(57)【要約】  本発明は、試料分析、とりわけ、単一の試料から表面上に多数のマイクロ堆積物を形成するための方法および装置に関連する。本発明は、より具体的には、液体試料のマイクロ堆積物を形成するための装置であって、複数のリザーバおよび針を含み、決められたプロファイルに従って、制御された規則的なマイクロ堆積物の形成を確保する、装置に関連する。
2011516875.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持上に液体試料のマイクロ堆積物を形成するための装置であって、：
−  各リザーバの底に貫通穴が設けられ、毛管作用によってリザーバ内に試料を保持するように穴がサイジングされている、堆積させる液体試料（１２）を受けるための複数のリザーバ（１１）：
−  各針がリザーバに対応し、穴を通過してその対応するリザーバ（１１）から外側に突出し、リザーバから試料の一部を搬送する位置の範囲において可動に設置された、先端（３４）を有する複数の針（３）；および
−  前記位置の範囲において前記先端の移動を制御する、制御部材（５）
を含むことを特徴とする、装置。
【請求項２】
先端（３４）がリザーバの内部に収容される位置と、リザーバから外側に突出する位置との間に可動に設置されている、請求項１記載の装置。
【請求項３】
穴が円形状であり、０．３〜０．６mmの直径を有する、請求項１または２記載の装置。
【請求項４】
先端（３４）が０．１０mm〜０．３mmの直径を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載の装置。
【請求項５】
先端が先端（３４）の自由端部から開始する増大区域のいくつかの連続部を有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の装置。
【請求項６】
各リザーバ（１１）が５〜１００マイクロリットル、好ましくは５〜５０マイクロリットルの容量を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の装置。
【請求項７】
各リザーバがその上側部（１３）に円筒穿孔を有し、その下側部（１４）において、円筒穿孔を貫通穴に連結する円錐穿孔を有する、請求項１〜６のいずれか１項記載の装置。
【請求項８】
貫通穴を囲むリザーバの外面部が疎水性被覆で被覆されている、請求項１〜７のいずれか１項記載の装置。
【請求項９】
針（３）の重量により、リザーバから外側に突出する位置に向かって先端が駆動され、
制御部材が、モータ（５２）と、モータによって作動し、先端（３４）がリザーバの内部に収容される位置に向かって針を駆動するレバー（５３）とを含む、請求項２記載の装置。
【請求項１０】
複数のリザーバが、一つの同じ間隔によって個々に離間されており、
レバーが、針の先端がそれらに対応するリザーバの内部に収容される位置に向かって先端を駆動することを特徴とする、請求項９記載の装置。
【請求項１１】
リザーバが一つの同じ一体の構成要素（１）内に配設されている、請求項１〜１０のいずれか１項記載の装置。
【請求項１２】
リザーバ（１１）に連結されているガイド（２）を含み、
針が、並進時にガイド（２）によってガイドされ、先端から突き出るとともに先端に連結されている本体（３２、３３）を含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載の装置。
【請求項１３】
リザーバ（１１）が、ガイド（２）の下側穿孔にねじ込まれた円筒形状の外面壁を有する、請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
ガイドが、リザーバ（１１）の外面壁から半径方向に突き出た肩部（２３）を形成する、請求項１２または１３記載の装置。
【請求項１５】
針が、軸受（２１）の下でガイド（２）の内部において半径方向に突き出た突起（３５）を形成する、請求項１〜１４のいずれか１項記載の装置。
【請求項１６】
さらに、：
−  ウェル（９２）が配設された支持（９１）；および
−  針がウェル（９２）に進入することを許容する上昇−下降装置を含む制御部材
を含み、前記複数の針および支持（９１）が相対的な垂直移動の対象となる、請求項１〜１５のいずれか１項記載の装置。
【請求項１７】
複数のリザーバおよび針が、支持または針の移動中に形成されるマイクロ堆積物のパターンを再現するように配設されている、請求項１〜１６のいずれか１項記載の装置。
【請求項１８】
２〜５０個のリザーバおよび対応する針を含み、前記リザーバおよび対応する針が幾何学的アレイ、好ましくは正方形または矩形に配設されている、請求項１〜１７のいずれか１項記載の装置。
【請求項１９】
さらに、先端（３４）の直下において支持を配置し、取り除くための部材を含む、請求項１〜１８のいずれか１項記載の装置。
【請求項２０】
−  支持（６）を処理方向に運ぶコンベヤ（７）；
−  コンベヤ（７）上に支持を載置するロード装置（８１）；
−  請求項１〜１９のいずれか１項に記載の試料のマイクロ堆積物（８５）を形成するための装置であって、ロード装置の下流にあるコンベヤ上に載置された支持の直上に配設されており、かつ、コンベヤの進行と同期した方式で支持上に堆積物を形成する装置；および
