(57)【要約】鉱物粒子、不溶性コラーゲン繊維、およびゲル形成性多糖成分および／または別の追加されたゲル形成剤を含む移植可能な可成形性医用材料が記載されている。可成形性医用材料は、骨原性タンパク質等の生理活性因子との併用を含め、患者における骨または他の組織欠損を治療するために用いることができる。可成形性医用材料を調製するために用いることができる方法および材料も記載されている。【選択図】なし
2011519285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約４０重量％〜約７５重量％の水を含む可成形性、凝集性、保形性パテを含む移植可能な医用材料であって、
前記パテはその中に分散した鉱物粒子を約０．２５ｇ／ｃｃ〜約０．５５ｇ／ｃｃのレベルで含み、
前記パテは不溶性コラーゲン粒子を約０．０４ｇ／ｃｃ〜約０．１５ｇ／ｃｃのレベルで含み、
前記パテは多糖成分を約０．０１ｇ／ｃｃ〜約０．２ｇ／ｃｃのレベルで含み、前記多糖成分は１つまたは複数の多糖化合物を含み、
生理活性物質も含み、
前記生理活性物質は組換えヒトＢＭＰ−２を含む、移植可能な医用材料。
【請求項２】
パテ中の不溶性コラーゲン粒子と多糖成分との重量比が約４：１〜約１：１の範囲であり、
骨原性タンパク質も含み、
骨原性タンパク質が骨形態形成タンパク質を含む、請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【請求項３】
生体親和性湿潤化剤も含み、前記湿潤化剤が有機ポリヒドロキシ化合物である、請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【請求項４】
前記多糖成分がアルギネートおよびデンプンを含む、請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【請求項５】
前記鉱物粒子が二相性リン酸カルシウムを含む、請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【請求項６】
前記多糖成分が、アルギネート、デンプン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヘパラン硫酸、キトサン、ゲランガム、キサンタンガム、グアーガム、およびＫ−カラギーナンからなる群から選択される１つまたは複数のメンバーを含む、請求項１に記載の移植可能な医用材料。
【請求項７】
（ｉ）ゲル形成性アルギネートおよび少なくとも１つの追加的なゲル形成剤を含む水性ゲル担体；および
（ｉｉ）不溶性コラーゲン粒子および鉱物粒子を含み、水性ゲル担体と混合された不溶性固体；および
（ｉｉｉ）骨形態形成タンパク質
を含む医用インプラント材料であって、
前記鉱物粒子が前記材料中に約０．２５〜約０．５５ｇ／ｃｃのレベルで存在する、医用インプラント材料。
【請求項８】
少なくとも１つの追加的なゲル形成剤がデンプンを含み、前記材料が約４０％〜約７５％の水を含む、請求項９に記載の医用インプラント材料。
【請求項９】
水、不溶性コラーゲン粒子、多糖、および鉱物粒子を含む可成形性の移植可能な材料を含む医用インプラント材料。
【請求項１０】
多糖がアルギネートである、請求項９に記載の医用インプラント材料。
【請求項１１】
鉱物粒子が二相性リン酸カルシウム顆粒を含む、請求項９に記載の医用インプラント材料。
【請求項１２】
骨原性タンパク質も含み、タンパク質がｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−７およびｒｈＧＤＦ−５から選択される、請求項１１に記載の医用インプラント材料。
【請求項１３】
移植可能な骨原性医用材料を調製する方法であって、
崩壊性マトリックス内に包埋された粒子状鉱物材料を含む乾燥された多孔材料を提供するステップであって、前記マトリックスが不溶性コラーゲンおよび１つまたは複数の多糖化合物を含む多糖成分を含むステップと、
乾燥された多孔材料に水性媒体を加え、マトリックスを崩壊させて４０重量％〜７５重量％の水を含む可成形性、凝集性、保形性パテを調製するステップとを含み、
水性媒体はその中に溶解した骨形態形成タンパク質を約０．６ｍｇ／ｃｃ〜約２ｍｇ／ｃｃのレベルで含み、
粒子状鉱物材料は乾燥された多孔材料の約７０重量％〜９０重量％を構成し、
不溶性コラーゲンは乾燥された多孔材料の約１％〜約１５％を構成し、
多糖成分は乾燥された多孔材料の約１％〜約１５％を構成する、
移植可能な骨原性医用材料を調製する方法。
【請求項１４】
マトリックス内に包埋された粒子状鉱物材料を含む乾燥された多孔体を含む医用インプラント材料であって、
マトリックスは、不溶性コラーゲン、１つまたは複数の多糖化合物を含むゲル形成性多糖成分、および少なくとも１つの湿潤化剤を含み、前記湿潤化剤は生体親和性有機ポリヒドロキシ化合物であり、
多孔体は約７０重量％から約９０重量％の粒子状鉱物材料、約１０重量％〜３０重量％の不溶性コラーゲン、および約１重量％〜１５重量％のゲル形成性多糖成分を含む、医用インプラント材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には医用パテインプラント材料ならびにある態様においてはコラーゲンおよび他の成分を含む医用パテインプラント材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨欠損の治療のため、種々の材料が提案されてきた。従来の骨移植に加えて、いくつかのパテ材料を含むいくつかの合成骨移植片代替物が用いられ、あるいは探索されてきた。
骨の一貫した成長を効果的に行うため、インプラント材料は生体親和性セラミックまたは他の鉱物足場等の実質的足場材料の存在から利点を導き出す。そのような鉱物材料は一般に硬く、脆い物質である。パテ材料に大量の鉱物粒子を組み込むことは、特に顆粒または他の比較的大きな粒子に関する限り、難しいことが判明している。というのは、硬い鉱物の大きな片はパテの塊を崩壊させる傾向があり、それによりパテの塊は容易に破壊または浸食されて、インプラント前の取扱いのためおよびインプラント後の持続性のために望ましい凝集性を失うからである。このことは、所望のインプラント量の中におよびそれを通して効果的な骨成長を達成する際に、足場微粒子の移動または分離によって問題を提起する可能性がある。
【発明の概要】
【０００３】
本領域における背景を考慮すると、成形性と凝集性の望ましい組合せを維持しつつ鉱物粒子を組み込んだ、改良されたパテ材料の必要性が存在する。ある態様においては、本発明はこれらの必要性を対象とする。
【０００４】
その態様のいくつかにおいては、本発明は可成形性医用インプラント組成物に関し、該組成物は液相と組み合わされた不溶性コラーゲン粒子および鉱物粒子を含み、該液相は少なくとも１つのゲル形成剤を含み、該ゲル形成剤は有利な形態においては多糖化合物である。したがって、ある実施形態においては、本発明は鉱物粒子、不溶性コラーゲン粒子、および１つまたは複数の多糖化合物を含む多糖成分を含む可成形性医用パテを含む移植可能な医用材料を提供する。可成形性医用パテは望ましくは凝集性、保形性のパテである。そのようなパテは例えば約４０重量％〜約７５重量％の液体水性媒体、ある実施形態においては約６０％〜約７５％の液体水性媒体を含んでよい。また、パテは、例えば１立方センチメートルあたり約０．６ミリグラム（ｍｇ／ｃｃ）〜約２ｍｇ／ｃｃのレベルで組み込まれた骨形態形成タンパク質を含んでよい。パテ中の鉱物粒子は、約０．４ミリメートル（ｍｍ）〜約５ｍｍの範囲の平均粒子直径を有してよく、パテ全体中に約０．２５ｇ／ｃｃ〜約０．５５ｇ／ｃｃのレベルで組み込まれてよい。パテはさらに、不溶性コラーゲン粒子を約０．０４ｇ／ｃｃ〜約０．１５ｇ／ｃｃのレベルで、可溶性コラーゲンを約０．０１ｇ／ｃｃ〜約０．０８ｇ／ｃｃのレベルで、また多糖を約０．０１〜約０．２０ｇ／ｃｃのレベルで含んでよい。パテ中の不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンとの重量比は約４：１〜約１：１の範囲であってよく、および／またはパテ中の可溶性コラーゲンと多糖成分（存在する１つまたは複数の多糖の合計を含む）との重量比は約４：１〜約１：４の範囲であってよい。
【０００５】
別の実施形態においては、本発明は移植可能な医用パテ材料を調製するための方法を提供する。該方法は、崩壊性マトリックス中に包埋された、約０．４ｍｍ〜約５ｍｍの平均粒子直径を有する粒子状鉱物材料を含む乾燥した多孔性材料を提供するステップを含む。崩壊性マトリックスは、不溶性コラーゲン粒子および１つまたは複数の多糖化合物を含む多糖成分を含む組合せを含む。ある量の水性媒体が乾燥した多孔性材料に加えられ、材料は崩壊して可成形性インプラント材料を形成する。ある形態においては、乾燥された材料は約７０重量％〜約９０重量％の粒子状鉱物材料、約１０重量％〜約３０重量％の不溶性コラーゲン粒子、および約１％〜約２０％の多糖成分を含む。ある実施形態においては、コラーゲン状マトリックスは４：１〜約１：１の重量比で存在する不溶性コラーゲン粒子および可溶性コラーゲン、ならびに約４：１〜約１：４の重量比で可溶性コラーゲンおよび多糖成分を含む。水性液体媒体は、パテ全体の約４０重量％〜７５重量％、ある実施形態においては、パテ全体の約６０重量％〜７５重量％を構成するために充分な量で加えることができる。ある態様においては、水性媒体は、移植可能な骨原性医用パテ材料をもたらすために、約０．６ｍｇ／ｃｃ〜約２ｍｇ／ｃｃのレベルでその中に溶解した骨形態形成タンパク質を含んでよい。
【０００６】
別の実施形態においては、本発明は、ゲル形成性アルギネートおよび少なくとも１つの追加的なゲル形成剤を含む水性ゲル担体を含む医用インプラント材料を提供する。不溶性コラーゲン粒子および鉱物粒子は、水性ゲル担体と配合される。そのようなインプラント材料は、水性媒体を不溶性コラーゲン粒子、鉱物粒子、ゲル形成性アルギネート、および少なくとも１つの追加的なゲル形成剤を含む乾燥した材料、望ましくは乾燥された多孔体に加えるステップを含む本発明の方法に従って調製することができる。前記少なくとも１つの追加的なゲル形成剤はある実施形態においてはデンプンを含んでよく、デンプンは水性ゲル担体または高分子物質の粘度を増大させ、これはゼラチン等の熱可逆的ゲルの形成に効果的である。
【０００７】
さらに別の実施形態においては、本発明はマトリックス中に包埋された粒子状鉱物材料を含む乾燥された多孔体を含むインプラント材料を提供し、マトリックスは不溶性コラーゲン粒子、１つまたは複数の多糖等の少なくとも１つのゲル形成剤、および水性媒体に接触した際に乾燥された多孔体の湿潤速度を増大させる少なくとも１つの生体親和性湿潤化剤の組合せを含む。粒子状鉱物材料は約０．４ｍｍ〜約５ｍｍの平均粒子直径を有してよい。マトリックスは湿潤によって崩壊することができ、パテの調製に有用である。多孔体は約７０重量％〜約９０重量％の粒子状鉱物材料、約１０重量％〜約３０重量％の不溶性コラーゲン、および約１％〜約１５％の１つもしくは複数の多糖または他のゲル形成剤を含んでよい。湿潤化剤はポリエチレングリコール等の有機ポリヒドロキシ化合物であってよい。ある形態においては、不溶性コラーゲン粒子および１つまたは複数の多糖化合物を含む多糖成分は、約４：１〜約１：１の重量比で存在する。乾燥された多孔体は生体親和性水性液体で湿潤化されて、少なくとも１つのゲル形成剤および湿潤化剤を含む水性ゲルと配合された不溶性コラーゲン粒子および鉱物粒子を含む可成形性、凝集性、保形性パテ材料を形成することができる。
