(57)【要約】  細胞構成成分の分離方法であって、ａ）ゲスト化合物が結合された反応性化合物を、細胞と接触させる段階、ｂ）細胞を溶解させる段階、ｃ）ホスト化合物が結合された固体相を、細胞の溶解液に加えて混合液とする段階、ｄ）細胞構成成分に結合されたゲスト化合物と固体相に結合されたホスト化合物との結合対を混合液から分離し、精製する段階、ｅ）結合対から細胞構成成分を分離する段階、とからなる。ゲスト化合物が結合された反応性化合物は、反応性化合物と式２のゲスト化合物との共有結合で得られ、ホスト化合物が結合された固体相は、固体相と、式１のホスト化合物との共有結合で得られる。反応性化合物は、生体成分、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、抗原、抗体、アプタマー、葉酸、トランスフェリン、およびこれらからの組合せのグループから選ばれる少なくとも一種である。【選択図】図３
2011518151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞構成成分の分離方法であり、
ａ）ゲスト（ｇｕｅｓｔ）化合物が結合された反応性化合物を、細胞と接触させる段階、
ｂ）前記細胞を溶解させる段階、
ｃ）前記細胞が溶解された溶液に、ホスト（ｈｏｓｔ）化合物が結合された固体相（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ）を加えて混合液とする段階、
ｄ）前記細胞構成成分に結合されたゲスト化合物と前記固体相に結合されたホスト化合物との結合対（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｉｒ）を、前記混合液から分離し、精製する段階、
ｅ）前記結合対から、前記細胞の構成成分を分離する段階、とからなり、
前記ゲスト化合物が結合された反応性化合物が、反応性化合物と、下記式２〔式２において、Ａ３は、式１で表されるホスト化合物と非共有結合を形成できる官能基であり、アダマンタン、フェロセン、メタロセン、カルボラン、シクラム、クラウンエーテル、アミノ酸、ペプチド、アルカロイド、シスプラチン、オキサリプラチン、オリゴヌクレオチド、ローダミンまたはナノ粒子のグループから選ばれる一つの化合物の末端から一つの原子を除いて得られ、Ａ４は、アミン基およびカルボキシル基から選ばれる官能基であり、Ｂ１は、−（Ｒ２Ｏ）ｍ−、Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ５−Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン基、Ｃ４−Ｃ７ヘテロアリーレン基、およびＣ１−Ｃ２０アルキルシリレン基からなるグループから選ばれる少なくとも一つの第１官能基、および−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）−、および−Ｓ−Ｓ−からなるグループから選ばれる少なくとも一つの第２官能基で、第２官能基においては−Ｎ（Ｒ１）−を必須であり、ｍは、１から５の実数であり、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ３アルキレン基であり、Ｒ１は、水素またはＣ１−Ｃ５アルキル基である。〕で表されるゲスト化合物とを共有結合させて得られ、前記ホスト化合物が結合された固体相が、固体相と、下記式１〔式１において、ｎは、６から１０の整数であり、Ｘは、Ｏ，ＳまたはＮＨのグループから選ばれる一つであり、Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨＲ、ＣＯＯＨ、Ｏ（ＣＨ２）ａＳ（ＣＨ２）ｂＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ａＳ（ＣＨ２）ｂＣＯＯＨであり、ａおよびｂはそれぞれ独立して、１から５の整数であり、Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３０アルキル基、Ｃ２−Ｃ３０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ３０アルキニル基、Ｃ２−Ｃ３０カルボニルアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０チオアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０アルキルチオール基、Ｃ１−Ｃ３０ヒドロキシアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０アルキルシリル基、Ｃ１−Ｃ３０アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０アミノアルキルチオアルキル基、Ｃ５−Ｃ３０シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０アリール基、Ｃ７−Ｃ３０アリールアルキル基、Ｃ４−Ｃ３０ヘテロアリール基、およびＣ４−Ｃ３０ヘテロアリールアルキル基から構成されたグループから選ばれ、Ａ１およびＡ２が同時に水素ではない。〕で表されるホスト化合物とを共有結合させて得られ、前記反応性化合物が、生体成分、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、抗原、抗体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、葉酸およびトランスフェリンおよびこれらからの組合せから選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする細胞構成成分の分離方法。
【化１１】
2011518151.tif 000013
【化１２】
2011518151.tif 000014
【請求項２】
前記細胞構成成分は、細胞膜タンパク質、酵素、核酸、タンパク質、アミノ酸、抗体、抗原、阻害剤、ビタミン、補助因子、脂肪酸、細胞膜、基質、基質類似物、抑制剤、補酵素、ウィルス、レクチン、多糖類、グリコプロテイン、受容体、ヒストン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、ホルモン受容体、グルタチオン、およびこれらからの組合せのグループから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項３】
前記生体分子が、細胞膜タンパク質、酵素、核酸、タンパク質、アミノ酸、抗体、抗原、阻害剤、ビタミン、補助因子、脂肪酸、細胞膜、基質、基質類似物、抑制剤、補酵素、ウイルス、レクチン、多糖類、グリコプロテイン、受容体、ヒストン、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ホルモン受容体、グルタチオン、およびこれらからの組合せのグループから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項４】
前記固体相が、ポリマー、磁性粒子、ポリマーコート磁性粒子、シリカゲル、アガロース・ゲル、ポリマーまたは金コートされたシリカゲル、酸化ジルコニウム、モノリシックポリマー、金薄膜、銀薄膜、ガラス、ＩＴＯ−コートガラス、シリコン、金属電極、ナノロッド、ナノチューブ、ナノワイヤ、カードランガム、セルロース、ナイロン膜、セファロース、セファデックス，およびこれらからの組合せのグループから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項５】
前記固体相が、その表面に末端反応性官能基を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項６】
前記末端反応性官能基が、ハロゲン基、シアノ基、カルボキシル基、アミン基、ヒドロキシ基、アリルオキシ基、スクシンイミジル基、チオール基、およびこれらからの組合せのグループから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項５に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項７】
前記固体相が、ビーズ状であることを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項８】
