(57)【要約】  本開示は、ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合することができる抗体または抗体断片であって、可変重鎖(VH)ドメインおよび/または可変軽鎖(VL)ドメインを含み、(a)VHドメインが、配列番号7の配列に対する同一性を有するCDR1配列;配列番号8の配列に対する同一性を有するCDR2配列;および配列番号9もしくは10の配列に対する同一性を有するCDR3配列からなる群から選択される相補性決定領域(CDR)を含む;ならびに/または(b)VLドメインが、配列番号11の配列に対する同一性を有するCDR4配列;配列番号12の配列番号に対する同一性を有するCDR5配列;配列番号13の配列に対する同一性を有するCDR6配列からなる群から選択されるCDRを含む、前記抗体または抗体断片に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合することができる抗体または抗体断片であって、可変重鎖(VH)ドメインおよび/または可変軽鎖(VL)ドメインを含み、
(a)VHドメインが、
配列番号7の配列に対する少なくとも20%、40%、60%、80%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR1配列;
配列番号8の配列に対する少なくとも5%、11%、17%、23%、29%、35%、41%、47%、52%、58%、64%、70%、76%、82%、88%、94%、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR2配列;および
配列番号9もしくは配列番号10の配列に対する少なくとも11%、22%、33%、44%、55%、66%、77%、88%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR3配列;
からなる群から選択される1、2もしくは3個の相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、ならびに/または
(b)VLドメインが、
配列番号11の配列に対する少なくとも7.5%、15%、23%、30%、38%、46%、53%、61%、69%、76%、84%、92%もしくは100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR4配列;
配列番号12の配列に対する少なくとも14%、28%、42%、57%、71%、85%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR5配列;
配列番号13の配列に対する少なくとも9%、18%、27%、36%、45%、54%、63%、72%、81%、90%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR6配列;
からなる群から選択される1、2もしくは3個の相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、前記抗体または抗体断片。
【請求項２】
VHドメインが請求項1により定義されたCDR1配列、CDR2およびCDR3配列を含むアミノ酸配列を含む、ならびに/またはVLドメインが請求項1により定義されたCDR4配列、CDR5およびCDR6配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の抗体または抗体断片。
【請求項３】
VHドメインが、配列番号1、3もしくは5からなる群から選択されるアミノ酸配列中に存在するCDR1、CDR2およびCDR3配列を含むアミノ酸配列または配列番号1、3もしくは5のいずれかのアミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%もしくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;ならびに/または
VLドメインが、配列番号2、4もしくは6からなる群から選択されるアミノ酸配列中に存在するCDR4、CDR5およびCDR6配列を含むアミノ酸配列または配列番号2、4もしくは6のいずれかのアミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%もしくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項1または2に記載の抗体または抗体断片。
【請求項４】
VHドメインが、配列番号1、3もしくは5からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号1、3もしくは5のいずれかのアミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%もしくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;ならびに/または
VLドメインが、配列番号2、4もしくは6からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号2、4もしくは6のいずれかのアミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%もしくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項５】
VHドメインが、配列番号1に対する少なくとも80%、85%、90%、95%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;および
VLドメインが、配列番号2に対する少なくとも80%、85%、90%、95%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項６】
VHドメインが、配列番号3に対する少なくとも80%、85%、90%、95%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;および
VLドメインが、配列番号4に対する少なくとも80%、85%、90%、95%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項７】
VHドメインが、配列番号5に対する少なくとも80%、85%、90%、95%または100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む;および
VLドメインが、配列番号6に対する少なくとも80%、85%、90%、95%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項８】
VHドメイン、VLドメイン、または好ましくはVHおよびVLドメインの両方が、記載された配列番号、または記載された配列番号のそれぞれの1つもしくは複数(例えば、全部)に対する100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項９】
VHドメイン、VLドメイン、またはVHおよびVLドメインの両方が、記載された配列番号、または記載された配列番号のそれぞれの1つもしくは複数(例えば、全部)に対する100%未満であるが、少なくとも80%、85%、90%、95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１０】
VHドメイン、VLドメイン、またはVHおよびVLドメインの両方が、記載された配列番号、または記載された配列番号のそれぞれの1つもしくは複数(例えば、全部)に対する100%未満であるが、少なくとも80%、85%、90%、95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合する抗体または抗体断片の能力が、対応する抗体または抗体断片の能力と等価である(すなわち、その少なくとも80%、85%、90%もしくは95%である)か、またはそれより高く、対応する抗体または抗体断片のVHドメインおよびVLドメインがそれぞれ、記載された配列番号、または記載された配列番号のそれぞれに対する100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗原結合配列を含む、
請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１１】
VHドメインおよびVLドメインが線状のポリペプチド配列中に存在する、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１２】
VHドメインおよびVLドメインがそれぞれ別々のポリペプチド配列中に存在し、好ましくは、別々のポリペプチド配列が(別々のポリペプチド配列間の1個または複数個のジスルフィド結合などによって)直接的または間接的に一緒に結合している、請求項1から11のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１３】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項1から10または請求項12のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体断片が、一本鎖抗体、Fv、scFv、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、dAb、CDR、またはscFv-Fc断片、ナノボディ、およびダイアボディ、またはPEG化などにより安定化された断片である、請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体断片。
【請求項１５】
ヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体などの、ヒトもしくはヒト化抗体または抗体断片である、請求項1から14のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１６】
ホスホリルコリンコンジュゲートに結合することができる、請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１７】
ホスホリルコリンコンジュゲートが、担体に、場合によりスペーサを介して、連結されたホスホリルコリン部分であり、好ましくは、抗体または抗体断片がホスホリルコリンコンジュゲート中のホスホリルコリン部分に特異的に結合する、請求項16に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１８】
請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含むか、または必須になる医薬組成物であって、場合により、組成物中に存在する唯一の抗体または抗体断片が請求項1から17のいずれか一項により定義されたものである、医薬組成物。
【請求項１９】
医学における使用のための、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項18に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症関連疾患または虚血性心血管疾患に対する、ヒトを含む哺乳動物の防止、予防および/または治療における使用のための、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項18に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
アルツハイマー病の予防、防止および/または治療における使用のための、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項18に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ヒトを含む哺乳動物における代謝性疾患に対する免疫化もしくは予防、またはその防止もしくは治療における使用のための、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項18に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症関連疾患または虚血性心血管疾患に対する、ヒトを含む哺乳動物の防止、予防および/または治療のための方法であって、哺乳動物に、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項18に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２４】
アルツハイマー病に対する対象の免疫化ならびに予防、防止および/または治療のための方法であって、対象に請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項18に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２５】
ヒトなどの哺乳動物における代謝性疾患に対する免疫化もしくは予防、またはその治療のための方法であって、哺乳動物に、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項18に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項２６】
代謝性疾患が、代謝症候群、インスリン耐性、耐糖能、高血糖、I型糖尿病、II型糖尿病、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、脂質異常症、および多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)からなる群から選択される状態である、請求項22に記載の使用、または請求項25に記載の方法のための、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗体断片、または請求項18に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片をコードする核酸配列。
【請求項２８】
請求項27に記載の核酸配列を含むベクターまたはプラスミド。
【請求項２９】
請求項27に記載の核酸配列および/または請求項28に記載のベクターもしくはプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項３０】
細胞が大腸菌細胞などの原核細胞、または動物、植物、もしくは真菌細胞などの真核細胞である、請求項29に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
請求項27に記載の核酸配列を発現し、それによって、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を生成する、請求項29または30に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
請求項31に記載の宿主細胞を培養するステップ、および請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片をそれから回収するステップを含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片を生成する方法。
