(57)【要約】本発明は細胞培養技術の分野に関する。Ｍｕｎｃ１８ｃ、Ｓｌｙ１又はＳＭタンパク質ファミリーの他のメンバーの異種発現により、真核細胞においてタンパク質の分泌輸送を増強するための新規方法を記載する。この方法は、組換えタンパク質産物の発現及び製造のための増強した産生能力を伴う最適化された宿主細胞系の生成のために特に有用である。
2011505850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の異種タンパク質を細胞中で産生させる方法であって、
ａ）ＳＥＣ１／Ｍｕｎｃ１８群のタンパク質（ＳＭタンパク質）からのタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させること、及び
ｂ）目的の異種タンパク質の発現に影響をもたらすこと
を含む方法。
【請求項２】
工程ｂ）において、目的の異種タンパク質の発現を増加させ、好ましくは工程ｂ）において、目的の異種タンパク質の分泌を増加させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）における１つの遺伝子が、３つのＭｕｎｃ１８アイソフォーム、Ｍｕｎｃ１８ａ、ｂ又はｃの１つ、好ましくはＭｕｎｃ１８ｃ（配列番号３９）をコードする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）における１つの遺伝子が、Ｓｌｙ−１（配列番号４１）をコードする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）がＳＭタンパク質をコードする少なくとも２つの遺伝子の発現を増加させることを含み、ＳＭタンパク質が小胞輸送の２つの異なる工程に関与する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
ａ）１つの遺伝子がＳＭタンパク質をコードし、それが小胞と細胞膜との融合を調節し、
ｂ）第２の遺伝子がＳＭタンパク質をコードし、それが小胞とゴルジ複合体との融合を調節する、
請求項５記載の方法。
【請求項７】
Ｍｕｎｃ１８ｃ（配列番号３９）及びＳｌｙ−１（配列番号４１）の発現が、増加される、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）が、
ｉ）ＳＭタンパク質ファミリーのメンバーをコードする第１の遺伝子の発現を増加させること、
ｉｉ）ＳＭタンパク質ファミリーの別のメンバーをコードする第２の遺伝子の発現を増加させること、及び
ｉｉｉ）ＸＢＰ−１をコードする第３の遺伝子の発現を増加させること
を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項９】
Ｍｕｎｃ１８ｃ（配列番号３９）、Ｓｌｙ−１（配列番号４１）及びＸＢＰ−１（配列番号４３）の発現が、増加される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ａ）細胞中に、１つ又は複数のベクターシステム（少なくとも２つのポリペプチドをコードする核酸配列を含み、
ｉ）少なくとも１つの第１の核酸配列がＳＭタンパク質をコードし、及び
ｉｉ）第２の核酸配列が目的のタンパク質をコードする）を導入すること、
ｂ）目的のタンパク質及び少なくとも１つのＳＭタンパク質を発現させること
を含む、細胞を操作する方法。
【請求項１１】
ＳＭタンパク質が、Ｍｕｎｃ−１８アイソフォームのいずれか１つ、好ましくはＭｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）又はＳｌｙ−１（配列番号４１）である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
工程ａ）ｉ）において、２つのＳＭタンパク質が組み合わせで使用され、ＳＭタンパク質が小胞輸送の２つの異なる工程に関与する、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
ａ）１つの遺伝子がＳＭタンパク質をコードし、それが小胞と細胞膜との融合を調節し、
ｂ）第２の遺伝子がＳＭタンパク質をコードし、それが小胞とゴルジ複合体との融合を調節すること
を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
組み合わせで使用される２つのＳＭタンパク質が、Ｍｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）及びＳｌｙ−１（配列番号４１）である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
工程ａ）ｉ）において、２つのＳＭタンパク質がＸＢＰ−１との組み合わせで使用される、請求項１０又は１２記載の方法。
【請求項１６】
ＳＭタンパク質が、ＸＢＰ−１（配列番号４３）と組み合わせたＭｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）及びＳｌｙ−１（配列番号４１）である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
細胞が、真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
目的のタンパク質が、治療用タンパク質である、請求項１〜１７記載の方法。
【請求項１９】
目的のタンパク質が、抗体又は抗体フラグメントである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ａ）少なくとも１つのポリペプチドがＳＭタンパク質であり、及び
ｂ）第２のポリペプチドが目的のタンパク質である、
少なくとも２つのポリペプチドをコードする発現ユニットを含む発現ベクター。
【請求項２１】
目的のタンパク質が、治療用タンパク質、好ましくは抗体又は抗体フラグメントである、請求項２０記載の発現ベクター。
【請求項２２】
発現ユニットが、マルチシストロン、好ましくはバイシストロンである、請求項２０又は２１記載の発現ベクター。
【請求項２３】
ＳＭタンパク質が、Ｍｕｎｃ−１８アイソフォームＭｕｎｃ  ａ、ｂ、ｃの１つ、好ましくはＭｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）である、請求項２０〜２２記載の発現ベクター。
【請求項２４】
ＳＭタンパク質が、Ｓｌｙ−１（配列番号４１）である、請求項２０〜２２記載の発現ベクター。
【請求項２５】
少なくとも２つのＳＭタンパク質が、組み合わせて使用される、請求項２０〜２４記載の発現ベクター。
【請求項２６】
ベクターが、少なくとも１つのバイシストロン発現ユニット（以下：
ａ）ＳＭタンパク質をコードする遺伝子、
ｂ）ＩＲＥＳエレメント、及び
ｃ）ＳＭタンパク質をコードする第２の遺伝子
の通りに配置される）を含む、請求項２５記載の発現ベクター。
【請求項２７】
少なくとも２つのＳＭタンパク質がＸＢＰ−１と組み合わせて、好ましくはＭｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）及びＳｌｙ−１（配列番号４１）がＸＢＰ−１（配列番号４３）と組み合わせて使用される、請求項２０〜２６記載の発現ベクター。
【請求項２８】
少なくとも２つの異種遺伝子：
ａ）ＳＭタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子及び
ｂ）目的のタンパク質をコードする別の遺伝子
を発現する細胞。
【請求項２９】
目的のタンパク質が、治療用タンパク質、好ましくは抗体又は抗体フラグメントである、請求項２８記載の細胞。
【請求項３０】
ＳＭタンパク質の発現レベルが、内因性レベルを有意に、好ましくは１０%上回る、請求項２８又は２９記載の細胞。
【請求項３１】
請求項２０〜２７記載の発現ベクターのいずれかを含む、請求項２８〜３０のいずれか一項記載の細胞。
【請求項３２】
細胞が、真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞である、請求項２８〜３１のいずれか一項記載の細胞。
【請求項３３】
細胞が、ＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ  ＤＧ４４細胞である、請求項３２記載の細胞。
【請求項３４】
目的のタンパク質、好ましくは、請求項１〜１９記載の方法のいずれかにより産生される抗体。
【請求項３５】
１つ又はいくつかのＳＭタンパク質の活性又は発現をブロック又は低下させるために有用な化合物及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項３６】
化合物が、ポリヌクレオチド配列である、請求項３５記載の医薬組成物。
【請求項３７】
ポリヌクレオチド配列が、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ、好ましくはｓｈＲＮＡである、請求項３６記載の医薬組成物。
【請求項３８】
ＳＭタンパク質が、Ｍｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）もしくはＳｌｙ−１（配列番号４１）又は２つの組み合わせである、請求項３５〜３７記載の医薬組成物。
【請求項３９】
ａ）少なくとも１つのＳＭタンパク質、好ましくはＭｕｎｃ−１８ｃを提供すること、
ｂ）工程ａ）のＳＭタンパク質をテスト薬剤と接触させること、
ｃ）タンパク質分泌又は細胞表面タンパク質の発現の増加又は減少に関連する効果を判断すること
を含む、ＳＭタンパク質機能のモジュレーターを同定するための方法。
【請求項４０】
癌、自己免疫疾患及び炎症の処置のための方法であって、それを必要とする患者に治療的有効量の請求項３５〜３８記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項４１】
細胞を請求項３５〜３８記載の医薬組成物と接触させることを含む、細胞の増殖又は移動を阻害又は低下させる方法。
【請求項４２】
目的のタンパク質の分泌及び／又は産生を増加させるための、ＳＭタンパク質又はＳＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドのインビトロ細胞又は組織培養システムでの使用。
【請求項４３】
請求項１〜４２記載の方法、発現ベクター、細胞又は医薬組成物のいずれかの診断的使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は細胞培養技術の分野に関する。タンパク質を産生するための方法ならびに生物製剤の製造のための新規の発現ベクター及び宿主細胞を生成するための方法に関する。本発明は、さらに、医薬組成物及び処置の方法に関する。
【０００２】
背景
ヒト治療における使用のための生物製剤の市場は、高速で成長し続けており、２７０の新たな生物製剤が臨床試験において評価されており、推定売上高は２００３年に３００億である。生物製剤は、種々の宿主細胞系（細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び哺乳動物細胞（ヒト由来細胞株を含む）を含む）から産生できる。現在、ますます多くの生物製剤が、ヒトタンパク質を正確にプロセシングし修飾するそれらの能力のため、真核生物細胞から産生される。これらの細胞からの生物製剤の成功した高収率の産生は、従って、極めて重要であり、プロセスにおいて使用する組換えモノクローナル細胞株の特徴に高度に依存する。従って、改善した特性を伴う新たな宿主細胞系を生成し、高収率プロセスのための基礎としての高い特異的な産生性を伴う産生細胞株を培養するための方法を確立する緊急の必要性が存在する。
【０００３】
任意の生物製剤の産生プロセスでの収率は、産生細胞が、プロセス条件下で成長された場合に、時間当たりで分泌するタンパク質産物の量に大きく依存する。多くの複雑な生物化学的な細胞内プロセスが、真核細胞から治療用タンパク質を合成及び分泌するために必要である。全てのこれらの工程、例えば転写、ＲＮＡ輸送、翻訳、翻訳後修飾、及びタンパク質輸送は、野生型宿主細胞株において厳重に調節されており、この宿主に由来する任意の産生細胞株の特異的な産生性に影響を及ぼしうる。
【０００４】
過去に、大半の操作アプローチでは、プロセス、例えば転写及び翻訳などを促し、タンパク質産生におけるこれらの工程の収率を増加させる分子ネットワークに焦点が合わされてきた。しかし、任意の複数工程の産生プロセスについて、プロセス鎖の初期工程中にボトルネックを広げることによって、恐らくは、さらなる下流、特に分泌経路中の翻訳後にボトルネックが作られる。特定の閾値まで、産生細胞の特異的な産生性が、産物遺伝子の転写レベルと直線的に相関することが報告されている。
【０００５】
ｍＲＮＡレベルでの産物発現のさらなる増強は、しかし、タンパク質合成、折り畳み又は輸送機構の過負荷を導き、タンパク質産物の細胞内蓄積をもたらしうる。実際に、これは現在の製造プロセスにおいて頻繁に観察できる。従って、産生細胞株の分泌輸送機構は、新規の宿主細胞操作戦略のための興味深い標的である。
【０００６】
分泌された治療用タンパク質の細胞内輸送の操作に関する最初の試験は、分子シャペロン様結合タンパク質ＢｉＰ／ＧＲＰ７８及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）の過剰発現の周辺に集中した。シャペロンは、小胞体（ＥＲ）内に宿る細胞タンパク質であり、新たに合成されたタンパク質の折り畳み及び組み立てを補助する。しかし、予測されうることと対照的に、哺乳動物細胞中でのＢｉＰ過剰発現は、それが関連するタンパク質の分泌を増加させるよりむしろ低下させることが示されており、ＣＨＯ細胞中でのＰＤＩの過剰発現は、様々なタンパク質産物を用いて矛盾する結果を生んだ。これらの驚くべき知見の可能な説明（細胞のタンパク質折り畳み能力の増加によって、さらに下流に産生ボトルネックが作られる）は、ＣＨＯ細胞株におけるＩＦＮガンマ産生でのＥＲからシス−ゴルジ輸送問題を記載する報告により裏付けられる（Hooker et al., 1999）。
【０００７】
要約すると、組換えタンパク質産生のための宿主細胞の分泌能力を改善するための必要性が存在する。これは、翻訳後のボトルネック及びタンパク質産物の細胞内蓄積を妨げるために、新規の転写増強技術との組み合わせで、高力価プロセスにおいてさらにより重要になりうる。しかし、現在、分泌輸送機構の標的操作への方法において２つの主要なハードル：基礎にある調節機構に関する依然として限定された知識、及び分泌プロセス中のさらに下流の工程へのボトルネックのシフトを妨げるための課題、が存在する。
【０００８】
発明の概要
本発明では、Ｓｅｃ１／Ｍｕｎｃ１８（ＳＭ）タンパク質ファミリーのメンバー、特に２つのメンバー、即ちＭｕｎｃ−１８ｃ及びＳｌｙ１の、分泌タンパク質の細胞表面への輸送におけるいくつかの続く工程を一体化して促進させ、分泌小胞と細胞膜との融合を調節することによる全エキソサイトーシスを刺激する際の新規の驚くべき役割を記載する。本発明は、また、真核細胞から分泌経路を介して輸送されるタンパク質の産生を効率的に改善させるための方法を提供する。さらに、疾患及び炎症状態の処置のための分泌経路の標的操作の使用を記載する。
【０００９】
タンパク質分泌は複雑な複数工程の機構である：細胞外空間又は細胞膜外へ輸送される運命にあるタンパク質は、最初に、翻訳と同時に、小胞体中へ輸入される。そこから、それらは脂質小胞中に充てんされ、ゴルジ装置へ、そして最後にトランスゴルジネットワークから細胞膜へ輸送され、そこで培養液中に放出される。
【００１０】
各輸送工程で、小胞及び標的膜の両方からのＳＮＡＲＥ［可溶性ＮＳＦ（Ｎ−エチルマレイミド感受性因子）付着受容体］タンパク質が、融合が起こるために必要とされるコア機構を構成するトランスＳＮＡＲＥ複合体を形成する。種々の状況における生理学的な必要条件を満たすために、ＳＮＡＲＥ媒介性の融合機構は、細胞内及び細胞外の両方の供給源からの刺激が適切に組込まれるように、空間的及び時間的に調節可能でなければならない。
【００１１】
Ｓｅｃ１／Ｍｕｎｃ１８（ＳＭ）タンパク質は、ＳＮＡＲＥタンパク質の調節へのカギを握ると思われる。２つのＳＭタンパク質、Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８（ａ、ｂ及びｃ、３つのアイソフォームを含む）が、分泌経路（ＥＲ−ゴルジ−細胞膜）に沿った小胞融合に関与する。Ｓｌｙ１が小胞体（ＥＲ）由来ＣＯＰＩＩ小胞のゴルジ装置への融合に、Ｍｕｎｃ１８が分泌小胞の細胞膜（ＰＭ）への融合に必要とされる。
【００１２】
本発明において、本発明者らは分泌経路に及ぼすＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃの生理学的影響を分析し、２つのＳＭタンパク質が全エキソサイトーシスを一致して刺激することを初めて見出した。Ｍｕｎｃ１８ｃ及びＳｌｙ１による活性化の役割の分子機構も保存されている可能性が高い。ここでの知見に基づき、本発明者らは、哺乳動物細胞において分泌増強をもたらすＳＭタンパク質ベースの分泌操作の先駆者となった。ＳＭタンパク質ベースの分泌操作は、代謝操作の新規戦略を表わし、工業におけるタンパク質医薬品の製造のための新たなプラットフォームを提供する。
【００１３】
本発明において記載する方法は、いくつかの点で有利である：第１に、本発明者らは、Ｍｕｎｃ−１８ｃ、Ｓｌｙ−１又は両方のタンパク質の一緒での異種発現が、宿主細胞の分泌能力を増加させることにより組換えタンパク質産生を増強するための戦略であることを実証する。
【００１４】
工業的用途に関して、試験によって、分泌経路中で翻訳後にその作用を発揮するトランスジーンの導入を通じた遺伝子操作によりこのボトルネックを迂回するための既存の展望が開かれた。これは特に関連するように見える。なぜなら、最新世代の高度に効率的な発現ベクターの使用は、産生細胞株内でのタンパク質の折り畳み、修飾及び輸送機構の過負荷を導き、そのためその理論上の最高生産性が低下しうるからである。ＳＭファミリー、例えばＭｕｎｃ１８及び／又はＳｌｙ１などの分泌増強タンパク質の異種導入によって、この限界を克服できる。
【００１５】
第２に、ＳＭタンパク質は進化的に酵母からヒトまで保存されている：酵母では、４つのＳＭタンパク質（Ｓｅｃ１ｐ、Ｓｌｙ１ｐ、Ｖｐｓ３３ｐ及びＶｐｓ４５ｐ）、ショウジョウバエでは３つ（ＲＯＰ、Ｓｌｙ１及びＶｐｓ３３／カーネーション）、寄生虫では６つ（Ｕｎｃ−１８ならびにゲノム配列データベースに従った５つの他の遺伝子）ならびに脊椎動物では７つのタンパク質（Ｍｕｎｃ１８−１、−２及び−３、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ３３−Ａ及び−ＢならびにＳｌｙ１）が存在する。種にわたる高度の保存性の観点から、ＳＭタンパク質を使用し、酵母から、寄生虫及び昆虫細胞を越えて、哺乳動物系までの全ての真核生物の宿主細胞種においてタンパク質の分泌及び細胞表面発現をモジュレートできる可能性が非常に高いと思われる。
【００１６】
第３に、ＳＭタンパク質ファミリーの全てのメンバーが、配列全体にわたり高度の配列類似性を示し、それらが同様の全構造を呈することを示唆する。さらに、機能喪失型の突然変異が、４つの種における９つのＳＭ遺伝子について記載されており、全てが小胞輸送及び融合の重度障害を導き、ＳＭタンパク質が小胞輸送及び分泌のプロセスにおいて同様の中心的な役割を果たすはずであることを示す。本発明者らは、従って、本発明に記載する目的のためのＭｕｎｃ１８及び／又はＳｌｙ１の適用性を、ＳＭタンパク質ファミリーの任意の他のメンバーに等しく移すことができることを主張する。
【００１７】
第４に、ＳＮＡＲＥ媒介性の小胞融合機構をモジュレートすることにより、ＳＭタンパク質ファミリーのメンバーが、ＥＲからゴルジ、ゴルジから細胞膜への小胞輸送の全ての様々な工程及び最終のエキソサイトーシス融合に関与する。このように、分泌輸送鎖の続く工程に関与する複数のＳＭタンパク質の異種発現は、膜貫通タンパク質の全エキソサイトーシス又は細胞表面発現に対する相加効果又はさらには相乗効果を生む潜在力を有する。さらに、転写因子ＸＢＰ−１の異種同時発現によるタンパク質輸送の開始点としてのＥＲの同時操作によって、さらに、この分泌増強効果が増加する。
【００１８】
第５の利点として、ＳＭタンパク質は、また、分泌経路のまさに最後の工程、即ち、細胞膜への小胞輸送に影響を及ぼし、そしてそれにより、さらに下流にボトルネックを作るリスクなしにタンパク質分泌を促進する。
【００１９】
まとめると、ＥＲからゴルジへ、及び、ゴルジ装置から細胞膜への小胞媒介性のタンパク質輸送の全ての工程におけるＳＭタンパク質の関与によって、Ｍｕｎｃ１８ｃ、Ｓｌｙ１及び他の全てのＳＭファミリータンパク質が、真核細胞の分泌能力を増強することを目指した（複数の）遺伝子操作アプローチのための非常に魅力的で有望な標的となる。
【００２０】
本発明に記載される小胞媒介性のタンパク質輸送の標的操作を、広範な用途のために使用できる。特に、２つの基本的アプローチ：
（ｉ）細胞の分泌輸送能力を増加させるためのＳＭタンパク質の過剰発現及び／又は活性増強、又は
（ｉｉ）癌細胞の増殖及び／又は浸潤を低下させるための遺伝子治療の手段としてのＳＭタンパク質の活性及び／又は発現の低下
を識別できる。
【００２１】
ＳＭタンパク質の過剰発現の適用性：
記載した発明には、細胞の全タンパク質分泌能力を、ＳＭファミリーのタンパク質の過剰発現により改善させることによる、異種タンパク質の産生のための改善された真核生物の宿主細胞を生成するための方法が記載されている。
【００２２】
これによって、真核細胞に基づく産生プロセスにおいてタンパク質の収率を増加させることが可能になる。それにより、そのようなプロセスでの商品のコストが低下し、同時に、治療用タンパク質の研究試験、診断、臨床試験又は市場供給のために必要とされる材料を生成するために産生される必要があるバッチ数が低下する。本発明は、さらに、薬物開発をスピードアップさせる。なぜなら、しばしば、前臨床試験のための十分量の材料の生成が、時系列に関する決定的なワークパッケージであるからである。
【００２３】
本発明を使用し、診断目的、研究目的（標的同定、リード同定、リード最適化）、又は市場もしくは臨床開発のいずれかにおける治療用タンパク質の製造のいずれかのための１つ又はいくつかの特定タンパク質の産生のために使用される全ての真核細胞のタンパク質産生能力を増加できる。
【００２４】
本願に示す通り、ＳＭタンパク質の異種発現は、全てのクラスのタンパク質（分泌酵素、成長因子及び抗体を含む）の産生増加を導く。膜貫通タンパク質は、ＳＭタンパク質及びＳＮＡＲＥの相互作用により調節される同じ小胞媒介性の輸送経路を共用するため、この操作アプローチは、膜貫通タンパク質の輸送を改善させ、細胞表面上でのそれらの存在量を増強するために等しく適用可能である。
【００２５】
従って、本明細書に記載の方法は、また、細胞表面受容体の機能を特徴付けることを目指した学術的及び工業的な研究目的のために使用できる。例えば、表面タンパク質の産生ならびに続く精製、結晶化及び／又は分析のために使用することができる。さらに、記載の方法により生成される膜貫通タンパク質又はこれらのタンパク質を発現する細胞を、スクリーニングアッセイ、例えば、物質のスクリーニング、オーファン受容体のリガンドの同定、又はリード最適化中での有効性改善の探求のために使用することができる。これは、新たなヒト薬物療法の開発のために決定的に重要である。なぜなら、細胞表面受容体は主なクラスの薬物標的であるからである。
【００２６】
さらに、本明細書に記載の方法は、細胞表面受容体と関連する細胞内シグナル伝達複合体の試験、又は、同じもしくは別の細胞上での可溶性成長因子とそれらの対応する受容体との相互作用により部分的に媒介される細胞間コミュニケーションの分析のために有利でありうる。
【００２７】
ＳＭタンパク質の発現及び／又は活性を減少／阻害する適用性：
本発明において、本発明者らは、ＳＭ発現の低下が、可溶性の細胞外タンパク質（Ｍｕｎｃ１８ｃ及びＳｌｙ１について示す）の分泌低下を導くとの証拠を提供する。これによって、ＳＭタンパク質は治療操作のための魅力的な標的となる。
【００２８】
正常な健康細胞から癌細胞への変換における顕著な特徴の１つは、外因性成長因子の存在からの非依存性の獲得である。正常細胞とは対照的に、腫瘍細胞は、それらの生存及び増殖のために必要な全ての成長因子をそれ自体により産生することができる。このオートクライン機構に加えて、癌細胞は、しばしば、それらの表面上に成長因子受容体の上方調節された発現を示し、それは周囲組織中の細胞から分泌されるパラクライン作用性の成長因子及び生存因子に対する応答性の増加を導く。腫瘍細胞においてＳｌｙ−１及びＭｕｎｃ１８などのＳＭタンパク質を標的にすることにより、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡアプローチを使用することにより、オートクラインならびにパラクラインの成長刺激機構及び／又は生存機構を２つの方法：（ｉ）成長因子の輸送及び分泌を低下させることによる、及び（ｉｉ）腫瘍細胞上の対応する成長因子受容体の量を減少させることによる、で破壊することが可能でありうる。それにより、両方、成長刺激シグナルの量、及び、これらのシグナルを認知して、応答する癌細胞の能力が低下しうる。癌細胞中でのＳＭタンパク質の発現又は活性の阻害は、従って、癌細胞の増殖及び生存を妨げるための強力なツールを表わすはずである。
