(57)【要約】インビボ及びインビトロにおけるＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴＨ１７）の生成を増加させる方法、並びに例えば感染症及び癌等の、免疫反応の誘導又は増強により利益を得る疾患を治療するためのＴＨ１７細胞に富む集団。【選択図】図１Ｇ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞の初期集団を提供する段階と、
該細胞集団を、６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）を含む十分な量の組成物と接触させる段階と、
任意で集団中のＴＨ１７細胞の存在及び／又は数を評価する段階と
を含む、Ｔ細胞の初期集団からＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴＨ１７）に富む集団を調製する方法であって、
前記方法により集団中の制御性ＴＨ１７細胞の数が増加する、方法。
【請求項２】
Ｔ細胞の初期集団がナイーブＴ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ６２リガンド＋Ｔ細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＨ１７媒介性免疫反応の増強により利益を得る障害に罹患している対象に、前記障害の症状を改善する又は寛解させるのに十分な量のＴＨ１７細胞を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｔ細胞集団がインビトロで存在する方法であって、有効量のインターロイキン−６（ＩＬ−６）及び形質転換成長因子（ＴＧＦ）−βの一方又は両方を細胞と接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対象に投与するための富化集団を調製することを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＴＨ１７媒介性免疫反応の増強により利益を得る疾患に罹患している対象を治療する方法であって、
免疫を増加させる治療を必要としている対象を同定する段階と、
治療有効量の６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）を含む組成物を対象に投与する段階と
を含み、
それにより対象を治療する方法。
【請求項７】
対象が、ウイルス、細菌、真菌、及び原生動物から成る群から選択される病原体に感染している、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
対象が癌に罹患している、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＦＩＣＺ又はｂＮＦが生体適合性ナノ粒子に結合している、請求項１または６に記載の方法。
【請求項１０】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する抗体を細胞と接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が生体適合性ナノ粒子に結合している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する抗体を投与することを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
抗体が生体適合性ナノ粒子に結合している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＦＩＣＺ又はｂＮＦと抗体とが同じナノ粒子上に共存している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
対象の疾患に関連する抗原を投与することを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
抗原が腫瘍関連抗原である、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
抗原が、ウイルス、細菌、真菌、及び原生動物から成る群から選択される病原体に関連している、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、２００８年３月２１日出願の米国仮特許出願第６１／０７０，４１０号及び２００８年１１月１０日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３０１６号の利益を主張し、これらの全文を参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
研究又は開発に対する連邦の支援
本発明は、国立衛生研究所により与えられた助成金番号ＡＩ４３５８０１、ＡＩ０４３４５８、及びＮＳ３８０３７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、インビボ及びインビトロにおけるＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴＨ１７）の数を増加させる及び／又は活性を高めることにより、対象の免疫反応を増強するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫系の自己反応性成分を支配する。Ｔｒｅｇの発生は、ＩＬ−１７を産生する炎症促進性Ｔ細胞（ＴＨ１７）の発生と相互に関連している。ＴＨ１７細胞は、転写因子レチノイン酸関連オーファン受容体γｔ（ＲＯＲγｔ）を発現し（Ｉｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：３４５−５０，２００７（非特許文献１））、これは細胞外病原体の支配に関与し、ヒト及び実験的自己免疫において重要な役割を果たしている（Ｂｅｔｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：３４５−３５０，２００７（非特許文献２）；Ｏ’Ｑｕｉｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｍｅｒ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９９：１１５−１６３（２００８）（非特許文献３））。
【０００５】
両方の細胞型は種々の免疫学的状態に寄与していると考えられるが、これら細胞型の生成及び／又は活性化を導く生理学的経路又は機構についてはほとんど知られていない。例えばＴＧＦβ１はＴｒｅｇの分化を誘導する（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８：１８７５−１８８６，２００３（非特許文献４））。対照的に、ＴＧＦβ１はＩＬ−６（Ｖｅｌｄｈｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２４：１７９−１８９，２００６（非特許文献５））又はＩＬ−２１（Ｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８：４８４−７，２００７（非特許文献６））と共にＴＨ１７細胞を分化させる。
【０００６】
病原体に対する免疫反応においてＴｒｅｇ及びＴＨ１７が中心的役割を果たしているため、例えばＴＨ１７細胞の生成（例えば細胞のＴＨ１７細胞への分化）を促進するために、又はＴＨ１７細胞の活性増加を促進するために、関与する経路の特徴付け及びこれら経路を調節することができる化合物の同定が、例えば感染症及び癌等の治療にとって重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｉｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：３４５−５０，２００７
【非特許文献２】Ｂｅｔｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：３４５−３５０，２００７
【非特許文献３】Ｏ’Ｑｕｉｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｍｅｒ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９９：１１５−１６３（２００８）
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８：１８７５−１８８６，２００３
【非特許文献５】Ｖｅｌｄｈｏｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２４：１７９−１８９，２００６
【非特許文献６】Ｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４８：４８４−７，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、少なくとも部分的に、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）の発現及び／又は活性を調節する（例えば、増加させる又は減少させる）ことができる化合物が、免疫反応を増強するために有用な標的を提供するという発見に基づいている。２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）によるＡＨＲの活性化は、ＴＧＦ−ｂ１−依存性機構により実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を抑制するＴｒｅｇ細胞を誘導し、一方６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）によるＡＨＲの活性化は、Ｔｒｅｇ細胞分化に干渉し、ＴＨ１７細胞の分化を促進し、ＥＡＥを悪化させた。したがって、ＡＨＲはリガンド特異的方式でＴｒｅｇ及びＴＨ１７細胞の分化を制御している。それ故本発明は、特に、不完全な免疫反応（例えば免疫反応の非存在又は不十分な免疫反応）により惹起される疾患を予防又は治療する組成物及び方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの態様では、本発明はＴ細胞の集団におけるＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴＨ１７）の数を増加させる又は活性を高める方法を特徴とする。この方法は、任意的に生体適合性ナノ粒子に結合している、Ｆｏｘｐ３の発現を低下させるＡＨＲリガンド、例えば６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）を含む十分な量の組成物を細胞の集団と接触させることと、任意的に集団中のＩＬ−１７発現細胞の存在及び／又は数を評価することとを含む。この方法により、ＴＨ１７細胞の数が増加する及び／又は活性が高まる。
【００１０】
幾つかの実施形態では、Ｔ細胞の初期集団はナイーブＴ細胞又はＣＤ４＋ＣＤ６２リガンド＋Ｔ細胞の一方又は両方を含む。Ｔ細胞の集団は、単離されていてもよく（すなわちインビトロ）、生存哺乳類対象、例えば腫瘍に罹患している、感染症に罹患している、又は免疫抑制されている対象内に存在してもよい。細胞集団はまた、例えば小児又は高齢者においてアジュバントとして投与されて、ワクチンに対する免疫反応を促進することもできる。具体的には、本方法は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した結果として免疫抑制されている対象、ＴＨ１７細胞の欠損に関連することが多い状態において使用することができる。Ｔ細胞が生存対象内に存在する場合の実施形態では、この方法は１種以上のリガンドを経口、粘膜、又は静脈内投与することを含んでもよい。
【００１１】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて生成又は活性化されるＴＨ１７細胞は、腫瘍若しくは感染症に罹患している、又は免疫抑制されている対象に、障害の症状を改善する又は寛解させるのに十分な量投与される。
【００１２】
また、ＴＨ１７細胞の生成を増加させる又は活性を高める候補化合物を同定する方法も本明細書に提供される。この方法は、哺乳類のＦｏｘｐ３プロモータ配列中にアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）に対する結合配列を含むレポーターコンストラクトを発現する細胞を提供する段階であって、前記結合配列が、例えばルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、及びこれらの変異体から成る群から選択されるレポーター遺伝子等のレポーター遺伝子に機能的に連結している、段階と；該細胞を試験化合物と接触させる段階と；レポーター遺伝子の発現に対する該試験化合物の効果を評価する段階とを含む。レポーター遺伝子の発現を増加させる又は減少させる試験化合物は、ＴＨ１７細胞の生成を調節する候補化合物である。
【００１３】
前記方法は、Ｆｏｘｐ３の発現を低下させるＡＨＲリガンド、例えばＦＩＣＺ又はｂＮＦの存在下でレポーターコンストラクトの発現を測定する段階と；候補化合物が、ＡＨＲに対する結合について既知の化合物と競合するかどうかを決定する段階と；候補化合物が既知の化合物と競合的にＡＨＲに結合する場合、その候補化合物を選択する段階と、を任意的に含んでもよい。
【００１４】
