(57)【要約】  本発明は、ＥＢＶタンパク質ＢＡＲＦ１の選択ペプチドと特異的に結合する抗体を含んでなる医薬組成物およびワクチン組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜３から選択されるペプチドと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含んでなる、医薬用組成物。
【請求項２】
配列番号１のペプチドと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含んでなる、請求項１に記載の医薬用組成物。
【請求項３】
前記抗体または抗体フラグメントが、モノクローナル抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１または２に記載の医薬用組成物。
【請求項４】
配列番号１〜３から選択されるペプチドを含んでなる、医薬用またはワクチン用組成物。
【請求項５】
配列番号１のペプチドを含んでなる、請求項４に記載の医薬用またはワクチン用組成物。
【請求項６】
配列番号１〜３から選択されるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、医薬用またはワクチン用組成物。
【請求項７】
配列番号１〜３から選択されるペプチドを発現する形質転換宿主細胞を含んでなる、医薬用またはワクチン用組成物。
【請求項８】
エプスタイン−バーウイルス陽性腫瘍の予防または治療のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
上咽頭癌、胃癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エイズ患者において誘発されるリンパ腫、食道および肝内胆管癌、鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、並びに口腔毛状白板症（ＯＨＬ）の予防または治療のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
上咽頭癌の予防または治療のための、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
胃癌の予防または治療のための、請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、ＢＡＲＦ１またはＢＡＲＦ１由来ペプチドと結合する抗体を含んでなる、免疫療法および予防接種に用いるための組成物に関する。
【０００２】
エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は、上咽頭癌(Nasopharyngeal carcinoma)、胃癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エイズ患者において誘発されるリンパ腫、食道および肝内胆管癌(Esophage and Intrahepatic cholangiocarcinoma)など、いくつかのヒトの癌と関係がある。最近のデータにより、ＥＢＶが鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫および肝内胆管癌にも関与することが示された。エイズ患者において頻繁に起こる口腔毛状白板症(Oral hairy leucoplasia)（ＯＨＬ）もＥＢＶと密接に関係している。そのため、ＥＢＶはリンパ球向性でも上皮親和性でもある。
【０００３】
放射線療法および化学療法を含むいくつかのＥＢＶ関連癌治療法が用いられてきた。しかしながら、放射線療法および化学療法は古典的な問題（毒性、用量など）を引き起こす。標的としてのウイルスおよび／または細胞タンパク質に一般に基づく細胞およびウイルス遺伝子療法もいくつか開発された。しかしながら、これらの療法は十分にうまくいかなかった。
【０００４】
免疫療法では、ＥＢＶと関連しているまたは関連していない上皮腫瘍細胞がＥＧＦＲを発現することから、抗ＥＧＦＲ抗体（上皮増殖因子受容体(Epidermal Growth Factor Receptor)）も、特に癌（ＮＰＣ、胸腺腫(Thymomes)、肺癌、子宮頸癌、結腸癌、乳癌および頭頸部癌）の治療のために提案されている。そのため、その治療はＥＢＶ関連癌に限定されない。治療効率（モノクローナル抗体セツムキシマブ(Cetumximab)）は子宮頸癌および胸腺腫に対して評価されている。しかしながら、放射線療法と組み合わせて抗ＥＧＦＲでの処置を受けた患者は放射線耐性を有するようになるというリスクがある。
【０００５】
上咽頭癌（ＮＰＣ）は後鼻腔の上皮から生じるヒト悪性腫瘍である。上咽頭癌はウイルスと一貫して関連しているヒト悪性腫瘍の最も特筆すべき例の１つである。エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の全長ゲノムは、総ての悪性ＮＰＣ細胞に含まれ、そのゲノムは、悪性の表現型におそらく寄与するであろうウイルスタンパク質をコードする(Decaussin G, Sbih-Lammali F, De Turenne-Tessier M, Bougermouh AM, Ooka T. 2000. Cancer Res 60: 5584-5588; Ooka T: 2005. In. Epstein-Barr Virus. Horizon Press, Annette Griffin: Edited by Erle S. Robertson. Chapter 28: p.p 613-630)。ＥＢＶ感染はヒトにおいていたるところで見られるが、ＮＰＣの罹患率は地理的地域によって極端に変動する。
【０００６】
ＮＰＣ生検材料は、ＥＢＥＲｓ、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、ＢＡＲＦ０およびＢＡＲＦ１をコードする遺伝子を含むいくつかのＥＢＶ遺伝子を一貫して発現した。それらの中で、ＬＭＰ１およびＢＡＲＦ１だけが齧歯類繊維芽細胞において悪性形質転換を誘導することができる(Wei and Ooka, 1989, EMBO J. 8: 2897-903; Wang D, Liebowitz D and Kieff E. 1985. Cell 43: 831-840)。ＮＰＣ生検材料の大半は（＞９８％）はＢＡＲＦ１を発現した(Decaussin G, Sbih-Lammali F, De Turenne-Tessier M, Bougermouth AM, Ooka T. 2000 Cancer Res. 60: 5584-8; Hayes DP, Brink AA, Vervoort MB, Middeldorp JM, Meijer CJ, van den Brule A. 1999 J. Mol. Pathol. 52: 97-103.)。さらに、世界中の胃癌の５〜１０％はＥＢＶ感染と関係があり、ほとんどのＥＢＶ関連癌の生検材料はＢＡＲＦ１を発現する。ウイルス溶解タンパク質の中で、ＢＡＲＦ１だけがin vitroでＮＰＣ−およびＥＢＶ関連ＧＣ癌だけでなくＥＢＶ不死化上皮細胞においても一貫してかつ高レベルで発現された(Ooka, 2005, Chapter 28, In. Epstein-Barr Virus. Horizon Press, Annette Griffin: Edited by Erle S. Robertson. Page 613-630)。一方で、ＢＡＲＦ１はin vitroでサル初代腎臓上皮細胞を不死化することができた(Wei MX, de Turenne-Tessier M, Decaussin G, Benet G and Ooka T. 1997 Oncogene 14: 3073-3082)。
