(57)【要約】本発明は、分離ステップ後に、分離された生体分子を捕捉および回収するためのデバイスを提供する。本発明は、分離デバイスと、回収チャンバとを備える、装置を提供する。回収チャンバは、分離デバイスの端部を受容するように適合される入口ポートと、捕捉媒体を備える出口ポートと、入口ポートと出口ポートとの間に位置するアクセスポートとを備え、回収チャンバの体積は、アクセスポートに対する入口ポートの中の分離デバイスの深さを調整することにより制御される。
2011502243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）分離デバイス、ならびに
ｂ）回収チャンバであって、
ｉ）前記分離デバイスの１つの端部を受容するように適合される、入口ポートと、
ｉｉ）捕捉媒体を備える、出口ポートと、
ｉｉｉ）前記入口ポートと前記出口ポートとの間に位置するアクセスポートであって、前記回収チャンバの体積は、前記アクセスポートに対する前記入口ポートの中の前記分離デバイスの深さを調整することにより制御される、アクセスポートと、を備える、
回収チャンバ、
を備える、装置。
【請求項２】
前記分離デバイスは、電気泳動分離デバイスを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記分離デバイスは、１０ｃｍ以下の分離経路長を有する分離デバイスを備える、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記分離デバイスは、ビス−ポリアクリルアミドまたはアガロースを含む分離媒体を含む、請求項２または３に記載の装置。
【請求項５】
前記分離デバイスは、６．０ｃｍ以下の高さおよび約０．２〜１．０ｃｍの直径の分離ゲルを含む、ポリアクリルアミドゲルを備える、請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項６】
前記回収チャンバは、除去可能なトラップを含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の装置。
【請求項７】
前記回収チャンバは、２つ以上の除去可能なトラップを含む、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記除去可能なトラップは、疎水性トラップ、親水性トラップ、イオン交換トラップ、分子量カットオフトラップ、親和性トラップ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項６または７に記載の装置。
【請求項９】
前記トラップは、端と端を接して配設される、請求項６〜８のいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
前記回収チャンバの中の前記アクセスポートは、弁をさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記捕捉媒体は、約１ｋＤａ〜約１０ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記装置は、化学的に不活性の非伝導性材料から本質的に構築される、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記装置は、２つ以上の回収チャンバを備える、請求項１〜１２のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
前記回収チャンバは、一片の材料から構築される、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記アクセスポート間の間隔は、標準的な多チャネルピペットを収容するように設計される、請求項１３に記載の装置。
【請求項１６】
前記アクセスポートは、標準的なピペット先端を収容するように設計される、請求項１３〜１５のいずれかに記載の装置。
【請求項１７】
前記回収チャンバは、前記分離デバイスと一列に並んで互いの下流に配置される、請求項１１に記載の装置。
【請求項１８】
２つ以上の分離デバイスをさらに備える、請求項１３に記載の装置。
【請求項１９】
分離デバイスの数は、回収チャンバの数に等しく、各回収チャンバは、分離デバイスの直接下流に配置される、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記分離デバイスおよび回収チャンバは、隣り合って並んでいる、請求項１８または１９に記載の装置。
【請求項２１】
隣り合って並んでいる分離デバイスおよび回収チャンバを備える、前記装置は、平面構成である、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
隣り合って並んでいる分離デバイスおよび回収チャンバを備える、前記装置は、弧状、半円状、または半楕円状に構成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２３】
隣り合って並んでいる分離デバイスおよび回収チャンバを備える、前記装置は、管状構成で構成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２４】
前記管状構成は、円筒形または楕円形である、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
装置はさらに、前記分離デバイスの上流に配置される上部チャンバと、前記回収チャンバの下流に配置される下部チャンバとを備える、請求項１３〜１６または１８〜２４のいずれかに記載の装置。
【請求項２６】
前記装置は、８つの分離デバイスと、８つの回収チャンバとを備える、請求項１３〜１６または１８〜２５のいずれかに記載の装置。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれかで定義される装置を使用して、１つ以上の試料から複数の分子または分子画分を精製するための方法であって、前記方法は、
ａ）１つ以上の試料を提供するステップと、
ｂ）前記分離デバイスを使用して前記分子を分離するステップと、
ｃ）前記回収チャンバの中の前記アクセスポートを介して、複数の画分を連続的に回収するステップと、
を含む、方法。
【請求項２８】
試料を前記分離デバイスに添加するステップをさらに含み、前記デバイスのローディング端部は、水平から１０度を上回る角度に持ち上げられる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料を前記分離デバイスの中へ移動させ、次いで、前記デバイスを水平から１０度未満の角度に下げるステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記分離ステップは、各回収ステップ中に前記分離ステップの一時的中断、続いて各回収ステップの完了後に前記分離ステップの再開を伴う、しばしば停止するサイクルで実行される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記分離および回収ステップは、前記装置が水平位置にある間に実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記回収チャンバの前記入口ポートの中の前記分離デバイスの深さを調整することにより、前記回収チャンバの体積を調整するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記回収された画分中の前記分子は、それらが前記試料中にあった濃度と同じ、またはそれよりも高い濃度を有する、請求項２７〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記画分は、除去可能なトラップを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記画分は、前記回収チャンバの中に除去可能なトラップと溶液の両方を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料は、粗細胞抽出物、部分的に精製された抽出物、または等電点電気泳動法もしくは分子を分離する他の方法により以前に分離された試料を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記装置は、請求項３〜９のいずれかに記載の装置であり、前記分子は、約２４０ボルトの電圧を使用して分離される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記分離および回収ステップは、約１００分で実施される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記分離された分子は、約５ｋＤａ〜約２００ｋＤａの範囲のタンパク質であり、約５ｋＤａ離れた分子量を有する分子が効果的に分離される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
各回収ステップ後に前記回収チャンバに緩衝液を添加するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
この出願は、２００７年１０月９日に出願された米国仮出願第６０／９７８，５０７号（これは、参考としてその全体が本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分離ステップの後に、分離された生体分子を捕捉および回収するためのデバイスに関する。本発明はまた、該デバイスを使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質、ポリ核酸、脂質、および炭水化物等の生体分子の分析は、多くの場合、分離および／または精製手段を必要とする。そのため、分離および精製プロセスに続いて、対象となる試料が回収され、分光計等の後続の分析プラットフォームに移されなければならない。クロマトグラフ分離および電気泳動分離を含む分離のための多くの方法が利用可能である。異なる種類の根底にある原理は、複合試料中の様々な種が分離の間に空間的に分離されるように、様々な生体分子に異なる速度で分離媒体中を移動させることである。したがって、一旦分離が完了すると、試料が分離媒体を離れ、次のステップ（例えば、別の分離ステップまたは分析ステップ）に移される状態になる際に、その空間分解能をどのように維持するかが問題となる。
【０００４】
高い分解能、再現性、および回収を提供する好ましいシステムを伴う分離は、プロテオーム分析に不可欠である。プロテオミクスにおいて、ＭＳペプチド配列戦略は、分析前の試料の複雑性を低減するために、十分に確立された分離技術を採用する（非特許文献１）。無傷タンパク質レベルにおいて、二次元電気泳動は、広く採用され続けているが、他に類のない分解能の程度を除いて（非特許文献２）、二次元電気泳動は、いまだに分離システムの所望の特徴の多くを提供できていない（非特許文献３）。
【０００５】
プロテオミクスのための「選択的」ショットガン法を記載する、Ｂｒｕｎｎｅｒらによる最近の報告は、分析を改善するための無傷タンパク質予備画分法の重要性を説明する（Ｂｒｕｎｎｅｒら、２００７）。トップダウンタンパク質分析の人気が高まっていることも、効果的なタンパク質分離戦略の必要性を増大させている。それにもかかわらず、いくつかの顕著な例外はあるものの（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｓｏｎ，  ２０００、Ｓｈｉら、２００４、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｈａｎａｓｈ，  ２００５、Ｌｕｂｍａｎら、２００２）、無傷レベルにおけるプロテオーム分離のための新しい方法の最適化または開発は、いまだ未開発の分野である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｗａｓｈｂｕｒｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１、１９、２４２〜２４７