更なる態様では、本発明は、ＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴＨ１７）の生成を調節する候補化合物を同定する方法を提供する。これらの方法は、レポーター遺伝子に機能的に連結しているＡＨＲに対する結合配列を含むレポーターコンストラクトを発現する細胞を提供する段階を含む。次いで細胞を試験化合物と接触させ、レポーター遺伝子の発現に対する試験化合物の効果を評価する。レポーター遺伝子の発現を増加させる又は減少させる試験化合物は、ＴＨ１７細胞の生成を調節する候補化合物である。
【００１５】
別の態様では、本発明はＴＨ１７細胞の生成を調節する候補化合物を同定する方法を提供する。これらの方法は、例えば産卵３０分後の生存ゼブラフィッシュ、例えばゼブラフィッシュ胚を提供する段階と；例えばゼブラフィッシュが生活している水中に試験化合物を入れる、又は化合物を胚に微量注入することにより、ゼブラフィッシュを試験化合物と接触させる段階と；ゼブラフィッシュにおけるＦｏｘｐ３発現に対する試験化合物の効果を評価する段階とを含み、ゼブラフィッシュにおけるＦｏｘ−３発現を増加させる又は減少させる試験化合物がＴＨ１７細胞の生成を調節する候補化合物である。
【００１６】
更なる態様では、本発明は、Ｆｏｘｐ３遺伝子の発現、活性、又は発現及び活性の両方の増加を促進することができる転写因子リガンドを含む組成物を提供する。
【００１７】
更に別の態様では、本発明は、Ｔ細胞の集団におけるＴＨ１７細胞の数を増加させる方法を提供する。これらの方法は、Ｆｏｘｐ３の発現を低下させる１種以上のＡＨＲリガンド、例えば６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）と細胞を接触させることを含み、この方法により制御性ＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴＨ１７）の数が増加する及び／又は活性が高まる。
【００１８】
更なる態様では、本発明は、対象におけるＴＨ１７細胞の数を増加させる方法を提供する。これらの方法は、１種以上のＡＨＲリガンド、例えば６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）を、治療のために選択された対象に投与する段階を含み、この方法によりＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴＨ１７）の数が増加する及び／又は活性が高まる。
【００１９】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞の初期集団からＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴＨ１７）に富む集団を調製する方法を提供する。この方法は、Ｔ細胞の初期集団を提供する段階と、該細胞集団を、ＡＨＲリガンド、例えば６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）を含む十分な量の組成物と接触させる段階と、任意的に集団中のＴＨ１７細胞の存在及び／又は数を評価する段階とを含む。この方法により集団中の制御性ＴＨ１７細胞の数が増加する。
【００２０】
幾つかの実施形態では、Ｔ細胞の初期集団はナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４＋ＣＤ６２リガンド＋Ｔ細胞を含む。
【００２１】
幾つかの実施形態では、Ｔ細胞の集団はインビトロで存在し、前記方法は、有効量のインターロイキン−６（ＩＬ−６）及び形質転換成長因子（ＴＧＦ）−βの一方又は両方を細胞と接触させることを更に含む。
【００２２】
幾つかの実施形態では、前記方法は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する１種以上の抗体を細胞と接触させることを更に含む。幾つかの実施形態では、抗体は生体適合性ナノ粒子に結合している。抗体及びＡＨＲリガンドの両方がナノ粒子に結合している実施形態では、それらは同じナノ粒子上に存在してもよく、別個のナノ粒子上に存在してもよい。
【００２３】
幾つかの実施形態では、前記方法は、対象に投与するための富化集団を調製することを更に含む。幾つかの実施形態では、前記方法は、ＴＨ１７媒介性免疫反応の増強により利益を得る障害に罹患している対象に、前記障害の症状を改善する又は寛解させるのに十分な量のＴＨ１７細胞を投与することを更に含む。
【００２４】
別の態様では、本発明は、ＴＨ１７媒介性免疫反応の増強により利益を得る疾患、例えば腫瘍、又は例えばウイルス、真菌、細菌、若しくは原生動物の病原体への感染に罹患している対象を治療する方法を特徴とする。この方法は、例えば免疫反応の増加により利益を得る疾患に罹患していることに基づいて対象を選択する等の、免疫反応を増加させる治療を必要としている対象を同定する段階と；治療有効量のＡＨＲリガンド、例えば６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）を含む組成物を対象に投与する段階とを含み、それにより対象を治療する。
【００２５】
幾つかの実施形態では、対象は、ウイルス、細菌、真菌、及び原生動物から成る群から選択される病原体に感染している。幾つかの実施形態では、対象は癌に罹患している。
【００２６】
幾つかの実施形態では、ＦＩＣＺ又はｂＮＦは生体適合性ナノ粒子に結合している。
【００２７】
幾つかの実施形態では、前記方法は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する１種以上の抗体を対象に投与することを更に含む。幾つかの実施形態では、抗体は生体適合性ナノ粒子に結合している。抗体及びＡＨＲリガンドの両方がナノ粒子に結合している実施形態では、それらは同じナノ粒子上に存在してもよく、別個のナノ粒子上に存在してもよい。
【００２８】
幾つかの実施形態では、前記方法は、対象の疾患に関連する抗原、例えば腫瘍関連抗原、又は対象がどの病原体に感染しているかに応じてウイルス、細菌、真菌、及び原生動物から成る群から選択される病原体に関連している抗原を投与することを含む。
【００２９】
１つの態様では、本発明は、例えば生体適合性ナノ粒子に結合している、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）転写産物に特異的に結合して、Ｆｏｘｐ３の発現を低下させるリガンドを含む組成物を特徴とする。リガンドは、例えば６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）であってもよい。
【００３０】
幾つかの実施形態では、組成物はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する抗体を含む。抗体は、同じナノ粒子上に存在（すなわち結合）してもよく、（同じ又は異なる種類の）異なるナノ粒子に結合していてもよく、または溶液中に遊離していてもよい。
【００３１】
幾つかの実施形態では、組成物はまた、リガンドの分解阻害剤、例えばトラニルシプロミン等のモノアミンオキシダーゼ阻害剤を含む。阻害剤は、同じナノ粒子上に存在（すなわち結合）してもよく、（同じ又は異なる種類の）異なるナノ粒子に結合していてもよく、または溶液中に遊離していてもよい。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法及び組成物は、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）転写因子に特異的に結合し、Ｆｏｘｐ３の発現を低下させるリガンド、及び、例えばその分解阻害剤の使用を含み、それらは両方又は一方がナノ粒子に結合していてもよく、両方共ナノ粒子に結合していなくてもよい。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「治療」は、疾患又は障害の１種以上の症状を寛解させる、又はさもなければ有利に変化させる方法のいずれかを意味する。本明細書で使用するとき、特定の障害の症状の寛解は、永続的であろうと一時的であろうと、持続性であろうと一過性であろうと、本発明の組成物及び方法による治療に起因し得る、又はそれらに関連し得る、いかなる症状の軽減も指す。
【００３３】
本明細書で使用するとき「有効量」及び「治療に有効な」という用語は、意図する効果又は生理学的結果を惹起するために組成物の投与状況において有効である、一定期間利用される（急性又は慢性投与、及び断続的又は連続投与を含む）本明細書に記載される組成物の１種以上の量又は濃度を指す。
【００３４】
「対象」という用語は、本明細書全体を通して、本発明の方法に係る治療を提供する対象となる動物、ヒト又は非ヒト、げっ歯類又は非げっ歯類を記載するために用いられる。獣医学的及び非獣医学的応用が考えられる。この用語には、哺乳類、例えばヒト、他の霊長類、ブタ、マウス及びラット等のげっ歯類、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジ、及びヤギが含まれるが、これらに限定されない。典型的な対象としては、ヒト、家畜、並びにネコ及びイヌ等のペットが挙げられる。
【００３５】
本明細書で使用するとき、遺伝子という用語は単離又は精製遺伝子を指す。「単離」又は「精製」という用語は、核酸分子又は遺伝子に適用するとき、核酸分子の天然源中に存在する他の核酸分子を含む他の物質から分離された核酸分子を含む。ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子等の「単離」核酸分子は、組み換え技術により産生されるとき他の細胞物質若しくは培養培地を実質的に含まない可能性がある、又は化学合成されるとき化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まないことが可能である。
【００３６】
「単離」又は「精製」ポリペプチド、ペプチド、又はタンパク質は、タンパク質が由来する細胞又は組織源に由来する細胞物質又は他の夾雑タンパク質を実質的に含まず、又は化学合成されるとき化学前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まない。「実質的に含まない」とは、選択されたタンパク質の調製物が約３０乾燥重量％未満（例えば２０％、１０％、又は５％未満）の、非選択タンパク質又は化学前駆体を含むことを意味する。かかる非選択タンパク質はまた本明細書では「夾雑タンパク質」とも称される。単離治療用タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドが組み換えで産生されるとき、それは培養培地を実質的に含まない可能性がある、すなわち培養培地はタンパク質調製物の体積の約２０％未満（例えば約１０％又は５％未満）を表す。本発明は、少なくとも０．０１、０．１、１．０、及び１０ミリグラム（乾燥重量）の単離又は精製調製物を含む。
【００３７】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明で用いるための方法及び材料を本明細書に記載するが、当該技術分野で既知である他の好適な方法及び材料を用いてもよい。材料、方法、及び実施例は、例示目的のためだけのものであり、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、及び他の参考文献は、その全文を参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含み、本明細書が優先である。
【００３８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１Ａ〜１Ｉは、使用されるリガンドに依存して、Ｔｒｅｇ又はＴＨ１７のいずれかへの分化が誘導されるＡＨＲリガンドによるＴ細胞の処理を示す。図１Ａは、ＦＩＣＺの有りまたは無しでＴＧＦｂ１の存在下にてＣＤ３及びＣＤ２８に対する抗体により刺激することによる、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３：ＧＦＰ−Ｔ細胞のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３：ＧＦＰ＋Ｔｒｅｇへの変換を示す３組のＦＡＣＳプロットである。図１Ｂはそのデータを棒グラフ形式で表す。図１Ｃは、４日間インビトロでＴＨ１、ＴＨ２、又はＴＨ１７細胞に分化させたナイーブＴ細胞におけるＡＨＲ発現を示す棒グラフである（アクチン発現で正規化した３つ組の平均＋ｓ．ｄ．）。図１Ｄは、表に示すサイトカインと共に４日間ＴＨ１７細胞に分化させたナイーブＴ細胞におけるＡＨＲ発現を示す棒グラフである（アクチン発現で正規化した３つ組の平均＋ｓ．ｄ．）。図１Ｅは、ＴＧＦβ１及びＩＬ−６のみ、又はＦＩＣＺと組み合わせて４日間ＴＨ１７細胞に分化させたナイーブＴ細胞のＲＯＲγｔ発現を示す棒グラフである（アクチン発現で正規化した３つ組の平均＋ｓ．ｄ．）。図１Ｆは、４日間ＴＧＦβ１及びＩＬ−６のみ、又はＩＬ−２３及び／又はＦＩＣＺと組み合わせて分化させたＩＬ−１７＋Ｔ細胞の頻度を示す９組のＦＡＣＳプロットである。図１ＧはＩＬ−１７を示す棒グラフであり、図１Ｈは分化の４日後ＥＬＩＳＡにより測定したとき、１Ｅで調製された培養物の上清中のＩＬ−２１（左）及びＩＬ−２２（右）レベルを示す一対の棒グラフである。図１Ｉは、ＡＨＲ拮抗剤リスベラトロールによるＴＨ１７分化の阻害を示す棒グラフである。
