(57)【要約】  本発明は、薬学的に活性な成分が抗体模倣物に融合されている融合タンパク質に関する。具体的には、本発明は、インターフェロン又はその生物学的に活性な変異タンパク質と、特異的な標的ドメインとして修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質とを含む融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、医薬に使用される、特に、がん又は感染性疾患の治療に使用されるこれらの融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、そのような融合タンパク質とともに、及びがん治療薬とともに、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。加えて、本発明は上記融合タンパク質を作製する方法に関する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の部分を含む融合タンパク質：
（ｉ）インターフェロン又はその生物学的に活性な変異タンパク質、
（ｉｉ）標的分子に結合可能な修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質、及び、
（ｉｉｉ）任意にリンカー。
【請求項２】
インターフェロンが、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）又はインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）、又はヒトインターフェロン−アルファ若しくはヒトインターフェロン−ベータである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＩＦＮ−αが、ＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂ、ＩＦＮ−α２ｃ、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α１４、ＩＦＮ−α４、ＩＦＮ−α５、及びこれらのいずれかの生物学的に活性な変異タンパク質からなる群より選択される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質が、Ｋｄ≦１０−７の標的分子に対する特異的な結合親和性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質が、ヘッドトゥテイル配置で互いに連結されている２つの単量体ユビキチンユニットを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
各修飾単量体ユビキチンユニットが、配列番号１により規定されるアミノ酸配列、又は配列番号９１により規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質の各単量体ユビキチンユニットが、配列番号１又は配列番号９１の領域２〜８及び／又は領域６２〜６８における１〜８個のアミノ酸の置換によって他方の単量体ユビキチンユニットにおける修飾とは独立的に修飾されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
単量体ユビキチンユニットにおける置換が、
（１）第１単量体ユニットにおいて、６、８、６３、６４、６５、及び６６のアミノ酸位置の群より選択される少なくとも１つ又は複数の位置における置換、並びに、
第２単量体ユニットにおいて、６、８、６２、６３、６４、６５、及び６６のアミノ酸位置の群より選択される少なくとも１つ又は複数の位置における置換、任意に更に２アミノ酸位置における置換、又は、
（２）第１単量体ユニットにおいて、２、４、６、６２、６３、６４、６５、及び６６のアミノ酸位置の群より選択される少なくとも１つ又は複数の位置における置換、並びに、
第２単量体ユニットにおいて、６、８、６２、６３、６４、及び６６のアミノ酸位置の群より選択される少なくとも１つ又は複数の位置における置換、任意に更に６５アミノ酸位置における置換、並びに、
任意に、他のアミノ酸の更なる修飾、又は置換、
を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質において１〜７アミノ酸が更に修飾されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
更に修飾された前記１〜７アミノ酸が、第１単量体ユビキチンユニットの２、４、８、３３、３６、３８、６２、４４、７０、及び７１位、並びに第２単量体ユビキチンユニットの２、１０、１６、３４、３６、４４、５１、５３、６５、７０、及び７１位における１つ又は複数のアミノ酸から選択される、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
リンカーが存在せず、ＩＦＮ、又はＩＦＮ−αと、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質とが、互いに直接的に融合されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
ＩＦＮ若しくはＩＦＮ−α、又はその生物学的に活性な変異タンパク質が、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質のＣ末端に位置されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
ＩＦＮ若しくはＩＦＮ−α、又はその生物学的に活性な変異タンパク質が、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質のＮ末端に位置されている、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
リンカーが存在し、ＩＦＮ若しくはＩＦＮ−α、又はその生物学的に活性な変異タンパク質と、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質とがリンカーを介して接続されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
融合タンパク質のＮ末端からＣ末端までの部分が以下の順である、請求項１４に記載の融合タンパク質：
修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質−リンカー−ＩＦＮ若しくは修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質−リンカー−ＩＦＮ−α、又は修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質−リンカー−ＩＦＮ若しくはＩＦＮ−αの生物学的に活性な変異タンパク質。
【請求項１６】
融合タンパク質のＮ末端からＣ末端までの部分が以下の順である、請求項１４に記載の融合タンパク質：
ＩＦＮ若しくはＩＦＮ−α、又はその生物学的に活性な変異タンパク質−リンカー−修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質。
【請求項１７】
前記リンカーが以下のアミノ酸配列：ＧＩＧ（配列番号３）、ＲＩＧ（配列番号７３）、ＳＧＧＧＧ（配列番号４）、ＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号５）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号６）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７）、ＳＧ、（ＳＧＧＧ（配列番号８８））ｎ（ｎは１〜１０である）及び（ＧＧＧＳ（配列番号８７））ｎ（ｎは１〜１０である）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
標的分子がフィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質が、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７及び配列番号１９〜３６、又は配列番号７４〜７７に記載の１つ又は複数のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を呈するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
融合タンパク質が、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、及び配列番号３７〜７２、又は配列番号７８〜８５に記載の１つ又は複数のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を呈するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
医薬に使用される請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
がん又は感染性疾患の治療に使用される請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
がん治療薬との併用投与用である、医薬に使用される、又はがん治療に使用される請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
がん治療薬が、ＣＨＯＰ、ビンブラスチン、シタラビン、ベバシズマブ、腫瘍ワクチン、放射性医薬品、細胞増殖抑制剤のナノ粒子配合物等からなる群より選択され、又はベバシズマブ、ＣＨＯＰ、及びビンブラスチンからなる群より選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２６】
請求項２５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２７】
−請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、
−請求項２５に記載のポリヌクレオチド、又は、
−請求項２６に記載のベクター、
を含む宿主細胞。
【請求項２８】
−請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、又は、
−請求項２５に記載のポリヌクレオチド、又は、
−請求項２６に記載のベクター、又は、
−請求項２７に記載の宿主細胞、
を含み、薬学的に許容可能な担体を更に含む、医薬組成物。
【請求項２９】
ＣＨＯＰ、ビンブラスチン、シタラビン、ベバシズマブ、腫瘍ワクチン、放射性医薬品、細胞増殖抑制剤のナノ粒子配合物等からなる群より選択され、又はベバシズマブ、ＣＨＯＰ、及びビンブラスチンからなる群より選択される１つ又は複数のがん治療薬を更に含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
複合製剤の形態、又はキットの部品の形態である、請求項２８又は２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を作製する方法であって、
（ａ）単量体ユビキチンタンパク質に由来する、別々に修飾された二量体ユビキチンタンパク質の集団を準備する工程であって、前記集団が、ヘッドトゥテイル(head-to-tail)配置であることができ、ともに連結された２つの修飾ユビキチンモノマーを含む二量体ユビキチンタンパク質を含み、前記二量体タンパク質の各単量体が、配列番号１又は配列番号９１の１〜８アミノ酸の置換によって別々に修飾されている工程と、
（ｂ）潜在的なリガンドとして標的分子を準備する工程と、
（ｃ）別々に修飾されたタンパク質の前記集団を前記標的分子と接触させる工程と、
（ｄ）スクリーニング作業によって修飾二量体ユビキチンタンパク質を同定する工程であって、前記修飾二量体ユビキチンタンパク質が、Ｋｄ≦１０−７Ｍの特異的な結合親和性で前記標的分子に結合する工程と、
（ｅ）前記結合親和性により、前記修飾二量体ユビキチンタンパク質を単離する工程と、
（ｆ）ＩＦＮ若しくはＩＦＮ−α、又はその生物学的に活性な変異タンパク質を工程ｅ）で得られた修飾二量体ユビキチンタンパク質に融合する工程と、
を含む、方法。
【請求項３２】
標的分子が、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を調製する方法であって、
（ａ）請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする核酸を調製する工程と、
（ｂ）前記核酸を発現ベクターに導入する工程と、
（ｃ）前記発現ベクターを宿主細胞に導入する工程と、
（ｄ）宿主細胞を培養する工程と、
（ｅ）宿主細胞を、前記ベクターから融合タンパク質が発現される培養条件に供する工程であって、それによって請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質を産生する工程と、
（ｆ）任意に、工程（ｅ）において産生された融合タンパク質を濃縮又は単離する工程と、
を含む、方法。
【請求項３４】
工程（ｅ）において産生された融合タンパク質が封入体の形態である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
封入体を単離する工程と、
前記封入体を可溶化する工程であって、それによって可溶性融合タンパク質を得て、前記工程において得られた可溶性融合タンパク質を、少なくとも２回のクロマトグラフィー工程によって更に精製する工程と、
を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬学的に活性な成分が抗体模倣物に直接的に又はリンカーを介して融合されている融合タンパク質に関する。具体的には、本発明は、薬学的に活性な成分としてインターフェロン又はその生物学的に活性な変異タンパク質と、抗体模倣物として修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質とを含む融合タンパク質に関する。さらに、本発明は、医薬に使用される、特にがん又は感染性疾患の治療に使用されるこれらの融合タンパク質に関する。また、本発明は、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチドを含むベクターとともに、上述の融合タンパク質、ポリヌクレオチド、又はベクターを含む宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、そのような融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター又は宿主細胞と組み合わせて薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、上記融合タンパク質を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンではないアミノ酸からなる結合分子に対する要求が高まりつつある。現在に至るまで、抗体が最も良く確立された結合分子群であるが、免疫グロブリン分子には大きな欠点があることから、高い親和性及び特異性でリガンドを標的とする新しい結合分子が今なお必要とされている。抗体は非常に容易に産生でき、ほとんどの全ての標的を対象とし得るものの、非常に複雑な分子構造を有する。より容易に取り扱うことが可能なより小さい分子によって、抗体を代用することが絶えず求められている。これらの代替結合剤を、例えば、疾患の診断、予防及び治療の医療分野において有用に使用することができる。
【０００３】
相対的に規定された３次元構造を有するタンパク質は、通常、足場タンパク質（protein scaffolds）と呼ばれ、上記の代替結合剤の設計の出発物質として使用され得る。これらの足場タンパク質は、典型的には、特異的な又はランダムな配列変異を許容する１つ又は複数の領域を含み、そのような配列のランダム化は、特異的結合分子が選択され得るタンパク質ライブラリーを作製するのに実施されることが多い。抗体よりもサイズが小さく、標的抗原に対する親和性が抗体に匹敵するか、又はより良好である分子は、薬物動態特性及び免疫原性の点で抗体よりも優れていると予想される。
【０００４】
修飾ユビキチンに基づく特異的ターゲッティングタンパク質
ユビキチンは、配列保存性の高い、小さな単量体の細胞質タンパク質であり、原虫から脊椎動物に至るまでの全ての既知の真核細胞に存在する。ユビキチンのポリペプチド鎖（配列番号１を参照）は、非常にコンパクトなα／β構造に折り畳まれた７６アミノ酸からなり（非特許文献１）、ポリペプチド鎖のほぼ８７％が水素結合による二次構造エレメントの形成に関与している。二次構造は、３回転半のアルファへリックスターン、及び４本鎖からなる逆平行βシートである。更なる構造的特徴は、アルファへリックスとβシートとの間のタンパク質内部における際立った疎水性領域である。ユビキチンは、多くの種間で高度に保存されているタンパク質である。
【０００５】
その小さいサイズのため、ユビキチンの人工的な調製は、化学合成によってもバイオテクノロジー手法によっても実施することができる。その有利なフォールディング特性に起因して、ユビキチンは、大腸菌（Escherichia
coli）等の微生物を使用する遺伝子工学によりその細胞質基質又はペリプラズム空間のいずれかにおいて比較的大量に産生することができる。
【０００６】
特許文献１は、Ａｆｆｉｌｉｎ（商標）（Scil Proteins GmbHの登録商標）とも呼ばれるユビキチンタンパク質に基づく人工結合タンパク質の作製を記載している。特許文献２は、予め規定されたリガンドに対する結合能が新たに生じた多量体ユビキチンを同定する方法に言及している。
【０００７】
抗体又はその他の代替足場タンパク質に比べ、ユビキチンタンパク質に基づく人工結合タンパク質は、高い標的親和性及び特異性、小さいサイズ、高い安定性、低免疫原性、及び費用対効果の高い製造という多くの利点を有している。さらに、ユビキチン足場タンパク質は、遺伝的及び化学的修飾を許容する。
【０００８】
フィブロネクチンのエキストラドメインＢ
フィブロネクチン（ＦＮ）は、健康な組織及び体液中に大量に発現される、重要な高分子量細胞外マトリクス糖タンパク質群である。それらの主な役割は、多くの異なる細胞外マトリクスへの細胞接着の促進である。培養物中での非形質転換細胞の表面上のフィブロネクチンの存在、及び形質転換細胞の場合におけるそれらの不在により、フィブロネクチンは重要な接着タンパク質として同定された。フィブロネクチンは、多数の様々な他の分子、例えば、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びフィブリンと相互作用し、細胞の形状及び細胞骨格の形成を制御する。さらに、フィブロネクチンは、胚発生の間の細胞遊走及び細胞分化を担う。また、フィブロネクチンは、マクロファージ及びその他の免疫細胞の遊走を促進することで創傷治癒に、及び血管の損傷領域へ血小板を接着させることによる凝血塊の形成に重要な役割を果たす。
【０００９】
フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）は、一次ＲＮＡ転写物の選択的スプライシングによってフィブロネクチン分子へと挿入される小さなドメインである。この分子は、細胞外マトリクスのフィブロネクチン分子中に存在するか、又は除去されており、新しい血管の周辺に大量に発現するが、ほぼ全ての正常な成体組織（子宮及び卵巣を除く）において検出不能であることから、血管形成及び組織再構築と関連する最も選択的なマーカーの１つとなっている。ＥＤ−Ｂは、主にがんに関与することが知られている。ＥＤ−Ｂの高発現は、乳がん、非小細胞肺がん、結腸直腸がん、膵臓がん、ヒト皮膚がん、肝細胞がん、頭蓋内髄膜腫（intracranial
meningioma）、神経芽細胞種を含む多くのヒト固形がん実体の原発巣、及び転移部において検出された（非特許文献２）。さらに、ＥＤ−Ｂを診断剤と結合させ、診断ツールとして有利に使用することができる。一例として、アテローム性動脈硬化プラークの分子画像化及びがん検出におけるその使用が挙げられる。さらに多くの診断用途が想定される。
【００１０】
フィブロネクチンのヒトエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）の９１アミノ酸のアミノ酸配列は配列番号２に示される。このタンパク質の発現には、開始メチオニンを追加しなければならない。ＥＤ−Ｂは、哺乳類、例えば、齧歯類、ウシ、霊長類、肉食動物、ヒト等に大量に存在する。ヒトＥＤ−Ｂと１００％の配列同一性を有する動物の例として、ラット（Rattus norvegicus）、ウシ（Bos taurus）、マウス（Mus musculus）、ウマ（Equus caballus）、アカゲザル（Macaca mulatta）、イヌ（Canis lupus familiaris）、及びチンパンジー（Pan troglodytes）が挙げられる。
【００１１】