【００２９】
ＳＭタンパク質は、さらに、腫瘍の浸潤及び転移を抑制するための強力な治療標的であると思われる。大半の型のヒト癌での後期中に、原発性腫瘍は先駆細胞を生み出し、それらは出て行き、隣接組織に浸潤し、遠隔部位まで移り、そこで新たなコロニーを作ることに成功しうる（転移として公知である）。
【００３０】
組織浸潤の必要条件として、癌細胞は、それらが周囲の健康組織を通じて移動し、基底膜を越えて、血流に入り、最後に目的の組織に浸潤できるようにする全セットのプロテアーゼを発現する。これらのプロテアーゼの一部は、膜結合タンパク質、例えばＭＴ−ＭＭＰ及びＡＤＡＭとして発現される。マトリクス再構築、成長因子の排出、及び腫瘍浸潤におけるそれらの決定的な役割のため、プロテアーゼ自体が癌療法のための薬物標的として考察される。本発明者らは、腫瘍細胞におけるＳＭタンパク質の発現及び／又は活性の阻害によって、標的細胞の表面上で膜結合プロテアーゼの量が低下することを主張する。これは、腫瘍細胞の浸潤能力ならびに成長因子の排出のためのその能力を減少又はさらに障害して、腫瘍の浸潤及び転移能力の低下をもたらすはずである。このように、ＳＭファミリーのタンパク質を標的とすることによって、後期の腫瘍形成、特に良性／充実性結節から進行性、転移性腫瘍への変換を妨げる新規方法が提供される。
【００３１】
治療的用途のために、このように、ＳＭタンパク質の活性及び／又は発現を低下及び／又は阻害することが目標である。これは、ＳＭタンパク質の機能を阻害することにより疾患を処置するためのヒト治療薬として使用されるヌクレオチド組成物（それにより薬物はｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡで構成される）又はそのＲＮＡの原動力となる配列への結合を通じてＳＭタンパク質を特異的に阻害するアンチセンスＲＮＡのいずれかにより達成できる。ＳＭタンパク質の活性／発現の低下／阻害は、また、それぞれのＳＭタンパク質遺伝子のプロモーターに結合して、発現停止させるヌクレオチドを含む薬物物質により達成できる。
【００３２】
さらに、薬物物質又は産物は、ＳＭタンパク質の発現又は活性を阻害する新たな化学物質又はペプチド又はタンパク質で構成されうる。タンパク質が活性な医薬的化合物である場合において、それは（ｉ）ＳＭタンパク質のプロモーターに結合して、それによりその発現を阻害するタンパク質、（ｉｉ）ＳＭタンパク質又はその相互作用パートナー（例、シンタキシン又はＳＮＡＲＥ複合体内のタンパク質）に結合して、それによりＳＭタンパク質とその結合パートナーとの機能的な相互作用を邪魔するタンパク質、（ｉｉｉ）ＳＭタンパク質と同様であるが、しかし、その機能を満たさず、「ドミナントネガティブ」ＳＭタンパク質変異体を意味するタンパク質、又は（ｉｖ）ＳＭタンパク質及びその結合パートナーの両方のためのスキャフォールドとして作用して、タンパク質の不可逆的な結合及び安定で非機能的なタンパク質複合体の形成をもたらすタンパク質でありうる。
【００３３】
本発明に従い、本発明の化合物を使用する新規方法が提供される。従って、本発明の化合物を使用して、癌又は他の異常増殖疾患を処置してよい。癌は２つの方法：癌が起因する組織の型（組織型）による、及び、原発部位又は癌が最初に発生した身体における位置による、で分類される。癌が発生する最も共通の部位は、皮膚、肺、女性の乳房、前立腺、結腸及び直腸、リンパ系、頚部及び子宮を含む。
【００３４】
化合物は、このように、種々な癌（限定はされないが、以下：
ＡＩＤＳ関連癌、例えばカポジ肉腫など；骨関連癌、例えばユーイング肉腫ファミリー腫瘍及び骨肉腫など；脳関連癌、例えば成人脳腫瘍、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児上衣腫、小児髄芽腫、小児テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児視覚路、及び視床下部神経膠腫ならびに他の小児脳腫瘍など；乳癌；消化器／胃腸関連癌、例えば肛門癌、肝外胆管癌、胃腸カルチノイド腫瘍、大腸癌、食道癌、胆嚢癌、成人原発性肝臓癌、小児肝臓癌、膵癌、直腸癌、小腸癌、及び胃（胃）癌など；内分泌関連癌、例えば副腎皮質性癌、胃腸カルチノイド腫瘍、島細胞癌（膵内分泌部）、副甲状腺癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、及び甲状腺癌など；眼関連癌、例えば眼球内黒色腫及び網膜芽細胞腫など；泌尿生殖器関連癌、例えば膀胱癌、腎臓（腎細胞）癌、陰茎癌、前立腺癌、移行細胞腎盂癌及び尿管癌、精巣癌、尿道癌、ウィルムス腫瘍、ならびに他の小児腎臓腫瘍など；生殖細胞関連癌、例えば小児期頭蓋外胚細胞性腫瘍、性腺外胚細胞性腫瘍、卵巣胚細胞性腫瘍、及び精巣癌など；婦人科関連癌、例えば子宮頚癌、子宮内膜癌、妊娠性トロホブラスト腫瘍、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞性腫瘍、卵巣の低悪性度の潜在的腫瘍、子宮肉腫、腟癌、及び外陰癌など；頭頚部関連癌、例えば下咽頭癌、喉頭癌、口唇癌及び口腔癌、原発不明癌を伴う転移性扁平上皮頸部癌、鼻咽腔癌、中咽頭癌、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌及び唾液腺癌など；血液学的／血液関連癌、例えば白血病、例えば成人急性リンパ芽球白血病、小児急性リンパ芽球白血病、成人急性骨髄性白血病、小児急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、及びヘアリーセル白血病など；ならびにリンパ腫、例えばＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、成人ホジキンリンパ腫、小児ホジキンリンパ腫、妊娠中のホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、成人非ホジキンリンパ腫、小児非ホジキンリンパ腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、セザリー症候群、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、及びワルデンストレームマクログロブリン血症ならびに他の血液学的／血液関連癌、例えば慢性骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、及び骨髄異形成／骨髄増殖性疾患など；肺関連癌、例えば非小細胞肺癌及び小細胞肺癌、筋骨格関連癌、例えばユーイング家族性腫瘍、骨肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、小児横紋筋肉腫、成人軟部組織肉腫、小児軟部組織肉腫、及び子宮肉腫など；神経系関連癌、例えば成人脳腫瘍、小児脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路及び視床下部の神経膠腫ならびに他の脳腫瘍、例えば神経芽細胞腫、下垂体腫瘍、及び原発性中枢神経系リンパ腫；呼吸器／胸部関連癌、例えば非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫、胸腺腫及び胸腺癌；皮膚関連癌、例えば皮膚Ｔ細胞リンパ腫、カポジ肉腫、黒色腫、メルケル細胞癌及び皮膚癌
などを含む）の処置において有用である。
【００３５】
これらの障害はヒトにおいて十分に特性付けされてきたが、しかし、他の哺乳動物においても同様の病因を伴い存在し、本発明の医薬組成物により処置できる。
【００３６】
治療的使用のために、化合物は、治療的有効量で、任意の従来の投与形態で、任意の従来の様式で投与してよい。投与経路は、限定はされないが、静脈内、筋肉内、皮下、滑液嚢内、注入により、舌下、経皮、経口、局所又は吸入により、錠剤、カプセル、カプレット、液剤、溶液、懸濁剤、乳濁液、ロゼンジ、シロップ、再構成粉剤、顆粒、座薬及び経皮パッチを含む。そのような投与形態を調製するための方法は公知である（例えば、H. C. Ansel and N. G. Popovish, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5th ed., Lea and Febiger (1990)を参照のこと）。治療的有効量は、当業者により、体重、代謝及び苦痛の重度などの因子に基づき決定することができる。好ましくは、活性化合物は、毎日、体重１キログラム当たり約１mg〜約５００mgで投与される。より好ましくは、活性化合物は、毎日、体重１キログラム当たり約１mg〜約１００mgで投与される。
【００３７】
化合物は、単独で、又は、アジュバント（インヒビターの安定性を増強させ、特定の実施態様においてそれらを含む医薬組成物の投与を促し、溶解又は分散の増加を提供し、阻害活性を増加させ、アジュバント治療を提供するなど）と組み合わせて投与してよい。有利に、そのような組み合わせによって活性成分のより低い投与量を利用してよく、このように起こりうる毒性及び有害な副作用を低下させる。
本発明の化合物との使用のための医薬的に許容可能な担体及びアジュバントは、例えば、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、緩衝物質、水、塩又は電解質、及びセルロースベースの物質を含む。これは、可能な医薬的に許容可能な担体及びアジュバントの完全なリストではなく、当業者は他の可能性を知りうるが、それらは当技術分野において豊富である。
【００３８】
まとめると、本発明では、Ｍｕｎｃ１８ｃ、Ｓｌｙ１、又はＳＭタンパク質ファミリーの他のメンバー及びその組み合わせの異種発現により、真核細胞においてタンパク質の分泌輸送を増強するための新規方法を記載する。この方法は、組換えタンパク質産物の発現及び製造のための増強した産生能力を伴う最適化された宿主細胞系の生成のために特に有用である。
【００３９】
Ｓｅｃ１／Ｍｕｎｃ１８（ＳＭ）タンパク質は、細胞内タンパク質輸送における膜融合のために必要とされるが、しかし、それらの作用の性質は、部分的にＳＭタンパク質とＳＮＡＲＥの間の相互作用の異質性のため、一体化というよりはむしろ多様であると長年提唱されている。本発明において、本発明者らは、２つのＳＭタンパク質の分泌経路に及ぼす生理学的影響を評価する。基本的な知見は、Ｍｕｎｃ１８ｃ及びＳｌｙ１が、細胞膜及びゴルジへの小胞融合に関与し、一致して全エキソサイトーシスを刺激することである。このモデルと一致して、本発明者らは、Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃがノックダウンされた場合に全エキソサイトーシスが低下することを示す（図３）。対照的に、過剰発現によるＳｌｙ１の上昇レベルによって分泌能力が増加する（図４）。重要かつ驚くべきことに、Ｍｕｎｃ１８ｃは、宿主細胞の分泌能力も有意に刺激する。この裏付けとして、本発明者らは、Ｍｕｎｃ１８ｃが、ＰＭ（細胞膜）への融合のために特化されたＳＮＡＲＥ複合体に直接的に結合することを実証した（図５）。
【００４０】
過去の試験では、エキソサイトーシスにおけるＭｕｎｃ１８ｃの阻害的な役割が割り当てられており（Riento et al., 2000；Kanda et al., 2005；Tellam et al., 1997；Thurmond et al., 1998）、それは本発明の結果と相反する。輸送機構、特にシンタキシン４、ＳＮＡＰ−２３及びＶＡＭＰ２から成るエキソサイトーシスＳＮＡＲＥタンパク質とのその相互作用におけるＭｕｎｃ１８ｃの役割に分子的洞察を提供するために、本発明者らは免疫沈降実験を報告する。図５に示す通り、Ｍｕｎｃ１８ｃ特異的抗体は、シンタキシン４、ＳＮＡＰ−２３及びＶＡＭＰ２の有意な分画と共にＭｕｎｃ１８ｃを定量的に沈殿させ、Ｍｕｎｃ１８ｃとこれらのＳＮＡＲＥとのインビボでの結合を示し、分泌経路において小胞−オルガネラ融合が促される（Peng and Gallwitz, 2002；Shen et al., 2007；Scott et al., 2004）。この知見は、Ｓｌｙ１（完全に組み立てられたＳＮＡＲＥ複合体に結合して、ゴルジ装置への融合を促す）と同様に、Ｍｕｎｃ１８ｃも直接的にＳＮＡＲＥ複合体と相互作用することを強調しており、ＳＮＡＲＥ媒介性の輸送機構を促進することによる保存された作用機構を示唆する。
【００４１】
そのため、Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ機能の生理学的な役割及び機構は、ＳＮＡＲＥ媒介性の分泌経路において保存されている。
【００４２】
ＳＭタンパク質ベースの分泌操作によって、Ｓｌｙ１、Ｍｕｎｃ１８ｃ、及び一般的なオルガネラ膨張因子Ｘｂｐ−１が過剰発現された場合、種々のタンパク質（酵素、成長ホルモン、及び免疫療法用モノクローナル抗体を含む）のエキソサイトーシスが増強される。
【００４３】
本願のデータは、同じ細胞内での２つのＳＭタンパク質の同時過剰発現時にタンパク質分泌に対する相加的又はさらには相乗的な効果を実証する（Ｍｕｎｃ１８ｃ及びＳｌｙ１について示す）。本発明者らのデータは、このように、ＳＮＡＲＥ媒介性の輸送機構を刺激する際のＳＭタンパク質の一体化した機能についてのモデルを裏付け、分泌増強のための翻訳後操作の新規戦略を表わす。
【００４４】
まとめると、本願において、本発明者らは、エキソサイトーシス／分泌経路におけるＳＭタンパク質の一体化した活性化の役割についての最初の驚くべき証拠を提供する。この知見に基づき、本発明者らはＳＭタンパク質ベースの翻訳後操作（それによりエキソサイトーシス増強の達成に成功している）の先駆者となる。
【００４５】
タンパク質治療薬の効率的な産生は、バイオテクノロジー工業への大きな課題のままである。今までに、種々の異なる代謝操作戦略が開発されてきた。例えば、転写を増加させることにより（転写操作）；哺乳動物細胞の翻訳性能をモジュレートさせることにより（翻訳操作）；特定の糖型の産生を増進させることにより（グリコシル化操作）；代謝エネルギーを産物形成へ排他的に向け直すこと（増殖技術の制御）により、及び産生細胞株の生存を改善させることにより（抗アポトーシス操作）。しかし、組織化された分泌機構に基づく代謝操作は、分かりにくいままである。Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃが一致して全エキソサイトーシスを刺激するとの知見に基づき、本発明者らは本明細書で初めて、哺乳動物細胞の分泌能力の増強を導くＳＭタンパク質ベースの翻訳後操作を報告する。システムは、発現の配置、使用されるプロモーターの型、及びプロモーター媒介性の転写レベルに非依存的であり、組換えタンパク質及び医薬品の工業的産生のために特に適する。
【００４６】
本発明は、さらに、ＳＭタンパク質発現に干渉することによりタンパク質のエキソサイトーシスを阻害又は低下させるための手段を提供する。これは、癌又は炎症状態の処置のための有用な手段を提供するはずである。
【００４７】
過去に、真核細胞において、膜結合輸送小胞が、細胞内の区画／オルガネラの間でタンパク質及び脂質を行き来させることが記載されている。各輸送工程で、小胞及び標的膜の両方からのＳＮＡＲＥ［可溶性ＮＳＦ（Ｎ−エチルマレイミド感受性因子）付着受容体］タンパク質が、融合が起こるために必要とされるコア機構を構成するトランスＳＮＡＲＥ複合体を形成する。種々の状況における生理学的な必要条件を満たすために、ＳＮＡＲＥ媒介性の融合機構は、細胞内及び細胞外の両方の供給源からの刺激が適切に組込まれるように、空間的及び時間的に調節可能でなければならない。このように、ＳＮＡＲＥの機能がインビボでモジュレート又は微調節され、膜融合の特異性とスピードのいずれも損なわれないことが極めて重要である。Ｓｅｃ１／Ｍｕｎｃ１８（ＳＭ）タンパク質は、ＳＮＡＲＥタンパク質の調節へのカギを握りうる。最初に酵母及び線虫において同定され、ＳＭタンパク質は融合に必須である。ＳＮＡＲＥ以外の相互作用パートナーが少ししか存在しないとの事実は、ＳＭタンパク質がＳＮＡＲＥタンパク質と機能的に共役しているとの広く知られた概念を導いてきた（Gallwitz and Jahn, 2003；Jahn et al., 2003；Toonen and Verhage, 2003）。しかし、ＳＭタンパク質についての機能モデルを一般化するための試みは、それらのＳＮＡＲＥとの相互作用の異質な性質により大幅に阻まれてきた。別個の輸送工程で、及び、異なる生物において、単量体のシンタキシン（Dulubova et al., 1999；Yang et al., 2000；Peng and Gallwitz, 2002）、小胞関連ＳＮＡＲＥ（Li et al., 2005；Carpp et al., 2006；Peng and Gallwitz； 2004；Shen et al., 2007）、ヘテロダイマーｔ−ＳＮＡＲＥ複合体（Scott et al., 2004；Zilly et al., 2006）ならびに三元の完全に組み立てられたＳＮＡＲＥ複合体（Carpp et al., 2006；Peng and Gallwitz； 2004；Shen et al., 2007；Togneri et al., 2006；Carr et al., 1999；Dulubova et al., 2007）が、個々のＳＭタンパク質に簡単に結合することが示されてきた。結果として、これらの相互作用の生理学的意義が、膜融合におけるＳＭタンパク質機能についてポジティブ及びネガティブの両方で解釈されてきた。
【００４８】
結果的に、分子機構、特に分泌経路におけるＳＭタンパク質の生理学的な役割は、依然として不可解である。例えば、Ｓｌｙ１は単量体のシンタキシン５、単量体の小胞結合ＳＮＡＲＥ、及び完全に組み立てられたＳＮＡＲＥ複合体と相互作用し（Li et al., 2005; Peng and Gallwitz; 2004）、ＳＮＡＲＥ複合体の形成及び融合特異性にポジティブな影響をもたらすことが示されている（Peng and Gallwitz, 2002; Kosodo et al., 2002）。
他方で、過去の試験は、Ｍｕｎｃ１８タンパク質についての阻害的な役割を膜融合及びエキソサイトーシスに割り当てた：ニューロン特異的Ｍｕｎｃ１８ａ（シナプス小胞の調節されたエキソサイトーシスのために特異的に必要とされる）は、ＳＮＡＲＥとの２つの機能的に矛盾する相互作用を担う：シンタキシン１の閉鎖立体構造への結合（このようにＳＮＡＲＥ複合体組み立てを阻害し（Dulubova et al., 1999；Yang et al., 2000)）、及び完全に組み立てられたＳＮＡＲＥ複合体への結合（従って、膜融合を促進する（Shen et al., 2007；Dulubova et al., 2007)）による。これと一致して、エキソサイトーシスに対するＭｕｎｃ１８ａの阻害的及び促進的な効果の両方が報告された（Wu et al., 1998；Verhage et al., 2000；Voets et al., 2001）。Ｍｕｎｃ１８ｂ及びＭｕｎｃ１８ｃは配列においてＭｕｎｃ１８ａと相同であるが、しかし、遍在的に発現される。インビトロでのデータは、Ｍｕｎｃ１８ｃが、ＳＮＡＲＥ結合においてＭｕｎｃ１８ａと同様であり（Latham et al., 2006；D'Andrea-Merrins et al., 2007）、２つのタンパク質の構造が保存されている（Misura et al., 2000；Hu et al., 2007）ことを示した。遺伝学的及び生理学的な試験は、しかし、今までに、Ｍｕｎｃ１８ｂ及びＭｕｎｃ１８ｃによるエキソサイトーシスにおける阻害的な役割についての排他的な証拠を提供してきた（Riento et al., 2000；Kanda et al., 2005；Tellam et al., 1997；Thurmond et al., 1998）。例えば、１）ハエにおけるＭｕｎｃ１８ａの過剰発現は、ニューロンの移動を阻害する（Wu et al., 1998）、２）Ｃａｃｏ−２細胞におけるＭｕｎｃ１８ｂの過剰発現は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素の頂端送達を阻害する（Riento et al., 2000）、３）Ｍｕｎｃ１８ｃはＶＡＭＰ２とシンタキシン４結合を競合する（Thurmond et al., 1998）；４）脂肪細胞におけるインシュリン刺激ＧＬＵＴ小胞の転位置は、Ｍｕｎｃ１８ｃの過剰発現により阻害されるが、しかし、Ｍｕｎｃ１８ｃヌルマウスにおいて増強される（Tellam et al., 1997；Thurmond et al., 1998）。
【００４９】
これらの報告とは対照的に、及び、支配的な予想とは反対に、本願において、本発明者らは、２つのＳＭタンパク質（Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ）についての新規の驚くべき役割を、両方のタンパク質が一般的にエキソサイトーシスを等しく刺激することを実証することにより実証する。Ｍｕｎｃ１８ｃ及びＳｌｙ１による活性化の役割の分子機構も保存されている可能性が高い。これらの驚くべき知見に基づき、本発明者らは、哺乳動物細胞において分泌増強をもたらすＳＭタンパク質ベースの分泌操作の先駆者となった。ＳＭタンパク質ベースの分泌操作は、代謝操作の新規戦略を表わし、工業におけるタンパク質医薬品の製造のための新たなプラットフォームを提供する。
【００５０】
特に、哺乳動物細胞の分泌能力に対するＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ発現のポジティブな効果は、分泌増加のために哺乳動物産生細胞株を操作するための新規の翻訳後アプローチを指摘する。
【００５１】
実施例５において、ｓｌｙ１及びｍｕｎｃ１８ｃの同時過剰発現は、ｓｌｙ１又はｍｕｎｃ１８ｃ単独による５倍と比較して、ＳＥＡＰ産生における８倍の増加を導くことが実証されている（図４ａ）。ＳＡＭＹ及びＶＥＧＦ１２１の分泌も増加する（図４ｂ、４ｃ）。ｓｌｙ１、ｍｕｎｃ１８ｃ及びｘｂｐ−１の過剰発現は、一斉に、ＳＥＡＰ、ＳＡＭＹ及びＶＥＧＦの分泌をそれぞれ１０倍、１２倍及び８倍増加させ（図４ａ、４ｂ、４ｃ）、Ｓｌｙ１とＭｕｎｃ１８ｃの間、及び２つのＳＭタンパク質と一般的なオルガネラ膨張因子Ｘｂｐ−１の間での分泌に対する相乗効果の存在を明確に実証する。
【００５２】
さらに、実施例６において、ｓｌｙ１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３）又はｍｕｎｃ１８ｃ（ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９）のいずれかの構成的発現のために操作された安定なＣＨＯ−Ｋ１由来細胞株の生成により、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３は、４倍及び８倍だけＳＥＡＰ分泌を（図６ａ）、４倍及び５倍だけＳＡＭＹ産生を（図６ｂ）刺激することが実証されている。興味深いことに、より多くのＳＥＡＰを産生するＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３は、また、より高いＳｌｙ１レベルを示し、ＳＭタンパク質と産物タンパク質とのポジティブな相関を示唆する（図６ｃ）。同様に、構成的なｍｕｎｃ１８ｃ発現のためのトランスジェニック細胞（ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９）は、９倍及び６．５倍多いＳＥＡＰ及びＳＡＭＹを産生し（図６ｅ及び６ｆ）、より多くのＳＥＡＰを産生するＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８９もより高いＭｕｎｃ１８ｃレベルを示す（図６ｄ）。安定な細胞株ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１（構成的なＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ発現のためのダブルトランスジェニック）及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７（構成的なＳｌｙ１、Ｍｕｎｃ１８ｃ及びＸｂｐ−１発現のためのトリプルトランスジェニック）は、親ＣＨＯ−Ｋ１と比較し、１３倍及び１６倍高いＳＥＡＰ産生を示す（図６ｇ）。
【００５３】
