(57)【要約】本発明は、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に対して免疫特異的に結合することが可能な抗体と、その抗原結合フラグメントと、その他の分子とに関連する。いくつかの実施形態において、上記分子は、Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＣの有する、ＰＤ−１に対して結合する能力を調節することがさらに可能であるか、または、上記Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１のシグナル伝達活性に対して影響を与えることが可能である。本発明はさらに、癌およびその他の疾病の診断および治療における上記分子の使用に関連する。
2014523401.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に免疫特異的に結合する抗体の抗原結合フラグメントを有する分子。
【請求項２】
前記免疫特異的に結合したＢ７−Ｈ１またはＰＤ−１が、生細胞の表面に内因性濃度または形質移入濃度で発現される請求項１に記載の分子。
【請求項３】
前記Ｂ７−Ｈ１はヒトＢ７−Ｈ１であり、かつ、前記ＰＤ−１はヒトＰＤ−１である請求項１〜２のいずれか１項に記載の分子。
【請求項４】
前記抗原結合フラグメントはＢ７−Ｈ１に結合し、かつ、前記生細胞は腫瘍細胞、病原体感染細胞、または抗原提示細胞である請求項１〜３のいずれか１項に記載の分子。
【請求項５】
前記抗原結合フラグメントはＰＤ−１に結合し、かつ、前記生細胞はＴ細胞である請求項１〜３のいずれか１項に記載の分子。
【請求項６】
前記分子は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体である請求項１〜５のいずれか１項に記載の分子。
【請求項７】
前記抗体は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または多重特異性抗体である請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
請求項３または４に記載の分子または請求項６または７に記載の抗体であって、分子または抗体がＢ７−Ｈ１に結合し、かつ、前記抗原結合フラグメントが、抗Ｂ７−Ｈ１抗体１Ｅ１２、１Ｆ４、２Ｇ１１、３Ｂ６、および３Ｄ１０のＣＤＲのうちの少なくとも１つのコンセンサスＣＤＲと、以下の（Ａ）から（Ｅ）：
（Ａ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体１Ｅ１２の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｂ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体１Ｆ４の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｃ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体２Ｇ１１の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｄ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体３Ｂ６の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；または、
（Ｅ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体３Ｄ１０の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ、から選択される全ての残りのＣＤＲとを有する６つのＣＤＲを有する分子または抗体。
【請求項９】
前記６つのＣＤＲが以下の（Ａ）から（Ｅ）：
（Ａ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体１Ｅ１２の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｂ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体１Ｆ４の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｃ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体２Ｇ１１の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｄ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体３Ｂ６の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；または、
（Ｅ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体３Ｄ１０の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ、のいずれかである請求項８に記載の分子または抗体。
【請求項１０】
前記抗体がＢ７−Ｈ１に結合し、かつ、抗体可変領域ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  １、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  ２、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  ３、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  ４、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  ５、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  ６、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  ７、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  ８、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  ９、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  １０、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  １１、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  １２、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  １３、またはｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ  １４を有する請求項６〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項３または５に記載の分子または請求項６または７に記載の抗体であって、分子または抗体がＰＤ−１に結合し、かつ、前記抗原結合フラグメントが、抗ＰＤ−１抗体１Ｅ３、１Ｅ８および１Ｈ３のうちの少なくとも１つのコンセンサスＣＤＲと、以下の（Ａ）から（Ｃ）：
（Ａ）抗ＰＤ−１抗体１Ｅ３の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｂ）抗ＰＤ−１抗体１Ｅ８の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；または、
（Ｃ）抗ＰＤ−１抗体１Ｈ３の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ、から選択される全ての残りのＣＤＲとを有する６つのＣＤＲを有する分子または抗体。
【請求項１２】
前記６つのＣＤＲが、以下の（Ａ）から（Ｃ）：
（Ａ）抗ＰＤ−１抗体１Ｅ３の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｂ）抗ＰＤ−１抗体１Ｅ８の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；または、
（Ｃ）抗ＰＤ−１抗体１Ｈ３の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ、のいずれかである請求項１１に記載の分子または抗体。
【請求項１３】
前記抗体がＰＤ−１に結合し、かつ、抗体可変領域ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  １、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  ２、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  ３、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  ４、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  ５、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  ６、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  ７、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  ８、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  ９、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  １０、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  １１、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  １２、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  １３またはｈ１Ｈ３  Ｖａｒ  １４を有する請求項６、７、１１および１２のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記分子または抗体は、検出可能に標識化されているか、または、共役毒素、薬剤、受容体、酵素、受容体リガンドを有すること請求項１〜５、８〜９および１１〜１２のいずれか１項に記載の分子または請求項６〜１３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記分子または抗体が、
（Ａ）Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に仲介されたシグナル伝達を調節する；
（Ｂ）Ｂ７−Ｈ１のＢ７−Ｈ１受容体に結合する能力、または、ＰＤ−１のＰＤ−１リガンドに結合する能力を弱める；
（Ｃ）Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１仲介シグナル伝達を刺激する；
（Ｄ）Ｔ細胞の増殖を仲介する；または、
（Ｅ）ＩＦＮ−γの産生を高める、請求項１〜５、８〜９、１１〜１２、および１４のいずれか１項に記載の分子または請求項６〜１４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１６】
治療効果のある量の請求項１５の分子、および、生理学的に許容できる担体または添加剤を有する医薬組成物。
【請求項１７】
癌、自己免疫疾患、感染症、または、Ｔ細胞の数または健康に影響する疾病の治療における請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
前記治療は予防的なものであり、かつ、前記癌、前記自己免疫疾患、前記感染症、または、前記Ｔ細胞の数または健康に影響する疾病の症状が出る前に施される請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に対する対象の細胞の結合能力に関して前記対象の細胞を分析することによって、前記対象における癌、自己免疫疾患、感染症、またはＴ細胞の数または健康に影響する疾病を診断するための、請求項１〜５、８〜９、１１〜１２および１４のいずれか１項に記載の分子または請求項６〜１４のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項２０】
（Ａ）前記感染症が慢性ウイルス病であるか、または、
（Ｂ）前記自己免疫疾患が移植片対宿主病である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、米国特許出願第６１／４７７，４１４号（２０１１年４月２０日出願；係属中）に基づいて優先権を主張するものであり、この米国特許出願の開示内容全体を参照によって本出願に援用する。
【０００２】
〔配列表の参照〕
本出願は、３７ＣＦＲ１．８２１に従い、１つ以上の配列表（以下を参照）を含んでいる。この配列表は、紙媒体とコンピュータ読み取り可能な媒体との両方で開示され、この紙による開示とコンピュータ読み取り可能な開示との全体を参照によって本出願に援用する。
【０００３】
〔発明の背景〕
〔発明の技術分野〕
本発明は、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に対して免疫特異的に結合することが可能な抗体と、その抗原結合性フラグメントと、その他の分子とに関連する。一部の実施形態において、上記分子は、Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＣの有する、ＰＤ−１に対して結合する能力を調節することがさらに可能であるか、または、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１のシグナル伝達活性に対して影響を与えることが可能である。本発明はさらに、癌およびその他の疾病の診断および治療における上記分子の使用に関連する。
【０００４】
〔先行技術の記載〕
（Ａ．細胞性免疫応答）
ヒトおよびその他の哺乳類における免疫系は、感染症および疾病に対する防御の提供を担っている。そのような防御は、体液性免疫応答と細胞性免疫応答との両方によってもたらされている。体液性免疫応答の結果、外来性の標的（抗原）を認識し中和することが可能な抗体およびその他の生体分子が産生される。これに対して、細胞性免疫応答では、マクロファージと、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）と、抗原特異性の細胞傷害性Ｔリンパ球とがＴ細胞によって活性化され、抗原の認識に反応して種々のサイトカインが放出される（Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48）。
【０００５】
Ｔ細胞が有する、抗原に対する免疫応答を最適に媒介する能力には、２つの異なるシグナル伝達相互作用が必要である（Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation," Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339）。まず、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に配列された抗原が、抗原特異性のナイーブＣＤ４+Ｔ細胞に対して提示されていなければならない。そのような提示の結果、提示された上記抗原に特異的となる免疫応答を上記Ｔ細胞に開始させるように指示するシグナルがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して伝達される。次に、ＡＰＣと異なるＴ細胞の表面分子との間の相互作用によって媒介された一連の共刺激抑制シグナルによって、最初にＴ細胞の活性化および増殖を引き起こし、最終的にはＴ細胞の阻害を引き起こす。よって、第１のシグナルは免疫応答に対して特異性を与える一方、第２のシグナルはその応答の性質と、規模と、持続時間とを決定する働きをする。
【０００６】
免疫系は、共刺激かつ共抑制的なリガンドおよび受容体によって厳密に制御されている。これらの分子は、上記第２のシグナルを供給してＴ細胞を活性化させ、正負シグナルのバランスがとれたネットワークを提供して、自己に対する免疫を制限しつつ感染症に対する免疫応答を最大化する（Wang, L. et al. (March 7, 2011) "VISTA, A Novel Mouse Ig Superfamily Ligand That Negatively Regulates T Cell Responses," J. Exp. Med. 10.1084/jem.20100619:1-16; Lepenies, B. et al. (2008) "The Role Of Negative Costimulators During Parasitic Infections," Endocrine, Metabolic & Immune Disorders - Drug Targets 8:279-288）。特に重要なのは、抗原提示細胞のＢ７．１（ＣＤ８０）リガンドおよびＢ７．２（ＣＤ８６）リガンドとＣＤ４+Ｔリンパ球のＣＤ２８受容体およびＣＴＬＡ−４受容体との間の結合である（Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation," Immunol. Rev. 229:307-321）。ＣＤ２８に対するＢ７．１またはＢ７．２の結合によってＴ細胞の活性化が刺激され、ＣＴＬＡ−４に対するＢ７．１またはＢ７．２の結合によって前記活性化が抑制される（Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation," Immunol. Rev. 229:307-321; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B7 Family Revisited," Ann. Rev. Immunol. 23:515-548）。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の表面において構成的に発現される（Gross, J., et al. (1992) "Identification And Distribution Of The Costimulatory Receptor CD28 In The Mouse," J. Immunol. 149:380-388）。これに対して、ＣＴＬＡ４の発現は、Ｔ細胞の活性化に続いて急速に上方制御される（Linsley, P. et al. (1996) "Intracellular Trafficking Of CTLA4 And Focal Localization Towards Sites Of TCR Engagement," Immunity 4:535-543）。ＣＴＬＡ４は親和性のより高い受容体なので（Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126）、結合によって最初にＴ細胞の増殖が（ＣＤ２８を介して）開始され、次にその増殖が（ＣＴＬＡ４の初期の発現を介して）抑制され、これにより、増殖が必要なくなった時に効果を減衰させる。
【０００７】
ＣＤ２８受容体のリガンドをさらに研究することによって、関連するＢ７分子一式（「Ｂ７スーパーファミリー」）の同定および特性決定を行なった（Coyle, A.J. et al. (2001) "The Expanding B7 Superfamily: Increasing Complexity In Costimulatory Signals Regulating T Cell Function," Nature Immunol. 2(3):203-209; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126; Greenwald, R.J. et al. (2005) "The B7 Family Revisited," Ann. Rev. Immunol. 23:515-548; Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7; Loke, P. et al. (2004) "Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells." Arthritis Res. Ther. 6:208-214; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339; Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity," J. Immunother. 30(3):251-260; Agarwal, A. et al. (2008) "The Role Of Positive Costimulatory Molecules In Transplantation And Tolerance," Curr. Opin. Organ Transplant. 13:366-372; Lenschow, D.J. et al. (1996) "CD28/B7 System of T Cell Costimulation," Ann. Rev. Immunol. 14:233-258; Wang, S. et al. (2004) "Co-Signaling Molecules Of The B7-CD28 Family In Positive And Negative Regulation Of T Lymphocyte Responses," Microbes Infect. 6:759-766）。現在、上記ファミリーのいくつかのメンバーが既知である。すなわち、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、プログラム死−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１；Ｂ７−Ｈ１）、プログラム死−２リガンド（ＰＤ−Ｌ２；Ｂ７−ＤＣ）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、およびＢ７−Ｈ６が既知である（Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7; Flajnik, M.F. et al. (2012) "Evolution Of The B7 Family: Co-Evolution Of B7H6 And Nkp30, Identification Of A New B7 Family Member, B7H7, And Of B7's Historical Relationship With The MHC," Immunogenetics epub doi.org/10.1007/s00251-012-0616-2）。
【０００８】
（Ｂ．Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ１相互作用）
（１．Ｂ７−Ｈ１）
Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２７４）は、腫瘍に対する免疫応答を形づくることに中枢的に関与しているため、Ｂ７スーパーファミリーでは特に重要なメンバーである（Flies, D.B. et al. (2007) "The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity," J. Immunother. 30(3):251-260、米国特許第６，８０３，１９２号および第７，７９４，７１０号；米国特許出願公開第２００５／００５９０５１号、第２００９／００５５９４４号、第２００９／０２７４６６６号、および第２００９／０３１３６８７号；および、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ０１／３９７２２号および第ＷＯ０２／０８６０８３号）。Ｂ７−Ｈ１は、およそ３３ｋＤａの１型膜貫通タンパク質である。Ｂ７−Ｈ１は、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患、および肝炎などのその他の疾患などの特定の事象の間、免疫系を抑止するのに重要な役割を果たしていると推測されてきた。
【０００９】
Ｂ７−Ｈ１は、ヒトおよびマウスの異なる組織（心臓、胎盤、筋肉、胎児肝臓、脾臓、リンパ節、および胸腺；また、肝臓、肺、および腎臓についてはマウスのみ）に広範囲に発現する（Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298）。ヒトにおいて、Ｂ７−Ｈ１タンパク質の発現は、ヒト内皮細胞（Chen, Y. et al. (2005) "Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells," Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92; de Haij, S. et al. (2005) "Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And B7-H1" Kidney Int. 68:2091-2102; Mazanet, M.M. et al. (2002) "B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T Cell Cytokine Synthesis," J. Immunol. 169:3581-3588）、心筋（Brown, J.A. et al. (2003) "Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T Cell Activation And Cytokine Production," J. Immunol. 170:1257-1266)）、合胞体栄養細胞（Petroff, M.G. et al. (2002) "B7 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface," Placenta 23:S95-S101）、一部組織の在住マクロファージ、または、インターフェロン（ＩＦＮ）−γまたは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αで活性化されたマクロファージ（Latchman, Y. et al. (2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation," Nat. Immunol 2:261-268）、および、腫瘍（Dong, H. (2003) "B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity," J. Mol. Med. 81:281-287）においてみられる。マウスにおいては、Ｂ７−Ｈ１タンパク質の発現は、心臓内皮、膵臓の島細胞、小腸、および、胎盤において確認される（Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298）。
【００１０】
（２．ＰＤ−１）
プログラム死−１（「ＰＤ−１」）は、Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣの受容体である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞調節因子の拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４ファミリーのおよそ３１ｋＤのＩ型膜タンパク質メンバーである（Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11:3887-3895、米国特許出願公開第２００７／０２０２１００号、第２００８／０３１１１１７号、および第２００９／００１１０６６７号；米国特許第６，８０８，７１０号、第７，１０１，５５０号、第７，４８８，８０２号、第７，６３５，７５７号および第７，７２２，８６８号；および、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ０１／１４５５７号）。ＣＴＬＡ４と比べ、ＰＤ−１は免疫応答をより広範囲で負に調節する。
【００１１】
ＰＤ−１は、活性Ｔ細胞、Ｂ細胞、および、単球上に発現し（Agata, Y. et al. (1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes," Int. Immunol. 8(5):765-772; Yamazaki, T. et al. (2002) "Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T Cells And APC," J. Immunol. 169:5538-5545）、かつナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞において低レベルに発現する（Nishimura, H. et al. (2000) "Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice," J. Exp. Med. 191:891-898; Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298）。
【００１２】
ＰＤ−１の細胞外領域は、ＣＴＬＡ４における等価ドメインに対して２３％の同一性を有する単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｖドメインからなる（Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298）。上記細胞外ＩｇＶドメインには、膜貫通領域および細胞内尾部が続く。細胞内尾部は、免疫受容体チロシンベース抑制モチーフおよび免疫受容体チロシンベーススィッチモチーフの中に位置する２つのリン酸化部位を含有し、これは、ＰＤ−１が、ＴＣＲシグナルを負に調節することを示唆する（Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11:3887-3895; Blank, C. et al. (Epub 2006 Dec 29) "Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer," Immunol. Immunother. 56(5):739-745）。
【００１３】
マウスＰＤ−１に対して免疫特異的に結合することが可能な抗体が報告されてきた（たとえば、Agata, T. et al. (1996) "Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And B Lymphocytes," Int. Immunol. 8(5):765-772、参照）。
【００１４】
（Ｃ．Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１との相互作用）
Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１との相互作用は、重要な負の共刺激のシグナルをＴ細胞およびＢ細胞に供給することが確認されており（Martin-Orozco, N. et al. (2007) "Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298）、細胞死誘導因子として機能する（Ishida, Y. et al. (1992) "Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death," EMBO J. 11:3887-3895; Subudhi, S.K. et al. (2005) "The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition," J. Molec. Med. 83:193-202）。
【００１５】
低濃度のＰＤ−１受容体とＢ７−Ｈ１リガンドとの間の相互作用により、結果として、抗原特異性ＣＤ８+Ｔ細胞の増殖を強く抑制する抑制シグナルが伝達される。より高濃度では、ＰＤ−１との相互作用は、Ｔ細胞の増殖を抑制しないが、複数のサイトカインの産生を明らかに抑制する（Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126）。以前に活性化されて、現在は休止期にあるＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の両方、さらには臍帯血からのナイーブＴ細胞によるＴ細胞増殖およびサイトカイン産生が、可溶性Ｂ７−Ｈ１−Ｆｃ融合タンパク質により抑制されることがわかっている（Freeman, G.J. et al. (2000) "Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation," J. Exp. Med. 192:1-9; Latchman, Y. et al. (2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation," Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. et al. (2002) "PD-1:PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+) and CD8(+) T cells and is overcome by IL-2," Eur. J. Immunol. 32(3):634-643; Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126）。
【００１６】
Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１との相互作用は、Ｇ０−Ｇ１における細胞周期停止を引き起こすが、細胞死を増加させることはない（Latchman, Y. et al. (2001) "PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T Cell Activation," Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. et al. (2002) "PD-1:PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+) and CD8(+) T cells and is overcome by IL-2," Eur. J. Immunol. 32(3):634-643）。よって、抗原性刺激が弱い、あるいは、制限されている場合、Ｂ７−Ｈ１-ＰＤ−１錯化剤は、Ｂ７-ＣＤ２８シグナルに拮抗する能力を有しており、Ｔ細胞応答を下方制御する際に重要な役割を果たす。
【００１７】
Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１とによって媒介されるシグナル伝達は、複雑である。両方の分子は、他のタンパク質にさらに結合する。Ｂ７−Ｈ１は、Ｂ７−１（ＣＤ８０）に対して結合することが可能である（Butte, M.J. et al. (2008) "Interaction of PD-L1 and B7-1," Molecular Immunol. 45:3567-3572）。また、ＰＤ−１は、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）に結合することが可能である（Lazar-Molnar, E. et al. (2008) "Crystal Structure Of The Complex Between Programmed Death-1 (PD-1) And Its Ligand PD-L2," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(30):10483-10488）。Ｂ７−１は、ＣＤ２８と相互作用し、免疫応答の初期段階で重要なＴ細胞活性化のための共刺激シグナルを発する（Elloso, M.M. et al. (1999) "Expression and Contribution of B7-1 (CD80) and B7-2 (CD86) in the Early Immune Response to Leishmania major Infection," J. Immunol. 162:6708-6715）。Ｂ７−ＤＣは、Ｔ細胞の強力な刺激因子であり、Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生を向上させる。しかしまた、Ｂ７−ＤＣは、ＰＤ−１との相互作用を介して免疫応答に対する抑制効果も示す（Ishiwata, K. et al. (epub January 10, 2010) "Costimulator Responses Induced by Nippostrongylus brasiliensis," J. Immunol. 184:2086-2094）。細菌および腫瘍は、免疫系による根絶を回避するのにＰＤ−１およびＢ７−Ｈ１を利用したようにみられる。ＰＤ−１およびＢ７−Ｈ１と相互作用する種々の受容体およびリガンドに対する結合親和性の違いが、疾病モデルにおけるＰＤ−１およびＢ７−Ｈ１の遮断の明らかな機能的結果を提供するという説が出されている（Butte, M.J. et al. (2008) "Interaction of PD-L1 and B7-1," Molecular Immunol. 45:3567-3572）。また、ＰＤ−１経路は、慢性感染の間の免疫機能の障害（「Ｔ細胞疲弊」）において重要な役割を果たすものとして関与している。そして、ＰＤ−１機能を遮断することによって、多くのＴ細胞機能を回復させることができる（Rodriquez-Garcia, M. et al. (November 19, 2010) "Expression Of PD-L1 And PD-L2 On Human Macrophages Is Up-Regulated By HIV-1 And Differentially Modulated By IL-10," J. Leukocyte Biol. 89: doi:10.1189/jlb.0610327:1-9）。
【００１８】
Ｔ細胞活性化および増殖の抑制におけるＢ７−Ｈ１およびＰＤ−１の役割は、これらの生体分子が、炎症および癌の治療のための治療標的として役立つであろうということを示唆した。感染および腫瘍を治療し、適応的免疫応答を上方調節するための抗-ＰＤ１抗体の使用が提案されている（米国特許出願公開第２０１０／００４０６１４号、第２０１０／００２８３３０号、第２００４／０２４１７４５号、第２００８／０３１１１１７号、および第２００９／０２１７４０１号；米国特許第７，５２１，０５１号、第７，５６３，８６９号および第７，５９５，０４８号；および、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００４／０５６８７５号および第ＷＯ２００８／０８３１７４号、参照）。逆に、Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１との相互作用を調節する薬剤が、免疫応答の上方または下方調節において有効性があることが示唆されている（米国特許第７，０２９，６７４号および第７，４８８，８０２号；米国特許出願公開第２００７／０１２２３７８号、第２００９／００７６２５０号、第２００９／０１１０６６７号、第２００９／０２６３８６５号、および、第２００９／０２９７５１８号；および、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ２００６／１３３３９６号）。同様に、感染および腫瘍を治療し、適応的免疫応答を上方調節するための抗Ｂ７−Ｈ１抗体の使用が提案されている（米国特許出願公開第２００９／００５５９４４号、第２００９／０２７４６６６号および第２００９／０３１７３６８号；米国特許第６，８０３，１９２号、および第７，７９４，７１０号；および、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ０１／３９７２２号および第ＷＯ０２／０８６０８３号）。
【００１９】
しかしながら、上記のすべての進歩に関わらず、Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１との間の相互作用を調節できる組成物の必要性が残っている。本発明は、癌および他の疾病や状態を治療するための上記組成物およびその使用を対象としている。
【００２０】
〔発明の概要〕
本発明は、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に対して免疫特異的に結合することが可能な抗体と、その抗原結合フラグメントと、その他の分子とに関連する。いくつかの実施形態において、上記分子は、Ｂ７−Ｈ１の有する、ＰＤ−１に対して結合する能力を調節することがさらに可能であるか、または、上記Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１のシグナル伝達活性に対して影響を与えることが可能である。本発明はさらに、癌およびその他の疾病の診断および治療における上記分子の使用に関連する。
【００２１】
詳細には、本発明は、内因性濃度または形質移入濃度で生細胞の表面に発現されることが好ましい、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１、特にヒトＢ７−Ｈ１またはヒトＰＤ−１に対して免疫特異的に結合する抗体の抗原結合フラグメントを有する分子を実現する。本発明は、上記抗原結合フラグメントが、Ｂ７−Ｈ１に結合し、かつ、上記生細胞が腫瘍細胞、病原体感染細胞、または、抗原提示細胞である分子の実施形態、および、上記抗原結合フラグメントが、ＰＤ−１に結合し、かつ、上記生細胞がＴ細胞である上記分子の実施形態に関わる。
【００２２】
本発明は、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に対して免疫特異的に結合することが可能な抗体と、その抗原結合フラグメントと、その他の分子とに関連する。いくつかの実施形態において、上記分子は、Ｂ７−Ｈ１の有する、ＰＤ−１に対して結合する能力を調節することがさらに可能であるか、または、上記Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１のシグナル伝達活性に対して影響を与えることが可能である。本発明はさらに、癌およびその他の疾病の診断および治療における上記分子の使用に関連する。
【００２３】
詳細には、本発明は、内因性濃度または形質移入濃度で生細胞の表面に発現されることが好ましい、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１、特にヒトＢ７−Ｈ１またはヒトＰＤ−１に対して免疫特異的に結合する抗体の抗原結合フラグメントを有する分子を実現する。本発明は、上記抗原結合フラグメントが、Ｂ７−Ｈ１に結合し、かつ、上記生細胞が腫瘍細胞、病原体感染細胞、または、抗原提示細胞である分子の実施形態、および、上記抗原結合フラグメントが、ＰＤ−１に結合し、かつ、上記生細胞がＴ細胞である上記分子の実施形態に関わる。
【００２４】
本発明は、さらに、上記分子が、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、または、ヒト化抗体である、上記分子の実施形態に関連する。本発明は、上記抗体が、単一特異性、二重特異性、三重特異性、または、多重特異性のものである上記実施形態を含む。
【００２５】
本発明は、さらに、Ｂ７−Ｈ１に結合する上記分子または抗体の実施形態であって、その上記抗原結合フラグメントが、抗Ｂ７−Ｈ１抗体１Ｅ１２、１Ｆ４、２Ｇ１１、３Ｂ６、および３Ｄ１０のＣＤＲのうちの少なくとも１つのコンセンサスＣＤＲと、以下の（Ａ）から（Ｅ）：
（Ａ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体１Ｅ１２の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｂ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体１Ｆ４の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｃ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体２Ｇ１１の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｄ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体３Ｂ６の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；または、
（Ｅ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体３Ｄ１０の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ、から選択される全ての残りのＣＤＲとを有する６つのＣＤＲを有する実施形態に関する。
【００２６】
本発明は、さらに、上記分子または抗体の実施形態であって、その上記抗原結合フラグメントが、以下の（Ａ）から（Ｅ）：
（Ａ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体１Ｅ１２の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｂ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体１Ｆ４の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｃ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体２Ｇ１１の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｄ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体３Ｂ６の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；または、
（Ｅ）抗Ｂ７−Ｈ１抗体３Ｄ１０の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ、である６つのＣＤＲを有する実施形態に関連する。
【００２７】
本発明は、さらに、上記抗体の実施形態であって、上記抗体がＢ７−Ｈ１に結合し、かつ、抗体可変領域ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ１、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ２、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ３、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ４、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ５、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ６、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ７、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ８、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ９、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ１０、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ１１、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ１２、ｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ１３、またはｈ３Ｄ１０  Ｖａｒ１４を有する実施形態に関連する。
【００２８】
本発明は、さらに、上記分子または抗体の実施形態であって、上記分子または抗体がＰＤ−１に結合し、かつ、上記抗原結合フラグメントが、抗ＰＤ−１抗体１Ｅ３、１Ｅ８および１Ｈ３のうちの少なくとも１つのコンセンサスＣＤＲと、以下の（Ａ）から（Ｃ）：
（Ａ）抗ＰＤ−１抗体１Ｅ３の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｂ）抗ＰＤ−１抗体１Ｅ８の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；または、
（Ｃ）抗ＰＤ−１抗体１Ｈ３の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ、から選択される全ての残りのＣＤＲとを有する６つのＣＤＲを有する実施形態に関連する。
