(57)【要約】  本発明は、ミクロシンＳと名付けられた新規の単離されたポリペプチド、ミクロシンＳポリペプチドをコードする単離された核酸分子ならびに核酸分子とハイブリダイズするプライマーおよびプローブに関する。本発明は、核酸分子を含むプラスミドおよび細胞、ポリペプチドに結合する抗体、組成物、ならびにポリペプチドを作製し、使用するための方法にも関する。本発明は、さらに、微生物感染症、機能性胃腸障害を治療もしくは予防するためまたは腫瘍を治療するための医学的使用に関する。本発明は、さらに、食料品を保存するための方法および包帯材をコーティングするための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上同一であるアミノ酸配列を含み、抗微生物活性を有するアミノ酸配列を含む、
ｂ）配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれか１つのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含むヌクレオチド配列と少なくとも７０％以上同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされ、配列番号１を含むヌクレオチド配列は少なくとも抗微生物活性もしくはミクロシンＳ自己免疫活性もしくはミクロシンＳ輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号２を含むヌクレオチド配列は抗微生物活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号３を含むヌクレオチド配列はミクロシンＳ自己免疫活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号４を含むヌクレオチド配列はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号５を含むヌクレオチド配列はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードする、
ｃ）配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれか１つのヌクレオチドの配列もしくはその相補体を含むヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされ、配列番号１を含むヌクレオチド配列は少なくとも抗微生物活性もしくはミクロシンＳ自己免疫活性もしくはミクロシンＳ輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号２を含むヌクレオチド配列は抗微生物活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号３を含むヌクレオチド配列はミクロシンＳ自己免疫活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号４を含むヌクレオチド配列はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号５を含むヌクレオチド配列はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードする、または
ｄ）抗微生物活性を有するアミノ酸配列を含む、配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体を含む、
単離されたポリペプチド。
【請求項２】
ミクロシンＳポリペプチド、ミクロシンＳ自己免疫活性を有するポリペプチドまたはミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、
ａ）配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれか１つもしくはその相補体と少なくとも７０％以上同一であるヌクレオチド配列を含み、配列番号１を含む核酸分子は少なくとも抗微生物活性もしくはミクロシンＳ自己免疫活性もしくはミクロシンＳ輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号２を含む核酸分子は抗微生物活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号３を含む核酸分子はミクロシンＳ自己免疫活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号４を含む核酸分子はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号５を含む核酸分子はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードする、
ｂ）配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれか１つのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含むヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子を含み、配列番号１を含む核酸分子は少なくとも抗微生物活性もしくはミクロシンＳ自己免疫活性もしくはミクロシンＳ輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号２を含む核酸分子は抗微生物活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号３を含む核酸分子はミクロシンＳ自己免疫活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号４を含む核酸分子はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号５を含む核酸分子はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードする、
ｃ）抗微生物活性を有する、配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、または
ｄ）抗微生物活性を有する、配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする核酸分子を含む、
核酸分子。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸分子または請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸分子を含むプラスミド。
【請求項４】
請求項２に記載の核酸分子および／または請求項１に記載のポリペプチドおよび／または請求項３に記載のプラスミドを含む細胞であって、請求項２に記載の天然に存在する核酸分子または請求項１に記載の天然に存在するポリペプチドまたは請求項３に記載の天然に存在するプラスミドを含む単離されていない細胞が除外される細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項６】
ａ）請求項１に記載のポリペプチド；および／または
ｂ）請求項４に記載の細胞
を含む組成物。
【請求項７】
薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
表面用の消毒薬である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
療法または予防において使用するための、請求項１に記載のポリペプチド、または請求項４に記載の細胞または請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
微生物感染症の治療または予防において使用するための、請求項１に記載のポリペプチド、請求項４に記載の細胞または請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
微生物感染症が腸管病原性大腸菌および／または腸管出血性大腸菌（ＥＰＥＣ、ＥＨＥＣ）の感染症を含む、または溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）を伴う微生物感染症の治療または予防において使用するための、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
胃腸障害または機能性胃腸障害の治療または予防において使用するための、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項４に記載の細胞または請求項６に記載の組成物。
【請求項１３】
腫瘍の治療において使用するための、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項４に記載の細胞または請求項６に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載のポリペプチドを作製するための方法であって、請求項２に記載の核酸分子、請求項３に記載のプラスミドもしくは請求項４に記載の細胞を使用すること、または液相もしくは固相ペプチド合成技法によって請求項１に記載のポリペプチドを合成することを含む方法。
【請求項１５】
ミクロシンＳに対して感受性の細菌を同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、請求項１に記載のポリペプチドまたは請求項２に記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドまたは請求項４に記載の細胞または請求項６に記載の組成物を細胞と接触させることを含み、細胞の腸上皮細胞への接着効率が低下することにより、細胞のミクロシンＳに対する感受性が示される方法。
【請求項１６】
食料品を保存するための方法であって、
食料品に少なくとも１種類の天然の抗微生物性作用剤を添加することを含み、作用剤が
ａ）請求項１に記載のポリペプチド；
ｂ）請求項４に記載の細胞；および／または
ｃ）請求項６に記載の組成物
である方法。
【請求項１７】
包帯材をコーティングするための方法であって、
包帯材を、
ａ）請求項１に記載のポリペプチド；および／または
ｂ）請求項６に記載の組成物
でコーティングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単離されたポリペプチド、ミクロシンＳポリペプチドをコードする単離された核酸分子ならびに核酸分子とハイブリダイズするプライマーおよびプローブに関する。本発明は、核酸分子を含むプラスミドおよび細胞、ポリペプチドに結合する抗体、組成物ならびにポリペプチドを作製し、使用するための方法にも関する。本発明は、さらに、微生物感染症、機能性胃腸障害を治療もしくは予防するためまたは腫瘍を治療するための医学的使用に関する。本発明は、さらに、食料品を保存するための方法および包帯材をコーティングするための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミクロシンは、リボソームで合成される低分子質量の抗微生物ペプチドである。腸内細菌、大部分は大腸菌によって生じるミクロシン合成は、栄養分が限られることなどのストレス条件下で急激に活性化される。ミクロシンは、密接に関連する種に対して強力な抗微生物／抗細菌活性を発揮し、それにより腸内ミクロフローラに非常に競争力のある利点がもたらされる（非特許文献１）。ミクロシン産生体は自身が産生するミクロシンに対して耐性であり、これは、１つの遺伝子クラスター内に位置する少なくとも１種の耐性付与遺伝子によって媒介される。１４種の公知のミクロシンの大部分はプラスミドにコードされるが、染色体にコードされる抗微生物／抗細菌ペプチドも記載されている。プロバイオティクス株大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（ＥｃＮ）はミクロシンＭおよびＨ４７を産生する（非特許文献２）。プロバイオティクスは、特定の数を摂取すると固有の基礎栄養を越える健康利益を発揮する、生きている微生物と定義される。ある株をプロバイオティクスにすることができる機構は十分には理解されていない。それにもかかわらず、ミクロシンの抗微生物活性は腸の平衡に正に影響を与え得る。病原性因子が存在しないことならびに十分に証明された臨床的安全性を仮定すると、ミクロシン産生株はプロバイオティクスの定義を明白に満たすことができる。腸内細菌のミクロシンとは対照的に、食物性乳酸菌はランチオニンを含有するペプチド抗生物質を産生する。いわゆるグラム陽性細菌のランチビオティクスはすでに食料品保存のために使用されている（非特許文献３）。２つのさらに論じられているバクテリオシンの適用は、抗腫瘍薬としての使用（非特許文献４）、または感染症における古典的な抗生物質の代替としての使用（非特許文献５及び非特許文献６）である。
【０００３】
何十年もずっと、そして現在でも、細菌感染症の治療は主に古典的な抗生物質に基づくものである。しかし、これらの古典的な抗生物質に対して耐性の病原体が出現することによって多くの問題が構成される。したがって、残りの治療の選択肢がさらに制限される。この負の影響は、他の経済的に重要な産業、例えば食品産業においても見られる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂａｑｕｅｒｏ，Ｆ．、Ｂｏｕａｎｃｈａｕｄ，Ｄ．、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，Ｍ．Ｃ．＆Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｃ．（１９７８）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １３５、３４２−３４７
【非特許文献２】Ｐａｔｚｅｒ，Ｓ．Ｉ．、Ｂａｑｕｅｒｏ，Ｍ．Ｒ．、Ｂｒａｖｏ，Ｄ．、Ｍｏｒｅｎｏ，Ｆ．＆Ｈａｎｔｋｅ，Ｋ．（２００３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４９、２５５７−２５７０
