(57)【要約】  本発明は、ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）のＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列を含むブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）をコードする核酸分子を含む、ブタサーコウイルスの新規のキメラ核酸分子（ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ）に関し、詳細には、ここでＰＣＶ１のＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）遺伝子であり、より詳細には、ここでそのＯＲＦ  Ｒｅｐ遺伝子はＯＲＦ１である。非常に望ましいキメラ核酸分子は、ＰＣＶ２のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子をＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子により入れ替えることにより構築される。本発明は、その独特のキメラ核酸分子を含む、生物学的に機能性のプラスミドまたはウイルスベクター、そのプラスミドまたはベクターによりトランスフェクションされる適切な宿主細胞、その適切な宿主細胞により産生される感染性キメラブタサーコウイルス、その新規キメラを利用する免疫原性ポリペプチド生成物の生産のためのプロセス、ブタをＰＣＶ２により引き起されるウイルス感染または離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）に対して保護するウイルスワクチン、ブタをＰＣＶ２により引き起されるウイルス感染または離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）に対して保護する方法、ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐの独特のキメラおよび同様のものを調製する方法も含む。この発明はさらに、細胞培養におけるＰＣＶ２の複製および力価を向上させるための新規の方法を含む。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）のＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列を含むブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）をコードする核酸分子を含む、ブタサーコウイルスのキメラ核酸分子（ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ）。
【請求項２】
請求項１に記載のキメラ核酸分子であって、ＰＣＶ１のＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列がオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）遺伝子であるキメラ核酸分子。
【請求項３】
ＯＲＦ  Ｒｅｐ遺伝子がＯＲＦ１である、請求項２に記載のキメラ核酸分子。
【請求項４】
ＰＣＶ２のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子がＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子により入れ替えられている、請求項３に記載のキメラ核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラ核酸分子を含む、生物学的に機能性のプラスミドまたはウイルスベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のプラスミドまたはベクターによりトランスフェクションされた、適切な宿主細胞。
【請求項７】
請求項６に記載の宿主細胞により産生された、感染性キメラブタサーコウイルス。
【請求項８】
免疫原性ポリペプチド生成物の生産のためのプロセスであって、前記プロセスが次のことを含むプロセス：請求項１〜４のいずれか１項に記載のブタサーコウイルスのキメラ核酸分子をトランスフェクションした原核または真核宿主細胞を、適切な栄養条件下で、前記ポリペプチド生成物を発現させる方式で増殖させる、およびキメラ分子の発現の望ましいポリペプチド生成物を単離する。
【請求項９】
ブタをＰＣＶ２により引き起されるウイルス感染または離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）に対して保護するウイルスワクチンであって、非毒性の生理的に許容できるキャリヤーおよび免疫原性の量の適切に弱毒化または不活化された、次のものからなるグループから選択されたメンバーを含むウイルスワクチン：
（ａ）ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）のＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列を含むブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）をコードする核酸分子を含む、ブタサーコウイルスのキメラ核酸分子（ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ）；
（ｂ）ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）のＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列を含むＰＣＶ２をコードする核酸分子を含むブタサーコウイルスのキメラ核酸分子（ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ）を含む、生物学的に機能性のプラスミドまたはウイルスベクター；および
（ｃ）ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）のＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列を含むＰＣＶ２をコードする核酸分子を含むブタサーコウイルスのキメラ核酸分子（ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ）から作られる、感染性キメラブタサーコウイルス。
【請求項１０】
請求項９に記載のワクチンであって、キメラ核酸分子がＰＣＶ１のＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列を含み、それがオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）遺伝子を含むワクチン。
【請求項１１】
キメラ核酸分子がＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子を含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
キメラ核酸分子がＰＣＶ２のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子の代わりにＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子を含む、請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
保護を必要とするブタに免疫学的有効量の請求項９〜１２のいずれか１項に記載のワクチンを投与することを含む、ＰＣＶ２により引き起されるウイルス感染または離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）に対してブタを保護する方法。
【請求項１４】
そのワクチンを非経口で、鼻腔内で、皮内でまたは経皮でブタに投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載のＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐのキメラ核酸分子を調製する方法であって、次の工程を含む方法：
（ａ）ＰＣＶ１をコードする核酸分子からＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列を取り外す；
（ｂ）ＰＣＶ１のＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列を、ＰＣＶ２をコードする核酸分子の中に組み込む；および
（ｃ）そのキメラ核酸分子を回復する。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、工程（ａ）がＰＣＶ１のＲｅｐタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）遺伝子を含む核酸配列を取り外すことを含む方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、工程（ａ）がＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子を含む核酸配列を取り外すことを含む方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、工程（ｂ）がさらにＰＣＶ２のＯＲＦ１遺伝子を取り外し、次いでＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子を含む核酸配列をＰＣＶ２をコードする核酸分子のＯＲＦ１遺伝子の位置に組み込むことを含む方法。
【請求項１９】
次の工程を含む、細胞培養におけるＰＣＶ２の複製および力価を向上させるための方法：
（ａ）ＰＣＶ２のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子がＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子により入れ替えられたＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラウイルスを構築する；
（ｂ）適切な細胞株にＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラを接種する；
（ｃ）ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラを適切なウイルス増殖培地において、標準的な条件の下で、十分な長さの時間培養してウイルス産生を誘導する；および
