(57)【要約】  本発明は、（ａ）配列番号１の配列又はそのアミノ酸類似体配列を有するペプチドと、（ｂ）前記ペプチド又はアミノ酸類似体配列の骨格と、を有する、止血又は組織シール材料に関する。この骨格は、止血性、例えば、天然若しくは遺伝子工学による吸収性ポリマー、合成の吸収性ポリマー、又はこれらの組み合わせであることが好ましい。天然又は遺伝子工学による吸収性ポリマーは、タンパク質と、多糖と、又はこれらの組み合わせと、からなる群より選択されてもよい。
2014523312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１の配列又はそのアミノ酸類似体配列を有するペプチドと、
（ｂ）骨格と、を含む、止血又は組織シール材料。
【請求項２】
前記骨格は、天然若しくは遺伝子工学による吸収性ポリマー、合成吸収性ポリマー、又はこれらの組み合わせである、請求項１に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項３】
前記天然若しくは遺伝子工学による吸収性ポリマーは、タンパク質と、多糖と、これらの組み合わせと、からなる群より選択される、請求項２に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項４】
前記タンパク質は、プロトロンビンと、トロンビンと、フィブリノゲンと、フィブリンと、フィブロネクチンと、ヘパリナーゼと、第Ｘ／Ｘａ因子と、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子と、第ＩＸ／ＩＸａ因子と、第ＸＩ／ＸＩａ因子と、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子と、組織因子と、バトロキソビンと、アンクロッドと、エカリンと、フォンビルブラント因子と、コラーゲンと、エラスチンと、アルブミンと、ゼラチンと、血小板表面糖タンパク質と、バソプレシンと、バソプレシン類似体と、エピネフリンと、セレクチンと、凝血促進毒素と、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤と、血小板活性化剤と、ペプチドと、これらの組み合わせと、からなる群より選択される、請求項３に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項５】
前記多糖は、セルロースと、アルキルセルロースと、メチルセルロースと、アルキルヒドロキシアルキルセルロースと、ヒドロキシアルキルセルロースと、セルロース硫酸と、カルボキシメチルセルロースの塩と、カルボキシメチルセルロースと、カルボキシエチルセルロースと、キチンと、カルボキシメチルキチンと、ヒアルロン酸と、ヒアルロン酸の塩と、アルギネートと、アルギン酸と、アルギン酸プロピレングリコールと、グリコーゲンと、デキストランと、デキストラン硫酸と、カードランと、ペクチンと、プルランと、キサンタンと、コンドロイチンと、コンドロイチン硫酸と、カルボキシメチルデキストランと、カルボキシメチルキトサンと、キトサンと、ヘパリンと、ヘパリン硫酸と、ヘパランと、ヘパラン硫酸と、デルマタン硫酸と、ケラタン硫酸と、カラギーナンと、キトサンと、デンプンと、アミロースと、アミロペクチンと、ポリ−Ｎ−グルコサミンと、ポリマンヌロン酸と、ポリグルクロン酸と、ポリグルロン酸と、前記多糖の誘導体と、これらの組み合わせと、からなる群より選択される、請求項３に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項６】
前記合成吸収性ポリマーは、脂肪族ポリエステルポリマー、脂肪族ポリエステル共重合体、又はこれらの組み合わせである、請求項２に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項７】
ゼラチンは、吸収性止血粉末マトリックス、スポンジマトリックス、ペーストマトリックス、ゲルマトリックス、又はこれらの組み合わせを含む、請求項４に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項８】
ゼラチンは、架橋され、かつ、液体担体を備える粒子形態にある、請求項７に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項９】
生理食塩水を更に含み、ゼラチンと前記ペプチドとは、液相としての前記生理食塩水と共に略均一に混合される、請求項７に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項１０】
前記止血材料中の前記ペプチドの濃度は、約０．００２５ｍＭ〜約１．２５ｍＭである、請求項９に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項１１】
抗菌剤と、界面活性剤と、抗酸化剤と、保湿剤と、湿潤剤と、滑剤と、増粘剤と、希釈剤と、照射スタビライザーと、これらの組み合わせと、からなる群より選択される１つ又は２つ以上の添加剤又は化合物を有効量で更に含む、請求項１０に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項１２】
押出しを増進する量のグリセリンを更に含む、請求項１１に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項１３】
前記ペプチドは、生体適合性のポリマーに接合される、請求項２に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項１４】
前記生体適合性のポリマーは、親水性ポリマーである、請求項１３に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項１５】
前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールと、ポリエチレングリコールの誘導体と、ポリプロピレングリコールと、多糖と、変性多糖と、タンパク質と、変性タンパク質と、ペプチドと、ポリラクチドグリコリドと、カプロラクトンと、トリメチレンカーボネートと、デンプンと、加工デンプンと、ゼラチンと、コラーゲンと、これらの組み合わせと、からなる群より選択される、請求項１４に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項１６】
前記親水性ポリマーは、迅速な止血又は迅速な組織シールを提供するように選択される分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項１４に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項１７】
前記ポリエチレングリコール分子は、線状分子、枝分れ分子、星型の分子、又はこれらの組み合わせである、請求項１６に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項１８】
前記分子量は、平均で、約１．６６×１０−２４ｋｇ〜約１．３３×１０−２３ｋｇ（約１０００ダルトン〜約８０００ダルトン）である、請求項１７に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項１９】
前記分子量は、平均で３．３２×１０−２４ｋｇ（２０００ダルトン）である、請求項１７に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項２０】
前記分子量は、平均で８．３０×１０−２４ｋｇ（５０００ダルトン）である、請求項１７に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項２１】
前記止血材料中の前記ペプチドの濃度は、約０．００２５ｍＭ〜約１．２５ｍＭであり、前記ポリエチレングリコールの分子量は、約３．３２×１０−２４ｋｇ〜約８．３０×１０−２４ｋｇ（約２０００〜約５０００ダルトン）である、請求項１７に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項２２】
前記アミノ酸類似体配列は、アミノ酸のうちの少なくとも１つが対応する類似体アミノ酸で置換された前記配列番号１の配列から得られる、請求項１に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項２３】
前記アミノ酸類似体配列は、配列番号２と、配列番号３と、配列番号４と、配列番号５と、これらの組み合わせと、からなる群より選択される、請求項２２に記載の止血又は組織シール材料。
【請求項２４】
止血又は組織シール材料を製造する方法であって、
（ａ）配列番号１の配列又はそのアミノ酸類似体配列を有するペプチドを提供する工程であって、前記ペプチドは、任意に、ポリエチレングリコールに接合される、工程と、
（ｂ）吸収性骨格を提供する工程と、
（ｃ）前記止血又は組織シール材料を略均一に形成する前記ペプチド及び前記吸収性骨格を混合する工程と、を含む、方法。
【請求項２５】
前記ペプチドは、ポリエチレングリコールに接合され、前記止血材料中の前記ペプチドの濃度は、約０．００２５ｍＭ〜約１．２５ｍＭであり、前記ポリエチレングリコールの分子量は、約３．３２×１０−２４ｋｇ〜約８．３０×１０−２４ｋｇ（約２０００〜約５０００ダルトン）である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記止血材料又は組織シール材料は、ヘパリン化血液を有する患者又は凝固阻止剤若しくは凝集阻止剤を含む患者に用いられる、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）
本出願は、ＥＦＳ−ウェブを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、その全体は、参照文献として本願に援用されるものである。２０１１年６月２８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、「ＥＴＨ５６２３．ｔｘｔ」というファイル名で、サイズは４，９１２バイトである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、止血を促進する試剤及び装置並びに組織シール材料に関し、特に、例えば、ゼラチンベースの止血骨格等の骨格とともに強い止血性及び組織シール性を有する合成ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
血液とは、液相中に分散した赤血球、白血球、小体、及び血小板を含む、液体の組織である。この液相は血漿であり、血漿は、酸性物質、脂質、溶解した電解質、及びタンパク質を含んでいる。この液相中に懸濁する特定のタンパク質がフィブリノゲンである。出血が発生したとき、フィブリノゲンは水及びトロンビン（酵素）と反応してフィブリンを形成するが、このフィブリンは血液に不溶であり、重合して血餅を形成する。
【０００４】
