(57)【要約】  前立腺癌の診断又は予後判別のためのある分析は、ＧＳＴＰ、ＡＰＣ、及びＲＡＲβ２遺伝子のハイパーメチル化の検出を組み込み、かつ、これをノモグラムに組み込むことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＳＴＰ１、ＡＰＣ、ＲＡＲβ２又はこれらの組み合わせの存在を検出するための試薬を含む、前立腺癌に関連する遺伝子のハイパーメチル化を検出するキットであって、前記試薬には、表１に示されているプライマー、プローブ、及びスコーピオン試薬からなる群から選択されるプライマー、プローブ、又はスコーピオン試薬が含まれる、キット。
【請求項２】
ＧＳＴＰ１、ＡＰＣ、ＲＡＲβ２遺伝子又はこれらの組み合わせのハイパーメチル化を試薬で検出することを含み、ここにおいて該試薬には、表１に示されているプライマー、プローブ、及びスコーピオン試薬からなる群から選択されるプライマー、プローブ、又はスコーピオン試薬が含まれる、前立腺癌の診断又は予後判定の方法。
【請求項３】
ハイパーメチル化の分析が、前立腺癌の診断又は予後判定の他のリスク因子又は指標と共に使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
他のリスク因子が、ノモグラムに含まれる、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第６１／０８６，２１８号（２００８年８月５日）の利益を主張する。
【０００２】
血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の測定は現在、前立腺癌スクリーニングの医療標準である。ＰＳＡ検査の特異性の低さから、多数の患者の不要な生検が結果として生じていることが示されており、通常、４ｎｇ／ｍＬを超える患者をスクリーニングできるＰＳＡ範囲に限定される。
【０００３】
新しい分析では、メチル化特異性ＰＣＲ（ＭＳＰ）を使用して、前立腺癌の存在を示唆する３つのマーカー（ＧＳＴＰ１、ＲＡＲβ２及びＡＰＣ）のプロモーター領域内にあるＣｐＧ島のメチル化（後成的変化）を検出する。この分析は、これまでに、９ヶ所の医療機関で採取されたＤＲＥ後の尿検体３３７件で評価が行われている（癌及び異型性１８７件／非癌１５０件）。患者は４０〜７５歳の年齢範囲であり、ＰＳＡレベルは２〜１０ｎｇ／ｍＬである。この分析の生検組織の前立腺癌の検出については、組織学検査による判定により、感受性５２％及び特異性８１％が観察された。ロジスティック回帰アルゴリズムにより、この分析については０．６７の曲線下面積（ＡＵＣ）値が提示された。この分析をノモグラム又はＰＣＰＴリスクカルキュレーターと共に使用した場合、ノモグラム又はＰＣＰＴリスクカルキュレーターのみの場合に比べて、ＡＵＣの増加（０．６９及び０．７２）、並びに、示された統計的有意性（ｐ＝０．００８及び０．０４３）が提示された。陽性であるマーカーが１つ（４８％）、２つ（６０％）、又は３つ（７１％）であった場合、同じ被験者について、この分析の陽性適中率は増大した。最適化された分析手順に従って、１８０件のＤＲＥ後尿検体（癌及び異型性１０３件／非癌７７件）のサブセットが調製された場合、感受性６０％及び特異性８１％（ＡＵＣ  ０．７２）が観察された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、前立腺癌に関連する遺伝子のハイパーメチル化を検出するための分析に関連し、ＧＳＴＰ１、ＡＰＣ、ＲＡＲβ２又はこれらの組み合わせの存在を検出するための試薬を含む。
【０００５】
本発明の別の態様において、この試薬には、表１に記載されているプライマー、プローブ、及びスコーピオン試薬からなる群から選択されるプライマー、プローブ、又はスコーピオン試薬が含まれる。
【０００６】
本発明の別の態様において、この分析は、前立腺癌が疑われる患者の診断又は予後を判定するため、ノモグラムと共に使用される。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
ＧＳＴＰ、ＡＰＣ、及びＲＡＲβ２マーカーの検出を含むハイパーメチル化分析は、例えば、米国特許公報第２００８０２５４４５５号に記載されており、これは参考として本明細書に組み込まれる。これらの分析は現在改善されており、他の診断及びリスク因子指標と共に使用することができる。