【００２９】
本発明は、さらに、上記６つのＣＤＲが以下の（Ａ）から（Ｃ）：
（Ａ）抗ＰＤ−１抗体１Ｅ３の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；
（Ｂ）抗ＰＤ−１抗体１Ｅ８の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ；または、
（Ｃ）抗ＰＤ−１抗体１Ｈ３の３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲ、のいずれかである、上記抗体の実施形態に関連する。
【００３０】
本発明は、さらに、上記抗体の実施形態であって、上記抗体がＰＤ−１に結合し、かつ、抗体可変領域ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ２、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ３、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ４、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ５、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ６、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ７、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ８、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ９、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１０、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１１、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１２、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１３、またはｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１４を有する実施形態に関連する。
【００３１】
本発明は、さらに、上記分子または抗体の実施形態であって、上記分子または抗体が検出可能に標識化されているか、または、共役毒素、薬剤、受容体、酵素、受容体リガンドを有する実施形態に関連する。
【００３２】
本発明は、さらに、上記分子の実施形態であって、上記分子または抗体が、
（Ａ）Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に仲介されたシグナル伝達を調節する；
（Ｂ）Ｂ７−Ｈ１のＢ７−Ｈ１受容体に対する結合能力、または、ＰＤ−１のＰＤ−１リガンドに対する結合能力を弱める；
（Ｃ）Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１仲介シグナル伝達を刺激する；
（Ｄ）Ｔ細胞の増殖を仲介する；または、
（Ｅ）ＩＦＮ−γの産生を高める実施形態に関連する。
【００３３】
本発明は、さらに、治療効果ある量の上記分子または抗体のいずれか、および、生理学的に許容できる担体または添加剤を有する医薬組成物に関連する。本発明は、さらに、癌、自己免疫疾患、感染症、または、Ｔ細胞の数または健康に影響する疾病の治療における上記医薬組成物の使用に関連する。本発明は、さらに、上記医薬組成物の使用であって、上記治療は予防的なものであり、上記癌、上記自己免疫疾患、上記感染症、または、上記Ｔ細胞の数または健康に影響する疾病の症状がでる前に施される、または、移植から起こる状態の治療のためのものである上記医薬組成物の使用に関連する。
【００３４】
本発明は、さらに、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に対する対象の細胞の結合能力に関して上記対象の細胞を分析することにより、上記対象における癌、自己免疫疾患（特に、移植片対宿主病）、感染症（特に、慢性ウィルス病）、またはＴ細胞の数または健康に影響する疾病を診断するための上記分子または抗体のいずれかの使用に関連する。
【００３５】
上記発明は、上記分子、抗体、および、組成物の実施形態であって、上記Ｂ７−Ｈ１がヒトＢ７−Ｈ１であり、上記ＰＤ−１がヒトＰＤ−１である実施形態に関連する。
【００３６】
上記発明は、特に、対象における疾病（特に、癌）を診断する方法であって、上記Ｂ７−Ｈ１結合分子のいずれかに対する結合能力に関して上記対象の細胞を分析する工程を含み、上記対象における疾病の存在を診断する細胞学的分析を実現する方法に関連する。
【００３７】
さらに、本発明は、対象における疾病（特に、Ｔ細胞の数および／または健康に影響する疾病）を診断する方法であって、ＰＤ−１結合分子に対する上記対象の細胞の結合能力に関して上記対象の細胞を分析する工程を含み、上記対象における疾病の存在および／または進行を診断するため、または、治療に対する対象の反応を評価するための細胞学的分析を実現する方法に関連する。
【００３８】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、Ｂ７−Ｈ１に結合する抗体に関してテストされたハイブリドーマ上清の結合を示す図である。陽性対照（ＰＣ）：ハイブリドーマ生成に用いられたマウス由来の１：１０００希釈血清；陰性対照（ＮＣ）：５％ミルク／ＰＢＳ。Ｂ７−Ｈ１−Ｆｃに対する結合および抗マウスＩｇＧを用いた検出に関してデータが示される。
【００３９】
図２は、単離抗Ｂ７−Ｈ１抗体がＰＤ−１に対するＢ７−Ｈ１の結合を調節することができるかどうかを判定するための実験結果を示す図である。陽性対照：クローンＭＩＨ−１および２９Ｅ．２Ａ３（両者は抗ヒトＣＤ２７４（Ｂ７−Ｈ１）；２つの陰性対照：無関係ハイブリドーマ（ランダムＡｂ）およびベクター対照（ＶＣ）由来の馴化培地。
【００４０】
図３は、ＣＨＯ−ＨＢ７−ＨＬに対するに関してテストされた抗Ｂ７−ＨＬ抗体の中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。テストされたクローンのいずれも、親ＣＨＯラインとの交差反応は認められず、発現した抗体がヒトＢ７−Ｈ１に対して免疫特異性があることを示した。
【００４１】
図４は、選択された抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体のヒトＢ７−Ｈ１発現ＣＨＯ細胞結合アッセイの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の結果を示す図である。
【００４２】
図５は、抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体５Ｈ１および１Ｅ１２のヒトＢ７−ＨＬ発現ＣＨＯ細胞結合アッセイの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の結果を比較する図である。
【００４３】
図６は、単離された抗ヒトＰＤ−１抗体の抗原結合及びアイソタイプを示す図である。
【００４４】
図７Ａ〜図７Ｂは、単離されたハイブリドーマの幾つかが、中和抗ヒトＰＤ−１抗体を発現したことを示す実験結果を示す図である。
【００４５】
図８は、ＣＨＯ−ｈＰＤ−１に対する結合に関してテストされた抗ＰＤ−１抗体の中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。テストされたクローンの何れも、親ＣＨＯラインとの交差反応は認められず、発現した抗体がヒトＰＤ−１に対して免疫特異的性があることを示した。
【００４６】
図９は、選択された抗ヒトＰＤ−１抗体のヒトＰＤ−１発現ＣＨＯ細胞結合アッセイの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。陽性対照：ＥＨ１２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから市販されている抗ヒトＰＤ−１抗体）；ｍＩｇＧ１：マウスＩｇＧ陰性対照。
【００４７】
図１０は、抗ヒトＰＤ−１抗体の濃度変更時の細胞ベースの競合アッセイの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の結果を示す図である。
【００４８】
図１１は、ヒトＰＤ−１抗体の濃度が２０μｇ／ｍｌの時の細胞ベースの競合アッセイの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の結果を示す図である。
【００４９】
図１２は、ヒトの完全長ＰＤ−１をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、ビオチン標識ｈＢ７−Ｈ１−ＦＣまたはｈＢ７−ＤＣｍＩｇにより染色する前に、飽和量の抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）または対照Ｉｇと共に事前培養した実験の結果を示す図である。
【００５０】
図１３は、パネルＡおよびパネルＢが、（Ａ）市販の抗ＰＤ−１抗体、ＥＨ１２、と（Ｂ）キメラ（”ＣＨ”）マウス抗ヒトＰＤ−１のＦａｂ領域およびヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とを有するマウスモノクローナル抗体との比較結合を示す図である。
【００５１】
図１４は、パネルＡおよびパネルＢが、ビオチン化Ｂ７−ＨＬ−Ｆｃとビオチン化Ｂ７−ＤＣ−ＦｃのＰＤ−１に対する結合のブロッキング効果を発揮する、本発明の抗ＰＤ−１抗体の能力を示す図である。
【００５２】
図１５は、抗ｈＩｇ抗体によって検出された、ＣＨＯ．ｈＰＤ−１細胞に対する１Ｈ３抗ヒトＰＤ−１キメラ抗体の結合曲線を示す図である。
【００５３】
図１６Ａ〜図１６Ｂは、陰性対照抗体（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ；ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ、Ｉｎｃ．）と比較して、ヒト初代Ｔ細胞ＣＤ８+（図１６Ａ）およびＣＤ４+（図１６Ｂ）に対して結合する、１Ｈ３抗ヒトＰＤ−１キメラ抗体の能力の研究結果を示す図である。
【００５４】
図１７は、破傷風毒素（ＴＴ）のリコールの際に、ＣＦＳＥ希釈により測定された抗原特異的Ｔ細胞の応答を高める、本発明の抗体の能力を示す図である。
【００５５】
図１８Ａ〜図１８Ｄは、ＣＨＯ．ｈＰＤｌ細胞に結合するヒト化１Ｈ３変異体（ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１〜ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１４）の能力を実証する図である。
【００５６】
図１９Ａ、図１９Ｂは、Ｂ７−Ｈ１（図１９Ａ）またはＢ７−ＤＣ（図１９Ｂ）を発現するｈＰＤ−１−ＦｃおよびＨＥＫ２９３細胞間の相互作用をブロックする、ヒト化抗ＰＤ−１抗体の能力を実証する図である。
【００５７】
図２０は、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１〜ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ６の結合曲線を示す図である。
【００５８】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に対して免疫特異的に結合することが可能な、抗体、その抗原結合フラグメント、およびその他の分子に関連する。一部の実施形態において、上記分子は、Ｂ７−Ｈ１またはＢ７−ＤＣの有する、ＰＤ−１に対して結合する能力を調節することがさらに可能であるか、または、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１のシグナル伝達活性に対して影響を与えることが可能である。本発明はさらに、癌およびその他の疾病の治療における上記分子の使用に関連する。
【００５９】
ある分子が他の分子に結合し、その結合が抗体のその同族抗原に対する特異性および親和性を示す場合、前記分子は、前記他の分子に「免疫特異的に結合する」ことが可能であるといわれる。上記結合が、免疫グロブリン分子の抗原認識部位にかかわる場合、抗体は、抗原（特に、上記抗原：Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１）の標的領域または立体配座（「エピトープ」）に対して「免疫特異的に結合している」ことができると言われる。他の抗原が、たとえば、イムノアッセイ、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ、または、本技術分野において知られるその他アッセイによりにより割り出される抗原認識部位により認識されるある配列または立体配座的類似性を有する場合、特定の抗原に免疫特異的に結合する抗体は、より低い親和性で上記他の抗原に結合する場合があるが、無関係な抗原には結合しない。しかし、抗体(および、それらの抗原結合性フラグメント)が、他の抗原と交差反応しないことが好ましい。また、抗体は、Ｆｃ領域のような抗原認識部位を含まない上記分子の他の領域／ドメインにおける結合ドメインによって、たとえば、ＦｃＲ受容体に対する結合のように、免疫特異的ではない方法で他の分子に対して結合する場合もある。
【００６０】
本明細書において用いられる「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、効果または結果を改変する能に関連する。特に、本発明は、Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１との間の結合の調節が可能である、および／または、Ｂ７−Ｈ１−ＰＤ−１結合の結果として起こるシグナル伝達の調節が可能である分子（特に、ヒトＢ７−Ｈ１またはヒトＰＤ−１に免疫特異的に結合する抗体、または、それらの抗原結合フラグメント）に関連する。このような調節により、ＰＤ−１に対するＢ７−Ｈ１の結合能力を弱めたり、完全に阻止したりできる。さらなる実施形態において、上記の調節により、シグナル伝達を仲介するＢ７−Ｈ１またはＰＤ−１の能力を弱めたり、完全に中和したりできる。さらなる実施形態において、上記の調節によって、（ｉ）Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１との間の相互作用を高め、Ｂ７−Ｈ１−ＰＤ−１結合を促進すること、または、（ｉｉ）Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１とに直接結合し、これにより、内因性リガンドの活性を模倣すること、等により、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１を介したシグナル伝達を高め得る、または、そうでなければ、シグナル伝達を刺激し得る。さらに別の実施形態において、誘発されるシグナル伝達の性質を変更するように、上記調節により、Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１との間の相互作用の性質を変更し得る。たとえば、本発明の上記分子は、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に対する結合により、他のリガンドおよび受容体に対して結合する上記分子の能力を変更し（例、Ｂ７−ＤＣに対して結合するＰＤ−１の能力、または、Ｂ７−１（ＣＤ８０）に結合するＢ７−Ｈ１の能力に影響を与える）、さらにそれにより、上記分子の活性全体を変更し得る。このような調節により、計測可能な免疫システム活性が少なくとも１０％変化することが好ましく、そのような活性が少なくとも５０％変化することがさらに好ましい、または、少なくとも２倍、５倍、または１０倍変化することが好ましく、または、そのような活性が少なくとも１００倍変化することがさらに一層好ましい。
【００６１】
本明細書において用いられる、「抗体」という用語は、「可変領域」抗原認識部位を有する免疫グロブリン分子を意味することを意図する。上記用語「可変領域」は、免疫グロブリンの上記ドメインを抗体に広く共有されるドメイン（例、抗体Ｆｃドメイン）から識別することを意図する。上記可変領域は、残基が抗原結合に関与する「超可変領域」を有する。上記超可変領域は、「相補性決定領域」、つまり、「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（たとえば、通常、軽鎖可変ドメインのおよそ２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）の残基、および、重鎖可変ドメインにおける、およそ２７−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）の残基；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）、および／または、「超可変ループ」（たとえば、軽鎖可変ドメインにおける２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）の残基、および、重鎖可変ドメインにおける２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）の残基；Chothia, C. et al. (1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901-917）からのアミノ酸残基を有する。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義された超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。上記用語、抗体、には、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体（たとえば、Muyldermans et al., 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttall et al., 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; Reichmann and Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25；国際公開公報第ＷＯ９４／０４６７８号および第ＷＯ９４／２５５９１号；および、米国特許第６，００５，０７９号、参照）、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（たとえば、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)、参照）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、細胞内抗体、および、抗イディオタイプの（抗Ｉｄ）抗体（たとえば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄおよび抗抗Ｉｄ抗体を含む）を含む。特に、上記抗体としては、任意のタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1およびＩｇＡ2）、または、サブクラスの免疫グロブリン分子が挙げられる。
【００６２】
本明細書に用いられる、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、抗体の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）を含有し、抗体の「可変領域」抗原認識部位を有するフレームワーク残基を任意に含有し、さらに、抗原に免疫特異的に結合する能力を示す抗体の１個以上のタンパク質を意味する。このようなフラグメントとしては、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、一本鎖（ＳｃＦｖ）、および、それらの突然変異体、天然の変異体、および、上記抗体の「可変領域」抗原認識部位および異種タンパク質（たとえば、毒素、異なる抗原に対する抗原認識部位、酵素、受容体、または、受容体リガンド、など）を有する融合タンパク質が挙げられる。本明細書に用いられる、用語「フラグメント」は、少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、または、少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。
【００６３】
ヒト抗体、キメラ抗体、または、ヒト化抗体が、人におけるインビボでの使用目的に特に好ましいが、マウス抗体、または、他種の抗体が多くの使用目的（たとえば、インビトロ、または、原位置検出アッセイ、インビボでの急性使用、など）に有利に用いられ得る。ヒトを対象とする治療上の処置の目的には、完全ヒト抗体が特に望ましい。
【００６４】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリを用いる上記のファージ提示法(米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；および、国際公開公報第ＷＯ９８／４６６４５号、第ＷＯ９８／５０４３３号、第ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９８／１６６５４号、第ＷＯ９６／３４０９６号、第ＷＯ９６／３３７３５および第ＷＯ９１／１０７４１号、参照)含む、本技術において周知の様々な方法で作製することができる。ヒト抗体は、機能性内因性免疫グロブリンを発現できないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できるトランスジェニックマウスを用いて産生できる。たとえば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに、または、相同的組み換えにより、マウス胚幹細胞に導入してもよい。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および、多様性領域を、マウス胚幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子を、相同的組み換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と、別に、または、同時に、非機能性に変更してもよい。特に、ＪH領域のホモ接合体欠失は、内因性抗体の産生を妨げる。修飾された胚幹細胞は、キメラマウスを作製するために、増殖され、未分化胚芽細胞に微量注入される。それから、上記キメラマウスを、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫を作製するために繁殖させる。上記トランスジェニックマウスは、選択された抗原、たとえば、本発明のポリペプチドの全て、または、一部を用いて、従来の手順を用いて免疫される。抗原に対して向けられるモノクローナル抗体が、従来のハイブリドーマ技術（たとえば、米国特許第５，９１６，７７１号参照）を用いて、免疫されたトランスジェニックマウスから得られる。上記トランスジェニックマウスが有する上記ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配列し、その後、クラススイッチおよび体細胞変異をする。よって、上記技術を用いて、治療上有益なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体の産生が可能である。ヒト抗体の産生のための本技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ  （1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93、この全体を参照によって本明細書に援用する）を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するための本技術の詳細な議論および上記抗体を産生するためのプロトコルについては、たとえば、国際公開公報第ＷＯ９８／２４８９３号、第ＷＯ９６／３４０９６号および第ＷＯ９６／３３７３５号；および、米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８および第５，９３９，５９８号（これらの全体を、参照によって本明細書に援用する）を参照のこと。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＭｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）などの企業は、上述の技術に類似した技術を用いて、選択された抗原に対して向けられるヒト抗体の提供に携わっている。
【００６５】
「キメラ抗体」は、抗体の異なる部分が、非ヒト抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体のような異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。本技術分野において、キメラ抗体の産出方法は周知である。たとえば、Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202；および、米国特許第６，３１１，４１５号、第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号および第４，８１６，３９７号を参照のこと。ヒト以外の生物種由来の１つ以上のＣＤＲおよびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有するキメラ抗体は、たとえば、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号；国際公開公報第ＷＯ９１／０９９６７号；および、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、または、リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7:805；および、Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA  91:969）、および、鎖混合（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、本技術分野において周知の様々な技術を用いて産生できる。
【００６６】
本発明は、特に、「ヒト化抗体」に関連する（たとえば、欧州特許第２３９，４００号、第５９２，１０６号および第５１９，５９６号；国際公開公報第ＷＯ９１／０９９６７号および第ＷＯ９３／１７１０５号；米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、第５，５６５，３３２号、第５，５８５，０８９号、第５，７６６，８８６号および第６，４０７，２１３号；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-73; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-25; Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13:353-60; Morea et al., 2000, Methods 20:267-79; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84; Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9:895-904; Couto et al., 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s; Couto et al., 1995, Cancer Res. 55:1717-22; Sandhu, 1994, Gene 150:409-10; Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-329；および、Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596、参照)。本明細書において用いられる、「ヒト化抗体」という用語は、ヒトフレームワーク領域と非ヒト（通常、マウス、または、ラット）免疫グロブリン由来の１つ以上のＣＤＲとを有する免疫グロブリンを指す。上記ＣＤＲを提供する上記非ヒト免疫グロブリンを、「ドナー」と呼び、上記フレームワークを提供する上記ヒト免疫グロブリンを、「アクセプター」と呼ぶ。定常領域は、存在する必要はないが、定常領域があれば、それらの定常領域は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一のもの、たとえば、少なくとも約８５％〜９０％、好ましくは約９５％以上同一のものでなければならない。したがって、ＣＤＲは除く可能性はあるが、ヒト化免疫グロブリンの全部が、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に同一である。ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを有する抗体である。たとえば、キメラ抗体の可変領域全体が、ヒト以外のものであるため、たとえば、ヒト化抗体は、典型的なキメラ抗体を含まない。ドナー抗体は、「ヒト化」工程によって「ヒト化」されているといわれる。これは、結果として得られるヒト化抗体が、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると見込まれるからである。たいてい、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、このヒト免疫グロブリンにおいて、上記レシピエントの超可変領域残基が、望ましい特異性、親和性、および、能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または、非ヒト霊長類などのヒト以外の生物種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基によって置き換えられる。場合によっては、上記ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体の中には見られない残基を有していてもよい。これらの修飾が、抗体の性能をさらに改良するためになされてもよい。一般的に、上記ヒト化抗体は、実質的に少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインの全てを有するものである。上記可変領域において、超可変領域の全て、または、実質全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、かつ、ＦＲの全て、または、実質全てが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。また、上記ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも１部、通常、ＦｃγＲＩＩＢポリペプチドに対して免疫特異的に結合し、アミノ酸残基の置換、欠失、または、付加の導入（つまり、変異）により変化したヒト免疫グロブリンの定常領域の１部を有するものである。
【００６７】
本発明の方法において用いられる抗体は、単一特異性のものであってよい。また、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に加えて異なる標的に対して特異性を示すより大きな多特異性の抗体も対象である。好ましい実施形態において、上記多重特異性抗体は、異なる免疫細胞標的に対して特異性を示すであろう。たとえば、上記抗体は、Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣの両方に結合して、それにより、両方のＰＤ−１依存性反応を調節してもよい。反対に、上記抗体は、ＰＤ−１およびＢ７−１の両方に結合して、両方のＢ７−Ｈ１依存性反応を妨げてもよい。別の実施形態において、上記多重特異性抗体は、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、４−１−ＢＢ、Ｂ７−Ｈ４、ＬＩＧＨＴ、または、ＬＡＧ３などの代替的免疫調節経路に含まれる分子（受容体、または、リガンド）に対して、免疫調節効果を高めるために結合してもよい。さらに、上記多重特異性抗体は、急性および慢性免疫反応の両方の調節に特に関連し得る、サイトカイン（たとえば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−４  ＴＧＦ−ｂｅｔａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＦＮｇ、Ｆｌｔ３、ＢＬｙｓ）およびケモカイン（たとえば、ＣＣＬ２１）のようなエフェクター分子に結合してもよい。
【００６８】
さらに、多重特異性抗体は、抗体の標的を特定の細胞型または組織とするのに重要な抗原に結合してもよい。たとえば、ＰＤ−１とＣＤ２７と（または、Ｂ７−Ｈ１とＣＤ２７と）の両者に結合する抗体は、活性記憶Ｂ細胞（ｍＢAct）の生存を助長するように抗原提示細胞（ＡＰＣ）により配列されたＰＤ−１がｍＢAct  Ｂ細胞の表面のリガンドと相互作用することができるように、ｍＢAct  Ｂ細胞とＡＰＣとの共存を促進することができる。ｍＢAct  Ｂ細胞の喪失は、ＡＩＤＳへのＨＩＶ感染の進行における引き金となるため（Titanji, K. et al. (2010) "Acute Depletion Of Activated Memory B Cells Involves The PD-1 Pathway In Rapidly Progressing SIV-Infected Macaques," J. Clin. Invest. 120(11):3878-3890）、ＰＤ−１とＣＤ２７との両者に結合する抗体は、感染の治療、および、ＡＩＤＳの発症を防ぐ、または、遅らせることにおいて有用性がある。上述のように、ＰＤ−１経路は、慢性ＨＩＶ感染中の免疫機能の障害（「Ｔ細胞疲弊」）において重要な役割を果たすものとして関与している（Khaitan, A. et al. (2011) "Revisiting Immune Exhaustion During HIV Infection," Curr. HIV/AIDS Rep. 8:4-11; Rodriquez-Garcia, M. et al. (November 19, 2010) "Expression Of PD-L1 And PD-L2 On Human Macrophages Is Up-Regulated By HIV-1 And Differentially Modulated By IL-10," J. Leukocyte Biol. 89: doi:10.1189/jlb.0610327:1-9; Grabmeier-Pfistershammer, K. et al. (2011) "Identification of PD-1 as a Unique Marker for Failing Immune Reconstitution in HIV-1-Infected Patients on Treatment," J Acquir. Immune Defic. Syndr. 56(2):118-124)。マクロファージは、有意にＨＩＶ感染の初期段階の一因となる（Carter, C. A. et al. (2008) "Cell Biology Of HIV-1 Infection Of Macrophages," Ann. Rev. Microbiol. 62:425-443; Noursadeghi, M. et al. (2006) "HIV-1 Infection Of Mononuclear Phagocytic Cells: The Case For Bacterial Innate Immune Deficiency In AIDS," Lancet Infect. Dis. 6:794-804）。したがって、ＰＤ−１とマクロファージ特異的マーカー（たとえば、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＴＬＲ２、など）とに結合する抗体は（特に、毒素に接合したならば）、ＨＩＶ感染を防ぐのに有用性がある。さらに、Ｔ細胞疲弊の複数のマーカー（たとえば、ＰＤ−１、および、以下のうちのいずれか、または、すべて：ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４またはＬＡＧ−３）に結合する抗体は、免疫応答性の治療または診断に有用性がある。対象となる他の標的抗原としては、癌細胞マーカーが挙げられる。
【００６９】
さらに、ＰＤ−１+  ＣＤ８+細胞が抗ＨＩＶ活性を有することが分かっている（Killian, M.S. et al. (2011) "Natural Suppression of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication Is Mediated by Memory CD8+ T Cells," J. Virol. 85(4):1696-1705）。よって、ＰＤ−１とＣＤ８との両者に結合する抗体は、たとえば、患者におけるＨＩＶ感染やＡＩＤＳの治療における最終的な使用目的で上記細胞集団を単離して産生する生体外手段において有用性がある。
【００７０】
上記抗ＰＤ−１または抗Ｂ７−Ｈ１二重特異性抗体、三重特異性抗体または多重特異性抗体において用いてもよいその他マーカーとしては、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５およびＣＴＬＡ−４が挙げられる（De Keersmaecker, B. et al. (2011) ("Fighting with the Enemy's Weapons? The Role of Costimulatory Molecules in HIV," Curr. Molec. Med. 566-5240/11: 1-25、および、Sarikonda, G. (2011) "Immunosuppressive Mechanisms During Viral Infectious Diseases;" Methods in Molec. Biol. 677:431-447、両文献を、参照により本明細書に援用する)。
【００７１】
同様に、ＣＤ４  Ｔ細胞は、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の成長と拡散を減速するために必要であるが、ＰＤ−１を介した抑制も、ＣＤ４+  Ｔ細胞が重症疾病を促進するのを防ぐのに必要とされる（Barber, D.L. et al. (2011) "CD4 T Cells Promote Rather than Control Tuberculosis in the Absence of PD-1-Mediated Inhibition," J. Immunol. 186:1598-1607; Sakai, S. et al. (2010) "PD-1 - PD-L1 pathway impairs Th1 immune response in the late stage of infection with Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin," Intl. Immunol. 22(12):915-925; Lazar-Molnar, E. et al. (2010) "Programmed Death-1 (PD-1)-Deficient Mice Are Extraordinarily Sensitive To Tuberculosis," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 107(30):13402-13407）。よって、ＣＤ４とＰＤ−１とに結合する抗体は、結核の治療において、および、結核の発症の防止、または、遅延において有用性がある。
【００７２】
好ましいヒトアクセプターフレームワーク配列をコードするＤＮＡ配列としては、ヒト生殖細胞系ＶＨセグメントＶＨ１−１８およびＪＨ６、および、ヒト生殖細胞系ＶＬセグメントＶＫ−Ａ２６およびＪＫ４由来のＦＲセグメントが挙げられるが、これらに限定はされない。具体的な実施形態において、所定の遺伝子組み換え技術を用いて、１つ以上のＣＤＲがフレームワーク領域内に挿入される。上記フレームワーク領域は、天然フレームワーク領域、または、コンセンサスフレームワーク領域であってよく、好ましくは、ヒトフレームワーク領域であってよい（ヒトフレームワーク領域の列挙については、たとえば、Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479、参照)。
【００７３】
本発明のヒト化またはキメラ抗体は、少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインの実質全てを有していてもよい。上記可変ドメインにおいて、ＣＤＲ領域の全て、または、実質全てが非ヒト免疫グロブリン（ｉ．ｅ．、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に対応し、かつ、フレームワーク領域の全て、または、実質全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列である。本発明の抗体も、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を有することが好ましい。本発明の上記抗体の上記定常ドメインは、上記抗体の提案された機能、特に、必要とされるであろうエフェクター機能に関して選択してよい。いくつかの実施形態において、本発明の上記抗体の上記定常ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭドメインである（または有する）。具体的な実施形態において、本発明のヒト化抗体が治療上の使用を目的とし、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性のような抗体エフェクター機能が必要とされる場合、ヒトＩｇＧ定常ドメイン、特に、上記ＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常ドメインが用いられる。たとえば、ＰＤ−１は、Ｔ細胞、および、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫（ＡＩＴＬ）のようなまれな抹消Ｔ細胞リンパ腫に高度に発現する。ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を有する抗ＰＤ−１抗体は、上記のような癌を治療するための治療剤として、特に関係がある。代替的な実施例において、本発明の上記抗体が治療目的を対象とし、抗体エフェクター機能が必要とされない場合には、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプが用いられる。たとえば、Ｔ細胞の表面のＰＤ−１を標的にすることにより、Ｔ細胞の活性を増幅したい場合、Ｔ細胞を殺すであろうエフェクター機能は、望ましくないであろう。本発明は、米国特許出願公開公報第２００５／００３７０００号および第２００５／００６４５１４号に記載されたもののような抗体エフェクター機能を変える１つ以上のアミノ酸修飾を有するＦｃ定常ドメインを包含する。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明の上記抗体は、軽鎖と少なくとも重鎖の可変ドメインとの両方を含有する。別の実施形態において、本発明の上記抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域の１つ以上をさらに有していてもよい。上記抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥ含む免疫グロブリンの任意のクラス、および、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3およびＩｇＧ4を含む任意のアイソタイプより選択できる。いくつかの実施形態において、上記定常ドメインは、上記抗体が細胞傷害活性を提示することが望ましい補体結合性定常ドメイン、上記クラスは、通常、ＩｇＧ1である。上記のような細胞傷害活性が望ましくない他の実施形態において、上記定常ドメインはＩｇＧ2クラスのものであってもよい。本発明の上記抗体は、１つ以上のクラス、または、アイソタイプ由来の配列を有していてもよい。そして、所望のエフェクター機能を最適化するように特定の定常ドメインを選択することは、本技術分野における通常技術の範囲内にある。
【００７５】
ヒト化抗体の上記フレームワークおよびＣＤＲ領域は、正確に親配列に対応している必要はない。たとえば、ＣＤＲまたはフレームワーク残基がその部位で、コンセンサスまたはドナー抗体のどちらにも対応しないように、少なくとも１個の残基の置換、挿入、または、欠失により、上記ドナーＣＤＲ、または、コンセンサスフレームワークを変異させてもよい。しかし、このような変異は、広範囲に及ばないことが好ましい。通例、ヒト化抗体残基の少なくとも７５％が、より多くの場合は９０％が、さらに好ましくは９５％超が、親フレームワーク領域（ＦＲ）およびＣＤＲ配列のものに対応する。ヒト化抗体は、本技術分野において周知の様々な技術を用いて産生できる。そのような技術としては、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号；国際公開公報第ＷＯ９１／０９９６７号；および、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号および第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、または、リサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号および第５１９，５９６号；Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814;および、Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973）、鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、および、たとえば、以下に開示される技術が挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第６，４０７，２１３号、第５，７６６，８８６号および第５，５８５，０８９号；国際公開公報第ＷＯ９３１７１０５号；Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-25, Caldas et al., 2000, Protein Eng. 13:353-60, Morea et al., 2000, Methods 20:267-79, Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84, Roguska et al., 1996, Protein Eng. 9:895-904, Couto et al., 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s, Couto et al., 1995, Cancer Res. 55:1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150:409-10, Pedersen et al., 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73, Jones et al., 1986, Nature 321:522-525, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323、および、Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596。しばしば、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基が、抗原結合を変えるため、好ましくは、改良するために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、本技術分野において周知の方法で特定される。その方法として、たとえば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定する、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、および、特定位置における異常なフレームワーク残基を特定する配列比較が挙げられる（たとえば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５８５，０８９号；米国公開公報第２００４／００４９０１４号および第２００３／０２２９２０８号；米国特許第６，３５０，８６１号、第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号および第５，５３０，１０１号；および、Riechmann et al., 1988, Nature 332:323、参照).
