(57)【要約】  上部チャンバ、中間チャンバおよび下部チャンバを備える装置であって、前記上部チャンバは第１の細孔を通して前記中間チャンバと連通し、前記中間チャンバは第２の細孔を通して前記下部チャンバと連通し、前記第１の細孔および第２の細孔は直径約１ｎｍ〜約１００ｎｍであり、互いから約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ離れており、前記チャンバのそれぞれは、電源に接続するための電極を備える、装置が提供される。この装置を使用する方法は、特にポリヌクレオチドのシークエンシングのためにも提供される。
2014529296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上部チャンバ、中間チャンバおよび下部チャンバを備える装置であって、
前記上部チャンバは第１の細孔を通して前記中間チャンバと連通し、前記中間チャンバは第２の細孔を通して前記下部チャンバと連通し、
前記第１の細孔および第２の細孔は直径約１ｎｍ〜約１００ｎｍであり、互いから約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ離れており、
前記チャンバのそれぞれは、電源に接続するための電極を備える、装置。
【請求項２】
前記第１のおよび第２の細孔は実質的に同軸である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記装置は、ケイ素，窒化ケイ素，二酸化ケイ素，グラフェン，カーボンナノチューブ，ＴｉＯ２，ＨｆＯ２，Ａｌ２Ｏ３，金属層，ガラス，生体ナノ細孔，生体細孔挿入物を備える膜，およびこれらの組み合わせからなる群から選択される材料を含む、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記第１の細孔および前記第２の細孔は深さ約０．３ｎｍ〜約１００ｎｍである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記電源は、前記上部チャンバと前記中間チャンバとの間に第１の電圧と、前記中間チャンバと前記下部チャンバとの間に第２の電圧と、を提供するように構成され、前記第１の電圧および前記第２の電圧は独立して調節可能な、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記第１の電圧は、前記第２の細孔に亘る測定されたイオン電流に基づき調節される、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記電源は、前記第１の電圧および第２の電圧のそれぞれを生成するために電圧クランプシステムまたはパッチクランプシステムを備える、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記中間チャンバは前記２つの電圧に対して接地するように調節される、請求項６または７に記載の装置。
【請求項９】
前記中間チャンバは、前記細孔のそれぞれと当該中間チャンバ内の前記電極との間に伝導性を提供するための媒体を備える、請求項１〜８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
前記電源は更に、前記細孔のそれぞれを通る前記イオン電流を測定するように構成される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
上部チャンバ、中間チャンバおよび下部チャンバを備える装置であって、
前記上部チャンバは、第１の細孔を通して前記中間チャンバと連通し、前記中間チャンバは第２の細孔を通して前記下部チャンバと連通し、前記第１の細孔および第２の細孔は直径約１ｎｍ〜約１００ｎｍであり、互いから約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ離れており、
前記細孔のそれぞれに電圧を印加して前記細孔のそれぞれを通るイオンを測定するために電圧クランプまたはパッチクランプシステムに接続するための、前記チャンバのそれぞれにある電極を備え、前記中間チャンバ内の前記電極は前記２つの電圧クランプまたはパッチクランプシステムの共通するアースに接続される、装置。
【請求項１２】
細孔を通る荷電ポリマーの移動を制御する方法であって、
（ａ）荷電ポリマーを含むサンプルを請求項１１に記載の装置の前記上部チャンバ、中間チャンバまたは下部チャンバの一つに装填するステップを備え、ここで、前記装置は前記上部チャンバと前記中間チャンバとの間の第１の電圧、ならびに前記中間チャンバと前記下部チャンバとの間の第２の電圧を提供するための電圧クランプまたはパッチクランプシステムに接続され、
（ｂ）前記ポリマーが前記チャンバ間を移動するように初期の第１の電圧および初期の第２の電圧を設定するステップを備え、これにより、前記第１の細孔および第２の細孔の両方に亘って前記ポリマーを配置し、
（ｃ）前記第１の電圧および前記第２の電圧の両方が前記荷電ポリマーを前記中間チャンバから引き離すための力を生成するように前記第１の電圧および前記第２の電圧を調節するステップを備え、ここで、前記荷電ポリマーが一方向にかつ制御された方法で両方の細孔に亘って移動するように前記２つの電圧は制御された条件下で強度が異なる、方法。
【請求項１３】
前記サンプルは前記上部チャンバ内に装填され、前記初期の第１の電圧は前記荷電ポリマーを前記上部チャンバから前記中間チャンバへ引っ張るように設定され、前記初期の第２の電圧は前記荷電ポリマーを前記中間チャンバから前記下部チャンバへ引っ張るように設定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルは前記中間チャンバ内に装填され、前記初期の第１の電圧は前記荷電ポリマーを前記中間チャンバから前記上部チャンバへ引っ張るように設定され、前記初期の第２の電圧は前記荷電ポリマーを前記中間チャンバから前記下部チャンバへ引っ張るように設定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記荷電ポリマーは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記荷電ポリマーはポリヌクレオチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ，一本鎖ＤＮＡ，二本鎖ＲＮＡ，一本鎖ＲＮＡ，およびＤＮＡ−ＲＮＡ混成物からな群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）における前記調節された第１の電圧および第２の電圧は、前記２つの電圧間の強度の相違よりも約１０倍〜約１０，０００倍高い、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーのモノマー単位を特定するステップを更に備え、これは前記モノマー単位が前記細孔の一つを通過するときに当該細孔に亘るイオン電流を測定することによってなされる、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記モノマー単位はヌクレオチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記モノマー単位はヌクレオチド対である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記モノマーは分子に結合される、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子は、ＤＮＡ結合タンパクまたはナノ粒子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ結合タンパクは配列特異的なＤＮＡ結合タンパクである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリマーは当該ポリマーの一端にて固体支持体に接着される、請求項１２から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ポリヌクレオチドのシークエンスを決定するための方法であって、
（ａ）  ポリヌクレオチドを含むサンプルを請求項１１に記載の前記装置の前記上部チャンバ内に装填するステップを備え、前記装置は前記上部チャンバと前記中間チャンバとの間の第１の電圧、ならびに前記中間チャンバと前記下部チャンバとの間の第２の電圧を提供するための電圧クランプまたはパッチクランプシステムに接続され、前記ポリヌクレオチドは当該ポリヌクレオチドの一端にて固体支持体に任意に接着され、
（ｂ）  前記ポリヌクレオチドが前記上部チャンバから前記中間チャンバへおよび前記中間チャンバから前記下部チャンバへ移動するように初期の第１の電圧および初期の第２の電圧を設定するステップを備え、これにより、前記第１の細孔および第２の細孔の両方に亘って前記ポリマーを配置し、
（ｃ）  両方の電圧が前記ポリヌクレオチドを前記中間チャンバから引き離すための力を生成するように第１の電圧および第２の電圧を調節するステップを備え、ここで、前記ポリヌクレオチドが一方向にかつ制御された方法で両方の細孔に亘って移動するように前記２つの電圧は制御された条件下で強度が異なり、
（ｄ）  前記細孔の一方を通る前記ポリヌクレオチドの各ヌクレオチドを特定するステップを更に備え、これは前記ヌクレオチドが当該細孔を通過するときに当該細孔に亘るイオン電流を測定することによってなされる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願のクロスリファレンス）
本願は、２０１１年７月２０日に出願した米国仮特許出願番号第６１／５７２，８４３号の米国特許法第１１９（ｅ）条に基づく優先権を主張し、その内容は本願において援用する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ細孔はナノスケールの開口部であり、脂質膜（生体細孔）におけるタンパクチャネルとして自然に形成し、あるいは固体の基板において開口部（固体の細孔）を穿孔またはエッチングすることによって作られる。係るナノ細孔がこのナノ細孔によって分離される２つのチャンバを備えるナノデバイス内に組み込まれると、高感度のパッチクランプ増幅器が、膜電圧を印加して細孔を通してイオン電流を測定するのに使用することができる。
【０００３】
ナノ細孔は廉価な全ゲノムＤＮＡシークエンシングに対して成功を約束するものである。この点に関し、個々のＤＮＡ分子は電気泳動によって細孔を通して捕捉され駆動されることができ、各捕捉事象はイオン電流において一時的な移動として検出される。次にＤＮＡ分子のシークエンスは、移動されたイオン電流の記録内のパターンから推測することができ、ＤＮＡが細孔チャネルを通過する際にナノ細孔内またはナノ細孔近くの他の補助的なセンサーから推測することができる。
