(57)【要約】本発明は、糖尿病マウスを作製する方法および薬剤開発におけるそれらの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約9週齢のマウスに高脂肪高糖質飼料を約20週間給餌する段階を含む、インスリン抵抗性、肥満、および2型糖尿病の非ヒト動物モデルを作製する方法。
【請求項２】
前記マウスが雄性マウスである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記マウスがC57BL/6Jマウスである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記高脂肪高糖質飼料の給餌を約22週間行う、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記高脂肪高ショ糖飼料の給餌を開始するまで前記マウスに通常の固形飼料を与える、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記固形飼料がKLIBA 3436飼料を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記高脂肪高糖質飼料が、専用に調製した、脂肪を60%Kcalに調整したSSNIFF D12492飼料である、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記マウスに高脂肪高糖質飼料を約30週間給餌する段階を含む、2型糖尿病の合併症の非ヒト動物モデルを作製するための請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記高脂肪高糖質飼料の給餌を約32週間行う、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
2型糖尿病および／またはその合併症の処置のための化合物を同定および／または試験するための方法であって、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法によって作製したマウスに関心対象の化合物を投与する段階、ならびに糖尿病および／または少なくとも1つのその合併症が前記化合物によって逆転されるかどうかを決定する段階を含む、方法。
【請求項１１】
2型糖尿病の処置および／または2型糖尿病に伴う合併症の処置のための化合物を同定および／または試験するための、請求項1〜9のいずれか一項記載のマウスの使用。
【請求項１２】
本明細書において説明される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病を逆転させることができかつ糖尿病およびその合併症の介入療法に適した化合物を同定する方法に使用することができる糖尿病マウスを作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去数十年間、肥満および2型糖尿病（T2D）有病率の劇的な増加が、主に米国においてみられてきたが、ヨーロッパおよび発展途上国においても増加している。世界中で、T2Dは糖尿病の全症例（遺伝性のインスリン依存型糖尿病すなわちT1D、および非インスリン依存型真性糖尿病すなわちT2D）の85〜90%に相当する。レプチン経路、インスリン分泌もしくはその受容体、またはGLUT4（インスリン感受性グルコース輸送）に影響するいくつかの突然変異が同定されているものの、肥満およびT2Dの大半の症例は非遺伝的な原因によるものであり、生活習慣（運動不足、高カロリー食等）が引き金となる。T2Dおよび肥満はいずれも、微小血管および大血管の合併症に起因して、高い罹患率、高い死亡率、および高額な医療費を伴う。
【０００３】
T2Dの主な特徴は、インスリン抵抗性とインスリン分泌不全である。インスリンは、膵β細胞で合成および分泌される重要なホルモンであり、様々な器官（特に、筋肉、肝臓、および脂肪組織）においてグルコースの取り込みを刺激する。インスリンはまた、グルコース-6-ホスファターゼをコードする遺伝子の発現を制御することによって肝臓のグルコース産生（HGP）を調節し、脂肪組織中の脂肪分解を阻害する。標的組織がインスリンの正常な濃度に応答できなくなると、インスリンの作用が低下する（すなわちインスリン抵抗性）。
【０００４】