本発明の抗体は、ポリペプチドの産生に有益な、本技術分野において周知の方法により、産生してもよい。このような方法としては、たとえば、インビトロ合成、組み換えＤＮＡ産生、などがある。上記ヒト化抗体は、遺伝子組み換えＤＮＡ技術により産生されることが好ましい。本発明の上記抗体は、組み換え免疫グロブリン発現技術を用いて、産生してもよい。ヒト化抗体を含む、免疫グロブリン分子の組み換え体の産生は、以下に記載されている：米国特許第４，８１６，３９７号(Boss et al.)；米国特許第６，３３１，４１５号および第４，８１６，５６７号(両方ともCabilly et al.に属する)；英国特許第２，１８８，６３８号(Winter et al.)；および、英国特許第２，２０９，７５７号。ヒト化免疫グロブリンを含む、免疫グロブリンの組み換え発現技術も、以下で確認できる：Goeddel et al., Gene Expression Technology Methods in Enzymology Vol. 185 Academic Press (1991)；および、Borreback, Antibody Engineering, W. H. Freeman (1992)。組み換え抗体の生成、設計、および、発現に関わる付加情報は、以下で確認できる：Mayforth, Designing Antibodies, Academic Press, San Diego (1993)。
【００７６】
本発明の組み換えキメラ抗体の産生工程の例は、以下の工程を有していてもよい：ａ）マウス抗Ｂ７−Ｈ１（または抗ＰＤ−１）モノクローナル抗体のＣＤＲおよび可変領域がヒト免疫グロブリン由来のＦｃ領域に融合している抗体重鎖をコードし、発現する発現ベクターを、従来の分子生物学的方法により構築し、それにより、キメラ抗体重鎖の発現用ベクターを産生する工程；ｂ）マウス抗Ｂ７−Ｈ１（または抗ＰＤ−１）モノクローナル抗体の抗体軽鎖をコードし、発現する発現ベクターを、従来の分子生物学的方法により、構築し、それにより、キメラ抗体軽鎖の発現用ベクターを産生する工程；ｃ）キメラ抗体の発現用のトランスフェクト宿主細胞を産生するように、従来の分子生物学的方法により発現ベクターを宿主細胞に移入する工程；および、ｄ）キメラ抗体を産生するために、従来の細胞培養技術でトランスフェクト細胞を培養する工程。
【００７７】
本発明の組み換えヒト化抗体の産出の工程の例は、以下の工程を有していてもよい：ａ）ドナー抗体結合特異性を保持する必要があるＣＤＲと可変領域フレームワークの最低限の部分とがマウス抗Ｂ７−Ｈ１（または抗ＰＤ−１）モノクローナル抗体のような非ヒト免疫グロブリンに由来しており、上記抗体の残りの部分が、ヒト免疫グロブリンに由来している抗体重鎖をコードし、発現する発現ベクターを、従来の分子生物学的方法により構築し、それにより、ヒト化抗体重鎖の発現用ベクターを産生する工程；ｂ）ドナー抗体結合特異性を保持する必要があるＣＤＲと可変領域フレームワークの最低限の部分とがマウス抗Ｂ７−Ｈ１（または抗ＰＤ−１）モノクローナル抗体のような非ヒト免疫グロブリンに由来しており、上記抗体の残りの部分が、ヒト免疫グロブリンに由来している抗体軽鎖をコードし、発現する発現ベクターを、従来の分子生物学的方法により構築し、それにより、ヒト化抗体軽鎖の発現用ベクターを産生する工程；ｃ）ヒト化抗体の発現用のトランスフェクト宿主細胞を産生するために、従来の分子生物学的方法により、発現ベクターを宿主細胞に移入する工程；および、ｄ）ヒト化抗体を産生するために、従来の細胞培養技術でトランスフェクト細胞を培養する工程。
【００７８】
いずれの方法の例についても、異なる選択可能なマーカーを含有していてもよいが重鎖および軽鎖をコードする配列を除いて同一であることが好ましい上記発現ベクターと、宿主細胞が共存していてもよい。この手順により、重鎖および軽鎖ポリペプチドが同等に発現される。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを用いてもよい。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡ、または、ゲノムＤＮＡ、または、これらの両方を有していてもよい。本発明の組み換え抗体を発現させるのに用いられる上記宿主細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のような細菌性細胞であってもよいし、または、より好ましくは、真核細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または、ＨＥＫ−２９３細胞）であってもよい。発現ベクターの選択は、宿主細胞の選択によってきまり、選択された宿主細胞において所望の発現、および、調節特性が得られるように選択してもよい。用いることが可能な他の細胞株としては、ＣＨＯ−Ｋ１、ＮＳＯ、およびＰＥＲ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ社、ライデン、オランダ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、宿主細胞が、種特異的なコドン使用頻度の偏りの主要因となり、タンパク質の発現を高めるように選択される場合、コドン使用頻度は、最適化できる。たとえば、ＣＨＯ細胞の発現のために、抗体をコードするＤＮＡが、優先的に用いられるコドンをモンゴルキヌゲネズミ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）（これからチャイニーズハムスター卵巣細胞が得られる)により組み込んでいてもよい。コドン最適化方法は、所望の宿主細胞による改良された発現を促進するために用いられる(たとえば、Wohlgemuth, I. et al. (2011) "Evolutionary Optimization Of Speed And Accuracy Of Decoding On The Ribosome," Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 366(1580):2979-2986; Jestin, J.L. et al. (2009) "Optimization Models And The Structure Of The Genetic Code," J. Mol. Evol. 69(5):452-457; Bollenbach, T. et al. (2007) "Evolution And Multilevel Optimization Of The Genetic Code," Genome Res. 17(4):401-404; Kurland, C.G. et al. (1984) "Optimization Of Translation Accuracy," Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 31:191-219; Grosjean, H. et al. (1982) "Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes," Gene 18(3):199-209、参照）。
【００７９】
上述の抗体のいずれかは、本技術分野における当業者に周知の技術を用いて、抗イディオタイプ抗体を生成するために用いることができる（たとえば、Greenspan, N.S. et al. (1989) "Idiotypes: Structure And Immunogenicity," FASEB J. 7:437-444；および、Nisinoff, A. (1991) "Idiotypes: Concepts And Applications," J. Immunol. 147(8):2429-2438、参照）。
【００８０】
上記抗体のいずれの結合特性も、望むなら、そのように所望の特性を提示する変異体についてスクリーニングすることによって、さらに改良することができる。たとえば、そのような抗体は、本技術分野において周知の様々なファージ提示法を用いて、生成できる。ファージ提示法では、機能抗体ドメインが、機能抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列があるファージ粒子の表面に提示される。特定の実施形態において、レパートリーまたは組み合わせ抗体ライブラリ（たとえば、ヒト、または、マウス）より発現したＦａｂおよびＦｖ、または、ジスルフィド結合安定化Ｆｖのような抗原結合ドメインを提示するために上記ファージを用いることができる。対象の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、たとえば、標識化された抗原、または、固体表面あるいはビーズに結合した、または、捕えられた抗原を用いて、選択または特定できる。これらの方法において用いられるファージは、通常、ｆｄおよびＭ１３を含む、線状ファージである。抗原結合メインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のどちらかに組み換え技術で融合したタンパク質として発現される。本発明の免疫グロブリン、または、そのフラグメントの作製に用いることができるファージ提示法の例としては、以下に開示される方法が挙げられる：Brinkman, U. et al. (1995) "Phage Display Of Disulfide-Stabilized Fv Fragments," J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995; Ames, R.S. et al. (1995) "Conversion Of Murine Fabs Isolated From A Combinatorial Phage Display Library To Full Length Immunoglobulins," J. Immunol. Methods, 184:177-186; Kettleborough, C.A. et al. (1994) "Isolation Of Tumor Cell-Specific Single-Chain Fv From Immunized Mice Using Phage-Antibody Libraries And The Re-Construction Of Whole Antibodies From These Antibody Fragments," Eur. J. Immunol., 24:952-958, 1994; Persic, L. et al. (1997) "An Integrated Vector System For The Eukaryotic Expression Of Antibodies Or Their Fragments After Selection From Phage Display Libraries," Gene, 187:9-18; Burton, D.R. et al. (1994) "Human Antibodies From Combinatorial Libraries," Adv. Immunol. 57:191-280；ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９２／００１０４７号、第ＷＯ９０／０２８０９号、第ＷＯ９１／１０７３７号、第ＷＯ９２／０１０４７号、第ＷＯ９２／１８６１９号、第ＷＯ９３／１１２３６号、第ＷＯ９５／１５９８２号および第ＷＯ９５／２０４０１号；および、米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号；、第５，４２７，９０８号；、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号。
【００８１】
上記参考文献に記載されるように、ファージの選択後、上記ファージ由来の抗体をコードする領域は、単離して、ヒト化抗体、または、任意の他の所望のフラグメントを含む全抗体を生成するのに用いることができ、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および、細菌を含む任意の所望の宿主において発現できる。この詳細は、たとえば、以下に記載される。たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2フラグメントを組み換え技術によって産出する技術も、以下の文献に開示された、本技術分野において周知の方法を用いて、用いることができる：ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９２／２２３２４；Mullinax, R.L. et al. (1992) "Expression Of A Heterodimeric Fab Antibody Protein In One Cloning Step," BioTechniques, 12(6):864-869; and Sawai et al. (1995) "Direct Production Of The Fab Fragment Derived From The Sperm Immobilizing Antibody Using Polymerase Chain Reaction And cDNA Expression Vectors," Am. J. Reprod. Immunol. 34:26-34；および、Better, M. et al. (1988) "Escherichia coli Secretion Of An Active Chimeric Antibody Fragment," Science 240:1041-1043）。一本鎖Ｆｖｓと抗体との産生に用いることができる技術の例として、以下の文献に記載のものが挙げられる：米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Huston, J.S. et al. (1991) "Protein Engineering Of Single-Chain Fv Analogs And Fusion Proteins," Methods in Enzymology 203:46-88; Shu, L. et al., "Secretion Of A Single-Gene-Encoded Immunoglobulin From Myeloma Cells," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90:7995-7999; and Skerra. A. et al. (1988) "Assembly Of A Functional Immunoglobulin Fv Fragment In Escherichia coli," Science 240:1038-1040。
【００８２】
ファージ提示技術は、本発明の抗体のＢ７−Ｈ１および／またはＰＤ−１に対する親和性を高めるために用いることができる。この技術は、本発明の組み合わせ方法において用いることが可能な高親和性抗体を得ることにおいて有益であろう。この技術は、親和性成熟と呼ばれ、上記受容体あるいはリガンド(または、それらの細胞外ドメイン)、または、それらの抗原フラグメントを用いた、変異生成またはＣＤＲウォーキング、および、再選択を用いて、初期抗体、または、親抗体と比べて抗原に対してより高い親和性で結合する抗体を特定する（たとえば、Glaser, S.M. et al. (1992) "Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A Filamentous Phage Vector System," J. Immunol. 149:3903-3913、参照）。単一ヌクレオチドよりもコドン全体を変異させる結果として、アミノ酸変異体の半ランダム化したレパートリーが得られる。単一ＣＤＲにおける単一アミノ酸変化によってそれぞれ異なる、そして、各ＣＤＲ残基のそれぞれ可能なアミノ酸置換を示す変異体を含有する、変異型クローンのプールからなるライブラリが構築できる。標識化抗原を有する固定化変異体を接触させることによって、抗原に対して高められた結合親和性を有する変異体をスクリーニングすることができる。抗原に対して高められた親和性を有する変異抗体を特定するのに、本技術分野において周知の任意のスクリーニング方法が用いられる（たとえば、ＥＬＩＳＡ）(たとえば、Wu, H. et al. (1998) "Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized Mab," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95(11):6037-6042; Yelton, D.E. et al. (1995) "Affinity Maturation Of The BR96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis," J. Immunol. 155:1994-2004、参照)。軽鎖をランダム化するＣＤＲウォーキングを場合によっては用いることができる(Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-Erbb-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site," J. Mol. Biol. 263:551-567、参照)。
【００８３】
したがって、本発明は、改良ＣＤＲおよび／または可変領域を特定するためにファージ提示法と合わせてランダム変異生成を使用することを検討する。ファージ提示技術は、代替的に、対象の変異生成（たとえば、親和性成熟または「ＣＤＲウォーキング」）によるＣＤＲ親和性を高める（または、低下させる）ために用いることができる。この技術は、初期抗体、または、親抗体と比べた場合に、抗原に対してより高い（または、より低い）親和性で結合するＣＤＲを有する抗体を特定するために、標的抗原、または、その抗原フラグメントを使用する（たとえば、Glaser, S.M. et al. (1992) "Antibody Engineering By Codon-Based Mutagenesis In A Filamentous Phage Vector System," J. Immunol. 149:3903-3913、参照）。単一ヌクレオチドよりもコドン全体を変異させる結果として、アミノ酸変異体の半ランダム化したレパートリーが得られる。単一ＣＤＲにおける単一アミノ酸変化によってそれぞれ異なる、そして、各ＣＤＲ残基のそれぞれの可能なアミノ酸置換を示す変異体を含有する、変異型クローンのプールからなるライブラリが構築できる。標識化された抗原を有する固定化変異体を接触させることによって、抗原に対して高められた（または、低下された）結合親和性を有する変異体をスクリーニングすることができる。抗原に対して高められた（または、低下された）親和性を有する変異抗体を特定するのに、本技術分野において周知の任意のスクリーニング方法が用いられる（たとえば、ＥＬＩＳＡ）（Wu, H. et al. (1998) "Stepwise In Vitro Affinity Maturation Of Vitaxin, An Alphav Beta3-Specific Humanized Mab," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95(11):6037-6042; Yelton, D.E. et al. (1995) "Affinity Maturation Of The BR96 Anti-Carcinoma Antibody By Codon-Based Mutagenesis," J. Immunol. 155:1994-2004、参照）。軽鎖をランダム化するＣＤＲウォーキングを場合によっては用いることができる（Schier et al. (1996) "Isolation Of Picomolar Affinity Anti-C-Erbb-2 Single-Chain Fv By Molecular Evolution Of The Complementarity Determining Regions In The Center Of The Antibody Binding Site," J. Mol. Biol. 263:551-567、参照）。
【００８４】
上記の親和性成熟を達成する方法は、たとえば、以下に記載されている:Krause, J.C. et al. (2011) An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody," MBio. 2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) "Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas," Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes," J. Mol. Biol. 401(1):84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) "Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41," MAbs 1(5):462-474; Gustchina, E. et al. (2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth," Virology 393(1):112-119; Finlay, W.J. et al. (2009) "Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions," J. Mol. Biol. 388(3):541-558; Bostrom, J. et al. (2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development," Methods Mol. Biol. 525:353-376; Steidl, S. et al. (2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification," Mol. Immunol. 46(1):135-144；および、Barderas, R. et al. (2008) "Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modeling," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26):9029-9034。
【００８５】
本発明は、特に、上記抗体のいずれかおよびそれらの抗原結合性フラグメントの「誘導体」の生産と使用とに関する。ここで「誘導体」とは、免疫特異的に抗原に結合し、親（または野生種）分子に対して１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上のアミノ酸の置換、付加、欠失、または修飾を含む抗体またはその抗原結合フラグメントのことを言う。そのようなアミノ酸の置換または付加によって、天然の（すなわち、ＤＮＡコードされた）または非天然のアミノ酸残基が取り込まれる。そのようなアミノ酸は、細胞リガンドや他のタンパク質に連結された周知の保護基、タンパク質分解的切断等によって、グリコシル化（たとえば、改変されたマンノース、２−Ｎアセチルグルコサミン、ガラクトース、フコース、グルコース、シアル酸、５−Ｎ−アセチルノラミン酸、５−グリコールノイラミン酸等の含有量を有する）、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、誘導体化してもよい。いくつかの実施形態では、改変された炭水化物修飾によって、以下の１つ以上が調節される：抗体の可溶化、抗体の細胞内輸送と分泌の円滑化、抗体集合の促進、立体構造の整合性、および抗体媒介エフェクター機能。特定の実施形態では、改変された炭水化物修飾によって、炭水化物の修飾が欠如した抗体に対する抗体媒介エフェクター機能が強化される。抗体媒介エフェクター機能の改変をもたらす炭水化物修飾は、当該技術において周知である（たとえば、Shields, R.L. et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity.," J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740; Davies J. et al. (2001) "Expression Of GnTIII In A Recombinant Anti-CD20 CHO Production Cell Line: Expression Of Antibodies With Altered Glycoforms Leads To An Increase In ADCC Through Higher Affinity For FC Gamma RIII," Biotechnology & Bioengineering 74(4): 288-294参照）。炭水化物含有量を改変する方法は、当業者に周知である（たとえば、Wallick, S.C. et al. (1988) "Glycosylation Of A VH Residue Of A Monoclonal Antibody Against Alpha (1----6) Dextran Increases Its Affinity For Antigen," J. Exp. Med. 168(3): 1099-1109; Tao, M.H. et al. (1989) "Studies Of Aglycosylated Chimeric Mouse-Human IgG. Role Of Carbohydrate In The Structure And Effector Functions Mediated By The Human IgG Constant Region," J. Immunol. 143(8): 2595-2601; Routledge, E.G. et al. (1995) "The Effect Of Aglycosylation On The Immunogenicity Of A Humanized Therapeutic CD3 Monoclonal Antibody," Transplantation 60(8):847-53; Elliott, S. et al. (2003) "Enhancement Of Therapeutic Protein In Vivo Activities Through Glycoengineering," Nature Biotechnol. 21:414-21; Shields, R.L. et al. (2002) "Lack Of Fucose On Human IgG N-Linked Oligosaccharide Improves Binding To Human Fcgamma RIII And Antibody-Dependent Cellular Toxicity.," J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740参照）。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は誘導体である。そのようなヒト化抗体は、１つ以上の非ヒトＣＤＲに、アミノ酸残基の置換、欠失、または付加を含む。このヒト化抗体誘導体は、非誘導体ヒト化抗体に比べて、同じ、優れた、または劣った結合を実質的に有してもよい。特定の実施形態では、ＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上のアミノ酸残基が置換、欠失、または付加（すなわち、変異）されている。
【００８７】
誘導体抗体また抗体フラグメントは、当業者に周知の技術を用いて化学的修飾によって修飾してもよい。この化学的修飾としては、限定されないが、特定の化学分解、アセチル化、製剤、ツニカマイシンの代謝合成等が挙げられる。ある実施形態では、抗体誘導体は、親抗体と類似または同一の機能を有する。別の実施形態では、抗体誘導体は、親抗体に対して改変された活性を示す。たとえば、誘導体抗体（またはそのフラグメント）は、そのエピトープによって強固に結合することができる。または、タンパク質分解に対して親抗体よりも高い抵抗を示すことができる。
【００８８】
誘導体化された抗体における置換、付加、または欠失は、抗体のＦｃ領域に位置してもよく、それによって、１つ以上のＦｃγＲに対する抗体の結合親和性を修飾する働きをしてもよい。１つ以上のＦｃγＲへの結合が修飾された抗体を修飾する方法は、当該技術において周知である（たとえば、ＰＣＴ出願第ＷＯ０４／０２９２０７号、第ＷＯ０４／０２９０９２号、第ＷＯ０４／０２８５６４号、第ＷＯ９９／５８５７２号、第ＷＯ９９／５１６４２号、第ＷＯ９８／２３２８９号、第ＷＯ８９／０７１４２号、および第ＷＯ８８／０７０８９号、ならびに米国特許第５，８４３，５９７および第５，６４２，８２１号参照）。いくつかの実施形態では、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩＡ等の活性化ＦｃγＲに対する親和性が改変された抗体を包含する。そのような修飾は、Ｆｃ媒介エフェクター機能も改変されていることが好ましい。Ｆｃ媒介エフェクター機能に影響を与える修飾は、当該技術において周知である（米国特許第６，１９４，５５１号ならびにＷＯ００／４２０７２参考）。１つの特定の実施形態では、Ｆｃ領域の修飾によって、抗体の抗体媒介エフェクター機能、他のＦｃ受容体（たとえば、Ｆｃ活性化受容体）への改変結合、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性、Ｃ１ｑ結合活性、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）活性、食細胞活性、またはこれらの組み合わせが改変される。
【００８９】
誘導体化された抗体は、哺乳類、好ましくはヒト、における親抗体の半減期（たとえば、血中半減期）を改変するのに用いてもよい。好ましくは、そのような改変によって、半減期が１５日、好ましくは２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、２ヶ月、３ヶ月、４か月、または５か月を超える。哺乳類、好ましくはヒト、における本発明のヒト化抗体またはそのフラグメントの半減期の増加によって、哺乳類における上記抗体または抗体フラグメントの血清力価が高くなり、それにより、上記抗体または抗体フラグメントの投与の頻度または投与する上記抗体または抗体フラグメントの濃度が低下する。生体内半減期が増加した抗体またはそのフラグメントは、当業者に周知の技術によって生成することができる。たとえば、生体内半減期が増加した抗体またはそのフラグメントは、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与すると同定されたアミノ酸残基を修飾（たとえば、置換、欠失、付加）することによって生成することができる。本発明のヒト化抗体は、生物学的半減期を増加させるように設計されてもよい（たとえば、米国特許第６，２７７，３７５号参照）。たとえば、本発明のヒト化抗体は、生体内または血中半減期を増加させるようにＦｃヒンジドメインで設計されてもよい。
【００９０】
生体内半減期が増加した抗体またはそのフラグメントは、高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の高分子を上記抗体または抗体フラグメントに結合させることによって生成することができる。ＰＥＧは、上記抗体または抗体フラグメントのＮ−またはＣ−末端にＰＥＧの部位特異的接合またはリジン残基に存在するイプシロンアミノ基を介して、多官能性リンカーの有無にかかわらず、上記抗体または抗体フラグメントに結合することができる。生物活性のロスが最小限となる線状または分岐状のポリマー誘導体化が用いられる。接合度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと質量分析法によって注意深く監視し、抗体に対するＰＥＧ分子の適正な接合を確保する。未反応ＰＥＧは、たとえば、サイズ排除またはイオン交換クロマトグラフィーによって、抗体とＰＥＧの複合体から分離することができる。
【００９１】
実質的な免疫原性反応なしに哺乳類の循環系に注入できる組成物を提供するために、本発明の抗体をDavis et al. （米国特許第４，１７９，３３７号参照）に記載の方法とカップリング剤によって修飾してもよい。
【００９２】