【０００４】
原理上としては、ナノ細孔シークエンサーはサンプル増幅の必要性をなくすことができ、シークエンシング動作中に触媒決定のために使用される酵素および試薬の使用をなくすことができ、シークエンシング進捗の検出のためのオプティクスをなくすことができ、これらのいくつかまたは全ては従来のシークエンシング・バイ・シンセシス（合成によるシークエンシング）法によって必要とされる。
【０００５】
ナノ細孔センサーは純粋に電気的なものであり、血液または唾液試料から得られるものよりも大きくはない濃度／体積におけるＤＮＡを検出することができる。更に、ナノ細孔はシークエンシングされたＤＮＡの読み出し長さ（ｒｅａｄ−ｌｅｎｇｔｈ）を４５０ベースから１０，０００ベース以上まで劇的に増加する。
【０００６】
ナノ細孔シークエンシングに対する２つの主な障害があり、それは（１）デノボシークエンシングのための核酸における各ヌクレオチドの特定を正確に決定するのに十分な感度の欠如（単一ヌクレオチド感度の欠如），および（２）検出中にナノ細孔を通して各ヌクレオチドユニットの配送率を制御する能力である。多くの調査団が障害１に対処するためにナノ細孔を開発および改良しているが、酵素またはオプティクスの使用を伴わない障害２に対処する方法がなく、酵素またはオプティクスの使用は、特化されたナノ細孔技術においてのみ効果があり、純粋な電気的方法と比較してより複雑かつコストが高い。
【発明の概要】
【０００７】
一実施形態において、上部チャンバ、中間チャンバおよび下部チャンバを備える装置であって、前記上部チャンバは第１の細孔を通して前記中間チャンバと連通し、前記中間チャンバは第２の細孔を通して前記下部チャンバと連通し、前記第１の細孔および第２の細孔は直径約１ｎｍ〜約１００ｎｍであり、互いから約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ離れており、前記チャンバのそれぞれは、電源に接続するための電極を備える、装置が提供される。
【０００８】
一の態様において、第１のおよび第２の細孔は実質的に同軸である。
【０００９】
一の態様において、この装置は、ケイ素，窒化ケイ素，二酸化ケイ素，グラフェン，カーボンナノチューブ，ＴｉＯ２，ＨｆＯ２，Ａｌ２Ｏ３，金属層，ガラス，生体ナノ細孔，生体細孔挿入物を備える膜，およびこれらの組み合わせからなる群から選択される材料を含む。
【００１０】
一の態様において、前記第１の細孔および前記第２の細孔は深さ約０．３ｎｍ〜約１００ｎｍである。
【００１１】
一の態様において、前記電源は、前記上部チャンバと前記中間チャンバとの間に第１の電圧と、前記中間チャンバと前記下部チャンバとの間に第２の電圧と、を提供するように構成され、前記第１の電圧および前記第２の電圧は独立して調節可能である。
【００１２】
一の態様において、この電源は、前記第１の電圧および第２の電圧のそれぞれを生成するために電圧クランプシステムまたはパッチクランプシステムを備える。一の態様において、この中間チャンバは前記２つの電圧に対して接地するように調節される。一の態様において、この中間チャンバは、この中間チャンバ内の前記細孔のそれぞれと前記電極との間に伝導性を提供するための媒体を備える。
【００１３】
いくつかの態様において、この電源（例えば電圧クランプシステムまたはパッチクランプシステム）は更に、前記細孔のそれぞれを通して前記イオン電流を測定するように構成される。
【００１４】
別の実施形態は、上部チャンバ、中間チャンバおよび下部チャンバを備える装置であって、前記上部チャンバは、第１の細孔を通して前記中間チャンバと連通し、前記中間チャンバは第２の細孔を通して前記下部チャンバと連通し、前記第１の細孔および第２の細孔は直径約１ｎｍ〜約１００ｎｍであり、互いから約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ離れており、前記細孔のそれぞれに電圧を印加するために電圧クランプまたはパッチクランプシステムに接続して前記細孔のそれぞれを通してイオンを測定するための前記チャンバのそれぞれにある電極を備え、前記中間チャンバ内の前記電極は前記２つの電圧クランプまたはパッチクランプシステムの共通するアースに接続される、装置を提供する。
【００１５】
更に、一実施形態において、細孔を通る荷電ポリマーの移動を制御する方法であって、
（ａ）荷電ポリマーを含むサンプルを上記実施形態のいずれかに記載の装置の前記上部チャンバ、中間チャンバまたは下部チャンバの一つに装填するステップを備え、ここで、前記装置は前記上部チャンバと前記中間チャンバとの間の第１の電圧、ならびに前記中間チャンバと前記下部チャンバとの間の第２の電圧を提供するための電圧クランプまたはパッチクランプシステムに接続され、（ｂ）前記ポリマーが前記チャンバ間を移動するように初期の第１の電圧および初期の第２の電圧を設定するステップを備え、これにより、前記第１の細孔および第２の細孔の両方に亘って前記ポリマーを配置し、（ｃ）両方の電圧が前記荷電ポリマーを前記中間チャンバから引き離すための力を生成するように第１の電圧および第２の電圧を調節するステップを備え、ここで、前記荷電ポリマーが一方向にかつ制御された方法で両方の細孔に亘って移動するように前記２つの電圧は制御された条件下で強度が異なる、方法が提供される。
【００１６】
一の態様において、送出の制御された方法は、第１のもしくは第２の電圧または両方の電圧のアクティブ制御またはフィードバック制御によって設定され、そのいずれかまたは両方が第１のもしくは第２のイオン電流測定または両方のイオン電流測定のフィードバック関数としてである。非限定的な実施例は、第２の電圧を一定に維持し、いずれかの方向に荷電ポリマーの設定されたコントロールド・デリバリーに対して第１の電圧のフィードバックまたはアクティブ制御のためのフィードバックとして第２のイオン電流を使用することを含む。従って、一の態様において、第１の電圧は第２の細孔にて測定されたイオン電流に基づき調節される。
【００１７】
一の態様において、このサンプルは前記上部チャンバ内に装填され、前記初期の第１の電圧は前記荷電ポリマーを前記上部チャンバから前記中間チャンバへ引っ張るように設定され、前記初期の第２の電圧は前記荷電ポリマーを前記中間チャンバから前記下部チャンバへ引っ張るように設定される。
【００１８】
別の態様において、前記サンプルは前記中間チャンバ内に装填され、前記初期の第１の電圧は前記荷電ポリマーを前記中間チャンバから前記上部チャンバへ引っ張るように設定され、前記初期の第２の電圧は前記荷電ポリマーを前記中間チャンバから前記下部チャンバへ引っ張るように設定される。
【００１９】
一の態様において、この荷電ポリマーは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。一の態様において、この荷電ポリマーはポリヌクレオチドであり、例えば、ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ，一本鎖ＤＮＡ，二本鎖ＲＮＡ，一本鎖ＲＮＡ，およびＤＮＡ−ＲＮＡ混成物である（これらに限定されない）。
【００２０】
一の態様において、ステップ（ｃ）における前記調節された第１の電圧および第２の電圧は、前記２つの電圧間の強度の相違よりも約１０倍〜約１０，０００倍高い。
【００２１】
一の態様において、この方法は更に、前記ポリマーのモノマー単位を特定するステップを更に備え、これは前記モノマー単位が前記細孔の一つを通過するときに当該細孔に亘るイオン電流を測定することによってなされる。一の態様において、このモノマー単位はヌクレオチドである。別の態様において、このモノマー単位はヌクレオチド対である。いくつかの態様において、単一ヌクレオチドおよびヌクレオチド対は、一の分子において検出され得る。例えば、係る分子は、より長いポリヌクレオチドあるいは一本鎖ポリヌクレオチドにおいて二重部位を有することができ、この二重部位は、ワトソン・クリックの相補的塩基対合によって部分的または完全に形成される。
【００２２】
一の態様において、このモノマーは、ＤＮＡ結合タンパクまたはナノ粒子といった分子に結合される。ＤＮＡ結合タンパクの非限定的な例は、ＲｅｃＡおよび配列特異的なＤＮＡ結合タンパクを含む（例えば、ラムダファージ・リプレッサー、ＮＦ−κＢおよびｐ５３）。ナノ粒子の非限定的な例は、量子ドットおよび蛍光標識を含む。
【００２３】
一の態様において、このポリマーはその一端部でビード（ｂｅａｄ）といった固体支持体に接合される。
【００２４】
更に別の実施形態は、ポリヌクレオチドのシークエンスを決定するための方法であって、（ａ）  ポリヌクレオチドを含むサンプルを上記実施形態のいずれかに記載の前記装置の前記上部チャンバ内に装填するステップを備え、前記装置は前記上部チャンバと前記中間チャンバとの間の第１の電圧、ならびに前記中間チャンバと前記下部チャンバとの間の第２の電圧を提供するための電圧クランプまたはパッチクランプシステムに接続され、前記ポリヌクレオチドは当該ポリヌクレオチドの一端にて固体支持体に任意に接着され、（ｂ）  前記ポリヌクレオチドが前記上部チャンバから前記中間チャンバへおよび前記中間チャンバから前記下部チャンバへ移動するように初期の第１の電圧および初期の第２の電圧を設定するステップを備え、これにより、前記第１の細孔および第２の細孔の両方に亘って前記ポリマーを配置し、（ｃ）  両方の電圧が前記ポリヌクレオチドを前記中間チャンバから引き離すための力を生成するように第１の電圧および第２の電圧を調節するステップを備え、ここで、前記ポリヌクレオチドが一方向にかつ制御された方法で両方の細孔に亘って移動するように前記２つの電圧は制御された条件下で強度が異なり、（ｄ）  前記細孔の一方を通る前記ポリヌクレオチドの各ヌクレオチドを特定するステップを更に備え、これは前記ヌクレオチドが当該細孔を通過するときに当該細孔に亘るイオン電流を測定することによってなさる、方法を提供する。
【００２５】
添付の図面は例示のみを目的として実施形態を記載している。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１（Ｉ）】図１（Ｉ）は、２細孔（デュアル細孔）装置を記載している。図１（Ｉ）は、独立した電圧制御（Ｖ１，Ｖ２）および各細孔の電流測定（Ｉ１，Ｉ２）のためのデュアル細孔チップおよびデュアル増幅器電子構成の概略図である。チャンバ（Ａ〜Ｃ）は共通する細孔を除き容量に関して分離されている。実現可能なチップパラメータは細孔の内部距離が１０〜５００ｎｍであり、膜厚０．３〜５０ｎｍ，および細孔直径１〜１００ｎｍである。
