(57)【要約】本発明は、式（Ｉ）：2011521889.tif 000013で示される新規化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物、その調製法、これらの方法にて用いることができる中間体、それらを含有する医薬組成物、および医薬としての、例えば、成長ホルモン分泌促進物質受容体（グレリン受容体またはＧＨＳＲ１ａ受容体とも称される）の調節因子としてのならびに／あるいはグレリン受容体によって媒介される障害の治療および／または予防のための、その使用に関する。
2011521889.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2011521889.tif 000010
で示される化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項２】
式：
【化２】
2011521889.tif 000011
である請求項１記載の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の調製法であって、
（Ａ）非プロトン性溶媒中アミドカップリング試薬および適当な塩基の存在下において一緒に、式（ＩＩ）の化合物を式（ＩＩＩ）のアミンと反応させること；次いで、
【化３】
2011521889.tif 000012
（Ｂ）必要に応じて、キラル分離
を含む、方法。
【請求項４】
グレリン受容体によって媒介される障害に罹患している哺乳動物の治療方法であって、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の有効量を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項５】
むちゃ食い障害に罹患している哺乳動物の治療方法であって、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の有効量を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項６】
医薬として用いる、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項７】
グレリン受容体によって媒介される障害の治療に用いる、請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物。
【請求項８】
むちゃ食い障害の治療のための医薬の製造における、請求項１または２記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の使用。
【請求項９】
請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を１種または複数の医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合して含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規アミド化合物、その調製法、これらの方法にて用いることができる中間体、および該化合物を含有する医薬組成物に関する。本発明はまた、医薬としての、例えば、成長ホルモン分泌促進物質受容体（グレリン受容体またはＧＨＳＲ１ａ受容体とも称される）の調節因子としてのならびに／あるいは摂食障害、例えば、むちゃ食い障害の治療および／または予防のためのアミド化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グレリンは、成長ホルモン（ＧＨ）分泌促進物質受容体に対する内因性リガンドである。それは、胃から初めて精製された、３位のセリンがｎ−オクタノイル化されている２８個のアミノ酸ペプチドホルモンである。それは、強いＧＨ放出活性を有するため、ＧＨ放出およびエネルギーホメオスタシスを保持するのに重要な役割を果たすと考えられている。特に、強い食欲刺激活性を発揮するように思われている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、グレリン受容体活性を調節する新規化合物を見出すことが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によれば、式（Ｉ）：
【化１】
2011521889.tif 000003
で示される化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物が提供される。
【０００５】
１の実施態様において、式（Ｉ）：
【化２】
2011521889.tif 000004
で示される化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物が提供される。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の化合物の塩はまた、本発明の範囲内に包含される。その可能な医薬用途のために、式（Ｉ）の化合物の塩は、医薬上許容されることが好ましい。適当な医薬上許容される塩には、酸付加塩が含まれうる。医薬上許容される酸付加塩は、所望により有機溶媒などの適当な溶媒中、式（Ｉ）の化合物を適当な無機酸または有機酸（例えば、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸またはナフタレンスルホン酸）と反応させ、例えば、結晶化および濾過により通常単離される塩を得ることにより形成されうる。式（Ｉ）の化合物の医薬上許容される酸付加塩の例として、ＨＣｌ、ＨＢｒ、ＨＩ、硫酸塩または重硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩またはリン酸水素塩、酢酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、サッカラート、フマル酸塩、マレイン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、カンシル酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩が挙げられる。適当な医薬塩の総説については、Ｂｅｒｇｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ，Ｓｃｉ．，６６，１−１９，１９７７；Ｐ  Ｌ  Ｇｏｕｌｄ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３  （１９８６），２０１−２１７；およびＢｉｇｈｌｅｙら，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９６，Ｖｏｌｕｍｅ  １３，第４５３−４９７頁を参照。医薬上許容されない、他の塩、例えば、トリフルオロ酢酸塩は、本発明の化合物の調製に有用であってもよく、これらは、本発明のさらなる態様を形成する。本発明は、式（Ｉ）の化合物の塩の全ての可能な化学量論的および非化学量論的形態をその範囲内に含む。
【０００７】
多数の有機化合物が、それらが反応するかまたは沈殿もしくは結晶化される溶媒との複合体を形成しうることは、有機化学分野の当業者には明らかであろう。これらの複合体は、「水和物」として知られている。例えば、水との複合体は、「水和物」として知られている。本発明の化合物の溶媒和物は、本発明の範囲内にある。