多種多様な状況において、ヒトを含む動物は、創傷が原因で又は外科的処置の間に出血に見舞われ得る。いくつかの状況においては、出血は比較的軽いものであり、通常の血液凝固作用が、簡単な応急処置の実施に加われば、それだけで十分である。他の状況においては、相当な出血が発生し得る。これらの局面では通常、専門的な設備及び物資、並びに適切な救助を施すように訓練された人員が必要となる。
【０００５】
上述の問題に対処する取り組みにおいて、過剰な出血を抑制するための物質が開発されてきた。
【０００６】
ゼラチン、コラーゲン、酸化セルロース、トロンビン、フィブリノゲンなどの既知の物質、及び他の物質が使用されてきたが、これらの物質の各々にはそれぞれ限界がある。例えば、従来技術による血液凝固物質のうちのある種類は、フィブリノゲン及び／又はトロンビンを含めて、血液由来タンパク質又は酵素であるが、それらは高価であり、特殊な保存条件を必要とし、また、血液感染症が伝染する可能性を排除するために徹底した精製を要求する。
【０００７】
トロンビン生物学的活性を維持するために、液体トロンビンを含む止血装置は、特殊な扱いを要求する。例えば、液体トロンビンは、シェルライフ安定度を維持するため、冷凍を必要とする。動物又はヒトに由来のトロンビンを用いる時に、汚染や免疫原性のリスクがあるため、安全性も懸念される。更に、ヒト又は動物の血漿から精製されるトロンビン及びフィブリノゲンは、非常にコストのかかるものである。したがって、シェルライフ安定性が高く、ウイルスその他の汚染リスクが低く、免疫原性が低く低コストで、ヘパリン化された血液中でも有用な、新しい止血剤を開発することが有利である。
【０００８】
ヒトタンパクトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）及びこれに関連したペプチドは、脈管形成及び血小板凝集に用いられると文献に記載されている。ＴＳＰ−１は、ホモ三量体のグリコプロテイン（ＭＷ〜４５０Ｋ）であり、最初は血小板中に発見されたトロンビン感応タンパクである。
【０００９】
論文「Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１（ＴＳＰ１）ｉｎ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｂｏｎｎｅｆｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６５（２００８）７１３〜７２７には、脈管形成、炎症、創傷治ゆ及び止血にＴＳＰ１が用いられることが記載され、また更に、ＴＳＰ１の構造及びドメインの他に、アミノ酸（配列番号１）ペプチドをＣＤ４７に結合することが教示されている。
【００１０】
論文「Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｈｅ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬＡＴ  ｂｕｔ  ｉｓ  ｌａｒｇｅｌｙ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ａｌｐｈａＩＩｂ／ｂｅｔａ３」，Ｔｒｕｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，２００３  Ｆｅｂ；１（２）：３２０〜９には、血小板活性化中にトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ１）が豊富に分泌され、不可逆の血小板凝集の役割を担うことが教示されている。ＴＳＰ１のＣ末端ドメインに由来するペプチド、配列番号１は、インテグリン関連タンパクへの結合を介して、ヒト血小板の少なくとも一部を活性化することができる。
【００１１】
論文「Ｔｈｒｏｍｂｓｐｏｎｄｉｎ  Ａｃｔｓ  ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  Ａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  αＩＩｂｂ３」，Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９７；２７２  Ｎｏ．２３，Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ｊｕｎｅ  ６，ｐｐ．１４７４０〜１４７４６には、ＣＢＤからのペプチド、配列番号２（４Ｎ１Ｋ）がＩＡＰ作用物質として認識されることが教示されている。ＴＳ１、ＣＢＤ、及びＴＳ１のＣＢＤからのＩＡＰ作用物質ペプチド（４Ｎ１Ｋ）は、血小板インテグリンａＩＩｂｂ３を活性化することにより、血小板が固定化フィブリノゲン上を拡散し、血小板凝集が刺激作用を発揮し、また、焦点接着キナーゼのチロシンリン酸化が進む。
【００１２】
論文「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ」Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，７２，１０９〜１１５（１９８８）では、止血へのＴＳＰの役割はよく理解されないものの、ＴＳＰは、血小板−フィブリノゲン凝集体を架橋して、フィブリンクロット発生を安定させフィブリン溶解反応を調整すると仮定し、ＴＳＰは、血小板粘着を抑制することにより止血の制御作用を持つことができ、非血栓形成表面を提供することができることを示唆する研究を行ったことが教示される。
【００１３】
論文「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１  ａｃｔｓ  ｖｉａ  ＩＡＰ／ＣＤ４７  ｔｏ  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｉｎ  ａｌｐｈａ２ｂｅｔａ１〜ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１９９９  Ｊｕｌ  １５；９４（２）：６４２〜８には、ＣＢＤに由来するＣＤ４７作用物質ペプチド４Ｎ１Ｋ（配列番号２）が、可溶性コラーゲンとの相乗作用を生じさせて血小板の豊富な血漿を凝集させることが記載されている。また、４Ｎ１Ｋ及び損われていないＴＳ１は、洗浄済で未撹拌の血小板を、固定コラーゲン上で凝集させチロシンリン酸化を迅速に増加させる。
【００１４】
論文「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」，Ｄｏｒａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９７；２７２：１３２３〜１３３０では、トロンボスポンジンのカルボキシル末端からのペプチド、配列番号１が、直接的かつ特異的に、５〜２５ｍＭの濃度の異なるドナーからの洗浄済ヒト血小板の活性化及び凝集を引き起こすことを教示する。低い濃度では、ペプチドは、ＡＤＰの次善の濃度に相乗作用を与え、凝集を誘導する。単クローン抗体によるペプチドアフィニティークロマトグラフィー及び免疫沈降を用いて、カルボキシル末端ペプチド用レセプタを、インテグリン関連タンパクとして識別した。５ｍＭのＥＤＴＡの存在下で混合されたペプチドで洗浄したとき、インテグリン関連タンパクは、ペプチドコラムを含む配列番号１に結合して残留し、二価のカチオンから独立した結合を示す。インテグリン関連タンパクは、残存血小板の表面のトロンボスポンジンに対するプライマリーレセプタであり、血小板凝集に応答する可能性を与えるものであると提案される。
【００１５】
論文「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＤ４７）ｐｈｙｓｉｃａｌｌｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｓ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｌｐｈａＩＩｂｂｅｔａ３  ｂｙ  ｉｔｓ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ」，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３；２７８：２６６５５〜２６６６５は、Ｃ末端細胞結合ドメインからのペプチド、配列番号２（４Ｎ１Ｋ）は、ＩＡＰに結合し、血小板凝集を含むインテグリン依存細胞機能を刺激することを教示する。ＡＤＰ又はコラーゲンで引き起こされた血小板応答は、完全に抑制されたものの、４Ｎ１Ｋによって引き起こされる血小板凝集は、アジ化ナトリウム及び２−デオキシ−Ｄ−グルコースによるエネルギー減損によっては完全に抑制出来なかった。
【００１６】
論文「Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｈａｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｂｙ  ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ」Ｔｕｌａｓｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００１；９８：３３４６〜３３５２には、トロンボスポンジン−１のＣ末端ドメインからのペプチド（Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（配列番号１）、４Ｎ１−１として知られる）が、血小板凝集を引き起こし、ＣＤ４７としても知られるインテグリン関連タンパク（ＩＡＰ）と結合することが報告されたことを教示する。４Ｎ１−１又はその誘導体ペプチド４Ｎ１Ｋが、ヒト血小板中のＦｃレセプタ（ＦｃＲ）ｇ鎖、Ｓｙｋ、ＳＬＰ−７６、及びホスホリパーゼＣ  ｇ２の迅速なリン酸化を引き起こすことが発見された。上記文献では、トロンボスポンジンのＣ末端ペプチドは、ＦｃＲ  ｇ鎖シグナリング経路を通して及び凝集作用を通して血小板凝集を引き起こすことが教示されている。
【００１７】
論文「Ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｂｕｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃｅｌｌｓ」，Ｖｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００３；５４４：２４０〜２４５には、トロンボスポンジン−１（４Ｎ１−１）のＣ末端ドメインからのペプチドが提案され、これにより、活性化に依存しない凝集作用と、活性化に依存するグリコプロテイン（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａの介在した凝集作用であってＧＰＶＩシグナリングを用いるがＣＤ４７は用いない凝集作用との、両方を伴う新しい機構によって、血小板凝集を刺激することが教示される。この研究では、４Ｎ１−１は、ＧＰＶＩ作用物質コンブルキシンとは信号伝達経路の異なるパターンを刺激したことが実証された。更に、４Ｎ１−１で生じた血小板凝集は、活性化に依存せず、ＧＰＶＩ又はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに依存していなかった。４Ｎ１−１はまた、異なる巨核球及び非巨核球細胞の活性化に依存しない凝集作用を刺激した。４Ｎ１−１細胞凝集作用を誘発したものの、血小板シグナリングは、反ＣＤ４７抗体によって抑制された。
