(57)【要約】本発明は、レラキシン融合タンパク質を提供し、ここで、リンカーが、レラキシンのカルボキシ末端とタンパク質半減期延長部分とを連結しており、リンカーはプロテアーゼ切断部位を含む。それゆえ、本発明は、延長した半減期を有することにより、融合タンパク質がそれ自体で生物学的に活性のレラキシンの放出のための貯蔵所として役立つレラキシン融合ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、前記融合ポリペプチドをコードする核酸配列、それを含むベクター、レラキシン融合ポリペプチドを発現する細胞、かかる融合ポリペプチドの医薬組成物および医薬用途を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-レラキシンを含む融合タンパク質、ここで、 
レラキシンは、レラキシン A 鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体、
およびレラキシン B 鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、
PCSは、エンド-プロテアーゼ切断部位を含み、そして、
HEMは、タンパク質半減期延長部分である。
【請求項２】
プロレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-プロレラキシンを含む融合ポリペプチド、
ここで、
プロレラキシンは、レラキシン A 鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体、
レラキシン C-鎖ポリペプチドおよびレラキシン B 鎖ポリペプチドまたはそれらの機能的変異体を含み、
PCSは、エンド-プロテアーゼ切断部位を含み、そして、
HEMは、タンパク質半減期延長部分である。
【請求項３】
PCSが細胞外エンド-プロテアーゼの切断部位である、請求項1 または2の融合タンパク質またはポリペプチド。
【請求項４】
エンド-プロテアーゼが内因性エンド-プロテアーゼである、請求項 3の融合タンパク質またはポリペプチド。
【請求項５】
タンパク質半減期延長部分が、免疫グロブリン Fc ドメイン、血清アルブミン、トランスフェリンおよび血清アルブミン結合タンパク質からなるタンパク質半減期延長部分の群に含まれる、前記請求項のいずれかの融合ポリペプチド。
【請求項６】
レラキシン A 鎖がヒトレラキシン 2 A 鎖であり、かつ、レラキシン B 鎖がヒトレラキシン 2 B 鎖である、前記請求項のいずれかの融合ポリペプチド。
【請求項７】
請求項2 〜 6のいずれかのプロレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-プロレラキシン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項 7のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
請求項 8のベクターまたは請求項 7のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１０】
さらにプロホルモン転換酵素活性を含む請求項 9の宿主細胞を培養する工程、および、タンパク質を単離する工程を含む、請求項1 - 6のいずれかのレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-レラキシンタンパク質を生産する方法。
【請求項１１】
請求項1 〜 6のいずれかのレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-レラキシンタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１２】
医薬としての請求項 11 の医薬組成物または請求項1 〜 6のいずれかのレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-レラキシンタンパク質。
【請求項１３】
心血管疾患、肺疾患、線維性障害または腎疾患の治療のための医薬としての、請求項 11または12の医薬組成物または請求項1〜6のいずれかのレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-レラキシンタンパク質。
【請求項１４】
治療上有効用量の、請求項 11 および 12の医薬組成物または請求項1 〜 6のいずれかのレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-レラキシンタンパク質の投与を含む、心血管疾患、肺疾患、線維性障害または腎疾患を治療する方法。
【請求項１５】
心血管疾患が、冠動脈心疾患、急性冠動脈症候群、心不全、または心筋梗塞の群に含まれる、請求項13 または14の治療。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レラキシン(Relaxin) 融合タンパク質を提供し、ここで、リンカーが、レラキシンのカルボキシ末端とタンパク質半減期(proteinaceous half-life) 延長部分(extending moiety)とを連結しており、リンカーはプロテアーゼ切断部位を含む。それゆえ、本発明は、延長した半減期を有することにより、融合タンパク質がそれ自体で生物学的に活性のレラキシンの放出(release)のための貯蔵所として役立つレラキシン融合ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、前記融合ポリペプチドをコードする核酸配列、それを含むベクター、レラキシン融合ポリペプチドを発現する細胞、かかる融合ポリペプチドの医薬組成物および医薬用途を提供する。 
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
インスリンスーパーファミリーのメンバーとしてのレラキシン (Relaxin) 2 (H2 レラキシン、RLN2)は、遺伝子レベルで、N- からC-末端へと配置された典型的な B - C - A 鎖プロホルモン構造を示す、2-鎖ペプチドである。ヒトにおいて7つの遺伝子によってコードされるこのスーパーファミリーのその他のメンバーは、レラキシン遺伝子であるRLN 1、RLN3、およびインスリン-様ペプチド遺伝子である INSL3、INSL4、INSL5、およびINSL6である。このファミリーのメンバーの間の全体の配列相同性は低い; にもかかわらず、系統発生解析により、これらの遺伝子はRLN3 先祖遺伝子から進化してきたことが示されている(Hsu、S. Y. (2003); Wilkinson、T. N. et al. (2005))。成熟タンパク質はおよそ 6000 Daの分子量を有し、プロホルモン転換酵素 1 (PC1) および 2 (PC2)によって触媒されるプロホルモンの酵素による切断の産物である(Hudson P. et al. (1983))。結果として得られる A- およびB-鎖は２つの分子間システイン架橋によって結合される; A-鎖は１つのさらなる分子内ジスルフィド結合を示す。
【０００３】
レラキシンは、種々の細胞型に対して複数の経路を介して多面的効果を惹起する。それはその活性を、LGR7 (ロイシンリッチ Gタンパク質共役型受容体 7) と称され、RXFP1 (レラキシンファミリーペプチド 1 受容体)とも名付けられるクラス I (ロドプシン様) Gタンパク質共役型受容体への結合によって与え、LRG8/RXFP2(レラキシンファミリーペプチド 2 受容体)に対する有意により低い親和性を示す (Kong RC et al. (2010))。レラキシン分子のなかで、B-鎖におけるアミノ酸モチーフ (Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X) (Schwabe and Buellesbach (2007)、Buellesbach and Schwabe (2000))がすべてのレラキシンペプチドにおいて保存されており、これらのペプチドの対応する受容体との相互作用のために重要である。レラキシンのLGR7/RXFP1への結合は、アデニル酸シクラーゼの活性化を導き、セカンドメッセンジャー分子 cAMPの上昇をもたらす。この機構を介して、レラキシン 2 は、例えば、ラット心臓における心房性ナトリウム利尿ペプチドの放出を媒介する(Toth、M. et al. (1996))。レラキシン 2のラット心房筋細胞に対する正の変力効果もまた示されている(Piedras-Renteria、E. S. et al. (1997))。レラキシン/LGR7 複合体により活性化されるその他のシグナル伝達分子は、ホスホイノシチド-3 キナーゼ、チロシンキナーゼ、およびホスホジエステラーゼである(Bartsch、O. et al. (2001)、Bartsch、O. et al. (2004))。このシステムにより活性化される別のシグナル伝達経路には、一酸化窒素 (NO) 経路が含まれ、これはラットおよびモルモット心臓におけるサイクリックGMPのレベルの上昇を導く (Bani-Sacchi、T. et al. (1995))。
【０００４】
レラキシンは、器官、例えば、肺、腎臓、脳、および心臓に対する生物活性を有する、多面的ホルモンとして機能する(Dschietzig T. et al. (2006))。レラキシンの強力な抗線維化(antifibrotic) および血管拡張活性は、もっとも顕著にこのペプチドにより、様々な動物疾患モデルならびに臨床研究において得られる正の効果の原因である(McGuane J.T. et al. (2005))。RLN2は病的状況下において心血管系にて複数の有利な効果を有する。それは組織恒常性を維持し、様々な病態生理学的過程の間に損傷した心筋を保護する。それは顕著な血管拡張性効果を示し、例えば、齧歯類冠動脈(Nistri、S. et al. (2003)) およびその他の器官の血管床における流れ(flow)および血管拡張に影響を与える。自然発症高血圧ラットにおいて、 RLN2は血圧を低下させ、これは上昇したNO 生成によって媒介される効果である。
【０００５】
レラキシン 2の心保護的活性が、様々な動物モデル、例えば、モルモット、ラットおよびブタにおいて評価されている(Perna A.M. et al. (2005)、Bani、D. et al. (1998))。RLN2は、心筋損傷、炎症細胞浸潤および引き続く線維症を寛解させ、それにより重篤な心室機能不全を緩和する (Zhang J. et al. (2005))。
【０００６】
レラキシン 2は強力な抗線維化活性を示す。損傷した組織において、線維芽細胞活性化および増殖はコラーゲン生成の上昇および間質性線維症をもたらす。心臓における線維症は生体力学過負荷によって上昇し、心室機能不全、リモデリング、および催不整脈に影響を与える。動物モデルにおいて、レラキシン 2 の持続注入は、心筋症、高血圧、イソプレナリン-誘導性心毒性、糖尿病性心筋症および心筋梗塞によってもたらされる、心機能不全を阻害し、あるいは逆転さえする。この線維形成の阻害または確立した線維症の回復は心室硬化を低減させ、拡張機能を改善することができる。特に、レラキシン 2 は異常コラーゲン蓄積を低下させるが、それは健康組織における基底コラーゲン含量には影響を与えず、治療用途のためのその安全性を強調する。
【０００７】
レラキシン 2 は、いくつかの臨床研究において急性心不全の患者の治療のための多面的血管拡張薬として試験されてきており、非常に有望な結果が出ている。これらの研究において、レラキシン 2は呼吸困難の好ましい軽減およびその他の臨床成績と関連していた(Teerlink J.R. et al. (2009)、Metra M. et al. (2010))。
【０００８】
レラキシンの制限されたインビボ半減期のために、患者の治療は14から21日ごとに繰り返さなくてはならず、したがって化合物投与は少なくとも 48 時間の持続注入としてなされなければならない。
【０００９】
さらに、レラキシン 2はまた、疾患、例えば、膵炎、関節リウマチなどの炎症-関連疾患、および癌 (Cosen-Binker L.I. et al. (2006) Santora K. Et al. (2007))または強皮症、肺、腎、および肝線維症 (Bennett RG. (2009))の治療においても有用でありうる。レラキシン 2は、ヒト MDA-MB-231 乳癌細胞の異種移植片腫瘍増殖を低減する(Radestock Y、Hoang-Vu C、Hombach-Klonisch S. ( 2008))。
【００１０】
レラキシン 2の化学的方法による合成は困難である。B-鎖の低い溶解度および、AとB-鎖との間のシステイン架橋の骨の折れる、特異的導入の必要性のために、かかる方法によって得られる活性ペプチドの収率は非常に低い(Barlos K.K. et al. (2010))。あるいは、レラキシン 2の組換え発現を行ってもよい。翻訳後修飾および成熟および生物活性ペプチドの分泌の際のプレプロ-ペプチドの効率的な切断を可能にするために、発現宿主細胞は常套的にプロホルモン転換酵素 1 および/または 2をコードする発現コンストラクトにより同時導入される (Park J.I. et al. (2008))。にもかかわらず、異種細胞におけるプレプロ-ペプチドの細胞内タンパク質分解プロセシング効率はしばしば生理活性分子の生成を有意に制限する(Shaw J.A. et al. (2002))。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
重要なことに、ヒトにおいて静脈内に投与されたレラキシン(Relaxin) 2の半減期は10 分未満である(Dschietzig T. et al. (2009))。その結果、臨床試験において、レラキシン 2 は48時間かけて連続的に投与されなければならない。それゆえ、レラキシンの生物学的半減期の向上またはより長時間作用するレラキシン(Relaxin)融合ポリペプチドは非常に有益でありうる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
生物学的半減期を向上させることは、目的のポリペプチドの化学修飾、例えば、ペグ化(PEGylation)またはHES化(HESylation)、追加の、非天然 N-グリコシル化部位の導入により、またはこのポリペプチドとその他の分子、例えば、抗体の免疫グロブリン Fc 断片、トランスフェリン、アルブミン、インビボでより長い半減期を媒介するその他の分子に結合する結合モジュール、またはその他のタンパク質と、それぞれ遺伝子融合させることにより行うことができる。しかしながら、IgG のFc ドメインのレラキシン(Relaxin) 2 のC-末端への融合はレラキシン活性に関して不活性の分子を導く。驚くべきことに、Fc ドメインが切断除去されると、レラキシン活性が回復することが見出された。これは、融合タンパク質が不活性であることにかかわらず、レラキシンが正しくフォールディングされるが活性がFc ドメインによりブロックされること、またはレラキシンがFc ドメインの放出の後に正しいフォールディングを回復することを意味する。抗補体プロドラッグのためのFc 融合ポリペプチドは J Biol Chem. 2003 Sep 19;278(38):36068-76に開示されている。それゆえ、本発明は、レラキシンがタンパク質半減期延長部分、例えば、IgG のFc ドメインに融合している、レラキシン融合ポリペプチドを提供し、ここで、レラキシンがタンパク質半減期延長部分にエンド-プロテアーゼ切断部位を含むリンカーポリペプチドを介して連結しており、レラキシンと比べて向上した半減期を有するポリペプチドが導かれ、それから、活性のレラキシンがエンドプロテアーゼの作用によって放出される(released)。
【００１３】
発明の概要
本発明は活性のレラキシン(Relaxin)の放出(release)のためのプロドラッグとしての半減期が延長したレラキシン融合ポリペプチドに関する。
【００１４】
本発明の一つの態様は、レラキシン、エンド-プロテアーゼ切断部位を含むリンカーペプチドおよびタンパク質半減期延長部分を含む融合ポリペプチドであり、ここで、リンカーペプチドはレラキシンと半減期延長部分とを連結する。
【００１５】
一つの態様において、上記レラキシンはレラキシン 2 またはレラキシン 3である。好ましいのはヒトレラキシン、例えば、ヒトレラキシン 2またはヒトレラキシン 3である。
【００１６】
一つの態様において、上記タンパク質半減期延長部分は、ポリペプチド、例えば、IgGのFc ドメイン、血清アルブミン、トランスフェリン、または血清アルブミン結合タンパク質またはペプチドである。好ましいのは、ヒトまたはヒト化タンパク質半減期延長部分、例えば、ヒト IgGのFc ドメインまたはヒト血清アルブミンである。
【００１７】
好ましい態様において、上記リンカーは、エンド-プロテアーゼ/エンド-ペプチダーゼのための切断部位を含み、ここで、エンド-プロテアーゼ/エンド-ペプチダーゼは、細胞外エンド-プロテアーゼ/エンド-ペプチダーゼである。さらに好ましい態様において、上記リンカーは、エンド-プロテアーゼ/エンド-ペプチダーゼのための切断部位を含み、ここで、エンド-プロテアーゼ/エンド-ペプチダーゼは、ヒトエンド-プロテアーゼ/エンド-ペプチダーゼである。さらに好ましい態様において、切断部位は、血液中で活性のエンド-プロテアーゼ/エンド-ペプチダーゼのもの、例えば、血液凝固因子 Xaのものである。さらに、血管内腔に向けられた活性部位を有する膜結合型または膜伸長型(membrane stretching)エンド-プロテアーゼ/エンド-ペプチダーゼの切断部位が好ましく、例えば、MMP12である。別の好ましい態様において、切断部位は、その活性がレラキシンの作用が望ましい部位にて富化されている(enriched)かまたは特異的なエンド-プロテアーゼ/エンド-ペプチダーゼのものであり、例えば、エンド-プロテアーゼ/エンド-ペプチダーゼは、所望のレラキシン活性の部位、例えば、特定の(specific)器官または組織にて特異的に発現および/または活性化されている。別の好ましい態様において、切断部位は、生理的過程の間の特定の(specific)時点、例えば、疾患の進行の特定の(specific)時点にて発現および/または活性化されるエンド-プロテアーゼ/エンド-ペプチダーゼのものである。
【００１８】
別の側面において、本発明は、上記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドはさらにシグナルペプチドのためのコード配列を含んでいてもよく、それにより融合ポリペプチドの分泌が可能となる。かかる融合ポリペプチドのためのポリヌクレオチドを含むベクターもまた含まれる。好適なベクターは、例えば、発現ベクターである。本発明のさらなる態様は、上記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ベクター、または発現ベクターを含む宿主細胞である。本発明の宿主細胞は真核細胞であっても原核細胞であってもよい。真核細胞は、哺乳類細胞または酵母または昆虫細胞であり得、好ましくは、哺乳類細胞である。原核細胞は、例えば、大腸菌(E. coli) 細胞であり得る。
【００１９】
別の態様において、本発明は、上記融合ポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。組成物は、静脈内、腹腔内、局所、吸入(inhalative) または皮下投与のために製剤されうる。
【００２０】
本発明の別の態様は、医薬組成物または医薬としての融合ポリペプチドを提供する。さらなる態様は、心血管疾患、膵炎、炎症、癌、強皮症、肺、腎、および肝線維症の治療における、医薬組成物または融合ポリペプチドの使用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
図面の簡単な説明
【図１】図1：レラキシン融合ポリペプチドの組織化およびその引き続く血流におけるプロテアーゼ切断部位(Protease Cleavage Site) (PCS)を含むリンカーを切断するエンド-ペプチダーゼ/エンド-プロテアーゼによる活性化の模式的表示。A-鎖、B-鎖および C-鎖は、それぞれのレラキシン鎖を表す。PCSを有するリンカーは、PCSを含むリンカーであり、黒線は、レラキシンにおける分子間および分子内ジスルフィド結合を示す。Fc ドメインはIgG分子のFc ドメインである。
【図２】図2：CHO-CRE-LGR7 細胞株を用いるレラキシン- Fc 融合コンストラクトの活性の決定。対照として、hレラキシン 2 (R＆D Systems、カタログ番号 6586-RN-025)を使用した。データは相対的光単位(Relative Light Unit) として表し、レラキシン変異体(variant)およびhレラキシン 2 誘導性ルシフェラーゼ発現の活性を表す。シンボルは平均値を表し、エラーバーはS.E.M. を表す。
【図３】図3 a - d： CHO-CRE-LGR7 細胞株を用いるレラキシン-融合コンストラクト 1  4の活性の決定。対照として、hレラキシン 2 (R＆D Systems、カタログ番号 6586-RN-025)を使用した。データは相対的光単位として表し、レラキシン変異体およびhレラキシン 2 誘導性ルシフェラーゼ発現の活性を表す。シンボルは平均値を表し、エラーバーはS.E.M. を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
定義:
【００２３】
