(57)【要約】本発明は、アレルギー疾患の分野に関し、特に、患者の症状が特定のアレルゲンに対する過敏症に関係するのかを評価する方法に関する。さらに、本発明は、結合アッセイを分析する装置と使用するための該方法の工程を制御する手段を含むコンピュータプログラム・プロダクトに関する。また、本発明は、かかる装置にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における症状がアレルゲンまたはアレルゲン成分に対する過敏症に関係するか否かを評価するパラメータを得る方法であり、
−該患者から免疫グロブリンを含む体液試料を得；
−該アレルゲンまたはアレルゲン成分に特異的に結合する第１のタイプの免疫グロブリンの試料中の量を決定し；
−該アレルゲンまたはアレルゲン成分に特異的に結合する第２のタイプの免疫グロブリンの試料中の量を決定し；ついで
−該試料中の該第２のタイプの免疫グロブリンの量に対する該第１のタイプの免疫グロブリンの量を関係付ける
工程を含む該方法。
【請求項２】
該第１および第２のタイプの免疫グロブリンが、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMならびにそれらのサブクラスよりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
該第１および第２のタイプの免疫グロブリンが、IgGおよびIgEよりなる群から選択される請求項２記載の方法。
【請求項４】
該第１および第２のタイプの免疫グロブリンのうちの１つがサブタイプIgG4である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該試料中の該第１のタイプの免疫グロブリンの量を該第２のタイプの免疫グロブリンの量に関係付ける工程が、各々、該第１および第２の免疫グロブリンの量の間の比の形成を含む請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該第１のタイプの免疫グロブリンおよび／または第２のタイプの免疫グロブリンの量が、各々、血清免疫グロブリンの合計である請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
アレルゲンまたはアレルゲン成分が呼吸性アレルゲンまたはアレルゲン成分である請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
アレルゲンまたはアレルゲン成分が、ネコ、ゴキブリ、イヌ、ウマ、マウス、イネ科植物花粉、樹木の花粉、オリーブ花粉、ハウスダストのノミおよびカビのような動物および植物よりなる群から選択されるアレルゲン供給源に由来する請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
症状が、持続性の喘鳴、喘息、鼻炎、鼻結膜炎、湿疹または他のアレルギー関連もしくはアレルギー様症状よりなる群から選択される請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
対象の症状がアレルゲンに対する過敏症に関係しているか否かを評価する方法であって、
−請求項１ないし９のいずれか１項に係る方法に従ってパラメータの値を得；
−該パラメータの得られた値を該パラメーターと該アレルゲンに対する過敏症との間の所定の相関に関係付けることによって、該患者について該アレルゲンに対する過敏症の確率を指定する
工程を含む該方法。
【請求項１１】
対象の症状がアレルゲンに対する過敏症に関係しているか否かを評価する方法であって、
−請求項１ないし９のいずれか１項に係る方法に従ってパラメータを得；
−得られたパラメータの値を該パラメータの少なくとも１の以前に決定した値と比較し、ここに以前に決定した値はその次にアレルゲンに対する過敏症に関係付けるべき症状についての確率スコアに結合し；ついで
−得られた値と該パラメータについて以前に決定した値との比較に基づいて、過敏症に関係付けるべき症状の確率が、該以前に決定した値に結合した確率スコアよりも高いか低いかを評価する
工程を含む該方法。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に係る方法の工程を制御するために適用するソフトウェアコード手段を含む、結合アッセイを分析するための装置と結合するプロセシング手段の内部メモリーに直接的にロード可能なコンピュータプログラム・プロダクト。
【請求項１３】
結合アッセイを分析する装置であって、
−アレルゲンに特異的に結合する第１のタイプの免疫グロブリンの量を表す値を受けるための手段（10）；
−該アレルゲンに特異的に結合する第２のタイプの免疫グロブリンの量を表す値を受けるための手段（11）；および
−該試料中の該第２のタイプの免疫グロブリンの量に該第１のタイプの免疫グロブリンの量を関係付けるための手段（20）；および
−該第１および第２のタイプの免疫グロブリンの間の関係を使用者に伝達するための手段（30）を含む該装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー疾患の分野に関し、特に、患者の症状が特定のアレルゲンに対する過敏症に関係するのかを評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
