(57)【要約】標的検出するポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および、とくに標的結合成分、骨格成分および制御された方法でカップリングおよび分離できる標準化したモジュール化単位によって形成したエンコード成分を有するモジュール式ポリヌクレオチド捕捉剤は、および関連する方法およびシステム。【選択図】図１
2011518553.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的に特異的に結合するようにしたモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤で、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、
標的に特異的に結合するようにした少なくとも１個の結合分子と、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するようにしたエンコードポリヌクレオチドと、
少なくとも１個の結合分子および位置的に区別可能な骨格結合ドメインを有するエンコードポリヌクレオチドに結合するようにした骨格分子と、
を有し、
位置的に区別可能な骨格結合ドメインは、骨格分子上に準備して、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに付着するとき、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子および基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドの存在を可能にするものとする、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項２】
請求項１に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤で、
骨格結合ドメインは、少なくとも１個の結合分子に結合する第１骨格結合ドメインおよびエンコードポリヌクレオチドに結合する第２骨格結合ドメインを有し、
第１骨格結合ドメインおよび第２骨格結合ドメインは、直行する化学物質を通して少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するものとする、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項３】
第１骨格結合ドメインおよび第２骨格結合ドメインを骨格結合分子上に準備して、骨格分子に結合した少なくとも１個の結合分子および骨格分子に結合したエンコードポリヌクレオチド間の相互作用を最小化するものとする、請求項２に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項４】
骨格分子は多くの第１骨格結合ドメインおよび／または多くの第２骨格結合ドメインを有するものとする、請求項１〜３のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項５】
骨格分子上の多くの第１結合ドメインはそれぞれ少なくとも１個の結合分子に結合し、骨格分子上の多くの第２結合ドメインはそれぞれエンコードポリヌクレオチドに結合するものとする、請求項４に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項６】
第２骨格結合ドメインは、ドメインを少なくとも１個の結合分子に結合する第１骨格結合を接続するリンカー分子を有する少なくとも１個の結合分子に結合するものとする、請求項２〜５のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項７】
リンカー分子は従来のリンカーであるとする、請求項６に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項８】
少なくとも１個の結合分子は、標的細胞に結合する多くの同じまたは異なる結合分子を有するものとする、請求項１〜７のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項９】
エンコードポリヌクレオチドは、関連する制限酵素によって解裂するために存在するエンコードポリヌクレオチドにおいて準備した少なくとも１個の制限酵素部位を有するものとする、請求項１〜８のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項１０】
少なくとも１個の骨格分子および少なくとも１個の結合分子はタンパク質であるとする、請求項１〜９のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項１１】
骨格分子は、ストレプトアビジン、ＳＡＣ，ＳＡＣ３、抗体または最適化したそれらの変異体であるとする、請求項１０に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項１２】
少なくとも１個の結合分子は、ＭＨＣ二量体、ＭＨＣ三量体、またはＭＨＣ四量体、アパタマー、小分子または抗体であるとする、請求項１０または１１に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項１３】
モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は極性モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤であるとする、請求項１〜１２のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤。
【請求項１４】
サンプルにおける標的を検出する方法で、その方法は、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドをモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤に結合するステップで、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合する骨格分子を有し、少なくとも１個の結合分子は特異的に標的に結合し、エンコードポリヌクレオチドは基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するステップと、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドに結合したモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を検出するステップと、
を有するものとする方法。
【請求項１５】
基質に付着した基質ポリヌクレオチドのモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤との結合は、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドを提供し、
少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに付着する骨格分子を有するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を提供し、少なくとも１個の結合分子は標的に特異的に結合し、エンコードポリヌクレオチドは基質ポリヌクレオチドに特異的に結合し；また、
モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を、結合分子をモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体における標的に結合させる時間および条件でサンプルおよび基質に接触させ、
エンコードポリヌクレオチドを基質ポリヌクレオチドに結合する
ことによって行うものとする請求項１４に記載の方法。  
【請求項１６】
モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は請求項１〜１３のうち一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤であるとする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルにおける標的分子を検出するシステムは、このシステムは、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドを有する基質と；
標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子と、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドと、
少なくとも１個の結合分子および位置的に区別可能な骨格結合ドメインを有するエンコードポリヌクレオチドに結合するようにする骨格分子と
を有するものとするシステム。
【請求項１８】
骨格結合ドメインは、少なくとも１個の結合分子に結合する第１骨格結合ドメインおよびエンコードポリヌクレオチドに結合する第２骨格結合ドメインを有するものとする、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
第１骨格結合ドメインおよび第２骨格結合ドメインは、骨格結合分子上に準備して、骨格分子に結合した少なくとも１個の結合分子および骨格分子に結合した第２結合分子の間の相互作用を最小化するものとする、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
複数の標的を分類する方法で、その方法は、
複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤に付着した複数の基質ポリヌクレオチドに結合するステップで、各基質ポリヌクレオチドは配列特異性で互いに位置的に区別でき、複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の各モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は少なくとも１個の結合分子に付着する骨格分子およびエンコードポリヌクレオチドを有し、少なくとも１個の結合分子は、複数の標的のそれぞれに特異的に結合し、エンコードポリヌクレオチドは複数の基質ポリヌクレオチドの配列特異的および位置的に区別できる基質ポリヌクレオチドに特異的に結合し、各結合分子およびエンコードポリヌクレオチドは互いに結合的に区別可能であるステップと；および
基質に結合した複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体における複数の標的を分類するステップと
を有するものとする方法。
【請求項２１】
複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は請求項１〜１３のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を有するものとする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
サンプルにおける複数の標的のうちの標的を分類する方法で、その方法は、
基質に付着した複数の基質ポリヌクレオチドを提供し、各基質ポリヌクレオチドは、配列特異的であり互いに位置的に区別可能であり、
複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を提供し、各モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに付着する骨格分子を有し、少なくとも１個の結合分子は複数の標的のうち予め特定した標的に特異的に結合し、エンコードポリヌクレオチドは複数の基質ポリヌクレオチドの配列特異的で位置的に区別可能な基質ポリヌクレオチドに特異的に結合し、各結合分子およびエンコードポリヌクレオチドは互いに結合的に区別可能であり；
複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を、少なくとも１個の結合分子を標的に結合させることができる時間および条件でサンプルに接触させ、それによって複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を提供するステップと；
複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を、エンコードポリヌクレオチドを基質に付着した基質ポリヌクレオチドに結合させることができる時間および条件で複数の基質ポリヌクレオチドに接触させるステップと、
それによって、基質に結合した複数のポリヌクレオチドエンコードタンパク質標的―複合体における複数の標的を分類するステップと、
を有するものとする方法。
【請求項２３】
複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は請求項１〜１３のうちいずれか一項に記載のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を有するものとする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
複数の標的を分類するシステムで、このシステムは、
基質に付着した基質ポリヌクレオチドを有する基質で、基質に付着した複数の基質ポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドは配列特異的および互いに区別可能である基質と、
複数の結合分子で、各結合分子は複数の標的の相補的な標的に特異的に結合する結合分子と、
複数のエンコードポリヌクレオチドで、各エンコードポリヌクレオチドは基質に付着した複数の基質ポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドと、
複数の結合分子の各結合分子および位置的に区別可能な骨格結合ドメインを有する複数のエンコードポリヌクレオチドの各エンコードポリヌクレオチドに結合するようにする少なくとも１個の骨格分子と、
少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するときに骨格分子上に準備した位置的に区別可能な骨格結合ドメインで、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子および基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドを提供する骨格結合ドメインと
を有するものとするシステム。
【請求項２５】
骨格分子は、
少なくとも１個の結合分子に付着するようにした第１骨格結合ドメインと、
エンコードポリヌクレオチドに付着するようにした第２骨格結合ドメインと
を有し、少なくとも１個の結合分子は標的に特異的に結合するようにし、エンコードポリヌクレオチドは基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するようにし、
第１骨格結合ドメインおよび第２骨格結合ドメインは、位置的に区別でき骨格分子において準備して、少なくとも１個の結合分子を第１結合ドメインにおよびエンコードポリヌクレオチドを第２結合ドメインに結合させるとき少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドの相互作用を最小化するものとする骨格分子。
【請求項２６】
骨格分子はＳＡＣまたはＳＡＣ３であるとする、請求項２５に記載の骨格分子。
【請求項２７】
ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、
標的に特異的に結合する結合分子と、
結合分子に付着したエンコードポリヌクレオチドと
を有し、エンコードポリヌクレオチドは基質ポリヌクレオチドに特異的に結合する配列を有し、この配列は、エンコードポリヌクレオチドにおいて準備した少なくとも１個の制限酵素部位を有して、関連する制限酵素によって解裂するようにするポリヌクレオチド捕捉剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本明細書は、２００８年４月９日に提出された整理番号ＣＩＴ−５１２７−Ｐの米国特許仮出願第６１１１２３４７８号明細書「遺伝子およびタンパク質の多重細胞分類および検出に関する統一されたプラットフォーム」に対する優先権を主張し、全体に参照することにより組み込まれる。本明細書はまた、２００７年８月１日に提出された整理番号Ｐ０１７−ＵＳの米国特許第１１８８８５０２号明細書「標的を検出および／または分類する方法およびシステム」の一部継続出願であり、それは、２００６年８月２日に提出された整理番号ＣＩＴ−４７０７の米国特許仮出願第６０１８３４８２３号明細書「遺伝子およびタンパク質の多重細胞分類に関する統一されたプラットフォーム」および２００７年７月１６日に提出された整理番号ＣＩＴ−４９４４の米国特許仮出願第６１０９５９６６５号明細書「デジタル対応：定量的およびデジタルタンパク質検出免疫測定」に対する優先権を主張し全体に参照することにより組み込まれる。本明細書はまた、２００８年７月１６日に提出された整理番号Ｐ２３５−ＵＳの米国特許第１２１１７４５９８号明細書「標的分子を検出するマイクロ流体装置、方法およびシステム」および２００８年７月１６日に提出された整理番号Ｐ２６２−ＵＳの米国特許第１２１１７４６０１号明細書「標的分子を検出するアレイ、基質、装置、方法およびシステム」に関連し、共に全体に参照することにより組み込む。
【０００２】
（政府の許可）
アメリカ合衆国政府は、国立衛生研究所によって認められた付与番号ＣＡ１１９３４７号に従って本発明における区別の権利を有する。
【０００３】
本発明は、生体サンプル等のサンプルにおける１個またはそれ以上の標的、とくにバイオマーカーの検出および／または分類に関連する。より詳細には、標的を検出および／または分類する捕捉剤および関連する方法およびシステムに関連する。
【背景技術】
【０００４】
標的およびとくにバイオマーカーの高感度検出は、生物学的分子分析の分野において、とくに複数の標的の検出および／または区別の大きさもしくは低濃度でサンプルにおいて存在する標的の検出を目指していたとき、挑戦されていた。病理学検査に対しても基礎生物学研究に対しても、いくつかの方法は様々な種類の生体材料および生体分子の検出に一般的に使われている。
【０００５】
一つの生物学的標的の検出に対する研究室において最も一般的に用いられる技術には、ゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ウェスタンブロット、蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）がある。これらの方法は、組織等の生物学的サンプルにおける１個またはそれ以上のバイオマーカーを検出できる能力を提供し、また、診断目的にも適切である。
【０００６】
本発明によって開発したそれに続くポリヌクレオチドのコード化の手法は、それまでの技術を改良し、とくに、高感度および高選択性の標的の多重検出を可能にする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ここに示すのは、いくつかの実施形態において、柔軟で多目的なモジュール式分子ツールを用いて莫大な量の標的の選択的および感度の高い検出を可能にする、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤およびとくに分子捕捉剤および関連するアレイ法およびシステムである。
【０００８】
とくに、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、制御された方法で結合および分離できる標準化した分子単位によって形成した、標的結合部位、骨格部位およびエンコード部位を有する。したがって、ここで説明する分子捕捉剤において、同じ骨格が異なり標的結合構造と結合するだけでなく、同じ骨格は複数の標的結合構造と結合し、これによって、捕捉剤による検出、感度、選択性の達成を大きく改良する。
【０００９】
第１態様に従って、標的への特異結合用に設定したモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を説明する。モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、標的に特異的に結合するようにした少なくとも１個の結合分子、基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するようにしたエンコードポリヌクレオチド、位置的に区別できる骨格結合ドメインを有する少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに付着させるようにした骨格分子を有する。骨格分子において、位置的に区別できる骨格結合ドメインは、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するとき、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子および基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドの存在を可能にする。
【００１０】
第２態様に従って、サンプルにおける標的を検出する方法およびシステムを開示し、基質に付着した基質ポリヌクレオチド、およびモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を組み合わせて用いる方法およびシステムは、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドで結合する骨格分子を有する。モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、少なくとも１個の結合分子は、標的に特異的に血符合するようにし、エンコードポリヌクレオチドは、基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するようにする。
【００１１】
この方法において、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および／または前記モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を有する単位、サンプルおよび基質ポリヌクレオチドは、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体における標的に少なくとも１個の結合分子が結合でき、また、基質ポリヌクレオチドにエンコードヌクレオチドが結合できるようにする時間および条件下で接触し、これによって、基質ポリヌクレオチドに結合したモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を提供する。この方法において、基質ポリヌクレオチドに結合したモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体は、その後、本明細書を読むときに当業者によって特定できる検出技術方法によって検出する。
【００１２】
このシステムにおいて、基質に付着した基質ポリヌクレオチドを有する基質は、標的に特異的に結合するようにした少なくとも１個の結合分子、基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチド、および少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドを位置的に区別できる骨格結合ドメインに付着するようにした骨格分子と共に提供する。骨格分子において、位置的に区別できる骨格結合ドメインは、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するとき、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子および基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドの存在を可能にする。
【００１３】
第３態様に従って、複数の標的の標的を分類する方法およびシステムを開示し、この方法およびシステムは、基質に付着した複数の基質ポリヌクレオチドおよび複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を組み合わせて用いる。いくつかの実施形態において、標的は細胞であり、この方法およびシステムは複数の細胞を分類するものである。
【００１４】
この方法およびシステムにおいて、各基質ポリヌクレオチドは、配列特異的であり他のものと位置的に区別できる。この方法およびシステムにおいて、各モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、複数の標的の補助的な標的に特異的に結合するようにした少なくとも１個の結合分子と、複数の基質ポリヌクレオチドのうちの基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するようにしたエンコードポリヌクレオチド、および少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドを位置的に区別可能な骨格結合ドメインに結合させるようにした骨格分子とを有し、位置的に区別可能な骨格結合ドメインは、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するとき、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子および基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドの存在を可能にするように骨格分子上に準備する。
【００１５】
この方法において、複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および／または前記複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を形成する単位は、標的に少なくとも１個の結合分子が結合できるようにする時間および条件下でサンプルに接触し、これによって、複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を提供する。この方法において、複数のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体は、その後、エンコードポリヌクレオチドが基質に付着した基質ポリヌクレオチドに結合できるような時間および条件下で複数の基質ポリヌクレオチドに接触し、これによって、基質に結合した複数のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体において複数の標的を分類する。
【００１６】
