(57)【要約】  本発明は、細胞内に浸透して癌細胞の細胞死を誘導する抗核酸抗体に関し、より詳細には、細胞の核酸鎖に対して結合能とその分解能を同時に保有する抗核酸抗体を癌細胞内に過発現させたり、あるいは抗体が癌細胞内に流入したとき、癌細胞の核酸鎖、すなわち、遺伝情報の損傷をもたらして細胞毒性を示す抗核酸抗体を用いた抗癌治療用または予防用組成物に関する。また、本発明の核酸加水分解抗体が細胞内に自ら流入する能力も正常細胞に比べて癌細胞で優れるという選択性があるため、正常細胞よりは癌細胞で選択的な細胞死を誘導できる治療剤組成物として使用可能である。
2011519370.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸加水分解能と細胞浸透能を同時にもつ抗体蛋白質、またはその類似体を有効成分として含有することを特徴とする、癌予防または治療用組成物。
【請求項２】
核酸加水分解能と細胞浸透能を同時にもつ抗体蛋白質をコード化する核酸配列を有効成分として含有することを特徴とする、癌予防または治療用組成物。
【請求項３】
前記蛋白質は、免疫グロブリン、またはその断片であって、核酸加水分解能と細胞浸透能を同時にもつことを特徴とする、請求項１または２に記載の癌予防または治療用組成物。
【請求項４】
前記免疫グロブリンは、免疫グロブリンＧであることを特徴とする、請求項３に記載の癌予防または治療用組成物。
【請求項５】
免疫グロブリンの断片は、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、及びＶＨとＶＬが相互接合したＦｖからなる群より選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項３に記載の癌予防または治療用組成物。
【請求項６】
前記免疫グロブリンＧは、３Ｄ８であることを特徴とする、請求項４に記載の癌予防または治療用組成物。
【請求項７】
前記ｓｃＦｖは、配列番号１に記載の配列で構成されることを特徴とする、請求項５に記載の癌予防または治療用組成物。
【請求項８】
前記ＶＨは、配列番号２に記載の配列で構成されることを特徴とする、請求項５に記載の癌予防または治療用組成物。
【請求項９】
前記ＶＬは、配列番号３に記載の配列で構成されることを特徴とする、請求項５に記載の癌予防または治療用組成物。
【請求項１０】
前記ｓｃＦｖをコード化する核酸配列は、配列番号４に記載の配列で構成されることを特徴とする請求項５に記載の癌予防または治療用組成物。
【請求項１１】
前記ＶＨをコード化する核酸配列は、配列番号５に記載の配列で構成されることを特徴とする、請求項５に記載の癌予防または治療用組成物。
【請求項１２】
前記ＶＬをコード化する核酸配列は、配列番号６に記載の配列で構成されることを特徴とする、請求項５に記載の癌予防または治療用組成物。
【請求項１３】
前記癌は、子宮頸癌、大腸癌、または神経細胞癌であることを特徴とする、請求項１に記載の癌予防または治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内に浸透して癌細胞の細胞死を誘導する抗核酸抗体に関し、より詳細には、細胞の核酸鎖に対して結合能とその分解能を同時に保有する抗核酸抗体を癌細胞内に過発現させたり、あるいは抗体が癌細胞内に流入したとき、癌細胞の核酸鎖、すなわち、遺伝情報の損傷をもたらして細胞毒性を示す抗核酸抗体の抗癌効果に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、抗核酸抗体が癌細胞に毒性を示して細胞死を誘導するといういくつかの報告がある。第一に、ＳＬＥ（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）及びＣＬＬ（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）患者の血清から分離した抗核酸抗体が細胞毒性を示して細胞死を誘導するとの報告（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．（２００２）８０：４１−４７．ＡＶ  Ｋｏｚｙｒ等）、第二に、ＬＥ（Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）患者の抗ＤＮＡ抗体が核に到達し、ＤＮＡ治療酵素であるＰＡＲＰの切断を誘導するとの報告（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２００５）２５：９９−１０５．Ｉｎｇｒｉｄ  Ｂｏｈｍ）、第三に、抗ＤＮＡ抗体（Ｆ４．１）が細胞を貫通して細胞死を誘発するとの報告（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００６）２６：５２−５６．Ｌｉｌｉａｎａ  Ｒｉｖａｄｅｎｅｙｒａ−Ｅｓｐｉｎｏｚａ等）、最後に、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスから得た抗ＤＮＡ抗体（Ｇ１−５）が核酸分解能により細胞死を誘導するとの報告（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００７）１５：２０１６−２０２３．Ｅｕｎ−Ｊｕｎｇ  Ｌｅｅ等）。
【０００３】
一方、核酸分解能をもつ抗核酸抗体が癌細胞に細胞毒性を示すという直接的な特許が登録されたことはまだないが、リボ核酸分解能をもつ酵素を用いた癌細胞から細胞毒性を確認したという特許はいくつかある。
【０００４】
その例として、米国登録特許第６，６５３，１０４号には、リボ核酸加水分解酵素の結合した抗体が悪性腫瘍細胞内に流入して毒性を示すことが開示されている。
【０００５】
また、米国登録特許６，３９５，２７６号には、核酸分解能をもつヒョウガエル（Ｒａｎａ  ｐｉｐｉｅｎｓ）由来の蛋白質が癌細胞表面の特定マーカーと結合する抗体に付着している構造が選択的かつ効果的に癌細胞を殺すことが開示されている。
【０００６】
さらに、米国登録特許第６，８６９，６０４号には、バクテリアで発現する核酸分解酵素組換え蛋白質が癌細胞に対して毒性を示すことが開示されている。
【０００７】
そのほか、米国特許第５，８４０，８４０号には、リボ核酸加水分解酵素と抗体を結合して選択的な細胞に毒性を示すことが開示されている。
【０００８】
このように、リボ核酸加水分解を用いた癌治療剤の開発は盛んになっており（ＢｉｏＤｒｕｇｓ．（２００８）２２：５３−５８．Ｌｅｅ  ＪＥ等）、細胞毒性効果を最大化するための努力（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．（２００７）２０：５０５−５０９．Ｆｕｃｈｓ  ＳＭ等）及び副作用を最小化するための努力により、癌細胞への選択性を与える傾向になっている（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．（２００５）３３１：５９５−６０２．Ｊｕｒｇｅｎ  Ｋｒａｕｓｓ等）。
【０００９】
しかしながら、前記のようなリボ核酸分解酵素を用いた癌細胞治療剤は、自ら細胞内に流入できるという利点があるが、細胞質内に過量存在するリボ核酸分解酵素抑制因子により細胞毒性効果が低減する問題を抱えている（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９：３９１９５−３９１９８．Ｍｏｎｔｉ  ＤＭ等）。これに対し、本発明の抗核酸抗体である３Ｄ８ｓｃＦｖは、リボ核酸分解酵素抑制因子による影響を克服することができ、リボ核酸のみならず、デオキシリボ核酸を分解する能力をもっているため、より効果的な癌治療剤の開発の基盤を提供することが期待されている。
【００１０】
一方、抗体蛋白質のごく一部は抗原に結合し、かつ抗原に対して酵素活性を示す触媒抗体として知られており、自然的に存在する触媒抗体としては、抗ＤＮＡ、抗ＲＮＡ、及び抗ＤＮＡ／ＲＮＡ抗体が一部知られている（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（１９９８）Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ７５：６３−７６、ＧＡ．Ｎｅｖｉｎｓｋｙ等；Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ（２００３）６０：３０９−３２０ＹＪ．Ｊａｎｇ等）。
【００１１】
また、組換え単鎖（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ）であって、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡを分解する抗ＤＮＡ触媒抗体としての構造及び触媒活性特性が報告されたものとしては、ＢＶ０４−０１（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）３４：１０８３−１０９３Ｇｏｌｏｌｏｂｏｖ、Ｇ．Ｖ等）が唯一である。
【００１２】
しかしながら、この抗体蛋白質が癌細胞に流入する具体的なメカニズムについては何ら報告がない。
【００１３】
これまで抗体を用いた治療蛋白質のメカニズムは、主に、細胞膜にある抗原に結合することで細胞成長を阻害したり直接的な細胞死を誘導するものだった。しかし、核酸加水分解能力をもつ抗体を用いて癌治療用または予防用に開発された例はまだないのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、上記の問題を解決し、かつ、上記の必要性によってなされたものであって、その目的は、特定の塩基配列に関係なく多様な核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を加水分解する能力をもつ核酸加水分解抗体を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記抗体を用いた癌治療用または予防用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記の目的を達成するために、本発明は、核酸加水分解能と細胞浸透能を同時にもつ抗体蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする癌予防または治療用組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、核酸加水分解能と細胞浸透能を同時にもつ抗体蛋白質をコード化する核酸配列を有効成分として含有することを特徴とする癌予防または治療用組成物を提供する。
【００１８】
本発明の一実施例において、前記蛋白質は、免疫グロブリン、またはその断片であって、核酸加水分解能と細胞浸透能を同時にもつことが好ましいが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の好ましい実施例において、前記免疫グロブリンは、免疫グロブリンＧであることが好ましく、免疫グロブリンの断片は、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、及びＶＨとＶＬが相互接合したＦｖからなる群より選択されるいずれか１つであることが好ましく、前記免疫グロブリンＧは、３Ｄ８であることがより好ましいが、これらに限定されない。
【００２０】
本発明の一実施例において、前記ｓｃＦｖは、配列番号１に記載の配列で構成されることが好ましく、前記ＶＨは、配列番号２に記載の配列で構成されることが好ましく、前記ＶＬは、配列番号３に記載の配列で構成されることが好ましいが、これらに限定されない。
【００２１】
また、本発明の一実施例において、前記ｓｃＦｖをコード化する核酸配列は、配列番号４に記載の配列で構成されることが好ましく、前記ＶＨをコード化する核酸配列は、配列番号５に記載の配列で構成されることが好ましく、前記ＶＬをコード化する核酸配列は、配列番号６に記載の配列で構成されることが好ましいが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明の好ましい実施例において、前記癌は、子宮頸癌、大腸癌、または神経細胞癌であることが好ましいが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書において、「核酸」とは、細胞内の核酸であることが好ましいが、これに限定されない。
【００２４】
本明細書において、「核酸加水分解能」とは、デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＤＮＡ）及びリボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＲＮＡ）鎖のリン酸エステル結合（３’−ａｎｄ  ５’−ｐｈｏｓｐｈｏｅｓｔｅｒ  ｂｏｎｄｓ）を加水分解反応により切断可能な能力を意味する。
【００２５】
また、本明細書に記載された「細胞」とは、癌細胞であることが好ましい。
【００２６】
本明細書において、「細胞浸透能」とは、蛋白質の人為的な変形、操作及び他の分子との結合がなくても、蛋白質自体で動物細胞膜を通過して細胞内に流入できる能力を意味する。
【００２７】
本発明で用いられた抗核酸加水分解抗体は、３Ｄ８ｓｃＦｖ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）であって、これは、ＤＮＡとＲＮＡに結合してこれを分解する能力がある。それだけでなく、蛋白質自体が細胞内に浸透して細胞死を誘発するため、癌治療剤として開発される可能性がある。
【００２８】
本発明の抗体は、細胞内の核酸鎖に対して分解能を保有する。
【００２９】
以下、本発明を簡単に説明する。
【００３０】
本発明では、特定の塩基配列に関係なく多様な核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）を加水分解する能力をもつ核酸加水分解抗体が癌細胞の内部に自ら浸透できることを示し、この能力をもつ核酸加水分解抗体が癌細胞内に流入すると、癌細胞の核酸鎖、すなわち、遺伝情報の損傷をもたらして、結局癌細胞に細胞毒性を示して抗癌効果を見せるというものであり、この核酸加水分解能と細胞浸透能を同時にもつ抗体を用いた癌治療用または予防用に用いるためのものである。
【００３１】
