(57)【要約】  ウイルスのＤＬＣ８への結合を阻害する新規抗ウイルス性ペプチド。多くのウイルス由来の病原体は、感染サイクルのある時点において、ダイニンに基づく細胞内輸送機構を使用する。本発明は、主としてウイルスタンパク質と細胞のＤＬＣ８タンパク質との相互作用を阻害する干渉メカニズムによる、ダイニンシステムを使用するウイルスによってもたらされるウイルス感染を阻害することから構成される、新規抗ウイルス療法からなる。本発明は、その配列が、ＤＬＣ８との結合ドメインに相当するウイルスタンパク質の全体又は部分配列を含む又はそれら配列からなるペプチドによる、この相互作用の機能の阻害を初めて開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１４又はそれに由来し、少なくとも１つのアミノ酸の保存的変化を有し、ＤＬＣ８タンパク質と結合し得る任意の配列によって表されるファミリーに関連するペプチドを含む抗ウイルス性組成物。
【請求項２】
配列番号１又はそれに由来し、少なくとも１つのアミノ酸の保存的変化を有し、ＤＬＣ８タンパク質と結合し得る任意の配列によって表されるファミリーに関連するペプチドを含む請求項１に記載の抗ウイルス性組成物。
【請求項３】
前記ペプチドが、前記ペプチドの細胞中への内在化を増大させるための手段をさらに含むことを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の抗ウイルス性組成物。
【請求項４】
前記ペプチドを細胞中へ内在化させるための手段が、８個のアルギニンのテール部に存在する請求項３に記載の抗ウイルス性組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９から選択される請求項１乃至４のいずれか１項に記載の抗ウイルス性組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが配列番号２である請求項１に記載の抗ウイルス性組成物。
【請求項７】
別の活性化合物及び／又は任意の薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤、担体又は希釈剤をも含んでなる請求項１乃至６のいずれか１項に記載の抗ウイルス性組成物。
【請求項８】
ＡＳＦＶ、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、エントモポックスウイルスＡ．ｍｏｏｒｅｉ、ワクシニアウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト単純ヘルペスウイルス、モコラウイルス又はＡＩＤＳウイルスから選択されるウイルスに起因する感染の治療に有用である請求項１乃至７のいずれか１項に記載の抗ウイルス性組成物。
【請求項９】
配列番号１４又は配列番号１、又は、それらに由来し、少なくとも１つのアミノ酸の保存的変化を有し、ＤＬＣ８タンパク質と結合し得る任意の配列のいずれかによって表されるファミリーに関連するペプチドであって、蛍光マーカーによって又は好ましくは、二次抗体、蛍光マーカー及び色素原によってそれを検出可能にする任意の一般的に使用されるタグによって検出可能となるようにコンジュゲート化されているペプチド。
【請求項１０】
配列番号７、配列番号８及び配列番号９から選択される請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
以下の工程を含むことを特徴とする抗ウイルス性化合物の選択方法及びそれらの有効性の評価方法：
ａ）ＤＬＣ８、その部分配列又は、ＤＬＣ８又はその部分配列と結合し得る、少なくとも１つのアミノ酸配列の保存的置換により産生される類似の配列と結合し得る化合物と細胞培養物とを、予めインキュベート又は予め混合する工程、
ｂ）工程ａ）において予めインキュベート又は混合された細胞培養物とウイルスを接触させて配置する工程、
ｃ）一定時間後の細胞内のウイルス感染レベルを検出及び定量する工程、
ｄ）ＤＬＣ８と結合し得る化合物と共に予めインキュベート又は予め混合させることなく、別の方法によりウイルス感染させた細胞培養物で到達した前記ウイルス感染レベルとの比較を行う工程。
【請求項１２】
配列番号１４又は配列番号１のいずれかによって表されるファミリーに関連するペプチドの１つを、トレース可能なマーカーで直接標識し、ペプチドと結合したマーカーによって放たれるシグナルを具体的に測定することによりそれを検出する方法、又は、二次抗体における第２段階のマーカーによって間接的に検出する方法等の任意の現在使用されている方法による、ペプチドの、特にウイルス起源のペプチドの、細胞内への内在化及び細胞質輸送の評価方法。
【請求項１３】
配列番号１４又は配列番号１のいずれかによって表されるファミリーに関連するペプチドのうちの１つ又は該ペプチドに特異的な二次抗体を、トレース可能なマーカーで標識し、ペプチド又は抗体のいずれかと結合したマーカーによって放たれるシグナルを測定することによってそれを検出する、細胞中のダイニンの細胞生物学及びその機能の研究方法。
【請求項１４】
前記ペプチド又は抗体が、フルオレセイン、ローダミン、又は、直接蛍光顕微鏡による検出を可能にする当技術分野において公知の任意のその他の蛍光マーカー等の蛍光分子により標識される請求項１２又は１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチド又は抗体が、ビオチン、ヘマグルチニン、ｃ−ｍｙｃ又はＧＳＴ等の任意の非蛍光マーカーにより標識される請求項１２又は１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドが、配列番号７、配列番号８及び配列番号９から選択される請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程を含むことにより特徴付けられる、抗ウイルス性化合物の選択方法及びその抗ウイルス効率の評価方法：
ａ）対照スペクトルとして、ＤＬＣ８タンパク質単独のＲＭＮスペクトルを取得する工程、
ｂ）ウイルスタンパク質とＤＬＣ８との間の相互作用が可能となるのに十分な時間、ＤＬＣ８をウイルスタンパク質と予めインキュベートし、次に、ウイルスタンパク質と結合したＤＬＣ８のＲＭＮスペクトルを取得する工程、
ｃ）初めに、抗ウイルス性化合物−ＤＬＣ８相互作用が可能となるのに十分な時間、ＤＬＣ８を抗ウイルス性化合物と予めインキュベートし、次に、ウイルスタンパク質を添加して、ＤＬＣ８−ウイルスタンパク質相互作用が可能となるのに十分な時間インキュベートし、次に、ＤＬＣ８スペクトルを取得する工程、
ｄ）工程ｃ）において得られたスペクトルを、工程ａ）又はｂ）において得られたスペクトルと比較する工程であって、工程ｃ）において得られるスペクトルが、工程ａ）の対照スペクトルと最も類似していれば、最も強力な結合阻害活性が検出される、前記工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規抗ウイルス性化合物の開発、並びに、動物又はヒトにおけるウイルス感染の防止又は治療にそれらを使用するための技術分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスは、細胞内寄生体であり、細胞内でそれらの複製サイクルが首尾よく行われ得るようにするために、特定の細胞の機能との統合性を必要とする。ダイニンは、様々なウイルスモデル、例えば、狂犬病ウイルス、ヒト単純ヘルペスウイルスタイプＩ又はヒト免疫不全ウイルス等におけるウイルス感染の様々なステップに関連する役割を有することが示されている。ダイニンは、微小管のモータータンパク質であり、微小管に関連する細胞内輸送及びエンドソーム経路に介在し、いくつかある機能の中でも特にその機能は、細胞内シグナルの様々な翻訳経路のモジュレーターである。ウイルスは、その内在化及び細胞内輸送のために、また、新しいビリオンが産生されるウイルスファクトリーを形成するため、並びに、これら及びその他のプロセスの協調に必要な細胞のシグナル伝達を制御するために、ダイニンを使用する。
【０００３】
特に、アフリカブタコレラウイルス（ＡＳＦＶ）のタンパク質ｐ５４は、微小管のモーター複合体の一部である細胞性タンパク質（ダイニンと称される）と相互作用し、その機能は本質的に、細胞内輸送に関連する［１］。この相互作用は、ウイルスのｐ５４タンパク質に対する潜在的な相互作用タンパク質に関してブタマクロファージｃＤＮＡライブラリー中の相互作用タンパク質を探索する、酵母（異種系）におけるダブルハイブリッドシステムを用いて見出された。ｐ５４のコード配列（Ｅ１８３Ｌ遺伝子）は、ＢＡ７１Ｖ分離株の完全配列中に含まれ、ＮＣＢＩデータベース中に登録番号ＵＩ８４６６で寄託されている。取得し陽性と同定されたクローンを配列決定することにより、それらが、ＤＬＣ８、ＬＣ８、ＤＬＣ１、ＤＮＬＣ１又はＰＩＮ（神経型一酸化窒素合成酵素の阻害タンパク質）と称される、８キロダルトン（ｋＤａ）の軽鎖ダイニンの完全なコード配列を含むことが発見された。Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａにおけるＤＬＣ８のコード配列は、ＮＣＢＩデータベースに番号ＡＦ４３６７７７で寄託されている。これらの結果は、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降法及び共焦点顕微鏡による両成分の共局在化を含む別のタイプの技術を用いて確認された。それらの結果は、ＡＳＦＶのｐ５４タンパク質とＤＬＣ８との間の相互作用を裏付けるのみであった。
【０００４】
ＤＬＣ８は、進化的に遠い種間（線虫からヒトへ）で高度に保存されているヌクレオチドアミノ酸配列を有するタンパク質である［２，３］。細胞質のダイニンは、微小管を通じて様々な負荷を駆動する、分子モーターのファミリーである。それらは、細胞の外部から内部、核又は核周辺領域への、小胞、エンドソーム及び細胞小器官の輸送を担う。それらは大きな多タンパク質複合体であり、球状の頭部と、動きをもたらすために必要なエネルギーの生成を担うＡＴＰアーゼ活性とを有する１〜３個の重鎖により構成される。これらの重鎖には、様々な数の中間鎖及び軽鎖が結合している。後者は、輸送する負荷との直接の相互作用を担っている。これまでに、７つのファミリーの軽鎖が記述されており、その中に、我々はＤＬＣ８を見出し得る。ＤＬＣ８は、インビボで二量体として配置されており、これにより、二つの単量体間で異なる配列からなる２つの同一の結合場所が存在し得る。
