(57)【要約】  本発明は、心原性因子を含有する組成物、前記因子の存在下に元細胞を培養して細胞を取得する方法及び心臓組織に取得した細胞を投与する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦβ−１、ＢＭＰ４、α−トロンビン並びにカルジオトロフィン及びＩＬ−６からなる群から選択される化合物並びにカルジオゲノールＣ及びレチノイン酸からなる群から選択される化合物を有する組成物。
【請求項２】
ＴＧＦβ−１、ＢＭＰ４、α−トロンビン、カルジオトロフィン及びカルジオゲノールＣを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、アクチビン−Ａ、ＴＮＦ−α、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＶＥＧＦ−Ａ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１及びアクチビン−Ａを有する、請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
アクチビン−Ａ、ＦＧＦ−２、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１及びレチノイン酸を有する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】
ＴＮＦ−α、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ及びＶＥＧＦ−Ａからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を欠如している、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
組成物に化合物が含有される場合、ＴＧＦβ−１は１ｍＬ当たり１〜５ｎｇ、ＢＭＰ４は１ｍＬ当たり１〜１０ｎｇ、カルジオトロフィンは１ｍＬ当たり０．５〜５ｎｇ、α−トロンビンは１ｍＬ当たり０．５〜５単位、カルジオゲノールＣは５０〜５００ｎＭ、ＦＧＦ−２は１ｍＬ当たり１〜１０ｎｇ、ＩＧＦ−１は１ｍＬ当たり１０〜１００ｎｇ、アクチビン−Ａは１ｍＬ当たり１〜５０ｎｇ、ＴＮＦ−αは１ｍＬ当たり１〜５０ｎｇ、ＦＧＦ−４は１ｍＬ当たり１〜２０ｎｇ、ＩＬ−６は１ｍＬ当たり１０〜１００ｎｇ、ＬＩＦは１ｍＬ当たり１〜１０単位、ＶＥＧＦ−Ａは１ｍＬ当たり１〜５０ｎｇ、レチノイン酸は１ｍＬ当たり０．１〜１．０μＭの量で含有される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項８】
組換えＴＧＦβ−１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ）、カルジオトロフィン（１ｎｇ／ｍＬ）、カルジオゲノールＣ（１００μＭ）を有し、これらを組み合わせて使用する、請求項１の組成物。
【請求項９】
α−トロンビン（１Ｕ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）及びアクチビン−Ａ（５ｎｇ／ｍＬ）を有する、請求項８の組成物。
【請求項１０】
組換えＴＧＦβ−１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ）、アクチビン−Ａ（５ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）、因子ＩＩａ（ｈα−トロンビン、１Ｕ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）及びレチノイン酸（１μＭ/mL）を有し、これらを組み合わせて使用する、請求項１の組成物。
【請求項１１】
ウシ胎児血清、ヒト血清、血小板溶解物及びそれらの混合物を含有する培地からなる群から選択される培地に含有される、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１２】
ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ、ＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ４ｍＲＮＡ、Ｆｌｋ−１ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ６ｍＲＮＡ、Ｆｏｇ−１ｍＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのｍＲＮＡの発現が上昇しており、及び／またはＮｋｘ２．５ポリペプチド、ＭＥＦ２Ｃポリペプチド、Ｔｂｘ−５ポリペプチド、ＦＯＧ−２ポリペプチド、ＧＡＴＡ−４ポリペプチド、ＭＥＳＰ−１ポリペプチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを有する分化細胞を、元細胞から取得する方法であって、前記少なくとも１つのポリペプチドが前記分化細胞の核に関連し、請求項１〜１１のいずれか１つに係る組成物の存在下に前記元細胞を培養することを有する、分化細胞を取得する方法。
【請求項１３】
前記分化細胞のＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ及びＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡの発現が上昇していることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。  
【請求項１４】
前記元細胞が間葉幹細胞である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記間葉幹細胞が骨髄由来幹細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記間葉幹細胞が、細胞表面上にＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ２９及びＣＤ４４を発現し、細胞表面上にＣＤ１４、ＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しないことを特徴とする、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分化細胞が心臓形成細胞である、請求項１２〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか１つに記載の方法により取得された細胞。
【請求項１９】
前記細胞が心臓形成性である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
（ａ）分化細胞の集団からの細胞検体が、ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ、ＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ４ｍＲＮＡ、Ｆｌｋ−１ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ６ｍＲＮＡ、Ｆｏｇ−１ｍＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのｍＲＮＡの発現が上昇しており、及び／または前記分化細胞の核に関与するペプチドである、Ｎｋｘ２．５ポリペプチド、ＭＥＦ２Ｃポリペプチド、Ｔｂｘ−５ポリペプチド、ＭＥＳＰ−１ポリペプチド、ＧＡＴＡ−４ポリペプチド、ＦＯＧ−２ポリペプチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを有する細胞を含有することを判定し、
（ｂ）前記分化細胞の集団からの細胞を哺乳類に投与することを含む、哺乳類に分化細胞を送達する方法。
【請求項２１】
前記分化細胞の集団が、請求項１２〜１６のいずれか１つに記載の細胞を、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の組成物の存在下に培養することにより取得したものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を使用することを含む、請求項２０または２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
投与ステップが、全身、心臓内及び冠動脈内投与からなる群から選択される投与方法により前記細胞を投与することを含む、請求項２０〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ａ）が、免疫細胞化学的方法を使用することを含む、請求項２０〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１１のいずれか１つに記載の組成物との接触により取得可能な、請求項１２〜１６のいずれか１つに記載の分化細胞を、心臓組織に投与することを含む、心筋細胞を有する心臓組織を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓細胞を取得し、使用することを有する方法及び材料に関する。例えば、本発明は、機能的心筋細胞としての心臓組織に組み込まれた細胞（例えば、分化型心臓前駆細胞または心臓形成細胞）を有する、哺乳類の心臓組織を提供する方法及び材料に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００８年５月２７日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４８９５号の優先権を請求する。
【背景技術】
【０００３】
心臓血管疾患は、患者管理の進歩にもかかわらず、世界的に罹患及び死亡の主な原因である。高い修復能を有する組織とは対照的に、心臓組織は修復不可能な損傷を受けやすい。従って、細胞による心血管再生医療が臨床の場において進められつつある。
【０００４】
最近の幹細胞生物学の出現により、現行の手法モデルの範囲が従来の病状の緩和から治療的修復へと広がっている。通常、臨床経験は、改変されない状態の自己由来成人幹細胞に基づいていた。第一世代生物製剤は、容易に入手可能な細胞型として認識されている、未感作のヒト幹細胞である。特定の個体は未感作のヒト幹細胞の送達によって病状が改善されることが分かっている。
【０００５】
（定義）
本明細書において、矛盾を起こさない限り、引用及び以下に示す用語は次のように定義される。
【０００６】
「ｈＭＳＣ」とは、ヒト間葉幹細胞を意味する。
【０００７】
細胞の「心臓形成可能性」とは、細胞を損傷した心臓に注入することにより、この細胞が心臓細胞、例えば、心筋を作り出すことに成功する能力を意味する。
【０００８】
