(57)【要約】  本発明は、樹状細胞の機能および分化を調節し、移植片生存率を増加させることができる、ヒト細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）に結合する抗体に関する。また、本発明は、前記抗体を含む医薬組成物、および疾患を治療するためにこれらを使用する方法を提供する。
2011530502.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００１９８として寄託されたハイブリドーマによって生産される抗体と、ヒト細胞間付着分子−１（ＩＣＡＭ−１）のドメイン１への結合をするために競合することを特徴とする、抗体。
【請求項２】
ヒトＩＣＡＭ−１がヒト白血球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）に結合することを阻害することなく、ヒトＩＣＡＭ−１のドメイン１に結合することを特徴とする、抗体。
【請求項３】
前記抗体は、単離された形態であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体は、単クローン抗体であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体は、ＩＣＡＭ−１との結合を通して樹状細胞の分化を調節するものであることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体は、ＭＤ−２（受託番号ＫＣＲＦ−ＢＰ−００１９８）であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体は、ＭＤ−２（受託番号ＫＣＲＦ−ＢＰ−００１９８）のヒト化された形態またはキメラ形態であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
重鎖および軽鎖を含むヒトＩＣＡＭ−１に結合する抗体であって、前記重鎖は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００１９８として寄託されたハイブリドーマによって生産される抗体の重鎖由来の３つのＣＤＲを含み、前記軽鎖は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００１９８として寄託されたハイブリドーマによって生産される抗体の軽鎖由来の３つのＣＤＲを含むものであることを特徴とする、抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載の抗体を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗体は、単離された形態であることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記抗体は、単クローン抗体であることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記抗体は、ＩＣＡＭ−１との結合を通して樹状細胞の分化を調節するものであることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗体は、移植された細胞または器官の拒絶反応を抑制するか、または移植された造血幹細胞による移植片対宿主疾患を抑制するものであることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
重鎖および軽鎖を含むヒトＩＣＡＭ−１に結合する抗体を含む医薬組成物であって、前記重鎖は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００１９８として寄託されたハイブリドーマによって生産される抗体の重鎖由来の３つのＣＤＲを含み、前記軽鎖は、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００１９８として寄託されたハイブリドーマによって生産される抗体の軽鎖由来の３つのＣＤＲを含むものであることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１７】
前記抗体は、移植された細胞または器官の拒絶反応を抑制するか、または移植された造血幹細胞による移植片対宿主疾患を抑制するものであることを特徴とする、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ヒト細胞間付着分子−１（ＩＣＡＭ−１）のドメイン１に結合する抗体を生産することを特徴とする、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００１９８として寄託された、ハイブリドーマ。
【請求項１９】
前記抗体は、ヒト細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）がヒト白血球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）に結合することを阻害することなく、ＩＣＡＭ−１に結合するものであることを特徴とする、請求項１８に記載のハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許庁に２００８年８月８日付で出願された米国特許出願第６１／０８７，２６５号に対する優先権および利益を主張し、前記米国出願は本明細書内で完全に説明されているようにすべての目的のために参考文献として本願に含まれる。
【０００２】
本発明は、樹状細胞の機能および分化を調節し、移植片生存率を増加させることができる、ヒト細胞間接着分子−１（ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ−１、ＩＣＡＭ−１）に結合する抗体に関する。また、本発明は、前記抗体を含む医薬組成物、および疾患を治療するためにこれらを使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＩＣＡＭ−１は、ドメイン１ないしドメイン５と名づけられ、Ｎ末端からＣ末端の方向に番号づけられた５つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、細胞膜透過領域および細胞内領域で構成された、９０ｋＤａのタイプＩ細胞表面糖タンパク質である（Ｃｅｌｌ．１９９０、６１：２４３−５４）。
【０００４】
ＩＣＡＭ−１は、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の相互作用のような、白血球／白血球の相互作用を媒介する。ＩＣＡＭ−１また、炎症過程中に組織への白血球の流出を媒介する（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９９９、６７：７２９−７３６）。インビトロ研究は、ＩＣＡＭ−１／白血球機能関連抗原−１（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ−１、ＬＦＡ−１）の相互作用を妨害する抗体がＴ細胞の内皮細胞への接着を阻害することができ、これらの抗体により、Ｔ細胞の活性化も混合リンパ球内で有意に減少することができることを示した（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８８、８５：３０９５−３０９９）。ヒトＩＣＡＭ−１に対するマウス（ｍｕｒｉｎｅ）の単クローン抗体であるＲ６−５−Ｄ６（エンリモマブ（ｅｎｌｉｍｏｍａｂ））を使用した猿の研究では、腎臓同種移植片生存率が増加し、移植片内へのＴ細胞の浸潤が対照群と比較して減少した（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０、１４４：４６０４−４６１２）。