(57)【要約】  生存微生物を含むことが疑われる試料中で前記微生物を検出および計数する方法であって：（１）前記試料を細胞栄養源および細胞増殖阻害物質と接触させる工程、（２）前記試料を、前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程、（３）蛍光シグナルを検出し、定量化する工程を含む方法であって、前記微生物はレジオネラ・ニューモフィラ種のものであり、前記細胞増殖阻害物質は、シプロフロキサシンおよびセファレキシンからなる群から選択される方法。本発明はまた、（１）細胞栄養源、（２）細胞増殖阻害物質、（３）前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、（４）蛍光シグナルを検出し、定量化するための手段を含むキットを含み、前記細胞増殖阻害物質は、シプロフロキサシンおよびセファレキシンからなる群から選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生存微生物を、前記微生物を含むことが疑われる試料中で検出および計数する方法であって：
（１）前記試料を細胞栄養源および細胞増殖阻害物質と接触させる工程、
（２）前記試料を、前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程、
（３）蛍光シグナルを検出し、定量化する工程を含み、
前記微生物がレジオネラ・ニューモフィラ種のものであり、前記細胞増殖阻害物質が、シプロフロキサシンおよびセファレキシンからなる群から選択される、方法。
【請求項２】
工程１）の前記細胞栄養源が、酸化防止剤、好ましくはピルビン酸（又はその塩）を含む成長サプリメントを含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程１）の前記細胞栄養源が、グルタミン酸（又はその塩）を含有する、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程１）の前記細胞栄養源が、グルタミン酸（又はその塩）およびピルビン酸（又はその塩）を含有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、ＰＮＥ１プローブ、ＬＥＧＰＮＥ１プローブ、およびＬＰ２プローブからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（２）において、前記試料を少なくとも第１プローブおよび第２プローブと接触させ、前記第１プローブは、前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズでき、前記第２プローブは、前記微生物のリポソーム核酸の少なくとも１つの異なる部分を特異的にハイブリダイズできる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（２）において、前記試料を少なくとも第１プローブおよび第２プローブと接触させ、前記第１プローブは、すべてレジオネラ属に属するリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズでき、前記第２プローブは、全てレジオネラ・ニューモフィラ種に属するリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズできる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１プローブが、ＬＥＧ７０５プローブ、ＬＥＧ２２６プローブ、Ｌｅｇａｌｌ１１プローブ、Ｌｅｇａｌｌ２２プローブ、およびＬｅｇ１２０ｖプローブからなる群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
落射蛍光顕微鏡を用いて工程（３）を自動的に実施する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、工業用冷却水、飲用水、および天然水から選択される群のいずれか由来である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
レジオネラ・ニューモフィラ種の生存微生物を、前記微生物を含むことが疑われる試料においてさらに迅速に検出し、計数するキットであって：
（１）細胞栄養源、
（２）細胞増殖阻害物質、
（３）前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズできる少なくとも１つの蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、
（４）蛍光シグナルを検出し、定量化するための手段
を含み、前記細胞増殖阻害物質が、シプロフロキサシンおよびセファレキシンからなる群から選択される、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のレジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）種の生存微生物を検出し、計数する方法に関する。本発明は、かかる方法での使用に適したキットも包含する。この方法およびキットによって、生存微生物をより迅速に定量化することが可能になる。
【０００２】