【請求項３３】
請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片のバリアントを調製するための方法であって、バリアントは、ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合する能力を保持し、
(i)親抗体または抗体断片をコードする請求項27に記載の核酸を用意するステップ;
(ii)変異核酸が親抗体または抗体断片と比較して異なるアミノ酸配列を有するバリアント抗体または抗体断片をコードするように、1個または複数個のヌクレオチド変異を、核酸配列のアミノ酸コード領域中に、場合により、VHおよび/またはVLドメインをコードする領域内に導入するステップ;
(iii)変異核酸配列によりコードされるバリアント抗体または抗体断片を発現させるステップ;ならびに
(iv)ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合する、バリアント抗体または抗体断片の能力と、親抗体または抗体断片の能力とを比較するステップ
を含む、方法。
【請求項３４】
ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合するバリアント抗体または抗体断片の能力を評価するステップが、親と比較してホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合する実質的に等しいか、または増強された能力を有するバリアントを選択することをさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
バリアント抗体または抗体断片をコードする変異核酸配列を含む核酸分子を回収するステップと、場合により、回収された核酸分子を含む組成物を用いて宿主細胞を形質転換するステップと、さらに場合により、宿主細胞からバリアント抗体または抗体断片を発現させるステップと、なおさらに場合により、宿主細胞からかくして発現されたバリアント抗体または抗体断片を回収するステップとをさらに含む、請求項33または34に記載の方法。
【請求項３６】
宿主細胞からかくして発現されたバリアント抗体または抗体断片を回収するステップを含み、回収されたバリアント抗体または抗体断片を薬学的に許容される組成物に製剤化するステップをさらに含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
医学における使用および/もしくは請求項20、12および/もしくは22に記載の使用または請求項24、25および/もしくは26のいずれか一項に記載の方法における使用のための、請求項33から35に記載の方法により得られる、もしくは得ることができるバリアント抗体もしくは抗体断片、または請求項36に記載の方法により得られる、もしくは得ることができる薬学的に許容される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる2011年8月9日に出願された米国仮特許出願第61/521,607号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、ホスホリルコリン(PC)および/またはPCコンジュゲートに結合し、驚くほど有効なin vivo特性を有する新規抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書中の見かけ上以前に公開された文献の一覧または考察は、その文献が技術水準の一部であるか、または共通一般知識であるという承認として必ずしも取られるべきではない。
【０００４】
心血管疾患のための治療選択肢が利用可能であるにも拘らず、急性冠症候群(ACS)は工業化社会における死因の第一位である。ACSは冠動脈の内腔内での血栓形成の結果として起こり、動脈壁内の慢性的炎症と関連する。動脈炎症は、脂質コアの形成および炎症細胞の浸潤により開始され、プラーク形成をもたらす。不安定なプラークは、内皮を破壊し、下層のコラーゲン、von Willebrand因子(vWF)、組織因子、脂質および平滑筋を露出させるプラーク破裂をもたらし得る実質的な壊死性コアおよびアポトーシス細胞を含み、血小板の付着、活性化、および凝集を開始させる(Libbyら、1996)。ACSは、抗血小板療法、コレステロール低下薬(例えば、スタチン)、抗凝固剤、ならびに経皮冠動脈インターベンション(PCI)およびステントの埋込みによる外科的再疎通の組合せを用いて処置される。
【０００５】
COX-1阻害剤(例えば、アスピリン)、ADP受容体拮抗薬(例えば、チクロペジンおよびクロピドグレル)、ならびに糖タンパク質IIb/IIIa受容体拮抗薬などの抗血小板療法は、いくつかの異なる臨床試験において主要有害心イベント(MACE)の発生を低下させることが示されている(Dupontら、2009)。しかしながら、長期抗血小板療法にある患者の一定割合は、心血管イベントを継続して有する。さらに、慢性防止療法は、最大有益効果を示すには最大2年かかることがあり、その後も多くの患者が依然として再発疾患について高リスクである。心筋梗塞後に、患者が、再狭窄に起因する再閉塞に起因することが多い、さらなるMACEに罹りやすい最大で6〜12ヶ月の期間が存在する(Tabas、2010)。
【０００６】
結果として、この期間のイベントを実質的に低下させることができる、特にさらなるプラーク進行の防止およびプラーク退縮の促進に対する治療が有意に必要である。
【０００７】
特定のリン脂質上の極性頭部基であるホスホリルコリンは、心血管疾患に広く関与してきた。冠動脈炎症の間に生成される反応性酸素種は、低密度リポタンパク質(LDL)の酸化を引き起こし、酸化LDL(oxLDL)を生成する。事実、アテローム性動脈硬化症、不安定狭心症または急性冠症候群などの心血管疾患(CVD)は、oxLDLの血漿レベルの上昇と関連することが示された(ItabeおよびUeda、2007)。LDLは、PC極性頭部基を有する脂質およびタンパク質、apoB100タンパク質を含有する循環リポタンパク質粒子である。
【０００８】
LDLの酸化中に、非修飾LDL上には存在しない新規エピトープを含有するPCが生成される。oxLDL上に新しく露出したPCは、CD36などの、マクロファージ上のスカベンジャー受容体により認識され、得られたマクロファージに貪食されたoxLDLは血管壁中での前炎症性泡沫細胞の形成に向かって進行する。酸化LDLはまた、内皮細胞表面上の受容体によっても認識され、これは内皮機能障害、アポトーシス、および変性タンパク質応答(unfolded protein response)などの様々な応答を刺激すると報告されている(Goraら、2010)。PC新規エピトープはまた、ホスホリパーゼA2またはアミン反応性疾患代謝物、例えば、糖化タンパク質の酸化から生成されるアルデヒドによる修飾後にLDL上に露出される。これらの交互に修飾されたLDL粒子もまた、CVDにおける前炎症因子である。
【０００９】
ホスホリルコリン(PC)に対する抗体は、in vivoモデルまたはin vitro試験において、酸化されたか、またはさもなければ修飾されたLDLに結合し、oxLDLの前炎症活性を遮断することが示された(Shawら、2000;Shawら、2001)。
【００１０】
さらに、臨床データの検査により、低レベルの天然IgM抗PC抗体がACS患者におけるMACEのリスクの増加と関連することが示された(Frostegard, J.、2010)。
【００１１】
従って、療法において有効に用いることができる抗PC抗体分子、特に、ヒトの療法にとって好適な完全ヒト抗PC抗体が必要である。出願人の知るところ、現在まで、当技術分野は治療上有効なヒト抗PC抗体を提供することに失敗してきた。そのような抗体の同定は、抗PC結合活性を有するヒト抗体のためのin vitroでのスクリーニング方法がin vivoでの治療活性の弱い予測因子であるという事実によって妨げられてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO 2005/100405
【特許文献２】US 2007-0286868
【特許文献３】WO 2010/003602
【特許文献４】米国特許出願第61/078677号
【特許文献５】WO 2012/010291
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
これを考慮すると、in vivo系において用いた場合、特に、療法のためにヒトに投与した場合に有効で有利な特性を提供するヒト抗PC抗体分子が当技術分野で必要である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Biacoreによる平衡結合分析からの結合親和性の見積もりを示す図である。(●)X9-C01(ロットW21574)(Kd = 352±59nM)、(○)X9-C01(ロットW22596)(Kd = 295±46nM)。パネルは抗体の2つの異なる調製物を比較するものである。
【図２】ELISAにより測定されたPC-BSAへの精製IgGの結合を示す図である。(●)M4-G02(EC50 = 0.14nM)、(○)M73-G03(EC50 = 0.91nM)、(▼)X9-C01(EC50 = 0.18nM)。データを、全体的Bmaxを用いて4パラメータロジスティック式に適合させて、EC50の見積もり値を得た。
【図３】大腿動脈カフ(cuffed)マウス内部へのCD45陽性白血球流入の阻害を示す図である。トランスジェニック雄ApoE*3 Leidenマウスに、1%コレステロールおよび0.05%コレートを含有する高コレステロールおよび高脂肪食を給餌して、高コレステロール血症を誘導した。高脂肪食の3週間後、マウスを麻酔し、大腿動脈をその周囲から切断し、非収縮性ポリエチレンカフ(Portex、内径0.40mm、外径0.80mmおよび長さ2.0mm)で緩く被覆した。マウスを、IP注射により、0日目に、PBS中に溶解した10mg/kgの組換え抗PC IgG抗体、PBSに溶解した10mg/kgの抗ストレプトアビジンA2 IgG抗体またはPBSのみで処置した。手術の3日後にマウスを犠牲にし、カフされた大腿動脈を収穫し、パラフィン包埋した。組織化学分析のために、カフされた大腿動脈断片の全長から連続横断面(5μm)を取得した。*P<0.01、n=15。
【図４Ａ】大腿動脈カフマウスにおける血管内膜肥厚の阻害を示す図である。トランスジェニック雄ApoE*3 Leidenマウスに、1%コレステロールおよび0.05%コレートを含有する高コレステロールおよび高脂肪食を給餌して、高コレステロール血症を誘導した。高脂肪食の3週間後、マウスを麻酔し、大腿動脈をその周囲から切断し、非収縮性ポリエチレンカフ(Portex、内径0.40mm、外径0.80mmおよび長さ2.0mm)で緩く被覆した。マウスを、IP注射により、手術後0日目、3日目、7日目および10日目に、PBS中に溶解した10mg/kgの組換え抗PC IgG抗体、PBSに溶解した10mg/kgの抗ストレプトアビジンA2 IgG抗体またはPBSのみで処置した。手術の14日後にマウスを犠牲にし、カフされた大腿動脈を収穫し、パラフィン包埋した。組織化学分析のために、カフされた大腿動脈断片の全長から連続横断面(5μm)を取得した。4つのパネルにおける血管内膜領域(矢印で示される)の比較は、抗体X9-C01が、カフ誘導血管傷害後14日目に観察される血管内膜肥厚を減少させたことを示している。
【図４Ｂ】大腿動脈カフマウスにおける血管内膜肥厚の阻害を示す図である。トランスジェニック雄ApoE*3 Leidenマウスに、1%コレステロールおよび0.05%コレートを含有する高コレステロールおよび高脂肪食を給餌して、高コレステロール血症を誘導した。高脂肪食の3週間後、マウスを麻酔し、大腿動脈をその周囲から切断し、非収縮性ポリエチレンカフ(Portex、内径0.40mm、外径0.80mmおよび長さ2.0mm)で緩く被覆した。マウスを、IP注射により、手術後0日目、3日目、7日目および10日目に、PBS中に溶解した10mg/kgの組換え抗PC IgG抗体、PBSに溶解した10mg/kgの抗ストレプトアビジンA2 IgG抗体またはPBSのみで処置した。手術の14日後にマウスを犠牲にし、カフされた大腿動脈を収穫し、パラフィン包埋した。組織化学分析のために、カフされた大腿動脈断片の全長から連続横断面(5μm)を取得した。(μm)2での血管内膜肥厚、n=10、*P<0.05。
【図５】ELISAを用いて測定されたX9-C01変異体のPC結合活性を示す図である。(●)X9-C01(EC50 = 0.35nM)、(○)X19-E01(EC50 = 0.38nM)、(▼)X19-E03(EC50 = 0.79nM)。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本出願は、ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合することができる新規抗体および新規抗原結合領域を含む抗体断片の生成および試験を記載する。
【００１６】
第一の態様において、本発明は、ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合することができる抗体または抗体断片であって、可変重鎖(VH)ドメインおよび/または可変軽鎖(VL)ドメインを含み、
(a)VHドメインが、
配列番号7の配列に対する少なくとも20%、40%、60%、80%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR1配列;
配列番号8の配列に対する少なくとも5%、11%、17%、23%、29%、35%、41%、47%、52%、58%、64%、70%、76%、82%、88%、94%、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR2配列;および
配列番号9もしくは配列番号10の配列に対する少なくとも11%、22%、33%、44%、55%、66%、77%、88%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR3配列;
からなる群から選択される1、2もしくは3個の相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、ならびに/または
(b)VLドメインが、
配列番号11の配列に対する少なくとも7.5%、15%、23%、30%、38%、46%、53%、61%、69%、76%、84%、92%もしくは100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR4配列;
配列番号12の配列に対する少なくとも14%、28%、42%、57%、71%、85%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR5配列;
配列番号13の配列に対する少なくとも9%、18%、27%、36%、45%、54%、63%、72%、81%、90%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR6配列;
