(57)【要約】  本発明の実施態様は、生物防除剤としての、即ち植物の真菌病を治療するためのトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１（ＣＢＳ番号１２２０８９）である。本発明の第二実施態様は、トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１を有効成分として有効量含む農業組成物である。本発明の組成物は、更に、第二生物防除剤及び／若しくは添加剤、乳化剤、植物栄養剤、湿潤剤、植物微量栄養剤又は基層を含んでもよく、ここで、前記基層は、栄養培地、穀物若しくはその誘導体、アメンダント、野菜若しくはその一部分、ピート、木若しくはその断片、粘土又は樹皮からなる群から選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物防除剤としてのトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１（ＣＢＳ番号１２２０８９）。
【請求項２】
植物の真菌病を治療するための請求項１に記載のトリコデルマ。
【請求項３】
同じ植物の病原体特異性を備える請求項１に記載のトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１に由来する変異体又は菌株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１を有効成分として含む農業組成物。
【請求項５】
１０２〜１０３分生子ｍｌ−１又はｇ−１の有効量を含む請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
更に、第二生物防除剤及び／若しくは添加剤、乳化剤、植物栄養剤、湿潤剤、植物微量栄養剤、又は基層を含む請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
前記基層が、栄養培地、穀物若しくはその誘導体、アメンダント、野菜若しくはその一部分、ピート、木若しくはその断片、粘土又は樹皮からなる群から選択される請求項４〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１を基層の中又は上に接種することと、少なくとも１０２〜１０３ｍｌ−１又はｇ−１の分生子数を得るまで１〜３０℃の温度でそれを成長させることとを含む農業組成物の調製方法。
【請求項９】
更に、凍結乾燥工程を含む請求項８に記載の農業組成物の調製方法。
【請求項１０】
前記基層が、栄養培地、穀物若しくはその誘導体、野菜若しくはその一部分、木若しくはその断片、アメンダント、ピート、粘土又は樹皮からなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記栄養培地が、少なくとも炭素源及び窒素源を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記炭素源が、マンノース、ガラクトース、スクロース、マルツエキス、セルビオース、グルコース、及びスレアロースからなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記窒素源は、酵母エキス、亜硝酸塩、トリプトン、ペプトン、グルタミン、及びアスパラギンからなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記穀物が米又は小麦である請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の接種前に前記基層を栄養培地で処理する請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記栄養培地を前記基層上に吹き付ける請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記吹き付けられた基層が樹皮である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
植物病原菌が原因の病気から植物を保護する方法であって、少なくとも植物の一部分又は前記植物近傍にある土壌を請求項３〜５のいずれかに記載の組成物で処理することを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記植物の一部分が、葉、果実、種子、又は創傷部である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が請求項７に従って調製されたことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記病原菌が、木の病気（ファエオモニエラ・クラミドスポラ、ファエオアクレモニウム・アレオフィルム及びフォミチポリア・メジテラネア）、葉の病気（粉末ウドンコ病病原体ポドスファエラ・キサンチイ）、果実及び花の病気（ボトリチス・シネレア）、並びにアルミラリア属（アルミラリア・メレア及びＡ．ガリカ）に起因する根の病気の原因になるものからなる群から選択される請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記植物が、ウリ科、バラ科、ブドウ科、アブラナ科、キク科、セリ科、ナス科及びユリ科からなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記植物が、ウリ科、バラ科又はブドウ科からなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜３のいずれかに記載のトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の凍結乾燥物又は寒天中での培養物。
【請求項２５】
請求項１〜３のいずれかに記載の微生物を有効量含むか又は請求項４〜６のいずれかに記載の組成物で処理した基層。
【請求項２６】
請求項７〜１６のいずれかに記載の方法に従って得られる請求項２５に記載の基層。
【請求項２７】
樹皮である請求項２５又は２６に記載の基層。
【請求項２８】
トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の特異的検出方法であって、エンドキチナーゼ４２遺伝子（ｅｃｈ４２）ジェンバンク受入番号ＡＢ０４１７５３．１及びＧタンパク質αサブユニット遺伝子（ｔｇａ３）ジェンバンク受入番号ＡＦ４５２０９７．１の平行増幅を適切なプライマーセットによるＰＣＲによって達成し、前記トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１を含むサンプルにおいては、エンドキチナーゼ４２遺伝子の位置１８５及び１９６における二つの多形ヌクレオチドを特異的に同定することを特徴とする方法。
【請求項２９】
エンドキチナーゼ４２遺伝子（ｅｃｈ４２）増幅のためのプライマーセットが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩＤＮＯ：２の配列を有しており、Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子（ｔｇａ３）増幅のためのプライマーセットが、ＳＥＱＩＤＮＯ：４及びＳＥＣＩＤＮＯ：５の配列を有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
リアルタイムＰＣＲであり、（ｅｃｈ４２）のプローブは、エンドキチナーゼ４２遺伝子の位置１８５及び１９６における多形ヌクレオチドを含み、好ましくはＳＥＱＩＤＮＯ：３に対応する請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、病原性真菌に起因する植物の病気の、新規トリコデルマ・アトロビリデ（Trichoderma atroviride）菌株で表わされる生物防除剤による生物防除である。
【背景技術】
【０００２】
化学殺菌剤の置換又は減少は、生物学に基づいた殺菌剤の使用、Ｃｏｏｋ及びＢａｋｅｒ（１９８３）が提案した生物防除の定義に含まれるアプローチによって達成された：「生物防除は、ヒト以外の一種以上の生物によって又は介して成し遂げられる、病原体の接種量又は病気を引き起こす活動の低減である」。
【０００３】
この広い定義には、病原体の毒性がより低い変種、宿主の耐性がより大きな品種、及び「病原体の生存活動又は病気を引き起こす活動を妨げる」微生物アンタゴニストの使用が含まれる。
【０００４】
環境相互作用のより複雑な評価は、かかる生物防除剤（ＢＣＡｓ）を使用することを要する。実際、環境条件は、ＢＣＡｓの生存のみならず、それらの病原体に対する有効性にも影響を及ぼす（Ｐａｕｌｉｔｚ，２０００）。環境への適応の観点からより柔軟性のあるＢＣＡｓは、それらの用途及び目標市場が特定の環境条件を必要とするＢＣＡｓより広い場合があるので、商業的な製品として非常に容易に発展することができる。
【０００５】
好ましくない環境条件に対する耐性が強化された拮抗性トリコデルマ菌株の選択は、トリコデルマ系生物防除プログラムの信頼性を増大させることができる（Ｋｒｅｄｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。また、植物病原体に対する使用に最も有効なＢＣＡｓは、それらの目標病原体より優れたストレス耐性を有するものであることに注目することが重要である（Ｋｒｅｄｉｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；２００４）。
【０００６】
トリコデルマは、汎存属であり、土壌、根圏及び葉圏にコロニーを作ることができる。トリコデルマ種は、木質材料及び植物質を腐らせるときにしばしば見つけられる。幾つかのトリコデルマ菌株は、工業用酵素の経済的に重要な産生株である。
【０００７】
トリコデルマ菌株は、多くの植物病原体に対する生物防除剤として既に使用されているが、農作物及び温室作物の商業的な生物防除製品（即ち、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum），Ｔｒｉｃｈｏｄｅｘ（登録商標）として知られている）としての使用については、かなりの数が開発されてきた（Ｅｌａｄ，２０００；Ｈａｒｍａｎ，２０００）。
【０００８】
しかしながら、生物防除活動、特異性、作用機序、代謝物の産生、及び土壌中又は植物上での生存の観点から、ＢＣＡｓとしての使用に影響を及ぼすトリコデルマ種の間で、大きなばらつきが存在する（Ｂｅｎｉｔｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００９】
更に、十分に有効な生物防除剤が単離も特徴付けもされていないブドウ上のアルミラリア属に起因するもののような、幾つかの重要な病原体が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の実施態様は、生物防除剤としての、即ち植物の真菌病を治療するためのトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１（ＣＢＳ番号１２２０８９）である。
【００１１】
本発明の第二実施態様は、トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１を有効成分として有効量含む農業組成物である。本発明の組成物は、更に、第二生物防除剤及び／若しくは添加剤、乳化剤、植物栄養剤、湿潤剤、植物微量栄養剤又は基層を含んでもよく、ここで、前記基層は、栄養培地、穀物若しくはその誘導体、アメンダント（amendant）、野菜若しくはその一部分、ピート、木若しくはその断片、粘土又は樹皮からなる群から選択される。
【００１２】
更なる実施態様は、木の病気（ファエオモニエラ・クラミドスポラ（Phaeomoniella chlamydospora）、ファエオアクレモニウム・アレオフィルム（Phaeoacremonium aleophilum）及びフォミチポリア・メジテラネア（Fomitiporia mediterranea））、葉の病気（粉末ウドンコ病病原体ポドスファエラ・キサンチイ（Podosphaera xanthii））、果実及び花の病気（ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea））、並びにアルミラリア属（アルミラリア・メレア（Armillaria mellea）及びＡ．ガリカ（gallica））に起因する根の病気の原因になるものからなる群から選択される病原菌が原因の植物の病気を治療又は予防する方法である。