【非特許文献３】Ｋｕｉｐｅｒｓ，Ａ．、Ｒｉｎｋ，Ｒ．＆Ｍｏｌｌ，Ｇ．Ｎ．（２０１１）Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ、Ｂｅｒｌｉｎ
【非特許文献４】Ｈｅｔｚ，Ｃ．、Ｂｏｎｏ，Ｍ．Ｒ．、Ｂａｒｒｏｓ，Ｌ．Ｆ．＆Ｌａｇｏｓ、Ｒ．（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９、２６９６−２７０１
【非特許文献５】Ｄｉｃｋｓ，Ｌ．Ｍ．Ｔ．、Ｈｅｕｎｉｓ，Ｔ．Ｄ．Ｊ．、ｖａｎ  Ｓｔａｄｅｎ，Ｄ．Ａ．、Ｂｒａｎｄ，Ａ．、Ｓｕｔｙａｋ  Ｎｏｌｌ，Ｋ．＆Ｃｈｉｋｉｎｄａｓ，Ｍ．Ｌ．（２０１１）Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ、Ｂｅｒｌｉｎ）
【非特許文献６】Ｇｉｌｌｏｒ，Ｏ．、Ｋｉｒｋｕｐ，Ｂ．Ｃ．＆Ｒｉｌｅｙ，Ｍ．Ａ．（２００４）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５４、１２９−１４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
技術的な問題
本発明は、上記の先行技術を考慮し、またヒトおよび動物用の医薬における新規の抗細菌性の予防的作用剤の需要の増加を考慮してなされた。基質特異性拡張型ベータラクタマーゼ（ｅｎｈａｎｃｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ）（ＥＳＢＬ）株の療法はますます困難である。本発明の目的は、従来の抗生物質、したがって、ＥＳＢＬ産生体である病原性微生物の制御の代替として使用することができる新規の抗微生物ミクロシンポリペプチドを提供することである。この関連で、本発明の目的は、ＥＳＢＬ産生大腸菌、さらに、ドイツにおけるごく最近の大規模な大発生の原因病原体であった毒性が高い腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）株も含めた病原性グラム陰性細菌の処置において使用することができる新規の抗微生物ミクロシンポリペプチドを提供することである（Ｆｒａｎｋ，Ｃ．ら（２０１１）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  １０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１１０６４８３；Ｍｅｌｌｍａｎｎ，Ａ．ら（２０１１）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６（７）：ｅ２２７５１．ｄｏｉ：１０．１３７１）。ＥＨＥＣ細胞は、特定の抗生物質を用いて処置することによってより大量の志賀毒素を放出する。したがって、患者を抗生物質で処置することは禁忌であると考えられている。新規のミクロシンポリペプチドはＥＨＥＣおよび腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）感染症の治療および予防において有効である。本発明のさらなる目的は、成人および小児における機能性胃腸障害、特に過敏性腸症候群の治療において使用することができる新規の抗微生物ミクロシンポリペプチドを提供することである。本発明のさらなる目的は、前記医学的使用のための、新規のミクロシンポリペプチドを産生する細胞の新規のミクロシンポリペプチドを含む組成物を提供することである。癌の治療において使用することができる新規のミクロシンポリペプチド、食料品の保存において使用することができる新規のミクロシンポリペプチドおよび包帯材のコーティングにおいて使用することができる新規のミクロシンポリペプチドを提供することも本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
問題を解決するために、本発明は、一態様では、
ａ）配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上同一であるアミノ酸配列を含む、
ｂ）配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれか１つのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含むヌクレオチド配列と少なくとも５０％以上同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされる、
ｃ）配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれか１つのヌクレオチドの配列もしくはその相補体を含むヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされる、または
ｄ）配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体を含む、
単離されたポリペプチドを特徴とする。
【０００７】
詳細には、
ａ）配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上同一であるアミノ酸配列を含み、抗微生物活性を有するアミノ酸配列を含む、
ｂ）配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれか１つのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含むヌクレオチド配列と少なくとも７０％以上同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされ、配列番号１を含むヌクレオチド配列は少なくとも抗微生物活性もしくはミクロシンＳ自己免疫（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｕｎｉｔｙ）活性もしくはミクロシンＳ輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号２を含むヌクレオチド配列は抗微生物活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号３を含むヌクレオチド配列はミクロシンＳ自己免疫活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号４を含むヌクレオチド配列はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号５を含むヌクレオチド配列はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードする、
ｃ）配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれか１つのヌクレオチドの配列もしくはその相補体を含むヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされ、配列番号１を含むヌクレオチド配列は少なくとも抗微生物活性もしくはミクロシンＳ自己免疫活性もしくはミクロシンＳ輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号２を含むヌクレオチド配列は抗微生物活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号３を含むヌクレオチド配列はミクロシンＳ自己免疫活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号４を含むヌクレオチド配列はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号５を含むヌクレオチド配列はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードする、または
ｄ）抗微生物活性を有するアミノ酸配列を含む、配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体を含む、
単離されたポリペプチドが記載されている。
【０００８】
「抗微生物活性」という用語は、ミクロシンによって、詳細にはミクロシンＳによって引き起こされる抗微生物活性と理解されなければならない。
【０００９】
本発明のさらなる態様では、ミクロシンＳポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、
ａ）配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれか１つまたはその相補体と少なくとも５０％以上同一であるヌクレオチド配列を含む、
ｂ）配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれか１つのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含むヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子を含む、
ｃ）配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも５０％以上同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、または
ｄ）配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする核酸分子を含む、
核酸分子が利用可能になる。
【００１０】
より詳細には、ミクロシンＳポリペプチド、ミクロシンＳ自己免疫活性を有するポリペプチドまたはミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子であって、
ａ）配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれか１つもしくはその相補体と少なくとも７０％以上同一であるヌクレオチド配列を含み、配列番号１を含む核酸分子は少なくとも抗微生物活性もしくはミクロシンＳ自己免疫活性もしくはミクロシンＳ輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号２を含む核酸分子は抗微生物活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号３を含む核酸分子はミクロシンＳ自己免疫活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号４を含む核酸分子はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号５を含む核酸分子はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードする、
ｂ）配列番号１、２、３、４もしくは５のいずれか１つのヌクレオチド配列もしくはその相補体を含むヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子を含み、配列番号１を含む核酸分子は少なくとも抗微生物活性もしくはミクロシンＳ自己免疫活性もしくはミクロシンＳ輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号２を含む核酸分子は抗微生物活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号３を含む核酸分子はミクロシンＳ自己免疫活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号４を含む核酸分子はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードし、配列番号５を含む核酸分子はミクロシンＳの輸送活性を有するポリペプチドをコードする、
ｃ）抗微生物活性を有する、配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも７０％以上同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、または
ｄ）抗微生物活性を有する、配列番号６もしくは配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子変異体をコードする核酸分子を含む、
核酸分子が記載されている。
【００１１】
種々の態様において、本発明は、本発明による核酸分子を含むプラスミドならびに本発明による核酸分子および／またはポリペプチドおよび／またはプラスミドを含む細胞に関する。
本発明は、本発明によるポリペプチドに選択的に結合する抗体も対象とする。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、
ａ）本発明によるポリペプチド；および／または
ｂ）本発明による細胞
を含む組成物に関する。
【００１３】
療法または予防において使用するための本発明のポリペプチド、細胞および組成物も開示されている。
【００１４】
一態様では、本発明のポリペプチド、細胞および組成物は微生物感染症の治療または予防において使用するためのものであり、好ましくは、微生物感染症は腸管病原性大腸菌および／または腸管出血性大腸菌（ＥＰＥＣ、ＥＨＥＣ）の感染症を含む、または、好ましくは、微生物感染症は溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、好ましくは腸疾患性の溶血性尿毒症症候群を含む。
【００１５】
別の態様では、本発明のポリペプチド、細胞および組成物は胃腸障害、好ましくは機能性胃腸障害の治療において使用するためのものである。
【００１６】
さらなる態様では、本発明のポリペプチド、細胞および組成物は腫瘍の治療において使用するためのものである。
【００１７】
本発明は、本発明のポリペプチドを作製するための方法であって、
本発明による核酸分子、核酸プライマーもしくはプローブ、プラスミドまたは細胞を使用すること、または