ＥＤ−Ｂは新生血管構造に特異的に蓄積し、がんにおける分子介入の標的となる。フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに対する抗体又は抗体フラグメントの多くが、がん及びその他の適応症の有力な治療薬として当該技術において知られている（例えば、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６を参照）。フィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに特異的なヒト一本鎖Ｆｖ抗体フラグメントは、実験的腫瘍モデル及びがん患者の両方において腫瘍新生脈管構造（neovasculature）を選択的に標的とすることが確認されている。さらに、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２４、又はＧＭ−ＣＳＦとともに抗ＥＤ−Ｂ抗体又は抗ＥＤ−Ｂ抗体フラグメントを含むコンジュゲートが、特に、がん、血管形成、又は新生物性成長の阻害に対する医薬の製造の標的薬剤として記載されている（例えば、特許文献７、特許文献８、特許文献９を参照）。細胞毒性剤又は免疫賦活剤等の適切なエフェクター機能に抱合させた抗ＥＤ−Ｂ抗体又は抗ＥＤ−Ｂ抗体フラグメントによる固形腫瘍の新生脈管構造の選択的ターゲッティングは、動物実験においては成功することが判明している。膵臓がんの治療に関し、インターロイキン−２部分と抗ＥＤ−Ｂ抗体部分とを含む融合タンパク質を小分子と併用した（例えば、特許文献１０を参照）。
【００１２】
特許文献１１及び特許文献１２は、フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対して高親和性結合を有する修飾ユビキチンに基づく多量体タンパク質を開示している。これらの出願は、腫瘍脈管系に対して高効率なターゲッティングを示す抗ＥＤ−Ｂ結合分子を記載している。
【００１３】
インターフェロン
インターフェロンアルファ（略語：ＩＦＮ−アルファ又はＩＦＮ−α）はサイトカインである。異なる遺伝子によってコードされた、１０を超える異なるサブタイプがヒトに存在する。全てのＩＦＮ−アルファサブタイプは、ＩＦＮ−ベータとともに、２つのサブユニット、ＩＦＮＡＲ１及びＩＦＮＡＲ２で構成されるＩＦＮ−アルファ受容体（ＩＦＮＡＲ）に結合する。ＩＦＮＡＲ分子は、ほとんどの細胞種に存在し、それらの細胞をＩＦＮ−アルファシグナルに対して応答性としている。ＩＦＮ−アルファとその受容体との間の相互作用は種特異性が高い。医薬における使用に関して、特にインターフェロンＩＦＮ−アルファ２ａ及びＩＦＮ−アルファ２ｂが着目されている。両インターフェロンは、ＩＦＮ−アルファ受容体に対して高親和性を示す。
【００１４】
インターフェロンアルファの役割ががんにおいて研究されている。ＩＦＮ−アルファ２ａ又は２ｂを含む医薬は、当初、有毛細胞白血病及び慢性骨髄性白血病のような適応症に使用されていた。ＩＦＮ−アルファは、今もなお腎細胞癌及び皮膚リンパ腫の治療において使用されているが、ＩＦＮ−アルファに比べてその他の治療法の有効性が高められている。治療反応を得るには、高用量のＩＦＮ−アルファを使用しなければならず、高い毒性を引き起こす。ＩＦＮ−アルファは、抗がん活性及び抗ウイルス活性を含む多くの細胞効果を有する。ＩＦＮ−アルファ療法は、治療結果を達成するのに何カ月にも亘って適用しなければならないことが多い。それでもなお、ＩＦＮ−アルファは、ヒトにおける転移性腫瘍に対して治療効果を有する可能性のある非常に数少ないがん治療法の一つである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第０４／１０６３６８号
【特許文献２】国際公開第２０１１／０７３２１４号
【特許文献３】国際公開第９７／４５５４４号
【特許文献４】国際公開第０７／０５４１２０号
【特許文献５】国際公開第９９／５８５７０号
【特許文献６】国際公開第０１／６２８００号
【特許文献７】国際公開第０６／１１９８９７号
【特許文献８】国際公開第０７／１２８５６３号
【特許文献９】国際公開第０１／６２２９８号
【特許文献１０】国際公開第０７／１１５８３７号
【特許文献１１】国際公開第２０１１／０７３２０８号
【特許文献１２】国際公開第２０１１／０７３２０９号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Vijay-Kumar et al.,1987 Apr 5; J. Mol.Biol., 194(3):531-44
【非特許文献２】Menrad andMenssen, 2005 Expert Opin Ther Targets 9:491-500
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
がんは、世界的に主要な死因の１つであることから、がん治療の薬剤の改良の必要性が高まっている。現在のがん治療薬及び放射線治療は、選択性が乏しいことが欠点である。ほとんどのがん治療薬は、腫瘍部位に蓄積しないため、腫瘍内で十分な濃度を達成することができない。このため重大な副作用を生じる。さらに、多くのがん治療薬の毒性プロファイルにより投与量が制限され、このため有益な効果も制限されている。がん治療薬が単独で投与された場合には、組織透過性が乏しく、また腫瘍取り込みも乏しいことが多いため、健康な組織にがん治療薬が蓄積する。言うまでもなく、効果的にがんを治療する強い医療的必要性が存在する。
【００１８】
画期的ながん治療は抗がん剤の腫瘍標的輸送を使用する。これらの薬物は、腫瘍に対して直接的に標的化され、健康な組織に害を与えない（spare）ものでなければならない。薬学的に活性な成分と腫瘍抗原を対象とする結合タンパク質（典型的には抗体）とを含むコンジュゲートが従来技術に記載されている。しかしながら、これらのコンジュゲートは、薬学的に活性な成分の側面及び／又は結合タンパク質の側面に欠点を有する。
【００１９】
当該技術分野において、結合タンパク質が上記のような通常使用される抗体の不利益を有さず、薬学的に活性な成分が傑出した抗腫瘍活性を呈するコンジュゲートに対する必要性が残されている。特に、当該技術分野において、効果的な腫瘍標的化治療薬に対する強い必要性が残されている。理想的には、結合タンパク質が通常使用される抗体の不利益を有さず、薬学的に活性な成分が傑出した抗腫瘍活性を呈する画期的なコンジュゲートが、効果的な治療薬であるとされる。これを達成するため、腫瘍標的は、高腫瘍特異性であり、腫瘍組織中に大量に存在しなければならない。腫瘍標的への結合は、高い親和性及び選択性により起こらなければならない。さらに、高い親和性標的結合に加え、腫瘍治療薬は、治療的効果を利用する高活性な機能的ドメインを有していなければならない。
【００２０】
したがって、本発明の目的は、（ｉ）抗体と比較して有利な標的化結合タンパク質と、（ｉｉ）改善された抗腫瘍活性を呈する薬学的に活性な成分とを含む新規な融合タンパク質を提供することである。
【００２１】
本発明の融合タンパク質に関連する利点は、疾患の特定部位、特にがん細胞へのＩＦＮ−アルファのターゲッティングである。これにより、治療の効果を高めることができる。さらに、腫瘍に対する特異的な治療効果は、分子を特定の細胞へと向けることにより高められる。したがって、本発明の融合タンパク質と関連すると予想される利点は、ＩＦＮ−アルファの投与量が低くなることからＩＦＮ−アルファ単独と比べて毒性が低いことである。
【００２２】
ＩＦＮとＥＤ−Ｂ標的化結合タンパク質との融合タンパク質の更なる利点は、腫瘍を扱う上で有益となり得る抗アポトーシス効果であるだろう。サイズの小さい融合タンパク質は、腫瘍への最適な浸透に好都合である。
【００２３】
本発明の融合タンパク質に関連する更なる利点は、薬学的に活性な成分を有さない（例えば、インターフェロン部分を有さない）結合タンパク質と比較して、またターゲッティングドメインを有さないインターフェロンと比較して、血漿中での安定性が強化されており、体内での生物学的半減期が増加されていることである。血漿半減期の延長、及び疾患標的への優れた親和性は、腫瘍における融合タンパク質の蓄積に有益である。いかなる特定の理論によっても束縛されることを望むものではないが、本発明の融合タンパク質のクリアランスの減少は、生物学的半減期の増加をもたらすと考えられる。
【００２４】
提出された独立請求項の主題によって、上記目的が解決され、利益が達成される。本発明の好ましい実施の形態は、従属請求項、並びに以下の説明、実施例及び図面に包含される。
【００２５】
上記概説は、必ずしも本発明によって解決される全ての課題を説明するものではない。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
第１の態様では、本発明は以下の部分を含む、から本質的になる、又はからなる融合タンパク質に関する：（ｉ）インターフェロン又はその生物学的に活性な変異タンパク質、（ｉｉ）標的分子に結合可能な修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質、及び（ｉｉｉ）任意にリンカー。
【００２７】
第２の態様では、本発明は医薬に使用される第１の態様による融合タンパク質に関する。
【００２８】
第３の態様では、本発明はがん又は感染性疾患の治療に使用される第１の態様による融合タンパク質に関する。
【００２９】
第４の態様では、本発明は第１の態様に規定される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００３０】
第５の態様では、本発明は第４の態様のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３１】
第６の態様では、本発明は第１の態様に規定される融合タンパク質、第４の態様に規定されるポリヌクレオチド、又は第５の態様に規定されるベクターを含む宿主細胞に関する。
【００３２】
第７の態様では、本発明は第１の態様に規定される融合タンパク質、第４の態様に規定されるポリヌクレオチド、第５の態様に規定されるベクター、又は第６の態様に規定される宿主細胞を含み、薬学的に許容可能な担体を更に含む、医薬組成物に関する。
【００３３】
第８の態様では、本発明は第１の態様に規定される融合タンパク質を作製する方法であって、
（ａ）単量体ユビキチンタンパク質に由来する、別々に修飾された二量体ユビキチンタンパク質の集団を準備する工程であって、上記集団が、好ましくはヘッドトゥテイル配置で、ともに連結された２つの修飾ユビキチンモノマーを含む二量体ユビキチンタンパク質を含み、上記二量体タンパク質の各単量体が、配列番号１又は配列番号９１の１〜８アミノ酸の置換によって別々に修飾されている工程と、
（ｂ）潜在的なリガンドとして標的分子を準備する工程と、
（ｃ）別々に修飾されたタンパク質の上記集団を上記標的分子と接触させる工程と、
（ｄ）スクリーニング作業によって修飾二量体ユビキチンタンパク質を同定する工程であって、上記修飾二量体ユビキチンタンパク質が、Ｋｄ≦１０−７Ｍの特異的な結合親和性で上記標的分子に結合する工程と、
（ｅ）上記結合親和性により、上記修飾二量体ユビキチンタンパク質を単離する工程と、
（ｆ）ＩＦＮ−α又はその生物学的に活性な変異タンパク質を工程ｅ）で得られた修飾二量体ユビキチンタンパク質に融合する工程と、
を含む、方法に関する。
【００３４】
第９の態様では、本発明は第１の態様に規定される融合タンパク質を調製する方法であって、
（ａ）第１の態様に規定される融合タンパク質をコードする核酸を調製する工程と、
（ｂ）上記核酸を発現ベクターに導入する工程と、
（ｃ）上記発現ベクターを宿主細胞に導入する工程と、
（ｄ）宿主細胞を培養する工程と、
（ｅ）宿主細胞を、上記ベクターから融合タンパク質が発現される培養条件に供する工程であって、それによって態様１〜８のいずれか１項に記載の融合タンパク質を産生する工程と、
（ｆ）任意に、工程（ｅ）において産生された融合タンパク質を濃縮又は単離する工程と、
を含む、方法に関する。
【００３５】
この本発明の概要は、必ずしも本発明の全ての特徴を説明するものではない。その他の実施形態は、次の詳細な説明の総括より明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＩＦＮ−アルファ配列の３つの異なるアラインメントを示す。一番上のアラインメントは、シグナルペプチドを有していないヒトＩＦＮ−アルファ−２ａ（配列番号８）、シグナルペプチドを有するヒトＩＦＮ−アルファ−２ａ（配列番号９）、シグナルペプチドを有していないヒトＩＦＮ−アルファ−２ｂ（配列番号１０）、及びシグナルペプチドを有してないヒトＩＦＮ−アルファ−２ｃ（配列番号１１）のアミノ酸配列を比較する。真中のアラインメントは、ヒトＩＦＮ−アルファ−２ａ（配列番号９）、ＩＦＮ−アルファ−６（配列番号１２）、ＩＦＮ−アルファ−１４（配列番号１３）、ＩＦＮ−アルファ−４（配列番号１４）、及びＩＦＮ−アルファ−５（配列番号１５）のアミノ酸配列を比較する。全てのＩＦＮ−アルファ形態はそれらのシグナルペプチドとともに示されている。一番下のアラインメントは、異なる種由来のＩＦＮ−アルファ配列、すなわち、ヒトＩＦＮ−アルファ−２ａ（配列番号９）、マウスＩＦＮ−アルファ−２（配列番号１６）、ラットＩＦＮ−アルファ−１（配列番号１７）、及びウサギＩＦＮ−アルファのフラグメント（配列番号１８）を比較する。灰色の背景は、ヒトＩＦＮ−アルファ−２ａ及び各ＩＦＮ−アルファ分子において同一のアミノ酸をハイライトしている。
【図２Ａ−１】本発明の幾つかの融合タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図２Ａは、ＩＦＮ−１０４１−Ｄ１１（配列番号３７）、ＩＦＮ−１２５５−Ｂ９（配列番号３８）、ＩＦＮ−１２５５−Ｂ１０（配列番号３９）、ＩＦＮ−１２４７−Ｇ１１（配列番号４０）、ＩＦＮ−１２５５−Ｇ１２（配列番号４１）、ＩＦＮ−１２４７−Ｆ８（配列番号４２）、ＩＦＮ−１２３７−Ｂ１０（配列番号４３）、ＩＦＮ−１２３７−Ｈ４（配列番号４４）、ＩＦＮ−１２３９−Ｂ１０（配列番号４５）、ＩＦＮ−１２４６−Ｈ５（配列番号４６）、ＩＦＮ−１２４７−Ｇ１（配列番号４７）、ＩＦＮ−１２４７−Ｈ２（配列番号４８）、ＩＦＮ−１２４８−Ｅ１（配列番号４９）、ＩＦＮ−１２４９−Ｅ５（配列番号５０）、ＩＦＮ−１２５３−Ａ１１（配列番号５１）、ＩＦＮ−１２５５−Ａ８（配列番号５２）、ＩＦＮ−１２５５−Ｇ３（配列番号５３）、及びＩＦＮ−１２５５−Ｈ３（配列番号５４）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図２Ｂは、ＩＦＮ−１３５３−Ｈ６（配列番号７８）、ＩＦＮ−１３５１−Ｅ９（配列番号７９）、ＩＦＮ−１３５４−Ａ８（配列番号８０）、及びＩＦＮ−１３５１−Ｅ９＿Ｆ６３Ｐ（配列番号８１）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図２Ａ及び図２Ｂに提示される修飾単量体ユビキチンサブユニットは、ユビキチンＦ４５Ｗ、すなわち、アミノ酸交換（aminoacid exchange）Ｆ４５Ｗによって配列番号１による野生型配列とは異なるユビキチン変異タンパク質に基づく。インターフェロンアルファ２ｂ配列は、図２Ａ及び図２Ｂにおいてイタリック体で示される。標的結合に関連する置換は、ユビキチン単量体において太字及び灰色の背景を使用してハイライトされている。アミノ酸交換Ｆ４５Ｗは、ハイライトされていない。リンカー領域には下線が引かれている。７５位及び７６位における交換（Ｇ７５Ａ及びＧ７６Ａ）は、ＥＤ−Ｂの結合に重要ではない（そのため、ハイライトされていない）。
【図２Ａ−２】同上
【図２Ｂ】同上
【図３Ａ−１】本発明の幾つかの融合タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図３Ａは、１０４１−Ｄ１１−ＩＦＮ（配列番号５５）、１２５５−Ｂ９−ＩＦＮ（配列番号５６）、１２５５−Ｂ１０−ＩＦＮ（配列番号５７）、１２４７−Ｇ１１−ＩＦＮ（配列番号５８）、１２５５−Ｇ１２−ＩＦＮ（配列番号５９）、１２４７−Ｆ８−ＩＦＮ（配列番号６０）、１２３７−Ｂ１０−ＩＦＮ（配列番号６１）、１２３７−Ｈ４−ＩＦＮ（配列番号６２）、１２３９−Ｂ１０−ＩＦＮ（配列番号６３）、１２４６−Ｈ５−ＩＦＮ（配列番号６４）、１２４７−Ｇ１−ＩＦＮ（配列番号６５）、１２４７−Ｈ２−ＩＦＮ（配列番号６６）、１２４８−Ｅ１−ＩＦＮ（配列番号６７）、１２４９−Ｅ５−ＩＦＮ（配列番号６８）、１２５３−Ａ１１−ＩＦＮ（配列番号６９）、１２５５−Ａ８−ＩＦＮ（配列番号７０）、１２５５−Ｇ３−ＩＦＮ（配列番号７１）、及び１２５５−Ｈ３−ＩＦＮ（配列番号７２）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図３Ｂは、１３５３−Ｈ６−ＩＦＮ（配列番号８２）、１３５１−Ｅ９−ＩＦＮ（配列番号８３）、１３５４−Ａ８−ＩＦＮ（配列番号８４）、及び１３５１−Ｅ９＿Ｆ６３Ｐ−ＩＦＮ（配列番号８５）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図３Ａ及び図３Ｂに提示される修飾単量体ユビキチンサブユニットは、ユビキチンＦ４５Ｗ、すなわち、アミノ酸交換Ｆ４５Ｗによって配列番号１による野生型配列とは異なるユビキチン変異タンパク質に基づく。インターフェロンアルファ２ｂ配列は、図３Ａ及び図３Ｂにおいてイタリック体で示される。標的結合に関連する置換は、ユビキチン単量体において太字及び灰色の背景を使用してハイライトされている。アミノ酸交換Ｆ４５Ｗは、ハイライトされていない。リンカー領域には下線が引かれている。７５位及び７６位における交換（Ｇ７５Ａ及びＧ７６Ａ）は、ＥＤ−Ｂの結合に重要ではない（そのため、ハイライトされていない）。
【図３Ａ−２】同上
【図３Ｂ】同上
【図４】図２Ａ及び図３Ａに示される融合タンパク質中に存在する１８個の修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質部分のコンセンサス配列を示す。上記１８個の修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質部分は、配列番号１９〜３６により配列表において示される。図４は、ランダム化されたそれらのアミノ酸位置のみを列挙する。数字２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、及び６６はＮ末端ユビキチン単量体（「第１モノマー」）におけるアミノ酸位置を指し、数字６’、８’、６２’、６３、’６４’、６５’、及び６６’はＣ末端ユビキチン単量体（「第２モノマー」）におけるアミノ酸位置を指す。
【図５】本発明の融合タンパク質のインターフェロン−ドメインの機能性を示す。結合は、最適線（fitted line）で結ばれた黒丸で示される。インターフェロンα／β受容体は、１６．７ｎＭ＝１．６７×１０−８Ｍの親和性で融合タンパク質（１０４１−Ｄ１１−ＩＦＮ、配列番号５５）に結合する。
【図６】異なる細胞種に関するＩＦＮ−アルファに融合された種々のがん結合タンパク質の解析を示す。第１列は、ＥＤ−Ｂ発現細胞株Ｗｉ３８に対する染色を示す。第２列は、コントロールとしてのＮＨＤＦ細胞株に関する解析を示す。１３５３−Ｈ６−ＩＦＮ及び１３５４−Ｈ８−ＩＦＮは、Ｗｉ３８細胞由来のＥＤ−Ｂ含有細胞外マトリクスに対して５０ｎＭという強い結合を示す。１０４１−Ｄ１１−ＩＦＮ及び１２５５−Ｂ９−ＩＦＮの検出は、１３５３−Ｈ６−ＩＦＮ及び１３５４−Ｈ８−ＩＦＮの結合ほど強くはなかった（行１）。ＮＨＤＦ細胞に対する結合は観察されなかった（列２）。行５及び行６において、タンパク質ＵＢ２−ＩＦＮ−アルファ（２つの予め修飾された、非標的化ユビキチン単量体（配列番号９１）と特異的ながんターゲッティング機能を有していないインターフェロンアルファとの融合タンパク質）ＩＦＮ−アルファ及びＰＢＳコントロールは染色を示さない。
【図７】種々の濃度の１０４１−Ｄ１１−ＩＦＮ、１２５５−Ｂ９−ＩＦＮ、１３５３−Ｈ６−ＩＦＮ、１３５４−Ａ８−ＩＦＮ及びＵＢ２−ＩＦＮのＦ９腫瘍切片に対する結合を示す。変異体１２５５−Ｂ９−ＩＦＮ（列２）、１３５３−Ｈ６−ＩＦＮ（列３）及び１３５４−Ａ８−ＩＦＮ（列４）は、５０ｎＭの濃度での強いＥＤ−Ｂ結合を提供する。１０４１−Ｄ１１−ＩＦＮは、より弱いＥＤ−Ｂ染色を示す（列１）。非ターゲッティングタンパク質ＵＢ２−ＩＦＮは、Ｆ９腫瘍切片では検出されなかった。抗ＩＦＮ−アルファ抗体の非特異的染色は検出されなかった（行３）。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義
本発明を以下で詳細に説明する前に、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコル及び試薬は変動し得ることから、本発明はこれらに限定されないと理解すべきである。本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、添付した特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解すべきである。他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。
【００３８】
好ましくは、本明細書中で使用される用語は、"A
multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)",
Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Koelbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica
Acta, CH-4010 Basel, Switzerlandに記載されているように定義される。
【００３９】
以下の本明細書及び添付の特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、「含む」という単語、及びその変化形（the
word "comprise", and variations such as "comprises" and
"comprising"）は、記載された整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を包含することを示唆するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外することを示唆しないと理解される。
【００４０】