個人がアレルゲンに曝露した場合のアレルギー疾患にアレルゲン特異的IgE抗体が関連していることはよく知られている。本発明者らは、絶対的な特異的IgE抗体レベルが、特異的IgEの存在だけというより、IgE−媒介感作と呼吸器系症状との間の関係に関するより多くの情報を提供することを以前に示している。本発明者らは、全IgEが特異的IgEの合計よりも喘鳴（wheeze）の不充分な予報であることを見出した。これらのデータは、任意のカットオフに基づいて対象が感作しているか否かを標識することは、喘鳴に対するその関係で二分しない特性を単純化しすぎることであることを示唆していた。ある種の状況下では、関連性は小さく、特に免疫療法後のような免疫系の強力な刺激の後においては関連性は小さい。さらに、家畜、特にネコに対する強力な曝露の後には、関連性が顕著でなくなる。このことの説明としては、重度の曝露はIgE刺激をオーバーロードし、より多くのIgG4抗体およびより少ないIgE抗体の産生を伴う別のTh2応答に向け得るということである。さらに、このことは、IgE抗体の二分の使用を、結果が是非となるように単純化しすぎるという見方を強調している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
第１の態様において、本発明は、対象における症状がアレルゲンまたはアレルゲン成分に対する過敏症に関連するか否かを評価するパラメータを得る方法に関し、方法は、
−該患者から免疫グロブリンを含む体液試料を得；
−該アレルゲンまたはアレルゲン成分に特異的に結合する第１のタイプの免疫グロブリンの試料中の量を決定し；
−該アレルゲンまたはアレルゲン成分に特異的に結合する第２のタイプの免疫グロブリンの試料中の量を決定し；ついで
−該試料中の該第２のタイプの免疫グロブリンの量に対する該第１のタイプの免疫グロブリンの量を関係付ける
工程を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の好ましい形態において、該第１および第２のタイプの免疫グロブリンは、IgGまたはIgE、またはIgG4のような、それらのサブタイプのような、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMよりなる群から選択される。
【０００５】
本発明の好ましい形態において、該試料中の該第２のタイプの免疫グロブリンの量に対する該第１のタイプの免疫グロブリンの量を関係付ける工程は、該第１および第２のタイプの免疫グロブリンの量の間の比を各々形成することを含む。
【０００６】
本発明の１の形態において、該第１および／第２のタイプの免疫グロブリンの量は、各々、血清免疫グロブリンの合計である。
【０００７】
アレルゲンは、好ましくは呼吸性アレルゲンであり、動物および植物、例えばネコ、ゴキブリ、イヌ、マウス、イネ科植物花粉、樹木の花粉、ウマ、ハウスダストのノミ、カビおよび／またはオリーブ花粉のような多数のアレルゲン供給源から生じ得る。
【０００８】
症状は、持続性の喘鳴、喘息、鼻炎、鼻結膜炎、湿疹ほかのようないずれかのアレルギー様またはアレルギー関連症状とし得る。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、対象の症状がアレルゲンに対する過敏症に関係しているか否かを評価する方法に関し、方法は、
−第１の態様に係る方法に従ってパラメータを得；
−該パラメータの得られた値を該パラメーターと該アレルゲンに対する過敏症との間の所定の相関に関係付けることによって、該患者について該アレルゲンに対する過敏症の確率を指定する
工程を含む。
【００１０】
第３の態様において、本発明は、対象の症状がアレルゲンに対する過敏症に関係しているか否かを評価する方法に関し、方法は、
−第１の態様に係る方法に従ってパラメータを得；
−得られたパラメータの値を該パラメータの少なくとも１の以前に決定した値と比較し、ここに以前に決定した値はその次にアレルゲンに対する過敏症に関係付けるべき症状についての確率スコアに結合し；ついで
−得られた値と該パラメータについて以前に決定した値との比較に基づいて、過敏症に関係付けるべき症状の確率が、該以前に決定した値に結合した確率スコアよりも高いか低いかを評価する
工程を含む。
【００１１】
前記した態様における対象は、ヒトまたは動物のいずれかとし得る。
【００１２】
対象からの試料中の免疫グロブリンの定量は、当該技術分野で使用されている従来の方法によって、例えば、ImmunoCAP（Phadia AB, Uppsala, Sweden）、ELISAのようなイムノアッセイ、マイクロアレイほかによって、行い得る。
【００１３】
第４の態様において、本発明は、第１または第２の態様に係る方法の工程を制御するために適用するソフトウェアコード手段を含む、結合アッセイを分析するための装置と結合するプロセシング手段の内部メモリーに直接的にロード可能なコンピュータプログラム・プロダクト（computer program products）に関する。
【００１４】