この調節不全が始まり、処置が行われないと、正常血糖（正常な循環グルコースレベル）を保つためにβ細胞のインスリン分泌量が増加する（＝高インスリン血症）。しかし、処置が行われないと、β細胞は十分なインスリンを産生できず、循環グルコースの増加を引き起こす（高血糖）。十分なβ細胞が生存可能であり、かつ正常血糖を保つのに適した速度でインスリンを分泌している限り、T2Dは発生しない。インスリン抵抗性を引き起こす機序は、過去数年間、多くのグループによって広範に研究されてきた。インスリン感受性非脂肪組織（肝臓および筋肉）に遊離脂肪酸（FFA）が蓄積されるとこれらの組織でインスリン媒介性グルコース取り込みが損なわれ得ることが広く受け入れられている。さらに、肝臓による脂質産生が増加すると、脂肪酸の酸化が促進され、肝臓のグルコース産生のインスリン依存性阻害が減少し、それにより糖新生（GNG）が増加し、高血糖症をさらに悪化させる。
【０００５】
T2Dの進行は、他の代謝障害を伴う。メタボリックシンドローム（シンドロームX）と呼ばれる、インスリン抵抗性、グルコース耐性障害、動脈高血圧、腹部肥満、および異脂肪血症の群は、成人治療委員会III（ATPIII）により、主要な心臓血管リスクの基礎をなす因子群と定義されている。多くの前臨床研究により、T2D患者における高血圧の進行にインスリンが主要な役割を果たしていることが示唆された。しかしながら、臨床診療の主な焦点は、グルコース代謝の異常を診断し処置することである。英国予想糖尿病研究（UKPDS, 1998）により報告されているように、実際、高い血糖値は、微小血管合併症の主な危険因子である。T2D患者においてグルコースレベルを正常に近いレベルに保つことで、神経障害（T2D患者の50%〜60%で生じる）、網膜障害および腎障害（糖尿病は、米国における失明および末期腎不全の原因の第1位である）などの障害の発症が予防されることが示された。
【０００６】
ロシグリタゾン（Avandia（登録商標））、ピオグリタゾン（Actos（登録商標））、およびトログリタゾン（Rezulin（登録商標））に現在代表される、チアゾリジンジオン（TZD）クラス由来の抗糖尿病薬（米国では1997年以降市販されている）は、末梢インスリン媒介性グルコース取り込みの増加に有効な薬剤である。TZDは、グルコース代謝および脂質代謝における遺伝子発現を制御する核ホルモン受容体ファミリーの転写因子であるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPARγ）の薬理学的アゴニストである。PPARγ薬剤は、特に末梢脂質貯蔵細胞において、前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化および増殖を増加することで、高血糖症、高脂血症、および高インスリン血症を抑え、インスリン感受性を改善した。このように、PPARγの活性化は、末梢脂肪細胞における脂肪酸貯蔵を増加し、循環脂肪酸を低減し、筋肉および肝臓におけるトリグリセリドレベルを減少する。PPARγ薬剤は、インスリン抵抗性および治療応答との濃度相関性が高い、アディポネクチン、TNFα、およびレジスチン等のいくつかの循環因子の発現を改変する。
【０００７】
T2Dおよびインスリン抵抗性の適切な動物モデルは、治療薬剤のインビボでの効力を特徴付けるために必須の前臨床手段である。過去20年間に開発されたT2Dの動物モデルのほとんどは遺伝子組換えに基づいている。db/dbマウス、ob/obマウス、GKラット、ZDFラット、およびfa/faラット等の自然発症糖尿病（またはインスリン抵抗性および肥満）げっ歯類モデルが、薬剤開発において世界中で最も一般的に使用されている。
【０００８】
その急速な代謝低下のゆえに、市販の抗糖尿病薬（ロシグリタゾン（PPARγ）およびラジグリタザール（PPARαγ））では、ZDFラットにおけるT2Dの主な特徴の逆転は達成できない。しかしながら、長期処置（13週間）したZDFラットで（Shibata et al., 2000）、または中程度の糖尿病を有するきわめて若い動物で（Brand et al., 2003; Pickavance et al., 2005）、T2Dが予防されることが示された。DPPIV阻害剤による介入療法にて使用された、Zucker系およびfa/fa系由来のVDF（バンクーバー糖尿病肥満）ラットと呼ばれる若干異なるT2Dモデルにおいて、グルコース耐性、末梢インスリン感受性、およびβ細胞機能を部分的に改善できることが、あるチームにより報告された。このモデルは、高血糖症でなく、グルコース不耐性が弱く、かつ末梢インスリン抵抗性を有しないことを特徴とし、糖尿病ではないことに注意が必要である。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の目標は、先行技術において説明された動物モデルの欠点（主に、たとえばレプチン経路などの変異経路による、標的経路の潜在的な妨害）を少なくとも一部克服した、インスリン抵抗性、肥満、2型糖尿病、およびその合併症の動物モデルを開発することであった。
