(57)【要約】  本発明は、外部プライマーセット、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセット及びＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを利用して標的核酸及び信号プローブを同時に増幅し、標的核酸を迅速に検出する方法に関する。本発明によれば、従来方法のＰＣＲ方法などに比べて簡便で、且つ迅速・正確に標的核酸を増幅することができ、信号プローブを同時に増幅することができるので、病原菌の検出及び確認、規定された表現型をもたらす遺伝子変更の検出、遺伝疾患に対する感受性の診断、遺伝子発現の評価といった多様なゲノムプロジェクトに応用されて、分子生物学的研究及び疾病診断に有用である。 【選択図】図２
2011505129.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）標的ＤＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＤＮＡと相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（ｉｉｉ）前記標的ＤＮＡと３′末端部分が相補的で、５′末端部分は非相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットを含む反応混合物を変性させる段階と；
（ｂ）前記（ａ）段階で変性された反応混合物に鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素及び前記外部プライマーセットとハイブリッドプライマーセットによって生成される増幅産物と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを含む酵素反応混合液を加えた後、前記標的ＤＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階と；を含むことを特徴とする標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項２】
前記外部プライマーセットは、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ及びハイブリッドオリゴＲＮＡ−ＤＮＡで構成された群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載の標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットは、５′末端ＤＮＡ−ＲＮＡ部分が標的ＤＮＡ配列と非相補的な塩基配列を有し、３′末端ＤＮＡ部分が標的ＤＮＡと相補的な塩基配列を有することを特徴とする請求項１に記載の標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ重合酵素は、耐熱性ＤＮＡ重合酵素であることを特徴とする請求項１に記載の標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項５】
前記耐熱性ＤＮＡ重合酵素は、Ｂｓｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素、Ｂｃａ  ＤＮＡ重合酵素、及びパイ２９  ＤＮＡ重合酵素で構成された群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項４に記載の標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡ分解酵素は、ＲＮａｓｅＨであることを特徴とする請求項１に記載の標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーは３２〜６６塩基からなることを特徴とする請求項１に記載の標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項８】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーはＤＮＡ部分の長さがそれぞれ１５〜３０塩基からなり、ＲＮＡ部分は長さが２〜６塩基からなることを特徴とする請求項７に記載の標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項９】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブは１８〜３８塩基からなることを特徴とする請求項１に記載の標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブは、ＤＮＡ部分の長さがそれぞれ８〜１６塩基からなり、ＲＮＡ部分は長さが２〜６塩基からなることを特徴とする請求項９に記載の標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブは、末端が標識物質で標識されていることを特徴とする請求項１に記載の標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項１２】
前記標識物質は、ビオチン、フルオレセント、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェニルからなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項１３】
前記等温増幅は、３０〜７５℃で行うことを特徴とする請求項１に記載の標的ＤＮＡの等温増幅方法。
【請求項１４】
（ａ）（ｉ）標的ＤＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＤＮＡと相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（ｉｉｉ）前記標的ＤＮＡと３′末端部分が相補的で、５′末端部分は非相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットを含む反応混合物を変性させる段階と；
（ｂ）前記（ａ）段階で変性された反応混合物に鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素及び前記外部プライマーセットとハイブリッドプライマーセットにより生成される増幅産物と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを含む酵素反応混合液を加えた後、前記標的ＤＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階と；
（ｃ）前記（ｂ）段階で増幅された標的ＤＮＡと信号プローブの増幅産物から酵素免疫反応及び側流クロマトグラフィーを利用して標的ＤＮＡを検出する段階と；を含むことを特徴とする標的ＤＮＡの検出方法。
【請求項１５】
（ｉ）標的ＲＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＲＮＡと相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡと３′末端部分が相補的で、５′末端部分は非相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットを含む反応混合物に、（ｉｖ）鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素及び逆転写酵素及び前記外部プライマーセットとハイブリッドプライマーセットにより生成される増幅産物と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを含む酵素反応混合液を混合した後、前記標的ＤＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階と；を含むことを特徴とする標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項１６】
前記外部プライマーセットは、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ及びハイブリッドオリゴＲＮＡ−ＤＮＡで構成された群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１５に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットは、５′末端ＤＮＡ−ＲＮＡ部分が標的ＲＮＡ配列と非相補的な塩基配列を有し、３′末端ＤＮＡ部分が標的ＲＮＡと相補的な塩基配列を有することを特徴とする請求項１５に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ重合酵素は、耐熱性ＤＮＡ重合酵素であることを特徴とする請求項１５に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項１９】
前記耐熱性ＤＮＡ重合酵素は、Ｂｓｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素、Ｂｃａ  ＤＮＡ重合酵素、及びパイ２９  ＤＮＡ重合酵素で構成された群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１８に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項２０】
前記ＲＮＡ分解酵素は、ＲＮａｓｅＨであることを特徴とする請求項１５に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項２１】