からなる群から選択される1、2もしくは3個の相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、前記抗体または抗体断片を提供する。
【００１７】
本発明の第一の態様による一実施形態においては、抗体または抗体断片は、上記で定義されたCDR1配列、CDR2およびCDR3配列を含むアミノ酸配列を含むVHドメイン、ならびに/または上記で定義されたCDR4配列、CDR5およびCDR6配列を含むアミノ酸配列を含むVLドメインを含む。
【００１８】
本発明の第一の態様のさらなる実施形態においては、抗体または抗体断片は、
配列番号1、3もしくは5からなる群から選択されるアミノ酸配列中に存在するCDR1、CDR2およびCDR3配列の3つ全部を含むアミノ酸配列または配列番号1、3もしくは5のいずれかのアミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%もしくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVHドメイン;ならびに/または
配列番号2、4もしくは6からなる群から選択されるアミノ酸配列中に存在するCDR4、CDR5およびCDR6配列の3つ全部を含むアミノ酸配列または配列番号2、4もしくは6のいずれかのアミノ酸配列に対する少なくとも80%、85%、90%もしくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むVLドメイン
を含む。
【００１９】
本発明の第一の態様のさらなる実施形態においては、抗体または抗体断片は、可変重鎖(VH)ドメインおよび/または可変軽鎖(VL)ドメインを含み、
VHドメインは、配列番号1、3もしくは5からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号1、3もしくは5のいずれかのアミノ酸配列に対する少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%もしくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;および
VLドメインは、配列番号2、4もしくは6からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号2、4もしくは6のいずれかのアミノ酸配列に対する少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%もしくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
配列番号1は、以下の実施例に記載されるX9-C01抗体の可変重鎖(VH)ドメインであり、配列:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYRMWWVRQAPGKGLEVWSSIGSSGGKTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRFMSLGFDYWGQGTLVTVSS
を有し、相補性決定領域(CDR):
VH CDR1: YYRMW (配列番号7);
VH CDR2: SIGSSGGKTFYADSVKG (配列番号8);
VH CDR3: RFMSLGFDY (配列番号9);
を含む。
【００２１】
配列番号2は、X9-C01抗体の可変軽鎖(VL)ドメインであり、配列:
QSELTQPHSASGTPGQRVTISCSGRRSNIGANYVYWYQQYPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSDTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKLTVL
を有し、相補性決定領域(CDR):
VL CDR4: SGRRSNIGANYVY (配列番号11);
VL CDR5: RNNQRPS (配列番号12);
VL CDR6: AAWDDSLSGWV (配列番号13),
を含む。
【００２２】
配列番号3は、以下の実施例に記載されるX19-E01抗体の可変重鎖(VH)ドメインであり、配列:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYRMWWVRQAPGKGLEVWSSIGSSGGKTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRFLSLGFDYWGQGTLVTVSS
を有し、相補性決定領域(CDR):
VH CDR1: 上記で定義された配列番号7;
VH CDR2: 上記で定義された配列番号8;
VH CDR3: RFLSLGFDY(配列番号10)
を含む。
【００２３】
配列番号4は、X19-E01抗体の可変軽鎖(VL)ドメインであり、配列:
QSELTQPHSASGTPGQRVTISCSGRRSNIGANYVYWYQQYPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSDTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKLTVL
を有し、相補性決定領域(CDR)として以下の配列:VL CDR4としての配列番号11;VL CDR5としての配列番号12;およびVL CDR6としての配列番号13を含む。
【００２４】
配列番号5は、以下の実施例に記載されるX19-E03抗体の可変重鎖(VH)ドメインであり、配列:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYRMWWVRQAPGKGLEVWSSIGSSGGKTFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRFLSLGFDYWGQGTLVTVSS
を有し、相補性決定領域(CDR)として以下の配列:VH CDR1としての配列番号7;VH CDR2としての配列番号8;およびVH CDR3としての配列番号10を含む。
【００２５】
配列番号6は、X19-E03抗体の可変軽鎖(VL)ドメインであり、配列:
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGRRSNIGANYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGVWFGGGTKLTVL
を有し、相補性決定領域(CDR)として以下の配列:VH CDR4としての配列番号11;VH CDR5としての配列番号12;およびVH CDR6としての配列番号13を含む。
【００２６】
上記で定義された配列番号の概要は、以下のように示される:
【００２７】
【表１】
2014529398.tif 000002
【００２８】
本発明の第一の態様のさらなる実施形態においては、抗体または抗体断片は、X9-C01抗体のVHおよび/またはVLドメインに基づくものであり、従って、
VHドメインは、(i)配列番号1に対する少なくとも80%、85%、90%、95%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ならびに/または(ii)配列番号7の配列に対する少なくとも20%、40%、60%、80%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR1配列、配列番号8の配列に対する少なくとも5%、11%、17%、23%、29%、35%、41%、47%、52%、58%、64%、70%、76%、82%、88%、94%、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR2配列;および配列番号9の配列に対する少なくとも11%、22%、33%、44%、55%、66%、77%、88%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR3配列を含む;ならびに/または
VLドメインは、(iii)配列番号2に対する少なくとも80%、85%、90%、95%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ならびに/または(iv)配列番号11の配列に対する少なくとも7.5%、15%、23%、30%、38%、46%、53%、61%、69%、76%、84%、92%もしくは100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR4配列;配列番号12の配列に対する少なくとも14%、28%、42%、57%、71%、85%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR5配列;および配列番号13の配列に対する少なくとも9%、18%、27%、36%、45%、54%、63%、72%、81%、90%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR6配列を含む。VHドメインは、配列番号1の配列を含み、VLドメインは配列番号2の配列を含むのが好ましい。
【００２９】
この実施形態の抗体または抗体断片は、重鎖定常(CH)領域またはその断片をさらに含んでもよく、その断片は、例えば、CH領域の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320個以上のアミノ酸を含んでもよい。CH領域またはその断片は、VHドメインに連結されていてもよい。CH領域には特定の制限はないが、一実施形態においては、それはヒトCH領域である。当技術分野は、ヒトCH領域の多くの例を含む。この文脈における使用のための例示的なヒトCH領域は、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号14)
を含む。
【００３０】
配列番号14は、X9-C01のCH領域であり、ヒトIgG1のCH領域の配列を有する(UniProtKB/Swiss-Prot:P01857.1)。場合により、配列番号14のCH領域中の末端K(Lys)を除去し、ペプチダーゼ分解の可能性を低下させるか、または回避してもよい。
【００３１】
この実施形態の抗体または抗体断片は、追加してまたは代わりに、軽鎖定常(CL)領域またはその断片をさらに含んでもよく、その断片は、例えば、CL領域の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個以上のアミノ酸を含んでもよい。CL領域またはその断片は、VLドメインに連結されていてもよい。CL領域には特定の制限はないが、一実施形態においては、それはヒトCL領域である。当技術分野は、ヒトCL領域の多くの例を含む。この文脈における使用のための例示的なヒトCL領域は、
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (配列番号15)
を含む。
【００３２】
配列番号15は、X9-C01のCL領域であり、ヒトラムダのCL領域の配列を有する(GenBank: J00253.1)。この実施形態によれば、VHドメインは、配列番号14のCH領域に連結された配列番号1の配列を含み、VLドメインは配列番号15のCL領域に連結された配列番号2の配列を含むのが好ましい。
【００３３】
本発明の第一の態様の別の実施形態においては、抗体または抗体断片は、X19-E01抗体のVHおよび/またはVLドメインに基づくものであり、従って、
VHドメインは、(i)配列番号3に対する少なくとも80%、85%、90%、95%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ならびに/または(ii)配列番号7の配列に対する少なくとも20%、40%、60%、80%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR1配列、配列番号8の配列に対する少なくとも5%、11%、17%、23%、29%、35%、41%、47%、52%、58%、64%、70%、76%、82%、88%、94%、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR2配列;および配列番号10の配列に対する少なくとも11%、22%、33%、44%、55%、66%、77%、88%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR3配列を含む;ならびに/または
VLドメインは、(iii)配列番号4に対する少なくとも80%、85%、90%、95%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ならびに/または(iv)配列番号11の配列に対する少なくとも7.5%、15%、23%、30%、38%、46%、53%、61%、69%、76%、84%、92%もしくは100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR4配列、配列番号12の配列に対する少なくとも14%、28%、42%、57%、71%、85%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR5配列、および配列番号13の配列に対する少なくとも9%、18%、27%、36%、45%、54%、63%、72%、81%、90%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR6配列を含む。VHドメインは配列番号3の配列を含み、VLドメインは配列番号4の配列を含むのが好ましい。
【００３４】
この実施形態の抗体または抗体断片は、重鎖定常(CH)領域またはその断片をさらに含んでもよく、その断片は、例えば、CH領域の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320個以上のアミノ酸を含んでもよい。CH領域またはその断片は、VHドメインに連結されていてもよい。CH領域には特定の制限はないが、一実施形態においては、それはヒトCH領域である。当技術分野は、ヒトCH領域の多くの例を含む。この文脈における使用のための例示的なヒトCH領域は、配列番号14を含む。
【００３５】
この実施形態の抗体または抗体断片は、追加してまたは代わりに、軽鎖定常(CL)領域またはその断片をさらに含んでもよく、その断片は、例えば、CL領域の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個以上のアミノ酸を含んでもよい。CL領域またはその断片は、VLドメインに連結されていてもよい。CL領域には特定の制限はないが、一実施形態においては、それはヒトCL領域である。当技術分野は、ヒトCL領域の多くの例を含む。この文脈における使用のための例示的なヒトCL領域は、配列番号15を含む。
【００３６】
この実施形態によれば、VHドメインは配列番号14のCH領域に連結された配列番号3の配列を含みVLドメインは配列番号15のCL領域に連結された配列番号4の配列を含むのが好ましい。
【００３７】
本発明の第一の態様の別の実施形態においては、抗体または抗体断片は、X19-E03抗体のVHおよび/またはVLドメインに基づくものであり、従って、