【非特許文献２】Ｇｏｒｇら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００４、４、３６６５〜３６８５
【非特許文献３】Ｇｙｇｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  ２０００、９７、９３９０〜９３９５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、分離ステップ後に、生体分子を捕捉および回収する装置および方法に関する。
【０００８】
第１の側面では、本発明は、分離デバイスおよび回収チャンバを備える、装置を提供する。回収チャンバは、分離デバイスの端部を受容するように適合される、入口ポート、捕捉媒体を備える出口ポート、および入口ポートと出口ポートとの間に位置するアクセスポートを備え、回収チャンバの体積は、アクセスポートに対する入口ポートの中の分離デバイスの深さを調整することにより制御される。一実施形態では、分離デバイスは、電気泳動分離デバイスを備える。本実施形態の分離デバイスは、１０ｃｍ未満の分離経路長有することができ、および／またはビス−ポリアクリルアミドまたはアガロースを備える分離媒体を含むことができる。特定の実施形態では、分離デバイスは、６．０ｃｍ未満の高さおよび約０．２〜１．０ｃｍの直径の分離ゲルを含む、ポリアクリルアミドゲルを備える。
【０００９】
別の実施形態では、装置の回収チャンバは、１つ以上の除去可能なトラップを含有する。トラップは、疎水性トラップ、親水性トラップ、イオン交換トラップ、分子量カットオフ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ）トラップ、親和性トラップ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。２つ以上のトラップを含有する実施形態では、トラップは、連続して並んでいてもよい。
【００１０】
さらに別の実施形態では、回収チャンバの中のアクセスポートは、弁をさらに備える。
【００１１】
さらに別の実施形態では、回収チャンバの出口ポートの中の捕捉媒体は、約１ｋＤａ〜約１０ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を備える。
【００１２】
さらなる実施形態では、該装置は、２つ以上の回収チャンバを備える。回収チャンバは、一片の材料から構築されてもよい。加えて、アクセスポート間の間隔は、標準的な多チャネルピペット（ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ  ｐｉｐｅｔｔｏｒ）を収容するように設計されてもよい。アクセスポートは、標準的なピペット先端を収容するように設計されてもよい。
【００１３】
さらなる実施形態では、該装置は、２つ以上の分離デバイスおよび２つ以上の回収チャンバを備える。分離デバイスの数は、回収チャンバの数に等しくてもよく、各回収チャンバは、分離デバイスの直接下流に配置されてもよい。分離デバイスおよび回収チャンバは、隣り合って並んでいてもよい。複数の分離デバイスおよび回収デバイスの構成は、平面であってもよい。多重装置はまた、弧状、半円状、半楕円状、または管状に構成されてもよい。管状構成は、円筒形または楕円形であってもよい。個々の分離デバイスは、多重装置の中のユニットの数に応じて、隣り合って並んでいるか、またはブロック等の他の構成であってもよい。多重装置は、８つの分離デバイスおよび８つの回収チャンバを備えることができる。
【００１４】
さらなる実施形態では、該装置はさらに、分離デバイスの上流に配置される上部チャンバ、および回収チャンバの下流に配置される下部チャンバを備える。
【００１５】
第２の側面では、本発明は、以下のステップを含む、本発明の装置を使用して１つ以上の試料から複数の分子または分子画分を精製するための方法を提供する。（１）１つ以上の試料を提供するステップ、（２）該装置の分離デバイスを使用して分子を分離するステップ、および（３）回収チャンバの中のアクセスポートを介して、複数の画分を連続的に回収するステップ。
【００１６】
第２の側面の一実施形態では、該方法は、試料を分離デバイスに添加するステップをさらに含み、デバイスのローディング端部（ｌｏａｄｉｎｇ  ｅｎｄ）は、水平から１０度を上回る角度に持ち上げられる。別の実施形態では、該方法は、試料を分離デバイスに移動させ、次いで、デバイスを水平から１０度未満の角度に下げるステップをさらに含む。
【００１７】
第２の側面のさらに別の実施形態では、分離ステップは、各回収ステップ中に分離ステップの一時的中断、続いて各回収ステップの完了後に分離ステップの再開を伴う、しばしば停止するサイクルで実行される。
【００１８】
第２の側面のさらに別の実施形態では、分離および回収ステップは、装置が水平位置にある間に実施される。
【００１９】
さらに別の実施形態では、該方法は、回収チャンバの入口ポートの中の分離デバイスの深さを調整することにより、回収チャンバの体積を調整するステップをさらに含む。
【００２０】
さらなる実施形態では、回収された画分中の分子は、それらが試料中にあった濃度と同じ、またはそれよりも高い濃度を有する。別の実施形態では、画分は、除去可能なトラップを備える。画分はまた、回収チャンバの中に除去可能なトラップおよび溶液の両方を備えることができる。
【００２１】
さらなる実施形態では、試料は、粗細胞抽出物、部分的に精製された抽出物、または等電点電気泳動法または他の方法により以前に分離された試料を備える。
【００２２】
さらなる実施形態では、該装置は、電気泳動分離デバイスを使用し、分子は、約２４０ボルトの電圧を使用して分離される。さらなる実施形態では、分離および回収ステップは、約１００分で実施される。分離された分子は、約５ｋＤａ〜約２００ｋＤａの範囲のタンパク質であってもよく、約５ｋＤａ離れた分子量を有する分子が、効果的に分離される。
【００２３】
別の実施形態では、該方法は、各回収ステップ後に回収チャンバに緩衝液を添加するステップをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】デバイスの一実施形態の断面図である。
【図２】デバイスの一実施形態の俯瞰図である。
【図３】回収チャンバの三次元図である。
【図４】回収チャンバの断面側面図である。
【図５】回収チャンバの断面図である。
【図６】デバイスの一実施形態の写真を示し、ポリアクリルアミドゲル上で行われた、前染色されたタンパク質の分離を示す。
【図７】多重デバイスの一実施形態の俯瞰図である。
【図８】多重デバイスの回収チャンバの三次元図である。
【図９】多重デバイスの回収チャンバの断面側面図である。
【図１０】多重デバイスの回収チャンバの断面図である。
【図１１】１および３ｃｍの長さの分離ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分離された枯草菌タンパク質から回収された、画分の銀染色ゲルを示す。
【図１２】回収チャンバから回収されたタンパク質の量を示す、染色されたポリアクリルアミドゲルの写真を示す。
【図１３】ＧｅｌＦｒＥＥ（Ｇｅｌ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）デバイスを用いた、３つの独立した分離の結果を示す、染色されたポリアクリルアミドゲルの写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の装置および方法は、分離ステップ後に分離された生体分子を捕捉および回収する他の装置および方法よりも多くの利点を提供する。第１に、本発明の装置は、生体分子の分離と分離媒体からの単離を直接結合させる。第２に、該装置および方法は、単離と同時に生体分子の濃縮を提供する。第３に、該装置および方法は、低またはサブμｇレベルにおいてさえ、生体分子の高い回収を提供する。第４に、生体分子の分離の溶出および単離への組み込みは、時間の節約、必要とされるステップ数の減少、および装置のために必要とされる空間の大きさの減少において、使用者に対して有意な利点を提供する。第５に、該装置は、多くの異なる分離デバイスおよび分離媒体を収容することができる。第６に、該装置は、生体分子の総合的分析ならびに標的分析に適している多次元プラットフォームを得るために、他の分離および分析デバイスと一体化することができる。
【００２６】
Ｉ  装置
本発明の装置は、分離デバイスが直接的に相互作用されてもよい、回収チャンバを備える。
【００２７】
Ａ．回収チャンバ
本発明の装置の回収チャンバは、チャンバの中の生体分子を捕捉するように設計される。回収チャンバはまた、分離された試料が分離デバイスから出た後に、それらの空間分解能を維持するように設計される。これを達成するために、回収チャンバは、分離デバイスと直接的に相互作用する。回収チャンバは、入口ポート、出口ポート、およびアクセスポートを含む。アクセスポートは、便利な試料回収のために捕捉された試料への直接的アクセスを可能にする。
【００２８】
１．入口ポート
回収チャンバの入口ポートは、分離デバイスとの直接的な相互作用を可能にする。入口ポートは、分離デバイスの端部の寸法を収容するように設計される。したがって、入口ポートは、分離デバイスの端部が回収チャンバに直接連結することを可能にする、円形、楕円形、もしくは長方形の孔、または円筒形、楕円形の管、もしくは中実矩形を備える。入口ポートは、分子量カットオフ膜であってもよい、膜を随意に含有することができる。一実施形態では、該膜は、分離媒体が回収チャンバに入らないように、分離デバイスの中に分離媒体を保持する膜である。別の実施形態では、該膜は、５００ｋＤａ等の高分子量カットオフを有する膜であってもよい。分離デバイスを密閉するための手段は、分離デバイスの接触面における流体の漏出、および回収チャンバへの流体の漏出を防ぐために使用可能である。密閉手段は、分離媒体によって決まり、必要とされる場合、または必要とされない場合がある。例えば、ゲル電気泳動に対して、密閉手段は、ゴムＯリングまたはクランプを備えることができる。入口ポートを介した分離デバイスと回収チャンバの連結は、複数の分離された画分の回収を可能にする。
【００２９】
入口ポートはまた、分離デバイスが入口ポートに入る深さを制御するだけで、回収チャンバの体積を調整することができるように設計される。
【００３０】
２．出口ポート
回収チャンバの出口ポートは、回収チャンバからの通路を提供し、入口ポートの下流にある。出口ポートは、溶媒ならびにある特定の溶質（例えば、塩、緩衝液成分、および恐らく望ましくない生体分子）を選択的に透過させる捕捉媒体を含む。捕捉媒体は、多くの捕捉媒体のいずれかを備えることができる。一実施形態では、捕捉媒体は、分子量カットオフ膜である。この膜は、透析膜、ニトロセルロース膜、限外濾過膜、または他の分子量カットオフ膜を含むがこれに限定されない、多くの膜のいずれかであってもよい。カットオフ分子量は、例えば、１〜１０ｋＤａ等、対象となる最小の試料成分の分子量よりも低くなければならない。分子量カットオフ膜または他の捕捉媒体は、低分子量分子等のいくつかの分子の通過を選択的に可能にする。この選択は、生体分子の単離と同時に生体分子の濃縮を可能にする。
【００３１】
３．アクセスポート
アクセスポートは、入口ポートと出口ポートとの間に回収チャンバの中の開口部を備える。開口部は、円形、楕円形、もしくは長方形の開口部、または円筒形、楕円形の管もしくは中実矩形を備える開口部を含むがこれに限定されない、任意の構成および寸法の開口部であってもよい。一実施形態では、開口部は、チャンバの中に配置される液位よりも上に孔を備える。本実施形態では、分離デバイスは、水平位置で、または水平と垂直との間の位置において作動される。別の実施形態では、アクセスポートは、標準的なピペット先端を収容する。さらに別の実施形態では、アクセスポートは、分子トラップの挿入および除去に適応する。それにより、アクセスポートは、分離された画分が捕捉デバイスの中に捕捉されているか、または溶液中に捕捉されているかにかかわらず、それらを投与および回収するための容易なアクセスを可能にする。
【００３２】