また、エンリモマブは、リウマチ性関節炎患者で疾患活性を抑制させる効果があることが立証された（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１９９４、３７：９９２−９９９；Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９６、２３：１３３８−１３４４）。しかし、ランダム化多施設試験によれば、腎臓移植後のエンリモマブ誘導治療は、急性拒絶反応の比率または移植片の機能が遅延する危険性を減少させることができなかった（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１９９９、６７：７２９−７３６）。また、急性虚血性脳卒中の患者での臨床実験は、エンリモマブによる抗ＩＣＡＭ−１治療が効果的でなく、脳卒中の経過を実際に有意に悪化させ、プラシーボ（ｐｌａｃｅｂｏ）と比較した時、より多くの副作用、一次感染および発熱を誘導することを示した（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００１、５７：１４２８−１４３４）。エンリモマブは、Ｔ細胞だけでなく、好中球の血管内皮細胞への接着を遮断する機能を果たし、したがって、好中球の移動を妨害するのは、潜在的に感染に対する感受性を増加させることが報告された（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９、１６２：２３５２−２３５７）。
【０００５】
樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ、ＤＣ）は、多様な免疫反応を統合させる高度に特性化された抗原提示細胞であり（Ｎａｔｕｒｅ．１９９８、３８２：２４５−２５２）、免疫の開始および免疫寛容に関連する、特化した（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）抗原提示細胞の異種ファミリーを含む。現在まで、未成熟樹状細胞は、Ｔ細胞を免疫反応不顕性（ａｎｅｒｇｙ）に誘導することが知られているのに対し、ＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）のような活性刺激剤によって成熟樹状細胞に形質転換された樹状細胞は、一次Ｔ細胞応答を誘導することが考えられてきた（Ｂｌｏｏｄ．２００６、１０８：１４３５−１４４０）。また、独特のサイトカイン生産プロファイルを有する半成熟樹状細胞は、免疫寛容性機能を付与することができる（Ｂｌｏｏｄ．２００６、１０８：１４３５−１４４０）。
【０００６】
ＩＣＡＭ−１は、樹状細胞で高いレベルで発現する。しかし、現在まで、樹状細胞内のＩＣＡＭ−１がＴ細胞−樹状細胞の相互作用中に、ＬＦＡ−１結合のための単なる接着分子として機能するものとみなされてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、樹状細胞の機能および分化を調節し、移植片生存率を増加させることができる、ヒト細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）に結合する抗体に関する。また、本発明は、前記抗体を含む医薬組成物、および疾患を治療するためにこれらを使用する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
より具体的には、本発明は、移植された細胞または器官の拒絶反応を抑制するか、または移植された造血幹細胞による移植片対宿主疾患を抑制する、抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体に関する。また、本発明は、ヒトＩＣＡＭ−１のドメイン１に結合することができるが、ＩＣＡＭ−１とそのリガンドであるＬＦＡ−１との間の相互作用は遮断しない抗体に関する。
【０００９】
また、本発明は、物質を生産する方法に関し、前記物質は、抗体またはその断片を生産する細胞を含む。さらに、本発明は、前記方法によって得られる、ハイブリドーマ細胞および前記ハイブリドーマ細胞によって生産される抗体を含む。
【００１０】
また、本発明は、移植された細胞または器官の拒絶反応を抑制するための医薬組成物を含む。医薬組成物は、ＩＣＡＭ−１に結合することができるが、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１の相互作用は阻害しない抗体、および、抗体の断片であって、ＩＣＡＭ−１に結合することができるが、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１の相互作用は阻害しない断片からなる群より選択される免疫抑制剤を含む。
【００１１】
さらに、本発明は、抗体または抗体断片からなる群より選択される免疫抑制剤を使用して移植された細胞または器官の拒絶反応を抑制するか、または移植された造血幹細胞による移植片対宿主疾患を抑制する方法に関する。前記抗体または抗体断片は、好ましくは、単クローンおよび多クローン抗体からなる群より選択され、より好ましくは、ヒトまたは動物（つまり、非ヒト）抗体である。
【００１２】
本発明に関するより完璧な理解と本発明に伴う多くの効果は、添付の図面と併せて考慮した場合、下記の詳細な説明を参照することにより、容易に明らかになり、同様によりよく理解されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】単色フローサイトメトリーを用いて、ヒトＩＣＡＭ−１形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上でのＭＤ−２およびＲ６−５−Ｄ６単クローン抗体の反応性を示す図である。
【図２】ｈ１ｍ２３４５およびｈ１２ｍ３４５ＩＣＡＭ−１変異体が形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞上でのＭＤ−２およびＲ６−５−Ｄ６単クローン抗体の反応性を示す図である。
【図３】ＭＤ−２およびＲ６−５−Ｄ６抗体の存在下での混合リンパ球反応後の、チミジン取り込みの結果を示す図である。
【図４】ＭＤ−２またはＲ６−５−Ｄ６抗体を事前培養した後の、ヒトＩＣＡＭ−１陽性ＤＵ１４５細胞上でのＲ６−５−Ｄ６およびＭＤ−２抗体の反応性を示す写真である。
【図５】表示の抗体で処理後の、樹状細胞の表面上の多様な分子の発現レベル、および樹状細胞の培養培地内のサイトカインの濃度を示す図である。
【図６】ヒト化マウスの末梢血液におけるＣＤ４５＋ヒト白血球およびＣＤ３＋ヒトＴ細胞の産成の動力学を示す図である。
【図７】ストレプトゾトシンで糖尿病を誘発した後、ラットの膵島を移植したヒト化マウスでの末梢血液グルコースレベルを示す図である。
【図８】表示の抗体で処理した膵島移植された各マウスから抽出した腎臓におけるヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色およびインシュリンに対する免疫組織化学的染色の結果を示す写真である。
【００１４】
次の実施例を参考にして本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、いかなる形態であれ、本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。
【００１５】
本発明は、免疫反応を抑制することができるマウス抗ヒトＩＣＡＭ−１単クローン抗体、ＭＤ−２およびＭＤ−２の断片に関する。より具体的には、本発明は、移植された細胞または器官の拒絶反応を抑制するか、または移植された造血幹細胞による移植片対宿主疾患を抑制する抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体に関する。
【００１６】