【００１８】
論文「Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１，ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ，ａｎｄ  ＧＰＩＩｂＩＩＩａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ」Ｂｏｎｎｅｆｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１；２７６：５６０５〜５６１２では、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ）は、血小板α顆粒からの分泌の後に血小板凝集に作用するが、しかしその作用様式はあまり理解されていないことを教示する。この研究では、ＴＳＰのキャパシティーを評価し、フィブリノゲン（Ｆｇ）に対する相互作用を通じて血小板間連結架橋を形成するが、その際、Ｆｇコーティングのビーズ又はビーズ上又は活性化固定血小板（ＡＦＰ）上で固定される活性化ＧＰＩＩｂＩＩＩａインテグリン（ＧＰＩＩｂＩＩＩａ＊）に結合されるＦｇのいずれかを用いており、すなわち、血小板シグナリング及び分泌機構が無いシステムにおいて行われる。
【００１９】
Ｆｒａｚｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，３９９，６６７号、発明の名称「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ」には、トロンボスポンジン１のレセプタに結合する新規なショートペプチドが教示されるが、それは、好ましくは５つのアミノ酸残基を有しており、それは、テトラペプチドＡｒｇ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ（配列番号２０）を共有し、特異的な配列を有する。上記特許は更に、トロンボスポンジン１レセプタに結合するＶＶＭ含有ペプチドを教示し、このレセプタは、ＲＦＹＶＶＭＷＫＱＶＴＱＳ（配列番号８）（上記米国特許５，３９９，６６７号の配列番号１）及び少なくとも配列番号３及び配列番号４の配列を含むそのフラグメント、及び少なくとも配列番号５の配列を含むそのフラグメントからなる群より選択される。
【００２０】
Ｊａｃｏｂ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，１９０，９２０号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎａｌｏｇｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」は、一般に、トロンボスポンジン類似の活性を保持するペプチドフラグメント及びトロンボスポンジン（ＴＳＰ）の合成類似体に関するものである。フラグメントを備える化合物及び組成物並びにトロンボスポンジン類似活性を促進又は抑制するトロンボスポンジンの合成類似体を用いる方法が提供されている。
【００２１】
Ｔｈａｄｄｅｕｓ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴ国際公開公報ＷＯ  １９９６／０４００３３には、生分解可能なマトリックスと、エプシロンアミノカプロン酸（ＥＡＣＡｓ）と、トロンビンレセプタ活性化ペプチド（ＴＲＡＰｓ）とから構成される止血パッチが記載される。本発明は、マトリックスとしてゼラチン、アルギネート、酸化再生セルロース、又はコラーゲンを含み、有効成分としてＥＡＣＡｓ、ＴＲＡＰｓ、カルシウム、ＲＧＤペプチド、及びカルシウムを含む多くの代表的な実施形態を開示する。開示された配列は、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号９）、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰ（配列番号１０）、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ（配列番号１１）、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹ（配列番号１２）、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫ（配列番号１３）、ＳＦＬＬＲＮＰＮＤ（配列番号１４）、ＳＦＬＬＲＮＰＮ（配列番号１５）、ＳＦＬＬＲＮＰ（配列番号１６）、ＳＦＬＬＲＮ（配列番号１７）、ＳＦＬＬＲ（配列番号１８）、ＳＦＬＬ（配列番号１９）、ＳＦＬ及びそれらの誘導体である。
【００２２】
Ｓｔｅｄｒｏｎｓｋｙの米国特許第７，２８５，５８０号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｉｍｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｓｅａｌａｎｔｓ」では、天然のタンパク質に加えて、組み換えにより生成される各種タンパク質も組織接着剤及びシーラントに使用することができることを教示する。上記の天然のタンパク質類を、組み換えにより生産することができるのみならず、架橋可能な非天然の各種組み換え型タンパク質を本明細書で使用することもできるであろう。好ましい非天然の組み換えにより生産されたタンパク質には、フィブロイン、エラスチン、コラーゲン、ケラチンなどの自然界で発生する構造タンパク質から天然に生じるアミノ酸配列ブロックの繰り返しユニットを有するタンパク質が含まれる。使用に好ましい繰返しユニットタンパク質には、ＳＥＬＰ８Ｋ、ＳＥＬＰ０Ｋ−ＣＳ１及びＳＥＬＰ０Ｋが含まれる。
【００２３】
Ｂｅｖｅｃ  ｅｔ  ａｌ．のＰＣＴ国際公開公報ＷＯ  ２００９／０４００３４号、発明の名称「ＵＳＥ  ＯＦ  Ａ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＡＳ  Ａ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＡＧＥＮＴ」は、癌、自己免疫性疾患、線維性疾患、炎症性疾患、神経変性疾患、感染症、肺病、心臓及び脈管の疾患及び代謝疾患予防並びに／又は治療を行うための治療試剤としての、ペプチド化合物Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨ（配列番号１）の使用に関するものであり、更に、好ましくは凍結乾燥又は液体緩衝液の形態の医薬品組成物、又は人工の母乳配合若しくはペプチドＡｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−ＯＨ（配列番号１）を含む母乳代用品の形態である医薬品組成物に関するものであり、これらは任意に、少なくとも１つの薬学上容認可能な担体、凍結保護物質、リオプロテクタント（lyoprotectant）、賦形剤及び／又は希釈剤と共に用いられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、（ａ）配列番号１の配列又はそのアミノ酸類似体配列を有するペプチドと、（ｂ）前記ペプチド又はアミノ酸類似体配列の骨格と、を有する、止血又は組織シール材料に関する。この骨格は、止血性、例えば、天然若しくは遺伝子工学による吸収性ポリマー、合成吸収性ポリマー、又はこれらの組み合わせであることが好ましい。天然若しくは遺伝子工学による吸収性ポリマーは、タンパク質と、多糖と、これらの組み合わせと、からなる群より選択されてもよい。タンパク質は、プロトロンビンと、トロンビンと、フィブリノゲンと、フィブリンと、フィブロネクチンと、ヘパリナーゼと、第Ｘ／Ｘａ因子と、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子と、第ＸＩ／ＸＩａ因子と、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子と、組織因子と、バトロキソビンと、アンクロッドと、エカリンと、フォンビルブラント因子と、コラーゲンと、エラスチンと、アルブミンと、ゼラチンと、血小板表面糖タンパク質と、バソプレシンと、バソプレシン類似体と、エピネフリンと、セレクチンと、凝血促進毒素と、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤と、血小板活性化剤と、ペプチドと、又はこれらの組み合わせと、からなる群より選択されてもよい。また多糖は、セルロースと、アルキルセルロースと、メチルセルロースと、アルキルヒドロキシアルキルセルロースと、ヒドロキシアルキルセルロースと、セルロース硫酸と、カルボキシメチルセルロースの塩と、カルボキシメチルセルロースと、カルボキシエチルセルロースと、キチンと、カルボキシメチルキチンと、ヒアルロン酸と、ヒアルロン酸の塩と、アルギネートと、アルギン酸と、アルギン酸プロピレングリコールと、グリコーゲンと、デキストランと、デキストラン硫酸と、カードランと、ペクチンと、プルランと、キサンタンと、コンドロイチンと、コンドロイチン硫酸と、カルボキシメチルデキストランと、カルボキシメチルキトサンと、キトサンと、ヘパリンと、ヘパリン硫酸と、ヘパランと、ヘパラン硫酸と、デルマタン硫酸と、ケラタン硫酸と、カラギーナンと、キトサンと、デンプンと、アミロースと、アミロペクチンと、ポリ−Ｎ−グルコサミンと、ポリマンヌロン酸と、ポリグルクロン酸と、ポリグルロン酸と、前記多糖の誘導体と、又はこれらの組み合わせと、からなる群より選択されてもよい。合成吸収性ポリマーは、脂肪族ポリエステルポリマー、脂肪族ポリエステル共重合体、又はこれらの組み合わせであってもよい。
【００２５】
ゼラチンは、吸収性止血粉末マトリックス、スポンジマトリックス、ペーストマトリックス、ゲルマトリックス、又はこれらの組み合わせの形であってもよい。更に、ゼラチンは架橋され、かつ、液体担体を備える粒子形態であってもよい。液体担体は、生理食塩水であってよく、生理食塩水中においてゼラチンとペプチド（又は複数のペプチド）とは、液相として生理食塩水と共に略均一に混合される。前記止血材料（粉末、スポンジ、ペースト又はゲル）中のペプチドの濃度は、約０．００２５ｍＭ〜約１．２５ｍＭである。１つ以上の添加剤又は化合物を、止血混合液に含ませてもよく、これは、抗菌剤と、界面活性剤と、抗酸化剤と、保湿剤と、湿潤剤と、滑剤と、増粘剤と、希釈剤と、照射スタビライザーと、からなる群より選択される。更に、押出しを増進する量のグリセリンを加えてもよい。
【００２６】
一具体例では、ペプチドは生体適合性のポリマーに接合される。生体適合性のポリマーは、親水性ポリマーであってもよく、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールの誘導体、ポリプロピレングリコール、多糖、変性多糖、タンパク質、変性タンパク質、ペプチド、ポリラクチドグリコリド、カプロラクトン、トリメチレンカーボネート、デンプン、加工デンプン、ゼラチン、コラーゲン、又はこれらの組み合わせであってもよい。
