(57)【要約】  本発明は、親キシログルカナーゼのバリアントに関する。本発明はまた、バリアントキシログルカナーゼをコードするポリヌクレオチドに関し、並びに当該ポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクト、ベクター、及び宿主細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
親キシログルカナーゼの単離されたバリアントであって、位置番号：
【化１】
2011521661.tif 000051
から成る群から選択される一つ以上の位置における前記親キシログルカナーゼの変更を含み、前記位置は配列番号３のアミノ酸配列における位置に対応し、そして、
ａ）前記変更（単数又は複数）は：
ｉ）前記位置を占めるアミノ酸の下流におけるアミノ酸の挿入、及び／又は
ｉｉ）前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
ｉｉｉ）前記位置を占めるアミノ酸と、異なるアミノ酸との置換
であり；
ｂ）前記親キシログルカナーゼはファミリー４４キシログルカナーゼであり；そして
ｃ）前記バリアントはキシログルカナーゼ活性を有する、前記バリアント。
【請求項２】
前記親キシログルカナーゼが、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７から成る群から選択されるか、又は前記親キシログルカナーゼが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するキシログルカナーゼから選択される、請求項１に記載のバリアント。
【請求項３】
以下の変更の組み合わせ：
【化２】
2011521661.tif 000052
【化３】
2011521661.tif 000053
【化４】
2011521661.tif 000054
【化５】
2011521661.tif 000055
【化６】
2011521661.tif 000056
【化７】
2011521661.tif 000057
のうち、一つ以上を含む、請求項１又は２に記載のバリアント。
【請求項４】
位置６８、又は位置１２３、又は位置１５６、又は位置１１８、又は位置２００、又は位置１２９、又は位置１３７、又は位置１９３、又は位置９２、又は位置７６、又は位置３３１に対応する、一つ以上の位置における変更を含み、ここで前記位置は、配列番号３のアミノ酸配列における位置に対応する、請求項１又は２に記載のバリアント。
【請求項５】
位置６８における置換、及び位置番号：
【化８】
2011521661.tif 000058
から成る群から選択される、一つ以上のさらなる位置における一つ以上の置換を含む、請求項１又は２に記載のバリアント。
【請求項６】
位置１５６における置換、及び位置番号：
【化９】
2011521661.tif 000059
から成る群から選択される、一つ以上のさらなる位置における一つ以上の置換を含む、請求項１又は２に記載のバリアント。
【請求項７】
位置１２９及び位置１５６における置換を含む、請求項６に記載のバリアント。
【請求項８】
【化１０】
2011521661.tif 000060
から成る群から選択される一つ以上の置換を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項９】
【化１１】
2011521661.tif 000061
から成る群から選択される一つ以上の置換を含む、請求項８に記載のバリアント。
【請求項１０】
以下の置換の組み合わせ：
【化１２】
2011521661.tif 000062
のうち、一つ以上を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項１１】
前記バリアント中における変更の総数が２個、好ましくは３個、さらにより好ましくは４個、さらにより好ましくは５個、さらにより好ましくは６個、さらにより好ましくは７個、さらにより好ましくは８個、さらにより好ましくは９個、そして最も好ましくは１０個である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項１２】
配列番号３の親キシログルカナーゼのアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項１３】
前記親キシログルカナーゼと比較して改善された化学安定性を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項１４】
前記改善された化学安定性が、改善された洗剤安定性をもたらす、請求項１３に記載のバリアント。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のバリアントをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１６】
配列番号１に対応する親ポリヌクレオチド配列の変異誘発によって、又は配列番号１のポリヌクレオチド配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリヌクレオチド配列の変異誘発によって製造される、請求項１５に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、組み換え宿主細胞。
【請求項１８】
親キシログルカナーゼのバリアントの産生方法であって、前記バリアントがキシログルカナーゼ活性を有し、以下のステップ：
ａ）前記バリアントの発現のために好適な条件下で請求項１７に記載の宿主細胞を培養し；及び
ｂ）培養培地から前記バリアントを回収すること
を含む前記方法。
【請求項１９】
キシログルカナーゼの洗剤安定性を改善するための方法であって、位置：
【化１３】
2011521661.tif 000063
から成る群から選択される一つ以上の位置を変更することを含み、前記位置は配列番号３のアミノ酸配列における位置に対応し、そして、
ａ）前記変更（単数又は複数）は：
ｉ）前記位置を占めるアミノ酸の下流におけるアミノ酸の挿入、及び／又は
ｉｉ）前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
ｉｉｉ）前記位置を占めるアミノ酸と、異なるアミノ酸との置換
であり；
ｂ）前記親キシログルカナーゼはファミリー４４キシログルカナーゼであり；そして
ｃ）前記バリアントはキシログルカナーゼ活性を有する、前記方法。
【請求項２０】
前記親キシログルカナーゼが、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７から成る群から選択されるか、又は前記親キシログルカナーゼが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するキシログルカナーゼから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記バリアントが、以下の変更の組み合わせ：
【化１４】
2011521661.tif 000064
【化１５】
2011521661.tif 000065
【化１６】
2011521661.tif 000066
【化１７】
2011521661.tif 000067
【化１８】
2011521661.tif 000068
【化１９】
2011521661.tif 000069
のうち、一つ以上を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のバリアントを含む製剤。
【請求項２３】
前記製剤が液体製剤である、請求項２２に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、コンピュータで読み取り可能な形態の配列表を含む。当該コンピュータで読み取り可能な形態は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明は、グリコシルヒドロラーゼのファミリー４４に属するキシログルカナーゼのバリアント、当該バリアントをコードするポリヌクレオチド、及び当該バリアントの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
キシログルカンは、植物の一次（増殖）細胞壁における主要な構造多糖類である。構造的にキシログルカンは、セルロース様のベータ−１，４−結合したグルコースの主鎖から成り、そしてそれは種々の側鎖で高頻度に置換される。キシログルカンは、植物の一次壁において、セルロースミクロフィブリルを架橋し、セルロース−キシログルカン・ネットワークを形成することによって機能すると考えられている。
【０００４】
キシログルカナーゼは、キシログルカンオリゴ糖へのキシログルカンの可溶化を触媒することができる。幾つかのキシログルカナーゼはキシログルカナーゼ活性のみを示すが、他のものはキシログルカナーゼ活性とセルラーゼ活性の両方を示す。キシログルカナーゼは、ＥＣ３．２．１．４又はＥＣ．３．２．１．１５１に分類され得る。キシログルカナーゼ活性を有する酵素は、例えば、Ｖｉｎｃｋｅｎ他（１９９７）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９８（４）：２９９−３１０に記載されており、当該文献において、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）（Ｔ．リーセイ（ｒｅｅｓｅｉ）に類似）由来の３つの異なるエンドグルカナーゼ、ＥｎｄｏＩ、ＥｎｄｏＶ及びＥｎｄｏＶＩが特徴付けされた。ＥｎｄｏＩ、ＥｎｄｏＶ及びＥｎｄｏＶＩは、グリコシルヒドロラーゼのファミリー５、７及び１２にそれぞれ属する。Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：３０９−３１６、及びＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．ａｎｄ  Ｂａｉｒｏｃｈ，Ａ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９３：７８１−７８８を参照。国際公開第９４／１４９５３号は、真菌のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）・アクレアツス（ａｃｕｌｅａｔｕｓ）からクローニングされたファミリー１２キシログルカナーゼ（ＥＧＩＩ）を開示する。国際公開第９９／０２６６３号は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）・リケニホルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）及びバチルス・アガラドヘレンス（ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）のそれぞれからクローニングされた、ファミリー１２及びファミリー５キシログルカナーゼを開示する。国際公開第０１／０６２９０３号は、ファミリー４４キシログルカナーゼを開示する。特に、国際公開第９９／０２６６３号及び国際公開第０１／０６２９０３号は、キシログルカナーゼが洗浄剤において使用され得ることを示唆している。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、その親酵素と比較して改善された特性を有する、グリコシルヒドロラーゼのファミリー４４に属する、キシログルカナーゼのバリアントを提供することである。
【０００６】
発明の概要
本発明は、親キシログルカナーゼの単離されたバリアントであって、位置番号：
【０００７】
【化１】
2011521661.tif 000002
【０００８】
から成る群から選択される一つ以上の（幾つかの）位置における変更（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ）を含み、当該位置は配列番号３のアミノ酸配列における位置に対応し、そして当該変更は、独立して：
ｉ）当該位置を占めるアミノ酸の下流におけるアミノ酸の挿入、
ｉｉ）当該位置を占めるアミノ酸の欠失、又は
ｉｉｉ）当該位置を占めるアミノ酸と、異なるアミノ酸との置換
であり；そしてキシログルカナーゼ活性を有する、当該バリアントに関する。
【０００９】
本発明はまた、バリアントキシログルカナーゼをコードする又はキシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクト、ベクター、及び宿主細胞、並びに親キシログルカナーゼのバリアント、又はキシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】コンセンサス配列１は、アラインメントから、所定の位置において最も豊富なアミノ酸を含む配列であり、コンセンサス配列２は、所定の位置において２番目に豊富なアミノ酸を有する配列である、などである。
【図１Ｂ】コンセンサス配列１は、アラインメントから、所定の位置において最も豊富なアミノ酸を含む配列であり、コンセンサス配列２は、所定の位置において２番目に豊富なアミノ酸を有する配列である、などである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、親のファミリー４４キシログルカナーゼのバリアントであって、好ましくは置換、及び／又は挿入、及び／又は欠失の形態である変更を一つ以上の（幾つかの）位置で含み、ここで当該位置の番号は配列番号３の位置の番号に対応する、当該バリアントに関する。本発明のバリアントは、キシログルカナーゼ活性を有し、そして同様に潜在的にセルロース分解性活性を有する。本発明のバリアントは、親のキシログルカナーゼと比較して改善された特性を有する。一つの態様において当該バリアントは、液体洗剤中で、特に洗濯用液体洗剤組成物中で改善された安定性を有する。
【００１２】
定義
キシログルカナーゼ活性：本明細書において用語「キシログルカナーゼ活性」は、キシログルカンの加水分解を触媒する酵素として定義される。当該反応は、キシログルカンの１，４−β−Ｄ−グリコシド結合のエンド（ｅｎｄｏ）加水分解を伴う。本発明の目的のために、キシログルカナーゼ活性は、ＡＺＣＬ−キシログルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ製）を反応基質として用いて決定される。当該アッセイは、幾つかの方法で、例えば本出願の実施例２において記載された方法、又は国際公開第０１／６２９０３号に記載された方法で行われ得る。キシログルカナーゼ活性の１ユニット（ＸｙｌｏＵ）は、国際公開第０１／６２９０３号、６０ページ、３〜１７行目に記載されたアッセイ方法を参照することによって定義される。
【００１３】
セルラーゼ活性：本明細書において用語「セルラーゼ活性」は、ベータ−１，４−グルカン（セルロース）における、１，４−ベータ−Ｄ−グリコシド結合の加水分解を触媒する酵素として定義される。本発明の目的のために、ＡＺＣＬ−ＨＥ−セルロース（Ｍｅｇａｚｙｍｅ製）を反応基質として用いてセルラーゼ活性は決定される。
【００１４】
バリアント：本明細書において用語「バリアント」は、位置が配列番号３におけるアミノ酸の位置に対応する、一つ以上の（幾つかの）特定の位置における一つ以上の（幾つかの）アミノ酸残基の変更、例えば置換、挿入、及び／又は欠失を含む、キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドとして定義される。本発明のバリアントはまた、セルラーゼ活性を有し得る。変更されたポリペプチド（バリアント）は、親の酵素をコードするポリヌクレオチド配列の修飾による、ヒトの介入を通じて得られる。親の酵素は、配列番号１、配列番号４、又は配列番号６によってコードされ得、或いはこれらの配列の一つと少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一であって、そして活性ポリペプチドをコードする配列によってコードされ得る。バリアントポリペプチド配列は、好ましくは天然において発見されないものである。
【００１５】
野生型酵素：用語「野生型」キシログルカナーゼは、天然に存在する微生物、例えば天然において見られる細菌、酵母、又は糸状菌によって発現されるキシログルカナーゼを示す。用語「野生型」は、用語「天然に存在する」と交換可能に使用され得る。
【００１６】
親酵素：本明細書において使用される用語「親」キシログルカナーゼ又は「親の」キシログルカナーゼは、本発明の酵素バリアントを産生するように、修飾、例えば置換（単数又は複数）、挿入（単数又は複数）、欠失（単数又は複数）、及び／又は切断（単数又は複数）がなされたキシログルカナーゼを意味する。本用語はまた、バリアントが比較され、且つ整列（アラインメント）がなされるポリペプチドのことである。当該親は、天然に存在する（野生型）ポリペプチド、例えば配列番号２、又は配列番号３、又は配列番号５、又は配列番号７の酵素、或いはこれらの配列の一つと少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一であるポリペプチドであり得る。親ポリペプチドはまた、アミノ酸配列が修飾又は変更された、天然に存在するポリペプチドのバリアントであり得る。親はまた、アレルのバリアントであり得、そしてそれは、同じ染色体座位を占める遺伝子の、任意の二つ以上の代替形態の遺伝子によってコードされるポリペプチドである。