「アミノ酸残基」という語は、アラニン (Ala または A)、システイン (Cys または C)、アスパラギン酸 (Asp または D)、グルタミン酸 (Glu または E)、フェニルアラニン (Phe または F)、グリシン (Gly または G)、ヒスチジン (His または H)、イソロイシン (Ile または I)、リジン (Lys または K)、ロイシン (Leu または L)、メチオニン (Met または M)、アスパラギン (Asn または N)、プロリン (Pro または P)、グルタミン (Gln または Q)、アルギニン (Arg または R)、セリン (Ser または S)、スレオニン (Thr または T)、バリン (Val または V)、トリプトファン (Trp または W)、およびチロシン (Tyr または Y) 残基からなる群に含まれるアミノ酸残基を示す意図である。
【００２４】
「レラキシン(Relaxin)の活性」または「レラキシン活性」という語は、その受容体への結合を介して刺激性 G-タンパク質 Gsを活性化し、したがってセカンドメッセンジャーであるサイクリックAMPの引き続く生成、および/またはPI3-キナーゼの刺激をもたらすレラキシンまたはその変異体の能力により定義される。レラキシンまたはその変異体はLGR7に結合し、 刺激性 G-タンパク質 Gsの細胞内活性化を導き、その結果、セカンドメッセンジャーであるサイクリックAMP (cAMP)の引き続く生成が起こる。しかしながら、cAMP 生成は時間依存的二相性応答である。初期の短い(initial short) Gs-アデニル酸シクラーゼ-媒介性cAMP 応答の後、受容体シグナルは抑制性 G タンパク質活性化に切り替わり、これによりPI3-キナーゼ媒介性応答が起こる(Halls M.L.、Bathgate R.A.、Summers、R.J. (2005))。
【００２５】
「半減期延長部分(half-life extending moiety)」という語は、直接的にまたはリンカーを介してレラキシン融合ポリペプチドに共有結合した (「接合した(conjugated)」)医薬上許容される部分、ドメイン、または「媒体」をいう。半減期延長部分が正に(positively)薬物動態または薬力学的挙動に影響を与える機構としては、これらに限定されないが以下が挙げられる： (i) レラキシン融合ポリペプチドのインビボタンパク質分解またはその他の活性-低減性化学修飾を阻止または軽減すること、(ii) 腎臓濾過の低下、受容体-媒介性クリアランスの低下または生物学的利用率の上昇により半減期またはその他の薬物動態特性を向上させること、(iii)毒性を低下させること、(iv) 溶解度を向上させること、(v) レラキシン融合ポリペプチドの生物活性および/または 標的選択性を上昇させること。さらに半減期延長部分は、レラキシン融合ポリペプチドの製造可能性の上昇、および/または免疫原性の低下に関して、レラキシン融合ポリペプチドの非接合形態と比較して正の効果を有しうる。「半減期延長部分」という語は、非-タンパク質半減期延長部分、例えば、PEGまたはHES、およびタンパク質半減期延長部分、例えば、血清アルブミン、トランスフェリンまたはFc ドメインを含む。
【００２６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書において互換的に用いられ、ペプチド結合を介して連結した二以上のアミノ酸の分子鎖を含む。これらの用語は、鎖の特定の長さをいうものではない。これらの用語には、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等が含まれる。さらに、タンパク質断片、類似体(analog)、突然変異または変異体タンパク質、融合タンパク質等も、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質の定義に含まれる。かかる用語にはまた、合成によるか、または公知のタンパク質操作技術を用いて組換えにより発現され得る、一以上のアミノ酸類似体または非標準(non-canonical)または非天然アミノ酸が含まれる分子が含まれる。さらに、本発明の融合タンパク質は、本明細書において記載されるように周知の有機化学技術によって誘導体化されていてもよい。
【００２７】
「機能的変異体(functional variant)」という語は、その化学構造において野生型ポリペプチドと異なり、 かつ少なくともいくらかのその天然の生物活性を保持している変異体ポリペプチドをいう。本発明によるレラキシン 2 変異体の場合、機能的変異体は、その天然の活性の少なくともいくらか、例えば、レラキシン受容体 LGR7の活性化を示す変異体である。レラキシン受容体 LGR7の活性化は、実験方法に開示される方法によって決定され得る。
【００２８】
本発明のポリペプチドをいう場合の、「断片」、「変異体(variant)」、「誘導体」および「類似体」という用語は、対応する野生型レラキシンポリペプチドの少なくともいくらかの受容体活性化特性を保持しているあらゆるポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片には、タンパク分解断片、ならびに欠失断片、およびまた、アミノ酸置換、欠失、または挿入により変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。変異体は天然に起こったものでも非天然発生のものであってもよい。非天然発生の変異体は当該技術分野において公知の突然変異誘発技術を用いて産生しうる。変異体ポリペプチドは、保存的または非-保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を含みうる。変異体ポリペプチドはまた、本明細書において「ポリペプチド類似体」として称されることもある。本明細書において用いる場合、ポリペプチドの「誘導体」は、官能基の反応により化学的に誘導体化された一以上の残基を有する対象ポリペプチドをいう。「誘導体」にはまた、２０の標準アミノ酸の一以上の天然発生のアミノ酸誘導体を含むペプチドが含まれる。例えば、プロリンは4-ヒドロキシプロリンにより置換され得; リジンは5-ヒドロキシリジンにより置換され得; ヒスチジンは3-メチルヒスチジンにより置換され得; セリンはホモセリンにより置換され得;リジンはオルニチンにより置換され得る。
【００２９】
「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」という語は、タンパク質が二以上の親タンパク質またはポリペプチド由来のポリペプチド成分を含むこと、および/または、融合タンパク質がそれらの野生型配向において配置していない(not arranged)一以上の親タンパク質またはポリペプチド由来のタンパク質ドメインを含むことを示す。 典型的には、融合タンパク質は、一つのタンパク質からのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が、インフレームにて、そして所望によりリンカーまたはストレッチャーにより異なるタンパク質からのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列から分離され、異なるタンパク質からのポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列に付加されている融合遺伝子から発現される。融合遺伝子は次いで組換え宿主細胞によって単一のタンパク質として発現され得る。
【００３０】
「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド」という語は、二以上のヌクレオチド分子の連続するストレッチを示す意図である。ヌクレオチド配列はゲノム、cDNA、RNA、半合成、合成起源、またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。
【００３１】
「EC50」 (最大半量有効濃度) という語は、特定の実験条件下でベースラインと最大との中間の応答を誘導する、治療的化合物の有効濃度をいう。
【００３２】
所与の物質に関連して用いられる場合、「免疫原性」という語は、物質が免疫系の応答を誘導する能力を示す意図である。免疫応答は細胞または抗体媒介性応答でありうる (免疫原性のさらなる定義については、例えば、Roitt: Essential Immunology (8th Edition、Black-well)を参照されたい)。通常、免疫応答、例えば、T-細胞増殖のトリガーに関与する過程の低下した誘導は、低下した免疫原性の指標であろう。低下した免疫原性は当該技術分野において公知のあらゆる好適な方法の使用によって、例えば、インビボまたはインビトロにて決定され得る。
【００３３】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」という語は一般に、所望のヌクレオチド配列の、例えば、米国特許第US 4,683,195号および US 4,683,195号に記載されているようなインビトロでの増幅方法をいう。一般に、PCR 方法は、テンプレート核酸に優先的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプライマーを用いたプライマー伸長合成の繰り返されるサイクルを伴う。
【００３４】
「ベクター」という語は、宿主細胞内で複製することができるか、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それ自体、適合性宿主細胞と併用して(ベクター-宿主系)以下のように様々な機能を発揮するために有用なプラスミドまたはその他のヌクレオチド配列をいう:ヌクレオチド配列のクローニングを促進する、即ち有用な量の配列を生産する、配列によりコードされる遺伝子産物の発現を起こす、およびヌクレオチド配列を宿主細胞のゲノムに組み込む。ベクターはそれが発揮すべき機能に応じて異なる成分を含むであろう。
【００３５】
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」および「細胞培養物(cell culture)」は本明細書において互換的に用いられ、かかる用語はすべて、細胞の増殖または培養に起因する子孫を含むものと理解されるべきである。
【００３６】
「機能的インビボ半減期」という語はその通常の意味において用いられ、即ちポリペプチドの生物活性の50％がいまだに体/標的器官に存在する時間、またはポリペプチドの活性が初期値の50％である時間をいう。
【００３７】
機能的インビボ半減期の決定に代わるものとして、「血清半減期」を決定することができ、即ちそれはポリペプチドの50％がポリペプチドがその生物学的機能を保持するか否かにかかわらず排除される前に血漿または血流中を循環する時間である。血清半減期の決定はしばしば機能的インビボ半減期の決定よりも容易であり、血清半減期の大きさは通常、機能的インビボ半減期の大きさの良好な指標である。血清半減期の代替的用語には、「血漿半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」、「末端(terminal)半減期」および「クリアランス半減期」が含まれる。ポリペプチドは、網内系 (RES)、腎臓、脾臓 または肝臓の一以上の作用により、組織因子、SEC 受容体またはその他の受容体媒介性排除により、または特異的または非特異的タンパク質分解により、排除される。通常、クリアランスは、(糸球体濾過についてのカットオフと比較した) サイズ、電荷、付加している炭水化物鎖、およびタンパク質のための細胞受容体の存在に依存する。保持されるべき機能性は通常、受容体結合または受容体活性化として決定される。機能的インビボ半減期および血清半減期は当該技術分野において公知のあらゆる好適な方法によって決定され得、例えば一般に好適な用量の目的のタンパク質またはポリペプチドを哺乳類に好適に投与する工程;血液サンプルまたはその他のサンプルを該哺乳類から一定の間隔で収集する工程;目的のタンパク質またはポリペプチドの該血液サンプル中のレベルまたは濃度を決定する工程;および、こうして得られたデータ(のプロット)から、目的のタンパク質またはポリペプチドのレベルまたは濃度が、適当な参照時点、例えば、静脈内(i.v.)適用の直後の初期(intial)濃度と比較して50％低下する時間を計算する工程を伴いうる。例えば、標準的ハンドブック、例えば、Kenneth、A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists およびPeters et al、Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)を参照されたい。また、 「Pharmacokinetics」、M Gibaldi and D Perron、published by Marcel Dekker、2nd Rev. edition (1982)も参照されたい。
【００３８】
「グリコシル化」は糖部分がポリペプチドに特定の部位にて付加する化学修飾である。ポリペプチドのグリコシル化は典型的には N-結合型またはO-結合型である。N-結合型は、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への付着をいう。トリペプチド配列Asn-X-Ser および Asn-X-Thr (「N-X-S/T」)、（ここで、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である）が、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的付着のための認識配列である。したがって、これらトリペプチド配列 (またはモチーフ)のいずれかのポリペプチドにおける存在が潜在的N-結合型グリコシル化部位を作る。O-結合型は、炭水化物部分のセリンおよびスレオニンのヒドロキシル基酸素への付着をいう。
【００３９】
「単離」ポリペプチドまたは融合ポリペプチドはそれを発現した細胞および/またはそれが分泌された培地の成分から同定および分離されたものである。細胞の混入成分は、融合ポリペプチドの診断または治療用途を干渉するであろう材料であり、酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質性または非-タンパク質性溶質を含みうる。好ましい態様において、融合ポリペプチドは、(1)融合ポリペプチドが95重量％を超えるとして、例えば、ローリー法、紫外可視分光法またはSDS-キャピラリーゲル電気泳動 (例えば、Caliper LabChip GXII、GX 90 または Biorad Bioanalyzer deviceで)により決定され、さらに好ましい態様において99重量％を超えるとして決定され、(2) N-末端または内部アミノ酸配列の少なくとも 15 残基を得るために十分な程度に、または(3)還元または非還元条件下でのクーマシーブルーまたは、好ましくは、銀染色を用いるSDS-PAGEにより均一となるまで、精製される。通常、しかしながら、単離融合ポリペプチドは少なくとも1回の精製工程により調製されるであろう。
【００４０】
概要
本出願は、延長した半減期を有するレラキシン融合タンパク質(Relaxin fusion protein)を提供する。本出願は、有意に伸長された生物学的半減期および有意に低下した生物活性を有する改善されたレラキシン融合タンパク質を記載する。レラキシンは、半減期延長部分に、インビボで活性のプロテアーゼのための切断部位をコードするアミノ酸のストレッチにより連結され、機能的レラキシンをレラキシン融合タンパク質から放出する(release)という事実により、このレラキシン融合タンパク質は、薬理学的貯蔵所効果を示す。
【００４１】
本発明の一つの態様は、レラキシン-PCS-HEMを含む融合タンパク質であり、ここで、 レラキシンは、プロセシングされたAおよびB鎖またはそれらの機能的変異体を含むレラキシンヘテロ二量体(hetreodimer)であり、PCSは、プロテアーゼ切断部位 (PCS) を含むリンカーポリペプチドであり、HEMは、タンパク質半減期延長部分(proteinaceous half-life extending moiety) (HEM)である。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、プロレラキシン(proRelaxin)-PCS-HEMを含む融合ポリペプチドであり、ここで、プロレラキシンは、C-鎖またはその機能的変異体を依然として含有するレラキシンのプロセシングされていないプロ形態(proform) であり、PCSは、プロテアーゼ切断部位 (PCS)を含むリンカーポリペプチドであり、HEM は、タンパク質半減期延長部分 (HEM)である。
【００４３】
本発明の別の態様は、 HEM-PCS-レラキシンを含む融合タンパク質であり、ここで、レラキシンは、プロセシングされたAおよびB鎖またはそれらの機能的変異体を含むレラキシンヘテロ二量体であり、PCSは、プロテアーゼ切断部位 (PCS)を含むリンカーポリペプチドであり、HEM は、タンパク質半減期延長部分 (HEM)である。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、 HEM-PCS-プロレラキシンを含む融合タンパク質であり、ここで、プロレラキシンは、C-鎖またはその機能的変異体を依然として含有するレラキシンのプロセシングされていないプロ形態であり、PCSは 、プロテアーゼ切断部位 (PCS)を含むリンカーポリペプチドであり、HEM は、タンパク質半減期延長部分 (HEM)である。
【００４５】
プロレラキシンは、プロホルモン転換酵素によってプロセシングされておらず、レラキシン B 鎖、レラキシン C-鎖 およびレラキシン A-鎖をその天然の配向にて含む、レラキシンのプロ形態として理解される。
【００４６】
レラキシン-PCS-HEM およびプロレラキシン-PCS-HEMが好ましい態様である。
【００４７】
レラキシンドメイン:
さらなる態様において、レラキシンは、レラキシン 2 A 鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む。さらなる態様において、レラキシンは、レラキシン 2 B 鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む。
【００４８】
さらなる態様において、レラキシンは、レラキシン 2 A 鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体およびレラキシン 2 B 鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む。
【００４９】
好ましい態様において、レラキシン A 鎖ポリペプチドは、ヒト最小(minimal) レラキシン 2 A 鎖ポリペプチド (配列番号7) またはその機能的変異体を含むか、または、ヒトレラキシン 2 A 鎖ポリペプチド (配列番号6) またはその機能的変異体を含む。好ましい態様において、レラキシン B 鎖ポリペプチドは、ヒトレラキシン 2 B 鎖ポリペプチド (配列番号8) またはその機能的変異体を含む。
【００５０】
より好ましい態様において、レラキシン A 鎖は、ヒト最小レラキシン 2 A 鎖ポリペプチド (配列番号7) またはその機能的変異体を含むか、またはヒトレラキシン 2 A 鎖ポリペプチド (配列番号6) またはその機能的変異体を含み、レラキシン B 鎖ポリペプチドはヒトレラキシン 2 B 鎖ポリペプチド (配列番号8) またはその機能的変異体を含む。
【００５１】
さらなる態様において、レラキシンは、レラキシン 3 A 鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体および/または レラキシン 3 B 鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む。
【００５２】
さらなる態様において、レラキシン A 鎖は、ヒトレラキシン 3 A 鎖ポリペプチド (配列番号9)、ヒト最小レラキシン 3 A 鎖ポリペプチド (配列番号12)またはそれらの機能的変異体を含む。さらなる態様において、レラキシン B 鎖ポリペプチドはヒトレラキシン 3 B 鎖ポリペプチド (配列番号11) またはその機能的変異体を含む。好ましい態様において、レラキシンは、ヒトレラキシン 3 A 鎖ポリペプチド (配列番号10) またはその機能的変異体を含み、ヒトレラキシン 3 B 鎖ポリペプチド (配列番号11) またはその機能的変異体を含む。
【００５３】
好ましい態様において、レラキシン AまたはB 鎖の機能的変異体は、野生型レラキシンAおよびB鎖と比較して、それぞれ1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸置換、挿入および/または欠失を有する。さらに好ましいのは、保存されたモチーフ Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xをさらに含む上記レラキシン 2 B 変異体であり、ここでX はヘリックス構造を形成することができるアミノ酸を表す。
【００５４】
レラキシン AおよびB鎖変異体は当該技術分野において公知である。レラキシンのよく特徴づけられた結合部位幾何学は、当業者にレラキシン AおよびB鎖変異体を設計するためのガイダンスを提供し、例えば、レラキシン B 鎖のバリエーションについてはBuellesbach and Schwabe J Biol Chem. 2000 Nov 10; 275(45):35276-80、およびレラキシン A 鎖および「最小」レラキシン A 鎖のバリエーションについては、Hossain et al. J Biol Chem. 2008 Jun 20; 283(25):17287-97 を参照されたい。例えば、保存されたレラキシン 2 B モチーフ (Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-X)について、X は３つの規定されたアミノ酸がレラキシン B 鎖の表面に受容体接触領域を形成するために、保存モチーフにおける適当なアミノ酸X を選択するためのヘリックス構造例を形成することができるアミノ酸を表す(Buellesbach and Schwabe、(2000))。 