（ｄ）キメラウイルスを集める。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、適切な細胞株が、ブタ抗原を含まないブタ腎臓細胞株（ＰＫ−１５細胞）またはブタ精巣（ＳＴ）細胞株である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する米国出願への相互参照
この出願は２００８年４月１６日に出願された米国仮出願第６１／１２４，３８３号の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §  １１９（ｅ）の下の利益を主張する。その先行出願をそのまま本明細書に援用する。
【０００２】
政府の資金提供を受けた研究または開発に関する記載
該当無し
”配列表”への参照
この出願において提供される配列表ファイルを含む１個のコンパクトディスク上の資料を援用する。
【０００３】
発明の背景
発明の分野
本発明は、ＰＣＶ１のＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列がＰＣＶ２のゲノムバックボーンの中に挿入されている独特のキメラブタサーコウイルス（ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ）およびブタのＰＣＶ２により引き起こされるウイルス感染または離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）からの保護のための新規の死菌または弱毒化キメラワクチンにおける抗原としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
関連技術についての記述
この出願において引用される全ての特許および刊行物をそのまま本明細書に援用する。
１９７４年に、ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）は最初はＰＫ−１５細胞株ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３３のしつこい汚染菌として単離された(I. Tischer et al., ”永久ブタ腎臓細胞株におけるパポバウイルスおよびピコルナウイルス様粒子の特性付け” Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2):153-167 (1974))。その同定以来、ＰＣＶ１はブタにおいて何の疾患も引き起こさない遍在性ブタウイルスであることが決定されている(G. M. Allan et al., ”ブタサーコウイルスの病理発生；初乳無摂取の仔ブタの実験的な感染およびブタ胎児物質の試験” Vet. Microbiol. 44:49-64 (1995); G. C. Dulac and A. Afshar, ”ＰＫ−１５細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３３）中のブタサーコウイルス抗原およびカナダのブタにおけるサーコウイルスに対する抗体の証拠” Can. J. Vet. Res.  53:431-433 (1989); S. Edwards and J. J. Sands, ”英国のブタにおけるサーコウイルス感染の証拠” Vet. Rec. 134:680-681 (1994); I. Tischer et al., ”ブタサーコウイルスの疫学および病原性についての研究” Arch. Virol. 91:271-276 (1986))。ＰＣＶ１はブタにおいて何の疾患も引き起こさないが、続いてブタサーコウイルス２型が病原性であることが決定された。１９９１年に、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）と名付けられたＰＣＶの異なる株がカナダのブタにおいて最初に認められ、離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）と関係していることが分かった(G. M. Allan et al., ”米国および欧州における消耗性疾患を有するブタからのブタサーコウイルス様ウイルスの単離” J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); I. Morozov et al., ”離乳後多臓器消耗症候群を有するブタにおけるブタサーコウイルスの新規の株の検出” J. Clin. Microbiol.  36:2535-2541 (1998))。
【０００５】
ＰＣＶ１およびＰＣＶ２は２個の主なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する類似したゲノム構成を有する：ＯＲＦ１はウイルスの複製に関わるウイルスのＲｅｐタンパク質をコードしており、ＯＲＦ２はウイルスのカプシドタンパク質をコードしている。概して、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２はそれらのゲノム全体において６８〜７６％のヌクレオチド配列の同一性を共有しており、一方でそれぞれの遺伝子型内の分離株は９０％より大きい同一性を共有している(A.K. Cheung, ”ブタサーコウイルス２型のウイルスタンパク質合成およびＤＮＡ複製に必須の、および必須で無い転写単位” Virology 313:452-9 (2003))。ＰＣＶ１およびＰＣＶ２は２個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する類似したゲノム構成を有する(A.K. Cheung, ”ブタサーコウイルス１型のタンパク質合成、ＤＮＡ複製および感染性ウイルス産生に必須の、および必須で無い転写単位の同定” Arch. Virol. 149(5):975-88 (2004); A. K. Cheung, ”ブタサーコウイルス２型の転写の分析” Virology 305(1):168-180 (2003); A. Mankertz et al., ”ブタサーコウイルスの複製に必須なタンパク質の同定” J. Gen. Virol. 79(Pt 2):381-384 (1998); P. Nawagitgul et al., ”ブタサーコウイルス２型のオープンリーディングフレーム２は主要カプシドタンパク質をコードしている” J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000))。両方のウイルスにおいて、ＯＲＦ１はウイルスの複製に寄与しており、オルタナティブスプライシングされて２種類の主な機能タンパク質であるＲｅｐおよびＲｅｐ’となる(A.K. Cheung, ”ブタサーコウイルス１型のタンパク質合成、ＤＮＡ複製および感染性ウイルス産生に必須の、および必須で無い転写単位の同定” Arch. Virol. 149(5):975-88 (2004); A. K. Cheung, ”ブタサーコウイルス２型の転写の分析” Virology 305(1):168-180 (2003); A. Mankertz and B. Hillenbrand, ”ブタサーコウイルス１型の複製はウイルスのｒｅｐ遺伝子によりコードされる２種類のタンパク質を必要とする” Virology 279:429-38 (2001); A. Mankertz et al., ”ブタサーコウイルスの複製に必須なタンパク質の同定” J. Gen. Virol. 79(Pt 2):381-384 (1998); A. Mankertz et al., ”ブタサーコウイルスのＤＮＡ複製の起点のマッピングおよび特性付け” J. Virol. 71:2562-6 (1997))。ＯＲＦ１は、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２の間で、おおよそ８３％のヌクレオチドおよび８６％のアミノ酸配列の同一性で高度に保存されている(I. Morozov et al., ”離乳後多臓器消耗症候群を有するブタにおけるブタサーコウイルスの新規の株の検出” J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998))。ＯＲＦ２は両方のウイルスにおいて免疫原性ウイルスカプシドタンパク質をコードしており(P. Nawagitgul et al., “ブタサーコウイルス２型のオープンリーディングフレーム２は主要カプシドタンパク質をコードしている” J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000))、それはＲｅｐタンパク質よりも変化しやすく、ＰＣＶ１およびＰＣＶ２の間でおおよそ６７％のヌクレオチドおよび６５％のアミノ酸配列の同一性を有する(I. Morozov et al., ”離乳後多臓器消耗症候群を有するブタにおけるブタサーコウイルスの新規の株の検出” J. Clin. Microbiol.  36:2535-2541 (1998))。最近、第３のＯＲＦであるＯＲＦ３がＰＣＶ２において同定されたが、ＰＣＶ１においては同定されておらず、それは報告によるとアポトーシスに関わっていた(J. Liu et al., ”ブタサーコウイルス���に感染した細胞における以前に同定されていないウイルスタンパク質の特性付けおよびウイルスに誘導されるアポトーシスにおけるその役割” J. Virol. 79:8262-74 (2005))。
【０００６】
以前に、米国特許第７，２７９，１６６号Ｂ２、米国特許第７，２７６，３５３号Ｂ２、M. Fenaux et al., ”非病原性ＰＣＶ１のゲノムバックボーンの中にクローン化された病原性ＰＣＶ２型（ＰＣＶ２）の免疫原性カプシド遺伝子を有するキメラブタサーコウイルス（ＰＣＶ）は、ブタにおいてＰＣＶ２感染に対する防御免疫を誘導する” J. Virol. 78:6297-303 (2004)、およびM. Fenaux et al., ”病原性ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）および非病原性ＰＣＶ１のキメラ感染性ＤＮＡクローンの、離乳したブタにおける免疫原性および病原性” J. Virol. 77:11232-243 (2003)は、ＰＣＶ２のＯＲＦがＰＣＶ１ゲノムのバックボーンの中にクローン化された、ＰＣＶ１−２と名付けられたキメラウイルスの構築を記述した。それらの刊行物は、ＰＣＶ１のＯＲＦ２の代わりの、ＰＣＶ２からのその遺伝子間配列を含むＯＲＦ２カプシド遺伝子の相互交換を強調しており、さらに、病原性ＰＣＶ２核酸分子のＯＲＦ２遺伝子の代わりに非病原性ＰＣＶ１からの免疫原性ＯＲＦ２遺伝子を有するＰＣＶ２をコードしている核酸分子を含む、ＰＣＶ２−１の感染性の相互キメラ核酸分子を開示している。ＰＣＶ１−２キメラは生来無毒性である特質をもたらしたが、単に実験的なモデルとして作成されたＰＣＶ２−１の相互キメラ核酸分子は、毒性のままであり、ＰＣＶ１−２とウイルス特性を比較する研究目的のため以外には、親であるＰＣＶ２を超える商業的な利点が何も無かった。前記の特許または論文はいずれも、病原性ＰＣＶ２のゲノムバックボーンを利用した他の相互キメラウイルスの作成を全く開示または示唆しておらず、そして確かに、明記された、および明確なＯＲＦ２免疫原性カプシド遺伝子以外の代替オープンリーディングフレームの交換を暗示していない。