レジオネラ菌は、土壌および非海洋水生生息地などの湿潤環境中に偏在する。これらは、温水および冷水設備、空調設備の冷却塔、および水加湿器においても見いだされる。
【０００３】
レジオネラ、特にレジオネラ・ニューモフィラは、一般的には「レジオネラ症」として知られ、感染者にとって致命的であることが多い急性細菌性肺炎を引き起こし得る病原菌である。
【０００４】
従来、レジオネラ・ニューモフィラの検出および計数は細胞培養によって行われる。この方法は、平板計数を用いて培養可能な細菌を測定することによるか、またはフィルター膜法を用いてマイクロコロニーを測定することによって行うことができる。これらの技術は、細菌がコロニーもしくはマイクロコロニーを形成する能力によって生菌を評価する。残念なことに、かかる方法は、通常、コロニーもしくはマイクロコロニーを形成させるために３〜１０日を要する。水設備が依然として稼働中であるならば、この間にもヒト感染の許容できない危険性が存在する。
【０００５】
全レジオネラ微生物を検出する他の方法は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術を含む。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、体外酵素的複製によってＤＮＡの断片を増幅する。技術の過程で、生じるＤＮＡを複製の鋳型として使用し、これによって連鎖反応が起こり、この反応ではＤＮＡ鋳型は指数的に増幅される。ＰＣＲは、数百万もしくはそれ以上のＤＮＡ断片を生成させることによって、１つもしくはいくつかのＤＮＡ断片を増幅させることができる。典型的には、かかる方法は、Ｄｉｅｄｅｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００７  Ｊａｎ；  ５６（Ｐｔ  １）：９４−１０１に記載されている。
【０００６】
しかし、ＰＣＲの欠点は、試料が重合反応阻害物質を含む傾向があるので、一貫して定量的な結果を提供しないことである。さらに、この技術は、事前のＤＮＡ精製工程に依存し、その結果、ＤＮＡが失われる可能性があり、存在するレジオネラが結果として過小評価される可能性がある。ある程度までは、定量的であるリアルタイムＰＣＲによってこれらの欠点は克服される。しかし、この技術は、生細胞と死細胞とを区別することができない。
【０００７】
別の技術は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）であり、この技術では、蛍光物質で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが細菌細胞中に浸透する。リボソーム核酸（ｒＲＮＡ）がその標的として知られるプローブに対して正しい配列を有している場合、このプローブはそれ自体がその標的に付着し、その後のいずれの洗浄工程によっても除去されない。プローブが固定された細菌は、したがって蛍光シグナルを発する。この蛍光シグナルを次いで、フローサイトメトリー、固相サイトメトリー、または落射蛍光顕微鏡法などの技術によって定量化することができる。典型的なＦＩＳＨ技術は、Ｄｕｔｉｌ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００６  Ｍａｙ；１００（５）：９５５−６３に記載されている。しかし、ＦＩＳＨ技術を単独で用いて、生存レジオネラ・ニューモフィラの合計数を検出することはできるが、残念なことに、この方法では、分裂できて結果としてコロニーを形成できるレジオネラ・ニューモフィラ菌のみを排他的に同定することができない。
【０００８】
生存レジオネラ・ニューモフィラを計数するためのさらなる方法は、ＣｈｅｍＣｈｒｏｍｅ  Ｖ６を含み、Ｄｅｌｇａｄｏ−Ｖｉｓｃｏｇｌｉｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００５  Ｊｕｌ；７１（７）：４０８６−９６に記載されている。この方法により、レジオネラ・ニューモフィラの定量化ならびに、生菌と非生菌の区別とが可能になる。この方法は、抗体および細菌生存マーカー（ＣｈｅｍＣｈｒｏｍ  Ｖ６）を用いたレジオネラ細胞の特異的検出と、計数のための落射蛍光顕微鏡法の使用を組み合わせる。しかし、この技術は、生菌と非生菌細胞とを区別するが、コロニー形成細菌を別々に同定することができない。
【０００９】
今日まで、分裂できるレジオネラ・ニューモフィラ菌の検出を可能にする唯一の方法は、マイクロコロニー法（Ｓｃａｎ−ＶＩＴ）に基づくものであった。しかし、この方法は約７２時間を要する。
【００１０】
Ａｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．  "Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉａｂｌｅ  ｂｕｔ  ｎｏｎ−ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｉｖｅｒ  ｗａｔｅｒ"  ｐｐ  ３４０−３４６，  Ｊ．  Ａｐｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ  ８３，  １９９７は、特異的マーカーを使用した直接生存率測定（ＤＶＣ）の使用を記載する。
【００１１】
Ｐｉｑｕｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  "Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｒｅｃｔ  ｖｉａｂｌｅ  ｃｏｕｎｔ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ  ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ"  ｐｐ  ３４５−３４９  Ｒｅｓ．  Ｍａｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ  １５７，  ２００６およびＪｊｅｍｂａ  ｅｔ  ａｌ．  "Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｉｎｇ  ｏｆ  ｐｙｒｅｎｅ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｓｏｉｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ"  ｐｐ  ２８７−２９８  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｅｃｏｌ．  Ｖｏｌ．  ５５，  ２００６は、どちらもＤＶＣ−ＦＩＳＨについて言及しているが、レジオネラ・ニューモフィラに関連しない微生物についてである。
【００１２】
ＥＰ−Ａ−１８５２５１２は、レジオネラ・ニューモフィラをはじめとするいくつかの病原性微生物の同定および計数のための方法を記載する。この方法は、直接生存率測定（ＤＶＣ）と蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）とを組み入れるが、シグナルを増幅するために、ヘルパープローブも使用する。ヘルパープローブは、特異的標識プローブによって標的とされる領域に隣接した領域と結合する未標識オリゴヌクレオチドである。これは、ｉｎ  ｓｉｔｕ接近可能性、ひいてはプローブ付与シグナルを増強する。
【００１３】
ＥＰ−Ａ−１８５２５１２に記載されている方法は、感受性細胞の細胞分裂を停止させ、細胞内ｒＲＮＡ含有量および細胞の長さを増大させるナリジクス酸などのＤＮＡジャイレース阻害剤を用いるとされる。しかし、実際には、ナリジクス酸は、レジオネラ・ニューモフィラの確実に有効なＤＮＡジャイレース阻害剤ではない。さらに、この文献は、天然に蛍光性である微生物の存在にために起こり得る不正確な計数の問題について言及していない。
【００１４】
試料中でコロニーを形成できる生存レジオネラ・ニューモフィラを、既知技術よりも迅速に、確実に定量化する方法を提供することが望ましい。加えて、これをより正確に行うことが望ましい。
【００１５】
本発明にしたがって、本発明者等は、生存微生物を含むことが疑われる試料中で前記微生物を検出および計数する方法であって：
（１）前記試料を細胞栄養源および細胞増殖阻害物質と接触させる工程、
（２）前記試料を、前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズすることができる蛍光標識された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程、
（３）蛍光シグナルを検出し、定量化する工程を含む方法であって、前記微生物がレジオネラ・ニューモフィラ種のものであり、前記細胞増殖阻害物質が、シプロフロキサシンおよびセファレキシンからなる群から選択される方法を提供する。
【００１６】
一般的に、工程はそれぞれ連続して実施し、工程（２）は工程（１）で処理した試料に関して実施し、次いで工程（３）を工程（２）後に行う。
【００１７】
本発明の方法の工程１は、直接生存率測定（ＤＶＣ）として既知であり、これは、抗生物質または細胞代謝を低下させることなく細胞分裂を阻害するＤＮＡジャイレース阻害剤の存在下で細菌をインキュベートすることに基づく。したがって、生細胞は長くなるが分裂しない傾向にあり、したがって大きさが変わらない死細胞と区別できる。その結果、顕微鏡法によって生細胞を同定することが可能になる。ＤＶＣ工程の実施前に、試料を濃縮し、例えばＦｒｅｎｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ（ＡＦＮＯＲ）１１，  Ａｖｅｎｕｅ  Ｆｒａｎｃｉｓ  ｄｅ  Ｐｒｅｓｓｅｎｓｅ−９３５７１  Ｓｔ  Ｄｅｎｉｓ  Ｌａ  Ｐｌａｉｎｅ  Ｃｅｄｅｘ，  Ｆｒａｎｃｅに編集および広められる標準法Ｔ９０−４３１（ＩＳＳＮ０３３５−３９３１）にしたがって酸及び／又は熱処理によって前処理することが望ましい。
【００１８】
本発明者等は、意外にも、シプロフロキサシンおよびセファレキシンが非常に有効なＤＮＡジャイレース阻害剤であることを見いだした。シプロフロキサシンおよびセファレキシンはどちらも、レジオネラ・ニューモフィラ細胞が細胞分裂のために長くなるのを許容するが、実際にはこれらの長くなった細胞が分裂するのを阻止する。一方、ナリジクス酸は、本発明の方法について有効であるために十分なほどレジオネラ・ニューモフィラ細胞を伸長させない。有利なことに、本発明者等は、本発明の方法によって、レジオネラ・ニューモフィラを、確実にそして通常は２４時間未満の時間スケール内で同定および定量化可能であることを見いだした。このことにより、水の衛生管理において著しい改善がもたらされる。