【０００８】
さらなる実施形態においては、本発明は本明細書に記載された、および／または本明細書に記載されたように調製された医用材料を患者に埋め込むステップを含む、患者を治療する方法を提供する。
【０００９】
本発明の追加的な実施形態ならびに特徴および利点は、本明細書の記載から当業者には明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】湿潤化液体を受容するためのリザバーを含む本発明の乾燥された多孔体インプラント材料の斜視図である。
【図２】本発明の円筒形態の乾燥された多孔体インプラント材料の斜視図である。
【図３】最終滅菌されたシリンジデバイス内に包装された医用ペーストまたはパテを含む本発明の医用製品の斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の原理の理解を助ける目的のため、ここでいくつかの実施形態について参照し、これを記述するために特定の専門用語を用いる。しかしそれによって本発明の範囲を限定することは意図されておらず、例示されたデバイスにおけるそのような変更およびさらなる改良ならびに本明細書に記載された本発明の原理のそのようなさらなる適用は、本発明が関連する技術分野における当業者には通常想到されるであろうと予期されることが理解されよう。
【００１２】
上述のようにある態様においては、本発明はパテ等の移植可能な可成形性医用材料およびそのような材料を調製するために有用な方法および材料に関する。本発明の好ましい医用材料は、高い鉱物含量、可成形性、凝集性、および保形性を含む有利な特性の組合せを有する。これに関し、本明細書において使用される用語「可成形性」は、材料が圧力をかけることによって第１の形状から第２の形状に永久的に変換できることを意味する。本明細書において使用されるパテを記述する用語「凝集性」は、伸張時に破断することなく実質的に伸びる能力を示すことを含む、パテが伸張時に単一の結合された塊を維持する傾向があることを意味する。不溶性コラーゲン繊維および多糖を含む本発明のパテを伸張する状況においては、有利なパテは、その間に互いに粘着するかなりの量の噛み合ったコラーゲン繊維の存在が明らかになるような伸張を示す。本明細書においてパテを記述するために用いられる用語「保形」は、パテが高粘度で、圧力が作用しなければそれが置かれた形状を保つ傾向があることを意味する。これは、容易に流動し、したがって表面に適用した際にプールまたは溜りを作ることになる薄いペースト形態材料と対照的である。本発明のある特徴においては、成分の新規な組合せによって、顕著で高いレベルの大粒子状鉱物粒子を含むのみならず、可成形性、凝集性、および保形性において優れた特性を示す医用パテ材料が提供される。
【００１３】
本発明の態様による可成形性インプラント材料は、不溶性コラーゲン、および１つまたは複数の多糖および／または別のゲル形成剤（「ＧＦＡ」）の組合せを含むことになる。ある実施形態においては、本発明の可成形性インプラント材料はまた、可溶性コラーゲンを含むことになる。これに関し、「可溶性コラーゲン」は酸性水性環境における個別のトロポコラーゲン分子の溶解性を指す。トロポコラーゲンはコラーゲン繊維のモノマー単位と考えてよく、その三重らせん構造はよく認識されている。可溶性コラーゲンは本明細書に記述された可成形性組成物中で有利に用いて、インプラント固体への配合のための濃縮された液体ゲル相の形成に関与させることができる。本明細書において使用される「不溶性コラーゲン」は、化学的改質なしには水性アルカリまたはいかなる無機塩溶液にも溶解させることができないコラーゲンを指し、例えば皮革、スプリットおよび他の哺乳類または爬虫類の被膜を含む。例えば、「天然不溶性コラーゲン」は皮と肉面との間に存在する動物皮革（例えばウシ、ブタ等）の中間層である真皮から誘導することができる。「再構成コラーゲン」は本質的に個別の三重らせん分子に解重合され、次いで溶液に曝され、次いでフィブリル様形態に再構築されたコラーゲン繊維セグメントである。
【００１４】
ある態様においては、可溶性コラーゲンおよび不溶性コラーゲン粒子、例えば繊維またはランダム化断片の両方を含む医用材料が提供される。可溶性コラーゲンおよび不溶性コラーゲン繊維または他の粒子は、最初に別々に調製し、次いで組み合わせることができる。可溶性コラーゲンおよび／または不溶性コラーゲンの両方はウシ皮革から誘導することができるが、他のコラーゲン源（例えばウシ腱、ブタ組織、組換えＤＮＡ技術、発酵等）から調製することもできる。例えば腱、皮膚もしくは筋膜または他の源からのヒト組織由来コラーゲンを含むヒトコラーゲンも、本明細書に記述した組成物において用いることができる。組換えヒトコラーゲンも用いることができる。
【００１５】
本発明のある態様による可成形性医用インプラント組成物の液相は、１つまたは複数の多糖化合物を含む多糖成分を含むことになる。望ましくは、多糖成分は液相の粘度を増大させるか、そうでなければ湿潤化された不溶性コラーゲン／可溶性コラーゲン／粒子状鉱物の配合物の凝集性を改善する量で含まれる。さらに、多糖成分は不溶性コラーゲン／鉱物粒子混合物を可塑化して、流動特性を改善し、および／または可成形性組成物全体の粘着性を低減させる役割を果たすことができる。
【００１６】
単独でもしくは多糖成分中に組み合わせて用いることができる多糖には、例えばアルギネート、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、へパリン、へパリン硫酸、キトサン、ゲランガム、キサンタンガム、グアーガム、およびＫ−カラギーナン、デンプン（例えばジャガイモデンプン、ムギデンプン、またはトウモロコシデンプン）、またはこれらのもしくは他の多糖の２つ以上の混合物が含まれる。ゲル形成剤は、ゼラチン等の熱可逆的ゲル形成ポリペプチドを含むゲル形成ポリペプチドであってもよい。ある実施形態においては、ゼラチンまたはヒト体温（約３７℃）もしくはそれより僅か上にゲル化温度を有する別の熱可逆的ゲル形成剤を、多糖化合物（１つまたは複数）に加えてもしくはその代替として用いることができる。このようにして、熱可逆的ゲル形成剤を体温より低い温度で可成形性インプラント材料の流動性担体成分の粘度を増大させる量で用いることができ、流体成分はゲルの熱反転による粘度の顕著な減少を受けることがない（なぜなら熱可逆的ゲル形成剤は実質的にそのゲル化温度もしくはそれ未満に留まるからである）。ゼラチンまたは体温もしくはそれより上にゲル化温度を有する他の熱可逆的ゲル形成剤を用いる他の実施形態においては、可成形性組成物をその流動性を高めるために体温より高い温度に加熱し（好ましくは体温より僅かにのみ高い温度、例えば約３８〜４０℃）、次いでヒト患者を含む患者に埋め込むことができる。ゼラチンまたは他の熱可逆的ゲル形成剤は次いで冷却してゲル化し、それにより埋込み箇所における埋め込まれた可成形性塊の一体性が高められる。
【００１７】
ある実施形態においては、可成形性組成物は、一価、二価または他の多価イオン性種、多くの場合にはカチオン性種との組合せによって熱不可逆的イオン架橋ゲルを形成することができる少なくとも１つのイオン性多糖を含む。本発明の実施における使用のために意図されたイオン架橋可能な材料には、アルギネート、キトサン、ゲランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸、ヘパリン、ペクチン、カラギーナン等のイオン性材料が含まれる。多くの適切な多糖は、アルギネートおよびペクチン等の植物由来多糖（それらのゲル形成性誘導体を含む）である。他の適切な多糖は細菌から誘導することができ、例えばシュードモナス・エロデア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ）から誘導されるゲランガムであってよい。
【００１８】
イオン性多糖の水溶液は一般に、対イオンの水溶液との接触によってイオン架橋ゲルを形成することができる。例えば、アルギネート、ペクチンおよび他の同様な多糖をイオン架橋するために有用な試薬には、好ましくは二価または三価カチオンを含むカチオン性ゲル化剤が含まれる。これらの目的のために有用な二価カチオンには、アルカリ土類金属、特にカルシウムおよびストロンチウムが含まれる。アルミニウムは有用な架橋性三価カチオンである。これらのイオン性架橋剤は通常、塩によって供給される。カルシウムまたは他の塩のために有用なアニオン性対イオンは、望ましくはクロライド、グルコネート、フルオライド、シトレート、ホスフェート、タータレート、サルフェート、アセテート、ボレート等の薬学的に許容されるアニオンから選択される。アルギネートまたはペクチン化合物とともに用いるための特に好ましいイオン性架橋剤は、塩化カルシウムによって供給される。イオン性多糖であるキトサンも用いることができ、多価のアニオン性ゲル化剤とともにイオン架橋することができる。そのような試薬には、アルカリ金属またはアンモニウムのポリホスフェート、ピロホスフェートまたはメタホスフェート等の金属ポリホスフェートが含まれる。シトレートも用いることができる。これらのアニオン性架橋剤はまた通常、塩によって供給される。ポリホスフェートまたは他の塩のためのカチオン性対イオンは、例えばナトリウム、カリウム、またはアンモニウムを含む任意の適切な生体親和性または薬学的に許容されるカチオンであってよい。さらに、ゲランガム等の細菌性多糖およびカラギーナン等の植物性多糖を含む、一価カチオンへの曝露によってゲル化する多糖は、上述のアルギネートの架橋のために使用可能なものと同様の方法を用いて架橋してヒドロゲルを形成することができる。ゲランガム等の、一価カチオンの存在下でゲル化する多糖も用いることができる。そのような多糖は、例えば生理的レベルのナトリウムを含む溶液への曝露でゲルを形成することができる。植物由来および動物由来材料を含む多くの他の生体親和性多糖ならびに対応するイオン架橋剤が知られており、これらも本発明の態様において用いることができる。
【００１９】
熱不可逆的イオン架橋ゲルを形成することができるそれらのイオン性多糖の使用が好ましいが、本発明においてはこれらの多糖は、仮にあったとしてもインプラント材料の可成形性を喪失しない程度にのみイオン架橋されることが理解されるであろう。したがって本発明の態様の中では、イオン性架橋剤は添加されないか実質的に添加されず、またはいくつかの例においては組成物全体の粘度を増大させるためにイオン性架橋剤を比較的少量だけ添加することができる。一方、本発明の他の態様においては、本明細書に述べる可成形性組成物を、材料を患者に埋め込む直前、その間、またはその後にイオン性架橋剤を含むある量の液体媒体と接触させることができる。例示的には、本明細書に述べる可成形性組成物を、可成形性組成物と架橋剤とがシリンジを出る際に混合される二重筒シリンジ投与法の場合のように、イオン性架橋剤の液体媒体とともに共投与することができる。あるいは、先に埋め込んだ量の可成形性組成物を適当なイオン性架橋剤を含む溶液または他の液体媒体で洗浄して、埋め込んだ材料をｉｎ  ｓｉｔｕで強化することができる。
【００２０】