また、本発明は、ヒトＩＣＡＭ−１のドメイン１に結合することができるが、ＩＣＡＭ−１とそのリガンドであるＬＦＡ−１との間の相互作用は遮断しない抗体を提供する。さらに、本発明は、そのような抗体を生産することができるハイブリドーマ細胞を含む。
【００１７】
また、本発明は、物質を生産する方法に関し、該方法は抗体またはその断片を生産する細胞を提供する。抗体またはその断片を生産する方法は、（ａ）ヒトＩＣＡＭ−１タンパク質またはタンパク質断片またはヒトＩＣＡＭ−１を発現する細胞で動物を免疫化するステップと、（ｂ）免疫化された動物から脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）を抽出するステップと、（ｃ）動物の脾臓細胞を骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞株と融合させるステップと、（ｄ）ハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、ＩＣＡＭ−１とＬＦＡ−１との間の相互作用を阻害せずに、移植された器官の拒絶反応を抑制するだけでなく、樹状細胞の機能および分化を調節するのに適したハイブリドーマ細胞を選別するステップとを含む。
【００１８】
前記物質は、インビトロ培養によるか、または前記物質を生産する細胞を動物に投与することによって得ることができる。前記物質は、前記物質を生産する細胞が腹膜内に投与された動物の腹水から得ることができる。前記物質は、イオン交換クロマトグラフィーまたは親和性カラムクロマトグラフィーによって培養上清液または腹水から精製することができる。
【００１９】
また、本発明は、前記方法によって得られる、ハイブリドーマ細胞および前記ハイブリドーマ細胞によって生産される抗体を含む。
【００２０】
本発明は、移植された細胞または器官の拒絶反応を抑制するための医薬組成物も含む。医薬組成物は、ＩＣＡＭ−１に結合することができるが、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１の相互作用は阻害しない抗体、および、抗体の断片であって、ＩＣＡＭ−１に結合することができるが、ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１の相互作用は阻害しない断片からなる群より選択される免疫抑制剤を含む。本発明による抗体またはその断片の投与は、医薬組成物を投与するのに許容される任意の方法を用いて行うことができる。
【００２１】
さらに、本発明は、抗体または抗体断片からなる群より選択される物質を使用して移植された細胞または器官の拒絶反応を抑制する方法に関する。前記抗体または抗体断片は、好ましくは、単クローンおよび多クローン抗体からなる群より選択され、より好ましくは、ヒトまたは動物抗体である。
【００２２】
また、本発明は、本願に開示されたＩＣＡＭ−１に対する抗体を使用してＩＣＡＭ−１を検出する方法を提供する。ＩＣＡＭ−１は、他の疾患過程での炎症マーカーであるため、このような検出は有用である。また、ＩＣＡＭ−１に対する抗体は、ＩＣＡＭ−１を検出するための研究用試薬として商業的に販売することもできる。
【００２３】
ヒト化抗体は、ドナー抗体に由来の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来の可変領域フレームワークおよび定常領域を有する抗体である。ＣＤＲは、一般的に、Ｋａｂａｔによって定義されるが、Ｃｈｏｔｈｉａによる定義、またはＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによる定義の組み合わせによって定義されることができる。したがって、一般的に、ヒト化抗体は、（ｉ）マウス抗体、例えば、ＭＤ−２由来の３つのＣＤＲを含む軽鎖、ヒト抗体（これらは、例えば、成熟ヒト抗体、ヒト生殖細胞配列、２つまたはそれ以上のヒト抗体配列の組み合わせ、またはヒト抗体配列の共通配列に由来することができる）由来の可変領域フレームワーク、およびヒト定常領域と、（ｉｉ）マウス抗体、例えば、ＭＤ−２由来の３つのＣＤＲを含む重鎖、ヒト抗体由来の可変領域フレームワーク、およびヒト定常領域を含む。可変領域フレームワークは、ヒト残基がこれに相応するマウス抗体の位置に存在する残基に代替された少数の（通常、１、２、３、４、５または１０より少ない）選択された位置での復帰突然変異（ｂａｃｋｍｕｔａｔｉｏｎ）を含むことができる（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許登録第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号を参照）。具体的には、フレームワーク内で代替されるアミノ酸は、一般的に、ＣＤＲと相互作用可能な能力に基づいて選択される。例えば、代替されたアミノ酸は、ドナー抗体配列内のＣＤＲに隣接するか、３次元空間で測定した時、ヒト化抗体内のＣＤＲで４−６オングストローム以内に位置することができる。
【００２４】
１つまたはそれ以上のＣＤＲ残基の置換、または１つまたはそれ以上のＣＤＲの省略も可能である。多くの抗体において、結合のために、１つまたは２つのＣＤＲが省略可能であることが科学的文献に開示されている（Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ９：１３３−１３９（１９９５）；Ｖａｊｄｏｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．３２０、ｐｐ．４１５−４２８（２００２）；Ｉｗａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９−１０９１、（１９９９）；Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０００、１６４：１４３２−１４４１（２０００））。ＣＤＲ内のある領域の置換は、不要なＣＤＲを省略するのと同じ原則に基づき、つまり、ＣＤＲ残基の小さい単位（ｓｕｂｓｅｔ）であるＳＤＲのみが実際に抗原と接触する。
【００２５】
抗原と接触しないＣＤＲ残基は、分子的モデリングおよび／または経験により、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲしか存在しないＫａｂａｔ  ＣＤＲ領域から、以前の研究に基づいて確認することができる（例えば、ＣＤＲＨ２内のＨ６０−Ｈ６５残基は、通常は必要でない）。仮に、ＣＤＲまたはこれらの残基が取り除かれる場合、これは、一般的に可変領域フレームワーク配列を提供するヒトアクセプター配列内の相応する位置に存在するアミノ酸に置換される。このような置換の数は、競争的反応（ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ）のバランスを反映する。このような置換は、ヒト化抗体内のマウスアミノ酸の数を減少させて、結果的に潜在的な免疫原性を減少させるため、潜在的に有利である。しかし、置換はまた、親和力の変化をもたらすことがあり、親和力の有意な減少は避けることが好ましい。ＣＤＲ内の置換の位置および置換されるアミノ酸は経験的にも選択可能である。経験的置換は、保存的または非保存的置換であり得る。しかし、一般的に、経験的置換は、マウスをヒトに置換して免疫原性を減少させる効果は有していない。経験的置換は、生成物であるヒト化抗体の親和力を増加または減少させることができる。
【００２６】
一般的に、ＩＣＡＭ−１に十分な結合親和力を有し、かつ実質的に免疫原性のないヒト化抗体は、前記原則に従って製造された少数の変異体を個別的にスクリーニングすることによって得ることができる。しかし、ファージディスプレイのようなディスプレイ選別方法を用いて、多数の変異体を同時にスクリーニングすることができる（Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ９１／１７２７１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ９２／００１０４７；およびＷｉｎｔｅｒ、ＷＯ９２／２０７９１を参照）。