【００１９】
シプロフロキサシンもしくはセファレキシンを任意の有効量で用いることができる。典型的には、細胞栄養源中に含まれる培地内で２０ｍｇ／Ｌまで又はそれ以上の濃度である。好ましくは、濃度は、１〜１０ｍｇ／Ｌである。好ましくは、細胞増殖阻害物質はシプロフロキサシンである。本発明者等は、１２時間後でシプロフロキサシン濃度が２〜６ｍｇ／Ｌ、特に３〜５ｍｇ／Ｌである場合に、最大の細胞伸長を達成できることを見いだした。
【００２０】
細胞栄養源は、ＤＶＣ法に適用可能であり、レジオネラ・ニューモフィラに適した任意の好適な成長培地組成物を含まなければならない。好適な培地組成物は、培地、選択サプリメント、細胞増殖阻害物質（シプロフロキサシンもしくはセファレキシン）、および成長サプリメントを含み得る。
【００２１】
培地は、レジオネラ・ニューモフィラの成長を可能にするために必要な最小栄養物を提供する。例えば、寒天および活性炭を使用せず標準法Ｔ９０−４３１（前述）に準拠した、文献に記載されている好適な培地であってもよい。
【００２２】
選択サプリメントは、多くの場合、妨害微生物の発生を制限するために必要である。最適の抗生物質は、ＤＶＣ法に適した任意の既知サプリメントであり、例えば標準法Ｔ９０−４３１（前述）に記載されている。それでも、各抗生物質の濃度は、一般的に、特定の液体培地に適合させなければならない。しかし、工程２は通常、妨害微生物の影響を克服するために十分特異的であるので、これらの他の微生物が完全に除去されない場合において必ずしも不利益ではない。
【００２３】
成長サプリメントはレジオネラ・ニューモフィラ菌の成長を可能にするために必須ではないが、その成長を最適化することができる。レジオネラ・ニューモフィラは（最適条件下で）１２０分で２倍になることによって特徴づけられる。しかし、本発明者らは、場合によって、コロニーを形成できる生存レジオネラ・ニューモフィラ菌は、かならずしも直ちにコロニーを形成するわけではなく、成長が始まる前に、遅滞もしくは遅滞期を経ることを見いだした。遅滞期は、初期生理状態の機能において、８〜２０時間以上であり得る。
【００２４】
本発明の好適な形態において、レジオネラ・ニューモフィラの遅滞期は、成長サプリメントおよび酸化防止剤を細胞栄養源中に含めることによって短縮することができる。酸化防止剤は、活性酸素（ＲＯＳ）に直接作用することができるか、またはＲＯＳの減少をもたらす、微生物の代謝に直接的もしくは間接的に影響を及ぼすような他の手段によって作用することができる。好適な酸化防止剤としては、カタラーゼ、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、ＴＤＰＡ（３，３’−チオジプロピオン酸）およびピルビン酸塩等が挙げられる。好ましくは、酸化防止剤はピルビン酸塩である。酸化防止剤、特にピルビン酸塩についての好適な投与量は、０．５〜１．５ｇ／Ｌ、特に約１ｇ／Ｌである。
【００２５】
細胞栄養源は、活性酸素（ＲＯＳ）の形成を間接的に阻害及び／又は分解させる少なくとも１つの化合物を含み得、前記化合物は、微生物の代謝を妨害することによって、ＲＯＳのレベルを低下させ得る。典型的には、かかる化合物はアミノ酸もしくはそれらの塩を含む。特に好適な化合物は、グルタミン酸もしくはグルタミン酸塩である。
【００２６】
本発明のさらに好適な形態において、細胞栄養源は、グルタミン酸もしくはグルタミン酸塩、特にナトリウム塩を含む。一般的に、グルタミン酸もしくはグルタミン酸塩の量は、ナトリウム塩として計算して、０．０１〜５質量％である。
【００２７】
細胞栄養源が、ピルビン酸もしくはピルビン酸塩（特にナトリウム塩）と、グルタミン酸もしくはグルタミン酸塩（特にナトリウム塩として）との両方をあわせて含むのが特に好適である。このピルビン酸もしくはピルビン酸塩とグルタミン酸もしくはグルタミン酸塩との組み合わせは、いずれかの化合物をそれぞれ単独で使用するよりも高い培養可能なレジオネラの評価（ひいてはより正確な評価）を可能にする点で相乗効果を誘発するようである。さらに、本発明者等は、この組み合わせによって、特に液体培地中でのレジオネラ・ニューモフィラの発生中の遅滞期のさらなる減少がもたらされることを見いだした。このような液体培地中での遅滞期が減少する結果、寒天プレート上で可視コロニーを得るために必要な時間が減少する。
【００２８】
望ましくは、ピルビン酸塩およびグルタミン酸塩の量は前述のとおりである。グルタミン酸塩のピルビン酸塩に対する比が、１：１〜５０：１、特に５：１〜２０：１、さらには７：１〜１５：１の範囲であるのが特に好適である。
【００２９】
グルタミン酸塩は酸化防止剤としては知られていない。しかし、間接的に、グルタミン酸塩は成長中に天然に形成されるＲＯＳの体内生産または高分子に対する影響（酸化）を低下させることができるようである。
【００３０】
理論に限定されないが、グルタミン酸はレジオネラの代謝を変えて、ピルビン酸塩の影響を増大させ、レジオネラの代謝のこの妨害は、細胞内ＲＯＳの形成を間接的に阻害及び／又は分解すると考えられていた。
【００３１】
本発明の方法は、用いられるインキュベーション期間をさらに短く、望ましくは約２４時間以下にすることを可能にできる。好ましくは、これは１２時間に短縮することができる。特に、特に細菌の干渉の発生率が低い場合及び／又はレジオネラ・ニューモフィラ菌の発生率が高い場合に、１２時間まで短縮することができる。