一方、本発明において、核酸加水分解能と細胞浸透能を同時にもつ抗体蛋白質は、好ましくは、免疫グロブリンまたはその断片及び／または誘導体であって、核酸加水分解能と細胞浸透能を同時にもつ断片が使用可能である。
【００３２】
本発明において、「蛋白質」とは、アミノ酸のポリマーを意味するもので、ここに記載された「抗体」も蛋白質の正義に含まれる。本発明において、「断片」という用語は、少なくとも蛋白質の２０の連続したアミノ酸または５０の連続したアミノ酸を有するポリペプチド部分を意味する。「誘導体」とは、１つ以上のポリペプチドの非保存または保存的なアミノ酸置換、あるいは、例えば、異種性ペプチドの付着または糖化、アセチル化、リン酸化などのような第２分子の共有的結合により変形された蛋白質またはその切片を意味する。
【００３３】
本発明において、「予防」という用語は、癌の開示または発生を防止するか、あるいは癌の開示の重症を阻害したり癌の開示の徴候を緩和するために、癌の診断または臨床的徴候の前に、その対象に本発明の抗体またはその誘導体などを投与することを意味する。
【００３４】
本発明において、「治療」という用語は、ある臨床段階において、癌の臨床または診断的徴候の開示後に、その対象に徴候の開示または発展を防止するか、あるいは癌の開示の重症を阻害したり癌の開示の徴候を緩和するために、癌の診断または臨床的徴候の前に、その対象に本発明の抗体またはその誘導体などを投与してその癌の臨床または診断的徴候を低減または除去することにより、患者に癌を緩和及び／または停止させることを意味する。治療は、徴候の重症度を低減、徴候の数または再発率の減少を含むことができる。
【００３５】
本発明において、「薬学的に受容可能な成分」という用語は、抗体が投与されるビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）、希釈剤、アジュバントまたは添加剤を意味する。
【００３６】
本発明において、「有効量」という用語は、患者において癌の１つ以上の臨床または診断徴候を緩和したり発生を阻害するのに十分な抗体またはその誘導体の量を意味する。薬剤の「投薬または処方計画」によって投与される。「投与または処方計画」とは、癌の治療または予防を達成するのに適した薬剤の容量及び投与頻度の組合せを意味する。
【００３７】
一部の実施例において、本発明の抗体は、キメラ抗体であり得る。キメラ抗体とは、抗体の諸部位が他の動物種由来の抗体を意味し、例えば、マウス・単クローン抗体由来の可変部位とヒトＩｇＧ免疫グロブリン固定部位を有する抗体を意味する。キメラ抗体を生産する方法は当業界には公知である（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５、２２９：１２０２；Ｏｉ等、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓ等、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１２５：１９１−２０２；米国特許５，８０７，７１５；４，８１６，５６７；及び４，８１６，３９７参照）。
【００３８】
本発明の抗体は、当業界に公知の方法により製造できる。例えば、単クローン抗体は、ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術またはその組合せを含む広範な技術を利用して製造できる。ハイブリドーマ技術は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ等、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２ｎｄ  ｅｄ．、１９８８）；及びＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ等、Ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、ｐｐ．５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８１）に一般的に記載されている。ファージディスプレイ技術の例は、多様な先行文献（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ等、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１；Ｑｕａｎ及びＣａｒｔｅｒ、２００２、Ｔｈｅ  ｒｉｓｅ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉ−ＩｇＥ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｒｇｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｊａｒｄｉｅｕ及びＦｉｃｋ  Ｊｒ．、ｅｄｓ．、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｈａｐｔｅｒ２０、ｐｐ．４２７−４６９；Ｂｒｉｎｋｍａｎ等、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８２：４１−５０；Ａｍｅｓ等、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ等、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ等、１９９７、Ｇｅｎｅ１８７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎ等、１９９４、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ５７：１９１−２８０；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１、及び米国特許５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５，５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３及び５，９６９，１０８）などに記載されている。
【００３９】
単鎖抗体の生産に用いられる技術の例は、米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ等、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ２０３：４６−８８；Ｓｈｕ等、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：７９９５−７９９９；及びＳｋｅｒｒａ等、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０３８−１０４０に記載されている。
【００４０】
二重特異性抗体を生産する方法は当業界には公知である。全長二重特異性抗体の伝統的な生産は、２鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいている（例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ等、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７−３９参照）。免疫グロブリン軽鎖と重鎖のアソートメント（ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）により、これらのハイブリドーマは、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合体を生成し、そのうち１つのみが正確な二重特異性構造を有する。類似した過程は、国際公開ＷＯ９３／０８８２９号などに記載されている。
【００４１】
二重特異性抗体に関するより多くの内容は、例えば、Ｓｕｒｅｓｈ等、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１２１：２１０；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ等、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１５１：６９５４−６１；Ｃａｒｔｅｒ等、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：１６３−６７；Ｃａｒｔｅｒ等、１９９５、Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ４：４６３−７０；Ｍｅｒｃｈａｎｔ等、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６：６７７−８１を参照すればよい。
【００４２】
本発明の抗体は、ヒト化抗体であり得る。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン分子から骨格と固定部位及びヒト以外の種から１つ以上のＣＤＲを有し、所望の抗原に結合する抗体分子である。多くの場合、ヒト骨格部位の骨格残基は、抗原結合を改善するために、ＣＤＲドナー抗体由来の当該残基に置換される。これらの骨格置換は、当業界に周知の方法により同定される（例えば、Ｑｕｅｅｎ等、米国特許５，５８５，０８９；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３）。抗体は、当業界に公知の様々な技術、例えば、ＣＤＲ接合（例えば、ＥＰ０２３９４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許５，２２５，５３９；５，５３０，１０１；及び５，５８５，０８９参照）、ベニヤリングまたはリサーフェイシング（例えば、ＥＰ０５９２１０６；ＥＰ０５１９５９６；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９１、２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ等、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａ等、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９６９−９７３）、及びチェーン・シャッフリング（例えば、米国特許５，５６５，３３２参照）を用いてヒト化が可能である。
【００４３】
ヒト化単クローン抗体は、例えば、国際公開ＷＯ８７／０２６７１号；欧州特許公開第０１８４１８７号；欧州特許公開第０１７１４９６号；欧州特許公開第０１７３４９４号；国際公開ＷＯ８６／０１５３３号などに記載された方法を利用する組換えＤＮＡ技術により生成可能である。
【００４４】
一部の実施例において、本抗体は、マウスＩｇＧ抗体である。マウス抗体は、例えば、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いたファージディスプレイ法を含む当業界の様々な技術により製造できる。例えば、米国特許第４，４４４，８８７号及び第４，７１６，１１１号；及び国際公開ＷＯ９８／４６６４５号、ＷＯ９８／５０４３３号、ＷＯ９８／２４８９３号、ＷＯ９８／１６６５４号、ＷＯ９６／３４０９６号、ＷＯ９６／３３７３５号、及びＷＯ９１／１０７４１号を参照すればよい。
【００４５】
本発明の抗体及びその誘導体は、例えば、組換え発現技術のような蛋白質合成に関する当業界の方法により生成される。本発明の抗体及びその誘導体の組換え発現は、本発明の抗体及びその誘導体をコード化する核酸を含む発現ベクターを構築することが必要である。そのベクターは、当業界に公知の技術を用いた組換えＤＮＡ技術により製造できる。その標準技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、３ｒｄ  ｅｄ．、２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、２ｎｄ  ｅｄ．、１９８９）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、４ｔｈ  ｅｄ．、１９９９）；及びＧｌｉｃｋ及びＰａｓｔｅｒｎａｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、２ｎｄ  ｅｄ．、１９９８）に記載された組換え核酸方法、核酸合成、細胞培養、トランスジーンの組込み及び組換え蛋白質発現技術であり得る。
【００４６】
例えば、本発明の抗体の組換え発現のために重鎖または軽鎖をコード化する発現ベクターは、プロモータに機能的に連結され得る。例えば、発現ベクターは、抗体分子の固定部位をコード化するヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；及び米国特許５，１２２，４６４）、抗体の可変部位はその全体の重鎖及び軽鎖の発現のためのベクターにクローニングできる。発現ベクターは、通常の技術により宿主細胞に入り、抗体を生成する通常の方法で培養される。二本鎖抗体の発現に関する典型的な実施例において、重鎖及び軽鎖の全てをコード化するベクターは、全長免疫グロブリン分子の発現のための宿主細胞で共発現できる。
【００４７】
様々な原核及び真核宿主発現ベクターシステムは、本発明の抗体またはその誘導体を発現するのに利用可能である。典型的に全長組換え抗体分子に対する真核細胞が組換え蛋白質の発現に用いられる。例えば、ＣＨＯ細胞のような哺乳類細胞がヒトＣＭＶウイルス由来の初期遺伝子プロモータのようなベクターのように、本発明の抗体生成システムの効果的な発現システムであり得る（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ等、１９８６、Ｇｅｎｅ４５：１０１；Ｃｏｃｋｅｔｔ等、１９９０、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２参照）。
【００４８】