【０００７】
さらに、ＰＣＶ１−２キメラウイルスはＰＫ−１５細胞においてＰＣＶ２の力価に類似した力価にまで複製する(M. Fenaux et al., ”病原性ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）および非病原性ＰＣＶ１のキメラ感染性ＤＮＡクローンの、離乳したブタにおける免疫原性および病原性” J. Virol. 77:11232-243 (2003))。一方、ＰＣＶ１はＰＫ−１５細胞においてよりよく増殖するように適応しており、そのＰＫ−１５細胞培養に適応したＰＣＶ１ウイルスはＰＣＶ２よりもよく増殖し、ＰＫ−１５細胞においてＰＣＶ２よりも少なくともおおよそ１−ｌｏｇ高い力価まで複製する(M. Fenaux et al., ”２型ブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）のカプシドタンパク質における２アミノ酸変異はインビトロでＰＣＶ２の複製を増進し、インビボでそのウイルスを弱毒化した” J. Virol. 78:13440-6 (2004); M. Fenaux et al., ”病原性ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）および非病原性ＰＣＶ１のキメラ感染性ＤＮＡクローンの、離乳したブタにおける免疫原性および病原性” J. Virol. 77:11232-243 (2003))。ＰＫ−１５細胞におけるＰＣＶ１のこの増進された複製能力は、ＰＣＶ１が元々ＰＫ−１５細胞株からしつこい細胞培養汚染菌として単離されたものであり、従ってＰＫ−１５細胞において増殖するのに適応しているという事実によるものでありそうである。しかし、病原性ＰＣＶ２株はＰＣＶ１と同じ複製能力を有しておらず、その病原体のＰＫ−１５細胞における比較的低い力価のため、ＰＣＶ２のワクチンの生産に関する主要な問題を引き起こす。結果として、ＰＣＶ２に基づくワクチン、例えば不活化したＰＣＶ２全体、（ＰＣＶ１起源のゲノムバックボーンに基づく）生来無毒性であるキメラＰＣＶ１−２、組み換えＰＣＶ２カプシドタンパク質、および同様のものの効率的な生産レベルを満たすことは、その産業におけるワクチン製造業者への真の難問および苦境である。
【０００８】
ＰＣＶ２の遺伝子間配列が以前に調べられた際に、インターフェロン−α−刺激応答要素（ＩＳＲＥ）様配列（ＧＡＡＡＮＮＧＡＡＡ）がＰＣＶ２において同定され、それは当分野で認められているＩＳＲＥ要素の活性と同様にＩＦＮ−αに応答して遺伝子の転写を活性化する可能性がある(J.E. Darnell, Jr., et al., ”ＩＦＮ類および他の細胞外シグナル伝達タンパク質に応答したＪａｋ−ＳＴＡＴ経路および転写の活性化” Science 264:1415-21 (1994))。カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスは、さらなるウイルス遺伝子の活性化に寄与するウイルスにコードされるＩＳＲＥ様配列と相互作用するウイルス遺伝子を発現することが示されている(J. Zhang, ”カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス／ヒトヘルペスウイルス８の複製および転写活性化因子は、インターフェロン刺激応答要素を介してウイルスおよび細胞の遺伝子を制御している” J. Virol. 79:5640-52 (2005))。Ｍｅｅｒｔｓらは最近、ＰＣＶ２を接種した後ＩＦＮ−αで処理したブタの腎臓細胞（ＰＫ−１５）およびブタの単球細胞（３Ｄ４／３１）がそれぞれ５２９％および３０８％まで増大した数の感染した細胞を有していたことを示した(P. Meerts et al., ”ＩＦＮ−ガンマの前および後処理による、ならびにＩＦＮ−αの後処理による、ブタ細胞株におけるブタサーコウイルス２の複製の増進” J. Interferon Cytokine Res 25(11):684-93 (November 2005))。興味深いことに、ＰＣＶ２の接種の前にＩＦＮ−αで処理したＰＫ−１５細胞は、減少した数の感染した細胞（６９％）を有していた（同書）。ＩＦＮ−αに加え、ＰＫ−１５および３Ｄ４／３１細胞の両方におけるＩＦＮ−γのＰＣＶ２感染への作用も評価された。ＰＣＶ２感染の後のＩＦＮ−γでの処理は結果としてＰＫ−１５細胞において６９１％大きな数の感染した細胞をもたらし、ＰＣＶ２接種の前のＩＦＮ−γの添加は、細胞のウイルスの内在化の増大により３Ｄ４／３１細胞においてＰＣＶ２抗原陽性細胞の数を７０６％増大させたことが分かった（同書）。ＩＦＮ−γの活性化に応答する転写因子はＰＣＶ２配列のプロモーター領域に存在する可能性があるが、現時点では、それは全て推測であり、まだ立証されていない。多くのウイルスは、細胞のＩＦＮ応答を逃れるために、いくつかの転写経路によりＩＦＮの発現に応答するだけでなくそれを操作する(S. Goodbourn, ”インターフェロン：細胞のシグナル伝達、免疫調節、抗ウイルス応答およびウイルス対策” J. Gen. Virol. 81:2341-64 (2000))。まとめると、細胞培養におけるＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γのＰＣＶ２感染への作用ならびにＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γ応答の制御におけるＩＳＲＥ様配列の役割はまだ研究されていない。それにも関わらず、インターフェロンを添加してＰＣＶ２の増殖を刺激することは、先行する研究により示されたように矛盾する結果をもたらした。インターフェロンをブタに与えることはできるが、インターフェロンは特に肝臓に有害な不都合な反応および副作用を引き起し得るため、インターフェロンに基づく最終的なＰＣＶ２製品における投与レベルに関して懸念があるであろう。安全にブタに投与することができる天然の成分の使用によりＰＣＶ２の複製特性を向上させるのがより望ましいであろう。
【０００９】
結果として、ＰＣＶ２ワクチンの製造の間の抗原生産の不十分な量が原因である、明確な分野で認められた問題が存在し、本発明はそれを、以前に入手可能であったものよりも大きいバッチ（ｂａｔｃｈｅｓ）のキメラワクチンを製造するためにそのウイルスの低い力価および複製能力を大きく向上させる新規のブタサーコウイルスキメラを開発することにより解決する。
【００１０】
従って、病原性ＰＣＶ２の抗原能力を保持しており十分な免疫応答を引き出すがＰＣＶ１の優れた力価増大特性を革新的に達成するＰＣＶ１およびＰＣＶ２の独特の組み合わせを提供することは、本発明の重要な目的である。
【００１１】
ブタをＰＣＶ２により引き起されるウイルス感染または離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）に対して保護するための、ＰＣＶ２に基づく向上したキメラワクチン製品を作ることは、本発明のさらに重要な目的であり、その向上は親のＰＣＶ２よりも優れた複製を含む。
【００１２】
本発明のさらなる目標および目的は、明細書が進むにつれて見えてくるであろう。
前記の目的は、本明細書で記述されるようにＰＣＶ１  Ｒｅｐ遺伝子をＰＣＶ２のゲノムバックボーン中に含む新規のキメラＰＣＶ２ウイルスを提供することにより達成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第７，２７９，１６６号Ｂ２
【特許文献２】米国特許第７，２７６，３５３号Ｂ２
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】I. Tischer et al., ”永久ブタ腎臓細胞株におけるパポバウイルスおよびピコルナウイルス様粒子の特性付け” Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226(2):153-167 (1974)
【非特許文献２】G. M. Allan et al., ”ブタサーコウイルスの病原性；初乳無摂取の小豚の実験的な感染およびブタ胎児物質の試験” Vet. Microbiol. 44:49-64 (1995)
【非特許文献３】G. C. Dulac and A. Afshar, ”ＰＫ−１５細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３３）中のブタサーコウイルス抗原およびカナダのブタにおけるサーコウイルスに対する抗体の証拠” Can. J. Vet. Res.  53:431-433 (1989)
【非特許文献４】S. Edwards and J. J. Sands, ”英国のブタにおけるサーコウイルス感染の証拠” Vet. Rec. 134:680-681 (1994)
【非特許文献５】I. Tischer et al., ”ブタサーコウイルスの疫学および病原性についての研究” Arch. Virol. 91:271-276 (1986)
【非特許文献６】G. M. Allan et al., ”米国および欧州における消耗性疾患を有するブタからのブタサーコウイルス様ウイルスの単離” J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998)
【非特許文献７】I. Morozov et al., ”離乳後多臓器消耗症候群を有するブタにおけるブタサーコウイルスの新規の株の検出” J. Clin. Microbiol.  36:2535-2541 (1998)
【非特許文献８】A.K. Cheung, ”ブタサーコウイルス２型のウイルスタンパク質合成およびＤＮＡ複製に必須の、および必須で無い転写単位” Virology 313:452-9 (2003)
【非特許文献９】A.K. Cheung, ”ブタサーコウイルス１型のタンパク質合成、ＤＮＡ複製および感染性ウイルス産生に必須の、および必須で無い転写単位の同定” Arch. Virol. 149(5):975-88 (2004)
【非特許文献１０】A. K. Cheung, ”ブタサーコウイルス２型の転写の分析” Virology 305(1):168-180 (2003)