【０００７】
ＢＡＲＦ１は、ＥＢＶによりコードされる癌遺伝子として１９８９年にWeiおよびOokaによって発見された(Wei and Ooka, 1989 EMBO J. 8: 2897-903)。ＢＡＲＦ１癌遺伝子は、齧歯類繊維芽細胞(Wei and Ooka, 1989 EMBO J. 8: 2897-903)、ヒトＢ細胞(Wei MX, Moulin, JC, Decaussin G, Berger F, Ooka T. 1994, Cancer Res. 54: 1843-8)、ヒト上皮細胞株および霊長類初代上皮細胞(Wei MX, de Turenne-Tessier M, Decaussin G, Benet G, Ooka T. 1997 Oncogene 14: 3073-3082)において発現されると形質転換活性と不死化活性の両方を示す。ＢＡＲＦ１は、ＥＢＶ粒子の注射後にタマリン（新世界サル）において誘発されたリンパ腫においても発現される(Zhang CX, Decaussin G, Finerty S, Morgan A, Ooka T. 1992, Virus Res 26: 153-166.)。ＢＡＲＦ１は、Ｂｃ１２、ｃ−ｍｙｃ、ＣＤ２３、ＣＤ２１、トランスフェリン受容体およびいくつかの転写因子を活性化する(Ooka, 2005, Chapter 28, In. Epstein-Barr Virus. Horizon Press, Annette Griffin: Edited by Erle S. Robertson. Page 613-630)。ＢＡＲＦ１は、トランスフェクト細胞において、そしてＥＢＶ関連胃癌細胞においてサイクリンＤ１を活性化する(Wiech, T., Nikolopoulos, E., Lassmann, S., Heidt, T., Sarbia, M., Werner, M., Shimizu, Y., Sakka, M., Ooka, T and Zur Hausen. A. 2008, Virchows Archiv 452: 621-628)。ＢＡＲＦ１は、上皮細胞にトランスフェクトされると細胞周期を活性化し、この配列は、ｃ−ｍｙｃおよびｍｄｍ２のような増幅される細胞遺伝子を含む癌細胞において頻繁に観察される《二重微小》染色体において見られた(Karran L., Teo C.G., King D., Hitt M.M., Gao Y., Wedderburn N. and Griffin B.E., 1990. Int. J. Cancer 45, 763-772)。ＢＡＲＦ１タンパク質は、潜伏感染Ｂ細胞によって分泌される(Fiorini and Ooka, 2008, Virology Journal, 5:70)。これは、ＢＡＲＦ１遺伝子が潜伏遺伝子ファミリーに属することを示唆している。形質転換ドメインは、抗アポトーシスＢｃ１２の活性化においても含意される１〜５６番ａ．ａを含むＢＡＲＦ１タンパク質Ｎ末端領域に局在した(Sheng W, Decaussin G, Sumner S, Ooka T. 2001, Oncogene 20: 1176-1185)。
【０００８】
ＢＡＲＦ１は、上皮発癌において重要な役割を果たすと思われる。ＢＡＲＦ１タンパク質は、結晶学的研究によって決定された六量体オリゴマー構造を示し(Tarbouriech N, Ruggiero F, de Turenne-Tessier M, Ooka T, Burmeister WP. 2006, J Mol Biol. 359: 667-678.)、強力なマイトジェンとして作用する(Sail A, Caserta S, Jolicoeur P, Franqueville L, de Turenne-Tessier M and Ooka T. 2004. Oncogene. 23:4938-4944.)。ＢＡＲＦ１タンパク質は、in vitroでＣＳＦ１（コロニー刺激因子−１(Colony Stimulating Factor-1)）と複合体形成することができ、マクロファージ活性化の阻害という結果につながり(Strockbine LD, Cohen JI, Farrah T, Lyman SD, Wagener F, DuBose RF, Armitage RJ and Spriggs MK LD. 1998, J Virol. 72: 4015-4021.)、またＥＢＶ感染Ｂ細胞においてＩＮＦ−αの分泌も阻害し得る(Cohen J. and Lekstrom K. 1999 J. Virol. 73: 7627-7632)。一方で、ＢＡＲＦ１はＡＤＣＣ試験においてＮＫ細胞により認識された(Tanner J, Wei M, Ahamad A, Alfieri C, Tailor P, Ooka T, Menezes J. 1997 J. Infect Disease. 175: 38-46.)。ＢＡＲＦ１はそのため発癌機構だけでなく、免疫修飾にも関与する。ＢＡＲＦ１は、胃上皮細胞において発現されると抗アポトーシス活性を示す(Wang Q., Tsao SW., Ooka T., Nicholls JM., Cheung HW, Fu S., Wong YC, Wang X. 2006 Cancer Letter 238: 90-103)。ＢＡＲＦ１は、その自己分泌機構により細胞周期を活性化し、抗アポトーシスに関与するいくつかの細胞タンパク質を活性化する。ＢＡＲＦ１の有糸分裂促進活性はＥＢＶ関連腫瘍の発生において重要な役割を果たす(Sail A, Caserta S, Jolicoeur P, Franqueville L, de Turenne-Tessier M, Ooka T. 2004, Oncogene 23: 4938-44)。
【０００９】