「心臓形成細胞」（ｃａｒｄｉｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ：ＣＰ）は、未分化細胞からの分化に関与している細胞である。「心臓形成細胞」は、初期心臓転写因子Ｎｋｘ２．５及び後期心臓転写因子ＭＥＦ２Ｃの核移行により定義される心臓分化を示す（Ｂｅｈｆａｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｒｄｉｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｙｉｅｌｄｓ  ｐｒｏｇｅｎｙ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｍａｒｃｈ  ２００６  ｖｏｌ．  ３  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，  ｐａｇｅｓ  Ｓ７８−Ｓ８２）。心臓転写因子ＧＡＴＡ４の核移行が確認できる。心臓形成細胞では、筋節が欠けていてもよく、筋節タンパク質の発現が欠けていてもよい。心臓形成細胞はそれ自身の分割能を保持している。心臓形成細胞は、心筋細胞へと分化する可能性を有しているので、「心筋細胞前駆体」または「心筋細胞前駆細胞」とも呼ばれている。本明細書の背景として、心臓形成細胞は、ヒト成人間葉幹細胞（ｈｕｍａｎ  ａｄｕｌｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ｈＭＳＣ）由来のものであってよく、「ＣＰ−ｈＭＳＣ」は、そのようなヒト成人間葉幹細胞由来心臓形成細胞を意味する。
【０００９】
「カクテル」または「心原性カクテル」とは、２つ以上の心原性物質を含有する組成物を意味する。
【００１０】
「心原性物質」とは、細胞の心臓形成可能性を改善する物質である。
【００１１】
「カクテル誘導細胞」または「心臓発生誘導細胞」とは、カクテルと接触することによりさらに分化される細胞である。
【００１２】
「分化」とは、特殊性の低い細胞がより特殊化された細胞になる過程である。
【００１３】
「駆出率」とは、心拍時に送り出される血液の分画を意味する。限定詞なしで、駆出率という用語は、特に左心室の駆出率（左心室駆出率、ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＬＶＥＦ）を指す。
【００１４】
「駆出率の変化」は、損傷した心臓に細胞を注入して治療した動物の心臓の、治療後の所定時間に測定された駆出率と、注入前に測定された駆出率との差を意味する。
【００１５】
特に別段の指定がない限り、ここで使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者により一般に理解されるのと同じ意味をもつ。ここに記載された方法及び材料と同様または同等の方法及び材料を、本発明の実施に使用できるが、好適な方法及び材料について以下に説明する。ここで言及された刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献の全ては、引用することによりその全体が組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書によって、支配されるものとする。また、材料、方法及び実施例は例示のみを目的とするもので、限定するものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、心臓細胞を取得し、使用することを有する方法及び材料を提供することを目的とする。例えば、本発明は、機能的心筋細胞としての心臓組織に組み込まれた細胞（例えば、分化型心臓前駆細胞または心臓形成細胞）を有する、哺乳類の心臓組織を提供する方法及び材料を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ＴＧＦβ−１、ＢＭＰ４、α−トロンビン並びにカルジオトロフィン及びＩＬ−６からなる群から選択される化合物並びにカルジオゲノールＣ及びレチノイン酸からなる群から選択される化合物を有する組成物に関する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＴＧＦβ−１、ＢＭＰ４、α−トロンビン、カルジオトロフィン及びカルジオゲノールＣを有する。本発明の組成物は、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、アクチビン−Ａ、ＴＮＦ−α、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＶＥＧＦ−Ａ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を有してもよい。これらの組成物はさらに、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１及びアクチビン−Ａを有してもよい。本発明の他の好ましい組成物は、アクチビン−Ａ、ＦＧＦ−２、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１及びレチノイン酸を有する。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＴＮＦ−α、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ及びＶＥＧＦ−Ａからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を欠如することができる。
【００１８】
本発明の組成物に以下の化合物の１つが含有される場合、ＴＧＦβ−１は１ｍＬ当たり１〜５ｎｇ、ＢＭＰ４は１ｍＬ当たり１〜１０ｎｇ、カルジオトロフィンは１ｍＬ当たり０．５〜５ｎｇ、α−トロンビンは１ｍＬ当たり０．５〜５単位及びカルジオゲノールＣは５０〜５００ｎＭ、ＦＧＦ−２は１ｍＬ当たり１〜１０ｎｇ、ＩＧＦ−１は１ｍＬ当たり１０〜１００ｎｇ、アクチビン−Ａは１ｍＬ当たり１〜５０ｎｇ、ＴＮＦ−αは１ｍＬ当たり１〜５０ｎｇ、ＦＧＦ−４は１ｍＬ当たり１〜２０ｎｇ、ＩＬ−６は１ｍＬ当たり１０〜１００ｎｇ、ＬＩＦは１ｍＬ当たり１〜１０単位、ＶＥＧＦ−Ａは１ｍＬ当たり１〜５０ｎｇ及びレチノイン酸は１ｍＬ当たり０．１〜１．０μＭの量で含有されてよい。
【００１９】
本発明に係る好ましい組成物は、組換えＴＧＦβ−１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ）、カルジオトロフィン（１ｎｇ／ｍＬ）、カルジオゲノールＣ（１００μＭ）を有し、これらを組み合わせて使用する。特に好ましい本発明の組成物は、上記化合物に加え、α−トロンビン（１Ｕ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）及びアクチビン−Ａ（５ｎｇ／ｍＬ）を有する。
【００２０】
本発明の他の好ましい組成物は、組換えＴＧＦβ−１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ）、アクチビン−Ａ（５ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）、因子ＩＩａ（ｈα−トロンビン、１Ｕ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）及びレチノイン酸（１μＭ/mL）を有し、これらを組み合わせて使用する。
【００２１】
好ましくは、本発明の組成物は、ウシ胎児血清、ヒト血清、血小板溶解物及びそれらの混合物を含有する培地からなる群から選択される培地に含有される。
【００２２】
本発明はまた、ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ、ＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ４ｍＲＮＡ、Ｆｌｋ−１ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ６ｍＲＮＡ、Ｆｏｇ−１ｍＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのｍＲＮＡの発現が上昇しており、及び／またはＮｋｘ２．５ポリペプチド、ＭＥＦ２Ｃポリペプチド、Ｔｂｘ−５ポリペプチド、ＦＯＧ−２ポリペプチド、ＧＡＴＡ−４ポリペプチド、ＭＥＳＰ−１ポリペプチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを有する分化細胞を、元細胞から取得する方法に関し、前記少なくとも１つのポリペプチドが前記分化細胞の核に関連し、前記方法は、本発明に係る組成物の存在下に元細胞を培養することを有する。そのような方法では、分化細胞のＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ及びＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡの発現が上昇していることが好ましい。
【００２３】
本発明の好ましい実施例において、元細胞は間葉幹細胞である。そのような細胞としては、骨髄由来幹細胞であってよい。これらの細胞は、細胞表面上にＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ２９及びＣＤ４４を発現でき、細胞表面上にＣＤ１４、ＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しない。
【００２４】
最も好ましくは、上記分化細胞は心臓形成細胞である。
【００２５】
本発明の他の態様は、哺乳類に分化細胞を送達する方法であって、（ａ）分化細胞の集団からの細胞検体が、ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ、ＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ４ｍＲＮＡ、Ｆｌｋ−１ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ６ｍＲＮＡ、Ｆｏｇ−１ｍＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのｍＲＮＡの発現が上昇しており、及び／または前記分化細胞の核に関与するペプチドである、Ｎｋｘ２．５ポリペプチド、ＭＥＦ２Ｃポリペプチド、Ｔｂｘ−５ポリペプチド、ＭＥＳＰ−１ポリペプチド、ＧＡＴＡ−４ポリペプチド、ＦＯＧ−２ポリペプチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを有する細胞を有することを判定し、（ｂ）前記分化細胞の集団からの細胞を、前記哺乳類に投与すること、を有する、方法である。前記分化細胞の集団は、元の細胞を本発明に係る組成物のいずれかの存在下に培養することにより取得できる。特に好ましい実施形態において、前記ステップ（ａ）は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応または免疫細胞化学を使用することを含んでよい。前記投与ステップは、全身、心臓内及び冠動脈内投与からなる群から選択される投与方法により前記細胞を投与することを含む。
【００２６】
本発明の他の態様は、心臓組織に心筋細胞を提供する方法である。この方法は、心臓組織に、本発明に係る組成物との接触により取得可能な、本発明の態様の前記分化細胞を投与することを有する。