【００５５】
さらにより好ましい態様において、レラキシン A 鎖ポリペプチドは、ヒトレラキシン 2 A 鎖ポリペプチド (配列番号6) またはその機能的変異体であり、レラキシン B 鎖ポリペプチドは、ヒトレラキシン 2 B 鎖ポリペプチド (配列番号8) またはその機能的変異体である。さらにより好ましい態様において、ヒトレラキシン 2 A 鎖ポリペプチド (配列番号6)の機能的変異体は、配列番号16と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸置換、欠失および/または挿入を有する機能的変異体である。さらに好ましいのは 、ヒトレラキシン 2 B 鎖ポリペプチド (配列番号8)の機能的変異体であり、ここで、機能的変異体は配列番号8と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸置換、欠失および/または挿入を有する。さらにより好ましいのは、保存モチーフ Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xをさらに含む上記 ヒトレラキシン 2 B 変異体である。
【００５６】
さらにより好ましい態様において、レラキシン A 鎖ポリペプチドは、ヒトレラキシン 2 A 鎖ポリペプチド (配列番号6) または配列番号6と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸交換を有するその機能的変異体であり、レラキシン B 鎖ポリペプチドは、ヒトレラキシン 2 B 鎖ポリペプチド (配列番号8) または配列番号18と比較して1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸交換を有し、保存モチーフ Arg-X-X-X-Arg-X-X-Ile/Val-Xを含むその機能的変異体である。 
【００５７】
当業者であれば機能的変異体をどのようにして得るかを知っている。機能的変異体の例は、レラキシン A 鎖については、Hossain et al J Biol Chem. 2008 Jun 20; 283(25):17287-97 または米国特許公開第US2011/0130332号に、レラキシン B 鎖については、Schwabe and Buellesbach (2007) Adv Exp Med Biol. 612:14-25 およびBuellesbach and Schwabe J Biol Chem. 2000 Nov 10;275(45):35276-80に開示されている。
【００５８】
PCS リンカー:
レラキシンを融合タンパク質から放出させる(release)ために、用いられるリンカー配列 PCS は、プロテアーゼ/ペプチダーゼのための切断配列を含む。プロテアーゼ/ペプチダーゼはその触媒機能がタンパク質のペプチド結合を加水分解する (分解する) 酵素の群である。それらはタンパク分解酵素またはプロテイナーゼとも称される。プロテアーゼはペプチド結合を加水分解するそれらの能力において異なっており、即ち、プロテアーゼは認識および切断部位として特定のペプチド配列について優先性を有しうる。プロテアーゼは6の群に細分され、セリンプロテアーゼ、例えば、凝固因子 IIa、VIIa、およびXa、およびメタロプロテアーゼ、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ 2 および 9は、もっとも大きなファミリーを表す。
【００５９】
プロテアーゼ基質の切断部位の位置はP1-P1’と名付けられ、切断部位のN 末端部位におけるアミノ酸がP1であるとして定義され、C 末端部位におけるアミノ酸がP1’として定義される意味である。切断されたペプチド結合のN-末端方向におけるアミノ酸は、P2、P3、およびP4として番号付される。切断部位のカルボキシル側では、番号付けは同様に増大する(P1'、P2'、P3'等) (Schlechter and Berger (1967 and 1968))。
【００６０】
本発明の文脈において、プロテアーゼ/ペプチダーゼはエンドプロテアーゼ/エンドペプチダーゼである。エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼは、非-末端アミノ酸のペプチド結合(即ちタンパク質内部)を切断するタンパク分解ペプチダーゼである。それとは対照的なのはエキソペプチダーゼであり、これはN-またはC-末端ペプチド結合を加水分解し、それゆえポリペプチドのN-末端またはC-末端アミノ酸を放出する。この理由のため、PCS リンカーを切断するエンドペプチダーゼは、プロドラッグ融合タンパク質から制御された様式でレラキシンを放出することができる。
【００６１】
好ましい態様において、PCS は、エンド-プロテアーゼのPCSである。好ましい態様において、PCSは、細胞外エンド-プロテアーゼのPCSである。さらに好ましい態様において、上記エンド-プロテアーゼは血液において、またはレラキシンの作用が所望される体の部位において、活性のものである。さらにより好ましいのは、血液中に天然に存在するエンド-プロテアーゼ、例えば、凝固因子 Xaであるか、または、レラキシンで治療可能な疾患の疾患組織中に天然に存在するエンド-プロテアーゼ、例えば、MMP メタロプロテアーゼである。また好ましいのは、膜結合型または膜貫通型であるがそれらの触媒ドメインを有し、それゆえ血管の内腔に(それゆえヒト血液中に)それらの触媒活性を有するかまたは組織の間質性空間にさらされているエンド-プロテアーゼ、例えば MMP12である。さらにより好ましいのは、ヒト血液中および/またはレラキシンで治療可能な疾患の疾患組織中で活性の上記エンド-プロテアーゼである。レラキシンで治療可能な疾患は、例えば、線維性疾患である。線維性疾患の疾患組織は、それゆえ、例えば、肺、心臓、肝臓または腎臓組織である。さらなるレラキシンで治療可能な疾患を以下に列挙する。もっとも好ましいのは、ヒト起源であるかまたはヒト化された上記エンド-プロテアーゼである。
【００６２】
当業者であれば、EC 命名法にしたがって、エンドプロテアーゼは、EC EC 3.4.21 - EC 3.4.24 (the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biologyにより決定)の群に属することを知っている。有用なエンドプロテアーゼは、例えば、トリプシン、トロンビン、因子 Xa、因子 VIIa、MMP2、MMP12 またはレニンである。
【００６３】
PCSを切断する外因性エンド-プロテアーゼが投与されることにより、プロドラッグからのレラキシンの放出を導くことができることも考慮される。好ましい態様において、この内因性プロテアーゼは、レラキシン活性の所望の部位(例えば、レラキシンで治療可能な疾患の疾患組織) へとプロテアーゼに連結されたターゲティング部分を介してターゲティングされる。
【００６４】
上記エンドプロテアーゼの発現に関する知識は技術水準である。本発明のいくつかの側面において、それは好ましくは、プロドラッグとしてより長い半減期を備えたレラキシンを有するだけではなく、特定の器官または体の部分においてプロドラッグから放出されたレラキシンを有する。それゆえ、当該技術分野における情報を利用することができ、ここで、エンドプロテアーゼはプロドラッグからのレラキシンの放出の部位を調整する(tailor)ように発現される。
【００６５】
レラキシンがプロドラッグから全身性放出される場合、血液に存在するエンド-プロテアーゼを選択することになろう。かかるプロテアーゼは、例えば、凝固因子 Xaである。
【００６６】
そのプロドラッグから放出されたレラキシンは、短い半減期を有するので、特定の器官、組織または区画、特に、疾患器官、組織または区画におけるレラキシン放出の調整は、さらに、疾患部位にてレラキシンが放出されるためにその薬効を向上させる。
【００６７】
例えば、レラキシンは心筋細胞に対して直接の抗肥大性効果を有し、心臓線維芽細胞に対して抗線維化活性を有する(Moore XL. Et al. (2007); Wang P. et al. (2009))。それゆえ、プロテアーゼは好ましくは主に心臓組織において発現されるもの、例えば、MMP2 (Overall CM. (2004))またはキマーゼ (Matsumoto C. et al. (2009))である。線維性疾患により影響を受けるその他の顕著な器官は、腎臓 (Klein J.  et al. (2011)) および肺 (Coward WR et al. (2010))である。 これらの器官において、レラキシンの投与は、強い抗線維化活性 (Bennett RG (2009))を示す。それゆえ、リンカーとしてのプロテアーゼ切断部位は、好ましくは、腎臓および/または肺において主に発現されるプロテアーゼ、例えば、肺におけるMMP12 (Garbacki N. et al. (2009)) または腎臓におけるレニン (Castrop H. et al. (2010))からのものである。
【００６８】
エンド-プロテアーゼのプロテアーゼ切断部位は当該技術分野において公知である。いくつかの例を表1に示す。
【００６９】
表 1:プロテアーゼおよびそれらの対応する切断部位の例
【表１】
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【００７０】
プロテアーゼ切断部位のバリエーションは基質の異なる代謝回転を導き得ることは当該技術分野において周知である。かかるバリエーションには認識配列内部の一以上のアミノ酸の保存的または非-保存的交換が含まれ、基質の代謝回転のkcat および/または Kmに影響を与え得る。したがって、レラキシン融合タンパク質においてPCSを変動させることは、レラキシンの放出動力学をさらに調整することの基礎を提供する。
【００７１】
エンドプロテアーゼの好ましい切断部位は公知であるので、PCS/エンドプロテアーゼの組合せは、エンドプロテアーゼが特異的にPCSを切断するが、レラキシンまたは半減期延長部分を切断しないように選択する。さらに、エンド-プロテアーゼがまたレラキシンまたは半減期延長部分のペプチド結合も加水分解するか否かを判定するための当該技術分野において提供される方法が存在する。 
【００７２】
好ましい PCSは凝固因子 Xaの切断部位であり、さらに好ましいのは、配列 IleGluGlyArgMetAspを有するPCSである。
【００７３】
さらなる態様において、上記融合ポリペプチド/タンパク質のPCS リンカーポリペプチドは、N-末端 および/または C-末端にてさらにストレッチャーポリペプチドを有しうる。ストレッチャーユニットはエンド-プロテアーゼのPCSへのより良好なアクセスを提供することができ、それゆえ融合タンパク質からのレラキシンのより良好な放出を提供しうる。所与の基質に対するプロテアーゼ活性を決定する方法は当該技術分野において公知である。
【００７４】
かかるストレッチャーは当該技術分野において公知であり、 1から約 100 アミノ酸長、1から約 50 アミノ酸長、1から約 25 アミノ酸長、1から約 15 アミノ酸長、1から10 アミノ酸長、または1から5 アミノ酸長である。
【００７５】
低い免疫原性潜在力を示すストレッチャーが好ましいが、ストレッチャー配列のアミノ酸組成は可変性である。本発明のある態様において、ストレッチャーポリペプチドはいずれのアミノ酸から構成されていてもよい。
【００７６】
より好ましい態様において、ストレッチャーポリペプチドは、Gly およびSer 残基を含む。さらに好ましい態様において、ストレッチャーペプチドは、グリシン-リッチリンカー、例えば、米国特許第7,271,149号に開示されるような、配列 [GGGGS]nを含むペプチドであり、ここで、nは1から20、好ましくは1から10、より好ましくは 1から 5、さらにより好ましくは1から3の整数である。その他の態様において、米国特許第5,525,491号に記載されるような、セリン-リッチストレッチャー(strecher) ポリペプチドが用いられる。さらに好ましい態様は、Gly およびSer 残基を含み、GlyのSerに対する比が少なくとも 3から1であるストレッチャーポリペプチドである。
【００７７】
ストレッチャーユニットがPCSとレラキシンとの間の導入された場合、ストレッチャーユニットはPCSの、それぞれPまたは P’アミノ酸に加えて、それぞれのエンド-プロテアーゼによる切断の後にレラキシン上に残る。それゆえ、レラキシン活性を減少させないストレッチャーユニットが使用される。好ましい態様において、ストレッチャーユニットはPCS と半減期延長部分との間に挿入される。
【００７８】
さらなる態様において、上記融合ポリペプチドは活性のレラキシンを放出する。さらに好ましい態様において、レラキシン活性は、レラキシン受容体 LGR7の活性化である。レラキシン活性を決定する方法は当該技術分野において公知であるかまたは本明細書において提供されている。さらに別の好ましい態様において、レラキシン受容体 LGR7の活性化は、本明細書において実験方法に開示される方法によって決定される。さらに別の好ましい態様において、レラキシン受容体 LGR7の活性化の決定は、 EC50 値を決定することである。さらにより好ましい態様において、上記レラキシン活性は、最大半量活性を含む対応する野生型レラキシン有効濃度と比較して105 倍(fold)未満、104 倍未満、103 倍未満、100 倍未満、75 倍未満、50 倍未満、25 倍未満または10 倍未満より低い。例えば、ヒトレラキシン 2に基づく融合ポリペプチドのための対応する野生型レラキシンは、ヒトレラキシン 2 タンパク質である。
【００７９】
タンパク質半減期延長部分を介する半減期延長: 
本発明の融合ポリペプチドの半減期を改善するために、タンパク質半減期延長部分との融合が考慮され、タンパク質半減期延長部分としては、例えば、免疫グロブリンの免疫グロブリン Fc 断片、トランスフェリン、トランスフェリン受容体 またはその少なくともトランスフェリン-結合部分、血清アルブミン、またはそれらの変異体またはインビボでより長い半減期を媒介するその他の分子に結合する結合モジュール、例えば、血清アルブミン結合タンパク質が挙げられる。
【００８０】
「免疫グロブリン」は、ジスルフィド結合によって一緒に保持されるポリペプチド鎖を含む分子であり、典型的には２つの軽鎖と２つの重鎖を有する。各鎖において、１つのドメイン (可変性ドメイン Fv) が分子の抗体特異性に応じて可変性アミノ酸配列を有する。その他のドメイン(定常ドメインC)は、同じクラスの分子に共通するかなり一定の配列を有する。
【００８１】
本明細書において用いる場合、免疫グロブリンの「Fc」部分は免疫学の分野においてこの用語に一般的に与えられる意味を有する。具体的には、この用語は、抗体から２つの抗原結合領域 (Fab 断片)を除去することによって得られる抗体断片をいう。 Fab 断片を除去するための１つの方法は、免疫グロブリンをパパインプロテアーゼで消化することである。したがって、Fc 部分は、両方の重鎖からの定常領域のおよそ同じサイズの断片から形成され、これらは、非共有結合相互作用および所望によりジスルフィド結合によって結合している。Fc 部分はヒンジ領域を含んでいてもよく、CH2 およびCH3 ドメインを介して抗体のC-末端へと伸長しうる。ヒトおよびマウス免疫グロブリンについての代表的なヒンジ領域は、Antibody Engineering、A Practical Guide、Borrebaeck、C.A.K.、ed.、W.H. Freeman and Co.、1992においてみることができる。
【００８２】
異なるエフェクターおよび薬物動態特性を有するヒト免疫グロブリン Fc 領域の５つのタイプが存在する: IgG、IgA、IgM、IgD、および IgEである。IgGは血清中でもっとも豊富な免疫グロブリンである。IgG はまた血清中であらゆる免疫グロブリンのもっとも長い半減期を有する(23 日間)。その他の免疫グロブリンと異なり、IgG はFc 受容体への結合の後のエンドサイトーシスの後に効率的に再循環する。４つの IgG サブクラスである G1、G2、G3、および G4が存在し、そのそれぞれは異なる効果または機能を有する。これらのエフェクター機能は一般に、 Fc 受容体 (FcγR) との相互作用によって、またはC1qに結合することおよび補体を固定することによって媒介される。FcγRへの結合は抗体依存的細胞媒介性細胞溶解を導き得、一方、補体因子への結合は補体媒介性細胞溶解を導き得る。異種 Fc 融合タンパク質の設計において、ここで、 Fc 部分は半減期を延長するその能力のためにのみ用いられるが、あらゆるエフェクター機能を最小化することが重要である。すべてのIgG サブクラスはFc 受容体 (CD16、CD32、CD64) に結合することができるがG1 およびG3 がG2およびG4と比べてより効率的である。IgG のFc 受容体結合領域は、ヒンジおよびCH2 ドメインのカルボキシ末端領域の両方に位置する残基によって形成される。
【００８３】
所望のインビボ効果に応じて、本発明の異種融合タンパク質は上記のアイソタイプのいずれかを含み得、または突然変異した Fc 領域を含み得、ここで、補体および/または Fc 受容体結合機能が変化している。したがって、本発明の異種融合タンパク質は、完全な免疫グロブリンのFc 部分、免疫グロブリンのFc 部分の断片、またはそれらの類似体を含みうる。
【００８４】
本発明の異種融合タンパク質に用いられるFc 領域は、IgG1またはIgG2 Fc 領域に由来することが好ましい。
【００８５】
一般に、本発明の異種融合タンパク質のために用いられるFc 領域はいずれの種に由来するものでもよく、種としては、ヒト、ラット、マウスおよびブタを含むがそれらに限定されない。好ましくは、本発明のために用いられるFc 領域は、ヒトまたはラットに由来する。しかしながら、もっとも好ましいのは、融合タンパク質がヒトにおいて免疫原性となるリスクを低下するために、ヒト Fc 領域およびその断片および変異体である。「ネイティブ(native) 配列 Fc 領域」は、天然にみられるFc 領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異体 Fc 領域」は、少なくとも一つのアミノ酸修飾のためにネイティブ配列 Fc 領域とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体 Fc 領域は、ネイティブ配列 Fc 領域または親ポリペプチドのFc 領域と比較して少なくとも一つのアミノ酸置換を有し、例えば、ネイティブ配列 Fc 領域または親ポリペプチドのFc 領域において、約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。変異体 Fc 領域は、本明細書において、好ましくはネイティブ配列 Fc 領域 および/または親ポリペプチドのFc 領域と少なくとも 約 80％の配列同一性、もっとも好ましくは ネイティブ配列 Fc 領域 および/または親ポリペプチドのFc 領域と少なくとも 約 90％の配列同一性、より好ましくはネイティブ配列 Fc 領域 および/または親ポリペプチドのFc 領域と 少なくとも 約 95％の配列同一性を有する。
【００８６】
上記のレラキシン化合物は、直接的にまたはペプチドストレッチャーを介してアルブミンまたはその類似体、断片、または誘導体に融合していてもよい。一般に、本発明の融合タンパク質のアルブミンタンパク質を構成する部分はいずれの種からクローニングされたアルブミンに由来するものであってもよい。しかしながら、ヒトアルブミンおよびその断片および類似体は、融合タンパク質がヒトにおいて免疫原性となるリスクを低下するために好ましい。ヒト血清アルブミン (HSA) は、585 アミノ酸の単一の非-グリコシル化ポリペプチド鎖からなり、式(formula)分子量が66,500である。HSA (配列番号3)のアミノ酸配列は例えば、Meloun、et al. (1975); Behrens、et al. (1975); Lawn、et al. (1981)およびMinghetti、et al. (1986) に記載されている。アルブミンの種々の多形性変異体ならびに類似体および断片が記載されている (Weitkamp、et al. (1973)を参照されたい)。例えば、EP0322094 およびEP0399666には、ヒト血清アルブミンの様々な断片が開示されている。本発明の異種融合タンパク質は、断片、類似体、および誘導体を含むいずれかのアルブミンタンパク質を含むレラキシン化合物を含むということを理解すべきであり、ここで、かかる融合タンパク質は生物学的に活性のものであり、かつ、対応する野生型レラキシン単独と比較してより長い血漿半減期を有するものである。したがって、融合タンパク質のアルブミン部分は必ずしもネイティブヒトアルブミンと同一の血漿半減期を有する必要はない。断片、類似体、および誘導体は公知であるか、または、より長い半減期またはネイティブヒトアルブミンと目的のレラキシン化合物との中間の半減期を有するよう作成すればよい。技術は当該技術分野において周知であり、例えば、WO 93/15199、WO 93/15200、WO 01/77137およびEP0413622を参照されたい。
【００８７】
本発明のある態様において、タンパク質半減期延長部分は低い免疫原性を有し、ヒトまたはヒト化のものである。好ましい態様において、タンパク質半減期延長部分はヒト、例えば、ヒトトランスフェリン (配列番号2)、ヒト血清アルブミン (配列番号3)、またはヒト IgG1 Fc (配列番号4)である。
【００８８】
さらに、生物学的半減期を向上させるその他のタンパク質、タンパク質ドメインまたはペプチドも融合パートナーとして用いることができる。
【００８９】
