(57)【要約】  サンプル調製装置が開示される。サンプル調製装置は第１の開口部および第２の開口部の間の経路を規定するハウジング；および前記経路の一部分を閉めるサンプルフィルターを含む。サンプルフィルターは核酸と特異的に結合するモノリス吸着剤を含有する。目的の分析物と特異的に結合する捕捉剤によってコーティングされたガラスフリットを収容するサンプルフィルター、細胞膜を溶解する薬品が含浸された親水性基剤を収容するサンプルフィルター、カートリッジベースおよび一体型サンプル調製カートリッジも開示される。
2011502251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の開口部と第２の開口部の間の経路を規定するハウジング；および
サンプルフィルターが核酸と特異的に結合するモノリス吸着剤を含む、前記経路の一部分を占める前記サンプルフィルターを含むサンプル調製装置。
【請求項２】
前記サンプルフィルターが化学的に処理されて陽電荷を生成する、請求項１に記載のサンプル調製装置。
【請求項３】
前記モノリス吸着剤がガラスフリット、多孔質ガラスモノリスおよび多孔質モノリスポリマーからなる群より選択される、請求項１に記載のサンプル調製装置。
【請求項４】
前記モノリス吸着剤が多孔質ガラスフリットを含む、請求項３に記載のサンプル調製装置。
【請求項５】
前記モノリス吸着剤が多孔質ガラスモノリスを含む、請求項３に記載のサンプル調製装置。
【請求項６】
前記モノリス吸着剤が多孔質モノリスポリマーを含む、請求項３に記載のサンプル調製装置。
【請求項７】
前記サンプルフィルターが核酸と特異的に結合する第１の部分および目的の分析物と特異的に結合する第２の部分を含む、請求項１に記載のサンプル調製装置。
【請求項８】
前記目的の分析物がタンパク質である、請求項７に記載のサンプル調製装置。
【請求項９】
前記第１の開口部が前記第２の開口部の直径よりも大きな直径を有し、且つ前記サンプルフィルターが前記第２の開口部のごく近傍に位置する、請求項１に記載のサンプル調製装置。
【請求項１０】
前記フリットの側面が前記経路の輪郭に対して先細である、請求項９に記載のサンプル調製装置。
【請求項１１】
前記ハウジングが前記第１のサンプルフィルターのごく近傍に留置された第２のサンプルフィルターをさらに含む、請求項１に記載のサンプル調製装置。
【請求項１２】
前期ハウジングが前記第１の開口部の近傍に留置されたエアロゾルフィルターをさらに含む、請求項１に記載のサンプル調製装置。
【請求項１３】
前記ハウジングがピペットチップ構造にある、請求項１に記載のサンプル調製装置。
【請求項１４】
第１の開口部と第２の開口部の間の経路を規定するハウジング；および
サンプルフィルターが目的の分析物と特異的に結合する吸着剤を含む、前記経路の一部分を占める前記サンプルフィルターを含むサンプル調製装置；および
前記調製装置と接続するよう設計された第１のポート；
液状物供給装置と接続するよう設計された第２のポート；および
前記第１のポートを前記第２のポートに接続する第１の導管を含むカートリッジベースを含む一体型サンプル調製カートリッジ。
【請求項１５】
前記カートリッジベースがポリカーボネート、ポリスチレンおよびポリプロピレンからなる群から選択される材料より製造される、請求項１４に記載の一体型サンプル調製カートリッジ。
【請求項１６】
前記液状物供給装置が流動制御ステーションである、請求項１４に記載の一体型サンプル調製カートリッジ。
【請求項１７】
前記の第２のポートがルアー起動バルブを含む、請求項１４に記載のサンプル調製カートリッジ。
【請求項１８】
前記カートリッジベースが：
第３のポート；および
前記第３のポートを前記第１のポートに接続する第２の導管をさらに含む、請求項１４に記載の一体型サンプル調製カートリッジ。
【請求項１９】
前記第３のポートがセルフシール式ポートである、請求項１８に記載の一体型サンプル調製カートリッジ。
【請求項２０】
前記の第３のポートが隔壁または一方向バルブを含む、請求項１８に記載の一体型サンプル調製カートリッジ。
【請求項２１】
上面および底面を有するベースボディ：
前記ベースボディの前記上面に形成され且つサンプル調製装置と接続するよう設計される第１のポート；
前記ベースボディの前記底面に形成され且つ液状物供給装置と接続するよう設計される第２のポート；および
前記第１のポートを前記第２のポートに接続する第１の導管を含むカートリッジベース。
【請求項２２】
１つまたはそれ以上の追加的ポート、および
前記１つまたはそれ以上の追加的ポートを前記第１のポートに接続する１つまたはそれ以上の追加的導管をさらに含む、請求項２１に記載のカートリッジベース。
【請求項２３】
第１の開口部と第２の開口部の間の経路を規定するハウジング；および
ガラスフリットが目的の分析物と特異的に結合する捕捉剤によってコーティングされる、前記経路の一部分を占める前記ガラスフリットを含むサンプル調製装置。
【請求項２４】
前記捕捉剤が抗体である、請求項２３に記載のサンプル調製装置。
【請求項２５】
前記捕捉剤がレクチンである、請求項２３に記載のサンプル調製装置。
【請求項２６】
第１の開口部と第２の開口部の間の経路を規定するハウジング；および
フィルターが含浸された細胞膜を溶解する薬品を有する親水性基剤を含む、前記経路の一部分を占める前記フィルターを含むサンプル調製装置。
【請求項２７】
前記親水性基剤がＦＴＡペーパーである、請求項２６に記載のサンプル調製装置。
【請求項２８】
液状サンプルを容器内に留置すること；
前記液状サンプルの少なくとも一部を：
第１の開口部と第２の開口部の間の経路を規定するハウジング；および
サンプルフィルターが分析物と特異的に結合する材料を含み、
前記液状サンプルの一部を前記第１の開口部を経て且つ前記フィルターを通過して前記ハウジングに取出し、且つ前記分析物が前記フィルターを通過する間に前記フィルターに結合する、前記経路の一部分を占める前記フィルターを含むサンプル調製装置に取出すること；
前記サンプル調製装置より流出する間に前記液状サンプルの一部が前記フィルターを２度目に通過する、前記サンプル調製装置より前記第１の開口部を経て前記液状サンプルの一部を排出すること；および
溶離バッファーが前記サンプル調製装置に流入および流出する際に前記フィルターを通過し、前記溶離バッファーを前記第１の開口部を経て前記サンプル調製装置内に取出し且つ前記溶離バッファーを前記サンプル調製装置より前記第１の開口部を経て排出することにより前記フィルターから前記分析物を溶離することを含む、前記液状サンプルから前記分析物を精製するための方法。
【請求項２９】
