(57)【要約】  本明細書では、生体外で増殖させたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を生成するための方法を開示する。本方法は、ヒトドナーから末梢血単核球を含む試料を抽出する工程を含む。抽出された細胞には、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞である所与の数の細胞が含まれる。Ｔｒｅｇ細胞が試料中の細胞の大半を構成するようにＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の相対集団を増強する。この後、第三者由来のＴｒｅｇ細胞を含み得る、濃縮されたＴｒｅｇ細胞の集団を増殖させて移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療に使用するための臨床的に有用な細胞の集団を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体外で増殖させたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減させるための方法において、
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を含む末梢血単核球を含む試料を、ヒトドナーから抽出する工程と、
前記試料中の前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を濃縮することによって、濃縮ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を生成する工程と、
前記濃縮されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の集団を増殖させる工程と、
前記増殖させたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の一部をヒトに投与して移植片対宿主病を治療する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記制御性Ｔ細胞を濃縮する工程が、全血から前記末梢血単核球を分離する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記末梢血単核球を分離する工程が、密度勾配遠心分離を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を濃縮する工程が、抗体を用いて非ＣＤ４細胞を除去することによってＣＤ４＋細胞をネガティブ単離する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を濃縮する工程が、抗ヒトＣＤ２５抗体を用いてＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞をポジティブ単離する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記集団を増殖させる工程が、少なくとも１週間にわたり、かつ３週間未満で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記集団を増殖させる工程が、約２週間にわたり行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を濃縮する工程により、濃縮試料が生成され、該濃縮試料は、前記濃縮試料中の全細胞集団に対してＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が４０％〜７８％であるような濃縮試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記集団を増殖させる工程の後に、前記試料が全細胞集団に対して４０％〜７８％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料中の前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の濃度が、増殖の前後の両方において約１０％の範囲内で等しい、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記濃縮されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、第三者由来のヒトＴｒｅｇ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
生体外で増殖させたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減させるための方法において、
試料中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を濃縮することによって、濃縮ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を生成する工程と、
前記分離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の集団を増殖させる工程であって、前記試料中の前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の純度が、増殖の前後の両方において約１０％の範囲内で等しい、工程と、
前記増殖させたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の一部をヒトに投与して移植片対宿主病を治療する工程と、を含む、方法。
【請求項１３】