本発明は、本発明のヒト化抗体のフレームワーク残基の修飾を包含する。フレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、抗原結合を変性、好ましくは改善、するために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基と置換してもよい。これらのフレームワーク置換は、当該技術において周知の方法によって同定される。たとえば、特定の位置で異常なフレームワーク残基を同定するための抗原結合および配列比較に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデル化によって同定される（たとえば、米国特許第５，５８５，０８９号およびRiechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies For Therapy," Nature 332:323-327参照)。
【００９３】
また、本発明は、異種分子（すなわち、非関連分子）に組み換え融合または化学的に結合（共有結合および非共有結合を共に含む）される抗ヒトＢ７−Ｈ１および抗ヒトＰＤ−１抗体（および、好ましくは、ヒト化抗体）およびその抗原結合フラグメントを包含する。融合は、必ずしも直接融合である必要はなく、リンカー配列を通じて生じてもよい。
【００９４】
融合タンパク質のＦｃ部分は、アイソタイプまたはサブクラスによって変化させてもよく、キメラタンパク質またはハイブリッドタンパク質であってもよく、および／または、たとえばエフェクター機能、半減期の制御、組織の入手しやすさを改善し、安定性などの生物物理学的特徴を強化し、生産の効率（およびコストの削減）を改善するために、修飾されてもよい。開示された融合プロテインの構築に有用な多くの修飾とその方法は、当該技術において周知である（たとえば、Mueller, J.P. et al. (1997) "Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With Chimeric Igg2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells," Mol. Immun. 34(6):441-452, Swann, P.G. (2008) "Considerations For The Development Of Therapeutic Monoclonal Antibodies," Curr. Opin. Immun. 20:493-499 (2008)およびPresta, L.G. (2008) "Molecular Engineering And Design Of Therapeutic Antibodies," Curr. Opin. Immun. 20:460-470参照）。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、天然のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ハイブリッド、たとえば、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４  Ｆｃ定常領域から成るキメラである。Ｆｃ領域への修飾としては、Ｆｃガンマ受容体と相補体への結合を防止するためのＩｇＧ４の修飾、１つ以上のＦｃガンマ受容体への結合を改善するためのＩｇＧ１の修飾、エフェクター機能（アミノ酸変化）を最小限に抑えるためのＩｇＧ１の修飾、（通常は発現ホストを変えることによって）グリカンが変性したまたはグリカンがないＩｇＧ１があるが、これらに限定されない。Ｆｃ領域は、ヒンジ領域全体、またはヒンジ領域全体未満を含んでもよい。
【００９５】
非ホジキンリンパ腫またはワルデンシュトレームマクログロブリン血症のためのリツキシマブ（ＣＤ２０に対するキメラマウス−ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体）で治療した患者における治療結果は、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに対して個別に内在する親和性を持ったＦｃγ受容体の対立遺伝子多型の個人の発現と相関性があった。特に、低親和性活性Ｆｃ受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＩＩＩＡ）の高親和性対立遺伝子を持った患者は、より高い反応速度を示し、非ホジキンリンパ腫の場合は、無進行性生存率が改善した。別の実施形態では、低親和性抑制性Ｆｃ受容体ＣＤ３２Ｂ（ＦｃγＲＩＩＢ）への結合を抑え、かつ、低親和性活性Ｆｃ受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＩＩＩＡ）への結合の野生型レベルを維持または親和性活性Ｆｃ受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＩＩＩＡ）への結合を促進する１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含んでもよい。
【００９６】
別の実施形態には、ＩｇＧ２−４ハイブリッドとＩｇＧ４突然変異体が含まれ、これらは、その半減期を延ばすＦｃＲに対る結合を抑える。代表的なＩｇＧ２−４ハイブリッドとＩｇＧ４突然変異体は、Angal, S. et al. (1993) "A Single Amino Acid Substitution Abolishes The Heterogeneity Of Chimeric Mouse/Human (IgG4) Antibody," Molec. Immunol. 30(1):105-108; Mueller, J.P. et al. (1997) "Humanized Porcine VCAM-Specific Monoclonal Antibodies With Chimeric IgG2/G4 Constant Regions Block Human Leukocyte Binding To Porcine Endothelial Cells," Mol. Immun. 34(6):441-452、および米国特許第６，９８２，３２３号に記載されている。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ドメインが欠失しており、たとえば、Angal et al.では、セリン２４１をプロリンで置換したＩｇＧ１およびＩｇＧ２ドメインが記載されている。
【００９７】
好ましい実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＤ１６Ａへの結合を促進するアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む。ＣＤ１６Ａへの結合を増加させ、かつ、ＣＤ３２Ｂへの結合を減少させるヒトＩｇＧ１のＦｃドメインにおける多くの置換は、Stavenhagen, J.B. et al. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors," Cancer Res. 57(18):8882-8890に記載されている。ＣＤ１６Ａへの結合増加および／またはＣＤ３２Ｂへの結合減少を持ったヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインの変異体としては、たとえば、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、またはＰ２９６Ｌ置換が挙げられる。これらのアミノ酸置換は、任意の組み合わせでヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインに存在してもよい。一実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、およびＹ３００Ｌ置換を含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ９２９Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、およびＰ２９６Ｌ置換を含む。別の実施形態では、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン変異体は、Ｎ２９７Ｑ置換を含むが、この突然変異体はＦｃＲ結合を破壊するためである。
【００９８】
一実施形態では、そのような異種分子は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、または少なくとも１００個のアミノ酸を有するポリペプチドである。あるいは、そのような異種分子は、酵素、ホルモン、細胞表面受容体、薬物部分であってもよい。これらの例としては、毒素（たとえば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素（すなわち、ＰＥ−４０）、ジフテリア毒素、リシン、ゲロニン、またはヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質）、タンパク質（たとえば、腫瘍壊死因子、インターフェロン（たとえば、α−インターフェロン、β−インターフェロン）、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、またはアポトーシス剤（たとえば、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子−β））、生物学的反応修飾物質（たとえば、リンホカイン（たとえば、インターロイキン-1（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」））、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、またはマクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ−ＣＳＦ」））、または成長因子（たとえば、成長ホルモン（「ＧＨ」）））、細胞毒素（たとえば、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ、たとえば、ベドチン）、ピューロマイシン、およびその類似体または同族体等の細胞増殖抑制または細胞破壊剤）、代謝拮抗物質（たとえば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（たとえば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、ＢｉＣＮＵ（登録商標）（カルムスチン、ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（たとえば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）、およびドキソルビシン）、抗生物質（たとえば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、または抗有糸分裂剤（たとえば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【００９９】
このような治療部分を抗体に接合させる技術は周知である（たとえば、Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Reisfeld et al. (eds.), 1985, pp.243-56, Alan R. Liss, Inc.); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in CONTROLLED DRUG DELIVERY (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), 1987, pp. 623-53, Marcel Dekker, Inc. ); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in MONOCLONAL ANTIBODIES '84: BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS, Pinchera et al. (eds.), 1985, pp. 475-506); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY,Baldwin et al. (eds.), 1985, pp. 303-16, Academic Press; Thorpe et al. (1982) "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates," Immunol. Rev. 62:119-158; Carter, P.J. et al. (2008) "Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy," Cancer J. 14(3):154-169; Alley, S.C. et al. (2010) "Antibody-Drug Conjugates: Targeted Drug Delivery For Cancer," Curr. Opin. Chem. Biol. 14(4):529-537; Carter, P. et al. (2005) "Designer Antibody-Based Therapeutics For Oncology," Amer. Assoc. Cancer Res. Educ. Book. 2005(1):147-154; Carter, P.J. et al. (2008) "Antibody-Drug Conjugates For Cancer Therapy," Cancer J. 14(3):154-169; Chari, R.V.J. (2008) "Targeted Cancer Therapy: Conferring Specificity To Cytotoxic Drugs," Acc. Chem Res. 41(1):98-107; Doronina, S.O. et al. (2003) "Development Of Potent Monoclonal Antibody Auristatin Conjugates For Cancer Therapy," Nat. Biotechnol. 21(7):778-784; Ducry, L. et al. (2010) "Antibody-Drug Conjugates: Linking Cytotoxic Payloads To Monoclonal Antibodies," Bioconjug Chem. 21(1):5-13; Senter, P.D. (2009) "Potent Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy," Curr. Opin. Chem. Biol. 13(3):235-244、およびTeicher, B.A. (2009) "Antibody-Drug Conjugate Targets," Curr Cancer Drug Targets. 9(8):982-1004参照）。
【０１００】
本発明のいかなる分子も、精製を促進するペプチド等のマーカー配列に融合することができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応するヘキサヒスチジンペプチドであるヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Wilson, I.A. et al. (1984) "The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein," Cell, 37:767-778）、およびフラグタグ（Knappik, A. et al. (1994) "An Improved Affinity Tag Based On The FLAG Peptide For The Detection And Purification Of Recombinant Antibody Fragments," Biotechniques 17(4):754-761）である。
【０１０１】
また、本発明は、診断用薬、治療薬、または血中半減期を延ばすことが望まれる他の分子に接合される抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを包含する。これらの抗体は、たとえば、所定の治療計画の有効性を決定するための臨床検査手順の一部として、たとえば、疾患、障害、または感染症の発症または進行を監視するために（生体内、自然位、または生体外で）診断に使用することができる。検出は、検出可能な物質に対する抗体を結合させることによって容易にすることができる。種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、当該技術で周知の技術を用いて、中間体（たとえば、当該技術において周知のリンカー等）を介して、直接または間接的に抗体に結合または接合してもよい。本発明に係る診断法として使用する抗体に接合させることができる金属イオンについては、たとえば、米国特許第４，７４１，９００号参照。そのような診断および検出は、検出可能な物質に交代を結合させることによって達成することができる。検出可能な物質としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼ等の種々の酵素、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン等の補欠分子族錯体、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリン等の蛍光物質、ルミノール等の発光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリン等の生物発光物質、ビスマス（213Ｂｉ）、炭素（14Ｃ）、クロム（51Ｃｒ）、コバルト（57Ｃｏ）、フッ素（18Ｆ）、ガドリニウム（153Ｇｄ、159Ｇｄ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、ゲルマニウム（68Ｇｅ）、ホルミウム（166Ｈｏ）、インジウム（115Ｉｎ、113Ｉｎ、112Ｉｎ、111Ｉｎ）、ヨウ素（131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、121Ｉ）、ランタン（140Ｌａ）、ルテチウム（177Ｌｕ）、マンガン（54Ｍｎ）、モリブデン（99Ｍｏ）、パラジウム（103Ｐｄ）、リン（32Ｐ）、プラセオジム（142Ｐｒ）、プロメチウム（149Ｐｍ）、レニウム（186Ｒｅ、188Ｒｅ）、ロジムム（105Ｒｈ）、ルテミウム（97Ｒｕ）、サマリウム（153Ｓｍ）、スカンジウム（47Ｓｃ）、セレン（75Ｓｅ）、ストロンチウム（85Ｓｒ）、硫黄（35Ｓ）、テクネチウム（99Ｔｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、スズ（113Ｓｎ、117Ｓｎ）、トリチウム（3Ｈ）、キセノン（133Ｘｅ）、イッテルビウム（169Ｙｂ、175Ｙｂ）、イットリウム（90Ｙ）、亜鉛（65Ｚｎ）等の放射性物質、種々の陽電子放出トモグラフィーを用いた陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
本発明の分子は、米国特許第４，６７６，９８０号においてSegalによって記載されている通り、第２の抗体に接合させて異種複合体を形成することができる。そのような異種複合体は、さらにハプテン（たとえば、フルオレセイン等）、細胞マーカー（たとえば４−１−ＢＢ、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＴＬＡ４、ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３、ＯＸ４０、ＴＩＭ３、ＴＩＭ４、ＴＬＲ２、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ７、Ｂ７−Ｈ７ＣＲ、ＣＤ７０、ＣＤ４７等）、サイトカイン（たとえば、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−４  ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＦＮγ，Ｆｌｔ３，ＢＬｙｓ）、またはケモカイン（たとえば、ＣＣＬ２１）等に結合してもよい。
【０１０３】
本発明の分子は、固体担体に取り付けることができ、これら担体は、標的抗原の、または、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントへの結合を介して担体に固定化された標的抗原に結合可能な他の分子のイムノアッセイまたは精製に特に有用である。そのような固体担体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本発明は、核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を伝達または複製することができる任意のそのような抗体、融合タンパク質またはその断片、ならびにベクター分子（たとえば、プラスミド等）をコードするそのような核酸分子を含む。核酸は、一本鎖、二本鎖とすることができ、一本鎖および二本鎖部分の両方を含んでもよい。
【０１０５】
（Ａ．本発明の好ましいモジュレータ組成物）
本発明は、特に、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に免疫特異的に結合し、かつ／または、被験者におけるＰＤ−１へのＢ７−Ｈ１の結合能を調節する抗体に関する。ここで、「被験者」は、好ましくは非霊長類（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（たとえば、サル、ヒト）のような哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。従って、本発明は、ヒトＢ７−Ｈ１またはヒトＰＤ−１に結合し、かつ、ヒトまたはヒトの組織（自然位または生体外で）におけるＰＤ−１へのＢ７−Ｈ１の結合能を調節するヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【０１０６】
最も好ましくは、そのような抗体および抗原結合フラグメントは、（特に、内因性濃度で表現されたときに）被験者の抗原提示細胞の表面に配列されたＢ７−Ｈ１が、（特に、内因性濃度で表現されたときに）当該被験者のＴ細胞の表面に配列されたＰＤ−１に結合する能力およびその逆の場合の能力を調節するのに十分な親和性を有する。ここで「内因性濃度」とは、正常細胞、がん細胞、または感染細胞において内因性分子が自然に発現されるレベル（すなわち、発現ベクターや組み換えプロモーターない場合）を指す。
【０１０７】
一実施形態では、そのような調節は、そのように（好ましくは内因的に発現され）配列されたＢ７−Ｈ１およびそのように（好ましくは内因的に発現され）配列されたＰＤ−１の結合を阻害または干渉することを含む。別の実施形態では、そのような調節は、内因的に発現され配列されたＢ７−Ｈ１およびそのように内因的に発現され配列されたＰＤ−１の結合の強化または促進を含む。さらに別の実施形態では、そのような調節は、抗Ｂ７−Ｈ１または抗ＰＤ−１の結合が、対応する受容体を介したシグナル変換のトリガとなる直接的刺激を含む。
【０１０８】
（１．好ましい抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体およびそのＣＤＲ）
本発明によると、そのような分子は、ヒトＢ７−Ｈ１に対して免疫特異的な抗体を産生する分子に対するハイブリドーマ系をスクリーニングし、その後任意で、調節活性（たとえば、中和活性、作動活性、変性シグナル変換活性等）を示す分子に対する当該系統の中でスクリーニングすることによって産生することができる。本発明は、特に、抗ヒトＢ７−Ｈ１クローン（すなわち、１Ｅ１２、１Ｆ４、２Ｇ１１、３Ｂ６、および３Ｄ１０）を提供する。
【０１０９】
抗ヒトＢ７−Ｈ１クローンによって発現された抗体を配列させて、それらの可変領域を明らかにした。ＣＤＲ配列を太字と下線で示す。
【０１１０】
【表１】
2014523401.tif 000003
【０１１１】
【表２】
2014523401.tif 000004
【０１１２】
（２．好ましい抗ヒトＰＤ−抗体およびそのＣＤＲ）
または、そのような抗体は、ヒトＰＤ−１に対して免疫特異的な抗体を産生する分子に対するハイブリドーマ系をスクリーニングし、その後任意で、調節活性（たとえば、中和活性、作動活性、変性シグナル変換活性等）を示す分子に対する当該系統の中でスクリーニングすることによって産生することができる。本発明は、特に、抗ヒトＰＤ−１クローン（すなわち、１Ｅ３、１Ｅ８、および１Ｈ３）を提供する。
【０１１３】
抗ヒトＰＤ−１クローンによって発現された抗体を配列させて、それらの可変領域を明らかにした。ＣＤＲ配列を太字と下線で示す。
【０１１４】
【表３】
2014523401.tif 000005
【０１１５】
（３．本発明の抗ヒトＢ７−Ｈ１および抗ヒトＰＤ−１抗体の共通ＣＤＲ）
同定された抗体のＣＤＲの分析を行って、共通ＣＤＲ配列および同様の結合特性を示す変異ＣＤＲ配列候補を同定した。そのような変異ＣＤＲは、表１に基づいたＢｌｏｓｕｍ６２．ｉｉｊ分析 によって算出した。表１にＢｌｏｓｕｍ６２．ｉｉｊ置換スコアを示す。スコアが高ければ高いほど、置換がより同類であり、置換が機能に影響を与えない可能性がより高い。
【０１１６】
【表４】
2014523401.tif 000006
【０１１７】
本発明によれば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの変異ＣＤＲを有する新規の抗体および抗原結合フラグメントの形成が可能になる。本発明の方法によって相当数の個別のＣＤＲが同定されたため、本発明によれば、特定の同定されたＣＤＲの任意の変異体において必要とされる可能性のあるＣＤＲ残基の認識が可能になる。そのような残基を表２〜５に太字で示す。比較されたＣＤＲの中で変化することが分かっている残基については、表１の置換スコアは、許容された置換の同定を決定するための手段となる。たとえば、特定のＣＤＲの特定の残基がＲまたはＳとして変化することが分かっている場合、ＲとＳは置換スコアが−１であるので、置換スコアが−１以上のＲまたはＳに対する任意の置換は、観察された変異体（ＲまたはＳ）と同程度に（もしくはＲまたはＳよりも）、特定のＣＤＲと結合特性が十分に類似した変異ＣＤＲを作製し、機能的な抗Ｂ７−Ｈ１、抗ＰＤ−１、または抗原結合フラグメントを形成するように、特定のＣＤＲの代わりに変異ＣＤＲを採用することを許容する可能性がある。各位置について、置換スコアの高い残基を選択することが、置換スコアの低い残基を選択することより好ましい。
【０１１８】
表２は、抗Ｂ７−Ｈ１抗体の軽鎖ＣＤＲの分析を示し、本発明の観察された好ましい変異軽鎖抗Ｂ７−Ｈ１ＣＤＲの共通配列を提供する。
【０１１９】
【表５】
2014523401.tif 000007
【０１２０】
【表６】
2014523401.tif 000008
【０１２１】
【表７】
2014523401.tif 000009
【０１２２】
表３は、抗Ｂ７−Ｈ１抗体の重鎖ＣＤＲの分析を示し、本発明の観察された好ましい変異重鎖抗Ｂ７−Ｈ１ＣＤＲの共通配列を提供する。
【０１２３】
【表８】
2014523401.tif 000010
【０１２４】
【表９】
2014523401.tif 000011
【０１２５】
【表１０】
2014523401.tif 000012
【０１２６】
このように、Ｂ７−Ｈ１抗体１Ｅ１２、１Ｆ４、２Ｇ１１、３Ｂ６、および３Ｄ１０のＣＤＲを有する抗体および抗原結合フラグメントに加えて、本発明は、さらに、上記軽／重鎖共通配列を有するＣＤＲを有する抗体および抗原結合フラグメントを提供する。
【０１２７】
表４は、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖ＣＤＲの分析を示し、本発明の観察された好ましい変異軽鎖抗ＰＤ−１ＣＤＲの共通配列を提供する。
【０１２８】
【表１１】
2014523401.tif 000013
【０１２９】
【表１２】
2014523401.tif 000014
【０１３０】
【表１３】
2014523401.tif 000015
【０１３１】
表５は、抗ＰＤ−１抗体の重鎖ＣＤＲの分析を示し、本発明の観察された好ましい変異軽鎖抗ＰＤ−１ＣＤＲの共通配列を提供する。
【０１３２】
【表１４】
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【０１３３】
【表１５】
2014523401.tif 000017
【０１３４】
【表１６】
2014523401.tif 000018
【０１３５】
このように、抗ＰＤ−１抗体１Ｅ３、１Ｅ８、および１Ｈ３のＣＤＲを有する抗体および抗原結合フラグメントに加えて、本発明は、さらに、上記軽／重鎖共通配列を有するＣＤＲを有する抗体および抗原結合フラグメントを提供する。
【０１３６】
本発明は、上記クローンのいずれかによって生成されるマウスモノクローナル抗体の可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列に対して、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であり、かつ、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に免疫特異的結合を示す可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体又はそのフラグメントを包含する。さらに、本発明は、上記に列挙したクローンの相補決定領域のアミノ酸配列に対して、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であり、かつ、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に免疫特異的結合を示すＣＤＲを含む抗体またはそのフラグメントを包含する。２つのアミノ酸配列の百分率同一性の決定は、ＢＬＡＳＴのタンパク質比較によって決定することができる。
【０１３７】
ある特定の実施例では、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、上記の好ましい抗体の相補決定領域の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、より好ましくは、６つすべてを含み、ヒトのＢ７−Ｈ１またはＰＤ−１に結合する能力を発揮する。
Ｂ．本発明の好ましい組成物の治療的および予防的使用
本発明は特に、ヒトＢ７−Ｈ１またはヒトＰＤ−１に免疫特異的に結合し、および／またはＢ７−Ｈ１およびＰＤ−１間の結合を調節することが可能であり、それによって対象（たとえば、ヒト患者）内において分子（Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１）が内生的に発現および配列され、および／またはＰＤ−１またはＢ７−Ｈ１を介した信号伝達を調節することが可能な分子（特に、抗体またはそれらの抗原結合フラグメント）の治療的および／または予防的使用に関する。
【０１３８】
本明細書に使用されるとき、「処置する」、「処置すること」、「処置」、および「治療的使用」という用語は、Ｂ７−Ｈ１およびＰＤ−１の相互作用によって悪化した疾患の症状または障害のうちの１つ以上の除去、低減、または改善を指す。本明細書に使用されるとき、「治療的な有効量」はそのような症状の臨床的に関連する除去、低減、または改善を媒介するのに十分な治療薬の量を指す。効果は、受容対象の健康または予後に影響を与えるのに十分な規模である場合、臨床的に関連する。治療的な有効量とは、疾患の発現を遅らせるまたは最小限に抑える（たとえば、癌の拡大を遅らせるまたは最小限に抑える）のに十分な治療薬の量を指す。治療的な有効量はまた、疾患の処置または管理において治療的な利益を提供する治療薬の量を指す。さらに、本発明の治療薬に関する治療的な有効量とは、疾患の処置または管理において治療的利益を提供する治療薬単体の量または他の治療と組み合わせた量を意味し、たとえば、疾患を処置または管理するのに十分な治療的抗体の治療的有効性を増強するのに十分な量である。
【０１３９】
