(57)【要約】  本発明は、発光ナノシステム（luminescent nanosystems）として使用するための、特に蛍光ナノシステム（fluorescent nanosystems）として使用するための、内径が１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満であるキャビティ内に封入されたサイズの異なる少なくとも２つの金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）を含むナノシステム；ならびに、それを得るための、および検出するための方法に関する。本発明はまた、前記発光ナノシステムの、蛍光プローブ、バイオマーカー、または造影剤としての使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内径が１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満であるキャビティ内に封入されたサイズの異なる少なくとも２つの金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）を含むナノシステムの発光ナノシステムとしての使用。
【請求項２】
前記キャビティが、ナノソーム、ミセル、および逆ミセルによって形成される群から選択されるナノシステムのコアであり、好ましくは、ナノソームの内部キャビティである、請求項１に記載のナノシステムの使用。
【請求項３】
前記キャビティが、ナノソームのコアであり、前記ナノソームは、ω‐ヒドロキシ酸およびω‐メルカプト酸を含む、請求項２に記載のナノシステムの使用。
【請求項４】
前記サイズの異なる少なくとも２つの金属ＡＱＣが：
−  ２から３０９個の金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦３０９）、
−  ２から１０２個の金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦１０２）、
−  ２から５５個の金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦５５）、または、
−  ２から２５個の金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦２５）、
から成ることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のナノシステムの使用。
【請求項５】
前記金属ＡＱＣの金属が、遷移金属、またはその組み合わせであり、好ましくは、前記遷移金属は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、およびその組み合わせから、より好ましくは、Ａｕ、Ａｇ、およびその組み合わせから選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載のナノシステムの使用。
【請求項６】
前記発光が、外部励起源による前記ナノシステムの励起後に得られる、請求項１から５のいずれか一項に記載のナノシステムの使用。
【請求項７】
前記発光が、蛍光である、請求項１から６のいずれか一項に記載のナノシステムの使用。
【請求項８】
ストークスシフトが、およそ１５０ｎｍ超、好ましくは、３００ｎｍ超である、請求項１から７のいずれか一項に記載のナノシステムの使用。
【請求項９】
前記発光が、０．１μｓよりも長い、好ましくは、１μｓよりも長い減衰時間を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のナノシステムの使用。
【請求項１０】
蛍光プローブ、バイオマーカー、または造影剤としての、請求項１から９のいずれか一項に記載のナノシステムの使用。
【請求項１１】
ａ）外部励起源を用いて、既定の励起波長（λｅｘｃ．）にて前記ナノシステムを励起する工程、および、
ｂ）前記ナノシステムの以下のパラメータ：
−  発光波長（λｅｍ．）
−  強度
−  平均寿命
−  異方性
のうちの１つ以上を適切な検出手段によって検出する工程、
を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノシステムを検出するための方法。
【請求項１２】
内径が１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満であるキャビティ内に封入されたサイズの異なる少なくとも２つの金属ＡＱＣを含み、前記金属ＡＱＣの金属が、Ａｕ以外の遷移金属、または遷移金属の組み合わせである、ナノシステム。
【請求項１３】
前記遷移金属が、好ましくは、ＡｇおよびＣｕから選択される、請求項１２に記載のナノシステム。
【請求項１４】
前記キャビティが、ω‐ヒドロキシ酸およびω‐メルカプト酸を含むナノソームの内部キャビティであり、ならびに前記サイズの異なる少なくとも２つの金属ＡＱＣが：
−  ２から３０９個の金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦３０９）、
−  ２から１０２個の金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦１０２）、
−  ２から５５個の金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦５５）、または、
−  ２から２５個の金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦２５）、
から成ることを特徴とする、請求項１２または１３のいずれか一項に記載のナノシステム。
【請求項１５】
ａ）ω‐ヒドロキシ酸およびω‐メルカプト酸を、水性媒体中、塩基の存在下にて混合することによってナノソームを作製する工程、
ｂ）工程ａ）で作製した前記混合物へ、少なくとも１つの金属塩を添加する工程、ならびに、
ｃ）工程ｂ）で得られた前記混合物を還元する工程、
を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のナノシステムを得るための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光ナノシステム（luminescent nanosystems）として使用するための、特に蛍光ナノシステム（fluorescent nanosystems）として使用するための、金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）を含むナノシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