このシステムにおいて、基質に付着した複数の基質ポリヌクレオチドを有する基質は、複数の結合分子と、各結合分子は複数の標的の補助的な標的に特異的に結合し、複数のエンコードポリヌクレオチドと、各エンコードポリヌクレオチドは、基質に付着した複数の基質ポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドに特異的に結合し、複数の結合分子の各結合分子および複数のエンコードポリヌクレオチドの各エンコードポリヌクレオチドを位置的に区別可能な骨格結合ドメインに結合するようにした少なくとも１個の骨格分子とを有し、位置的に区別可能な骨格結合ドメインは、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するとき、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子および基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するエンコードポリヌクレオチドの存在を可能にするように骨格分子上に準備する。
【００１７】
第４態様に従って、骨格分子を説明し、骨格分子は、少なくとも１個の結合分子に付着するようにした第１骨格結合ドメインおよびエンコードポリヌクレオチドに付着するようにした第２骨格結合ドメインを有し、少なくとも１個の結合分子は、標的に特異的に結合するようにし、エンコードポリヌクレオチドは、基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合するようにした。骨格分子において、第１骨格結合ドメインおよび第２骨格結合ドメインは、位置的に区別でき、少なくとも１個の結合分子を第１結合ドメインに、およびエンコードポリヌクレオチドを第２結合ドメインに結合させるとき、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドの相互作用を最小化するように骨格分子において準備する。
【００１８】
第５態様に従って、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を説明する。ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、標的に特異的に結合する結合分子および結合分子に付着したエンコードポリヌクレオチドから成る。エンコードポリヌクレオチドは、基質ポリヌクレオチドに特異的に結合する配列から成る。基質ヌクレオチドは、基質に付着し、また、エンコードポリヌクレオチドに特異的に結合する配列から成る。ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、エンコードポリヌクレオチドは、関連する制限酵素によって開裂するために存在するエンコードポリヌクレオチドにおいて準備した少なくとも１個の制限酵素部位を有する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤とする。
【００１９】
第６態様に従って、ここで説明する各方法、システムおよびアレイの基質は、液体を運搬するマイクロ流体の特性を有するマイクロ流体要素に関連して操作可能であり、ここで説明する方法において、少なくともエンコードポリヌクレオチドを基質ポリヌクレオチドへの接触は、マイクロ流体特性によって運搬した液体において起こる。加えて、ここで説明する各システムはさらに、マイクロ流体特性を有するマイクロ流体要素を有する。
【００２０】
モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ方法およびシステムにおいて、標的結合構造は、骨格構造から切り離し、これによって、関連する当該技術の装置と比較して仕様の柔軟性および多様性を改良することができる。
【００２１】
加えて、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ方法およびシステムは、いくつかの実施形態において、１個のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤へ複数の結合分子、とくにタンパク質を付着させ、それぞれ同じ標的に結合するようにできる。したがって、その結果できたモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の感度および／選択性は、制御、とくに改良される。
【００２２】
とくに、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムは、いくつかの実施形態において、当該技術の特定の方法およびシステムと比較すると、標的検出の選択性および感度を改良することができる。
【００２３】
より特別には、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムは、いくつかの実施形態において、低親和性の配位子が存在する細胞等の標的、および配位子が複合混合物から０．１％未満の非常に低い存在度で存在する細胞用の標的を検出および／または分類することができる。
【００２４】
モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムはまた、いくつかの実施形態において、抗体を必ずしも含まない強固なプラットフォームを用いて標的検出を行うことができる。
【００２５】
とくに、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムは、いくつかの実施形態において、高効率での標的の検出および／または分類に関する強固およびモジュール式のアレイを生成することができ、それらの安定性の点で、標的捕捉する表面結合タンパク質を用いる文献のアプローチより顕著に効率を良くするこができる。
【００２６】
さらに、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムは、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体の選択的な放出ができ、したがって、検出したおよび／または分類した標的、とくに標的細胞上で多数の生物分析方法の展開を可能にする。
【００２７】
モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムは、標的を検出および／または分類するように設計したいくつかのアッセイの実行に関連して使用し、それらには、限定することはないが、ゲノムおよびプロテオームアッセイ、および当業者により特定できる他のアッセイ等のモノパラメータおよびマルチパラメータアッセイがある。とくに、ここで説明したプラットフォームのモジュール方式によって、免疫組織化学、ＦＩＳＨ、および本明細書を読む当業者によって特定できるさらなるアッセイ等の、ガラス基質上で通常行う標準化したアッセイの捕捉した標的（およびとくに捕捉した細胞）上で行うことができる。
【００２８】
モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびここで説明する関連するアレイ、方法およびシステムは、限定することはないが、分子診断、分子治療研究、組織工学、および生体材料等の様々な分野において用いることができる。
【００２９】
本発明の１個またはそれ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および説明および以下の説明において示す。他の特性、目的、および利点は、説明、実施例および図面から、および請求項から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
本明細書の一部に組み込み構成する添付の図面は、本発明の１個またはそれ以上の実施形態を、詳細な説明および実施例とともに示し、本発明の主旨および実施を説明する。
【図１】ここで説明する実施形態に従った、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の略図である。
【図２】ここで説明する実施形態に従った、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の略図である。
【図３】ここで説明する実施形態に従った、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の略図である。
【図４】ここで説明する実施形態に従った、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の略図である。
【図５】ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いて行った細胞分類実験の結果を示す。パネルＡは、Ｔ細胞と接触したチロシナーゼＴＣＲに特異的なｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。この画像は、ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体のエンコードポリヌクレオチドに相補的な基質ＤＮＡが付着した基質上のＴ細胞の検出および細胞分類を示す。パネルＢは、互いに結合的に区別可能なｓｓＤＮＡをそれぞれエンコードした２個のセットのｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体を用いた細胞分類を示す。矢印は、標的Ｔ細胞に接触後の各セットの結合を示す。
【図６】ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いて行った細胞分類実験の結果を示す。パネルＡは、相補的基質ポリヌクレオチドおよびＴ細胞に示したように異なる頻度で接触したチロシナーゼＴＣＲに特異的なｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＢは、パネルＡにおいて示したデータの定量化を示すダイアグラムを示す。
【図７】ここで説明する実施形態に従った骨格（パネルＡ）および関連する最適な骨格（パネルＢ）の代表的な構造を示す。
【図８】ここで説明する実施形態に従った最適化したポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の結合能力を実証する実験の結果を示す。とくに、パネルＡは、発現、リフォールディング、および精製の様々な段階で検出したＳＡＣタンパク質に対するＰＡＧＥゲルの変性を示す。ＳＡＣモノマーの分子量は〜１２ｋＤａである。パネルＢは、ｓｓＤＮＡ−ＳＡＣ複合体の形成を検証するために実行したゲル移動度シフトアッセイである。パネルＣは、分子２−（４´−ヒドロキシアゾベンゼン）安息香酸（ＨＡＢＡ）を用いてビオチンのＳＡに対するモル比を画定する式を示す。
【図９】ここで説明する実施形態に従ったポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の捕捉能力を実証する実験の結果を示す。とくに、パネルＡは、ヒトＴＣＲ形質導入Ｔ細胞（左）およびマウスＴＣＲ遺伝子導入Ｔ細胞（右）に特異的なストレプトアビジン骨格およびｐ／ＭＨＣ結合タンパク質等のｓｓＤＮＡエンコードタンパク質のアレイのグレースケールの明視野像を示す。パネルＡの各サブパネルは、示したようにｓｓＤＮＡエンコードタンパク質を相補的基質ＤＮＡおよび特異的な細胞に接触後のアレイの明視野像を示す。パネルＢは、ヒトＴＣＲ形質導入Ｔ細胞（左）およびマウスＴＣＲ遺伝子導入Ｔ細胞（右）（上野パネルと同じ細胞）に特異的な最適化したストレプトアビジン骨格およびｐ／ＭＨＣ結合タンパク質等のｓｓＤＮＡエンコードタンパク質のアレイのグレースケールの明視野像を示す。パネルＢの各サブパネルは、示したようにＳＡＣ−ｓｓＤＮＡ  ｐ／ＭＨＣを相補的基質ＤＮＡおよび特異的な細胞に接触後のアレイの明視野像を示す。
【図１０】従来のタンパク質アレイおよびここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤で実行した標的捕捉の比較を示す。パネルＡは、示したような様々なモデル基質上の従来の直接的なｐ／ＭＨＣタンパク質スポッティング戦略と比較して最適化したＳＡ骨格等をさらに含むポリヌクレオチドエンコードタンパク質において存在するｐ／ＭＨＣのアレイのグレースケールの明視野像を示す。パネルＢは、パネルＡにおいて示したデータの定量化を示すダイアグラムである。各データポイントは、３個の別々のスポットから導いた。
【図１１】従来のタンパク質アレイおよびここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤で実行した標的捕捉の比較を示す。パネルＡは、ＳＡＣ骨格等をさらに含むｓｓＤＮＡ−エンコードエンコードタンパク質において存在するｐ／ＭＨＣタンパク質のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＢは、ｐ／ＭＨＣタンパク質のみでスポットした誘導体化表面のグレースケールの蛍光画像を示す。各矢印は、異なるスライド上で実行した別々の実験を示す。
【図１２】ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いて行った細胞分類実験の結果を示す。パネルＡは、ポリヌクレオチドＡに相補的なｓｓ−ＤＮＡでエンコードしたｐ／ＭＨＣ四量体およびＪｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞によって提供された標的に接触後の、３個の異なる基質ポリヌクレオチド（Ａ，ＢおよびＣ）のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＢは、ポリヌクレオチドＡに相補的なｓｓ−ＤＮＡでエンコードしたＭａｒｔ−１−特異ＴＣＲに特異的なｐ／ＭＨＣ四量体、ポリヌクレオチドＢに相補的なｓｓ−ＤＮＡでエンコードしたＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ−特異ＴＣＲに特異的なｐ／ＭＨＣ四量体および親油性色素で予め染色したＪｕｒｋｅｔａ−ＭＡＲＴ−１Ｊｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞の混合によって提供された標的に接触後の、異なる基質ポリヌクレオチド（Ａ，ＢおよびＣ）のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＣは、示したように異なる希釈（５０％，１０％，１％，０．１％）でＪｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒに接触後のＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ−特異ＴＣＲに特異的なポリヌクレオチドエンコードタンパク質のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＤは、パネルＣにおいて示したデータの定量化を示すダイアグラムである。
【図１３】ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いて行った人工細胞の検出を示す。パネルＡは、Ｆ５  ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲでＰＭＢＣ細胞を形質導入する実験アプローチの概略図およびフローサイトメトリ−によって画定した導入効率を示す関連するダイアグラムを示す。パネルＢは、それぞれＡおよびＢにエンコードした類似の捕捉タンパク質（ＭＡＲＴ−１２６−３５／ＨＬＡ−Ａ２．１）および対照の捕捉タンパク質（ＣＭＶｐｐ６５４９５−５０３／ＨＬＡ−Ａ２．１）を含むマイクロアレイ上で分類した形質導入したＰＢＭＣのグレースケールの明視野像を示す。パネルＣは、共焦点および明視野像の重ね合わせをしめし、パネルＢにおいて示した細胞捕捉が特異であることを検証する（ＭＡＲＴ−１細胞は明るいグレーで示した）。
【図１４】ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の特異性および選択性の検出を示すダイアグラムである。パネルＡは、フローサイトメトリ−によって画定したように、ＥＢＶ  ＢＭＬＦ１２５９−２６７に特異なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の量および特異性を示すダイアグラムである。パネルＢは、フローサイトメトリ−によって画定したように、ＣＭＶ  ｐｐ６５４９５−５０３に特異なヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の量および特異性を示すダイアグラムである。
【図１５】ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いた内因性初代細胞の検出を示す。パネルＡは、図１３のＥＢＶ−ＢＭＬＦ−１に特異的なＣＤ８＋細胞に接触した後の、示したポリヌクレオチドエンコードｐ／ＭＨＣ捕捉タンパク質ＥＢＶ  ＢＭＬＦ１２５９−２６７／ＨＬＡ−Ａ２．１およびＣＭＶ  ｐｐ６５４９５−５０３／ＨＬＡ−Ａ２．１等のアレイの画像を示す（患者ＮＲＡ１３）。左側のパネルは、ＣＭＶ−ｐｐ６５ではなくＥＢＶ−ＢＭＬＦ−１（それぞれ図１３におけるフローサイトメトリ−によって検証した）特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を含む患者ＮＲＡ１３の接触および捕捉後の、ｐ／ＭＨＣ捕捉タンパク質ＥＢＶ  ＢＭＬＦ１２５９−２６７／ＨＬＡ−Ａ２．１およびＣＭＶ  ｐｐ６５４９５−５０３／ＨＬＡ−Ａ２．１で（それぞれＡおよびＢ  ｃＤＮＡへ）局在化したアレイを示す。右側の２個のパネルは、蛍光ＥＢＶ  ＢＭＬＦ１２５９−２６７／ＨＬＡ−Ａ２．１（青、白色矢印で図に示す）およびＣＭＶ  ｐｐ６５４９５−５０３／ＨＬＡ−Ａ２．１（赤、黒色矢印でグレースケールの図に示す）での細胞染色後の、アレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＢは、図１３において示したＥＢＶ−ＢＭＬＦ−１（患者ＮＲＡ１３）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＭＶ−ｐｐ６５（患者ＮＲＡ１１）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の１：１の混合物に接触後の、示したようなＥＢＶまたはＣＭＶに特異的なｓｓ−ＤＮＡ−ＳＡＣ−ｐ／ＭＨＣのアレイの画像を示す。左側のパネルは、スポットＡおよびＢ上に局在化したＴ細胞での細胞捕捉後すぐの明視野像を示す。右側の２個のパネルは、蛍光ＥＢＶ（青、白色矢印で図に示す）およびＣＭＶ  ｐ／ＭＨＣ四量体（赤、黒色矢印でグレースケールの図に示す）での細胞染色後の、アレイのグレースケールの蛍光画像を示す。パネルＣは、フローサイトメトリによって画定した、０．４％未満、０．２％および０．１％のヒトＥＢＶ特異性Ｔ細胞集団の混合物の量および特異性を示すダイアグラムである。パネルＤは、パネルＣの混合物に接触後のＥＢＶに特異的なモジュール式ポリヌクレオチドエンコードタンパク質のアレイのグレースケールの蛍光画像を示す。ＥＢＶ特異Ｔ細胞集団は、明るいグレーの矢印で示し、非特異性の細胞は黒色の矢印で示す。
【図１６】ここで説明する実施形態に従ったモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いて捕捉した制御放出を示す。パネルＡは、実験アプローチの略図を示す。パネルＢは、（ｉ）ｐ／ＭＨＣアレイ上で捕捉した（ｉｉ）ＢａｍＨＩで処理後（ｉｉｉ）ＥｃｏＲＩで処理後および（ｉｖ）ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで処理後のＪｕｒｋｅｔａ−ＭＡＲＴ−１（グレースケールで暗いグレーで示した赤）およびＪｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ（グレースケールで明るいグレーで示した緑）のグレースケールの蛍光画像である。
【図１７】フローサイトメトリの染色試薬として利用できＤＮＡハイブリダイゼーションによる縣濁液から抗原特異性Ｔ細胞を局在化できる蛍光標識したｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体を示す。パネルａにおいて、Ｃｙ３−標識Ａ´−ＳＡＣ複合体は、蛍光チロシナーゼ３６８−３７６ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体を生成するために使用し、また、フローサイトメトリによってＪｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞を検出するために使用した。同様の染色プロファイルはｍＣｙ３ＮＡＣＳ  ｐ／ＭＨＣ四量体（下のパネル）および従来のチロシナーゼ３６８−３７６（ＰＥ）ｐ／ＭＨＣ四量体（上のパネル）の間に観察された。パネルｂにおいて、Ｊｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞を、ＤＮＡアレイに露呈する前に３６８−３７６−Ａ´ｐ／ＭＨＣ四量体で染色した。
【図１８】分岐ペプチドの略図を示す。反応性１級アミンは、「星」によって強調し、チオール反応性マレイミド基は破線の四角で強調する。
【図１９】最適化したタンパク質骨格（左側のパネル）およびＳＡＣ３（右側のパネル）から作成したらせん構造Ａ´にエンコードした３６８−３７６／ＨＬＡ−Ａ２．１四量体を用いたＪｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞の検出を示す。
【図２０】免疫ＰＣＲを用いた細胞表面受容体の検出を示す。パネルＡは、ｓｓＤＮＡでエンコードした蛍光ＭＡＲＴ−１ｐ／ＭＨＣ四量体で染色したＪｕｒｋｅｔａ−ＭＡＲＴ−１およびＪｕｒｋｅｔα−ＴｙｒＴ細胞のフローサイトメトリ分析を示す。パネルＢは、ｓｓＤＮＡでエンコードした蛍光抗ＥＧＦＲ抗体標識で染色したＣＤグリオーマ細胞およびＪｕｒｋｅｔＴ細胞のフローサイトメトリ分析を示す。下のパネルは、ＰＣＲでエンコードしたｓｓＤＮＡを増大させることによる、類似の細胞受容体の検出を示す（ａ−ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲ，パネルＣ；ＥＧＦＲ，パネルＤ）。
【図２１】ＤＮＡエンコードｐ／ＭＨＣ四量体およびＤＮＡエンコード抗体を用いた捕捉抗原特異性細胞のＴＣＲ誘発活性の機能プロファイルの略図である。
【図２２】ガラス基質上で捕捉および活性化した抗原特異性Ｔ細胞の機能プロファイルを示す。パネルＡは、３個の異なる時点で３個の異なるサイトカインでエンコードした個々のスポットの蛍光画像を含む。パネルＢは、１個の個々のＩＦＮ−ｙ−クラスターの蛍光拡大図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤およびとくにモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤およびここで説明する関連するアレイ方法およびシステムは、ＮＡＣＳアプローチまたは技術でも特定できるここで示すアプローチに従って、サンプルにおける１個またはそれ以上の標的を検出するために基質ポリヌクレオチドを組み合わせて用いることができる。
【００３２】
単語「ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤」は、標的に特異的に結合するポリヌクレオチドエンコード分子構成を意味する。とくに、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、概して、標的に特異的に結合し、それによって標的に相補的であるように画定した結合成分、結合成分を支持する構造成分、および分子構造にエンコードする構造成分に付着したエンコードポリヌクレオチドを有する。
【００３３】
「モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤」において、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の結合成分、構造成分およびエンコード成分は、制御された方法で互いに結合または分離できる標準化された分子単位によって形成される。とくに、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、結合成分は、少なくとも１個の結合分子によって形成され、標的に特異的に結合し、またこれによって標的に相補的であると画定し；エンコード成分は、基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合し、またこれによって相補的であると画定するようにしたエンコードポリヌクレオチドによって形成し；また、構造成分は、少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに付着する骨格分子によって形成する。とくに、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、標的に特異的に結合する少なくとも１個の結合分子、骨格分子およびエンコードポリヌクレオチドは、以下でもさらに説明するように図１または図２の概略図に従って１個もしくは他に付着するまたは付着される。
【００３４】
ここで用いる用語「付着する」または「付着した」は、２個またはそれ以上の成分を保持するために結合、リンク、力または結ぶことによって結合またはユニット化することを意味し、第１分子を第２分子または材料に直接結合する実施形態および１個またはそれ以上の中間体分子を第１分子および第２分子または材料の間に露呈する実施形態等のように直接または間接的に付着していることも含む。分子には、限定することはないが、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびとくにタンパク質および抗体、多糖、アプタマーおよび小分子がある。
【００３５】
ここで用いる用語「ポリヌクレオチド」は、２個またはそれ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、またはそれら類似体から成る有機ポリマーを示す。用語「ヌクレオチド」は、プリンもしくはピリミジンに接合したリボース糖またはデオキシリボース糖からなるいくつかの化合物のいずれか、および核酸の基本構造単位であるリン酸基を意味する。用語「ヌクレオシド」は、デオキシリボースまたはリボースに結合したプリンまたはピリミジン塩基から成り、とくに核酸において見られる化合物（グアノシンまたはアデノシン）を意味する。用語「ヌクレオチド類似体」または「ヌクレオシド類似体」は、それぞれ、１個またはそれ以上の個々の原子が異なる原子または異なる官能基でり患されたヌクレオチドまたはヌクレオシドを意味する。したがって、用語ポリヌクレオチドには、いずれかの長さのＤＮＡ  ＲＮＡ類似体およびそれらの断片の核酸を含む。３個またはそれ以上のヌクレオチドのポリヌクレオチドはまた、オリゴマーまたはオリゴヌクレオチドとも呼ぶ。
【００３６】
ここで用いる用語「ポリペプチド」は、２個もしくはそれ以上のアミノ酸モノマーから成る有機ポリマーおよび／またはそれらの類似体を示す。用語「ポリペプチド］には、全長タンパク質およびペプチドと、類似体およびそれら断片等のいずれかの長さのアミノ酸ポリマーがある。３個またはそれ以上のアミノ酸のポリペプチドもまた、オリゴマーまたはオリゴヌクレオチドとも呼ぶ。ここで用いる「アミノ酸」、「アミノ酸モノマー」、または「アミノ酸残基」は、非天然の側鎖を有する合成アミノ酸を含みＤおよびＬ光学異性体を含む２０個の天然アミノ酸のいずれかを意味する。用語「アミノ酸類似体」は、１個またはそれ以上の原子を異なる原子、同位体、または異なる官能基のいずれかで置換したが、その天然アミノ酸類似体ではないアミノ酸を意味する。
【００３７】
ここで用いる用語「タンパク質」は、とくに、限定することはないが、抗体、ＤＮＡ，ＲＮＡ、脂質、代謝物、ホルモン、ケモカイン、および小分子等の他のタンパク質と含む他の生体分子と相互作用することができる特別な二次および三次構造を有するポリペプチドを示す。
