(57)【要約】本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスに対する中和分子を同定、産生、および操作するための方法および手段、ならびに産生された中和分子に関する。特に、本発明は、種々のインフルエンザＡ型ウイルス亜型に対する中和分子（Ｈ５および／またはＨ３および／またはＨ１（例えば、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５亜型の全てなど）に対する中和抗体が含まれる）およびかかる分子の作製方法および手段に関する。１つの態様では、本発明は、インフルエンザウイルスの少なくとも１つの亜型および／またはインフルエンザウイルスの少なくとも１つの分離株を中和することができる分子に関する。１つの実施形態では、分子は、（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスの１つを超える亜型および／または１つを超える分離株を中和し、（ｉｉ）ウイルスの血球凝集素（ＨＡ）抗原に結合し、かつ（ｉｉｉ）血球凝集を阻害しない、抗体または抗体様分子である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体または抗体様分子である分子であって、該分子は、（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスの１つを超える亜型および／または１つを超える分離株を中和し、（ｉｉ）該ウイルスの血球凝集素（ＨＡ）抗原に結合し、かつ（ｉｉｉ）血球凝集を阻害しない、分子。
【請求項２】
ＶｐｒｅＢ配列および／またはλ５配列を含むポリペプチドである、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
λ５配列に融合したＶｐｒｅＢ配列を含むポリペプチドである、請求項１に記載の分子。
【請求項４】
Ｖκ様配列および／またはＪＣκ配列を含むκ様代替軽鎖（ＳＬＣ）構築物である、請求項１に記載の分子。
【請求項５】
抗体である、請求項１に記載の分子。
【請求項６】
Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、およびＨ９からなる群より選択される少なくとも２つのＨＡ抗原と交差反応する、請求項１に記載の分子。
【請求項７】
Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ９からなる群より選択される少なくとも２つのＨＡ抗原と交差反応する、請求項１に記載の分子。
【請求項８】
前記ＨＡ抗原のＨ１亜型のエピトープに結合する、請求項１に記載の分子。
【請求項９】
前記ＨＡ抗原のＨ５亜型のエピトープに結合する、請求項１に記載の分子。
【請求項１０】
前記ＨＡ抗原のＨ３亜型のエピトープに結合する、請求項１に記載の分子。
【請求項１１】
前記エピトープはインフルエンザＡ型ウイルスの表面上に提示されている、請求項８、９、または１０に記載の分子。
【請求項１２】
インフルエンザＡ型ウイルスＨ５、Ｈ３、およびＨ１亜型の少なくとも１つを中和する、請求項８、９、または１０に記載の分子。
【請求項１３】
インフルエンザＡ型ウイルスＨ５および／またはＨ３および／またはＨ１亜型の１つを超える分離株を中和する、請求項８、９、または１０に記載の分子。
【請求項１４】
前記インフルエンザＡ型ウイルスの球状頭部が細胞表面に結合するのを阻止しない、請求項１に記載の分子。
【請求項１５】
前記ウイルスの少なくとも１つがヒトに感染する能力を有する、請求項１に記載の分子。
【請求項１６】
前記分離株の少なくとも１つがヒト被験体から得たものである、請求項１に記載の分子。
【請求項１７】
前記分離株の少なくとも１つが非ヒト動物から得たものである、請求項１に記載の分子。
【請求項１８】
前記非ヒト動物がトリである、請求項１７に記載の分子。
【請求項１９】
前記トリが野鳥またはニワトリである、請求項１８に記載の分子。
【請求項２０】
Ｈ１  ＨＡ抗原に結合する、請求項１に記載の分子。
【請求項２１】
少なくとも１つのさらなるＨＡ抗原に結合する、請求項２０に記載の分子。
【請求項２２】
前記さらなるＨＡ抗原が、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、およびＨ９からなる群より選択される、請求項２１に記載の分子。
【請求項２３】
ＨＡ抗原のＨ５にさらに結合する、請求項２１に記載の分子。
【請求項２４】
ＨＡ抗原のＨ３およびＨ９にさらに結合する、請求項２１に記載の分子。
【請求項２５】
ＨＡ抗原のＨ３、Ｈ５、およびＨ９にさらに結合する、請求項２１に記載の分子。
【請求項２６】
配列番号４、配列番号４５、配列番号９、および配列番号６１からなる群より選択されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列を含む重鎖ポリペプチドを含む抗体または抗体様分子のエピトープと本質的に同一のエピトープに結合する、抗体または抗体様分子。
【請求項２７】
配列番号７１、配列番号１４０、配列番号８１、配列番号１５８、配列番号１５９、および配列番号１６０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む抗体または抗体様分子のエピトープと本質的に同一のエピトープに結合する、請求項２６に記載の抗体または抗体様分子。
【請求項２８】
式：Ｘ１−Ｘ２−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｘ３−Ｅ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｘ５−Ｓ−Ｖ−Ｘ６−Ｘ７−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｘ８−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ９−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ａ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｗ−Ｖ−Ｒ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｘ１２−Ｇ−Ｉ−Ｉ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｘ１５−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｑ−Ｋ−Ｆ−Ｑ−Ｇ−Ｒ−Ｘ１６−Ｔ−Ｘ１７−Ｔ−Ａ−Ｄ−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｔ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｙ−Ｍ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２０−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｙ−Ｙ−Ｃ−Ａ−Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｅ−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｌ−Ｄ−Ｙ−Ｗ−Ｇ−Ｘ２３−Ｇ−Ｔ−Ｘ２４を有するアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列またはそのフラグメントを含む重鎖ポリペプチドを含む抗体または抗体様分子のエピトープと本質的に同一のエピトープに結合する、抗体または抗体様分子であって、式中、Ｘ１はＱまたはＥであり、Ｘ２はＶまたはＭであり、Ｘ３はＡまたはＴであり、Ｘ４はＫまたはＱであり、Ｘ５はＳまたはＡであり、Ｘ６はＫまたはＲであり、Ｘ７はＶまたはＬであり、Ｘ８はＡ、Ｔ、またはＶであり、Ｘ９はＴ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ１０はＩまたはＶであり、Ｘ１１はＳまたはＴであり、Ｘ１２はＧまたはＡであり、Ｘ１３はＰまたはＧであり、Ｘ１４はＩまたはＭであり、Ｘ１５はＡまたはＴであり、Ｘ１６はＶまたはＬであり、Ｘ１７はＩ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ１８はＫまたはＥであり、Ｘ１９はＳ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ２０はＥまたはＤであり、Ｘ２１はＳ、Ｔ、またはＮであり、Ｘ２２はＳまたはＴであり、Ｘ２３はＱ、Ｋ、Ｇ、またはＲであり、Ｘ２４はＬ、Ｔ、またはＭである、抗体または抗体様分子。
【請求項２９】
配列番号７１、配列番号１４０、配列番号８１、配列番号１５８、配列番号１５９、および配列番号１６０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む抗体または抗体様分子のエピトープと本質的に同一のエピトープに結合する、請求項２８に記載の抗体または抗体様分子。
【請求項３０】
配列番号４、配列番号４５、配列番号９、および配列番号６１からなる群より選択されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列を含む重鎖ポリペプチドを含む、抗体または抗体様分子。
【請求項３１】
配列番号７１、配列番号１４０、配列番号８１、配列番号１５８、配列番号１５９、および配列番号１６０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む、請求項３０に記載の抗体または抗体様分子。
【請求項３２】
式：Ｘ１−Ｘ２−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｘ３−Ｅ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｘ５−Ｓ−Ｖ−Ｘ６−Ｘ７−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｘ８−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ９−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ａ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｗ−Ｖ−Ｒ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｘ１２−Ｇ−Ｉ−Ｉ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｘ１５−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｑ−Ｋ−Ｆ−Ｑ−Ｇ−Ｒ−Ｘ１６−Ｔ−Ｘ１７−Ｔ−Ａ−Ｄ−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｔ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｙ−Ｍ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２０−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｙ−Ｙ−Ｃ−Ａ−Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｅ−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｌ−Ｄ−Ｙ−Ｗ−Ｇ−Ｘ２３−Ｇ−Ｔ−Ｘ２４を有するアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列またはそのフラグメントを含む重鎖ポリペプチドを含む、抗体または抗体様分子であって、式中、Ｘ１はＱまたはＥであり、Ｘ２はＶまたはＭであり、Ｘ３はＡまたはＴであり、Ｘ４はＫまたはＱであり、Ｘ５はＳまたはＡであり、Ｘ６はＫまたはＲであり、Ｘ７はＶまたはＬであり、Ｘ８はＡ、Ｔ、またはＶであり、Ｘ９はＴ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ１０はＩまたはＶであり、Ｘ１１はＳまたはＴであり、Ｘ１２はＧまたはＡであり、Ｘ１３はＰまたはＧであり、Ｘ１４はＩまたはＭであり、Ｘ１５はＡまたはＴであり、Ｘ１６はＶまたはＬであり、Ｘ１７はＩ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ１８はＫまたはＥであり、Ｘ１９はＳ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ２０はＥまたはＤであり、Ｘ２１はＳ、Ｔ、またはＮであり、Ｘ２２はＳまたはＴであり、Ｘ２３はＱ、Ｋ、Ｇ、またはＲであり、Ｘ２４はＬ、Ｔ、またはＭである、抗体または抗体様分子。
【請求項３３】
配列番号７１、配列番号１４０、配列番号８１、配列番号１５８、配列番号１５９、および配列番号１６０からなる群より選択されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列を含む軽鎖ポリペプチドをさらに含む、請求項３２に記載の抗体または抗体様分子。
【請求項３４】
（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスの１つを超える亜型および／または１つを超える分離株を中和し、（ｉｉ）該ウイルスの血球凝集素（ＨＡ）抗原に結合し、かつ（ｉｉｉ）血球凝集を阻害しない、請求項２６から３３のいずれか１項に記載の抗体または抗体様分子。
【請求項３５】
請求項１から２５のいずれか１項に記載の分子を含む組成物。
【請求項３６】
請求項２６から３４のいずれか１項に記載の抗体または抗体様分子を含む組成物。
【請求項３７】
Ｋａｂａｔアミノ酸ナンバリングに従ってアミノ酸５２Ａ位、５３位、７３位、および７４位と決定される、表面に露出したクラスター中に少なくとも１つの置換を含む抗体重鎖可変ドメインを含む分子であって、該分子がウイルス抗原に結合してそれを中和することができる、分子。
【請求項３８】
アミノ酸５２Ａ位、５３位、７３位、および７４位の少なくとも１つに置換を含む、請求項３７に記載の分子。
【請求項３９】
アミノ酸５２Ａ位、５３位、７３位、および７４位の全てに置換を含む、請求項３７に記載の分子。
【請求項４０】
アミノ酸５７位に置換をさらに含む、請求項３９に記載の分子。
【請求項４１】
Ｐ５２Ｇ置換、Ｉ５３Ｍ置換、Ｌ７３Ｅ置換、およびＳ７４Ｌ／Ｍ置換を含む、請求項３９に記載の分子。
【請求項４２】
Ａ５７Ｔ置換をさらに含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４３】
アミノ酸２４位、３４位、３５位、および５０位の少なくとも１つに置換をさらに含む、請求項４２に記載の分子。
【請求項４４】
アミノ酸２４位、３４位、３５位、および５０位の全てに置換を含む、請求項４３に記載の分子。
【請求項４５】
Ｖ２４Ｔ置換、Ｗ３４Ｖ置換、Ｇ３５Ｔ置換、およびＳ５０Ａ置換を含む、請求項４４に記載の分子。
【請求項４６】
前記重鎖可変ドメイン配列が、ＶＨ１ｅ生殖系列重鎖に由来する、請求項３７から４５のいずれか１項に記載の分子。
【請求項４７】
前記重鎖可変ドメイン配列の残部が、ＶＨ１ｅ生殖系列重鎖の配列を保持している、請求項４６に記載の分子。
【請求項４８】
前記ＶＨ１ｅ生殖系列の重鎖可変ドメインが、少なくとも１つのさらなる保存的置換を含む、請求項４６に記載の分子。
【請求項４９】
軽鎖配列をさらに含む、請求項３８から４８のいずれか１項に記載の分子。
【請求項５０】
前記軽鎖配列が抗体のλまたはκ軽鎖配列である、請求項４９に記載の分子。
【請求項５１】
前記軽鎖配列が代替軽鎖配列である、請求項４９に記載の分子。
【請求項５２】
前記代替軽鎖配列が、ＶｐｒｅＢ配列および／またはλ５配列を含む、請求項５１に記載の分子。
【請求項５３】
前記代替軽鎖配列が、λ５配列に融合したＶｐｒｅＢ配列を含む、請求項５２に記載の分子。
【請求項５４】
前記代替軽鎖配列が、Ｖκ様配列および／またはＪＣκ配列を含むκ様代替軽鎖（ＳＬＣ）構築物である、請求項５１に記載の分子。
【請求項５５】
前記ウイルス抗原が、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−Ｉおよび−ＩＩウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ＨＣＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＤＶ、ＨＥＶ、トキソプラスマウイルス、梅毒トレポネーマウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、麻疹、ムンプス、および風疹由来のウイルス抗原からなる群より選択される、請求項３７から５４のいずれか１項に記載の分子。
【請求項５６】
前記ウイルス抗原が、インフルエンザウイルスまたはＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２ウイルスに由来する、請求項５５に記載の分子。
【請求項５７】
請求項１から３６のいずれか１項に記載の分子の中和エピトープを機能的に模倣するペプチドまたはポリペプチドを含む、インフルエンザＡ型ウイルスに有効なワクチン。
【請求項５８】
請求項３７から５７のいずれか１項に記載の分子の中和エピトープを機能的に模倣するペプチドまたはポリペプチドを含む、ウイルス抗原に有効なワクチン。
【請求項５９】
インフルエンザＡ型ウイルスＨ５分離株および／もしくはインフルエンザＡ型ウイルスＨ１分離株、またはインフルエンザＡ型ウイルスＨ５亜型および／もしくはインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型を中和することができる抗体を同定する方法であって、抗体ライブラリー中のＨ５分離株および／もしくはＨ１分離株またはＨ５亜型および／もしくはＨ１亜型の両方と反応する抗体を同定する工程、ならびに該Ｈ５および／もしくはＨ１分離株またはＨＡタンパク質または該Ｈ５および／もしくはＨ１亜型またはＨＡタンパク質に結合するそれらの能力に基づいて、同定された該抗体を連続的な交互の選択ラウンドに供する工程を包含する、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法によって同定された中和抗体によって共有される、配列のコレクション。
【請求項６１】
１つまたは複数の表２に示す固有の重鎖および／もしくは軽鎖配列または該配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列を含む配列のコレクション。
【請求項６２】
請求項５９に記載の方法によって同定され得る中和抗体またはそのフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウイルス抗原（インフルエンザＡ型ウイルスが含まれる）に対する中和分子を同定、産生、および操作するための方法および手段ならびに産生された中和分子に関する。本発明は、さらに、産生された分子の種々の使用（標的ウイルス抗原（インフルエンザＡ型ウイルスなど）上の本発明の中和分子の結合部位を使用したワクチンのデザインおよび産生が含まれる）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、重病（世界的な公衆衛生の主な脅威（インフルエンザ、ＡＩＤＳ、および肝炎など）が含まれる）を引き起こし得る感染性病原体である。多数の癌も環境因子と併せてウイルスに関連している。典型的なウイルスは、キャプシドとして公知の殻にパッケージングされたＤＮＡまたはＲＮＡを有するμｍ以下の粒子である。ウイルス抗原は、キャプシドから突出し、しばしば、宿主細胞へのドッキング、融合、およびウイルスＤＮＡ／ＲＮＡの注入における重要な機能を果たしている。抗体ベースの免疫応答は、ウイルス感染からの宿主の防御の最前線を形成するが、多くの場合、有効なウイルス排除にはＴ細胞およびＮＫ細胞によって媒介される力強い細胞性免疫応答が必要である。細胞性免疫がウイルスを排除できない場合、感染は慢性化するようになり、疾患診断の第１の指標としてウイルス病原体に対する血清抗体を使用する。抗体および抗体様分子は、かかるウイルス疾患の受動免疫化または処置のための有益なツールであろう。
【０００３】
ウイルス疾患の１つであるインフルエンザは、インフルエンザウイルスに起因する接触伝染性の呼吸器疾患である。インフルエンザは軽度から重度の疾患を引き起こし、時には死に至り得る。米国において年間人口の５〜２０％がインフルエンザを罹患し、約２００，０００人が入院し、約３６，０００人が死亡する。
【０００４】
インフルエンザウイルスは咳およびくしゃみによって呼吸器中の液滴に広がり、通常は人から人へ伝播する。インフルエンザ表面抗原（特に、血球凝集素）に対する免疫は、感染の可能性、および感染した場合の疾患の重症度を軽減する。インフルエンザワクチンを利用できるが、あるインフルエンザウイルスの型または亜型に対するワクチンは別のインフルエンザの型または亜型をわずかにまたは全く防御しないので、毎年インフルエンザワクチン中に１つまたは複数の新規の株を組み合せる必要がある。
【０００５】
インフルエンザウイルスは負鎖ＲＮＡウイルスに分類され、オルトミクスウイルス科に属する。インフルエンザＡ型ウイルスは、９個の構造タンパク質からなり、調節機能を有する１つの非構造ＮＳ１タンパク質をさらにコードする。非構造ＮＳ１タンパク質は、再生サイクル中に大量に合成され、感染細胞のサイトゾルおよび核内に局在している。ウイルスゲノムの分割性により、細胞の異なるウイルス株との混合感染中に遺伝子再集合（ゲノムセグメントの交換）機構が起こる。インフルエンザＡ型ウイルスを、その表面上にディスプレイされる異なる血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）ウイルスタンパク質に応じて種々の亜型にさらに分類することができる。インフルエンザＡ型ウイルス亜型は、２つのウイルス表面糖タンパク質である、血球凝集素（ＨＡまたはＨ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡまたはＮ）によって同定される。各インフルエンザウイルス亜型は、ＨおよびＮタンパク質のその組み合せによって同定される。１６種のＨＡ亜型および９種のＮＡ亜型が公知である。インフルエンザＡ型ウイルスは、ヒト、トリ、ブタ、ウマ、および他の動物に感染し得るが、野鳥がこれらのウイルスの天然の宿主である。いくつかのインフルエンザＡ型亜型（すなわち、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、およびＨ３Ｎ２）のみが、現在ヒト間伝染で認められているが、１６種のＨ亜型と９種のＮＡ亜型との全ての組み合せが鳥類、特に、水鳥および浜に生息する鳥で同定されている。さらに、Ｈ５およびＨ７インフルエンザウイルスもヒト疾病を引き起こし得るという証拠が増加しつつある。
【０００６】
インフルエンザＡ型ウイルスのＨＡは、２つの構造的に異なる領域（すなわち、球状頭部領域（ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｈｅａｄ  ｒｅｇｉｏｎ）およびステム領域（ｓｔｅｍ  ｒｅｇｉｏｎ））を含む。球状頭部領域は、標的細胞へのウイルス付着を担い、且つＨＡの血球凝集活性に関与する受容体結合部位を含む。ステム領域は、ウイルスエンベロープと細胞のエンドソーム膜との間の細胞融合に必要であり、したがって融合活性に関連する融合ペプチドを含む（非特許文献１）。
【０００７】
パンデミック（世界的流行病）は、世界的な疾患の発生である。インフルエンザパンデミックは、新規のインフルエンザＡ型ウイルスが、（１）ヒト集団においてほとんどまたは全く免疫が存在しないものとして出現した場合、（２）重篤な疾病を引き起こし始め、次いで、（３）世界規模で人から人へ容易に伝播する場合に起こる。２０世紀には、かかるインフルエンザパンデミックが３回起こっている。第１に、１９１８年に、「スペイン風邪」インフルエンザパンデミックにより、米国で少なくとも５００，０００人が死亡し、世界で４０００万人までが死亡した。このパンデミックは、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１亜型に起因していた。第２に、１９５７年に、インフルエンザＡ型Ｈ２Ｎ２亜型に起因する「アジア風邪」インフルエンザパンデミックにより、米国で少なくとも７０，０００人が死亡し、世界で１００〜２００万人が死亡する結果となった。最も最近では、１９６８年に、インフルエンザＡ型Ｈ３Ｎ２亜型に起因する「ホンコン風邪」インフルエンザパンデミックにより、米国で約３４，０００人が死亡し、世界で７００，０００人が死亡する結果となった。
【０００８】
１９９７年に、最初のインフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１の症例が香港で報告された。これは、このトリウイルス型のヒトへの最初の直接感染であるが、ヒトからヒトへの感染が認められなかったので、パンデミックという結果にならなかった。
【０００９】
非特許文献２（ｄｏｉ：１０．１１８６／１４６５−９９２−７−４３）は、不活化Ｈ５Ｎ１ウイルスを接種したウマ由来の抗Ｈ５Ｎ１  ＩｇＧおよびＨ５Ｎ１特異的Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの調製を報告しており、これらは、Ｈ５Ｎ１ウイルスを感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスを防御すると説明されていた。
【００１０】
非特許文献３（ｄｏｉ：１０．１１８６／１４６５−９９２１−７−１２６）は、マウスの受動免疫化のためのインフルエンザＡ型ウイルスＨ５血球凝集素に特異的なキメラモノクローナル抗体の使用を記載している。
【００１１】
インフルエンザウイルスに対する中和抗体は、２００８年１月１７日公開の特許文献１に開示されている。
【００１２】
一定のインフルエンザＡ型ウイルスに起因する呼吸器疾患の重症度および潜在的パンデミックの脅威を考慮して、有効な防止方法および処置方法が非常に必要とされている。本発明は、ウイルスの種々のＨ亜型（インフルエンザＡ型ウイルスのＨ１亜型、Ｈ３亜型、およびＨ５亜型が含まれるが、これらに限定されない）に対するインフルエンザＡ型中和分子を提供することによってこの必要性に取り組んでいる。本発明は、さらに、インフルエンザＡ型ウイルスの所与の亜型の１つを超える、好ましくは全ての分離株（株）（種々のヒトおよび非ヒト種から得た分離株ならびに種々のインフルエンザのエピデミックおよび／またはパンデミックの犠牲者および／または生存者由来の分離株が含まれるが、これらに限定されない）を中和することができる分子を提供する。
【００１３】
かかる中和分子を、インフルエンザウイルス感染の防止および／または処置（感染集団またはエピデミックもしくはパンデミックの場合のリスク集団の受動免疫化が含まれる）のために使用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／００１４２０５号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｗｉｌｅｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）５６：３６５−３９４
【非特許文献２】Ｌｕら、Ｒｅｓｐ．Ｒｅｓ．（２００６）７：４３
【非特許文献３】Ｈａｎｓｏｎら、Ｒｅｓｐ．Ｒｅｓ．７：１２６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の概要
１つの態様では、本発明は、インフルエンザウイルスの少なくとも１つの亜型および／またはインフルエンザウイルスの少なくとも１つの分離株を中和することができる分子に関する。１つの実施形態では、分子は、（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスの１つを超える亜型および／または１つを超える分離株を中和し、（ｉｉ）ウイルスの血球凝集素（ＨＡ）抗原に結合し、かつ（ｉｉｉ）血球凝集を阻害しない、抗体または抗体様分子である。別の実施形態では、分子は、ＶｐｒｅＢ配列および／またはλ５配列を含むポリペプチドである。１つの他の実施形態では、分子は、λ５配列に融合したＶｐｒｅＢ配列を含むポリペプチドである。別の実施形態では、分子は、Ｖκ様配列および／またはＪＣκ配列を含むκ様代替軽鎖（ＳＬＣ）構築物である。１つの実施形態では、分子は抗体である。別の実施形態では、分子は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、およびＨ９からなる群より選択される少なくとも２つのＨＡ抗原と交差反応する。さらに別の実施形態では、分子は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ９からなる群より選択される少なくとも２つのＨＡ抗原と交差反応する。
【００１７】
すべての実施形態では、分子は抗体または抗体様分子である。
【００１８】
すべての実施形態では、分子は抗体フラグメントである。
【００１９】
１つの態様では、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルス亜型を中和する中和分子に関する。１つの実施形態では、分子は、（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスの１つを超える亜型および／または１つを超える分離株を中和し、（ｉｉ）ウイルスの血球凝集素（ＨＡ）抗原に結合し、かつ（ｉｉｉ）血球凝集を阻害しない、抗体または抗体様分子である。他の実施形態では、分子は、インフルエンザＡ型ウイルスの球状頭部が細胞表面に結合するのを阻害しない。別の実施形態では、細胞は、感染される細胞である。別の実施形態では、分子は、インフルエンザＡ型ウイルスが細胞に付着するのを阻止しない。
【００２０】
１つの実施形態では、分子は、ＨＡ抗原のＨ５亜型；ＨＡ抗原のＨ１亜型；またはＨＡ抗原のＨ３亜型のエピトープに結合する。１つの他の実施形態では、Ｈ５、Ｈ３、またはＨ１エピトープは、インフルエンザＡ型ウイルスの表面上に提示される。別の実施形態では、Ｈ５亜型はＨ５Ｎ１亜型である。１つの他の実施形態では、Ｈ１亜型はＨ１Ｎ１亜型である。別の実施形態では、分子は、インフルエンザＡ型ウイルスＨ５および／またはＨ３および／またはＨ１亜型の１つを超える分離株を中和する。別の実施形態では、分子は、インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５Ｎ１および／またはＨ３Ｎ１および／またはＨ１Ｎ１亜型の１つを超える分離株を中和する。１つの実施形態では、分子は、インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５および／またはＨ３および／またはＨ１亜型の全ての分離株を中和する。
【００２１】
すべての実施形態では、中和されるインフルエンザＡ型ウイルス亜型を、ノイラミニダーゼ（Ｎ）糖タンパク質（Ｎ１およびＮ２が含まれるが、これらに限定されない）によってさらに特徴づけることができる。
【００２２】
１つの他の実施形態では、分子は、インフルエンザＡ型ウイルスの少なくとも１つのＨ５および／またはＨ３および／またはＨ１亜型を中和する。
【００２３】
別の実施形態では、分子は、インフルエンザＡ型ウイルスの全てのＨ５および／またはＨ３および／またはＨ１亜型を中和する。
【００２４】
別の実施形態では、分子は、インフルエンザＡ型ウイルス亜型の１つを超えるＨ５および／またはＨ３および／またはＨ１分離株を中和する。
【００２５】
さらに別の実施形態では、分子は、インフルエンザＡ型ウイルス亜型の全てのＨ５および／またはＨ３および／またはＨ１分離株を中和する。
【００２６】
別の実施形態では、分子は、インフルエンザＡ型ウイルス亜型の全てのＨ５および／またはＨ３および／またはＨ１分離株（分離株はヒトに感染することができる）を中和する。
【００２７】
すべての実施形態では、Ｈ５亜型はＨ５抗原を含むことができ、そして／またはＨ１亜型はＨ１抗原を含むことができる。
【００２８】
１つの他の実施形態では、本発明は、配列番号４、配列番号４５、配列番号９、または配列番号６１として示したアミノ酸配列；または前記アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列またはそのフラグメントを含む重鎖ポリペプチドを有する分子のエピトープと本質的に同一のエピトープに結合する分子を提供する。別の実施形態では、分子は、配列番号７１、配列番号１４０、配列番号８１、配列番号１５８、配列番号１５９、または配列番号１６０として示したアミノ酸配列；または前記アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む分子のエピトープと本質的に同一のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号４、配列番号４５、配列番号９、または配列番号６１、または前記アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列またはそのフラグメントを含む重鎖ポリペプチドを含む分子を提供する。他の実施形態では、分子は、さらに、配列番号７１、配列番号１４０、配列番号８１、配列番号１５８、配列番号１５９、または配列番号１６０、または前記アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列またはそのフラグメントを含む軽鎖ポリペプチドを含む。