他の宿主発現システム、例えば、細菌性細胞におけるプラズミド基盤発現システム（例えば、Ｒｕｔｈｅｒ等、１９８３、ＥＭＢＯ１、２：１７９１；Ｉｎｏｕｙｅ及びＩｎｏｕｙｅ、１９８５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ及びＳｃｈｕｓｔｅｒ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９）；昆虫システム；及び、例えば、アデノウイルス基盤システムのような哺乳類細胞におけるウイルス基盤発現システム（例えば、Ｌｏｇａｎ及びＳｈｅｎｋ、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３５５−３５９；Ｂｉｔｔｎｅｒ等、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１−５４４）も含まれる。
【００４９】
また、挿入配列の発現を制御したり、所望する形態の遺伝子産物を変形し加工する宿主細胞が選択され得る。適切な細胞株または宿主システムが発現する蛋白質の正確な変形と加工のために選択され得る。その哺乳類宿主細胞は、例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、及びＷ１３８を含む。
【００５０】
本発明の抗体の発現レベルは、ベクターの増幅により増加できる（例えば、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ及びＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）参照）。
【００５１】
本発明の抗体が重鎖及び軽鎖またはその誘導体を全て含むと、宿主細胞は、第１ベクターには重鎖蛋白質を、第２ベクターには軽鎖蛋白質をコード化する２つの発現ベクターで共トランスフェクションできる。
【００５２】
本発明の抗体が生成されると、それは適切なクロマトグラフィなどの方法を利用して精製できる。
【００５３】
本発明の抗体またはその誘導体を含む組成物は、癌を有したり危険性のある対象に投与できる。ここで使われた「対象」という用語は、ヒト及びヒト以外の哺乳類を含む本発明の抗体が投与できる哺乳類患者を意味し、より好ましくは、本発明の抗体を用いた治療対象はヒトを意味する。
【００５４】
癌の予防及び治療に効果的な抗体の量は、標準臨床技術により決定可能である。また、最適な投与範囲を明らかにするために、インビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）分析が選択的に採用され得る。調剤に採用される正確な量は、投与経路及び癌の段階にも依存し、医者の判断や患者の状態により決定されなければならない。有効量は、動物モデルまたはインビトロシステムからの容量依存曲線から求めることができる。
【００５５】
例えば、抗体の毒性及び治療効果は、ＬＤ５０及びＥＤ５０を決定するための標準薬学的過程により細胞培養または実験動物から決定可能である。毒性及び治療効果間の容量比率は治療インデックスであり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比で表現される。
【００５６】
一般的に、癌患者に投与される本発明の抗体の量は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。患者への投与量は、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重である。一般的に、ヒト抗体は、外来の蛋白質に対する免疫反応により他種由来の抗体より人体でより長い半減期を有する。したがって、ヒト化キメラ抗体またはヒト抗体を含む抗体は、より低い投与量及びより少ない投与頻度が可能となる。
【００５７】
本発明において、「抗体」とは、（ａ）免疫グロブリン蛋白質及び免疫グロブリン蛋白質の免疫的活性化部分（すなわち、特定の抗原に対して免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む免疫グロブリン系の蛋白質またはその断片）、または（ｂ）抗原に免疫特異的に結合する免疫グロブリン蛋白質または断片の保存的に置換された誘導体を意味する。一般的に、抗体は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８）に記載されている。
【００５８】
本発明において、「保存的置換」とは、抗原に対する免疫グロブリン蛋白質またはその断片の特異的な結合を実質的に減少させない１つ以上のアミノ酸の置換を意味する。
【００５９】
本発明において、「抗体誘導体」とは、異種分子の共有的結合（異種ペプチド結合、糖化、アセチル化など）により変形された抗体を意味する。
【００６０】
本発明において、好ましくは、前記免疫グロブリンは、免疫グロブリンＧであってよく、より好ましくは、前記免疫グロブリンＧは、３Ｄ８蛋白質であってよい。
【００６１】
免疫グロブリンとは、血清成分のうち、免疫に重要な役割を果たし、かつ、抗体作用を果たす蛋白質の総称であって、基本構造は、分子量約２万３０００のＬ鎖（軽鎖）一対と、５万〜７万のＨ鎖（重鎖）一対がジスルフィド結合したものであって、Ｈ鎖の種類γ、α、μ、δ、εにより、それぞれＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥに分類される。
【００６２】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、分子量約２万５０００のＬ鎖一対と分子量約５万のＨ鎖一対とからなり、全体の分子量は約１５万であり、両棲類以上の高等動物において重要な免疫グロブリンであり、人間では免疫グロブリンの約７０％を占めており、胎盤を通過し、様々な形態の抗体活性を有する。
【００６３】
一方、免疫グロブリンの断片は、核酸加水分解能と細胞浸透能を同時にもつ断片であれば、いずれかまたはそれらの組合せを多様に使用できる。好ましくは、ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、及びＶＨとＶＬが相互接合したＦｖからなる群より選択されるいずれか１つが使用できるが、これらに限定されない。
【００６４】
ｓｃＦｖは、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）がリンカーで連結されたもので、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のみを使用したものに比べて通常抗原に対する結合力が優れていることが知られている。このとき、ＶＨとＶＬを結合するリンカーは、当業界において通常使用されているリンカーであればどれを使用してもかまわない。
【００６５】
ＶＨ及びＶＬは、一般的に、ｓｃＦｖに比べて抗原に対する結合力が劣ることが知られているが、必要により、すなわち、組織への浸透性を増大させるなどの目的については、ｓｃＦｖより好適であり得る。
【００６６】
本発明の抗癌組成物は、癌の治療、予防または処理に通常用いられてきた治療法と併用して投与される。通常の治療法の例は、外科手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、生物学的療法及び免疫療法を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書において、「癌」という用語は、固体腫瘍及び血液腫瘍を含むが、これらに限定されない。「癌」という用語は、膀胱、骨または血液、脳、乳房、子宮頸部、胸、結腸、子宮内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ）、食道、目、頭、腎臓、肝臓、リンパ節、肺、口、首、卵巣、すい臓、前立腺、直腸、胃、睾丸、咽喉及び子宮の癌を含むが、これらに限定されず、皮膚組織、器官、血液及び血管の疾病を意味する。特定の癌は、進行悪性腫瘍（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）、アミロイド症、神経芽細胞腫、髄膜腫、血管周囲細胞腫、多発性脳転移、多形性膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｓ）、膠芽細胞腫、脳幹神経膠腫、予後不良悪性脳腫瘍（ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ）、悪性神経膠腫、再発性悪性神経膠腫、未分化星細胞腫（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、未分化希突起グリオーマ（ａｎａｐｌａｓｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）、神経内分泌腫瘍、腺癌（ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｄｕｋｅｓ  Ｃ＆Ｄ直腸結腸癌、切除不能直腸結腸癌、転移性肝細胞癌、カポシ肉腫、核型急性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−Ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ローグレード濾胞性リンパ腫（ｌｏｗ  ｇｒａｄｅ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、悪性黒色腫、悪性中皮腫、悪性胸膜滲出中皮腫症候群、虫垂癌、乳頭漿液腺癌（ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｓｅｒｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、婦人科癌、軟部組織の肉腫（ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、皮下血管炎、ランゲルハンス細胞組織球症、平滑筋肉腫、進行性骨化性線維形成異常症（ｆｉｂｒｏｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）、ホルモン耐性前立腺癌、切除高リスクの軟部組織の肉腫（ｒｅｓｅｃｔｅｄ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、切除不能肝細胞癌（ｕｎｒｅｓｃｅｃｔａｂｌｅ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、くすぶり型骨髄種（ｓｍｏｌｄｅｒｉｎｇ  ｍｙｅｌｏｍａ）、無痛性骨髄種、卵管炎、アンドロゲン非依存性前立腺癌、アンドロゲン依存性ステージＩＶ非転移性前立腺癌、ホルモン非感受性前立腺癌、化学療法非感受性前立腺癌、甲状腺乳頭癌、濾胞性甲状腺癌、髄質（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ）甲状腺癌、及び平滑筋腫（ｌｅｉｏｍｙｏｍａ）、頭頸部癌を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明において、効果的な癌は、子宮頸癌、大腸癌、または神経細胞癌を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
特定の実施例において、癌は転移性である。他の実施例において、癌は化学療法または放射線療法に対して難治性または耐性であることを特徴とする。
【００７０】
本発明は、癌に関連するか、これにより特徴づけられる疾病または障害に対して、かつて治療ができなかった人だけでなく、治療できたものの標準療法に対して反応を示さなかった患者を治療する方法を含む。また、本発明は、たとえ一部の疾病または障害が特定の年齢群においてより一般的であっても、患者の年齢を問わずに患者を治療する方法を含む。本発明は、そうでない人々だけでなく、問題となる疾病または疾患を治療してもらうために外科手術を受けていた患者を治療する方法をさらに含む。癌により特徴づけられる疾病または障害をもつ患者は異なる臨床所見と多様な臨床結果を有するため、患者に与えられた治療は患者の予後によって多様であり得る。熟練した臨床医は、不当な実験なく癌を有する個々の患者を治療するのに効果的に使用できる特定の第２次薬物、外科手術の類型及び非薬物に基づいた標準療法を容易に決定することができる。
【００７１】
また、本発明の薬学的組成物及び投与形態は、１つ以上の付加的活性成分をさらに含むことができる。結果的に、本発明の薬学的組成物及び投与形態は、本明細書に開示された活性成分を含む。
【００７２】
本発明の単一ユニットの投与形態は、経口、粘膜（例えば、鼻腔、舌下、膣、口腔、または直腸）、非経口（例えば、皮下、静脈、ボーラス注入、筋肉内または動脈内）、局所（例えば、目）、茎皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）または皮膚通過（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与が適切である。投与形態の例は、錠剤；カプレット；軟弾性ゼラチンカプセルなどのカプセル剤；カシェー（ｃａｃｈｅｔｓ）；トローチ；薬用ドロップ（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）；分散剤；坐剤；パウダー；エアロゾル（例えば、鼻腔用スプレーまたは吸入器）；ゲル；懸濁製剤（例えば、水性または非水性液体懸濁製剤、水中油型乳剤、または油中水型乳剤）、溶液剤及びエリキシル剤を含む経口または粘膜投与に適した液状投与剤型；注射投与に適した液状投与剤型、局所投与に適した点眼薬または他の眼科製剤；及び注射投与に適した液状投与形態を提供するために再構成できる滅菌固形製剤（例えば、結晶形または無定形固体）を含むが、これらに限定されない。
【００７３】
本発明の投与形態の組成物、形状、及びタイプは、一般的に、それらの使用により非常に多様である。例えば、疾患の急性治療のために用いられた投与形態は、同じ疾患の慢性治療のために用いられる投与形態よりも、それが含む１つ以上の活性成分を多量含むことができる。同様に、非経口的投与形態は、同じ疾患を治療するために用いられた経口投与形態よりも、それが含む１つ以上の活性成分をより少量含むことができる。本発明により含まれる特定の投与形態のこのような方式及び他の方式はそれぞれ非常に多様であり、本発明の属する分野における通常の知識を有する者に自明である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（１９９０）を参照すればよい。
【００７４】