【図２】図２Ａは、ＦＩＣＺ又は対照処置マウスにおけるＥＡＥ発達（平均ＥＡＥスコア＋ｓ．ｅ．ｍ．）を示す線グラフである。図２Ｂは、ＦＩＣＺ又は対照処置マウスから採取した脾細胞においてＭＯＧ３５−５５により誘発されたサイトカイン分泌（ｐｇ／ｍＬ）を示す１対の棒グラフである；左、ＩＦＮγ、右、ＩＬ−１７。図２Ｃ〜２Ｅは各々、ＦＩＣＺ又は対照処置マウス由来の脾細胞におけるＩＦＮγ（２Ｃ）、ＩＬ−１７（２Ｄ）、又はＦｏｘｐ３（２Ｅ）の頻度を示すＦＡＣＳプロット対である。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、ＦＩＣＺ（３Ａ）又はＦＩＣＺ＋ＨＢＳＡｇ（３Ｂ）で処置したＨＣＣ腫瘍モデルにおけるＡＦＰ濃度を示す棒グラフである。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、ＥＡＥのゼブラフィッシュモデルにおけるＣＤ３（４Ａ）、ＩＦＮγ（４Ｂ）、及びＩＬ−１７（４Ｃ）のレベル変化を示す棒グラフである。図４Ｄは、ゼブラフィッシュにおけるＩＬ−１７発現に対するＦｏｘｐ３特異的モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す棒グラフである。
【図５】図５は、ＡＨＲリガンド送達のための金ナノ粒子の概略図である。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは、ＡＨＲリガンドを含む金ナノ粒子の機能を示す。６Ａは、ＡＨＲリガンドＴＣＤＤ及びＦＩＣＺに結合しているナノ粒子による、ＡＨＲレポーター細胞株におけるルシフェラーゼ活性の活性化を示す棒グラフである。６Ｂは、構築されたナノ粒子の吸収スペクトルである。
【図７】図７は、ＡＨＲ−リガンドナノ粒子によるＥＡＥの調節を示す線グラフである。ＥＡＥはＢ６マウス（ｎ＝５）において誘導され、マウスは０日目から始めて毎週ナノ粒子で処置され、この動物はＥＡＥの徴候について追跡された。
【図８】図８は、ＡＨＲレポータールシフェラーゼコンストラクト、及び正規化の目的のためのＴＫ−Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼコンストラクトでトランスフェクトされた２９３細胞における蛍光を示す棒グラフである。細胞を様々な濃度のＡＨＲリガンドＴＣＤＤと共にインキュベートし、ＡＨＲレポーターの活性化を、ルシフェラーゼからの蛍光をモニタすることにより追跡した。
【図９】図９は、β−ナフトフラボン（ｂＮＦ）若しくはＦＩＣＺ（１００ｎＭ）の存在下又は非存在下にて、ＴＧＦ−β及びＩＬ−２１の存在下にて、インビトロにおいてＣＤ３及びＣＤ２８に対する抗体で活性化することによる、Ｔ細胞のＴｈ１７細胞への分化を示す棒グラフである。ＩＬ−１７産生はリアルタイムＰＣＲにより測定された。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
腫瘍及び病原体に対する炎症及び免疫反応におけるＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴＨ１７）の中心的役割が重要であるため、例えばＴＨ１７細胞の生成（例えば細胞のＴＨ１７細胞への分化）を促進するために、又はＴＨ１７細胞の活性増加を促進するために、経路の特徴付け及びこれら経路を調節することができる化合物の同定が、例えば感染症及び癌等の治療にとって重要である。
【００４１】
本発明は、特に、治療的免疫調節にとって有用な組成物及び方法を提供する。
【００４２】
したがって、本発明は、少なくとも部分的に、本明細書に記載される特定の高親和性リガンドによるＡｈＲの調節を用いて、インビトロ及びインビボでＴＨ１７細胞を調節する（例えば数及び／又は活性を増加させる又は減少させる）ことができるという発見に基づいている。興味深いことに、Ｔ等の他のＡＨＲ特異的リガンドも制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の分化を制御しているため（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３０１６号、及び２００７年１１月２０日出願の米国特許仮出願第６０／９８９，３０９号、両方共その全文を参照により本明細書に組み込まれる）、ＡＨＲは免疫に基づく治療法の有用な標的となる。
【００４３】
幾つかの実施形態では、本発明は、インビトロ及びインビボにおけるＴＨ１７分化（例えば生成）及び／又は活性の制御因子としての、リガンド活性化転写因子アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）の同定に基づく。また、ＴＨ１７細胞の分化及び／又は活性化を促進するのに有用なＡＨＲのリガンドについても本明細書に記載される。より具体的には、本明細書に提示されるデータは、Ｆｏｘｐ３の発現を低下させるＡＨＲ特異的リガンド、例えば６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）の使用が、ＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴＨ１７）の数及び／又は活性増加を促進することを示し、これは免疫反応が異常に低いことに関連する疾患若しくは障害、又は免疫反応の増強により利益を得る障害、例えば感染症又は癌の治療において、免疫反応を抑制するために有用である。幾つかの実施形態では、有効用量のリガンド、例えばＦＩＣＺ又はｂＮＦを静脈内又は経口投与してもよい。
【００４４】
本明細書に提示されるデータは、Ｆｏｘｐ３の発現を低下させるＡＨＲリガンド、例えば６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）の使用が、ＴＨ１７免疫調節細胞の数及び／又は活性増加を促進することを示し、これは免疫反応の非存在又は不十分な免疫反応により惹起される疾患又は障害（例えば癌及び感染症）の治療において、免疫反応を高める又は促進するのに有用である。
【００４５】
ＴＨ１７細胞の生成及び／又は活性を増加させる化合物
本明細書で記載する、Ｆｏｘｐ３の発現を低下させるＡＨＲリガンド、例えばＦＩＣＺ又はｂＮＦは、ＴＨ１７細胞の生成及び／又は活性を増加させるため、免疫反応を増強する方法において有用である。ＡＨＲに対してＦＩＣＺ又はｂＮＦと同じ作用を有する他の化合物を用いることもでき、ＡＨＲに結合する多数の他の化合物が知られており、簡単なアッセイを用いてそれらもＴＨ１７細胞の生成及び／又は活性を増加させるかどうかを決定することができる。
【００４６】
本明細書に記載される方法の幾つかの実施形態では、Ｆｏｘｐ３の発現を低下させるＡＨＲリガンド、例えば６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）を含む組成物は、インビボで対象に投与される、又はインビトロで細胞集団に接種される。幾つかの実施形態では、リガンドは生体適合性ナノ粒子に結合している。
【００４７】
幾つかの実施形態では、組成物はまた、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する抗体を含む。抗体は、同じナノ粒子上（すなわちナノ粒子に結合）に存在してもよく、（同じ又は異なる種類の）異なるナノ粒子に結合していてもよく、溶液中に遊離していてもよい。
【００４８】
幾つかの実施形態では、例えばリガンドがインビボで投与されるとき、組成物はまた、抗原特異的反応を誘導するために特定の抗原を含む。抗原は、例えば腫瘍又は病原体特異的抗原であってもよい。
【００４９】
ＡＨＲ
代表的なヒトＡＨＲｍＲＮＡ配列は当該技術分野で既知であり、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１６２１．３が挙げられ；そのタンパク質のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１６１２．１である。ＡＨＲの活性断片は、転写活性を有するＤＮＡ結合断片であり、少なくとも１つのＰＡＳ領域を含み、例えばＮＰ＿００１６１２．１のアミノ酸１２２〜２２４、又は２８２〜３８１である。ＡＨＲに結合する共通認識配列としては、配列ＴＮＧＣＧＴＧが挙げられる。
【００５０】
幾つかの実施形態では、アッセイは、ヒトＡＨＲ配列と少なくとも８０％同一である、例えば本明細書に記載されるヒト配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一である核酸又はポリペプチドの使用を含む。
【００５１】
２つの配列の同一性の割合を決定するために、最適な比較目的のために配列を整列させる（例えば、最適な整列のために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを入れてもよく、比較目的のために非相同配列を無視してもよい）。比較目的のために整列させるリファレンス配列の長さは、リファレンス配列の長さの少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１配列のある位置が第２配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドを共有しているとき、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性の割合は、２つの配列の最適な整列のために入れる必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、配列が共有している同一位置の数の関数である。
【００５２】
配列の比較及び２つのアミノ酸配列間の同一性の割合決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成できる。現在の方法では、２つの配列間の同一性の割合は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを用いて決定され、これはギャップペナルティ：１２、ギャップ伸長ペナルティ：４、及びフレームシフトギャップペナルティ：５を用いたＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリクスを用いるものである。
【００５３】
試験化合物
本明細書に記載される方法で使用するための試験化合物は限定されず、有機源の粗製物、又は部分的若しくは実質的に精製された抽出物、例えば植物（例えば草本）及び藻類抽出物、無機元素又は化合物、並びに部分的若しくは実質的に精製された又は合成化合物、例えば小分子、ポリペプチド、抗体、及びポリヌクレオチド、並びにこれらのライブラリを挙げることができる。
【００５４】
本明細書に記載される方法によりスクリーニングされ、本明細書においてＴＨ１７細胞のレベル及び／又は活性を増加させると決定された試験化合物は、免疫反応の増強により利益を得る障害、例えば癌又は感染症を治療するための候補化合物と見なすことができる。例えば癌又は感染症等のかかる障害のインビボモデルにおいてスクリーニングされ、障害、例えば障害の１種以上の症状に対して所望の効果を有すると決定された候補化合物は、候補治療剤と見なすことができる。候補治療剤は、一旦スクリーニングされ、臨床状況で検証されると、治療剤となる。候補治療剤及び治療剤は、任意的に最適化及び／又は誘導体化され、生理学的に許容できる賦形剤と共に配合されて、医薬組成物を形成することができる。
【００５５】
幾つかの実施形態では、試験化合物はＡＨＲに結合することが知られている。ＡＨＲ転写因子リガンドは、Ｄｅｎｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎａｇｙ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：３０９−３４，２００３及び本明細書に引用される参考文献に記載されており、これらは全て全文が本明細書に組み込まれる。他のかかる分子としては、平面状疎水性ＨＡＨ（ポリハロゲン化ジベンゾパラダイオキシン、ジベンゾフラン、及びビフェニル等）及びＰＡＨ（３−メチルコラントレン、ベンゾ（ａ）ピレン、ベンズアントラセン、及びベンゾフラボン等）、並びに関連化合物が挙げられる（Ｄｅｎｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｎａｇｙ，２００３、上掲）。Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．６５：２００−１０（２００２）には、他のリガンドを同定し、確認するために有用な高速スクリーニングについて記載されている。Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：８６１−６８（２００２）も参照。幾つかの実施形態では、本発明で有用なこれらリガンドは、ＦＩＣＺ又はｂＮＦと競合して結合するリガンドである。
【００５６】
治療化合物の同定方法
化合物がＴＨ１７細胞の生成及び／又は活性を増加させるかどうかを評価する多くの方法が当該技術分野で既知である。例えば、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法で有用な化合物はＡＨＲに結合する、例えばＡＨＲの結合についてＦＩＣＺ又はｂＮＦと競合し、ＴＨ１７細胞の生成及び／又は活性を増加させる。幾つかの実施形態では、好適な化合物はまた、ＴＨ１７細胞の分化に関連する転写因子であるＲＯＲγｔのレベルを増加させる。幾つかの実施形態では、好適な化合物はまた、ＩＬ−１７のレベルを増加させる。
【００５７】