【００２９】
１つの実施形態では、分子は、式：Ｘ１−Ｘ２−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｘ３−Ｅ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｘ５−Ｓ−Ｖ−Ｘ６−Ｘ７−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｘ８−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ９−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ａ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｗ−Ｖ−Ｒ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｘ１２−Ｇ−Ｉ−Ｉ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｘ１５−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｑ−Ｋ−Ｆ−Ｑ−Ｇ−Ｒ−Ｘ１６−Ｔ−Ｘ１７−Ｔ−Ａ−Ｄ−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｔ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｙ−Ｍ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２０−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｙ−Ｙ−Ｃ−Ａ−Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｅ−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｌ−Ｄ−Ｙ−Ｗ−Ｇ−Ｘ２３−Ｇ−Ｔ−Ｘ２４（配列番号１６１）を有するアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列（式中、Ｘ１はＱまたはＥであり、Ｘ２はＶまたはＭであり、Ｘ３はＡまたはＴであり、Ｘ４はＫまたはＱであり、Ｘ５はＳまたはＡであり、Ｘ６はＫまたはＲであり、Ｘ７はＶまたはＬであり、Ｘ８はＡ、Ｔ、またはＶであり、Ｘ９はＴ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ１０はＩまたはＶであり、Ｘ１１はＳまたはＴであり、Ｘ１２はＧまたはＡであり、Ｘ１３はＰまたはＧであり、Ｘ１４はＩまたはＭであり、Ｘ１５はＡまたはＴであり、Ｘ１６はＶまたはＬであり、Ｘ１７はＩ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ１８はＫまたはＥであり、Ｘ１９はＳ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ２０はＥまたはＤであり、Ｘ２１はＳ、Ｔ、またはＮであり、Ｘ２２はＳまたはＴであり、Ｘ２３はＱ、Ｋ、Ｇ、またはＲであり、Ｘ２４はＬ、Ｔ、またはＭである）を含む重鎖ポリペプチドを含む分子と本質的に同一のエピトープに結合する。１つの実施形態では、配列番号１６１として示したアミノ酸配列は、さらに、Ｘ２４の後のＣ末端に−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｓまたは−Ｖ−Ｒ−Ｖ−Ｓ−Ｓを含む。
【００３０】
さらに別の実施形態では、分子は、配列番号７１、配列番号１４０、配列番号８１、配列番号１５８、配列番号１５９、または配列番号１６０として示したアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む分子と本質的に同一のエピトープに結合する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明は、式：Ｘ１−Ｘ２−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｘ３−Ｅ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｘ５−Ｓ−Ｖ−Ｘ６−Ｘ７−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｘ８−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ９−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ａ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｗ−Ｖ−Ｒ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｘ１２−Ｇ−Ｉ−Ｉ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｘ１５−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｑ−Ｋ−Ｆ−Ｑ−Ｇ−Ｒ−Ｘ１６−Ｔ−Ｘ１７−Ｔ−Ａ−Ｄ−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｔ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｙ−Ｍ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２０−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｙ−Ｙ−Ｃ−Ａ−Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｅ−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｌ−Ｄ−Ｙ−Ｗ−Ｇ−Ｘ２３−Ｇ−Ｔ−Ｘ２４（配列番号１６１）を有するアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列（式中、Ｘ１はＱまたはＥであり、Ｘ２はＶまたはＭであり、Ｘ３はＡまたはＴであり、Ｘ４はＫまたはＱであり、Ｘ５はＳまたはＡであり、Ｘ６はＫまたはＲであり、Ｘ７はＶまたはＬであり、Ｘ８はＡ、Ｔ、またはＶであり、Ｘ９はＴ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ１０はＩまたはＶであり、Ｘ１１はＳまたはＴであり、Ｘ１２はＧまたはＡであり、Ｘ１３はＰまたはＧであり、Ｘ１４はＩまたはＭであり、Ｘ１５はＡまたはＴであり、Ｘ１６はＶまたはＬであり、Ｘ１７はＩ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ１８はＫまたはＥであり、Ｘ１９はＳ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ２０はＥまたはＤであり、Ｘ２１はＳ、Ｔ、またはＮであり、Ｘ２２はＳまたはＴであり、Ｘ２３はＱ、Ｋ、Ｇ、またはＲであり、Ｘ２４はＬ、Ｔ、またはＭである）を含む重鎖ポリペプチドを含む重鎖ポリペプチドを含む分子を提供する。１つの実施形態では、配列番号１６１として示したアミノ酸配列は、さらに、Ｘ２４の後のＣ末端に−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｓまたは−Ｖ−Ｒ−Ｖ−Ｓ−Ｓを含む。
【００３２】
他の実施形態では、分子は、さらに、配列番号７１、配列番号１４０、配列番号８１、配列番号１５８、配列番号１５９、または配列番号１６０として示したアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチドを含む。
【００３３】
すべての実施形態では、分子は抗体または抗体様分子である。
【００３４】
１つの実施形態では、抗体または抗体様分子は、（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスの１つを超える亜型および／または１つを超える分離株を中和し、（ｉｉ）ウイルスの血球凝集素（ＨＡ）抗原に結合し、かつ（ｉｉｉ）血球凝集を阻害しない。
【００３５】
別の実施形態では、本明細書中に記載の分子によって中和される少なくとも１つのウイルス亜型および／または分離株は、ヒトに感染する能力を有する。
【００３６】
他の実施形態では、少なくとも１つの前記分離株をヒト被験体から得た。別の実施形態では、ヒト被験体は、分離株を得た時点でインフルエンザウイルス疾患に罹患しているか罹患していた。他の実施形態では、ヒト被験体は、インフルエンザＡ型ウイルス感染から回復していた。別の実施形態では、インフルエンザＡ型ウイルスは、インフルエンザＡ型ウイルスのＨ５亜型および／またはＨ１亜型である。
【００３７】
１つの実施形態では、少なくとも１つの前記分離株を非ヒト動物から得た。別の実施形態では、少なくとも１つの分離株は、トリ（野鳥およびニワトリが含まれるが、これらに限定されない）に由来する。
【００３８】
１つの実施形態では、分子はＨ５亜型およびＨ１亜型を中和する。
【００３９】
別の実施形態では、本発明の中和分子はＨ５および／またはＨ１タンパク質に結合する。１つの実施形態では、Ｈ５タンパク質はＨ５ＨＡタンパク質である。好ましくは、分子は、Ｈ５タンパク質の１つを超える改変体、さらにより好ましくは、Ｈ５タンパク質の実質的に全ての改変体に結合する。
【００４０】
別の実施形態では、分子はまた、少なくとも１つのさらなるＨＡ抗原に結合する。１つの他の実施形態では、さらなるＨＡ抗原はＨ１ＨＡ抗原である。１つの他の実施形態では、分子は、Ｈ１ＨＡタンパク質の実質的に全ての改変体に結合する。１つの実施形態では、少なくとも１つのさらなるＨＡ抗原は、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、およびＨ９からなる群より選択される。別の実施形態では、少なくとも１つのさらなるＨＡ抗原はまた、ＨＡ抗原のＨ５、ＨＡ抗原のＨ３およびＨ９、またはＨＡ抗原のＨ３、Ｈ５、およびＨ９に結合する。
【００４１】
他の実施形態では、本明細書中に記載の分子は、Ｈ５タンパク質および少なくとも１つのさらなるＨタンパク質（Ｈ１タンパク質など）に結合する。
【００４２】
異なる態様では、本発明は、本明細書中に記載の中和分子を含む組成物に関する。１つの実施形態では、組成物は、本明細書中に記載の抗体または抗体様分子を含む。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、単一のインフルエンザＡ型ウイルス亜型または複数のインフルエンザＡ型ウイルス亜型の１つを超える分離株を中和することができる分子の同定方法に関する。本方法は、抗体ライブラリー中のインフルエンザＡ型ウイルス亜型の第１および第２の分離株またはインフルエンザＡ型ウイルスの第１および第２の亜型の両方と反応する分子（例えば、抗体、抗体フラグメント、または抗体様分子）を同定する工程、および第１および第２の分離株または第１および第２の亜型に結合するそれらの能力に基づいて、同定された分子を連続的な交互の選択ラウンドに供する工程を含む。１つの実施形態では、本方法は、さらに、同定した抗体を単離する工程を含む。
【００４４】
別の実施形態では、第１および第２のインフルエンザＡ型ウイルス亜型分離株の両方に反応する分子を、それぞれ第１および第２の分離株と反応する分子の少なくとも２ラウンドの個別の富化および同定された分子の組換えによって同定した。
【００４５】
別の態様では、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスＨ５分離株および／またはインフルエンザＡ型ウイルスＨ１分離株またはインフルエンザＡ型ウイルスＨ５亜型および／またはインフルエンザＡ型ウイルスＨ１亜型を中和することができる抗体を同定する方法を提供する。１つの実施形態では、本方法は、抗体ライブラリー中のＨ５分離株および／またはＨ１分離株またはＨ５亜型および／またはＨ１亜型の両方と反応する抗体を同定する工程、および前記Ｈ５および／またはＨ１分離株またはＨＡタンパク質または前記Ｈ５および／またはＨ１亜型またはＨＡタンパク質に結合するそれらの能力に基づいて、同定された前記抗体を連続的な交互の選択ラウンドに供する工程を含む。別の実施形態では、本方法は、少なくとも２ラウンドの選択を含む。１つの実施形態では、本方法は、さらに、同定された抗体を単離する工程を含む。別の実施形態では、Ｈ５分離株はインフルエンザＡ型ウイルスまたはＨＡのＨ５亜型であり、そして／またはＨ１分離株は前記インフルエンザＡ型ウイルスまたはＨＡのＨ１亜型である。さらに別の実施形態では、第１および第２のインフルエンザＡ型ウイルス亜型の分離株またはＨＡの両方に反応する抗体を、それぞれ第１の分離株またはＨＡおよび第２の分離株またはＨＡに反応する抗体の少なくとも２ラウンドの個別の富化および同定された抗体の組換えによって同定した。１つの他の実施形態では、前記インフルエンザＡ型のＨ５およびＨ１亜型の分離株またはＨＡの両方に反応することができる抗体を変異誘発に供し、その後、前記Ｈ５および第２のＨ１亜型の分離株またはＨＡに結合するそれらの能力に基づいて連続的な交互の選択ラウンドに供する。１つの他の実施形態では、インフルエンザＡ型ウイルス亜型はＨ５亜型またはＨＡであり、前記インフルエンザＡ型ウイルス亜型はＨ１亜型またはＨＡである。別の実施形態では、Ｈ５亜型またはＨＡはＨ５ウイルスの２００６年トルコ分離株に由来するか；Ｈ５亜型またはＨＡはＨ５ウイルスの２００３／２００４年ベトナム分離株に由来するか；Ｈ５亜型またはＨＡは、Ｈ５ウイルスの１９９７年香港分離株に由来するか；Ｈ１亜型またはＨＡはＨ１ウイルスのニューカレドニア／２０／９９分離株に由来するか、；Ｈ５および／または前記Ｈ１亜型またはＨＡは異なる種を起源とするか；その任意の組み合せである。１つの他の実施形態では、前記種の少なくとも１つはヒトであるか、前記種の少なくとも１つはトリである。別の実施形態では、前記Ｈ５および／またはＨ１分離株に結合することができる抗体を、１つを超えるインフルエンザＡ型亜型に結合する能力に基づいてさらに選択する。
【００４６】
別の実施形態では、分子ライブラリーはファージ提示ライブラリーである。１つの実施形態では、バイオパニングによって選択する。
【００４７】
別の実施形態では、第１および第２のインフルエンザＡ型亜型の分離株の両方と反応することができる分子を変異誘発に供し、その後、第１および第２の分離株に結合するそれらの能力に基づいて連続的な交互の選択ラウンドに供する。必要に応じて、第１および第２の分離株に結合することができる分子を、１つを超えるインフルエンザＡ型亜型に結合する能力に基づいてさらに選択する。
【００４８】
かかる富化技術を、一般に、結合する標的と無関係に、分子に同様に適用することができる。かかる一般的な富化／選択方法は、明確に本発明の一部として含まれる。
【００４９】
別の実施形態では、本発明は、本発明の中和分子によって共有され、且つ本明細書中に記載の方法によって同定される配列のコレクションに関する。１つの他の実施形態では、配列のコレクションは、表２に示す１つまたは複数の固有の重鎖および／または軽鎖配列または前記配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列を含む。別の実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の方法によって同定された中和抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００５０】
なおさらなる態様では、本発明は、有効量の本明細書中の中和分子または分子組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体におけるインフルエンザＡ型感染の処置方法に関する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、有効量の本明細書中の中和分子または分子組成物をインフルエンザＡ型感染症の発症リスクのある被験体に投与する工程を含む、インフルエンザＡ型感染の防止方法に関する。１つの実施形態では、中和分子は、中和抗体、抗体フラグメント、または抗体様分子である。
【００５２】
すべての実施形態では、被験体はヒト患者である。すべての実施形態では、被験体は、インフルエンザＡ型感染症の発症リスクのある被験体である。
【００５３】
異なる態様では、本発明は、（ａ）少なくとも２つの機能的に異なる分子（例えば、抗体、抗体フラグメント、または抗体様分子）のＣＤＲ配列をアラインメントする工程、（ｂ）アラインメントしたＣＤＲ配列間で保存されたアミノ酸残基を同定する工程、および（ｃ）少なくとも機能的に異なる分子中に存在するアミノ酸残基をコードする縮重オリゴヌクレオチドプローブを使用して、少なくとも１つのアラインメントしたＣＤＲ配列中の複数の非保存アミノ酸残基の変異誘発を行い、変異誘発された非保存位置に、アラインメントしたＣＤＲ配列の複数の改変体を産生する工程、および、必要に応じて、１つまたは複数の改変体を使用して分子コレクションが所望の多様度および／またはサイズに到達するまで工程（ｂ）および（ｃ）を繰り返す工程を含む、多様な多機能分子コレクションの産生方法に関する。
【００５４】
特定の実施形態では、アラインメントしたＣＤＲ配列は同一の長さである。
【００５５】
別の実施形態では、保存されたアミノ酸残基は、少なくとも２つのアラインメントしたＣＤＲ配列中で保持されている。
【００５６】
さらなる態様では、本発明は、相互に少なくとも１つの性質が互いに異なる複数の中和分子（例えば、抗体、抗体フラグメント、または抗体様分子）を含む分子コレクションに関する。
【００５７】
本発明は、さらに、コレクション中の核酸を固有に同定する方法であって、かかるコレクション中に存在する核酸配列に連結しているか組み込まれた固有のバーコードを使用して核酸を標識する工程を含む方法に関する。
【００５８】
本発明は、さらに、本発明の分子に結合した中和エピトープを機能的に模倣するペプチドまたはポリペプチドを含む、インフルエンザＡ型ウイルスに有効なワクチンに関する。１つの実施形態では、ワクチンは合成ワクチンである。別の実施形態では、ワクチンは弱毒化インフルエンザＡ型ウイルスまたはその一部を含む。１つの他の実施形態では、ワクチンは死滅させたインフルエンザＡ型ウイルスまたはその一部を含む。別の実施形態では、中和エピトープに結合する分子は、以下のうちの１つである：
（ａ）（ｉ）インフルエンザＡ型ウイルスの１つを超える亜型および／または１つを超える分離株を中和し、（ｉｉ）ウイルスの血球凝集素（ＨＡ）抗原に結合し、かつ（ｉｉｉ）血球凝集を阻害しない、分子；
（ｂ）配列番号４、配列番号４５、配列番号９、および配列番号６１からなる群より選択されるアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列またはそのフラグメントを含む重鎖ポリペプチドを含む分子のエピトープと本質的に同一のエピトープに結合する分子；
（ｃ）式：Ｘ１−Ｘ２−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｘ３−Ｅ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｘ５−Ｓ−Ｖ−Ｘ６−Ｘ７−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｘ８−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ９−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ａ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｗ−Ｖ−Ｒ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｘ１２−Ｇ−Ｉ−Ｉ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｘ１５−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｑ−Ｋ−Ｆ−Ｑ−Ｇ−Ｒ−Ｘ１６−Ｔ−Ｘ１７−Ｔ−Ａ−Ｄ−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｔ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｙ−Ｍ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２０−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｙ−Ｙ−Ｃ−Ａ−Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｅ−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｌ−Ｄ−Ｙ−Ｗ−Ｇ−Ｘ２３−Ｇ−Ｔ−Ｘ２４（配列番号１６１）を有するアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列またはそのフラグメント（式中、Ｘ１はＱまたはＥであり、Ｘ２はＶまたはＭであり、Ｘ３はＡまたはＴであり、Ｘ４はＫまたはＱであり、Ｘ５はＳまたはＡであり、Ｘ６はＫまたはＲであり、Ｘ７はＶまたはＬであり、Ｘ８はＡ、Ｔ、またはＶであり、Ｘ９はＴ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ１０はＩまたはＶであり、Ｘ１１はＳまたはＴであり、Ｘ１２はＧまたはＡであり、Ｘ１３はＰまたはＧであり、Ｘ１４はＩまたはＭであり、Ｘ１５はＡまたはＴであり、Ｘ１６はＶまたはＬであり、Ｘ１７はＩ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ１８はＫまたはＥであり、Ｘ１９はＳ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ２０はＥまたはＤであり、Ｘ２１はＳ、Ｔ、またはＮであり、Ｘ２２はＳまたはＴであり、Ｘ２３はＱ、Ｋ、Ｇ、またはＲであり、Ｘ２４はＬ、Ｔ、またはＭである）を含む重鎖ポリペプチドを含む分子のエピトープと本質的に同一のエピトープに結合する分子；
（ｄ）配列番号４、配列番号４５、配列番号９、および配列番号６１からなる群より選択されるアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列またはそのフラグメントを含む重鎖ポリペプチドを含む分子；または
（ｅ）式：Ｘ１−Ｘ２−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ｘ３−Ｅ−Ｖ−Ｘ４−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｘ５−Ｓ−Ｖ−Ｘ６−Ｘ７−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｘ８−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ９−Ｆ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ａ−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｗ−Ｖ−Ｒ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｗ−Ｍ−Ｇ−Ｘ１２−Ｇ−Ｉ−Ｉ−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｆ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｘ１５−Ｎ−Ｙ−Ａ−Ｑ−Ｋ−Ｆ−Ｑ−Ｇ−Ｒ−Ｘ１６−Ｔ−Ｘ１７−Ｔ−Ａ−Ｄ−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｔ−Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｙ−Ｍ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２０−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｙ−Ｙ−Ｃ−Ａ−Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｙ−Ｙ−Ｙ−Ｅ−Ｘ２１−Ｘ２２−Ｌ−Ｄ−Ｙ−Ｗ−Ｇ−Ｘ２３−Ｇ−Ｔ−Ｘ２４（配列番号１６１）を有するアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列に基づいたコンセンサス配列もしくは改変体配列またはそのフラグメント（式中、Ｘ１はＱまたはＥであり、Ｘ２はＶまたはＭであり、Ｘ３はＡまたはＴであり、Ｘ４はＫまたはＱであり、Ｘ５はＳまたはＡであり、Ｘ６はＫまたはＲであり、Ｘ７はＶまたはＬであり、Ｘ８はＡ、Ｔ、またはＶであり、Ｘ９はＴ、Ｓ、またはＡであり、Ｘ１０はＩまたはＶであり、Ｘ１１はＳまたはＴであり、Ｘ１２はＧまたはＡであり、Ｘ１３はＰまたはＧであり、Ｘ１４はＩまたはＭであり、Ｘ１５はＡまたはＴであり、Ｘ１６はＶまたはＬであり、Ｘ１７はＩ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ１８はＫまたはＥであり、Ｘ１９はＳ、Ｌ、またはＭであり、Ｘ２０はＥまたはＤであり、Ｘ２１はＳ、Ｔ、またはＮであり、Ｘ２２はＳまたはＴであり、Ｘ２３はＱ、Ｋ、Ｇ、またはＲであり、Ｘ２４はＬ、Ｔ、またはＭである）を含む重鎖ポリペプチドを含む分子。
【００５９】
１つの実施形態では、配列番号１６１として示したアミノ酸配列は、さらに、Ｘ２４の後のＣ末端に−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｓまたは−Ｖ−Ｒ−Ｖ−Ｓ−Ｓを含む。
【００６０】
別の実施形態では、ワクチンはＨＡ抗原に結合する分子に基づく。いくつかの他の実施形態では、ＨＡ抗原はＨ５亜型またはＨ１亜型である。１つの他の実施形態では、抗原は、インフルエンザＡ型ウイルスの表面上に提示される。さらに別の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、中和分子（例えば、抗体）を惹起する抗原決定基を含む。
【００６１】
すべての実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の分子を含む組成物を提供する。すべての実施形態では、分子は、抗体、抗体フラグメント、または抗体様分子である。
【００６２】
１つの態様では、本発明は、本明細書中に記載の方法によって同定された中和抗体を提供する。１つの実施形態では、中和抗体は抗体または抗体フラグメントである。別の実施形態では、中和抗体または抗体フラグメントは、トリまたは哺乳動物被験体にインフルエンザＡ型ウイルス感染に対する受動免疫を付与することができる。別の実施形態では、哺乳動物被験体はヒトである。１つの他の実施形態では、インフルエンザＡ型ウイルス感染はＨ５亜型および／またはＨ１亜型に起因する。
【００６３】
別の態様では、本発明は、ウイルス抗原に結合してそれを中和することができる分子を提供する。１つの実施形態では、分子は、Ｋａｂａｔアミノ酸ナンバリングに従ってアミノ酸５２Ａ位、５３位、７３位、および７４位と決定される、表面に露出したクラスター中に少なくとも１つの置換を含む抗体重鎖可変ドメインを含み、前記分子はウイルス抗原に結合してそれを中和することができる。別の実施形態では、分子は、アミノ酸５２Ａ位、５３位、７３位、および７４位の少なくとも１つに置換を含む。別の実施形態では、分子は、アミノ酸５２Ａ位、５３位、７３位、および７４位の全てに置換を含む。別の実施形態では、分子は、アミノ酸５７位に置換をさらに含む。別の実施形態では、分子は、Ｐ５２Ｇ置換、Ｉ５３Ｍ置換、Ｌ７３Ｅ置換、およびＳ７４Ｌ／Ｍ置換をさらに含む。別の実施形態では、分子は、Ａ５７Ｔ置換をさらに含む。別の実施形態では、分子はまた、アミノ酸２４位、３４位、３５位、および５０位の少なくとも１つに置換をさらに含む。別の実施形態では、分子は、アミノ酸２４位、３４位、３５位、および５０位の全てに置換を含む。別の実施形態では、分子は、Ｖ２４Ｔ置換、Ｗ３４Ｖ置換、Ｇ３５Ｔ置換、およびＳ５０Ａ置換を含む。
【００６４】
１つの態様では、本発明の分子は、生殖系列重鎖由来の重鎖可変ドメイン配列を含む。１つの実施形態では、生殖系列重鎖はＶＨ１ｅまたはＶＨ１−６９生殖系列重鎖である。別の実施形態では、重鎖可変ドメイン配列の残部は生殖系列重鎖の配列を保持している。別の実施形態では、生殖系列の重鎖可変ドメインは少なくとも１つのさらなる保存的置換を含む。
【００６５】
１つの実施形態では、分子は軽鎖配列をさらに含む。別の実施形態では、軽鎖配列は抗体のλまたはκ軽鎖配列である。１つの実施形態では、軽鎖配列は代替軽鎖配列である。１つの他の実施形態では、代替軽鎖配列はＶｐｒｅＢ配列および／またはλ５配列を含む。さらに別の実施形態では、代替軽鎖配列はλ５配列に融合したＶｐｒｅＢ配列を含む。別の実施形態では、代替軽鎖配列はＶκ様配列および／またはＪＣκ配列を含むκ様代替軽鎖（ＳＬＣ）構築物である。
【００６６】
１つの実施形態では、分子によって中和されるウイルス抗原は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−Ｉおよび−ＩＩウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス（ＨＣＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＤＶ、ＨＥＶ）、トキソプラスマウイルス（ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ  ｖｉｒｕｓ）、梅毒トレポネーマウイルス（ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ  ｖｉｒｕｓ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、脳炎ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、麻疹、ムンプス、および風疹由来のウイルス抗原からなる群より選択される。
【００６７】
別の実施形態では、ウイルス抗原は、インフルエンザウイルスまたはＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２ウイルスに由来する。
【００６８】
１つの他の態様では、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスに有効なワクチンを提供する。１つの実施形態では、ワクチンは、本明細書中に記載の分子の中和エピトープを機能的に模倣するペプチドまたはポリペプチドを含む。別の実施形態では、ウイルス抗原に有効なワクチンは、本明細書中に記載の分子の中和エピトープを機能的に模倣するペプチドまたはポリペプチドを含む。１つの実施形態では、ウイルス抗原は、インフルエンザウイルスまたはＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２ウイルスに由来する。
【００６９】
別の実施形態では、ワクチンは、本明細書中に記載の分子の中和エピトープを機能的に模倣するペプチドまたはポリペプチドを含む、インフルエンザＡ型ウイルスに有効なワクチンである。１つの実施形態では、分子は抗体である。別の実施形態では、抗体はＨＡ抗原に結合する。１つの他の実施形態では、ＨＡ抗原はＨ５亜型である。１つの他の実施形態では、ＨＡ抗原はＨ１亜型である。１つの他の実施形態では、抗原は、インフルエンザＡ型ウイルスの表面上に提示される。１つの他の実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、中和抗体を惹起する抗原決定基を含む。
【００７０】
１つの実施形態では、ワクチンは合成ワクチンである。別の実施形態では、ワクチンは弱毒化インフルエンザＡ型ウイルスまたはその一部を含む。１つの他の実施形態では、ワクチンは死滅させたインフルエンザＡ型ウイルスまたはその一部を含む。
【００７１】
他の実施形態では、ワクチンは、経口投与、非経口投与、経皮送達、または経粘膜送達に適切である。１つの実施形態では、経粘膜送達は鼻腔内投与である。１つの他の実施形態では、ワクチンは小児期免疫化用ワクチンである。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、２つの異なる標的ＡおよびＢに対する反応強度の増加についての典型的なパニング富化スキームを示す。各富化ラウンドにより、各標的に対するプールの反応強度が増加する。
【図２】図２は、標的ＡおよびＢとの交差反応性を示すクローンの選択ストラテジーを示す。連続した各ラウンドにより、両標的に対する得られたプールの反応強度が強化される。
【図３】図３は、交差反応性を生じる／増加させるための並行した発見プールの組換えによる、２つの異なる標的（標的ＡおよびＢ）に対する反応強度を増加するためのストラテジーを示す。組換え抗体ライブラリーの各選択ラウンドにより、両標的に対する得られたプールの反応強度が強化される。