【０００５】
細胞性タンパク質に関し、細胞性タンパク質との２タイプの選択的結合部位（それによってそれらが相互作用する）が、ＤＬＣ８について発見されている［１２，１３］。モチーフの１つである（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）ＸＴｈｒＴｈｒ（Ｘは任意のアミノ酸）は、ダイニンの中間鎖、プロアポトーシス分子Ｂｉｍ、Ｋｉｄ１及びＳｗａｌｌｏｗ転写因子及び様々な起源由来のいくつかのウイルスタンパク質等の一連の分子とＤＬＣ８を結合させる。この結合部位は、ＤＬＣ８分子の２つの二量体の間に位置する。第２のモチーフは、ＧＩｙ（Ｉｌｅ／Ｖａｌ）ＧｌｎＶａｌＡｓｐであり、これは、これまでに記述されているように、ＤＬＣ８を、神経型一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）又は、ニューロンの足場タンパク質と結合させる。
【０００６】
ウイルスタンパク質のダイニンへの結合に必要とされるアミノ酸残基を同定するために、ｐ５４タンパク質のいくつかの切断型断片を酵母系において発現させて試験することにより、ＤＬＣ８との結合領域が、Ｔｙｒ１４９とＴｈｒ１６１との間に含まれる１３アミノ酸（ＴｙｒＴｈｒＴｈｒＴｈｒＶａｌＴｈｒＴｈｒＧｌｎＡｓｎＴｈｒＡｌａＳｅｒＧｌｎＴｈｒ）のｐ５４タンパク質のカルボキシ末端に位置することを調べた［１］。
【０００７】
いくつかのウイルスは、宿主細胞内におけるそれらの感染サイクルの様々な場合において、軽鎖ダイニン（ＤＬＣ８）を利用する。ペプスキャンと呼ばれる技術により、ウイルス由来の様々なタンパク質の直鎖状配列を擬したペプチドを合成して、濾紙上にブロットし、ＤＬＣ８をプローブとすることにより、どの直鎖状配列がその相互作用に適当であるかを調べた［１０］。適当といえるレベルには満たないと思われる直鎖状配列も、理論的には、ＤＬＣ８との結合に適し得る。これらは、高い頻度でＧｌｎ（Ｑ）残基を含み、以下の配列において連続するＴ残基（Ｔｈｒ）を含む場合も多い：
−アフリカブタコレラウイルスのｐ５４タンパク質のＴｙｒＡｌａＳｅｒＧｌｎＴｈｒモチーフ
−呼吸器合胞体ウイルスの結合糖タンパク質のＴｙｒＳｅｒＴｈｒＧｌｎＴｈｒモチーフ
−狂犬病ウイルス及びモコラウイルスのＰタンパク質、ヒト単純ヘルペスウイルスのヘリカーゼ、アデノウイルスプロテアーゼ、又はＡ．ｍｏｏｒｅｉエントモポックスウイルスのＬｙｓＳｅｒＴｈｒＧｌｎＴｈｒモチーフ
−ヒトパピロウイルスのＥ４タンパク質、又はワクシニアウイルスポリメラーゼのＬｙｓＧｌｎＴｈｒＧｌｎＴｈｒモチーフ
−ヒトヘルペスウイルスの遺伝子Ｕ１９のＬｙｓＧｌｎＴｈｒＧｌｎＴｈｒモチーフ
−ヒトコクサッキーウイルスのキャプシドのタンパク質のＡｒｇＶａｌＭｅｔＧｌｎＬｅｕモチーフ等。
【０００８】
いくつかの直鎖状ウイルスタンパク質配列が、理論的にＤＬＣ８と結合し得ることが判明しているとしても、このことにより、これらの配列の全てが、天然の形態のタンパク質においてその相互作用に好適であり、又は、その分子がインビボでモーター複合体中に統合されるのに適しているはずであることが除外されるものではない。また、それらのウイルス配列は、ウイルス粒子中である程度露出されていることは実証されておらず、それらの推定結合部位が実際にＤＬＣ８と結合し得ることも実証されておらず、及び／又は、これらのウイルスタンパク質が、感染時にダイニンに接近し得る細胞内区画、例えば、細胞質ゾル（小胞体又はその他の離れた細胞小器官及び構造体ではない）中で合成されるか否かについても実証されていない。さらに、これらの直鎖状配列のいずれも、いかなる手段によっても所定のタンパク質のＤＬＣ８との結合を阻害し得ることが今日まで示されておらず、最終的に、この部位のブロッキングが感染の阻害をもたらし得ることには何の保証もない。実際、上述したように、ＤＬＣ８分子あたり２つの推定結合部位が存在し、又、任意の所定のウイルスにより代替的に使用され得る、多くのその他の軽鎖及び中間鎖が存在する。要するに、これらの知見の何ひとつとして、この部位の阻害が相互作用を妨害することも、ウイルス感染を妨げ得ることも実証しておらず、上記配列が抗ウイルス性化合物として有用であり得ることを何ら保証しない。
【０００９】
さらに、任意のペプチドが抗ウイルス剤として使用される候補であるためには、何らかの手段により、適切に細胞内環境に到達する必要があり、生細胞中において毒性が全くないか、毒性が非常に低いことが保証されねばならない。アミノ酸配列が、ウイルスタンパク質とＤＬＣ８との間の結合に関与すると認められ得るという事実は、それらの配列が一次（直鎖状）構造である場合、それらの直鎖状配列が、ウイルスタンパク質とＤＬＣ８との相互作用を阻害し得、したがって、それらのアミノ酸配列を含むペプチドが抗ウイルス性化合物として機能し得るということを除外するものではない。タンパク質−タンパク質相互作用をブロックするのに適したペプチド配列を設計するために、（例えば、それらの核磁気共鳴スペクトルにより）両方の相互作用面を分析すべきである。その理由は、直鎖状アミノ酸配列が、細胞内でより複雑な構造で折り畳まれている場合に、例えば、微小管モーター複合体と呼ばれる高分子複合体に結合している場合、ＤＬＣ８又はウイルスタンパク質のいずれかとの結合に関与するアミノ酸残基を隠す場合があり、したがって、折り畳まれた二次構造のペプチドが何ら抗ウイルス活性を示し得ない、という事実に基づいている。また、インビトロ、又は、酵母のような異種系が結合に関与し得る規定された配列が、ウイルス粒子との関連で顕在化されない場合があり、且つ／又は、離れた細胞小器官及び構造体において合成される場合があり、このことにより、その配列は、哺乳動物細胞における感染時の細胞タンパク質へと接近し得ないこととなる。この場合の全てにおいて、理論的に相互作用をブロックし得るペプチドは、何ら抗ウイルス活性を示さないであろう。さらなる理由は、直鎖状ペプチドが、細胞の細胞質ゾル中に溶解している場合には、凝集体を形成し、その結果、ＤＬＣ８又はウイルスタンパク質のいずれかとの結合を担うアミノ酸を再び隠してしまい得ることである。それらの凝集したペプチドは、いずれも抗ウイルス特性を示さないであろう。新規抗ウイルスペプチドの設計における別の重要な面は、非感染細胞におけるそれらの毒性に関する。市販の抗ウイルス性薬物は、好ましくは、非感染細胞の細胞生存性及び細胞増殖性に影響を与えることなく、ウイルス感染を防止及び／又は阻害する必要がある。最後に重要なこととして、本発明は、このモチーフ周辺のアミノ酸が、ＤＬＣ８−ウイルスタンパク質結合領域（特に、それらの疎水性）に関与し、それらが、真の抗ウイルス性化合物とみなされるために、それらペプチドの結合阻害能において重要な役割を果たすことを見出した。ウイルスタンパク質のＤＬＣ８との結合の効率的阻害を達成する抗ウイルスペプチドは、細胞の細胞質ゾル中に十分に溶解されている必要があり、したがって、結合モチーフに隣接するアミノ酸の疎水性及びプロリン含量が重要である。
【００１０】
これらの全ての理由のために、ウイルスが細胞のダイニンを利用することを妨害することによる、すなわち、ウイルス起源の様々なタンパク質がダイニンを適当に利用することを可能にするその機能又は結合部位のいずれかをブロックすることによる、ウイルスの感染をブロックするための抗ウイルス戦略を作成する必要がある。しかしながら、いくつかの重複する部分アミノ酸配列（それらのウイルス中に存在する）は、ＤＬＣ８に対する結合モチーフ、例えば、ＫＳＴＱＴ又はＧＩＱＶＤとして繰り返すが、ウイルス−ＤＬＣ８相互作用が効率的に起こり得るか否かを評価するためには、隣接する残基を調べることも重要である。それらのアミノ酸における具体的な変化を、ＤＬＣ８との相互作用を無効にするそれらの能力を評価した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
我々は、ウイルスモデル（アフリカブタコレラウイルス，ＡＳＦＶ）を用いることにより、ＤＬＣ８−ダイニン系の妨害が、感染のブロックを引き起こし、そのことが、本発明の目的を構成する新規な抗ウイルス戦略のための主要な試験を提供することを示した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
我々は、相互作用に関与するタンパク質のいくつかの相互作用ドメインとその隣接配列を比較し、この情報を、対のタンパク質の相互作用の主要なアンタゴニストとして機能するペプチドを設計するために使用した。このペプチドは、相互作用するが、同時に、適切に細胞内環境に到達するためにタグ付けされており、又、抗ウイルス性化合物が、主として、上述の条件：所定の条件においてウイルスタンパク質−ＤＬＣ８結合を特異的に阻害すること、細胞質ゾル中での接近可能性及び溶解性、凝集体形成が無いこと、及び、細胞生存率と増殖能に障害を及ぼさないこと（細胞毒性が無いこと）、を満たすべき全ての要件を満たすものである。
【００１３】
結論として、本発明は、感染の成功に必要な工程としてウイルスがダイニン−ＤＬＣ８と結合するその配列（全体又は部分）に基づいて設計された抗ウイルス性ペプチド化合物の使用を初めて開示し、それらのペプチドは、感受性を有する細胞においてウイルス感染を効率的に阻害し、明示可能な抗ウイルス効果を有することが示される。ウイルス−ＤＣＬ８相互作用の阻害は、ウイルスによる細胞変性効果の阻害及び感染細胞数の劇的な減少に反映される。また、この化合物の抗ウイルス効果は、細胞あたりのウイルスゲノムコピーの減少（これは、細胞中に見られるウイルス複製の減少を反映する（単位ｎｇ／μｌ））に関し、定量的ＰＣＲを用いてそれらの相対効率を比較するよう定量的に測定し、その結果としてのウイルス生成及びウイルスタンパク質合成の有意な減少をも測定した。本発明は、感染の進行を防止する、様々なＡＳＦＶ分離株のｐ５４配列に基づいて作製され、抗ウイルス療法の基礎となるペプチドにより例示される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】抗ウイルス性ペプチドの設計。多様な起源由来の様々なウイルス分離株中に存在するウイルスＡＳＦＶタンパク質ｐ５４の配列分析の比較に基づき、我々は、保存モチーフを含有させ、様々なウイルス分離株間で違いを有する、ウイルスタンパク質中に実際に存在する配列の中から、最も好ましい隣接配列を選択することにより、一連のペプチドを設計した（表１）。