【非特許文献１１】A. Mankertz et al., ”ブタサーコウイルスの複製に必須なタンパク質の同定” J. Gen. Virol. 79(Pt 2):381-384 (1998)
【非特許文献１２】P. Nawagitgul et al., ”ブタサーコウイルス２型のオープンリーディングフレーム２は主要カプシドタンパク質をコードしている” J. Gen. Virol. 81:2281-2287 (2000)
【非特許文献１３】A. Mankertz and B. Hillenbrand, ”ブタサーコウイルス１型の複製はウイルスのｒｅｐ遺伝子によりコードされる２種類のタンパク質を必要とする” Virology 279:429-38 (2001)
【非特許文献１４】A. Mankertz et al., ”ブタサーコウイルスのＤＮＡ複製の起点のマッピングおよび特性付け” J. Virol. 71:2562-6 (1997)
【非特許文献１５】I. Morozov et al., ”離乳後多臓器消耗症候群を有するブタにおけるブタサーコウイルスの新規の株の検出” J. Clin. Microbiol. 36:2535-2541 (1998)
【非特許文献１６】J. Liu et al., ”ブタサーコウイルス２に感染した細胞における以前に同定されていないウイルスタンパク質の特性付けおよびウイルスに誘導されるアポトーシスにおけるその役割” J. Virol. 79:8262-74 (2005)
【非特許文献１７】M. Fenaux et al., ”非病原性ＰＣＶ１のゲノムバックボーンの中にクローン化された病原性ＰＣＶ２型（ＰＣＶ２）の免疫原性カプシド遺伝子を有するキメラブタサーコウイルス（ＰＣＶ）は、ブタにおいてＰＣＶ２感染に対する防御免疫を誘導する” J. Virol. 78:6297-303 (2004)
【非特許文献１８】M. Fenaux et al., ”病原性ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）および非病原性ＰＣＶ１のキメラ感染性ＤＮＡクローンの、離乳したブタにおける免疫原性および病原性” J. Virol. 77:11232-243 (2003)
【非特許文献１９】M. Fenaux et al., ”２型ブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）のカプシドタンパク質における２アミノ酸変異はインビトロでＰＣＶ２の複製を増進し、インビボでそのウイルスを弱毒化した” J. Virol. 78:13440-6 (2004)
【非特許文献２０】J.E. Darnell, Jr., et al., ”ＩＦＮ類および他の細胞外シグナル伝達タンパク質に応答したＪａｋ−ＳＴＡＴ経路および転写の活性化” Science 264:1415-21 (1994)
【非特許文献２１】J. Zhang, ”カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス／ヒトヘルペスウイルス８の複製および転写活性化因子は、インターフェロン刺激応答要素を介してウイルスおよび細胞の遺伝子を制御している” J. Virol. 79:5640-52 (2005)
【非特許文献２２】P. Meerts et al., ”ＩＦＮ−ガンマの前および後処理による、ならびにＩＦＮ−αの後処理による、ブタ細胞株におけるブタサーコウイルス２の複製の増進” J. Interferon Cytokine Res 25(11):684-93 (November 2005)
【非特許文献２３】S. Goodbourn, ”インターフェロン：細胞のシグナル伝達、免疫調節、抗ウイルス応答およびウイルス対策” J. Gen. Virol. 81:2341-64 (2000)
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、ブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）の複製またはＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列がブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）のゲノムバックボーンの中に組み込まれた独特のキメラブタサーコウイルスに関する。本発明の非常に望ましい態様は、ＰＣＶ１のオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）Ｒｅｐ遺伝子がＰＣＶ２のゲノム構造中でＰＣＶ２のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子と入れ替わっているＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラの構築に関する。本発明は、本明細書で記述される新規のキメラ核酸分子を含む生物学的に機能性のプラスミド、ウイルスベクターおよび同様のもの、そのキメラＤＮＡを含むプラスミドまたはベクターをトランスフェクションする適切な宿主細胞、ならびにそのキメラコンストラクトを作成する方法も含む。加えて、例えばキメラＤＮＡ、キメラＤＮＡをふくむプラスミド、キメラウイルス等を含む弱毒化または不活化ワクチン、およびその保護を必要とするブタに免疫学的有効量の弱毒化または不活化ワクチンを投与することを含むＰＣＶ２により引き起されるウイルス感染または離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）に対してブタを保護する新規の方法が本発明の範囲内に含まれる。驚いたことに、および好都合なことに、この発明のキメラブタサーコウイルスは親ウイルスであるＰＣＶ２を超えて大きく向上した複製および力価をもたらし、従って、本発明のさらなる態様は、細胞培養においてＰＣＶ２の複製および力価を向上させるための新規の方法に向けられている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の背景およびその当分野からの発展は、添付された図への参照により以下でさらに記述され、ここで：
【図１】図１は、キメラＳＤＭ−Ｃ６  ＤＮＡクローン（ＰＣＶ２ゲノムのバックボーンの中にクローン化されたＰＣＶ１のＲｅｐ遺伝子を有する）がＰＫ−１５細胞の中にトランスフェクションされた際に感染性であることを示す。パネルＡおよびａは、コンカテマー形成した（ｃｏｎｃａｔｏｍｅｒｉｚｅｄ）ＳＤＭ−Ｃ６キメラゲノムをトランスフェクションされたＰＫ−１５細胞を図説している；パネルＢおよびｂは、線状にした単一コピーのＳＤＭ−Ｃ６キメラゲノムをトランスフェクションされたＰＫ−１５細胞を図説している；ならびに、パネルＣおよびｃは、陰性対照としてのトランスフェクション試薬およびＭＥＭを図説している。左のパネルは、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２モノクローナル抗体で染色したＩＦＡの結果を与える；一方、右のパネルは、ＩＦＡの結果と重ね合わせたＰＫ−１５細胞の単層を与える。
【図２】図２は、１段増殖曲線によるＰＫ−１５細胞におけるＰＣＶ１（◆）、ＰＣＶ２（■）およびキメラＳＤＭ−Ｃ６（Δ）ウイルスの増殖特性の特性付けを図説している。６〜１２ウェルプレート上のＰＫ−１５細胞を、０．１感染多重度でそれぞれのウイルスを用いて２通り（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で接種した。２個の２通りのウェルの感染した細胞を１２時間ごとに集め、ウイルスの力価をＩＦＡにより測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明に従って、ブタサーコウイルスの独特の、感染性のキメラ核酸分子（ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ）、そのキメラ核酸分子から産生される生キメラウイルスおよびブタをブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）により引き起されるウイルス感染または離乳後多臓器消耗症候群（ＰＭＷＳ）から保護するための獣医用ワクチンが提供される。本発明は、具体的には、ＰＣＶ２をコードする核酸分子がブタサーコウイルス１型（ＰＣＶ１）の複製（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする核酸配列を含むブタサーコウイルスのキメラ核酸分子（ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ）の構築およびインビトロでの特性付けを取り扱う。ＰＣＶ２核酸分子の中に挿入するために、Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸配列は、非病原性ブタサーコウイルス株のウイルス複製に必要である１種類以上の複製タンパク質をコードする１種類以上の機能性ヌクレオチド配列であることができる。ＰＣＶ２のゲノムバックボーン中への組み込みのために、ＰＣＶ１のＲｅｐタンパク質をコードする完全なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）遺伝子を用いるのが、好ましくは、ＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子を用いるのが望ましい。最適なキメラ特性のためには、ＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子が、ＰＣＶ２のゲノムバックボーン中でＰＣＶ２のオープンリーディングフレーム、特にＰＣＶのＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子と入れ替わるのがさらにもっと好ましい。
【００１８】
本発明の別の態様は、本発明で記述されるＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐのキメラ核酸分子を作成する新規の方法を含み、それは次の工程を含む：
（ａ）ＰＣＶ１をコードする核酸分子からＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列を取り外す；
（ｂ）ＰＣＶ１のＲｅｐタンパク質をコードする核酸配列を、ＰＣＶ２をコードする核酸分子の中に組み込む；および
（ｃ）そのキメラ核酸分子を回復する。
【００１９】