ＢＡＲＦ１およびＬＭＰ１−エキソソームは培養培地中に分泌されるため(Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh and T. Ooka. 2007, Clin. Cancer Res. 13: 4993-5000)、これらの癌タンパク質はＮＰＣ患者の血清中にも唾液中にも分泌された。血清中に分泌されたこれらのタンパク質は、細胞活性化、免疫修飾および／または免疫抑制に対して重要な役割を果たし得る。ＮＰＣ患者の血清および唾液中へのＢＡＲＦ１タンパク質の分泌が立証され(Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Boμguermouh and T. Ooka. 2007, Clin. Cancer Res. 13: 4993-5000)、ＢＡＲＦ１タンパク質はin vitroで強力な有糸分裂促進活性を示した。この有糸分裂促進活性は腫瘍の発生に関係していると思われる。
【００１０】
Ｂ細胞の不死化に必要な癌遺伝子としてのＢＡＲＦ１の役割は述べられている。しかしながら、他の癌遺伝子も述べられ、それらも不死化に必要である。
【００１１】
ＥＰ−Ａ−１２２９０４３には、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２およびＢＡＲＦ１由来の種々のペプチドおよびそれと反応する抗体試薬が記載されている。しかしながら、これらの抗体を用いる免疫療法アッセイは記載されていない。さらに、ＥＰ−Ａ−１２２９０４３に記載されたペプチドは３４〜４２個間のアミノ酸を含んでなる。
【００１２】
Decaussin ら(Cancer Res., 60:5584-8, 2000)は、ＢＡＲＦ１由来ペプチドおよびこれらのペプチドに対する抗体が記載されている。これらの抗体は、上咽頭癌におけるＢＡＲＦ１の発現を検出するために用いられた。
【００１３】
しかしながら、技術の現状では、ＢＡＲＦ１と特異的に結合する抗体を用いた免疫療法の適用が成功したことはない。
【００１４】
本発明は、驚くべきことに、ＢＡＲＦ１の特定領域と結合する抗体が、in vivoで癌タンパク質を中和することができ、マウスモデルにおける腫瘍の予防および抑制を可能にすることを示す。
【００１５】
３つのＢＡＲＦ１由来ペプチドと結合するポリクローナル抗体が作製された。ＮＰＣ由来上皮腫瘍細胞の注射前に抗ＢＡＲＦ１抗体を連続注射すると腫瘍出現の予防につながった。腫瘍サイズが直径約０．８ｃｍとなった後に抗ＢＡＲＦ１抗体を連続注射した場合には、腫瘍は退縮し、完全に消失した。これは、ＥＢＶ陽性腫瘍を抑制し、ＥＢＶ陽性腫瘍から保護する抗ＬＭＰ１抗体を用いる免疫療法についての最初の報告である。
【００１６】
培養培地へ抗ＢＡＲＦ１抗体を添加することによってもＥＢＶ陽性Ｂ細胞の増殖を阻害することができ、抗ＢＡＲＦ１に基づく免疫療法はＥＢＶ関連リンパ腫の発生を阻害し、ＥＢＶ関連リンパ腫の発生から保護するのにも有効であることが示唆された。抗ＢＡＲＦ１による免疫療法に基づく治療および予防は、ＮＰＣタイプの癌に対してだけではなく、ＧＣタイプの癌に対しても有効である。阻害効果はin vivoおよびin vitroで観察された。
【００１７】
抗ＢＡＲＦ１抗体はＮＰＣ患者の血清においてほとんど検出できないことから、抗ＢＡＲＦ１抗体処置に基づく免疫療法はいっそう将来有望であると思われる。
【発明の開示】
【００１８】
配列表
配列番号１：ヒトヘルペスウイルス４型１のＢＡＲＦ１タンパク質のＮ１７２〜Ｄ１８０位に相当するＢＡＲＦ１由来ペプチド（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ３７８３７７２、ｍＲＮＡおよびタンパク質ＹＰ＿４０１７１９．１）
配列番号２：ヒトヘルペスウイルス４型１のＢＡＲＦ１タンパク質のＧ２０３〜Ｅ２０９位に相当するＢＡＲＦ１由来ペプチド（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ３７８３７７２、ｍＲＮＡおよびタンパク質ＹＰ＿４０１７１９．１）
配列番号３：ヒトヘルペスウイルス４型１のＢＡＲＦ１タンパク質のＷ４８〜Ｅ５５位に相当するＢＡＲＦ１由来ペプチド（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ３７８３７７２、ｍＲＮＡおよびタンパク質ＹＰ＿４０１７１９．１）
【００１９】
発明の具体的説明
本発明の第１の目的は、配列番号１〜３から選択されるペプチドと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含んでなる医薬用組成物である。
【００２０】
好ましい実施形態において、前記医薬用組成物は、配列番号１のペプチドと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含んでなる。
【００２１】
もう１つの好ましい実施形態において、前記医薬用組成物は、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である抗体または抗体フラグメントを含んでなる。
【００２２】
本発明の第２の目的は、配列番号１〜３から選択されるペプチドを含んでなる医薬用またはワクチン用組成物である。
【００２３】
好ましくは、前記医薬用またはワクチン用組成物は、配列番号１のペプチドを含んでなる。
【００２４】
本発明のもう１つの目的は、配列番号１〜３から選択されるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる医薬用またはワクチン用組成物である。
【００２５】
本発明はまた、配列番号１〜３から選択されるペプチドを発現する形質転換宿主細胞を含んでなる医薬用またはワクチン用組成物にも関する。
【００２６】
好ましくは、前記組成物は、エプスタイン−バーウイルス陽性腫瘍の予防または治療のためのものである。
【００２７】
より好ましいのは、前記組成物が、上咽頭癌、胃癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エイズ患者において誘発されるリンパ腫、食道および肝内胆管癌、鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫並びに口腔毛状白板症（ＯＨＬ）の予防または治療のためのものであることである。
【００２８】
さらに好ましいのは、前記組成物が、上咽頭癌または胃癌の予防または治療のためのものであることである。
【００２９】
本発明は、ＥＢＶタンパク質ＢＡＲＦ１から選択したペプチドと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含んでなる医薬用組成物に関する。本発明はさらに、ＥＢＶタンパク質ＢＡＲＦ１由来の選択ペプチドを含んでなる医薬用またはワクチン用組成物に関する。本発明のもう１つの目的は、ＢＡＲＦ１の選択ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる医薬用またはワクチン用組成物である。本発明のさらなる目的は、ＢＡＲＦ１由来の選択ペプチドを発現する形質転換宿主細胞を含んでなる医薬用またはワクチン用組成物である。