洗浄バッファーが前記サンプル調製装置に流入および流出する際に前記フィルターを通過し、前記洗浄バッファーを前記第１の開口部を経て前記サンプル調製装置内に取出し且つ前記洗浄バッファーを前記第１の開口部を経て前記サンプル調製装置より排出することにより前記フィルターを洗浄することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記洗浄操作が２回またはそれ以上反復される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記のサンプル取出およびサンプル排出操作が、前記液状サンプルのすべてが前記フィルターを少なくとも１回通過するまで反復される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記分析物が核酸であり且つ前記フィルターがガラスフリットを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプル調製装置がピペットチップ構造を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記の取出、排出および溶離操作が電子ピペッターによって制御される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記の取出、排出および溶離操作がロボット式ピペッティングステーションによって制御される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
第１の開口部と第２の開口部の間の経路を規定するハウジング；および
サンプルフィルターが分析物と特異的に結合する材料を含み且つサンプルがサンプル調製装置を通過する際に前記サンプルフィルターを通過する、前記経路の一部分を占めるフィルターを含む前記サンプル調製装置に前記サンプルを通過させること；および
前記サンプルおよび溶離溶液が同一の開口部を経て前記ハウジングに流入および流出する、前記溶離溶液による前記サンプルフィルターと結合した分析物を溶離することを含む前記サンプルから前記分析物を精製するための方法。
【請求項３７】
前記サンプル調製装置が前記サンプル調製装置を受容するよう設計された第１のポートおよび液状物供給装置を受容するよう設計された第２のポートを含むカートリッジベースに着接する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
洗浄溶液が同じ開口部を経て前記ハウジングに流入および流出する、前記洗浄溶液によって前記フィルターを洗浄することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
第１の開口部と第２の開口部の間の経路を規定するハウジング；および
サンプルフィルターが目的の分析物と特異的に結合するモノリス吸着剤を含む、前記経路の一部分を占める前記サンプルフィルターを含むサンプル調製装置；
前記サンプル調製装置を受容するよう設計された第１のポート；
液状物供給装置を受容するよう設計された第２のポート；
前記第１のサンプルポートと前記第２のサンプルポートを接続する導管を含むカートリッジベース；および
前記サンプル調製装置および前記カートリッジベースにおける流動物の流動を制御する、前記カートリッジベースに接続される、液状物供給装置を含むサンプル精製システム。
【請求項４０】
前期液状物供給装置が前記ハウジング上の同一の開口部を経て前記サンプル調製装置に液状物を供給および取出する、請求項３９に記載のサンプル精製システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術分野は、生化学技術におけるサンプル調製装置であり、且つ具体的には、サンプルのろ過、分離および精製のための多孔質モノリスフィルターを用いたサンプル調製装置である。
【背景技術】
【０００２】
サンプル中の塩、界面活性剤、および他の夾雑物の存在は、サンプルの生化学的分析にとって有害となりうる。生化学技術において目的の分析物を含有する液状サンプルより溶媒、溶質、および他の分子／物質を除去するために多くのサンプル調製装置が開発されてきた。
【０００３】
たとえば、米国特許第６，０４８，４５７号および第６，２００，４７４号はタンパク質およびペプチドの精製のためにその中にクロマトグラフィ媒質を有するピペットチップを記載する。クロマトグラフィ媒質は、典型的にはＣ４、Ｃ１８またはポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチエレン、酢酸セルロース、ポリスチレン、ポリスチレン／アクリロニトリル共ポリマーおよびＰＶＤＦなどの強陽イオン樹脂により官能基付加されたガラスビーズよりなる。米国特許第６，５３７，５０２号もサンプルの分離および精製のために、ピペットチップの内面上に固形基質コーティングを有するサンプル精製ピペットチップを記載する。固形基質はポリテトラフルオロエチレン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリスチレン、ポリスチレン／アクリロニトリルコポリマーおよびポリフッ化ビニリデンなどのポリマー基材より組成される。
【０００４】
しかし、使用が容易であり且つ低コストで製造することのできるサンプル調製装置に対するニーズはまだ存在する。
【０００５】
（関連する明細書の相互参照）
本明細書は、２００７年１０月３１日に出願され、その主題全体が本明細書に参照文献として援用される「核酸を精製するための装置、システムおよび方法」と題された米国特許明細書第１１／９３３，１１３号の部分的延長である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
サンプル調製装置が開示される。サンプル調製装置は第１の開口部および第２の開口部の間の経路を規定するハウジング；および前記経路の一部分を閉めるサンプルフィルターを含む。サンプルフィルターは核酸と特異的に結合するモノリス吸着剤を含有する。目的の分析物と特異的に結合する捕捉剤によってコーティングされたガラスフリットを含有するサンプルフィルター、および細胞膜を溶解する薬品を含浸した親水性基剤を含有するサンプルフィルターも開示される。
【０００７】
一体型サンプル調製カートリッジも開示される。一体型サンプル調製カートリッジはサンプル調製装置およびカートリッジベースを含む。サンプル調製装置は第１の開口部および第２の開口部の間の経路を規定するハウジング、および経路の一部分を占めるサンプルフィルターを含み、サンプルフィルターは目的の分析物と特異的に結合する吸着剤を含む。カートリッジベースはサンプル調製装置と接続するよう設計された第１のポート、液状物供給装置と接続するよう設計された第２のポート、および第１のポートを第２のポートと接続する第１の導管を含む。
【０００８】
サンプル精製システムも開示される。サンプル精製システムはサンプル調製装置、カートリッジベースおよび液状物供給装置を含む。
【０００９】
サンプルより分析物を精製する方法も開示される。方法は、サンプルフィルターが前記分析物と特異的に結合する材料を含み且つサンプルがサンプル調製装置を通過する際にサンプルフィルターを通過する、第１の開口部と第２の開口部の間の経路を規定するハウジング、および経路の一部分を占めるフィルターを含む装置にサンプルを通過させること；およびサンプルおよび溶離溶液が同じ開口部を経てハウジングに流入し流出する、サンプルフィルターに結合した分析物の溶離溶液による溶離を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
「発明を実施するための形態」は、同様の番号が同様の要素に対応する以下の図面を参照する。
【００１１】
【図１Ａ−Ｄ】図１Ａ〜１Ｄは１つのサンプル調製装置の多様な実施形態の模式図である。