【００２７】
キメラ抗体は、マウス（または他の齧歯類）抗体の重鎖および軽鎖可変領域が、ヒト抗体の重鎖および軽鎖定常領域と組み合わされた抗体であって、これらの構造は、遺伝工学的手段により公知である。このような抗体は、マウス抗体の結合特異性を有するが、ヒト抗体の約２／３程度である。マウス、キメラおよびヒト化抗体内の非ヒト配列の存在の比率は、キメラ抗体の免疫原性がマウスおよびヒト化抗体間の中間程度であることを示す。
【００２８】
一般的に、ヒト化およびキメラ抗体は、カッパ軽鎖を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプである。
【００２９】
単クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｍＡｂ）は、動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、またはニワトリ）起源であり得、または遺伝学的に製作可能である。齧歯類の単クローン抗体は、当業界に公知の標準方法によって製造可能であり、適切な免疫増強剤と共に、腹腔内、静脈内、または足蹠（ｆｏｏｔｐａｄ）内にＩＣＡＭ−１を多重免疫化した後、脾臓またはリンパ節細胞を抽出し、適切な不死化細胞株と融合した後、ＩＣＡＭ−１と結合する抗体を生産するハイブリドーマを選別することを含む。例えば、下記の実施例を参照すればよい。また、ヒト抗体は、ファージディスプレイ（例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ９１／１７２７１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ９２／００１０４７；Ｗｉｎｔｅｒ、ＷＯ９２／２０７９１；およびＷｉｎｔｅｒ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３：９２、１９９８を参照）か、または形質転換マウスを使用しても製造することができる（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ９３／１２２２７；およびＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ＷＯ９１／１０７４１を参照）。キメラおよびヒト化単クローン抗体が、本発明の具体例として好ましい。
【００３０】
抗体は、非常に大きく、内部構造が複雑な複合分子である（〜１５０，０００の分子量または約１３２０アミノ酸）。天然抗体分子は、２対の同一のポリペプチド鎖を含み、各対は１つの軽鎖と１つの重鎖を有する。各軽鎖および重鎖は、同様に、ターゲット抗原との結合に関連する可変（“Ｖ”）領域と、免疫システムの他の構成要素と相互作用する定常（“Ｃ”）領域の２つの領域で構成される。軽鎖および重鎖可変領域は、抗原（例えば、細胞表面受容体）に結合する可変領域を形成するために、３次元的空間内で互いに折り畳まれる。各軽鎖および重鎖可変領域内には、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる３つの短い断片がある（平均的に１０アミノ酸の長さ）。抗体可変領域内の６つのＣＤＲ（軽鎖に３つおよび重鎖に３つ）は、ターゲット抗原上に固定される実際の抗体結合部位を形成するために、３Ｄ空間内に互いに折り畳まれる。ＣＤＲの位置と長さは明確に定義されている（Ｋａｂａｔ、Ｅ．ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、１９８３、１９８７）。ＣＤＲ内に含まれない可変領域の部分はフレームワークと呼ばれ、ＣＤＲのための周辺環境を形成する。
【００３１】
抗体は、特定の標的タンパク質に特異的に結合、つまり、標的タンパク質を含む他のタンパク質の混合物内で標的タンパク質と優先的に結合する。また、特異的結合は、一般的に、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、または１０−９Ｍ以下の解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）で表される。
【００３２】
本発明の天然の単クローン抗体（ｍＡｂ）は、これらのハイブリドーマから生産可能である。遺伝学的に製作された単クローン抗体、例えば、キメラまたはヒト化抗体は、当業界に公知の多様な方法によって発現することができる。例えば、これらの軽鎖および重鎖Ｖ領域をコード化する遺伝子は、オーバーラップオリゴヌクレオチドから合成されるか、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ領域などの必須調節領域を提供する発現ベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商業的に使用可能）内で利用可能なＣ領域と共に挿入されることができる。ＣＭＶプロモーター−エンハンサーの使用が好ましい。次に、発現ベクターは、リポフェクションまたは電気穿孔法のような、当技術分野で公知の多様な方法を利用して、ＣＨＯまたはＳｐ２／０およびＮＳ０を含む非生産性骨髄腫細胞のような多様な哺乳動物細胞株に形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）され、抗体を発現する細胞は適切な抗生剤の選別によって選別することができる。
【００３３】
一旦発現すると、本発明の単クローン抗体または他の抗体は、精密ろ過、限外ろ過、タンパク質ＡまたはＧ親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、および／または有機染料に基づく他の形態の親和性クロマトグラフィーなどのような、当技術分野の標準技術により精製することができる。製薬学的用途のためには、少なくとも約５０、９０、または９５％の均質性を有する、実質的に純粋な抗体が好ましく、９８％または９９％またはそれ以上の均質性があるものがより好ましい。
【００３４】
本発明において、「単離された」および「精製された」という用語は、実質的にまたは本質的に天然の環境および／または好ましくない汚染物内から、濃縮された物質またはこれらから除去された物質をいう。例えば、単離された抗体は、他の抗原に結合する他の抗体から分離され、および自然的に関連する他の生物学的物質（例えば、他の核酸、タンパク質、脂質、細胞成分）から分離される。また、本発明の抗体は、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２のような抗体結合断片、二重機能的ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０５、１９８７）、短鎖抗体（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９、１９８８；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３、１９８８）、および変形された定常領域を有する抗体（例えば、米国登録特許第５，６２４，８２１号）を含む。
【００３５】
好ましい具体例として、本発明は、本願に開示された抗体を含む薬学的製剤を提供する。つまり、前記抗体は、疾患を治療するための医薬の製造に使用されることができる。前記抗体の薬学的製剤（つまり、医薬）は、凍結乾燥または水溶性溶液の形態で、生理学的に許容される担体内の単クローン抗体、選択的には、添加剤または安定化剤を含む。許容可能な担体、添加剤または安定化剤は、使用される容量および濃度でレシピエントに毒性がなく、かつ一般的にｐＨ５．０〜８．０、より一般的にはｐＨ６．０〜７．０の、リン酸、クエン酸、または酢酸のような緩衝液、等張性にするための塩化ナトリウム、塩化カルシウムなどのような塩、酸化防止剤、保存剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、ポリソルベート８０のような親水性ポリマー、アミノ酸、炭水化物、キレート剤、糖、および当技術分野で公知のその他の標準構成要素を含む。