前記式１で表されるホスト化合物に含まれたヒドロキシ基の数が、１から１４の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項９】
前記式１で表されるホスト化合物に含まれたヒドロキシ基の数が、５から６の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項１０】
前記ホスト化合物が、下記の式３ないし５〔式中、ｎは６ないし１０の整数であり、ＸはＯ，ＳまたはＮＨから選ばれる一つである。〕のグループから選ばれる一つで表わされることを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【化１３】
2011518151.tif 000015
【請求項１１】
前記式１において、ｎが７であり、ＸがＯであることを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項１２】
前記ゲスト化合物が、下記の式６ないし１０のグループから選ばれる一つで表わされることを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【化１４】
2011518151.tif 000016
【請求項１３】
前記ｄ）段階と前記ｅ）段階との間で、還元剤を用いて式２のゲスト化合物のジスルフィド結合を開裂させる段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項１４】
前記ｅ）段階で、前記細胞構成成分の分離が、前記結合対に塩基性水溶液を適用することによってなされることを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項１５】
前記ｅ）段階で、前記結合対に塩基性水溶液を作用させて、前記細胞構成成分を分離することを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項１６】
前記ａ）段階および前記ｂ）段階の代わりに、
ａ’）細胞を溶解させる段階、ｂ’）前記細胞が溶解された溶液に、ゲスト化合物が結合された反応性化合物を加える段階、を行うことを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項１７】
前記ａ）段階で、前記ゲスト化合物の代わりに、前記ホスト化合物が前記反応性化合物に結合され、前記ｃ）段階で、前記ホスト化合物の代わりに、前記ゲスト化合物が前記固体相に結合されることを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項１８】
前記ｄ）段階の精製において、使用される洗浄液が、メタノール、トリフルオロ酢酸、トリエチルアミン、塩化メチレン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、トルエン、アセトニトリル、キシレン、クロロベンゼン、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、エタノール、ジグリコールエーテル、シリコンオイル、超臨界二酸化炭素、イオン性液体、Ｎ−メチルピロリジン、ピリジン、水、水酸化アンモニウム、ジオキサン、クロロホルム、およびこれらからの組合せのグループから選ばれる少なくとも一つの溶剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞構成成分の分離方法。
【請求項１９】
前記ｄ）段階の精製において、使用される洗浄液が、トリス塩酸、塩化ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トライトン（ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、トライトン（ｔｒｉｔｏｎ）ｘ−１１４、トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）−２０、トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）−８０、ブリジ（Ｂｒｉｊ）−３５、ブリジ（Ｂｒｉｊ）−５８、オクチル−ベータ−グルコシド、Ｏ６グアニン・トランスフェラーゼ（ＯＧＴ）、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ジオキシコール酸ナトリウム、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、プロテアーゼ・インヒビター（ＰＭＳＦ）、ピロホスフェート、ベータ−グリセロホスフェート、フッ化ナトリウム、塩化カリウム、バナジン酸ナトリウムからのグループから選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）ホスト化合物が結合された固体相と、
ｂ）ゲスト化合物が結合された反応性化合物と、を含む細胞構成成分の分離装置であって、
前記ホスト化合物が結合された固体相が、固体相と、下記式１〔式１において、ｎは、６から１０の整数であり、Ｘは、Ｏ，ＳまたはＮＨのグループから選ばれる一つであり、Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨＲ、ＣＯＯＨ、Ｏ（ＣＨ２）ａＳ（ＣＨ２）ｂＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ａＳ（ＣＨ２）ｂＣＯＯＨであり、ａおよびｂはそれぞれ独立して、１から５の整数であり、Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３０アルキル基、Ｃ２−Ｃ３０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ３０アルキニル基、Ｃ２−Ｃ３０カルボニルアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０チオアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０アルキルチオール基、Ｃ１−Ｃ３０ヒドロキシアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０アルキルシリル基、Ｃ１−Ｃ３０アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０アミノアルキルチオアルキル基、Ｃ５−Ｃ３０シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０アリール基、Ｃ７−Ｃ３０アリールアルキル基、Ｃ４−Ｃ３０ヘテロアリール基、およびＣ４−Ｃ３０ヘテロアリールアルキル基から構成されたグループから選ばれ、Ａ１およびＡ２が同時に水素ではない。〕で表されるホスト化合物とを共有結合させて得られ、前記ゲスト化合物が結合された反応性化合物が、反応性化合物と、下記式２〔式２において、Ａ３は、式１で表されるホスト化合物と非共有結合を形成できる官能基であり、アダマンタン、フェロセン、メタロセン、カルボラン、シクラム、クラウンエーテル、アミノ酸、ペプチド、アルカロイド、シスプラチン、オキサリプラチン、オリゴヌクレオチド、ローダミンまたはナノ粒子のグループから選ばれる一つの化合物の末端から一つの原子を除いて得られ、Ａ４は、アミン基およびカルボキシル基から選ばれる官能基であり、Ｂ１は、−（Ｒ２Ｏ）ｍ−、Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ５−Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン基、Ｃ４−Ｃ７ヘテロアリーレン基、およびＣ１−Ｃ２０アルキルシリレン基からなるグループから選ばれる少なくとも一つの第１官能基、および−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）−、および−Ｓ−Ｓ−からなるグループから選ばれる少なくとも一つの第２官能基で、第２官能基においては−Ｎ（Ｒ１）−を必須であり、ｍは、１から５の実数であり、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ３アルキレン基であり、Ｒ１は、水素またはＣ１−Ｃ５アルキル基である。〕で表されるゲスト化合物とを共有結合させて得られ、前記反応性化合物が、生体成分、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、抗原、抗体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、葉酸およびトランスフェリンおよびこれらからの組合せから選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする細胞構成成分の分離装置。