前記逆転写酵素は、ＡＭＶ（ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素またはＭＭＬＶ（ｍａｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素であることを特徴とする請求項１５に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーは、３２〜６６塩基からなることを特徴とする請求項１５に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーは、ＤＮＡ部分の長さがそれぞれ１５〜３０塩基からなり、ＲＮＡ部分は長さが２〜６塩基からなることを特徴とする請求項２２に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブは、１８〜３８塩基からなることを特徴とする請求項１５に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項２５】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブは、ＤＮＡ部分の長さがそれぞれ８〜１６塩基からなり、ＲＮＡ部分は長さが２〜６塩基からなることを特徴とする請求項２４に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブは、末端が標識物質で標識されていることを特徴とする請求項１５に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項２７】
前記標識物質は、ビオチン、フルオレセント、ジゴキシゲニン、２，４−ジニトロフェニルからなる群から選択されることを特徴とする請求項２６に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項２８】
前記等温増幅は、３０〜７５℃で行うことを特徴とする請求項１５に記載の標的ＲＮＡの等温増幅方法。
【請求項２９】
（ａ）（ｉ）標的ＲＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＲＮＡと相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡと３′末端部分が相補的で、５′末端部分は非相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットを含む反応混合物に、（ｉｖ）鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素、逆転写酵素及び前記外部プライマーセットとハイブリッドプライマーセットにより生成される増幅産物と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを含む酵素反応混合液を混合した後、前記標的ＲＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階と；
（ｂ）前記（ａ）段階で増幅された標的ＲＮＡと信号プローブの増幅物から酵素免疫反応及び側流クロマトグラフィーを利用して標的ＲＮＡを検出する段階と；を含むことを特徴とする標的ＲＮＡの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸と信号プローブの等温増幅方法及び増幅された信号プローブを利用した核酸の検出方法に関し、より詳細には、外部プライマーセット、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ  ハイブリッドプライマーセット及びＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを利用して標的核酸と信号プローブを同時に増幅して標的核酸を速かに検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅技術は、少量の核酸を検出し、分析する有用な技術である。標的核酸に対する核酸増幅技術の高い敏感性は、感染性疾患及び遺伝性疾患を診断・分析するための遺伝子の分離技術、及び法医学的面での特定核酸を検出する技術の発展をもたらし、このような核酸検出方法に基づいて非常にセンシティブな診断・分析を行うことができる方法が提案されてきた（Ｂｅｌｋｕｍ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ３：４９７，  ２００３）。核酸の検出は、ＤＮＡ鎖の相補性とｉｎ  ｖｉｔｒｏで一本鎖の核酸が二本鎖のハイブリッド分子を形成する能力に起因するもので、このような能力により試料から特定核酸を検出することができる（  Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １２：２１，  ２００１）。
【０００３】
核酸検出に使用されるプローブは、核酸試料に存在する標的配列と混合化することができる特定配列で構成される。前記プローブは、化学物質、免疫化学物質、螢光または放射性同位元素によって読まれる。通常、プローブは、標的核酸に対する相補的配列を有する短い断片の核酸と、ＤＮＡハイブリダイゼーションを読むことができる螢光物質や、ビオチン及びジゴキシゲニンのような標識またはリポーター分子を含む構成を有する。
【０００４】
しかし、上記のような核酸検出方法では、特に、染色体ＤＮＡ上の短い配列を検出することができず、コピー数が低く、野生型遺伝子に対する変形した対立遺伝子の制限されたコピー数を解決するのに限界があった。核酸検出方法の他の問題点は、標的配列、化学物質及びプローブと、他の分子あるいは構造との物理的相互作用を制限するｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕの環境条件と関連がある。
【０００５】
標的核酸を検出するための方法は、３つのカテゴリーに分けることができる。標的核酸を増幅させる方法である目標配列の増幅と、プローブ分子自体を増幅させるプローブ増幅と、各プローブが示す信号を複合プローブや連結プローブ技術により増加させる信号増幅がある。
【０００６】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸増幅技術は、少量の核酸を検出及び分析する主な方法として利用されてきた。特に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）は最も広く利用される核酸の増幅方法であって、相補的配列の各ストランド（ｓｔｒａｎｄ）を鋳型として使用し、プライマーにより核酸の合成が反復して行われることで相補的配列の各ストランドの複製が合成される。ＰＣＲ過程を行うためには、予めプログラムされた熱循環装備（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）が必要である。しかし、この方法は、費用が高く、特異性が比較的低く、また、結果を再現するためには実行段階を標準化しなければならないという短所がある。
【０００７】
さらに、他の核酸増幅方法であるＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、２つの隣接したオリゴヌクレオチドが標的核酸と混合化され、リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）によりライゲーションされる。これによって形成されたプローブ（ｐｒｏｂｅ）は、相補的なヌクレオチドとともに温度サイクリング（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ）により増幅される。
【０００８】
ＬＣＲは、プライマーを用いた核酸の伸長（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）より高い識別力（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ  ｐｏｗｅｒ）を有するので、遺伝子の点突然変異（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）においては、ＰＣＲより高い対立遺伝子特異性（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を示す。ＬＣＲはこれまで開発された核酸増幅技術の中で最も高い特異性を有し、すべての識別メカニズムが最適化されている最も簡単な方法であるが、反応速度が最も遅く、多数の変形プローブを必要とするという短所がある。
【０００９】
ＬＣＲのようにライゲーションを利用する方法は、ＬＣＲまたはＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）過程で発生するＤＮＡ接合によって第１に円形化されるパドロックプローブ（ｐａｄｌｏｃｋ  ｐｒｏｂｅ）を利用してＲＣＡ方法で増幅させることにより、標的増幅ＰＣＲを行わなくても遺伝子型を分析（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）することができる（ Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９：ｅ１１６，２００１）。
【００１０】
しかし、ＰＣＲ等の熱循環過程を利用する増幅方法は、各サイクルの「標的」温度に達するため熱循環ブロックを必要とし、熱ブロックが標的温度に達するまで遅延時間が必要であるので、増幅反応が完了するまで長時間がかかるという短所がある。
【００１１】
ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、エンドヌクレアーゼによってストランドを置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）させることにより、サンプル内の標的核酸配列及びこれの相補的ストランドを増幅させる方法である。この方法は、核酸重合酵素（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ポリメラーゼ）、少なくとも１つの置換されたｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含むｄＮＴＰｓ、及び標的断片（ｔａｒｇｅｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）の３′末端に対して相補的なプライマーを少なくとも１つ以上含有する混合物を使用する。各プライマーは、５′末端に制限エンドヌクレアーゼ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）が認知することができる配列を有しいる（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２０：１６９１，  １９９２）。
【００１２】
