(57)【要約】  本発明は、人工多能性幹細胞の製造方法であって、少なくとも1の初期化因子をコードする遺伝子が組み込まれた非ウイルス発現ベクター（より好ましくはプラスミドベクター）の少なくとも1種類を体細胞に導入する工程を含む方法を提供する。誘導される外因性遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれていない人工多能性幹細胞も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞の製造方法であって、少なくとも1の初期化因子をコードする遺伝子が組み込まれた非ウイルス発現ベクターの少なくとも1種類を体細胞に導入する工程を含む方法。
【請求項２】
該ベクターが染色体外で自律複製できる非ウイルス発現ベクターである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ベクターがプラスミドベクターである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
初期化因子をコードする遺伝子が国際公開WO 2005/80598に記載された核初期化因子のスクリーニング方法により陽性を示す遺伝子から選ばれる単一の又は複数の遺伝子である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
初期化因子をコードする遺伝子がOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
初期化因子をコードする遺伝子が下記の組み合わせ：
(a)Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子からなる2種の遺伝子の組み合わせ；
(b)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子からなる3種の遺伝子の組み合わせ；
(c)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ； 
(d)Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ；及び
(e)Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる6種の遺伝子の組み合わせ、
のいずれかの組合わせ、又はこれらの組み合わせのいずれかにおいてTERT遺伝子及び／又はSV40 Large T antigen遺伝子をさらに含む組合わせである請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
初期化因子をコードする遺伝子が下記の組み合わせ：
(a)Oct3/4及びSox2からなる2種の遺伝子の組み合わせ；
(b)Oct3/4、Klf4、及びSox2からなる3種の遺伝子の組み合わせ；
(c)Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycからなる4種の遺伝子の組み合わせ； 
(d)Oct3/4、Sox2、Lin28、及びNanogからなる4種の遺伝子の組み合わせ；及び
(e)Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、及びNanogからなる6種の遺伝子の組み合わせ、
のいずれかの組合わせ、又はこれらの組合わせのいずれかにおいてTERT遺伝子及び／又はSV40 Large T antigen遺伝子をさらに含む組み合わせである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
体細胞に導入される非ウイルス発現ベクターの種類の数が1種、2種、3種、又は4種である請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
初期化因子をコードする遺伝子が、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子からなる3種の遺伝子の組み合わせ、又はOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせであり、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子が１種類の非ウイルス発現ベクターに組み込まれている請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子が5'から3'方向にこの順番で1種類の非ウイルス発現ベクターに組み込まれている請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子がポリシストロニック発現を可能にする介在配列で1種類の非ウイルス発現ベクターに組み込まれている請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
Octファミリー遺伝子がOct3/4であり、Klfファミリー遺伝子がKlf4であり、Soxファミリー遺伝子がSox2であり、Mycファミリー遺伝子がc-Mycである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
第一の非ウイルス発現ベクター及び第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入する請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
上記導入を2回以上繰り返して行う請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
体細胞がヒトを含む哺乳類動物の体細胞である請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法により得ることができる人工多能性幹細胞。
【請求項１７】
少なくとも１の導入された非ウイルス発現ベクターの一部又は全部が実質的に染色体に組み込まれていない請求項１６に記載の人工多能性幹細胞。
【請求項１８】
少なくとも1の初期化因子をコードする遺伝子が組み込まれた非ウイルス発現ベクター。
【請求項１９】
該ベクターがプラスミドベクターである請求項１８記載のベクター。
【請求項２０】
Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子が組み込まれている、請求項１８又は１９に記載のベクター。
【請求項２１】
Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子が5'から3'方向にこの順番で組み込まれている、請求項２０記載のベクター。
【請求項２２】
Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子がポリシストロニック発現を可能にする介在配列を介して組み込まれている、請求項２１記載のベクター。
【請求項２３】
Octファミリー遺伝子がOct3/4であり、Klfファミリー遺伝子がKlf4であり、Soxファミリー遺伝子がSox2である、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２４】
初期化因子をコードする１以上の導入遺伝子がプラスミドの形態で細胞のゲノムに組み込まれている人工多能性幹細胞。
【請求項２５】
誘導される外来性遺伝子が細胞のゲノムに組み込まれていない人工多能性幹細胞。
【請求項２６】
２種類以上の初期化因子を含む人工多能性幹細胞の誘導用の非ウイルス発現ベクターを調製するための、口蹄疫ウイルス由来の２Ａ配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は体細胞を初期化して人工多能性幹細胞を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ES細胞）はヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞であり、生体に存在する全ての種類の細胞へと分化できる能力を維持したまま長期にわたって培養することができる。この性質を利用してヒトES細胞はパーキンソン病、若年性糖尿病、白血病など多くの疾患に対する細胞移植療法に役立つことが期待されている。しかしながら、ES細胞の移植は臓器移植と同様に拒絶反応を惹起してしまうという問題がある。また、ヒト胚を破壊して樹立されるES細胞の利用に対しては倫理的見地から反対意見も多い。
【０００３】
患者自身の体細胞の脱分化を誘導し、ES細胞に近い多能性や増殖能を有する細胞（これらの細胞を本明細書において「人工多能性幹細胞」(iPS細胞)と言うが、「胚性幹細胞様細胞」又は「ES様細胞」と呼ばれる場合もある）を樹立することができれば、樹立された細胞は拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞として有用であろう。最近、このiPS細胞をマウス及びヒトの分化細胞から製造できることが報告され、極めて大きな注目を集めている(国際公開WO2007/69666; Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007; Nature, 451, pp.141-146, 2008)。
【０００４】
これら全ての方法は、複数の特定の核初期化因子(例えばCell, 126, pp.1-14, 2006ではOct3/4、Sox2、Klf4、及びc-Mycの4因子が用いられている)を体細胞に導入して初期化を行う工程を含んでいるが、核初期化因子をコードする遺伝子を効率的に体細胞に導入する目的でレトロウイルス又はレンチウイルスが用いられている。しかしながら、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入については安全性の問題もあり、ウイルスベクターを用いることなくiPS細胞を製造する方法の開発が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題はレトロウイルスなどのウイルスベクターを使用せずに体細胞を初期化してiPS細胞を製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、プラスミドベクターなどの非ウイルス発現ベクターを用いて初期化因子をコードする遺伝子を体細胞に導入することによりiPS細胞を製造できること、及び該方法により体細胞から安全なiPS細胞を得ることができることを見出した。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
【０００７】
すなわち、本発明により、人工多能性幹細胞の製造方法であって、少なくとも1の初期化因子をコードする遺伝子が組み込まれた非ウイルス発現ベクターの少なくとも1種類を体細胞に導入する工程を含む方法が提供される。
【０００８】
好ましい態様によれば、本発明により、該ベクターが染色体外で自律複製できる非ウイルス発現ベクターである上記の方法；及び該ベクターがプラスミドベクターである上記の方法が提供される。
【０００９】