−  前記堆積物形成装置の下流に配設されている、コンベヤから支持をアンロードするアンロード装置（８７）
を含む、請求項１〜１９のいずれか１項記載の装置。
【請求項２１】
液体試料の堆積物を支持上に形成するための方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項記載の装置を用いて前記堆積物を適用する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の分析、とりわけ、表面上に試料の多数のマイクロ堆積物を形成するための方法および装置に関する。本発明は、より具体的には、複数のリザーバおよび針を含み、画定されたパターンにより、制御された規則的なマイクロ堆積物生成を確保する、液体試料のマイクロ堆積物を形成するための装置に関する。
【０００２】
発明の技術的背景
平坦な表面上において試薬のマイクロ堆積物を使用し、一つの同じ試料の数百の多重分析を実施することが可能であることは、現在のところ、広く証明されている。一つの同じ試料の遺伝子発現の分析は、なかでも、ヌクレオチド配列のマイクロ堆積物生成に依存する。抗原のマイクロ堆積物生成は、免疫化学分野において、感染またはワクチン接種状況を有する被験者の抗体を判定するためにも使用される。
【０００３】
試料の多重分析は、現在のところ、マイクロ堆積方法のコストおよび遅いプロセスのため、研究分野に制限されている。しかし、前記多重分析は、診断分野で多くの用途を供する。特に、一つの試料をいくつかの試薬の対象にできる点で有効である。加えて、多数の個別の試料に対し、一つの同じ試薬を頻繁に適用する必要がある。
【０００４】
堆積物生成手法は、ＤＮＡチップの形成のために設計されてきた。ＤＮＡチップは、特定の遺伝子の特徴である核酸配列が堆積され、分子の混合物における相補的核酸配列とのマッチングにより、分析対象細胞における同じ遺伝子の存在が検出されることを可能とする、ガラス、シリコンまたはプラスチックの小さいプレートである。
【０００５】
しかし、非常に高いコストおよび低い生産率を理由として、これらの手法を大規模な診断用途に転用することはできない。
【０００６】
ＤＮＡチップを製作するための機器は、例として、特許出願第ＥＰ１６１８９４８号に記載されている。この機器は、支持を持つワークテーブルと、溶液を貯蔵するための手段と、溶液を採取し、これらの支持上に堆積させるための手段とを含む。この文書は、複数のリザーバおよび針と、針がウェルに垂直方向に進入することを許容する上昇−下降装置とを含む、液体試料のマイクロ堆積物を形成するための器具を記載していない。
【０００７】
他のマイクロ堆積機械は、ＤＮＡチップの調製で公知である。これらの機械は、顕微鏡スライド上に堆積物スポットまたは試料スポットを形成するように設計される。顕微鏡フォーマット（２５×７５mm）の特定数のガラススライドがキャリヤ上に配置される。堆積させる溶液は、リザーバを形成するくぼみを持つプレート内に含有される。堆積物ヘッドにより、くぼみ付きプレートから溶液が吸引される。堆積物ヘッドは、スライドにわたって移動し、その上に溶液を堆積させ、非常に精密なＸ、Ｙ、Ｚ機構によって駆動される。
【０００８】
これらの機械は、大きい数の異なるスポットを減少した数のスライドに堆積させるように最適化される。しかし、堆積物ヘッドの再使用頻度に応じ、多くのリンス作業を伴うことから、堆積させる溶液が多量に無駄になる。加えて、これらの機械は、診断プレート上に堆積物を形成する能力がない。標準診断プレートは、９mmの間隔および８mmの深さで８行および１２列にわたって分散された９６個のウェルを含み、現在の機械による堆積が不可能である。
【０００９】
とりわけ、Genetic Microsystemsは、Arrayer 417の名称で堆積機械を製造している。この機械では、＜＜ピン＆リング＞＞タイプの技術を使用している。現在のところ、唯一、この技術が閉塞なく細菌懸濁液を堆積させる能力を有する。これは、ピン案内に関連する米国特許第６，２６９，８４６号をもたらした。
【００１０】
実際、堆積物サイズがスライドの位置に関係して変動することが確認される。堆積させる溶液の注入および蒸発も制御されず、その濃度が変動する結果をもたらす。この機械では、堆積物ヘッドの洗浄を繰り返し実行し、実際、堆積させる溶液の９５％程度の損失を伴う。
【００１１】
本発明は、これらの問題の一つ以上を解決することを企図する。本発明は、事実上、安定的、再現可能かつ確実な方式により、好適な支持上における試料のマイクロ堆積物生成を許容する、方法および装置を提供する。本発明は、とりわけ、一連の多数のマイクロ堆積物を達成することを許容し、任意のタイプの試料に適用することができる。
【００１２】
発明の概要
【００１３】
本発明は、支持上（または表面上）に液体試料のマイクロ堆積物を形成するための装置であって、複数の針およびリザーバを含む、装置に関する。
【００１４】
より詳細には、本発明は、液体試料のマイクロ堆積物を形成するための装置であって、：
−  リザーバの底に貫通穴が設けられ、毛管作用下によってリザーバ内に試料を保持するように穴がサイジングされている、堆積させる液体試料を受けるためのリザーバ；
−  穴を通過してリザーバから外側に突出し、リザーバの外部に試料の一部を搬送する位置の範囲において可動である、可動設置された先端を有する針；および