ＳＤＡ方法と類似する方法としては、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーまたはＲＮＡプライマーを利用してプライマーを伸長させた後、鋳型ＤＮＡと混合化をなしているＲＮＡプライマーを切断するＲＮａｓｅＨ酵素を用いてプライマーと鋳型ＤＮＡを切断した後、鎖置換により新たなプライマーを伸長させる方法であって、５′−ＲＮＡ−ＤＮＡ−３′プライマーを使用するＳＰＩＡ法（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＵＳ  ６，２５１，６３９）、５′−ＤＮＡ−ＲＮＡ−３′プライマーを使用するＩＣＡＮ法（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（（ＵＳ  ２００５／０１２３９５０）、ＲＮＡプライマーを使用するＲｉｂｏ  ｐｒｉｍｅｒ法（ＵＳ  ２００４／０１８０３６１）等がある。
【００１３】
ＴＭＡ法（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、一定の温度、一定のイオン強度（ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）及び一定のｐＨで１つのプロモータープライマーのみを使用して標的核酸を増幅させる方法である（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ，  ８６：１１７３，  １９８９）。ＴＭＡ法は、実質的に標的核酸で構成された混合物と標的核酸の３′末端部位あるいはこれと隣接した部位と混合化させるための標的配列の３′末端部位と相補的なオリゴヌクレオチドであるプロモータープライマー（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｐｒｉｍｅｒ）を結合させることを特徴とする。前記プロモータープライマーは、コンプレックシング配列（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の５′末端部位に位置したＲＮＡ重合酵素に対するプロモータ部位の配列も含む。前記プロモータープライマー及び標的配列は、プロモータープライマー／標的配列ハイブリッドを形成してＤＮＡが伸長するようになる。
【００１４】
前記ＴＭＡ法のＤＮＡ伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）過程において、標的配列の３′末端はコンプレックシング配列と標的配列の間でプロモータープライマーが混合化された複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）に近接した位置から伸長するものと推測される。プロモーター配列は、第１のＤＮＡ伸長生成物を生成して二本鎖プロモーター配列を形成する前記伸長過程に対する鋳型として作用する。プロモータープライマーの３′末端は、第２のＤＮＡ伸長過程に対するプライマーとしても使用できる。前記伸長過程では、鋳型として標的配列を用いて二本鎖核酸複合体が形成される。前記複合体は、ＲＮＡ標的配列が使用される場合はＤＮＡ−ＲＮＡ複合体であり、ＤＮＡ標的配列が使用される場合はＤＮＡ−ＤＮＡ複合体になる。次いで、標的配列の様々なＲＮＡ複製を生産するために、プロモータープライマーのプロモーターを認知するＲＮＡ重合酵素が前記第１のＤＮＡ伸長生成物を用いてＲＮＡを合成する。
【００１５】
ＮＡＳＢＡ法（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）には、一本鎖ＲＮＡの合成、一本鎖ＤＮＡの合成及び二本鎖ＤＮＡの合成が含まれる（Ｃｏｍｐｔｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５０：９１，  １９９１）。前記一本鎖ＲＮＡは、第１のプライマーに対する第１の鋳型となり、前記一本鎖ＤＮＡは、第２のプライマーに対する第２の鋳型となり、前記二本鎖ＤＮＡは、前記第１の鋳型に対する複製を合成するにおいて第３の鋳型となる。
【００１６】
ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ等の等温標的核酸増幅方法は、一定の温度で核酸増幅が行われるため、別途の熱循環装置が不要で、操作が簡単であるという長所がある。しかし、上記の等温標的核酸増幅方法には、幾つかの問題点がある。ＳＤＡ方法による核酸増幅は、規定された制限酵素のための部位が存在する必要があるため応用性に制限があり、ＮＡＳＢＡ及びＴＭＡのような転写ベースの増幅方法は、プライマーによる重合酵素プロモーター配列と増幅生成物との結合が必要であり、この過程は非特異的増幅をもたらす傾向がある。このため、これら転写ベースの増幅方法によるＤＮＡ標的の増幅メカニズムは確立されていない。
【００１７】
また、現在使用されている核酸増幅方法には、さらに別の問題点がある。先行増幅反応の増幅生成物によりテストサンプルが汚染されるおそれがあり、このため、サンプルの非標的特異的増幅をもたらす。これを防止するために、増幅反応の最後に、あるいは標的核酸の増幅開始前にテストサンプルの汚染を除去する様々な手段及び物理的手段を採用したテスト溶液の汚染検出方法が提案されているが、これらのほとんどは核酸増幅操作を複雑にする。
【００１８】
核酸検出のための他の方法であるプローブを増幅させる方法としては、前記核酸増幅方法で使用されるＬＣＲ方法がある。
【００１９】
核酸検出のためのまた他の方法としては、目的核酸やプローブを増幅させるのではなく、信号を増幅させる方法がある。これらの方法には、標的核酸をキャプチャーするために４種のセットのプローブを使用するｂＤＮＡ（ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ）増幅法がある（Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄ．，  １０１：１５９，  ２００２）。信号増幅を利用するハイブリッドキャプチャー方法は、標的核酸を直接検出し、標的核酸を増幅する方法と同様の敏感性を有し、信号検出のために抗体や化学発光物質を使用する（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４０：３５６４，２００２；  Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２４：４９９８，１９９６）。
【００２０】
また、信号プローブを増幅する方法として、ＣＰＴ（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）増幅法がある（Ｄｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ９：１４２，  １９９０）。前記方法は、標的核酸と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを使用する。これは標的核酸と前記プローブが混合される場合、ハイブリッド信号プローブのＲＮＡ部分がＲＮａｓｅＨ酵素により切断され、切断されたハイブリッド信号プローブは、標的核酸と分離され、また他のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブが標的核酸と混合される過程を繰り返すことによって、信号プローブを増幅する方法である。しかし、ＣＰＴ方法は、増幅効率が１０２〜１０４と比較的低く、独立的に診断に利用することは難しく、ＰＣＲ方法等、従来の核酸増幅により一次的に標的核酸の特定部位の量を増加させた後、別途に信号プローブを増幅することになるので、使用が複雑で、高費用と長時間がかかるという問題点がある。
【００２１】
一方、本出願人は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーなどを利用して核酸と信号プローブを同時に等温増幅させることによって、標的核酸を簡単に検出することができる方法を開発したことがある（韓国公開特許２００６−００８５８１８号）。しかし、前記ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーは、ＲＮＡ部分が長い１５〜２５塩基であるので、ＲＮＡモノマーの単価が高いため合成費用が高く、またＲＮＡがＤＮＡに比べて加水分解されやすいという化学的特性によって、ハイブリッドプライマーの精製及び保管の時の安定性の劣る恐れがある。
【００２２】
そこで、本発明の発明者らは、上記のような問題点を解決し、標的核酸を迅速かつ正確に増幅する方法及び標的核酸の増幅と同時に前記増幅産物を検出する方法を開発するために努力した結果、標的核酸と相補的な塩基配列を有する外部プライマーセットと標的核酸と部分的に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットを利用すれば、ハイブリッドプライマーを構成するＲＮＡ部分を最小化しながら、等温で標的核酸を速かに増幅させることができることを確認した。前記方法により増幅された増幅産物と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを利用すれば、等温で標的核酸とプローブ信号を同時に増幅できるこことを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明は、標的核酸と信号プローブを等温で迅速かつ正確に増幅する方法を提供することを目的とする。
【００２４】
本発明は、等温で標的核酸及びプローブ信号の増幅を同時に行うことを特徴とする標的核酸の検出方法を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
上記目的を達成するために本発明は、（ａ）（ｉ）標的ＤＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＤＮＡと相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（ｉｉｉ）前記標的ＤＮＡと３′末端部位が相補的で、５′末端部位が非相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットを含む反応混合物を変性させる段階と；（ｂ）前記（ａ）段階で変性された反応混合物に鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素及び前記外部プライマーセットとハイブリッドプライマーセットによって生成された増幅産物と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを含有する酵素反応混合液を添加した後、前記標的ＤＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階を含む標的ＤＮＡの等温増幅方法、及び増幅された信号プローブを利用することを特徴とする標的ＤＮＡの検出方法を提供する。