【図１（ＩＩ）】図１（ＩＩ）は、２細孔（デュアル細孔）装置を記載している。図１（ＩＩ）において、電気的にＶ１およびＶ２は、Ｉ１およびＩ２を効果的に減結合するために全てのアクセス抵抗を最小限にする装置を構成することによって、原則的に各ナノ細孔抵抗全体に亘る。
【図１（ＩＩＩ）】図１（ＩＩＩ）は、２細孔（デュアル細孔）装置を記載している。図１（ＩＩＩ）では、競合電圧が制御用に使用される（青い矢印が各電圧の力の方向を示す）。細孔が同一の電圧・力影響を備えてかつ｜Ｖ１｜＝｜Ｖ２｜＋δＶを用いると仮定すると、値δＶ＞０（＜０）はＶ１（Ｖ２）方向において調整可能な動きのために調節される。実際には、各細孔での電圧誘起による力はＶ１＝Ｖ２に一致しないが、キャリブレーション実験は、所定の２細孔チップのための同等の牽引力となる必要とされる電圧バイアスを特定することができ、そのバイアス周辺のバリエーションは方向制御のために使用することができる。
【００２７】
【図２】図２は、流体アクセスおよびサンプル装填（ｌｏａｄｉｎｇ）のために開口部をそれぞれ有するチャンバＡ，チャンバＢおよびチャンバＣを有する２細孔ハウジング装置の外面図である。デュアル細孔チップは、ハウジング装置の各部分の各ガスケット部を備える２つのガスケット間に配置され、これら２つの部分はチップ周辺のハウジングを開閉するためにヒンジ（中間上部）を中心に回転する。
【００２８】
図のいくつかまたは全ては例示的な概略図であり、図示された要素の実際の相対的サイズまたは位置を表しているわけではない。これらの図は一または複数の実施形態を示す目的で表されており、後述の特許請求の範囲または請求項の意味を限定するために用いられるものではないことは容易に理解されよう。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本願全体を通して，その記載内容は本発明の装置および方法の様々な実施形態を参照する。説明する様々な実施形態は様々な説明上の例を提供するものとして意図し、種発明を記載するものとして理解されるべきではない。様々な実施形態の説明は本明細書においてその範囲が重複し得ることに留意されたい。本明細書において記載された実施形態は単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【００３０】
更に、本明細書の全体を通して、様々な文献、特許および公開公報が引用によって参照される。これらの文献、特許および公開公報の開示内容は本発明に関する技術を完全に記載するために本明細書に参照により組み込まれる。
【００３１】
明細書および特許請求の範囲に使用される、単数「ａ」，「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈から明確である場合を除き、複数も含む。例えば、用語「ａｎ  電極」は複数の電極も含む。
【００３２】
本明細書において使用される用語「備える・含む」は装置および方法が、記載された部品またはステップを含むが他のものを排除するものではない。「から実質的になる」は、装置および方法を特定するのに使用される場合、その組み合わせに対して本質的な意義を有する他の部品またはステップを排除することを意味する。「のみからなる」は、他の部品またはステップを排除することを意味する。これらの移行用語のそれぞれによって定義された実施形態は本発明の範囲内である。
【００３３】
全ての数字表示、例えば、距離，サイズ，温度，時間，電圧および濃度（範囲を含む）は、０．１単位でプラスまたはマイナスに変化する近似値である。必ずしも明確には記載していないが、全ての数字表示は「約」という文言が前に付くと理解されたい。更に、必ずしも明確には記載していないが、本明細書において記載された部品は単に例であり、係る均等物も当該技術分野において知られている。
２細孔装置（Ｔｗｏ−Ｐｏｒｅ  Ｄｅｖｉｃｅ）
【００３４】
本発明の一実施形態は、２細孔装置を提供する。この装置は、３つのチャンバと、これらのチャンバ間の流体連通を可能にする２つの細孔とを含む。更に、各チャンバは別個の電圧をチャンバ間の各細孔に設定することができるように電源に接続するための電極を含む。
【００３５】
本発明の一実施形態によると、上部チャンバ，中間チャンバおよび下部チャンバを備える装置が提供され、上部チャンバは第１の細孔を通して中間チャンバと連通し、中間チャンバは第２の細孔を通して下部チャンバと連通し、第１の細孔および第２の細孔は直径約１ｎｍ〜約１００ｎｍであり、互いから約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍ離れており、更に、各チャンバは電源に接続するための電極を備える。
【００３６】
図１（１）を参照すると、この装置は上部チャンバ（チャンバＡ），中間チャンバ（チャンバＢ），および下部チャンバ（チャンバＣ）を含む。このチャンバは、別個の細孔（１１１および１１２）をそれぞれ有する２つの別個の層または膜（１０１および１０２）によって分離される。更に、各チャンバは電源に接続するために電極（１２１，１２２および１２３）を有する。上部，中間および下部チャンバの表示は相対的な文言であり、例えば、上部チャンバが地面に対して中間または下部チャンバの上にあることを意味し、その逆も然りであることは明らかである。
【００３７】
各細孔（１１１および１１２）は大小の分子または微生物が通過できるサイズを独立して有する。一の態様において、各細孔は少なくとも直径約１ｎｍである。あるいは、各細孔は少なくとも直径約２ｎｍ，３ｎｍ，４ｎｍ，５ｎｍ，６ｎｍ，７ｎｍ，８ｎｍ，９ｎｍ，１０ｎｍ，１１ｎｍ，１２ｎｍ，１３ｎｍ，１４ｎｍ，１５ｎｍ，１６ｎｍ，１７ｎｍ，１８ｎｍ，１９ｎｍ，２０ｎｍ，２５ｎｍ，３０ｎｍ，３５ｎｍ，４０ｎｍ，４５ｎｍ，５０ｎｍ，６０ｎｍ，７０ｎｍ，８０ｎｍ，９０ｎｍまたは１００ｎｍである。
【００３８】
一の態様において、この細孔は直径約１００ｎｍ以下である。あるいは、この細孔は直径約９５ｎｍ，９０ｎｍ，８５ｎｍ，８０ｎｍ，７５ｎｍ，７０ｎｍ，６５ｎｍ，６０ｎｍ，５５ｎｍ，５０ｎｍ，４５ｎｍ，４０ｎｍ，３５ｎｍ，３０ｎｍ，２５ｎｍ，２０ｎｍ，１５または１０ｎｍ以下である。
【００３９】
一の態様において、この細孔は直径が約１ｎｍ〜約１００ｎｍの間、または約２ｎｍ〜約８０ｎｍの間、または約３ｎｍ〜約７０ｎｍの間、または約４ｎｍ〜約６０ｎｍの間、または約５ｎｍ〜約５０ｎｍの間、または約１０ｎｍ〜約４０ｎｍの間、または約１５ｎｍ〜約３０ｎｍの間である。
【００４０】
いくつかの態様において、細孔は実質的に円形を有する。本明細書において使用される「実質的に円形」は少なくとも約８０または９０％の円筒形を指す。いくつかの実施形態において、細孔は方形、矩形、三角形、楕円または六角形である。
【００４１】
各細孔（１１１および１１２）はある深さを独立して有する。一の態様において、各細孔は深さが少なくとも約０．３ｎｍである。あるいは、各細孔は深さが少なくとも約０．６ｎｍ，１ｎｍ，２ｎｍ，３ｎｍ，４ｎｍ，５ｎｍ，６ｎｍ，７ｎｍ，８ｎｍ，９ｎｍ，１０ｎｍ，１１ｎｍ，１２ｎｍ，１３ｎｍ，１４ｎｍ，１５ｎｍ，１６ｎｍ，１７ｎｍ，１８ｎｍ，１９ｎｍ，２０ｎｍ，２５ｎｍ，３０ｎｍ，３５ｎｍ，４０ｎｍ，４５ｎｍ，５０ｎｍ，６０ｎｍ，７０ｎｍ，８０ｎｍ，または９０ｎｍである。
【００４２】
一の態様において、各細孔は深さが約１００ｎｍ以下である。あるいは、深さは約９５ｎｍ，９０ｎｍ，８５ｎｍ，８０ｎｍ，７５ｎｍ，７０ｎｍ，２５ｎｍ，６５ｎｍ，６０ｎｍ，５５ｎｍ，５０ｎｍ，４５ｎｍ，４０ｎｍ，３５ｎｍ，３０ｎｍ，２５ｎｍ，２０ｎｍ，１５または１０ｎｍ以下である。
【００４３】
一の態様において、この細孔は深さが約１ｎｍ〜約１００ｎｍの間であり、または約２ｎｍ〜約８０ｎｍの間であり、約３ｎｍ〜約７０ｎｍの間であり、または約４ｎｍ〜約６０ｎｍの間であり、約５ｎｍ〜約５０ｎｍの間であり、または約１０ｎｍ〜約４０ｎｍの間であり、または約１５ｎｍ〜約３０ｎｍの間である。
【００４４】
一の態様において、この細孔は距離が約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの間の分だけ離れている。一の態様において、この距離は少なくとも約１０ｎｍ，または少なくとも約２０ｎｍ，３０ｎｍ，４０ｎｍ，５０ｎｍ，６０ｎｍ，７０ｎｍ，８０ｎｍ，９０ｎｍ，１００ｎｍ，１５０ｎｍ，２００ｎｍ，２５０ｎｍ，または３００ｎｍである。別の態様において、この距離は約１０００ｎｍ，９００ｎｍ，８００ｎｍ，７００ｎｍ，６００ｎｍ，５００ｎｍ，４００ｎｍ，３００ｎｍ，２５０ｎｍ，２００ｎｍ，１５０ｎｍ，または１００ｎｍ以下である。更に別の態様において、この距離は、約２０ｎｍ〜約８００ｎｍの間か、約３０ｎｍ〜約７００ｎｍの間か、約４０ｎｍ〜約５００ｎｍの間か、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍの間である。
【００４５】
これら２つの細孔はチャンバ間の流体連通を可能にする限り任意の位置に配置されることができ、所定の大きさを有し、かつそれらの間に所定の距離を有する。一の態様において、この細孔は、それらの間に直接障害物がないように配置される。更に、一の態様において、これらの細孔は実質的は図１（１）に示されるように同軸である。
【００４６】
一の態様において、この装置はチャンバ内の電極を通して一または複数の電源に接続される。いくつかの態様において、この電源は各細孔に電圧を供給するための電圧クランプまたはパッチクランプを備え、これは各細孔を通して電流を独立して測定することもできる。この点に関して、この電源は中間チャンバを両方の電圧源のための共通の接地（アース）に設定する。一の態様において、この電源は、上部チャンバ（例えば、図１（１）におけるチャンバＡ）と中間チャンバ（例えば、図１（１）におけるチャンバＢ）の間の第１の電圧を提供し、かつ中間チャンバと下部チャンバ（例えば、図１（１）におけるチャンバＣ）との間の第２の電圧を提供するように構成される。
【００４７】
いくつかの態様において、第１の電圧および第２の電圧は独立して調節可能である。一の態様において、中間チャンバは２つの電圧に関して接地されるように調節される（図１（Ｉ〜ＩＩＩ）に図示される）。一の態様において、中間チャンバは、各細孔と中間チャンバ内の電極との間に導電性を提供するための媒体を備える。一の態様において、中間チャンバは、各細孔と中間チャンバ内の電極との間に抵抗を提供するための媒体を備える。係る抵抗をナノ細孔抵抗に対して十分に小さく保つことは細孔において２つの電圧および電流を減結合するのに有用であり、このことは電圧の独立した調節にとって有用である。
【００４８】