VHドメインは、(i)配列番号5に対する少なくとも80%、85%、90%、95%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ならびに/または(ii)配列番号7の配列に対する少なくとも20%、40%、60%、80%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR1配列、配列番号8の配列に対する少なくとも5%、11%、17%、23%、29%、35%、41%、47%、52%、58%、64%、70%、76%、82%、88%、94%、もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR2配列;および配列番号10の配列に対する少なくとも11%、22%、33%、44%、55%、66%、77%、88%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR3配列を含む;ならびに/または
VLドメインは、(iii)配列番号6に対する少なくとも80%、85%、90%、95%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ならびに/または(iv)配列番号11の配列に対する少なくとも7.5%、15%、23%、30%、38%、46%、53%、61%、69%、76%、84%、92%もしくは100%配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR4配列、配列番号12の配列に対する少なくとも14%、28%、42%、57%、71%、85%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR5配列、および配列番号13の配列に対する少なくとも9%、18%、27%、36%、45%、54%、63%、72%、81%、90%もしくは100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むCDR6配列を含む。VHドメインは配列番号5の配列を含み、VLドメインは配列番号6の配列を含むのが好ましい。
【００３８】
この実施形態の抗体または抗体断片は、重鎖定常(CH)領域またはその断片をさらに含んでもよく、その断片は、例えば、CH領域の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320個以上のアミノ酸を含んでもよい。CH領域またはその断片は、VHドメインに連結されていてもよい。CH領域には特定の制限はないが、一実施形態においては、それはヒトCH領域である。当技術分野は、ヒトCH領域の多くの例を含む。この文脈における使用のための例示的なヒトCH領域は、配列番号14を含む。
【００３９】
この実施形態の抗体または抗体断片は、追加してまたは代わりに、軽鎖定常(CL)領域またはその断片をさらに含んでもよく、その断片は、例えば、CL領域の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個以上のアミノ酸を含んでもよい。CL領域またはその断片は、VLドメインに連結されていてもよい。CL領域には特定の制限はないが、一実施形態においては、それはヒトCL領域である。当技術分野は、ヒトCL領域の多くの例を含む。この文脈における使用のための例示的なヒトCL領域は、配列番号15を含む。
【００４０】
この実施形態によれば、VHドメインは配列番号14のCH領域に連結された配列番号5の配列を含みVLドメインは配列番号15のCL領域に連結された配列番号6の配列を含むのが好ましい。
【００４１】
様々な上記実施形態において、CH領域およびその断片の考察は、いずれかのバリアント(variant)を使用する選択肢を含むことも意図される。バリアントは、記載のCH領域またはその断片に対する50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性などの、100%未満の配列同一性を有する配列を含む。従って、CH領域またはその断片のバリアントは、記載のCH領域またはその断片と比較して1個または複数個(2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160個以上)の配列変化(variation)を有してもよい。配列中の変異は、記載のCH領域またはその断片と比較した1個もしくは複数個のアミノ酸付加、1個もしくは複数個のアミノ酸欠失および/または1個もしくは複数個のアミノ酸置換に起因するものであってもよい。1個より多い変化が存在する場合、その変化は連続的または非連続的位置にあってもよい。
【００４２】
同様に、様々な上記実施形態において、CL領域およびその断片の考察は、いずれかのバリアントを使用する選択肢を含むことも意図される。バリアントは、記載のCL領域またはその断片に対する50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性などの、100%未満の配列同一性を有する配列を含む。従って、CL領域またはその断片のバリアントは、記載のCL領域またはその断片と比較して1個または複数個(2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60個以上)の配列変化を有してもよい。配列中の変化は、記載のCL領域またはその断片と比較した1個もしくは複数個のアミノ酸付加、1個もしくは複数個のアミノ酸欠失および/または1個もしくは複数個のアミノ酸置換に起因するものであってもよい。1個より多い変化が存在する場合、その変化は連続的または非連続的位置にあってもよい。
【００４３】
上記実施形態による抗体または抗体断片において、VHドメイン、VLドメイン、または好ましくはVHおよびVLドメインの両方は、記載の配列番号、または個々のCDR配列に対応する記載の配列番号の場合、記載の配列番号のそれぞれの1個もしくは複数個(2個もしくは3個など)に対する100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むのが好ましい。
【００４４】
かくして、例えば、X9-C01抗体に基づくものである上記実施形態による好ましい抗体または抗体断片は、配列番号1の配列を含むVHドメインおよび/または配列番号2の配列を含むVLドメインを含んでもよい;X19-E01抗体に基づくものである上記実施形態による好ましい抗体または抗体断片は、配列番号3の配列を含むVHドメインおよび/または配列番号4の配列を含むVLドメインを含んでもよい;ならびにX19-E03抗体に基づくものである上記実施形態による好ましい抗体または抗体断片は、配列番号5の配列を含むVHドメインおよび/または配列番号6の配列を含むVLドメインを含んでもよい。
【００４５】
あるいは、別の実施形態においては、上記実施形態による抗体または抗体断片は、記載の配列番号、または個々のCDR配列に対応する記載の配列番号の場合、記載の配列番号のそれぞれの1個もしくは複数個(2個もしくは3個など)に対する100%未満の配列同一性を有するアミノ酸配列をそれぞれ含む、VHドメイン、VLドメイン、またはVHおよびVLドメインの両方を含んでもよい。
【００４６】
本発明の第一の態様に従えば、記載の配列番号に対する100%未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む配列は、記載の配列番号と比較して1個または複数個(2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上など)の配列変化を有する配列であってもよい。配列中の変化は、記載の配列番号と比較した1個もしくは複数個(2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上など)のアミノ酸付加、1個もしくは複数個(2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上など)のアミノ酸欠失および/または1個もしくは複数個(2、3、4、5、6、7、8、9、10個以上など)のアミノ酸置換に起因するものであってもよい。1個より多い変化が存在する場合、その変化は連続的または非連続的位置にあってもよい。
【００４７】
配列番号1〜6から選択される記載の配列番号に対する100%未満であるが、少なくとも80%、85%、90%、95%の配列同一性を有するバリアント抗原結合領域における配列中の1個または複数個の変化は、1個または複数個のフレームワーク領域を形成するアミノ酸配列中に、またはその中にのみ存在してもよい。フレームワーク領域は、本明細書で定義されるCDRを形成しないアミノ酸領域を含む。
【００４８】
追加してまたは代わりに、配列番号1〜6から選択される記載の配列番号に対する100%未満であるが、少なくとも80%、85%、90%、95%の配列同一性を有する抗原結合領域における配列中の1個または複数個の変化が、1個または複数個の相補性決定領域(CDR)を形成するアミノ酸配列中に、またはその中にのみ存在してもよい。配列番号1〜6中のCDRは、配列番号7〜13に対する参照により上記で定義された通りであり、また、以下のTable 2(表3)およびTable 3(表4)に示される。
【００４９】
本発明の第一の態様の全ての実施形態においては、一般に、抗体もしくは抗体断片の結合特性および/またはin vivoでの効果を実質的に変化させることなく、より高レベルの配列改変がCDR中よりもフレームワーク領域中で許容され得る。
【００５０】
かくして、例えば、さらなる実施形態においては、本発明の第一の態様による抗体または抗体断片中のCDR、またはそれぞれのCDRは、配列番号7〜13の1つに定義された「親」CDR配列と比較して、最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個のアミノ酸置換、挿入および/もしくは欠失ならびに好ましくは、5、4、3、2もしくは1個以下のアミノ酸置換、挿入および/もしくは欠失を含んでもよい;CDR配列中に含まれるアミノ酸置換、挿入および/または欠失の数は、対応する定義された配列番号と比較して50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%未満まで配列同一性のレベルを低下させないのが好ましい。
【００５１】
追加しておよび/または代わりに、本発明の第一の態様による抗体または抗体断片中のフレームワーク領域、またはそれぞれのフレームワーク領域は、配列番号1〜16に定義されたVHまたはVL配列のいずれかに存在する対応するフレームワーク配列と比較して最大で1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個以上のアミノ酸置換、挿入および/または欠失、ならびに場合により10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1個以下のアミノ酸置換、挿入および/または欠失を含んでもよい;いずれかのフレームワーク領域中に含まれるアミノ酸置換、挿入および/または欠失の数は、対応する定義された配列番号と比較して10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%未満まで配列同一性のレベルを低下させないのが好ましい。
【００５２】
1個または複数個のフレームワーク中にあっても、または相補性決定領域中にあっても、置換は保存的または非保存的置換であってよい。「保存的置換」は、Gly、Ala;Val、Ile、Leu;Asp、Glu;Asn、Gln;Ser、Thr;Lys、Arg;およびPhe、Tyrなどの組合せを意図する。
【００５３】
配列変化は、例えば、抗原結合領域の配列を生殖細胞配列により近いものにするため、バリアント抗原結合領域を含む抗体もしくは抗体断片の安定性を改善するため、バリアント抗原結合領域を含む抗体もしくは抗体断片の免疫原性を低下させるため、および/または製造方法における欠点であり得る特性を回避するか、もしくは減少させるために導入してもよい。好適な配列変化の非限定例は、X19-E01および/またはX19-E03を生成するためにX9-C01の重鎖および/または軽鎖中に導入される変化を参照する実施例に示される。
【００５４】
そのようなバリアントを、以下に記載されるタンパク質工学および部位特異的変異誘発の方法または当技術分野で周知である別の方法を用いて作製することができる。
【００５５】
本発明の第一の態様の抗体または抗体断片のVHドメイン、VLドメイン、またはVHおよびVLドメインの両方が記載の配列番号、またはそれぞれの記載の配列番号の1個もしくは複数個に対する100%未満の配列同一性を有する1個または複数個のアミノ酸配列を含む場合、一実施形態においては、ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合する抗体または抗体断片の能力は、例えば、対応する「親」抗体または抗体断片のVHドメインおよびVLドメインがそれぞれ、記載の配列番号またはそれぞれの記載の配列番号に対する100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗原結合配列を含む場合、対応する「親」抗体または抗体断片の能力と実質的に等価である(すなわち、その少なくとも80%、85%、90%もしくは95%)か、またはそれより高いものであってよい。
【００５６】
かくして、例えば、抗体または抗体断片がX9-C01抗体に基づくものであり、VHドメインが配列番号1に対する100%未満であるが、少なくとも80%、85%、90%もしくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗原結合配列を含む;および/またはVLドメインが配列番号2に対する100%未満であるが、少なくとも80%、85%、90%もしくは95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗原結合配列を含む場合、ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合する抗体または抗体断片の能力は、例えば、配列番号1の配列を含むVHドメインおよび配列番号2の配列を含むVLドメインを有する対応する「親」抗体または抗体断片の結合能力と等価であってもよい。この文脈において、[対応する「親」抗体または抗体断片]とは、手持ちの「抗体または抗体断片」と、[対応する「親」抗体または抗体断片]との配列の唯一の相違が、VHおよび/またはVLドメインの抗原結合配列の一方または両方にあることを意味する。一実施形態においては、対応する親抗体は、X9-C01のVH、VL、CHおよびCL領域、すなわち、配列番号14のCH領域に連結された配列番号1のVHドメインおよび配列番号15のCL領域に連結された配列番号2のVLドメインの配列を有する抗体である。
【００５７】
同じことは、VHおよび/またはVLドメインが、記載の配列番号またはそれぞれの記載の配列番号の1個もしくは複数個に対する100%未満の配列同一性を有する1個もしくは複数個のアミノ酸配列を含み、ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートとの結合等価性を決定するための[対応する「親」抗体または抗体断片]が、VHおよび/VLドメインの一方または両方においてのみ異なり、記載の配列番号またはそれぞれの記載の配列番号に対する100%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗原結合配列またはそれぞれの抗原結合配列を有する場合、上記に列挙された他の抗体または抗体断片にも変更すべきところは変更して準用される。