【００３２】
試料は、任意の好適な位置から集めることができる。これは、例えば冷却装置中の再循環水の試料であってよい。しかし望ましくは、試料はエアゾル形態の水から得ることができる。典型的には、エアゾルは、冷却塔もしくは空調装置中に位置していてもよい。望ましくは、本発明の方法にしたがって試験する前にエアゾルから水を凝縮させる。
【００３３】
インキュベーション様式は、ＤＶＣ法を記載する文献で定義されるとおりであり得る。このような方法は、試料の濾過と、次いで培地に浸したパッド上でのフィルターインキュベーションを含み得る。好ましくは、本発明にしたがって、試料または濃縮試料を、培地を用いて直接インキュベートし、次いで濾過する。このようにして、本発明者等は、インキュベーション過程で細菌が失われる危険を軽減することができ、インキュベーション中のより良好な条件、例えば酸素移動または試料の撹拌を提供することができる。
【００３４】
本発明の方法の工程２は、標準ＦＩＳＨプロトコルを用いることができる。
【００３５】
ＦＩＳＨ手順の最初の部分で、細胞の外部膜もしくは外皮を処理して、オリゴヌクレオチドプローブに対して透過性にすることによって、細胞を固定することができる。一般的に、これは、２５℃で水と混和性であるアルコールもしくはアルデヒドの水溶液である固定液を用いて達成される。好適なアルコールまたはアルデヒドとしては、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、エタノール及び／又はメタノールが挙げられる。典型的には、ホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒドの溶液は、１０質量％まで、好ましくは１〜５％であり得る。通常、アルコールは少なくとも５０質量％であり、一般的には６０〜９０質量％である。好ましくは、この処理は１種以上のこれらの溶液を用いた連続処理によって行うことができる。好ましくは、処理は、１〜５％のホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒドの溶液、続いて５０％から９０％の間で濃度が増大するエタノールもしくはメタノールの２または３種の溶液を含んでもよい。
【００３６】
ＦＩＳＨ法は、次に、オリゴヌクレオチドが細胞内の特異的配列を標的とすることができる蛍光マーカーが付着したオリゴヌクレオチドを含む、少なくとも１つの蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液を用いることによって、ハイブリダイゼーション法を用いる。オリゴヌクレオチドプローブは、細胞の外部膜を通過し、オリゴヌクレオチドに対応する標的配列と結合する。結合は、相補的核酸種間の水素結合の形成を意味すると解釈される。ＦＩＳＨ技術において、オリゴヌクレオチドプローブは相補的であり、微生物内のリボソーム標的配列のある領域と結合できる。典型的には、プローブは一本鎖デオキシリボ核酸断片として１５〜３０塩基長を含み、微生物に対して特異的な、特異的標的領域に向けられる。
【００３７】
オリゴヌクレオチドプローブは、望ましくは、レジオネラ・ニューモフィラの特異的リボソームＡＲＮ１６Ｓプローブである。レジオネラ・ニューモフィラ種の微生物を特異的に標的とする任意のオリゴヌクレオチドプローブを用いることができる。好ましくは、プローブは、ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＣＣＧ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＴＴの５’３’塩基配列を有する、Ｇｒｉｍｍ等（１９９８）によって記載されるＰＮＥ１プローブ、ＡＴＣＴＧ  ＡＣＣＧＴ  ＣＣＣＡＧ  ＧＴＴの５’３’塩基配列を有するＧｒｉｍｍ等（１９９８）およびＤｅｃｌｅｒｃｋ等（２００３）によって記載されるＬＥＧＰＮＥ１プローブ（配列番号２２）、およびＡＧＣＴＴ  ＴＣＡＴＣ  ＣＡＡＡＧ  ＡＴＡの５’３’塩基配列を有するＹａｍａｍｏｔｏ等（１９９３）によって記載されるＬＰ２プローブ（配列番号２３）からなる群から選択される。
【００３８】
３つのプローブＰＮＥ１プローブ、ＬＥＧＰＮＥ１プローブ、もしくはＬＰ２プローブのいずれかと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を有するプローブを代わりに用いることも望ましい。
【００３９】
天然に蛍光性である微生物が誤って同定される危険性を克服するために、本発明の好適な形態は２つのヌクレオチドプローブを用いる。１つのプローブはレジオネラ属由来の全ての微生物を標的とし、第２のプローブは、レジオネラ・ニューモフィラ種の微生物を特異的にハイブリダイズするように設計される。各プローブを異なる蛍光色素で標識する。天然に蛍光性である微生物は、特定の波長もしくは狭帯域の波長でのみ蛍光性であり、したがって、異なる波長で蛍光を発する異なる色素を有する２つのプローブを使用することによって、特にレジオネラ・ニューモフィラではない天然に蛍光性である微生物が除去される。
【００４０】