【図４】図４は、標的Ｂに対する交差反応性を増加させる一方で、標的Ａに対する反応性を維持するストラテジーを示す。第１に、標的Ａに反応性を示すクローンを選択し、次いで、標的Ａに反応性を示すクローンの変異誘発ライブラリーを調製し、示すように選択が行われ、標的Ａおよび標的Ｂの両方と強い反応性を示す１つまたは複数の抗体を得る。
【図５】図５は、「目的変異誘発」法によって多様な多機能抗体コレクションを生成するための代表的な変異誘発法を示す。
【図６】図６は、異なるインフルエンザＡ型亜型由来の血球凝集素への抗体結合の分析を示す。
【図７】図７は、Ｆａｂ４７ｅの結晶構造上の必要なＨ５血球凝集素結合群１の位置および優性変異の位置を示す。
【図８】図８は、Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３／０４血球凝集素タンパク質に対するトルコ人のトリインフルエンザ生存者の交差反応力価を示す。
【図９】図９は、注釈つきレパートリーのクローニングおよびバーコーディングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
詳細な説明
Ａ．定義
ほかで定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同様の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）は、本出願で使用した多数の用語に対する一般的な指針を当業者に提供している。
【００７４】
当業者は、本発明の実施の際に使用することができる本明細書中に記載のものと類似または等価の多数の方法および材料を認識するであろう。実際、本発明は、記載の方法および材料に決して制限されない。本発明の目的のために、以下の用語を下記のように定義する。
【００７５】
用語「インフルエンザＡ型亜型」または「インフルエンザＡ型ウイルス亜型」は交換可能に使用され、これらは、血球凝集素（Ｈ）ウイルス表面タンパク質によって特徴づけられ、それにより、Ｈ番号（例えば、Ｈ１、Ｈ３、およびＨ５など）によって分類されるインフルエンザＡ型ウイルス改変体を表す。さらに、亜型を、Ｎ番号（例えば、Ｎ１およびＮ２など）によって示したノイラミニダーゼ（Ｎ）ウイルス表面タンパク質によってさらに特徴づけることができる。そのようなものとして、亜型を、Ｈ番号およびＮ番号の両方によって表すことができる（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２など）。本用語には、具体的には、通常は変異に起因し、異なる病理学的プロフィールを示す各亜型内の全ての株（絶滅した株が含まれる）が含まれる。かかる株はまた、ウイルス亜型の種々の「分離株」（過去、現在、および未来の分離株の全てが含まれる）と表されるであろう。したがって、本文脈中で、用語「株」および「分離株」は交換可能に使用される。亜型は、インフルエンザＡ型ウイルスに基づいた抗原を含む。抗原は血球凝集素ウイルス表面タンパク質に基づくことができ、この抗原を「ＨＡ抗原」と指定することができる。いくつかの例では、かかる抗原は特定の亜型（例えば、Ｈ１亜型およびＨ５亜型など）のタンパク質に基づき、それぞれＨ１抗原およびＨ５抗原と指定することができる。
【００７６】
用語「インフルエンザ」を、インフルエンザウイルスに起因する接触伝染病を表すために使用する。
【００７７】
本発明の文脈において、用語「抗体」（Ａｂ）は最も広い意味で使用され、抗体には、特定の抗原に対して結合特異性を示すポリペプチドが含まれる。
【００７８】
「未変性の抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、共有結合性のジスルフィド結合によって重鎖に連結されている一方で、ジスルフィド結合数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的間隔の鎖間ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、その後に多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと並列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に境界を形成すると考えられている（Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１（１９８５）；ＮｏｖｏｔｎｙおよびＨａｂｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４５９２（１９８５））。
【００７９】
抗体鎖に関する用語「可変」を、抗体間の配列が非常に異なり、且つ特定の各抗体のその特定の抗原に対する結合および特異性が関連する抗体鎖部分を表すために使用する。かかる可変性は、両軽鎖および重鎖可変ドメイン中の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存されている部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。未変性の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４）を含み、ＦＲはそのほとんどが３つの超可変領域と連結したβシート配置の形態をとり、それにより、超可変領域はβシート構造に連結してループを形成し、いくつかの場合βシート構造の一部を形成する。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって他の鎖由来の超可変領域とごく接近して相互に保持され、これが抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、６４７−６６９頁を参照のこと）。定常ドメインは抗原への抗体の結合に直接は関与しないが、種々のエフェクター機能（抗体依存性細胞傷害性における抗体の関与など）を示す。
【００８０】
用語「超可変領域」は、本明細書中で抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を表す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基３０〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、および８６〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３０〜３５（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、および９３〜１０１（Ｈ３））を含む（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９６）。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中に定義の超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００８１】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体を異なるクラスに割り当てることができる。５つの主な抗体クラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）が存在し、これらのうちのいくつかをサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、およびＩｇＡ２）にさらに分類することができる。
【００８２】
異なる免疫グロブリンクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
【００８３】
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」を、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型の１つに割り当てることができる。
【００８４】
用語「抗体フラグメント」は、全長抗体の一部、一般に、その抗原結合ドメインまたは可変ドメインである。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、線状抗体、一本鎖抗体分子、ディアボディ、ならびに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体フラグメントのさらなる例には、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ｄＡｂ（単一ドメイン抗体）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、およびミニボディ（その２つのループが組み合せ変異誘発の影響を受けやすい最小化可変ドメインである）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
用語「モノクローナル抗体」を、Ｂ細胞の単一クローンによって合成される抗体分子を表すために使用する。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体の特徴を示し、任意の特定の方法によって抗体産生が必要であると解釈されるべきではない。したがって、モノクローナル抗体を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１（１９７６）に最初に記載されたハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ技術によって作製することができるか、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００８６】
用語「ポリクローナル抗体」を、Ｂ細胞集団によって合成された抗体分子集団を表すために使用する。
【００８７】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、さらに、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含み、それにより、ｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することができる。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９−３１５頁（１９９４）を参照のこと。単鎖抗体は、例えば、ＷＯ８８／０６６３０号およびＷＯ９２／０１０４７号に開示されている。
【００８８】
用語「ディアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントを表し、このフラグメントは同一ポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。短すぎて同一鎖上の２ドメイン間で対合が不可能なリンカーの使用により、ドメインは別の鎖の相補ドメインと強制的に対合して２つの抗原結合部位が作製される。ディアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）中により完全に記載されている。
【００８９】
用語「ミニボディ」を、自己アセンブリして８０ｋＤａの２価の二量体（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）２を形成するｓｃＦｖ−ＣＨ３融合タンパク質を表すために使用する。
【００９０】
用語「アプタマー」を、高い特異性および親和性を有するタンパク質標的に結合する合成核酸リガンドを表すために本明細書中で使用する。アプタマーは、タンパク質機能の有力なインヒビターとして公知である。
【００９１】
ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４  ５４６（１９８９））は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなる。
【００９２】
本明細書中で使用する場合、用語「抗体結合領域」は、抗原に結合することができる免疫グロブリンまたは抗体可変領域の１つまたは複数の部分を表す。典型的には、抗体結合領域は、例えば、抗体軽鎖（ＶＬ）（またはその可変領域）、抗体重鎖（ＶＨ）（またはその可変領域）、重鎖Ｆｄ領域、抗体軽鎖と重鎖（またはその可変領域）との組み合せ（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２など）、単一ドメイン、または一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、または全長抗体（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４亜型）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体）である。
【００９３】
用語「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原型に特異性を示す抗体を表す。この用語には、本明細書中で具体的に使用する場合、標的抗原および特定の組織への送達を容易にする別の抗原に対して結合特異性を示す抗体が含まれるが、これらに限定されない。同様に、多重特異性抗体は、２つ以上の結合特異性を有する。
【００９４】
表現「線状抗体」を、抗原結合領域対を形成するタンデムＦｄセグメント対（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含むことを表す。線状抗体は二重特異性または単一特性であり得、例えば、Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に記載されている。
【００９５】
本発明の目的のために、用語「抗体様分子」には、ウイルス抗原に結合してそれを中和することができる上記定義の抗体フラグメント以外の任意の分子が含まれる。本用語には、具体的には、代替軽鎖（ＳＬＣ）エレメントを含む「サロボディ」と呼ばれるｐｒｅ−Ｂ細胞受容体（ｐｒｅ−ＢＣＲ）様構造（例えば、２００８年１０月２日公開のＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／１１８９７０号およびＸｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０５（３１）：１０７５６−６１（２００８）に記載）が含まれるが、これらに限定されない。ＳＬＣは、非共有結合したＶｐｒｅ−Ｂおよびλ５タンパク質から構成される非分散型のヘテロ二量体である。それぞれ、ＶｐｒｅＢ鎖はＶλＩｇドメインに相同であり、λ５鎖は基準抗体のＣλドメインに相同である。ヘテロ二量体ＳＬＣは、ｐｒｅ−ＢＣＲ  ＨＣのＣλドメインと第１の定常ドメインとの間のジスルフィド結合によってｐｒｅ−ＢＣＲ複合体中の重鎖と共有結合している。ＳＬＣの固有の特徴は、ＶｐｒｅＢ１およびλ５ドメインの非基準ペプチドがそれぞれ伸長していることである。ＶｐｒｅＢ１はそのＣ末端にさらなる２１残基を有し、λ５はそのＮ末端上に５０アミノ酸長のテールを有する（例えば、Ｖｅｔｔｅｒｍａｎｎら、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４４−５５（２００６）を参照のこと）。サロボディ構造には、具体的には、ｐｒｅ−ＢＣＲの未変性三量体ｐｒｅ−ＢＣＲ様機能単位、ＶｐｒｅＢ１とλ５との融合物、およびλ５のＮ末端５０アミノ酸、ＶｐｒｅＢ１のＣ末端２１アミノ酸、または両方のペプチド伸長物のいずれかが排除された三量体が含まれるが、これらに限定されない。さらに、古典的抗体軽鎖の定常成分を使用したキメラ構築物は、サロボディの定義内に明確に含まれる。
【００９６】
他の代表的な「抗体様分子」は、本明細書中に定義されるように、抗体代替κ軽鎖配列を含む類似の構造であり、このκ軽鎖配列は別のポリペプチド（例えば、抗体重鎖および／または軽鎖ドメイン配列など）と任意選択的にパートナーを組む。κ様Ｂ細胞受容体（κ様ＢＣＲ）はκ様代替軽鎖（κ様ＳＬＣ）を使用して同定されている（Ｆｒａｎｃｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５９３７−４３（１９９４）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８：３０５−１１（１９９８）；Ｒａｎｇｅｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０：１７８０７−１４（２００５））。Ｒａｎｇｅｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０（１８）：１７８０７−１７８１４（２００５）は、非再配列Ｖκ遺伝子の産物であるＶκ様タンパク質の同定および分子の特徴づけを報告しており、これは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８：３０５−３１１（１９９８）によって以前に報告されたｃＤＮＡ配列と同一であることが判明した。それに対して、Ｆｒａｎｃｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５９３７−４３（１９９４）は、Ｂ細胞前駆体表面でμ重鎖と会合する能力を有し、それにより、Ｂ細胞成長のためのλ５経路の代替物が得られる再配列生殖系列ＪＣｋの同定および特徴づけを報告していた。κ様およびλ様ｐｒｅ−ＢＣＲが協力して軽鎖の再配列を促進するように作用し、Ｂ細胞前駆体の成熟を確実にすることが示唆されている。概説については、ＭｃＫｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｖａｌｄｅｚ  Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １８：４０４３（２００６）を参照のこと。
【００９７】
用語「λ５」は本明細書中で最も広い意味で使用され、λ５は任意の未変性配列または改変体λ５ポリペプチドを表し、具体的には、未変性配列のヒトおよび他の哺乳動物のλ５ポリペプチド、翻訳後修飾によって形成された改変体、ならびにかかる未変性配列のポリペプチドの改変体が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
用語「改変体ＶｐｒｅＢポリペプチド」および「ＶｐｒｅＢポリペプチドの改変体」は交換可能に使用され、これらは、本明細書中で、アミノ酸修飾の結果として１つまたは複数のアミノ酸位置で未変性配列のＶｐｒｅＢポリペプチドと異なるポリペプチドであると定義する。「改変体ＶｐｒｅＢポリペプチド」は、本明細書中に定義されるように、未変性の抗体λまたはＫ軽鎖配列またはそのフラグメントと異なるであろう。「改変体ＶｐｒｅＢポリペプチド」は、好ましくは、未変性配列のＶｐｒｅＢポリペプチドと少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持するであろう。別の好ましい実施形態では、「改変体ＶｐｒｅＢポリペプチド」は、未変性抗体のλまたはＫ軽鎖配列とそのアミノ酸配列が９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、または６０％未満同一であろう。改変体ＶｐｒｅＢポリペプチドには、具体的には、ＶｐｒｅＢ配列のＣ末端の非ｌｇ様の固有のテールが部分的または完全に除去されたＶｐｒｅＢポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。用語「改変体λ５ポリペプチド」および「λ５ポリペプチドの改変体」は交換可能に使用され、アミノ酸修飾の結果として、１つまたは複数のアミノ酸位置における未変性配列のλ５ポリペプチドと異なるポリペプチドであると本明細書中で定義する。「改変体λ５ポリペプチド」は、本明細書中に定義されるように、未変性抗体のλまたはＫ軽鎖配列またはそのフラグメントと異なるであろう。「改変体λ５ポリペプチド」は、好ましくは、未変性配列のλ５ポリペプチドと少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持するであろう。別の好ましい実施形態では、「改変体λ５ポリペプチド」は、未変性の抗体のλまたはκ軽鎖配列とそのアミノ酸配列が９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、または６０％未満同一であろう。改変体λ５ポリペプチドは、具体的には、λ５配列のＮ末端の固有のテールが部分的または完全に除去されたλ５ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
用語「ＶｐｒｅＢ配列」を、上記定義の「ＶｐｒｅＢ」の配列またはそのフラグメントを表すために本明細書中で使用する。
【０１００】
用語「λ５配列」を、上記定義の「λ５」またはそのフラグメントを表すために本明細書中で使用する。
【０１０１】
用語「代替軽鎖配列」は、本明細書中に定義されるように、上記定義の「ＶｐｒｅＢ配列」および／または「λ５配列」を含む任意のポリペプチドを意味する。
【０１０２】
用語「κ様代替軽鎖可変ドメイン」、「Ｖκ様ＳＬＣ」、および「Ｖκ様」は交換可能に使用され、これらは、非再配列Ｖκ遺伝子およびその改変体の産物である任意の未変性配列のポリペプチドを表す。１つの実施形態では、未変性配列のＶκ様ポリペプチドの改変体は、抗体κ軽鎖配列に関連するＣ末端伸長（テール）をいう。特定の実施形態では、未変性配列のＶκ様ポリペプチドの改変体は、Ｖκ様ポリペプチドと対応する抗体κ軽鎖とを区別する固有のＣ末端伸長（テール）の少なくとも一部、好ましくは全てを保持する。別の実施形態では、改変体Ｖκ様ポリペプチドのＣ末端テールは、残りの配列と天然には関連しない配列である。後者の実施形態では、未変性Ｖκ様配列中に天然に存在するＣ末端テールと改変体配列との相違は、１つまたは複数のアミノ酸の変化（置換、挿入、欠失、および／または付加）に起因し得るか、Ｃ末端テールは異なるＶκ様タンパク質中に天然に存在するテールと同一であり得る。Ｖκ様ポリペプチドは、１つまたは複数の抗体κ軽鎖  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列に対応する領域中にアミノ酸の変化を含み得る。全ての例では、改変体は、未変性の抗体のκ軽鎖可変領域配列と比較して少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは４〜１００個、４〜９０個、４〜８０個、４〜７０個、４〜６０個、４〜５０個、４〜４５個、４〜４０個、４〜３５個、４〜３０個、４〜２５個、４〜２０個、４〜１５、または４〜１０個のアミノ酸残基のＣ末端伸長を含むことができるか、好ましくは含む。本明細書中に定義されるように、Ｖκ様ポリペプチド改変体は、未変性の抗体のκまたはλ軽鎖配列またはそのフラグメントと異なり、好ましくは、未変性配列のＶκポリペプチドと少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持するであろう。別の好ましい実施形態では、Ｖκ様ポリペプチド改変体は、未変性の抗体のλまたはκ軽鎖配列とそのアミノ酸配列が９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、または４０％未満同一であろう。他の実施形態では、配列同一性は、約４０％と約９５％との間、約４５％と約９０％との間、約５０％と約８５％との間、約５５％と約８０％との間、約６０％と約７５％との間、約６０％と約８０％との間、約６５％と約８５％との間、約６５％と約９０％との間、または約６５％と約９５％との間である。すべての実施形態では、好ましくは、Ｖκ様ポリペプチドは標的に結合することができる。      
【０１０３】
用語「ＪＣκ」および「ＪＣκ様」は交換可能に使用され、これらは、未変性配列のκＪ定常（Ｃ）領域セグメントおよび固有のＮ末端伸長（テール）、ならびにその改変体と同一の部分を含む未変性配列のポリペプチドを表す。１つの実施形態では、未変性配列のＪＣκ様ポリペプチドの改変体は、抗体ＪＣセグメントと区別されるＮ末端伸長（テール）を含む。特定の実施形態では、未変性配列のＪＣκ様ポリペプチドの改変体は、ＪＣκ様ポリペプチドを対応する抗体κ軽鎖ＪＣセグメントと区別する固有のＮ末端伸長（テール）の少なくとも一部、好ましくは全てを保持する。別の実施形態では、改変体ＪＣκ様ポリペプチドのＮ末端テールは、残りの配列と天然には関連しない配列である。後者の実施形態では、未変性ＪＣκ様配列中に天然に存在するＮ末端テールと改変体配列との相違は、１つまたは複数のアミノ酸の変化（置換、挿入、欠失、および／または付加）に起因し得るか、Ｎ末端テールは異なるＪＣκ様タンパク質中に天然に存在するテールと同一であり得る。未変性配列のＪＣκ様ポリペプチドの改変体は、未変性の抗体のκ可変ドメインＪＣ配列と同一の配列の一部に１つまたは複数のアミノ酸の変化を含み得る。全ての場合、改変体は、未変性の抗体のκ軽鎖ＪＣ配列と比較して少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のアミノ酸、好ましくは４〜１００個、または４〜９０個、または４〜８０個、または４〜７０個、または４〜６０個、または４〜５０個、または４〜４５個、または４〜４０個、または４〜３５個、または４〜３０個、または４〜２５個、または４〜２０個、または４〜１５、または４〜１０個のアミノ酸残基のＮ末端伸長（固有のＮ末端）を含むことができるか、好ましくは含む。ＪＣκ様ポリペプチド改変体は、本明細書中に定義されるように、未変性の抗体のλまたはκ軽鎖ＪＣ配列またはそのフラグメントと異なり、好ましくは、未変性配列のＪＣポリペプチドと少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を保持するであろう。別の好ましい実施形態では、ＪＣκ様ポリペプチド改変体は、未変性の抗体のλまたはκ軽鎖ＪＣ配列とそのアミノ酸配列が９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、または６０％未満同一であろう。他の実施形態では、配列同一性は、約４０％と約９５％との間、約４５％と約９０％との間、約５０％と約８５％との間、約５５％と約８０％との間、約６０％と約７５％との間、約６０％と約８０％との間、約６５％と約８５％との間、約６５％と約９０％との間、または約６５％と約９５％との間である。
【０１０４】
アミノ酸配列同一率を、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を使用して決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムを、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードすることができるか、そうでなければ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手することができる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２はいくつかの検索パラメーターを使用し、これらの検索パラメーターの全てをデフォルト値（例えば、アンマスク＝イエス、鎖＝全て、予想される発生数＝１０、最小低複雑性長＝１５／５、マルチパスｅ値＝０．０１、マルチパス定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、およびスコアリング行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２が含まれる）に設定する。
【０１０５】
用語「抱合体」、「抱合した」、および「抱合」は、任意のおよび全ての共有結合または非共有結合の形態を表し、直接的な遺伝子融合または化学的融合、リンカーまたは架橋剤によるカップリング、および、例えば、ファンデルワールス力またはロイシンジッパーの使用による非共有結合が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
用語「融合」を、そのヌクレオチドコード配列のインフレームでの組み合せによる１つのポリペプチド鎖中の異なる起源のアミノ酸の組み合せを表すために本明細書中で使用する。用語「融合」は、その末端の１つへの融合に加えて、内部融合、すなわち、ポリペプチド鎖内の異なる起源の配列の挿入を明確に含む。
【０１０７】
本明細書中で使用する場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、全て、共有結合性の「ペプチド結合」によって連結されたアミノ酸の一次配列を表す。一般に、ペプチドは、少数のアミノ酸、典型的には、約２〜約５０個のアミノ酸からなり、タンパク質より短い。用語「ポリペプチド」は、本明細書中に定義されるように、ペプチドおよびタンパク質を含む。
【０１０８】
用語「アミノ酸」または「アミノ酸残基」は、典型的には、その分野で認識された定義を有するアミノ酸（アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）からなる群より選択されるアミノ酸など）を表すが、必要に応じて、修飾アミノ酸、合成アミノ酸、または稀なアミノ酸を使用することができる。したがって、連邦規則集第３７巻１．８２２（ｂ）（４）に列挙した修飾アミノ酸および通常でないアミノ酸は、本定義内に明確に含まれ、明確に本明細書中で参考として援用される。アミノ酸を、種々の亜群に分類することができる。したがって、アミノ酸を、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負電荷の側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正電荷の側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；または無電荷極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒ）を有するアミノ酸に分類することができる。アミノ酸を、小アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ）、求核性アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ）、疎水性アミノ酸（Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、アミド（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、および塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）に分類することもできる。
【０１０９】
用語「ポリヌクレオチド」は、核酸（ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子など）およびそのアナログ（例えば、ヌクレオチドアナログまたは核酸化学を使用して生成したＤＮＡまたはＲＮＡ）を表す。必要に応じて、ポリヌクレオチドを、例えば、当該分野で認識された核酸化学を使用して合成的に作製するか、例えば、ポリメラーゼを使用して酵素的に作製するか、必要に応じて、修飾することができる。典型的な修飾には、メチル化、ビオチン化、および他の当該分野で公知の修飾が含まれる。さらに、核酸分子は、必要に応じて検出可能な部分に連結した一本鎖または二本鎖であり得る。
【０１１０】
基準ポリペプチドに関する用語「改変体」は、未変性ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸の変異または修飾（すなわち、変化）を保有するポリペプチドを表す。「アミノ酸修飾」によって生成された改変体を、例えば、未変性アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または化学修飾によって産生することができる。
【０１１１】
「アミノ酸修飾」は、所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列の変化を表す。例示的な修飾には、アミノ酸の置換、挿入、および／または欠失が含まれる。
【０１１２】
「特定の部位のアミノ酸修飾」は、特定の残基の置換もしくは欠失または特定の残基に隣接する少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入を表す。「隣接する」特定の残基の挿入は、その１〜２個の残基内の挿入を意味する。挿入は、特定の残基のＮ末端またはＣ末端であり得る。
【０１１３】
「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列中の少なくとも１つの既存のアミノ酸残基の別の異なる「置換」アミノ酸残基との置換を表す。置換残基は、「天然に存在するアミノ酸残基」（すなわち、遺伝暗号によってコードされる）であり、アラニン（Ａｌａ）；アルギニン（Ａｒｇ）；アスパラギン（Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ）；システイン（Ｃｙｓ）；グルタミン（Ｇｌｎ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ）；グリシン（Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ロイシン（Ｌｅｕ）；リジン（Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐｒｏ）；セリン（Ｓｅｒ）；トレオニン（Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｔｒｐ）；チロシン（Ｔｙｒ）；およびバリン（Ｖａｌ）からなる群より選択され得る。１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸残基との置換はまた、本明細書中のアミノ酸置換の定義に含まれる。
