(57)【要約】  液体サンプル中のサブスタンス（＝Ｓ）のヘテロフォームのアナライト部分母集団の存在を決定する方法であって、以下の工程：（ｉ）次の要件を満たすフローパスを準備し、ａ）出口および入口を含み、ｂ）Ｓとのアフィニティ結合能を有し、Ｓの種々のヘテロフォームとは異なるアフィニティを有する固定されたアナライトに特異的なバインダー（Ｂ）を提示する固相を含有する捕獲ゾーン（ＣＺ）を含み、およびｃ）ＣＺを通る液体の流れを駆動させるために出口から毛管吸引させる；（ｉｉ）ＳをＣＺのバインダーＢで捕獲しながら、Ｓを含有する液体サンプルをＣＺを通って下流方向に流し、（ｉｉｉ）ＣＺの少なくとも１つのサブゾーン１にあるＳの相対量を測定することでＣＺの流れ方向に沿ったＳの分布を決定し、および（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）にて決定した分布に基づいて、アナライト部分母集団の存在を決定する、工程を含むことを特徴とする、方法。
2011524983.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプル中のサブスタンス（＝Ｓ）のヘテロフォームのアナライト部分母集団の存在を決定する方法であって、以下の工程：
（ｉ）次の要件を満たすフローパスを準備し、
ａ）出口および入口を含み、
ｂ）Ｓとのアフィニティ結合能を有し、Ｓの種々のヘテロフォームとは異なるアフィニティを有する固定されたアナライトに特異的なバインダー（Ｂ）を提示する固相を含有する捕獲ゾーン（ＣＺ）を含み、および
ｃ）ＣＺを通る液体の流れを駆動させるために出口から毛管吸引させる；
（ｉｉ）ＳをＣＺのバインダーＢで捕獲しながら、Ｓを含有する液体サンプルをＣＺを通って下流方向に流し、
（ｉｉｉ）ＣＺの少なくとも１つのサブゾーン１にあるＳの相対量を測定することでＣＺの流れ方向に沿ったＳの分布を決定し、および
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）にて決定した分布に基づいて、アナライト部分母集団の存在を決定する
工程を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
１または複数の少なくとも１つのサブゾーン１がＣＺの流れ方向に沿った単一位置であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
サブゾーン１中のＳの絶対量を測定し、および該サブゾーン１とは異なり、好ましくはＣＺ中の流れ方向に沿ってＳが最も多い量の位置であるか、あるいはその位置を含む、ＣＺ中の標準サブゾーンにて測定されるＳの絶対量であることが好ましい、標準成分に対して認められる絶対量を正規化することにより、サブゾーン１中の相対量を得ることを特徴とする、請求項１−２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
その相対量が計算されるべきサブゾーン１と、該標準サブゾーンが重複していないことを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
標準サブゾーンが少なくとも１つの該サブゾーン１の一つであることを特徴とする、請求項３−４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ａ）液体サンプル、および／または
ｂ）場合によっては、洗浄液であるか、工程（ｉｉ）の間にＣＺにて捕獲されるＳを検出するための分析で検出可能な試薬を含む、液体アリコートを
液体の流れを作るのに毛管吸引を用いてＣＺを通って輸送することを特徴とする、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
フローパスが不活性基板上に置かれた親水性吸着シート材料にて定義され、典型的には、疎水性および／または使用される液体について不透過性であることを特徴とする、請求項１−６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉｉ）の測定工程が、
ａ）分析で検出可能な試薬を含有する液体アリコートをＣＺを通して流し、ここで該試薬は工程（ｉｉ）の間にＣＺにて捕獲されるＳとの、または工程（ｉｉ）の後でＣＺに残っている占有されていないバインダーＢとのアフィニティ結合能を有し、該アリコートがアフィニティ結合を生じさせるのに必要な条件を提供し、
ｂ）少なくとも１個のサブゾーン１中の該試薬の相対量を測定する
ことを含むことを特徴とする、請求項１−７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｉｉ）の測定工程が、分析で検出可能な試薬を測定するのに適合されるピクサス概念に基づき、イメージング検出器を用いることで測定することを特徴とする、請求項１−８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ａ）液体サンプル中の部分母集団の相対量の変化、例えばレベルの減少または増加の存在が、少なくとも１つのサブゾーン１との等価条件の下で得られる標準分布と比べて、該サブスタンスのヘテロフォームの標準組成物について特徴的な偏差をもたらし、
Ｂ）工程（ｉｖ）が
ａ）工程（ｉｉｉ）で見られた分布を標準分布と比較し、
ｂ）該偏差が認められること、または認められないことが、該液体サンプル中の該部分母集団の相対量の変化の、存在または不存在の指標であるとする、
ことからなることを特徴とする、請求項１−９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
液体サンプルが部分母集団の相対量の変化について試験されるべき個体から誘導され、標準組成物が正常な個体から誘導される対応するサンプルを代表することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
変化の存在および／または不存在が、
ａ）親サンプルの該部分母集団のレベルの変化に関連付けられる疾患に罹患している、および／または
ｂ）該親サンプルの該部分母集団のレベルの変化を促進する生物活性な化合物を摂取している、
個体の特性であることを特徴とする、請求項１０−１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
個体が群（ｂ）に属し、該生物活性な化合物が中毒物質または治療の一部として摂取されていることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
Ｓがポリペプチド構造および／または糖鎖構造を示し、該ヘテロフォームがこれら２つの構造の一方または両方のいずれに関しても相互に異なることを特徴とする、請求項１−１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
バインダーＢが該アナライトの１または複数のヘテロフォームにて存在する一のポリペプチド構造について特異性を有することを特徴とする、請求項１−１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
バインダーＢが抗体であることを特徴とする、請求項１−１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
フローパスが０．５−１５μｍのインタバル内の粒径を有する吸着シート材料の形態のフローマトリックスにて定められる、請求項１−１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
フローパスが１００μｍ以下のインタバル内のＨＥＴＰを支持する吸着シート材料の形態のフローマトリックスにて定められる、請求項１−１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