電圧の調節は、チャンバ内の荷電された粒子の移動を制御するために使用されることができる。例えば、両方の電圧が同じ方向に設定された場合、適切に荷電された粒子が上部チャンバから中間チャンバおよび下部チャンバに移動され、または逆方向に順に移動されることができる。そうでなければ、荷電された粒子は、上部チャンバまたは下部チャンバのいずれかから中間チャンバに移動されることができ、そこに保持される。
【００４９】
この装置内の電圧の調節は、同時に両方の細孔をまたぐのに十分な長さの巨大分子（例えば荷電ポリマー）の動きを制御するのに特に有用である。係る態様において、分子の動きおよび分子の動きの速度が電圧の相対強度および方向によって制御されることができ、これは更に後述する。
【００５０】
この装置は、液体サンプル（特に生体サンプル）を保持するために適切な材料を保持し、および／またはナノファブリケーションのために適切な材料を保持することができる。一の態様において、係る材料は誘電材料（例えば、ケイ素，窒化ケイ素，二酸化ケイ素，グラフェン，カーボンナノチューブ，ＴｉＯ２，ＨｆＯ２，Ａｌ２Ｏ３，または他の金属層，またはこれらの材料の任意の組み合わせ（しかしこれらに限定されない）を含む。グラフェンの単一シートは、厚さ０．３ｎｍの膜を形成し、例えば細孔を有する膜として使用されることができる。
【００５１】
マイクロ流体に関し、かつ２細孔マイクロ流体チップの構成を有する装置は、様々な手段および方法によって作られることができる。２つの平行する膜を備えるマイクロ流体チップにとって、両方の膜は単一のビームによって同時に穿孔されることができ、２つの同心の細孔を形成する（但し、この膜の各側部に異なるビームを用いることも任意の適切な配置技術と共に可能である）。大まかにいえば、ハウジングはチャンバＡ〜Ｃの密封した分離状態を確実にする。一の態様において、このハウジングは、電圧電極（２源および１接地）とナノ細孔との間の抵抗に最小限のアクセスを提供し、各電圧は各細孔に主に印加されることを確実にする。
【００５２】
一の態様において、図２は、別の実施形態の装置の外観を示す。図２において，この装置は、スペーサーによって接続される２つの平行な膜からなるマイクロ流体チップ（「２核チップ（ｄｕａｌ−ｃｏｒｅ  ｃｈｉｐ）」と称される）を含む。各膜は、この膜の中心を通る単一ビームによって穿孔された細孔（図示せず）を含む。更に、この装置はこのチップのためのテフロン（登録商標）ハウジングを好ましくは有する。このハウジングはチャンバＡ〜Ｃの密封された分離状態を確実にし、電解質のための抵抗への最小限のアクセスを提供し、各電圧が各細孔に主に印加されることを確実にする。
【００５３】
より具体的には、細孔を有する膜は、厚さ５〜１００ｎｍのケイ素、窒化ケイ素，または二酸化ケイ素ウィンドウを備えるＴＥＭ（透過電子顕微鏡法）グリッドで作られることができる。スペーサーはこの膜を分離するために使用されることができ、これは、絶縁体（ＳＵ−８，フォトレジスト，ＰＥＣＶＤ酸化物，ＡＬＤ酸化物，ＡＬＤアルミナ）または蒸着金属（Ａｇ，Ａｕ，Ｐｔ）材料を用い、かつ、これらの膜間のチャンバＢの他の含水部分内の小さい体積を占領することによってなされる。ホルダーは、チャンバＢの最も大きい体積部分を備える水性槽に着座される。チャンバＡおよびＣは、（低アクセス抵抗のための）膜シールに導くより大きなチャネルによってアクセス可能である。
【００５４】
集中された電子またはイオンビームは膜を通して細孔を穿孔し、それらを自然に整合させるために使用されることができる。これらの細孔は正確なビーム焦点を各層に印加することによってより小さなサイズに形成（縮小）することもできる。任意の単体のナノ細孔穿孔方法は２つの膜内に１対の細孔を穿孔するために使用されることもでき、所定の方法にとって可能な穿孔深さおよび膜の厚さを考慮に入れる。膜厚を更に洗練するために、マイクロ細孔を所定の深さに予備穿孔し、膜の残りを貫通するナノ細孔を作ることも可能である。
【００５５】
別の態様において、ハイブリッド細孔を形成するために個体のナノ細孔内に生体ナノ細孔を挿入することを、２細孔方法において片方のナノ細孔または両方のナノ細孔において用いることができる（ホール他、Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．，  ５（１２）：８７４−７，２０１０）。生体細孔はイオン電流測定の感度を増し、一本鎖ポリヌクレオチドが（例えばシークエンシングのために）２細孔装置（デバイス）において捕捉され制御されるべき場合に有用である。
【００５６】
２細孔装置での分子の動きの制御
この装置の細孔に存在する電圧により、荷電された分子をチャンバ間の細孔を通して移動することができる。移動の速度および方向は、電圧の強度および方向によって制御することができる。更に、２つの電圧のそれぞれを独立して調節することができるため、荷電された分子の移動および速度を各チャンバにおいて細かく制御することができる。
【００５７】
例えば、この装置は、制御された状態で２つの正に荷電された分子を混ぜるために使用されることができる。このために，第１の分子が上部チャンバに最初に装填され、第２の分子が下部チャンバに装填される。第１のポートにおける第１の電圧は、上部チャンバから中間チャンバ内に第１の分子の移動を誘発する。同様に、第１の電圧の方向とは反対の方向への第２の電圧は，下部チャンバから中間チャンバ内への第２の分子の移動を誘発することができる。電圧が反対方向であることによって、両方の分子が互いに反応するように中間チャンバ内に保持される。更に、電圧の相対強度を調節することによって、各分子の流入速度が微調整され、制御反応に導く。
【００５８】
別の例は、両方の細孔の深さにこれら２つの細孔間の距離を加算して組み合わせた距離よりも長い長さを有する荷電ポリマー（例えばポリヌクレオチド）に関する。例えば、１０００ｂｐ（塩基対）ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）は、長さ３４０ｎｍであり、２０ｎｍだけ離れた長さ１０ｎｍの２つの細孔によって及ぶ４０ｎｍよりも実質的に長い。第１のステップにおいて，ポリヌクレオチドは上部チャンバまたは下部チャンバのいずれかに装填される。生理的条件（〜ｐＨ７．４）の下でその負電荷によって、電圧が印加された細孔をまたいでポリヌクレオチドを移動することができる。従って、第２のステップにおいて、同じ方向および同じもしくは類似する強度の２つの電圧が細孔に印加され、両方の細孔に亘るポリヌクレオチドの移動を順に誘発する。
【００５９】
ポリヌクレオチドが第２の細孔に到達する頃、これらの電圧のうち一または両方を変化することができる。このポリヌクレオチドは両方の細孔をカバーする距離よりも長いため、このポリヌクレオチドが第２の細孔に到達するときには第１の細孔内にもある。従って、第１の細孔での電圧の方向の急速な変化は、ポリヌクレオチドを引っ張り第２の細孔から離す力を生成する（図１（ＩＩＩ））。
【００６０】
この時点で、第１の細孔での電圧誘起による力が第２の細孔での電圧誘起による力よりも小さい場合、このポリヌクレオチドは第２の細孔に向かって両方の細孔にまたがることを続けるが、より低速にである。これに関し、ポリヌクレオチドの移動の速度および方向は両方の電圧の方向および強度によって制御されることができる。更に後述するように、係る移動の微調整は幅広い用途を有すると理解されたい。
【００６１】
従って、一の態様において、細孔を通しての荷電ポリマーの移動を制御する方法が提供される。この方法は（ａ）上記実施形態のいずれかの上部チャンバ，中間チャンバまたは下部チャンバのうち一つにおいて荷電ポリマーを備えるサンプルを装填するステップを備え、ここで、この装置は上部チャンバと中間チャンバとの間の第１の電圧、および中間チャンバと部チャンバとの間の第２の電圧を供給するための電源に接続され、（ｂ）ポリマーがチャンバ間を移動するように初期の第１の電圧および初期の第２の電圧を設定するステップを備え、これにより第１のおよび第２の細孔に亘ってポリマーを所在させ、（ｃ）両方の電圧がこの荷電されたポリマーを引っ張り、中間チャンバから離す力を生成するように（電圧−競合モード），第１の電圧および第２の電圧を調節するステップを備え、ここで、荷電ポリマーがいずれかの方向および制御された状態にて両方の細孔に亘って移動するようにこれら２つの電圧は制御状態の下、異なる強度である。
【００６２】
ステップ（ｃ）における電圧−競合モードを設定する目的のために、各細孔における各電圧によって生じる相対力は、使用される各２細孔装置のために決定されるべきであり、これはキャリブレーション実験を伴うことで、ポリヌクレオチドの動きに対する異なる電圧値の影響を観察することによってなされる（移動はポリヌクレオチドにおける位置が分かった検出可能（ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ）な特徴を検知（ｓｅｎｓｉｎｇ）することによって測定されることができ、係る特徴の例は後述する）。力が各共通の電圧に等しい場合、例えば、（接地された中間チャンバに比して上部および下部チャンバ内の共通する極性を備える）各細孔での同じ電圧値を使用することで、熱運動なしにゼロ・ネット移動が生じる（ブラウン運動の存在および影響は後述する）。この力が各共通電圧にて等しくない場合、等しい力を達成することは、共通の電圧にてより小さい力を受ける細孔でのより大きな電圧の特定および使用を必要とする。電圧−競合モードのためのキャリブレーションが各２細孔装置のために必要とされ、かつ特定の荷電ポリマーまたは分子（各細孔を通る特徴が力に影響するもの）のために必要とされる。
【００６３】
一の態様において、サンプル（試料）が上部チャンバ内に装填され、初期の第１の電圧が荷電ポリマーを上部チャンバから中間チャンバに引っ張るように設定され、初期の第２の電圧はポリマーを中間チャンバから下部チャンバに引っ張るように設定される。同様に、サンプルは最初に下部チャンバ内に装填されることができる。
【００６４】
別の態様において、サンプルは中間チャンバ内に装填され、最初の第１の電圧は荷電ポリマーを中間チャンバから上部チャンバに引っ張るように設定され、最初の第２の電圧は荷電ポリマーを中間チャンバから下部チャンバに引っ張るように設定される。
【００６５】
いくつかの態様において、荷電ポリマーはポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。特定の態様において、荷電ポリマーはポリヌクレオチドである。非限定的なポリヌクレオチドの例は、二本鎖ＤＮＡ，一本鎖ＤＮＡ，二本鎖ＲＮＡ，一本鎖ＲＮＡ，およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む。
【００６６】