幾つかの文書（例えば、特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、使用説明書、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号配列寄託等）が、本明細書の文章の至るところで引用されている。本明細書において、いかなる事項も、本発明が、先行発明によるそのような開示に先行する権利を与えられていないことを承認するものとして解釈されるものではない。本明細書に引用される幾つかの文献は、「引用することにより本明細書の一部をなす」ものと特徴づけられる。そのような本明細書の一部をなす引用文献の規定又は教示と本明細書において詳述される規定又は教示との間に不一致が生じた場合には、本明細書の文章を優先する。
【００４１】
配列：本明細書において言及される全ての配列は、その内容全体及び開示とともに本明細書の一部をなす添付の配列表において開示される。
【００４２】
「約」という用語が数値に関連して使用される場合、示される数値よりも５％小さい下限及び示される数値よりも５％大きい上限を有する範囲内に数値が包含されることを意味する。
【００４３】
「フィブロネクチンのエキストラドメインＢ」又は「ＥＤ−Ｂ」と簡略して示される用語は、配列番号２に対して少なくとも７０％、任意に７５％、更に任意に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％若しくは９７％の配列同一性を示し、又は最も好ましくは配列番号２に対して１００％の配列同一性を示し、上記に規定されるＥＤ−Ｂの機能性（特に、上記「腫瘍特異的タンパク質としてのフィブロネクチンのエキストラドメインＢ」と題される節を参照）を有する全てのタンパク質を含む。
【００４４】
「結合可能なタンパク質」又は「結合タンパク質」という用語は、以下に更に規定される標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ等の腫瘍抗原）に対する結合ドメインを含むユビキチンタンパク質を指す。ユビキチンに基づく任意のそのような結合タンパク質は、例えば、多量体化部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー、及び／又は非タンパク質性ポリマー分子等の結合ドメインではない更なるタンパク質ドメインを含んでもよい。非タンパク質性ポリマー分子の幾つかの例として、ヒドロキシエチルスターチ、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリアルキレンが挙げられる。
【００４５】
抗体及びそのフラグメントは当業者に既知である。本発明の結合タンパク質は、Ｆａｂ又はｓｃＦｖフラグメント等の抗体又はそのフラグメントではない。さらに、本発明の結合ドメインは、抗体に存在するような免疫グロブリンフォールドを含まない。
【００４６】
本明細書において、「リガンド」及び「標的分子」、並びに「結合パートナー」という用語は、同意語として使用され、交換可能である。リガンドは、本明細書に規定される親和性を伴ってヘテロ多量体修飾ユビキチンタンパク質に結合可能な任意の分子（例えば、抗原又はハプテン）である。
【００４７】
本発明の実施に際して好ましい「標的分子」はタンパク質であり、より具体的にはタンパク質上に存在する抗原エピトープである。より好ましくは、「標的分子」は、腫瘍細胞の外側に存在するが、同一の組織種の正常細胞に存在しないか、又は腫瘍組織に存在するが、同一組織種の正常組織には存在しないタンパク質又はエピトープ等の腫瘍抗原である。本発明との関連で特に好ましい「標的分子」は、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂである。
【００４８】
「ユビキチンタンパク質」という用語は、配列番号１によるユビキチン、及び以下の規定によるその修飾タンパク質を含む。ユビキチンは真核生物において高度に保存されている。例えば、これまで調査された全ての哺乳類において、ユビキチンは同一のアミノ酸配列を有する。ヒト、齧歯類、ブタ、及び霊長類由来のユビキチン分子が特に好ましい。さらに、任意の他の真核生物起源のユビキチンを使用することができる。例えば、酵母のユビキチンは、配列番号１の配列と３個のアミノ酸が相違するのみである。一般的に上記「ユビキチンタンパク質」という用語に含まれるユビキチンタンパク質は、配列番号１に対して７０％を超える、好ましくは７５％を超える、好ましくは８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９６％を超える、９７％を超える、又は９８％を超えるアミノ酸同一性を示す。また、本明細書において使用される場合、「ユビキチンタンパク質」という用語は、配列番号１に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、又は少なくとも９８％のアミノ酸同一性を呈するユビキチン由来タンパク質も含む。
【００４９】
「修飾ユビキチンタンパク質」という用語は、ユビキチンタンパク質の修飾、アミノ酸の置換、挿入若しくは欠失のいずれか１つ、又はこれらの組み合わせを指すが、上記の修飾のいずれか１つによって為される修飾で最も好ましいのは置換である。修飾の数は、上記修飾単量体ユビキチンユニットが、配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％及び少なくとも９０％からなる群の１つのアミノ酸同一性を有するように厳密に制限される。したがって、単量体ユニットにおける置換の総数は多くても、８０％アミノ酸同一性に相当する１５個のアミノ酸に制限される。ヘテロ二量体ユビキチン分子における修飾アミノ酸の合計数は、ヘテロ二量体タンパク質に基づいて２０％アミノ酸修飾に相当する３０個のアミノ酸である。配列番号１の基本的な単量体配列を有する二量体非修飾ユビキチンタンパク質と比較した二量体修飾ユビキチンタンパク質のアミノ酸同一性は、少なくとも８０％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、及び少なくとも９０％からなる群の１つより選択される。
【００５０】
２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定するため、例えば、ＳＩＭ  Ｌｏｃａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙプログラム（Xiaoquin Huang and Webb Miller, Advances in Applied Mathematics,
vol. 12: 337-357, 1991）又はＣｌｕｓｔａｌＷを使用することができる（Thompson
et al., Nucleic Acids Res., 22(22): 4673-4680, 1994）。特に、ユビキチン誘導体と配列番号１のアミノ酸配列との間の配列同一性（％）を、これらのプログラムのいずれによっても決定することができる。好ましくは、配列同一性（％）を算出する際、ＳＩＭ  Ｌｏｃａｌ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙプログラム又はＣｌｕｓｔａｌＷのデフォルトパラメーターを使用する。好ましくは、配列番号１に対する修飾タンパク質の配列同一性の程度は、配列番号１の完全配列と比較して決定される。
【００５１】
本発明に関連して、修飾配列とその配列の元となる配列（「親配列」とも呼ばれる）との間の配列同一性の程度は、別段の明確な指定がない限り、一般的に、非修飾配列の全長について算出される。
【００５２】
「二量体」は、本発明において、２つの単量体ユビキチンタンパク質を含むタンパク質と見なされる。二量体が２つの別々に修飾された単量体を含む場合、それは「ヘテロマー二量体（heteromeric-dimer）」又は「ヘテロ二量体（hetero-dimer）」と呼ばれる。したがって、本発明の「ヘテロ二量体」は、その特定の標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ等の腫瘍抗原又は任意の他の抗原）に対して組み合わされた結合特性（結合ドメイン）を呈する２つの別々に修飾された単量体ユビキチンタンパク質の融合体と見なされる。
【００５３】
本発明の修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質は、各単量体ユビキチンタンパク質を個別にスクリーニングし、その後それら２つを組み合わせることによって得られるのではなく、共同で標的分子に対して結合活性を呈する第１単量体ユニット及び第２単量体ユニットからなるヘテロ二量体タンパク質をスクリーニングすることによって得られることが強調される。組み合わされた二量体修飾ユビキチンタンパク質のみが本明細書に記載の優れた結合特性を有し、上記サブユニットの各々は、標的分子に対して非常に限られた結合親和性を呈すると予想される。
【００５４】
最も有力な結合ユビキチン分子に関する配列情報を取得した後は、任意のその他の方法、例えば化学合成により又は遺伝子工学的方法、例えば２つの既に同定された単量体ユビキチンユニット同士を連結することによりこれらの分子を得ることができる。
【００５５】
結合活性を有するヘテロ多量体結合タンパク質（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）を作製する上で別々に修飾されたユビキチン単量体の多量体化の利点は、標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ等の腫瘍抗原）に対して新たに高親和性結合特性を生じるように修飾することができるアミノ酸残基の合計数の増加にある。主な利点は、更に多くのアミノ酸が修飾されても、標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ等の腫瘍抗原）に対する上記の新たに創出された結合タンパク質の足場の安定性全体を低下させることなく、タンパク質の化学的完全性（protein-chemical integrity）が維持されることである。修飾残基を２つの単量体ユビキチンタンパク質に配分できることから、標的分子に対する新規な結合部位を作製するように修飾することができる残基の合計数が増加する。それゆえ、修飾ヘテロ二量体タンパク質において許容される修飾数は、修飾単量体ユビキチン分子における修飾数の二倍である。ユビキチン系標的分子結合タンパク質のモジュール構造は、上記修飾アミノ酸を２つの単量体ユビキチン分子上に含めると、修飾アミノ酸の総数を増加することができる。本発明の方法は、標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ等の腫瘍抗原）に対して１つの特異性を有するヘテロ二量体ユビキチン分子の同定を提供する。
【００５６】
したがって、結合パートナーに対して共通の結合部位を有するヘテロ二量体の使用は、それらの修飾残基の総量が、二量体を形成する２つの単量体ユニットに割り当てられることから、最終的な結合分子のタンパク質の化学的完全性に過度に影響を与えずに修飾残基数を増加する可能性を広げる。標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ等の腫瘍抗原）に結合する上記ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質は、タンパク質ライブラリーに存在する。
【００５７】
上記修飾ユビキチンが、各単量体タンパク質を単独で用いるよりも標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ等の腫瘍抗原）に対してより一層効率的に結合可能となるように、両結合領域は、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質表面上のアミノ酸の連続領域として形成される結合部位を形成する。本発明によれば、最も有力な結合ユビキチン分子をスクリーニングした後に２つの単量体タンパク質同士を連結するのではなく、既にヘテロ二量体ユビキチンが存在する状態でスクリーニング作業が行われる。最も有力な結合ユビキチン分子に関する配列情報を取得した後は、任意の他の方法、例えば化学合成により又は遺伝子工学的方法、例えば既に同定された単量体ユビキチンユニット同士を連結することにより、これらの分子を得ることができる。
【００５８】
本発明によれば、１つのリガンドに結合する２つの別々に修飾されたユビキチン単量体は、例えば、遺伝学的方法を使用して、ヘッドトゥテイル融合により互いに連結されている。この別々に修飾された融合ユビキチン単量体は、両方の「結合ドメイン領域」がともに作用する場合にのみ有効である。本明細書において、「結合ドメイン領域」は、標的への結合に関与する、配列番号１又は配列番号９１の領域２〜８及び領域６２〜６８、好ましくは２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、６８アミノ酸位置の１〜８個のアミノ酸、好ましくは少なくとも３個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも６個のアミノ酸において修飾されたアミノ酸を有するユビキチン単量体上の領域と規定される。
【００５９】
「ヘッドトゥテイル融合」は、第１タンパク質のＣ末端を第２タンパク質のＮ末端に融合するものと理解される。ヘッドトゥテイル融合において、単量体は、いかなるリンカーも伴わず、すなわち、直接的なペプチド結合により直接的に接続されてもよい。代替的には、ユビキチン単量体の融合を、リンカーを介して行うことができる。
【００６０】
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、共有結合若しくは非共有結合（例えば、水素結合を介する）、イオン相互作用若しくはファンデルワールス相互作用のいずれかにより少なくとも２つの他の分子を結び付ける分子、例えば、５’末端において１つの相補配列、及び３’末端において他の相補配列にハイブリダイズし、そのようにして２つの非相補配列を結び付ける核酸分子を指す。「リンカー」は、本出願との関連において、第１ポリペプチドと少なくとも更なるポリペプチドとを接続する部分として理解される。第２ポリペプチドは、第１ポリペプチドと同一であってもよく、又は異なってもよい。
【００６１】
本明細書において、ペプチドリンカーが好ましい。これは、ペプチドリンカーは、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとを接続するアミノ酸配列であることを意味する。ペプチドリンカーは、ペプチド結合によって第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドへと接続される。典型的には、ペプチドリンカーは、１〜２０個のアミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸の長さを有する。ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、ヒトに対して免疫原性でないことが好ましい。例えば、少なくともアミノ酸配列ＧＩＧ（配列番号３）を有するリンカー、又はアミノ酸配列ＳＧＧＧＧ（配列番号４）を有するリンカー、又は任意の他のリンカー、例えばＧＩＧ（配列番号３）、ＲＩＧ（配列番号７３）、ＳＧＧＧＧ（配列番号４）、ＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号５）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号６）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７）、ＳＧ、（ＳＧＧＧ）ｎ（すなわち、ｎは配列番号８８の繰り返しであり、ここで、ｎは１〜１０である（例えば、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってもよい））若しくは（ＧＧＧＳ）ｎ（すなわち、ｎは配列番号８７の繰り返しであり、ここで、ｎは１〜１０である（例えば、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってもよい））、又は任意の他のペプチドリンカーを使用することができる。また、２つのユビキチン単量体を遺伝学的に融合する他のリンカーは当該技術分野において既知であり、これらを使用することもできる。
【００６２】
同様に、ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質は、本発明の融合タンパク質においていかなるリンカーも伴わずに直接的にインターフェロンに接続されてもよい。代替的には、ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質のインターフェロンへの融合を、配列番号３、４、５、６、７、及び７３により規定されるリンカー等のリンカーを介して行うことができる。２つのタンパク質を遺伝学的に融合する他のリンカーは当業者に既知である。
【００６３】
本発明の修飾ユビキチンタンパク質は、標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ等の腫瘍抗原）に対する新規な結合親和性を有する操作された人工のタンパク質である。これは、野生型ユビキチンにおいて或る特定のアミノ酸を置換することによって、標的に対する結合親和性が新たに創出されたことを意味する。ユビキチン単量体において１〜８アミノ酸を置換し、２つの修飾ユビキチン単量体を連結した後、これらの新規な人工タンパク質、すなわちヘテロ二量体ユビキチンは、それ以前には存在しなかった結合能を有する。
【００６４】
また、「置換」という用語は、例えば、元のアミノ酸への化学基若しくは残基の置換又は付加によるアミノ酸の化学的修飾も含む。ベータシート領域の少なくとも１つのベータシート鎖に位置するアミノ酸、又はベータシート鎖に隣接する３アミノ酸以内に位置するアミノ酸を含むタンパク質の少なくとも１つの表面露出領域におけるアミノ酸の置換が極めて重要である。
【００６５】
本発明によれば、標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ等の腫瘍抗原）に対して特異的な新規の結合ドメインを作製するアミノ酸の置換を、任意の所望のアミノ酸を用いて行うことができる。すなわち、標的分子に対する新規な結合特性を生じる修飾には、所望の任意のアミノ酸をこの目的に使用することができるよう、アミノ酸がそれぞれ、置換されたアミノ酸と同様の特定の化学特性又は側鎖を有することに注意する必要はない。
【００６６】
本発明によれば、選択されたアミノ酸の修飾工程は、好ましくはランダム突然変異誘発、すなわち、選択されたアミノ酸のランダム置換による遺伝子レベルでの突然変異誘発によって行われる。好ましくは、ユビキチンの修飾は、各タンパク質に属するＤＮＡを改変するのに遺伝子工学的方法を用いて実施される。好ましくは、その後、原核生物又は真核生物においてユビキチンタンパク質の発現を実施する。
【００６７】
特に、置換は、ユビキチンタンパク質のベータシートの４つのベータ鎖の表面露出アミノ酸、又はベータシート鎖に隣接する３アミノ酸以内の表面露出アミノ酸において行われる。通常、各ベータ鎖は、５〜７個のアミノ酸からなる。例えば、配列番号１を参照すれば、ベータ鎖は、通常、アミノ酸残基２〜７、アミノ酸残基１２〜１６、アミノ酸残基４１〜４５及びアミノ酸残基６５〜７１を含む。付加的にかつ好ましく修飾され得る領域は、ベータシート鎖に隣接する３アミノ酸以内（すなわち、１、２、又は３アミノ酸）の位置を含む。付加的かつ好ましく修飾され得る上記好ましい領域は、特にアミノ酸残基８〜１１、アミノ酸残基６２〜６４及びアミノ酸残基７２〜７５を含む。好ましい領域は、２つのベータ鎖同士を連結するベータターンを含む。１つの好ましいベータターンは、アミノ酸残基６２〜６４を含む。ベータシート鎖に密接する最も好ましいアミノ酸は８位のアミノ酸である。さらに、アミノ酸置換に一層好ましい例は３６、４４、７０、及び／又は７１位である。例えば、付加的にかつ好ましく修飾され得るこれらの領域は、アミノ酸６２、６３、及び６４（３アミノ酸）、又はアミノ酸７２、７３（２アミノ酸）、又はアミノ酸８（１アミノ酸）を含む。
【００６８】
好ましい実施形態において、アミノ酸残基はアミノ酸置換によって改変される。しかしながら、欠失及び／又は挿入も可能である。付加され得るアミノ酸の数は、単量体ユビキチンサブユニットにおいて１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸に制限され、したがって、二量体ユビキチンタンパク質に関しては１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個のアミノ酸に制限される。欠失され得るアミノ酸の数は、単量体ユビキチンサブユニットにおいて１、２、３、４、５、６、７、又は８個のアミノ酸に制限され、したがって、二量体ユビキチンタンパク質に関しては１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個のアミノ酸に制限される。１つの実施形態において、アミノ酸の挿入は為されない。更なる実施形態においては、欠失は行われない。また他の実施形態においては、幾つかの欠失（例えば、ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個の欠失）が、幾つかの挿入（例えば、ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６個の挿入）と組み合わされている。
【００６９】