【００２６】
また、本発明は（ｉ）標的ＤＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＤＮＡと相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（ｉｉｉ）前記標的ＤＮＡと３′末端部位が相補的で、５′末端部位が非相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットを含む反応混合物に、（ｉｖ）鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素、逆転写酵素及び前記外部プライマーセットとハイブリッドプライマーセットにより生成される増幅産物と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを含む酵素反応混合液を混合した後、前記標的ＲＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階と；を含む標的ＲＮＡの等温増幅方法、及び前記増幅された信号プローブを利用することを特徴とする標的ＲＮＡの検出方法を提供する。
【００２７】
本発明の他の特徴及び具現例は以下の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲によってさらに明確になる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明による標的ＤＮＡの等温増幅方法を示す図面。
【図２】本発明による標的ＤＮＡと信号プローブの等温増幅方法を示す図面。
【図３】本発明による標的ＲＮＡの等温増幅方法を示す図面。
【図４】本発明による標的ＲＮＡと信号プローブの等温増幅方法を示す図面。
【図５】本発明による標的ＤＮＡの等温増幅方法によって生成された増幅産物を電気永動で分析した結果を示す図面。
【図６】本発明による増幅方法によって生成された信号プローブを酵素免疫反応（ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）で検出する過程を示す図面。
【図７】本発明による標的ＤＮＡの増幅方法によって生成された信号プローブを酵素免疫反応で検出した結果を示す図面。
【図８】本発明による標的ＤＮＡの増幅方法によって生成された信号プローブを側流クロマトグラフィー（ｌａｔｅｒａｌ−ｆｌｏｗ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で検出する過程を示す図面。
【図９】本発明による標的ＤＮＡの増幅方法によって生成された信号プローブを側流クロマトグラフィーで検出した結果を示す図面。
【図１０】本発明による標的ＲＮＡの等温増幅方法によって生成された増幅産物を電気永動で分析した結果を示す図面。
【図１１】本発明による標的ＲＮＡの等温増幅方法によって生成された増幅産物を電気永動で分析した結果を示す図面。
【図１２】本発明による標的ＲＮＡの増幅方法によって生成された信号プローブを酵素免疫反応で検出した結果を示す図面。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、一観点で、（ａ）（ｉ）標的ＤＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＤＮＡと相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（ｉｉｉ）前記標的ＤＮＡと３′末端部位が相補的で、５′末端部位が非相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットを含む反応混合物を変性させる段階と；（ｂ）前記（ａ）段階で変性された反応混合物に鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素及び前記外部プライマーセットとハイブリッドプライマーセットによって生成された増幅産物と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを含有する酵素反応混合液を添加した後、前記標的ＤＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階を含む標的ＤＮＡの等温増幅方法に関する。
【００３０】
図１に示すように、本発明による標的ＤＮＡの等温増幅は以下の過程により行うことができる。まず、増幅を行う鋳型となる標的ＤＮＡ、外部プライマーセット及びＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットを含む反応混合物を変性させて各々一本鎖ＤＮＡを調剤する。変性させた反応混合物を等温増幅温度で冷却させ、前記反応混合物にＤＮＡ重合酵素とＲＮＡ分解酵素が含有された酵素反応溶液を混合させる。このとき、増幅温度に冷却された反応液内で標的ＤＮＡにに前記外部プライマーセットと前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットがアニールされる。前記外部プライマーセットは、ハイブリッドプライマーセットより標的ＤＮＡの両末端側に近い配列と、相補的な配列を含むことが好ましい。また、ハイブリッドプライマーセットは、外部プライマーより標的ＤＮＡの中心に近い配列を含むことが好ましい。この場合、ハイブリッドプライマーは外部プライマーよりＤＮＡ鎖伸長方向の前側にアニールされる。アニールされた外部プライマーとハイブリッドプライマーは、鎖置換能力のあるＤＮＡ重合酵素によって伸長され、外部プライマーが標的ＤＮＡに沿って伸長することにより、伸長方向の前側に位置するハイブリッドプライマーで伸長したＤＮＡ鎖が標的ＤＮＡから離れていき鎖置換が生じる。最終的には、ハイブリッドプライマーで伸長された一本鎖のＤＮＡ増幅産物と外部プライマーで伸長された二本鎖のＤＮＡ増幅産物が得られる。
【００３１】
前記増幅産物である一本鎖ＤＮＡを鋳型にして外部プライマーとハイブリッドプライマーアニールされる。アニールされた外部プライマーとハイブリッドプライマーは、鎖置換能力のあるＤＮＡ重合酵素によって伸長され、外部プライマーが一本鎖ＤＮＡに沿って伸長されることにより、伸長方向の前側に位置するハイブリッドプライマーで伸長されたＤＮＡ鎖が一本鎖ＤＮＡから離れていき鎖置換が生じる。最終的には、ハイブリッドプライマーで伸長された新たな一本鎖のＤＮＡ増幅産物と外部プライマーで伸長された二本鎖のＤＮＡ増幅産物が得られる。外部プライマーが伸長して二本鎖ＤＮＡが形成され、伸長されたＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーは鎖置換によって一本鎖ＤＮＡが分離される。前記増幅された一本鎖ＤＮＡを鋳型にＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーがアニールされ伸長されてＲＮＡを含む二本鎖ＤＮＡ増幅産物が得られる。二本鎖ＤＮＡのＲＮＡ部分はＲＮａｓｅＨによって分離され、伸長、鎖置換によって一本鎖ＤＮＡが生成される。前記一本鎖ＤＮＡを鋳型にプライマーのアニール、伸長、鎖置換、ＲＮＡ切断の過程が繰り返されるながら標的ＤＮＡが増幅される（図１）。
【００３２】
本発明の一実施形態による信号プローブの増幅は、前記核酸等温増幅と同時に行われ、前記標的ＤＮＡの等温増幅を介して増幅されたＤＮＡは、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブとアニールされてＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド二本鎖が形成されると、ＲＮａｓｅＨの活性によってＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブのＲＮＡ部分が切断され、切断された信号プローブは標的ＤＮＡから分離されていき、新しいＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブが結合され、ＲＮａｓｅＨにより切断、分離されるサイクルが繰り返されることで信号プローブが増幅される（図２）。
【００３３】
本発明で使用される外部プライマーセットは、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡ及びハイブリッドオリゴＲＮＡ−ＤＮＡで構成された群から選択されるいずれか１つを使用することができ、標的核酸配列に相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）、１５〜３０塩基からなることが好ましい。また、前記外部プライマーと相補的な標的ＤＮＡ配列は、ハイブリッドプライマーと相補的な標的ＤＮＡ配列と隣接する配列（１〜６０ｂｐ差）であることが好ましく、外部プライマーと相補的な標的ＤＮＡ配列は、ハイブリッドプライマーと相補的なＤＮＡ配列より標的ＤＮＡ配列の３′末端側に近い配列であることが好ましい。
【００３４】
本発明で使用されるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットは５′末端ＤＮＡ−ＲＮＡ部位が標的ＤＮＡ配列と非相補的な塩基配列を有し、３′末端ＤＮＡ部位が標的ＤＮＡと相補的な塩基配列を有することを特徴とする。前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーは、３２〜６６塩基からなることが好ましく、このとき、ＤＮＡ部分の長さはそれぞれ１５〜３０塩基からなり、ＲＮＡ部分は、長さが２〜６塩基からなることが好ましい。
【００３５】
本発明でＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーと相補的な標的ＤＮＡの配列は外部プライマーと相補的な標的ＤＮＡの配列より５′末端側に位置した配列を含んでいることが好ましく、ハイブリッドプライマーと相補的な標的ＤＮＡ配列は、外部プライマーと相補的な標的ＤＮＡ配列に隣接する配列（１〜６０ｂｐ差）であることが好ましい。
【００３６】
本発明で使用されるＤＮＡ重合酵素は、ＤＮＡ鋳型に沿って核酸プライマーを拡張することができる酵素であって、置換されたストランドが結合されるポリヌクレオチドから核酸ストランドを置換できなければならない。本発明で使用できるＤＮＡ重合酵素は耐熱性ＤＮＡ重合酵素であることが好ましく、耐熱性ＤＮＡ重合酵素としては、Ｂｓｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）Ｄｅｅｐ  ｖｅｎｔ  ＤＮＡ重合酵素、ｅｘｏ（−）Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素、Ｂｃａ  ＤＮＡ重合酵素及びパイ２９  ＤＮＡ重合酵素等を挙げることができる。