【図２】相互作用のＮＭＲ動態及び活性ペプチドによる阻害。Ａ，ＮＭＲ解析のための１５−Ｎ標識ＤＬＣ８及びｐ５４の取得及び精製。様々な滴定ポイントにおける１５Ｎ−標識ＤＬＣ８の１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル；Ｂ，遊離ＤＬＣ８；Ｃ，遊離ＤＬＣ８（黒色スペクトル）と２等量（ｅｑ）の非標識ｐ５４（灰色スペクトル）；Ｄ，遊離ＤＬＣ８（黒色スペクトル）と５等量のペプチドＰＳ１９（配列番号２）及び２等量の非標識ｐ５４（灰色スペクトル）；Ｅ，遊離ＤＬＣ８（黒色スペクトル）と５等量のペプチドＰＳ１９及び２等量の非標識ｐ５４（灰色スペクトル）、及び、２等量の非標識ｐ５４（灰色スペクトル）。
【図３】ペプチドの細胞中への内在化の実証。アルギニンリッチ分子トランスポーターと結合した様々な濃度のペプチド構築物と共に１及び３時間インキュベートした、ベロ細胞中でのフルオレセイン標識ペプチドＣＯＶＡ２（配列番号７）の分布（ＣＯＶＡ２）。ＦＩＴＣ標識されたペプチド（ＣＯＶＡ２）は、１００μＭのペプチド濃度で細胞に１００％内在化される。
【図４】細胞へのウイルス感染並びに本発明のペプチドＣＯＶＡ１（配列番号６）の活性による感染の阻害の概略図。１．前の晩までに、５％ＤＭＥＭ中、９ｘ１０４／ｃｍ２の密度で培養したベロ細胞。２．ペプチドの内在下のために、３００μｌの溶液を、ＤＭＥＭ  ＳＣ中の０〜１００μＭの範囲の様々なペプチドと共に、３７℃にて１時間添加する。３．１ｐｆ／細胞のＢＡ７１Ｖによる感染。４．３７℃、２時間の吸収。５．１１ｍｌのＤＭＥＭ  ＳＣを用いた２回の洗浄による残っているウイルスの除去。６．ＤＭＥＭ＋ペプチド条件下での感染後６〜１８時間後の感染の経過。７．感染細胞の検出。
【図５】細胞変性効果による抗ウイルス及び対照ペプチドの抗ウイルス活性の比較。抗ウイルス性ペプチド（ＲＳ２７−配列番号３−及びＰＳ１９−配列番号２−）の濃度を上昇させながら（列１及び２）、対照（ＲＳ２８−配列番号５−及びＳＳ２０−配列番号４−）（列３及び４）、並びに、ペプチドの非存在下（列５）における、ＡＳＦＶの細胞変性効果の阻害についての通常の顕微鏡（倍率１００倍）による表示。
【図６】抗ウイルス性ペプチドの処理及び免疫蛍光による感染細胞数。図６Ａは、ＡＳＦＶのｐ３０に対する抗体を用いて標識した、濃度を増加させた阻害剤（ＣＯＶＡ２−配列番号７−）及び対照（ＲＳ２８）と共にインキュベートした、６ｈｐｉの感染細胞のパーセンテージを示す。Ｂは、５μＭ及び５０μＭのＣＯＶＡ２及びＲＳ２８ペプチドと共にインキュベートした感染細胞に対する免疫蛍光アッセイの代表的写真を示す。
【図７】抗ウイルス性ペプチドによる処理及びウイルスタンパク質の合成。様々な濃度のＣＯＶＡ１（配列番号６）ペプチドを１及び３時間用いた、初期（ｐ３０）及び後期（ｐ７２）タンパク質合成の分析。Ａは、ｐ３０及びｐ７２タンパク質のウェスタンブロットの代表的ゲルを示し、Ｂは、密度計による、ｐ３０及びｐ７２タンパク質の定量を示す。
【図８】抗ウイルス性ペプチドによる処理及び定量ＰＣＲによるＡＳＦウイルスＤＮＡの定量。対照ペプチドＲＳ２８と比較した、増大濃度の阻害ペプチド（ＣＯＶＡ１、ＰＥＰ１−配列番号９−及びＰＥＰ３−配列番号８−）を用いた処理後の、１６ｈｐｉのＡＳＦＶのＤＮＡ複製に及ぼす影響。その他のＤＬＣ８結合配列（ＰＥＰ１及びＰＥＰ３）を含むペプチドも本図面に表し、ＣＯＶＡ１配列がより低いペプチド濃度から有効であることを示す。
【図９】ウイルス生成における抗ウイルス性ペプチドの影響。対照ペプチドＲＳ２８（白色四角）と比較し、増大濃度の阻害ペプチドＣＯＶＡ１（黒色四角）を用いた、３６ｈｐｉ後に回収した、細胞内（Ａ）及び細胞外（Ｂ）のウイルス力価に及ぼす影響。
【図１０】化合物の細胞毒性の欠如。ベロ細胞の増殖指数は、様々な濃度の抗ウイルス性ペプチド（ＣＯＶＡ１）及び対照ペプチド（ＲＳ２８）を３６時間インキュベートした後で変化しない。
【図１１】ペプチドの内在化後の細胞構造の維持。様々な濃度のＣＯＶＡ２ペプチドを用いて１及び３時間処理したベロ細胞の共焦点顕微鏡の代表的写真。写真は、非処理細胞において保存されている微小管の細胞骨格構造体（チューブリン）（左欄）及びＦＩＴＣ標識された増大濃度のペプチドで処理された細胞における構造体（右欄）を示す。
【図１２】有糸分裂時における形態の維持及び紡錘体の形成。対照（Ａ）及び阻害ペプチドＣＯＶＡ１（Ｂ）を用いて処理したベロ細胞の共焦点顕微鏡の代表的写真。対照（Ａ）及び（Ｂ）ペプチド処理された細胞両方の様々な段階の細胞分裂時に、チューブリン繊維は紡錘体を形成する。細胞生存度及び増殖能は、ペプチド処理によって影響されない。
【図１３】フルオレセイン標識されたＣＯＶＡ２ペプチドの細胞分布パターン。ペプチドは、ＤＬＣ８のカーゴ（ｃａｒｇｏ）部位の１つと結合し、蛍光ペプチドは、細胞突出部（Ａ）、細胞質輸送部位（Ａ）、及び、ＤＬＣ８が細胞分裂後の細胞小器官を再配置させる機能をする、有糸分裂後の娘細胞の細胞質（Ｂ）等の細胞の動的区画においてＤＬＣ８と明確に共局在化する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
多様な起源由来の様々なウイルス分離株中に存在するＡＳＦＶタンパク質ｐ５４の配列分析比較に基づいて、我々は、多くのウイルス分離株中に保存されているコンセンサス配列と、異なるウイルス分離株間（図１）でこのタンパク質が違いをもたらすものの中から最も便利な隣接配列とを含むペプチドセット（表１）を設計した。長さ、疎水性及びプロリン含量が考慮された。プロリンは、溶液中及び凝集体中でｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化を受け得る。いったんペプチドセットを選択したならば、我々は、それらのアミノ酸組成によって、可溶性かつ安定であることが予測されるものを合成し、細胞へとそれらを輸送するための配列をそれらに付して、次に、以下の方法によりそれらのペプチドを試験する。
【００１６】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）技術は、様々なタンパク質間の相互作用表面の深度分析を可能にする。本発明においては、ＮＭＲによって、ＡＳＦＶタンパク質ｐ５４とダイニン軽鎖（ＤＬＣ８）との間の相互作用を分析した。この分析は、相互作用を詳細に知ることを可能にするデータを提供し、両タンパク質の三次元構造と両方の相互作用表面とを考慮することにより、相互作用に関与する残基を覆うために最適なペプチド配列を絞り込むことを可能にする。ＤＬＣ８のＮＭＲスペクトルを取得し、ウイルスｐ５４の濃度を増大させながら、両タンパク質間の高親和性相互作用を示すこれらのスペクトルがどのように変化するか（化学シフト）を評価した。それらは相互作用に関与していることから、スペクトルから消えるＤＬＣ８の残基によって構成されるタンパク質の活性中心を決定することが可能であった。これらの残基は、以下の通りである：Ｔｒｐ５４、Ｌｙｓ９、Ｓｅｒ８８、Ａｓｎ６ｌ、Ａｓｎ２３、Ａｓｎ３３、Ｇｌｙ５９、Ｓｅｒ８６、Ａｒｇ６０、Ｇｌｕ１５、及びＴｙｒ７５。次に、我々は、相互作用表面に関与する残基と結合し得る及び残基を覆い得るペプチドを選択することができ、次に、この高親和性相互作用をブロックすることにより、どのペプチドが任意の濃度のウイルスタンパク質ｐ５４の任意のさらなる結合を防止し得るかについて試験した。
【００１７】
本発明は、ウイルスタンパク質の細胞ダイニンとの正確な相互作用が、膜から核周辺領域（正常細胞においてＤＬＣ８の最大の蓄積を生じる場所である、微小管形成中心、すなわち、ＭＴＯＣ、に相当する領域）へのウイルスの細胞内輸送を必然的に含む感染にとって重要であることを示し、ＡＳＦＶによる感染の場合、その場所は、ウイルスファクトリーが位置し、新しいビリオンを組み立てて生じるように、ウイルスタンパク質が合成される場所である。
【００１８】
最近では、上述のＮＭＲを用いて行った研究により、ｐ５４中に存在する相互作用配列ＴｙｒＴｈｒＴｈｒＴｈｒＶａｌＴｈｒＴｈｒＧｌｎＡｓｎＴｈｒＡｌａＳｅｒＧｌｎＴｈｒ（配列番号１３）を含むペプチドを予めＤＬＣ８に添加することによって、ｐ５４のＤＬＣ８への結合を阻害し得ることが、我々の研究室において実証することが可能となった。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態は、感染を防ぐために、ウイルスタンパク質配列、又はその一部を利用することによって、また、いくつかのケースにおいては、ウイルスタンパク質−ダイニン結合に対する抗ウイルス性ペプチドアンタゴニストによる、細胞タンパク質の結合部位の飽和によって、感染時のウイルスによるダイニンの利用を妨害することから構成される。かかるペプチドについて、本発明は、そのペプチド配列を用いて任意の起源の細胞を処理した場合に、それらが、ウイルスタンパク質と軽鎖ダイニンとの作用を妨害することを証明した。例えば、かかるペプチドとしては、以下の１４アミノ酸：ＴｙｒＴｈｒＴｈｒＴｈｒＶａｌＴｈｒＴｈｒＧｌｎＡｓｎＴｈｒＡｌａＳｅｒＧＩｎＴｈｒ（配列番号１３）を含むものが挙げられ、また、その配列中、及び様々な動物ウイルスの類似する配列中、又はこのペプチドに機能的に類似する配列中の保存的アミノ酸の変更をも含む。重要なモチーフ（ｐ５４−ＤＬＣ８間の相互作用を維持するアミノ酸配列、ＴｈｒＡｌａＳｅｒＧｌｎＴｈｒ−配列番号１４−）に隣接する配列の疎水性が、ＤＬＣ８へのこのペプチドの結合能を変化させることを見出した。ペプチド配列の設計は、ＤＬＣ８の三次元構造によって示される疎水性の谷部に位置する特定の部位において、ペプチドはＤＬＣ８と結合する必要があるということを考慮すべきである。上述したように、理論的配列はＤＬＣ８と結合することが予想されるが、それらのうちのいくつかはＤＬＣ８と結合し、その他のものは結合しなかったという事実を考慮して、本発明は、ＮＭＲを用いてペプチド配列をさらに絞り込み、阻害ペプチドのセットを選択した。我々は、ｐ５４−ＤＬＣ８相互作用が、それらのＮＭＲ相互作用動態によって規定されるように、高親和性相互作用であることを実証した。それでもなお、我々は、いくつかのペプチドを添加することにより、この高親和性相互作用をブロックすることができた。このことは、所定のペプチド配列との結合を妨げることにより、ｐ５４−ＤＬＣ８相互作用を妨害し得ることを初めて示すこととなった（表１）。選択された最適なペプチド配列は、相互作用をブロックすることができたが、その他のものは、ＮＭＲにより分析されるｐ５４とＤＬＣ８との間の相互作用動態を変化させない、対照ペプチドとして使用した。