結合を評価する方法は、当該技術分野で既知であり、例えばＧｏｏｄｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｋｕｇｅｌ，Ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ３０，２００７））；及びＯｄｅｌｌ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｈｉｍｏｎｔ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ；２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９８２））参照。ｍＲＮＡレベルを評価する方法は当該技術分野で周知であり、ノーザン分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、及びＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されない（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）参照）。タンパク質及びペプチドのレベルは、例えばウエスタン分析、免疫アッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション、又は細胞内染色／ＦＡＣＳ分析によりモニタできる（例えばＩｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：３４５−５０，２００７参照）。転写因子活性、例えばプロモータ結合性の変化及び／又は転写活性は、例えば電気泳動移動度シフト解析、ＤＮＡフットプリンティング、レポーター遺伝子アッセイ、又はセリン、スレオニン、若しくはチロシンリン酸化アッセイにより決定することができる。幾つかの実施形態では、発現、レベル、又は活性に対する試験化合物の効果は、細胞、細胞抽出物、共培養物、外植片、又は対象の耐糖能又はインスリン分泌の変化として観察される。幾つかの実施形態では、転写因子の発現、レベル、又は活性に対する試験化合物の効果は、耐糖能又はインスリン分泌の変化している、形質転換細胞、又は非ヒト動物、若しくは外植片、組織、又はそれらに由来する細胞において評価され、対照、例えば野性型動物、又は外植片、若しくはそれらに由来する細胞と比較することができる。
【００５８】
発現、レベル、又は活性に対する試験化合物の効果は、細胞、例えば培養哺乳類細胞、初代細胞、細胞溶解物、又は対象、例えばラット、マウス、若しくはウサギ等のげっ歯類等の非ヒト実験哺乳類、又は細胞、組織、若しくは器官外植片、例えば脾臓若しくは脾臓細胞において評価することができる。
【００５９】
幾つかの実施形態では、ＴＨ１７細胞の生成及び／又は活性を増加させる試験化合物の能力は、動物、例えば実験動物において更に評価される。これらの方法では、本明細書に記載されるインビトロ法により同定された化合物が、検証のために動物に投与される。ＴＨ１７細胞のレベルは、既知の方法を用いて決定することができる。或いは又は更に、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、又はＩＬ−２２のレベルはまた、当該技術分野で既知である例えばＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、又はＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて評価することもできる（例えばＯ’Ｑｕｉｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｍｅｒ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９９：１１５−１６３（２００８）参照）。ＴＨ１７由来サイトカイン、例えばＩＬ−１７、ＩＬ−２１（Ｓｐｏｌｓｋｉ  ａｎｄ  Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：２９５−３０１（２００８））、又はＩＬ−２２のレベルを増加させる化合物は、有用な化合物である。
【００６０】
治療方法
上記のように、本発明は、少なくとも部分的に、ＴＨ１７細胞のレベル及び／又は活性を増加させる化合物として特定のＡＨＲリガンドを同定することに基づいている。したがって、本発明は、免疫反応の増強により利益を得る状態、例えばＴＨ１７媒介性免疫反応の非存在若しくは不十分なＴＨ１７媒介性免疫反応に惹起される、又はそれらに関連する状態を有する対象（例えばヒト）を治療する組成物及び方法を提供する。この方法は、治療を必要としている対象を選択する段階（例えば対象がＴＨ１７媒介性免疫反応の増強により利益を得る１種以上の状態を有することに基づいて対象を選択すること）と、ＴＨ１７細胞のレベル又は活性を増加させるＡＨＲリガンドを治療（活性）剤として含む本明細書に記載される１種以上の組成物を対象に投与する段階とを含んでもよい。治療を必要としている対象は、例えばその対象の主治医が同定することができる。
【００６１】
ＴＨ１７媒介性免疫反応の非存在又は不十分なＴＨ１７媒介性免疫反応により惹起される障害
免疫反応の非存在又は不十分な免疫反応は、例えば免疫系に影響を与える疾患（例えばＨＩＶ及び癌）、侵入病原体による宿主の免疫反応の回避、又は免疫反応に対する耐性により惹起される場合がある。本明細書に記載される組成物及び方法を用いる治療から利益を得ることができる免疫反応の非存在若しくは不十分な免疫反応により惹起される又はそれらに起因する疾患としては、感染症（例えば細菌（例えば肺炎桿菌）、ウイルス、真菌（例えばカンジダアルビカンス）及び原生動物の感染）が挙げられるが、これらに限定されない。ＴＨ１７媒介性免疫反応を誘発することが知られている多くの感染症が当該技術分野で既知であり、例えばＯ’Ｑｕｉｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｍｅｒ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９９：１１５−１６３（２００８）参照。
【００６２】
またこの方法を用いて免疫不全である対象、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染している対象を治療することができる。ＨＩＶに感染している対象では、ＴＨ１７細胞の欠損がしばしば見られ、特にＡＩＤＳに進行している対象で見られる（例えばＢｒｅｎｃｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１２：２８２６−２８３５（２００８）；Ｄｏｕｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．６０：４７１−８４（２００９）；Ｂｒｅｎｃｈｌｅｙ  ａｎｄ  Ｄｏｕｅｋ，Ｍｕｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１（１）：２３−３０（２００８）；Ｃｅｃｃｈｉｎａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１（４）：２７９−２８８（２００８）参照）。本方法は、これらの対象に加えて他の理由で免疫不全である対象、例えば栄養不良である対象、高齢者若しくは小児（例えば１２月齢未満の乳児）（例えばＳｉｅｇｒｉｓｔ  ａｎｄ  Ａｓｐｉｎａｌｌ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１８５−１９４（２００９）参照）、又は化学療法を受けた結果免疫が抑制された対象で特に有用である。遺伝子突然変異に起因する免疫不全である一部の対象、例えばＳＴＡＴ３における突然変異に関連している常染色体優性高ＩｇＥ症候群（ＨＩＥＳ、「Ｊｏｂ症候群」）（例えばＭｉｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４５２：７７３−７７７（２００８）参照）もまた、本明細書に記載される方法を用いて治療することができる。活性化合物の直接投与が不十分な対象では、方法は本明細書に記載される方法を用いてインビトロで得られたＴＨ１７細胞集団を投与することを含んでもよい。
【００６３】
更に、本明細書に記載される方法を用いて、癌に罹患している対象、例えば癌腫（皮膚又は内部器官を裏打ちしている若しくは被覆している組織から発現し始める癌と定義される）；肉腫（骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、又は他の結合組織若しくは支持組織から発現し始める癌と定義される）；白血病（骨髄等の血液形成組織から発現し始め、多数の異常な血液細胞を産生させ、血液にも転移する癌と定義される）；リンパ腫及び骨髄種（免疫系細胞から発現し始める癌と定義される）；又は中枢神経系癌（脳及び脊髄組織から発現し始める癌と定義される）に罹患している対象を治療することができる。
【００６４】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて、以下の１種以上に罹患している対象を治療することができる：鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、咽頭、気管、気管支、肺、顎骨、皮膚、耳、骨、甲状腺、前立腺、卵巣、バルトリン腺、外陰部、膣、卵管、子宮体、子宮、子宮頸部、乳、膀胱、腎臓、胆嚢、直腸、結腸、虫垂、小腸、胃、食道、又は唾液腺の悪性腫瘍。
【００６５】
本明細書に記載されるように、免疫反応の非存在若しくは不十分な免疫反応より惹起される疾患又は障害は、インビトロ及び／又はインビボでＴＨ１７細胞の数又は活性の増加を促進することができる、Ｆｏｘｐ３の発現を低下させる治療有効量の１種以上のＡＨＲリガンド（例えば６−ホルミルインドロ［３，２−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）及びＡＨＲシグナル伝達に対してＦＩＣＺ又はｂＮＦと同じ効果を有する化合物）を用いて、対象におけるＴＨ１７細胞の数を増加させる及び／又はＴＨ１７細胞の活性を高めることにより治療することができる。
【００６６】
幾つかの実施形態では、治療を必要としている対象に、インビトロ及び／又はインビボでＴＨ１７細胞の数又は活性の増加を促進することができる、Ｆｏｘｐ３の発現を低下させる薬学的有効用量の１種以上のＡＨＲリガンド（例えばＦＩＣＺ又はｂＮＦ）を投与してもよい。
【００６７】
或いは又は更に、ＴＨ１７細胞に分化し得る細胞集団（例えばナイーブＴ細胞及び／又はＣＤ４＋ＣＤ６２リガンド＋Ｔ細胞）を、インビトロでＡＨＲリガンド（例えばＦＩＣＺ若しくはｂＮＦ、又はＡＨＲシグナル伝達に対してＦＩＣＺ若しくはｂＮＦと同じ効果を有する化合物）と接触させて、それにより集団中のＴＨ１７細胞の数の増加を有効に促進することができる。或いは又は更に、ＴＨ１７細胞を含有している細胞集団（例えば単離ＴＨ１７細胞（例えば１００％））、又は少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、又は９９％のＴＨ１７細胞を含有している細胞の集団）を、ＦＩＣＺ若しくはｂＮＦ、又はＡＨＲシグナル伝達に対してＦＩＣＺ若しくはｂＮＦと同じ効果を有する化合物と接触させて、それにより集団中のＴＨ１７細胞の活性の上昇を有効に促進することができる。インビトロで投与されるとき、ＡＨＲリガンド（例えばＦＩＣＺ又はｂＮＦ）は、一般的にＩＬ−６及びＴＧＦ−βの一方又は両方と同時投与される。（これらの化合物はインビボで存在するため、ＡＨＲリガンド（例えばＦＩＣＺ又はｂＮＦ）がインビボで投与されるとき投与する必要はないが、任意的に投与してもよい。）次いでこれらの集団由来の１つ以上の細胞を、単独で、又はインビトロ及び／若しくはインビボでＴＨ１７細胞の数若しくは活性の増加を促進することができる１種以上のＡＨＲリガンド（例えばＦＩＣＺ若しくはｂＮＦ、又はＡＨＲシグナル伝達に対してＦＩＣＺ若しくはｂＮＦと同じ効果を有する化合物）と組み合わせて投与してもよい。
【００６８】
治療の検証／治療の有効性のモニタ
治療中及び／又は治療後、例えば疾患又はその症状の重篤度を評価するための当該技術分野で既知である方法を用いて、１つ以上の時点で対象を評価して、治療の効果を決定してもよい。幾つかの実施形態では、ＩＬ−１７産生Ｔ細胞（ＴＨ１７）のレベルを評価してもよい。次いで、修正することなく治療を継続してもよく、修正を行って進行又は結果を改良してもよく（例えば投与量、投与頻度、医薬組成物の量を増やす、及び／又は投与方法を変える等）、或いは治療を中止してもよい。
【００６９】
有効性を評価するための多くの方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ又は細胞内染色／ＦＡＣＳ分析を用いて、例えば（ＲＯＲγｔ）ＴＨ１７細胞の分化に関連する転写因子のレベルの検出等を用いることができ（例えばＩｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：３４５−５０，２００７参照）；或いは又は更に、例えば当該技術分野で既知である細胞内サイトカイン染色、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、又はＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、又はＩＬ−２２のレベルを評価することもできる。臨床的パラメータ、例えば腫瘍の大きさ又は成長、存在する病原体の感染支配又はレベル（「量（ｌｏａｄ）」としても知られている）を評価することもできる。
【００７０】
投与
治療有効量の本明細書に記載される１種以上の組成物を、標準的な方法により、例えば１種以上の投与経路により、例えば米国食品医薬品局（ＦＤＡ；例えばアドレスｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｄｓｍ／ＤＲＧ／ｄｒｇ００３０１．ｈｒｍ参照）により現在承認されている１種以上の投与経路により、例えば経口、局所、粘膜、静脈内、又は筋肉内に投与することができる。
【００７１】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される１種以上のリガンドの経口投与は驚くべき効果をあげることができる。
【００７２】
ＡＨＲリガンド−ナノ粒子
本明細書に示すように、ＡＨＲリガンド（例えばＦＩＣＺ又はｂＮＦ）に結合しているナノ粒子を含む組成物は、経口及び注入の両方によるリガンドの送達において、また生存動物におけるＴｒｅｇ反応の誘導において驚くべき効果を有する。したがって、本発明は、任意的に選択された細胞又は組織をナノ粒子の標的にさせる抗体と共に、生体適合性ナノ粒子に結合しているＡＨＲリガンドを含む組成物を更に含む。