【００１７】
単離されたバリアント又はポリペプチド：本明細書において使用される用語「単離されたバリアント」又は「単離されたポリペプチド」は、源、例えばそれが発現される宿主細胞、又はそれが通常存在する酵素複合体から単離される、バリアント又は酵素複合体のことである。当該ポリペプチドは好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定される通り、少なくとも４０％純粋、より好ましくは少なくとも６０％純粋、さらにより好ましくは少なくとも８０％純粋、最も好ましくは少なくとも９０％純粋、そしてさらに最も好ましくは少なくとも９５％純粋である。
【００１８】
実質的に純粋なバリアント又はポリペプチド：本明細書における用語「実質的に純粋なバリアント」又は「実質的に純粋なポリペプチド」は、天然又は組み換えに関連する他のポリペプチド材料を、最大１０重量％、好ましくは最大８重量％、より好ましくは最大６重量％、より好ましくは最大５重量％、より好ましくは最大４重量％、より好ましくは最大３重量％、さらにより好ましくは最大２重量％、最も好ましくは最大１重量％、そしてより最も好ましくは最大０．５重量％含むポリペプチド調製物を示す。したがって、実質的に純粋なバリアント又はポリペプチドは、当該調製物中に存在する総ポリペプチド材料が少なくとも９２重量％純粋、好ましくは少なくとも９４重量％純粋、より好ましくは少なくとも９５重量％純粋、より好ましくは少なくとも９６重量％純粋、より好ましくは少なくとも９７重量％純粋、より好ましくは少なくとも９８重量％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９９重量％純粋、最も好ましくは少なくとも９９．５重量％純粋、そしてさらに最も好ましくは少なくとも１００重量％純粋であることが好ましい。本発明のバリアント及びポリペプチドは、好ましくは実質的に純粋な形態で存在する。これは例えば、周知の組み換え法により、又は古典的な精製法により、当該バリアント又はポリペプチドを精製することによって達成され得る。
【００１９】
成熟ポリペプチド：本明細書において用語「成熟ポリペプチド」は、翻訳及び任意の翻訳後修飾、例えばＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などを経たその最終形態で存在する、キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドとして定義される。配列番号２によって定義されたポリペプチドに関して、成熟キシログルカナーゼ配列は、理論上配列番号２の位置２８で開始し得る。当該成熟配列は、配列番号２の位置５５１で終了する。理論上の成熟キシログルカナーゼ配列が配列番号３に示される。発現系に依存して、実際の成熟ポリペプチドの長さは理論上の成熟ポリペプチドに基づいて、１〜１０個のアミノ酸の長さで変化し得る。成熟ポリペプチドは例えば、配列番号２の位置３３で開始し、そして配列番号２の位置５５１で終了し得る。
【００２０】
成熟ポリペプチドコード配列：本明細書において用語「成熟ポリペプチドコード配列」は、キシログルカナーゼ活性を有する成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列として定義される。一つの態様において、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド８２〜１６５３である。当該成熟ポリペプチドコード配列は、発現系に依存して、３〜３０個のヌクレオチドの長さで変化し得る。当該成熟ポリペプチドコード配列は例えば、配列番号１のヌクレオチド９７〜１６５３に対応する。
【００２１】
同一性：２つのアミノ酸配列間の関連性、又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「同一性」によって記載される。
【００２２】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：２７６−２７７；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムに備わった、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、１０のギャップ・オープン・ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」のアウトプットは、パーセント同一性として使用され、そして以下のように計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）
【００２３】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド酸配列間の同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：２７６−２７７；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）のＮｅｅｄｌｅプログラムに備わった、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定される。使用される任意のパラメータは、１０のギャップ・オープン・ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）、０．５のギャップ・エクステンション・ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性（ｌｏｎｇｅｓｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」のアウトプットは、パーセント同一性として使用され、そして以下のように計算される：
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメント中のギャップ総数）
【００２４】
機能性断片：用語「ポリペプチドの機能性断片」は、より長いポリペプチド、例えば成熟ポリペプチドに由来するポリペプチドを説明するために使用され、そして当該成熟ポリペプチドは、親ポリペプチドの断片を生じるためにＮ末端領域かＣ末端領域のいずれかで、又は両方の領域で切断される。機能性ポリペプチドであるために、当該断片は、完全長／成熟ポリペプチドの少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも１００％のキシログルカナーゼ活性を維持しなければならない。
【００２５】
アレルのバリアント：本明細書における用語「アレルのバリアント」は、同一の染色体座を占める遺伝子の、任意の２つ以上の代替形態を示す。アレルの変化は、天然においては変異を通じて生じ、そして群内において多型をもたらす。遺伝子の変異は、サイレント（コードされたポリペプチドにおいて変化がない）であり得るか、又はアミノ酸配列が変化したポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドのアレルのバリアントは、遺伝子のアレルのバリアントによってコードされたポリペプチドである。
【００２６】
単離されたポリヌクレオチド：本明細書において使用される用語「単離されたポリヌクレオチド」は、源から単離されるポリヌクレオチドのことである。一つの態様において、単離されたポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動によって決定される通り、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも９５％純粋である。
【００２７】
実質的に純粋なポリヌクレオチド：本明細書において使用される用語「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、他の異質の又は不要なヌクレオチドを有しない、遺伝子組み換えがなされたポリペプチド産生系における使用に好適な形態であるポリヌクレオチド調製物のことである。したがって、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然又は組み換えに関連する他のポリヌクレオチド材料を最大１０重量％、好ましくは最大８重量％、好ましくは最大６重量％、より好ましくは最大５重量％、より好ましくは最大４重量％、より好ましくは最大３重量％、さらにより好ましくは最大２重量％、最も好ましくは最大１重量％、そしてさらに最も好ましくは最大０．５重量％含む。しかし、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然で生じる５’及び３’未翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含み得る。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、少なくとも９０重量％、好ましくは少なくとも９２重量％、より好ましくは少なくとも９４重量％、より好ましくは少なくとも９５重量％、より好ましくは少なくとも９６重量％、より好ましくは少なくとも９７重量％、さらにより好ましくは少なくとも９８重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％、そしてさらに最も好ましくは９９．５重量％純粋であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは実質的に純粋な形態で、すなわち、ポリヌクレオチド調製物が天然又は組み換えに関連する他のポリヌクレオチド材料を実質的に有しない形態で存在する。当該ポリヌクレオチドは、遺伝子、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来のもの、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００２８】
コード配列：本明細書において使用されるとき、用語「コード配列」は、そのポリペプチド産物のアミノ酸配列を直接的に特定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、オープンリーディングフレームによって一般的に決定され、そしてそれはＡＴＧ開始コドンで、又は代替的開始コドン、例えばＧＴＧ及びＴＴＧで通常開始し、そして終止コドン、例えばＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡで終止する。当該コード配列は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成又は組み換えポリヌクレオチドであり得る。
【００２９】
機能し得るように連結された：本明細書において、用語「機能し得るように連結された」は、コントロール配列がポリペプチドのコード配列の発現を命令するように、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対して好適な位置に当該コントロール配列が配置される形態のことを示す。
【００３０】
宿主細胞：本明細書において使用される用語「宿主細胞」は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又はベクターを用いた形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受け易い任意の細胞種を含む。用語「宿主細胞」は、複製時に生じる変異のために親細胞と同一ではない、親細胞の任意の後代を含む。
【００３１】
改善された化学安定性：用語「改善された化学安定性」は、親酵素の酵素活性を減少させる、天然由来又は合成性のいずれかである化学物質（単数又は複数）の存在下におけるインキュベーションの後において、バリアント酵素が酵素活性の維持を示すこととして定義される。改善された化学安定性はまた、かかる化学物質の存在下において反応を触媒することが可能な、より優れたバリアントをもたらし得る。本発明の特定の態様において、改善された化学安定性は、洗剤中、特に液体洗剤中における改善された安定性である。改善された洗剤安定性は特に、本発明のキシログルカナーゼバリアントが液体洗剤製剤へと混合され、その後１５〜５０℃で保管されるときにおける、キシログルカナーゼ活性の改善された安定性である。
【００３２】
本発明において、液体洗剤は液体洗濯洗剤として特に有用である。
【００３３】
バリアントの命名規則
本発明の目的のために、配列番号３で示されたキシログルカナーゼのアミノ酸配列は、別のキシログルカナーゼにおいて対応するアミノ酸残基を決定するために使用される。別のキシログルカナーゼのアミノ酸配列は、配列番号３に開示されたキシログルカナーゼのアミノ酸配列と整列（アラインメント）がなされ、そして当該アラインメントに基づいて、配列番号３に開示されたキシログルカナーゼのアミノ酸配列における任意のアミノ酸残基に対応するアミノ酸の位置番号が決定され得る。
【００３４】
ポリペプチド配列のアラインメントは、例えば、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ａｎｄ  Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，１９９４，ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２：４６７３−４６８０）を用いてなされ得る。ＤＮＡ配列のアラインメントは、鋳型としてポリペプチドアラインメントを用い、当該アミノ酸をＤＮＡ配列由来の対応するコドンに置き換えることでなされ得る。
【００３５】
本発明の種々のキシログルカナーゼバリアントを説明するときに、参照しやすいように、以下に記載された命名が適用される。全ての場合において、一般に認められているＩＵＰＡＣの一文字又は三文字アミノ酸略記が使用される。
【００３６】
置換：アミノ酸の置換に関して、以下の命名が使用される：元のアミノ酸／位置／置換されたアミノ酸。したがって、アラニンを用いた位置２２６におけるスレオニンの置換は、「Ｔｈｒ２２６Ａｌａ」又は「Ｔ２２６Ａ」と命名される。多重変異は、マーク（「＋」）を付加することによって分離され、例えば「Ｇ２０５Ｒ＋Ｓ４１１Ｆ」は、位置２０５及び４１１において、アルギニン（Ｒ）を用いたグリシン（Ｇ）の置換、及びフェニルアラニン（Ｆ）を用いたセリン（Ｓ）の置換をそれぞれ表す。元のアミノ酸が、ある群から選択されたアミノ酸によって置換され得る場合、それは「Ｋ１２９Ｒ，Ｓ，Ａ，Ｉ，Ｆ，Ｑ」と命名され、そしてそれは：アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、フェニルアラニン（Ｆ）及びグルタミン（Ｑ）から成る群から選択されるアミノ酸を用いた、位置１２９におけるリシン（Ｋ）の置換を表す。或いは、「Ｋ１２９Ｒ，Ｓ，Ａ，Ｉ，Ｆ，Ｑ」は、Ｋ１２９Ｒ、又はＫ１２９Ｓ、又はＫ１２９Ａ、又はＫ１２９Ｉ、又はＫ１２９Ｆ、又はＫ１２９Ｑと記載され得る。
【００３７】
欠失：アミノ酸欠失に関して、以下の命名が使用される：元のアミノ酸／位置／アスタリスク（*）。したがって、位置１９５におけるグリシンの欠失は、「Ｇｌｙ１９５*」又は「Ｇ１９５*」と命名される。多重欠失は、例えば「Ｇ１９５*＋Ｓ４１１*」のように、マーク（「＋」）を付加することによって分離される。
【００３８】
挿入：アミノ酸の挿入に関して、以下の命名が使用される：アスタリスク（*）／位置／小文字／挿入されるアミノ酸、ここで小文字は位置番号の下流におけるアミノ酸の付加を示す。したがって、位置１０の下流におけるグルタミン酸（Ｅ）の挿入は、「*１０ａＥ」と命名される。第二のアミノ酸、例えばバリン（Ｖ）が、位置１０の下流に、グルタミン酸（Ｅ）の後に挿入される場合、それは「*１０ａＥ＋*１０ｂＶ」と命名される。ポリペプチドのＮ末端の付加は、０（ゼロ）で示される。ポリペプチドのＮ末端アミノ酸へ付加される、グルタミン酸（Ｅ）及びバリン（Ｖ）の付加は、「*０ａＥ＋*０ｂＶ」と命名される。「下流」への挿入はまた、指定された位置と当該指定された位置の直後の位置との間における一つ以上のアミノ酸の付加として記載され得、例えば位置１９５の下流への挿入は、位置１９５と１９６との間における一つ以上のアミノ酸の挿入をもたらし、それにより新規位置である*１９５ａ、*１９５ｂなどを生じる。
【００３９】
親キシログルカナーゼ