【０００８】
一見健康で、前立腺癌の既往のない男性３３７人からなる母集団での研究において、９ヶ所の異なる泌尿器科医療施設で尿検体が採取された。定義されたＤＲＥの後、尿検体（最高４０ｍＬ）が採取された。このＤＲＥには、前立腺表面を０．５〜１．０ｃｍ押し、底部から頂部へ、及び側方から正中線方向へと移動し、１葉当たり最低３回押すことが含まれる。採尿容器の内容物を、０．５Ｍ  ＥＤＴＡが８００μＬ入った５０ｍＬ輸送用試験管に移した。この輸送用試験管を採取後最長３日間、２〜８℃で保管し、標準の氷詰めと共に翌日到着便で輸送された。受け取り次第、輸送用試験管をすぐに４℃で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけるか、又は二等分量に分けてから、４℃で１０分間、３０００ｇの遠心分離にかけた。尿検体を分割したのは、検体調製の最適化と、全体の性能の見積りとに役立てるためである。上清を捨て、結果として得られたペレットを冷ＰＢＳで洗った。ＤＮＡは、パッケージ同梱書類に従い、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社（ドイツ））を使用して抽出され、及び、Ｅｐｉｔｅｃｔ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社（ドイツ））を使用して修飾された。検体はすべて、２５μＬの容積に抽出された。修飾ＤＮＡ  ５μＬを、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社（カリフォルニア州サニーベール））で前立腺癌メチル化分析を使用して分析した。
【０００９】
２工程の多重ＭＳＰ分析において使用するため、３つのメチル化マーカー（ＧＳＴＰ１、ＲＡＲＢ、及びＡＰＣ）用のプライマー及びスコーピオンプローブ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州ノバート））、並びに内部対照のβ−アクチンが選択された。第１工程の増幅では、５μＬの増幅混合物、５μＬの酵素混合物及び５μＬの検体を、ＳｍａｒｔＣａｐ管（Ｃｅｐｈｅｉｄ社（カリフォルニア州サニーベール））に加えた。酵素混合物は、増幅工程及び検出工程の両方で使用する目的で配合され、８ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．００５％  ＢＳＡ、０．６Ｕ／μＬ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．０１６％ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含む。
【００１０】
増幅工程サイクルは次の通りであった：９５℃で５分間、次に９５℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、７０℃で３０秒間、及び７０℃で５分間のサイクルを１８サイクル。増幅混合物は、８種のプライマーとして、各２０ｎＭのＧＳＴＰ１、ＲＡＲＢ、ＡＰＣ、１６ｎＭのβ−アクチン、７５ｍＭのＤ−トレハロース無水物、０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０溶液１０％、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０、１Ｍ）、１．７５ｍＭのＭｇＣｌ２溶液、１％のＤＭＳＯ、０．１５５ｍＭのｄＮＴＰ混合物、０．０１６％のＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００を含む。
【００１１】
増幅工程が完了したら、ＳｍａｒｔＣａｐ管を装置から取り出した。第２工程である検出工程には、５μＬの検出混合物及び５μＬの酵素混合物をＳｍａｒｔＣａｐ管に加えることが含まれた。分析サイクルは次の通りであった：９５℃で５分間、次に９５℃で２０秒間、及び５５℃で３０秒間のサイクルを４０サイクル。検出混合物は、次の点を除き、上記の増幅混合物に記述されているものと全く同様に配合された：８種のプライマーの代わりに、４種のプライマーとして各２００ｎＭのＧＳＴＰ１、ＲＡＲＢ、ＡＰＣ及びβ−アクチン、並びに４つのスコーピオンプローブとして各２００ｎＭのＧＳＴＰ１、ＲＡＲＢ、ＡＰＣ及びβ−アクチンを使用した。分析の有効性を判定するために、各分析実施において、陰性（β−アクチン）及び陽性（ＧＳＴＰ１、ＡＰＣ、ＲＡＲβ２）の合成外部対照が利用された。
