(57)【要約】本発明は、ＨＣＶ感染患者の試料からＨＣＶポリヌクレオチド配列をクローニングし、得られたレプリコンを薬物感受性について試験するのに有用な、新規なＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼレプリコンシャトルベクターを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）ＮＳ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の５’末端から、５’へ１０ヌクレオチドと、３’へ１０ヌクレオチドとの間に配置されたユニーク制限酵素配列；
（ｂ）ＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列；
（ｃ）ＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列の３’末端から、５’へ１０ヌクレオチドと、３’へ１０ヌクレオチドとの間に配置されたユニーク制限酵素配列；
（ｄ）ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列；
（ｅ）ＮＳ４Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｆ）ＮＳ４Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；
（ｇ）ＮＳ５Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；及び
（ｈ）ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列
をこの順番で含む、ＨＣＶポリヌクレオチド配列を含むＨＣＶレプリコンシャトルベクター。
【請求項２】
ＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列が、ＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインが機能しないように改変又は欠失されている、請求項１記載のＨＣＶレプリコンシャトルベクター。
【請求項３】
ＮＳ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の５’末端におけるユニーク制限酵素配列はＥｃｏＲＶを認識し、ＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列の３’末端におけるユニーク制限酵素配列はＡｓｉＳＩを認識する、請求項１又は請求項２記載のＨＣＶレプリコンシャトルベクター。
【請求項４】
配列番号３又は配列番号６から選択されるＨＣＶポリヌクレオチド配列を含むＨＣＶレプリコンシャトルベクター。
【請求項５】
被験体のＨＣＶ感染を制御するＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の効力を評価するための方法であって、以下の工程：
（ａ）ＨＣＶに感染した被験体から試料を提供する工程；
（ｂ）ユニーク制限酵素配列を含むセンス鎖プライマー、及び異なるユニーク制限酵素配列を含むアンチセンス鎖プライマーを用いて、試料中に存在する複数のＨＣＶ疑似種からＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅する工程：
（ｃ）前記のＰＣＲ増幅されたポリヌクレオチド配列をＨＣＶレプリコンシャトルベクターにクローニングすることにより、キメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを作製する工程；
（ｄ）前記のキメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを鎖状化し、前記の鎖状化されたポジティブミドをインビトロ転写にかけることにより、キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡを作製する工程；
（ｅ）Ｈｕｈ７細胞株を前記のＨＣＶレプリコンＲＮＡでトランスフェクトし、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で前記のＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製レベルを測定する工程
を含む方法。
【請求項６】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項１のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項５の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項２のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項５の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項３のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項５の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項４のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項５の方法。
【請求項１０】
被験体のＨＣＶ感染を制御するＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の効力を評価するための方法であって、以下の工程：
（ａ）ＨＣＶに感染した被験体から試料を提供する工程；
（ｂ）ＥｃｏＲＶを認識する制限酵素配列を含むセンス鎖プライマー、及びＡｓｉＳＩを認識する制限酵素配列を含むアンチセンス鎖プライマーを用いて、試料中に存在する複数のＨＣＶ疑似種からＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅する工程：
（ｃ）前記のＰＣＲ増幅されたポリヌクレオチド配列をＨＣＶレプリコンシャトルベクターにクローニングすることにより、キメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを作製する工程；
（ｄ）前記のキメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを鎖状化し、前記の鎖状化されたポジティブミドをインビトロ転写にかけることにより、キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡを作製する工程；
（ｅ）Ｈｕｈ７細胞株を前記のＨＣＶレプリコンＲＮＡでトランスフェクトし、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で前記のＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製レベルを測定する工程