【００１３】
植物若しくは植物の一部分に直接的に、又は間接的に土壌中若しくはその上にあるトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１（ＣＢＳ番号１２２０８９）を富ませた基層を植物の近傍に適用することで、処理を行うことができる。この処理から利益を得る植物は、好ましくは、ウリ科、バラ科、ブドウ科、アブラナ科、キク科、セリ科、ナス科及びユリ科からなる群から選択される。
【００１４】
本発明の更なる実施態様は、微生物トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１を有効量含むか又は前記菌株を有効量備える組成物で処理した基層である。好ましい基層は、樹皮又は炊いた米で表される。
【００１５】
更なる実施態様は、トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の特異的検出のための分子的方法で表わされ、ここで、エンドキチナーゼ４２遺伝子（ｅｃｈ４２）ジェンバンク受入番号ＡＢ０４１７５３．１及びＧタンパク質αサブユニット遺伝子（ｔｇａ３）ジェンバンク受入番号ＡＦ４５２０９７．１の平行増幅を適切なプライマーセットによって達成し、前記トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１を含むサンプルにおいては、エンドキチナーゼ４２遺伝子の位置１８５及び１９６における二つの多形ヌクレオチドを観察する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】異なる温度でのトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の放射方向成長。トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１をジャガイモブドウ糖寒天（ＰＤＡ）上で成長させ、異なる温度でインキュベートした：１０℃（◇）、１５℃（●）、２０℃（■）、２５℃（△）及び３０℃（×）。−１℃、５℃、３７℃又は４０℃では、成長が観測されなかった。データ点は、１０回の反復試験の平均値である。同一文字を伴う値は、チューキー法によれば有意差がない（Ｐ≦０．０５）。成長開始前期間（遅延期間）は、２０℃、２５℃及び３０℃で１日であり、１５℃で２日であり、１０℃で３日であった。
【図２】トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１放射方向成長に対するｐＨの効果。ジャガイモブドウ糖寒天（ＰＤＡ）上で、異なるｐＨレベルにて成長を行った。ｐＨ３（△）、ｐＨ４（□）、ｐＨ５（▲）、ｐＨ６（＋）、ｐＨ７（●）、ｐＨ８（◇）、ｐＨ９（×）及びｐＨ１０（■）。データ点は、１０回の反復試験の平均値である。同一文字を伴う値は、チューキー法によれば有意差がない（Ｐ≦０．０５）。
【図３】トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の成長速度に対する水分活性の効果。トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１を、グリセロールで修飾したジャガイモブドウ糖寒天上で、０．９９８（▲）、０．９９０（■）、０．９８０（△）、０．９６０（×）、０．９４０（●）及び０．９１０（○）の水分活性レベルにて成長させた。データ点は、１０回の反復試験の平均値である。同一文字を伴う値は、チューキー法によれば有意差がない（Ｐ≦０．０５）。成長開始前期間（遅延期間）は、０．９９８、０．９９０及び０．９８０で１日であり、０．９４０で２日であり、０．９１０で４日であった。
【図４】ｅｃｈ４２及びｔｇａ３の多重増幅。純粋なトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１  ＤＮＡの特異的プローブｅｃｈ４２（■）及び一般的プローブｔｇａ３（○）を用いて増幅を行った。二つの希釈曲線は重なり合い、同一の効率、決定係数（Ｒ２）及び勾配を有する。
【図５】トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１  ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲによる回復。核酸量は、既知量の分生子を接種した土壌１ｇにおける一倍体ゲノムコピー数として表される。６の独立した数量化から標準偏差（％）を求めた。
【図６】コロニー形成単位（ＣＦＵ）として評価したイチゴ葉上のトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の生存。０日目に分生子−水の懸濁液（１０６ＣＦＵ・ｍｌ−１）を吹き付けることによって、葉に接種した。データ点は、１０回の反復試験の平均を表す。データをｌｏｇ（ｘ）で変換した。誤差棒は、平均値の標準偏差を表す。
【図７】静置土壌ミクロ生態系でのトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の生存。０日目に１０６ＣＦＵ・ｇ−１土壌の速度で、三つの異なる滅菌（ａ）及び非滅菌（ｂ）土壌：土壌１（●）、土壌２（□）及び土壌３（△）に対して真菌を適用した。データ点は、５回の反復試験の平均を表しており、ｌｏｇ（ｘ）で変換した。各日についての異なる文字は、チューキー法によれば著しく異なる値（Ｐ≦０．０５）を示唆する。
【図８】粉末ウドンコ病感染の重症度に対するトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の効果。キュウリ（パネルＡ）及びズッキーニ（パネルＢ）の植物に対して人工的にポドスファエラ・キサンチイ（Podosphaera xanthii）分生子を接種し、未処理、硫黄及び二つの生物防除標準物質（トリコデルマ・ハルジアナムＴ３９−取引名Ｔｒｉｃｈｏｄｅｘ（登録商標）−及びＴ．アトロビリデＦ１２２）と比較した。接種して２週間後に評価を行い、重症度を点数化した（感染した葉組織の割合）。処理につき５回の反復試験（植物）を評価した。同じ文字の列は、チューキーＨＳＤによれば有意差がない（Ｐ≦０．０５）。人工的な接種では、各植物上に、分生子の水性懸濁液（１０７分生子ｍｌ−１）約５ｍｌを吹き付けた。日々の適用を接種してから１２時間後に始めた。
【図９】エスカ病の三つの主要な病原体の成長に対するトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の有効性。（ファエオモニエラ・クラミドスポラ（Phaeomoniella chlamydospora）：パネルＡ；ファエオアクレモニウム・アレオフィルム（Phaeoacremonium aleophilum），パネルＢ；フォミチポリア・メジテラネア（Fomitiporia mediterranea），パネルＣ）。制御効力を式：［（Ｃ−Ｔ）／Ｃ］×１００（ここで、Ｃは、処理無しでの病原体の成長であり、Ｔはトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１処理での成長である）に従って算出した。ペトリ皿中のジャガイモブドウ糖寒天上で、エスカ病原体及びＴ．アトロビリデＳＣ１の接種を行った。グラフは、５回の反復試験（ペトリ皿）の平均を表す。
【図１０】トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の存在下及び不在下（未処理）でのアルミラリア・メレア（Armillaria mellea）及びアルミラリア・ガリカ（Armillaria gallica）（根腐れ病原体）の菌糸体成長。トリコデルマ・ハルジアナムＴ３９−Ｔｒｉｃｈｏｄｅｘ（登録商標）−の実験効果を標準比較としてここに示す。成長は、２０℃のペトリ皿上のＰＤＡ上の木片上で成長させた５回の反復試験の直径の平均として表される。
【図１１】土壌処理後にアルミラリア・メレア及びＡ．ガリカに感染した（死んだ）イチゴ植物の割合。トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の効果を未処理のものと比較した。トリコデルマ・ハルジアナムＴ３９−Ｔｒｉｃｈｏｄｅｘ（登録商標）−をＡ．ガリカの比較として用い、Ｔ．アトロビリデＦ１２２をＡ．メレアの比較として用いた。値は、植物の１０回の反復試験で求めた割合である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の目的は、植物の地上部及び根上での真菌病の発生を抑制するための、トリコデルマ・アトロビリデ種に属する生物防除剤、菌株ＳＣ１を提供することである。
【００１８】
好ましい実施態様に従って、トリコデルマ・アトロビリデ，菌株ＳＣ１は、ブダペスト条約の下、ＣＢＳ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）にてＣＢＳ１２２０８９の番号で２００７年１１月２７日に預けられている。
【００１９】
本発明の主要な態様によれば、トリコデルマ・アトロビリデ，菌株ＳＣ１は、植物病原体の発生、特には果実及び根の腐敗、ボトリチス・シネレア（Botrytis cinerea）及びアルミラリア菌種が原因のもの、粉末ウドンコ病、木の病気（エスカ病）等を抑制すること及び防止することが提案されている。
【００２０】
好ましい実施態様によれば、本発明は、トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１を有効量で、固体組成物を用いる場合には少なくとも１０２〜１０３分生子ｍｌ−１又はｇ−１の量で含む組成物を使用することを特徴とした、真菌病の発生を抑制又は防止する方法を提供する。
【００２１】
トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１は、最も多くのトリコデルマ菌種のように中温性の真菌である（Ｋｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｅｖｅｌｅｉｎｇｈ，１９９８）。それは、単独の炭素源及び窒素源として広範囲に及ぶ化合物を利用することができる。培地中での真菌の成長は、酵母エキス、亜硝酸塩、トリプトン、ペプトン、グルタミン及びアスパラギン等の一部の窒素源又はマンノース、ガラクトース、スクロース、マルツエキス、セルビオース、グルコース及びスレアロース等の一部の炭素源の場合に優れている。
【００２２】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、−１〜３５℃の温度範囲において生存し、５〜３０℃の温度範囲で成長する。成長の最適温度は、２５℃±１℃であるが、２０℃での真菌の放射方向成長は、２５℃で観測された成長と比べて有意差がない。Ｔ．アトロビリデＳＣ１の生存のための最高温度（３０℃）は、ヒトの体温より低く、この真菌がヒトに対して病原性が無いことを良く示している。
【００２３】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１のｐＨに対する許容レベルは、トリコデルマ菌株の通常の範囲内にあり、即ち３〜１０のｐＨ範囲である。Ｔ．アトロビリデＳＣ１の水分活性許容度（ａｗ）の最小限度は、０．９１０である。水分活性の好ましい値は、０．９９８であり、大部分の真菌性植物病原体に好まれる高い相対湿度条件の値（９０−１００％）に相当する。
【００２４】
トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１は、以下に示す特性によって特徴付けられる：
−  それは、アルミラリア菌種が原因の病気、及び有効な化学農薬が知られていない「エスカ病」の病原体に対して特に活性がある。本発明によれば、「アルミラリア菌種」の語は、特にアルミラリア・メレア及びアルミラリア・ガリカを包含し、「エスカ病」の語は、エスカ病を引き起こす最も重要な病原体、特にはファエオモニエラ・クラミドスポラ、ファエオアクレモニウム・アレオフィルム及びフォミチポリア・メジテラネアを包含する。アルミラリア菌種は、４００を超える植物種（作物及び森林樹）に影響を及ぼす。「エスカ病」の病原体は、ブドウに影響を及ぼす。