典型的な薬学的組成物及び投与形態は、１つ以上の賦形剤を含む。適切な賦形剤は薬学分野において通常の知識を有する者に公知であり、適切な賦形剤の非限定的な例は本明細書に開示されている。特定の賦形剤が薬学的組成物または投与形態に含まれることが適切かどうは、投与形態が患者に投与される方式を含むが、これに限定されず、本発明の属する分野において周知の様々な因子による。例えば、錠剤のような経口投与形態・非経口投与形態での使用に適合しない賦形剤を含むことができる。
【００７５】
また、本発明は、活性成分が分解速度を低減できる１つ以上の化合物を含有する薬学的組成物及び投与形態を含む。前記化合物は、安定化剤、アスコルビン酸のような抗酸化剤、ｐＨ緩衝剤、または塩緩衝剤を含むが、これらに限定されない。
【００７６】
賦形剤の量及びタイプのように、投与形態において活性成分の量及び特定の形態は、患者に投与される経路であるが、これらに限定されない因子によって異なり得る。
【００７７】
経口投与のために好適な本発明の薬学的組成物は、錠剤（例えば、チュアブル錠）、カプレット、カプセル、及び液剤（例えば、香味シロップ）であるが、これらに限定されず、別の投与形態で存在し得る。前記投与形態は、予め定められた量の活性成分を含み、本発明の属する分野において周知の薬学方法により製造できる。一般的に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（１９９０）を参照すればよい。
【００７８】
本発明の一般的な経口投与形態は、活性成分を少なくとも１つの賦形剤と通常の薬学的混合技術に基づいて緻密な混合物で混合することによって製造される。賦形剤は、投与のために好ましい製剤の形態によって非常に多様な形態であり得る。例えば、経口液状またはエアロゾル投与形態の使用に適した賦形剤は、水、グリコール、オイル、アルコール、香料成分、保存剤、及び着色成分を含むが、これらに限定されない。固体経口投与形態（例えば、パウダー、錠剤、カプセル剤及びカプレット）での使用に適した賦形剤の例は、澱粉、砂糖、微結晶セルロース、賦形剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤、及び崩壊剤を含むが、これらに限定されない。
【００７９】
投与の便宜性から、錠剤及びカプセル剤は、最も有用な経口投与ユニット形態であり、この場合、固体賦形剤が適用される。好ましくは、錠剤は標準水性または非水性技術を用いてコーティング可能である。その投与形態は、薬学分野におけるどの方法によっても製造できる。一般的に、薬学的組成物及び投与形態は、活性成分と液体キャリア、微細に分離された固体キャリア、または両方と均一かつ親密に混合し、その後必要であれば、好ましい形態とするために、プロダクトを形作ることにより製造される。
【００８０】
本発明の経口投与形態で使用可能な賦形剤の例は、結合剤、充填剤、崩壊剤、及び潤滑剤を含むが、これらに限定されない。薬学的組成物及び投与形態での使用に適した結合剤は、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、または他の澱粉、ゼラチン、アカシアのような天然及び合成ゴム類、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸、他のアルギン酸塩、粉末トラガカント、グアーガム（ｇｕａｒ  ｇｕｍ）、セルロース及びその誘導体（例えば、エチルセルロース、セルロースアセテート、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、アルファ化澱粉（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｚｅｄ  ｓｔａｒｃｈ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、Ｎｏｓ．２２０８、２９０６、２９１０）、微結晶セルロース、及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
微結晶セルロースの適切な形態は、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０１、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０３、ＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ−５８１、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０５（ＦＭＣ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｉｓｃｏｓｅ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ａｖｉｃｅｌ  Ｓａｌｅｓ、Ｍａｒｃｕｓ  Ｈｏｏｋ、ＰＡから商業的に入手可能）という名前で市販されている物質及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。特定の結合剤は、ＡＶＩＣＥＬ  ＲＣ−５８１という名前で市販されている微結晶セルロースとカルボキシメチルセルロースナトリウムとの混合物である。適切な無水または低水分添加剤または付加剤は、ＡＶＩＣＥＬ−ＰＨ−１０３ＴＭ及びＳｔａｒｃｈ１５００ＬＭを含む。
【００８２】
本明細書に開示された薬学的組成物及び投与形態での使用に適した充填剤の例は、タルク、炭酸カルシウム（例えば、顆粒またはパウダー）、微結晶セルロース、粉末セルロース、デキストレート、カオリン、マンニトール、ケイ酸、ソルビトール、澱粉、アルファ化澱粉、及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物の結合剤または充填剤は、一般的に薬学的組成物または投与形態の約５０〜約９９重量パーセント存在する。
【００８３】
崩壊剤は、錠剤が水性環境にさらされたときに崩壊されるようにするために、本発明の組成物に用いられる。過度に多い崩壊剤を含む錠剤は保管中に崩壊できるのに対し、過度に少ない崩壊剤を含む錠剤は好適な条件下に好適な速度で崩壊されない。したがって、活性成分の放出を制御するのに悪影響しないように、過度に多くも少なくもない十分な崩壊剤の量が本発明の固体経口投与形態を形成するために使用されなければならない。崩壊剤の使用量は、製剤のタイプにより多様であり、本発明の属する分野における通常の知識を有する者にとって容易に判断できる。典型的な薬学的組成物は、約０．５〜約１５重量パーセントの崩壊剤、好ましくは、約１〜約５重量パーセントの崩壊剤を含有する。
【００８４】
本発明の薬学的組成物及び投与形態で使用可能な崩壊剤は、寒天、アルギン酸、炭酸カルシウム、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、ポラクリリンカリウム、澱粉グリコール酸ナトリウム、ジャガイモまたはタピオカ澱粉、アルファ化澱粉、他の澱粉、粘土、他のアルギン、他のセルロース、ゴム類、及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
本発明の薬学的組成物及び投与形態で使用可能な潤滑剤は、カルシウムステアレート、マグネシウムステアレート、ミネラルオイル、ライトミネラルオイル、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール、他のグリコール、ステアリン酸、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、水素化植物油（例えば、ピーナッツ油、綿実油、ヒマワリ油、胡麻油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油）、ステアリン酸亜鉛、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、寒天、及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。付加的潤滑剤は、例えば、シロイドシリカ（ＡＥＲＯＳＩＬ２００、Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ  Ｃｏ．製造、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）、合成シリカの凝固エアロゾル（Ｄｅｇｕｓｓａ  Ｃｏ．製造、Ｐｌａｎｏ、ＴＸ）、ＣＡＢ−Ｏ−ＳＩＬ（ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ  ｓｉｌｉｃｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ、Ｃａｂｏｔ  Ｃｏ．、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、及びこれらの混合物を含む。潤滑剤の場合は、一般的にそれを含む薬学的組成物または投与形態の約１重量パーセント以下の量で使用される。
【００８６】
本発明の好ましい固体経口投与形態は、本発明の選択的なサイトカイン阻害薬、無水ラクトース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸、コロイダル無水シリカ、及びゼラチンを含む。
【００８７】
本発明の活性成分は、放出制御手段により、または本発明の属する分野における通常の知識を有する者に周知の伝達装置により投与可能である。例えば、米国特許第３，８４５，７７０号；第３，９１６，８９９号；第３，５３６，８０９号；第３，５９８，１２３号；及び第４，００８，７１９号、第５，６７４，５３３号、第５，０５９，５９５号、第５，５９１，７６７号、第５，１２０，５４８号、第５，０７３，５４３号、第５，６３９，４７６号、第５，３５４，５５６号、及び第５，７３３，５６６号に開示されたものを含むが、これらに限定されない。前記引用文献は、引用により本明細書に含まれる。その投与形態は、例えば、多様な割合で好ましい放出プロファイルを提供するためのヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、滲透システム、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェア、またはこれらの混合物を使用して１つまたはそれ以上の活性成分の緩徐または放出制御を提供するために使用可能である。本明細書に開示されたものを含む本発明の属する分野における通常の知識を有する者に周知の適切な放出制御製剤は、本発明の活性成分における使用のために容易に選択可能である。そのため、本発明は、放出制御のために適した錠剤、カプセル剤、ジェルギャップ剤（ｇｅｌｃａｐｓ）、及びカプレットであるが、これらに限定されず、経口投与のために適切な単一ユニット投与形態を含む。
【００８８】
全ての放出制御薬学的組成物は、これらの非制御対応物により達成される薬物治療効果を改善しようとする一般的な目的を有する。理想的に、医療治療において最適に設計された放出制御製剤の使用は、最小の時間内に病状を治療または制御するように採用された最小の薬物物質により特徴づけられる。放出制御製剤の利点は、薬物活性の拡張、投与周期の減少、及び患者の服薬順応度の増加を含む。付加的に、放出制御製剤は、作用の開示時期または薬物の血中レベルのような他の特性を制御するために使用可能であり、これにより、付加反応（例えば、副作用）の発生に影響を及ぼし得る。
【００８９】
大部分の放出制御製剤は、初期に好ましい治療効果が直ちに現れる薬物（活性成分）の量を放出し、次第に連続して拡張した時期の間、治療的または予防的効果のレベルを維持するために薬物の異なる量を放出するように設計される。体内においてこのような一定の薬物レベルを維持するために、薬物は、投与形態から体内において排出及び代謝される薬物の量を代替する速度で放出されなければならない。活性成分の放出制御は、ｐＨ、温度、酵素、水分、または他の生理的な条件または化合物を含むが、これらに限定されず、多様な条件により促進可能である。
【００９０】
非経口的投与形態は、皮下、静脈（ボーラス注入を含む）、筋肉内及び動脈内経路を含むが、これらに限定されず、多様な経路を介して投与できる。その投与は、一般的に汚染源に対する患者の自然的防御を迂回できるため、非経口的投与形態は、好ましくは、滅菌または患者への投与前に滅菌できなければならない。非経口的投与形態の例は、注射用溶液、注射のための薬学的に許容可能なビークルで容易に溶解または懸濁可能な乾燥プロダクト、注射用懸濁液、及び乳剤を含むが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明の非経口的投与形態を提供するために使用可能な適切なビークルは、本発明の属する分野における通常の知識を有する者に周知である。例えば、ＵＳＰ注射用蒸溜水；塩化ナトリウム注射液、リンガー液、ブドウ糖注射液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム注射液、及び乳酸加リンガー液などであるが、これらに限定されず、水性ビークル；エチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコールなどであるが、これらに限定されず、水混和性ビークル；コーン油、綿実油、ピーナッツ油、胡麻油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び安息香酸ベンジルなどであるが、これらに限定されず、非水性ビークルを含むが、これらに限定されない。
【００９２】
本明細書に開示された１つ以上の活性成分の溶解度を増加できる化合物も、本発明の非経口的投与形態に含まれる。例えば、シクロデキストリン及びその誘導体は、本発明の選択的なサイトカイン阻害薬及びその誘導体の溶解度を増加させるために使用可能である。例えば、米国特許第５，１３４，１２７号を参照すればよい。この文献は、引用により本明細書に含まれる。
【００９３】