【化１５】
2011518151.tif 000017
【化１６】
2011518151.tif 000018
【請求項２１】
前記生体分子が、細胞膜タンパク質、酵素、核酸、タンパク質、アミノ酸、抗体、抗原、阻害剤、ビタミン、補助因子、脂肪酸、細胞膜、基質、基質類似物、抑制剤、補酵素、ウイルス、レクチン、多糖類、グリコプロテイン、受容体、ヒストン、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ホルモン受容体、グルタチオン、およびこれらからの組合せのグループから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項２０に記載の細胞構成成分の分離装置。
【請求項２２】
前記固体相が、ポリマー、磁性粒子、ポリマーコート磁性粒子、シリカゲル、アガロース・ゲル、ポリマーまたは金コートされたシリカゲル、酸化ジルコニウム、モノリシックポリマー、金薄膜、銀薄膜、ガラス、ＩＴＯ−コートガラス、シリコン、金属電極、ナノロッド、ナノチューブ、ナノワイヤ、カードランガム、セルロース、ナイロン膜、セファロース、セファデックス，およびこれらからの組合せのグループから選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする請求項２０に記載の細胞構成成分の分離装置。
【請求項２３】
前記ホスト化合物が、下記の式３ないし５〔式中、ｎは６ないし１０の整数であり、ＸはＯ，ＳまたはＮＨから選ばれる一つである。〕のグループから選ばれる一つで表わされることを特徴とする請求項２０に記載の細胞構成成分の分離装置。
【化１７】
2011518151.tif 000019
【請求項２４】
前記式１において、ｎが７であり、ＸがＯであることを特徴とする請求項２０に記載の細胞構成成分の分離装置。
【請求項２５】
前記ゲスト化合物が、下記の式６ないし１０のグループから選ばれる一つで表わされることを特徴とする請求項２０に記載の細胞構成成分の分離装置。
【化１８】
2011518151.tif 000020
【請求項２６】
前記ゲスト化合物の代わりに、前記ホスト化合物が前記反応性化合物に結合され、前記ホスト化合物の代わりに、前記ゲスト化合物が前記固体相に結合されることを特徴とする請求項２０に記載の細胞構成成分の分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞構成成分の分離および精製方法に係り、特に、ククルビツリル誘導体であるホスト化合物と、ゲスト化合物との間の非共有結合を用いての細胞構成成分の選択的分離および精製方法、並びにこれを利用した装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
シクロデキストリン（特許文献１参照）、クラウンエーテル（特許文献２参照）のようなホスト化合物（ｈｏｓｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、各種ゲスト化合物（ｇｕｅｓｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）と結合することができ、特定物質の分離および除去の方法として有用である。ホスト化合物は、カラム充填剤として使用されるシリカゲル、ゼオライト、酸化チタン、セルロースのようなポリマー固体基質に、共有結合的に結合する。固体基質と共有結合したホスト化合物は、多種のカラムクロマトグラフィでのカラム充填剤の固定相（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ）として利用され、試料の分離に利用される。
【０００３】
シクロデキストリンなどとは異なり、ククルビツリルは、疎水性化合物以外に多種の親水性化合物をゲスト化合物と、特にアミンが置換された生化学的化合物と非共有結合を形成できるホスト化合物である（非特許文献１，２、特許文献３参照）。従って、ククルビツリル誘導体を用いて多様な化合物が分離できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４５３９３９９号明細書
【特許文献２】韓国特許第０２６３８２号明細書
【特許文献３】欧州特許第１０９４０６５号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】アメリカ化学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）２００１年，１２３巻，１１３１６頁
【非特許文献２】有機化学雑誌（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）１９８６年，５１巻，１４４０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ククルビツリル誘導体とゲスト化合物との非共有結合を利用した細胞構成成分の分離および精製方法を提供する。本発明はまた、この方法を利用した装置を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の態様によれば、本発明は細胞構成成分の分離方法であり、
ａ）ゲスト（ｇｕｅｓｔ）化合物が結合された反応性化合物を、細胞と接触させる段階と、
ｂ）前記細胞を溶解させる段階と、
ｃ）前記細胞が溶解された溶液に、ホスト（ｈｏｓｔ）化合物が結合された固体相（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ）を加えて混合液とする段階と、
ｄ）細胞構成成分に結合されたゲスト化合物と固体相に結合されたホスト化合物との結合対（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｉｒ）を、前記混合液から分離し、精製する段階と、
ｅ）結合対から、細胞構成成分を分離する段階と、からなっている。
ここで、ゲスト化合物が結合された反応性化合物は、反応性化合物と、下記式２のゲスト化合物とを共有結合されて得られ、ホスト化合物が結合された固体相は、固体相と、下記式１のホスト化合物とを共有結合されて得られる。反応性化合物は、生体成分、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、抗原、抗体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、葉酸およびトランスフェリンおよびこれらからの組合せから選択される少なくとも一種である。
【０００８】
【化１】
2011518151.tif 000003
【０００９】
ここで、ｎは、６から１０の整数であり、Ｘは、Ｏ，ＳまたはＮＨのグループから選ばれる一つである。
Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨＲ、ＣＯＯＨ、Ｏ（ＣＨ２）ａＳ（ＣＨ２）ｂＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ａＳ（ＣＨ２）ｂＣＯＯＨであり、ａおよびｂはそれぞれ独立して、１から５の整数であり、Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３０アルキル基、Ｃ２−Ｃ３０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ３０アルキニル基、Ｃ２−Ｃ３０カルボニルアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０チオアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０アルキルチオール基、Ｃ１−Ｃ３０ヒドロキシアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０アルキルシリル基、Ｃ１−Ｃ３０アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０アミノアルキルチオアルキル基、Ｃ５−Ｃ３０シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０アリール基、Ｃ７−Ｃ３０アリールアルキル基、Ｃ４−Ｃ３０ヘテロアリール基、およびＣ４−Ｃ３０ヘテロアリールアルキル基から構成されたのグループから選ばれ、Ａ１およびＡ２が同時に水素ではない。