フローパスが、該フローパスの出口端からの毛管吸引によって、５ｃｍ／分以下の流速を支持する吸着シート材料の形態のフローマトリックスにて定められる、請求項１−１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ピクセル概念に基づくイメージング検出器が工程（ｉｉｉ）の測定に用いられ、固定されたＢを含有するＣＺのセグメントが少なくとも２つの端から端まで置かれたピクセルの流れ方向において一の幅を有することを特徴とする、請求項１−１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
検出可能な試薬が、例えば粒子の形態、好ましくは炭素粒子などのブラック粒子の形態であることを特徴とする、請求項１−２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ピクセル概念に基づくイメージング検出器が工程（ｉｉｉ）の測定にて用いられ、２５６レベル以上を提供するグレースケールを有することを特徴とする、請求項１−２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サブスタンス（＝Ｓ）の別のヘテロフォームをも含有する液体サンプル中にあるサブスタンスのヘテロフォームの部分母集団の正規分布を測定する方法に関する。測定される部分母集団はまた、アナライト（＝アナライト部分母集団）とも称される。該方法は、
ａ）疾患に罹患している個体または疾患に罹患していると思われる個体の体液中のＳの特定の部分母集団のレベルの変化と関連する疾患の診断および／またはモニター観察、
ｂ）個体の体液中のＳの特定の部分母集団のレベルの変化をもたらす生物活性化合物の個体の使用についてのモニター観察、および／または
ｃ）Ｓのヘテロフォームの特定の組成物または部分母集団を含むであろう生物有機サブスタンスＳの生成を、例えば細胞培養、組織培養等によりモニター観察するのに使用され得る。
（ｂ）におけるモニター観察は、生物活性化合物が、生体において、例えば個体中の生物有機化合物のメディケーション、乱用、産生等のような、生物活性応答を創り出すために用いられることを包含する。治療の一部として、または抗体を産生するための両方の免疫化が含まれる。
【０００２】
本願明細書にて引用される特許および特許刊行物は、出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００３】
定義
ヘテロフォームはサブスタンスのバリアントであり、通常のアフィニティカウンターパートと結合してアフィニティする能力を有する。典型的には、結合は阻害方式、すなわち、ヘテロフォームのアフィニティカウンターパートへの結合が、同じ結合部位での競合によるなどの、サブスタンスの別の１個または複数のヘテロフォームによって阻害されることで起こる。ヘテロフォームは蛋白のイソフォーム、例えば；イソ酵素、異なるクラス、サブクラス、抗原特異性、エピトープ特異性の抗体またはイムノグロブリン（Ｉｇ）などであってもよい。ヘテロフォームの概念はまた、サブスタンスが、通常のアフィニティカウンターパートと種々のヘテロフォームとの複合体である個々のヘテロフォームとのバイオアフィン（bioaffine）複合体であることを包含する。具体的な例は、ａ）抗原は共通するも、抗体が異なる（例えば、クラス、サブクラス、エピトープ特異性などに関して異なる）免疫複合体、および／またはｂ）抗体が共通し（例えば、モノクローナル）、抗原がヘテロフォーム（例えば、多形性であることによる）を含む免疫複合体である。サブスタンスの２種のバリアントが互いにヘテロフォームであるかどうかを決定する一の方法が、いわゆる阻害試験を行うことである。
【０００４】
本願発明の大部分の文脈において、「部分母集団」なる語は、サブスタンスの単一のヘテロフォームあるいは２またはそれ以上のヘテロフォームの組み合わせを意味する。本願発明の文脈において、「測定されるべき部分母集団」なる語は、典型的には、共通の起点を有するヘテロフォーム、例えばａ）生体または組換え操作により特定の種類の宿主細胞の特定の起点にて産生されるヘテロフォーム、ｂ）特定の疾患、あるいは薬物または他の生物活性物質または化合物を治療のために、または乱用で摂取した結果として、生体にて存在するヘテロフォームをいう。種々の組換え操作により産生される形態の蛋白もまた、別の部分母集団として、例えば別に突然変異したバリアント、同じポリペプチド骨格を有するが、異なる種類の細胞を産生するバリアントとして考慮される。ヘテロフォームは１より多くの部分母集団に共通してもよい。かくして、測定されるべき部分母集団は、上記した種類の別の起源を有する１または複数の部分母集団と一緒に流体サンプル中にあってもよい。
【０００５】
本願発明にて測定されるべき個々の部分母集団は、典型的には、ａ）サブスタンスの絶対的な総量に対して、および／またはｂ）１または複数の他のヘテロフォームの組み合わせの絶対的な総量に対して、多量または少量の１または複数のサブスタンスの特定のヘテロフォームを含有することを特徴とする。
【０００６】
「レベル」、「量」および「濃度」なる語は互換的に用いられ、それらが第一に正規化数、すなわち、サンプル中の関連するアナライトの総数であることが通常の標準数と関連付けられる絶対数を示すと特記されない限り、絶対値または相対／正規化値のいずれかをいう。
【背景技術】
【０００７】
本願発明の目的とする大部分のアナライトは、トランスフォームの含量の割には、インビボにて極めて異種であることが多い、一連の化合物である循環糖蛋白のヘテロフォームである。このことが、典型的には、個々の部分母集団のヘテロフォームの含量が重複している、すなわちヘテロフォームが数種の部分母集団に共通している、ということと一緒になって、微妙な構造的違いに基づく分離操作を用い、同じ糖蛋白の別の部分母集団をも含有する親生物学的サンプル中の特定の部分母集団の存在を明確に区別することを困難にしている。
【０００８】
ヘテロフォームの推定数が約３０−５０である、エリスロポエチン（ＥＰＯ）の場合、従来の方法は、シアリル基の含量における違いを用いるものであり、サンプル、例えばＥＰＯの尿または血清サンプルを濃縮し、つづいて濃縮したＥＰＯを電気泳動、特に等電点電気泳動（ＩＥＦ）に付し、ヘテロフォームを相互に分離する。見出されたイソフォームパターンの逸脱を測定するために、レクチンの標識化を用いることが示唆された。目的として重要なことは、ａ）個体に投与された外因的ＥＰＯ、例えば種々の組換えフォームより由来する、またはｂ）疾患に関連する、特に異常な部分母集団およびヘテロフォームの存在を反映するヘテロフォームの逸脱パターンを見つけることである。さらには、本願発明者らの同時係属中の国際特許出願ＷＯ２００８１５３４６２「イソエリスロポエチンの部分母集団の測定」（２００８年４月２１日付出願）およびその中で引用されている刊行物を参照のこと。
【０００９】
イオン交換および／または他の種類のアフィニティなどのアフィニティ原理を基礎とする種々のクロマトグラフィー技法を、アナライト部分母集団を臨床的に測定するための診断アッセイにて用いることが示唆された：
ａ．ｉ）溶出液中のトランスフェリン部分母集団を検出することによるアルコール依存症の検出（Cerven Eら、ＷＯ１９８２０００２０４； Joustraら、ＷＯ１９８５００３７５８など）、およびｉｉ）場合によっては、有用な情報を得るために、溶出液フラクション中でも測定することを組み合わせた、カラムを横切るイソフォームパターンを検出することによる、部分母集団の存在によるポリクローナル抗体の応答の等級付け（(Gyros AB、ＷＯ２００６０００９５０５）。 