を含む方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項１のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項１０の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項２のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項１０の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項３のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項５の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項４のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項５の方法。
【請求項１５】
被験体のＨＣＶ感染を制御するＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の効力を評価するための方法であって、以下の工程：
（ａ）ＨＣＶに感染した被験体から試料を提供する工程；
（ｂ）配列番号１１又は配列番号１２から選択されたヌクレオチド配列を含むセンス鎖プライマー、及び配列番号１３又は配列番号１４から選択されたヌクレオチドを含むアンチセンス鎖プライマーを用いて、試料中に存在する複数のＨＣＶ疑似種からＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅する工程：
（ｃ）前記のＰＣＲ増幅されたポリヌクレオチド配列をＨＣＶレプリコンシャトルベクターにクローニングすることにより、キメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを作製する工程；
（ｄ）前記のキメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを鎖状化し、前記の鎖状化されたポジティブミドをインビトロ転写にかけることにより、キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡを作製する工程；
（ｅ）Ｈｕｈ７細胞株を前記のＨＣＶレプリコンＲＮＡでトランスフェクトし、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で前記のＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製レベルを測定する工程
を含む方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項１のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項１５の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項２のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項１５の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項３のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項１５の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項４のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項１５の方法。
【請求項２０】
被験体のＨＣＶ感染を制御するＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の効力を評価するための方法であって、以下の工程：
（ａ）ＨＣＶに感染した被験体から試料を提供する工程；
（ｂ）ユニーク制限酵素配列を含むセンス鎖プライマー、及び異なるユニーク制限酵素配列を含むアンチセンス鎖プライマーを用いて、試料中に存在する複数のＨＣＶ疑似種からＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅する工程：
（ｃ）前記のＰＣＲ増幅されたポリヌクレオチド配列をＨＣＶレプリコンシャトルベクターにクローニングすることにより、キメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを作製する工程；
（ｄ）前記のポジティブミドを細胞内に形質転換することにより、複数の形質転換細胞のコロニーを作製する工程；
（ｅ）前記のコロニーをプールし、プールされたコロニーからキメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを単離する工程；
（ｆ）工程（ｅ）の前記キメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを鎖状化し、前記の鎖状化されたポジティブミドをインビトロ転写にかけることにより、キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡを作製する工程；
（ｇ）Ｈｕｈ７細胞株を前記のＨＣＶレプリコンＲＮＡでトランスフェクトし、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で前記ＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製レベルを測定する工程
を含む方法。
【請求項２１】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項１のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項２０の方法。
【請求項２２】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項２のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項２０の方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項３のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項２０の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項４のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項２０の方法。
【請求項２５】
被験体のＨＣＶ感染を制御するＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の効力を評価するための方法であって、以下の工程：
（ａ）ＨＣＶに感染した被験体から試料を提供する工程；
（ｂ）ＥｃｏＲＶを認識する制限酵素配列を含むセンス鎖プライマー、及びＡｓｉＳＩを認識する制限酵素配列を含むアンチセンス鎖プライマーを用いて、試料中に存在する複数のＨＣＶ疑似種からＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅する工程：
（ｃ）前記のＰＣＲ増幅されたポリヌクレオチド配列をＨＣＶレプリコンシャトルベクターにクローニングすることにより、キメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを作製する工程；
（ｄ）前記のポジティブミドを細胞内に形質転換することにより、複数の形質転換細胞のコロニーを作製する工程；
（ｅ）前記コロニーをプールし、プールされたコロニーからキメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを単離する工程；