特に、ＳＭタンパク質ベースの分泌操作によって、産生細胞株の特異的な抗体産生性が増加する。実施例７では、これを、プロトタイプ生物製剤の製造シナリオにおいてＳＭタンパク質ベースの分泌操作を使用し、モノクローナル抗ヒトＣＤ２０  ＩｇＧ１（リツキシマブとして公知）をＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３において（最高１０倍増加）、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１において（最高１５倍増加）、ならびにＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｘｂｐ−１４において（最高１３倍増加）及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７において（最高１９倍増加）発現させることにより例証する（図７ａ）。ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７においてリツキシマブを産生する場合、その場限りの産生レベルである最高４０pg/細胞/日に達することができ、それはアイソジェニックなコントロール細胞株と比較し２０倍近くの増加に相当する（図７ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７細胞及び野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞により産生される抗体は、構造的にインタクトであり、互いに識別不能であることが示される（図７ｂ、７ｃ）。ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７において産生されるリツキシマブからのＮ結合型Ｆｃオリゴ糖のＭａｌｄｉ−ＴＯＦベースの糖プロファイリングによって天然産生細胞株と比較しても、差異は明らかにならず、ＳＭ／Ｘｂｐ−１ベースの分泌操作が産物の品質を損なわないことを示す（図７ｄ及び７ｅ）。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１ａ】ＨＥＫ−２９３におけるＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８の発現及び局在化。（ａ）及び（ｂ）アクチンを内因性コントロールとして使用したｓｌｙ１（ａ）及びｍｕｎｃ１８（ｂ）転写物のＲＴ−ＰＣＲベースの検出。１Ｋｂラダーをサイズスタンダードとして使用する。（ｃ）Ｍｕｎｃ１８ａ／ｂ／ｃのウエスタンブロット。（ｄ）ＹＦＰ−Ｍｕｎｃ１８ｃ（ｐＲＰ２３）及びＣＦＰ−Ｓｙｎｔａｘｉｎ  ４（Ｓｔｘ４，ｐＲＰ２９）又はＹＦＰ−Ｓｌｙ１（ｐＲＰ３２）及びＣＦＰ−Ｓｙｎｔａｘｉｎ  ５（Ｓｔｘ５，ｐＲＰ４０）のセットを用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３におけるＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃの細胞内局在化を示す共焦点顕微鏡写真。矢印はＳｌｙ１及びシンタキシン５（上パネル）又はＭｕｎｃ１８ｃ及びシンタキシン４（下パネル）のいずれかの共局在化を示す。
【図１ｂ】ＨＥＫ−２９３におけるＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８の発現及び局在化。（ａ）及び（ｂ）アクチンを内因性コントロールとして使用したｓｌｙ１（ａ）及びｍｕｎｃ１８（ｂ）転写物のＲＴ−ＰＣＲベースの検出。１Ｋｂラダーをサイズスタンダードとして使用する。（ｃ）Ｍｕｎｃ１８ａ／ｂ／ｃのウエスタンブロット。（ｄ）ＹＦＰ−Ｍｕｎｃ１８ｃ（ｐＲＰ２３）及びＣＦＰ−Ｓｙｎｔａｘｉｎ  ４（Ｓｔｘ４，ｐＲＰ２９）又はＹＦＰ−Ｓｌｙ１（ｐＲＰ３２）及びＣＦＰ−Ｓｙｎｔａｘｉｎ  ５（Ｓｔｘ５，ｐＲＰ４０）のセットを用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３におけるＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃの細胞内局在化を示す共焦点顕微鏡写真。矢印はＳｌｙ１及びシンタキシン５（上パネル）又はＭｕｎｃ１８ｃ及びシンタキシン４（下パネル）のいずれかの共局在化を示す。
【図１ｃ】ＨＥＫ−２９３におけるＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８の発現及び局在化。（ａ）及び（ｂ）アクチンを内因性コントロールとして使用したｓｌｙ１（ａ）及びｍｕｎｃ１８（ｂ）転写物のＲＴ−ＰＣＲベースの検出。１Ｋｂラダーをサイズスタンダードとして使用する。（ｃ）Ｍｕｎｃ１８ａ／ｂ／ｃのウエスタンブロット。（ｄ）ＹＦＰ−Ｍｕｎｃ１８ｃ（ｐＲＰ２３）及びＣＦＰ−Ｓｙｎｔａｘｉｎ  ４（Ｓｔｘ４，ｐＲＰ２９）又はＹＦＰ−Ｓｌｙ１（ｐＲＰ３２）及びＣＦＰ−Ｓｙｎｔａｘｉｎ  ５（Ｓｔｘ５，ｐＲＰ４０）のセットを用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３におけるＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃの細胞内局在化を示す共焦点顕微鏡写真。矢印はＳｌｙ１及びシンタキシン５（上パネル）又はＭｕｎｃ１８ｃ及びシンタキシン４（下パネル）のいずれかの共局在化を示す。
【図１ｄ】ＨＥＫ−２９３におけるＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８の発現及び局在化。（ａ）及び（ｂ）アクチンを内因性コントロールとして使用したｓｌｙ１（ａ）及びｍｕｎｃ１８（ｂ）転写物のＲＴ−ＰＣＲベースの検出。１Ｋｂラダーをサイズスタンダードとして使用する。（ｃ）Ｍｕｎｃ１８ａ／ｂ／ｃのウエスタンブロット。（ｄ）ＹＦＰ−Ｍｕｎｃ１８ｃ（ｐＲＰ２３）及びＣＦＰ−Ｓｙｎｔａｘｉｎ  ４（Ｓｔｘ４，ｐＲＰ２９）又はＹＦＰ−Ｓｌｙ１（ｐＲＰ３２）及びＣＦＰ−Ｓｙｎｔａｘｉｎ  ５（Ｓｔｘ５，ｐＲＰ４０）のセットを用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３におけるＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃの細胞内局在化を示す共焦点顕微鏡写真。矢印はＳｌｙ１及びシンタキシン５（上パネル）又はＭｕｎｃ１８ｃ及びシンタキシン４（下パネル）のいずれかの共局在化を示す。
【図２ａ】ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃのｓｈＲＮＡベースのノックダウン。（ａ）異なるｓｌｙ１特異的ｓｈＲＮＡのためのｓｌｙ１特異的ノックダウンレポーターコンストラクトとして使用されるジシストロンｓｌｙ１／ＧＦＰをコードする発現ベクターｐＲＰ３の模式図。（ｂ）ｐＲＰ３及び異なるｓｈＲＮＡをコードする発現ベクターを用いてコトランスフェクトされ、４８時間培養されたＣＨＯ−Ｋ１の蛍光顕微鏡写真。（ｃ）異なるＭｕｎｃ１８ｃ特異的ｓｈＲＮＡのためのＭｕｎｃ１８ｃ特異的ノックダウンレポーターコンストラクトとして使用されるジシストロンＭｕｎｃ１８ｃ／ＧＦＰをコードする発現ベクターｐＲＰ４の模式図。ｐＲＰ４及び異なるｓｈＲＮＡをコードする発現ベクターを用いてコトランスフェクトされ、４８時間培養されたＨＥＫ−２９３の蛍光顕微鏡写真。
【図２ｂ】ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃのｓｈＲＮＡベースのノックダウン。（ａ）異なるｓｌｙ１特異的ｓｈＲＮＡのためのｓｌｙ１特異的ノックダウンレポーターコンストラクトとして使用されるジシストロンｓｌｙ１／ＧＦＰをコードする発現ベクターｐＲＰ３の模式図。（ｂ）ｐＲＰ３及び異なるｓｈＲＮＡをコードする発現ベクターを用いてコトランスフェクトされ、４８時間培養されたＣＨＯ−Ｋ１の蛍光顕微鏡写真。（ｃ）異なるＭｕｎｃ１８ｃ特異的ｓｈＲＮＡのためのＭｕｎｃ１８ｃ特異的ノックダウンレポーターコンストラクトとして使用されるジシストロンＭｕｎｃ１８ｃ／ＧＦＰをコードする発現ベクターｐＲＰ４の模式図。ｐＲＰ４及び異なるｓｈＲＮＡをコードする発現ベクターを用いてコトランスフェクトされ、４８時間培養されたＨＥＫ−２９３の蛍光顕微鏡写真。
【図２ｃ】ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃのｓｈＲＮＡベースのノックダウン。（ａ）異なるｓｌｙ１特異的ｓｈＲＮＡのためのｓｌｙ１特異的ノックダウンレポーターコンストラクトとして使用されるジシストロンｓｌｙ１／ＧＦＰをコードする発現ベクターｐＲＰ３の模式図。（ｂ）ｐＲＰ３及び異なるｓｈＲＮＡをコードする発現ベクターを用いてコトランスフェクトされ、４８時間培養されたＣＨＯ−Ｋ１の蛍光顕微鏡写真。（ｃ）異なるＭｕｎｃ１８ｃ特異的ｓｈＲＮＡのためのＭｕｎｃ１８ｃ特異的ノックダウンレポーターコンストラクトとして使用されるジシストロンＭｕｎｃ１８ｃ／ＧＦＰをコードする発現ベクターｐＲＰ４の模式図。ｐＲＰ４及び異なるｓｈＲＮＡをコードする発現ベクターを用いてコトランスフェクトされ、４８時間培養されたＨＥＫ−２９３の蛍光顕微鏡写真。
【図２ｄ】ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃのｓｈＲＮＡベースのノックダウン。（ａ）異なるｓｌｙ１特異的ｓｈＲＮＡのためのｓｌｙ１特異的ノックダウンレポーターコンストラクトとして使用されるジシストロンｓｌｙ１／ＧＦＰをコードする発現ベクターｐＲＰ３の模式図。（ｂ）ｐＲＰ３及び異なるｓｈＲＮＡをコードする発現ベクターを用いてコトランスフェクトされ、４８時間培養されたＣＨＯ−Ｋ１の蛍光顕微鏡写真。（ｃ）異なるＭｕｎｃ１８ｃ特異的ｓｈＲＮＡのためのＭｕｎｃ１８ｃ特異的ノックダウンレポーターコンストラクトとして使用されるジシストロンＭｕｎｃ１８ｃ／ＧＦＰをコードする発現ベクターｐＲＰ４の模式図。ｐＲＰ４及び異なるｓｈＲＮＡをコードする発現ベクターを用いてコトランスフェクトされ、４８時間培養されたＨＥＫ−２９３の蛍光顕微鏡写真。
【図３ａ】ｓｌｙ１及びｍｕｎｃ１８ｃのｓｈＲＮＡベースのノックダウンによって全エキソサイトーシスが減少する。（ａ）ｓｌｙ１標的ｓｈＲＮＡ発現ベクター（ｓｈＲＮＡｓｌｙ１＿１／２／３；ｐＲＰ５−７）を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３のｓｌｙ１特異的ウエスタンブロット。親ベクターｐｍＵ６、コントロールｓｈＲＮＡ及びｐ２７Ｋｉｐ１をコントロールとして使用する。（ｂ）ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ及び異なるｓｈＲＮＡｓｌｙ１発現ベクターを用いてコトランスフェクトした（４８時間）ＨＥＫ−２９３のＳＥＡＰ発現プロファイル。（ｃ）ｍｕｎｃ１８ｃ標的ｓｈＲＮＡ発現ベクター（ｓｈＲＮＡｍｕｎｃ１８ｃ＿１／２／３；ｐＲＰ１２、１４、３８、３９）を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３のｍｕｎｃ１８ｃ特異的ウエスタンブロット。（ｄ）ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ及び異なるｓｈＲＮＡｍｕｎｃ１８発現ベクターを用いてコトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３のＳＥＡＰ発現プロファイル。
【図３ｂ】ｓｌｙ１及びｍｕｎｃ１８ｃのｓｈＲＮＡベースのノックダウンによって全エキソサイトーシスが減少する。（ａ）ｓｌｙ１標的ｓｈＲＮＡ発現ベクター（ｓｈＲＮＡｓｌｙ１＿１／２／３；ｐＲＰ５−７）を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３のｓｌｙ１特異的ウエスタンブロット。親ベクターｐｍＵ６、コントロールｓｈＲＮＡ及びｐ２７Ｋｉｐ１をコントロールとして使用する。（ｂ）ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ及び異なるｓｈＲＮＡｓｌｙ１発現ベクターを用いてコトランスフェクトした（４８時間）ＨＥＫ−２９３のＳＥＡＰ発現プロファイル。（ｃ）ｍｕｎｃ１８ｃ標的ｓｈＲＮＡ発現ベクター（ｓｈＲＮＡｍｕｎｃ１８ｃ＿１／２／３；ｐＲＰ１２、１４、３８、３９）を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３のｍｕｎｃ１８ｃ特異的ウエスタンブロット。（ｄ）ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ及び異なるｓｈＲＮＡｍｕｎｃ１８発現ベクターを用いてコトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３のＳＥＡＰ発現プロファイル。
【図３ｃ】ｓｌｙ１及びｍｕｎｃ１８ｃのｓｈＲＮＡベースのノックダウンによって全エキソサイトーシスが減少する。（ａ）ｓｌｙ１標的ｓｈＲＮＡ発現ベクター（ｓｈＲＮＡｓｌｙ１＿１／２／３；ｐＲＰ５−７）を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３のｓｌｙ１特異的ウエスタンブロット。親ベクターｐｍＵ６、コントロールｓｈＲＮＡ及びｐ２７Ｋｉｐ１をコントロールとして使用する。（ｂ）ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ及び異なるｓｈＲＮＡｓｌｙ１発現ベクターを用いてコトランスフェクトした（４８時間）ＨＥＫ−２９３のＳＥＡＰ発現プロファイル。（ｃ）ｍｕｎｃ１８ｃ標的ｓｈＲＮＡ発現ベクター（ｓｈＲＮＡｍｕｎｃ１８ｃ＿１／２／３；ｐＲＰ１２、１４、３８、３９）を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３のｍｕｎｃ１８ｃ特異的ウエスタンブロット。（ｄ）ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ及び異なるｓｈＲＮＡｍｕｎｃ１８発現ベクターを用いてコトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３のＳＥＡＰ発現プロファイル。
【図３ｄ】ｓｌｙ１及びｍｕｎｃ１８ｃのｓｈＲＮＡベースのノックダウンによって全エキソサイトーシスが減少する。（ａ）ｓｌｙ１標的ｓｈＲＮＡ発現ベクター（ｓｈＲＮＡｓｌｙ１＿１／２／３；ｐＲＰ５−７）を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３のｓｌｙ１特異的ウエスタンブロット。親ベクターｐｍＵ６、コントロールｓｈＲＮＡ及びｐ２７Ｋｉｐ１をコントロールとして使用する。（ｂ）ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ及び異なるｓｈＲＮＡｓｌｙ１発現ベクターを用いてコトランスフェクトした（４８時間）ＨＥＫ−２９３のＳＥＡＰ発現プロファイル。（ｃ）ｍｕｎｃ１８ｃ標的ｓｈＲＮＡ発現ベクター（ｓｈＲＮＡｍｕｎｃ１８ｃ＿１／２／３；ｐＲＰ１２、１４、３８、３９）を用いてトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３のｍｕｎｃ１８ｃ特異的ウエスタンブロット。（ｄ）ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ及び異なるｓｈＲＮＡｍｕｎｃ１８発現ベクターを用いてコトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３のＳＥＡＰ発現プロファイル。
【図４ａ】Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃの異所性発現によって、転写後に、ＣＨＯ−Ｋ１のタンパク質産生が増進される。（ａ−ｃ）ＳＥＡＰ（ｐＳＥＡＰ１−Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ａ）、ＳＡＭＹ（ｐＳＳ１５８）（ｂ）又はＶＥＧＦ１２１（ｐＷＷ２７６）（ｃ）産生ベクターならびにＳｌｙ１−（ｐＲＰ２４）、Ｍｕｎｃ１８ｃ−（ｐＲＰ１７）及びＸｂｐ−１（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｘｂｐ−１）をコードする発現ベクター（の異なる組み合わせ）を用いてコトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１の産生プロファイル。（ｄ）ＳＭタンパク質発現の存在下又は非存在下での産物ｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲベースのプロファイリング。
【図４ｂ】Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃの異所性発現によって、転写後に、ＣＨＯ−Ｋ１のタンパク質産生が増進される。（ａ−ｃ）ＳＥＡＰ（ｐＳＥＡＰ１−Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ａ）、ＳＡＭＹ（ｐＳＳ１５８）（ｂ）又はＶＥＧＦ１２１（ｐＷＷ２７６）（ｃ）産生ベクターならびにＳｌｙ１−（ｐＲＰ２４）、Ｍｕｎｃ１８ｃ−（ｐＲＰ１７）及びＸｂｐ−１（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｘｂｐ−１）をコードする発現ベクター（の異なる組み合わせ）を用いてコトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１の産生プロファイル。（ｄ）ＳＭタンパク質発現の存在下又は非存在下での産物ｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲベースのプロファイリング。
【図４ｃ】Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃの異所性発現によって、転写後に、ＣＨＯ−Ｋ１のタンパク質産生が増進される。（ａ−ｃ）ＳＥＡＰ（ｐＳＥＡＰ１−Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ａ）、ＳＡＭＹ（ｐＳＳ１５８）（ｂ）又はＶＥＧＦ１２１（ｐＷＷ２７６）（ｃ）産生ベクターならびにＳｌｙ１−（ｐＲＰ２４）、Ｍｕｎｃ１８ｃ−（ｐＲＰ１７）及びＸｂｐ−１（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｘｂｐ−１）をコードする発現ベクター（の異なる組み合わせ）を用いてコトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１の産生プロファイル。（ｄ）ＳＭタンパク質発現の存在下又は非存在下での産物ｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲベースのプロファイリング。
【図４ｄ】Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃの異所性発現によって、転写後に、ＣＨＯ−Ｋ１のタンパク質産生が増進される。（ａ−ｃ）ＳＥＡＰ（ｐＳＥＡＰ１−Ｃｏｎｔｒｏｌ）（ａ）、ＳＡＭＹ（ｐＳＳ１５８）（ｂ）又はＶＥＧＦ１２１（ｐＷＷ２７６）（ｃ）産生ベクターならびにＳｌｙ１−（ｐＲＰ２４）、Ｍｕｎｃ１８ｃ−（ｐＲＰ１７）及びＸｂｐ−１（ｐｃＤＮＡ３．１−Ｘｂｐ−１）をコードする発現ベクター（の異なる組み合わせ）を用いてコトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１の産生プロファイル。（ｄ）ＳＭタンパク質発現の存在下又は非存在下での産物ｍＲＮＡレベルの定量的ＲＴ−ＰＣＲベースのプロファイリング。
【図５】Ｍｕｎｃ１８ｃとエキソサイトーシスＳＮＡＲＥ複合体との相互作用。親和性精製プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ共役抗Ｍｕｎｃ１８ｃ抗体を使用したＨＥＫ−２９３ライセートの免疫沈降に続く、Ｍｕｎｃ１８ｃ、シンタキシン４、ＳＮＡＰ−２３及びＶＡＭＰ２／シナプトブレビン２（ＳｙｂＩＩ）のウエスタンブロット分析。非沈降タンパク質（上清）ならびにＳｌｙ１をコントロールとして使用する。
【図６ａ】ＳＭタンパク質ベースの分泌操作によって、ＣＨＯ−ＫＩ由来細胞株における異種タンパク質の産生が増強される。（ａ）構成的なＳｌｙ１及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｂ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘでのＳＡＭＹ産生。（ｃ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３のＳｌｙ１特異的ウエスタンブロット。（ｄ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９のＭｕｎｃ１８ｃ特異的ウエスタンブロット。（ｅ）構成的なＭｕｎｃ１８ｃ及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｆ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｍｉｘのＳＡＭＹ産生。（ｇ）Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１）、Ｓｌｙ１及びＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｘｂｐ１４）及びＳｌｙ１、Ｍｕｎｃ１８ｃならびにＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７）を構成的に発現する、４８時間培養された、安定な細胞クローンのＳＥＡＰ産生プロファイル。
【図６ｂ】ＳＭタンパク質ベースの分泌操作によって、ＣＨＯ−ＫＩ由来細胞株における異種タンパク質の産生が増強される。（ａ）構成的なＳｌｙ１及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｂ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘでのＳＡＭＹ産生。（ｃ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３のＳｌｙ１特異的ウエスタンブロット。（ｄ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９のＭｕｎｃ１８ｃ特異的ウエスタンブロット。（ｅ）構成的なＭｕｎｃ１８ｃ及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｆ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｍｉｘのＳＡＭＹ産生。（ｇ）Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１）、Ｓｌｙ１及びＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｘｂｐ１４）及びＳｌｙ１、Ｍｕｎｃ１８ｃならびにＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７）を構成的に発現する、４８時間培養された、安定な細胞クローンのＳＥＡＰ産生プロファイル。
【図６ｃ】ＳＭタンパク質ベースの分泌操作によって、ＣＨＯ−ＫＩ由来細胞株における異種タンパク質の産生が増強される。（ａ）構成的なＳｌｙ１及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｂ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘでのＳＡＭＹ産生。（ｃ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３のＳｌｙ１特異的ウエスタンブロット。（ｄ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９のＭｕｎｃ１８ｃ特異的ウエスタンブロット。（ｅ）構成的なＭｕｎｃ１８ｃ及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｆ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｍｉｘのＳＡＭＹ産生。（ｇ）Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１）、Ｓｌｙ１及びＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｘｂｐ１４）及びＳｌｙ１、Ｍｕｎｃ１８ｃならびにＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７）を構成的に発現する、４８時間培養された、安定な細胞クローンのＳＥＡＰ産生プロファイル。