ある実施形態においては、パテ形態の組成物は不溶性コラーゲン繊維をパテに対して０．０４ｇ／ｃｃ〜０．１５ｇ／ｃｃのレベルで、また全ＧＦＡ（例えば多糖（単数または複数）および／またはゼラチン）をパテに対して０．０１ｇ／ｃｃ〜０．２０ｇ／ｃｃのレベルで含む。他の実施形態においては、そのような組成物は不溶性コラーゲン繊維をパテ中に約０．０５〜０．１ｇ／ｃｃのレベルで、また任意選択で可溶性コラーゲンおよび多糖（単数または複数）をそれぞれパテ中に約０．０２〜約０．０５ｇ／ｃｃのレベルで含む。有益なパテは、パテ材料の望ましい取扱いおよびインプラント特性に有利に寄与するために、不溶性コラーゲン繊維を少なくともＧＦＡの全量以上の量（重量％）で含んでよい。さらなる実施形態においては、パテは重量比４：１〜１：１で存在する不溶性コラーゲン繊維および全ＧＦＡを含むことになる。さらなる実施形態においては、パテは可溶性コラーゲンおよび多糖成分（１つまたは複数の多糖を含む）を重量比４：１〜１：４で含むことになり、これには不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンとを重量比約７５：２５〜約６０：４０で、および可溶性コラーゲンと多糖成分とを重量比約２：１〜１：２で含むパテが含まれる。さらに、本発明の追加的な望ましいパテは、不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンとを約７５：２５〜約６５：３５の重量比で、また可溶性コラーゲンと多糖（単数または複数）とを約２：１〜１：２の重量比で含み、ある特定の実施形態においては、不溶性コラーゲンと可溶性コラーゲンとの重量比は約７０：３０で、一方可溶性コラーゲンと多糖（単数または複数）との重量比は約１：２〜２：１の範囲に留まる。
【００２１】
本発明の医用パテまたは他の組成物はまた、ある量の粒子状鉱物材料を含む。本発明のある態様においては、粒子状鉱物は本発明のパテ組成物に、パテに対して少なくとも約０．２５ｇ／ｃｃのレベルで、また典型的には約０．２５ｇ／ｃｃ〜約０．５５ｇ／ｃｃの範囲で組み込まれる。そのような比較的高レベルの鉱物は、新生骨の内部成長のための足場の提供に役立ち得る。
【００２２】
本発明において用いられる鉱物は、骨の内部成長のための足場を提供するために効果的な天然もしくは合成の鉱物または鉱物材料の混合物を含んでよい。例示的には、鉱物マトリックスは骨粒子、Ｂｉｏｇｌａｓｓ（登録商標）、リン酸三カルシウム、二相性リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、サンゴヒドロキシアパタイト、および生体親和性セラミックからなる群からの１つまたは複数の材料から選択することができる。二相性リン酸カルシウムは、本発明における使用に特に望ましい合成セラミックである。そのような二相性リン酸カルシウムのリン酸三カルシウム：ヒドロキシアパタイトの重量比は、約５０：５０〜約９５：５、より好ましくは約７０：３０〜約９５：５、さらにより好ましくは約８０：２０〜約９０：１０、最も好ましくは約８５：１５であってよい。鉱物材料は平均粒子直径が約０．４〜５．０ｍｍの間、より典型的には約０．４〜３．０ｍｍの間、望ましくは約０．４〜２．０ｍｍの間の微粒子であってよい。
【００２３】
本発明の別の態様においては、鉱物材料は、粒子状鉱物材料について上述したものと共通した平均粒子直径を得るために磨砕された、場合により海綿骨粒子、好ましくは皮質骨粒子を含んでよい。ヒトおよび非ヒト骨源の両方が本発明における使用に適しており、骨はインプラントを受容する哺乳類に対して事実上、自家移植片、同種移植片または異種移植片であってよい。骨粒子を鉱物材料としてまたはその中で用いる際の疾病伝播および／または免疫原性反応の危険を最小化するために、当技術分野で知られた適当な前処理を用いてもよい。前記骨粒子は、単独でまたは本明細書で述べる合成鉱物材料と組み合わせて用いることができる。
【００２４】
１つの実施形態においては、その免疫原性を低減または除去するために前処理された異種骨が、インプラント組成物における多孔性鉱物マトリックスとしてまたはその中で用いられる。例えば、インプラント材料に対する免疫原性反応の危険を低減するために、骨を焼成または除タンパクすることができる。
【００２５】
本発明のパテ形態の組成物は大きな割合の、一般に水、生理食塩液、または緩衝溶液等の水性液体である液体担体を含んでよい。１つの態様においては、本発明の可成形性、凝集性、保形性パテは、約６０重量％〜７５重量％の、水等の水性液体媒体を含む。しかし、より硬い（例えば減衰固体マトリックス）または患者に埋め込むためのペースト等のより流動性の高い材料のいずれかを調製するために、より高いまたはより低いレベルの液体媒体を用いることもできることが理解されよう。また当業者に認識されるように、ＧＦＡに付与される粘度を制御または調節するために、液体担体媒体のｐＨ、イオン強度、および他の特性を選択することができる。例示的には、好ましいインプラント組成物の可成形性の特徴を過度に妨害する可能性がある望ましくないレベルの、存在するいかなる多糖（単数または複数）のイオン架橋をも防止するために、液体成分のこれらのおよび他のパラメーターを制御することができる。
【００２６】
本明細書に述べる可成形性組成物はまた、ヒト患者等の哺乳類に埋め込まれた際に組成物を骨原性にするために効果的な量でその中に組み込まれた骨形態形成タンパク質または別の骨原性物質を含んでもよい。１つの実施形態においては、本発明のパテ組成物は骨形態形成タンパク質または他の同様の骨原性タンパク質をパテ１立方センチメートルあたり約０．６ミリグラム（ｍｇ／ｃｃ）〜約２ｍｇ／ｃｃパテのレベルで、有利には約０．８ｍｇ／ｃｃ〜約１．８ｍｇ／ｃｃのレベルで含む。
【００２７】
上述のように、ある実施形態においては、本発明の組成物は重量ベースで全ＧＦＡと少なくとも同程度の量の不溶性コラーゲン繊維を、例えば約４：１〜約１：１の重量比で組み込むことになる。いくつかの形態においては、パテ組成物は不溶性コラーゲン繊維および可溶性コラーゲンを、存在する可溶性コラーゲンよりも多い不溶性コラーゲン繊維をもって、例えば約７５：２５〜約６０：４０、より望ましくは約７５：２５〜約６５：３５、ある特定の実施形態においては約７０：３０の重量比で含むことになる。これらの目的に適したコラーゲン材料は、文献で知られた方法を用いて調製することができ、または例えばＳｅｍｅｄ  Ｓとして知られる可溶性コラーゲン、Ｓｅｍｅｄ  Ｆとして知られる繊維状コラーゲン、およびＰ１０７６として知られるコンポジットコラーゲンを製造しているＫｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｅｘｔｏｎ，Ｐａ．）を含む商業的供給源から得ることができる。
【００２８】
例えば採取された自家骨または他の適切な骨原性物質を含む、任意の適切な骨原性材料を、本発明の方法および／または組成物において用いることができる。ある実施形態においては、骨原性物質には、骨形成の誘導に効果的な成長因子が含まれ得る。望ましくは、成長因子は骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）として一般に知られるタンパク質のクラスからのものであり、ある実施形態においては組換えヒト（ｒｈ）ＢＭＰであってよい。これらのＢＭＰタンパク質は骨原性、軟骨原性ならびに他の成長および分化活性を有することが知られており、その中にはｒｈＢＭＰ−２、ｒｈＢＭＰ−３、ｒｈＢＭＰ−４（ｒｈＢＭＰ−２Ｂとも称される）、ｒｈＢＭＰ−５、ｒｈＢＭＰ−６、ｒｈＢＭＰ−７（ｒｈＯＰ−１）、ｒｈＢＭＰ−８、ｒｈＢＭＰ−９、ｒｈＢＭＰ−１２、ｒｈＢＭＰ−１３、ｒｈＢＭＰ−１５、ｒｈＢＭＰ−１６、ｒｈＢＭＰ−１７、ｒｈＢＭＰ−１８、ｒｈＧＤＦ−１、ｒｈＧＤＦ−３、ｒｈＧＤＦ−５、ｒｈＧＤＦ−６、ｒｈＧＤＦ−７、ｒｈＧＤＦ−８、ｒｈＧＤＦ−９、ｒｈＧＤＦ−１０、ｒｈＧＤＦ−１１、ｒｈＧＤＦ−１２、ｒｈＧＤＦ−１４が含まれる。例えば、米国特許第５，１０８，９２２号、第５，０１３，６４９号、第５，１１６，７３８号、第５，１０６，７４８号、第５，１８７，０７６号および第５，１４１，９０５号に開示されたＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１８０９８に開示されたＢＭＰ−８；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２に開示されたＢＭＰ−９；米国特許第５，６３７，４８０号に開示されたＢＭＰ−１０；米国特許第５，６３９，６３８号に開示されたＢＭＰ−１１；または米国特許第５，６５８，８８２号に開示されたＢＭＰ−１２もしくはＢＭＰ−１３；米国特許第５，６３５，３７２号に開示されたＢＭＰ−１５；ならびに米国特許第５，９６５，４０３号および第６，３３１，６１２号に開示されたＢＭＰ−１６。また有用と思われる他の組成物には、Ｖｇｒ−２およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／１５９６５、ＷＯ９４／１５９４９、ＷＯ９５／０１８０１、ＷＯ９５／０１８０２、ＷＯ９４／２１６８１、ＷＯ９４／１５９６６、ＷＯ９５／１０５３９、ＷＯ９６／０１８４５、ＷＯ９６／０２５５９およびその他に記述されたものを含む任意の成長および分化因子（ＧＤＦ）が含まれる。本発明においてまた有用なのは、ＷＯ９４／０１５５７に開示されたＢＩＰ；ＪＰ公開番号７−２５０６８８に開示されたＨＰ００２６９；およびＰＣＴ出願ＷＯ９３／１６０９９に開示されたＭＰ５２である。これにより、これらの特許および出願の全ての開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明においてまた有用なものは、上記および改質タンパク質のヘテロダイマーまたはそれらの部分欠失生成物（生物学的に活性なフラグメント）である。これらのタンパク質は個別にまたは２種以上の混合物で用いることができる。骨成長を誘導する能力を示すｒｈＢＭＰ−２またはその生物学的に活性な誘導体またはフラグメントが好ましい。
【００２９】
ＢＭＰは組換えによって製造し、またはタンパク質組成物から精製することができる。ＢＭＰはホモダイマーであってもよく、または他のＢＭＰとのヘテロダイマー（例えばＢＭＰ−２およびＢＭＰ−６のそれぞれ１つのモノマーからなるヘテロダイマー）もしくはアクチビン、インヒビンおよびＴＧＦ−β１等のＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーとのヘテロダイマー（例えばＢＭＰのそれぞれ１つのモノマーおよびＴＧＦ−βスーパーファミリーの関連するメンバーからなるヘテロダイマー）であってもよい。そのようなヘテロダイマータンパク質の例は、例えばＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９３／０９２２９に記載されており、これによりその明細書は参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において有用な骨原性タンパク質の量は、浸潤する前駆細胞の骨原活性の増大を刺激するのに効果的な量であり、治療される欠損の寸法および性質、ならびに用いる担体および特定のタンパク質を含むいくつかの因子に依存することになる。ある実施形態においては、インプラント部位に送達すべき骨原性タンパク質の量は、約０．０５〜約１．５ｍｇの範囲となる。
【００３０】
他の治療用成長因子または物質、特に骨形成を刺激するために用いることができるものも、本発明のパテまたは他の可成形性組成物において用いることができる。そのようなタンパク質は知られており、例えば血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、軟骨由来形態形成タンパク質、成長分化因子５（ＧＤＦ−５）等の成長分化因子、ならびにＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βを含む形質転換成長因子が含まれる。さらに、脱塩骨マトリックス（ＤＢＭ）等の他の生物学的に誘導されたマトリックス材料を本発明のパテに組み込むことができる。