本明細書に使用されるとき、「予防薬」という用語は、障害または疾患の任意の症状を検出する前に、そのような障害または疾患の防止に使用され得る物質を指す。「予防的に有効な」量とは、そのような保護を媒介するのに十分な予防薬の量である。予防的に有効な量とは、疾患の防止において予防的利益を提供する予防薬の量も指し得る。さらに、本発明の予防薬に関する予防的に有効な量とは、疾患の防止において予防的利益を提供する予防薬単体の量または他の物質と組み合わせた量を意味する。
【０１４０】
本明細書における投与量および投与頻度は、治療的に有効なおよび予防的に有効なという用語に包含される。さらに、通常は、投与量および頻度はそれぞれの患者に特有な要因によって異なり、投与される特定の治療薬または予防薬、癌の重篤度および種類、投与の経路、ならびに当該患者の年齢、体重、反応、および過去の病歴によって異なる。当業者は、そのような要因を考慮し、また、たとえば、文献において報告され、Physician’s Desk Reference (56th ed., 2002)において推奨された投与量に従って、適切な投与計画を選択することができる。
【０１４１】
（１．免疫システムの上流修飾因子の使用）
好ましい実施形態において、１つ以上の部位においてそれらの抗原と結合するそのような抗体およびフラグメントは、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に対して、Ｂ７−Ｈ１−ＰＤ−１結合部位に対して近接し、破壊的である。上述した通り、ＰＤ−１およびＢ７−Ｈ１間の相互作用によって、Ｔ細胞の増殖が抑制され、多数のサイトカインの生産が減少する（Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126参照）。このように、好ましい実施形態において、本発明の分子を対象に投与することによってＢ７−Ｈ１−ＰＤ−１結合を相殺し、それによって対象の免疫システムを上流修飾する。別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体の結合活性および／または親和性は、非常に高レベルのＰＤ−１を発現するＴ細胞であって、消耗したまたは機能不全のＴ細胞とのみ結合する（およびＴ細胞へのＢ７−Ｈ１結合を阻害する）ような結合活性および／または親和性であり、したがって、この細胞集団を特異的に標的とすることができる。このように、本発明は、ＩＦＮ−γの生産向上を媒介する本発明の抗体の使用に関連する。このように、本発明は、ＩＦＮ−γによって処置可能な疾患および病気（卵巣癌および他の形態の癌、慢性肉芽腫性疾患、大理石骨病、フリードライヒ失調症、など）の処置におけるそのような抗体の使用に関する。さらに、本発明は、Ｔ細胞の増殖の向上を媒介する本発明の抗体の使用に特に関連する。このように、本発明はＴ細胞の増殖の向上によって処置可能な疾患および病気の処置におけるそのような抗体の使用に関連し、そのような疾患および病気としては：エイズ；重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）；オーメン症候群；軟骨毛髪形成不全症；器官または組織の移植または化学療法によって起こるＴ細胞の損失または除去；低ガンマグロブリン血症；伴性無ガンマグロブリン血症；一過性低ガンマグロブリン血症；異ガンマグロブリン血症；ＩｇＡ欠損症・ＩｇＧ欠損症；ＩｇＭ欠損症；高ＩｇＭ症候群；ウィスコット・アルドリック症候群；高ＩｇＥ症候群；分類不能型免疫不全（common variable immunodeficiency）；ＩＣＦ症候群；胸腺形成不全症（たとえば；ディ・ジョージ症候群；ネゼロフ症候群；血管拡張性失調症）；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症；アデノシンデアミナーゼ欠損症；ＺＡＰ７０欠損症；不全リンパ球症候群；白血球減少症；リンパ球減少症（たとえば；特発性ＣＤ４＋リンパ球減少症）；または補体欠損症が挙げられる。本発明は、ＩＦＮ−γの生産の向上およびＴ細胞増殖の向上の両方を媒介する本発明の抗体の使用に特に関連する。
【０１４２】
免疫システムの上流修飾は、癌および慢性感染症の処置において特に好ましく、したがって本発明はそのような障害の処置において有用性を有する。ＰＤ−１およびＢ７−Ｈ１の両方は、ＨＩＶ感染において過剰発現する（Xu, Huanbin et al. (2010) "Increased B7-H1 Expression on Dendritic Cells Correlates with Programmed Death 1 Expression on T Cells in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques and May Contribute to T Cell Dysfunction and Disease Progression," J.Immunol. 185:7340-7348; Grabmeier-Pfistershammer, K. et al. (2011) "Identification of PD-1 as a Unique Marker for Failing Immune Reconstitution in HIV-1-Infected Patients on Treatment," J Acquir. Immune Defic. Syndr. 56(2):118-124）。このように、そのような細胞におけるＢ７−Ｈ１の発現は、ヒトのＨＩＶを診断するのに使用することができる。したがって、本発明の抗ＰＤ−１および抗Ｂ７−Ｈ１抗体は、ＨＩＶ感染およびエイズの処置に対して特定の治療的な有用性を有する。本明細書に使用されるとき、「癌」という用語は、細胞の異常な無制限増殖から起こる新生物または腫瘍を指す。本明細書に使用されるとき、癌は明示的に白血病およびリンパ腫を含む。「癌」という用語は、遠位部位に転移する潜在性を有し、非癌細胞とは異なる表現型形質を示す細胞を伴う疾患を指し、たとえば、軟寒天などの３次元基質におけるコロニーの形成または３次元基底膜もしくは細胞外基質の生成における管状網もしくはクモの巣状マトリクスの形成が挙げられる。非癌細胞は、軟寒天においてコロニーを形成せず、３次元基底膜または細胞外基質の生成においては明確な球状構造を形成する。
【０１４３】
本発明の方法および組成物によって処置され得るまたは防止され得る癌および関連する障害としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性白血病、急性リンパ性白血病、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄単球、単球、赤白血病（erythroleukemia leukemias）および骨髄異形成症候群などの急性骨髄球性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリー細胞白血病などの慢性白血病、などの白血病；真性赤血球増加症；ホジキン病または非ホジキン病リンパ腫（たとえば、びまん性未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陰性、大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；びまん性未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陽性、大型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）陽性、ＡＬＫ＋未分化大型細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、急性骨髄性リンパ腫（ＡＭＬ））などのリンパ腫；くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫、および髄外性形質細胞腫などの多発性骨髄腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；重度不確定な単クローン性免疫グロブリン血症；良性単クローン性免疫グロブリン血症；重鎖病；骨肉腫（bone sarcoma）、骨肉腫（osteosarcoma）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜性肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫（血管内皮腫）、線維肉腫、カポージ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫などの骨および結合組織の肉腫；神経膠腫、星細胞腫、脳幹神経膠腫、脳室上皮腫、乏突起神経膠腫、非神経膠の腫瘍、聴神経腫、頭蓋咽頭腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫などの脳腫瘍；腺癌、小葉（小細胞性）癌、分泌管内癌、骨髄性乳癌、粘液乳癌、管状腺乳癌、乳頭乳癌、パジェット病、および炎症性乳癌などの乳癌；褐色細胞腫（pheochromocytom）および副腎皮質癌などの副腎癌；乳頭性または濾胞性甲状腺癌、骨髄性甲状腺癌、および未分化甲状腺癌などの甲状腺癌；インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ビポーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、およびカルチノイドまたは膵小島腫瘍などの膵癌；クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症、および尿崩症（insipius）などの下垂体癌；虹彩黒色腫、脈絡膜メラノーマ、および毛様（cilliary）体メラノーマなどの眼メラノーマ、および網膜芽細胞腫などの目癌；扁平上皮癌、腺癌、およびメラノーマなどの腟癌；扁平上皮癌、メラノーマ、腺癌、基底細胞癌、肉腫、およびパジェット病などの外陰癌；扁平上皮癌および腺癌などの子宮頸癌；子宮内膜癌および子宮肉腫などの子宮癌；上皮性卵巣癌、境界型腫瘍、胚細胞腫瘍、および間質腫瘍などの卵巣癌；扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌（adenoid cyctic carcinoma）、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、メラノーマ、形質細胞腫、疣状癌、および燕麦細胞（小細胞）癌などの食道癌；腺癌、菌状発生的（ポリープ状）、潰瘍形成性、表在拡大型、びまん性拡大型、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、および癌肉腫などの胃癌；結腸癌；直腸癌；肝細胞癌および肝芽腫、腺癌などの胆嚢癌などの肝臓癌；乳頭性、結節性、およびびまん性などの胆管癌；非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大���胞癌、および小細胞肺癌などの肺癌；胚腫瘍、セミノーマ、未分化、標準的（典型的）、精母細胞性、非セミノーマ、胎児性癌、奇形腫癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、前立腺癌（腺癌、平滑筋肉腫、および横紋筋肉腫など）などの精巣癌；陰茎（penal）癌；扁平上皮癌などの口腔癌；基底（basal）癌；腺癌、粘表皮癌、および腺様嚢胞癌などの唾液腺癌；扁平上皮癌および疣状などの咽頭癌；基底細胞癌、扁平上皮癌およびメラノーマ、表在拡大型メラノーマ、結節性メラノーマ、悪性黒子メラノーマ、末端黒子型メラノーマなどの皮膚癌；腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行細胞癌（腎盂および／または尿管（uterer））などの腎臓癌；ウィルムス腫瘍；移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫などの膀胱癌。さらに、癌としては、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ管内皮肉腫（lymphangioendotheliosarcoma）、中皮腫、滑膜性腫瘍、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支原生癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌および乳頭腺癌が挙げられる（そのような病気については、Fishman et al., 1985, Medicine, 2d Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia and Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of Americaを参照）。
【０１４４】
したがって、本発明の方法および組成物は、様々な癌または他の異常増殖性疾患の処置または防止においても有用である。これらの様々な癌または異常増殖性疾患としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌および皮膚癌などの癌腫；扁平上皮癌など；白血病、急性リンパ球性白血病、急性リンパ性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキット（Berketts）リンパ腫などのリンパ系造血器腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球白血病などの骨髄細胞系造血器腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫（rhabdomyoscarcoma）などの間葉由来腫瘍；メラノーマ、セミノーマ、テトレート（tetrato）癌腫、神経芽細胞腫、および神経膠腫などの他の腫瘍；星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫などの中枢神経系および末梢神経系腫瘍；線維肉腫（fibrosafcoma）、横紋筋肉腫（rhabdomyoscarama）、および骨肉腫などの間葉由来腫瘍；メラノーマ、色素性乾皮症（xenoderma pegmentosum）、角化性棘細胞腫（keratoactanthoma）、セミノーマ、甲状腺濾胞癌、および奇形癌腫などの他の腫瘍。アポトーシスにおける異常によって引き起こされた癌も、本発明の方法および組成物によって処置されることを意図する。そのような癌としては、濾胞性リンパ腫、ｐ５３突然変異による癌腫、胸部、前立腺、および卵巣のホルモン依存腫瘍、および家族性大腸腺腫症および骨髄異形成症候群などの前癌病変などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、卵巣、膀胱、胸部、結腸、肺、皮膚、膵臓、または子宮における悪性または異常増殖性（dysproliferative）変化（化生および異形成など）または過剰増殖性障害が、本発明の方法および組成物によって処置または防止される。他の特定の実施形態において、肉腫、メラノーマ、または白血病が本発明の方法および組成物によって処置または防止される。
【０１４５】
癌細胞は、様々な機序を通じてではあるが、自身の発達中に機能特性を身につける。そのような機能としては、アポトーシスの回避、増殖信号の自足、抗増殖信号に対する無感覚、組織浸潤／転移、無限説明的潜在性、および持続的血管形成が挙げられる。「癌細胞」という用語は、前癌性細胞および悪性癌細胞の両方を包含することを意味している。いくつかの実施形態では、癌は、限局性を保った良性腫瘍を指す。他の実施形態において、癌は、周辺の身体構造に侵入および破壊し、その後遠位部位に拡大する悪性腫瘍を指す。さらに他の実施形態において、癌は、特定の癌抗原（たとえば、汎癌抗原（ＫＳ１／４）、卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２/ｎｅｕ、など）に関連する。
【０１４６】
本発明の抗体および抗体フラグメントは、異常に高レベルなＰＤ−１を発現する細胞（たとえば、消耗したＴ細胞、Ｂ細胞、単球、など）に関連する癌の処置に特に有用である（Youngblood, B. (2011) "Chronic Virus Infection Enforces Demethylation Of The Locus That Encodes PD-1 In Antigen-Specific CD8(+) T Cells," Immunity 35(3):400-412; Spahn, J. et al. (2011) "Ineffective CD8(+) T-Cell Immunity To Adeno-Associated Virus Can Result In Prolonged Liver Injury And Fibrogenesis," Amer. J. Pathol. 179(5):2370-2381; Wang, C. et al. (2011) "Phenotype, Effector Function, And Tissue Localization Of PD-1-Expressing Human Follicular Helper T Cell Subsets," BMC Immunol. 12:53, 1-15; Eichbaum, Q. (2011) "PD-1 Signaling In HIV And Chronic Viral Infection Potential For Therapeutic Intervention?" Curr. Med. Chem. 18(26):3971-3980; Hallett, W.H. et al. (2011) "Immunosuppressive Effects Of Multiple Myeloma Are Overcome By PD-L1 Blockade," Biol Blood Marrow Transplant. 17(8):1133-1145; Ni, L. et al. (2010) "PD-1 Modulates Regulatory T Cells And Suppresses T-Cell Responses In HCV-Associated Lymphoma," Immunol. Cell. Biol. 89(4):535-539; Inozume, T. et al. (2010) "Selection Of CD8+PD-1+ Lymphocytes In Fresh Human Melanomas Enriches For Tumor-Reactive T Cells," J. Immunother. 33(9):956-964; and Jin, H.T. et al. (2010) "Cooperation Of Tim-3 And PD-1 In CD8 T-Cell Exhaustion During Chronic Viral Infection," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 107(33):14733-14738）。
【０１４７】
上述した腫瘍に対する使用と同様に、本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、単独で、またはアジュバントとして、ワクチンまたは抗菌剤（antimibrobial agents）と組み合わせて、毒素または自己抗原に対する、または病原体（たとえば、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ワクシニアウイルス、狂犬病ウイルスなどのウイルス；マイコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌（Pneumonococci）、髄膜炎菌、コノコッカス、莢膜杆菌、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、コリネバクテリア、サルモネラ、ビブリオ、クロストリジウム、バチルス、パスツレラ、レプトスピラ、ボルデテラ、および、特に、コレラ、破傷風、ボツリヌス中毒症、炭疽病、ペスト、およびライム病に関連するそれらの病原体などの細菌；またはカンジダ（アルビカンス、クルセイ、グラブラタ、トロピカリス、など）などの菌類病原体または寄生性病原体、クリプトコックス、アスペルギルス（フミガーツス（jumigatus）、ニガー、など）、ムーコル目（ケカビ、アブシジア、クモノスカビ（rhizophus）、スポロトリクス（シェンキー）、ブラストミセス（デルマチチジス）、パラコクシジオイデス（ブラジリエンシス）、コクシジオイデス（イミチス）およびヒストプラスマ（カプスラツーム）、エントアメーバ、ヒストリティカ、大腸バランチジウム、ネグレリアフォーレリ、アカントアメーバ種、ランブル鞭毛虫（Giardia lambia）、クリプトスポリジウム種、ニューモシスチス−カリニ、三日熱マラリア原虫、バベシア−ミクロチ、トリパノソーマ−ブルセイ、クルーズトリパノソーマ、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondi）、など）、スポロトリクス属、ブラストミセス属、パラコクシジオイデス属、コクシジオイデス属、ヒストプラスマ属、エントアメーバ属、ヒストリティカ属、バランチジウム属、ネグレリア属、アカントアメーバ属、ジアルジア属、クリプトスポリジウム属、ニューモシスチス属、プラズモディウム属、バベシア属、またはトリパノソーマ属、などに対する免疫反応を促進するために使用することができる。このように、本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、感染症の処置における有用性を有する。
【０１４８】
（２．免疫システムの下流修飾因子の使用）
別の実施形態において、本発明の抗Ｂ７−Ｈ１または抗ＰＤ−１抗体は、Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１の抗イディオタイプペプチドまたは抗体の生成に使用される（Wallmann, J. et al. (2010) "Anti-Ids in Allergy: Timeliness of a Classic Concept," World Allergy Organiz. J. 3(6):195-201; Nardi, M. et al. (2000) "Antiidiotype Antibody Against Platelet Anti-Gpiiia Contributes To The Regulation Of Thrombocytopenia In HIV-1-ITP Patients," J. Exp. Med. 191(12):2093-2100) or mimetics (Zang, Y.C. et al. (2003) "Human Anti-Idiotypic T Cells Induced By TCR Peptides Corresponding To A Common CDR3 Sequence Motif In Myelin Basic Protein-Reactive T Cells," Int. Immunol. 15(9):1073-1080; Loiarro, M. et al.(Epub 2010 Apr 8) "Targeting TLR/IL-1R Signalling In Human Diseases," Mediators Inflamm. 2010:674363）。そのような分子はＢ７−Ｈ１またはＰＤ−１の代用物として機能し、したがって、それらを対象に投与すると、Ｂ７−Ｈ１−ＰＤ−１結合を擬態または促進し、それによってその対象の免疫システムを下流修飾する。そのような分子は、移植片対宿主病の処置における有用性を有する。同様に、ｉ）そのような抗体とそのような受容体／リガンドとの結合を増強するまたはｉｉ）Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１と直接結合した時に情報伝達を引き起こすアゴニスト抗体は、Ｂ７−Ｈ１−ＰＤ−１間信号伝達のアゴニストとして有用性を有し、したがって、直接的または間接的に受容体活性を刺激することによって、炎症および自己免疫疾患の処置における有用性を有する。
【０１４９】
ＰＤ−１およびＢ７−Ｈ１の両方との免疫特異性結合を示す二重特異性抗体は、ＡＰＣおよびＴ細胞の両方との結合が可能であり、したがって、ＡＰＣおよびＴ細胞の共局在化を促進する。そのような共局在化は、抗体と錯体を形成しないＢ７−Ｈ１およびＰＤ−１分子を介してまたは共抑制性分子によって、そのような細胞同士の結合能力を促進する。そのような結合は、受容者の免疫システムの下流修飾を提供する。
【０１５０】
免疫システムの下流修飾は、炎症性および自己免疫性疾患、および移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の処置において好ましい。本発明の抗体を投与することによって処置可能な自己免疫障害の例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎および睾丸炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック病‐皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャウグ・シュトラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛‐線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺腫、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス（lupus erthematosus）、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、視神経脊髄炎症候群（ＮＭＯ）、１型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎（polychrondritis）、多腺症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、先天性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象（Raynauld’s phenomenon）、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎（temporal arteristis）／巨細胞動脈炎、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症などの脈管炎が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５１】
本発明の方法によって防止、処置、または管理し得る炎症性障害の例としては、喘息、脳炎（encephilitis）、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性疾患、敗血症性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルス性感染症または慢性細菌性感染症に起因する慢性炎症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５２】
このように、本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、炎症性および自己免疫疾患の処置において有用性を有する。
【０１５３】
（Ｃ．投与方法）
様々な送達システムが周知であり、本発明の治療的または予防的組成物の投与に使用可能である。たとえば、リポソームによるカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル、抗体または融合プロテインを発現可能な組み換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（たとえば、Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432参照）、レトロウイルス性媒介動物または他の媒介動物の一部としての核酸の構築などが挙げられる。
【０１５４】
本発明のヒト化抗体の投与方法としては、非経口的投与としての（たとえば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下）注射、硬膜外投与、および粘膜投与（たとえば、鼻腔内および経口経路）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の抗体は、筋肉内、静脈内、または皮下に投与される。組成物は、任意の都合の良い経路によって投与すればよく、たとえば、注入または静脈内ボーラスによって、上皮内層または皮膚粘膜層（たとえば、口腔粘膜、直腸粘膜、および腸粘膜、など）を通じた吸収によって投与することができる。また、他の生物学的に活性な物質と共に投与してもよい。投与は、全身性でも局所性でもよい。さらに、たとえば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル化剤を用いた製剤による肺内投与でもよい。たとえば U.S. Patent Nos. 6,019,968; 5,985, 20; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; および4,880,078; およびPCT Publication Nos. WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; およびWO 99/66903参照。特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を処置が必要な部位に局所的に投与することが好ましい；たとえば、この投与は、注射または移植手段による局所注入によって行うことができるが、これに限定されない。当該移植とは、シラスティック（sialastic）膜などの膜もしくは繊維などの多孔性物質、非多孔性物質、またはゲル状物質の移植である。好ましくは、本発明の抗体が投与される場合、抗体または融合プロテインが吸収されていない物質の使用には、注意しなければならない。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本発明のヒト化またはキメラ抗体は、本発明の抗体の標的化送達用のリポソームに調剤される。リポソームは、水相をカプセル化する、同心円状に配置されたリン脂質（phopsholipid）二重層からなる小胞である。通常は、リポソームは様々な種類の脂質、リン脂質、および／または界面活性剤を含む。生物学的な膜の脂質配列と同様に、リポソームの成分は二層構造で配置される。その生体適合性、低免疫原性、および低毒性が一因で、リポソームは特に好ましい送達媒体である。リポソームの作製方法は当該技術分野において周知であり、本発明に包含される。たとえば、Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688; Hwang et al., 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4; U.S. Patent Nos. 4,485,045および4,544,545参照。
【０１５６】
本発明は、延長された血中半減期、すなわち、U.S. Patent No. 5,013,556に開示されたような延長された循環時間によるリポソームの作製方法も包含する。本発明の方法において使用される好ましいリポソームは、循環から速やかに除去されない、すなわち、単核食細胞系（ＭＰＳ）に取り込まれない。本発明は、当業者に周知の一般的な方法を用いて作製した立体的に安定化されたリポソームを包含する。特定の作用機序に制約されないが、立体的に安定化されたリポソームは、リポソームと血清タンパク質との不要な反応を低減し、血清成分のオプソニン作用（oposonization）を低減し、ＭＰＳによる認識を低減する、高度に柔軟で大きな親水性部分を有する脂質成分を含む。立体的に安定化されたリポソームは、ポリエチレングリコールを用いて作製することが好ましい。リポソームおよび立体的に安定化されたリポソームの作製については、たとえば、Bendas et al., 2001 BioDrugs, 15(4): 215-224; Allen et al., 1987 FEBS Lett. 223: 42-6; Klibanov et al., 1990 FEBS Lett., 268: 235-7; Blum et al., 1990, Biochim. Biophys. Acta., 1029: 91-7; Torchilin et al., 1996, J. Liposome Res. 6: 99-116; Litzinger et al., 1994, Biochim. Biophys. Acta, 1190: 99-107; Maruyama et al., 1991, Chem. Pharm. Bull., 39: 1620-2; Klibanov et al., 1991, Biochim Biophys Acta, 1062; 142-8; Allen et al., 1994, Adv. Drug Deliv. Rev, 13: 285-309参照。本発明は、特定の器官の標的化に適合するリポソーム（たとえば、U.S. Patent No. 4,544,545参照）、または特定の細胞の標的化に適合するリポソームも包含する（たとえば、U.S. Patent Application Publication No. 2005/0074403参照）。本発明の組成物および方法に使用するのに特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。規定の孔径のフィルターを通してリポソームを押し出すことによって、所望の直径のリポソームが生成される。いくつかの実施形態では、本発明の抗体のフラグメント（たとえばＦ（ａｂ’））は、上述した方法を用いてリポソームと接合することができる（Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288参照）。