【００２０】
本発明の方法論的近似は、前記配列のいずれかを含むペプチド配列、又は、その配列中に保存的アミノ酸の変更を有するペプチド配列による任意の起源の任意の処理をも含む。それらは、それら配列の全ての保存的変化を含み、また、現在知られている全てのメカニズムは、これらのペプチドを細胞内に輸送することを目的としており、そのような例としては、以下を挙げることができる：細胞内に輸送される配列と結合した任意のペプチド（アミノカプロン酸又はアミノヘキシン酸付加等）；リポソーム、又は、細胞中にペプチドを内在化させる機能を有する任意のその他のビヒクル、例えば、ベクター、特に、アデノウイルス又はレトロウイルス、プラスミド等のウイルスベクター等であって、好ましくは、それらのベクターはタグ配列に結合している。ペプチドによる処理は、ダイニン軽鎖、ＤＬＣ８タンパク質、又は、それに含まれる任意のアミノ酸配列、又はモチーフ（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）ＸＴｈｒＧｌｎＴｈｒ又はＧｌｙ（Ｉｌｅ／Ｖａｌ）ＧｌｎＶａｌＡｓｐを含む任意のペプチド、又はアミノ酸の保存的変更を有するそれらに由来する配列と共に予めインキュベートすることにより、ダイニンに関連する輸送体を使用するダイニン結合モチーフを多く供給するという目的を有する。保存的変更とは、そのタンパク質の負荷、形態又は形成を変更しないものとして規定される。同様に、本発明は、ペプチドを細胞内に内在化するために、その他のペプチド配列、ペプチド輸送体等と結合しているか、又は、リポソーム及びその他のビヒクルと共に供給される前記ペプチドのいずれかを含み、一般的に、任意の起源の細胞について輸送システムが現在知られている。
【００２１】
発明の詳細な説明
したがって、本発明の目的は、ウイルスタンパク質のＤＬＣ８との結合と競合し得る、様々なウイルス分離株由来のＰ５４配列から選択されるペプチドの抗ウイルス性組成物である。特に、それらのペプチドは、タンパク質及びウイルスのＤＬＣ８との結合をインビトロ及びインビボで効率的に防止し、したがって、ウイルス感染を阻害する必要がある。それらのペプチドの中から、ウイルスタンパク質配列又はＤＬＣ８配列自体のいずれかより単離された、ウイルスタンパク質−ＤＬＣ８相互作用に関与する配列に関連するペプチドが選択され得る。それに由来する任意のペプチド（特に、保存的アミノ酸置換を有するもの）も、本発明に含まれ得る［１４：Ｔａｙｌｏｒ，Ｗ．Ｒ．］。
【００２２】
選択されたペプチドは、ＤＬＣ８とのウイルス−タンパク質の相互作用の阻害は別として、抗ウイルス保護が求められる細胞とインキュベートする場合、毒性を示さない必要がある。さらに、ウイルスタンパク質又はダイニン軽鎖（ＤＬＣ８）のいずれかより単離される、ＤＬＣ８とのウイルスタンパク質の結合に関与する単離ペプチドの多くは、凝集する及び二量体を形成する傾向を示す。それが起こる場合、ペプチドの結合能は非常に低く、結合能が消失さえし得る。その二量体形成及び／又は凝集は、疎水性、全長及びプロリン含量を考慮しながら、それらのペプチド配列中のいくつかのアミノ酸を変更することにより容易に回避することができる。本発明は、それらの変更について詳しく調べ、凝集又は二量体形成を示さず、ウイルス感染が防止又は治療される必要がある細胞に対する毒性が低い、ＤＬＣ８と高い親和性を示す競合的結合により、ＤＬＣ８とのウイルスの結合を妨害するペプチドのファミリーを選択した。
【００２３】
さらに、選択されたペプチドは、例えば、８個のアルギニンからなるテール部を有し、それらのペプチドが、ウイルス感染を防止又は治療すべき細胞内に侵入することを容易にしている。
【００２４】
選択されたペプチドのファミリー（ＰＳ１９、ＣＯＶＡ１、ＣＯＶＡ２、ＰＥＰ１及びＰＥＰ３）、それらは全て、Ｐ５４に関連する配列の一部に由来し、ＤＬＣ８との結合を担う。本発明のペプチドのファミリーは、配列番号１４によって表され、配列番号１４のアミノ酸の少なくとも１つの保存的置換によってそれに由来する任意のその他のペプチドを含む。配列番号１によって表されるペプチドのサブファミリーは、細胞へのそれらの非毒性により、特に興味深い。
【００２５】
配列番号１４又は配列番号１のいずれかにより表されるファミリーのうちの少なくとも１つのペプチドを含む本発明の抗ウイルス性組成物は、任意のその他の活性化合物及び／又は薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤をさらに含んでもよい。
【００２６】
ウイルス感染の中で、本発明の抗ウイルス性組成物によって治療され得るものは：ＡＳＦＶ、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、エントモポックスウイルスＡ．ｍｏｏｒｅｉ、ワクシニアウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト単純ヘルペスウイルス、モコラウイルス又はＡＩＤＳウイルスであり得る。
【００２７】
本発明の別の目的は、以下の工程を含むことを特徴とする、抗ウイルス性化合物の選択方法及びそれらの有効性の評価方法に存在する：
ａ）適当な細胞内送達配列がタグ付けされているか、又は、そのペプチド配列を発現するベクターによって形質転換されている、リポソーム等の既知の送達方法と組み合わせられ、ＤＬＣ８と結合し得る化合物と細胞培養物とを、予めインキュベート又は予め混合する工程、
ｂ）工程ａ）において予めインキュベート又は混合された細胞培養物とウイルスを接触させて配置する工程、
ｃ）一定時間後の細胞内のウイルス感染レベルを検出及び定量する工程、
ｄ）ＤＬＣ８と結合し得る化合物と共に予めインキュベート又は予め混合させることなく、ウイルス感染させた細胞培養物で到達した前記ウイルス感染レベルとの比較を行う工程。
【００２８】
本発明の別の主題は、以下の工程を含むことを特徴とする、抗ウイルス性化合物の選択方法及びそれらの有効性の評価方法に存在する：
ａ）ＤＬＣ８と結合し得る配列、その部分配列又は、ＤＬＣ８と結合し得る配列又はその部分配列の少なくとも１つのアミノ酸の保存的置換により産生される類似配列を含む化合物とウイルスとを、予めインキュベート又は予め混合する工程、
ｂ）工程ａ）において予めインキュベート又は混合されたウイルスを細胞培養物と接触させて配置する工程、
ｃ）一定時間後の細胞内のウイルス感染レベルを検出及び定量する工程、
ｄ）工程ａ）の化合物と予めインキュベート又は予め混合させることなく、ウイルス感染させた細胞培養物で到達した前記ウイルス感染レベルとの比較を行う工程。
【００２９】
また、本発明のその他の目的は、ダイニン輸送システムと関連する、細胞内のウイルス経路の研究に関する。ＤＬＣ８と結合し得る一連のペプチドを標識することにより特徴付けられる研究方法もまた本発明の範囲であり、それらペプチドは、例えば、直接蛍光顕微鏡により検出され得る。標識マーカーとして、以下の、細胞研究において利用可能ないずれも選択することができる：フルオレセイン、ローダミン又はその他の蛍光及び非蛍光マーカー、例えば、ビオチン、ヘマグルチニン、ｃ−ｍｙｃ等。二次抗体等が検出用タグとして優先的に使用される。
【００３０】
最終的に、本発明は、軽鎖ダイニン（ＤＬＣ８）スペクトルの変化を測定することによる、リガンドのＤＬＣ８との結合の阻害を評価するための方法にも関する。
【００３１】
以下の実施例は、本願に含まれる関連する発明を実行する好ましい実施形態であり、範囲を限定することなく、当業者がそれらの関連する発明を、過度の努力を必要とせずに再現することを可能にすることのみを目的として示される。
【００３２】
実施例：ｐ５４及び、細胞の８ｋＤａのダイニン軽鎖（ＤＬＣ８）の間の相互作用を妨げるペプチドによる、アフリカブタ熱ウイルス（ＡＳＦＶ）による感染の阻害
【００３３】
１．１．  材料
１．１．１  使用した細胞株及び培地
本実施例を通じ、ベロ細胞株をモデルとして使用してきた。感染及びペプチドの内在化の試験は、異数性で培養中に無制限に増殖するこの確立された細胞株において展開した。それは成体アフリカミドリザルの腎臓（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ）に由来し、第８４１１３００１番に登録されており、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）を通じて入手した。それらの形態は線維芽細胞型で、常に２０未満の工程で用い、凍結保存を保ち、かつ、使用まで液体窒素中に小分けした。この細胞株を、３０分間、５６℃で不活化した５％ウシ胎仔血清（ＢＦＳ，  Ｌｏｎｚａ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ，  Ｌｏｎｚａ）、４ｍＭ  グルタミン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２００ｌＵ／ｍｌのペニシリン及び１００ｍＭのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて培養した。細胞の培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気であった。定常的に、これらの細胞を１週間に２回、Ｎｕｎｃｌｏｎ（登録商標）（Ｎｕｎｃ）にて被覆された７５ｃｍ２のＥａｓｙ−Ｔ−Ｆｌａｓｋｓ培養フラスコ中、１：６で継代培養した。