【図２Ａ−Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、１つの一体型サンプル調製装置の１つの実施形態の３次元（図２Ａ）、上面（図２Ｂ）および下面（図２Ｃ）模式図である。
【図３】血液サンプルより精製されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ核酸のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。対照は水中に１０４ｃｆｕ／ｍＬの濃度で懸濁された未処理Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＮＴＣ（非テンプレート対照）を含む。
【図４】多様なＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ濃度のサンプルより精製されたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ核酸のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。対照は水中に１０４ｃｆｕ／ｍＬの濃度で懸濁された未処理Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓサンプルおよびＮＴＣ（非テンプレート対照）を含む。
【図５】鼻咽頭サンプルより精製されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ核酸のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。対照は水中に１０４ｃｆｕ／ｍＬの濃度で懸濁された未処理Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを含む。
【図６】血液サンプルより精製されたベネズエラウマ脳炎ウイルス核酸のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。対照は水中に１０４ｐｆｕ／ｍＬの濃度で懸濁された未処理ベネズエラウマ脳炎ウイルスサンプルおよびＮＴＣ（非テンプレート対照）を含む。すべてのサンプルは２回試験する。
【図７】フロープロ流動操作システムのサンプルトグル画面を示すスクリーンショットである。
【図８】フロープロ流動操作システム（グローバルＦＩＡ、ワシントン州フォックスアイランド）のリアルタイムＰＣＲ結果画面を示すスクリーンショットである。対照は水中に１０４ｃｆｕ／ｍＬの濃度で懸濁された未処理Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓおよびＮＴＣ（非テンプレート対照）を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
この発明を実施するための形態は、本発明の文書による全説明の一部と見なすべき付属の図面と関連付けて読まれることを意図している。図面の外形は必ずしも倍率を定めるものではなく、また本発明のいくつかの特性は倍率を拡大して示されることもあれば、明確さおよび簡潔さのために幾分模式的な形態であることもある。説明において、「前方」、「後方」、「上方」、「下方」、「上部」および「底部」さらにはその派生語などの相対的な用語はそのときに記載される、または論じられている図面の外形に示されるところの向きを表すと解釈されるべきである。これらの相対的な用語は記述の簡便性を目的とし、且つ通常は具体的な向きを要求することを意図していない。「接続された」および「着接された」などの着接、連結などに関する用語は、特に説明的に記述されない場合、構造物が互いに直接的または媒介構造物を経て間接的に固定あるいは着接された関係、さらには両者が可動的なまたは剛直な着接または関係を指す。
【００１３】
本発明の実施形態を記述する際、明確性を目的として具体的な用語を使用する。しかし、本発明はそのように選択された具体的な用語によって限定されることを意図していない。それぞれの具体的な要素は同様の目的を達成するために同様の様式で作動するすべての技術的な同等物を含むことが理解されなければならない。
【００１４】
本発明の１つの態様はサンプル調製装置に関する。１つの実施形態においては、サンプル調製装置は２つの開口部の間のサンプル経路を規定するハウジング、および経路の一部分に包埋されたフィルター構造物を含む。フィルター構造物は核酸と特異的に結合するモノリス吸着剤を収容する。
【００１５】
以下に記載する実施形態において用いるところの用語「モノリス吸着剤」または「モノリス吸着材料」は、単一片において連続的相互接続小孔構造を有する多孔質、３次元吸着材料を指す。モノリスは、たとえば前駆体を所望の形状の型の中で鋳造、焼結または重合することによって調製される。用語「モノリス吸着剤」または「モノリス吸着材料」は、最終生成物が個別の吸着剤粒子を含む、充填されてベッドを形成するか、または多孔質基剤に包埋された個々の吸着剤粒子の集合体と識別されることを意図している。用語「モノリス吸着剤」または「モノリス吸着材料」は、ろ紙または吸着剤でコーティングされたろ紙といった、吸着剤繊維または吸着剤でコーティングされた繊維の集合体と識別されることも意図している。
【００１６】
以下に記載する実施形態において用いるところの用語「特異的に結合する」または「特異的結合」は、分析物とサンプルの他の成分または夾雑物を識別するために十分な特異性を伴う吸着剤の分析物（例：核酸）への結合を指す。１つの実施形態においては、吸着剤／リガンド複合体の解離定数は１×１０−６Ｍ未満である。当業者は、吸着物に対する分析物の結合および溶離の厳格性は結合および溶離バッファーの処方によって制御することができることを理解する。たとえば、核酸の溶離厳格度はＫＣｌまたはＮａＣｌを用いた塩濃度によって制御することができる。核酸はタンパク質よりも負電荷が高く溶離に対して抵抗性がある。選択的な結合および溶離に使用することが可能なその他の処理は温度、ｐＨおよび穏やかな界面活性剤である。結合および溶離の熱的一定性はヒートブロックまたは水浴によって維持してもよい。溶離バッファーを変更すると下流の分析器に及ぼす影響の評価が必要となるので、結合バッファーの操作の方が好ましい。
【００１７】
以下に記載する実施形態の記述において用いるところの用語「核酸」は個々の核酸、および天然に生成するものであれ人工的に合成されたものであれ（その類似体を含む）、またはその修飾物、特に自然に発生することが知られている修飾物であれ、あらゆる長さを有するＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸の重合鎖を意味する。本発明に適した核酸鎖長の例は、ＰＣＲ生成物に適した長さ（例：約５０から７００塩基対（ｂｐ））、およびヒトゲノムＤＮＡ（例：ほぼキロ塩基対（Ｋｂ）からギガ塩基対（Ｇｂ）単位である）を含むが、これに限定されない。したがって、用語「核酸」が単独の核酸、さらには小さなフラグメントである天然または人工の連鎖ヌクレオチド、ヌクレオシドおよびその組み合わせ、たとえば発現した配列タグまたは遺伝子フラグメント、さらには個別の遺伝子および染色体全体までも含むゲノム材料を例とするより長い鎖を包含することが認識されるであろう。