その方法は本発明のキメラウイルスの変種を構築するために都合よく修正することができ、その場合工程（ａ）はＰＣＶ１のＲｅｐタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）遺伝子を含む核酸配列を取り外すこと、またはより具体的には、ＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子を含む核酸配列を取り外すことを含んでいてよい。この発明の代わりの態様として、工程（ｂ）はさらに、ＰＣＶ２のＯＲＦ１遺伝子を取り外し、次いでＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子を含む核酸配列をＰＣＶ２をコードする核酸分子のＯＲＦ１遺伝子の位置に組み込むことを含んでいてよい。
【００２０】
この発明の新規のキメラブタサーコウイルスは、親ウイルスであるＰＣＶ２を超えて大きく向上した複製能力および増進された力価をもたらすように優先的に設計される。代表的なキメラが本明細書の下記の実施例において構築され、”ＳＤＭ−Ｃ６”と名付けられた。ＳＤＭ−Ｃ６キメラウイルス試料は、ＰＫ−１５細胞の中にトランスフェクションした際にインビトロで感染性であり、これはＰＣＶ１およびＰＣＶ２の間でＲｅｐ遺伝子を交換可能であることを示している。
【００２１】
ＳＤＭ−Ｃ６キメラウイルスの向上した増殖の特質は、キメラウイルスの増殖特性を野生型のＰＣＶ１およびＰＣＶ２ウイルスと比較する１段増殖曲線により特性付けられる。その結果は、キメラウイルスは驚いたことに細胞培養においてその親ウイルスであるＰＣＶ２よりもおおよそ１−ｌｏｇ高い力価で、より効率的に複製することを実証している。キメラウイルスは非病原性ＰＣＶ１と類似した力価まで複製するが、研究はさらに本発明のキメラＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐが意外にもＰＫ−１５細胞のトランスフェクション（すなわち、感染または接種）の際にその親のＰＣＶ１およびＰＣＶ２ウイルスの両方よりも急速に複製することを示している。
【００２２】
ＰＣＶ２を産業的スケールでの十分なワクチン生産のためにより高い力価まで増殖させることは解決が難しかったため−そこでは１−ｌｏｇの力価の増大さえも重要であると考えられる−、本発明は獣医学の分野においてＰＣＶ２ワクチンの開発に重要な影響を及ぼす注目すべき進歩を可能にする。他のウイルスに関しては１−ｌｏｇの差は重要ではないかもしれないが、ＰＣＶ２に関する１−ｌｏｇの力価の増大はＰＣＶ２ワクチンの生産において非常に大きな違いを生み、すなわち、より高い力価はワクチンの用量あたりの体積を低減させ、それにより最終的な製品の効力および製造プロセス全体の効率を増大させるであろう。好都合なことに、本発明の新規のＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラの使用は、以前に過去に成し遂げることが可能であったよりも明らかに優れたＰＣＶ２ワクチンの生産を提供する。また、ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラは独特にＰＣＶ２起源のゲノムバックボーンに基づいているので、接種されたブタにおいて免疫応答を引き出すのに重要であるキメラコンストラクト内のＰＣＶ２の免疫原性ＯＲＦ２カプシド遺伝子の存在のため、それはブタをＰＣＶ２により引き起されるウイルス感染またはＰＭＷＳに対して保護するためのワクチン中の優秀な抗原物質を作る。
【００２３】
本発明のＳＤＭ−Ｃ６キメラウイルスを以前に米国特許第７，２７９，１６６号Ｂ２および米国特許第７，２７６，３５３号Ｂ２において記述されたＰＣＶ１−２キメラウイルスから区別する主な違いの１つは核酸配列である：本発明のＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラウイルス（ＳＤＭ−Ｃ６）のゲノム配列は病原性ＰＣＶ２起源のものであり、一方で前のＰＣＶ１−２キメラウイルスは非病原性ＰＣＶ１起源のものである。文献において、２種類のウイルス（ＰＣＶ１およびＰＣＶ２）のＣａｐおよびＲｅｐ遺伝子の間の遺伝子間配列がＰＣＶの複製の制御において重要な役割を果たしている可能性があると報告されている(A. K. Cheung, ”ブタサーコウイルス１型のＤＮＡ複製の起点における高頻度（ｒａｍｐａｎｔ）ヌクレオチド復帰変異の検出” Virology 333:22-30 (2005); A. K. Cheung, ”ブタサーコウイルス２型のＤＮＡ複製の起点における、ウイルスタンパク質、ＤＮＡ、および子孫ウイルスの生合成に必須な８ヌクレオチドモチーフ配列の同定” Virology 324:28-36 (2004); A. Mankertz et al., ”新規のレポーター遺伝子に基づく複製アッセイはブタサーコウイルス１型および２型の複製因子の交換可能性を明らかにする” J. Virol. 77:9885-93 (2003))。キメラＳＤＭ−Ｃ６ウイルスを構築するためのＰＣＶ２株の改変は、ＰＣＶ２のＤＮＡ配列中のＲｅｐ遺伝子の代わりのＰＣＶ１からのＲｅｐ遺伝子の付加にあるため、ＰＣＶ１のＲｅｐ遺伝子が増進された複製能力に寄与している可能性があると仮定するかもしれない。しかし、その仮定は、特に非病原性ＰＣＶ１および病原性ＰＣＶ２はそれらの全ゲノムにおいて６８〜７６％のヌクレオチド配列の相同性しか共有していないという事実のため、そのコンストラクトが実際に作られて増殖試験において試験されるまでは全くの憶測であろう。ＰＣＶ１のＲｅｐ遺伝子はＰＣＶ２ゲノムの機能的コード（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｄｅｓ）に翻訳されないかもしれないし、またはＰＣＶ２をコードする異なるヌクレオチド配列内ではよりよい複製能力をもたらさないかもしれない。従って、キメラＳＤＭ−Ｃ６ウイルスがＰＣＶ１の力価に類似した力価まで複製するという本発明に関する最新の観察は、驚くべき結果である。別の意外な特質として、ＳＤＭ−Ｃ６ウイルスはＰＣＶ１およびＰＣＶ２親株の両方よりも速く複製し、これは本発明のＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラウイルスに関する増進された複製能力の機構がまだ決定されていないことを示している。
【００２４】
現在までに、本明細書で記述されるようにＰＣＶ１のＲｅｐ遺伝子を病原性ＰＣＶ２のゲノムバックボーン内に組み込み、両方の親株を超える向上した複製特性を有する感染性病原体を得る先行する報告は存在しない。従って、新規ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラウイルスの増進された複製能力を考慮すると、本発明のさらなる態様は、次の工程を含む、細胞培養におけるＰＣＶ２の複製および力価を向上させるための新規の方法に関する：
（ａ）ＰＣＶ２のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子がＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子により入れ替えられたＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラウイルスを構築する；
（ｂ）適切な細胞株にＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラを接種する；
（ｃ）ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラを適切なウイルス増殖培地において、標準的な条件の下で、十分な長さの時間培養してウイルス産生を誘導する；および
（ｄ）キメラウイルスを集める。
【００２５】
前記の方法において、適切な細胞株の例は、ブタ抗原を含まないブタ腎臓細胞株（ＰＫ−１５細胞）、ブタ精巣（ＳＴ）細胞株およびブタサーコウイルスを増殖させることができる、または特にブタサーコウイルスを増殖させるのに適応させた類似の細胞株であろう。
【００２６】
本明細書で記述される新規のキメラ核酸分子を含む生物学的に機能性のプラスミド、ウイルスベクターおよび同様のもの、それらのプラスミドまたはベクターをトランスフェクションする適切な宿主細胞、ならびにその宿主細胞により産生される生キメラブタサーコウイルスも本発明の範囲内に含まれる。本発明はさらに、免疫原性ポリペプチド生成物の生産のためのプロセスを含み、ここでそのプロセスは、本明細書で記述されるブタサーコウイルス（ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ）のキメラ核酸分子をトランスフェクションした原核または真核宿主細胞を、適切な栄養条件下で、前記ポリペプチド生成物を発現させる方式で増殖させること、およびキメラ分子の発現の望ましいポリペプチド生成物を単離することを含む。
【００２７】
キメラウイルスおよびＤＮＡ分子の適切に弱毒化または不活化された（すなわち死菌）ワクチン、ならびにそれらを用いる方法も、本発明の範囲内に含まれる。接種されたブタは、ＰＣＶ２により引き起される重篤なウイルス感染およびＰＭＷＳから保護される。その新規の方法は、ウイルス感染またはＰＭＷＳに対する保護を必要とするブタを、そのブタに免疫学的有効量の本発明に従うワクチン、例えば免疫原性の量のＰＣＶ２Ｇｅｎ−１ＲｅｐをコードするキメラＤＮＡ配列、クローン化されたキメラウイルス、そのキメラＤＮＡ分子を含むプラスミドまたはウイルスベクター、組み換えＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ  ＤＮＡ配列等を含むワクチンを投与することにより保護する。ウイルス感染に対する広いスペクトルの保護を提供するために、他の抗原、例えばＰＲＲＳＶ、ＰＰＶ、他のブタの感染性因子（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｓｗｉｎｅ  ａｇｅｎｔｓ）および免疫刺激剤を同時にブタに与えてよい。
【００２８】
そのワクチンは、例えばＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐのキメラ核酸分子、例えばｐＳＫベクターのような適切なプラスミドまたはベクター中のクローン化されたキメラゲノム、死菌（不活化）または弱毒化キメラウイルス等を、非毒性の生理的に許容できるキャリヤーおよび場合により１種類以上の標準的なアジュバントとの組み合わせで含む。好ましくは、そのワクチンは死菌キメラウイルスを抗原として用いる。
【００２９】