【００３０】
ＢＡＲＦ１由来ペプチドおよびそれと反応する抗体試薬はすでに述べられていたが、免疫療法においてそれらの使用が成功したことはなかった。現在では驚くべきことに配列番号１〜３のペプチドと特異的に結合する抗体はin vivoマウスモデルにおいて腫瘍の発生を予防し、抑制することができるということが見出されている。
【００３１】
本発明は、
ａ）本明細書に記載の抗体または抗体フラグメントの有効量、本明細書に記載のペプチドの有効量、本明細書に記載のポリヌクレオチドの有効量、または本明細書に記載の形質転換宿主細胞の有効量と、
ｂ）不活性であってもまたは生理学的に活性であってもよい、薬学上許容される担体
とを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００３２】
本発明は、
ａ）本明細書に記載のポリペプチドの有効量、本明細書に記載のポリヌクレオチドの有効量、または本明細書に記載の形質転換宿主細胞の有効量と、
ｂ）アジュバント
とを含んでなるワクチン組成物をさらに提供する。
【００３３】
本明細書において、「薬学上許容される担体」とは、生理学的に適合性のあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬などを含む。好適な担体、希釈剤および／または賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどの１種以上、ならびにそれらの組合せが挙げられる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。特に、好適な担体の関連例としては、（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミンを含有するまたは含有しない、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ〜７．４、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが挙げられ；酸化防止剤、例えば、トリプタミンおよび安定剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０も含んでよい。
【００３４】
本発明に含まれる医薬組成物は、ＥＢＶと関係がある癌の治療のためのさらなる治療薬も含んでよい。
【００３５】
本発明の組成物は、種々の形態であってよい。これらの形態は、例えば、液体、半固体、および固体投与形を含むが、好ましい形態は意図された投与様式および治療用途によって決まる。典型的な好ましい組成物は注射液または輸液形態である。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内(intraperinoneal)、皮下）である。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ボーラスとしてまたは持続注入によって一定期間にわたって静脈内投与される。もう１つの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、筋肉内、皮下、関節内、滑液嚢内、腫瘍内、腫瘍周囲、病変内、または病変周囲の経路によって注射され、局所的および全身的な治療効果を与える。
【００３６】
非経口投与用の無菌組成物は、必要な量の、本発明に記載の、抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを適当な溶媒に混合し、続いて精密濾過により滅菌することによって調製することができる。溶媒またはビヒクルとして、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組合せを用いてよい。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。これらの組成物は、アジュバント、特に湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤および安定剤も含んでよい。非経口投与用の無菌組成物は、使用時に滅菌水または任意の他の注射用無菌媒質に溶解され得る無菌固体組成物の形態で調製してもよい。
【００３７】
本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または形質転換宿主細胞は経口投与もされ得る。経口投与用の固体組成物として、錠剤、丸剤、散剤（ゼラチンカプセル剤、サシェ剤）または顆粒剤を用いてよい。これらの組成物において、本発明による有効成分は、１種以上の不活性希釈剤、例えば、デンプン、セルロース、スクロース、ラクトースまたはシリカとアルゴン流下で混合される。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば、１種以上の滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなど）、着色剤、コーティング剤（糖衣錠）またはグレイズ(a glaze)も含んでもよい。
【００３８】
経口投与用の液体組成物として、不活性希釈剤、例えば、水、エタノール、グリセロール、植物油またはパラフィン油を含有する薬学上許容される溶液、懸濁液、エマルション、シロップおよびエリキシル剤を用いてよい。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば、湿潤剤、甘味剤、増粘剤、香味剤または安定剤を含んでもよい。
【００３９】
用量は、所望の効果、治療期間および用いる投与経路によって決まる。
【００４０】
本発明はまた、ＥＢＶ陽性腫瘍またはＥＢＶ関連腫瘍、例えば、上咽頭癌、胃癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エイズ患者において誘発されるリンパ腫、食道および肝内胆管癌、鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫および口腔毛状白板症（ＯＨＬ）の予防または治療のための医薬の製造のため、またはワクチンの製造のための本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは形質転換宿主細胞の使用にも関する。
【００４１】