−  それは、トリコデルマ・ハルジアナムＴ３９（取引名Ｔｒｉｃｈｏｄｅｘ（登録商標））又はＴ．アトロビリデＦ１２２（Ｌｏｎｇａ，２００７）等の他の既知のトリコデルマ菌株と比べて、（ポドスファエラ・キサンチイが原因の）粉末ウドンコ病に対して有効である。粉末ウドンコ病は、正常な状態の（order）エリシファレ（Erysiphale）における菌類の多くの異なる種が原因となる真菌病であり（Ｓｐｅｎｃｅｒ，１９７８）、特にはブドウ、リンゴ、イチゴ、園芸作物及び草花栽培作物に対して、経済的に重大な損害を与える。
−  それは、土壌中において有効レベルで長い期間（１年を超える期間）持続する。
−  それは、野菜又は木の一部に容易に分散でき、そこで、抗真菌剤として１年を超える期間生存する。
【００２５】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１を用いて行った幾つかの試験は、実験パートにおいて更に詳細に説明されるが、それが、植物上での真菌病を抑制するための最適な生物防除剤として提案されることを可能にする。
【００２６】
好ましい実施態様によれば、Ｔ．アトロビリデＳＣ１の農業組成物の調製は、懸濁液中の一般的な栄養基体上に又は固体基体上に、少なくとも１０２〜１０３分生子／ｍｌ−１又はｇ−１の基質（活性濃度）を得るように、Ｔ．アトロビリデＳＣ１を接種することで行われる。
【００２７】
最も一般的に使用される液体培地又は半固体培地には、栄養ブロス、ジャガイモブドウ糖寒天（ＰＤＡ）、栄養寒天、マルツエキス寒天、マルツ寒天、ＬＢブロス及び当業者に知られている類似のものが含まれ、そこで、連続振盪下、少なくとも４８時間、好ましくは７２時間又は分生子が作られるまで、２０℃〜３０℃の最適な成長温度、好ましくは２２〜２６℃又は約２５℃±１℃にて、真菌を成長させる。これらの条件では、最初の分生子が少なくとも４８時間後に作られる。
【００２８】
好ましい固体基体は、無菌化穀物（炊いた米又は小麦等）、小麦粉若しくは粉砕した穀物、又は類似の炭水化物が豊富な基体が含まれ、そこに、Ｔ．アトロビリデＳＣ１を接種し、少なくとも一週間、２０〜３０℃又は好ましくは２２〜２６℃又は約２５℃±１℃にてインキュベートする。小麦粉又は粉砕した穀物等の穀物誘導体も同様に適している。
【００２９】
植物の治療及び／又は予防は、液体培地若しくは半固体培地中で又は固体基体上で成長したＴ．アトロビリデＳＣ１培養物を用い、かかるＴ．アトロビリデＳＣ１懸濁液を植物の一部の上に適用したり又は該ＳＣ１の豊富な基体をかかる治療が必要な植物の近傍にある土壌上に又はその中に適用することによって行われる。
【００３０】
植物に、植物の葉の上に、切断若しくは刈り込み時にできた創傷上に、又は土壌に、農業組成物を適用し、根についての真菌病の発生を抑えることにより、処理を行うことができる。特定の病気に適応させるべきタイミングで（即ち、感染前で、移植、開花、収穫後のような特定の生物季節学的段階にて）、植物に対して一般的な殺菌剤として吹き付けることにより、処理を適用する。また、土壌に吹き付けたり若しくは注入したりして処理を行うことができ、幾つかの基体上の土壌と共に異なる製剤（即ち、粘土若しくは類似の製品、樹皮、野菜、又は他の有機物若しくは類似物若しくは誘導体と混合させた顆粒剤）を混合させる。植物の生育期間又は休眠中に処理を適用することができる。処理を刈り込み後に吹き付けて行ったり又は刈り込み創傷部に直接適用したりして、感染を防止することができる。処理は、毎週又はより高い頻度で、更には一年に一度適用できる。処理は、一回（即ち、土壌への植え付け時に）適用してもよいし、必要に応じて繰り返してもよい。
【００３１】
土壌中での高い持続性、及び樹皮等の土壌支持体上での分散の容易さは、植物及び／又は植物を備える領域を処理するのに特に適した本発明の微生物を提供し、処理の回数を最小限に抑える。
【００３２】
培養基層は、液体、固体又は半固体（ゼリー）の場合がある有機培養支持体、米、樹皮若しくは木片若しくはピート等の野菜アメンダントのような有機物のもの、粘土のような無機物（即ち鉱物）のものを意味する。基層は、栄養剤若しくはマトリックス作用剤又はその両方を有していてもよい。木片、樹皮又は無機物の基層は、ＳＣ１接種の前に栄養剤で前処理されるのが好ましい。
【００３３】
注目すべきは、樹皮片上での成長は、１２２Ｆ菌株のような他のＴ．アトロビリデ菌株では不可能である。従って、この実施態様は、本発明に従うＳＣ１菌株の更に目立った特徴を表す。
【００３４】
また、Ｔ．アトロビリデＳＣ１分生子を集めて（即ち、空気フラックス又は培養基層の洗浄により集めて）、液体又は液体栄養剤中に分散させることができる。このような懸濁液、つまり農業組成物は、植物に直接的に又は植物近傍の土壌に対して適用される。それは、炭素源（即ち、糖）及びアミノ酸、ペプチド等の窒素源のような栄養剤、栄養要素、又はインサイチューでの微生物の良好な維持のための植物微量栄養剤と組み合わせて適用されるのが好ましい。
【００３５】
上記組成物は、レシチン、サポニン等の乳化剤、Ｔｗｅｅｎ８０等の湿潤剤、又は類似物、ＵＶ保護剤、乳化剤を備える抗酸化剤、希釈剤、湿潤剤、噴霧アジュバントを更に含んでもよい。本発明の目的のため、Ｔ．アトロビリデＳＣ１を有効量１０２〜１０３分生子ｍｌ−１又はｇ−１含んでなる固体又は液体の培養基層を農業組成物とみなす。
【００３６】
少なくとも１０２〜１０３ｍｌ−１又はｇ−１の分生子を含む懸濁液又は組成物は、植物若しくは根、葉、種子、果実等の植物の一部分に直接適用されるか、又は土壌、好ましくは上記固体支持体上にある土壌に間接的に適用される。
【００３７】
上記農業組成物においては、ＳＣ１菌株を、第二の、即ち更なる生物防除剤、栄養補助剤、肥料、鉱物、植物ホルモン、植物成長用の修正剤（amender）、Ｔ．アトロビリデＳＣ１に対して無毒性の化学農薬、又は洗浄水中で刈り込み創傷部を保護するためのワックスと任意に混合することができる。
【００３８】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１で土壌を処理する最も好適な方法の一つは、この菌株を穀物（即ち、炊いた米）又は樹皮又は木片又はピート等の野菜修正剤のような基体上で成長させ、処理されるべき植物／複数の植物に近傍の土壌上に又はその中に前記支持体を分布させることである。
【００３９】
かかる固体基体（即ち、樹皮片）上での有効量のＴ．アトロビリデＳＣ１培養物（１０２〜１０３分生子ｍｌ−１又はｇ−１）の成長は、それを微生物培地（ジャガイモブドウ糖ブロス、マルツエキス、栄養ブロス又はその類似物等）又は炭素源及び窒素源を含有する栄養物質（牛肉エキス、ペプトン、粉砕穀物、酵母エキス、スクロース又はその類似物等）で前処理し、かかる基層にＴ．アトロビリデＳＣ１を接種し、それを上記の条件で少なくとも一週間又はコロニー形成が得られるまでインキュベートすることにより行われるのが好ましい。
【００４０】
また、組成物は、感染プレート又は培養基体から分生子を洗い流し、病原体の感染前に植物の地上部に、毎週、一部の特異的な植物の生物学的段階で又は刈り込み、切断、植え付けのような一部の農作業の後に、かかる懸濁液を吹き付けることにより調製できる。
【００４１】
上記組成物が無事に適用される植物は、ウリ科、バラ科、ブドウ科、アブラナ科、キク科、セリ科、ナス科及びユリ科からなる群から選択されるのが好ましい。特に好ましい植物は、ウリ科、バラ科、ブドウ科である。
【００４２】
接種された固体基層（即ち、樹皮又は野菜修正剤）による処理又は吹き付け等の他の手段による処理は、植物の培養を通していつでも行われ、生存する土壌伝播性の病原体の制御を提供したり又は新たな感染を防止する。
【００４３】
本発明の生物防除剤による根圏処理の好ましい方法は、無菌化された炊いた米（又は他の穀物）中で、数日（最低限１週間、通常１５日）の間、最適範囲の温度、好ましくは約２５℃±１℃にて、１０７〜１０８分生子／１００ｇ炊いた米又は１×１０６ｃｆｕ ｇ−１土壌の範囲の最適接種量が得られるまで、Ｔ．アトロビリデＳＣ１を成長させることにより達成される。この実施態様によれば、生物防除剤は、菌が豊富な米のマトリックスとして直接適用される。
【００４４】
ＢＣＡの制御に最重要となる、環境において放出された微生物の運命及び挙動を監視するためには、分子アプローチ（リアルタイムＰＣＲ）を開発し、本発明の更なる実施態様を表す。
【００４５】
この方法は、環境中のＴ．アトロビリデＳＣ１を追跡及び数量化すること、特には放出された菌株を同定すること、それを天然の微生物群集と区別すること、その個体群の動態を経時的に追跡することを可能にする。
【００４６】
実際には、欧州における農薬としての特異的な生物防除剤（ＢＣＡ）の登録は、食料品の混入（生存可能な及び生育不能なＢＣＡ残留物）の可能性の評価に加えて、環境におけるＢＣＡの持続性及び増殖に焦点を合わせたリスク評価を必要とする。
【００４７】
本発明の更なる実施態様に従って開発された分子試験は、Ｔ．アトロビリデＳＣ１エンドキチナーゼ遺伝子（ｅｃｈ４２）に基づいている（Ｃａｒｓｏｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。従って、リアルタイムＰＣＲプライマー及び菌株特異的ＴａｑＭａｎプローブセット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．ルイス，ミズーリ）が、ジェンバンク受入番号ＡＢ０４１７５３．１配列の番号付けに従う位置１８５及び１９６におけるｅｃｈ４２遺伝子の３'ストランド上の二つのヌクレオチドミスマッチに基づいて設計された。第二プライマーセット及びＴａｑＭａｎプローブは、ｔｇａ３遺伝子に対して設計され、それは、Ｇタンパク質αサブユニットをコード化する（表１）。
【００４８】
ｅｃｈ４２及びｔｇａ３プライマーを用いたＰＣＲは、トリコデルマ菌種株からの全ＤＮＡの特異的な増幅産物をもたらしたが、土壌サンプルからの他の真菌ではなかった（即ち、アスペリギルス（Asperigillus）菌種、ペニシリウム（Penicillium）菌種、クラドスポリウム（Cladosporium）菌種）。該産物は、各遺伝子について単一の融解ピークを与え、該プライマーがｅｃｈ４２及びｔｇａ３産物だけを増幅したことを示す。
【００４９】
逆に言えば、ｅｃｈ４２遺伝子配列（好ましくはＳＥＱＩＤＮＯ３）の二つのＳＣ１特異的点変異を含有するｅｃｈ４２ＴａｑＭａｎプローブの存在下でリアルタイムＰＣＲを行うと、Ｔ．アトロビリデＳＣ１のみが単一の信号を作り、プローブ増幅産物ハイブリダイゼーションはブドウ及び土壌サンプルにおける他の真菌（含まれる菌株Ｆ１２２及びＳＢ１８）に対して起こらず、ｅｃｈ４２プローブの高い特異性が確認される。
【００５０】
一連の濃度のＴ．アトロビリデＳＣ１  ＤＮＡに対するｅｃｈ４２及びｔｇａ３ＴａｑＭａｎプローブの二重増幅は、与えられた濃度それぞれについて同一の閾値にて起こった。これは、ゲノムにおけるｅｃｈ４２アンプリコンの単一コピーとＴｇａ３遺伝子の単一コピーとがあることを実証し、またそれら二つの配列が類似の標準曲線を有するため、適切な増幅プライマーセットを表すことを実証しており、二つの配列それぞれについてのＰＣＲ反応が同等レベルの効率で進行したという事実によって確認されたとおりである（図４）。
【００５１】
この方法は、ＰＣＲ反応につき五つのゲノムコピーの検出限界（ＬＯＤ）及び定量限界（ＬＯＱ）をもたらす。土壌サンプルについては、計算されたＬＯＤが、反応混合物につき３５のコピーまで増加し、ｇ土壌につき６．２×１０３分生子に相当し、ＬＯＱは、２×１０４〜３×１０４ｇ土壌−１の範囲に及んだ。該方法の正確さは、実験パートに示されるように五つの試験分生子濃度レベルにて非常に高いものである。本発明の方法において同定されたＥｃｈ４２Ｐの対立遺伝子変異から開始する当業者は、代替のプライマーセットと、ＳＣ１菌株に特異的な二つの同定されたミスマッチを依然として含む異なるプローブとを容易に特定することができる。また、異なる分子プローブは、プローブ及び／又はプライマーに結合する可能性がある。
【００５２】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１の検出及び定量化のために設計されたリアルタイムＰＣＲプライマー及びプローブを以下の表に示す。ｅｃｈ４２ＴａｑＭａｎプローブの塩基ミスマッチは太字である。