本発明の局所及び粘膜投与形態は、スプレー、エアロゾル、溶液、乳剤、懸濁製剤、点眼薬または他の眼科製剤、あるいは本発明の属する分野における通常の知識を有する者に周知の他の形態を含むが、これらに限定されない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ  ａｎｄ  １８ｔｈ  ｅｄｓ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（１９８０＆１９９０）；及びＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、４ｔｈ  ｅｄ．、Ｌｅａ＆Ｆｅｂｉｇｅｒ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９８５）を参照すればよい。口腔内の粘膜組織を治療するための適切な投与形態は、マウスウォッシュまたは経口ゲル剤で製剤化できる。
【００９４】
本発明により含まれる局所及び粘膜投与形態を提供するために使用可能な適切な添加剤（例えば、キャリア及び賦形剤）及び他の物質は、薬学分野における通常の知識を有する者に公知であり、公知の薬学的組成物または投与形態が適用される特定の組織に依存する。このような事実を考慮して、溶液、乳剤またはゲル剤を形成するための典型的な添加剤は、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミネラルオイル、及びこれらの混合物を含むが、これらに限定されるものではなく、これらは非毒性かつ薬学的に許容可能である。加湿剤（ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｅｒ）または湿潤剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）も、好適な場合、薬学的組成物及び投与形態に添加できる。その付加的成分の例は、本発明の属する分野における通常の知識を有する者に公知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ  ａｎｄ  １８ｔｈ  ｅｄｓ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ（１９８０＆１９９０）を参照すればよい。
【００９５】
薬学的組成物または投与形態のｐＨも、１つ以上の活性成分の伝達を改善するために制御できる。同様に、溶媒キャリアの極性、そのイオン強度、または滲透圧も、伝達を改善するために制御できる。ステアレートのような化合物が伝達を改善するために、１つ以上の活性成分の親水性または親油性を有益に制御するために薬学的組成物または投与形態に添加できる。この観点から、ステアレートは、製剤化のための脂質ビークルであって、乳化剤または界面活性化剤として、及び伝達促進または浸透促進成分として使用可能である。活性成分の異なる塩、水和物または溶媒和物が生成される組成物の物性をさらに制御するために使用可能である。
【発明の効果】
【００９６】
本発明の核酸加水分解抗体は、細胞の核酸鎖に対して結合能とその分解能を同時に保有して抗体を癌細胞内に過発現させたり、あるいは抗体が癌細胞内に流入したとき、癌細胞の核酸鎖、すなわち、遺伝情報の損傷をもたらして細胞毒性を示し、また、細胞内に自ら流入する能力も正常細胞に比べて癌細胞で優れるという選択性があるため、正常細胞よりは癌細胞で選択的な細胞死を誘導できる治療剤組成物として使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明の３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を癌細胞で過発現させるための発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ２）の切断地図である。
【図２】本発明の３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を癌細胞で過発現させるための発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）の切断地図である。
【図３】本発明の３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−３Ｄ８ｓｃＦｖ）を用いてヒト子宮癌細部株（ＨｅＬａ）で過発現させた後、細胞毒性をフローサイトメーターで測定した結果である。
【図４】本発明の３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−３Ｄ８ｓｃＦｖ）を用いてＨｅＬａ細胞株で過発現させた後、細胞毒性をＭＴＴ試薬を用いて測定した結果である。
【図５】本発明の３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−３Ｄ８ｓｃＦｖ）を用いてＨｅＬａ細胞株で過発現させた後、細胞死の程度をフローサイトメーターで測定した結果である。
【図６】本発明の３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質発現ベクター（ｐｃＤＮＡ−３Ｄ８ｓｃＦｖ）を用いてＨｅＬａ細胞株で過発現させた後、ＤＮＡをＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）で染色し、フローサイトメーターにより細胞内ＤＮＡの量が減少したことを確認した結果である。
【図７】本発明の３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−３Ｄ８ｓｃＦｖ）を用いてＨｅＬａ細胞株で過発現させた後、ゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノム遺伝子の断片化を電気泳動で確認した結果である。
【図８】本発明の３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−３Ｄ８ｓｃＦｖ）を用いてＨｅＬａ細部株で過発現させた後、細胞溶解物で切断された形態のＰＡＲＰ蛋白質をウェスタンブロット法により検出した結果である。
【図９】カスパーゼ阻害剤（ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）であるｚ−ＶＡＤを細胞に前処理した後、３Ｄ８ｓｃＦｖ発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−３Ｄ８ｓｃＦｖ）を用いてＨｅＬａ細胞株で過発現させたとき、細胞生存率が回復することを位相差顕微鏡で観察した結果である。
【図１０】カスパーゼ阻害剤であるｚ−ＶＡＤを前処理した後、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質発現ベクターを用いてＨｅＬａ細胞株で過発現させた後、ＭＴＴ試薬を用いて細胞生存率を測定した結果である。
【図１１】カスパーゼ阻害剤であるｚ−ＶＡＤを前処理した後、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−３Ｄ８ｓｃＦｖ）を用いてＨｅＬａ細胞株で過発現させた後、ゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子の断片化を観察した電気泳動結果である。
【図１２】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質がＨｅＬａ細胞株から抽出したゲノムＤＮＡ及びパクテリア由来のプラズミドＤＮＡの分解を示す電気泳動結果である。
【図１３】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質をＴＯＭ培地（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｍｅｄｉａ）にてＨｅＬａ細胞株に処理した後、抗３Ｄ８ｓｃＦｖ抗体で染色し、蛋白質が細胞内に流入して細胞質に位置することを共焦点蛍光顕微鏡で確認した結果である。
【図１４】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質をＴＯＭ培地にてＨｅＬａ細胞株に処理した後、蛋白質が細胞内に流入した程度を、抗３Ｄ８ｓｃＦｖ抗体で染色し、フローサイトメーターで測定した結果である。
【図１５】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の濃度に応じた細胞内への流入度を、抗３Ｄ８ｓｃＦｖ抗体で染色し、共焦点蛍光顕微鏡法で確認した結果である。
【図１６】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の濃度に応じた細胞内への流入度を、抗３Ｄ８ｓｃＦｖ抗体で染色し、フローサイトメーターで測定した結果である。
【図１７】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の時間に応じた細胞内への流入度を、抗３Ｄ８ｓｃＦｖ抗体で染色し、共焦点蛍光顕微鏡法で確認した結果である。
【図１８】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の時間に応じた細胞内への流入度を、抗３Ｄ８ｓｃＦｖ抗体で染色し、フローサイトメーターで測定した結果である。
【図１９】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の細胞内に流入後、時間に応じた位置の変化を、抗３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質抗体で染色し、共焦点蛍光顕微鏡法で確認した結果である。
【図２０】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の細胞内への流入効率をウェスタンブロット法で確認した結果である。
【図２１】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質と細胞膜の相互作用にヘパリン硫酸プロテオグリカン（Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ、ＨＳＰＧｓ）が関与することを共焦点蛍光顕微鏡法で確認した結果である。
【図２２】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質をＴＯＭ培地にて複数の濃度で多様な癌細胞株に処理した後、ＭＴＴ試薬を用いて細胞毒性を測定した結果である。
【図２３】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質をＴＯＭ培地にてＨｅＬａ細胞株に処理した後、合成ＲＮＡ断片の分解を確認した蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）分析結果である。
【図２４】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質をＴＯＭ培地にてＨｅＬａ細胞株に処理した後、ＲＮＡ全体を抽出し、ｔＲＡＮ、ｒＲＮＡ、及びｍＲＮＡの損傷程度を確認した電気泳動結果である。
【図２５】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質をＨｅＬＡ癌細胞株と正常乳房上皮細胞株に処理した後、ＭＴＴ試薬を用いて細胞毒性の程度を比較した結果である。
【図２６】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質をＨｅＬＡ癌細胞株と正常乳房上皮細胞株に処理した後、ＭＴＴ試薬を用いて細胞毒性の程度を位相差顕微鏡写真で確認した結果である。
【図２７】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質をＨｅＬａ癌細胞株と正常乳房上皮細胞株に処理した後、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の細胞内への流入度をフローサイトメーターにより比較した結果である。
【図２８】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を癌細胞株と正常細胞株に処理した後、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の細胞内への流入度をウェスタンブロット法により比較した結果である。
【図２９】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を癌細胞株と正常細胞株に処理した後、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の細胞内への流入度を共焦点蛍光顕微鏡法で確認した結果である。
【図３０】ＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株と正常ヒト肝細胞におけるグリピカン３（ｇｌｙｐｉｃａｎ−３）の発現レベルをフローサイトメーターにより比較した結果である。
【図３１】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質をＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株と正常ヒト肝細胞に処理した後、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の細胞内への流入度をフローサイトメーターにより比較した結果である。
【図３２】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質をＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株に処理した後、ＭＴＴ試薬を用いて細胞毒性の程度を確認した結果である。
【図３３】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質をＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株に処理した後、ゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子の断片化を観察した電気泳動結果である。
【図３４】３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を正常ヒト肝細胞に処理した後、ＭＴＴ試薬を用いて細胞毒性の程度を確認した結果である。
【図３５】バクテリアで精製した３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質内のリポ多糖類（ＬＰＳ）の含有度を測定したゲル凝固反応実験結果である。