今日、蛍光分光分析、蛍光顕微鏡検査、フローサイトメトリー、または生体内蛍光イメージングなどの蛍光技術の使用により、生体分子間の相互作用、またはこれらの生体分子と、例えば薬物などのその他の無機もしくは有機分子との間の相互作用を、迅速に、明確に、信頼性高く、簡便に検出することが可能となっている。これらの技術は、励起波長（λｅｘｃ．）、発光波長（λｅｍ．）、強度もしくは量子収率、平均寿命、および蛍光異方性などの特定の実験パラメータの測定を必要とする。
【０００３】
創薬、遺伝子解析、フローサイトメトリー、または高速スクリーニングにおいてナノセンサーまたはバイオプローブとして用いるのに適する蛍光プローブは、以下の特性を有するべきであり：それは、その周囲に存在するマトリックスに影響を及ぼすことなく励起可能でなければならず、検出が容易であり、高い量子収率を有し、細胞培養物を例とする媒体に対して適合可能であり、安定であり、ならびに分子標識を可能とする官能基を有する。また、このような発光プローブは、長い平均寿命を有し、無毒性であり、およびその発光パラメータが経時で再現性を有することも好適であり得る。
【０００４】
今日、２００ｎｍを超える非常に大きなストークスシフト、および１マイクロ秒を超える長い減衰時間を有することが知られている唯一の蛍光システムは、希土類イオンに基づくものである。しかし、これらは、以下のような複数の欠点を示す：その蛍光特性を喪失しない形でマトリックス中にそれを組み込むことが困難であること；各希土類に対応して固定された特定の励起、発光、およびストークスシフト特性が存在するために、変化させることが容易ではないこと、ならびにそれらが高価である希少な物質であること。このようなシステムの例は、Sardar, D.K. et al., Biophotonics, January 2008；Resch-Genger, U., Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology II Springer Series on Fluorescence, 2010, Volume 9, Part 1, 3-40；Harma H. et al., Analytical Chemistry, 2005, 77, 2643-2648；米国特許第７４６５７４７  Ｂ２号；米国特許出願第２０１０／０２２４８３１  Ａ１号、および米国特許第４２８３３８２号に記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、希土類元素に基づくナノ粒子のこのような欠点を克服する発光プローブを見出すことが必要であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
驚くべきことに、本発明の筆者らは、非常に大きいストークスシフト、および現行技術で報告されているものと比較して非常に長い減衰時間を有する、希土類元素を用いない蛍光ナノシステムを発見した。このようなナノシステムは、内部キャビティまたはナノキャビティを含み、そこに、少なくとも２つのサイズの異なる金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）、好ましくは遷移金属の金属原子量子クラスターが封入されている。この内部キャビティの内表面は、ＡＱＣを適切に安定化させることが可能となるように官能化されており、前記キャビティは、ナノメートルオーダーの内径を有することで、前記ナノキャビティ内に存在する少なくとも２つのサイズの異なるＡＱＣ間の距離を約１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満としている。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、このことによって、発光を発生させるフェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を得ることが可能になるものと考えられる。これらのナノキャビティは、１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満の距離であるフェルスター距離よりも小さい内径を有することから、前記ナノキャビティ内に活性種のみが存在するとした場合、発光、特に蛍光の不活性化が防止され、これらのシステムによって、希土類に基づくシステムで得られるものよりも大きい高い量子収率を達成することが可能である。
【０００７】
励起および発光波長は、ナノシステムのナノキャビティ内に存在するＡＱＣのサイズに依存する。従って、励起および発光波長は、前記ナノキャビティ内の少なくとも２つのサイズの異なるＡＱＣ間にてＦＲＥＴが得られるように必要なサイズのＡＱＣの形成を指向することで、任意に選択することができる。ＦＲＥＴを最適化するために、ドナーのように作用するＡＱＣである小さいＡＱＣまたはサイズが小さい方のＡＱＣの発光波長（λｅｍ．）を、アクセプタのように作用するＡＱＣである大きいＡＱＣまたはサイズが大きい方のＡＱＣの励起と、可能な限り重なり合わせることが必要である。従って、得られることになるストークスシフトを任意に選択することができ、それによって、希土類に基づく蛍光法に存在する定められた特有の負担から開放される。さらに、用いられるＡＱＣの特徴に起因して、光退色が発生することがなく、および提案される方法の基礎としてＦＲＥＴプロセスを用いることで、１マイクロ秒よりも長い蛍光減衰時間が確保される。
【０００８】
非常に低濃度で存在する場合に無毒性である例えばＡｕまたはＡｇなどの遷移金属元素を用いることができる。さらに、これらの元素が自然界に非常に豊富であることにより、これは完全に持続可能な方法となる。合成される発光ナノシステムは：
−  自然光および室温下にて少なくとも１年間にわたる保存の間にその特性を喪失することのない安定性を有し、
−  ３から１０のｐＨ範囲にて安定であり、
−  濃縮乾固することができ、乾燥された形態であってもその蛍光特性を喪失することがなく、
−  乾燥された後、その蛍光特性を喪失することなく再溶解することができ、および、さらには、
−希土類元素に基づく発光システムで用いられるよりも低い濃度で用いられる。
【０００９】
ナノシステムは、異なる環境でそれを使用するために、その外部表面にてさらに官能化することができる。
【００１０】
従って、本発明の態様は、内径が１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満、好ましくは５ｎｍと等しいかまたはそれ未満であるキャビティ内に封入されたサイズの異なる少なくとも２つの金属原子量子クラスター（ＡＱＣ）を含むナノシステムの、発光ナノシステムとしての使用に関する。
【００１１】
本発明の別の態様は、前記蛍光ナノシステムを検出するための方法である。
【００１２】
さらなる態様は、内径が１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満であるキャビティ内に封入されたサイズの異なる少なくとも２つの原子量子クラスター（ＡＱＣ）を含むナノシステム自体に関し、ここで、ＡＱＣの金属は、Ａｕ以外の遷移金属、または遷移金属の組み合わせである。