アクセスポートは、弁を含むことができる。弁は、分離デバイスが垂直位置で作動される場合に特に有用である。弁は、ストップコック、ルアーロック、面シール、またはサイドシール弁等の単純な弁であってもよい。該弁はまた、一方向弁であってもよく、開いている時に、一方向にのみ液体の流動を可能にする。一方向弁の例としては、Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｂｅｂｅｅ（２００７）が記載するような逆止め弁、またはＣｈｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉｏｋａ（１９９０）が記載するような一方向弁が挙げられるがこれに限定されない。一方向弁の他の例としては、医療デバイスの弁置換術に使用される弁が挙げられる。
【００３３】
４．内部
回収チャンバの内部は、溶液相であるか、または固相であるかにかかわらず、画分の保持を可能にする。内部は、回収チャンバの壁により画定される。回収チャンバは、円筒形、球形、正方形、長方形、および他の構成を含むがこれに限定されない、任意の構成であってもよい。一実施形態では、回収チャンバの内部は、円筒形の分離デバイスの外径にほぼ等しい直径を有する、円筒形である。
【００３４】
回収チャンバの内部はまた、疎水性トラップ、親水性トラップ、分子量カットオフトラップ、イオン交換トラップ（アニオン性および／またはカチオン性）親和性トラップ、またはそれらの組み合わせ等の捕捉デバイスも収容することができる。トラップは、サイズ、荷電、疎水性、親水性、リガンドに対する親和性、またはそれらの組み合わせ等の特定の物理的特性を有する分子を捕捉する媒体を備えることができる。該媒体は、分子がトラップに出入りすることを可能にする封入部の中に含有されてもよい。例えば、トラップは、イオン交換樹脂を含有することができる。別の実施例として、トラップは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）からのガード挿入部等のガードカラム挿入部であってもよいが、これに限定されない。一実施形態では、回収チャンバは、異なる種類の分子が同時に捕捉され得るように、２つ以上のトラップを収容することができる。該トラップはまた、回収チャンバの中に連続して並んでいてもよい。
【００３５】
別の実施形態では、２つ以上の回収チャンバは、１つの分離デバイスを含む装置の中に存在する。本実施形態では、回収チャンバは、分離デバイスの下流に並んでいてもよい。このように整合される回収チャンバは、それらの間に異なる分子量カットオフ膜を有することができる。別の実施形態では、回収チャンバは、異なる分子トラップを含むことができる。
【００３６】
Ｂ．分離デバイス
本発明の装置はまた、生体分子を分離するための分離デバイスを含む。分離デバイスは、分離媒体、および分離媒体を含有するための筐体を含む。
【００３７】
分離媒体は、生体分子を分離するために有用な任意の媒体を含む。該媒体としては、分子のサイズまたは質量に基づき生体分子を分離する媒体が挙げられるがこれに限定されない。これらは、セファデックスおよびセファロース等のゲル濾過材料、ならびにポリアクリルアミドおよびアガロースゲルを含む、分子のサイズに基づく電気泳動分離のための材料を含むがこれに限定されない。他の分離媒体としては、カチオンおよびアニオン交換樹脂を含むイオン交換材料、リン酸セルロース、ヒドロキシアパタイト、およびブルーデキストラン等の一般的な親和性材料を含む親和性材料が挙げられる。ある特定の生体分子が結合するリガンドを運ぶ材料等、より具体的な親和性材料も含まれる。リガンドとしては、抗体、タンパク質、ペプチド、核酸配列、炭水化物、および他のリガンドが挙げられるがこれに限定されない。分離媒体はまた、疎水性に基づき生体分子を分離する、疎水性および親水性材料を含むことができる。
【００３８】
分離媒体は、デバイスの中に収納され、概して、上流端部および下流端部を有する。該デバイスは、標準的な円筒形カラムを含む多くの形状を成すことができる。別の形状は、例えば、スラブポリアクリルアミドゲルにあるような中実矩形である。分離媒体のための筐体のサイズは、分離媒体、および試料のサイズに応じて大きく異なり得る。円筒形カラムに関して、サイズは、短いキャピラリーカラムから、大型分離、概して、工業的分離に使用される非常に大きいカラムまで異なり得る。固定相充填カラムも含まれる。中実矩形の筐体も同様に、小さい筐体から非常に大きい筐体まで異なり得る。
【００３９】
回収チャンバの入口ポート、およびいくつかの実施形態では、回収チャンバの寸法は、分離デバイスの筐体を収容するように設計される。
【００４０】
分離媒体を通じて生体試料を移動させるための駆動力が必要である。分離デバイスは、電気泳動、圧力、重力浸透、温度勾配、塩勾配、またはそれらの組み合わせが挙げられるがこれに限定されない駆動力から、回収チャンバの方向への溶質の移動性を提供する。
【００４１】
駆動力（高電圧等）が発熱をもたらす場合、デバイスを冷却するために、熱伝達または冷却デバイスが使用されてもよい。
【００４２】
Ｃ．付属品
デバイスは、概して、分離デバイスの上流および回収チャンバの下流にチャンバを含む。チャンバは、選択された分離媒体を通じて生体分子を移動させるために必要な緩衝液を含有することができる。
【００４３】
デバイスはまた、漏出から装置を密閉するための装置を必要とする場合がある。これらは、ゴムガスケットおよびクランプ、またはナットおよびボルト、ならびに当業者に既知の密閉のための他の装置を含むことができる。密閉装置はまた、回収チャンバの出口ポートにおいて分子量カットオフ膜を密閉する働きもする。
【００４４】
Ｄ．材料
デバイスは、接触して配置される材料と非反応性である、比較的剛性の支持材料から形成されてもよい。材料はまた、非伝導性であってもよい。材料としては、ポリメタクリル酸、プラスチック、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ＰＴＦＥ、ＴＥＦＬＯＮ、または他の非反応性もしくは化学的に不活性の材料が挙げられるがこれに限定されない。加えて、デバイスを製造するために、２つ以上の材料が使用されてもよい。
【００４５】
Ｅ．ポリアクリルアミド電気泳動
プロテオーム分離は、タンパク質の溶出順序が予測可能な形で生じる場合に最も有益である。そのような予測可能性は、特定のタンパク質または特定の種類のタンパク質の単離を可能にし（例えば、ＰＴＭタンパク質の強化）、同定プロセスに役立つこともできる（Ｐａｌら、２００６）。タンパク質の分子量は定数であり、概して、試料または溶媒条件による影響を受けない、定義されたパラメータを明確に提供する。荷電および疎水性の両方と関連しないため、タンパク質の分子量は、非常に望ましい分離モードを示す。しかしながら、サイズに応じてタンパク質を分離する、確立された溶液ベースのシステムは、ほとんどない。膜濾過および限外濾過戦略は、本質的に大きな労働力を要し、提供する分解能の程度は低い。サイズ排除クロマトグラフィは、他の分離プラットフォームと連結されるが（Ｂｕｓｈｅｙ  ａｎｄ  Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，  １９９０、Ｏｐｉｔｅｃｋ  ａｎｄ  Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ，  １９９７、Ｌｅｃｃｈｉら、２００３）、比較的低いピーク容量も提供するため、プロテオミクスにおおける広範な使用は見られていない。高度の分解能、処理能力、および試料回収を伴う、サイズベースのタンパク質分離プラットフォームは、より望ましいシステムを示すであろう。
【００４６】
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）は、ほぼ間違いなく、サイズベースのタンパク質分離のための最適な方法である。興味深いことに、ＳＤＳ  ＰＡＧＥの最も重大な制限は、分離プロセス自体よりもむしろ、典型的には、消化後の、ゲルからのタンパク質の回収に関する（Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ，  ２００２）。ＳＤＳの存在は、近い将来、ＭＳ（質量分光学）分析に対して制限を与える可能性がある。しかしながら、予測可能なサイズベースの分離の実現化、ならびにタンパク質可溶化の補助におけるＳＤＳの利益は、ほぼ間違いなく、その不利点を上回る。これを考慮すると、スポット切除、ゲル内消化、およびペプチド抽出の困難な作業を回避しながら、分子量分離のためのＳＤＳ  ＰＡＧＥの高分解能を上手く利用することが、最も有益であり得る。
【００４７】
溶媒抽出の代替方法として、タンパク質は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ後にゲルから電気泳動的に単離されてきた。Ｂｉｏ−ＲａｄからのＷｈｏｌｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｕｔｅｒは、ゲル全体にわたる電気溶出の戦略を適用する。Ｄａｖｉｄｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．は、ヒト脳脊髄液からのタンパク質の画分および分析のために、このシステムを使用してきた（Ｄａｖｉｄｓｓｏｎら、２００１）。デバイスが広範なサイズベースの分離を達成する一方で、このデバイスで利用可能な画分の制限された数は、分解能を最適化する柔軟性を制限する。さらに、試料ローディング量は、スラブゲルの寸法により制限される。さらに、Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｕｔｅｒは、多重化が困難であり、多次元の溶液ベースのプラットフォームに容易に組み込めないであろう。
【００４８】
予備ゲル電気泳動に対する異なる戦略として、タンパク質は、分離電場の連続的印加により、ゲル「カラム」の端部から溶出され得、タンパク質は、分子量膜により捕捉され、続いて回収される（Ｌｅｗｉｓ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋ，  １９６３、Ｒａｃｕｓｅｎ  ａｎｄ  Ｃａｌｖａｎｉｃｏ，  １９６４、Ｊｏｖｉｎら、１９６４、Ｓｈａｉｎら、１９９２）。この技術は、概して、連続溶出チューブゲル電気泳動と称される。極めて高い高分解能を伴う、タンパク質を精製するための能力が十分に確立されているが（Ｍａｓｕｏｋａら、１９９８）、そのような方法によるプロテオーム全体を分画する能力は問題である（Ｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｏｐｉｔｅｋ，  １９９４、Ｍｅｎｇら、２００２、Ｄｕら、２００４）。一般に、この方法に基づくシステムは、より低い分子量のタンパク質に偏っている（Ｍｅｎｇら、２００２、Ｄｕら、２００４、Ｚｅｒｅｆｏｓら、２００６、Ｘｉｘｉら、２００６）。現在のシステムの他の有意な制限としては、長い分離時間、低い試料ローディングにおける不十分な回収、および分離中、特に高分子量における試料の許容できないほど大きい希釈物が挙げられる。これらの問題は、連続溶出電気泳動技術が、概して、包括的で広範な質量プロテオーム分離のために適合され得る前に、克服される必要がある。
【００４９】
超遠心分離、膜濾過、ゲル濾過クロマトグラフィ、およびキャピラリー（ゲル）電気泳動を含む、分子量に従ったタンパク質および他の材料の分離のためのいくつかの技術が利用可能である。しかしながら、全ての技術のうち、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動が、明らかに、最高度の分解能を提供する。薄い分析用スラブゲルの従来の形式は、単純だが効果的な熱放散を可能にするだけでなく、試料切除のために、分離後にゲルへの便利なアクセスを提供する。歴史的には、ＰＡＧＥは、チューブの中で達成される。電気泳動カラムの円筒形状は、単に冷却デバイスを追加することにより、高質量範囲プロテオームを分離するためのより高いローディング量のために拡大され得る。
【００５０】