【００２７】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の記載により説明する。本発明の他の特徴、目的、利点は本明細書及び特許請求の範囲から明らかである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明は、心臓細胞を取得し、使用することを有する方法及び材料を提供する。例えば、本発明は、機能的心筋細胞としての心臓組織に組み込まれた細胞（例えば、分化型心臓前駆細胞または心臓形成細胞）を有する、哺乳類の心臓組織を提供する方法及び材料を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】１１人の冠動脈疾患患者の骨髄由来未感作ヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣ）による処置の前後における駆出率（ΔＥＦ）の変化（％）を示す。
【図２】ＤＡＰＩによる免疫染色後の共焦点顕微鏡法の結果であり、処置後に、駆出率変化を示さなかった患者２（左）の心臓転写因子のタンパク質発現、及び駆出率の変化があった患者９（右）のタンパク質発現を示す。
【図３】上記１１患者のｈＭＳＣにおける２つの有意な心臓転写因子ｍＲＮＡ発現を示す。
【図４】無処置の未感作ｈＭＳＣ（左）と心原性カクテルで処置したＣＰ−ｈＭＳＣ（右）のそれぞれのＮｋｘ２．５ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ−６ｍＲＮＡ及びＦｏｇ−１ｍＲＮＡの心臓転写因子の任意単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔ：Ａ．Ｕ．）におけるｍＲＮＡ発現を示す。
【図５】心原性カクテルで処置したＣＰ−ｈＭＳＣ（右）を未感作ｈＭＳＣ（左）と比較した、ＮＫＸ２．５、ＭＥＦ２Ｃ、ＦＯＧ−２及びＧＡＴＡ４ポリペプチドの核移行を示す、共焦点顕微鏡法により得られた画像を示す。
【図６】未感作ｈＭＳＣから「カクテル誘導」ＣＰ−ｈＭＳＣ及び最終的に心筋細胞（ＣＭ）への（Ｄ０、Ｄ５、Ｄ１５及びＤ２０日における）進行性変換を示す。
【図７】未感作ｈＭＳＣ及びカクテル誘導心筋細胞の遷移電子顕微鏡超微細構造を示す。
【図８】光学顕微鏡法によるカクテル誘導心筋細胞を示す。
【図９】左側の最初のグラフは図１の各患者からの未感作ｈＭＳＣ及びＣＰ−ｈＭＳＣのＴｂｘ−５ｍＲＮＡ発現（Ａ．Ｕ．）を示し、未感作細胞の結果をヒストグラムの右に、ＣＰ細胞の結果を左に示す。中央の第２のグラフはＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ発現を示し、右側の３番目のグラフはＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ発現を示す。全患者の未感作細胞の平均値及び全患者のＣＰ細胞の平均値は、ヒストグラムのバックグラウンド程度である。
【図１０】ＣＰ−ｈＭＳＣ（すなわち、カクテル誘導ｈＭＳＣ）で心臓を処置した場合に対する、異なる種々の量の未感作ｈＭＳＣで心臓を処置した後の駆出率の変化（Δ駆出率：１２患者それぞれについてヒストグラムの右側部分に示す）を示すグラフである。
【図１１】心臓形成細胞未処置（左）及び処置後（右）の梗塞のある心臓の心エコー検査結果であり、ＣＰ−ｈＭＳＣでの処置により前壁の蘇生がはるかに良くなっていることが分る。
【図１２】図５と同様のグラフであり、梗塞のある心筋への未感作（左側）と心臓形成細胞（右側）の注入後の駆出率の変化（ΔＥＦ）を示す。Ｓｈａｍは細胞無しでの注入である。
【図１３】梗塞のあるマウス心臓への未感作ｈＭＳＣまたはＣＰ−ｈＭＳＣの処置を６ヶ月続けた結果を示す。未感作ｈＭＳＣ処置心臓では修復せず残ってしまった動脈瘤及び瘢痕が、筋再構築を誘導するＣＰ−ｈＭＳＣ処置により解決された。
【図１４】心臓形成ｈＭＳＣ処置マウス心筋に、ヒト特異的ラミン免疫染色によりヒトに特異的なｈ−ＡＬＵ−ＤＮＡ配列が陽性染色された、コントロールとしての梗塞では存在しないヒト由来細胞が広く存在することが、共焦点解像によって明らかになったことを示す。
【図１５】ヒト起源の心筋細胞が心臓形成ｈＭＳＣ処置心臓のヒト心トロポニンＩ及びα−アクチニンの共局在により追跡されたことを示す。ヒト起源の心筋細胞は、未感作ｈＭＳＣ処置心臓には存在しなかった。梗塞のある前壁内での定量化では、ＣＰ−ｈＭＳＣ処置心臓に対して、未感作では心筋核の３±２％及び２５±５％であることが明らかになった。これは心臓形成ｈＭＳＣ処置の生着の増進を伴っていた。
【図１６】ヒトトロポニン、心室ミオシン軽鎖ｍｌＣ２Ｖ及びＤＡＰＩ染色した未感作及びＣＰ−ｈＭＳＣの写真である。心室細胞表現型は、図１５に示されるように修復された前壁または図１７に示されるように消散された瘢痕での、心室ミオシン軽鎖ｍｌＣ２Ｖの免疫染色によるヒトトロポニン陽性細胞の対比染色により実証された。
【図１７】ヒトトロポニン、心室ミオシン軽鎖ｍｌＣ２Ｖ及びＤＡＰＩを染色した残余瘢痕の写真である。
【図１８】閉塞心臓血管の遠位での血管形成を示す、ＣＰ−ｈＭＳＣ処置再生心筋の写真である。
【図１９】心筋血管系内のヒトＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ−３１）の発現を介してＣＰ−ｈＭＳＣが新たに血管形成に貢献することを示す。
【図２０】細胞送達後の時間（月）に対するＳｈａｍ（％）に比較したΔ駆出率をプロットしたグラフである。ＣＰ−ｈＭＳＣ処置の長期間の効果を１年以上またはヒトの人生の２５年に匹敵するマウスの寿命の３分の１にわたって追跡した。Ｓｈａｍと比較して、未感作ｈＭＳＣでは、６ヶ月及び１２ヶ月でそれぞれ５％、２．５％の駆出率の増加効果があった。反対に、心臓形成ｈＭＳＣで処置された梗塞マウスでは、Ｓｈａｍに比較して、６ヶ月及び１２ヶ月で２５％という著しい駆出率の改善が見られた。
【図２１】細胞移植後の時間（月）に対するΔ駆出率をプロットしたグラフである。梗塞集団を、効果を評価するために、治療時における明白な心疾患（駆出率：＜４５％）の記録によりサブグループに分類した。処置前において駆出率が３５％で同等であったが、心臓形成ｈＭＳＣ処置集団のみにおいて６及び１２ヶ月で１０％の絶対的な駆出率の改良が見られ、未感作ｈＭＳＣ処置集団では逆に駆出率は５％低下した。
【図２２】梗塞が示されたマウスのサブグループの生存率（％）をプロットした棒グラフである。明白な心臓疾患サブグループの４００日のフォローアップでは、Ｓｈａｍでは生存したマウスは存在せず、未感作処置ｈＭＳＣでは、５０％以上が死亡した。これに対して、心臓形成ｈＭＳＣ処置では、８０％以上が生存した。
【図２３】病理学的実験及び心電図記録法により決定された、ＣＰ−ｈＭＳＣでの処置の安全性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書は、心臓細胞（例えば、分化型心臓前駆細胞）に関する方法及び材料を提供する。例えば、本明細書は、機能的心筋細胞として心臓組織に組み込むことができる細胞、そのような細胞を作製する方法、そのような細胞を作製するための組成物及び細胞（例えば、分化型心臓前駆細胞）の集団が機能的心筋細胞として心臓組織に組み込まれる能力を有する細胞を含有するかどうかを決定する方法を提供する。本発明はまた、心臓組織（例えば、ヒト心臓組織）に機能的心筋細胞を提供するための方法及び材料を提供する。
【００３１】
本明細書において提供される分化型心臓前駆細胞は、ヒト、サル、ウマ、イヌ、ネコ、ラット、マウスを含むがこれらに限定されない任意の種から取得できる。例えば、分化型心臓前駆細胞は、哺乳類（例えば、ヒト）の分化型心臓前駆細胞であることができる。
【００３２】
場合によっては、本明細書において提供される分化型心臓前駆細胞は機能的心筋細胞として心臓組織に組み込まれる能力を有する。
【００３３】
分化型心臓前駆細胞は、任意の好適な方法により取得することができる。例えば、哺乳類（例えば、ヒト）の幹細胞などの幹細胞から抽出できる。
【００３４】
場合によっては、分化型心臓前駆細胞は、胚幹細胞から抽出することができる。場合によっては、分化型心臓前駆細胞は、間葉幹細胞から抽出することができる。間葉幹細胞は、いずれから取得してもよい。例えば、間葉幹細胞は、骨髄や骨梁などの哺乳類（例えば、ヒト）の組織から取得することができる。間葉幹細胞は、生体外で培養することができる。例えば、間葉幹細胞の数を生体外で増やすことができる。間葉幹細胞は、細胞表面にポリペプチドマーカーを発現することもしないことも可能である。例えば、間葉幹細胞は、細胞表面上にＣＤ１３３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９及びＣＤ４４を発現することができ、細胞表面にＣＤ１４、ＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しない。
【００３５】
分化型心臓前駆細胞は、任意の好適な方法により幹細胞（例えば、間葉幹細胞）から抽出することができる。例えば、分化型心臓前駆細胞は、組成物（例えば、培養培地）で間葉幹細胞を培養することにより、間葉幹細胞から抽出することができる。組成物は、１つまたは複数の因子を含有する任意の好適な組成物であることができる。因子は、ポリペプチド、ステロイド、ホルモン、小分子など、任意のタイプの因子であることができる。そのような因子の例には、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、アクチビン−Ａ、カルジオトロフィン、α−トロンビン及びカルジオゲノールＣが含まれるが、これらに限定されない。
【００３６】
１つの実施形態において、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、カルジオトロフィン、α−トロンビン及びカルジオゲノールＣを含有する培地を使用して、幹細胞（例えば、間葉幹細胞）から分化型心臓前駆細胞を取得することができる。そのような場合、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、カルジオトロフィン、α−トロンビン及びカルジオゲノールＣを含有する培地での初期培養期間（例えば、１〜２日）の後、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、アクチビン−Ａまたはそれらの組み合わせを培地に添加することができる。
【００３７】
ＴＧＦβは、ヒトＴＧＦβなどのＴＧＦβ活性を有する任意のポリペプチドであってよい。例えば、ＴＧＦβは、組換えＴＧＦβまたは合成ＴＧＦβであってよい。１つの実施形態において、ＴＧＦβはＴＧＦβ−１であってよい。ＴＧＦβは、任意の好適な濃度で使用することができる。例えば、１ｍＬ当たり１〜１０ｎｇのＴＧＦβ（例えば、１ｍＬ当たり約２．５ｎｇのＴＧＦβ−１）を使用することができる。
【００３８】
ＢＭＰは、ヒトＢＭＰなどのＢＭＰ活性を有する任意のポリペプチドであってよい。例えば、ＢＭＰは、組換えＢＭＰまたは合成ＢＭＰであってよい。１つの実施形態において、ＢＭＰはＢＭＰ４であってよい。ＢＭＰは、任意の濃度で使用することができる。例えば、１ｍＬ当たり１〜２０ｎｇのＢＭＰ（例えば、１ｍＬ当たり約５ｎｇのＢＭＰ４）を使用することができる。