【図３６】ヌードマウスにＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株を移植して育てた後、３Ｄ８ｓｃＦｖを投与し、癌組織の大きさを測定した結果である。
【図３７】ヌードマウスにＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株を移植して育てた後、３Ｄ８ｓｃＦｖを投与し、癌組織をマウスから摘出した写真である。
【図３８】肝臓癌患者から分離した肝臓癌細胞に３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を処理した後、ＭＴＴ試薬を用いて細胞毒性を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００９８】
以下、非限定的な実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する。
【００９９】
実施例１：３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質発現ベクターの構築、発現及び精製
ｓｃＦｖ蛋白質を精製するために、大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３（ｐＬｙｓＥ）細胞（入手先：Ｎｏｖａｇｅｎ社）にｐＩｇ２０−３Ｄ８ｓｃＦｖベクターを形質転換した。３Ｄ８ハイブリドーマ細胞（韓国細胞株銀行に寄託：ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−００１４６）約１×１０６個にＲＮＡ抽出溶液（ＲＮＡｚｏｌ  Ｂ、ＴＥＬ−ＴＥＳＴ社）０．２ｍｌを添加し、細胞を溶解及び均質化した。クロロホルム０．０２ｍｌを添加して１５秒間撹拌した後、氷に５分間放置した。遠心分離を行い、上澄液を分離した後、０．２５ｍｌのエタノールを添加し、４℃の温度にて１５分間静置した後、１５分間遠心分離（１２，０００ｇ、４℃）を行った。ＲＮＡ沈殿物を７０％エタノールで洗浄し、乾燥後、蒸溜水に溶解した。抽出したＲＮＡからＲＴ−ＰｒｅＭｉｘキット（Ｂｉｏｎｅｅｒ社）を用いてｃＤＮＡを合成し、このとき、プライマーとしてオリゴ−（ｄＴ）オリゴヌクレオチドを使用した。このｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによりＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を増幅した。ＶＨ遺伝子を増幅するためには、５’−ＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＲＴＡＴＣＡＴＳＹＴＣＴＴ−３’（配列番号：７）と５’−ＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣ−３’（配列番号：８）プライマーを、ＶＬ遺伝子を増幅するためには、５’−ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣ−３’（配列番号：９）と５’−ＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣ−３’（配列番号：１０）を使用した。それぞれ増幅したＶＨ遺伝子（約３６０ｂｐ）とＶＬ遺伝子（約３４０ｂｐ）をｐＩｇ２０ベクター（入手先：米国Ｔｕｒｆｓ大学のＳｔｏｌｌａｒ  ＢＤ教授）に順次にサブクローニング（ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ）することにより、ｐＩｇ２０−３Ｄ８ｓｃＦｖ発現ベクターを確立した。このとき、ＶＨクローニングのためにはＸｍａＩ／ＸｂａＩ制限酵素認識部位、ＶＬのためにはＢｇｌＩＩ／ＮｃｏＩ制限酵素認識部位のあるプライマーを作製して使用した。形質転換されたＢＬ２１ＤＥ３（ｐＬｙｓＥ）細菌をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とクロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培養液で吸光度Ａ６００の値が０．８に達するまで培養した。ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−Ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を０．５ｍＭの濃度で添加し、室温にて４時間追加培養した後、１０，０００×ｇ、４℃で、１０分間遠心分離をして得た上澄液を０．４５μｍの膜にろ過した。ろ過液をＩｇＧ−セファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に通過させ（１ｍｌ／ｍｉｎ）、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）と酢酸アンモニウム（ｐＨ５．０）で洗浄した後、０．１Ｍ酢酸（ｐＨ３．４）で蛋白質を溶離した。溶離した蛋白質をＰＢＳ溶液で透析した後、還元条件下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで蛋白質の純度を分析した。蛋白質約２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動した後、クマシー・ブルー（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ）で染色したとき、ｓｃＦｖ抗体が９５％以上の純度で精製されたことを確認した。
【０１００】
実施例２：動物細胞で３Ｄ８ｓｃＦｖを発現させるためのベクターの作製
３Ｄ８ｓｃＦｖを動物細胞で発現させるために、２つのベクター、すなわち、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（入手先：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）とｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（入手先：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ２は、３Ｄ８ｓｃＦｖのＣ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）にＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を共発現するように考案したものであり、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターは、３Ｄ８ｓｃＦｖのみを発現するように考案したものである。実施例１で確立したｐＩｇ２０−３Ｄ８ｓｃＦｖベクターを鋳型としてＰＣＲを行うことにより３Ｄ８ｓｃＦｖ遺伝子を増幅した後、１％アガロースゲルで電気泳動を行い、ゲルからｓｃＦｖ遺伝子（約７５０ｂｐ）を抽出し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２ベクター内のＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ制限酵素部位に、また、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター内のＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位にクローニングした（図１及び２）。
【０１０１】
実施例３：ＶＨとＶＬ蛋白質の存在形態及びこれらの相互結合
精製したＶＨ、ＶＬ、ｓｃＦｖ、及びＦｖ（ＶＨとＶＬの非共有結合体）の蛋白質のＳＥＣ（Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）分析のためにＨＰＬＣシステムを用いた。ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｊａｐａｎ）に５〜２０μＭ蛋白質０．０２ｍｌを注入した後、リン酸緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を０．７ｍｌ／ｍｉｎの速度で流し、クロマトグラムは２８０ｎｍにおける吸光度から得た。
【０１０２】
リン酸緩衝液の条件下、ＶＨとＶＬの各々は、単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の形態で存在することを観察することができ、多量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒ）の形態では観察できなかった。
【０１０３】
一方、ＶＨ、ＶＬの間にはこれらの自然的な相互結合が生じた結果であるＦｖ形態を確認することができた。ＶＨとＶＬ間の定量的な相互結合は、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ２０００  ＳＰＲバイオセンサ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により分析した。
【０１０４】
ＣＭ５センサチップ（製造会社：Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）のカルボキシメチル化デキストラン（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｄｅｘｔｒａｎ）の表面にＶＬ蛋白質（０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ）を固定させた後、リン酸緩衝液の条件下、ＶＨ蛋白質（１２．５、２５、５０、１００、２００ｎＭ）を流し、センサグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）を分析した結果、ＶＨはＶＬとＫＤ１４ｎＭの親和力で結合することを確認した。
【０１０５】
実験例１：ｐＥＧＦＰ−３Ｄ８ｓｃＦｖベクターを用いた３Ｄ８ｓｃＦｖの細胞内発現による細胞毒性効果の確認
＜１−１＞細胞培養
ヒト子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａ細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリンと１００ｕｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地において、５％ＣＯ２が供給されるインキュベータで培養し、細胞毒性の分析に用いた。
【０１０６】
＜１−２＞細胞内の核酸の注入
単純トランスフェクション法によるＨｅＬａ細胞株に３Ｄ８ｓｃＦｖを過発現させるために、ＨｅＬａ細胞株を２４時間前に６ウェルプレートに培養して（２×１０５細胞／ウェル）用意した後、形質転換の直前にＰＢＳで２回洗浄した後、ＴＯＭ培地にて交換した。リポフェクトアミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０μｌとｐＥＧＦＰ−Ｎ２またはｐＥＧＦＰ−３Ｄ８ｓｃＦｖベクター（図１）１μｇを撹拌した後、室温にて１５分間静置した。これを６ウェルプレートに培養されたＨｅＬａ細胞株にそれぞれ添加し、６時間後に１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にて交換し、２４時間培養後、３Ｄ８ｓｃＦｖの発現レベルと細胞毒性効果を確認する実験に使用した。
【０１０７】
＜１−３＞フローサイトメトリーによる３Ｄ８ｓｃＦｖの細胞内発現による細胞毒性の分析
核酸加水分解抗体が癌細胞に発現したとき、癌細胞に及ぼす細胞毒性を判断するために、３Ｄ８ｓｃＦｖをヒト子宮頸癌細胞株であるＨｅＬａ細胞株に発現させた（製造例２及び図３）。ｐＥＧＦＰ−Ｎ２ベクター（陰性対照）、ｐＥＧＦＰ−３Ｄ８ｓｃＦｖベクター（図１）０．５、１、及び２ｕｇをリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて細胞内に注入し、３７℃、ＣＯ２インキュベータで２４時間培養した後、３Ｄ８ｓｃＦｖの発現程度及び細胞死をフローサイトメトリーを用いて分析した。すなわち、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞を２００ｕｌ  ＰＢＳに懸濁した後、ＰＩ（５μｇ／ｍｌ）を１ｕｌ添加してから、室温にて１０分間反応させた後、フローサイトメトリーで分析した（図３）。また、細胞毒性をＭＴＴアッセイ（ａｓｓａｙ）で分析した（図４）。すなわち、９６ウェルプレートでベクターをトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、２４時間後、培養液にＭＴＴ溶液を入れ、４時間、３７℃、ＣＯ２インキュベータで反応させた後、培養液を除去し、ＤＭＳＯで懸濁し、５９５ｎｍでＯＤ値を測定した（図４）。その結果、ＨｅＬａ細胞株で３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質が十分に発現していることを確認し、３Ｄ８ｓｃＦｖの発現率が高いほど細胞生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が低下することを確認した。
【０１０８】
実験例２：ｐｃＤＮＡ−３Ｄ８ｓｃＦｖベクターを用いた３Ｄ８ｓｃＦｖの細胞内発現による細胞毒性効果の確認