前記集団を増殖させる工程が、少なくとも１週間にわたり、かつ３週間未満で行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記集団を増殖させる工程が、約２週間にわたり行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記集団を増殖させる工程が、３０倍の増加以上から３００倍の増加以下の範囲の細胞集団の倍数変化をもたらすだけの充分な期間にわたって行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記倍数変化が、８０倍の増加以上かつ１５０倍の増加以下である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記濃縮されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、第三者由来のヒトＴｒｅｇ細胞を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも４０％がＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞である、複数個の細胞を含む、生体外細胞試料。
【請求項１９】
前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、Ｆｏｘｐ３を発現する、請求項１８に記載の細胞試料。
【請求項２０】
前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、ＣＤ２７、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ４、ＣＤ４９ｄ、及びｉｎｔｅｒｇｒｉｎｐ７を発現する、請求項１９に記載の細胞試料。
【請求項２１】
前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＬＡ、及びＣＤ１０６を発現しない、請求項２０に記載の細胞試料。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本願は、参照により本明細書にその全容を組み込む２００７年１１月３０日出願の同時係属中の米国仮特許出願第６０／９９１，３０１号、及び２００７年１２月５日出願の同第６０／９９２，３４７号に基づく優先権及びその利益を主張するものである。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、一実施形態において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を生体外増殖させるための方法に関する。本方法は、ヒトドナーから末梢血単核球を含む試料を抽出する工程を含む。抽出された細胞には、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞である所与の数の細胞が含まれる。Ｔｒｅｇ細胞が試料中の細胞の大半を構成するようにＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の相対集団を濃縮する。この後、第三者ドナーに由来するＴｒｅｇ細胞を含み得る、濃縮されたＴｒｅｇ細胞の集団を増殖させてＧＶＨＤ（移植片対宿主病）の治療に使用するための臨床的に有用な細胞の集団を得る。
【０００３】
〔発明の背景〕
同種間の造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、血液悪性腫瘍及び遺伝性血液疾患の潜在的に有効な治療法である。臨床的ＨＳＣＴにおける主要な障害かつ致死的な合併症の１つに、活性化したドナーＴ細胞によって宿主の組織が広範に攻撃される移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）がある。低グレードの移植片対宿主効果は、悪性細胞を死滅させるうえで重要な役割を担っていると考えられるが、重篤なＧＶＨＤはＨＳＣＴを受ける患者における死亡例及び発病例の主因となっている。グレードＩＩ〜ＩＶの急性ＧＶＨＤのリスクは、同種幹細胞移植後には７０％に達する。カルシニューリン阻害剤及びステロイドなどの各種の免疫抑制剤がＧＶＨＤのリスクを低減するために広く用いられているが、グレードＩＩ〜ＩＶのＧＶＨＤの患者の５０％以上で現在用いられているこうした治療法では治療効果が得られない。更に、高用量の免疫抑制剤の使用により、免疫再構築が妨げられ、Ｔ細胞により媒介される移植片対白血病（ＧＶＬ）応答が消失する。従来の治療法による治療の高い失敗率のため、代替的なＧＶＨＤの治療法が望まれている。
【０００４】
〔発明の概要〕
本発明は、その一形態において、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の濃縮試料を生成するための方法を含む。本発明の教示に従って単離及び増殖された細胞は、ＧＶＨＤの症状を治療するうえで有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
本発明を付属の図面を参照しつつ開示する。
【図１Ａ】精製の前後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の純度のグラフ。
【図１Ｂ】精製の前後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の純度のグラフ。
【図１Ｃ】精製の前後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の純度のグラフ。
【図１Ｄ】増殖の前後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の純度のグラフ。
【図１Ｅ】増殖の前後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の純度のグラフ。
【図１Ｆ】増殖の前後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の純度のグラフ。
【図２】ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の表現型の特徴を示す複数のグラフを示したもの。
【図３Ａ】長期間の増殖後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の特定の表現型変化を示すグラフ。
【図３Ｂ】長期間の増殖後のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の特定の表現型変化を示すグラフ。
【図４Ａ】ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞のＩｎ  Ｖｉｔｒｏでの抑制活性を示すグラフ。
【図４Ｂ】ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞のＩｎ  Ｖｉｔｒｏでの抑制活性を示すグラフ。