【００３８】
ここで用いる用語「抗体」は、抗原による刺激後の活性化Ｂ細胞によって生成し、生態系において免疫反応を促進する抗原に特異的に結合し、概して２個の重質鎖および２個の軽質鎖を含む４個のサブユニットから成るタンパク質を意味する。用語「抗体」には、限定することはないが、モノクローナル抗体、ポリクロ―ナル抗体またはそれら断片を含む天然および合成抗体がある。例示的な抗体には、ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＧＩ，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＭおよび同様のものがある。例示的な断片物には、Ｆａｂ  Ｆｖ，Ｆａｂ‘Ｆ（ａｂ’）２および同様のものがある。モノクローナル抗体は、「エピトープ」と呼ぶ他の生体分子の１個の特定の空間および極性組織に特異的に結合し、それによって相補的であると画定した抗体である。ポリクロ―ナル抗体は、異なる抗原エピトープに結合する各モノクローナル抗体とのモノクローナル抗体の混合物を意味する。抗体は、宿主の免疫付与および血清の収集（ポリクロ―ナル）または連続するハイブリドーマ細胞を準備し分泌タンパク質を収集することによって（モノクローナル）等の、当業者に既知の技術によって準備できる。
【００３９】
ここで用いる用語「多糖」は、グリコシド結合によって共に接合した単糖によって形成したポリマーである。多糖には、非常に大きく、しばしば分岐した高分子があり、単糖または二糖ポリマーから何百から何千もの単糖を含み１０００Ｄａ〜約２０ＫＤａの分子量を有するポリマーまでいずれかの長さのポリマーがある。例示的な多糖は、グリコーゲン、セルロース、でんぷんおよびキチンを有する。
【００４０】
ここで用いる用語「アプタマー」は、特異的な標的に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子を示す。とくに、核酸アプタマーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択または同等の繰り返し環ＳＥＬＥＸ（指数関数的な配位子の系統的進化）を通して、小分子、タンパク質、核酸、および細胞、組織および器官までもの様々な分子標的に結合する核酸種を有する。アプタマーは、抗体と競争する分子認識特性をしばしば必要とするため、バイオ技術および治療用途において利用できる。ペプチドアプタマーは、細胞内の他のタンパク質相互作用で妨げるように設計したタンパク質である。それらは、両端で付着しタンパク質骨格となる様々なタンパク質ループから成る。この二重構造制限は、抗体と比較してペプチドアプタマーの結合親和性を大きく増加させる（ナノモル範囲）。
【００４１】
ここで用いる用語「小分子」は、ポリマーではなく約１０Ｄａから２０００〜３０００Ｄａの大きさを有する有機化合物を示す。小分子は、生物学的に活性である分子および生物活性を持たない分子を有する。例示的な小分子は、４−［（４−メチルピぺラジン−１−イル）メチル］−Ｎ−［４−メチル−３−［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）−フェニル］−ベンズアミド（Ｇｌｅｅｖｅ（登録商標））、スルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサン酸塩、およびスクシンイミジル−６−ヒドラジノニコチン酸酢酸ヒドラゾンを有する。
【００４２】
ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、少なくとも１個の結合分子は標的に特異的に結合し、エンコード捕捉剤は基質に付着した基質ポリヌクレオチドに特異的に結合する。
【００４３】
分子および他方の結合または付着に関してここで用いる単語「特異的な」、「特異的に」または「特異性」は、分子および他方の間の安定した複合体の認識、接触および形成で、各分子および他の分子を有する他方との間の安定した複合体の認識、接触および形成がないことは実質的にないことを意味する。例示的な特異的な結合は、抗体−抗原相互作用、細胞受容体−配位子相互作用、ポリヌクレオチド混成、酵素基質相互作用などである。複合体の分子成分に関してここで用いる用語「特異的な」は、成分が一部である特異的な複合体への成分の独特の関連を意味する。ポリヌクレオチド配列に関してここで用いる用語「特異的な」は、相補配列である単一ポリヌクレオチドｗ有する配列の独特の関連を意味する。
【００４４】
ここで用いる単語「基質ポリヌクレオチド」は、基質に付着しその相補的ポリヌクレオチドへの結合能力を維持するポリヌクレオチドを意味する。基質ポリヌクレオチドは、とくに、特異的に結合する配列から成り、これによって、ポリヌクレオチドエンコードタンパク質のエンコードポリヌクレオチドに相補的であると画定する。
【００４５】
ここで用いる「基質」は、下支えまたは底質を示す。例示的な基質には、ガラス板、マイクロタイターウェルプレート、電磁ビーズ、シリコンウェハおよび本発明を読む当業者によって特定可能なさらなる基質がある。
【００４６】
いくつかの実施形態において、骨格成分に付着したエンコードポリヌクレオチドは、結合成分に対し特異的である。それらの実施形態は、結合成分−標的の特異的な相互作用を用いてタンパク質、サイトカイン、ケモカイン、小分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質などを検出し、標的は標的が必要な既知で感度の高い検出である。いくつかの実施形態において、結合成分および構造成分はタンパク質によって形成する。
【００４７】
ここで用いる用語「検出する」または「検出」は、限定することはないが、サンプル、反応混合物、分子複合体および基質等の空間の限られた部分における標的もしくはシグナルの実在、存在または事実の画定を示す。検出は、標的もしくはシグナルの量または総量の測定を意味する、関連するまたは含むとき「定量的」であり（定量も意味する）、限定することはないが、標的もしくはシグナルの総量または割合を画定するように設計したいずれかの分析がある。検出は、他の標的またはシグナルに対する相対存在量に関する標的もしくはシグナルの質または種類に関連する、または有するとき「定性的」であり、定量的ではない。
【００４８】
ここで用いる用語「標的」は、対象の検体を示す。用語「検体」は、検出しなければならないサンプルにおいて存在するもしくは存在しない物質、化合物または成分を意味する。検体には、限定することはないが、生体分子およびとくにバイオマーカーがある。ここで用いる用語「生体分子」は、生態環境に関連する物質、化合物または成分を示し、限定することはないが、砂糖、アミノ酸、ペプチドタンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、有機分子、ヘプテン、エピトープ、生体細胞、生体細胞の一部、ビタミン、ホルモンおよび同様のものがある。用語「バイオマーカー」は、限定することはないが、細胞周期の相、健康状態および疾患状態等の生体環境の特定の状態に関連する生体分子を示す。バイオマーカーの存在、非存在、減少、上方調節は、特定の状態に関連し、それを示す。
【００４９】
ここで用いる用語「サンプル」は、限定することはないが、生体環境、被試験物、培養物、組織、組み換えタンパク、合成化合物またはそれら一部からの液体等の多量の何かしらのうち指標である限定された量の何かしらを示す。
【００５０】
いくつかの実施形態において、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード分子は、少なくとも１個の結合分子、骨格分子およびエンコードポリヌクレオチドを有する。
【００５１】
ここで用いる用語「結合分子」または「親和剤」は、適切な条件下で標的に特異的に結合することができる分子を示す。結合分子または親和剤は、とくに、適切な条件下で少なくとも１個の標的に特異的に結合することができ、例えば、溶液において（例えば、生体由来、または合成した）、細胞表面上で、人工表面上（例えば誘導体化したビーズ、ナノ粒子）または他の混合物においてもしくは当業者に特定できる表面上で標的に結合する。結合分子の例は、所定の標的に対して結合親和性を示すいずれかの分子であり、限定することはないが、抗体、レクチン、Ｆｃ受容体、ＭＨＣタンパク質Ａ／Ｇ、ペプチドアプタマー等のタンパク質結合剤、ポリヌクレオチド（例えばＲＮＡｅ／ｏＤＮＡ）核酸アプタマー、ペプチド、小分子等の非ペプチド結合剤、およびメシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖａｃ（登録商標））、ブンガロトキシン、ニコチルアセチルコリン受容体などの薬剤がある。モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、親和剤は、結合が直接的にまたは間接的に、例えば中間体分子（例えばビオチン分子）、いずれかの共有結合機構（当業者にによって容易に特定できる）または静電気、Ｆｃ−タンパク質Ａ／Ｇ相互作用、ビオチンなど等の非共有機構を通して行われる骨格に付着する。
【００５２】
一般的に、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコードタンパク質において用いる結合分子は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ），および当業者に特定可能なさらなる技術等の当該技術における既知の技術で測定することができる検定標的に対して結合親和性および結合選択性を示す。モジュール式ポリヌクレオチド捕捉剤に対する結合分子の選択は、検出する標的および実験設計の観点で当業者によって行う。例えば、標的が細胞であるとき、結合分子は生体分子、とくに特別な細胞の種類の表面に存在するバイオマーカーに対して結合親和性および選択性を示す。例示的な表面分子には、限定することはないが、膜タンパク、受容体、糖タンパク質、イオンチャネルまたは主要組織適合性複合体および本明細書を読む当業者に特定可能な他の分子がある。
【００５３】
当業者はまた、標的に対する対象の結合分子によって示された結合親和性および選択性の画定に基づき、また骨格に付着可能な結合分子の数から特定の標的に対して適切な結合分子を特定できる（以下参照）。
【００５４】
いくつかの実施形態において、適切な骨格を選択するとき、骨格に付着する結合分子の数を調整して、標的に対する捕捉剤の価数（すなわち、標的を有する捕捉剤によって形成した化学結合の数）を制御することによって所定の結合親和性および／または選択性を達成する。
【００５５】
例えば、特定の標的に対する低親和性（例えばＫｄ＞１０−６）の結合分子は、骨格に付着した分子の数を増加させる必要があり、この結合分子を有するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の特定の結合を可能にする。
【００５６】
したがって、いくつかの実施形態において、特定の標的に対する捕捉剤の結合親和性は、制御され、とくに、同じまたは異なる結合分子の多岐の複製を提供することによって増加する。とくに、同じまたは異なる結合分子の多岐の複製は、骨格上に適切にあれば、結合分子／骨格構造が非常に高い結合親和性を対象の細胞の種類に示し、それらによって親和剤となる。
【００５７】
とくに、多岐の配位子捕捉剤は、様々な分子（上述した１個等の）を同じ骨格に結合させることによって組み立てる。これは、標的サンプル（例えば、同じ抗原が存在する細胞からの多細胞表面マーカー、内因性および外因性ペプチド／ＭＨＣ）内に存在する多くの要素を調べるのが望ましい特定の状況において有利である。
【００５８】
いくつかの実施形態において、結合分子は、抗体、レクチン、Ｆｃ受容体、ＭＨＣ、タンパク質Ａ／Ｇおよび当業者に特定可能なさら成るタンパク質である。
【００５９】
とくに、いくつかの実施形態において、結合分子は抗体である。とくに、それらの実施形態において、抗体は、所定の標的に特異的に結合するように生成する。氷的な、混合物においてまたは細胞表面上で（例えばＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ３参照）検出されるバイオマーカーである。後者の場合、抗体はまた、細胞標的を検出および／または分類するのに用いるモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の結合分子として用いることができる（実施例１３参照）。
【００６０】
いくつかの実施形態において、タンパク質はＭＨＣ複合体である。ここで用いる用語「ＭＨＣ」または「ｐ／ＭＨＣ」は、ペプチド主要組織適合性複合体分子（ｐ／ＭＨＣ）および、より特別には、Ｔ細胞上に見られるＴ細胞受容体に結合する同類の結合剤であるヘテロ三量体タンパク質結合剤を示す。とくに、ｐ／ＭＨＣ複合体は、抗原が存在する細胞の細胞表面上に見られるヘテロ三量体タンパク質であり、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩおよびＭＨＣクラスＩＩＩタンパク質を有する。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、ペプチド、鎖、およびＰ２−マイクロ−グロブリンを有する。ＡＰＣ発現ＭＨＣクラスＩタンパク質は、表面分子ＣＤｂによって安定化した細胞毒性Ｔ細胞に抗原フラグメントを提供する。ＭＨＣクラスＩＩはヘテロ三量体ペプチド結合タンパク質およびＭＨＣ  ＩＩ  ＤＭ，ＭＨＣ  ＩＩ  ＤＲ、およびＭＨＣ  ＩＩ  ＤＰ等のリソソーム部分におけるＭＨＣクラスＩＩタンパク質上に乗ったモジュール式抗原を含む。抗原が存在する細胞上で、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、α＆β鎖を有し、Ｔヘルパー細胞上のＴＣＲおよびＣＤ４受容体に結合することによって抗原フラグメントにＴヘルパー細胞を提供する。ＭＨＣクラスＩＩＩは、相補的な成分（例えばＣ２、Ｃ４、因子Ｂ）等の他の免疫成分およびエンコードサイトカイン（例えばＴＮＦ−ａ）およびｈｓｐを有する。
【００６１】
ＭＨＣに対する典型的な受容体／標的は、ＭＨＣ複合体において存在する様々な抗原（例えばＭＡＲＴ−１、サイトメガロウィルス、チロシナーゼなど）に対して特異的であるＴ細胞上に見られるＴ細胞受容体である。特定の標的に対する適切な標的は、結合特異性ＭＨＣ対象分子の観点で関心の標的に基づいて当業者によって特定することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＭＨＣモノマーは、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の結合分子を提供する。それらの実施形態において、標的は、好ましくは、検出する細胞内に標的がないとき状態または形における分子バイオマーカーまたは他の分子によって提供される。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ二量体および三量体は、フローサイトメトリを介して溶液内に抗原特異的Ｔ細胞を検出するのに用いることができる。いくつかの実施形態において、高い親和相互作用（例えばＴＣＲ−ｐ／ＭＨＣ）を有するＭＨＣ二量体および三量体は、複合体環境においても抗原特異的なＴ細胞を検出するように期待され、チロシナーゼ抗原に対するＴＣＲを発現するＪｕｒｋｅｔ細胞を準最適な捕捉剤で分類する実施例５および図９ａで説明する（下の左側パネル）（図８の二量体および三量体の混合も参照）。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ三量体は、ポリヌクレオチドエンコード骨格と結合させて用いて、有利には、細胞検出および／または分類を目指す用途において用いる（例えば実施例９および１０および図５，６，９，１０，１１，１２および１３−１４，１５，１６，１９，２２参照）
【００６３】
とくに、いくつかの実施形態において、抗原に存在するＭＨＣの四量体は、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の結合分子を提供する。ＭＨＣ四量体は、ＭＨＣモノマーまたは二量体よりも対象のＴ細胞に対する大幅に高い親和性を示し、また、フローサイトメトリによって抗原特異的なＴ細胞の検出に対して現在確立した試薬である。ここで説明するモジュール式捕捉剤において骨格と結合するとき、ＭＨＣ四量体は、当該技術において既知のいくつかの方法と比較して高い感度および特異性で標的の検出および／または分類ができる。
【００６４】
図および実施例を含む以下の説明において、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード分子と結合する結合分子の特性および用途を議論するとき、ＭＨＣに対して参照する。当業者は、ＭＨＣよりもたんぱく質および他の分子を作成および使用する説明を適用することができる。とくに、当業者は、ｐ／ＭＨＣ分子ではなく結合たんぱく質を用いるとき、選択の主な決定因子は検出する標的であることを理解できる。例えば、小分子（例えばカフェイン）およびカフェインに特異的なアプタマーを検出することが望ましければ、当業者は、結合部位としてアプタマーを選択し、それを骨格構築に適用する（実施例１３参照）。
【００６５】
ここで用いる用語「骨格」および「骨格分子」は、エンコードポリヌクレオチド（例えばｓｓＤＮＡタグ）に親和剤（例えばＭＨＣ）を集めるようにした捕捉剤の分子構造を示す。この構造は、タンパク質（ストレプトアビジンまたはＳＡ等）、他の生体分子（ＲＮＡおよびＤＮＡ、ペプチド核酸などのポリヌクレオチド等）、またはポリマーの区別および分離された部位において親和剤およびエンコードポリヌクレオチドに結合できるほかのポリマーから誘導される。
【００６６】
ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、骨格分子は、骨格結合ドメインを有する少なくとも１個の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合するように設定する。
【００６７】
ここで用いる用語「ドメイン」は、独特な構造および機能特性によってマークされた領域を示す。とくに、骨格結合ドメインは、他の分子に結合するようにした骨格の領域である。したがって、本発明の意味における骨格結合ドメインには、他の分子に結合する官能基および骨格に結合するほかの分子によって占領された骨格上の骨格結合領域を有する。官能基を特定したら、関連する骨格結合領域は、大きさおよびとくに付着するのに選択するほかの分子の最大径を特定するのに適切な技術で特定する。いくつかの実施形態において本発明に従ったタンパク質の平均最大径は、選択するタンパク質に依存して約１０Å〜約５０Åであり、小分子に対しては約３Å〜約１０Åであり、また、ポリヌクレオチドに対して約１０Å〜約２０Åである。分子の直径を特定するのに適切な技術には、限定することはないが、結晶化できる分子にたいするＸ線結晶学（例えば参考文献３９〜４１）および結晶化できないポリマー等の分子に対する持続長の技術（例えば参考文献４２〜４３）がある。分子直径を検出するそれらの技術は、本明細書を読む当業者によって特定できる。
【００６８】
ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、骨格結合ドメインは、互いに位置的に区別でき、したがって覆えない。
【００６９】
分子またはドメインに関してここで用いる単語「位置的に区別できる」は、分子もしくはドメインによって占領された点または範囲に基づいて区別できる分子またはドメインを示す。したがって、位置的に区別できる骨格結合ドメインは、骨格上の異なる点または範囲を占領する結合ドメインであり、それによって位置的に区別できる。
【００７０】
とくに、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、骨格分子は、少なくとも１個の結合分子に付着するようにした第１骨格結合ドメインおよびエンコードポリヌクレオチドを付着するようにした第２骨格結合ドメインを有する。
【００７１】
モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、第１骨格結合ドメインおよび第２骨格結合ドメインは、位置的に区別できる官能基および付着分子が骨格上に存在する付着できるようにする関連する骨格結合領域を特定することによって選択する。
【００７２】
化学反応性を有し骨格において存在する分子またはそれら部位（例えば官能基または制限部位）に関してここで用いる用語「存在する」は、分子またはそれら部位はこの化学反応性の検出可能な程度を維持する構造における分子または官能基の形態を意味する。したがって、骨格上に存在する分子または官能基は、適切な条件下で機能および検出できる形態における骨格において存在する分子または部位であり、１個またはそれ以上の化学反応分子またはそれら部位を化学的および／または物理的に特徴付ける。
【００７３】
したがって、本発明のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、結合分子およびエンコードポリヌクレオチドが骨格に付着するとき、結合分子は標的に結合するために存在し、エンコードポリヌクレオチドは基質ポリヌクレオチドに結合するために存在する。
【００７４】
モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において、骨格上の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドの存在は、適切な第１および第２骨格結合ドメインを有する骨格を選択することによって達成する。
【００７５】
第１骨格結合ドメインにおいて含まれる、結合分子に結合する官能基は、結合分子の化学的性質に依存し、また、本明細書を読む当業者によって特定できる。例えば、結合分子に結合する官能基には、限定することはないが、ＢｉｒＡリガーゼ（ビオチン基を所定のペプチド配列に付着させる酵素）、ホルミルグリシン生成酵素（参考文献４４における実施例で説明した再結合タンパク質内へのアルデヒド基の部位特異的導入）等の他の酵素がある。
【００７６】
第２骨格結合ドメインにおいて含まれる、ポリヌクレオチドに結合する官能基も、本明細書を読む当業者によって特定できる。ポリヌクレオチドに結合する骨格上に存在する例示的な官能基には、スルホルヒジル（例えばシステイン残基において）、第１アミンおよび従来の接合戦略を介して誘導ＤＮＡに付着し、当業者によって特定可能な他の官能基がある。
【００７７】
それらの官能基は、骨格上の内因基である（例えば、骨格タンパク質上の負のリジン残基）または、遺伝子クローニング（例えばタンパク質）、合成技術（ポリマー、小分子）等の方法および他の方法によって導入される。骨格に付着するポリヌクレオチドまたは結合分子の複製の数は、骨格上で用いることができる官能基の数に正比例する。
【００７８】
特異的な第１および第２官能基および関連する骨格結合ドメインは、実験設計の観点で選択する。通常は、骨格は、第１および第２骨格結合ドメインが直角化学物質を用いて結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに付着することができるように選択する。一連の付着化学反応が直角であると、いずれかの特定の化学反応を行うとき、官能基は、特定の化学物質が直角セット内のいずれかの化学物質と反応しない化学反応に関与および／または行う。例示的な直行化学反応には、骨格がタンパク質であるときシステインーマレイミドカップリング、アミン−ＮＨＳカップリング、およびストレプトアビジンービオチン結合があり、骨格が多糖であるとき、ＮａＩＯ４を有する異なる骨格結合ドメインにおけるＯＨ官能基の制御された酸化物がある。
【００７９】
いくつかの実施形態において、親和剤およびエンコードＤＮＡに適合する異なる骨格結合ドメインに加えて、骨格も対象の標的の環境に匹敵するように選択する（例えば、標的が細胞表面マーカーであれば水溶液において溶解する）。
【００８０】
いくつかの実施形態において、骨格は多座配位子の相互作用を介して特異的な細胞の種類に高い親和性で結合するように、およびその後それらの異なる細胞種類の空間的に方向付け多重化するようにした高分子骨格から成る。
【００８１】
とくに、いくつかの実施形態において、骨格は、モジュール式設計特性を発現する非天然分子によって提供する。それらの実施形態において、タンパク質骨格を設計して、特異的な結合分子おおびエンコードポリヌクレオチドの多くのおよび制御された数の複製を特異的な骨格ポリヌクレオチド結合ドメインで骨格に付着する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、骨格は、多くの第２骨格結合ドメインにおいて１個の標準的なエンコードポリヌクレオチド（例えばＤＮＡオリゴマー）の多くの複製の付着を可能にするまたは容易にするように設定することができる。それらの実施形態において、第２骨格結合ドメインは、基質ポリヌクレオチドで被覆した表面上で骨格を特定の点に空間的に方向付けるように用いたエンコードポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションできるように選択できる。
【００８３】
このように設計した骨格は、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤が特異的な細胞種類の空間的に選択的な分類に用いる実施形態において有効である。例えば、多くの骨格は、それぞれが異なる親和剤を有し、また、結合的に区別可能なｓｓＤＮＡオリゴマーで独特にラベル化したが、本発明の観点で当業者に明らかなように個々の部位に多くの細胞種類の混合物を空間的に分類するのと平行して抑制する。例えば、いくつかの実施形態において、ｐ／ＭＨＣと一緒にビオチン化抗体を含むモジュール式捕捉剤を親和試薬として用いるのが好ましく、それぞれ結合的に区別可能なｓｓＤＮＡオリゴマーにエンコードする。抗体は、ＣＤ４，ＣＤ８，ＣＤ３などの細胞表面マーカーに従って細胞を分類するのに用いるが、ｐ／ＭＨＣタンパク質は、ＴＣＲによって画定するように抗原特異性に従って細胞を分類する。
【００８４】
いくつかの実施形態において、骨格の所定の形態およびとくに、骨格タンパク質は、伝統的なクローニング技術または当業者によって特定可能な他の技術等の当業者に既知の技術で修正した対象の骨格の修正を通して達成できる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、骨格は特異的な捕捉剤に対して最適化することができる。とくに、特異的な捕捉剤において、最適化した骨格は、結合分子およびエンコードポリヌクレオチドを独立してカップリングするよく画定した骨格結合ドメインを有し、結合分子およびエンコードポリヌクレオチドを結合するとき、ポリヌクレオチドおよび結合分子の集合の間の起こりうる接合部分を最小化する。これは、通常、標的および基質ポリヌクレオチドに対して所定の結合親和性を有する捕捉剤に対して、結合分子および骨格に付着したエンコードポリヌクレオチドの間の骨格重複を最小化することによって達成するが、標的および基質ポリヌクレオチドに対する捕捉剤の所定の結合親和性を維持する。
【００８６】