【００１８】
図１Ａを参照すると、サンプル調製装置１００の実施形態はハウジング１０およびサンプルフィルター２０を含む。ハウジング１０は第１の開口部１４と第２の開口部１６の間のサンプル経路１２を規定する。ハウジング１０の形状およびサイズは特に限定されない。流動ベクトルが操作中ほぼ直線上となることにより、非円筒状の構造で発生する可能性がある希釈洗浄が最小化あるいは回避されるよう、好ましいハウジングの構造はほぼ円筒状である。図１Ａ〜１Ｄに示す実施形態においては、ハウジング１０はピペットチップの形状、すなわち第１の開口部１４が前記第２の開口部１６の直径よりも大きな直径を有し、且つ第１の開口部１４がピペッターの先端に嵌合するよう寸法取りされている。サンプルフィルター２０は、サンプルが第２の開口部１６を経てハウジング１０内に取り込まれた直後にろ過されるよう、第２の開口部１６に非常に近接して留置される。１つの実施形態においては、サンプルフィルター２０は第２の開口部１６に隣接する。他の実施形態においては、サンプルフィルター２０は第２の開口部１６と１〜２０ｍｍの距離で離れている。他の実施形態では、ハウジング１０はカラムの形態を有する。
【００１９】
１つの実施形態においては、ハウジング１０は約０．１μＬから約１０ｍＬの容積を有する。他の実施形態においては、ハウジング１０は約５μＬから約５ｍＬの容積を有する。ハウジング１０に適した材料は特に限定されず、且つプラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリスチレンなど）、ガラスおよびステンレスを含む。
【００２０】
サンプルフィルター２０は、核酸と特異的に結合するあらゆる多孔質モノリス材料から製造することができる。多孔質モノリス材料の多孔率は用途によって異なる。一般的に、多孔質モノリス材料は特定の用途にとって望ましいサンプル流量を考慮した多孔率を有する必要がある。
【００２１】
１つの実施形態においては、サンプルフィルター２０はその中を液状サンプルが通過できる細かな多孔質ガラスフリットより製造される。多孔質ガラスフリットは、ホットプレス内でのビーズの粉砕より始まって単一のモノリス構造を形成する焼結ガラスであり、核酸を精製するための優れた基材である。フリットの均一な構造は、フリット内部における予測可能な液状物の流動を提供し、且つ溶離物がサンプルの流動と同様の流体力学を有することを可能とする。予測可能な液状物の流動によって、溶離プロセスにおいて回収率がより高くなる。
【００２２】
本明細書に記載の多様な実施形態を含む、本発明とともに使用するのに適した典型的なガラスフリットの孔径は、約２ミクロンから約２２０ミクロンの間である。１つの実施形態においては、ガラスフリットは約２ミクロンから約１００ミクロンの間の孔径を有する。他の実施形態においては、ガラスフリットは約４０ミクロンから約７５ミクロンの間の孔径を有する。他の実施形態においては、ガラスフリットは約１５０ミクロンから約２００ミクロンの間の孔径を有する。さらに他の実施形態においては、ガラスフリットは約２ミクロンから約２０ミクロンの間の孔径を有する。微生物ＤＮＡの精製を包含する用途に対しては、約１０ミクロンから約１５ミクロンのガラスフリットのサイズが適している。
【００２３】
１つの実施形態においては、ガラスフリットは約１ｍｍと約２０ｍｍの間の厚さを有する。他の実施形態においては、ガラスフリットは約２ｍｍと約５ｍｍの間の厚さを有する。さらに他の実施形態においては、ガラスフリットは約２ｍｍと約３ｍｍの間の厚さを有する。
【００２４】
他の実施形態においては、ガラスフリットは化学的に処理されてその表面に官能基を有する。たとえば、ガラスフリットはアミノシランによって誘導体化されることも、または負に荷電した核酸の吸着が向上するための陽電荷の荷電を作り出すためにＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ&reg;技術（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）により処理されることもある。
【００２５】
ガラスフリットが核酸に対する良好な吸着剤である時、当業者はガラスフリットを他の種類の分子を吸収するために用いることもできることを認識するであろう。たとえば、ガラスフリットは目的とする他のリガンドをサンプルから抽出するために抗体でコーティングすることもできる。１つの実施形態においては、ポリメチルメタクリン酸（ＰＭＭＡ）およびシクロオレフィンコポリマーＣＯＣ内で、微生物および毒素の捕捉部分である抗体によりガラスフリットを誘導体化する。本明細書で使用するところの用語「抗体」は最大限可能な範囲の意味で使用され、抗体、組み替え抗体、遺伝子操作された抗体、キメラ抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、異種抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、免疫原性除去抗体、および抗イディオタイプ抗体を含むが、これに限定されない。用語「抗体」は、たとえば抗原結合変異領域などの未変化抗体の少なくとも一部などの抗体フラグメントも含むが、これに限定されない。抗体フラグメントの例はＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、線形抗体、単鎖抗体分子、多変異性抗体、および／または抗体の他の抗原結合配列を含む。他の実施形態においては、ガラスフリットは、細菌の莢膜に認められる炭水化物と結合し、且つサンプル中の細菌を捕捉するために用いることのできるレクチンによってコーティングされる。
【００２６】
他の実施形態においては、サンプルフィルター２０は液状サンプル多孔質ガラスモノリス、多孔質ガラス−セラミック、または多孔質モノリスポリマーより製造される。多孔質ガラスモノリスは、本明細書に参照文献として援用される米国特許第４，８１０，６７４号および第４，７６５，８１８号に記載されたゾル−ゲル法を用いて生成することもできる。多孔質ガラス−セラミックは、多孔質ガラスモノリスの制御された結晶化によって生成することができる。
【００２７】
多孔質モノリスポリマーは、最近１０年間に開発された新たな材料のカテゴリーである。モノリスは、非常に小さなビーズより構成されるポリマーとは対照的に、単純な成形プロセスを用いて調製された連続ポリマー片である。１つの実施形態においては、ハウジング１０は多孔質モノリスポリマーの型の役割を果たす。簡単に言うと、ハウジング１０の流路１２の一部分がモノマーとポロジェンの混合物によって満たされる。次に、紫外線を透過させないマスクで充填された部分を覆う。マスクは充填された一部分である小さな部分を露出させる小さなスリットを有する。最後に、充填された部分のモノマー／ポロジェン混合物がマスクの小さな開口部を経た紫外線ライトによって照射される。ＵＶ照射は、経路１２の充填された一部分内に固形ではあるが多孔質であるモノリス材料を生成する重合プロセスを開始させる。
【００２８】