本発明の装置で使用する予備ゲル電気泳動の技術の改良は、多くの利点を有する。第１に、タンパク質の広範な質量範囲の分離に適応する。第２に、約６ｋＤａ〜約２００ｋＤａの分子量範囲にわたるプロテオームの迅速な画分を可能にする。第３に、分離後に試料が回収される際に、タンパク質の濃縮を提供する。第４に、低またはサブマイクログラムレベルにおける、試料ローディングのための高回収を可能にする。第５に、複合タンパク質抽出物の包括的で再現可能な分離をもたらす。第６に、質量分析による極めて高いＭＷプロテオーム画分の単離および同定に適用され得る。
【００５１】
一実施形態では、装置は、２ｃｍ未満の短いポリアクリルアミドカラムを備える。溶出時間がゲルの長さに比例することから、短いゲルを使用する利点は、はるかに速い分離である。より短いカラムはまた、溶出された画分が時間と共に希釈されなくなることを意味する。加えて、発熱がより低いため、より高い電圧が使用され得る。一側面では、分離デバイスは、２または３ｃｍ未満の短いポリアクリルアミド分離ゲル、および随意に２〜３ｃｍの濃縮ゲルを備える。分離ゲルは、高い割合の架橋結合（約１２〜１５％）を有することができ、その理由は、２４０ボルトを使用した１つの９０分間の処理において、１０ｋＤａ未満から最大で２５０ｋＤａの分離を分解することができる、より短いゲルである。ゲルの寸法は、より高いローディング量のために拡大されてもよい。
【００５２】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動と比較して、分子量に従ってタンパク質を分離する無ゲルプラットフォームは、概して、より低い分解能を有し、広範な質量範囲にわたって適用できない。したがって、本発明の一実施形態は、マイクログラム範囲において、迅速で広範な質量範囲のプロテオーム分離に適応するために、予備ゲル電気泳動の技術を最適化する。タンパク質画分は、ゲルカラムの端部からの電気泳動後に、最終的に溶液相中に回収され、無ゲル電気泳動後の期間を与える。したがって、Ｇｅｌ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、またはＧｅｌＦｒＥＥと呼ばれる本発明の本実施形態は、プロテオーム画分のための代替または補完的分離ツールを提供し、分離の予測可能および再現可能な本質に基づき、試料に関する有益な固有情報も提供する。そのコンパクトな設計および単純な構成により、ＧｅｌＦｒＥＥデバイスは、多重化に容易に適合する。
【００５３】
Ｆ．多重装置
本発明の装置の単純な設計は、デバイスの多重化を可能にする。多重デバイスは、２つ以上の分離デバイスに連結される、２つ以上の回収チャンバを備える。各回収チャンバおよび各分離デバイスは、１つの回収チャンバおよび１つの分離デバイスを伴うデバイスと同一の構成要素を備える。
【００５４】
多重デバイスの原理は、複数の試料の分離に適応することであり、各々は、それ自体の分離デバイスおよび個々の回収チャンバ内にある。一実施形態では、画分または試料が標準的な多チャネルピペットを使用して回収され得、複数の回収チャンバの中の全ての溶液が同時に移され得るように、回収チャンバのアクセスポートが配置され得る。別の実施形態では、回収チャンバは、接続され、同一ブロックの材料から製造される。一例を図８に示す。
【００５５】
別の実施形態では、回収チャンバは、分離デバイスよりも少ない。一実施形態では、２つの分離デバイスが１つの回収チャンバの中に溶出し、別の実施形態では、３つまたはそれ以上の分離デバイスが、１つの回収チャンバの中に溶出する。
【００５６】
さらに別の実施形態では、各分離デバイスに対して、２つ以上の回収チャンバが存在する。一実施形態では、回収チャンバは、分離デバイスの下流に並んでいる。例えば、装置は、２つの分離デバイスＡおよびＢ、ならびに６つの回収チャンバ１〜６を備える。回収チャンバ１は、分離デバイスＡの直接下流にあり、回収チャンバ２は、回収チャンバ１の直接下流にあり、回収チャンバ３は、回収チャンバ２の直接下流にある。また、回収チャンバ４は、分離デバイスＢの直接下流にあり、回収チャンバ５は、回収チャンバ４の直接下流にあり、回収チャンバ６は、回収チャンバ５の直接下流にある。このように整合される回収チャンバは、それらの間に異なる分子量カットオフ膜を有することができる。別の実施形態では、それらは、異なる分子トラップを含むことができる。
【００５７】
別の実施形態では、１つの分離デバイスが、２つ以上の試料を収容するための複数のレーンを含有する。例えば、非限定的に、分離デバイスは、例えば、８つのレーンを伴う、スラブポリアクリルアミドまたはアガロースゲルであってもよい。各レーンは、回収チャンバに接続される。本実施形態では、複数の回収チャンバが１つの材料から製造されてもよく、または各回収チャンバが１つの材料から製造されてもよい。
【００５８】
回収チャンバに接続される各分離デバイスは、平面構成、弧状、半楕円状、または管状構成を含むがこれに限定されない、異なる構成で隣り合って並んでいてもよい。管状構成は、円筒形、管状楕円、長方形の管または他の構成であってもよい。
【００５９】
多重デバイスの中で回収チャンバに連結される分離デバイスの数は、実用的な数であればいくつでも、２〜２０以上まで及ぶことができる。一実施形態では、多重デバイスは、８つの回収チャンバに連結される８つの分離デバイスを備える。
【００６０】
多重装置の中の各分離デバイスは、同一構成を有することができ、多重装置の中の他の分離デバイスと同一の分離媒体を含有することができる。あるいは、各分離デバイスは、同一構成を有するが、同一多重装置の中の他の分離デバイスとは異なる分離媒体を含有することができる。別の代替方法として、各分離デバイスは、同一装置の中で他の分離デバイスとは異なる構成を有するが、他の分離デバイスと同一の分離媒体を含有する。第４の代替方法として、各分離デバイスは、同一装置の中で他の分離デバイスとは異なる構成を有し、他の分離デバイスとは異なる分離媒体を含有する。異なる代替方法は、同一多重装置の異なる分離デバイス上で処理される異なる試料、または同一多重装置の異なる分離デバイス上で処理される異なる量の試料を収容することができる。
【００６１】
複数の分離デバイスは、１つの上流チャンバに接続することができ、または各分離デバイスは、それ自体の上流チャンバを有することができる。例えば、多重装置は、図７に図示するデバイスと同様に、１つの上流チャンバに全て接続される、８つの分離デバイスを備えることができる。あるいは、多重装置の中の各分離デバイスは、８つの分離デバイスを伴う装置に対して、各分離デバイスの各上流に、８つの上流チャンバがあるように、それ自体の上流チャンバを有することができる。同様に、複数の回収チャンバは、図７に図示するデバイスと同様に、それらの出口ポートを介して、１つの下流チャンバに接続することができ、または各回収チャンバは、それ自体の下流チャンバに接続することができる。
【００６２】
Ｇ．他の分離または分析デバイスとの相互作用
デバイスは、並列デバイスに接続されてもよく、高処理能力、ならびに同時の分離および回収を可能にする。並列デバイスは、本発明の装置の分離デバイス上での分離の前後に達成される分子分離ステップ、または質量分析、ガスクロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、あるいは当業者に既知の多くの他の分析ステップのいずれか等の分析ステップを含むことができる。本発明の装置はコンパクトであることができ、本発明の装置が並列デバイスに接続されるのがより容易になるが、本発明のより大きい装置が他のデバイスに接続することもできる。
【００６３】
多重デバイスはまた、多次元分離プラットフォームのために、他の分離デバイスと一体化する能力を有し、分離の第１の次元からの各「画分」は、多重化システムの中の分離チャネルのうちの１つにローディングされる。第１の次元の分離の実施例としては、溶液等電点電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、およびイオン交換クロマトグラフィが挙げられるがこれに限定されない。
【００６４】
一実施形態では、８つのポリアクリルアミド分離ゲルを備える多重デバイスは、溶液等電点電気泳動デバイスに組み込まれてもよい。２つのデバイスの組み合わせは、二次元タンパク質ゲル電気泳動に類似する、溶液ベースの分離を提供することができる。２ｃｍ未満などの短いポリアクリルアミドゲルが使用される場合、上記の組み合わせは、３時間未満の総処理時間で完了することができる２Ｄゲルと類似する、溶液ベースの分離を提供することができる。
【００６５】
ＩＩ．方法
生体分子を分離および回収するために、該装置を使用するための方法は、以下のステップを含む。（１）試料（複数を含む）を提供するステップ、（２）分離デバイスを使用して試料を分離するステップ、および（３）回収チャンバを介して分離デバイスから生体分子の画分を回収するステップ。
【００６６】
Ａ．試料
試料は、生体分子を含む。生体分子を含むいかなる試料も、本発明の装置を使用して分離され得る。例えば、試料は、粗細胞抽出物、部分的に精製された抽出物または試料、ならびに非限定的に膜画分、核画分、ミトコンドリア画分、および細胞質画分等の細胞内画分の形であってもよい。試料はまた、いかなる生物からの体液、または組織もしくは臓器の抽出物を含むことができる。部分的に精製された画分はまた、該装置を使用して分離され得る。一実施形態では、試料は、分離されるタンパク質を含み、別の実施形態では、試料は、核酸を含む。試料はまた、合成ペプチド、タンパク質、核酸等の合成分子を含むことができる。
【００６７】
試料は、分離ステップのために調製されてもよい。調製は、分離デバイス、および分離デバイスの中の材料によって決まる。例えば、分離デバイスがＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を備える場合、試料は、通常、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含有する緩衝液中で沸騰させ、緩衝液表面と共に移動する染料を添加することにより、変性される。分離デバイスの中の材料が、例えば、アガロースを備える場合、試料は、ゲルが処理される緩衝液を含むように調製される。
【００６８】
Ｂ．分離
分離ステップは、試料（複数を含む）を分離デバイスにローディングし、試料中の生体分子が分離するように分離デバイスを作動させるステップを含む。
【００６９】
試料は、特定の分離のために行われる標準的な方法で、分離デバイスにローディングされ得る。例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に対して、液体試料は、ゲルよりも上の体積に適用される。一実施形態では、回収チャンバがその出口ポートの中に弁を有しない装置を使用して、デバイスは、水平から１０度を上回る角度に持ち上げられ、試料が分離媒体の上部に重力により流動することを可能にする。試料が分離デバイスの媒体の中に移動するまで、ポリアクリルアミド媒体に対する電圧、またはイオン交換もしくはゲル濾過媒体に対する圧力等の駆動力が開始され、その時点で、デバイスの持ち上げられた角度は、下げられてもよく、または下げなくてもよい。
【００７０】
分離は、次いで駆動力を使用して実行され、分離媒体を通じて試料中の生体分子を移動させる。回収チャンバのアクセスポートが弁を有しない場合、デバイスは、材料がアクセスポートを通じて回収チャンバから漏出しないように、水平位置または角度の付いた位置に保持される。回収チャンバのアクセスポートが漏出を防ぐ弁を有する場合、デバイスは、垂直、水平、または角度の付いた位置で作動されてもよい。
【００７１】
Ｃ．回収
回収チャンバを介した分離された画分の回収は、分離デバイスに応じた方法で実行される。しかしながら、全てのデバイスに対して、回収チャンバの体積は、回収チャンバの入口ポートの中の分離デバイスの深さを調整することにより調整される。これは、回収チャンバに試料がローディングされる前、およびその後のいかなる時点でも行われ得る。
【００７２】