ヒト血清アルブミンとの融合を介する半減期延長は、例えばWO93/15199に開示されている。タンパク質の薬物動態を向上させるための一般的戦略としてのアルブミン結合は、例えば、Dennis et al.、The Journal of Biological Chemistry、Vol. 277、No 38、Issue of September 20、pp. 35035-35043に記載されている。ヒト血清アルブミン結合タンパク質との融合を介する半減期延長は、例えば 、US20100104588に開示されている。ヒト血清アルブミンまたはIgG-Fc 結合タンパク質との融合を介する半減期延長は、例えば WO01/45746に開示されている。ヒト血清アルブミン結合ペプチドとの融合を介する半減期延長のさらなる例は、WO2010/054699に開示されている。
【００９０】
Fc ドメインとの融合を介する半減期延長は、例えば、WO2001/058957に開示されている。
【００９１】
生物活性は、目的のタンパク質のその融合パートナーに対する好ましい配向を決定する。融合パートナーの C-末端 ならびに N-末端配向が含まれる。さらに、生物学的半減期またはその他の機能の向上のために、融合パートナーは、リン酸化、硫酸化、アクリル化(acrylation)、グリコシル化、脱グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化またはその他によって修飾してもよい。
【００９２】
タンパク質半減期延長部分の例は、トランスフェリン、トランスフェリン受容体またはその少なくともトランスフェリン-結合部分、血清アルブミン、血清アルブミン結合タンパク質、免疫グロブリン(Immunglobulin)、および免疫グロブリンのFc ドメインである。好ましくは、ヒトタンパク質半減期延長部分、例えば、ヒトトランスフェリン、ヒトトランスフェリン受容体またはその少なくともトランスフェリン-結合部分、ヒト血清アルブミン、ヒト免疫グロブリンまたはヒト Fc ドメインである。
【００９３】
さらなる態様において、少なくとも一つの半減期延長部分を含む上記融合ポリペプチドは、対応する野生型レラキシンと比較して延長した半減期を有し、ここで、半減期延長は、少なくとも 5、10、20、50、100 または500-倍である。好ましくは、半減期は、血清半減期として決定され、血清または全血中の融合タンパク質の、例えば、市販の定量 ELISA アッセイ (例えば、 R＆D Systems、Human Relaxin-2 Quantikine ELISA kit、カタログ番号 DRL200)を用いる検出を意味する。半減期は好ましくはヒト血液半減期である。
【００９４】
クローニング、ベクター系、発現、宿主、および精製
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチド HEM-PCS-プロレラキシン(proRelaxin)またはプロレラキシン-PCS-HEMをコードする単離核酸分子を含むベクターも提供する。このベクター系は、宿主細胞におけるその発現を駆動することができる発現配列に作動可能に連結している。
【００９５】
好適な宿主細胞は、細菌細胞 (例えば、大腸菌(E. coli))、酵母細胞(例えば、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae))、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞からなる群から選択されうる。動物細胞としては、これらに限定されないが、HEK293 細胞、CHO 細胞、COS 細胞、BHK 細胞、HeLa 細胞および様々な初代哺乳類細胞が挙げられる。哺乳類細胞の誘導体、例えば、HEK293T 細胞もまた適用可能である。
【００９６】
本発明のDNA 分子
本発明はまた、本発明の融合タンパク質 HEM-PCS-プロレラキシンまたはプロレラキシン-PCS-HEMをコードするDNA 分子にも関する。
【００９７】
本発明のDNA 分子は、本明細書において開示される配列には限定されず、それらの変異体もまた含む。本発明の範囲内のDNA 変異体はハイブリダイゼーションにおけるそれらの物理的特性を参照することにより記載することができる。当業者であれば、DNAは二本鎖であるため、核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて、DNAはその相補鎖、その等価物またはホモログを同定するために用いることができることを認識しているであろう。ハイブリダイゼーションは、100％未満の相補性によっても起こりうることも認識されているであろう。しかしながら、適当な条件の選択を与えると、ハイブリダイゼーション技術を用いて、特定のプローブに対するそれらの構造関連性に基づいてDNA 配列間を区別することができる。かかる条件に関するガイダンスのために、Sambrook et al.、1989 前掲およびAusubel et al.、1995 (Ausubel、F. M.、Brent、R.、Kingston、R. E.、Moore、D. D.、Sedman、J. G.、Smith、J. A.、＆ Struhl、K. eds. (1995). Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley and Sons)を参照されたい。
【００９８】
２つのポリヌクレオチド配列の間の構造類似性は、２つの配列が互いにハイブリダイズする条件下の「ストリンジェンシー」の関数として表すことができる。本明細書において用いる場合、「ストリンジェンシー」という語は、ハイブリダイゼーションを嫌う条件の程度をいう。ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーションを強く嫌い、もっとも構造的に関連した分子のみがかかる条件下で互いにハイブリダイズする。逆に、非−ストリンジェントな条件はより低い程度の構造関連性を示す分子のハイブリダイゼーションを好む。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、それゆえ、直接的に２つの核酸配列の構造関係性と相関する。以下の関係性はハイブリダイゼーションと関連性とを相関させることにおいて有用である(ここで、Tm は核酸二本鎖の融解温度である):
a.Tm = 69.3 + 0.41(G+C)％
b.二本鎖 DNAのTmは不適正(mismatched)塩基対の数が1％増加するごとに1℃ずつ低下する。
c.(Tm)μ2 − (Tm) μ1 = 18.5 log10μ2/μ1
ここで、μ1 およびμ2は２つの溶液のイオン強度である。
【００９９】
ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、多くの因子の関数であり、かかる因子としては、全体の DNA 濃度、イオン強度、温度、プローブサイズおよび水素結合を破壊する剤の存在が挙げられる。ハイブリダイゼーションを促進する因子としては、高い DNA 濃度、高いイオン強度、低い温度、より長いプローブサイズおよび水素結合を破壊する剤の不在が挙げられる。ハイブリダイゼーションは典型的には二相にて行われる: 「結合」相および「洗浄」相である。
【０１００】
第一に、結合相において、プローブはハイブリダイゼーションを好む条件下で標的に結合される。ストリンジェンシーは通常、この段階では、温度を変化させることによって制御される。高いストリンジェンシーのためには、短い (＜ 20 nt) オリゴヌクレオチドプローブが使用されない限り、温度は通常65℃から70℃である。代表的なハイブリダイゼーション溶液は、6X SSC、0.5％ SDS、5X デンハルト液および100 μgの非特異的キャリアDNAを含む。Ausubel et al.、section 2.9、supplement 27 (1994)を参照されたい。もちろん、多くの異なる、しかし機能的に等価な、バッファー条件が公知である。関連性の程度がより低い場合、より低い温度を選択するとよい。低いストリンジェンシーの結合温度は、約 25℃ から40℃である。中程度のストリンジェンシーは少なくとも 約 40℃から約 65℃未満である。高いストリンジェンシーは少なくとも 約 65℃である。
【０１０１】
第二に、過剰なプローブを洗浄により除去する。よりストリンジェントな条件が通常適用されるのはこの相においてである。したがって、ハイブリダイゼーションを介する関連性の決定においてもっとも重要なのは、この「洗浄」段階である。洗浄溶液は典型的にはより低い塩濃度を含有する。一つの例示的な中程度のストリンジェンシー溶液は、 2X SSC および 0.1％ SDSを含有する。高いストリンジェンシーの洗浄溶液は、約 0.2未満X SSCの等価物 (イオン強度において) を含有し、好ましくはストリンジェント溶液は約 O.1X SSCを含有する。様々なストリンジェンシーと関連する温度は、「結合」について上記にて議論したものと同じである。洗浄溶液はまた典型的には洗浄の間に何度も交換される。例えば、典型的な高いストリンジェンシーの洗浄条件は、30 分間55℃での2回の洗浄および15 分間60℃での3回の洗浄を含む。
【０１０２】
本発明の一つの態様は、本発明の融合ポリペプチドをコードする単離核酸配列である。
【０１０３】
組換え DNA コンストラクトおよび発現 
本発明はさらに、一以上の本発明のヌクレオチド配列を含む組換え DNA コンストラクトを提供する。本発明の組換えコンストラクトは、ベクター、例えば、プラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターと関連して用いられ、かかるベクター中に本発明の融合ポリペプチドをコードするDNA 分子が挿入される。
【０１０４】
本明細書において提供される融合ポリペプチドは、宿主細胞における融合ポリペプチドをコードする核酸配列の組換え発現により調製され得る。組換えにより融合ポリペプチドを発現させるために、宿主細胞を融合ポリペプチドをコードするDNA 断片を担持する組換え発現ベクターによりトランスフェクトすることができ、それにより、融合ポリペプチドが宿主細胞において発現される。標準的組換え DNA 方法が、融合ポリペプチドをコードする核酸を調製および/または取得するため、かかる核酸を組換え発現ベクターに組み込むため、およびベクターを宿主細胞に導入するために用いられ、例えば、 Sambrook、Fritsch and Maniatis (eds.)、Molecular Cloning; A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor、N.Y.、(1989)、Ausubel、F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates、(1989) およびBoss et al.による米国特許第4,816,397号に記載されているものが挙げられる。 
【０１０５】
融合ポリペプチドを発現させるために、標準的組換え DNA 発現方法を用いることができる(例えば、Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、Calif. (1990) を参照されたい)。例えば、所望のポリペプチドをコードするDNAを発現ベクターに挿入することができ、それを次いで好適な宿主細胞にトランスフェクトする。好適な宿主細胞は、原核および真核細胞である。原核宿主細胞についての例は、例えば、細菌であり、真核宿主細胞についての例は、酵母、昆虫または哺乳類細胞である。発現ベクターの設計、例えば、調節配列の選択は、因子、例えば、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、および発現が構成的であるかまたは誘導性であるかによって影響を受けるということを理解すべきである。
【０１０６】
細菌発現
細菌での使用のために有用な発現ベクターは、所望のタンパク質をコードする構造 DNA 配列を、機能的プロモーターとの作動可能な読み取り相(in operable reading phase)において好適な翻訳開始および終止シグナルとともに挿入することによって構築される。ベクターは、ベクターの維持を確実にするために、そして所望の場合、宿主内での増幅を提供するために、一以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含むであろう。形質転換のために好適な原核宿主としては、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium) および属、シュードモナス(Pseudomonas)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、およびブドウ球菌(Staphylococcus)に含まれる様々な種が挙げられる。
【０１０７】
細菌ベクターは、例えば、バクテリオファージ-、プラスミド- またはファージミド-に基づくものでありうる。これらベクターは市販のプラスミドに由来する選択マーカーおよび細菌複製起点を含み得、 典型的には、周知のクローニングベクター pBR322 (ATCC 37017)の要素を含む。好適な宿主株の形質転換および宿主株の適当な細胞密度までの増殖の後、選択されたプロモーターは適当な手段(例えば、温度シフトまたは化学的誘導)によって抑制解除/誘導され、細胞は追加の期間培養される。細胞は典型的には遠心分離によって収集され、物理的または化学的手段によって破壊され、結果として得られる粗抽出物がさらなる精製のために保持される。
【０１０８】
細菌系において、多数の発現ベクターが発現されるタンパク質について意図される用途に応じて有利に選択され得る。例えば、大量のかかるタンパク質を生産するべき場合は、ただちに精製される高レベルの融合ポリペプチド産物の発現を駆動するベクターが望ましいであろう。本発明の融合ポリペプチドには、精製された産物、化学的合成手順の生成物、および原核宿主、例えば、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium) および属、シュードモナス(Pseudomonas)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、およびブドウ球菌(Staphylococcus)に含まれる様々な種、好ましくは大腸菌(E. coli) 細胞から組換え技術によって生産される産物が含まれる。
【０１０９】
哺乳類発現および精製
哺乳類宿主細胞発現のための好ましい調節配列としては、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を駆動するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス (CMV) (例えば、CMV プロモーター/エンハンサー)、サルウイルス40 (SV40) (例えば、SV40 プロモーター/エンハンサー)、アデノウイルス、(例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター (AdMLP))およびポリオーマに由来するプロモーターおよび/またはエンハンサーが挙げられる。ウイルス調節要素、およびそれらの配列のさらなる記載については、例えば、Stinski によるU.S. 5,168,062、Bell et al. によるU.S. 4,510,245およびSchaffner et al.によるU.S. 4,968,615を参照されたい。組換え発現ベクターはまた、複製起点および選択マーカーを含みうる (例えば、Axel et al.によるU.S. 4,399,216、4,634,665およびU.S. 5,179,017を参照されたい)。好適な選択マーカーとしては、ベクターが導入された宿主細胞に薬物耐性を与える遺伝子、例えば、G418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートが挙げられる。例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素 (DHFR) 遺伝子はメトトレキサート耐性を与え、neo 遺伝子はG418耐性を与える。
【０１１０】
発現ベクターの宿主細胞へのトランスフェクションは、標準的技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、およびDEAE-デキストラン、リポフェクションまたはポリカチオン-媒介トランスフェクションを用いて行うことができる。
【０１１１】
本明細書において提供される融合ポリペプチドを発現するために好適な哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO 細胞) (Urlaub and Chasin、(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載のdhfr- CHO 細胞を含み、例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載のDHFR 選択マーカーとともに用いられる)、NSO ミエローマ細胞、COS 細胞およびSP2 細胞が挙げられる。いくつかの態様において、発現ベクターは、発現されたタンパク質が宿主細胞が培養された培地に分泌されるように設計される。抗体の一過性トランスフェクション/発現(epression) は、例えば、Durocher et al (2002) Nucl.Acids Res. Vol 30 e9によるプロトコールにしたがって達成され得る。抗体の安定なトランスフェクション/発現は、例えば、UCOE システム (T. Benton et al. (2002) Cytotechnology 38: 43-46)のプロトコールにしたがって達成され得る。
【０１１２】
融合ポリペプチドは標準的タンパク質精製方法を用いて培地から回収され得る。
【０１１３】
本発明の融合ポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインAクロマトグラフィー、プロテインGクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含むがそれらに限定されない周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収および精製され得る。高速液体クロマトグラフィー (「HPLC」) もまた精製のために用いることができる。例えば、引用によりそれぞれその全体を本明細書に組み込む、Colligan、Current Protocols in Immunology、または Current Protocols in Protein Science、John Wiley ＆ Sons、NY、N.Y.、(1997-2001)、例えば、Chapters 1、4、6、8、9、10を参照されたい。
【０１１４】
本発明の融合ポリペプチドには、精製または単離産物、化学的合成手順の生成物、および、真核宿主、例えば、酵母 (例えば、ピキア(Pichia))、高等植物、昆虫および哺乳類細胞、好ましくは、哺乳類細胞から組換え技術によって生産された産物が含まれる。組換え産生手順に用いた宿主に応じて、本発明の融合ポリペプチドはグリコシル化されているかまたは非-グリコシル化であり得、グリコシル化されているものが好ましい。かかる方法は、多くの標準的研究室マニュアル、例えば Sambrook、前掲、Sections 17.37-17.42; Ausubel、前掲、Chapters 10、12、13、16、18 および20に記載されている。
【０１１５】
治療用途
本発明の一つの態様は、本発明の医薬組成物または融合ポリペプチドの、心血管疾患、腎疾患、膵炎、炎症、癌、強皮症、肺、腎、および肝線維症の治療における使用である。
【０１１６】
心血管疾患
心血管系の障害、即ち心血管障害とは、本発明の文脈において、例えば、以下の障害を意味する: 高血圧 (高い血圧)、末梢および心臓血管障害、冠動脈心疾患、安定および不安定狭心症、心筋機能不全、持続性虚血性機能不全 (「冬眠心筋」)、一過性虚血後機能不全 (「気絶心筋」)、心不全、末梢血流の障害、急性冠動脈症候群、心不全および心筋梗塞。
【０１１７】
本発明の文脈において、心不全という用語には、心不全、ならびにより特異的または関連性タイプの疾患、例えば、急性非代償性心不全、右心不全、左心不全、全身不全(global failure)、虚血性心筋症、拡張型心筋症、先天性心疾患、心臓弁異常、心臓弁異常と関連する心不全、僧帽弁狭窄、僧帽弁閉鎖不全、大動脈弁狭窄、大動脈弁閉鎖不全、三尖弁狭窄、三尖弁閉鎖不全、肺動脈弁狭窄、肺動脈弁機能不全、複合型心臓弁異常、心筋炎症 (心筋炎)、慢性心筋炎、急性心筋炎、ウイルス性心筋炎、糖尿病性心不全、アルコール性心筋症、心臓貯蔵障害、および拡張期および収縮期心不全 および悪化する(worsening) 心不全の急性期の、急性および慢性徴候の両方が含まれる。
【０１１８】
本発明による化合物はさらにまた、梗塞に冒されている心筋の領域を減少させるため、および続発性梗塞の予防のためにも好適である。
【０１１９】
本発明による化合物はさらに、血栓塞栓性障害、虚血後の再灌流障害、微小血管性および大血管性病変(血管炎)、動脈および静脈血栓症、浮腫、虚血、例えば、心筋梗塞、脳卒中および一過性虚血性発作の予防および/または治療のため、冠状動脈バイパス手術(CABG)、初回経皮経管冠動脈形成術 (PTCAs)、血栓溶解後のPTCAs、血栓溶解治療後において不成功例に対し行う経皮的冠動脈形成術(rescue PTCA)、心臓移植術および心臓切開手術に関連した心保護のため、および移植術、バイパス手術、カテーテル検査およびその他の外科手術手技に関連した臓器保護のために好適である。
【０１２０】