３Ｄ８ｓｃＦｖの発現による細胞毒性を、ＥＧＦＰが融合されていない純ｓｃＦｖの発現で再確認した。ＨｅＬａ細胞株を６ウェルプレートで２４時間培養後、ｐｃＤＮＡ（陰性対照）及びｐｃＤＮＡ−３Ｄ８ｓｃＦｖベクターをリポフェクトアミン２０００を用いて単純トランスフェクションして一定時間培養した後、ＰＢＳで２回洗浄し、蛍光物質が付着している（ＦＩＴＣ）アネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ）（２．５ｍｇ／ｍｌ）とＰＩ（５μｇ／ｍｌ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加し、室温にて１５分間反応後、フローサイトメーターで染色程度を測定した。これは、死滅する細胞のＤＮＡと結合するＰＩ物質を用いて、３Ｄ８ｓｃＦｖを発現する細胞はＰＩにより染色され、アネキシンＶはアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）で細胞が死ぬときに検出される原理を利用したものである。その結果、３Ｄ８ｓｃＦｖを発現する癌細胞で発現率が高いほど細胞死が比例して発生することを確認し、細胞死がアポトーシスによるものであることを確認した（図５）。結論的に、これらの結果は、３Ｄ８ｓｃＦｖが癌細胞内に発現したときに細胞毒性を誘導することを示す。また、細胞死を細胞内ＤＮＡ含量変化分析により確認するために、ＰＩ染色を行った（図６）。ＨｅＬａ細胞株を６ウェルプレートで２４時間培養した後、リポフェクトアミン２０００トランスフェクション法を利用して３Ｄ８ｓｃＦｖを過発現させ、２４時間培養後、ＰＢＳで２回洗浄し、７０％エタノールで細胞固定した後、ＰＩ（５μｇ／ｍｌ）で染色し、フローサイトメーターで細胞周期を分析した。死滅する細胞の場合、２ｎ未満のＤＮＡを有し、これらをｓｕｂ  Ｇ１というが、実験の結果、３Ｄ８ｓｃＦｖが発現した場合、２ｎ未満の細胞増加を観察することにより細胞死が誘導されることを確認した（図６）。
【０１０９】
実験例３：ＨｅＬａ細胞における３Ｄ８ｓｃＦｖの発現による細胞死類型の分析
ＨｅＬａ細胞における３Ｄ８ｓｃＦｖの発現による細胞死の類型がアポトーシスであることを確認するために、ＤＮＡ断片化の有無及び切断された形態のＰＡＲＰ分子の検出を行った（図７）。ＨｅＬａ細胞株にｐＥＧＦＰ−３Ｄ８ｓｃＦｖベクター（図１）１ｕｇをリポフェクトアミン２０００を用いて細胞内に注入し、３７℃、ＣＯ２インキュベータで２４時間培養した。ＤＮＡ断片化の有無を確認するために、約２×１０５／ｍｌ細胞数のＨｅＬａ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し（ゲノムＤＮＡ抽出キットを使用（Ｇ−ＤＥＸＴＭＩＩｃ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ））を、ＥｔＢｒを含む２％アガロースゲルに電気泳動した（図７）。また、切断された形態のＰＡＲＰ分子を検出するために、細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動した後、ウェスタンブロット法を行った。トランスフェクションして２４時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞溶解緩衝液（５ｍＭ／Ｌ  ＥＤＴＡ；３００ｍＭ／Ｌ  ＮａＣｌ；０．１％ＮＰ−４０；０．５ｍＭ／Ｌ  ＮａＦ；０．５ｍＭ／Ｌ  Ｎａ３ＶＯ４；０．５ｍＭ／Ｌフッ化フェニルメチルスルホニル；及び１０μｇ／ｍＬの各アプロチニン、ペプスタチン及びロイペプチン(ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ)；Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて十分に溶解させた後、遠心分離機で５，０００×ｇ３０分間遠心分離を行い、上澄液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、メンブレインに移動させ、第１次抗体としてウサギ抗ＰＡＲＰ抗体を（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、第２次抗体として抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ社）を使用した。ＰＡＲＰ分子のシグナルを視角化するために、ケミルミネッセンス検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた後、Ｘ線フィルムに感光させ、現像した（図８）。その結果、ゲノムＤＮＡが一定の大きさに断片化されることが観察され（図７）、切断された形態のＰＡＲＰ蛋白質が検出されることにより（図８）、触媒抗体の過発現による細胞死の形態がアポトーシスであることを確認した。また、アポトーシス阻害剤であるｚ−ＶＡＤ（１０ｕＭ）を処理したとき、細胞生存率が回復し（図９及び図１０）、ゲノムＤＮＡの断片化が抑制されること（図１０）を観察することにより、細胞がアポトーシス機序により死ぬことを再確認した（図９〜図１１）。
【０１１０】
実験例４：３Ｄ８ｓｃＦｖのＤＮＡ分解活性の確認
ＨｅＬａ細胞から抽出したゲノムＤＮＡ３００ｎｇまたはプラズミドＤＮＡ３００ｎｇを、Ｍｇ２＋イオンを添加したＴＢＳ溶液で、多様な濃度（０．２５、２、５及び２５ｕｇ／ｍｌ）のバクテリアから精製された３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質と３７℃／１時間反応させた後、ＥｔＢｒを含む１％アガロースゲルに電気泳動した。その結果、３Ｄ８ｓｃＦｖの濃度に依存的にプラズミドのみならずゲノムＤＮＡに対して分解活性を示すことを確認した（図１２）。これは、癌細胞内に３Ｄ８ｓｃＦｖが発現した場合、癌細胞株のＤＮＡに損傷をもたらす可能性を表す結果である。
【０１１１】
実験例５：３Ｄ８ｓｃＦｖ自体の細胞内流入の確認
３Ｄ８ｓｃＦｖを細胞に処理したとき、自ら細胞内に流入することを共焦点顕微鏡法及びフローサイトメーターにより分析した（図１３及び図１４）。共焦点顕微鏡法において、ＨｅＬａ細胞を、滅菌したカバーガラスを入れた２４ウェルプレートのウェルに入れ（２×１０５細胞／ウェル）、２４時間培養した。２４時間後、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＴＯＭ培地にて交換し、３０分間静置した後、ウェルごとに１０ｍＭ処理し、一定時間培養した。培養後、細胞内に流入した３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を顕微鏡で観察するために、免疫蛍光染色を行った。すなわち、各ウェルから培地を除去した後、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ緩衝液で細胞を１回洗浄し、固定／透過溶液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）４００ｕｌを入れ、４℃で２０分間静置した。２％ＦＢＳを含むＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、３Ｄ８ｓｃＦｖ抗体を含むウサギ血清５００ｕｌ（１：５００で希釈）を入れ、室温にて６０分間反応させ、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。これに、蛍光物質ＴＲＩＲＣが共有結合した抗ウサギ抗体（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ緩衝液に１：５００で希釈）５００ｕｌを入れ、室温にて３０分間反応させ、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、４％ＰＦＡで室温にて２０分間固定した。用意したスライドガラスに核を青色に染色させる試薬であるＤＡＰＩ（４’−６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を含む固定溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３μｇ添加し、細胞が付着しているカバーガラスを覆った後、周辺を固定液で封じ、共焦点顕微鏡で細胞内の３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質（赤色蛍光）を観察した。その結果、３Ｄ８ｓｃＦｖを１０ｕＭの濃度で２時間処理したとき、ＨｅＬａ細胞の細胞質に自ら流入することが確認された（図１３）。
【０１１２】
３Ｄ８ｓｃＦｖの流入した細胞を定量化するために、フローサイトメトリーを行った（図１４）。ＨｅＬａ細胞株を６ウェルプレートのウェルに入れ（３×１０６細胞／ウェル）、２４時間培養した。２４時間後、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＴＯＭ培地にて交換し、３０分間インキュベーションし、ウェルごとに１０ｍＭ処理後、一定時間培養した。各ウェルから培地を除去した後、ＴＥ（Ｔｒｙｐｓｉｎｅ／ＥＤＴＡ）を処理して細胞を分離した後、ＰＢＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、固定／透過溶液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）４００ｕｌを入れ、４℃で２０分間静置した。ＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した後、１：５００で希釈した３Ｄ８ｓｃＦｖ抗体を含むウサギ血清５００ｕｌを入れ、氷に６０分間反応させ、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。また、１：５００で希釈した蛍光物質ＴＲＩＴＣが共有結合した抗ウサギ抗体を含む溶液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ緩衝液）５００ｕｌを入れ、氷に３０分間反応させ、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、４％ＰＦＡで室温にて２０分間固定した後、フローサイトメーターにより３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質が流入した細胞比率を分析した。その結果、ほぼ全ての細胞において３Ｄ８ｓｃＦｖが流入したことを確認した（図１４）。
【０１１３】
実験例６：３Ｄ８ｓｃＦｖの濃度と培養時間に応じた流入度の確認
３Ｄ８ｓｃＦｖの濃度と培養時間に応じた流入度を確認するために、共焦点顕微鏡法及び免疫蛍光フローサイトメトリーを行った（図１５〜図１８）。大体の実験過程は実験例５と同様である。濃度に応じた流入度を確認するために、ＨｅＬａ細胞に処理した３Ｄ８ｓｃＦｖの蛋白質の濃度を１、５、１０、または２０ｕＭ処理し、２時間後観察し（図１５及び図１６）、時間に応じた流入度を確認するために、１０ｕＭの３Ｄ８ｓｃＦｖを処理し、０．５、２、６、１２時間培養した後観察した（図１７及び図１８）。その結果、３Ｄ８ｓｃＦｖの濃度と培養時間に応じた細胞内への流入度が比例して現れることを確認した。
【０１１４】
実験例７：３Ｄ８ｓｃＦｖ流入後、時間に応じた細胞内分布様相の確認
３Ｄ８ｓｃＦｖ流入後、時間に応じた細胞内分布様相を確認するために、共焦点顕微鏡法を行った（図１９）。大体の実験過程は実験例５と同様である。３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質（１０ｕＭ）を３０分間ＨｅＬａ細胞に処理した後、０．５、２、１２、２４、４８時間後、共焦点顕微鏡で細胞を観察した結果、時間の経過に伴って細胞質に均一に分布し、核には位置しないことを確認した（図１９）。
【０１１５】
実験例８：３Ｄ８ｓｃＦｖの流入効率の確認
ＨｅＬａ細胞株を６ウェルプレートで２４時間培養後、ＴＯＭ培地において、３７℃、ＣＯ２インキュベータで３０分間培養した後、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を処理し（１０ｕＭ／２時間）、細胞から蛋白質を抽出し、ウェスタンブロット法により細胞内の流入効率を分析した（図２０）。ウェスタンブロット法は実験例３におけるのと同様の過程で行った。３Ｄ８ｓｃＦｖの流入効率は、精製された３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質のバンド強度と比較したイメージを数値化して％に換算した。その結果、３Ｄ８ｓｃＦｖを１０ｕＭの濃度で２時間処理したとき、処理した蛋白質の約３８％が細胞内に流入したことを確認した。
【０１１６】
実験例９：３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の流入時における細胞膜との相互作用分子の確認
３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の流入時、蛋白質が細胞膜の成分であるＨＳＰＧｓと相互作用するか否かを確認するために、共焦点顕微鏡法を行い（図２１）、大体の実験過程は実験例５と同様である。ＴＯＭ培地にて細胞を３０分間静置した後（３７℃、ＣＯ２インキュベータで）、ＨＳＰＧｓの競争的阻害剤である水溶性ヘパリン（１００Ｕ／ｍｌ）を３０分間前処理し、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質（１０ｕＭ）を処理した。３７℃、ＣＯ２インキュベータで２時間培養した後、共焦点顕微鏡により細胞内に流入する３Ｄ８ｓｃＦｖの程度を分析した。その結果、陰性対照として用いたトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）におけるのとは異なり、水溶性ヘパリン処理により３Ｄ８ｓｃＦｖの細胞内流入が完全に阻害されたことを確認した。これは、細胞内流入時、３Ｄ８ｓｃＦｖが細胞膜のＨＳＰＧｓとの相互作用を要することを示す結果である（図２１）。
【０１１７】
実験例１０：ＨｅＬａ細胞以外の他の癌細胞株における３Ｄ８ｓｃＦｖによる細胞毒性の確認
ＨｅＬａ細胞に３Ｄ８ｓｃＦｖを処理したときに細胞死が発生するが、このときのＥＣ５０値を確認するために、また、他の癌細胞株であるＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌細胞株）とＵ８７ＭＧ（ヒトグリオーマ細胞株）に対する３Ｄ８ｓｃＦｖの細胞毒性を確認するために、多様な濃度の３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を処理し、４８時間後、ＭＴＴアッセイを行った（図２２）。その結果、ＨｅＬａ、ＨＣＴ１１６及びＵ８７ＭＧ細胞においても、細胞毒性が３Ｄ８ｓｃＦｖの濃度に比例して増加することを確認した（図２２）。
【０１１８】
実験例１１：３Ｄ８ｓｃＦｖの細胞内流入によるリボ核酸（ＲＮＡ）損傷の確認