本発明の修飾ユビキチンタンパク質が、請求項で特定され、本明細書中に説明される上記置換に加えて、１つ又は複数のアミノ酸の欠失及び／又は付加をも含む場合には、野生型ヒトユビキチン（配列番号１）に与えられるアミノ酸位置を、対応するタンパク質同士で分配するために、上記修飾ユビキチンについてアラインメントさせなければならない。融合タンパク質の場合（以下を参照）、各単量体ユビキチンサブユニットのナンバリング（及びアラインメント）は同じ方法で行われ、すなわち、例えば、二量体のアラインメントは、各々のサブユニットの１位のアミノ酸から開始される。
【００７０】
単量体ユビキチン、好ましくは哺乳類、例えばヒト由来の単量体ユビキチンにおいて、ベータ鎖に存在するアミノ酸の少なくとも１０％（約２アミノ酸に相当する）、好ましくは少なくとも２０％（約４アミノ酸に相当する）、更に好ましくは少なくとも２２％（約５アミノ酸に相当する）を本発明に従って修飾、好ましくは置換し、以前には存在しなかった結合特性が生じることができる。ベータ鎖における修飾に加えて、特に、ベータ鎖に密接する更なるアミノ酸を修飾することができる。最大で約３０％、又は最大で約２５％が修飾、好ましくは置換される。１つのベータ鎖において、概して１〜４個のアミノ酸が修飾される。１つの実施形態において、２つのベータ鎖のアミノ酸が修飾される。好ましくは、第１ベータ鎖及び第４ベータ鎖、例えば、アミノ酸残基２〜７又はアミノ酸残基６５〜７１の領域において６個のアミノ酸のうち３個のアミノ酸が修飾されることが好ましい。
【００７１】
ヘテロ二量体の構成ユニットとして使用される本発明による修飾単量体ユビキチンの修飾アミノ酸は、最小でアミノ酸の６％から最大で合計アミノ酸の２０％を占める（約５〜約１５アミノ酸に相当する）。これを考慮すれば、配列番号１に対する修飾ユビキチンタンパク質の配列同一性は少なくとも８０％である。本発明の更なる実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列に対するアミノ酸レベルでの配列同一性は、少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、及び更には少なくとも９０％、少なくとも９２％又は少なくとも９５％である。また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、９７％を超えるアミノ酸配列同一性の修飾ユビキチンタンパク質を含む。
【００７２】
本発明の更なる実施形態において、ユビキチンは、配列番号１の領域２〜８及び／又は領域６２〜６８において、好ましくは２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、及び／又は６８位から選択される、５個又は６個又は７個のアミノ酸において修飾される。その他の実施形態において、これらの位置において修飾されるユビキチンは、既に前修飾（pre-modified）されていた。例えば、更なる修飾として、アミノ酸７４及び／又は７５及び／又は７６における、及び／又はアミノ酸４５における修飾を含むことができ、これにより新規な結合特性に影響を与えることなく、より良好な安定性又はタンパク質の化学的特性（protein-chemical properties）を生じる。修飾ユビキチン単量体は、配列番号１のユビキチンの合計５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個及び最大１５個のアミノ酸のアミノ酸が修飾、好ましくは置換されることで得られる。一例によれば、１４個の置換及び欠失を有する修飾単量体ユビキチンが得られた。ユビキチンのアミノ酸の合計数に基づけば、これは約２０％の割合に相当する。これは、通常は、はるかに低い割合で十分にタンパク質のフォールディングを妨げてしまうことから、予想外であった。
【００７３】
「ベータシート構造」は、本質的にシート様であり、ほぼ完全に引き延ばされていることによって定義される。ポリペプチド鎖の連続したセグメントから形成されるアルファへリックスとは対照的に、ベータシートはポリペプチド鎖の異なる領域により形成され得る。このようにして、一次構造において離れた領域を、互いに接近させることができる。ベータ鎖は、典型的には５〜１０アミノ酸（通常、ユビキチンにおいては５〜７残基）の長さを有し、ほぼ完全に引き延ばされた構造を有する。ベータ鎖同士は一方の鎖のＣ−Ｏ基と他方の鎖のＮＨ基の間に（その逆の場合も同様である）互いに水素結合を形成するように互いに接近している。ベータシートは、複数の鎖から形成され、Ｃアルファ原子の位置がシート状平面の上方又は下方の間で交互に入れ替わるシート様構造を有する。アミノ酸側鎖はこのパターンに従い、それにより交互に（alternatively）上端又は下端に向く。ベータ鎖の配向性により、このシートは平行シート又は逆平行シートに分類される。本発明によれば、両方とも突然変異可能であり、請求されるタンパク質の調製に使用することができる。
【００７４】
ベータ鎖及びベータシート構造の突然変異誘発に関して、表面に近いユビキチンにおいてベータ鎖又はベータ鎖（ベータシートの１つの鎖である）に隣接する３アミノ酸以内の位置を選択する。利用可能なＸ線結晶構造により、表面露出アミノ酸を同定することができる。結晶構造が利用可能でない場合には、コンピューター解析を試み、そのようにして利用可能な一次構造から表面露出ベータシート領域及び個々のアミノ酸位置の接近性を予測するか、又は３次元タンパク質構造をモデル化し、潜在的な表面露出アミノ酸に関する情報を得ることができる。その更なる開示を、例えば、非特許文献１から得ることができる。
【００７５】
しかしながら、ベータシートにおける修飾又はベータ鎖に隣接する３アミノ酸以内の位置の修飾を実施することは可能であり、突然変異が誘発されるアミノ酸位置の時間かかる前選択（pre-selection）を省略することができる。ベータシート構造又はベータシート鎖に隣接する３個以内のアミノ酸をコードするこれらのＤＮＡ領域は、それらのＤＮＡ環境から単離され、ランダム突然変異誘発に供され、その後、予めそれらが除去されたタンパク質をコードするＤＮＡ中へと再度組み込まれる。その後、所望の結合特性を有する変異体に対する選択作業を行う。
【００７６】
本発明のその他の実施形態においては、ベータ鎖、又は表面に近いベータ鎖に隣接する３個以内のアミノ酸は上述のように選択され、これらの選択された領域内において突然変異が誘発されるアミノ酸位置が同定される。その後、このようにして選択されたアミノ酸位置に、部位特異的突然変異誘発によってＤＮＡレベルで突然変異を誘発することができ、すなわち、特定のアミノ酸をコードするコドンが別の予め選択された特定のアミノ酸をコードするコドンによって置換されるか、又はこの置換がランダム突然変異誘発との関連で実施される。ここで、置換されるアミノ酸部位は規定されるが、新規ないまだ決定されていないアミノ酸をコードするコドンは規定されない。
【００７７】
「表面露出アミノ酸」は、周囲の溶媒に接触可能なアミノ酸である。タンパク質におけるアミノ酸の接触性がモデルトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙにおけるアミノ酸の接触性に比べて８％を超える場合、そのアミノ酸は「表面露出」と呼ばれる。これらのタンパク質領域又は個々のアミノ酸位置は、それぞれ、本発明により選択される潜在的な結合パートナーに対する好ましい結合部位でもある。さらに、Caster
et al., 1983 Science,
221, 709-713及びShrake & Rupley, 1973 J. Mol. Biol. 79(2):351-371を参照されたい。それらは完全な開示が引用することにより本出願の一部をなすものとする。
【００７８】
新たに生じた人工結合部位領域におけるアミノ酸置換によって、親タンパク質及び互いのタンパク質とは異なるユビキチン足場タンパク質の多様性は、各配列セグメントのターゲット突然変異誘発によって生み出され得る。この場合、極性、電荷、溶解性、疎水性又は親水性等の或る特定の特性を有するアミノ酸を、他の特性を有する各アミノ酸により、それぞれ置き換え又は置換することができる。置換の他に、「突然変異誘発」及び「修飾」及び「置き換え」という用語は、挿入及び／又は欠失も含む。また、タンパク質レベルにおいて、当業者に既知の方法によるアミノ酸側鎖の化学的改変によって修飾を実施することができる。
【００７９】
「ランダムに修飾されたヌクレオチド配列又はアミノ酸配列」は、幾つかの位置がヌクレオチド又はアミノ酸による挿入、欠失又は置換に供された、特徴を予測することのできないヌクレオチド配列又はアミノ酸配列である。多くの場合、挿入されたランダムなヌクレオチド（アミノ酸）は、「完全にランダム」であろう（例えば、ランダム化合成又はＰＣＲ媒介突然変異誘発の結果として）。しかしながら、ランダム配列は、共通の機能的特徴（例えば、発現産物のリガンドとの反応性）を有する配列も含むことができ、またランダム配列は、最終発現産物が、例えば、異なるアミノ酸の分布においても完全にランダムな配列であるという意味でランダムであってもよい。
【００８０】
本発明によれば、「Ｋｄ」（又はその代替的な綴りである「ＫＤ」）という用語は、本発明によれば１０−７〜１０−１２Ｍの範囲にある特異的な結合親和性を規定する。１０−５以下の値は、定量化可能な結合親和性と見なすことができる。本出願によれば、１０−７〜１０−１１Ｍは例えばクロマトグラフィー用途に好ましく、又は１０−９〜１０−１２Ｍは例えば診断又は治療用途に好ましい。更に好ましい結合親和性は、１０−７〜１０−１０Ｍ、好ましくは１０−１１Ｍの範囲である。結合親和性を決定する方法はそれ自身既知であり、例えば以下の方法から選択することができる：ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）により提供される）、蛍光分光法、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、超遠心分析法、ＦＡＣＳ。
【００８１】
「融合タンパク質」という用語は、機能的成分又はエフェクター成分に融合された本発明の結合タンパク質又は非結合タンパク質を含む融合タンパク質に関する。１つの実施形態において、本発明は、インターフェロン等の機能的ドメイン又はエフェクタードメインに融合されたターゲッティング部分として本発明のヘテロ二量体結合タンパク質を含む融合タンパク質に関する。本発明の融合タンパク質は、非ポリペプチド成分、例えば、治療的又は診断的に関連のある放射性核種の、例えば、非ペプチドリンカー、非ペプチドリガンドを更に含んでもよい。また、例えば、糖、オリゴ糖、又は多糖、脂肪酸等の小さい有機物又は非アミノ酸系化合物を含んでもよい。本発明の１つの好ましい実施形態において、ヘテロ二量体ユビキチン系ＥＤ−Ｂ結合分子は、治療的に関連のある特性を有するタンパク質又はペプチドに共有結合的に又は非共有結合的に抱合される。目的のタンパク質を支持体に共有結合的に及び非共有結合的に付着する方法は、当該技術分野において既知であり、したがって本明細書では更に詳細には記載しない。
【００８２】
インターフェロンの「生物学的に活性な変異タンパク質」という用語は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８の配列変異体であり、配列番号８〜１８による天然インターフェロン分子と同一の生物学的機能を呈するポリペプチドを包含する。そのような「生物学的に活性な変異タンパク質」分子は、天然に生じたものでもよく、又は人工的に創出されたポリペプチドであってもよい。本出願と関連して、「インターフェロンの生物学的に活性な変異タンパク質」という用語は、配列番号８〜１８（特に配列番号８又は１０）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％）を呈し、配列番号８〜１８（特に、それぞれ配列番号８又は１０）のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を有する、天然に生じるインターフェロン分子と同様に活性を呈するポリペプチドを特に指す。配列番号８〜１８（好ましくは配列番号８又は１０）によるアミノ酸配列の配列変異体は、上記配列変異体が配列番号８又は１０によるアミノ酸配列を有するヒトインターフェロン（特に、インターフェロンアルファ又はインターフェロンベータ、より好ましくはインターフェロンアルファ２ａ又は２ｂ）の活性の少なくとも９０％を呈する場合、本発明の目的のための「インターフェロンの生物学的に活性な変異タンパク質」ポリペプチドと見なされる。活性は、例えば、本出願の実施例３において説明される受容体結合アッセイにより、又は本出願の実施例８に詳述されるＩＳＲＥレポーター遺伝子アッセイにより決定され得る。
【００８３】
本発明による「医薬組成物」は、種々の活性成分、並びに希釈剤及び／又は担体が互いに混合されている組成物の形態で存在してもよく、又は有効成分が部分的若しくは全体的に明らかに異なる形態で存在する併用製剤の形態をとってもよい。そのような組み合わせ又は併用製剤の例として、キットの部品が挙げられる。
【００８４】
本発明による「組成物」は、少なくとも２種の薬理学的に活性な化合物を含む。これらの化合物は、同時、又は１分から数日の時間的隔たりにより個別に投与することができる。化合物は、同一経路又は異なった経路で投与することができる。例えば、一方の活性化合物の経口投与及び他方の活性化合物の非経口投与が可能である。また、活性化合物は、１つの薬剤、例えば、１つの輸液において、又は個別に配合された両方の化合物を含むキットとして配合されてもよい。また、両方の化合物が２以上の包装中に存在することも可能である。
【００８５】
本発明による「併用製剤」は、医薬活性剤、好ましくは細胞毒性剤又は細胞増殖抑制剤又は抗がん剤とともに本発明の融合タンパク質を含む。
【００８６】
本発明の実施形態
本発明を以下に更に説明する。以下の一節において、本発明の種々の態様をより詳細に規定する。規定される各態様は、特にそれとは反対の指示がない限り、任意の他の態様と組み合わせられてもよい。特に、好ましい又は有利であると示される任意の特徴は、特にそれとは反対の指示がない限り、任意の他の好ましい又は有利であると示される任意の特徴と組み合わせられてもよい。
【００８７】
第１の態様では本発明は、以下の部分を含む、から本質的になる、又はからなる融合タンパク質に関する：
（ｉ）インターフェロン又はその生物学的に活性な変異タンパク質、
（ｉｉ）標的分子に結合可能な修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質、及び、
（ｉｉｉ）任意にリンカー。
【００８８】
第１の態様の好ましい実施形態において、インターフェロンは、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）又はインターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）である。特に好ましい実施形態では、インターフェロンは、ＩＦＮ−α２ａ、ＩＦＮ−α２ｂ、ＩＦＮ−α２ｃ、ＩＦＮ−α６、ＩＦＮ−α１４、ＩＦＮ−α４、ＩＦＮ−α５、及びこれらのいずれかの生物学的に活性な変異タンパク質からなる群より選択されるＩＦＮ−αである。ＩＦＮ−アルファ２がより好ましく、ＩＦＮ−アルファ２ｂが更に好ましい。ＩＦＮ−アルファ２ａ及びＩＦＮ−アルファ２ｂは同一の受容体に対して特に高い親和性を有することから、両ＩＦＮ−アルファ分子がターゲッティング部分に対する融合パートナーとして使用され得る。
【００８９】
第１の態様の好ましい実施形態において、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質は、Ｋｄ≦１０−７、好ましくはＫｄ≦１０−８、より好ましくはＫｄ≦１０−９、更に好ましくはＫｄ≦１０−１０、最も好ましくはＫｄ≦１０−１１の標的分子に対する特異的な結合親和性を有する。
【００９０】
第１の態様の好ましい実施形態において、標的分子は腫瘍抗原である。特に好ましい実施形態において、標的分子はフィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）である。
【００９１】
第１の態様の好ましい実施形態において、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質は、ヘッドトゥテイル配置で互いに連結された２つの単量体ユビキチンユニットを含む。幾つかの実施形態において、これら２つの単量体ユビキチンユニットは、直接的に、すなわちリンカーを伴わずに連結される。代替的には、これら２つの単量体ユビキチンユニットは、リンカー配列により連結されてもよい。好ましくは、上記リンカーは、以下のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる：ＧＩＧ（配列番号３）、ＲＩＧ（配列番号７３）、ＳＧＧＧＧ（配列番号４）、ＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号５）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号６）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７）、ジペプチドリンカーＳＧ、（ＳＧＧＧ）ｎ（すなわち、ｎは配列番号８８の繰り返しであり、ここで、ｎは１〜１０である（例えば、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってもよい））、又は（ＧＧＧＳ）ｎ（すなわち、ｎは配列番号８７の繰り返しであり、ここで、ｎは１〜１０である（例えば、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってもよい））。
【００９２】
ユビキチンの修飾領域
修飾領域は、基本的には、それらが結合パートナーとしての標的分子に接触可能であるかどうか、及びタンパク質の全体構造が推定上、修飾に耐性を示すかどうかで選択され得る。ユビキチン分子内のアミノ酸の修飾には２つの領域が特に好ましい。第１の好ましい領域はアミノ酸２〜８の間であり、第２領域はアミノ酸６２〜６８の間である。
【００９３】
また、表面露出ベータ鎖における修飾以外に、タンパク質の他の表面露出領域における修飾を、好ましくはベータ鎖に隣接する３アミノ酸以内の位置で実施することもできる。これらの修飾された領域は、新たに生じるＥＤ−Ｂに対する高い結合親和性に関与する。
【００９４】
本発明の他の任意の実施形態において、タンパク質における４つのベータ鎖のうち１つ若しくは２つ、好ましくは２つにおけるアミノ酸、又は好ましくは４つのうち２つのベータ鎖に隣接する３アミノ酸以内の位置が修飾されて新規の結合特性を生じる。また、４つのベータ鎖のうち３つ若しくは４つにおける修飾、又はベータ鎖の３つ若しくは４つに隣接する３アミノ酸以内の位置における修飾を、ＥＤ−Ｂ結合の創出のために任意に行ってもよい。
【００９５】
アミノ末端鎖及びカルボキシ末端鎖におけるアミノ酸、又はアミノ末端鎖及びカルボキシ末端鎖に隣接する３アミノ酸以内の位置におけるアミノ酸が修飾、好ましくは置換されてＥＤ−Ｂに対する新規な結合部位を生じることが特に好ましい。これに関して、カルボキシ末端ベータシート鎖に隣接する４アミノ酸以内が（例えば、６２、６３、及び６４位において）修飾、好ましくは置換され、またアミノ末端ベータシート鎖に隣接する１アミノ酸以内が（例えば、８位において）修飾、好ましくは置換されることが特に好ましい。
【００９６】
哺乳類ユビキチン、好ましくはヒトユビキチンの２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、及び６８位のうちの３以上の少なくとも３個の表面露出アミノ酸における修飾、好ましくは置換が特に好ましい。これは、結合パートナーとしての標的分子に関して以前は存在しなかった結合親和性を有する修飾タンパク質の作製に重要である。
【００９７】
第１の態様の好ましい実施形態において、上記修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質における各単量体ユビキチンユニットは、配列番号１又は配列番号９１の領域２〜８及び／又は領域６２〜６８より選択される、好ましくは２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、及び６８位より選択される１〜８個のアミノ酸、好ましくは少なくとも３個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、及び最も好ましくは（preferably）少なくとも６個のアミノ酸の置換により、他方の単量体ユビキチンユニットにおける修飾とは独立的に修飾される。任意に、上記アミノ酸残基のうち１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個が修飾され、任意にアミノ酸残基の付加を組み合わせることができる。その他の位置も同様に置換に好適である可能性がある。ユビキチン単量体の修飾により、がん標的に対する高特異的結合が生み出され、かつユビキチンの構造が維持されることが重要である。
【００９８】
第１の態様の好ましい実施形態において、各修飾単量体ユビキチンユニットは、配列番号１又は配列番号９１により規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％（例えば少なくとも８３％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％又は少なくとも９７％）のアミノ酸配列同一性を有する。
【００９９】
第１の態様の好ましい実施形態において、単量体ユビキチンユニットにおける置換には、アミノ酸領域２〜８、及びアミノ酸領域６２〜６６における置換が含まれる。特に、両第１単量体ユニットについて、少なくとも６、６２、６３、６４、６５、６６のアミノ酸位置の１つ又は複数における置換、及びその他のアミノ酸の任意の更なる修飾、好ましくは置換が好ましい。