【００３４】
特定の試験要件に応じて、いくつかの形態でＤＭＥＭ培地を補充した。すなわち、抗生物質、グルタミン又はＳＢＦを含まないものを用いる場合に、我々はＤＭＥＭ  ＳＣと称する。先の段落中に記述された濃度において、別の添加剤を維持して２％のＳＢＦを加える場合、我々は、２％ＤＭＥＭと称する。
【００３５】
寒天プレートのためには、ダルベッコ２X（Ｇｉｂｃｏ）培地を用いた。
【００３６】
１．１．２．  使用したウイルス分離株
感染の阻害試験に用いたアフリカブタ熱ウイルスの分離株は、ベロ細胞株での成長に採用されたＢＡ７１Ｖであった［４］。ウイルスのストックを、１００μｌのアリコートで、−８０℃、１５％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地中に保存した。それらの使用時に、必要なアリコートを、３７℃のバス中で迅速に解凍して、氷中に保存した。
【００３７】
１．１．３．  使用した代替可能な材料
・ウイルス分離株のアリコートを保存し、ベロ細胞株を液体窒素中で維持するための、容量１ｍｌのｃｒｙｏｔｕｂｅｓ（Ｎａｌｇｅｎｅ）。
・最大容量１０００、２００及び２０μｌのマイクロピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）。
・１０００、２００及び２０μｌ容量の、汚染の可能性を回避するための、フィルター付きでＲＮａｓｅフリーのマイクロピペットチップ（Ａｒｃ）。
・容量１．５ｍｌのＲＮＡｓｅフリーのチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）。
・４、６、１２及び２４ウェルマルチウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）。
・直径１２ｍｍのカバースリップ（Ｇｅｖｅｒ  Ｌａｂｓ）。
・通常の長方形のスライドグラス（Ｇｅｖｅｒ  Ｌａｂｓ）。
・タンパク質のためのニトロセルロース薄膜、９×７ｃｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。
・Ｗｈａｔｍａｎの濾紙、９×７ｃｍ。
【００３８】
１．１．４．  使用した抗体及び色素原
・抗ｐ３０モノクローナル抗体：Ｄｒ．Ｊｏｓｅ  Ａｎｇｅｌ  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｅｓｃｒｉｂａｎｏのラボラトリーにて開発され、ＡＳＦＶの初期タンパク質であるｐ３０を特異的に認識及び検出する。
・Ｅ．ｃｏｌｉの異種系で発現させた１０個のヒスチジン残基に結合させたＤＬＣ８タンパク質を用いて免疫したウサギにおいて取得し、後に精製した抗ＤＬＣ８ポリクローナル抗体。我々の研究室で生成した。
・抗αチューブリンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）。
・抗ｐ７２モノクローナル抗体（抗ｐ７３）：Ｉｎｇｅｎａｓａにより販売されており、後期構造タンパク質の主としてＡＳＦＶのｐ７２又はｐ７３を特異的に認識及び検出する。
・Ａｌｅｘａ５９４蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）へとコンジュゲートさせたマウス抗ＩｇＧ抗体。
・Ａｌｅｘａ４８８蛍光色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）へとコンジュゲートさせたマウス抗ＩｇＧ抗体。
・ＨＲＰペルオキシダーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へとコンジュゲートさせたマウス抗ＩｇＧ抗体。
・ＨＲＰペルオキシダーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へとコンジュゲートさせたウサギ抗ＩｇＧ抗体。
【００３９】
１．１．５．  その他の試薬
・Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）
・Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）
・リン酸緩衝液（ＰＢＳ）
・ＢＳＡ，ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）
・ＥＣＬ化学発光試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）．
・ＲＮＡｓｅフリーの水（Ａｍｂｉｏｎ）．
・作業表面及び材料からＲＮＡｓｅ活性を除くためのＲＮＡｓｅＺＡＰ溶液（Ａｍｂｉｏｎ）
・フルオレセインを保存するためのマウント試薬であるＰｒｏＬｏｎｇ
・核酸の挿入色素原試薬としてのＨｏｅｃｈｓｔ３３３２（Ｓｉｇｍａ）
・β−メルカプトエタノール、ＳＤＳ、Ｔｒｉｓベース（Ｓｉｇｍａ）
・ＮＰ−４０（Ｆｌｕｋａ）
・ＮａＣｌ（Ｄｕｃｈｅｆａ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）．
・Ｕｌｔｒａ  ｐｕｒｅ  ｌｏｗ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ  ａｇａｒｏｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
【００４０】
１．１．６．  使用したペプチド
ＡＳＦＶ  ｐ５４タンパク質中の先に記述されるＤＬＣ８結合モチーフを含む各種のペプチド、及び、陰性対照として使用するための無関係の配列の別の一連のペプチド（ＲＳ２７及びＳＳ２０ペプチド）を設計した。それらの全てを表１中に記述する。あるペプチドにおいては、以下のようにいくつかの変更が含まれる：
・細胞中へのペプチドの内在化を増加させる目的による、Ｎ末端における８個のアルギニン残基（Ｒ）の付加［６］（ＲＳ２７；ＲＳ２８；ＣＯＶＡ１；ＣＯＶＡ２；ＰＥＰ３；ＰＥＰ１）
・蛍光顕微鏡観察により直接的に示される、Ｎ末端でのフルオレセインへのコンジュゲート（ＣＯＶＡ２；ＰＥＰ３；ＰＥＰ１）
・ペプチドの脱離を助け、その凝集を回避するための特定の残基の置換（ＣＯＶＡ１、ＣＯＶＡ２、ＰＥＰ１及びＰＥＰ３）
・ＤＬＣ８と相互作用する（ＰＥＰ３）ｐ５４の能力を維持するその部分のための、
ＴｈｒＡｌａＳｅｒＧｌｎＴｈｒモチーフ内部の残基の置換［１］
【００４１】
本実施例に使用される全ての設計されたペプチドは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓにより合成した。それらの精製は、全ての場合で純度９０％を上回る程度が得られるＨＰＬＣによって行われた。ひとたび合成され、精製されると、ペプチドは凍結乾燥物としてラボラトリーに受領された。
【００４２】
【表１】
2011502110.tif 000002
【００４３】
１．２．  方法
１．２．１  配列比較分析
異なる領域中に存在するｐ５４及び、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＮＣＢＩ）中に登録されたＡＳＦウイルスのラボラトリー分離株の配列を、ＢＬＡＳＴデータベース上にプロットし、Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌを用いて比較した。各種の分離株に由来する各種の配列から、保存されているモチーフと、最も適切な隣接配列が得られた。このペプチド設計のために、鎖長、疎水性及びプロリン含量が考慮された。プロリンは、溶液中及び凝集体中でｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化を受け得る。ペプチドの疎水的な特性は、純化及び沈殿の促進のためには難しいものでもあり得る。いったんペプチドのセットを設計し、我々は、それらのアミノ酸組成によって、可溶性かつ安定であることが予測されたものを合成するよう選択し、細胞へとそれらを輸送するための配列（後述されるような８個のアルギニンテール部）をそれらに付した。
【００４４】
１．２．２．  核磁気共鳴
Ｎ１５による標識と、ＡＳＦＶタンパク質ｐ５４及びＤＬＣ８の精製の後に、核磁気共鳴スペクトルを取得した。この実験に用いた方法は、化学シフト摂動法と称される。まず、両方のタンパク質を精製し、ＤＬＣ８に関し、Ｌｏ等，１９９８により報告されたものとスペクトルを比較する（図２）。
【００４５】
１．２．３  ペプチドの操作
分子量に従って（表１参照）、ペプチドを、相当する程度の純度のｍＱ及び滅菌度のＨ２Ｏ容量中に再懸濁して、５ｍＭの濃度の保存溶液を得た。溶液の濁りを回避するためには特別に注意を払い、クロスコンタミネーションの可能性を防ぐために、チップは常にフィルターを伴って使用した。２０μｌのアリコートを調製し、それらを使用時まで−８０℃で保存した。それらを使用するために、解凍はゆっくりと、氷中で行った。
ペプチドを含む希釈標準溶液は、それらの分解を避けるために、細胞培養物へと添加する直前に、ＤＭＥＭ  ＳＣ培地中の保存溶液から０〜１００μＭの範囲の濃度で、常に滅菌状態で調製した。
【００４６】
１．２．４  細胞培養物中のペプチドによる、ｐ５４−ＤＬＣ８相互作用のブロッキング
実験の前夜、９×１０４個のベロ細胞を２４ウェルプレート中に培養した。翌朝、細胞をＤＭＥＭ  ＳＣ中で洗浄し、存在する培地を、各種ペプチドを各種濃度で含む３００μｌの溶液で置換した。ペプチドと細胞とのインキュベーションは、１時間、３７℃、５％ ＣＯ２にて行い、その後細胞をＡＳＦＶにて感染させた。細胞を感染させるために、存在する細胞培養液を除去し、細胞あたり１プラークフォーミングユニット（ｐｆｕ）の感染多重度が得られるために相当する量を含む２％ ３５０μｌ／ウェルに置き換えた。感染は所望の時間まで、３７℃、５％ＣＯ２にて行わせることが可能であった。
【００４７】
吸着時間（２時間、３７℃）後、ＤＭＥＭ  ＳＣにて２回洗浄することにより残留するウイルスを除去し、最終的に細胞を、相当する濃度のペプチドを含む３００μｌの新鮮なＤＭＥＭ  ＳＣ中に入れた。実験毎に、解析すべき感染のパラメータに応じて、所望される期間、３７℃にて感染を継続させた。このプロセスを図４中に概略で示す。