参考文献は、本発明に従ったモジュール式捕捉剤の異なる形態を示す図１および２に対して用いた。とくに、図１および２の説明において、骨格ドメイン、結合分子ドメイン（タンパク質結合剤ドメイン）およびポリヌクレオチドドメイン（ＤＮＡドメイン）を概略的に示す。すでに上述したように、ここで用いる用語「ドメイン」は、異なる構造的および機能的特定によってマークされた領域である。したがって、骨格分子。結合分子およびに関する用語「ドメイン」は、特定の温度で捕捉剤において結合した分子（骨格分子、結合分子、ポリヌクレオチド）の配座によって画定した特別な領域を示す。特定の分子のドメインは、Ｘ線結晶学、サイズ排除クロマトグラフィー、質量分析、ゲル電気泳動および当業者によって特定可能なほかの技術等の、他の分子の大きさおよびとくに三次元構造を特定するのに適切な技術によって画定する。
【００８７】
特定の捕捉剤に対して最適化した骨格において、骨格結合ドメインは、骨格上の結合分子ドメインおよびポリヌクレオチドの間の重複を最小化するように選択し、捕捉剤への所定の結合親和性を提供する。
【００８８】
いくつかの実施形態において、最適化した骨格は、骨格上のすべて利用できる位置的に区別可能な骨格結合ドメイン上のその結果できた捕捉剤の所定の結合親和性に関連する結合分子およびエンコードポリヌクレオチドを提供する。一方、いくつかの実施形態において、最適化していない骨格は、付着した結合分子およびエンコードポリヌクレオチドの数が、骨格上で用いることができる部位の全数に一致しない。例えば、骨格が結合タンパク質に付着する４部位およびＤＮＡに付着する３部位を有すれば、最適化していない骨格は、モル過剰の大きさに関わらず骨格１個に対して4未満の結合タンパク質および３未満を有することができる。骨格ごとの結合分子および／またはポリヌクレオチドのこの存在（または非存在）は測定できる（例えば図８参照）。捕捉剤はまた、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリ、ＳＰＲなどの伝統的な分析で試験して捕捉剤の効果を測定できる。
【００８９】
特異的な捕捉剤において、骨格はまた２個の部位（すなわち、結合分子およびエンコードポリヌクレオチド）に対する積分点として骨格機能を最適化するように修正できるが、これらの部位に結合する骨格ドメインの間のいずれかの起こりうる相互作用を最小化し、その結果付着した部位の機能効果が低下する。低下した機能効果は、立体障害（結合分子およびエンコードポリヌクレオチドの間の重複領域）により、骨格上の付着領域の不可逆的な修正は、カップリング化学の性質による。最適化していない骨格（天然ＳＡ）および最適化した骨格（システインＳＡ）を有するＴ細胞効果の比較は、実施例４〜６および図７〜９において説明する。
【００９０】
したがって、特定の結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに結合する特定の骨格分子は、結合分子およびエンコードポリヌクレオチドを結合する骨格結合ドメインを特定することによってそれらの結合分子およびエンコードポリヌクレオチドに対して最適化し、また、骨格分子の残っている部分を修正して骨格上の骨格結合ドメインを整備し、結合分子およびエンコードポリヌクレオチドの間の相互作用を最小化する。このようにして、特定の骨格分子の最適化した変形を誘導することができる。
【００９１】
いくつかの実施形態において、骨格はタンパク質である。とくにいくつかの実施形態において、タンパク質骨格は、結合分子に対して特異的に結合できる官能基をすでに含むように提供する。例えば、ストレプトアビジンは、ビオチンに対するその天然の親和性のために良い骨格タンパク質であり、ビオチン化ｐ／ＭＨＣ分子に対する特異性を与える。歩アノ実施例はタンパク質Ａ／Ｇである。これらのタンパク質は、抗体のＦｃ領域に対する天然の親和性を有し、後者は結合タンパク質として用いる。これは、天然の特性がないタンパク質骨格よりも有利であり、この場合、結合タンパク質およびエンコードポリヌクレオチドをカップリングする２個の化学的に直角な処理を導入する必要がある。ほとんどのタンパク質は、大きさおよび配列長さの狭い範囲内にあるため（すなわち溶解度および修飾するのに利用可能な多くの部位等の特性）、いずれのタンパク質も骨格分子として用いることができると期待できる。とくに、生体接合に対して用いる条件において安定であるタンパク質は、とくに骨格として安定であると期待される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、骨格タンパク質はストレプトアビジン（ＳＡまたはＳａ）によって形成される。ストレプトアビジンは、配列HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGH  DTFTKVKPSAAS  （配列番号１）を有するバクテリアＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ  ａｖｉｓｉｎｉｔからの四量体タンパク質である。ＳＡは、その天然配位子ビオチン（Ｋｄ−１０−１５ｍｏｌ／Ｌ）に対して四面体的に配置した、非常に高い親和性および２個の独特の結合部位を有する。ストレプトアビジンのビオチンに対するモル結合能力は、４：１＝ビオチン：ＳＡである。ＳＡは、結合分子に特異的に結合しないが（例えばビオチン相互作用を介する）、代案のカップリング方法をＳＡに結合単位を結合させるのに用いる実施形態は、ビオチンに対してＳＡは４分の１の価数および強い相互作用を有する。特異的には、ＳＡが骨格であるいくつかの実施形態において、Ｃ末端部位は、タンパク質のＮ末端部位上のビオチンに対する結合ポケットの位置の観点からエンコードポリヌクレオチドの付着する部位として選択する。
【００９３】
したがって、骨格タンパク質がストレプトアビジンであるいくつかの実施形態において、結合分子（例えばＭＨＣ分子）は、ビオチン化でき、四量体をタンパク質−配位子対ＳＡと組み立てることができる。いくつかの実施形態において、結合分子はまた、共有結合を介してＳＡとカップリングでき（アミドカップリング等）、これによって、ビオチン−ＳＡ相互作用を介する必要がなくなる。当業者は、選択した実験設計に基づいた最も適切な結合を特定することができる。本発明のいくつかの実施形態において、ＳＡは、四量体にｐ／ＭＨＣを組み込むのに用いる標準的な骨格として用いる。
【００９４】
骨格がＳＡである実施形態において、修飾したＳＡは、それから由来した分子としても用いることができる（とくにＳＡ−フィコビリタンパク質（ＰＥまたはＡＰＣ）複合体）。いくつかの実施形態において、骨格は、蛍光ｐ／ＭＨＣ四量体準備に対するＳＡ再結合突然変異体である骨格を用いることができる。それらの実施形態のうちいくつかにおいて、ＳＡ変異体は、例えばその場所でビオチン結合ポケットから除去した、カルボキシ末端でのシステイン残基を組み込んだ変異体を用いることができる。それらの実施形態において、システイン反応性マレイミド誘導体の複合体は、システイン残基は天然ＳＡに存在しないためＣ末端に限定される。
【００９５】
より特別には、いくつかの実施形態において、ストレプトアビジン−システイン（ＳＡＣ）と呼ぶ、最適化したストレプトアビジンは、Ｃ末端でいくつかの外因的なアミノ酸を有するものを用いることができる。これらの残基は、誘導体化したＤＮＡ（またはいずれかの他のマレイミド−誘導化分子）をカップリングできるシステインアミノ酸を有する。ＳＡＣ骨格は、配列HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGH  DTFTKVGGSGCP（配列番号２）を有する。
【００９６】
本発明において、参考文献をＳＡおよびＳＡＣ骨格に対してしばしば用いる。当業者は、本明細書にＳＡおよびＳＡＣではなく骨格および最適化した骨格を適用することができ、また、実施例の章によって提供されるガイダンスを参照することができる。とくに付加的な骨格タンパク質には、限定することはないが、タンパク質Ａ／Ｇ、分岐ペプチド、ＮＨＣエステルＰＥＧ−マレイミド等の小分子およびそれらの最適化した変異体がある。
【００９７】
所定の標的および予め選択した結合分子を与えたさらなる骨格および最適化した骨格は、以下のアプローチを用いて誘導し，（ａ）第１カップリング化学物質を選択して骨格に予め選択した結合分子を付着し、第２カップリング化学物質を選択して骨格にポリヌクレオチドを付着させるステップと（例えばＮＨＳ−アミンおよびチオールマレイミド化学物質）、（ｂ）候補の骨格構造を選択して、その結果できた捕捉剤の価数および極性を考察するステップと（例えば、価数を増加させるために分岐したペプチドを用いる、結合タンパク質間に空間をつくるためにグリシン−セリン伸展を用いる）、（ｃ）ポリヌクレオチドおよび結合分子を候補の骨格構造にカップリングさせて候補の捕捉剤を提供するステップと、（ｄ）経験的および随意的に所定の標的を特異的に結合させる候補の捕捉剤を試験するステップと、（ｅ）所定の標的への捕捉剤の結合親和性および／または特異性を増加させる必要があればもしくは望ましければいくつかまたはすべてのステップを反復する。最適化が望ましければ、候補の骨格を選択するステップは、予め選択した結合分子およびポリヌクレオチド間の重複を減少、とくに最小化するために骨格を修正するステップを行う、または有する。
【００９８】
ここで用いる用語「エンコードポリヌクレオチド」は、ここで説明するモジュール式捕捉剤の骨格に付着し、基質に付着した基質ポリヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態において、第１標的に特異的なモジュール式捕捉剤をエンコードするエンコードポリヌクレオチドは、とくに、第１標的が第２標的と異なるとき、第２標的に特異的な捕捉剤をエンコードするエンコードポリヌクレオチドから結合的に区別可能である。
【００９９】
分子に関してここで用いる単語「結合的に区別可能な」は、特異的な分子に特異的に結合することができるそれらの能力に基づいて区別でき、したがって特異的な分子と相補的であると画定できる分子を示す。したがって、第１分子が第３分子と特異的に結合し第３分子と相補的であると画定でき、第２分子が第４分子と特異的に結合し第４分子と相互的であると画定でき、第４分子が第３分子と区別できれば、第１分子は第２分子と結合的に区別できる。したがって、第１エンコードポリヌクレオチドが第１基質ポリヌクレオチドと特異的に結合し（相補的であると画定でき）、第２エンコードポリヌクレオチドが第２基質ポリヌクレオチドと特異的に結合し（相互的であると画定でき）、第１基質ポリヌクレオチドが第２基質ポリヌクレオチドと区別できれば、第１および第２エンコードポリヌクレオチドは結合的に区別できる。
【０１００】
ここで説明するアレイ基質、方法およびシステムのいくつかの実施形態において、各基質ポリヌクレオチドおよびエンコードポリヌクレオチドは、互いに結合的に区別できる。ここで説明する方法およびシステムのいくつかの実施形態において、基質の各基質ポリヌクレオチドは、特異な配列であり互いに位置的に区別可能である。
【０１０１】
すでに上述したように、分子に関してここで用いる単語「位置的に区別可能な」は、分子によって占領された点または範囲に基づいて区別できる分子を示す。したがって、位置的に区別可能な基質ポリヌクレオチドは、基質上の異なる点および範囲を占領し、位置的に区別可能な基質ポリヌクレオチドである。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、エンコードポリヌクレオチドは、１個またはそれ以上の制限酵素に対して１個またはそれ以上の制限酵素認識部位を有する。単語「制限酵素認識部位」は、制限酵素によって認識されるヌクレオチドの特異的な配列を示す。単語「制限酵素」は、制限酵素認識部位として既知の特異的な認識のヌクレオチド配列での二本鎖または一本鎖のＤＮＡを切断するいずれかの酵素を示す。ここで説明するエンコードポリヌクレオチドにおいて含まれる例示的な制限酵素認識部位は、ＥｃｏＲＩ  ＢａｍＨＩ，Ｎｄｅｌおよび当業者に特定できる他の酵素等に対する６塩基制限酵素認識部位がある。さらなる例示的な制限酵素認識部位には、限定することはないが、Ａｖａｌ，ＢｇＩＩＩ，ＤｒａｌＩ，ＥｃｏＲＶおよび参考文献４５において開示されたさらなる制限酵素認識部位があり、全体に参照として組み込む。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、骨格は、結合的に区別できる捕捉剤間でそれ自体互換性があり、１個の骨格は、異なるモジュール式捕捉剤の構築において用いることができる。さらに、骨格は、一連の改良および最適化をすることができる。いくつかの実施形態において、骨格および少なくとも１個の結合分子も結合的に区別できる。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、骨格は、図１（上部パネル）の概略図において示すように放射相称を持たず、図１（下部パネル）および図２（上部右側パネル）の概略図において示すような対称の捕捉剤、または図２（上部左側パネル）の概略図において示すような疑似極性捕捉剤を有する極性の捕捉剤を提供するように設計する。
【０１０５】
とくに、極性捕捉剤は、結合分子ドメイン、骨格ドメインおよびエンコードポリヌクレオチドの重複を最小化する捕捉剤である。疑似極性捕捉剤は、結合分子ドメインおよびエンコードポリヌクレオチドドメインの小部分が互いにおよび骨格ドメインと重複する。合成捕捉剤において、すべての結合分子およびエンコードポリヌクレオチドドメインは、ある程度重複する。各極性捕捉剤、疑似極性捕捉剤および合成捕捉剤において、骨格は結合分子ドメイン、骨格分子ドメインおよびポリヌクレオチドドメインの間の特異的な捕捉剤内の重複を最小化するように最適化する。この最小化は、極性捕捉剤に対して最大である。
【０１０６】
したがって、いくつかの実施形態において、完全に組み立てた、極性のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、非極性捕捉剤に関して高い親和性を有することが期待され、極性捕捉剤において結合分子は対象の標的と自由に相互作用し、またエンコードポリヌクレオチドは、基質上にプリントされたｃＤＮＡと自由に相互作用する。出願人は、約「１８０度転換」の構築の結果フローサイトメトリによってアクセスされて細胞表面マーカーが染色されることが実証された。
【０１０７】
とくに、出願人は、１本のＤＮＡ鎖（蛍光標識した）をＳＡＣごとに付着するようにＳＡＣ−ＤＮＡ構築物を生産した。この部分は、ＭＨＣ捕捉タンパク質（結合ドメイン）が容易に骨格に分配できるため疑似極性であるが、ＤＮＡドメインは特異である（したがって、構築物の残部と比較して極性である）（以下参照）。この構築物は、放射相称の構築物と直接比較すると、細胞表面受容体より良く結合する（１７８対１５３平均強度）（図２下部パネル参照）。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、関連するエンコードポリヌクレオチドを有する単一骨格は、単一骨格を有する結合構造のライブラリを対にすることによって結合構造のライブラリを繰り返し用いることができる。それらの実施形態は、同じ骨格（ＳＡＣ−Ａ´）をＭＡＲＴ−１，ＯＶＡ，Ｐｍｅｌ，チロシナーゼ、およびＣＭＶに対して特異的なＮＡＣＳ捕捉剤として用いた図５，６，９，１２Ａ，Ｂ，１３Ｂ，１５ＡＢ，１６，１９，２２における実施例５，８，９および１０において説明する。それらの実施形態において、システムのモジュール方式および交換能力がある。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ここで説明するポリヌクレオチドエンコード捕捉剤およびとくに、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、結合分子を骨格にカップリングさせるのに用いる様々な長さのリンカーを有する。ここで用いる用語「リンカー」は、骨格を結合分子トカップリングさせるまたは接続するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤において含まれる分子を示す。リンカーは、それを含む捕捉剤の骨格および結合分子と反応するいずれかの化学分子から由来する。例示的なリンカーには、限定することはないが、ペプチド（例えば１０ｍｅｒ）、核酸、ポリマー（ポリエチレングリコール）および炭素鎖がある。リンカーの長さは、技術知見を有する読者から明らかである、従来の化学方法によって制御する。リンカーは、当該技術の読者に明らかである従来の生体接合方法で付着することができる。
【０１１０】
それらの実施形態において、リンカーの含有物は、対象の標的と適切な相互作用する結合タンパク質の自由度を増加させることが期待される。これは、適切な空間方向が高い親和性の相互作用に関して重要である特定のドメインにおいて標的が固定または限定されたとき（例えば、細胞膜に限定された標的細胞表面）相互作用の強度を増加させることが期待される。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、リンカーはまた、結合分子および含まれるエンコードポリヌクレオチドの間のスペーサとして機能し、結合分子ドメインおよびポリヌクレオチドドメインが互いに干渉しないようにする。例示的なリンカーには、限定することはないが、５０Ｄａ〜５０００Ｄａの大きさの分子がある。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、さらに以下で議論するリンカーは、制御された刺激の観点において配座を変化させる従来のリンカーである。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、標的に対する捕捉剤の親和性は、多くの結合単位が１個の骨格にカップリングすることによって増加する。捕捉剤の価数の増加は、互いに隣り合うものが結合するときに参入するために集合錯体の親和性を改良し、実施例５および図７，８および９において説明するように、正味の影響が標的のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤をの全体の関係性において増加する。これは、とくに、モノマーとして標的細胞に対して弱い親和性を有することによって特徴づけられるが、マルチマーにおいて束ねるときに親和性を増加させるＭＨＣ等の結合分子に関連がある。
【０１１４】
結合分子が低い親和結合タンパク質によって形成される実施形態において、標的に対する捕捉剤の高い親和性は、標的に効率的に結合するのに必要である。分子配座の就職に関する親和性の変化は、それぞれの相補的な標的へのポリヌクレオチドエンコード分子の相互作用を時間的に制御されるように利用される。例えば、いくつかの細胞表面受容体は、相補的な配位子を結合するときに細胞活性を制御する機能を有する（受容体が特異的である分子）。この活性は、配位子が受容体に結合しないときに逆になるまたは回復する。したがって、結合分子の骨格からの分離および多価の性質を利用することによって、従来のリンカーを用いることによって結合を制御することができる−リンカーは、外因性の外部刺激に応じて構造変化をし、その結果、捕捉剤の結合親和性のために親和性が減少する−また、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤のその後の不活性により標的に結合したままとなる。従来のリンカーの実施例は、Ｗ光に露呈したときに破壊するＷ不安定塩基を組み込んだペプチドまたは核酸である。実際のこの実施例は、Ｗ不安定ペプチドリンカーを介してＳＡＣ−ＤＮＡ骨格にカップリングしたｐ／ＭＨＣタンパク質を用いる。Ｔ細胞受容体に結合するとき捕捉剤は、標的細胞を活性化する。ポリヌクレオチドエンコードｐ／ＭＨＣ捕捉剤は、その後Ｗ光に露呈することによって所定の時間後に除去できる。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、ここで説明するポリヌクレオチドエンコード捕捉剤には、互いに結合的に区別可能な多重結合分子がある。それらの実施形態において、多座配位子エンコード捕捉剤は、同時に多くの標的を調べるのに用いることができる。これは、活性の上昇（上述したように）は、複合体の親和性が個々の結合タンパク質の親和性よりも高いこのシステムに等しく適用するため、標的が細胞表面上のようにドメイン内に組み込まれているときに最も有利である。多座配位子エンコード捕捉剤の実施例には、各タンパク質が異なるペプチド配列から成るｐ／ＭＨＣ複合体がある。他の組み合わせは、Ａｂ  Ａｂ，Ａｂペプチド、Ａｂアパタマー、ペプチドアプタマー、および本発明を読む当業者によって特定可能なさらなる分子等がある。
【０１１６】
ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、当業者に特定可能な手順に従った特異的な捕捉および実験設計の観点から単位を結合することによって製造することができる。例えば、結合分子が骨格に特異的に結合する実施形態において、エンコードポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）は、結合分子（例えばＭＨＣ）を組み込む前に骨格（例えばＳＡＣ）に最初にカップリングされる。他の実施形態において、結合分子が骨格に特異的に結合しない、結合単位は共有結合的に付着する必要がある。これは、ポリヌクレオチドの骨格への付着前後のいずれかで起こる。ここで説明するモジュール式捕捉剤を他の骨格および結合分子に組み込むさらなる手順は、当該技術の読者に容易に特定できる。それらの手順は、結合タンパク質単位の特異性がポリヌクレオチド配列によって独特にエンコードされる必要がある限り、試薬を組み込む順序に関わらずここで説明する捕捉剤を組み込むのに適切である。
【０１１７】
骨格がストレプトアビジンである、いくつかの実施形態において、モジュール式ポリヌクレオチドエンコードタンパク質は、ビオチン化ＭＨＣ分子を市販のストレプトアビジン（ＳＡ）と通常４：１の割合で酵素的に混合することによって準備し、ストレプトアビジンは通常、蛍光染色分子に接合する。フローサイトメトリに基づいた細胞分類に対してＭＨＣ四量体を改善することに焦点を当てたこの手順の種類は、当業者によって特定できる。
【０１１８】
例えば、いくつかの実施形態において、結合タンパク質は、タンパク質−配位子相互作用（ストレプトアビジン  ビオチン）、タンパク質−タンパク質相互作用（Ｆｃドメインおよびタンパク質Ａ／Ｇ）、または生体接合方法（アミンカップリング、スルヒルジルカップリングなど）を介して接着する。結合分子がＭＨＣであるいくつかの実施形態において、ＭＨＣはＣ末端でビオチン化する。骨格がＳＡＣであるいくつかの実施形態において、ＳＡＣはＣ末端でＤＮＡ修飾する。いくつかの実施形態において、全単位はビオチン−ＭＨＣをＳＡＣ−ＤＮＡでいっぱいにすることによって組み込み、ＳＡＣはビオチンを介して４ＭＨＣタンパク質分子と特異的に結合する。
【０１１９】
エンコードポリヌクレオチドのここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤との接合は、結合するタンパク質における１級アミンの存在に依存する技術がある化学的架橋結合等の一般的な生体接合方法で生成する。とくに、ポリヌクレオチドエンコードタンパク質は、全体に参照して組み込むＰＣＴ特許ＷＯ２００８／０１６６８０号明細書において説明されたもの等の共有結合接合方法によって生成する。とくに、化学的接合は、骨格タンパク質およびポリヌクレオチド間の共有結合を生成するのに用いて、それらには、ＮＨＳ−アミンカップリング、チオール−チオールカップリング、チオール−マレイミドカップリング、ヒドラジド−アルデヒドカップリングなどがある。これらの生体接合方法は、当該技術の当業者によって証明される。
【０１２０】
特定のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤と接合するエンコードポリヌクレオチドの数は様々である。とくに、タンパク質部位に付着したポリヌクレオチドの数は、大きさおよびそれによって懸垂部分の立体障害を最小化するように調節するが、結合特異性を維持する。最適化は、全体に参照して組み込むＰＣＴ特許ＷＯ２００８／０１６６８０号明細書において説明された手順の方法によって行う（とくに図３および実施例３参照）。それらの実施形態において、捕捉剤の最適化は、捕捉剤の最適化を化学的に進行する（すなわち捕捉剤（例えば抗体）との小分子の化学量論的反応量を変化させる）。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、各タンパク質に付着するエンコードポリヌクレオチドの数は１〜６または６より大きいいずれかとする。いくつかの実施形態において、細胞分類等は、骨格ごとに１〜４個のエンコードポリヌクレオチドを付着すると、標識化の立体効果を最小化するさらなる利点を与え、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を相補的な基質ポリヌクレオチドと高親和性でハイブリダイゼーションする複数のエンコードポリヌクレオチドで標識化することができる。
【０１２２】
懸垂部分を形成するポリヌクレオチドの長さも、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の基質への結合を最適化する様に制御する。とくに、エンコードポリヌクレオチドの長さは、直交化させるために最適化する。それらの実施形態において、エンコード領域は２０ｍｅｒ認識配列を有する。これらは、全体に参照して組み込むＰＣＴ特許ＷＯ２００８／０１６６８０号明細書において説明された手順の方法に従ってコンピュータ内で生成した。とくに、実施例において説明する制限酵素認識部位を有する配列は、全体に参照して組み込むＰＣＴ特許ＷＯ２００８／０１６６８０号明細書において説明された手順の方法に従って最初に生成した配列に６塩基の切断部位を加えることによって生成した。
【０１２３】
基質ポリヌクレオチドは、当該技術において既知の技術によって生成する。例えば、まずポリヌクレオチドは化学的に合成する。ポリヌクレオチドは、その後ＳｔａｎｆｏｒｄのＰａｔ  Ｂｒｏｗｎによって概要が説明されたパラダイムに従って固定する［参考文献４６］。そのように生成した基質ポリヌクレオチドは、その後、本発明を読む当業者によって特定可能な技術に従って基質に付着する。とくに、基質ポリヌクレオチドの生成に適切なポリヌクレオチドは、ポリリジン基質上に少なくとも７５ｍｅｒを有する。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、エンコードポリヌクレオチドおよび／または基質ポリヌクレオチドを直交化して、エンコードポリヌクレオチドおよび基質ポリヌクレオチドの間の非特異的結合を最小化する。したがって、直交化したポリヌクレオチドには、配列が計算的に生成して不完全な塩基対、準安定状態および／または他の第２構造を最小化して、ポリヌクレオチド間の非特異的な相互作用および関連配列の乱雑な生成に通常関連するポリヌクレオチドにおける非線形第２相互作用を最小化する、ポリヌクレオチドがある。
【０１２５】
一連のポリヌクレオチドが計算的に生成するプロセスに関してここで用いる用語「直交化」は、不完全な塩基対、準安定状態および他の第２構造が最小化して、ポリヌクレオチドはその相互的ならせん構造にのみ結合し他には結合しない。本発明において用いる例示的な直交化技術には、全体に参照して組み込むＤｉｒｋｓらによって概論が説明されたパラダイム［参考文献４７］に従って行う直交化がある。
【０１２６】
とくに、いくつかの実施形態において、エンコードポリヌクレオチドおよび関連する相補的な基質ポリヌクレオチドは、実施例６および図５，６，９−１３，１５，１７，１９，２２において詳細を説明するポリヌクレオチドＡ，ＢおよびＣおよび実施例７および図１６において説明するポリヌクレオチドＡＥｃｏＲＩ．ＢＢａｍＨＩ等のポリヌクレオチドを直交化する。
【０１２７】
さらに直交化したポリヌクレオチドは、さらに、本明細書を読む当業者に明らかな手順に従ったポリヌクレオチドのコンピュータ内直交化（すなわち計算した直交化）等の方法および手順によって特定する。