2011518545.tif 000002
【００５３】
以下に、非制限的な例を与え、本発明を更に説明する。
【実施例】
【００５４】
（実験パート）
例１．トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の単離及び成長
真菌株Ｔ．アトロビリデＳＣ１を、イタリア北部で腐ったヘーゼルナッツの木から単離し、単一胞子法により純粋培養液中で得た。ＳａｆｅＣｒｏｐ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ａｇｒａｒｉｏ  ｄｉ  Ｓａｎ  Ｍｉｃｈｅｌｅ  ａｌｌ’Ａｄｉｇｅ）において、それをジャガイモブドウ糖寒天（ＰＤＡ；Ｏｘｏｉｄ，ケンブリッジ，ＵＫ）の斜面上に４℃で保持し、ブダペスト条約の下、ＣＢＳコレクションに預けた（ＣＢＳ  １２２０８９）。該菌株をトリコデルマ・アトロビリデＰ．Ｋａｒｓｔとして形態学的に同定し、その同一性を、ＴｒｉｃｈＯＫＥＹ同定ツール第２版を用いたＩＴＳ配列分析によって確認した（ｗｗｗ．ｉｓｔｈ．ｉｎｆｏ）。
【００５５】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、単独の炭素源及び窒素源として広範囲に及ぶ化合物を利用することができる。培地での真菌の成長は、酵母エキス、亜硝酸塩、トリプトン、ペプトン、グルタミン及びアスパラギン等の一部の窒素源又はマンノース、ガラクトース、スクロース、マルツエキス、セルビオース、グルコース及びスレアロース等の一部の炭素源が供給される場合、有意に優れている。
【００５６】
ソルビトール、ラクトース、マルトース、フルクトース、アラビノース、キシロース、ＮＨ４ＮＯ３、ＫＮＯ３、ＮＨ４Ｃｌ、セリン、アルギニン及びグルタミンは、菌糸体の成長を促進しなかった。
【００５７】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１菌糸体乾燥重量に対する、窒素源（ＮＳ）、ＮＨ４ＮＯ３、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＮＯ３、ＮａＮＯ３、ＮａＮＯ２、セリン、アルギニン、グルタミン、アスパラギン、トリプトン及びペプトン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．ルイス，ＭＯ，ＵＳＡ）、並びに炭素源（ＣＳ）、ソルビトール、ラクトース、マルトース、フルクトース、アラビノース、キシロース、スレアロース、グルコース、セルビオース、マルツエキス、スクロース、ガラクトース及びマンノース（Ｓｉｇｍａ）の効果を試験した。ＮＳ及びＣＳをろ過により無菌化し、２ｇ・ｌ−１（ＮＳ）及び２０ｇ・ｌ−１（ＣＳ）の速度で、ＮＳ及びＣＳを試験する際にそれぞれグルコース（１０ｇ・ｌ−１）（Ｓｉｇｍａ）又はグリシン（１ｇ・ｌ−１）（Ｓｉｇｍａ）で修正されたオートクレーブ処理Ｃｚａｐｅｋ  Ｄｏｘ液体培地（Ｏｘｏｉｄ）に加えた。各栄養培地を１００ｍｌ含有するフラスコに、７日たったＴ．アトロビリデＳＣ１培養液から寒天プラグをそれぞれ接種した。１３日のインキュベーションの後、菌糸体をろ紙によって収集し、乾燥させ、その乾燥重量をモイスチャーバランスＡＭＢ１１０（Ａｄａｍ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，ＵＫ）により測定した。各処理及び研究要素について、５回の反復試験に接種した。実験を２回繰り返し行った。
【００５８】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、１０℃〜３０℃の間の温度で成長することができる。成長の最適温度は２５℃であった。この温度での成長速度は、他の温度と比べて有意に大きかった（Ｐ≦０．０５）（図１）。従って、最適な成長は、２５℃で達成された。最初の分生子が、接種してから３日後に作られた。２０℃での真菌の放射方向成長は、２５℃で観察された成長と比べて有意差がなかった。Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、３５℃又はより高い温度で成長しなかった。３５℃で３０日のインキュベーションの後、真菌は死んでいるとみなした。なぜなら、それは、２５℃の最適温度まで温度を低下させた後でさえも、成長できなかったためである。また、−１℃及び５℃の温度も菌糸体の成長を阻害した。しかしながら、−１℃及び５℃では、３０日後、再度２５℃でインキュベートした際に、真菌はまだ成長することができた。成長がほとんど観察できない又は全く観察できない遅延期は、１０℃（２日）及び１５℃（３日）で最も長かった。
【００５９】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、広範囲に及ぶｐＨレベルの耐性があり（図２）、酸性培地（ｐＨ４〜６）で最適な成長が観察された。Ｔ．アトロビリデＳＣ１の菌糸体の成長は、アルカリ性培地（ｐＨ≧８）で有意に低減し（Ｐ≦０．０５）、８以上のｐＨ値と同様に、胞子形成はｐＨ３で低減した。遅延期は、試験された全ｐＨレベルで同じであった（１日）。
【００６０】
また、成長速度は、水分活性（ａｗ）の変化に影響を受けた。該水分活性は、系中での水のエネルギー状態の測定値であり、即ち、水の蒸気圧を同一温度での純水の蒸気圧で割ったものである（図３）。試験した最高ａｗレベル（０．９９８）は、真菌の成長の最適なレベルであった。このパラメータを０．９９０より下に減少させた場合、成長速度は、未修飾ＰＤＡ培地（ａｗ＝０．９９８）のものと比較して有意に低下した（Ｐ≦０．０５）。制限された成長を０．９１０で観察した。遅延期は、ａｗが０．９４０（２日）及び０．９１０（４日）より下に低下した場合に長かった。
【００６１】
実験条件
Ｔ．アトロビリデＳＣ１に対する温度、ｐＨ及び水分活性（ａｗ）の効果を、ＰＤＡを含有する９０ｍｍペトリ皿上で成長させた培養物中で試験した。各プレートに、７日たった培養物の縁から集めた一つの寒天プラグ（直径５ｍｍ）を接種した。接種プラグを各プレートの中央に置いた。菌糸体の成長を毎日評価した。各レベルの研究パラメータについて、１０回の反復試験プレートに接種した。
【００６２】
温度アッセイでは、プレートを、暗闇で、−１℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃及び４０℃にて、培地ｐＨ５によってインキュベートした。ｐＨアッセイでは、１ＮのＨＣｌ又は２ＮのＮａＯＨの滅菌溶液を加えることによりオートクレーブ処理した後、培地のｐＨレベルを３、４、５、６、７、８、９及び１０に調整した。ａｗの効果を試験するため、増加する量のグリセロールを加えることで培地を修飾し、０．９９０、０．９８０、０．９６０、０．９４０及び０．９１０のａｗレベルを得た。培地のｐＨをオートクレーブ処理の前に１ＮのＨＣｌ又は２ＮのＮａＯＨで４．５に調整した。全ての培地のａｗ値を、ＡｑｕａＬａｂシリーズ３計器（Ｄｅｃａｇｏｎ，Ｐｕｌｌｍａｎ，ワシントン  ＵＳＡ）で測定した。ｐＨ及びａｗアッセイについては、プレートを暗闇で２５℃にてインキュベートした。
【００６３】
放射方向成長をインキュベーションの３日目に評価した。インキュベーションの３日目は、おおよそ、真菌が最適条件下でこのサイズのペトリ皿を完全にコロニー形成させるのに必要とする時間である。
【００６４】
例２．Ｔ．アトロビリデＳＣ１の検出及び数量化
ｅｃｈ４２及びｔｇａ３プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲは、トリコデルマ菌種株からの全ＤＮＡ、他の真菌及び土壌サンプルの増幅産物をもたらした。該産物は、各遺伝子について単一の融解ピークを与え、該プライマーがｅｃｈ４２及びｔｇａ３産物だけを増幅したことを示す。逆に言えば、ｅｃｈ４２遺伝子配列の二つのＳＣ１特異的点変異を含有するｅｃｈ４２ＴａｑＭａｎプローブの存在下で、Ｔ．アトロビリデＳＣ１のみが単一の信号を作り、プローブ増幅産物ハイブリダイゼーションは、他の真菌（含まれる菌株Ｆ１２２及びＳＢ１８）、ブドウ及び土壌サンプルに対して起こらず、ｅｃｈ４２プローブの高い特異性が確認された。ｔｇａ３プローブからなる内部コントロール（二重反応）は、全てのトリコデルマ菌種サンプルのリアルタイムＰＣＲ実験において信号を作ることで、プロセスの正確さを確認した。
【００６５】
一連の濃度のＴ．アトロビリデＳＣ１  ＤＮＡに対するｅｃｈ４２及びｔｇａ３ＴａｑＭａｎプローブの二重増幅は、所定の濃度それぞれについて同一の閾値にて起こった。これは、ゲノムにおけるｅｃｈ４２アンプリコンの単一コピーとＴｇａ３遺伝子の単一コピーとがあること、またそれら二つの配列が類似の標準曲線を有することを実証する。また、我々の結果は、二つの配列それぞれについてのＰＣＲ反応が同等レベルの効率で進行することを示した（図４）。
【００６６】
この方法は、ＰＣＲ反応につき五つのゲノムコピーのＬＯＤをもたらす。土壌サンプルについては、計算されたＬＯＤが、反応混合物につき３５のコピーまで増加し、ｇ土壌あたり６．２×１０３分生子に相当し、ＬＯＱは、２×１０４〜３×１０４ｇ土壌−１の範囲に及んでおり、後者は、一連の別個に接種された土壌に線引きをした（表２）。絶対ＬＯＤは、ＰＣＲ反応当たり８．５×１０３〜１．２×１０４コピーの範囲である。
【００６７】
上記方法の正確さは、試験した五つの分生子濃度レベルで非常に高いものであり（図５）、１０２〜１０７分生子ｇ−１の量での分子法によってＴ．アトロビリデＳＣ１の数量化を得る。
【００６８】
実験条件
リアルタイムＰＣＲプライマー及びプローブ：Ｔ．アトロビリデＳＣ１エンドキチナーゼ遺伝子（ｅｃｈ４２）（Ｃａｒｓｏｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）を、ＮＣＢＩジェンバンクに既に存在している配列に基づいた共通プライマーによって増幅させた。得られた完全配列を、ＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷプログラム（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／］で入手可能）をそれぞれ用いて、同じデータベースの３４の配列と比較し、整列させた。ヌクレオチド配列において幾つかの差異が観測され（特に、特定の遺伝子の第一イントロンでの二つのヌクレオチドミスマッチに気付き）、データベースの一つの配列（日本で単離されたＴ．ハルジアナムＳＫ−５５を指すＮＣＢＩジェンバンク受入番号ＡＢ０４１７５３．１）のみが我々の単離したものと同一であった。従って、リアルタイムＰＣＲプライマー及び菌株特異的ＴａｑＭａｎプローブセット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．ルイス，ミズーリ）は、ｅｃｈ４２遺伝子の３’ストランド上での二つのヌクレオチドミスマッチに基づき、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖ２．０ソフトウェア（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティ，カリフォルニア）を用いて、設計された（表１）。第二プライマーセット及びＴａｑＭａｎプローブは、ｔｇａ３遺伝子について設計され、それはＧタンパク質αサブユニットをコード化する（表１）。
【００６９】