【００４８】
１．２．５  間接的免疫蛍光（ＩＩＦ）による、ＡＳＦＶに感染した細胞の検出
予め各種のペプチドに曝した細胞における、ＡＳＦＶに感染した細胞の検出を、感染６時間後に実行した。ＡＳＦＶに感染したそれらの細胞を免疫蛍光によって検出するためのＩＩＦの技術は通常的なものであった。概略すれば、細胞を、１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで３．８％のＰＢＳ−パラホルムアルデヒド溶液にて、室温、１０分間固定した。次いで、残留したパラホルムアルデヒドを、１ｍｌのＰＢＳで細胞を３度洗浄することによって除いた。０．２％のＰＢＳ−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて、１５分間、室温にて、細胞膜の透過性を上昇させた。さらにＰＢＳにて３回洗浄後、３７℃にて、ブロッキング溶液（３％ＰＢＳ−ＢＳＡ）中、４５分間、細胞をインキュベートした。検出すべきウイルス抗原として、ＡＳＦＶ  ｐ３０［５］の初期タンパク質を選択し、ＰＢＳで１：２００に希釈した抗ｐ３０抗体を用いて、１時間、３７℃、その検出を行った。細胞をＰＢＳにて３度洗浄し、それらを、ＰＢＳで１：３００に希釈したマウス抗ｌｇＧ抗体を有する溶液で、３０分間室温にてインキュベートした。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、最終的にＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３２を有する細胞核のマーキングを取り込ませた。最後に、マウント液としてＰｒｏｌｏｎｇを用いて、細胞を含むカバースリップをスライド上に載せた。調製物を通常の蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）にて観察し、ウイルス抗原ｐ３０に関して陽性の細胞数を計数した。
【００４９】
１．２．６．  ＡＳＦＶによる感染の間のウェスタンブロットによる、ウイルスタンパク質の合成の解析
解析されるべきウイルスタンパク質は、感染の最初の段階で発現される初期ＡＳＦＶ  ｐ３０タンパク質［５］、及び、感染の後期で発現されるｐ７２タンパク質（場合によりｐ７３とも称する）［７、８］であった。ウェスタンブロットは細胞上で行われ、５０μｌの凍結ＲＩＰＡタンパク質抽出バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％のＮＰ４０、１％のＳＤＳ及び５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝８）中に回収する前に、１ｍｌの氷冷ＰＢＳにより洗浄した。それらを４℃、回転撹拌にて、２０分間インキュベートして、タンパク質を可溶化し、次いでそれらを卓上遠心機にて１２，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間、遠心分離した。沈殿を廃棄し、上清を回収して、ウェスタンブロットによる解析までの間、−７０℃にて保存した。
【００５０】
サンプルを氷中で解凍し、各種のサンプル中のタンパク質の量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により定量した。２０μｇの総変性タンパク質（１００℃、５分間）を、１５％のアクリルアミド：ｂｉｓ−アクリルアミドゲル中、９０分間、１００Ｖ定電圧にて電気泳動することにより分離した。分離されたタンパク質を、トランスファーバッファー（Ｔｒｉｓ−グリシン、２０％メタノール）存在下、９０分間、１００Ｖ定電圧で、ニトロセルロース膜へとトランスファーした。５０ｍｌの５％ＰＢＳ−スキムミルク粉末の存在下で、室温にて最低１時間、回転撹拌にて、膜をブロッキングした。次いで膜を、ＰＢＳで１：５０に希釈した１０ｍｌの抗ＤＬＣ８ポリクローナル抗体と、１時間、室温にて、撹拌しながらハイブリダイズさせた。この期間の後、２０ｍｌの０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにて、室温にて、各回１５分間、膜を３回洗浄した。ペルオキシダーゼにコンジュゲートされ、ＰＢＳで１：４０００に希釈された２次ウサギ抗ｌｇＧ抗体とのインキュベーションを、１時間、室温にて撹拌しながら継続した。これを終了後、０．００５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにて各回１５分間、膜を３回洗浄した。最終的に、ＥＣＬを用いた化学発光による検出を、通常の手法で、製造者の説明書に従って実行した。
【００５１】
分析するための出発サンプルとしては、１６時間の間、各種のペプチドに曝すか又は曝さないで、後にＡＳＦＶに感染した又は感染しなかったベロ細胞に由来する、総可溶性タンパク質抽出物を用いた。
【００５２】
一次抗体として、ＰＢＳ中で１：１００に希釈した抗ｐ３０モノクローナル抗体及び、ＰＢＳ中で１：２０００に希釈した抗ｐ７２モノクローナル抗体を独立の膜において使用した。膜を両方の抗体と共に、回転震盪しながら１時間室温にてインキュベートした。
【００５３】
二次抗体として、ペルオキシダーゼへとコンジュゲートされたマウス抗ＩｇＧ抗体を、両方の場合において用いた。
【００５４】
最終的に、各バンド中に存在するタンパク質を定量し、相対化するための化学発光反応の濃度を検出した。
【００５５】
１．２．７．  ＡＳＦＶゲノムの検出及び定量
特異的なオリゴヌクレオチド（配列番号１０及び配列番号１１）及びＴａｑＭａｎプローブ（配列番号１２）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲにより、ＡＳＦＶゲノムの検出及び定量を行った。接種１６時間後（１６ｈｐｉ）に、０．５ｐｆｕ／ｃｅｌｌのＢＡ７１Ｖを感染又は偽感染させた細胞由来のＤＮＡを抽出し、ＤＮｅａｓｙ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）を測定することにより、ＤＮＡ濃度及び純度を評価した。
【００５６】
増幅混合物は以下のように氷上で調製した：
３μｌ  鋳型ＤＮＡ（１μｇ）
１μｌ  オリゴヌクレオチドＯＥ３Ｆ  ５０ｐｍｏｌ
１μｌ  オリゴヌクレオチドＯＥ３Ｒ  ５０ｐｍｏｌ
１０μｌ  Ｑｕａｎｔｉｍｉｘ  Ｅａｓｙ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｂｉｏｔｏｏｌｓ  ２Ｘ
１μｌ  ＴａｑＭａｎ（商標）  ｐｒｏｂｅ  ＳＥ２  ５ｐｍｏｌ
４μｌ  Ｈ２Ｏ
【００５７】
増幅反応は、Ｒｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ６０００（商標）（Ｃｏｒｖｅｔｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）中で、以下の表に従って行った：
【００５８】
【表２】
2011502110.tif 000003
【００５９】
陽性増幅対照（ＡＳＦＶウイルス粒子から精製したＤＮＡ）及び陰性増幅対照（偽感染細胞由来のＤＮＡ）をアッセイに含め、各サンプルから２連を分析した。
【００６０】
１．２．８．  ＡＳＦＶ感染の間のウイルスの子孫産生に及ぼすペプチド処理の効果
実験前夜に、９×１０４個のベロ細胞を２４ウェルプレート中に播いた。感染１時間前に、各種濃度のＣＯＶＡ１又はＲＳ２８ペプチドを含む３００μｌのＤＭＥＭ中で、細胞をインキュベートした。次いで、０．５ｐｆｕ／ｃｅｌｌのＡＳＦＶ  ＢＡ７１Ｖ株を用いて細胞を感染又は偽感染させた。接種３６時間後（３６ｈｐｉ）に、１００μｌの培地をウェルから回収し、細胞外のウイルス子孫を分析するまでの間、−８０℃にて保存した。感染した細胞をまた、１００μｌの新鮮なＤＭＥＭ中に回収した。細胞を３度凍結融解し、細胞内のウイルス子孫を可溶化させ、次いで、使用するまで−８０℃にて保存した。細胞内又は細胞外サンプルのウイルス力価を、プレートアッセイにより分析した。手短に言えば、６ウェルプレートに播いたベロ細胞の単層に、ウイルス子孫を含む１０倍希釈系列のサンプル５００μｌを接種した。９０分間の吸収期間の後、細胞を新鮮なＤＭＥＭ５％で２度洗浄し、３ｍｌ／ウェルの重層（低融点アガロース２％及びＤＭＥＭ  ２×、ｖ：ｖ）を細胞に加えた。重層物が固化したら、プレートを、３７°Ｃ、及び５％のＣＯ２にて１２日間インキュベートした。次いで、１％のクリスタルバイオレット（５％ホルムアルデヒド溶液中）で細胞を染色し、ウイルスのプラークを視覚化可能にした。ウイルス力価は以下のように計算した：ｐｆｕ／ｍｌ＝２×ｎ０  プラーク×１０希釈倍率
【００６１】
１．２．９  細胞毒性分析。細胞生存率及び増殖アッセイ。
細胞生存率を評価するために、２４ウェルプレート中に播いたベロ細胞を、阻害ペプチドＣＯＶＡ１又は陰性対照ＲＳ２８を０〜１００μＭの範囲の濃度で含むＤＭＥＭ中でインキュベートした。ペプチドとともに２４時間インキュベートを行った後、細胞を収穫し、トリパンブルー（Ｓｉｇｍａ）色素排除アッセイにより、細胞懸濁液中に存在する生存細胞の数を調べた。手短に言えば、０．０８％のトリパンブルーを含む２０μｌのＰＢＳを、等量の細胞懸濁液へと添加し混合した。２分後に、血球計算盤及び通常の光学顕微鏡により、青色の細胞（死細胞）を計数した。
【００６２】
細胞増殖を評価するために、９６ウェルプレート中に播いた３×１０４個のベロ細胞を、阻害ペプチドＣＯＶＡ１又は陰性対照ＲＳ２８を０〜１００μＭの範囲の濃度で含む５０μｌのＤＭＥＭ中でインキュベートした。３６時間のインキュベート後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）アッセイを、製造者の説明書に従って用いて、細胞増殖を調べた。
【００６３】
１．３．  結果
１．３．１  抗ウイルスペプチドの設計