本発明において、親キシログルカナーゼは、（ａ）ファミリー４４キシログルカナーゼとも呼ばれるグリコシルヒドロラーゼのファミリー４４に属するキシログルカナーゼであるか；或いは（ｂ）配列番号３、配列番号５、及び配列番号７から成る群から選択されるポリペプチドであるか；或いは（ｃ）配列番号３の成熟ポリペプチドと少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであるか；或いは（ｄ）（ｉ）配列番号１、若しくは配列番号４、若しくは配列番号６の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）配列番号１、若しくは配列番号４、若しくは配列番号６の成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）の完全長相補鎖、を有する中等度ストリジェンシー条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであるか；或いは（ｅ）配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであるかのいずれかである。
【００４０】
第一の態様において、親キシログルカナーゼは、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９８％、又はさらに最も好ましくは少なくとも９９％の同一性度を有するアミノ酸配列を含み、そしてそれはキシログルカナーゼ活性を有する（これ以降、「類似（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ポリペプチド」と呼ぶ）。第一の態様において、類似ポリペプチドは、配列番号３の成熟ポリペプチドとは１０個の、好ましくは９個の、より好ましくは８個の、より好ましくは７個の、より好ましくは６個の、より好ましくは５個の、より好ましくは４個の、さらにより好ましくは３個の、最も好ましくは２個の、そしてさらに最も好ましくは１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。
【００４１】
実質的に類似の親キシログルカナーゼは、一つ以上の（幾つかの）アミノ酸の変更、例えば置換、欠失及び／又は挿入を有し得る。これらの変化は、好ましくは小規模な性質のものであり、そしてそれは保存的アミノ酸置換、及びタンパク質又はポリペプチドの３次元フォールディング又は活性に著しく影響を与えない他の置換；典型的には１〜約９個のアミノ酸の、好ましくは１〜約１５個のアミノ酸の、そして最も好ましくは１〜約３０個のアミノ酸の小規模の欠失；及び小規模のアミノ若しくはカルボキシル末端の伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基の伸長、約５〜１０個の残基の、好ましくは１０〜１５個の残基の、及び最も好ましくは２０〜２５個の残基の小さいリンカーペプチド、又は精製を容易にする小規模の伸長（アフィニティタグ）、例えばポリヒスチジンタグ、若しくはプロテインＡ（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１０７５；Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８：３．同様に、一般的にはＦｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５−１０７を参照）である。
【００４２】
上記の変化は好ましくは小規模な性質のものであるが、かかる変化はまた、実質的な性質のもの、例えばアミノ又はカルボキシル末端の双方の伸長として、３００個以上のアミノ酸の、より大きなポリペプチドの融合であり得る。
【００４３】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、及びバリン）、芳香族性アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、並びに小さいアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、及びメチオニン）の群の内で存在する。一般的に特異的な活性を変更しないアミノ酸置換は、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。最も一般的に生じる交換は：
【００４４】
【化２】
2011521661.tif 000003
【００４５】
である。
【００４６】
本発明のキシログルカナーゼポリペプチドにおいて必須のアミノ酸は、当技術分野において既知の手法に従って、例えば部位特異的変異誘発、又はアラニン−スキャニング変異誘発で同定され得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５，１９８９）。後者の技術において、単一のアラニンの変異が分子中の全ての残基に導入され、そして生じた変異分子の生物活性（すなわちキシログルカナーゼ活性）が試験され、当該分子の活性において重要であるアミノ酸残基が同定される。同様に、Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８，１９９６を参照。酵素の活性部位又は他の生物学的相互作用がまた、構造の物理学的分析によって、例えば、推定上の接触部位アミノ酸の変異と共に、核磁気共鳴、結晶構造解析、電子回折、又は光アフィニティラベリングのような技術によって決定され得る。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２，１９９２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４，１９９２；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４，１９９２を参照。必須のアミノ酸の特性はまた、本発明のポリペプチドと関連性があるポリペプチドとの相同性の分析から推測され得る。ファミリー４４グリコシルヒドロラーゼに属する酵素の結晶構造は、Ｋｉｔａｇｏ  ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２８２：３５７０３−３５７１１，２００７に公開されている。この構造に基づいて、親キシログルカナーゼ（配列番号３）の三次元構造をイン・シリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）で生じさせることが可能である。公開された構造との比較に基づいて、配列番号３の以下の残基が、酵素機能のために重要であるものとして同定された：Ｅ１８７（触媒性−酸／塩基）、Ｅ３５８（触媒性−求核種）、Ｅ５６（Ｃａ２＋と配位するカルボキシレート基）、及びＤ１５４（Ｃａ２＋と配位するカルボキシレート基）。したがってこれらの位置は、親酵素中において好ましくは変異されるべきではない。
【００４７】
親キシログルカナーゼは好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列又はキシログルカナーゼ活性を有するそのアレルのバリアントを含む。一つの態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号２の成熟ポリペプチドを含む。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号３のアミノ酸配列、若しくはそのアレルのバリアント、又はキシログルカナーゼ活性を有するそれらの断片から成る。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号５のアミノ酸配列、若しくはそのアレルのバリアント；又はキシログルカナーゼ活性を有するそれらの断片を含む。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号７のアミノ酸配列、若しくはそのアレルのバリアント；又はキシログルカナーゼ活性を有するそれらの断片を含む。別の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号２、又は配列番号３、又は配列番号５と、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号３の成熟ポリペプチドの断片は、このアミノ酸配列のアミノ及び／又はカルボキシル末端から一つ以上の（幾つかの）アミノ酸が欠失しているが、なおキシログルカナーゼ活性を維持しているポリペプチドである。
【００４８】
第二の態様において、親キシログルカナーゼは、非常に低いストリジェンシー条件下で、好ましくは低ストリジェンシー条件下で、好ましくは中等度ストリジェンシー条件下で、より好ましくは中等度〜高ストリジェンシー条件下で、さらにより好ましくは高ストリジェンシー条件下で、そして最も好ましくは非常に高いストリジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、又は配列番号４、又は配列番号６の、成熟ポリペプチドコード配列（ｉｉ）配列番号１、又は配列番号４、又は配列番号６の、成熟ポリペプチドコード配列を含むゲノムＤＮＡ配列（ｉｉｉ）（ｉ）若しくは（ｉｉ）のサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）、又は（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、若しくは（ｉｉｉ）の完全長相補鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。当該サブ配列は、キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチド断片をコードし得る。一つの態様において、相補鎖は、配列番号１、又は配列番号４、又は配列番号６の成熟ポリペプチドコード配列の完全長相補鎖である。
【００４９】
配列番号１、又は配列番号４、又は配列番号６の、成熟ポリペプチドコード配列のサブ配列、又はその相同体は、一つ以上の（幾つかの）ヌクレオチドが５’及び／又は３’末端から欠失したヌクレオチド配列であり、ここで当該サブ配列によってコードされたポリペプチドはキシログルカナーゼ活性を有する。
【００５０】
親酵素はまた、キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドの、アレルのバリアントであり得る。
【００５１】
配列番号１、若しくは配列番号４、若しくは配列番号６のポリヌクレオチド；又はそのサブ配列；及び配列番号３、若しくは配列番号５、若しくは配列番号７のアミノ酸配列；又はその断片は、当技術分野において周知の方法に従って、異なる属又は種の株由来の親キシログルカナーゼをコードするＤＮＡを同定且つクローニングするための核酸プローブを設計するために使用され得る。特に、かかるプローブは、対応する遺伝子を同定且つ単離するために、対象の属若しくは種のゲノム又はｃＤＮＡとハイブリダイゼーションさせ、その後標準的サザンブロッティング法を行うために使用され得る。かかるプローブは、完全配列よりもかなり短いものであり得るが、少なくとも１４、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、そして最も好ましくは少なくとも７０ヌクレオチド長であるべきである。しかし、核酸プローブは少なくとも１００ヌクレオチド長であることが好ましい。例えば、核酸プローブは、少なくとも２００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド長、又は最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチド長であり得る。さらにより長いプローブが使用され得、例えば好ましくは少なくとも６００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも７００ヌクレオチド長、さらにより好ましくは少なくとも８００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも９００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１１００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１２００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１３００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１４００ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５００ヌクレオチド長、又は最も好ましくは少なくとも１６００ヌクレオチド長である核酸プローブである。ＤＮＡプローブ及びＲＮＡプローブの両方が使用され得る。当該プローブは通常、対応する遺伝子を検出するために（例えば32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、又はアビジンで）標識され得る。かかるプローブは本発明に包含される。
【００５２】
他の生命体から調製されたゲノムＤＮＡライブラリーが、上記のプローブとハイブリダイズし、且つ親キシログルカナーゼをコードするＤＮＡのためにスクリーニングされ得る。他の生命体由来のゲノムＤＮＡ又は他のＤＮＡは、アガロース若しくはポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、又は他の分離技術によって分離され得る。当該ライブラリ−由来のＤＮＡ又は当該分離されたＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の好適なキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）材料上に移動且つ固定化される。配列番号１と相同性を有するクローン若しくはＤＮＡ、又はそのサブ配列を同定するために、当該キャリア材料はサザンブロットにおいて使用される。本発明の目的のために、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、配列番号１に示されたポリヌクレオチドに相当する標識化ヌクレオチドプローブと、その相補鎖と、又はそれらのサブ配列と、低〜非常に高いストリジェンシー条件下でハイブリダイズすることを示す。当該プローブがハイブリダイズする分子は、例えばＸ線フィルム、又は当技術分野で既知の他の検出手段を用いて検出され得る。
【００５３】
一つの態様において、核酸プローブは、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列である。別の態様において、核酸プローブは、配列番号１のヌクレオチド８２〜１６５３、又は配列番号１のヌクレオチド９７〜１６５３である。別の態様において、核酸プローブは、配列番号２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、又はそのサブ配列である。別の態様において、核酸プローブは配列番号１である。
【００５４】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブのために、非常に低い〜非常に高いストリジェンシー条件が、４２℃、５Ｘ  ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの剪断且つ変性されたサケ精子ＤＮＡ、並びに非常に低い〜低いストリジェンシーにおいては２５％ホルムアミド中における、中程度及び中程度〜高いストリジェンシーにおいては３５％ホルムアミド中における、高い〜非常に高いストリジェンシーにおいては５０％ホルムアミド中における、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義され、好ましくはその後に標準的なサザンブロッティング法が１２〜２４時間かけて行われる。
【００５５】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブのために、キャリア材料は最終的に、２Ｘ  ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、好ましくは４５℃で（非常に低いストリジェンシー）、より好ましくは５０℃で（低ストリジェンシー）、より好ましくは５５℃で（中等度ストリジェンシー）、より好ましくは６０℃で（中等度〜高ストリジェンシー）、より好ましくは６５℃で（高ストリジェンシー）、そして最も好ましくは７０℃で（非常に高いストリジェンシー）３回、各１５分間洗浄される。
【００５６】
約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチド長である短いプローブのために、ストリジェンシー条件は、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及びＢｏｌｔｏｎ及びＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ４８：１３９０）に従った計算を使用して計算されたＴmよりも約５℃〜約１０℃低い温度で、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１Ｘ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭモノリン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、及び１ｍｌあたり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡによる、ハイブリダイゼーション後の洗浄、好ましくはその後に標準的なサザンブロッティング法が１２〜２４時間かけて行われるものとして定義される。