一の態様において、ステップ（ｃ）にて調節された第１の電圧および第２の電圧は、これら２つの電圧間の差と同程度に強度が高い約１０倍〜約１０，０００倍である。例えば、これらの２つの電圧はそれぞれ９０ｍＶおよび１００ｍＶである。電圧の強度（〜１００ｍＶ）はそれら（１０ｍＶ）の間の差の約１０倍である。いくつかの態様において、電圧の強度はそれらの間の差と同程度に高く少なくとも約１５倍，２０倍，２５倍，３０倍，３５倍，４０倍，５０倍，１００倍，１５０倍，２００倍，２５０倍，３００倍，４００倍，５００倍，１０００倍，２０００倍，３０００倍，４０００倍，５０００倍，６０００倍，７０００倍，８０００倍または９０００倍である。いくつかの態様において、電圧の強度は、電圧の強度はそれらの間の差と同程度に約１００００倍，９０００倍，８０００倍，７０００倍，６０００倍，５０００倍，４０００倍，３０００倍，２０００倍，１０００倍，５００倍，４００倍，３００倍，２００倍，または１００倍以下である。
【００６７】
一の態様において、ステップ（ｃ）にて第１の電圧および第２の電圧のリアルタイム調節またはオンライン調節が行われ、これは、専用ハードウェアおよびソフトウェアを用いて数百メガヘルツまでのクロックレートにてアクティブ制御またはフィードバック制御によって行われる。第１の電圧もしくは第２の電圧または両方の電圧の自動化された制御は第１のイオン電流もしくは第２のイオン電流または両方のイオン電流測定のフィードバックに基づく。
２細孔装置を使用した分子の分析
【００６８】
本願の２細孔装置は、細孔に印加された制御電圧によってこの装置内を動くかこの装置内に保持される分子または粒子の分析を行うために用いられることができる。一の態様において、この分析は細孔のいずれかまたは両方にて行われる。各電圧クランプまたはパッチクランプシステムは各細孔を通るイオン電流を測定し、この測定された電流は、通過する荷電された粒子または分子の存在を検出するのに使用され、または通過する荷電された粒子または分子に関連する特徴を検出するのに使用される。
【００６９】
上記の様に、ポリヌクレオチドは同じ方向を有する２つの電圧によって両方の細孔内に装填されることができる。この例において、一旦、第１の細孔に印加された電圧の方向が反転され、新たな電圧誘起による力の強度が第２の細孔に印加された電圧誘起による力よりも僅かに小さくなると、ポリヌクレオチドは同じ方向への移動を継続するが、著しく低い速度にてである。これに関し、第２の細孔に電圧を供給する増幅器も第２の細孔を通過する電流を測定し、次にイオン電流は、各異なるヌクレオチドの通過が（例えば、イオン電流振幅における移行に基づく）異なる電流界シグナチャーを引き起こすため、細孔を通過するヌクレオチドの特定をする。従って、ポリヌクレオチドにおける各ヌクレオチドの特定はポリヌクレオチドのシークエンスを明らかにする。
【００７０】
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドを再シークエンシングするための繰り返しのコントロールド・デリバリーはシークエンシングの質を更に改善する。各電圧は、各方向においてコントロールド・デリバリーのためにより大きくなると交互する。更に、２つの細孔を通る２つの電流が、改善された正確性に相関することができること考えられる。ブラウン運動は分子の動きに変動を与ることができ、分子のコントロールド・デリバリーに影響を与えることが考えられる。しかしながら、係る影響は最小限にすることができ、または、例えば、ＤＮＡシークエンシング中に、ＤＮＡの繰り返しのコントロールド・デリバリーによって、およびシークエンシング測定値を平均化することによって避けることができる。更に、巨大分子（例えばポリヌクレオチドおよびポリペプチド）の制御された動きへのブラウン運動のインパクトは、特に競合力が巨大分子を引っぱりこの分子内に張力を生成するときに取るに足らないと考えられる。
【００７１】
係る方法は、先行技術において解決されていない問題への解決策を提供する。
【００７２】
例えば、ナノ細孔シークエンシングに必要なコントロールド・デリバリーおよび正確な検知を達成するための２つの矛盾する障害があることが知られている。一方は、十分なシークエンシング感度を提供するために細孔にて比較的高電圧が必要とされることである。他方において，高電圧によってポリヌクレオチドが細孔を速く通過することになり、各ヌクレオチドの特定のために十分な時間がなくなる。
【００７３】
より具体的には、ナノ細孔シークエンシングのプラットフォームは、細孔を通過するポリヌクレオチドの速度が１ｍｓ／ヌクレオチド（ｎｔ）またはそれ以下に制御され、一方、なおシークエンス感応性電流を生成する。このことは電流シグナチャー（高電圧がよい）を検出するために十分な高信号対雑音を必要とするが、測定値が確実に記録帯域幅（低電圧がよい）内にあるようにするために細孔を通る分子の動が十分に遅いことを必要とする。単一細孔の態様において、ポリヌクレオチド速度は、電圧に比例し、よって電圧が高いほど、検知のために良いが、ポリヌクレオチド速度を低下させるためにはより悪くなる：速度はポリヌクレオチド捕捉を促進する電圧にて１μｓ／ｎｔおよびこれより速い（＞１０００倍は速すぎる）。一方、より低い電圧は検知性能を減じ、読み出しの正確性を害するブラウン運動によって引き起こされる速度変動の相対的な寄与度も増す。
【００７４】
本明細書に記載したもの以外に、特化したナノ細孔技術においてのみ作用する酵素または光学機器の使用を伴わないこれらの障害に対処する方法は現在存在しない。
【００７５】
いくつかのアプローチが検出能力の欠如および低電圧に関する問題に対処するために提案されている。一つは、生体ナノ細孔の感度を向上させるためにこれらの生体ナノ細孔を作りかえることである。別のものは、グラフェン膜を使用するものであり、これは、単一シートとしてｓｓＤＮＡ（単鎖ＤＮＡ）においてヌクレオチド間の距離よりも薄い。更に別のものは、ナノ細孔に近接して測定された補助電流の使用である（例えば、トンネル電流）。
【００７６】
生体ナノ細孔は、第１のアプローチにおいてテストされた。α溶血素ナノ細孔は、研究において最も一般に使用される生体細孔である。研究結果は、α溶血素がホモポリマー内の単一ヌクレオチド置換を溶解し、あるいは全て核酸塩基のＤＮＡ内の基本的な（１’，２’−ジデオキシ）残基を溶解することができる。しかしながら、単一ヌクレオチド感度は、（イオン電流がチャネルにおいて〜１０ヌクレオチドによって影響を受ける）野生形（ＷＴ）α溶血素を備える異種ＤＮＡにおいて可能ではない。α溶血素のタンパク質工学はＤＮＡ分析およびシークエンシングのためのその感度を向上させるために使用されている。係る一の突然変異の細孔は、高精度で４つのヌクレオシド５’−一リン酸塩分子を区別することができる、共有結合された分子アダプター（クラーク他、Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈ，  ４（４）：２６５−７０，２００９）を備えるα溶血素を使用する。しかしながら、この突然変異の細孔は、細孔を通過する完全な異種ｓｓＤＮＡをシークエンシングするための感度を有しないと思われる。
【００７７】
別の例示的な生体細孔はＭｓｐＡであり、これは、イオン電流の感度をチャネルの底に集中させる漏斗状の形状を有する。更に、ＭｓｐＡおよびα溶血素によってＤＮＡの速度を減少させることを達成することは、酵素を用いることによって達成することができる。（マンラノ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０：３４９−５３，２０１２）の図１に示されるように、ＤＮＡの速度の減少はＭｓｐＡナノ細孔上に位置する酵素によって達成される。しかしながら、このことは、非決定性の検知期間において、バックトラッキングによって引き起こされる繰り返しの読み出し、およびホモポリマー領域を検出することができないといった結果となる。ｐｈｉ２９（ファイ２９）ポリメラーゼ媒介ＤＮＡ転座の機構は、α溶血素上に（チャーフ他、  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ３０（４）：３４４−８，２０１２）において開発され、より感度の高いＭｓｐＡナノ細孔（マンラオ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０：３４９−５３，２０１２）において実施された。重合触媒された転座の段階的速度は２．５〜４０ｎｔ／ｓであり、ＤＮＡ速度低下のための要件に合う。しかしながら、生体細孔上の酵素が転座の速度を低下させることができる一方、各ヌクレオチドのドウェル時間の制御を欠き、このことは繰り返しのブラインドトラッキングを非常に困難なものにし、単一ヌクレオチド読み出しの長い中止時間と区別することを困難にする。感度に関し，（Ｍａｎｒａｏ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０：３４９−５３，２０１２）の図３に示されるように、繰り返しのＤＮＡテンプレートを読み出すことは、ＭｓｐＡ上のファイ２９によって達成することができる。図（３ａ）は、繰り返しのＣＡＴトリヌクレオチドからなるＤＮＡテンプレートのためのトレース例を示し、このシークエンスの中間における一のＣＡＧトリプレットの例外がある。＊は、２つのレベル間の繰り返しの転座（これは酵素に基づく制御方法に本来備わっており、読み出しエラーを引き起こす）の際に（人体分析によって）検出された代表的な「トグル（ｔｏｇｇｌｅｓ）」を表す。図（３ｂ）は（３ａ）の理想化も示し、公知のＤＮＡシークエンスに連携するレベルの平均電流を備え、（３ａ）に示された測定された期間の差異を除く。理想化は単一ｄＧ置換によって妨害される３つのレベルの繰り返しパターンを示す。４つのレベルは、置換に最も近い最も大きな偏差を備える単一ｄＧによって影響され、提案する残留電流は〜４ヌクレオチドによって主に影響を受ける。ＭｓｐＡを流れるイオン電流が開口に最も近接する〜４ヌクレオチドによる影響をうけることは、シークエンスを特定するのに相当な複雑性を加える。当該技術において示唆されるように４４＝２５６の組み合わせのそれぞれをマッピングする明確な電流振幅のライブラリを作ることが理想的であるが、係るライブラリは実現が困難である。その理由は、チャネル電流の記録における特定ステップの遷移は、片振幅法を伴う少なくとも２の信号対雑音比（ＳＮＲ）を必要とするからである（マルコフに基づく方法ではＳＮＲ≧１．５）。記録帯域幅にて０．５ｐＡのＲＭＳ雑音を伴うと、振幅シフトは必要とされるＳＮ���を有するために少なくとも１ｐＡでなければならず、ＭｓｐＡ（またはＳＮＲ１．５にて最大でも５３レベル）を備える４０ｐＡの振幅レンジ内で〜４０個の検出可能レベルのみという結果になる。更に、このレンジは画一的に利用され４０個のレベルよりも少ないものが観察され、更にフィルタリングが雑音を減少して振幅弁別を加えることができる一方、それは既に存在するより速いｓｓＤＮＡ運動遷移のより多くを失という結果にもなる。