【０１１４】
「天然に存在しないアミノ酸残基」は、ポリペプチド鎖中の隣接アミノ酸残基に共有結合することができる上記列挙の天然に存在するアミノ酸残基以外の残基を表す。天然に存在しないアミノ酸残基の例には、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、および他のアミノ酸残基アナログ（Ｅｌｌｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１  ３３６（１９９１）に記載のものなど）が含まれる。かかる天然に存在しないアミノ酸残基を生成するために、Ｎｏｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）およびＥｌｌｍａｎら、前出の手順を使用することができる。簡潔に述べれば、これらの手順は、天然に存在しないアミノ酸残基での抑制性ｔＲＮＡの化学的活性化およびその後のＲＮＡのインビトロ転写および翻訳を含む。
【０１１５】
「アミノ酸挿入」は、所定のアミノ酸配列への少なくとも１つのアミノ酸の組み込みを表す。挿入は通常１つまたは２つのアミノ酸残基の挿入からなる一方で、本出願はより巨大な「ペプチド挿入」（例えば、約３〜約５個、またはさらに約１０個までのアミノ酸残基の挿入）を意図する。挿入される残基は、上記開示の天然に存在する残基または天然に存在しない残基であり得る。
【０１１６】
「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を表す。
【０１１７】
用語「変異誘発」は、他で特定しない限り、任意の当該分野で認識されたポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を変化させる技術を表す。好ましい変異誘発型には、エラー多発性ＰＣＲ変異誘発、飽和変異誘発、または他の部位特異的変異誘発が含まれる。
【０１１８】
「部位特異的変異誘発」は、当該分野で標準的な技術であり、少数のミスマッチを除いて所望の変異を示す変異誘発すべき一本鎖ファージＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して行う。簡潔に述べれば、合成オリゴヌクレオチドを、一本鎖ファージＤＮＡに相補的な鎖の合成を指示するためのプライマーとして使用し、得られた二本鎖ＤＮＡを、ファージ支持宿主細菌に形質転換する。形質転換細菌の培養物を上層寒天にプレートし、ファージを保有する単一の細胞からプラークを形成させる。理論的には、新規のプラークの５０％が一本鎖として変異形態を有するファージを含み、５０％が元の配列を有するであろう。目的のプラークを、正確に適合するハイブリッド形成が可能であるが、元の鎖とのミスマッチがハイブリッド形成の防止に十分である温度でのキナーゼ化合成プライマーとのハイブリッド形成によって選択する。次いで、プローブとハイブリッド形成するプラークを選択し、配列決定し、培養し、ＤＮＡを回収する。
【０１１９】
用語「中和分子」は本明細書中でその最も広い意味で使用され、これは、中和を行う機構と無関係にウイルスが標的細胞に複製的に感染するのを阻害する任意の分子を表す。中和分子は、好ましくは、上記定義の抗体または抗体様分子である。中和を、例えば、細胞表面へのウイルスの付着または接着の阻害（例えば、ウイルスの付着または接着を担う部位に直接結合するか隣接部位に結合する分子（抗体または抗体様分子など）の操作）によって行うことができる。中和を、ビリオン表面に指向してビリオンを凝集させる分子（抗体または抗体様分子など）によって行うこともできる。中和は、標的細胞へのウイルスの付着後のウイルス膜と細胞膜との融合の阻害、エンドサイトーシスの阻害、および感染細胞由来の子孫ウイルスの阻害などによってさらに生じ得る。本発明の中和分子（抗体または抗体様分子など）は、中和機構に制限されない。
【０１２０】
用語「抗体レパートリー」は、本明細書中で最も広い意味で使用され、これは、特定の性質（結合能力、結合特異性、胃腸管輸送能力、安定性、および親和性など）をスクリーニングするために使用することができる抗体または抗体フラグメントの集団を表す。本用語には、具体的には、抗体ライブラリーが含まれる。この抗体ライブラリーには、組み合せライブラリーの全ての型（例えば、抗体ファージ提示ライブラリーなど）が含まれる。この抗体ファージ提示ライブラリーには、任意の供給源由来の単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）およびＦａｂ抗体ファージ提示ライブラリー（ナイーブライブラリー、合成ライブラリー、および半合成ライブラリーが含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】
同様に、「抗体様分子のレパートリー」は、（上記定義のように）特定の性質（結合能力、結合特異性、胃腸管輸送能力、安定性、および親和性など）をスクリーニングするために使用することができるかかる分子の集団を表す。本用語には、具体的には、サロボディライブラリーおよびκ様軽鎖構築物のライブラリー（上記定義）が含まれる。これらのライブラリーには、組み合せライブラリーの全ての型（例えば、抗体ファージ提示ライブラリーなど）が含まれる。組み合せサロボディライブラリーは、例えば、Ｘｕら、（２００８）、前出に開示されている。
【０１２２】
「ファージ提示ライブラリー」は、ファージコートタンパク質との融合物としてのクローン化タンパク質配列集団を発現するタンパク質発現ライブラリーである。したがって、句「ファージ提示ライブラリー」は、本明細書中で、ファージ（例えば、繊維状ファージ）のコレクションを表し、このファージは外部（典型的には、異種）タンパク質を発現する。外部タンパク質は、ファージが接触する他の部分と自由に相互作用する（または結合する）。外部タンパク質を提示する各ファージは、ファージ提示ライブラリーの「メンバー」である。
【０１２３】
「抗体ファージ提示ライブラリー」は、抗体または抗体フラグメントを提示するファージ提示ライブラリーを表す。抗体ライブラリーには、ファージ集団、かかるファージ集団をコードするベクター集団、またはかかるファージ集団またはベクター集団を保有する細胞が含まれる。ライブラリーは、ファージ粒子あたり平均して１つの一本鎖抗体または抗体フラグメントを提示する１価であり得るか、ウイルス粒子あたり平均して２つ以上の抗体または抗体フラグメントを提示する２価であり得る。用語「抗体フラグメント」には、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントおよびＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。好ましい抗体ライブラリーは、平均して１０６個超、１０７個超、１０８個超、または１０９個超の異なるメンバーを含む。
【０１２４】
用語「繊維状ファージ」は、その表面上に異種ポリペプチドを提示することができるウイルス粒子を表し、繊維状ファージには、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ１、およびＭ１３が含まれるが、これらに限定されない。繊維状ファージは、テトラサイクリン（例えば、「ｆｄ−ｔｅｔ」）などの選択マーカーを含むことができる。種々の繊維状ファージ提示系が当業者に周知である（例えば、Ｚａｃｈｅｒら、Ｇｅｎｅ  ９：１２７−１４０（１９８０）、Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７（１９８５）；およびＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−３１８（１９８８）を参照のこと）。
【０１２５】
用語「パニング」を、標的に対して高い親和性および特異性を有する抗体などの化合物を保有するファージの同定および単離における複数ラウンドのスクリーニング過程を表すために使用する。
【０１２６】
本明細書中で使用する場合、用語「非ヒト動物」には、哺乳動物（例えば、非ヒト霊長類など）、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）、および非げっ歯類動物（例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、およびロバなど）が含まれるが、これらに限定されない。鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、およびガチョウなど）も含まれる。本明細書中で使用する場合、用語「非霊長類動物」は、霊長類以外の哺乳動物（特に上記列挙の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない）を表す。
【０１２７】
句「機能的に異なる抗体」およびその文法上の異形を、少なくとも１つの性質（結合特異性、結合親和性、および任意の免疫学的機能または生物学的機能（例えば、標的を中和する能力、生物学的活性の範囲または質など）が含まれるが、これらに限定されない）が相互に異なる抗体を表すために使用する。
【０１２８】
句「保存アミノ酸残基」を、相互にアラインメントされた２つ以上のアミノ酸配列間で同一のアミノ酸残基を表すために使用する。
【０１２９】
本明細書中で使用する場合、用語「エピトープ」は、少なくとも約３〜５個、好ましくは少なくとも約５〜１０個、または少なくとも約５〜１５個のアミノ酸、典型的には、せいぜい５００個または約１，０００個のアミノ酸の配列を表し、それ自体またはより大きな配列の一部としてかかる配列に応答して生成される抗体に結合する配列を定義する。エピトープは、由来する親タンパク質の一部と同一の配列を有するポリペプチドに制限されない。実際、ウイルスゲノムは、その状態が絶えず変化し、分離株間で比較的高い変異性を示す。したがって、用語「エピトープ」は、未変性配列と同一の配列および未変性配列の修飾物（欠失、置換および／または挿入など）を含む。一般に、かかる修飾物は事実上保存されるが、非保存的修飾も意図される。この用語には、具体的には、「ミモトープ」（すなわち、連続的な線状の未変性配列と同一でないか、必ずしも未変性タンパク質中に生じないが、未変性タンパク質上のエピトープを機能的に模倣する配列）が含まれる。用語「エピトープ」には、具体的には、線状および高次構造エピトープが含まれる。
【０１３０】
Ｂ．一般的技術
本発明の方法を実施するための技術は当該分野で周知であり、標準的な実験テキスト（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｐ．Ｍ．Ｏ’ＢｒｉａｎおよびＲ．Ａｉｔｋｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１７８巻；Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃ．Ｆ．Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｇ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ編、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ、２００４が含まれる）に記載されている。変異誘発を、例えば、部位特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５））を使用して行うことができる。
【０１３１】
１つの態様では、本発明のウイルス抗原中和分子は、典型的には抗体ライブラリーを使用して選択される抗体である。以下の記載では、本発明を、一定の抗体ライブラリー型を参照して例示しているが、本発明は、任意の特定の抗体ライブラリー型の使用に制限されない。組換えモノクローナル抗体ライブラリーは、免疫フラグメントまたはナイーブフラグメントに基づき得る。免疫抗体ライブラリー由来の抗体は、典型的には、無作為な組み合せライブラリーを産生するために元のＢ細胞から発現に適切なベクターにクローン化されるＶＨおよびＶＬ遺伝子プールを使用して構築し、その後に抗体を選択および／またはスクリーニングすることができる。他のライブラリー型は、抗原に結合するクローンに明確に偏っていない遺伝子供給源由来の抗体フラグメントから構成され得る。したがって、ナイーブ抗体ライブラリーは、天然で免疫化されていない再配列Ｖ遺伝子に由来する。合成抗体ライブラリーを、インビトロ法（１つまたは複数のＶ遺伝子のＣＤＲへの完全または適合した縮重領域の導入）によって完全に構築するする。半合成ライブラリーは、天然の多様性と合成の多様性が組み合わされており、しばしば、天然の多様性が増加する一方で、所望のレベルの機能的多様性が保持されるように作製される。したがって、かかるライブラリーを、例えば、天然ＣＤＲ領域のシャフリング（Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：８５２−８５６（２０００））またはヒトＢ細胞由来の天然に再配列されたＣＤＲ配列と合成ＣＤＲ１およびＣＤＲ２多様性との組み合せ（Ｈｏｅｔら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：４５５−３８（２００５））によって作製することができる。本発明は、ナイーブ抗体ライブラリー、合成抗体ライブラリー、および半合成抗体ライブラリー、またはその任意の組み合せの使用を含む。
【０１３２】
同様に、本発明の方法は、抗体の提示のために使用されるいかなる特定のテクノロジーにも制限されない。本発明はファージ提示を参照して例示されているが、本発明の抗体を、他の提示および富化テクノロジーによって同定することもできる。抗体フラグメントは、抗体遺伝子をコードする繊維状ファージの表面に提示されている（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：３８１  ３８８（１９９２）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８（６３０１）：５５２  ５５４（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１３（１４）：３２４５−３２６０（１９９４））。抗体ライブラリーの選択およびスクリーニング技術の概説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（９）：１１０５−１１１６（２００５）を参照のこと。さらに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ａｇｔｅｒｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅ  ８８：３７−４５（１９９０）；Ｃｈａｒｂｉｔら、Ｇｅｎｅ  ７０：１８１−１８９（１９８８）；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２７１３−２７１７（１９９２））および酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）（ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７（１９９７）；Ｋｉｅｋｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１０：１３０３−１３１０（１９９７））の表面上の異種タンパク質およびフラグメントの提示について当該分野で公知の系が存在する。他の公知の提示技術には、リボゾームまたはｍＲＮＡ提示（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２−９０２６（１９９４）；ＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４９３７−４９４２（１９９７））、ＤＮＡ提示（Ｙｏｎｅｚａｗａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３１（１９）：ｅ１１８（２００３））；微生物細胞提示（細菌提示など）（Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：２９−３４（１９９７））、哺乳動物細胞上の提示、胞子提示（Ｉｓｔｉｃａｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：６２９４−６３０１（２００１）；Ｃｈｅｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：３３３７−３３４１（２００５）および２００６年１１月１３日出願の同時継続仮出願番号６０／８６５，５７４号））、ウイルス提示（レトロウイルス提示など）（Ｕｒｂａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ３５（２００５））、タンパク質−ＤＮＡ結合に基づいた提示（Ｏｄｅｇｒｉｐら、Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：２８０６−２８１０（２００４）；Ｒｅｉｅｒｓｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅ１０（２００５））、およびマイクロビーズ提示（Ｓｅｐｐら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５３２：４５５−４５８（２００２））が含まれる。
【０１３３】
Ｃ．好ましい実施形態の詳細な説明
１つの態様では、本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスの１つを超える亜型および／または１つを超える分離株を中和し、ウイルスの血球凝集素（ＨＡ）抗原に結合するが、血球凝集を阻害しないモノクローナル抗体および抗体様分子の選択、産生、および使用に関する。
【０１３４】
インフルエンザＡ型ウイルスのビリオンは、８セグメントの線状の負のセンス一本鎖ＲＮＡを含む。総ゲノム長は１３６００ヌクレオチドであり、８セグメントは、それぞれ、２３５０ヌクレオチド長、２３５０ヌクレオチド長、２２５０ヌクレオチド長、１７８０ヌクレオチド長、１５７５ヌクレオチド長、１４２０ヌクレオチド長、１０５０ヌクレオチド長、および９００ヌクレオチド長である。インフルエンザＡ型ウイルスの宿主特異性および弱毒化は、ウイルス血球凝集素（Ｈ、ＨＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックス（Ｍ）、および非構造（ＮＳ）遺伝子にそれぞれまたはウイルス遺伝子の組み合せで寄与している（例えば、Ｒｏｇｅｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２７：３６１−３７３（１９８３）；Ｓｃｈｏｌｔｉｓｓｅｋら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４７：２８７−２９４（１９８５）；Ｓｎｙｄｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２４：４６７−４６９（１９８６）；Ｔｉａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：７７１−７７５（１９８５）；Ｔｒｅａｎｏｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７１：１−９（１９８９）を参照のこと）。
【０１３５】
インフルエンザＡ型ウイルスおよびその表面タンパク質（血球凝集素およびノイラミニダーゼタンパク質が含まれる）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよび他の配列データベース（例えば、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙが保持しているインフルエンザ配列データベースなど）から利用可能である。インフルエンザＡ型ウイルス血球凝集素の１５種の公知のＨ亜型（Ｈ１〜Ｈ１５）のアミノ酸配列は、２００８年１月１７日公開の米国特許出願公開第２００８００１４２０５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に示されている。さらなるインフルエンザＡ型ウイルス血球凝集素亜型（Ｈ１６）が、最近スウェーデンにてユリカモメから単離され、Ｆｏｕｃｈｉｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（５）：２８１４−２２（２００５）によって報告された。各Ｈ亜型の非常に多様な株も公知である。例えば、Ｈ５  Ａ／ホンコン／１５６／９７と指定されたＨＡタンパク質配列は１９９７年５月にホンコンでヒトから単離されたインフルエンザＡ型Ｈ５Ｎ１ウイルスから決定され、Ｓｕａｒｅｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６６７８−６６８８（１９９８）に他の関連Ｈ５Ｎ１分離株から得たいくつかのさらなる株の配列と比較して示されている。
【０１３６】
インフルエンザウイルスノイラミニダーゼの触媒部位および抗原部位の構造はＣｏｌｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：４１−４（１９８３）によって公開されており、ノイラミニダーゼ配列はＧｅｎＢａｎｋおよび他の配列データベースから利用可能である。
【０１３７】
感染個体の免疫応答に起因するウイルス特異的抗体が典型的にはウイルス血球凝集素との相互作用を介してウイルスを中和することが公知である（Ａｄａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２８：１−５４（１９８６）；Ｃｏｕｃｈら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｏｂｉｏｌ．３７：５２９−５４９（１９８３））。インフルエンザウイルス血球凝集素の三次元構造およびインフルエンザウイルス血球凝集素と中和抗体との複合体の結晶構造も決定され、公開されている（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８９：３６６−７３（１９８１）；Ｒｕｉｇｒｏｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９（Ｐｔ  １１）：２７８５−９５（１９８８）；Ｗｒｉｇｌｅｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １３１（２）：３０８−１４（１９８３）；Ｄａｎｉｅｌｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１４５９−１４６５（１９８７）；およびＢｉｚｅｂａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：９２−９４（２００２）を参照のこと）。
【０１３８】
本発明によれば、所望の性質を有する抗体を１つまたは複数の抗体ライブラリーから同定し、この抗体は、種々の供給源に由来し、異なる型であり得る。
【０１３９】
包括的ヒトインフルエンザ抗体ライブラリー
包括的ヒトインフルエンザ抗体ライブラリーを、種々の以前のインフルエンザ、季節性の大流行、エピデミック、およびパンデミック（１９６８年のホンコン風邪（Ｈ３Ｎ２）、１９５７年のアジア風邪（Ｈ２Ｎ２）、１９１８年のスペイン風邪（Ｈ１Ｎ１）、および２００４／２００５年のトリインフルエンザ（Ｈ５Ｎ１）が含まれる）の回復期患者から得た抗体から作製することができる。例えば、２００８年１月１７日公開の米国特許出願公開第２００８００１４２０５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。かかるライブラリーを調製するために、血液または骨髄のサンプルを、インフルエンザウイルスに感染していることが知られているか疑いのある個体から採取する。特に地理的に離れた供給源由来の末梢血サンプルを、輸送および使用前に安定化することが必要であり得る。この目的のためのキットは周知且つ市販されており、例えば、ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（商標）細胞調製管などをリンパ球の遠心精製のために使用することができ、グアニジウム、トリゾール、またはＲＮＡｌａｔｅｒをサンプル安定化のために使用した。安定化リンパ球または全骨髄の受取りの際、当該分野で公知の免疫グロブリンオリゴプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを行い、重鎖および軽鎖レパートリーをレスキューする。当該分野で公知の手順に従って、ＰＣＲレパートリー産物をリンカーオリゴと組み合わせてｓｃＦｖライブラリーを生成し、ｍ１３  ｐＩＩＩタンパク質を使用してインフレームで直接クローン化する。
【０１４０】
典型的なプロトコールでは、ヒト血清中の抗体を、周知の血清学的アッセイ（例えば、周知の血球凝集素阻害（ＨＡＩ）アッセイ（Ｋｅｎｄａｌ，Ａ．Ｐ．、Ｍ．Ｓ．ＰｅｒｅｉｒａおよびＪ．Ｊ．Ｓｋｅｈｅｌ．１９８２．Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．、米国保健社会福祉省、公衆衛生局、疾病対策センター、Ａｔｌａｎｔａ，Ｇｅｏｒｇｉａ）またはマイクロ中和アッセイ（Ｈａｒｍｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２６：３３３−３３７（１９８８））が含まれる）によって検出することができる。血清サンプルがインフルエンザ中和抗体を含むと既に確認されている場合、この検出工程は必要ないかもしれない。全血由来のリンパ球または骨髄中に存在するリンパ球を、次に、当該分野で公知の方法によって処理する。新鮮な組織またはＲＮＡｌａｔｅｒで安定化した組織由来の全ＲＮＡをＴｒｉＢＤ試薬（Ｓｉｇｍａ）によって抽出した。その後、単離したドナー総ＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ精製（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｍＲＮＡにさらに精製する。次に、ＡｃｃｕＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のプロトコールに従ったランダム九量体オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴ（ｄＴ）１８プライマーの使用によって第１のｃＤＮＡ鎖を合成する。簡潔に述べれば、１００ｎｇのｍＲＮＡ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、および３００ｎｇのランダム九量体および／または５００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）１８プライマーを含むＡｃｃｕｓｃｒｉｐｔＲＴ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を６５℃で５分間インキュベートし、その後に４℃に急冷する。次いで、１００ｍＭのＤＴＴ、Ａｃｃｕｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、およびＲＮＡｓｅＢｌｏｃｋを各反応物に添加し、４２℃で１時間インキュベートし、逆転写酵素を７０℃で１５分間の加熱によって不活化する。得られたｃＤＮＡを抗体重鎖および軽鎖Ｖ遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用することができ、次いで、ベクターにクローン化することができるか、ファージ提示ライブラリーを意図する場合、ファージベクターにクローン化することができる。この手順により、抗体重鎖および軽鎖可変領域クローンのレパートリー（ＶＨおよびＶＬライブラリー）が得られ、これを分離したままにするか、スクリーニングのために組み合せることができる。
【０１４１】
先のエピデミックおよびパンデミック（１９１８年のスペイン風邪など）の生存者の末梢リンパ球由来の免疫グロブリンレパートリーを、上記に類似の様式で回収し、安定化し、レスキューすることができる。さらなるＨ１およびＨ３ライブラリーレパートリーを、適切にタイミングを合わせてワクチン接種を行った局所起源のドナーから回収することができる。さらなる選択肢として、市販の骨髄総ＲＮＡまたはｍＲＮＡを商業的供給源から購入し、Ｈ２抗体スクリーニングにも適切なドナーのバックグラウンドに応じてＨ１およびＨ３に適切なライブラリーを産生することができる。
【０１４２】
合成ヒト様レパートリー
本発明の方法では、合成ヒト抗体レパートリーを、合成抗体ライブラリーによって示すことができ、このレパートリーを、当該分野で公知の方法によって作製することができるか、商業的供給源から入手することができる。したがって、例えば、完全に合成のヒトレパートリーは、２００７年９月２８日出願の米国特許出願第１１／８６４，５２５号（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。簡潔に述べれば、この特許出願は、所定のアミノ酸が目的の免疫グロブリンの１つまたは複数の相補性決定領域に組み合わせて導入された免疫グロブリンのライブラリーを記載している。さらに、例えば、免疫グロブリンユニバーサルライブラリー（かかるライブラリーのサブセットが含まれる）は、２００３年１２月１１日公開の米国特許出願公開第２００３０２２８３０２号（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている。
【０１４３】
種々の変異を有する抗体重鎖および軽鎖の特定のサブライブラリーを組み合わせて本発明の抗体のフレームワーク構築物を得て、その後に重鎖および軽鎖の両方のＣＤＲに多様性を導入することができる。この多様性を、当該分野で公知の方法（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発など）によって達成することができ、これを数回繰り返して多様性をさらに増大させることができる。したがって、例えば、複数のＫｕｎｋｅｌ変異誘発ラウンドによって重鎖および軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤ２領域に多様性を個別または同時に導入することができる。必要に応じて、種々のＫｕｎｋｅｌクローンをＣＤＲの長さによって分離することができ、そして／またはターゲティングしたＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１またはＣＤＲ３）中に多様性を欠くクローンを、例えば、テンプレート特異的制限酵素での消化によって除去することができる。これらの工程の完了の際、ライブラリーのサイズは、約１０９メンバーを超えるべきであるが、より少数のメンバーを有するライブラリーも有用である。
【０１４４】
特定の実施形態では、免疫化抗体ライブラリーおよび合成抗体ライブラリーの両方を、本発明の中和抗体の同定のために使用する。２つのライブラリー型は基本的に異なる。合成抗体ライブラリーは抗原に結合する能力が予想されるヒト抗体集団を合成する一方で、免疫化レパートリーはトリＨ５血球凝集素、および／またはＨ１、Ｈ２、またはＨ３血球凝集素（場合による）を特異的に認識するための配列を含むであろう。したがって、免疫化レパートリーは、理論的には、ターゲティングされたインフルエンザ亜型の重要成分を認識するように至適化される。これらの相違の結果として、２つの方法によって異なる抗体組が産生され、したがって、所望の中和抗体を同定するためのより有効なアプローチが得られる。
【０１４５】
高免疫化非ヒト霊長類抗体ライブラリー
本方法では、抗体ライブラリーを高免疫化非ヒト霊長類（例えば、マカクまたはヒヒなど）からレスキューする。具体的には、非ヒト霊長類を、インフルエンザＡ型ウイルスの種々の亜型または種々の血球凝集素（Ｈ）タンパク質で免疫化する。動物が免疫化されるインフルエンザＡ型ウイルス亜型または血球凝集素を認識する抗体の力価を生じる動物を屠殺し、その脾臓を採取する。上の包括的インフルエンザ抗体ライブラリーについて記載のように、免疫化した動物の血液または骨髄を採取し、産生された抗体を回収し、増幅する。
【０１４６】
本発明の中和抗体の単離のためのストラテジー
使用した抗体ライブラリーの型と無関係に、二重特異性（例えば、２つの異なるインフルエンザＡ型亜型および／または同一亜型の２つの株（分離株）、および／またはヒトおよび非ヒト分離株との反応など）を有する抗体を、調節された交差反応選択および／または定方向組み合せおよび／または変異誘発操作によって発見および至適化することができる。
【０１４７】