【００５７】
約１５ヌクレオチド長〜約７０ヌクレオチド長である短いプローブのために、キャリア材料は、計算されたＴmよりも５〜１０℃低い温度で、６Ｘ  ＳＣＣプラス０．１％ＳＤＳで１５分間かけて１回、及び６Ｘ  ＳＣＣを用いて各１５分間で２回洗浄される。
【００５８】
第三の態様において、親キシログルカナーゼは、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列と、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、そしてさらに最も好ましくは９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性度を有するヌクレオチド配列を含む、又はから成り、且つ活性ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドによってコードされる。一つの態様において、成熟ポリペプチドコード配列は、配列番号１のヌクレオチド８２〜１６５３、又は配列番号１のヌクレオチド９７〜１６５３である。
【００５９】
親キシログルカナーゼは、任意の属の微生物から得られる。一つの態様において、親キシログルカナーゼは細胞外に分泌される。
【００６０】
さらなる態様において、親キシログルカナーゼは、細菌性キシログルカナーゼであり得る。例えば、キシログルカナーゼは、グラム陽性細菌性ポリペプチド、例えばバチルス、好ましくはバチルス／ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）サブディビジョン（ｓｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ）由来、好ましくは，パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来の種、特にパエニバチルス・ポリミキサ（ｐｏｌｙｍｙｘａ）、例えばパエニバチルス・ポリミキサ、ＡＴＣＣ８３２であり、好ましくは、キシログルカナーゼはファミリー４４キシログルカナーゼ、例えば国際公開第０１／６２９０３号に記載されたもの、より好ましくは配列番号５のキシログルカナーゼ、より好ましくは配列番号７のキシログルカナーゼ、そして最も好ましくは配列番号２のキシログルカナーゼ又はその成熟ポリペプチドであり得る。
【００６１】
バリアントの生成
親キシログルカナーゼのバリアントは、当技術分野で既知の任意の変異誘発法に従って、例えばランダム及び／又は部位特異的変異誘発、合成遺伝子作成、半合成遺伝子作成、ランダム変異誘発、シャッフリングなどで調製され得る。
【００６２】
合成遺伝子作成は、対象のポリペプチド分子をコードする設計されたポリヌクレオチド分子の、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）における合成を必要とする。遺伝子合成は、多くの技術、例えば複合マイクロチップ型技術（Ｔｉａｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：１０５０−１０５４）、並びに、オリゴヌクレオチドが光プログラム制御可能な（ｐｈｏｔｏ−ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）マイクロ流体チップ上に合成され、及び組み立てられる、同様の技術を利用して行われ得る。
【００６３】
半合成遺伝子作成は、合成遺伝子作成、及び／又は部位特異的変異誘発、及び／又はランダム変異誘発、及び／又はシャッフリングの態様を組み合わせることによって達成される。半合成作成は、ＰＣＲ技術と組み合わせて、合成されるポリヌクレオチド断片を利用する工程によって典型的に表される。したがって、遺伝子の特定の領域は初めから合成され得るが、他の領域は部位特異的変異誘発プライマーを用いて増幅され得、さらに他の領域はエラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ又は非エラープローンＰＣＲ増幅がなされ得る。ポリヌクレオチド断片はその後、シャッフルされ得る。
【００６４】
部位特異的変異誘発は、一つ又は幾つかの変異が、親キシログルカナーゼをコードするポリヌクレオチド分子における特定の部位において作成される技術である。当該技術は、インビトロ又はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において行われ得る。
【００６５】
部位特異的変異誘発は、所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーの使用を伴うＰＣＲによってインビトロにおいて達成され得る。部位特異的変異誘発はまた、親キシログルカナーゼをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドのある部位での制限酵素による切断、及び当該ポリヌクレオチド中において変異を含む、オリゴヌクレオチドのその後のライゲーションを伴うカセット変異誘発によって、インビトロで行われ得る。通常、プラスミド及びオリゴヌクレオチドにおいて消化する制限酵素は同一であり、プラスミドの付着末端を許容し、そして互いをライゲーションするために挿入する。好適な技術のさらなる説明のために、以下が参照される：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）”Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ，Ｓ．Ｍ．（ｅｄｓ．）”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ”．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９０）、及び国際公開第９６／３４９４６号；Ｓｃｈｅｒｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：４９４９−４９５５；及びＢａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８：７３４９−４９６６。
【００６６】
リガーゼ反応後、ライゲーション混合物は、宿主細胞を形質転換するために使用され得、クローニングの目的のために、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌに記載された通りにＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が使用される。形質転換がなされたＥ．コリ細胞は、液体培地中で、又は固体寒天プレート上で増殖され得、プラスミドは当該形質転換された細胞から回収され得、そしてＢ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を形質転換するために使用され得る。好適なコンピテントバチルス細胞、例えばＭＢ１５１０、１６８−誘導体（例えばＢＧＳＣから受入番号１Ａ１  １６８ｔｒｐＣ２で市販されている）は、国際公開第０３／０９５６５８号において記載されている通り、形質転換され得る。ライブラリー構築のための、Ｅ．コリのプラスミド由来融合カセットが、バチルスの形質転換のために使用され得る。当該方法は、国際公開第０３／０９５６５８号に詳細に記載されている。或いは、インビトロで増幅されたＰＣＲ−ＳＯＥ−産物（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇｍａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，１０５６）が使用され得る。
【００６７】
部位特異的変異誘発は、当技術分野において既知の方法によってインビボで達成され得る。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１１５４号明細書；Ｓｔｏｒｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：７７３−７７６；Ｋｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２８５−２９０；及びＣａｌｉｓｓａｎｏ  ａｎｄ  Ｍａｃｉｎｏ，１９９６，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔ．４３：１５−１６を参照。
【００６８】
任意の部位特異的変異誘発法が本発明において使用され得る。親キシログルカナーゼのバリアントを調製するために使用され得る、多くの市販の利用可能なキットが存在する。
【００６９】
変異誘発、組み換え、及び／又はシャッフリングの既知の方法を用いて、単一の又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入がなされ、及び試験され得、その後関連性スクリーニング法、例えばＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号；又は国際公開第９５／２２６２５号に記載されたものが行われる。使用され得る他の方法は、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号）、及び領域特異的変異誘発（（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）を含む。
【００７０】
上記の変異誘発／シャッフリングは、宿主細胞、例えばバチルスによって上記の通り発現される、クローン化され、変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するための、ハイスループット自動スクリーニング法と組み合わされ得る。キシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする変異誘発されたＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収され得、そして当技術分野における標準的手法を使用して速やかにシーケンシングがなされる。
【００７１】
バリアント
本発明において、親キシログルカナーゼの単離されたバリアントは、位置番号：
【００７２】
【化３】
2011521661.tif 000004
【００７３】
から成る群から選択される、一つ以上の（幾つかの）位置における変更を含み、ここでキシログルカナーゼ活性を有する当該バリアントは、親キシログルカナーゼのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは少なくとも９８％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９９％の同一性度を有する。位置の番号付けは、配列番号３のアミノ酸配列に対するものである。好ましくは、一つ以上の、上で同定された位置における変更を含むバリアントは、親キシログルカナーゼと比較して、洗剤中、好ましくは液体洗剤中において増大した安定性を有する。
【００７４】
好ましい実施形態において、バリアントは、以下の変更の組み合わせを一つ以上（数個）含む：
【００７５】
【化４】
2011521661.tif 000005
【００７６】
【化５】
2011521661.tif 000006
【００７７】
【化６】
2011521661.tif 000007
【００７８】
【化７】
2011521661.tif 000008
【００７９】
【化８】
2011521661.tif 000009
【００８０】
【化９】
2011521661.tif 000010
【００８１】
一つの態様において、本発明のバリアント中におけるアミノ酸の変更の数は、好ましくは全部で５５個、好ましくは、５２個、より好ましくは５０個、より好ましくは４０個、より好ましくは３０個、より好ましくは２０個、より好ましくは１５個、より好ましくは１０個、より好ましくは９個、より好ましくは８個、さらにより好ましくは７個、さらにより好ましくは６個、さらにより好ましくは５個、さらにより好ましくは４個、さらにより好ましくは３個、そして最も好ましくは２個の変更、そして最も好ましくは１個の変更を含む。別の態様において、変更の総数は１個、好ましくは２個、より好ましくは３個、さらにより好ましくは４個、さらにより好ましくは５個、さらにより好ましくは６個、さらにより好ましくは７個、さらにより好ましくは８個、さらにより好ましくは９個、最も好ましくは１０個である。変更は、ｉ）当該位置を占めるアミノ酸の下流における、あるアミノ酸の挿入；ｉｉ）当該位置を占めるアミノ酸の欠失、又はｉｉｉ）当該位置を占めるアミノ酸の、異なるアミノ酸を用いた置換、の形態であり得る。当該変更は各々独立してなされ得、例えば、親キシログルカナーゼに対して、一つの位置における挿入が起こり得るが、第二の位置における置換が起こり、そして第三の位置における欠失が起こる。好ましい実施形態において、バリアントは置換のみを含む。
【００８２】
本発明の一つの態様において、変異誘発される位置は、コンセンサス配列分析に基づいて同定され得る。当該分析は、配列番号３と、配列番号５及び配列番号７とを、並びに
配列番号３のファミリー４４グリコシルヒドロラーゼ領域と３０％同一である、ｕｎｉｐｒｏｔデータベースからの他の配列とをアラインメントすることによって行われる。生じるコンセンサス配列を図１に示す。コンセンサス配列１は、アラインメントから、所定の位置において最も豊富なアミノ酸を含む配列であり、コンセンサス配列２は、所定の位置において２番目に豊富なアミノ酸を有する配列である、などである。本発明の第一の態様において、配列番号３の一つ以上の（幾つかの）残基は、コンセンサス配列１、又はコンセンサス配列２、又はコンセンサス配列３、又はコンセンサス配列４からの対応する残基によって交換される。本発明の一つの態様において、バリアントは、位置番号：
【００８３】
【化１０】
2011521661.tif 000011
【００８４】
から成る、コンセンサス配列分析によって同定された５２個の位置の群から選択される、一つ以上の（幾つかの）位置における変更を含む。好ましい実施形態において、当該変更は：
【００８５】
【化１１】
2011521661.tif 000012
【００８６】
から成る群から選択される、一つの置換、又は幾つかの置換である。
【００８７】
本発明の別の態様において、バリアントは、親ペプチドにおける、正の電荷を有し且つカルシウムイオンから２０Å以内に位置するアミノ酸を、中性又は負に荷電したアミノ酸へと変化させることによって生じる。本発明の好ましいバリアントは、カルシウムイオンから２０Å以内における総電荷がより負に荷電するバリアントを含む。かかるバリアントにおいて、正に荷電したアミノ酸は、本出願の条件下において、中性又は負に荷電したアミノ酸へと交換され得る。本明細書に従って、好ましいバリアントは、「化学的安定性」又は本出願における条件下において部分的又は完全に正に荷電したアミノ酸残基を有することができ、すなわち、Ｌｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓは、負に荷電した又は中性のアミノ酸と交換され得る。好ましい置換アミノ酸は、負に荷電したアミノ酸、例えばＡｓｐ及びＧｌｕであり、又は中性アミノ酸、例えばＡｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅである。本発明の好ましいバリアントは、位置番号４９、８７、１１８、１２９、１３４、１４２、１５６、１６９及び１９７から成る群から選択される、一つ以上の位置における変更を含む。好ましい実施形態において、当該変更は、８７、１１８、１２９、１３４、１４２、１５６、及び１６９から成る群から選択される、一つ以上の位置における置換である。好ましい実施形態において、当該置換は：
【００８８】
【化１２】
2011521661.tif 000013
【００８９】
から成る群から選択される。
【００９０】
一つの態様において、親キシログルカナーゼのバリアントは、位置６８、又は１２３、又は１５６、又は１１８、又は２００、又は１２９、又は１３７、又は１９３、又は９２、又は７６、又は３３１に対応する一つ以上の（幾つかの）位置における変更を含む。好ましくは、当該バリアントは、位置６８における置換、及び位置番号：
【００９１】
【化１３】
2011521661.tif 000014
【００９２】
から成る群から選択される、一つ以上のさらなる位置における、一つ以上の置換を含む。
【００９３】
別の態様において、バリアントは、位置１５６における置換、及び位置番号：
【００９４】
【化１４】
2011521661.tif 000015