【図６ｄ】ＳＭタンパク質ベースの分泌操作によって、ＣＨＯ−ＫＩ由来細胞株における異種タンパク質の産生が増強される。（ａ）構成的なＳｌｙ１及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｂ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘでのＳＡＭＹ産生。（ｃ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３のＳｌｙ１特異的ウエスタンブロット。（ｄ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９のＭｕｎｃ１８ｃ特異的ウエスタンブロット。（ｅ）構成的なＭｕｎｃ１８ｃ及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｆ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｍｉｘのＳＡＭＹ産生。（ｇ）Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１）、Ｓｌｙ１及びＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｘｂｐ１４）及びＳｌｙ１、Ｍｕｎｃ１８ｃならびにＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７）を構成的に発現する、４８時間培養された、安定な細胞クローンのＳＥＡＰ産生プロファイル。
【図６ｅ】ＳＭタンパク質ベースの分泌操作によって、ＣＨＯ−ＫＩ由来細胞株における異種タンパク質の産生が増強される。（ａ）構成的なＳｌｙ１及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｂ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘでのＳＡＭＹ産生。（ｃ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３のＳｌｙ１特異的ウエスタンブロット。（ｄ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９のＭｕｎｃ１８ｃ特異的ウエスタンブロット。（ｅ）構成的なＭｕｎｃ１８ｃ及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｆ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｍｉｘのＳＡＭＹ産生。（ｇ）Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１）、Ｓｌｙ１及びＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｘｂｐ１４）及びＳｌｙ１、Ｍｕｎｃ１８ｃならびにＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７）を構成的に発現する、４８時間培養された、安定な細胞クローンのＳＥＡＰ産生プロファイル。
【図６ｆ】ＳＭタンパク質ベースの分泌操作によって、ＣＨＯ−ＫＩ由来細胞株における異種タンパク質の産生が増強される。（ａ）構成的なＳｌｙ１及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｂ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘでのＳＡＭＹ産生。（ｃ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３のＳｌｙ１特異的ウエスタンブロット。（ｄ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９のＭｕｎｃ１８ｃ特異的ウエスタンブロット。（ｅ）構成的なＭｕｎｃ１８ｃ及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｆ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｍｉｘのＳＡＭＹ産生。（ｇ）Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１）、Ｓｌｙ１及びＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｘｂｐ１４）及びＳｌｙ１、Ｍｕｎｃ１８ｃならびにＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７）を構成的に発現する、４８時間培養された、安定な細胞クローンのＳＥＡＰ産生プロファイル。
【図６ｇ】ＳＭタンパク質ベースの分泌操作によって、ＣＨＯ−ＫＩ由来細胞株における異種タンパク質の産生が増強される。（ａ）構成的なＳｌｙ１及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｂ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１ｍｉｘでのＳＡＭＹ産生。（ｃ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３のＳｌｙ１特異的ウエスタンブロット。（ｄ）負荷コントロールとしてｐ２７Ｋｉｐ１を伴うＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９のＭｕｎｃ１８ｃ特異的ウエスタンブロット。（ｅ）構成的なＭｕｎｃ１８ｃ及びＳＥＡＰ発現のためのトランスジェニックである安定な混合されたクローンＣＨＯ−Ｋ１由来集団（ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃｍｉｘ）（４８時間培養）でのＳＥＡＰ産生。（ｆ）ｐＳＳ１５８を用いて一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８、ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｍｉｘのＳＡＭＹ産生。（ｇ）Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１）、Ｓｌｙ１及びＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｘｂｐ１４）及びＳｌｙ１、Ｍｕｎｃ１８ｃならびにＸｂｐ−１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７）を構成的に発現する、４８時間培養された、安定な細胞クローンのＳＥＡＰ産生プロファイル。
【図７ａ】分泌操作されたＣＨＯ−Ｋ１派生物において産生されたリツキシマブの産生及び糖プロファイリング。（ａ）様々に分泌操作されたＣＨＯ−Ｋ１派生物での特異的なリツキシマブ産生性。（ＳＭタンパク質ベースの代謝操作によるヒトＩｇＧ１の分泌増加）（ｂ、ｃ）ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞から精製したリツキシマブを、非還元（ｂ）及び還元（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。スタンダードタンパク質の分子量（ｋＤａ）及びＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖（ＨＣ、ＬＣ）を示す。（ｄ、ｅ）ＣＨＯ−Ｋ１及び分泌操作されたＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７において産生されたリツキシマブのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦベースの糖プロファイリング。
【図７ｂ】分泌操作されたＣＨＯ−Ｋ１派生物において産生されたリツキシマブの産生及び糖プロファイリング。（ａ）様々に分泌操作されたＣＨＯ−Ｋ１派生物での特異的なリツキシマブ産生性。（ＳＭタンパク質ベースの代謝操作によるヒトＩｇＧ１の分泌増加）（ｂ、ｃ）ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞から精製したリツキシマブを、非還元（ｂ）及び還元（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。スタンダードタンパク質の分子量（ｋＤａ）及びＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖（ＨＣ、ＬＣ）を示す。（ｄ、ｅ）ＣＨＯ−Ｋ１及び分泌操作されたＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７において産生されたリツキシマブのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦベースの糖プロファイリング。
【図７ｃ】分泌操作されたＣＨＯ−Ｋ１派生物において産生されたリツキシマブの産生及び糖プロファイリング。（ａ）様々に分泌操作されたＣＨＯ−Ｋ１派生物での特異的なリツキシマブ産生性。（ＳＭタンパク質ベースの代謝操作によるヒトＩｇＧ１の分泌増加）（ｂ、ｃ）ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞から精製したリツキシマブを、非還元（ｂ）及び還元（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。スタンダードタンパク質の分子量（ｋＤａ）及びＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖（ＨＣ、ＬＣ）を示す。（ｄ、ｅ）ＣＨＯ−Ｋ１及び分泌操作されたＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７において産生されたリツキシマブのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦベースの糖プロファイリング。
【図７ｄ】分泌操作されたＣＨＯ−Ｋ１派生物において産生されたリツキシマブの産生及び糖プロファイリング。（ａ）様々に分泌操作されたＣＨＯ−Ｋ１派生物での特異的なリツキシマブ産生性。（ＳＭタンパク質ベースの代謝操作によるヒトＩｇＧ１の分泌増加）（ｂ、ｃ）ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞から精製したリツキシマブを、非還元（ｂ）及び還元（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。スタンダードタンパク質の分子量（ｋＤａ）及びＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖（ＨＣ、ＬＣ）を示す。（ｄ、ｅ）ＣＨＯ−Ｋ１及び分泌操作されたＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７において産生されたリツキシマブのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦベースの糖プロファイリング。
【図７ｅ】分泌操作されたＣＨＯ−Ｋ１派生物において産生されたリツキシマブの産生及び糖プロファイリング。（ａ）様々に分泌操作されたＣＨＯ−Ｋ１派生物での特異的なリツキシマブ産生性。（ＳＭタンパク質ベースの代謝操作によるヒトＩｇＧ１の分泌増加）（ｂ、ｃ）ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７細胞及びＣＨＯ−Ｋ１細胞から精製したリツキシマブを、非還元（ｂ）及び還元（ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。スタンダードタンパク質の分子量（ｋＤａ）及びＩｇＧ１の重鎖及び軽鎖（ＨＣ、ＬＣ）を示す。（ｄ、ｅ）ＣＨＯ−Ｋ１及び分泌操作されたＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７において産生されたリツキシマブのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦベースの糖プロファイリング。
【図８】発現コンストラクトの模式図：少なくとも１つの目的のタンパク質（ＧＯＩ）及び別々の発現ユニット（ａ）から又は１つのバイシストロンユニット（ｂ）からのＳＭタンパク質をコードするベクター。別々の発現カセットから（ｃ）又はバイシストロン（２つの遺伝子がＩＲＥＳエレメントを介して連結される）（ｄ）のいずれかでコードされる２つのＳＭタンパク質の遺伝子を含む発現ベクター。少なくとも２つのＳＭタンパク質及び目的の遺伝子（ｅ）又は１つのマルチシストロン発現ユニットからのいくつかのＳＭタンパク質をコードする発現ベクター。
【図９】ＳＭタンパク質はヒト細胞からのＨＲＰ分泌を増強する：分泌型の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｓｓＨＲＰ）及び空ベクター（Ｍｏｃｋ、黒色バー）、Ｍｕｎｃ１８ｃ（灰色バー）、Ｓｌｙ１（影付きバー）又はＭｕｎｃ１８ｃ及びＳｌｙ１（Ｍｕｎｃ−ＩＲＥＳ−Ｓｌｙ、縞模様バー）をコードするバイシストロンのコンストラクトを用いてコトランスフェクトしたヒトＨＴ１０８０細胞の上清中でのＨＲＰ活性の測定。トランスフェクションから２４及び４８時間後に測定された相対的ｓｓＨＲＰ力価ならびに特異的な産生性を、１．０に設定したＭｏｃｋコントロールと比較してプロットする。値は３通りのサンプルでの平均値に相当する（エラーバー＝ＳＥＭ）。
【図１０Ａ】ＩｇＧ産生細胞株におけるＳＭタンパク質の過剰発現によって、特異的な産生性及び最終的なＩｇＧ力価が増加する。（Ａ）空ベクター（Ｍｏｃｋ）又はＳｌｙ−１（Ｓｌｙ１）、Ｍｕｎｃ−１８ｃ（Ｍｕｎｃ）もしくは両方のＳＭタンパク質（Ｍｕｎｃ／Ｓｌｙ１）のための発現コンストラクトのいずれかを安定的に発現する細胞の相対的な特異的ＩｇＧ１産生性。産生性は、流加産生プロセス中での力価及び生存細胞数から算出した。バーは、ｎ＝２（Ｍｏｃｋ）からｎ＝６のモノクローナルトランスジェニックＩｇＧ産生細胞株での平均値を表わし、１００%に設定されたＭｏｃｋ細胞における特異的な産生性との比較で描写する。（Ｂ）記載のコンストラクトを９日間の流加発酵プロセスにわたり安定的に発現する安定な細胞集団からのＩｇＧ力価。
【図１０Ｂ】ＩｇＧ産生細胞株におけるＳＭタンパク質の過剰発現によって、特異的な産生性及び最終的なＩｇＧ力価が増加する。（Ａ）空ベクター（Ｍｏｃｋ）又はＳｌｙ−１（Ｓｌｙ１）、Ｍｕｎｃ−１８ｃ（Ｍｕｎｃ）もしくは両方のＳＭタンパク質（Ｍｕｎｃ／Ｓｌｙ１）のための発現コンストラクトのいずれかを安定的に発現する細胞の相対的な特異的ＩｇＧ１産生性。産生性は、流加産生プロセス中での力価及び生存細胞数から算出した。バーは、ｎ＝２（Ｍｏｃｋ）からｎ＝６のモノクローナルトランスジェニックＩｇＧ産生細胞株での平均値を表わし、１００%に設定されたＭｏｃｋ細胞における特異的な産生性との比較で描写する。（Ｂ）記載のコンストラクトを９日間の流加発酵プロセスにわたり安定的に発現する安定な細胞集団からのＩｇＧ力価。
【００５５】
発明の詳細な説明
一般的な実施態様「含む」又は「含まれる」は、より具体的な実施態様「から成る」を包含する。さらに、単数形及び複数形は、限定的な方法において使用されない。
【００５６】
本発明の経過において使用される用語は、以下の意味を有する。
【００５７】
「遺伝子」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）配列（例、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ）を意味する。本発明において、遺伝子は、好ましくは、ヒトＤＮＡ配列を指すが、しかし、他の哺乳動物種、好ましくはマウス、ハムスター及びラットからの相同配列、ならびに追加の真核生物種（ニワトリ、アヒル、コケ、寄生虫、ハエ及び酵母を含む）からの相同配列が等しく含まれる。
【００５８】
集合語「Ｓｅｃ１／Ｍｕｎｃ−１８タンパク質」又は「ＳＭタンパク質」又は「Ｓｅｃ１／Ｍｕｎｃ１８群のタンパク質」又は「ＳＭタンパク質」又は「ＳＭタンパク質をコードする遺伝子」又は「ＳＭファミリー」は、高度の構造的類似性を共有する６０〜７０ｋＤａの親水性タンパク質のファミリーを含み、酵母からヒトまで進化的に保存されている。
Ｍｕｎｃ１８及びＳｌｙ１は両方ともＳｅｃ１／Ｍｕｎｃ１８タンパク質のファミリーに属する。このファミリーは、さらに、今までに以下：
酵母において：Ｓｅｃ１ｐ、Ｓｌｙ１ｐ、Ｖｐｓ３３ｐ及びＶｐｓ４５ｐ
ショウジョウバエにおいて：ＲＯＰ、Ｓｌｙ１及びＶｐｓ３３／カーネーション
線虫において：Ｕｎｃ−１８ならびにゲノム配列データベースに従った５つの他の遺伝子
脊椎動物において：Ｍｕｎｃ１８−１、−２及び−３、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ３３−Ａ及び−Ｂ、ならびにＳｌｙ１
を含む。
【００５９】
ＳＭタンパク質という用語は、そのようなタンパク質の派生物、突然変異体及びフラグメント、例えば、ｆｌａｇタグ付き、ＨＩＳタグ付き又は他の方法でのタグ付きＳＭタンパク質も包含する。そのような派生物は、頻繁に、例えば、タンパク質の精製又は単離又は可視化を簡単にするために使用される。
【００６０】
ＳＭタンパク質は全配列にわたり高い相同性を示し、それらが同様の全構造を呈しうることを示唆する。さらに、機能喪失突然変異が、４種中の９つのＳＭ遺伝子について記載されており、それらは全て小胞輸送及び融合の重度の障害を導き、ＳＭタンパク質が小胞輸送及び分泌のプロセスにおいて同様の中心的な役割を果たすことを示唆する。
【００６１】
本発明の実施例では、モデルタンパク質としてＭｕｎｃ１８及びＳｌｙ１を使用しているが、しかし、本発明は、ＳＭタンパク質ファミリーの他のメンバーに等しく上手く移すことができる。
【００６２】
さらに、種にわたる高度の保存の観点から、ＳＭタンパク質を使用して、酵母を越えて寄生虫及び昆虫細胞から哺乳動物系までの全ての真核生物宿主細胞種におけるタンパク質の分泌及び細胞表面発現をモジュレートできる。
【００６３】
真核細胞においては、膜結合輸送小胞が、細胞内の区画／オルガネラの間でタンパク質及び脂質を行き来させる。細胞輸送小胞と細胞膜又は標的区画（例えばリソソーム、ゴルジ複合体又は細胞膜など）との融合は、ＳＮＡＲＥ［可溶性ＮＳＦ（Ｎ−エチルマレイミド感受性因子）付着受容体］タンパク質により媒介される。細胞の生理学的な必要条件を満たし、区画特異的な膜組成を維持するために、ＳＮＡＲＥ媒介性の融合機構が、Ｓｅｃ１／Ｍｕｎｃ１８（ＳＭ）ファミリーの小タンパク質により空間的及び時間的に制御される。ＳＮＡＲＥ及びシンタキシンへの直接的な結合により、ＳＭタンパク質は、細胞内の区画／オルガネラと細胞膜の間の小胞媒介性輸送の全工程を調節する。
【００６４】
「Ｍｕｎｃ−１８」又は「Ｍｕｎｃ−１８タンパク質」又は「Ｍｕｎｃ−１８タンパク質ファミリー」という用語は、真核生物中に存在する全てのＭｕｎｃ−１８遺伝子及び遺伝子産物／タンパク質を含む。これは、明確に、３つのＭｕｎｃ−１８パラログ、即ち、Ｍｕｎｃ−１８ａ（「Ｍｕｎｃ−１８−１」とも呼ばれる）、Ｍｕｎｃ−１８ｂ及びＭｕｎｃ−１８ｃを含み、それらは脊椎動物において進化してきた。
【００６５】
より具体的には、「Ｍｕｎｃ−１８ｃ」という用語は、ヒト遺伝子及びタンパク質Ｍｕｎｃ１８ｃを指し、「シンタキシン結合タンパク質３」（ＳＴＸＢＰ３）又は「血小板Ｓｅｃ１タンパク質」（ＰＳＰ）、配列番号３９としても公知であり、他の哺乳動物種（マウス、ハムスター、ラット、イヌ及びウサギを含む）におけるそのホモログを含む。
【００６６】
「Ｓｌｙ−１」又は「Ｓｌｙ−１タンパク質」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物における全てのＳｌｙ１遺伝子及びこれらの遺伝子から発現されるタンパク質を指す。より具体的には、「Ｓｌｙ−１」はヒトＳｌｙ−１タンパク質を指し、「Ｓｅｃ１ファミリードメイン含有タンパク質１」（ＳＣＦＤ１）又は「シンタキシン結合タンパク質１様タンパク質２」（ＳＴＸＢＰ１Ｌ２）、配列番号４１としても公知である。
【００６７】
「ＸＢＰ−１」という用語は、等しく、ＸＢＰ−１  ＤＮＡ配列及びこの遺伝子（ＸＢＰ−１  ＤＮＡスプライス変異体を含む）から発現される全てのタンパク質を指す。優先的に、ＸＢＰ−１は、ヒトＸＢＰ−１配列を、好ましくは、スプライシングされた活性型のＸＢＰ−１（「ＸＢＰ−１（ｓ）」とも呼ばれる）を指す。転写因子ＸＢＰ−１は、分泌細胞分化ならびにＥＲホメオスタシス及び膨張の維持の重要調節因子の１つであることが公知である（Lee, 2005；Iwakoshi, 2003）。これらの機能によって、ＸＢＰ−１が分泌操作アプローチのための候補になる。
【００６８】
より具体的には、「ＸＢＰ−１」はヒトＸＢＰ−１タンパク質、配列番号４３を指す。
【００６９】
「産生性」又は「特異的な産生性」という用語は、定められた時間内に定められた細胞数により産生される特定タンパク質の量を記載する。特異的な産生性は、従って、目的タンパク質を発現／合成／産生するための細胞の能力についての定量的測定である。工業的な製造に関連し、特異的な産生性は、通常、１細胞当たり１日に産生されるピコグラム量（「pg/細胞＊日」又は「ｐｃｄ」）のタンパク質として表わす。
【００７０】
分泌タンパク質の「特異的な産生性」を測定するための１つの方法は、培養液中に分泌される目的のタンパク質の量を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により定量的に測定することである。この目的のために、細胞を定められた密度で新鮮培養液中に播種する。定められた時間後、例えば２４、４８又は７２時間後、細胞培養液のサンプルを採取し、目的のタンパク質の力価を測定するためのＥＬＩＳＡ測定に供する。特異的な産生性は、力価を平均細胞数及び時間により割ることにより決定できる。
【００７１】
細胞の「特異的な産生性」を測定する方法の別の例は、均一系時間分解蛍光（ＨＴＲＦ（登録商標）：homogenous time resolved fluorescence）アッセイにより提供される。
【００７２】
細胞内の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質についての細胞の「産生性」は、ウエスタンブロッティングによっても検出及び定量化できる。細胞を最初に洗浄し、続いて、界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ−Ｘ、ＮＰ−４０又はＳＤＳなど）又は高塩濃度のいずれかを含む緩衝液中で溶解する。細胞ライセート内のタンパク質は、次に、サイズごとにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ナイロンメンブレンにトランスファーし、そこで目的のタンパク質は、続いて、特異的抗体を使用することにより検出及び可視化される。
【００７３】
細胞の「特異的な産生性」を測定するための別の方法は、目的のタンパク質を、目的のタンパク質に対して惹起された蛍光標識抗体により免疫学的に検出し、蛍光シグナルをフローサイトメーターで定量化することである。細胞内タンパク質の場合では、細胞を最初に、例えばパラホルムアルデヒド緩衝液中で固定し、そして次に透過処理し、検出抗体の細胞中への浸透を可能にする。細胞表面タンパク質を、事前の固定化又は透過処理の必要なしに、生細胞上で定量化することができる。
【００７４】
細胞の「産生性」を、さらに、レポータータンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（目的のタンパク質を伴う融合タンパク質として、又は、２、３もしくは複数の発現ユニットの部分としての目的のタンパク質と同じｍＲＮＡからのいずれかで発現される））の発現を測定することにより間接的に決定することができる。
【００７５】
「産生性の増強／増加」という用語は、細胞の特異的な産生性を増加／増強するための方法を含む。特異的な産生性は、産生性が、それぞれのコントロール細胞と比較し、研究中の細胞においてより高い場合に、及び、この差異が統計的に有意である場合に、増加又は増強される。研究中の細胞は、処理、トランスフェクト又は遺伝子改変された細胞の異種集団又はクローン細胞株でありうる；未処理、未トランスフェクト又は未改変の細胞はコントロール細胞として役立てることができる。目的の分泌タンパク質に関連し、「増強／増加／改善された産生性」及び「増強／増加／改善されたエキソサイトーシス」及び「増強／増加／改善された分泌」という用語は、同じ意味を有し、互換的に使用される。
【００７６】
「派生物」という用語は、一般的に、本発明の使用目的を実現するために適した配列を含み、配列が細胞中での分泌輸送における増加を媒介することを意味する。
【００７７】