リアルタイムＰＣＲ：ＩＱ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｗｅｒ  Ｍｉｘ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ヘラクレス，カリフォルニア）、それぞれが０．３μＭのｅｃｈ４２プライマー及びそのプローブ、０．４μＭのｔｇａ３プローブ及びそれぞれが０．６μＭのｔｇａ３プライマーを含有する２０μｌの最終ボリューム中で反応を行った。リアルタイムＰＣＲは、ＭＪ  Ｃｈｒｏｍｏ４サーモサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ウォルサム，マサチューセッツ）において以下に示す標準プログラムにより行われた：初期変性では２分３０秒９５℃、伸長工程では９５℃で１５秒及び１分６１℃のサイクルを４０サイクルであり、ここで、蛍光信号をＯｐｔｉｃｏｎ２ソフトウェア（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ウォルサム，マサチューセッツ）により測定・分析した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  ケミストリーによりサンプルを分析する場合には、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，フォスターシティ，カリフォルニア）を、０．３μＭのｅｃｈ４２プライマーセット及び０．３μＭのｔｇａ３プライマーセットと共に使用した。次いで、増幅条件を変えた：９５℃で１０分の加熱開始、伸長では９５℃１５秒及び６１℃で１分のサイクルを４０サイクル、４０℃〜９０℃の最終融解曲線、その間、サンプルをゆっくり加熱した（１０秒毎に０．５℃）。
【００７０】
ＤＮＡサンプルの定量は、サンプルの閾値サイクル（Ｃｔ）値を、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カールズバッド，カリフォルニア）によって先に定量化された精製ゲノムＴ．アトロビリデＳＣ１  ＤＮＡの既知濃度の標準回帰曲線のＣｔ値で補間することにより行われた。標準曲線は、ＳＣ１ゲノムＤＮＡの八つの１：３段階希釈に基づいており、各ＰＣＲの実行に含めた。得られた曲線は、傾きが３．０〜３．５の範囲であり、決定係数が０．９より高く、ＰＣＲ効率が１００％であった。ＳＣ１の定量は、ゲノムの一倍体コピー数として表され、トリコデルマの単一コピーゲノムサイズが０．０３４ｐｇであるとみなされた。
【００７１】
特異性：上記方法の特異性は、培養収集からのトリコデルマ菌種の５０個の単離物（ＣＢＳからの２６個の単離物、ＡＴＣＣからの１個の単離物、パビア大学からの１３個の単離物、及びＳａｆｅＣｒｏｐからの２個の単離物、即ちＦ１２２及びＳＢ１８）、市販の生物農薬として用いられる２個の単離物（Ｔ．ハルジアナムＴ３９及びＴ．ハルジアナムＴ２２）、イタリア北部の商業ブドウ園で集められた土壌からの６個のトリコデルマ単離物（ＧＩＳ座標：Ｎ４６°１０．８９７’及びＯＥ１１°０６．９８３’）上で試験された。試験した単離物の７個をＴ．アトロビリデとして確認した。また、特異性は、土壌中に一般的に存在する真菌属上で試験した：ＳａｆｅＣｒｏｐ（２１）若しくはＣＢＳ（１）収集又は土壌からの単離（７）からの、アスペルギルス（Aspergillus）、クラドスポリウム（Cradosporium）、ペニシリウム（Penicilllium）、フサリウム（Fusarium）、アウレオバジジウム（Aureobasidium）、ムコール（Mucor）、グリオクラジウム（Gliocladium）、リゾプス（Rhizopus）、アクレモニウム（Acremonium）、コエロマイセテス（Coelomycetes）、ゲオトリクム（Geotricum）プラスモパラ（Plasmopara）及びアルミラリア（Armillaria）である。
【００７２】
全ての真菌単離物をジャガイモブドウ糖寒天（ＰＤＡ，Ｏｘｏｉｄ，ベーシングストーク，英国）上で成長させた。ＤＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ヒルデン，ドイツ）を用いて、５０〜１００ｍｇの菌糸体からＤＮＡを直接抽出した。Ｔ．アトロビリデＳＣ１に対する方法の特異性は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ試験で得た増幅産物及び融解曲線を、ｅｃｈ４２及びｔｇａ３特異的ＴａｑＭａｎプローブを用いて得たものと比較することで試験された。
【００７３】
また、トレンティノから４個及び他のイタリア地域（マルケ、バレダオスタ、エミリアロマーニャ、及びカラブリア）から６個の、１０個の土壌サンプルも特異性試験に含めた。ＤＮＡは、注記されない限り、通常、ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏ  Ｂｉｏ，カールズバッド，カリフォルニア）のために規定されたプロトコルに従って、一晩乾燥した２００ｍｇの土壌サンプルから抽出された。
【００７４】
ヴィティス・ヴィニフェラ（Vitis vinifera）栽培品種カベルネ（Cabernet）からのＤＮＡを特異性試験に含め、Ｔ．アトロビリデＳＣ１で処理した土壌に存在する根の物質からのＤＮＡの増幅を制御した。植物ＤＮＡは、ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，イタリア）を用いて抽出された。Ｔ．アトロビリデＳＣ１のゲノムＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析では、対照として用いた他の真菌ＤＮＡ及ぶブドウＤＮＡを約０．２〜１ｎｇ取り込み、各ＰＣＲ反応では、１〜５ｎｇのＤＮＡ（４ｍｇの土壌サンプルそれぞれから抽出した合計量）を取り込んだ。
【００７５】
再現性、精度及び感度：我々のリアルタイムＰＣＲ手順の再現性は、ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ  Ｍｅｇａ  Ｐｒｅｐ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｏ  Ｂｉｏ，カールズバッド，カリフォルニア）のための製造業者の使用説明書に従い、純粋Ｔ．アトロビリデＳＣ１  ＤＮＡと真菌（１０７分生子ｇ−１）が予め接種された土壌７．５ｇから抽出し、４ｍｌで溶出した全ＤＮＡとの懸濁液に対して評価された。方法の精度は、異なる濃度のＴ．アトロビリデＳＣ１を含有する土壌を用いて評価された。この評価では、篩にかけた滅菌砂状土壌５０ｇのバッチを、最終濃度が１０７、１０６、１０４及び１０２分生子ｇ−１土壌に達するように、１０ｍｌのＴ．アトロビリデＳＣ１分生子懸濁液と混合した。土壌を一晩６０℃にて乾燥させ（２００ｍｇ）、それらの各分生子濃度を二つの独立したリアルタイムＰＣＲの実行で定量化した後に、各濃度処理について、三つの独立サンプルからＤＮＡを抽出した。
【００７６】
定量法の正確さは、推定ゲノムコピーを期待分生子濃度と比較することで求められた。
【００７７】
感度：リアルタイムＰＣＲ法の感度は、検出限界（ＬＯＤ）及び定量限界（ＬＯＱ）によって定義された。ＬＯＤは、再現性条件下での標準偏差が３３％以下のサンプルにおける最低コピー数に相当する。ＬＯＱは、再現性条件下での標準偏差が２５％以下のサンプルにおける最低コピー数に相当する。方法の絶対ＬＯＤは、少なくとも９５％の正確さを確保するためにサンプル中に存在する必要のあるコピーの最低数として求められた。
【００７８】
表１  トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の検出及び数量化のために設計されたリアルタイムＰＣＲプライマー及びプローブ。ｅｃｈ４２ＴａｑＭａｎプローブ中の塩基ミスマッチは太字である。
【００７９】
【表１】
2011518545.tif 000003
【００８０】
表２  二つの希釈系列の純粋Ｔ．アトロビリデＳＣ１  ＤＮＡと、二つの希釈系列の、ｌｏｇ１０７分生子ｇ土壌−１が接種された土壌サンプルから抽出した全ＤＮＡと、減少する量の分生子が接種された一連の土壌から抽出された全ＤＮＡの分析とから決定したゲノムコピー数（ＣＮ）の総体標準偏差（ＲＳＤｒ）を用いて決定した検出限界（ＬＯＤ）及び定量限界（ＬＯＱ）。ＬＯＤ及びＬＯＱは相対標準偏差（ＲＳＤｒ）がそれぞれ３３％及び２５％に設定された。絶対ＬＯＤは、９５％のＤＮＡ検出レベルに相当する。
【００８１】
【表２】
2011518545.tif 000004
【００８２】
例３．生成方法及び処理方法
Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、ジャガイモブドウ糖寒天、栄養ブロス、マルツエキス寒天としての幾つかの一般的な実験用培地上で首尾よく成長させた。
【００８３】
それは、以下に示す三つの既知の方法の内の一つによって適用された：培養ブロス中、米上、又は樹皮／ピート上での成長である。
【００８４】
三つの方法は、Ｔ．アトロビリデＳＣ１のうち９９％の生存可能なムカゴを提供した。
【００８５】
米上で生成された又は樹皮上で成長したＴ．アトロビリデＳＣ１は、少なくとも１年間１５℃及び９８％ＲＨにて生存する。Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、野菜修正剤又は樹皮上で成長した。
【００８６】
他のＴ．アトロビリデ菌株の場合には違いが観測され、特には、Ｔ．アトロビリデＦ１２２は、上記条件にて樹皮又はピート上で生存しなかった。
【００８７】
実験条件
農業組成物の調製は、以下に示す方法のうち一つに従って行われた：
ａ）培養ブロス（栄養ブロス又はマルツエキスブロス）のＴ．アトロビリデＳＣ１菌糸体又は分生子（少なくとも１０２分生子／Ｌ）の接種、及び連続振盪下でのインキュベーションを、２０〜２５℃の温度にて少なくとも４８時間行った。ろ過した又はろ過しない培養ブロスを植物に吹き付け又は土壌に取り入れた。
ｂ）滅菌された炊いた米（又は同等の穀物）に分生子Ｔ．アトロビリデＳＣ１菌糸体又は分生子（少なくとも１０２分生子／１００ｇ）を接種し、２１日間２５℃でインキュベートした。土壌処理では、米−Ｔ．アトロビリデＳＣ１を、土壌の最初の３ｃｍにおける接種量が１×１０６ｃｆｕ  ｇ−１土壌であるように、土壌に混合した。葉の処理では、水で洗浄することで、米からＴ．アトロビリデＳＣ１分生子を回収し、他の噴霧アジュバント（湿潤剤、乳化剤等）を添加した場合と添加しない場合で適用した。
ｃ）Ｔ．アトロビリデＳＣ１を、成長微生物培地（栄養ブロス）で予め処理した若しくは処理しなかった樹皮片上で、又は炭素源及び窒素源を含有する栄養物質（粉砕した米）上で成長させた。樹皮にＴ．アトロビリデＳＣ１（少なくとも１０２分生子／１００ｇ）を接種し、少なくとも２日間又はコロニー形成まで２０〜２５℃にてインキュベートした。接種した樹皮は、植物の培養中いつでも修正剤として使用でき、生存する土壌伝播性の病原体の制御を提供したり又は新たな感染を防止する。野菜修正剤（ピート）に、栄養物質なしで、樹皮にしたようにして接種した。
【００８８】
例４．イチゴ葉面上でのＴ．アトロビリデＳＣ１の生存
イチゴ葉面上での生存可能なＴ．アトロビリデＳＣ１分生子の個体群密度は、接種後の第１週目の間にすぐに減少した。真菌の個体群は、適用後１５日目まで、連続する減少を示し、その後、実験を完結した４５日目まで低いＣＦＵ濃度を維持した（図６）。Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、植物毒性を起こさず、イチゴの葉、花又は果実の病原体とならず、イチゴ葉上で一月以上生存した。
【００８９】
実験条件
Ｔ．アトロビリデＳＣ１の分生子懸濁液は、炊いた米上で成長し２１日たった培養物を、滅菌蒸留水（ＳＤＷ）中０．０１％のＴｗｅｅｎ８０（Ｓｉｇｍａ）で洗浄することで得られた。三層の滅菌レンズティッシュを通して、分生子懸濁液をろ過し、菌糸体断片を除去した。分生子濃度は、Ｔｈｏｍａｓ血球計算器を用いて決定され、１０６分生子・ｍｌ−１の濃度に調整した。接種材料中での生存可能な分生子の濃度は、２ｍｌ・ｌ−１のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）で修正されたＰＤＡ上の連続希釈におけるコロニー形成単位（ＣＦＵｓ）を数えることにより決定された。２５℃で数日間の培養物のインキュベーションの後に、コロニーを数えた。
【００９０】
制御されたグリーンハウス条件（２５±２℃、ＲＨ＝６０±１０％）下で保たれた１０個のイチゴ植物の葉は、ハンドスプレーを用いて、Ｔ．アトロビリデＳＣ１接種材料が均一に吹き付けられた。無作為に選んだ一枚の葉を、接種後０日、１日、３日、７日、１５日、３０日及び３５日で、各植物から取り去った。滅菌コルク穿孔器を用いて、各葉から一枚の葉のディスク（直径２５ｍｍ）を切り取った。ディスクを、Ｔｗｅｅｎ８０（０．０１％）５ｍｌを含有するファルコン管に移し、４分間振盪し、その後、１分間放置した。ＳＤＷの希釈系列を、ローズベンガル（１００ｐｐｍ）、ストレプトマイシン（１００ｐｐｍ）及びクロラムフェニコール（５０ｐｐｍ）で修正されたＰＤＡからなる半選択的培地上に固定し、細菌の存在を最小限に抑えた。適切な希釈物上でＣＦＵｓを数え、その結果をＣＦＵ・ｍｍ−２葉として表した。希釈プレートからのＣＦＵカウントを葉ｍｍ−２当たりのＣＦＵに変換した。この実験を２回行ったが、２回の実験間で実験上の有意差は観察されなかった。