【００５８】
これに関して、ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合する抗体または抗体断片の能力を、表面プラズモン共鳴(SPR)分析などの任意の好適な方法により決定して、Biacore SPRバイオセンサなどの固相表面に固定された(例えば、アミノフェニルリンカーを介して)ホスホリルコリンへの抗体または抗体断片の結合を測定することができる。
【００５９】
以下の実施例で考察されるように、X9-C01は、約300nMの見かけのKdでアミノフェニルホスホリルコリンに結合する。一実施形態においては、本発明による抗体または抗体断片は、約300nMの見かけのKdで固定されたアミノフェニルホスホリルコリンへのX9-C01のVHおよびVLドメイン(それぞれ配列番号1および配列番号2により定義される)を有する抗体または抗体断片の結合を提供する条件(実施例で用いられるSPR条件など)下で試験した場合、約600nM、約500nM、約400nM、約350nM、約325nM、約320nM、約315nM、約310nM、約305nM、約300nM以下の見かけのKdで固定されたアミノフェニルホスホリルコリンに結合する。この文脈において、用語「約」は、記載の値の±20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、または1%以内である値を意味するように用いられる。
【００６０】
さらなる実施形態においては、本発明の第一の態様による抗体または抗体断片は、本明細書で定義されるPCまたはPCコンジュゲートへの結合について「コンパレータ」抗体または抗体断片と競合する(例えば、ELISAまたはSPRアッセイにおいて決定される)。この文脈において、コンパレータ抗体または抗体断片は、X9-C01(それぞれ配列番号1、2、14および15により定義される)、X19-E01(それぞれ配列番号3、4、14および15により定義される)またはX19-E03(それぞれ配列番号5、6、14および15により定義される)のVHおよびVLドメイン、場合によってはCHおよびCLドメインも含んでもよく、好ましくはVHおよび/またはVL領域中の配列変化によってのみ試験される抗体または抗体断片とは異なる。「競合する」とは、本発明者らは、アッセイにおける本発明の第一の態様による抗体または抗体断片と、「コンパレータ」抗体との等モル量の含有が、本発明の第一の態様による抗体または抗体断片の非存在下での同じアッセイにおける「コンパレータ」抗体のPCまたはPCコンジュゲートへの結合の検出可能なレベルと比較して、コンパレータ抗体のPCまたはPCコンジュゲートへの結合の検出可能なレベルを10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%以上、例えば、実質的には100%低下させることができることを意図する。
【００６１】
また、以下の実施例で考察されるように、X9-C01は、nM範囲のIC50を有するoxLDLによる刺激に応答して単球からのMCP-1の放出を遮断することができる。別の実施形態においては、本発明による抗体または抗体断片は、約0.6〜3.4nMの範囲のX9-C01のVHおよびVLドメイン(それぞれ、配列番号1および配列番号2により定義される)を有する抗体または抗体断片のIC50を提供する条件(以下の実施例に記載のものなど)下で試験した場合、約10nM、約7nM、約6nM、約5nM、約4nM、約3nM、約2nM、約1nM、約0.9nM、約0.8nM、約0.7nM、約0.6nM未満またはそれ以下のIC50を有するoxLDLによる刺激に応答して内皮細胞からのMCP-1の放出を遮断する。この文脈において、用語「約」は、記載の値の±20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、または1%以内である値を意味するように用いられる。
【００６２】
ホスホリルコリンコンジュゲートに結合する本発明による抗体または抗体断片の能力を、ホスホリルコリンをホスホリルコリンコンジュゲートに置きかえて、上記のものと同等の方法により決定することができる。好適なホスホリルコリンコンジュゲートは、場合によりスペーサを介して、担体に連結されたホスホリルコリン部分を含む、上記で考察されたもの、例えば、PC-BSAおよびPC-KLHコンジュゲートを含む。好ましくは、ホスホリルコリンコンジュゲートに結合する抗体または抗体断片の能力が決定される場合、それはホスホリルコリンコンジュゲート中のホスホリルコリン部分に特異的に結合する抗体または抗体断片の能力に関して決定される。これを、ホスホリルコリンコンジュゲートおよびホスホリルコリン部分を含有しない対応する分子に結合する抗体または抗体断片の能力を比較することなどにより、当技術分野で公知の技術により決定することができる。
【００６３】
一実施形態においては、本発明の抗体または抗体断片は、線状ポリペプチド配列中にVHドメインおよびVLドメインを含んでもよい。
【００６４】
別の実施形態においては、本発明の抗体または抗体断片は、別々のポリペプチド配列中のVHドメインおよびVLドメインをそれぞれ含んでもよい。この実施形態においては、別々のポリペプチド配列は直接的または間接的に一緒に連結される(別々のポリペプチド配列間の1個または複数個のジスルフィド結合などによる)のが好ましい。
【００６５】
別の実施形態においては、VHドメインを、CH領域、またはその断片に連結してもよく、その断片は、例えば、上記のCH領域、またはCH領域のバリアントもしくはその断片の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320個以上のアミノ酸を含んでもよい。連結は、VHドメインおよびCH領域が単一のポリペプチドとして提供されるようなペプチド結合を介する直接的融合であってもよく、または連結はペプチドもしくは他のリンカーなどのリンカーを介するか、またはペプチド結合以外の直接的化学結合を介するものであってもよい。CH領域には特定の制限はないが、一実施形態においては、それはヒトCH領域である。当技術分野はヒトCH領域の多くの例を含む。この文脈における使用のための例示的ヒトCH領域は、配列番号14を含む。
【００６６】
別の実施形態においては、VLドメインをCL領域に連結してもよく、または断片は、例えば、上記のCL領域、またはCL領域のバリアントもしくはその断片の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100個以上のアミノ酸を含んでもよい。連結は、VLドメインおよびCL領域が単一のポリペプチドとして提供されるようなペプチド結合を介する直接的融合であってもよく、または連結はペプチドもしくは他のリンカーなどのリンカーを介するか、またはペプチド結合以外の直接的化学結合を介するものであってもよい。CL領域には特定の制限はないが、一実施形態においては、それはヒトCL領域である。当技術分野はヒトCL領域の多くの例を含む。この文脈における使用のための例示的ヒトCL領域は、配列番号15を含む。
【００６７】
別の実施形態においては、本発明の抗体または抗体断片は、1つのポリペプチド配列中のCH領域に連結されたVHドメイン、および別の個別のポリペプチド配列中のCL領域に連結されたVLドメインを含んでもよい。この実施形態においては、別々のポリペプチド配列は直接的または間接的に一緒に結合される(別々のポリペプチド配列間の1個または複数個のジスルフィド結合などによる)のが好ましい。
【００６８】
さらなる実施形態においては、本発明の抗体または抗体断片は、
・第一のCH領域に連結された第一のVHドメインを含む第一の重鎖、
・第一のCL領域に連結された第一のVLドメインを含む第一の軽鎖、
・第二のCH領域に連結された第二のVHドメインを含む第二の重鎖、
・第二のCL領域に連結された第二のVLドメインを含む第二の軽鎖
を含んでもよく、場合により、第一の軽鎖および第一の重鎖は直接的または間接的に一緒に結合され(別々のポリペプチド配列間の1個または複数個のジスルフィド結合などによる)、第二の軽鎖および第二の重鎖は直接的または間接的に一緒に結合され(別々のポリペプチド配列間の1個または複数個のジスルフィド結合などによる)、さらに場合により、第一および第二の重鎖は直接的または間接的に一緒に結合される(別々のポリペプチド配列間の1個または複数個のジスルフィド結合などによる)。
【００６９】
さらなる実施形態においては、本発明の抗体または抗体断片は、モノクローナル抗体、より好ましくは、ヒトモノクローナル抗体であってよい。
【００７０】
本発明の抗体または抗体断片は、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってよい。
【００７１】
1つの好ましい実施形態においては、本発明の抗体または抗体断片は、単離された抗体または抗体断片である。
【００７２】
別の実施形態においては、本発明の抗体または抗体断片は、標準的なタンパク質工学技術を用いて、免疫グロブリンのタンパク質足場上に移植された上記のVH、VL、CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5および/またはCDR6配列を含む1つまたは複数のアミノ酸配列を含んでもよい。当業者であれば、様々なタンパク質足場が使用のために入手可能であり、当技術分野で一般的に公知であることを理解できる。最終的な結果は、新しいフレームワーク中の保存された抗原結合活性である。
【００７３】
例えば、免疫グロブリンの足場は、IgA、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgMに由来するものでよい。足場は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ラクダ、ラマ、霊長類などの任意の哺乳動物に由来する免疫グロブリンに由来するものでよい。免疫グロブリン足場はヒト免疫グロブリンに由来するものが好ましい。
【００７４】
本発明の第一の態様による抗体断片を、標準的な分子生物学技術により、またはこれらの断片を生成する酵素(例えば、ペプシンもしくはパパイン)を用いる精製抗体の切断により生成することができる。本発明によるそのような抗体断片としては、限定されるものではないが、一本鎖抗体、Fv、scFv、Fab、F(ab')2、Fab'、Fd、dAb、CDR、またはscFv-Fc断片もしくはナノボディおよびダイアボディ、または例えば、PEG化により安定化されていてもよい任意の断片が挙げられる。
【００７５】
本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様による抗体または抗体断片と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。場合により、組成物中に存在する唯一の抗体または抗体断片は、本発明の第一の態様のものである。より好ましくは、例えば、型がアミノ酸配列、分子量および/またはホスホリルコリンに対する結合特異性に関して決定される場合、組成物中には1つの型の抗体または抗体断片が存在してもよい。これに関して、当業者であれば、例えば、N末端変化および/または部分的分解に起因して、任意の集団中の抗体または抗体断片の配列中にいくらかの低レベルの変化が存在してもよいことを理解できる;従って、この文脈において、組成物は、例えば、組成物中の検出可能なレベルの抗体または抗体断片の少なくとも約80重量%、約90重量%、約95重量%、約96重量%、約97重量%、約98重量%、約99重量%または実質的には100重量%が、アミノ酸配列、分子量および/またはホスホリルコリンに対する結合特異性に関して決定された場合に1つの型のものである場合、1つの型の抗体または抗体断片を含むと言うことができる。
【００７６】
本発明の第三の態様は、医学における使用のため、例えば、ヒトもしくは動物の身体またはそれに由来するex vivo試料に対して実施される療法、手術または診断の方法における使用のための、本発明の第一の態様による抗体もしくは抗体断片、または本発明の第二の態様による医薬組成物を提供する。
【００７７】
例えば、本発明の第三の態様は、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症関連疾患または心血管疾患に対する、ヒトを含む哺乳動物の防止、予防および/または治療における使用のための、本発明の第一の態様による抗体もしくは抗体断片、または本発明の第二の態様による医薬組成物を提供する。
【００７８】
換言すれば、本発明の第三の態様は、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症関連疾患または心血管疾患に対する、ヒトを含む哺乳動物の防止、予防および/または治療のための薬剤の製造における、本発明の第一の態様による抗体もしくは抗体断片、または本発明の第二の態様による医薬組成物の使用を提供する。
【００７９】
また、アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症関連疾患または心血管疾患に対する、ヒトを含む哺乳動物の防止、予防および/または治療のための方法であって、前記哺乳動物に、本発明の第一の態様による抗体もしくは抗体断片、または本発明の第二の態様による医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法が提供される。
【００８０】
本発明の第三の態様はまた、アルツハイマー病の予防、防止および/または治療における使用のための、本発明の第一の態様による抗体もしくは抗体断片、または本発明の第二の態様による医薬組成物も提供する。
【００８１】
換言すれば、本発明の第三の態様は、アルツハイマー病の予防、防止および/または治療のための薬剤の製造における、本発明の第一の態様による抗体もしくは抗体断片、または本発明の第二の態様による医薬組成物の使用を提供する。
【００８２】
また、アルツハイマー病に対する対象の免疫化ならびに予防、防止および/または治療のための方法であって、前記対象に、本発明の第一の態様による抗体もしくは抗体断片、または本発明の第二の態様による医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法が提供される。
【００８３】
本発明の第三の態様はまた、ヒトを含む哺乳動物における代謝性疾患に対する免疫化もしくは予防、またはその防止もしくは治療における使用のための、本発明の第一の態様による抗体もしくは抗体断片、または本発明の第二の態様による医薬組成物も提供する。
【００８４】
換言すれば、本発明の第三の態様は、ヒトを含む哺乳動物における代謝性疾患に対する免疫化もしくは予防、またはその防止もしくは治療のための薬剤の製造における、本発明の第一の態様による抗体もしくは抗体断片、または本発明の第二の態様による医薬組成物の使用を提供する。
【００８５】
また、ヒトなどの哺乳動物における代謝性疾患に対する免疫化もしくは予防、またはその治療のための方法であって、前記哺乳動物に、本発明の第一の態様による抗体もしくは抗体断片、または本発明の第二の態様による医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法も提供される。