異なる領域中に存在するｐ５４及びＡＳＦウイルスのラボラトリー分離株の配列をデータベース上にプロットし、比較した。様々な起源から単離された各種ウイルス中に存在するウイルスＡＳＦＶタンパク質のｐ５４の、この配列分析比較に基づいて、我々はペプチドのセットを設計し（表１）、それは、ほとんどのウイルス分離株中に保存されているコンセンサス配列と、最も適切な隣接配列をそれらの中に含み、異なるウイルス分離株の間でそのタンパク質がバリエーションを有していた（図１）。ペプチドを設計するために、鎖長、疎水性及びプロリン含量を考慮した。プロリンは、溶液中及び凝集体中でｃｉｓ／ｔｒａｎｓ異性化を受け得る。ペプチドの疎水的な特性は、純化及び沈殿の促進のためには難しいものでもあり得る。いったんペプチドのセットを設計し、我々は、それらのアミノ酸組成によって、可溶性かつ安定であることが予測されたものを合成するよう選択し、細胞へとそれらを輸送するための配列（後述されるような８個のアルギニンテール部）をそれらに付してから、以下のアプローチにより、それらのペプチドの試験を進めた。
【００６４】
１．３．２．  核磁気共鳴スペクトルによる相互作用表面の解析
Ｎ１５による標識と両タンパク質の精製の後に、核磁気共鳴スペクトルを取得した。この実験に用いた方法は、化学シフト摂動法と称される。この方法は、標的タンパク質において観察される化学変化を、それがリガンドと相互作用するときに解析する。まず、両方のタンパク質を精製し、ＤＬＣ８に関し、Ｌｏ等，１９９８（１３）により報告されたものとスペクトルを比較する（図２Ａ）。ＡＳＦＶタンパク質であるｐ５４の濃度を増加させて存在させたとき、ＤＬＣ８のスペクトルは変化し、かつ、モチーフの結合に関与するシグナルは徐々に消失した。ｐ５４の濃度が０．１当量の場合、最初の消失シグナルは、Ｗ５４、Ｋ９、Ｓ８８、Ｎ６１、Ｎ２３残基に相当する。濃度が０．３当量に達すると、消失シグナルはＮ３３、Ｇ５９、Ｎ２３、Ｓ８６、Ｒ６０、Ｅ１５、Ｙ７５残基に相当する（図１Ａ）。ＤＬＣ８及びＰ５４の間で観察される相互作用工程のゆっくりとした相互変化は、これらのタンパク質間の結合が高い親和性で起こることを示唆した。それにもかかわらず、我々は、ある種のペプチドを添加した場合に、この高い親和性の相互作用に干渉することができ、かつ、ｐ５４のいかなる濃度においても、そのタンパク質の活性中心に由来する上記された残基のいずれにおいてもＤＬＣ８スペクトルの変化が観察されず（図２Ｂ）、この相互作用が所定のペプチド配列（表１）によって効果的に阻害され得ることが初めて示された。
【００６５】
１．３．３．  ベロ細胞におけるペプチドの内在化
参考文献には、ペプチドの末端にアルギニン残基を付加することが、細胞内部へのそれらの浸透を顕著に増加させることが記述されている。その目的で、我々は、８個のアルギニンからなる細胞内送達トランスポーターを組み込ませた。設計したペプチドが細胞内部に効率よく内在化されていることを確認するために、フルオレセイン標識をＮ末端に組み込んだ。アルギニン細胞内送達トランスポーターを組み込んでいないそれらのペプチドは、細胞内に入ることができなかったのに対し、トランスポーターテール部を組み込んだものは効果的に内在化し、ペプチドと共にインキュベートして１〜３時間後には、微小管中の連続的なパターンで、培養物中に存在するほぼ１００％の細胞が染色された（図３）。ＣＯＶＡ２ペプチドは、ｐ５４において先に記述されたＤＬＣ８結合モチーフを含むこの一連の特徴に合致し、ベロ細胞における内在化を直接的に観察するために使用された。
【００６６】
図３中に見られるように、ペプチドは効率的に内在化され、その添加６時間後でさえも、直接蛍光顕微鏡法により容易にそれが検出されることが可能であった。
【００６７】
ＣＯＶＡ２ペプチドの最適濃度は、５０及び１００μＭであり、両濃度の間で顕著な差異はみられなかった。より高い濃度において検出するよりは検出が困難ではあったが、２５μＭのＣＯＶＡ２でも検出可能であり、しかし、より低い濃度、すなわち、５μＭを下回る濃度では、蛍光顕微鏡によってほとんど検出ができなかった。
【００６８】
１．３．４．  ｐ５４−ＤＬＣ８結合を阻害するペプチドによる、ＡＳＦＶによる感染の阻害
本実施例の方法の項に詳述するように、感染は、各種のペプチドに予め曝したベロ細胞の単層ＡＳＦＶに対し、１ｐｆｕ／ｃｅｌｌで実施した。感染はペプチドの存在下で行うようにし、以下の感染パラメータを分析して、対象のペプチドにおける阻害効果を確認した。
【００６９】
１．３．４．１．  ウイルス感染の細胞変性効果特性におけるペプチドの効果
ＡＳＦＶ感染は、感染した細胞に対し、非常に特徴的で、かつ、通常の顕微鏡によって細胞変性の影響として容易に検出が可能なダメージを生じる。それは、感染後の早期に開始し、最終的には、進行性の細胞内の空胞化、細胞の輪郭が丸みを帯びること、及び、感染した細胞がそれに対して付着する表面の剥離を導く［９］。
【００７０】
各種ペプチドの存在下で感染が進行するとき、ベロ細胞培養物において、感染１８時間後の細胞変性効果が普及しているか否かを評価した。この方法を用いて、ペプチド（それらの配列中に、ＤＬＣ８結合モチーフと、細胞内部へのそれらの取り込みを助けるアルギニン配列とを共に含む）と共にインキュベートした場合の、それらの細胞培養物に対する細胞変性効果の阻害を検証することができた。対照的に、アルギニン配列を有さない対照ペプチドに曝したそれらの細胞は、感染が通常通り進行している細胞において観察されるのと同様の細胞変性効果を示した。
【００７１】
図５中に示されるように、観察される細胞変性効果の程度は、使用したペプチドの濃度に直接的に比例することが観察された。すなわち、ＰＳ１９ペプチドの濃度は、２５〜１００μＭの濃度範囲で総合的に細胞変性効果を阻害したが、２５μＭを下回る濃度では細胞変性効果を阻害するには効果的でなかった。
【００７２】
以下の表は、試験した各種のペプチドにおける細胞変性効果の阻害能力と、それらの相当する濃度をまとめたものである。
【００７３】
【表３】
2011502110.tif 000004
【００７４】
さらに、それらの修飾を有するＤＬＣ８結合モチーフを含むペプチドは、ペプチドの相互作用能力を維持しており、感染の際の細胞変性効果を阻害する場合に効果的であることが実証された。
【００７５】
１．３．４．２．  感染した細胞のパーセンテージにおけるペプチドの効果
（抗原ｐ３０に対し陽性である）ＡＳＦＶに感染した細胞数を計数することにより、ペプチドの阻害効果を解析した。これを行うために、ウイルス感染に先立ち、本実施例の方法の項に詳述するように、各種の阻害ペプチド及び対照ペプチドの存在下で、細胞をインキュベートした。
【００７６】
図６中に示されるように、感染に先立ってＣＯＶＡ２ペプチドと共にインキュベーションすることにより、対照ペプチドＲＳ２８と共にインキュベートした細胞において得られるデータと比較して、感染した細胞のパーセンテージの劇的な減少がもたらされた。さらに、この減少は、使用したＣＯＶＡ２ペプチドの濃度に依存的であった。
【００７７】
１．３．４．３．  ウイルスタンパク質の合成におけるペプチドの効果
特異的な抗体を用いたウェスタンブロットにより、初期及び後期ＡＳＦＶタンパク質の合成を解析した。すなわち、ＣＯＶＡ１ペプチド存在下で、ＡＳＦＶによる感染が起こるとき、初期（ｐ３０）及び後期（ｐ７２）のウイルスタンパク質の両方の合成が、投与量依存的に減少することが観察され得た。さらに、この減少は、細胞培養物へと加えられたＣＯＶＡ１の投与量に依存していた（図７）。
【００７８】
１．３．４．４．  ウイルスゲノム複製カウントにより測定したペプチドの効果
ベロ細胞を、各種濃度のペプチドと共に上述の通り予めインキュベートし、ＢＡ７１Ｖ  ＡＳＦＶ分離株を用いて感染させた。細胞を接種１６時間後に回収し、特異的なＴａｑＭａｎプローブ及びオリゴヌクレオチドを用いた定量的リアルタイムＰＣＲにより、ＡＳＦＶゲノムの複製を解析した［１１］。図８中に見られるように、阻害ペプチドであるＣＯＶＡ１を用いた処理は、ＡＳＦＶゲノムの複製を投与量依存的に強度に減少させた。同様に、ｐ５４−ＤＬＣ８相互作用に影響しないＤＬＣ８結合モチーフ中の変化を含む、その他のブロッキングペプチド（ＰＥＰ１及びＰＥＰ３）と共に予めインキュベートすることによっても、ＡＳＦＶゲノムの複製の減少がもたらされたが、ＣＯＶＡ１配列による処理は、より低濃度のペプチド（２５μＭ）でも効果的であった。ペプチド処理後のウイルスＤＮＡの複製におけるこの減少は、これらのペプチドによる感染の阻害の結果である。すなわち、この感度の良い定量的な方法により、ｐ５４−ＤＬＣ８結合を妨げ、感染を妨げ得るペプチド内部に、インビボにおける感染をより効果的にブロックできる所定の配列が存在することを明確にすることができる（図８）。
【００７９】
１．３．４．５．  ＡＳＦＶ感染の間のウイルス子孫産生に対するペプチド処理の影響
２４ウェルプレート中で生育させた９×１０４個のベロ細胞を、材料と方法の項に記載の通り、各種濃度のペプチドＣＯＶＡ１及びＲＳ２８により１時間、３７℃で処理した。次いで、細胞を、０．５ｐｆｕ／ｃｅｌｌのＢＡ７１Ｖに感染又は偽感染させた。接種３６時間後に、感染した細胞培養物由来の細胞外及び細胞内のウイルス子孫を、プラークアッセイにより解析した。図９中に示すように、５０μＭ又はそれより高い濃度のＣＯＶＡ１存在下で感染が進行する場合に、細胞外（図９Ｂ）及び細胞内（図９Ａ）のウイルス力価の統計学的に有意な減少が観察された。それにもかかわらず、各種濃度の陰性対照ペプチドＲＳ２８と共にインキュベーションすることは、ウイルス力価に影響を及ぼさず、ウイルス子孫の値は、ペプチド非存在下の感染細胞から得られたものと同様であった。
【００８０】
１．３．５．  細胞毒性分析。細胞生存率及び細胞増殖におけるペプチド処理の効果
ペプチドでベロ細胞を処理することに対し、何らかの細胞毒性または副作用が関連するか否かを評価するために、細胞増殖及び細胞生存率アッセイを行った。これらの実験において、各種の濃度のＣＯＶＡ１ペプチドにて処理を行った後の細胞の増殖値は、陰性対照ペプチドＲＳ２８にて処理を行った後の細胞と比較して減少しなかった（図１０）。ＣＯＶＡ１によって得られる増殖値は、ペプチド非存在下の対照細胞において得られる値と同様であった。また、細胞生存率は、トリパンブルー排除アッセイから判断されるように、各種のペプチド（インヒビター又は対照ペプチド）と共にインキュベーションを行った後に変化しなかった。細胞生存率は、すべての場合において９０％前後であった。これらの結果は、本発明に記載するペプチドと共にインキュベーションを行うことが、ベロ細胞の増殖又は生存率のいずれかに影響することがないことを実証する。