【００２７】
他の実施形態として、親水性ポリマーは、迅速な止血又は迅速な組織シールを提供するように選択される分子量を有するポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコール分子は、線状分子、枝分れ分子、星型の分子、又はこれらの組み合わせであってもよい。分子量は、平均で約１．６６×１０−２４ｋｇ〜約１．３３×１０−２３ｋｇ（約１０００ダルトン〜約８０００ダルトン）であってもよく、好ましくは、分子量は、平均で３．３２×１０−２４ｋｇ又は８．３０×１０−２４ｋｇ（２０００又は５０００ダルトン）である。
【００２８】
他の実施形態では、止血又は組織シール材料は、配列番号１の配列から得られるアミノ酸類似体配列を含み、少なくとも１つのアミノ酸が、対応する類似体アミノ酸で置換される。アミノ酸類似体配列は、配列番号２と、配列番号３と、配列番号４と、配列番号５と、これらの組み合わせと、からなる群より選択可能である。
【００２９】
また、本発明は、創傷部位に止血処理又は組織シールを提供する方法に関し、この方法は、（ａ）上記のように止血又は組織シール材料を形成する工程と、（ｂ）止血又は組織シール材料を創傷部位に塗布する工程と、を有している。
【００３０】
また、本発明は、止血又は組織シール材料を製造する方法に関し、この方法は、（ａ）配列番号１の配列又はそのアミノ酸類似体配列を有するペプチドを提供する工程であって、前記ペプチドは、任意に、ポリエチレングリコールに接合される、工程と、（ｂ）吸収性骨格を提供する工程と、（ｃ）止血又は組織シール材料を略均一に形成する前記ペプチド及び前記吸収性骨格を混合する工程と、を含む。
【００３１】
一具体例では、止血材料又は組織シール材料及び上記の方法が、ヘパリン化血液を有する患者又は凝固阻止剤若しくは凝集阻止剤を含む患者に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】数個の試験されたシステムに対する止血時間のデータを示す図である。
【図２】数個の試験されたシステムに対する止血時間のデータを示す図である。
【図３】数個の試験されたシステムに対する止血時間のデータを示す図である。
【図４】数個の試験されたシステムに対する止血時間のデータを示す図である。
【図５】数個の試験されたシステムに対する止血時間のデータを示す図である。
【図６】数個の試験されたシステムに対する止血時間のデータを示す図である。
【図７】ヘパリン化血液中、数個の試験されたシステムに対する止血時間に関するデータを示す図である。
【図８】血小板不活性化モデルにおける２つの試験されたシステムに対する止血時間に関するデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
アミノ酸及びペプチドは、通常、以下に示すように略記される。
【００３４】
【表１】
2014523312.tif 000003
【００３５】
本発明の実施形態によれば、配列ＲＦＹＶＶＭＷＫ（Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（配列番号１））を有する８−アミノ酸ペプチドは、ここではＲＫ−８（任意にＰＥＧ接合又はＰＥＧ化）とも称し、ヒトタンパクＴＳＰ−１に由来するものもあり、これは、骨格、好ましくは止血骨格材料と共に用いるときに、強い止血性及び／又は組織シール性を有することが見いだされた。
【００３６】
好ましい止血骨格は、天然若しくは遺伝子工学による吸収性ポリマー若しくは合成吸収性ポリマー、又はこれらの混合物である。天然若しくは遺伝子工学による吸収性ポリマーの例としては、タンパク質、多糖及びこれらの組み合わせが挙げられる。タンパク質とは、プロトロンビンと、トロンビンと、フィブリノゲンと、フィブリンと、フィブロネクチンと、ヘパリナーゼと、第Ｘ／Ｘａ因子と、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子と、第ＸＩ／ＸＩａ因子と、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子と、組織因子と、バトロキソビンと、アンクロッドと、エカリンと、フォンビルブラント因子と、コラーゲンと、エラスチンと、アルブミンと、ゼラチンと、血小板表面糖タンパク質と、バソプレシンと、バソプレシン類似体と、エピネフリンと、セレクチンと、凝血促進毒素と、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤と、血小板活性化剤と、止血活性を有する合成ペプチドと、及び／又はこれらの組み合わせと、を挙げることができるが、これらに限定されない。また多糖には、セルロース、アルキルセルロース、例えば、メチルセルロース、アルキルヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロース硫酸、カルボキシメチルセルロースの塩、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、カルボキシメチルキチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の塩、アルギネート、アルギン酸、アルギン酸プロピレングリコール、グリコーゲン、デキストラン、デキストラン硫酸、カードラン、ペクチン、プルラン、キサンタン、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸類、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルキトサン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、カラギーナン類、キトサン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、ポリ−Ｎ−グルコサミン、ポリマンヌロン酸、ポリグルクロン酸、ポリグルロン酸、及び上記のいずれかの誘導体を挙げることができる。合成の吸収性ポリマーの例としては、脂肪族ポリエステルポリマー、共重合体、及び／又はこれらの組み合わせを挙げることができる。脂肪族ポリエステルは、典型的には、乳酸、ラクチド（Ｌ−、Ｄ−、メソ形、及びＤ、Ｌ混合物を含む）、グリコール酸、グリコリド、ε−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン（１，４−ジオキサン−２−オン）、及びトリメチレンカーボネート（１，３−ジオキサン−２−オン）を含むが、これらに限定されないモノマーの開環重合において合成される。一具体例では、天然吸収性ポリマーは、例えば、粒子形態の架橋ゼラチンであるＥｔｈｉｃｏｎから入手可能なＳＵＲＧＩＦＬＯ（商標）ゼラチンであり、注射器等の供給装置の中で、液体担体及び気体成分と組み合わせられる。
【００３７】
一具体例では、アミノ酸類似体配列が用いられることにより、配列番号１の配列中のアミノ酸の少なくとも１つが、類似又はバイオ類似アミノ酸で置換される。類似又はバイオ類似アミノ酸の表は以下の通りである。
【００３８】
【表２】
2014523312.tif 000004
【００３９】
アミノ酸は、Ｌ型でも、Ｄ型でもよく、又はそれらの誘導体［例えば、疑似アミノ酸、官能基化アミノ酸（例えば、フッ化アミノ酸等）、ベータアミノ酸、ガンマアミノ酸等］であってもよい。配列番号１のペプチド配列の特に好ましい類似体ペプチドの例としては、以下の通りである。
ＫＲＦＹＶＶＭＷＫＫ
（Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号２））
ＲＦＹＶＶＭ（Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ（配列番号３））
ＦＩＲＶＶＭＹＥＧＫＫ
（Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号４））
ＩＲＶＶＭ（Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ（配列番号５））
【００４０】
本発明の実施形態によればペプチドは、生体適合性のポリマーに、より好ましくは親水性ポリマーに、任意に、接合される。親水性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールの誘導体、ポリプロピレングリコール、多糖、変性多糖、タンパク質、変性タンパク質、ポリペチド、ポリラクチドグリコリド、カプロラクトン、又はトリメチレンカーボネート、及び／又はこれらの組み合わせであってもよい。
【００４１】
本発明の実施形態によれば、止血用配列番号１の配列を含むアミノペプチドを、骨格形成（ゼラチン等の）と組み合わることで、以下の利点が提供される。配列番号１等の低分子量ペプチドは、トロンビン等の大型タンパク止血剤より安定であり、また、冷凍せず保存可能である。ペプチドの大規模生産は、組換えＤＮＡ技術又は化学ペプチド合成により可能であり、これら両方の方法とも、生物学的製剤（例えば、トロンビン）の精製より経済的である。ＰＥＧと接合されるアミノペプチド配列番号１及び類似ペプチドは、ペプチドの溶解性が良好であるという利点を有している。更に、ＰＥＧ化ペプチドは、止血剤よりも低い濃度でより有効であり、ヘパリン化血液中で高い作用を呈することが発見された。
【００４２】
本発明は更に、出血部位に止血処理をもたらす方法に関するものであり、その方法は、上述した止血製剤を形成する工程と、出血部位にその止血製剤を塗布する工程と、を含む。
【００４３】
本発明は更に、半液状止血剤を製造する方法に関するものであり、その方法は、止血マトリックスを配列番号１のアミノ酸ペプチドを含む止血促進剤及び／又はこれらのアミノ酸類似体配列と混合する工程と、得られた材料を創傷部位に塗布する工程と、を含む。
【００４４】
ゼラチン担体の説明本発明のゼラチン材料は、好ましくは、液体透過性で水不溶性のゼラチン系スポンジ又はペーストである。ゼラチンは、変性型のタンパク質コラーゲンであるが、多様な創傷被覆材に使用されてきた。ゼラチンゲルは比較的低い融点を有するので、体温ではあまり安定しない。したがって、タンパク鎖の間に架橋を樹立することによって、これらのゲルを安定させることが不可避である。実際に、架橋は、通常、グルタルアルデヒド若しくはホルムアルデヒド又は熱でゼラチンを処理することによって達成される。こうして架橋されたゼラチンは、出血している創傷に止血を誘発するのに有用な乾燥スポンジへと製作されるか、又は粒状の形態に粉砕され得る。
【００４５】
「ゲル」という用語は本明細書において、その体積全体にわたって基本的に連続的である膨潤抱水高分子網目を示すために用いられている。タンパク質ゲルは、結合したタンパク質分子の基本的に連続的な網目と、液体の（典型的には水性の）溶媒と、から構成されており、その溶媒はタンパク質基質内の空間を充填する。タンパク質基質は、溶媒分子に対して強い粘性抵抗を及ぼして、それらの溶媒分子が自在に流動することを阻止する。ゲル網目をなす成分分子は、イオン結合、疎水結合、金属結合、又は共有結合で結合され得る。共有結合は、これらの結合の中でも最も熱的に安定である。