ｂ．ＥＰＯ関連疾患およびＥＰＯの乱用を診断するための分離ゾーンの下流に位置する検出ゾーンでのＥＰＯを測定することによる特定の部分母集団の多孔質シート物質での水平式クロマトグラフィーおよび測定（Carlsson, J & Lonnberg, M、米国特許第６９０２８８９号、米国特許第６７３７２７８号、米国特許第６５２８３２２号、米国２００４００２３４１２明細書および本願発明者らの同時係属国際特許出願ＷＯ２００８１５３４６２「イソエリスロポエチンの部分母集団の測定」（２００８年４月２１日付出願））
【００１０】
フローマトリックスを用いてイソフォームを測定するための免疫アッセイがMaria Lonnberg “Membrane-Assisted Isoform ImmunoAssay: Separation and Determination of Protein Isoforms” Thesis 2002, Uppsala Universityおよびその中に記載の刊行物に記載されている。
【００１１】
ＳＥの優先権を主張する出願にてＳＥ特許庁で作成されたサーチレポートでは、次の付加的な文献が引用された：Ａ）Lonnbergら、J. of Immunol. Meth. 246 (2000) 25-36; Ｂ） Lonnbergら、J. Chromatog. B 763 (2001) 107-120; Ｃ）Lonnbergら、Anal. Biochem. 293 (2001) 224-31, およびEP 0724157 (Bayer Corporation)。文献（Ａ）、（Ｃ）およびＥＰ０７２４１５７は、アナライトの異なるヘテロフォームを区別する能力を有するバインダー／キャプチャーを用いる必要のない捕獲／検出ゾーンにおけるアナライトの絶対的総量を測定することに関する。
【００１２】
これまで、本願発明の分野にて臨床的使用が承認されているアッセイは、多大な時間と費用を必要とし、高度な技術および専門研究所を要求する。簡略化されたアッセイに対する要求がある。厄介な問題は、内因性の糖蛋白および組換え操作された糖蛋白について得られる複雑なイソフォームパターンである。個体より由来の、その中に組換えバリアントが治療を目的として、あるいはドープ剤として投与されているサンプルのように、組換え操作により産生されるバリアントが内因性バリアントと一緒にある場合、重複を原因として、複雑性は一層強化される。外因的に投与して生成されるバリアントの代謝作用により、状況はさらに複雑となるであろう。他の部分母集団、例えば、疾患関連のバリアントまたは非内因性バリアントをも含有する親サンプル中にある臨床的に関連する部分母集団を、信頼して定性的かつ定量的に測定するためのイソバリアントを相互に分離するクロマトグラフィー操作に基づいて信頼できる臨床的アッセイを行うことは実際には不可能であると考えられる。種々のイソフォームが類似しており、イソフォームが複雑であるため、他の部分母集団の存在下にある特定の部分母集団では単純な免疫アッセイを行うことをも困難となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
目的
本発明の主たる目的は、「技術分野」に記載の分野における方法であって、「背景技術」に記載の１または複数の欠点を少なくとも部分的に解決する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明
本発明者らは、上記した目的は、アナライトをサブスタンス（＝Ｓ）の別のヘテロフォームと一緒に、
ａ）出口および入口を含み、
ｂ）Ｓとアフィニティ結合する能力を有し、Ｓの種々のヘテロフォームに対しては異なるアフィニティを有する固定されたアナライトに特異的なバインダー（＝Ｂ）を提示する固相を含有する捕獲ゾーン（ＣＺ）を含み、および
ｃ）ＣＺを通って液体が流れるように出口から毛管吸引させる
一のフローパスにて捕獲することを含む、「技術分野」に記載の方法によって達成され得ると認識する。
【００１５】
この種のフローパス（＝工程（ｉ））を提供する工程に加えて、本発明者らは、本発明の方法は、少なくとも、
（ｉｉ）ＳをＣＺにてバインダーＢで捕獲しながら、Ｓを含有する液体サンプルをＣＺを通って下流方向に流す工程、
（ｉｉｉ）ＣＺの少なくとも１つのサブゾーン１にあるＳの相対量を測定することでＣＺの流れ方向に沿ったＳの分布を測定する工程、および
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）にて測定した分布に基づいて、液体サンプル中のアナライトの部分母集団の存在を測定する工程
を含むべきであると認識している。
【００１６】
工程（ｉｉｉ）の少なくとも１つのサブゾーン１は、サンプル中のアナライト部分母集団の存在がこれらの少なくとも１つのサブゾーン１にて相対量の特徴的パターン（＝分布）を生じさせるように選択される。
【００１７】
親サンプルにて、および／または工程（ｉｉ）に用いたサンプルにて、１０−７Ｍより低い濃度で存在するサブスタンスＳおよび／またはアナライトでは、特に有利かつ意外な結果が、本願明細書にて選択的に示されているラベルおよびディテクター（すなわち、「すべき」、「有利な」、「好ましい」、「特に」等などの語で示される）について得られた。
【００１８】
本発明の実施の簡略化は実験セクションから明らかであろう。サンプル中に発生するサブスタンスＳのヘテロフォームの部分母集団のサンプル中での存在は、捕獲ゾーンのサブゾーン１中のサブスタンスＳの量を、同じ捕獲ゾーンの標準サブゾーン中のサブスタンスＳの量と比較することをベースに測定される。
【００１９】
フローパスおよびフローアレンジメント（工程（ｉ）および（ｉｉ））
フローパスは、典型的には、ａ）平面基板上の表面層として設置された、またはｂ）平面基板の表面層に組み立てられたフローマトリックスで定義され、Ｓおよび／または試薬含有の水性液体サンプルをＣＺを通って輸送するための水性液体の毛管輸送を支持する。フローマトリックスは、ｉ）内面を含む単一のフローチャネル（例えば、毛管寸法および可湿性表面特徴を有するチャネル）として、およびｉｉ）親水性フローチャネルの貫通性システムを有するマトリックス（多孔質マトリックス）として定義される。フローマトリックスは多孔質モノリス、多孔質シート、カラム、分離フローチャネル、またはフローチャネルの凝集システムの形態であってもよい。また、カラムカートリッジに充填される粒子の形態であってもよく、あるいはカットグローブまたは圧縮線維等の形態であってもよい。フローパスは不活性基板または裏打ち上にある親水性吸着シート材料の形態のフローマトリックスにて定義される好ましいバリアントである。基板／裏打ちは、典型的には、疎水性および／または使用される液体について不透過性である。フローパスは、これらのおよび他のバリアントにおいて、その液体に対して不透過性であるリッドでカバーされていても、いなくてもよい。
【００２０】
フローマトリックスは、水性液体がフローパスの入口と液体接触して置かれると、該液体がキャピラリー（自己吸収）によりフローパスまたはマトリックスに輸送されるように十分な湿潤性の内面特性と一緒になって十分に小さな寸法のマイクロ構造を提供するであろう。かくして、第一の主たる代替手段において、本願発明にて使用されるフローパスは、表面が平面の横方向に伸びるマイクロ構造として、例えばａ）１または複数の横方向に伸びるグルーブまたはマイクロチャネルとして設計されてもよく、および／またはｂ）表面に対して実質的に垂直方向に伸び、相互に十分に短い距離にあり、フローパスの入口と液体接触して置かれる水などの親水性液体の自己吸収を提供するマイクロプロジェクションを含んでもよい。
【００２１】