別の好ましい態様によれば、本発明により、初期化因子をコードする該遺伝子が国際公開WO 2005/80598に記載された核初期化因子のスクリーニング方法により選ばれる単一の遺伝子又は複数のこのような遺伝子の組み合わせである上記の方法；及び初期化因子をコードする該遺伝子がOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子、好ましくは2種の遺伝子の組み合わせ、さらに好ましくは3種の遺伝子の組み合わせ、特に好ましくは4種又は4種以上の遺伝子の組み合わせである上記の方法が提供される。
【００１０】
より好ましい組み合わせは、(a)Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子からなる2種の遺伝子の組み合わせ；(b)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子からなる3種の遺伝子の組み合わせ；(c)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ；(d)Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ；(e)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる6種の遺伝子の組み合わせなどである。さらに、TERT遺伝子及び／又はSV40 Large T antigen遺伝子を組み合わせることも好ましい。場合により、Klfファミリー遺伝子を除くことが好ましい場合もある。
これらのうち、特に好ましい組み合わせは、Oct3/4及びSox2からなる2種の遺伝子の組み合わせ；Oct3/4、Klf4、及びSox2からなる3種の遺伝子の組み合わせ；Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycからなる4種の遺伝子の組み合わせ；Oct3/4、Sox2、Lin28、及びNanogからなる4種の遺伝子の組み合わせ；並びにOct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28、及びNanogからなる6種の遺伝子の組み合わせである。これらの組み合わせにTERT遺伝子及び／又はSV40 Large T antigen遺伝子を含めることも好ましい。場合によりKlf4を除くことが好ましい場合もある。
【００１１】
別の好ましい態様によれば、本発明により、体細胞に導入される非ウイルス発現ベクターの種類の数が1種、2種、3種、又は4種である上記の方法；初期化因子をコードする遺伝子が、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子からなる3種の遺伝子の組み合わせであり、これらの遺伝子が1種類の非ウイルス発現ベクターに組み込まれている上記の方法；核初期化因子をコードする遺伝子がOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせであり、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子が1種類の非ウイルス発現ベクターに組み込まれている上記の方法；Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子が5'から3'方向にこの順番で1種類の非ウイルス発現ベクターに組み込まれている上記の方法；並びにOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子がポリシストロニック発現を可能にする介在配列で1種類の非ウイルス発現ベクターに組み込まれている上記の方法が提供される。
【００１２】
また、別の好ましい態様によれば、本発明により、2種以上の上記非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入する上記の方法；初期化因子をコードする遺伝子がOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせであり、該4種の遺伝子から選ばれる3種以下の遺伝子が組み込まれた第一の非ウイルス発現ベクター、及び該4種の遺伝子のうち残りの遺伝子が組み込まれた第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入する上記の方法；該3種以下の遺伝子がOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子であり、残りの遺伝子がMycファミリー遺伝子である上記の方法；該3種以下の遺伝子がOct3/4、Klf4、及びSox2であり、残りの遺伝子がc-Mycである上記の方法；並びに体細胞への非ウイルス発現ベクターの導入を2回以上繰り返して行う上記の方法が提供される。
特に好ましい態様によれば、本発明により、Oct3/4、Klf4、及びSox2を含む第一の非ウイルス発現ベクター、及びc-Mycを含む第二の非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入する上記の方法；Oct3/4、Klf4、及びSox2を5'から3'方向にこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、及びc-Mycを含む第二の非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入する上記の方法；Oct3/4、Klf4、及びSox2が5'から3'方向にこの順番にポリシストロニック発現を可能にする介在配列で連結され、第一の非ウイルス発現ベクターに挿入されている上記の方法；第一の非ウイルス発現ベクター及び第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入する上記の方法；並びに導入を2回以上繰り返して行う上記の方法が提供される。また、導入された少なくとも1の非ウイルス発現ベクターの全部又は一部が実質的に染色体に組み込まれない上記の方法も提供される。
【００１３】
また、別の好ましい態様によれば、本発明により、体細胞がヒトを含む哺乳類動物の体細胞、好ましくはヒト又はマウスの体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞である上記の方法；体細胞がヒト胎児細胞又は成人ヒト由来の体細胞である上記の方法；及び体細胞が患者から採取した体細胞である上記の方法が提供される。
【００１４】
別の観点からは、上記の方法により得られることができる人工多能性幹細胞が本発明により提供される。好ましい態様によれば、本発明により、導入された少なくとも1の非ウイルス発現ベクターの全部又は一部が実質的に染色体に組み込まれていない人工多能性幹細胞も提供される。
【００１５】
体細胞がヒトを含む哺乳類動物の体細胞、好ましくはヒト又はマウスの体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞である上記の人工多能性幹細胞；体細胞がヒト胎児細胞又は成人ヒト由来の体細胞である上記の人工多能性幹細胞；及び体細胞が患者から採取した体細胞である上記の人工多能性幹細胞も提供される。
【００１６】
上記人工多能性幹細胞の製造方法において用いられる非ウイルス発現ベクター、好ましくはプラスミドベクターであって、少なくとも1の初期化因子をコードする遺伝子が組み込まれた非ウイルス発現ベクターも、本発明により提供される。
【００１７】
上記の人工多能性幹細胞から分化誘導された体細胞も本発明により提供される。
【００１８】
また、本発明により、幹細胞療法であって、患者から分離した体細胞を用いて上記の方法により得られた人工多能性幹細胞を分化誘導して得られる体細胞を該患者に移植する工程を含む療法も提供される。
【００１９】
さらに本発明により、上記の方法により得られた人工多能性幹細胞を分化誘導して得られる各種細胞を用いて、化合物、薬剤、毒物などの生理作用や毒性を評価する方法が提供される。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により提供される人工多能性幹細胞はレトロウイルスなど染色体に組み込まれるベクターを使用せずに製造されることから、この人工多能性幹細胞を分化して得られる体細胞や組織において腫瘍化などの問題を生じないという点で有利である。本発明の好ましい態様では、本発明の方法により製造される人工多能性幹細胞において、導入された少なくとも1の非ウイルス発現ベクターの全部又は一部がエピソーマル(染色体外)に存在し、実質的に染色体に組み込まれることがない。従って、本発明の方法により、例えば患者自身の体細胞から安全性の高い人工多能性幹細胞を作製することができ、この細胞を分化させることにより得られる細胞（例えば心筋細胞、インスリン産生細胞、又は神経細胞など）は、心不全、インスリン依存性糖尿病、パーキンソン病や脊髄損傷など多様な疾患に対する幹細胞移植療法に安全に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の方法に従って体細胞(MEF)にプラスミドを用いてOct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycを導入する経時的プロトコール、7つの独立した試験結果(左写真、432A-1〜432A-7：細胞密度 1×106個/100 mmディッシュ)及び別の試験結果(右写真、432B-1：細胞密度2×105個/100 mmディッシュ)を示す。中央の最下段は対照（非トランスフェクション）の結果を示す。図１中、Phaseは位相差像、GFPはGFP陽性コロニー像を示す。
【図２】iPS細胞生成用の発現プラスミドを示す。Oct3/4、Klf4、及びSox2をコードする3種のcDNAを、この順序で2Aペプチドをコードする配列を介在配列として連結し、pCXプラスミド内に挿入した(pCX-2A-mOKS)。さらに、c-MycのcDNAを、pCX内に挿入した(pCX-c-Myc)。太線は、ゲノム内へのプラスミドの組み込みを検出するためのPCR解析(図6)において使用した増幅領域を示す。
【図３】プラスミドを用いたiPS細胞誘導のためのタイムスケジュールを示す。黒の矢印は、各プラスミドのトランスフェクションのタイミングを示す。
【図４】ウイルスを用いずに樹立されiPS細胞の形態を示す。上図は位相差像、下図はGFP陽性コロニー像を示す（スケールバー＝200μm）。
【図５】ES細胞、レトロウイルスで誘導したiPS細胞（クローン20D-17: Nature, 448, pp.313-317, 2007）、プラスミドで誘導したiPS細胞（クローン440A-3、4、7、8、10及び11；クローン432A-1)、並びにMEF細胞から単離された全RNAを用いて得られた、ES細胞マーカーの遺伝子発現をPCRで解析した結果を示す。
【図６】PCRによるプラスミドの組み込みの検出を示す。C57BL/6マウス、レトロウイルスで誘導したiPS細胞(クローン20D-17)、プラスミドで誘導したiPS細胞(クローン432A-1；クローン440A-1〜11)、及びMEF細胞からゲノムDNAを抽出し、図2、図13および図14に示したプライマーを用いてPCRで解析した。O-1、K及びMに対するPCRでは、内在遺伝子に由来するバンドは白の矢頭で示し、組み込まれたプラスミドに由来するバンドは黒の矢頭で示す。Fbx15レポーターについては、下のバンドは野生型対立遺伝子を示し、上のバンドはノック・インした対立遺伝子を示す。