分離中、画分の回収は、回収チャンバの中のアクセスポートを介して実行される。画分は、駆動力が作用している間に回収され得るか、または駆動力は、各画分が回収されている間、停止されてもよい。各画分が回収されている間、駆動力が停止されている場合、分離は、各回収ステップ中に分離の一時的中断、続いて各回収ステップの完了後に分離ステップの再開を伴う、しばしば停止するサイクルで実行される。
【００７３】
画分は、均等な時間間隔後に回収されてもよく、または各画分の回収の間の時間は、異なってもよい。本発明の装置は、使用者が、各画分が回収される時間を制御することを可能にし、それは、他のデバイスに優る利点である。一実施形態では、回収間のより短い時間間隔が、より速く早く溶出する溶質のために設定され、より長い時間間隔が、より長く溶出する溶質のために設定される。回収時間のこの制御は、より長く溶出する溶質の希釈の発生を少なくする。回収チャンバは、一定流量とは対照的に一定体積に保持されるため、溶質はまた、希釈とは対照的に濃縮され得る。したがって、連続的回収間の時間は、分離が進むにつれてより遅く移動する種を収容するように、徐々に増加される。例えば、サイズに基づきタンパク質を分離する媒体を使用する場合、タンパク質がより大きいと、その特定のタンパク質バンドが分離媒体から溶出するのにかかる時間は、より長くなる。同一画分中にその特定のタンパク質の全体量を保持するために、回収時間を増加させることにより収容する必要がある。出口ポートにおけるトラップ（例えば、分子量カットオフ膜）により、試料中の分子は、回収または除去される時間まで、チャンバの中に捕捉されたままである。
【００７４】
回収チャンバは、試料を回収するためのチャンバとして機能するだけでなく、チャンバの中の溶質の絶対量が経時的に増加することができる、予備濃縮チャンバとしても機能する。これは、回収チャンバが、一定流量とは対照的に一定体積に保持されるためである。それにより、回収チャンバの調整可能な体積はまた、試料ローディングがサブマイクログラムレベルである場合に、より高い回収を可能にする。例えば、ローディングがサブマイクログラムレベルである場合、回収チャンバの体積は、回収チャンバの入口ポートの中の分離デバイスの深さを調整することにより、より小さい体積に調整され得る。分子が回収チャンバの中で濃縮されるため、回収チャンバのより小さい体積は、サブマイクログラムの試料からの少量の分離された分子の高回収を可能にする。
【００７５】
上記の分子トラップは、分離処理前または分離処理中に回収チャンバの中に配置され得る。これは、固相中に残る、すなわち捕捉デバイス上に吸着される分離された画分を使用者が回収することを可能にする。回収チャンバの中の捕捉デバイスを使用する場合、液体画分はまた、分子トラップと同時に回収されてもよい。本実施形態では、各時点において、２つの画分が回収される。１つは、分子トラップの中に分子を含む、分子トラップを備え、もう１つは、溶液中にあり、分子トラップにより保持されなかった分子を含む。別の実施形態では、分子トラップは、分離処理中に回収された一部だが全てではない画分に対して、配置および回収されてもよい。捕捉デバイスは、分離処理中に、アクセスポートを通じて、未使用の捕捉デバイスと連続して配置されてもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態では、各試料が回収された後に、回収チャンバの中の緩衝液を交換する必要がある。例えば、分離デバイスがポリアクリルアミドゲル電気泳動である場合、各液体画分が回収された後に、回収チャンバに緩衝液を添加する必要がある。
【００７７】
画分の回収は、手動で実行されてもよく、または回収は、画分コレクタもしくは当業者に既知の他のデバイスを使用して、自動化されてもよい。
【００７８】
多重システムに対して、使用する方法は、単一の分離デバイスおよび回収チャンバを伴うシステムの方法と同様である。
【００７９】
一実施形態では、分離媒体は、ポリアクリルアミド、アガロース、または同様の種類のゲルである。多重ＧｅｌＦｒＥＥ（Ｇｅｌ  Ｆｒａｃｔｉｏ  Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）と呼ばれる本実施形態は、タンパク質、核酸、または他の生体分子等の試料の質量ベースの分離を表す。本発明の多重化デバイスは、１回の実行で複数の試料を収容することができる。電圧印加は、温度および溶媒緩衝液組成物等の他の条件のように同一である。同一試料が、複製データのために複数回処理されてもよく、または独立した試料が、同時に処理されてもよい。一実施形態では、多重デバイスは、多次元分離を実行するために使用される。
【００８０】
単一試料分離および多重分離の両方に対して、第１の分離から回収された画分は、独立した形の分離を使用してさらなる画分の対象となり得る。例えば、タンパク質分析に対して、最も一般的な形の多次元分離は、２Ｄゲル電気泳動によるものであり、等電点電気泳動法（次元１）およびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（次元２）の組み合わせを使用する。該技術がその長所を有する一方で、研究者によりよい代替方法を要求させる、２Ｄゲル電気泳動のいくつかの既知の問題がある。
【００８１】
一側面では、溶液ＩＥＦは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動と組み合わされる。一実施形態では、１試料当たり約３００μＬの体積を伴う、試料の８つの画分を作製するＩＥＦデバイスは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および本発明の装置を使用した試料の回収（ＧｅｌＦｒＥＥ）に結合される。８つの回収チャンバに連結される８つの分離デバイスを備える、本発明の多重デバイスは、上記のＩＥＦで生成される８つの試料と上手く作用する。このように、本発明のデバイスを使用した分離および回収に溶液ＩＥＦを結合することにより、２Ｄゲルがタンパク質に対して達成する分離は、本発明の多重装置を使用して、溶液相中で達成され得る。
【００８２】
ＩＩＩ．図面による実施形態
添付図面に図示し、本明細書に記載する具体的なデバイスおよびプロセスは、添付の特許請求の範囲に定義する本発明の概念の単に例示的な実施形態である。したがって、本明細書に開示する実施形態に関する具体的な寸法および他の物理的特徴は、特許請求の範囲が明示的に別段の定めをした場合を除き、限定的と見なされるものではない。
【００８３】
図１は、本発明のデバイスの一実施形態の断面図を示す。図２は、その実施形態の俯瞰図を示す。参照番号１０は、概して、図１に示すデバイスの一実施形態を示す。回収チャンバ２０は、分離デバイス３０の下流に配置される。回収チャンバは、入口ポート２２、出口ポート２４、およびアクセスポート２６を含む。回収チャンバはまた、分子量カットオフ膜２８も含む。分離デバイス３０は、入口ポート２２を介して回収チャンバ２０と相互作用する。本実施形態では、入口ポート２２は、回収チャンバ２０の上流端部の中に孔または円筒を備える。出口ポート２４は、回収チャンバと下流チャンバ５０とを接続する。出口ポート２４には、分子量カットオフ膜２８がある。回収チャンバはまた、アクセスポート２６を含み、それは、回収チャンバの内容物がアクセス可能である孔または弁を備える。
【００８４】
図３、４、および５は、回収チャンバの図を示す。図３は、回収チャンバを含有するブロックの三次元図を示し、出口ポート２４およびアクセスポート２６を示す。図４は、回収チャンバの断面側面図であり、入口ポート２２、出口ポート２４、およびアクセスポート２６を示す。図５は、回収チャンバブロックの断面正面図であり、入口と出口ポートとの間にある、アクセスポート２６および回収チャンバ内部２３を示す。
【００８５】
図１の分離デバイス３０は、分離媒体３４を備え、それは、濃縮媒体またはゲル３３、および分離ゲルまたは媒体３５を含む。分離媒体３４は、ポリアクリルアミドゲル、アガロース、または他の分離媒体であってもよい。分離デバイス３０は、円筒形管３８、および管内に含有される分離媒体３４を備える。円筒形管３８は、ガラス、シリコン処理ガラス、もしくは透明プラスチック、または他の透明剛性材料から製造されてもよい。
【００８６】
図１および２のデバイス１０はまた、上流チャンバ４０および下流チャンバ５０を含む。分離デバイス３０の円筒形管３８の上流端部３２は、その出口ポート４２を介して上流チャンバ４０に接続する。同様に、分離デバイス３０の円筒形管３８の下流端部３６は、その入口ポート５２を介して下流チャンバ５０に接続する。上流４０および下流５０チャンバはまた、電極４４、５４およびポート４６、５６を含む。チャンバ４０および５０は、典型的には、分離媒体に好適な緩衝液を含有する。
【００８７】
デバイス１０はまた、上流および下流密閉装置６０および７０のそれぞれを含む。上流密閉装置６０は、典型的には、ゴムから製造されるガスケット６２、ならびにガスケット６２の両側にプレート６４および６６を備える。下流密閉装置７０もまた、典型的には、ゴムから製造されるガスケット７２、ならびにガスケット７２の上流端部にプレート７４を備える。デバイスは、クランプにより、または図２に示すようなナット（例えば、７８）およびボルト（例えば、６７、７７）により、漏出しないように密閉され得る。
【００８８】
図６は、デバイス１０の一実施形態の写真を示す。
【００８９】
動作中、装置１０は組み立てられ、入口ポート２２または回収チャンバ２０の中の分離デバイス３０の深さが調整され、回収チャンバの体積を設定する。ゲルカラムの周囲に密閉を形成するために、ゴムガスケットも使用される。試料は、分離デバイス３０の円筒形管３８の上流端部３２に配置され、濃縮媒体またはゲル３３の上流端部に流動することが可能となる。これを達成するための一方法は、装置１０を水平から約３０°の角度に傾け、試料が濃縮媒体３３の上流端部に重力により移動することを可能にする方法である。電位が上流電極４４および下流電極５４にわたって印加され、試料が濃縮媒体３３に移動することを可能にする。次いで、装置は、随意に水平に、または３０°と水平との間に下げられてもよい。試料の回収は以下のように達成される。第１に、電極４４および５４にわたって印加される電位を停止する。第２に、ピペットを使用して回収チャンバ２０の全体積を清潔なバイアルに移し、アクセスポート２６を介して回収チャンバに到達させる。第３に、アクセスポート２６を介して、未使用の緩衝液を回収チャンバにローディングする。第４に、電位を電極４４および５４にわたって再印加し、分離を再開する。ステップ１〜４を分離の間に繰り返し、ステップ１〜４の各サイクル中に画分を回収する。ステップ１〜４の各サイクル間の時間は、分離処理中に調整可能である。入口ポート２２の中の分離デバイス３０の深さを調整するさらなるステップは、ステップ２と３との間で実行され得る。
【００９０】
多重デバイスの一実施形態をデバイスの俯瞰図である図７に示す。図７は、多重デバイスの構成要素を容易に見るための拡大図であることに留意されたい。動作中、例えば、回収チャンバ１２０と下流チャンバ１５０との間の空間は、閉じている。参照番号１１０は、図７に示すデバイスの一実施形態を示す。図１および２のデバイスと同様に、回収チャンバ１２０を備えるブロックは、分離デバイス１３０の下流に配置される。各回収チャンバは、入口ポート１２２、出口ポート１２４、およびアクセスポート１２６を含む。各回収チャンバはまた、分子量カットオフ膜１２８を含む。分離デバイス１３０は、入口ポート１２２を介して回収チャンバ１２０と相互作用する。出口ポート１２４は、回収チャンバと下流チャンバ１５０とを接続する。出口ポート１２４には、分子量カットオフ膜１２８があり、それは、多重デバイスの本実施形態では、出口ポート１２４の全てを覆う１つの膜である。他の実施形態では、各出口ポートは、別個の分子量カットオフ膜を有することができる。さらに他の実施形態では、各回収チャンバの各出口ポートは、異なるサイズの分子量カットオフ膜を有することができる。回収チャンバはまた、アクセスポート１２６を含み、それは、回収チャンバの内容物がアクセス可能な孔または弁を備える。図７に示す実施形態では、複数の回収チャンバは、１つのブロックの材料から製造される。他の実施形態では、回収チャンバはそれぞれ、別々に製造され、分離デバイス１３０と並んでいてもよい。
【００９１】