【００１３】
本発明の別の態様は、内径が１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満、好ましくは５ｎｍと等しいかまたはそれ未満であるキャビティ内に封入されたサイズの異なる少なくとも２つの原子量子クラスター（ＡＱＣ）を含むナノシステムを得るための方法に関し、ここで、ＡＱＣの金属は、Ａｕ以外の遷移金属、または遷移金属の組み合わせである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明の概略図を示し、ここで、数字：１．ナノシステム、２．小ＡＱＣまたはドナー、３．大ＡＱＣまたはアクセプタ、４．ナノシステムの外部表面の官能化、５．内部キャビティの官能化、６．約１０ｎｍもしくはそれ未満であるフェルスター距離の範囲内であるナノキャビティの内径、７．より高いエネルギー準位への電子の励起（λｅｘｃ．）、８．発光（λｅｍ．）を意味し；および、矢印は、フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）の存在を示す。
【図２】図２は、ナノシステム、特に、ω‐ヒドロキシ酸およびω‐メルカプト酸がナノソームの単層を形成するナノソームの概略図を示し、ここで、単層は、およそ５ｎｍの厚さを有しており、酸基がナノソームの外部表面を形成して、ヒドロキシル、ＯＨ、およびメルカプト、ＳＨの基が内側を向いてナノソームの内部キャビティの表面を形成していることが観察される。
【図３】図３は、ナノシステムの内側、特に実施例１および２のナノソームの内側でのＡＱＣの形成の概略図を示す。第一の工程にて、ω‐ヒドロキシ酸およびω‐メルカプト酸が、塩基性媒体の存在下にて、水中でナノソームを形成する。第二の工程では、還元によって小ＡＱＣまたはドナー、および大ＡＱＣまたはアクセプタを生成する遷移金属または金属の組み合わせが添加される。この例では、各タイプのＡＱＣを１つだけ概略的に示しているが、キャビティの内側には、両方が様々な数で存在していてよい。
【図４】図４は、実施例１で得られたナノシステムのＨＡＡＤＦ  ＳＴＥＭ電子顕微鏡イメージを示し、金クラスターを含有するナノキャビティのおよそのサイズが１．５ｎｍであることが観察される。
【図５】図５は、図４のイメージのＥＤＸマップを示し、ナノシステムの組成を示しており、金クラスターが分子によって保護されて、ナノソームを形成していることが観察される（Ｃ、Ｏ、Ｓ）。
【図６】図６は、上記マップから抽出した、単独のナノシステムのＥＤＸスペクトルを示す。このスペクトルは、ナノシステムの範囲内にてＳおよびＯの著しいシグナルを示しており、Ａｕクラスターを保護するこれらの原子を含有する分子の存在（ナノソームのヒドロキシルおよびメルカプト酸）を示している。
【図７】図７は、実施例１で得られたナノシステムの蛍光を示し、ここで、Ａは、吸光度であり；Ｂは、６００ｎｍでの発光に対する励起曲線であり、およそ３００ｎｍの励起波長にてそれが最大となることが観察され、ならびにＣは、３００ｎｍでの励起に対する発光曲線であり、およそ６００ｎｍの波長にてそれが最大となることが観察される。この結果は、ストークスシフトが３００ｎｍであることを示している。強度Ｉは、任意単位（ａ．ｕ．）で測定され、波長（λ）は、ナノメートル（ｎｍ）単位である。
【図８】図８は、実施例２で得られた金ナノシステムのＨＡＡＤＦ  ＳＴＥＭ電子顕微鏡イメージを示す。クラスターを含有するナノキャビティのおよその内径は、およそ１．８ｎｍであることが観察される。クラスターの個々の原子も、キャビティ内部にて観察することができる。
【図９】図９は、実施例２で得られたナノシステムの蛍光を示し、ここで、Ａは、６２０ｎｍでの発光に対する励起曲線を表し、およそ２５０ｎｍの励起波長にてそれが最大となることが観察され、およびＢは、２５０ｎｍでの励起に対する発光曲線であり、およそ６２０ｎｍの波長にてそれが最大となることが観察される。この結果は、ストークスシフトが３７０ｎｍであることを示している。強度Ｉは、任意単位（ａ．ｕ．）で測定され、波長（λ）は、ナノメートル（ｎｍ）単位である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の以下の用語の意味を、以下で詳述する。
【００１６】
「ナノシステム」の用語は、両親媒性分子の１もしくは２つの層によって形成される回転楕円体様（spheroid-like）ナノメートルサイズ超分子構造を意味し、ここで、前記両親媒性分子は、ナノシステムの内側にナノキャビティを形成する。特に、ナノシステムは、外径がおよそ２０ｎｍと等しいかまたはそれ未満、好ましくは１８ｎｍと等しいかまたはそれ未満、より好ましくは１５ｎｍと等しいかまたはそれ未満である。ナノシステムの内側は、内径が１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満、好ましくは５ｎｍと等しいかまたはそれ未満、より好ましくは０．８から４ｎｍの間である少なくとも１つのナノキャビティから成る。特定の実施形態では、ナノキャビティの内径は、約１．５〜１．８ｎｍの間である。ナノシステムの限定されない例は、ナノソーム、ミセル、逆ミセル、ナノエマルジョン、またはマイクロエマルジョンである。
【００１７】
「回転楕円体様」の表現は、球に類似の形状である堅固な幾何学的形態を有することを意味する。
【００１８】
ナノシステムを形成する両親媒性分子は、同一であっても、または異なっていてもよく、好ましくは、２種類の異なる分子であってよく、各分子は、親水性および親油性の両方を有する。
【００１９】
親油性は、３０＞ｎ＞２、好ましくは２０＞ｎ＞１０であるＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−または−（ＣＨ２）ｎ−の形態の脂肪族鎖など、典型的には炭化水素部分である基によって与えられる。
【００２０】
親水性は、親水性基によって付与される。親水性基は、荷電基または極性の非荷電基であってよい。荷電基は、アニオン性基から選択され、好ましくは、カルボキシレート、サルフェート、スルホネート、およびホスフェートによって形成される群から選択される。極性の非荷電基は、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、および−ＮＲ−によって形成される群から選択され、ここで、Ｒは、短炭化水素鎖、Ｃ１‐Ｃ４、の有機アルキル基、好ましくはメチル、エチル、またはプロピル基を表す。
【００２１】
両親媒性分子は、１つの脂肪族ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−鎖、およびそれに結合した１つの親水性基を、または１つずつが脂肪族−（ＣＨ２）ｎ−鎖の各末端に結合した２つの親水性基を有してよい。
【００２２】