【００３１】
本発明において用いるべき骨原性タンパク質または他の生物学的活性剤は、液体製剤、例えば緩衝水性製剤で提供することができる。ある実施形態においては、そのような製剤は乾燥されたインプラント材料と混合され、その上および／またはその中に受容され、または他の方法で組み合わされて、次いで本発明の可成形性骨原性材料を調製するために操作される。
【００３２】
本発明の組成物のさらなる強化として、当業者は他の骨原性強化因子が組成物に組み込まれ得ることを容易に認識するであろう。そのような追加的な因子には、それだけに限らないが、宿主親和性の骨原性前駆細胞、自家移植骨髄、同種移植骨髄、形質転換成長因子−β、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子、ミクログロブリン−β、抗生物質、抗真菌剤、湿潤化剤、グリセロール、ステロイドおよび非ステロイド抗炎症性化合物が含まれる。
【００３３】
別の態様においては、本発明は、パテ材料を調製するために適当な量の水性媒体と組み合わせることができる乾燥インプラント材料を提供する。乾燥インプラント材料は、例えば混合粉末を含む任意の適切な形態であってよい。有利な形態においては、乾燥インプラント材料は崩壊性マトリックス中に包埋された粒子状鉱物材料を含む多孔体であり、粒子状鉱物材料は望ましくは約０．４ｍｍ〜約５．０ｍｍの平均粒子直径を有する。乾燥された多孔インプラント体または他の乾燥材料は、約７０重量％〜約９０重量％の粒子状鉱物材料、約１０重量％〜約３０重量％の不溶性コラーゲン粒子、および約１重量％〜約１５重量％の多糖（単数または複数）および／または他の追加的なゲル形成成分を含んでよい。不溶性および可溶性コラーゲンの両方を用いる場合、組み合わされたコラーゲンの中で、乾燥された多孔体または他の材料は、約１重量％〜２５重量％の不溶性コラーゲンおよび約１重量％〜１５重量％の可溶性コラーゲン、より好ましくは約８重量％〜約２０重量％の不溶性コラーゲンおよび約２％〜約１２％の可溶性コラーゲンを含んでよい。ある実施形態においては、乾燥された多孔インプラント体または他の材料は、全ＧＦＡを約６重量％〜約１０重量％の量で含んでよい。
【００３４】
本明細書に述べる乾燥されたインプラント体はまた、乾燥された材料を水性媒体で湿潤化する速度を増大させる量の試薬を含んでよい。例えば、湿潤化剤は多糖または他のゲル形成剤の分子量よりも低い分子量を有する生体親和性有機ポリヒドロキシ化合物であってよい。例示的には、生体親和性湿潤化剤は約１０，０００未満、ある実施形態においては例えば約５００〜約５０００の範囲の分子量を有するポリエチレングリコールポリマー等のポリオール化合物であってよい。そのような湿潤化剤は、乾燥重量ベースでインプラント体の約１重量％〜約２５重量％を構成してよい。特にアルギネート等の湿潤化しにくい比較的疎水性の多糖の場合には、生体親和性湿潤化剤を組み込むことによって、乾燥されたインプラント体または本明細書に述べた他の乾燥材料に水性媒体を加えることによる可成形性材料の形成が顕著に促進されることが見出された。デンプンおよびアルギネートの混合物を含む乾燥されたインプラント体はまた、アルギネート単独の場合よりも容易に湿潤化されることが見出され、任意選択によりデンプン、アルギネート、および上述の生体親和性湿潤化剤の３種全ての混合物を含んでもよい。
【００３５】
本明細書に述べた組成を有する乾燥された多孔体はまた、非崩壊性の３次元体で、パテまたは他の適合した材料を形成するための手作業による粉砕および混練に湿潤条件で影響されにくく、むしろ単一で一体の片として持ちこたえられるものであってよい。そのようなデバイスは硬くてもよく、または例えばスポンジまたはフォームデバイスを含む形状記憶を示してもよい。これらの非崩壊性体または崩壊性体は、任意選択で、乾燥形態でまたは湿潤条件で埋め込むことができる。さらに、そのような崩壊性または非崩壊性体は、本明細書に述べた生物活性剤またはそれらの混合物によって処理され、またはそれらを含んでよい。
【００３６】
重量比ベースで成分を考慮すると、多孔体または他の乾燥材料（およびそれらから調製する際は可成形性組成物）は、重量比４：１〜１：１、有利には約７５：２５〜約６０：４０で存在する不溶性コラーゲン粒子およびＧＦＡを含んでよい。さらにまたはもしくは、多孔体または他の乾燥材料は、可溶性コラーゲンおよび多糖または他のＧＦＡ成分を重量比約４：１〜約１：４、有利には約２：１〜約１：２で含んでよい。さらに、上述のように、粒子状鉱物材料は０．４〜３．０ｍｍの間、より望ましくは０．４〜２．０ｍｍの間の平均粒子直径を有してよい。
【００３７】
ある実施形態においては、上述の乾燥された多孔体は、約０．１ｇ／ｃｃ〜約０．３ｇ／ｃｃの間、より望ましくは約０．１５ｇ／ｃｃ〜約０．２５ｇ／ｃｃの間、ある態様においては約０．１８ｇ／ｃｃ〜約０．２５ｇ／ｃｃの間の密度を有してよい。そのような乾燥された多孔インプラント体はまた、少なくとも約５０％、より望ましくは少なくとも約７０％〜約９０％まで、ある実施形態においては約８０％〜約９０％の範囲の空隙率を示してよい。
【００３８】
本発明による乾燥された多孔インプラント体は、円柱、立方体、塊、ペレットまたは他の形状を含む任意の適当な形状で供給してよい。ある態様においては、乾燥された多孔インプラント体は、例えば乾燥されたインプラント材料からパテまたは他の可成形性材料の調製で用いられ、または単にインプラント体を湿潤化するために用いられる量の湿潤化液体を受容するためのリザバーを画定してよい。
【００３９】
乾燥された多孔体は、例えば乾燥成分を含む液体媒体をキャストするステップと、次いでその媒体を風乾または凍結乾燥等の任意の適当な手段で乾燥するステップとを含む、任意の適切な手法を用いて調製することができる。これに関し、液体媒体中の固体および他の材料の濃度は乾燥された材料の最終的な空隙率を制御するために調節することができ、固体濃度がより低いと典型的にはより高い空隙率が得られ、固体濃度がより高いと典型的にはより低い空隙率が得られる。空隙率の追加的な変動は、例えば乾燥中のキャスト材料の実質的な崩壊または収縮を避けるために凍結乾燥サイクルを変更することを含む乾燥手法の変更によって付与することができる。これらのおよび他の空隙率制御パラメーターを操作して、形成体の空隙率を制御することができる。
【００４０】
ここで図１を参照して、本発明の例示的な乾燥された多孔インプラント体１１を描写する。多孔体１１はリザバー１３を画定するキャスト材料１２を有する。リザバー１３は底表面１４および側壁１５を有し、例えばパテまたは湿潤化インプラント体の形成において多孔体１１を湿潤化するために用いる液体を保持することができ、それにより液体が都合良くリザバー１３に充填され、やがて多孔体１１に含浸される。多孔体１１はリザバー１３を取り囲む上表面１６、ならびに側壁１７および底表面１８を有する。
【００４１】
図２を参照して、本発明の１つの実施形態による別の乾燥された多孔インプラント体２１が示される。インプラント体２１は円柱形状をしており、円形の断面を有している。したがってインプラント体２１は、概ね対応するまたはより大きな断面寸法を有する円筒状のシリンジ筒の中に受容されるために都合の良い形状をしている。インプラント体２１は第１端部２２、第２端部２３、および平滑で丸い外表面２４を含む。
【００４２】
ある使用モードにおいては、乾燥された多孔体（例えば１１、２１）は崩壊性体であってよく、例えば本明細書に述べたようなパテまたは他の可成形性形態材料を調製するために充分な量の水性媒体等の液体材料と組み合わせることができる。これらの実施形態においては、多孔体（１１、２１）は崩壊性特徴を示し、それによりこれは物理的操作（例えば手作業による粉砕および混練）によって崩壊し、液体と組み合わせたときにパテまたは他の可成形性材料を形成することができる。したがって、崩壊性の乾燥された材料におけるコラーゲン材料の間の化学的共有結合架橋は、あったとしても一般には最小となる。多孔体（１１、２１）に一体性を付与する他の方法、例えば脱水熱架橋またはイオン性もしくは水素結合によって付与される架橋もしくは付着力を用いることができる。したがって架橋が乾燥された多孔体（１１、２１）に存在し得ること、しかしそれは本明細書に述べたように多孔体を崩壊性にして可成形性物質を形成させる性質のものであることが理解されよう。
【００４３】
典型的には、本発明の崩壊性の乾燥された多孔インプラント体と液体担体との組合せおよび得られる塊の物理的な混練または他の混合により、乾燥された多孔体の体積の減少がもたらされ、例えば元のインプラント体の体積の約３０％〜約７０％、より典型的には約４０％〜約６０％のパテ体積がもたらされることになる。これは、乾燥されたインプラント体の元の多孔性の破壊の結果であり、比較的低い多孔性のまたは非多孔性のパテインプラント組成物が形成される。液体担体は典型的には水性物質であり、例えば滅菌水、生理食塩液、血液、骨髄、骨髄分画または他の溶液（有機共溶媒とともにまたはなしに）、乳濁液または懸濁液を含み、これらは適切な湿潤化特性を提供して本発明のパテを形成することになる。
【００４４】
ある実施形態においては、本発明の可成形性組成物は即使用可能なフォーマットで製造し、湿潤化された可成形性材料のための医学的に許容される容器内に包装することができる。いくつかの実施形態においては、図３に示すように、即使用可能な医用製品は、本発明の可成形性組成物３３のある量が入ったシリンジデバイス３２を含む製品３１であり得る。組成物はシリンジ筒３４の中に入っており、プランジャー３５を作動させることによって筒３４から移送することができる。
【００４５】
使用の際には、本発明の可成形性または寸法的に安定なインプラント組成物は、骨成長が望ましい部位に埋め込まれて、例えば疾患、欠損または損傷の位置を治療し、および／または人工的な関節固定を促進することができる。本発明のある組成物の可成形性形態により、新生骨成長が望ましい空隙、欠損または他の領域の中にそれらを位置合わせし、成形しおよび／または成型することが可能になる。特に有利な実施形態においては、保形性パテ材料は、骨の埋込み部位において近傍の体軟組織が衝突した際に実質的な圧縮に抵抗するために充分な３次元的一体性を提供することになる。
【００４６】
本発明の組成物を用いて治療することができる骨修復部位には、例えば外傷、手術の経過の間に引き起こされた欠損、感染、悪性疾患または発生奇形に起因するものが含まれる。組成物は幅広い種類の整形外科、歯周、神経外科ならびに口腔および顎顔面外科手術において用いることができ、その中には、それだけに限らないが、単純および複雑骨折ならびに偽関節の修復；外および内固定；関節固定等の関節再建；一般的関節形成；腰部カップ関節形成；大腿骨および上腕骨頭置換；大腿骨頭表面置換および全関節置換；脊椎固定および内固定を含む脊柱修復；腫瘍手術、例えば欠損ファイリング；椎間板切除；椎弓切除；脊髄腫瘍の切除；前方頚部および胸部手術；脊髄外傷の修復；脊柱側弯症、脊柱前弯症および脊柱後弯症の治療；骨折の顎間固定；顎形成；顎関節置換；歯槽堤強化および再建；インレイ骨インプラント；インプラント設置および修正；サイナスリフト；美容増進等が含まれる。組成物を用いて修復または置換することができる特定の骨には、それだけに限らないが、篩骨；前頭骨；鼻骨；後頭骨；頭頂骨；側頭骨；下顎骨；上顎骨；頬骨；頸椎；胸椎；脊椎；仙骨；肋骨；胸骨；鎖骨；肩甲骨；上腕骨；橈骨；尺骨；手根骨；中手骨；指骨；腸骨；坐骨；恥骨；大腿骨；脛骨；腓骨；膝蓋骨；踵骨；足根骨および中足骨が含まれる。