図７の分離デバイス１３０は、２つ以上の分離デバイスを備える。図示する実施形態では、各分離デバイスは、分離媒体１３４を含有する円筒形管１３８を備える。分離媒体１３４は、ポリアクリルアミドゲル、アガロース、または他の分離媒体であってもよい。円筒形管１３８は、ガラス、シリコン処理ガラス、もしくは透明プラスチック、または他の透明剛性材料から製造されてもよい。図７は、相互に同一の分離デバイスを示す。他の実施形態では、円筒形管は、異なる直径を有し、および／または異なる分離媒体を含有することができる。図７はまた、６つの回収チャンバに接続される６つの分離デバイスを示す。分離デバイスおよび回収チャンバの数は、実用的な数であればいくつでも、２つほどの少数から２００ほどの多数であってもよい。別の実施形態では、分離デバイスおよび回収チャンバの数は、多チャネルピペットを収容するために８つである。
【００９２】
図７のデバイス１１０はまた、上流チャンバ１４０および下流チャンバ１５０を含む。分離デバイス１３０の円筒形管１３８の上流端部は、その出口ポート１４２を介して上流チャンバ１４０に接続する。同様に、分離デバイス１３０の円筒形管１３８のの下流端部は、その入口ポート１５２を介して下流チャンバ１５０に接続する。上流１４０および下流１５０チャンバはまた、電極１４４および１５４を含む。チャンバ１４０および１５０は、典型的には、分離媒体に好適な緩衝液を含有する。図７に図示する実施形態は、全ての分離デバイスが接続する、１つの上流チャンバおよび１つの下流チャンバを有する。他の実施形態では、各分離デバイスは、別々の上流および下流チャンバに接続される。つまり、８つの分離デバイスがある場合、８つの上流および８つの下流チャンバがある。
【００９３】
デバイス１１０はまた、上流および下流密閉装置１６０および１７０のそれぞれを含む。上流密閉装置１６０は、典型的には、ゴムから製造されるガスケット１６２、ならびに上流チャンバ１４０の上流にあるプレート１６４、およびガスケット１６２の下流あるプレート１６６を備える。下流密閉装置１７０はまた、典型的には、ゴムから製造されるガスケット１７２、ならびにガスケット１７２の上流端部にあるプレート１７２、および下流チャンバ１５０の下流ある第２のプレート１７６を備える。本実施形態におけるガスケット１６２および１７２は、１枚のゴムシートである。他の実施形態では、ガスケットは、ゴムリングを備えることができ、各分離デバイスに対して２つのゴムリング（上流および下流）がある。デバイスは、ナット１６８および１７８、ならびにボルト１６７および１７７により漏出しないように密閉される。デバイスはまた、クランプで密閉されてもよい。
【００９４】
図８、９、および１０は、収チャンバの図を示す。図８は、回収チャンバを含有するブロックの三次元図を示し、出口ポート１２４およびアクセスポート１２６を示す。図９は、回収チャンバの断面側面図であり、入口ポート１２２、出口ポート１２４、およびアクセスポート１２６を示す。図１０は、回収チャンバブロックの断面正面図であり、入口ポートと出口ポートとの間のアクセスポート１２６およびチャネル１２３を示す。
【００９５】
多重デバイスは、単一デバイスと同様に作動される。装置１１０は組み立てられ、回収チャンバ１２０の入口ポート１２２の中の分離デバイス１３０の深さが調節され、回収チャンバの体積を設定する。その各入口ポート１２２の中の各分離デバイス１３０の深さは、各分離デバイスおよび入口ポートに対して同一であってもよく、したがって、各回収チャンバ１２０に対して同一の体積を設定する。あるいは、その各入口ポート１２２の中の各分離デバイス１３０の深さは、各分離デバイスおよび入口ポートに対して異なってもよく、したがって、１つ以上の回収チャンバ１２０に対して異なる体積を設定する。試料は、分離デバイス１３０の円筒形管１３８の上流端部１３２の中に配置され、分離媒体１３４の上流端部に流動することが可能となる。これを達成するための一方法は、装置１１０を水平から約３０°の角度に傾け、試料が濃縮媒体１３４の上流端部に重力により移動することを可能にする方法である。電位が上流電極１４４および下流電極１５４にわたって印加され、試料が濃縮媒体１３４に移動することを可能にする。次いで、装置は、随意に水平に、または３０°と水平との間に下げられてもよい。試料の回収は以下のように達成される。第１に、電極１４４および１５４にわたって印加される電位を停止する。第２に、ピペットを使用して回収チャンバ１２０の全体積を清潔なバイアルまたはマルチウェルプレートに移し、アクセスポート１２６を介して回収チャンバに到達させる。第３に、アクセスポートト１２６を介して、未使用の緩衝液を回収チャンバにローディングする。第４に、電位を電極ト１４４およびト１５４にわたって再印加し、分離を再開する。ステップ１〜４を分離の間に繰り返し、ステップ１〜４の各サイクル中に画分を回収する。ステップ１〜４の各サイクル間の時間は、分離処理中に調整可能である。入口ポート１２２の中の分離デバイス１３０の深さを調整するさらなる（任意の）ステップは、第２のステップと第３のステップとの間で実行され得る。
【００９６】
動作中、デバイスは、使用者を高電圧印加から保護する働きをするボックスの内側に含有される。
【実施例】
【００９７】
本明細書に記載する実施例、実験、および結果は、本発明を図示するために提供され、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定すると見なされるものではない。
【００９８】
実施例１：材料
Ｍｉｌｌｉ−Ｑグレードの水を１８．２ｍΩ／ｃｍに精製した。ゲル電気泳動のための全ての試薬をＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）から得た。３．５ｋＤａの分子量画分透析膜をＦｉｓｈｅｒ  Ｃａｎａｄａ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）から購入した。トリプシン（ＴＰＣＫ処理済み、ｃａｔ．Ｔ８８０２）を含む全てのタンパク質、凍結乾燥枯草菌、および他の化学物質をＳｉｇｍａ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）から購入した。
【００９９】
実施例２：試料調製
枯草菌の凍結乾燥細胞を純水中に懸濁し、加圧型細胞破壊装置で８，０００ｐｓｉで溶解した。溶解細菌を１３，０００×ｇで遠心分離し、上清を回収した。試料を使用する直前まで−２０℃で保存した。標準タンパク質を重量で近似濃度に調製した。一貫性を保つために、１８０μＬの試料と２０μＬの５×ゲルローディング緩衝液（０．２５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％ｗ／ｖのＳＤＳ、５０％のグリセロール、０．５％ｗ／ｖのブロモフェノールブルー）を混合し、２００μＬの試料をデバイスにローディングした。カラムへのローディング前に、試料を５分間、９５℃まで加熱した。
【０１００】
実施例３：分離および回収デバイス
カラムを除いて、これらの実施例におけるＧｅｌＦｒＥＥデバイスは、テフロン（登録商標）から構成され、図６に示される。デバイスは、カソードチャンバ、ゲルカラム、回収チャンバ、およびアノード電解質チャンバの４つの主な構成要素を備える。
【０１０１】
本実施例に使用する分離デバイスは、ポリアクリルアミドゲルカラムであり、それを０．８ｃｍ（外径）ｘ６．０ｃｍのガラス管に投入した。別段の記載がない限り、ゲルカラムは、１５％Ｔ、２．６７％Ｃにキャストされた高さ１．０ｃｍの分離ゲルと、４％Ｔ、２．６７％Ｃの高さ１．５ｃｍの濃縮ゲルとから成る。分析用スラブゲルをキャストするための標準的な方法を使用して、ゲルを調製した（Ｌａｍｅｌｌｉ，１９７０）。試料を濃縮ゲルの上方で、ガラス管の空隙体積にローディングした。
【０１０２】
分離後、試料を捕捉し、回収チャンバの中に回収する。それは、ゲルカラムを含有するガラス管の外径と一致するような直径を伴う、円形チャンバから成る。３．５ｋＤａの分子量画分透析膜を回収チャンバとアノード電解質チャンバとの間に挟み、チャンバが合わせてクランプで締められるにつれて、圧力により密閉した（図６Ａを参照）。チャンバの頂部に穴を開けてアクセスポートを形成し、デバイスを分解することなく、画分が除去されることを可能にした。チャンバの中に挿入したゲルカラムの深さを制御することにより、回収チャンバの体積を調整した。
【０１０３】
実施例４：動作条件
デバイスの動作を３つの異なる段階で記載する。（１）試料ローディング、（２）分離、および（３）回収。試料ローディングのために、デバイスの電解質チャンバ、ならびにゲルカラムの上方の空隙体積を泳動緩衝液（０．１９２Ｍのグリシン、０．０２５Ｍのトリス、０．１％のＳＤＳで完全に充填した（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）。１００μＬの泳動緩衝液も回収チャンバの中に導入した。試料ローディングを補助するために、デバイスのカソード（ローディング）端部を３０°の角度に持ち上げ、試料が濃縮ゲルの上部に重力により流動するようにした。分離は、システムにわたる２４０Ｖの一定印加により生じた。試料が完全にゲルの中に移動した後（約１０分）、残りの分離のためにデバイスを平らに置いた。回収は、染料表面が回収チャンバに明白に入った時に開始した。回収中、電力供給を停止し、ピペットを使用して回収チャンバの全体積を清潔なバイアルに移した。未使用の１００μＬの泳動緩衝液を回収チャンバにローディングし、電源を入れ分離を再開した。本プロセスを分離の間に繰り返し、各しばしば停止するサイクル中に画分を回収した。
【０１０４】
図６Ｂは、２４０Ｖでの、直径０．６ｃｍのアクリルアミドゲル上でのデバイス内の前染色されたＭＷプロテインラダーの分離を示す。この写真は、システムへの電圧の最初の印加から測定して、分離が始まって約１５分後に撮影した。より高い電圧印加（最大で２４０Ｖ）は、より低い電圧（１２０Ｖ）での分離と比較して、バンドの分解能を低下させることなく、より速い分離を提供する（結果は図示せず）。また、試料プラグの長さの少なくとも２倍である濃縮ゲルと結合した直径６ｍｍのチューブゲルは、最大で２００μＬがローディングされ、効果的にデバイスが積まれることを可能にし、より少ない体積の試料ローディングと比較して、分解能の顕著な損失はもたらさない。図６から、従来の分析用スラブゲルで観察されるものと同様に、タンパク質の明確な分離が観察される。図６Ｂから分かるように、最小のタンパク質（７ｋＤａ）は、約１ｃｍの分離ゲルを通じて移動した後、染料表面から完全に分解された。
【０１０５】
実施例５：分離ゲルカラム
１５％Ｔの分解スラブゲルを用いた不連続ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより、ＧｅｌＦｒＥＥ（Ｇｅｌ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）画分を分析した。このために、２０μＬのＧｅｌＦｒＥＥで分離された画分を５μＬの５×ゲルローディング緩衝液と混合し、このうちの２０μＬを、適切な標準液と共に、ゲルの個々のレーンにローディングした。ゲルを銀（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら１９９６）あるいはクマシー染色し、フラットベッドスキャナでスキャンした。
【０１０６】
図１１Ａは、１５％Ｔにキャストされた１ｃｍ長さの（分解）ゲルカラムを使用して、２００μｇの枯草菌のプロテオーム抽出物の分離から回収された画分を示す。分離ゲルの組成（すなわち％Ｔ）は、所与の質量範囲にわたる分離の分解能を考慮した場合、重要なパラメータである。一般に、より低い％Ｔにキャストされるゲルが、高質量の種に対して最適な分解能を提供する一方で、より高い％Ｔは、低質量範囲を好む。狭い範囲にわたって最適化することは可能であるが、本実施例では、ＧｅｌＦｒＥＥデバイスを用いて、広範な質量範囲のプロテオーム分離を達成した。１０ｋＤａ以下に及ぶ低質量制限を伴うタンパク質を分画するために、最小で１５％Ｔのゲルが必要とされる。これを下回ると、タンパク質は、緩衝液の染料表面と共に溶出し、それにより分離することができなくなる。１５％Ｔのゲルを用いると、２ｋＤａほどの小さい分子量差に対してさえも、部分的分離が生じ得る。