本発明の範囲内における「ナノソーム」の用語は、人工的に作製され、脂質層によって形成されたナノメートルサイズの小胞に関する。従って、「ナノソーム」の用語は、１つずつが脂肪族−（ＣＨ２）ｎ−鎖の各末端に結合した、または脂肪族ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−鎖の最後から三番目、χ、もしくは最後から二番目、ψ、の位置に結合した２つの親水性基を有する両親媒性分子（脂質）の１層によって形成される回転楕円体ナノメートルサイズ超分子構造を意味する。
【００２３】
従って、本発明のナノソームの前記単層を形成する脂質は（図２参照）：
−  脂肪族鎖の一方の末端に、例えばカルボキシル（ＣＯＯ−）またはホスフェート（ＰＯ４−）などの小胞の外表面上に存在する親水性基、を含み、ならびに、
−  脂肪族ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−鎖の最後から三番目、χ、最後から二番目、ψ、の位置にて、または脂肪族−（ＣＨ２）ｎ−鎖の最後、ω、の位置にて、例えば、Ｒがナノソームを形成することができる短炭化水素鎖、Ｃ１‐Ｃ４の有機基を表すものである−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、もしくは−ＮＲ−などの基によって置換されており、これらは、脂肪族鎖の他方の末端、または親水性基に対して前記脂肪族鎖の最も遠い位置にあって、小胞の内側に向かって位置し、前記基は、内径が１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満、好ましくは５ｎｍと等しいかまたはそれ未満、より好ましくは０．８から４ｎｍの間であるナノキャビティを形成する。特定の実施形態では、ナノキャビティの内径は、約１．５〜１．８ｎｍの間である。
【００２４】
「ミセル」の用語は、両親媒性分子凝集体を意味する。水性媒体中にて、分子凝集体の親油性ドメインは、ミセルの内側に向かって配向され、親水性ドメインは、媒体と接する。「逆ミセル」では、分子は、親油性領域が外側に露出し、親水性領域が内側に向くように構成される。現行技術では、「マイクロエマルジョン」の用語も、「逆ミセル」を意味するために用いられており、すなわち、「マイクロエマルジョン」は、「逆ミセル」の特定の実施形態である。「マイクロエマルジョン」の用語は、単一相であり、熱力学的に安定であり、ナノメートルサイズの液滴によって形成される、少なくとも３つの成分（水、油として一般的に知られる有機溶媒、および両親媒性化合物）の系を意味する。限定するものではないが、水滴が有機媒体中に分散されているものである油中水型マイクロエマルジョンの使用が、本発明にとって特に興味深い。このような油中水型マイクロエマルジョンの中でも、アクリルアミドまたは１，６‐ヘキサンジオールジアクリレートを例とするアクリルモノマーを水滴中に含有し、これらが、例えばラジカル光重合開始剤などの何らかの開始剤の導入によって重合されるものであるマイクロエマルジョンに関する重合されたマイクロエマルジョンの使用もまた、その安定性のために興味深い。このようにして、マイクロエマルジョン液滴を、より高い耐性を有するものとすることができる。
【００２５】
「ナノエマルジョン」の用語は、二相であり、熱力学的に不安定であるが化学的または物理的プロセスによって一時的に安定化され、ナノメートルサイズ液滴によって形成される、少なくとも３つの成分（水、有機溶媒、および安定化化合物）の系を意味する。ナノメートルサイズ液滴の形成が、ナノエマルジョンと現行技術で知られるエマルジョンとを区別する唯一のものであることから、「ナノエマルジョン」の用語は、一般的に、液滴がナノメートルサイズであるエマルジョンを意味する。
【００２６】
特定の実施形態では、ナノシステムは、ナノソーム、ミセル、および逆ミセルから形成される群より選択され、好ましくは、ナノシステムは、ナノソームである。
【００２７】
ナノシステムがナノソームである特定の実施形態では、ナノソームは、ω‐ヒドロキシ酸（ＨＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨ）およびω‐メルカプト酸（ＨＳ−（ＣＨ２）ｐ−ＣＯＯＨ）を含み、ここで、ｍおよびｐは、２から３０までの値を有し、好ましくは、ｍおよびｐは、１０から２０までの値を有する。特定の実施形態では、ｍおよびｐは、１５の値を有する。ｍおよびｐの値は、異なっていても、または同一であってもよい。ｍおよびｐが異なる場合、これらの差は炭素数６未満であり、好ましくは、ｍおよびｐの値の差は、１から４である。好ましい実施形態では、ｍおよびｐは同一である。ナノソーム中に存在するω‐ヒドロキシ酸およびω‐メルカプト酸は、２つの略同心球が形成されるように、または文献で称される脂肪酸「ボーラ」の形態となるように、その酸基、−ＣＯＯＨ（または、対応する酸の塩が用いられる場合は−ＣＯＯ−）がナノシステムの外表面に向き、−ＯＨおよび−ＳＨ基が内側に向いてナノソームの内部キャビティを形成することにより、球状単層を形成している。この球状単層は、およそ２〜１０ｎｍ、好ましくはおよそ５ｎｍの厚さを有し得る。
【００２８】
ナノシステムが逆ミセルである特定の実施形態では、逆ミセルは、少なくとも２つの異なる界面活性剤を含み、ここで、少なくとも一方は、その極性基としてチオールまたはチオエーテル基を含む。より具体的な実施形態では、少なくとも２つの界面活性剤は、アルコールエトキシレートおよびω‐メルカプト酸である。
【００２９】
ナノシステムの内部キャビティは閉じられている。上述のように、前記内部キャビティの内径は、１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満、好ましくはおよそ５ｎｍと等しいかまたはそれ未満であり、より好ましくは、前記内部キャビティの内径は、およそ０．８から４ｎｍの間である。特定の実施形態では、この内部ナノキャビティの直径は、およそ１．５〜１．８ｎｍの間である。ナノソームの特定の実施形態では、前記ナノキャビティは、ヒドロキシル、−ＯＨ、およびメルカプト、−ＳＨの基によって形成されるが、これらの官能基を、Ｒがナノソームを形成することができる短炭化水素鎖、Ｃ１‐Ｃ４、の有機基を表すものである−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ−などの金属と相互作用を起こすその他の基で置換することも可能である。
【００３０】
このようなナノソームの特定の例は、Gaillard, C., Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 337, 2, 610-613、に記載されており、これは、このようなナノシステムの内部での金粒子の合成について述べている。
【００３１】