【００３７】
本発明で使用されるＲＮＡ分解酵素は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド体のＲＮＡストランドを切断する特徴を有し、一本鎖ＲＮＡは分解しないことが良く、好ましくは、ＲＮａｓｅＨを使用することが好ましい。
【００３８】
本発明で使用されるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブは前記外部プライマーまたはＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーによって増幅される核酸増幅産物と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドであることが好ましく、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブの５′末端と３′末端はオリゴＤＮＡからなり、中間部分はオリゴＲＮＡからなることが好ましい。
【００３９】
前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブは１８〜３８塩基からなることが好ましく、５′末端と３′末端のＤＮＡ部分はそれぞれ８〜１６塩基からなることが好ましく、中間に位置するＲＮＡ部分は２〜６塩基からなることが好ましい。
【００４０】
また、前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブは末端が標識物質に標識されていることを特徴とすることができ、前記標識物質はビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）、２、４−ジニトロフェニル（２、４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）などを使用することができる。
【００４１】
本発明において、前記等増幅は、本発明のプライマーと鋳型ＤＮＡとがアニールされることができ、使用される酵素の活性を実質的に抑制しない温度で行うことが好ましい。本発明で増幅反応を行う温度は、好ましくは３０〜７５℃、より好ましくは３７〜７０℃、５０〜６５℃が最も好ましい。
【００４２】
本発明による核酸の等温増幅方法は、追加外部プライマーを使用するので、単一のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーを使用する従来方法（米国特許６，２５１，６３９）に比べてその特異性が高く、外部プライマーにより置換された内部プライマーが新たな鋳型として作用して幾何級数的に増幅されるので、増幅効率を画期的に改善することが可能である。また、従来の方法が、単一のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーを用いて標的塩基配列の増幅時に一定の部位を増幅させるため、増幅を遮断する別途の遮断器（ｂｌｏｃｋｅｒ）、あるいは鋳型スイッチオリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）を使用するのに対して、本発明では、正方向プライマーと逆方向プライマーのペアーを用いて、別途の遮断器や鋳型スイッチオリゴヌクレオチドを使用せずに、所望の部位だけをきれいに増幅することができるという長所がある。
【００４３】
さらに、増幅されたＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブが結合及び分離するサイクルを繰り返して信号プローブを増幅させることができ、核酸増幅と信号プローブ増幅が同時にシングルチューブ（ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ）で行われ、核酸増幅と信号プローブ増幅を同時に行うことができるという長所がある。
【００４４】
また、本発明は、使用されるＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーのうち５′末端ＤＮＡ−ＲＮＡ部分が鋳型と非相補的な塩基配列を有しており、単一のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーを使用する従来の方法でＲＮＡ分解酵素の反応活性がＤＮＡ重合酵素のプライマー拡張活性より高いときに発生する問題点を考慮する必要がないという長所がある。
【００４５】
また、本発明によるＤＮＡの等温増幅方法は、最初のプライマー拡張と鎖置換の反応後、新たに合成された増幅産物が新しい鋳型として使用される際に、鋳型と非相補的なＲＮＡ部位がプライマーと相補的な鋳型として作用してプライマーとの結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）温度を上昇させることによって増幅効率を増加させると同時に、プライマーダイマー（ｐｒｉｍｅｒ  ｄｉｍｅｒ）の形成を防止して、増幅産物の純度を高めることができる。
【００４６】
本発明による核酸の等温増幅方法は、試料のＤＮＡ抽出から完全な増幅まで約１時間がかかり、試料ＤＮＡの抽出が済んでいれば約４０分がかかるので、極めて速かに増幅反応を行うことができるという長所がある
【００４７】
本発明は、他の観点から、（ａ）（ｉ）標的ＤＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＤＮＡと相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（ｉｉｉ）前記標的ＤＮＡと３′末端部位が相補的で、５′末端部位が非相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットを含む反応混合物を変性させる段階と；（ｂ）前記（ａ）段階で変性された反応混合物に鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素と、ＲＮＡ分解酵素及び前記外部プライマーセットとハイブリッドプライマーセットによって生成された増幅産物と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを含有する酵素反応混合液を添加した後、前記標的ＤＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階と；（ｃ）前記（ｂ）段階で増幅された標的ＤＮＡと信号プローブの増幅物から酵素免疫反応または側流クロマトグラフィーを利用して標的ＤＮＡを検出する段階を含む標的ＤＮＡの検出方法に関する。
【００４８】
本発明の方法によって増幅された信号プローブは、マイクロプレートで西洋ワサビのペルオキシダーゼを利用して検出することができる（Ｂｅｋｋａｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ.Ｄｉａｇｎ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｉｎｆｅｃｔ.Ｄｉｓ.、３４：８３−９３，１９９９）。この時、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブは末端をそれぞれフルオレスセインとビオチンで標識させることが好ましく、信号プローブが増幅された反応は、ビオチンと選択的に結合するストレプトアビジンが表面処理されたマイクロウェルプレートとフルオレスセインと選択的に結合するフルオレスセインである抗体が複合されたＨＲＰ（ｈｏｒｅｓ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）を使用して結合、洗浄した後、ＨＲＰの基質であるＴＭＢ（ｔｅｔｒａｎｉｔｒｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）との反応を通じて４６５ｎｍでの吸光度の変異率を測定することによって、プローブの存在を確認することができるが、これに限定されるのではない。また、フルオレスセインとビオチンの他に、２、４−ジニトロフェニルまたはジゴキシゲニンを使用して、前記物質と選択的に結合をする抗体が複合された標識も使用することができる。
【００４９】
また、本発明の方法によって増幅された信号プローブはニトロセルロースメンブレインで側流（ｌａｔｅｒａｌ−ｆｌｏｗ）を利用して検出することができる（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.，３８：２５２５−２５２９，２０００）。この時、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブの末端はフルオレスセイン及びビオチンで標識させることが好ましく、信号プローブが増幅された反応はビオチンと選択的に結合するストレプトアビジンが複合された金物質とニトロセルロースメンブレインにフルオレスセインが選択的に結合するフルオレスセイン抗体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）が表面処理されたストリップを使用して結合反応を通じて肉眼で信号プローブの存在を確認することができるが、これに限定されるのではない。また、フルオレスセイン及びビオチンの他に、２、４−ジニトロフェニルまたはジゴキシゲニンを用いて前記物質と選択的に結合をする抗体が複合された標識も使用することができる。
【００５０】
さらに、本発明は他の観点で、（ｉ）標的ＲＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＲＮＡと相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡと３′末端部分が相補的で、５′末端部分が非相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットを含む反応混合物に、（ｉｖ）鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素、逆転写酵素及び前記外部プライマーセットとハイブリッドプライマーセットによって生成される増幅産物と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを含む酵素反応混合液を混合した後、前記標的ＲＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階を含む標的ＲＮＡの等温増幅方法に関する。