その他の適応症(indication)の領域は、例えば、呼吸障害、例えば、慢性閉塞性肺疾患 (慢性気管支炎、COPD)、喘息、肺気腫、気管支拡張症、嚢胞性線維症(cystic fibrosis) (嚢胞性線維症(mucoviscidosis)) および肺高血圧、特に、肺動脈高血圧等の予防および/または治療である。
【０１２１】
腎疾患
本発明は、腎疾患、特に、急性および慢性腎疾患および急性および慢性腎機能不全、ならびに急性および慢性腎不全、例えば、透析の要求があるかまたはない急性および慢性段階の腎不全、ならびに基礎または関連腎疾患、例えば、腎低灌流、透析誘導性低血圧、糸球体症、糸球体性蛋白尿および尿細管性蛋白尿、腎浮腫、血尿、原発性、続発性、ならびに急性および慢性糸球体腎炎、膜性腎症および膜性増殖性糸球体腎炎、アルポート症候群、糸球体硬化症、間質性尿細管疾患、腎障害疾患、例えば、原発性および先天的腎疾患、腎炎症、免疫性腎疾患、例えば、腎移植拒絶反応、免疫複合体誘導性腎疾患、ならびに、クレアチニンクリアランスおよび/または水排出の異常な低下、尿素、窒素、カリウムおよび/またはクレアチニンの異常な血液濃度上昇、腎酵素、例えば、グルタミルシンテターゼの活性、尿浸透圧および尿量の変化、ミクロアルブミン尿症、顕性アルブミン尿、糸球体および細動脈病変の上昇、尿細管拡張、高リン血症および/または透析の要求を特徴とし、診断的にそれらと関連する、中毒誘導性腎障害疾患、糖尿病性および非-糖尿病性腎疾患、腎盂腎炎、嚢胞腎、腎硬化症、高血圧性腎硬化症、ネフローゼ症候群の予防および/または治療のための医薬としての本発明の融合ポリペプチドの使用に関する。
【０１２２】
さらに、本発明の融合ポリペプチドは、腎臓の不完全な摘出の後の腎癌、利尿剤の乱用後の脱水、悪性高血圧を伴う制御されない血圧上昇、尿路閉塞および感染、アミロイド症、ならびに糸球体損傷と関連する全身性疾患、例えば、エリテマトーデス、およびリウマチ性免疫性全身性疾患、ならびに腎動脈狭窄、腎動脈血栓症、腎静脈血栓症、鎮痛剤誘導性腎症および腎尿細管アシドーシスの予防および/または治療のための医薬として用いることができる。
【０１２３】
さらに、本発明の融合ポリペプチドは、造影剤誘導性および薬物誘導性急性および慢性間質性腎疾患、メタボリックシンドロームおよび脂質異常症の予防および/または治療のための医薬として用いることができる。
【０１２４】
さらに、本発明は、急性および/または慢性腎疾患と関連する後遺症、例えば、肺浮腫、心不全、尿毒症、貧血、電解質異常 (例えば、高カリウム血症、低ナトリウム血症)、ならびに骨性および炭水化物代謝の予防および/または治療のための医薬としての本発明の融合ポリペプチドの使用を含む。
【０１２５】
肺疾患
さらに、本発明による融合タンパク質はまた、肺疾患、特に、喘息性障害、肺動脈高血圧 (PAH) およびその他の形態の肺高血圧 (PH)、例えば、左心疾患、HIV、鎌状赤血球貧血、血栓塞栓症 (CTEPH)、サルコイドーシス、COPD または肺線維症-関連肺高血圧、慢性-閉塞性肺疾患 (COPD)、急性呼吸促迫症候群 (ARDS)、急性肺損傷 (ALI)、アルファ1抗トリプシン欠損症 (AATD)、肺線維症、肺気腫 (例えば、たばこの煙に誘導される肺気腫)および嚢胞性線維症 (CF)の治療および/または予防のためにも好適である。
【０１２６】
線維性障害
本発明による融合タンパク質は、さらに、内臓器官、例えば、肺、心臓、腎臓、骨髄および、特に、肝臓の線維性障害、および皮膚線維症および線維性眼障害等の治療および/または予防にも好適である。本発明の文脈において、線維性障害という用語には、特に以下の語が含まれる: 肝線維症、肝硬変、肺線維症、心内膜心筋線維症、腎症、糸球体腎炎、間質性腎線維症、糖尿病に起因する線維性損傷、骨髄線維症および類似の線維性障害、強皮症、モルフェア、ケロイド、肥厚性瘢痕 (外科手術手技の後も)、母斑、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症および結合組織障害 (例えば、サルコイドーシス)。
【０１２７】
癌
癌は、細胞の群が制御されない増殖を示す疾患である。癌は通常、上皮細胞に由来する癌である癌腫(この群は多くのもっとも一般的な癌を含み、例えば、乳房、前立腺、肺および結腸のものが挙げられる);結合組織、または間葉系細胞に由来する肉腫;造血性細胞に由来するリンパ腫および白血病; 多能性(pluripotent)に由来する生殖細胞腫瘍; および、未熟「前駆体」または胚組織に由来する癌である芽細胞腫に、分類される。
【０１２８】
本発明はさらに、障害、特に上記の障害の治療および/または予防のための医薬を調製するための本発明の融合タンパク質の使用を提供する。
【０１２９】
本発明はさらに、有効量の少なくとも一つの本発明の融合タンパク質を用いる、障害、特に上記の障害の治療および/または予防のための方法を提供する。
【０１３０】
本発明はさらに、冠動脈心疾患、急性冠動脈症候群、心不全、および心筋梗塞の治療および/または予防のための方法における使用のための本発明の融合タンパク質を提供する。
【０１３１】
医薬組成物および投与 
本発明はまた、医薬上許容される媒体中にレラキシン融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。レラキシン融合タンパク質は全身的または局所的に投与されうる。当該技術分野において公知のあらゆる適当な投与方法を用いることができ、例えば、静脈内、腹腔内、動脈内、吸入による、鼻腔内、経口、局所注射によるかまたは外科的移植の形態における、皮下投与を含むがそれらに限定されない。
【０１３２】
本発明はまた、本発明の融合ポリペプチドを、単独でまたは少なくとも一つのその他の剤(agent)、例えば、安定化化合物と組み合わせて含みうる医薬組成物にも関し、それはあらゆる無菌の生体適合性医薬用担体中にて投与することができ、かかる担体は生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖(dextrose)、および水を含むがそれらに限定されない。これらの分子のいずれも患者に単独でまたは医薬組成物中にてその他の剤(agent)、薬物またはホルモンと組み合わせて投与され得、医薬組成物においてそれは賦形剤または医薬上許容される担体と混合されている。本発明の一つの態様において、医薬上許容される担体は薬剤的に不活性なものである。
【０１３３】
本発明はまた、医薬組成物の投与にも関する。かかる投与は経口または非経口により達成される。非経口送達の方法には、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が含まれる。有効成分に加えて、これら医薬組成物は、賦形剤および補助剤(auxiliaries)を含む好適な医薬上許容される担体を含んでいてもよく、これらは活性化合物の医薬上利用できる調製物への加工を促進する。製剤および投与についての技術に関するさらなる詳細は、the lastest edition of Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co、Easton、Pa.)においてみることができる。
【０１３４】
経口投与のための医薬組成物は、経口投与のために好適な用量(dosage)において当該技術分野において周知の医薬上許容される担体を用いて製剤することができる。かかる担体は医薬組成物が、患者による摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として製剤されることを可能とする。
【０１３５】
非経口投与のための医薬製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射のために、本発明の医薬組成物は、水溶液、好ましくは、生理的に適合性の緩衝液、例えば、ハンクス液、リンゲル液、または生理的(physiologically)緩衝食塩水中に製剤することができる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を上昇させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含んでいてもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒または媒体としては、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。所望により、懸濁液はまた、好適な安定化剤または化合物の溶解度を上昇させる剤(agent)も含んでいてもよく、これにより調製物を高度に濃縮された溶液とすることができる。
【０１３６】
本発明による融合タンパク質は、単独で、または必要である場合、その他の活性化合物と組合せて用いることができる。本発明はさらに、少なくとも一つの本発明による融合ポリペプチドおよび特に上記の障害の治療および/または予防のための一以上のさらなる有効成分を含む医薬を提供する。
【０１３７】
組合せのために好適な有効成分は、例として、および優先性として(by way of preference):脂質代謝を調節する有効成分、抗糖尿病薬、降圧薬、灌流促進(perfusion-enhancing)および/または抗血栓薬、抗酸化剤、ケモカイン受容体アンタゴニスト、p38−キナーゼ阻害剤、NPY アゴニスト、オレキシンアゴニスト、食欲低下薬、PAF-AH 阻害剤、消炎薬 (COX 阻害剤、LTB4-受容体アンタゴニスト)、鎮痛薬、例えば、アスピリン、抗うつ薬およびその他の向精神薬である。
【０１３８】
本発明は、特に、少なくとも一つの本発明による融合ポリペプチドと、少なくとも一つの、脂質代謝を変化させる有効成分、抗糖尿病薬(anti-diabetic)、血圧を低下させる有効成分および/または抗血栓性効果を有する剤(agent) との組合せに関する。
【０１３９】
本発明による融合ポリペプチドは好ましくは以下の一以上と組み合わせることができる：
・脂質代謝-調節性有効成分、例として、および優先性として以下の群からのもの： HMG-CoA レダクターゼ阻害剤、HMG-CoA レダクターゼ発現阻害剤、スクアレン合成阻害剤、ACAT 阻害剤、LDL 受容体誘導原、コレステロール吸収阻害剤、重合体胆汁酸吸収体(polymeric bile acid adsorber)、胆汁酸再吸収阻害剤、MTP 阻害剤、リパーゼ阻害剤、LpL 活性化剤、フィブラート系薬剤、ナイアシン、CETP 阻害剤、PPAR-α、PPAR-γおよび/または PPAR-δアゴニスト、RXR 修飾薬、FXR 修飾薬、LXR 修飾薬、甲状腺ホルモンおよび/または甲状腺模倣物(mimetics)、ATP クエン酸リアーゼ阻害剤、Lp(a) アンタゴニスト、カンナビノイド受容体 1 アンタゴニスト、レプチン受容体アゴニスト、ボンベシン受容体アゴニスト、ヒスタミン受容体アゴニストおよび抗酸化剤/ラジカルスカベンジャー;
・Rote Liste 2004/II、chapter 12に言及されている抗糖尿病薬、およびまた、例として、および優先性として、以下の群からのもの：スルホニル尿素、ビグアナイド、メグリチニド誘導体、グルコシダーゼ阻害剤、ジペプチジル-ペプチダーゼ IV阻害剤(DPP-IV 阻害剤)、オキサジアゾリジノン(oxadiazolidinone)、チアゾリジンジオン、GLP 1 受容体アゴニスト、グルカゴンアンタゴニスト、インスリン増感剤、CCK 1 受容体アゴニスト、レプチン受容体アゴニスト、糖新生および/またはグリコーゲン分解の刺激に関与する肝臓酵素阻害剤、グルコース取り込み修飾薬およびまた、カリウムチャネル開口薬、例えば、WO 97/26265 およびWO 99/03861に開示されているもの等;
・降圧性有効成分、例として、および優先性として以下の群からのもの： カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシン AII アンタゴニスト、ACE 阻害剤、レニン阻害剤、ベータ-受容体遮断薬、アルファ-受容体遮断薬、アルドステロンアンタゴニスト、ミネラルコルチコイド受容体アンタゴニスト、ECE 阻害剤、ACE/NEP 阻害剤およびバソペプチダーゼ阻害剤; および/または、
・抗血栓薬、例として、および優先性として、以下の群からのもの： 血小板凝集阻害剤または抗凝血薬;
・利尿剤;
・バソプレシン受容体アンタゴニスト;
・有機硝酸塩(organic nitrate)およびNO ドナー; 
・陽性変力活性を有する化合物;
・環状グアノシン一リン酸 (cGMP)および/または環状アデノシン一リン酸 (cAMP)の分解を阻害する化合物、例えば、ホスホジエステラーゼ(PDE) 1、2、3、4 および/または 5阻害剤等、特に PDE 5 阻害剤、例えば、シルデナフィル、バルデナフィルおよびタダラフィル、およびまたPDE 3 阻害剤、例えば、ミルリノン;
・ナトリウム利尿ペプチド、例えば、「心房性ナトリウム利尿ペプチド」 (ANP、アナリチド)、「B型ナトリウム利尿ペプチド」または「脳ナトリウム利尿ペプチド」(BNP、ネシリチド)、「C型ナトリウム利尿ペプチド」(CNP) およびまたウロジラチン等;
・プロスタサイクリン受容体 (IP 受容体) アゴニスト、例えば、例として、イロプロスト、ベラプロスト、シカプロスト;
・If電流（funnyチャネル電流）(If (funny channel) channel)阻害剤、例えば、例として、イバブラジン;
・カルシウム増感剤、例えば、例として、および優先性として、レボシメンダン;
・カリウム補充剤;
・NO-非依存性であるがヘム依存性のグアニル酸シクラーゼ刺激剤、例えば、特に、WO 00/06568、WO 00/06569、WO 02/42301 およびWO 03/095451に記載の化合物;
・NO-およびヘム-非依存性のグアニル酸シクラーゼ活性化剤、例えば、特に、WO 01/19355、WO 01/19776、WO 01/19778、WO 01/19780、WO 02/070462 および WO 02/070510 に記載されている化合物;
・ヒト好中球エラスターゼ (HNE) 阻害剤、例えば、シベレスタットおよびDX-890 (レルトラン(Reltran))等;
・シグナル伝達カスケードを阻害する化合物、例えば、チロシン-キナーゼ阻害剤、特に、ソラフェニブ、イマチニブ、ゲフィチニブおよびエルロチニブ等; および/または、
・心臓のエネルギー代謝を調節する化合物、例えば、エトモキシル、ジクロロ酢酸、ラノラジンおよびトリメタジジン等。
【０１４０】
脂質代謝を調節する有効成分は、好ましくは、以下の群からの化合物： HMG-CoA レダクターゼ阻害剤、スクアレン合成阻害剤、ACAT 阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、MTP 阻害剤、リパーゼ阻害剤、甲状腺ホルモンおよび/または甲状腺模倣物、ナイアシン受容体アゴニスト、CETP 阻害剤、PPAR-αアゴニスト、 PPAR-γアゴニスト、PPAR-δアゴニスト、重合体胆汁酸吸収体、胆汁酸再吸収阻害剤、抗酸化剤/ラジカルスカベンジャーおよびまたカンナビノイド 受容体 1 アンタゴニストを意味するものとして理解すべきである。
【０１４１】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合ポリペプチドは、スタチン系薬剤のクラスからのHMG-CoA レダクターゼ阻害剤、例えば、例として、および優先性として、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチンまたはピタバスタチンと組合せて投与される。
【０１４２】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合ポリペプチドは、スクアレン合成阻害剤、例えば、例として、および優先性として、BMS-188494 または TAK-475と組合せて投与される。
【０１４３】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合ポリペプチドは、ACAT 阻害剤、例えば、例として、および優先性として、アバシミベ、メリナミド、パクチミベ、エフルシミベまたはSMP-797と組合せて投与される。
【０１４４】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、コレステロール吸収阻害剤、例えば、例として、および優先性として、エゼチミブ、チクェシドまたはパマクエシドと組合せて投与される。
【０１４５】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、MTP 阻害剤、例えば、例として、および優先性として、インプリタピド、BMS-201038、R-103757 またはJTT-130と組合せて投与される。
【０１４６】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、リパーゼ阻害剤、例えば、例として、および優先性として、オルリスタットと組合せて投与される。 
【０１４７】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、甲状腺ホルモンおよび/または甲状腺模倣物、例えば、例として、および優先性として、D-チロキシンまたは3,5,3'-トリヨードチロニン (T3) と組合せて投与される。
【０１４８】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、ナイアシン受容体のアゴニスト、例えば、例として、および優先性として、ナイアシン、アシピモックス、アシフランまたはラデコール(radecol) と組合せて投与される。
【０１４９】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、CETP 阻害剤、例えば、例として、および優先性として、ダルセトラピブ(dalcetrapib)、BAY 60-5521、アナセトラピブまたはCETP ワクチン (CETi-1) と組合せて投与される。
【０１５０】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、PPAR-γアゴニスト、例えば、チアゾリジンジオンのクラスからのもの、例えば、例として、および優先性として、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンと組合せて投与される。
【０１５１】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、PPAR-δアゴニスト、例えば、例として、および優先性として、GW-501516 または BAY 68-5042と組合せて投与される。
【０１５２】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、重合体(polymeric) 胆汁酸吸収体(adsorber)、例えば、例として、および優先性として、コレスチラミン、コレスチポール、コレソルバム(colesolvam)、コレスタゲル(CholestaGel)またはコレスチミドと組合せて投与される。
【０１５３】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、胆汁酸再吸収阻害剤、例えば、例として、および優先性として、ASBT (= IBAT) 阻害剤、例えば、AZD-7806、S-8921、AK−105、BARI-1741、SC-435 またはSC-635等と組合せて投与される。
【０１５４】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、抗酸化剤/ラジカルスカベンジャー、例えば、例として、および優先性として、プロブコール、AGI-1067、BO-653またはAEOL-10150 と組合せて投与される。
【０１５５】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、カンナビノイド受容体 1 アンタゴニスト、例えば、例として、および優先性として、リモナバン またはSR-147778 と組合せて投与される。
【０１５６】
抗糖尿病薬は、好ましくは、インスリンおよびインスリン誘導体、およびまた経口的に有効な血糖降下有効成分を意味するものとして理解すべきである。ここで、インスリンおよびインスリン誘導体は、動物のインスリン、ヒトまたは生物工学的起源のインスリンおよびまたそれらの混合物の両方を含む。経口的に有効な血糖降下有効成分には、好ましくは、スルホニル尿素、ビグアナイド、メグリチニド誘導体、グルコシダーゼ阻害剤およびPPAR-ガンマアゴニストが含まれる。
【０１５７】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、インスリンと組合せて投与される。
【０１５８】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、スルホニル尿素、例えば、例として、および優先性として、トルブタミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジドまたはグリクラジドと組合せて投与される。
【０１５９】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、ビグアナイド、例えば、例として、および優先性として、メトホルミンと組合せて投与される。 
【０１６０】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、メグリチニド誘導体、例えば、例として、および優先性として、レパグリニドまたはナテグリニドと組合せて投与される。 
【０１６１】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、グルコシダーゼ阻害剤、例えば、例として、および優先性として、ミグリトールまたはアカルボースと組合せて投与される。