【００８６】
本発明の第三の態様に従って対処および/または処置される代謝性疾患は、例えば、代謝症候群、インスリン耐性、耐糖能、高血糖、I型糖尿病、II型糖尿病、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、脂質異常症、および多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)からなる群から選択される状態であってもよい。
【００８７】
本発明の第四の態様は、本発明の第一の態様による、抗体もしくは抗体断片、または抗体もしくは抗体断片のポリペプチド鎖形成部分をコードする配列を含む核酸分子を提供する。この核酸分子は、例えば、DNAまたはRNAであってもよい。核酸分子は、本発明の第一の態様による抗体もしくは抗体断片、またはその一部をコードする配列に対して5'側および/または3'側にさらなる配列を含んでもよい。そのような5'および3'配列は、転写および/または翻訳調節配列、例えば、プロモーターおよび/またはターミネーター配列を含んでもよく、それらは当技術分野で周知であり、例えば、選択された宿主細胞中で機能的であるように選択することができる。従って、核酸分子は、選択された宿主細胞中への形質転換後に、宿主細胞の転写および/または翻訳系により発現され、本発明の第一の態様による、コードされた抗体もしくは抗体断片、または抗体もしくは抗体断片のポリペプチド鎖形成部分の生成をもたらすことができる発現カセットを含んでもよい。
【００８８】
本発明の第五の態様は、本発明の第四の態様による1つまたは複数の核酸配列を含むベクターまたはプラスミドを提供する。抗体または抗体断片が1つより多いポリペプチド鎖を含む場合、ベクターまたはプラスミドは、ベクターまたはプラスミドで形質転換された宿主細胞が抗体または抗体断片中に存在する全てのポリペプチド鎖を発現することができるように、例えば、それぞれのポリペプチド鎖をコードする核酸コード配列を含んでもよい。
【００８９】
従って、第五の態様は、宿主細胞の形質転換におけるベクターまたはプラスミドの使用も提供する。ベクターまたはプラスミドで宿主細胞を形質転換する方法は、当技術分野で周知である。形質転換された宿主細胞の選択を助けるために、ベクターまたはプラスミドは選択マーカーを含んでもよい。
【００９０】
本発明の第六の態様は、本発明の第五の態様による1つまたは複数のベクターまたはプラスミドを含む宿主細胞を提供する。第六の態様は、本発明の第五の態様による1つまたは複数のベクターまたはプラスミドを含む細胞の培養物、例えば、全てまたは実質的に全ての細胞が本発明の第五の態様による同じ1つまたは複数のベクターまたはプラスミドを含む単培養物も提供する。そのような単培養物を、例えば、1つまたは複数のプラスミドまたはベクター上の1つまたは複数の選択マーカーの存在について細胞を選択し、場合により、培養物中での選択された細胞の増殖の間に選択圧を維持することにより取得することができる。
【００９１】
本発明の第一の態様による抗体または抗体断片が1つより多いポリペプチド鎖を含む場合、ベクターまたはプラスミドで形質転換された宿主細胞が抗体または抗体断片中に存在する全てのポリペプチド鎖を発現することができるように、それぞれのポリペプチド鎖をコードする核酸コード配列を含む単一のベクターまたはプラスミドで宿主細胞を形質転換することができる。
【００９２】
あるいは、本発明による第一の態様による抗体または抗体断片が1つより多いポリペプチド鎖を含む場合、1つより多いベクターまたはプラスミドで形質転換された宿主細胞が抗体または抗体断片中に存在する全てのポリペプチド鎖を発現することができるように、少なくとも1つのポリペプチド鎖をコードする核酸コード配列をそれぞれ含む1より多いベクターまたはプラスミドで宿主細胞を形質転換することができる。
【００９３】
さらなる代替において、本発明の第一の態様による抗体または抗体断片が1つより多いポリペプチド鎖を含む場合、抗体または抗体断片を形成する異なるポリペプチド鎖の1つまたは複数の異なるメンバーをそれぞれコードする異なる核酸コード配列をそれぞれ含むベクターまたはプラスミドで複数の宿主細胞をそれぞれ形質転換し、それぞれ異なる宿主細胞を別々に培養して、それぞれのポリペプチド鎖を発現させることができる。次いで、回収された異なるポリペプチド鎖を組み合わせて、抗体または抗体断片を生成することができる。
【００９４】
任意の好適な宿主細胞を、本発明の第五および/または第六の態様において用いることができる。例えば、宿主細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌(Escherichia coli)細胞であってよい。宿主細胞は、真核細胞、例えば、動物細胞、植物細胞、および真菌細胞であってもよい。好適な動物細胞としては、哺乳動物細胞、鳥類細胞、および昆虫細胞が挙げられる。好適な哺乳動物細胞は、CHO細胞、およびCOS細胞を含んでもよい。好適な真菌細胞は、酵母細胞、例えば、サッカロミセス・セレビジア(Saccharomyces cerevisiae)細胞を含んでもよい。哺乳動物細胞は、ヒト細胞を含んでも、または含まなくてもよく、胚細胞を含んでも、または含まなくてもよい。
【００９５】
本発明の第七の態様は、本発明の第一の態様による抗体または抗体断片抗原結合配列を生成する方法であって、上記の1つまたは複数の形質転換された宿主細胞を培養するステップと、それから本発明の第一の態様による抗体または抗体断片を回収するステップとを含む、前記方法を提供する。
【００９６】
本発明の第八の態様は、ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合する能力を保持する本発明の第一の態様の抗体または抗体断片のバリアントを調製するための方法であって、
(i)親抗体もしくは抗体断片またはそのポリペプチド鎖形成部分をコードする本発明の第四の態様による核酸を用意するステップ;
(ii)変異核酸が親抗体または抗体断片と比較して異なるアミノ酸配列を有するバリアント抗体または抗体断片をコードするように、1個または複数個のヌクレオチド変異(場合により、最大で50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、または1個のヌクレオチド変異)を、核酸配列のアミノ酸コード領域中に、場合により、VHおよび/またはVLドメインをコードする領域内に導入するステップ;
(iii)変異核酸配列によりコードされる、バリアント抗体もしくは抗体断片、またはそのポリペプチド鎖形成部分を発現させるステップ;ならびに
(iv)ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合する、バリアント抗体または抗体断片の能力と、親抗体または抗体断片の能力とを比較するステップ
を含む前記方法を提供する。
【００９７】
本発明の第八の態様に従えば、ヌクレオチド変異を、無作為に、または部位特異的様式で、核酸配列のアミノ酸コード領域中に導入することができる。そのような変異は、変異前の核酸によりコードされるアミノ酸配列と比較して、1個もしくは複数個のアミノ酸付加、1個もしくは複数個のアミノ酸欠失および/または1個もしくは複数個のアミノ酸置換を含有するアミノ酸配列をコードするコード領域をもたらすことができる。
【００９８】
そのようなヌクレオチド変異は、抗原結合領域中の配列中に1個または複数個の変化を含有するアミノ酸配列をコードするコード領域をもたらしてもよく、またはもたらさなくてもよい。そのようなヌクレオチド変異は、例えば、1つまたは複数のフレームワーク領域を形成するアミノ酸配列中に、またはその中にのみ存在するアミノ酸配列変化(すなわち、1個もしくは複数個のアミノ酸付加、1個もしくは複数個のアミノ酸欠失および/もしくは1個もしくは複数個のアミノ酸置換)をもたらしてもよい。追加してまたは代わりに、そのようなヌクレオチド変異が、例えば、1つまたは複数の相補性決定領域を形成するアミノ酸配列中に、またはその中にのみ存在するアミノ酸配列変化(すなわち、1個もしくは複数個のアミノ酸付加、1個もしくは複数個のアミノ酸欠失および/もしくは1個もしくは複数個のアミノ酸置換)をもたらしてもよい。全体としてフレームワーク領域、CDRおよび/またはVHもしくはVLドメインに関して許容されるアミノ酸変化/改変のレベルは、本発明の第一の態様に関して上記で考察されており、本発明の第八の態様の方法に従って導入することができる変化/改変のレベルに変更すべきところは変更して準用することができる。
【００９９】
追加してまたは代わりに、そのようなヌクレオチド変異が、抗原結合領域以外の抗体または抗体断片の1つまたは複数の部分、例えば、1つまたは複数のCH1、CH2、CH3、CL領域または他の領域における配列中に1個または複数個の変化を含有するアミノ酸配列をコードするコード領域をもたらしてもよく、またはもたらさなくてもよい。
【０１００】
1個または複数個のヌクレオチド変異が、コードされた生成物中の1個または複数個のアミノ酸置換をもたらす場合、1個または複数個の置換はそれぞれ独立に、保存的または非保存的置換であってもよい。「保存的置換」とは、Gly、Ala;Val、Ile、Leu; Asp、Glu; Asn、Gln; Ser、Thr; Lys、Arg;およびPhe、Tyrなどの組合せを意図する。
【０１０１】
ヌクレオチド変異は、例えば、コードされる抗体もしくは抗体断片の配列を、生殖細胞配列により近くするため、バリアント抗原結合領域を含む抗体もしくは抗体断片の安定性を改善するため、バリアント抗原結合領域を含む抗体もしくは抗体断片の免疫原性を低下させるため、および/または製造方法における欠点であり得る特性を回避するか、もしくは減少させるために導入することができる。
【０１０２】
そのようなヌクレオチド変異を、当技術分野で周知の方法を用いて作製することができる。
【０１０３】
本発明の第八の態様に従えば、ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合するバリアント抗体または抗体断片の能力を評価するステップは、親と比較して実質的に等しいか、または増強されたホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合する能力を有するバリアントを選択するステップをさらに含んでもよい。
【０１０４】
ホスホリルコリンおよび/またはホスホリルコリンコンジュゲートに結合するバリアントおよび親の能力を、本発明の第一の態様に関して上記で考察されたものなどの方法により評価することができる。
【０１０５】
本発明の第八の態様の方法は、場合により、バリアント抗体または抗体断片をコードする変異核酸配列を含む核酸分子を回収するステップと、場合により、宿主細胞を、回収された核酸分子を含む組成物で形質転換するステップと、さらに場合により、宿主細胞からバリアント抗体または抗体断片を発現させるステップと、なおさらに場合により、このように発現されたバリアント抗体または抗体断片を宿主細胞から回収するステップと、なおさらに場合により、回収されたバリアント抗体または抗体断片を薬学的に許容される組成物に製剤化するステップとを含んでもよい。
【０１０６】
本発明の第八の態様はまた、医薬における使用のための、本発明の第八の態様の方法により得られる、もしくは得ることができるバリアント抗体もしくは抗体断片、または本発明の第八の態様の方法により得られる、もしくは得ることができる薬学的に許容されるも提供する。
【０１０７】
本発明の第八の態様はまた、
(i)アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症関連疾患もしくは心血管疾患に対する、ヒトを含む哺乳動物の防止、予防および/もしくは治療;
(ii)アルツハイマー病の予防、防止および/もしくは治療;ならびに/または
(iii)ヒトを含む哺乳動物における代謝性疾患に対する免疫化もしくは予防、またはその防止もしくは治療
における使用のための、本発明の第八の態様の方法により得られる、もしくは得ることができるバリアント抗体もしくは抗体断片、または本発明の第八の態様の方法により得られる、もしくは得ることができる薬学的に許容されるを提供する。
【０１０８】
換言すれば、本発明の第八の態様は、
(i)アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症関連疾患もしくは心血管疾患に対する、ヒトを含む哺乳動物の防止、予防および/もしくは治療;
(ii)アルツハイマー病の予防、防止および/もしくは治療;ならびに/または
(iii)ヒトを含む哺乳動物における代謝性疾患に対する免疫化もしくは予防、またはその防止もしくは治療
のための薬剤の製造における、本発明の第八の態様の方法により得られる、もしくは得ることができるバリアント抗体もしくは抗体断片の使用、または本発明の第八の態様の方法により得られる、もしくは得ることができる薬学的に許容されるの使用も提供する。
【０１０９】
従って、本発明の第八の態様により、
(i)アテローム性動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症関連疾患もしくは心血管疾患に対する、ヒトを含む哺乳動物の防止、予防および/もしくは治療;
(ii)アルツハイマー病に対する対象の免疫化ならびに予防、防止および/もしくは治療;ならびに/または
(iii)ヒトなどの哺乳動物における代謝性疾患に対する免疫化もしくは予防、またはその治療
のための方法であって、前記哺乳動物または対象に、本発明の第八の態様の方法により得られる、もしくは得ることができるバリアント抗体もしくは抗体断片を投与するステップ、または本発明の第八の態様の方法により得られる、もしくは得ることができる薬学的に許容されるの使用を含む、前記方法も提供される。
【０１１０】
本発明の第八の態様に従って対処および/または処置される代謝性疾患は、例えば、代謝症候群、インスリン耐性、耐糖能、高血糖、I型糖尿病、II型糖尿病、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、脂質異常症、および多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)からなる群から選択される状態であってもよい。
【０１１１】
ホスホリルコリン
ホスホリルコリン(PC)とは、式、
【０１１２】
【化１】
2014529398.tif 000003
【０１１３】
によるホスホリルコリンを意味する。
【０１１４】
ホスホリルコリンコンジュゲートとは、好ましくはスペーサを介して担体に連結されたホスホリルコリン部分を意味する。ホスホリルコリン部分を、担体に共有的または非共有的に連結することができる。好ましくは、ホスホリルコリン部分は、ホスフェート基を介して担体に連結される。
【０１１５】
担体は、例えば、タンパク質、炭水化物、ポリマー、ラテックスビーズ、またはコロイド金属であってもよい。
【０１１６】
ホスホリルコリンコンジュゲートは、例えば、タンパク質-PCコンジュゲート、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)-PCコンジュゲート、トランスフェリン-PCコンジュゲート、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)-PCコンジュゲートまたはウシ血清アルブミン(BSA)-PCコンジュゲートであってもよい。