本発明において使用する「派生物」という用語は、配列において元の配列又はその相補配列と少なくとも７０%同一であるポリペプチド分子又は核酸分子を意味する。好ましくは、ポリペプチド分子又は核酸分子は、配列において、元の配列又はその相補配列と少なくとも８０%同一である。より好ましくは、ポリペプチド分子又は核酸分子は、配列において、元の配列又はその相補配列と少なくとも９０%同一である。最も好ましくは、配列において、元の配列又はその相補配列と少なくとも９５%同一であり、元の配列と同じ又は同様である、分泌に対する効果を呈するポリペプチド分子又は核酸分子である。
【００７８】
配列の差異は、異なる生物からの相同配列における差異に基づきうる。それらは、また、１つ又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸、好ましくは１、２、３、４、５、７、８、９又は１０の置換、挿入又は欠失による配列の標的改変に基づきうる。欠失、挿入又は置換突然変異体は、部位特異的な突然変異誘発及び／又はＰＣＲベースの突然変異誘発技術を使用して生成されうる。参照配列の配列同一性は、例えば標準的な「アラインメント」アルゴリズム（例、「ＢＬＡＳＴ」）を使用することにより決定できる。配列は、それらの配列において一致し、標準的な「アラインメント」アルゴリズムの助けを用いて同定可能である場合、整列化する。
【００７９】
さらに、本発明において、「派生物」という用語は、他の核酸配列とハイブリダイズする核酸分子（一本鎖又は二本鎖）を意味する。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄の条件下（例、６５℃の５×ＳＳＣを含む緩衝液中でのハイブリダイゼーション；４２℃の０．２×ＳＳＣ／０．１%  ＳＤＳを使用した洗浄）で実施する。
【００８０】
「派生物」という用語は、さらに、タンパク質欠失及び／又は挿入突然変異体、特にセリン、スレオニン又はチロシンの位置でのリン酸化突然変異体、及びタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）又はカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）での結合部位の欠失を持つ突然変異体を意味する。
【００８１】
「活性」という用語は、細胞内又はインビトロアッセイにおけるタンパク質の生物学的機能を記載及び定量化する。
【００８２】
ＳＭタンパク質の「活性」を測定するための１つのアッセイは、例えば、モデルタンパク質、目的の抗体又はタンパク質についての分泌アッセイである。細胞を、ｓｓ−ＨＲＰ−Ｆｌａｇプラスミドを用いて、空ベクター又は研究中の遺伝子（例えばＭｕｎｃ−１８ｃ又はＳｌｙ−１など）のいずれかと一緒にコトランスフェクトする。２４時間トランスフェクション後の細胞を無血清培地で洗浄し、ＨＲＰ分泌を、０、１、３及び６時間後に、ＥＣＬ試薬を用いた清澄化細胞上清のインキュベーションにより定量化する。測定は、ルミノメーター（Ｌｕｃｙ２、Ａｎｔｈｏｓ）を用いて４５０nmで行う。
【００８３】
ＳＭタンパク質の機能的結合という点での「活性」の検出のための別の方法は、ＳＭタンパク質のその公知の相互作用パートナーへの結合、例えば、Ｍｕｎｃ−１８ｃのＳｙｎｔａｘｉｎ−４への結合又はＳｌｙ１のＳｙｎｔａｘｉｎ−５との物理的相互作用を示すことである。ＳＭタンパク質の他のタンパク質への結合は、同時免疫沈降、例えばビーズに共役させた特異的抗体を使用したＳＭタンパク質のプルダウン、ビーズの変性、及び続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットによる同時免疫沈降タンパク質の分離及び検出により実証することができる。
ＳＭタンパク質の別のタンパク質（例、シンタキシン）への直接結合は、さらに、酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて検出することができる。このアッセイにおいて、両方のタンパク質は、酵母細胞において、１つの転写因子のそれぞれＤＮＡ結合ドメイン及びトランス活性化ドメインとの融合タンパク質として発現される。両方のタンパク質の直接的な相互作用は、活性が比色測定で又は酵母細胞が選択的条件下で成長する能力により検出される転写因子の再構成を導く。
【００８４】
別の、さらに間接的な方法が、ＳＭタンパク質及びその結合パートナーの同時免疫蛍光ならびに細胞内でのそれらの同時局在化の検出により提供される。
【００８５】
ＸＢＰ−１の「活性」を測定するための１つの方法は、ＸＢＰ−１転写因子のそのＤＮＡ結合部位への結合を検出するためのバンドシフト実験を実施することである。別の方法は、活性ＸＢＰ−１スプライス変異体のサイトゾルから核への転位置を検出することである。あるいは、ＸＢＰ−１「活性」は、ＸＢＰ−１の異種発現時の真正のＸＢＰ−１標的遺伝子（例えば結合タンパク質（ＢｉＰ）など）の発現誘導を測定することにより間接的に確認することができる。
【００８６】
本発明の意味における「宿主細胞」は、ハムスター細胞などの細胞、好ましくはＢＨＫ２１、ＢＨＫ  ＴＫ−、ＣＨＯ、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５、ＣＨＯ由来の突然変異細胞株Ｌｅｃ１からＬｅｃ３５、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ  Ｂ１、及びＣＨＯ−ＤＧ４４細胞又はそのような細胞株のいずれかの派生物／後代である。特に好ましいのは、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−Ｋ１及びＢＨＫ２１であり、さらにより好ましいのはＣＨＯ−ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞である。本発明のさらなる実施態様では、宿主細胞は、また、マウスミエローマ細胞、好ましくはＮＳ０細胞及びＳｐ２／０細胞又はそのような細胞株のいずれかの派生物／後代を意味する。本発明の意味において使用することができるマウス細胞及びハムスター細胞の例も表１にまとめる。しかし、それらの細胞、他の哺乳動物細胞、限定はされないが、ヒト、マウス、ラット、サル及びげっ歯類の細胞株又は真核細胞、限定はされないが、酵母、昆虫、植物及びトリの細胞の派生物／後代も、本発明の意味において、特に生物製剤タンパク質の産生のために使用することができる。
【００８７】
【表１】
2011505850.tif 000003
【００８８】
宿主細胞は、無血清条件下で、場合により動物由来の任意のタンパク質／ペプチドを含まない培地中で、樹立、適応、そして完全に培養される場合、最も好ましい。市販の培地、例えばHam’s F12（Sigma, Deisenhofen, Germany）、RPMI-1640（Sigma）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Sigma）、基礎培地（ＭＥＭ；Sigma）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Sigma）、CD-CHO（Invitrogen, Carlsbad, CA）、CHO-S-Invtirogen）、無血清ＣＨＯ培地（Sigma）、及び無タンパク質ＣＨＯ培地（Sigma）などは、例示的な適切な栄養溶液である。培地のいずれにも必要に応じて種々の化合物を添加してよく、その例は、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、上皮成長因子、インシュリン様成長因子など）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸など）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジンなど）、グルタミン、グルコース、又は他の等価のエネルギー源、抗生物質、微量元素である。任意の他の必要な添加剤も、当業者に公知でありうる適切な濃度で含まれてよい。本発明において、無血清培地の使用が好ましいが、しかし、適量の血清を添加した培地も宿主細胞の培養のために使用することができる。選択可能な遺伝子を発現する遺伝子改変細胞の成長及び選択のために、適した選択剤を培養液に加える。
【００８９】
「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基配列又はポリペプチドと互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語は、また、反応（限定はされないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化又はタンパク質プロセシングを含む）を通じて翻訳後に修飾されるタンパク質を含む。修飾及び変化、例えば他のタンパク質への融合、アミノ酸配列の置換、欠失又は挿入を、分子がその生物学的な機能活性を維持したまま、ポリペプチドの構造中に施すことができる。例えば、特定のアミノ酸配列の置換を、ポリペプチド又はその基礎となる核酸コード配列中に施すことができ、同様の特性を伴うタンパク質を得ることができる。
【００９０】
「ポリペプチド」という用語は、１０個を超えるアミノ酸を伴う配列を意味し、「ペプチド」という用語は、最高１０個までのアミノ酸長の配列を意味する。本発明は、生物製剤用ポリペプチド／タンパク質の産生のための宿主細胞を生成するために適する。本発明は、特に、増強した細胞産生性を示す細胞による、多数の異なる目的の遺伝子の高収率発現のために適する。
【００９１】
「目的の遺伝子」（ＧＯＩ）、「選択された配列」又は「産物遺伝子」は、本明細書において同じ意味を有し、目的の産物又は「目的のタンパク質」をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を指し、「所望の産物」という用語によっても言及される。選択された配列は完全長の又は切断された遺伝子、融合又はタグ付き遺伝子でありうる。そして、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＤＮＡフラグメント、好ましくはｃＤＮＡでありうる。それは、天然配列、即ち、天然形態でありうる。又は、所望の通りに突然変異させる、又は、他の方法で改変させることができる。これらの改変は、選択された宿主細胞におけるコドン使用を最適化するためのコドン最適化、ヒト化又はタギングを含む。選択された配列は、分泌、細胞質、核内、膜結合又は細胞表面のポリペプチドをコードしうる。「目的のタンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、そのフラグメント、ペプチドを含み、その全てを選択された宿主細胞において発現させることができる。所望のタンパク質は、例えば、抗体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、受容体及びその派生物又はフラグメント、ならびにアゴニスト又はアンタゴニストとして役立ちうる、及び／又は、治療的又は診断的使用を有しうる任意の他のポリペプチドでありうる。所望のタンパク質／ポリペプチドの例も以下に与える。より複雑な分子（例えばモノクローナル抗体など）の場合において、ＧＯＩは２つの抗体鎖の１つ又は両方をコードする。
【００９２】
「目的の産物」は、また、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ又はｓｈＲＮＡでよい。
【００９３】
「目的のタンパク質」又は「所望のタンパク質」は上記のものである。特に、所望のタンパク質／ポリペプチド又は目的のタンパク質は、例えば、限定はされないが、インシュリン、インシュリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）、例、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）アルファ、ＩＦＮベータ、ＩＦＮガンマ、ＩＦＮオメガ又はＩＦＮタウ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦアルファ及びＴＮＦベータ、ＴＮＦガンマ、ＴＲＡＩＬなど；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１及びＶＥＧＦである。また、エリスロポエチン又は任意の他のホルモン成長因子の産生が含まれる。本発明の方法は、また、抗体又はそのフラグメントの産生のために使用すると有利でありうる。そのようなフラグメントは、例えばＦａｂフラグメント（Fragment antigen-binding＝Ｆａｂ）を含む。Ｆａｂフラグメントは、隣接する定常領域により一緒に保持される両鎖の可変領域からなる。これらは、プロテアーゼ消化、例えば、パパインを用いて、従来の抗体から形成されうるが、しかし、同様のＦａｂフラグメントも平均時間中に遺伝子操作により産生されうる。さらなる抗体フラグメントはＦ（ａｂ‘）２フラグメントを含み、それはペプシンを用いたタンパク質分解的切断により調製してよい。
【００９４】
目的のタンパク質は、好ましくは、培養液から分泌ポリペプチドとして回収され、又は、それは、分泌シグナルなしに発現される場合、宿主細胞のライセートから回収できる。他の組換えタンパク質からの目的のタンパク質及び宿主細胞タンパク質を、実質的に均質な目的のタンパク質の調製物が得られる方法で、精製することが必要である。第１工程として、細胞及び／又は粒子状の細胞細片を、培養液又はライセートから除去する。目的の産物を、その後、混入する可溶性のタンパク質、ポリペプチド及び核酸から、例えば、免疫親和性カラム又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、Sephadexクロマトグラフィー、シリカ上又は陽イオン交換樹脂（例えばＤＥＡＥなど）上でのクロマトグラフィーにより精製する。一般的に、当業者に、宿主細胞により異種発現されたタンパク質をどのように精製するのかを教える方法は、当技術分野において周知である。
【００９５】
遺伝子操作方法を使用し、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域だけから成る短縮した抗体フラグメントを産生することが可能である。これらは、Ｆｖフラグメント（Fragment variable＝可変部分のフラグメント）と呼ばれる。
【００９６】
これらのＦｖフラグメントでは定常鎖のシステインによる２つの鎖の共有結合が欠けるため、Ｆｖフラグメントはしばしば安定化される。短いペプチドフラグメント（例、１０〜３０アミノ酸、好ましくは１５アミノ酸）による重鎖及び軽鎖の可変領域を連結することが有利である。この方法において、単一のペプチド鎖（ＶＨ及びＶＬから成り、ペプチドリンカーにより連結される）が得られる。この種類の抗体タンパク質は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である。この種類のｓｃＦｖ抗体タンパク質の例は、先行技術から公知である。
【００９７】
近年、種々の戦略が、ｓｃＦｖならびに多量体の派生物を調製するために開発されてきた。これは、特に、改善された薬物動態特性及び体内分布特性を伴う、ならびに、増加した結合力を伴う組換え抗体を導くことを意図する。ｓｃＦｖの多量体化を達成するために、ｓｃＦｖを、多量体化ドメインを伴う融合タンパク質として調製した。多量体化ドメインは、例えば、ＩｇＧのＣＨ３領域又はコイルドコイル構造（ヘリックス構造）、例えばロイシン−ジッパードメインでありうる。しかし、また、ｓｃＦｖのＶＨ／ＶＬ領域の間での相互作用を多量体化（例、ダイアボディ、トリアボディ及びペンタボディ）のために使用する戦略が存在する。ダイアボディにより、当業者は二価のホモ二量体ｓｃＦｖ派生物を意味する。ｓｃＦＶ分子中のリンカーの５〜１０個のアミノ酸への短縮化は、鎖内ＶＨ／ＶＬ重ね合わせ（superimposition）が起こるホモ二量体の形成を導く。ダイアボディは、加えて、ジスルフィド架橋の取り込みにより安定化されうる。ダイアボディ−抗体タンパク質の例は、先行技術から公知である。
【００９８】
ミニボディにより、当業者は二価のホモ二量体ｓｃＦｖ派生物を意味する。それは、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を、ヒンジ領域（例、ＩｇＧ１からも）及びリンカー領域を介してｓｃＦｖに連結される二量体化領域として含む融合タンパク質から成る。ミニボディ−抗体タンパク質の例が、先行技術から公知である。
【００９９】
トリアボディにより、当業者は、三価のホモ三量体ｓｃＦｖ派生物を意味する。ｓｃＦｃ派生物（ここでＶＨ−ＶＬは、リンカー配列なしに、直接的に融合される）は、三量体の形成を導く。
【０１００】
「スキャフォールドタンパク質」により、当業者は、遺伝子クローニングにより又は同時翻訳プロセスにより別のタンパク質又は別の機能を有するタンパク質の部分と共役するタンパク質の任意の機能的ドメインを意味する。
【０１０１】
当業者は、また、二価、三価又は四価の構造を有し、ｓｃＦｖに由来するいわゆるミニ抗体に精通しうる。多量体化は、二量体、三量体又は四量体のコイルドコイル構造により行われる。
【０１０２】
定義により、宿主細胞中に導入される任意の配列又は遺伝子は、導入された配列又は遺伝子が、宿主細胞中の内因性の配列又は遺伝子と同一である場合でさえ、宿主細胞に関して、「異種配列」又は「異種遺伝子」又は「トランスジーン」又は「組換え遺伝子」と呼ばれる。
【０１０３】
配列は、目的の配列が内因性配列であるが、しかし、配列が細胞中に（人工的／意図的／実験的に）取り込まれ、従って、内因性遺伝子の遺伝子座とは異なる宿主ゲノム中の遺伝子座から発現される場合でさえ、「異種配列」と呼ばれる。
【０１０４】
配列は、目的の配列（例、ｃＤＮＡ）が（人工的／意図的／実験的に）再導入された（＝組換え）内因性配列であり、この配列の発現が、調節配列の変化／改変により（例えば、プロモーターの変化又は任意の他の手段による）影響を受ける場合でさえ、「異種配列」と呼ばれる。
【０１０５】
「異種」タンパク質は、このように、異種配列から発現されるタンパク質である。
【０１０６】
異種遺伝子配列を、標的細胞中に、「発現ベクター」、好ましくは真核生物、及びさらに好ましくは哺乳動物の発現ベクターを使用することにより導入することができる。ベクターを構築するために使用される方法は、当業者に周知であり、種々の刊行物に記載されている。特に、適したベクターを構築するための技術（機能的な構成要素、例えばプロモーター、エンハンサ―、終結シグナル及びポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点、ならびにスプライシングシグナルなどの記載を含む）が、先行技術において公知である。ベクターは、限定はされないが、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体（例、ＡＣＥ）、又はウイルスベクター、例えばバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペス単純ウイルス、レトロウイルス、バクテリオファージなどを含みうる。真核生物の発現ベクターは、典型的に、ベクターの細菌中での増殖を促す原核生物の配列、例えば複製起点及び細菌中での選択のための抗生物質耐性遺伝子も含みうる。種々の真核生物発現ベクター（ポリヌクレオチドを機能的に連結できるクローニング部位を含む）が、当技術分野において周知であり、一部は、企業、例えばStratagene（La Jolla, CA）；Invitrogen（Carlsbad, CA）；Promega（Madison, WI）、又はBD Biosciences Clontech（Palo Alto, CA）などから市販されている。
【０１０７】
好ましい実施態様において、発現ベクターは、目的のペプチド／ポリペプチド／タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写及び翻訳のために必要な調節配列である少なくとも１つの核酸配列を含む。
【０１０８】
本明細書において使用する「発現」という用語は、宿主細胞内の異種核酸配列の転写及び／又は翻訳を指す。宿主細胞における所望の目的の産物／タンパク質の発現レベルは、細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量、又は本実施例における選択された配列によりコードされる所望の目的のポリペプチド／タンパク質の量のいずれかに基づいて測定されうる。例えば、選択された配列から転写されるｍＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞ＲＮＡへのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、又はＰＣＲにより定量化することができる。選択された配列によりコードされるタンパク質は、種々の方法により、例えば、ＥＬＩＳＡにより、ウエスタンブロッティングにより、ラジオイムノアッセイにより、免疫沈降により、タンパク質の生物学的活性についてのアッセイにより、タンパク質の免疫染色、続くＦＡＣＳ分析により、又は、均一系時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）アッセイにより定量化することができる。
【０１０９】
本発明において、「発現」という用語は、遺伝子（ＤＮＡ配列を意味する）との関連で、ならびに、ＤＮＡ配列が翻訳されるタンパク質産物との関連で等しく使用される。「遺伝子」及び「タンパク質」という用語は、このように、発現との関連で互換的に使用でき、例えば、「目的のタンパク質の発現」及び「目的の遺伝子の発現」を互換的に使用し、両方の表現は同じ事象を指す。本発明において、これらの用語は、好ましくは、ヒトの遺伝子及びタンパク質を指し、しかし、他の哺乳動物種、好ましくはマウス、ハムスター及びラットからの相同配列、ならびに追加の真核生物種（トリ、アヒル、コケ、寄生虫、ハエ及び酵母を含む）からの相同配列が等しく含まれる。
【０１１０】
本明細書において使用する目的のタンパク質の発現に「影響をもたらす」、又は、目的のタンパク質の分泌に「影響をもたらす」という用語は、同じものにポジティブに影響をもたらす、又は、同じものを引き起こすことを指す。本明細書において使用するこれらの用語は、好ましくは、「発現を増加させること」又は「分泌を増加させること」を指す。
【０１１１】
ポリヌクレオチド又は発現ベクターを用いた真核生物の宿主細胞の「トランスフェクション」は、遺伝子改変細胞又はトランスジェニック細胞をもたらし、当技術分野において周知の任意の方法により実施できる。トランスフェクション方法は、限定はされないが、リポソーム媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、ポリカチオン（例えばＤＥＡＥデキストラン）媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、ウイルス感染、及びマイクロインジェクションを含む。好ましくは、トランスフェクションは安定的トランスフェクションである。特定の宿主細胞の株及び型において異種遺伝子の最適なトランスフェクション頻度及び発現を提供するトランスフェクション方法が好まれる。適した方法は、ルーチンの手順により決定できる。安定なトランスフェクタントのために、コンストラクトを、宿主細胞のゲノム中又は人工染色体／ミニ染色体中のいずれかに組み込み、エピソームに位置させ、宿主細胞内に安定的に維持させる。
【０１１２】
本発明の実践では、特に明記しない限り、細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの従来の技術を用いるが、それらは当業者の技術中にある。これらの技術は、本文献中に完全に開示される。
【０１１３】
本発明は、目的の異種タンパク質を細胞中で産生させる方法に関し、ａ）ＳＭタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現、あるいは、それぞれのタンパク質又はその少なくとも１つの派生物、突然変異体もしくはフラグメントの活性を増加させること、及びｂ）目的の異種タンパク質の発現に影響をもたらすことを含む。
【０１１４】
本発明は、具体的には、目的の異種タンパク質を細胞中で産生させる方法に関し、ａ）ＳＥＣ１／Ｍｕｎｃ１８群のタンパク質（ＳＭタンパク質）からのタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させること、及びｂ）目的の異種タンパク質の発現に影響をもたらすことを含む。好ましくは、方法の工程ｂ）における目的のタンパク質の分泌を増加させる。本発明は、このように、好ましくは、目的の異種タンパク質を細胞中で産生させる方法に関し、ａ）ＳＥＣ１／Ｍｕｎｃ１８群のタンパク質（ＳＭタンパク質）からのタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させること、及びｂ）目的の異種タンパク質の分泌を増加させることを含む。