【０００８】
本発明はまた、本発明の化合物の全ての適当な同位体を含む。本発明の同位体は、少なくとも１つの原子が、同一の原子番号を有するが、通常自然界に見られる原子量とは異なる原子量を有する原子で置き換えられるものとして定義される。本発明の化合物の一部となりうる同位体の例として、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素および塩素の同位体、例えば、各々、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆおよび３６Ｃｌが挙げられる。本発明の特定の同位体、例えば、放射性同位体、例えば、３Ｈまたは１４Ｃが組み込まれているものは、薬物および／または基質組織分布アッセイにおいて有用である。トリチウム化同位体、すなわち、３Ｈ同位体、および炭素−１４同位体、すなわち、１４Ｃ同位体は、それらの調製および検出の容易性から所望により選択されうる。さらに、ジューテリウム、すなわち、２Ｈなどの同位体との置換は、より大きな代謝安定性から生じるある種の治療的利点、例えば、インビボ半減期の増大または必要量の減少をもたらすことができ、故に、選択されることがある。本発明の化合物の同位体は、一般的に、適当な試薬の適当な同位体を用いて従来法によって、例えば、例示的方法によってまたは以下の化合物に記載の調製によって調製されうる。
【０００９】
したがって、さらなる実施態様において、本発明はまた、薬物療法に用いる、特に、グレリン受容体によって媒介される障害の治療における、式（Ｉ）の化合物およびその医薬上許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００１０】
さらなる実施態様において、本発明は、グレリン受容体によって媒介される障害の予防および／または治療のためのグレリン受容体活性の調節方法を対象とする。
【００１１】
さらなる実施態様において、本発明は、グレリン受容体によって媒介される障害に罹患している哺乳動物の治療方法であって、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の有効量を該対象に投与することを含む、方法を提供する。かかる治療は、医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む、式（Ｉ）の化合物の治療上有効な量を投与する工程を含む。かかる治療はまた、医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を含む、式（Ｉ）の化合物を含有する医薬組成物の治療上有効な量を投与する工程を含む。本明細書に用いられる、「治療」なる語は、特定の病態を改善すること、病態の症状を取り除くことまたは軽減すること、病態の進行を遅らせることまたは止めること、および患者または対象が以前患っていた病態の再発を防止することまたは遅延させることをいう。
【００１２】
本発明のさらなる実施態様は、グレリン受容体によって媒介される障害の治療のための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の使用を提供する。
【００１３】
内因性リガンドグレリンのグレリン受容体での作用は、強い成長ホルモン放出活性、食欲増進、胃運動性および酸分泌の刺激、陽性の心臓血管系作用ならびに骨形成に対する直接作用をもたらすことが示されている。したがって、グレリン受容体調節因子は、成長ホルモン欠損症、摂食障害、消化器疾患、心臓血管系疾患、骨粗鬆症、加齢および異化状態または慢性消耗症候群の治療において有益な作用をもたらしうる(Kojima and Kangawa, Nature Clincal Practice, Feb 2006, Vol 2, No.2, 80-88)。グレリン受容体調節因子はまた、睡眠障害の治療において有益な作用をもたらしうる(Brain Research, 1088 (2006) 131-140)。
【００１４】
グレリン受容体に付随するために、グレリン受容体調節因子が有益な作用をもたらしうるようなグレリン受容体によって媒介されうる、特定の障害には、肥満および限定されるものではないが、糖尿病、糖尿病に付随する合併症、メタボリック・シンドローム、心臓血管系障害（アテローム性動脈硬化および脂質異常症を含む）を含む、肥満に付随する危険因子が含まれる。
【００１５】
グレリン受容体によって媒介される他の疾患および／または病態には、以下：成長ホルモン欠損状態を処置すること、筋肉量を増加させること、骨密度を増加させること、男性および女性の性的機能不全を処置すること、体重増加をもたらすこと、体重維持をもたらすこと、食欲増進をもたらすことが含まれる（例えば、体重増加、維持または食欲増進をもたらすことは、障害を有する患者、または体重減少を伴う、治療において有用である）。体重減少を伴う疾患または障害の例として、拒食症、過食症、癌悪液質、ＡＩＤＳ、消耗，悪液質および衰弱した高齢者の消耗が挙げられる。体重減少を伴う治療の例として、化学療法、放射線治療、一時的または持続的固定化、および透析が挙げられる。
【００１６】
さらなる疾患または病態には、睡眠障害、うっ血性心不全、代謝性障害、記憶機能の改善、乳癌、甲状腺癌、虚血性神経または筋肉損傷の改善が含まれる。
【００１７】
本発明の化合物は、グレリン受容体の活性を調節することによって機能する。それらは、アゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニストまたは部分的アンタゴニストとして作用することによって受容体を活性化／不活性化しうる。
【００１８】
摂食障害には、神経性無食欲症（３０７.１）（亜型である制限型および過食／排出型を含む）；神経性多食症（３０７.５１）（亜型である排出型および非排出型を含む）；肥満；強迫性摂食障害；むちゃ食い障害；ならびに特定不能の摂食障害（３０７.５０）が含まれる。［上記の疾患の後の括弧内数字は、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 第4版, published by the American Psychiatric Association (DSM-IV)および／またはthe International Classification of Diseases, 第10版(ICD-10)における分類コードをいう］。
【００１９】
さらなる実施態様において、本発明は、摂食障害の治療のための医薬の製造における、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の使用を提供する。
【００２０】
さらなる実施態様において、本発明は、摂食障害に罹患している哺乳動物の治療方法であって、式（Ｉ）の化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の有効量を該対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００２１】
消化器疾患には、胃イレウス、胃潰瘍および炎症性腸疾患、例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる。本発明の化合物はまた、食欲／代謝関連悪液質の有無に関わらず、胃食道逆流および／または消化不良に付随する症状を軽減するための治療に、ならびに麻痺性イレウスまたは偽性閉塞、および便秘、例えば、便秘−顕著な過敏性腸症候群に付随する病態の治療において有用でありうる。