【００３９】
ＦＧＦ−２は、ヒトＦＧＦ−２などのＦＧＦ−２活性を有する任意のポリペプチドであってよい。例えば、ＦＧＦ−２は、組換えＦＧＦ−２または合成ＦＧＦ−２であってよい。ＦＧＦ−２は、任意の濃度で使用することができる。例えば、１ｍＬ当たり１〜２０ｎｇのＦＧＦ−２（例えば、１ｍＬ当たり約５ｎｇのＦＧＦ−２）を使用することができる。
【００４０】
ＩＧＦ−１は、ヒトＩＧＦ−１などのＩＧＦ−１活性を有する任意のポリペプチドであってよい。例えば、ＩＧＦ−１は、組換えＩＧＦ−１または合成ＩＧＦ−１であってよい。ＩＧＦ−１は、任意の濃度で使用することができる。例えば、１ｍＬ当たり１０〜１００ｎｇのＩＧＦ−１（例えば、１ｍＬ当たり約５０ｎｇのＩＧＦ−１）を使用することができる。
【００４１】
アクチビン−Ａは、ヒトアクチビン−Ａなどのアクチビン−Ａ活性を有する任意のポリペプチドであってよい。例えば、アクチビン−Ａは、組換えアクチビン−Ａまたは合成アクチビン−Ａであってよい。アクチビン−Ａは、任意の濃度で使用することができる。例えば、１ｍＬ当たり１〜５０ｎｇのアクチビン−Ａ（例えば、１ｍＬ当たり約１０ｎｇのアクチビン−Ａ）を使用することができる。
【００４２】
α−トロンビンは、ヒトα−トロンビンなどのα−トロンビン活性を有する任意のポリペプチドであってよい。例えば、α−トロンビンは、組換えα−トロンビンまたは合成α−トロンビンであってよい。α−トロンビンは、任意の濃度で使用することができる。例えば、１ｍＬ当たり０．５〜１０単位のα−トロンビン（例えば、１ｍＬ当たり約１単位のα−トロンビン）を使用することができる。
【００４３】
カルジオトロフィンは、ヒトカルジオトロフィン−１などのカルジオトロフィン活性を有する任意のポリペプチドであってよい。例えば、カルジオトロフィンは、組換えカルジオトロフィンまたは合成カルジオトロフィンであってよい。カルジオトロフィンは、任意の濃度で使用することができる。例えば、１ｍＬ当たり０．５〜１０ｎｇのカルジオトロフィン（例えば、１ｍＬ当たり約１ｎｇのカルジオトロフィン−１）を使用することができる。
【００４４】
ＩＬ−６は、ヒトＩＬ−６などのＩＬ−６活性を有する任意のポリペプチドであってよい。例えば、ＩＬ−６は、組換えＩＬ−６または合成ＩＬ−６であってよい。ＩＬ−６は、任意の濃度で使用することができる。例えば、１ｍＬ当たり１００〜２００ｎｇのＩＬ−６を使用することができる。
【００４５】
任意の濃度のカルジオゲノールＣまたはその薬学的に許容できる塩（例えば、カルジオゲノールＣ塩酸塩）を使用することができる。例えば、１０〜１０００ｎＭのカルジオゲノールＣ（例えば、約１００ｎＭのカルジオゲノールＣ）を使用することができる。
【００４６】
レチノイン酸は、合成レチノイン酸、天然レチノイン酸、ビタミンＡ代謝産物、ビタミンＡの天然誘導体またはビタミンＡの合成誘導体などのレチノイン酸活性を有する任意の分子であってよい。レチノイン酸は任意の濃度で使用することができる。例えば、１×１０−６〜２×１０−６μＭのレチノイン酸を使用することができる。
【００４７】
場合によっては、ＴＧＦβ−１（例えば、２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（例えば、５ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（例えば、５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（例えば、５０ｎｇ／ｍＬ）、アクチビン−Ａ（例えば、１０ｎｇ／ｍＬ）、カルジオトロフィン（例えば、１ｎｇ／ｍＬ）、α−トロンビン（例えば、１Ｕ／ｍＬ）及びカルジオゲノールＣ（例えば、１００ｎＭ）を補った血清含有または無血清培地を使用して、幹細胞（例えば、間葉幹細胞）から分化型心臓前駆細胞を取得することができる。場合によっては、培地（例えば、血清含有または無血清培地）は血小板溶解物を含有することができる。
【００４８】
場合によっては、間葉幹細胞から分化型心臓前駆細胞を取得するために使用する組成物はさらに、ＴＮＦ−α、ＬＩＦ及びＶＥＧＦ−Ａなどの因子を任意に含有してよい。
【００４９】
ＴＮＦ−αは、ヒトＴＮＦ−αなどのＴＮＦ−α活性を有する任意のポリペプチドであってよい。例えば、ＴＮＦ−αは、組換えＴＮＦ−αまたは合成ＴＮＦ−αであってよい。ＴＮＦ−αは、任意の濃度で使用することができる。例えば、１ｍＬ当たり５〜５０ｎｇのＴＮＦ−αを使用することができる。
【００５０】
ＬＩＦは、ヒトＬＩＦなどのＬＩＦ活性を有する任意のポリペプチドであってよい。例えば、ＬＩＦは、組換えＬＩＦまたは合成ＬＩＦであってよい。ＬＩＦは、任意の濃度で使用することができる。例えば、１ｍＬ当たり２．５〜１００ｎｇのＬＩＦを使用することができる。
【００５１】
ＶＥＧＦ−Ａは、ヒトＶＥＧＦ−ＡなどのＶＥＧＦ−Ａ活性を有する任意のポリペプチドであってよい。例えば、ＶＥＧＦ−Ａは、組換えＶＥＧＦ−Ａまたは合成ＶＥＧＦ−Ａであってよい。ＶＥＧＦ−Ａは、任意の濃度で使用することができる。例えば、１ｍＬ当たり５〜２００ｎｇのＶＥＧＦ−Ａを使用することができる。
【００５２】
本明細書において提供される組成物は、任意の組み合わせの因子を含有することができる。例えば、本明細書において提供される組成物は、ＴＧＦβ−１、ＢＭＰ４、アクチビン−Ａ、カルジオトロフィン、α−トロンビン及びカルジオゲノールＣを含有することができる。場合によっては、本明細書において提供される組成物は、ＴＧＦβ−１、ＢＭＰ４、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、カルジオトロフィン、α−トロンビン及びカルジオゲノールＣを含有することができる。場合によっては、本明細書において提供される組成物は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、レチノイン酸またはそれらの組み合わせ（例えば、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＶＥＧＦ−Ａ及びレチノイン酸；ＬＩＦ、ＶＥＧＦ−Ａ及びレチノイン酸；またはＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＬＩＦ及びＶＥＧＦ−Ａ）を欠如することもできる。
【００５３】
本明細書において提供される組成物は、任意の好適な方法により調製することができる。例えば、本明細書において提供される組成物は、市販の因子を使用して調製することができる。場合によっては、本明細書において提供される組成物は、細胞溶解物（例えば、血小板溶解物）を含有するように調製することができる。または心筋細胞やＴＮＦ−α−刺激内胚葉細胞などの細胞からの馴化培地であることができる。例えば、本明細書において提供される組成物は、市販の因子が補充された血小板溶解物を使用して調製することができる。場合によっては、本明細書において提供される組成物は、馴化培地から単離された因子を使用して調製することができる。場合によっては、前記因子は、血清を含有または含有しない細胞培養培地などの培地に溶解させることができる。
【００５４】
幹細胞（例えば、間葉幹細胞）を本明細書において提供される組成物とともに任意の好適な方法を使用して培養し、機能的心筋細胞として心臓組織に組み込まれる能力を有する分化型心臓前駆細胞を取得することができる。例えば、間葉幹細胞は、本明細書において提供される組成物とともに、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５または５０日間培養することができる。場合によっては、本明細書において提供され、間葉幹細胞を培養するために使用される組成物は、毎日または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５または５０日毎に交換することができる。
【００５５】
場合によっては、間葉幹細胞は、血清の存在または非存在下に本明細書において提供される組成物とともに培養することができる。任意の好適な細胞密度で、幹細胞を本明細書において提供される組成物とともに培養することができる。例えば、１ｃｍ２当たり約１０００〜２０００個の間葉幹細胞（例えば、約１５００〜２０００細胞／ｃｍ２）を、本明細書において提供される組成物とともに培養して分化型心臓前駆細胞を取得することができる。
【００５６】
一旦幹細胞（例えば、間葉幹細胞）を本明細書において提供される組成物とともに培養または分化因子により処置すると、分化の状態を、幹細胞が機能的心筋細胞として心臓組織に組み込まれる能力を有する分化型心臓前駆細胞に分化したか否かを決定するためにモニターすることができる。例えば、細胞検体を集め、ウェスタンブロット法、蛍光活性化細胞分類（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）法、免疫染色法、レーザー共焦点顕微鏡法、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＲＴ−ＰＣＲ）法（例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲ）などの方法により評価することができる。場合によっては、ＭＥＦ２ｃ、ＭＥＳＰ−１、Ｔｂｘ−５、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ６、Ｆｌｋ−１、Ｆｏｇ１及びＦｏｇ２ポリペプチドまたはｍＲＮＡの発現が上昇していることが見出された細胞を選択し、心臓組織の治療のために哺乳類に投与することができる。
【００５７】
本明細書に記載されているように、ＴＧＦβ−１、ＢＭＰ４、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、アクチビン−Ａ、カルジオトロフィン、α−トロンビン及びカルジオゲノールＣを含有する血小板溶解物とともに培養した間葉幹細胞から抽出された分化型心臓前駆細胞では、ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ、ＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ６ｍＲＮＡ、Ｆｌｋ−１またはＦｏｇ１ｍＲＮＡの値が、処置前の間葉幹細胞における値に比較して、２〜５倍に上昇した。これらの分化型心臓前駆細胞はまた、虚血性及び非虚血性両状況における構造修復に直接相関する心ポンプ機能の改善とともに、心筋内、皮下または血管内に注入されたときに、機能的心筋細胞として心臓組織に組み込まれる能力を示した。機能的利点が、生体内心エコー及びヒト特異的タンパク質の染色による剖検により組織学的に立証された。また、本明細書に記載のように、ＴＧＦβ−１、ＢＭＰ４、ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、アクチビン−Ａ、カルジオトロフィン、α−トロンビン及びカルジオゲノールＣを含有する血清とともに培養された間葉幹細胞から抽出した分化型心臓前駆細胞は、ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ、ＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ及びＴｂｘ−５ｍＲＮＡ値も、処置前の間葉幹細胞における値に比較して、５〜１０倍に上昇した。