（ｆ）工程（ｅ）の前記キメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを鎖状化し、前記の鎖状化されたポジティブミドをインビトロ転写にかけることにより、キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡを作製する工程；
（ｇ）Ｈｕｈ７細胞株を前記のＨＣＶレプリコンＲＮＡでトランスフェクトし、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で前記ＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製レベルを測定する工程
を含む方法。
【請求項２６】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項１のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項２５の方法。
【請求項２７】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項２のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項２５の方法。
【請求項２８】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項３のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項２５の方法。
【請求項２９】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項４のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項２５の方法。
【請求項３０】
被験体のＨＣＶ感染を制御するＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の効力を評価するための方法であって、以下の工程：
（ａ）ＨＣＶに感染した被験体から試料を提供する工程；
（ｂ）配列番号１１又は配列番号１２から選択されたヌクレオチド配列を含むセンス鎖プライマー、及び配列番号１３又は配列番号１４から選択されたヌクレオチドを含むアンチセンス鎖プライマーを用いて、試料中に存在する複数のＨＣＶ疑似種からＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅する工程：
（ｃ）前記のＰＣＲ増幅されたポリヌクレオチド配列をＨＣＶレプリコンシャトルベクターにクローニングすることにより、キメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを作製する工程；
（ｄ）前記のポジティブミドを細胞内に形質転換することにより、複数の形質転換細胞のコロニーを作製する工程；
（ｅ）前記コロニーをプールし、プールされたコロニーからキメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを単離する工程；
（ｆ）工程（ｅ）の前記キメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを鎖状化し、前記の鎖状化されたポジティブミドをインビトロ転写にかけることにより、キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡを作製する工程；
（ｇ）Ｈｕｈ７細胞株を前記のＨＣＶレプリコンＲＮＡでトランスフェクトし、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で前記ＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製レベルを測定する工程
を含む方法。
【請求項３１】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項１のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項３０の方法。
【請求項３２】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項２のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項３０の方法。
【請求項３３】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項３のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項３０の方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）のＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、請求項４のＨＣＶレプリコンシャトルベクターを含む、請求項３０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＣＶ及び他のフラビウイルスのプロテアーゼ阻害剤をスクリーニングし、試験し、評価するのに有用である、新規なＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼレプリコンシャトルベクターに関する。
【０００２】
Ｃ型肝炎は、世界中の主要な健康問題であり、また慢性肝疾患の第一原因でもある。（Boyer, N. et al. J. Hepatol. 2000 32:98-112）。ＨＣＶに感染した患者は、肝硬変、続いて肝細胞ガンを発症する危険性があり、従って、ＨＣＶは、肝移植の主要な適応症である。
【０００３】
世界保健機構によれば、世界中に２億人を超える感染個体があり、毎年、少なくとも３〜４百万人の人々が感染している。一度感染すると、約２０％の人はウイルスを排除するが、しかし残りの人は生涯にわたってＨＣＶを保有し得る。慢性感染個体の１０〜２０％が、最終的に、肝破壊性の肝硬変又は肝ガンを発症する。このウイルス疾病は、汚染した血液及び血液製剤、汚染した針により非経口的に、又は、感染した母体もしくは保菌者の母体からその子供へと性的及び垂直的に伝染する。現在のＨＣＶ感染処置は、組換え体のインターフェロンαを単独で、又はヌクレオシド類似体のリバビリンと併用する免疫療法に限られており、その臨床的利益は特に遺伝子型１に限られている。慢性ＨＣＶ感染を効果的に根絶する、改良された治療剤が早急に必要とされている。
【０００４】
ＨＣＶは、属であるフラビウイルス属、ペスチウイルス属、及びヘパシウイルス属（Ｃ型肝炎ウイルスを含む）を含む、フラビウイルス科のウイルスの一員として分類されている（Rice, C. M., Flaviviridae: The viruses and their replication, in: Fields Virology, Editors: Fields, B. N., Knipe, D. M., and Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa., Chapter 30, 931-959, 1996）。ＨＣＶは、約９．４ｋｂのポジティブのセンス鎖の一本鎖ＲＮＡゲノムを含む、エンベロープを有するウイルスである。このウイルスゲノムは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、約３０１１アミノ酸のポリタンパク質前駆体をコードしている長いオープンリーディングフレーム、及び短い３’ＵＴＲからなる。５’ＵＴＲは、ＨＣＶゲノムの中で最も高度に保存されている部分であり、ポリタンパク質の翻訳の開始及び制御に重要である。