他の実施形態においては、サンプルフィルター２０はタンパク質を変性させて細胞膜を溶解する薬品を含浸された親水性基材より製造され、且つ核酸を捕捉する。１つの実施形態においては、親水性基材はＦＴＡペーパー（登録商標）（ワットマン、ニュージャージー州フローハムパーク）である。生物学的サンプルはＦＴＡ（登録商標）ペーパーに適用され、サンプル中に含有される細胞はろ紙上で溶解される。ろ紙を洗浄してあらゆる非ＤＮＡ材料を除去する（ＤＮＡはろ紙内に絡まったままである。）次にＤＮＡを溶離し、続いて分析する。
【００２９】
サンプルフィルター２０は、経路１２内に緊合するよう成形されて、操作中にサンプルの導管が形成されたり、サンプルフィルター２０を迂回してサンプルが流れたりすることを防止する。１つの実施形態においては、フィルター２０は圧着、プレス嵌合、およびハウジング１０またはその一部の熱収縮などの機械的手段によって経路１２に嵌合する。他の実施形態においては、フリットの側部が経路１２の輪郭に対して先細となる。図１Ａ〜１Ｄに示す実施形態においては、ハウジング１０は、マニュアル式ピペッターまたは電子ピペッティング装置などの液状物供給システムの末端に嵌合するよう寸法取りされた第１の開口部１４を有する円錐台型ピペットチップの形状を有する。サンプルは第２の開口部１６より取り込まれ、サンプルフィルター２０を通過した後、サンプルフィルター１０の上部にあるハウジング１０の一部分に保持される。１つの実施形態においては、液状物供給システムは電子ピペッターまたはロボット型ピペッティングステーションなどの電子装置である。
【００３０】
１つの実施形態においては、サンプルフィルター２０は、核酸と特異的に結合する第１の部分２２およびタンパク質といった目的とする他の分析物と特異的に結合する第２の部分２４の少なくとも２つの部分を含む（図１Ｂ）。他の実施形態においては、ハウジング１０は第２の開口部１６とサンプルフィルター２０の間に留置されたプレフィルター３０を収容する（図１Ｃ）。プレフィルター３０はサンプルフィルター２０の孔径よりも大きな孔径を有し、且つ核酸とは特異的に結合しない。さらに他の実施形態においては、ハウジングは、ポンピング装置が汚染されることを防止するために、エアロゾルフィルター４０を第１の開口部１４の近傍に収容する（図１Ｄ）。
【００３１】
他の実施形態においては、ハウジング１０はガラスビーズなどの多数の機械的溶解ビーズを、サンプルフィルター２０とエアロゾルフィルター４０の間の空隙内にさらに収容する。機械的溶解ビーズは、サンプル調製装置１００全体をボルテックスで撹拌することにより細胞を破壊し且つ核酸を放出させるために用いられる。この実施形態においては、液状物が第２の開口部１６より脱出することを防ぐために、ボルテックスミキサーで混合する際に第２の開口部１６をキャップで覆ってもよい。
【００３２】
本発明の他の態様は、一体型サンプル調製カートリッジに関する。ここで図２Ａ〜２Ｃを参照すると、一体型サンプル調製カートリッジの１つの実施形態２００は、基盤５０およびサンプル調製装置１００を含む。基盤５０は、上面６１上の第１のサンプルポート５１および第２のサンプルポート５２、底面６２の第３のサンプルポート５３および第４のサンプルポート５４、第１のサンプルポート５１を第３のサンプルポート５３と接続する第１の導管５５、第２のサンプルポート５２を第４のサンプルポート５４と接続する第２の導管５６、および第１の導管５５と第２の導管５６を接続する第３の導管５７を含む。
【００３３】
第１のサンプルポート５１はサンプル調製装置１００を受容し、サンプル調製装置１００がカラム構造であれピペットチップ構造であれ、サンプルポート５１に容易に挿入され、ベース５０と共に液状物が漏れないシールを形成するよう設計される。
【００３４】
サンプル調製装置１００は、一旦第１のサンプルポート５１に着接されると、直立状態を保つ。サンプルは、始めに第１の開口部１４から（すなわちサンプル経路１２を下降する）、または第２の開口部１６（すなわち経路１２を通過する）からサンプル調製装置１００に装填してもよい。これに代えて、サンプル調製装置１００を事前に装填したサンプルとともに第１のサンプルポート５１に着接することもできる。
【００３５】
また第２のサンプルポート５２は、一体型サンプル調製カートリッジ２００内に液状物を導入するためにも、または一体型サンプル調製カートリッジ２００より液状物を取出するためにも使用することができる。第２のサンプルポート５２は、ピペッターまたはロボット型ピペッティングステーションなどの液状物供給装置の先端２６を受容するよう設計されている。１つの実施形態においては、第２のサンプルポート５２はピペットチップを刺入することができ、且つチップの抜去後には密封されるセルフシール式の入口である。このようなピペット用のセルフシール式の導入ポートにより、汚染の原因となることの多いキャップ開蓋リスクを伴わずにサンプルを容易に導入することができる。１つの実施形態においては、シール５８はＡｂｇｅｎｅ（英国エプソム）のＭｕｌｔｉｓｉｐ（商標）分割隔膜プラグである。他の実施形態においては、シール５８はドックビルバルブおよびミニバルブ・インターナショナル（オハイオ州イエロースプリングス）のドームバルブなどのポートバルブである。他の実施形態においては、第１のサンプルポート５１も、サンプル調製装置１００を受容するドームバルブまたは隔膜などのセルフシール装置を収容する。
【００３６】
他の実施形態においては、第１のサンプルポート５１または第２のサンプルポート５２または両ポートは、サンプルの導入および取出を可能とするスクリューキャップまたはプレスフィットキャップで密封することができる。ポートはテープシールによって密封して自動プロセス中の漏出を防止することもできる。
【００３７】
第１の導管５５，第２の導管５６および第３の導管５７は、一体型サンプル調製カートリッジ２００内で核酸精製プロセスが完了するよう、第１のサンプルポート５１を第２のサンプルポート５２に接続する。第３のサンプルポート５３および第４のサンプルポート５４は、廃液ボトルに接続してサンプル調製装置１００からの流出液を捕集してもよい。
【００３８】
一体型サンプル調製カートリッジ２００は、フロープロ流動操作システム（グローバルＦＩＡ、ワシントン州フォックスアイランド）などの流動制御システムと互換的に設計することができる。１つの実施形態においては、第１のサンプル出口５３および第２のサンプル出口５４がルアー起動バルブ５９に嵌合する。ルアー起動バルブ５９は、ルアー型フィッティングが挿入された時のみ開く、通常は閉じたバルブである。ルアー起動バルブ５９は、流動制御システムへの容易な挿入を可能とし、またサンプル調製カートリッジ２００が液状物制御システムより取出された後のサンプル調製カートリッジ２００からのサンプルの漏出を防止する。１つの実施形態においては、一体型サンプル調製カートリッジ２００はねじを緊合あるいはボルトを調節する必要を伴わずに流動制御システムに塞入されるよう設計される。
【００３９】