【０１２８】
結合分子としてＭＨＣを用いるここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、全体に参照して組み込む［参考文献３３］において広く説明された手順を用いて製造する。この手順に従って、ｐ／ＭＨＣタンパク質分子のライブラリは、制御された刺激を通して就職可能な犠牲ペプチドを最初に合成することによって生成する。例えば、いくつかの実施形態において、この犠牲ペプチドはニトロ−フェニル側鎖を有する非天然アミノ酸を含む。この官能基は、Ｗ不安定であり；Ｗが存在すると、犠牲ペプチドは２個の小ペプチドに開裂する。したがって、犠牲ペプチドを与えるｐ／ＭＨＣを生成し、全複合体をＷ光に露呈することができるが、後者は過剰モルの交換ペプチドを含む溶液において行う。Ｗ光上で、犠牲ペプチドは２個に開裂し、全長交換ペプチドを置換し、ＭＨＣは高い親和性を有する。ペプチドのライブラリを用いることによって、１つのＵＶ交換ステップにおいて大きなｐ／ＭＨＣライブラリを生成することができる。
【０１２９】
ここで説明する方法およびシステムは、モノ−パラメータ分析および多パラメータ分析等の標的の検出分析を行うために使用し、これらすべては多重分析として行うことができる。
【０１３０】
ここで用いる用語「モノパラメータ」は、１個の標的の存在、非存在または量を画定するのに行う分析を示す。用語「マルチパラメータ」は、複数の標的の存在、非存在または量を画定するのに行う分析を示す。用語「多重」または「多重化」分析は、例えば多重分析の検体の刺激分析等の多重分析反応が１個の反応チャンバにおいて行われるおよび／または単一に分離して検出フォーマットで分析する分析を示す。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、ここで説明する方法およびシステムは、有利には、検出する標的が予め画定した疾患に関連する予め画定したバイオマーカーである診断分析をするのに用いることができる。それらの実施形態は、とくに、異なる生体材料および生体分子を一般的に不均一の組織サンプルの異なる領域からそれぞれ測定し、定量するのが難しい不可避のノイズ源を導く診断アプローチにおいて有利である。
【０１３２】
ここで説明する方法およびシステムのいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および基質ポリヌクレオチドは図３，４，１２において概略的に示したように組み合わせて用いる。
【０１３３】
図３，４，２１において示した実施形態において、タンパク質アレイからのここで説明したポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、サンプルにおいて標的を検出するために標的に接触させる。図３，４，２１の実施形態は、タンパク質標的を検出および／または分類するのにとくに有利である。
【０１３４】
さらなる実施形態において、細胞標的を検出および／または分類するのにとくに適切である、いくつかのまたはすべてのモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード抗体を相補的な基質ポリヌクレオチドに接触させる前に、サンプルに接触させる。それらのさらなる実施形態において、抗体および１個またはそれ以上の関連する標的は、基質が存在しない、例えば溶液相において結合し、両分子は、完全に方向的に自由であり、親和剤の結合部位に対する標的のアクセスは、基質によって害することがない。さらに、行う分析の感度および特異性は、当該技術の関連する方法およびシステムと比較して、基質に結合したモジュール式ポリヌクレオチドエンコード標的複合体の検出能も改善する。いくつかの上述の利点を示す例示的な実施形態は、図１２および図１７において示す。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、多くの細胞種類は、骨格が異なるポリヌクレオチドでエンコードするようにカップリングするタンパク質結合剤のライブラリを用いることによってアレイ上で分類して、それぞれの異なるタンパク質結合剤の特異性は、異なるＤＮＡ配列でエンコードする。実際に行うこのアプローチの実施例は、実施例８〜１１および図５ｂ，１２ｂ，１５ｂ，１６において示す。
【０１３６】
ここで説明する方法およびシステムのいくつかの実施形態において、基質に結合するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード標的複合体は最終的に基質から検出する。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、複合体の検出は、標識化した分子を提供することによって行い、それらには、検出するモジュール式ポリヌクレオチドエンコードタンパク質標的複合体に特異的に結合するいずれかの分子（例えば、抗体、アパタマー、ペプチドなど）および標識化シグナル、分子に付着する標識化化合物を提供する標識がある。標識化した分子は、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤複合体に接触し、基質上のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤複合体に結合した標識化合物からの標識化シグナルは、本発明、とくに実施例の章を読む当業者によって特定可能な手順に従って検出する。
【０１３８】
１個またはそれ以上の標的および／または複数の標的を以下で詳細に説明するように検出する実施形態において、標識化分子は、複数の標識化分子からなる。それぞれの標識化分子は、１個またはそれ以上の標的／複数の標的のうち１個の標的を特異的に結合する分子および分子に付着した標識化合物があり、標識化合物は標識化シグナルを提供し、それぞれの標識化分子は他のものから検出的に区別できる。
【０１３９】
標識化分子に関してここで用いる単語「検出的に区別できる」は、分子に付着した標識化合物によって与えられた標識化シグナルの材料に基づいて検出可能な分子を示す。検出的に区別可能な標識化分子を提供するのに用いることができる例示的な標識化合物には、限定することはないが、放射性同位体、フルオロフォア（蛍光色素分子）、化学発光染色、発色団、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、染色、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、配位子（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテン）および本発明を読む当業者によって特定可能なさらなる化合物がある。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、複数の標識化分子は、複数のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を複数の標識化分子に結合させることができる時間および条件で複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体に接触させる。標識化シグナルは、その後、基質上の複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体に結合する複数の標識化分子から検出する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、検出方法は、蛍光ベースの読み出しを介して行い、標識化抗体は、限定することはないが、小分子染色、タンパク質発色団、量子ドットおよび金ナノ粒子等のフルオロフォアで標識化する。とくに、いくつかの実施形態において、ここで説明するいずれの方法およびシステムにおいて、検出は、一般的な写真現像液がさらに以下で説明するように金ナノ粒子を増幅することができる金ナノ粒子標識化二次検出システム上で行う。また、読み出しが金粒子の暗場散乱から行われるとき、単一分子デジタルプロテオームができる。さらなる技術は、本発明を読む当業者によって特定でき、詳細はさらに説明しない。
【０１４２】
複合体または分子の成分としてここで示す用語「標識化分子」は、限定することはないが、放射性同位体、フルオロフォア（蛍光色素分子）、化学発光染色、発色団、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、染色、金属イオン、ナノ粒子、金属ゾル、配位子（ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテン）およびそのようなものがある、検出できる分子を示す。用語「フルオロフォア」は、検出可能な画像において蛍光を示すことができるそれらの基質または部位を示す。結果として、ここで用いる単語「標識化シグナル」は、限定することはないが、放射能、蛍光、化学発光、酵素反応の結果における化合物の生成などがある標識の検出ができる標識から出たシグナルを示す。とくに金ナノ粒子は、検出複合体を金ナノ粒子に結合するサンドウィッチ式検出分析において用いることができる。これは、検出細胞が伝統的な顕微鏡技術を用いて簡単に行うように、タンパク質、ペプチドなどの小分子の検出において明らかである。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、１個の特異的な標的を検出する。それらの実施形態において、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の標的への接触は、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を基質に接触させる前または後に行う。とくに、モジュール式捕捉剤を形成する単位は、単一の反応混合物において接触する。しかし、このアプローチは、骨格および結合分子および骨格およびエンコードポリヌクレオチド（通常すでに特異的である）間の結合特異性を必要とする。
【０１４４】
モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の標的への接触を、モジュール式ポリヌクレオチドエンコードタンパク質を基質に接触させる前に行う実施形態は、とくに細胞を分類または検出するのに適切である。このアプローチは、実施例１２および図１７において説明する。
【０１４５】
モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の標的への接触を、モジュール式ポリヌクレオチドエンコードタンパク質を基質に接触させる後に行う実施形態は、とくに高感度のタンパク質を分類または検出するのに適切である。
【０１４６】
ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の標的への接触を、ポリヌクレオチドエンコードタンパク質を基質に接触させる後に行う例示的な実施形態は、実施例３，７，８，９，１０，１１において説明し、図５〜６，９〜１３，１５〜１６，１９，２２において示す。それらの実施形態において、標的に結合したポリヌクレオチドエンコードタンパク質および標的に結合していないポリヌクレオチドエンコードタンパク質の間の同じ特異的基質ポリヌクレオチドの競争が減少して、分析の感度が結果として増加する。さらに、それらの実施形態において、基質上のポリヌクレオチドの濃度を最適化して、高濃度のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を基質に結合させて、逆にその結果正しく組み込んだ複合体が高濃度となり、逆に、各結合を決める平衡熱力学によって全検出感度が高くなる。
【０１４７】
図５ａ、６，９−１１，１２Ａｃ，１３ｂ，１５ａｂ，１７ｂ，１９，２２および実施例１，７−１０において説明した方法およびシステムで行うモノパラメータ分析には、限定することはないが、血清における単一マーカーに対する検出、生体サンプルにおける単一タンパク質検出、１個の表面マーカーに従った細胞分類に対するいずれかの分析、および本明細書を読む当業者によって特定可能な更なる分析がある。
【０１４８】
とくに、モノパラメータ分析は、サンプルＣＤ８細胞、ＣＤ４細胞または抗原特異性Ｔ細胞（すなわち、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によってもう片方から区別可能な細胞で、それらに抗原特異性を与える）における検出を行う。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、複数の標的の検出は、実施例３，８，１０および１１および図３−６，１２ｂ，１５ｂ，１６，２２において概略的に示される方法によって行う。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、複数の結合的に区別可能なおよび位置的に区別可能なモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤から成るタンパク質アレイを生成する。それらの実施形態は、高感度で異なるタンパク質−標的を分類および／または検出するのにとくに有利である。
【０１５１】
更なる実施形態において、複数のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、基質ポリヌクレオチドに接触する前に関連する標的を検出するためにサンプルに接触させる。それらの実施形態において、ここで説明する方法およびシステムは、基質がないときに結合タンパク質および標的に関連する改良した感度および選択性のために、また減少した生物付着およびタンパク質変性の観点において、多数のバイオマーカーを定量的および／または定性的に効果的に検出する多重マルチパラメータ分析を行うのに用いることができる。
【０１５２】
実施例３，８−１１において説明し図３−６，１２ｂ，１５ｂ，１６，２２において示す方法およびシステムで行うことができるマルチパラメータ分析には、限定することはないが、いずれかのタンパク質分析、組織分析、血清診断、バイオマーカー、血清プロファイル、マルチパラメータ細胞分類、単一細胞研究、および本明細書を読む当業者によって特定可能な更なる分析がある。
【０１５３】
それらの実施形態のうちいくつかにおいて、マルチパラメータ分析は、多重検出アプローチでサンプルＣＤ８細胞、ＣＤ４細胞および抗原特異的Ｔ細胞における検出することができる。
【０１５４】
複数の標的が異なる種類の細胞から成る方法およびシステムの実施形態は、細胞が下部の基質上にプリントした表面マーカー特異的抗体と相互作用するパニング当の当該技術の関連する方法およびシステムよりとくに有利である［参考文献４８］。とくに、基質上の細胞捕捉の効果は、当該技術の方法およびシステムに関して改良するが、これは、パニングすると捕捉抗体の四量体構造を一般的に誘導化された基質に吸収／共有結合的に付着することによって有害におよび不可逆的にダメージを受けるためである。この結果、実施例７において説明し図１０および１１において示すようにＮＡＣＳと比較して反応性が低い表面となる。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、細胞分類アプローチにおいて用いる。
【０１５６】
実施例１〜１１において説明し図３〜１３，１５〜１７，１９，２１，２２において示した方法およびシステムで実行可能な標的を分類する分析には、混合物における特定の標的（限定することはないが、細胞標的、タンパク質−標的または遺伝子標的）の検出を必要とする分析があり、これは本明細書を読む当業者によって特定可能である。
【０１５７】
とくに、ここで説明する方法およびシステムは、細胞種類の複合体混合物内で少なくとも１：１０００希釈液から特異的な細胞種類の多重分類を行うことができる。珍しい細胞のこの分類は、細胞特異的な親和剤が比較的弱い結合親和性を示すときでさえもできる。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、捕捉剤をエンコードするために用いるポリヌクレオチド（例えばＤＮＡオリゴマー）は、相互的な制限エンドヌクレアーゼが解裂できる（解放可能なポリヌクレオチド捕捉剤も）異なる制限酵素部位を有するように設計する。
【０１５９】
とくに、制限酵素部位は、異なる制限酵素が結合的に区別可能な捕捉剤上で異なるＤＮＡ配列を認識できるように含まれる。したがって、複数の異なる制限酵素を用いることによって、異なる集団の捕捉剤およびその結果として異なる集団の標的、とくに細胞の接着は、細胞種類を分類するのに用いる配列に特異的な相補的な制限酵素を加えることによって個々に制御することができる。解放した細胞は、さらに集積させる細胞培養によってｉｎ  ｖｉｖｏで増大する、または、本明細書において示すようにモノパラメータもしくはマルチパラメータで遺伝子的にもしくはタンパク質的に（例えばＰＣＲ，ウェスタンブロットなど）分析できる。
【０１６０】
ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤で細くした標的の制御解放は、さらに、ＰＣＲ，質量スペクトル、ウェスタンブロットなどの他の従来の生物分析技術および当業者によって特定可能な他の技術によって標的をさらに分析することができる。
【０１６１】
したがって、いくつかの実施形態において、ここで説明する解放可能なポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、１個の標的およびとくに複数の標的を提供する方法に関連して用いることができ、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、基質上のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を形成することができる時間および条件で標的および基質ポリヌクレオチドに付着する基質に接触させる。解放可能なポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の制限酵素部位に対する制限酵素は、その後、相補的な制限酵素部位を解裂することができる解放可能なポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体に接触し、それによって、制限酵素に相互的な制限酵素部位を有する解放可能なポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を選択的に解放することができる。いくつかの実施形態において、個々で説明する方法で行った解放は、制御された方法で（例えば異なる時間に）異なる解放可能なポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を解放するように選択的に制御することができる。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、解放可能なポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤である。とくに、いくつかの実施形態において、この方法に従った解放可能なモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、さらに、リンカー分子を有し、ここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の制御解放を可能にし、それによって捕捉剤がないときに標的の更なる分析を可能にする。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、アレイにおいて捕捉した標的、とくにアレイ上で捕捉した細胞も、さらなる分析に従うことができる。特異的には、免疫―ＰＣＲは、細胞表面受容体をプロファイルするのに用いることができる。さらに、または代案として、全体に参照して組み込むＷＯ２００８／０１６６８０号明細書において説明したもの等の一連のポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を用いることができ、実施例１６および図２０−２２において説明した手順に従って行うこの分析を行うことができる。とくに、図２０−２２の実施例において、標的表面バイオマーカーに対する抗体は、独特なＤＮＡ配列で標識化する。これらのポリヌクレオチドエンコード抗体は、その後、アレイ上で捕捉した細胞を染色するのに用いる。エンコード抗体上のＤＮＡタグをその後分析し、標的細胞バイオマーカーの存在または非存在は、細胞バイオマーカーに関連したＤＮＡタグの存在または非存在に相互に関連する。ＤＮＡタグは、ＰＣＲ，配列マイクロアレイ、および当業者によって特定可能なさらなる技術等の従来の技術で検出する。
【０１６４】
したがって、いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤およびここで説明するモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、標的を検出とくに分析する方法を組み合わせて使用し、少なくとも１個のモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤およびポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は標的および／もしくは基質上に付着した基質ポリヌクレオチドに接触させて、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体および／またはポリヌクレオチドエンコード捕捉剤−標的複合体を形成する。さらなるポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および／またはモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、さらにそれらの複合体と接触して、標的および／または標的上に存在する更なる標的に結合させて、さらなるポリヌクレオチドエンコード捕捉剤を形成することができる。さらなる標的を有するさらなるポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および／またはモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の複合体を検出できる。リンカー、およびとくに従来のリンカーを有する解放可能なポリヌクレオチ捕捉剤および／またはポリヌクレオチドエンコード捕捉剤の使用に基づいた更なる変化は、当業者には既知である。
【０１６５】
さらなる実施形態において、ここで説明するいずれかの方法およびシステムの基質は、マイクロ流体成分に関連し、マイクロ流体を基にした分析を可能にする。マイクロ流体を基にした分析は、減少したサンプルおよび試薬体積、および短縮化した分析時間等の長所を必要とする［参考文献４９］。例えば、特定の操作条件下で、表面結合分析速度論は、拡散によってではなく、検体（タンパク質）濃度および検体／抗原結合親和性によって主に画定する［参考文献５０］。
【０１６６】
ここで用いる用語「マイクロ流体」は、一般的にマイクロまたは準マイクロスケールで加工する例えばチャネルおよび／もしくはチャンバ等のマイクロ流体の特性を有する成分またはシスエムを示す。例えば、典型的なチャネルまたはチャンバは、約０．１ミクロン〜約１５００ミクロンの範囲、より典型的には約０．２ミクロン〜約１０００ミクロンの範囲、より典型的には約０．４ミクロン〜約５００ミクロンの範囲の少なくとも１断面の大きさを有する。個々のマイクロ流体の特徴は、典型的には、例えば約１０ナノリットル〜約５ミリリットル、より典型的には約１００ナノリットル〜約２ミリリットル、さらに典型的には約２００ナノリットル〜約５００マイクロリットル、さらに典型的には約５００ナノリットル〜約２００マイクロリットルの少量を有する。
【０１６７】
マイクロ流体成分は、集積デバイスにおいて含まれる。ここで用いるように、「集積デバイス」は、物理的および操作的にともに組み込める２個（またはそれ以上）の成分を有するデバイスを示す。成分は、（全体的にまたは部分的に）互いに分離して加工する、または集積デバイスは、集積デバイスにおける異なる成分を含むように加工する。集積マイクロ流体アレイデバイスは、マイクロ流体成分に組み込んだアレイ成分を有し、マイクロ流体成分およびアレイ成分は互いに操作可能な関連を融資、アレイ成分のアレイ基質は、マイクロ流体成分のマイクロ流体特徴を有する流体連結する。マイクロ流体成分は、舞う黒流体特徴を有する成分であり、アレイ成分に関連して操作可能であるように適用する。アレイ成分は、基質を有する成分であり、マイクロ流体成分に関連して操作可能であるように適用する。
【０１６８】
マイクロ流体システムはまた、モジュール形式で提供する。「モジュール式」は、ともに用いる多重の標準化した成分を有するシステムまたはデバイスを示し、成分種類の多重の異なる実施例の一つは、システムもしくはデバイスの機能または能力を変化させる同じ種類の成分のほかのものに置換でき；このシステムまたはデバイスにおいて、それぞれの標準化した成分は「モジュール」である。
【０１６９】
ここで説明する方法およびシステムのマイクロ流体の実施形態において、極端に小さいサンプル体積内および非常に小さい背景／生物付着のタンパク質バイオマーカーの大きなパネルの測定が可能である。
【０１７０】
個々で説明する方法およびシステムのマイクロ流体実施形態において、分析の感度も上げることができる。
【０１７１】
さらに、ここで説明するマイクロ流体方法およびシステムは、（ｉ）モノステップ分析（ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、標的および標識化抗体が単一ステップにおいて接触する）および（ｉｉ）マルチステップ分析（基質は順にモジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、標的および二次抗体に露呈する）の両方を、当該技術の関連するマイクロ流体方法およびシステムおよび分子検出の非マイクロ流体方法およびシステムと比較して短い時間、小さいサンプル、高感度で行うことができる。
【０１７２】
ここで説明するマイクロ流体方法およびシステムに関連したさらなる利点には、基質−支持抗体を有するマイクロ流体環境においていずれかの分析を行うことができ、それまでの技術と組み合わせたマイクロ流体チップを有さない。
【０１７３】
ここで説明する方法およびシステムに関連するさらなる利点は；ガラス、およびプラスチック等の低コストの試薬を用いた高感度測定を行うことができる；およびサンプル前処理および精製のためのさらなる成分を組み合わせて用いることができる。
【０１７４】
ここで説明する方法およびシステムは、対象および関連する診断分析のバイオマーカーの多重マルチパラメータ検出、分類ができる。診断分析に関するここで説明する方法およびシステムの用途の例示的な説明は、実施例９〜１０において説明し図１３−１５，２１，２２および本発明を読む当業者によって特定可能なさらなる分析において示す。
【０１７５】
とくに、図１３−１５の例示的な診断分析において、抗原特異性Ｔ細胞集団が、ヒトＰＢＭＣからのＮＡＣＳで検出した。これらのＴ細胞の検出は、それらが癌およびウィルス性病原菌に対する免疫反応を有するため診断目的に重要である。治療的分析の実施例は、代わりに図１３において与える。ここでヒトＨＭＢＣは、抗原に関連する癌に対して特異的なＴＣＲで形質導入する。これらのＴ細胞が、患者に点滴する前にＮＡＣＳアレイ上で検出する。
【０１７６】