【００４６】
一実施形態において、本発明の滅菌された組成物は、止血における利用に好適な生体適合性ポリマーの中実、多孔質、又は非多孔質粒子と、生体適合性の液体と、上述したような止血用の抽出物とを、３つの主成分として含み得る。粒子、液体、及び止血用の抽出物が、連続的な液相を備える実質的に均質な止血用組成物を得るのに効果的な条件下で化合及び混合され、その止血用組成物は止血用の抽出物を含み、その組成物全体にわたって均一に分散した中実ポリマー粒子を有するものである。組成物中に含まれる粒子の量及び平均直径、並びに固体、液体及び止血用の抽出物の相対量は、以下で説明するような止血及び物理特性を組成物にもたらすのに効果的なものである。
【００４７】
本明細書で用いるとき、「連続的」及び「不連続的」は、分散系の定義及び説明に用いられる正式名称に照らして、これらの語の通常の意味で用いられている。
【００４８】
本明細書で用いるとき、「実質的に均質」とは、固体と液体との比、及び組成物又はペーストの任意の部分又は横断面の密度が実質的に同じとなるように、中実粒子が連続的な液相の全体に均一に分散している、組成物又はペーストの物理的状態を示す。
【００４９】
本明細書で用いるとき、「無菌」は、病原菌及び／又は微生物が実質的に存在しないことを意味し、これは、本明細書で説明及び主張する組成物及び医療装置に関する政府基準によって更に認識及び説明されるものである。
【００５０】
本明細書で用いるとき、「止血」、又は「止血性」は、本明細書の実施例で更に例示するが、止血の分野の当業者には分かるように、出血を止めるか又は最小限にする能力を意味する。
【００５１】
本発明の組成物で用いられる中実粒子を調製するために、生体適合性の多様な天然、半合成又は合成ポリマーが用いられ得る。選択されたポリマーは、特定の組成物に選ばれた液体中で実質的に不溶性でなければならない。好ましくは、機械的、化学的及び／又は生物学的な止血活動をもたらす、水不溶性の生体適合性ポリマーが使用される。使用され得るポリマーには、限定するものではないが、タンパク質及び多糖類が挙げられる。使用され得る多糖類には、酸化セルロース、キトサン、キチン、アルギネート、酸化アルギン酸及び酸化デンプンが挙げられる。各粒子を調製するために使用される生体適合性ポリマーは、好ましくは、ゼラチン、コラーゲン、フィブリノゲン又はフィブロネクチンなど、架橋又は変性タンパク質である。ある好ましいゼラチン粉末は、レーザー回折で判定して約４０マイクロメートル〜約１２００マイクロメートル、より好ましくは約１００マイクロメートル〜約１０００マイクロメートルの平均直径を有する粒子へとゼラチンスポンジを練ることによって調製された部分架橋ゼラチン粉末である。
【００５２】
本発明の無菌組成物は、好ましくは、連続的な液相を備え、その液相において、止血用の抽出物と中実のゼラチン系粒子が分散する。特定の医療装置とその使用法に応じて、液体は水溶性であっても非水溶性であってもよい。好ましくは、液相は水溶性である。水溶性の液体には、限定するものではないが、塩化カルシウム及び食塩水など、生体適合性の水溶液を挙げることができる。より好ましくは、液相は食塩水を含む。液相と中実粒子相は、止血をなす上で使用するのに好適な組成物、例えば、ペースト又はスラリーを得るのに効果的な相対量で存在する。特定の実施形態において、中実粒子と液体との重量比は一般に、約１：１〜約１：１２、又は約１：３〜約１：８、あるいは約１：５にもなる。
【００５３】
止血用の組成物は、限定するものではないが、抗菌剤、界面活性剤、抗酸化剤、保湿剤、湿潤剤、潤滑剤、増粘剤、希釈剤、照射スタビライザー、例えば、ラジカルスカベンジャー、可塑剤、及び安定剤を含む、有効量の１又は２種類以上の添加剤又は化合物を更に含み得る。例えば、組成物の押出し性又は射出性を増進させるために、グリセリンが添加されてもよい。利用されるとき、グリセリンは、液相の重量を基準として約０重量％〜約２０重量％で組成物中に存在してもよい。好ましくは、組成物は、液相の重量を基準として約１重量％〜約１０重量％のグリセリンを含んでもよい。より好ましくは、組成物は、液相の重量を基準として約１重量％〜約５重量％のグリセリンを含んでもよい。
【００５４】
加えて、組成物に特性の向上をもたらすために、第４級アミンが使用されてもよい。例えば、塩化ベンザルコニウム、ポリブレン又はＯｎａｍｅｒ  Ｍが、液相の重量を基準として、最大で約１重量パーセントの濃度で使用されてもよい。好ましくは、塩化ベンザルコニウムが、液相の重量を基準として約０．００１重量％〜約０．０１重量％の濃度で使用される。より好ましくは、組成物は、液相の重量を基準として約０．００２重量％〜約０．００６重量％の塩化ベンザルコニウムを含んでよい。第４級アミンは複数の機能を発揮し、抗菌剤、発泡剤、ラジカルスカベンジャー、及びヘパリン中和剤として作用し得ると考えられている。
【００５５】
その止血製剤は、抗菌剤、界面活性剤、抗酸化剤、保湿剤、湿潤剤、潤滑剤、増粘剤、希釈剤、照射スタビライザー、例えばラジカルスカベンジャー、可塑剤、及び安定剤からなる群から選択された、有効量の１又は２種類以上の添加剤又は化合物を更に含み得るものであり、より具体的には、押出しを増進する量のグリセリンを含み、好ましくは、そのグリセリンは、止血製剤全体の液相の重量を基準として約１重量％〜約２０重量％の量で存在する。
【００５６】
そのような止血用の組成物は、ヘパリン中和剤、フィブリノゲン、フィブリン、第Ｘａ因子、又は第Ｖｉｌａ因子などの付加的な凝血促進剤又は止血剤を更に含んでもよい。「有効量」とは、その添加剤が添加される理由となる特性を組成物にもたらすのに必要な量を意味する。有効量はまた、有害な生物学的作用を引き起こすことなく添加され得る最大量を限度とする。
【００５７】
ゼラチン担体上にペプチドを取り入れる方法。本発明の組成物を作製するための一実施形態において、粒子を液体と混合して均一なペーストを形成することによって、実質的に均質なペーストが調製される。この液体は、止血ペプチド材料を有しており、上記のようにそこに溶解される別の添加剤を有効量有していてもよい。混合は、押出しによって達成されても、中実粒子を液相中に均一に分散させるのに有効な条件下で、閉鎖空間にて混合することによって達成されてもよい。それに代わって、ミキサ、例えば，ダブル・プラネタリ・ミキサが、本発明の組成物を作製する上で利用されてもよい。止血ペプチド材料を含む液体が、ミキサに加えられる。液体は、溶液に粒子を添加するのに先立って、その液体中に溶解した有効量の添加剤を含んでもよい。例えば、止血ペプチド材料、グリセリン及び塩化ベンザルコニウムを含む食塩水を調製した後、これをミキサに加えてもよい。中実粒子は、すべての成分が加えられるまで、絶えず混合しながら時間をかけてミキサに加えられる。連続的な液相の全体に均一に分散した中実粒子を含んだ、実質的に均質な組成物が形成されるまで、混合は継続される。
【００５８】
他の実施形態では、止血ペプチドは、スプレー又はプリンティングにより、ほぼ乾いたスポンジの主面上に塗布される。
【００５９】
上記のように調製された止血組成物を殺菌処理して、止血ペプチドを含む殺菌組成物を提供することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、上述のように医療装置に移送され、その止血用の組成物を含んだ装置は、好ましくは電離放射線によって滅菌される。より好ましくは、滅菌は、本明細書で例示したようにガンマ線照射によるものである。
【００６０】
本発明の組成物は、例えば、あるレベルの電離放射線を照射されていることから、本明細書で説明する無菌の組成物を含む。そのような放射線照射には、電子ビーム又はガンマ線照射が挙げられる。放射線照射のレベル及び滅菌の条件は、組成物が照射される時間を含めて、本明細書で定義するように、滅菌をもたらすものである。本開示の利益を享受すると、当業者であれば、無菌組成物を得るのに必要な放射線照射のレベルを容易に決定できるであろう。
【００６１】
本発明の止血用の組成物が利用され得る医療装置には、流動可能又は射出可能な止血用ペースト又はスラリーを、止血を必要とする部位又は創傷に塗布するために現在使用されている任意の装置が含まれる。スポンジは、従来の形式で手又は他の手段で貼り付けられ得る。止血を必要とする部位は、外傷又は外科的処置の結果として生じたものであってもよい。装置又は塗布器の例には、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ又はＭｏｎｏｊｅｃｔのルアー注射器などの注射器が挙げられる。他の装置が、参照によってその全容が本明細書に組み込まれる米国特許第６，０４５，５７０号に詳細に開示されている。
【００６２】
Ｆｍｏｃを介在させた固体担持ペプチド合成法により、配列の異なる合成ペプチドを合成した。ＰＥＧ−接合ペプチド、ＰＥＧ２０００−ＲＫ−８又はＰＥＧ５０００−ＲＫ−８、それぞれ、Ｐ２Ｋ−ＲＫ−８又はＰ５Ｋ−ＲＫ−８と表すが、精製された配列番号１のＮ末端上に、メトキシポリエチレングリコール−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）を、溶液合成法により接合することによって、これらを合成した。ペプチドは、純度が９５％よりも高くなるよう、Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドの識別は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ又はＥＳＩ−ＭＳによって分析された。
【００６３】
ゼラチンベースの止血マトリックスであるＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）との混合物が、次のように調製された。テスト品には、ゼラチンベースのＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）と、生理食塩水２ｍＬ又は配列番号１、ＰＥＧ化配列番号１若しくはその類似体等の有効成分を含む生理食塩水２ｍＬとの混合液、又は主にヒトトロンビンを含むＥＶＩＴＨＲＯＭ（商標）溶液２ｍＬとの混合液（Ｅｖｉｔｈｒｏｍ（登録商標）の全組成は、ヒトトロンビン（８００〜１２００のＩＵ／ｍＬ）、塩化カルシウム、ヒトアルブミン、マンニトール、酢酸ナトリウム、及び注射水を含む）が含まれる。
【００６４】
テスト品の製剤では、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）は、以下の工程によって止血材料と完全に混合された。１．生理食塩水又はペプチド入り生理食塩水等の止血材料溶液２ｍＬを、空の注射器に吸い込む、２．予備充填された注射器にルアーコネクタを取り付け、ルアーアダプタの別の末端に止血材料溶液を含む注射器を取り付け、次いで予備充填された注射器に止血材料溶液を注射することにより、２つの成分を混合する、３．粘稠度が均一となるまで、組み合わせを前後に押すことにより、成分の混合を継続し、これを創傷に塗布する。