当業者は、一体型サンプル調製カートリッジ２００の一般的な配置が他のサンプルの導入および溶離物の取出の戦略を考慮に入れていることを理解する。１つの実施形態においては、サンプル調製カートリッジ２００は流動制御システムに接続される。サンプル調製装置１００は第１のサンプルポート５１に挿入される。サンプルは、サンプル導入後に密封される第２のサンプルポート５２を経て一体型サンプル調製カートリッジ２００に導入される。流動制御システムによって、グアニジンなどのカオトロープが第４のサンプルポート５４を経て一体型サンプル調製カートリッジ２００に導入され、さらに一体型サンプル調製カートリッジ２００内でサンプルと混合される。次に、サンプル／カオトロープ混合物は、サンプル調製装置１００の第２の開口部１６から、フィルター２０を通過してサンプル調製装置１００内に押出され、さらにサンプルフィルター２０の上にあるハウジング１０の一部分に流入する。次に、サンプル・カオトロープ混合物は第４のサンプルポート５４を経て一体型サンプル調製カートリッジ２００より取出され、廃液として廃棄される。流動制御システムにより、第３のサンプルポート５３を経て洗浄バッファーが一体型サンプル調製カートリッジ２００内に導入される。サンプル／カオトロープ混合物の移動と同様に、洗浄バッファーはサンプル調製装置１００に押入された後で取出され、プロセス中フィルター２０を２回通過する。洗浄操作は数回繰り返してもよい。最後に、溶離バッファーが第２の開口部１６を経てサンプル調製装置１００内に導入され、そこから次の分析のために溶離液が取出される、サンプルフィルター２０の上にあるハウジング１０の一部分に、結合した核酸を溶離させる。
【００４０】
他の実施形態においては、サンプルは第１のサンプルポート５１に着接するサンプル調製装置１００の第１の開口部１４を経て導入され、また溶離液は第２のサンプルポート５２より取出される。他の実施形態においては、サンプルは第１のサンプルポート５１に着接するサンプル調製装置１００の第１の開口部１４を経て導入され、また溶離液はサンプル調製装置１００の第１の開口部１４より取出される。他の実施形態においては、サンプルは第２のサンプルポート５２を経て第１のサンプルポート５１に着接するサンプル調製装置１００上に導入され、また溶離液は第２のサンプルポート５２より取出される。他の実施形態においては、サンプル調製装置１００を一体型サンプル調製カートリッジ２００の第１のサンプルポート５１に挿入する前に、サンプル調製装置１００内にサンプルを事前装填する。洗浄および溶離操作の後、溶離液を第２のサンプルポート５２より取出する。さらに他の実施形態においては、サンプル調製装置１００を一体型サンプル調製カートリッジ２００の第１のサンプルポート５１に挿入する前に、サンプル調製装置１００内にサンプルを事前装填する。洗浄操作後、サンプルフィルター２０に結合した分析物をサンプル調製装置１００内に溶離した後、サンプルフィルター２０とエアロゾルフィルター４０の間の空隙内にある溶離バッファー中の精製された分析物とともにこれをサンプルポート５１より取出する。
【００４１】
一体型サンプル調製カートリッジ２００は使用が容易である。第１に、この装置は遠心分離を必要としないため、試験管からスピンカラムにサンプルを移し替えることによる煩雑さが除かれるのみならず、必要とされる機器装備が単純化される。さらに、ピペッター用のセルフシール式導入ポートにより、汚染の原因となることの多いキャップ開蓋のリスクを伴わずにサンプルを容易に導入することができる。さらに、ルアー起動バルブにより、プロセス完了後の漏出によるサンプル損失のリスクを伴うことなく、カートリッジの挿入および取出が単純且つ容易となる。
【００４２】
さらに、サンプル調製装置１００が垂直方向となっていることにより、気泡がサンプルフィルター２０から装置最上部まで上昇させられるので、流動制御が向上し且つ分析物の結合および溶離が促進される。さらに、サンプルフィルター２０の小孔によって、サンプル経路１２の内部で大きな空気の固まりが小さな気泡に変化して液状物カラムの最上部に移動し、サンプルとカオトロープとの振動混合効果を生成する。サンプル調製装置１００のピペットチップ構造によってサンプル／洗浄／溶離液がサンプルフィルター２０を経て双方向に流動することが可能となる一方、大半のサンプル調製手法はフィルターを経た１方向のみの流動に依拠することに留意すべきである。双方向性流動特性は、同じ開口部（例：第２の開口部１６）からサンプル液をサンプル調製装置１００に取り込み、サンプル調製装置１００より溶離させることを可能とするのみならず、ユーザーにサンプルに多数のピペット吸引送出サイクルを実施することを可能にすることにより、サンプル調製装置１００よりも大きな容積のサンプルを処理する能力が提供される。
【００４３】
１つの実施形態においては、導管５５、５６および５７は、一体型サンプル調製カートリッジ２００の内面への生体分子（核酸）の好ましくない吸着を低減するため、可能な限り最短の長さに設計される。導管は望ましくない生体分子の吸着を低下させるために表面コーティングされてもよい。１つの実施形態においては、比表面積を低下させ、且つこれにより望ましくない核酸吸着を低下させるために、導管５５、５６および５７は０．１〜５ｍｍの範囲の直径を有する。
【００４４】
溶離液を取出した後、一体型サンプル調製カートリッジ２００を流動制御ステーションより取出し、さらに廃棄する。
【００４５】
一体型サンプル調製カートリッジ２００のベース５０は、サンプルの可溶化／洗浄／溶離プロセスにおいて一般的に用いられる薬品に対して抵抗性のあるあらゆる材料より製造することができる。１つの実施形態においては、ベース５０は透明な材料より製造される。ベース５０の材料の例はポリカーボネートおよびポリプロピレンを含むが、これに限定されない。
【００４６】
流動制御システムは、一体型サンプル調製カートリッジ２００において所望の流量を提供する能力のあるあらゆる流動制御システムとすることができる。１つの実施形態においては、流動制御システムはグローバルＦＩＡ（ワシントン州フォックスアイランド）によるフロープロ流動操作システムである。
【実施例１】
【００４７】
（２．０ｍＬレイニンフィルター装着ピペットチップおよび３ｍｍガラスフリットを用いたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを含有する血液サンプルからの核酸の精製）
この実験においては、以下のプロトコルにより、２．０ｍＬレイニンフィルター装着ピペットチップおよび３ｍｍガラスフリット（ＲＯＢＵ  Ｇｌａｓｆｉｌｔｅｒ−Ｇｅｒａｅｔｅ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを含有する血液サンプルから核酸を精製した。
１．１５ｍｇコニカルチューブ１本に「流動液」とラベルし、１．５ｍｇ遠心管４本に「エタノール１」、「エタノール２」、「エタノール３」および「溶離液」とラベルする。
２．血液３６０μＬとＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（１０５コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬ水）４０μＬを「流動液」チューブ内で混合する（最終濃度１０４ｃｆｕ／ｍＬ）。
３．キアゲンＡＬ溶解バッファー１１２０μＬを混合物に加える。
４．プロテイナーゼＫ８０μＬを加える（２０ｍｇ／ｍＬ）。
５．リゾチーム４００μＬを加え、ボルテックスで混合し、遠心沈殿する。
６．サンプル混合物を５５℃で１時間インキュベートする。