十分な湿潤性を付与する典型的な値は、水接触角が９０°以下、例えば４５°以下、好ましくは３０°以下である（使用温度で測定）。例えば、WO/2007/149043, WO 2007/149042, 2006/137785, WO 2005/118139; WO 2005089082 (all of Amic AB)を参照のこと。好ましい第二の主たる代替手段は、マイクロ構造の表面がフローパスに輸送される液体については不浸透性である平面基板の形態の裏打ち上に置かれる親水性の多孔質吸着シート材料であることを意味する。例えば、US 6902889, US 6737278, US 6528322, US 20040023412, and our copending international patent application WO 2008153462  “Determination of a subpopulation of isoerythropoietins” filed on April 21, 2008を参照のこと。ハイブリッドバリアントにおいて、該フローパスは、その各々が第一の代替手段の（ａ）または（ｂ）のいずれかによる、あるいは第二の代替手段による、種々のセクションを含む。好ましいバリアントにおいて、少なくとも捕獲ゾーン（ＣＺ）の固相は第一の代替手段の（ｂ）に従うか、または第二の代替手段に従うかのいずれかである。他の具体的な代替手段は、フローパスが単一のマイクロチャネル／グルーブまたは凝集されたマイクロチャネル／グルーブにより限定されること、およびＣＺがフローパスのセクションであって、その中のマイクロチャネルが充填された粒子を含有することを含む。
【００２２】
フローパスは、典型的には、ａ）Ｓを含有する液体サンプルをＣＺを通って流れさすための、あるいはｂ）液体サンプルを装置内でこの種のサンプルに処理させるための、アプリケーションゾーン（ＡＺ）を含有する装置の一部である。ｂ）に従う液体サンプルは、例えば、ＣＺを通ることのできるサンプルに加えてヘテロフォームを含有してもよく、その場合には、ＡＺとＣＺの間に分離ゾーンがあり、かかる付加的なヘテロフォームを除去してもよい (Carlsson Lonnberg, WO 9960402, WO 0111355, WO 0111363 and US patents and patent applications deriving therefrom)。該装置はＡＺとＣＺを含有するフローパスの入口との間に液体連絡を提供する。この液体連絡は、第一の代替手段の（ａ）または（ｂ）に記載されるような、あるいは第二の代替手段に記載されるようなフローパスとして設計される最も簡単なバリアントである（上記参照）。
【００２３】
ＣＺを含有するフローパスの入口はまた、典型的には、Ｓあるいは以下に記載の型の試薬を含有するサンプルがフローパスに導入される前後に、フローパスを通る液体の連続的な流れを作るために、使用される液体用のリザバーと液体連絡するように置かれ得る。同様に、ＣＺを含有するフローパスの出口は、典型的には、ＣＺを通って流れた液体を集めるためのリザバーと液体連絡して置かれ得る。この収集液体リザバーは、典型的には、フローチャネルが水性液体で満たされ、リザバーとその上流にある液体貯蔵リザバーの間にフローパスを介して液体連絡が確立されると、フローパスの入口から、ＣＺを通って、フローパスの出口に向かって、毛管式吸入による液体の流れが確立される。これらのＣＺを含有するフローパスの入口および出口は、機能的には互換性があり、すなわち、サンプルの入口に用いられる部分は、別の液体、例えば試薬の液体、脱着用液体または洗浄用液体をフローパスに入れる際には、ＣＺを通る液体のための出口であってもよい（ＣＺを通る流れ方向に逆行する）。ＣＺを通る液体を集めるための液体リザバーは、典型的には、本願発明の方法のこれらのバリアントのこの段階で、新たな液体、例えば脱着用または洗浄用液体を含むリザバーと置き換えられる。
【００２４】
一の種類の適当なフローマトリックスは、セルロース構造などの糖鎖構造を通過する液体に曝す、液体接触表面を有する。この種の表面構造は、好ましいバリアントにおいては、ニトロセルロースのようにニトロ基を含有してもよい。適当には、マトリックスは、典型的には、０．５−１５μｍのインタバルで、好ましくは３−１０μｍのインタバルで孔径を有する。ＣＺを有するフローパスが規定されているフローマトリックスは、本願明細書に記載の毛管吸引力によって、および／または５０μｍ以下、例えば２０μｍ以下のインタバルで、典型的には下限が５μｍまたは１０μｍのＨＥＴＰ（理論段相当高さ）で、５ｃｍ／分以下、例えば２．５ｃｍ／分以下、好ましくは１ｃｍ／分以下または０．５ｃｍ／分以下のインタバルにて一定の流速を支持する能力を有する。これらのインタバルは、孔径、流速の種類に言及しており、ＨＥＴＰはMaria Lonnberg “Membrane-Assisted Isoform ImmunoAssay: Separation and Determination of Protein Isoforms” Thesis 2002, Uppsala Universityにて言及されている。
【００２５】
前段落に記載のキャピラリー駆動の液体の流れは、典型的には、ａ）Ｓ含有の液体サンプル、および／またはｂ）ＣＺにて捕獲されるＳを検出および測定するための分析用の検出可能な試薬を含有する液体アリコート／サンプル、および／または既に示されている洗浄および／または脱着用液体を輸送するのに使用される。
【００２６】
サブスタンスおよびアナライト
サブスタンスＳは、糖鎖／多糖類構造、ヌクレオチド／ポリヌクレオチド構造、ペプチド／ポリペプチド構造および脂質構造の中から選択される１または複数の構造を含む生物有機巨大分子または生体高分子であることが好ましい。サブスタンスＳの種々のヘテロフォームは、少なくとも１のこれらの構造に関して相互に異なっており、以下のことを包含する：
Ａ）アミノ酸配列の天然に生成される変形、
Ｂ）アミド分解、糖鎖構造の付加、リン酸化、スルホン化などの翻訳後修飾、
Ｃ）１または複数のアミノ酸残基の置換、欠失および／または付加についての組換え技法による修飾（＝蛋白アナログ）
Ｄ）化学修飾、例えばコンジュゲーションなどのフラグメンションおよび他の誘導化、
Ｅ）相互に非共有結合している等しいまたは異なる数のサブユニット（モノマーおよびマルチマー、例えばダイマー、トリマーなど）、および／または
Ｆ）チャージ、例えばトータルチャージにおける変形（ネットチャージ）。
【００２７】
サブスタンスＳとして、ポリペプチド構造を示す生物高分子化合物が好ましい。
【００２８】
高分子構造なる語は一般的であり、オリゴマー構造ならびに真にポリマー構造を包含する。
【００２９】
工程（ｉｉ）で用いられる液体サンプル中に、または親サンプル中に１０−７Ｍ以下の、特に１０−９Ｍ以下の濃度で存在するサブスタンスが、本願発明においてサブスタンスＳとして用いるのに特に興味がある。これらの限定はアナライトにも適用可能である。
【００３０】
本願発明にて用いることのできる可能性のあるサブスタンス／バリエーションとして、例えば、次のものが挙げられる。
Ａ）その各々が、上記したように、例えば炭水化物含量（糖鎖形成）に関して、および／または同じまたは異なるポリペプチド骨格を有する、相互に異なるヘテロフォームを含む、糖蛋白である。
ａ）糖蛋白についてのヘテロフォーム／イソフォームのバリエーションが、癌、炎症、肝疾患などの多くの疾患で知られている。特に、ｉ）アシアロ、モノシアロおよびジシアロトランスフェリンのコンビネーション、ｉｉ）ＨｂＡｌｃ（ヘモグロビンの部分母集団）、ｉｉｉ）エリスロポエチンなどの部分母集団の測定に言及され得る。
ｂ）糖蛋白の炭水化物含量におけるバリエーションが、例えば、月経周期の間、一生涯の間、雄と雌の間などの正常な生物学的変化について知られている。
ｃ）糖鎖形成度のバリエーションが、用いられる発酵時間などの条件に応じて、組換え蛋白の生成の間に生じることが知られている。
Ｂ）酵素のヘテロフォーム／イソフォームのバリエーションが活性に反映することが知られている。
Ｃ）受容体結合の蛋白、ポリペプチドおよび他の生物分子のヘテロフォーム／イソフォームのバリエーションが、受容体との結合能に影響すること（例えば、結合能の充足、軽減または喪失）が知られている。
Ｄ）蛋白、ペプチドおよび他の生物分子についてのヘテロフォーム／イソフォームのバリエーションが、そのアフィニティカウンターパートに対するアフィニティの強度に影響することが知られている。