【００９１】
例５．土壌中でのＴ．アトロビリデＳＣ１の生存
Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、少なくとも三つの異なる種類の土壌中で生存することができた。土壌中への導入後、Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、図７に示される滅菌土壌及び非滅菌土壌からの希釈プレート上での回復によって示されるように、実験の終わりまで（４５日）生存した。また、異なる土壌の特徴は、真菌の生存に影響を与えた。高いレベルの有機物を備える砂状ローム質土壌（２及び３）で得られた結果は、相互に類似していたが、より少ない有機物を有する粘土質ローム（土壌１）で得られた結果と異なっていた。
【００９２】
オートクレーブ処理による土壌無菌化は、Ｔ．アトロビリデＳＣ１のより長い生存と関係があった。滅菌土壌では、真菌濃度が、三日でほぼ１桁増加し、滅菌土壌１においては、最大濃度が１０７ＣＦＵ・ｇ−１乾燥土壌に達し、土壌２及び３においては少し低かった。その後、Ｔ．アトロビリデＳＣ１濃度は、全ての土壌タイプで接種（図７ａ）してから４５日後まで１０６〜１０７ＣＦＵ・ｇ−１乾燥土壌の間にとどまっていた。無菌化土壌中の最終真菌濃度は、土壌１の場合と比べて土壌２及び３の場合が有意に高かった（Ｐ≦０．０５）。
【００９３】
接種後３０日での土壌１の場合を除いて、各評価日での各土壌タイプの滅菌処理及び非滅菌処理に対するＣＦＵ値間には有意差があった。Ｔ．アトロビリデＳＣ１のＣＦＵ値は、無菌化土壌中で増加した。非滅菌土壌２中でのＣＦＵ値は、非滅菌土壌３と類似していた。未処理土壌１では、接種後１日でのＣＦＵｓ数の増加が小さかったが、全ての土壌タイプの実験の終わりでの分生子濃度は、初期接種のものより低かった。未処理土壌での最終分生子（ＣＦＵ）濃度は、土壌２及び３の場合と比べて土壌１の場合が有意に高かった（Ｐ≦０．０５）。Ｔ．アトロビリデＳＣ１の生存に対する土壌無菌化の効果は、土壌１の場合より土壌２及び３の場合の方がより明白であった。
【００９４】
対照として用いた未処理（非接種）ミクロ生態系では、非常に低いレベルの天然トリコデルマ菌種（１〜３・１０２ＣＦＵ ｇ−１）を検出したが、ＣＦＵｓのどれもがＴ．アトロビリデとして同定されなかった。
【００９５】
実験条件
土壌生存アッセイは、一部変更があるものの、Ｂｅｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）に記載の方法に基づいていた。異なる物理的特性及び化学的特性を持つイタリア北部（トレンティノ地域）からの土壌３種類（表１）を用いた。土壌を室温で乾燥させ、篩にかけた（メッシュ＜２ｍｍ）。篩にかけた土壌（１００ｇ）を５００ｍｌのポリプロピレンボトルに置き、サンプルを室温にて未処理のまま置いておくか（非滅菌）又は２度連日でオートクレーブ処理（１２１℃，３０分）した（滅菌）。
【００９６】
接種物を上記のようにして用意した。無菌条件下で実験を行った。分生子を土壌に加え、１０６分生子・ｇ−１土壌の最終濃度を得、滅菌スパチュラで混合した。ボトルを室温でインキュベートした。土壌種類×土壌処理（非滅菌及び滅菌）の組み合わせそれぞれに対し、５回の反復試験をセットした。
【００９７】
土壌のサブサンプル（１ｇ）を、滅菌サンプルスプーン（ＰＢＩ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ホイットスタブル，ＵＫ）を用いて各サンプルボトルから無菌で取り出し、１０ｍｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０中に置き、４分間振盪し、１分間放置した。希釈系列をセットし、上記のように半選択的培地上に固定した。２５℃でのインキュベーションの７日後、適切な希釈プレート上でＣＦＵｓを数え、ＣＦＵ・ｇ−１乾燥土壌として表した。土壌サンプル中でのＣＦＵ評価は、接種直後と、接種後１日、５日、１０日、２０日、３０日及び４５日目に行われた。希釈プレートからのＣＦＵカウントを乾燥土壌のグラム当たりのＣＦＵ（ＣＦＵ・ｇ−１）として表した。
【００９８】
例６．ブドウ園土壌中でのＴ．アトロビリデＳＣ１の生存
商業ブドウ園における土壌中での生存についても１年間にわたって調べた。実験は２回繰り返し行った。
【００９９】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、両方の年で長い期間（処理後少なくとも１８週間）、土壌の第一層（土壌表面）上で、高い分生子濃度（１０８ＣＦＵ・ｇ乾燥土壌−１）にて生存することができた。Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、処理後極めて迅速に（一週間）、土壌中を垂直方向に移動し、０．４ｍの深さに達した。そのときのＣＦＵ濃度は、二年間の間１８週目の評価まで安定した値を維持した。個体群密度の勾配が、両方の年で表面から土壌深層まで存在していた。検出された最高ＣＦＵ数は、土壌深さ０．１ｍで１０５ＣＦＵｇ乾燥土壌−１であり、０．２ｍで約１０４ＣＦＵｇ乾燥土壌−１であり、０．３及び０．４ｍで１０３ＣＦＵｇ乾燥土壌−１であった。二年間での個体群動態の違いが、有意に異なる処理（チューキー法；α＝０．０５）から５週後及び９週後、土壌表面のＣＦＵ濃度のみに存在していた。特に９週後には、土壌表面上でのＴ．アトロビリデＳＣ１のＣＦＵが、５週目の初期減少の後の、初期接種濃度（１０９ＣＦＵｇ乾燥土壌−１）よりもはるかに増加した。土壌接種後１年では、Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、未処理領域での常在トリコデルマ菌種と比較できる濃度にて両実験について、１０２〜１０３ＣＦＵｇ乾燥土壌−１の濃度で検出された。リアルタイムＰＣＲ法は、土壌導入前での菌株の非存在及び土壌層での菌株の持続性を確認した。
【０１００】
二つの方法（ＣＦＵ計算法及び分子法）で得た結果間での直線関係（ｙ＝０．８４７２ｘ＋０．１１０５，Ｒ２＝０．６７９４）は、Ｔ．アトロビリデＳＣ１の分子検出効率を確認する。
【０１０１】
その土壌中での９週の放出後、土壌表面における処理穴から０．５及び２ｍの距離、土壌深さ０．１及び０．３ｍで、Ｔ．アトロビリデＳＣ１を見つけた。ＣＦＵは、未処理領域、土壌表面、処理穴から０．５及び２ｍ、処理穴から０．５ｍの距離での土壌深さ１０ｃｍで単離された常在トリコデルマ菌種個体群と比べて有意に高かった（チューキー法；α＝０．０５）。処理穴から０．５及び２ｍの距離での他の土壌層におけるＳＣ１分生子濃度は、未処理領域で単離された常在トリコデルマ菌種個体群と比べて有意に高くなかった（チューキー法；α＝０．０５）。Ｔ．アトロビリデＳＣ１の発生頻度は、高く（全ての土壌深さでの処理穴から０．５ｍでそれぞれ１００％）、土壌表面、土壌深さ０．１及び０．３ｍでの処理穴から２ｍの距離でそれぞれ９０％、７０％及び３０％に減少した。
【０１０２】
その土壌中での導入から１８週後でも、土壌表面において、処理穴から２及び４ｍの距離でＴ．アトロビリデＳＣ１をまだ回復することが可能であった。それらのＣＦＵ濃度は、未処理領域から得た常在トリコデルマ菌種の分生子濃度と比較して有意差がなかった（チューキー法；α＝０．０５）。１８週後に低濃度を検出しても、Ｔ．アトロビリデＳＣ１の発生頻度は高かった（処理穴から２及び４ｍでそれぞれ８０及び７０％）。
【０１０３】
処理土壌中に植えたブドウの木の葉の上でＴ．アトロビリデＳＣ１を見つけた。Ｔ．アトロビリデＳＣ１のＣＦＵ数（葉のｍｍ２）−１は、未処理領域の植物上で単離した常在トリコデルマ菌種と比較して、処理土壌における植物の葉が有意に高かった（チューキー法；α＝０．０５）。処理領域における植物の最高部及び底部の葉の間では、表面単位（ｍｍ２）当たりのＴ．アトロビリデＳＣ１のＣＦＵにおいて有意差があった（チューキー法；α＝０．０５）。
【０１０４】
処理穴に植えてから１８週後、ブドウ根圏におけるＴ．アトロビリデＳＣ１の濃度は、１０７ＣＦＵｇ乾燥土壌であった。
【０１０５】
葉数、芽数、乾燥根重、茎長、ブドウ植物の全長は、未処理又はＴ．アトロビリデＳＣ１処理の土壌に植えたブドウ間で有意差を示さず（チューキー法；α＝０．０５，データを示さず）、真菌がブドウ培養の病原体でないことを示した。
【０１０６】
接種から１年後のＴ．アトロビリデＳＣ１の単離は、それが冬の低温及び土壌中での湿度変動に耐えることができることを示す。接種から１年後の土壌中でのＴ．アトロビリデＳＣ１の濃度は、常在トリコデルマ菌種と同様に、それが土壌に根付くことができることを示す。
【０１０７】
異なる菌株Ｔ．アトロビリデＦ１２２を用いて、２００６年に同一の試験を行った。接種してから１８週後までのみこの菌株を検出し、接種してから一年後に検出を行わなかった。比較できる成長条件において接種してから１年後にＴ．アトロビリデＦ１２２が生存できないことは、Ｔ．アトロビリデＳＣ１の他の菌株に対する優位性を示す。
【０１０８】
実験条件
全ての実験において、生存可能なＴ．アトロビリデＳＣ１の濃度は、各プロットから土壌のサンプル１ｇを回収し、各サンプルを１０ｍｌの滅菌水中に置き、次いで、１０倍連続希釈後の、この懸濁液１ｍｌを半選択的培地上に置くことで評価された。インキュベーションの７日後に真菌のコロニーを数え、固体群数をｌｏｇＣＦＵｇ乾燥土壌−１の単位で表した。土壌の乾燥重量は、サンプル（又はサブサンプル）の６０℃にて４８時間のインキュベーションの後で評価された。接種物として用いた米上の分生子は、通常、１００％に近い平均生存率を有していた。Ｔ．アトロビリデＳＣ１コロニーは、他のトリコデルマ種と、それらの特徴的な気菌糸（最初が白色で、次いで黄色っぽい緑色からオリーブグリーンに変化する）によって区別された。我々の単離物の明確な同定については、Ｔ．アトロビリデとして形態学的に識別された各プレートからのコロニーのほぼ１０％の同一性が、（例２の場合のように）Ｔ．アトロビリデＳＣ１に特異的なエンドキチナーゼ遺伝子（Ｅｃｈ４２）の塩基変異に基づく、プライマー及びＴａｑ−Ｍａｎプローブセットを用いたＰＣＲ分析によって確認された。実験は、それぞれが０．６×０．６ｍである６個のプロットで構成されており、それらは、ブドウ園の作条にあるブドウ植物間に位置していた。３個のプロットにＴ．アトロビリデＳＣ１を接種し、それぞれがそこで成長した真菌を備える５００ｇの炊いた米の培地を受けた。接種材料を土壌表面層（深さが約３０ｍｍ）中に混合した。この層中での真菌接種材料の初期濃度は、１０８ＣＦＵｇ乾燥土壌−１であると評価された。３個の接種されてない追加のプロットを未処理の対照として用いた。各プロットでは、プロットの一面の外側部分を掘削し、土壌断面をさらすことで、土壌のサンプリングをした。異なる深さ（表面、０．１ｍ、０．２ｍ、０．３ｍ、及び０．４ｍ）及び時点（接種時、Ｔ．アトロビリデＳＣ１接種の１週間後、５週間後、９週間後、１８週間後）で、土壌（直径５０ｍｌ、３００ｍｍ）の三つの横ニンジン（transverse carrot）を集めることで、サンプリングを行った。追加の土壌サンプリングを最初の実験の接種から１年後に行った。
【０１０９】
土壌のサブサンプル（１ｇ）を滅菌スプーンを用いて各サンプルから取り出した。土壌のサブサンプルを０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，ヘール，ベルギー）１０ｍｌ中に置き、ｖｏｒｔｅｘ（Ｈｉｄｏｌｐｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，シュワーバハ，ドイツ）を用いて４分間振盪し、１分間放置した。滅菌蒸留水の希釈系列をセットし、希釈懸濁液を半選択的培地を含有するペトリ皿上に固定した。次に、該ペトリ皿を２５℃でインキュベートし、インキュベーションの５日後に適切な希釈物に相当する培地上で最終コロニーのカウントを行った（プレート当たり３０〜３００コロニーの範囲のＣＦＵ）。各土壌サンプルについて３回の反復試験があった。結果をＣＦＵｇ乾燥土壌−１として表した。Ｔ．アトロビリデＳＣ１コロニーの同一性を実験番号に記載されるようにして確認した。