７．９６〜１００％エタノール２０００μＬを「流動液」チューブに加える。混合物をボルテックスミキサーで混合し、極短時間遠心沈殿する。
８．溶離バッファー（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）１００μＬを「溶離液」遠心管に分注する。遠心管を７０℃に設定したヒートブロックに載置する。（溶離バッファーは少なくとも５分間７０℃に加熱しなければならない。バッファーは操作１３までヒートブロック上に保持する。）
９．３本の「エタノール」遠心管に７０％エタノールを１ｍＬずつ分注する。
１０．レイニン電子ピペッターに取り付けたフリットチップ（中孔径）を用いて、ピペットでサンプル混合物を「流動液」チューブに移す。ピペッティングを５サイクル繰り返す（サイクル＝吸引＋送出）。
１１．レイニン電子ピペッターを用い、「エタノール１」遠心管内の７０％ＥｔＯＨで１０サイクルピペッティングして結合した核酸を洗う。「エタノール２」遠心管および「エタノール３」遠心管で７０％ＥｔＯＨによる洗浄を繰り返す（合計３回洗浄）。
１２．空気を２０サイクルピペッティングしてＥｔＯＨをフリットチップよりパージする。チップの外側を拭き取り、相当量のエタノールが残っている場合はチップを穏やかにたたく。
１３．操作８の７０℃の溶離バッファーで１０サイクルピペッティングしてフリット上の核酸を溶離する。バッファーに気泡が生じる始めることもあるが、ピペッティングを続け、完了したならばマイクロ遠心管を１回完全に遠心沈殿させる。チップよりバッファーがすべてパージされたことを確認すること。
１４．溶離液を捕集し、フリットチップを廃棄する。
１５．リアルタイムＰＣＲにより溶離した核酸を定量する。
【００４８】
図３に示すように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の核酸が溶離液中に検出される。
【実施例２】
【００４９】
（２．０ｍＬレイニンフィルター装着ピペットチップおよび２ｍｍガラスフリットを用いたＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来する核酸の精製）
この実験においては、以下のプロトコルにより、２．０ｍＬレイニンフィルター装着ピペットチップおよび２ｍｍガラスフリット（ＲＯＢＵ  Ｇｌａｓｆｉｌｔｅｒ−Ｇｅｒａｅｔｅ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて、各濃度のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ懸濁液に由来する核酸を精製した。
１．１．５ｍＬ遠心管３本に「サンプル＋グアニジン」、「エタノール」および「溶離液」とラベル表示する。
２．ガラスビーズを用い、ボルテックスミキサーで混合して溶解する。
３．ボルテックスミキサーにより、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓサンプル５００μＬを６Ｍグアニジン５００μＬ、ｐＨ６．５と混合する。未処理（すなわちプレグアニジン）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの一部も、操作１０のリアルタイムＰＣＲ分析のために保存する。
４．溶離バッファー（１ｍＭ  ＮａＯＨ）１００μＬを「溶離液」遠心管に分注する。フリットチップ（中孔径）およびレイニン電子ピペッターを用いて、サンプル／グアニジン混合物をピペッティングする。５サイクルピペッティングする（サイクル＝吸引＋送出）。
５．レイニン電子ピペッターを用い、７０％ＥｔＯＨ１ｍＬを５サイクルピペッティングして結合した核酸を洗う。
６．電子ピペッターを用い、フリットチップに空気を通過させてＥｔＯＨをパージする。ピペッティングを２０サイクル繰り返して痕跡量のＥｔＯＨを除去する。相当量のエタノールが残っている場合は、フリットチップをたたく。チップの外側のＥｔＯＨをキムワイプ&reg;で取り除く。
７．操作４の７０℃の溶離バッファーで１０サイクルピペッティングしてフリット上の核酸を溶離する。チップよりバッファーがすべてパージされたことを確認すること。
８．溶離液を捕集し、フリットチップを廃棄する。
９．リアルタイムＰＣＲにより溶離した核酸を定量する。
【００５０】
図４に示すように、フリットチップによって調製されたサンプルにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓの核酸が検出される。
【実施例３】
【００５１】
（２．０ｍＬレイニンフィルター装着ピペットチップおよび２ｍｍガラスフリットを用いたＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを含有する鼻咽頭サンプルからの核酸の精製）
この実験においては、以下のプロトコルにより、２．０ｍＬレイニンフィルター装着ピペットチップおよび２ｍｍガラスフリット（ＲＯＢＵ  Ｇｌａｓｆｉｌｔｅｒ−Ｇｅｒａｅｔｅ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを含有する鼻咽頭サンプルより核酸を精製した。
１．１．５ｍＬ遠心管３本に「サンプル＋グアニジン」、「エタノール」および「溶離液」とラベル表示する。
２．鼻咽頭液４５０μＬとＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（１０５コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬ水）５０μＬを「サンプル＋グアニジン」遠心管中で混合して鼻咽頭サンプルを調製する（最終濃度１０４ｃｆｕ／ｍＬ）。鼻咽頭サンプルの一部は操作１１のリアルタイムＰＣＲ分析の対照用に保存する。
３．グアニジンｐＨ６．５、５００μＬを「サンプル＋グアニジン」遠心管に加え、ボルテックスミキサーで混合する。
４．溶離バッファー（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）１００μＬを「溶離液」遠心管に分注する。管を７０℃に設定したヒートブロックに載置する（溶離バッファーは７０℃で少なくとも５分間加熱しなければならない）。遠心管は操作９までヒートブロック上に保持する。
５．レイニン電子ピペッターに取り付けたフリットチップ（中孔径）を用いて、サンプル／グアニジン混合物をピペッティングする。５サイクルピペッティングする（サイクル＝吸引＋送出）。
６．レイニン電子ピペッターを用い、７０％ＥｔＯＨ１ｍＬをピペッティングして結合した核酸を洗う。
７．電子ピペッターを用い、空気をフリットチップに通してＥｔＯＨをパージする。ピペッティングを２０サイクル繰り返して痕跡量のＥｔＯＨを除去する。相当量のエタノールが残っている場合は、フリットチップをたたく。チップの外側のＥｔＯＨをキムワイプ&reg;で取り除く。
８．操作４の７０℃の溶離バッファファーで１０サイクルピペッティングしてフリット上の核酸を溶離する。チップよりバッファーがすべてパージされたことを確認すること。
９．溶離液を捕集し、フリットチップを廃棄する。
１０．リアルタイムＰＣＲにより溶離した核酸を定量する。
【００５２】