図１に示す典型的な富化スキームでは、標的ＡおよびＢと指定した２つの標的に交差反応性を示す抗体を含むライブラリーを、複数の富化ラウンドに供する（２００８年１月１７日公開の米国特許出願公開第２００８００１４２０５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。富化が標的Ａとの反応性に基づく場合、各富化ラウンドにより、標的Ａに対してプールの反応強度が増加するであろう。同様に、富化が標的Ｂとの反応性に基づく場合、各富化ラウンドにより、標的Ｂに対してプールの反応強度が増加するであろう。このアプローチがパニング（ファージ提示ライブラリーをスクリーニングする場合に使用される選択方法である）（以下を参照のこと）を表すにもかかわらず、アプローチは、上記で考察した任意のライブラリー型、当該分野で公知の他の型、および任意の提示技術型に等しく適用可能である。標的ＡおよびＢには、抗体が結合する任意の標的（インフルエンザウイルスの種々の分離株、型、および亜型が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。
【０１４８】
本発明の目的が複数の特異性を有する中和抗体を同定することであるので、交差反応発見選択スキームを作製した。簡潔にするために、このスキームを、図２に例示する。図２は、二重特異性を有する抗体の選択を示す。この場合、２つの標的である標的ＡおよびＢと反応性を示す抗体を含む抗体ライブラリーを、一方の標的（例えば、標的Ａ）との反応性について最初に選択し、その後に他方の標的（例えば、標的Ｂ）との反応性について選択する。それぞれの連続的な選択ラウンドにより、両標的に対する得られたプールの反応強度が強化される（２００８年１月１７日公開の米国特許出願公開第２００８００１４２０５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）も参照のこと）。したがって、本方法は、二重特異性を有する抗体の同定に特に有用である。勿論、本方法を、さらなる標的に対するさらなる富化ラウンドを含めることによって、さらなる標的に対する反応性を示す抗体の同定に拡大することができる。また、スクリーニングされるライブラリーがファージ提示ライブラリーである場合、交差反応パニングによって選択するが、他のライブラリーおよび他の選択方法も使用することができる。
【０１４９】
上記で考察した２つの方法の組み合せは、上記のように、それぞれ標的Ａおよび標的Ｂに対する反応性についての２つの個別の富化ラウンド、得られた２つのプールの組換え、およびその後の交差反応選択ラウンドを含む（２００８年１月１７日公開の米国特許出願公開第２００８００１４２０５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。このアプローチを、図３に示す。純粋な交差反応と同様に、組換えられたライブラリーの各選択ラウンドにより、両標的に対する得られたプールの反応強度が増加する。
【０１５０】
図４に例示するさらなる実施形態では、第１に、標的Ａと強い反応性を示し、且つ標的Ｂと検出可能な交差反応性を有するクローンを同定する。このクローンに基づいて、変異誘発ライブラリーを調製し、次いで、交互のラウンドにおいてそれぞれ標的Ｂおよび標的Ａとの反応性について選択する。このスキームにより、標的Ａとの強い反応性を保持し、且つ標的Ｂとの反応性が増加した抗体が得られるであろう。（２００８年１月１７日公開の米国特許出願公開第２００８００１４２０５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。これまでと同様に、スクリーニングされるライブラリーがファージ提示ライブラリーである場合、パニングによって選択するが、同一のストラテジーに従って、他のライブラリー、他の提示技術、および他の選択方法も使用することができる。
【０１５１】
上記で考察するように、標的ＡおよびＢは、例えば、インフルエンザＡ型ウイルスの２つの異なる亜型、同一のインフルエンザＡ型ウイルスの２つの異なる株（分離株）、２つの異なる種（一方の種は好ましくはヒトである）由来の亜型または分離株であり得る。従って、例えば、標的Ａは２００４年のＨ５Ｎ１ウイルスのベトナム分離株であり得、標的Ｂは１９９７年のＨ５Ｎ１ウイルスのホンコン分離株であり得る。これらの例は例示のみを目的とし、任意の２つまたは複数の標的に対する二重および複数の特異性を有する抗体を類似の様式で同定、選択、および至適化することができることを強調しておく。
【０１５２】
あるいは、個別のフレームワークおよびＣＤＲの長さを分離することが可能な抗体ライブラリー（ＵＡＬなど）を使用して標的Ａに対する抗体を見出す場合、抗原Ｂをスクリーニングし、ライブラリーを類似のパラメーターの多様な集団に制限することができる。一旦抗原Ｂに対する抗体が見出された場合、各Ａ抗体およびＢ抗体に基づいたキメラ抗体または変異誘発抗体を使用して二重特異性集団を操作することができる。
【０１５３】
ファージ提示
特定の実施形態では、本発明は、複数の（二重が含まれる）特異性を有するモノクローナル中和抗体を機能的に発見するためにファージ提示抗体ライブラリーを使用する。かかる抗体は、例えば、１つを超えるインフルエンザＡ型ウイルス亜型（Ｈ５、Ｈ７および／またはＨ９亜型（Ｈ５およびＨ１；Ｈ５およびＨ２；Ｈ５およびＨ３；Ｈ５、Ｈ１、およびＨ２；Ｈ５、Ｈ１、およびＨ３；Ｈ５、Ｈ２、およびＨ３；Ｈ１、Ｈ２およびＨ３などの亜型）が含まれる）および／または同一亜型の１つを超える株（分離株）を中和することができるモノクローナル抗体であり得る。
【０１５４】
ファージ抗体ライブラリーを生成するために、任意の供給源から得たｃＤＮＡライブラリー（上記考察のライブラリーが含まれる）をファージベクターにクローン化する。
【０１５５】
したがって、例えば、上記のようにＲＴ−ＰＣＲによってリンパ球または骨髄からレスキューした抗体重鎖および軽鎖レパートリー集団を、ｍ１３  ｐＩＩＩタンパク質に融合したｓｃＦｖライブラリーとして再アセンブリする。組み合せライブラリーは、約１０６超、１０７超、１０８超、または１０９超の異なるメンバーを含み、１０７以上の異なるメンバーが好ましい。品質管理のために、ランダムクローンを配列決定して、全体的なレパートリーの複雑さを評価する。
【０１５６】
同様に、ナイーブ、免疫化ヒト、または高免疫化非ヒト霊長類の抗体ライブラリー由来の重鎖および軽鎖可変領域の最初のＰＣＲレスキュー後、ＰＣＲ産物をリンカーオリゴと組み合わせて、Ｍ１３  ｐＩＩＩコートタンパク質を使用してインフレームで直接クローン化するためのｓｃＦｖライブラリーを生成する。このライブラリーは、約１０６超、１０７超、１０８超、または１０９超の異なるメンバーを含み、１０７以上の異なるメンバーが好ましい。品質管理のために、ランダムクローンを配列決定して、全体的なレパートリーのサイズおよび複雑さを評価する。
【０１５７】
抗体ファージ提示ライブラリーは、種々の形式（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）形式またはＦａｂ形式など）の抗体を含むことができる。概説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：１−３７（２００２）を参照のこと
スクリーニング
所望の中和特性を有する抗体を同定するためのスクリーニング方法は上に記載している。所望の血球凝集素タンパク質への直接結合に基づいて反応性を評価することができる。
【０１５８】
血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の産生
血球凝集素（ＨＡ）タンパク質を、組換えＤＮＡテクノロジーによって産生することができる。この方法では、ＨＡ遺伝子を、適切なベクター、好ましくは、バキュロウイルス感染昆虫細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）細胞など）における発現のためのバキュロウイルス発現ベクター）にクローン化する。
【０１５９】
ＨＡタンパク質をコードする核酸を、Ｃ末端エピトープタグ（ポリ−ｈｉｓ（ヘキサヒスチジンタグ）など）を使用するか使用しないでバキュロウイルス発現ベクター（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など）に挿入する。ポリ−ｈｉｓタグにより、ニッケルキレートクロマトグラフィによって容易に精製される。
【０１６０】
一般に、クローニングは、アセンブリＰＣＲによって個別に合成されたオリゴから基準ｃＤＮＡを作製する工程を含む。対応する分離株の改変体ＨＡタンパク質を、さらなるアセンブリＰＣＲへの適切な変異オリゴの置換または変異誘発技術（Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発など）のいずれかによって作製する。Ｈ５について２つのＨＡタンパク質配列クラスターが存在する（１９９７年および２００４年の亜型分離株）。したがって、各クラスターについて単一の基準タンパク質を作製する。同様に、１９１８年スペイン風邪（Ｈ１）、１９５８年アジア風邪（Ｈ２）、１９６８年ホンコン風邪（Ｈ３）、および現在のＨ１、Ｈ２、Ｈ３分離株についての基準タンパク質を生成する。
【０１６１】
組換えバキュロウイルスを、リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬから市販されている）を使用した上記バクミドのＳｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）へのトランスフェクションによって生成する。２８℃での４〜５日間のインキュベーション後、放出されたウイルスを回収し、さらなる増幅のために使用する。ウイルス感染およびタンパク質発現を、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４）に記載のように行う。
【０１６２】
次いで、発現したポリ−Ｈｉｓタグ化ＨＡポリペプチドを、例えば、以下のようにＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィによって精製することができる。Ｒｕｐｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：１７５−１７９（１９９３）に記載のように、組換えウイルス感染Ｓｆ９細胞から上清を回収する。総容積５ｍＬのＮｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎから市販されている）を調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬのローディング緩衝液で平衡化する。濾過した細胞抽出物を、０．５ｍＬ／分でカラムにロードする。カラムをローディング緩衝液でベースラインＡ２８０まで洗浄し、その時点で画分回収を開始する。次に、カラムを二次洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸塩；３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール（ｐＨ６．０））で洗浄し、非特異的結合タンパク質を溶離する。Ａ２８０ベースラインに再度到達した後、カラムを、二次洗浄緩衝液を含む０〜５００ｍＭイミダゾール勾配を使用して展開する。１ｍＬの画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色またはアルカリホスファターゼ抱合Ｎｉ２＋−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用したウェスタンブロットによって分析する。溶離したＨｉｓ１０タグ化ＨＡポリペプチドを含む画分をプールし、ローディング緩衝液に対して透析する。
【０１６３】
あるいは、ＩｇＧタグ化（またはＦｃタグ化）ＨＡポリペプチドの精製を、公知のクロマトグラフィ技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラムクロマトグラフィが含まれる）を使用して行うことができる。
【０１６４】
Ｓｆ９細胞の代替物として、ＨＡタンパク質を、他の組換え宿主細胞、原核生物、酵母、または高等真核細胞中で産生することもできる。適切な原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物などの真正細菌（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびＳｈｉｇｅｌｌａなど）、ならびにＢａｃｉｌｌｉ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０号に開示のＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ）など）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなど）、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない。種々のＥ．ｃｏｌｉ株（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＭＭ２９４株（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）；およびＫ５  ７７２（ＡＴＣＣ  ５３，６３５）など）を公的に利用可能である。
【０１６５】
原核生物に加えて、真核微生物（糸状菌または酵母など）は、ＨＡポリペプチドをコードする核酸を含むベクターの適切なクローニング宿主または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般的に使用されている下等真核宿主微生物である。しかし、多数の他の属、種、および株（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：１４０（１９８１）；１９８５年５月２日公開の欧州特許第１３９，３８３号）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５（１９９１））（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７３７（１９８３））、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：１３５（１９９０））、Ｋ  ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなど）；ｙａｒｒｏｗｉａ（欧州特許第４０２，２２６号）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許第１８３，０７０号；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２６５−２７８（１９８８））；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（欧州特許第２４４，２３４号）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：５２５９−５２６３（１９７９））；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（１９９０年１０月３１日公開の欧州特許第３９４，５３８号）など）；および糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（１９９１年１月１０日公開のＷＯ９１／００３５７号）など）、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓなど（Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２：２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ  ２６：２０５−２２１（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４（１９８４））およびＡ．ｎｉｇｅｒ（ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５−４７９（１９８５））など）など）を本明細書中一般的に利用可能であり、且つ有用である。メチロトロープ酵母が本明細書中で適切であり、メタノール中で成長することができる酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる属から選択される）が含まれるが、これらに限定されない。この酵母クラスの例である特定の種のリストを、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ、Ｔｈｅ  Ｂｉ��ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ  ２６９（１９８２）中に見出すことができる。
【０１６６】
ＨＡタンパク質発現に適切な宿主細胞には、多細胞生物細胞が含まれる。無脊椎動物細胞の例には、上記昆虫細胞（ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９など）および植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＣＯＳ細胞が含まれる。より具体的な例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（ＨＥＫ２９３または懸濁培養での成長についてサブクローン化されたＨＥＫ２９３細胞（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；およびマウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）が含まれる。適切な宿主細胞の選択は、当業者の範囲内と見なされる。
【０１６７】
血球凝集素（ＨＡ）タンパク質パニング
ＨＡタンパク質を、マイクロタイターウェルまたは磁性ビーズの表面上に固定して、上記ライブラリーをパニングする。特定の実施形態では、各ライブラリーをＨ５タンパク質に４℃で２時間結合させ、次いで、冷ＰＢＳで強く洗浄し、その後に０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５）を使用してＨＡ特異的結合クローンを溶離する。回収したファージを中性ｐＨにし、感受性宿主Ｅ．ｃｏｌｉの感染によって増幅させる。その後、陽性クローン富化を繰り返すためにファージミド産生を誘導し、その後に選別のためにクローンを単離することができる。十分な富化の際に、全プールを感染によって非アンバー抑制性Ｅ．ｃｏｌｉ株（ＨＢ２１５１など）に導入して可溶性ｓｃＦｖタンパク質を発現させる。あるいは、下記のように、プールを単量体ｓｃＦｖ  発現ベクター（ｐＢＡＤなど）にサブクローン化することができ、組換え可溶性ｓｃＦｖタンパク質をインビトロでの分析および特徴づけのために発現させる。
【０１６８】
特徴づけ
Ｈ５クローンを、上記のように産生したＨ５タンパク質への結合親和性について最初に試験する。特定の例では、２００４年Ｈ５タンパク質（Ｒｅｆｓｅｑ  ＡＡＳ６５６１８、分離株；Ａ／タイ／２（ＳＰ−３３）／２００４（Ｈ５Ｎ１））への結合を試験し、１９９７年Ｈ５タンパク質（Ｒｅｆｓｅｑ  ＡＡＦ７４３３１、分離株；Ａ／ホンコン／４８６／９７（Ｈ５Ｎ１））への結合を並行して試験するが、他の分離株も単独または任意の組み合せで使用することができる。２００４年および１９９７年Ｈ５タンパク質を使用して得た陽性クローンは、以下の２つの広いカテゴリーに分類されるであろう：２００４年の選択性および２００４／１９９７年の非選択性。中和についての典型的な機能試験は、赤血球への全ウイルス結合を使用した血球凝集阻害アッセイを含む。安全性を考慮して、組換えタンパク質および赤血球を使用した代替的な血球凝集アッセイが好ましい。全血の必要性を排除するために、気道上皮細胞に対して血球凝集素結合阻害アッセイを行うことができる。結合アッセイを、任意の形態（任意のフローサイトメトリーまたは細胞ＥＬＩＳＡ（ｃＥＬＩＳＡ）ベースのアッセイが含まれるが、これらに限定されない）で行うことができる。高価なフローサイトメトリー装置を使用する必要がなく、クローン評価がより自動化され、より多数のデータを収集することができるという点で、ｃＥＬＩＳＡの使用は有利である。他方では、フローサイトメトリーは、より優れた感度、一貫性、および速度が可能である。
【０１６９】
Ｈ１クローンを、任意のＨ１タンパク質への結合（現在の２００４年Ｈ１への結合が含まれる）について試験し、並行して、１９１８年および１９７６年タンパク質への結合を試験することができる。陽性クローンは以下の２つの広いカテゴリーに分類されるであろう：２００４年の選択性および２００４年の非選択性。再度、上記と類似の方法を使用して、中和について試験することが重要である。
【０１７０】
他のＨＡタンパク質（Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、およびＨ９など）を、類似の様式で特徴づけることができる。
【０１７１】
１つの態様では、本発明の抗体は、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、もしくはＨ９ＨＡを含有するインフルエンザウイルスまたはＨ１ＨＡを含有するインフルエンザウイルス（例えば、Ｈ１／Ｈ３、Ｈ１／Ｈ５など）に結合親和性を有する。本発明の抗体の結合親和性を、当業者に公知の方法（例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析）によって決定することができる。１つの実施形態では、抗体の結合親和性は、約１×１０−７〜約１×１０−１３Ｍ、約１×１０−８〜約１×１０−１２Ｍ、または約１×１０−９〜約１×１０−１１Ｍである。他の実施形態では、抗体の結合親和性は、約１×１０−７Ｍ、約１×１０−８Ｍ、約１×１０−９Ｍ、約１×１０−１×１０Ｍ、約１×１０−１１Ｍ、約１×１０−１２Ｍ、または約１×１０−１３Ｍである。例えば、本発明の抗体は、Ｈ５ＨＡ（ベトナム／１２０３／０４）を含有するインフルエンザウイルスに対する結合親和性が１３ｐＭであることが証明された（以下の実施例の生存者２由来の抗体を参照のこと）。別の抗体は、Ｈ５ＨＡ（ベトナム／１２０３／０４）を含有するインフルエンザウイルスに対する結合親和性が一桁のｎＭであることが証明された（以下の実施例の生存者５由来の抗体を参照のこと）。
【０１７２】
至適化
インフルエンザエピデミックおよびパンデミック（トリ（Ｈ５）ウイルスに起因するヒト感染に関連する潜在的パンデミックが含まれる）の有効な管理のために、Ｈタンパク質（Ｈ５タンパク質など）の現在の分離株および未来の変異体を有効に中和する抗体が必要である。この目的を達成するために、ターゲティングした血球凝集素亜型の全ての公知の分離株に結合する多様なＨ（例えば、Ｈ５）中和クローンを単離する必要がある。
【０１７３】
必要に応じて、当該分野で公知の方法（例えば、２００５年６月２３日公開の米国特許出願公開第２００５０１３６４２８号（その開示全体が本明細書中で参考として明確に援用される）に記載のルックスルー変異誘発（ＬＴＭ）など）によって交差反応性をさらに改善することができる。
【０１７４】
ルックスルー変異誘発（ＬＴＭ）は、選択したアミノ酸の組み合せ変異を同時に評価および至適化する多次元的な変異誘発法である。本過程は、１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）ドメイン内の正確な分布に注目し、アミノ酸側鎖化学の相乗的な寄与を調査する。ＬＴＭにより、ＣＤＲ内に位置的な一連の単一変異が得られ、これは、各野生型残基が多数の選択されたアミノ酸のうちの１つに体系的に置換されている。変異されたＣＤＲを組み合わせて、全改変体の定量的提示が不可能になることなく複雑さおよびサイズが増加した組み合せ単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ライブラリーを生成する。ポジティブ選択後、性質が改善されたクローンを配列決定し、有利な変異をマッピングする。ＨＡ結合性の改善について相乗的変異を同定するために、全ての有利な置換を発現する組み合せライブラリー（有利な組み合せ変異、ＣＢＭ）を、ポジティブ選択された混合ＤＮＡプローブによって産生し、これらを分析して一連の至適化ｓｃＦｖ候補を同定することができる。Ｆｖおよび他の抗体ライブラリーを使用して同一の様式でこの手順を行うことができる。
【０１７５】
変異誘発を、上記のようにウォークスルー変異誘発（ＷＴＭ）によって行うこともできる。
【０１７６】
１つを超えるインフルエンザＡ型亜型および／または同一亜型の１つを超える分離株との本明細書中の抗体の交差反応性を意図的にデザインするための別の有用な変異誘発法を、本明細書中で「目的」変異誘発と表す。目的変異誘発を使用して、好ましくは反応性の異なる１つまたは複数の抗体クローンに基づいて抗体のコレクションを合理的に操作することができる。本発明の文脈では、目的変異誘発を使用して、類似の配列（抗体の個別のＣＤＲ中の配列など）上の類似の位置によって同定された単一または複数の残基をコードする。この場合、これらの集団を、類似の位置に見出される残基の範囲を捕捉するためのオリゴ縮重を使用して生成する。このコレクション内で、親クローンの特異性の間またはそれを超えて一連の特異性が存在すると予想される。目的変異誘発の目的は、２つ以上の個別の物質またはコレクションの間に多様な多機能抗体コレクションまたはライブラリーを生成することである。インフルエンザの場合、本方法を、２つの異なるエピトープ、分離株、または亜型を認識する２つの抗体を使用し、両機能的質を単一の抗体に変えるために利用ことができる。例として、第１のインフルエンザＡ型抗体はＨ５亜型のベトナム分離株に特異性を示し得、第２の抗体はインフルエンザＡ型ウイルスのＨ５亜型のタイまたはトルコ分離株に特異性を示す。目的変異誘発ライブラリーを作製するために、両抗体についてのＣＤＲ配列を最初に獲得し、アラインメントする。次に、同一性が保存された全ての位置を、適合した残基に単一コドンを使用して固定する。非保存位置で、両残基をコードするために縮重コドンを組み込む。いくつかの例では、縮重コドンは、この位置で２つの親残基のみをコードするであろう。しかし、いくつかの例では、さらなる副産物が産生される。副産物の産生レベルを、副産物産生を強制するように調節するか、サイズの限度または目的に応じてこの産生を排除することができる。
【０１７７】
したがって、例えば、２つの抗体の第１の位置がそれぞれトレオニンおよびアラニンである場合、第１の２つの位置中にＡ／Ｇ−Ｃ−を有する縮重コドンは、第３の位置中の塩基と無関係にトレオニンまたはアラニンのみをコードするであろう。例えば、次の位置の残基がリジンおよびアルギニンである場合、縮重コドンＡ−Ａ／Ｇ−Ａ／Ｇはリジンまたはアルギニンのみをコードするであろう。しかし、縮重コドンＡ／Ｃ−Ａ／Ｇ−Ａ／Ｇ／Ｃ／Ｔを使用した場合、アスパラギン、ヒスチジン、グルタミン、およびセリン副産物が同様に生成されるであろう。
【０１７８】
便宜上、適合したＣＤＲ長を有する抗体のみを使用することがより簡潔である。これを強制するための１つの方法は、最初に発見された抗体によって与えられたＣＤＲの長さおよび潜在的なさらなるフレームワーク制限に基づいて、第２の抗原についてサイズが制限されたライブラリーをスクリーニングすることである。しかし、同じ長さのＣＤＲの使用は単に便利であるが、必用条件ではないことを付け加えておく。この方法がインフルエンザＡ型ウイルスの中和抗体の機能的に多様な巨大ライブラリーを作製するのに有用である一方で、その適用性は遥かにより広いことが明白である。この変異誘発技術を使用して、任意の抗体の機能的に多様なライブラリーまたはコレクションを産生することができる（２００８年１月１７日公開の米国特許出願公開第２００８００１４２０５号（その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。したがって、図５は、変異誘発された親配列としてＴＮＦ−α抗体およびＣＤ１１ａ抗体のＣＤＲを使用した目的変異誘発法の使用を例示するために本明細書中に含まれる。
【０１７９】
他の例示的な変異誘発法には、標的化ランダム変異誘発、飽和変異誘発、およびエラー多発性ＰＣＲが含まれる。
【０１８０】
曖昧に合成されたオリゴヌクレオチドを使用した標的化ランダム変異誘発（ＭａｔｔｅｕｃｈｉおよびＨｅｙｎｅｋｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：３１１３−３１２１（１９８３））は、意図するコドンおよび全ての可能なコドンを相互に関して特定の比で指定の位置に生成する技術である。曖昧に合成されたオリゴヌクレオチドにより、指定の場所への非「野生型」塩基（または、コドン）の特異的付加によるヌクレオチド付加の正確さが低下する。これを、典型的には、オリゴヌクレオチド合成機における野生型塩基と非野生型塩基との比の固定および合成時の２つの試薬の混合物の指定によって行う。
【０１８１】
飽和変異誘発（Ｈａｙａｓｈｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：３１０−３１５（１９９４））は、タンパク質中の特定の位置の２０種全てのアミノ酸を置換し、各改変体に対応するクローンを特定の表現型についてアッセイする技術である（米国特許第６，１７１，８２０号、同第６，３５８，７０９号、および同第６，３６１，９７４も参照のこと）。
【０１８２】
エラー多発性ＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５（１９８９）；ＣａｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３（１９９２））は、クローン化した遺伝子にランダム点変異を導入する修正ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術である。得られたＰＣＲ産物をクローン化してランダム変異ライブラリーを産生することができるか、Ｔ７プロモーターが適切なＰＣＲプライマー内に組み込まれる場合に直接転写することができる。
【０１８３】
他の変異誘発技術も当該分野で周知であり、例えば、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｊ．Ｂｒａｍａｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００１に記載されている。
【０１８４】
この場合、主な目的の１つは、現在のＨ５（またはＨ７もしくはＨ９）分離株ならびに将来の変異体を有効に処置するために抗体（または複数の抗体）を操作することである。新規の分離株中の変異を認識することができる寛容を有する抗体を操作するために、種々のＨ５分離株（例えば、最近の２００４年分離株および以前の１９９７年分離株の両方が含まれる）に結合するＨ５中和クローンを同定すべきである。２００４年分離株に対してクローンを選択する場合、より低いレベルで１９９７年分離株に結合／中和すると予想される。この場合、目的は、２００４年分離株結合の改善（または少なくとも維持）という状況において１９９７年の認識を劇的に改善することである。したがって、１９９７年の基準タンパク質の改善のために最初に選択し、その後に２００４年タンパク質を選択する。それにより、新規の株に対してより高い選択圧が得られる一方で、第２のパラメーターに対する選択圧が維持される。
【０１８５】
至適化は、上記で考察した任意のライブラリーまたは当該分野で公知の任意の他のライブラリー型の単独または任意の組み合せに基づき得る。特定の実施形態では、至適化は、３つのＬＴＭライブラリー型（三重変異誘発軽鎖ライブラリー、三重変異誘発重鎖ライブラリー、および六重変異誘発（軽鎖＋重鎖）ライブラリー）のスクリーニングによって開始することができる。少し修正することが望ましいかもしれないが、本質的に上記のようにＨ５をパニングする。例えば、グリシン−ＨＣｌ溶離の前に、以下の方法のいずれかまたは両方によって各ラウンドでの洗浄ストリンジェンシーを増加させることによって改善された結合について選択することができる：室温または３７℃での広範な洗浄または過剰量の可溶性親ｓｃＦｖの存在下での長期間のインキュベーション。これらの選択の修正により、得られたクローンのオフレート動態が改善されるはずである。３〜４ラウンドの選択後、ランダムクローンを配列決定し、ＥＬＩＳＡによって結合について試験する。改善されたクローンの配列分析後、全ての許容可能に改善された変異体を有用変異誘発（ＣＢＭ）ライブラリーと組み合わせて、両亜型Ｈ５分離株分離株の結合の相乗的改善について選択する。ＣＢＭライブラリーを、全ての位置の全ての改善された残基および元の親残基を示すための縮重オリゴヌクレオチドを合成することによって作製する。得られたライブラリーを、ＬＴＭスクリーニングに類似の増加したストリンジェンシー下で選択する。十分な選択後、プールをｐＢＡＤ発現ベクターにサブクローン化して、上記の結合および中和アッセイのためにＥ．ｃｏｌｉ由来の単量体ｓｃＦｖタンパク質を発現および精製する。
【０１８６】
Ｈ１中和抗体を類似の様式で至適化することができる。この場合、出発点または目的のいずれかとして１９１８年、１９７６年、および現在由来の任意の基準タンパク質配列を使用して、選択および至適化することができる。
【０１８７】
さらに、中和抗体クローンを使用して、型間認識を試験する。型間認識の例は、Ｈ５起源のクローンまたは至適化クローン由来の同時または操作されたＨ１結合である。
【０１８８】
抗体ライブラリー（種々のドナーに由来し、ウイルス（インフルエンザウイルスが含まれるが、これらに限定されない）亜型の異なる分離株に対する反応性によって特徴づけられるライブラリーなど）の取り扱いを、種々の抗体集団を区別する固有のバーコードを適用することによって非常に容易にすることができる。バーコードが標識したクローンと共に増殖することができるようにバーコードを選択することが好ましい。
【０１８９】