ＡＱＣと略される「原子量子クラスター」の用語は、前述のように、金属原子量子クラスターとして理解される。金属原子量子クラスターは、ゼロ価酸化状態である金属原子Ｍｎからによってのみ形成され、金属原子数は２００未満であり（Ｍｎ、ｎ＜２００）、サイズは２ｎｍ未満である。ＡＱＣは、経時で安定である。
【００３２】
記載するナノシステムは、その内部キャビティ内に、すなわち封入された状態で、原子量子クラスターを含み、それは、もはや「金属」の様に挙動せず、分子の様に挙動するようになるゼロ価金属のファミリーであることが公知である。従って、塊（mass）としてのナノ粒子、マイクロ粒子、または金属物質では観察されない新しい特性が、このようなクラスターでは出現する。従って、ＡＱＣの物理化学的特性は、ナノ／マイクロ粒子のそれから単純に外挿することができるものではない。
【００３３】
本発明において、述べた内部キャビティ内に封入された前記ＡＱＣは、遷移金属またはその２つの金属から成る組み合わせの金属元素、Ｍｎ、によって形成され、少なくとも２つの異なるサイズでナノシステム中に存在し、ここで、ｎは、存在する金属原子の数であり、ｎは：
−  ２から３０９金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦３０９）、
−  ２から１０２金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦１０２）、
−  ２から５５金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦５５）、または、
−  ２から２５金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦２５）、
の値を有する。
【００３４】
本発明のＡＱＣは、およそ０．３から２．２ｎｍの間、好ましくはおよそ０．３から２ｎｍの間、より好ましくはおよそ０．３から１．８ｎｍの間から成るサイズを有する。
【００３５】
本発明の１つの実施形態は、内径が１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満、好ましくは５ｎｍと等しいかまたはそれ未満であるキャビティ内に封入されたサイズの異なる少なくとも２つの原子量子クラスター（ＡＱＣ）を含む上述のナノシステムの、発光ナノシステムとしての使用に関する。それは、好ましくは、蛍光ナノシステムとして用いられる。このようなナノシステムの使用において、ＡＱＣの金属Ｍは、遷移金属またはその組み合わせである。好ましくは、遷移金属は、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｐｔ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ｐｄ、Ｎｉ、Ｒｈ、およびこれらの組み合わせから選択され、好ましくは、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、およびこれらの組み合わせから選択され、より好ましくは、それは、Ａｕ、Ａｇ、およびこれらの組み合わせから選択される。
【００３６】
本発明の範囲において、「遷移金属の組み合わせ」の用語は、少なくとも２つの異なる遷移金属の原子を有するＡＱＣを、ならびに単一の遷移金属のＡＱＣが、第一のものとは異なる別の遷移金属のＡＱＣの存在下にて存在することを意味し、それによって、サイズの異なる少なくとも２つのＡＱＣが、同一の遷移金属を有するＡＱＣ、または異なる遷移金属を有するＡＱＣ、または同一もしくは異なる２つの金属から成る組み合わせを有するＡＱＣであり得る。
【００３７】
ＡＱＣｓの内部キャビティ内に少なくとも２つの異なるサイズが存在することにより、前記ナノシステムを発光ナノシステムとして用いることが可能となる。具体的な実施形態において、ナノソームの内部キャビティにＯＨおよびＳＨ基が存在することにより、少なくとも２つの種類のクラスターの生成およびそれらのサイズの選択が可能となるものであり、すなわち、ＯＨ／ＳＨ比を変化させることにより、図２および３にて概略的に示されるように、生成される２つの種類のクラスターのサイズを選択することができる。
【００３８】
合成されることになるクラスターのサイズは、［メルカプト］／［Ｍ］＝Ｒ１および［ヒドロキシル］／［メルカプト］＝Ｒ２の濃度比によって決定される。
【００３９】
比Ｒ１は、小さい方のクラスター、ドナークラスターのサイズを決定するものであり、それは、比を増加させると、生成される小さい方のクラスターのサイズが低下する形で行われる（「成長停止（arrested growth）」）。
【００４０】
比Ｒ２は、大きい方のクラスター（アクセプタクラスター）のサイズを決定するものであり、それは、この比を増加させると、生成される大きい方のクラスターのサイズが上昇する形で行われる。
【００４１】
ＡＱＣの「異なるサイズ」の表現は、少なくとも２つのＡＱＣが、少なくとも３個の金属原子分の数の差を有することを意味する。好ましくは、それらは、少なくとも４個の金属原子分の数の差を有する。より好ましくは、それらは、少なくとも５個の金属原子分の数の差を有する。
【００４２】
特定のいかなる理論にも束縛されるものではないが、発光は、フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって発生するものと考えられ、これには、励起波長（λｅｘｃ．）でのフルオロフォアによるエネルギー吸収、およびこれに続く、励起波長よりも長い発光波長（λｅｍ．）、すなわちλｅｍ．＞λｅｘｃ．、での別のフルオロフォアによる発光が関与している。ＦＲＥＴを発生させる相互作用は、およそ１０ｎｍに等しいかまたはそれ未満という非常に短い距離にて、一方の発光波長が他方の励起波長と一致する２つの蛍光分子の２つの電子励起状態間でのみ生ずる。この励起エネルギーは、放射線なしで、双極子‐双極子分子間結合を通して転移される。λｅｘｃ．およびλｅｍ．の両波長は、数十または数百ナノメートルで隔てられている。この波長差が、ストークスシフト、δｓｔｏｋｅｓ＝λｅｍ．−λｅｘｃ．、として知られるものである。
【００４３】
従って、本発明の範囲内において、サイズの異なる少なくとも２つのＡＱＣ間にてフェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を通して発光を発生させるために、ドナーＡＱＣの様に作用するサイズが小さい方のＡＱＣ、または励起クラスターが、特定の励起波長にて外部励起を受け、従ってそれが、励起された電子状態となる。この励起エネルギーは、図１に概略的に示されるように、１０ｎｍのフェルスター距離に等しいかもしくはそれ未満の距離にあるアクセプタＡＱＣまたは発光クラスターへ転移される。
【００４４】