第５の態様において、本発明は、結合アッセイを分析する装置に関し、該装置は、第１または第２の態様に係る方法を行うように適合され、
−アレルゲンに特異的に結合する第１のタイプの免疫グロブリンの量を表す値を受けるための手段（10）；
−該アレルゲンに特異的に結合する第２のタイプの免疫グロブリンの量を表す値を受けるための手段（11）；および
−該第１および第２のタイプの免疫グロブリンの間の関係を使用者に伝達するための手段（30）を含む。
【００１５】
かかる装置の概略図を図５に示す。前記した手段は、典型的には装置のデジタルプロセシング部分中のソフトウェア規定機能手段、すなわち必ずしも物理的存在ではない、とみなすべきであろう。装置はデスクトップコンピュータのような１の物理的装置に入れることができるが、異なる場所に位置するサーバーのような多数の物理的装置にわたって分配してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】所与のネコ−特異的IgE値と多変量ロジスティック回帰分析から導いたFel d 1−特異的IgG値の持続性の喘鳴（persistent wheeze）の近似予想確率曲線である。ネコに対するより高いIgE抗体レベルは、より低いIgG抗体レベルが存在するアレルギー疾患、喘鳴または喘息のより高い確率と関係付けられる。IgG抗体レベルが高ければ高い程、この関係は減少する。
【図２】所与のネコ−特異的IgE値と多変量ロジスティック回帰分析から導いたFed d 1-特異的IgG4値の持続性の喘鳴の近似予想確率曲線である。ネコに対するより高いIgE抗体レベルは、アレルギー疾患、喘鳴または喘息のより高い確率と関係付けられる。IgG4抗体レベルが高くても、この関係は変化しない。
【図３】5年間の累積的なFel d 1曝露、ネコ−特異的IgE値および多変量ロジスティック回帰分析から導いたFed d 1−特異的IgG値の間の近似予想確率曲線である。ネコに対する曝露が高ければ高い程、IgEおよびIgG抗体のより高いレベルと関係している。
【図４】5年間の累積的なFel d 1曝露、ネコ−特異的IgE値および多変量ロジスティック回帰分析から導いたFed d 1−特異的IgG4値の間の近似予想確率曲線である。ネコに対する曝露が高ければ高い程、IgEおよびIgG4抗体のより高いレベルと関係している。
【図５】本発明の第５の態様に係る装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
アレルゲン源とは、本明細書において、それからアレルゲンが由来するネコ、イヌ、カバノキほかのような生物と解釈されるべきである。
【００１８】
アレルゲンとは、本明細書において、イネ科草本の花粉またはイヌの鱗屑ほかからの抽出物のような、アレルゲン源に由来する減感作する環境因子として解釈されるべきである。
【００１９】
アレルゲン成分とは、本明細書において、ネコからのFel d 1、オオアワガエリからのPhl p 1ほかのようなアレルゲンの成分である単離されたまたは組換え産生した分子として解釈されるべきである。
【００２０】
発明の詳細な説明
以下の実施例において本発明をさらに説明し、ここで、アレルゲンはネコ由来であり、免疫グロブリンはIgG、IgG4およびIgEであり、過敏症に関係する症状は喘鳴である。この実施例は本発明の範囲を限定するものと考えてはならず、本発明の範囲は添付する特許請求の範囲によって規定される。
【００２１】
実施例
実施例１
方法
実験集団
Manchester asthma and allergy studyは、他に詳細に記載されている、任意抽出集団に基づく出生コホート研究である（12、13）。対象は、すべての妊娠女性（最初の妊娠3ヶ月）を適格性についてスクリーニングした場合の出産前クリニックから募集した。両親には問診および皮膚プリックテストを行った。子供は将来を見越して追跡し、3歳時および5歳時（±4週間）に検査診断に出席させた。研究は、Local Research Ethics Committeeによって認められた。対象の家族からは書面でインフォームド・コンセントを得、子供に同意を得た。
【００２２】
この集団に基づく観察出生コホートにおける保有は優れたが、本発明者らは対象のほぼ半分からのデータを分析した（主として、子供が静脈穿刺を拒絶したためである）。本発明者らは、いずれの関連したパラメータにおいても分析において子供間の相違は全く排除することやまたは含めていないことを強調する。さらに、子供の親の中のアレルギー感作の罹患率は、UK21における十代の若者のものと同様であり、このことは対象が一般大衆の代表であることを示唆している。
【００２３】
結果
症状：確認した質問（14）は、インタビュアーが施して親からとして報告された症状、医師が診断した病気および受けた治療に対する情報を収集した。子供は、5歳時の先の12ヶ月に喘鳴を有していた場合には最近喘鳴を有していたと定義した。また、本発明者らは、2の追跡（15）の喘鳴の履歴に従って異なる喘鳴の表現型に子供を割り当てた：
喘鳴なし−出生の最初の3年間に喘鳴がなく、5歳までにかつて喘鳴がない；
一過性の早期の喘鳴−最初の３年間に喘鳴があり、5歳の先の12ヶ月に喘鳴がない；