Ｅ）外因的サブスタンス（例えば、薬物）または内因的サブスタンスについての天然の輸送蛋白におけるヘテロフォーム／イソフォームのバリエーションが、輸送蛋白に結合する外因的または内因的サブスタンスの数に関連するかもしれない。血清アルブミンが薬物についての典型的な輸送蛋白である。チロシン結合グロブリン（ＴＢＧ）およびチロシン結合プレアルブミン（ＴＢＰＡ）がトリヨードチロシンおよびチロキシンについての輸送蛋白である。
Ｆ）ＩｇＧおよび／またはＩｇＡの特性の変化として反映したヘテロフォーム／イソフォームのバリエーションが、リウマチまたは自己免疫疾患について知られている。
Ｇ）親蛋白の異なる分解フラグメントの存在として反映したヘテロフォーム／イソフォームのバリエーションが特定の蛋白について知られている。例えば、クレアチンキナーゼの分解は、心臓病のマーカーとして用いることができるヘテロフォーム／フラグメントに至る。
Ｈ）異なる抗体の混合物におけるヘテロフォーム／イソフォームのバリエーションが該混合物の効能に反映することが知られている。該混合物は同じ抗原に、あるいは一の抗原の同じ抗原部位に向かう異なる抗体、例えば抗原特異的ポリクローナル抗体または抗原／ハプテン特異的抗体を含有するモノクローナル抗体の混合物を含有してもよい。該混合物はＩｇＡ−、ＩｇＧ−、ＩｇＤ−、ＩｇＥ−および／またはＩｇＭ−クラス／サブクラスの抗体を含有してもよい。
【００３１】
上記したサブスタンスＳおよびアナライトの例は、本願明細書にて概説されるように、ＣＺにて適切なＢを固定することにより本願発明に適合される。さらには、該アッセイをどのようにアレンジするかについてのアドバイスは、WO 9960402 (Carlsson  Lonnberg)に、またはWO 20060009505 (Gyros AB)に見ることができる。別のＨは、例えば、ＣＺ中のＢとして適切な抗原／ハプテン／アレルゲンを用いることができる。ついで、工程（ｉｉｉ）におけるＩｇＡ−、ＩｇＧ−、ＩｇＤ−、ＩｇＥ−および／またはＩｇＭ−特異的な分析のために検出可能な試薬を用いることで、異なるクラス／サブクラスおよび／または抗原／ハプテン／アレルゲンに対する結合力（アフィニティ）のレベルの抗体の部分母集団を決定することができるようである。WO 20060009505に記載されるように、このことは個体における免疫応答を等級化するのに、例えばＩｇＥ介在アレルギーを等級化するのに用いられてもよい（工程（ｉｉ）のＣＺ中のＢとしてのアレルゲン、および工程（ｉｉｉ）の分析のために検出可能な抗−ＩｇＥ）用いられてもよい。
【００３２】
サブスタンスＳのアナライトおよび他のヘテロフォームを含有するサンプル
工程（ｉｉ）にて用いられる液体サンプルは、典型的には、ａ）本願明細書にて記載されるように、ヘテロフォームにて存在し、アナライトを定義することのできるサブスタンスを含有する生物学的流体のサンプル、またはｂ）この種の生物学的流体の親サンプルより誘導されるサンプルである。かかる典型的な流体は、体液、例えば全血および種々の血液フラクション、例えば血漿および血清、尿、涙液、脳脊髄液、腸液など、細胞培養上澄、均質化した組織または細胞などからの上澄、またはＳについて上記されている１または複数の構造を含む生物有機サブスタンスを含有する他の流体である。親サンプルは該装置の内部および／または外部でＣＺを含むフローパス内で扱われるのに適するサンプルに処理されてもよい。親サンプルおよび中間の液体サンプルを処理する内部装置および外部装置は、典型的には、Ｓの測定に悪影響を及ぼすアナライトでない成分のレベルを減少させることからなる。例えば、Ｓが糖蛋白であり、ＢがＳ上の糖鎖構造に対して特異性を有するならば、例えば、親または中間体のサンプルをアフィニティ吸着によりＳが特異的に富むサンプルに変換することにより、該サンプルを糖蛋白のアナライトでない成分を欠くサンプルに変えることが有益である。この種の処理はまた、一のサンプルを、アナライト部分母集団の特徴である、相対的または絶対的に高い濃度のヘテロフォームを有するサンプルに変えることを包含する。装置内での処理は、分離ゾーン（ＳＺ）を含むフローパスでの処理を、およびアナライト含有のサンプルをＳＺを通過するように用いられる流れとして同方向、横方向または逆方向にある液体の流れによってＳＺから脱着させることを含んでもよい。この脱着の流れは、典型的には、ＣＺを含むフローパスの入口と下流にて液体連絡している。ＳＺおよび合した捕獲および検出ゾーン（ＣＺ／ＤＺ）を利用するフローパスを備え、ＳＺからＣＺ／ＤＺに輸送するための液体脱着流れを備えた装置が以前に記載されている。例えば、本願発明者らの同時係属国際特許出願 (“Determination of a subpopulation of isoerythropoietins” international patent application WO 2008153462) およびその中で引用されている刊行物を参照のこと。
【００３３】
捕獲ゾーン、固相およびアナライト特異的バインダー（Ｂ）
捕獲ゾーン（ＣＺ）は、固定バインダー（＝Ｂ）を含有する、最も上流から最も下流の位置でのフローパスのセクションとして規定される。固相は、典型的には、上記した種類のフローマトリックスの中から選択されるフローマトリックスであり、フローパスを規定する物質と一般に同じ型の物質であることが好ましい。
【００３４】
ＣＺは、典型的には、フローパスを横切るシングルラインの形態である。該ラインの幅、すなわち、流れ方向の広さは、典型的には、１０ｍｍ以下、例えば５ｍｍ以下または２．５ｍｍ以下のインターバル内にあり、好ましくは１ｍｍ以下、または０．５ｍｍ以下である。一般に、その幅は、典型的には、０．１ｍｍ以上、例えば、０．２５ｍｍ以上である。工程（ｉｉｉ）の測定にて用いられるディテクターとの関連において、該幅は２、３、４またはそれ以上のピクセルを端から端までに配置されるようにすべきであり、好ましくはかかるピクセルが１５以上、または２５以上のように１０以上である。Ｂのラインを数本含む捕獲ゾーンの場合には、これらの数字は個々のラインの幅の合計を言う。
【００３５】
Ｂは、ＣＺのセグメントがＢを欠くことなく、ＣＺの上流末端から下流末端にＣＺにて固定された形態にて存在するバリアントであることが好ましい。ＢのＣＺ中の濃度はＣＺの種々の位置で変化し、例えば、ＣＺの下流方向では一定の、増加した、または減少した濃度を有する。ＣＺのＳを捕獲する能力は、典型的には、Ｓ−運搬液体により得られる流速および他の条件で、ＣＺに入るＳの量を本質的に１００％捕獲するほど十分に高い（＝ＣＺにて過剰な捕獲能）。このことは、Ｂを２またはそれ以上のセグメントとして不含または極めて低い濃度のＢをセグメントの間にアレンジすることで生じる利益、および個々のセグメントが一のセグメントに入るアナライトイソフォームに１００％結合する能力を欠くことで生じる利益を排除するものではない。この文脈にて能力を欠くとは、結合能が、適用される流速および他の条件でＣＺに入るサンプル中のアナライトの量の、５０％以下、例えば２５％以下または１５％以下であることを意味する。この後者のバリアントにおいては、Ｓの結合能および／または隣接するセグメント中のＢの濃度は、下流方向にて一定、増加または減少してもよい。典型的には、ＣＺのこれらのバリアントにおけるセグメントの数は、典型的には、１５以下、例えば１０以下または５以下または３以下である。ＣＺのかかるセグメントをすべて横切る全体の能力は、セグメント化されていないＣＺについて記載されるように過剰でなければならない。
【００３６】
使用された流速でＳが本質的に１００％捕獲されないバリアントも想像できる（Ｓの結合能を欠く）。
【００３７】
上記した本質的に１００％の捕獲は、少量の、例えば０−１０％のＳがＣＺを通過し、すなわち実際の捕獲は９０％以上、例えば９５％以上または１００％であることを意味する。
【００３８】