【００４７】
本発明の組成物が骨原性である場合には、それは一旦設置されると、より小さな哺乳類、例えばげっ歯類またはウサギと比べて比較的遅い骨形成速度を示すヒト等のヒトまたは他の霊長類の対象においてさえも、所望の領域における骨の内部成長を効果的に誘導することができる。
【００４８】
本発明の骨原性組成物は、中程度にのみまたは低いレベルで血管新生する骨または骨の部分において用いた際に特に有利である。これらの領域は、骨形成速度が特に遅く、したがって担体の急速な再吸収は困難性を増大させる。中程度にまたは僅かにのみ血管新生する部位の例には、例えば脊椎の横突起または他の後部要素、長骨の骨幹、特に脛骨の骨幹中央部、および頭蓋欠損が含まれる。本発明の組成物の特に好ましい用途は、例えば椎体間、後部および／または後側部固定術を含む、ヒトまたは他の哺乳類の脊椎固定術における椎骨間の固定を促進するためのインプラントとしての用途である。
【００４９】
さらに、本発明の他の態様によれば、本発明の可成形性または他の組成物は、固定用ケージ、合わせ釘、または骨原性組成物を収容するためのポケット、チャンバーもしくは他の空洞を有する他のデバイス等の、耐荷重性脊椎インプラントデバイス（例えば少なくとも約１００００Ｎの圧縮強さを有する）の中に、その上にまたはその周囲に組み込むことができ、また椎体間固定等の脊椎固定術に用いることができる。１つの例示的な例においては、本発明の骨原性組成物は、椎体間固定を達成するための耐荷重性椎体間脊椎スペーサーと併せて用いることができる。
【００５０】
本発明の医用組成物はまた、例えば胎児または成人組織源から誘導された、および／または培養から取り出された、前駆細胞および／または幹細胞を含む細胞と組み合わせて用いることができる。例示的には、本発明の組成物には、治療すべき患者からの血液、骨髄、もしくは他の組織源（自家細胞）から、または適当な同種もしくは異種ドナー源から誘導された細胞を組み込むことができる。本発明のある実施形態においては、本発明のパテには、例えば２００４年７月８日に出願された米国特許出願第１０／８８７，２７５号で２００５年６月１６日に公開されＭｃＫａｙらの米国特許公開第２００５／０１３０３０１号に記載されたように調製された富化骨髄分画が組み込まれる。ここで該特許はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、インプラント材料には、生物学的試料（例えば治療すべき患者からのもの）を遠心分離することによって、試料を結合組織成長成分に富む分画を含む分画に分離して調製した結合組織成長成分に富む骨髄分画を組み込むことができる。結合組織成長成分に富む分画は、次いで分離された試料から単離し、例えば上述のように乾燥された多孔体の湿潤化媒体中の、または湿潤化媒体としての分画を用いることによって、本発明のパテ材料の中に組み込むことができる。
【００５１】
本発明はまた、インプラント組成物を調製するために用いることができる医用キットを提供する。そのようなキットは、本発明による乾燥された多孔体を、可成形性インプラント組成物もしくは別の湿潤化インプラント形態を形成するために多孔体と組み合わせるための水性媒体、および／または耐荷重性インプラント（例えば脊椎スペーサー）等の別の物品および／またはＢＭＰ等の骨原性物質とともに含んでもよい。ある特定の形態においては、そのような医用キットは、乾燥された多孔体、凍結乾燥形態のＢＭＰ（例えばｒｈＢＭＰ−２）、および次に乾燥された多孔体と組み合わせることができる水性製剤を調製し、骨原性パテまたは本発明の他の湿潤化インプラント形態を調製するためにＢＭＰを再構成するための水性媒体を含むことになる。
【００５２】
ここで以下の具体的な実施例を参照して、本発明をより詳しく記述する。これらの実施例は例示的であって、本発明を限定するものではないことが理解されるであろう。
【実施例】
【００５３】
実施例１
乾燥されたインプラント体の調製
ＮａＯＨでｐＨが６．５〜７．０の範囲となるように調整した不溶性コラーゲン繊維と可溶性コラーゲンとを含む製剤に、アルギン酸ナトリウムを添加混合する。この混合物に二相性リン酸カルシウムセラミック顆粒を添加混合する。得られた混合物を円筒形にキャストし、次いでキャスト混合物を凍結乾燥することによって、乾燥された多孔体を調製する。乾燥体は約８５％の空隙率を示す。乾燥体の成分の相対量は下記の通りである：
【００５４】
【表１】
2011519285.tif 000003
【００５５】
実施例２
骨伝導性パテの調製
実施例１の多孔体にリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を加え、多孔体を崩壊させ、混練して可成形性パテを形成する。水が形成されたパテの約７０重量％を占めるのに充分な量のＰＢＳを加える。形成されたパテは約０．３ｇ／ｃｃの二相性リン酸カルシウムセラミック顆粒、０．０５ｇ／ｃｃの不溶性コラーゲン繊維、０．０２ｇ／ｃｃの酸可溶性コラーゲン、および０．０２ｇ／ｃｃのアルギネートを含む。形成されたパテはセラミック顆粒が混入した可成形性で凝集性の繊維性塊である。
実施例３
骨原性パテの調製
実施例１の多孔体にｒｈＢＭＰ−２の緩衝水溶液（１．５ｍｇ／ｍｌ溶液、ＩＮＦＵＳＥ（登録商標）Ｂｏｎｅ  Ｇｒａｆｔ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏｆａｍｏｒ  Ｄａｎｅｋ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮより入手可能）を加え、多孔体を崩壊させて混練し、可成形性パテを形成させる。水が形成されたパテの約７０重量％を占めるのに充分な量のｒｈＢＭＰ−２溶液を加える。形成されたパテは約０．３ｇ／ｃｃの二相性リン酸カルシウムセラミック顆粒、０．０５ｇ／ｃｃの不溶性コラーゲン繊維、０．０２ｇ／ｃｃの酸可溶性コラーゲン、０．０２ｇ／ｃｃのアルギネート、および約１．５ｍｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ−２を含む。形成されたパテはセラミック顆粒が混入した骨原性、可成形性で凝集性の繊維性塊である。
実施例４
椎体間脊椎固定における本発明のパテの使用
ヒツジ椎体間固定モデルを用いて、自家移植片を充填した５ｍｍ×１１ｍｍ×１１ｍｍのポリエーテルエーテルケトン脊椎スペーサー（ＶＥＲＴＥ−ＳＴＡＣＫ（登録商標）ＣＯＲＮＥＲＳＴＯＮＥ（登録商標）ＰＳＲ  ＰＥＥＫ  Ｉｍｐｌａｎｔ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏｆａｍｏｒ  Ｄａｎｅｋ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮ）と、実施例３の骨原性パテを充填したＰＥＥＫスペーサーとの、術後６カ月における椎体間固定に影響する能力を比較する。ヒツジ脊椎固定モデルにおけるこれらの処置の椎体間固定を誘導する効率を、盲検法によるＸ線写真、生体力学、および組織学的手段を用いて評価する。固定の評価は、Ｆａｘｉｔｒｏｎ高分解能Ｘ線写真撮影、非破壊的生体力学試験、および対応するマイクロＸ線写真を用いた非脱灰組織学によって行う。全ての解析は盲検法によって行う。さらに、非脱灰組織学を用いて実施例３のパテの骨親和性を評価する。評価される処置群に加えて、同じ方法を用いて正常脊椎を評価する。全てのデータ取得が完了すればキーを開き、処置群によってＸ線写真、生体力学、および組織学データを解析する。
動物モデル：
ヒツジとヒトとの脊椎の間の生体力学的類似性のため、ヒツジ脊椎モデルを用いる。Ｗｉｌｋｅらはヒツジ脊椎の生体力学的パラメーター（可動域、中立域、およびレベル剛性）を特性化し、ＷｈｉｔｅおよびＰａｎｊａｂｉによって以前に発表されていたヒト検体からのデータと比較した（Ｗｉｌｋｅら、Ｓｐｉｎｅ：２２（２０）：２３６５〜２３７４頁、１９９７；ならびにＷｈｉｔｅ  ＡＡおよびＰａｎｊａｂｉ  ＭＭ、編集、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｐｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、１９９０参照）。Ｗｉｌｋｅらは「種々の負荷方向に対するヒツジ脊椎の可動域は、その頭尾方向において、文献で報告されたヒト検体のそれと定性的に同様である」ことを見出した。彼らはさらに「この研究において示されたヒツジとヒトの脊椎の生体力学的類似性に基づき、ヒツジ脊椎は・・・脊椎インプラントの評価のための代替物としての役目を果たし得ると思われる」と結論付けた。
手術手技：
施設到着の際、１２匹のヒツジを大きな動物研究用建物の適切な放牧地に配置する。ヒツジを駆虫し、識別のために耳に札を付ける。健康診断を実施し、呼吸器疾患の兆候のあるいかなる動物についても、静脈血を完全な血算（ＣＢＣ）に付した。
【００５６】
ヒツジを麻酔する。背部脊椎領域から羊毛を除去し、ヒツジを手術台上で腹ばいに位置させる。
腸骨稜自家移植片採取：自家移植片を対照として用いる。以下のプロトコルに従う。背部および背側部脊椎ならびに腸骨稜領域をポビドン−ヨードとイソプロピルアルコールで交互に複数回摩擦して、無菌手術のために準備する。この領域にドレープを掛け、左腸骨稜の上に３ｃｍの切開を作製する。殿筋を部分的に反転した後、オステオトームを用いて腸骨稜の頭背面表面に小さな窓を作製する。キュレットを用いて約２ｃｃの自家海綿骨を除去し、脊椎固定に用いるインプラント（例えばＰＥＥＫスペーサー）の１つの中に後でパックする（これは対照例である）。腸骨稜切開を閉鎖する前に、病巣内に硫酸モルヒネを投与する。腸骨稜部位は、皮下組織については２／０ポリソーブを用い、皮膚についてはステンレススチールステープルを用いて、常法で閉鎖する。
【００５７】
腹部（「前部」）椎体間固定：背部および背側部脊椎領域をポビドン−ヨードとイソプロピルアルコールで交互に複数回摩擦して、無菌手術のために準備する。この領域にドレープを掛け、斜腹筋を経由し、腹部平面へ、および横突起へのＬ３／Ｌ４およびＬ５／Ｌ６への腹側両面の後腹膜アプローチを行う。
【００５８】
インプラントの挿入：腸骨稜からの骨移植片または実施例３のパテをＰＥＥＫスペーサーの中に配置し（材料約１．５ｃｃ）、終板を整備した後で椎間板スペースに埋め込む。
創傷の閉鎖：外腹部筋膜（０  Ｐｏｌｙｓｏｒｂ（吸収性縫合糸））、皮下組織（２／０  Ｐｏｌｙｓｏｒｂ）および皮膚（２／０  モノフィラメント非吸収性縫合糸）を常法で閉鎖する。各動物についての手術時間は約４０分である。術中抗生物質（セファゾリンナトリウム）を投与する。ヒツジがまだ全身麻酔下にある間に術後Ｘ線写真撮影を行う。
【００５９】
アフターケア：術後直ちにヒツジを手術台から改良一輪車に移し、まだ全身麻酔下にある間にＸ線室に運び、ここで固定部位の背腹方向および側方向のＸ線写真を撮影する。Ｘ線写真評価の後、まだ改良一輪車に乗っている間に、嚥下反射が回復するまで観察する。その時点でヒツジからカテーテルを抜去してトレーラーに移し、ここでヒツジを腹ばいに保持する。その日の終わりに、その日に手術した全ての動物を研究用放牧地に移す。ヒツジを回復のため（３面シェルターへのアクセスがある）戸外で飼育し、自由に運動させる。記載のように術後鎮痛を行う。術後３カ月でヒツジを麻酔し、Ｘ線写真撮影を行う。