【００７３】
生体適合性ナノ粒子
本明細書に記載される方法及び組成物で有用なナノ粒子は、（ｉ）生体適合性である、すなわち薬学的に関連する量で用いられるとき、生存動物において著しい有害反応を惹起せず；（ｉｉ）それに対して結合部分が共有結合し得る官能基を特徴とし；（ｉｉｉ）相互作用部分のナノ粒子への非特異的結合が少なく；且つ（ｉｖ）溶液中で安定である、すなわちナノ粒子が沈殿しない物質から作製される。ナノ粒子は、単分散性（ナノ粒子当たり、物質、例えば金属結晶が１種）であっても、多分散性（ナノ粒子当たり、複数種の結晶、例えば２、３、又は４種）であってもよい。
【００７４】
多くの生体適合性ナノ粒子が当該技術分野で既知であり、例えば有機又は無機ナノ粒子である。リポソーム、デンドリマー、カーボンナノ粒子、及び高分子ミセルは有機ナノ粒子の例である。量子ドットを用いることもできる。無機ナノ粒子としては、例えばＡｕ、Ｎｉ、Ｐｔ、及びＴｉＯ２ナノ粒子等の金属ナノ粒子が挙げられる。また例えばデキストラン又はＰＥＧ分子に取り囲まれているＦｅ２＋及び／又はＦｅ３＋コアを有する１０〜２０ｎｍの球形ナノ結晶等の磁性ナノ粒子を用いてもよい。幾つかの実施形態では、例えばＱｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１）：８３−９０（２００８）；米国特許第７０６０１２１号；同第７２３２４７４号；及び米国特許出願公開第２００８／０１６６７０６号に記載されているように、コロイド金ナノ粒子が用いられる。好適なナノ粒子、及び多官能性ナノ粒子の構築及び使用法は、例えばＳａｎｖｉｃｅｎｓ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｏ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２６（８）：４２５−４３３（２００８）で論じられている。
【００７５】
全ての実施形態において、ナノ粒子は官能基を介して本明細書に記載されるＡＨＲリガンドに付着（結合）している。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は官能基を含むポリマーと会合しており、また金属酸化物が互いに分散しているよう機能する。ポリマーは、ポリエチレングリコール又はシラン等であるがこれらに限定されない合成ポリマー、天然ポリマー、又は合成ポリマー若しくは天然ポリマーのいずれかの誘導体、又はこれらの組み合わせであってもよい。有用なポリマーは親水性である。幾つかの実施形態では、ポリマー「コーティング」は磁性金属酸化物の周囲の連続フィルムではなく、金属酸化物に結合し、金属酸化物を取り囲んでいる延伸ポリマー鎖の「網目（ｍｅｓｈ）」又は「雲（ｃｌｏｕｄ）」である。ポリマーは、多糖類及び誘導体を含んでもよく、デキストラン、プルラン、カルボキシデキストラン、カルボキシメチルデキストラン、及び／又は還元カルボキシメチルデキストランが挙げられる。金属酸化物は、互いに接触している、又はポリマーに個々に捕捉されている若しくはポリマーに取り囲まれている１つ以上の結晶の集合体であってもよい。
【００７６】
他の実施形態では、ナノ粒子は非ポリマー官能基組成物と会合している。ポリマーの会合なしに安定化された官能化ナノ粒子を合成する方法は既知であり、これも本発明の範囲内である。かかる方法は、例えばＨａｌｂｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，８０（５−６）：３７９−９０，１９９８に記載されている。
【００７７】
幾つかの実施形態では、ナノ粒子は直径約１〜１００ｎｍ未満、例えば２５〜７５ｎｍ、例えば約４０〜６０ｎｍ、又は約５０〜６０ｎｍの外形寸法を有する。ポリマー成分は、幾つかの実施形態では、例えば約５〜２０ｎｍ以上の厚さのコーティングの形態であってもよい。ナノ粒子の外形寸法は、約１５〜２００ｎｍ、例えば約２０〜１００ｎｍ、約４０〜６０ｎｍ、又は約６０ｎｍである。
【００７８】
ナノ粒子の合成
ナノ粒子を調製できる種々の方法が存在するが、全ての方法において、結果は、ナノ粒子を結合部分に結合させるために用いることができる官能基を有するナノ粒子でなければならない。
【００７９】
例えば、ＡＨＲリガンドは、官能化ポリマーへの共有結合を通して金属酸化物に、又は非ポリマー表面官能化金属酸化物に結合することができる。後者の方法では、ナノ粒子はＡｌｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，８０（５−６）：３７９−９０，１９９８の変法に従って合成することができる。ジメルカプトコハク酸はナノ粒子にカップリングし、カルボキシル官能基を提供する。官能化とは、ナノ粒子に所望の部分、例えば本明細書に記載されるＡＨＲリガンド又は抗体を付着させるために用いることができるアミノ又はカルボキシル又は他の反応基の存在を意味する。
【００８０】
別の実施形態では、ＡＨＲリガンドは、ナノ粒子に会合している官能化ポリマーを介してナノ粒子に結合している。幾つかの実施形態では、ポリマーは親水性である。特定の実施形態では、コンジュゲートは、末端アミノ、スルフヒドリル、又はリン酸基を有するオリゴヌクレオチドと、親水性ポリマー上にアミノ基又はカルボキシ基を備える超常磁性酸化鉄ナノ粒子とを用いて作製される。カルボキシ及びアミノ誘導体化ナノ粒子を合成する方法が幾つか存在する。官能化、コーティングナノ粒子を合成する方法について以下に詳述する。
【００８１】
カルボキシ官能化ナノ粒子は、例えばＧｏｒｍａｎの方法（国際公開第００／６１１９１号参照）に従って作製することができる。カルボキシ官能化ナノ粒子はまた、強塩基中でブロモ酸又はクロロ酢酸と反応させてカルボキシル基を結合させることにより、多糖類でコーティングされたナノ粒子から作製することもできる。更に、カルボキシ官能化粒子は、無水コハク酸又は無水マレイン酸等の試薬を用いることにより、アミノ基をカルボキシ基に変換することによりアミノ官能化ナノ粒子から作製することもできる。
【００８２】
ナノ粒子の大きさは、例えば米国特許第５，２６２，１７６号に記載されているような温度の変更等、反応条件を調整することにより制御できる。均一な粒径の物質はまた、例えば米国特許第５，４９２，８１４号に記載されているように、遠心分離、限外濾過、又はゲル濾過を用いて粒子を分画することにより作製することもできる。
【００８３】
ナノ粒子はまた、過ヨウ素酸塩で処理してアルデヒド基を形成することもできる。次いでアルデヒド含有ナノ粒子はジアミン（例えばエチレンジアミン又はヘキサンジアミン）と反応し、これはシッフ塩基を形成し、続いて水素化ホウ素ナトリウム又はシアノ水素化ホウ素ナトリウムにより還元される。
【００８４】
デキストランでコーティングされたナノ粒子はまた、例えばエピクロロヒドリンを用いて作製することができ、またそれと架橋することができる。アンモニアの添加によりエポキシ基と反応して、アミン基を生成させる、例えばＨｏｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０００．１１（６）：９４１−６、及びＪｏｓｅｐｈｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，１０（２）：１８６−９１参照。
【００８５】
カルボキシ官能化ナノ粒子は、水溶性カルボジイミド及びエチレンジアミン又はヘキサンジアミン等のジアミンの使用によりアミノ官能化磁性粒子に変換することができる。
【００８６】
アビジン又はストレプトアビジンは、オリゴヌクレオチド又はポリペプチド等のビオチン化結合部分と共に用いるためにナノ粒子に付着させることができる。例えば、Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，７（３）：３１１−６参照。同様にビオチンは、アビジン標識結合部分と共に用いるためにナノ粒子に付着させることができる。
【００８７】
これらの方法全てにおいて、低分子量化合物は、限外濾過、透析、磁気分離、又は他の手段によりナノ粒子から分離することができる。未反応ＡＨＲリガンドは、例えばサイズ排除クロマトグラフィーにより、リガンド−ナノ粒子コンジュゲートから分離することができる。
【００８８】
幾つかの実施形態では、コロイド金ナノ粒子は、例えばＱｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１）：８３−９０（２００８）；米国特許第７０６０１２１号；同第７２３２４７４号；米国特許出願公開第２００８／０１６６７０６号に記載されているような、当該技術分野で既知である方法を用いて作製される。
【００８９】
幾つかの実施形態では、例えば米国特許第７２９１５９８号；同第５１４５６８４号；同第６２７０８０６号；同第７３４８０３０号その他に記載されているように、ナノ粒子はペグ化される。
【００９０】
抗体
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される組成物はまた、選択的に細胞を標的とする抗体を含み；幾つかの実施形態では、抗体は例えばＡＨＲリガンドと同じ又は異なるナノ粒子に結合している。本明細書で使用するとき、「抗体」という用語は、完全長、２本鎖免疫グロブリン分子、並びにその抗原結合部分及び断片を指し、合成変異体を含む。典型的な完全長抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び２つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）を含む。本明細書で使用するとき、抗体の「抗原結合断片」という用語は、標的に特異的に結合する能力を保持している完全長抗体の１種以上の断片を指す。抗原結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインから成る一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合している２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一腕部のＶＬ及びＶＨドメインから成るＦｖ断片；（ｖ）ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９））、ＶＨドメインから成る；並びに（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられるが、これらに限定されない。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子にコードされているが、組み換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域を単一タンパク質鎖（そこでＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子が形成される）として作製することを可能にする合成リンカーにより、ＶＬ及びＶＨを接合させることができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）参照）。かかる単鎖抗体もまた、「抗原結合断片」という用語に包含される。
【００９１】
抗体及び抗体断片の産生はこの分野で数多く報告されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）は、ヒト抗体ＣＤＲの、マウス抗体のＣＤＲでの置換について開示している。Ｍａｒｘ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：４５５−４５６（１９８５）は、マウス可変領域及びヒト定常領域を有するキメラ抗体について論じている。Ｒｏｄｗｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：９９−１００（１９８９）は、抗体のＣＤＲ情報に由来する低分子量認識エレメントについて論じている。Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．３０５２：３６−３９（１９９１）は、Ｆｖ断片誘導体、単鎖抗体、融合タンパク質キメラ抗体、及びヒト化げっ歯類抗体を含む、遺伝子操作されたモノクローナル抗体について論じている。Ｒｅｉｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）は、ラット超可変領域がグラフトされているヒト抗体を開示している。Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）は、ヒト抗体へのマウスの抗原結合部位のグラフトについて教示している。
【００９２】
本明細書に記載される方法では、化合物がＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び／又はマクロファージを標的とすることが望ましく、したがってこれら細胞型の１種以上に対して選択的な抗体を用いることができる。例えばＴ細胞では、抗ＣＸＣＲ４、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ８、抗ＴＴＬＡ４、又は抗ＣＤ３抗体を用いることができ；例えばＢ細胞では、ＣＤ２０、ＣＤ１９、又はＢ細胞受容体に対する抗体を用いることができ；樹状細胞を標的とする場合、ＣＤ１１ｃ、ＤＥＣ２０５、ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ、ＣＤ８０、又はＣＤ８６に対する代表的な抗体を用いることができ；マクロファージでは、ＣＤ１１ｂ、ＭＨＣクラスＩ若しくはクラスＩＩ、ＣＤ８０、又はＣＤ８６に対する代表的な抗体を用いることができる。他の好適な抗体も当該技術分野で既知である。