【００９５】
から成る群から選択される、一つ以上のさらなる位置における、一つ以上の置換を含む。
【００９６】
別の態様において、親キシログルカナーゼのバリアントは、位置６８、又は１２３、又は１５６、又は１１８、又は２００、又は１２９、又は１３７、又は１９３、又は９２、又は７６、又は３３１に対応する、２つ以上の（幾つかの）位置における変更を含む。好ましくは、バリアントは、位置６８、又は１２３、又は１５６、又は１１８、又は２００、又は１２９における置換を含む。さらにより好ましくは、バリアントは、位置１２９及び位置１５６における置換を含む。
【００９７】
別の態様において、親キシログルカナーゼのバリアントは、位置６８、又は１２３、又は１５６、又は１１８、又は２００、又は１２９、又は１３７、又は１９３、又は９２、又は７６、又は３３１に対応する、３つ以上の（幾つかの）位置における変更を含む。
【００９８】
別の態様において、親キシログルカナーゼのバリアントは、位置６８、又は１２３、又は１５６、又は１１８、又は２００、又は１２９、又は１３７、又は１９３、又は９２、又は７６、又は３３１に対応する、４つ以上の（幾つかの）位置における変更を含む。
【００９９】
別の態様において、親キシログルカナーゼのバリアントは、位置６８、又は１２３、又は１５６、又は１１８、又は２００、又は１２９、又は１３７、又は１９３、又は９２、又は７６、又は３３１に対応する、５つ以上の（幾つかの）位置における変更を含む。
【０１００】
別の態様において、親キシログルカナーゼのバリアントは、位置６８、又は１２３、又は１５６、又は１１８、又は２００、又は１２９、又は１３７、又は１９３、又は９２、又は７６、又は３３１に対応する、６つ以上の（幾つかの）位置における変更を含む。
【０１０１】
別の態様において、親キシログルカナーゼのバリアントは、位置６８、又は１２３、又は１５６、又は１１８、又は２００、又は１２９、又は１３７、又は１９３、又は９２、又は７６、又は３３１に対応する、７つ以上の（幾つかの）位置における変更を含む。
【０１０２】
別の態様において、親キシログルカナーゼのバリアントは、位置１２９、及び１５６、及び３３１、及び２００、及び１１８に対応する位置における変更を含む。
【０１０３】
別の態様において、親キシログルカナーゼのバリアントは、位置６８、位置１２９、及び１５６、及び３３１、及び２００、及び１１８に対応する位置における変更を含む。
【０１０４】
別の態様において、親キシログルカナーゼのバリアントは、位置６８、位置９２、位置１２９、及び１５６、及び３３１、及び２００、及び１１８に対応する位置における変更を含む。
【０１０５】
別の態様において、バリアントは：
【０１０６】
【化１５】
2011521661.tif 000016
【０１０７】
から成る群から選択された一つ以上の（幾つかの）置換を含む。好ましくは、当該置換は：
【０１０８】
【化１６】
2011521661.tif 000017
【０１０９】
から成る群から選択される。より好ましくは、当該置換は：
【０１１０】
【化１７】
2011521661.tif 000018
【０１１１】
から成る群から選択される。より好ましくは、バリアントは、９個の、又は８個の、又は７個の、又は６個の、又は５個の、又は４個の、又は３個の、又は２個の、又は１個の位置（単数又は複数）において置換を含み、ここで当該置換は：
【０１１２】
【化１８】
2011521661.tif 000019
【０１１３】
から成る群から選択される。
【０１１４】
さらなる態様において、バリアントは、以下の置換の組み合わせを、一つ以上（数個）含む：
【０１１５】
【化１９】
2011521661.tif 000020
【０１１６】
好ましい実施形態において、上記の全てのバリアントは、グリコシルヒドロラーゼのファミリー４４に属する親キシログルカナーゼのバリアントであり、より好ましくは、当該親キシログルカナーゼは、配列番号３と、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するキシログルカナーゼから選択され、より好ましくは、当該親キシログルカナーゼは、配列番号２、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７から成る群から選択され、そして最も好ましくは、親キシログルカナーゼは配列番号３から成る。
【０１１７】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の親キシログルカナーゼのバリアントをコードする、単離されたポリヌクレオチドに関する。特に、上のバリアントの節で記載されたキシログルカナーゼをコードするポリヌクレオチドは、本発明に含まれる。本発明のポリヌクレオチドは、バリアント中において実際のアミノ酸変更に対応する適切な配列変更を有する、配列番号１の位置８２〜１６５３か配列番号１の位置９７〜１６５３のいずれかに対応する完全バリアント配列を含む、変性した二重鎖ＤＮＡプローブと、或いは少なくとも約１００塩基対の長さを有する、そのバリアントのサブ配列を含む任意のプローブと、少なくとも中等度ストリジェンシー条件で、しかし好ましくは高ストリジェンシー条件でハイブリダイズし得る。本発明のバリアントポリヌクレオチドはまた、上のバリアントの節において記載されたアミノ酸変更を生じる変異に加えて、サイレント変異を含み得る。サイレント変異は、アミノ酸の変化を生じない３文字コードにおける変異、例えばいずれもバリンをコードするＧＴＴからＧＡＴの変異である。
【０１１８】
本発明のキシログルカナーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ＤＮＡ及びＲＮＡを単離するための方法は、当技術分野において周知である。対象の遺伝子をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋにおいて、又はＤＮＡライブラリーにおいて、当技術分野で周知の方法によりクローニングされ得る。本発明のキシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはその後、例えばハブリダイゼーション又はＰＣＲによって、同定及び単離される。
【０１１９】
発現ベクター
本発明はまた、本発明の核酸コンストラクトを含む発現ベクター、特に組み換え発現ベクターに関する。本発明の核酸コンストラクトは、本発明のバリアントキシログルカナーゼをコードし、好ましくは、コントロール配列と混合可能な条件下において、好適な宿主細胞におけるコード配列の発現を行う一つ以上のコントロール配列に、機能し得るように連結される、単離されたポリヌクレオチドを含む。発現ベクターの製造において、発現のために、コード配列が好適なコントロール配列と機能し得るように連結されるように、当該コード配列はベクター中に配置される。当該コントロール配列は、ベクターによって、又は当該ベクターへと挿入される核酸コンストラクトによってのいずれかで提供され得る。
【０１２０】
コントロール配列は、好適なプロモーター配列、すなわち本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるヌクレオチド配列であり得る。当該プロモーターは、変異プロモーター、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）プロモーター、及びハイブリッドプロモーターを含む、最適な宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であり得、そして宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかである、細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。かかるプロモーターは当技術分野で周知である。コントロール配列はまた、好適な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列である。当該ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端と、機能し得るように連結される。最適な宿主細胞中において機能的である任意のターミネーターが、本発明において使用され得、かかるターミネーターは当技術分野において周知である。コントロール配列はまた、好適なリーダー配列、すなわち宿主細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域であり得る。当該リーダー配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に、機能し得るように連結される。最適な宿主細胞中において機能的である任意のリーダー配列は本発明において使用され得、かかるリーダー配列は当技術分野において周知である。コントロール配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端と連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域であって、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路へと移動させる。ヌクレオチド配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域の断片と、翻訳リーディングフレームにおいて天然において連結したシグナルペプチドコード領域を本来含み得る。或いは、コード配列の５’末端は、当該コード配列とは異なるシグナルペプチドコード領域を含み得る。当該異なるシグナルペプチドコード領域は、当該コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含まない場所において必要とされ得る。或いは、ポリペプチドの分泌を向上させるために、当該異なるシグナルペプチドコード領域は、天然のシグナルペプチドコード領域と容易に交換し得る。しかし、発現されたポリペプチドを好適な宿主細胞の分泌経路へ移動させる任意のシグナルペプチドコード領域が、本発明において使用され得る。当該コントロール配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわち、ヌクレオチド配列の３’末端に機能し得るように連結され、そして転写時に宿主細胞によってシグナルとして認識されて、転写されるｍＲＮＡへポリアデノシン残基を付加する配列であり得る。好適な宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列が、本発明において使用され得る。宿主細胞の増殖に関連するポリペプチドの発現の制御を可能とする、制御（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）配列を付加することがまた、所望であり得る。制御系の例は、制御化合物の存在を含む、化学的又は物理学的刺激に応答してオン又はオフにされる遺伝子の発現を引き起こすものである。
【０１２１】
本発明のバリアントキシログルカナーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドは、種々の方法で操作されて、ポリペプチドの発現を提供する。ベクターへの挿入に先立つポリヌクレオチド配列の操作が、発現ベクターに依存して、所望であるか又は必要であり得る。組み換えＤＮＡ法を利用する、ポリヌクレオチド配列の修飾のための技術は、当技術分野において周知である。さらに、ポリペプチドの精製又は固定化を補助し得るタグが、ポリペプチドに付加され得る。かかるタグは、例えばポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）であり得る。好ましくはタグは、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に配置され、そしてベクターによってコードされ得る。或いは当該タグは、ポリペプチドの機能に影響を与えない限り、ポリペプチド内部に配置され得る。
【０１２２】
組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ手順に好都合に晒され得、そしてヌクレオチド配列の発現を引き起こし得る任意のベクター（例えばプラスミド、ファージミド、ファージ、又はウィルス）であり得る。ベクターの選択は通常、当該ベクターが導入され得る宿主細胞とのベクターの適合性に依存し得る。
【０１２３】
ベクターは、線状プラスミド又は環状に近いプラスミドであり得る。当該ベクターは、自発的に複製するベクターであり得、即ち染色体外のものとして存在するベクターであって染色体の複製とは独立した複製を行うもの、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体であり得る。
【０１２４】
ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含み得る。或いはベクターは、宿主細胞へ導入されるとき、ゲノムへと組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体（単数又は複数）と共に複製されるものであり得る。さらに、宿主細胞のゲノムへと導入されるべき全ＤＮＡを共に含む、単一のベクター若しくはプラスミド、又は２つ以上のベクター若しくはプラスミド、或いはトランスポゾンが使用され得る。
【０１２５】
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能とする、一つ以上の選択マーカーを含む。選択マーカーは、その産物が殺生物剤、若しくはウィルス抵抗性、重金属への抵抗性、栄養要求株への原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）などを提供する遺伝子である。細菌の選択マーカーの例は、バチルス・サブチリス、若しくはバチルス・リケニホルミス由来のｄａｌ遺伝子、又は抗生物質抵抗性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、若しくはテトラサイクリン抵抗性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞に好適であるマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。真菌糸状宿主細胞における使用のための選択マーカーは、限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、及びそれらの等価体である。アスペルギルス・ニジュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリザエ（ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子、及びストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子が、アスペルギルス細胞における使用のために好ましい。
【０１２６】
本発明のベクターは、宿主細胞ゲノムへの当該ベクターの安定な組み込み、又は細胞内における、ゲノムから独立した当該ベクターの自律的複製を可能とする成分（単数又は複数）を含み得る。
【０１２７】
本発明のヌクレオチド配列の一つ以上のコピーは、宿主細胞へと挿入されて遺伝子産物の産生を増大させる。当該ヌクレオチド配列のコピー数の増大は、当該配列の少なくとも一つの追加のコピーを、宿主細胞ゲノムへ組み込むことによって得られ、或いは増幅可能な選択マーカーを当該ヌクレオチド配列と共に含めることによって得られ、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、そしてそれにより当該ヌクレオチド配列の追加のコピーを含む細胞は、好適な選択薬剤の存在下で細胞を培養することによって選択され得る。
【０１２８】
本発明の組み換え発現ベクターを構築するために、上記の成分を連結するために使用される手順は、当業者に周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，同上を参照）。
【０１２９】
本発明の一つの態様において、プラスミドベクターは、以下の成分を含み得る：
ｉ）シグナルペプチドコード領域（例えば、バチルス  ＮＣＩＢ１１８３７マルトース生成（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ）アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ−アミラーゼ、バチルス・リケニホルミス・サブチリシン、バチルス・リケニホルミス・アルファ−アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ，ｎｐｒＳ，ｎｐｒＭ）、及びバチルス・サブチリスｐｒｓＡの遺伝子から得られるもの）、並びに、成熟キシログルカナーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド配列。この配列は、以下のものに先行され、且つ機能し得るように連結され得る：