本発明のこの好適な形態において、第１プローブはレジオネラ属に属する微生物をハイブリダイズし、この微生物としては、これらに限定されるものではないが、レジオネラ・ロングビーチ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｌｏｎｇｂｅａｃｈａｅ）、レジオネラ・ヨルダニス（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｊｏｒｄａｎｉｓ）、レジオネラ・アニサ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ａｎｉｓａ）、レジオネラ・ニューモフィラが挙げられる。この第１プローブは、レジオネラ属内に含まれる細菌のいずれか由来の標的リボソーム配列と結合することができるヌクレオチドを含むことができる。典型的には、第１プローブは、Ｍａｎｚら（Ｍａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）で記載され、ＣＴＧＧＴ  ＧＴＴＣＣ  ＴＴＣＣＧ  ＡＴＣの５’３’塩基配列を有するＬＥＧ７０５プローブ（配列番号７）、Ｍａｎｚら（Ｍａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５）で記載され、ＴＣＧＧＡ  ＣＧＣＡＧ  ＧＣＴＡＡ  ＴＣＴの５’３’塩基配列を有するＬＥＧ２２６プローブ（配列番号８）、Ｌｅｓｋｅｌａら（Ｌｅｓｋｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）で記載され、ＣＣＴＣＣ  ＴＣＣＣＣ  ＡＣＴＧＡ  ＡＡＧＴの５’３’塩基配列を有するＬｅｇａｌｌ１１プローブ（配列番号９）、Ｌｅｓｋｅｌａら（Ｌｅｓｋｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）で記載され、ＣＡＣＴＧ  ＴＡＴＧＴ  ＣＡＡＧＧ  ＧＴＡＧＧの５’３’塩基配列を有するＬｅｇａｌｌ２２プローブ（配列番号１０）、Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒら（Ｂｕｓｈｂｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）で記載され、ＡＡＧＧＣ  ＡＴＡＴＴ  ＣＣＴＡＣ  ＧＣＧの５’３’塩基配列を有するＬｅｇ１２０ｖプローブ（配列番号１１）からなる群から選択されるプローブのいずれかであり得る。
【００４１】
３つのプローブ：ＬＥＧ７０５プローブ、ＬＥＧ２２６プローブ、Ｌｅｇａｌｌ１１プローブ、Ｌｅｇａｌｌ２２プローブ、およびＬｅｇ１２０ｖプローブのいずれかと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する配列を有するプローブを代わりに用いることも望ましい。
【００４２】
第２プローブは、レジオネラ・ニューモフィラの特定種のみをハイブリダイズすることができ、この特性を有する前記ヌクレオチドプローブのいずれか、例えば３つのプローブ：ＰＮＥ１プローブ、ＬＥＧＰＮＥ１プローブ、またはＬＰ２プローブのいずれかであり得る。
【００４３】
ＦＩＴＣ（例えば、Ｓｙｔｏ９、Ａｌｅｘａ４８８）またはＣｙ３（例えば、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ａｌｅｘａ  ５８３）の適切な発光／励起スペクトルと適合性であることが知られている蛍光色素のどれでも使用することができる。
【００４４】
工程３は、顕微鏡を使用して関連する細菌を定量化することを含む。これは、手作業でまたは自動的に、例えば落射蛍光顕微鏡を用いて行うことができる。好ましくは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって標識し、フィルター上に固定された細菌の検出および計数は、落射蛍光装置を備えた顕微鏡の使用を必要とする。
【００４５】
好適な検出装置としては、ＣｈｅｍＳｃａｎ  ＲＤＩおよびＳｃａｎＶＩＴ−Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ＴＭ（Ｖｅｒｎｉｃｏｎ  ＡＧ、ドイツ国ミュンヘン）が挙げられる。ｃｈｅｍｓｃａｎ（ＡＥＳＣｈｅｍｕｎｅｘによって開発された固体サイトメトリー）を使用して、標識された細菌を検出し、計数することが可能である。しかし、この装置は、１組の発光／励起ミラー（４８８ｎｍ）しか使用できず、したがって本発明者等のプロトコルは１つの標識されたプローブの使用に限定される。
【００４６】
ＳｃａｎＶＩＴ−Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ＴＭは、特に、少なくとも２つのプローブを用いる本発明の前記好適な態様によると好適である。その理由は、この技術によって、レジオネラ・ニューモフィラでない天然に蛍光である微生物を除去するために、２つの異なる蛍光シグナルを使用することが可能になるからである。
【００４７】
本発明の方法は、レジオネラ・ニューモフィラの存在の正確かつ迅速な定量的測定を容易にする。この方法は、工業用冷却水、飲用水、および天然水から選択される群のいずれか由来の試料中のレジオネラ・ニューモフィラを検出するのに適している。
【００４８】
本発明は、レジオネラ・ニューモフィラ種の生存微生物を含むことが疑われる試料において前記微生物さらに迅速に検出し、計数するキットであって：