【００２２】
心臓血管系疾患には、心不全および拡張型心筋症が含まれる。
【００２３】
異化状態または慢性消耗症候群は、術後患者に見られ、また、ＡＩＤＳ関連および癌関連消耗症候群、例えば、癌悪液質を含みうる。
【００２４】
医薬用途について、治療上有効な量の式（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を化学原料として投与しうることが可能である場合、医薬組成物が活性成分として存在することは可能である。したがって、さらなる実施態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を１種または複数の医薬上許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合して含む医薬組成物を提供する。担体（複数）、希釈剤（複数）または賦形剤（複数）は、処方の他の成分と混合可能であり、そのレシピエントに有害ではないという意味で許容されなければならない。さらなる実施態様において、本発明はまた、（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を１種または複数の医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と混合することを含む医薬組成物の調製法を提供する。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、任意の適当な経路による、例えば、経口（口腔または舌下を含む）、直腸、鼻腔、局所（口腔、舌下または経皮を含む）、膣内または非経口（皮下、筋肉内、静脈内または皮内）経路による投与のために処方されうる。したがって、本発明の医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル、散剤、顆粒剤、ロゼンジ、クリームまたは液体製剤、例えば、経口または滅菌非経口溶液もしくは懸濁液として処方されうる。かかる医薬処方は、薬学分野にて既知の任意の方法によって、例えば、活性成分を担体（複数）または賦形剤（複数）と関連させることによって調製されうる。
【００２６】
経口投与用の錠剤およびカプセルは、単位用量表示形態であってもよく、通常の賦形剤、例えば、結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、またはポリビニルピロリドン；充填剤、例えば、ラクトース、シュガー、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；錠剤化潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレン・グリコールまたはシリカ；崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプン；または許容される湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを含有していてもよい。錠剤は、通常の調剤業務にて既知の方法にしたがってコーティングされうる。経口液体製剤は、例えば、水性もしくは油性懸濁液、溶液、乳液、シロップまたはエリキシル剤の形態であってもよく、あるいは使用前に水または他の適当なビヒクルで再生するための乾燥製剤として存在していてもよい。かかる液体製剤は、通常の添加剤、例えば、懸濁化剤、例えば、ソルビトール、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは硬化食用油脂；乳化剤、例えば、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、またはアカシア；非水性ビヒクル（食用油脂を含んでいてもよい）、例えば、アーモンド油、油性エステル、例えば、グリセリン、プロピレン・グリコール、またはエチルアルコール；保存剤、例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピルまたはソルビン酸、および必定に応じて、通常の香味剤または着色料を含有していてもよい。
【００２７】
本発明の局所処方は、例えば、軟膏、クリームまたはローション、眼軟膏および点眼薬または点耳薬、含浸包帯およびエアロゾルとして存在していてもよく、保存剤、薬物透過を補助する溶媒ならびに軟膏およびクリーム中の皮膚軟化剤を含有していてもよい。処方はまた、混合可能な通常の担体、例えば、クリームまたは軟膏基剤およびローション用エタノールまたはオレイルアルコールを含有していてもよい。かかる担体は、処方の約１％〜約９８％として存在していてもよい。より一般的には、それらは、処方の最大約８０％を形成するであろう。
【００２８】
非経口投与に適した医薬処方には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および処方を対象レシピエントの血液と等張にする溶質を含有していてもよい水性および非水性滅菌注射溶液；ならびに、懸濁化剤および増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。処方は、単位用量または複数回用量の容器、例えば、密封アンプルおよびバイアル中に存在していてもよく、使用直前に、滅菌液体担体、例えば、注射用水を加えることのみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存していてもよい。必要に応じて調製される注射溶液および懸濁液は、滅菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製されうる。
【００２９】
直腸投与に適した医薬処方は、坐剤または浣腸として存在してもよい。
【００３０】
担体が固体である、鼻腔投与に適した医薬処方には、嗅ぎタバコを吸う手法で、すなわち、鼻の近くに保持される粉末の容器から鼻腔への急速吸入により投与される、例えば、２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末が含まれうる。鼻腔用スプレーまたは点鼻薬として投与するための、担体が液体である、適当な処方には、活性成分の水性または油性溶液が含まれる。
【００３１】
吸入投与に適した医薬処方には、種々の定量加圧エアロゾル、ネプライザーまたは吸入器によって生成されうる、微粒子ダストまたはミストが含まれる。
【００３２】
膣内投与に適した医薬処方は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡沫またはスプレー処方として存在してもよい。
【００３３】
特に上記の成分に加えて、問題となっている処方の種類を考慮すると、処方が当該分野で慣用の他の薬剤を含んでいてもよいことは理解されるべきである。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の治療上有効な量は、例えば、ヒトまたは他の動物の年齢および体重、治療を要する明確な病態およびその重篤度、処方の特徴、ならびに投与経路を含む、多数の因子によるものであろうし、最終的にはかかりつけ医師または獣医師の判断によるものであろう。しかしながら、グレリン受容体によって媒介される障害の治療のための式（Ｉ）の化合物の有効量は、一般的には、１日当たり０．１〜１００ｍｇ／レシピエント（哺乳動物）の体重ｋｇの範囲およびより一般的には、１日当たり１〜１０ｍｇ／体重ｋｇであろう。したがって、７０ｋｇの成体哺乳動物について、１日当たりの実際の量は、通常７〜７００ｍｇであり、該量は、１日当たりの総量が同一になるように１日当たり一回量でまたはより一般的には、１日当たり複数回（例えば、２回、３回、４回、５回または６回）の分割量で提供されうる。その医薬上許容される塩または溶媒和物の有効量は、式（Ｉ）の化合物それ自体の有効量の割合として決定されうる。