【図４Ｃ】ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞のＩｎ  Ｖｉｔｒｏでの抑制活性を示すグラフ。
【図５】ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＤＴＨ様の局所炎症に対するＴｒｅｇ細胞の影響を示す図。
【図６Ａ】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＧＶＨＤマウスモデルに対するＴｒｅｇ細胞の影響を示す図。
【図６Ｂ】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＧＶＨＤマウスモデルに対するＴｒｅｇ細胞の影響を示す図。
【図６Ｃ】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＧＶＨＤマウスモデルに対するＴｒｅｇ細胞の影響を示す図。
【図６Ｄ】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＧＶＨＤマウスモデルに対するＴｒｅｇ細胞の影響を示す図。
【図６Ｅ】ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ＧＶＨＤマウスモデルに対するＴｒｅｇ細胞の影響を示す図。
【図７Ａ】インビトロの抑制アッセイにおいて、増殖させたヒトＴｒｅｇが、同種ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＴエフェクターＴ細胞の増殖及び自家ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＴエフェクターＴ細胞の増殖の両方を同様に阻害したことを示すグラフ。
【図７Ｂ】インビトロの抑制アッセイにおいて、増殖させたヒトＴｒｅｇが、同種ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＴエフェクターＴ細胞の増殖及び自家ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＴエフェクターＴ細胞の増殖の両方を同様に阻害したことを示すグラフ。
【０００６】
複数の図面を通じて、対応する参照符号は対応する部材を示す。本明細書に述べる実施例は、発明の異なる実施形態を説明するものであって、発明の範囲をいかようにも限定するものとして解釈されるべきではない。
【０００７】
〔詳細な説明〕
一実施形態では、本発明は、ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を健康なドナーから抽出するための方法に関する。Ｔｒｅｇ細胞（即ち、制御性Ｔ細胞）は、免疫系の活性化を抑制することによって自己免疫疾患を防止する細胞である。ＣＤ４及びＣＤ２５は、特定の細胞によって発現され得るタンパク質である。したがって、ＣＤ４＋かつＣＤ２５＋であるＴｒｅｇ細胞はＴｒｅｇ細胞のサブセットである。リンパ球や全血などの未処理の血液試料をドナーから抜き取る。未処理の抽出物を精製してＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の相対集団を濃縮する。濃縮された試料を生体外で増殖させてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞の相対集団を維持しつつ全細胞数を増やす。得られた細胞を患者に投与し、ＧＶＨＤの症状を防止するのに役立てる。
【０００８】
健康なドナーからのヒト末梢血単位は、商業的な血液銀行（commercial blood blanks）から購入するか、従来の技術を用いてドナーから直接得ることができる。最初に末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ（アマシャム社（Amersham））を用いて密度勾配遠心分離によって血液試料から単離する。標準的な単離用キット（例、ミルテニー・バイオテック社（Miltenyi Biotec）（カリフォルニア州オーバーン）より販売されるヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を使用したａｕｔｏＭＡＣＳなど）を製造者の指示に従って使用し、単離されたＰＢＭＣからＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を精製する。例えば、最初に、ヒトＣＢＳ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲＹ／６及びＣＤ２３５ａに対するモノクローナル抗体の混合物によって非ＣＤ４細胞を枯渇させることによってＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＭＢＣからネガティブ単離する。次いで、濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団から、抗ヒトＣＤ２５抗体接合マイクロビーズを用いてヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇをポジティブ単離する。必要に応じて、精製後にフローサイトメトリーによって単離細胞の純度を求めてもよい。
【０００９】
精製したヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇは、組み換えヒトＩＬ−２（ｒｈＩＬ−２、１０００Ｕ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&Dsystems））の存在下、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ  Ｄｙｎａｌｂｅａｄｓ（インビトロジェン（Invitrogen）社）を用い、市販の細胞培養バッグ（ミルテニー・バイオテック社（Miltenyi Biotec）及びＬＩＦＥＣＥＬＬ、バクスター社（Baxter））又は細胞培養プレート中で生体外で活性化及び増殖させる。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇは、１０％熱不活化ヒトＡＢ血清（ロンザ社（Lonza）、メリーランド州）、Ｌ−グルタミン、ＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン、ストレプトマイシン（ギブコ社（Gibco））を添加したＸ−ＶＩＶＯ（商標）１５培地中で培養した。ｒｈＩＬ−２を含む新鮮な培地を週に２〜３回加えた。２週間後、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズをＴｒｅｇから除去し、この後、増殖させたＴｒｅｇを１〜２日間、低濃度のＩＬ−２（５０Ｕ／ｍＬ）を含む培地中でインビトロキャラクタリゼーション及び機能分析を行うまで休ませた。ラパマイシン及び／又はＤＲＢなどの特定の添加物は試料を濃縮し、増殖過程の間に高い純度を維持するうえで有用である。