【００１２】
分類分析は、研究母集団における患者の既知の生検結果に基づいて行われた。サイクル閾（Ｃｔ）値は、ＧＳＰＴ１、ＲＡＲβ２及びＡＰＣマーカーに関する独立した分析カットオフを生成するのに使用された。不十分なＤＮＡ量によって生じた無試験率（ＮＴＲ）を判定するには、β−アクチンのＣｔ値カットオフが使用された。検体は、３つのメチル化マーカーのうちの１つのＣｔ値が既定のカットオフ値を下回った場合、メチル化に関して陽性と見なされた。既定のカットオフ値を上回るＣｔ値の検体は、メチル化に関して陰性として記録された。ＮＴＲは、β−アクチンのＣｔカットオフに基づいて算出された。操作受診者曲線下面積（ＡＵＣ）値は、受診者操作特性（ＲＯＣ）分析に基づいて算出された。単独マーカー及び複数マーカー分析のＡＵＣ値は、ＭｅｄＣａｌｃ（ＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社（ベルギー））を使用して生成された。ロジスティック回帰モデルは、複数マーカー分析について、ＭｅｄＣａｌｃを使用して生成された。
【００１３】
この分析は、前立腺癌患者を、生検結果が陰性の患者から区別する性能について評価された。生検結果が陰性及び陽性の男性におけるＧＳＴＰ１、ＲＡＲβ２、及びＡＰＣのＣｔ値は、有意に差があり（それぞれｐ＝０．００９、０．０００及び０．０３９）、陽性のＲＯＣ曲線を示した。３つのマーカーを合わせて、この分析は、生検組織に対する組織学的所見による判定により、前立腺癌の検出に関して、５２％の感受性及び８１％の特異性を示した（８４件の癌、及び１０４件の非癌が正しく検出された）。この分析における偽陽性の多くは、異常なＤＲＥを有していた、及び／又は複数のマーカーが陽性であった。偽陽性の説明として可能性があるものとしては、前立腺生検時のサンプリングエラー、又は、メチル化されたが癌ではない前立腺細胞の存在がある。３つのマーカーすべてを用いたロジスティック回帰アルゴリズムの結果、ＡＵＣ値は０．６７であった。合計血清ＰＳＡは、誰が前立腺生検を受けるべきかを判定するリスク因子として一般的に利用されている。ＰＳＡの性能と、前立腺癌メチル化分析の性能とが比較された。ＰＳＡのＲＯＣ曲線分析は、この研究母集団においてＡＵＣが０．５５を示したが、本発明の分析は、ＰＳＡのみの場合に比べて、統計的有意性（ｐ＝０．０１）を示した。より重要なこととして、単一変数及び複数変数の両方のロジスティック回帰モデルによって、この分析は、複数のリスク因子を分析した場合でさえも、前立腺癌についての有意な予測指標であった（ｐ＝０．００１）。
【００１４】
ＰＳＡ単独よりも、ノモグラム又は予測アルゴリズムにおける複数リスク要因の組み合わせは、より優れた有効性と効率をもたらしていることが、出版されている文献においてますます大きな傾向となっている。前立腺癌メチル化分析、ＰＳＡ、ＤＲＥ結果、及び患者の年齢を含む一般的に使用されているノモグラム、並びにＰＣＰＴリスクカルキュレーターの比較が示されている。ＰＣＰＴリスクカルキュレーターパラメーターについての情報は、２５３人の被験者から入手された。このノモグラムを使用したロジスティック回帰アルゴリズムは、ＡＵＣ値が０．６１の結果を生じた。興味深いことに、ＰＣＰＴリスクカルキュレーターは、ＡＵＣが０．６７の結果を生じた。前立腺癌メチル化分析は、ノモグラム又はＰＣＰＴリスクカルキュレーターと比較したとき、統計学的に有意ではなかった（それぞれｐ＝０．１５０及び０．９３５）。しかしながら、この分析は、ノモグラム又はＰＣＰＴリスクカルキュレーターと共に使用した場合、ノモグラム又はＰＣＰＴカルキュレーター単独の場合に比べて、ＡＵＣを改善し（それぞれ０．６９及び０．７２）、統計的有意性を示した（それぞれｐ＝０．００８及び０．０４３）。前立腺癌メチル化分析を更に評価するために、個々の医療機関からのデータが評価された。ＲＯＣ曲線の独立分析が実施された場合、医療機関と試験全体の母集団との間の差は、有意ではなかった。
【００１５】