後期開始の喘鳴−最初の3年間に喘鳴がなく、5歳の先の12ヶ月に喘鳴がある；
持続性の喘鳴−最初の3年間に喘鳴があり、5歳の先の12ヶ月に喘鳴がある。
【００２４】
抗体測定
アレルゲン特異的抗体レベルは、製造業者に従ってImmunoCAP（商標）アッセイ（Phadia AB, Uppsala, Sweden）を用いて決定した。IgE抗体の決定については、ノミおよびネコの全アレルゲン抽出物の市販の試薬を用いた。一貫して、アッセイの再現性および精度は非常に良好と報告されている（18）。
【００２５】
特異的IgG抗体測定については、純粋なrFed d 1  Allergen  ImmunoCAPを用いた。rFel d 1はPhadia ABによって製造され、つづいて、CNBr法によって活性化した可撓性で親水性のセルローススポンジポリマーマトリクスの固相に結合した。以前に記載されている（18）標準的な簡易法に従って、精製した成分をタンパク質のアミノ基を介して活性化した固相に共有結合した。
【００２６】
環境曝露
出生直後ならびに3歳時および5歳時に本発明者らは家庭を訪問した。子供のベッド、子供寝室の床、両親のベッドおよびラウンジの床からのダスト試料を、標準化した様式で1ｍ２のエリアを2分間吸引することによって各機会に収集した。Fel d 1は以前に記載されている（21）酵素結合免疫アッセイを用いてアッセイした。結果をアレルゲン濃度（μg／g）として表す。本発明者らは、3の時点の4の場所におけるアレルゲンレベルの合計として最初の5年間にわたる累積アレルゲン曝露を見積もった（すなわち、アレルゲン曝露の12の別の測定）。
【００２７】
統計方法
主な結果の測定は、5歳時における「持続性の喘鳴」であった。抗体応答と結果測定との関係は、ロジスティック回帰を用いて分析した。オッズ比（OR）は回帰モデルを用いて推定し、95％信頼区間（95％CI）は有意確率として0.05のp−値を用いてWaldに従って作成した。近似予想確率曲線は、ロジスティック回帰からの結果を用いてプロットした。特異的抗体のレベルを分析の前に対数変換（logarithmic transformation）に付し；ORを増加する抗体レベルと相関する増大または減少した危険性を表す異なる抗体レベルについて示す。対数変換を用いたため、すべての計算は対数スケール、すなわちORをexp(r*b)およびrと推定し、ある種の抗体レベルと抗体の不存在を示すレベルとの間の距離をr=ln（x2）-ln（x1）と定義した。Fel d 1曝露と抗体レベルとの間の関係は、線形回帰分析を用いて確認した。計算化した統計分析はSAS System V8.01を用いて行った。
【００２８】
結果
参加することに同意した1211の夫婦のうち1085は首尾よい月満ちた妊娠を有し（>36週の妊娠期間；子供に集中治療を施す必要がなかった）、さらなる追跡に同意した。これらのうち、128は出生前に環境制御に無作為化し（19、20）（この分析から除外した）、957の子供を観察コホートで追跡した。観察コホートの子供のうち、840（87.8％）が5年間の追跡に出席した。これらの子供はすべて質問データを有しており、540は抗体測定のための血液試料を提供した（62％）。
【００２９】
除外した子供は家族履歴、両親の喫煙、母の年齢、社会経済的ステータス、懐胎年齢、出生時体重、喘鳴の履歴および皮膚テスト結果に関して含まれる子供と何ら異ならなかった。5歳時の最近の喘鳴は114の子供の両親によって報告され（21.9%）；257の子供は喘鳴を経験しておらず、107は一過性の早期の喘鳴を有し、26は後期開始の喘鳴を有し、70は持続性の喘鳴を有していた（61の子供は4の喘鳴の表現型のうちの1に分類することができなかった）。
【００３０】
多変量
しかしながら、この効果はFel d 1−特異的IgG抗体によって顕著に改善した。特異的IgEの効果の程度は、Fel d 1−特異的IgGが増加するに従って減少した。例えば、50kUA／LのネコIgEを有する持続性の喘鳴の予想確率は0.82であり、Fel d 1に対するIgGが低い、2mg／Lの場合は7.4のOR（95％  CI  5.9−9.1）に対応し；これは、Fel d 1に対するIgG抗体レベルが6mg／Lまで増加した場合は2.5のOR（95％  CI  1.5−4.4）まで減少した。Fel d 1−特的IgG4はネコ−特異的IgEのレベルと持続性の喘鳴との間の関係を改変しなかった（図4）。
【００３１】
ディスカッション
アレルゲンに対する曝露がIgE、IgGおよびIgG4抗体の産生につながり得ることはよく知られている。感受性の個人においては、IgE抗体レベルはアレルゲンに対する曝露によって引き金が引かれる臨床上の疾患とほとんど相関する。しかしながら、大量の曝露はIgGおよびIgG4抗体形成につながり得るが疾患の発現につながり得ないこともよく知られている。本発明は、IgE抗体と臨床上の疾患との間の相関に対するIgG抗体の負の影響を定量的に確立するが、IgG4抗体は確立しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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