【００３５】
本発明に用いるための式（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物は、１種または複数の他の治療剤と組み合わせて用いられうる。したがって、さらなる実施態様において、本発明は、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を、例えば、付加的な抗肥満薬であってもよい、さらなる治療剤と一緒に含む組み合わせを提供する。よりさらなる実施態様において、本発明はまた、グレリン受容体によって媒介される障害の治療における式（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物をさらなる治療剤と一緒に含む組み合わせの使用を提供する。
【００３６】
式（Ｉ）の化合物、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を１種または複数の他の治療剤と組み合わせて用いる場合、化合物は、任意の都合の良い経路によって連続してまたは同時に投与されうる。
【００３７】
上記の組み合わせは、都合の良いことに、医薬処方の形態での使用を示しうるので、好ましくは医薬上許容される担体または賦形剤と一緒に上記の組み合わせを含む医薬処方は、本発明のさらなる実施態様を含む。かかる組み合わせの個々の成分は、個々のまたは合した医薬処方中に連続してまたは同時に投与されうる。
【００３８】
同一処方中で合した場合、２種の化合物が安定かつ互いにおよび処方の他の成分と混合可能でなければならず、投与のために処方されうることは明らかであろう。個々に処方された場合、それらは、任意の都合の良い処方中に、都合の良いことには、当該分野においてかかる化合物にて知られているような手法で提供されうる。
【００３９】
化合物を同一疾患に活性な第２の治療剤と組み合わせて用いる場合、各化合物の投与量は、化合物を単独で用いる場合と異なっていてもよい。適当な投与量は、当業者であれば容易に分かるであろう。
【００４０】
本明細書で引用される特許および特許出願を含むがこれらに限定されないすべての刊行物は、個々の刊行物が十分に開示されているかの如く具体的かつ個別的に出典明示により本明細書の一部とすることが明示されているかのように出典明示により本明細書の一部とする。
【００４１】
実験
本発明は、下記の化合物で説明されている。
【００４２】
化合物は、ACD/Name PRO 6.02化学名命名ソフトウェア(Advanced Chemistry Development Inc., Toronto, Ontario, M5H2L3, Canada)を用いて命名される。
【００４３】
「エナンチオマー１」は、未知の絶対立体化学の単一エナンチオマーを示す。
【００４４】
プロトン磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、３００、４００もしくは５００ＭＨｚのＶａｒｉａｎ装置または３００もしくは４００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ機器のいずれかで記録された。化学シフトは、内部標準として残存溶媒系を用いてｐｐｍ（δ）単位で記録される。分裂パターンは、ｓ、シングレット；ｄ、ダブレット；ｔ、トリプレット；ｑ、カルテット；ｍ、マルチプレット；ｂｒ、ブロードで示される。ＮＭＲスペクトルは、２５〜９０℃の範囲の温度で記録された。
【００４５】
質量スペクトル（ＭＳ）は、ＥＳ（＋）およびＥＳ（−）イオン化モードで作動する、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭＳＤ  １１００質量分析計、ＨＰＬＣ装置Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ［ＬＣ／ＭＳ−ＥＳ（＋／−）：Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＡＢＺ＋Ｐｌｕｓ（３３ｘ４．６ｍｍ、３μｍ）（移動相：１００％［水＋０．１％ＨＣＯ２Ｈ］１分間、次いで、１００％［水＋０．１％ＨＣＯ２Ｈ］〜５％［水＋０．１％ＨＣＯ２Ｈ］および９５％［ＭｅＣＮ］で５分、最終的にこれらの条件下で２分間；Ｔ＝４０℃；流速＝１ｍｌ／分）を用いて行われる分析；ＬＣ／ＭＳ−ＥＳ（＋／−）：Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＡＢＺ＋Ｐｌｕｓ（３３ｘ４．６ｍｍ、３μｍ）（移動相：１００％［水＋０．０５％ＮＨ３］１分間、次いで、１００％［水＋０．０５％ＮＨ３］〜５％［水＋０．０５％ＮＨ３］および９５％［ＭｅＣＮ］で５分、最終的にこれらの条件下で２分間；Ｔ＝４０℃；流速＝１ｍｌ／分）上で行われる分析］と連動してＥＳ（＋）およびＥＳ（−）イオン化モードで作動する、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＬＣ／ＭＳＤ  １１００質量分析計で得られた。質量スペクトルにおいて、分子イオンクラスターにおけるピークは１つのみ記録される。全イオン電流（ＴＩＣ）およびピークに関連するＭＳおよびＵＶスペクトルを一緒に伴うＤＡＤ  ＵＶクロマトグラフィートレースは、２９９６  ＰＤＡ検出器を備え、正または負のエレクトロスプレーイオン化モードで作動するＷａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ（商標）質量分析計と連動するＵＰＬＣ／ＭＳ  Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）システム上でも得られた。［ＬＣ／ＭＳ−ＥＳ（＋／−）：Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（５０ｘ２１ｍｍ、粒径１．７μｍ）、カラム温度４０℃（移動相：Ａ−水＋０．１％ＨＣＯＯＨ／Ｂ−ＭｅＣＮ＋０．０７５％ＨＣＯＯＨ、流速：１．０ｍｌ／分、勾配：ｔ＝０分  ３％Ｂ、ｔ＝０．０５分  ６％Ｂ、ｔ＝０．５７分  ７０％Ｂ、ｔ＝１．４分  ９９％Ｂ、ｔ＝１．４５分  ３％Ｂ）を用いて行われる分析］。
【００４６】
キラル分離およびキラルクオリティーコントロールについて、２つの異なる技法を用いた：１）超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）：分析的クロマトグラフィーはＢｅｒｇｅｒ  ＳＦＣ  Ａｎａｌｙｔｉｘ上で行われたが、分取ＳＦＣについては、Ｇｉｌｓｏｎ  ＳＦＣ  シリーズＳＦ３を用いた；２）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：キラル分取ＨＰＬＣはＷａｔｅｒｓ  ６００  ＨＰＬＣシステムおよびＡｇｉｌｅｎｔ  シリーズ１１００装置を用いて行われたが、分析的クロマトグラフィーについては、Ａｇｉｌｅｎｔ  シリーズ１１００  ＨＰＬＣを用いた。