【００６０】
安楽死：術後６カ月で１２匹のヒツジを人道的な方法で安楽死させる。安楽死は、安楽死に関するＡＶＭＡパネル（Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２０２：２２９〜２４９頁、１９９３）によって示されたガイドラインに従って実施する。これらのヒツジにおいて脊椎固定部位のＸ線写真を撮影し、Ｌ３−Ｌ４における固定の程度を評価する。
【００６１】
試料採取および取扱い：安楽死の後、１２匹の動物全てについて完全な巨視的剖検を行う。全ての主要臓器系の標準的な巨視的検査および、任意の病変部の病理組織評価を実施する。研究の経過の間に死亡したまたは予定より早く安楽死させたいかなる動物についても、疾患または死亡の原因を究明するために完全な剖検を実施する。剖検の際、固定した脊椎を採取する。
【００６２】
材料分析：ヒツジの腰部からの全ての試料を、固定部位の機械的試験に供する。それらを矢状面および冠状面の曲げモーメント（屈曲、伸張、左右横曲げ）に対する剛性について試験する。これらの機械的試験は非破壊的であるので、固定部位を組織学的にも検査する。
インプラント材料：
処置した１２個の脊椎レベル（Ｌ４−Ｌ５）について評価する。研究群を以下のように定義する。
【００６３】
【表２】
2011519285.tif 000004
【００６４】
研究の生存相が完了した後、脊椎は評価のため直ちに凍結する。
解析方法：
１．処置された脊椎運動セグメントのエクスビボ生体力学試験：
可撓性試験
凍結試料を解凍した後、全ての脊椎について非破壊的方法で非拘束生体力学試験を実施する。全ての試験は試料を解凍した後、１２時間以内に実施する。試料は１回のみ凍結されている。椎体の前部に取り付けられた装置は生体力学試験の前に取り外し、装置ではなく脊椎および固定塊構造物の剛性のみが試験されるようにする。運動セグメントの可撓性を屈曲、伸張、左右横曲げ、および左右軸回転において決定する。生体力学試験の目的は、既述の椎体間固定処置によって強化された脊椎運動セグメントの剛性を定量化することである。採取した脊椎から処置された（Ｌ４−Ｌ５）運動セグメントを切除し、外部の軟組織を除去して、靭帯および骨組織をそのままに残す。特別に設計した負荷および基礎フレームをＬ４およびＬ５椎骨にそれぞれ固定する。
【００６５】
各負荷方向に０、０．５、２．５、４．５、６．５、および８．５Ｎｍのモーメントをかける。純モーメントを適用するために静荷重を用いる。赤外光を反射する３個のマーカーを各椎骨に取り付ける。赤外反射マーカーの位置を３個のＶＩＣＯＮカメラ（ＶｉｃｏｎＰｅａｋ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて各荷重において記録する。次いで、屈曲、伸張、左右横曲げ、および左右軸回転において純モーメントを適用して、３次元荷重−変位データを取得する。３−Ｄ荷重−変位挙動を検討するために３−Ｄ運動解析システムを用いることの基礎的原理は文献でよく知られている。
【００６６】
以前に得られたヒツジ脊椎運動セグメントの正常（未処置）インタクト群からの生体力学データを、ヒツジＬ４−Ｌ５の正常脊椎運動のベースラインデータとして用いる。群および正常群との間の剛性（可撓性）の相違を統計的に比較する。生体力学データを解析するために、非母数Ｋｒｕｓｋａｌ−ＷａｌｌｉｓおよびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いる。
２．Ｘ線写真評価：
手術直後（ＡＰおよび側方視）、術後一定間隔（ＡＰおよび側方視）、および犠牲死の際（ＡＰおよび側方視）にＸ線写真を撮影する。生体力学試験の後で、高分解能Ｘ線写真ユニット（Ｆａｘｉｔｒｏｎ、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ、ＭｃＭｉｎｎｖｉｌｌｅ、ＯＲ）および高分解能フィルム（ＥＫＴＡＳＣＡＮ  Ｂ／ＲＡフィルム４１５３、Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を用いて、採取した脊椎の高分解能ＰＡおよび側方Ｘ線写真を得る。Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＸＰワークステーション上で稼働する画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ５．０、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用いてＸ線写真を走査する。ビデオカメラ（Ｍｏｄｅｌ  ＤＦＣ２８０、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて、Ｘ線写真のデジタル画像を取得する。これらのＸ線写真はまた、以下に概略を示すように組織学的解析の試料をグロスするために用いる。
【００６７】
予備知識を持たない３名の評価者が、椎体間固定について得られたＦａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ線写真を評価する。側方Ｘ線写真については、椎間板スペースの中央部ならびに前部および後部縁を、以下のスコア付け方法に基づいて固定について評価する：４＝連続骨架橋、３＝骨密度の増加、２＝いくらかの骨架橋を伴う透過像、および１＝固定なし。最後に、Ｐ／Ａおよび側方Ｘ線写真の両方に基づいて、予備知識を持たない評価者が、以下の基準を用いて脊椎レベルについて全固定スコアをランク付けする：
３＝椎体間スペースにＸ線透過性がないしっかりした椎体間固定
２＝椎体間スペースがＸ線透過性で固定の可能性あり
１＝上部から下部への骨架橋の証拠がなく、椎間板スペースに顕著なＸ線透過性がある非固定
３．非脱灰組織学およびマイクロＸ線写真撮影：
処理および染色非脱灰切片
処置群全てにおいて、非脱灰法（マイクロＸ線写真および多重染色）を用いて、二分した脊椎レベルを解析する。定性的光学顕微鏡法とともに分染を実施し、ＰＥＥＫスペーサー内に充填した自家移植片または骨移植片代替物に伴う骨架橋および固定の程度を評価する。分染は、ＰＥＥＫスペーサーの近傍およびその中の固定の程度、ＰＥＥＫスペーサーおよび実施例３のパテ（存在するならば）に対する宿主の反応、ＰＥＥＫスペーサー、骨移植片および実施例３のパテ組込みの界面、ならびに固定塊の中の骨のリモデリングを評価するために用いる。
【００６８】
Ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ線写真撮影の後、インプラントを含む全ての脊椎レベルを以下の方法でグロスする。帯鋸を用いて、脊柱の全長に沿って椎根の前面で前頭面切除を行い、前部組織はそのままに残す。椎間板スペースの後部組織は廃棄する。次に、脊椎レベルの前柱を矢状中央で二分割して右半部および左半部を作製する。椎間板スペース全体はそのままに残す。処置したレベルに隣接するＬ４前柱の下半部を取っておく。処置されたレベルに隣接するＬ５前柱の上半部を取っておく。そのレベルからの左右の矢状試料をそのようにラベルし、ホルマリン固定し、処理する（アルコールで連続的に脱水し、キシレン代替物で透明化し、等級付けられた触媒を含むメチルメタクリレートに包埋する）。
【００６９】
重合が完了して試料が硬化した後、切片作製および染色を実施する。脊椎レベルの処置側の右半部および左半部を含むブロックを、低速ダイヤモンド鋸（Ｂｕｅｈｌｅｒ  Ｉｓｏｍｅｔ、Ｌａｋｅ  Ｂｌｕｆｆ、ＩＬ）で、矢状面で切片作製する。包埋された組織ブロック全てについて、矢状切片作製は脊椎レベルの処置側の中央部から開始し、処置領域の外側面に至る。したがって、「右ブロック」からの切片＃１は固定塊の中央部から採取され、一方「右ブロック」からの切片＃６は処置領域の遠い外側面で採取される。３００μｍのオーダーの切片を作製するために重りを用いる。椎体間スペースの各半部を通る矢状面において、ほぼ５〜１０個の切片を作製する。必要であれば、所望の厚みを得るために研磨する。切片の厚みはメートル法のマイクロメーター（Ｆｏｗｌｅｒ、日本）を用いて測定する。組織学的な区別を可能にするためにトリクローム染色を用いて分染を行う。
【００７０】
染色非脱灰切片をＷｉｎｄｏｗｓ  ＸＰワークステーション上で稼働する画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ５．０、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用いて走査する。ビデオカメラ（Ｍｏｄｅｌ  ＤＦＣ２８０、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて、染色非脱灰切片のデジタル画像を取得する。
【００７１】
切片固定基準：非脱灰切片を、前縁部および後縁部において、椎間板スペースの中央部またはデバイスの内部増殖領域における固定について評価する。各切片についてのこれらの解剖学的位置は、上部から下部への連続的な骨架橋が見られた場合にのみ、固定されたと考えられる。
【００７２】
レベル固定基準：評価した全ての切片に基づいて、組織学的固定がレベルに存在するか否かを決定するために以下の基準を用いる。切片の５０％超（対応するマイクロＸ線写真を同時に解析するが、固定に関しては「２回カウント」はしない）が連続的な骨架橋を示す場合には、脊椎レベルは固定されたと考えられる。切片の５０％未満（および対応するマイクロＸ線写真）が連続的な骨架橋を示す場合には、部分的固定が存在する。切片および対応するマイクロＸ線写真が連続的な骨架橋を示さない場合には、非固定が存在する。
マイクロＸ線写真撮影
処置された脊椎レベルからの非脱灰切片を、マイクロＸ線写真ユニット（Ｆａｘｉｔｒｏｎ  ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ  ｕｎｉｔ、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ、ＭｃＭｉｎｎｖｉｌｌｅ、ＯＲ）および分光フィルム（Ｂ／ＲＡ４１５３フィルム、Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を用いてＸ線写真撮影する。露出時間を決定するために、切片の厚みをメートル法のマイクロメーター（Ｆｏｗｌｅｒ、日本）を用いて測定する。切片を超微細恒久マーカーでラベルし、Ｅｋｔａｓｃａｎ  Ｂ／ＲＡ４１５３フィルムに載せ、切片の厚み１００μｍごとに２０ｋＶ、３ｍＡで約４５秒間、Ｘ線源に露出する。次いでフィルムを現像し、固定し、標準的な光学顕微鏡法を用いて骨化について解析する。Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＸＰワークステーション上で稼働する画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ５．０、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用いてマイクロＸ線写真を走査する。ビデオカメラ（Ｍｏｄｅｌ  ＤＦＣ２８０、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて、マイクロＸ線写真のデジタル画像を取得する。
【００７３】