液相もしくは固相ペプチド合成技法によって本発明のポリペプチドを合成すること
を含む方法を特徴とする。
【００１８】
本発明による単離されたポリペプチドは、ポリペプチドを作製するための前記方法によって作製することができる。
【００１９】
追加の態様では、ミクロシンＳに対して感受性の細菌を同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、本発明によるポリペプチド；核酸分子、核酸プライマーもしくはプローブ、細胞、抗体または組成物を使用することを含む方法が提供される。
【００２０】
本発明は、食料品を保存するための方法であって、
食料品に少なくとも１種類の天然の抗微生物性作用剤を添加することを含み、作用剤が、
ａ）本発明によるポリペプチド；
ｂ）本発明による細胞；および／または
ｃ）本発明による組成物
である方法にも関する。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、包帯材をコーティングするための方法であって、
包帯材を、
ａ）本発明によるポリペプチド；および／または
ｂ）本発明による組成物
でコーティングする方法に関する。
【００２２】
発明の有利な効果
すなわち、本発明者らは、新規の、従前のミクロシンではない、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が独特であるポリペプチドミクロシンＳを同定した。ミクロシンＳの効果に関与する遺伝子が同定されており、それらの効果は機能的に特徴付けられている。本発明者らは、驚いたことに、古典的なベータ−ラクタム系抗生物質の大部分とは対照的に、ミクロシンＳはＥＳＢＬ産生Ｏ１０４：Ｈ４アウトブレイク株ならびにＯ１２８：Ｈ２およびＯ１５７：Ｈ７  ＥＨＥＣ分離株を含むＥＨＥＣの阻害効果を示すことを見いだした（図５）。したがって、さらに、ミクロシンＳが腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）および腸管病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）の感染症の治療において有効であることが見いだされた。したがって、ミクロシンＳは、従来の抗生物質、したがって、病原性微生物の制御の代替として使用することができる。さらに、食料品保存のための使用が可能であり、それにより、本発明は完了した。さらに、プラスミドｐＳＹＭ１（図１）によりコードされる大腸菌Ｇ３／１０のミクロシンＳ（ＭｃｃＳ）遺伝子クラスター（配列番号１）が、４種のクラスター化された遺伝子、ｍｃｓＳ（配列番号２）、ｍｃｓＩ（配列番号３）、ｍｃｓＡ（配列番号４）およびｍｃｓＢ（配列番号５）からなることも見いだされた。大腸菌Ｇ３／１０は、例えば胃腸障害を治療するために使用される十分に証明されたプロバイオティクスであるので、必ずしもミクロシンＳを該株から精製しなければならないとは限らない。ＭｃｃＳはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて有利に有効であるはずである。
【００２３】
利点は、ミクロシンＳは非毒性であり、アレルギーを誘導し得ず、また、病原性微生物が耐性を生じることが難しいことである。
【００２４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＭｃｃＳオペロンをコードするメガプラスミドｐＳＹＭ１のベクターマップを示す図である。
【図２】ミクロシンＳ前駆体をコードする遺伝子ｍｃｓＳのアミノ酸配列の略図である（上のパネル）。推定リーダーペプチドに下線が引かれている。アスタリスクは、クラスＩＩミクロシンに典型的なジスルフィド結合の形成に関与する可能性があるＣｙｓを示す。メガプラスミドｐＳＹＭ１上のミクロシンＳ遺伝子クラスターＭｃｃＳ（下のパネル）は、４種のクラスター化された遺伝子ｍｃｓＳ、ｍｃｓＩ、ｍｃｓＡおよびｍｃｓＢからなる。
【図３】大腸菌株ＭＤＳ４２およびＧ４／９（野生型）ならびに適切なプラスミド相補性突然変異体と一緒にプレインキュベートした後の、ＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９のヒト腸上皮細胞内への接着効率を示すグラフである。使用されているアスタリスクの意味：＊ｐ≦０．０１。
【図４】種々のミクロシン発現株および非発現株と一緒にプレインキュベートした後の、ＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９野生型およびプラスミド相補突然変異体のヒト腸上皮細胞への接着効率を示すグラフである。使用されているアスタリスクの意味：＊ｐ≦０．０１、＊＊ｐ≦０．０５。ｐＡＺ８［ｍｃｓＡ、ｍｃｓＢ、ｍｃｓＩ］、ｐＡＺ１３［ｍｃｓＩ］、ｐＡＺ１４［ｍｃｓＩ、切断型］。
【図５】ＥｃＮまたは大腸菌Ｇ３／１０と一緒にプレインキュベートした後の、ＥＨＥＣ株８６−２４血清型Ｏ１５７：Ｈ７（Ａ）、ドレスデンにおいて単離されたＥＨＥＣ  Ｏ１０４：Ｈ４（Ｂ）ならびにフランクフルト（オーデル）において単離されたＥＨＥＣ  Ｏ１０４：Ｈ４（Ｃ）およびＯ１２８：Ｈ２（Ｄ）のヒト腸上皮細胞内への接着効率を示すグラフである。使用されているアスタリスクの意味：＊陰性対照と比較してｐ≦０．０１。
【図６】多重ＰＣＲ、および阻害対照として遺伝子ｒｅｃＡを用いたｍｃｓＳスクリーニングの結果を例示する図である。
【００２６】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、大腸菌Ｇ３／１０のミクロシンＳオペロンのヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号２は、大腸菌Ｇ３／１０の遺伝子ｍｃｓＳのヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号３は、大腸菌Ｇ３／１０の遺伝子ｍｃｓＩのヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号４は、大腸菌Ｇ３／１０の遺伝子ｍｃｓＡのヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号５は、大腸菌Ｇ３／１０の遺伝子ｍｃｓＢ遺伝子のヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号６は、リーダー配列を含む、大腸菌Ｇ３／１０のミクロシンＳ前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号７は、リーダーペプチドを伴わない、大腸菌Ｇ３／１０のミクロシンＳポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号８〜２６は、ミクロシンＳオペロン（配列番号１）に含有される遺伝子を増幅するために使用するオリゴヌクレオチドプライマー、またはミクロシンＳポリペプチドをコードするｍｃｓＳ遺伝子（配列番号２）についてスクリーニングするためのプローブである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
特に定義されていなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書が優先される。
【００３５】
冠詞「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」または「ｔｈｅ（その）」は、本明細書において使用される時はいつでも「１つ（ｏｎｅ）」または「いくつか（ｓｅｖｅｒａｌ）」を指す、すなわち、「１つ（ｏｎｅ）」、「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」または「１つまたは複数（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」を意味する。例えば、「１つの細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」という用語は、単一の細胞だけでなく複数の細胞も指す場合がある。
【００３６】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語が「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」を意味する実施形態も包含する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸分子の「同一性」とは、アミノ酸または核酸分子の「相同性」と等しい。
【００３８】
「ストリンジェントな条件」という句は、プローブ核酸分子が、一般には核酸分子の複合混合物中のその標的核酸分子配列とはハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、異なる状況では異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションのパラメータは、そのような方法が編集されている参考文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋにおいて見いだすことができる。一般に、ストリンジェントな条件は、決められたイオン強度、ｐＨにおいて、特定な配列の熱的融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、標的と相補的なプローブの５０％が標的配列と平衡状態でハイブリダイズする（標的配列はＴｍにおいて過剰に存在し、プローブの５０％が平衡状態で占有される）温度である（定義済みのイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度の下で）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、一般には、約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に対しては少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）に対しては少なくとも約６０℃である条件になる。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することで実現することもできる。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションに関し、陽性シグナルは、少なくともバックグラウンドの２倍であり、好ましくはバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションである。例示的な高ストリンジェンシーまたはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄することを伴う、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベートすることが挙げられる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドの「ミクロシン様活性」という用語は、ポリペプチドが、密接に関連する種に対する強力な抗微生物／抗細菌活性を発揮することを意味する。この用語は、さらに、ミクロシン産生体が、自身が産生するミクロシンに対して耐性であることを意味し、これは、１つの遺伝子クラスター内に位置する少なくとも１種の耐性付与遺伝子によって媒介される。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「プラスミド」という用語は、細胞において複製することができ、また、結合したセグメントの複製が生じるように、別の核酸分子を作動可能に連結することができる核酸分子を指す。対象ポリペプチドをコードする構造遺伝子の発現を導くことができるプラスミドは、本明細書では「発現プラスミド」と称される。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」という句は、対象核酸分子が、核酸分子によって形成される構造遺伝子の発現がプラスミドの制御下になるようにプラスミドに結合していることを意味する。
【００４２】
「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。
【００４３】
本明細書では、「接合性プラスミド」という用語は、コンジュゲーションのプロセスの間に１つの細胞から別の細胞に移動させることができるプラスミドを指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための、リン酸カルシウム共沈澱または塩化カルシウム共沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含めた種々の当技術分野で認められている技法を指すものとする。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「プロバイオティクス」という用語は、特定の数を摂取すると、固有の基本的な栄養を越える健康利益を発揮する、生きている微生物を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」とは、本明細書に記載の活性成分、すなわち、本発明によるポリペプチド（もしくはその薬学的に許容される塩）または本発明による細胞の１つまたは複数の、生理的かつ薬学的に許容される担体および賦形剤などの他の化学成分を伴う調製物を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【００４７】
以下、「生理的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という句は互換的に使用することができ、生物に対する著しい刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物学的な活性および性質を抑止しない担体または希釈剤を指す。薬学的に許容される担体に含まれる成分のうちの１つは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、有機媒体および水媒体のどちらにおいても広範囲の溶解性を有する生体適合性ポリマー（Ｍｕｔｔｅｒら（１９７９）であってよい。