（１）細胞栄養源、
（２）細胞増殖阻害物質、
（３）前記微生物のリボソーム核酸の少なくとも一部を特異的にハイブリダイズできる少なくとも１つの蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブ、
（４）蛍光シグナルを検出し、定量化するための手段
を含み、前記細胞増殖阻害物質が、シプロフロキサシンおよびセファレキシンからなる群から選択されるキットも包含する。
【００４９】
好適な形態において、キットは以下の溶液を含んでもよい：長期保存のために脱水することができる培地組成物（前記定義のとおり）；細菌の外部膜を固定するための溶液、例えばホルムアルデヒド；例えば使用直前に作製しなければならない前記のハイブリダイゼーション溶液；例えば前記定義の、使用直前に作製しなければならない洗浄液；長期保存のために脱水することができる核酸蛍光色素、例えばＤＡＰＩ；退色防止封入剤。好ましくは、キットはフィルターを含んでもよい。さらに好ましくは、キットは、生理的緩衝液；５０〜９０％の濃度のエタノール溶液；および滅菌水をさらに含んでもよい。キットは、例えば２ｍｌのエッペンドルフを含んでもよい。
【００５０】
キットは、本発明の第１の態様に関して記載された実施形態のどれでも含むことができる。
【００５１】
キットは、本発明の方法を用いた使用に適し、レジオネラ・ニューモフィラの迅速かつ確実な計数を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】標準法ＡＦＮＯＲ（８日）と２４時間未満しか必要としない本発明の方法との間の相関関係を示す図。
【図２】天然に蛍光性である細菌とレジオネラ・ニューモフィラを区別できるようにする４つのケースを示す図。
【００５３】
以下の実施例で本発明を説明する。
【００５４】
実施例１
１０６細菌／ｍｌの最終濃度のレジオネラ・ニューモフィラ懸濁液を同じ体積の２つの懸濁液中で処理する。最初の懸濁液（Ｓ１）のみを周囲温度（２０〜２２℃）で３０分間、３．７％（ｖ／ｖｌ）ホルムアルデヒドで固定する。両懸濁液を次いでＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、遠心分離（６，０００×ｇ、２０℃で５分）によって３回洗浄する。
【００５５】
両懸濁液を最終的に第１表にしたがって混合する。
【表１】
2011516052.tif 000002
【００５６】
各混合物を下記実験プロトコルにしたがって処理する。
【００５７】
結果
結果を図１に示す。図１は、標準法ＡＦＮＯＲ（８日）と２４時間未満しか必要としない本発明の方法との間の相関関係を示す。結果は、レジオネラ・ニューモフィラの同定の精度の点で、この２つの方法の間の良好な相関関係を示す。
【００５８】
実験プロトコル
試料（Ｖ1）を、直径２５ｍｍ、細孔径０．２μｍの白色ポリカーボネート膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＧＴＴＰ０２５００）を通して濾過した。フィルターを１０ｍｌの溶液Ａで２回すすぎ、１ｍｌの溶液Ａを含む滅菌試験管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ２ｍｌ）中に入れた。試験管を３０Ｈｚ（４℃）で１分振とうした。フィルターを除去した後、各懸濁液を次のようにして処理した：
１．５００μｌの懸濁液を、５００μｌの溶液Ｂを含む滅菌試験管中に無菌的に入れる。試験管を次いで撹拌しながら３７℃または４５℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、直径２５ｍｍ、細孔径０．２μｍの白色ポリカーボネート膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＧＴＴＰ０２５００）を通して懸濁液を濾過し、周囲温度（２０〜２２℃）で３０分間、溶液Ｃを用いて固定した。フィルターをリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で２回すすぎ、空気乾燥させた。
【００５９】
２．５００μｌの懸濁液を、直径２５ｍｍ、細孔径０．２μｍの白色ポリカーボネート膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＧＴＴＰ０２５００）を通して直接濾過し、周囲温度（２０〜２２℃）で３０分間、溶液Ｃを用いて固定した。フィルターをリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で２回すすぎ、空気乾燥させた。
【００６０】
溶液Ｄ、溶液Ｅおよび溶液Ｆ中で連続洗浄し（それぞれ２分）、次いで３７℃で３０分間インキュベーションすることにより乾燥させることによって、フィルターを脱水した。フィルターをスライド上に置き、５０μｌの溶液Ｇをフィルターに塗布した。脱水しないようにカバーガラスをフィルター上に置いた。ハイブリダイゼーションを、加湿器中、４６±１℃で２時間実施した。次いで、４６℃で予熱した５ｍｌの溶液Ｈでフィルターを３回洗浄し、次いで滅菌水で２回すすいだ。フィルターを１ｍｌの溶液Ｉとともに１５分間インキュベートし、滅菌水で２回洗浄した。空気乾燥した後、フィルターを最終的に２０μｌの溶液Ｊとともにスライド上に載せた。ハイブリダイズした細胞を、１００倍液浸対物レンズおよび２つの発光／励起フィルター、すなわち５１０〜５５０ｎｍ励起フィルターおよび５９０ｎｍバリアフィルターを用いた落射蛍光顕微鏡法によって可視化した。