【００６５】
実施例及び図中の全ての濃度は、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）６ｍＬと混合する前の、２ｍＬの生理食塩水中の濃度のことである。混合に際し、テスト品中の活性成分又は賦形剤の濃度は、食塩水中の濃度の１／４に対応し、例えば、実施例中に濃度が５ｍＭと記載されていれば、止血材料中に、０．２５×５ｍＭ＝１．２５ｍＭの終末濃度に対応する。
【００６６】
図中、ＳＦは、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）止血マトリックスを表し、ＴＨは、局所（ヒト）トロンビンを８００〜１２００ＩＵ／ｍＬ含むＥｔｈｉｃｏｎ社より入手可能なＥＶＩＴＨＲＯＭ（商標）を表す。
【００６７】
以下の実施例は本発明の特定の実施形態を示すが、それらは本発明の範囲を限定するものとしてではなく、発明を十分に説明するのに寄与するものとして解釈すべきである。
【実施例】
【００６８】
（実施例１）
図１を参照すると、分で表示の止血までの時間のデータが、数個の試験されたシステムに対して与えられ、これら全てはＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（図上でＳＦと指示）を含み、かつ、ヒトトロンビン（図上でＴＨと指示）及び０．０１ｍＭ〜５ｍＭの異なる濃度の合成ペプチドの配列番号１を含む異なるタイプの止血性改良添加剤を含んでいる。Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）とトロンビンとの混合物は、図の上でＳＦ／ＴＨと指示され、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）と配列番号１との混合物は、図上でＳＦ／ＲＫ−８と指示されている。
【００６９】
ブタ肝臓生検穿孔モデル［幅８ｍｍ×深さ７ｍｍ］を用いてデータを収集し、初期タンポナーデ時間は３０秒、観測時間は３０秒、Ｎは、各々のデータポイント実験数であり、Ｎ＝３であった。図の誤差バーは、標準偏差に対応する。
【００７０】
インビボに、ブタ肝臓生検穿孔モデルを用いて止血活性調査を実行したが、その際、幅８ｍｍ×深さ７ｍｍで穿孔した創傷を肝臓に創り、この新たに創られた創傷部位にテスト品を塗布し、その後、指圧を加えて閉塞した（タンポナーデ）。圧力を最初に３０秒間加え、電子タイマーを使用して時間を測った。３０秒間のタンポナーデの後、指圧を中断し、テスト品上のガーゼパッドを直ちに取り除いた。３０秒の止血評価期間が行われた。自由に流れる出血が３０秒以内に観察されなかった場合、止血時間を何分何秒の形式で書き留め、そのテスト品に関して試験を終えた。自由に流れる出血が観察された場合、止血が達成されるまで、又は試験期間が１０分に達するまで、更に３０秒のタンポナーデ及び観察期間の間、指圧及びガーゼを再適用した。止血は、１０分未満における自由に流れる出血の停止によって判断された。陰性対照として、ガーゼパッドを用いた。
【００７１】
図１から分かるように、配列番号１（５ｍＭ）が高濃度のＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）混合物は、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）／トロンビン混合物（ＳＦ／ＴＨ）と同様の効能を有しており、配列番号１ペプチドが強い止血効果を示すことがわかった。
【００７２】
（実施例２）
図２を参照すると、分で表示の止血までの時間のデータが、数個の試験されたシステムに対して与えられ、これら全てはＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（図上でＳＦと指示）を含み、かつ、ヒトトロンビン（図上でＴＨと指示）及びＰＥＧ接合（又はＰＥＧ化）合成ペプチドの配列番号１を含む、異なるタイプの止血性改良添加剤を含んでいる。ＰＥＧ接合には、ＰＥＧ２０００又は平均分子量２０００Ｄａのポリエチレングリコールを用い、これは図ではＰ２Ｋとして指示される。ＰＥＧ化配列番号１及びＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）の混合物は、図ではＳＦ／Ｐ２Ｋ−ＲＫ−８と指示される。配列番号１の濃度を０．０５ｍＭから５ｍＭまで変えて、この混合物の試験を行った。
【００７３】
インビボブタ脾臓生検穿孔モデル［幅６ｍｍ×深さ３ｍｍ］を用い、初期タンポナーデ時間３０秒、観測時間３０秒、Ｎ＝３にて、データを収集した。
【００７４】
インビボに、ブタ脾臓生検穿孔モデルを用いて止血活性調査を実行したが、その際、幅６ｍｍ×深さ３ｍｍで穿孔した創傷を脾臓に創り、この新たに創られた創傷部位にテスト品を塗布し、その後、指圧を加えて閉塞した（タンポナーデ）。圧力を最初に３０秒間加え、電子タイマーを使用して時間を測った。３０秒間のタンポナーデの後、指圧を中断し、テスト品上のガーゼパッドを直ちに取り除いた。３０秒の止血評価期間が行われた。自由に流れる出血が３０秒以内に観察されなかった場合、止血時間を何分何秒の形式で書き留め、そのテスト品に関して試験を終えた。自由に流れる出血が観察された場合、止血が達成されるまで、又は試験期間が１０分に達するまで、更に３０秒のタンポナーデ及び観察期間の間、圧力及びガーゼを再適用した。止血は、１０分未満における自由に流れる出血の停止によって判断された。陰性対照として、ガーゼパッドを用いた。
【００７５】
図２から分かるように、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）との混合物では、ＰＥＧ化配列番号１につき、０．０５ｍＭ〜５ｍＭの広範囲にわたって濃度を変えてトロンビンと比較し、実際には止血までの時間はトロンビンと同程度であり、ＰＥＧ化配列番号１が濃度０．１ｍＭでは、止血までの時間はトロンビンよりおそらく良い値を示している。
【００７６】
（実施例３）
図３を参照すると、分で表示の止血までの時間のデータが、数個の試験されたシステムに対して与えられ、これら全てはＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（図にはＳＦと指示）を含み、かつ、ヒトトロンビン（図上でＳＦ／ＴＨ）、濃度５ｍＭの配列番号１ペプチド（ＳＦ／ＲＫ−８と指示）、濃度５ｍＭのＰＥＧ  ２０００と接合される配列番号１（図にはＳＦ／ＰＥＧ２０００−ＲＫ８と指示）、濃度５ｍＭのＰＥＧ−２０００（図にはＳＦ／ＰＥＧ２０００と指示）、生理食塩水（図ではＳＦ／ｓａｌｉｎｅと指示）を含む、異なるタイプのコントロール又は止血性改良添加剤を含む。
【００７７】
ブタ脾臓生検穿孔モデル［幅６ｍｍ×深さ３ｍｍ］を用い、初期タンポナーデ時間３０秒、観測時間３０秒、Ｎ＝３にて、データを収集した。
【００７８】
図３から分かるように、配列番号１を含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）の混合物及びＰＥＧ化配列番号１を含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）の混合物を、トロンビンを含む混合物及びＰＥＧ２０００や生理食塩水で代表される止血の効果を示さない賦形剤を含む混合物を代表するコントロールと直接比較することにより、ＰＥＧ化配列番号１（５ｍＭ）を含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）の混合物及び配列番号１（５ｍＭ）を含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）の混合物は、トロンビンを含む混合物と同様の止血効能を有することが示される。ＰＥＧ化配列番号１による又は配列番号１によるＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）の混合物は、生理食塩水及びＰＥＧ２０００（５ｍＭ）を含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）の混合物に比べると、止血までの時間が非常に短かったことが実証された。
【００７９】
（実施例４）
図４を参照すると、分で表示の止血までの時間のデータが、数個の試験されたシステムに対して与えられ、これら全てはＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（チャート上でＳＦと指示）を含み、かつ、異なるタイプのコントロール又は止血性改良のための濃度を様々に変えた添加剤を含むが、これらコントロール又は添加剤を以下に示す。
−ＰＥＧ  ２０００と接合した濃度０．０５〜５ｍＭの配列番号１（図にはＳＦ／ＰＥＧ２０００−ＲＫ８と指示）、
−濃度０．０５〜５ｍＭの配列番号１ペプチド（図にはＳＦ／ＲＫ−８と指示）、
−コントロール：ヒトトロンビンを含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（ＳＦ／ＴＨと指示）、
−コントロール：生理食塩水を含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（図にはＳＦ／Ｓａｌｉｎｅと指示）。
【００８０】
ブタ脾臓生検穿孔モデル［幅６ｍｍ×深さ３ｍｍ］を用い、初期タンポナーデ時間３０秒、観測時間３０秒、Ｎ＝３にて、データを収集した。
【００８１】
図４から分かるように、配列番号１及びＰＥＧ化配列番号１を含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）の混合物をトロンビンを含む混合物及び生理食塩水を含む混合物と直接比較すれば、ＰＥＧ化配列番号１を含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）の混合物は全ての濃度で、トロンビンを含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）の混合物に比べて、良好又は同等の止血効能を示し、ＰＥＧ化配列番号１が０．０５ｍＭのときに、止血までの時間が特に短いことが示された。更に、配列番号１を含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）の混合物は、トロンビンを含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）の混合物に匹敵する止血効能を示した。全てのケースで、止血効能は、生理食塩水を含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）混合物に比べて良好であった。更なる分析では、ＰＥＧ化配列番号１が、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）との混合物中の配列番号１及びトロンビンよりも良好な止血効能を示した。
【００８２】
（実施例５）