【００１０】
【化２】
2011518151.tif 000004
【００１１】
ここで、Ａ３は、式１で表されるホスト化合物と非共有結合を形成できる官能基であり、アダマンタン、フェロセン、メタロセン、カルボラン、シクラム、クラウンエーテル、アミノ酸、ペプチド、アルカロイド、シスプラチン、オキサリプラチン、オリゴヌクレオチド、ローダミンまたはナノ粒子のグループから選ばれる一つの化合物の末端から一つの原子を除いて得られる。Ａ４は、アミン基およびカルボキシル基から選ばれる官能基である。
【００１２】
Ｂ１は、−（Ｒ２Ｏ）ｍ−、Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ５−Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン基、Ｃ４−Ｃ７ヘテロアリーレン基、およびＣ１−Ｃ２０アルキルシリレン基からなるグループから選ばれる少なくとも一つの第１官能基、および−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）−、および−Ｓ−Ｓ−からなるグループから選ばれる少なくとも一つの第２官能基で、第２官能基においては−Ｎ（Ｒ１）−を必須であり、ｍは、１から５の実数であり、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ３アルキレン基であり、Ｒ１は、水素またはＣ１−Ｃ５アルキル基である。
【００１３】
本発明の態様によれば、本発明は細胞構成成分の分離装置であり、
ａ）ホスト化合物が結合された固体相と、
ｂ）ゲスト化合物が結合された反応性化合物と、からなっている。
ここで、ホスト化合物が結合された固体相は、固体相と式１のホスト化合物との共有結合で得られ、ゲスト化合物が結合された反応性化合物は、反応性化合物と式２のゲスト化合物との共有結合で得られる。反応性化合物は、生体成分、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、抗原、抗体、アプタマー、葉酸、トランスフェリン、およびこれらからの組合せから選択される少なくとも一種である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の分離方法によれば、固体相または細胞構成成分に選択的に共有結合で結合されたホスト化合物が、ゲスト化合物と、条件によって可逆的に結合／分解する非共有結合対を形成することによって、細胞構成成分が、細胞などから容易に選択的に分離され、精製可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】固体相に結合されたホスト化合物と、反応性化合物に結合されたゲスト化合物、との間に形成された非共有結合を図示している。
【図２】製造例１によるモノアミン・ククルビット［７］ウリルのアガロース・ビーズへの固定化を図示している。
【図３】実施例１による細胞構成成分の分離および精製を図示している。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いての、実施例１および比較例１によって分離および精製された細胞膜タンパク質の結果である。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いての、実施例２および比較例２によって分離および精製された細胞膜タンパク質の結果である。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いての、実施例３によって分離および精製された抗原（Ｍｕｎｃ−１８）の結果である。
【図７】実施例４と比較例３によって分離および精製された細胞膜タンパク質の免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）の結果である。
【図８】製造例２による、ヒドロキシ・ククルビット［７］ウリル（ＣＢ［７］（ＯＨ）６）の、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルセファロース・ビーズへの固定化を図示している。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の具体的実施形態を示した添付図面を参照しつつ、より詳細に記載する。
一つの実施形態による細胞構成成分の分離方法は、
ａ）ゲスト（ｇｕｅｓｔ）化合物が結合された反応性化合物を、細胞と接触させる段階、
ｂ）細胞を溶解させる段階、
ｃ）ホスト（ｈｏｓｔ）化合物が結合された固体相（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ）を、細胞の溶解液に加えて混合液とする段階、
ｄ）細胞構成成分に結合されたゲスト化合物と固体相に結合されたホスト化合物との結合対（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｉｒ）を、混合液から分離し、精製する段階、
ｅ）結合対から、細胞構成成分を分離する段階、とからなっている。
ここで、ゲスト化合物が結合された反応性化合物は、反応性化合物と式２のゲスト化合物との共有結合で得られ、ホスト化合物が結合された固体相は、固体相と式１のホスト化合物との共有結合で得られる。反応性化合物は、生体成分、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、抗原、抗体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、葉酸、トランスフェリン、およびこれらからの組合せのグループから選ばれる少なくとも一種である。
【００１７】
【化３】
2011518151.tif 000005
【００１８】
ここで、ｎは、６から１０の整数であり、Ｘは、Ｏ，ＳまたはＮＨのグループから選ばれる一つである。Ａ１およびＡ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＨＲ、ＣＯＯＨ、Ｏ（ＣＨ２）ａＳ（ＣＨ２）ｂＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ａＳ（ＣＨ２）ｂＣＯＯＨのグループから選ばれ、ａとｂはそれぞれ独立して、１から５の整数であり、Ｒは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ３０アルキル基、Ｃ２−Ｃ３０アルケニル基、Ｃ２−Ｃ３０アルキニル基、Ｃ２−Ｃ３０カルボニルアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０チオアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０アルキルチオール基、Ｃ１−Ｃ３０ヒドロキシアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０アルキルシリル基、Ｃ１−Ｃ３０アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ３０アミノアルキルチオアルキル基、Ｃ５−Ｃ３０シクロアルキル基、Ｃ２−Ｃ３０ヘテロシクロアルキル基、Ｃ６−Ｃ３０アリール基、Ｃ７−Ｃ３０アリールアルキル基、Ｃ４−Ｃ３０ヘテロアリール基、およびＣ４−Ｃ３０ヘテロアリールアルキル基のグループから選ばれ、Ａ１およびＡ２が同時に水素ではない。
【００１９】
【化４】
2011518151.tif 000006
【００２０】