ｉｉ）ｍＲＮＡ安定化断片を含むＤＮＡ配列（例えば、国際公開第９９／０４３８３５号に開示されている、Ｃｒｙｌｌｌａ遺伝子由来である）；
ｉｉｉ）マーカー遺伝子（例えば、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子）；並びに
ｉｖ）フランキング断片とバチルスのゲノムとの間における相同的組み換えによってゲノムの組み込みを可能とする、ポリヌクレオチドの上流及び下流に各々存在する５’及び３’フランキング断片。
【０１３０】
上記のベクターはまた、先に記載した変異誘発法を使用するバリアントの生成及びスクリーニングに有用である。
【０１３１】
宿主細胞
本発明はまた、本発明のバリアントキシログルカナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む組み換え宿主細胞に関し、そしてそれは、ポリペプチドの組み換え体産生に有利に使用される。本発明のポリヌクレオチド配列を含むベクターは、当該ベクターが染色体の組み換え体として、又は先に記載した自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞へと導入される。
【０１３２】
宿主細胞は、原核生物、例えば細菌細胞、古細菌、又は真核細胞、例えば真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞であり得る。
【０１３３】
有用な原核生物は、細菌細胞、例えばグラム陽性細菌であり、限定されないが、バチルス細胞、例えばバチルス・アルカロフィルス（ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシ（ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ハロデュランス（ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・ロータス（ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム（ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・サブチリス、及びバチルス・チューリンゲンシス（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）；又はストレプトミセス細胞、例えばストレプトミセス・リビダンス（ｌｉｖｉｄａｎｓ）、若しくはストレプトミセス・ムリヌス（ｍｕｒｉｎｕｓ）を含み、或いはグラム陰性細菌であり、例えばＥ．コリ、及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属を含む。好ましい実施形態において、細菌宿主細胞は、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィルス、又はバチルス・サブチリス細胞である。別の好ましい実施形態において、バチルス細胞は好アルカリ性バチルスである。
【０１３４】
細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６８：１１１−１１５を参照）によって、コンピテント細胞（例えば、Ｙｏｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｐｉｚｉｚｉｎ，１９６１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ８１：８２３−８２９、又はＤｕｂｎａｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５６：２０９−２２１を参照）を使用して、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ  ａｎｄ  Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２−７５１を参照）によって、又はコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｅ，１９８７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １６９：５７７１−５２７８を参照）によって達成され得る。
【０１３５】
好ましい実施形態において、宿主細胞は真菌細胞である。本明細書において使用される「真菌」は、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門、及び接合菌門（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫに定義された通りである）、並びに卵菌類（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ，１７１ページに引用された通りである）、並びに全ての栄養胞子形成菌（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を含む。より好ましい実施形態において、真菌宿主細胞は酵母細胞である。本明細書において使用される「酵母」は、子嚢胞子類の（ａｓｃｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母（エンドマイセタレス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子胞子菌類の（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母、及び不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）に属する酵母（不完全酵母菌類（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））を含む。酵母の分類は将来変化し得るため、この発明の目的のために、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，ａｎｄ  Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，ｅｄｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９，１９８０）に記載された通りに定義されるものとする。
【０１３６】
さらにより好ましい実施形態において、酵母宿主細胞は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏサッカロミセス）、又はヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞である。最も好ましい実施形態において、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ジアスタチクス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシ（ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、又はサッカロミセス・オビホルミス（ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）細胞である。別の最も好ましい実施形態において、酵母宿主細胞は、クリベロミセス・ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）細胞である。別の最も好ましい実施形態において、酵母宿主細胞は、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞である。
【０１３７】
別のより好ましい実施形態において、真菌宿主細胞は糸状真菌細胞である。真菌類及び卵菌類のサブディビジョンの全ての糸状形態を含む（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫに定義された通りである）。糸状菌類は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖から成る菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養成長は、菌糸の伸長によって行われ、そして炭素異化は偏性好気性である。対照的に、酵母、例えばサッカロミセス・セレビシエによる栄養成長は、単細胞性葉状体の出芽によるものであり、そして炭素異化は発酵性であり得る。さらにより好ましい実施形態において、糸状真菌宿主細胞は、限定されないが、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属種の細胞である。最も好ましい実施形態において、宿主糸状真菌は、アスペルギルス・アワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォティダス（ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニジュランス、アスペルギルス・ニゲル（ｎｉｇｅｒ）、又はアスペルギルス・オリザエ細胞である。別の最も好ましい実施形態において、糸状真菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリジオイデス（ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウェレンス（ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・カルモルム（ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラタム（ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロセウム（ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシウム（ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・サルフレウム（ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）フザリウム・トリコテシオイデス（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、又はフザリウム・ベネナツム（ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）細胞である。さらに最も好ましい実施形態において、糸状真菌親細胞は、フザリウム・ベネナツム（Ｎｉｒｅｎｂｅｒｇｓｐ．ｎｏｖ．）細胞である。別の最も好ましい実施形態において、糸状真菌宿主細胞は、フミコラ・インソレンス（ｉｎｓｏｌｅｎｓ��、フミコラ・ラヌギノサ（ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラッサ（ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲナム（ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、チエラビア・テレストリス（ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）トリコデルマ・ハルジアナム（ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラチアタム（ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーセイ（ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（ｖｉｒｉｄｅ）細胞である。
【０１３８】
真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生成を伴う過程によって、それ自体既知の方法で形質転換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のために好適な手順は、ＥＰ２３８０２３、及びＹｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４に記載されている。フザリウム種を形質転換するために好適な方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６、及び国際公開第９６／００７８７号に記載されている。酵母は、Ｂｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９４：１８２−１８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３：１６３；及びＨｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９７８，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ７５：１９２０に開示された手順を使用して形質転換され得る。
【０１３９】
本発明の特定の実施形態は、本発明のバリアントキシログルカナーゼをコードするポリヌクレオチドを用いて形質転換された組み換え宿主細胞である。好ましくはかかる宿主細胞は、先天的にキシログルカナーゼコード遺伝子を含まないか、又はかかる遺伝子が破壊されている。それにより、組み換えバリアントキシログルカナーゼは、本発明の組み換え宿主細胞によって産生される唯一のキシログルカナーゼである。
【０１４０】
産生方法
本発明はまた、キシログルカナーゼバリアントを産生するための方法であって、以下のステップ：（ａ）当該バリアントの発現のために好適な条件下で本発明の宿主細胞を培養し；及び（ｂ）培養培地から当該バリアントを回収すること、を含む当該方法に関する。
【０１４１】
本発明の産生方法において、宿主細胞は、当技術分野で既知の方法を用いて、キシログルカナーゼバリアントの産生に好適な栄養培地中で培養される。例えば当該細胞は、振とうフラスコ培養によって、又は好適な培地中で、及びポリペプチドが発現され及び／又は単離される条件下で行われる、実験室用又は工業用発酵槽中での小スケール若しくは大スケール発酵（連続発酵、回分発酵、流加発酵、又は固体発酵を含む）によって培養され得る。当該培養は、炭素、及び窒素源、並びに無機塩を含む好適な栄養培地中で、当技術分野で既知の手順を用いて行われる。好適な培地は、民間の市販業者から入手可能であり、又は公開されている組成（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中のもの）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地中へと分泌される場合、当該ポリペプチドは当該培地から直接的に回収され得る。当該ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収され得る。
【０１４２】
本発明の一つの実施形態は、親キシログルカナーゼのバリアントの産生方法であって、前記バリアントがキシログルカナーゼ活性を有し、以下のステップ：ａ）当該バリアントの発現のために好適な条件下で細胞を培養し、ここで前記細胞は親キシログルカナーゼのバリアントをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記バリアントは：
【０１４３】
【化２０】
2011521661.tif 000021
【０１４４】
から成る群から選択される一つ以上の（幾つかの）アミノ酸位置（単数又は複数）において変更がなされ、そして前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号４、及び配列番号６から成る群から選択される親ポリヌクレオチド配列の変異誘発によって、又は配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する親ポリヌクレオチド配列の変異誘発によって製造され；並びに、ｂ）培養培地からキシログルカナーゼバリアントを回収すること、を含む前記方法である。
【０１４５】
別の態様において、キシログルカナーゼバリアントは回収されずに、バリアントを発現する本発明の宿主細胞が、当該バリアント源として使用される。
【０１４６】
キシログルカナーゼバリアントは、発現されたポリペプチドに特異的である、当技術分野で既知の方法を用いて検出され得る。これらの検出方法は、特定の抗体の使用、酵素産物の形成、又は酵素基質の消失を含み得る。例えば酵素アッセイが、実施例において本明細書に記載された通りに、バリアントキシログルカナーゼの活性を決定するために使用され得る。
【０１４７】