【００５８】
これらの分化型心臓前駆細胞はまた、虚血性及び非虚血性両状況における構造修復に直接相関する心ポンプ機能の改善とともに、心筋内（例えば、心内膜または心外膜経由）、冠動脈内、心内注入または全身投与（例えば、皮下）により注入された場合に、機能的心筋細胞として心臓組織に組み込まれる能力を示した。また、機能的利点が、生体内心臓超音波及びヒト特異的タンパク質の染色による剖検における顕微鏡分析により立証された。このように、ＭＥＦ２ｃ、ＭＥＳＰ−１、Ｔｂｘ−５、ＧＡＴＡ６、Ｆｌｋ−１、Ｆｏｇ１、ＦＯＧ２またはそれらの組み合わせにおけるポリペプチドまたはｍＲＮＡの上昇などの放出基準を、哺乳類への投与に先立つ細胞の評価に使用することができる。
【００５９】
ここで、細胞集団内におけるＭＥＦ２ｃ、ＭＥＳＰ−１、Ｔｂｘ−５、ＧＡＴＡ６、Ｆｌｋ−１、Ｆｏｇ（例えば、ｍＲＮＡとしてのＦＯＧ１、ポリペプチドとしてのＦＯＧ２）のポリペプチドまたはｍＲＮＡの値について使用される「上昇値」という用語は、ポリペプチドまたはｍＲＮＡとしての基準値よりも大きい値を指す。
【００６０】
ここで、細胞集団内におけるＭＥＦ２ｃ、ＭＥＳＰ−１、Ｔｂｘ−５、ＧＡＴＡ６、Ｆｌｋ−１、Ｆｏｇ（例えば、ｍＲＮＡとしてのＦＯＧ１、ポリペプチドとしてのＦＯＧ２）のポリペプチドまたはｍＲＮＡの値について使用される「基準値」という用語は、処置前の細胞（例えば、処置前の間葉幹細胞）に通常見出される値を指す。例えば、ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ基準値、ＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ基準値、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡ基準値、ＧＡＴＡ６ｍＲＮＡ基準値及びＦＯＧ１ｍＲＮＡ基準値は、それぞれ、本明細書において提供される組成物または他の分化因子で処置されていない間葉幹細胞を無作為抽出したサンプル中に存在するＭＥＦ２ｃ、ＭＥＳＰ−１、Ｔｂｘ−５、ＧＡＴＡ６、Ｆｌｋ−１及びＦＯＧ１ｍＲＮＡの平均値であることができる。当然のことながら、比較サンプルの値を使用して、ある特定の値が上昇値であるか否かを決定する。
【００６１】
ＭＥＦ２ｃ、ＭＥＳＰ−１、Ｔｂｘ−５、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、Ｆｌｋ−１、Ｆｏｇ２またはＦＯＧ１の上昇したポリペプチド及び／またはｍＲＮＡ値は、対応する基準値より大きい限りどの程度でもよい。
【００６２】
例えば、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡの上昇値は、未処置間葉幹細胞において観察されるＴｂｘ−５ｍＲＮＡの基準値の１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍またはそれ以上であることができる。なお、基準値はいずれの量であってもよい。例えば、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡの基準値は０（ゼロ）でもよい。そのような場合、ゼロより大きいＴｂｘ−５ｍＲＮＡの値はどれも上昇値であると言える。
【００６３】
場合によっては、同定基準に哺乳類への投与に先立つ細胞の顕微鏡分析を含めることができる。そのような顕微鏡分析では、核に関連する転写因子ポリペプチドに対する細胞の評価を含めることができる。例えば、哺乳類内への放出に好適な細胞は、哺乳類内に放出される前に核に関連するＮｋｘ２．５、ＭＥＦ２ｃ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＳＰ−１、ＦＯＧ２、Ｔｂｘ−５またはそれらの組み合わせの存在について評価することができる。
【００６４】
機能的心筋細胞として心臓組織内に組み込まれる能力を有する分化型心臓前駆細胞を有する心臓組織は、任意の好適な方法により提供できる。例えば、分化型心臓前駆細胞は、心筋内（例えば、心内膜または心外膜経由）、冠動脈内、心内注入または全身投与（例えば、皮下）により注入できる。
【００６５】
分化型心臓前駆細胞により任意の心臓組織を提供することができる。例えば、分化型心臓前駆細胞により哺乳類（例えば、ヒト）心臓組織を提供することができる。場合によっては、分化型心臓前駆細胞により虚血性心筋症、心筋梗塞または心不全に罹った心臓組織を提供することができる。
【００６６】
任意のタイプの分化型心臓前駆細胞を心臓組織に投与することができる。例えば、自己または異種分化型心臓前駆細胞を心臓組織に投与することができる。場合によっては、本明細書において提供される組成物とともに培養された幹細胞（例えば、間葉幹細胞）を心臓組織に投与することができる。
【００６７】
幹細胞は、心臓組織に投与される前に、本明細書において提供される組成物とともに任意の時間培養される。例えば、幹細胞は、心臓組織に投与される前に、本明細書において提供される組成物とともに６〜２４時間（例えば、８、１０、１２、１８または２２時間）または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５または５０日間培養することができる。場合によっては、本明細書において提供される組成物とともに培養された幹細胞は、本明細書において提供される組成物とともに心臓組織に投与することができる。
【００６８】
幹細胞は、本明細書において提供される組成物とともに心臓組織に投与される前に、本明細書において提供される組成物とともに任意の時間培養される。例えば、幹細胞は、本明細書において提供される組成物とともに心臓組織に投与される前に、本明細書において提供される組成物とともに６〜２４時間（例えば、８、１０、１２、１８または２２時間）または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５または５０日間培養される。
【００６９】
場合によっては、分化型心臓前駆細胞を哺乳類に投与する前に、特定の放出基準を達成しているか否かを決定するために評価してよい。例えば、分化型心臓前駆細胞を哺乳類に投与する前に、分化型心臓前駆細胞がＭＥＦ２ｃ、ＭＥＳＰ−１、Ｔｂｘ−５、ＧＡＴＡ６、Ｆｌｋ−１、Ｆｏｇ（ｍＲＮＡとしてのＦＯＧ１、ポリペプチドとしてのＦＯＧ２）またはそれらの組み合わせのポリペプチドまたはｍＲＮＡ値が上昇していることを確認するためにＲＴ−ＰＣＲにより評価できる。
【００７０】
本発明を以下の実施例によりさらに記載するが、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものではない。
【００７１】
虚血性心疾患に対して冠動脈バイパス術を受けた患者から、無作為に骨髄採取を行った。インフォームド・コンセントを得て、研究プロトコールは適切な倫理審査委員会及び動物実験審査委員会の承認を得た。何の意味もない注入をマウス以外、患者にすることはなかった。
【実施例１】
【００７２】
間葉幹細胞は、１８〜４５歳の健常者（Ｃａｍｂｒｅｘ，  Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）の骨盤骨の後腸骨稜から抽出したヒト骨髄から採取した。フローサイトメトリー分析の結果では、間葉幹細胞はＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９及びＣＤ４４を発現し、ＣＤ１４、ＣＤ３４及びＣＤ４５は発現しなかった。
【００７３】
ヒト骨髄由来間葉幹細胞を、血小板溶解物またはＴＧＦβ−１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）、アクチビン−Ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）、カルジオトロフィン（１ｎｇ／ｍＬ）、α−トロンビン（１Ｕ／ｍＬ）及びカルジオゲノールＣ（１００ｎＭ）が補充された血清中で培養した。細胞密度１０００〜２０００個／ｃｍ２の血小板溶解物含有培養では、４〜１０日後に、未処置間葉幹細胞に比較して、ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ、ＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ６ｍＲＮＡ及びＦｌｋ−１またはＦＯＧ１ｍＲＮＡの発現が２〜５倍以上であることが認められた。
【００７４】
細胞密度１０００〜２０００個／ｃｍ２の血清含有培養では、５〜１５日後に、未処置間葉幹細胞に比較して、ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ、ＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ４ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ６ｍＲＮＡ及びＦｌｋ−１またはＦＯＧ１ｍＲＮＡの発現が５〜１０倍以上であることが認められた。
【００７５】
ＲＴ−ＰＣＲ分析に使用されたプライマー対としては、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した標準プライマーを使用した。
【００７６】
分化型心臓前駆細胞が機能的心筋細胞として心臓組織に組み込まれる能力を有することを示す結果は、鼓動する心臓での生体内及び続いての剖検による生体外の両方において観察された。生体内では、イソフルラン麻酔下に、二次元Ｍモード探索短軸及び長軸心エコー法、ドップラーパルス波形分析及び１２誘導心電図検査によりモニターされたように、疾患心臓の心筋に直接心臓前駆細胞を投与することにより心臓性能が改善された。
【００７７】
摘出した心臓組織を３％パラホルムアルデヒド内に固定し、薄片にし、ヒト細胞追跡の免疫探索を行った。機能改善及び瘢痕消散した、新たなヒト由来心筋細胞と脈管は、放出基準（例えば、ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ、ＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ４ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ６ｍＲＮＡ及びＦｌｋ−１またはＦＯＧ１ｍＲＮＡ値の上昇）を満たす心臓前駆細胞で処置されたマウスの分析により立証された。これは、放出基準を満たさなかった細胞における効果の欠如と対照的である。
【００７８】