【００９３】
病原体及び腫瘍特異的抗原
例えば細胞集団が対象に投与される幾つかの実施形態では、方法は特異的抗原を同時投与して、抗原特異的反応を誘導することを含む。したがって、例えば対象が腫瘍に罹患している場合、１種以上の腫瘍特異的抗原、例えば対象が有する腫瘍の種類に関連する抗原を投与してもよい。
【００９４】
特異的抗原は精製されていてもよく、例えば単離及び精製ポリペプチド又はグリコペプチドであり、例えばナイーブ又は組み換えであり、同様に抗原断片を含んでもよい。対象が腫瘍又はウイルス以外の感染症に罹患しており、抗原が腫瘍細胞、細菌、真菌、又は原生動物に由来する場合、すなわち細胞関連抗原である場合、全細胞又はその断片を投与してもよい。
【００９５】
特異的抗原を選択及び調製する方法は当該技術分野で周知である。例えば、ワクチンとして潜在的に有用であると同定されている任意の抗原を用いることができる。この場合、方法は、ワクチン接種プロトコルの一部として、例えばワクチン抗原に対する免疫反応を促進するためのアジュバントとして、ＡＨＲリガンド、又は本明細書に記載される方法により調製されたＴＨ１７細胞を投与することを含んでもよい。したがって、本方法は、アジュバントとして投与するために、任意の既知のワクチン接種プロトコルに組み込んでもよい。
【００９６】
本組成物及び方法で有用な代表的な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）としては、以下のうち１つに分類され得るものが挙げられる：
１．突然変異癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子の産物；
２．他の突然変異遺伝子の産物；
３．過剰発現又は異常発現細胞タンパク質；
４．発癌ウイルスにより産生される腫瘍抗原；
５．癌胎児抗原；
６．改変細胞表面糖脂質及び糖タンパク質；又は
７．細胞型特異的分化抗原。
【００９７】
ＴＡＡの例としては、以下のものが挙げられる：生殖細胞腫瘍ではαフェトプロテイン（ＡＦＰ）；消化管の癌では癌胎児抗原（ＣＥＡ）；卵巣癌ではＣＡ−１２５；乳癌ではＭＵＣ−１；乳癌では上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）；悪性黒色腫ではチロシナーゼ；悪性黒色腫では黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）；前立腺癌では前立腺酸性ホスファターゼ又は前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；又は悪性黒色腫ではＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１。他のものとしては、ｒａｓ又はｐ５３の異常産物；ホルモン、例えばＡＣＴＨ、カルシトニン、及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）；腫瘍関連糖タンパク質ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、及びＣＡ１５−３が挙げられる。
【００９８】
代表的な病原体関連抗原としては、例えば髄膜炎等の疾患の原因物質から小児及び高齢者を保護するために、例えばペプチド担体に結合している、ＦＩＣＺと共に投与され得る（タンパク質担体にコンジュゲート化し得る）抗原性多糖類が挙げられ、例えばＡｍｉｒ−Ｋｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：６１６５−６１７１（２００３）参照。代表的な多糖類としては、肺炎連鎖球菌；髄膜炎菌；及びヘモフィルスインフルエンザｂ菌（Ｈｉｂ）の表面多糖類が挙げられる。
【００９９】
他の代表的な抗原としては、例えば培地から細胞を除去した後の百日咳菌ホルマリン不活化百日咳毒素（無細胞百日咳、ａＰ）；破傷風菌ホルマリン不活化毒素；ジフテリア菌ホルマリン不活化毒素；Ｂ型肝炎ウイルス抗原（ＨＢｓＡｇ）；及び種々の不活化ウイルス／細菌が挙げられる。多くの他の抗原が当該技術分野で既知である。
【０１００】
医薬製剤
治療有効量の１種以上の本明細書に記載される組成物（すなわち、単独又はナノ粒子に結合している、例えばＦＩＣＺ又はｂＮＦ等のＡＨＲリガンドを活性（治療）剤として含む）は、例えばヒト等の対象に投与するのに好適な医薬組成物に組み込むことができる。かかる組成物は、典型的には組成物と、薬学的に許容できる担体とを含む。本明細書で使用するとき、「薬学的に許容できる担体」という用語は、薬学的投与に適合する任意の且つ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等を含むことを意図する。薬学的活性物質にかかる媒体及び剤を用いることは既知である。任意の従来の媒体又は剤が活性化合物に不適合である場合を除いて、かかる媒体を本発明の組成物で用いることができる。補助的活性化合物、例えばリガンドの分解阻害剤を組成物に組み込んでもよい。
【０１０１】
医薬組成物は、その意図する投与経路に適合するよう配合され得る。非経口、皮内、又は皮下適用で用いられる溶液又は懸濁液は、以下の成分を含んでもよい：注入用水等の滅菌希釈剤、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗細菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩等の緩衝剤；及び塩化ナトリウム又はデキストロース等の張度調整剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基で調整することができる。非経口製剤は、ガラス又はプラスチックで作製されるアンプル、使い捨てシリンジ、又は多用量バイアルに封入されていてもよい。
【０１０２】
注入用途に好適な医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性である場合）若しくは分散液、及び滅菌注入溶液若しくは分散液の即時調整用滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ（商標）（ポリエトキシ化ヒマシ油；ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌されていなくてはならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。例えばレシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合必要な粒径を維持することにより、及び界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。微生物作用の阻止は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成できる。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注入組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の吸収遅延剤を組成物中に含むことによりもたらされ得る。
【０１０３】
滅菌注入溶液は、必要に応じて、上に列挙する成分の１種又は組み合わせと共に、適切な溶媒中に必要な量の組成物（例えば本明細書に記載される剤）を組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製できる。一般的に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒と上に列挙したものの中から必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注入溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、これらにより、既に滅菌濾過されているその溶液から活性成分と任意の追加の所望成分の粉末が得られる。
【０１０４】
経口組成物は一般的に、不活性希釈剤又は可食性担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよい。経口治療投与の目的のために、活性化合物を賦形剤とともに組み込んで、錠剤、トローチ剤、又はカプセル剤の形態で用いてもよい。経口組成物はまた、洗口液として用いるために液体担体を用いて調製してもよく、ここで液体担体中の化合物は経口で適用され、含嗽（ｓｗｉｓｈ）され、吐き出される又は飲み込まれる。薬学的適合性結合剤、及び／又はアジュバント物質は、組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、任意の以下の成分又は類似の性質を有する化合物を含有してもよい：微結晶性セルロース、トラガカントガム、又はゼラチン等の結合剤；デンプン又はラクトース等の賦形剤；アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ（商標）（カルボキシメチルスターチナトリウム）、又はコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＥＲＯＴＥＳ（商標）等の潤滑剤；コロイド二酸化ケイ素等の流動促進剤；スクロース又はサッカリン等の甘味剤；又はペパーミント、サリチル酸メチル、若しくはオレンジ香料等の着香剤。
【０１０５】
全身投与はまた、経粘膜又は経皮手段によるものであってもよい。経粘膜又は経皮投与では、浸透する障壁に対して適切な浸透剤が製剤中に用いられる。かかる浸透剤は一般的に既知であり、例えば経粘膜投与の場合、洗剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻薬又は坐薬の使用を通して達成できる。経皮投与の場合、活性化合物は、一般的に当該技術分野で既知である軟膏、硬膏、ゲル、又はクリームに配合される。
【０１０６】
１つの実施形態では、活性化合物は、移植片及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤等の、化合物が体内から急速に排泄されるのを防ぐ担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを用いることができる。かかる製剤の調製方法は、当業者に明らかである。物質はまた、Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞を標的とするリポソームを含む）もまた、薬学的に許容できる担体として用いることができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に既知の方法に従って調整することができる。
【０１０７】
核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして用いてもよい。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注入、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号参照）により、又は定位注入（例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９１：３０５４−３０５７，１９９４参照）により、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容できる希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含んでもよく、或いは遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリクスを含んでもよい。或いは、例えばレトロウイルスベクター等の完全遺伝子送達ベクターを組み換え細胞からインタクトな状態で産生する場合、医薬製剤は遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含んでもよい。
【０１０８】
医薬組成物は、投与説明書と共に容器、パック、又はディスペンサに収容されてもよい。１つの態様では、医薬組成物はキットの一部として含まれてもよい。
【０１０９】
一般的に、医薬組成物を投与するために用いられる投与量は、毒性、炎症、又はアレルギー反応等の不所望の副作用なしに、予防及び／又は治療のための意図される目的を促進する。個々の要件は変化してもよいが、製剤の有効量の最適な範囲の決定は当該技術分野の技能の範囲内である。ヒトの用量は、動物実験から容易に推定され得る（Ｋａｔｏｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２７  Ｉｎ：“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）。一般的に、当業者が容易に調整できる、有効量の製剤を提供するために必要な投与量は、年齢、健康、体調、体重、レシピエントの疾患又は障害の種類及び程度、治療頻度、併用療法の性質、並びに必要に応じて所望の効果（１又は複数）の性質及び範囲を含む、幾つかの要因に依存して変化する（Ｎｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  “Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６）。
【０１１０】
キット
本発明はまたキットを含む。幾つかの実施形態では、キットは１以上の用量の本明細書に記載される組成物を含む。導入レジメン及び維持レジメンのための剤形の組成、形状、及び種類は、対象の要件に応じて変化してもよい。例えば、剤形は、非経口剤形、経口剤形、遅延放出又は制御放出剤形、局所及び粘膜剤形（これらの任意の組み合わせを含む）であってもよい。