【００１０】
＜ヒトＴｒｅｇ細胞の生体外増殖の実施例＞
ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを、正常なドナー（ｎ＝１６）の全血構成成分（whole blood units）又はｌｅｕｋｏｐａｋから得たＰＢＭＣから、ａｕｔｏＭＡＣＳ及びヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キットにより精製した。単離したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの純度を細胞内Ｆｏｘｐ３染色により求めた。ＣＤ４陽性細胞は、これらの精製細胞の９０％〜９８％を構成し、その内、平均で５５％がＦｏｘｐ３陽性であった（４０％〜７８％の範囲）（図１Ｂ、１Ｃ）。これらの結果は、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが集団のわずか約１％、又はＣＤ４＋Ｔ細胞の１０％を構成するＰＢＭＣから、ヒトＴｒｅｇが大幅に濃縮され得ることを示すものであった（図１Ａ、１Ｃ）。Ｔｒｅｇの収率はＰＢＭＣの約０．５％であった。試験を行った６人の正常ドナーのｌｅｕｋｏｐａｋ（２〜６×１０９個のＰＢＬ）において、各ドナーから少なくとも１×１０７個のＴｒｅｇを得ることができた。これらの結果は、ＣｌｉｎＭＡＣＳ（ミルテニー・バイオテック社（Miltenyi Biotec）（カリフォルニア州））を用いた大規模な精製においても確認された。有利な点として、増殖期間が約２週間である場合には細胞の全体の組成に対するＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の集団は大きく変化しなかった。機能的な観点からは、増殖させた集団は、治療目的で使用される際に所望の生物学的効果を維持するうえで充分な組成を有することが望ましい。一実施形態では、相対集団は約１０％よりも大きく変化することはない。
【００１１】
次いで、濃縮されたヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを、ｒｈＩＬ２及び１０％の熱不活化ヒト男性ＡＢ血清を含むＸ−ＶＩＶＯ１５（商標）培地中、１／３の比でＣＤ３／２８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｄｅｒビーズを用いて活性化及び増殖させた。小規模な培養プレートでは、ヒトＴｒｅｇは２週間後におよそ１００倍に増殖し、細胞内Ｆｏｘｐ３染色によって測定される純度は維持された（ｎ＝１５、図１Ｄ、１Ｅ）。より大規模な細胞バッグ培養（ｎ＝１０、４バッチの１００ｍＬのＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｔ  ｃｅｌｌ増殖バッグ、及び６バッチの０．３〜３ＬのＬＩＦＥＣＥＬＬ培養バッグ）では、ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇは２〜３週間で１００倍以上に増殖し、これは約１０兆個の細胞に相当した（図１Ｆ）。１４日間増殖させた試料では、これは約３０〜約３００倍の増加の倍数変化を表わす。これらの結果は、大規模な生体外増殖培養によって臨床的に有効な数のヒトＴｒｅｇ細胞を得ることができることを示すものであった。
【００１２】
２週目の増殖ヒトＴｒｅｇの純度を上述したような細胞内Ｆｏｘｐ３染色を用いて評価した。１０個の細胞バッグ培養において、平均で５７．３％のＦｏｘｐ３陽性細胞が得られた（それぞれ、３７％、３９％、４５％、５１．８％、６２％、６５％、６８％、６８％、６８％及び７０％）。更に、これらの細胞では、ＣＤ２７、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ４、ＣＤ４９ｄ、ｉｎｔｅｒｇｒｉｎｐ７の強い発現が認められ、ＯＸ４０、グランザイムＢ、ＣＣＲ７の部分的な発現が認められたが、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＬＡ、ＣＤ１０６については陰性であった（図２）。これらの結果は、生体外増殖させたヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが、ヒトＴｒｅｇの表現型の特徴の多くを維持していることを示すものである。２週間の培養では、これらのマーカーの発現は、Ｆｏｘｐ３＋集団とＦｏｘｐ３−集団との間で有意な差は認められなかった（データは示さず）。しかしながら、３週目の培養では、Ｆｏｘｐ３＋細胞においてＣＤ２７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２５、及びＣＣＲ７が選択的に発現していた。Ｆｏｘｐ３＋細胞では、Ｆｏｘｐ３−細胞と比較してＣＴＬＡ−４、ＨＬＡ−ＤＲの発現も高率で認められた（図３Ａ、３Ｂ）。
【００１３】
＜生体外増殖させたＴｒｅｇがインビトロで能力を維持することを示す実施例＞