ここで説明するシステムは、部分のアレイまたはキットにおいて提供することができる。「マイクロアレイ」を時々示すアレイには、領域に関連した特定の分子を有するアドレス可能な領域の１，２または３次元の装備がある。通常、特徴的な大きさはマイクロメートルである。実施例３〜１１および図３−６，９−１３，１５−１７，１９，２１−２２は、例示的なマイクロアレイを提供する。
【０１７７】
部品のキットにおいて、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤および／または関連する部品のいずれかは、基質を有するキットにおいて個々に含まれる。とくに、モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、１個またはそれ以上の成分において含まれ、各モジュール式ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤は、適切な車両キャリアまたは助剤を有する１成分において含まれる。
【０１７８】
システムにおいて提供した基質は、それに付着した基質ポリヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態において、基質ポリヌクレオチドは、さらにキットのさらなる成分として提供する。さらなる成分には、標識化ポリヌクレオチド、標識化抗体、標識、マイクロ流体チップ、参照基準、および本は明細書を読む当業者によって特定可能なさらなる成分を有する。とくに、キットの成分は、適切な説明書および必要な試薬とともに提供し、個々で説明した方法を行う。キットは、通常分かれた容器において構成物を有する。分析を行うための、例えば紙またはテープもしくはＣＤ−ＲＯＭ等の電子機器上に書かれたまたはオーディオの説明は、キットにおいて通常含まれる。このキットはまた、用いる特定の方法に依存して、他の包装の試薬および材料を有する（すなわち、洗浄緩衝液および同様のもの）。
【０１７９】
成分の適切なキャリア剤または助剤の特定、およびキットの一般的な製造および包装に関連するさらなる詳細は、本明細書を読む当業者によって特定可能である。
【実施例】
【０１８０】
ここで説明する方法およびシステムは、以下の実施例において説明し、説明によって与えられ、限定することはない。
実施例１：ポリヌクレオチドエンコードＳＡＣ骨格タンパク質の生成
【０１８１】
ＳａＣの発現は、以前出版されたプロトコールに従って行った［参考文献３６］。簡単には、ｐＥＴ−３ａプラスミドにクローンしたストレプトアビジンーシステイン（ＳａＣ）遺伝子は、Ｄｒ．Ｔａｋｅｓｈｉ  Ｓａｎｏ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）から送られた。その後、コロニー選択および一晩培養を開始し、プラスミドを含むＢＩ２１（ＤＥ３）−ｐＬｙｓＥを３７°ＣでＬＢ培養液およびｐＥＴ−３ａ−ＳａＣに対する選択抗生物質アンピシリン（５０Ｉｔｇ／ｍｌ）およびｐＬｙｓＥに対するクロロフェニコール（２５Ｉｔｇ／ｍｌ）において振動させながら成長させ、ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．４ｍＭになるまで加えた。その後細胞誘導を３７°Ｃで４時間行った。培養液をその後１６００ｇで１０分間遠心分離し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８で洗浄した。細胞は、その後リシン緩衝液（２ｍＭ  ＥＤＴＡ，３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ｐＨ８．０）で溶解した。
【０１８２】
溶液の粘度を下げるため、溶解物をＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ（それぞれＪ２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を有する１０Ｉｔｇ／ｍｌ）を用いて２０分間室温で処理した。不溶性物質含有体は、その後３９０００ｇで１５分間遠心分離することによって溶解物から分離し、その後、沈殿物を再び利新緩衝液で洗浄した。沈殿物を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ，ｐＨ１．５において溶解させて最初の培養物の体積にした。細胞ビオチンを除去するため、１００ｍＬの溶解した沈殿溶液を１Ｌの６Ｍグアニジン−ＨＣｌ，ｐＨ４．５において透析した。透析物を、０．２Ｍ酢酸ナトリウム，ｐＨ６．０に移して、グアニジンを除去し、リフォールドＳａＣを処理した。ここで透析は、攪拌棒を除去することによってゆっくり行うことが重要である。透析物は、その後３０００ｇで１０分間回転させ、沈殿材料を除去し０．２Ｌｍｔｌｌｔｅｒ（ａｍｉｃｒｏｎ）を通して濾過した。リフォールドＳａＣは、５０ｍＭ重炭素酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ１１に対して最後に透析した。
【０１８３】
ＳａＣは、以下のように生成した。リフォールドＳａＣを、結合緩衝液（５０ｍＭ重炭素ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ｂ−Ｍｅ，ｐＨ１１）と１：１で混合した。１．５ｍｌのイミノビオチアガロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）で包装した重力カラムをその後カラムに取り付け、溶出フラクションを収集してカラムに再び着せて、ＳａＣ回復を最大化する。カラムを２０ｍｌ結合緩衝液で洗浄後、ＳａＣをｐＨ４溶出緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム，１０ｍＭ）で溶出した。ＳａＣを含むフラクションは、ＯＤ２８０によってモニタリングしたように、収集して、１０ｍＭのＰＢＳを含む緩衝液交換して１０Ｋ  ｍｗｃｏフィルタ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて最終濃度１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０１８４】
ＳａＣオリゴヌクレオチド接合は以下のように行った。用いる前に、ストックＳａＣを、脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて５ｍＭ  ＴＣＥＰを含むトリス緩衝液（ＴＢＳ）に緩衝液交換した。ＴＣＥＰは、接合の間ＳａＣから還元した状態を維持する還元剤を有するノンチオールである。ＤＭＦ内ＭＨＰＨ（３−Ｎ−マレイミドー６−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）をＳａＣに３００：１のモル過剰で加えた。平行して、ＤＭＦ内ＳＦＢ（スクシンイミジル４−ホルミル安息香酸塩、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を５´アミン化オリゴ（ＩＤＴ）に４０：１のモル過剰で加えた。
【０１８５】
混合物をその後、３〜４時間室温で反応させた。過剰なＭＨＰＨおよびＳＦＢを除去してサンプルを緩衝液交換して脱塩スピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてクエン酸塩緩衝液（５０ｍＭクエン酸ナトリウム，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐｈ６．０）とした。ＳＦＢ−標識化オリゴをその後、誘導化ＳａＣと２０：１のモル過剰で組み合わせ、一晩４°Ｃで培養させる前に２〜３時間室温で反応させた。未反応のオリゴをＰｈａｒｎａｃｉａ  Ａｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｇｅｌフィルタカラムを用いてＰＢＳ０．５ｍｌｌｍｉｎアイソクラチックフローで除去した。ＳａＣ−オリゴ接合体を有するフラクションは、１０Ｋｍｗｃｏ濃フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。ＳａＣ−オリゴ構成体の合成は、非還元８％トリスＨＣｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検証した。
実施例２：マイクロアレイ加工
【０１８６】
ＤＮＡマイクロアレイは、アミンコートされたガラススライド上でＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＢ−Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）でのマイクロアレイ施設による標準的な方法を介してプリントした。典型的なスポットの大きさは、６００ｆｉｌｍ（ＳＭＰＸＢ１５ｐｉｎ，Ａｒｒａｙｉｔ）とした。すべてのＤＮＡ鎖は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、すべての相補体は５´アミン化した。すべての６個の３Ｄ−ｍｅｒおよびそれらのそれぞれの設計に対する配列は、以下の表１および表２において与えた。
【表１】
2011518553.tif 000003
【表２】
2011518553.tif 000004
実施例３：ＮＡＣＳを用いた検出および分類方法およびシステム
【０１８７】
ｓｓＤＮＡ−オリゴマー標識かＳａＣ骨格上で組織化した抗原に存在するＭＨＣ分子抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞分類は、図３および図４において概略的に示すように行った。とくに、図３および４において概略的に示した分析は、細胞分類を目的とし、異なる細胞種類をガラス基板上で分類し従来の顕微鏡技術によって検出する。モジュール式ＤＮＡ−ＳＡＣ−ＭＨＣ構成体は、最初にアレイに組み込み、その後、対象の標的Ｔ細胞を有する複合体細胞サンプルを用いてアレイ上で分類する。
【０１８８】
最初の実験に従って、タンパク質ＳａＣを発現させ、ｓｓＤＮＡオリゴマーは、実施例１に説明した手順に従ってチオールカップリングを用いてシステイン残基にカップリングした（図３参照）。
【０１８９】
ビオチン化した抗原に存在するＭＨＣは、ｐ／ＭＨＣモノマーをＳａＣ−オリゴに対してモル過剰で結合させることによってビオチン／ＳａＣ結合部位でＳａＣにカップリングさせ、３７°Ｃで２０分間培養した（図３参照）。
【０１９０】
ＳａＣ／ＭＨＣ／ｓｓＤＮＡ骨格はその後、対象のＣＤ８＋細胞を含む溶液と結合させ、全ＳａＣ／ＭＨＣ／ｓｓＤＮＡ／ＣＤ８＋集合は、実施例３において説明した手順に従って（図３参照）、表面上の相補的ｓｓＤＮＡ´オリゴマー特定のスポットに位置づけた。
【０１９１】
第２実験に従って、抗原特異細胞を多重分類する自己集合ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体アレイを準備した（図４）。ｓｓＤＮＡタグｐ／ＭＨＣ四量体は、モル過剰のビオチン化ｐ／ＭＨＣモノマーに露呈する前にＳＡＣにｓｓＤＮＡ部位を特異的に結合させることによって生成させた（図４）。ｐ／ＭＨＣ四量体アレイは、相補的にプリントしたｓｓＤＮＡマイクロアレイへ特異的に選択し組み込むｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体をプーリングすることによって形成する（図４）。類似のＴＣＲを発現するＴ細胞は、表面局限四量体に結合させることによって検出した。
【０１９２】
両方の実験を行うため、黒色腫抗原に特異的なＴＣＲを発現するように遺伝子的に加工した２個のＴ細胞株Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ−ＴＣＲトランスジェニックＪｕｒｋａｔおよびＭａｒｔ−Ｉ−ＴＣＲトランスジェニックＪｕｒｋａｔは、チロシナーゼ３６９−３７７（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ−配列番号９）およびＭａｒｔＩ２６−３５（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ−配列番号１０）ペプチドに関連するＨＬＡ−Ａ２制限クラスＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）モノマーとともに用いた。
【０１９３】
分類実験の前に、マイクロアレイスライドを遮断して、ＰＢＳにおいて溶解した１ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｓｕｎｂｉｏ）で非特異的な細胞吸収を２時間室温で妨げた。スライドは、その後、５回０．５ＰＢＳに浸し過剰なＰＥＧを除去し、その直後にｄＨ２０においてさらに５回浸けて塩を除去した。スライドは、窒素ガンで吹き飛ばして乾燥させた。スライドは、最長２週間デシケータにおいて保管し、効率的に劣化させないようにする。
【０１９４】
固体状態の分類は、最初のモル過剰ｐ／ＭＨＣモノマーをＳａＣ−オリゴに結合させることによって行い、３７°Ｃ２０分間培養した。四量体化後、１０％ＦＢＳで補足した２００μｌのＤＭＥＭを加えて、溶液をＤＮＡマイクロアレイの上部でピペッティングした。
【０１９５】
四量体は、１時間３７°Ｃで相補的スポットに局限化させた。スライドをその後ＰＢＳ内３％ＦＢＳでリンスした。リンス後、１００ＩＩＩの新鮮ＤＭＥＭにおける１０６Ｔ細胞をアレイ上部上でスライドに加えた。スライドをその後、３７°Ｃのインキュベータに２０〜３０分間移して、細胞をｐ／ＭＨＣアレイと相互作用させた。培養後、スライドをＰＢＳ内３％ＦＢＳでおだやかに動かし、未結合の細胞を除去して明視野および蛍光顕微鏡を介して可視化した。同様に、溶液相の捕捉を１０６個の細胞を０．５μｇの集合ＮＡＣＳ四量体と組み合わせることによって行い、捕捉剤が溶液相において細胞に結合できるようにした。２０分間３７°Ｃで培養後、細胞を５００ｇで５分間回転させ、過剰の四量体をアスピレートすることによって除去した。細胞は、１００μＬのＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳにおいて再懸濁し、予めブロックしたマイクロアレイに直接用いた。スライドはさらに２０分間３７°Ｃで培養した。その後の洗浄および画像化のステップは、固体状態の分類と等しい。
【０１９６】
単一パラメータおよびマルチパラメータ細胞分類を得るために行った上述の手順の結果を図５において示す。とくに、図５の結果は、抗原特異ＣＤ８＋Ｔ細胞を分類する単一パラメータ（図５Ａ）およびマルチパラメータ（図５Ｂ）に対するＮＡＣＳの実用性を示す。当業者は、図５の詳細からＤＮＡハイブリダイゼーションの特異性および標的分類およびとくに細胞分類を最少の内部スポットノイズで行うことができる特別に局限化したｐ／ＭＨＣタンパク質を理解する。
【０１９７】
上述の手順を通して行った検出／分類の感度を評価するため、更なる実験を上述の手順を行って、他の細胞の混合物においてｓｓＤＮＡ−ＳＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体アレイで１０％，１％および０．１％の濃度で希釈した抗原特異ＣＤ８＋Ｔ細胞を選択的に検出および分類した。
【０１９８】
図６において示した結果は、他の細胞の混合物における抗原特異性細胞を選択的に検出および／または分類するＮＡＣＳアプローチの実用性を示す。とくに、図６Ａの顕微鏡画像は、細胞分類の効率性を示し、標的Ｔ細胞集団は、各サブパネルの上左に示したパーセンテージで急上昇するが、図６Ｂのヒストグラムは、この実験を定量的に示す。短いバーは、分類実験の目的とは異なる抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を示し、背景のシグナルのレベルを示す。
実施例４：最適化骨格
【０１９９】
ストレプトアビジンの構造を図７Ａにおいて示し、最適化ストレプトアビジンＳＡＣの構造を図７Ｂにおいて示す。
【０２００】
これは、最適化ストレプトアビジンーシステインタンパク質構成物の結晶構造である。ストレプトアビジンは、４個の異なるサブユニット（様々なグレー）から成る。タンパク質に対するビオチン結合ドメインを図において示し、ビオチン配位子が結合している（白）。これは、誘導化ＤＮＡの付着部位である。２個の領域は２０〜３０オングストロームの距離だけ離れていることに留意されたい。ｌｙｓ１２１（灰）によって示した、結晶構造における第３要素がある。これはまた、システイン残基に付着する代わりに誘導化ＤＮＡの付着部位として機能する（アミン−ＮＨＳカップリングを介する）。付着部位の問題は、ビオチンポケットへの接近が近すぎることであり（すなわち、ドメイン重複、７オングストローム）、これは最適でない骨格である。ｓｓＤＮＡの直径は、約１０オングストロームであり、ｄｓＤＮＡは約２０オングストロームである。したがって、ＤＮＡはリジン残基二付着すると、ビオチン結合領域に重複し（１０Å＞７Å）、ビオチン化結合タンパク質への特異的な相互作用を妨げる（例えばビオチン化ｐ／ＭＨＣ）。
【０２０１】
骨格設計における合成アプローチは、最適化骨格の様々なパラメータを正確に制御することができる。例えば、ペプチドを骨格として用いる場合、骨格最適化におけるいくつかのパラメータは制御でき、結合タンパク質およびエンコードポリヌクレオチド付着領域を分離するリンカー長さ、極性および価数がある。
実施例５：最適化および非最適化ｓｓＤＮＡ−エンコードｐ／ＭＨＣ四量体
【０２０２】
用途は、タンパク質を５´マレイミドｓｓＤＮＡをカップリングしたＳＡＣを発現し、接合形成を移動度シフトアッセイで検証する。
【０２０３】
とくに、ｓｓＤＮＡ−ＳＡＣ接合の生成は、以下のように行った。ＳＡＣの発現は、ｐＥＴ３ａプラスミドから以前出版されたプロトコールに従って行った［参考文献３６］。接合する前に、ストックＳＡＣを、ｚａｂａ脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて５ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン酸塩酸塩（ＴＣＥＰ）を含むＰＢＳに緩衝液交換した。ＤＭＦ内ＭＨＰＨ（３−Ｎ−マレイミド−６−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）をＳａＣに３００：１のモル過剰で加えた。平行して、ＤＭＦ内ＳＦＢ（スクシンイミジル４−ホルミル安息香酸塩、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を５´アミン化オリゴ（ＩＤＴ）に４０：１のモル過剰で加えた。混合物は、ｚｅｂａカラムを用いてクエン酸塩（５０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ６．０）に緩衝液交換する前に室温（ＲＴ）で３〜４時間反応させた。ＳＦＢ−標識オリゴは、誘導化ＳＡＣとの２０：１のモル過剰で結合させ、一晩ＲＴで培養した。未反応のオリゴは、Ｐｈａｒｎａｃｉａ  Ａｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｇｅｌフィルタカラムを用いてＰＢＳ０．５ｍｌｌｍｉｎアイソクラチックフローで除去した。ＳａＣ−オリゴ接合体を有するフラクションは、１０Ｋｍｗｃｏ濃度フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。平行して、ｓｓＤＮＡを直接比較するため天然のＳＡとカップリングさせた。
【０２０４】
図８において示したその結果は、Ｃ末端システイン残基を発現するストレプトアビジンの変形の加工は、天然のストレプトアビジンのｓｓＤＮＡとの接合と比較して優れたビオチン結合能を有することを示す。とくに、図８の結果は、ＳＡＣモノマーの分子量が〜１２ｋＤａであることを示し（図８Ａ）、１個のＤＮＡ鎖によって異なるＳＡＣ−オリゴ接合体を示すそれぞれのバンドを溶解することができ、また、下位ＳＡＣ−オリゴ接合体（タンパク質当たり１〜２オリゴ）は、核酸の電荷／質量密度において異なるために未修飾のＳＡＣと比較して「軽質」となる（図８Ｂ）。ＳＡ当たり３〜４ＤＮＡ鎖に関連する上位のＳＡＣ−オリゴ接合体に有利に働いた（図８Ｂ）。
【０２０５】
ビオチン結合能を試験するため、ＳＡＣ−オリゴ接合体を２−（４´−ヒドロキシルアジベンゼン）安息香酸（ＨＡＢＡ）でプローブした［参考文献２８］。ビオチン分子模倣体をビオチンがＳＡに結合するかしないかによって異なる最適な密度係数でプローブした。分析において４未満の関連するビオチン：ＳＡのモル比は、ビオチン結合能における減少を示す。天然ＳＡから誘導した接合体は、期待値以下の全単位より大きく（２．８６対４．０）であったが、ＳＡＣで形成した接合体は、最適な結合能（３．７）の近くを維持した（図８Ｃ)。
【０２０６】
とくに、図８に示すように、ＳＡモルに対して〜２．９モルのビオチンを結合した天然ＳＡ−オリゴ接合体は、４：１の比の未修飾ＳＡと比較して大きな減少を示す。ＳＡＣ−オリゴ接合体は、最適な結合能の近くを維持した（３．７：１）。
【０２０７】
これらの接合体は、４個の異なるモノクローナルＴ細胞集団（２個のヒトＴＣＲ形質導入した細胞株および２個のマウスＴＣＲトランスジェニック脾細胞懸濁液）を通して試験した。ｓｓＤＮＡ−タグＳＡＣ構成は、天然ＳＡで準備したｐ／ＭＨＣ四量体と比較して非常に高い細胞捕捉能を有した（図９）。とくに、図９Ａは、天然ストレプトアビジンを用いて行った細胞捕捉実験の結果を示し、図９Ａ内の各サブパネルは、異なる細胞種類を用いた別々の実験の結果を示す。図９Ｂにおいて、同じ細胞を用いたが、最適化したＳＡＣ骨格で細胞捕捉能を試験した。当業者は、図９Ａの実験の細胞捕捉能は高く変化するが、図９Ｂの実験の細胞捕捉能は、すべての細胞種類の中で均一であることを理解する。すべてのＮＡＣＳ四量体ＳＡ構成物は、ＳＡＣ変異体で準備した。
【０２０８】
ここで、ＤＮＡ円コードドメインは、非最適化した骨格（ＳＡ）に付着したときビオチン結合能（結合タンパク質ドメイン）を減少させ、その結果、Ｔ細胞捕捉能が大きく減少する。最適化骨格（ＳＡＣ）は、２個の異なるモダリティ間の相互作用を最小化し、その結果Ｔ細胞分類の能力を高くする。
【０２０９】
この実施例において示した結果はさらに、１個の捕捉剤において含まれる結合分子の数を増加させることによって結合分子の親和性を増加させることを示す。それぞれのモノマーとしてのｐ／ＭＨＣタンパク質は、低い親和性（電離定数Ｋｄ〜１０−５、［参考文献２］）によって特徴付けられる。しかし、４個のｐ／ＭＨＣタンパク質を束ねてｐ／ＭＨＣ四量体を形成するとき、複合体の親和性は大きく増加する（Ｋｄ〜１０−９、［参考文献１］）。多価であるためのこの親和性の増加は、タンパク質結合剤、アパタマー、ペプチド、小分子のいずれかの族まで広がる。捕捉剤複合体の親和性上の価数の効果は、図８〜９において明らかに見える。ここで３ｐ／ＭＨＣタンパク質で形成した捕捉剤は、十分な親和性を有し、Ｔ細胞集団のサブセットを捕捉するが、完全に形成した四量体（４ｐ／ＭＨＣ）は、すべての４Ｔ細胞集団を捕捉および結合することができた。
【０２１０】
当業者は、この実験において示した目的が他の最適化骨格を理解するのに用いて、細く剤の価数が同じ理由で計算できることを理解する。とくに、当業者は、多価の骨格を用いて特異的に結合する分子は、モノマーと比較したときより貪欲であることを理解する。
実施例６：制限酵素部位を有するポリヌクレオチドでのマイクロアレイ製造
【０２１１】
すべてのＤＮＡ鎖は、ＩＤＴから購入した。ＤＮＡマイクロアレイは、Ａ，ＢまたはＣスポットの代案の列を有する１２×１２アレイ、またはＳＭＰＸＢ１５ピン（Ａｒｒａｙｉｔ）を有するＡＥｃｏＲＩおよびＢＢａｍＨＩ同じように３倍したアミンコートしたガラススライド（ＧＡＰＳＩＩ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）上でＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＢ−Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）でマイクロアレイを製造することによってプリントした。すべてのらせんに対する配列を以下の表３において報告する。
【表３】
2011518553.tif 000005
【０２１２】
ＳＡＣに接合する表３のすべての配列（Ａ´，Ｂ´，Ｃ´，ＡＥｃｏＲＩ´およびＢＢａｍＨＩ´）は、ｐｏｌｙＡリンカーおよびその後２０ｍｅｒハイブリダイゼーション領域で設計した。５´アミンは、ヘテロ二機能マレイミド誘導化ＭＨＰＨの付着に必要である。ガラス基板上にプリントした配列（Ａ，Ｂ，Ｃ，ＡＥｃｏＲＩおよびＢＢａｍＨＩ）は、ｐｏｌｙＡによって分離した２個のハイブリダイゼーション領域で設計した。これは、アミンガラス基板に静電吸着するように設計した。
【０２１３】
配列ＡＥｃｏＲＩおよびＢＢａｍＨＩは、以下の実施例１１において説明するような手順に従って、標的を解放、とくに選択的に解放できるように示した制限酵素部位を含むように設計した。
実施例７：従来のタンパク質アレイと比較したＤＮＡ固定化および直接スポッティングを介して生成したｐ／ＭＨＣアレイの性能
【０２１４】
用途は実施例６においてアレイ上のＮＡＣＳの性能を、様々なモデル基質上の従来の直接的なスポッティング技術と直接比較した。基質は、タンパク質を固定化するのに一般的に用いる表面化学物質のスペクトルを示すように選択した（共有結合、静電、疎水性、および親水性吸着）。蛍光ＭＡＲＴ−１  ＳＡ−ＰＥ四量体の希釈液（ＨＬＡ−Ａ２．１  ＭＨＣ分子上に載せた黒色腫ペプチドエピトープＭＡＲＴ−１２６−３５）は、製造説明書にしたがって基質上にスポットした。
【０２１５】
Ｔ細胞は、以下の手順に従って準備した。チロシナーゼ３６８−３７６に特異的なＴＣＲのアルファおよびベータ鎖を用いた。ＴＣＲＴｙｒｏアルファおよびベータ鎖は、説明するように両方のトランス遺伝子を２Ａ自己解裂配列によって結合させたレンチウイルスベクターにクローン化する［参考文献３７］。このレンチウイルスベクターからの濃縮した浮遊物は、Ｊｕｒｋｅｔ細胞を感染させるのに用いて、Ｊｕｒｋｅｔα―Ｔｙｒｏ細胞を生成した。ＭＳＧＶ１−Ｆ５ＡｆＴ２ＡＢレトロウィルスベクターを発現する初代ヒトＴリンパ球を生成するために、白血球除去輸血から得たＰＢＭＣは、４８時間５０ｍｇ／ｍｌのＯＫＴ３（ムロモナブ抗ヒトＣＤ３抗体、Ｏｒｔｈｏ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）および３００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（アデスローキン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）で活性化させた。ＭＳＧＶ１−Ｆ５ＡｆＴ２ＡＢレトロウイルス浮遊物は、レトロネクチンコートしたウェル（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ，Ｊａｐａｎ）に適用した。
【０２１６】
ＲＰＭＩプラス３００ＩＵのＩＬ−２で補足した５％ヒトＡＢ血清において活性化したＰＢＭＣをこれらのウェルに加え、３７°Ｃ一晩５％ＣＯ２で培養した。その後日、ＰＢＭＣを第２セットの予めコートしたレトロネクチンレトロウイルスベクター組織培養プレートに移して、３７°Ｃ一晩５％ＣＯ２で培養した。細胞はその後洗浄して上述の培養液において再懸濁させた。患者ＮＲＡ１１およびＮＲＡ１３（ＵＣＬＡ  ＩＲＢ♯０３−１２−０２３）凍結白血球除去輸血フラクションを解かして、１０％ヒトＡＢ血清および１％ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアンフォテリシン（Ｏｍｅｇａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で補足したＲＰＭＩにおいて一晩培養し、製造説明書に従ってＡｕｔｏＭＡＣＳ機械を用いてＣＤ８＋濃縮物（抗ＣＤ８マイクロビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の前にした。分離後、細胞を３０Ｕ  ＩＬ２／ｍＬを有するＲＰＭＩ−ヒトＡＢ培養液において保存した。