【００１０】
本発明の目的は、インスリン抵抗性、肥満、2型糖尿病の、非ヒト動物モデルを作製する方法を提供することである。当該方法は、約9週齢のマウスに高脂肪高糖質飼料を約20週間給餌する段階を含む。
【００１１】
1つの好ましい態様において、マウスは雄性マウスである。
【００１２】
さらに好ましい態様において、マウスはC57BL/6Jマウスである。
【００１３】
さらに好ましい態様において、高脂肪高糖質飼料の給餌を約22週間行う。
【００１４】
さらに好ましい態様において、高脂肪高ショ糖飼料の給餌を開始するまでマウスには通常の固形飼料を与える。
【００１５】
さらに別の好ましい態様において、固形飼料はKLIBA 3436飼料を含む。KLIBA 3436飼料の詳細な成分を図4に示す。
【００１６】
さらに好ましい態様において、高脂肪高糖質飼料は、専用に調製した、脂肪を60%Kcalに調整したSSNIFF D12492飼料である。脂肪を60%Kcalに調整したSSNIFF D12492飼料の詳細な成分を図5に示す。
【００１７】
本発明の第2の局面は、2型糖尿病の合併症の非ヒト動物モデルを作製する方法を提供することであり、この方法には、約9週齢のマウスに高脂肪高糖質飼料を約30週間給餌する段階が含まれる。高脂肪高糖質飼料を約30週間給餌したマウスは、インスリン抵抗性、肥満、2型糖尿病、および2型糖尿病合併症の好適な動物モデルである。
【００１８】
好ましい態様において、高脂肪高糖質飼料の給餌を約32週間行う。
【００１９】
第2の局面において、本発明は、2型糖尿病および／またはその合併症の処置のための化合物を同定および／または試験する方法を提供する。この方法は、本発明の方法によって作製したマウスに関心対象の化合物を投与する段階、ならびに糖尿病および／または少なくとも1種類の2型糖尿病の合併症が当該化合物によって逆転したかどうかを決定する段階を含む。
【００２０】
「2型糖尿病の合併症」なる用語は、心血管疾患、網膜障害、神経障害、腎障害、およびNAFLD（非アルコール性脂肪肝）などの疾患を含む。
【００２１】
2型糖尿病の処置のための化合物を同定および／または試験する方法の例示的態様において、本発明の方法によって作製したマウスに候補化合物を投与し、続いて、インスリン抵抗性、肥満、および／または2型糖尿病と相関する指標値（例えば、血糖値、または血中もしくは他の組織中のインスリンレベル）をマウスにおいて測定する。その後、得られた指標値を対照動物の値と比較する。比較結果に基づき、候補化合物が2型糖尿病の症状を軽減または除去できるか否かを確認する。具体的には、候補化合物が投与された本発明のマウスの血糖値を測定する。測定された血糖値が、候補化合物と接触していない対照動物の値より低ければ、候補化合物は2型糖尿病の処置用の薬剤として選択することができる。
【００２２】
さらに、候補化合物が投与された本発明のマウスのインスリンレベルを、インスリン抵抗性、肥満、および／または2型糖尿病と相関する指標値として測定することができる。測定されたインスリンレベルが、候補化合物と接触していない対照動物の値より低ければ、候補化合物は2型糖尿病の処置用の薬剤として選択することができる。
【００２３】
本発明のマウスは2型糖尿病に伴う合併症（例えば、腎毒性およびNAFLD）を発症するため、本発明の動物モデルにより、2型糖尿病に伴う合併症（例えば、腎毒性およびNAFLD）を処置する能力について化合物を試験することができる。例えば、上述のように、2型糖尿病を処置する能力について試験化合物を試験することができ、ならびに、本発明の動物が発症した2型糖尿病の合併症（例えば、腎毒性およびNAFLD）を試験化合物が逆転および／または軽減できるかどうかを決定することで、2型糖尿病に伴う合併症を処置する能力について試験化合物を試験することができる。
【００２４】
候補化合物の例には、ペプチド、タンパク質、非ペプチド化合物、合成化合物、発酵産物、細胞抽出物、細胞培養上澄み、植物抽出物、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト等）の組織抽出物および血漿が含まれる。そのような化合物は新規化合物であっても既知の化合物であってもよい。これらの候補化合物は塩を形成してもよい。そのような候補化合物の塩には、生理学的に許容される酸（例えば、有機酸および無機酸等）との塩または塩基との塩（例えば、金属塩）が含まれる。特に、生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。そのような塩には、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩または有機酸（例えば、酢酸、葉酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸等）との塩が含まれる。