【００４８】
本明細書では、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を指す。賦形剤の例としては、これだけに限定することなく、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種々のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患過程の有害作用を予防すること、治癒させること、反転させること、減弱させること、緩和すること、最小化すること、抑制することまたは停止させることを指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明から利益を得る可能性がある対象、例えば、動物または哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、ヒト）など、好ましくはヒト対象を指す。
【００５１】
本明細書では、「機能性胃腸障害」という用語は、胃腸管の異なる部分に影響を及ぼすいくつもの別々の特発性障害を包含する。
【００５２】
ポリペプチド
本発明のミクロシンＳポリペプチドは、そのアミノ酸残基配列および新規の機能的性質を特徴とする。ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて単離することができる。すなわち、天然に存在するまたは組換えによって作製されたミクロシンＳポリペプチドを、標準のタンパク質の精製技法を用いた適切な精製スキームによって細胞または組織供給源から単離することができる。しかし、ミクロシンＳポリペプチドは細胞内に天然に存在してもよく、または組換えＤＮＡ技法によって作製することもでき、あるいは組換え発現の代わりに、標準のペプチド合成技法を用いてミクロシンＳポリペプチドを化学的に合成することができる。本明細書では、ミクロシンＳポリペプチドは、表現型により特徴付けられ、ミクロシンＳと名付けられた大腸菌ミクロシンに分類される。図２では、上のパネルにミクロシンＳ前駆体のアミノ酸配列が示されている。２重のグリシンリーダーペプチドに下線が引かれている。アスタリスクは、クラスＩＩミクロシンに典型的なジスルフィド結合の形成に関与する可能性があるシステインを示す。アミノ酸配列は２重のグリシン切断部位を有するグリシンリッチペプチドを示す。配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは配列番号６または配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物活性変異体を本明細書に記載の方法において使用することができる。
【００５３】
したがって、好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列と、または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００５４】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、最適に比較する目的で配列をアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸配列または核酸配列および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができる）。
【００５５】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４または５のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補体を含むヌクレオチド配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる核酸分子によりコードされる。
【００５６】
次いで、対応する位置にある残基を比較し、一方の配列のある位置が他方の配列の対応する位置と同じ残基によって占められている場合、それらの分子はその位置において同一である。したがって、２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列に共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列を最適にアラインメントするために導入したギャップの数、および各ギャップの長さを考慮に入れた、それらの配列に共有される同一の位置の数の関数である。
【００５７】
配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的なアルゴリズムを使用して実現することができる。配列を比較するために利用される数学的なアルゴリズムの非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３にある通り改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み入れられる。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いてＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施することができる。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施することができる。比較する目的でギャップを挿入したアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（１７）：３３８９に記載のギャップ挿入ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ挿入ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期状態のパラメータを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。配列を比較するために利用されるアルゴリズムの別の好ましい非限定的な例はＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）である。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０または２．ＯＵ）に組み入れられる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み付け残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）１２、およびギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）４を使用することができる。配列解析のための追加的なアルゴリズムは当技術分野で公知であり、それらとして、ＴｏｒｅｌｌｉおよびＲｏｂｏｔｔｉ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：３に記載のＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４に記載のＦＡＳＴＡが挙げられる。
【００５８】
さらなる実施形態では、ポリペプチドは、ミクロシン様活性、抗微生物活性、抗細菌活性または抗腫瘍活性を有する。ポリペプチドは、細菌ポリペプチド、好ましくは細菌ミクロシンＳである。さらに、ポリペプチドは細菌のヒト腸上皮細胞への接着を阻害する。すなわち、ポリペプチドは密接に関連する種に対する抗微生物／抗細菌活性をもたらすが、ポリペプチドは、自身が産生するミクロシンに対して耐性であるその産生体に対する抗微生物／抗細菌活性は発揮しないことが理解されなければならない。したがって、ポリペプチドは密接に関連する細菌種のヒト腸上皮細胞への接着を阻害する。
【００５９】
ポリペプチドは大腸菌株から得られることができることが好ましく、大腸菌Ｇ３／１０から得られることができることがより好ましい。他の実施形態では、大腸菌Ｇ３／１０は大腸菌Ｇ３／１０ＤＳＭ１６４４３である。
【００６０】
ポリペプチドは生分解性であることがさらに好ましい。
【００６１】
核酸分子
プロバイオティクス大腸菌株Ｇ３／１０のゲノムは、「パイロシークエンス」技術を用いて完全に配列決定され、その後、自動的にアノテートされ、さらに手動で編集された。
【００６２】
大腸菌Ｇ３／１０は４９３５４０３ｂｐのゲノムおよびサイズが１．３ｋｂ〜５０ｋｂの６種のプラスミドを有する。５０ｋｂのプラスミドのうちのｐＳＹＭ１と称される４０ｋｂは、尿路病原性大腸菌由来のｐＭＡＳ２０２７とほぼ完全に同一（９９％相同性）である（Ｏｎｇ，Ｃ．Ｌ．、Ｂｅａｔｓｏｎ，Ｓ．Ａ．、ＭｃＥｗａｎ，Ａ．Ｇ．＆Ｓｃｈｅｍｂｒｉ，Ｍ．Ａ．（２００９）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７５、６７８３−６７９１）。残りの１０ｋｂは、ＮＣＢＩおよびＥｘＰＡＳｙのデータベースに蓄積されているヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対して相同性がないまたは相同性が低い読み枠を含有する。これらの遺伝子のうちの４種は、免疫系および輸送系を含めた、完全に新しい、上記されていない大腸菌ミクロシンクラスＩＩａをコードする。４種のクラスター化された遺伝子、ｍｃｓＳ（配列番号２）、ｍｃｓＩ（配列番号３）、ｍｃｓＡ（配列番号４）およびｍｃｓＢ（配列番号５）からなるこのミクロシンＳ遺伝子クラスター（配列番号１）が単離されている。このミクロシンは遺伝子型で特徴付けられ、ミクロシンＳと名付けられた。ＭｃｃＳの２種の輸出遺伝子はｍｃｓＡおよびｍｃｓＢである（図２）。遺伝子ｍｃｓＡは大腸菌溶血素ＨｌｙＤファミリーのメンバーであり、コリシン分泌タンパク質ｃｖａＡとの相同性は小さいことを示す。遺伝子ｍｃｓＢは、２つの膜貫通ドメインの領域および１つのペプチダーゼドメインを有するＡＢＣ輸送体をコードする。ＭｃｃＳの輸出遺伝子、ｍｃｓＡおよびｍｃｓＢはどちらも、細胞、特に細菌細胞質から細胞外空間へのミクロシンＳの輸送に関与するポリペプチドをコードする。
【００６３】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１〜５のいずれか１つまたは配列番号８〜２６のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその部分を有する核酸分子は、標準の分子生物学技法および本明細書において提供される配列情報を用いて単離することができる。例えば、配列番号１〜５のいずれか１つまたは配列番号８〜２６のいずれか１つの核酸配列の全部または一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、標準のハイブリダイゼーションおよびクローニング技法を用いてミクロシンＳ核酸分子を単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．らＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載の通り）。
【００６４】
本発明の核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいは、ゲノムＤＮＡを鋳型として、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、標準のＰＣＲ増幅技法に従って増幅することができる。さらなる有用なプライマーは本明細書の以下に記載されている。そのように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けることができる。さらに、ミクロシンＳヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準の合成法によって、例えば、自動ＤＮＡ合成機を使用して調製することができる。
【００６５】
好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号１、２、３、４または５のいずれか１つまたはその相補体と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、核酸分子は、配列番号６のアミノ酸配列と、または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６７】
さらなる実施形態では、核酸分子は、細菌ポリペプチド、好ましくは細菌ミクロシンＳをコードする。
【００６８】
核酸分子は大腸菌株から得ることが可能であることが好ましく、大腸菌Ｇ３／１０から得ることが可能であることがより好ましい。特定の実施形態では、核酸分子は大腸菌Ｇ３／１０ＤＳＭ１６４４３から得ることが可能である。
【００６９】
核酸プライマーまたはプローブ
ミクロシンＳ遺伝子をクローニングすることで決定されるヌクレオチド配列により、本発明のミクロシンＳ遺伝子の増幅および／または他の種におけるミクロシンＳ遺伝子の同定において使用するために設計されたプローブおよびプライマーを生成することが可能になる。
【００７０】
したがって、本発明は、さらに、本発明による核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、プライマーまたはプローブとしての核酸分子を提供する。そのような核酸プライマーまたはプローブは、少なくとも１５個の連続した塩基の配列を含む。
【００７１】
核酸プライマーまたはプローブは、一般には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。
【００７２】