【０１１１】
特定の実施形態では、キットは包装又は容器内に以下の１種以上を備えてもよい：（１）１以上の投与量の本明細書に記載される組成物；（２）１種以上の薬学的に許容できるアジュバント又は賦形剤（例えば薬学的に許容できる塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、及びクラスレート）；（３）用量を投与するための１種以上のビヒクル；（５）投与説明書。構成要素（１）〜（５）のうち２種以上（全種を含む）を同じ容器に入れた実施形態を用いてもよい。
【０１１２】
キットを供給するとき、含まれる組成物の異なる成分を別々の容器に包装し、使用直前に混合してもよい。成分をこのように別々に包装することは、活性成分の機能を失わせることなしに長期間保存することを可能にする。２種以上の生物活性剤が特定のキットに含まれるとき、生物活性剤は、（１）別々に包装され、使用直前に適切な（類似の異なるものであるが適合性である）アジュバント又は賦形剤と別々に混合してもよく、（２）一緒に包装され、使用直前に一緒に混合されてもよく、又は（３）別々に包装され、使用直前に一緒に混合されてもよい。選択された化合物が混合後も安定な状態を保つ場合、例えば数分前、数時間前、数日前、数ヶ月前、数年前、及び製造時を含む、使用直前以外の使用前のある時点で化合物を混合してもよい。
【０１１３】
本発明の特定のキットに含まれる組成物は、異なる成分の寿命が最適に保たれ、容器の材料に吸収又は変質されないように、いかなる種類の容器に入れて供給することもできる。これら容器に好適な材料としては、例えばガラス、有機ポリマー（例えばポリカーボネート及びポリスチレン）、セラミック、金属（例えばアルミニウム）、合金、又は類似の試薬を収容するために典型的に使用されている任意の他の材料を挙げることができる。代表的な容器としては、限定するものではないが、試験管、バイアル、フラスコ、瓶、シリンジ等を挙げることができる。
【０１１４】
上述のように、キットはまた説明書と共に供給されてもよい。これらの説明書は、印刷されていてもよく、及び／又は限定するものではないが、フロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、Ｚｉｐディスク、ビデオカセット、オーディオテープ、およびフラッシュメモリーデバイス等の電子可読媒体として供給されてもよい。或いは、説明書はインターネットウェブサイトに公開されてもよく、電子メールとしてユーザに配布されてもよい。
【実施例】
【０１１５】
本発明は、以下の実施例において更に記載されるが、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１６】
実施例１：インビトロにおけるＴＨ１７分化に対するＡＨＲの役割
ＵＶＢ光に曝露されたケラチノサイトが表面のＲＡＮＫＬレベルをアップレギュレートし、表皮樹状細胞にシグナルを送ってＴｒｅｇ増殖を補助することが近年報告されている（Ｌｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１２：１３７２−１３７９，２００６）。ＵＶＢはインビトロでＡＨＲリガンドＦＩＣＺの形成を触媒し、皮膚でＦＩＣＺを生成させると考えられている（Ｆｒｉｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０４：８８５１−８８５６，２００７）。Ｔｒｅｇに対するＡＨＲの役割を鑑みて（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３０１６号、及び米国特許仮出願第６０／９８９，３０９号参照（２００７年１１月２０日出願）、両方共その全文を参照により本明細書に組み込まれる）、及びＴｒｅｇ増殖に対するＵＶＢの報告されている効果を鑑みて（Ｌｏｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１２：１３７２−１３７９，２００６）、Ｔｒｅｇに対するＦＩＣＺの効果を調べた。
【０１１７】
図１Ａ及び１Ｂに示すように、驚くべきことにＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３：ＧＦＰ−Ｔ細胞のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３：ＧＦＰ−Ｔｒｅｇへの変換を促進するのではなく、ＦＩＣＺはインビトロでＴＧＦ−β１により誘発されるＴｒｅｇの分化を干渉した。ＴＨ１７とＴｒｅｇ細胞との間に存在する、報告されている相互関係（Ｂｅｔｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４４１：２３５−２３８，２００６）及び本明細書に記載されるＴｒｅｇ分化に対するＦＩＣＺの阻害効果に基づいて、ＦＩＣＺ及びＡＨＲのＴＨ１７分化に対する役割を調べた。
【０１１８】
図１Ｃに示すように、ＡＨＲ発現は、ＴＧＦ−β１及びＩＬ−６による活性化によってインビトロで誘導されたＴＨ１７Ｔ細胞内で、非常にアップレギュレートされる。更に、ＡＨＲ発現はまた、ＴＨ１７分化がＴＧＦ−β１、ＩＬ−６、及びＩＬ−２３により促されたとき、又はＩＬ−２１をＩＬ−６の代わりに用いたときにもアップレギュレートされた（図１Ｄ参照）。
【０１１９】
次に、インビトロにおけるＴＨ１７分化に対する、ＦＩＣＺによるＡＨＲ活性化の効果を、ＴＨ１７分化マーカーとしてＴＨ１７転写因子であるＲＯＲγｔを用いて調べた。図１Ｅに示すように、ＦＩＣＺは単独ではＴＨ１７転写因子ＲＯＲγｔの発現量をそれ程アップレギュレートしなかった。しかし、図１Ｆ〜１Ｈに示すように、ＦＩＣＺはＴＧＦβ１、ＩＬ−６、及びＩＬ−２３と協同して、インビトロでＴＨ１７分化を促した。この相乗作用は、図１Ｉに示すようにＡＨＲ拮抗剤レスベラトロールによりブロックされ得る。この観察結果は、ＡＨＲがＦＩＣＺ媒介性ＴＨ１７分化にとって重要であることを示す。まとめると、これらの結果は、ＦＩＣＺがインビトロでＴＨ１７分化を促進することを示す。
【０１２０】
実施例２：インビボにおけるＴＨ１７分化に対するＡＨＲの役割
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８３０１６号、及び米国特許仮出願第６０／９８９，３０９号（２００７年１１月２０日出願）に記載のＥＡＥモデルを用いて、ＦＩＣＺの効果をインビボで評価した。図２Ａ及び表１に示すように、ＦＩＣＺ投与によりＥＡＥが有意に悪化した。図２Ｂ〜２Ｄに示すように、ＦＩＣＺ投与はまた、ＩＬ−１７＋ＣＤ４＋及びＣＤ４＋ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の頻度増加、並びにＭＯＧ３５〜５５によるインビトロ刺激後のＩＬ−１７及びＩＦＮγの分泌増加にも関連していた（図２Ｂ参照）。ＴＨ１７とＴｒｅｇとの間に存在する相互関係と一致して、ＦＩＣＺ処置マウスはＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの頻度低下を示した（図２Ｅ）。まとめると、これらの結果はＦＩＣＺがインビボでＴＨ１７分化を促進することを示す。
【０１２１】
（表１）ＥＡＥに対するＦＩＣＺ処置の効果
2011519266.tif 000003
マウスはＰＢＳ（対照）又はＩＴＥで処置し、ＣＦＡ中のＭＯＧ３５〜５５ペプチドで免疫化し、ＥＡＥ発現についてモニタした。
【０１２２】
実施例３：肝細胞癌のインビボモデルにおけるＦＩＣＺの効果
この実施例では、肝細胞癌に対するＦＩＣＺ投与の効果を癌のマウスモデルにおいて評価した。
【０１２３】
本研究は、実験用マウスの１種であり、無毛で正常胸腺が欠損しており、遺伝子変異のために免疫系の不全を有する、胸腺欠損ヌードマウス（Ｎ＝７）を用いた。胸腺欠損ヌードマウスは癌の研究で用いられることが多く、その理由はマウス又は他の種由来の腫瘍細胞を拒絶しないためである。
【０１２４】
１００μｇの凍結ＦＩＣＺ（ＢＩＯＭＯＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）を、５ｍＬのＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（商標）（ポリエトキシ化ヒマシ油：エタノールのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に溶解させ、２０μｇ／ｍＬの希釈標準溶液を作製した。２５０μＬ（合計５μｇ）のＨＢ抗原を処置群Ｃに注入した。実験は、以下のように実施した。
2011519266.tif 000004
【０１２５】
Ｖｅｒｎｉｅｒノギスを用いて腫瘍の大きさを３次元で測定し、腫瘍体積は、半径が平均腫瘍寸法の半分である球形であると仮定して計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝ｄ２×Ｄ／２。腫瘍を週２回測定し、マウスを日常的にモニタして処置効果を評価した。結果は、ＦＩＣＺの投与が腫瘍の成長を抑制することを示した。
【０１２６】
更に、血清ＡＦＰ濃度をモニタした；ＡＦＰはＨＣＣの認められた腫瘍マーカーである。結果を図３Ａ及び３Ｂに示す。処置開始７日後（図３Ａ）及び１４日後（図３Ｂ）にＡＦＰ濃度を測定したところ、ＦＩＣＺは腫瘍の成長を著しく抑制している。更に、ＦＩＣＺの投与とＨＢｓＡＧの投与とを含む併用処置は、ＦＩＣＺ単独より若干良好な結果をもたらし、これは腫瘍関連抗原の同時投与により相乗作用が得られることを示す。
【０１２７】
６週目に動物を屠殺し、脾臓から得られた細胞に対してＦＡＣＳ選別を実施してＴ細胞を単離及び精製し、以下を測定する：Ｈｅｐ３Ｂ及びＨＣＣ溶解物に対する脾細胞の増殖；サイトカイン：ＩＦＮ、ＩＬ１７、ＴＧＦ  ＩＬ６、ＩＬ２、ＩＬ１０；ＨＢｓＡｇに対するＴ細胞の細胞傷害性；並びにＣＤ４及びＣＤ８中のパーフォリン。
【０１２８】
実施例４：硬骨魚類ゼブラフィッシュにおけるＴＨ１７
ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）のような硬骨魚類の免疫系は、幾つかの面で哺乳類の免疫系に類似している。哺乳類の自己免疫病態に関連しているマクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞（Ｌａｎｇｅｎａｕ  ａｎｄ  Ｚｏｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，３０７−３１７（２００５））、並びにサイトカインＩＬ−１７（Ｇｕｎｉｍａｌａｄｅｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１，３９３−４０３（２００６））、ＩＦＮｇ（Ｒｏｂｅｒｔｓｅｎ，Ｆｉｓｈ  Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０，１７２−１９１（２００６））及びＴＮＦａ（Ｃｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９，２８３−２９４（２００８））、及び転写因子Ｔ−ｂｅｔ（Ｔａｋｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４５，１２７−１３６（２００８））、及びレチノイド関連オーファン受容体（Ｆｌｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ７，５３５−５４３（２００７））が硬骨魚類で報告されている。哺乳類と同様に、硬骨魚類の免疫レパートリは、組み換え及び突然変異機構により生成される（Ｂｏｅｈｍ，Ｃｅｌｌ  １２５，８４５−８５８（２００６）；Ｂｏｅｈｍ  ａｎｄ  Ｂｌｅｕｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，１３１−１３５（２００７）；Ｃｏｏｐｅｒ  ａｎｄ  Ａｌｄｅｒ，Ｃｅｌｌ  １２４，８１５−８２２（２００６）；Ｌａｎｇｅｎａｕ  ａｎｄ  Ｚｏｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５，３０７−３１７（２００５）；Ｐａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｏｐｅｒ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４，４９７−５１８（２００６））。しかしながら、これらのプロセスは潜在的に有害な自己反応性免疫受容体を生成する恐れがあるが、適応自己免疫及び免疫調節機構の可能性は低級顎口類では未だ特徴付けされていない。実際Ｆｏｘｐ３にドライブされる末梢性トレランスは、脊椎動物の進化において最近適応したものであると仮定されている（Ｂｏｅｈｍ，Ｃｅｌｌ  １２５，８４５−８５８（２００６））。
【０１２９】
これらの動物における自己免疫反応は、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化させたゼブラフィッシュ脳ホモジネート（ｚＣＮＳ）で腹腔内（ｉｐ）免疫化された６ヶ月齢のゼブラフィッシュで研究された。
【０１３０】
ｚＣＮＳ及びその誘導ペプチドに対するｚＣＮＳ免疫誘導自己抗体の存在（ゼブラフィッシュミエリンマイクロアレイを用いて検出された（Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１  Ｓｕｐｐｌ  ２，１４６１５−１４６２１（２００４）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１，１０３３−１０３９（２００３）））、並びにｚＣＮＳで免疫化されたゼブラフィッシュの脳におけるＣＤ３、ＩＦＮγ及びＩＬ−１７発現細胞の蓄積により証明されるように、自己免疫脳脊髄炎が検出された（図４Ａ〜４Ｃ）。
【０１３１】