−  前記位置の範囲において先端の移動を制御する、制御部材
を含むことを特徴とする、装置に関連する。
【００１５】
本発明は、有利には、支持上に液体試料のマイクロ堆積物を形成するための装置であって、：
−  各リザーバの底に貫通穴が設けられ、毛管作用下でリザーバ内に試料を保持するように穴がサイジングされている、堆積させる液体試料１２を受けるための複数のリザーバ１１；
−  各針がリザーバに対応し、穴を通過して対応するリザーバ１１から外側に突出し、リザーバの外部で試料の一部を搬送する位置の範囲において可動に設置された、先端３４を有する複数の針３；および
−  前記位置の範囲において先端の移動を制御する、制御部材５
を含むことを特徴とする、装置に関する。
【００１６】
一つの特に好ましい変形態様により、装置は、さらに、：
−  ウェル９２が配設された支持９１（例を挙げれば、プレート）；および
−  針をウェル９２内に進入させることができる上昇−下降装置を含む制御部材
を含み、複数の針および支持９１が相対的な垂直移動の対象となる。
【００１７】
本発明の装置の一つの最も好ましい実施態様では、複数のリザーバおよび針が、支持または複数の針の移動中、形成するマイクロ堆積物のパターンを再現するように配設されている。
【００１８】
好ましい実施態様では、本発明の装置は、さらに、下記の特徴の一つ以上を含む。
−  先端３４がリザーバの内部に収容される位置と、リザーバから外側に突出する位置との間で可動に設置されている；
−  穴が円形状であり、０．３〜０．６mmの直径を有する；
−  先端３４が０．１０mm〜０．３mmの直径を有する；
−  先端が先端３４の自由端部から開始する増大区域のいくつかの連続部を有する；
−  リザーバ１１が５〜１００マイクロリットル、好ましくは５〜５０マイクロリットルを含む容量を有する；
−  リザーバがその上側部１３に円筒穿孔を有し、その下側部１４において、円筒穿孔を貫通穴に連結する円錐穿孔を有する；
−  貫通穴を囲むリザーバの外面部が疎水性被覆で被覆されている；
−  針３の重量により、リザーバから外側に突出する位置に向かって先端が駆動され、制御部材が、モータ５２と、モータによって作動し、先端３４がリザーバの内部に収容される位置に向かって針を駆動するレバー５３とを含む；
−  装置は、一つの同じ間隔によって隔てられた、いくつかの対応するリザーバおよび針を含む。レバーにより、針の先端がそれらに対応するリザーバの内部に収容される位置に向かって駆動される；
−  リザーバが一つの同じ一体の構成要素１内に配設されている；
−  装置がガイド２を含み、針が、並進時にガイド２によってガイドされ、先端から突き出るとともに先端に連結されている本体３２、３３を含む；
−  ガイド２がリザーバ１１に連結されている；
−  リザーバ１１がガイド２の下側穿孔にねじ込まれた円筒形状の外面壁を有する；
−  ガイドがリザーバ１１の外面壁から半径方向に突き出た肩部２３を形成する；
−  装置は、形成するマイクロ堆積物のパターンを再現する、格子様式でグループ化された複数の針と、ウェル９２が配設されたプレート９１と、針がウェル９２内に進入することを許容する上昇−下降装置とを含み、複数の針およびプレート９１が相対的な垂直移動の対象となる；
−  針が、軸受２１の下でガイド２の内部において半径方向に突き出た突起３５を形成する；および／または
−  装置は、さらに、先端３４の直下において支持を位置に配置し、取り除くための部材を含む。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、：
−  支持を処理方向に運ぶコンベヤ；
−  コンベヤ上に支持を載置するロード装置；
−  試料のマイクロ堆積物を形成するための先に画定したような装置であって、ロード装置の下流にあるコンベヤ上に配置された支持の直上に配設されており、コンベヤによる駆動と同期した方式で支持上に堆積物を形成する、装置；および
−  マイクロ堆積物を形成するための装置の下流に配設されている、コンベヤから支持をアンロードするアンロード装置８７
を含む装置である。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、液体試料の堆積物を支持上に形成するための方法であって、先に画定したような装置により、マイクロ堆積物を適用する工程を含む、方法に関する。
【００２１】
本発明は、一つ以上の液体試料のマイクロ堆積物を支持上に形成するための先に画定したような装置の使用にも関する。
【００２２】
本発明は、さらに、試料のマイクロ堆積物を含有する支持を作製するための方法であって、先に画定したような装置により、マイクロ堆積物を適用する工程を含む、方法に関する。
【００２３】
本発明の他の特徴および効果は、添付図面を参照しつつ、示唆として以降に提示する記載から明確になるであろうが、それに限定されるわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】マイクロ堆積機械の第一の実施態様の断面側面図である；
【図２】図１の機械を使用した、ガラススライド上の堆積ラインの模式上面図である；
【図３】運転時におけるマイクロ堆積機械の第二の実施態様の模式上面図である；