【００３６】
単クローン抗体は、一般的に、１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度、例えば、１０ｍｇ／ｍｌで存在する。
【００３７】
他の好ましい態様において、本発明は、薬学的製剤内の抗ＩＣＡＭ−１単クローン抗体を使用して、患者、一般的にはヒトの疾患を治療する方法を提供する。単クローン抗体は、任意の適切な経路、具体的に、静脈注射またはボーラス注射による非経口投与、筋肉内投与、または皮下投与により患者に投与可能である。静脈注射は、少なくとも１５分以上であって３０分以上の間隔、または１、２もしくは３時間以上の間隔で投与可能である。単クローン抗体は、疾患（例えば、腫瘍）部位に直接投与されるか、リポソームのような運搬体内にカプセル化することができる。投与量は、治療される状態を緩和させるのに十分な量とし（「治療学的有効量」）、体重あたり０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、例えば、１、２、３または４ｍｇ／ｋｇがよいが、１０ｍｇ／ｋｇまたは１５または２０ｍｇ／ｋｇまで高くあり得る。固定単位投与量は、例えば、５０、１００、２００、５００または１０００ｍｇで投与してもよく、または、前記投与量は、患者の表面積、例えば、１００ｍｇ／ｍ２に基づいて投与してもよい。
【００３８】
単クローン抗体は、例えば、単クローン抗体の半減期に依存して、毎日、毎週、毎週２回ずつ、隔週、毎月ごとに、または任意の他の間隔で１週、２週、４週、８週、３〜６ヶ月、またはそれ以上の間に投与可能である。慢性投与のように、治療の繰り返しも可能である。疾患の進行過程における合併症および中間病理学的表現型を含む、疾患の症状の緩和、または少なくとも部分的に中断させる投与量および投与間隔の投与療法（生化学的、組織学的および／または臨床学的）を、治療学的に有効な投与療法という。
【００３９】
ＩＣＡＭ−１は、公知のヒトタンパク質であって、そのアミノ酸配列は、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ３３１、６２４−６２７（１９８８）およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号０６９９０．１によって提供される。ＬＦＡは、ＣＤ１１ａおよびＣＤ１８のヘテロダイマーである。ヒトＣＤ１１ａのアミノ酸配列は、Ｌａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０８、７０３−７１２（１９８９）およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ００７９６．１によって提供される。ヒトＣＤ１８のアミノ酸配列は、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ４８、６８１−６９０（１９８７）およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１５３９５．１によって提供される。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、下記の実施例を参照してより詳細に説明される。しかし、このような実施例は、どの形態であれ、本発明の範囲を制限するものと解釈されてはならない。
【００４１】
実施例１．抗ヒトＩＣＡＭ−１単クローン抗体を生産可能なハイブリドーマ細胞の分離
ＩＣＡＭ−１／Ｆｃタンパク質を製造するために、ＰＨＡ活性化されたヒト末梢血液単核細胞からｍＲＮＡを抽出し、リーダー遺伝子断片およびヒトＩＣＡＭ−１の細胞外ドメインに相応するｃＤＮＡ断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。ＩＣＡＭ−１の細胞外ドメインをコード化する断片は、５’および３’末端にそれぞれＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩサイトを導入してクローン化した。ＩＣＡＭ−１およびヒトＩｇＧ  Ｆｃの融合コンストラクトを製造するために、前記断片をｈＩｇＧ１のヒンジＣＨ２およびＣＨ３ドメインをコード化する、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素処理されたプラスミド内で連結させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に前記プラスミドを一時的に形質移入させ、タンパク質Ｇカラムを使用してＩＣＡＭ−１／Ｆｃタンパク質を培養上清液から精製した。
【００４２】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、完全フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ）免疫増強剤で乳化されたＩＣＡＭ−１／Ｆｃタンパク質１００μｇを腹腔内投与し、次に、ＩＣＡＭ−１／Ｆｃタンパク質１００μｇを、不完全フロイント免疫増強剤と共に、２週間隔で２回免疫化した。２週後、免疫化されたマウスにＩＣＡＭ−１／Ｆｃタンパク質１００μｇを追加接種した。脾臓細胞浮遊液を製造するために、最終投与から３日後に、Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓を摘出した。単クローン抗体は、９−アザグアニンに抵抗性のあるＳＰ２／０−Ａｇ１４マウス骨髄腫細胞と、ヒトＩＣＡＭ−１／Ｆｃで免疫化されたＢａｌｂ／ｃの脾臓細胞とを融合することによって製造した。細胞融合方法は、ＫｏｅｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法に従った（Ｋｏｅｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６、４９５−４９７）。５０％ポリエチレングリコール４０００を使用して、１０８個の脾臓細胞を１０７個の骨髄腫細胞と融合した。細胞を洗浄し、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００μＭヒポキサンチン、０．４４μＭアミノプテリンおよび１６μＭチミジン（ＨＡＴ  ｍｅｄｉａ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）に再浮遊した。前記細胞を４つの９６ウェルプレートに導入し、３７℃、５％ＣＯ２培養器内で培養した。
【００４３】
２週後、コロニーが形成された時、ヒトＩＣＡＭ−１形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して上清液をスクリーニングした。ＩＣＡＭ−１形質移入した細胞と野生型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の両方を培養上清液で染色し、ＩＣＡＭ−１形質移入した２９３Ｔ細胞に反応するが、野生型２９３Ｔ細胞には反応しない上清液を生産する細胞を選別した。高反応性抗体を生産する、安定したハイブリドーマクローンを製造するために、陽性ウェルで取った細胞を、限界希釈法により、ウェルあたり０．５細胞でサブクローン化した。
【００４４】