【０１５７】
本発明のヒト化抗体またはキメラ抗体はまた、免疫リポゾームとして製剤化されてもよい。免疫リポゾームは、本発明の抗体またはそのフラグメントがリポソームの表面に共有結合または非共有結合しているリポソーム組成物を指す。抗体をリポソームの表面に結合させる化学的性質は当該技術分野において公知であり、本発明に含まれる（たとえば、米国特許第６，７８７，１５３号；Allen et al., 1995, Stealth Liposomes, Boca Rotan: CRC Press, 233-44；Hansen et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1239: 133-144参照）。最も好適な実施形態では、本発明の方法および組成物に使用される免疫リポゾームはさらに、立体的に安定化されている。好ましくは、本発明のヒト化抗体は、リポゾームの脂質二重層に安定して定着している疎水性アンカーと共有結合または非共有結合している。疎水性アンカーの例は、リン脂質（たとえば、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ））を含むが、これに限定されない。抗体と疎水性アンカーとの間に共有結合を実現するために、当該技術分野に公知の任意の生化学的方法を使用してもよい（たとえば、J. Thomas August, ed., 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA, p. 399-435参照）。たとえば、抗体分子の官能基は、リポゾームに関連の疎水性アンカーの活性基と反応してもよい。たとえば、抗体のリジン側鎖のアミノ基は、水溶性カルボジイミドで活性化された、リポゾームに関連のＮ−グルタリル−ホスファチジルエタノールアミンと結合されてもよい。または、還元抗体のチオール基は、ピリジルチオプロピオニルホスファチジルエタノールアミンなどのチオール反応アンカーを介してリポゾームに結合されることが可能である。たとえば、Dietrich et al., 1996, Biochemistry, 35: 1100-1105; Loughrey et al., 1987, Biochim. Biophys. Acta, 901: 157-160; Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 286-288; Martin et al., 1981, Biochemistry, 20: 4429-38参照。特定の作用機序によって結合されることを意図するものではないが、本発明の抗体を含む免疫リポゾーム製剤は、標的細胞（すなわち、本発明の抗体が結合する受容体を有する細胞）の細胞質に本発明の抗体を送達することから、治療剤として特に効果的である。上記免疫リポゾームは、好ましくは血中（特に標的細胞中）の半減期が増大しており、標的細胞の細胞質内へ取り込まれることによって、治療剤の損失またはリソソーム内経路での分解を回避することが可能である。
【０１５８】
本発明の免疫リポゾーム組成物は、小胞を形成する１つ以上の脂質と、本発明の抗体またはそのフラグメントまたは変異体と、適宜、親水性ポリマーとを含む。小胞を形成する脂質は、好ましくは、２つの炭化水素鎖（アシル鎖など）と極性頭部基とを有する脂質である。小胞を形成する脂質の例は、リン脂質（たとえば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン）および糖脂質（たとえば、セレブロシド、ガングリオシド）を含む。発明の製剤に有用なさらなる脂質は当業者に公知であり、本発明に含まれる。一部の実施形態では、免疫リポゾーム組成物は、親水性ポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール）と、リポソームの血中半減期を増大させるガングリオシドＧＭ１とをさらに含む。親水性ポリマーをリポソームに結合する方法は当該技術分野に周知であり、本発明に含まれる。免疫リポゾームおよびその調製方法については、たとえば、米国特許出願公開第２００３／００４４４０７号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９７／３８７３１号；Vingerhoeads et al., 1994, Immunomethods, 4: 259-72；Maruyama, 2000, Biol. Pharm. Bull. 23(7): 791-799；Abra et al., 2002, Journal of Liposome Research, 12(1&2): 1-3；Park, 2002, Bioscience Reports, 22(2): 267-281；Bendas et al., 2001 BioDrugs, 14(4): 215-224、J. Thomas August, ed., 1997, Gene Therapy: Advances in Pharmacology, Volume 40, Academic Press, San Diego, CA, p. 399-435を参照。
【０１５９】
本発明はまた、本発明のヒト化抗体またはキメラ抗体が、抗体量を記した密封容器（アンプルまたはサシェットなど）内に詰め込まれていることを規定している。一実施形態では、本発明の抗体は、密封容器内に含まれる、乾燥滅菌が行われた凍結乾燥紛体または無水濃縮物として供給される。本発明の抗体は、たとえば水または生理食塩水を加えて対象への投与に適した濃度としてもどすことが可能である。好ましくは、本発明の抗体は、密封容器に含まれる、乾燥滅菌が行われた凍結乾燥紛体として、少なくとも５ｍｇ、より好ましくは、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、または少なくとも７５ｍｇの単位投与量で供給される。発明の凍結乾燥抗体は、当初含まれていた容器内に２℃〜８℃で保存されるべきである。また、上記抗体は、乾燥状態からもどされてから１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内に投与されるべきである。代替の実施形態では、本発明の抗体は、抗体、融合タンパク質、または共役分子の量および濃度を記した密封容器に含まれる液体の形態で供給される。好ましくは、上記抗体の液状形態は、抗体含有量を少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２００ｍｇ／ｍｌにして、密封容器内に供給される。
【０１６０】
上記製剤に採用する正確な投与量はまた、投与経路および病態の重症度に依存することになるので、施術者の判断および各患者の状況に応じて決定されるべきである。有効量は、インビトロ試験系または動物モデル試験系から導かれる投与量−反応曲線より推定されてもよい。本発明に含まれる抗体に関しては、患者への投与量は、通常は患者の体重に対して０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲の比とする。好ましくは、患者への投与量は、患者の体重に対して０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇの範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇの範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇの範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．１５ｍｇ／ｋｇの範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．１０ｍｇ／ｋｇの範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０２５ｍｇ／ｋｇの範囲の比である。具体的には、本発明では、患者への投与量を０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの比とする場合を意図している。０．０１ｍｇ／ｋｇ程度の少量の投与量は、かなりの薬力学的効果を示すであろうことが予想される。０．１０ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量レベルが最も適当であると予想される。より多量の投与量（たとえば、１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ）についても、活性となることが期待されるであろう。一般的に、ヒト抗体のヒト体内における半減期は、異質ポリペプチドに対するヒト体内の免疫反応によって、ヒト以外の種から得られる抗体と比較して長くなる。したがって、ヒト抗体の投与量をより少量にするとともに、その投与頻度をより少なくすることが多くの場合可能である。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与量および投与頻度は、改変（たとえば脂質化）によって本発明の抗体の摂取および組織透過性を向上させることによって減少させてもよい。
【０１６１】
さらに他の実施形態では、上記組成物を制御放出系または持続放出系内で送達することが可能である。当業者に周知の任意の技術を使用して、本発明の抗体を１つ以上含む持続放出性製剤を作製することが可能である。たとえば、米国特許第４，５２６，９３８号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１/０５５４８号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９６／２０６９８号；Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179 189；Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372 397；Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853 854；およびLam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759 760を参照。一実施形態では、制御放出系においてポンプを使用してもよい（Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; and Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574参照）。他の実施形態では、ポリマー材料を用いて抗体の制御放出を実現することができる（たとえば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; See also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); 米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号;ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／１５１５４号；およびＰＣＴ国際公開第ＷＯ９９／２０２５３参照）。持続放出性製剤に用いられるポリマーの例は、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン共ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニールアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド共グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルを含むが、これらに限定されない。さらに他の実施形態では、制御放出系を治療標的（たとえば、肺）に近接して配置することができるので、全身投与量の僅か一部のみを必要とする（たとえば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)参照）。他の実施形態では、制御放出インプラントとして有用なポリマー組成物をDunn et al. (米国第５，９４５，１５５号参照)にしたがって使用する。この特定の方法は、上記ポリマー系からの生体活性材料のｉｎ ｓｉｔｕ制御放出の効果に基づいている。移植は、通常、治療処置を必要としている患者体内のあらゆる部位で行うことが可能である。他の実施形態では、患者体内の非ポリマー性インプラントが薬剤送達系として使用される非ポリマー性の持続送達系を使用する。体内への移植後、上記インプラントの有機溶媒は消散するか、分散するか、または上記組成物から周囲の組織液へと滲出することになるので、上記非ポリマー材料は次第に凝固することになるか、または沈殿して固体状の微孔性マトリクスを形成することになる（米国第５，８８８，５３３号参照）。制御放出系については、Langerによる論評（1990, Science 249:1527-1533）内にて検討されている。当業者に周知の任意の技術を用いて、発明に係る治療剤を１つ以上含む持続放出性製剤を作製することが可能である。たとえば、米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第ＷＯ９１／０５５４８号およびＷＯ９６／２０６９８号；Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39:179 189；Song et al., 1995, PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372 397；Cleek et al., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853 854；およびLam et al., 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759 760を参照。
【０１６２】
本発明の治療用または予防用組成物が本発明の抗体をエンコードする核酸またはその抗原結合性フラグメントである特定の実施形態では、この核酸を適当な核酸発現ベクターの一部として構築して細胞内核酸となるように投与する（たとえば、レトロウイルスベクターの使用（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、直接注射法、微粒子照射の使用（たとえば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）、脂質によるコーティング、細胞表面受容体、形質転換剤、または、核細胞内に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連鎖させた投与（たとえば、Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868参照）など）ことによって、前記核酸をin vivoで投与して、前記核酸にエンコードされる抗体の発現を向上させることができる。代替法として、核酸を細胞内導入し、発現を目的として相同的組み換えによって宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことも可能である。
【０１６３】
本発明の抗体を治療的または予防的に有効な量を用いた対象の治療は単一の治療を含むことができる。または、好ましくは、一連の治療を含むことができる。
【０１６４】
（Ｄ．医薬組成物）
本発明の組成物は、単位剤形の調製に使用することのできる、医薬組成物の製造に有用なバルク薬剤組成物（すなわち、対象または患者への投与に好適な組成物）を含む。このような組成物は、本願開示の予防薬および/または治療薬を予防的または治療的観点から有効とされる量含むか、またはこれと薬学的に許容可能な担体との組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、本発明のヒト化抗体を予防的または治療的観点から有効とされる量と、薬学的に許容可能な担体とを含む。
【０１６５】
特定の実施形態では、用語「薬学的に許容可能」は、動物（特にヒト）への使用について連邦または州政府の管理機関による認可を受けていること、または、米国薬局方のリストまたはそれ以外で一般に認知されている薬局方のリストに載せられていることを意味する。用語「担体」は、希釈剤、アジュバント（たとえば、（完全および不完全）フロイントアジュバント）、賦形剤、界面活性剤、抗凍結剤、または治療剤の投与媒体を指す。このような医薬担体として、水または油などの滅菌液体を使用することができる。このような用途に用いられる水または油は、石油源、動物源、植物源、または合成源由来の水または油（ピーナッツ油、大豆油、およびゴマ油など）を含む。医薬組成物を静脈内投与する場合には水が好適な溶媒である。また、液体担体（特に注射剤用の液体担体）として、食塩水、デキストロース水溶液、およびグリセロール水溶液を採用することができる。好適な医薬賦形剤は、スターチ、グルコース、ラクトース、サッカロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、およびポリソルベート−８０などを含む。必要に応じて、上記組成物は、湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を少量含むことができる。これらの組成物については、溶液、懸濁液、乳濁液、タブレット、ピル、カプセル、粉末、および持続放出性製剤などの形態を採ることができる。
【０１６６】
通常、本発明の組成物の成分は別々に供給されるか、または単位製剤状に混合されて供給される。たとえば、活性剤の量を表示のアンプルまたはサシェットなどの密封容器内に含まれる、乾燥が行われた乾燥紛体または無水濃縮物として供給される。上記組成物の投与を注射によって行う場合では、滅菌が行われた製薬等級純水または生理食塩水を含む注射用ボトルを用いて上記組成物の分注を行うことができる。上記組成物を注射によって投与する場合では、投与前に成分同士の混合を行い得るように、注射用の滅菌水または生理食塩水を入れたアンプルを提供することができる。
【０１６７】
本発明の組成物は、中性形態または塩形態として製剤化することができる。薬学的に許容可能な塩は、アニオンを用いて形成される塩（塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される塩など）およびカチオンを用いて形成される塩（ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導される塩など）を含むが、これらに限定されない。
【０１６８】
（Ｅ．キット）
本発明は、本発明のヒト化抗体で充填された１つ以上の容器を備える医薬パックまたは医薬キットを提供する。さらに、上記医薬パックまたは医薬キットには、疾病治療に有用な他の予防剤または治療剤を１つ以上含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分で充填された容器を１つ以上備える医薬パックまたは医薬キットも提供する。このような容器に適宜関連するものとしては、調合薬または生物学的製剤の製造、使用、または販売の管理行政機関によって指定の形態で呈示される情報を挙げることができる。なお、このような情報呈示は、ヒトに投与される調合薬または生物学的製剤の製造、使用、または販売の管理行政機関から取得した認可を反映するものである。
【０１６９】
本発明は、上述の方法で使用可能なキットを提供する。一実施形態では、キットは、本発明のヒト化抗体を１つ以上備える。他の実施形態では、キットは、癌治療に有用な１つ以上の他の予防剤または治療剤を１つ以上の容器にさらに備える。他の実施形態では、キットは、癌に関連する１つ以上の癌抗原に結合する１つ以上の細胞傷害抗体をさらに備える。特定の実施形態では、上記他の予防剤または治療剤は化学療法薬である。他の実施形態では、上記予防剤または治療剤は生物学的治療薬またはホルモン治療薬である。
【０１７０】
（Ｇ．診断方法）
本発明の抗体およびその抗原結合性フラグメントは、診断目的（Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１発現に関連する疾病、疾患、または感染症の検出、診断、または監視など）に使用することができる。本発明は、疾病、疾患、または感染症（特に、自己免疫疾患）の検出または診断であって、（ａ）免疫特異的に抗原に結合する１つ以上の抗体（またはそのフラグメント）を使用して、対象の細胞または組織サンプル内のＢ７−Ｈ１またはＰＤ−１発現のアッセイを行うこと、および（ｂ）前記抗原のレベルを対照レベル（たとえば、正常組織サンプル内の抗原レベルまたは治療前の抗原レベル）と比較することを備え、前記アッセイを行った抗原レベルが前記抗原の対照レベルと比較して増大または減少している場合では、疾病、疾患、または感染症、または、治療に対する患者の反応が示されている、疾病、疾患、または感染症の検出または診断を提供する。したがって、本発明はまた、疾病、疾患、または感染症の進行の監視であって、（ａ）抗原に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体（またはそのフラグメント）を使用して、対象の細胞または組織サンプル内のＢ７−Ｈ１またはＰＤ−１発現のアッセイを一時点において行う工程、および（ｂ）前記対象の細胞または組織サンプル内のＢ７−Ｈ１またはＰＤ−１発現の発現レベルの比較を他の一時点または期間において行う工程を備え、前記アッセイを行った抗原レベルの増大または減少は、疾病、疾患、または感染症の進行を示している、監視法を提供する。本発明はさらに、治療に対する応答の監視法であって、（ａ）抗原に免疫特異的に結合する１つ以上の抗体（またはそのフラグメント）を用いた処理を行う前に、対象の細胞または組織サンプル内のＢ７−Ｈ１またはＰＤ−１発現のアッセイを行う工程、および（ｂ）処理後の１以上の時点で対象の細胞または組織サンプル内のＢ７−Ｈ１またはＰＤ−１発現のアッセイを事前に行っておき、抗原レベルの経時比較を行う工程を備え、前記アッセイを行った抗原レベルが処理前の抗原レベルと比較して増大または減少している場合では治療に対する応答の存在が示されている、疾病、疾患、または感染症の進行の監視を提供する。このような抗体およびそのフラグメントは、好ましくは、酵素免疫測定吸着（ＥＬＩＳＡ）法、放射免疫測（ＲＩＡ）定、および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）法などの免疫学的検定法に採用される。
【０１７１】
本発明の一態様は、このような抗体およびフラグメント、および、特にヒトＢ７−Ｈ１に結合するような抗体およびフラグメントをＩＨＣ分析用の試薬としてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｓｉｔｕ組織サンプルの細胞内またはｉｎ ｖｉｖｏで使用することに関する。たとえば、Ｂ７−Ｈ１は癌細胞によって発現されるが、正常組織によって発現されることはない（Dong, H. (2003) "B7-H1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity," J. Mol. Med. 81:281-287）ので、こうした癌細胞が抗体またはフラグメントと結合することに基づいて細胞上のＢ７−Ｈ１の存在を検出することによって、癌細胞の存在が示唆されるとともに、癌細胞の診断が行われることになる。したがって本発明は、対象内の癌の存在を診断するための細胞学的アッセイを提供する。
【０１７２】
腫瘍細胞上のＢ７−Ｈ１の存在は、腫瘍に反応するＴ細胞のアポトーシスを促進させることが見出されてきた（米国特許第７，７９４，７１０号）。したがって、癌患者の腫瘍細胞表面上に示されるＢ７−Ｈ１の範囲または程度を決定することによって、本発明は、癌の臨床的な深刻性を決定し、免疫反応に対する癌の抵抗が生じるであろう範囲および程度を決定する手段を提供する。
【０１７３】
同様に、Ｂ７−Ｈ１はリンパ系および粘膜系の樹状細胞（骨髄樹状細胞および形質細胞様樹状細胞の両方）上に発現され、その発現はＳＩＶ感染後に著しく増大する（Xu, Huanbin et al. (2010) "Increased B7-H1 Expression on Dendritic Cells Correlates with Programmed Death 1 Expression on T Cells in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques and May Contribute to T Cell Dysfunction and Disease Progression," J. Immunol. 185:7340-7348）。このような細胞上のＢ７−Ｈ１の発現を用いてヒトのＨＩＶの診断を行い得る。さらに、ＣＤ８＋細胞上のＰＤ−１発現がＨＩＶ感染との関連において増大することが見出されてきた（Killian, M.S. et al. (2011) "Natural Suppression of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Replication Is Mediated by Memory CD8+ T Cells," J. Virol. 85(4):1696-1705）。したがって、ＰＤ−１およびＣＤ８の両方に結合する抗体は、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳ進行の診断用途に特に有用である。
【０１７４】
本発明のさらなる態様は、このような抗体およびフラグメント、および、特にヒトＰＤ−１に結合するこのような抗体およびフラグメントの使用に関する。ＰＤ−１は、免疫系の慢性的な活性化およびＴ細胞の疲弊を示すマーカーとして特に有用である。ＰＤ−１の発現はＨＩＶウイルス感染患者のＴ細胞上で促進され、これら患者体内のウイルス量と相関する（Khaitan, A. et al. (2011) "Revisiting Immune Exhaustion During HIV Infection," Curr. HIV/AIDS Rep. 8:4-11; Grabmeier-Pfistershammer, K. et al. (2011) "Identification of PD-1 as a Unique Marker for Failing Immune Reconstitution in HIV-1-Infected Patients on Treatment," J Acquir. Immune Defic. Syndr. 56(2):118-124）。したがって、ＰＤ−１はＨＩＶ進行を示すマーカーとして特に有用である。最も好ましくは、ＰＤ−１発現のアッセイはフローサイトメトリー法を用いて行われる。このような抗体およびフラグメントの使用を介することによって、たとえＴ細胞（ＰＤ−１を発現する）が異種の調製物中に存在している場合であっても、複数の変数（たとえば、細胞カウント、細胞サイズ、表現型、および細胞の健常性など）についてＴ細胞のアッセイを行うことができる。したがって、ＰＤ−１に対する抗体およびその抗原結合性フラグメントと協調してこのような方法を用いることによって、ＡＩＤＳ、白血病、およびＴ細胞の細胞数および健常性に影響する他の疾病の程度および重症度の診断を行うことができる。本発明の目的に適合し得るフローサイトメトリー―の方法については、Peters, J.M. et al. (2011) "Multiparameter Flow Cytometry In The Diagnosis And Management Of Acute Leukemia," Arch. Pathol. Lab. Med. 135(1):44-54；Meyerson, H.J. (2010) "A Practical Approach To The Flow Cytometric Detection And Diagnosis Of T-Cell Lymphoproliferative Disorders," Lab. Hematol. 16(3):32-52；Vandewoestyne, M. et al. (Epub 2010 Aug 3) Laser Capture Microdissection In Forensic Research: A Review," Int. J. Legal. Med. 124(6):513-521；Ornatsky, O. et al. (Epub 2010 Jul 21) "Highly Multiparametric Analysis By Mass Cytometry," J. Immunol. Meth. 361(1-2):1-20；Mach, W.J. et al. (Epub 2010 Jul 13) "Flow Cytometry And Laser Scanning Cytometry, A Comparison Of Techniques," J. Clin. Monit. Comput. 24(4):251-259；およびChattopadhyay, P.K. et al. (2010) "Good Cell, Bad Cell: Flow Cytometry Reveals T-Cell Subsets Important In HIV Disease," Cytometry A. 77(7):614-622、並びに、米国特許第７，８７６，４３６号、同７，８４７，９２３号、同７，８４２，２４４号、同７，７４６，４６６号、同７，５９０，５００号、同７，５２７，９７８号、同７，５０７，５４８号、同７，４９１，５０２号、同７，４８６，３８７号、同７，４７９，６３０号、同７，４６５，５４３号、同７，３５４，７７３号、同６，７９４，１５２号、および同６，７８４，９８１号に開示されている。
【０１７５】
したがって、本発明の抗体およびフラグメントは、ヒトの疾病、疾患、または感染症の検出および診断に有用である。一実施形態では、このような診断は、（ａ）Ｂ７−Ｈ１またはＰＤ−１に免疫特異的に結合する標識抗体または抗原結合性フラグメントの有効量を対象に投与（たとえば、非経口的投与、皮下投与、または腹腔内への投与）すること、（ｂ）前記投与後に時間間隔を経過させて、前記対象内のＢ７−Ｈ１またはＰＤ−１発現部位において上記標識分子の濃度を特異的に増大させること（および、上記標識分子のうち非結合状態のものをバックグラウンドレベルまで除去すること）、（ｃ）バックグラウンドレベルを決定すること、および（ｄ）前記対象内の前記標識抗体を検出することを備え、前記バックグラウンドレベルを超える標識抗体の検出は、前記対象が疾病、疾患、または感染症を有していることを示している。上記実施形態によれば、上記標識抗体は、当業者に周知の撮像系を用いて検出可能な撮像部分で標識される。バックグラウンドレベルの決定は、上記標識分子の検出量と特定の系について事前に決定した基準値との比較を含む多様な方法によって行うことが可能である。
【０１７６】
対象のサイズおよび使用する撮像系によって診断画像の形成に必要となる撮像部分の量が決定されることは、当該技術分野において理解されるであろう。腫瘍のin vivo撮像については、S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)に記載されている。
【０１７７】
上記標識分子の濃度が上記対象の部位において特異的に増大するのを可能にし、かつ上記非結合状態の標識分子をバックグラウンドレベルとなるまで除去することを可能にするための、上記投与後の時間間隔は、使用する標識の種類および投与方法を含む幾つかの変数に応じて、６時間〜４８時間、６時間〜２４時間、または６〜１２時間となる。他の実施形態では、上記投与後の時間間隔は、５日間〜２０日間、または５日間〜１０日間である。