【００４７】
マイクロ波照射に関する反応について、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｅｍｒｙｓ（商標）  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを用いた。
【００４８】
フラッシュシリカゲルクロマトグラフィーは、シリカゲル２３０−４００メッシュ（Ｍｅｒｃｋ  ＡＧ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙにより供給）またはＶａｒｉａｎ  Ｍｅｇａ  Ｂｅ−ＳｉプレパックカードリッジまたはプレパックＢｉｏｔａｇｅシリカカートリッジで行われた。
【００４９】
ＳＰＥ−ＳＣＸカートリッジは、Ｖａｒｉａｎにより供給されるイオン交換固相抽出カラムである。ＳＰＥ−ＳＣＸカートリッジで用いられる溶出液は、メタノール、次いで、メタノール中アンモニア溶液である。
【００５０】
Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ  ＬＰ抽出カートリッジは、Ｗａｔｅｒｓにより抽出されるイオン交換固相抽出カラムである。ＨＬＢカートリッジで用いられる溶出液は、水、次いで、メタノールである。
【００５１】
多数の製剤において、Ｂｉｏｔａｇｅ手動フラッシュクロマトグラフィー（Ｆｌａｓｈ＋）または自動フラッシュクロマトグラフィー（Ｈｏｒｉｚｏｎ）システムのいずれかを用いて精製が行われた。すべての装置は、Ｂｉｏｔａｇｅシリカカートリッジと連動する。
【００５２】
ＳＰＥ−ＳＩカートリッジは、ＶａｒｉａｎまたはＩＳＴ  Ｉｓｏｌｕｔｅにより供給されるシリカ固相抽出カラムである。
【００５３】
収率がラセミ混合物から単離された単一エナンチオマーに引用されている場合、これは、物質の最大限可能な収率（すなわち、１００％）がラセミ体の全質量の半分であることに基づいて計算されている。
【００５４】
振動円二色性（ＶＣＤ）の比較を以下のとおりに行った：
・分光計：４ｃｍ−１で操作されるＢｏｍｅｍ  ＣｈｉｒａｌＩＲ  ＶＣＤ分光計
・周波数範囲：２０００〜８００
・ＰＥＭ較正：１４００ｃｍ−１で較正されたＰＥＭ
・スキャン法：３つの１２０分のブロックスキャン／エナンチオマー
・溶媒（複数）：ＣＤＣｌ３
・濃度（複数）：［ ］  約４ｍｇ／１５０ｕｌ
・基準線補正法：エナンチオマー補正法
・付加的な処理：手動で基準線補正を行うＳａｖｉｔｓｋｙ−Ｇｏｌａｙ（９点）
平滑化
【００５５】
略語：
ＡｃＯＥｔ：  酢酸エチル
ＤＣＭ：      ジクロロメタン
Ｅｔ２Ｏ：    ジエチルエーテル
ＭｅＣＮ：    アセトニトリル
ＴＢＴＵ：    テトラフルオロホウ酸Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム
ＤＭＦ：      ジメチルホルムアミド
ＣＣｌ４：    四塩化炭素
ＤＩＰＥＡ：  ジイソプロピルエチルアミン
【実施例】
【００５６】
以下の製法において、各出発物質の後の、記載例または実施例への言及は、典型的には番号により提供される。これは、単に当該分野の化学者を支援するために提供されている。出発物質は、記載された群から必ずしも調製されているわけではない。
【００５７】
中間体１：（±）−（４−メチル−１−ピペラジニル）（１−ナフタレニル）酢酸
【化３】
2011521889.tif 000005
４５２μｌのＮ−メチルピペラジン（４．０７ｍｍｏｌｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、７００ｍｇの１−ナフタレンボロン酸（４．０７ｍｍｏｌｅ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）および３７５ｍｇのグリオキシル酸一水和物（４．０７ｍｍｏｌｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ）の７ｍｌのＭｅＣＮ中溶液に加えた。Ｎ−メチルピペラジンを加えた後、混合物を２４時間還流した。溶液は、ベージュ色沈殿物を形成して暗色になった。反応物を室温に冷却し、ＡｃＯＥｔ（１４ｍｌ）に注いだ。沈殿物を濾過し、真空乾燥した。次いで、それをＥｔ２Ｏで１時間トリチュレートして、ベージュ色固体として標記化合物を得た（１．１１ｇ、９６％）。1H NMR(400MHz, d6DMSO) δ 2.09-2.21 (3H, s), 2.23-2.71 (7H, m), 2.93-3.00 (1H, m), 4.66-4.74 (2H, m), 7.45-7.59 (3H, m), 7.65 (1H, d), 7.90 (2H, dd), 8.54 (1H. d); LC-MS [Supelcosil ABZ+Plus, 33x4.6mm, 3μm, 勾配: A: H2O +0.1% HCOOH/B: MeCN: 0%〜95% Bで3分、95%Bで1分、95%〜0%Bで0.1分、実行時間4.5分、流速:2ml/分]。Rt=0.261分。(m/z=285(M+H)+)。
【００５８】
化合物１：（±）−Ｎ−［（３，５−ジクロロフェニル）メチル］−２−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２−（１−ナフタレニル）エタンアミド
【化４】
2011521889.tif 000006
１．１１ｇの（４−メチル−１−ピペラジニル）（１−ナフタレニル）酢酸（中間体１，３．９ｍｍｏｌｅ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）中懸濁液に、１．３６ｍｌのＤＩＰＥＡ（７．８２ｍｍｏｌｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ）および１．５ｇのＴＢＴＵ（４．６９ｍｍｏｌｅ、Ｆｌｕｋａ）を加えた。１０分後、０．６２５ｍｌの３，５−ジクロロベンジルアミン（４．６９ｍｍｏｌｅ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ）を加えた。溶液は透明および暗色になり、それを室温にて２日間攪拌した。次いで、それをＡｃＯＥｔで希釈し、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液（２０ｍｌ）で洗浄した。相を分取し、有機層をＡｃＯＥｔ（３ｘ３０ｍｌ）で抽出した。合した有機層を水および氷（２ｘ５０ｍｌ）で再度洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮乾固して、粗化合物を得、溶出液としてＤＣＭ／ＭｅＯＨ  １０／０〜８／２の勾配を用いて、２５ｇシリカゲルカートリッジのフラッシュクロマトグラフィーに付して精製した。溶媒を減圧下で除去して、ベージュ色泡沫として標記化合物を得た（７８２ｍｇ、４６％）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 2.25-2.37 (3H, m), 2.38-2.78 (8H, m), 4.36 (1H, dd), 4.49 (1H, dd), 4.76-4.82 (1H, m), 6.96-7.01 (2H, m), 7.20 - 7.25 (1H, m), 7.29 - 7.39 (1H, m), 7.43 - 7.63 (4H, m), 7.86 (2H, dd), 8.37 (1H, d)。