【図４Ａ】異なる運転工程における図３の機械の針の断面側面図である；
【図４Ｂ】異なる運転工程における図３の機械の針の断面側面図である；
【図５】運転時における図３の機械の断面図である；
【図６】本発明による機械を使用して作った堆積物の蛍光画像である。
【００２５】
発明の詳細な記載
本出願は、一つ以上の試料のマイクロ堆積物（またはスポット堆積物）を好適な支持の表面上に形成するための方法および装置に関する。以降により詳細に記載するように、本発明は、任意のタイプ、すなわち、なかでも、任意の溶液または懸濁液、例を挙げれば、水性の液体試料に適用することができる。試料は、変動するタイプ、例えば、例として、ポリペプチドタイプ（ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体など）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、細胞質、ウイルス、脂質、生物などの試料であることができる。本発明により、マイクロ堆積物、すなわち、通常、５０nl未満、通常、０．０１〜１０nlの容積を有し、この分量が当業者によって調整可能である、堆積物の形成が可能となる。
【００２６】
本発明により、堆積物を任意のタイプの好適な支持上に形成することが可能となる。これらは、好ましくは、本質的に平坦な表面を含む支持（例えば、スライド、膜、フィルタなど）である。仕切板によって隔てられた一つ以上の平坦な表面またはくぼみが配設された平坦な表面を有する支持、例を挙げれば、マルチウェルプレートであることもできる。支持は、任意の適応材料（ガラス、プラスチック、任意の相溶性ポリマー、金属、シリカ、セラミック、コーラルなど）であることができる。支持は、通常、マルチウェルプレート、例えば、１２、２４もしくは９６またはそれ以上のウェルのプレートである。支持は、ガラススライドであることもできる。
【００２７】
一つの好ましい実施態様により、本発明の装置は、：
−  各リザーバの底に貫通穴が設けられ、毛管作用下でリザーバ内に試料を保持するように穴がサイジングされている、堆積させる液体試料１２を受けるための複数のリザーバ１１；
−  各針がリザーバに対応し、穴を通過して対応するリザーバ１１から外側に突出し、リザーバの外部に試料の一部を搬送する位置の範囲において可動に設置された、先端３４を有する、複数の針３；および
−  前記位置の範囲において先端の移動を制御する制御部材５を含み、支持または複数の針の移動中、形成するマイクロ堆積物のパターンを再現するように、前記複数のリザーバおよび針が配設されている。
【００２８】
一つの特に好ましい実施態様により、装置は、さらに、：
−  ウェル９２が配設された支持９１（例を挙げれば、プレート）；および
−  針がウェル９２に進入することを可能にする上昇−下降装置を含む、制御部材；
を含み、前記複数の針および支持９１が相対的な垂直移動の対象となる。
【００２９】
装置は、変動する数のリザーバおよび対応する針を含むことができる。したがって、複数という用語は、通常、２〜５０、好ましくは４〜５０および好ましくは９〜５０の数を指す。具体的な例では、装置は、２、４、６、８、９、１２、１５、２５または３６個のリザーバおよび対応する針を含む。
【００３０】
好ましくは、リザーバおよび針は、格子様式または所定の幾何学的アレイ（例を挙げれば、正方形または矩形アレイ）で配設され、連続的な工業生産ラインに沿ったマイクロ堆積物のプロファイルの再現およびライン配列を許容し、実施された堆積物について、いくつかの遠隔装置による整列の同時的な維持をもたらす。一つの具体的な実施態様により、リザーバおよび針は、６×６、５×５、４×４または３×３の正方形アレイの格子配列を有する。
【００３１】
本発明の具体的な実施態様により、先端３４は、：
−  リザーバの内部に収容される位置と、リザーバから外側に突出する前記位置との間に可動に設置され、および／または
−  ０．１０mm〜０．３mmの直径を有し、および／または
−  先端３４の自由端部から開始する増大区域のいくつかの連続部を有する。
【００３２】
本発明の一つの具体的な実施態様により、リザーバ内に試料を保持するために設けられる穴は、円形状であり、０．３〜０．６mmの直径を有する。
【００３３】
本発明は、リザーバ１１が５〜１００マイクロリットル、好ましくは５〜５０マイクロリットルの容量を有する、装置にも関する。本発明のリザーバは、その上側部１３に円筒穿孔を有し、その下側部１４において、円筒穿孔を貫通穴に連結する円錐穿孔を有することができる。貫通穴を囲むリザーバの外面部は、疎水性被覆で被覆されていることができる。
【００３４】
本発明の一つの具体的な態様は、針３の重量により、リザーバから外側に突出する位置に向かって先端が駆動され、かつ、制御部材がモータ５２と、モータによって作動し、先端３４がリザーバの内部に収容される位置に向かって針を駆動する、レバー５３とを含む、装置に関する。
【００３５】