核酸加水分解活性がある３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質が細胞内に流入したとき、細胞内のＲＮＡ分解活性が維持されるか否か及びＲＮＡ基質特異性を分析するために、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ及びアガロースゲル電気泳動法を行った（図２３及び図２４）。ＦＲＥＴアッセイのために（図２３）、ＴＯＭ培地にて３０分間ＨｅＬａ細胞を静置した後（３７℃、ＣＯ２インキュベータで）、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質（１０ｕＭ）と２時間または２４時間培養した。これに、５’末端には蛍光物質ＦＡＭで、３’末端にはブラックホール消光剤（ｂｌａｃｋ−ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）で二重マークされた２４塩基長の合成ＲＮＡ断片を、リポフェクトアミン２０００を用いて細胞にトランスフェクションした後、蛍光検出器でリアルタイム（０−２時間まで）に蛍光強度を測定することにより、細胞内で３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質がＲＮＡ基質を分解するか否かを調査した。その結果、３Ｄ８ｓｃＦｖが細胞内に流入して２４時間経過した細胞においては、３Ｄ８ｓｃＦｖを流入させなかった陰性対照とは異なり、トランスフェクションされたＲＮＡ分子が分解されることを確認した（図２３）。一方、アガロースゲル電気泳動法においては（図２４）、ＴＯＭ培地にて３０分間ＨｅＬａ細胞を静置した後（３７℃、ＣＯ２インキュベータで）、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質（１０ｕＭ）と２時間培養し、ＨｅＬａ細胞からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをＥｔＢｒを含む４％または１％アガロースゲルに電気泳動するか、またはｃＤＮＡを合成した後、ＧＡＰＤＨまたはベータアクチン（β−ａｃｔｉｎ）遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、細胞内のＧＡＰＤＨとベータアクチンｍＲＮＡの発現程度を確認した。その結果、リボソーム蛋白質により蓄積されたｒＲＮＡに比べてｔＲＮＡとｍＲＮＡの損傷が顕著に観察された（図２４）。これは、癌細胞内に流入した３Ｄ８ｓｃＦｖがｔＲＮＡまたはｍＲＮＡの損傷を誘導して癌細胞の正常な代謝作用（ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）が行われず、癌細胞毒性を示す可能性を示唆している。
【０１１９】
実験例１２：正常細胞と癌細胞株における３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の毒性の比較
癌細胞株と正常細胞において３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質による毒性程度を調査するために、癌細胞株としてはＨｅＬａ細胞を、正常細胞としてはヒト乳房上皮細胞（入手先：Ｃａｍｂｒｅｘ社）を使用した（図２５及び図２６）。３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を正常乳房上皮細胞とＨｅＬａ癌細胞株に処理し、３７℃、ＣＯ２インキュベータで４８時間培養した後、ＭＴＴ溶液を入れ、４時間、３７℃、ＣＯ２インキュベータで反応させた後、培養液を除去し、ＤＭＳＯで懸濁した後、５９５ｎｍでＯＤ値を測定し（図２５）、このときの細胞の形状を位相差顕微鏡で観察した（図２６）。その結果、正常細胞に比べて癌細胞株で強い毒性を示していることを確認した。
【０１２０】
実験例１３：正常細胞と癌細胞株における３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の細胞内流入度の比較
癌細胞株と正常細胞における３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の細胞内流入度を調査するために、癌細胞朱としてはＨｅＬａ細胞を、正常細胞としてはヒト乳房上皮細胞（入手先：Ｃａｍｂｒｅｘ社）を使用し、正常細胞とＨｅＬａ癌細胞株に３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を処理し、２４時間培養した後、分析を行った（図２７〜図２９）。蛋白質の細胞内流入度は、免疫蛍光フローサイトメトリー（図２７）、ウェスタンブロット法（図２８）、及び共焦点蛍光顕微鏡（図２９）により分析された。免疫蛍光フローサイトメトリー及び共焦点顕微鏡法に対する大体の実験過程は実験例５と同様であり、ウェスタンブロット法に対する大体の実験過程は実験例３と同様であるが、３Ｄ８ｓｃＦｖ検出のために、ウサギ抗３Ｄ８ｓｃＦｖ血清及びアルカリ性ホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が結合した抗ウサギ抗体を使用し、反応基質としてＢＣＩＰ（３−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−５−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）を用いて発色を誘導した。その結果、３つの分析法の全てにおいて、癌細胞に比べて正常細胞内への蛋白質の流入が顕著に低いことを確認した（図２７〜図２９）。これは、３Ｄ８ｓｃＦｖによる癌細胞と正常細胞の細胞毒性の差が３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の細胞内流入の差に起因し得ることを示す結果である。
【０１２１】
実験例１４：正常肝細胞と肝臓癌細胞株表面のグリピカン３の発現程度の比較
肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２）と正常ヒト肝細胞（入手先：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／細胞由来情報：白人女性、１０歳）表面のグリピカン３の発現程度を細胞表面の抗グリピン３抗体で染色した後、フローサイトメトリーにより分析した。その結果、肝臓癌細胞では高いレベルで発現するのに対し、正常肝細胞では全く発現しないことを確認した（図３０）。また、これら２つの細胞間の３Ｄ８ｓｃＦｖの細胞内流入度を３Ｄ８ｓｃＦｖ処理後（２時間）、抗３Ｄ８ｓｃＦｖ抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析を行ったとき、グリピカン３を過発現するＨｅｐＧ２細胞における３Ｄ８ｓｃＦｖの細胞流入が非常に高いのに対し、正常肝細胞では３Ｄ８ｓｃＦｖがほとんど細胞内に流入しないことを確認した（図３１）。これは、グリピカン３が３Ｄ８ｓｃＦｖの細胞流入時に受容体として作用することを示唆する結果である。
【０１２２】
実験例１５：正常肝細胞と肝臓癌細胞株における３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の毒性の比較
肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２）と正常ヒト肝細胞（入手先：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／細胞由来情報：白人女性、１０歳）において３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質による毒性の程度を調査するために、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を正常肝細胞とＨｅｐＧ２肝臓癌細胞株に処理し、３７℃、ＣＯ2インキュベータで４８時間培養した後、ＭＴＴ溶液を入れ、４時間、３７℃、ＣＯ2インキュベータで反応させた。細胞培養にはコラーゲン（Ｒａｔ  Ｔａｉｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｔｙｐｅ１：ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｃａｔ．Ｎｏ．３５４２３６）が５０ｕｇ／ｍｌの濃度でコーティングされた９６ウェルプレートを用いた。４時間後、培養液を除去し、ＤＭＳＯを入れて撹拌した後、５９５ｎｍで吸光度を測定した（図３２及び図３３）。その結果、ＨｅｐＧ２細胞（図３２）に比べて正常肝細胞（図３３）で細胞死があまり発生しないことを確認した。また、３Ｄ８ｓｃＦｖ処理により細胞毒性の現れたＨｅｐＧ２細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動を行った結果、ＤＮＡの断片化が観察されることにより、アポトーシスが誘導されたことを確認した（図３４）。
【０１２３】
実験例１６：バクテリアから精製した３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質内の内毒素（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）含有度の調査
インビボマウスモデルにおける３Ｄ８ｓｃＦｖの抗癌活性を確認する前に、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質の精製過程中に汚染される内毒素の含有度を内毒素検出キット（Ｐｙｒｏｓａｔｅ  ｋｉｔ  ｃａｔ．ｎｏ  ＰＳＤ１０；Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ、Ｉｎｃ（ｗｗｗ．ａｃｃｉｕｓａ．ｃｏｍ））を用いて調査した。このキットの感受性は０．２５ＥＵ／ｍｌであり、原理は、蛋白質に内毒素が０．２５ＥＵ／ｍｌ以上の濃度で含有されている場合、指示液（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）がゲル状に変化することである。精製された３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質１ｕｇと指示液とを反応させた結果、ゲル化が発生せず、このため、精製された３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質１ｕｇには少なくとも０．２５ＥＵ／ｍｌ以上の内毒素は含有されていないことを確認した（図３５）。
【０１２４】
実験例１７：マウスモデルにおける３Ｄ８ｓｃＦｖの抗癌活性の観察
癌細胞活性を動物モデルで確認するために、ヒト肝臓癌細胞株（ＨｅｐＧ２）を５週齢のヌードマウスの右大腿部に皮下注射した（５×１０6  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  １００ｕｌ  ＰＢＳ／マウス）。このとき、陰性対照はＰＢＳを使用し、グループあたり８匹のマウスを用いた。注射した癌の大きさが約３００ｍｍ3に達したとき（９日目）、１日に１回ずつ、３日間で計３回、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質（６０ｕｇ  ３Ｄ８ｓｃＦｖ／２０ｇマウス）を癌に直接注射（ｉｎｔｒａ−ｔｕｍｏｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した後、３週間、３日間の間隔で癌細胞の容積をキャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）で測定した（図３６）。その結果、陰性対象群のマウスに比べて、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を注射したマウス群において明確な癌細胞増殖抑制効果を確認し、癌塊をマウスから摘出した際にも、３Ｄ８ｓｃＦｖ投与群において、３Ｄ８ｓｃＦｖ蛋白質を注射したマウス群よりも顕著に小さい癌塊を確認することができた（図３７）。
【０１２５】
実験例１８：肝臓癌患者（ＨＣＣ患者）から分離した肝臓癌細胞に対する３Ｄ８ｓｃＦｖの毒性の調査
肝臓癌患者から分離した肝臓癌組織をＰＢＳで洗浄した後、１ｍｍ3の大きさになるように細かく切った後、０．１％コラゲナーゼタイプＩＶ（Ｓｉｇｍａ社／ｃａｔ．ｎｏ  Ｃ−５１３８）を３７℃で３０分間処理した。これを４０ｎｍナイロンメッシュ（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ、ｃａｔ  ｎｏ．３５２３４０）に通過させ、組織の残渣を除去し、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、４℃、５分間）して細胞を採取した。採取された細胞に赤血球溶血液（１５０ｍＭ  ＮＨ4Ｃｌ、１ｍＭ  ＫＨＣＯ3、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２−７．４）を入れ、３７℃で５分間静置することにより赤血球を除去し、２０％ＦＢＳを含むＦ１２倍地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ、ｃａｔ  ｎｏ．３１７６５０３５）に浮遊させ、コラーゲン（Ｒａｔ  Ｔａｉｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｔｙｐｅ  １：ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｃａｔ．Ｎｏ．３５４２３６）が５０ｕｇ／ｍｌの濃度でコーティングされた９６ウェルプレートで培養した後、３Ｄ８ｓｃＦｖを４８時間処理し、ＭＴＴを用いて細胞生存率を測定した。その結果、５ｕＭ３Ｄ８ｓｃＦｖの処理においても、約９０％の肝臓癌細胞が死ぬことを確認することができた（図３８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２７】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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【図１７】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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