好ましい実施形態では、核酸プライマーまたはプローブは、配列番号１、２、３、４または５のいずれか１つのセンス配列またはその相補体または配列番号１、２、３、４または５のいずれか１つの天然に存在する対立遺伝子変異体または突然変異体の少なくとも約１２個または１５個、好ましくは約２０個または２５個、より好ましくは約３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７５個、または１００個の連続したヌクレオチドとハイブリダイズする。一実施形態では、核酸プライマーまたはプローブは、配列番号１、２、３、４または５のいずれか１つのヌクレオチド配列またはその相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００７３】
より好ましい実施形態では、核酸プライマーまたはプローブは、配列番号８〜配列番号２６の少なくとも１つを含む。典型的な核酸プライマーまたはプローブの配列が表１に示されている。
【００７４】
【表１】
2014529397.tif 000002
【００７５】
本発明による核酸プライマーまたはプローブを、本発明による核酸分子を増幅するため、またはスクリーニングするために使用する。
【００７６】
したがって、核酸分子またはその部分を、例えば、ＰＣＲまたは他の当技術分野で周知の増幅技法によって増幅することができ、増幅された核酸分子またはその部分を当技術分野で公知の方法によって配列決定することができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸を増幅する方法であり、核酸の変性、アニーリングおよび伸長を含み、アニーリングのプロセスの間にプローブと標的核酸のハイブリダイゼーションが起こる。ＰＣＲのための条件はプローブと標的核酸の間の相同性の程度に従って変更することができる。所与のＰＣＲ条件下でアニーリング温度を上昇させると、非特異的なハイブリダイゼーション産物の収率が低下し、アニーリング温度を低下させると、非特異的なハイブリダイゼーション産物の収率が上昇する。例えば、Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、（２０００）を参照されたい。
【００７７】
本明細書に開示されているプローブは、さらに、種々の細胞型において本発明の核酸分子を検出するために使用することができる。例えば、本発明による核酸プライマーまたはプローブは、多重ＰＣＲを用いて本発明による核酸分子をスクリーニングするために使用することができる。多重ＰＣＲにより、増幅しようとする異なる遺伝子を同じ反応において同時に増幅することが可能になる。すなわち、それぞれの標的配列を増幅することができる異なるプライマーセットを１つの反応器に入れ、標的配列の増幅を単一のＰＣＲ反応において同時に実施する（例えば、Ｗｉｔｔｗｅｒ  Ｃ．Ｔ．ら、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５（４）：４３０−４４２、（２００１）；Ｍａｒｋｏｕｌａｔｏｓ  Ｐ．ら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ：ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１７（４）：１０８−１１２、（２００３）；Ｏ．Ｈｅｎｅｇａｒｉｕら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ：Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐ−ｂｙ−Ｓｔｅｐ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：５０４−５１１、（１９９７）；およびＭａｒｋｏｕｌａｔｏｓ  Ｐ．ら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１６（１）：４７−５１、（２００２）を参照されたい。
【００７８】
プラスミド
プラスミドはベクターの１種類であり、追加的なＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。特定のプラスミドは、それらが発生するまたはそれらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌プラスミドおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。
【００７９】
さらに、特定のプラスミドは、それが作動可能に連結した遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現プラスミド」と称される。
【００８０】
大腸菌Ｇ３／１０は、サイズが１．３ｋｂ〜５０ｋｂの６種のプラスミドを有する。ｐＳＹＭ１（図１）と称される５０ｋｂのプラスミドのうち４０ｋｂは尿路病原性大腸菌由来のｐＭＡＳ２０２７とほぼ完全に同一（９９％の相同性）である。残りの１０ｋｂは、ＮＣＢＩおよびＥｘＰＡＳｙのデータベースに蓄積されているヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に対して相同性がないまたは低い相同性しかない読み枠を含有する。これらの遺伝子のうちの４種は、免疫系および輸送系を含めた、完全に新しい、上記されていない大腸菌ミクロシンクラスＩＩａをコードする。４種のクラスター化された遺伝子、ｍｃｓＳ（配列番号２）、ｍｃｓＩ（配列番号３）、ｍｃｓＡ（配列番号４）およびｍｃｓＢ（配列番号５）からなるこのミクロシンＳ遺伝子クラスター（配列番号１）が単離されている。
【００８１】
したがって、プラスミドは本発明の核酸分子を含んでよい。好ましい実施形態では、プラスミドは発現プラスミドである。
【００８２】
本発明の発現プラスミドは、本発明の核酸を、細胞における核酸分子の発現に適した形態で含み、これは、天然に存在するまたは組換え型の発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基づいて選択され、発現させる核酸配列に作動可能に連結した１つまたは複数の調節配列を含むことを意味する。
【００８３】
したがって、プラスミドの調節エレメントは本発明の核酸分子に作動可能に連結していることがさらに好ましい。
【００８４】
別の実施形態では、プラスミドは接合性プラスミドである。
【００８５】
本発明で使用したプラスミドが表２に示されている：
【００８６】
【表２】
2014529397.tif 000003
【００８７】
細胞
細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る宿主細胞であってよい。例えば、ミクロシンＳポリペプチドは、本明細書において好ましい大腸菌などの細菌の細胞、または昆虫細胞、酵母もしくは哺乳動物の細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞など）において発現させることができる。他の適切な宿主細胞は当業者に公知である。
【００８８】
プラスミドＤＮＡは細胞に天然に存在するものであってもよく、または従来の形質転換またはトランスフェクション技法によって原核細胞または真核細胞に導入することもできる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）、および他の実験マニュアルに見いだすことができる。
【００８９】
したがって、本発明は、本発明の核酸分子、および／または請求項１に記載のポリペプチドおよび／または本発明のプラスミドを含む細胞にも関する。
【００９０】
核酸分子は、本発明の細胞（対象細胞）のゲノム内に、または、好ましくは対象細胞内のプラスミド内に組み込むことができる。
【００９１】
対象細胞は、細菌の細胞であることが好ましい。例えば、細胞は、大腸菌細胞、好ましくは大腸菌ＤＳＭ１７２５２由来の細胞、最も好ましくは大腸菌Ｇ３／１０ 細胞である。
【００９２】
対象細胞は組換え宿主細胞であってもよい。
【００９３】
好ましい実施形態では、対象細胞はプロバイオティクス細胞である。それで、細胞は抗微生物活性、抗細菌活性または抗腫瘍活性を有する。細胞は、密接に関連する種に対する抗微生物活性をもたらすが、細胞は、自身が産生するミクロシンに対して耐性であるその産生体に対する抗微生物活性は発揮しないことが理解されなければならない。
【００９４】
したがって、対象細胞は細菌のヒト腸上皮細胞への接着を阻害する。
【００９５】
本発明の核酸、ポリペプチドまたはプラスミドを天然に含み、詳細には単離された形態にない細胞は本出願の特許請求の範囲から除外される。
【００９６】
抗体
ミクロシンＳ免疫原は、一般には、適切な対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫原で免疫化することによって抗体を調製するために使用される。適切な免疫原性調製物は、例えば、天然に存在するもしくは組換えによって発現させたミクロシンＳポリペプチドまたは化学的に合成したミクロシンＳペプチドを含有してよい。調製物は、フロイントの完全アジュバントもしくは不完全アジュバントなどのアジュバント、または同様の免疫賦活剤をさらに含んでよい。免疫原性ミクロシンＳ調製物を用いて適切な対象を免疫化することにより、ポリクローナル抗ミクロシンＳ抗体応答を誘導する。そのような方法は当技術分野で公知である。
【００９７】
したがって、ポリクローナル抗ミクロシンＳ抗体は、上記の通り、適切な対象をミクロシンＳ免疫原で免疫化することによって調製することができる。所望であれば、ミクロシンＳポリペプチドを対象とする抗体分子を、哺乳動物から（例えば、血液から）単離し、さらに、プロテインＡクロマトグラフィーなどの周知の技法によって精製して、ＩｇＧ画分を得ることができる。免疫化した後の適切な時間に、例えば、抗ミクロシンＳ抗体価が最高になった時に、抗体産生細胞を対象から得、最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７に記載されたハイブリドーマ技法（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５も参照されたい）、ごく最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ．７７−９６）またはトリオーマ技法などの標準の技法によってモノクローナル抗体を調製するために使用することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを作製するための技術は周知である（一般に、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｒ．Ｈ．ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２；Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．、３：２３１−３６を参照されたい）。簡単に述べると、不死細胞株（一般には、骨髄腫）を上記の通りミクロシンＳ免疫原で免疫化した哺乳動物由来のリンパ球（一般には、脾細胞）と融合し、生じたハイブリドーマ細胞の培養物の上清をスクリーニングして、ミクロシンＳポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【００９８】
したがって、複数の実施形態では、本発明は、ミクロシンＳポリペプチドであるポリペプチドに選択的に結合する抗体にも関する。したがって、よく確立された免疫学的交差反応性の原理を考慮して、本発明は、配列番号６または配列番号７のポリペプチドの抗原性関連変異体を意図している。「抗原性関連変異体」とは、配列番号６または配列番号７のポリペプチドの少なくとも６つのアミノ酸残基配列部分を含み、配列番号６または配列番号７のポリペプチドに免疫応答する抗体分子を誘導することができるポリペプチドである。抗体は、合成抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体であってよく、当技術分野で周知の技法によって作出することができる。
【００９９】
組成物および医薬組成物
ミクロシンＳポリペプチド、またはさらには、本発明の細胞は、投与するために適した組成物または医薬組成物に組み入れることができる。したがって、本発明は、本発明によるポリペプチドまたは本発明による細胞を含む組成物を意図している。
【０１００】
さらに好ましい実施形態では、組成物は水性組成物である。
【０１０１】
さらなる実施形態では、組成物は抗微生物活性、抗細菌活性または抗腫瘍活性を有する。それで、組成物は細菌のヒト腸上皮細胞への接着を阻害する。
【０１０２】
好ましい実施形態では、組成物はプロバイオティクス組成物である。プロバイオティクス組成物は、プロバイオティクス微生物、好ましくは大腸菌ＤＳＭ１７２５２の混合物を含むことが好ましい。例えば、組成物は、大腸菌Ｇ１／２（ＤＳＭ１６４４１）、Ｇ３／１０（ＤＳＭ１６４４３）、Ｇ４／９（ＤＳＭ１６４４４）、Ｇ５（ＤＳＭ１６４４５）、Ｇ６／７（ＤＳＭ１６４４６）およびＧ８（ＤＳＭ１６４４８）またはこれらの混合物のうちの少なくとも１つの細胞および／または自己溶解物を含む。組成物は、自己溶解物ならびに細胞を、１ｍｌ当たり細胞３．００×１０６〜２．２５×１０８個、１ｍｌ当たり好ましくは細胞１．５〜４．５×１０７個の量で含有してよい。組成物は、大腸菌細菌の自己溶解物ならびに細胞、ならびにさらなる添加物を含むことが好ましい。したがって、本発明は、細菌株、大腸菌Ｇ１／２（ＤＳＭ１６４４１）、Ｇ３／１０（ＤＳＭ１６４４３）、Ｇ４／９（ＤＳＭ１６４４４）、Ｇ５（ＤＳＭ１６４４５）、Ｇ６／７（ＤＳＭ１６４４６）およびＧ８（ＤＳＭ１６４４８）の少なくとも１つ、すなわち、上記の株または本発明の方法によって選択される任意の細菌株のうちの１つを含むプロバイオティクス組成物を提供し、組成物は、少なくとも１種の株、好ましくは２〜３種の株、より好ましくは２〜４種の株、さらに好ましくは２〜５種の株および最も好ましくは２〜６種の株を含み、株のそれぞれは、組成物中に０．１％〜９９．９％、好ましくは１％〜９９％、より好ましくは１０％〜９０％の割合で存在する。好ましい実施形態では、組成物は、本発明の細菌株の少なくとも１つを、別の株または株の混合物と一緒に含み、混合物は、好ましくは２〜６種の株、より好ましくは２〜４種の株、最も好ましくは２〜３種の株を含み、株のそれぞれは、組成物中に０．１％〜９９．９％、好ましくは１％〜９９％、より好ましくは１０％〜９０％の割合で存在する。本発明のプロバイオティクス組成物は、凍結乾燥した形態、凍らせた形態、またはさらには死んだ形態であることが好ましい。好ましい実施形態では、プロバイオティクス組成物は、１種または複数種のプロバイオティクス微生物と、１種または複数種のプロバイオティクス微生物を胃腸管に輸送する機能を果たす担体とを含み、担体は、改変された、または改変されていない難消化性デンプンを高アミロースデンプンまたはそれらの混合物の形態で含んでよい。担体は、胃腸管内の微生物の成長培地または維持培地として働き、したがってプロバイオティクス微生物は大腸または胃腸管の他の領域を通過する間保護される。