好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または形質転換宿主細胞は、ＥＢＶ陽性腫瘍の予防または治療のために用いられる。より好ましい実施形態において、上記に開示した、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または形質転換宿主細胞を含む医薬組成物またはワクチン組成物の１つが、ＥＢＶ陽性腫瘍の予防または治療のために用いられる。より好ましくは、それらは、上咽頭癌、胃癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エイズ患者において誘発されるリンパ腫、食道および肝内胆管癌、鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、並びに口腔毛状白板症（ＯＨＬ）の予防または治療のために用いられる。好ましい実施形態において、それらは、上咽頭癌または胃癌の予防または治療のために用いられる。
【００４２】
本発明はまた、ＥＢＶ陽性腫瘍を予防または治療するための方法であって、本明細書に記載の抗体、抗体フラグメント、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、形質転換宿主細胞の有効量をヒトすなわちそれを必要とする患者に投与することを含む方法も提供する。好ましい実施形態において、本発明は、上咽頭癌、胃癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エイズ患者において誘発されるリンパ腫、食道および肝内胆管癌、鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、並びに口腔毛状白板症（ＯＨＬ）の予防または治療のための方法に関する。さらに好ましいのは、本発明が、上咽頭癌または胃癌の予防または治療のための方法に関することである。
【００４３】
第１の実施形態において、本発明の組成物は、ＢＡＲＦ１から選択したペプチドと特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを含んでなる。
【００４４】
本明細書において「結合」という用語は、配列番号１〜３のペプチドのうちの１つのエピトープと反応するかまたは配列番号１〜３のペプチドのうちの１つに対して作製された抗体または抗体フラグメントを意味する。
【００４５】
好ましくは、前記抗体は、配列番号１〜３のペプチドのうちの１つのエピトープと特異的に結合し、他の抗原と交差反応しない。よって、前記抗体は１つの特異的な抗原と反応する。
【００４６】
本発明において、配列番号１〜３のペプチドと特異的に結合するポリクローナル抗体は、ウサギにおいて作製した。配列番号１〜３のペプチドと特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体は標準的な技術により作製し得る。好ましい抗体は、配列番号１のペプチドと結合する抗体である。
【００４７】
「抗体」という用語は、本明細書において最も広義に用いられ、具体的には、任意のイソ型のモノクローナル抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および抗体フラグメントを含む。特異的な抗原と反応する抗体は、組換え法、例えば、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択により、または抗原もしくは抗原をコードする核酸によって動物を免疫化することにより作製することができる。
【００４８】
典型的なＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合によって連結された２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖で構成される。各重鎖および軽鎖は定常領域および可変領域を含む。各可変領域は、抗原のエピトープとの結合に主に関与する「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントを含む。それらの領域は、通常、Ｎ末端から順に番号付けされ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。可変領域のより高度に保存された部分は、「フレームワーク領域」と呼ばれる。
【００４９】
本明細書において、「ＶＨ」または「ＶＨ」とは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を意味する。「ＶＬ」または「ＶＬ」についての記載は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２フラグメントの軽鎖を含む、抗体の免疫グロブリン軽鎖の可変領域を意味する。
【００５０】
「ポリクローナル抗体」とは、１以上の他の同一でない抗体の間でまたは存在下で産生された抗体である。一般に、ポリクローナル抗体は、同一でない抗体を産生するいくつかの他のＢリンパ球の存在下でＢリンパ球から産生される。通常、ポリクローナル抗体は、免疫動物から直接得られる。
【００５１】
本明細書における「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体である。すなわち、この集団を形成する抗体は、わずかな量で存在する可能性がある天然に存在する突然変異を除いて本質的に同一である。これらの抗体は単一のエピトープに対して向けられ、従って極めて特異的である。
【００５２】
「エピトープ」は、抗体が結合する抗原上の部位である。
【００５３】
本明細書において、「キメラ抗体」は、定常領域またはその一部が改変、置換または交換され、その結果、可変領域が、異なる種のまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する定常領域と結合している抗体である。
【００５４】
「キメラ抗体」とは、可変領域またはその一部が改変、置換または交換され、その結果、定常領域が、異なる種のまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する可変領域と結合している抗体も意味する。キメラ抗体を作製するための方法は当技術分野で公知である。
【００５５】
本明細書における「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含むキメラ抗体を意味する。ヒト化の目的は、抗体の完全な抗原結合親和性および特異性を維持しながら、ヒトに導入するために、異種抗体、例えば、ネズミ抗体の免疫原性を低下させることである。ヒト化抗体、または他の哺乳類によって拒絶されないように適合させた抗体は、いくつかの技術、例えば、リサーフェイシング(resurfacing)およびＣＤＲグラフティングを用いて作製し得る。ヒト化キメラ抗体は、好ましくは、対応するヒト抗体領域に実質的にまたは排他的に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の定常領域および可変領域ならびにヒト以外の哺乳類に実質的にまたは排他的に由来するＣＤＲを有する。