これらの結果は、ゼブラフィッシュが、適応抗原特異的自己免疫反応を開始させ得ることを示す。
【０１３２】
ゼブラフィッシュにおけるｚＦｏｘｐ３の機能を更に調べるために、ｚＦｏｘｐ３を過剰発現させた、或いはゼブラフィッシュの発生中の胚においてノックアウトした。
【０１３３】
メーカの説明書に従ってＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いることにより、ゼブラフィッシュの腎臓から調製したｃＤＮＡからｚＦｏｘｐ３をクローニングした。
【０１３４】
ゼブラフィッシュの卵を産卵後１時間以内に回収し、精製プラスミド又はモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを、自動注入器に接続されているガラス細針で微量注入した。ｚＦｏｘｐ３
2011519266.tif 000005
及び５塩基が不一致である対照オリゴヌクレオチド
2011519266.tif 000006
の翻訳をブロックするよう設計されたモルホリノオリゴヌクレオチドを設計し、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，ＯＲ）により合成した。各モルホリノヌクレオチドを、１〜４細胞期で胚の卵黄に注入した。
【０１３５】
ｚＦｏｘｐ３発現コンストラクトの微量注入により、ｚＦｏｘｐ３レベルがアップレギュレートされ、同時にＩＬ−１７レベルはダウンレギュレートされた。反対に、ｚＦｏｘｐ３の翻訳をブロックするよう設計されたモルホリノオリゴヌクレオチドの微量注入は、ＩＬ−１７発現のアップレギュレーションを導き、これは５塩基が不一致である陰性対照モルホリノの注入では見られなかった（図４Ｄ）。
【０１３６】
更に、哺乳類細胞で述べたように、発生中のゼブラフィッシュ胚を高親和性ＡＨＲリガンドである２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（ＴＣＤＤ）で処理すると、ｚＦｏｘｐ３発現が用量依存的に増加し；この増加は同時にＩＬ−１７発現をダウンレギュレートした。
【０１３７】
全体として、これらの結果は、ｚＦｏｘｐ３が哺乳類におけるＦｏｘｐ３のゼブラフィッシュ機能的相同体であることを示す。ｚＦｏｘｐ３の増加はＴｒｅｇを増加させ、一方Ｆｏｘｐ３発現の減少によりＩＬ−１７レベルは増加する。
【０１３８】
実施例４：ＦＩＣＺ担持（ｌｏａｄｅｄ）ナノ粒子の投与はＥＡＥを悪化させる
上述のように、ＡＨＲリガンドであるＦＩＣＺを１μｇ／マウスの単一用量投与するとＥＡＥが悪化する。金コロイドは、関節リウマチの治療に５０年以上用いられており、これら金コロイドナノ粒子は長期毒性又は有害作用をほとんど有しないことが示されている（Ｐａｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．１１，１６９（Ｍａｙ−Ｊｕｎ，２００４））。金コロイドナノ粒子は寸法が小さいため（直径１０〜１００ｎｍ）、その上に複数の小さいタンパク質又は他の分子がコンジュゲートすることができる大きな表面積を有する（Ｐａｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．１１，１６９（Ｍａｙ−Ｊｕｎ，２００４））。金コロイドナノ粒子のＰＥＧ化は、共有結合している分子の全体的安定性を著しく高める（Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，８３（Ｊａｎ，２００８））。更に、近年ではＰＥＧ化金コロイドナノ粒子が特定の抗体に結合して、その抗体が特定の細胞型を標的とするようにできることが示されている（Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，８３（Ｊａｎ，２００８））。したがって、ＦＩＣＺの半減期を増加させるため、またＦＩＣＺによる特定の細胞型のターゲティングを促進するために、ＡＨＲリガンドを担持した、ポリエチレングリコールでコーティングされた（ＰＥＧ化）金コロイドナノ粒子を構築した（図５）。
【０１３９】
ＡＨＲリガンドであるＦＩＣＺ、ＩＴＥ、又はＴＣＤＤを備えるＰＥＧ化金コロイドナノ粒子は、典型的な光吸収スペクトルを示した（図６Ａ〜６Ｂ）。更に、ＦＩＣＺ、ＩＴＥ、又はＴＣＤＤ担持ナノ粒子は、ＡＨＲレポーター細胞株におけるルシフェラーゼ発現を、１０ｎＭのＴＣＤＤにより得られるレベルと同程度まで活性化した。
【０１４０】
ＡＨＲリガンド担持ナノ粒子のインビボにおける機能を調べるために、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスでＥＡＥを誘導し、０日目から開始して、４５フェントモルのナノ粒子で毎週該マウスを処置した。上記結果と同様に、ＴＣＤＤによる処置は、ＥＡＥを完全に抑制し、一方ＡＨＲリガンドであるＦＩＣＺは疾患を悪化させた（図７）。ＩＴＥ担持ナノ粒子の毎週投与により、ＥＡＥ発達が著しく阻害された（図７）。
【０１４１】
実施例５：ＡＨＲの調節因子を同定するためのＡＨＲレポーター系
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ｒｅｎ）に融合しているＦｏｘｐ３をコードしているコンストラクトを作製して、ＡＨＲの発現を増加させ（延いては対照と比べてルシフェラーゼ発現及び蛍光を増加させる）、又はＡＨＲの発現を減少させる（延いては対照と比べてルシフェラーゼ発現及び蛍光を減少させる）化合物を同定するための簡単なアッセイを提供する。記載されているように（Ｂｅｔｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２，５１３８−５１４３（２００５））、ＡＨＲレポータールシフェラーゼコンストラクト及び正規化するためのＴＫ−ＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼコンストラクトでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。
【０１４２】
細胞を様々な濃度のＡＨＲリガンドＴＣＤＤと共にインキュベートし、ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いてＡＨＲレポーターの活性化をアッセイした。Ｔｋ−Ｒｅｎｉｌｌａを標準化に用いた。図８に示す結果は、予想された通りコンストラクトはＡＨＲリガンドＴＣＤＤに応答し、レポーターの発現が用量依存的に増加することを示す。
【０１４３】
実施例６：ｂＮＦによるＴ細胞のＴＨ１７細胞への分化
Ｔ細胞のＴＨ１７細胞への分化に対して同じ効果を有する他のＡＨＲリガンドが存在するかどうかを決定するために、ＡＨＲリガンドβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を評価した。
【０１４４】
簡潔に述べると、ｂＮＦ又はＦＩＣＺ（１００ｎＭ）が存在してもしなくても、記載されているように（Ｎａｔｕｒｅ  ２００８；４５４（７２０２）：３５０−２）ＴＧＦ−β及びＩＬ−２１の存在下で、Ｔ細胞はＣＤ３及びＣＤ２８に対する抗体によるインビトロ活性化によりＴＨ１７細胞に分化した。ＩＬ−１７産生はリアルタイムＰＣＲにより測定した。
【０１４５】
図９に示す結果は、ｂＮＦがＴ細胞のＴＨ１７細胞への分化に対して同じ効果を有することを示す。
【０１４６】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の記載は添付の特許請求の範囲により規定されている本発明の範囲を例示することを意図し、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修正は、以下の特許請求の範囲の範囲内
である。
【図１Ａ】
2011519266.tif 000007
【図１Ｂ】
2011519266.tif 000008
【図１Ｃ】
2011519266.tif 000009
【図１Ｄ】
2011519266.tif 000010
【図１Ｅ】
2011519266.tif 000011
【図１Ｆ】
2011519266.tif 000012
【図１Ｇ】
2011519266.tif 000013
【図１Ｈ】
2011519266.tif 000014
【図１Ｉ】
2011519266.tif 000015
【図２Ａ】
2011519266.tif 000016
【図２Ｂ】
2011519266.tif 000017
【図２Ｃ】
2011519266.tif 000018
【図２Ｄ】
2011519266.tif 000019
【図２Ｅ】
2011519266.tif 000020
【図３Ａ】
2011519266.tif 000021
【図３Ｂ】
2011519266.tif 000022
【図４Ａ】
2011519266.tif 000023
【図４Ｂ】
2011519266.tif 000024
【図４Ｃ】
2011519266.tif 000025
【図４Ｄ】
2011519266.tif 000026
【図５】
2011519266.tif 000027
【図６Ａ】
2011519266.tif 000028
【図６Ｂ】
2011519266.tif 000029
【図７】
2011519266.tif 000030
【図８】
2011519266.tif 000031
【図９】
2011519266.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月27日(2011.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
[請求項1001]
Ｔ細胞の初期集団を提供する段階と、
該細胞集団を、6−ホルミルインドロ［3，2−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）を含む十分な量の組成物と接触させる段階と、
任意で集団中のＴＨ17細胞の存在及び／又は数を評価する段階と
を含む、Ｔ細胞の初期集団からＩＬ−17産生Ｔ細胞（ＴＨ17）に富む集団を調製する方法であって、
前記方法により集団中の制御性ＴＨ17細胞の数が増加する、方法。
[請求項1002]
Ｔ細胞の初期集団がナイーブＴ細胞又はＣＤ4＋ＣＤ62リガンド＋Ｔ細胞を含む、請求項1001に記載の方法。
[請求項1003]
ＴＨ17媒介性免疫反応の増強により利益を得る障害に罹患している対象に、前記障害の症状を改善する又は寛解させるのに十分な量のＴＨ17細胞を投与することを更に含む、請求項1001に記載の方法。
[請求項1004]
Ｔ細胞集団がインビトロで存在する方法であって、有効量のインターロイキン−6（ＩＬ−6）及び形質転換成長因子（ＴＧＦ）−βの一方又は両方を細胞と接触させることを更に含む、請求項1001に記載の方法。
[請求項1005]
対象に投与するための富化集団を調製することを更に含む、請求項1004に記載の方法。
[請求項1006]
ＴＨ17媒介性免疫反応の増強により利益を得る疾患に罹患している対象を治療する方法であって、
免疫を増加させる治療を必要としている対象を同定する段階と、
治療有効量の6−ホルミルインドロ［3，2−ｂ］カルバゾール（ＦＩＣＺ）又はβ−ナフトフラボン（ｂＮＦ）を含む組成物を対象に投与する段階と
を含み、
それにより対象を治療する方法。
[請求項1007]
対象が、ウイルス、細菌、真菌、及び原生動物から成る群から選択される病原体に感染している、請求項1006に記載の方法。
[請求項1008]
対象が癌に罹患している、請求項1006に記載の方法。
[請求項1009]
ＦＩＣＺ又はｂＮＦが生体適合性ナノ粒子に結合している、請求項1001または1006に記載の方法。
[請求項1010]
Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する抗体を細胞と接触させることを更に含む、請求項1001に記載の方法。
[請求項1011]
抗体が生体適合性ナノ粒子に結合している、請求項1010に記載の方法。
[請求項1012]
Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、又はマクロファージ上に存在する抗原に選択的に結合する抗体を投与することを更に含む、請求項1006に記載の方法。
[請求項1013]
抗体が生体適合性ナノ粒子に結合している、請求項1012に記載の方法。
[請求項1014]
ＦＩＣＺ又はｂＮＦと抗体とが同じナノ粒子上に共存している、請求項1013に記載の方法。
[請求項1015]
対象の疾患に関連する抗原を投与することを更に含む、請求項1006に記載の方法。
[請求項1016]
抗原が腫瘍関連抗原である、請求項1008に記載の方法。
[請求項1017]
抗原が、ウイルス、細菌、真菌、及び原生動物から成る群から選択される病原体に関連している、請求項1007に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
ゼブラフィッシュの卵を産卵後１時間以内に回収し、精製プラスミド又はモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを、自動注入器に接続されているガラス細針で微量注入した。ｚＦｏｘｐ３
2011519266.tif 000033
及び５塩基が不一致である対照オリゴヌクレオチド
2011519266.tif 000034
の翻訳をブロックするよう設計されたモルホリノオリゴヌクレオチドを設計し、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，ＯＲ）により合成した。各モルホリノヌクレオチドを、１〜４細胞期で胚の卵黄に注入した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011519266000001.app
【国際調査報告】
2011519266.tif 000035