バインダーＢに特異的なアナライトはＳに対するアフィニティカウンターパートであり、かくして、ＣＺに入るアナライト含有のサンプル中に存在するＳの本質的にすべての種々のヘテロフォームに対してアフィニティを有する。Ｂは、本願明細書に開示されるように、上記した少なくとも１のサブゾーン１中のＳの相対量を測定する（＝分布の変化を測定する）ことで標準レベルに対する可変レベルのアナライトの部分母集団を含有するサンプルを区別することを可能とする、異なるヘテロフォームで異なるアフィニティを有するように選択される。好ましいと考えられるバリアントにおいて、このことは、典型的には、Ｂは、他のサブゾーン、例えば標準サブゾーンに存在するヘテロフォームから、アナライトの部分母集団に特徴的であり、１または複数の少なくとも１のサブゾーン１にて測定されるヘテロフォームまたはヘテロフォームのコンビネーションを区別できることを意味するであろう。Ｓが糖蛋白である場合、このことはＢが優先的にヘテロフォームの間で本質的に一定であるが、少なくともいくつかのヘテロフォーム、例えばアナライトヘテロフォームとアナライト以外のヘテロフォームの間で変化する構造によって未だ影響を受けている構造を関連付けられる１または複数のエピトープに対して方向付けられることを意味する。かくして、適当なＢはアミノ酸配列の定常部に関連付けられるエピトープおよび／または糖蛋白Ｓの本質的に一定の糖鎖構造に対して方向付けられるべきである。
【００３９】
Ｂは、例えば、異なるヘテロフォームについての特異性を含む、異なるアフィニティを有する異なる結合分子の混合物であってもよい。混合物はＳの種々のヘテロフォームを効率的に捕獲するのに効果的であるかもしれない。
【００４０】
好ましいＢは抗体であり、それには全長抗体の抗原／ハプテン結合のフラグメントおよび種々の人工抗原／ハプテン結合の誘導体およびその他の構成物、例えば変異形態、組換え形態、キメラ形態、一本鎖およびＣＺにてＢとして本願発明の機能化について所望の特異性およびアフィニティを有する他の形態が包含される。レクチン、例えば天然レクチンまたは適当な特異性およびアフィニティを有する、その修飾変異体もまたＢとして有用である。本願明細書の文脈において、レクチンはまた、糖鎖構造に方向付けられる抗体も包含する。
【００４１】
固定化の技術は、当該分野にて知られている技術より選択されてもよく、例えば、共有結合、アフィニティ結合（例えば、二特異性アフィニティ結合）、物理吸着（主に、疎水性相互作用）などが挙げられる。使用可能なバイオアフィニティの例は、アビジン／ストレプトアビジン／ニュートラビジンなど、およびビオチンまたはビオチン誘導体、高アフィニティ抗体およびハプテンまたはハプテン誘導体などのバイオアフィニティペアの個々のメンバーの間の結合であり、ここで該ペアの一のメンバーが固相に連結し、他方がバインダーに連結する。他のアフィニティ結合の例が、固相上の極性基または帯電基と、バインダー上の極性基または帯電基との間の結合であり（静電結合を含む）、固相上の疎水性基と、バインダー上の疎水性基との間の結合である。適切な固定アフィニティ基が本質的に固相またはＢ上に存在しない場合、かかる基を誘導化（化学操作、組換え操作など）により導入してもよい。
【００４２】
Ｂをキャリア分子を介して固相に固定し、そのキャリア分子１個に１、２、３個またはそれ以上のＢの分子を共有結合させることが何倍も有利である。該キャリア分子は、本質的に、固相に固定するのに必要な基を含んでいてもよく、あるいはかかる基を含有するように誘導体化されてもよい。これらの基は前の段落に記載されている型の共有結合またはアフィニティ結合を介しての固定を提供しうる。好ましいバリアントにおいて、Ｂとキャリアの間の結合を共有結合とし、その一方でアフィニティ結合を用いてキャリアを固相に結合させる。該キャリアは、典型的には、ポリマー構造からなり、固相との多点結合を提供し、同時に（キャリア分子当たり）２個またはそれ以上のＢ分子を結合する。適当なキャリアは意図する反応、すなわちサブスタンスＳとＢの間のアフィニティ反応に対して不活性であり、ポリペプチド構造、例えば血清アルブミンなどのアルブミンからなっていてもよく、あるいは他の種類のポリマー構造、例えば複数のヒドロキシルおよび／またはアミン基を示す構造からなっていてもよく、要すれば、上記した型のアフィニティ基を示すように誘導化されてもよい。
【００４３】
分布測定（工程（ｉｉｉ））
ＣＺにおける分布測定は、ＣＺの少なくとも１個のサブゾーン１におけるアナライトの相対量を測定することからなる。
【００４４】
サブゾーン１はＣＺ中の流れ方向に沿った単一位置であってもよく、あるいはＣＺの上流位置と下流位置の間のセグメントからなっていてもよい。少なくとも１個のサブゾーン１は、サブゾーン１についてのＳの単一の相対量、または少なくとも２個のうち少なくとも１個の該サブゾーン１のコンビネーションとして測定された特定の分布が、サンプル中のアナライト部分母集団の存在または非存在の指標であるように選択される。一般に、サブゾーン１はＣＺの全長を覆わないが、ＳがＣＺにて完全に捕獲されない場合にはかかるバリアントを予測しうる（使用された条件下で能力欠損）。
【００４５】
この文脈での単一位置は、典型的には、サブゾーンがピクセルの流れ方向における幅に相当することを意味する。
【００４６】
サブゾーン１中のＳの相対量を測定することは、サブゾーンに存在するＳの絶対量が標準成分の量に対して正規化されることを含む。標準成分は、好ましくは、サブゾーン（標準サブゾーン）に存在するＳの絶対量であり、その量は特定のサブゾーン１とは異なり、それについてその相対量を計算する。標準サブゾーンはサブゾーン１であっても、ＣＺの他のサブゾーンであってもよい。標準サブゾーンは重複していないか、重複しているかのいずれかであるが、サブゾーン１と完全には一致せず、そのための相対量が計算されるべきである。標準サブゾーンはＣＺ中の単一位置であってもよく、あるいはＣＺの全長に至る特定の長さを覆っていてもよい（長さ方向にて）。標準サブゾーンがＣＺの全長を覆う場合には、正規化は工程（ｉｉ）にて使用されるサンプル中のＳの全体量に対するものであろう。好ましくは、標準サブゾーンは流れ方向に沿ってＣＺ中のＳの最も高い相対量／濃度の位置であるか、またはこの位置を含む。バインダーが上記した好ましい特異性を有する抗体であるところのバリアントの場合、この位置は、典型的には、最も上流の位置に置かれるか、またはＣＺのＳの含量との部分は、典型的には、親サンプルおよび液体サンプル中のアナライトの量の関数である。代替手段として、標準成分は、例えば親サンプル中、または工程（ｉｉ）にて使用された液体サンプル中のＳの全体量を別々に測定することによって測定されてもよい。
【００４７】
サブゾーン、例えばサブゾーン１または標準サブゾーンは連続しても、連続しなくてもよい。
【００４８】
好ましいバリアントにおいて、工程（ｉｉｉ）の測定は、典型的には、ＳまたはＢとのアフィニティ結合能を有する分析で検出可能な試薬、すなわち、ＳまたはＢに対するアフィニティカウンターパートを用いることを含む。工程（ｉｉｉ）は、このように：
ａ）分析で検出可能な試薬を含有する液体アリコート／サンプルをその検出可能な試薬をＣＺにて捕獲可能な条件下でＣＺを通して流し、
ｂ）上記した少なくとも１つのサブゾーン１にある該試薬の絶対量を測定する
工程を含む。
【００４９】
分析で検出可能な試薬のＣＺでのアフィニティ捕獲を可能とする条件は、液体アリコートにより提供される。工程（ｉｉ）と工程（ａ）の間および／または工程（ａ）と工程（ｂ）の間で、洗浄工程、すなわち、洗浄液をＣＺに通過させる１回または複数回の工程があってもよい。
【００５０】
ある種のバリアントにおけるサブスタンスＳは、分離する検出可能な試薬を必要としない、そのような意味として検出可能である。その場合、分離工程としての工程（ａ）は省略できる。典型的な例は、Ｓが酵素であるバリアント、および工程（ｉｉ）捕獲される実際のＳが分析で検出可能な試薬と一緒にプレインキュベートすることで形成されるバリアントである（以下、参照のこと）。