【００５６】
本発明の抗体は、上述の全長抗体、ならびにそのエピトープ結合フラグメントの両方を含む。本明細書において、「抗体フラグメント」とは、「エピトープ結合フラグメント」と一般に呼ばれる、全長抗体によって認識されるエピトープと結合する能力を保有するいずれの抗体部分をも含む。抗体フラグメントの例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合したＦｖｓ（ｄｓＦｖ）およびＶＬまたはＶＨ領域のいずれかを含んでなるフラグメントが挙げられる。単鎖抗体を含むエピトープ結合フラグメントは、可変領域（群）を単独でまたは以下のもの：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全部もしくは一部と組み合わせて含んでなってよい。
【００５７】
第２の実施形態において、本発明の組成物は、配列番号１〜３のペプチドから選択されるペプチドを含んでなる。
【００５８】
第３の実施形態において、本発明の組成物は、配列番号１〜３のペプチドから選択されるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる。
【００５９】
本発明による「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖ヌクレオチド鎖またはその相補鎖（ＤＮＡまたはＲＮＡタイプのものであり得る）、または二本鎖ヌクレオチド鎖（ｃＤＮＡ（相補的）またはゲノムＤＮＡタイプのものであり得る）を意味する。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡタイプのもの、すなわち二本鎖ＤＮＡである。「ポリヌクレオチド」という用語は、修飾ポリヌクレオチドも意味する。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドは、それらの自然環境から単離または精製される。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、従来の分子生物学技術、例えば、Sambrook et al.により記載されたもの(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989)を用いて、または化学合成によって調製することができる。
【００６１】
前記ポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、ウイルスベクターであってよい。
【００６２】
本発明のもう１つの目的は、配列番号１〜３のペプチドから選択されるペプチドを発現する形質転換宿主細胞を含んでなる組成物である。
【００６３】
当業者は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための標準的な方法、例えば、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス感染、熱ショック、膜の化学的透過化後の形質転換または細胞融合については十分理解している。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】ＥＢＶ陽性またはＥＢＶ陰性細胞株における抗ＢＡＲＦ１抗体の効果：１０５細胞に対して５μｇのＰｅｐＩＩＩ抗体を、ヒトＥＢＶ陽性ＡＫＡＴＡおよびＥＢＶ陰性Ｌｏｕｃｋｅｓ  Ｂ細胞株ならびにヒト上皮ｃ６６６−１細胞株の培養物に加え、その後１２０時間培養した。クマシーブルー染色により生存率％を決定した。
【図２】ＥＢＶ−ＡＧＳ細胞増殖に対する抗ＢＡＲＦ１  ＰｅｐＩＩＩ抗体の効果  ＥＢＶ陰性ＡＧＳ（１）およびＥＢＶ陽性ＡＧＳ（２）を５μｇのＰｅｐＩＩＩ抗体の存在下で培養した。対照細胞には抗体を与えなかった。クマシーブルー染色により細胞の生存を５日間測定した。
【図３】上咽頭癌由来腫瘍に対する免疫療法アッセイ：ｃ６６６−１細胞の注射前に（ｊ）、注射と同時に（ｋ）または注射後に（ｌ）、５０μｇの抗ＢＡＲＦ１  ＰｅｐＩＩＩ抗体を腹腔内(intrapenetorially)注射した。１０７細胞（ｃ６６６−１）は皮下注射した。図に示した値は平均腫瘍サイズ径（単位ｍｍ）に相当する。プロトコール１：ｃ６６６−１に対してのＳ１２（ｊ）：。プロトコール２：ｃ６６６−１に対してのＳ１２（ｋ）。プロトコール３：ｃ６６６−１に対してのＳ１２（ｌ）。抗体を注射しなかった場合のｃ６６６−１細胞注射後の腫瘍発生（ｉ）。
【図４】胃癌由来腫瘍に対する免疫療法アッセイ  ＥＢＶ−ＡＧＳ細胞の注射前に（ｎ）、注射と同時に（ｏ）または注射後に（ｐ）、抗ＢＡＲＦ１  ＰｅｐＩＩＩを注射した。５０μｇの抗体を腹腔内(intrapenetorially)注射した。１０７細胞（ＥＢＶ−ＡＧＳ）は皮下注射した。図に示した値は腫瘍直径サイズの平均（ｍｍ）に相当する。プロトコール１：ＥＢＶ−ＡＧＳに対してＰｅｐＩＩＩを注射した場合（ｎ）：。プロトコール２：ＥＢＶ−ＡＧＳに対してＰｅｐＩＩＩを注射した場合のＥＢＶ−ＡＧＳ細胞増殖に対するＰｅｐＩＩＩの効果（ｏ）。プロトコール３：ＥＢＶ−ＡＧＳに対してＰｅｐＩＩＩを注射した場合（ｐ）。抗体を注射しなかった場合のＡＧＳ−ＥＢＶ細胞注射後の腫瘍発生（ｍ）。
【図５】腫瘍発生における抗ＥＢＶ  ＤＮＡアーゼの効果  ウサギポリクローナル抗ＥＢＶ  ＤＮＡアーゼ（５０μｇ）を５日おきに２０日間処置し、その後１０６  ｃ６６６−１細胞を注射した。腫瘍発生をモニタリングした。腫瘍発生に対する抗体の阻害効果なし。
【図６】腫瘍発生に対する抗ウサギＩｇの効果  抗ウサギＩｇまたは抗マウスＩｇ（５０μｇ）を５日おきに２０日間処置し、その後１０６  ｃ６６６−１細胞を注射した。腫瘍発生をモニタリングした。腫瘍発生に対する抗体の阻害効果なし。
【図７】免疫ブロット法によるマウス血清および腫瘍細胞中のＢＡＲＦ１／ＰｅｐＩＩＩ複合体の検出  ＢＡＲＦ１／ＰｅｐＩＩＩ複合体を単離し、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで解析した。高感度化学発光システム(enhanced chemiluminescence system)（ＥＣＬ； Amersham）により抗原抗体複合体を検出した。ｃ６６６−１またはＥＢＶ−ＡＧＳ腫瘍を発生しているマウスの血清においてＢＡＲＦ１の存在を解析した（１）。対照陽性は、精製ＢＡＲＦ１  ｐ２９．血清から単離したＢＡＲＦ１／ＰｅｐＩＩＩ複合体：（２）Ｓ−ｃ６６６−１．腫瘍から単離したＢＡＲＦ１／ＰｅｐＩＩＩ複合体（３）：ＭＴ−ｃ６６６−１：であった。二次ウサギ抗Ｉｇ）によりＰｅｐＩＩＩを明らかにした。陽性対照として市販のウサギＩｇを用いた：Ｉｇ（１，２，３）。