【００２５】
第3の局面において、本発明は、2型糖尿病および／またはその合併症を処置するための化合物の同定および／または試験における本発明のマウスの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】高脂肪／高ショ糖（HF-HS飼料）を給餌したマウス対固形飼料を給餌したマウスの体重を示す。高脂肪／高ショ糖を給餌したマウスが肥満を発症することが分かる。
【図２】高脂肪／高ショ糖（HF-HS飼料）を給餌したマウス対固形飼料を給餌したマウスの血中グルコース濃度を示す。高脂肪／高ショ糖（HF-HS飼料）を給餌したマウスが空腹時高血糖を発症することが分かる。
【図３】特別飼料を与えたマウス対固形飼料を与えたマウスの、19〜22週間後の空腹時血漿インスリンレベルを示す（DIO=食餌性肥満）。高脂肪／高ショ糖（HF-HS飼料）を給餌したマウスが空腹時高インスリン血症を発症することが分かる。
【図４】KLIBA 3436飼料の成分を示す。
【図５】脂肪エネルギーを60%に調整したssniff（商標）EF M D12492飼料の成分を示す。
【図６】図6aは42週齢のDIOマウス（高脂肪飼料）の肝臓のH&E染色を示す。高脂肪／高ショ糖（HF-HS飼料）を給餌したマウスが重篤な脂肪肝を発症することが分かる。図6bは25週齢の固形飼料を給餌したマウス（対照）の肝臓のH&E染色を示す。
【図７】図7aは42週齢のDIOマウス（高脂肪飼料）の肝臓のシリウスレッド染色を示す。図7bは25週齢の固形飼料を給餌したマウス（対照）の肝臓のシリウスレッド染色を示す。高脂肪／高ショ糖（HF-HS飼料）を給餌したマウスが重篤な脂肪肝を発症することが分かる。図7cは42週齢のDIOマウス（高脂肪飼料）の肝臓のマッソントリクローム染色を示す。高脂肪／高ショ糖（HF-HS飼料）を給餌したマウスが重篤な脂肪肝を発症することが分かる。
【図８】図8aは42週齢のDIOマウス（高脂肪飼料）の腎臓のH&E染色を示す。高脂肪／高ショ糖（HF-HS飼料）を給餌したマウスが重篤な糸球体肥大およびメサンギウム増殖を発症することが分かる。図8bは25週齢の固形飼料を給餌したマウス（対照）の腎臓のH&E染色を示す。図8cは42週齢のDIOマウス（高脂肪飼料）の腎臓のH&E染色を示す。高脂肪／高ショ糖（HF-HS飼料）を給餌したマウスが重篤な糸球体硬化症を発症することが分かる。図8dは25週齢の固形飼料を給餌したマウス（対照）の腎臓のH&E染色を示す。図8eは42週齢のDIOマウス（高脂肪飼料）の腎臓のマッソントリクローム染色を示す。高脂肪／高ショ糖（HF-HS飼料）を給餌したマウスが重篤な腎炎を発症することが分かる。図8fは25週齢の固形飼料を給餌したマウス（対照）の腎臓のマッソントリクローム染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２７】
実験の部
マウスにおける糖尿病および肥満の誘発 
- マウスの提供元： Charles River Germany
- 系統： 雄性C57BL/6Jマウス
- 飼育条件： 標準−12時間点灯サイクル
- 食餌： 9週齢まで通常の固形飼料、その後高脂肪高ショ糖（HF-HS）（エネルギー：脂肪由来60%、糖質由来20%−調整SSNIFF D12492）を14週間与え、23週齢でRocheに移した。
- 順応期間：Rocheで6〜20週間、動物にはHF-HS飼料を維持した。
- 対照痩せ型動物： 動物10匹の群には標準固形飼料KLIBA 3436を維持した。
- 動物は、29〜31週齢または42週齢で、糖尿病合併症実験の準備ができた。
- 実験段階の間、HF-HS飼料を維持した。
【００２８】
DIOマウスにおけるNASH
米国の人口の少なくとも4分の１は、非アルコール性脂肪肝（NAFLD）に罹患していると見積もられており、これは肝機能異常の最も一般的な原因である。NAFLDは、内臓肥満、異脂肪血症、アテローム性動脈硬化、およびインスリン抵抗性として集合的に顕在化するメタボリックシンドロームの一構成要素であり、肝臓の脂質代謝調節不全に起因すると考えられる。多くの症例では予後は良性であるにも関わらず、NAFLDは非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、肝線維症、肝硬変、および肝癌へ進行することがあり、NAFLDからNASHへの移行のメカニズムの包括的な理解は未だ達成されていない。慢性炎症を伴う脂質代謝異常は、アテローム性動脈硬化およびNASHの発症の中心的な経路である。実際、「ツーヒット」セオリーが提唱されており、脂質およびコレステロール代謝ならびに炎症に関連する、NAFLD患者においてNASHを誘発する二次的な感受性因子の同定は、この疾患の処置における重要な工程である。NAFLDおよびNASHの進行に対する感受性は、遺伝的変異、感染、環境曝露、ならびに慢性炎症および／または酸化ストレスを引き起こす可能性がある食事の寄与を含みうる。