【００５９】
中間体２：Ｎ−［（３，５−ジクロロフェニル）メチル］−２−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２−（１−ナフタレニル）エタンアミド  ジ−Ｏ，Ｏ’−ｐ−トルイル−Ｌ−酒石酸塩−エナンチオマー１
【化５】
2011521889.tif 000007
６８５ｍｇの（−）−ジ−Ｏ，Ｏ’−ｐ−トルイル−Ｌ−酒石酸（１．７７ｍｍｏｌｅ、Ｆｌｕｋａ）の４ｍｌのアセトン中溶液を、化合物１（（±）−Ｎ−［（３，５−ジクロロフェニル）メチル］−２−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２−（１−ナフタレニル）エタンアミド、７８２ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌｅ）の７ｍｌのアセトン中溶液に滴下した。反応物を３時間攪拌し、塩が沈殿した。白色沈殿物を濾過し、真空乾燥して、５２２ｍｇの白色粉末を得た。次いで、それを５ｍｌのアセトンで懸濁し、２時間還流温度で加熱し、次いで、一晩室温に冷却した。沈殿物を濾過し、乾燥して、白色固体として標記化合物を得た（３５４ｍｇ、４８％）。1H NMR(400MHz, d6DMSO) δ 2.01-2.14 (3H, m), 2.26-2.40 (6H, m), 2.58-2.74 (2H, m), 2.74-3.05 (2H, m), 3.06-3.62 (4H, m), 4.16-4.38 (2H, m), 4.81-4.85 (1H, m), 5.66-5.66 (2H, m), 7.09 (2H, d), 7.30 (4H, d), 7.38-7.42 (1H, m), 7.46-7.59 (3H, m), 7.68 (1H, d), 7.82 (4H, d), 7.87-7.98 (2H, m), 8.53 (1H, d), 8.77-8.86 (1H, m);キラルHPLC[Chiralcel OD, 25x4.6cm。流速: 10.8ml/分。UV検出:225nm。移動相:ｎ−ヘキサン/エタノール 70/30]:Rt=5.625分(98.28%ee)。
【００６０】
化合物２：（２Ｒ）−Ｎ−［（３，５−ジクロロフェニル）メチル］−２−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２−（１−ナフタレニル）エタンアミド
【化６】
2011521889.tif 000008
３５４ｍｇの中間体２（（Ｎ−［（３，５−ジクロロフェニル）メチル］−２−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２−（１−ナフタレニル）エタンアミド  ジ−Ｏ，Ｏ’−ｐ−トルイル−Ｌ−酒石酸塩−エナンチオマー１、０．４２８ｍｍｏｌｅ）を、ＤＣＭ（７ｍｌ）およびＫ２ＣＯ３の飽和溶液（７ｍｌ）の間に分配した。有機層をＫ２ＣＯ３の１０％溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮乾固して、白色固体として標記化合物を得た（１９０ｍｇ、定量的収率）。1H NMR(400MHz, CDCl3) δ 2.27-2.34 (3H, m), 2.37-2.72 (8H, m), 4.79-4.82 (1H, m), 7.00 (2H, d), 7.21-7.26 (1H, m), 7.33-7.43 (1H, m), 7.44-7.67 (4H, m), 7.81-7.94 (2H, m), 8.37 (1H, d); キラルHPLC[Chiralcel OD, 25x4.6cm。流速:10.8ml/分。UV検出:225nm。移動相:ｎ−ヘキサン/エタノール 70/30]: Rt=5.642分(98.28%ee)。
絶対立体化学は、コンパレータとして（アブイニシオＶＣＤ分析により測定された）既知の絶対立体化学の密接に関連するアナログを用いて、振動円二色性（ＶＣＤ）の比較を用いて測定した。
【００６１】
化合物３：（２Ｒ）−Ｎ−［（３，５−ジクロロフェニル）メチル］−２−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２−（１−ナフタレニル）エタンアミド塩酸塩
【化７】
2011521889.tif 000009
２０ｍｇの化合物２（（２Ｒ）−Ｎ−［（３，５−ジクロロフェニル）メチル］−２−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２−（１−ナフタレニル）エタンアミド、０．０４５ｍｍｏｌｅ）を、窒素下、乾燥フラスコ中にて４５０μｌの乾ＤＣＭで溶解した。次いで、４５μｌのＨＣｌのＥｔ２Ｏ中１Ｍ溶液（０．０４５ｍｍｏｌｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。次いで、溶液を３０分間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた粗固体をＥｔ２Ｏでトリチュレートした。固体を濾過し、乾燥して、砂色固体として標記化合物を得た（２１．３ｍｇ、定量的）。1H-NMR(CDCl3, 400MHz): δ 2.60-3.04 (4H, m), 2.76-283 (3H, m), 3.06-3.41 (4H, m), 4.18-4.30 (1H, m), 4.30-4.43 (1H, m), 4.83 (1H, br s), 6.80 (3H, d), 7.11-7.17 (1H, m), 7.44-7.61 (3H, m), 7.65-7.75 (1H, m), 7.84-7.94 (2H, m), 8.50 (1H, d), 12.53 (1H, br s); m/z (ES+): 442.3 [M+H]+。
【００６２】
生物学的アッセイ
グレリン受容体ＧＨＳ−Ｒのクローニング
ヒトＧＨＳ−Ｒを、ヒト視床下部ｃＤＮＡおよびｐＣＲ２．１にクローン化されたＴＯＰＯ  Ｔａからクローン化した。配列を確認した。発現分析のために完全遺伝子をｐＣＤＮに導入した。配列を再度確認し、プラスミドをＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションした。クローンをＦＬＩＰＲによりスクリーンした。
【００６３】
グレリン受容体ＧＨＳ−Ｒを一時的に発現する細胞の産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＳＶ４０ラージＴ抗原を安定発現するＨＥＫ２９３細胞）を、１０％（ｖ／ｖ）新生子牛血清および２ｍＭグルタミンを含有するＤＭＥＭで維持した。細胞を６０ｍｍ培養皿中で播種し、リポフェクトアミン試薬を用いて関連ＤＮＡ種を含有するｐＣＤＮＡ３でトランスフェクションする前に６０〜８０％密集度に成長させた（１８〜２４時間）。トランスフェクションについて、３μｇのＤＮＡを、０．２ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ(Life Technologies Inc.)中で１０μｌのリポフェクトアミンと混合し、１．６ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭの添加前に室温にて３０分間培養した。共トランスフェクション実験について、１．５μｇの各ｃＤＮＡ種を用いた。細胞を、リポフェクトアミン／ＤＮＡ混合物に５時間曝し、次いで、２ｍＬのＤＭＥＭ中１０％（ｖ／ｖ）新生子牛血清を添加した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を採取した。