【００５１】
図３に示すように、本発明による標的ＲＮＡの等温増幅は下記の過程で行われることができる。まず、増幅を行う鋳型となる標的ＲＮＡ、外部プライマーセット、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセット、ＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素、及び逆転写酵素が含まれた酵素反応溶液とＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを混合させる。この時、標的ＲＮＡに前記外部プライマーセットと前記ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットがアニールされる。前記外部プライマーセットはハイブリッドプライマーセットより標的核酸の両末端側に近い配列と相補的な配列を含んでいることが好ましく、ハイブリッドプライマーセットは外部プライマーより標的核酸の中心に近い配列を含んでいることが好ましく、この場合、ハイブリッドプライマーは外部プライマーよりＤＮＡ鎖伸長方向の先方にアニールされる。アニールされた外部プライマーとハイブリッドプライマーは逆転写酵素と鎖置換能力があるＤＮＡ重合酵素によって伸長され、外部プライマーが標的ＲＮＡに沿って伸長されるによって伸長方向の前方に位置しているハイブリッドプライマーで伸長されたＤＮＡ鎖が標的ＲＮＡから離れていきながら鎖置換が生じる。最終的に、ハイブリッドプライマーで伸長された一本鎖のＤＮＡ増幅産物と外部プライマーで伸長された二本鎖のハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡ増幅産物が得られる。
【００５２】
前記増幅産物である一本鎖ＤＮＡを鋳型にして外部プライマーとハイブリッドプライマーがアニールされる。アニールされた外部プライマーとハイブリッドプライマーは、鎖置換能力のあるＤＮＡ重合酵素によって伸長され、外部プライマーが鋳型（標的核酸）に沿って伸長されることにより、伸長方向の前側に位置するハイブリッドプライマーで伸長されたＤＮＡ鎖が標的ＤＮＡから離れていきながら鎖置換が生じる。最終的には、ハイブリッドプライマーで伸長された一本鎖のＤＮＡ増幅産物と外部プライマーで伸長された二本鎖のＤＮＡ増幅産物が得られる。外部プライマーが伸長して二本鎖ＤＮＡが形成され、伸長されたＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーは鎖置換によって一本鎖ＤＮＡが分離される。前記増幅された一本鎖ＤＮＡを鋳型にＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーがアニールされ、伸長されて、ＲＮＡを含む二本鎖ＤＮＡ増幅産物が得られる。二本鎖ＤＮＡのＲＮＡ部分はＲＮａｓｅＨによって分離され、伸長、鎖置換によって一本鎖ＤＮＡが生成される。前記一本鎖ＤＮＡを鋳型にプライマーのアニール、伸長、鎖置換、ＲＮＡ切断の過程が繰り返されながら標的ＲＮＡが増幅される（図３）。
【００５３】
本発明の一実施形態による信号プローブの増幅は、前記の核酸等温増幅と同時に行われる。前記標的ＲＮＡの等温増幅を通じて増幅されたＤＮＡがＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブとアニールされて、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの二本鎖が形成されれば、ＲＮａｓｅ  Ｈの活性によってＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブのＲＮＡ部分が切断され、切断された信号プローブは標的ＤＮＡから分離して落ちて、新しいＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブが結合され、ＲＮａｓｅ  Ｈによって切断、分離されるサイクルが繰り返されながら、信号プローブが増幅される（図４）。
【００５４】
本発明による標的ＲＮＡの等温増幅方法、酵素反応液に逆転写酵素がさらに含まれた他に、前述した標的ＤＮＡの等温増幅方法で使用された外部プライマーセット、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセット、ＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマー、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブなどを使用することができ、等温増幅温度または同一に適用することができる。前記逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型にＤＮＡを伸長させるためのもので、ＡＭＶ（ａｖｉａｎ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素またはＭＭＬＶ（ｍａｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素を使用することが好ましい。
【００５５】
本発明は、他の観点から、（ｉ）標的ＲＮＡ、（ｉｉ）前記標的ＲＮＡと相補的な塩基配列を有する外部プライマーセット、及び（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡと３′末端部分が相補的で、５′末端部分は非相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマーセットを含む反応混合物に、（ｉｖ）鎖置換が可能なＤＮＡ重合酵素、ＲＮＡ分解酵素、逆転写酵素及び前記外部プライマーセットとハイブリッドプライマーセットにより生成される増幅産物と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブを含む酵素反応混合液を混合した後、前記標的ＲＮＡと前記信号プローブを等温で同時に増幅させる段階と；前記段階で増幅された標的ＲＮＡと信号プローブの増幅物から酵素免疫反応及び側流クロマトグラフィーを利用して標的ＲＮＡを検出する段階と；を含む標的ＲＮＡの検出方法に関する。
【００５６】
本発明による核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の等温増幅方法及び核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）の検出方法は、一定温度で反応を行うワンステップ（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ）核酸及び信号プローブ等温増幅であって、特別の熱変換装置を必要としないので、迅速かつ簡単に標的核酸を増幅させることができる。また、増幅過程で２ペアのプライマーセットとプローブを使用することで、従来の方法に比べて、標的核酸だけを正確に増幅すると同時に、信号プローブも増幅することができるという長所を有する。
【００５７】
また、本発明による核酸の等温増幅方法及び核酸の検出方法は、等温で１つのチューブ（ｏｎｅ−ｔｕｂｅ）内で行われるので、核酸のリアルタイム検出のための大量処理が可能であるという長所を有する。このような長所は、増幅技術の広範囲での使用を制限した汚染による付加反応が発生する恐れを最小化することができる。
【００５８】
（実施形態）
以下、実施形態を参照して本発明をさらに詳しく説明する。これら実施形態は単に例示のために提供され、本発明の範囲を制限するものではないことは、当該分野における通常の知識を有する者であれば明確である。
【００５９】
（第１実施形態）
ＤＮＡの等温増幅
標的ＤＮＡとしてクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ゲノムＤＮＡを使用した。グラム陰性桿菌であるクラミジア・トラコマチスゲノムＤＮＡを抽出するために、クラミジア・トラコマチス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−８８７）でＧ−ｓｐｉｎＴＭゲノムＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（イントロン  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ.Ｎｏ.１７１２１）を使用して、ゲノムＤＮＡを抽出した後、増幅反応を実施した。ゲノムＤＮＡの抽出は、菌懸濁液５００ｍｌを１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離して上層液を除去し、５００ｍｌＰＢＳ（ｐＨ  ７.２）で混ぜて遠心分離して上層液を除去した後、ＲＮａｓｅ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋが添加されたＧ−ｂｕｆｆｅｒ溶液３００ｍｌを添加して、細胞粒を懸濁し、６５℃で１５分間静置させた。次に、結合バッファー２５０ｍｌを入れてよく混合した後、スピンカラムにＤＮＡを結合させた。５００ｍｌの洗浄バッファーＡを添加した後、１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離して除去し、洗浄バッファーＢを５００ｍｌ添加して遠心分離した。１.５ｍｌ微少遠心管にカラムを移して、５０ｍｌの溶出バッファーを添加した後、１分間遠心分離して、１５.８ｎｇ／ｍｌのゲノムＤＮＡを得た。これを所定量希薄して等温増幅反応の鋳型として使用した。
【００６０】
外部プライマー（配列番号１及び２）は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡに相補的な配列を含むように設計した。
配列番号１：５′−ＴＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＴＣＧＴＴＣＣＧ−３′
配列番号２：５′−ＴＴＴＴＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＡＣＴＴＡＡＡＣＴＣＡ−３′
【００６１】
ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマー（配列番号３及び４）は、５′末端オリゴＤＮＡ−ＲＮＡ部分はＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡに非相補的な配列を有し、３′末端オリゴＤＮＡ部分はＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡに相補的な配列を有するように設計した（オリゴＲＮＡ部分は下線で示した）。
配列番号３：５′−ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＣＧＡＴＧＴＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＧＣＡＴＧＣＡＡＧＡＴＡ−３′
配列番号４：５′−ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴＡＴＡＣＴＣＡＧ−３′
【００６２】
信号プローブ増幅を行うためのＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブ（配列番号５）は前記プライマーセットによって増幅されたＤＮＡに相補的な塩基配列を有し、５′末端がフルオレスセインで、３′末端がビオチンで標識されている（オリゴＲＮＡ部分は下線で示した）。
配列番号５：５′−フルオレスセイン−ＧＣＴＴＴＧＴＴＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧ−ｂｉｏｔｉｎ−３′
【００６３】
前記外部プライマーセットとハイブリッドプライマーセットを利用して標的核酸を増幅するために、まず、前記外部プライマーセット、ハイブリッドプライマーセット及び標的ＤＮＡを含む反応混合物を用意した。前記反応混合物は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８.５）バッファーに１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ，０.２５ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、２.９ｍＭ  ＤＴＴ、０.１μｇ  ＢＳＡ、０.１ｍＭ  ｓｐｅｒｍｉｎｅ、０.０５ｍＭ  ＥＧＴＡ、０.１μＭ外部プライマーセット、０.５μＭ内部プライマーセット及び１ナノグラムで、１０フェムトグラムのクラミジア・トラコマチスクリプティック・プラスミド（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡを添加して製造した。 
【００６４】
前記反応混合物を９５℃で５分間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させ、６０℃で５分間冷却させた後、ＤＮＡを増幅するために酵素反応混合液を添加して、最終的容積が２０μｌになるようにして、６０℃で１時間等温増幅を行った。
【００６５】
前記酵素反応混合液の成分は下記の通りである。０．３μｇ  Ｔ４  遺伝子  ３２Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＵＳＢ）、６ｕｎｉｔ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（イントロン）、３ｕｎｉｔ  ＲＮａｓｅＨ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）及び６ｕｎｉｔ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ＮＥＢＭ０２７５Ｍ）、１ｎＭ  ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブ。
【００６６】
一方、対照群として人間ゲノムＤＮＡを使用した。増幅反応が終了した反応溶液６μｌをローディングバッファ（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）と混合し、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を含む１．８％のアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）に電気泳動した後、ＵＶトランスイルミネータで発色するバンドの様相で核酸増幅反応の効率を判断した。
【００６７】
その結果、図５に示すように、人間ゲノムＤＮＡを添加した陰性対照群に比べてクラミジア・トラコマチスクリプティック・プラスミド（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｃｒｙｐｔｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ）ＤＮＡを添加したサンプルで標的核酸の増幅産物を確認することができた。
【００６８】
（第２実施形態）
酵素免疫反応（ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）によるＤＮＡ検出
実施形態１で得られた増幅物に１７０ｍｌのＰＢＳＴバインディングバッファーを添加して反応混合物を製造し、組成は次の通りである。１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、８.１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１.５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０.０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，１／７０００希薄されたａｎｔｉ−Ｆ−ＨＲＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）。前記混合物をストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）がコーティングされたマイクロプレートウェル（Ｒｏｃｈｅ）に移した後、３７℃で、１０分間、２００ｒｐｍで反応させた。ウェル内の上等液を除去し、ＰＢＳＴ洗浄バッファー（前記バインディングバッファーで抗体を除去しものを除いたバインディングバッファーと同じ組成）３００ｍｌを添加して洗浄した。洗浄が終わったウェルに２００ｍｌ  ＨＲＰ基質、３，３′５，５′−テトラメチルベンジジン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＴＭＢ）を添加して、５分間暗い所で発色させた後、１００ｍｌ  １Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止させた。実験区と対照区の有效性の判断のためにＥＬＩＳＡリーダー（Ｚｅｎｙｔｈ  ３４０ｒｔ）を利用して４６５ｎｍでの吸光度値を比べ、数値の差が大きいほど有效であると判断した。
【００６９】
その結果、図６及び図７に示したように、核酸増幅産物が存在する実験区の場合、抗フルオレセインが複合されたＨＲＰ（ｈｏｒｅｓ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）によって基質が発色されていないことを確認することができた。
【００７０】
（第３実施形態）
側流クロマトグラフィー（ｌａｔｅｒａｌ−ｆｌｏｗ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によるＤＮＡの検出
１００ｍｇのストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）に４０ｎｍ直径の金コロイド溶液（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）１０ｍｌを添加して、２分間ボルテックスさせて、室温で、３時間反応させた。反応物に１％ＢＳＡ（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ２ｍＭ  ｂｏｒａｔｅ）溶液１ｍｌを混合し、１００００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心分離させた後、上層液をとり除去した。上層液が除去された反応物に２ｍＭ  ホウ酸緩衝液１ｍｌを入れて３回洗浄した後、１％ＢＳＡ（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ２ｍＭ  ｂｏｒａｔｅ）溶液を添加して再懸濁させた。 
【００７１】
金複合溶液は５２０ｎｍで読まれる吸光度値が１０になるようにして、４℃に保管しながら、使用の前に適正の割合で希薄して使用した。ニトロセルロースメンブレインの検査線と対照線部位の位置にフルオレスセイン抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）とビオチン接合カゼイン（バイオフォーカス）をそれぞれラインコーティングした。
【００７２】
実施形態１で得られた増幅物に金複合溶液をランニングバッファー（１ｘ  ＰＢＳ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０.６％  ＢＳＡ）で１／５０希薄して、６０ｍｌを添加した後、ニトロセルロースメンブレインのストリップを漬けて、室温で１０分間側流動を行って、検査線の発色可否を通じて目的核酸の存在有無を検出した。
【００７３】
その結果、図８及び図９に示したように、陰性対照群サンプルは、検査線と対照線の二つラインが発色されるのに比べて、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ  ｃｒｙｐｔｉｃ  プラスミドＤＮＡを添加したサンプルでは対照線一つのラインのみで発色されて標的核酸の増幅産物を確認することができた。
【００７４】
（第４実施形態）
ＲＮＡの等温増幅