【００７８】
現在、イオン電流検出が核酸シークエンシングのために単一ヌクレオチド感度を提供することができるナノ細孔はない。依然として、生体細孔および固体の細孔（グラフェン）の感度の改善は活発であり、継続中の調査分野である。問題の一つは、イオン電流検出が領域を通して進行する直接的トラッキング（ベースリピート（ｂａｓｅ  ｒｅｐｅａｔ））を可能としないということであり、なぜなら、細孔を通してのホモポリマーｓｓＤＮＡの移動のヌクレオチド毎の非固有の信号があるからである。トラッキング・リピートは必要不可欠であり、例えば、ヒトミトコンドリアＤＮＡ内の特定のモノヌクレオチド・リピート（７，９ｎｔ）の削除および挿入はいくつかの種類の癌において行われている（サンチェス−セスペデス，他、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ６１（１９）：７０１５−７０１９，２００１）。生体細孔上の酵素が転座の速度を低下させることができる一方、各ヌクレオチドのドウェル時間の制御を欠く。他方では、２細孔制御を伴う一定送出速度を用いて、非決定性中断が消滅され、リピート長さ（反復長）の正確な推定がなされることができる。何度もリピートセクションを再読み出しすることで推定誤りも向上し、誤り限界をも特定することができ、このことは酵素によって生じた重合化学的性質を保存することを必要とせずになされることができる。
【００７９】
最近の研究が示したことは、単一ナノ細孔では、速度の低下は単に電圧の低下のみによっては実現することができないということである（ルー他、  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１０１（１）：７０−９，２０１１）。代わりに、電圧が減少されると、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の速度はよりランダムになり（バックトラッキングを含む）、なぜなら、ブラウン運動が速度変動の一因になるからである。研究によって、高電圧力がブラウン運動によって引き起こされた速度変動を抑制するために必要とされることも示し（この速度変動はさもなければシークエンシング測定を失敗させる）、これは理想化された単一ヌクレオチド感応性ナノ細孔センサーを用いた場合でもである。
【００８０】
本願において提供される、２細孔装置に基づくこのシークエンシング方法は、これらの問題への解決策を提供し、既存の方法に対する付加的な利点を提供する。シークエンシングのために十分な感度を有する１つまたは２つの細孔に合わせて高電圧または低電圧にてこの２細孔制御は単一ナノ細孔態様のシークエンシング速度制御の問題を解決する。係る細孔は固体の基板に内蔵された生体細孔、固体の基板全体に形成された膜における生体細孔、または固体の細孔（例えば、グラフェン，ケイ素，または他の基板において）を含むことができる。一の態様において、ＭｓｐＡといった生体細孔上のファイ２９といった酵素は、一または両方の細孔にて使用することができ、これには、シークエンシングのための大信号を生成するのに使用される高電圧、および、各細孔上の適所に酵素を保持し重合触媒されたＤＮＡ移動を可能にするのに十分な、各酵素に力を生成する作動電圧（但しその酵素を失速させるか解離させるほど大きくはない）を伴う。係る構成は、測定信号を著しく増大させ、２細孔に同時にＤＮＡの１スタンドを読み出すことを可能にすることによって、チャーフ他（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３０（４）：３４４−８，２０１２およびマンラオ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３０：３４９−５３，２０１２）における方法を改善することができる。
【００８１】
更に、本願に開示された方法はイオン電流検出を用いて細孔にて検出感度を確実にするのに十分高い電圧を細孔にて生成することができる。高電圧は各細孔を通して一定速度を確実にするのに十分なブラウン運動を抑制し、各細孔の外側のＤＮＡの構成が一方へのＤＮＡの移動のエネルギー特性に影響すると考えられる。更に、この方法（図１（ＩＩＩ））において用いられる電圧競合は、分子がこの分子の分析を可能にするのに十分な時間を細孔にて過ごすように調節されることができる。更に、本方法は、酵素，光学部品，またはＤＮＡのアタッチメントの必要性がない。従って、この方法は、分子送出速度を規制する間、ナノ細孔を通して高信号対雑音検出回路を提供し、これは単一ナノ細孔態様では不可能な能力である。
【００８２】
この方法は荷電ポリマーにおけるモノマーの組成を特定するのに使用されることができる。一の態様において、モノマー単位はポリマーが単一鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである場合にヌクレオチドである。別の態様において、モノマーユニットはポリマーが二重鎖である場合にヌクレオチド対であり得る。
【００８３】
一の態様において、この方法は、特に結合した分子が荷電される場合に、ポリマーへの修飾（例えばモノマーへの分子結合）を特定するのに使用されることができる。結合分子は電荷されなくてもよいが、中性分子はそのサイズによってイオン電流を変化させることができる。
【００８４】
別の態様において、この修飾はポリマーに対する分子の結合を含む。例えば、ＤＮＡ分子のために、結合分子はＤＮＡ結合タンパク（例えばＲｅｃＡ，ＮＦ−κΒおよびｐ５３）であり得る。更に別の態様において、この修飾は特定のモノマーまたはフラグメントに結合する粒子である。例えば、遺伝子型決定またはＤＮＡマッピングの目的のために特定のＤＮＡ箇所に結合された量子ドットまたは蛍光標識がこの装置によって検出されることができる。従って、本願に開示された装置は、遺伝子型決定およびＤＮＡマッピングの廉価な方法も提供する（これらに限定されない）。
【００８５】
一の態様において、ポリマーがその一端部でビード（ｂｅａｄ）といった固体支持体に接合される。
【００８６】
一実施形態において、ポリヌクレオチドのシークエンスを決定する方法を提供し、この方法は、（ａ）上記実施形態のいずれかの装置の上部チャンバにおいてポリヌクレオチドを含むサンプルを装填するステップを含み、ここで、この装置は上部チャンバと中間チャンバとの間の第１の電圧と、中間チャンバと下部チャンバとの間の第２の電圧とを提供する電源に接続され、このポリヌクレオチドはポリヌクレオチドの一端で固体支持体に任意に接合され、（ｂ）ポリヌクレオチドが上部チャンバから中間チャンバおよび中間チャンバから下部チャンバに移動するように、初期の第１の電圧および初期の第２の電圧を設定するステップを備え、これにより、前記第１の細孔および第２の細孔の両方に亘って前記ポリマーを配置し、（ｃ）両方の電圧が前記荷電ポリマーを前記中間チャンバから引き離すための力を生成するように第１の電圧および第２の電圧を調節するステップを備え、前記ポリヌクレオチドが一方向にかつ制御された方法で両方の細孔に亘って移動するように前記２つの電圧は制御された条件下で強度が異なり、（ｄ）前記ヌクレオチドが細孔を通過するときに前記細孔のうちいずれかのイオン電流を測定することによって、当該細孔を通過するポリヌクレオチドの各ヌクレオチドを特定するステップを備える。
実施例
【００８７】
本技術は、以下の実施例を参照して更に定義される。糸および方法に対する多くの変更が本発明の範囲を逸脱せずに行われ得ることは当業者には明らかであろう。
【００８８】
実施例１．細孔内の個別のｄｓＤＮＡ分子の捕捉および制御
この実施例は、２細孔装置において各細孔内へのＤＮＡの捕捉が、測定された各独立したイオン細孔電流の変化として容易に検出されることを示す。
【００８９】
この実施例は、一端に接着されたビードを伴うｄｓＤＮＡおよびこれを伴わないｄｓＤＮＡを用いてデュアル細孔捕捉を実証する。ビードに連結されたｓｓＤＮＡを伴う実験も行うことができる。
【００９０】
ＤＮＡの捕捉および失速の際、ビードに最も近い細孔電圧（Ｖ１，図１（Ｉ）（チャンバＡからの捕捉の場合））は、ＤＮＡへの競合力がこれをチャンバＡに向かって引き戻すまで反転され、増大されることができる。いずれかの細孔のイオン電流は、実験の間、ＤＮＡの捕捉および退出を容易に検出することができる。
【００９１】
ビードが使用される際、このビードは細孔のいずれかまたは両方を通過することができない適切なサイズを有する。ビード対ＤＮＡが１対１であることを確実にする方法は、当該技術分野にて開発されてきた。例えば、ビオチン化ＤＮＡ重複部位（またはｓｓＤＮＡ）に共役する一価のストレプトアビジン被覆された量子ドット（ＱＤｓ；ＱＤ６５５，インビトロゲン）は、直径が２０〜３０ｎｍのビードを提供することができ、金粒子またはラテックスを使用することによって可能なより大きいなビード（３０〜１００ｎｍ）を伴う。流体力学および荷電へのビードの影響は、これが捕捉速度に関係するため、実験を設計する際に検討され得る。
【００９２】
ビードなしでは、ｄｓＤＮＡは〜０．１ｍｓ／ｋｂｐにて細孔を通過する。長さ５００ｂｐおよび４ｋｂｐのＤＮＡ，およびλ−フェーズｄｓＤＮＡ分子（〜４８ｋｂｐ）が使用される。ＤＮＡサンプルは、チャンバＡからの捕捉を促進してチャンバＢからチャンバＣに通過するために各細孔のために共通の電圧極性を用いてチャンバＡから両方の細孔内に送出されることができる（図１（Ｉ））。ｄｓＤＮＡの大きな持続長（１クーン（Ｋｕｈｎ）長は１００ｎｍ）は、各細孔内部のＤＮＡセグメントが完全に延びて棒状になり易いことを確実にする。電圧およびイオン濃度は適切な捕捉速度を特定するために変えることができる。異なる緩衝されたイオン濃度が、捕捉速度と、各細孔においてＤＮＡの存在を登録するコンダクタンスシフト値とを高めるか変えるために各チャンバにおいて使用されることもできる。
【００９３】
直径が１０ｎｍ以上のナノ細孔を用いることで、ｄｓＤＮＡとナノ細孔壁との間の干渉（例えば、摩擦および固着）を最小限にする。より大きな細孔のために、ｄｓＤＮＡが折り畳まれた構造および折り畳まれていない構造において捕捉されることができるが、一列縦列の（折り畳まれていない）構成は、より高電圧かつより短い（≦３ｋｂｐ）ｄｓＤＮＡにてより生じ易い。５００ｎｍ以下の細孔の内部距離のために、第１の細孔での捕捉の後の（チャンバＡとＢとの間）デュアル細孔捕捉の可能性は１  Ｍ  ＫＣＩにおける少なくとも２００ｍＶの電圧において非常に高い。
【００９４】