【０１７８】
一実施形態では、最初の診断を行ってからたとえば１カ月経過後、６カ月経過後、または一年経過後などに疾病、疾患、または感染症の診断方法を繰り返し行うことによって、疾病、疾患、または感染症の観測を行う。
【０１７９】
上記標識の存在は、当該技術分野に公知の方法をin vivo走査に用いて対象内で検出することができる。これらの方法は、使用する標識の種類に応じて決まる。専門家であれば、特定の標識を検出する適切な方法を決定することができるであろう。本発明の診断方法に使用し得る方法および装置は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）法、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）法、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）法などの全身走査法、および超音波法を含むが、これらに限定されない。
【０１８０】
特定の実施形態では、上記分子は放射性同位体で標識され、放射線反応性外科用器具を用いて患者体内で検出される（Thurston et al., 米国特許第５，４４１，０５０号）。他の実施形態では、上記分子は蛍光化合物で標識され、蛍光反応性走査用器具を用いて患者体内で検出される。他の実施形態では、上記分子は陽電子放出金属で標識され、陽電子放出断層撮影法を用いて患者体内で検出される。さらに他の実施形態では、上記分子は常磁性標識で標識され、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）法を用いて患者体内で検出される。
【０１８１】
以上、本発明の概要を説明した。本発明の内容は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。なお、以下の実施例は一例に過ぎず、特に規定のない限り、本発明を制限するよう意図されたものではない。
【０１８２】
〔実施例１〕：抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体の単離および特性決定
高親和性の中和抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体の単離を行うために、マウスに最初に免疫性を与え、次にヒトＢ７−Ｈ１−Ｆｃを用いて追加免疫を行った。標準的なプロトコルに従い、抗Ｂ７−Ｈ１陽性動物の脾細胞を骨髄腫細胞と融合させた。この結果得られたマウスハイブリドーマのうちＢ７−Ｈ１免疫反応性モノクローナル抗体を発現しているものを特定するためにスクリーニングを行った。抗体の評価をさらに行って、これらがＩｇＧ抗体またはＩｇＭ抗体の何れであるかについての決定を行った。これに応じて、Ｂ７−Ｈ１−Ｆｃまたは陰性対照を固相担体に固定した。その後、上記固相担体にハイブリドーマ上清を接触させ、Ｂ７−Ｈ１抗体の存在を標識抗マウス抗ＩｇＧまたは標識抗マウス抗ＩｇＭを用いて決定した。図１は、試験を行ったハイブリドーマ上清の結果を示し、ヒトＢ７−Ｈ１に対して免疫反応性を有する抗体を発現する複数のハイブリドーマ株の単離を示す。
【０１８３】
同定したハイブリドーマをスクリーニングに掛けて、その発現抗体が中和抗体であり、Ｂ７−Ｈ１とＰＤ−１との結合を阻害可能であるか否かの決定を行った。ＰＤ−１−Ｆｃを固相担体に固定し、これをビオチン化Ｂ７−Ｈ１−Ｆｃを含む希釈馴化培地の存在下で培養した。上記固相担体に対するストレプトアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）の結合のアッセイを行って、上記Ｂ７−Ｈ１および上記ＰＤ−１の互いに結合する能を検出した。抗Ｂ７−Ｈ１抗体は、ＰＤ−１に対するＢ７−Ｈ１の結合を改変可能なため、上記アッセイにおけるＳＡ−ＨＡＳ結合の減少を媒介していた。本実験の結果を図２に示す。図２の実験結果は、上記単離を行ったハイブリドーマの幾つかはヒトＢ７−Ｈ１中和抗体を発現したことを示す。抗体ＭＩＨ−１（抗ヒトＣＤ２７４（Ｂ７−Ｈ１））（Chen, Y. et al. (Epub 2005 Nov 11）”Expression Of B7-H1 In Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells," Nephron. Exp. Nephrol. 102(3-4):e81-e92）を陽性対照として使用した。２９Ｅ.２ＡＥは抗ＰＤ−１抗体であるが、上記アッセイでは非中和抗体であることが示された。無関係のハイブリドーマ（ｒａｎｄ Ａｂ）由来の馴化培地とベクター対照（ＶＣ：ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌ）を陰性対照として使用した。
【０１８４】
発現された上記中和抗体が細胞表面上に配列されているＢ７−Ｈ１と結合可能であるか否かを決定するために、細胞結合アッセイを実施した。上記ハイブリドーマの各クローンの上清を１：４の比率で希釈し、これを親ＣＨＯ細胞と全長ヒトＢ７−Ｈ１を過剰発現するクローンＣＨＯ株との存在下で培養した。結合を生じさせた後、上記細胞を洗浄した。そして、蛍光標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、上記洗浄後に残存している細胞結合抗Ｂ７−Ｈ１抗体の存在を検出した。ＣＨＯ−ｈＢ７−Ｈ１に対する結合についての蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を図３に示す。試験を行ったクローンの何れについても親ＣＨＯ株との交差反応が見出されず、このことより、上記発現抗体はヒトＢ７−Ｈ１に特異的であることが示された。
【０１８５】
さらなる評価として、３つのクローンの濃度を異ならせて抗Ｂ７−Ｈ１抗体ＭＩＨ−１と比較した。抗体は、プロテインＧを用いて精製されており、内因性レベルを有してＡＰＣ表面上に配列されている場合のＢ７−Ｈ１との結合能について評価が行われていた。ヒトＢ７−Ｈ１を発現するＣＨＯ細胞を異なる濃度（１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、または０．１μｇ／ｍｌ）の抗Ｂ７−Ｈ１抗体で培養し、その後にＡＰＣ結合ロバ抗マウス抗体で培養した。蛍光強度の中央値を測定することによって結合を報告した。結果は、試験抗体が対照抗体（ＭＩＨ１）よりも大きな結合活性をＢ７−Ｈ１に対して示したことを呈示し（図４）、抗体１Ｅ１２が対照の抗Ｂ７−Ｈ１抗体（５Ｈ１）（Dong, H. et al. (2002) "Tumor-Associated B7-H1 Promotes T-Cell Apoptosis: A Potential Mechanism Of Immune Evasion," Nature Med. 8(8):793-800）よりも大きな結合活性をＢ７−Ｈ１に対して示したことを呈示している（図５）。
【０１８６】
要約すれば、ハイブリドーマを発現している複数の抗ヒトＢ７−Ｈ１が得られたことをデータに示されている。全クローンは、Ｂ７−Ｈ１−Ｆｃを認識するＩｇＧ抗体であった。クローン１Ｂ３、１Ｄ１１、１Ｅ２、１Ｅ４、１Ｅ１０、２Ａ６、２Ｅ１２、２Ｆ２、２Ｆ５、２Ｆ１１、３Ａ４、および３Ｂ１は、スクリーニング結合アッセイでは脆弱な抗体であった。低信号は、低発現レベルおよび／または弱親和性に因るものであると考えられる。
【０１８７】
意義深いことに、幾つかのクローン（たとえば、クローン１Ｄ５、１Ｅ１２、１Ｆ４、２Ａ７、２Ｇ１１、３Ｂ６、３Ｄ１０）は強力な中和活性を示した。上記クローンの全ては、試験を行った各濃度において中和活性を示しており、抗原と良好に結合しているように思われた。ＣＨＯ−Ｂ７−Ｈ１細胞と結合するＭＦＩは次のものである：１Ｄ５＝５０，８２１；１Ｅ１２＝５６，１５２；１Ｆ４＝６２，０１５；２Ａ７＝４９，００８；２Ｇ１１＝５５，９４７；３Ｂ６＝５９，６３８；３Ｄ１０＝５３，１１４。
【０１８８】
〔実施例２：抗ヒトＰＤ−１抗体の単離および特性決定〕
高親和性の中和抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体の単離を行うために、マウスに最初に免疫性を与え、次にヒトＰＤ−１−Ｆｃを用いて追加免疫を行った。標準的なプロトコルに従い、抗ＰＤ−１陽性動物の脾細胞を骨髄腫細胞と融合させた。この結果得られたマウスハイブリドーマのうち高親和性のヒトＰＤ−１免疫反応性モノクローナル抗体を発現しているものを特定するためにスクリーニングを行った。抗体の評価をさらに行って、これらがＩｇＧ抗体またはＩｇＭ抗体の何れであるかについての決定を行った。これに応じて、ＰＤ−１−Ｆｃまたは陰性対照（Ｂ７−Ｈ４−Ｆｃ）を固相担体に固定した。その後、上記固相担体にハイブリドーマ上清を接触させ、抗ＰＤ−１抗体の存在を標識抗マウスＩｇＧまたは標識抗マウスＩｇＭを用いて決定した。図６は、単離した抗ヒトＰＤ−１抗体の抗原結合およびイソ型を示すとともに、ヒトＰＤ−１に対して免疫反応性を有する抗体を発現する複数のハイブリドーマ株の単離を表す。
【０１８９】
同定したハイブリドーマをスクリーニングに掛けて、その発現抗体が中和抗体であってＢ７−ＤＣとＰＤ−１との結合を阻害可能であるか否かの決定を行った。ＰＤ−１を結合する融合タンパク質であるＢ７−ＤＣ−Ｆｃを固相担体に固定し、これをビオチン化ＰＤ−１−Ｆｃを含む希釈馴化培地の存在下で培養した。上記固相担体に対するストレプトアビジンセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ：ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）の結合についてアッセイを行って、Ｂ７−ＤＣおよびＰＤ−１の互いに対する結合する能を検出した。抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１に対するＢ７−ＤＣの結合を阻害可能であるため、上記アッセイにおいてＳＡ−ＨＲＰ結合の減少を媒介していた。本実験の結果を図７Ａおよび７Ｂに示す。図７Ａおよび７Ｂの実験結果は、単離を行った上記ハイブリドーマの幾つかはヒトＰＤ−１中和抗体を発現したことを示す（図７Ｂは図７Ａと同一のグラフを異なるスケールで示している）。
【０１９０】
発現された上記中和抗体が細胞表面上に配列されているＰＤ−１と結合可能であるか否かを決定するために細胞結合アッセイを実施した。各ハイブリドーマクローンの上清を１：４の比で希釈し、これを親ＣＨＯ細胞と全長ヒトＰＤ−１を過剰発現するクローンＣＨＯ株との存在下で培養した。結合を形成させた後、上記細胞を洗浄した。そして、蛍光標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて、洗浄後に残存している細胞結合抗ＰＤ−１抗体の存在を検出した。ＣＨＯ−ｈＰＤ−１に対する結合についての蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を図８に示す。抗体１Ｅ３、１Ｅ８、および１Ｈ３は細胞表面上に発現されたヒトＰＤ−１と特に結合可能であることが結果に示された。試験を行ったクローンの何れについても親ＣＨＯ株との交差反応が見出されず、このことは、上記発現抗体がヒトＰＤ−１に特異的であることを示すものであった。Ｊ１１６は市販の抗ヒトＰＤ−１対照抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ, Ｉｎｃ.）である。イソ型の同定より、１Ｅ３、１Ｅ８、１Ｈ３はＩｇＧ１／カッパであることが明らかになった。
【０１９１】
さらなる研究用に２つのクローン（１Ｅ３および１Ｈ３）を選択した。さらなる評価として、上記２つのクローンの濃度を異ならせて抗ＰＤ−１抗体Ｍ３およびＥＨ−１２と比較した。抗体は、タンパク質Ｇを用いて精製され、ＣＨＯ細胞表面上に発現されたＰＤ−１と結合する能について評価が行われた。ＣＨＯ−ｈＰＤ１細胞を非標識抗ＰＤ−１抗体（１０μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、および０．１μｇ／ｍＬ）で染色し、その後にＡＰＣ結合ロバ抗マウス抗体で染色し、蛍光強度の中央値を記録した。このアッセイの結果を図９に報告する。陰性対照はマウスＩｇＧ（ｍＩｇＧ１）であり；陽性対照はＭ３（ヒトＰＤ−１に対する中和モノクローナル抗体（Wu, K. et al. (2009) "Kupffer Cell Suppression of CD8+ T Cells in Human Hepatocellular Carcinoma Is Mediated by B7-H1/Programmed Death-1 Interactions," Cancer Res 69(20):8067-8075）および抗ＰＤ−１抗体ＥＨ１２（Dorfman, D.M. et al. (2006) "Programmed Death-1 (PD-1) Is A Marker Of Germinal Center-Associated T Cells And Angioimmunoblastic T-Cell Lymphoma," Am. J. Surg. Pathol. 30(7):802-810）であった。
【０１９２】
５０，０００個のＣＨＯ−ｈＰＤ１細胞を抗ＰＤ−１抗体（０ｍｇ／ｍｌ〜０．１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で存在）で３０分間培養させることによって、細胞ベースの競合アッセイを行った。その後に１０μｇ／ｍｌのＡＰＣ標識Ｂ７−ＤＣ−Ｆｃを添加し、培養をさらに３０分間続けた。その後、結合Ｂ７−ＤＣ−Ｆｃの蛍光を測定した。蛍光強度の中央値を図１０に示す。抗体濃度を２０μｇ／ｍＬに固定して上記競合アッセイを繰り返し行った（図１１）。
【０１９３】
要約すれば、クローン１Ｅ３、１Ｅ８、および１Ｈ３は中和活性を示すとともに、抗原を良好に認識していたことが結果に示された。クローン１Ｅ６は、ＰＤ−１を中和することなくこれと交差結合することが可能であるので、結合の向上をもたらす。しかし、上記クローン１Ｅ６は、ＰＤ−１を細胞表面上に結合しているようには思われなかった。
【０１９４】
〔実施例３：ヒト化抗体の産生：一般手法〕
上述のように、特定の目的（たとえば、ヒト疾病のｉｎ ｖｉｖｏ治療への使用用途など）については、上述の抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体および／または抗ヒトＰＤ−１抗体のヒト化誘導体を採用することが好ましい。
【０１９５】
このような誘導体を形成するためには、最初に、３Ｄ１０抗体または１Ｈ３抗体と受容体ヒト抗体一式とのフレームワーク配列間の差異を同定するために、３Ｄ１０抗体または１Ｈ３抗体のフレームワーク配列（「親」配列）を「受容体」ヒト抗体一式のフレームワーク配列と位置合わせした。上記親および受容体のフレームワーク配列間で不一致の残基を置換することによってヒト化を行った。バーニア域内の位置、ＶＨ／ＶＬ鎖間界面、またはＣＤＲ標準クラスの決定位置などの潜在的に重要となる位置での置換に関しては、想定される復帰突然変異について分析を行った（Foote, J. et al. (1992) ”Antibody Framework Residues Affecting The Conformation Of The Hypervariable Loops,"J. Molec. Biol. 224:487-499参照）。合計で１４個のヒト化変異体配列を同定した。
【０１９６】
保存ドメインデータベース（ＣＯＤ）（Marchler-Bauer, et al. (2011) "COD: A Conserved Domain Database For The Functional Annotation Of Proteins," Nucleic Acids Res. 39:D225-D229）を使用して、各アミノ酸鎖のドメインの含有量および各ドメインのおおよその境界を決定した。一般的に使用される幾つかの定義（Kabat, E.A. et al. (1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242; Chothia, C. et al. (1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901-917); Honegger, A. et al. (2001) "Yet Another Numbering Scheme For Immunoglobulin Variable Domains: An Automatic Modeling And Analysis Tool," J. Molec. Biol. 309(3):657-670; Chothia's CDR definition (Chothia, C. et al. (1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901-917）に従い、可変ドメイン境界を相補性決定領域（ＣＤＲ）の境界に沿って正確に決定した。以下では、このようなヒト化配列に対して使用する。
【０１９７】
マウスおよびヒトの生殖細胞配列に対する親配列の多重位置合わせをＭＡＦＦＴを用いて作製し（Katoh, K. et al. (2002) "MAFFT: A Novel Method For Rapid Multiple Sequence Alignment Based On Fast Fourier Transform," Nucleic Acids Res. 30: 3059-3066）、前記親配列との配列同一性に応じて各位置合わせのエントリを順序付けた。１００％の配列同一性でクラスタリングを行い、重複しているエントリを除外することによって、参照配列一式を非反復配列一式にまで減少させた。
【０１９８】
最適な受容体フレームワークの選択は、上記親抗体全体の配列の両鎖のフレームワーク全域が上記受容体に対して有する配列同一性に基づいて行われた。しかし、ＶＨ／ＶＬ鎖間界面を形成する位置は特に関心のある対象であった。さらに、何れの生殖細胞のフレームワークが互いに同一の界面残基の両方を備えるとともに、上記ＣＤＲの類似のループ構造を支持していることが知られていたかを決定するために、上記ＣＤＲの５について定義された不連続な標準構造一式に関与している上記ＣＤＲのグループ長および位置（Chothia, C. et al. (1987) "Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901-917; Martin, A.C. et al. (1996) "Structural Families In Loops Of Homologous Proteins: Automatic Classification, Modelling And Application To Antibodies," J. Molec. Biol 263:800-815; Al-Laziniki, B. et al. (1997) "Standard Conformations For The Canonical Structures Of Immunoglobulins," J. Molec. Biol. 273:927-948）を上記生殖細胞系列と比較された。表６および表７は、Ｃｈｏｔｈｉａの定義に従って番号付けが行われており、上記ＶＨ／ＶＬ界面内の保存位置および上記ＣＤＲの標準クラスの決定位置をそれぞれ示す。
【０１９９】
【表１７】
2014523401.tif 000019
【０２００】
【表１８】
2014523401.tif 000020
【０２０１】
上記ヒト生殖細胞系列に対する上記親抗体配列の位置合わせに応じて、最も一致性の高いエントリを同定した。好適なヒト生殖細胞系列の選択は、順序付けがなされた次の基準（１）〜（５）に応じて行われた：（１）フレームワーク全域の配列同一性；（２）同一または対応する鎖間界面残基；（３）親ＣＤＲの標準立体構造によるループの支持；（４）発現抗体に見られる重鎖および軽鎖の生殖細胞系列の組み合わせ；および（５）除去する必要のあるＮ−グリコシル化部位の存在。
【０２０２】
抗体１Ｈ３のＦｖ領域の構造モデルを作製した。フレームワーク（ＦＲ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、および全長Ｆｖの構造鋳型配列候補は、標的に対する配列同一性および鋳型構造の定性性の結晶学的測定（結晶解像度（単位：オングストローム（Å）））に応じて、スコア付けおよびランク付けを行い、抗体データベースからの選択を行った。
【０２０３】
上記ＣＤＲをＦＲ鋳型に対して構造的に位置合わせするために、上記ＣＤＲの何れかの側の５残基をＣＤＲ鋳型に含める。上記フラグメントの位置合わせは、重複セグメントおよび作製した構造配列位置合わせに応じて作製した。上記位置合わせに沿った上記鋳型フラグメントをＭＯＤＥＬＬＥＲで処理した（Sali, A. et al. (1993) "Comparative Protein Modelling By Satisfaction Of Spatial Restraints," J. Molec. Biol. 234:779-815）。このプロトコルによって、位置合わせを行った構造鋳型一式から誘導される立体構造の制限が形成される。共役勾配処置および焼き鈍し最適化処置によって、上記制限を満たす構造集合を作製した。タンパク質構造のスコアおよび構造制限の充足から導き出したエネルギースコアに応じて、この集合からモデル構造を選択した。上記モデルの検査を行い、標的および上記鋳型の間で異なる位置の側鎖は、鎖最適化アルゴリズムおよび最小化したエネルギーを用いて最適化した。視覚化および演算ツール一式を使用して上記ＣＤＲ構造の可変性、局所包装、および表面分析の評価を行って、１つ以上の好適なモデルを選択した。
【０２０４】
上記親抗体の構造モデルを構築して、原子の不完全包装、または、結合長、結合角度、またはねじれ角の歪みなどの欠陥について検査を行った。これらの欠陥は、抗体の構造安定性に関わる潜在的な問題を示している。モデル化プロトコルでは、このような欠陥を最小限に抑止することを図っている。ヒト化Ｆｖの初期の構造モデルは、安全な置換（すなわち、結合親和力または安定性に作用を及ぼすことのないであろう置換）および慎重な置換（すなわち、位置置換が行われるが、結合親和力にとって位置が重要になり得る）の全てを含むものである。結合親和力の低下または安定性の低下のリスクに関連していると考えられる位置での置換に対しては改変が行われなかった。親との一致性の高い変異体モデルを作製することよりも、良好な独立モデルを作製するために、親鋳型の選択から独立して鋳型の検索または選択が行われた。潜在的な置換の評価が行われるにつれて、上記モデルはアップグレードされて、好適な置換および復帰突然変異の効果を反映した。
【０２０５】
〔実施例４：ヒト化抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体〕
このようなヒト化誘導体の作製を説明するために、上述の手順に従って抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体３Ｄ１０のヒト化誘導体を作製した。
【０２０６】
３Ｄ１０の軽鎖の可変ドメインをヒト生殖細胞系と比較する配列位置合わせは、ＩＧＫＶ３軽鎖の生殖細胞系（ＩＧＫＶ３−１１*０１、ＩＧＫＶ３−１１*０２、ＩＧＫＶ３−ＮＬ５*０１、ＩＧＫＶ３Ｄ−１１*０１、ＩＧＫＶ３−ＮＬ４*０１、ＩＧＫＶ３Ｄ−７*０１、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０*０１、ＩＧＫＶ３−２０*０１、ＩＧＫＶ３−２０*０２、およびＩＧＫＶ３−１５*０１）、ＩＧＫＶ１軽鎖の生殖細胞系（ＩＧＫＶ１−９*０１、ＩＧＫＶ１−３９*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１３*０１、ＩＧＫＶ１−１６*０１、 ＩＧＫＶ１−８*０１、ＩＧＫＶ１−１３*０２、ＩＧＫＶ１−ＮＬ１*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−４３*０１、ＩＧＫＶ１−２７*０１、およびＩＧＫＶ１−１２*０１）、およびＩＧＫＪ軽鎖の生殖細胞系（ＩＧＫＪ４*０１、ＩＧＫＪ２*０２、ＩＧＫＪ２*０１、 ＩＧＫＪ２*０４、ＩＧＫＪ２*０３、ＩＧＫＪ５*０１、ＩＧＫＪ１*０１、および ＩＧＫＪ３*０１）を用いて作製した。
【０２０７】
３Ｄ１０の重鎖の可変ドメインをヒト生殖細胞系と比較する配列位置合わせは、ＩＧＨＶ１の重鎖の生殖細胞系（ＩＧＨＶ１−２*０２、ＩＧＨＶ１−２*０４、ＩＧＨＶ１−ｆ*０１、ＩＧＨＶ１−４８*０１、ＩＧＨＶ１−２*０３、ＩＧＨＶ１−２*０１、ＩＧＨＶ１−４６*０２、ＩＧＨＶ１−２*０５、ＩＧＨＶ１−３*０１、およびＩＧＨＶ１−８*０１）、ＩＧＨＶ３の重鎖の生殖細胞系（ＩＧＨＶ３−４９*０４、ＩＧＨＶ３−４９*０１、ＩＧＨＶ３−４９*０２、ＩＧＨＶ３−４９*０３、ＩＧＨＶ３−６４*０１、ＩＧＨＶ３−６４*０２、ＩＧＨＶ３−７２*０１、ＩＧＨＶ３−６６*０１、およびＩＧＨＶ３−２３*０１）、およびＩＧＨＪの重鎖の生殖細胞系（ＩＧＨＪ３*０２、 ＩＧＨＪ６*０１、ＩＧＨＪ３*０１、ＩＧＨＪ６*０３、ＩＧＨＪ５*０２、ＩＧＨＪ５*０１、ＩＧＨＪ４*０１、ＩＧＨＪ１*０１、ＩＧＨＪ６*０４、およびＩＧＨＪ２*０１）を用いて作製した。
【０２０８】
（Ａ）軽鎖のヒト化
上記基準に基づいて、上記抗体３Ｄ１０の軽鎖は生殖細胞系ＩＧＫＶ３−１１*０１（配列番号７８）の軽鎖：
【０２０９】
【表１９】
2014523401.tif 000021
【０２１０】
および、生殖細胞系ＩＧＫＶ１−９*０１（配列番号７９）の軽鎖：
【０２１１】
【表２０】
2014523401.tif 000022
【０２１２】
に最も類似していることが見出された。なお、表８（上記抗体３Ｄ１０のＣＤＲ残基はイタリック体で示し、位置合わせが行われた同一の残基は下線で示す）に示すように、ＩＧＫＶ３−１１*０１が好適である。
【０２１３】
【表２１】
2014523401.tif 000023
【０２１４】
Ｊセグメントの遺伝子と親配列とをＦＲ４全域について比較し、軽鎖にはＪセグメントのＩＧＫＪ４*０１（配列番号８０：LTFGGGTKVEIK）を選択した。
【０２１５】
上記に示すように、上記抗体３Ｄ１０の軽鎖は、標準クラスＩループと類似する残基１０個分の短鎖ＣＤＲＬ１を有している。ヒト生殖細胞系列は、このような短鎖ＣＤＲＬｌを有していない。選択した各生殖細胞系列（ＩＧＫＶ３−１１*０１およびＩＧＫＶ１−９*０１）は、こうした種類のループを担持するための正常フレームワーク残基を含むより短鎖のＬＩループを有する。良好な配列全体の類似性は受容体フレームワークおよび親配列の間に確認されるが、重要な相違点は界面位置Ｙ３３およびＰ４５で確認される。残基Ｙ３３はＣＤＲＬＩ内に存在する。選択した上記２つの受容体群はこの位置にチロシンを含んでいないが、他の生殖細胞系配列はこの位置にチロシンを含んでいる。上記位置Ｐ４５における上記受容体フレームワークと上記親配列の相違点は、ヒト生殖細胞系と異なりＦＲ２を有する親生殖細胞系に起因している。この結果として、選択される受容体フレームワークに関わらず、この領域内の変化が提唱され、これにより、ＩＧＫＶ３−１１*０１およびＩＧＫＶ１−９*０１は受容体フレームワークとして促進された。
【０２１６】
上記２つの好適な受容体フレームワーク（ＩＧＫＶ３−１１*０１およびＩＧＫＶ１−９＊０１）の各々について３つのヒト化鎖を作製した。３つのＬＣ１鎖をＩＧＫＶ３−１１*０１から誘導し、３つのＬＣ２鎖をＩＧＫＶ１−９*０１から誘導した。各受容体フレームワークの第１のヒト化鎖がヒト化置換の全てを含むことは可能であると考えられ、３つの鎖で最もヒト鎖の性質を示すものであった。各受容体フレームワークの第２のヒト化鎖は、帯電を改変するか、潜在的にコアのパッキングを妨げるか、またはＣＤＲの立体構造に影響を及ぼし得る位置に幾つかの復帰突然変異を含んでいた。コア受容体フレームワークの第３の鎖は、復帰突然変異のほぼ全て（帯電を改変し、かつ結合親和力を改変する可能性を有し得る置換を含む）を含んでいた。上記６つのヒト化鎖の配列を以下に示す。
【０２１７】
【表２２】
2014523401.tif 000024
【０２１８】
親３Ｄ１０軽鎖との相対的な相違点を太字および下線で示しつつ、上記６つのヒト化鎖の配列を表９に示す。
【０２１９】
【表２３】
2014523401.tif 000025
【０２２０】
（Ｂ）重鎖のヒト化
上述の基準に照らして、生殖細胞系受容体フレームワークの２つの候補であるＩＧＨＶ１−２*０２（ＩＧＨＶ１生殖細胞系）およびＩＧＨＶ３−４９*０４（ＩＧＨＶ３生殖細胞系）を上記抗体３Ｄ１０の重鎖のヒト化に選択した。
【０２２１】
上記親配列との配列類似性を有しており、かつドメインのコアパッキングに関与している極めて類似性の高い残基を含んでいることを理由にして、受容体フレームワークＩＧＨＶ１−２*０２を選択した。ＩＧＨＶ１−２*０２に類似の他の生殖細胞系配列を検討して排斥した後に、受容体フレームワークＩＧＨＶ３−４９*０４を選択した。受容体フレームワークＩＧＨＶ３−４９*０４は、上記親配列に対する非類似性がＩＧＨＶ１−２*０２よりも僅かに高いので、より多くの置換基が必要とされた。しかし、この生殖細胞系受容体フレームワークは親ＣＤＲを担持することが可能である。上記受容体フレームワークＩＧＨＶ１−２*０２および上記フレームワークＩＧＨＶ３−４９*０４の配列を以下に示す。
【０２２２】
受容体フレームワークＩＧＨＶ１−２*０２（配列番号８７）
【０２２３】
【表２４】
2014523401.tif 000026
【０２２４】
受容体フレームワークＩＧＨＶ３−４９*０４（配列番号８８）
【０２２５】
【表２５】
2014523401.tif 000027
【０２２６】
表１０は、これら配列と上記抗体３Ｄ１０の重鎖との位置合わせを示す（上記抗体３Ｄ１０のＣＤＲ残基はイタリックで示し、位置合わせの行われた同一の残基は下線で示す）；
【０２２７】
【表２６】
2014523401.tif 000028
【０２２８】
上記Ｊセグメントの配列を上記親配列とＦＲ４全域について比較し、上記ＪセグメントのＩＧＨＪ３*０２（配列番号８９：DAFDIWGQGTMVTVSS）を重鎖に選択した。
【０２２９】
上記２つの好適な受容体フレームワークＩＧＨＶ１−２*０２およびＩＧＨＶ３−４９*０４の各々について３つのヒト化鎖を作製した。ＩＧＨＶ１−２*０２から３つのＨＣ１鎖を誘導し、ＩＧＨＶ３−４９*０４から３つのＨＣ２鎖を誘導した。各受容体フレームワークの第１のヒト化鎖は、可能と考えられる全てのヒト化置換を含み、３つの鎖のうち最もヒト鎖に近いものであった。各受容体フレームワークの第２のヒト化鎖は、帯電を改変するか、潜在的にコアのパッキングを妨げるか、ＣＤＲの立体構造に影響を及ぼし得るような位置に幾つかの復帰突然変異を含む。各受容体フレームワークの第３の鎖は、復帰突然変異のほぼ全て（帯電を改変し、かつ潜在的に結合親和力を改変し得る置換）を含むものであった。上記６つの鎖の配列を以下に示す。
【０２３０】
【表２７】
2014523401.tif 000029
【０２３１】
上記親３Ｄ１０の重鎖に相対的な相違点を太字および下線で示しつつ、上記６つのヒト化鎖の配列を図１１に示す。
【０２３２】
【表２８】
2014523401.tif 000030
【０２３３】
（Ｃ）抗体３Ｄ１０のヒト化誘導体
ＩＧＫＶ３−１１*０１およびＩＧＨＶ１−２*０２の対合に類似の生殖細胞系の組み合わせを有する抗体が存在したことを検査によって確認した。この対合を受容体１と標識した。さらに、ＩＧＫＶ１−９*０１とＩＧＨＶ３−４９*０４に類似の生殖細胞系の組み合わせを有する抗体を発見した。この対合を受容体２と標識した。
【０２３４】
上述の重鎖および軽鎖のヒト化鎖を組み合わせて１４個の変異ヒト化抗体を作製した。これら変異ヒト化抗体の配列を表１２に示す。
【０２３５】
【表２９】
2014523401.tif 000031
【０２３６】
〔実施例５：ヒト化抗ヒトＰＤ−１抗体の作製〕
このようなヒト化誘導体の作製を説明するために、上述の手順（１Ｈ３の可変領域およびヒトＩｇＧ１のＦｃ領域を組み込んだキメラ抗体を親抗体として使用した）に従って抗ヒトＰＤ−１抗体１Ｈ３のヒト化誘導体を作製した。
【０２３７】