したがって、バーコードは、配列決定ＰＣＲプライマーまたは特異的なＰＣＲプライマーによってデコンボリューションすることができる約１〜２４非コードヌクレオチド長の非コードＤＮＡ配列であり得る。この方法で、核酸のコレクション（抗体レパートリーなど）を、クローニング工程で連結することができる。
【０１９０】
別の例では、バーコードは、サイレント変異のコード配列である。ライブラリーが断続性のパリンドローム（ｐａｌｉｄｒｏｍｅ）（例えば、Ｓｆｉ  ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ）を認識する制限酵素を利用する場合、種々のクローン集団（抗体ライブラリーなど）を区別するために「Ｎ」の代わりに異なるヌクレオチドを組み込むことができる。このバーコードアプローチは、増幅工程でレパートリーを連結するという利点を有する。
【０１９１】
異なる例では、バーコードは、ファージ粒子に融合した免疫学的に異なるペプチド配列またはタンパク質配列をコードするコード配列である。例には、例えば、ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、ｐＶＩＩ、またはｐＩＸファージとのエピトープ（例えば、Ｍｙｃ、ＨＡ、ＦＬＡＧ）融合物が含まれる。エピトープを単一または種々の組み合せで使用することができ、シス配列（ライブラリーコードプラスミド上）またはトランス配列（特異的に修飾したヘルパーファージ）配置で提供することができる。
【０１９２】
可能なバーコードの他の例には、ハプテンまたは蛍光発色団を有する化学的および酵素的ファージ修飾物（ファージライブラリー用）が含まれるが、これらに限定されない。かかるタグは、単一ラウンドの選択に好ましい。
【０１９３】
抗体ライブラリーを区別するためのバーコーディングを本明細書中に例示しているが、当業者は、一般に、記載のアプローチは固有に標識および識別される核酸分子および核酸分子集団に広く適用可能であると認識するであろう。
【０１９４】
中和抗体のエピトープマッピング
一旦所望の性質を有する中和抗体が同定されると、かかる抗体の大部分によって認識される優性のエピトープを同定することが望ましいかもしれない。エピトープのマッピング方法は当該分野で周知であり、例えば、Ｍｏｒｒｉｓ、Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６；およびＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＷｅｓｔｗｏｏｄおよびＨａｙ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１に開示されている。
【０１９５】
エピトープマッピングは、抗体が結合するエピトープの同定に関する。タンパク質上のエピトープの位置を決定するための当業者に公知の方法が多数存在する（抗体−抗原複合体の結晶学的分析、競合アッセイ、遺伝子フラグメント発現アッセイ、および合成ペプチドベースのアッセイが含まれる）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  およびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、１９９９の第１１節；米国特許第７，３３２，５７９号（それぞれ、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。２つの抗体が同一のエピトープまたは立体的に重複するエピトープを認識する場合に、抗体は基準抗体と「本質的に同一のエピトープ」に結合する。同一または立体的に重複するエピトープに２つの抗体が結合するかどうかを決定するための一般的に使用されている方法は競合アッセイであり、このアッセイを、標識した抗原または標識した抗体のいずれかを使用して全ての異なる形式で形成することができる。通常、抗原を９６ウェルプレート上に固定し、非標識抗体が標識抗体の結合を遮断する能力を、放射性標識または酵素標識を使用して測定する。
【０１９６】
中和抗体の産生
一旦所望の中和特性を有する抗体が同定されると、かかる抗体（抗体フラグメントが含まれる）を、当該分野で周知の方法（例えば、ハイブリドーマ技術または組換えＤＮＡテクノロジーが含まれる）によって産生することができる。
【０１９７】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物（ハムスターなど）を免疫化して、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか産生することができるリンパ球を惹起する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、適切な融合剤（ポリエチレングリコールなど）を使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。
【０１９８】
このようにして調製したハイブリドーマ細胞を、適切な培養培地中に播種し、成長させる。この培地は、非融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含むことが好ましい。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（これらの物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害する）を含むであろう（ＨＡＴ培地）。
【０１９９】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性を示す骨髄腫細胞である。これらの細胞株のうち、好ましい骨髄腫細胞株はマウス骨髄腫株（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡから利用可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来の細胞株およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ  ＵＳＡから利用可能なＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞など）である。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７））。
【０２００】
ハイブリドーマ細胞が成長する培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）によって決定する。
【０２０１】
組換えモノクローナル抗体を、例えば、必要な抗体鎖をコードするＤＮＡの単離、周知の組換え発現ベクターを使用した組換え宿主細胞と同時発現用のコード配列との同時トランスフェクションによって産生することができる。組換え宿主細胞は、原核細胞および真核細胞（上記の細胞など）であり得る。
【０２０２】
ヒト化抗体の作製で使用すべきヒト可変ドメイン（重鎖および軽鎖の両方）の選択は、抗原性の減少に非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、げっ歯類抗体の可変ドメイン配列を、公知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、げっ歯類配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）として許容する（Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７））。抗体を抗原に対する高親和性および他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目的を達成するために、好ましい方法にしたがって、ヒト化抗体を、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用した親配列および種々の概念ヒト化産物の分析過程によって調製する。
【０２０３】
さらに、当該分野で公知の方法にしたがってヒト抗体を生成することができる。例えば、免疫化の際に内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３（１９９３）；および米国特許第５，５９１，６６９号、同第５，５８９，３６９号、および同第５，５４５，８０７号を参照のこと。
【０２０４】
中和抗体
本明細書中に記載の技術（以下の実施例に記載の技術が含まれる）の使用によって多数の中和抗体が同定されている。１つの態様では、本発明は、血球凝集素タンパク質エピトープに結合する中和抗体を提供する。１つの実施形態では、中和抗体は、血球凝集素タンパク質のＨＡ１サブユニット上の少なくとも１つのエピトープに結合する。別の実施形態では、中和抗体は、血球凝集素タンパク質のＨＡ１サブユニット上の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのエピトープに結合する。好ましい実施形態では、本発明の中和抗体は、（ｉ）配列番号４として示した重鎖アミノ酸配列および配列番号７１として示した軽鎖アミノ酸配列を含む抗体（以下の実施例中および表１に示した抗体１）；（ｉｉ）配列番号４５として示した重鎖アミノ酸配列および配列番号１４０として示した軽鎖アミノ酸配列を含む抗体（以下の実施例中および表１に示した抗体２）；（ｉｉｉ）配列番号９として示した重鎖アミノ酸配列および配列番号８１として示した軽鎖アミノ酸配列を含む抗体（以下の実施例中および表１に示した抗体３）；（ｉｖ）配列番号６１として示した重鎖アミノ酸配列および配列番号１５８として示した軽鎖アミノ酸配列を含む抗体（以下の実施例中および表１に示した抗体４）；または（ｖ）配列番号６１として示した重鎖アミノ酸配列および配列番号１５９として示した軽鎖アミノ酸配列を含む抗体（表１中の抗体５）；（ｖｉ）配列番号６１として示した重鎖アミノ酸配列および配列番号１６０として示した軽鎖アミノ酸配列を含む抗体（表１中の抗体６）のエピトープと本質的に同一のエピトープに結合する。これを、以下の表１にまとめる。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ｈ５および／またはＨ１を含むウイルスを中和する。他の実施形態では、抗体はＨ５およびＨ１の両方を中和する。１つの実施形態では、本発明の抗体は血球凝集を阻害しない。他の実施形態では、抗体は、感染すべき標的細胞へのインフルエンザＡ型ウイルスの結合を阻害しない。別の実施形態では、抗血球凝集素抗体は、インフルエンザＡ型ウイルスのＨＡの球状頭部上の受容体結合部位が標的細胞に付着してＨＡの血球凝集素活性が生じるのを阻害しない。
【０２０６】
【表１】
2011516423.tif 000002
以下の実施例に記載の実験に基づいて、多数のＨ５抗血球凝集素抗体の重鎖／軽鎖対合を同定した。表２に示すように、カラム１は重鎖アミノ酸配列を示す。カラム２は重鎖配列に対応する配列番号を示す。カラム３は同行の重鎖と対合する軽鎖のアミノ酸配列を示す。カラム４は軽鎖配列に対応する配列番号を示す。例えば、配列番号１として示した重鎖配列は配列番号６８として示した軽鎖配列と対合し、配列番号２は配列番号６９と対合するなど。いくつかの実施形態では、重鎖は１つを超える軽鎖と対合することができる。例えば、配列番号６として示した重鎖配列は配列番号７４として示した軽鎖配列または配列番号７５として示した軽鎖配列のいずれかと対合するか、配列番号７として示した重鎖配列は、（ｉ）配列番号７５として示した軽鎖配列、（ｉｉ）配列番号７６として示した軽鎖配列、または（ｉｉｉ）配列番号７７として示した軽鎖配列のうちの１つと対合する。
【０２０７】
１つの実施形態では、本発明の中和抗体は、表２に示したアミノ酸配列を含む少なくとも１つの重鎖ポリペプチドおよび／または表２に示したアミノ酸配列を含む少なくとも１つの軽鎖ポリペプチドを含む。
【０２０８】
【表２−１】
2011516423.tif 000003
【０２０９】
【表２−２】
2011516423.tif 000004
【０２１０】
【表２−３】
2011516423.tif 000005
【０２１１】
【表２−４】
2011516423.tif 000006
【０２１２】
【表２−５】
2011516423.tif 000007
【０２１３】
【表２−６】
2011516423.tif 000008
【０２１４】
【表２−７】
2011516423.tif 000009
【０２１５】
【表２−８】
2011516423.tif 000010
【０２１６】
【表２−９】
2011516423.tif 000011
【０２１７】
【表２−１０】
2011516423.tif 000012
【０２１８】
【表２−１１】
2011516423.tif 000013
【０２１９】
【表２−１２】
2011516423.tif 000014
【０２２０】
【表２−１３】
2011516423.tif 000015
【０２２１】
【表２−１４】
2011516423.tif 000016
【０２２２】
【表２−１５】
2011516423.tif 000017
【０２２３】
【表２−１６】
2011516423.tif 000018
【０２２４】
【表２−１７】
2011516423.tif 000019
【０２２５】
【表２−１８】
2011516423.tif 000020
中和抗体の使用
本発明のインフルエンザ中和抗体を、インフルエンザＡ型感染の防止および／または治療のために使用することができる。治療に適用するために、抗体または抗体ベースの輸送配列によってその送達が容易になった抗体または他の分子を、通常、薬学的組成物の形態で使用する。技術および処方を、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９９０）に見出すことができる。ＷａｎｇおよびＨａｎｓｏｎ  “Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ”、  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｎｏ．１０、補足４２−２Ｓ（１９８８）も参照のこと。
【０２２６】
抗体は、典型的には、凍結感想処方物または水溶液の形態で処方する。許容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに無毒であり、これらには、緩衝液（リン酸、クエン酸、および他の有機酸の緩衝液など）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンが含まれる）；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（メチルパラベンまたはプロピルパラベンなど）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなど）；モノサッカリド、ジサッカリド、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンが含まれる）；キレート剤（ＥＤＴＡなど）；糖（スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなど）；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）が含まれる。
【０２２７】
抗体を、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−メチルメタクリラート）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中に捕捉することもできる。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出に開示されている。
【０２２８】
本明細書中に開示の中和抗体を、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を含むリポソームを、当該分野で公知の方法（Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；  Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ    Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号；および１９９７年１０月２３日公開のＷＯ９７／３８７３１号に記載の方法など）によって調製する。循環期間が増加したリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０２２９】
特に有用なリポソームを、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ由来ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を使用した逆相蒸発法によって生成する。リポソームを、規定の孔サイズのフィルターを介して押出して所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントを、ジスルフィド鎖間反応によってＭａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載のリポソームに抱合することができる。化学療法薬を任意選択的にリポソーム内に含める。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０２３０】
疾患の防止または処置のために、抗体の適切な投薬量は、処置すべき感染の型、疾患の重症度および経過、ならびに抗体投与が防止または治療のいずれを目的とするかに依存するであろう。抗体を、１回または一連の処置にわたって患者に適切に投与する。疾患の型および重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの抗体は、例えば、１回または複数回の個別の投与または連続注入のいずれかでの抗体への投与のための典型的な最初の候補投薬量である。
【０２３１】
本発明の中和抗体を、インフルエンザＡ型ウイルスの抗原決定基のエピトープマッピングのためのツールとしてさらに使用することができ、これはワクチン開発で有用である。実際、以下の実施例に示すように、本発明者らは、ワクチンデザインにガイドとして使用することができるいくつかの広範に反応性を示す中和抗体を同定した。
【０２３２】
したがって、本発明の中和抗体を使用して、抗体が結合する中和エピトープを機能的に模倣するペプチドまたはポリペプチドを選択することができ、それにより、インフルエンザＡ型ウイルス感染のワクチンを開発することができる。１つの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載の抗体に結合した中和エピトープを機能的に模倣するペプチドまたはポリペプチドを含む、インフルエンザＡ型ウイルスに有効なワクチンを提供する。１つの実施形態では、ワクチンは、血球凝集素（ＨＡ）抗原に結合する抗体に結合した中和エピトープを機能的に模倣するペプチドまたはポリペプチドを含む。別の実施形態では、ワクチンは合成ワクチンであり得る。他の実施形態では、ワクチンは、（ｉ）弱毒化インフルエンザＡ型ウイルスまたはその一部、または（ｉｉ）死滅させたインフルエンザＡ型ウイルスまたはその一部を含むことができる。１つの他の実施形態では、ワクチンは、血球凝集素（ＨＡ）抗原に結合する抗体に結合した中和エピトープを機能的に模倣するペプチドまたはポリペプチドを含む。ＨＡ抗原はＨ５亜型またはＨ１亜型であり得る。別の実施形態では、ＨＡ抗原は、インフルエンザＡ型ウイルスの表面上に提示される。
【０２３３】
別の実施形態では、ワクチンのペプチドまたはポリペプチドは、インフルエンザＡ型ウイルス中和抗体を惹起する抗原決定基を含む。
【０２３４】
より一般的な態様では、中和分子（抗体が含まれるが、これらに限定されない）は、ウイルス感染の防止または処置に有用である。したがって、本発明の中和分子は、免疫療法（１つまたは複数のかかる分子を使用した受動免疫化など）およびウイルス抗原標的に指向するワクチンの開発の両方で有用である。
【０２３５】
中和機能に重要な残基の同定
本発明の有意な態様では、中和特性に重要な抗体残基クラスターを同定した。特に、Ｋａｂａｔアミノ酸ナンバリングに従ってアミノ酸５２Ａ位、５３位、７３位、および７４位と決定される、表面に露出したクラスター中に少なくとも１つの置換を含む抗体重鎖可変ドメインを含む抗体は、優れた中和特性（インフルエンザウイルスの中和が含まれるが、これらに限定されない）を有することが見出されている。特に、以下の変異：５２Ａ（Ｐｒｏ→Ｇｌｙ）、５３（Ｉｌｅ→Ｍｅｔ）、７３（Ｌｙｓ→Ｇｌｕ）、および７４（Ｓｅｒ→ＬｅｕまたはＭｅｔ）は、生殖系列化学と比較して、４つの重鎖可変ドメインの露呈表面上に顕著に強固なクラスターを作製し、これらのクラスターがタンパク質表面から顕著に突出した隆起を形成することが見出された。中和特性に重要なさらなる変異（５７（Ａｌａ→Ｔｈｒ））は、ＣＤＲ２ループの底部に部分的に埋もれている。ＣＤＲ２およびフレームワーク３の表面露呈の変化は、抗原結合において直接的な役割を有すると考えられ、５７位でのあまり露呈していない変異およびいくつかのさらなる変異はＣＤＲ２ループの安定化および／または位置による間接的な影響を及ぼす可能性がある。かかるさらなる変異には、ＣＤＲ１の３４位（Ｉｌｅ→Ｖａｌ）および３５位（Ｓｅｒ→Ｔｈｒ）での保存的変化が含まれ、ＣＤＲ２の５０位（Ｇｌｙ→Ａｌａ）での変化も含まれる。これらの変異は、ウイルス中和特性（インフルエンザＡ型ウイルス（Ｈ５ＨＡなど）およびＨＩＶウイルスの中和が含まれるが、これらに限定されない）に広く重要であると考えられる。
【０２３６】
これらの結果は、本明細書中に開示され、且つ特許請求の範囲に記載のように、中和の免疫化学的根拠の理解だけでなく、広範且つ改良されたウイルス中和特性を有する抗体および抗体様分子のデザインにも非常に有益である。
【０２３７】
本明細書中に開示の中和特性に重要または有利な残基についての情報を使用した改良された性質を有するワクチンの開発および中和抗体の開発は、２００８年７月２４日公開のＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００８／０８９０７３号に記載の高次構造が制限されたポリペプチド配列の組み合せライブラリーからさらに恩恵を受けることができる。
【０２３８】
中和特性を有する非抗体分子
前述で本発明は抗体ライブラリーを参照して例示されているが、他の非抗体分子（サロボディなど）のライブラリーを、類似の様式で調製し、使用し、至適化することができる。したがって、プレＢ細胞受容体（ｐｒｅ−ＢＣＲ）に基づいた固有の組み合せタンパク質ライブラリー（「サロボディライブラリー」）の構築は、Ｘｕら、２００８、前出に記載されている。前に考察のように、ｐｒｅ−ＢＣＲは、抗体レパートリーの通常の作製中に産生されるタンパク質である。基準抗体と異なり、ｐｒｅ−ＢＣＲサブユニットは、２つの代替軽鎖（ＳＬＣ）成分と対合した抗体重鎖から構成される三量体である。多様な重鎖が固定ＳＬＣと対合するこれらのｐｒｅ−ＢＣＲタンパク質に基づいた組み合せライブラリーを、哺乳動物系、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ系、およびファージミド系で発現させた。これらのライブラリーは、標的抗原に対してナノモルの親和性を有するメンバーを含む。ライブラリーの構築、選択的富化、およびライブラリーメンバーの生物物理学的特徴づけの説明は、Ｘｕらの論文の材料と方法の項に詳述されている。
【０２３９】
本発明のさらなる詳細を、以下の非限定的な実施例によって例示する。
【実施例】
【０２４０】
実施例１−以前に大流行したトリインフルエンザの生存者由来の抗体ライブラリーおよび中和抗体の調製
トリ集団におけるＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスの広範な発生は、ヒトの健康に危険を及ぼす。このウイルスは依然としてヒト間の容易な伝染に適合していないが、このウイルスは重症疾患を引き起こし、しばしば死に至らしめ得る。ここに、本発明者らは、トルコにおける最近のＨ５Ｎ１トリインフルエンザ大流行の５人の生存者の骨髄からの組み合せ抗体ライブラリーの生成を報告する。現在まで、これらのライブラリーは、Ｈ５Ｎ１ウイルス抗原の固有の抗体を３００種を超えて生成してきた。これらの抗体のうち、本発明者らは、Ｈ５Ｎ１ウイルスの受動免疫化またはワクチンデザインのガイダンスとして使用することができるいくつかの広範に反応性を示す中和抗体を同定している。これらの生存者から得た多数の抗体により、実際の病原性のあるインフルエンザ大流行の状況におけるウイルス中和に対する個別のヒトの解決法を免疫化学的に詳細に分析する。顕著には、これらの抗体のうちの２つがＨ１およびＨ５亜型インフルエンザウイルスを共に中和させた。
【０２４１】
新規に出現した高病原性インフルエンザウイルス株は、ヒトに対する深刻な脅威である。インフルエンザパンデミックが過去１００年間に３回起こっており、それぞれ壊滅的な結果をもたらした（Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ．およびＳｈａｗ，Ｍ．Ｌ．、Ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１１巻、（Ｋｎｉｐｅ，ＤＭおよびＨｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．編）Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，２００６、１６４８−１６８９））。最近のＨ５Ｎ１ウイルス株の出現は、現在は主にトリ宿主に限定されているが、ヒトにおける毒性が既に証明されており、２００人超が死亡している（（２００８）（世界保健機関（ＷＨＯ）、Ｇｅｎｅｖａ））。したがって、ヘルスケアに携わる職員，研究者、および政府は、パンデミックになることを非常に懸念している。１つの広く認められたアプローチは、疾患の防止またはウイルス曝露後の治療のいずれかのための受動的抗体の使用に関する（Ｌｕｋｅ，Ｔ．Ｃ．ら、（２００６）Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １４５、５９９−６０９）。インフルエンザに対する受動免疫化の可能性は、ほぼ１世紀まえのスペインインフルエンザから明らかであり、血液、血清、および血液製剤の輸液の利点により、死亡率のリスクが５０％を超えて減少していた（同文献）。最近、回復期患者の血漿での治療の利点もＨ５Ｎ１インフルエンザの症例で報告されている（Ｋｏｎｇ  ＬＫおよびＺｈｏｕ  ＢＰ（２００６）Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ  Ｍｅｄ  Ｊ  １２、４８９；Ｚｈｏｕ，Ｂ．ら、（２００７）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５７、１４５０−１４５１）。さらに、ヒトおよびマウスのモノクローナル抗体での受動免疫化がＨ５Ｎ１感染後に投与した場合でさえも動物を死亡から防御したことが報告されている（Ｈａｎｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．ら、（２００６）Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ  ７、１２６））。
【０２４２】
受動療法のための最も論理的なヒト抗体供給源は、感染症を生き延びた患者であろう。現代の組み合せ抗体ライブラリーテクノロジーを使用して、現在、感染に対する個体の応答の全ての免疫学的歴史を得ることが可能である（Ｌａｗ，Ｍ．ら、（２００７）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．Ｊａｎ；１４（１）：２５−７．２００７年１２月６日付け電子公開；Ｌｅｒｎｅｒ  ＲＡ（２００６）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４５，８１０６−８１２５）。抗体ライブラリーが病原体に対する個体の応答の完全な記録を含むので、選択的富化の実験過程の使用によって所与の作用因子に特異的なレパートリーを回収することができる。かかるライブラリーは、感染中に作製された抗体の性質に関するアーカイブ情報を与え、潜在的に治療的なヒトモノクローナル抗体を回収可能である。重要には、抗体回収は、サンプルを採取する時点で能動的な抗体応答が依然として起こっているかどうかと無関係である。したがって、ライブラリーが構築される場合に応じて、その時点で作製され、そして／または個体の免疫学的歴史の一部である抗体を得ることができる。致死性であり得る感染のために、生存患者に対して行った，かかる分析は特に重要であり得る。なぜなら、この分析により、大流行の実際の臨床背景での首尾のよい宿主防御中に使用したいくつかの免疫学的機構が図示されるからである。
【０２４３】
典型的には、ウイルス感染した個体からライブラリーを調製する場合、数百から数千の異なる抗体が得られる。これは他の方法を使用した場合に数種の抗体しか得られないのと対照的である（Ｌｅｒｎｅｒ  ＲＡ（２００６）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４５，８１０６−８１２５）。これはいくつかの結果を有する。これらの抗体の比較配列分析により、抗体結合化学の詳細なマップが得られる。同様に、中和抗体と非中和抗体との比較により、中和に重要な結合相互作用性に関する重要な情報を得ることができる。
【０２４４】
本発明者らは、ここに、確認された大流行中にトリインフルエンザウイルス感染の生存者から作製した第１の包括的トリインフルエンザ抗体ライブラリーの作製を記載する。これらのライブラリーを使用して、  Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスに対する多数のモノクローナル抗体を得た。そのいくつかの抗体は、ウイルス亜型にわたって広い反応性および中和性を示す。最終的に、これらの組み合せ抗体ライブラリーは、１つまたは複数のメンバー抗体を使用した免疫療法（受動免疫化など）の鍵を握り得るか、ライブラリー中の中和抗体の抗原標的を使用したワクチン開発をガイドすることができる。
【０２４５】
大流行および材料の供給源。２００５年１２月と２００６年１月の間にトルコでトリインフルエンザＨ５Ｎ１が発生した（Ａ．Ｆ．Ｏｎｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５５、２１７９（Ｎｏｖ  ２３，２００６））。全部で１２人の個体が感染し、８人しか生き残らなかった。骨髄ＲＮＡが個体によって作製された全ての抗体のアーカイブ記録を含むので、原材料としてこれを選択した。回復から約４ヶ月後に６人のトルコ人生存者から骨髄および血清を得、６つの骨髄サンプルのうちの５つから抗体ライブラリーを首尾よく調製した。第６のサンプルにおいて、ＲＮＡが分解された。
【０２４６】
血清学的分析。血球凝集素タンパク質は、感染した細胞へのインフルエンザウイルスの結合に不可欠であり、一般に、中和抗体の主な標的と見なされている（Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ．およびＳｈａｗ，Ｍ．Ｌ．、Ｉｎ  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１１巻（Ｋｎｉｐｅ，ＤＭおよびＨｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．編）Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２００６、１６４８−１６８９）（２００８）（世界保健機関（ＷＨＯ）、Ｇｅｎｅｖａ））。したがって、Ｈ５血球凝集素タンパク質（図８）およびインタクトなウイルス（データ示さず）に対する抗体の検出のために、高血清希釈倍率の各血清サンプルをＥＬＩＳＡによって試験した。この分析により、患者が１０，０００倍に希釈した場合でさえ容易に検出可能な血清抗体を有することが示された。容易に利用可能であり、且つトルコでの疾患の大流行を生じたインフルエンザウイルス株に関連すると考えられるので、ベトナム／１２０３／０４血球凝集素を標的として選択した。
【０２４７】
ライブラリーの構築。本発明者らの主な目的は、感染に対する免疫学的応答の性質を理解し、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス感染の拡大の防止および／または治療のために受動的に使用することができる特異的抗体を同定することであった。偏りが最小であるか全く偏りがない可能なあらゆるＨ５Ｎ１感染の解決法を得ることが望ましい。各免疫グロブリンファミリーの遺伝子発現が等しくなく、遺伝子発現が偏りがちになるか過剰発現するので、免疫グロブリン回収に対して標準的なプールアプローチを使用することを決定した。実際、ライブラリー構築中に２３個の個別に増幅可能な遺伝子ファミリーのうちの２０個を個別にレスキューした。頻繁に使用しないので、残り３つの遺伝子ファミリー（ＶＨ２、５、および６）をプールとして回収した。ファージミド提示ベクターへのクローニングのための各免疫グロブリンファミリーＤＮＡの等モルプールの作製によって遺伝子さらに正規化した。
【０２４８】
各クローンが元の患者供給源にまで遡れるようにファージミドベクターの非破壊部分に固有のＤＮＡバーコードを埋め込んだ（図９）。このバーコーディングにより、複数の生存者由来のファージライブラリーが同時にスクリーニングされた場合でさえ、各患者にクローンを割り当てることが可能である。このタグ化の結果として、任意のライブラリーから単離したあらゆるクローンを、確信をもって同族生存者に帰属させることができる。