【図７】テラトーマ形成の結果を示す。プラスミドの組み込みのないiPS細胞(クローン440A-3、-4、及び-8)をヌードマウスの皮下に移植した。4週間後、腫瘍を切除し、ヘマトキシリン及びエオシン染色した。上からそれぞれ、腸管様上皮組織、表皮組織、横紋筋、及び神経組織についての結果を示す（スケールバー＝50μm）。
【図８】組み込みのないiPS細胞(クローン440A-3及び-8)に由来するキメラマウスを示す。
【図９】PCRによるプラスミドの組み込みの検出を示す。ICRマウス、iPS細胞（クローン432A-1）、及びプラスミドを用いて誘導したiPS細胞(クローン432A-1；クローン440A-3、8)に由来するキメラマウスからゲノムDNAを抽出し、図2に示したO-1、K及びM部分をPCRで増幅した。内在遺伝子に由来するバンドは、白の矢頭で示し、組み込まれたプラスミドに由来するバンドは黒の矢頭で示す。Nanogレポーター及びFbx15レポーターの存在もまたPCRによって検出した。
【図１０】サザンブロット解析で使用したプローブ及び制限酵素認識部位の位置を示す。EはEcoRIを、BはBamHIを示す。
【図１１】サザンブロット解析の結果を示す。ゲノムDNA(6μg)をRF8 ES細胞及びiPS細胞（クローン440A-3、4、7、8、10、及び11；クローン432A-1）から抽出し、BamHI及びEcoRIで切断した。pCX-2A-mOKS及びpCX-c-Mycプラスミド（各20pg）の混合物を対照として使用した。白い矢頭は内在遺伝子に由来するバンドを示し、黒の矢頭は第3染色体上のOct3/4偽遺伝子に由来するバンドを示す（予想サイズは2049bp）。矢印は導入遺伝子に由来するバンドを示す。クローン432A-1で観察された多数のバンドの性質は不明であるが、多数の導入遺伝子の組み込みを示す可能性がある。GFPプローブはNanogレポーター対立遺伝子を検出するために用いられた。
【図１２】SSLP解析の結果を示す。C57BL/6マウス、RF8 ES細胞、組み込みのないiPS細胞（クローン440A-3〜11）及びMEF細胞からのゲノムDNA（各50ng）について、SSLP解析を行った。これらのiPS細胞は5個のMEF細胞クローンの混合物に由来する（クローン1、2、3、5、及び6）。
【図１３】実施例1〜3におけるPCRで使用したプライマーを示す。
【図１４】実施例1〜3におけるPCRで使用したプライマーを示す。
【図１５】本発明の方法に従ってヒト歯髄幹細胞にプラスミドを用いてOct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28、NanogおよびSV40 Large T antigenを導入する経時的プロトコール、及び16個の独立したiPS細胞のコロニー像を示す。
【図１６】胎児HDFから樹立したiPS細胞（5クローン：203A-1〜203A−5、これらの内203A-4は陰性対照としてピックアップした）の、トランスフェクション後31日の写真を示す。
【図１７】胎児HDFから樹立したiPS細胞（5クローン：203A-1〜203A−5、これらの内203A-4は陰性対照としてピックアップした）の、二回目の継代培養における写真を示す。
【図１８】5個のiPS細胞クローン（203A-1〜203A-5）のゲノムPCR解析の結果を示す。
【図１９】ヒト歯髄幹細胞から樹立したiPS細胞（5クローン：217A-1〜-4及び-6）の、トランスフェクション後35日の写真を示す。
【図２０】ヒト歯髄幹細胞から樹立したiPS細胞（5クローン：217A-1〜-4及び-6）の、二回目の継代培養における写真を示す。
【図２１】5個のiPS細胞クローン（217A-1〜-4及び-6）のゲノムPCR解析の結果を示す。
【図２２】若い女性のHDFから樹立したiPS細胞（2クローン：279A-1及び-2）の、最初のエレクトロポーレーション後35日の写真を示す。
【図２３】若い女性のHDFから樹立したiPS細胞（2クローン：279A-1及び-2）の、継代培養後のクローン279A-2の写真を示す（右図は左図中の囲み部分の拡大写真である）。
【図２４】導入遺伝子の組み込みを示すiPS細胞クローン279A-2のゲノムPCR解析の結果を示す。
【図２５】選択後のiPS細胞（8クローン：497A-1〜A-8）の写真を示す（コロニーはトランスフェクション後25日に選択した）。上図は位相差像を示し、下図はGFP陽性コロニーを示す。
【図２６】5個のiPS細胞クローン（497A-1〜A-5）のゲノムPCR解析の結果を示す。497A-2及び497A-5において、外因性遺伝子はゲノムに組み込まれなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の方法は、人工多能性幹細胞の製造用であり、少なくとも1の初期化因子をコードする遺伝子を組み込んだ非ウイルス発現ベクターの少なくとも1種を体細胞に導入する工程を含む。該非ウイルス発現ベクターとして好ましくは染色体外で自律複製できる発現ベクターであり、さらに好ましくはプラスミド発現ベクターである。
【００２３】
核初期化因子を確認する手段としては、例えば、国際公開WO2005/80598に記載された核初期化因子のスクリーニング方法を利用することができる。前記刊行物の全ての開示を参照により本明細書に含める。当業者は上記刊行物を参照することにより核初期化因子をスクリーニングし、それらを本発明の方法に利用することができる。また、上記のスクリーニング方法に修飾ないし改変を加えた方法を用いて核初期化因子を確認することもできる。
【００２４】
初期化因子をコードする遺伝子の組み合わせのいくつかの例が国際公開WO2007/69666に開示されている。前記刊行物の全ての開示を参照により本明細書に含める。当業者は上記刊行物を参照することにより本発明の方法に好適に使用可能な遺伝子を適宜選択することが可能である。初期化因子をコードする遺伝子の組み合わせの別の例がScience, 318, pp.1917-1920, 2007、国際公開WO2008/118820などに記載されている。従って、当業者は核初期化因子をコードする遺伝子の組み合わせの多様性を理解することができ、国際公開WO 2005/80598に記載された核初期化因子のスクリーニング方法を利用することにより、国際公開WO2007/69666及びScience, 2007（上記）に記載された組み合わせ以外の適宜の遺伝子の組み合わせを本発明の方法において利用できる。
【００２５】
好ましい初期化因子をコードする遺伝子として、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子、好ましくは2種の遺伝子の組み合わせ、さらに好ましくは3種の遺伝子の組み合わせ、特に好ましくは4種の遺伝子の組み合わせを含めることができる。
Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子については国際公開WO2007/69666に具体例が示されている。同じく、Linファミリー遺伝子についても当業者は同様にファミリー遺伝子を抽出することが可能である。例えば、Linファミリー遺伝子の具体例として、Lin28及びLin28Bが含まれ得る。
【００２６】
より好ましい組み合わせとしては、
(a)Octファミリー遺伝子及びSoxファミリー遺伝子からなる2種の遺伝子の組み合わせ；
(b)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子からなる3種の遺伝子の組み合わせ；
(c)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ；
(d)Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせ；
(e)Octファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、及びNanog遺伝子からなる6種の遺伝子の組み合わせ；
などを含めることができるが、これらに限定されることはない。
これらの遺伝子はいずれもヒトを含む哺乳類動物において共通して存在する。本発明において、任意に選択された哺乳類動物（例えばヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サル）由来の遺伝子を用いることが可能である。また、野生型の遺伝子のほか、その翻訳産物が数個（例えば1〜10個、好ましくは1〜6個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、特に好ましくは1又は2個）のアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失を有し、且つ野生型の遺伝子産物と同様の機能を有する変異遺伝子も利用可能である。例えば、c-Mycの遺伝子としては野生型のほか安定型変異体(T58A)コードする遺伝子などを用いてもよい。他の遺伝子産物についても同様である。
【００２７】
上記の遺伝子に加えて、細胞の不死化を誘導する因子をコードする遺伝子をさらに組み合わせてもよい。国際公開WO2007/69666に開示されているように、例えば、TERT遺伝子、及び下記の遺伝子：SV40 Large T antigen、HPV16 E6、HPV16 E7、及びBmilからなる群から選ばれる1種以上の遺伝子を単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
好ましい組み合わせとして、例えば、
(f)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、及びTERT遺伝子からなる5種の遺伝子の組み合わせ；
(g)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、及びSV40 Large T antigen遺伝子からなる5種の遺伝子の組み合わせ；
(h)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、TERT遺伝子、及びSV40 Large T antigen遺伝子からなる6種の遺伝子の組み合わせ；並びに、
(i)Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、Mycファミリー遺伝子、Linファミリー遺伝子、Nanog遺伝子、及びTERT遺伝子又はSV40 Large T antigen遺伝子からなる7種の遺伝子の組み合わせを含めることができる。
必要に応じて、上記の組み合わせからKlfファミリー遺伝子を除くことができる場合もある。
【００２８】
さらに、上記の遺伝子に加えて、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、及びβ-cateninからなる群から選ばれる1種以上の遺伝子を組み合わせてもよく、及び／又はECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、ECAT15-1、Fthl17、Sall4、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、及びGrb2からなる群から選ばれる1種以上の遺伝子を組み合わせることもできる。これらの組み合わせについては国際公開WO2007/69666に具体的に説明されている。
【００２９】