【０１１５】
本発明は、好ましくは、目的の異種タンパク質を細胞中で産生させる方法に関し、ａ）ＳＥＣ１／Ｍｕｎｃ１８群のタンパク質（ＳＭタンパク質）（Ｓｅｃ１ｐ、Ｓｌｙ１ｐ、Ｖｐｓ３３ｐ及びＶｐｓ４５ｐ、ＲＯＰ、Ｓｌｙ１及びＶｐｓ３３／カーネーション、Ｕｎｃ−１８、Ｍｕｎｃ１８−１、２及び−３、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ３３−Ａ、ＶＰＳ３３−Ｂ、ならびにＳｌｙ１から成る）より選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現を増加させること、
及びｂ）目的の異種タンパク質の発現に影響をもたらすこと、好ましくは、目的の異種タンパク質の発現、又は特に好ましくは分泌を増加させることを含む。
【０１１６】
好ましくは、工程ａ）におけるタンパク質は、ＳＥＣ１／Ｍｕｎｃ１８群のタンパク質（ＳＭタンパク質）（Ｓｅｃ１ｐ、Ｓｌｙ１ｐ、Ｖｐｓ３３ｐ、Ｖｐｓ４５ｐ、Ｍｕｎｃ１８−１、−２及び−３、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ３３−Ａ及び−Ｂ、ならびにＳｌｙ１から成る）より選択される。
【０１１７】
より好ましくは、工程ａ）におけるタンパク質は、ＳＥＣ１／Ｍｕｎｃ１８群のタンパク質（ＳＭタンパク質）（Ｍｕｎｃ１８−１、−２及び−３、ＶＰＳ４５、ＶＰＳ３３−Ａ及び−Ｂ、ならびにＳｌｙ１から成る）より選択される。
【０１１８】
最も好ましくは、工程ａ）におけるタンパク質は、ＳＥＣ１／Ｍｕｎｃ１８群のタンパク質（ＳＭタンパク質）（Ｍｕｎｃ１８−３／Ｍｕｎｃ１８ｃ及びＳｌｙ−１から成る）より選択される。
【０１１９】
本発明の特定の実施態様において、方法は、工程ａ）における１つの遺伝子がＭｕｎｃ−１８タンパク質又はＭｕｎｃ−１８タンパク質ファミリーメンバーをコードすることを特徴とする。本発明の特定の実施態様において、方法は、工程ａ）における１つの遺伝子が３つのＭｕｎｃ１８アイソフォーム、Ｍｕｎｃ１８ａ、ｂ又はｃの１つ、好ましくはＭｕｎｃ１８ｃをコードすることを特徴とする。
【０１２０】
本発明の別の特定の実施態様において、方法は、工程ａ）における１つの遺伝子がＭｕｎｃ１８ｃ（配列番号３９）をコードすることを特徴とする。
【０１２１】
本発明の特定の実施態様において、方法は、工程ａ）における１つの遺伝子がＳｌｙ−１タンパク質又はＳｌｙ−１タンパク質ファミリーメンバー、好ましくはＳｌｙ−１をコードすることを特徴とする。本発明のさらなる特定の実施態様において、方法は、工程ａ）における１つの遺伝子がＳｌｙ−１（配列番号４１）をコードすることを特徴とする。
【０１２２】
本発明の好ましい実施態様において、方法は、工程ａ）がＳＭタンパク質をコードする少なくとも２つの遺伝子の発現又は活性を増加させることを含み、それによりＳＭタンパク質が小胞輸送の２つの異なる工程に関与することを特徴とする。本発明の特定の実施態様において、方法は、ａ）１つの遺伝子がＳＭタンパク質をコードし、それが小胞と細胞膜との融合を調節し、ｂ）第２の遺伝子がＳＭタンパク質をコードし、それが小胞とゴルジ複合体との融合を調節することを特徴とする。
本発明の特に好ましい実施態様において、方法は、Ｍｕｎｃ１８ｃ（配列番号３９）及びＳｌｙ−１（配列番号４１）の発現又は活性が増加されることを特徴とする。
【０１２３】
本発明のさらなる実施態様において、方法は、工程ａ）が、ａ）ＳＭタンパク質ファミリーのメンバーをコードする第１の遺伝子の発現又は活性を増加させること、ｂ）ＳＭタンパク質ファミリーの別のメンバーをコードする第２の遺伝子、及びｃ）ＸＢＰ−１をコードする第３の遺伝子を含むことを特徴とする。
【０１２４】
本発明の特に好ましい実施態様において、方法は、Ｍｕｎｃ１８ｃ（配列番号３９）、Ｓｌｙ−１（配列番号４１）及びＸＢＰ−１（配列番号４３）の発現又は活性が増加されることを特徴とする。
【０１２５】
本発明は、さらに、細胞を操作する方法に関し、ａ）細胞中に、１つ又は複数のベクターシステム（少なくとも２つのポリペプチドをコードする核酸配列を含み、それによりｉ）少なくとも１つの第１の核酸配列がＳＭタンパク質又はその派生物、突然変異体もしくはフラグメントをコードし、及びｉｉ）第２の核酸配列が目的のタンパク質をコードする）を導入すること、ｂ）目的のタンパク質及び少なくとも１つのＳＭタンパク質又はその派生物、突然変異体もしくはフラグメントを細胞中で発現させることを含む。
【０１２６】
本発明の特定の実施態様において、方法は、核酸配列を連続的に細胞中に導入することを特徴とする。
【０１２７】
本発明のさらなる特定の実施態様において、方法は、ＳＭタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を、目的のタンパク質をコードする核酸配列の前に導入することを特徴とする。
【０１２８】
本発明の別の実施態様において、方法は、目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を、ＳＭタンパク質をコードする核酸配列の前に導入することを特徴とする。
【０１２９】
本発明の好ましい実施態様において、方法は、核酸配列を細胞中に同時に導入することを特徴とする。
【０１３０】
本発明の特定の実施態様において、方法は、ＳＭタンパク質がＭｕｎｃ−１８アイソフォームのいずれか１つ、好ましくはＭｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）又はＳｌｙ−１（配列番号４１）であることを特徴とする。
【０１３１】
本発明の好ましい実施態様において、方法は、工程ａ）ｉ）において、２つのＳＭタンパク質が組み合わせで使用され、それによりＳＭタンパク質が小胞輸送の２つの異なる工程に関与することを特徴とする。
【０１３２】
本発明のさらなる実施態様において、方法は、ａ）１つの遺伝子がＳＭタンパク質をコードし、それが小胞と細胞膜との融合を調節し、ｂ）第２の遺伝子がＳＭタンパク質をコードし、それが小胞とゴルジ複合体との融合を調節することを特徴とする。
【０１３３】
本発明の特定の実施態様において、方法は、組み合わせで使用される２つのＳＭタンパク質がＭｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）及びＳｌｙ−１（配列番号４１）であることを特徴とする。
【０１３４】
本発明の好ましい実施態様において、方法は、工程ａ）ｉ）において、２つのＳＭタンパク質がＸＢＰ−１との組み合わせで使用されることを特徴とする。
【０１３５】
本発明の特に好ましい実施態様において、方法は、ＳＭタンパク質がＸＢＰ−１（配列番号４３）と組み合わせたＭｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）及びＳｌｙ−１（配列番号４１）であることを特徴とする。
【０１３６】
本発明の別の実施態様において、方法は、細胞が真核細胞、例えば酵母、植物、寄生虫、昆虫、トリ、魚、爬虫類又は哺乳動物の細胞などであることを特徴とする。
【０１３７】
本発明の特定の実施態様において、方法は、細胞が真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞であることを特徴とする。好ましくは、脊椎動物細胞はトリ細胞、例えばニワトリ又はアヒルの細胞などである。本発明のさらなる特定の実施態様において、方法は、哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、サル腎臓ＣＶ１、サル腎臓ＣＯＳ、ヒトレンズ上皮ＰＥＲ．Ｃ６（商標）、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３、ヒトミエローマ、ヒト羊膜細胞、ベビーハムスター腎臓、アフリカミドリザル腎臓、ヒト子宮頚癌、イヌ腎臓、バッファローラット肝臓、ヒト肺、ヒト肝臓、マウス乳腺腫瘍又はミエローマ細胞、ＮＳ０、イヌ、ブタ又はマカクの細胞、ラット、ウサギ、ネコ、ヤギ、好ましくはＣＨＯ細胞であることを特徴とする。
【０１３８】
本発明の好ましい実施態様において、方法は、ＣＨＯ細胞がＣＨＯ野生型、ＣＨＯ  Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５又はそれに由来する突然変異体（ＣＨＯ突然変異体Ｌｅｃ１からＬｅｃ３５）、好ましくはＣＨＯ  ＤＧ４４であることを特徴とする。
【０１３９】
本発明のさらなる実施態様において、方法は、目的のタンパク質が治療用タンパク質であることを特徴とする。
【０１４０】
本発明の特定の実施態様において、方法は、目的のタンパク質が膜タンパク質又は分泌タンパク質、好ましくは抗体又は抗体フラグメントであることを特徴とする。
【０１４１】
本発明のさらなる特定の実施態様において、方法は、抗体がモノクローナル、ポリクローナル、哺乳動物、マウス、キメラ、ヒト化、霊長類化、霊長類、ヒト又はその抗体フラグメント又は派生物、例えば抗体、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｃ−Ｆｃ融合タンパク質、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、単一ドメインＦｖ、四価の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合型Ｆｖ、欠失ドメイン、ミニボディ、ダイアボディ、又は上のフラグメントの１つと別のペプチドもしくはポリペプチドとの融合ポリペプチド、Ｆｃペプチド融合、Ｆｃ毒素融合、スキャフォールドタンパク質であることを特徴とする。
【０１４２】
本発明のさらなる実施態様において、方法は、異種ＳＭタンパク質が少なくとも１つのＳＮＡＲＥタンパク質を含む小胞融合複合体中に存在することを特徴とする。
【０１４３】
本発明の特定の実施態様において、方法は、異種ＳＭタンパク質が少なくとも１つのＳＮＡＲＥタンパク質及びシンタキシン４又はシンタキシン５を含む小胞融合複合体中に存在することを特徴とする。
【０１４４】
本発明のさらなる実施態様において、方法は、細胞中での目的の異種タンパク質の特異的な産生性が、少なくとも５pg/細胞及び日、１５pg/細胞及び日、２０pg/細胞及び日、２５pg/細胞及び日であることを特徴とする。
【０１４５】
本発明の別の実施態様において、方法は、方法が、目的のタンパク質を発現するコントロール細胞と比較し、細胞中で目的のタンパク質の特異的な細胞産生性の増加をもたらすが、しかし、それによりコントロール細胞が任意のＳＭタンパク質の発現又は活性の増加を有さないことを特徴とする。
【０１４６】
本発明の好ましい実施態様において、方法は、産生性の増加が約５%〜約１０%、約１１%〜約２０%、約２１%〜約３０%、約３１%〜約４０%、約４１%〜約５０%、約５１%〜約６０%、約６１%〜約７０%、約７１%〜約８０%、約８１%〜約９０%、約９１%〜約１００%、約１０１%〜約１４９%、約１５０%〜約１９９%、約２００%〜約２９９%、約３００%〜約４９９%、又は約５００%〜約１０００%であることを特徴とする。
【０１４７】
本発明は、さらに、目的の膜タンパク質又は分泌タンパク質の細胞中での特異的な細胞産生性又は力価を増加させる方法に関し、ａ）細胞中に、１つ又は複数のベクターシステム（少なくとも２つのポリペプチドをコードする核酸配列を含み、それによりｉ）少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドがＳＭタンパク質又はその派生物、突然変異体もしくはフラグメントをコードし、及びｉｉ）第２のポリヌクレオチドが目的のタンパク質をコードする）を導入すること、及びｂ）目的のタンパク質及びＳＭタンパク質又はその派生物、突然変異体もしくはフラグメントを細胞中で発現させることを含む。
【０１４８】
本発明は、さらに、発現ベクター（少なくとも２つのポリペプチドをコードする発現ユニットを含み、それによりａ）少なくとも１つのポリペプチドがＳＭタンパク質又はその派生物、突然変異体又はフラグメントであり、及びｂ）第２のポリペプチドが目的のタンパク質である）に関する。
【０１４９】
本発明の特定の実施態様において、発現ベクターは、目的のタンパク質が治療用タンパク質、好ましくは抗体又は抗体フラグメントであることを特徴とする。
【０１５０】
本発明の好ましい実施態様において、発現ベクターは、抗体がモノクローナル、ポリクローナル、哺乳動物、マウス、キメラ、ヒト化、霊長類化、霊長類、ヒト、又はその抗体フラグメント又は派生物、例えば抗体、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｃ−Ｆｃ融合タンパク質、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、単一ドメインＦｖ、四価の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合型Ｆｖ、欠失ドメイン、ミニボディ、ダイアボディ、又は上のフラグメントの１つと別のペプチドもしくはポリペプチドとの融合ポリペプチド、Ｆｃペプチド融合、Ｆｃ毒素融合、スキャフォールドタンパク質であることを特徴とする。
【０１５１】
本発明の別の実施態様において、発現ベクターは、発現ユニットがマルチシストロン、好ましくはバイシストロンであることを特徴とする。
【０１５２】
本発明の特定の実施態様において、発現ベクターは、ベクターが図８に記載する発現コンストラクトのいずれかを含むことを特徴とする。
【０１５３】
本発明の好ましい実施態様において、発現ベクターは、ベクターが少なくとも１つのバイシストロン発現ユニット（以下：ａ）ＳＭタンパク質をコードする遺伝子、ｂ）ＩＲＥＳエレメント、及びｃ）ＳＭタンパク質をコードする第２の遺伝子、の通りに配置される）を含むことを特徴とする。図８ｄ）を参照のこと。
【０１５４】
本発明の別の好ましい実施態様において、発現ベクターは、それが少なくとも１つの目的のタンパク質（ＧＯＩ）及び１つのＳＭタンパク質（別々の発現ユニットから（図８ａ）又は１つのバイシストロンユニットから（図８ｂ））をコードすることを特徴とする。本発明のさらなる好ましい実施態様において、発現ベクターは、それが別々の発現カセットから（図８ｃ）又はバイシストロン（それにより２つの遺伝子がＩＲＥＳエレメントを介して連結される（図８ｄ））のいずれかでコードされる２つのＳＭタンパク質の遺伝子を含むことを特徴とする。本発明のさらなる実施態様において、発現ベクターは、それが少なくとも２つのＳＭタンパク質及び目的の遺伝子（図８ｅ）又は１つのマルチシストロン発現ユニットからのいくつかのＳＭタンパク質をコードすることを特徴とする。
【０１５５】
本発明の好ましい実施態様において、発現ベクターは、ＳＭタンパク質がＭｕｎｃ−１８アイソフォームＭｕｎｃ  ａ、ｂ、ｃの１つ、好ましくはＭｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）であることを特徴とする。
【０１５６】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、発現ベクターは、ＳＭタンパク質がＳｌｙ−１（配列番号４１）であることを特徴とする。
【０１５７】
本発明のさらなる実施態様において、発現ベクターは、少なくとも２つのＳＭタンパク質が組み合わせて使用されることを特徴とする。
【０１５８】
本発明の特定の実施態様において、発現ベクターは、少なくとも２つのＳＭタンパク質が小胞輸送の２つの異なる工程に関与することを特徴とする。
【０１５９】
本発明の別の実施態様において、発現ベクターは、ａ）１つのＳＭタンパク質が、小胞と細胞膜との融合を調節し、ｂ）第２のＳＭタンパク質が、小胞とゴルジ複合体との融合を調節することを特徴とする。
【０１６０】
本発明の好ましい実施態様において、発現ベクターは、ＳＭタンパク質がＭｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）及びＳｌｙ−１（配列番号４１）であることを特徴とする。
【０１６１】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、発現ベクターは、少なくとも２つのＳＭタンパク質がＸＢＰ−１と組み合わせて、好ましくはＭｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）及びＳｌｙ−１（配列番号４１）がＸＢＰ−１（配列番号４３）と組み合わせて使用されることを特徴とする。
【０１６２】
本発明は、さらに、少なくとも２つの異種遺伝子：ａ）ＳＭタンパク質又はその派生物、突然変異体もしくはフラグメントをコードする少なくとも１つの遺伝子及びｂ）目的のタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞に関する。
【０１６３】
本発明の特定の実施態様において、細胞は、目的のタンパク質が治療用タンパク質、好ましくは抗体又は抗体フラグメントであることを特徴とする。本発明の好ましい実施態様において、細胞は、抗体がモノクローナル、ポリクローナル、哺乳動物、マウス、キメラ、ヒト化、霊長類化、霊長類、ヒト、又はその抗体フラグメント又は派生物、例えば抗体、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｃ−Ｆｃ融合タンパク質、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、単一ドメインＦｖ、四価の一本鎖Ｆｖ、ジスルフィド結合型Ｆｖ、欠失ドメイン、ミニボディ、ダイアボディ、又は上のフラグメントの１つと別のペプチドもしくはポリペプチドとの融合ポリペプチド、Ｆｃペプチド融合、Ｆｃ毒素融合、スキャフォールドタンパク質であることを特徴とする。
【０１６４】
本発明の特定の実施態様において、細胞は、ＳＭタンパク質の発現レベルが内因性レベルを有意に、好ましくは１０%上回ることを特徴とする。本発明の別の実施態様において、細胞は、タンパク質の発現レベルが内因性レベルを５%上回り、好ましくは内因性レベルを１０%、１５%、２０%、２５%、３０%、３５%、４０%、４５%、５０%、５５%、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、１００%、１２０%、１５０%、１７５%、２００%、３００%、４００%、５００%、１０００%上回る。
【０１６５】
本発明のさらなる実施態様において、細胞は、本発明の発現ベクターのいずれかを含む。
【０１６６】
本発明の特定の実施態様において、細胞は、細胞が真核細胞、好ましくは脊椎動物細胞、最も好ましくは哺乳動物細胞であることを特徴とする。具体的には、げっ歯類細胞が好ましい。
【０１６７】
本発明の好ましい実施態様において、細胞は、真核細胞がトリ細胞であることを特徴とする。
【０１６８】
本発明のさらなる特定の実施態様において、細胞は、哺乳動物細胞がげっ歯類細胞、好ましくはハムスター細胞又はマウス細胞であることを特徴とする。本発明の好ましい実施態様において、細胞は、哺乳動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、サル腎臓ＣＶ１、サル腎臓ＣＯＳ、ヒトレンズ上皮ＰＥＲ．Ｃ６（商標）、ヒトミエローマ、ヒト羊膜細胞、ヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３、ベビーハムスター腎臓、アフリカミドリザル腎臓、ヒト子宮頚癌、イヌ腎臓、バッファローラット肝臓、ヒト肺、ヒト肝臓、マウス乳腺腫瘍又はミエローマ細胞、ＮＳ０、イヌ、ブタ又はマカクの細胞、ラット、ウサギ、ネコ、ヤギ、好ましくはＣＨＯ細胞であることを特徴とする。
【０１６９】
本発明のさらなる好ましい実施態様において、細胞は、ＣＨＯ細胞がＣＨＯ野生型、ＣＨＯ  Ｋ１、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ  Ｐｒｏ−５又はそれに由来する突然変異体（ＣＨＯ突然変異体Ｌｅｃ１からＬｅｃ３５）、好ましくはＣＨＯ  ＤＧ４４であることを特徴とする。
【０１７０】
本発明の特に好ましい実施態様において、細胞は、細胞がＣＨＯ細胞、好ましくはＣＨＯ  ＤＧ４４細胞であることを特徴とする。
【０１７１】
本発明は、さらに、目的のタンパク質、好ましくは本発明の方法のいずれかにより産生される抗体に関する。
【０１７２】
本発明は、さらに、１つ又はいくつかのＳＭタンパク質の活性又は発現、好ましくは発現をブロック又は低下させるために有用な化合物及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。
【０１７３】
本発明の特定の実施態様において、医薬組成物は、化合物がポリヌクレオチド配列であることを特徴とする。好ましくは、ポリヌクレオチド配列はｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ、最も好ましくはｓｈＲＮＡである。
【０１７４】
本発明のさらなる特定の実施態様において、医薬組成物は、ＳＭタンパク質がＭｕｎｃ−１８ｃ（配列番号３９）もしくはＳｌｙ−１（配列番号４１）又は２つの組み合わせであることを特徴とする。
【０１７５】
本発明は、さらに、ａ）少なくともＳＭタンパク質又はその派生物、突然変異体もしくはフラグメント、好ましくはＭｕｎｃ−１８ｃを提供すること、ｂ）工程ａ）のＳＭタンパク質をテスト薬剤と接触させること、ｃ）タンパク質分泌又は細胞表面タンパク質の発現の増加又は減少に関連する効果を判断することを含む、ＳＭタンパク質機能のモジュレーターを同定するための方法に関する。
【０１７６】
本発明は、さらに、癌、自己免疫疾患及び炎症の処置のための方法であって、それを必要とする患者に治療的有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
【０１７７】
本発明は、また、癌、自己免疫疾患及び炎症の処置のための本発明の医薬組成物の適用を含む方法に関する。
【０１７８】
本発明は、また、細胞を本発明の医薬組成物と接触させることを含む、細胞の増殖又は移動を阻害又は低下させる方法に関する。
【０１７９】
本発明の可能な治療的適用は、癌治療、自己免疫疾患及び炎症における細胞間コミュニケーションを制御するために、タンパク質、例えば細胞又は組織からの炎症メディエータ、成長因子、血管新生因子などの分泌を妨げること、又は、浮遊状態での成長を促し、細胞凝集を妨げる目的のためのアンカー型膜貫通タンパク質の細胞表面での存在を低下させることによる細胞付着の低下を含む。
【０１８０】
本発明は、さらに、目的のタンパク質の分泌及び／又は産生を増加させるための、ＳＭタンパク質又はＳＭタンパク質をコードするポリヌクレオチドのインビトロ細胞又は組織培養システムでの使用に関する。好ましくは、ＳＭタンパク質は、Ｍｕｎｃ  １８タンパク質は、例えばＭｕｎｃ１８ｃ（配列番号３９）である。また、Ｓｌｙ−１タンパク質、例えばＳｌｙ−１（配列番号４１）が好ましい。
【０１８１】
本発明は、さらに、本発明の方法、発現ベクター、細胞又は医薬組成物のいずれかの診断的使用に関する。
【０１８２】
本発明は、追加で、細胞のタンパク質分泌を増強する／細胞を操作する／細胞中で目的の異種タンパク質を産生するための方法に関し、以下
ａ）ヒトＳｅｃ１／Ｍｕｎｃ１８及びＳｌｙ１／ＳＣＦＤ１の、発現ベクター（例、哺乳動物ＢＩ−ＨＥＸ（登録商標）発現プラットフォーム）中へのクローニング、それによりタンパク質は１つ又は異なるバイ／マルチシストロン発現ユニットによりコードされうる、及び、それによりタンパク質は同じ又は異なるプラスミド上に含まれうる、
ｂ）コンストラクトの、単独又は組み合わせのいずれかでの、同時又は連続的のいずれかでの、真核生物の宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３、ＰｅｒＣ．６などへのトランスフェクション、
ｃ）場合により、トランスジーン発現の検証、
ｄ）目的の遺伝子（ＧＯＩ）、好ましくは分泌タンパク質又は膜貫通タンパク質をコードするコンストラクトの導入、
ｅ）ＧＯＩの、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット又はフローサイトメトリーによる発現分析を含む。あるいは、工程（ｂ＋ｃ）及び（ｄ＋ｅ）の順番を変えることができ、それによりＧＯＩを最初に導入し、又は工程（ｂ）及び（ｄ）を同時に行うことができる。
【０１８３】
一般的に上に記載する本発明は、以下の実施例の参照によりより容易に理解されうる。実施例は、本明細書により、単に、本発明の特定の実施態様の例証の目的のために含まれる。以下の実施例は非限定的である。それらは、単に、本発明の可能な実施態様を示す。当業者は、条件を簡単に調整し、それを他の実施態様に適用しうる。
【０１８４】
実験
材料及び方法
プラスミドの設計
ヒトｓｌｙ１をＨＥＫ−２９３全ＲＮＡからオリゴヌクレオチドＯＲＰ７０
【表２】
2011505850.tif 000004
及びＯＲＰ７１
【表３】
2011505850.tif 000005