【００５１】
工程（ｂ）の測定は、検出可能なラベルからシグナルを得ることを含む。サブゾーン１について得られるシグナルの数値は、サブゾーンにあるＳの絶対数と検出可能な試薬の絶対数の両方の関数である。すなわち、サブゾーン１および他のサブゾーンについてのＳの絶対数は、Ｓの標準数の増加を別個に測定することで得られる標準曲線より誘導され得る。
【００５２】
検出可能な試薬がアナライトに対するアフィニティカウンターパートである場合、該試薬は、典型的には、Ｂについて上記した異なる種類の候補体の中から選択される。用心すべきことは、検出可能な試薬の特異性が、Ｂによって利用される結合部位と比べて構造的に異なるＳ上の結合部位に対するものであるか、および／またはこの結合部位から離れていなければならないことである。その他の優先事項はＢの場合と同じである。工程（ａ）のこの種の検出可能な試薬での好ましいバリアントは、工程（ｉｉ）および工程（ｉｉｉ．ａ）が別々であることを含むことである。別のバリアントにおいては、例えば、Ｓが本質的に検出可能であるか、またはＳが検出可能な試薬と一緒に装置内もしくは装置外でプレインキュベートされる場合、２つの工程は同時に行うことができる。プレインキュベートされると、ＣＺを含有するフローパスに入る液体サンプルはＳと検出可能な試薬との両方を含有するアフィニティ複合体を含有し、その複合体は工程（ｉｉ）にて捕獲される実際のサブスタンスＳであろう。アナライト部分母集団の特徴であるヘテロフォームに対するアフィニティが、Ｓの他のヘテロフォーム対するアフィニティよりも高い場合に、利点があると見なすことができる。その違いが十分に大きい場合、工程（ｉｉ）にて用いたサンプル中のＳの合計量の測定は、Ｓの合計を測定するのにより適切なアフィニティを有する検出可能な試薬を用いての別の測定が必要であるかもしれない。この種の検出可能な試薬は、典型的には、アナライトに対してアフィニティカウンターパートである一の部分と、検出特性（＝ラベル）を提供するもう一つ別の部分とのコンジュゲートの形態である。
【００５３】
検出可能な試薬がバインダーに対するカウンターパートである場合、Ｓのラベル化された形態、すなわち検出特性（＝ラベル）を付与する一の部分と、Ｂ上の結合部位付近でＳとの競合能を有するもう一つの部分とを含むコンジュゲートが好ましい。
【００５４】
コンジュゲートは、検出可能な試薬との関連で、天然ならびに人工のコンジュゲートを包含する。アフィニティカウンターパートとコンジュゲートすることができ、アフィニティアッセイにて用いることのできるラベルは当該分野にて周知であり、ａ）シグナル発生基、例えば酵素系のメンバー、フルオロフォア、放射性同位体、ケミルミノフォアなど、およびｂ）アフィニティラベル、例えばビオチン、ハプテンおよび使用されるアフィニティラベルについてのアフィニティで標識化された他のコンジュゲートを必要とする他の基を包含する。
【００５５】
用いられるラベルは、比較的高い検出能、例えば、１００アトモル／ｍｍ２以下または５０アトモル／ｍｍ２以下、または２５アトモル／ｍｍ２以下または１５アトモル／ｍｍ２以下または１０アトモル／ｍｍ２以下を有するであろう。好ましいラベルは、多くの場合、さらにより良い検出能、例えば、１アトモル／ｍｍ２以下またはさらに低い値、例えば、０．５アトモル／ｍｍ２以下を有する。上記の濃度間隔のモル濃度について、検出能は、典型的には、少なくとも０．０１または少なくとも０．０５アトモル／ｍｍ２であろう。粒子は、ラベル、特に、ＣＺに存在するフローマトリックス／固相に比べて高コントラストを与える着色粒子として好ましい。言い換えれば、暗粒子、例えば、ブラック粒子、特に、カーボン、例えば、カーボンブラックからなる粒子および／またはそれを含有する粒子。これは、特に、フローマトリックスが白色であるかまたはラベルによって生じるシグナルを有する良いコントラストを提供する他の色を有する場合に適用可能である。さらに、好ましい凝集したカーボンブラック粒子、例えば、sp 100についてさらに情報を提供する、Maria Lonnberg “Membrane-Assisted Isoform ImmunoAssay: Separation and Determination of Protein Isoforms” Thesis 2002, Uppsala Universityを参照のこと。
【００５６】
工程（ｉｉｉ）における測定は、典型的には、工程（ｉｉｉ）または工程（ｉｉ）において形成される検出可能な固定化錯体からの所望のＣＺのサブゾーン中のシグナルを測定し、上記の相対量に変化することを意味する。好ましい変化では、これは、形成される複合体濃度の局所変化／検出可能な試薬／ＣＺ領域内のラベル変化を示すＣＺの画像を生じうる（イメージング検出器）、検出器の使用によって測定することを含む。典型的なイメージング検出器は、ＣＺの種々のサブゾーンに捕獲される分析で検出可能な試薬からのシグナルを測定するのに適している。それらは、好ましくは、下記のピクセルサイズを提供し、技法、例えば、ＣＣＤ、ＣＭＯＳなどを含むピクセル概念に基づくので、デジタルカメラと考えられうる。それらは、スキャナーの形態であってもよい。
【００５７】
適当なイメージング検出器は、典型的には、フロー方向ではさらに小さいピクセル、例えば、５０ピクセル／ｍｍ以上または７５ピクセル／ｍｍ以上、より好ましい１０ピクセル／ｍｍ以上、例えば、１５ピクセル／ｍｍ以上または２５ピクセル／ｍｍ以上に相当するピクセルサイズを提供しうるであろう。上限値は、７５以下または１００ピクセル／ｍｍ以下である。
【００５８】
イメージング検出器はまた、グレースケールについて適当な分解能を有するものが選択されるであろう。本発明について、これは、適当なスキャナー／検出器が、例えば、２５６以上、例えば、１０２４以上、または４０９６以上または１６３８４レベル以上または６５５３６レベル以上の間隔である多数のレベルを含むグレースケールを含む、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４または少なくとも１６ビットのグレースケールより好ましい少なくとも８ビットのグレースケールを有するであろうことを意味する。さらにMaria Lonnberg “Membrane-Assisted Isoform ImmunoAssay: Separation and Determination of Protein Isoforms” Thesis 2002, Uppsala Universityを参照のこと。
【００５９】
親サンプルにおける被分析部分母集団の発現の測定（工程（ｉｖ））
該工程において、少なくとも１つの上記のサブゾーン１中のＳの相対量（＝分布）は、Ｓ含有サンプル（工程（ｉｉ）および恐らく、本明細書に記載の前処理をも含む）として用いられるように、基本的に同等の条件下で本発明の方法にしたがって処理されたＳのイソフォームの標準組成物／サンプルとして得られた対応する分布と比較される。偏差が少なくとも１つのサブゾーン１で見出される場合には、これは、これらのサブゾーン（群）を選択する部分母集団（群）の相対量の変化（増加または減少）を示すであろう。偏差の結果は、親サンプルおよび標準組成物における部分母集団（群）の相対量の間に相違がないことを示すものではない。
【００６０】
工程（ｉｉ）に用いられるサンプルは、典型的には、部分母集団（群）の相対量の変化を試験する個体から得られる。
【００６１】
標準組成物は、典型的には、正常な個体からまたは種々の理由から相対量が変化した個体から得られた対応するサンプルの典型である。正常な個体に比べた相対量の変化または偏差（増加または減少）は、個体：
ａ）前記の親サンプルにおける前記の部分母集団のレベルの変化に関連する疾患に罹患している個体、および／または
ｂ）前記の親サンプルにおける前記の部分母集団のレベルの変化を促す生物活性化合物を得た個体