【０１６２】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、DPP-IV 阻害剤、例えば、例として、および優先性として、シタグリプチンおよびビルダグリプチンと組合せて投与される。
【０１６３】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、PPAR-ガンマアゴニスト、例えば、チアゾリンジオン(thiazolinedione)のクラスからのもの、例えば、例として、および優先性として、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンと組合せて投与される。
【０１６４】
降圧薬は好ましくは、以下の群からの化合物を意味するとして理解されるべきである：カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシン AII アンタゴニスト、ACE 阻害剤、ベータ-受容体遮断薬、アルファ-受容体遮断薬および利尿剤。
【０１６５】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、カルシウムアンタゴニスト、例えば、例として、および優先性として、ニフェジピン、アムロジピン、ベラパミルまたはジルチアゼムと組合せて投与される。
【０１６６】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、アンジオテンシン AII アンタゴニスト、例えば、例として、および優先性として、ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン、エムブサルタン(embusartan)、オルメサルタンまたはテルミサルタンと組合せて投与される。
【０１６７】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、ACE 阻害剤、例えば、例として、および優先性として、エナラプリル、カプトプリル、リシノプリル、ラミプリル、デラプリル、ホシノプリル、キノプリル(quinopril)、ペリンドプリルまたはトランドプリル(trandopril)と組合せて投与される。
【０１６８】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、ベータ-受容体遮断薬、例えば、例として、および優先性として、プロプラノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、アルプレノロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ブプラノロール、メチプラノロール、ナドロール、メピンドロール、カラザロール(carazalol)、ソタロール、メトプロロール、ベタキソロール、セリプロロール、ビソプロロール、カルテオロール、エスモロール、ラベタロール、カルベジロール、アダプロロール、ランジオロール、ネビボロール、エパノロールまたはブシンドロールと組合せて投与される。
【０１６９】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、アルファ-受容体遮断薬、例えば、例として、および優先性として、プラゾシンと組合せて投与される。
【０１７０】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、利尿薬、例えば、例として、および優先性として、フロセミド、ブメタニド、トルセミド、ベンドロフルメチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロロメチアジド、クロロタリドン(chlorothalidone)、インダパミド、メトラゾン、キネタゾン、アセタゾラミド、ジクロロフェナミド、メタゾラミド、グリセロール、イソソルビド、マンニトール、アミロライドまたはトリアムテレンと組合せて投与される。
【０１７１】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、アルドステロンまたはミネラルコルチコイド受容体アンタゴニスト、例えば、例として、および優先性として、スピロノラクトンまたはエプレレノンと組合せて投与される。
【０１７２】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、バソプレシン受容体アンタゴニスト、例えば、例として、および優先性として、コニバプタン、トルバプタン、リキシバプタンまたはSR-121463と組合せて投与される。
【０１７３】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、有機硝酸塩またはNO ドナー、例えば、例として、および優先性として、ニトロプルシドナトリウム、ニトログリセロール、一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、モルシドミン またはSIN-1と組合せて、または、吸入（inhalative） NO と組合せて投与される。
【０１７４】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、陽性変力化合物、例えば、例として、および優先性として、強心配糖体 (ジゴキシン)、ベータ-アドレナリン作動薬およびドパミン作動薬、例えば、イソプロテレノール、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドパミンまたはドブタミンと組合せて投与される。
【０１７５】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、アンチシンパソトニック(antisympathotonics)、例えば、レセルピン、クロニジンまたはαメチルドパと組合せて、または、カリウムチャンネルアゴニスト、例えば、ミノキシジル、ジアゾキシド、ジヒドララジンまたはヒドララジン、または窒素酸化物を放出する物質、例えば、グリセリルトリニトラートまたはニトロプルシドナトリウムと組合せて投与される。
【０１７６】
抗血栓性剤(antithrombotics)は、好ましくは、以下の群からの化合物を意味するものとして理解すべきである：血小板凝集阻害剤または抗凝血薬。
【０１７７】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、血小板凝集阻害剤、例えば、例として、および優先性として、アスピリン、クロピドグレル、チクロピジンまたはジピリダモールと組合せて投与される。
【０１７８】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、トロンビン阻害剤、例えば、例として、および優先性として、キシメラガトラン、メラガトラン、ダビガトラン、ビバリルジンまたはクレキサンと組合せて投与される。
【０１７９】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、GPIIb/IIIa アンタゴニスト、例えば、例として、および優先性として、チロフィバンまたはアブシキシマブと組合せて投与される。
【０１８０】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、因子 Xa 阻害剤、例えば、例として、および優先性として、リバーロキサバン (BAY 59-7939)、DU-176b、アピキサバン、オタミキサバン(otamixaban)、フィデキサバン、ラザキサバン、フォンダパリヌクス、イドラパリナックス、PMD-3112、YM-150、KFA-1982、EMD-503982、MCM-17、MLN-1021、DX 9065a、DPC 906、JTV 803、SSR-126512またはSSR-128428と組合せて投与されるが、ただし、PCS は 因子 Xa 切断部位ではない。
【０１８１】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、ヘパリンまたは低分子量 (LMW) ヘパリン誘導体と組合せて投与される。
【０１８２】
本発明の好ましい態様において、本発明による融合タンパク質は、ビタミン K アンタゴニスト、例えば、例として、および優先性として、クマリンと組合せて投与される。
【０１８３】
本発明の文脈において、特に優先されるのは、少なくとも一つの本発明による融合タンパク質およびまた以下からなる群から選択される一以上のさらなる有効成分を含む組合せ： HMG-CoA レダクターゼ阻害剤 (スタチン系薬剤)、利尿剤、ベータ-受容体遮断薬、有機硝酸塩およびNO ドナー、ACE 阻害剤、アンジオテンシン AII アンタゴニスト、アルドステロンおよびミネラルコルチコイド受容体アンタゴニスト、バソプレシン受容体アンタゴニスト、血小板凝集阻害剤および抗凝血薬、およびまた、それらの上記の障害の治療および/または予防のための使用である
【０１８４】
本発明はさらに、少なくとも一つの本発明による融合タンパク質を、通常、一以上の不活性の非毒性の医薬上好適な補助剤とともに含む医薬、およびまた、それらの上記の目的のための使用を提供する。
【０１８５】
治療上有効な用量(Therapeutically Effective Dose)
本発明における使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、意図される目的、例えば、心不全の目的を達成するために有効な量にて含まれる組成物が含まれる。有効な用量の決定は当業者の能力の範囲内である。 
【０１８６】
あらゆる化合物について、治療上有効な用量は、インビトロアッセイにて、例えば、LGR7 受容体活性化により、エキソビボにて、単離灌流適用ラット心臓において、または動物モデル、通常、マウス、ウサギ、イヌ、またはブタにおいて最初に見積もることができる。動物モデルはまた、望ましい濃度範囲および投与経路を達成するためにも使用される。かかる情報はヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するために次いで用いることができる。
【０１８７】
治療上有効な用量とは、症候または症状を寛解させる融合タンパク質の量をいう。かかる化合物の治療効果および毒性は、インビトロまたは実験動物にて、標準的な医薬の手順により、例えば、ED50 (集団の50％において治療上有効な用量)およびLD50 (集団の50％に対して致死的な用量)により決定され得る。治療および毒性効果の間の用量比は治療指数であり、それは、ED50/LD50比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。インビトロアッセイおよび動物研究から取得されたデータは、ヒトへの使用のための用量範囲を処方することにおいて用いられる。かかる化合物の用量は好ましくは循環濃度範囲の中に含まれ、これは毒性がほとんどまたはまったくないED50を含む。用量は、用いられる用量形態、患者の感受性および投与経路に依存してこの範囲内で変動する。
【０１８８】
通常の投与量は、投与経路に応じて、0.1から100,000 ミリグラムの全用量と変動しうる。特定の用量および送達方法に関するガイダンスは文献に提供されている。米国特許第4,657,760; 5,206,344; または5,225,212号を参照されたい。当業者であれば、ポリヌクレオチドについて、タンパク質またはそれらの阻害剤についてとは異なる製剤を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、症状、部位等に特異的であろう。
【０１８９】
本発明をさらに以下の実施例により記載する。実施例は特定の態様を参照することにより本発明を例示する目的のみにて提供される。これらの例証は、本発明の特定の具体的側面を例示するが、開示される発明の範囲の限定を描くものでも、制限するものでもない。
【０１９０】
特に別に詳細に記載しない限りすべての実施例は当業者に周知であって常套的な標準的技術を用いて行った。以下の実施例の常套的な分子生物学技術は標準的研究室マニュアル、例えば、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1989に記載されている ようにして行うことができる。 
【０１９１】
さらなる好ましい態様は以下である:
【０１９２】
1.レラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-レラキシンを含む融合タンパク質、ここで、 
レラキシンは、レラキシン A 鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体、
およびレラキシン B 鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体を含み、
PCSは、エンド-プロテアーゼ切断部位を含み、そして、
HEMは、タンパク質半減期延長部分である。
【０１９３】
2.プロレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-プロレラキシンを含む融合ポリペプチド、
ここで、
プロレラキシン は、レラキシン A 鎖ポリペプチドまたはその機能的変異体、
レラキシン C-鎖ポリペプチドおよびレラキシン B 鎖ポリペプチドまたはそれらの機能的変異体を含み、
PCSは、エンド-プロテアーゼ切断部位を含み、そして、
HEMは、タンパク質半減期延長部分である。
【０１９４】
3.論点 1または2の融合タンパク質またはポリペプチド、ここで、PCSは、細胞外エンド-プロテアーゼの切断部位である。
【０１９５】
4. 論点 3の融合タンパク質またはポリペプチド、ここで、エンド-プロテアーゼは、内因性(endogenous) エンド-プロテアーゼである。
【０１９６】
5.論点 3または4の融合タンパク質またはポリペプチド、ここで、エンド-プロテアーゼは、心臓、肝臓、腎臓または肺で発現されるエンド-プロテアーゼである。
【０１９７】
6. 論点 3の融合タンパク質またはポリペプチド、ここで、エンド-プロテアーゼは、膜の細胞外側にその触媒活性を有する膜結合型または膜貫通型プロテアーゼである。  
【０１９８】
7.論点 1から6のいずれかの融合タンパク質またはポリペプチド、ここで、エンド-プロテアーゼは、表 1に示されるエンドプロテアーゼの群から選択される。
【０１９９】
8. 論点 1から6 のいずれかの融合タンパク質またはポリペプチド、ここで、PCS は、表 1に示されるPCSの群から選択される。
【０２００】
9. 論点 3 - 8のいずれかの融合タンパク質またはポリペプチド、ここで、エンド-プロテアーゼは、因子 Xa、トリプシン、MMP2、MMP9、MMP12、レニン、エラスターゼおよびキマーゼからなる群から選択される。 
【０２０１】
10. 論点 3 - 9 のいずれかの融合タンパク質またはポリペプチド、ここで、エンド-プロテアーゼは、ヒトのものである。
【０２０２】
11. 論点 1 - 10のいずれかの融合タンパク質またはポリペプチド、ここで、PCSは、IleGluGlyArgMetAsp (FXa 切断部位)、RAKRFASL (MMP9 切断部位),INARVSTI (トリプシン切断部位)、RVGFYESD (キマーゼ切断部位)およびGLRVGFYE (エラスターゼ切断部位) からなる配列の群に含まれる(comprised in) 配列を有する。
【０２０３】
12. 論点 1 - 11のいずれかの融合タンパク質またはポリペプチド、ここで、PCSは、N-末端および/またはC-末端に、ストレッチャーポリペプチドを有する。
【０２０４】
13. 前記論点のいずれかの融合ポリペプチド、ここで、タンパク質半減期延長部分が、免疫グロブリン Fc ドメイン、血清アルブミン、トランスフェリンおよび血清アルブミン結合タンパク質からなるタンパク質半減期延長部分の群に含まれる (are comprised in)。
【０２０５】
14. 前記論点のいずれかの融合ポリペプチド、ここで、タンパク質半減期延長部分は、IgG1 Fc ドメインである。
【０２０６】
15. 前記論点のいずれかの融合ポリペプチド、ここで、タンパク質半減期延長部分は、ヒトのものである。
【０２０７】
16. 前記論点のいずれかの融合ポリペプチド、ここで、レラキシン A 鎖はヒトレラキシン 2 A 鎖であり、かつ、レラキシン B 鎖はヒトレラキシン 2 B 鎖である。
【０２０８】
17. 前記論点のいずれかの融合ポリペプチド、ここで、融合ポリペプチドは、プロレラキシン-PCS-HEMである。
【０２０９】
18. 前記論点のいずれかの融合タンパク質、ここで、融合ポリペプチドは、レラキシン-PCS-HEMである。
【０２１０】
19. 論点 2 - 18のいずれかのプロレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-プロレラキシン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【０２１１】
20.論点 19のポリヌクレオチドを含むベクター。
【０２１２】
21.論点 20のベクターまたは論点 17のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【０２１３】
22. 以下の工程を含む論点 1 - 18のいずれかのレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-レラキシンタンパク質を生産する方法：さらにプロホルモン転換酵素活性を含む論点 21の宿主細胞を培養する工程および前記タンパク質を単離する工程。
【０２１４】
23. 論点 1 - 18のいずれかのレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-レラキシンタンパク質を含む医薬組成物。
【０２１５】
24. 医薬としての論点 23の医薬組成物または論点 1 - 18のいずれかのレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-レラキシンタンパク質。
【０２１６】
25. 心血管疾患、肺疾患、線維性障害または腎疾患の治療のための医薬としての、論点 23または24の医薬組成物または論点 1 - 18のいずれかのレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-レラキシンタンパク質。
【０２１７】
26.治療上有効用量の、論点 23および24の医薬組成物または論点 1 - 18のいずれかのレラキシン-PCS-HEMまたはHEM-PCS-レラキシンタンパク質の投与を含む、心血管疾患、肺疾患、線維性障害または腎疾患を治療する方法。
【０２１８】
27.論点 25または26の治療、ここで、心血管疾患は、冠動脈心疾患、急性冠動脈症候群、心不全、または心筋梗塞からなる心血管疾患の群に含まれる(is comprised in)。
【実施例】
【０２１９】
実施例
実験プロトコール
レラキシン-Fc 融合タンパク質の構築:
レラキシン変異体のcDNA 配列を化学的遺伝子合成によって作成した。合成された遺伝子を哺乳類発現ベクター pCEP4 (Invitrogen、カタログ番号 V044-50) にサブクローニングした。結果として得られるタンパク質の正しい分泌のためのシグナルリーダー配列として 、LDL 受容体-関連タンパク質 (LRP、アミノ酸組成 MLTPPLLLLLPLLSALVAA) またはCD33 (アミノ酸組成 MPLLLLLPLLWAGALA)のいずれかのリーダー配列を用いた。合成されたコンストラクトのサブクローニングのために、制限酵素 HindIIIおよびBamH1 を製造業者の指示にしたがって用いた。
【０２２０】
血漿半減期を改善するために、ヒト IgG1のFc 部分を化学的基礎の(chemically based)遺伝子合成によりヒトレラキシン 2と結合した。ヒトレラキシン 2 (以下のように配置したそのゲノム組織化(organization)にしたがった: B 鎖 - C 鎖 - A 鎖) のカルボキシ-末端部分をヒト IgG1 Fc 部分のN 末端に融合させ、それによりこれら２つの融合タンパク質の部分を凝固因子 Xa 切断部位をコードする配列 IleGluGlyArgMetAspを有するポリペプチドからなる6 アミノ酸長リンカー配列によって連結した。
【０２２１】
プロレラキシン-Fc 融合(fusion)は以下の配列を有する(タンパク質: 配列番号1: ヌクレオチド配列 : 配列番号17):
【化１】
2014529293.tif 000003
プロホルモン転換酵素により切り取られるC-鎖配列を小文字で示す。FXa 切断部位を下線を付した太字で示す。
【０２２２】
ポリペプチドの生物学的半減期を改善するためのその他の選択肢は、トランスフェリン (受入番号 P02787)またはアルブミン (受入番号 P02768)などのポリペプチドとの融合である (SR Schmid (2009))。
【０２２３】
もう一つの選択肢は、 FXa についてのもの以外のその他のプロテアーゼ切断部位の使用であり、例えば、表 1に列挙する切断部位の使用である。
【０２２４】
MMP9 切断部位を示すコンストラクトであるレラキシン-融合 1 は、配列番号13 (ポリペプチド) およびヌクレオチド配列、配列番号29を有する。
【０２２５】
キマーゼ切断部位を示すコンストラクトであるレラキシン-融合 2は、配列番号14 (ポリペプチド) およびヌクレオチド配列、配列番号30を有する。
【０２２６】
トリプシン切断部位を示すコンストラクトであるレラキシン-融合 3は、配列番号15 (ポリペプチド)およびヌクレオチド配列、配列番号31を有する。
【０２２７】
エラスターゼ切断部位を示すコンストラクトであるレラキシン-融合 4は、配列番号16 (ポリペプチド) およびヌクレオチド配列、配列番号32を有する。
【０２２８】
レラキシン Fc 融合タンパク質の発現:
スモールスケール発現 (2 ミリリットルまでの培養体積)のために、HEK293 (ATCC、カタログ番号 CRL-1573) 細胞を製造業者の指示にしたがってLipofectamine2000 Transfection Reagent (Invitrogen、カタログ番号 11668-019)を用いてレラキシン-Fc 融合コンストラクトをコードする発現プラスミドで一過性にトランスフェクトした。レラキシンの正しいプロセシングのために、細胞にヒトプロホルモン転換酵素 1 (受入番号 NP＿000430.3) をコードする発現ベクターを同時導入した。細胞を加湿インキュベーター 中で5％ 二酸化炭素にて37℃でD-Mem F12 (Gibco、#31330)、1％ ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco、#15140)および 10％ ウシ胎仔血清 (FCS、Gibco、#11058)中で培養した。
【０２２９】
トランスフェクションの３から５日後、トランスフェクトされた細胞の条件培地を安定にトランスフェクトされた CHO-CRE-GR7 細胞株を用いて活性について試験した。
【０２３０】
ラージスケール発現 (10ミリリットルおよびそれを超える培養体積)のために、コンストラクトをTom et al.、2007に記載されているようにして哺乳類細胞で一過性に発現させた。簡単に説明すると、発現プラスミドをHEK293-6E 細胞にトランスフェクトし、フェルンバッハ(Fernbach-)フラスコまたはウェーブバッグ(Wave-Bag)にてインキュベートした。発現は37℃で5から6 日間F17 培地 (Invitrogen)中で行った。 5 g/l トリプトン TN1 (Organotechnie)、1％ 超低 IgG FCS (Invitrogen)および0.5 mM バルプロ酸 (Sigma) をトランスフェクションの後に追加した。
【０２３１】
レラキシン Fc 融合タンパク質の精製:
レラキシン Fc-融合コンストラクトを哺乳類細胞培養上清から精製する。まず上清を遠心分離により細胞残骸から清澄化する。タンパク質を、プロテインA (MabSelect Sure、GE Healthcare) アフィニティークロマトグラフィー、次いで、サイズ排除クロマトグラフィー (SEC)により精製する。それゆえ上清をあらかじめPBS pH 7.4 (Sigma /Aldrich) で平衡化したプロテインA カラムにアプライし、混入物を10 カラム体積のPBS pH 7.4 + 500 mM NaClにより除去する。レラキシン Fc 融合コンストラクトを50 mM 酢酸ナトリウム pH 3.5 + 500 mM NaClにより溶出し、さらにPBS pH 7.4中でSuperdex 200 カラムを用いるSEC により精製する。 
【０２３２】
発現されたレラキシン-Fc 融合タンパク質の定量:
分泌され、精製された組換えレラキシン変異体の定量のために、市販の定量 ELISA (R＆D Systems、Human Relaxin-2 Quantikine ELISA Kit、カタログ番号 DRL200)を製造業者の指示にしたがって用いた。
【０２３３】
さらにいくつかのコンストラクトについて、タンパク質を FC-ELISAを用いることにより定量した。Fc ELISAのために、96 ウェルマイクロタイタープレート (Nunc、Maxi Sorp black、カタログ番号 460918)を抗-Fc 抗体 (SigmaAldrich、カタログ番号 A2136)で一晩 4℃で5 μg/ml濃度にて被覆した。プレートをPBSおよび 0,05％ Tween 20 (SigmaAldrich、カタログ番号 63158) バッファーからなる50 μl /ウェルのバッファーを用いることにより一回洗浄した。30μlのブロッキングバッファー (Candor Bioscience、カタログ番号 113500)を添加し、プレートを1 時間37℃でインキュベートした。プレートを3 回50 μl /ウェルのPBS/0,05％ Tween 20 バッファーを用いて洗浄した。サンプルをプレートに添加し、1 時間37℃でインキュベートした。必要である場合、サンプルを上記ブロッキングバッファーを用いることにより希釈しなければならない。インキュベーションの後、プレートを50 μl /ウェルの PBS/0,05％ Tween 20 バッファーを用いて3 回洗浄した。
【０２３４】
検出のために、10％ ブロッキングバッファー中1:10000 に希釈した30 μl の抗-h-Fc-POD (SigmaAldrich、カタログ番号 A0170) を添加し、1 時間37℃でインキュベートした。インキュベーションの後、プレートを50 μl /ウェルのPBS/0,05％ Tween 20 バッファーを用いて3 回洗浄した。30μlのBM Blue Substrate POD (Roche Diagnostics、カタログ番号 11484281001)を添加し、５分間のインキュベーションの後、反応を1 M 硫酸(acid sulfur) 溶液の添加により停止させた。吸収をTecan Infinite 500 リーダー、吸光度モード、吸光(extinction) 450nm、発光 690nmを用いて測定した。
【０２３５】
活性試験:
CHO K1 細胞(ATCC、カタログ番号 CCL-61) をサイクリックAMP 応答配列 (CRE) ルシフェラーゼレポーター遺伝子コンストラクト (Biomyx Technology、pHTS-CRE、カタログ番号 P2100)で安定にトランスフェクトした結果、CHO-CRE-ルシフェラーゼ細胞株が得られた。
【０２３６】
この細胞株を引き続いて、哺乳類発現ベクター pcDNA3.1(-) (Invitrogen、カタログ番号 V79520)へと2271 塩基対長 DNA 断片としてクローニングされた、ヒト LGR7/RXFP1 受容体 (受入番号NM_021634.2)で安定にトランスフェクトした結果、CHO-CRE-LGR7 細胞株が得られた。この細胞株を、 D-Mem F12 (Gibco、#31330) 2 mM Glutamax (Gibco、#35050)、100 nM Pyruvat (Gibco、# 11360-070)、20 mM Hepes (Gibco、# 15630)、1％ ペニシリン-ストレプトマイシン (Gibco、#15140)および10％ ウシ胎仔血清 (FCS、Gibco、#11058)中で培養した。
【０２３７】
刺激のために、培地を様々な濃度の組換えにより発現されたレラキシン-Fc 融合タンパク質(通常、100 nMの濃度から開始し、次いで 1:2 希釈を行った)を含有するOptiMem (Gibco、#11058) + 1％ FCSに交換した。陽性対照として、市販の組換え発現されたヒトレラキシン 2を用いた(R＆D Systems、カタログ番号 6586-RN-025)。引き続いて、細胞を加湿インキュベーター中、5％ 二酸化炭素にて37℃で6 時間インキュベートした。6 時間後、細胞を、Luciferase Assay System(Promega、# E1500)およびTecan Infinite 500 リーダー、発光モード、1000 ミリ秒積分時間、測定時間 30 秒を用いてルシフェラーゼ活性について試験した。
【０２３８】
コンピュータープログラム Graph Pad Prism Version 5の使用により様々な分子のEC50 値を決定するために相対発光ユニットを用いた。
【０２３９】
レラキシンならびに本発明の融合ポリペプチドの代替活性試験のために、LGR7 受容体を内因性発現する細胞株 (例えば、THP1、ATCC カタログ番号 TIB-202)または初代細胞 (例えば、 Celprogen Inc.、Human Cardiomyocyte Cell Culture、カタログ番号 36044-15)を用いる。これら細胞を製造業者の指示にしたがって培養する。
【０２４０】
レラキシンまたはレラキシン-Fc 融合タンパク質誘導性cAMP生成の検出のための方法は当該技術分野において公知である。例えば、かかる測定は、製造業者の指示にしたがって、cAMP ELISA (例えば、IBL International GmbH、cAMP ELISA、カタログ番号 CM 581001)を用いて行われる。 
【０２４１】
レラキシンまたはレラキシン-Fc 融合タンパク質誘導性PI3 キナーゼ活性化の検出のための方法は当該技術分野において公知である。例えば、かかる測定は、製造業者の指示にしたがって 、PI3-Kinase HTRF Assay (例えば. Millipore、PI3-Kinase HTRF Assay、カタログ番号 33-016)を用いて行われる。
【０２４２】
レラキシン-Fc 融合タンパク質のプロテアーゼ処理および活性試験
レラキシン融合タンパク質を発現するHEK293 細胞の上清を以下に示す対応するプロテアーゼとともにインキュベートする:
-2 mlの、レラキシン-Fcを発現するHEK293 細胞の上清を、1 μgの因子 Xa プロテアーゼ (New England Biolabs、カタログ番号 P8010)とともに6 時間23℃でインキュベートした。
-2 mlの、レラキシン-融合(fusion) 2を発現するHEK293 細胞の上清を、0,83 μg/mlのキマーゼ (Sigma Aldrich、カタログ番号 C8118) の濃度で6 時間37℃でインキュベートした。
-2 mlの、レラキシン-融合 3を発現するHEK293 細胞の上清を、10 μg/mlのトリプシン (Sigma Aldrich、カタログ番号 T0303)の濃度で6 時間37℃でインキュベートした。
-2 mlの、レラキシン-融合 4を発現するHEK293 細胞の上清を、5 μg/mlのエラスターゼ (Sigma Aldrich、カタログ番号 E7885) の濃度で6 時間37℃でインキュベートした。
-使用前に、MMP9 (R＆D Systems、カタログ番号 911-MP)は、プロテアーゼをAPMA (p-アミノフェニル酢酸第二水銀; Sigma Aldrich、カタログ番号 A-9563)とともにインキュベートすることにより活性化される必要がある。このために、MMP9は、アッセイバッファー (50mM Tris、10mM CaCl2、150mM NaCl2、0,05％ Brij35、pH 7,5.)中、100 μg/mlの濃度(例えば、100 μlの最終体積中1 μg)へと希釈する必要がある。APMAを、1 mMの最終濃度 (例えば、100 μlの最終体積中、20 μlの5 mM ストック溶液)となるよう添加する。この混合物を24 時間37℃でインキュベートする。後で、活性化されたMMP9 を、2 mlの、レラキシン-融合 1を発現するHEK293 細胞の上清中に0,4 ng/mlの最終濃度となるように希釈する。活性化されたMMP9とともに6 時間37℃でインキュベートした。
【０２４３】
レラキシン-Fc 融合タンパク質を発現するHEK293 細胞の上清を上記の通りのCHO-CRE-LGR7 細胞株を用いることにより活性について試験した。陽性対照として、ヒトレラキシン 2を用いた。
【０２４４】
レラキシン-Fc 融合タンパク質について、活性は検出されなかった。対照的に、レラキシン-Fc 融合タンパク質を含有する上清のFXa インキュベーションの後、CHO-CRE-LGR7 細胞株の有意な活性化が観察された。この活性は、ヒトレラキシン 2 陽性対照について取得された活性より低かったが、それは、PCSの使用により遊離(放出)可能な(releasable)活性のレラキシン分子が作成されたことを示す。
【０２４５】
非-精製レラキシン融合タンパク質の使用は、サンプル中のありうる(possible) 不純物が、濃度の偽決定(false determination)を導くか、または、細胞に基づくルシフェラーゼアッセイの正確性に対して負の影響を有しうるので、わずかにより低い活性の可能性のある説明(likely explanation)である。
【０２４６】
空の発現ベクターでトランスフェクトされたHEK293 細胞の上清の使用により活性アッセイにておよそ 3倍(by a factor of)の低下が導かれる。もう一つの説明は、切断された(cleave off)機能的に活性のレラキシンおよび不活性レラキシン融合タンパク質の混合物を導くレラキシン融合タンパク質の不完全な切断でありうる。
【０２４７】
実施例 1: レラキシン-Fc
生物学的半減期を改善するために、ヒト IgG1のFc 部分をヒトレラキシン 2と化学的基礎の遺伝子合成により結合した。ヒトレラキシン 2のカルボキシ-末端部分 (そのゲノム組織化にしたがって以下のように配置される: B 鎖 - C 鎖 - A 鎖)をヒト IgG1 Fc 部分のN 末端に融合させ、融合タンパク質のこれら２つの部分を凝固因子 Xa 切断部位をコードする配列 IleGluGlyArgMetAspを有するポリペプチドからなる6 アミノ酸長リンカー配列により連結した。レラキシンは、上記の通りのプロテアーゼ FXaとともにコンストラクトをインキュベートした後、CHO-CRE-LGR7 細胞株を用いることによってのみ検出可能な活性を示す。
【０２４８】
実施例 2: レラキシン-融合 1
生物学的半減期を改善するために、ヒト IgG1のFc 部分をヒトレラキシン 2と化学的基礎の遺伝子合成により結合した。ヒトレラキシン 2のカルボキシ-末端部分 (そのゲノム組織化にしたがって以下のように配置される: B 鎖 - C 鎖 - A 鎖)をヒト IgG1 Fc 部分のN 末端に融合させ、融合タンパク質のこれら２つの部分をプロテアーゼ MMP9 切断部位をコードする配列 ArgAlaLysArgPheAlaSerLeuを有するポリペプチドからなる6 アミノ酸長リンカー配列により連結した。レラキシンは、上記の通りのプロテアーゼ MMP9とともにコンストラクトをインキュベートした後、CHO-CRE-LGR7 細胞株を用いることによってのみ検出可能な活性を示す。
【０２４９】
実施例 3: レラキシン-融合 2
生物学的半減期を改善するために、ヒト IgG1のFc 部分をヒトレラキシン 2と化学的基礎の遺伝子合成により結合した。ヒトレラキシン 2のカルボキシ-末端部分 (そのゲノム組織化にしたがって以下のように配置される: B 鎖 - C 鎖 - A 鎖)をヒト IgG1 Fc 部分のN 末端に融合させ、融合タンパク質のこれら２つの部分をプロテアーゼであるキマーゼ切断部位をコードする配列ArgValGlyPheTyrGluSerAspを有するポリペプチドからなる6 アミノ酸長リンカー配列により連結した。レラキシンは、上記の通りのプロテアーゼであるキマーゼとともにコンストラクトをインキュベートした後、CHO-CRE-LGR7 細胞株を用いることによってのみ検出可能な活性を示す。キマーゼ実験において取得された低いシグナル値は、キマーゼプロテアーゼの添加によりスクリーニング細胞株によって発現されるLGR7 受容体の切断に起因する可能性がある。当業者であればアッセイ系においてキマーゼ活性を除去または低下させる方法を知っている (例えば、特異的プロテアーゼ阻害剤の使用による)。にもかかわらず、これらデータは機能的レラキシンが融合タンパク質から放出されうることを実証している。  
【０２５０】
実施例 4: レラキシン-融合 3
生物学的半減期を改善するために、ヒト IgG1のFc 部分をヒトレラキシン 2と化学的基礎の遺伝子合成により結合した。ヒトレラキシン 2のカルボキシ-末端部分 (そのゲノム組織化にしたがって以下のように配置される: B 鎖 - C 鎖 - A 鎖)をヒト IgG1 Fc 部分のN 末端に融合させ、融合タンパク質のこれら２つの部分をプロテアーゼであるトリプシン切断部位をコードする配列IleAsnAlaArgValSerThrIleを有するポリペプチドからなる6 アミノ酸長リンカー配列により連結した。レラキシンは、上記の通りのトリプシンとともに上清をインキュベートした後のみ検出可能な活性を示す。インキュベートしていない上清はわずかな活性を示し、これはおそらくはトリプシンと類似の切断部位を認識する、細胞培養上清におけるプロテアーゼの混入に起因する。
【０２５１】
実施例 5: レラキシン-融合 4
生物学的半減期を改善するために、ヒト IgG1のFc 部分をヒトレラキシン 2と化学的基礎の遺伝子合成により結合した。ヒトレラキシン 2のカルボキシ-末端部分 (そのゲノム組織化にしたがって以下のように配置される: B 鎖 - C 鎖 - A 鎖)をヒト IgG1 Fc 部分のN 末端に融合させ、融合タンパク質のこれら２つの部分をプロテアーゼであるエラスターゼ切断部位をコードする配列GlyLeuArgValGlyPheTyrGluを有するポリペプチドからなる6 アミノ酸長リンカー配列により連結した。レラキシンは、上記の通りのプロテアーゼであるエラスターゼとともにコンストラクトをインキュベートした後、CHO-CRE-LGR7 細胞株を用いることによってのみ検出可能な活性を示す。インキュベートしていない上清はわずかな活性を示し、これはおそらくはエラスターゼと類似の切断部位を認識する、細胞培養上清におけるプロテアーゼの混入に起因する。
【０２５２】
表2:
コンストラクトおよび対応する配列番号のリスト
【表２−１】
2014529293.tif 000004
【表２−２】
2014529293.tif 000005
【０２５３】
引用文献:
Arlaud,G.J., Rossi,V., Gaboriaud,C. and Thielens,N.M. Complement component C1s. In Handbook of Proteolytic Enzymes, 2 edn (Barrett,A.J., Rawlings,N.D. and Woessner,J.F. eds), p.1620-1623, Elsevier, London (2004)
auf dem Keller,U., Prudova,A., Gioia,M., Butler,G.S. and Overall,C.M.(2010) A statistics-based platform for quantitative N-terminome analysis and identification of protease cleavage products. Mol Cell Proteomics 9:912-927
Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) 
Bani, D., Masini, E., Bello, M. G., Bigazzi, M. and Sacchi, T. B. (1998) Relaxin protects against myocardial injury caused by ischemia and reperfusion in rat heart. Am. J. Pathol. 152:1367-1376
Bani-Sacchi, T., Bigazzi, M., Bani, D., Mannaioni, P. F., and Masini, E. (1995) Relaxin-induced increased coronary flow through stimulation of nitric oxide production. Br J Pharmacol 116:1589-1594
Barlos KK, Gatos D, Vasileiou Z, Barlos K. (2010) An optimized chemical synthesis of human relaxin-2. J Pept Sci. 16:200-211
Bartsch, O., Bartlick, B., and Ivell, R. (2001). Relaxin signaling links tyrosine phosphorylation to phosphodiesterase and adenylyl cyclase activity. Mol Hum Reprod 7:799-809
Bartsch, O., Bartlick, B., and Ivell, R. (2004). Phosphodiesterase 4 inhibition synergizes with relaxin signaling to promote decidualization of human endometrial stromal cells. J Clin Endocrinol Metab 89:324-334
Behrens,Spiekerman and Brown (1975) Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 34, 591
Bennett RG. (2009) Relaxin and its role in the development and treatment of fibrosis. Transl Res. 154:1-6
Benton T, Chen T, McEntee M, Fox B, King D, Crombie R, Thomas TC, Bebbington C. (2002) The use of UCOE vectors in combination with a preadapted serum free, suspension cell line allows for rapid production of large quantities of protein. Cytotechnology 38:43-46
Bjork,I., Danielsson,A., Fenton,J.W. and Jornvall (1981) The site in human antithrombin for functional proteolytic cleavage by human thrombin. FEBS Lett 126:257-260.