初期化すべき体細胞においてこれらの遺伝子のうちの1種以上がすでに発現している場合には、その遺伝子を導入すべき遺伝子から除外することができる。レトロウイルスなど染色体に組み込まれるベクターを用いてこれらの遺伝子のうちの1種以上を初期化すべき体細胞に導入する場合には、残りの1以上の遺伝子を本発明の方法に従って非ウイルス発現ベクターを用いて導入することができる。あるいは、これらの遺伝子の遺伝子産物のうちの1種以上を融合タンパク質や核内へのマイクロインジェクションにより核内に導入する場合には、残りの1以上の遺伝子を本発明の方法に従って非ウイルス発現ベクターを用いて導入することができる。
【００３０】
特に好ましい遺伝子の組み合わせは、
(1)Oct3/4及びSox2からなる2種の遺伝子の組み合わせ；
(2)Oct3/4、Klf4、及びSox2からなる3種の遺伝子の組み合わせ；
(3)Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycからなる4種の遺伝子の組み合わせ；
(4)Oct3/4、Sox2、Lin28、及びNanogからなる4種の遺伝子の組み合わせ;
(5)Oct3/4、Sox2、c-Myc、TERT、及びSV40 Large T antigenからなる5種の遺伝子の組み合わせ；
(6)Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、TERT、及びSV40 Large T antigenからなる6種の遺伝子の組み合わせ；
(7)Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Lin28、及びNanogからなる6種の遺伝子の組み合わせ；
(8) Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Lin28、Nanog、及びTERT又はSV40 Large T antigenからなる7種の遺伝子の組み合わせ、
などである。
上記の遺伝子に加えて、細胞の不死化を誘導する因子をコードする遺伝子をさらに組み合わせてもよい。国際公開WO2007/69666に開示されているように、例えば、TERT遺伝子、及び下記の遺伝子：HPV16 E6、HPV16 E7、及びBmilからなる群から選ばれる1種以上の遺伝子を単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
内在性にSox2及びc-Mycを発現している神経幹細胞などを体細胞ソースに用いて初期化を行う場合は、Oct3/4およびKlf4からなる2種の遺伝子の組み合わせ、又はOct3/4およびc-Mycからなる2種の遺伝子の組み合わせ（Nature, Published online, 29 June 2008,p1-5 (doi:10.1038/nature07061)を参照）も例示することができる。
上記の(3)、(5)、(6)、及び(7)の組み合わせにおいて、c-Mycに替えてL-Mycを用いることもできる。
【００３１】
もっとも、遺伝子の組み合わせはこれらに限定されることはない。また、本発明の範囲には上記の遺伝子から選択される1以上の遺伝子を非ウイルス発現ベクターを用いて体細胞に導入し、残りの遺伝子又は遺伝子産物を他の手段により体細胞に導入する方法も包含される。例えば、上記の遺伝子から選択される1以上の遺伝子を非ウイルス発現ベクターを用いて体細胞に導入し、残りの遺伝子をレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて体細胞に導入することもできる。
【００３２】
初期化因子をコードする2種以上の遺伝子を非ウイルス発現ベクターを用いて体細胞に導入する場合には、導入する2種以上の遺伝子のうちの一部を他の遺伝子とは異なる時点で体細胞に導入することができ、あるいは導入すべき全ての種類の遺伝子を同時に体細胞に導入することもできるが、導入すべき全ての遺伝子を同時に体細胞に導入することが好ましい。2種以上の遺伝子の導入のために2種以上の異なる非ウイルス発現ベクターを用いる場合には、全ての種類の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができ、この手段は本発明の好ましい態様である。
【００３３】
本発明の方法では、初期化因子をコードする遺伝子として、例えばOctファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子からなる4種の遺伝子の組み合わせを用いることができる。また、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子からなる3種の遺伝子の組み合わせ、又は上記の3種の遺伝子から選ばれる2種の遺伝子の組み合わせを用いることもできる。
本発明の方法では、上記の4種、3種、又は2種の遺伝子を同時に体細胞に導入することが好ましい。上記の4種、3種、又は2種の遺伝子を導入するために、これらの遺伝子の全てを組み込んだ1種の非ウイルス発現ベクターを用いてもよい。あるいは、これらの遺伝子の組み合わせを網羅するように数種類の非ウイルス発現ベクターを適宜組み合わせて用いてもよい。数種類の非ウイルス発現ベクターを用いる場合には、好ましくは2又は3種類、さらに好ましくは2種類の非ウイルス発現ベクターを用いることが好ましい。これらの非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましい。
【００３４】
導入する遺伝子の数が4種を超える場合は、これらの遺伝子の組み合わせを網羅するように数種類の非ウイルス発現ベクターを適宜組み合わせてもよい。数種類の非ウイルス発現ベクターを用いる場合には、好ましくは2から5種類、より好ましくは2から4種類、さらに好ましくは3又は4の非ウイルス発現ベクターを用いることが好ましい。これらの非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましい。
【００３５】
好ましい方法としては、例えば、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子を含む1個の非ウイルス発現ベクター、及びMycファミリー遺伝子を含む1個の非ウイルス発現ベクターを同時に、又は時間を変えて体細胞に導入する方法を挙げることができ、この方法において該2種類の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましい。別の好ましい態様では、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、Soxファミリー遺伝子、及びMycファミリー遺伝子を含む1個の非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入する方法を採用することもできる。
【００３６】
本発明の好ましい態様では、Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycからなる4種の遺伝子の組み合わせ、あるいはこれらの4種の遺伝子から選ばれる3種又は2種の任意の組み合わせにおいて、好ましくは、c-Mycを含まない3種又は2種の遺伝子の組み合わせを用いることができる。以下、この好ましい態様について具体的に説明するが、本発明の範囲はこの態様に限定されることはない。
(a1) Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycを含む１種の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。
(b1) Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycから選ばれる2種の遺伝子を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycから選ばれる残りの2種の遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(c1) Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycから選ばれる3種の遺伝子を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、Oct3/4、Klf4、Sox2、及びc-Mycから選ばれる残りの1種の遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(d1) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる残りの1種の遺伝子及びc-Mycを含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(e1) Oct3/4、Klf4、及びSox2を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、c-Mycを含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(f1) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子を5'から3'方向にこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、c-Myc及び第一の非ウイルス発現ベクターには含まれないOct3/4、Klf4、又はSox2のいずれか一つの遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。より具体的には、5'から3'方向に(i)Oct3/4及びKlf4、(ii)Klf4及びSox2、又は(iii)Oct3/4及びSox2をこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、好ましくはプラスミドベクターを用いることができ、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(g1) Oct3/4、Klf4、及びSox2を5'から3'方向にこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、c-Mycを含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
体細胞がマウス由来である場合、好ましくは(f1)又は(g1)の方法を使用することができる。
【００３７】
上記の(b1)〜(f2)において、第一の非ウイルス発現ベクター及び第二の非ウイルス発現ベクターの何れか一方について、非ウイルス発現ベクターに替えてウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなど）を用いることができる。
【００３８】
本発明の別の好ましい態様によれば、以上の(a1)〜(f2)において、c-Mycに替えてL-Mycを用いることができる。
【００３９】
さらに別の好ましい態様によれば、Oct3/4、Klf4、及びSox2からなる3種の遺伝子の組み合わせを用いることができる。以下、この好ましい態様について具体的に説明するが、本発明の範囲はこの態様に限定されることはない。
(a2) Oct3/4、Klf4、及びSox2を含む１種の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。
(b2) Oct3/4、Klf4、及びSox2を5'から3'方向にこの順番で含む1種の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。