本発明のワクチンと共に投与されてよいアジュバントは、ブタのそのワクチンへの免疫応答を増大させる物質である。そのアジュバントはワクチンと同時に同じ部位で投与されてよく、または異なる時点で、例えばブースターとして投与されてよい。アジュバントはブタに、そのワクチンが投与された方式または部位と異なる方式または部位で、都合よく投与されてもよい。獣医学の分野の当業者に既知の適切なアジュバントには、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、非イオン性ブロックポリマーまたはコポリマー、サイトカイン類（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ等）、サポニン類、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）、ムラミールジペプチド類（ＭＤＰ）および同様のものが含まれるが、それらに限定されない。他の適切なアジュバントには、例えば、硫酸アルミニウムカリウム、大腸菌から単離された易熱性または熱安定性腸毒素、コレラ毒素またはそのＢサブユニット、ジフテリア毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、フロイント不完全または完全アジュバント等が含まれる。毒素に基づくアジュバント、例えばジフテリア毒素、破傷風毒素および百日咳毒素は使用の前に、例えばホルムアルデヒドを用いた処理により不活化してよい。
【００３０】
そのワクチンはさらに、例えば豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、他のブタの感染性因子および免疫刺激剤のような、本発明のキメラウイルスまたはＤＮＡの免疫学的活性を促進するための追加の抗原を含んでいてよい。
【００３１】
この発明の新規のワクチンは、いずれかの特定のタイプまたは調製の方法に限定されることは決して無い。クローン化されたウイルスのワクチンには、感染性ＤＮＡワクチン（すなわち、プラスミド、ベクターまたは他の一般に用いられるキャリヤーを用いてＤＮＡをブタの中に直接注入する）、弱毒化ワクチン、不活化（死菌）ワクチン、遺伝学的に設計したワクチン等が含まれるがそれらに限定されない。これらのワクチンは、当分野で既知の標準的な方法により調製される。
【００３２】
この発明のワクチン中の抗原物質は病原性ＰＣＶ２株に基づいているため、その活性な薬剤はまず適切な分野で認められている方法により弱毒化または不活化されなければならない。不活化されたウイルスワクチンを調製するためには、例えば、その感染性ＤＮＡクローンからのウイルスの増殖を、当分野で既知の、または本明細書で記述される方法により行う。次いで、一連のウイルスの不活化を、当業者に一般的に知られているプロトコルにより最適化する。
【００３３】
不活化されたウイルスワクチンは、クローン化されたＤＮＡに由来するキメラウイルスを、不活化剤、例えばホルマリンまたは疎水性溶媒、酸等を用いて、紫外線またはＸ線の照射により、加熱により、等で処理することにより調製されてよい。不活化は当分野で理解されている方式で実施される。例えば、化学的不活化では、そのウイルスを含む適切なウイルス試料または血清試料を、通常は十分な長さの時間、十分な量または濃度の不活化剤を用いて、十分に高い（または低い、不活化剤による）温度またはｐＨで処理してそのウイルスを不活化する。加熱による不活化は、そのウイルスを不活化するのに十分な温度で、および十分な長さの時間実施するのが典型的である。照射による不活化は、しばしばそのウイルスを不活化するのに十分な波長の光または他のエネルギー源を、十分な長さの時間用いて実施される。一般に、用語”不活化”、”死菌”（”ｄｅａｄ”  ｏｒ  ”ｋｉｌｌｅｄ”）は、ウイルスワクチンの文脈で、そのワクチンが不活化されたウイルスを含むことを意味するように交換可能で用いられる。そのウイルスは、もしそれが感染に感受性のある細胞を感染させることができないならば、不活化されていると考えられる。
【００３４】
病原性のクローンから弱毒化ワクチンを調製するため、組織培養に適応させた、生きた、病原性ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐを、まず当分野で既知の方法により弱毒化し（非病原性または無害にする）、それは細胞培養を通した連続継代によりなされるのが典型的である。病原性クローンの弱毒化は、遺伝子欠失またはウイルス産生遺伝子変異によりなされてもよい。
【００３５】
さらに、毒性の原因であるウイルスゲノム中のヌクレオチド配列を正確にねらう（ｐｉｎｐｏｉｎｔ）、および例えば部位特異的変異誘発により無毒性のウイルスを遺伝学的に設計することが可能である。部位特異的変異誘発は、１個以上のヌクレオチドを追加する、削除する、または変化させることができる（例えばZoller et al., DNA 3:479-488, 1984を参照）。望まれる変異を含むオリゴヌクレオチドを合成し、１本鎖ウイルスＤＮＡの一部にアニーリングする。その手順から得られるハイブリッド分子を用いて細菌を形質転換する。次いでその適切な変異を含むものを単離した２本鎖ＤＮＡを用いて、後者の制限酵素切断断片へのライゲーションにより完全長ＤＮＡを生成し、続いてそれを適切な細胞培養物の中にトランスフェクションする。ゲノムの移入に適したベクター中へのライゲーションは、当業者に既知のあらゆる標準的な技法により成し遂げられてよい。ウイルスの子孫の産生のための、そのベクターの宿主細胞中へのトランスフェクションは、一般に行われている方法の内のいずれか、例えばリン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、電気穿孔法、プロトプラスト融合および他の周知の技法を用いて行われてよい（例えば、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）。次いで、クローン化されたウイルスは望まれる変異を示す。あるいは、適切な変異を含む２種類のオリゴヌクレオチドを合成することができる。これらをアニーリングして２本鎖ＤＮＡを形成することができ、それをウイルスＤＮＡに挿入して完全長ＤＮＡを生成することができる。
【００３６】
そのウイルスの免疫優性タンパク質の内の１種類以上をコードする、そのウイルスから得られた、またはそのウイルスゲノムからコピーされた核酸分子を含む移入ベクターを用いて、（ＨＩ−ＦＩＶＥのような）昆虫細胞株を形質転換することができる。その移入ベクターには、例えば、線状にしたバキュロウイルスＤＮＡおよびその免疫原性ポリヌクレオチドを含むプラスミドが含まれる。組み替えバキュロウイルスを作るために、宿主細胞株をその線状にしたバキュロウイルスＤＮＡおよびプラスミドでコトランスフェクションすることができる。あるいは、生ベクター（ｌｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒ）、例えばポックスウイルスまたはアデノウイルスを、本発明のキメラと組み合わせてワクチンとして用いることができる。
【００３７】
免疫学的有効量の本発明のワクチンを、ウイルス感染またはＰＭＷＳに対する保護を必要とするブタに投与する。ブタに接種する免疫学的有効量または免疫原性の量は、型にはまった試験により容易に決定する、またはすぐに滴定することができる。有効量は、ＰＭＷＳを引き起すウイルスに晒されたブタを保護するのに十分なそのワクチンに対する免疫応答が得られる量である。好ましくは、そのブタは、そのウイルス性疾患の不都合な生理的症状または影響の１から全てまで（ｏｎｅ  ｔｏ  ａｌｌ）が著しく低減する、改善される、または完全に予防される程度まで保護される。
【００３８】
そのワクチンは、１回量で、または反復用量で投与することができる。投与量は、例えば約１マイクログラムから約１，０００マイクログラムまでの感染性キメラＤＮＡゲノムを含むプラスミドＤＮＡ（そのワクチンの免疫活性成分の濃度に依存する）、好ましくは１００〜２００マイクログラムのキメラＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ  ＤＮＡクローンの範囲であってよい。有効な抗原性薬剤の適切な投与量を決定または滴定して、ブタの体重、抗原の濃度および他の典型的な要素に基づく最小有効投与量を見出すための方法は、当分野で既知である。
【００３９】
望ましくは、そのワクチンはまだＰＣＶウイルスに晒されていないブタに投与される。抗原性物質を含むワクチンは、鼻腔内で、経皮で（すなわち、全身吸収のために皮膚の表面上で、または皮膚の表面において適用される）、非経口で、等で都合よく投与することができる。非経口投与経路には、筋肉内、静脈内、腹膜内、皮内（すなわち、皮膚の下に注射される、またはそうでなければ置かれる）、皮下経路および同様のものが含まれるが、それらに限定されない。筋肉内および皮内接種経路は、ウイルス感染性ＤＮＡクローンを用いた他の研究で成功しているため(E. E. Sparger et al., ”ネコ免疫不全ウイルスの分子クローンのＤＮＡの注射によるネコの感染” Virology 238:157-160 (1997); L. Willems et al., ”ウシ白血病プロウイルスのヒツジ中へのインビボトランスフェクション” Virology 189:775-777 (1992))、これらの経路は実用的な鼻腔内投与経路に加えて最も好ましい。それほど好都合では無いが、そのワクチンをブタにリンパ内（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈｏｉｄ）接種経路を通して与えることも意図される。
【００４０】
液体として投与される場合、本ワクチンは水溶液、シロップ、エリキシル、チンキおよび同様のものの形で調製されてよい。その配合物は当分野で既知であり、抗原および他の典型的な添加物の、適切なキャリヤーまたは溶媒系中での溶解により調製されるのが典型的である。適切なキャリヤーまたは溶媒には、水、生理食塩水、エタノール、エチレングリコール、グリセロール等が含まれるがそれらに限定されない。典型的な添加物は、例えば、保証された染料、香味、甘味剤および抗微生物性保存剤、例えばチメロサール（エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム）である。その溶液は、例えば、部分的に加水分解されたゼラチン、ソルビトールまたは細胞培養培地の添加により安定化されてよく、当分野で既知の試薬、例えばリン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、それらの混合物、および同様のものを用いる一般に行われる方法により緩衝されてよい。
【００４１】
液体配合物は、懸濁化剤または乳化剤を含む懸濁液および乳濁液を、他の標準的な共配合剤（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｎｔｓ）との組み合わせで含んでいてもよい。これらのタイプの液体配合物は一般に行われる方法により調製されてよい。例えば懸濁液はコロイドミルを用いて調製してよい。例えば乳濁液はホモジェナイザーを用いて調製してよい。
【００４２】