もう一つの態様は、リザーバが一つの同じ間隔によって相互に離間された、いくつかのリザーバおよび対応する針を含み、レバーにより、これらの先端が対応するリザーバの内部に収容される位置に向かって前記針の先端が駆動される、装置に関する。好ましくは、リザーバが一つの同じ一体構成要素１内に配設されている。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、リザーバ１１に連結されたガイド２を含む装置であって、針が先端から突き出て連結された本体３２、３３を含み、本体が並進時にガイド２によってガイドされる、装置に関する。前記リザーバ１１は、ガイド２の下側穿孔にねじ込まれた円筒形状の外面壁を有することができ、前記ガイドは、リザーバ１１の外面壁から半径方向に突き出た肩部２３を形成することができる。
【００３７】
本発明の一つの具体的な目的は、針が軸受２１下でガイド２の内部において半径方向に突き出た突起３５を形成する、装置に関する。
【００３８】
本発明の装置は、さらに、先端３４の直下において支持を配置し、取り除くための部材を含むことができる。前記装置は、：
−  支持６を処理方向に運ぶコンベヤ７；
−  コンベヤ７上に支持６を載置するロード装置８１；
−  上記のように定義された試料のマイクロ堆積物を形成するための装置８５であって、ロード装置の下流のコンベヤ上に配置された支持の鉛直上方に配設されており、前記コンベヤによる駆動と同期した方式で支持上に堆積物を形成する装置；および
−  堆積物形成装置の下流に配設されている、コンベヤから支持をアンロードするアンロード装置８７
を含むこともできる。
【００３９】
本発明の他の実施態様により、本発明の装置は、リザーバおよび針の代わりに、圧電圧縮（例として、Perkin-Elmerによる「Piezoarray」）または（例として、米国特許第５，５５１，８８３号に記載された方法による）マイクロ沸騰によって液滴を発射する、先に記載したように配設されたピペットタイプの複数の従来式ヘッドを備えることができる。
【００４０】
本発明のさらなる目的は、液体試料の堆積物を支持上に形成するための方法であって、本発明による装置により、堆積物を適用する工程を含む、方法に関する。
【００４１】
先に示唆したように、本発明は、リザーバ内に含有された液体試料（例を挙げれば、水溶液）から堆積物を形成するための装置に関する。本発明の装置の一つの特徴は、貫通穴がリザーバの底に設けられ、毛管作用下でリザーバ内に液体試料を保持するように穴がサイジングされるという事実にある。装置は、穴を通じて試料を搬送する能力を有する針先端を含む。
【００４２】
図１に例示する堆積物形成装置は、ガラススライド６を運ぶコンベヤベルト７を含む。連続スライド６は、既定の間隔、例を挙げれば、３５mmの間隔でベルト７上に配設される。スライド６は、例として、テンプレートにより、ＸおよびＹに沿って位置付けることができる。スライド６の二つの垂直側面は、テンプレートの二つのそれぞれの側面に接触している。ベルト７がスライドをＸ方向に駆動する。装置は、ベルト７にわたって位置付けられたプレート１を含む。いくつかのリザーバ１１がプレート１内に配設され、その底部に貫通穴を有する。これらのリザーバ１１には、堆積物として堆積される溶液１２が充填される。各穴は、毛管作用下でリザーバ１１内に溶液を保持するようにサイジングされている。リザーバは、当業者により、この容量を適応させることができる場合であっても、通常、５〜１００マイクロリットル、好ましくは５〜５０マイクロリットルの容量を有し、リザーバ毎に変動することができる。プレート１の上面には、蓋およびガイドとして機能するカバープレート４がある。カバープレート４は、例として、保守作業を行うか、例として、リザーバ１１の充填を簡易にするため、プレート１に脱着可能に取り付けられる。カバープレート４は、プレート１のそれぞれのリザーバ１１の直上方に配設されたねじ付き穿孔を有する。ガイド支持２は、カバープレート４の穿孔内に固定されている。針３は、並進時、ガイド支持２によってＺ軸に沿ってガイドされる。針３は、例示された位置においてそれぞれのリザーバ１１の内部に配設される、先端３４をその下側端部に有する。装置は、先端３４の並進ストロークを画定するレバー５３も含む。
【００４３】
先端３４をＺ方向に下降させることにより、この先端が貫通穴を通じ、リザーバ１１内の溶液１２の一部を駆動し、鉛直下方にあるガラススライド６上にこの一部を堆積させる。
【００４４】
本発明では、リザーバ１１内に存在する溶液１２から、この溶液１２の蒸発を制限することにより、高速度で多数の堆積を実行することが可能である。加えて、先端３４は、リザーバ１１の穴を通過するピストンを形成し、その閉塞を防止する。先端３４は、形成された堆積物の広範な再現性を保証する。堆積物形成のプロセス全体を通し、溶液および針３が外部から遮断され、汚染のリスクも解消される。
【００４５】
プレート１は、ガラススライド６上に堆積させる溶液１２を受けることを意図された、いくつかのリザーバ１１を有する。一つの同じ金属プレートを機械加工することにより、これらのリザーバ１１を製作することができる。リザーバ１１は、ベルト７上の連続スライド６間の間隔に合致する間隔で配設されている。
【００４６】
有利には、リザーバ１１およびベルト７をＹ方向に沿って互いに相対的に移動させ、ガラススライド６の最も大きい寸法に従っていくつかの堆積物を形成することができる。特に、プレート１を電動式にし、ＸおよびＹ軸に沿ってベルト７に対して相対的に移動させることができる。疎水性区画に囲まれた最大１８個の堆積物領域を有する各ガラススライド６を使用することができる。