患者への自己移植注入用の心臓形成細胞の作製規模を拡大するために、時間のかかる、定性的かつオペレーター依存の可能性のある免疫蛍光法の代替方法を検討した。選択肢の１つは、リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＲＴ−ｑＰＣＲ）である。この方法では、オペレーター非依存的であり、参照標準に関して定量的な結果をより早く（１日以内）得ることができる。また、免疫染色サンプルは一つ一つ蛍光顕微鏡評価する必要があるが、異なるサンプル（または条件）を４８まで９６穴プレートを使ってＲＴ−ｑＰＣＲにより二重に試験することができる。
【００７９】
ＲＴ−ｑＰＣＲの好適なマーカーを同定するために、心臓病患者（ｎ＝７）から得られた骨髄サンプル由来の心臓形成細胞を使用した。細胞は、ＭＥＦ２Ｃ及びＮｋｘ２．５に対する免疫蛍光染色により評価した。ＲＮＡはこれらの細胞から抽出し、Ｎｋｘ２．５及びＭＥＦ２Ｃの発現はリアルタイム定量ＰＣＲにより測定した。
【００８０】
参照標準は、心原性カクテルの非存在下に培養した同一バッチからの細胞で構成した。
【００８１】
結果は、処置細胞から得られたデータを非処置細胞のそれに標準化する二重デルタＣｔ法を使用して計算した。
【００８２】
ＭＥＦ２Ｃが、未感作細胞に比較した場合、ｑＰＣＲ及び免疫蛍光（核移行）の両者で心臓形成細胞の好適なマーカーとして同定された。一方、免疫蛍光（核移行）によるＮｋｘ２．５のタンパク質値としての量的変化は、未処置細胞に比べてＲＮＡ値での量的変化に当初は置き換えられなかった。Ｎｋｘ２．５の発現誘導は、Ｎｋｘ２．５の核移行に依存するので、Ｎｋｘ２．５の下流の遺伝子を調査した。これにより、ｑＰＣＲの追加の好適な遺伝子として、ＭＥＳＰ−１、Ｆｌｋ−１及びＴｂｘ５が同定された。
【００８３】
ヒト骨髄吸引物（１５〜２０ｍＬ）は胸骨切開に続く冠動脈バイパス手術において取得した。骨髄は、ＤＭＳＯ系無血清溶液中に冷凍保存した。間葉幹細胞は、原料の骨髄をプラスチック皿上に置き、１２時間洗浄、Ｄ３４−／ＣＤ４５−／ＣＤ１３３＋マーカーパネルを使用して蛍光活性化細胞分類（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）分析により確認された、同一性を有する接着細胞を選択したものを採用した。細胞は、５％ヒト血小板溶解物（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ，  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，  ＭＮ）を補充したＤＭＥＭ中、３７℃で培養した。
【００８４】
免疫不全ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）に心筋梗塞を誘発した。盲検の前に、梗塞の１ヶ月後に、左心室の前壁の５つの心外膜部位に全部で６００，０００個の未感作または心臓発生誘導ｈＭＳＣを１２．５μＬの増殖培地に懸濁し、検鏡下に注入した。Ｓｈａｍに対しては、細胞の注入をせずに同一の外科的処置を行った。この慢性梗塞モデルへの骨髄ｈＭＳＣの心筋注入は、心エコー法で駆出率の改良が認められた１１の被検体において、２被検体のみで細胞の移植による成果が得られ、その成果の多様性を示した。
【００８５】
患者３及び９は、心臓生成可能性が高い個体であることが確認された。図１から、患者３及び９それぞれから取得したｈＭＳＣで処置したマウス（ｎ＝３）における駆出率の変化は、有意に陽性であることが観察されたが、他の患者の変化は陽性ではなかった。
【００８６】
心臓転写因子のタンパク質発現は、図２に示されるように、共焦点顕微鏡法によりｈＭＳＣに観察された。図中の線の長さは、全てのパネルにおいて２０μｍに対応する。
【００８７】
免疫染色は、ＭＥＦ２Ｃ（１：４００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｄａｎｖｅｒｓ，  ＭＡ）、Ｎｋｘ２．５（１：１５０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＣＡ）、ＧＡＴＡ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、リン酸化ＡＫＴＳｅｒ４７３（１：１００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｔｂｘ５（１：５０００、Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）、Ｍｅｓｐ−１（１：２５０、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏ，  Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，  ＣＯ）、Ｆｏｇ−２（１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、サルコメアタンパク質α−アクチニン（１：５００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びヒト特異的トロポニン−Ｉ（１：１００、Ａｂｃａｍ）に特異的な抗体、並びにｍｌＣ２ｖ（１：５００、Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｇｏｔｔｉｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓｃａ−１（１：１００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ＭＮ）、ＣＤ−３１／ＰＥＣＡＭ−１（１：５００、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ）、α−平滑筋アクチン（Ａｂｃａｍ）、ヒト特異的トロポニン−Ｉ（１：１００、Ａｂｃａｍ）、ヒトラミンＡ／Ｃ（１：５０、Ｎｏｖａｃａｓｔｒａ，  Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，  ＵＫ）及びＫｉ６７（１：５００、Ａｂｃａｍ）を使用して行い、３％パラホルムアルデヒド中に固定、１％トライトンＸ−１００で透過処置し、核をＤＡＰＩ染色して可視化し、ＬＳＭ５１０共焦点走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｊｅｎａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して共焦点顕微鏡法を行った。
【００８８】
早期心臓転写因子であるＮｋｘ２．５、Ｔｂｘ−５及びＭＥＳＰ１並びに後期心臓転写因子であるＭＥＦ２ＣがＤＡＰＩ染色により観察された。患者２の結果を左に、患者９の結果を右に示す。得られた画像によれば、心臓転写因子の発現は、患者２のｈＭＳＣで弱く、患者９のｈＭＳＣで高かった。これは、患者９からのｈＭＳＣは効率的な治療的効果を与えるが、治療患者２からのｈＭＳＣではそのような効果は得られない、という事実を実証している。ＤＡＰＩによる着色は青である。
【００８９】
図２では、Ｎｋｘ２．５の最初の一連の画像は、患者２（左）のｈＭＳＣにおいて細胞核のみがＤＡＰＩ（左）で青く着色されたことを示す。細胞質内のＮｋｘ２．５の存在に対応して薄い緑色も現れている。患者９の対応する画像（右）は、細胞質及び細胞核にもＮｋｘ２．５（緑）の強い発現が見られる。
【００９０】
第２の一連の画像は、患者２の心臓転写因子であるＴｂｘ−５（緑）及びＭＥＳＰ−１（赤）を示す。細胞株がＤＡＰＩにより青く染色され、緑及び赤は観察されないので、ＴｂＸ−５及びＭＥＳＰ−１の発現がないことを示す。患者９では、細胞の細胞質が赤く、核が緑に着色され、これは両心臓転写因子が強く発現され、細胞核へのＴｂｘ−５の転位が起こっていることを示す。
【００９１】
第３の一連の画像は、ＭＥＦ２Ｃの結果を示し、その結果はＮｋｘ２．５に類似している。
【００９２】
図３は、研究対象１１人の患者のｈＭＳＣにおける心臓転写因子発現（ＭＥＦ２Ｃ及びＴｂｘ−５）を示す、ｑＰＣＲにより検討されたｍＲＮＡ発現を示す。
【００９３】
定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｑＰＣＲ）は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７，９００ＨＴ配列検出システムを有するＴａｑＭａｎＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて行った。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現反応は、９６穴プレート内で培養して行い、三重で行った。閾値サイクル（ＣＴ）は、蛍光が通過する固定閾値での分画サイクル数として定義される。ＴａｑＭａｎＣＴ値は、−△△ＣＴ法を使用して決定された相対倍率変化に転換し、ＧＡＰＤＨ（Ｐ／Ｎ４３５，２６６２−０５０６００３）発現に標準化した。
【００９４】
その心筋転写活性を評価した遺伝子を表１に記載した。
【００９５】
細胞は、ヒト組換えＴＧＦβ−１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ）、カルジオトロフィン（１ｎｇ／ｍＬ）、α−トロンビン（１Ｕ／ｍＬ）及びカルジオゲノールＣ（１００μＭ）を含有する心原性カクテルでの刺激前及び刺激の５日後に、ｍＲＮＡとタンパク質値により評価した。患者２及び９のｈＭＳＣにおいて、ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ及びＴｂｘ−５ｍＲＮＡ双方の発現（任意単位：Ａ．Ｕ．）が、他の患者に比較して非常に高い。
【００９６】
【表１】
2011521645.tif 000002
【００９７】
左心室機能及び構造を、連続的に経胸腔的心エコー法により追跡した（Ｓｅｑｕｏｉａ  ５１２；  Ｓｉｅｍｅｎｓ，  Ｍａｌｖｅｒｎ，  ＰＡ  ａｎｄ  ＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ，  Ｔｏｒｏｎｔｏ，  Ｃａｎａｄａ）。駆出率（％）は、［（ＬＶＶｄ−ＬＶＶｓ）／ＬＶＶｄ］×１００として算出した。ＬＶＶｄは左心室拡張末期容積（μＬ）であり、ＬＶＶｓは左心室収縮末期容積（μＬ）である。
【００９８】
図４は、未処置の未感作ｈＭＳＣ（左）及び心原性カクテルで処置したＣＰ−ｈＭＳＣ（右）における心臓転写因子、Ｎｋｘ２．５ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ−６ｍＲＮＡ及びＦｏｇ−１ｍＲＮＡ、の任意単位（Ａ．Ｕ．）でのｍＲＮＡ発現を示す。各因子において、心原性カクテルで処置した細胞を使用することにより結果がはるかに良好であることが明らかである。
【００９９】
図５は、心原性カクテルで処置した未感作ＣＰ−ｈＭＳＣにおけるＮｋｘ２．５、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４及びＦＯＧ−２ポリペプチドの核移行を示す、共焦点顕微鏡法により得られた画像を示す。Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ２Ｃ、ＧＡＴＡ４及びＦＯＧ−２は緑に、ＤＡＰＩは青く見える。未感作ｈＭＳＣの画像では、転写因子は現れない。ポリペプチドは、濃い緑色で示されるように、ＣＰ−ｈＭＳＣ（右）の核に移行される。