ここで、Ａ３は、式１のホスト化合物と非共有結合を形成できる官能基であり、アダマンタン、フェロセン、メタロセン、カルボラン、シクラム、クラウンエーテル、アミノ酸、ペプチド、アルカロイド、シスプラチン、オキサリプラチン、オリゴヌクレオチド、ローダミンまたはナノ粒子のグループから選ばれる一つの化合物の末端原子から一つの原子が除かれて得られる官能基であり、Ａ４は、アミン基およびカルボキシル基のグループからなる選ばれる官能基である。
【００２１】
Ｂ１は、−（Ｒ２Ｏ）ｍ−、Ｃ１−Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ５−Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ６−Ｃ２０アリーレン基、Ｃ４−Ｃ７ヘテロアリーレン基、およびＣ１−Ｃ２０アルキルシリレン基のグループから選ばれる少なくとも一つの第１官能基、および−Ｎ（Ｒ１）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ１）Ｃ（＝Ｏ）−、およびＳ−Ｓ−のグループから選ばれる少なくとも一つの第２官能基で、第２官能基においては−Ｎ（Ｒ１）−を必須であり、ｍは、１から５の実数であり、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ３アルキレン基であり、Ｒ１は、水素またはＣ１−Ｃ５アルキル基であり、例えば、Ｒ１はメチル基であってよい。
【００２２】
本発明の分離方法によれば、固体相または細胞構成成分に選択的に共有結合で結合されるホスト化合物が、ゲスト化合物と、条件によって可逆的に結合／分解する非共有結合対を形成することによって、細胞構成成分が、細胞などから容易に選択的に分離され、精製可能である。
【００２３】
ａ）段階で、ゲスト化合物が結合された反応性化合物は、細胞と接触して細胞構成成分を結合する。反応性化合物は、細胞構成成分と共有結合を形成し得る反応基を有する化合物、または特定の細胞構成物質を認識できる化合物である。細胞構成成分と共有結合を形成できる反応性化合物を使用して、細胞膜タンパク質を分離できる。特定の細胞構成成分を認識できる反応性化合物を用いて、ホスホリパーゼ（ＰＬＤ）、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）、ムンク１８タンパク質（Ｍｕｎｃ−１８）のような特定タンパク質が分離できる。適切な反応性化合物を用いることにより、式２で表されるゲスト化合物は、種々の細胞構成成分に結合できる。
【００２４】
一般に、反応性化合物と共有結合した式２のゲスト化合物は、ゲスト化合物を細胞含有溶液に加えることにより細胞と接触できる。しかし、当業者で一般に使用されるいかなる方法も使用できる。
【００２５】
ｂ）段階では、細胞は、細胞溶解溶液に溶解される。しかし、当業者で一般に使用されるいかなる方法も限定されることなく使用できる。
【００２６】
ｃ）段階では、ホスト化合物に結合された固体相をゲスト化合物溶液に加えることにより、ホスト化合物に結合された固体相は、ゲスト化合物と非共有結合して結合対を形成できる。結合対の形成は、ＩＲ吸収スペクトルで確認できる。
【００２７】
例えば、式２のゲスト化合物が、式１のククルビツリル誘導体の空洞に挿入され、非共有結合を形成する。この非共有結合の形成は、溶液のｐＨに依存している。特に、式１のホスト化合物としての式１のククルビツリル誘導体は、酸性溶液中で式２のゲスト化合物と結合対を形成する。結合対は、塩基性溶液中では、分解する。言い換えれば、式２のゲスト化合物のアミン基が水素化される条件では、結合対が形成され、アミン基が脱水素化される条件では、結合対が分解する。ｐＨが８またはそれ以下での溶液中では、ククルビツリル誘導体化合物とゲスト化合物との結合定数が約１０１０〜１０１５Ｍ−１になり、ククルビツリル誘導体の殆どは、ゲスト化合物と非共有的に結合している。しかし、ｐＨが８より大きい溶液では、ククルビツリル誘導体化合物とゲスト化合物との結合定数が、およそ１００〜１０４Ｍ−１の範囲となり、結合対の殆どは分解する。このように、溶液のｐＨが下がる、すなわち、酸性になるほど、ククルビツリル誘導体とゲスト化合物との結合定数は増加する。溶液のｐＨが上昇する、すなわち、塩基性になるほど、ククルビツリル誘導体とゲスト化合物との結合定数は減少する。
【００２８】
例えば、ホスト化合物であるククルビツリル誘導体（ｎ＝７）と、ゲスト化合物であるアダマンタンアミンまたはフェロセンメチルアミン誘導体との間の結合定数は、ｐＨが８またはそれ以下では、およそ１０１２Ｍ−１またはそれ上の結合定数であり、ククルビツリル誘導体は、アダマンタンアミンまたはフェロセンメチルアミン誘導体と非共有的ではあるが結合している。一方、ｐＨが８より大きいと、１０４Ｍ−１またはそれ以下であり、結合対は分解する。
【００２９】
ｄ）段階では、結合対が、例えば、濾過、磁石を使用する方法など当業者で一般に用いられる方法で、混合物から分離され、精製される。この分離および精製方法は、結合対に含まれた固体相の性状によって変えることができる。
【００３０】
ｅ）段階では、分離された細胞構成成分は、さらに透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）のような精製段階を用いて精製できる。
【００３１】
細胞構成成分は、細胞膜タンパク質、酵素、核酸、タンパク質、アミノ酸、抗体、抗原、阻害剤、ビタミン、補助因子、脂肪酸、細胞膜、基質、基質類似物、抑制剤、補酵素、ウィルス、レクチン、多糖類、グリコプロテイン、受容体、ヒストン、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、ホルモン受容体、およびグルタチオンのグループから選ばれる少なくとも一つであるが、これに限定されるものではない。細胞構成成分の表面にあるアミン基またはカルボキシル基のような末端反応性官能基を有し、反応性化合物と共有結合を形成できる化合物、または反応性化合物が認識できる化合物は、いずれも使用できる。
【００３２】
生体分子は、細胞膜タンパク質、酵素、核酸、タンパク質、アミノ酸、抗体、抗原、阻害剤、ビタミン、補助因子、脂肪酸、細胞膜、基質、基質類似物、抑制剤、補酵素、ウイルス、レクチン、多糖類、グリコプロテイン、受容体、ヒストン、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ホルモン受容体、グルタチオンのグループから選ばれる少なくとも一つである。すなわち、細胞構成成分は、反応性化合物である。例えば細胞構成成分において、抗原がゲスト化合物に結合され、抗体と結合されたとき、抗原は、反応性化合物として機能する。生体分子は、アミン基またはカルボキシル基のような末端反応性官能基を有しており、細胞構成成分と共有結合を形成する。
【００３３】
酵素は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびこれらの組み合わせのグループから選ばれる少なくとも一つである。
【００３４】
固体相は、ポリマー、磁性粒子、ポリマーコート磁性粒子、シリカゲル、アガロース・ゲル、ポリマーまたは金コートされたシリカゲル、酸化ジルコニウム、モノリシックポリマー、金薄膜、銀薄膜、ガラス、ＩＴＯ−コートガラス、シリコン、金属電極、ナノロッド、ナノチューブ、ナノワイヤ、カードランガム、セルロース、ナイロン膜、セファロース、セファデックス，およびこれらからの組合せのグループから選ばれる少なくとも一つであり、例えば、アガロース・ゲルである。固体相は、表面に末端反応基を有することができる。末端反応基は、式１のホスト化合物と共有結合を形成する。この末端反応基は、ハロゲン基、シアノ基、カルボキシル基、アミン基、ヒドロキシ基、アリルオキシ基、スクシンイミジル基、チオール基、およびこれらからの組合せのグループから選ばれる少なくとも一つである。固体相は、ビーズ（ｂｅａｄ）の形状であることができる。
【００３５】
式１のホスト化合物の１つの分子中に含まれるヒドロキシ基の数は、１から１４の範囲であって、例えば、５あるいは６である。このホスト化合物は、下記の式３〜５で表わされるグループから選ばれる。
【００３６】
【化５】
2011518151.tif 000007
【００３７】
ここで、ｎは６から１０の範囲の整数であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨのグループから選ばれる一つである。