【０１０３】
好ましい実施形態では、組成物はさらに医薬組成物であってよい。そして、医薬組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。医薬組成物は、治療有効量のポリペプチドまたは細胞ならびに１種または複数種のアジュバント、賦形剤、担体、および／または希釈剤を含有してよい。許容される希釈剤、担体および賦形剤は、一般には、レシピエントの恒常性（例えば、電解質の平衡）に悪影響を及ぼさない。許容される担体としては、生体適合性、不活性または生体吸収性の塩、緩衝剤、オリゴ糖または多糖、ポリマー、粘度改善剤、防腐剤などが挙げられる。医薬組成物の製剤化および投与のための技法についてのさらなる詳細は、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．）に見いだすことができる。
【０１０４】
添加物の例としては、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。望ましい色、味、安定性、緩衝能、分散または他の公知の望ましい特徴をもたらすために添加することができる添加物の例は、赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インクなどである。圧縮錠剤を作出するために同様の希釈剤を使用することができる。
【０１０５】
複数の実施形態では、補足的な活性化合物も組成物に組み入れることができる。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤化する。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与、および直腸内投与が挙げられる。
【０１０７】
非経口適用、皮内適用、または皮下適用のために使用する液剤または懸濁剤は、以下の構成成分を含んでよい：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒など；抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸など；緩衝液、例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸および張度を調整するための作用剤、例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖など。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムなどを用いて調整することができる。非経口用調製物はガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多数回投与用バイアルに封入することができる。
【０１０８】
注射での使用に適した組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または滅菌注射用溶液または分散剤を即時調製するための分散液と滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与するためには、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌されなければならず、また、容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する限りでは流体であるべきである。組成物は、製造および保管の条件下で安定でなければならず、また、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびに適切なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒度を維持することによって、および界面活性物質を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【０１０９】
経口投与は、カプセル剤、液剤、錠剤、ピル、または持続放出製剤の形態で適用することができる。
【０１１０】
経口用組成物は、一般に、不活性な希釈剤または食用担体を含む。経口用組成物は、ゼラチンカプセルに封入することもでき、または圧縮して錠剤にすることもできる。経口的な治療的投与のために、活性化合物を賦形剤と一緒に組み入れ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口用組成物は、流動性担体を用いて調製することもでき、流動性担体中の化合物を経口的に適用し、口の中で回し、喀出または嚥下する。薬学的に適合性する結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。経口用組成物は、以下の成分のいずれか、または同様の性質の化合物を含有してよい：塩、例えば、塩化ナトリウム、または硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏなどの硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏなどの塩化カルシウム、塩化マグネシウム・６Ｈ２Ｏなどの塩化マグネシウムなど、精製水、結合剤、例えば、結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなど；賦形剤、例えば、デンプンまたはラクトースなど、崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、またはトウモロコシデンプンなど；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）など；滑剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素など；甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリンなど；または香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味など。
【０１１１】
吸入による投与のためには、化合物を、適切な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧型容器もしくはディスペンサー、または、ネブライザーからエアロゾル噴霧剤の形態で送達する。
【０１１２】
全身投与は、経粘膜的または経皮的な方法によるものであってよい。経粘膜投与または経皮投与のためには、浸透するべき障壁に適した浸透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は、一般に、当技術分野で公知であり、それらとして、例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、経鼻スプレーまたは坐剤を使用することによって実現することができる。経皮投与のためには、活性化合物を当技術分野で一般に公知の軟膏剤、膏薬、ゲル剤、またはクリーム剤に製剤化する。
【０１１３】
化合物は、坐剤の形態（例えば、従来の坐薬基剤、例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどを用いて）または直腸内送達のためには停留浣腸の形態で調製することもできる。
【０１１４】
一実施形態では、活性化合物を、化合物を体内からの急速な排除から保護する担体、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル封入送達系を含めた制御放出製剤などと一緒に調製する。生分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などを使用することができる。そのような製剤を調製するための方法は、当業者には明らかであろう。材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから購入することもできる。リポソーム懸濁剤（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載の方法に従って調製することができる。
【０１１５】
経口用組成物は、投与を容易にし、かつ投与量を均一にするために単位剤形に製剤化することが特に有利である。単位剤形とは、本明細書で使用される場合、治療される対象の単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果がもたらされるように算出された所定の数量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の独特の特性および実現されるべき特定の治療効果、ならびに個体を治療するためのそのような活性化合物の配合の技術分野に固有の限定によって規定され、それに直接左右される。
【０１１６】
代替の実施形態では、組成物は、表面用の消毒薬であってよい。したがって、表面を消毒するための組成物の使用も本明細書において意図されている。
【０１１７】
好ましい実施形態では、消毒組成物は、適切な場合にはいつでも、表面活性物質（表面活性剤）または物質の混合物、芳香性物質、アジュバントおよび結合剤をさらに含む。
【０１１８】
別の実施形態では、消毒組成物は、結合剤ならびに場合によって芳香性物質および着色性物質およびアジュバント、例えば、水を軟化するための物質、増量剤などをさらに含み、液体の形態で、錠剤として、または顆粒状の形態で利用可能である。
【０１１９】
消毒組成物は食料品として安全であることが好ましい。
【０１２０】
消毒組成物により、さらに抗生物質耐性を有する病原性微生物からも保護される。
【０１２１】
キット
１つまたは複数の容器内に、治療的または予防的に有効な量の本発明の組成物を含むキットも提供される。キットは、場合によって、本明細書に開示されている意図された医学的使用を実施するためまたは提供される方法を実施するための説明書を含んでよい。
【０１２２】
ポリペプチド、細胞、組成物およびキットの医学的使用
ポリペプチド；細胞および組成物は抗微生物活性、抗細菌活性または抗腫瘍活性を示すので、本発明は、さらに、療法または予防におけるそれらの医学的使用に関する。
【０１２３】
詳細には、これらは、微生物感染症の治療または予防において使用することができる。さらに、これらは、胃腸障害、例えば、機能性胃腸障害の治療および予防法において、一実施形態では下痢の治療および予防法において使用される。
【０１２４】
好ましい実施形態では、微生物感染症は、腸管病原性大腸菌および／または腸管出血性大腸菌（ＥＰＥＣ、ＥＨＥＣ）の感染症を含む。さらなる実施形態では、微生物感染症は、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、好ましくは腸疾患に基づく溶血性尿毒症症候群を含む。しかし、本発明は、ＥＰＥＣまたはＥＨＥＣによって引き起こされる疾患に限定されず、下痢などの胃腸障害に関与する他の微生物、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属の種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ属の種およびＹｅｒｓｉｎｉａ属の種によって引き起こされる疾患の治療または予防法も含む。
【０１２５】
好ましい実施形態では、微生物感染症は、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）感染を含む。すなわち、腸管出血性大腸菌Ｏ１０４：Ｈ４アウトブレイク株またはミクロシンＳの影響を受けやすい任意の他のＥＨＥＣ。さらに好ましい実施形態では、微生物感染症は、志賀毒素産生大腸菌感染症を含む。志賀毒素産生大腸菌は、腸管出血性大腸菌であってよい。他の毒性因子に加えて、志賀毒素（Ｓｔｘ１；Ｓｔｘ２；Ｓｔｘ１，２）が重度の、大部分が血性である下痢、および溶血性尿毒症症候群の発症に関与する。ＥＨＥＣ細胞は特定の抗生物質を用いて処置することによってより多くの量の志賀毒素を放出する。したがって、患者を抗生物質で処置することは禁忌であると論じられている。微生物感染症を対象ポリペプチド；対象細胞または本発明の組成物を用いて処置することにより、志賀毒素の産生を阻害することができる。
【０１２６】
他の実施形態では、微生物感染症は腸管病原性大腸菌感染を含む。
【０１２７】
複数の実施形態では、微生物感染症は、基質特異性拡張型ベータラクタマーゼ産生腸内細菌科感染症を含む。微生物感染症は、基質特異性拡張型ベータラクタマーゼ産生大腸菌を含むことが好ましい。
【０１２８】
複数の実施形態では、本発明の対象ポリペプチド；対象細胞または組成物は、微生物感染症を引き起こす微生物を１：１０００、好ましくは１：５００、より好ましくは１：１００、なおより好ましくは１：５０、最も好ましくは１：２０、またはさらには１：１〜１：１０の割合で阻害する。
【０１２９】
代替の実施形態では、本発明の対象ポリペプチド；対象細胞；組成物または本発明のキットは、機能性胃腸障害、好ましくは過敏性腸症候群の治療において使用するためのものである。これらを成体および小児の治療において使用することが好ましい。
【０１３０】