この分析の適中率は、ＧＳＴＰ１、ＲＡＲβ２及びＡＰＣマーカーの高い特異性により強調される。患者コホートが、マーカー１つが陽性、マーカー２つが陽性、又はマーカー３つが陽性の場合に従って階層化された場合、この分析性能の陽性適中率（ＰＰＶ）が改善された（４８％〜７１％）。このことは、この分析で、２つ又はそれ以上のマーカーが存在する場合、癌を有する可能性が高いということを示す。
【００１６】
前立腺細胞のメチル化分析の適中率は、この分析の高い特異性によって強調される。これは、発現に基づく分析に比べて、ＭＳＰ手法を採用していることによるものであり得る。この分析のマーカーは、それぞれ９０％、８９％及び９５％と、高い特異性を示した。ＰＣＡ３マーカーに対するこの分析の他の利点は、３遺伝子多重分析の独特の性質により、患者が複数のマーカーを呈した場合に、臨床医がより高い信頼度を有することができる点である。２５％癌罹患率でこの分析で観察されたＰＰＶは、同じ被験者において、１つ（４８％）、２つ（６０％）、又は３つ（７１％）のマーカーが陽性である場合に向上した。
【００１７】
分析スコアを供給するのに使用されたアルゴリズムは、メチル化特異性ＰＣＲ（ＭＳＰ）Ｃｔ値の線形混合のロジスティック関数に基づいており、生検陽性の確率に関連づけられる。このモデルは、各個人を、高リスク値又は低リスク値に配置するため、判断がより容易になる。具体的には、「高」スコア（６０．００より大）は尤度比が３．０より大となり、「低」スコア（２９．００より小）は尤度比が０．３５より小となる。このスコアにより、患者は、生検陽性を有する確率に関して、より多くの情報を踏まえた議論を医師と行うことが可能になる。
■  スコア＝１００×１／［１＋ｅｘｐ（線形Ｃｔ混合）］、
■  式中、「線形Ｃｔ混合」は治験データに基づいて形成される：
■  １．７８８７＋（−０．０６８６×ＧＳＴＰ１＿Ｃｔ）＋（−０．０３９４７×ＲＡＲβ２＿Ｃｔ）＋（−０．０１２６３×ＡＰＣ＿Ｃｔ）＋（０．０９８６２×β−アクチン＿Ｃｔ）
【００１８】
他の既知のリスク因子と組み合わせた分析スコアは、陽性の前立腺生検の予測における、統計学的に有意な因子となる。このリスク因子には、年齢、前立腺癌の家族歴、ＰＳＡ濃度、人種、及び以前の陰性の前立腺生検が挙げられる。
【００１９】
表１の設計は、ＣｐＧＭ及びＣｐＧＵ  ＤＮＡについてマーカーが評価された場合の、元の実行可能性設計に比べて、改善された特異性を示す。ＣｐＧＵに比べてＣｐＧＭのＣｔ値の差が大きいほど、マーカー設計の特異性が大きくなる。
【００２０】
【表１】
2011530287.tif 000002
【００２１】
元のＧＳＴＰ１スコーピオン設計の不適切な折り畳みは、ｔａｑ開裂の基質として作用する可能性があり、これにより、失活分子の分解が生じ、新しいＧＳＴＰ１設計に比べて、バックグラウンドでの一定のずれが生じる。新しい設計は、全体的な性能を向上させる。
【００２２】
〔実施の態様〕
（１）  ＧＳＴＰ１、ＡＰＣ、ＲＡＲβ２又はこれらの組み合わせの存在を検出するための試薬を含む、前立腺癌に関連する遺伝子のハイパーメチル化を検出するキットであって、前記試薬には、表１に示されているプライマー、プローブ、及びスコーピオン試薬からなる群から選択されるプライマー、プローブ、又はスコーピオン試薬が含まれる、キット。
（２）  ＧＳＴＰ１、ＡＰＣ、ＲＡＲβ２遺伝子又はこれらの組み合わせのハイパーメチル化を試薬で検出することを含み、ここにおいて該試薬には、表１に示されているプライマー、プローブ、及びスコーピオン試薬からなる群から選択されるプライマー、プローブ、又はスコーピオン試薬が含まれる、前立腺癌の診断又は予後判定の方法。
（３）  ハイパーメチル化の分析が、前立腺癌の診断又は予後判定の他のリスク因子又は指標と共に使用される、実施態様２に記載の方法。
（４）  他のリスク因子が、ノモグラムに含まれる、実施態様３に記載の方法。
【配列表】
2011530287000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年4月7日(2011.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
【表１】
2011530287.tif 000003
【国際調査報告】
2011530287.tif 000004
2011530287.tif 000005
2011530287.tif 000006