図５を参照すると、分で表示の止血までの時間のデータが、２つの異なる止血骨格を基礎に、数個の試験されたシステムに対して与えられるが、これら骨格は、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（図中ＳＦで指示）を含む骨格と、酸化再生セルロース又はＯＲＣ粉末の骨格（図中ＯＲＣで指示）とで、ある。
【００８３】
酸化再生セルロース（ＯＲＣ）は、既知の及び広く使われる止血剤であり、ＳＵＲＧＩＣＥＬ  Ｏｒｉｇｉｎａｌ、ＳＵＲＧＩＣＥＬ  Ｎｕ−Ｋｎｉｔ、ＳＵＲＧＩＣＥＬ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｒ、ＳＵＲＧＩＣＥＬ  ＳＮｏＷとして、Ｅｔｈｉｃｏｎ社から入手可能である。ＯＲＣ粉末は、ＯＲＣファブリックを粉砕し、得られた粉末を生理食塩水と、及び又は対応するペプチドと混在させることにより調製された。
【００８４】
本発明者らは、以下のＯＲＣベースの組成物を試験した。
−ＰＥＧ化配列番号１を５ｍＭの濃度で含むＯＲＣ混合物（図中ＯＲＣ／ＰＥＧ２０００−ＲＫ−８で指示）
−配列番号１を５ｍＭの濃度で含むＯＲＣの混合物（図中ＯＲＣ／ＲＫ−８で指示）
−生理食塩水を含むＯＲＣの混合物。
【００８５】
ブタ脾臓生検穿孔モデル［幅６ｍｍ×深さ３ｍｍ］を用い、初期タンポナーデ時間３０秒、観測時間３０秒、Ｎ＝４にて、データを収集した。
【００８６】
コントロールと比較すれば、全てのＯＲＣ−ベースの組成物は、生理食塩水を含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（図にはＳＦ／ｓａｌｉｎｅと指示）と同等の止血効果を示し、ヒトトロンビンを含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（図にはＳＦ／ＴＨと指示）と比べて止血までの時間が長かった。したがって、ＯＲＣベースの止血骨格は、配列番号１及び又はＰＥＧ化配列番号１の用途には適切でない。
【００８７】
図５は更に、ＰＥＧ化配列番号１及びＰＥＧ化配列番号１類似のアミノ酸８個のペプチドを含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）混合物を用いて、５ｍＭの濃度で配列を変更することで得られるデータを例示する。次に表１を参照すると、配列番号１及び３つの配列番号１類似のアミノ酸８個のペプチドの配列が略称とともに図に提示されている。配列番号１を含む全てのペプチドは、ＰＥＧ化された。
【００８８】
【表３】
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【００８９】
アミノ酸８個のペプチドＰＥＧ２０００−ＫＶＹＲＷＦＭＶ（配列番号２１）又はＰＥＧ２０００−ランダムＲＫ−８は、ランダム配列ＫＶＹＲＷＦＭＶ（配列番号２１）を有し、
アミノ酸８個のペプチドＰＥＧ２０００−ＲＬ４Ｌ５Ｋ８又はＰＥＧ２０００−配列番号６は、ＲＫ−８に類似する配列ＲＦＹＬＬＭＷＫを有する（（Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ）配列番号６））を有するがＬＬＭはＶＶＭで置換されるので、Ｖ及びＬは、類似アミノ酸である。
【００９０】
アミノ酸８個のペプチドＰＥＧ２０００−ＫＲ−８又はＰＥＧ２０００−配列番号７は、配列ＫＹＦＬＬＱＦＲ（（Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）配列番号７））を有し、ＲＫ−８の各々の個々のアミノ酸は、異なる側鎖において類似体アミノ酸で置換される。
【００９１】
データの分析によれば、ＲＫ−８類似配列を有するアミノ酸８個のＰＥＧ化ペプチド、特に配列番号６は、ＰＥＧ化配列番号１及びトロンビンと比較して、同程度の止血効能を見せたことが示された。
【００９２】
アミノ酸８個のＰＥＧ化ペプチド配列番号７の止血までの時間は、多少長かった（非ＰＥＧ化配列番号１と同程度である）。
【００９３】
ＰＥＧ化ランダム配列アミノ酸８個のペプチドＫＶＹＲＷＦＭＶ（配列番号２１）の止血までの時間は、より長かった（ＳＦ／生理食塩水混合物に同程度である）。
【００９４】
（実施例６）
図６を参照すると、分で表示の止血までの時間のデータが、２つの異なる止血骨格を基礎に、数個の試験されたシステムに対して与えられ、これら骨格は、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（図中Ｓｕｒｇｉｆｌｏと指示）及びＰｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  Ｆ１２７で形成される骨格（図中Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  Ｆ１２７で指示）である。
【００９５】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  Ｆ１２７は、（ＰＰＯ）ｘ−（ＰＥＯ）ｙブロック共重合体であり、平均分子量は１２６００Ｄａである。これをＢＡＳＦから購入し、次のように調製した。０．５８ｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  Ｆ１２７を、２ｍＬの生理食塩水又は５ｍＭのＰＥＧ化ＰＲ−８を含む生理食塩水と混合した。
【００９６】
ブタ脾臓生検穿孔モデル［幅６ｍｍ×深さ３ｍｍ］を用い、初期タンポナーデ時間３０秒、観測時間３０秒にて、データを収集した。
【００９７】
データ分析によれば、ＰＥＧ化ＲＫ−８との、又は生理食塩水との、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄの混合物は、止血テストが上手くいかなかった。このように、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄベースの組成物は、止血剤としての性能が低く、ＰＥＧ化ＲＫ−８の用途に適切でない。
【００９８】
また、図６は、生理食塩水とＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）との混合物で得られたデータを提示し（Ｓｕｒｇｉｆｌｏ／Ｓａｌｉｎｅと指示）、及びＥｖｉｔｈｒｏｍ（商標）（ヒトトロンビン、局所（ヒト）トロンビン、８００〜１２００ＩＵ／ｍＬ）とＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）との混合物で得られたデータをコントロールとして提示し（Ｓｕｒｇｉｆｌｏ／Ｅｖｉｔｈｒｏｍと指示）、更に、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）と以下の混合物を提示する。
−濃度５ｍＭの配列ＶＶＭ、ＬＬＭ、ＶＭＶを有するショート３−アミノ酸ペプチド（図中、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ／ＶＶＭ、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ／ＬＬＭ、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ／ＶＭＶで指示）、
−濃度５ｍＭの配列番号１のペプチド（Ｓｕｒｇｉｆｌｏ／ＲＫ−８で指示）、
−ＰＥＧ  ２０００と接合される濃度５ｍＭの配列番号１（図中Ｓｕｒｇｉｆｌｏ／ＰＥＧ２０００−ＲＫ８で指示）、
−３つのアミノ酸Ｖ、Ｖ、Ｍそれぞれの混合物（図ではそれぞれＳｕｒｇｉｆｌｏ／Ｖ、／Ｖ、／Ｍ、各々濃度５ｍＭ）、
−３つのアミノ酸Ｌ、Ｌ、Ｍそれぞれの混合物（図ではそれぞれＳｕｒｇｉｆｌｏ／Ｌ、／Ｌ、／Ｍ、各々濃度５ｍＭ）。
【００９９】
３つのアミノ酸ペプチドＶＶＭ、ＬＬＭ、及びＶＭＶは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ社によって合成されたものである。
【０１００】
図６に示されるデータの分析によれば、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ（商標）のアミノ酸との混合物及びショート３−アミノ酸ペプチドとの混合物はそれぞれ、多少有効だったＶＭＶペプチドを除いて、止血剤として有効でないことが示された。
【０１０１】
更にデータの分析によれば、配列番号１及びＰＥＧ−配列番号１は、トロンビンと同様の効果が示された。
【０１０２】
（実施例７）
図７を参照すると、分で表示の止血までの時間のデータが、ヘパリン化血液を用いて、数個の試験されたシステム及びコントロールに対して与えられている。
【０１０３】
モデルは、ヘパリン化ブタ脾臓生検穿孔モデルであり（幅６ｍｍ×深さ３ｍｍ、タンポナーデ時間３０秒、観測時間３０秒）、必要であれば更に２０００ＩＵのヘパリン溶液を注ぐことにより、活性化凝固時間（ＡＣＴ）が３００秒を超えるように維持した。最初に、９９７５ＩＵのヘパリン溶液を３９．１Ｋｇのブタに塗布した。
【０１０４】
提示されるデータから分かるように、
−ガーゼ（陰性対照、止血活性物質の添加無しで用いた）は、ヘパリン化血液中での止血剤として不合格であり、
−トロンビンとＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）との混合物（ＳＦ／ＴＨで指示）は、ヘパリン化血液中の止血剤として不合格であり、
−生理食塩水とＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（ＳＦ／Ｓａｌｉｎｅで指示）の混合物は、ヘパリン化血液中の止血剤として不合格であり、
−生理食塩水中に５ｍＭの配列番号１を２ｍＬ含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（ＳＦ／ＲＫ−８と指示）は、ヘパリン化血液中の止血剤として不合格であり、
−生理食塩水中に５ｍＭのＰＥＧ２０００−配列番号１を２ｍＬ含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（ＳＦ／Ｐ２Ｋ−ＲＫ−８で指示）は、止血に多少の効果を示したが、止血までの時間が６．８分と、実用するには長過ぎ、
−生理食塩水中に５ｍＭのＰＥＧ５０００−配列番号１を２ｍＬ含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（ＳＦ／Ｐ５Ｋ−ＲＫ−８で指示）は、高い止血効能を示した。
【０１０５】
したがってＰＥＧ化配列番号１、特に、配列番号１に接合したＰＥＧ−５０００は、トロンビン、非ＰＥＧ化配列番号１、及びヘパリン化血液中の別のコントロールに対して、優れた止血効能を示した。
【０１０６】
（実施例８）
ベンチトップ型実験として、合成孔性パッドを、食塩水中、ＰＥＧ化配列番号１又は生理食塩水のコントロール溶液で処理し、血液との相互作用を評価した。生理食塩水（０．５ｍＭ）中１００μＬのＰＥＧ化配列番号１又は２００μＬの生理食塩水を、０．０２５ｇのモノクリル（ポリグリカプロン２５）パッドに加えることにより、サンプルを調製した。次いで、含浸モノクリル＊（ポリグリカプロン２５）パッドを２時間空気乾燥し、その後、真空乾燥処理を１時間行った。