クラスターの励起および発光波長の近似的な推定は、ジェリウムモデルによる近似によって求めることができる（例えば、J.Calvo et al., Encyclopedia of Nanotechnology, Ed. by B. Bhushan, Springer Verlag, 2011、を参照）。このモデルは、クラスターの禁止（prohibited）エネルギーバンドギャップを、従って、その発光バンドギャップの位置を、ある程度近似的な態様で予測するものである。次に、クラスターの励起バンドギャップは、この発光バンドギャップから、特定のサイズのクラスターにおけるストークスシフトがおよそ５０〜１００ｎｍであることを考慮に入れて予測することができる。以下の表、表１は、このモデルに従うＡｕまたはＡｇのＡＱＣについての理論データを示しており、すなわち、ＡｕまたはＡｇのＡＱＣにおける近似的な励起λｅｘｃ．および発光λｅｍ．の波長を、前記ジェリウムモデル（Ｅｅｍ＝ＥＦ／Ｎ１／３；Ｅｅｍ＝発光エネルギー；Ｎ＝ＡＱＣ中の原子数；およびＥＦ＝金および銀について同一でありおよそ５．５ｅＶであるフェルミレベル）によって±５０ｎｍの誤差にて算出した。
【００４５】
【表１】
2014523932.tif 000002
【００４６】
これらの値はまた、実際には、ナノシステムが、ナノシステムの内部キャビティ内にてＯＨおよびＳＨ基を他のリガンドと交換するように反応するよう作製される場合、変動する場合もある。限定されるものではないが、交換されるリガンドは、Ｒがナノソームを形成することができる短鎖有機基を表すものである−ＮＨ２、−ＮＨ−、−Ｃｌ、−ＰＨ３、−ＳＲ、−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＮＨＲ、−ＮＲ−から選択することができる。
【００４７】
本発明に関して、記載の発光ナノシステムは、およそ１５０ｎｍ超、好ましくはおよそ３００ｎｍ超のストークスシフトを示す。
【００４８】
言い換えると、特定の励起および発光波長を得るために用いられるクラスターの種類は、上記の表から決定することができる。従って、例えば、３００ｎｍの励起波長、５５０ｎｍの発光波長、および２５０ｎｍのストークスシフトを有する系を得るためには、以下のクラスターサイズが選択されるべきである：
−  励起クラスター（「ドナー」）：Ａ３／Ａ４、
−  発光クラスター（「アクセプタ」）：Ａ１２
【００４９】
従って、本発明の別の態様は：
ａ）外部励起源を用いて、励起波長λｅｘｃ．にてナノシステムを励起する工程、および、
ｂ）前記ナノシステムの以下のパラメータ：
−  発光波長（λｅｍ．）
−  強度
−  平均寿命
−  異方性
のうちの１つ以上を適切な検出手段によって検出する工程、
を含む、前記ナノシステムを検出するための方法に関する。
【００５０】
好ましい実施形態では、ナノシステムを検出するための方法は、以下のパラメータ、発光波長、強度、平均寿命、または異方性のうちの１つ以上を検出するための工程ｂ）が、特定の遅延時間にて実施されることをさらに含む。この実施形態は、本発明のナノシステムの発光の半減期の時間が、０．１μｓよりも長いという事実に基づいている。パラメータの１つ以上の検出および測定のための遅延時間は、０．１μｓよりも長く、好ましくは、１μｓよりも長い。これによって、外部励起源を用いた励起波長λｅｘｃ．における励起後に、本発明のナノシステム物体の発光波長に加えて作り出され得る他の発光波長λｅｍ．に起因して起こり得る干渉が防止される。
【００５１】
「励起」とは、本発明の範囲において、特定の波長の光放射線によってナノシステムを照射することとして理解される。
【００５２】
「適切な検出手段」は、当業者に公知である、示したパラメータを検出し、所望に応じて測定するための方法に関し、すなわち、発光、特に蛍光の発光波長を検出するための方法、発光、特に蛍光の強度を検出するための方法、発光の強度の平均寿命を検出するための方法、または異方性を検出するための方法に関する。
【００５３】
ナノシステムの内部ナノキャビティ内には他の分子は存在しないことから、エネルギーは、放散または喪失することがなく、すなわち、発光が維持される。具体的な実施形態において、サンプルを３０秒ごとに３００ｎｍにて励起することにより、少なくとも５００分間はブリンキングや光退色が発生しない。
【００５４】
発光の減衰時間である発光寿命（τ）を、または励起の終了から発光強度が最大強度値の１／ｅに減少するまで、すなわちそれがおよそ３７％に減少するまでの経過時間である平均寿命を測定することができる。本発明の実施形態では、発光の、好ましくは蛍光の平均寿命は、０．１μｓ超、好ましくは１μｓ超である。特定の実施形態では、合成されたナノシステムは、蛍光シグナルの３７％超について、マイクロ秒よりも長い発光寿命を有する。
【００５５】
前記ナノシステムは、その外側に官能基を有しており、例えば、ナノソームは、タンパク質、核酸、およびその他の生体分子との共有結合に用いることができるＣＯＯＨ基を有する。従って、この特性による別のさらなる態様は、本発明の発光ナノシステムの蛍光プローブ、バイオマーカー、または造影剤としての使用に関する。このようなナノシステムは、生体外および生体内の両方の生物学系において用いることができる。
【００５６】
別のさらなる態様は、内径が１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満、好ましくは５ｎｍと等しいかまたはそれ未満であるキャビティ内に封入されたサイズの異なる少なくとも２つの原子量子クラスター（ＡＱＣ）を含むナノシステムに関し、ここで、ＡＱＣの金属は、Ａｕ以外の遷移金属であるか、またはＡｕを含んでいてよい遷移金属の組み合わせであり、およびここで、遷移金属は、好ましくは、Ａｇ、Ｃｕ、および遷移金属の組み合わせから選択される。具体的実施形態では、キャビティは、ω‐ヒドロキシ酸およびω‐メルカプト酸を含むナノソームの内部キャビティであり、ここで、サイズの異なる少なくとも２つのＡＱＣは：
−  ２から３０９個の金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦３０９）、
−  ２から１０２個の金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦１０２）、
−  ２から５５個の金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦５５）、および、
−  ２から２５個の金属原子（Ｍｎ、２≦ｎ≦２５）、
から成ることを特徴とする。
【００５７】
本発明の別の態様は、内径が１０ｎｍと等しいかまたはそれ未満、好ましくは５ｎｍと等しいかまたはそれ未満であるキャビティ内に封入されたサイズの異なる少なくとも２つの原子量子クラスター（ＡＱＣ）を含む本発明で述べるナノシステムを得るための方法に関し、ここで、ＡＱＣの金属は、Ａｕ以外の遷移金属であるか、または遷移金属の組み合わせであり、好ましくは、遷移金属は、Ａｇ、Ｃｕ、および遷移金属の組み合わせから選択され、その方法は：
ａ）ω‐ヒドロキシ酸およびω‐メルカプト酸を、水性媒体中、塩基の存在下にて混合することによってナノソームを作製する工程、
ｂ）工程ａ）で作製した混合物へ、少なくとも１つの金属塩を添加する工程、ならびに、