【００２９】
以下の病変は、42週齢のDIOマウス対25週齢のDIOマウスおよび25週齢の固形飼料を給餌した痩せ型マウスの肝臓の組織学的検査において観察された（図6および7を参照のこと）。
・散在性の大空胞性脂質沈着（脂質染色により確認）と関連する、中程度から重症の散在性の大空胞性肝細胞空胞化（図6a対図6b）
・極小から軽微な胆管過形成およびクッパー細胞増殖（図6a対図6b）
・極小から顕著な単核炎症細胞の浸潤（図6a対図6b）
・極小から中程度の線維化（シリウスレッド染色およびマッソントリクローム染色により確認）（図7aおよび7c対図7b）
【００３０】
（表１）42週齢DIOマウスにおけるNASH
DIOマウスにおける関連する肝臓変化の発生率
2011519569.tif 000002
【００３１】
DIOマウスにおける糖尿病性腎症
糖尿病性腎症は、腎糸球体の毛細血管の血管障害によって起こる、進行性の腎疾患である。糖尿病性腎症は、ネフローゼ症候群および結節性糸球体硬化症を特徴とする。また、長期にわたる真性糖尿病に起因し、多くの西洋各国において透析の主な原因となっている。今日、2型糖尿病はより低い年齢で発症するようになっているため、患者は通常の高年齢（50歳〜70歳）よりも早く腎症を発症するであろうと予想される。この疾患は進行性であり、初期病変の2年後または3年後に死をもたらすことがあり、男性においてより多く見られる。糖尿病性腎症は、米国における慢性腎不全および末期腎疾患の最も一般的な原因である。1型および2型糖尿病を有する人はいずれもリスクを有する。血糖値の制御が不十分だとリスクはより高い。さらに、一旦腎症が発症すると、血圧の制御が不十分な患者において進行速度が最も速い。血中コレステロールレベルが高い人は他の人よりもリスクが高い。糖尿病性腎症は徐々に悪化し続ける。慢性腎不全の合併症は、糖尿病により引き起こされる場合、他の原因による場合よりも早く発症し、急速に進行する傾向にある。末期腎疾患が発症すると、透析が必要になりうる。この段階では、腎移植を検討する必要がある。透析開始後または移植後であっても、糖尿病を有する人は糖尿病を有さない人よりも悪化しがちである。
【００３２】
処置の目標は、腎損傷の進行を遅らせ、関連する合併症を制御することである。一旦タンパク尿症が起こると、実行可能な主な処置はACE阻害剤およびアンギオテンシン受容体遮断薬であるが、これらは、通常タンパク尿レベルを低減し疾患の進行を遅らせるもののいくつかの問題点がある。重要な問題点は、効果的な処置であるにも関わらず、糖尿病性腎症患者におけるESRD（末期腎疾患）の残存リスクが高いまま（約16%）であることである。新規の薬剤が、糸球体硬化症を遅らせることにより、相対的リスクの実質的な低下をもたらすことができるのであれば、それは主な絶対的リスクの低下ももたらすと考えられる。
【００３３】
糖尿病性腎症の発症をより効果的な方法で予防するまたは遅らせる医薬、ならびに忍容性がより良好でありかつ副作用が少ない処置に対する大きな医学的必要性が存在する。
【００３４】
以下の病変は、42週齢のDIOマウス対25週齢のDIOマウスおよび25週齢の固形飼料を給餌した痩せ型マウスの腎臓の組織学的検査において観察された（図8を参照のこと）。
・極小から軽微な糸球体肥大（図8a対図8b）
・極小から顕著なメサンギウム増殖（図8c対図8d）
・極小から軽微な糸球体硬化（図8c対図8d）
・極小から中程度の単核性炎症細胞の浸潤（図8e対図8f）
【００３５】
（表２）DIOマウスにおける糖尿病性腎症
関連する腎変化の発生率
2011519569.tif 000003
【００３６】
本発明の現在好ましい態様を示し説明したが、本発明はそれらに限定されず、むしろ、添付の特許請求の範囲内で様々に具体化および実施されうることが明確に理解される。
【図１】
2011519569.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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