電圧の影響が熱拡散を支配しかつ高い確率で捕捉をもたらす半径距離は、少なくとも４ｋｂｐの長さのｄｓＤＮＡを伴う細孔サイズ（直径６〜１５ｎｍ）で電圧（１２０〜５００ｍＶ）において少なくとも９００ｎｍ（細孔の内部距離よりも大きい）であると推定されている（ガーショーおよびゴロブチェンコ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：７７５−７７９，２００７）。これらの発見は、ｄｓＤＮＡの単一（第１の）細孔捕捉の後に、高い確率のｄｓＤＮＡの迅速なデュアル細孔捕捉を支持する。
【００９５】
２細孔によるＤＮＡの捕捉および制御は、アクティブ制御ハードウェアおよび実時間アルゴリズムから利益を得ることができる。発明者らは、ＤＮＡ制御のためのアクティブ制御ハードウェア／ソフトウェアを開発した。例えば、ギアーファス，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，１００：１５０９−１６，２０１１）；ウィルソン他、ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．，３（４）：９９５−１００３，２００９；およびベンナー他、Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．，２（１１）：７１８−２４，２００７を参照。有用なソフトウェアはＦＰＧＡ（フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ）システム（ＰＣＩ−７８３１Ｒ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））において実装されたＬａｂＶＩＥＷソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）である。参照したＦＰＧＡは４つの増幅器まで同時に制御することができる。更に、ＰＣ上でデータをデジタル化して記録（ログ）するために使用されるＡｘｏｎ  Ｄｉｇｉｄａｔａ１４４０Ａデータ収集システム（Ｄａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）は、並列の８つの増幅器までの電圧および電流を記録するのに十分な１６個の入力チャネルを有する。実時間制御および測定のためのハードウェア／ソフトウェアに合う他の実時間オペレーティングシステムは、増幅器を制御し、データをデジタル化して記録するために使用されることもできる。
【００９６】
発明者らは、省スペースおよびマルチチャネル装置における一または複数のナノ細孔の使用を機能化および最適化するために、「ナノクランプ」と称する低雑音電圧クランプ増幅器（キム他、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．  Ｏｎ  Ｂｉｏｍ．Ｃｉｒｃ．Ａｎｄ  Ｓｙｓｔ．Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ，Ｍａｙ  ２０１２；キム他、Ｅｌｅｃ．Ｌｅｔｔｅ．，４７（１５）：８４４−６，Ｊｕｌｙ，２０１１；およびキム他、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＥＥＥ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＳｏＣ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  （ＩＳＯＣＣ），Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１０）も開発した。任意の他の商業的卓上電圧クランプまたはパッチクランプ増幅器，または一体型電圧クランプまたはパッチクランプ増幅器は、２つの細孔制御および測定のために使用されることができる。
【００９７】
様々な固体細孔材料および直径に対し、０．１〜１０ｋｂｐが転座されるのに〜１ｍｓかかる。ＦＰＧＡで制御される増幅器によって、捕捉を検出することができ、および０．０２０ｍｓ（ミリ秒）以内に競合電圧制御を開始し、これは１ｋｂｐ  ＤＮＡの合計通過速度１ｍｓよりもかなり速く、よって、（ビードアタッチメントを伴わずに）ＤＮＡが逃げる前に制御方法をトリガする可能性も高い。制御の実証として、細孔の分子の退出までの時間、および細孔の分子の方向は、競合電圧間の強度および差異の関数として実証することができる（図１（ＩＩＩ））。単一の細孔実験において，細孔による長い（≧１ｋｂｐ）ｄｓＤＮＡの速度における大きな変動は実験的に観察され、およびこれらの変動は拡散ブラウン運動に帰するには大きすぎる。（ルー他，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１０１（１）：７０−７９，２０１１）において、正味速度変動の主要源（すなわち、合計通過時間によって割られるＤＮＡ長さ）は、電圧領域が拡張する、細孔に入っているＤＮＡの部分に加えて、細孔にまだ入っていないＤＮＡの電圧に影響を受ける部分によって誘発される粘性抵抗によるとされた。このモデルは実験データと妥当に適合した。注目すべきは、ｄｓＤＮＡの質量中心が捕捉の際に細孔と同一線上にある場合、正味速度はより速いが、もし細孔から偏位される場合には、正味速度はより遅い。競合電圧が２細孔装置内で使用されるとき、ｄｓＤＮＡ速度は電圧差が十分に高くないのであれば、この粘性抵抗によってもたらされる摂動によって影響を受けない。この理由は、細孔および競合電圧の両方によるｄｓＤＮＡ捕捉がなされた後に、細孔間のｄｓＤＮＡは完全に延びて棒状となっており、よっていずれの細孔入口の近くにおいて構造体を作ることに関わることができないからである。一方、細孔の外側上のｄｓＤＮＡ構造体は各局所細孔電圧によって常に中間チャネルから離され、よって細孔入口動力学に反論する可能性がより低い。係る構造体は、コントロールド・デリバリー動力学に影響を与えることができ、キャリブレーション実験がこれを定量化するために使用することができる。
【００９８】
ランダムに横切るＤＮＡ移動によってもたらされる力の不確実性は最小限になり易い。更に、電圧力は、ＤＮＡ移動の逆方向において電気浸透流（ＥＯＦ）を起こし、もたらされた対イオン流がない場合よりも低速でＤＮＡを移動させる。分子の異なる放射状位置がナノ細孔における異なるＥＯＦフィールドを引き起こすため、問題の一つは有効な電荷密度そして正味駆動力が速度変動をもたらすためにＤＮＡ放射状位置における変動の間に十分変化する。１Ｍ  ＫＣＩにおけるＤＮＡの有効な電荷密度は細孔とＤＮＡ間の１ｎｍ以上の距離に対して安定していると考えられる。
【００９９】
更に、ＳｉＮナノ細孔は、本質的にＤＮＡを排除する負の表面電荷を有する。よって、数ナノメートルよりも大きい直径を備えるＳｉＮ細孔を用いることによって、分子が放射状位置変動を受けるが、各一定電圧値が２細孔のそれぞれにて一定の有効力をもたらし易く、よって２細孔設定において２つの競合電圧を使用するときにより大きな力の方向において一定速度をもたらし易い。他の細孔材料表面の処置はＳｉＮのものに対して同等の効果をなす。
【０１００】
ブラウン運動によって生じたランダムに横切るＤＮＡ以上によってもたらされた速度の不確実性は、競合電圧を高めることによって減少され得る。実験は、係る減少が起こるか否かを決定するために、行われることができる。単一ナノ細孔の研究は（ルー他、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１０１（１）：７０−７９，２０１１）競合力を高めることでブラウン運動によって生じる不確実性を減少することができることを支持する。研究は、ブラウン運動（速い（ナノセカンド）タイムスケールにおいて生じる）によって、かつ、かかる変動に起因するシークエンシングエラーによって、生じた速度変動を分析する。仮定のおよび理想化された単一ヌクレオチドセンサー（＞２２ＭＨｚ帯域幅にてノイズフリーの検出）を仮定すると、ブラウン運動だけで７５％読み出しエラーになる。エラーを予測するための関連パラメータは／ｋＢＴ／Ｆ＊（０．３４ｎｍ）であり、熱エネルギーとＤＮＡを転座するためになされる仕事との比率であり、その距離はヌクレオチド間の距離（０．３４ｎｍ）である。この比率において力Ｆ＝Ｖλは電荷密度λ（ｄｓＤＮＡのために０．２ｅ−／ｂｐ）を備えるＤＮＡを駆動する電圧１である。当該制御方法のために、電圧を５０倍に高めることで５％読み出しエラーになる高電圧は更にエラーを改善する。しかしながら、単一細孔を伴い，平均速度ν（−）（注：νの上にハイフン。以下同じ）は拡散定数ｄを備えるＦ＊ｄ／（ｋＢＴ）ため、ＤＮＡ速度もＦを伴って高まり、シークエンシング帯域幅により非現実的な要求をする。
【０１０１】
２２ＭＨｚ帯域幅を維持するために、単一ナノ細孔を備える力において５０倍の増加は同じν（−）を維持するために溶液粘度における５０倍の増加とペアにならなければならないであろう。しかしながら、実際には、２２ＭＨｚ帯域幅は、単一ヌクレオチドシークエンシングのために、実証されたか実証することを約束する任意の実験的ナノ細孔プラットフォームよりも既に非常に高い。更に、粘度を増加させることは、単一ナノ細孔で１０倍までのみＤＮＡを遅くすることができる（フォロゲア，他、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，５（９）：１７３４−７，２００５）。２細孔プラットフォームを用いて、各電圧を十分に高く維持することができ、このことはブラウン運動によって生じた変動を抑制することができ、一方、正味ＤＮＡ速度を決定する差動電圧は、制御速度が確実に実際のシークエンシング帯域幅（通常１ｋＨｚ）以内となるように調節することができる。ブラウン運動によってもたらされた速度変動を抑制する別の方法は、帰還制御を用いることである。一の態様において、１０ｋＨｚ帯域幅での第１の細孔電圧の駆動への第２の細孔電流帰還の１０ｋＨｚ帯域幅では、ブラウン運動はＤＮＡへの検出可能な特徴を制御するための補償型であり得、これらのｋＨｚ閉ループ帯域幅での第２の細孔内およびこの付近に留まる。この能力は、Ｈｚ閉ループ帯域幅にて分子に取り付けられたビードの光学的強制により、２つの空間次元および仕事においてブラウン運動を抑制した反ブラウン導電学（ＡＢＥＬ）トラップに類似する一次元である（ワングおよびモエナー，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，５：５７９２−９，２０１１）。
【０１０２】
実施例２．  ＤＮＡに結合したＲｅｃＡフィラメントの検出および局所化
この実施例は、２細孔装置が特知惠のシークエンスを有するかこれに結合しないタンパク質のために、ｄｓＤＮＡへのＤＮＡ結合タンパクの結合をマッピングするために使用することができることを示す。
【０１０３】