【００６４】
培養した細胞からの膜調製物
４℃で予め冷却した試薬と共にプロトコルの全工程を行った。細胞ペレットを１０ｅ−４Ｍロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）（アセチル−ロイシル−ロイシル−アルギナル；Ｓｉｇｍａ  Ｌ２８８４）、２５μｇ／ｍＬバシトラシン（Ｓｉｇｍａ  Ｂ０１２５）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）および２ｘ１０ｅ−６Ｍペプスタイン（ｐｅｐｓｔａｉｎ）Ａ（Ｓｉｇｍａ）が追加された、５０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４０）を含有する１０容量のバッファーＡ２で再懸濁した。次いで、細胞を１リットルのガラス製ワーリングブレンダー中で２ｘ１５秒バーストさせて均質化し、次いで、５００ｇで２０分間遠心分離した。次いで、上清を４８，０００ｇで３０分間回転させた。ペレットを５秒間ボルテックスして４容量のバッファーＡ２で再懸濁し、次いで、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（１０−１５ストローク）で均質化した。この時点で、調製物をポリプロピレンチューブにアリコートし、−７０℃で保存した。
【００６５】
本発明の化合物を、以下のＧＴＰγＳアッセイにしたがってインビトロ生物活性について試験した：
【００６６】
ＧＨＳ−Ｒ  ＧＴＰγＳ機能的アゴニストアッセイプロトコル
アッセイする各化合物について、Ｏｐｔｉ透明底９６ウェルプレート中に、以下のものを加える：
（ａ）アッセイバッファー（２０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）＋１００ｍＭ  ＮａＣｌ＋１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調節）中で必要濃度に希釈された２０μｌの試験化合物（または非特異的結合対照として１０μｌのグアノシン５’−三リン酸（ＧＴＰ）（Ｓｉｇｍａ））；
（ｂ）アッセイバッファー中１００ｍｇ／ｍＬでコムギ胚芽凝集素−ポリビニルトルエン（ＷＧＡ−ＰＶＴ）シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）ビーズを懸濁し、次いで、膜（上記の方法にしたがって調製）と混合し、アッセイバッファー中で希釈し、１０μｇタンパク質および０．５ｍｇビーズ／ウェルを含有する６０μｌの最終容量を得ることにより調製された６０μｌのビーズ／膜／ＧＤＰミックス−混合物を４℃にて３０分間ローラー上で予め混合し、プレートに添加する直前に、最終濃度１０μＭのグアノシン５’二リン酸（ＧＤＰ）（Ｓｉｇｍａ；アッセイバッファー中で希釈）を加えた；
（ｃ）最終濃度０．３８ｎＭを得るためにアッセイバッファー中で３．８ｎＭに希釈された１０μｌのグアノシン５’［γ３５−Ｓ］チオ三リン酸、トリエチルアミン塩（Ａｍｅｒｓｈａｍ；放射能濃度＝３７ｋＢｑ／μｌまたは１ｍＣｉ／ｍｌ；比放射能１１６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
【００６７】
次いで、プレートを室温にて３０分間シェーカー上で培養し、次いで、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。プレートを、１分の正規化トリチウムカウントプロトコルでＷａｌｌａｃ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａカウンター中にて行った遠心分離が終わって３〜６時間後に読み取った。データを、４−パラメータロジスティック方程式を用いて分析した。定常活性を最小値として用いた。
【００６８】
ＧＨＳ−Ｒ  ＧＴＰγＳ機能的アンタゴニストアッセイプロトコル
［３５−Ｓ］の添加前に、１０ｕｌのヒトグレリンのアッセイバッファー中溶液を加え、ＥＣ８０（各アッセイについて測定）に等しい最終濃度を得ることを除く、機能的アゴニストアッセイについての上記プロトコル。
【００６９】
化合物１（トリフルオロ酢酸塩として）および化合物３をＧＨＳ−Ｒ  ＧＴＰγＳ機能的アンタゴニストアッセイ中で試験し、８．０以上のｐＫｉを得ることを見出した。
【００７０】
グレリン受容体ＧＨＳ−Ｒのクローニング
ヒトＧＨＳ−Ｒを、ヒト視床下部ｃＤＮＡおよびｐＣＲ２．１にクローン化されたＴＯＰＯ  Ｔａからクローン化した。配列を確認した。発現分析のために全遺伝子をｐＣＤＮに導入した。配列を再度確認し、プラスミドをＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションした。クローンをＦＬＩＰＲでスクリーンした。
【００７１】
ＧＨＳ−Ｒ  ｂａｃｍａｍウイルスの産生およびウイルス力価測定
ウイルス産生
ＧＨＳ−Ｒのオープン・リーティング・フレームを、ｐＣＤＮからｐＦａｓｔＢａｃｍａｍベクターに導入した。該ベクターを、昆虫細胞特異的ポリヘドリンプロモーターが哺乳類細胞−活性プロモーターで置き換えられている組み換えバキュロウイルス、この場合にはＣＭＶを産生するために用いた。次いで、これをＢａｃ発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＢａｃと共に用いた。簡潔に言えば、ベクターをＤＨ１０  ｂａｃ大腸菌に形質転換し、ｂａｃｍｉｄを形質転換した細胞から単離した。次いで、ｂａｃｍｉｄを、組み換えバキュロウイルス粒子の産生のために６ウェル皿にてＥｘＣｅｌｌ  ４２０（ＪＲＨ）培地中で成長させたＳｆ９昆虫細胞に導入した。
組み換えＧＨＳ−Ｒ  ｂａｃｍａｍウイルスを含有するこれらの細胞からの上清を採取した。次いで、該Ｐ０ウイルスストックを、ＥｘＣｅｌｌ  ４２０培地で２００ｍｌの１ｘ１０−６細胞／ｍｌ  Ｓｆ９細胞を感染させ、さらにウイルスを増殖し、Ｐ１ストックを得るために用いた。
次いで、該Ｐ１ウイルスストックを、１０ｘ１リットルの三角振盪フラスコのＰ２ウイルスストックを増幅するために用い、再度細胞から上清を採取した。次いで、これを、アッセイの哺乳類細胞を形質導入するために用いた。
【００７２】
ウイルス力価測定
ウイルス力価を、ウイルススケールアップのすべての段階にてｇｐ６４エンベロープ・タンパク質モノクローナル抗体を用いてプラークｅｌｉｓａ法で測定した。
ＳＦ９細胞を９６ウェルプレートにプレートアウトし、希釈範囲のウイルスを細胞に１時間加えた。ウイルスを除去し、１％メチルセルロースおよび培地ミックスを細胞に加え、４８時間培養した。次いで、細胞を、８分間ホルムアルデヒドおよびアセトンミックス中で固定した。次いで、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、正常なヤギ血清を２５分間加えた。次いで、これを除去し、ｇｐ６４モノクローナル抗体を２５分間加えた。次いで、ウェルをＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗マウス／ＨＲＰ結合抗体を２５分間加えた。ウェルを再度ＰＢＳで洗浄し、Ｔｒｕｅ  Ｂｌｕｅペルオキシダーゼ基質溶液（Kirkegaard & Perry Laboratories）を加え、６０分間培養した。