標的ＲＮＡとしては、ｐＤｒｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒにＮｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｇ１  Ｔｙｐｅ  ＲＮＡのｃＤＮＡがクローニングされたプラスミドＤＮＡからインビトロ転写させたＲＮＡを使用した。インビトロ転写反応を行うために、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｃａｔ.Ｎｏ.ＡＭ１３３３）を利用した。インビトロ転写反応は次のように行った。まず、鋳型として使用されるプラスミドＤＮＡを適切な制限酵素を利用して線形化させた後、１ｍｇのＤＮＡに８ｍｌのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）混合物、２ｍｌの１０×反応バッファー、２ｍｌのＴ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼ及びヌクレアーゼ・フリー水を加えて、最終容積を２０ｍｌに調整した後、よく混合して３７℃で４時間反応させた。反応が終了した後、鋳型として使われたＤＮＡを除去するために１ｍｌのＴｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅを加えて、３７℃で１５分間反応させた後、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｔ.Ｎｏ.７４２０４）を利用して増幅されたＲＮＡを精製した。このＲＮＡを一定量希薄して等温増幅反応の鋳型として使用した。
【００７５】
外部プライマー（配列番号６及び７）は、Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ  Ｔｙｐｅ  ＲＮＡに相補的な配列を含むように設計した。
配列番号６：５′−ＡＴＧＣＧＧＴＴＣＣＡＣＧＡＴＣＴＴＧＧ−３′
配列番号７：５′−ＧＣＧＡＣＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＴＣＡＣＣ−３′
【００７６】
ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドプライマー（配列番号８及び９）は、５′末端オリゴＤＮＡ−ＲＮＡ部分はＮｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ  Ｔｙｐｅ  ＲＮＡに非相補的な配列を有し、３′末端オリゴＤＮＡ部分はＮｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ  Ｔｙｐｅ  ＲＮＡに相補的な配列を有するように設計した（オリゴＲＮＡ部分は下線で示した）。
配列番号８：５′−ＣＣＡＡＴＴＣＡＣＡＡＧＴＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＴＣＴＣＣＴＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡ−３′
配列番号９：５′−ＴＣＴＡＣＣＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＴＧＣＴＡＡＡＡＴＧＣＴＣ
ＡＧＣＴＧＴＡＴＴＡＧＣＣＴＣ−３′
【００７７】
信号プローブ増幅を行うためのＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブ（配列番号１０）は、前記プライマーセットによって増幅されたＤＮＡに相補的な塩基配列を有し、５′末端がフルオレスセインで、３′末端がビオチンで標識されている（オリゴＲＮＡ部分は下線で示した）。
配列番号１０：５′−フルオレスセイン−ＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＴＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＴＣ−ｂｉｏｔｉｎ−３′
【００７８】
前記外部プライマーセット、ハイブリッドプライマーセット及びハイブリッド信号プローブを利用して標的ＲＮＡを増幅するために反応混合物を用意した。前記反応混合物は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８.５）バッファーに１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１６ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０.２５ｍＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、２.９ｍＭ  ＤＴＴ、０.１μｇ  ＢＳＡ、０.１μＭ外部プライマーセット、０.５μＭハイブリッドプライマーセット、０.３μｇ  Ｔ４  遺伝子  ３２  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＵＳＢ）、６ｕｎｉｔ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（イントロン）、９ｕｎｉｔ  ＲＮａｓｅＨ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）及び３ｕｎｉｔ  ＢｓｔＤＮＡ  ポリメラーゼ（ＮＥＢＭ０２７５Ｍ）、３ｕｎｉｔ  ＡＭＶ  逆転写（ＵＳＢ）、１０ｎＭ  ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド信号プローブ及び１００  ｐｇ  Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ  Ｔｙｐｅ  ＲＮＡを添加して、最終容積が２０μｌになるようにし、６０℃で９０分間等温増幅を行った。
【００７９】
一方、対照群として人間ＲＮＡを使用した。増幅反応が終了した反応溶液６μｌをローディングバッファ（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）と混合し、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を含む２.５％のアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）に電気泳動した後、ＵＶトランスイルミネータで発色するバンドの様相で核酸増幅反応の効率を判断した。
【００８０】
その結果、図１０に示すように、人間ＲＮＡを添加した陰性対照群サンプルに比べて、Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ  Ｔｙｐｅ  ＲＮＡを添加したサンプルで標的核酸の増幅産物を確認することができた。また、前記増幅産物がＤＮＡ汚染によるものである否かを確認するために、Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ  ＴｙｐｅプラスミドＤＮＡに酵素反応混合液にＡＭＶ逆転写の有無を変更して同じ実験を行った。実験の結果、図１１に示したように、増幅された産物がＲＮＡを鋳型にした増幅産物であることを確認することができた。
【００８１】
（第５実施形態）
酵素免疫反応（ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）によるＲＮＡの検出
実施形態４で得られた増幅物に１７０ｍｌのＰＢＳＴバインディングバッファーを添加して反応混合物を製造し、組成は下記の通りである。１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、２.７ｍＭ  ＫＣｌ、８.１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１.５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０.０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，１／７０００希薄されたａｎｔｉ−Ｆ−ＨＲＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）。前記混合物をストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）がコーティングされたマイクロプレートウェル（Ｒｏｃｈｅ）に移した後、３７℃で１０分間２００ｒｐｍで反応させた。ウェル内の上等液を除去し、ＰＢＳＴ  洗浄バッファー（前記バインディングバッファーで抗体を除去したものを除いてバインディングバッファーと同じ組成）３００ｍｌを添加して洗浄した。洗浄を終了したウェルに２００ｍｌ  ＨＲＰ  基質、３，３′５，５′−テトラメチルベンジジン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＴＭＢ）を添加して  ５分間暗い所で発色させた後、１００ｍｌ  １Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止させた。実験区と対照区の有效性の判断のために、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｚｅｎｙｔｈ  ３４０ｒｔ）を利用して、４６５ｎｍでの吸光度値を比べ、数値の差が大きいほど有效であると判断した。
【００８２】
その結果、図１２に示したように、核酸増幅産物が存在する実験区の場合、抗フルオレセインが複合されたＨＲＰ（ｈｏｒｅｓ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）によって、基質が発色されていないことを確認することができた。
【００８３】
（産業上の利用の可能性）
以上で詳細に説明したように、本発明は標的核酸を等温で迅速且つ正確に増幅する方法及び等温で標的核酸の増幅及び信号プローブの増幅を同時に行う核酸の検出方法を提供する效果を奏する。本発明によれば、従来の方法であるＰＣＲ方法などに比べて簡便で、汚染の危険がなく、迅速・正確に標的核酸を増幅することができ、信号プローブを同時に増幅することができるので、病原菌の検出及び確認、規定された表現型をもたらす遺伝子変更の検出、遺伝疾患や疾患に対する感受性の診断、遺伝子発現の評価といった様々なゲノムプロジェクトに応用されて、分子生物学的研究及び疾病診断に有用である。
【００８４】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述しており、当該技術分野で通常の知識を有する者において、このような具体的技術は、単なる好ましい実施形態であり、これによって本発明の範囲が制限されるのではない点は明白である。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるものとすべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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