【０１００】
図６は、未感作ｈＭＳＣから「カクテル誘導」ＣＰ−ｈＭＳＣ及び最終的に心筋細胞ＣＭへの進行性変換（Ｄ０、Ｄ５、Ｄ１５及びＤ２０日）を示す。第０日（Ｄ０）で、核はＤＡＰＩにより青に着色されている。第５日（Ｄ５）で、ＭＥＦ２Ｃポリペプチドが核に移行（緑）される。第１５日（Ｄ１５）で、サルコメアα−アクチニンが存在（赤）し、筋節が存在し、細胞が心筋細胞への分化に確実に関与しており、もはや心臓形成ではないことを示している。大量のトロポニン−１が、第２０日（Ｄ２０：最終分化）に心筋細胞に存在している。
【０１０１】
図７は、未感作ｈＭＳＣ（左）及びカクテル誘導心筋細胞（右）の遷移電子顕微鏡超微細構造を示す。このために、細胞を１％血小板溶解物中で１５日間培養した。心筋細胞にはミトコンドリア成熟、サルコメア形成及び筋管の形成が見られる。
【０１０２】
図８は、光学顕微鏡法によるカクテル誘導心筋細胞を示す。興奮収縮システムの成熟はカルシウム濃度変化の誘導により評価した。このために、細胞を１５日間培養した後、カクテル刺激を５日間行い、５μＭのカルシウム選択プローブであるフルオ−４−アセトキシメチルエステル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）で３７℃で３０分間負荷し、温度調節ＺｅｉｓｓＬＳＭ５１０顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）及び１Ｈｚの刺激の間に得られた線走査画像を使用して生のイメージを得た。
【０１０３】
図９は、処置及び未処置ｈＭＳＣにおけるＴｂｘ−５、ＭＥＦ２Ｃ及びＭＥＳＰ−１がそれぞれ３、８及び８倍の増加を示す。
【０１０４】
図１０に示されるように、ＣＡＲＰＩ基準に適合するＣＰ−ｈＭＳＣを梗塞に続く１ヶ月間生体に投与し、未感作患者適合ｈＭＳＣに対して有意に駆出率を改善した。
【０１０５】
図１１は、心臓形成細胞で未処置（左）及び処置（右）の梗塞のある心臓の心エコー検査結果であり、ＣＰ−ｈＭＳＣでの処置により前壁の蘇生がはるかに良くなっていることが分る。心電図は、軽麻酔（１．５％イソフルラン）下に四肢誘導心電図検査（ＭＰ１５０：Ｂｉｏｐａｃ，  Ｇｏｌｅｔａ，  ＣＡ）により測定した。
【０１０６】
心エコー法では、収縮性は、未感作ｈＭＳＣ（ｎ＝１７）またはＳｈａｍ（ｎ＝１０：図９）において未変化であったのに対して、ＣＰ−ｈＭＳＣ（ｎ＝１４）処置後の１及び２ヶ月でそれぞれ１５％及び２０％改善された。上段：冠動脈結紮の４週間後の細胞移植の前日（４ｗｋｓ  ｐｏｓｔ  ＭＩ  −  ｎｏ  Ｔｘ）における梗塞のある心臓の心エコーが、Ｍモードで両調査対象群において前壁の無動を示した。中段：細胞移植の４週間後（４ｗｋｓ  ｐｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｘ）の未感作ｈＭＳＣで処置した心臓は、ＣＰ−ｈＭＳＣ処置群では蘇生が見られたのに対して、前壁は無動のままであった。下段：細胞移植の８週間後（８ｗｋｓ  ｐｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｘ）に、未感作ｈＭＳＣで処置された心臓は、ＣＰ−ｈＭＳＣ処置された梗塞のある心臓における健全な収縮活性に対して、限られた心筋の修復を示した。左側のパネルは胸骨傍（ＰＳ）長軸図であり、破線は２−Ｄ、Ｍモードの捕獲レベルを示す。右側のパネルの矢印は、前壁の蘇生を示す。
【０１０７】
図１２は、平均して、誘導心臓形成ｈＭＳＣの梗塞心臓への注入後、１及び２ヶ月後に著しい改良を達成したことを示す。対照的に、未感作ｈＭＳＣまたはＳｈａｍコントロールでは駆出率に対する効果が限定されていた。星印及び二重星印は、２時点での未感作ｈＭＳＣに対してｐ＜０．０１であることを示す。
【０１０８】
ｈＭＳＣ由来の心臓形成細胞で処置した心臓では、機能の改善が３ヶ月及び１８ヶ月で心筋再生の病理組織学的評価に相関していた。未感作ｈＭＳＣで処置した心臓に修復されずに残っていた動脈瘤及び瘢痕は、再筋形成を誘導した心臓形成ｈＭＳＣ処置により解消された（図１３）。
【０１０９】
肉眼的病理評価では、処置開始６ヶ月で、未感作（左）ｈＭＳＣ処置梗塞心臓とは対照的に、断面において、健全な再筋形成及び心臓形成の再構築の低下（ＣＰ、右）を伴う、左前下行（ＬＡＤ）枝結紮（心臓の黄丸）の下流の瘢痕の解消が認められた。これらの結果は、特に優れたものである。
【０１１０】
ヒトＡＬＵプローブ（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ，  Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，  ＣＡ）を使用して、８５℃で５〜１０分間ハイブリダイズさせ、３７℃で一晩培養し、抗蛍光ＧＦＰ標識第２抗体による検出により、ＡＬＵ−ＤＮＡの探索を行った。
【０１１１】
ＣＰ−ｈＭＳＣ処置マウス心筋では、ヒト特異的ラミン免疫染色によりヒトに特異的なＡＬＵＤＮＡ配列が陽性染色された、梗塞コントロールでは全く存在しなかったヒト由来細胞が広範囲に存在することが、共焦点解析により明らかになった（図１４）。
【０１１２】
Ｓｈａｍ（左）とは対照的に、心臓形成ｈＭＳＣ処置心臓の共焦点顕微鏡法による評価では、マウス梗塞心臓内に埋め込んだヒトｈ−ＡＬＵＤＮＡプローブ（中央）により染色されて、ヒト核の著しい存在が明らかになり、さらにヒト特異的ラミン抗体染色により確認された（右、図１４に示される写真）。凍結心筋切片は、ＰＢＳ潅流中超酸素処置３％パラホルムアルデヒド固定した心から作製した。図中の線の長さは、５０μｍを示す。
【０１１３】
図１５は、ヒト特異的トロポニン−Ｉ抗体により心臓形成ｈＭＳＣ処置心臓（中央及び右パネル）の前壁が有意に染色されたのに対し、未感作（左）では全く染色されなかったことを示す。
【０１１４】
さらに、図１６に示されるように、ｍｌＣ２ｖで対比染色した、未感作（上段）及び心臓形成（下段）ｈＭＳＣ処置心臓のヒトトロポニン−Ｉ染色は、移植されたヒト細胞からの心室心筋の発生を証明した。図中の線の長さは、２０μｍ（上段）及び５０μｍ（下段）を示す。
【０１１５】
図１７に示されるように、ｈＭＳＣ処置心臓由来の心臓形成に残る瘢痕内で、心筋由来ヒト幹細胞は、ｍｌＣ２ｖでのヒトトロポニン共局在化により本来のマウス心筋から区別することができた。図中の線の長さは、５０μｍを示す。
【０１１６】
図１８では、表面顕微鏡検査により、右冠動脈（ＲＣＡ：左下）及び回旋枝（右下）から生じたＣＰ−ｈＭＳＣ処置心臓において、結紮ＬＡＤ（黒丸）の末梢側に血管新生を検出した。
【０１１７】
図１９は、ヒト特異的ＣＤ−３１（ＰＥＣＡＭ−１）染色による、心臓形成ｈＭＳＣ処置心臓からの側副血管の共焦点評価を示す。図中の線の長さは、２０μｍを示す。
【０１１８】
図２０は、未感作及びカクテル誘導（ＣＰ）ｈＭＳＣでの処置による１２ヶ月間での駆出率の変化の進展をＳｈａｍに対する比（％）として示す。Ｓｈａｍに比較して、未感作ｈＭＳＣでの処置は、６ヶ月及び１２ヶ月でそれぞれ５％、２．５％の駆出率の増加効果を示した。
【０１１９】
対照的に、ＣＰ−ｈＭＳＣ処置梗塞マウスは、Ｓｈａｍに比較して、６ヶ月及び１２ヶ月で２５％の駆出率の著しい改善が見られた（図２０）。さらに、梗塞集団を、効果を評価するために、治療時での明白な心臓疾患（駆出率＜４５％）の記録によりサブグループに分類した。処置前において駆出率が３５％で同等であったが、心臓形成ｈＭＳＣ処置集団のみにおいて６及び１２ヶ月で１０％の絶対的な駆出率の改良が見られ、未感作ｈＭＳＣ処置集団では逆に駆出率は５％低下した（図２１）。図２２に示したように、カプランマイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）法による審査により、未感作処置集団及びＳｈａｍとは対照的に、心臓形成ｈＭＳＣ処置群では、優れた生存率が得られた。
【０１２０】
心臓形成（ＣＰ）ｈＭＳＣの効果を、心エコー法による１年のフォローアップにより示した（図２３参照）。未感作幹細胞処置心臓の長軸画像は、心尖部Ｍモード評価で最も明確に認められる線維性及び運動不全前壁を明らかにした（患者１１、左パネル）。対照的に、ＣＰ−ｈＭＳＣ処置心臓は、誘導幹細胞治療により得られる持続効果を反映する前壁を通して、健全な収縮性プロファイルを示した（患者１１、右パネル）。
【実施例２】
【０１２１】
組換えＴＧＦβ−１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ）、カルジオトロフィン（１ｎｇ／ｍＬ）、カルジオゲノールＣ（１００μＭ）及びα−トロンビン（１Ｕ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）及びアクチビン−Ａ（５ｎｇ／ｍＬ）を含有し、これらを組み合わせて使用するカクテルで幹細胞を処置した場合も、同様な結果が得られた。
【実施例３】
【０１２２】
組換えＴＧＦ−β１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ−４（５ｎｇ／ｍＬ）、アクチビン−Ａ（５ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）、因子ＩＩａ（ｈα−トロンビン、１Ｕ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）及びレチノイン酸（１μＭ）を含有し、これらを組み合わせて使用するカクテルで幹細胞を処置した場合も、同様な結果が得られた。
【０１２３】
本発明をその詳細な説明によりさらに説明したが、上記説明は例示を目的とするものであって、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、変更は以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
2011521645.tif 000003
【図２】
2011521645.tif 000004
【図３】
2011521645.tif 000005
【図４】
2011521645.tif 000006
【図５】
2011521645.tif 000007
【図６】
2011521645.tif 000008
【図７】
2011521645.tif 000009
【図８】
2011521645.tif 000010
【図９】
2011521645.tif 000011
【図１０】
2011521645.tif 000012
【図１１】
2011521645.tif 000013
【図１２】
2011521645.tif 000014
【図１３】
2011521645.tif 000015
【図１４】
2011521645.tif 000016
【図１５】
2011521645.tif 000017
【図１６】
2011521645.tif 000018
【図１７】
2011521645.tif 000019
【図１８】
2011521645.tif 000020
【図１９】
2011521645.tif 000021
【図２０】
2011521645.tif 000022
【図２１】