【００６１】
溶液
【表２】
2011516052.tif 000003
【００６２】
培地２Ｘ
【表３】
2011516052.tif 000004
【００６３】
すべての反応性物質は、細孔径０．２μｍのニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＳＬＧＳ０２５  ０Ｓ）を通した濾過によって滅菌した。試薬の各組の詳細については、以下を参照。
【００６４】
ハイブリダイゼーション溶液
【表４】
2011516052.tif 000005
【００６５】
全ての反応性物質を、細孔径０．２μｍのニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＳＬＧＳ０２５  ０Ｓ）を通した濾過によって滅菌した。
【００６６】
ＦＩＳＨ検出に用いたプローブは、レジオネラ科に特異的であり、ＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアネート）で標識されたＬＥＧ７０５（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ：５’−ＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＴＴＣＣＧＡＴＣ−３’）およびレジオネラ・ニューモフィラ属に特異的であり、Ｃｙ３で標識されたＰＮＥ１（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ：５’−ＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＴＴＣＣＧＡＴＣ−３’）である。
【００６７】
プローブを１ｎｇ／μｌの最終濃度でハイブリダイゼーション溶液に添加した。
【００６８】
洗浄液
【表５】
2011516052.tif 000006
【００６９】
すべての反応性物質を、細孔径０．２μｍのニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  ＳＬＧＳ０２５  ０Ｓ）を通した濾過によって滅菌した。
【００７０】
実施例２
緑色蛍光色素で標識したｌｅｇ７０５第１プローブおよび赤色蛍光色素で標識したＰＮＥ１第２プローブを用いて、実施例１の実験プロトコルを試料に適用する。
【００７１】
図２は、天然に蛍光性である細菌とレジオネラ・ニューモフィラを区別できるようにする４つのケースを示す。図２を参照して：
ケース１：緑色でも赤色蛍光でもない細菌−細菌はレジオネラ属およびレジオネラ・ニューモフィラ種に属さない；
ケース２−緑色蛍光のみの細菌−この細菌はレジオネラ属に属するか、または天然に蛍光性である；
ケース３−赤色のみの細菌−緑色蛍光性でなく、したがってレジオネラ属に属さないので、赤色蛍光にもかかわらず、細菌はレジオネラ・ニューモフィラに属さない。この細菌は天然に赤色蛍光性である；および
ケース４−緑色及び赤色蛍光性細菌−この細菌はレジオネラ属およびレジオネラ・ニューモフィラ種に属する。
【００７２】
この方法を使用して、本発明者等は、天然に蛍光性である細菌の検出を制限することによって（それ以外の方法ではこの細菌を誤って示してしまう）、レジオネラ・ニューモフィラを正確に検出することができる。
【００７３】
ＰＮＥ１プローブは最初にＧｒｉｍｍ等（Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）で記載されている。特異的配列は：５’−ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＣＣＧ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＧＴＴ−３’である。
【００７４】
Ｌｅｇ７０５プローブは、最初にＭａｎｚ等（Ｍａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）で記載されている。特異的配列は：５’−ＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＴＴＣＣＧＡＴＣ−３’である。
【００７５】
この試験で使用した３つの色素は次のとおりである：
第１の色素を用いて、全ての微生物の核酸を染色する。ＤＡＰＩを使用して、細菌をＵＶ励起下で青色に染色する。この色素は、オリゴヌクレオチドプローブとカップリングしない。
【００７６】
第２の２つの色素をオリゴヌクレオチドプローブとカップリングさせ、特異的検出を可能にする。これら２つの色素は、励起／発光の２つの異なるスペクトルによって特徴づけられるはずである。この試験では、ＦＩＴＣおよびＣｙ３を使用し、これらはＦＩＳＨ検出に使用される最も一般的な色素であるが、それぞれ同じスペクトルを有する多くの色素が利用可能である。
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
2011516052000001.app
【国際調査報告】
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