【０１１７】
PCコンジュゲートがスペーサを介して担体に連結されたPCを含む場合、任意の好適なスペーサを用いることができる。スペーサの非限定例としては、カップリング剤(典型的には、二官能性化合物)、例えば、コハク酸およびグルタル酸のようなジカルボン酸、その対応するジアルデヒド、ジアミン、例えば、1,6-ジアミノヘキサン、二置換フェノール、例えば、p-アミノ-フェノール、p-ジアゾ-フェノール、p-フェニレンジアミン、p-ベンゾキノンなどが挙げられる。
【０１１８】
心血管疾患
用語「心血管疾患」とは、限定されるものではないが、アテローム性動脈硬化症、急性冠症候群、急性心筋梗塞、心筋梗塞(心臓発作)、安定および不安定狭心症、動脈瘤、冠動脈疾患(CAD)、虚血性心疾患、虚血心筋、心臓死および突然心臓死、心筋症、鬱血性心不全、心不全、狭窄、末梢動脈疾患(PAD)、間欠性跛行、重症虚血肢、および発作を含むことが意図される。
【０１１９】
ホスホリルコリンおよびホスホリルコリンコンジュゲートに対する反応性を有する抗体を用いる心血管疾患の治療または防止は、例えば、WO 2005/100405およびUS 2007-0286868(両文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる)で考察されている。
【０１２０】
アルツハイマー病
本発明によれば、第一の態様による抗体または抗体断片を用いて、それを必要とするか、またはそのリスクにある個体におけるアルツハイマー病を処置または防止することができる。
【０１２１】
WO 2010/003602および米国特許出願第61/078677号は、ホスホリルコリンおよびホスホリルコリンコンジュゲートに対する反応性を有する抗体を用いるアルツハイマー病の治療または防止を記載しており、両文献の内容は、第一の態様による抗体または抗体断片を用いてアルツハイマー病を処置または防止することができる方法のさらなる開示として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２２】
代謝性疾患
用語「代謝性疾患」は、限定されるものではないが、代謝症候群X、インスリン耐性(IRS)、耐糖能、高血糖、I型糖尿病、II型糖尿病、高脂血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、脂質異常症、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)および関連する疾患を含むことが意図される。
【０１２３】
ホスホリルコリンおよびホスホリルコリンコンジュゲートに対する反応性を有する抗体を用いて処置される代謝性疾患のさらなる考察は、WO 2012/010291で考察されており、その内容はまた、第一の態様による抗体または抗体断片を用いて代謝性疾患を処置または防止することができる方法のさらなる開示として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
アミノ酸配列同一性
2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、以下のように決定される。第一に、アミノ酸配列を、例えば、BLASTNバージョン2.0.14およびBLASTPバージョン2.0.14を含む独立型のBLASTZからのBLAST 2 Sequences(Bl2seq)プログラムを用いて配列番号1と比較する。この独立型のBLASTZを、ncbi.nlm.nih.gov.のU.S.government's National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトから取得することができる。Bl2seqプログラムを用いる方法を説明する指示書を、BLASTZに付属するリードミーファイルに見出すことができる。Bl2seqは、BLASTPアルゴリズムを用いて2つのアミノ酸配列間の比較を実施する。2つのアミノ酸配列を比較するために、Bl2seqのオプションは以下のように設定される:-iは、比較しようとする第一のアミノ酸配列を含むファイルに設定される(例えば、C:\seq1.txt); -jは、比較しようとする第二のアミノ酸配列を含むファイルに設定される(例えば、C:\seq2.txt);-pは、blastpに設定される;-Oは、任意の所望のファイル名(例えば、C:\output.txt)に設定される;および他の全てのオプションはそのデフォルト設定のままにされる。例えば、以下のコマンドを用いて、2つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを生成することができる:C:\Bl2seq-i c:\seq1.txt-j c:\seq2.txt-p blastp -o c:\output.txt。2つの比較された配列が相同性を有する場合、指定の出力ファイルは、整列された配列として相同性の領域を提供する。2つの比較された配列が相同性を有さない場合、指定の出力ファイルは、整列された配列を提供しない。一度整列されたら、両方の配列中で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が提示される位置の数を計数することにより、一致数を決定する。
【０１２５】
同一性パーセントは、一致数を、同定された配列中に記載される配列の長さで除算した後、得られた値に100を乗算することにより決定される。例えば、配列を配列番号Aに記載される配列と比較し(配列番号Aに記載される配列の長さは10である)、一致数が9である場合、その配列は配列番号Aに記載される配列に対する90%の同一性パーセント(すなわち、9÷10*100=90)を有する。
【０１２６】
抗体
本発明の文脈において本明細書で呼ばれる用語「抗体または抗体断片」は全抗体を含み、任意の抗原結合断片はその「抗原結合領域」または単一鎖と呼ばれる。
【０１２７】
「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも2つの重鎖(H)および2つの軽鎖(L)を含むタンパク質、またはその抗原結合部分を指してもよい。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと省略される)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと省略される)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLを含む。
【０１２８】
VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。それぞれのVHは典型的には、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に向かって整列された、3つのCDRおよび4つのFRを含む:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。同様に、それぞれのVLは、典型的には、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に向かって整列された、3つのCDRおよび4つのFRを含む:FR5、CDR4、FR6、CDR5、FR7、CDR6、FR8。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、宿主組織または免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(C1q)などの因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【０１２９】
本明細書で用いられる用語「抗原結合領域」とは、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能を、完全長抗体の断片により実施することができることが示されている。抗体の用語「抗原結合領域」内に包含される結合断片の例としては、
(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価断片であるFab断片;
(ii)ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された2つのFab断片を含む二価断片であるF(ab')2断片;
(iii)本質的にヒンジ領域の一部を含むFabである、Fab'断片;
(iv)VHおよびCH1ドメインからなるFd断片;
(v)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFv断片;
(vi)VHドメインからなるdAb断片;
(vii)単離された相補性決定領域(CDR);ならびに
(viii)1つの可変ドメインと2つの定常ドメインとを含む重鎖可変領域であるナノボディ
が挙げられる。
【０１３０】
さらに、Fv断片の2つのドメイン、VLおよびVHは別々の遺伝子によりコードされるが、それらは、VLおよびVH領域が対形成して一価分子(一本鎖Fv(scFv)として知られる)を形成する単一のタンパク質として作製することができるようにする合成リンカーにより、組換え方法を用いて連結することができる。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の用語「抗原結合部分」内に包含されることが意図される。
【０１３１】
ダイアボディは、ペプチドリンカーにより接続された同じポリペプチド鎖上で軽鎖可変ドメイン(VL)に接続された重鎖(VH)可変ドメイン(VH-VL)をそれぞれ含む2つのポリペプチドからなる。これらの抗体断片は、当業者には公知の従来の技術を用いて得られ、その断片は無傷の抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
【０１３２】
本明細書で用いられる「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される(例えば、ホスホリルコリンに特異的に結合する単離された抗体は、ホスホリルコリン以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。さらに、単離された抗体は、他の細胞材料および/または化学物質を実質的に含まないものであってよい。
【０１３３】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、単一の結合特異性および特定のエピトープに対する親和性を示す。
【０１３４】
用語「ヒト化抗体」とは、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を指すことが意図される。さらなるフレームワーク領域改変を、ヒトフレームワーク配列内で作製することができる。
【０１３５】
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列がある種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を指すことが意図される。
【０１３６】
医薬組成物
本発明による医薬組成物は、本発明による結合タンパク質と共に、薬学的に許容される担体および/または賦形剤を含んでもよく、これは典型的には、意図される投与経路および標準的な製薬実務に関して選択される。組成物は、即時、遅延または制御放出適用の形態にあってもよい。好ましくは、製剤は、活性成分の日用量もしくは単位、日分割用量またはその適切な画分を含有する単位剤形である。
【０１３７】
本発明による医薬組成物は、非経口、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、脳室内、もしくは皮下投与を意図し、かくして、それにとって好適な様式で製剤化してもよいか、またはしなくてもよく、またはそれらを注入技術により投与してもよい。それらは、他の物質、例えば、溶液を血液または脳脊髄液(CSF)と等張性にするための十分な塩もしくはグルコースを含有してもよい滅菌水性溶液の形態で最良に用いることができる。水性溶液は、必要に応じて、好適に緩衝化することができる(好ましくは、3〜9のpH)。滅菌条件下での好適な医薬製剤の調製は、当業者には周知の標準的な製薬技術により容易に達成される。
【０１３８】
そのような製剤は、酸化防止剤、バッファー、静菌剤および製剤を意図されるレシピエントの血液またはCSFと等張性にする溶質を含んでもよい水性および非水性滅菌注入溶液;ならびに懸濁剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性滅菌懸濁液を含んでもよい。製剤を、単回用量または複数回用量容器、例えば、密閉されたアンプルおよびバイアル中に提供し、使用の直前に、滅菌液体担体、例えば、注射用の水の添加のみを必要とする凍結-乾燥(凍結乾燥)状態で保存することができる。即興の注射溶液および懸濁液を、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【０１３９】
日用量レベルに基づく、ヒト患者などの患者への投与のための本発明による抗体または抗体断片の治療上有効量は、単回または分割用量で投与される、成人1人あたり0.01〜1000mgの抗体または抗体断片(例えば、患者体重1kgあたり約0.001〜20mg、例えば、0.01〜10mg/kg、例えば、0.1mg/kgを超える、および20、10、5、4、3または2mg/kg、例えば、約1mg/kg)であってもよい。
【０１４０】
医師であれば、任意のイベントにおいて、任意の個々の患者にとって最も好適である実際の用量を決定することができ、それは特定の患者の年齢、体重および応答に応じて変化する。上記用量は平均的な事例の例である。勿論、より高いか、またはより低い用量範囲が価値がある個々の例が存在してもよく、そのようなものは本発明の範囲内にある。
【０１４１】
(実施例)
以下の実施例は、本発明の様々な態様をさらに例示するために含まれる。当業者であれば、以下の実施例に開示される技術が、本発明の実施において良好に機能することが本発明者によって発見された技術および/または組成物であり、かくして、その実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることを理解すべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を為すことができることを理解すべきであり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様の、または類似する結果を依然として得るべきである。
【０１４２】
ファージディスプレイ抗体ライブラリーのスクリーニング
PCに結合し、oxLDLまたは心血管疾患におけるアポトーシス内皮細胞上に曝露されるようになるPCの前炎症活性を中和するヒト抗体を同定するためのファージディスプレイ選択およびスクリーニングキャンペーンを実施した。
【０１４３】
抗PC抗体の選択は、ウシ血清アルブミン(BSA)にコンジュゲートしたPCを用いて行い、フェリチンにコンジュゲートしたPCとの間で周回した。
【０１４４】