別の代替の実施形態では、ポリペプチド；細胞；組成物またはキットは腫瘍の治療において使用するためのものである。これらは、程度は変動するとしても、腫瘍細胞の成長を阻害することができる。ミクロシンＳポリペプチドはヒト細胞株においてアポトーシスを誘導することができることが好ましい。例えば、本発明によるポリペプチド、核酸分子、細胞または組成物は、対象に、本明細書に記載の投与経路を用いて、例えば、静脈内に適用することができる。ポリペプチド、核酸分子または細胞を腫瘍内に蓄積させることができる。対象細胞を投与する場合、細胞を腫瘍内に蓄積させ、本発明によるポリペプチドを産生させることができる。ポリペプチドは、対象核酸分子から発現させることもでき、または組成物から放出させることもできる。ミクロシンＳは、腫瘍活性プロモーターの制御下に置くことができる。ポリペプチド；細胞または組成物は、医薬の投与に適した、生物学的に適合する形態で対象に投与する。
【０１３１】
ポリペプチド；細胞；組成物またはキットは、腫瘍細胞において有意なレベルでアポトーシスを誘導するが、正常細胞系に対してはいかなる影響も生じさせないべきである。
【０１３２】
ポリペプチド；細胞；組成物またはキットを使用することによって治療および／または予防することができる疾患または障害の非限定的な例は、一般に腫瘍、具体的には結腸直腸癌、肝臓の癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、扁平上皮細胞性口腔癌腫、リンパ系腫瘍、前立腺の癌、膀胱の癌、乳房の癌、胸膜および腹膜の癌である。
【０１３３】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ポリペプチド；細胞または組成物は、非経口用の形態、例えば、静脈内用、皮内用、皮下用、経口用、経皮（局所）用、経粘膜用および直腸内用の形態、好ましくは経口用の形態で対象に投与することができる。
【０１３４】
ポリペプチド；細胞または組成物は、薬学的有効量で対象に投与することができる。薬学的有効量の本発明のポリペプチド；細胞または組成物の投与とは、所望の結果を実現するために必要な投与量、およびそれに必要な期間にわたる有効量と定義される。例えば、ポリペプチド；細胞または組成物の薬学的有効量は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびにポリペプチド；細胞または組成物の個体における所望の応答を引き出す能力などの因子に応じて変動してよい。投与量レジメンは、最適な治療応答をもたらすように調整することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与することもでき、または治療状況の緊急性によって示される通り用量を比例的に減少させることもできる。
【０１３５】
治療効果を最適化するために、種々の時点で種々の投薬レジメンでミクロシンＳポリペプチドを投与する。
【０１３６】
単一の薬学的に有効な用量または多数の薬学的に有効な用量、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれ以上を対象に投与することができる。詳細には、単回の薬学的に有効な用量を１日に２回、３回、４回、５回、６回、７回、またはそれ以上の回数で対象に投与することができる。
【０１３７】
詳細には、水性組成物５〜１５滴の用量を対象に投与することができる。１０滴の用量を投与することがより好ましい。そのような実施形態では、１ｍｌは約１４滴を含有する。
【０１３８】
薬学的有効量（すなわち、薬学的に有効な投与量）は、体重１ｋｇ当たり約０．００１〜３０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．０１〜２５ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．１〜２０ｍｇ、なおより好ましくは体重１ｋｇ当たり約１〜１０ｍｇ、体重１ｋｇ当たり２ 〜９ｍｇ、体重１ｋｇ当たり３〜８ｍｇ、体重１ｋｇ当たり４〜７ｍｇ、または体重１ｋｇ当たり５〜６ｍｇにわたる。
【０１３９】
多数の用量の投与を、数時間、数日、数週間、または数カ月の間隔に分けることができる。さらなる実施形態では、１日に少なくとも１回、２回または３回、食事と一緒に、水に入れて、好ましくは１日３回、食事と一緒に、水に入れて投与する。
【０１４０】
これらは、場合によって、限られた期間にわたり、かつ／または限られた数の用量で対象に投与することができる。例えば、いくつかの実施形態では、対象への投与を、例えば、１年以内、６カ月以内、１カ月以内、または２週間以内に終了する（すなわち、さらなる投与を提供しない）ことができる。例えば、投与の提供を６カ月後に終了することができる。慢性疾患では、期間を６カ月にまで増やすことが必要な場合がある。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、用量を２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後またはそれ以上後に増加させることができる。対象に投与する用量を水性組成物１５〜２５滴、より好ましくは２０滴に増加させることができる。
【０１４２】
小児では、水性組成物５〜１５滴を経口用の形態で投与することができる。小児に１０滴を投与することがより好ましい。さらなる実施形態では、水性組成物を小児に少なくとも１日に１回、２回または３回、食事と一緒に、水に入れて、好ましくは１日に１回、食事と一緒に、水に入れて投与する。
【０１４３】
全ての医学的使用の実施形態において、本発明のポリペプチド；細胞；組成物またはキットを、治療の開始時に、成体には１０滴を１日３回、食事と一緒に、水に入れて投与し、用量を１週間後に２０滴に増加させ、また、小児には、１日当たり１回１０滴を食事と一緒に、水に入れて投与する。
【０１４４】
ミクロシンＳポリペプチドを作出するためのプロセス
本発明のポリペプチドは、天然に精製された産物であってもよく、または化学的合成手順の産物であってもよく、または組換え技法によって原核生物の宿主または真核生物の宿主に産生させることもできる（例えば、培養物中の細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞によって）。
【０１４５】
詳細には、本発明の細胞、例えば、培養物中の原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞などを用いて、ミクロシンＳポリペプチドを作製する（すなわち、発現させる）ことができる。したがって、本発明は、さらに、本発明の細胞を用いてミクロシンＳポリペプチドを作製するための方法を提供する。
【０１４６】
対象ポリペプチドであるミクロシンＳを作製するための方法が本明細書において意図されている。そのような方法は、本発明による核酸分子、核酸プライマーもしくはプローブ、プラスミドまたは細胞を使用すること、または、
本発明によるポリペプチドを液相または固相ペプチド合成技法によって合成することを含む。
【０１４７】
好ましい実施形態では、該方法は、
ｉ）本発明の核酸分子または本発明のプラスミドを含む細胞をもたらすステップと、
ｉｉ）細胞を、核酸分子からのポリペプチドの発現が可能になる条件下で培養するステップと
を含む。
【０１４８】
好ましい実施形態では、該方法は、（ｉｉｉ）作製されたポリペプチドを回収するステップをさらに含む。
【０１４９】
したがって、単離された対象ポリペプチドは前記方法によって作製される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ミクロシンＳポリペプチドは、天然に存在する細胞によって、あるいは、組換えＤＮＡ技法によって作製される。例えば、ミクロシンＳポリペプチドをコードする核酸分子は、すでにプラスミドによってコードされていてもよく、またはプラスミド、例えば、発現プラスミドに挿入することもできる。プラスミドを使用して、組換え方法によって核酸分子を細胞に導入することができる。細胞において発現させる場合、細胞をミクロシンＳポリペプチドの発現が可能になる条件下で培養することが好ましい。ミクロシンＳポリペプチドは、所望であれば細胞浮遊液から回収することができる。本明細書で使用される場合、「回収」とは、ミクロシンＳポリペプチドを、回収プロセスの前にそれが存在していた細胞または培養培地の構成成分から取り出すことを意味する。回収プロセスは、１回または複数回のリフォールディングまたは精製ステップを含んでよい。変性したミクロシンＳポリペプチドのフォールディングを誘導するための緩衝液および方法は当技術分野で公知である。
【０１５１】
本発明の範囲内に入るポリペプチドは、当技術分野で公知の標準の液相技法または固相技法を使用して合成することができる（例えば、Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）．「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉ．Ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  Ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ」．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５（１４）：２１４９−２１５４）。したがって、対象ポリペプチドは、部分的なペプチドまたはアミノ酸を縮合させることによって作製することができる。部分的なペプチドまたはアミノ酸が保護基を有する場合、対象ポリペプチドが作製されたら保護基を脱離させる。固相、すなわち樹脂での合成は、α−アミノ基および側鎖の官能基が適切に保護されたアミノ酸またはペプチドから開始する。これらを、それ自体が公知である種々の縮合技法によって、対象ポリペプチドの配列に応じて樹脂上で縮合させる。一連の反応の最後に、ペプチドまたは保護されたペプチドを樹脂から取り出し、保護基を除去して目的のポリペプチドを得る。例えば、固相合成は、保護されたアミノ酸を使用してペプチドのカルボキシ末端から開始する。他の保護基が適切であっても、全てのアミノ基に対してＢＯＣ保護基またはＦＭＯＣ保護基を使用することができる。例えば、クロロメチル化ポリスチレン樹脂支持体でＢＯＣ−ｌｙｓ−ＯＨをエステル化することができる。ポリスチレン樹脂支持体は、スチレンと、特定の有機溶媒中でポリスチレンポリマーを完全に不溶性にする架橋剤としての約０．５〜２％ジビニルベンゼンとの共重合体であることが好ましい。Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９６９）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６３）８５：２１４９−２１５４を参照されたい。これらおよび他のペプチド合成の方法は、米国特許第３，８６２，９２５号；同第３，８４２，０６７号；同第３，９７２，８５９号；および同第４，１０５，６０２号にも例示されている。
【０１５２】
ポリペプチド合成には、手動の技法を用いることもでき、または自動的に、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４０３Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）またはＢｉｏｓｅａｒｃｈ  ＳＡＭ  ＩＩ自動ペプチド合成機（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造者から供給される説明マニュアルにおいて提供される説明に従って使用することもできる。
【０１５３】
食料品を保存するためのプロセス
本発明は、食料品を保存するための方法であって、
食料品に少なくとも１種類の天然の抗微生物性作用剤を添加することを含み、作用剤が
ａ）本発明によるポリペプチド；
ｂ）本発明による細胞；および／または
ｃ）本発明による組成物
である方法にも関する。
【０１５４】
グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌は大抵食料品中に一緒に見いだされるので、本発明の範囲内に入るポリペプチド、核酸分子、細胞または組成物は、細菌、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、大腸菌、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＬｉｓｔｅｒｉａに対して有効性を示す。より詳細には、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、大腸菌の他の種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびその他などの細菌。
【０１５５】
該作用剤は、汚染細菌を阻害するために十分な量で添加することが理解されるべきである。
【０１５６】
食料品に添加したポリペプチド、核酸分子、細胞または組成物により、保護効果が実現されることが好ましい。一実施形態では、ポリペプチド、細胞または組成物は、食料品の消費に影響を及ぼさない。例えば、これらは無味であり、かつヒトおよび動物に対して非毒性である。
【０１５７】
したがって、本発明の範囲内に入るポリペプチド、核酸分子、細胞または組成物は、生の成分、加工された食料品および飲料が細菌性病原体および他の微生物腐敗有機体によって汚染されることを制御および予防することに特に適する。これらは、細菌の成長または分解の影響を受けやすい食品に関連して使用することができる。潜在的な食料品に関連する使用としては、肉、特に家禽肉、卵、チーズ、乳製品、果実、野菜由来製品、穀物および穀物由来製品、缶詰、サラダドレッシング、発酵飲料および魚肉などの海産食品、または多くの他の食料品の処理が挙げられる。乳食品の例としては、これだけに限定されないが、チーズ、乳、クリーム、およびヨーグルトなどの発酵乳食品が挙げられる。肉の例としては、例えば、ハム、牛肉、サラミ、鶏肉、およびシチメンチョウが挙げられ、全体またはそれらから作られた加工肉製品が含まれる。他の食品としては、インスタント食品、アントレ、および肉、デリサラダ、マヨネーズ、ドレッシング（サラダドレッシングを含む）、ソースおよび香辛料、パスタ、スープ、食用油、魚肉および魚肉製品、卵製品、飲料、無菌包装された食料品、ならびに前述のものの混合物を含めた加工食品が挙げられる。他の食料品に関連する使用としては、食料品の包装および取扱い設備の処理が挙げられる。さらなる使用としては、例えば、プロセスチーズ、クリーム、乳、乳製品における、および家禽肉、魚肉、肉または野菜の清浄における食料品防腐剤としての使用が挙げられる。