(c2) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる残りの1種の遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(d2) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子を5'から3'方向にこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、第一の非ウイルス発現ベクターには含まれないOct3/4、Klf4、又はSox2のいずれか一つの遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。より具体的には、5'から3'方向に(i)Oct3/4及びKlf4、(ii)Klf4及びSox2、又は(iii)Oct3/4及びSox2をこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、好ましくはプラスミドベクターを用いることができ、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
体細胞がマウス由来である場合、好ましくは(b2)又は(d2)の方法を使用することができる。
【００４０】
上記の(c2)又は(d2)において、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターの何れか一方について、非ウイルスベクターに替えてウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなど）を用いることもできる。
【００４１】
本発明のさらに別の好ましい態様によれば、Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子の組み合わせを用いることができる。以下、この好ましい態様について具体的に説明するが、本発明の範囲はこの態様に限定されることはない。
(a3) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子を含む１種の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。
(b3) 5'から3'方向に(i)Oct3/4及びKlf4、(ii)Klf4及びSox2、又は(iii)Oct3/4及びSox2をこの順番で含む１種の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。
(c3) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる1種の遺伝子を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターと、第一の非ウイルス発現ベクターには含まれないOct3/4、Klf4、及びSox2のいずれか一つの遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
体細胞がマウス由来である場合、好ましくは(b3)の方法を使用することができる。
【００４２】
上記の(c3)において、第一の非ウイルス発現ベクターと第二の非ウイルス発現ベクターの何れか一方について、非ウイルスベクターに替えてウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなど）を用いることもできる。
【００４３】
本発明のさらに別の好ましい態様によれば、Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc、Lin28及びNanogから選ばれる6種の遺伝子の組み合わせを用いることができる。以下、この好ましい態様について具体的に説明するが、本発明の範囲はこの態様に限定されることはない。
(a4) Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる2種の遺伝子を含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクター、Oct3/4、Klf4、及びSox2から選ばれる残りの1種の遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクター、並びにc-Myc、Lin28及びNanog遺伝子を含む第三の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。好ましくは、第一、第二及び第三の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することができる。
(b4) 5'から3'方向に(i)Oct3/4及びKlf4、(ii)Klf4及びSox2、(iii)Oct3/4及びSox2又は(iv)Sox2及びKlf4をこの順番で含む第一の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクター、Oct3/4、Klf4及びSox2から選ばれる残りの1種の遺伝子を含む第二の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクター、並びにc-Myc、Lin28及びNanog遺伝子を5'から3'方向にこの順番で含む第三の非ウイルス発現ベクター、より好ましくはプラスミドベクターを体細胞に導入する方法。
【００４４】
TERT、SV40 Large T antigen、HPV16 E6、HPV16 E7、又はBmilなどの細胞の不死化を誘導する因子をコードする遺伝子を上述の2、3、4又は6遺伝子とさらに組み合わせる場合、好ましくは別の非ウイルス発現ベクターに組み込むことができる。
【００４５】
上記において複数の遺伝子（例えば、Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子）を1種類の非ウイルス発現ベクターに組み込む場合、これらの遺伝子は、好ましくはポリシストロニック発現を可能にする介在配列で該非ウイルス発現ベクターに挿入することができる。ポリシストロニック発現を可能にする介在配列を用いることにより、1種類の非ウイルス発現ベクターに組み込まれている複数の遺伝子をより効率的に発現させることが可能になる。ポリシストロニック発現を可能にする有用な配列としては、例えば、口蹄疫ウイルスの2A配列（配列番号61、なおFMDV 2A-self-processing sequenceと称する場合もある）（PLoS ONE 3,e2532,2008、Stem Cells 25, 1707,2007）、IRES配列などが挙げられ、2A配列が好ましい。より具体的には、5'から3'方向に、(i) Oct3/4、Klf4及びSox2、(ii)Oct3/4及びKlf4、(iii)Klf4及びSox2、(iv)Oct3/4及びSox2、(v)Sox2及びKlf4又は(vi)c-Myc、Lin28及びNanogをこの順番で含む非ウイルス発現ベクターを構築する場合には、これらの遺伝子の間に2A配列を挿入することが好ましい。従って、本発明は、2種類以上の初期化因子を含むiPS細胞誘導用の非ウイルス発現ベクターを調製するための2A配列の使用も提供する。
【００４６】
非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入する際の導入操作の回数は、体細胞を初期化して人工多能性幹細胞を製造するという本発明の効果を達成できる限り特に限定されず、トランスフェクションは1回以上の任意の回数（例えば、1回から10回、1回から5回など）行うことができる。2種以上の非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入する場合には、これらの全ての種類の非ウイルス発現ベクターを同時に体細胞に導入することが好ましいが、この場合においても、トランスフェクションは１回以上の任意の回数（例えば、1回から10回、1回から5回など）行うことができ、好ましくはトランスフェクションを2回以上(例えば3回又は4回)繰り返して行うことができる。
トランスフェクションを2回以上繰り返す場合の間隔は特に限定されないが、例えば12時間から1週間、好ましくは12時間から4日、例えば、1日から3日とすることができる。
【００４７】
本明細書において、用語「人工多能性幹細胞」(iPS細胞)とはES細胞に近い性質を有する細胞のことであり、より具体的には、体細胞から初期化された未分化細胞であって多能性及び増殖（自己再生）能を有する細胞を包含する。しかしながら、この用語をいかなる意味においても限定的に解釈してはならず、最も広義に解釈する必要がある。仮想的な核初期化因子を用いて人工多能性幹細胞を調製する方法については国際公開WO2005/80598に説明されており（この公報においてはES様細胞という用語が用いられている）、人工多能性幹細胞の単離手段についても具体的に説明されている。国際公開WO2007/69666には初期化因子及びその初期化因子を用いた体細胞の初期化方法の具体例が開示されている。従って、本発明を実施するにあたり当業者はこれらの刊行物を参照することが望ましい。
【００４８】
非ウイルス発現ベクターには、初期化因子をコードする遺伝子のほか、転写に必要な制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び／又はターミネーター等）が該遺伝子に機能的に連結されていることが好ましい。
プロモーターとしては体細胞において転写活性を示すDNA配列を用いることができるが、プロモーターは動物種や体細胞の種類に応じて適宜選択することができる。哺乳類動物細胞中で発現可能な有用なプロモーターとして、例えば、サイトメガロウイルス(ヒトCMV)のIE (immediate early)遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等が含まれる。ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。有用なプロモーターは、CAGプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ-アクチンプロモーターとβ-グロビン遺伝子のポリAシグナル部位を含む）である。
【００４９】
非ウイルス発現ベクターには該発現ベクターが哺乳類動物の体細胞内で自律複製することを可能にするDNA配列を組み込んでもよい。そのようなDNA配列の一例としてSV40複製起点が挙げられる。
【００５０】
非ウイルス発現ベクターは、好ましくは染色体外で自律複製できる発現ベクターであり、該非ウイルス発現ベクターは染色体に組み込まれないものであることが好ましい。さらに好ましい例としてプラスミドベクターを挙げることができる。プラスミドベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pBluescriptなどのColE系プラスミド等）、放線菌由来のプラスミド（pIJ486等）、枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110、pSH19その他）、酵母由来のプラスミド（YEp13、YEp 24、Ycp50等）などのほか、人工的に作成されたプラスミドベクターなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。