Buellesbach EE, Schwabe C. (2000) The relaxin receptor-binding site geometry suggests a novel gripping mode of interaction. J Biol Chem. 275:35276-35280
Castrop H, Hoecherl K, Kurtz A, Schweda F, Todorov V, Wagner C. (2010) Physiology of kidney renin. Physiol Rev. 2010 90:607-673
Caughey,G.H., Raymond,W.W. and Wolters,P.J. (2000) Angiotensin II generation by mast cell alpha- and beta-chymases. Biochim Biophys Acta 1480:245-257
Cirman,T., Oresic,K., Mazovec,G.D., Turk,V., Reed,J.C., Myers,R.M., Salvesen,G.S. and Turk,B. (2004) Selective disruption of lysosomes in HeLa cells triggers apoptosis mediated by cleavage of Bid by multiple papain-like lysosomal cathepsins. J Biol Chem 279:3578-3587
Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley ＆ Sons, NY, N.Y., (1997-2001), e.g., Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10
Cosen-Binker LI, Binker MG, Cosen R, Negri G, Tiscornia O. (2006) Relaxin prevents the development of severe acute pancreatitis. World J. Gastroenterol. 12:1558-1568; 
Coward WR, Saini G, Jenkins G. (2010) The pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis. Ther Adv Respir Dis. 4:367-388
Dennis MS, Zhang M, Meng YG, Kadkhodayan M, Kirchhofer D, Combs D, Damico LA. (2002) Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins. J Biol Chem. 277:35035-35043
Dschietzig T, Bartsch C, Baumann G, Stangl K. (2006) Relaxin - a pleiotropic hormone and its emerging role for experimental and clinical therapeutics. Pharmacol. Ther. 112:38-56
Dschietzig T, Teichmann S, Unemori E, Wood S, Boehmer J, Richter C, Baumann G, Stangl K (2009) Intravenous Recombinant Human Relaxin in Compensated Heart Failure: A Safety, Tolerability, and Pharmacodynamic Trial. J Cardiac Fail  5:182-190
Duncan,R.C., Wijeyewickrema,L.C. and Pike,R.N. (2008) The initiating proteases of the complement system: controlling the cleavage. Biochimie 90:387-395
Dunn,B.M. (2004) Rhizopuspepin. In Handbook of Proteolytic Enzymes, 2 edn (Barrett,A.J., Rawlings,N.D. ＆ Woessner,J.F. eds), p.108-111, Elsevier, London 
Durocher Y, Perret S, Kamen A. (2002) High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic Acids Res. 15;30(2):E9
Edelstein,C., Italia,J.A., Klezovitch,O. and Scanu,A.M. (1996) Functional and metabolic differences between elastase-generated fragments of human lipoprotein[a] and apolipoprotein. J Lipid Res 37:1786-1801
Fosang,A.J., Last,K., Fujii,Y., Seiki,M. and Okada,Y. (1998) Membrane-type 1 MMP (MMP-14) cleaves at three sites in the aggrecan interglobular domain. FEBS Lett 430:186-190
Fosang,A.J., Neame,P.J., Last,K., Hardingham,T.E., Murphy,G. and Hamilton,J.A. (1992) The interglobular domain of cartilage aggrecan is cleaved by PUMP, gelatinases, and cathepsin B. J Biol Chem 267:19470-19474
Freeman WH and Co. (1992) Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C.A.K., ed. 
Garbacki N, Di Valentin E, Piette J, Cataldo D, Crahay C, Colige A. (2009) Matrix metalloproteinase 12 silencing: a therapeutic approach to treat pathological lung tissue remodeling? Pulm Pharmacol Ther. 22:267-278
Goeddel; (1990) Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. 
Haas,C., Aldudo,J., Cazorla,P., Bullido,M.J., de Miguel,C., Vazquez,J. and Valdivieso,F. (1997) Proteolysis of Alzheimer's disease beta-amyloid precursor protein by factor Xa. Biochim Biophys Acta 1343:85-94
Halls M.L., Bathgate R.A., Summers, R.J. (2005) Signal Switching after Stimulation of LGR7 Receptors by Human Relaxin 2. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041:288-291
Harris CL, Hughes CE, Williams AS, Goodfellow I, Evans DJ, Caterson B, and Morgan BP (2003) Generation of Anti-complement“Prodrugs”: J. Biol. Chem. 278: 36068-36076
Harris JM, Martin NE, Modi M. (2001) Pegylation: a novel process for modifying pharmacokinetics. Clin Pharmacokinet. 40:539-551
Hossain MA, Rosengren KJ, Haugaard-Joensson LM, Zhang S, Layfield S, Ferraro T, Daly NL, Tregear GW, Wade JD, Bathgate RA. (2008) The A-chain of human relaxin family peptides has distinct roles in the binding and activation of the different relaxin family peptide receptors. J Biol Chem. 283:17287-17297
Hsu, S. Y. (2003). New insights into the evolution of the relaxin-LGR signaling system. Trends Endocrinol Metab 14:303-309
Hudson P, Haley J, John M, Cronk M, Crawford R, Haralambidis J, Tregear G, Shine J, Niall H. (1983) Structure of a genomic clone encoding biologically active human relaxin. Nature 301: 628-631
Ireland,L.S., Harrison,D.J., Neal,G.E. and Hayes,J.D. (1998) Molecular cloning, expression and catalytic activity of a human AKR7 member of the aldo-keto reductase superfamily: evidence that the major 2-carboxybenzaldehyde reductase from human liver is a homologue of rat aflatoxin B1-aldehyde reductase. Biochem J 332:21-34
Johnson,G.D. and Bond,J.S. (1997) Activation mechanism of meprins, members of the astacin metalloendopeptidase family. J Biol Chem 272:28126-28132
Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists 
Klein J, Kavvadas P, Prakoura N, Karagianni F, Schanstra JP, Bascands JL, Charonis A. (2011) Renal fibrosis: insight from proteomics in animal models and human disease. Proteomics. 11:805-815
Kong RC, Shilling PJ, Lobb DK, Gooley PR, Bathgate RA. (2010) Membrane receptors: structure and function of the relaxin family peptide receptors. Mol Cell Endocrinol. 320):1-15
Lam,J.K., Chion,C.K., Zanardelli,S., Lane,D.A. and Crawley,J.T. (2007) Further characterization of ADAMTS-13 inactivation by thrombin. J Thromb Haemost 5:1010-1018
Lawn RM, Adelman J, Bock SC, Franke AE, Houck CM, Najarian RC, Seeburg PH, Wion KL (1981) The sequence of human serum albumin cDNA and its expression in E. coli. Nucleic Acids Res. 25:6103-6114
M Gibaldi and D Perron, (1982) published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition 
Matsumoto C, Hayashi T, Kitada K, Yamashita C, Miyamura M, Mori T, Ukimura A, Ohkita M, Jin D, Takai S, Miyazaki M, Okada Y, Kitaura Y, Matsumura Y. (2009) Chymase plays an important role in left ventricular remodeling induced by intermittent hypoxia in mice. Hypertension. 54:164-171
McGuane JT, Parry LJ. (2005) Relaxin and the extracellularmatrix: Molecular mechanisms of action and implications for cardiovascular disease. Expert. Rev. Mol.Med. 7:1-18
Meloun B, Moravek L, Kostka V.(1975) Complete amino acid sequence of human serum albumin. FEBS Lett. 58:134-137
Metra M, Teerlink JR, Felker GM, Greenberg BH, Filippatos G, Ponikowski P, Teichman SL, Unemori E, Voors AA, Weatherley BD, Cotter G. (2010) Dyspnoea and worsening heart failure in patients with acute heart failure: results from the Pre-RELAX-AHF study. Eur J Heart Fail. 12:1130-1139
Minghetti PP, Ruffner DE, Kuang WJ, Dennison OE, Hawkins JW, Beattie WG, Dugaiczyk A. (1986) Molecular structure of the human albumin gene is revealed by nucleotide sequence within q11-22 of chromosome 4. J Biol Chem. 261:6747-6757.
Moore XL, Tan SL, Lo CY, Fang L, Su YD, Gao XM, Woodcock EA, Summers RJ, Tregear GW, Bathgate RA, Du XJ. (2007) Relaxin antagonizes hypertrophy and apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes. Endocrinology 148:1582-1589
Morrissey,J.H. (2004) Coagulation factor VIIa. In Handbook of Proteolytic Enzymes, 2 edn (Barrett,A.J., Rawlings,N.D. ＆ Woessner,J.F. eds), p.1659-1662, Elsevier, London 
Mortensen,S.B., Sottrup-Jensen,L., Hansen,H.F., Petersen,T.E. and Magnusson,S. (1981) Primary and secondary cleavage sites in the bait region of alpha2-macroglobulin. FEBS Lett 135:295-300
Moss,M.L. and Rasmussen,F.H. (2007) Fluorescent substrates for the proteinases ADAM17, ADAM10, ADAM8, and ADAM12 useful for high-throughput inhibitor screening. Anal Biochem 366:144-148
Nistri, S., Chiappini, L., Sassoli, C. and Bani, D. (2003) Relaxin inhibits lipopolysaccharide-induced adhesion of neutrophils to coronary endothelial cells by a nitric oxide-mediated mechanism. FASEB J. 17:2109-2111
Overall CM. (2004) Dilating the degradome: matrix metalloproteinase 2 (MMP-2) cuts to the heart of the matter. Biochem J. 383(Pt. 3):e5-7
Pasut and Veronese (2009) PEGylation for improving the effectiveness of therapeutic biomolecules. Drugs Today 45:687-695
Pawar,S.C., Demetriou,M.C., Nagle,R.B., Bowden,G.T. and Cress,A.E. (2007) Integrin alpha6 cleavage: a novel modification to modulate cell migration. Exp Cell Res 313:1080-1089
Perna AM, Masini E, Nistri S, Briganti V, Chiappini L, Stefano P, Bigazzi M, Pieroni C, Bani Sacchi T, Bani D. (2005) Novel drug development opportunity for relaxin in acute myocardial infarction: evidences from a swine model. FASEB J. 19:1525-1527
Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996)
Piedras-Renteria ES, Sherwood OD, Best PM. (1997) Effects of relaxin on rat atrial myocytes. II. Increased calcium influx derived from action potential prolongation. Am J Physiol. 1997 272(4 Pt 2):H1798-803
Kaufman RJ, Sharp PA. (1982) Amplification and expression of sequences cotransfected with a modular dihydrofolate reductase complementary dna gene. J Mol Biol. 159:601-621.
Radestock Y, Hoang-Vu C, Hombach-Klonisch S. (2008) Relaxin reduces xenograft tumour growth of human MDA-MB-231 breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10:R71
Raymond,W.W., Ruggles,S.W., Craik,C.S. ＆ Caughey,G.H. (2003) Albumin is a substrate of human chymase. Prediction by combinatorial peptide screening and development of a selective inhibitor based on the albumin cleavage site. J Biol Chem 278:34517-34524
Robbins,K.C., Summaria,L., Hsieh,B. and Shah,R.J. (1967) The peptide chains of human plasmin. Mechanism of activation of human plasminogen to plasmin. J Biol Chem 242:2333-2342
Rodriguez-Manzaneque,J.C., Westling,J., Thai,S.N., Luque,A., Knauper,V., Murphy,G., Sandy,J.D. and Iruela-Arispe,M.L. (2002) ADAMTS1 cleaves aggrecan at multiple sites and is differentially inhibited by metalloproteinase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun 293:501-508
Roitt and Delves (2004): Essential Immunology (8th Edition, Black-well)
Rosmann,S., Hahn,D., Lottaz,D., Kruse,M.N., Stocker,W. and Sterchi,E.E. (2002) Activation of human meprin-alpha in a cell culture model of colorectal cancer is triggered by the plasminogen-activating system. J Biol Chem 277:40650-40658
Safa,O., Morrissey,J.H., Esmon,C.T. and Esmon,N.L. (1999) Factor VIIa/tissue factor generates a form of factor V with unchanged specific activity, resistance to activation by thrombin, and increased sensitivity to activated protein C. Biochemistry 38:1829-1837
Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)
Santora K, Rasa C, Visco D, Steinetz BG, Bagnell CA. (2007) Antiarthritic effects of relaxin, in combination with estrogen, in rat adjuvant induced arthritis. J. Pharmacol. Exp. Ther. 322:887-893
Schlechter and Berger (1967) On the size of the active site in proteases. I. Papain. Biochem Biophys Res Commun 27:157-162
Schlechter and Berger (1968) On the active site of proteases. 3. Mapping the active site of papain; specific peptide inhibitors of papain. Biochem Biophys Res Commun 32:898-902
Schmid SR, (2009) Fusion-proteins as biopharmaceuticals--applications and challenges. Curr Opin Drug Discov Devel.12:284-95
Schwabe C, Buellesbach EE. (2007) Relaxin, the relaxin-like factor and their receptors. Adv Exp Med Biol. 612:14-25
Shaw JA, Delday MI, Hart AW, Docherty HM, Maltin CA, Docherty K. (2002) Secretion of bioactive human insulin following plasmid-mediated gene transfer to non-neuroendocrine cell lines, primary cultures and rat skeletal muscle in vivo. J Endocrinol. 172:653-672
Sim,R.B. and Tsiftsoglou,S.A. (2004) Proteases of the complement system. Biochem Soc Trans 32:21-27
Starck, S., Van Den Steen,P.E., Verbeek,R., van Noort,J.M. and Opdenakker,G. (2003) A novel rationale for inhibition of gelatinase B in multiple sclerosis: MMP-9 destroys alphaB-crystallin and generates a promiscuous T cell epitope. J Neuroimmunol 141:47-57
Suzuki,F., Murakami,K., Nakamura,Y. ＆ Inagami,T. Renin. In Handbook of Proteolytic Enzymes, 2 edn (Barrett,A.J., Rawlings,N.D. ＆ Woessner,J.F. eds), p.54-61, Elsevier, London (2004)
Szmola,R. and Sahin-Toth,M. (2007) Chymotrypsin C (caldecrin) promotes degradation of human cationic trypsin: identity with Rinderknecht's enzyme Y. Proc Natl Acad Sci USA 104:11227-11232
Taggart,C.C., Lowe,G.J., Greene,C.M., Mulgrew,A.T., O'Neill,S.J., Levine,R.L. and McElvaney,N.G. (2001) Cathepsin B, L, and S cleave and inactivate secretory leucoprotease inhibitor. J Biol Chem 276:33345-33352
Teerlink JR, Metra M, Felker GM, Ponikowski P, Voors AA, Weatherley BD, Marmor A, Katz A, Grzybowski J, Unemori E, Teichman SL, Cotter G. (2009) Relaxin for the treatment of patients with acute heart failure (Pre-RELAX-AHF): a multicentre, randomised, placebo-controlled, parallel-group, dose-fi nding phase IIb study. Lancet. 373:1429-39
Tortorella,M.D., Arner,E.C., Hills,R., Gormley,J., Fok,K., Pegg,L., Munie,G. and Malfait,A.M. (2005) ADAMTS-4 (aggrecanase-1): N-terminal activation mechanisms. Arch Biochem Biophys 444:34-44
Toth, M., Taskinen, P., and Ruskoaho, H. (1996). Relaxin stimulates atrial natriuretic peptide secretion in perfused rat heart. J Endocrinol 150: 487-495
Ueno,T., Linder,S., Na,C.L., Rice,W.R., Johansson,J. and Weaver,T.E. (2004) Processing of pulmonary surfactant protein B by napsin and cathepsin H. J Biol Chem 279:16178-16184
Urlaub G, Chasin LA. (1980) Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 77:4216-4220
Vakili,J., Standker,L., Detheux,M., Vassart,G., Forssmann,W.G. and Parmentier,M. (2001) Urokinase plasminogen activator and plasmin efficiently convert hemofiltrate CC chemokine 1 into its active [9-74] processed variant. J Immunol 167:3406-3413
Walter,M., Sutton,R.M. ＆ Schechter,N.M. (1999) Highly efficient inhibition of human chymase by alpha(2)-macroglobulin. Arch Biochem Biophys 368:276-284
Wang P, Li HW, Wang YP, Chen H, Zhang P. (2009) Effects of recombinant human relaxin upon proliferation of cardiac fibroblast and synthesis of collagen under high glucose condition. J Endocrinol Invest.32:242-247
Wilkinson, T. N., Speed, T. P., Tregear, G. W., Bathgate, R. A. (2005).Evolution of the relaxin-like peptide family. BMC Evol Biol 5:14
Witt,H., Luck,W., Hennies,H.C., Classen,M., Kage,A., Lass,U., Landt,O. and Becker,M. (2000) Mutations in the gene encoding the serine protease inhibitor, Kazal type 1 are associated with chronic pancreatitis. Nat Genet  25:213-216
Zhang J, Qi YF, Geng B, Pan CS, Zhao J, Chen L, Yang J, Chang JK, Tang CS. (2005) Effect of relaxin on myocardial ischemia injury induced by isoproterenol. Peptides 26:1632-1639
EP0322094 
EP0399666
EP0413622
U.S. 4,399,216, 4,634,665
Bell et al によるU.S. 4,510,245 
Schaffner et alによる U.S. 4,968,615 
Stinski によるU.S. 5,168,062 
Axel et alによる U.S. 5,179,017 
米国特許第 4,657,760号
Boss et alによる米国特許第4,816,397号
米国特許第5,225,212号
米国特許第5,206,344号
米国特許第5,525,491号
米国特許第7,271,149号
US 4,683,195
米国特許第US 4,683,195号
米国特許第US2011/0130332号
US20100104588
WO 00/06568 
WO 01/19355
WO 01/19778
WO 01/77137 
WO 02/070462 
WO 02/42301 
WO 93/15199 
WO 93/15200 
WO 97/26265 
WO01/45746 
WO2001/058957
WO2010/054699
WO93/15199
【図１】
2014529293.tif 000006
【図２】
2014529293.tif 000007
【図３ａ】
2014529293.tif 000008
【図３ｂ】
2014529293.tif 000009
【図３ｃ】
2014529293.tif 000010
【図３ｄ】
2014529293.tif 000011
【配列表】
2014529293000001.app
【国際調査報告】
2014529293.tif 000012
2014529293.tif 000013
2014529293.tif 000014
2014529293.tif 000015