【０２１７】
Ｊｕｒｋｅｔα―Ｔｙｒｏ細胞（ペプチドエピトープＭＡＲＴ−１２６−３５に特異的なＦ５  ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲで形質導入したヒトＴ白血病細胞株Ｊｕｒｋａｔ［参考文献２９］）をその後実施例３において説明したように実施例６のアレイおよびタンパク質アレイに適用した。収集および定量化したアレイの画像は図１０において示した。
【０２１８】
とくに、図１０Ａ（収集した画像）および図１０Ｂ（定量化した画像）において示した結果は、同じ濃度のｐ／ＭＨＣ四量体で固定化したＮＡＣＳアレイと比較して調査した表面の大部分上にはＴ細胞捕捉（静電、疎水性）または大きなノイズ（親水性）がほとんどないまたは全くない。とくに、図１０Ａの図面は、細胞結合はＳＡＣを用いて最適化した骨格に対して一定で均一であったが、細胞結合は一表面（共有結合）でのみ観察されたが、細胞捕捉は大きく変化した。図１０Ｂの図面は、図１０Ａの結果の定量化を示す。当業者が図１０の詳細から理解することには、等価の細胞捕捉密度を達成するために従来のアレイはＳＡＣ骨格より５倍以上のタンパク質材料を必要とする（とくに図１０Ｂの定量化参照）
【０２１９】
さらなる実験において、ＮＡＣＳを行って結合するＴ細胞の構造安定性は、異なるスポッティングで行って結合するＴ細胞と比較して試験した。とくに、ｐ／ＭＨＣ四量体は、Ｔ細胞を捕捉するのに見られた（細胞を結合しない００１６４におけるほかの表面と比較して）誘導化表面（エポキシ官能基）上にスポットした。ｐ／ＭＨＣ四量体を製造説明書に従ってスポットし、同じ量の局在化したｐ／ＭＨＣタンパク質と組み込んだＮＡＣＳ分析と直接比較した。
【０２２０】
結果は、図１１においてＳＡＣ細胞捕捉プラットフォームの一貫性および構造安定性、および大きな内部スポット細胞捕捉異種によって示すような従来のアプローチの関連する矛盾を示す。
【０２２１】
とくに、直接スポットした表面上で結合する（共有結合）Ｔ細胞が観察されたが、細胞捕捉は、内スポットおよび間スポットの両方の異種および示した交雑実験変化によって示したように高く変化した（図１１Ｂ参照）。
【０２２２】
逆に、Ｔ細胞のＮＡＣＳでの一貫性および構造安定性は、スポットしたアレイと直接比較したとき図１１Ａの画像空明らかであり、内スポット、間スポット、および内部実験異種の高さに困った（図１１Ｂ参照）。
【０２２３】
さらに、等価のＴ細胞捕捉密度を達成するため、ＮＡＣＳ  ｐ／ＭＨＣアレイは共有結合固定化より５倍以上少ない材料を必要とした（最大値の半分のｐ／ＭＨＣモノマー＝Ｋ１／２＝ＮＡＣＳで１．１ｎｇおよび共有結合固定化で５．７ｇ）。
【０２２４】
ＮＡＣＳ  ｐ／ＭＨＣアレイの性能および再現性が大きく改善し、広い用途のアレイを基にしたＴ細胞検出機構を広げるための不可欠なステップを示す。これは少ない原因を有する。まず、表面拘束ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体は、表面に適合するのに必要な吸着タンパク質と比較した表面／溶液界面での方向性自由が大きい。この効果は、機能的タンパク質の密度を増やし、その結果アレイ製造に必要な材料の量を減少させる。第２に、タンパク質アレイの生成およびその後の保管の間の環境の水和状態は、アレイ再現性に必要な要素である［参考文献９，１２，１７］。この効果は、ＤＮＡチップが長い時間プリントされ保管され、またｓｓＤＮＡタグｐ／ＭＨＣ四量体アレイを実験の直前に溶液において自己集合するため、ＮＡＣＳで最小化する。
実施例８：ＮＡＣＳ検出特異性および検出感度
【０２２５】
ｐ／ＭＨＣアレイ集合の特異性およびＴ細胞分類を評価するため、実施例６において説明した手順に従って、ＤＮＡマイクロアレイを２個のさらなる異なる配列（設計ＢおよびＣ）に沿って相補的ならせん鎖（Ａ）にプリントした。
【０２２６】
ＮＡＣＳｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体（ペンダントＤＮＡ配列Ａ´と共に黒色腫抗原ペプチドチロシナーゼ３６８−３７６に載せたヒトＨＬＡ−Ａ*０２０１ＭＨＣ分子）をそのように準備したＤＮＡマイクロアレイに混成した。
【０２２７】
Ｊｕｒｋｅｔα−ＴｙｒＴ細胞（チロシナーゼ３６８−３７６に特異的なＴＣＲで形質導入したＪｕｒｋｅｔ細胞）［参考文献３０］の均一な集団を、その後実施例３に従ってアレイに混成した。
【０２２８】
図１２において示す結果は、Ｊｕｒｋｅｔα−ＴｙｒＴ細胞が、非相補的な配列ＢおよびＣにプリントしたスポットではなく混成した同族のｐ／ＭＨＣを有する相補的なスポット（Ａ）に局限化していることを示す（図１２Ａ）。３個のスポットから計算した平均結合能（−６００μｍ）は、−１４６８±６２Ｊｕｒｋｅｔα−ＴｙｒＴ細胞であった。
【０２２９】
ＮＡＣＳ，ＭＡＲＴ−１およびＤＮＡ配列ＡおよびＢにエンコードしたチロシナーゼｓｓＤＮＡ  ｐ／ＭＨＣ四量体の多重化能を示すため、それぞれを結合して３個のＤＮＡマイクロアレイ（らせん鎖Ａ，ＢおよびＣ）に同時に集合させた。新油性色素で予め染色した（グレースケールで明るいグレーおよび暗いグレーで表した緑および赤）Ｊｕｒｋｅｔａ−ＭＡＲ−１ＴおよびＪｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞の１：１の混合集団を、アレイに適用して代案のカラムに置いた（図１２Ｂ）。最小の交差反応性を観察した。スポットＡおよびＢの平均密度は、均一な分類よりも２個の因子が少なかった（６６１±１９Ｔ細胞／スポット）（図１２Ｂ）。検出限度を画定するため、Ｊｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞の標的集団を１０％，１％および０．１％で野生型（ｗ．ｔ．）Ｊｕｒｋｅｔ細胞に固定し分類した（図１２Ｃ）。各混合物に種類ごとのスポット当たりのＴ細胞捕捉密度を列挙し平均した（図１２Ｄ）。
【０２３０】
アレイに付着した非特異的なｗ．ｔ．Ｊｕｒｋｅｔ細胞の数は、すべての希釈で一定であったが、スポット当たりのＪｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞の数は、スポット当たりＩＩ捕捉できる全細胞数Ｊｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞に対応する制限−１０００細胞において１である検出限度を有するＪｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞の区画成分に対して線形的に減少した。したがって、このアプローチの感度は、不活性範囲にある抗原特異性のＴ細胞が同族ｐ／ＭＨＣ四量体をサンプリングおよび結合することができないため、正確に幾何制約となった。感度は、捕捉領域の大きさを大きくすることによって（すなわち、スポット直径および／または組み込んだスポット余剰を大きくする）または不活性領域を小さくすることによって（すなわちプリント密度を増加させる）改良する。
【０２３１】
さらに、おだやかな撹拌またはマイクロ流体は、全Ｔ細胞集団が細胞分類間に全タンパク質アレイをサンプリングすることができる。アレイの幾何学的配置は、同時に調べることができる抗原特異性の数を画定する。現在の例において、６００μｍスポットを１２グリッド（−１ｉｎ２）によって１２にプリントし、１０６Ｔ細胞（概して１ｉｎ２領域を覆うのに必要な細胞の数）１４４個の異なる抗原特異性を潜在的に画定することができる。
実施例９：ＴＣＲ操作初代ヒトＴ細胞のＮＡＣＳ分類および検出
【０２３２】
末梢血単核細胞（ＰＢＭC)のＴＣＲ操作は、黒色腫および他の癌を有する患者における養子免疫伝達に対して多くの腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を敏速に生成する新たな臨床的アプローチである［参考文献３１，３２］。このアプローチにおいて、Ｔ細胞を患者から収集して、標的の癌抗原に対して特異的なＴＣＲで形質導入し、自己免疫点滴する。ＴＣＲ操作初代ヒトＴ細胞リンパ球の検出の実現可能性の実証は、ＮＡＣＳの臨床的アプローチに重要である。
【０２３３】
したがって、最初の実験において、ＣＤ８＋細胞を有するヒトＰＢＭＣを、白血球除去輸血を介して患者から得て、拡大してＦ５  ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲを含むレトロウィルスベクターで形質導入する。
【０２３４】
図１３Ａにおいて示した結果は、フローサイトメトリによって画定したように９０％以上の形質導入効率を示す。
【０２３５】
これらの細胞は、その後、ＭＡＲＴ−１（正のコントロール）およびＣｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶｐｐ６５４９５−５０３／ＨＬＡ−Ａ２．１、負のコントロール）ｐ／ＭＨＣ四量体上に分類した。
【０２３６】
とくに、チロシナーゼ３６９−３７７（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）ＨＬＡ−Ａ*０２０１（配列ＩＤ番号１０）およびＭＡＲＴ−１２６−３３（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）（配列ＩＤ番号１１）を載せたＨＬＡ−Ａ*０２０１限定ＭＨＣクラスＩモノマーを、以前出されたプロトコール（３８）に従ってハウスにおいて生成した。Ａ．２．１−限定ＥＢＶ  ＢＭＬＦＩ２５９−２６７（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）（配列ＩＤ番号１２），ＣＭＶｐｐ６５４９５−５０３（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ）（配列ＩＤ番号２２）、ムリネＨ−Ｄｂ／−ｇｐ１００２５−３３（ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ）（配列ＩＤ番号２４）およびＨＬＡ−Ａ*０２０１四量体をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒから購入した。染料ＤｉＯ，ＤｉＤおよびＤｉＬで染色した親油性細胞膜をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
【０２３７】
実験の前に、マイクロアレイスライドを遮断して非特異性細胞をＰＢＳ内１ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｓｕｎｂｉｏ）に２時間室温で結合させるのを防ぐ。４分の１倍のモル過剰量のｐ／ＭＨＣモノマーをｓｓＤＮＡ−ＳＡＣと３７°Ｃで２０分間結合させた。ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体を１時間３７°Ｃで２００μｌ培地においてＤＮＡアレイに混成し、ＰＢＳ内３％ＦＢＳでリンスした。Ｔ細胞（１０６／１００μｌ培地）をアレイ上３７°Ｃで３０分間培養した。アレイをＰＢＳ内３％ＦＢＳでリンス氏、細胞捕捉を明視野（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００）および／または共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅ８００）を介して可視化した。ポストＴ細胞捕捉ｐ／ＭＨ四量体の染色を、蛍光ｐ／ＭＨＣ四量体および蛍光ｃＤＮＡ（Ｃｙ５−Ａ´および／もしくはＣｙ３−Ｂ´）を含む２００μｌの培地とアレイを培養することによって行った。アレイを画像化の前にＰＢＳ内３％ＦＢＳでリンスした。選択的Ｔ細胞解放実験に対して、３個の別々のアレイは、細胞を固定化するために用いた。ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩまたはＤＮａｓｅと四量体を、ＲＰＭＩ培地において１〜２時間３７°Ｃにおいた。ＤＮａｓｅをシグマから、すべての他の酵素をＮＥｂｉｏｌａｂｓから購入した。
【０２３８】
ｐ／ＭＨＣ比較研究に対して、ＳｕｐｅｒＥｐｏｘｙおよびＳｕｐｅｒＰｒｏｔｅｉｎ（それぞれ共有結合および疎水性表面を示す）をＡｒｒｙｉｔ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から購入した。ポリカルボン酸塩ヒドロゲル（親水性）スライドをＸａｎＴｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。蛍光ＭＡＲＴ−１四量体を、各スライドに対する製品説明書に従ってプリントした。細胞分類画像をＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）で定量化し、Ｏｒｉｇｉｎ（Ｏｒｉｇｉｎ  Ｌａｂ，ＭＡ）を有するＨｉｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ＮＡＣＳ  ｎ＝２，Ｒ２＝０．９５，共有結合  ｎ＝２．１，Ｒ２＝０．９７）に固定した。
【０２３９】
形質導入したＴ細胞をＭＡＲＴ−１領域のみに固定化した。捕捉した細胞の抗原特性を、細胞をアレイ上に固定した後に蛍光ＭＡＲＴ−１およびＣＭＶ  ｐ／ＭＨＣ四量体（それぞれ赤および緑）で染色することによって二重に確認した。
【０２４０】
図１３Ｂおよび図１３Ｃにおいて示した結果は、細胞がＣＭＶに特異的に染色せず（図１３Ｂにおける点線の円）細胞捕捉が特異的であった（図１３Ｃの共焦点および明視野画像全体）ことを示す。
図１０：内因性初代ヒトＴ細胞のＮＡＣＳ分類および検出
【０２４１】
末梢血から単離した初代ヒトＴ細胞のＮＡＣＳ検出を行った。これは、末梢血から単離した初代ヒトＴ細胞の一般的な検出は、培養した細胞株よりも一般的に多くを要求するため、抗原特異性Ｔ細胞の単一集合は異なる血液細胞および様々な特異性のモノクローナルおよびポリクローナルＴＣＲを発現するＴ細胞の大きなバックグラウンド内に存在する。加えて、これらＴ細胞は、内因性のＴＣＲを発現する。上述の実施例において見られる同じ性質のＮＡＣＳを用いるかどうかを調査した明細書は、内因性初代ヒトＴ細胞に等しい。
【０２４２】
患者ＮＲＡ１１およびＮＲＡ１３からの凍結白血球除去輸血サンプルを、ＮＡＣＳ分類の前にＣＤ８＋で満たした。
【０２４３】
患者ＮＲＡ１１およびＮＲＡ１３におけるＥＢＶ特異およびＣＭＶ特異Ｔ細胞の量および特異性を蛍光ＥＢＶおよびＣＭＶ  ｐ／ＭＨＣ四量体で染色しフローサイトメトリによって分析した。
【０２４４】
図１４において示した結果は、ＮＲＡ１３から単離したリンパ球は高濃度のＥＢＶ特異性Ｔ細胞（４．９％）および最少ＣＭＶ特異性Ｔ細胞を有するが（図１４Ａ参照）、ＮＲＡ１１から単離したリンパ球は、高濃度のＣＭＶ特異性Ｔ細胞（９％）および低濃度のＥＢＶ特異性細胞の集団を有する（０．１２％）（図１４Ｂ参照）ことを示す。
【０２４５】
この画定後、患者ＮＲＡ１１およびＮＲＡ１３からのリンパ球を、一標的検出および多重検出実験におけるＮＡＣＳ技術を用いて分析した。
【０２４６】
一標的検出実験に関して、患者ＮＲＡ１３からの凍結リンパ球サンプルをＣＤ８＋で増やして、実施例６の手順によって与えられたＣＭＶおよびＥｐｓｔｅｉｎ−ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶ  ＢＭＬＦＩ２５９−２６７／ＨＬＡ−Ａ２．１）ｐ／ＭＨＣアレイに塗布した。
【０２４７】
多重検出に関して、１：１のＥＢＶ特異およびＣＭＶ特異ＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、ＮＲＡ１３リンパ球を患者ＮＲＡ１１からのＣＭＶ特異Ｔ細胞と結合させることによって生成し、混合物を実施例６の手順によって与えられたＣＭＶおよびＥｐｓｔｅｉｎ−ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶ  ＢＭＬＦＩ２５９−２６７／ＨＬＡ−Ａ２．１）ｐ／ＭＨＣアレイに塗布した。
【０２４８】
図１５において示した結果は、両実験においてＴ細胞を選択的および定量的に検出したことを示す。とくに、患者ＮＲＡ１３のリンパ球で行った検出において、Ｔ細胞のみがＥＢＶ領域内で捕捉された（図１５Ａ参照）。ＮＲＡ１１およびＮＲＡ１３の１：１の混合物から検出したＴ細胞（左パネル）は、ＥＢＶおよびＣＭＶに特異的に変化した。とくに、ＮＡＣＳ細胞分類および蛍光ｐ／ＭＨＣ四量体染色後、集団は適切な抗原特異性に対して相補的に染色した（図１５Ｂ）。
【０２４９】
患者ＮＲＡ１３からのＴ細胞は、ＥＢＶ特異的Ｔ細胞を有する細胞の混合物をつくるように連続的に希釈した（ＦＡＣＳによって〜０．４％，０．２％，および０．１％）（図１４Ｃ）。ＥＢＶ特異Ｔ細胞の３個の混合物を、ＥＢＶ／ＨＬＡ−Ａ２．１四量体でエンコードしたアレイ上で検出し、図１５Ｄにおいて示す。
【０２５０】
図１５Ｃおよび図１５Ｄにおいて示す結果は、それぞれの一撃が〜０．１％程度低い頻度であったことを示す（図１５Ｄ、暗いグレーの矢印）。捕捉領域内の未染色細胞（黒色矢印）はすべての希釈で一定であり（−１−２細胞／スポット）、非特異的な相互作用からのバックグラウンドレベルを示す。Ｔ細胞を図示する目的で固定化した後蛍光ｐ／ＭＨＣ四量体染色を組み込んだが、補足した細胞の特異性は、アレイの登録からそれぞれ画定することに留意されたい。
実施例１１：ＮＡＣＳアプローチを用いて固定化したＴ細胞の制限エンドヌクレアーゼを通した制御された選択的解放
【０２５１】
ガラス上に固定した抗原特異Ｔ細胞は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）およびサイトカイン分泌アッセイ等の多くが［参考文献５，７］通常行われ基質に局在化した細胞に適合するため、第２分析にすぐに利用できる。しかし、いくつかの他の関連するアッセイは、それらをＴ細胞表現型またはゲノム／ｍＲＮＡ分析に用いるように設計した、または簡単に、表現型の培養が捕捉した細胞を解放する方法を必要とする。いずれかの解放機構は、理想的には与えられた細胞種類に対して選択的である。ＮＡＣＳに対して、ＤＮＡ限界かどうかを見極める出願は、制限エンドヌクレアーゼの配列特異性を用いることによって選択的に開裂する。
【０２５２】
独特の制限酵素部位を各ＤＮＡ配列に組み込んだ本明細書は、細胞分類のために使用し、抗原特異Ｔ細胞の異なる集団の接着は、事実、別々に制御されたことがわかった（図１６ｂ）。
【０２５３】
とくに、実施例６のオリゴヌクレオチドＡおよびＢは、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩに対してそれぞれ特異的な６個のｂｐ制限酵素部位を組み込むことによって修飾し、図１６Ａにおいて概略的に示したアプローチにしたがってオリゴヌクレアーゼＡＥｃｏＲＩおよびＢＢａｍＨＩを獲得した。
【０２５４】
したがって、ＤＮＡマイクロアレイは、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素部位を有する直行する配列でプリントした。実施例７において説明したように準備したＪｕｒｋｅｔａ−ＭＡＲＴ−１およびＪｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞および親油性染料で予め染色した（それぞれ赤および緑）を、その後実施例６において説明した手順に従ってＤＮＡ配列ＡＥｃｏＲＩおよびＢＢａｍＨＩでプリントしたアレイ上で分類した。
【０２５５】
図１６Ｂにおいて示した結果は、ＡＥｃｏＲＩおよびＢＢａｍＨＩの分類および対応する制限酵素でその後処理した選択した標的の正しい解放を示す。
【０２５６】
とくに、赤色染色を暗いグレーおよび緑色染色を明るいグレーで示した図１６Ｂｉにおいて示すように、細胞を最初にアレイ上に固定した。
【０２５７】
Ｔ細胞を固定後、アレイを、ＢＢａｍＨＩスポットを開裂して結合Ｊｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞を選択的に解裂するＢａｍＨＩで処理した（図１６Ｂｉｉ）。反対に、別々のしかし同じアレイ上で、Ｊｕｒｋｅｔα−Ｔｙｒ細胞をＥｃｏＲｉで処理後に解放した（図１６Ｂｉｉｉ）。相補的なエンドヌクレアーゼ（ＥｃｏＲｉ対状態（ｉｉ）またはＢａｍＨＩ対状態（ｉｉｉ））で酵素処理する第２ラウンドは、残った接着細胞を除去した（図１６ｉｖ）。代案として、すべての捕捉細胞（ｉ）は、ＤＮａｓｅを付加する単一ステップにおいて非選択的に解放した。
実施例１２：溶液において捕捉した標的のＮＡＣＳ検出を行う手順
【０２５８】
細胞の標的集団を、エンコード捕捉剤を基質に結合する前に標的に接触させる手順に従って捕捉する。
【０２５９】
このアプローチにしたがって行った一連の例示的な実験を図１７において示す。生体サンプルにおける対象のバイオマーカーを、溶液におけるポリヌクレオチドエンコード捕捉剤に結合させる。結合後、全サンプルをｃＤＮＡでプリントした基質に塗布する。生体サンプルは、基質に塗布するとき、ＤＮＡハイブリタイゼーションによって媒介した空間的に離れた場所におく。ポリヌクレオチドエンコード捕捉剤に結合した積荷を、その後、当業者によって特定可能な従来の蛍光および他の可視化技術を用いて特定する。
【０２６０】
図１７の実験において、エンコードポリヌクレオチド捕捉剤は、溶液における細胞表面上の生体標的に結合させるのに用いることができる。これは、パネルＡにおいて実証され、蛍光ポリヌクレオチドエンコードチロシナーゼ／ＨＬＡ−Ａ２．１ｐ／ＭＨＣ四量体をＪｕｒｋａｔα―Ｔｙｒ細胞を染色しフローサイトメトリで分析するのに用いた。これを、蛍光チロシナーゼ／ＨＬＡ−Ａ２．１ｐ／ＭＨＣ四量体と直接比較した。両方の試薬は同じ強度でＪｕｒｋａｔα―Ｔｙｒ細胞を染色した。ポリヌクレオチドエンコードチロシナーゼ／ＨＬＡ−Ａ２．１ｐ／ＭＨＣ四量体で予め染色したＪｕｒｋａｔα―Ｔｙｒ細胞を捕捉し、ＤＮＡハイブリダイゼーションによって媒介したアレイ上で検出した（パネルＢ）。図を参照して結果の説明を与える。
実施例１３：タンパク質結合分子を有するさらなる最適化骨格捕捉剤
【０２６１】
さらなる最適化骨格を、すべてのサブクラスＩｇＧのＦｃドメインに結合する細菌再結合の族でありＩｇＡ，ＩｇＥ，ＩｇＭおよびＩｇＤにおいて限定されたタンパク質Ａ，タンパク質Ｇおよびタンパク質Ａ／Ｇによって与える。とくに、これらのタンパク質は、ＤＮＡをＮＨＳ−アミドカップリング化学を解してタンパク質表面上の遊離リジン残基にランダムに付着させる実施形態において非最適化骨格として機能する。結合タンパク質は、所定のバイオマーカーに対するＩｇＧ抗体である（例えばＴ細胞上に見られるＣＤ３）。モル過剰のＩｇＧ抗体をｓｓＤＮＡ−タンパク質Ａ／Ｇで培養し、対象の生体標的を分類および捕捉するのに用いる（例えば、抗−ＣＤ３−タンパク質Ａ／Ｇ−ｓｓＤＮＡ接合体は、細胞の複合体混合物からＴ細胞を分類するのに用いる）。
【０２６２】
図１８において示したのは、分岐ペプチドの仮説の図である。ここで、ペプチドの長さは、Ｎ末端アラニンからＣ末端チロシン残基まで伸びた９個のアミノ酸である。Ｃ末端から位置４におけるリシン残基で分岐点を有し、この骨格を２価とする。Ｎ末端での反応性マレイミド基は、遊離を有する２個の結合タンパク質に付着し、エンコードポリヌクレオチドは、Ｃ末端のチロシン残基の隣の遊離地オールにＮＨＳ−アミドカップリングを解して付着する。結合タンパク質およびエンコードポリヌクレオチドに対する付着部位はこの分岐ペプチドアプローチで分離するため、その結果できた捕捉剤はすべて極性であり最適される。例示的な結合分子は、システイン残基（Ａｎａｓｐｅｃ，♯２９８９７）を有するＲＧＤペプチドである。検出する標的には、インテグリン受容体（ＡＴＣＣ，♯ＣＣＬ−９２）を発現する細胞がある。
【０２６３】
他の最適化したタンパク質骨格は、第１アミノ酸配列によって示したタンパク質ＳＡＣ３である。HMGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEAMNTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVGGSGCGGSGCGGSGCP（配列ＩＤ番号２５）
【０２６４】
この代案の最適化したストレプトアビジン骨格は、エンコードポリヌクレオチドが特異的に付着する部位に対するＣ末端での３システイン残基を有する。モル過剰のビオチン化ｐ／ＭＨＣ（チロシナーゼ／ＨＬＡ−Ａ２．１）にｓｓＤＮＡ−ＳＡＣ３を結合させることによって、その結果できた捕捉剤は、複合体混合物から標的Ｔ細胞を検出するのに用いる。図１９において、最適化骨格ＳＡＣ３のＴ細胞捕捉（Ｊｕｒｋａｔα―Ｔｙｒ細胞）効果（右パネル）を、最適化骨格ＳＡＣと直接比較する。細胞捕捉効果は同じである。
【０２６５】
いずれかの形のＳＡＣ最適化機構は、４：１の比のビオチンとの結合を保持する。明細書は、１個以上のＳＡ最適化および特定の標的と異なる最適化ＳＡの機能を提供する。骨格は、標的に結合する能力の観点から最終的に選択する。図１８において説明したような。分岐ペプチドは、ＳＡ結合の変わりに多重結合として使用し、実験設計によって一重結合もしくは二重結合またはｎ結合を有する。
実施例１４：タンパク質結合分子を有する捕捉剤
【０２６６】
代案の結合タンパク質および骨格を用いる。インテグリンは、概してペプチド様アルギニンーグリシン-−アスパラギン酸から成る細胞外マトリクスタンパク質に結合する二量体細胞表面受容体である。ＲＧＤ様を有するビオチン化ペプチドは、Ａｎａｓｐｅｃ（♯６２３４７）から購入する。これらのタンパク質結合分子は、ＳＡＣ−Ａのような最適化骨格に組み込み、３Ｔ３線維芽細胞（ＡＴＣＣ，＃ＣＣＬ−９２）等のインテグリンを発現する標的細胞を含む細胞集団を分類するのに用いる。
実施例１５：リンカーを有する捕捉剤
【０２６７】
リンカーは、結合タンパク質を骨格に接続させる機能を果たす。これは、ペプチド配列から成る。例えば、リンカーＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列ＩＤ番号２６）はＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣ分子のＣ末端に付加する。ビオチン分子は、酵素ＢｉｒＡリガーゼを有するその結果できたリンカーに付着する。このビオチン化ｐ／ＭＨＣ構成物は、最適化Ａ−ＳＡＣ骨格と接合して、ｃＤＮＡプリント基質上の抗原特異細胞を分類するのに用いる。
【０２６８】
他のリンカーは、ペプチドＬＣＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲ（配列ＩＤ番号２７）から成り、これもＭＨＣ分子のような結合タンパク質のＣ末端に付加する。グリシン残基は、酵素ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）でアルデヒド基に修飾する。ヒドラジドを含む骨格（例えば、ＳＡＮＨ（スクシンイミド６−ヒドラジノニコチン酸酢酸ヒドラジン、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を骨格ＳＡと反応させる）は、アルデヒド−ＭＨＣ結合タンパク質に付着するのに用いることができる。
【０２６９】
リンカーの例は、ポリウンアクリルＲＮＡ配列ＵＵＵＵＵＵＵＵＵ（配列ＩＤ番号２８）である。このリンカーは、ＲＮａｓｅの存在下で解裂し、エンドリボヌクレアーゼは非対（すなわち単一のらせん鎖）ＣおよびＵ残基の３´端を解裂する。