【０１０７】
次いで、新鮮なブタ血液１５０μＬを、各々のパッドに別々に加え、室温で２分間放置した。その後、食塩水を２０ｍＬ入れたペトリ皿にパッドを移し、パッドから外へ拡散する非凝固血液を観測した。ＰＥＧ化配列番号１で処理されたモノクリルパッド中に大量の凝固血液が捉えられたことが観測された一方、コントロールパッドからの非凝固血液の強い拡散が観測された。したがって、ＰＥＧ化配列番号１は、血液凝固を迅速に促進することが示された。
【０１０８】
（実施例９）
ベンチトップ型実験として、生理食塩水中のＰＥＧ化配列番号１、生理食塩水中の非ＰＥＧ化配列番号１、及び生理食塩水のコントロール溶液をそれぞれ試験し、血液との相互作用を評価した。生理食塩水（０．５ｍＭ）中にＰＥＧ化配列番号１を１００μＬを加えたもの、生理食塩水（０．５ｍＭ）中に配列番号１を加えたもの、及び生理食塩水を、クエン酸ナトリウム（０．１０５Ｍ）を含むブタ血液１００μＬを含む各ガラスバイアルに、これらを分離することにより、各サンプルが調製された。ＰＥＧ化配列番号１又は配列番号１の溶液では、血液に加えられた時、直ちに、血液の曇りが観測された一方、生理食塩水のコントロール溶液を入れたバイアルには、曇りは観測されなかった。２時間の後、ＰＥＧ化配列番号１又は配列番号１を含んでいるバイアル中に血液の完全な沈降が観測された一方、生理食塩水のコントロール溶液入りのバイアル中には、血液の完全な沈降は観測されなかった。したがって、ＰＥＧ化配列番号１及び非ＰＥＧ化配列番号１は、迅速な血液凝固を促進することが示された。
【０１０９】
（実施例１０）
次に図８を参照すると、分で表示の止血までの時間のデータが、２つの試験されたシステムに対して与えられ、これらシステムは全てＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）を含み、また、止血性向上のため、以下の異なるタイプの添加剤又はコントロールを含む。
−生理食塩水中のＰＥＧ  ２０００と接合した配列番号１ペプチド０．５ｍＭ（図中、生理食塩水中Ｓｕｒｇｉｆｌｏ／０．５ｍＭ  ＰＥＧ２０００−ＲＫ８と指示）、
−コントロール：ヒトトロンビンを含むＳｕｒｇｉｆｌｏ（商標）（Ｓｕｒｇｉｆｌｏ／ＴＨと指示）。
【０１１０】
データは、クロピドグレル及びアセチルサリチル酸処理されたブタ脾臓生検穿孔モデル（幅６ｍｍｘ深さ３ｍｍ、タンポナーデ時間３０秒、観測時間３０秒）を用いて収集され、４ヵ月の雌ブタ（体重６６．１ｋｇ）に対して以下の経口供与量が与えられた。
研究の２日前：Ｐｌａｖｉｘ  ３００ｍｇ及びアスピリン３２５ｍｇ。
研究前日：Ｐｌａｖｉｘ  ７５ｍｇ及びアスピリン３２５ｍｇ。
研究当日：手術前にＰｌａｖｉｘ  ７５ｍｇ及びアスピリン３２５ｍｇ。
【０１１１】
図８で提示されるデータでは、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ／ＰＥＧ化配列番号１のペプチドは、血小板不活性化モデルで、Ｓｕｒｇｉｆｌｏ／トロンビンと同様の作用を示し、かつ、同様の止血効能を示すことが実証された。したがって、配列番号１のペプチドは、非欠陥血液中、すなわちヘパリン化血液中だけでなく、血小板不活性化血液中でも、止血効能が実証された。
【０１１２】
〔実施の態様〕
（１）  （ａ）配列番号１の配列又はそのアミノ酸類似体配列を有するペプチドと、
（ｂ）骨格と、を含む、止血又は組織シール材料。
（２）  前記骨格は、天然若しくは遺伝子工学による吸収性ポリマー、合成吸収性ポリマー、又はこれらの組み合わせである、実施態様１に記載の止血又は組織シール材料。
（３）  前記天然若しくは遺伝子工学による吸収性ポリマーは、タンパク質と、多糖と、これらの組み合わせと、からなる群より選択される、実施態様２に記載の止血又は組織シール材料。
（４）  前記タンパク質は、プロトロンビンと、トロンビンと、フィブリノゲンと、フィブリンと、フィブロネクチンと、ヘパリナーゼと、第Ｘ／Ｘａ因子と、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子と、第ＩＸ／ＩＸａ因子と、第ＸＩ／ＸＩａ因子と、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子と、組織因子と、バトロキソビンと、アンクロッドと、エカリンと、フォンビルブラント因子と、コラーゲンと、エラスチンと、アルブミンと、ゼラチンと、血小板表面糖タンパク質と、バソプレシンと、バソプレシン類似体と、エピネフリンと、セレクチンと、凝血促進毒素と、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤と、血小板活性化剤と、ペプチドと、これらの組み合わせと、からなる群より選択される、実施態様３に記載の止血又は組織シール材料。
（５）  前記多糖は、セルロースと、アルキルセルロースと、メチルセルロースと、アルキルヒドロキシアルキルセルロースと、ヒドロキシアルキルセルロースと、セルロース硫酸と、カルボキシメチルセルロースの塩と、カルボキシメチルセルロースと、カルボキシエチルセルロースと、キチンと、カルボキシメチルキチンと、ヒアルロン酸と、ヒアルロン酸の塩と、アルギネートと、アルギン酸と、アルギン酸プロピレングリコールと、グリコーゲンと、デキストランと、デキストラン硫酸と、カードランと、ペクチンと、プルランと、キサンタンと、コンドロイチンと、コンドロイチン硫酸と、カルボキシメチルデキストランと、カルボキシメチルキトサンと、キトサンと、ヘパリンと、ヘパリン硫酸と、ヘパランと、ヘパラン硫酸と、デルマタン硫酸と、ケラタン硫酸と、カラギーナンと、キトサンと、デンプンと、アミロースと、アミロペクチンと、ポリ−Ｎ−グルコサミンと、ポリマンヌロン酸と、ポリグルクロン酸と、ポリグルロン酸と、前記多糖の誘導体と、これらの組み合わせと、からなる群より選択される、実施態様３に記載の止血又は組織シール材料。
【０１１３】
（６）  前記合成吸収性ポリマーは、脂肪族ポリエステルポリマー、脂肪族ポリエステル共重合体、又はこれらの組み合わせである、実施態様２に記載の止血又は組織シール材料。
（７）  ゼラチンは、吸収性止血粉末マトリックス、スポンジマトリックス、ペーストマトリックス、ゲルマトリックス、又はこれらの組み合わせを含む、実施態様４に記載の止血又は組織シール材料。
（８）  ゼラチンは、架橋され、かつ、液体担体を備える粒子形態にある、実施態様７に記載の止血又は組織シール材料。
（９）  生理食塩水を更に含み、ゼラチンと前記ペプチドとは、液相としての前記生理食塩水と共に略均一に混合される、実施態様７に記載の止血又は組織シール材料。
（１０）  前記止血材料中の前記ペプチドの濃度は、約０．００２５ｍＭ〜約１．２５ｍＭである、実施態様９に記載の止血又は組織シール材料。
【０１１４】
（１１）  抗菌剤と、界面活性剤と、抗酸化剤と、保湿剤と、湿潤剤と、滑剤と、増粘剤と、希釈剤と、照射スタビライザーと、これらの組み合わせと、からなる群より選択される１つ又は２つ以上の添加剤又は化合物を有効量で更に含む、実施態様１０に記載の止血又は組織シール材料。
（１２）  押出しを増進する量のグリセリンを更に含む、実施態様１１に記載の止血又は組織シール材料。
（１３）  前記ペプチドは、生体適合性のポリマーに接合される、実施態様２に記載の止血又は組織シール材料。
（１４）  前記生体適合性のポリマーは、親水性ポリマーである、実施態様１３に記載の止血又は組織シール材料。
（１５）  前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールと、ポリエチレングリコールの誘導体と、ポリプロピレングリコールと、多糖と、変性多糖と、タンパク質と、変性タンパク質と、ペプチドと、ポリラクチドグリコリドと、カプロラクトンと、トリメチレンカーボネートと、デンプンと、加工デンプンと、ゼラチンと、コラーゲンと、これらの組み合わせと、からなる群より選択される、実施態様１４に記載の止血又は組織シール材料。
【０１１５】
（１６）  前記親水性ポリマーは、迅速な止血又は迅速な組織シールを提供するように選択される分子量を有するポリエチレングリコールである、実施態様１４に記載の止血又は組織シール材料。
（１７）  前記ポリエチレングリコール分子は、線状分子、枝分れ分子、星型の分子、又はこれらの組み合わせである、実施態様１６に記載の止血又は組織シール材料。
（１８）  前記分子量は、平均で、約１．６６×１０−２４ｋｇ〜約１．３３×１０−２３ｋｇ（約１０００ダルトン〜約８０００ダルトン）である、実施態様１７に記載の止血又は組織シール材料。
（１９）  前記分子量は、平均で３．３２×１０−２４ｋｇ（２０００ダルトン）である、実施態様１７に記載の止血又は組織シール材料。
（２０）  前記分子量は、平均で８．３０×１０−２４ｋｇ（５０００ダルトン）である、実施態様１７に記載の止血又は組織シール材料。
【０１１６】
（２１）  前記止血材料中の前記ペプチドの濃度は、約０．００２５ｍＭ〜約１．２５ｍＭであり、前記ポリエチレングリコールの分子量は、約３．３２×１０−２４ｋｇ〜約８．３０×１０−２４ｋｇ（約２０００〜約５０００ダルトン）である、実施態様１７に記載の止血又は組織シール材料。
（２２）  前記アミノ酸類似体配列は、アミノ酸のうちの少なくとも１つが対応する類似体アミノ酸で置換された前記配列番号１の配列から得られる、実施態様１に記載の止血又は組織シール材料。
（２３）  前記アミノ酸類似体配列は、配列番号２と、配列番号３と、配列番号４と、配列番号５と、これらの組み合わせと、からなる群より選択される、実施態様２２に記載の止血又は組織シール材料。
（２４）  創傷部位に止血処理又は組織シールを提供する方法であって、
（ａ）実施態様１又は実施態様２３に記載の止血又は組織シール材料を形成する工程と、
（ｂ）前記創傷部位に前記止血又は組織シール材料を塗布する工程と、を含む、方法。
（２５）  止血又は組織シール材料を製造する方法であって、
（ａ）配列番号１の配列又はそのアミノ酸類似体配列を有するペプチドを提供する工程であって、前記ペプチドは、任意に、ポリエチレングリコールに接合される、工程と、
（ｂ）吸収性骨格を提供する工程と、
（ｃ）前記止血又は組織シール材料を略均一に形成する前記ペプチド及び前記吸収性骨格を混合する工程と、を含む、方法。
【０１１７】
（２６）  前記ペプチドは、ポリエチレングリコールに接合され、前記止血材料中の前記ペプチドの濃度は、約０．００２５ｍＭ〜約１．２５ｍＭであり、前記ポリエチレングリコールの分子量は、約３．３２×１０−２４ｋｇ〜約８．３０×１０−２４ｋｇ（約２０００〜約５０００ダルトン）である、実施態様２５に記載の方法。
（２７）  前記止血材料又は組織シール材料は、ヘパリン化血液を有する患者又は凝固阻止剤若しくは凝集阻止剤を含む患者に用いられる、実施態様２６に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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