【０１０７】
図１１Ａに見られるように、最初の電圧印加から９０分後に回収された、最後のタンパク質画分は、１５０ｋＤａ〜２００ｋＤａ（Ｒｆ値から測定）の近似の分子量範囲にわたってタンパク質を含有する。１００ｋＤａ以上の分子量と伴うタンパク質は、１時間の処理時間内で容易に回収された。迅速分離は、短いゲルカラムに対して高電場強度で実行された処理の結果である。したがって、図１１は、単一の動作条件下で、本質的にプロテオーム全体の迅速な広範な質量範囲の分離を示す。
【０１０８】
予備電気泳動において極めて短い分離ゲルを使用することは、一般的とは言えないであろう。しかしながら、ゲル電気泳動におけるバンド広がりに寄与するタンパク質分散の本質により、より長いゲルは、特に試料の全質量範囲にわたって、より高い全分解能を必ずしも提供しない場合がある（Ｙａｒｍｏｌａ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｍｂａｃｈ，１９９８）。また、定電場を仮定すると、より長いゲルは、比例的により長い分離時間を必要とする。図１１Ｂは、３ｃｍゲル上で実行された同等の分離プロファイルを示す。より長いゲルを伴う分離時間は、３時間超に増加し、質量範囲の上限が、１ｃｍのゲル分離の質量範囲の上限にまだ到達していないことを意味する。さらに、回収チャンバからの試料回収の理由で、３ｃｍゲル上での処理は、分離にわたる画分の約３倍もの画分を生成する。図１１が示唆するように、このより長いゲルによる分解能の増加は、特に３０ｋＤａを超える質量範囲において、有意差はない。さらに、高質量タンパク質が複数の画分にわたって溶出し始めると、高質量タンパク質の回収中に試料希釈が増加し、増加した作業量が増す。
【０１０９】
１ｃｍゲルカラムは、全分離時間を最小限化することにより、最大処理能力を維持しながら、実質的に全プロテオーム質量範囲にわたって非常に優れた分解能を提供する。図１１の分離は、特にそのような好ましい分離時間の下で、連続溶出ゲル電気泳動デバイスにおいて分解される、最大質量範囲を表し得る。
【０１１０】
実施例６：捕捉、回収チャンバの独自の特徴
ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより表示されるような明らかに線形の分離（実際には、対数分子量分離を表す）は、後続の画分の回収間の分離時間間隔を徐々に増加させることにより達成される。これらの時間は、図１１に示す全ての指示された分離時間から推論される。そうすることで、ＧｅｌＦｒＥＥによる画分は、連続溶出電気泳動デバイスで経験する試料希釈の問題を容易に克服する。つまり、連続溶出システムが、捕捉チャンバから試料を抽出するために一定流量の液体流を採用するため、より大きい分子量の種が、必然的により大きい体積で回収され、したがって希釈される。これは、より大きい分子量の種の移動性の減少に起因し、タンパク質バンドの溶出時間帯を増加させ、分離における分散および他のプロセスの結果として、有限幅を有する。ＧｅｌＦｒＥＥ装置を使用すると、溶出時間の増加にもかかわらず、一定体積が溶出および試料回収中に維持される。回収時間間隔は、より大きい分子量のタンパク質の増加する溶出時間帯と一致するために、単に増加される。本明細書に報告する実験では、タンパク質画分が１００μＬの間隔で回収されるため、２００μＬの試料ローディングが、２倍の試料濃度の増加をもたらす可能性がある。したがって、デバイスは、過剰な試料希釈を回避することにより、はるかに高い質量範囲において回収を提供し、それは、特に、低からサブマイクログラムローディングに有益である。デバイスからの試料回収は、以下の項において詳細に説明する。
【０１１１】
実施例７：回収チャンバからの回収
ＧｅｌＦｒＥＥ回収チャンバの重要な特徴は、３．５ｋＤａの分子量カットオフ膜の捕捉効率性である。再生セルロースアセテートは、３．５の等電点を有する（Ｐｏｎｔｉｅ，１９９８）。作用緩衝液ｐＨ８において、膜は、負に帯電され（Ｐｉｎｃｅｔ，１９９５）、それによりＳＤＳ結合タンパク質をはじき、膜への結合を防止する。実際には、２．５μｇ／μＬのＢＳＡ溶液を回収チャンバにローディングした場合（カラムに通すことにより）、実験誤差内で、我々は、２４０Ｖで３０分間の捕捉後に、定量的回収を観察した。ンパク質濃度が減少するにつれて、タンパク質損失のリスクが増加すると予想され、したがって、５０ηｇ／μＬのＢＳＡ（１００μＬの全ローディング）を使用して、同様の実験を実施した。試料を分析するために使用した、クマシー染色されたゲルプロファイルは、５〜１５分に及ぶ捕捉間隔において、高回収が認められたことを示唆し、捕捉膜が、本デバイスでの試料損失に有意に起因していないことを示す。３０分の捕捉時間において、ゲル中のバンド強度は、ある程度の試料損失と一致していた。したがって、所与の画分に対する捕捉時間間隔は、回収チャンバ内のより長い捕捉における膜への試料損失を防ぐために、実験全体にわたって１５分以下に維持された。
【０１１２】
実施例８：ＧｅｌＦｒＥＥデバイスのローディング量
連続溶出予備電気泳動デバイスにおけるポリアクリルアミドゲルからのタンパク質回収は、試料ローディングに依存し、デバイス上にローディングされる量が、ゲル１平方センチメートル当たり３ｍｇ〜１００μｇに減少されると、９０％から６０％の収率に低下すると報告された（Ｃｈｒａｍｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｒｏｄｂａｒｄ，１９７１）。ＧｅｌＦｒＥＥデバイス（０．３ｃｍ２ゲルカラム）からの試料回収は、サブマイクログラムからミリグラムの量までの試料ローディング範囲にわたって調査された。試料を捕捉および濃縮する回収チャンバの効率性は、一貫して高いデバイスからの試料回収を提供する。単一標的タンパク質としてシトクロムＣを使用して、０．５μｇ（２００μＬ中）をローディングし、ＧｅｌＦｒＥＥ実験から回収し、続いて銀染色された分析用スラブゲル中で視覚化した。これは、図１２Ａに図示され、ＧｅｌＦｒＥＥ分離からの全ての回収された画分のうちの５分の１のみの分析を表す。このゲル中の１０ηｇのシトクロムＣの最大ローディングは、銀染色の検出限界に近いが、それでもなお、ＧｅｌＦｒＥＥ分離後に、タンパク質は、単一画分中で容易に視覚化され、２分の分離時間帯を表す。より高い試料ローディングにおいて（最大で２００μｇのシトクロムＣ）、顕著な分解能損失なく、高回収が認められる（図１２Ｂ）。しかしながら、１ｍｇの負荷において、クマシー染色されたゲル中に示されるように、分解能は低下し始めた（図１２Ｃ）。効果的な濃縮および試料回収により、内径０．６ｃｍのゲルカラムは、プロテオーム混合物に対して最大で２．５ｍｇの試料ローディングに適応することができる。図１３Ａ、Ｂ、およびＣは、分解能が、１ｍｇ、０．５ｍｇ、および０．１ｍｇのそれぞれの全タンパク質負荷において、５つのタンパク質の標準混合物に対して変化がないことを示す。さらに、タンパク質標準レーンとのバンド強度の比較は、この質量範囲内における、およびこれらの試料ローディングにおける全タンパク質の高回収を示唆する。図１３の標準レーンは、試料ローディングと回収との間の体積減少に起因する、２倍の試料濃縮係数を占めることに留意されたい。試料損失は、高分解能においてタンパク質を回収することにより（つまり単一画分中で）、および一旦タンパク質がゲルカラムから溶出すると、不必要な希釈を回避することにより、最小限化される。このようにして、これらの結果は、ＧｅｌＦｒＥＥの試料画分および回収が、どのように試料ローディングの範囲にわたって極めて高いタンパク質回収を提供するかを示す。
【０１１３】
実施例９：再現性
ＧｅｌＦｒＥＥ処理の再現性は、泳動緩衝液の一貫性、ならびにゲルカラムのキャスティングに非常に依存している。ゲルの組成（％Ｔ、％Ｃ、重合プロセス）、ならびにカラムの長さは、一定の溶出時間を提供するように維持されなければならない。図１３ＡおよびＢは、同一条件を使用し、同一回収時間を用いたＧｅｌＦｒＥＥにより分離された、５つのタンパク質の混合物のゲルプロファイルを示す。画像は、回収されたタンパク質の大部分が、同一の回収された画分中に生じる、言い換えれば、これらのタンパク質が、同一の期間においてゲルカラムから溶出することを示す。図１３Ｃは、画分回収時間が、前の画像の時間よりも１分後にシフトされたことを除いて、５つのタンパク質の混合物の同等の分離を表す。タンパク質は、より少ない画分数において観察されると予想される。これは、試料の溶出プロファイル上での回収時間の小さい変化の強い影響を示す（典型的な９０分の処理中１分間）。それでもなお、制御された一連の動作条件下で、ＧｅｌＦｒＥＥデバイスは、極めて再現可能な分離を提供する。高再現性は、最終的に、所与の一連の条件下での処理時間に直接基づき、使用者が溶出タンパク質の分子量範囲を予測することを可能にする。これは、既知の分子量のタンパク質の標的回収に特に有用になる。これはまた、タンパク質同定を補助するための固有の分子量情報も提供し得る。
【０１１４】
参考文献
【０１１５】
【化１】
2011502243.tif 000003
【０１１６】
【化２】
2011502243.tif 000004
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて記載されてきたが、上述の説明は、例示目的であり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を制限することを目的としていないことを理解されたい。他の側面、利点、および修正は、以下の特許請求の範囲内に入る。
【０１１７】
本明細書に挙げられる全ての参考文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2011502243.tif 000005
【図２】
2011502243.tif 000006
【図３】
2011502243.tif 000007
【図４】
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【図５】
2011502243.tif 000009
【図６】
2011502243.tif 000010
【図７】
2011502243.tif 000011
【図８】
2011502243.tif 000012
【図９】
2011502243.tif 000013
【図１０】
2011502243.tif 000014
【図１１】
2011502243.tif 000015
【図１２】
2011502243.tif 000016
【図１３】
2011502243.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月8日(2010.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
別の実施形態では、該方法は、各回収ステップ後に回収チャンバに緩衝液を添加するステップをさらに含む。
したがって、本発明は以下の項目を提供する：
（項目１）
ａ）分離デバイス、ならびに
ｂ）回収チャンバであって、
ｉ）上記分離デバイスの１つの端部を受容するように適合される、入口ポートと、
ｉｉ）捕捉媒体を備える、出口ポートと、
ｉｉｉ）上記入口ポートと上記出口ポートとの間に位置するアクセスポートであって、上記回収チャンバの体積は、上記アクセスポートに対する上記入口ポートの中の上記分離デバイスの深さを調整することにより制御される、アクセスポートと、を備える、
回収チャンバ、
を備える、装置。
（項目２）
上記分離デバイスは、電気泳動分離デバイスを備える、項目１に記載の装置。
（項目３）
上記分離デバイスは、１０ｃｍ以下の分離経路長を有する分離デバイスを備える、項目２に記載の装置。
（項目４）
上記分離デバイスは、ビス−ポリアクリルアミドまたはアガロースを含む分離媒体を含む、項目２または３に記載の装置。
（項目５）
上記分離デバイスは、６．０ｃｍ以下の高さおよび約０．２〜１．０ｃｍの直径の分離ゲルを含む、ポリアクリルアミドゲルを備える、項目１〜４のいずれかに記載の装置。
（項目６）