【０２４９】
図９に示すように、注釈漬けしたレパートリーのクローニングおよびバーコーディングにより、全てのクローンがその供給源に遡ることが可能である。各生存者を固有のバーコードベクターに割り当て、免疫グロブリンレパートリーを、上のパネルに示した制限部位を介してクローン化する。任意のクローン由来のプラスミドを、その軽鎖クラスおよびその生存者バーコードを介して指定したサブライブラリーに割り当てることができる。
【０２５０】
そのコーディング系を有するこのベクターを使用して、単鎖（ｓｃＦｖ）およびＦａｂファージミド形式で６人の生存者のうちの５人の骨髄からレパートリーを首尾よくクローン化した。各生存者由来の各集団は、１．０×１０８メンバーを超える多様性を有する。さらに、混合した生存者の軽鎖および重鎖から構成されるさらなるバーコード化ライブラリーを１．１×１０９の最終多様性で作製した。まとめると、５ドナーの特異的集団および全ドナー由来のプールライブラリーの全多様性は、ｓｃＦｖ集団としては１．０×１０９であり、Ｆａｂ提示集団としては４．２×１０９である（表３）。
【０２５１】
表３は、ｓｃＦｖ形式およびＦａｂ形式の両方における軽鎖および全ライブラリーの全形質転換体を示す。全ライブラリーによって示される全多様性は５．６×１０９である。
【０２５２】
【表３】
2011516423.tif 000021
結合抗体の選択。上記のように、これらの研究の１つの興味深い特徴は、感染を引き起こすウイルス株および抗原に関連するが異なるウイルス株および抗原への結合のための抗体を最初に選択することであった。これは、患者由来のウイルス分離株が利用できないからであった。より広範に中和する抗体を単離することができたかもしれないので、抗体選択のための関連株使用の必要性は偶然に証明できたのかもしれない（以下を参照のこと）。
【０２５３】
ライブラリーを、ベトナム／１２０３／０４ウイルスのＨＡおよびＮＡタンパク質および組換え精製血球凝集素を含む不活化ウイルスに対してパニングした（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．ら、（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ））。典型的には、３〜４ラウンドのファージパニング後、富化ファージプール由来の各クローンを、ＥＬＩＳＡによってＨ５Ｎ１ウイルスまたは精製血球凝集素に対して分析し、陽性クローンを配列決定してその重鎖および軽鎖配列を決定し、その生存者バーコードを読み取った（Ｄ．Ｗ．Ｃｏｏｍｂｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７８、１３３（２００２））。これらの研究から、生存者由来の５つ全ての各ライブラリー由来の特異的Ｈ５血球凝集素結合クローンを単離した。合計で、今までのところ、３００００を超える異なる抗ウイルス抗体を回収しており、そのうちの１４６種がＨ５血球凝集素タンパク質に特異的に結合する。
【０２５４】
選択クローンの一般的特徴。全体的に見て、各患者は重鎖および軽鎖の両方について異なる生殖系列を使用し、このことは、各患者が同一の潜在的に致死性の免疫学的攻撃に対して異なる解決策を見出していることを示す。得られたレパートリーの質に関して信頼性を与え、且つ抗体結合および／または中和の化学に関する情報を得るために使用することができる組み合わせ抗体ライブラリーの主な特徴がこれらのクローンに認められる。これらのクローンは、親和性成熟の天然の進行および選択された合成抗体ライブラリーで見出される抗原結合に対する前述の反復クローン（「ジャックポットソリューション」）の全ての特徴を含む（Ｌｅｒｎｅｒ、Ｒ．Ａ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４５、８１０６（２００６年１２月１１日）；Ａ．Ｒａｊｐａｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０２、８４６６（２００５年６月１４日））。これらの巨大集団中の「ジャックポット」の存在により、スクリーニング手順が確認される。これは、活性に基づいてファージを選択しない限り、同一クローンを複数回得られる機会は極めてありそうにないからである。さらに、群内の重鎖の相違を分析する場合、多数のアミノ酸置換が化学的および構造的な保存性を示すことが認められた（表１）。繰り返しクローンと同様に、化学的に合理的な複数のアミノ酸置換の出現は、無作為事象である可能性が低い。
【０２５５】
回収した抗体の結合特異性。Ｈ５ベトナム血球凝集素タンパク質へのＢｉｏ−Ｌａｙｅｒインターフェロメトリー結合を使用したＦａｂ組の最初の試験により、少なくとも４つの異なるエピトープが同定されたことが示された（データ示さず）。完全なＩｇＧ１タンパク質への変換のために２つの異なるエピトープを認識する３人の生存者から６つのクローンを選択した。これらの抗体のうちの３つの結合を、ウェスタンブロット分析によって血球凝集素タンパク質のＨＡ１サブユニットにマッピングした（データ示さず）。
【０２５６】
これらの研究の１つの目的は、多岐にわたるウイルス株を広範に中和する稀な抗体を回収することであった。ドナー由来の血清が感染したウイルスを超えて拡大したＨ５Ｎ１ウイルスの多様なサブファミリーに対して高力価の抗体を有していたため、本発明者らのいくつかの抗体は広範に反応性を示し得ることが示唆された。各抗体レベルでの交差反応度を決定するために、異なるインフルエンザ血球凝集素抗原への本発明者らのクローンの結合を分析した（図６）。
【０２５７】
図６は、Ｈ１Ｎ１ウイルス由来の血球凝集素を有する２人の生存者由来のＨ５Ｎ１の交差反応性を示す。（Ａ）バーは、Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３／０４（ダークグレイ）、Ｈ５Ｎ１トルコ／６５５９６／０６（白）、Ｈ５Ｎ１インドネシア／５／０５（斜線）、Ｈ１Ｎ１ニューカレドニア／２０／９９（縦縞）、Ｈ１Ｎ１サウスカロライナ／１／１８（斜交平行線）、およびＨ３Ｎ２ウィスコンシン／６７／０５（ライトグレイ）である。（Ｂ）種々のタンパク質におけるバックグラウンドを超えたそのＥＬＩＳＡシグナルによる抗体の相対ランキング（「＋」はバックグラウンドを超え、且つ２倍未満である。「＋＋」はバックグラウンドの２倍と９倍との間である。「＋＋＋」はバックグラウンドの９倍と１５倍との間である。「＋＋＋＋」はバックグラウンドの１５倍超である。「−」は、バックグラウンドを超えない。）。驚くほどのことではないが、これらの抗体は対応する感染性トルコ／６５５９６／０６株由来の血球凝集素を認識し、さらに、選択のために使用したベトナム／１２０３／０４株由来の異種血球凝集素を認識する。さらに、これらは、抗原性に多様なインドネシア／５／０５Ｈ５血球凝集素を認識する。プロトタイプ抗体に対して動態学的結合分析を行い、生存者５由来の抗体が１桁ナノモルの親和性でベトナム／１２０３／０４血球凝集素に結合した一方で、生存者２抗体は測定値１３ｐＭの親和性でより強固に結合したことが見出された。Ｈ５およびＨ１に対する利用可能な結合親和性および抗体のＦａｂフラグメントのクローンの正体を以下に示す。
【０２５８】
【数１】
2011516423.tif 000022
本発明者らの抗体がさらにより広い反応性を示すかどうかを決定するために、異なるインフルエンザＡ型亜型由来のより巨大な血球凝集素集団への結合を研究した（図６）。４つのプロトタイプ抗体が密接に関連するＨ１Ｎ１亜型の現在の基準株であるニューカレドニア／２０／９９由来の血球凝集素に結合したことが見出された。特に、生存者５に属する３つの中和抗体も、１９１８年のスペイン風邪パンデミック中に出現したＨ１Ｎ１サウスカロライナ／１／１８分離株由来の血球凝集素に結合した。逆に、これら４つの抗体は現在のＨ３Ｎ２ウィスコンシン／６７／０５基準株由来の血球凝集素に結合せず、これは、抗体がインフルエンザ亜型の間で広範な結合を示したにもかかわらず、反応性が全てのインフルエンザ亜型に拡大されなかったことを示した。
【０２５９】
Ｈ１／Ｈ５交差反応性の免疫学的根拠をさらに調査するために、Ｈ１Ｎ１ニューカレドニア／２０／９９血球凝集素タンパク質に対してライブラリーを再スクリーニングした。この選択から、Ｈ５血球凝集素タンパク質をパニングに使用した場合に（表５）以前に生存者５から得た配列に有意に類似するクローンが見出された（表６）。
【０２６０】
中和研究。最初に、抗体を、Ｈ５ＨＡ（ベトナム／１２０３／０４）含有インフルエンザウイルスを中和する能力についてアッセイした。共通エピトープ（エピトープ「Ａ」）を認識した生存者２および３ならびに生存者５由来の１つの抗体は全て中和抗体であったのに対して、第２のエピトープ（エピトープ「Ｂ」）を認識した生存者１由来の２つの抗体は中和抗体でなかった。
【０２６１】
Ｈ５Ｎ１またはＨ１Ｎ１血球凝集素のいずれかに対して生存者５から個別に単離したクローンの顕著な配列同一性に基づいて、その交差反応性が単純な結合を超えて拡大し、Ｈ５Ｎ１ウイルスおよびＨ１Ｎ１ウイルスの両方の非常に稀な中和特性も有すると予想された。ＩｇＧの交差中和活性を試験するために、中和アッセイにおいてＨ５Ｎ１スクリーニング由来の代表的な抗体を試験して、これらの抗体がＨ１Ｎ１ウイルスまたはＨ３Ｎ２ウイルスも中和するかどうかを調査した（表４）。Ｈ１保有ウイルスＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌ／２０／９９およびＨ３保有ウイルスＡ／ホンコン／６８を研究した。Ｈ５亜型血球凝集素を保有するウイルス集団も試験した（Ａ／Ｖｎ／１２０３／０４；Ａ／Ｉｎｄｏ／５／０５；Ａ／トルコ／６５５９６／０６；Ａ／エジプト／０６）。抗体は、Ｈ３亜型インフルエンザに対して活性を示さなかった。しかし、Ｈ５含有ウイルスを中和させた３つのモノクローナル抗体（１〜３）も、Ｈ１亜型由来のＨＡを保有する全てのウイルスを強く中和させた（表４）。
【０２６２】
【表４】
2011516423.tif 000023
表４の結果を以下のように得た。ＭＤＣＫ細胞を、モノクローナル抗体の２倍連続希釈物の存在下で１００  ＴＣＩＤ５０のウイルスとインキュベートした。†−二連のサンプルにおいてウイルスを中和するために必要な最小阻害濃度をｕｇ／ｍｌで示す。‡−２つの独立した実験由来のウイルス中和の結果を共に示す。§−Ｍａｂ♯８は、Ａ／ベトナム／１２０３／０４に対して惹起したマウスモノクローナルＨ５Ｎ１中和抗体である。
【０２６３】
中和の免疫化学的根拠。抗体ライブラリーの１つの利点は、多数の抗体が得られた場合に抗体をその関連性に関して分類することができることである。したがって、集団中の所与の抗体の機能が認められる場合、抗体が属する群の他のメンバーが類似の活性を有すると予想することができる。
【０２６４】
表５は、Ｈ５Ｎ１ベトナムパニング後の生存者５ライブラリーから発見された中和の免疫化学的根拠を示す例示的配列を示す。６１の固有の重鎖配列を、１１４の固有の重鎖と軽鎖との組み合わせ由来のその生殖系列可変領域（可変（Ｖ）領域遺伝子ＶＨ１ｅ／ＶＨ１−６９）とアラインメントした。要求性の変異を太字の下線文字で示し（カラム５−ＰＩからＧＭおよびＡからＴ；カラム６−ＫＳからＥＬまたはＥＭまたはＸＬ）、優性変異を斜体の下線文字で示す（カラム２−ＡからＴ；カラム３−ＩＳからＶＴ；カラム５−ＧからＡ；カラム８−ＫからＱまたはＲ）。Ｈ１Ｎ１ニューカレドニアパニングでも発見された重鎖配列を、グレーで強調している。抗体領域およびＫａｂａｔナンバリング範囲を、各配列カラムの最上部に列挙する。重鎖／軽鎖対合を、第１のカラム中に以下のように示す：
【０２６５】
【数２】
2011516423.tif 000024
【０２６６】
【表５−１】
2011516423.tif 000025
【０２６７】
【表５−２】
2011516423.tif 000026
これまでのところ分析した生存者５由来のエピトープ「Ａ」に対する中和抗体集団を含む群の全メンバーを表１に示す。群は、可変（Ｖ）領域の遺伝子ＶＨ１ｅ／ＶＨ１−６９生殖系列重鎖に最も密接に類似する６１の固有のメンバーから構成される。いくつかの重鎖を、１つを超える軽鎖と対合する。合計で、これらの重鎖は、κおよびλ軽鎖の両方と１１４の固有の対合を有する。これらの重鎖を高度に関連するＶＨ１ｅ／ＶＨ１−６９生殖系列と比較して、３つの点置換型が認められた。ある残基は変化を必要とするようであり、ある残基は優性であり、ある残基は散発性にのみ変化した。必要な変化は、群中のＣＤＲ２内のあらゆるクローン中の５２Ａ位（Ｐｒｏ＞Ｇｌｙ）、５３位（Ｉｌｅ＞Ｍｅｔ）、および５７位（Ａｌａ＞Ｔｈｒ）、フレームワーク３領域中の７３位（Ｌｙｓ＞Ｇｌｕ）および７４位（Ｓｅｒ＞ＬｅｕまたはＭｅｔ）で起こり、その全てが生殖系列側鎖の化学的性質によって異なる。これにより、これらの変異が抗原の結合および中和に重要であることが示唆される。第２の変異誘発組は優性であり、ほとんどのクローンで見出される。第１に、フレームワーク１中の２４位（Ａｌａ＞Ｔｈｒ）は有意な化学変化を示す。次の３つは、ＣＤＲ１中の３４位（Ｉｌｅ＞Ｖａｌ）および３５位（Ｓｅｒ＞Ｔｈｒ）およびさらにＣＤＲ２中の５０位（Ｇｌｙ＞Ａｌａ）の保存的変化である。しかし、これらの４つ全ての優性置換は重要でなく、有利であるが必須ではないことが示唆される。フレームワーク領域１、３、および４ならびにＣＤ３の全体で見出された散発性の変化は全て保存性であり、小さな至適化事象を示す可能性がある。
【０２６８】
表６は、Ｈ１Ｎ１ニューカレドニアパニング後の生存者５ライブラリーから発見された中和の免疫化学的根拠を示す配列の例を示す。３５の固有の重鎖配列を、８２の固有の重鎖および軽鎖組み合わせ由来のその生殖系列可変領域とアラインメントした。要求性の変異を太字の下線文字で強調し（カラム２−ＡからＴ；カラム３−ＩＳからＶＴ；カラム５−ＰＩからＧＭおよびＡからＴ；カラム６−ＫＳからＥＬまたはＥＭおよびＫからＥ）、優性変異を斜体の下線文字で示す（カラム２−ＱからＥ；カラム５−ＧからＡ；カラム６−ＩからＬまたはＭ；カラム８−ＱからＫまたはＲまたはＥ）。Ｈ５Ｎ１ベトナムパニングでも発見された重鎖配列をグレーで強調している。
【０２６９】
【表６】
2011516423.tif 000027
表６では、抗体領域およびＫａｂａｔナンバリング範囲を、各配列カラムの最上部に列挙する（
【０２７０】
【数３】
2011516423.tif 000028
）。
【０２７１】
図７は、４７ｅと呼ばれる高度に関連する抗ＨＩＶ  Ｆａｂの結晶構造に重ね合わせた抗体の構造中必要な変異の位置を示す（１ｒｚｉ．ｐｄｂ）（Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１，２７０６−２７１１）。図７は、必要とされるＨ５血球凝集素結合群１の位置およびＦａｂ４７ｅの結晶構造上の優性変異を示す。必要な変異を、Ｇ５２（５２Ａ（Ｐｒｏ＞Ｇｌｙ））、Ｍ５３（Ｉｌｅ＞Ｍｅｔ）、Ｔ５７（Ａｌａ＞Ｔｈｒ）、Ｅ７３（Ｌｙｓ＞Ｇｌｕ）、およびＬＭ７４（Ｓｅｒ＞ＬｅｕまたはＭｅｔ）として示す。優性変異を、Ｔ２４（Ａｌａ＞Ｔｈｒ）、Ｖ３４（Ｉｌｅ＞Ｖａｌ）、Ｔ３５（Ｓｅｒ＞Ｔｈｒ）、およびＡ５０（Ｇｌｙ＞Ａｌａ）として示す。Ｈ５ベトナム／１２０３／２００４ＨＡバイオパニングにおいて同定された必要且つ優性の群１重鎖配列を、高度に関連する抗ＨＩＶ  Ｆａｂ４７ｅの結晶構造に重ねる。変異を、骨格（上）および空間充填（下）モデルの両方で示す。ＣＤＲ２中およびＣＤＲ２に隣接した必要な変異のうちの４つによって強固なクラスターを形成する。必要な変異５２Ａ（Ｐｒｏ＞Ｇｌｙ）、５３（Ｉｌｅ＞Ｍｅｔ）、７３（Ｌｙｓ＞Ｇｌｕ）、および７４（Ｓｅｒ＞ＬｅｕまたはＭｅｔ）により、重鎖可変ドメインの露呈した表面上に顕著に強固なクラスターを形成し、これらの変異がタンパク質表面から顕著に突出した隆起を形成する（図７）。残りの必要な変異５７（Ａｌａ＞Ｔｈｒ）は、ＣＤＲ２ループの底部に部分的に埋もれている。ＣＤＲ２およびフレームワーク３中の表面露呈の変化は、抗原結合において直接的な役割を有する可能性が高い一方で、あまり露呈していない必要な変異および必須でない優性変異は、ＣＤＲ２ループの安定化および／または位置付けによる間接的な影響を有し得る。
【０２７２】
生存者２由来の抗体は、ＶＨ４−４ｂ生殖系列重鎖に最も密接に類似する２個の固有の重鎖から構成される（表７）。第１の重鎖は、５個の固有のλ軽鎖と対合することが見出されており、その４つが頻繁に使用されないλ６軽鎖ファミリーに由来し、その他が単一のκ軽鎖と対合する。その中和プロフィールがより制限された抗体４は、この群に由来していた。
【０２７３】
【表７】
2011516423.tif 000029
所与の変異が抗体の活性に重要である確率は、独立して選択された時間数の関数として増加する。必要な変異が体細胞変異中に独立したクローンから選択されるか、その後の複製中にさらに変異した単一クローンの子孫に由来するかどうかを決定するために、優性変異のコドン使用頻度を分析した（表８Ａ〜８Ｂ）。データにより、異なるコドンを使用したにもかかわらず、これらのコドンによって同一のアミノ酸の変化が得られることが明らかとなり、これらの変異が異なるクローンで独立して起こり、したがって、選択した複数の時間で起こることが証明された。独立して選択された事象についてのこの収束性の結果は、これらの優性変異がウイルスへの結合および／またはその中和において重要な役割を果たすことを強く証明している。
【０２７４】
表８Ａ〜８Ｂに例示するように、各クローンのコドン使用頻度は、選択されたＨ５ＨＡ結合クローンの独立した起源を示す。ＶＨ１−ｅ生殖系列に対する６つの代表的な群１抗体のＤＮＡアラインメントおよびコードされるアミノ酸。同一アミノ酸の異なるコドンの使用は、各固有の配列が異なる起源であることを証明している。表８ＡはＣＤＲ２に対応し、表８Ｂはフレームワーク３に対応する。生殖系列コドンを太字のコドンとして示す。生殖系列コドンから同一アミノ酸への変化を、標準文字のコドンとして示す。生殖系列アミノ酸由来の第１の変化を、太字の下線を引いたコドンとして示す。生殖系列アミノ酸由来の第２の変化を、斜体の下線を引いたコドンとして示す。生殖系列アミノ酸由来の第３の変化を、下線を引いたグレーで強調したコドンとして示す。
【０２７５】
【表８Ａ】
2011516423.tif 000030
【０２７６】
【表８Ｂ】
2011516423.tif 000031
本報告では、トリインフルエンザ中和ウイルスに起因する感染の防止および治療に関する２つの主な問題を浮かび上がらせている。第１の問題は、免疫系の他の成分と比較した抗体の重要性に関する。免疫血清の受動的投与によって感染を防止することができることが８０年にわたって知られているが（Ｌｕｋｅ，Ｔ．Ｃ．ら、Ｋｉｌｂａｎｅ  ＥＭ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＪＬおよびＨｏｆｆｍａｎ  ＳＬ（２００６）Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １４５、５９９−６０９）、モノクローナル抗体を使用したより最近の研究でも支持されている（Ｈａｎｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．ら、（２００６）Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ  ７、１２６；Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｃ．ら、（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１、２７０６−２７１１；Ｓｉｍｍｏｎｓ  Ｃ．Ｐ．ら、（２００７）ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ４，ｅ１７８）。例えば、Ｈａｎｓｏｎらは、Ｈ５Ｎ１ウイルスに対するモノクローナル抗体が、マウスにおいて接種の３日後に投与した場合でさえも、致死性感染を完全に防御することを示した（Ｈａｎｓｏｎ，Ｂ．Ｊ．ら、（２００６）Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ  ７、１２６）。悲劇的なエピデミックの可能性を考慮して、当該分野の多くで進めるべき方法は明確なようである。政府が本明細書中に報告した中和抗体などの中和抗体のストックを保持することが示唆されている。完全にヒトであり、且つウイルス感染と首尾よく戦った個体から単離した本発明者らの抗体から利点を得ることができる。しかし、たとえかかる抗体を備蓄しても、多くの障害が残されている。例えば、抗体が結合するエピトープをコードする遺伝子を変異する場合、抗体の有効性は低下し得る。また、細胞性免疫がウイルスのクリアランスを増強するという証拠がいくつか存在する。にもかかわらず、受動免疫化の唯一の効果が感染の重症度を軽減することであり、それにより、他の免疫エフェクターを操作するのに必要な時間が与えられる場合、免疫、心血管、および呼吸器系が脆弱な患者および高齢者での死亡率の低下に極めて重要であり得る。受動免疫化は、急速に増殖するウイルスに対するサイトカインストーム（１９１８年のインフルエンザ大流行の際に健康な若年成人でさえ生じた）を防止し得る。
【０２７７】
この報告の第２の重要な特徴は、組み合わせライブラリー由来の抗体が問題になる特別の利点に関する（Ｌｅｒｎｅｒ  ＲＡ（２００６）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４５、８１０６−８１２５）。最も一般的な態様は、かかるライブラリーが核酸ベースであるので、ライブラリーは、重要な抗体がその時に産生されるかどうかに依存しないことである。これにより、一連の疾患でサンプルが得られる場合の任意の懸念が排除される。実際、本明細書の場合のように、抗体遺伝子の供給源が骨髄である場合、抗体が能動的に発現されるか、記憶区画に保存されるかどうと無関係に、個体の抗体応答の全ての免疫学的履歴を得ることができる。したがって、ここで研究した個体における抗体発生の分析では、時間的要因が排除され、関連抗体の間の前駆体産物の関係の明確な見解を得ることができる。この態様では、いくつかの本発明者らの抗体集団（すなわち、群１）の最も顕著な特徴の１つは、必要な体細胞変異が起こると最も予想されるＣＤＲＨ３よりもむしろフレームワーク３またはＣＤＲＨ２に必要な体細胞変異が限局することである。これは、ウイルスの極度の病原性が免疫応答の進化に時間的制約を課すからであり得る。Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルス感染を乗りきるために、有効な免疫応答を迅速に開始しなければならない。タンパク質のフレームワーク領域およびＣＤＲ２がむしろ構造的に制限されているので、体細胞変異による結合エネルギーの増加についての配列空間の進化的探索は、より可動性が高く多様なＣＤＲ３領域による類似の探索よりこれらの領域に有効であり得る。実際、主に抗体をヒト化する試みから、フレームワーク変異が結合のエネルギーおよび／または特異性に直接または間接的に影響を及ぼし得ることが周知である（Ｆｏｏｔｅ  ＪおよびＷｉｎｔｅｒ  Ｇ，（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２４、４８７−４９９；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｍ．Ａ．ら、（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７、２９６−３０１）。あるいは、免疫系は、おそらく類似のウイルスへの早期の曝露に応答して予め至適化されたフレームワークおよび／またはＣＤＲを使用することができる。正確な機構と無関係に、本発明者らの結果は、マウスにおける致死性水疱性口内炎ウイルス感染に対する免疫応答を研究したＺｉｎｋｅｒｎａｇｅｌおよびｃｏｌｌｅａｇｕｅｓの結果と広く一致する（Ｋａｌｉｎｋｅ  Ｕ  ら、（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５、６３９−６５２；Ｋａｌｉｎｋｅ  Ｕら、（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７、１０１２６−１０１３１）。かれらの研究では、たった１つのＶＨ生殖系列遺伝子を使用し、一次中和免疫応答が体細胞変異を欠いていた。その後にＣＤＲに体細胞変異が起こった。本発明者らの分析により、現在までに多数の興味深い抗体が明らかとなっている一方で、今までのところライブラリーの小画分しか分析されていないと強調すべきである。さらなる分析を行う場合、ウイルス感染の問題に対する多数の他の免疫学的解決法を調査することが期待される。
【０２７８】
抗体操作の観点から、必要に応じて、抗体ライブラリーに固有の巨大データベースは抗体の結合エネルギーおよび／または特異性を改善するための指針となる。例えば、その軽鎖パートナーに関して非常に雑多な重鎖（表１、２、およびＳＩ４）が存在すると直ちに理解される。これらの重鎖は、非常に多数の新規の軽鎖が単一の雑多な重鎖と対合する軽鎖シャフリング実験に理想的である（Ｌｅｒｎｅｒ  ＲＡ（２００６）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ  ４５、８１０６−８１２５；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら、（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８、１１１２０−１１１２３）。最終的に、異なる抗体の最良の特徴を単一の抗体に合体することができ、それにより、非常に有効であり、さらに変異によるウイルス回避を克服することができる。異なる抗体鎖、鎖内の異なるＣＤＲもしくはフレームワーク、またはその両方のいずれかで中和に重要なコンセンサス配列が生じる場合にこれは特に起こりやすい。したがって、多数の組み合わせを試験することができ、合体抗体はこれらの種々のループおよびフレームワークの最良のエレメントを含むことができる。批判的にいえば、合体抗体に組み込まれたいくつかの特徴がウイルス上の中和標的への別の結合様式を示す場合、ウイルス回避がより困難になると予想されるであろう。
【０２７９】
インフルエンザ問題に特に重要であり得るライブラリーから得た多数の抗体由来の別の特徴が存在する。感染に起因する（大部分ではないにしても）多数の抗体は、さらなる感染性（簡潔にはウイルスの外来の性質に対する応答）の防止とほとんど関係ない。したがって、ほんの数種類の抗体しか選択しない場合、最も重要なまれな抗体を見逃し得る。なぜなら、大量の免疫応答中でこの抗体が過小評価されるからである。実際、低濃度しか必要とせず、そして／または免疫応答の進化の過程で多数の他の「試み」を行った後のみの感染の後期で起こり得るので、これは最も強い抗体の特徴であり得る。本発明者らは癌患者由来のヒトライブラリーでこの現象を認めており、その現象とは、転移を防止する抗体が１．０×１０８個のライブラリーメンバーのうちの約１つの非常にまれな頻度で存在するというものである（Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ  Ｂら、（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１、１７２１０−１７２１５）。スクリーニングすることができ、稀であると予想される特徴は、例えば、広範な中和を示すか、重要な組織区画に異常に接近する抗体である。このような目的で、本発明者らのクローン集団中にウイルスに結合するが血球凝集素に指向しない任意の中和抗体が存在するかどうかを調査することは興味深いであろう。
【０２８０】
実際の症例由来の免疫応答の分析により、新規の受動的抗体療法およびワクチンデザインの両方のための指針を得ることができる。例えば、Ｈ５株とＨ１株との間で広範な反応性を示すが、Ｈ３はスキップする血球凝集素に対する抗体を患者が作製することを本発明者らは既に承知している。本発明者らの患者について本明細書中で認められる一連の活性を血清が含むので、簡潔な血清学からこれを知ることができない。したがって、血清の分析から任意の反応性のクローンによる根拠を決定することは不可能である。本明細書中および他で既に見出されている交差反応性エピトープの局在化は、現在指針としてライブラリー由来の抗体を使用すると比較的容易である。数人のウイルス感染の生存者由来の複数の抗体を利用して血球凝集素以外の共通のエピトープをマッピングすることも可能であり、その全生存者が高親和性抗体を産生していた。いくつかの以前に知られていないエピトープの知識により、新規のワクチンのデザイン基礎を得ることができる。
【０２８１】
特徴づけられた中和抗体から、候補ワクチンの潜在的有効性に関する情報も得ることができる。例えば、特定の伝統的または組換えのワクチン調製物は、実際の感染の生存者の分析から中和が証明された抗体クラスを生成する。さらに、これらの抗体を、中和に重要なエピトープがワクチン構築物中に適切に存在することを確実にする試験試薬として使用することができる。この後者の点が自明なようである一方で、今まで、サブユニットワクチンの構築中またはインタクトなウイルス調製物の処方中でさえも重要なエピトープが破壊されるかどうかを知るための簡潔な方法は存在しなかった。
【０２８２】
最後に、本発明者らは、ウイルス抗原で単純に免疫化した動物またはヒトと対照的に、感染と首尾よく戦った患者からライブラリーを調製したことが重要であるかどうかという興味深い疑問をしばしば持つようになった。本発明者らのコホート内の患者の実質的な画分が死滅したので、生存者はその好ましい臨床結果に関連した抗体を作製したと推測してしまう。患者の生存には多数の要因が寄与し、そのいくつかは免疫応答の頑強さとほとんど関係ないので、これは難しい議論である。生存者から得た天然の抗体は、不活性抗原での単純な免疫化後に得た抗体と少なくとも同様、おそらくより良好と妥当に予想することができると簡潔に述べるべきである。最低限でも、個体生存に適切な免疫応答が可能な様式でウイルスが提示されたことが確実であり得る。したがって、本発明者らは、この分析から、感染因子の病原性のために短時間である場合にどのようにして免疫学的レパートリーが配列空間を検索するのかについて洞察した。
【０２８３】
材料と方法
Ｈ５Ｎ１トルコの症例−骨髄の回収。６人のＨ５Ｎ１生存者から、本研究用の骨髄および血清の提供を受けた。全員を２００５年１２月および２００６年１月に診断した。その診断の記述は以前に報告されている（Ｏｎｅｒら、（２００６）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５５：２１７９−２１８５）。簡潔に述べれば、ほとんどのサンプルは、トルコでＥＬＩＳＡ、迅速なインフルエンザ試験、および／またはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって試験した鼻咽頭スワブであった。さらに、６人の生存者のうちの４人を、ロンドンでのＷＨＯ臨床検査によってさらに検証した。回収から４および５ヶ月後、６人の生存者由来の骨髄吸引液および血清を回収し、ＲＮＡの完全性を保存するためにＲＮＡＬａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）で最低限の処理を行い、ドライアイスでの凍結状態で本発明者らの研究所まで輸送した。本研究は、トルコ保健省およびＹｕｚｕｎｃｕ  Ｙｉｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｖａｎ，Ｔｕｒｋｅｙの両方によって再調査され、承認された。全てのドナーから説明と同意が得られた。
【０２８４】
抗体、タンパク質、およびウイルス。血球凝集素タンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈ５プロテインＡ／ベトナム／１２０３／２００４、Ｈ１プロテインＡ／ニューカレドニア／２０／９９、Ｈ３プロテインＡ／ウィスコンシン／６７／０５）から購入したか、真核生物コドンを至適化した可溶性分泌ＨＡ遺伝子（ＤＮＡ  ２．０）としてｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって生成し（Ｈ１プロテインＡ／サウスカロライナ／１／１８）、次いで、哺乳動物タンパク質発現のためにｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローン化し、配列を検証し、次いで、製造者のガイドラインにしたがって２９３フリースタイル細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。簡潔に述べれば、２０μｇの軽鎖および１０μｇ重鎖をコードするプラスミドを１．０ｍｌの２９３フェクチンと合わせ、６０分間インキュベートした。このプレインキュベーション後、３０ｍｌ培地中でＤＮＡ混合物を３×１０７細胞と合わせ、次いで、製造者の提案に従って得られた細胞懸濁液を７日間成長させた。７日後、分泌した免疫グロブリンを、プロテインＡクロマトグラフィ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して培養上清から精製した。得られた精製抗体を、遠心サイズ濾過（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０）を使用して滅菌ＰＢＳと緩衝液を交換し、そのタンパク質濃度を比色ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。
【０２８５】