実施例１６：細胞捕捉の表面マーカーをＮＡＣＳでプロファイルする免疫ＰＣＲ
【０２７０】
アレイ上で捕捉した細胞をさらに分析する。一つの分析アッセイは、免疫ＰＣＲである［参考文献５１］。ここで異なるＤＮＡタグで標識化した抗体（ＤＥＡＬ接合体）は、対象に標的に結合させるのに使用し、この実施例において、細胞表面上で発現するバイオマーカーである。結合後、抗体上のＤＮＡタグを拡大してＰＣＲを用いて検出した。これは、溶液からタンパク質を機能させることを示し、明細書は、この概念が、バイオメーカーは細胞表面に固定されているとき実現可能であることを示す。図２０（上部右パネル、フローサイトメトリによって実証した）に示したＥＧＦＲ（ＣＤ細胞）を発現する細胞株およびＥＧＦＲを発現しない細胞株（Ｊｕｒｋａｔ細胞）は、ともにα−ＥＧＦＲ−ｓｓＤＮＡ  ＤＥＡＬ接合体で染色する。染色後、ＥＧＦＲ抗体上のタグをＰＣＲおよびＱ−ＰＣＲを用いて詳しく説明した（下部パネル）。タグの存在は、１４．６サイクル（ＣＤ細胞）および２３．２サイクル（Ｊｕｒｋａｔ細胞）内に検出した。コレは４００：１のノイズに対するシグナルに関連する。
【０２７１】
平行して、ＤＮＡでエンコードしたｐ／ＭＨＣ四量体をＴ細胞上のＴＣＲの存在を検出するのに用いた。２個の細胞株、一方はＭＡＲＴ−１抗原に特異的なＴＣＲを発現し（Ｊｕｒｋａｔａ―ＭＡＲＴ−１細胞）もう片方はチロシナーゼ抗原に特異的なＴＣＲを発現する（Ｊｕｒｋａｔα―Ｔｙｒ細胞、両方の細胞株は蛍光ｐ／ＭＨＣ四量体で染色することによって確認しフローサイトメトリによって分析した、図２０、上部左パネル）を、ＤＮＡでエンコードしたＭＡＲＴ−１／ＨＬＡ−Ａ２．１ｐ／ＭＨＣ四量体で染色した。ＤＮＡタグは、ＰＣＲによって拡大してゲル電気泳動で検出した。Ｊｕｒｋａｔα−ＭＡＲＴ−１細胞は、１５サイクル内で検出したが、接合ＴＣＲを発現しないＪｕｒｋａｔα―Ｔｙｒ細胞は、１０サイクル前後でゲル内に現れた。したがって、ＭＡＲＴ−１特異ＴＣＲの存在を特異的に検出した。
実施例１７：ＮＡＣＳおよびＤＥＡＬ接合を用いたＴ細胞の動的機能プロファイリング
【０２７２】
本明細書は、ｐ／ＭＨＣ  ＮＡＣＳでＥＬＩＳＰＯＴ型サンドウィッチアッセイを組み込むことによって捕捉したマウスＴＣＲトランスジェニック膵細胞「ｏｎ−ｔｈｅ−ｓｐｏｔ」によって生成したサイトカインを検出する。３個のマウス抗サイトカイン抗体（ＩＬ−２，ＩＦＮ−ｙおよびＴＮＦ−ａ）をそれぞれＤＮＡ鎖Ａ´，Ｂ´，およびＣ´でエンコードした。Ｈ−２Ｋｂ−ＯＶＡ２５７−２６４ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体をすべての３個のらせん鎖にエンコードした。ｓｓＤＮＡ−ｐ／ＭＨＣ四量体および抗体接合体をプールして、相補的ならせん鎖Ａ，ＢおよびＣにプリントしたマイクロアレイに組み込んだ。マウスＯＴ１リンパ球（ＴＣＲトランスジェニック由来で、ほとんどの膵細胞はモデル抗原ＯＶＡ２５７−２６４に特異的である）を、その後アレイ上に播種した。２，５、または１８時間培養した後、プールしたサイトカイン検出抗体を加えて共焦点顕微鏡でスライドを画像化した（図２２Ａ）。    炎症性サイトカインＩＦＮ−ｙは、５および１８の時点で検出し、時間とともに平均径が増加し、分子拡散および持続分泌に寄与する拡散塊として現れた（５時間で直径５０〜１００μｍ）。各一撃の局所的近接の紙面は、各蛍光塊は単一細胞であったが、隣り合う細胞は比応答性であることがわかり（図２２Ｂ）、各ＩＦＮ−ｙ一撃が単一細胞由来であることが示唆される。ＩＦＮ−ｙ塊の数は、５および１８時間の間は３で一定であり、その時間は活性化Ｔ細胞の数が増加しなかったことを意味する。高濃度のマウスＩＬ−２およびＴＮＦ−ａはこれらの時点では検出されなかった。
【０２７３】
行った実施例において、本明細書は、Ｔ細胞にとくに関連して説明した、高効率な標的検出および分類のための強固なモジュール式ｐ／ＭＨＣアレイの生成方法を説明する。直行するＤＮＡ配列の大きなセット［参考文献１９，２４］は、Ｔ細胞スクリーニング実験に対する高次ｐ／ＭＨＣアレイのモジュール式組み立てを可能にする（例えば、一つのセットのＤＮＡ配列は、いずれかの組み合わせのｐ／ＭＨＣアレイを生成するために互換的に用いる）。これは、近年、新規の抗原ペプチドがマウスおよびヒトにおいて多色フローサイトメトリを用いたＣＤ８＋スクリーニング実験を通して高濃度で発見された［参考文献３３，３４］ＴＣＲペプチドエピトープの発見の分野ですぐに用いることができる（２０００もの異なるｐ／ＭＨＣ四量体を準備し試験した）。
【０２７４】
ＮＡＣＳアレイは、この実験を簡素化することが期待される。単一のｐ／ＭＨＣモノマーを生成する特定の通常の方法は時間がかかり困難であるが、近年、従来のペプチド交換技術を用いて１０００エレメントｐ／ＭＨＣライブラリを比較的真っすぐに敏速に構築することができるようになった［参考文献３４〜３６］。これらのペプチド交換技術のＮＡＣＳへの組む込みは、現実的である。ＮＡＣＳアレイは、再現性および均一性等の重要な基準において評価した従来のスポット化アレイより優れている。細胞分類にＤＮＡ配列を用いる多用途は、プログラムすることができるように利用し、下流分析の制限エンドヌクレアーゼで固定化したＴ細胞の標的集団を選択的に解放できる。ｐ／ＭＨＣ四量体アレイの性能、容易さおよびモジュール式集合によって、ＮＡＣＳ多重のＴ細胞検出に対する多用途のプラットフォームとして約束される。
【０２７５】
本明細書はまた、ＮＡＣＳプラットフォームの多くの利点も実証する。細胞を捕捉する表面結合ｐ／ＭＨＣ四量体を利用する特定の文献のアプローチよりも優れている。細胞分類は通常のＤＮＡプリント技術を介して準備したガラス基板上で行うため、組み込むのが簡単で安価である。加えて、分類した細胞は選択的に解放でき、ＮＡＣＳ分類した細胞上の生体分析方法を展開することができる。
【０２７６】
本明細書は、ＮＡＣＳがＴＣＲ特異性に基づいたＴ細胞の多重分類に及ぶ用途を発見することを期待する。前述した実施例において用いたプラットフォームの主な成分−ストレプトアビジンーシステイン核および直行する単一らせん鎖ＤＮＡ配列−は、配向したカップリングおよび空間的対処を可能にするように合理的に開発した。したがって、子オプラットフォームは、ビオチンで標識化した結合タンパク質または小分子のいずれかの族に入る。ＳＡの価数の結果としてモノマーよりもｐ／ＭＨＣ四量体の親和性の増加は、他の捕捉剤まで広がり、抗体、アパタマーまたはペプチド等の高い親和性から中程度の親和性までの範囲のプローブを有する細胞アレイを生成することを可能にする。
【０２７７】
とくに、ＮＡＣＳアプローチは、ＭＨＣ複合体を含む治療および／または診断用途において用いる。ＭＨＣ複合体は、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の溝内にある抗原（ペプチド）の断片から成る。ＴＣＲの一部は、ＭＨＣに対する親和性を有し、様々な部分がペプチド抗原に対して親和性を有する。このペプチドは、非常に短いフラグメントであり（＜１０アミノ酸長さ）、そのため、ＴＣＲおよびＭＨＣ／抗原間の親和性は弱い。それにもかかわらず、多くの基礎的および臨床目的に対して、それらの抗原特異性によるＴ細胞の分類が非常に重要である。この分類は、免疫システムが感染症または癌等のいくつかの疾患に反応するかどうかを画定するのに用いる。また、黒色腫等の特定の癌の治療における用途を見つける様々な免疫治療の重要な鍵である。この場合、患者からのＴ細胞を回収し、遺伝子的に修飾して、特定の癌細胞を特定し殺すようにエンコードした抗原特異Ｔ細胞とする。
【０２７８】
一度修飾して、それらのＴ細胞を患者に戻す。この治療におけるすべてのステップには、Ｔ細胞を分類するステップがあるが、最後のステップ−Ｔ細胞が抗原特異Ｔ細胞を有するかどうかを特定するステップ−は、抗原特異性によってＴ細胞を分類するステップを含む。複合体混合物から様々な抗原特異性Ｔ細胞を分類する高親和性の試薬は、この治療の中核を成す。
【０２７９】
他の実施例は、様々な巻くタンパク質によって細胞を分類するのが望ましいが、それらの巻くタンパク質は抗体ベースの分類方法の良い「操作」を提供しない。
【０２８０】
例は、ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩと呼ぶＥＧＦＲタンパク質の遺伝子的突然変異体を発現する癌細胞である。ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩは、発癌タンパク質であるー重要な遺伝子的突然変異が癌を導くことを意味する。しかし、それはまた膜タンパク質であり、タンパク質のほとんどの細胞外部位が解裂される。残りの部分は、小さな「操作」を示し、ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩに対する抗体は、タンパク質に対して弱い親和性しか示さない。ＥＧＦＲ，ＥＧＦＲ−ＶＩＩＩなどの様々な癌に関連するタンパク質による腫瘍内の細胞の多重分類は、癌に関する重要な診断情報を提供し、直接治療または組み合わせ治療に利用できる。
【０２８１】
要約すると、いくつかの実施形態においてここで与えるのは、標的検出のためのポリヌクレオチドエンコード捕捉剤、およびとくに標的結合成分、骨格成分および制御された方法でカップリングおよび分離できる標準化した分子単位によって形成したエンコード成分を有し、モジュール式ポリヌクレオチド捕捉剤および関連する構成方法およびシステムである。
【０２８２】
上述した実施例は、当業者に本明細書の捕捉剤、装置、システムのおよび方法の実施形態のつくり方および用途を完全に開示し説明するが、発明の範囲を限定することはない。当業者に明らかである本発明を行うための上述の修正は、以下の請求項の範囲内で行う。明細書におけるすべての特許文献および文献は、当業者の指標となる。本明細書に示したすべての参考文献は、各参考文献をそれぞれ全体に参照して組み込むように、参照して組み込む。
【０２８３】
背景、詳細な説明、および実施例において示した各文献（特許文献、特許明細書、雑誌文書、要旨、研究室マニュアル、本または他の明細書）のすベての説明は、参照して組み込む。さらに、提出した文書のハードコピーおよび関連するコンピュータ読み取りも共に参照して全体に組み込む。
【０２８４】
本発明は、特定の成分または生体システムに限定されず、もちろん変化することを理解されたい。また、ここで用いる技術は、特定の実施形態を説明する目的のみであり、限定することも理解されたい。本明細書および添付した請求項において用いたように、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明確に説明する内容がなければ単数有する。用語「複数の」は、明確に説明する内容がなければ２個またはそれ以上有する。断りのない限り、ここで用いるすべての技術的および科学的用語は、本発明の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【０２８５】
特定の方法および材料を本発明において説明するが、ここで説明するのと類似した方法および材料は、ここで説明する特定の実施例を試験するのに用いることができる。
【０２８６】
本発明の多くの実施形態を説明した。しかし、本発明の意味および範囲を逸脱することなく様々な修正をすることが可能である。したがって、他の実施形態は以下の請求項の範囲内とする。
【０２８７】
（参考文献）
1)  Altman,  J.D.;  Moss,  P.A.H.;  Goulder,  P.J.  R.;  Barouch,  D.H.;  McHeyzer-Williams,  M.G.;  Bell,  J.I.;  McMichael,  A.J.;  Davis,  M.M.  Science  1996,  274,94-96.
2)  Matsui,  K.;  Boniface,  J.J.;  Steffner,  P.;  Reay,  P.A.;  Davis,  M.M.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  1994,91,  12862-12866.
3)  McLaughlin,  B.E.;  Baumgarth,  N.;  Bigos,  M.;  Roederer,  M.;  DeRosa,  S.C.,  Altman,  J.D.;  Nixon,  D.F.;  Ottinger,  J.;  Oxford,  C.;  Evans,  T.G.;  Asmuth,  D.M.  Cytometry  A  2008,  73,  400-4010.
4)  Chattopadhyay,  P.K.;  Price,  D.A.;  Harper,  T.F.;  Betts,  M.R.;  Yu,  J.;  Gostick,  E.;  Perfetto,  S.P.;  Goepfert,  P.;  Koup,  R.A.;  De  Rosa,  S.C.;  Bruchez,  M.P.;  Roederer,  M.  Nat.  Med.  2006,  12,  972-977.
5)  Chen,  D.S.;  Soen,  Y  .;  Stuge,  T.B.;  Lee,  P.P.;  Weber,  J.S.;  Brown,  P.O.;  Davis,  M.M.  PLoS  Med.  2005,2,  1018-1030.
6)  Soen,  Y.;  Chen,  D.S.;  Kraft,  D.L.;  Davis,  M.M.;  Brown,  P.O.  PLoS  Biol.  2003,1,429-438.
7)  Stone,  J.D.;  Dernkowicz,  W.E.;  Stem,  L.J.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  2005,  102,  3744-3749.
8)  Deviren,  G.;  Gupta,  K.;  Paulaitis,  M.E.;  Schneck,  J.P.  J.  Mol.  Recognit.  2007,20,32-38.
9)  Haab,  B.B.;  Dunham,  M.J.;  Brown,  P.O.  Genome  Biology  2001,2,  1-13.
10)  Butler,  J.E.  ;  Ni,  L.;  Brown,  W.R.;  Joshi,  K.S.;  Chang,  J.;  Rosenberg,  B.;  Voss  Jr,  E.W.  Mol.  Immunol.  1993,30,  1  165-1  175.
1  1)  Butler,  J.  E.;  Ni,  L.;  Nessler,  R.;  Joshi,  K.S.;  Suter,  M.;  Rosenberg,  B.;  Chang,  J.;  Brown,  W.R.;  CantareroButler,  L.A.  JImmunol.  Methods,  1992,  150,  77-90.
12)  MacBeath,  G.;  Schreiber,  S.L.  Science  2000,289,  1760-1763.
13)  Lesaicherre,  M.  L.;  Lue,  Y  .P.R.;  Chen,  G.Y.J.;  Zhu,  Q.;  Yao,  Q.  J.  Am.  Chem.  Soc.  2002,  124,  8786
14)  Peluso,  P.;  Wilson,  D.;  Do,  D.;  Tran,  H.;  Venkatasubbaiah,  M.;  Quincy,  D.;  Heidecker,  B.;  Poindexter,  K.;  Tolani,  N.;  Phelan,  M.;  Witte,  K.;  Jung,  L.;  Wagner,  P.;  Nock,  S.  Anal.  Biochem.  2003,312,113-124.
15)  Kwon,  Y.;  Han,  Z.;  Karatan,  E.;  Mrksich,  M.;  Kay,  B.  K.  Anal.  Chem.  2004,  76,  5713-5720.
16)  Arenkov,  P.;  Kukhtin,  A.;  Gemmel,  A.;  Voloshchuk,  S.;  Chupeeva,  V.;  Mirzabekov,  A.  Anal.  Biochem.  2000,278,123-13  1.
17)  Kiyonaka,  S.;  Sada,  K.;  Yoshimura,  I.;  Shinkai,  S.;  Kato,  N.;  Hamachi,  I.  Nat.  Mater.  2004,  3,  58-64.
19)  Bailey,  R.C.;  Kwong,  G.A.;  Radu,  C.G.;  Witte,  O.N.;  Heath,  J.R.  J  Am.  Chem.  Soc.  2007,  129:  1959-1967.
20)  Boozer,  C.;  Ladd,  J.;  Chen,  S.F.;  Jiang,  S.T.  Anal.  Chem.  2006,  78,  15  15-15  19
21)  Niemeyer,  C.M.  Nano  Today  2007,2,42-52.
22)  Chandra,  R.A.;  Douglas,  E.S.;  Mathies,  R.A.;  Bertozzi,  C.R.;  Francis,  M.B.  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  Engl.  2006  45,  896-901.
23)  Hsiao,  S.C.;  Crow,  A.K.;  Lam,  W.A.;  Bertozzi,  C.R.;  Fletcher,  D.A.;  Francis,  M.B.  Angew.  Chem.  Int.  Ed.  Engl.  2008,47,  8473-7.
24)  Fan,  R.;  Verrnesh,  0.;  Srivastava,  A.;  Yen,  B.K.H.;  Qin,  L.;  Ahmad,  H.;  Kwong,  G.A.;  Liu,  C.C.;  Gould,  J.;  Hood,  L.;  Heath,  J.R.  Nat.  Biotechnol.  2008,  26,  1373  -  1378
25)  Ramachandiran,  V.;  Grigoriev,  V.;  Lan,  L.;  Ravkov,  E.;  Mertens,  S.A.;  Altman,  J.D.  J.  Immunol.  Methods  2007,  319,  13-20.
26)  Cameron,  T.O.;  Cochran,  J.R.;  Yassine-Diab,  B.;  Sekaly,  R.P.;  Stem,  L.J.  J.  Immunol.  2001,  166,74  1-745.
27)  Reznik,  G.O.;  Vajda,  S.;  Cantor,  C.R.;  Sano,  T.  Bioconj.  Chem.  2001,12,  1000-1004.
28)  Green,  N.M.  Methods  Enzymol.  1970,18,418-424.
29)  Johnson,  L.A.;  Heemskerk,  B.;  Powell,  D.J.;  Cohen,  C.J.;  Morgan,  R.A.;  Dudley,  M.E.;  Robbins,  P.F.;  Rosenberg,  S.A.  J.  Immunol.  2006,177,  6548-6559.
30)  Nishimura,  M.I.;  Avichezer,  D.;  Custer,  M.C.;  Lee,  C.S.;  Chen,  C.;  Parkhurst,  M.R.;
Diamond,  R.A.;  Robbins,  P.F.;  Schwartzentruber,  D.J.;  Rosenberg,  S.A.  Cancer  Res.  1999,  59,  6230-6238.
31)  Schumacher,  T.N.  Nat.  Rev.  Immunol.  2002,2,5  12-5  19.
32)  Morgan,  R.A.;  Dudley,  M.E.;  Wunderlich,  J.R.;  Hughes,  M.S.;  Yang,  J.C.;  Sherry,  R.M.;  Royal,  R.E.;  Topalian,  S.L.;  Kammula,  U.S.;  Restifo,  N.P.;  et  al.  Science  2006,  314,  126-129.
33)  Toebes,  M.;  Coccoris,  M.;  Bins,  A.;  Rodenko,  B.;  Gomez,  R.;  Nieuwkoop,  N.J.;  van  de  Kasteele,  W.;  Rimmelzwaan,  G.F.;  Haanen,  J.;  Ovaa,  H.;  Schumacher,  T.N.  Nat.  Med.  2006,  12,  246-25  1.
34)  Grotenbreg,  G.M.;  Roan,  N.R.;  Guillen,  E.;  Meijers,  R.;  Wang,  J.;  Bell,  G.W.;  Starnbach,  M.N.;  Ploegh,  H.L.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  2008,105,3831-3836.
35)  Bakker,  A.H.;  Hoppes,  R.;  Linnemann,  C.;  Toebes,  M.;  Rodenko,  B.;  Berkers,  C.R.;
Hadrup,  S.R.;  van  Esch,  W.J.;  Heemskerk,  M.H.;  Ovaa,  H.;  Schumacher,  T.N.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  2008,105,3825-3830.
36)  Sano,  T.;  Cantor,  C.R.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  1990,  87,  142-146.
37)  Szymczak,  A.L.;  Workman,  C.J.;  Wang,  Y.;  Vignali,  K.M.;  Dilioglou,  S.;  Vanin,  E.F.;  Vignali,  D.A.A.  Nat.  Biotechnol.  2004,22,  589-594.
38)  Garboczi,  D.N.;  Hung,  D.T.;  Wiley,  D.C.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  1992,89,3429-3433
39)  W  A  Hendrickson,  et  al.  PNAS  April  1,  1989  vol.  86  no.  7  2190-2194
40)  Christopher  Baugh,  et  al.,  J  Mol  Biol.  2000  Aug  4;301(1):117-28
41)  Jennifer  L.  Meagher,  et  al.,  Glycobiology  2005  15(10):  1033-1042
42)  C.  Bustamante,  et  al.,  Science  265  (1994)  1599-600
43)  John  B.  Hays,  et  al.,  Biopolymers,  8(4):  531  -  536
44)  Isaac  S  Carrico  et  a1  Nature  Chemical  Biology  3,  321  -  322  (2007)
45)  http://www.neb.com/nebecomm/products/cateol  .asp?#2  April  9,2009
46)  Schena  M,  Shalon  D,  Davis  RW,  Brown  PO.  Science.  1995  Oct  20;  270(5235):  467-70
47)  Dirks,  R.  M.;  Lin,  M.;  Winfree,  E.;  Pierce,  N.  A.  Nucleic  Acids  Research  2004,  32,  (4),  1392-1403
48)  Cardoso,  A.  A.;  Watt,  S.  M.;  Batard,  P.;  Li,  M.  L.;  Hatzfeld,  A.;  Genevier,  H.;  Hatzfeld,  J.  Exp.  Hematol.  1995,23,407-412
49)  Breslauer,  D.  N.;  Lee,  P.  J.;  Lee,  L.  P.  Mol.  BioSyst.  2006,2,  97-1  12
50)  Zimmermann,  M.;  Delamarche,  E.;  Wolf,  M.;  Hunziker,  P.  Biomedical  Microdevices  2005,  7,  (2),  99-  11  0
51)  Cano  et  al.,  Science  2  October  1992:Vol.  258.  no.  5079,  pp.  120  -  122
【図１】
2011518553.tif 000006
【図２】
2011518553.tif 000007
【図３】
2011518553.tif 000008
【図４】
2011518553.tif 000009
【図５】
2011518553.tif 000010
【図６】
2011518553.tif 000011
【図７】
2011518553.tif 000012
【図８】
2011518553.tif 000013
【図９】
2011518553.tif 000014
【図１０】
2011518553.tif 000015
【図１１】
2011518553.tif 000016
【図１２】
2011518553.tif 000017
【図１３】
2011518553.tif 000018
【図１４】
2011518553.tif 000019
【図１５】
2011518553.tif 000020
【図１６】
2011518553.tif 000021
【図１７】
2011518553.tif 000022
【図１８】
2011518553.tif 000023
【図１９】
2011518553.tif 000024
【図２０】
2011518553.tif 000025
【図２１】
2011518553.tif 000026
【図２２】
2011518553.tif 000027
【配列表】
2011518553000001.app
【国際調査報告】
2011518553.tif 000028
2011518553.tif 000029
2011518553.tif 000030