生体外増殖させたヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのインビトロでの抑制機能を評価するため、抗原提示細胞として同種樹状細胞（ＤＣ）を生成し、自家のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を応答細胞として用いた。図４Ａ及び４Ｂに示されるように、生体外増殖させたヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇは、ＭＬＲ及びＯＫＴ３−誘導Ｔ細胞増殖アッセイの両方においてインビトロで強い抑制活性を示した。いずれのアッセイにおいても、増殖させたヒトＴｒｅｇは用量依存的にＴ細胞の増殖を阻害した（図４Ａ、Ｂ）。生体外増殖させたヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの大半のバッチでは、両アッセイにおいて、１／１０〜１／２７のＴｒｅｇ／Ｔエフェクター比で５０％よりも高いＴ細胞増殖の阻害率を示した（図４）。更に、増殖させたヒトＴｒｅｇは、ＯＫＴ３アッセイにおいてＩＦＮｙの生成を阻害した（図４Ｃ）。これらの結果は、生体外増殖させたヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇは強力なＩインビトロ抑制活性を維持することを示すものであった。同時に、増殖させたヒトＴｒｅｇ細胞は、自家のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞増殖と比較して、同種ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を同等に阻害する能力を示した（図７Ａ、７Ｂ）。
【００１４】
ヒト樹状細胞（ＤＣ）を、接着細胞又はＰＢＭＣからＣＤ１４ビーズで精製した単核細胞から生成し、１０％ＦＣＳ、組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&Dsystems））及びＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&Dsystems））の存在下、ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。サイトカイン及び培地は１日置きに交換した。５〜６日目にＤＣを収穫してインビトロ抑制アッセイで使用した。
【００１５】
本発明の教示に従って単離した、生体外増殖させたヒトＴｒｅｇのインビトロ抑制活性を、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）及び抗ＣＤ３抗体誘導Ｔ細胞増殖アッセイにおいて測定した。ＭＬＲアッセイでは、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔエフェクター細胞（１×１０５細胞／ウェル）を９６穴Ｕ底プレートで同種ヒト樹状細胞（１×１０４細胞／ウェル）と培養した。
【００１６】
増殖させたヒトＴｒｅｇを連続希釈し、異なるＴｒｅｇ／Ｔエフェクター比で各培養に加え、細胞を６日間培養した。培養の最後の１６時間において、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）を加えた。各プレートの細胞を収穫し、３Ｈ−チミジンの取り込み率をＴｏｐｃｏｕｎｔ（パーキンエルマー社（Perkin Elmer））によりカウントした。３重の培養の１分当たりの平均のカウント数（ｃｐｍ）及び標準偏差を計算した。増殖の阻害率（％）を次のように計算した。阻害率（％）＝［（応答細胞のｃｐｍ−応答Ｔｒｅｇのｃｐｍ）／（応答細胞のｃｐｍ）］×１００
【００１７】
抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、エビオサイエンス社（Ebioscience））誘導Ｔ細胞増殖アッセイ（ＯＫＴ３アッセイ）では、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞及び同種ＤＣを抗ヒトＣＤ３抗体（１μｇ／ｍＬ、ＯＫＴ３）の存在下、９６穴プレートで培養した。増殖させたヒトＴｒｅｇを連続希釈し、異なるＴｒｅｇ／Ｔエフェクター比で各培養に加え、細胞を４日間培養した。抑制活性の読み取り値及び計算値は、ＭＬＲアッセイにおけるものと同様であった。
【００１８】
＜ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける異種ＧＶＨＤ治療の実施例＞
生体外増殖させたヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇのインビボ活性を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病／重度複合免疫不全症）マウスでヒトＰＢＬにより誘導した異種ＧＶＨＤのモデルにおいて更に評価した。異種ＧＶＨＤは、調整したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにヒトＰＢＬを脾臓内注射することによって誘導した。図６Ａ〜６Ｃに示されるように、ヒトＰＢＬの移植後、レシピエントＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、例えば曲がった背中、下痢及び体重の減少といったＧＶＨＤ様の症状を呈し、マウスは通常４週間以内に死亡した。
【００１９】
生体外増殖させたＴｒｅｇを、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脾臓にＰＢＬと同時移植した場合、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存率は大幅に向上した（図６Ａ）。増殖させたＴｒｅｇとともにヒトＰＢＬを投与した８頭のマウスの内、１ヶ月以内に死亡したのが１匹のみであったに対して、ヒトＰＢＬのみを投与した６頭のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの内、５匹が１ヶ月以内に死亡した。同時に、生体外増殖させたヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３  Ｔｒｅｇは更に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて曲がった背中及び体重減少といったＧＶＨＤの症状を大幅に低減させた（図６Ｂ、６Ｃ）。更に、増殖させたヒトＴｒｅｇは、ｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてヒトＩｇＧ及びＩｇＭの血清レベルを阻害した。ヒト細胞の注射の２週間後、増殖させたヒトＴｒｅｇを同時移植したｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ  ７）の血清中におけるヒトＩｇＧ及びＩｇＭの平均濃度が、それぞれ６３．０４ｐｇ／ｍＬ及び４．５４８ｐｇ／ｍＬであったのに対して、ヒトＴｒｅｇを移植しないｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ  ５）では１１６３ｐｇ／ｍＬ及び１６．３９８ｐｇ／ｍＬであった（図６Ｄ、６Ｅ）。この結果は、増殖させたＴｒｅｇがヒトＢ細胞の活性化及び増殖を阻害したことを示唆するものである。同時に、この実験では、増殖させたヒトＴｒｅｇ及びＰＢＬは異なるドナーに由来するものを使用したが、このことは、第三者に由来するヒトＴｒｅｇがｈｕ−ＰＢＬ−ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルにおいてＧＶＨＤを防止したことを示唆するものである。