【００４７】
穿孔は、各リザーバ１１内に配設され、円筒形状の上側部１３を有し、円錐形状の下側部１４がリザーバ１１の底を形成する。下側部１４に貫通穴が形成される。リザーバ１１は、通常、数ミリメートル、例として、２〜４ミリメートルの高さを有することができる。上側部１３は、数ミリメートルの直径を有することができる。下側部１４に配設された貫通穴は、有利には、０．３〜０．６ミリメートルの直径を有する。前記直径は、溶液１２内に存在する粒子の通過を許容するのに十分である。堆積させる溶液の大部分について、穴の前記直径により、毛管力のため、溶液１２を流出させずにリザーバ１１内に保持することが許容される。したがって、溶液を留めるための複雑な機構に依存する必要がない。溶液１２に対する毛管力を強化するため、リザーバ１１の下側部１４は、有利には、疎水性被覆、例を挙げれば、シリコンまたはポリテトラフルオロエチレンで被覆されている。
【００４８】
ガイド支持２は、中空シリンダとして製作される。これは、ブロック機械加工されるか、追加のリングから形成されるかのいずれかである、針の上側および下側ガイド軸受を支持する。ガイド支持は、リザーバに連結されている。
【００４９】
一つの具体的な実施態様では、ガイド支持の下側部がねじ切りされ、リザーバがねじ付けされている。この実施態様は、特に、マルチウェルプレート、例として、９６ウェルプレート上における堆積物の形成に適応される。このタイプの支持では、リザーバがウェルに進入できるように、高さ方向に移動できるべきであることが有利であり、それは、例として、リザーバを針に懸架することによって実現される。
【００５０】
もう一つの実施態様では、ガイド支持２の下側部の外面表面がねじ切りされ、リザーバはねじ切りされた穿孔によって載っている。
【００５１】
もう一つの実施態様では、いくつかのリザーバを対応させるために有利に、ガイド支持の下側部がカバープレート４の合致するねじ切り穿孔にねじ込まれている。
【００５２】
針３の並進時における半径方向の位置決めおよび誘導は、ガイド支持に配設された上側軸受２１およびカバープレート４に配設された下側軸受２２を介して確保される。上側軸受２１は、ガイド支持２の上側部に配設された肩部に作られる。下側軸受２２は、カバープレート４のねじ切り穿孔の底に配設された肩部に作られる。ガイド支持２に下側軸受２２を配設することも想定できる。この肩部は、リザーバ１１のためのカバーも形成する。上側軸受２１および下側軸受２２は、約２０mmの距離によって隔てられている。下側および上側軸受には、ポリテトラフルオロエチレンの円筒リングを設けることができる。
【００５３】
針３は、溶液１２に浸漬され、その下側端部において、この溶液の一部をガラススライド６に接触させることを意図された、先端３４を有する。先端３４は、有利には、０．１〜０．３mmの直径を有する。先端３４の下側端部は、好ましくは、研磨されている。先端３４には、第一の並進用誘導部３３が載っている。先端３４は、その自由端部と、その第一のガイド部３３との接続との間に増大する区域を有し、溶液１２の攪拌を増大させ、それにより、異なる堆積物を作る際にこの溶液の均質性を確保することができる。先端３４は、直径が異なり、第一のガイド部３３の範囲において自由端部から増大を開始する、いくつかの区域を有することもできる。先端は、特に、自由端部を第一のガイド部３３に連結する、直径が０．３mmの区域を有することができる。このガイド部３３は、約１mmの直径を有し、軸受２２に適応するようにスライド可能に設置されている。第一のガイド部３３には、第二の並進用ガイド部３２が載っている。ガイド部３２は、約４mmの直径を有し、ガイド支持２の軸受２１に適応するようにスライド可能に設置されている。第二のガイド部３２には、この第二のガイド部３２よりも大きい直径を有する、支台３１が載っている。針３は、ステンレス鋼で製作することができ、およそ４〜６グラムの重量を有することができる。針３は、３０〜５０mmの高さを有することができる。並進時に軸受２１および２２によって誘導される針３のそれらの表面は、有利には、摩擦を限定するために研磨されている。針３の並進中の摩擦力は、有利には、０．０１Ｎ未満である。
【００５４】
下記の寸法を有する針で試験を実施した：
−  直径０．１５mmおよび高さ０．８mmの自由端部が設けられ、直径０．３mmおよび高さ３．２mmの接続部が設けられた、先端３４；
−  直径１mmおよび高さ１７mmを持つ第一のガイド部３３；
−  直径２．３２mmおよび高さ８．０２mmの第一の区域と、直径４mmおよび高さ８mmの第二の区域とを有する、第二のガイド部３２；
−  直径８mmおよび高さ８mmを有する支台３１。
【００５５】
前記針３は、清掃のため、高度にアクセス性が良好であり、容易に脱着可能であることが証明された。
【００５６】
ガイド支持２に対する針３の相対的なセンタリング精度、および、プレート４に対するガイド支持２の相対的なセンタリング精度により、先端３４と対応するリザーバの貫通穴との間に隙間を維持することが可能となる。この隙間は、好ましくは、１００μm未満である。針の適切なセンタリングにより、堆積物の位置付けを５０μmの精度で画定することが許容される。
【００５７】
装置は、堆積させる液体試料のための攪拌器を含むことができる。