【０１００】
したがって、１つの実施形態において融合タンパク質は、概して第１ユビキチン単量体及び第２ユビキチン単量体において異なるアミノ酸置換を有する上記ユビキチン単量体の融合ヘテロ二量体であり、表１に示されるものが好ましい。
【０１０１】
表１：腫瘍への特異的ターゲッティングに関連するユビキチン単量体における好ましい置換（それぞれ、配列番号１９、２０、２１、７４、７５、７６、及び７７）
【表１】
2014523238.tif 000003
【０１０２】
第１の態様の好ましい実施形態において、単量体ユビキチンユニットにおける置換は、
（１）第１単量体ユニットにおいて、６、８、６３、６４、６５、及び６６のアミノ酸位置の群より選択される少なくとも１つ又は複数の位置における置換、並びに、
第２単量体ユニットにおいて、６、８、６２、６３、６４、６５、及び６６のアミノ酸位置の群より選択される少なくとも１つ又は複数の位置における置換、任意に更に２アミノ酸位置における置換、又は、
（２）第１単量体ユニットにおいて、２、４、６、６２、６３、６４、６５、及び６６のアミノ酸位置の群より選択される少なくとも１つ又は複数の位置における置換、並びに、
第２単量体ユニットにおいて、６、８、６２、６３、６４、及び６６のアミノ酸位置の群より選択される少なくとも１つ又は複数の位置における置換、任意に更に６５アミノ酸位置における置換、並びに、任意に、他のアミノ酸の更なる修飾、好ましくは置換を含む。
【０１０３】
第１単量体ユニットの２、４、６、６２、６３、６４、６５、及び６６のアミノ酸位置の群より選択される１つ又は複数の位置における好ましいアミノ酸置換は、図４に示されるコンセンサス配列から同定され得る（８位に示されるロイシン残基は、野生型配列に存在するアミノ酸である）。さらに、第２単量体ユニットの６、８、６２、６３、６４、６５、及び６６のアミノ酸位置の群より選択される１つ又は複数の位置における好ましいアミノ酸置換は、図４に示されるコンセンサス配列から同定され得る。第１単量体の６４のアミノ酸位置がリジン（Ｋ）によって置換され、第２単量体の８のアミノ酸位置がグルタミン（Ｑ）によって置換されていることが最も好ましい。
【０１０４】
したがって、１つの実施形態において、融合タンパク質は、第１ユビキチン単量体の２、４、６、及び６２〜６６のアミノ酸位置の群より選択される１つ又は複数の位置におけるアミノ酸置換、並びに第２ユビキチン単量体の６、８、６２〜６４及び６６のアミノ酸位置の群より選択される１つ又は複数の位置、また任意に６５位におけるアミノ酸残基の置換を有する上記ユビキチン単量体の遺伝学的に融合されたヘテロ二量体であり、好ましくは
第１ユビキチン単量体における置換は、
２位におけるグルタミン（Ｑ）からスレオニン（Ｔ）（又は置換なし）、
４位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）（又は置換なし）、
６位におけるリジン（Ｋ）からヒスチジン（Ｈ）、
６２位におけるグルタミン（Ｑ）からアスパラギン（Ｎ）、
６３位におけるリジン（Ｋ）からフェニルアラニン（Ｆ）、
６４位におけるグルタミン酸（Ｅ）からリジン（Ｋ）、
６５位におけるセリン（Ｓ）からロイシン（Ｌ）、及び、
６６位におけるスレオニン（Ｔ）からセリン（Ｓ）であり、
第２ユビキチン単量体における置換は、
６位におけるリジン（Ｋ）からヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）又はロイシン（Ｌ）、
８位におけるロイシン（Ｌ）からグルタミン（Ｑ）又はプロリン（Ｐ）、
６２位におけるグルタミン（Ｑ）からグリシン（Ｇ）又はトリプトファン（Ｗ）、
６３位におけるリジン（Ｋ）から芳香族側鎖を有するアミノ酸、好ましくはトリプトファン（Ｗ）又はチロシン（Ｙ）、
６４位における、グルタミン酸（Ｅ）から側鎖に−ＮＨ２基、又は−ＮＨ−基を含むアミノ酸、好ましくはグルタミン（Ｑ）又はヒスチジン（Ｈ）、
任意に、６５位におけるセリン（Ｓ）から多量の側鎖を有していないアミノ酸、好ましくはアラニン（Ａ）又はアスパラギン酸（Ｄ）、及び、
６６位におけるスレオニン（Ｔ）からプロリン（Ｐ）又はフェニルアラニン（Ｆ）、好ましくはアミノ酸置換Ｑ６２Ｇ及びＥ６４Ｑが存在する場合、プロリン（Ｐ）である。
【０１０５】
生じる修飾ユビキチンヘテロ二量体がフィブロネクチンの上記エキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）に対するＫｄ≦１０−７Ｍの特異的な結合親和性を示す限り、またユビキチンタンパク質の構造安定性が破壊又は障害されていない限り、いかなる制限も伴わずに第２単量体における選択的置換（alternative substitutions）を互いに組み合わせることができる。ＥＤ−Ｂに対するＫｄ≦１０−７Ｍの特異的な結合親和性が達成される限り、その他のアミノ酸置換が可能である。
【０１０６】
第１の態様の好ましい実施形態において、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質において１〜７アミノ酸が更に修飾されている。好ましくは更に修飾された上記１〜７のアミノ酸は、第１単量体ユビキチンユニットの２、４、８、３３、３６、３８、６２、４４、７０、及び７１位、並びに第２単量体ユビキチンユニットの２、１０、１６、３４、３６、４４、５１、５３、６５、７０、及び７１位における１つ又は複数のアミノ酸から選択される。
【０１０７】
第１の態様の幾つかの実施形態において、第１単量体ユビキチンユニットの４５、７５及び／又は７６位、及び／又は第２単量体ユビキチンユニットの４５、７５及び／又は７６位におけるアミノ酸が更に置換される。これらの位置における好ましい置換は、Ｆ４５Ｗ、Ｇ７５Ａ及びＧ７６Ａからなる群より選択される１つ又は複数の置換である。
【０１０８】
本発明の特に好ましい実施形態において、前修飾されたユビキチンは、Ｆ４５Ｗ、Ｇ７４Ａ及びＧ７５Ａの３つ全てのアミノ酸交換を含有する。上記前修飾されたユビキチンは、配列番号９１に示され、本発明の実施に特に適している。より具体的には、配列番号１による野生型ユビキチン配列を参照する本発明の全ての実施形態は、類似の方法で配列番号９１のアミノ酸配列に適用される。
【０１０９】
本発明の融合タンパク質
本発明は、インターフェロン又は生物学的に活性な変異タンパク質と、標的分子に結合可能な修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質とを含む融合タンパク質を提供する。がんターゲットが好ましい。
【０１１０】
第１の態様の幾つかの実施形態において、リンカーは存在せず、ＩＦＮ、好ましくはＩＦＮ−α、最も好ましくはＩＦＮ−アルファ２、更に好ましくはＩＦＮ−アルファ２ａ若しくはＩＦＮ−アルファ２ｂ、又はその生物学的に活性な変異タンパク質（複数の場合もある）、及び修飾ヘテロン二量体ユビキチンタンパク質が互いに直接的に融合される。
【０１１１】
第１の態様の幾つかの実施形態において、ＩＦＮ、好ましくはＩＦＮ−α、又はその生物学的に活性な変異タンパク質は、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質のＣ末端に位置されている。代替的には、ＩＦＮ、好ましくはＩＦＮ−α、又はその生物学的に活性な変異タンパク質は、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質のＮ末端に位置されている。
【０１１２】
第１の態様の幾つかの他の実施形態において、リンカーは存在し、ＩＦＮ、好ましくはＩＦＮ−α、又はその生物学的に活性な変異タンパク質と、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質とがリンカーを介して接続されている。幾つかの実施形態では、融合タンパク質のＮ末端からＣ末端までの部分は以下の順である：修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質−リンカー−ＩＦＮ、好ましくはＩＦＮ−α、又はその生物学的に活性な変異タンパク質。代替的には、融合タンパク質のＮ末端からＣ末端までの部分は以下の順である：ＩＦＮ、好ましくはＩＦＮ−α、又はその生物学的に活性な変異タンパク質−リンカー−修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質。好ましくは、上記リンカーは以下のアミノ酸配列：ＧＩＧ（配列番号３）、ＲＩＧ（配列番号７３）、ＳＧＧＧＧ（配列番号４）、ＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号５）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＩＧ（配列番号６）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７）、ＳＧ、（ＳＧＧＧ）ｎ（すなわちｎはＳＧＧＧ（配列番号８８）の繰り返しであり、ここで、ｎは１〜１０である（例えば、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってもよい））又は（ＧＧＧＳ）ｎ（すなわちｎはＧＧＧＳ（配列番号８７）の繰り返しであり、ここで、ｎは１〜１０である（例えば、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であってもよい））から選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる。
【０１１３】
第１の態様の更に好ましい実施形態において、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質は、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７及び配列番号１９〜３６、又は配列番号７４〜７７に記載の１つ又は複数のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を呈するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる。
【０１１４】
第１の態様の更に好ましい実施形態において、融合タンパク質は、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、及び配列番号３７〜７２、又は配列番号７８〜８５に記載の１つ又は複数のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を呈するアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、から本質的になる、又はからなる。
【０１１５】
第１の態様の幾つかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、非ポリペプチド成分、例えば、非ペプチドリンカー、非ペプチドリガンド、例えば、治療的に関連性のある放射性核種を含んでもよい。また小さい有機物又は非アミノ酸系化合物、例えば、糖、オリゴ糖又は多糖、脂肪酸等を含んでもよい。
【０１１６】
インターフェロン部分とヘテロ二量体ユビキチン部分とを含む融合タンパク質をいかにして得るかに関して幾つかの例を以下に示す：
ａ）ユビキチンに存在するリジン残基を介するインターフェロンの抱合、
ｂ）Ｃ末端又はその他の任意の位置（例えばアミノ酸残基２４又は５７）に位置し得るシステイン残基を介するヘテロ二量体ユビキチンベース結合タンパク質の抱合、マレイミド選択的成分（maleimide selectable components）による抱合、
ｃ）ペプチド又はタンパク新生抱合−遺伝学的融合（好ましくはＣ末端又はＮ末端）、
ｄ）「タグ」に基づく融合−標的タンパク質ＥＤ−ＢのＣ末端又はＮ末端のいずれかに位置するタンパク質又はペプチド。融合「タグ」、例えば、ポリイオニック（poly-ionic）（ｐｏｌｙ  Ｅ／ｐｏｌｙ  Ｒ）。
【０１１７】
目的のタンパク質を共有結合的に及び非共有結合的に支持体に付着するこれらの方法及び他の方法は、当該技術分野において既知であり、したがって、本明細書では更に詳細に記載しない。
【０１１８】
本発明の更なる実施形態において、本発明による融合タンパク質は、人工アミノ酸を含有してもよい。
【０１１９】
更なる実施形態は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする国際公開第２００６／０４０４１２９号に記載されるようなタンパク質、ペプチド、高分子（例えば、ポリエチレングリコール）、低分子量化合物、糖等より選択される機能的成分を更に含む、本発明による融合タンパク質に関する。
【０１２０】
更なる実施形態は、血清半減期を調節する成分、好ましくはポリエチレングリコール、アルブミン結合ペプチド、及び免疫グロブリンからなる群より選択される成分を更に含む、本発明による融合タンパク質に関する。
【０１２１】
第２の態様において、本発明は医薬に使用される第１の態様による融合タンパク質に関する。
【０１２２】
第３の態様において、本発明はがん又は感染性疾患の治療に使用される第１の態様による融合タンパク質に関する。
【０１２３】
本発明の第３の態様は、以下の通り代替的に表現され得る。すなわち、本発明の第３の態様は、がん又は感染症疾患を治療する方法であって、治療量の第１の態様による融合タンパク質を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、方法に関する。
【０１２４】
第３の態様の好ましい実施形態において、がんは、黒色腫、腎細胞がん、有毛細胞白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、カルチノイド腫瘍、多形性膠芽腫（脳）、乳がん、肺がん、肺の腺癌、結腸直腸がん、中皮腫、扁平上皮癌、肝臓がん、小細胞癌、大細胞癌、非小細胞肺がん、膵臓がん、及びホジキンリンパ腫からなる群より選択される。
【０１２５】
第３の態様の好ましい実施形態において、感染性疾患は、長期Ｂ型肝炎及び長期Ｃ型肝炎からなる群より選択される。
【０１２６】
第４の態様において、本発明は、第１の態様において規定される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。第４の態様の更なる実施形態において、ポリヌクレオチドは、医薬に使用され、例えば、がん又は感染性疾患の治療に使用される。
【０１２７】
本発明の１つの実施形態は、がん又は感染性疾患を治療する方法であって、治療量の第４の態様によるポリヌクレオチドを、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、方法に関する。第４の態様により治療されるがんは、好ましくは、第３の態様に関して上記に規定されるものと同一のがんのリストから選択される。同様に、第４の態様により治療される感染性疾患は、好ましくは、第３の態様に関して上記に規定されるものと同一の感染性疾患のリストから選択される。
【０１２８】
第４の態様の幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、原核宿主細胞及び／又は真核宿主細胞における本発明の融合タンパク質の発現を可能とする発現制御配列に制御可能に連結されている。そのような発現調節配列として、当業者に既知であり遺伝子発現を誘導させるか、又は制御する、誘導性及び非誘導性、構成的、細胞周期調節性、代謝調節性のプロモーター、エンハンサー、オペレーター、サイレンサー、リプレッサー及びその他のエレメントが挙げられるが、これらに限定されない。そのような調節エレメントとして、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写されるプロモーター（例えば、ｓｎＲＮＡ  Ｕ６又はｓｃＲＮＡ  ７ＳＫ遺伝子に対するプロモーター）、サイトメガロウイルスｈＣＭＶ即時型初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウイルスの初期プロモーター又は後期プロモーター、例えばＮＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶ、ＭＭＴＶ又はＨＩＶ由来のウイルスプロモーター及びアクチベーター配列のような構成的発現を指示する調節エレメント；例えば、ＣＵＰ−Ｉプロモーター、例えばｔｅｔ−ｏｎ又はｔｅｔ−ｏｆｆシステム、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステムに利用されるｔｅｔリプレッサーのような誘導性発現を可能とする調節エレメント；組織特異的発現を指示する調節エレメント、例えば、ｃｄｃ２、ｃｄｃ２５Ｃ又はサイクリンＡのような細胞周期特異的発現を指示する調節エレメント；又はＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ファージＡの主要なオペレーター及びプロモーター領域、ｆｄ外被タンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター並びに酵母α接合因子又はａ接合因子のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
第５の態様において、本発明は第４の態様のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。第５の態様の更なる実施形態において、ベクターは医薬に使用され、例えば、がん又は感染性疾患の治療に使用される。
【０１３０】
本発明の１つの実施形態は、がん又は感染性疾患を治療する方法であって、治療量の第５の態様によるベクターを、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、方法に関する。第５の態様により治療されるがんは、好ましくは、第３の態様に関して上記に規定されるものと同一のがんのリストから選択される。同様に、第５の態様により治療される感染性疾患は、好ましくは、第３の態様に関して上記に規定されるものと同一の感染性疾患のリストから選択される。
【０１３１】
本発明において好適に使用されるベクターには、プラスミド、ファージミド、ファージ、コスミド、人工哺乳類染色体、ノックアウトコンストラクト又はノックインコンストラクト、ウイルス、特にアデノウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、特に単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−Ｉ）、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ライノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、フィロウイルス及びそれらの遺伝子操作されたもの（engineered
versions）、ビロソーム、「ネイキッド（naked）」ＤＮＡリポソーム、及び核酸被覆粒子、特にゴールドスフィア（gold spheres）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
受容体をコードするｃＤＮＡを発現するのに、典型的には、転写を指示する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、及び翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクター中に受容体ｃＤＮＡをサブクローニングする。好適な細菌プロモーターは当該技術分野において既知であり（例えば、大腸菌、バシラス属（Bacillus sp.）、及びサルモネラ（Salmonella））、そのような発現システムのキットが商業的に入手可能である。同様に、哺乳類細胞、酵母、及び昆虫細胞に対する真核生物発現システムが当該技術分野において既知であり、これも商業的に入手可能である。真核生物発現ベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、又はレトロウイルスベクターであってもよい。
【０１３３】
第６の態様において、本発明は、第１の態様において規定される融合タンパク質、第４の態様において規定されるポリヌクレオチド、又は第５の態様において規定されるベクターを含む宿主細胞に関する。第６の態様の更なる実施形態において、宿主細胞は、医薬に使用され、例えば、がん又は感染性疾患の治療に使用される。
【０１３４】
本発明の１つの実施形態は、がん又は感染性疾患を治療する方法であって、治療量の第６の態様による宿主細胞を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む、方法に関する。第６の態様により治療されるがんは、好ましくは、第３の態様に関して上記に規定されるものと同一のがんのリストから選択される。同様に、第６の態様により治療される感染性疾患は、好ましくは、第３の態様に関して上記に規定されるものと同一の感染性疾患のリストから選択される。
【０１３５】