前記実験の結果、抗ＩＣＡＭ−１単クローン抗体を生産する３つの分離されたハイブリドーマ細胞株を分離およびクローン化した。これらのハイブリドーマ細胞株の１つは、カッパ軽鎖を有するＩｇＧ１抗体を生産し、これをＭＤ−２と名づけた。ＭＤ−２と名づけられたハイブリドーマは、大韓民国、ソウル、鍾路区（チョンノグ）、蓮建洞（ヨンゴンドン）２８番地所在のソウル大学校医科大学（郵便番号１１０−７４４）にある癌研究所に２００８年１２月２４日付で寄託し、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００１９８を受けた。前記寄託は、寄託機関で最近のサンプルの譲渡の要求後少なくとも５年間、寄託した日から少なくとも３０年間、または関連特許の有効期間の間のうち、最も長い期間がどの期間であれ、公認微生物寄託機関に保存され、突然変異、死滅または破壊される場合に交替されるはずである。前記細胞株の公衆の利用可能性に対するすべての制限は、本出願の特許権の設定により最終的に除去されるはずである。
【００４５】
図１に示されるように、ＩＣＡＭ−１形質移入した２９３Ｔ細胞は、公知の抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体であるＲ６−５−Ｄ６のみならず、ＭＤ−２抗体によっても陽性染色されたのに対し、どの抗体も野生型非形質移入体には反応しなかった。
【００４６】
代表的な抗体（例えば、ＭＤ−２）が分離されると、ＩＣＡＭ−１上の同一またはオーバーラップエピトープに結合する他の抗体は、競争的結合アッセイによって確認することができる。仮に、各々が抗原で互いの結合を競争的に阻害（遮断）すると、２つの抗体が同一またはオーバーラップエピトープに結合するのである。つまり、１、５、１０、２０、または１００倍過剰の１つの抗体は、競争的結合アッセイ（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：１４９５、１９９０を参照）で測定した時、少なくとも５０％程度、または、好ましくは７５％、９０％もしくは９９％で、他の抗体の結合を阻害する。競争的結合アッセイは、完全な（ｉｎｔａｃｔ）ＩＣＡＭ−１、５つの免疫グロブリン様ドメインを含むこれらの細胞外領域、または他の免疫グロブリン様ドメインから分離されたドメイン１に対して行うことができる。あるいは、同一のエピトープを有して原型（ａｒｃｈｔｙｐａｌ）の単クローン抗体ＭＤ−２と類似の性質を有する単クローン抗体を選別する過程のために、本願に参考文献として含まれるＪｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：８９９、１９９４の方法を用いることができる。ファージディスプレイを用いる場合、まず、ＨＧＦ結合単クローン抗体を選別するために、原型の抗体の重鎖を（好ましくはヒトの）軽鎖のレパートリーと共にペアをなし、次に、原型の単クローン抗体と同一のエピトープを有する（好ましくは、ヒトの）ＩＣＡＭ−１結合単クローン抗体を選別するために、新しい軽鎖を（好ましくは、ヒトの）重鎖のレパートリーと共にペアをなす。
【００４７】
ＭＤ−２の変異体およびそのヒト化およびキメラ形態は、具体的に可変領域フレームワークサイトでアミノ酸の置換によって製造することができる。このような置換は保存的または非保存的であり得る。アミノ酸の置換が保存的または非保存的なのかを分類するために、アミノ酸を次のようにグループ化することができる：グループＩ（疎水性側鎖）：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響を与える残基）：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。保存的置換は、同一グループ内のアミノ酸間の置換に関連するものである。変異体は、ＩＣＡＭ−１、具体的には、ＩＣＡＭ−１の１番目のドメインと結合するもの、選択的には、ＭＤ−２抗体と競争するものをスクリーニングすることができる。変異体の重鎖および軽鎖は、具体的には、ＣＤＲ領域内で、好ましくは、ＭＤ−２のような参照抗体と比較して、少なくとも９０％または９５％のアミノ酸配列同一性を示す。配列同一性は、ギャップをカウントしないＫａｂａｔ番号づけによって、参照抗体の重鎖または軽鎖可変領域と最大限に整列された重鎖または軽鎖可変領域を比較することによって決定することができる。
【００４８】
実施例２．抗体結合ドメインのマッピング
ＩＣＡＭ−１は、５つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン、細胞膜透過ドメイン、および細胞質ドメインで構成された構造を有する（Ｃｅｌｌ．１９９２、６８：７１−８１）。具体的なＩＣＡＭ−１  Ｉｇ様ドメインに結合するＭＤ−２結合サイトの位置を知るために、ヒトおよびマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＩＣＡＭ−１ｃＤＮＡクローンを使用して、ヒトドメイン１／マウス細胞膜透過および細胞質ドメインを含むマウスドメイン２−５をコード化するｃＤＮＡ（ｈ１ｍ２３４５）およびヒトドメイン１−２／マウスドメイン３−５をコード化するｃＤＮＡ（ｈ１ｍ２３４５）の２種のキメラｃＤＮＡを製造した。これらのキメラ突然変異を製作するために、オーバーラップＰＣＲ技術を利用した。まず、次のプライマーを使用して、ヒトドメイン１（ｈ１）を含むｃＤＮＡを増幅した：５’プライマーＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＣＴ（配列番号１）；３’プライマーＡＧＧ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＣＣＧ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＣＡＣ  ＧＧＴ  ＧＡＧ  ＧＡＡ  Ｇ（配列番号２）。マウスドメイン２−５、細胞膜透過ドメインおよび細胞質ドメイン（ｍ２３４５）を製造するためのプライマーは次のとおりである：５’プライマーＣＴＧ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＡＣＧ  Ｇ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＡＧＡ  ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ（配列番号３）；３’プライマーＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＧＧＣ（配列番号４）。これら２種類のｃＤＮＡを混合し、配列番号１および配列番号４のプライマーを使用して再増幅し、最終生成物（ｈ１ｍ２３４５）をｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローン化した。ｈ１２ｍ３４５をコード化する変異体は、次のプライマーを使用してｈ１ｍ２３４５に対するのと類似の方式でクローン化した：ｈ１２に対する５’プライマーＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＣＣＣ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＣＴ（配列番号５）；ｈ１２に対する３’プライマーＧＧＴ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＧＧＧ  ＧＧＣ  ＣＧＡ  ＧＧＴ（配列番号６）；ｍ３４５に対する５’プライマーＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＡＣＣ（配列番号７）；ｍ３４５に対する３’プライマーＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＧＧＣ（配列番号８）。
【００４９】