生じるキシログルカナーゼバリアントは、当技術分野で既知の方法によって回収され得る。例えば当該ポリペプチドは、限定されないが、収集、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、エバポレーション、又は沈降を含む従来法によって栄養培地から回収され得る。
【０１４８】
本発明のキシログルカナーゼバリアントは、限定されないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマト分画、及びサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば分取等電点電気泳動）、溶解度差（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（例えば、硫酸アンモニウム沈降）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊ．−Ｃ．Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照）を含む、当技術分野において既知の様々な方法により精製されて、実質的に純粋なキシログルカナーゼバリアントを得る。
【０１４９】
組成物
本発明はまた、バリアントキシログルカナーゼ、又は本発明のキシログルカナーゼ活性を有するポリペプチドを含む組成物に関する。好ましくは当該組成物は、かかるバリアント又はポリペプチドが豊富である。用語「豊富な」は、当該組成物のキシログルカナーゼ活性が、例えばエンリッチメント・ファクター（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）が１．１以上で増大されることを示す。好ましくは、当該組成物は製剤化されて所望の特性、例えば低着色、低臭気、低く且つ許容可能な保管安定性を提供するように製剤化される。
【０１５０】
当該組成物は、主要酵素成分として本発明のバリアント又はポリペプチドを含み得、例えば、単一成分組成物である。或いは、当該組成物は多数の酵素活性を含み得、例えば、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デコキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ,ベータ−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼである。
【０１５１】
当該ポリペプチド組成物は、当技術分野で既知の方法に従って調製され得、そしてそれは液体又は乾燥製剤の形態であり得る。例えば、当該ポリペプチドは、顆粒又は微小顆粒の形態で製剤化され得る。当該組成物中に含まれるバリアント又はポリペプチドは、当技術分野で既知の方法に従って安定化され得る。好ましい実施形態において、バリアントキシログルカナーゼは液体製剤に製剤化される。
【０１５２】
用途
本発明はまた、キシログルカナーゼバリアントを使用するための方法を対象とする。当該バリアントキシログルカナーゼは、好ましくは洗剤組成物、例えば洗濯洗剤組成物、例えば家庭用洗濯洗剤組成物に、特に液体洗濯洗剤組成物に組み込まれ、及び／又はそれらと共に使用される。洗剤組成物は通常、従来の洗剤成分、例えば界面活性剤（アニオン性、カチオン性、非イオン性、双性イオン性、両性）、増強剤（ｂｕｉｌｄｅｒ）、漂白剤、ポリマー、他の酵素及び他の成分、例えば、参照によりそれ全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第２００７／１３０５６２号及び国際公開第２００７／１４９８０６号に記載されたものを含む。
【０１５３】
洗剤組成物は、任意の形態で、例えば固体、液体、ゲル、又はそれらの任意の組み合わせで存在し得、好ましくは当該組成物は液体形態で存在し、好ましくは液体洗濯洗剤組成物である。
【０１５４】
本発明の態様は、ファブリック若しくは衣類における、毛玉除去（ｄｅｐｉｌｌｉｎｇ）、及び／又はファブリックの柔軟性、及び／又は着色の浄化（ｃｏｌｏｕｒ−ｃｌａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び／又は土の除去（ｓｏｉｌ  ｒｅｍｏｖａｌ）、及び／又は土の抗再付着（ａｎｔｉ−ｒｅｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、及び／又は染料移動阻害（ｄｙｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）の利益を付与するための、キシログルカナーゼバリアントの使用、又は本発明のキシログルカナーゼバリアント組成物及び洗剤組成物の使用である。
【０１５５】
さらに本発明は、洗剤組成物及び本発明のキシログルカナーゼバリアント又はキシログルカナーゼバリアント組成物を含む洗浄溶液でファブリックを処理することを含む、ファブリックの洗浄方法に関する。洗浄処理は、例えば機械洗浄工程において、又は手動洗浄工程において行われ得る。当該洗浄溶液は、例えば、洗剤組成物を含み、且つｐＨ３〜１２である洗浄水溶液であり得る。
【０１５６】
洗浄及び使用の間に、ファブリック又は衣類の表面は通常、当該ファブリックに色褪せた且つ擦り切れた外観を与え得る、破れた又は緩んだ繊維断片で品質が損なわれるようになる。当該ファブリックからのこれらの表面繊維の除去は、部分的に元の色及びファブリックの外観を回復させ、その結果着色の浄化及び外観の向上をもたらす。本発明のキシログルカナーゼバリアント又はキシログルカナーゼバリアント組成物は、単一又は多数（反復）の洗浄サイクルの使用によって、着色の浄化及び／又は外観の向上を提供するために使用され得る。
【０１５７】
さらに、布地の表面から突き出ている微小繊維は、集まって小さな玉、いわゆる毛玉又は綿毛となり、そしてそれらは当該表面にくっついて、ファブリックの外観を悪くする。本発明のキシログルカナーゼバリアント又はキシログルカナーゼバリアント組成物は、かかる毛玉を除去するために使用され得、かかる効果を毛玉除去と呼ぶ。
【０１５８】
着色の浄化及び毛玉除去は、試験群パネルを用いて目視検査によって評価され得る。当該効果はまた、光学的測定を用いて、光反射によって又は綿の綿毛の決定によって測定され得る。これらの方法は当技術分野で一般的に既知であり、そしてＥｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｃｙ，１９９７，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，１３９〜１４０ページに簡潔に記載されている。
【０１５９】
特に、洗浄サイクル数の増大と共に、微粒子の土、溶解性の土、染料及び顔料、並びに不溶性の塩を含み得る付着物は、布地の繊維表面上に蓄積する。これは、検出される洗浄処理の洗浄性能の可視的な悪化をもたらし、例えば灰色がかった又は黄色がかったファブリックの外観をもたらす。これは、洗浄サイクルにおいて本発明のキシログルカナーゼバリアント又はキシログルカナーゼバリアント組成物を用いることで防止され得る。この効果は、抗再付着、又は染料移動阻害、又は土の除去と呼ばれ、そして光学的測定によって評価され得る。
【０１６０】
ファブリックの表面上、及び繊維間に捕捉される土又は不溶性塩粒子は、当該ファブリックの硬化をもたらし得る。洗浄サイクルにおいて本発明のキシログルカナーゼバリアント、又はキシログルカナーゼバリアント組成物を含むことによって、当該ファブリックは軟化され得る。
【０１６１】
本発明の方法に晒されるファブリックは、従来の洗濯可能な洗濯物、例えば家庭における洗濯物であり得る。好ましくは当該洗濯物の大部分が、綿花、綿との混紡、又は天然若しくは人工のセルロース誘導体（例えば木材パルプ由来）、或いはそれらの混合物から製造されたニット、織物、デニム、毛糸、及びタオル地のものを含む、衣類及びファブリックである。混合の例は、綿、又はレーヨン／ビスコースと、一つ以上の対の材料、例えば羊毛、合成繊維（例えばポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ポリウレタン繊維、ポリウレア繊維、アラミド繊維）、及びセルロース含有繊維（例えば、レーヨン／ビスコース、ラミー、フラックス／リネン、ジュート、酢酸セルロース繊維、リヨセル）との混合である。
【０１６２】
本発明のキシログルカナーゼバリアント又はキシログルカナーゼバリアント組成物を含む洗剤溶液を用いた、ファブリック及び／又は衣類の処理は、例えば新しい繊維、及び／又はファブリック、及び／又は衣類との関連で、並びに使用されたファブリック及び／又は衣類の洗濯中、例えば家庭における洗濯工程の間、又は施設における洗濯工程中において適切であると認識される。
【０１６３】
本発明のキシログルカナーゼバリアント又はキシログルカナーゼバリアント組成物の用量、並びに洗剤溶液の組成及び濃度を含む、当該組成物が使用される他の条件は、当技術分野で既知の方法に基づいて決定され得る。
【０１６４】
本発明は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない、以下の実施例によってさらに説明される。
【０１６５】
キシログルカナーゼバリアントは、本発明の組成物中において使用され得、その結果セルロース又はヘミセルロースの誘導体を含む土の除去を達成し、抗再付着を向上させ、及び土の放出を改善する。キシログルカナーゼはまた、本発明の組成物中に使用され得、後に続く洗濯工程の間において土の放出の利益を綿に付与する。土の放出の利益は、綿ファブリック上で及び／又は相当量の綿を含む全ての種類のファブリック上で、例えば綿−合成繊維（例えばポリエステル、ポリアミド、例えばナイロン（商標）、及びエラステイン）混合物上で観察される。
【実施例】
【０１６６】
実施例１−キシログルカナーゼバリアントの産生及び精製
本発明のキシログルカナーゼバリアントは標準的手順によって製造され、簡潔に言えば：ランダム及び／又は部位特異的変異誘発を遺伝子へと導入し、変異した遺伝子を用いてバチルス・サブチリス宿主細胞を形質転換し、当該形質転換された宿主細胞を発酵させ、そして当該発酵培養液からキシログルカナーゼバリアントを得た。レファレンスのキシログルカナーゼ（配列番号３）を、バチルス・サブチリス中で組み換えにより同様の方法で産生した。
【０１６７】
流れを調節された（ｂａｆｆｌｅｄ）５００ｍｌ三角フラスコ中、ＣａＣＯ3タブレット（０．５ｇ）を一錠含む１００ｍｌのＰＳ−１培地を振盪しながら、振盪フラスコ培養中で、３７℃にて４日間発酵を行った。ＰＳ−１培地組成物は、１００ｇ／Ｌスクロース、４０ｇ／Ｌ大豆かすミール（Ｓｏｙｍｅａｌ  Ｍｅａｌ）、１０ｇ／Ｌ  Ｎａ2ＨＰＯ4*１２Ｈ2Ｏ、０．１ｍｌ／Ｌ  Ｄｏｗｆａｘ６３Ｎ１０、及び６μｇ／ｍｌクロラムフェニコールの形態である抗生物質を含む。
【０１６８】
発酵の後、培養液は遠心分離（２６０００×ｇ、２０分）によって回収された。少量の上清を、０．４５μｍフィルターを通じてろ過することで無菌化し、そして冷凍保管した。下記の安定性アッセイを開始する以前に、当該試料を速やかに解凍した。
【０１６９】
幾つかの場合において、酵素試料が安定性試験のために使用される以前に、当該試料を精製した。酵素精製に関して、残余の宿主細胞を除去するために、ＮＡＬＧＥＮＥ  ０．２μｍろ過ユニット（カタログ番号５６９−００２０）を通じて上清をろ過した。０．２μｍろ液のｐＨを、２０％ＣＨ3ＣＯＯＨを用いてｐＨ５．０に調整し、そして当該ろ液を、５０ｍＭコハク酸／ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、ｐＨ５．０で平衡化されたＸｐｒｅｓｓＬｉｎｅ  ＰｒｏＡカラム（ＵｐＦｒｏｎｔ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ／Ｓ）へアプライした。ＸｐｒｅｓｓＬｉｎｅ  ＰｒｏＡカラムを、平衡化バッファーを用いて広範囲に洗浄した後、キシログルカナーゼは５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．０を用いた段階的溶出（ｓｔｅｐ−ｅｌｕｔｉｏｎ）によって溶出された。溶出中にフラクションを回収した。カラムからのフラクションをキシログルカナーゼ活性に関して分析し（実施例２）、そして活性を有するフラクションを保管した。当該保管物のｐＨを、３Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基にてｐＨ９．０に調整し、そして当該保管物を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ９．０と同一の（又はより低い）伝導性となるように脱塩された水を用いて希釈した。調整された溶液を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ９．０で平衡化されたＳＯＵＲＣＥ  Ｑカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。平衡化バッファーを用いて広範囲にＳＯＵＲＣＥ  Ｑカラムを洗浄した後、同一のバッファー中、ＮａＣｌの直線的グラジエント（０→０．５Ｍ）を用いて５カラム体積超にて当該酵素を希釈した。キシログルカナーゼ活性に関して当該カラムからのフラクションを再度分析し、そして活性のあるフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにてさらに分析した。クーマシィーで着色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で一つのバンドが見られるフラクションを、精製された調製物として保管した。
【０１７０】
実施例２−キシログルカナーゼアッセイ
酵素試料、例えば精製された酵素試料のキシログルカナーゼ活性を、ＡＺＣＬ−キシログルカンアッセイで測定した。
【０１７１】
ＡＺＣＬ−キシログルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を、キシログルカナーゼと共にインキュベートし、そして遊離した青い呈色を６５０ｎｍで測定した。適切なブランク値を差引した後における、インキュベーション中における青い呈色の増大としてキシログルカナーゼ活性を計算した。
【０１７２】
ＡＺＣＬ−キシログルカン基質：攪拌により、０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で均質に懸濁された、４ｍｇ／ｍｌ  ＡＺＣＬ−キシログルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）
アッセイ温度：       ３７℃
アッセイバッファー：５０ｍＭコハク酸／ＮａＯＨ，０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，ｐＨ５．０
【０１７３】
５００μｌのＡＺＣＬ−キシログルカン基質懸濁液をエッペンドルフチューブに入れ、氷上に置いた。５００μｌアッセイバッファーを添加し、そして当該混合物を氷冷とした。２０μｌの酵素試料（０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で希釈）を加えた。エッペンドルフチューブをエッペンドルフ・サーモミキサー（ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）へと移すことによってアッセイを開始した。当該チューブをエッペンドルフサーモミキサー上で１５分間、その最大の振盪速度で（１４００ｒｐｍ）インキュベートした。当該チューブを氷浴へと戻すことによってインキュベーションを停止した。チューブが氷冷となった後、氷冷された遠心分離機中で当該チューブを短時間遠心分離し、未反応の基質を沈澱させた。２００μｌの上清をマイクロタイタープレートへ移し、そしてＡ650を読み取った。バッファー・ブランク（酵素の代わりに、２０μｌ，０．０１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）は当該アッセイに含まれ、そして酵素試料とバッファー・ブランクとの間のＡ650の差がキシログルカナーゼ活性の測定値であった。
【０１７４】
実施例３−キシログルカナーゼバリアントの安定性
本発明のキシログルカナーゼバリアントの洗剤安定性を、液体洗剤中でのインキュベーション後における当該バリアントの活性を測定することによって評価した。
【０１７５】
酵素試料を液体洗剤へと加え、そしてそれを高温、例えば３５℃又は４０℃で保管することによって、安定性試験を行った。所定の保管時間の後、酵素活性を決定し、そして約−１８℃で同じ時間保管された同等試料の活性と比較した。安定性試験の結果は、低温で保管された試料において見られた活性の％として表現される、高温で保管された試料で見られた活性である。
【０１７６】
キシログルカナーゼバリアントの結果は、同一条件下で試験した親キシログルカナーゼ（配列番号３）の結果と比較された。これら２つの安定性の結果間における比が、安定性改善係数（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＳＩＦ）である。
【０１７７】