第６の態様による宿主細胞は、例えば、本発明のポリヌクレオチド分子を含有する組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換され得る、細菌（例えば、大腸菌又は枯草菌（B. subtilis））等の原核細胞；例えば、本発明のポリヌクレオチド分子を含有する組み換え酵母発現ベクターにより形質転換され得る、酵母（例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces）及びピチア属（Pichia））のような単純な真核細胞；例えば、ポリヌクレオチド分子を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）により感染され得る、例えば、Ｓｆ９又はＨｉ５細胞のような昆虫細胞系；例えばプラスミドにより注入され得る、両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル（Xenopus）卵母細胞；例えば、組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、若しくはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））により感染され得る、又は本発明のポリヌクレオチド配列を含有する組み換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換され得る、植物細胞系；又は、例えば、哺乳類細胞のゲノム由来プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、哺乳類ウイルス由来プロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター及びワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）、若しくは細菌細胞由来プロモーター（例えば、ｔｅｔ−リプレッサー結合がｔｅｔ−ｏｎシステム及びｔｅｔ−ｏｆｆシステムに利用される）を含有する組み換え発現コンストラクトによって形質転換され得る、哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｗｉ３８細胞、及びＮＩＨ  ３Ｔ３細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。宿主細胞としては、哺乳類から直接的に得られ、プラスミドベクターにより遺伝子導入されるか、又はウイルスベクターにより感染される、初代細胞又は二次細胞もまた有用である。本発明のポリヌクレオチドを導入するのに使用される宿主細胞及び各ベクターに依存して、ポリヌクレオチドを、例えば染色体若しくはミトコンドリアＤＮＡ中に組み入れることができ、又は例えばエピソームのように染色体外に維持することができ、又は細胞中に一時的にだけ含ませることができる。
【０１３６】
第７の態様において、本発明は、
第１の態様に規定される融合タンパク質、
第４の態様に規定されるポリヌクレオチド、
第５の態様に規定されるベクター、又は、
第６の態様に規定される宿主細胞、
を含み、薬学的に許容可能な担体を更に含む、医薬組成物に関する。
【０１３７】
本発明による融合タンパク質は、通常の有機合成戦略、固相支持合成技法等の多くの従来既知の技法、又は商業的に入手可能な自動化合成装置のいずれかによって調製され得る。一方、また本発明による融合タンパク質は、従来の組み換え技法単独で、又は従来の合成技法と組み合わせて調製されてもよい。
【０１３８】
第８の態様において、本発明は第１の態様に規定される融合タンパク質を作製する方法であって、
（ａ）単量体ユビキチンタンパク質に由来する、別々に修飾された二量体ユビキチンタンパク質の集団を準備する工程であって、上記集団が、好ましくはヘッドトゥテイル配置で、ともに連結された２つの修飾ユビキチンモノマーを含む二量体ユビキチンタンパク質を含み、上記二量体タンパク質の各単量体が、配列番号１又は配列番号９１の領域２〜８及び／又は領域６２〜６８、好ましくは２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６及び６８位の少なくとも１〜８個のアミノ酸、好ましくは少なくとも３個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも６個のアミノ酸の置換によって別々に修飾されている工程と、
（ｂ）潜在的なリガンドとして標的分子を供給する工程と、
（ｃ）別々に修飾されたタンパク質の上記集団を上記標的分子と接触させる工程と、
（ｄ）スクリーニング作業によって修飾二量体ユビキチンタンパク質を同定する工程であって、上記修飾二量体ユビキチンタンパク質が、Ｋｄ≦１０−７Ｍ（好ましくはＫｄ≦１０−８、より好ましくはＫｄ≦１０−９、更に好ましくはＫｄ≦１０−１０、最も好ましくはＫｄ≦１０−１１）の特異的な結合親和性で上記標的分子に結合する工程と、
（ｅ）上記結合親和性により、上記修飾二量体ユビキチンタンパク質を単離する工程と、
（ｆ）ＩＦＮ、好ましくはＩＦＮ−α、又はその生物学的に活性な変異タンパク質を工程ｅ）で得られた修飾二量体ユビキチンタンパク質に融合する工程と、
を含む、方法に関する。
【０１３９】
第８の態様の好ましい実施形態において、上記置換は、
（１）第１単量体ユニットにおいて、少なくとも６、８、６３、６４、６５、及び６６のアミノ酸位置の置換、並びに第２単量体ユニットにおいて、少なくとも６、８、６２、６３、６４、６５、及び６６のアミノ酸位置の置換、任意に更に２位の置換、又は、
（２）第１単量体ユニットにおいて、少なくとも２、４、６、６２、６３、６４、６５及び６６のアミノ酸位置の置換、並びに第２単量体ユニットにおいて、少なくとも６、８、６２、６３、６４、及び６６のアミノ酸位置の置換、任意に更に６５位の置換、
を含む。
【０１４０】
第８の態様の好ましい実施形態において、標的分子は腫瘍抗原である。特に好ましい実施形態において、標的分子はフィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）である。
【０１４１】
任意に、ＤＮＡレベルでの遺伝子組み換え、及び原核生物若しくは真核生物、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける修飾タンパク質の発現によって、修飾を行ってもよい。更なる実施形態において、修飾には化学合成工程が包含される。
【０１４２】
１つの実施形態において、上記別々に修飾されたタンパク質の集団は、別々に修飾された単量体ユビキチンタンパク質の各々をコードする２つのＤＮＡライブラリーを遺伝学的に融合することにより得られる。
【０１４３】
他の実施形態において、修飾タンパク質を更に化学合成によって調製することができる。この実施形態において、この態様の工程ｃ）〜ｄ）は、その後１つの工程において行われる。
【０１４４】
第９の態様において、本発明は第１の態様に規定される融合タンパク質を調製する方法であって、
（ａ）第１の態様に規定される融合タンパク質をコードする核酸を調製する工程；
（ｂ）上記核酸を発現ベクターに導入する工程と、
（ｃ）上記発現ベクターを宿主細胞に導入する工程と、
（ｄ）宿主細胞を培養する工程と、
（ｅ）宿主細胞を、上記ベクターから融合タンパク質が発現される培養条件に供する工程であって、それによって第１の態様に規定される融合タンパク質を産生する工程と、
（ｆ）任意に、工程（ｅ）において産生された融合タンパク質を濃縮又は単離する工程と、
を含む、方法に関する。
【０１４５】
第９の態様の１つの実施形態において、工程（ｅ）において産生される融合タンパク質は、封入体の形態である。
【０１４６】
第９の態様の好ましい実施形態において、上記方法は、封入体を単離する工程と、上記封入体を可溶化する工程であって、それにより可溶性融合タンパク質を得る工程と、上記工程で得られた可溶性融合タンパク質を少なくとも２回のクロマトグラフィー工程によって更に精製する工程とを更に含む。好適なクロマトグラフィー工程として、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
ユビキチンの突然変異誘発方法
各配列セグメントの突然変異誘発の開始点として、例えば、当業者に既知の方法によって調製され、改変され及び増幅され得るユビキチンのｃＤＮＡを使用することができる。一次配列の比較的狭い領域（約１〜３アミノ酸）におけるユビキチンの部位特異的改変には、商業的に入手可能な試薬及び方法が利用できる（"Quick
Change", Stratagene; "Mutagene Phagemid in vitro Mutagenesis
Kit", Bio-Rad）。より大きな領域の部位特異的突然変異誘発には、具体的な実施形態として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が当業者に利用可能である。この目的のため、所望の位置で変性された塩基対組成を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドの混合物を、例えば、突然変異導入に使用することができる。これは、例えばイノシン等のゲノムＤＮＡに天然では生じない塩基対アナログの使用によっても為され得る。
【０１４８】
ベータシート領域の１つ又は複数のベータ鎖、又はベータシート鎖に隣接する３アミノ酸以内の位置の突然変異誘発の出発点は、例えば、ユビキチンのｃＤＮＡであってもよく、又はゲノムＤＮＡであってもよい。さらに、ユビキチンタンパク質をコードする遺伝子は合成的に調製されてもよい。
【０１４９】
部位特異的変異誘発法、ランダム変異誘発法、ＰＣＲ又は同様の方法を使用する変異誘発等のそれ自身既知の種々の手法を変異誘発に利用することができる。
【０１５０】
本発明の好ましい実施形態において、変異が誘発されるアミノ酸の位置は予め定められている。修飾されるアミノ酸の選択は、修飾されるべきアミノ酸に関する所定の制限を満たすように実施される。各場合において、一般的に、スクリーニングされる異なる突然変異体のライブラリーは、それ自身既知の方法を使用して確立される。一般的に、修飾されるアミノ酸の前選択（pre-selection）は、修飾されるユビキチンタンパク質に関する十分な構造情報が利用可能であることから、特に容易に行うことができる。
【０１５１】
本発明によれば、標的化突然変異誘発とともに、例えば、当該技術分野に属する、ＰＣＲ、化学的突然変異誘発、又は細菌突然変異誘発株を使用する、より長い配列セグメントの突然変異誘発を使用することができる。
【０１５２】
本発明の１つの実施形態において、突然変異誘発は、アミノ酸コドンＮＮＫを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの集合により実施される。但し、その他のコドン（トリプレット）もまた使用することができることも理解されるべきである。突然変異は、好ましくはベータシート構造が維持される方法で行われる。一般的に、突然変異誘発は、タンパク質表面に露出される安定なベータシート領域の外側で行われる。突然変異誘発には、部位特異的突然変異誘発及びランダム突然変異誘発の両方が含まれる。一次構造における比較的狭い領域（約３〜５アミノ酸）を含む部位特異的突然変異誘発は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（商標）（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（商標））又はＢｉｏ−Ｒａｄ（商標）（Ｍｕｔａｇｅｎｅ（商標）ファージミドｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発キット）（米国特許第５，７８９，１６６号、米国特許第４，８７３，１９２号を参照）の商業的に入手可能なキットにより作製され得る。
【０１５３】
より広い領域を部位特異的突然変異誘に供する場合、ＤＮＡカセットを調製しなければならず、突然変異が誘発される領域は、突然変異部位及び不変部位を含むオリゴヌクレオチドの集合により得られる（Nord et
al., 1997 Nat.
Biotechnol. 8, 772-777、McConell and Hoess, 1995 J. Mol. Biol. 250, 460-470.）。ランダム突然変異誘発は、突然変異誘発株におけるＤＮＡの伝播により、又はＰＣＲ増幅（エラープローンＰＣＲ）（例えば、Pannekoek et al.,
1993 Gene 128, 135
140）により導入され得る。この目的のため、エラー率の高いポリメラーゼを使用する。導入される突然変異誘発の程度を高めるのに、又は異なる突然変異を組み合わせるのにそれぞれ、ＤＮＡシャッフリングの手法によりＰＣＲフラグメント中の突然変異を組合せることができる（Stemmer,
1994 Nature 370,
389-391）。酵素に関連するこれらの突然変異誘発戦略の総説が、Kuchner
and Arnold (1997) TIBTECH
15, 523-530の総説において提供される。選択されたＤＮＡ領域におけるこのランダム突然変異誘発を実施するためにも、突然変異誘発に使用されるＤＮＡカセットを構築しなければならない。
【０１５４】
ランダム修飾は、当該技術分野において十分に確立された既知の方法により行われる。ランダム化されたフラグメントをベクター中に適切に導入するため、本発明では、ランダムヌクレオチドはＰＣＲ媒介部位特異的突然変異誘発の原理によって発現ベクター中に導入されることが好ましい。しかしながら、その他の選択肢は当業者に既知であり、例えば、合成ランダム配列ライブラリーを同様にベクター中に挿入することが可能である。
【０１５５】
融合ＰＣＲによって突然変異体又はライブラリーを作製するのに、例えば、３回のＰＣＲ反応を実施してもよい。部分的に重複する中間体フラグメントを作製するのに、２回のＰＣＲ反応を行う。３回目のＰＣＲ反応を実施して中間体フラグメントを融合する。
【０１５６】
ライブラリー又は突然変異体（mutant
variants）の構築方法は、所望の制限部位周辺のプライマー（制限酵素認識部位プライマー）、フォワード制限プライマー及びリバース制限プライマーの第１セットと、例えば目的のコドンの上流及び下流周辺のプライマー（変異原性プライマー）、フォワード及びリバース変異原性プライマーの第２セットとを構築することを含んでもよい。１つの実施形態において、プライマーは、それぞれ目的のコドンのすぐ上流及び下流に構築される。制限プライマー及び変異原性プライマーは、第１中間体フラグメントを及び第２中間体フラグメントを構築するのに使用される。２回のＰＣＲ反応により、これらの直鎖状中間体フラグメントが産生される。これらの直鎖状中間体フラグメントの各々は、少なくとも１つの目的の突然変異コドンと、フランキングヌクレオチド配列と、消化部位とを含む。３回目のＰＣＲ反応では、２つの中間体フラグメント、並びにフォワード制限プライマー及びリバース制限プライマーを使用して直鎖状の融合産物を産生する。一方、直鎖状の産物の結合していない末端は制限酵素で消化され、直鎖状の産物に付着末端が作られる。直鎖状の産物の付着末端は、ＤＮＡリガーゼを使用して融合され、環状の産物、例えば環状ポリヌクレオチド配列を産生する。
【０１５７】
中間体フラグメントを構築するのに、２セットのフォワードプライマー及びリバースプライマーの設計及び合成を行う。第１セットはそのフランキングヌクレオチド配列とともに制限酵素消化部位を含み、第２セットは少なくとも１つの目的の変異体コドンを含む（変異原性プライマー）。当業者であれば、変異体の数は、所望の変異アミノ酸の修飾数に対応することを認識するであろう。本発明者らは、この作業において他の制限酵素が使用される場合、この消化部位の正確な位置、並びにフォワードプライマー及びリバースプライマーの対応する配列が適宜改変され得ることを熟考した。当該技術分野における他の方法を、代替して使用してもよい。
【０１５８】
多くの場合、少なくとも１つの融合パートナーをコードするヌクレオチド配列に融合されたランダム化された核酸配列を有することにより、融合パートナーにランダム配列を繋げる必要がある。そのような融合パートナーは、例えば、発現及び／又は精製／単離及び／又は発現産物の更なる安定化を促進することができるか、又はその他の有益な効果を伴う可能性がある。
【０１５９】
本発明の一例によれば、単量体ユビキチンの領域、領域２〜８及び／又は領域６２〜６８、好ましくは２、４、６、８、６２、６３、６４、６５、６６、及び／又は６８位における１〜８個のアミノ酸、好ましくは少なくとも３個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、最も好ましくは６個のアミノ酸のランダム置換を、上記位置がタンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端近傍に位置していることから、ＰＣＲによって特に容易に行うことができる。したがって、操作されるコドンは、対応するｃＤＮＡ鎖の５’末端及び３’末端に存在する。したがって、変異原性ＰＣＲ反応に使用される第１オリゴデオキシヌクレオチドは、突然変異される領域２〜８のコドン、好ましくは２、４、６、及び／又は８位から離れており、ユビキチンの配列におけるアミノ末端に対するコーディング鎖に対応する。したがって、第２オリゴデオキシヌクレオチドは、突然変異される領域６２〜６８のコドン、好ましくは６２、６３、６４、６５、６６、及び／又は６８位から離れており、少なくとも部分的にカルボキシ末端のポリペプチド配列の非コーディング鎖に対応する。両方のオリゴデオキシヌクレオチドにより、ポリメラーゼ連鎖反応は、鋳型として単量体ユビキチンをコードするＤＮＡ配列を使用して行うことができる。
【０１６０】
さらに、得られた増幅産物を、例えば、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を挿入するフランキングオリゴデオキシヌクレオチドを使用する、別のポリメラーゼ連鎖反応に添加することができる。本発明によれば、所定のハプテン又は抗原に対して結合特性を有するユビキチン変異体の単離のための後の選択工程での使用に適したなベクターシステムに、得られた遺伝子カセットを導入することが好ましい。
【０１６１】
標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ）に対して結合親和性を有する修飾ユビキチンタンパク質の選択及び結合親和性を担う修飾アミノ酸の決定
例えば、各単量体ユビキチンユニットにおいて選択されたアミノ酸を別々に修飾することによって、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質をコードする少なくとも２つの異なるＤＮＡライブラリーを確立した後、これらのライブラリーを、例えばリンカー技術によって遺伝学的に融合して、ヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質をコードするＤＮＡ分子を得る。本発明によれば、これらのライブラリーのＤＮＡはタンパク質へと発現され、そのようにして得られた修飾二量体タンパク質を、標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ等の腫瘍抗原）と接触させ、結合親和性が存在する場合には、パートナーと互いに任意に結合することを可能とする。
【０１６２】
ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質に関して、接触作業及びスクリーニング作業が既に行われていることは、本発明の極めて重要な側面である。この作業により、その標的分子に対して結合親和性を提供するそれらのユビキチンタンパク質に対するスクリーニングが可能となる。例えば、選択方法についての更なる詳細は、Scil
Proteinsの特許文献２、特許文献１１、及び特許文献１２を参照されたい。これらの参考文献は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１６３】
本発明による接触は、好ましくは、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、ｍＲＮＡディスプレイ法又は細胞表面ディスプレイ法、酵母表面ディスプレイ法又は細菌表面ディスプレイ法等の好適な提示及び選択方法、好ましくはファージディスプレイ法により行われる。徹底した開示のため、以下の参考文献も参照されたい：Hoess,
Curr. Opin. Struct. Biol.. 3 (1993), 572-579、Wells and Lowmann,
Curr. Opin. Struct. Biol. 2 (1992), 597-604、Kay et al.,
Phage Display of Peptides and Proteins-A Laboratory Manual (1996), Academic
Press。上述の方法は当業者に既知であり、本発明によれば、その改良も含めて使用され得る。
【０１６４】
本発明によれば、修飾タンパク質が、所定の結合パートナーに対して定量可能な結合親和性を有するかどうかの決定は、好ましくは以下の１つ又は複数の方法により行うことができる：ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴分光法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定及び超遠心分析法。
【０１６５】
ファージディスプレイ選択法
本出願に適合されるファージディスプレイ手法の１種は、結合特性を示すユビキチン変異体についての、本発明における選択手法の例として以下に記載される。同様に、例えば、細菌上（細菌表面ディスプレイ、Daugherty
et al., 1998, Protein
Eng. 11(9):825-832）又は酵母細胞上（酵母表面ディスプレイ、Kieke et
al., 1997 Protein
Eng. 10(11):1303-10）へ提示する方法、又はリボソームディスプレイ（Hanes
and Plueckthun,
1997 Proc
Natl Acad Sci U S A. 94(10):4937-4942、He and Taussig, 1997 Nucleic Acids Res.
25(24):5132-5134）若しくはｃｉｓディスプレイ（Odegrip et al., 2004 Proc Natl Acad Sci U S A.