切片およびマイクロＸ線写真の解析は、以下のために用いる：
１）ＰＥＥＫスペーサーの近傍およびその中の固定の程度、骨移植片および実施例３のパテの組込み、ならびに固定塊の中の骨のリモデリングの評価。
２）用いたバイオマテリアルに対する宿主の反応の測定。
３）ＰＥＥＫスペーサーの界面の評価。
実施例５
後側方固定における骨原性パテの使用
自家移植片および実施例３の骨原性パテの術後６カ月における後側方固定に影響する能力を評価するために、装置を取り付けたヒツジ後側方固定モデルを用いる。ヒツジ脊椎固定モデルにおけるこれらの処置の後側方固定を誘導する効率を、盲検法によるＸ線写真、生体力学、および組織学的手段を用いて評価する。固定の評価は、Ｆａｘｉｔｒｏｎ高分解能Ｘ線写真撮影、非破壊的生体力学試験、およびマイクロＸ線写真撮影を伴う非脱灰組織学によって行う。全ての解析は盲検法で行う。さらに、非脱灰組織学を用いて骨原性パテの骨親和性を評価する。評価される処置群に加えて、同じ方法を用いて正常脊椎の生体力学特性を評価する。全てのデータ取得が完了すればキーを開き、処置群によってＸ線写真、生体力学、および組織学データを解析する。
動物モデル：
ヒツジとヒトとの脊椎の間の生体力学的類似性のため、ヒツジ脊椎モデルを用いる。Ｗｉｌｋｅらはヒツジ脊椎の生体力学的パラメーター（可動域、中立域、およびレベル剛性）を特性化し、ＷｈｉｔｅおよびＰａｎｊａｂｉによって以前に発表されていたヒト検体からのデータと比較した（Ｗｉｌｋｅら、Ｓｐｉｎｅ：２２（２０）：２３６５〜２３７４頁、１９９７；ならびにＷｈｉｔｅ  ＡＡおよびＰａｎｊａｂｉ  ＭＭ、編集、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｐｉｎｅ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、１９９０参照）。Ｗｉｌｋｅらは「種々の負荷方向に対するヒツジ脊椎の可動域は、その頭尾方向において、文献で報告されたヒト検体のそれと定性的に同様である」ことを見出した。彼らはさらに「この研究において示されたヒツジとヒトの脊椎の生体力学的類似性に基づき、ヒツジ脊椎は・・・脊椎インプラントの評価のための代替物としての役目を果たし得ると思われる」と結論付けた。
手術手技：
１２匹のヒツジを大きな動物研究用建物の適切な放牧地に配置する。ヒツジを駆虫し、識別のために耳に札を付ける。健康診断を実施し、呼吸器疾患の兆候のあるいかなる動物についても、静脈血を完全な血算（ＣＢＣ）に付す。
【００７４】
ヒツジを麻酔する。背部脊椎領域から羊毛を除去し、ヒツジを手術台上で腹ばいに位置させる。背部および背側部脊椎をポビドン−ヨードとイソプロピルアルコールで交互に複数回摩擦して、無菌手術のために準備する。この領域にドレープを掛け、背部脊椎筋肉組織を通してＬ３−Ｌ６への背部アプローチを行う。
【００７５】
腸骨稜自家移植片採取：自家移植片を対照として用いる。以下のプロトコルに従う。背部および背側部脊椎ならびに腸骨稜領域をポビドン−ヨードとイソプロピルアルコールで交互に複数回摩擦して、無菌手術のために準備する。この領域にドレープを掛け、左腸骨稜の上に３ｃｍの切開を作製する。殿筋を部分的に反転した後、オステオトームを用いて腸骨稜の頭背面表面に小さな窓を作製する。キュレットを用いて約２ｃｃの自家海綿骨を除去し、脊椎固定に用いるインプラント（例えばＰＥＥＫスペーサー）の１つの中に後でパックする（これは対照例である）。腸骨稜切開を閉鎖する前に、病巣内に硫酸モルヒネを投与する。腸骨稜部位は、皮下組織については２／０ポリソーブを用い、皮膚についてはステンレススチールステープルを用いて、常法で閉鎖する。
【００７６】
背側部（「後側部」）椎体間固定：：背部脊椎領域をポビドン−ヨードとイソプロピルアルコールで交互に複数回摩擦して、無菌手術のために準備する。この領域にドレープを掛け、Ｌ３およびＬ４ならびに棘突起への背部からのアプローチのために意図された切開部位に沿って局所麻酔（ブピビカイン）を浸潤させる。
【００７７】
横突起へのアプローチ：２０ｃｍの皮膚切開を作製し、傍脊柱筋群を棘突起および薄層から切離する。Ｌ３およびＬ４の間の面関節および横突起を露出する。
装置取付けおよび脊椎固定方法：Ｌ３およびＬ４の横突起を両側で剥離する。腸骨稜からの骨移植片または実施例３の骨原性パテを、横突起の間に配置する（１側あたり約１０ｃｃ）。ここでスクリューおよびロッドを用いてヒツジにトランスペディキュラースクリュー固定を行う。手術においてこの時点でペディクルスクリューおよびロッドを挿入する。
【００７８】
創傷の閉鎖：外腹部筋膜（０  Ｐｏｌｙｓｏｒｂ（吸収性縫合糸））、皮下組織（２／０  Ｐｏｌｙｓｏｒｂ）および皮膚（２／０  モノフィラメント非吸収性縫合糸）を常法で閉鎖する。各動物についての手術時間は約５０分である。術中抗生物質（セファゾリンナトリウム）を投与する。ヒツジがまだ全身麻酔下にある間に術後Ｘ線写真撮影を行う。
【００７９】
アフターケア：術後直ちにヒツジを手術台から改良一輪車に移し、まだ全身麻酔下にある間にＸ線室に運び、ここで固定部位の背腹方向および側方向のＸ線写真を撮影する。Ｘ線写真評価の後、まだ改良一輪車に乗っている間に、嚥下反射が回復するまで観察する。その時点でヒツジからカテーテルを抜去してトレーラーに移し、ここでヒツジを腹ばいに保持する。その日の終わりに、その日に手術した全ての動物を研究用放牧地に移す。ヒツジを回復のため（３面シェルターへのアクセスがある）戸外で飼育し、自由に運動させる。記載のように術後鎮痛を行う。術後３カ月でヒツジを麻酔し、Ｘ線写真撮影を行う。
【００８０】
安楽死：術後６カ月で１２匹のヒツジを人道的な方法で安楽死させる。安楽死は、安楽死に関するＡＶＭＡパネル（Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２０２：２２９〜２４９頁、１９９３）によって示されたガイドラインに従って実施する。これらのヒツジにおいて脊椎固定部位のＸ線写真を撮影し、Ｌ３−Ｌ４における固定の程度を評価する。
【００８１】
試料採取および取扱い：安楽死の後、１２匹の動物全てについて完全な巨視的剖検を行う。全ての主要臓器系の標準的な巨視的検査および、任意の病変部の病理組織評価を実施する。研究の経過の間に死亡したまたは予定より早く安楽死させたいかなる動物についても、疾患または死亡の原因を究明するために完全な剖検を実施する。剖検の際、固定した脊椎を採取する。
【００８２】
材料分析：ヒツジの腰部からの全ての試料を、固定部位の機械的試験に供する。それらを矢状面および冠状面の曲げモーメント（屈曲、伸張、左右横曲げ）に対する剛性について試験する。これらの機械的試験は非破壊的であるので、固定部位を組織学的にも検査する。
インプラント材料：
研究群を以下のように定義する。
【００８３】
【表３】
2011519285.tif 000005
【００８４】
動物研究の生存相が完了した後、脊椎は評価のため直ちに凍結する。後側部固定および骨治癒に影響する骨移植片および骨移植片代替物の効率を、Ｘ線写真解析、生体力学解析、および組織学的解析を以下に詳細に述べるように実施することによって評価する。研究は盲検法で実施する。全ての解析が完了すれば、キーを開き、処置群によるＸ線写真、生体力学、および組織学データを解析する。
解析方法：
１．Ｘ線写真評価
手術直後、術後一定間隔、および犠牲死の際にＸ線写真を撮影する。生体力学試験の後で、Ｆａｘｉｔｒｏｎ（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ、ＭｃＭｉｎｎｖｉｌｌｅ、ＯＲ）高分解能Ｘ線ユニットおよび高分解能フィルム（ＥＫＴＡＳＣＡＮ  Ｂ／ＲＡフィルム４１５３、Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を用いて、採取した脊椎の高分解能ＰＡ  Ｘ線写真を得る。Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＸＰワークステーション上で稼働する画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ５．０、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用いてＸ線写真を走査する。ビデオカメラ（Ｍｏｄｅｌ  ＤＦＣ２８０、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて、Ｘ線写真のデジタル画像を取得する。これらのＸ線写真はまた、以下に概略を示すように組織学的解析の試料をグロスするために用いる。
【００８５】
予備知識を持たない３名の評価者が、横突起間固定で得られたＦａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ線写真を評価する。ＰＡ  Ｘ線写真については、レベルの左右両側において、横突起間スペースを、以下のスコア付け方法に基づいて固定について評価する：４＝連続骨架橋、３＝骨密度の増加、２＝いくらかの骨架橋を伴う透過像、および１＝固定なし。ＰＡ  Ｘ線写真の左右両側に基づいて、予備知識を持たない評価者が、以下の基準を用いて脊椎レベルについて全固定スコアをランク付けする：
３＝しっかりした固定：Ｘ線透過性がない右および左の中実の横突起間固定
２＝固定の可能性：右または左であるが両側ではない横突起間固定。右または左の横突起間スペースに透過性あり
１＝非固定：左右両側に上部から下部への連続的な骨架橋がない孤立した骨形成。右または左の横突起間固定の証拠がなく、顕著な透過性あり。
【００８６】
処置コードを開いた後、Ｘ線固定データを統計的に解析する。
２．処置された脊椎運動セグメントのエクスビボ生体力学試験：
可撓性試験
凍結試料を解凍した後、全ての脊椎について非破壊的方法で非拘束生体力学試験を実施する。後側方固定を安定化させるために用いた全ての金属製後部装置は生体力学試験の前に取り外し、脊椎および固定塊構造物の剛性が試験されるようにする。運動セグメントの可撓性を屈曲、伸張、左右横曲げ、および左右軸回転において決定する。全ての試験は試料を解凍した後、１２時間以内に実施する。試料は１回のみ凍結されている。生体力学試験の目的は、既述の固定処置によって強化された脊椎運動セグメントの剛性を定量化することである。採取した脊椎から処置された（Ｌ４−Ｌ５）運動セグメントを切除し、外部の軟組織を除去して、靭帯および骨組織をそのままに残す。特別に設計した負荷および基礎フレームをＬ４およびＬ５椎骨にそれぞれ固定する。
【００８７】
各負荷方向に０、０．５、２．５、４．５、６．５、および８．５Ｎｍのモーメントをかける。純モーメントを適用するために静荷重を用いる。適用されたモーメントを確認するために６自由度のロードセルを試料と直列に設置する。赤外光を反射する３個のマーカーを各椎骨に取り付ける。赤外反射マーカーの位置を３個のＶＩＣＯＮカメラ（Ｖｉｃｏｎ  Ｐｅａｋ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて各荷重において記録する。次いで、屈曲、伸張、左右横曲げ、および左右軸回転において純モーメントを適用して、３次元荷重−変位データを取得する。三次元座標データを解析して、下部椎骨に対する上部椎骨の回転角および各運動セグメントの回転可撓性を得る。
【００８８】