【０１１０】
リアルタイムＰＣＲを用いて、２００６年の全てのサンプルにおけるＴ．アトロビリデＳＣ１ゲノムコピー（ＣＮ）の数を決定した。ＲＴ−ＰＣＲ分析では、深さ及び時間の組み合わせそれぞれについて、独立した二つのサブサンプルを集め、各サンプルのＤＮＡ抽出及びリアルタイムＰＣＲ分析を例２に記載されるように行った。
【０１１１】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１の分散を２００６年に試験した。０．３×０．３×０．３ｍの寸法の穴を、ブドウ園の作条においてブドウ植物間に掘った。１０個の穴を掘った土壌及びＴ．アトロビリデ接種材料の混合物でいっぱいに満たした（４００ｇ穴−１）。初期真菌接種濃度は、１０６ＣＦＵｇ乾燥土壌−１であった。他の１０個の穴は、未処理の掘った土壌を戻して満たされた。１歳のブドウ植物（Ｋｏｂｅｒ５ＢＢ上でのピノ・グリ）を各穴に植えた。
【０１１２】
二組の土壌サンプルを回収した。接種してから９週後に、処理及び未処理の両方の穴（０ｍ）において、また穴から０．５及び２．０ｍの水平距離にて、第一のサンプリングを行った。それら距離のそれぞれについて、土壌サンプルを、三つの土壌深さ（０、０．１及び０．３ｍ）で集めた。第二のサンプリングを接種してから１８週間後に行い、その時には、穴の表面（土壌の最初の３０ｍｍ）と接種場所から２．０及び４．０ｍの水平距離のみにて、土壌サンプルを回収した。サンプルを回収し、各サンプルにおけるＣＦＵ数を先に記載のように決定した。Ｔ．アトロビリデＳＣ１濃度（ＣＦＵｇ乾燥土壌−１）及び頻度（少なくとも１のＣＦＵを持つ土壌サンプルの割合）を考慮して、分散を評価した。
【０１１３】
土壌からのＴ．アトロビリデＳＣ１の、ブドウの葉に対する移動を、土壌接種してから１０週後に評価した。３枚の頂端側の葉と３枚の底部の葉とを、処理及び未処理穴で成長する各植物（各植物は平均１５枚の葉を有していた）から取り除いた。回収された新鮮な葉のそれぞれを、滅菌蒸留水及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０の３０ｍｌを含有するファルコン管に移した。該管を３分間振盪し、次いで、得られた各懸濁液１ｍｌを、半選択的培地を含有するペトリ皿に移した。２５℃でのインキュベーションの７日後にＣＦＵを数えた。葉の面積を、画像処理解析プログラム、Ｉｍａｇｅ  Ｔｏｏｌ  第２版（ＵＴＨＳＣＳＡ，サンアントニオ，ＴＸ，ＵＳＡ）を用いて算出した。実験の終わりに、土壌から植物を取り出した。しっかりと根に付着しなかった土壌は、軽い振盪で慎重に取り去り、次いで、ビニール袋中で根を激しく振盪し、根圏土壌を除去した。根圏土壌のサンプリング及び該サンプルのＣＦＵ集計（サブサンプル１ｇ；３回の反復試験）は、先に記載のように行われた。
【０１１４】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１の植物の成長に対する影響を評価するため、各植物について、処理及び未処理領域において、土壌接種してから９週及び１８週後に、全長、茎長、葉及び芽の数の測定を行った。また、各植物について、実験の終わりに（接種してから１８週後に）根乾燥重量を決定した。
【０１１５】
例７．生体外での生物防除活性
二重培養生物アッセイでは、Ｔ．アトロビリデＳＣ１が、１００％の拮抗効率で、Ｂ．シネレア及びＡ．メレアを完全に抑制した。
【０１１６】
実験条件
一つの葉と果物（ボトリチス・シネレア）及び一つの土壌伝染性（アルミラリア・メレア）病原体に対する生体外Ｔ．アトロビリデＳＣ１拮抗作用を、以下の通り二重培養法を用いて試験した：病原体（Ｂ．シネレア又はＡ．メレア）を、ペトリ皿（直径９０ｍｍ）のＰＤＡ上のＴ．アトロビリデＳＣ１（Ｂ）から２ｃｍの距離（Ａ）に接種した。Ｂ．シネレア、Ａ．メレア及びＴ．アトロビリデＳＣ１をそれぞれ未処理の対照として単独で成長させた。各組み合わせで、少なくとも３回の反復試験があった。２０℃でのインキュベーションの１週後に、拮抗効率を（ＡＤ−ＡＣ）×１００／ＡＤとして算出した。ここで、ＡＣ及びＡＤは、それぞれＴ．アトロビリデＳＣ１が有りの場合と無しの場合での病原体の放射方向成長である。
【０１１７】
例８．粉末ウドンコ病の生物防除
Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、キュウリ及びズッキーニのような園芸作物上での粉末ウドンコ病（ポドスファエラ・キサンチイ）を、最も広く使用される化学農薬の一つであり、それ故に標準（図８）として含めた硫黄と同じレベルで制御した。特に、Ｔ．アトロビリデＳＣ１が硫黄と同じレベルで病気を制御し、標準として用いた二種のトリコデルマ菌種より優れていることが観測された。また、ズッキーニに対しても、生物防除効力を示した（未処理の場合と有意差があった）。
【０１１８】
実験条件
感受性栽培品種のうち十分に大きくなった葉を少なくとも５枚持つ植物を用いた。用いた栽培品種は、ズッキーニがＡｆｒｏｄｉｔｅ又はＸａｒａで、キュウリが８０７であった。１リットルポット中のピート：火山砂利ポッティングミックス（１：１）に種を植えて、２０〜３０℃に保たれたＣＰＭフリーのグリーンハウス内にて自然な光周期で成長させた。各処理及び穀物の５〜６回反復試験（ポット）があった。Ｐ．キサンチイ接種材料は、最初に、商業グリーンハウスにおいて、自然に感染したズッキーニ及びキュウリ植物上で集められ、その後、３週たった植物を感染させ、個別のグリーンハウス区画内で感染植物を最高で一月保持することで、キュウリ及びズッキーニ上に保存した。新鮮で新しい分生子形成菌糸を有する葉を水で洗浄することにより分生子を得、すぐに植物上に吹き付けた。接種濃度は約１０７分生子ｍｌ−１であり、５ｍｌ植物−１のボリュームを適用した。乾燥させた時点で、植物を、２２℃及び高い相対湿度（ＲＨ＞９５％）で一晩インキュベートした。人為的な接種後の日中の条件は、２０〜３０℃で、３０〜７０％ＲＨであり、夜間の条件は、１５〜２０℃で、８５〜９０％ＲＨであった。完全に無作為に選ばれたブロックに植物を並べた。
【０１１９】
Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、栄養ブロス中で成長させ（方法ａ），例３）、ハンドスプレーによって葉上に吹き付けた。また、未処理対照、硫黄（Ｔｈｉｏｖｉｔ，Ｓｙｎｇｅｎｔａ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）及び市販の生物防除剤（トリコデルマ・ハルジアナムＴ３９，Ｔｒｉｃｈｏｄｅｘ（登録商標），Ｉｎｔｒａｃｈｅｍ  ｂｉｏ）も実験に含めた。各処理では、植物に対して５ｍｌの溶液植物−１を吹き付けた。実験を少なくとも２回繰り返し行った。Ｔ．アトロビリデＳＣ１及び対照を完全に無作為に選んだブロックに並べた。接種して７日後から始まり、週一回、粉末ウドンコ病の症状に関して葉を調べた。存在する場合、病気の重症度を点数化した。病気の重症度は、葉全体に対する徴候のある葉の面積の割合として測定された。
【０１２０】
分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、逆正弦変換して正規化したデータを分析した。この分析は、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ第７版（ＳｔａｔＳｏｆｔ，タルサ，ＯＫ，ＵＳＡ）を用いて行われた。チューキーＨＳＤ法（α＝０．０５）に従って、平均値を分けた。ＡＮＯＶＡの条件を満たさない場合には、Ｋｕｒｓａｌ−Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック試験を用いた。
【０１２１】
例９．木の病気（エスカ病）の薬剤の生物防除
Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、エスカ病の主要な三つの病原体を制御する。ファエオモニエラ・クラミドスポラ、ファエオアクレモニウム・アレオフィルム及びフォミチポリア・メジテラネアの制御の有効性は、非常に高く、１００％に近い（図９）。グラフは、５回の反復試験（ペトリ皿）の平均を表す。Ｔ．アトロビリデＳＣ１の制御効力は、通常、標準として用いた生物防除剤（バチルス・サブチリスＦ７７）より優れていた。
【０１２２】
実験条件
先に述べた三つの病原体のそれぞれを、ペトリ皿のＰＤＡ上で、縁から３ｃｍに接種し、２５℃にて一週間インキュベートした。次いで、Ｔ．アトロビリデＳＣ１を、反対側で、縁から３ｃｍの距離に接種した。各病原体及び未処理対照について、５回の反復試験を行った。菌糸体の成長を、処理から２、４、９、１４、１９、２４及び２９日後に測定した。特に、Ｃは、未処理での成長（ｍｍ）であり、ＴはＴ．アトロビリデＳＣ１による処理での成長（ｍｍ）である。効力は、以下の式［（Ｃ−Ｔ）／Ｃ］×１００で求めた（Ｓｉｖａｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０１２３】
例１０．根腐れの生物防除
アルミラリア・メレア及びＡ．ガリカは、数種の作物に関する根の腐敗の主要な病原体である。Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、これら二つの病原体に対して有効であり、また標準的な生物防除剤としてのＴ．ハルジアナムＴ３９よりも効果的である。それは、病原体の成長を低減し、最終的にはそれらを殺した。これは、図１０に示す木片上で成長した二つの病原体に対する制御条件実験において明らかである。ここでは、トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の存在下又はその不存在下におけるアルミラリア・メレア及びアルミラリア・ガリカ（根腐れ病原体）の菌糸体成長を比較した。トリコデルマ・ハルジアナムＴ３９−取引名Ｔｒｉｃｈｏｄｅｘ（登録商標）−の実験効果を比較のためにここに示す。その成長は、２０℃のペトリ皿のＰＤＡ上の木片上で成長した５回の反復試験の直径の平均として表される。
【０１２４】
また、Ｔ．アトロビリデＳＣ１は、植物への感染を防止することもできる。実際、死んだ（感染した）植物の割合を最初の適用から６月後に評価した。それは病気の症状が明らかになった時である。そして、Ｔ．アトロビリデＳＣ１がＡ．メレア（６０％の保護）及びＡ．ガリカ（１００％の保護）からイチゴ植物を保護したことが分かった。逆に言えば、該病気に対し、Ｔ．アトロビリデＦ１２２はほんの２０％の保護であり、Ｔ．ハルジアナムＴ３９はほんの１３％の保護であった（図１０及び１１の値は、１０回の反復試験植物で求めた割合である）。
【０１２５】
イチゴ植物の場合、それは、適用から６月後であっても、Ａ．メレア及びＡ．ガリカが原因の病気を有意に減少させた。
【０１２６】
Ｔ．アトロビリデＦ１２２をＡ．メレア用の比較として用い（図１１）、それがＳＣ１菌株と比べて有意に低い活性を示すことが分かった。
【０１２７】
実験条件
Ａ．メレア及びＡ．ガリカを、ペトリ皿のＰＤＡ上の木片上における該木片の一方の面に接種し、２５℃で一週間インキュベートした。次いで、Ｔ．アトロビリデＳＣ１を反対側に接種した。各病原体及び未処理の対照について５回の反復試験を行った。治療後に週一回６週間、菌糸の成長を測定した。
【０１２８】
イチゴ植物（Ｅｌａｓａｎｔａ  ｃｖ）には、Ａ．メレア又はＡ．ガリカにより感染した三つの木片を植物の樹冠近傍に置くことにより接種した。植物は、方法ｂ）（例３参照）により成長させたＴ．アトロビリデＳＣ１を用いて処理され、そして、例３に記載の方法ｃ）は、ブルーベリー植物のような高いレベルの有機物を必要とする植物を保護するという同様の目的のために代わりに使用され、図１１に示されるイチゴ植物の場合に得た結果と同様の結果を与えた。植物は、グリーンハウス制御条件下で保たれた。
【０１２９】
（参考資料）
Altschul SF, Madden TL., Shaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman D J. 1997 Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acid Res. 25:3389-3402.