【００２０】
ＯＫＴ３により活性化した正常なドナーのＰＢＭＣをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右耳に皮下注射することによってＤＴＨ（遅延型過敏症）様の局所炎症を誘導した。ＤＴＨの強度を、細胞移植の２４時間後に測定した耳の厚さによって判定した。図５に示されるように、ＯＫＴ３で活性化した正常ドナーのＰＢＭＣは、同量のＰＢＳを投与したネガティブコントロールの耳と比較して顕著なＤＴＨを誘導した。生体外増殖させたヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ（ＰＢＭＣとは異なるドナーに由来するもの）を１／２のＴｒｅｇ／ＰＢＭＣ比で、活性化させた正常ドナーＰＢＭＣとともに同時注射すると、増殖させたヒトＴｒｅｇは、ＯＫＴ３で活性化したＰＢＭＣによって誘導される耳の腫れを顕著に阻害した（図５）。しかしながら、同量の増殖させない非Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞）を、活性化したＰＢＭＣと同時注射した場合には耳の腫れを阻害しなかった。この結果は、生体外で増殖させたヒトＴｒｅｇが養子移植による局所的ＤＴＨ反応を阻害したことを示すものであり、増殖させたＴｒｅｇが局所的な組織環境においてその免疫抑制活性を維持していることを示すものである。
【００２１】
ヒトＰＢＭＣをＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに養子移植することによって誘導したＤＴＨ（反応）を、Ｘｕらによる報告（１９）に基づいた改変プロトコールによって発展させた。簡単に述べると、ヒトＰＢＭＣ（１×１０７細胞）を、生体外増殖させたヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ（５×１０６細胞）の存在下又は非存在下で抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、マウス１頭当たり１０μｇ、エビオサイエンス社（Ebioscience））と混合し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右耳に２５μＬの最終容量で皮下（ｓ．ｃ．）注射した。同じ容量のＰＢＳを同じマウスの左耳に内部コントロールとして注射した。養子移植されたヒトＰＢＬの活性化によって誘導されるＤＴＨ様の局所炎症である耳の腫れを、Ｓｅｒｉｅｓ１０１０  Ｓｔａｒｒｅｔｔ  カリパーにより細胞注射の２４時間後に測定した。細胞注射の前に測定した耳の厚さを基準コントロールとして用いた。
【００２２】
ヒト細胞を移植する１日前に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに放射線を照射した（３００ｒａｄのγ線放射）。この後、マウスに２０μＬの抗アシアロＧＭＩ抗体（和光純薬工業、日本・大阪）を、ヒト細胞の移植後−１、７、１４、及び２１日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。健康な正常ドナーから得たヒトＰＢＬ（１×１０７細胞／マウス）を単独で、又は生体外増殖させたヒトＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ（１×１０７細胞／マウス）と混合して、調整したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脾臓に注射するか、調整したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに静脈内注射した。ヒト細胞の脾臓内移植の詳細な手順については、デプラテレ（Depraetere）Ｓらにより以前に述べられている（Depraetere S et al. J. lmmunol. 2001:166:2929-2936）。マウスの生存率、並びに曲がった背中、下痢、及び体重といったＧＶＨＤの症状を毎日観測した。細胞の移植後、キメラＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスから血漿を毎週回収し、ＥＬＩＳＡキット（アルファ・ダイアグノスティック・インターナショナル（Alpha Diagnostic International）テキサス州）を用いてヒトＩｇＧ及びＩｇＭレベルを求めた。
【００２３】
以上、本発明を特定の実施形態に照らして説明したが、当業者であれば、発明の範囲を逸脱することなく、特定の状況に適合するように様々な変更を行うことが可能であり、発明の要素を均等物に置き換えることが可能であることは理解されるであろう。したがって、本発明は、本発明を実施するうえで考えられる最良の態様として開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、付属の請求項の範囲及び趣旨に包含されるすべての実施形態を含むものである。
【００２４】
〔実施の態様〕
（１）  生体外で増殖させたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減させるための方法において、
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を含む末梢血単核球を含む試料を、ヒトドナーから抽出する工程と、