実施例１において実証されるように、ＤＮＡサンプルはチャンバＡから捕捉することができる。ＲｅｃＡタンパクは、壊れたＤＮＡを損傷を受けていないＤＮＡの相補領域とペアにするＡＴＰ依存ＤＮＡ鎖交換反応を触媒する。不十分に加水分解するＡＴＰ類似体ＡＴＰγＳを用いて、ｄｓＤＮＡに結合されたＲｅｃＡフィラメントは、第１に生理食塩水内で組み立てられる際に高い塩において非常に安定している（例えば、１Ｍ  ＫＣＩ）。ゆっくり加水分解されるＡＴＰγＳに対する代替として、この実施例はＡＤＰ−ＡＩＦ４（四フッ化アルミニウム）も使用することができ、これは全く入れ替わることがなく、ＲｅｃＡがより強固にＤＮＡに結合するようにする。
【０１０４】
２０〜３０ｎｍナノ細孔を通してλ−ＤＮＡに結合されたＲｅｃＡフィラメントの検出は、実証されているが（コワルクジク他、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１０（１）：３２４−８，２０１０；スミーツ他、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．９（９）：３０８９−９５，２００９；およびホール他、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．９（１２）：４４４１−５，２００９）、長さ＜２０ｂｐのフィラメント（６個以下のＲｅｃＡタンパク）は、単一ナノ細孔を用いても、転座速度と測定ＳＮＲとの間の結合によって解決することができない。
【０１０５】
この実施例の初期実験は、ほぼ被覆されていない、部分的に被覆されている、および完全に被覆されているＤＮＡを生成するために、ＲｅｃＡの変化する濃度にされているビード結合および非結合λ−ＤＮＡを用いる。各細孔電流の実時間監視は、コントロールド・デリバリーの進歩状況を計るために使用することができ、フィラメントの位置マッピングのために相関される。各ＤＮＡの繰り返し測定はＲｅｃＡマッピングの正確性を向上させる。
【０１０６】
ＲｅｃＡがＤＮＡに結合されるときに、加えられた電荷およびバルク、ならびに高濃度の塩における安定性は、提案された器具を伴うコントロールド・デリバリーの間に検出および位置マッピングを試みるために理想的な候補となる。
【０１０７】
更に、ＲｅｃＡ結合されたＤＮＡの制御は、転座を止めるためにビードを取り付けることなく試みることができる。実施例１のｄｓＤＮＡ実験と同様に、能動的電圧制御は、ＤＮＡがナノ細孔を出る前に競合電圧制御を迅速に開始するために使用することができる。ＡｓＤＮＡに結合する荷電された種（ｓｐｅｃｉｅｓ）がＤＮＡの正味荷電および剛性を変えることによって電場におけるＤＮＡの機動性に影響するため、移動制御調整実験は、ｄｓＤＮＡの移動を制御するために使用される力平衡への、ｄｓＤＮＡに結合するＲｅｃＡの影響を試験することができる。
【０１０８】
この実施例は、低いＲｅｃＡ濃度で観察された最も短いフィラメント長さを高いＳＮＲかつ十分に遅い制御された速度にて測定することができ、分離して結合された任意のＲｅｃＡタンパクが存在しているかを検出することができる。
【０１０９】
従って、２細孔装置は基本的な調査のために全く新しい単一分子の器具を提供し、なぜなら付加的なタンパクがＲｅｃＡ−ＤＮＡフィラメントに結合するのを検出する能力を試験することができるからであり、このことはフィラメント幅を広くし、よって観察された電流の減少によって検出される。例えば、ＲｅｃＡ−ＤＮＡフィラメントに結合するタンパクは、ＬｅｘＡおよびバクテリアフォージラムダリプレッサーを含み、これらは細胞の状態を検出して下流の調節事象をオンまたはオフに切り替えるためにＲｅｃＡを使用する。
【０１１０】
キャリブレーション実験はＤＮＡの特定のシークエンス（位置）に結合するタンパクを検出することを含み、タンパクによってもたらされた電流シフトが細孔を通してＤＮＡの速度および速度制御性能の推定を可能にする。ｄｓＤＮＡの特定の箇所に結合する例示的なタンパクは、Ｌａｃリプレッサー（２１ｂｐセグメントに結合する）、ラムダファージ・リプレッサー（λ−ＤＮＡの複数のオペレーター部位を有する），および他のタンパクを含む。
【０１１１】
実施例３．一本鎖ＤＮＡ内の二本鎖セグメントの検出および局所化
この実施例は、可変長の二本鎖セグメントを備える１０ｋｂまでのｓｓＤＮＡの生成を実証する。
【０１１２】
第１のステップにおいて、１０ｋｂｐのｄｓＤＮＡはロングレンジＰＣＲによって作ることができる。鎖の一端はビードアタッチメントのためのビオチン化であり、この鎖は化学変性によって分離される。その後、ビードのない１０ｋｂ  ｓｓＤＮＡは２細孔実験において測定された鎖として機能する。所望のサイズを備える相補的一本鎖セグメントは、ＰＣＲによって作られ、ビード捕捉および鎖状分離（ｓｔｒａｎｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）が続く。
【０１１３】
測定された１０ｋｂ  ｓｓＤＮＡ内の複数の箇所にて可変長のｓｓＤＮＡセグメントを使用することができ、１セットの１００ｎｔセグメントで始まる。単一固体細孔を通るイオン電流は、ｄｓＤＮＡをｓｓＤＮＡホモポリマーならびにプリンおよびピリミジンホモポリマーから識別するために使用された（スキナー他、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，９（８）：２９５３−６０，Ｊａｎ  ２００９）。よって、ＤＮＡの単一鎖セグメントを二本鎖セグメントから識別する可能性は２細孔装置を用いて十分な高電圧にて高いものとなる。ｓｓＤＮＡセグメント対ｄｓＤＮＡセグメントをマッピングすることで、ハイブリダイゼーションでアシストされた方法（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（提案されたこの方法は高価なハイブリダイゼーションでアシストされた処理に依存する）を用いてナノ細孔シークエンシングを可能にし、長距離において目標ＤＮＡシークエンスの位置および特定を明らかにするために使用することができる（目標とされたシークエンシング）。単一鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパクの使用の可能性を探ることもできる（ｓｓＤＮＡに結合することによってイオン電流においてｓｓＤＮＡ対ｄｓＤＮＡの差異を更に拡大し、ｄｓＤＮＡよりも大きなインピーダンスを作るビードとして）。
実施例４．長いｓｓＤＮＡの捕捉および制御ならびにＲｅｃＡの局所化
【０１１４】
この実施例は長いｓｓＤＮＡの捕捉および制御ならびにＲｅｃＡの検出および局所化を実証する。更に、この２細孔装置はｓｓＤＮＡ内のプリン対ピリミジンホモポリマーセグメントを検出することができる。
【０１１５】
２０ｎｍのＳｉＮ膜における１０ｎｍの細孔を通しての７ｋｂのｓｓＤＮＡの確率論的なもつれは、ステファン他、  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１０：１４１４−２０，２０１０に示されるように行うことができる。ステファン他２０１０における単一ナノ細孔方法が、もつれたｓｓＤＮＡと細孔／膜表面との間の機械的接触力によってｓｓＤＮＡをほぐす一方、２細孔の競合電圧セットアップは、各細孔に最も近いＤＮＡ骨格への各電圧力の作用によって、ｓｓＤＮＡを十分に高い競合電圧にて細孔の近くかつ細孔の間でもつれを電気泳動的力的にほぐさせることができると考えられる。
【０１１６】
ほぐしおよびこれに続く２細孔セットアップによるｓｓＤＮＡの速度の正確な制御は、長いｓｓＤＮＡ分子の最終的なシークエンシングのために重要である。十分に高い電圧（〜４００ｍＶ）にて、ｓｓ−ＤＮＡ内のプリンおよびピリミジンホモポリマーセグメントを区別することが可能であり、（スキナー他、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，９（８）：２９５３−６０，Ｊａｎ  ２００９），このことは診断用途および癌の研究のために有用である。
【０１１７】
この実施例は、ｓｓＤＮＡに結合してより大きなインピーダンスを作ることによってｓｓＤＮＡイオン電流から区別可能な検出可能な「速度−ｂｕｍｐｓ」として、ＲｅｃＡあるいはおそらく他の一鎖およびＤＮＡ  結合（ＳＳＢ）  タンパクの使用の可能性も探る。これらの速度抑止物（ｓｐｅｅｄ  ｂｕｍｐ）は、制御されたｓｓＤＮＡ速度の直接定量化を可能にし、そして必要とされる１ｍｓ／ｎｔが達成可能であることを実証する。ＲｅｃＡは特定のトリヌクレオチドシークエンス箇所に結合する必要はないが、好ましくはＴＧＧ繰り返しシークエンスに結合し、ＲｅｃＡフィラメントが既に形成されたところに結合する傾向もあるため、キャリブレーション実験は、特定の既知のシークエンス箇所に結合する他のｓｓＤＮＡ結合分子の使用を必要とする。結合箇所が各細孔を通過するときに検出可能な結合箇所を知っていることは、競合電圧値の関数として分子の速度を決定するために必要である。非限定的な実施例は、一または複数の既知の箇所に融合する二重鎖（あるいはビードで拘束された二重鎖）を使用することであり、これから電流のシフトが各細孔を通して各重複部位の経路を検出するために使用することができ、そして選択された電圧値のための通過する鎖速度を推定する。続いて、ＲｅｃＡフィラメントが形成され、係る分子において検出され、ベンチマーク検出点として重複部位の特徴を維持し、これに関連してＲｅｃＡフィラメントが検出され、それらの位置が推定される。
【０１１８】
遺伝的なハプロタイプを決定する方法および蛍光標識をｄｓＤＮＡ内に組み込むことによるＤＮＡマッピングの方法（シヤオ他、米国特許第７７７１９４４号Ｂ２，２０１０）も、２細孔装置を使用することができ、なぜなら、ビードラベル（例えば、量子ドット，または任意の蛍光標識）はよりバルキーであり、ちょうどｄｓＤＮＡ上の結合タンパクがなすように電流においてシフトを生じさせるからである。更に、２細孔方法はより単純で、ラベル位置を検出してマッピングするために、高分解能撮像方法（すなわち、完全内部反射蛍光顕微鏡法）を使用するよりも非常に廉価である。コントロールド・デリバリー中のブラウン運動によって生じる速度変動は、小さな特徴を検出するためよりも大きな特徴（タンパク，重複部位セグメント，ビードアタッチメント）を検出するための害がより少ない。
【０１１９】
本発明は上記実施形態とともに記載したが、上記記載および例は本発明を説明するためのものであり本発明の範囲を限定するものではないと理解されよう。本発明の範囲内の他の態様、利点および変更は当業者には自明であろう。
【図１（Ｉ）】
2014529296.tif 000003
【図１（ＩＩ）】
2014529296.tif 000004
【図１（ＩＩＩ）】
2014529296.tif 000005
【図２】
2014529296.tif 000006
【国際調査報告】
2014529296.tif 000007