101(9):2806-2810）、若しくはｍＲＮＡディスプレイ等の無細胞選択系を適用することができる。後者の場合、遺伝子型及び表現型の一過性の物理的な結合が、リボソームを介する適切なｍＲＮＡへのタンパク質変異体の連結により達成される。
【０１６６】
本明細書に記載されるファージディスプレイ手法において、提示された変異体のコーディングＤＮＡはファージエンベロープ中に一本鎖の形態でパッケージングされて、同時に提示されるのに対し、ユビキチンの組み換え変異体は繊維状ファージ上に提示される。したがって、親和性濃縮の枠組みにおいて、或る特定の特性を有する変異体をライブリーから選択することができ、それらの遺伝子情報を、それぞれ、好適な細菌の感染によって増幅するか、又はその他の濃縮サイクルに付与することができる。ファージ表面上への突然変異ユビキチンの提示は、アミノ末端シグナル配列、好ましくはＰｅｌＢシグナル配列、及びファージのキャプシド又は表面タンパク質への遺伝子融合によって達成され、キャプシドタンパク質ｐＩＩＩ又はそのフラグメントへのカルボキシ末端融合が好ましい。さらに、コードされた融合タンパク質は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる検出及び／又は精製のための親和性タグ若しくは抗体エピトープ、又は親和性濃縮過程における融合タンパク質の特異的開裂のためのプロテアーゼ認識配列等の更なる機能性エレメントを含んでもよい。さらに、アンバー停止コドンは、例えば、ユビキチン変異体に対する遺伝子と、ファージキャプシドタンパク質又はそのフラグメントのコーディング領域との間に存在させてもよく、上記アンバー停止コドンは、部分的な１アミノ酸の挿入により好適なサプレッサー株において翻訳の間認識されない。
【０１６７】
標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ）に対する結合特性を有するユビキチン変異体の単離との関連で選択手法に好適であり、上述の融合タンパク質に対する遺伝子カセットが挿入された細菌ベクターは、ファージミドと呼ばれる。とりわけ、ファージミドは繊維状ファージ（例えば、Ｍ１３又はｆ１）の遺伝子間領域又はその一部を含み、例えば、Ｍ１３Ｋ０７等のヘルパーファージによりファージミドを輸送する細菌細胞の重複感染の場合に、ファージミドＤＮＡの閉鎖鎖（closed strand）がファージキャプシド中へとパッケージングされる。このように作製されたファージミドは、細菌によって分泌され、キャプシドタンパク質ｐＩＩＩ又はそのフラグメントとの融合により、コードされた各ユビキチン変異体を細菌の表面上に提示する。天然ｐＩＩＩキャプシドタンパク質は、好適な細菌株に再感染できるようにファージミド中に存在し、したがって対応するＤＮＡを増幅する可能性は保持される。このため、ユビキチン変異体の表現型、すなわち、その潜在的な結合特性とその遺伝子型との間の物理的結合が確保される。
【０１６８】
得られたファージミドを、当業者に既知の方法により、ファージ上に提示されたユビキチン変異体の標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ）への結合により選択することができる。この目的のため、提示されたユビキチン変異体を、例えばマイクロタイタープレート上に結合された標的物質に一時的に固定化し、結合していない変異体を分離した後に特異的に溶出することができる。溶出は、例えば１００ｍＭトリエチルアミン等の塩基性溶液によって行われることが好ましい。代替的には、溶出を、酸性条件下でのタンパク質分解又は感染細菌の直接的な添加により行うことができる。このようにして得られたファージミドを、標的分子（例えば、ＥＤ−Ｂ）に対する結合特性を有するユビキチン変異体の選択及び増幅の連続的なサイクルにより、再度増幅し、濃縮することができる。
【０１６９】
この方法で得られるユビキチン変異体の更なる特性評価を、ファージミドの形態（すなわちファージへの融合）、又は好適な発現ベクター中への対応する遺伝子カセットのクローニング後に、可溶性タンパク質の形態で行うことができる。適切な方法は当業者に既知であるか、又は上記文献に記載されている。特性評価には、例えばＤＮＡ配列の決定が含まれ、したがって単離された変異体の一次配列の決定を含めることができる。さらに、単離された変異体の親和性及び特異性を、例えば、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴分光法、蛍光分光法、ＦＡＣＳ、等温滴定熱量測定、超遠心分析法等の生化学的な標準的方法により検出することができる。安定性分析については、例えば、化学的又は物理的変性についての分光法が当業者に既知である。
【０１７０】
リボソームディスプレイ選択法
本発明のリボソームディスプレイ手法の更なる実施形態において、ユビキチン変異体は無細胞転写／翻訳系により調製され、対応するｍＲＮＡ及びリボソームとともに複合体として提示される。この目的のため、上記ＤＮＡライブラリーは基礎として使用され、ここで、変異遺伝子は発現及びタンパク質生合成の対応する制御配列との融合体の形態で存在する。遺伝子ライブラリーの３’末端における停止コドンの欠失、及び好適な実験条件（低温、高濃度Ｍｇ２＋）により、新生タンパク質、ｍＲＮＡ及びリボソームからなる三成分複合体はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳の間維持される。
【０１７１】
各単量体ユビキチンユニットにおいて選択されたアミノ酸を別々に修飾することによってヘテロ二量体修飾ユビキチンタンパク質を含むタンパク質ライブラリーを確立した後に、本発明によれば、修飾二量体タンパク質はＥＤ−Ｂと接触され、結合親和性が存在する場合には、パートナー同士の結合を可能とする。これらのタンパク質ライブラリーは、修飾タンパク質と標的タンパク質との接触が可能な方法で修飾タンパク質を提示する任意の他の方法をディスプレイ、又は使用するディスプレイ法ライブラリーの形態であってもよく、ここで、上記ディスプレイ法は、任意に、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法、ＴＡＴファージディスプレイ法、酵母ディスプレイ法、細菌ディスプレイ法又はｍＲＮＡディスプレイ法である。
【０１７２】
１０−７〜１０−１２Ｍの範囲のＫｄの特異的な結合親和性による標的分子への結合活性に関する修飾ユビキチン変異体の選択を、当業者に既知の方法により行うことができる。この目的のため、例えば、リボソーム複合体上に提示されたユビキチン変異体を、それぞれ、例えばマイクロタイタープレート上に結合した標的物質に一時的に固定化することができ、又は溶液中での結合後に磁性粒子へと結合させることができる。非結合変異体の分離後に、結合活性を有する変異体の遺伝子情報を、リボソーム複合体を破壊することによりｍＲＮＡの形態で特異的に溶出することができる。溶出は、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて行うことが好ましい。このようにして得られたｍＲＮＡを単離し、好適な方法（逆転写酵素反応）を使用してＤＮＡに逆転写し、このように得られたＤＮＡを再度増幅することができる。
【０１７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写／翻訳、選択、及び増幅の連続的なサイクルにより、所定のハプテン又は抗原に対して結合特性を有するユビキチン変異体を濃縮することができる。
【０１７４】
本発明の好ましい融合タンパク質、例えば、インターフェロン等のエフェクターに融合された、ＥＤ−Ｂに対して特異的なヘテロ二量体ユビキチン系結合タンパク質の使用
インターフェロン、特にインターフェロンアルファ及びインターフェロンベータが抗増殖効果、抗ウイルス効果、及び免疫調節効果を示すことから、インターフェロン、好ましくはインターフェロンアルファ又はインターフェロンベータとの融合タンパク質を、特定の治療に使用することができる。抗増殖部分としてインターフェロンと、腫瘍特異的ターゲッティングドメインとを含む融合タンパク質を、疾患部位（腫瘍）に特異的に方向付けてその部位において作用させることができ、それによりターゲッティングドメインを伴わないインターフェロンを単独で与えることによって生じ得る副作用を軽減する。さらに、ＥＤ−Ｂに対して特異的な修飾ユビキチンヘテロ二量体とインターフェロンとを含む本発明の融合タンパク質は、例えば、治療手段を調製するのに使用される。本発明による融合タンパク質を、例えば、直接エフェクター分子（direct
effector molecules）として使用することができる。ＥＤ−Ｂ抗原が大量に現れる腫瘍の例が表２に示される。
【０１７５】
表２：腫瘍におけるＥＤ−Ｂの発生
【表２】
2014523238.tif 000004
【０１７６】
選択された融合パートナーにより、本発明の医薬組成物は、表２に列挙される腫瘍等のＥＤ−Ｂが豊富ながん又はその他の任意の腫瘍性疾患の治療を対象とするように適合される。本発明の融合タンパク質の使用に最も好ましい適応症は、腎細胞がん、黒色腫、及びリンパ腫であるが、その他の任意の適応症を治療することができる。
【０１７７】
上記組成物は、治療的に有効な用量を含有するように適合される。投与される用量は、治療される生物、疾患の種類、患者の年齢及び体重、並びにそれ自体既知の更なる要因に依存する。
【０１７８】
上記組成物は、薬学的に許容可能な担体を含有し、また任意にそれ自体既知の助剤及び賦形剤を更に含有してもよい。これらには、例えば安定化剤、界面活性剤、塩類、緩衝溶液、着色剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
上記医薬組成物は、局所塗布用の液体製剤、クリーム、ローションの形態、エアロゾル、粉末、顆粒、錠剤、坐剤、若しくはカプセル剤の形態、乳剤又はリポソーム製剤の形態であってもよい。特に、異なる組成物の組み合わせを使用することもでき、例えば、局所塗布用の液体製剤、クリーム、ローションの形態、エアロゾル、粉末、顆粒、錠剤、坐剤、若しくはカプセル剤の形態、乳剤若しくはリポソーム製剤の形態の本発明の融合タンパク質と、リポソーム製剤のがん治療薬とを適用することができる。上記組成物は、好ましくは滅菌され、非発熱性で等張であり、それ自体既知の薬学的に通常の許容可能な添加剤を含有する。さらに、米国薬局方の規則、又はRemington's
Pharmaceutical Sciences, Mac Publishing Company (1990)を参照されたい。
【０１８０】
ヒト及び獣医の薬物療法及び予防法の分野において、本発明による修飾されたＥＤ−Ｂ結合ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質の少なくとも１種を含有する薬学的に有効な医薬を、それ自体知られている方法によって調製することができる。ガレヌス製剤により、これらの組成物を、注射又は点滴により非経口的に、全身的に、直腸に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、経皮的に、又はその他の従来利用される適用方法により投与することができる。医薬製剤の種類は、治療される疾患の種類、疾患の重症度、治療される患者及び医学分野における当業者に既知のその他の要因に依存する。
【０１８１】
１つの実施形態において、医薬組成物は、本発明のタンパク質若しくは融合タンパク質、又はこれらの組み合わせを含有する。その他の実施形態において、医薬組成物は、本発明のタンパク質若しくは融合タンパク質、又はこれらの組み合わせを含有し、１つ又は複数のがん治療薬を更に含む。本発明の融合タンパク質を、細胞毒性薬と組み合わせて使用することができる。１つの実施形態において、医薬組成物は、本発明の融合タンパク質、又は２以上の本発明の融合タンパク質の組み合わせを含有し、１つ又は複数のがん治療薬を更に含む。
【０１８２】
好ましい実施形態において、がん治療薬は、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤及びトポイソメラーゼ阻害剤、細胞毒性抗生物質、抗生物質等の物質群から選択されるが、これらに限定されない。好ましくは、がん治療薬は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びプレドニゾロンの組み合わせ）、ビンブラスチン、シタラビン（cytarabine）、ベバシズマブ、腫瘍ワクチン、又は放射性医薬品若しくは細胞増殖抑制剤（例えば、ドキシル及びアブラキサン）のナノ粒子配合物等、及びアジュバントからなる群より選択される。
【０１８３】
本発明の融合タンパク質とベバシズマブ、ＣＨＯＰ、及びビンブラスチンとの組み合わせが特に好ましい。本発明の融合タンパク質とベバシズマブとの組み合わせが最も好ましい。
【０１８４】
さらに、延長された半減期を有するインターフェロンを、特定の腫瘍タンパク質に対して標的化された修飾ユビキチンとの融合に使用することができる。延長された半減期を有するインターフェロンを産生する複数の技法が当該技術分野において知られている。
【０１８５】
インターフェロン及び特定のウイルスタンパク質に対する結合能を有する修飾ユビキチンによる融合タンパク質は、ウイルス性疾患、特にＢ型肝炎、Ｃ型肝炎又はエイズ（ＨＩＶ）の治療に使用され得る。医薬組成物が肝炎、特にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症の治療用に配合される実施形態において、医薬組成物は、他の医薬、好ましくはリバビリンを更に含んでもよい。延長された半減期を有するインターフェロンを、特定のウイルスタンパク質に対して標的化された修飾ユビキチンとの融合に使用することができる。延長された半減期を有するインターフェロンを産生する幾つかの技法が当該技術分野において知られている。
【０１８６】
驚いたことに、インターフェロンに融合されたユビキチンヘテロ二量体の融合タンパク質において、好ましくは、融合タンパク質が配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、及び８５からなる群より選択される配列を有する場合、治療において有利に適用され得ることが判明した。本発明のインターフェロン融合タンパク質を適用することにより、非毒性であるが、なおも治療的に有効な濃度でインターフェロンを投与することが可能である。前臨床試験では、優れた腫瘍ターゲッティング効果及び望ましい生体内分布が示された。さらに、本発明は、ＩＦＮ−アルファ活性が融合タンパク質において有効であることを示している。インターフェロンが本発明の腫瘍ターゲッティング融合タンパク質に連結されていることから、疾患部位（例えば、腫瘍部位）において直接的に有効であり、したがって、「遊離」インターフェロン量が大幅に低減することができる（このため、血球減少症（leucopenia）、血小板減少症（thrombopenia）、肝機能不全、自己免疫疾患、鬱病等の副作用を軽減する）。さらに、インターフェロンは抗腫瘍効果で知られている。したがって、本発明の修飾ユビキチンタンパク質等の腫瘍特異的ドメインの融合により、インターフェロンを疾患部位に方向付けることができる。インターフェロンアルファ及びインターフェロンベータは、いずれのタンパク質も同一の受容体に結合し、同等の効果を有することから、特に好ましい。
【０１８７】
インターフェロンの全身性副作用は、本発明による融合タンパク質としてインターフェロンを投与することにより顕著に軽減され得る。したがって、本発明のインターフェロン融合タンパク質を使用することにより、治療効果に到達するインターフェロンの総投与量を大幅に低減することができ、特に他のがん治療薬と組み合わせて全身性の腫瘍治療に有利に使用することができる。
【０１８８】
更なる実施形態において、医薬組成物は、本発明の融合タンパク質に対する分離された実体を提供する、キットの部品の形態である。その他の実施形態において、医薬組成物は、１つ又は複数のがん治療薬と組み合わされた本発明の融合タンパク質に対する分離された実体を提供する、キットの部品の形態である。
【実施例】
【０１８９】
以下の実施例は、本発明の方法及び組成物をどのように作り、使用するかについての完全な開示及び説明を当業者に提供する限りにおいて提示され、本発明者らが自身の発明と見なしている範囲の制限を意図するものではない。使用される数に関する正確性を確実とする努力が為されてきたが、一部の実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段の定めがない限り、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、また圧力は大気圧又は大気圧近傍である。
【０１９０】
実施例１．本発明の融合タンパク質の発現
本発明の融合タンパク質は、ターゲッティングドメインとしての修飾ヘテロ二量体ユビキチン及び少なくとも１つのインターフェロン、好ましくはインターフェロン−アルファからなる。１つの実施形態において、融合タンパク質は、大腸菌において封入体として産生され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏリフォールディングの後に精製される。性質決定のため、得られた融合タンパク質製剤を、純度及び均質性について解析した。細胞培養物中でのＩＦＮ−アルファ活性、ＩＦＮ−アルファ受容体結合活性、標的タンパク質ＥＤ−Ｂに対する親和性、選択性及び細胞培養物中での特異的結合を試験した。Ｎ末端からＣ末端が以下の通り配置された融合タンパク質部分を有する融合タンパク質が最も好ましい：
修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質−リンカー−ＩＦＮ、好ましくはＩＦＮ−α、又はその生物学的に活性な変異タンパク質。特に好ましくはＩＦＮ−アルファ、より好ましくはＩＦＮ−アルファ２、更に好ましくはＩＦＮ−アルファ２ａ又はＩＦＮ−アルファ２ｂである。
【０１９１】
工程１：融合タンパク質のクローニング用ベクターの産生
融合タンパク質のクローニング用ベクターとして、商業的に入手可能なベクター（例えば、InvitrogenによるｐＥＴ２０ｂ）又は独占所有権を有する発現ベクター（Scil Proteins GmbH、ｐＳＣＩＬ００８ｂ、国際公開第０５／０６１７１６号を参照）を、ＩＦＮ−アルファに対するコーディング配列の挿入により修飾した。ＩＦＮ−アルファ配列は、ＰＣＲにより増幅した。修飾ユビキチン配列の挿入を容易にするため、固有の制限酵素認識部位を得られた発現プラスミド中に導入した。
【０１９２】
工程２：修飾ヘテロ二量体ユビキチン系ＥＤ−Ｂ融合タンパク質のクローニング
ＥＤ−Ｂ結合修飾ユビキチン系変異体とＩＦＮ−アルファとの融合タンパク質の産生のため、ＥＤ−Ｂ結合修飾ユビキチンをコードする目的の配列を、標準的な手法に従ってＰＣＲによりプラスミドテンプレートから増幅し、工程１に記載される発現プラスミド中に挿入した。ＤＮＡ配列解析により、融合タンパク質をコードする発現ベクターの正確な配列を確認した。
【０１９３】
工程３：修飾ヘテロ二量体ユビキチン系ＥＤ−Ｂ融合タンパク質の発現
融合タンパク質を大腸菌において産生し、封入体の形態で単離した。融合タンパク質の発現のため、クローンを培養し、各発現ベクターに対応する適切な抗生物質を含有する複合培地中で流加発酵により成長させた。ＩＰＴＧの添加により発現を誘導した。誘導の２〜４時間後に微生物細胞を回収し、懸濁し、そしてフレンチプレスにおける高圧分散によって破壊した。不溶性画分を採取し、発現されたタンパク質を含有する封入体を標準的な洗浄プロトコルによって単離した。
【０１９４】
実施例２：ユビキチン系ＩＦＮ−アルファ融合タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏリフォールディング及び精製
活性な融合タンパク質を、６Ｍ塩化グアニジン中に可溶化された封入体材料の急速希釈の後に、温度４℃でのｉｎ  ｖｉｔｒｏリフォールディングにより調製し、一連のクロマトグラフィー工程によって精製した。精製には少なくとも２回のクロマトグラフィー工程を必要とする。これらのクロマトグラフィー工程は、例えば、Ｏｃｔｙｌ−ＦＦ上での疎水性相互作用クロマトグラフィーにおける捕捉工程、及び／又は例えばＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ上でのイオン交換クロマトグラフィーを含むものであった。全ての場合において、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び分析用ＨＰＬＣにより純度について解析した。好適な画分を保存し、例えば、ｒｐＨＰＬＣ、ＳＥ−ＨＰＬＣ、分析用親和性相互作用クロマトグラフィー（analytical
affinity interaction chromatography）、及び表面プラズモン共鳴に基づく相互作用分析（surface
plasmon resonance-based interaction analysis）を含む一連の方法によって均質性及び活性を解析した。融合タンパク質１３５４−Ａ８−ＩＦＮについて、流加発酵からの発現培養物１リットル当たり１５０ｍｇに及ぶ収率で活性融合タンパク質を得た。他の融合変異体について得られた収率は同等であった。非ターゲッティングＵＢ２−ＩＦＮについて、流加発酵からの発現培養物１リットル当たり６９０ｍｇに及ぶ収率で活性融合タンパク質を得た。
【０１９５】
実施例３．インターフェロン受容体への融合タンパク質の結合