個々のウェルの青点をカウントし、希釈因子を考慮して、ウイルスのプラーク形成単位／ｍｌを測定した。
【００７３】
グレリン受容体ＧＨＳ−Ｒを一時的に発現するＵ２ＯＳ細胞の産生
アッセイの２４時間前に、密集度１００％のＵ２ＯＳ細胞を採取し、沈降させた。上清を除去し、細胞を培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｌ−グルタミン）で再懸濁した。Ｃｅｄｅｘ機器を用いて細胞をカウントし、細胞の濃度を培地を用いて調節し、２００Ｋ細胞／ｍｌ（１０Ｋ細胞／５０ｕｌ）を得た。
【００７４】
ヒトＧＨＳＲ  ＢＡＣＭＡＭウイルスを、適当な容量％（ウイルス力価が変わるように個々のＢＡＣＭＡＭウイルス群を計算）で細胞懸濁液に加えた。形質導入細胞懸濁液を、ＦＬＩＰＲ  ３８４−ウェル透明底プレートに５０ｕｌ／ウェルで分配した。細胞プレートを３７℃で一晩培養した。
【００７５】
化合物調製
方法Ａ
親化合物プレートを１００％ＤＭＳＯ中で調製した。最大濃度は３ｍＭであり（１０μＭの最終濃度を得）、連続して１／４希釈した。親プレートからの１ｕｌを娘プレートに導入し、それに５０μｌの化合物希釈物（タイロード｛Ｅｌｇａ水＋１４５ｍＭ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＫＣｌ＋２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１０ｍＭグルコース＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２｝を加えた。アゴニストアッセイについて、化合物バッファーも０．１％ＢＳＡを含有していた。該プレートをアッセイに用いた。グレリンを０．１％ＢＳＡを含有するバッファー中で必ず調製した。
【００７６】
方法Ｂ
親化合物プレートを１００％ＤＭＳＯ中で調製した。最大濃度は３ｍＭであり（１０μＭの最終濃度を得）、連続して１／４希釈した。親プレートからの１ｕｌを娘プレートに導入し、それに５０μｌの化合物希釈物（ＨＢＳＳ｛Ｅｌｇａ水＋１３７ｍＭ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＫＣｌ＋０．４１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ａｎｈｙｄ）＋２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋５ｍＭグルコース＋０．８１ｍＭ  ＭｇＳＯ４（ａｎｈｙｄ）＋１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２＋４．１６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３｝を加えた。アゴニストアッセイについて、化合物バッファーも０．１％ＢＳＡを含有していた。該プレートをアッセイに用いた。グレリンを０．１％ＢＳＡを含有するバッファー中で必ず調製した。
【００７７】
ＧＨＳＲアゴニストＢＡＣＭＡＭ  ＦＬＩＰＲアッセイプロトコル
方法Ｘ
培地を、細胞洗浄機を用いて、上記方法Ａにしたがって調製された、細胞プレートから吸引した（１０ｕｌの培地が残った）。細胞をローディングバッファー（タイロードバッファー−（Ｅｌｇａ水＋１４５ｍＭ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＫＣｌ＋２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１０ｍＭグルコース＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）＋１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２＋０．７１４ｍｇ／ｍｌプロベネシド（１Ｍ  ＮａＯＨで予め溶解）＋０．２５ｍＭブリリアントブラック＋２ｕＭ  Ｆｌｕｏ４染料）ですぐにロードして、３７．５℃にて５％ＣＯで９０分間培養した。プレートを、１０μｌの化合物を細胞に加えた蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）中に入れ、蛍光測定値を得た。蛍光の最大変化を、３００ｎＭ  ｈグレリンによって誘発される最大反応の割合としてプロットし、４−パラメータロジスティック方程式を用いて曲線に当てはめて、ｐＥＣ５０値を得た。化合物の内活性を、ｈグレリン濃度反応曲線の最大漸近線に対するその濃度反応曲線の最大漸近線を用いることにより計算した。
【００７８】
方法Ｙ
培地を、細胞洗浄機を用いて、上記方法Ｂにしたがって調製された細胞プレートから吸引した（１０ｕｌの培地が残った）。細胞をローディングバッファー（ＨＢＳＳ（Ｅｌｇａ水＋１３７ｍＭ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＫＣｌ＋０．４１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ａｎｈｙｄ）＋２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋５ｍＭグルコース＋０．８１ｍＭ  ＭｇＳＯ４（ａｎｈｙｄ））＋１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２＋４．１６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３＋０．７１４ｍｇ／ｍｌプロベネシド（１Ｍ  ＮａＯＨで予め溶解）＋０．２５ｍＭブリリアントブラック＋２ｕＭ  Ｆｌｕｏ４染料）ですぐにロードして、３７．５℃にて５％ＣＯで９０分間培養した。プレートを、１０μｌの化合物を細胞に加えた蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）中に入れ、蛍光測定値を得た。蛍光の最大変化を、３００ｎＭ  ｈグレリンによって誘発される最大反応の割合としてプロットし、４−パラメータロジスティック方程式を用いて曲線に当てはめて、ｐＥＣ５０値を得た。化合物の内活性を、ｈグレリン濃度反応曲線の最大漸近線に対するその濃度反応曲線の最大漸近線を用いることにより計算した。
【００７９】
ＧＨＳＲアンタゴニストＢＡＣＭＡＭ  ＦＬＩＰＲアッセイプロトコル
１０μｌの化合物を、ＦＸロボットを用いて、上記方法ＡまたはＢのいずれかにしたがって調製された、細胞プレートに加え、次いで、プレートをさらに３０分間培養し（３７．５℃、５％ＣＯ２）、その後に、１０μｌのＥＣ８０濃度のｈグレリンを細胞に加えた、ＦＬＩＰＲでアッセイし、蛍光測定値を得た。蛍光の最大変化をプロットし、４−パラメータロジスティック方程式を用いて曲線に当てはめて、ｐＩＣ５０値を得た。
【００８０】
化合物３をＧＨＳＲアンタゴニストＢＡＣＭＡＭ  ＦＬＩＰＲアッセイ（方法Ｂ）で試験し、８．０のｐＩＣ５０値が得られることを見出した（該データは、表示値の±０．５以内まで正確であると考えられる）。
【００８１】
化合物３をＧＨＳＲアゴニストＢＡＣＭＡＭ  ＦＬＩＰＲアッセイ（方法Ｙ）で試験し、＜５．７のｐＥＣ５０値が得られることを見出した（該データは、表示値の±０．５以内まで正確であると考えられる）。
【国際調査報告】
2011521889.tif 000014
2011521889.tif 000015