修正された連結部が収得されたかを確認するために、コンストラクト全体を配列決定し、次に、プラスミドＤＮＡをリン酸カルシウム沈澱法を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入させた。リン酸カルシウムおよびプラスミドＤＮＡの共沈物を有するＨＥＫ２９３Ｔを１６〜２０時間培養した後、培地を１０ｍｌの新しい溶液に代替し、再び２４時間細胞を培養した。次に、形質移入体をＭＤ−２またはＲ６−５−Ｄ６抗体と共に氷上で染色した。３０分間培養後に、細胞を５％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）および０．１％アジ化合物と共にＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄し、ＦＩＴＣ結合されたヤギ抗マウスＩｇ抗体（二次抗体）と３０分間培養した。さらに３回洗浄した後に、各抗体と反応する能力をテストするため、フローサイトメトリー分析を行った（図２）。陰性対照群として、二次抗体のみが染色された細胞を使用した。図２に示されるように、全体のヒトＩＣＡＭ−１形質移入体は、ＭＤ−２およびＲ６−５−Ｄ６抗体ですべて陽性的に染色されたのに対し、どの抗体も全長のマウスＩＣＡＭ−１形質移入体には反応せず、これは、これらの抗ヒトＩＣＡＭ−１抗体がマウスＩＣＡＭ−１と交差反応しないことを示す。キメラ変異体の場合、ＭＤ−２抗体がキメラｈ１ｍ２３４５およびｈ１２ｍ３４５の両方で反応したのに対し、ドメイン２に結合する（Ｃｅｌｌ．１９９２、６８：７１−８１）Ｒ６−５−Ｄ６抗体は、ｈ１２ｍ３４５キメラにのみ反応した。したがって、これらすべての結果は、ＭＤ−２抗体がドメイン１上のエピトープに特異的であり、Ｒ６−５−Ｄ６抗体はドメイン２をエピトープに結合することを示す。
【００５０】
実施例３．混合リンパ球反応で抗ＩＣＡＭ−１抗体の効果
たとえ、ＬＦＡ−１結合部位がＩＣＡＭ−１のドメインに位置するとしても、ドメイン１の確認においてドメイン２が重要な役割を果たすことが知られている（Ｃｅｌｌ．１９９２、６８：７１−８１）。したがって、ＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１間の相互作用を遮断するある抗体はドメイン１でマッピングされるが、Ｒ６−５−Ｄ６抗体のようにドメイン２でマッピングされた他の抗体もこのような相互作用を阻害することができる（Ｃｅｌｌ．１９９２、６８：７１−８１）。本発明者らは、ＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１の相互作用が、ＭＤ−２抗体に影響を受けるかを調べた。
【００５１】
２人の非血縁者由来のリンパ球が、互いの存在下で培養される場合、リンパ球の増殖が観察されるが、このような混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）は、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１の相互作用に依存的であることが知られている（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８８、８５：３０９５−３０９９）。したがって、抗ＩＣＡＭ−１抗体のＭＤ−２が、ＬＦＡ−１がＩＣＡＭ−１に接着するのを阻害することができるかを調べるために、ＭＬＲ分析を行った。新鮮な血液細胞を２人の非血縁ドナーから獲得し、末梢血液単核球細胞を主にフィコールハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）および２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して収集し、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が含まれたＤＭＥＭに再浮遊させた。実施例５で述べているＭＡＣＳ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて、一方のドナーからＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。他方のドナーからの細胞は、コバルト放射線源を用いて、２０００ｃＧｙで放射線処理した。次に、各供与者からの細胞を混合した後に、混合された細胞を、平底９６ウェル組織培養プレートに１×１０６細胞／ウェルで接種し、抗ＩＣＡＭ−１抗体（２０μｇ／ｍｌ）の存在下または不在下で培養した。３日後、培養物を［３Ｈ］チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）で電気パルス処理し、１６時間後にガラス繊維ろ過紙上に収集し、次に、液体シンチレーション計数管（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  β  ｃｏｕｎｔｅｒ）で計数した。図３に示されるように、抗ＩＣＡＭ−１遮断抗体Ｒ６−５−Ｄ６はＭＬＲを抑制したのに対し、培養された細胞の増殖はＭＤ−２抗体による影響を受けなかった。このような結果は、ＭＤ−２抗体がＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−１の相互作用を遮断する活性を有していないことを示すものである。
【００５２】
実施例４．ＭＤ−２およびＲ６−５−Ｄ６抗体の結合エピトープの比較
実施例２の結果からＭＤ−２抗体の結合エピトープは、Ｒ６−５−Ｄ６の結合エピトープと異なる形態であり得ることが分かった。これを確認するために、順次に１つの抗体の結合を他の抗体と競合させる交差閉塞（ｃｒｏｓｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）研究を行った（Ｃｅｌｌ．１９９２、６８：７１−８１）。１０、１、または０．１μｇのＭＤ−２またはＲ６−５−Ｄ６抗体を、ＩＣＡＭ−１陽性ＤＵ１４５細胞と共に３０分間氷上で事前培養し、１μｇのＦＩＴＣ結合Ｒ６−５−Ｄ６抗体と培養する前に、２回洗浄した。使用した対照群は、アッセイで競争する抗体が存在しないものである。細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーを用いて分析した。図４に示されるように、ＦＩＴＣ結合Ｒ６−５−Ｄ６抗体の結合は、非結合Ｒ６−５−Ｄ６抗体と事前培養することによって用量依存的に抑制された。ＭＤ−２抗体と共に、ＤＵ１４５細胞の事前培養がＲ６−５−Ｄ６抗体の結合に効果がなかったのは、ＭＤ−２抗体のエピトープの結合がＲ６−５−Ｄ６抗体のエピトープの結合とは異なることを表す。
【００５３】
実施例５．単核球由来の樹状細胞の分化における抗ＩＣＡＭ−１抗体の効果
末梢血液単核細胞をフィコールハイパック密度遠心勾配法によって健常ドナー血液から分離した。ＰＢＳで２回洗浄した後に、細胞を１×１０８細胞／ｍｌの濃度でＭＡＣＳバッファー内に再浮遊し、次に、氷中で１５分間、抗ＣＤ１４磁気ビーズ（２０μｌ／１０７細胞；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に培養し、次に、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて磁性分離した。精製されたＣＤ１４＋単核球を１０％ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ内で再浮遊し、顆粒球マクロファージ細胞コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、１０００Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）と共に６日間培養した。培養０日目と３日目の培地に抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）を追加し、６日目にＬＰＳを培養培地に追加した。