【０１５８】
本発明のポリペプチド、核酸分子、細胞または組成物は、混和可能な食品と混合することおよび／またはそれに適用することによって使用することができるが、固体の食品表面に浸漬、すすぎ、または噴霧によって、またはそのような食品の内部に、例えば、注入によって適用することによって適用することができる。これらは、マリネード、パン粉、シーズニングラブ（ｓｅａｓｏｎｉｎｇ  ｒｕｂ）、グレーズ、着色混合物などとして、または食品と混合され、それに組み入れられる成分として適用することができる。さらに他の態様では、ポリペプチド、核酸分子、細胞または組成物は、組成物を食料品包装材料、例えば、ケーシングまたはフィルムなどに適用し、その後、包装を、組成物が外側の食料品表面と接触するように食料品表面に適用することによって食料品表面と間接的に接触させることができる。使用最適量は、処理される特定の食品および組成物を食料品および／または食料品表面に適用するのに用いる方法に左右されるが、常套的な実験によって決定することができる。
【０１５９】
利点は、本発明のポリペプチド、細胞または組成物は容易に消化され、非毒性であり、アレルギーを誘導し得ず、病原性微生物が耐性を生じることが難しいことである。
【０１６０】
ミクロシンＳポリペプチドに対して感受性の細菌を同定するためのプロセス：
本発明は、さらに、ミクロシンＳポリペプチドに対して感受性の細菌を同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。そのような方法では、対象ポリペプチド；対象核酸分子、対象核酸プライマーもしくはプローブ、対象細胞、対象抗体または対象組成物を用いることができる。
【０１６１】
一実施形態では、該方法は、微生物感染症を引き起こす病原性細菌を、対象ポリペプチド；対象核酸分子、対象核酸プライマーもしくはプローブ、対象細胞、または対象組成物と接触させるステップを含み、細胞の腸上皮細胞（腸細胞）への接着効率が低下することにより、細胞のミクロシンＳに対する感受性が示される。
【０１６２】
ミクロシンＳは、対象ポリペプチドの形態で病原性細菌に添加することができることが理解されなければならない。しかし、ミクロシンＳを発現させることができる対象の核酸分子を加えることもできる。さらに、ミクロシンＳを産生する対象細胞を添加することが可能である。最後に、ミクロシンＳを含む対象組成物を病原性細菌に添加することができる。
【０１６３】
好ましい実施形態では、該方法は、
第１の細胞のセットを提供するステップと、
第１の細胞のセットを対象ポリペプチド、対象核酸分子、対象細胞、対象抗体または対象組成物と一緒にプレインキュベートするステップと、
第２の細胞のセットを提供するステップと、
第１の細胞のセットおよび第２の細胞のセットに、微生物感染症を引き起こす病原性細菌を感染させるステップと、
第１の細胞のセットおよび第２の細胞のセットの接着効率を測定するステップと、
第１の細胞のセットの接着効率と第２の細胞のセットの接着効率を比較するステップであって、第１の細胞のセットの接着効率が第２の細胞のセットのよりも低い場合に、第１の細胞のセットの細胞がミクロシンＳに対して感受性であるステップと
を含む。
【０１６４】
第１の細胞のセットの接着効率が、第２の細胞のセットの対応する系と比較して低下し、ミクロシンＳが対象ポリペプチド； 対象核酸分子、対象細胞または対象組成物の形態で添加されていなければ、第１の細胞のセットがミクロシンＳに対して感受性であることが示される。
【０１６５】
好ましい実施形態では、第１の細胞のセットの細胞および第２の細胞のセットの細胞はヒト腸上皮細胞である。
【０１６６】
好ましい実施形態では、細菌を同定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、改変された寒天拡散試験である。第１のステップにおいて、微生物感染症を引き起こす細菌を培養プレートに適用する。第２のステップにおいて、濾紙ディスクに対象ポリペプチド；対象核酸分子、対象核酸プライマーもしくはプローブ、対象細胞、対象抗体または対象組成物を浸透させる。次いで、濾紙を培養プレート上の寒天の表面上に置く。
【０１６７】
これにはミクロシンＳを濾紙から寒天内に拡散させる効果がある。ミクロシンＳの濃度がディスクの隣で最も高く、ディスクまでの距離とともに低下する濃度勾配を確立した。
【０１６８】
ミクロシンＳが特定の濃度で細菌に対して有効であれば、寒天内の濃度が有効濃度以上である場合、コロニーは成長しない。これが阻害帯域である。したがって、阻害の帯域のサイズは、化合物の有効性の尺度である：濾過ディスクの周りの何もない面積が大きいほど化合物の有効性が高い。
【０１６９】
包帯材をコーティングするための方法：
包帯材をコーティングするための方法であって、
包帯材を、
ａ）本発明によるポリペプチド；および／または
ｂ）本発明による組成物
でコーティングする方法は本発明の範囲内である。
【０１７０】
本発明の新規のミクロシンＳポリペプチドは抗微生物効果を示すので、包帯材をコーティングするために使用することができる。例えば第１度熱傷および第２度熱傷の患者などの対象の群のための、コーティングされた包帯が有利であることが理解されるべきである。そのような対象は、細菌感染症からの保護を必要とする。好ましい実施形態では、包帯材は消毒包帯である。より好ましい実施形態では、消毒包帯はパッチまたは絆創膏である。複数の実施形態では、コーティングされた包帯材により、熱傷創傷に関連する病原体であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの保護がもたらされる。
【実施例】
【０１７１】
〔実施例１〕
細菌株および成長条件
本明細書において使用した細菌株が表３及び表４に列挙されている。
【表３】
2014529397.tif 000004
【０１７２】
【表４】
2014529397.tif 000005
【０１７３】
〔実施例２〕
大腸菌Ｇ３／１０におけるミクロシンをコードする遺伝子クラスターの同定
６種の大腸菌：大腸菌Ｇ１／２、Ｇ３／１０、Ｇ４／９、Ｇ５、Ｇ６／７およびＧ８のゲノムについて配列決定した。アノテーションにより、大腸菌Ｇ３／１０のゲノム内に既知のミクロシンは示されなかった。大腸菌Ｇ３／１０は、サイズが５０．６ｋｂの大きな接合性プラスミドｐＳＹＭ１（図１）を含有する。このプラスミドは尿路病原性大腸菌分離株のプラスミドｐＭＡＳ２０２７と９９％同一である。さらに、このプラスミドは、１０ｋｂの挿入断片を含有するが、ＢＬＡＳＴ分析では、特徴付けられていない無名の遺伝子のみが示された。殺菌作用の起源を同定するために、大腸菌Ｇ３／１０株をそのメガプラスミドｐＳＹＭ１からキュアリング（ｃｕｒｅ）することを試みた。一般的なキュアリング手順の多く、例えば、マイトマイシンＣまたは加熱処理を実施したにもかかわらず、この株をキュアリングすることはできなかった。したがって、プラスミドｐＳＹＭ１をコンジュゲーションによって大腸菌Ｇ４／９に移入した。接合体のスクリーニングを可能にするために、まずアンピシリン耐性カセットをｐＳＹＭ１に組み込み、その結果ｐＳＹＭ１−ＳＴ７６Ａｎが生じた。生じた大腸菌Ｇ４／９ｐＳＹＭ１−ＳＴ７６ＡｎはＥＰＥＣ接着を有意に阻害することができた（図３）。プラスミドｐＳＹＭ１が示されている効果に関与する遺伝子を有することが結論づけられた。プラスミドｐＳＹＭ１の４．７ｂｐの断片をｐＢＲ３２２にクローニングし、その結果、プラスミドｐＡＺ６が生じ、次いでこれを大腸菌Ｇ４／９に入れて形質転換した。ｐＡＺ６により、大腸菌Ｇ４／９がＥＰＥＣ接着効率を有意に阻害することができるようになり（図３）、これは、ｐＳＹＭ１の４．７ｋｂの断片が、大腸菌Ｇ３／１０のＥＰＥＣ接着阻害効果に関与することを示している（図２）。自動的にアノテートされたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＢＬＡＳＴ分析により、特徴付けられたタンパク質またはタンパク質ファミリーとの相同性が小さいことが明らかになり、これにより、ミクロシンをコードするオペロンとの関係が示されている。それにもかかわらず、ミクロシン自体は、未検出のままであった。ｍｃｓＩ、ｍｃｓＡおよびｍｃｓＢと称される３種の遺伝子をｐＢＲ３２２にクローニングし、その結果、ｐＡＺ８が生じた。ミクロシンをコードする遺伝子である可能性のあるこのオペロンの上流の小さなＯＲＦ（図２）をｐＡＣＹＣ１８４にクローニングし、大腸菌Ｇ４／９ｐＡＺ８にサブクローニングした。このステップにより、推定ミクロシンとミクロシン−ヘルパータンパク質を別々のプラスミドにコードさせることが容易になった。プラスミドｐＡＺ８およびｐＡＺ９を含有する大腸菌Ｇ４／９のみがＥＰＥＣ接着を有意に阻害したが、Ｇ４／９ｐＡＺ８はＧ４／９ 野生型と同様にＥＰＥＣ接着に影響を及ぼす（図３）。ｍｃｓＳと名付けられた小さな遺伝子は、ミクロシンＳと名付けられたミクロシンをコードする。
【０１７４】
〔実施例３〕
ミクロシンＳの機能的な特徴付けおよびその自己免疫の解明
細菌の接着は、多くの感染症の極めて重要な最初のステップである。したがって、ヒト腸上皮細胞への接着の阻害を数量化する試験系は、宿主に対する有益な効果を実証するために適している。第１の実験において、ＣＡＣＯ−２細胞またはＬＯＶＯ細胞の集密の単層を、細菌試験株ＥｃＮ、大腸菌Ｇ３／１０、大腸菌Ｇ４／９または大腸菌Ｇ４／９ｐＡＺ６と一緒に、大腸菌：宿主細胞１００：１のＭＯＩでプレインキュベートした。２時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、ＥＰＥＣ：宿主細胞１００：１のＭＯＩを用いてＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９を感染させた。大腸菌Ｇ３／１０および大腸菌Ｇ４／９ｐＡＺ６はＥｃＮと同様にＥＰＥＣ接着を阻害することができた。ＥｃＮによる接着阻害は、株のミクロシン活性に左右されることが示された。％単位の接着効率は、いかなるプレインキュベーションもしていない接着（陰性対照）を１００％に設定し、それと比較したＥＰＥＣの接着として表されている。データは、２連のウェルでの少なくとも３回の別々の実験の平均±ＳＤである。図４は、種々のミクロシン発現株（大腸菌Ｇ３／１０、Ｇ４／９ ｐＡＺ６およびＥｃＮ）ならびに非発現株（大腸菌Ｇ４／９）と一緒にプレインキュベートした後の、ＥＰＥＣ  Ｅ２３４８／６９野生型およびｍｃｓＩを有するプラスミド相補突然変異体のヒト腸上皮細胞への接着効率を示す。結果として、ｍｃｓＩをミクロシンＳ自己免疫遺伝子であると確実に同定することができた。
【０１７５】
〔実施例４〕
腸管出血性大腸菌に対する影響
腸管出血性大腸菌は腸上皮細胞に接着する。第２の実験において、ＬＯＶＯ細胞の集密の単層を細菌試験株と一緒に、大腸菌：宿主細胞１００：１の感染多重度（ＭＯＩ）でプレインキュベートした。ＥｃＮおよび大腸菌Ｇ３／１０の影響を試験した。２時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、ＥＨＥＣ：宿主細胞１００：１のＭＯＩを用いてＥＨＥＣを感染させた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ接着アッセイを用いて３つのＥＨＥＣ分離株を指標株として試験した。ＨＵＳ関連ＥＨＥＣ８６−２４血清型Ｏ１５７：Ｈ７およびＥＨＥＣ  Ｏ１０４：Ｈ４アウトブレイク株の２つの異なる分離株ならびにＥＨＥＣ  Ｏ１２８：Ｈ２患者分離株を使用した。ＥＨＥＣ  Ｏ１０４：Ｈ４分離株はＥＳＢＬ産生体であるので、医学的処置は限定される。％単位の接着効率は、いかなるプレインキュベーションもしていない接着（陰性対照）を１００％に設定し、それと比較したＥＨＥＣの接着として表されている。データは、２連のウェルでの３回の別々の実験の平均±ＳＤである。ＥＨＥＣ接着は、大腸菌Ｇ３／１０によってのみ阻害されたが、これは、ＥｃＮ由来のＭｃｃＭ／Ｈ４７と大腸菌Ｇ３／１０由来のＭｃｃＳの作用機構が異なることを示す。図５は、ＥｃＮまたは大腸菌Ｇ３／１０と一緒にプレインキュベートした後の、ＥＨＥＣ株８６−２４血清型Ｏ１５７：Ｈ７（Ａ）、ドレスデンにおいて単離されたＥＨＥＣ  Ｏ１０４：Ｈ４（Ｂ）ならびにフランクフルト（オーデル）において単離されたＥＨＥＣ  Ｏ１０４：Ｈ４（Ｃ）およびＯ１２８：Ｈ２（Ｄ）のヒト腸上皮細胞内への接着効率を示す。
【０１７６】
〔実施例５〕
種々の大腸菌および他のｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅにおけるミクロシンＳ遺伝子ＭｃｃＳについてのスクリーニング
ヌクレオチドおよびアミノ酸のデータベースにおいてミクロシンＳの配列は未知である。ＭｃｃＳ遺伝子クラスターについてのスクリーニングを３８種の大腸菌株、２種の赤痢菌株および２種のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ株において、多重ＰＣＲ、および阻害対照として遺伝子ｒｅｃＡを用いて実施した。試験した株は、異なる起源の一般的な実験室株、ヒト臨床分離株および動物分離株である。ＭｃｓＳ遺伝子は、試験した４２種のヒト分離株および動物分離株ならびに実験室株のいずれにおいても検出することができなかった。結果は図６に示されている。
【図１】
2014529397.tif 000006
【図２】
2014529397.tif 000007
【図３】
2014529397.tif 000008
【図４】
2014529397.tif 000009
【図５】
2014529397.tif 000010
【図６】
2014529397.tif 000011
【配列表】
2014529397000001.app
【国際調査報告】
2014529397.tif 000012
2014529397.tif 000013
2014529397.tif 000014
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