１Ｈ３軽鎖の可変ドメインをヒト生殖細胞系と比較する配列アライメントは、ＩＧＫＶ３軽鎖生殖細胞系（ＩＧＫＶ３−１１*０１、ＩＧＫＶ３−１１*０２、ＩＧＫＶ３Ｄ−１１*０１、ＩＧＫＶ３Ｄ−２０*０１、ＩＧＫＶ３−ＮＬ４*０１、ＩＧＫＶ３Ｄ−７*０１、ＩＧＫＶ３−２０*０１、ＩＧＫＶ３−ＮＬ５*０１、ＩＧＫＶ３−１５*０１、ＩＧＫＶ３−ＮＬ１*０１、ＩＧＫＶ３−２０*０１、ＩＧＫＶ３−ＮＬ２*０１、ＩＧＫＶ３−ＮＬ３*０１）、ＩＧＫＶ１軽鎖生殖細胞系（ＩＧＫＶ１−９*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−４３*０１、ＩＧＫＶ１−３９*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１３*０２、ＩＧＫＶ１−８*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１３*０１、ＩＧＫＶ１−１２*０１、ＩＧＫＶ１Ｄ−１６*０１、ＩＧＫＶ１−５*０１、およびＩＧＫＶ１−ＮＬ１*０１）、およびＩＧＫＪ軽鎖生殖細胞系（ＩＧＫＪ２*０２、ＩＧＫＪ２*０１、ＩＧＫＪ２*０４、ＩＧＫＪ２*０３、ＩＧＫＪ５*０１、ＩＧＫＪ４*０１、ＩＧＫＪ３*０１、およびＩＧＫＪ１*０１）を用いて作製した。
【０２３８】
１Ｈ３重鎖の可変ドメインをヒト生殖細胞系と比較する配列アライメントは、ＩＧＨＶ３重鎖生殖細胞系（ＩＧＨＶ３−４８*０１、ＩＧＨＶ３−４８*０２、ＩＧＨＶ３−４８*０３、ＩＧＨＶ３−１１*０１、ＩＧＨＶ３−２１*０１、ＩＧＨＶ３−１１*０３、ＩＧＨＶ３−３０*０３、ＩＧＨＶ３−９*０１、ＩＧＨＶ３−７*０１、およびＩＧＨＶ３−３０*１０）、ＩＧＨＶ１重鎖生殖細胞系（ＩＧＨＶ１−３*０１、ＩＧＨＶ１−６９*０８、ＩＧＨＶ１−６９*１１、ＩＧＨＶ１−４６*０１、ＩＧＨＶ１−６９*０５、ＩＧＨＶ１−６９*０６、ＩＧＨＶ１−６９*０１、ＩＧＨＶ１−４６*０２、ＩＧＨＶ１−６９*０２、およびＩＧＨＶ１−６９*１０）、および、ＩＧＨＪ重鎖生殖細胞系（ＩＧＨＪ６*０１、ＩＧＨＪ６*０３、ＩＧＨＪ４*０１、ＩＧＨＪ６*０４、ＩＧＨＪ５*０２、ＩＧＨＪ３*０２、ＩＧＨＪ５*０１、ＩＧＨＪ３*０１、ＩＧＨＪ２*０１、およびＩＧＨＪ１*０１）を用いて作製した。
【０２３９】
軽鎖および重鎖の各々について、全体の配列同一性、マッチング界面位置、および類似分類のＣＤＲ標準位置に基づいて、２つの生殖細胞系群を可能な受容体フレームワークとして同定した（軽鎖についてはＩＧＫＶ３およびＩＧＫＶ１を同定し、重鎖については１ＧＨＶ３およびＩＧＨＶ１を同定した）。抗体１Ｈ３は、上記軽鎖の生殖細胞系１ＧＫＶ３−１１*０１および上記重鎖の生殖細胞系ＩＧＨＶ３−４８*０１に最も類似しているが見出された。軽鎖および重鎖の各々について、全体の配列同一性、マッチング界面位置、および類似分類のＣＤＲ標準位置に基づいて、２つの生殖細胞系群を可能な受容体フレームワークとして同定した（軽鎖についてはＩＧＫＶ３およびＩＧＫＶ１を同定し、重鎖については１ＧＨＶ３、ＩＧＨＶ１を同定した）。
【０２４０】
（Ａ）軽鎖のヒト化
抗体１Ｈ３は、残基１０個分の短鎖のＣＤＲＬ１を含み、標準クラスＩに分類される。ヒト生殖細胞系ではこのように短鎖のＣＤＲＬ１を含むものはないが、選択された各群（ＩＧＫＶ３−ＩＩ*０１およびＩＧＫＶ１−９*０１）のうち最も近しい生殖細胞系は短Ｌ１ループを有し、クラスＩのＬＩループを担持するのに適正のフレームワーク残基を含んでいる。全体の配列類似性は受容体フレームワークの両方にとって良好であるが、２つの界面位置（Ｙ３３およびＰ４５）において相違している。Ｙ３３はＣＤＲＬｌ内に存在する。上記２つの受容体群がこの位置にチロシンを含まない一方で、他の潜在的な受容体群はこの位置にチロシンを含んでいる。Ｐ４５の相違点は、上記親軽鎖のＦＲ２内に存在する多数の他の相違点と結び付いていた。要するに、上記親生殖細胞系は、ＦＲ２がヒト生殖細胞系内の何れにも非類似のマウス生殖細胞系群に属している。
【０２４１】
軽鎖の受容体フレームワークとして、生殖細胞系１ＧＫＶ３−１１*０１およびＩＧＫＶ１−９*０１を選択した。上記１ＧＫＶ３−１１*０１およびＩＧＫＶ１−９*０１の軽鎖の配列は、それぞれ配列番号７８および配列番号７９として先述している。上記配列と抗体１Ｈ３の軽鎖との位置合わせを表１３に示す（抗体１Ｈ３のＣＤＲ残基はイタリックで示し、位置合わせを行った同一の残基は下線で示す）。
【０２４２】
【表３０】
2014523401.tif 000032
【０２４３】
ＦＲ４全体についてＪセグメントの遺伝子を親配列と比較し、ＪセグメントのＩＧＫＪ２*０２（配列番号９６：CTFGQGTKLEIK）を軽鎖に選択した。
【０２４４】
上記２つの好適な受容体フレームワークＩＧＫＶ３−１１*０１およびＩＧＫＶ１−９*０１の各々について２つのヒト化鎖を作製した。ＩＧＫＶ３−１１*０１から２つのＬＣ１鎖を誘導し、ＩＧＫＶ１−９*０１から２つのＬＣ２鎖を誘導した。各受容体フレームワークの第１のヒト化鎖は、可能と考えられるヒト化置換の全てを含んでおり、３つの鎖のうち最もヒト鎖に近いものであった。各受容体フレームワークの第２のヒト化鎖は、帯電を改変するか、潜在的にコアのパッキングを妨げるか、または、ＣＤＲの構造に影響を及ぼし得る位置に幾つかの復帰突然変異を含んでいる。上記４つのヒト化鎖の配列を以下に示す。
【０２４５】
【表３１】
2014523401.tif 000033
【０２４６】
上記４つのヒト化鎖の配列は、親１Ｈ３  Ｖａｒ１軽鎖に相対的な相違点を太字および下線で示して表１４に示す。
【０２４７】
【表３２】
2014523401.tif 000034
【０２４８】
（Ｂ）重鎖のヒト化
上述の基準に照らして、生殖細胞系受容体フレームワークの２つの候補であるＩＧＨＶ３−４８*０１（ＩＧＨＶ３生殖細胞系）およびＩＧＨＶ１−３*０１（ＩＧＨＶ１生殖細胞系）を抗体１Ｈ３  Ｖａｒ１の重鎖のヒト化のために選択した。
【０２４９】
受容体フレームワーク１ＧＨＶ３−４８*０１は、その全体的な配列類似性から一次重鎖受容体フレームワークとして選択した。上記界面残基は、変異の発生可能であって、この変異がＣＤＲＨ１の標準クラスを決定するための適正残基を含んでいる位置であるＨ３５を除いて一致性を示す。ＣＤＲＨ２は、位置５６のチロシンの存在によって、配列系の標準クラスに分類されなかった。上記受容体フレームワークＩＧＨＶ３−４８*０１と密接に関連している任意の生殖細胞系を除いた後、上記第２の重鎖受容体フレームワークの選択を行った。最も近しい生殖細胞系はその後にＩＧＨＶ１−３*０１となった。考慮すべき相違点の数は、下コアのパッキングが異なっているため増大することになった。しかし、上記生殖細胞系は、ＣＤＲを担持し、好適な受容体フレームワークとして機能するものである。なお、上記親配列は、全ヒト生殖細胞系がチロシンを含んでいる保存位置６０においてシステインを含む。上記受容体フレームワーク１ＧＨＶ３−４８*０１およびＩＧＨＶ１−３*０１の配列を以下に示す。
【０２５０】
受容体フレームワーク１ＧＨＶ３−４８*０１（配列番号１０１）
【０２５１】
【表３３】
2014523401.tif 000035
【０２５２】
受容体フレームワークＩＧＨＶ１−３*０１（配列番号１０２）
【０２５３】
【表３４】
2014523401.tif 000036
【０２５４】
表１５は、上記配列と抗体１Ｈ３の重鎖との位置合わせの結果を示している（抗体１Ｈ３のＣＤＲ残基はイタリックで示し、位置合わせを行った同一残基は下線で示している）。
【０２５５】
【表３５】
2014523401.tif 000037
【０２５６】
ＦＲ４全体についてＪセグメントの遺伝子を上記親配列と比較した。ＪセグメントのＩＧＨＪ６*０１（配列番号１０３：WGQGTTVTV）を重鎖に選択した。
【０２５７】
上記２つの好適な受容体フレームワークＩＧＨＶ３−４８*０１およびＩＧＨＶ１−３*０１の各々について３つのヒト化鎖を作製した。上記ＩＧＨＶ３−４８*０１から３つのＨＣ１鎖を誘導し、上記ＩＧＨＶ１−３*０１から３つのＨＣ２鎖を誘導した。各受容体フレームワークの第１のヒト化鎖は、可能とみなされる全てのヒト化置換を含み、上記３つの鎖のうち最もヒト鎖に近いものであった。各受容体フレームワークの第２のヒト化鎖は、帯電を改変するか、潜在的にコアのパッキングを妨げるか、またはＣＤＲの構造に影響を及ぼし得る位置に幾つかの復帰突然変異を含んでいた。各受容体フレームワークの第３の鎖は、ほぼ全ての復帰突然変異（帯電を改変し、かつ潜在的に結合親和力を改変し得る置換を含む）を含んでいた。上記６つのヒト化鎖の配列を以下に示す。
【０２５８】
【表３６】
2014523401.tif 000038
【０２５９】
上記親１Ｈ３との相対的な相違点を太字および下線で示しつつ、上記６つのヒト化鎖の配列を表１６に示す。
【０２６０】
【表３７】
2014523401.tif 000039
【０２６１】
（Ｃ）抗体１Ｈ３のヒト化誘導体
ＩＧＫＶ３−１１*０１および重鎖ＩＧＨＶ３−４８*０１との対合に近しい生殖細胞系の組み合わせを有する抗体が存在したことを検査によって確認した。この対合を受容体Ｉと標識した。その後、ＩＧＫＶＩ−９*０１およびＩＧＨＶＩ−３*０１の対合に類似の対合を有する抗体が発見された。この対合を受容体２と標識した。
【０２６２】
上述の軽鎖および重鎖ヒト化鎖を組み合わせて１４個の変異ヒト化抗体を作製した。これら変異ヒト化抗体の配列を表１７に記載する。
【０２６３】
【表３８】
2014523401.tif 000040
【０２６４】
〔実施例６：１Ｈ３抗ヒトＰＤ−１抗体の特性決定〕
本発明の抗ＰＤ−１抗体の特性の評価を行うために、抗体１Ｈ３のマウス抗ヒトキメラ（「ｃｈ」）ＰＤ−１のＦａｂ領域とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とを有するコンストラクト（１Ｈ３コンストラクト）を作製した。ヒトＰＤ−１との結合能について、上記コンストラクトの試験を行った。
【０２６５】
ヒト全長ＰＤ−１で形質転換したＣＨＯ細胞をビオチン標識抗ｈＢ７−Ｈ１−Ｆｃまたは抗ｈＢ７−ＤＣｍＦｃで染色する前に飽和線量のＰＤ−１ ｍＡｂｓで事前に培養を行った実験の結果を図１２に示す。図１２では、抗体１Ｈ３のマウス抗ヒトキメラ（「ｃｈ」）ＰＤ−１Ｆａｂ領域とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とを有するマウスモノクローナル抗体のコンストラクトは、ヒトＰＤ−１を発現している細胞に抗体が結合した結果として、Ｂ７−Ｈ１−ＦｃおよびＢ７−ＤＣ−Ｆｃがこの細胞と結合することを阻害したことを示している。Ｍ１、ｍ３、１Ｅ８は全て、陽性対照の抗ＰＤ−１抗体である。非還元ゲル上では、上記コンストラクトが約２００ＭＷの単一の帯として遊走した。還元条件下において、上記帯と約５２ＭＷの帯との置換を行った。
【０２６６】
上記１Ｈ３コンストラクトは、２．１９ｎＭの親和性ＫD、０．７３４×１０-5／Ｍｓの「ｏｎ速度」、および１．６１×１０-4／ｓの「ｏｆｆ速度」を示した。上記コンストラクトのＥＣ50は７５ｇであることが見出された。図１３では、このコンストラクトによって得られた結合を市販の抗ＰＤ−１抗体であるＥＨ１２によって得られた結合と比較している。上記コンストラクトは、図１４に示すようなＢ７−Ｈ１−ＦｃまたはＢ７−ＤＣ−Ｆｃに対するｈＰＤ−１（ＣＨＯ細胞によって発現）の結合能を完全に阻害することが可能であることが見出された。図１５では、キメラ１Ｈ３コンストラクトがｈＰＤ−１−Ｆｃと結合し、このようなｈＰＤ−１−ＦｃがＣＨＯ細胞によって発現されるｈＢ７−Ｈ１と結合することを阻害するが可能であることを示している。
【０２６７】
上記ＩＨ３コンストラクトが有するヒト一次Ｔ細胞との結合能を対照抗体（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ：ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ, Ｉｎｃ.）と相対的に評価した。上記ＩＨ３は、ＣＤ８細胞およびＣＤ４細胞の双方に対する結合が向上していることを示した（図１６Ａおよび１６Ｂ）。
【０２６８】
本発明の抗体の機能特性を説明するために、上記コンストラクト１Ｈ３、抗体１Ｈ３のＦＡＢ領域を含むキメラ抗体コンストラクト（「コンストラクト１Ｈ３」）、抗体１Ｅ３のＦＡＢ領域を含むキメラ抗体コンストラクト（「１Ｅ３コンストラクト」）、および抗体３Ｄ１０のＦＡＢ領域を含むキメラ抗体コンストラクト（「３Ｄ１０コンストラクト」）について、Ｔ細胞活性を向上させる能の評価を行った。未成熟の樹状細胞（ＤＣ）をＴＮＦαおよびＰＧＥ２に２日間晒した（成熟２日目に細胞を５０μｇ／ｍｌの破傷風トキソイド（ＴＴ）の存在下で一晩培養した）。この結果得られた細胞は、Ｂ７−Ｈ１およびＢ７−ＤＣを発現する能を獲得してこの能に決定されるような成熟ＤＣとなっていたことが見出された。その後、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した自己Ｔ細胞と、１００ｎｇ／ｍｌのＴＴと、上述の抗体コンストラクトとの存在下で、成熟後のＤＣ細胞を２週間培養した。図１７に示すように、本発明の抗体は、抗体特異的記憶Ｔ細胞の膨張によって測定されるように、Ｂ７−Ｈ１およびＰＤ−１の相互作用を阻害することが可能であった。７日目、細胞上清中に存在しているサイトカインの分析を行った（表１８）。
【０２６９】
【表３９】
2014523401.tif 000041
【０２７０】
表１８に示すように、上記抗ｈＰＤ−１コンストラクトの双方のＴｈ１反応およびＴｈ２反応が促進された。上記細胞上清中には極めて少量のＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、およびＧ−ＣＳＦが見出された。ｍＡｂは全て、エンドトキシンが０．０１ＥＵ／ｍｇ未満と極めて少量であった。さらに、上記ＤＣ細胞および上記Ｔ細胞を無血清培地に保存した。７日目の細胞に細胞内ＩＦＮ−γ染色を行ったことによって、対照細胞の僅か０．１５％のみがＩＦＮ−γ+であったのに対して、上記ＩＨ３コンストラクトで培養を行っていた細胞の１．９％がＩＦＮ−γ+であり、上記１Ｅ３コンストラクトで培養を行っていた細胞の０．９１％がＩＦＮ−γ+であり、上記３Ｄ１０コンストラクトで培養を行っていた細胞の３．２％がＩＦＮ−γ+であったことが明らかになった。
【０２７１】
したがって要約すれば、上記１Ｈ３コンストラクトは、Ｔ細胞の細胞増殖が約７倍に増大することを媒介し、各細胞毎のＩＦＮ−γ産生が約１２倍に増大することを媒介したことが見出された。このような作用の累積的な効果として、ＩＦＮ−γ分泌が約１００倍に増大した。
【０２７２】
さらなる機能特性決定として、単球由来のＤＣをＴＮＦαおよびＰＧＥ２で培養することによって成熟させた。その後、クラスＩおよびＩＩの制限ＣＥＦペプチド（すなわち、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、エプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）、およびインフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）のペプチド）を混合した集合の存在下で細胞にパルスを２時間与え、ＣＦＳＥで標識した自己Ｔ細胞（ＬＤカラム、純度９５％）を用いて２週間培養を行った。その後、ＣＦＳＥで標識した自己Ｔ細胞（ＬＤカラム、純度９５％）および上述の抗体コンストラクトの存在下において、上記処理を行った細胞を２週間培養した。７日目、ＣＦＳＥで希釈したＴ細胞のパーセンテージは、対照抗体で培養した細胞については４０％であり、上記１Ｈ３コンストラクトで培養した細胞については３７％であり、上記３Ｄ１０コンストラクトで培養した細胞については５０％であり、抗体ＣＡ−１８Ｃ３（抗ＩＬ−１α特定的モノクローナル抗体）で培養した細胞については５７％であることが見出された。１１日目、ＣＦＳＥで希釈したＴ細胞のパーセンテージの評価を再度行った。その結果、上記ＣＦＳＥで希釈したＴ細胞のパーセンテージは、上記対照抗体で培養した細胞については１７％であり、上記１Ｈ３コンストラクトで培養した細胞については３８％であることが見出された。その後、上記ＣＦＳＥで希釈したＴ細胞のパーセンテージは、上記抗体ＣＡ−１８Ｃ３で培養した細胞については２７％であることが見出された。
【０２７３】
７日目、ＩＬ−２サイトカインおよびＩＦＮ−γサイトカインに関しても、上記処理を行った細胞の上清の分析を行った（表１９）。
【０２７４】
【表４０】
2014523401.tif 000042
【０２７５】
１１日目、ＩＦＮ−γサイトカイン、ＴＮＦαサイトカイン、およびＧＭ−ＣＳＦサイトカインに関しても、上記処理を行った細胞の上清の分析を行った。上記１Ｈ３コンストラクトは、３種類全てのサイトカインが対照抗体と相対的して向上するのを媒介したことが見出された（表２０）。
【０２７６】
【表４１】
2014523401.tif 000043
【０２７７】
さらなる機能特性決定として、単球由来のＤＣ（ＨＬＡ−Ａ２陽性のドナーＰＢＭＣから取得）をＴＮＦαおよびＰＧＥ２に曝して成熟させた。その後、ＨＬＡ−Ａ２制限ＭＡＲＴ−１ペプチドおよびＨＬＡ−Ａ２制限ＦｌｕＭ１ペプチドと一緒に、上記成熟させたＤＣにパルスを２時間与えた。その後、ＣＦＳＥで標識した自己Ｔ細胞（ＬＤカラム、純度９５％）と上述の１Ｈ３コンストラクトまたは３Ｄ１０コンストラクトとの存在下において、上記細胞を２週間培養した。上記ＭＡＲＴ−１ペプチドおよび上記Ｍ１ペプチドのサイトカイン産生に対する効果を表２１に示す。
【０２７８】
【表４２】
2014523401.tif 000044
【０２７９】
〔実施例７：ヒト化抗ＰＤ−１抗体の特性決定〕
上述のヒト化抗体１Ｈ３＿ｖａｒ１〜１Ｈ３＿ｖａｒ１４（表１７参照）の評価を行って、ヒトＰＤ−１に対する結合能および治療能力の確認を行った。上記抗体をエンコードするポリペプチドはＣＨＯ細胞内で発現された。ＥＬＩＳＡ法を用いて機能的抗体の力価の決定を行った（表２２）。
【０２８０】
【表４３】
2014523401.tif 000045
【０２８１】
結合がヒトＰＤ−１に特定的であるよう確実にするために、ヒトＰＤ−１を発現するように形質転換を行ったＣＨＯ細胞を用いて結合の評価を行った。このような結合実験の結果を図１８Ａ〜１８Ｄに示す。上記結合の実験を１ｎｇ、３ｎｇ、１０ｎｇ、３０ｎｇ、１００ｎｇ、３００ｎｇ、１０００ｎｇ、または３０００ｎｇのｈ１Ｈ３変異体の存在下において繰り返し行うことによって、このようなヒト化抗体のＰＤ−１に対する結合能はあらゆる場合において抗体濃度に依存していることが見出された。
【０２８２】
ＰＤ−１およびその天然リガンドの間の相互作用を阻害する本発明のヒト化抗ＰＤ−１抗体の阻害能を実証するために、Ｂ７−Ｈ１（またはＢ７−ＤＣ）と選択したｈ１Ｈ３変異体との存在下において、ＰＤ−１を発現するＨＥＫ２９３細胞を培養した。上記ｈ１Ｈ３変異抗体は、上記Ｂ７−Ｈ１が上記ＨＥＫ２９３細胞に結合することを阻害可能であることが見出された（図１９Ａ（Ｂ７−Ｈ１）；図１９Ｂ（Ｂ７−ＤＣ）（Ｃｔｌ＝ ｓｙｎａｇｉｓ， ＷＴ＝キメラ１Ｈ３））。
【０２８３】
表２３は、５００ｍｌ規模での一過性発現および精製手段で得られた結果を示す。非還元性ゲルは、発現された抗体は主として約１６０ｋＤの単一の帯として遊走することを示した。なお、還元性ゲル中で分析を行った場合では、上記帯は約６０ｋＤおよび約３０ｋＤの帯に置換されていた。この結果は、受容体１ｈ１Ｈ３変異体（ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ３、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ４、およびｈ１Ｈ３  Ｖａｒ６）はヒトＰＤ−１との良好な結合を示す一方で、受容体２ｈ１Ｈ３変異体（ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ７〜ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１４）はヒトＰＤ−１とのより不良の結合を示した。したがって、受容体１ｈ１Ｈ３変異体であるｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１〜ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ６の重鎖および軽鎖をクローニングして二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ：Lonza Biologics, Berkshire, UK; Bebbington, C.R. et al. (1992) "High-Level Expression Of A Recombinant Antibody From Myeloma Cells Using A Glutamine Synthetase Gene As An Amplifiable Selectable Marker," Biotechnology (NY) 10(2):169-175）を作製し、これをＣＨＯに形質転換することによって、安定して抗体を産生する細胞株の作製を可能にした。
【０２８４】
【表４４】
2014523401.tif 000046
【０２８５】
抗体濃度を０．５ｎｇ／ｍｌ、１．５ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、および５００ｎｇ／ｍｌ、並びに１．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、および５０μｇ／ｍｌとして結合分析を行った結果、結合は抗体濃度に依存していることが判明した。上記変異体のＰＤ−１特異的な結合能は、０ｎＭ〜約３５０ｎＭの範囲の抗体濃度で決定した。図２０は、その結果得られるｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１〜ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ６についての曲線を示し、これらの抗体がＰＤ−１に結合することを示唆している。抗体ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１およびｈ１Ｈ３  Ｖａｒ４は、親抗体と相対して低下した結合を示した。その一方、抗体ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ２、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ３、ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ５、およびｈ１Ｈ３  Ｖａｒ６は、上記親抗体の結合に相当する結合を示した。これらの抗体に関するＥＣ５０のデータを表２３に示す。
【０２８６】
本明細書で言及した全ての刊行物および特許については、参照することによって、その内容を援用するものである。なお、援用の範囲に関しては、参照することによって、その内容全体を援用する旨を個々の刊行物および特許について個別具体的に示した場合と同一の範囲まで含めるものである。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、さらなる変更を行うことが可能であることが理解されるであろう。また、本出願は、一般的に本発明の原則に従い、発明の任意の変更、使用、または適合を含むように意図されたものであることも理解されるであろう。そして、本出願は、本願開示内容からの変更が本発明の属する技術分野において公知または慣行の範囲内において行われる場合には、これら変更も含むものであり、先に規定した本質的特徴について適用され得ることも理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２８７】
【図１】Ｂ７−Ｈ１に結合する抗体に関してテストされたハイブリドーマ上清の結合を示す図である。陽性対照（ＰＣ）：ハイブリドーマ生成に用いられたマウス由来の１：１０００希釈血清；陰性対照（ＮＣ）：５％ミルク／ＰＢＳ。Ｂ７−Ｈ１−Ｆｃに対する結合および抗マウスＩｇＧを用いた検出に関してデータが示される。
【図２】単離抗Ｂ７−Ｈ１抗体がＰＤ−１に対するＢ７−Ｈ１の結合を調節することができるかどうかを判定するための実験結果を示す図である。陽性対照：クローンＭＩＨ−１および２９Ｅ．２Ａ３（両者は抗ヒトＣＤ２７４（Ｂ７−Ｈ１）；２つの陰性対照：無関係ハイブリドーマ（ランダムＡｂ）およびベクター対照（ＶＣ）由来の馴化培地。
【図３】ＣＨＯ−ＨＢ７−ＨＬに対するに関してテストされた抗Ｂ７−ＨＬ抗体の中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。テストされたクローンのいずれも、親ＣＨＯラインとの交差反応は認められず、発現した抗体がヒトＢ７−Ｈ１に対して免疫特異性があることを示した。
【図４】選択された抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体のヒトＢ７−Ｈ１発現ＣＨＯ細胞結合アッセイの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の結果を示す図である。
【図５】抗ヒトＢ７−Ｈ１抗体５Ｈ１および１Ｅ１２のヒトＢ７−ＨＬ発現ＣＨＯ細胞結合アッセイの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の結果を比較する図である。
【図６】単離された抗ヒトＰＤ−１抗体の抗原結合及びアイソタイプを示す図である。
【図７Ａ】単離されたハイブリドーマの幾つかが、中和抗ヒトＰＤ−１抗体を発現したことを示す実験結果を示す図である。
【図７Ｂ】単離されたハイブリドーマの幾つかが、中和抗ヒトＰＤ−１抗体を発現したことを示す実験結果を示す図である。
【図８】ＣＨＯ−ｈＰＤ−１に対する結合に関してテストされた抗ＰＤ−１抗体の中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。テストされたクローンの何れも、親ＣＨＯラインとの交差反応は認められず、発現した抗体がヒトＰＤ−１に対して免疫特異的性があることを示した。
【図９】選択された抗ヒトＰＤ−１抗体のヒトＰＤ−１発現ＣＨＯ細胞結合アッセイの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。陽性対照：ＥＨ１２（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから市販されている抗ヒトＰＤ−１抗体）；ｍＩｇＧ１：マウスＩｇＧ陰性対照。
【図１０】抗ヒトＰＤ−１抗体の濃度変更時の細胞ベースの競合アッセイの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の結果を示す図である。
【図１１】ヒトＰＤ−１抗体の濃度が２０μｇ／ｍｌの時の細胞ベースの競合アッセイの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の結果を示す図である。
【図１２】ヒトの完全長ＰＤ−１をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、ビオチン標識ｈＢ７−Ｈ１−ＦＣまたはｈＢ７−ＤＣｍＩｇにより染色する前に、飽和量の抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）または対照Ｉｇと共に事前培養した実験の結果を示す図である。
【図１３】パネルＡおよびパネルＢが、（Ａ）市販の抗ＰＤ−１抗体、ＥＨ１２、と（Ｂ）キメラ（”ＣＨ”）マウス抗ヒトＰＤ−１のＦａｂ領域およびヒトＩｇＧ１のＦｃ領域とを有するマウスモノクローナル抗体との比較結合を示す図である。
【図１４】パネルＡおよびパネルＢが、ビオチン化Ｂ７−ＨＬ−Ｆｃとビオチン化Ｂ７−ＤＣ−ＦｃのＰＤ−１に対する結合のブロッキング効果を発揮する、本発明の抗ＰＤ−１抗体の能力を示す図である。
【図１５】抗ｈＩｇ抗体によって検出された、ＣＨＯ．ｈＰＤ−１細胞に対する１Ｈ３抗ヒトＰＤ−１キメラ抗体の結合曲線を示す図である。
【図１６Ａ】陰性対照抗体（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ；ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ、Ｉｎｃ．）と比較して、ヒト初代Ｔ細胞ＣＤ８＋（図１６Ａ）およびＣＤ４＋（図１６Ｂ）に対して結合する、１Ｈ３抗ヒトＰＤ−１キメラ抗体の能力の研究結果を示す図である。
【図１６Ｂ】陰性対照抗体（ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ；ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標）、Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ、Ｉｎｃ．）と比較して、ヒト初代Ｔ細胞ＣＤ８＋（図１６Ａ）およびＣＤ４＋（図１６Ｂ）に対して結合する、１Ｈ３抗ヒトＰＤ−１キメラ抗体の能力の研究結果を示す図である。
【図１７】破傷風毒素（ＴＴ）のリコールの際に、ＣＦＳＥ希釈により測定された抗原特異的Ｔ細胞の応答を高める、本発明の抗体の能力を示す図である。
【図１８Ａ】ＣＨＯ．ｈＰＤｌ細胞に結合するヒト化１Ｈ３変異体（ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１〜ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１４）の能力を実証する図である。
【図１８Ｂ】ＣＨＯ．ｈＰＤｌ細胞に結合するヒト化１Ｈ３変異体（ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１〜ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１４）の能力を実証する図である。
【図１８Ｃ】ＣＨＯ．ｈＰＤｌ細胞に結合するヒト化１Ｈ３変異体（ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１〜ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１４）の能力を実証する図である。
【図１８Ｄ】ＣＨＯ．ｈＰＤｌ細胞に結合するヒト化１Ｈ３変異体（ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１〜ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１４）の能力を実証する図である。
【図１９Ａ】Ｂ７−Ｈ１（図１９Ａ）またはＢ７−ＤＣ（図１９Ｂ）を発現するｈＰＤ−１−ＦｃおよびＨＥＫ２９３細胞間の相互作用をブロックする、ヒト化抗ＰＤ−１抗体の能力を実証する図である。
【図１９Ｂ】Ｂ７−Ｈ１（図１９Ａ）またはＢ７−ＤＣ（図１９Ｂ）を発現するｈＰＤ−１−ＦｃおよびＨＥＫ２９３細胞間の相互作用をブロックする、ヒト化抗ＰＤ−１抗体の能力を実証する図である。
【図２０】ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ１〜ｈ１Ｈ３  Ｖａｒ６の結合曲線を示す図である。
【図１】
2014523401.tif 000047
【図２】
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【図３】
2014523401.tif 000049
【図４】
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【図５】
2014523401.tif 000051
【図６】
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【図７Ａ】
2014523401.tif 000053
【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2014523401.tif 000059
【図１３】
2014523401.tif 000060
【図１４】
2014523401.tif 000061
【図１５】
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【図１６Ａ】
2014523401.tif 000063
【図１６Ｂ】
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【図１７】
2014523401.tif 000065
【図１８Ａ】
2014523401.tif 000066
【図１８Ｂ】
2014523401.tif 000067
【図１８Ｃ】
2014523401.tif 000068
【図１８Ｄ】
2014523401.tif 000069
【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
2014523401.tif 000072
【配列表】
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【国際調査報告】
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