体液系の中への注入のために設計された非経口配合物は、ブタの体液の一致するレベルまでの適切な等張性およびｐＨの緩衝を必要とする。等張性は塩化ナトリウムおよび必要に応じて他の塩類を用いて適切に調節することができる。適切な溶媒、例えばエタノールまたはプロピレングリコールを用いてその配合物中の成分の溶解性およびその液体製剤の安定性を増大させることができる。本ワクチン中で用いることができるさらなる添加物には、デキストロース、一般に用いられる抗酸化剤および一般に用いられるキレート剤、例えばエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）が含まれるが、それらに限定されない。また、非経口剤形は使用の前に滅菌されなければならない。
【００４３】
下記の実施例は本発明の特定の観点を実証する。しかし、これらの実施例は説明のためだけのものであり、この発明の条件および範囲に関して完全に決定的なものであることを意味しないことは理解されるべきである。典型的な反応条件（例えば、温度、反応時間等）が与えられた際に、一般にそれほど好都合では無いがその明記された範囲の上および下の条件も共に用いることができることは理解されるべきである。実施例は室温（約２３℃〜約２８℃）において大気圧で実施される。別途明記しない限り、本明細書で言及される全ての部（ｐａｒｔｓ）およびパーセントは重量に基づくものであり、全ての温度は摂氏度で表される。
【００４４】
下記に続く限定的で無い実施例から、本発明のさらなる理解を得ることができる。
【実施例】
【００４５】
実施例１
キメラＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐの構築
下記に続くインビトロ実験全体を通して、ＰＣＶを含まないＰＫ−１５細胞を用いた。これらの細胞は、以前に終点希釈（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）により得られた(M. Fenaux et al., ”２型ブタサーコウイルスのクローン化されたゲノムＤＮＡは、直接ブタの肝臓およびリンパ節中に注入した際に感染性である：臨床疾患、ウイルスの分布、および病理学的病変の特性付け” J. Virol. 76:541-51 (2002))。ＰＣＶ２およびＰＣＶ１単一コピーならびに二量体化したタンデム反復の感染性ＤＮＡクローンの構築は、以前に記述された（同書）。
【００４６】
ＰＣＶ２ゲノムのバックボーン中で（その遺伝子間配列を含めて）ＰＣＶ２のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子と入れ替わったＰＣＶ１のＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子を有するキメラＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐを構築するため、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクター中のＰＣＶ１感染性ＤＮＡクローンの単一コピーゲノムを、プライマーＰＣＶ１ＲＥＰＦ（５’  ＣＡＡＣＴＧＧＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＧ  ３’（配列ＩＤ番号：１に対応する））およびＰＣＶ１ＲＥＰＲ（５’  ＡＡＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＧＴＧＡＴＣＡＡＡＡＡＧＡＣＴＣＡＧＴＡＡＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧ  ３’（配列ＩＤ番号：２に対応する））を用いたＰＣＲにより増幅し、それぞれの末端に設計された制限酵素部位ＢａｌＩおよびＢｃｌＩを有するＰＣＶ１Ｒｅｐ遺伝子断片を生成した。ＰＣＲ反応は４５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）、２０ｐＭのプライマーＰＣＶ１ＲＥＰＲ、２０ｐＭのプライマーＰＣＶ１ＲＥＰＦ、および１μｌの単一コピーＰＣＶ１感染性ＤＮＡクローンで構成されていた。サーモサイクラー反応は、９４℃で２分間の最初の変性、ならびに３５サイクルの９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および６８℃で３０秒間の伸張、その後６８℃で７分間の最後の保温で構成されていた。ＰＣＶ１Ｒｅｐ断片を１％アガロースゲルにより分離し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，カリフォルニア州アーバイン）を用いて精製した。次いでＰＣＶ１Ｒｅｐ断片をＢａｌＩおよびＢｃｌＩで別々に消化し、得られた消化された断片を１％アガロースゲル中で泳動し（ｒｕｎ）、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ  Ｋｉｔを用いて精製した。
【００４７】
Ｒｅｐ遺伝子を除いたＰＣＶ２ゲノムバックボーン断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中の単一コピーＰＣＶ２感染性ＤＮＡクローンから、プライマーＰＣＶ２ＧＥＮＦ（５’  ＣＴＴＴＴＴＧＡＴＣＡＣＴＴＣＧＴＡＡＴＧＧＴＴＴＴＴＡ  ３’（配列ＩＤ番号：３に対応する））およびＰＣＶ２ＧＥＮＲ（５’  ＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＴ  ３’（配列ＩＤ番号：４に対応する））を用いたＰＣＲにより増幅させた。その断片のそれぞれの末端においてＢｆｒＢＩおよびＢｃｌＩ制限酵素部位が導入された。ＰＣＲ反応は２０ｐＭのプライマーＰＣＶ２ＧＥＮＦ、２０ｐＭのプライマーＰＣＶ２ＧＥＮＲ、４０ｍＭ  ｄＮＴＰ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ペンシルベニア州ピッツバーグ）、２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μｌ  １０Ｘ  ＰＣＲ緩衝液、７２μｌ  ｄＨ２Ｏ、５ユニット  ＡｍｐｌｉＴａｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスターシティ）、および１μｌの単一コピーＰＣＶ２感染性ＤＮＡクローンで構成されていた。サーモサイクラー反応は、９４℃で１０分間の最初の変性、ならびに３８サイクルの９４℃で１分間の変性、５０℃で１分間のアニーリング、および７２℃で４５秒間の伸張、その後７２℃で７分間の最後の伸張で構成されていた。ＰＣＶ２ゲノムバックボーン断片（Ｒｅｐ遺伝子無し）、ＰＣＶ２Ｇｅｎ断片を、１％アガロースゲルにより分離し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ  Ｋｉｔを用いて精製した。次いでＰＣＶ２Ｇｅｎ断片をＢｆｒＢＩおよびＢｃｌＩで別々に消化し、１％アガロースゲル上で泳動し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ  Ｋｉｔを用いて精製した。
【００４８】
キメラＰＣＶ感染性ＤＮＡクローンを生成するため、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＤＮＡライゲーションキット（カリフォルニア州ラホヤ）を用いてＰＣＶ１ＲｅｐおよびＰＣＶ２Ｇｅｎ断片の一夜ライゲーションを行った。そのライゲーション混合物を用いて、製造業者のプロトコルに従ってＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。白いコロニーを選択し、一夜培養し、ＳｉｇｍａのＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ミズーリ州セントルイス）を用いてプラスミドを抽出した。そのプラスミドを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、１％アガロースゲル上で泳動して、おおよそ１．７ｋｂ（ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ）および２．９ｋｂ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋ベクター）の２種類のバンドを有する本物のプラスミドを同定した。
【００４９】
実施例２
キメラＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ  ＤＮＡクローンの生存度試験
キメラＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ  ＤＮＡクローンの生存度試験を、ＰＫ−１５細胞のトランスフェクションにより行った。制限酵素ＫｐｎＩを用いてキメラＰＣＶ２Ｇｅｎ−１ＲｅｐゲノムをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋プラスミドベクターから切り出した。キメラＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐゲノムを１％アガロースゲル上で泳動し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩを用いて精製し、続いてＴ４  ＤＮＡリガーゼにより、本質的に以前に記述された一般に行われる技法を用いてコンカテマー形成した（Ｍ．  Ｆｅｎａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  上記）。Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ上で増殖しているおおよそ７０％コンフルエントのＰＫ−１５細胞を、コンカテマー形成したＰＣＶ２Ｇｅｎ−１ＲｅｐゲノムＤＮＡで、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよびＰｌｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２特異的ポリクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）を、以前に記述されたように行い（同書）、感染性を決定した。ＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐキメラゲノムの感染性をさらに評価するため、Ｔ−２５フラスコ中で増殖している７０％コンフルエントのＰＫ−１５細胞を、フラスコあたりおおよそ１２μｇのコンカテマー形成したキメラゲノムで、以前に記述されたようにトランスフェクションした（同書）。トランスフェクションの３日後にウイルスストックを集め、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２特異的ポリクローナル抗体を用いるＩＦＡにより、以前に記述されたように滴定した（同書）。