【００３８】
式１において、ｎ＝７、ＸがＯであることができる。すなわち、ホスト化合物は、ククルビット［７］ウリル誘導体であることができる。
【００３９】
式２のゲスト化合物は、下記の式６〜１０で表わされるグループから選ばれる一つである。
【００４０】
【化６】
2011518151.tif 000008
【００４１】
式６〜１０の一つで表わされるゲスト化合物は、反応性化合物であるＮ−ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドスルホネートと共有結合で結合して、式１１〜１５の一つで表わされるａ）段階のゲスト化合物が結合された反応性化合物を形成する。
【００４２】
【化７】
2011518151.tif 000009
【実施例】
【００４３】
本発明を、以下の実施例を参照してさらに詳細に説明する。以下の実施例は、説明のためのものであるので、本発明の範囲を制限することを意図していない。
〔製造例１〕ホスト化合物（モノアミン・ククルビット［７］ウリル）の固体相への固定：
モノアミン・ククルビット［７］ウリル１０ｍｇ（７．７×１０−３ｍｍｏｌ）を、カップリングバッファー（０．１Ｍ−ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ−ＮａＣｌ、ｐＨ８．４）２ｍＬに加えて溶かした。臭化シアノゲン活性化アガロース・ビーズ（ｃｙａｏｇｅｎ  ｂｒｏｍｉｄｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｇａｒｏｓｅ  ｂｅａｄ）０．５ｇをＨＣｌ水溶液（１ｍＭ）５０ｍＬに加え、３０分間膨脹させた。この混合物を、ビーズが割れないように４００ｒｐｍまたはそれ以下の速度で遠心分離し、その上澄み液を除去し、蒸溜水５０ｍＬを加えてビーズを洗浄した。ビーズを、４ｍＬバイアル小瓶に移し、モノアミン・ククルビット［７］ウリルが溶解したカップリング・バッファー２ｍＬを加えて、常温で２時間ゆっくり回転させた。４００ｒｐｍまたはそれ以下の速度で遠心分離し、上澄み液を除去し、残留物をカップリング・バッファーで洗浄した。エタノールアミン（１Ｍ）４ｍＬを加え、混合物を常温で２時間ゆっくり回転し、残存するシアノゲン基を不活性化させた。酢酸バッファー（０．１Ｍ−酢酸、０．５Ｍ−ＮａＣｌ、ｐＨ４）とカップリング・バッファーで交互に洗浄した（各５回）。図２に、この固定化プロセスを図示している。
【００４４】
〔製造例２〕ホスト化合物（ヒドロキシ・ククルビット［７］ウリル）の固体相への固定：
イソプロパノールに溶解したＮ−ヒドロキシスクシンイミジル・セファロース・ビーズスラリー（Ｈ８２８２０Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（商品名）、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社品）１ｍＬを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で洗浄してイソプロパノールを除いた。ヒドロキシ・ククルビット［７］ウリル（ＣＢ［７］（ＯＨ）６）２７６ｍｇ（１４４μｍｏｌ）を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩８８ｍｇ（４６０μｍｏｌ）およびＮａＣｌ５０ｍｇ（８５０μｍｏｌ）を、ＤＭＳＯ６ｍＬに溶解し、トリエチルアミン１ｍＬと共にビーズに加えた。混合物を、常温で４８時間ゆっくり回転した後、４００ｒｐｍまたはそれ以下の速度で遠心分離し、上澄み液を除き、残留物をＤＭＳＯで洗浄した。次いで、蒸溜水と塩化ナトリウム水溶液（０．５Ｍ−ＮａＣｌ）で洗浄した（各５回）。図８に、固定化プロセスを図示する。
【００４５】
〔製造例３〕反応性化合物に結合されたゲスト化合物、フェロセン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ−ＮＨＳ）−ベースのゲスト化合物、の合成：
反応性化合物に結合されたゲスト化合物を、文献（Ｃ．Ｐａｄｅｓｔｅ，Ａ．Ｇｒｕｂｅｌｎｉｋ，Ｌ．Ｔｉｅｆｅｎａｕｅｒ，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０００年，１５巻，４３１頁）に記載された方法で合成した。
反応性化合物に結合されたこのゲスト化合物を、下記反応式１により合成した。
【００４６】
【化８】
2011518151.tif 000010
【００４７】
〔製造例４〕反応性化合物に結合されたゲスト化合物、アダマンタン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ａｄａｍａｎｔａｎｅ−Ｓ−Ｓ−ＮＨＳ）−ベースのゲスト化合物、の合成：
Ｎ−（１−アダマンタイル）エチレンジアミン１０ｍｇ（５．２×１０−２ｍｍｏｌ、ＴＣＩ）と、ジチオジグリコール酸２８ｍｇ（１．５×１０−１ｍｍｏｌ）を、水５ｍＬに入れた。これを攪拌しつつ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）社品）９．８ｍｇ（５．２×１０−２ｍｍｏｌ）と、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、アルドリッチ社品）７．０ｍｇ（５．２×１０−２ｍｍｏｌ）を加え、２時間撹拌した。反応物を、セファデックス（ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１０を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ−ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）法で分離し、中間体化合物（アダマンタン−Ｓ−Ｓ−カルボン酸）１０ｍｇを得た（収率：５４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：ｄ＝１．７１−２．１４（ｍ）、２．６６（ｔ）、３．４５（Ｓ）、３．５０（ｍ）、３．５２（ｍ）；
ＥＩ−Ｍａｓｓ［Ｍ＋］計算値＝３５８．１、測定値＝３５８．１；
【００４８】
次いで、中間体化合物（アダマンタン−Ｓ−Ｓ−カルボン酸）１０ｍｇ（２．８×１０−２ｍｍｏｌ）を水５ｍＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ、アルドリッチ社品）４ｍｇ（３．５×１０−２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、常温で２時間撹拌して、生成物（アダマンタン−Ｓ−Ｓ−ＮＨＳ）を得た。反応混合物は、分離することなく、そのまま実施例２に供した。この中間体および生成物を、下記の反応式２に示している。
【００４９】
【化９】
2011518151.tif 000011
【００５０】
〔製造例５〕反応性化合物に結合されたゲスト化合物、フェロセン−Ｎ−メチル−ヒドロキシスクシンイミド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ−ｎ−ｍｅｔｈｌｙ−ＮＨＳ）ベースのゲスト化合物、の合成：
フェロセンアルデヒド６９０ｍｇ（３．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１０ｍＬに溶解し、２Ｍ−ＮａＯＨ２．５ｍＬに溶解した８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸４５６ｍｇ（２．８ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で２時間撹拌した。混合物を、常温に冷却し、蒸溜水２．５ｍＬに溶解したＮａＢＨ４を３２０ｍｇ（８．４ｍｍｏｌ）加え、１２時間撹拌した。混合物に酢酸（Ｈ２Ｏ中１０％）をゆっくり加えてｐＨを５に調整した。副生成物であるＦｃ−ＣＨ２ＯＨなどと、未反応で残っている８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸を、酢酸エチルを用いて反応物から抽出した。水層を、減圧条件下で５０℃に加熱して全体容積を減らし、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィで分離した。ＣＨＣｌ３中３０％−ＭｅＯＨ溶出液を用いて、Ｎ−（フェロセニルメチル）−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸を分離した（収率：４２％）。