を使用してＲＴ−ＰＣＲ増幅させ、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩを用いてｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）中にクローン化し、ｐＲＰ２４（ＰｈＣＭＶ−ｓｌｙ１−ｐＡＳＶ４０）をもたらす。同様に、ｍｕｎｃ１８ｃをクローン化
【表４】
2011505850.tif 000006
し、ｐＲＰ１７（ＰｈＣＭＶ−ｍｕｎｃ１８ｃ−ｐＡＳＶ４０）をもたらす。ｐＲＰ３２  （ＰｈＣＭＶ−ＥＹＦＰ−ｓｌｙ１−ｐＡＳＶ４０）を、ｓｌｙ１（ＯＲＰ２９
【表５】
2011505850.tif 000007
及びＯＲＰ３０
【表６】
2011505850.tif 000008
を使用してｐＲＰ２４からＰＣＲ増幅した）をＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩを用いてｐＥＹＦＰ−Ｃ１（Clontech）中に挿入することにより構築する。ｐＲＰ２３（ＰｈＣＭＶ−ＥＹＦＰ−ｍｕｎｃ１８ｃ−ｐＡＳＶ４０）を、ｍｕｎｃ１８ｃをＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩを用いてｐＲＰ１７から切り出し、それをＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩを用いてｐＥＹＦＰ−Ｃ１中にクローン化することにより設計する。ｐＲＰ３を、ｓｌｙ１（ＯＲＰ９
【表７】
2011505850.tif 000009
及びＯＲＰ１０
【表８】
2011505850.tif 000010
を使用してＰＣＲ増幅した）をＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩを用いてｐＲＰ１（ｐＩＲＥＳｎｅｏ（Clontech）に由来する）中に挿入し、ネオマイシン耐性を与える遺伝子をＳｍａＩ／ＸｂａＩを用いてＧＦＰ（ＯＲＰ５
【表９】
2011505850.tif 000011
及びＯＲＰ６
【表１０】
2011505850.tif 000012
を使用してｐＬＥＧＦＰ−Ｎ１（Clontech）からＰＣＲ増幅した）と置き換えることにより生成する。同様に、ｐＲＰ４を、ｍｕｎｃ１８ｃ（ｐＲＰ１７
【表１１】
2011505850.tif 000013
からＰＣＲ増幅した）をＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩを用いてｐＲＰ１中に挿入することにより構築する。ｐＲＰ２９（ＰｈＣＭＶ−ＥＣＦＰ−ｓｙｎｔａｘｉｎ４−ｐＡＳＶ４０）を、シンタキシン４
【表１２】
2011505850.tif 000014
のＰＣＲ媒介性の増幅、それに続くＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩを用いたｐＥＣＦＰ−Ｃ１（Clontech）中へのクローン化により構築する。同様に、シンタキシン５をクローン化
【表１３】
2011505850.tif 000015
し、ｐＲＰ４０（ＰｈＣＭＶ−ＥＣＦＰ−ｓｙｎｔａｘｉｎ５−ｐＡＳＶ４０）をもたらす。ｓｌｙ１又はｍｕｎｃ１８ｃ特異的ｓｈＲＮＡを持つ発現ベクターを、二本鎖ＤＮＡフラグメントをＢｂｓＩ／ＸｂａＩを用いてｐｍＵ６中に挿入することによりクローン化：（ｉ）ｓｌｙ１
【表１４】
2011505850.tif 000016
；（ｉｉ）ｍｕｎｃ１８ｃ
【表１５】
2011505850.tif 000017
；（ｉｉｉ）コントロールｓｈＲＮＡ
【表１６】
2011505850.tif 000018
する。
【０１８５】
ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするｐＳＥＡＰ２−ｃｏｎｔｒｏｌを、Clontechから購入し、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の分泌αアミラーゼ（ＳＡＭＹ）を持つｐＳＳ１５８が以前に記載されている４９。ヒト血管内皮成長因子１２１（ＶＧＥＦ１２１）を含むｐＷＷ２７６ならびにヒトＩｇＧ１リツキシマブの重鎖及び軽鎖をそれぞれコードするｐＷＷ９４３及びｐＷＷ９４６が、ご厚意でWilfried Weberにより提供されている。ｘｂｐ−１発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｘｂｐ−１（ＰｈＣＭＶ−ｘｂｐ−１−ｐＡＳＶ４０）は、以前に記載されている（Tigges and Fussenegger, 2006）。
【０１８６】
細胞培養及びトランスフェクション
ａ）付着細胞の培養：
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）及びヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）を、ChoMaster HTS培地（Cell Culture Technology, Gravesano, Switzerland）又はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）（５%  ＦＣＳ（PAN Biotech, Aidenbach, Germany；cat. no. 3302, lot no.P231902）を添加）中で、３７℃で、５%  ＣＯ２を含む加湿空気中で培養する。一過性トランスフェクションのために、１×１０５個の細胞を１２ウェルの組織培養プレートの１つのウェル中に播種し、２４時間後に改変リン酸カルシウムベースのプロトコール４７又はＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Roche, Basel, Switzerland）を使用してトランスフェクトする。構成的なトランスジーン発現のために操作されたモノトランスジェニックな安定ＣＨＯ−Ｋ１派生物を、以下の組み合わせの発現ベクター及び選択ベクターならびに抗生物質を使用して産生する：（ｉ）ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３；ｐＲＰ２４；４００μg/ml  Ｇ４１８（Merck）；（ｉｉ）ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９、ｐＲＰ１７；４００μg/ml  Ｇ４１８。ダブルトランスジェニック細胞株ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｘｂｐ１４を、それぞれｐＲＰ１７及びｐＰＵＲ（Clontech）、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｘｂｐ−１３５及びｐＰＵＲの、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３中へのコトランスフェクション、それに続くＧ４１８及びピューロマイシン（４μg/ml）でのクローン選択により構築する。トリプルトランスジェニック細胞株ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７（ｓｌｙ１、ｍｕｎｃ１８ｃ及びｘｂｐ−１の構成的発現を可能にする）を、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｘｂｐ−１及びｐＺｅｏＳＶ２（Invitrogen）のＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１へのコトランスフェクション、それに続くＧ４１８（４００μg/ml）、ピューロマイシン（４μg/ml）、及びゼオシン（１５０μg/ml）での選択により構築する。
【０１８７】
ｂ）浮遊培養
モノクローナル抗体（ｍＡＢ）産生ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞（Urlaub et al., 1986）及びその安定トランスフェクタントの浮遊培養物を、ＢＩ商標の化学的に定義された無血清培地中でインキュベートする。シードストック培養物を２〜３週間毎に継代培養する（播種密度はそれぞれ３×１０５〜２×１０５個細胞/ml）。細胞をＴフラスコ又は振盪フラスコ（Nunc）中で成長させる。Ｔフラスコを加湿インキュベータ（Thermo）中で、振盪フラスコをMultitron HTインキュベータ（Infors）中で、５%  ＣＯ２、３７℃及び１２０rpmでインキュベートする。細胞の濃度及び生存率を、血球計を使用したトリパンブルー排除により測定する。
【０１８８】
流加培養
細胞を、３×１０５個細胞/mlで、１０００ml振盪フラスコ中へ、抗生物質又はＭＴＸを伴わない２５０mlのＢＩ商標産生培地（Sigma-Aldrich, Germany）中へ播種する。培養物を、１２０rpmで、３７℃及び５%  ＣＯ２（後に、細胞数が増加するにつれて２%まで低下する）中で撹拌する。培養パラメータ（ｐＨ、グルコース及び乳酸の濃度を含む）を毎日測定し、ｐＨを、必要に応じてＮａＣＯ３を使用してｐＨ  ７．０に調整する。ＢＩ商標フィード溶液を２４時間毎に加える。細胞の密度及び生存率を、自動ＣＥＤＥＸ細胞定量化システム（Innovatis）を使用したトリパン−ブルー排除により測定する。細胞培養液からサンプルを回収し、ＥＬＩＳＡによる力価測定に供する。
【０１８９】
ＥＬＩＳＡでは、ヒトＦｃフラグメントに対する抗体（Jackson Immuno Research Laboratories）及びヒトカッパ軽鎖ＨＲＰ抱合体に対する抗体（Sigma）を使用する。
【０１９０】
累積的で特異的な産生性を、所定の日での産物濃度（その時間点までの「生存細胞の積分」（ＩＶＣ）により割る）として算出する。
【０１９１】
ＲＮＡ単離、ＲＴ−ＰＣＲ、及び定量的リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、哺乳動物細胞から、NucleoSpin RNA IIキット（Macherey-Nagel, Oensingen, Switzerland）を使用して調製し、ＲＴ−ＰＣＲを、TITANIUM（商標）One-Step RT-PCRキット（Clontech）を用いて、製造業者のプロトコールに従って実施する。ｓｅａｐ、ｓａｍｙ及びｖｅｇｆ１２１  ｍＲＮＡの相対的な定量化を、Applied Biosystems 7500リアルタイムＰＣＲデバイスを用いて、２５μlの反応（Power SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems, Warrington, UK）、１００ngのｃＤＮＡ、９００nMのｓｅａｐに特異的なフォワード及びリバースのプライマー
【表１７】
2011505850.tif 000019
）を使用して実施する。全てのサンプルを、リボソーム１８Ｓ−ＲＮＡ特異的な転写物アッセイ（Applied Biosystems）を使用して標準化し、融解曲線分析を全てのアンプリコンについて行い、非特異的な増幅の非存在を確認する。
【０１９２】
共焦点顕微鏡法
ＨＥＫ−２９３を、ポリリジンコーティングしたガラススライド上に播種し、トランスフェクトし、４８時間後にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、パラホルムアルデヒド（３%  w/v）で固定し、ＰＢＳで再び洗浄し、共焦点顕微鏡により分析する。画像をLeica TCS SP1（Leica, Heerbrugg, Switzerland）を用いて記録し、Adobe Photoshop 10により分析する。
【０１９３】
抗体、免疫沈降法及びウエスタンブロット
哺乳動物細胞を氷上で溶解緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ  ７．５、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＤＴＴ、１mM  ＥＤＴＡ、１%  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中に溶解する。全タンパク質ライセートを１４，０００ｘｇでの遠心分離（１０分間４℃）、それに続くプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Amersham Biosicences, Uppsla, Sweden）を用いたインキュベーション（３０分間４℃）により得る。免疫沈降は、２mgの全タンパク質を親和性精製Ｍｕｎｃ１８ｃ抗体（プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅへ共役した）と、最終容積５００μlの溶解緩衝液中で、４℃で一晩の回転により混合させることにより実施する。ビーズを次に５００μl溶解緩衝液で４回洗浄し、タンパク質を溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、それに続くウエスタンブロット分析により分離する。Ｓｌｙ１に特異的な抗体は、ご厚意で、Jesse Hay（University of Montana, Missoula, MO, USA）により提供される。Ｍｕｎｃ１８ａ、シンタキシン４及びＶａｍｐ２に特異的な抗体をSynaptic Systems（Goettingen, Germany）から購入し、Ｍｕｎｃ１８ｂ、Ｍｕｎｃ１８ｃ及びｐ２７Ｋｉｐ１に対する抗体はSanta Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA, USA）からである。ブロットしたタンパク質をECL-Plus検出試薬及びＨＲＰ抱合二次抗体（Amersham, Piscataway, NJ, USA）を使用して可視化する。
【０１９４】
タンパク質の産生
タンパク質の産生を、４８時間後に培養中で標準化アッセイ：ＳＥＡＰ、ｐ−ニトロフェニルリン酸ベースの吸光度の時間経過、ＳＡＭＹ、ブルースターチPhadebas（登録商標）アッセイ（Pharmacia Upjohn, Peapack, NJ, cat. no. 10-5380-32）；ヒトＶＥＧＦ１２１特異的ＥＬＩＳＡ（R&D Systems, Minneapolis, MN, cat. no. DY293）によるＶＥＧＦ１２１及びＥＬＩＳＡ（Sigma, cat. no. I2136及びA0170）によるリツキシマブ、を使用して評価する。
【０１９５】
浮遊培養中で成長している細胞の抗体力価及び特異的な産生性を、以下の通りに測定する：
抗体産生ＣＨＯ−ＤＧ４４を、バイシストロンベクターを用いてトランスフェクトし、異種タンパク質発現のｍＡｂ産生性に対する効果を分析する。シードストック培養中での産生性を評価するために、細胞培養上清からのサンプルを３つの連続継代から回収する。産物の濃度を、次に、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により分析する。ＥＬＩＳＡでは、ヒトＦｃフラグメントに対する抗体（Jackson Immuno Research Laboratories）及びヒトカッパ軽鎖ＨＲＰ抱合体に対する抗体（Sigma）を使用する。細胞の密度及び生存率と一緒に、特異的な産生性を以下の通りに算出する：
【数１】
2011505850.tif 000020
ｑｐ＝特異的な産生性（pg/細胞/日）
ｍＡｂ＝抗体濃度（mg/L）
ｔ＝時間点（日）
ｃｃ＝細胞数（×１０６個細胞/mL）
Ｐ＝継代
【０１９６】
リツキシマブのＮ結合型グリコシル化プロファイル
リツキシマブをプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用して精製し、１０mMグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）を用いて溶出し、その後に２M  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）で中和する。精製／完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認する。オリゴ糖を、次に、抗体からＮグリコシダーゼ消化（PNGaseF, EC 3.5.1.52, QA-Bio, San Mateo, CA）（２mM  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）中の０．０５mU/mgタンパク質で、３７℃で３時間）により酵素的に放出させる。放出したオリゴ糖を、マトリクスとしてＤＨＢを用いたＭＡＬＤＩ分析（Papac et al., 1998）（陽イオンモードで動作するAutoflex MALDI/TOF（Bruker Daltonics, Faellanden, Switzerland）を使用する）の前に、１５０mM酢酸中でインキュベートする。
【０１９７】
ＨＲＰ輸送アッセイ
ヒトＨＴ１０８０線維肉腫細胞を、分泌西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｓｓＨＲＰ）をコードするコンストラクト及び空ベクター、Ｍｕｎｃ１８ｃ、Ｓｌｙ１のための発現コンストラクト、又はＭｕｎｃ１８ｃ、Ｓｌｙ１の両方をコードするバイシストロン発現ユニットのいずれかを用いてコトランスフェクトする。トランスフェクションから２４時間及び４８時間後、細胞培養液からのサンプルを採取し、レポーター−タンパク質ｓｓＨＲＰの分泌を清澄化した細胞上清とＴＭＢ試薬（BD Biosciences, Pharmingen）とのインキュベーションにより検出する。３分後、反応を停止させ、吸光度を４５０nmのＥＬＩＳＡリーダー（Spectra Rainbow Thermo）を用いて測定し、ｓｓＨＲＰ力価を測定する。特異的な産生性をさらに分析するために、細胞を最後の測定後にトリプシン処理し、ＣＡＳＹ（登録商標）セルカウンター（Schaerfe System）を使用してカウントし、特異的な産生性を、ｓｓＨＲＰ力価を全細胞数により割ることにより算出する。
【０１９８】
実施例
実施例１：Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃは、ＨＥＫ−２９３において分泌経路に沿って局在化する。
本発明者らはＲＴ−ＰＣＲベースの分析を使用し、ＨＥＫ−２９３におけるＳＭタンパク質Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８のアイソフォーム（ａ、ｂ、ｃ）の発現をプロファイリングする。図１ａ及び１ｂに示す通り、ｓｌｙ１（ＮＭ＿０１６１６０）及びｍｕｎｃ１８ｃ（ＮＭ＿００７２６９）が高レベルで、ｍｕｃ１８ｂ（ＮＭ＿００６９４９）が微量レベルで発現されるが、ニューロン特異的ｍｕｎｃ１８ａ（ＮＭ＿００３１６５）の転写物は検出できない。ＳＭタンパク質プロファイルをウエスタンブロットにより確認する（図１ｃ）。Ｓｌｙ１の細胞内局在化及び主要なＭｕｎｃ１８アイソフォームＭｕｎｃ１８ｃを、ＨＥＫ−２９３においてＹＦＰ−Ｓｌｙ１（ｐＲＰ３２）及びＣＦＰ−シンタキシン５（ｐＲＰ４０）、又はＹＦＰ−Ｍｕｎｃ１８ｃ（ｐＲＰ２３）及びＣＦＰ−シンタキシン４（ｐＲＰ２９）を同時発現させることにより分析する。シンタキシン５はＳｌｙ１結合ＳＮＡＲＥであり、ゴルジ装置に局在化し、シンタキシン４はＭｕｎｃ１８ｃ相互作用ＳＮＡＲＥであり、細胞膜に結合する。共焦点顕微鏡法によって、Ｓｌｙ１がゴルジ装置でシンタキシン５と非常にコンパクトな核周囲共局在化を呈し、細胞膜がＭｕｎｃ１８ｃ及びシンタキシン４について同時染色されることが示される（図１ｄ）。これらの結果によって、Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃがＨＥＫ−２９３において発現され、ゴルジ装置及び細胞膜に局在化することが実証され、これはそれぞれのオルガネラでの２つの別個の融合工程におけるそれらの役割と一致する（Jahn et al., 2003）。
【０１９９】
実施例２：Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８はタンパク質分泌を調節する。
ＳＭタンパク質は小胞融合（細胞内タンパク質輸送に必須であるが、しかし、タンパク質分泌でのそれらの役割が分かりにくいままである）を制御することが公知である。全エキソサイトーシスに及ぼすＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８の影響を特性付けするために、本発明者らはこれらのＳＭタンパク質に特異的なｓｈＲＮＡを設計する。Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃのノックダウンは、ジシストロンＳｌｙ１−（ｐＲＰ３；ＰｈＣＭＶ−ｓｌｙ１−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ−ｐＡ）及びＭｕｎｃ１８ｃ−（ｐＲＰ４；ＰｈＣＭＶ−ｍｕｎｃ１８ｃ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰ−ｐＡ）（レポーターコンストラクト、そして特異的ならびに非特異的なコントロールｓｈＲＮＡをコードする）を用いてコトランスフェクトした細胞の蛍光顕微鏡法により実証される（図２）。個々のｓｈＲＮＡが内因性Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ発現をノックダウンする能力が、ＨＥＫ−２９３において確認され、最高７０%に達する（図３ａ及び３ｃ）。哺乳動物細胞の全タンパク質分泌能力に及ぼすＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃノックダウンの影響を分析するために、本発明者らは、ｐＳＥＡＰ２−ｃｏｎｔｒｏｌ及びｐＲＰ５（ｓｈＲＮＡｓｌｙ１＿１）、ｐＲＰ６（ｓｈＲＮＡｓｌｙ１＿２）、ｐＲＰ７（ｓｈＲＮＡｓｌｙ１＿３）、又はｐＲＰ１２（ｓｈＲＮＡｍｕｎｃ１８ｃ＿１）、ｐＲＰ１４（ｓｈＲＮＡｍｕｎｃ１８ｃ＿２）、ｐＲＰ３８（ｓｈＲＮＡｍｕｎｃ１８ｃ＿３）、ｐＲＰ３９（ｓｈＲＮＡｍｕｎｃ１８ｃ＿４）をＨＥＫ−２９３中へコトランスフェクトし、培養上清中でのＳＥＡＰレベルをプロファイリングした。Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃノックダウンとＳＥＡＰ産生における減少との直接的な相関は、哺乳動物の分泌経路におけるこれらのＳＭタンパク質の中心的な役割を示唆する（図３ｂ及び３ｄ）。
【０２００】
実施例３：Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃの異所性発現によって哺乳動物細胞の分泌能力が増加する。
ＣＨＯ−Ｋ１におけるＳｌｙ１又はＭｕｎｃ１８ｃの異所性発現に続き（図４ａ、４ｂ、４ｃ）、ＳＥＡＰ、ＳＡＭＹ又はＶＥＧＦ１２１の異種産生が、産物遺伝子の転写を促すために使用されるプロモーター（ＰＳＶ４０、ＰｈＣＭＶ、ＰＥＦ１α）に非依存的に最高５倍増加される。同様の結果が、ＨＥＫ−２９３細胞を使用する場合にも観察される（データ示さず）。異種タンパク質産生の増進は、翻訳後機構により媒介される。なぜなら、ＳＥＡＰ、ＳＡＭＹ及びＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルは、Ｓｌｙ１、Ｍｕｎｃ１８ｃ、又は両方の上昇の存在又は非存在において、およそ一定であるからである（図４ｄ）。本発明者らの結果は、過去の試験とは明瞭に対照的であり、一連の細胞型（脂肪細胞及び筋細胞）におけるエキソサイトーシスのためのＭｕｎｃ１８タンパク質の阻害効果を主張し（Riento et al., 2000；Kanda et al., 2005；Tellam et al., 1997；Thurmond et al., 1998）、Ｍｕｎｃ１８ｃ及びＳｌｙ１の両方が全エキソサイトーシスを促進するとの最初の証拠を提供する。
【０２０１】
実施例４：分泌経路に対するＳＭタンパク質及びＸｂｐ−１の相乗効果
Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ならびにＸｂｐ−１は、近年、分泌オルガネラのサイズを増加させることによりタンパク質分泌を増強し（Tigges and Fussenegger, 2006）、分泌経路において異なる標的を有することが確認されているため、それらはタンパク質産生を相乗的に増強することが可能でありうる。本発明者らは、従って、Ｓｌｙ１、Ｍｕｎｃ１８ｃ及びＸｂｐ−１をコードする、ならびに、ＳＥＡＰ、ＳＡＭＹ及びＶＥＧＦ１２１を含む発現ベクターの異なる組み合わせをＣＨＯ−Ｋ１中にコトランスフェクトし、培養上清中のレポータータンパク質レベルをプロファイリングする。図４ａに示す通り、ｓｌｙ１及びｍｕｎｃ１８ｃの同時過剰発現は、ｓｌｙ１又はｍｕｎｃ１８ｃ単独による５倍と比較し、ＳＥＡＰ産生における８倍の増加を導く。ＳＡＭＹ及びＶＥＧＦ１２１の分泌も増加する（図４ｂ、４ｃ）。ｓｌｙ１、ｍｕｎｃ１８ｃ及びｘｂｐ−１の過剰発現は、一斉に、ＳＥＡＰ、ＳＡＭＹ及びＶＥＧＦの分泌をそれぞれ１０倍、１２倍及び８倍増加させ（図４ａ、４ｂ、４ｃ）、Ｓｌｙ１とＭｕｎｃ１８ｃの間、及び２つのＳＭタンパク質と一般的なオルガネラ膨張因子Ｘｂｐ−１の間での分泌に対する相乗効果の存在を明確に実証する。