前記試料中の前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を濃縮することによって、濃縮ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を生成する工程と、
前記濃縮されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の集団を増殖させる工程と、
前記増殖させたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の一部をヒトに投与して移植片対宿主病を治療する工程と、を含む、方法。
（２）  前記制御性Ｔ細胞を濃縮する工程が、全血から前記末梢血単核球を分離する工程を含む、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記末梢血単核球を分離する工程が、密度勾配遠心分離を含む、実施態様２に記載の方法。
（４）  前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を濃縮する工程が、抗体を用いて非ＣＤ４細胞を除去することによってＣＤ４＋細胞をネガティブ単離する工程を含む、実施態様１に記載の方法。
（５）  前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を濃縮する工程が、抗ヒトＣＤ２５抗体を用いてＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞をポジティブ単離する工程を含む、実施態様４に記載の方法。
（６）  前記集団を増殖させる工程が、少なくとも１週間にわたり、かつ３週間未満で行われる、実施態様１に記載の方法。
（７）  前記集団を増殖させる工程が、約２週間にわたり行われる、実施態様６に記載の方法。
（８）  前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を濃縮する工程により、濃縮試料が生成され、該濃縮試料は、前記濃縮試料中の全細胞集団に対してＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が４０％〜７８％であるような濃縮試料である、実施態様１に記載の方法。
（９）  前記集団を増殖させる工程の後に、前記試料が全細胞集団に対して４０％〜７８％のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を含む、実施態様８に記載の方法。
（１０）  前記試料中の前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の濃度が、増殖の前後の両方において約１０％の範囲内で等しい、実施態様８に記載の方法。
【００２５】
（１１）  前記濃縮されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、第三者由来のヒトＴｒｅｇ細胞を含む、実施態様１に記載の方法。
（１２）  生体外で増殖させたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を用いて移植片対宿主病の影響を低減させるための方法において、
試料中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を濃縮することによって、濃縮ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を生成する工程と、
前記分離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の集団を増殖させる工程であって、前記試料中の前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の純度が、増殖の前後の両方において約１０％の範囲内で等しい、工程と、
前記増殖させたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の一部をヒトに投与して移植片対宿主病を治療する工程と、を含む、方法。
（１３）  前記集団を増殖させる工程が、少なくとも１週間にわたり、かつ３週間未満で行われる、実施態様１２に記載の方法。
（１４）  前記集団を増殖させる工程が、約２週間にわたり行われる、実施態様１３に記載の方法。
（１５）  前記集団を増殖させる工程が、３０倍の増加以上から３００倍の増加以下の範囲の細胞集団の倍数変化をもたらすだけの充分な期間にわたって行われる、実施態様１２に記載の方法。
（１６）  前記倍数変化が、８０倍の増加以上かつ１５０倍の増加以下である、実施態様１５に記載の方法。
（１７）  前記濃縮されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、第三者由来のヒトＴｒｅｇ細胞を含む、実施態様１２に記載の方法。
（１８）  少なくとも４０％がＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞である、複数個の細胞を含む、生体外細胞試料。
（１９）  前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、Ｆｏｘｐ３を発現する、実施態様１８に記載の細胞試料。
（２０）  前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、ＣＤ２７、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ３９、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ４、ＣＤ４９ｄ、及びｉｎｔｅｒｇｒｉｎｐ７を発現する、実施態様１９に記載の細胞試料。
【００２６】
（２１）  前記ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞が、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＬＡ、及びＣＤ１０６を発現しない、実施態様２０に記載の細胞試料。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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