によって特徴付けられる。
【００６２】
変化を促す生物活性化合物は、乱用の一環としておよび／または治療的処置の一環として得られうる。生物活性化合物は、被分析部分母集団を含有する物質Ｓまたは被分析部分母集団のインビボ形成をもたらす化合物でありうる。
【００６３】
標準分布に対する見出された分布の分布および／または分類の測定は、有利なことに、コンピュータプログラム（コンピュータに基づくパターン認識）の使用によって行われうる。したがって、本発明はまた、これらの操作を実施するためのコンピュータプログラム、かかるプログラムを有するキャリア媒体ならびにこの種のプログラムを有するキャリアを搭載するコンピュータを提供する。
【００６４】
最良の形態
実行に要約される最良の形態は、実験項に与える。有利であると考えられる将来の形態は、好ましい／有利な等の記載により、実験項を含む記載部分に示される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】実施例２にて得られる結果を示す。
【００６６】
実験項
実験項において用いられる技術の選択、例えばフローマトリックスの種類、物質、特性の選択、ラベルの選択等についてのさらなる詳細は、Ｍａｒｉａ  Ｌoｎｎｂｅｒｇ「Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｉｓｏｆｏｒｍ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ：Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｆｏｒｍｓ」Ｔｈｅｓｉｓ  ２００２，Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに与えられる。
【００６７】
実施例１
免疫クロマトグラフ試験を用いる、ＥＰＯ抗体に対する異なるアフィニティにより、ＥＰＯおよびＥＰＯアナログを識別する試験
試料物質：組み換えエポエチンベータであるＮｅｏｒｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標）、およびメトキシポリエチレングリコール−エポエチンベータであるＭＩＲＣＥＲＡ（登録商標）を、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍＢＨ（マンハイム、ドイツ）から入手した。組み換えＥＰＯアナログダーベポエチンであるＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）を、Ａｍｇｅｎ（サザンオークス、カルフォルニア州、米国）から購入した。希釈系列を、２０ｍＭのビス−トリスバッファー（ｐＨ６．５）、０．１ＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０および０．０２％ＮａＮ３で行った。
【００６８】
ＥＰＯ濃度の測定およびアフィニティ比の計算：ＥＰＯおよび２つのＥＰＯアナログの希釈系列を、免疫クロマトグラフＥＰＯ試験により試験した；この試験において、２５μｌの試料をマイクロタイターウェルに二重に分配し、他端に３０ｍｍの吸収シンクを有する膜の一方の端から約１３ｍｍの細い線の抗−ＥＰＯ  ３Ｆ６を有する、５ｍｍ幅および２２ｍｍ長の孔の側方流動試験ストリップ（ＭＡＩＩＡ  ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を、個々のウェルに置いた。５分後、全試料容量を吸い上げ、ストリップを、２５μｌのカーボンブラック抗ＥＰＯ  ７Ｄ３（ＭＡＩＩＡ  ＡＢ）を含有する他のウェルに移し、そこで５分間静置し、最後に、２５μｌ洗浄溶液（ＭＡＩＩＡ  ＡＢ）を含有するウェルに５分間置いた。
【００６９】
ストリップを、紙のシート上に載せ、吸収シンクを除去し、ストリップを乾燥した後、シートをスキャナーに置いた。先行文献［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９３，２２４−２３１（２００２）］に従って、取得した抗−ＥＰＯゾーンにおけるカーボンブラックの強度を個々のストリップに関して測定し、最大シグナル（ピーク）でのピクセルあたりの黒さの差分（シグナル−ベースラインシグナル）を、３列のピクセル（３×４２．３μｍ）の平均について計算した。加えて、ピークの下流のいくつかの位置でのピクセルあたりの黒さの差分もまた、３列のピクセルの平均を用いて計算した。
検量線を、Ｎｅｏｒｅｃｏｒｍｏｎの希釈系列の公知のＥＰＯ濃度を、ピークについての対応するピクセルあたりの黒さの差分と関連付けることにより作成した。
【００７０】
ピーク値と後続位置（０．２１および０．４２ｍｍ）から計算したＥＰＯ濃度の比を、別のタイプのＥＰＯおよびそのアナログのアフィニティ特性を明らかにするのに用いた。
【００７１】
結果：下記表１を参照のこと。
【００７２】
実施例２
免疫クロマトグラフ試験を用いる、ＥＰＯ抗体に対する異なるアフィニティにより、ＥＰＯおよびＥＰＯアナログを識別する試験
試料物質：尿検体を、健康な個体から収集した。組み換えエポエチンアルファであるＥｐｒｅｘ（登録商標）（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ  ＡＢ（ソルレツナ（Ｓｏｌｌｅｎｔｕｎａ）、スウェーデン））、および組み換えＥＰＯアナログダーベポエチンであるＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）を、２５ｎｇ／Ｌの濃度で、内因性ＥＰＯを５ｎｇ／Ｌ以下含む尿に適用した。融解した尿を静かに回転させて、沈殿物を均一に分散させ、アリコートを他のチューブに、尿沈殿溶解バッファー（ＭＡＩＩＡ  ＡＢ）と一緒に、９部の尿および１部のバッファーで移した。尿沈殿物はすぐに溶解し、得られた溶液２．５ｍｌを、ＰＤ１０カラム（３．５ｍｌのバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ｔｗｅｅｎ２０および０．０２％ＮａＮ３）で溶出）で脱塩した。Ｅｐｒｅｘを基準として用い、希釈系列（０．３−１００ｎｇＥＰＯ／Ｌ）を、０．０３％ＢＳＡ、２０ｍＭのＴＲＩＳ（ｐＨ７．５）、７５ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ｔｗｅｅｎ２０および０．０２％ＮａＮ３で調製した。
【００７３】
ＥＰＯ濃度の測定およびアフィニティ比の計算
プロシージャは、２００μｌの脱塩尿またはＥｐｒｅｘ基準を用い、個々のウェルのインキュベーション時間が７５、６および６分であること以外は、実施例１に従った。
【００７４】
結果：図１：ストリップにおける抗−ＥＰＯゾーンに沿った異なる位置について計算した比は、ＥＰＯについての比がＥＰＯアナログＡｒａｎｅｓｐについての比とは異なることを示す。ＥＰＯは、Ｅｐｒｅｘ（組み換えエポエチンアルファ）を尿に加えた６つの試料および内因性ＥＰＯを含有する５つの尿により表される。６つの試料は、尿に加えられたＡｒａｎｅｓｐを含有していた。
【００７５】
前年の間、試料および基準についての２つまたはそれ以上のサブゾーン１における測定を含むことは有利であり得るという兆候があった。
【００７６】
本発明は、その有効な具体例に関して記載し、注目しているが、種々の変更、修飾、置換および削除が、本発明の精神から逸脱することなく行えることは当業者に理解できるだろう。したがって、本発明が特許請求の範囲内の等価物を包含することを目的とする。
【００７７】
【表１】
2011524983.tif 000003
【図１】
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【国際調査報告】
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