容易に入手可能な非ウイルス発現ベクターとしては、例えば、pCMV6-XL3（OriGene Technologies Inc.社製）、EGFP-C1（Clontech社製）、pGBT-9(Clontech社製)、pcDNAI（フナコシ社製）、pcDM8（フナコシ社製）、pAGE107（Cytotechnology, 3,133, 1990）、pCDM8（Nature, 329, 840, 1987）、pcDNAI/AmP（Invitrogen社製）、pREP4（Invitrogen社製）、pAGE103（J.Blochem., 101, 1307,1987）、pAGE210等を例示することができるが、これらに限定されることはない。
【００５１】
非ウイルス発現ベクターには必要に応じて選択マーカーを組み込んでもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子若しくはシゾサッカロマイセス・ポンベTPI遺伝子等のような宿主細胞に欠けている遺伝子、及び例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、若しくはハイグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を含めることができる。
【００５２】
体細胞に導入されるプラスミドベクターなどの非ウイルス発現ベクターは、通常細胞のゲノムに組み込まれないが、iPS細胞誘導のための選択圧下では、初期化因子の安定した発現が必要なために、非ウイルス発現ベクターの組み込み効率の増加が観察され得る。従って、目的のiPS細胞が、再生医療などへの使用を目的としている場合、非ウイルス発現ベクターは、好ましくは、導入遺伝子の切除を可能にする配列、例えばloxP配列（Chang et al., STEM CELLS Published Online: 12 Feb 2009 (doi: 10.1002/stem.39)、piggybackトランスポゾン（Kaji et al., Nature advance online publication 1 March 2009 (doi:10.1038/nature07864); Woltjen et al., Nature advance online publication 1 March 2009 (doi:10.1038/nature07863)）及びプロモーター領域におけるテトラサイクリン応答因子（Tet-OnR & Tet-Off R Gene Expression Systems, Clontech社製）など）を含むことができる。
【００５３】
本発明で用いる初期化因子をコードする遺伝子、プロモーター、エンハンサー、及び／又はターミネーターなどを適宜の順に連結して体細胞内で初期化因子を発現可能な非ウイルス発現ベクターを構築する方法は当業者に自明である。
【００５４】
初期化因子をコードする遺伝子を2種類以上用いる場合には、一つの非ウイルス発現ベクターに該遺伝子を組み込んでもよい。あるいは異なる遺伝子を組み込んだ2種以上の非ウイルス発現ベクターを用いてもよい。後者においては、2種類以上の遺伝子を組み込んだ一つの非ウイルス発現ベクターと、それらの遺伝子とは異なる1種以上の遺伝子を組み込んだ非ウイルス発現ベクターとを適宜組み合わせることもできる。
【００５５】
当業者が利用可能な、動物細胞に発現ベクターを導入する任意の方法を用いて、非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入することができる。有用な方法としては、例えば、FuGENE 6 transfection reagent（Roche社製）のようなトランスフェクション試薬の使用、マイクロポレーターの使用、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAE-デキストラン媒介トランスフェクション法、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション法などが含まれる。またヌクレオフェクションを使用して遺伝子を導入することもできる。これらの方法を組み合わせて使用してもよい。
【００５６】
非ウイルス発現ベクターを体細胞に導入するにあたり、フィーダー細胞上に培養された体細胞に対して発現ベクターの導入を行ってもよく、体細胞にのみ導入を行ってもよい。発現ベクターの導入効率を高めるために後者の方法が適している場合がある。使用されるフィーダー細胞は、胚性幹細胞の培養に用いられるフィーダー細胞であってもよく、例えば、マウス14〜15日胚の線維芽細胞初代培養細胞やSTO（線維芽細胞由来細胞株）等をマイトマイシンCなどの化学薬剤で処理した細胞や放射線処理した細胞などを用いることができる。
【００５７】
非ウイルス発現ベクターを導入した体細胞を適宜の条件下で培養することにより自律的に核初期化を進行させ、体細胞から人工多能性幹細胞を製造することができる。非ウイルス発現ベクターを導入した体細胞を培養して人工多能性幹細胞を得る工程は従来のレトロウイルスを用いる方法に準じて行うことができ、例えば、これは、Cell, 126, pp.1-14, 2006; Cell, 131, pp.1-12, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007などの刊行物に記載されているようにして行うことができる。ヒト人工多能性幹細胞を製造する場合には、発現ベクター導入後の細胞の培養密度を通常の動物細胞培養の場合よりも低いレベルに設定することが望ましい場合がある。例えば、細胞培養用ディッシュあたり1万〜10万個、好ましくは5万個程度の細胞密度で培養を継続することが好ましい。培養には任意の培地を使用することができ、当業者により適宜選択されるが、例えば、ヒト人工多能性幹細胞を製造する場合にはヒトES細胞培養に適した培地を用いることが好ましい場合がある。培地の選択及び培養条件について、上記刊行物を参照することができる。
【００５８】
生成した人工多能性幹細胞は未分化細胞に特有の各種マーカーで確認することができるが、その確認の手段についても上記の刊行物に具体的かつ詳細に説明されている。ES細胞の未分化状態及び多能性を維持可能な各種培地又はこれらの性質を維持することができない培地は当業界で知られており、適宜の培地を組み合わせて用いることにより、人工多能性幹細胞を効率よく単離することができる。単離された人工多能性幹細胞の分化能及び増殖能はES細胞について汎用されている確認手段を利用することにより当業者が容易に確認可能である。生成した人工多能性幹細胞を適宜の条件下で増殖させると人工多能性幹細胞のコロニーが得られ、コロニーの形状から人工多能性幹細胞の存在を同定することが可能である。例えば、マウス人工多能性幹細胞は盛り上がったコロニーを形成するのに対して、ヒト人工多能性幹細胞は扁平なコロニーを形成することが知られており、これらのコロニー形状はそれぞれマウスES細胞及びヒトES細胞のコロニーのものと極めて類似しているので、当業者はコロニーの形状から生成した人工多能性幹細胞を同定することが可能である。ES細胞特異的発現遺伝子のプロモーター下流にGFPなどのマーカー遺伝子を組み込んだ遺伝子を有する体細胞を用いて初期化を行った場合は、細胞がマーカー（GFP）陽性となれば、人工多能性幹細胞を同定することが可能である。
【００５９】
本発明の方法により初期化すべき「体細胞」とは、初期胚及びES細胞等の分化全能性及び多能性細胞を除く任意の細胞を意味し、その選択は特に限定されない。例えば、胎児期の体細胞のほか、新生児の体細胞や成熟した体細胞を用いてもよい。好ましくはヒトを含む哺乳類動物由来の体細胞が用いられ、より好ましくはヒト又はマウス由来の体細胞が用いられる。具体的には、（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、又は（3）リンパ球、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝臓細胞、胃粘膜細胞等の分化した細胞が挙げられる。人工多能性幹細胞を疾病の治療に用いる場合には、治療されるべき患者又は患者のものと同じ種類のＨＬＡを有する別の人から分離した体細胞を用いることが望ましく、例えば、疾病に関与する体細胞や疾病治療に関与する体細胞などを用いることができる。
【００６０】
本発明においては、人工多能性幹細胞の樹立効率を向上させるために、本発明の非ウイルス発現ベクターの導入に加えて、種々の樹立効率改善剤の導入または添加も行うことができる。iPS細胞の樹立効率改善剤としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸(VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（登録商標）(Millipore社製)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene社製)等）等の核酸性発現阻害剤など］、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human)(Santa Cruz Biotechnology社製)等）等の核酸性発現阻害剤など］、Ｌ−チャネルカルシウム作動薬（L-channel calcium agonist）（例、Bayk8644）(Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、UTF1 (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling (例、可溶性Wnt3a)(Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008))、2i/LIF (2iはマイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナル伝達及びglycogen synthase kinase-3の阻害剤である; PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、p53阻害剤(例、p53に対するsiRNAおよびshRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))等が挙げられるが、それらに限定されない。核酸性発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。この場合、siRNAもしくはshRNAをコードするDNAは、初期化因子と共に、本発明の非ウイルス発現ベクターに挿入されてもよい。
【００６１】
本発明の方法により製造される人工多能性幹細胞の用途は特に限定されず、ES細胞の替わりに、ES細胞を利用して行われているあらゆる試験・研究やES細胞を用いた疾病の治療に使用することができる。例えば、本発明の方法により患者から採取された体細胞から得られた人工多能性幹細胞をレチノイン酸、EGFなどの増殖因子、又はグルココルチコイドなどで処理することにより、所望の分化細胞（例えば神経細胞、心筋細胞、血球細胞など）に誘導することができ、適宜の組織を形成させることができる。このようにして得られた分化細胞や組織を患者に戻すことにより自家細胞移植による幹細胞療法を達成することができる。もっとも、本発明の人工多能性幹細胞の用途は上記の特定の態様に限定されることはない。