Bennett AJ, Leifert C, Whipps JM. 2003 Survival of the biocontrol agents Coniothyrium minitans and Bacillus subtilis MBI 600 introduced into pasteurised, sterilised and non-sterile soils. Soil Biol Biochem; 35: 1565-1573
Carsolio C, Gutierrez A, Jimenez B, Van Montagu M, Herrera-Estrella A. 1994. Characterization of ech-42, a Trichoderma harzianum endochitinase gene expressed during mycoparasitism. PNAS USA; 91:10903-10907.
Elad Y. Trichoderma harzianum T39 preparation for biocontrol of plant disease-control of Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum and Cladosporium flavum. Biocontol Sci Techn 2000; 10: 499-507.
Harman GE. Myths and dogmas of biocontrol: changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Dis 2000; 84(4): 377-393.
Klein D, Eveleingh E. 1998 Ecology of Trichoderma. In: Harman GE, Kubicek CP, eds. Trichoderma & Gliocladium, vol. 1. Taylor & Francis, Padstow, UK: 57-74.
Kredics L, Anthal Z, Manczinger L. 2000 Influence of water potential on growth, enzyme secretion and in vitro enzyme activities of Trichoderma harzianum at different temperatures. Curr Microbiol; 40: 310-314.
Kredics L, Manczinger L, Anthal Z, Penzes Z, Szekeres A, Kevei F, Nagy E. 2004 In vitro activity and pH dependence of mycelial growth and extracellular enzyme activities of Trichoderma strains with biocontrol potential. J Appl Microbiol; 96: 491-498.
Longa C. 2007 Fungal biocontrol agents: identification and fate of Trichoderma atroviride P. Karst.in the environment. PhD thesis.
Paulitz TC. 2000 Population dynamics of biocontrol agents and pathogens in soil and rhizospheres. Eur J Plant Pathol; 106: 401-413.
Sivakumar D, Wilson Wijeratnam RS, Wijesundera, RLC, Marikar FMT, Abeyesekere M.. 2000 Antagonistic effect of Trichoderma harzianum on postharvest pathogens of rambutan (Nephelium lappaceum). Phytoparasitica; 28: (3), pp. 240-247.
Spencer DM 1978 The Powdery Mildews. Academic Press, New York, USA.
【図１】
2011518545.tif 000005
【図２】
2011518545.tif 000006
【図３】
2011518545.tif 000007
【図４】
2011518545.tif 000008
【図５】
2011518545.tif 000009
【図６】
2011518545.tif 000010
【図７】
2011518545.tif 000011
【図８】
2011518545.tif 000012
【図９】
2011518545.tif 000013
【図１０】
2011518545.tif 000014
【図１１】
2011518545.tif 000015
【配列表】
2011518545000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年1月18日(2010.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物防除剤としての単離されたトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１菌株（ＣＢＳ番号１２２０８９）。
【請求項２】
植物の真菌病を治療するための請求項１に記載のトリコデルマ。
【請求項３】
同じ植物の病原体特異性を備える請求項１に記載のトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１に由来する変異体又は菌株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の単離されたトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１を有効成分として含む農業組成物。
【請求項５】
１０２〜１０３分生子ｍｌ−１又はｇ−１の有効量を含む請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
更に、第二生物防除剤及び／若しくは添加剤、乳化剤、植物栄養剤、湿潤剤、植物微量栄養剤、又は基層を含む請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
前記基層が、栄養培地、穀物若しくはその誘導体、アメンダント、野菜若しくはその一部分、ピート、木若しくはその断片、粘土又は樹皮からなる群から選択される請求項４〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載の単離されたトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１を基層の中又は上に接種することと、少なくとも１０２〜１０３ｍｌ−１又はｇ−１の分生子数を得るまで１〜３０℃の温度でそれを成長させることとを含む農業組成物の調製方法。
【請求項９】
更に、凍結乾燥工程を含む請求項８に記載の農業組成物の調製方法。
【請求項１０】
前記基層が、栄養培地、穀物若しくはその誘導体、野菜若しくはその一部分、木若しくはその断片、アメンダント、ピート、粘土又は樹皮からなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記栄養培地が、少なくとも炭素源及び窒素源を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記炭素源が、マンノース、ガラクトース、スクロース、マルツエキス、セルビオース、グルコース、及びスレアロースからなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記窒素源は、酵母エキス、亜硝酸塩、トリプトン、ペプトン、グルタミン、及びアスパラギンからなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記穀物が米又は小麦である請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の接種前に前記基層を栄養培地で処理する請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記栄養培地を前記基層上に吹き付ける請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記吹き付けられた基層が樹皮である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
植物病原菌が原因の病気から植物を保護する方法であって、少なくとも植物の一部分又は前記植物近傍にある土壌を請求項３〜５のいずれかに記載の組成物で処理することを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記植物の一部分が、葉、果実、種子、又は創傷部である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が請求項７に従って調製されたことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記病原菌が、木の病気（ファエオモニエラ・クラミドスポラ、ファエオアクレモニウム・アレオフィルム及びフォミチポリア・メジテラネア）、葉の病気（粉末ウドンコ病病原体ポドスファエラ・キサンチイ）、果実及び花の病気（ボトリチス・シネレア）、並びにアルミラリア属（アルミラリア・メレア及びＡ．ガリカ）に起因する根の病気の原因になるものからなる群から選択される請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記植物が、ウリ科、バラ科、ブドウ科、アブラナ科、キク科、セリ科、ナス科及びユリ科からなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記植物が、ウリ科、バラ科又はブドウ科からなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜３のいずれかに記載のトリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の凍結乾燥物又は寒天中での培養物。
【請求項２５】
請求項１〜３のいずれかに記載の微生物を有効量含むか又は請求項４〜６のいずれかに記載の組成物で処理した基層。
【請求項２６】
請求項７〜１６のいずれかに記載の方法に従って得られる請求項２５に記載の基層。
【請求項２７】
樹皮である請求項２５又は２６に記載の基層。
【請求項２８】
トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１の特異的検出方法であって、エンドキチナーゼ４２遺伝子（ｅｃｈ４２）ジェンバンク受入番号ＡＢ０４１７５３．１及びＧタンパク質αサブユニット遺伝子（ｔｇａ３）ジェンバンク受入番号ＡＦ４５２０９７．１の平行増幅を適切なプライマーセットによるＰＣＲによって達成し、前記トリコデルマ・アトロビリデＳＣ１を含むサンプルにおいては、エンドキチナーゼ４２遺伝子の位置１８５及び１９６における二つの多形ヌクレオチドを特異的に同定することを特徴とする方法。
【請求項２９】
エンドキチナーゼ４２遺伝子（ｅｃｈ４２）増幅のためのプライマーセットが、ＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩＤＮＯ：２の配列を有しており、Ｇタンパク質αサブユニット遺伝子（ｔｇａ３）増幅のためのプライマーセットが、ＳＥＱＩＤＮＯ：４及びＳＥＣＩＤＮＯ：５の配列を有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
リアルタイムＰＣＲであり、（ｅｃｈ４２）のプローブは、エンドキチナーゼ４２遺伝子の位置１８５及び１９６における多形ヌクレオチドを含み、好ましくはＳＥＱＩＤＮＯ：３に対応する請求項２９に記載の方法。
【国際調査報告】
2011518545.tif 000016
2011518545.tif 000017
2011518545.tif 000018