【００５１】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ：２．９９（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝４．２Ｈｚ）、３．５８（ｓ状、４Ｈ）、３．６７（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝４．２Ｈｚ）、３．９０（ｓ、２Ｈ）、３．９５（ｓ、２Ｈ）、４．１５（ｓ、５Ｈ）、４．１９（ｓ、２Ｈ）、４．３５（ｓ、２Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、１２５ＭＨｚ）δ：４７．０、６７．０、７０．１（５Ｃ）、７０．７（２Ｃ）、７１．１、７１．２、７１．６、７１．７、７１．８（２Ｃ）、７６．７、１７６．９；
ＥＩＭＳ：３６１（Ｍ＋＋１）；
【００５２】
Ｎ−（フェロセニルメチル）−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸３６ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル２ｍＬに溶解し、３０％−ホルマリン水溶液を５０Ｌ加え，３０分間撹拌した。ＮａＢＨ３ＣＮを加え、さらに３０分間撹拌した後，氷酢酸を加えてｐＨを５にした。混合物を常温で１２時間撹拌した後、過剰量の蒸溜水を加えて、３０分間撹拌し、濃縮し、カラムクロマトグラフィを用いて分離した。１：３ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３溶出液で、中間体化合物（Ｎ−（フェロセニルメチル）−Ｎ−メチル−８−アミノ−３，６、−ジオキサオクタン酸２０ｍｇを得た（収率：５５％）。
【００５３】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ：２．６１（ｓ、３Ｈ）、３．０１（ｓ状、２Ｈ）、３．６９−３．７１（ｍ、４Ｈ）、３．８１（ｓ状、２Ｈ）、４．０２（ｓ、２Ｈ）、４．１４（ｓ、５Ｈ）、４．２０（ｓ、２Ｈ）、４．２７（ｓ、２Ｈ）、４．３５（ｓ、２Ｈ）；
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δ：３９．４、５２．９、５５．７、６５．８、６９．０（５Ｃ）、６９．６（２Ｃ）、６９．９、７０．３（２Ｃ）、７０．８、７１．３（２Ｃ）、１７５．６；
ＥＩＭＳ：３７５（Ｍ＋＋１）
【００５４】
次いで、この中間体化合物（Ｎ−（フェロセニルメチル）−Ｎ−メチル−８−アミノ−３，６、−ジオキサオクタン酸）１０ｍｇ（２．６×１０−２ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ５０μＬに溶解し、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ、アルドリッチ社品）４ｍｇ（３．５×１０−２ｍｍｏｌ）と、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、アルドリッチ社品）６．６ｍｇ（３．５×１０−２ｍｍｏｌ）を加え、常温で２時間撹拌して、生成物（Ｆｃ−ＮＭｅ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）を得た。生成物は、分離することなく、そのまま実施例４に使用した。反応式３に、中間体化合物および生成物を示す。
【００５５】
【化１０】
2011518151.tif 000012
【００５６】
〔製造例６〕ゲスト化合物と抗体（ａｎｔｉ−Ｍｕｎｃ１８）との結合対の形成：
製造例３で合成したゲスト化合物（フェロセン−ＮＨＳリガンド）２．０ｍｇ（４．５×１０−３ｍｍｏｌ）を、抗体（ａｎｔｉ−Ｍｕｎｃ１８、０．１ｍｇ／１ｍＬ）１ｍＬと混合し、４℃で４時間回転させた。生成したゲスト化合物−抗体の結合対を，透析で精製した。リガンド−抗体の結合対の生成は、赤外線（ＩＲ）分光光度計で確認した。この結合対は、実施例３で使用した。
【００５７】
〔実施例１〕（フェロセン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ−ＮＨＳ）−ベースのゲスト化合物を用いた）細胞膜タンパク質の精製：
ＨＥＫ２９３細胞を、プレートで培養した後、培養液を除いた。細胞を、氷冷したリン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）５ｍＬで２回洗浄して、残っている培養液を完全に除いた。製造例３で合成したゲスト化合物２．０ｍｇ（３．８×１０−３ｍｍｏｌ）を、ＰＢＳ５ｍＬに溶解し、その溶液をＨＥＫ２９３細胞を含むプレートに加えた。細胞を、４℃で３０分間培養し、ゲスト化合物と細胞表面のタンパク質とで共有結合を形成するようにした。次に、プレートからゲスト化合物を含むＰＢＳを完全に除き、新たなＰＢＳを加えてタンパク質と結合せずに残っているゲスト化合物を除いた。０．１Ｍ−グリシン水溶液をプレートに加え、４℃で３０分間培養し、残存するゲスト化合物を不活性化させた。次いで、０．１Ｍ−グリシン水溶液を除き、残留物をＰＢＳバッファーで洗浄した。
【００５８】
細胞溶解液（１０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、０．１％−デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１％−Ｔｘ−１００、１％−デオキシコール酸ナトリウム）１ｍＬを、ＨＥＫ２９３細胞を含むプレートに加えた。細胞溶解液を含むプレート溶液を、１．５ｍＬのチューブに入れ、超音波をかけて細胞を溶解させ、１４，０００ｒｐｍの速度で遠心分離し、上澄み液０．７ｍＬを分けた。製造例１で合成したモノアミン・ククルビット［７］ウリル−アガロース・ビーズを４０μＬ加え、４℃で４時間ゆっくり回転した。混合液を、１，０００ｒｐｍの速度で遠心分離して上澄み液を除去し、残留ビーズを、細胞溶解液で５回洗浄した。２Ｘサンプルバッファー３０μＬを、洗浄したアガロース・ビーズに加え、混合物を、９５℃で５分間加熱し、ビーズからタンパク質を分離した。タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分離し、タンパク質のサイズ別に分けた。分離プロセスを、図３に図示している。実施例１によって分離したタンパク質を、図４の第２レーンに示している。
【００５９】
〔実施例２〕細胞膜タンパク質（アダマンタン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ａｄａｍａｎｔａｎｅ−Ｓ−Ｓ−ＮＨＳ）ゲスト化合物）の精製：
ＨＥＫ２９３細胞をプレートで培養した後、培養液を除いた。氷冷したリン酸食塩水（ＰＢＳ）５ｍＬで２回洗浄し、残っている培養液成分を完全に除いた。製造例４で合成したジスルフィド結合を持つゲスト化合物３．０ｍｇ（４．４×１０−３ｍｍｏｌ）をＰＢＳバッファー５ｍＬに溶解し、ＨＥＫ２９３細胞を含むプレートに加えた。４℃で３０分間培養し、リガンドと細胞表面のタンパク質とが共有結合するようにした。次いで、プレートからゲスト化合物を含むＰＢＳを除き、新たなＰＢＳを加えて、タンパク質と結合せずに残存しているゲスト化合物を除いた。プレートに０．１Ｍ−グリシン溶液を加え、４℃で３０分間培養して、残存しているゲスト化合物を不活性化させた。０．１−Ｍグリシン溶液を除き、ＰＢＳで洗浄した。
【００６０】
細胞溶解液（１０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、０．１％−ＳＤＳ、１％−Ｔｘ−１００、１％−デオキシコール酸ナトリウム）１ｍＬをプレートに加えた。この細胞溶解液を含むプレート溶液を、１．５ｍＬチューブに入れ、超音波をかけた。この混合物を、１４，０００ｒｐｍの速度で遠心分離し、その上澄み液０．７ｍＬを分けた。上澄み液に、製造例１で製造したモノアミン・ククルビット［７］ウリル−アガロース・ビーズ４０μμＬを加え、４℃で４時間ゆっくりと回転させた。次いで、１，０００ｒｐｍの速度で遠心分離し、その上澄み液を除き、分離したビーズを、細胞溶解液で５回洗浄した。洗浄されたアガロース・ビーズに、ＤＴＴ水溶液（１ｍＭ）４０μＬを加え、リガンドに含まれるジスルフィド結合を還元した。上澄み液２０μＬを、５Ｘサンプルバッファー５μＬを加え、９５℃で５分間加熱した。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを利用して分離し、タンパク質のサイズ別に区分けした。図３に、この分離プロセスを図示している。実施例２によって分離されたタンパク質を、図５の２レーンに示している。