【０２０２】
実施例５：ＳＭタンパク質は、ＳＮＡＲＥ媒介性の輸送機構を刺激することにより分泌経路を増強する。
過去の試験では、エキソサイトーシスにおけるＭｕｎｃ１８ｃに阻害的な役割を割り当てており、それは本発明の結果とは対照的である（Riento et al., 2000；Kanda et al., 2005；Tellam et al., 1997；Thurmond et al., 1998）。輸送機構、特にシンタキシン４、ＳＮＡＰ−２３及びＶＡＭＰ２から成るエキソサイトーシスＳＮＡＲＥタンパク質とのその相互作用におけるＭｕｎｃ１８ｃの役割に分子的洞察を提供するために、本発明者らは免疫沈降実験を実施する。図５に示す通り、Ｍｕｎｃ１８ｃ特異的抗体は、シンタキシン４、ＳＮＡＰ−２３及びＶＡＭＰ２の有意な分画と共にＭｕｎｃ１８ｃを定量的に沈殿させ、Ｍｕｎｃ１８ｃとこれらのＳＮＡＲＥとのインビボでの結合を示し、分泌経路において小胞−オルガネラ融合を促す（Peng and Gallwitz, 2002；Shen et al., 2007；Scott et al., 2004）。この知見は、Ｓｌｙ１（完全に組み立てられたＳＮＡＲＥ複合体に結合し、ゴルジ装置への融合を促す）と同様に、Ｍｕｎｃ１８ｃは直接的にＳＮＡＲＥ複合体とも相互作用することを強調しており、ＳＮＡＲＥ媒介性の輸送機構を促進することによる保存された作用機構を示唆する。
【０２０３】
実施例６：哺乳動物細胞における分泌能力の増加のための哺乳動物細胞のＳＭタンパク質ベースの操作。
哺乳動物細胞の分泌能力に対するＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ発現のポジティブな効果は、分泌増加のために哺乳動物産生細胞株を操作するための新規の翻訳後アプローチを指摘する。本発明者らは、従って、ｓｌｙ１（ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３）又はｍｕｎｃ１８ｃ（ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ８及びＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９）のいずれかの構成的発現のために操作された安定なＣＨＯ−Ｋ１由来細胞株を生成する。ＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３は、４倍及び８倍だけＳＥＡＰ分泌を（図６ａ）、４倍及び５倍だけＳＡＭＹ産生を（図６ｂ）刺激する。興味深いことに、より多くのＳＥＡＰを産生するＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３は、また、より高いＳｌｙ１レベルを示し、ＳＭタンパク質と産物タンパク質とのポジティブな相関を示唆する（図６ｃ）。同様に、構成的ｍｕｎｃ１８ｃ発現のためのトランスジェニック細胞（ＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８ｃ９）は、９倍及び６．５倍多いＳＥＡＰ及びＳＡＭＹを産生し（図６ｅ及び６ｆ）、より多くのＳＥＡＰを産生するＣＨＯ−Ｍｕｎｃ１８９は、また、より高いＭｕｎｃ１８ｃレベルを示す（図６ｄ）。安定な細胞株ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１（構成的なＳｌｙ１及びＭｕｎｃ１８ｃ発現のためのダブルトランスジェニック）及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７（構成的なＳｌｙ１、Ｍｕｎｃ１８ｃ及びＸｂｐ−１発現のためのトリプルトランスジェニック）は、親ＣＨＯ−Ｋ１と比較し、１３倍及び１６倍高いＳＥＡＰ産生を示す（図６ｇ）。
【０２０４】
実施例７：ＳＭタンパク質ベースの分泌操作によって、産生細胞株の特異的な抗体産生性が増加する。
プロトタイプ生物製剤の製造シナリオにおいてＳＭタンパク質ベースの分泌操作を検証するために、本発明者らは、モノクローナル抗ヒトＣＤ２０  ＩｇＧ１（リツキシマブとして公知）をＣＨＯ−Ｓｌｙ１１６及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１２３において（最高１０倍増加）、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ１において（最高１５倍増加）、ならびにＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｘｂｐ−１４において（最高１３倍増加）及びＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７において（最高１９倍増加）発現させる（図７ａ）。ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７中でリツキシマブを産生する場合、その場限りの産生レベルである最高４０ｐｇ／細胞／日に達することができ、それはアイソジェニックなコントロール細胞株と比較し２０倍近くの増加に相当する（図７ａ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７細胞及び野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞により産生される抗体は、構造的にインタクトであり、互いに識別不能であることが示される（図７ｂ、７ｃ）。ＣＨＯ−Ｓｌｙ１−Ｍｕｎｃ１８ｃ−Ｘｂｐ−１７において産生されるリツキシマブからのＮ結合型Ｆｃオリゴ糖のＭａｌｄｉ−ＴＯＦベースの糖プロファイリングによって、ＳＭ／Ｘｂｐ−１ベースの分泌操作が産物の品質を損なわないことを示す天然産生細胞株と比較し、差異は明らかにならなかった（図７ｄ及び７ｅ）。
【０２０５】
実施例８：ＳＭタンパク質ベースの分泌操作によって、産生プロセスにおける全抗体収率が増加する。
ａ）ＳＭタンパク質の異種発現を使用し、工業的な製造に関連する条件下での治療用タンパク質の分泌を増強することもできるか否かをテストするために、抗体産生ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ  ＤＧ４４）（ヒト化抗ＣＤ４４ｖ６  ＩｇＧ抗体ＢＩＷＡ  ４を分泌する）を、空ベクター（ＭＯＣＫコントロール）あるいはＳｌｙ１（配列番号４１）もしくはＭｕｎｃ−１８（配列番号３９）又はバイシストロン発現ユニットとしての両方のタンパク質をコードする発現コンストラクトを用いて安定的にトランスフェクトする。細胞を、次に、安定な細胞プールを得るための選択に供する。続く６継代中に、上清を全ての安定な細胞プールのシードストック培養から採取し、ＭＣＰ−１力価をＥＬＩＳＡにより測定し、平均細胞数により割り、特異的な産生性を算出する。ＳＭタンパク質のいずれかを発現する全ての細胞中で、ＩｇＧ発現が、ＭＯＣＫ又は非トランスフェクト細胞と比較して、有意に増強され、それにより最も高い値が、両方のＳＭタンパク質を同時に発現する細胞プール中で見られる。
【０２０６】
同様の結果を、安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は流加発酵に供する場合に得ることができる。全細胞数及び細胞生存率を、毎日ならびに３、５、７、９及び１１日目に測定し、サンプルを細胞培養液から採取し、ＩｇＧ力価及び特異的な産生性を測定する（図１０Ａ、Ｂ）。これらの条件下で、ＳＭタンパク質トランスジェニック細胞は、ＭＯＣＫコントロール及び非トランスフェクト親細胞株と比較し、同様の成長特性を示す。しかし、ＭＯＣＫコントロールと比較し、特異的なＩｇＧ産生性が、Ｓｌｙ１もしくはＭｕｎｃ−１８又は両方のＳＭタンパク質を同時に発現する細胞中で有意に増加し（最高５０%高い）（図１０Ａ）、産生プロセス中でのモノクローナル抗体力価における明らかな増加をもたらす（図１０Ｂ）。
【０２０７】
まとめると、このデータは、複数の培養型式（連続培養、バイオリアクターバッチ及び流加培養を含む）における治療用タンパク質産生を増強するためのＳＭタンパク質ベースの細胞操作アプローチの適用性を実証する。
【０２０８】
ｂ）ＣＨＯ宿主細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）を、最初に、Ｓｌｙ１（配列番号４１）もしくはＭｕｎｃ−１８（配列番号３９）又は両方のタンパク質を一緒にコードするベクターを用いてトランスフェクトする。細胞を選択圧に供し、ＳＭタンパク質の異種発現を実証する細胞株を選別する。続いて、これらの細胞株及び並行してＣＨＯ  ＤＧ  ４４野生型細胞を、目的の遺伝子としてヒトモノクローナルＩｇＧ型抗体をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクトする。２回目の選択後、上清を、全ての安定な細胞プールのシードストック培養から、続く６継代の期間にわたり採取し、ＩｇＧ力価をＥＬＩＳＡにより測定し、平均細胞数により割り、特異的な産生性を算出する。
【０２０９】
最も高い値が両方のＳＭタンパク質を持つ細胞プールにおいて見られ、Ｓｌｙ１又はＭｕｎｃ−１８のいずれか単独を発現するものが続き、それらは依然として、ＳＭタンパク質のいずれも発現しないＣＨＯ  ＤＧ−４４細胞と比較して、有意に高い抗体力価を産生する。同様の結果を、安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は流加発酵に供する場合に得ることができる。これらの設定の各々において、両方のＳＭタンパク質の一緒での過剰発現は、両方（抗体力価及び特異的な産生性）における有意な増加を導く。これは、Ｓｌｙ１又はＭｕｎｃ−１８単独の異種発現が、治療用抗体の分泌を増強するために十分であることを示す。加えて、両方のタンパク質の組み合わせでの異種発現は、一体化して、相乗的な様式で、一過性ならびに安定なトランスフェクト細胞株における全エキソサイトーシスを増加させる。
【０２１０】
実施例９：ＳＭタンパク質の過剰発現は、生物製剤用タンパク質（線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ））の産生を増加させる。
（ａ）膜貫通ゼラチナーゼ線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）を発現するヒト線維肉腫細胞株（ＨＴ１０８０、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２１）を、空ベクター（ＭＯＣＫコントロール）あるいはＳｌｙ１（配列番号４１）もしくはＭｕｎｃ−１８（配列番号３９）又はバイシストロン発現ユニットとしての両方のタンパク質をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクトする。細胞を、次に、安定な細胞プールを得るための選択に供する。これらのプールのシードストック培養から、細胞を回収し、そしてＦＡＣＳによるＦＡＰ表面発現の決定のために固定化する、又は、細胞ライセートを、抗ＦＡＰ抗体を使用したウエスタンブロットのために調製する。ＭＯＣＫ細胞と比較し、細胞表面上のＦＡＰの量は、ＳＭタンパク質を発現する全ての細胞において有意に増加し、発現は、両方（Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ−１８）を発現する細胞において最も高い。この結果は、両方のＳＭタンパク質が相乗的に作用して、細胞表面の膜貫通タンパク質についての細胞の産生及び輸送能力を増強することを示す。
【０２１１】
ｂ）ヒトＨＴ１０８０又はＨＥＫ２９３細胞を、最初に、Ｓｌｙ１（配列番号４１）もしくはＭｕｎｃ−１８（配列番号３９）又は両方のタンパク質を一緒にコードするベクターを用いてトランスフェクトする。細胞を選択圧に供し、ＳＭタンパク質の異種発現を実証する細胞株を選別する。続いて、これらの細胞株及び並行してＨＴ１０８０又はＨＥＫ２９３野生型細胞を、目的の遺伝子としてＦＡＰアルファをコードするベクターを用いてトランスフェクトする。２回目の選択後、細胞を、全ての安定な細胞プールの培養から採取し、ＦＡＰの発現レベルをＦＡＣＳ又はウエスタンブロッティングにより測定する。最も高い値が両方のＳＭタンパク質を持つ細胞プールにおいて見られ、Ｓｌｙ１又はＭｕｎｃ−１８のいずれか単独を発現するものが続き、それらは依然として、ＳＭタンパク質のいずれも発現しない親細胞と比較して、有意に高いＦＡＰレベルを発現する。同様の結果を、安定なトランスフェクタントを浮遊状態での成長に適用させ、バッチ発酵又は流加発酵に供する場合に得ることができる。これらの設定の各々において、両方のＳＭタンパク質の一緒での過剰発現は、ＦＡＰ発現における有意な増加を導く。これは、Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ−１８の異種発現が、膜貫通タンパク質の産生及び細胞表面局在化の改善をもたらし、それにより効果が、両方のタンパク質の組み合わせでの異種導入時に最も高いことを示す。
【０２１２】
実施例１０：ＳＭタンパク質の過剰発現は、生物製剤用タンパク質（膜貫通タンパク質上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ））の産生を増加させる。
（ａ）膜貫通タンパク質上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現するＣＨＯ細胞株（例、ＣＨＯ−ＤＧ４４）を、空ベクター（ＭＯＣＫコントロール）あるいはＳｌｙ１（配列番号４１）もしくはＭｕｎｃ−１８（配列番号３９）又はバイシストロン発現ユニットとしての両方のタンパク質をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクトする。細胞を、次に、安定な細胞プールを得るための選択に供する。これらのプールのシードストック培養から、細胞を続く４継代中に採取し、そしてＥＧＦＲの発現レベルをＦＡＣＳ又はウエスタンブロットにより測定する。ＭＯＣＫ細胞と比較し、細胞表面上のＥＧＦＲの量は、ＳＭタンパク質を発現する全ての細胞において有意に増加し、発現は、両方（Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ−１８）を発現する細胞において最も高い。極めて同様の結果を、安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は流加発酵に供する場合に得ることができる。これらの設定の各々において、Ｓｌｙ１又はＭｕｎｃ−１８のいずれかの過剰発現が、コントロールと比較し、ＥＧＦＲ発現において中程度の増加をもたらすのに対して、ＥＧＦＲレベルは、Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ−１８の同時過剰発現時に有意に増加し、両方のＳＭタンパク質が相乗的に作用し、複数の培養型式（連続培養、バイオリアクターバッチ及び流加培養を含む）における細胞表面膜貫通タンパク質についての細胞の産生及び輸送能力を増強する。
【０２１３】
ｂ）ＣＨＯ宿主細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）を、最初に、Ｓｌｙ１（配列番号４１）もしくはＭｕｎｃ−１８（配列番号３９）又は両方のタンパク質を一緒にコードするベクターを用いてトランスフェクトする。細胞を選択圧に供し、ＳＭタンパク質の異種発現を実証する細胞株を選別する。続いて、これらの細胞株及び並行してＣＨＯ  ＤＧ  ４４野生型細胞を、目的の遺伝子としてＥＧＦＲをコードするベクターを用いてトランスフェクトする。２回目の選択後、細胞を、全ての安定な細胞プールのシードストック培養から、連続６継代について採取し、ＥＧＦＲの発現レベルをＦＡＣＳ又はウエスタンブロッティングにより測定する。最も高い値が両方のＳＭタンパク質を持つ細胞プールにおいて見られ、Ｓｌｙ１又はＭｕｎｃ−１８のいずれか単独を発現するものが続き、それらは依然として、ＳＭタンパク質のいずれも発現しないＣＨＯ  ＤＧ−４４細胞と比較して、有意に高いＥＧＦＲレベルを発現する。同様の結果を、安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は流加発酵に供する場合に得ることができる。これらの設定の各々において、両方のＳＭタンパク質の一緒での過剰発現は、ＥＧＦＲ発現における有意な増加を導く。これは、Ｓｌｙ１及びＭｕｎｃ−１８の異種発現が、膜貫通タンパク質の産生及び細胞表面局在化の改善をもたらし、それにより効果が、両方のタンパク質の組み合わせでの異種導入時に最も高いことを示す。
【０２１４】
実施例１１：ＳＭタンパク質の過剰発現は、生物製剤用タンパク質（単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１））の産生を増加させる。
（ａ）単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）を分泌するＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ  ＤＧ４４）を、空ベクター（ＭＯＣＫコントロール）あるいはＳｌｙ１（配列番号４１）もしくはＭｕｎｃ−１８（配列番号３９）又はバイシストロン発現ユニットとしての両方のタンパク質をコードする発現コンストラクトを用いてトランスフェクトする。細胞を、次に、安定な細胞プールを得るための選択に供する。続く６継代中に、上清を全ての安定な細胞プールのシードストック培養から採取し、ＭＣＰ−１力価をＥＬＩＳＡにより測定し、平均細胞数により割り、特異的な産生性を算出する。ＳＭタンパク質のいずれかを発現する全ての細胞中で、ＩｇＧ発現が、ＭＯＣＫ又は非トランスフェクト細胞と比較し、有意に増強され、それにより最も高い値が、両方のＳＭタンパク質を同時に発現する細胞プール中で見られる。同様の結果を、安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は流加発酵に供する場合に得ることができる。これらの設定の各々において、両方のＳＭタンパク質の過剰発現は、ＭＣＰ−１分泌の増強を導き、両方のＳＭタンパク質が相乗的に作用し、複数の培養型式（連続培養、バイオリアクターバッチ及び流加培養を含む）における細胞のタンパク質産生能力を改善することを示す。
【０２１５】
ｂ）ＣＨＯ宿主細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４）を、最初に、Ｓｌｙ１（配列番号４１）もしくはＭｕｎｃ−１８（配列番号３９）又は両方のタンパク質を一緒にコードするベクターを用いてトランスフェクトする。細胞を選択圧に供し、ＳＭタンパク質の異種発現を実証する細胞株を選別する。続いて、これらの細胞株及び並行してＣＨＯ  ＤＧ  ４４野生型細胞を、目的の遺伝子として単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）をコードするベクターを用いてトランスフェクトする。２回目の選択後、上清を、全ての安定な細胞プールのシードストック培養から、続く６継代の期間にわたり採取し、ＭＣＰ−１力価をＥＬＩＳＡにより測定し、平均細胞数により割り、特異的な産生性を算出する。
【０２１６】
最も高い値が両方のＳＭタンパク質を持つ細胞プールにおいて見られ、Ｓｌｙ１又はＭｕｎｃ−１８のいずれか単独を発現するものが続き、それらは依然として、ＳＭタンパク質のいずれも発現しないＣＨＯ  ＤＧ−４４細胞と比較して、有意に高いＭＣＰ−１力価を産生する。同様の結果を、安定なトランスフェクタントをバッチ発酵又は流加発酵に供する場合に得ることができる。これらの設定の各々において、両方のＳＭタンパク質の一緒での過剰発現は、両方（ＭＣＰ−１力価及び特異的な産生性）における有意な増加を導く。これは、Ｓｌｙ１又はＭｕｎｃ−１８単独の異種発現が、ＭＣＰ−１分泌を増強するために十分であることを示す。しかし、両方のタンパク質の組み合わせでの異種発現は、一体化して、相乗的な様式で、一過性ならびに安定なトランスフェクト細胞株における全エキソサイトーシスを増加させる。
【０２１７】
実施例１２：ＳＭタンパク質は、ヒト細胞からのＨＲＰ分泌を増強する。
ＳＭタンパク質の過剰発現を使用し、非げっ歯類、特にヒトの細胞における分泌輸送を増強することもできるか否かという疑問に答えるために、本発明者らは、分泌型西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｓｓＨＲＰ）（構成的なタンパク質分泌のためのレポーターとして使用できる）をコードするプラスミドを使用する。
【０２１８】
ヒト線維肉腫細胞株（ＨＴ１０８０、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２１）を、ｓｓＨＲＰをコードする発現プラスミドと、空ベクター（Ｍｏｃｋコントロール）あるいはＳｌｙ１（配列番号４１）もしくはＭｕｎｃ−１８（配列番号３９）又はバイシストロン発現ユニットとしての両方のタンパク質をコードする発現コンストラクトのいずれかを用いてコトランスフェクトする。トランスフェクションから２４及び４８時間後、細胞培養上清からのサンプルを採取し、ペルオキシダーゼ活性について分析する。測定に続き、細胞をトリプシン処理及びカウントし、細胞の特異的な産生性を決定する。
【０２１９】
既に、２４時間後には、コントロール細胞と比較し、ｓｓＨＲＰ分泌におけるわずかな増加が、Ｍｕｎｃ１８又はＭｕｎｃ１８及びＳｌｙ１の両方を発現する細胞において検出できる（図９）。トランスフェクションから４８時間後、ＳＭタンパク質を発現する全ての細胞が、Ｍｏｃｋコントロールと比較し、ｓｓＨＲＰ力価の増強を示す（図９）。最も高い値が、Ｍｕｎｃ１８を用いてトランスフェクトした細胞からのサンプル中で測定され、それはコントロールサンプルと比較して１．４倍増加したＨＲＰ活性を示す。また、Ｍｕｎｃ１８、Ｓｌｙ１、又は両方のＳＭタンパク質のいずれかを用いてトランスフェクトした細胞の特異的な産生性は、コントロール細胞と比較し、有意に増強された（図９）。
【０２２０】
これによって、両方のＳＭタンパク質が機能的に発現され、ヒト細胞からのタンパク質分泌を増強することが確認される。
【０２２１】
【表１８】
2011505850.tif 000021
2011505850.tif 000022
2011505850.tif 000023
【図１ｃ】
2011505850.tif 000024
【図１ｄ】
2011505850.tif 000025
【図２ａ】
2011505850.tif 000026
【図２ｃ】
2011505850.tif 000027
【図３ｂ】
2011505850.tif 000028
【図３ｄ】
2011505850.tif 000029
【図４ａ】
2011505850.tif 000030
【図４ｂ】
2011505850.tif 000031
【図４ｃ】
2011505850.tif 000032
【図６ａ】
2011505850.tif 000033
【図６ｂ】
2011505850.tif 000034
【図６ｃ】
2011505850.tif 000035
【図６ｄ】
2011505850.tif 000036
【図６ｅ】
2011505850.tif 000037
【図６ｆ】
2011505850.tif 000038
【図６ｇ】
2011505850.tif 000039
【図７ａ】
2011505850.tif 000040
【図７ｄ】
2011505850.tif 000041
【図７ｅ】
2011505850.tif 000042
【図８ａ】
2011505850.tif 000043
【図８ｂ】
2011505850.tif 000044
【図８ｃ】
2011505850.tif 000045
【図８ｄ】
2011505850.tif 000046
【図８ｅ】
2011505850.tif 000047
【図８ｆ】
2011505850.tif 000048
【図１０Ｂ】
2011505850.tif 000049
【図１ａ】
2011505850.tif 000050
【図１ｂ】
2011505850.tif 000051
【図２ｂ】
2011505850.tif 000052
【図２ｄ】
2011505850.tif 000053
【図３ａ】
2011505850.tif 000054
【図３ｃ】
2011505850.tif 000055
【図４ｄ】
2011505850.tif 000056
【図５】
2011505850.tif 000057
【図７ｂ】
2011505850.tif 000058
【図７ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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