【００６２】
本発明はまた、上記人工多能性幹細胞の製造方法において用いられる非ウイルス発現ベクター、すなわち、少なくとも1の初期化因子をコードする遺伝子が組み込まれた非ウイルス発現ベクター（好ましくはプラスミドベクター）をも提供するものである。当該ベクターの構造については、本発明の人工多能性幹細胞の製造方法の項で詳細に説明したとおりである。
Octファミリー遺伝子、Klfファミリー遺伝子、及びSoxファミリー遺伝子が、好ましくは、5'から3'方向にこの順番で組み込まれている非ウイルス発現ベクターが例示される。より好ましくは、これらの遺伝子がポリシストロニック発現を可能にする介在配列で組み込まれている非ウイルス発現ベクターが例示され、特に好ましくは、Oct3/4、Klf4およびSox2が、ポリシストロニック発現を可能にする介在配列（好ましくはFMDV 2A-self-processing sequence）で5'から3'方向にこの順番で組み込まれている非ウイルス発現ベクターが例示される。
【００６３】
体細胞に導入されるプラスミドベクターなどの非ウイルス発現ベクターは、通常は細胞のゲノムに組み込まれないため、好ましい態様において、本発明は、導入遺伝子がゲノムに組み込まれていない人工多能性幹細胞を提供する。このようなiPS細胞は、それから分化した組織又は器官における腫瘍形成及び／又は内在遺伝子のかく乱（例えば、破壊又は活性化）を引き起こす危険を低減するため、好ましくは、細胞移植療法などの再生医療のために使用することができる。
【００６４】
しかしながら、iPS細胞誘導のための選択圧下では、初期化因子の安定した発現の必要性に起因して、非ウイルス発現ベクターの組み込み効率の増加が観察され得る。従って、別の好ましい態様において、本発明は、導入遺伝子がプラスミドの形態でゲノムに組み込まれている人工多能性幹細胞を提供する。このようなiPS細胞は、レトロウイルス感染により誘導されるiPS細胞と比較して、それから分化した組織又は器官における腫瘍形成を引き起こす危険を低減することができる。また、該導入遺伝子は、Cre/loxPシステム(Chang et al., 2009 (上記))又はpiggybackトランスポゾンベクター及びpiggybackトランスポゾン(Kaji et al., 2009 (上記); Woltjen et al., 2009 (上記))又はテトラサイクリン依存遺伝子誘導を使用して、必要に応じて、ゲノムから切除され得る。切除のためのCreリコンビナーゼ又はトランスポザーゼは、プラスミドベクター又はアデノウイルスベクターを使用してiPS細胞に導入され、発現させることができる。テトラサイクリン依存遺伝子誘導を使用する場合、Tetリプレッサータンパク質又は変異Tetリプレッサータンパク質を同時に発現させる。
【実施例】
【００６５】
下記の実施例により、以下、本発明をより詳細に説明するが、それらが本発明の範囲を限定するものであるとは解釈すべきではない。
【実施例１】
【００６６】
実験系としてNanogレポーターを持つマウスを使用した（Okita et al. Nature, Vol.448, pp.313-317, 2007）。このマウスはBACPAC Resourcesより購入したBAC(bacterial artificial chromosome)のNanog遺伝子座にEGFPとピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んで作製した。マウスNanog遺伝子はES細胞や初期胚といった多能性細胞において特異的に発現する遺伝子である。このレポーターが陽性となったマウスiPS細胞はES細胞とほぼ同等の分化能力を持つことがわかっている。このNanogレポーターマウスとFbx15レポーターマウス（Tokuzawa et al. Mol Cell Biol, Vol.23, 2699-2708 (2003)）とを交配させることによりNanogレポーターおよびFbx15レポーターの両方を持つ変異マウスを作製した。
【００６７】
初期化に用いるプラスミドは、pCX-EGFP（大阪大学岡部勝博士より提供されたプラスミド: FEBS Letters, 407, 313-319, 1997）をEcoRIで処理し、EGFPの代わりにOct3/4、Sox2、及びKlf4（全てマウス由来の遺伝子）の翻訳領域を口蹄疫ウイルスの2A配列を介してOct3/4、Klf4、及びSox2の順に繋げたコンストラクトを挿入して作製した(pCX-2A-mOKS；図2)。同様にc-Mycの翻訳領域を挿入したプラスミドを作製した(pCX-c-Myc；図2)。
【００６８】
2A配列とOct3/4、Klf4、及びSox2とを連結したコンストラクトの作製においては、まず、口蹄疫ウイルスの2A配列（配列番号61）、上流制限酵素部位（XbaI及びBglII)、並びに下流制限酵素部位(BspHI、Mfel及びPstI)を含むセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドをアニールし、XbaI及びPstIで消化したpBluscriptII KS (-)ベクターに挿入した（pBS-2A）。次いでOct3/4又はKlf4をコードするマウスcDNAをPCRにより増幅して、翻訳終止コドンをBamHI部位に置換し、各cDNAをpCR2.1内にクローニングした。次いでOct3/4およびKlf4のcDNAを適切な制限酵素を用いてpBS-2Aとライゲートし、pBS-Oct3/4-2AならびにpBS-Klf4-2Aを作製した。次いで適切な制限酵素を用いてインフレームでpBS-Oct3/4-2A内にKlf4-2Aを挿入し、それによりpBS-Oct3/4-2A-Klf4-2Aを作製した。次いで、作製したOct3/4-2A-Klf4-2Aコンストラクトを適切な制限酵素を用いて、インフレームで翻訳終止コドンを有するSox2のcDNAとライゲートした。最後に、生成した2A配列とOct3/4、Klf4、及びSox2とを連結したコンストラクトである、Oct3/4-2A-Klf4-2A-Sox2-STOPコンストラクトをpCX-EGFPのEcoRI部位内に挿入することによりpCX-2A-mOKSを作製した。
【００６９】
前記変異マウスの胎児（受精後13.5日）から線維芽細胞(MEF)を単離した。MEFはNanog遺伝子を発現しないため、EGFPを発現せず、緑色蛍光を示さない。このMEFを、0.1%ゼラチン(Sigma)であらかじめコートした6ウェル培養プレート(Falcon)に、１well当り1.3 x 105個の細胞を播種した。培養液はDMEM/10% FCS (DMEM(ナカライテスク社製)にウシ胎児血清を10%加えたもの)を使用し、MEFを37℃、5%CO2で培養した。翌日、FuGene6 transfection reagent (Roche社製) 4.5 μLをOpti-MEM I Reduced-Serum Medium (Invitrogen社製) 100μLに入れ、室温で5分間静置した。その後、発現ベクター(pCX-2A-mOKS) 1.5 μgを加え、室温で15分静置してからMEFの培養液に加えた。翌日に培地を除去し、別の発現ベクター(pCX-c-Myc) 1.5 μgを上記と同様にFuGene6 transfection reagentで導入した。
【００７０】
翌日に、上記と同様に、培養液を新鮮な培地(DMEM/10% FCS)と交換し、発現ベクター(pCX-2A-mOKS)を導入した。その翌日には培養液をES細胞用培地（DMEM (ナカライテスク社製)に15%ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン(Invitrogen社製)、100 μM 非必須アミノ酸(Invitrogen社製)、100μM 2−メルカプトエタノール(Invitrogen社製)、50 U/mL ペニシリン(Invitrogen社製)と50 mg/mL ストレプトマイシン(Invitrogen社製)を加えたもの）に交換し、発現ベクター(pCX-c-Myc)を上記と同様にFuGene6 transfection reagentで導入した。
【００７１】
翌日に培地をES細胞用培地と交換した。播種より9日目にMEFの培地を除き、PBS 2 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/ 1 mM EDTA (Invitrogen社製)を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったところでES細胞用培地を加えて細胞を懸濁し、あらかじめフィーダー細胞を播いておいた100 mm ディッシュに1x106個（Exp432A）又は2x105個（Exp432B）の細胞を播いた。フィーダー細胞としてマイトマイシンCで処理して細胞分裂を停止したSNL細胞を用いた。
【００７２】
以後、視認可能なコロニーが現れるまで2日ごとにES細胞用培地を新鮮な培地と交換した。17日目ごろにはコロニーの形成が始まり、24日目ごろには完全なコロニーの形成が観察された（図１）。以上のタイムスケジュールを図１及び図３のExp432にまとめる。
【００７３】
得られた細胞は徐々にGFP陽性となり、マウスES細胞と区別がつかない形態を示し（図4の432A-1）、ES細胞の場合と同等のレベルで各種ES細胞マーカーに対し陽性を示し（図5のiPS-432A-1）、アダルトキメラマウスを生じさせた。マウスiPS細胞に特徴的なコロニーの形状並びにGFP陽性の結果及び他の未分化マーカー陽性の結果から、上記の発現ベクターをMEF細胞に導入することにより核初期化が完全に進行してiPS細胞が生成し、そのiPS細胞が増殖して視認可能なコロニーを形成したものと結論された。すなわち、これらの結果から、レトロウイルス若しくはレンチウイルスを用いることなくiPS細胞を作製し得ることが示された。PCR解析では、上記の発現ベクターの宿主ゲノムへの組み込みが検出された（図6のiPS-432A-1）。
【実施例２】
【００７４】
pCX-2A-mOKS及びpCX-c-Mycの宿主ゲノムへの組み込みを回避するために、トランスフェクションのプロトコールを修正した。
実験開始から第1、3、5、及び7日目に、pCX-2A-mOKS及びpCX-c-Mycを一緒にトランスフェクトした(図3のExp440)。その結果、多数のGFP陽性コロニーが得られ、形態学的にES細胞と区別し得ない細胞が生じた（図4の440A-3）。得られた細胞は、ES細胞の場合と同等のレベルでES細胞マーカーを発現した（図5のiPS-440A）。プラスミドDNAのゲノムへの組み込みを調べるために、プラスミドの各部分を増幅し得る16セットのPCRプライマーを設計した（図2、13及び14）。修正したプロトコールによって得られた11個のGFP陽性クローンのうちの9クローンでは、外来性DNAの増幅は観察されなかった（図6）。さらに、サザンブロット解析では、これらのクローンでは外来遺伝子の組み込みは検出されなかった（図11）。小さなプラスミド断片の存在の可能性を厳密に除外することはできないが、以上の結果から、これらのiPS細胞は、宿主ゲノム内へ組み込まれたpCX-2A-mOKS及びpCX-c-Mycプラスミドを有していないことが示された。
【００７５】