ファージディスプレイ選択の出力を、ELISAによるPC-BSAへの結合について個々のファージとしてスクリーニングし、ヒットをDNA配列決定して、ユニークな抗体の正確な数を同定した;それらを全てIgGに組換え的に変換させた。まとめると、2つの異なるファージディスプレイライブラリー上での選択を実施した後、本発明者らは41個の完全ヒトIgGを同定および生成した。これらの抗体を、ELISAにより合計10,660個の異なるファージクローンをスクリーニングした後に同定したところ、1,511個のELISA陽性ヒットがあった。
【０１４５】
ELISAヒットを、固定された標的(すなわち、PC-BSA)上にシグナルを有するものと定義し、これはバックグラウンドシグナル(ストレプトアビジン被覆プレート)よりも少なくとも3倍高かった。
【０１４６】
1,511個のELISA陽性物を配列決定し、抗体をファージ上に展示されたFab断片から完全ヒトIgGに変換した後、第一のファージミドライブラリーから26個および第二のファージライブラリーから30個の、PCに結合する56個の異なる抗体配列が回収された。
【０１４７】
IgG再初期化、発現および精製
ここで、本発明者らは、ファージ上に展示されたFabから完全長IgGに組換え的に再初期化した後の56個の抗体のうち40個の回収の結果を記載する。
【０１４８】
それぞれのIgGのDNAを調製し、ヒト腎臓293T細胞中にトランスフェクトして、10日目に培地を収穫した後、IgGを一過的に生成させた。in vitro試験のために用いたIgGを、プロテインA Sepharose(MabSelect)を用いて精製し、PBSにバッファー交換した。
【０１４９】
in vivo試験のために意図されたIgGをプロテインA Sepharose、次いで勾配溶出を用いる陽イオン交換(Poros HS)により精製した。in vivo試験のために意図されたIgG抗体を、抗体製剤バッファー(0.1Mクエン酸-リン酸、50mM NaCl、0.01%Tween-80、2%トレハロース、pH6.0)にバッファー交換した。抗体濃度を、280nmでの吸光度(1mg/mL = 1.4 O.D.)により精製された試料上で決定した。
【０１５０】
in vitroアッセイ
40個のIgGを一連のin vitro試験において試験して、所望の特性を有する抗体を同定した。Table 1(表2)は、完全ヒトIgG抗ホスホリルコリン抗体の選択のための結合特性をまとめたものである。
【０１５１】
Table 1(表2)中の第2列(A列)は、96穴プレート表面上に固定されたPC-BSAに添加されたわずかに15.6ng/mLのIgGを用いて得られたELISAシグナルを示す。1より大きいELISAシグナルを有する抗体は、より高い親和性の抗体であると予想される。
【０１５２】
Table 1(表2)中の第3列(B列)は、バイオセンサチップ上に共有的に固定されたアミノフェニルホスホリルコリン上に抗体を注入し、結合をBiacore 3000装置を用いる表面プラズモン共鳴により検出した場合に得られたシグナルを示す。Biacoreシグナルが高くなるほど、より多くの結合が観察された。
【０１５３】
Table 1(表2)中の第4列(C列)は、BSAまたはバイオセンサチップにホスホリルコリンを共有カップリングさせるために用いられるリンカーである、共有結合によって固定されたアミノフェノールへの結合について試験することにより、ホスホリルコリンに対する抗体の特異性を決定する試験の結果を示す。いくつかの抗体はリンカー分子に、アミノフェニルホスホリルコリンと同様に、またはそれより良好に結合する。これらの抗体は、有効な治療的抗ホスホリルコリン抗体である可能性は低い。
【０１５４】
Table 1(表2)中の第5列(D列)は、心血管炎症における初期のイベントであり、泡沫細胞の形成を誘導するマクロファージによるoxLDLの取込みを阻害する抗体の能力を試験する結果をまとめたものである。マクロファージの取込みを、80μg/mLの試験抗体の存在下または非存在下で蛍光修飾されたoxLDLを用いるフローサイトメトリーによりモニタリングした。各実験において、100μg/mLの親和性精製されたIgM抗PCポリクローナル抗体を、陽性対照として用いた。蛍光によりモニタリングした、試験モノクローナル抗体の存在下で取り込まれたoxLDLの量を、ポリクローナル抗体の存在下で観察された蛍光で除算した後、100を乗算した。かくして、100未満の値は、80μg/mLの濃度の抗体が、100μg/mLの濃度のヒト血清から抽出されたポリクローナル抗PCよりも、oxLDL取込みの阻害においてより有効であったことを示す。100を超える値は同様に、抗体がポリクローナル抗PCよりも効果がなかったことを示す。
【０１５５】
いくつかの抗体が、ポリクローナル抗PC対照と同様に、またはそれより良好に取込みを阻害することが観察された。さらに、いくつかの抗体が、これらの抗体をリード選択から排除する特性である、oxLDLのマクロファージによる取込みを刺激することが観察された。
【０１５６】
Table 1(表2)中の最終列(E列)は、oxLDLまたは天然のLDLを含有する96穴プレートのウェルにIgGを添加することにより得られたELISAデータを示す。oxLDLへの結合について観察されたELISAシグナルの比を、LDLについて観察されたもので除算したものを、それぞれの試験抗体についてTable 1(表2)に列挙する。特定の抗体がLDLと比較してoxLDLの良好な結合剤であることが明らかである。
【０１５７】
【表２】
2014529398.tif 000004
【０１５８】
a)マクロファージによるoxLDLの取込み:Dil標識(1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンペルコレート)Cu酸化LDL(oxLDL、Intracel Corp、US)の取込みを、ヒトTHP-1単球(ATCC、US)に由来するマクロファージ中で調査した。RPMIおよび10%FCS中、100nM PMA(Sigma-Aldrich)と共に24hインキュベートすることにより分化を誘導した後、培地を交換し、細胞をさらに48時間放置した。次いで、細胞を、示された抗体と共に37℃で50〜60minインキュベートした。その後、20μg/mlのoxLDLを添加し、インキュベーションを5時間継続した。インキュベーション期間の終わりに、細胞を氷冷PBS/0.2%BSAで2回洗浄し、PBSで1回洗浄した。細胞を、2%PFAを含有するPBS中に収穫した。データの獲得および分析のために、Cell Questソフトウェアを含むFACS Caliburを用いた。各試料につき、最少で10,000個の細胞を分析した。
【０１５９】
b)oxLDL ELISA:hLDL(Kalen Biochemical #770200-4)、oxLDL(Kalen Biochemical #770252-7)(これらのデータは示されない)を、ELISAプレート(Immulon 2HB)上、4℃で一晩、10μg/mlの濃度および100μl/ウェルの容量で被覆した。プレートを、室温で2時間、1%BSA溶液(300μl/ウェル)で遮断した。洗浄後、プレートを室温で1時間、示された抗体(100μl/ウェル;25〜100nM)と共にインキュベートした。1:5000希釈率でAPコンジュゲート化ヤギ抗ヒト二次抗体(ThermoScientific #31316)を、100μl/ウェルで洗浄したプレートに添加し、室温で1時間インキュベートした。検出試薬(ThermoScientific #37621)を添加し(100μl/ウェル)、プレートを30℃の温度で405nmの動的モードですぐに読み取った。結果を、ODoxLDL/ODLDLとして示す。
【０１６０】
SPRによるPCに対する抗PC IgGの親和性の分析
Biacore表面プラズモン共鳴(SPR)バイオセンサを用いて、PCへの結合についてIgGをスクリーニングした。アミノフェニルホスホリルコリン(Biosearch Technologies)を、遊離アミノ基を介して、120RUの密度でCM5チップの1つのフローセルにカップリングさせた。アミノフェノールリンカーを、約120RUの密度で同じCM5チップの別のフローセルにカップリングさせた。PC-KLHおよびPC-BSAも、CM5チップの別々のフローセルにカップリングさせた。
【０１６１】
異なる状況で固定されたPCを有するこれらの表面を用いて、抗体を50μL/minで100nMで注入し、結合センサーグラムを取得した。50μL/minで表面上に異なる濃度の抗体を流動させることにより、X9-C01の親和性を調査した。この固定された抗原に対して、抗体は速い結合速度および速い解離速度を示し、本発明者らは動的センサーグラムから信頼できるkonおよびkoff見積もり値を得ることができなかった。
【０１６２】
注入の終わり近くでそれぞれの抗体濃度について観察されたシグナルを抗体濃度に対してプロットし、データを標準双曲線平衡結合式に適合させた(図1)。X9-C01の試験した調製物は両方とも、約300nMの見かけのKd値で同様に表面に結合した(図1)。この表面上で抗体について観察された見かけのKd値は、より多くの生理学的基質上で観察される親和性を表しても、または表さなくてもよい。
【０１６３】
精製された抗PC IgGのELISAスクリーニング
精製されたIgGも、PC-BSAを用いるELISAを用いてPCへの結合についてスクリーニングした。このデータを適合させて、EC50見積もり値を提供した(図2)。
【０１６４】
単球からのoxLDL誘導性MCP-1放出の阻害
いくつかの抗体を、oxLDLによる刺激に応答する単球からのケモカインMCP-1の放出を遮断するその能力について試験した。Table 2(表3)に示されるように、X9-C01は、oxLDL誘導性MCP-1放出の遮断において非常に有効であった。この抗体は、nM範囲のIC50でMCP-1放出を強力に阻害した。
【０１６５】
MCP-1は、アテローム性動脈硬化病変部位で白血球の流入を促進する強力な前炎症ケモカインである(ReapeおよびGroot、1999)。陰性対照としての対照IgG抗ストレプトアビジンA2は、単球からのoxLDL誘導性MCP-1放出の阻害を示さなかった(データは示さない)。
【０１６６】
【表３】
2014529398.tif 000005
【０１６７】
単球をヒト血液から単離し、10pM〜40nMの抗PC IgGの存在下または非存在下で2μg/mLの銅酸化oxLDLで刺激した。細胞培地中のMCP-1レベルを、市販のMCP-1特異的ELISAキットを用いて定量した。
【０１６８】
in vivoアッセイ
ここで、本発明者らは、好ましいin vitro結合特性とin vitroアッセイにおける機能性との組合せに基づいてさらなる試験のために選択された抗体M4-G2、M73-G03およびX9-C01の冠動脈炎症のin vivoでのさらなる試験に関して報告する。
【０１６９】
このマウスモデルは、露出した大腿動脈の周囲に拘束カフを配置することにより誘導された血管損傷に応答する内皮下組織(すなわち、中膜(media))への炎症細胞流入を測定した(図3)。X9-C01は内皮下層への白血球流入を減少させたことが図3から明らかである。対照的に、およびそれらの好ましいin vitro結合特性およびin vitroアッセイにおける機能性にも拘らず、M4-G2またはM73-G03はいずれも、対照抗体と比較していかなる顕著な減少も示さなかった(抗ストレプトアビジンA2 IgGを「HuIgG1 a-A2」と呼ぶ)。
【０１７０】
M4-G2およびM73-G03と比較した、このアッセイにおけるX9-C01の非常に異なる効果は、予測することができなかったものであり、本発明者らにとって驚くべきものであった。これは、抗PC抗体のin vivoでの効果が陽性のin vitroデータから予測可能ではないことを示している。
【０１７１】
結果として、X9-C01を、大腿動脈の周囲にカフを配置することにより損傷を再度誘導するが、3日間の代わりに14日間進行させる、マウスにおける血管再狭窄モデルにおいて試験した。次いで、罹患した動脈中の血管新生内膜(neotima)の肥厚として観察された狭窄の量を、組織化学により分析した(図4)。図4から、X9-C01が、カフ誘導性血管損傷後の血管壁肥厚を有意に阻害したことが明らかである。これはさらに、X9-C01がin vivoで非常に有効であることを示している。
【０１７２】
生殖細胞系列および安定性変異体の構築
X9-C01のアミノ酸配列分析により、潜在的な免疫原性を低下させ、抗体の発現および精製中に起こり得るアミノ酸修飾の可能性を回避することを意図して構築するためのアミノ酸置換が同定された。
【０１７３】
以下の表は、Kabatデータベースを用いる、X9-C01抗体のアミノ酸配列と、その最も近縁の生殖細胞系列抗体配列とのアラインメントを示す。また、表中で強調されているのは、潜在的な脱アミド化部位を除去する変異体に加えて、抗体を生殖細胞系列により近いものにするために抗体中で作製されたアミノ酸置換であり、その全てのメチオニンは製造性に関する疑念を提起し得る(いわゆる「安定性変異体」)。
【０１７４】
X9-C01の変異体
X19-E01変異体の配列は、それがHV-CDR3中にMからLへの安定性変異を有すること以外は野生型X9-C01と同じである。
【０１７５】
X19-E03の配列は、HV-CDR3中でのMからLへの安定性変異に加えて、VH3-23、JH4重鎖およびVL1-1g、JL2軽鎖生殖細胞系列配列に関して生殖細胞系列化される。
【０１７６】
【表４】
2014529398.tif 000006
【０１７７】
【表５】
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【０１７８】
疑いを避けるために、本出願内の配列の提示物間の任意の故意でない不一致の事象において、Table 3(表4)およびTalbe 4(表5)においてVHおよびVLドメインについて提供される配列ならびに様々なCDR配列が、最終的な配列である。
【０１７９】
X9-C01の変異体のPC結合
構築されたX9-C01の変異体のPC結合を、ELISAにより評価した(図5)。X9-C01中でのHv-CDR3のメチオニンのロイシンへの置換は、PC結合に有意に影響しなかった(図5においてX9-C01とX19-E01とを比較されたい)。全ての軽鎖生殖細胞系列置換が親和性を低下させた(図5においてX9-C01とX19-E03とを比較されたい)。
【０１８０】
以下の参考文献を、例示的な手法または本願明細書で記載されるものを補う他の詳細なものを提供する限りにおいて、本願明細書に参照として具体的に組み込む。
【０１８１】
(参考文献)
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【図１】
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【図２】
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【図４Ａ】
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【図５】
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【図３】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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