融合タンパク質のインターフェロン部分へのインターフェロンα／β受容体の結合を、ＥＬＩＳＡ設定において精査した。非中和インターフェロン抗体を、Ｎｕｎｃマイクロウェルプレートに２〜１０μｇ／ｍｌの濃度で４℃にて一晩コーティングした。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でこのプレートを洗浄した後、ウェルをＰＢＳ中のカゼインブロッキング溶液を用いて室温にて２時間ブロックした。ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、融合タンパク質を適切な濃度で室温にて１時間ウェルに加えた。ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。インターフェロンα／β受容体を、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に融合した。このキメラを、０．３４５μｇ／ｍｌの濃度でウェルに加え、室温にて１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、Ｆｃ特異的抗ヒトＩｇＧのＨｒｐ−コンジュゲートを、ＰＢＳＴ中の適切な希釈（例えば、１：１００００）で加えた。プレートを緩衝溶液ＰＢＳＴ３００μｌ／ウェルで３回洗浄した。ＴＭＢ基質溶液（ＫＥＭ−ＥＮ−Ｔｅｃ）５０μｌを各ウェルに添加してインキュベートした。１ウェル当たり０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止した。ＥＬＩＳＡプレートをTECANのＳｕｎｒｉｓｅ  ＥＬＩＳＡ−Ｒｅａｄｅｒを使用して読み上げた。参照波長として６２０ｎｍを使用し、４５０ｎｍで吸光度測定を行った。図５は、融合タンパク質（配列番号５５）のインターフェロン部分へのインターフェロンα／β受容体の見かけ上のＫＤ値１６．７ｎＭという非常に高親和性の結合を明確に示している。この結果は、融合タンパク質のＩＦＮ−アルファ受容体結合活性が損なわれていないことを立証している。
【０１９６】
実施例４：ＢｉａｃｏｒｅアッセイによるヒトＥＤ−Ｂへの融合タンパク質の結合アッセイ
当業者に既知の方法を使用して、ＣＭ５−ｃｈｉｐ（Ｂｉａｃｏｒｅ）上に固定化されたＥＤ−Ｂへの結合に関し、種々の濃度（例えば、０〜５００ｎＭ）の融合タンパク質（１０４１−Ｄ１１−ＩＦＮ）を解析した。得られたデータをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア及び１：１−Ｌａｎｇｍｕｉｒ−ｆｉｔｔｉｎｇにより処理した。ＫＤは７．２５ｎＭであった。結合速度定数はｋｏｎ＝４．１６×１０５Ｍ−１ｓ−１、ｋｏｆｆ＝３．０１×１０−３ｓ−１であった。
【０１９７】
実施例５：凍結／融解実験
ＥＤ−Ｂ  ＥＬＩＳＡ：ヒトＥＤ−Ｂ及びＮＧＦで被覆されたＮＵＮＣ−ｍｅｄｉｓｏｒｐプレートに加えられた増量する（increasing
amounts）精製タンパク質は、ネガティブコントロールとしての役割を果たした。１ウェル当たり１〜２．５μｇ／ｍｌの抗原コーティングを４℃にて一晩行った。ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）（ＰＢＳＴ）でプレートを洗浄した後、ウェルをブロッキング溶液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、３％ＢＳＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）を使用して室温にて２時間ブロックした。ウェルを、ＰＢＳＴで更に３回洗浄した。その後、種々の濃度の融合タンパク質をウェル中で室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでウェルを洗浄した後、抗Ｕｂｉ  ｆａｂフラグメント（ａ−Ｕｂｉ−Ｆａｂ）ＰＯＤコンジュゲートをＰＢＳＴ中の適切な希釈（例えば、１：６５００）で加えた。プレートを緩衝溶液ＰＢＳＴ３００μｌ／ウェルで３回洗浄した。各ウェルにＴＭＢ基質溶液（ＫＥＭ−ＥＮ−Ｔｅｃ）５０μｌを添加し、インキュベートした。各ウェルに０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止した。ＥＬＩＳＡプレートをTECANのＳｕｎｒｉｓｅ  ＥＬＩＳＡ−Ｒｅａｄｅｒを使用して読み上げた。参照波長として６２０ｎｍを使用し、４５０ｎｍで吸光度測定を行った。
【０１９８】
表３に、−８０℃での複数回の凍結／融解サイクルの後のインターフェロンドメインの機能性及び本発明の融合タンパク質の親和性結合を要約する。試料アリコートを、解析前に３回まで凍結し、そして室温にて融解した。実施例１に記載される濃度依存ＥＬＩＳＡにより、インターフェロンドメインの機能性を決定した。ヒトＥＤ−Ｂへの融合タンパク質の結合も、濃度依存ＥＬＩＳＡによりアッセイした。インターフェロンドメインの機能性及び記載される融合タンパク質の結合部位の親和性のいずれについても、記載された条件後の検出可能な減少は見られなかった。
【０１９９】
【表３】
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【０２００】
実施例６：線維芽細胞に対する本発明の融合タンパク質の特異的ＥＤ−Ｂ結合
ＥＤ−Ｂは腫瘍及び胚細胞の基質で発現される。Ｗｉ３８細胞は、ＥＤ−Ｂの高発現を伴う正常ヒト胚性肺線維芽細胞である。低レベルでＥＤ−Ｂを発現する正常成体ヒト皮膚線維芽細胞株をネガティブコントロールとして使用した。本発明の融合タンパク質のＥＤ−Ｂへのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合を解析するため、融合タンパク質１０４１−Ｄ１１−ＩＦＮ、１２５５−Ｂ９−ＩＦＮ、１３５３−Ｈ６−ＩＦＮ、１３５４−Ａ８＿Ｆ６３Ｐ−ＩＦＮ及びＵＢ２−ＩＦＮ（コントロール）を固定されたＷｉ３８細胞に対して調査した。
【０２０１】
染色実験のため、６００００細胞／ｍｌを培養し、その後、冷無水アルコールで固定し、５％ウマ血清でブロッキングし、そして５０ｎＭの融合タンパク質１０４１−Ｄ１１−ＩＦＮ、１２５５−Ｂ９−ＩＦＮ、１３５３−Ｈ６−ＩＦＮ、１３５４−Ａ８−ＩＦＮ及びＵＢ２−ＩＦＮ又はコントロールとしてのＰＢＳとともにインキュベートした。細胞への融合タンパク質の結合を直接ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮ抗体（ＰＢＬ、２１１１２−３）により検出した。核をＤＡＰＩで染色した。
【０２０２】
解析は、ＩＦＮ−アルファ融合がん結合タンパク質が、細胞外マトリクスを含むＥＤ−Ｂに対して高特異性で生体（vital）Ｗｉ３８細胞に結合することを明確に示している（図６を参照）。特に、１３５３−Ｈ６−ＩＦＮ及び１３５４−Ａ８−ＩＦＮは、Ｗｉ３８細胞に対して５０ｎＭで強い結合を示すが、正常な線維芽細胞に対してはネガティブ染色である。ＰＢＳコントロール及び非結合タンパク質ＵＢ２−ＩＦＮを用いた染色により、ＩＦＮ−アルファ抗体の非特異的結合を排除することができる。ネガティブコントロール細胞種ＮＨＤＦは、低レベルでＥＤ−Ｂフィブロネクチンを発現する、正常な初代線維芽細胞株である。ＮＨＤＦ細胞に対して何らの結合も観察されなかった。
【０２０３】
実施例７：Ｆ９腫瘍切片に対する融合タンパク質のＥＤ−Ｂ結合の特異性
ＥＤ−Ｂは、腫瘍血管のように新生血管構造の周辺に蓄積する（Tarli et al., 1999, Blood 94: 192-198）。種々の濃度の本発明の融合タンパク質を、Ｆ９奇形腫切片に対するＥＤ−Ｂ結合について比較した。厚さ６μｍの切片を、氷冷無水アセトンで固定した。５％ウマ血清によりブロッキングした後、それぞれ、１０ｎＭ及び５０ｎＭの１２５５−Ｂ９−ＩＦＮ（配列番号５６）、１０４１−Ｄ１１−ＩＦＮ（配列番号５５）、１３５３−Ｈ６−ＩＦＮ（配列番号８２）、１３５４−Ａ８−ＩＦＮ（配列番号８４）、並びにコントロールとして非ターゲッティングタンパク質ＵＢ２−ＩＦＮ（配列番号８９）及びＰＢＳとともに、切片をインキュベートした。直接ＦＩＴＣ標識抗ＩＦＮ−アルファ抗体（ＰＢＬ、２１１１２−３）により融合タンパク質を検出した。ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）は、広く使用されている内皮細胞マーカーである。抗マウスＣＤ３１抗体（Abcam、ａｂ５６２９９）１０μｇ／ｍｌ及びＡｌｅｘａ５９４抱合二次抗体を使用して血管を染色した。
【０２０４】
図７は、Ｆ９腫瘍組織に対する１０ｎＭ及び５０ｎＭ濃度での１２５５−Ｂ９−ＩＦＮ、１３５３−Ｈ６−ＩＦＮ、１３５４−Ａ８−ＩＦＮ及び１０４１−Ｄ１１−ＩＦＮの特異的結合を示す。非ターゲッティング融合タンパク質ＵＢ２−ＩＦＮ及びコントロール切片（ＰＢＳ）において抗ＩＦＮ−アルファ抗体の非特異的染色は検出されなかった。ＩＦＮ−アルファに融合された全ての結合タンパク質により、顕著な血管との関連性（vessel association）が示された。この結果は、融合タンパク質の高特異的ターゲッティング機能を明確に示している。
【０２０５】
実施例８：本発明の種々の融合タンパク質のエフェクタードメインの活性アッセイ
本発明の融合タンパク質の生理学的ＩＦＮ−アルファ活性を解析するため、ＩＳＲＥ−Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙを確立した。ＩＦＮ−アルファは、ＩＳＧ５４のようなインターフェロン刺激遺伝子（interferon-stimulated genes）（ＩＳＧ）を誘導することができる。ＩＳＧ５４は、そのプロモーター中に遺伝子の誘導性発現を担うシス作用エレメント（ＴＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＣＣ、配列番号８６）を含む。このエレメントは、ＩＳＲＥエレメント（ＩＦＮ刺激応答エレメント）と呼ばれる。ＩＳＲＥエレメントの５つのタンデムコピーを基本的なプロモーターエレメント（ＴＡＴＡボックス）及びｐＧＬ４．２７−Ｌｕｃ２プラスミド（Promega）のルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入した。子宮頸癌細胞株であるＨｅｌａ細胞に遺伝子導入を行い、細胞プールを、ハイグロマイシンを用いた選択によって維持した。本発明のＩＦＮ−アルファ融合タンパク質のＩＦＮ−アルファ活性を観察するため、受容体細胞をＩＳＲＥ−Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙに使用した。
【０２０６】
１０％ＦＣＳを含有する好適な培地中に細胞を再懸濁した。５％ＦＣＳを含有する培地中の３×１０５細胞／ｍｌの密度の細胞懸濁物を、白色の９６ウェル細胞培養プレートに播種した。２４時間後、一定の濃度範囲（例えば、３×１０−１０〜４．６×１０−１４Ｍ）の融合タンパク質で細胞を処理した。代謝活性をＯＮＥ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質（Promega）により測定した。アッセイを検証するために、組み換えヒトＩＦＮ−アルファ２ｂ（Biomol）の用量範囲を試験することによって、本発明の融合タンパク質の各試験を比較した。定量的評価は、ＰＬＡ２．０ソフトウェアによる平行線法によるＩＦＮ−アルファ２ｂ標準に対する相対力価に基づく。３回繰り返して力価を決定した。融合タンパク質は、内部標準に対して７．９〜２２．７％の力価を有する。ＩＦＮ−アルファ２ｂの力価は１００％±２０％の範囲内にあり、４パラメーターロジスティック法により算出された平均ＥＣ５０は２．３±０．４ｐＭである（表４を参照）。
【０２０７】
表４に融合タンパク質の親和性及び活性解析の結果を要約する。
【０２０８】
表４：融合タンパク質の解析
【表４】
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【配列表フリーテキスト】
【０２０９】
添付の配列表に示される配列番号１、２及び８〜１８による配列は、フリーテキスト情報を含んでいない。但し、これらの配列についても簡単な説明を以下に提示する。
配列番号１：    ユビキチン
配列番号２：    フィブロネクチンのエキストラドメインＢ（ＥＤ−Ｂ）
配列番号３：    リンカー配列
配列番号４：    リンカー配列
配列番号５：    リンカー配列
配列番号６：    リンカー配列
配列番号７：    リンカー配列
配列番号８：    ヒトＩＦＮ−アルファ−２ａ
配列番号９：    シグナルペプチドを有するヒトＩＦＮ−アルファ−２ａ
配列番号１０：  ヒトＩＦＮ−アルファ−２ｂ
配列番号１１：  ヒトＩＦＮ−アルファ−２ｃ
配列番号１２：  ヒトＩＦＮ−アルファ−６
配列番号１３：  ヒトＩＦＮ−アルファ−１４
配列番号１４：  ヒトＩＦＮ−アルファ−４
配列番号１５：  ヒトＩＦＮ−アルファ−５
配列番号１６：  マウスＩＦＮ−アルファ−２
配列番号１７：  ラットＩＦＮ−アルファ−１
配列番号１８：  ウサギＩＦＮ−アルファ
配列番号１９：  １０４１−Ｄｌ１、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号２０：  １２５５−Ｂ９、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号２１：  １２５５−Ｂ１０、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号２２：  １２４７−Ｇ１１、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号２３：  １２５５−Ｇ１２、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号２４：  １２４７−Ｆ８、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号２５：  １２３７−Ｂ１０、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号２６：  １２３７−Ｈ４、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号２７：  １２３９−Ｂ１０、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号２８：  １２４６−Ｈ５、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号２９：  １２４７−Ｇ１、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号３０：  １２４７−Ｈ２、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号３１：  １２４８−Ｅ１、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号３２：  １２４９−Ｅ５、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号３３：  １２５３−Ａ１１、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号３４：  １２５５−Ａ８、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号３５：  １２５５−Ｇ３、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号３６：  １２５５−Ｈ３、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号３７：  融合タンパク質ＩＦＮ−１０４１−Ｄ１１
配列番号３８：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２５５−Ｂ９
配列番号３９：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２５５−Ｂ１０
配列番号４０：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２４７−Ｇ１１
配列番号４１：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２５５−Ｇ１２
配列番号４２：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２４７−Ｆ８
配列番号４３：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２３７−Ｂ１０
配列番号４４：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２３７−Ｈ４
配列番号４５：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２３９−Ｂ１０
配列番号４６：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２４６−Ｈ５
配列番号４７：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２４７−Ｇ１
配列番号４８：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２４７−Ｈ２
配列番号４９：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２４８−Ｅ１
配列番号５０：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２４９−Ｅ５
配列番号５１：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２５３−Ａ１１
配列番号５２：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２５５−Ａ８
配列番号５３：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２５５−Ｇ３
配列番号５４：  融合タンパク質ＩＦＮ−１２５５−Ｈ３
配列番号５５：  融合タンパク質１０４１−Ｄ１１−ＩＦＮ
配列番号５６：  融合タンパク質１２５５−Ｂ９−ＩＦＮ
配列番号５７：  融合タンパク質１２５５−Ｂ１０−ＩＦＮ
配列番号５８：  融合タンパク質１２４７−Ｇ１１−ＩＦＮ
配列番号５９：  融合タンパク質１２５５−Ｇ１２−ＩＦＮ
配列番号６０：  融合タンパク質１２４７−Ｆ８−ＩＦＮ
配列番号６１：  融合タンパク質１２３７−Ｂ１０−ＩＦＮ
配列番号６２：  融合タンパク質１２３７−Ｈ４−ＩＦＮ
配列番号６３：  融合タンパク質１２３９−Ｂ１０−ＩＦＮ
配列番号６４：  融合タンパク質１２４６−Ｈ５−ＩＦＮ
配列番号６５：  融合タンパク質１２４７−Ｇ１−ＩＦＮ
配列番号６６：  融合タンパク質１２４７−Ｈ２−ＩＦＮ
配列番号６７：  融合タンパク質１２４８−Ｅ１−ＩＦＮ
配列番号６８：  融合タンパク質１２４９−Ｅ５−ＩＦＮ
配列番号６９：  融合タンパク質１２５３−Ａ１１−ＩＦＮ
配列番号７０：  融合タンパク質１２５５−Ａ８−ＩＦＮ
配列番号７１：  融合タンパク質１２５５−Ｇ３−ＩＦＮ
配列番号７２：  融合タンパク質１２５５−Ｈ３−ＩＦＮ
配列番号７３：  リンカー配列ＲＩＧ
配列番号７４：  １３５３−Ｈ６、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号７５：  １３５１−Ｅ９、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号７６：  １３５４−Ａ８、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号７７：  １３５１−Ｅ９＿Ｆ６３Ｐ、修飾ヘテロ二量体ユビキチンタンパク質
配列番号７８：  融合タンパク質ＩＦＮ−１３５３−Ｈ６
配列番号７９：  融合タンパク質ＩＦＮ−１３５１−Ｅ９
配列番号８０：  融合タンパク質ＩＦＮ−１３５４−Ａ８＿Ｆ６３Ｐ
配列番号８１：  融合タンパク質ＩＦＮ−１３５１−Ｅ９＿Ｆ６３Ｐ
配列番号８２：  融合タンパク質１３５３−Ｈ６−ＩＦＮ
配列番号８３：  融合タンパク質１３５１−Ｅ９−ＩＦＮ
配列番号８４：  融合タンパク質１３５４−Ａ８−ＩＦＮ
配列番号８５：  融合タンパク質１３５１−Ｅ９＿Ｆ６３Ｐ−ＩＦＮ
配列番号８６：  シス作用エレメント
配列番号８７：  基本リンカー配列
配列番号８８：  基本リンカー配列
配列番号８９：  融合タンパク質ＵＢ２−ＩＦＮ
配列番号９０：  融合タンパク質ＩＦＮ−ＵＢ２
配列番号９１：  ユビキチン変異タンパク質（Ｆ４５Ｗ／Ｇ７５Ａ／Ｇ７６Ａ）、突然変異誘発の開始配列
【図１】
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【図２Ａ−１】
2014523238.tif 000008
【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ】
2014523238.tif 000013
【図４】
2014523238.tif 000014
【図５】
2014523238.tif 000015
【図６】
2014523238.tif 000016
【図７】
2014523238.tif 000017
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014523238.tif 000019
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