以前に得られたヒツジ脊椎運動セグメントの正常（未処置）インタクト群からの生体力学データを、ヒツジＬ４−Ｌ５の正常脊椎運動のベースラインデータとして用いる。群および正常群との間の剛性（可撓性）の相違を統計的に比較する。生体力学データを解析するために、非母数Ｋｒｕｓｋａｌ−ＷａｌｌｉｓおよびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いる。
３．非脱灰組織学およびマイクロＸ線写真撮影：
処理および染色非脱灰切片：各処置群において、非脱灰法（マイクロＸ線写真および多重染色）を用いて、二分した脊椎横突起間スペースを解析する。定性的光学顕微鏡法とともに分染を実施し、自家移植片および実施例３の骨原性パテに伴う骨架橋および固定の程度を評価する。
【００８９】
Ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ線写真撮影の後、インプラントを含む全ての脊椎レベルを以下の方法でグロスする。処置された（Ｌ４−Ｌ５）機能性脊椎ユニット（ＦＳＵ）をそのままに残して、上部（Ｌ３−Ｌ４）および下部（Ｌ５−Ｌ６）椎間板スペースを横切断する。帯鋸を用いて、脊柱の全長に沿って椎根の前面で前頭面切除を行い、後部組織はそのままに残す。前部組織は廃棄する。次に、脊椎レベルの後部要素を矢状中央で二分割して右半部および左半部を作製する。軸平面に角度をつけた切断を作製して、左右側部において頭側横突起の頭側の組織を廃棄する。軸平面に角度をつけた切断を作製して、左右側部において尾側横突起の尾側の組織を削除して廃棄する。左右横突起間スペースの組織を矢状面でさらに分割して、左固定塊の中間部および側部の試料ならびに右固定塊の中間部および側部の試料を作製する。左右の中間部および側部の試料をそのようにラベルし、ホルマリン固定し、処理する（アルコールで連続的に脱水し、キシレンまたはキシレン代替物で透明化し、等級付けられた触媒を含むメチルメタクリレートに包埋する）。
【００９０】
重合が完了して試料が硬化した後、切片作製および染色を実施する。横突起、自家移植片および実施例３のパテ、ならびに横突起スペースの組織を含むブロックを、低速ダイヤモンド鋸（Ｂｕｅｈｌｅｒ  Ｉｓｏｍｅｔ、Ｌａｋｅ  Ｂｌｕｆｆ、ＩＬ）で、矢状面で切断する。上述の中間部および側部包埋組織ブロックについて、切片作製は中間部および側部ブロックの両方の固定塊の中央部から始める。したがって、「右側部ブロック」からの切片＃１は固定塊の中央部から採取され、一方「右側部ブロック」からの切片＃６は固定塊の遠い側部の解剖学側（横突起の先端）から採取される。同様に、「右中間部ブロック」からの切片＃１は固定塊の中央部から採取され、一方「右中間部ブロック」からの切片＃６は固定塊の遠い中間部の解剖学側（薄層および面関節）から採取される。３００μｍのオーダーの切片を作製するために重りを用いる。横突起間スペースの各半部を通る矢状面において、ほぼ５〜１０個の切片を作製する。必要であれば、所望の厚みを得るために研磨する。切片の厚みはメートル法のマイクロメーター（Ｆｏｗｌｅｒ、日本）を用いて測定する。組織学的な区別を可能にするためにトリクローム染色を用いて分染を行う。
【００９１】
染色非脱灰切片をＷｉｎｄｏｗｓ  ＸＰワークステーション上で稼働する画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ５．０、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用いて走査する。ビデオカメラ（Ｍｏｄｅｌ  ＤＦＣ２８０、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて、染色非脱灰切片のデジタル画像を取得する。非脱灰組織学切片およびこの研究のためのマイクロＸ線写真を、背部が画像の上にあるように走査する。切片の腹側は通常平坦であり、２つの楕円形の横突起を示す。横突起が画像の下部（腹側面）にあるように切片を走査する。画像の下部（腹側面）でｍｍスケールを走査する。画像を切り取るためにＭｉｃｒｏｓｏｆｔフォトエディターを用いる。
【００９２】
切片固定基準：非脱灰切片は、その切片において上部から下部への連続的な骨架橋が見られた場合に、固定されたと考えられる。非骨組織の存在が連続的な骨架橋を妨害した場合には、その切片を以下のようにさらに評価する。非固定切片について、切片をＡ）不完全な架橋を伴うが切片の長さの５０％超に見られる新生骨を伴う非固定、またはＢ）不完全な架橋を伴い、切片の長さの５０％未満に見られる新生骨を伴う非固定に分類する。
【００９３】
左右側レベル固定基準：評価した全ての切片に基づいて、組織学的固定がレベルの右側または左側に存在するか否かを決定するために以下の基準を用いる。脊椎レベルの右側または左側は、切片の５０％超（＞５０％）および対応するマイクロＸ線写真が連続的な骨架橋を示す場合には、固定されたと考えられる。脊椎レベルの右側または左側からの切片の５０％以下（≦５０％）および対応するマイクロＸ線写真が連続的な骨架橋を示す場合には、部分的固定が存在する。脊椎レベルの右側または左側からの切片および対応するマイクロＸ線写真が連続的な骨架橋を示さない場合には、非固定が存在する。
【００９４】
マイクロＸ線写真撮影：処置された脊椎レベルからの非脱灰切片を、マイクロＸ線写真ユニット（Ｆａｘｉｔｒｏｎ  ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ  ｕｎｉｔ、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ、ＭｃＭｉｎｎｖｉｌｌｅ、ＯＲ）および分光フィルム（Ｂ／ＲＡ４１５３フィルム、Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を用いてＸ線写真撮影する。露出時間を決定するために、切片の厚みをメートル法のマイクロメーター（Ｆｏｗｌｅｒ、日本）を用いて測定する。切片を超微細恒久マーカーでラベルし、Ｅｋｔａｓｃａｎ  Ｂ／ＲＡ４１５３フィルムに載せ、切片の厚み１００μｍごとに２０ｋＶ、３ｍＡで約４５秒間、Ｘ線源に露出する。次いでフィルムを現像し、固定し、標準的な光学顕微鏡法を用いて骨化について解析する。Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＸＰワークステーション上で稼働する画像解析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ５．０、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用いてマイクロＸ線写真を走査する。ビデオカメラ（Ｍｏｄｅｌ  ＤＦＣ２８０、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて、マイクロＸ線写真のデジタル画像を取得する。
【００９５】
切片およびマイクロＸ線写真の解析は、以下のために用いる：
１）組織学的固定の評価、
２）自家移植片および骨移植片代替物に対する宿主の反応の測定、および
３）横突起間スペース内の固定塊における骨の性質および量の推定。
実施例６
追加的なパテの調製
６．１  乾燥された材料の調製
一般的には実施例１に述べた方法を用いて、以下の表１に示す量で成分の組合せを有する乾燥された多孔体を調製する。３シリーズ、即ちシリーズＡ、ＢおよびＣの乾燥体を調製する。各成分のレベルを特定された「好ましい範囲」内に調節しながら、乾燥された材料を調製する。特定された「より好ましい」レベルを用いれば、より好ましい材料がもたらされる。
【００９６】
【表４】
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【００９７】
６．２  乾燥された材料からの骨伝導性パテの調製
表１に従って調製した乾燥されたインプラント体にリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を加え、インプラント体を崩壊させて混練し、可成形性パテを形成する。ＰＢＳは乾燥されたインプラント体の１グラムあたり約０．５ｃｃの量で加える。得られるパテは、骨空隙充填材として、または他の方法で本明細書に開示した骨の欠損を処置するために有用な骨伝導性材料を提供する。ＰＥＧおよび／またはデンプンの存在は、アルギネート含有乾燥体の湿潤性を顕著に増大させる。
６．３  乾燥された材料からの骨誘導性パテの調製
表１に従って調製したインプラント体にｒｈＢＭＰ−２の緩衝水溶液（１．５ｍｇ／ｍｌ溶液、ＩＮＦＵＳＥ（登録商標）Ｂｏｎｅ  Ｇｒａｆｔ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏｆａｍｏｒ  Ｄａｎｅｋ、Ｍｅｍｐｈｉｓ、ＴＮより入手可能）を加え、インプラント体を崩壊させて混練し、可成形性パテを形成させる。ｒｈＢＭＰ−２溶液は、乾燥されたインプラント体の１グラムあたり約０．５ｃｃの量で加える。得られるパテは、本明細書に開示した骨の欠損を処置するのに有用な骨誘導性材料を提供する。再び、ＰＥＧおよび／またはデンプンの存在は、アルギネート含有乾燥体の湿潤性を顕著に増大させる。
６．４  湿潤包装された骨伝導性または骨誘導性パテの調製
代替の実施形態においては、上の６．１節の湿潤混合操作を行い、得られるパテ材料をシリンジ、バイアルまたは他の適当な医用容器に湿潤状態で直接包装し、最終滅菌する。骨誘導性パテの場合には、混合操作の間に加える溶液（単数または複数）はｒｈＢＭＰ−２を含む。さらに、そのような湿潤包装製品においてＰＥＧの使用が選択できる。
【００９８】
本発明を記述する文脈における用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の言及の使用は（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）、本明細書において別段の指示があるか文脈によって明らかに否定されない限り、単数および複数の両方をカバーするものと解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他に指示されない限り、その範囲に入る各個別の値に個別に言及するための簡略法としての役割を果たすことを単に意図しており、各個別の値は、それが本明細書に個別に列挙されたかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載した全ての方法は、本明細書において別段の指示があるか文脈によって他に明らかに否定されない限り、任意の適当な順序で実施することができる。本明細書に提示されたありとあらゆる例、または例示的用語（例えば「等」）の使用は、本発明をより良く明らかにすることを単に意図しており、他に主張しない限り本発明の範囲の限定をもたらすものではない。本明細書中の言語は、特許請求されていないいかなる要素も本発明の実施に必須であることを示すものと解釈されるべきではない。
【００９９】
図面および上記の記載において本発明を詳細に説明し既述したが、これは説明的であり、その性格において限定的ではないと考えるべきであって、好ましい実施形態のみが示され、述べられていること、ならびに本発明の精神の中で起こる全ての変更および改変は保護されることが望ましいことが理解される。さらに、本明細書に列挙した全ての参照は当技術分野における技術水準を示すものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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