ｃ）工程ｂ）で得られた混合物を還元する工程、
を含む。
【００５８】
工程ａ）の塩基としては、水酸化テトラブチルアンモニウム、水酸化テトラオクチルアンモニウム、水酸化トリエチルベンジルアンモニウム、水酸化トリ‐ｎ‐オクチルメチルアンモニウム、水酸化トリメチルデシルアンモニウム、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウム、または対イオンなどのかさ高い基（voluminous group）を有するその他のいずれかの水酸化物を、好ましくは水酸化テトラブチルアンモニウムを用いることができる。
【００５９】
工程ｂ）において、遷移金属またはその組み合わせの金属塩を用いることができる。金属塩の限定されない例としては、遷移金属の硝酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、リン酸塩、水酸化物、シアン酸塩、カルボン酸塩、チオリンゴ酸塩、チオグルコセート（thioglucosate）である。単一の金属塩として、または他の金属塩と組み合わせて用いられるこれらの金属塩の例としては、ＡｇＮＯ３、ＣＨ３ＣＯＯＡｇ、Ａｇ３ＡｓＯ４、ＡｇＢｒＯ３、ＡｇＢｒ、Ａｇ２ＣＯ３、ＡｇＣｌＯ３、ＡｇＣｌ、ＡｇＣｒＯ４、ＡｇＯＣＮ、ＡｇＩＯ３、ＡｇＩ、Ａｇ２Ｏ、ＡｇＣｌＯ４、Ａｇ３ＰＯ４、Ａｇ２ＳＯ４、Ａｇ２Ｓ、Ａｇ２ＳＯ３、ＣｕＳＯ４、ＣｕＣｌ２、ＣｕＢｒ２、ＣｕＩ２、Ｃｕ２Ｓ、ＣｕＳＣＮ、ＣｕＣＮ、ＣｕＣＯ３、Ｃｕ２Ｏ、Ｃｕ（ＯＨ）２、Ｃｕ（ＮＯ３）２、Ｃｕ（ＣｌＯ４）２、Ｃｕ（ＨＣＯ２）２、またはＣｕ（ＣＯ２ＣＨ３）２である。組み合わせて用いられる金の金属塩の限定されない例としては、ＨＡｕＣｌ４、ＡｕＣｌ、ＡｕＣｌ３、ＨＡｕＣｌ４、ＨＡｕＣｌ４・ａｑ、ＫＡｕＣｌ４、ＬｉＡｕＣｌ４、（ＣＨ３）２ＳＡｕＣｌ、Ｃ３Ｈ９ＡｕＣｌＰ、Ｃ６Ｈ１５ＡｕＣｌＰ、Ｃ１８Ｈ１５ＡｕＣｌＰ、Ｃ８Ｈ１１ＡｕＣｌＰ、Ｃ５Ｈ５ＡｕＣｌ３Ｎ、（Ｃ４Ｈ９）３ＰＡｕＣｌ、Ｃ２７Ｈ３６ＡｕＣｌＮ２、Ｃ２１Ｈ１２ＡｕＣｌＦ９Ｐ、Ｃ２０Ｈ２７ＡｕＣｌＰ、Ｃ３３Ｈ４９ＡｕＣｌＰ、Ｃ４２Ｈ６３ＡｕＣｌＯ３Ｐ、Ｃ２１Ｈ２４ＡｕＣｌＮ２、Ｃ３５Ｈ４９ＡｕＦ６ＮＯ４ＰＳ２、または（Ｃ２０Ｈ１５ＡｕＦ６ＮＯ４ＰＳ２）・２Ｃ７Ｈ８である。
【００６０】
工程ｃ）で得られた混合物を還元するために工程ｃ）で用いられる還元系または還元剤の限定されない例としては、ＮａＢＨ４、ＤＩＢＡＨ、ＬｉＡｌＨ４、Ｎ２Ｈ４、またはＳｎＣｌ２であってよく、また、次亜リン酸ナトリウム、アミン、糖類、有機酸、ポリビニルピロリドンなどのポリマー、ＵＶ‐ＶＩＳ照射、超音波、および光還元などのより温和な還元剤であってもよい。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、「およそ」の用語は、指定された値の僅かな変動、好ましくは指定された値の１０パーセント以内の変動を意味する。しかし、「およそ」の用語は、例えば用いられた実験技術に応じて、より大きい許容される変動を意味する場合もある。当業者であれば指定された値の前記変動は理解され、それらは本発明の文脈に含まれる。さらに、より正確な記述を提供する目的で、本文書にて提供される定量的表現の一部は、「およそ」の用語なしで記載される。「およそ」の用語は、明示的に、またはそうではなく用いられること、本文書にて与えられる値の各々は、実際の与えられた値を表すことを意図していること、ならびにそれは、実験条件に起因する、および／または測定からのそのような与えられた値に対する同等値および近似値を含む本技術分野における一般的知見に基づけば合理的に導き出されるであろうそのような与えられた値の近似を表すことも意図していることは理解される。
【実施例】
【００６２】
実施例１．ストークスシフトが３００ｎｍである金ＡＱＣナノソームの合成
本実施例では、図３に概略的に示される方法に従った。
【００６３】
１６‐ヒドロキシパルミチン酸の水溶液（２ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）と１６‐メルカプトパルミチン酸の水溶液（０．６２２ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）とを、５．４ｍＬの水および必要量の水酸化テトラブチルアンモニウム中にて、中間の塩基性（basic mean）となるまで激しく攪拌しながら混合した。４００μＬの量のＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ（塩化Ａｕ（ＩＩＩ）水和物、金属ベースで９９．９９９％、アルドリッチ）（５．８ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、得られたナノソームの溶液へ添加し、続いて、４００μＬのＮａＢＨ４溶液（０．０５Ｍ）を添加することで還元した。用いた濃度の場合、Ｒ１およびＲ２の値は、それぞれ３．７および３．４である。この金ナノソームのストック溶液を３５℃にて１時間攪拌した。クラスターを含有するナノソームを精製するために、ｐＨ７．８まで酢酸０．５Ｍを添加することで析出させ、遠心分離によって過剰の試薬およびナノソームを含有する固体を、クラスターを有するナノソームを含有する上清から分離する。最後に、この上清を０．４５ミクロンのフィルターでろ過する。ＨＡＡＤＦ（高角度散乱暗視野）およびＥＤＸ（エネルギー分散型Ｘ線分光分析）の検出器を備えたＴｅｃｎａｉ  ＯＳＩＲＩＳ顕微鏡によって得られた、本実施例で得たＡｕ  ＡＱＣナノソームサンプルの電子顕微鏡イメージ  ＳＴＥＭ（走査型透過電子顕微鏡法）を図４に示し、ＡＱＣを含有するナノソームのナノキャビティの近似的サイズが、およそ１．５ｎｍであることが観察される。図５は、ＥＤＸによる図４の化学的分析を示し、Ａｕクラスターが、ナノソームを形成する分子（Ｃ、Ｏ、Ｓ）によって保護されていることが観察される。図６は、図４で観察される個々のナノソームのうちの１つの典型的なＥＤＸ分析結果を示す。スペクトルから、ナノシステムの領域においてＳおよびＯの著しいシグナルが示されており、これは、Ａｕクラスターを保護している、これらの原子を含有する分子（ナノソームのヒドロキシル酸およびメルカプト酸）の存在を示唆している。次に、同じ装置を用いて得られたＨＲ‐ＳＴＥＭ（高解像度）のイメージは、クラスターの形態でのＡｕの存在に結晶特性がまったくないことが示される（ＡＱＣ）。図７は、Ａｕ  ＡＱＣナノソームの吸収スペクトル（１ｍｍ×１ｃｍ×３ｃｍの石英セルによりヒューレットパッカードＨＰ８４５２
Ａ分光光度計で測定）、励起スペクトル、および発光スペクトル（Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｖａｒｉａｎ蛍光分光光度計で測定）を示し、これらが３００ｎｍでの最大励起および６００ｎｍでの最大発光を表していることが観察され、このことは、ストークスシフトが３００ｎｍであることを示唆している。そして、３００ｎｍでの励起は、表１によると、ナノソームに存在する励起ドナークラスターが、３から５個の原子を有し、一方、発光アクセプタクラスターが、約１５個の原子を有することを示唆している。