組み込みのないiPS細胞が、Nanog-GFP  ES細胞の混入に由来するという可能性を除外するために、SSLP解析を行なった。図3のExp440において、5体の胎児に由来するMEF細胞を使用した。SSLP解析では、これらの5体を区別することができ、組み込みのないiPS細胞の由来を同定した(図12)。この解析はまた、組み込みのないiPS細胞が129S4株に由来するES細胞と異なることを示した（図12）。
【実施例３】
【００７６】
組み込みのないiPS細胞の多分化能を確認するために、実施例２に記載のように得られたiPS細胞をヌードマウスの皮下に移植した。試験に供された全クローン(440A-3、-4、-8および-10)は腫瘍を発生させ、それは三胚葉のすべてに由来する細胞を含む広範な細胞型を含むものであった（図7）。さらに、ICRマウスの胚盤胞に、組み込みのないiPS細胞を注入した。毛色から判断される通り、注入されたすべてのクローン(440A-3、-4、-6、-8、-9および-10)からアダルトキメラを得た（図8）。これらのキメラマウスでは、PCR解析によって導入遺伝子の組み込みは検出されなかった（図9）。PCR解析では、キメラにおいてNanog及びFbx15レポーターの両方が検出された(図9)。ダブルレポーターマウスから組み込みのないiPS細胞が生成したこと、及び本発明者の研究室にはダブルレポーターを有するES細胞を所有していないことと合わせて考えると、これらの結果から、当該キメラは、組み込みのないiPS細胞に由来するものであり、混入したES細胞に由来するものではないことが示された。すなわち、これらの結果から、組み込みのないiPS細胞が多能性を有することが確認された。
得られたキメラマウス71匹およびその子孫を長期観察した結果、4遺伝子（Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc）をレトロウイルスで導入して作製したiPS細胞由来のキメラマウスおよびその子孫では正常マウスと比較して早期から死亡率が上昇していくのに対し、4遺伝子の組み込みのないiPS細胞由来のキメラマウスおよびその子孫は正常マウスと同様の生存曲線を示すことが分かった。
得られたキメラマウスと野生型マウスとを交配させるとF1マウスが得られた。従って、組み込みのないiPS細胞が生殖系列に寄与すること（germline-transmission)が確認された。
【実施例４】
【００７７】
実験系としてヒトの歯髄幹細胞(クローン名; DP31、PCT/JP2008/068320、J.Dent.Res.,87(7):676-681 (2008))を使用した。DP31は、Cell, 131, 861-872 (2007) に記載のように、レンチウイルスを用いて、マウスエコトロピックウイルスレセプターSlc7a1遺伝子を発現させた。この細胞はMSCGM bullet kit (Lonza社製)を用いて培養した。
初期化に用いるプラスミドはpCX-EGFP（大阪大学、岡部勝博士より提供された。FEBS Letters, 407, 313-319, 1997）から、実施例１と同様にして作製した。具体的には、pCX-EGFPをEcoRIで処理し、EGFPの代わりに、SOX2およびKLF4の翻訳領域を口蹄疫ウイルスの2A配列を介して連結したコンストラクトを挿入することによりプラスミドpCX-hSKを作製した。同様にc-Myc、LIN28、Nanogを2A配列を介して連結したプラスミド(pCX-hMLN)、OCT3/4翻訳領域を挿入したプラスミド(pCX-hOCT3/4)、およびSV40 Large T antigenを挿入したプラスミド(pCX-SV40LT)を作製した。
【００７８】
100 mmディッシュで培養したDP31をPBSで洗浄し、0.25% Trypsin/ 1 mM EDTA (Invitrogen社製)を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらMSCGMを加えて細胞を懸濁し、6x105個の細胞を15 mLチューブに回収した。細胞を800 rpmで5 分間遠心し、上清を取り除いた後、Human Dermal Fibroblast Nucleofector Kit (Amaxa社製)を用いて、発現プラスミドを導入した。使用したプラスミドの量はpCX-hOCT3/4が0.5μg、pCX-hSKが1.0μg、pCX-hMLNが1.5μg、pCX-SV40LTが0.5μgである。処理後、細胞は6ウェルプレートに播種した。MSCGMで10日間培養した後、再び細胞をPBSで洗浄し、0.25% Trypsin/ 1 mM EDTA (Invitrogen社製)を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらMSCGMを加えて細胞を懸濁し、1x106個の細胞をあらかじめフィーダー細胞を播いておいた100 mmディッシュに播いた。フィーダー細胞にはマイトマイシンCで処理して、細胞分裂を止めたSNL細胞を用いた。以後コロニーが観察されるようになるまで2日ごとに、培地を新鮮な培地と交換した。使用した培地はそれぞれMSCGMとbFGF（4 ng/mL）を加えた等量の霊長類ES細胞用培地（ReproCELL社製）を混合することにより調製した。コロニー形成は19日後ごろから始まり、ヒトのiPS細胞が樹立されたことが確認された（図15）。
【００７９】
次にヒト胎児HDF (Cell applications, INC社製）に前記のように同じ7種の遺伝子を導入した。導入後、霊長類ES細胞培養用培地(ReproCELL社製)に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO社製）を加えた培地を用いて細胞を培養した。フィーダー細胞にはMSTO細胞を用いた。導入から31日目の細胞（203A-1〜203A-5の5クローン、このうち203A-4はネガティブコントロールとしてピックアップしたもの）の写真を図16に、また2継代目の細胞の写真を図17に示す。203A-1〜203A-3および203A-5クローンは、典型的なES細胞様の形態を示し、ヒトiPS細胞の樹立が確認された。
これらの細胞について、Genomic-PCR解析を行い、導入遺伝子がゲノム上に挿入されているか検討した。結果を図18に示す。いずれのクローンについてもOct3/4(pCX-hOCT3/4)、c-Myc（pCX-hMLN）の組み込みが検出された。203A-4以外のクローンにおいてKlf4（pCX-hSK）の組み込みが検出された。いずれのクローンにおいてもSV40LT（pCX-SV40LT）の組み込みは検出されなかった。
【実施例５】
【００８０】
実施例４で用いた歯髄幹細胞DP31に、実施例４と同じ方法で、SV40 Large T antigenを除く6種類の遺伝子（pCX-hSK、pCX-hMLN、pCX-hOCT3/4）を導入した。導入から35日目の細胞（217A-1〜-4および-6の5クローン）の写真を図19に、また2継代目の細胞の写真を図20に示す。いずれのクローンも典型的なES細胞様の形態を示し、ヒトiPS細胞の樹立が確認された。
これら樹立したヒトiPS細胞クローン（217A-1〜217A-4、217A-6）について、Genomic-PCR解析を行った。結果を図21に示す。いずれのクローンについても導入遺伝子の組み込みが実証された。
【実施例６】
【００８１】
日本人6歳女児由来のHDF細胞株(HDF-120; JCRB)にSlc7a1遺伝子を発現させた。その結果得られた細胞(HDF-120-Slc)に、前記6種の遺伝子およびp53に対するshRNA（shRNA2：配列番号62）を導入した（導入したベクター：pCX-hOCT3/4、pCX-hSK、pCX-hMLN-shp53）。
pCX-hOCT3/4（0.5μg）、pCX-hSK（1.0μg）、pCX-hMLN-shp53（1.5μg）のそれぞれをMicroporator (100μL tip、1600V、10ms、3 times)で6.0x105個のHDF-120-Slcに電気的に導入した。10日後、もう一度同じ条件で各ベクターを電気的に導入し、細胞をMSTO上に播いた（100mmディッシュ）。これらの細胞を、10日目まではDMEM/10% FCSを用いて培養し、その後は霊長類ES細胞培養用培地(ReproCELL社製)に4 ng/mlのリコンビナントヒトbFGF（WAKO社製）を加えた培地を用いて培養した。最初のエレクトロポーレーションから35日目の細胞の写真を図22に、また継代培養後の細胞の写真を図23に示す。典型的なES細胞様の形態を示し、ヒトiPS細胞の樹立が確認された。Genomic-PCR解析の結果、導入遺伝子の組み込みが実証された（図24のレーン279A-2）。
【実施例７】
【００８２】
Nanogレポーターマウス（Okita et al. Nature, Vol.448, pp.313-317, 2007）由来のMEF細胞に、Oct3/4、Klf4、Sox2及びc-Mycの4種の遺伝子を別々に組み込んだ発現ベクター（pCX-Oct4、pCX-Sox2、pCX-Klf4、pCX-c-Myc)を実施例２のプロトコールに従い導入した。
まず、NanogレポーターMEF細胞をゼラチンコートした6ウェルプレート上に播き（1.3x105個/ウェル)、pCX-Oct4（0.37μg）、pCX-Sox2（0.36μg）、pCX-Klf4（0.39μg）、pCX-c-Myc（0.38μg）のそれぞれをFuGene6を用いて1、3、5、および7日目にトランスフェクトした。9日目に、1x106個（1.0)または0.2x106個(0.2)の細胞をMSTO-PH上またはゼラチン上に播き(100mmディッシュ)、25日目にコロニーを選択した。選択後の細胞の写真を図25に示す。マウスiPS細胞に特徴的なコロニーの形状並びにGFP陽性の結果が得られ、マウスiPS細胞の樹立が確認された。樹立したマウスiPS細胞クローン（497A-1〜A-5）について、Genomic-PCR解析を行った。結果を図26に示す。497A-2および497A-5はいずれも、いずれの外来遺伝子の組み込みもないiPS細胞であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の方法により、例えば患者の体細胞から安全性の高い人工多能性幹細胞を作製することができる。この人工多能性幹細胞を分化させることにより得られる細胞（例えば心筋細胞、インスリン産生細胞、神経細胞など）は、心不全、インスリン依存性糖尿病、パーキンソン病や脊髄損傷など多様な疾患に対する幹細胞移植療法に安全に利用することができる。
【００８４】
本発明は、好ましい実施形態に重点をおいて記載されたが、好ましい実施形態が改変され得ることは当業者に明らかである。本発明は、本発明が本明細書中に詳細に記載られたもの以外の方法により実施され得ることを意図する。従って、本発明は、要約及び添付の「特許請求の範囲」の範囲に包含される全ての改変を包含する。
本明細書中に引用される任意の刊行物（特許および特許出願を含む）中に開示される内容は、それらが本明細書中で開示された程度まで、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、米国仮特許出願番号61/071,508、61/136,246、61/136,615および61/193,363を基礎とし、それらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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