一日経過した後に、培養した細胞を収集し、フローサイトメトリーによりＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＣＤ８３の発現を測定した。培養培地内のＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの量を測定するために、ＥＬＩＳＡも行った。ＣＤ１４＋単核球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で培養すると、未成熟樹状細胞に分化することができ、ＬＰＳ処理は未成熟樹状細胞の成熟を誘導した。図５Ｂに、各培養培地内のサイトカインの濃度および図示の抗原の平均蛍光強度（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ、ＭＦＩ）を示す。予想したとおり、未成熟樹状細胞へのＬＰＳの処理は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＣＤ４０の発現およびサイトカインの生成を増加させた。ＬＰＳ刺激によるこれらの分子の表面発現の上方調節、およびＤＣにおけるサイトカインの生成は、抗ＩＣＡＭ−１遮断抗体であるＲ６−５−Ｄ６の前処理によっても抑制されなかった。しかし、Ｒ６−５−Ｄ６抗体とは異なり、ＬＰＳ刺激の前に、ＭＤ−２抗体を前処理した場合、樹状細胞で表面分子発現の上方調節およびサイトカインの生成が抑制されたが、これは、ＭＤ−２抗体が単核球由来の樹状細胞の成熟を阻害することができることを表す。
【００５４】
実施例６．ヒト化マウスの製造
抗ＩＣＡＭ−１抗体のインビボ効果を測定するために、Ｉｔｏ、Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ．２００２、１００：３１７５−８２に記載された方法により、免疫欠乏マウスにヒト造血幹細胞を移植してヒト化マウスを製造した。
【００５５】
満期正常分娩中に正常臍帯血細胞を収集し、フィコールハイパック遠心分離によって単核細胞を分離した。分離した単核細胞は、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび５％ＦＢＳを含有するＰＢＳ内で３．３×１０８細胞／ｍｌで浮遊し、Ｆｃ遮断抗体と共に３０分間氷中で培養し、次に、抗ＣＤ３４磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に３０分間氷中で培養した。２回洗浄した後、ＭＡＣＳを用いてビーズ付着細胞を磁性分離した。２回の磁性分離後に、フローサイトメトリーによって純度を評価した結果、収集した細胞の９５％以下がＣＤ３４＋であった。８〜１２週齢のＮＯＤ．ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌマウス（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｊａｐａｎ）に、コバルト放射線源を用いて２４０ｃＧｙで放射線処理し、１日後に、１×１０５のＣＤ３４＋細胞を、尾静脈を通して各マウスに投与した。移植４週および１６週が経過後、順次に、眼窩静脈叢（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ  ｖｅｎｏｕｓ  ｐｌｅｘｕｓ）から末梢血液を取り、フローサイトメトリー分析のために、抗ヒトＣＤ４５および抗ヒトＣＤ３抗体で染色した。図６は、細胞移植後に、表示の週でのマウスの末梢血液内のヒト細胞のキメラ比率を示す。すべてのマウスでヒト白血球が検出されたが、移植１１週後に、末梢血液内の６０％以上の白血球がヒトＣＤ４５＋であり（図６Ａ）、移植１６週後に、約１０％のヒトＣＤ４５＋細胞がＣＤ３を発現した（図６Ｂ）。
【００５６】
実施例７．異種膵島移植の拒絶反応を抑制する抗ＩＣＡＭ−１抗体の効果
移植拒絶反応を抑制するＭＤ−２抗体の効果を究明するために、膵島異種移植モデルを使用した。ヒト化マウスに、ｐＨ４．５のクエン酸緩衝液に溶解させた１００ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を、連続２日間、２回腹腔内投入して糖尿状態にした。ストレプトゾトシン投与３日後、ＡＣＣＵ−ＣＨＥＣＫ血糖測定器（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて血中のグルコースレベルを測定し、血中のグルコースが＞２５０ｍｇ／ｄｌである動物のみを糖尿病レシピエントとして使用した。移植する膵島は、非流動的コラゲナーゼ分解（０．０７％タイプＸＩコラゲナーゼ、Ｓｉｇｍａ）および前に開示されたような（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２０００、６９：１５６７−１５７１）不連続的フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）密度勾配法を用いて、ＳＤラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ）から分離した。分離後は、未精製の膵島細胞を５％ＣＯ２培養器内に１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地で、３７℃にて一晩中培養した後、ストレプトゾトシン投与４日後に、各糖尿病ヒト化マウスの左腎臓皮膜下の空間に膵島を５００移植した。抗ＩＣＡＭ−１抗体（３００μｇ／マウス）を膵島移植６日および３日前に腹腔内投与した。動物対照群には関連性のないマウスＩｇＧを投与した。２００ｍｇ／ｄｌ以下の血糖グルコースレベルの回復を移植機能の指標として使用し、連続２日間＞２５０ｍｇ／ｄｌのレベルに急増した場合には拒絶反応を示したものとみなした。図７に示されるように、対照群マウスは、死亡したか、膵島移植３週後に拒絶反応を起こしたのに対し、膵島移植前にＭＤ−２抗体を投与したすべてのマウスは、実験期間を通して、依然として２００ｍｇ／ｄｌ以下を維持した。
【００５７】
マウスが病的状態を現した時、これらを犠牲にし、移植拒絶反応を立証するために左腎臓切除試料を組織学的に分析した。対照群マウスは、移植後、９、２１および４４日目に犠牲にした。ＭＤ−２抗体処理群では、移植後、３４、７７および８７日目にマウスを犠牲にした。各マウスから得た腎臓切除試料は、１０％中性ホルマリンに固定させ、パラフィンに埋め込んだ後、一般的なヘマトキシリン−エオシン染色または免疫組織化学染色のために、厚さ４μｍに連続的に切断した。インシュリン染色のために、ヒトインシュリンに対する一次ヤギ抗血清（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を使用し、次に、基質として、ジアミノベンジジンおよびアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ方法を用いた。図８に示されるように、対照群抗体を投与したマウスの皮膜下の空間で単核細胞の浸潤が明確に観察され、免疫組織化学的染色の結果、これらのマウスで生存可能な膵島は観察することができなかった。しかし、対照群とは異なり、ＭＤ−２処理されたマウスでは、依然として移植片生存率が明確に観察され、単核細胞の浸潤が観察されなかった。また、移植された膵島はインシュリンの生産を続けた。したがって、移植前のＭＤ−２の処理は、膵島異種移植の生存率を増加させることができる。
【００５８】
本願に引用されたすべての公開文献、特許および出願は、各個別公開文献、特許および特許出願が具体的および個別的にすべての目的のためにその全体が参考文献として含まれているように、同一の範囲内ですべての目的のためにその全体が本発明に参考文献として含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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