図５に示すように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の核酸が溶離液中に検出される。
【実施例４】
【００５３】
（１．２ｍＬギルソンフィルター装着ピペットチップおよび５ｍｍガラスフリットを用いたベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有する血液サンプルからの核酸の精製）
この実験においては、以下のプロトコルにより、２．０ｍＬレイニンフィルター装着ピペットチップおよび５ｍｍガラスフリット（ＲＯＢＵ  Ｇｌａｓｆｉｌｔｅｒ−Ｇｅｒａｅｔｅ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて、ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含有する血液サンプルから核酸を精製した。
１．１．５ｍＬ遠心管６本に「流動液」、「エタノール１」、「エタノール２」、「エタノール３」、「溶離液１」および「溶離液２」とラベルする。
２．血液９０μＬとベネズエラウマ脳炎ウイルス（１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍＬ水）１０μＬを「流動液」遠心管中で混合する（最終濃度１０４ｃｆｕ／ｍＬ）。
３．キアゲンＡＬ溶解バッファー２８０μＬを混合物に加える。
４．プロテイナーゼＫ４０μＬを加える（２０ｍｇ／ｍＬ）。
５．リゾチーム１００μＬを加え、ボルテックスで混合し、遠心沈殿する。
６．サンプル混合物を５５℃で１時間インキュベートする。
７．９６〜１００％エタノール５００μＬを「流動液」遠心管に加える。混合物をボルテックスミキサーで混合し、遠心沈殿する。
８．溶離バッファー（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０）１００μＬを「溶離液」遠心管に分注する。管を７０℃に設定したヒートブロックに載置する。（溶離バッファーは少なくとも５分間７０℃に加熱しなければならない。バッファーは操作１３までヒートブロック上に保持する。）
９．３本の「エタノール」遠心管に７０％エタノールを１ｍＬずつ分注する。
１０．ギルソン電子ピペッターに取り付けたフリットチップ（中孔径）を用いて、ピペットでサンプル混合物を「流動液」遠心管に移す。ピペッティングを５サイクル繰り返す（サイクル＝吸引＋送出）。電子ピペッターを用い、「エタノール１」遠心管内の７０％ＥｔＯＨを１０サイクルピペッティングして結合した核酸を洗う。「エタノール２」遠心管および「エタノール３」遠心管で７０％ＥｔＯＨによる洗浄を繰り返す（合計３回洗浄）。チップの外側を拭き取り、相当量のエタノールが残っている場合はチップを穏やかにたたく。
１１．操作８の７０℃の溶離バッファーで１０サイクルピペッティングしてフリット上の核酸を溶離する。サイクルが終了したならば、ヒートブロック上より溶離バッファーを取り除く。チップよりバッファーがすべてパージされたことを確認する。
１２．「溶離液１」遠心管に溶離液を捕集する。
１３．同じフリットチップを用いて操作１３を繰り返し、「溶離液２」遠心管に溶離液を捕集し、フリットチップを廃棄する。
１５．リアルタイムＰＣＲにより溶離した核酸を定量する。
【００５４】
図６に示すように、ベネズエラウマ脳炎ウイルス由来の核酸が第１および第２溶離液中に検出される。しかし、第１の溶離液はベネズエラウマ脳炎の核酸をより高い濃度で含有する。
【実施例５】
【００５５】
（流動制御システムおよび一体化サンプル調製システムを用いた自動サンプル調製）
図２Ａに示す一体型サンプル調製システムのプロトタイプを、フロープロ流動操作システム（グローバルＦＩＡ、ワシントン州フォックスアイランド）に接続した。以下のプロトコルに従い、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ懸濁液より核酸を精製した。
１．１．５ｍＬ遠心管２本に「サンプル」および「溶離液」とラベル表示する。
２．１ｍＭ  ＮａＯＨ１５０μＬを、グローバルＦＩＡシステム上に留置された「溶離バッファー」と指定された遠心管に分注する。
３．７０％ＮａＯＨ５００μＬを、グローバルＦＩＡシステム上に留置された「洗浄」遠心管に分注する。
４．「サンプル」遠心管（操作１）内でＹｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ懸濁液（１０４ｃｆｕ／ｍＬ水）５００μＬを６ＭグアニジンｐＨ６．５、５００μＬと混合し、ボルテックスで攪拌する。後の分析のために未混合サンプルの一部を保存する。
５．レイニン電子ピペッターを用いて、フリットチップ（中孔径）にサンプル／グアニジン混合物を吸引する。
６．フリットチップ（内部にサンプルを有する）を、グローバルＦＩＡ装置上に留置したサンプル調製カートリッジ上に載置する。
７．ＦｌｏＬＶソフトウェアを用いて、「フリットチップサンプルトグル」シークエンス（図７）を実行する。８．ＦｌｏＬＶソフトウェアを用いて、「フリットチップＥｔＯＨ洗浄」シークエンスを実行する。
９．ＦｌｏＬＶソフトウェアを用いて、「フリットチップＥｔＯＨ乾燥」シークエンスを実行する。
１０．ＦｌｏＬＶソフトウェアを用いて、「フリットチップ溶離」シークエンスを実行する。
１１．シークエンスが完了したならば、グローバルＦＩＡシステムよりフリットチップを取出し、フリットチップをレイニン電子ピペッターに着接し、溶離液を「溶離液」とラベル表示した１．５ｍＬ遠心管に分注する。
１１．フリットチップを廃棄する。
１２．リアルタイムＰＣＲにより溶離した核酸を定量する。
【００５６】
図８に示すように、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ由来の核酸が溶離液中に検出される。
【００５７】
本明細書で使用する用語は、例示的な方法でのみ説明され、限定としては意図されていない。当業者は、特に指摘がない場合すべての用語がその最も広い意味で理解されるべきである、以下の請求項に定義する本発明の趣旨および範囲、およびその同等物の中で数多くの変法が可能であることを認識するであろう。
【図１Ａ】
2011502251.tif 000003
【図１Ｂ】
2011502251.tif 000004
【図１Ｃ】
2011502251.tif 000005
【図１Ｄ】
2011502251.tif 000006
【図２Ａ】
2011502251.tif 000007
【図２Ｂ】
2011502251.tif 000008
【図２Ｃ】
2011502251.tif 000009
【図３】
2011502251.tif 000010
【図４】
2011502251.tif 000011
【図５】
2011502251.tif 000012
【図６】
2011502251.tif 000013
【図７】
2011502251.tif 000014
【図８】
2011502251.tif 000015
【国際調査報告】
2011502251.tif 000016
2011502251.tif 000017
2011502251.tif 000018
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