上記回収チャンバは、除去可能なトラップを含有する、項目１〜４のいずれかに記載の装置。
（項目７）
上記回収チャンバは、２つ以上の除去可能なトラップを含む、項目６に記載の装置。
（項目８）
上記除去可能なトラップは、疎水性トラップ、親水性トラップ、イオン交換トラップ、分子量カットオフトラップ、親和性トラップ、またはそれらの組み合わせを含む、項目６または７に記載の装置。
（項目９）
上記トラップは、端と端を接して配設される、項目６〜８のいずれかに記載の装置。
（項目１０）
上記回収チャンバの中の上記アクセスポートは、弁をさらに備える、項目１に記載の装置。
（項目１１）
上記捕捉媒体は、約１ｋＤａ〜約１０ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を備える、項目１に記載の装置。
（項目１２）
上記装置は、化学的に不活性の非伝導性材料から本質的に構築される、項目１に記載の装置。
（項目１３）
上記装置は、２つ以上の回収チャンバを備える、項目１〜１２のいずれかに記載の装置。
（項目１４）
上記回収チャンバは、一片の材料から構築される、項目１３に記載の装置。
（項目１５）
上記アクセスポート間の間隔は、標準的な多チャネルピペットを収容するように設計される、項目１３に記載の装置。
（項目１６）
上記アクセスポートは、標準的なピペット先端を収容するように設計される、項目１３〜１５のいずれかに記載の装置。
（項目１７）
上記回収チャンバは、上記分離デバイスと一列に並んで互いの下流に配置される、項目１１に記載の装置。
（項目１８）
２つ以上の分離デバイスをさらに備える、項目１３に記載の装置。
（項目１９）
分離デバイスの数は、回収チャンバの数に等しく、各回収チャンバは、分離デバイスの直接下流に配置される、項目１８に記載の装置。
（項目２０）
上記分離デバイスおよび回収チャンバは、隣り合って並んでいる、項目１８または１９に記載の装置。
（項目２１）
隣り合って並んでいる分離デバイスおよび回収チャンバを備える、上記装置は、平面構成である、項目２０に記載の装置。
（項目２２）
隣り合って並んでいる分離デバイスおよび回収チャンバを備える、上記装置は、弧状、半円状、または半楕円状に構成される、項目２０に記載の装置。
（項目２３）
隣り合って並んでいる分離デバイスおよび回収チャンバを備える、上記装置は、管状構成で構成される、項目２０に記載の装置。
（項目２４）
上記管状構成は、円筒形または楕円形である、項目２３に記載の装置。
（項目２５）
装置はさらに、上記分離デバイスの上流に配置される上部チャンバと、上記回収チャンバの下流に配置される下部チャンバとを備える、項目１３〜１６または１８〜２４のいずれかに記載の装置。
（項目２６）
上記装置は、８つの分離デバイスと、８つの回収チャンバとを備える、項目１３〜１６または１８〜２５のいずれかに記載の装置。
（項目２７）
項目１〜２６のいずれかで定義される装置を使用して、１つ以上の試料から複数の分子または分子画分を精製するための方法であって、上記方法は、
ａ）１つ以上の試料を提供するステップと、
ｂ）上記分離デバイスを使用して上記分子を分離するステップと、
ｃ）上記回収チャンバの中の上記アクセスポートを介して、複数の画分を連続的に回収するステップと、
を含む、方法。
（項目２８）
試料を上記分離デバイスに添加するステップをさらに含み、上記デバイスのローディング端部は、水平から１０度を上回る角度に持ち上げられる、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
上記試料を上記分離デバイスの中へ移動させ、次いで、上記デバイスを水平から１０度未満の角度に下げるステップをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
上記分離ステップは、各回収ステップ中に上記分離ステップの一時的中断、続いて各回収ステップの完了後に上記分離ステップの再開を伴う、しばしば停止するサイクルで実行される、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
上記分離および回収ステップは、上記装置が水平位置にある間に実施される、項目２７に記載の方法。
（項目３２）
上記回収チャンバの上記入口ポートの中の上記分離デバイスの深さを調整することにより、上記回収チャンバの体積を調整するステップをさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目３３）
上記回収された画分中の上記分子は、それらが上記試料中にあった濃度と同じ、またはそれよりも高い濃度を有する、項目２７〜３２のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
上記画分は、除去可能なトラップを含む、項目２７に記載の方法。
（項目３５）
上記画分は、上記回収チャンバの中に除去可能なトラップと溶液の両方を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
上記試料は、粗細胞抽出物、部分的に精製された抽出物、または等電点電気泳動法もしくは分子を分離する他の方法により以前に分離された試料を含む、項目２７に記載の方法。
（項目３７）
上記装置は、項目３〜９のいずれかに記載の装置であり、上記分子は、約２４０ボルトの電圧を使用して分離される、項目２７に記載の方法。
（項目３８）
上記分離および回収ステップは、約１００分で実施される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
上記分離された分子は、約５ｋＤａ〜約２００ｋＤａの範囲のタンパク質であり、約５ｋＤａ離れた分子量を有する分子が効果的に分離される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
各回収ステップ後に上記回収チャンバに緩衝液を添加するステップをさらに含む、項目２７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）上流の端部および下流の端部を有する分離デバイス、ならびに
ｂ）回収チャンバであって、
ｉ）前記分離デバイスの１つの端部を受容するように適合される、入口ポートと、
ｉｉ）捕捉媒体を備える、出口ポートと、
ｉｉｉ）前記入口ポートと前記出口ポートとの間に位置するアクセスポートであって、前記回収チャンバの体積は、前記アクセスポートに対する前記入口ポートの中の前記分離デバイスの深さを調整することにより制御される、アクセスポートと、を備える、
回収チャンバ、
を備える、装置。
【請求項２】
前記分離デバイスは、１０ｃｍ以下の分離経路長を有する電気泳動デバイスを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記分離デバイスは、６．０ｃｍ以下の高さおよび約０．２〜１．０ｃｍの直径の分離ゲルを含む、ポリアクリルアミドゲルを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記回収チャンバは、少なくとも１つの除去可能なトラップを含有し、前記少なくとも１つの除去可能なトラップは、疎水性トラップ、親水性トラップ、イオン交換トラップ、分子量カットオフトラップ、親和性トラップ、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
分離デバイスの数は、回収チャンバの数に等しく、前記分離デバイスに対する前記回収チャンバの配置は、
ａ）直ぐ下流、ならびに
ｂ）平面構成、弧状の構成、半円状の構成、楕円形の構成、管状構成、円筒形の構成およびこれらの組み合わせからなる群より選択される隣り合った構成
のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記装置はさらに、前記分離デバイスの上流に配置される上部チャンバと、前記回収チャンバの下流に配置される下部チャンバとを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記回収チャンバは、前記分離デバイスと一列に並んで互いの下流に配置される、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
ａ）上流の端部および下流の端部を有する分離デバイス、ならびに
ｂ）２つ以上の回収チャンバであって、各回収チャンバは、
ｉ）前記分離デバイスの１つの端部を受容するように適合される、入口ポートと、
ｉｉ）捕捉媒体を備える、出口ポートと、
ｉｉｉ）前記入口ポートと前記出口ポートとの間に位置するアクセスポートであって、前記回収チャンバの体積は、前記アクセスポートに対する前記入口ポートの中の前記分離デバイスの深さを調整することにより制御される、アクセスポートと、を備える、
回収チャンバ、
を備える、多重装置。
【請求項９】
前記２つ以上の回収チャンバは、一片の材料から構築される、請求項８に記載の多重装置。
【請求項１０】
前記アクセスポートは、標準的な多チャネルピペットを収容するように設計され、前記アクセスポートは、標準的なピペット先端を収容するように作動可能である、請求項８に記載の多重装置。
【請求項１１】
２つ以上の分離デバイスをさらに備える、請求項８に記載の多重装置。
【請求項１２】
前記多重装置は、８つの分離デバイスと、８つの回収チャンバとを備える、請求項８に記載の多重装置。
【請求項１３】
請求項１で定義される装置を使用して、１つ以上の試料から複数の分子または分子画分を精製するための方法であって、前記方法は、
ａ）１つ以上の試料を提供するステップと、
ｂ）前記分離デバイスを使用して前記分子を分離するステップと、
ｃ）前記回収チャンバの中の前記アクセスポートを介して、複数の画分を連続的に回収するステップと、
を含む、方法。
【請求項１４】
試料を前記分離デバイスの上流の端部に添加するステップをさらに含み、前記デバイスの上流の端部は、水平から１０度を上回る角度に持ち上げられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料を前記分離デバイスの中へ移動させ、次いで、前記分離デバイスを水平から１０度未満の角度に下げるステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離ステップは、各回収ステップ中に前記分離ステップを一時的に中断し、そして各回収ステップの完了後に前記分離ステップを再開する、しばしば停止するサイクルで実行される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記分離および回収ステップは、前記装置が水平位置にある間に実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記回収チャンバの前記入口ポートの中の前記分離デバイスの深さを調整することにより、前記回収チャンバの体積を調整するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記画分は、前記回収チャンバの中に少なくとも１つの除去可能なトラップ溶液またはそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の試料は、粗細胞抽出物、部分的に精製された抽出物、等電点電気泳動での画分、約５ｋＤａ〜約２００ｋＤａの範囲のタンパク質またはこれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記分子は、約２４０ボルトの電圧を使用して分離される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記分離および回収ステップは、約１００分で実施される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
各回収ステップ後に前記回収チャンバに緩衝液を添加するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【国際調査報告】
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