【００５８】
レバー５３は、針３の並進用ストロークを画定する。このレバー５３は、二つの軸５１の周囲に旋廻可能に設置されている。レバー５３は、カムに対応したモータ５２によって駆動される。カムは、レバー５３を支持する、突き出したオフセット部を有する。突き出し部の回転中、レバー５３がその自重の影響によって下降する。その軸に対するオフセットの相対的な回転による摩耗を制限するために、設置されたボール軸受を使用することも可能である。
モータ５２は、針３の降下速度を毎秒１０〜２０mm前後に制限する。モータ５２を制御することによって、先端３４とガラススライド６との間の接触時間として０．０５〜０．１５秒を確保することができる。接触時間は、特に、レバー５３の端部のストロークと針３のストロークとの間の差により、画定することができる。この実施態様では、針３は、その自重によって下向きに駆動される。その後、レバー５３を使用し、針３の降下速度を制御する。レバー５３は、支台３１を介して針３を留める。レバー５３の下降ストロークは、先端３４とガラススライド６との間の接触を越えて継続することができ、その後、接触力が針３の重量のみによって画定され、ガラススライド６上への支持力の実質的な規則性が保証される。先端３４の並進用ストロークは、例として、４〜７mmであることができる。レバー５３は、堆積指示が与えられるまで、リザーバ１１内に先端３４を保持する。堆積指示が出されると、レバー５３が旋廻し、ガラススライド６に接触するまで先端３４を下降させる。先端３４が溶液１２の滴を搬送し、この滴をガラススライド６上に堆積させる。針３を上昇させるため、モータ５２がそのストロークを継続し、レバー５３を反対方向に旋廻させ、針３が支台３１を介して上向きに駆動される。
【００５９】
一つの変形態様により、レバー５３がばねを介して針３に連結されることを想定できる。先端３４がガラススライドに接触した後にレバー５３を駆動する場合、ばねにより、レバー５３と先端３４との間に伝達される接触力が制限される。
【００６０】
もう一つの変形態様により、針ヘッドは、円錐支持を介してレバー５３上に載置され、前記レバー５３によって針のガイドが確保され、それにより、ガイド支持２の必要が取り除かれる。
【００６１】
針３の下降は、他の制御機構で画定することができる。下降は、特に、ステッピングモータ、円移動を直線移動に変換するカム、ラックまたはウォームねじ装置を介して画定することができる。元来の配置位置でステッピングタイプのモータ５２を使用することも可能である。一つの変形態様により、同じ配置位置で非同期タイプのモータ５２が使用される。
【００６２】
図２は、図１に詳述するタイプの機械を使用した、ガラススライド６上における堆積物の形成８の模式上面図である。堆積ライン８は、ガラススライド６が処理を受ける方向に進行するコンベヤベルト７を含む。堆積ライン８は、ベルト７上にガラススライド６を配置する装置８１を含む。装置８１は、ベルト７上に規則的な隔たりでガラススライド６を配置する作動シリンダ８２を含む。装置８１とベルト７との間のガラススライド６の経路上には、洗浄ランプ８３が配設されている。ベルト７の下流上方にドライヤ装置８４が配設され、洗浄ランプ８３によってガラススライド６上に堆積された残留水を取り除く。
【００６３】
さらに下流では、堆積ライン８は、上記に詳述したタイプのいくつかの堆積機械８５を含む。各堆積機械８５は、軸５１の周囲に旋回可能に設置されたレバー５３と、レバー５３の持ち上げまたは下降を制御するモータ５２とを含む。各レバー５３は、先に詳述したように、コンベヤの進行方向に整列した六つの針３の持ち上げおよび下降を制御する。各堆積機械８５の直下には、前記機械に連結された、図２に図示しないテンプレートがあり、堆積のために所望される正確な位置へスライドを規制するために使用される。堆積ライン８は、一つのスライド６上に異なる溶液を堆積させるのに必要な数の針を有することができる。制御部材８６は、堆積機械８５の下流のガラススライド６上に形成された堆積物の適合性を分析する。制御部材８６は、不適合とみなされたガラススライド６をベルト７から取り除く。制御部材８６の下流において、ハンドリング装置８７は、作動シリンダ８８を含む。シリンダ８８により、数多くのガラススライド６を受けることを意図された貯蔵マガジン８９内にガラススライド６が配置される。ベルト７が駆動されると、プレート６間の間隔に対応して増加された距離にわたって、ガラススライド６が移動される。コンベヤベルト７を、歯または切り欠きを持つ剛性を有するプラットフォームに交換し、循環的な動作によりスライドを捕捉および解放することにより、スライドを１ピッチ移動させ、スライドが好適な位置に保持される固定のテンプレート内にスライドを配置することができる。
【００６４】
図３は、標準診断プレートを使用した堆積物形成機械のもう一つの実施態様の上面図である。診断プレート９１は、標準として、９mmの間隔で８ラインおよび１２列にわたって分散された９６個のウェル９２を含む。診断プレート９１は、それらをＸ方向に駆動する能力を有するコンベヤ９４上に配設されている。機械は、Ｙ方向に沿って向けられた二つのレール９３も含む。ヘッド９５は、レール９３上にスライド可能に設置されている。モータは、図示しないが、ヘッド９５をＹ方向に位置付ける。ヘッド９５は、６×６の正方形アレイ、例えば、いわゆる格子配列内でガイドされて配設される、複数のリザーバおよび針３を搬送する。黒丸によって例示された針３は、ウェル９２に向かって鉛直Ｚ方向に下降する。白丸によって例示された針３は、ウェルに向かって下降しない。針および対応するリザーバの配列は、ウェルの底におけるマイクロ堆積物に従ったパターンと同じパターンを再現する。