他の場所に記載のように、組換えウイルスを遺伝子操作し、産生した（Ｆｏｄｏｒら、（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９６７９−９６８２）。さらに、インドネシア、トルコ、およびエジプトを、そのＨＡ遺伝子を真核生物コドン至適化配列（ＤＮＡ  ２．０）を使用して合成的にアセンブリしたことを除いて同様に作製した。他の場所に記載のように不活化ウイルスを作製した（Ｆｏｄｏｒら、前出）。
【０２８６】
血清学：血球凝集素およびウイルスＥＬＩＳＡ。組換えＨＡタンパク質：  Ｈ５プロテインＡ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）−１０ｎｇ／ウェル；組換えＨＡＨ１プロテインＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）−１０ｎｇ／ウェル；組換えＨＡＨ３プロテインＡ／ウィスコンシン（Ｗｉｓｏｎｓｉｎ）／６７／０５（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）−１０ｎｇ／ウェル；Ｈ１Ｎ１ウイルスＡ／ニューカレドニア（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）−７０ｎｇ／ウェル；Ｈ３Ｎ２ウイルスＡ／パナマ／２００７／９９（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）−１０ｎｇ／ウェル；Ｈ５Ｎ１ｒｇＡ／ベトナム／１２０３／２００４（ＣＢＥＲ）用ＦＤＡインフルエンザウイルスワクチン−１０ｎｇ／ウェル。
【０２８７】
示すように、ＥＬＩＳＡプレートを、組換え血球凝集素タンパク質または室温で一晩インキュベートした不活化ウイルスのいずれかでコーティングした。翌日、プレートを適切にブロッキングし（１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）、次いで、ブロッキング緩衝液で希釈した０．１ｍｌ血清サンプルをインキュベートし、洗浄し、ペルオキシダーゼ抱合抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ）およびＴＭＢ検出（ＢｉｏＦＸ）を使用して検出した。４５０ｎｍでの吸光度を読みとり、データを記録し、本明細書中に報告した。
【０２８８】
ドナー特異的レパートリーの回収。２５ｍｌ  ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）中に予め保存した２〜２．５ｍｌのドナー骨髄を、製造者の指示にしたがってＴＲＩ−ＢＤ（Ｓｉｇｍａ）で処理し、次いで、他の場所に記載のようにさらに処理して、精製総ＲＮＡを抽出した（Ｂａｒｂａｓら、（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ））。次に、ｍＲＮＡをＯｌｉｇｏｔｅｘスピンカラム精製（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製した。次に、ランダムノナマーで反応物をプライミングし、オリゴｄＴ逆転写反応を製造者の指示にしたがってＡｃｃｕｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して行った。
【０２８９】
各ドナーについて、以下を行った。１１種のλ軽鎖ファミリーのそれぞれについて、ファミリー特異的ＶＬプライマー（ＪＬプライマーの混合物）を使用して１回のＰＣＲ増幅を行い、７５ｎｇのオリゴｄＴｃＤＮＡでプライミングした。７５ｎｇのランダムノナマープライミングしたｃＤＮＡを使用したことを除いて６つの各κ軽鎖ファミリーと同様にκの回収を行った。重鎖回収のために、ＶＨ１／７、ＶＨ３、およびＶＨ４を個別に回収し、ＶＨ２，５、および６を、遺伝子特異的プライマー（ＪＨプライマーの混合物）を使用してプール増幅し、それぞれ１００ｎｇのランダムノナマープライミングしたｃＤＮＡでプライミングした。プライマーおよび増幅条件は、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ｒｅｆ）を使用して、他の場所の記載に本質的に従った。ＰＣＲ産物を、Ａ２６０によって定量したＰＣＲ  Ｃｌｅａｎｕｐ（Ｑｉａｇｅｎ）によって最小にプロセシングした。重鎖反応物をゲル濾過し、次いで、必要に応じて、再度増幅してクローニングに十分な量を産生した。
【０２９０】
ファージライブラリーの構築
軽鎖クローニング。ドナー特異的なバーコード化ベクターならびにκおよびλ軽鎖の等モルプールを、個別にＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル精製した。２００ｎｇのゲル精製κまたはλインサートおよび１μｇのゲル精製ベクターを使用して、ライブラリーライゲーションを行った。インキュベーションは、室温で少なくとも１時間および１４℃で一晩である。Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ  Ｐｅｒｆｒｏｍａスピンカラムを使用してライゲーション物を脱塩した。８０μｌのＴＧ−１アリコート中でライブラリーあたり５回のエレクトロポレーションを行い、それぞれ１ｍｌ  ＳＯＣ中に回収し、プールし、３７℃で１時間増殖させた。プレーティングのために各サンプルを取り、これらを使用して形質転換体の総数を決定した。残部を２００ｍｌの２ＹＴ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋２％グルコースに移し、３７℃で一晩成長させた。形質転換体の標的数／ライブラリーは、少なくとも１×１０６／μｇベクターＤＮＡであった。次いで、軽鎖ライブラリープラスミドをペレット化し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｅｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを使用してプラスミドを精製した。
【０２９１】
重鎖クローニングおよびファージ産生。ドナー特異的重鎖（ＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ４、およびＶＨ２、５、６プール）および軽鎖ライブラリー回収物を、ＳｆｉＩおよびＸｈｏＩを４０単位／μｇＤＮＡで使用して個別に消化し、ゲル濾過した（Ｑｉａｇｅｎ）。５μｇのκおよびλ軽鎖ライブラリーを、１．２μｇの４つのドナー特異的重鎖調製物の等モル混合物で一晩個別にライゲーションした。ライブラリーライゲーション物を、スピンカラムで脱塩し（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ）、次いで、１６〜２０回エレクトロポレーション／ライブラリーで形質転換した。形質転換体数を決定するための処理を以下に記載する。ファージ産生を、他の場所に記載のように進めた。ファージ産生後、ファージをＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿によって採取し、５０％グリセロール含有ＰＢＳに再懸濁し、保存した。
【０２９２】
パニングおよびクローナルＥＬＩＳＡ。パニングおよびクローナルＥＬＩＳＡを、以前に記載のように行った（Ｆｏｄｏｒ，Ｅ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９９；７３（１１）：９６７９−８２）。
【０２９３】
マイクロ中和。トリインフルエンザの生存者から回収した抗体による交差亜型中和。インドネシアおよびトルコ血球凝集素遺伝子を、ヒトコドン至適化配列（ＤＮＡ  ２．０）を使用して合成的にアセンブリし、次いで、これを使用して、組換え操作ウイルスを生成した。組換えインフルエンザウイルスを、以前に記載のように逆遺伝学を使用して生成した（Ｆｏｄｏｒ，Ｅ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９９；７３（１１）：９６７９−８２）。簡潔に述べれば、１μｇの各１０個のプラスミドを、単層中の２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。各トランスフェクションは、ｖＲＮＡ（ｐＰＯＬ１型）およびタンパク質発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ型）（Ａ／ベトナム／１２０３／０４ＨＡおよびＮＡ用（ｐＣＡＧＧＳ発現プラスミドは、Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ、Ｏｓａｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎから譲渡された））（Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｊ．ら、Ｇｅｎｅ  １９８９；７９（２）：２６９−７７）に加えて、アンビセンスプラスミド（ｖＲＮＡおよびｍＲＮＡの両方の発現用）（Ａ／プエルトリコ／８／３４／ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳセグメント用）を含んでいた。トランスフェクション２４時間後、２９３Ｔ細胞を細胞培養上清に再懸濁し、これを使用して１０日齢の孵化卵に接種した。
【０２９４】
下記のように、ウイルスに対する中和活性について抗体をスクリーニングした。各Ｍａｂの２倍連続希釈物を、１００  ＴＣＩＤ５０のウイルスを含むＰＢＳ中にて３７℃で１時間インキュベートした。２４ウェルプレート中のＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞単層をＰＢＳで１回洗浄し、ウイルス−抗体混合物を接種した。５％ＣＯ２中の３７℃で１時間のインキュベーション後、接種材料を除去し、単層を再度ＰＢＳで１回洗浄した。０．３％ＢＳＡ、０．０１％ＦＢＳ、および１μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ処理トリプシンを補足したＯｐｔｉ−ＭＥＭを添加し、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。細胞培養上清中のウイルスの存在を、０．５％ニワトリ赤血球を使用したＨＡアッセイによって評価した。
【０２９５】
交差反応ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ。マイクロタイタープレートを、コーティング緩衝液で希釈した０．１ｍｌの以下の抗原でコーティングし、室温で一晩インキュベートした：１００ｎｇ／ｍｌ  Ｈ５Ｎ１ベトナム１２０３／０４、２５０ｎｇ／ｍｌ  Ｈ５Ｎ１トルコ／６５５９６／０６、１μｇ／ｍｌ  Ｈ５Ｎ１インドネシア／５／０５、７００ｎｇ／ｍｌ  Ｈ１Ｎ１ニューカレドニア／２０／９９、１μｇ／ｍｌ  Ｈ１Ｎ１ノースカロライナ／１／１８、および１００ｎｇ／ｍｌ  Ｈ３Ｎ２ウィスコンシン／６７／０５。０．３ｍｌのブロッキング緩衝液（４％脱脂粉乳を含むＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を使用してブロッキングした。ブロッキング後、２％脱脂粉乳ブロッキング緩衝液で０．５μｇ／ｍｌに希釈した抗体を、４℃で２時間インキュベートし、洗浄し、その後にペルオキシダーゼ抱合抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の３０００倍希釈物を含む２％脱脂粉乳ブロッキング緩衝液および標準ＴＭＢ気質検出（ＢｉｏＦＸ）を使用して検出した。４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、データを記録し、本明細書中に報告した。（Ｂ）種々のタンパク質におけるＥＬＩＳＡシグナル／ノイズ比による抗体の相対ランキング（−＜２、＋＝２−＜９、＋＋＝９−＜１５、＋＋＋≧１５）およびマイクロ中和アッセイにおける最小阻害濃度（ＭＩＣ）。適切なプロトコールを、Ｂａｒｂａｓ  Ｃ．ら、（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に見出すことができる。
【０２９６】
血球凝集素結合Ｆａｂのエピトープ分析。
【０２９７】
ＨＡタンパク質のビオチン化：１００μｇの精製血球凝集素タンパク質を、製造者の指示にしたがって、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈ  ＰＥＯ４ビオチン（カタログ番号２１３２９）を使用して２０倍モル過剰でビオチン化し、断続的に混合しながら室温で１〜３時間インキュベートし、次いで、４℃で一晩インキュベートした。過剰なビオチンを、サイズ排除スピンカラムによって除去し、ＰＢＳと交換した。
【０２９８】
Ｆａｂの定量：ＨＡ結合Ｆａｂを、Ｎｉ２＋アフィニティクロマトグラフィを使用したＦＰＬＣによって精製し、脱塩して過剰なイミダゾールを除去し、濃縮し、定量的軽鎖ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｅｌ  Ｌａｂｓ、カタログ番号Ｅ８０−１１５−κ、およびＥ８０−１１６−λ）による定量を、製造者の説明書にしたがって行った。
【０２９９】
サンプルの準備：ＨＡタンパク質をセンサに結合し、新規のベースラインに到達させた。次に、サンプルおよびエピトープ結合標準を、動態解析から決定した条件を使用してＨＡ飽和について試験する。脱塩し、濃縮したＦａｂを、０．５〜１６ｕｌの典型的な範囲を含む２００μｌサンプル希釈剤中でのＨＡ結合について評価した。飽和試験で同定された条件を使用して、標準エピトープ結合抗体を、ＨＡコーティングしたバイオセンサ上に最初にローディングする。新規のベースラインを確立し、次いで、半飽和濃度の試験サンプルをエピトープ飽和センサ上にローディングする。抗体を、本方法における全ての可能なエピトープ認識標準に対して試験した。以下は、サンプルの型および時間のまとめであり、センサを溶液の各カラム中に保持した：
カラム１        ベースライン        サンプル希釈剤        １〜２分間
カラム２        ＨＡ結合            ビオチン化ＨＡ        ５〜１５分間
カラム３        ベースライン        サンプル希釈剤        １〜２分間
カラム４        飽和                希釈抗体              ５〜１５分間
カラム５        ベースライン        サンプル希釈剤        １〜２分間
カラム６        サンプル結合        希釈試験抗体          ５〜１５分間
カラム７        ベースライン        サンプル希釈剤        １〜２分間
飽和レベルを超える干渉シフトの増加は、新規のエピトープ認識を示す。この分析型に由来する３つの可能な結果は以下である：
１）   完全なブロッキング−干渉シフトなし
２）   飽和の修復−結合後のベースライン中に標準の解離が生じる場合、飽和レベルにシグナルが修復されるサンプル結合は、同一エピトープへの結合を示す。
３）   新規のエピトープ結合−飽和レベルを超える干渉シフトの増加。
【０３００】
血球凝集素結合Ｆａｂの動態解析
ＨＡタンパク質のビオチン化：１００μｇの精製血球凝集素タンパク質を、製造者の指示にしたがって、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｏ−Ｗｅｉｇｈ  ＰＥＯ４ビオチン（カタログ番号２１３２９）を使用して２０倍モル過剰でビオチン化し、断続的に混合しながら室温で１〜３時間インキュベートし、次いで、４℃で一晩インキュベートした。過剰なビオチンを、サイズ排除スピンカラムによって除去し、ＰＢＳと交換した。
【０３０１】
Ｆａｂの定量：ＨＡ結合Ｆａｂを、Ｎｉ２＋アフィニティクロマトグラフィを使用したＦＰＬＣによって精製し、脱塩して過剰なイミダゾールを除去し、濃縮し、定量的軽鎖ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｅｌ  Ｌａｂｓ、カタログ番号Ｅ８０−１１５−κ、およびＥ８０−１１６−λ）による定量を、製造者の説明書にしたがって行った。
【０３０２】
動態解析：動態解析を、経験的に決定したサンプル濃度範囲で行う。第１の範囲は、典型的には、２倍連続希釈での１５ｎＭ〜５００ｎＭであり、サンプルを、ＨＡタンパク質でコーティングしたバイオセンサと１５分までインキュベートし、次いで、サンプル希釈剤中で１時間までインキュベートする。これらの全工程を、１５００ＲＰＭのサンプルプレート回転を使用して行う。ＨＡコーティングしたバイオセンサとのＦａｂインキュベーション中に会合を測定し、結合後のサンプル希釈剤のインキュベーション中に解離を測定する。以下は、サンプルの型および時間のまとめであり、センサを溶液の各カラム中に保持した：
カラム１        ベースライン        サンプル希釈剤        １〜２分間
カラム２        ＨＡ結合            ビオチン化ＨＡ        ５〜１５分間
カラム３        ベースライン        サンプル希釈剤        １〜２分間
カラム４        会合                希釈抗体              ５〜１５分間
カラム５        解離                サンプル希釈剤        １５〜１８０分間
Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ動態解析ソフトウェアを使用したデータ解析により、ｒ２値を使用してオンレートおよびオフレートを評価する。ｒ２値＞０．９５の高信頼度の場合、値は報告すべきと見なされる。次いで、ｋＤを、分子の親和性として容認する。
【０３０３】
ウイルスマイクロ中和。ＭＡｂのＶＮ活性を、以下のように測定した。ＭＡｂ希釈物（５０ｍｌ）を含むＩＳＣ−ＣＭ-０．１％ＢＳＡ（希釈物あたり８回反復）を、９６ウェル平底組織培養プレートに分注した。ＰＲ８（５０ｍｌ）を含むＩＳＣ−ＣＭ-０．１％  ＢＳＡ（；１００  ＴＣＩＤ５０）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、ＭＤＣＫ細胞を各ウェル（２  ３  １０６細胞／ｍｌを含む２５ｍｌ  ＩＳＣ−ＣＭ−０．１％ＢＳＡ）に添加し、プレートを８〜１４時間インキュベートしてＭＤＣＫ細胞を接着させた。次いで、培地を軽く弾き飛ばし、トリプシン（２．５％トリプシン［Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．］）を最終希釈度１／３０００（；８ｍｇ／ｍｌ）で補足した２００ｍｌの無抗体ＩＳＣ−ＣＭ-０．１％ＢＳＡと置換した。さらに２．５日間のインキュベーション後、培養上清を、ＨＡ力価決定によってウイルスの存在について試験した。５０％の培養物が感染から防御されるＭＡｂ濃度を内挿によって計算し、ＭＡｂ  ＶＮ活性として使用した。低濃度は高ＶＮ活性を示すことに留意のこと（Ｍｏｚｄｚａｎｏｗｓｋａ，Ｋら、（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１、４３４７−４３５５）。
【０３０４】
実施例２−ユニバーサルインフルエンザワクチンの生成
異種病原体のワクチンデザインの目的は、有効且つ広範な防御抗原を同定およびデザインすることである。インフルエンザの場合、相当な歴史的努力によって保存された線状配列および領域の経験的試験が行われてきたが、ほとんど成功していない。これらの失敗についてのもっともらしい理由は、抗原性被験物質に対する注目される応答が実際の感染条件での病原体上の抗原の中和のための実際の真の産生部位であるという知識不足である。インフルエンザのために、インフルエンザ感染の生存者のレパートリー内にこれらの真の解決策が見出されると期待されるであろう。本発明者らの場合、Ｈ５Ｎ１インフルエンザ生存者由来の巨大な抗体集団の間のいくつかの関連する抗体（上記の表４を参照のこと）がいくつかのインフルエンザ亜型を後半に中和することができると証明された。これらの抗体は、血球凝集の古典的阻害を含まない新規の機構によってインフルエンザを中和する。この機構は、現在、２つのさらなる独立した群によって構造レベルで確認および説明されている。まとめると、真の生存者由来のかかる交差中和抗体を使用したワクチンのデザインおよび評価が交差反応性または「ユニバーサル」インフルエンザワクチンのデザインおよび妥当性に役に立つと期待される。
【０３０５】
具体的には、交差中和モノクローナル抗体を、現在および将来的に製造されるワクチン中の交差中和エピトープの質および抗原性を維持または増強するワクチン産生過程のデザインおよび確証で使用することができる。ワクチンへの抗体結合が構造の完全性および抗原潜在性を反映すると仮定すると、かかるワクチン過程の誘導体への交差中和抗体（Ａｂ−１（上記表４を参照のこと）など）の結合を評価して、その交差中和潜在性を定量的に評価するであろう。
【０３０６】
これらのユニバーサルエピトープに対する応答を最大にするために、これらのユニバーサルエピトープに対する免疫原性を増加させるための誘導体を作製するであろう。この場合、得られた抗原を再度試験して、標的への結合有効性を維持するだけでなく、定方向の免疫原性も達成されることを保証するであろう。これは、おそらく表４由来のＡｂ−１（または関連抗体）に対する競合ＥＬＩＳＡによって免疫化した個体または試験動物由来の血清中に含まれる特異的なユニバーサル中和力価の決定を含むであろう。インビトロ代替物として、免疫原性のために抗原−抗体結合データをインビトロまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予想モデルの抗体結合データと組み合わせるであろう。ユニバーサルエピトープに対する応答をさらに指示するために、公知の非中和血球凝集素エピトープを脱免疫化することができる。
【０３０７】
操作した組換え血球凝集素のキメラ、フラグメント、および高次構造模倣物のデザインおよび確証のために本抗体を拡大することが妥当である。例えば、インフルエンザが非中和応答を生じる多数の免疫原性エピトープを含むことが十分に確立されている。交差防御抗体を使用して、これらの免疫優性非中和エピトープが部分的または完全に脱免疫化されたワクチンの抗原改変体が維持されるか、ユニバーサル保護エピトープの認識が強化されるのかどうかを評価することが可能である。
【０３０８】
異なるエピトープに対する特異的応答をガイドするさらなる方法は、組み換えワクチンデザインから非中和および非保存領域を簡潔に除去することである。例として、ＨＡ１（すなわち、血球凝集素のＨＡ０球状シアル酸結合ドメイン）を除去して、免疫応答のための主な標的としての血球凝集素のより保存されたステム領域を遊離するであろう。配列空間が物理的空間と厳格に相関しないので、これには、タンパク質の中間のコード領域を除去してかかる非球状構築物を作製する必要があるであろう。さらに、いっそう多くの球状ドメインが除去されるので、これにより、通常はタンパク質構造内に包埋している残基が露呈するであろう。通常は溶媒に暴露されていないこれらの残基を変異誘発および脱免疫化して、残基を構造的により適切にするか、溶媒暴露をより適合させることが必要であり得る。上記の試みと同様に、これらの交差防御エピトープの完全性が保証されていると以前に同定された抗体を使用するであろう。
【０３０９】
これらの非球状ワクチンデザインから、抗原エピトープを最小にし、さらに、血球凝集素の構成から除去して、高次構造交差特異性抗原を作製することができる。
【０３１０】
上記で概説したストラテジーは、中和エピトープまたはエレメントを最小にするために応答をガイドする方法を詳述している。高次構造的に依存している可能性が高く、不連続な配列空間内に存在するかかる最小化したエレメントの知識から、以前に記載のように（Ｈｏｒｏｗｉｔｚら、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５０８７７号を参照のこと）、より小さなポリペプチド内に組み合わせ様式で高次構造中和エピトープを作製する可能性があるであろう。ここで、不連続なエピトープのみの近位の配置またはデザインした構造支持体の文脈では、高次構造エピトープの必須の性質を再生することができる。
【０３１１】
かかるデザインでは、高次構造エピトープの形態をとり、これらを血球凝集素関連および非関連構造足場上で発現させるか、高次構造依存性抗体（Ａｂ−１など）によって選択することができるライブラリー内の高次構造エピトープ集団としての形態もとるであろう。
【０３１２】
不連続エピトープの高次構造エピトープへの減少により、伝統的なタンパク質操作を使用して可能なペプチド免疫原よりもさらにより小さなサイズのペプチド免疫原が得られるであろう。さらに、これらの構造エピトープを、非ペプチド模倣物の使用によって、さらに増強、サイズの減少、または置換することができる。任意の事象では、任意のこれらの高次構造誘導体または模倣物を、Ａｂ−１、Ａｂ−１関連抗体、または最良のインフルエンザウイルスに対応する抗体によって確証するであろう。
【０３１３】
方法と材料。インフルエンザ融合エピトープ胞子ワクチン標的。
１．分泌タンパク質または哺乳動物細胞としての標的の哺乳動物発現
ａ．   発現ステム（ＨＡ２のみ）
ｂ．   非球状ＨＡ０
ｃ．   非球状ＨＡ１／ＨＡ２
ｄ．   非球状ＨＡ１／トップレスＨＡ２
２．分泌タンパク質または哺乳動物細胞のＡ６関連抗原での高次構造エピトープの検出。
３．首尾の良いステムまたは非球状抗原の胞子発現への導入
４．  Ａ６関連抗体での胞子結合の試験
５．マウスの免疫化
実施例３  −交差亜型中和抗体の効力および範囲の増加
前述のように、Ａｂ−１、２、および３によって部分的に示されたレパートリーである交差亜型中和抗体群は、ＣＤＲ２およびフレームワーク３（ＦＲ３）内に非常に異なり、且つ外見的に要求性の重鎖変異を含むが、ＣＤＲ３内にはほとんどまたは全く多様性がない。これらの特徴的配列を使用して同定したクローンの剪断数を考慮して（これら全てが１−ｅまたは１−ｅ様フレームワークに制限される）、この特異的重鎖フレームワーク、ＣＤＲ２、およびフレームワーク３（ＦＲ３）の変異によってこの広範な活性が主に駆動されるとの疑いが生じる。最近、２つの群は、血球凝集素および１−ｅ様、１−６９生殖系列フレームワークを使用する他の広範な抗体の共結晶の分析によって結晶レベルでこのことが確認された（Ｋａｓｈｙａｐら、前出；Ｔｈｒｏｓｂｙら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３（１２）：ｅ３９４２）。それぞれの例では、主な結合は、Ｋａｓｈｙａｐら（前出）に記載の領域に対応するＣＤＲ２配列およびＦＲ３配列によって駆動された。この広範な特異性のための最小の結合エレメントを同定するために、ＣＤＲ２変異およびＦＲ３変異がそれぞれ連続的に生殖系列に戻ることによって開始し、広範な亜型インフルエンザ結合を評価するであろう。ＣＤＲ３の場合、アラニンスキャニングを使用して、交差反応性の最小の必須エレメントをさらに定義するであろう。
【０３１４】
広範な特異的結合に関与する配列の範囲を調査する際に、変異誘発法を使用して、個別またはライブラリー中のコレクションを試験するための改良された変異体を作製するであろう。変異を導入するために一般に使用される方法は、結合を担うことが公知の領域にわたって結合または謝りがちのＰＣＲ変異誘発を担う部位での飽和変異誘発であり得る。同様に、前述の変異誘発法を、より大域の様式で認識に影響を及ぼし得る重鎖の他の領域に適用することができる。
【０３１５】
一旦これらの１−ｅまたは１−ｅ様の至適化クローンが同定されると、次に、他の関連および非関連重鎖フレームワーク上のこれらの定義された最小のエレメントをグラフティングするための組換え方法を使用する。これにより、異なる状況下で元より優れ得るさらなる至適化された解決法を調査する能力が得られる。次の工程として、これらの最小エレメントを、他の関連および非関連タンパク質上にモデル化および／またはグラフティングするであろう。これらの試みの成功により、交差反応性結合モチーフの模倣物が存在するか模倣する最小化または制限されたペプチドが得られる優れた薬物、さらには手段を得ることができる。次いで、この段階での成功を、非ペプチド模倣物の分野に拡大するであろう。
【０３１６】
最後に、他の関連抗体の配列データベースの検索により、多数の抗感染抗体が明らかとなり、１−ｅまたは１−ｅ様フレームワークが感染性の生物およびウイルスに対する第一線の防御として機能することができることが示唆された。そのようなものとして、１−ｅまたは１−ｅ様レパートリーがＡｂ−１およびインフルエンザの関連抗体について概説された工程と同様に開発することができる抗感染抗原のｄｅ  ｎｏｖｏ同定のための理想的な供給であると推定される。
【０３１７】
材料と方法。１−６９／１−ｅ抗イディオタイプ抗体およびワクチン。
１．特定の試薬のための最小化フレームワークエレメント抗体のパニング。
２．抗インフルエンザレパートリーを拡大するためのＢ細胞刺激薬の存在または非存在下での抗イディオタイプ抗体の投与。
３．抗インフルエンザ力価の測定（ｅｘ  ｖｉｖｏでＰＢＭＣまたは骨髄由来）。
【０３１８】
実施例４−１−ｅおよび１−ｅ様抗インフルエンザ抗体の誘導。
【０３１９】
記憶Ｂ細胞の増殖の誘導により、特定の抗体が増殖および分泌され、Ｂ細胞が刺激される。おそらく交差亜型血球凝集素結合に必要な最小結合エレメントを調査する際、抗イディオタイプ抗体を同定するための選択ツールとしてこのエレメントを使用することができる。かかるフレームワークおよび変異特異的抗イディオタイプ抗体の投与により、これらの広範な特異的記憶Ｂ細胞が拡大され、疾患の予防または処置においてこれらの抗インフルエンザ抗体が血清学的に増加するであろう。
【０３２０】
また、他の関連抗体の配列データベースによって多数の抗感染症抗体が明らかとなっているので、１−ｅまたは１−ｅ様フレームワークが感染性の生物およびウイルスに対する最前線の防御として機能することができることが示唆される。１−ｅまたは１−ｅ様抗イディオタイプレパートリーの発現が感染症の防御または処置に理想的に適切であると予想される。
【０３２１】
広範に特異的な抗体を誘導または産生するための薬剤（１−６９／１−ｅおよび関連フレームワーク）。薬剤には、遺伝子療法薬として送達させるための再配列Ｖｈ（インビボおよびｅｘ  ｖｉｖｏ）、Ｖｈ特異的遺伝子の操作した転写アクチベーターが含まれる。かかる薬剤は、インフルエンザ（抗ウイルス）処置／予防；（抗ウイルス）予防のためのアジュバントとして；処置および予防のためのＶｈ特異的Ｂ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ選択（および可能な拡大）；Ｖｈ特異的誘導／産生のためのインフルエンザエピトープ；Ｖｈ特異的記憶応答を拡大するための１−６９／１−ｅおよび関連抗イディオタイプ抗体／サロボディ（サロボディ上の共刺激因子または個別の投与が含まれ得る）；１−６９／１−ｅおよび関連抗体の増殖および産生を誘導するために１−６９／１−ｅフレームワークに指向するワクチン；および上記の任意の組み合わせに有用であろう。
【０３２２】
実施例５−防御の効力および範囲を増加させるためのワクチンおよび抗体の同時投与
抗体と抗原との複合体は、動物における多数の微生物タンパク質および他のタンパク質に対する応答を潜在的に誘導することが公知である。１つの可能な説明は、ワクチン抗体複合体の強制的な取り込みは抗原提示細胞上のＦｃ受容体によって生じるということである。交差反応性抗体（Ａｂ−１など）と季節性ワクチンとの複合体により、効力を年々増大させることが可能であろう。これは、新規のウイルス分離株を各季節のインフルエンザワクチンのために選択した場合、Ａｂ−１および関連抗体が多数の血球凝集素抗原を認識し、新規の抗体を再度作製する必要がなくなるからである。さらに、これらの抗体が保存された中和領域に指向するので、抗原と複合体を形成した場合、抗体はこれらの非常に保存された感受性領域へのより有効な防御応答を実際に指示することができる。前述のように、ワクチンは、伝統的な生ウイルスまたは死滅ウイルス、組換えタンパク質またはタンパク質フラグメント、またはさらに最小化されたペプチド、または抗体、抗体フラグメント、または誘導体と複合体化した非ペプチドの高次構造エピトープ、またはサロボディであり得る。
【０３２３】
上記の説明中で本発明は一定の実施形態を参照して例示しているが、本発明はこれらに制限されない。実際、本明細書中に示し、且つ記載した実施形態に加えて、本発明の種々の修正形態が上記の説明から当業者に明らかとなり、これらの修正形態は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【０３２４】
明細書を通して引用された全ての引例は、その全体が本明細書中で明確に参照として援用される。
【図１】
2011516423.tif 000032
【図２】
2011516423.tif 000033
【図３】
2011516423.tif 000034
【図４】
2011516423.tif 000035
【図５】
2011516423.tif 000036
【図６】
2011516423.tif 000037
【図７】
2011516423.tif 000038
【図８】
2011516423.tif 000039
【図９】
2011516423.tif 000040
【配列表】
2011516423000001.app
【国際調査報告】
2011516423.tif 000041
2011516423.tif 000042
2011516423.tif 000043
2011516423.tif 000044
2011516423.tif 000045
2011516423.tif 000046
2011516423.tif 000047