【実施例】
【００６５】
抗ＢＡＲＦ１抗体をＥＢＶ関連癌（ＮＰＣおよびＧＣ）の予防および抑制に用いることができることを証明するために、本発明者らは動物モデル：ヌードマウスを用いた。
【００６６】
配列番号１〜３のペプチドと結合するポリクローナル抗体はウサギにおいて作製した。
【００６７】
配列番号１のペプチドと結合するポリクローナル抗体（以下、ＰＥＰＩＩＩと呼ぶ）は、これまでに記載されている通りウサギにおいて作製した(Decaussin et al, Cancer Res., 60:5584-8, 2000)。
【００６８】
抗ＢＡＲＦ１抗体の効果のin vitro解析では、ポリクローナル抗ＢＡＲＦ１を、ＥＢＶ陽性ＮＰＣ由来ｃ６６６−１上皮細胞株およびＥＢＶ陽性またはＥＢＶ陰性ヒトＢ細胞株において調べた。ＮＰＣ由来またはＧＣ由来の腫瘍は、ＮＰＣ由来ｃ６６６−１上皮細胞(Cheung ST, Huang DP, Hui AB, Lo KW, Ko CW, Tsang YS, Wong N, Whitney BM, Lee JC. 1999, Int J Cancer 83:121-6)またはＧＣ由来ＥＢＶ陽性ＡＧＳ上皮細胞(Kassis J , Maeda A, Teramoto N, Takada, K, Wu C, Wells A. 2002, Int. J. Cancer 99: 644-51)をヌードマウスに注射した場合に誘発された。本発明者らはこれらのマウスにおいて抗ＢＡＲＦ１の効果を解析した。
【００６９】
in vitro実験
細胞培養物に対する抗ＢＡＲＦ１（ＰＥＰＩＩＩ抗体）の効果
抗ＢＡＲＦ１抗体の効果をＥＢＶ陽性ｃ６６６−１上皮細胞株、ＥＢＶ陽性ヒトＡＫＡＴＡおよびＲａｊｉ  Ｂ細胞株、ＥＢＶ陰性ヒトＬｏｕｃｋｅｓ  Ｂ細胞株、ヒト胃ＡＧＳ細胞株およびＥＢＶ陽性ヒト胃ＡＧＳ細胞株のin vitro培養物において解析した（図１）。
【００７０】
ｃ６６６−１細胞は培養培地中にＢＡＲＦ１タンパク質を分泌した(Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bouguermouh and T. Ooka. 2007, Clin. CancerRes. 13: 4993-5000)。
【００７１】
この分泌された癌タンパク質がin vitroで抗ＢＡＲＦ１抗体により中和されると（１０５細胞に対して５μｇの抗体を培養培地に添加）、図１の生存曲線により示されるようにｃ６６６−１細胞は死に至った。抗体の添加後、生存細胞は２４時間の時点では７５％、４８時間の時点では４０％、９６時間の時点では２０％まで減少し、１２０分（５日）後にはほとんどのｃ６６６−１細胞が死に至った（図１−３）。これは、ＢＡＲＦ１の有糸分裂促進活性が主要な細胞活性化プロセスと直接関係しているということを示唆している。
【００７２】
同じような現象がＥＢＶ陽性ヒトＡＫＡＴＡ  Ｂ細胞でも観察されたが効果は低かった。図１−４に示されるように、１２０分の時点において、細胞の約３０％が死に至った。この現象はこれらの細胞においてＢＡＲＦ１発現が低レベルであることと関連していると思われる(Fiorini and Ooka, 2008 Virology J. 5: 70)。
【００７３】
予想通り、ＥＢＶ陰性Ｌｏｕｃｋｅｓ  Ｂ細胞（図１−２）およびＲａｊｉ  ＥＢＶゲノムがＢＡＲＦ１配列陰性であるＥＢＶ陽性Ｒａｊｉ  Ｂ細胞（図１−１）では阻害効果は観察されなかった。
【００７４】
胃癌ＡＧＳまたはＥＢＶ−ＡＧＳ細胞において抗ＢＡＲＦ１の阻害効果を調べた（図２）。培養培地への抗ＢＡＲＦ１の添加によりＡＧＳ細胞増殖に対する阻害は見られなかったが（図２−１）、一方、抗ＢＡＲＦ１は１２０時間の時点においてＥＢＶ−ＡＧＳ細胞増殖の顕著な阻害を与えた。この時点において、ほとんどのＥＢＶ−ＡＧＳ細胞は死に至った（図２−２）。この阻害は、ＥＢＶ−ＡＧＳの培養物中に分泌されたＢＡＲＦ１タンパク質によってもたらされた。結論として、ＢＡＲＦ１タンパク質のエピトープ１７２〜１８０番ａ．ａ．を認識する抗ＢＡＲＦ１抗体は、ＢＡＲＦ１タンパク質を発現するＥＢＶ陽性ｃ６６６−１およびＡＧＳ上皮細胞株ならびにＥＢＶ陽性Ｂ細胞株の細胞増殖を阻害することができた。
【００７５】
in vivo実験
本発明者らは、１０７培養ＥＢＶ関連腫瘍細胞株：ＮＰＣ由来ｃ６６６−１細胞またはＧＣ由来ＥＢＶ陽性ＡＧＳ（ＥＢＶ−ＡＧＳ）を皮下注射したヌードマウスにおいて抗ＢＡＲＦ１抗体の活性を調査した。ここで用いたヌードマウスはイタリアにおいて生産されたＨａｒｌａｎ(France)由来のものである：系統：Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘｌｎｕ。本発明者らは、ＨｓｄＣｐｂ：ＮＭＲＩ−Ｆｏｘｌｎｕも試験した。ヌードマウスの年齢は４週齢である。ヌードマウスの性別は雄である。４週時点でのヌードマウスの重量は約１９〜２１ｇである。
【００７６】
ｃ６６６−１細胞に関し、未処置のマウスでは第２日目または第３日目までには腫瘍が認められ、第４日目までには直径約２ｍｍに達し、第８日目には８ｍｍ、その後第１４日目には１６ｍｍ、第２０日目には２０ｍｍに達する（図３−ｉ）。
【００７７】
ＥＢＶ陽性ＡＧＳ細胞に関し、未処置のマウスでは第２日目または第３日目までには腫瘍が認められ、第４日目までには直径約３ｍｍに達し、第８日目には１５ｍｍ、その後第１４日目には２５ｍｍ、第２０日目には３０ｍｍに達する（図４−ｍ）。
【００７８】
誘発された腫瘍（腫瘍サイズ、直径単位ｍｍ）は、ｃ６６６−１細胞ではＥＢＶ−ＡＧＳ細胞の場合よりもわずかに小さい（図３−ｉおよび図４−ｍ）。
【００７９】
抗ＢＡＲＦ１の効果を解析するために、１匹のマウス当たり２５μｇの抗ＢＡＲＦ１を３つのプロトコールにより腹腔内注射した：
プロトコール番号１、予防プロトコールによりＢＡＲＦ１（Ｐｅｐ−ＩＩＩ）２５μｇを５日おきに５回の腹腔内注射として投与し、腫瘍投与の３日前に終えた（ｃ６６６−１については図３−ｊ、ＥＢＶ−ＡＧＳについては図４−ｎ）。
プロトコール番号２、いずれも腫瘍投与と同時に開始し、５日間毎日注射（ｃ６６６−１については図３−ｋ、ＥＢＶ−ＡＧＳについては図４−ｏ）。
プロトコール番号３、腫瘍サイズが直径約０．８ｃｍとなったときに５回注射（毎日１回注射）（ｃ６６６６−１については図３−４、ＥＢＶ−ＡＧＳについては図４−４）。
プロトコール番号１および番号２は予防のためのものであり、プロトコール番号３は腫瘍の処置である。
【００８０】
両方の細胞株についての抗ＢＡＲＦ１による予防（プロトコール番号１−図３−ｊおよび図４−ｎ）または同時（プロトコール番号２−図３−ｋおよび図４−ｏ）処置により処置マウスのいずれにおいても腫瘍の出現が少なくとも３ヶ月間完全に排除された。
【００８１】