【００６１】
〔実施例３〕抗原（Ｍｕｎｃ１８）の精製：
ＰＣ１２細胞をプレートで培養し、培養液を除いた。氷冷したＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄し、培養液を完全に除いた。ＰＣ１２を含むプレートに、細胞溶解液（１０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、０．１％−ＳＤＳ、１％−Ｔｘ−１００、１％−デオキシコール酸ナトリウム）１ｍＬを加えた。細胞溶解液を含むプレート溶液を、１．５ｍＬチューブに入れ、超音波をかけた。次いで、１４，０００ｒｐｍの速度で遠心分離し、上澄み液０．７ｍＬを分けた。
【００６２】
上澄み液に、製造例６で合成したゲスト化合物−抗体複合体３０μＬを加え、４℃で２４時間ゆっくりと回転させた。製造例１で製造されたモノアミン・ククルビット［７］ウリル−アガロース・ビーズ４０μＬを加え、４℃で４時間ゆっくり回転させ、次いで、１，０００ｒｐｍの速度で遠心分離し、上澄み液を除き、得られたビーズを、細胞溶解液で５回洗浄した。２Ｘサンプルバッファー３０μＬを加え、９５℃で５分間加熱し、タンパク質をビーズから分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製したタンパク質は、図６で、６８ＫＤａのサイズの抗原（Ｍｕｎｃ１８）であることが確認できた。
【００６３】
〔実施例４〕細胞膜タンパク質（フェロセン−Ｎ−メチル−ヒドロキシスクシンイミド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ−Ｎ−ｍｅｔｈｌｙ−ＮＨＳ）ベースのゲスト化合物）の精製：
ＨＥＫ２９３細胞をプレートで培養し、培養液を除いた。氷冷したＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄し、培養液を完全に除いた。製造例５で合成したゲスト化合物２．０ｍｇ（４．２×１０−３ｍｍｏｌ）をＰＢＳバッファー５ｍＬに溶解し、この溶液を、ＨＥＫ２９３細胞を含むプレートに加え、４℃で３０分間培養し、ゲスト化合物と細胞表面のタンパク質とに共有結合を形成させた。プレートから、ゲスト化合物が溶解しているＰＢＳを完全に除き、新たなＰＢＳを加えて、タンパク質と結合せずに残っているゲスト化合物を除いた。０．１Ｍ−グリシン溶液を、プレートに加え、４℃で３０分間培養し、残存するゲスト化合物を不活性化させた。０．１Ｍ−グリシン溶液を除き、ＰＢＳで洗浄した。
【００６４】
次いで、ＨＥＫ２９３細胞を含むプレートに、細胞溶解液（ＲＩＰＡバッファー、１０ｍＭ−トリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１ｍＭ−ＥＤＴＡ、０．１％−ＳＤＳ、１％−Ｔｘ−１００、１％−デオキシコール酸ナトリウム）１ｍＬを加えた。細胞溶解液を含むプレート溶液を、１．５ｍＬチューブに入れ、超音波をかけた。この溶液を、１４，０００ｒｐｍの速度で遠心分離し、上澄み液０．７ｍＬを分けた。この上澄み液に、製造例２で合成したヒドロキシ・ククルビット［７］ウリル−セファロース・ビーズ４０μＬを加え、４℃で４時間ゆっくり回転させた後、１，０００ｒｐｍの速度で遠心分離し、上澄み液を除き、得られたビーズを細胞溶解液で５回洗浄した。洗浄されたセファロース・ビーズに、２Ｘサンプルバッファー３０μＬを加え、９５℃で５分間加熱し、タンパク質をビーズから分離した。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、タンパク質のサイズ別に区分けした。図３には、この分離プロセスを図示している。
【００６５】
このタンパク質を、ポリフッ化ビニリデン膜を透過させた。抗体を用いて、図７に示すタンパク質の免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。図７によると、細胞膜タンパク質は、他の細胞小器官（ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）タンパク質からの汚染を少なくし、かつ選択的に回収される。
【００６６】
図７で、左側レーンがコントロールであり、ビーズで培養する前の細胞溶解液に含まれるタンパク質の初期量を示している。右側レーンのＨＯ−ＣＢ［７］−ビーズは、ＨＯ−ＣＢ［７］−ビーズを細胞溶解液で培養した後で回収されたタンパク質の量を示している。図７で、ＦＡは、フェロセン−ベースのゲスト化合物を使用したときの結果であり、ＮＴは、フェロセン−ベースのゲスト化合物を使用しないときの結果である。図７に示したタンパク質の位置を、各タンパク質の名称の下に括弧で示している。
【００６７】
〔比較例１〕（フェロセン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ−ＮＨＳ）−ベースのゲスト化合物を用いた）細胞膜タンパク質の精製：
ゲスト化合物と接触していないＨＥＫ２９３細胞を使用したことを除いて実施例１と同じ方法で、細胞膜タンパク質を分離した。比較例１によって分離されたタンパク質の分離結果を、図４の１レーンに示している。
【００６８】
〔比較例２〕細胞膜タンパク質（アダマンタン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ａｄａｍａｎｎｔａｎｅ−Ｓ−Ｓ−ＮＨＳ）−ベースのゲスト化合物）の精製：
ゲスト化合物と接触していないＨＥＫ２９３細胞の溶解液を使用したことを除いて実施例２と同じ方法で、細胞膜タンパク質を分離した。比較例２によって分離されたタンパク質の分離結果を、図５の１レーンに示している。
【００６９】
〔比較例３〕（フェロセン−Ｎ−メチル−ヒドロキシスクシンイミド（ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ−Ｎ−ｍｅｔｈｌｙ−ＮＨＳ）−ベースのゲスト化合物を用いた）細胞膜タンパク質の精製：
ゲスト化合物と接触していないＨＥＫ２９３細胞を使用したことを除いて実施例４と同じ方法で細胞膜タンパク質を分離した。比較例３によって分離されたタンパク質の分離結果を、図７の最右側のレーン（ＮＴ）に示している。
【００７０】
実施例および比較例で示したように、細胞構成成分は、本発明の方法により、簡単に、かつ選択的に分離することができる。
【００７１】
本発明を、実施形態を挙げて説明したが、当業者であれば、ここに記載された形態および詳細を、以下の特許請求の範囲に定義した技術範囲から逸脱することなく変更できることが理解されよう。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の方法によれば、細胞構成成分を、簡単に、かつ選択的に分離することができる。
【図１】
2011518151.tif 000021
【図２】
2011518151.tif 000022
【図３】
2011518151.tif 000023
【図４】
2011518151.tif 000024
【図５】
2011518151.tif 000025
【図６】
2011518151.tif 000026
【図７】
2011518151.tif 000027
【図８】
2011518151.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月4日(2011.1.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第４５３９３９９号明細書
【特許文献２】韓国特許第０２６３７８２号明細書
【特許文献３】欧州特許第１０９４０６５号明細書
【国際調査報告】
2011518151.tif 000029
2011518151.tif 000030