ＳＩＦ＞１のバリアントは試験条件下で親キシログルカナーゼよりも安定である。好ましいバリアントは、この試験において高いＳＩＦを有するものである。
【０１７８】
洗剤
安定性試験のために使用された液体洗剤は、以下の組成を有した。
【０１７９】
【表１】
2011521661.tif 000022
【０１８０】
保管試験
実施例１に従って調製された酵素試料を、保管安定性試験を開始する前に速やかに解凍した。
【０１８１】
酵素試料を１ｍｌ当たり０．２５ｍｇ酵素タンパク質の濃度で希釈した。
【０１８２】
液体洗剤を、約１２ｍｌの容量でガラス容器へと分注し、各々のガラス容器に１．０±０．０５グラムの洗剤を提供した。
【０１８３】
各々の酵素試料に関して、２つの複製容器を用意した。５０μｌの希釈された酵素、及び小さいマグネティック・スターラーバーを容器へと加え、そして（保管中における蒸発を防ぐために）それらをしっかりと密閉した。マグネティック・スターラーバーを用いて約５分間内容物を混合した。対の内、一方の容器を約−１８℃でフリーザーに置いた。他方の容器を好適なインキュベーター・オーブンに、試験されるべき所定の高温、例えば３５℃又は４０℃にて置いた。所定の保管時間の後、インキュベーター・オーブン中の容器をフリーザーへと移動した。
【０１８４】
活性アッセイ
洗剤中における保管後の酵素試料の活性を、以下の手順を用いて測定した。
【０１８５】
材料及び試薬：
１Ｍ  リン酸バッファーｐＨ７：
１３８グラムのＮａＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏを約７５０ｍｌの水に溶解し、４Ｎ  ＮａＯＨを加え、ｐＨ７．０とした。その後、最終容量を１０００ｍｌとした。
アッセイバッファー（５０ｍＭ  リン酸バッファーｐＨ７）：
９５０ｍｌの水、５０ｍｌの１Ｍ  リン酸バッファーｐＨ７、及び５ｍｌのＢｅｒｏｌ５３７（Ａｋｚｏ  Ｎｏｂｅｌによって提供された、非イオン性界面活性剤）を混合し、最終的なｐＨを７．００±０．０２へと調節した。
基質：
Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ  Ｌｔｄにより提供されたＣｅｌｌａｚｙｍｅ  Ｃ錠、カタログ番号Ｔ−ＣＣＺ。当該錠剤は、架橋され、染色されたＨＥセルロースを含んだ。
【０１８６】
手順
アッセイ開始約３０分前、容器をフリーザーから約４℃の冷蔵庫へと移した。アッセイを開始する直前に、当該容器を冷蔵庫から取り出し、そしてラボラトリー・ベンチ上に置き、そして開いた。
【０１８７】
１０ｍｌのアッセイバッファー（室温）を各々の開いた容器へと加えた。当該容器をその後、水中マルチポイント・マグネティックスターラーを備えた３０℃の水浴へと移した。内容物を約５分間緩やかに攪拌した。
【０１８８】
各々の容器にＣｅｌｌａｚｙｍｅ  Ｃ錠を一錠加えた。基質粒子が動き続け、且つ沈澱を回避するのに十分なスターラー速度で攪拌を継続した。錠剤の添加から３０分後、容器を水浴から除去し、その後攪拌せずに１５分間室温で静置した。
【０１８９】
ピペットを用いて約１ｍｌの実質的に透明な上清を各々の容器の上部から取り、セミミクロ分光光度計キュベットへと移した。その後、好適な分光光度計を用いて５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。全ての測定を１５分以内に終了した。ブランク試料、すなわちキシログルカナーゼ酵素を加えられていないこと以外同等な洗剤試料を当該アッセイに含めた。
【０１９０】
計算
各々の酵素試料に関して、２つのＡｂｓ５９０測定値が存在する：
・Ａ５９０ｆ：−１８℃で保管された試料のＡｂｓ５９０値
・Ａ５９０ｗ：高温で保管された試料のＡｂｓ５９０値
Ａ５９０ｆからブランク値（Ａ５９０ｂ）を引き（Ａ５９０ｆ−Ａ５９０ｂ）、そしてＡ５９０ｗからブランク値を引いた（Ａ５９０ｗ−Ａ５９０ｂ）。
【０１９１】
安定性を以下のように計算した：
【０１９２】
【数１】
2011521661.tif 000023
【０１９３】
各々の酵素に関して、（Ａ５９０ｆ−Ａ５９０ｂ）の結果は、０．１〜１．２の範囲あるはずである。当該値がこの範囲外である場合、その酵素に関する結果は信頼できないと見なされ、そして当該試験は当該酵素試料の異なる希釈を用いて反復されるべきである。
【０１９４】
最終的に、各々の酵素に関する安定性改善係数（ＳＩＦ）を以下のように計算した：
ＳＩＦ＝酵素試料の％安定性／親酵素（配列番号３）の％安定性
【０１９５】
結果
以下は、異なる条件下で試験されたキシログルカナーゼバリアントの安定性の結果である。
【０１９６】
【表２】
2011521661.tif 000024
【０１９７】
【表３】
2011521661.tif 000025
【０１９８】
【表４】
2011521661.tif 000026
【０１９９】
【表５】
2011521661.tif 000027
【０２００】
【表６】
2011521661.tif 000028
【０２０１】
【表７】
2011521661.tif 000029
【０２０２】
【表８】
2011521661.tif 000030
【０２０３】
【表９】
2011521661.tif 000031
【０２０４】
実施例４  キシログルカナーゼバリアントの安定性
液体洗剤中にてインキュベーション後、当該バリアントの活性を測定することによって、本実施例のキシログルカナーゼバリアントの洗剤安定性を評価した。
【０２０５】
酵素試料を液体洗剤へと加え、そしてそれを高温、例えば３５℃又は４６℃で保管することによって、安定性試験を行った。所定の保管時間の後、酵素活性を決定し、そして同じ時間、約＋５℃で低温保管された同等試料の活性と比較した。安定性試験の結果は、低温で保管された試料（ストレスを受けていない試料）において見られた活性の％として表現される、高温で保管された試料（ストレスを受けた試料）で見られた活性である。
【０２０６】
キシログルカナーゼバリアントの結果は、同一条件下で試験した親キシログルカナーゼ（配列番号３）の結果と比較された。
【０２０７】
洗剤
安定性試験のために使用された液体洗剤は、以下の組成を有した。
【０２０８】
【表１０】
2011521661.tif 000032
【０２０９】
保管試験
実施例１に従って調製された酵素試料を、保管安定性試験を開始する直前に解凍した。
【０２１０】
さらなる希釈をすることなく酵素試料を使用した。
【０２１１】
液体洗剤を丸底ポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレート（プレート１）へと分注し、１ウェル当たり１９０μｌの洗剤を提供した。
【０２１２】
１０μｌの酵素試料、及び小さいマグネティック・スターラーバーを各々のウェルへ加え、そして（蒸発を防ぐために）接着性アルミ箔のフタ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてしっかりと密閉した。マグネティック・スターラーバーを用いて約３０分間内容物を混合した。
【０２１３】
プレート１の各々のウェルから、２０μｌの洗剤−酵素混合物を新しい空の同一のプレート（プレート２）へとその後移した。両方のプレートをその後密閉した。
【０２１４】
元のプレート（プレート１）を試験されるべき所定の高温、例えば３５℃又は４６℃でインキュベーター・オーブン中に置いた。他方のプレート（プレート２）を約５℃で冷蔵庫中に置いた。
【０２１５】
所定の時間のインキュベーションの後、当該プレートを冷蔵庫及びインキュベーター・オーブンから取り出した。プレートを少なくとも３０分間ラボラトリー・ベンチ上に置き、全てのウェルを室温とした。
【０２１６】
その後、プレート１の各々のプレートから２０μｌを、新しい空の丸底９６ウェルプレート（プレート１ａ）へと移した。
【０２１７】
プレート１は、２０μｌの、ストレスを受けた試料を含み、そしてプレート２は２０μｌの、ストレスを受けていない試料を含む。
【０２１８】
活性アッセイ
室温にて以下の手順を用いて、洗剤中における、保管後の酵素試料の活性を測定した。
【０２１９】
アッセイの原理：
パラ−ニトロフェノール−ベータ−Ｄ−セロテトラオシド（ｐＮＰ−ベータ−Ｄ−セロテトラオシド）は、特定のキシログルカナーゼ酵素の触媒作用によって加水分解される合成基質である。
【０２２０】
基質自体は無色であるが、終端の還元性末端グリコシド結合の加水分解時に、パラ−ニトロフェノールが放出され、そしてそれは４０５ｎｍにおける強い吸光度のためにｐＨ８のバッファー中において黄色である。
【０２２１】
ｐＮＰ−ベータ−Ｄ−セロテトラオシド自体は、所定のアッセイ条件下において非常に安定である。したがって、４０５ｎｍにおける吸光度の増大は、酵素活性の特性である。
【０２２２】
４０５ｎｍにおける強い吸光度の増大によって証明される通り、親キシログルカナーゼ（配列番号３）が、ｐＮＰ−ベータ−Ｄ−セロテトラオシドを基質として受容することを我々は発見した。
【０２２３】
材料及び試薬：
アッセイバッファー：１００ｍＭ  ＥＰＰＳ；０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ８．０
ｐＮＰ−ベータ−Ｄ−セロテトラオシド（ＣＡＳ番号：１２９４１１−６２−７；Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；カナダ）
基質溶液：１ｍＭ  ｐＮＰ−ベータ−Ｄ−セロテトラオシドのアッセイバッファー溶液
【０２２４】
手順
プレート１ａは、２０μｌの、ストレスを受けた試料を含み、そしてプレート２は２０μｌの、ストレスを受けていない試料を含む。
【０２２５】
５０μｌアッセイバッファーをプレート１ａ及びプレート２の全てのウェルへ加えることによって試料を希釈し、そしてマイクロタイタープレート・シェーカーを用いて１時間混合した。その後、さらに５０μｌのアッセイバッファーを全てのウェルへ加え、そして振盪をさらに１０分間継続した。
【０２２６】
２０μｌの６倍希釈試料を透明な３８４ウェルのポリスチレンマイクロタイタープレートへ移し、そして２０μｌの基質溶液を全てのウェルへ加えた。当該マイクロタイタープレートを軽く振って、当該試料を混合した。３８４ウェルの分光光度計リーダーを用いて４０５ｎｍにおける吸光度の増大速度を観測することによって、酵素活性の動力学測定を速やかに開始した。
【０２２７】
反応の初期速度（Ａｂｓ／分）を決定した。反応の初期速度は、適切な酵素濃度内における線形検量線によって確認される、試料中における酵素活性の基準であった。
【０２２８】
計算：
ストレスを受けた試料における酵素活性を、ストレスを受けていない同等の試料における酵素活性で割ることで％残存活性（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を計算した。
【０２２９】
【数２】
2011521661.tif 000033
【０２３０】
結果
異なる条件下で試験されたキシログルカナーゼバリアントの安定性の結果を以下に示す。
【０２３１】
【表１１】
2011521661.tif 000034
【０２３２】
【表１２】
2011521661.tif 000035
【０２３３】
【表１３】
2011521661.tif 000036
【０２３４】
【表１４】
2011521661.tif 000037
【０２３５】
【表１５】
2011521661.tif 000038
【０２３６】
【表１６】
2011521661.tif 000039
【０２３７】
【表１７】
2011521661.tif 000040
【０２３８】
【表１８】
2011521661.tif 000041
【０２３９】
【表１９】
2011521661.tif 000042
【０２４０】
【表２０】
2011521661.tif 000043
【０２４１】
【表２１】
2011521661.tif 000044
【０２４２】
【表２２】
2011521661.tif 000045
【０２４３】
【表２３】
2011521661.tif 000046
【０２４４】
【表２４】
2011521661.tif 000047
【０２４５】
【表２５】
2011521661.tif 000048
【０２４６】
【表２６】
2011521661.tif 000049
【０２４７】
【表２７】
2011521661.tif 000050
【図１Ａ】
2011521661.tif 000070
【図１Ｂ】
2011521661.tif 000071
【配列表】
2011521661000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月7日(2011.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親キシログルカナーゼの単離されたバリアントであって、位置６８における、並びに位置番号：
【化１】
2011521661.tif 000072
から成る群から選択される一つ以上の位置における、前記親キシログルカナーゼの変更を含み、前記位置は配列番号３のアミノ酸配列における位置に対応し、そして、
ａ）前記変更（単数又は複数）は：
ｉ）前記位置を占めるアミノ酸の下流におけるアミノ酸の挿入、及び／又は
ｉｉ）前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
ｉｉｉ）前記位置を占めるアミノ酸と、異なるアミノ酸との置換
であり；
ｂ）前記親キシログルカナーゼは、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７から成る群から選択されるか、又は配列番号３の前記親キシログルカナーゼのアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するキシログルカナーゼから選択され；
ｃ）前記バリアントは、配列番号３の前記親キシログルカナーゼのアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして
ｄ）前記バリアントはキシログルカナーゼ活性を有する、前記バリアント。
【請求項２】
【化２】
2011521661.tif 000073
から成る群から選択される一つ以上の置換を含む、請求項１に記載のバリアント。
【請求項３】
【化３】
2011521661.tif 000074
から成る群から選択される一つ以上の置換を含む、請求項１又は２に記載のバリアント。
【請求項４】
以下の変更の組み合わせ：
【化４】
2011521661.tif 000075
のうち、一つ以上を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項５】
前記親キシログルカナーゼと比較して改善された洗剤安定性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバリアント。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のバリアントをコードする、単離されたポリヌクレオチド配列。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、組み換え宿主細胞。
【請求項８】
親キシログルカナーゼのバリアントの産生方法であって、前記バリアントがキシログルカナーゼ活性を有し、以下のステップ：
ａ）前記バリアントの発現のために好適な条件下で請求項７に記載の宿主細胞を培養し；及び
ｂ）培養培地から前記バリアントを回収すること
を含む前記方法。
【請求項９】
キシログルカナーゼの洗剤安定性を改善するための方法であって、位置６８を変更し、並びに位置：
【化５】
2011521661.tif 000076
から成る群から選択される一つ以上の位置を変更することを含み、前記位置は配列番号３のアミノ酸配列における位置に対応し、そして、
ａ）前記変更（単数又は複数）は：
ｉ）前記位置を占めるアミノ酸の下流におけるアミノ酸の挿入、及び／又は
ｉｉ）前記位置を占めるアミノ酸の欠失、及び／又は
ｉｉｉ）前記位置を占めるアミノ酸と、異なるアミノ酸との置換
であり；
ｂ）前記親キシログルカナーゼは、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７から成る群から選択されるか、又は配列番号３の前記親キシログルカナーゼのアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するキシログルカナーゼから選択され；
ｃ）前記バリアントは、配列番号３の前記親キシログルカナーゼのアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み；そして
ｄ）前記バリアントはキシログルカナーゼ活性を有する、前記方法。
【請求項１０】
前記バリアントが、以下の変更の組み合わせ：
【化６】
2011521661.tif 000077
のうち、一つ以上を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のバリアントを含む液体製剤。
【国際調査報告】
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