抗ＢＡＲＦ１抗体の注射は、腫瘍がすでにかなりの大きさに達しているときに与えても非常に効果的であった。約８ｍｍ（ｃ６６６−１）および約１５ｍｍ（ＥＢＶ−ＡＧＳ）の小結節は、抗ＢＡＲＦ１抗体を５日間毎日注射することによる処置後に急速に安定し、その後進行的に退縮した（ｃ６６６−１については図３−１、ＥＢＶ−ＡＧＳについては図４−ｐ）。処置開始から１１日後に腫瘍塊は完全に消失し、マウスは少なくとも３ヶ月間無腫瘍状態であった。
【００８２】
腫瘍増殖の阻害に対する抗ＢＡＲＦ１の特異性を確認するために、本発明者らは、プロトコール番号１（予防）によりＥＢＶがコードするＤＮＡアーゼ抗体またはマウスポリクローナル抗Ｉｇ抗体のいずれかを注射した。予防プロトコールにより抗ＥＢＶ−ＤＮＡアーゼまたは抗マウスＩｇのいずれかの２５μｇを５日おきに５回の腹腔内注射として投与し、腫瘍投与の３日前に終えた。
【００８３】
その際、対照実験として用いた未処置動物、または抗ＢＡＲＦ１の代わりに、ｃ６６６−１に関するプロトコール番号１（予防）における抗ＤＮＡアーゼ（図５）または抗ウサギＩｇ（図６）で処置した動物は急速な腫瘍増殖を示した（図５および図６）。これは、腫瘍発生の特異的な阻害が抗ＢＡＲＦ１によるＢＡＲＦ１タンパク質の中和による可能性が高いことを示唆している。
【００８４】
用いた抗ウサギＩｇはSigma (France)から購入した（カタログ番号１８７７２）。
ここで用いたウサギポリクローナル抗ＤＮＡアーゼは、バキュロウイルス系により得たＥＢＶ−ＤＮＡアーゼから本発明者らの研究所で作製した(Sbih-Lammali F, Berger F, Busson P and Ooka T, 1996, Virology, 222: 64-74) (Zeng Y, Middeldorp J, Madjar JJ and Ooka T , 1997, Virology 239:285-295)。
【００８５】
次いで、本発明者らは、抗ＢＡＲＦ１とＢＡＲＦ１タンパク質の複合体が血清中および腫瘍細胞中に存在するかどうかを調べた。
【００８６】
ＢＡＲＦ１はｃ６６６−１（図７−１、ｃ６６６−１）およびＥＢＶ−ＡＧＳ（図７−１、ＥＢＶ−ＡＧＳ）を有するマウスの血清中に存在した。この実験で用いた陽性対照（ｐ２９と呼ぶ）は、ＢＡＲＦ１組換えアデノウイルスに感染した２９３細胞から精製したＢＡＲＦ１である(Sall A, Caserta S, Jolicoeur P, Franqueville L, De Turenne-Tessier M and Ooka T. (2004) Oncogene. 23: 4938-4944)。
【００８７】
本発明者らは、これらの血清成分を腫瘍発生後に抗体で処置したマウスにおいて調査した（プロトコール番号３）。処置第３日目に血清からコンカナバリンＡアフィニティークロマトグラフィーによりＢＡＲＦ１を回収した(Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh and T. Ooka. Clin. Cancer Res. 13: 4993-5000; De Turenne and Ooka, 2007 J. Gen. Virol. 88: 2656-2661)。
【００８８】
ｃ６６６−１処置マウス血清中の複合体のウエスタンブロット法による解析では、ＢＡＲＦ１の存在（図７−２：Ｓ−ｃ６６６−１）をウサギ免疫グロブリン（図７−２、Ｓ−ｃ６６６−１−Ｉｇ）と関連づけて示している。市販のウサギＩｇを対照陽性として加えた（図７−２：Ｉｇ）。
【００８９】
腫瘍生検材料中においてもウサギ免疫グロブリン（図７−３、ＭＴ−ｃ６６６−１−Ｉｇ）と関連づけて同じような複合体が見られた（図７−３、ＭＴ−ｃ６６６−１）。市販のマウスＩｇを対照陽性として加えた（図７−３：Ｉｇ）。
【００９０】
驚くべきことに、本発明者らは、適当に処置したマウスの腫瘍生検材料から単離した細胞内部にＢＡＲＦ１／ＰｅｐＩＩＩ抗体複合体を見出した。腫瘍から抽出した細胞をスライド上に載せ、アセトンで固定した。複合体をＰｅｐＩＩＩについて抗ウサギＩｇにより明らかにした。ＢＡＲＦ１／ＰｅｐＩＩＩ複合体は細胞質内および核内の斑点として見られた。これらの通常有糸分裂促進性を有する成分はその特異的抗体と組み合わせることにより効果がなくなったことは明らかである。
【００９１】
本発明者らは、ＮＰＣ患者の血清から精製したＢＡＲＦ１がＥＢＶ陰性Ｌｏｕｃｋｅｓ細胞において有糸分裂促進性を有することをこれまでに示している(Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh and T. Ooka. Clin. Cancer Res. 13: 4993-5000)。
【００９２】
一般に、ほとんどのＥＢＶ陽性ＧＣ生検材料はＢＡＲＦ１を発現する(zur Hausen A, Brink A A, Craanen ME., Middeldorp JM, Meijer C J, van Den Brule AJ. 2000, Cancer Res. 60: 2745-2748)。ＢＡＲＦ１の転写をｃ６６６−１およびＥＢＶ−ＡＧＳ細胞においてex vivoでおよび培養物において半定量的および定量的ＲＴ−ＰＣＲにより比較した。
【００９３】
本発明者らは、ＢＡＲＦ１発現は培養ｃ６６６−１細胞においてどういうわけか弱いが、腫瘍生検材料においてその発現はよりいっそう重要なものとなることを見出した。ＥＢＶ−ＡＧＳでは、ＢＡＲＦ１転写は培養ＥＢＶ−ＡＧＳ細胞において非常に弱かったが、腫瘍生検材料はＢＡＲＦ１をよりいっそう高く発現する。標準的な対照として用いたアクチン発現はそれらの間で類似していたため、これらはＢＡＲＦ１発現がex vivoで活性化されたことを示唆している。ex vivoでのＥＢＶ遺伝子発現の活性化は、本発明者らのグループによって、ヌードマウスにおいてＥＢＶ−ＡＫＡＴＡ細胞を注射した後に腫瘍生検材料で解析したときにすでに観察された(Sheng W, Decaussin, G., Ligout A., Takada, K and Ooka, T. 2003. J. Virol. 77: 3859-3865)。
【００９４】
本発明者らはこれらの結果を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。転写レベルは、培養細胞（ＥＢＶ−ＡＧＳおよびｃ６６６−１）から得た値と比べて、ＥＢＶ−ＡＧＳ腫瘍（ＥＢＶ−ＡＧＳ／ＥＢＶ−ＡＧＳ−Ｔ）において２倍、ｃ６６６−１腫瘍（ｃ６６６−１／ｃ６６６−１−Ｔ）においてはほぼ３倍高かった。
【００９５】
腫瘍におけるＢＡＲＦ１転写の驚くべき活性化は、腫瘍が発生する細胞周期活性化におけるＢＡＲＦ１の重要な役割を示唆している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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