2011521645.tif 000023
【図２２】
2011521645.tif 000024
【図２３】
2011521645.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月30日(2010.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明に係る好ましい組成物は、組換えＴＧＦβ−１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ）、カルジオトロフィン（１ｎｇ／ｍＬ）、カルジオゲノールＣ（１００ｎＭ）を有し、これらを組み合わせて使用する。特に好ましい本発明の組成物は、上記化合物に加え、α−トロンビン（１Ｕ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）及びアクチビン−Ａ（５ｎｇ／ｍＬ）を有する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
細胞は、ヒト組換えＴＧＦβ−１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ）、カルジオトロフィン（１ｎｇ／ｍＬ）、α−トロンビン（１Ｕ／ｍＬ）及びカルジオゲノールＣ（１００ｎＭ）を含有する心原性カクテルでの刺激前及び刺激の５日後に、ｍＲＮＡとタンパク質値により評価した。患者２及び９のｈＭＳＣにおいて、ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ及びＴｂｘ−５ｍＲＮＡ双方の発現（任意単位：Ａ．Ｕ．）が、他の患者に比較して非常に高い。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２１】
組換えＴＧＦβ−１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ）、カルジオトロフィン（１ｎｇ／ｍＬ）、カルジオゲノールＣ（１００ｎＭ）及びα−トロンビン（１Ｕ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）及びアクチビン−Ａ（５ｎｇ／ｍＬ）を含有し、これらを組み合わせて使用するカクテルで幹細胞を処置した場合も、同様な結果が得られた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦβ−１、ＢＭＰ４、α−トロンビン並びにカルジオトロフィン及びＩＬ−６からなる群から選択される化合物並びにカルジオゲノールＣ及びレチノイン酸からなる群から選択される化合物を有する組成物。
【請求項２】
ＴＧＦβ−１、ＢＭＰ４、α−トロンビン、カルジオトロフィン及びカルジオゲノールＣを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１、アクチビン−Ａ、ＴＮＦ−α、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ、ＶＥＧＦ−Ａ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＦＧＦ−２、ＩＧＦ−１及びアクチビン−Ａを有する、請求項１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
アクチビン−Ａ、ＦＧＦ−２、ＩＬ−６、ＩＧＦ−１及びレチノイン酸を有する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】
ＴＮＦ−α、ＦＧＦ−４、ＬＩＦ及びＶＥＧＦ−Ａからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を欠如している、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
組成物に化合物が含有される場合、ＴＧＦβ−１は１ｍＬ当たり１〜５ｎｇ、ＢＭＰ４は１ｍＬ当たり１〜１０ｎｇ、カルジオトロフィンは１ｍＬ当たり０．５〜５ｎｇ、α−トロンビンは１ｍＬ当たり０．５〜５単位、カルジオゲノールＣは５０〜５００ｎＭ、ＦＧＦ−２は１ｍＬ当たり１〜１０ｎｇ、ＩＧＦ−１は１ｍＬ当たり１０〜１００ｎｇ、アクチビン−Ａは１ｍＬ当たり１〜５０ｎｇ、ＴＮＦ−αは１ｍＬ当たり１〜５０ｎｇ、ＦＧＦ−４は１ｍＬ当たり１〜２０ｎｇ、ＩＬ−６は１ｍＬ当たり１０〜１００ｎｇ、ＬＩＦは１ｍＬ当たり１〜１０単位、ＶＥＧＦ−Ａは１ｍＬ当たり１〜５０ｎｇ、レチノイン酸は１ｍＬ当たり０．１〜１．０μＭの量で含有される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項８】
組換えＴＧＦβ−１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ）、カルジオトロフィン（１ｎｇ／ｍＬ）、カルジオゲノールＣ（１００ｎＭ）を有し、これらを組み合わせて使用する、請求項１の組成物。
【請求項９】
α−トロンビン（１Ｕ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）及びアクチビン−Ａ（５ｎｇ／ｍＬ）を有する、請求項８の組成物。
【請求項１０】
組換えＴＧＦβ−１（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍＬ）、アクチビン−Ａ（５ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）、因子ＩＩａ（ｈα−トロンビン、１Ｕ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（５０ｎｇ／ｍＬ）及びレチノイン酸（１μＭ/mL）を有し、これらを組み合わせて使用する、請求項１の組成物。
【請求項１１】
ウシ胎児血清、ヒト血清、血小板溶解物及びそれらの混合物を含有する培地からなる群から選択される培地に含有される、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１２】
ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ、ＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ４ｍＲＮＡ、Ｆｌｋ−１ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ６ｍＲＮＡ、Ｆｏｇ−１ｍＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのｍＲＮＡの発現が上昇しており、及び／またはＮｋｘ２．５ポリペプチド、ＭＥＦ２Ｃポリペプチド、Ｔｂｘ−５ポリペプチド、ＦＯＧ−２ポリペプチド、ＧＡＴＡ−４ポリペプチド、ＭＥＳＰ−１ポリペプチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを有する分化細胞を、元細胞から取得する方法であって、前記少なくとも１つのポリペプチドが前記分化細胞の核に関連し、請求項１〜１１のいずれか１つに係る組成物の存在下に前記元細胞を培養することを有する、分化細胞を取得する方法。
【請求項１３】
前記分化細胞のＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ及びＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡの発現が上昇していることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。  
【請求項１４】
前記元細胞が間葉幹細胞である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記間葉幹細胞が骨髄由来幹細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記間葉幹細胞が、細胞表面上にＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＣＤ２９及びＣＤ４４を発現し、細胞表面上にＣＤ１４、ＣＤ３４及びＣＤ４５を発現しないことを特徴とする、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分化細胞が心臓形成細胞である、請求項１２〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれか１つに記載の方法により取得された細胞。
【請求項１９】
前記細胞が心臓形成性である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
（ａ）分化細胞の集団からの細胞検体が、ＭＥＦ２ｃｍＲＮＡ、ＭＥＳＰ−１ｍＲＮＡ、Ｔｂｘ−５ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ４ｍＲＮＡ、Ｆｌｋ−１ｍＲＮＡ、ＧＡＴＡ６ｍＲＮＡ、Ｆｏｇ−１ｍＲＮＡ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのｍＲＮＡの発現が上昇しており、及び／または前記分化細胞の核に関与するペプチドである、Ｎｋｘ２．５ポリペプチド、ＭＥＦ２Ｃポリペプチド、Ｔｂｘ−５ポリペプチド、ＭＥＳＰ−１ポリペプチド、ＧＡＴＡ−４ポリペプチド、ＦＯＧ−２ポリペプチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを有する細胞を含有することを判定し、
（ｂ）前記分化細胞の集団からの細胞を哺乳類に投与することを含む、哺乳類に分化細胞を送達する方法。
【請求項２１】
前記分化細胞の集団が、請求項１２〜１６のいずれか１つに記載の細胞を、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の組成物の存在下に培養することにより取得したものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ａ）が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を使用することを含む、請求項２０または２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
投与ステップが、全身、心臓内及び冠動脈内投与からなる群から選択される投与方法により前記細胞を投与することを含む、請求項２０〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ａ）が、免疫細胞化学的方法を使用することを含む、請求項２０〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１１のいずれか１つに記載の組成物との接触により取得可能な、請求項１２〜１６のいずれか１つに記載の分化細胞を、心臓組織に投与することを含む、心筋細胞を有する心臓組織を提供する方法。
【国際調査報告】
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