【００８１】
１．３．５．１．  細胞構造及びＤＬＣ８の機能的統合性
我々は、微小管モーターであるダイニンに関連する主要な細胞構造が、ペプチド処理により変化を受けるか否かを試験した。ペプチドの内在化と共に、我々は細胞骨格要素の統合性を解析し、微小管がペプチドＣＯＶＡ２の存在下で変化を受けないことを観察した（図１１）。また、軽鎖ダイニンの微小管における分布パターンは、微小管形成中心（ＭＴＯＣ）に相当する濃縮領域により保存されていた（図１１）。ダイニンの機能は、有糸分裂において重要であることが知られており、紡錘体の形成及び染色体の移動に役割を果たすが、細胞分裂には変化がないことを我々は見出した（図１２）。
【００８２】
１．３．５．２．  フルオレセイン標識されたＣＯＶＡ２ペプチドの細胞分布パターン
フルオレセイン標識したペプチドＣＯＶＡ２は、ＤＬＣ８分子全体に対するポリクローナル抗体を用いて染色されたＤＬＣ８と同様の分布を示した。ＤＬＣ８は、細胞質中で、オルガネラ、ＲＮＡ及びタンパク質の微小管のマイナス末端への（核に向かう）輸送に介在する選択されたカーゴと相互作用し、その機能は、有糸分裂後のゴルジ体等のオルガネラの再配置にとり不可欠である。興味深いことに、ＣＯＶＡ２ペプチドは、ＤＬＣ８分子の動的要素とまさに共局在化していた。蛍光ペプチドは、主として細胞質、細胞突起、糸状仮足及び休止細胞の細胞接触点領域に分布していた。有糸分裂を行っている細胞中で、それは、有糸分裂後期が開始するまで周辺の細胞質領域中に留まる。次いで、核分裂中の細胞及び娘細胞中でＣＯＶＡ２染色は増加し、有糸分裂後のオルガネラの再分布中には、それらの細胞中、全ての細胞質領域で、非常に強く染色される（図１３）。ＤＬＣ８分子全体を染色する抗体を用いた共局在化のパーセンテージは、有糸分裂後に細胞オルガネラを活発に再配置する細胞中において、より高かった。次いで、それが、細胞中のＤＬＣ８より介在される輸送を関連する動的要素の選択的マーカーであることが見いだされた。
【００８３】
これらの結果は、（ＡＳＦＶによる）ウイルス感染が、各種のウイルス分離株におけるウイルスｐ５４中に存在し、両方のタンパク質間の相互作用を阻害するＤＬＣ８結合モチーフに基づいて特異的に設計されたペプチドを用いて阻害され得ることを、明確に実証する。この阻害は、細胞変性効果の阻害、感染した細胞数、細胞あたりのウイルスゲノムのコピー数（細胞中にｎｇ／μｌで見いだされるウイルスの複製における減少を反映する）における大幅な減少、及び、結果的なウイルス産生及びウイルスタンパク質の合成における顕著な低減に反映される。
【００８４】
結論として、本発明は、感染を成功させるために不可欠なステップであるダイニンＤＬＣ８へとウイルスが結合するための配列に基づいて設計されたペプチドを、最初に使用するものであり、それらのペプチドは、感受性細胞におけるウイルス感染を効果的に阻害し、実証可能な抗ウイルス効果を有することが示される。
【００８５】
参考文献
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１０．  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｏｒｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｖｉｒａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｈａｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｄｙｎｅｉｎ  ＬＣ８  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  ｐｅｐｓｃａｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２００３．５４４：２６２−２６７．
１１．  Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００３．１０７：５３−６１．
１２．  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｒｅｓｐｏ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＬＣ８  ｄｙｎｅｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｅｐｓｃａｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．５０３：１３５−１４１（２００１）．
１３．  Ｌｏ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ８−ｋＤａ  ｄｙｎｅｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｉｔｓ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｖｉａ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ（Ｋ／Ｒ）ＸＴＱＴ  ｍｏｔｉｆ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１４０５９−１４０６６（２００１）．
１４．  Ｔａｙｌｏｒ，Ｗ．Ｒ．，Ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１９：２０５−２１８（１９８６）．
【図１】
2011502110.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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2011502110.tif 000016
【図１２】
2011502110.tif 000017
【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月29日(2010.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列が第１位に配置されたアミノ酸残基Ｓｅｒ及び／又は第３位に配置されたアミノ酸残基Ａｌａを有する時、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９及び配列番号１４の群から選択されたＤＬＣ８タンパク質と結合し得るペプチドを含む抗ウイルス性組成物。
【請求項２】
前記ペプチドが、前記ペプチドの細胞中への内在化を増大させるための手段をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の抗ウイルス性組成物。
【請求項３】
前記ペプチドを細胞中へ内在化させるための手段が、８個のアルギニンのテール部に存在する請求項２に記載の抗ウイルス性組成物。
【請求項４】
別の活性化合物及び／又は任意の薬学的に許容されるビヒクル、賦形剤、担体又は希釈剤をも含んでなる請求項１に記載の抗ウイルス性組成物。
【請求項５】
ＡＳＦＶ、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、エントモポックスウイルスＡ．ｍｏｏｒｅｉ、ワクシニアウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト単純ヘルペスウイルス、モコラウイルス又はＡＩＤＳウイルスから選択されるウイルスに起因する感染の治療に使用するための請求項１に記載の抗ウイルス性組成物。
【請求項６】
配列番号１４又は配列番号１、又は、それらに由来し、少なくとも１つのアミノ酸の保存的変化を有し、ＤＬＣ８タンパク質と結合し得る任意の配列のいずれかによって表されるファミリーに関連するペプチドであって、蛍光マーカーによって又は好ましくは、二次抗体、蛍光マーカー及び色素原によってそれを検出可能にする任意の一般的に使用されるタグによって検出可能となるようにコンジュゲート化されているペプチド。
【請求項７】
配列番号７、配列番号８及び配列番号９から選択される請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
配列番号１４又は配列番号１のいずれかによって表されるファミリーに関連するペプチドの１つを、トレース可能なマーカーで直接標識し、ペプチドと結合したマーカーによって放たれるシグナルを具体的に測定することによりそれを検出する方法、又は、二次抗体における第２段階のマーカーによって間接的に検出する方法等の任意の現在使用されている方法による、ペプチドの、特にウイルス起源のペプチドの、細胞内への内在化及び細胞質輸送の評価方法。
【請求項９】
配列番号１４又は配列番号１のいずれかによって表されるファミリーに関連するペプチドのうちの１つ又は該ペプチドに特異的な二次抗体を、トレース可能なマーカーで標識し、ペプチド又は抗体のいずれかと結合したマーカーによって放たれるシグナルを測定することによってそれを検出する、細胞中のダイニンの細胞生物学及びその機能の研究方法。
【請求項１０】
前記ペプチド又は抗体が、フルオレセイン、ローダミン、又は、直接蛍光顕微鏡による検出を可能にする当技術分野において公知の任意のその他の蛍光マーカー等の蛍光分子により標識される請求項８又は９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチド又は抗体が、ビオチン、ヘマグルチニン、ｃ−ｍｙｃ又はＧＳＴ等の任意の非蛍光マーカーにより標識される請求項８又は９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、配列番号７、配列番号８及び配列番号９から選択される請求項８乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2011502110.tif 000023
2011502110.tif 000024