【００６４】
実施例２．ストークスシフトが３７０ｎｍであるＡｕ  ＡＱＣナノソームの合成
実施例１で述べたよりも大きいストークスシフトを得るためには、アクセプタクラスターのサイズを減少させ、ドナーのサイズを増加させることが必要である。本明細書で述べるように、これは、Ｒ１およびＲ２の値を実施例１で用いた値と比較して増加させることによって達成される。本実施例で選択した値は、Ｒ１＝４．１およびＲ２＝４．３であった。次に、これを以下の方法で進めた。１６‐ヒドロキシパルミチン酸の水溶液（２．５２ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）と１６‐メルカプトパルミチン酸の水溶液（０．６２２ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ）とを、４．９ｍＬの水および必要量の水酸化テトラブチルアンモニウム中にて、中和されるまで激しく攪拌しながら混合した。３６０μＬの量のＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ（塩化Ａｕ（ＩＩＩ）水和物、金属ベースで９９．９９９％、アルドリッチ）（５．８ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、得られたナノソームの溶液へ添加し、続いて、４００μＬのＮａＢＨ４溶液（０．０５Ｍ）を添加することで還元した。この金ナノソームのストック溶液を２５℃にて３０分間攪拌した。クラスターを含有するナノソームを精製するために、ｐＨ７．８まで酢酸０．５Ｍを添加することで析出させ、遠心分離によって過剰の試薬およびナノソームを含有する固体を、クラスターを有するナノソームを含有する上清から分離する。最後に、この上清を０．４５ミクロンのフィルターでろ過する。図８は、球面収差補正機能を備えたＪｅｏｌ  ＪＥＭ‐ＡＲＭ２００Ｆ顕微鏡によって得られた高解像度ＨＡＡＤＦ‐ＳＴＥＭイメージを示し、ここで、サイズがおよそ１．８ｎｍであるＡｕクラスターがナノソームのキャビティを占有していることが明らかに分かる。このイメージにより、ナノソームのナノキャビティ内部に封入されたクラスターを形成する原子を可視化することができる。図９は、Ａｕ  ＡＱＣナノソームの励起および発光スペクトル（Ｃａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｖａｒｉａｎ蛍光分光光度計で測定）を示し、これらが２５０ｎｍでの最大励起および６２０ｎｍでの最大発光を表していることが観察され、このことは、ストークスシフトが３７０ｎｍであることを示唆している。そして、最大励起および発光の位置は、表１によると、ナノソームに存在するドナーＡｕクラスターが、２から３個の原子を有し、一方、発光アクセプタクラスターが、約２０個の原子を有すること
を示唆している。
【００６５】
実施例３．Ａｇ  ＡＱＣナノソームの合成
まず、１６‐メルカプトパルミチン酸および１６‐ヒドロキシパルミチン酸のストック溶液を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度にて作製し、所定量の水酸化テトラブチルアンモニウム溶液（１．５Ｍ水溶液）を添加して、脂肪酸／ＴＢＡＯＨのモル比１を確保する。次に、所定量の各脂肪酸ストック溶液を２５ｍＬの純水と混合することでナノソームを作製する（３．１１ｍＬの１６‐メルカプトヘキサデカン酸および１０ｍＬの１６‐ヒドロキシヘキサデカン酸）。
【００６６】
第二の工程にて、０．０１４７Ｍ  ＡｇＮＯ３のストック溶液を純水で作製する。次に、この溶液の２．７ｍＬをナノソームサンプル中へ注ぎ入れる。過剰量のＴＢＡＯＨ溶液をこの混合物へ添加し、物質の再分散を確保する。次に、新しく作製した０．０５Ｍ  ＮａＢＨ４のストック溶液の２．７ｍＬを、激しく攪拌しながらサンプルへ滴下する。反応は、サーモスタット付き恒温浴中、３５℃にて１時間攪拌後に終了する。
【００６７】
実施例４．Ａｕ  ＡＱＣ短鎖長ナノソームの合成
まず、１２‐メルカプトドデカン酸および１２−ヒドロキシドデカン酸のストック溶液を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度にて作製し、所定量の水酸化テトラブチルアンモニウム溶液（１．５Ｍ水溶液）を添加して、脂肪酸／ＴＢＡＯＨのモル比１を確保する。次に、所定量の各脂肪酸ストック溶液を２５ｍＬの純水と混合することでナノソームを作製する（３．１１ｍＬの１２‐メルカプトドデカン酸および１０ｍＬの１２−ヒドロキシドデカン酸）。
【００６８】
第二の工程にて、０．０１４７Ｍ  ＨＡｕＣｌ４のストック溶液を純水で作製する。次に、この溶液の２．７ｍＬをナノソームサンプル中へ注ぎ入れる。過剰量のＴＢＡＯＨ溶液をこの混合物へ添加し、物質の再分散を確保する。次に、新しく作製した０．０５Ｍ  ＮａＢＨ４のストック溶液の２．７ｍＬを、激しく攪拌しながらサンプルへ滴下する。反応は、サーモスタット付き恒温浴中、３５℃にて１時間攪拌後に終了する。
【００６９】
実施例５．逆ミセルで封入されたＡｕ  ＡＱＣの合成（マイクロエマルジョン）
逆ミセルで封入された金クラスター（マイクロエマルジョン）を、一方はＨＡｕＣｌ４塩を含有するもの、他方はＮａＢＨ４を含有するものである予め作製しておいた２つの異なるマイクロエマルジョンを混合することによって作製する。
【００７０】
第一のマイクロエマルジョンは、１５．４ｍＬのＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）１５Ｓ５、１．３７ｍＬの１‐ブタンチオール、および２．７ｍＬのＨＡｕＣｌ４水溶液（０．０１４７Ｍ）を、８０．６ｍＬのイソオクタンに溶解することで作製する。第二のマイクロエマルジョンは、１５．４ｍＬのＴｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）１５Ｓ５、１．３７ｍＬの１‐ブタンチオール、および２．７ｍＬのＮａＢＨ４水溶液（０．０５Ｍ）を、８０．６ｍＬのイソオクタンに溶解することで作製する。次に、両マイクロエマルジョンを混合し、この反応液を２４時間攪拌する。
【図１】
2014523932.tif 000003
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図９】
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【国際調査報告】
2014523932.tif 000012
2014523932.tif 000013
2014523932.tif 000014