【００６５】
図４ａおよび４ｂは、二つの運転位置における針３を例示している。図４ａに例示された位置では、先端３４がリザーバ１１の内部に収容され、溶液１２に浸漬される。図４ｂに例示された位置では、先端３４がリザーバ１１から外部に突き出し、それと共に溶液１２の一部を搬送し、支持上にマイクロ堆積物を形成する。針３は、図１に類似した方式でガイド支持２にスライド可能に設置されている。ガイド支持２は、その下側部にねじ付き穿孔を有する。リザーバ１１は、外面円筒形状を有する。リザーバ１１の外面表面は、ねじ付けされている。リザーバ１１は、ガイド支持２のねじ付き穿孔にねじ込まれている。リザーバは、ウェル９２に進入することができるように、８mm以下の外周直径を有することができる。リザーバ１１のウェル９２内への下降を許容することにより、貫通穴を越えた先端３４の必要なストロークを限定することが可能である。貫通穴を越えた先端３４のストロークは、例として、２mmに限定することができる。ガイド支持２の下側部は、リザーバ１１の外面表面に対して相対的な肩部２３を形成する。この肩部２３を支台として使用し、くぼみ９２の内部におけるリザーバ１１の下降を規制する。下側軸受２２が配設された肩部は、リザーバ１１を覆うカバーを形成する。針３は、針３が持ち上げられたときに上側肩部を駆動する能力を有する突起３５を有する。したがって、支台３３の牽引により、くぼみ９２からリザーバ１１を引き抜くことが可能である。針３、そのガイドおよび貫通穴は、ウェルの軸に対して相対的にわずかにオフセットされ、堆積物間の適切な離間を得ることができる。
【００６６】
図５は、診断プレート９１のウェル９２における機械の断面図である。堆積物基材、例えば、ガラスまたはプラスチックの透明なシート９６は、プレート９１の底に対するように配設されている。基材９６には、ウェル９２が形成されたグリッドが載っている。
【００６７】
機械は、電磁石５５ａ〜５５ｅが設けられた制御プレート５４を有する。電磁石５５ａ〜５５ｅにより、針３ａ〜３ｅをそれぞれ保持または解放することが許容される。針３ａ〜３ｅの上側端部は、制御プレート５４によって保持される。下降位置では、針３ａ〜３ｅの上側端部が指令プレート５６によって支持される。針３ｂ〜３ｅのリザーバは、その後、ウェル９２内に配設される。グリッドの上側部９７は、所定の高さにあり、針３の下降中に肩部２３のための支台を形成する。指令プレート５６は、点線によって図示された上端位置と、実線によって図示された底位置との間で鉛直方向に可動である。指令プレート５６は、その底位置において、先端３４がそのリザーバの貫通穴から突出し、支持９６上に堆積物を形成するまで針の下降を許容する。
【００６８】
針３ａは、グリッド領域の外部に配設され、その対応するリザーバは、プレート９１の周辺表面９８の上方にある。針３ａおよび針３ｅも、電磁石５５ａにより、上昇位置に保持される。針３ｂ〜３ｄのためのガイドの肩部２３は、方形のプレートの上側部９７に対する支台に配置している。
【００６９】
したがって、これらの針のリザーバおよびガイドは、鉛直方向に不動である。指令プレート５６に下降指示が適用されていることから、針３ｂ〜３ｄの先端３４がリザーバから外側に突き出して基材９６に接触し、マイクロ堆積物を形成する。図１の例のように、針３は、それらの自重の影響によって基材９６に接触する。
【００７０】
直径２ミリメートルおよび高さ５mmを有するリザーバでアッセイを実施した。アミノメチルクマリンで標識化された１０マイクロリットルのウシアルブミン溶液をこのリザーバ内に配置した。４マイクロリットルの死容積を維持した。アッセイでは、蒸発が減少した。この溶液は、リザーバに補給することなく、６５００個の堆積物の堆積を許容した。したがって、死容積がなければ、前記リザーバは、約１５マイクロリットルの溶液を含むことが可能であり、１００００個の堆積物の形成を許容することができる。図６は、３６５nmの励起で得られたＢＳＡ＊ＡＭＣＡの８１個の堆積物の青色蛍光画像を示す。これらの堆積物は互いに極めて均質であることが注目され、リザーバ内部での針の移動により、溶液の規則的な攪拌が維持されることが確かめられる。スライド内ＣＶは、１０〜１３％（ｎ＝８１％）である。平均スライド内ＣＶは、５．６２％（ｎ＝１４）である。
【００７１】
堆積物の平均蛍光画像から、試料のマイクロ堆積物の青色蛍光、その標準偏差、およびＣＶが、異なるアッセイ条件下で、各スライドについて定量化される。特に、６．４８ｇ〜１２．５６ｇの重量を有する異なる針を使用しても、堆積物のサイズまたは蛍光の変化が引き起こされないことが確認された。したがって、減圧下で堆積物を形成可能であり、細胞の堆積にとって特に好ましいことが推測される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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