【００５０】
実施例３
キメラゲノムを確認するためのＤＮＡ配列決定
プライマーＲｅｐ８３０Ｆ（５’  ＧＧＴＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＧＴＡＡＣＧ  ３’  （配列ＩＤ番号：５に対応する））およびＲｅｐ８３０Ｒ（５’  ＧＴＴＣＴＡＣＣＣＴＣＴＴＣＣＡＡＡＣＣＴＴＣＣ  ３’  （配列ＩＤ番号：６に対応する））を用いて、ＰＣＶ２Ｇｅｎ断片の３’とＰＣＶ１Ｒｅｐ断片の５’の間の連結領域を増幅した。プライマーＲｅｐ１０Ｆ（５’  ＧＧＡＡＧＡＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＡＣＡＡＴＣＣ  ３’  （配列ＩＤ番号：７に対応する））およびＲｅｐ１０Ｒ（５’  ＣＧＴＴＡＣＴＴＣＡＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＧ  ３’  （配列ＩＤ番号：８に対応する））を用いて、ＰＣＶ１Ｒｅｐ断片の５’とＰＣＶ２Ｇｅｎ断片の３’の間の連結領域を増幅した。増幅したＰＣＲ産物を、両方の鎖に関して配列決定した。
【００５１】
実施例４
部位特異的変異誘発
最初のキメラＰＣＶ２Ｇｅｎ−１Ｒｅｐ  ＤＮＡクローンは、ＰＫ−１５細胞中にトランスフェクションした際に感染性では無かった。キメラゲノムの配列を分析した後、ＰＣＶ１  ＯＲＦ１  Ｒｅｐ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの後に６ヌクレオチド（ＧＴＡＡＧＣ）の挿入が確認された。ＰＣＲおよびクローニングの工程を通して導入されたこのエラーおよび望まれない挿入を訂正するため、プライマーＭＶＴＦ（５’  ＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧ  ３’  （配列ＩＤ番号：９に対応する））およびＭＶＴＲ（５’  ＣＣＧＣＴＴＴＴＣＴＴＧＣＴＴＧＧＣＡＴＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧ  ３’  （配列ＩＤ番号：１０に対応する））を用いて、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてその６ヌクレオチドの挿入を削除した。ＴＯＰ１０細胞を、その変異誘発した産物で、製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って形質転換した。白いコロニーを選択し、一夜培養した。クローンＳＤＭ−Ｃ６をアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上にストリークし、３７℃で一夜増殖させた。４個のコロニーを選択し、一夜培養した。それらのプラスミドを抽出し、プライマーＲｅｐ８３０ＦおよびＲｅｐ８３０Ｒを用いて配列決定し、導入された６ヌクレオチドがキメラゲノムから除去されたことを確認した。
【００５２】
その６ヌクレオチド（ＧＴＡＡＧＣ）の挿入がキメラクローンを非感染性にしたこと、およびその望まれない挿入が部位特異的変異誘発により上手く除去されたことが分かった。その新規キメラクローンＳＤＭ−Ｃ６は、その後のＰＫ−１５細胞中へのトランスフェクションの際に感染性であることが分かった。
【００５３】
実施例５
キメラウイルスのインビトロでの特性付けのためのウイルスストックの調製
ＰＣＶ１およびＰＣＶ２ウイルスストックを、それぞれＰＣＶ１およびＰＣＶ２感染性ＤＮＡクローンから、ＰＫ−１５細胞のトランスフェクションにより、以前に記述された一般に行われる技法（Ｍ．  Ｆｅｎａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  上記）に従って調製した。それぞれのウイルスストックの感染力価を、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２特異的抗体を用いるＩＦＡにより決定した（同書）。
【００５４】
ＰＣＶ２ゲノムのバックボーン中でＰＣＶ１  Ｒｅｐ遺伝子を含むＳＤＭ−Ｃ６キメラゲノムを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋プラスミドから、制限酵素ＫｐｎＩを用いて切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ  Ｋｉｔを用いて精製した。おおよそ４０μｇのＳＤＭ−Ｃ６キメラゲノムを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによりコンカテマー形成し、それを用いて４フラスコのおおよそ７０％コンフルエントのＰＫ−１５細胞を以前に記述されたように（同書）ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅおよびＰｌｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてトランスフェクションした（フラスコあたり１０μｇ）。トランスフェクションの３日後、トランスフェクションされた細胞を３回凍結融解することによりＳＤＭ−Ｃ６キメラウイルスを集め、キメラＳＤＭ−Ｃ６ウイルスストックの感染力価を、リン酸緩衝生理食塩水（１０Ｘ，  ｐＨ  ７．４）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１：１０００希釈のＰＣＶ２  ＯＲＦ２モノクローナル抗体（Ｒｕｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，サウスダコタ州ブルッキングズ）を用いるＩＦＡにより決定した。ＳＤＭ−Ｃ６ウイルスストックは、０．５  ｘ  １０５．５  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの優秀なウイルス感染力価を有していた。コンカテマー形成した、および線状にしたＳＤＭ−Ｃ６ゲノムをトランスフェクションしたＰＫ−１５細胞は共にＩＦＡにより強く陽性であり（図１）、これはＰＣＶ２ゲノムのバックボーン中にクローン化されたＰＣＶ１  Ｒｅｐ遺伝子を有するＳＤＭ−Ｃ６キメラゲノムがインビトロで感染性であることを証明している。
【００５５】
実施例６
１段増殖曲線
キメラウイルスの増殖特性を特性付けるため、ならびにそれを野生型のＰＣＶ１およびＰＣＶ２ウイルスと比較するため、１段増殖曲線を行った。ＰＫ−１５細胞を６枚の１２ウェルプレートの８個のウェルの中で培養した。おおよそ７０％コンフルエントにおいて、それぞれのウェルを２ｍＬのＭＥＭで洗浄した。２通りのプレート中の８個のウェルをそれぞれＰＣＶ１、ＰＣＶ２、およびＳＤＭ−Ｃ６を用いて、０．１感染多重度（ＭＯＩ）で接種した。１時間の培養の後、接種物を除去した。続いて細胞の単層を３回、それぞれ２ｍＬのＰＢＳで洗浄して、あらゆる余分な量のウイルス接種物を除去した。２％ＦＢＳおよび１Ｘ抗生物質−抗真菌物質を含む２ｍＬのＭＥＭをそれぞれのウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で連続して培養した。接種後０、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、および９６時間（ｈｐｉ）の時点で、それぞれの２通りのプレートの１ウェル中の細胞を上清中へかき落とす（ｓｃｒａｐｉｎｇ）ことにより集めた。集めた細胞を３回凍結融解し、滴定まで−８０℃で保管した。それぞれのｈｐｉにおける感染力価を、８ウェルＬａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ニューヨーク州ロチェスター）において、系列希釈した接種物、続いてＰＣＶ２  ＯＲＦ２モノクローナル抗体によるＩＦＡを用いて、スペアマン−カーバー（Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ）法を用いて決定した（Ｍ．  Ｆｅｎａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２，  上記）。
【００５６】
データは、ＳＤＭ−Ｃ６キメラウイルスが、ＰＣＶ１ウイルスが増殖するのと同じくらいよく、９６ｈｐｉにおいて２．２０  ｘ  １０４．０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価まで増殖し（図２）、一方でＰＣＶ２は９６ｈｐｉにおいて２．２０  ｘ  １０３．０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬまでしか増殖しなかったことを示した。１２ｈｐｉにおいて、キメラＳＤＭ−Ｃ６ウイルスは６．９５  ｘ  １０２．０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価まで増殖し、一方でＰＣＶ１およびＰＣＶ２ウイルスは両方とも検出不能な力価を有しており、これはそのキメラウイルスが親ウイルスよりも速く複製するという結論を可能にする。ＰＣＶ１は２４ｈｐｉまでには検出可能なウイルスの力価である８．７０  ｘ  １０２．０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬを有しており、一方でＰＣＶ２は４８ｈｐｉ（７．９１  ｘ  １０１．０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）まで検出可能な力価を有しなかった。従って、キメラＳＤＭ−Ｃ６ウイルスおよびＰＣＶ１は類似の力価まで増殖し、それは親のＰＣＶ２ウイルスの力価よりもおおよそ１−ｌｏｇ高かったことが観察された。
【００５７】
上記において、本発明の特定の態様の詳細な記述を、説明のために、かつ限定のためでは無く提供した。この開示に基づいて当業者には明らかである全ての他の修正、分岐および均等物は、主張される本発明の範囲内に含まれることを意図することは理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１ａ】
2011519273.tif 000003
【図１Ｂ】
2011519273.tif 000004
【図１ｂ】
2011519273.tif 000005
【図１Ｃ】
2011519273.tif 000006
【図１ｃ】
2011519273.tif 000007
【図２】
2011519273.tif 000008
【配列表】
2011519273000001.app
【国際調査報告】
2011519273.tif 000009