【０００５】
ＨＣＶの遺伝子解析により、ＤＮＡ配列が３０％超の異なりを示す６つの主要な遺伝子型が同定された。各遺伝子型は、ヌクレオチド配列の２０〜２５％において多様性を示す、より密接に関連した一連のサブタイプを含んでいる（Simmonds, P. 2004 J. Gen. Virol. 85:3173-88）。３０を超えるサブタイプが識別されている。米国では、感染個体の約７０％が、１ａ型及び１ｂ型の感染を有している。１ｂ型はアジアにおいて最も流行しているサブタイプである（X. Forns and J. Bukh, Clinics in Liver Disease 1999 3:693-716; J. Bukh et al., Semin. Liv. Dis. 1995 15:41-63）。残念なことに、１型感染は、２型又は３型遺伝子型のいずれよりも、現在の療法に対する応答性が低いようである（N. N. Zein, Clin. Microbiol. Rev., 2000 13:223-235）。
【０００６】
ペスチウイルス及びヘパシウイルスのＯＲＦの非構造的タンパク質部分の遺伝子構成及びポリタンパク質のプロセシングは、非常に似ている。これらのポジティブ鎖ＲＮＡウイルスは、ウイルス複製に必要とされる全てのウイルスタンパク質をコードしている単一の大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有している。これらのタンパク質は、ポリタンパク質として発現され、これは、細胞及びウイルスの両方によりコードされるプロテイナーゼにより翻訳と同時か及び翻訳後にプロセシングされることにより、成熟ウイルスタンパク質を生成する。ウイルスゲノムＲＮＡの複製に関与するウイルスタンパク質は、カルボキシ末端側に位置している。ＯＲＦの３分の２が、非構造（ＮＳ）タンパク質と呼ばれている。ペスチウイルス及びヘパシウイルスの両方における、成熟非構造（ＮＳ）タンパク質は、非構造タンパク質コード領域のアミノ末端からＯＲＦのカルボキシ末端に向かって順番に、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂから構成されている。
【０００７】
ペスチウイルス及びヘパシウイルスのＮＳタンパク質は、特異的なタンパク質機能に特徴的である配列ドメインを共有している。例えば、両群のウイルスのＮＳ３タンパク質は、セリンプロテアーゼ及びヘリカーゼに特徴的なアミノ酸モチーフを有している（Gorbalenya et al. Nature 1988 333:22; Bazan and Fletterick Virology 1989 171:637-639; Gorbalenya et al. Nucleic Acid Res. 1989 17.3889-3897）。同様に、ペスチウイルス及びヘパシウイルスのＮＳ５Ｂタンパク質は、ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼに特徴的なモチーフを有している（Koonin, E. V. and Dolja, V. V. Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 1993 28:375-430）。
【０００８】
ペスチウイルス及びヘパシウイルスのＮＳタンパク質がウイルスの生活環において果たす実際の役割及び機能は、まさに類似している。どちらの場合においても、ＮＳ３セリンプロテアーゼは、ＯＲＦにおけるその位置の下流におけるポリタンパク質前駆体の全てのタンパク質分解プロセシングに関与している（Wiskerchen and Collett Virology 1991 184:341-350; Bartenschlager et al. J. Virol. 1993 67:3835-3844; Eckart et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1993 192:399-406; Grakoui et al. J. Virol. 1993 67:2832-2843; Grakoui et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993 90:10583-10587; Ilijikata et al. J. Virol. 1993 67:4665-4675; Tome et al. J. Virol. 1993 67:4017-4026）。どちらの場合においても、ＮＳ４Ａタンパク質は、ＮＳ３セリンプロテアーゼと共に補因子として作用している（Bartenschlager et al. J. Virol. 1994 68:5045-5055; Failla et al. J. Virol. 1994 68: 3753-3760; Xu et al. J Virol. 1997 71:53 12-5322）。両方のウイルスのＮＳ３タンパク質はまたヘリカーゼとしても機能している（Kim et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1995 215: 160-166; Jin and Peterson Arch. Biochem. Biophys. 1995, 323:47-53; Warrener and Collett J. Virol. 1995 69:1720-1726）。最後に、ペスチウイルス及びヘパシウイルスのＮＳ５Ｂタンパク質は、予測されているＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ活性を有している（Behrens et al. EMBO 1996 15:12-22; Lechmann et al. J. Virol. 1997 71:8416-8428; Yuan et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997 232:231-235; Hagedorn, PCT WO 97/12033; Zhong et al. J. Virol. 1998 72:9365-9369）。
【０００９】
ＨＣＶ ＮＳタンパク質３（ＮＳ３）は、大半のウイルス酵素を処理するのを助けるセリンプロテアーゼ活性を含み、従って、ウイルスの複製及び感染力にとって必須であると考えられている。黄熱病ウイルスのＮ３プロテアーゼの突然変異により、ウイルス感染力が低下することが知られている（Chambers et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:8898-8902）。ＮＳ３の最初の１８１アミノ酸（ウイルスポリタンパク質の１０２７〜１２０７残基）が、ＨＣＶポリタンパク質の４つ全ての下流部位をプロセシングする、ＮＳ３のセリンプロテアーゼドメインを含むことが示された（Lin et al., J. Virol. 1994 68:8147-8157）。ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼ及びその関連する補因子であるＮＳＡ４Ａは、全てのウイルス酵素のプロセシングを助け、従って、ウイルス複製に必須であると考えられている。このプロセシングは、ヒト免疫不全ウイルスのアスパルチルプロテアーゼ（これもまた、ウイルス酵素のプロセシングに関与している）により行なわれるプロセシングに類似しているようである。ウイルスタンパク質のプロセシングを阻害するＨＩＶプロテアーゼ阻害剤は、ヒトにおける強力な抗ウイルス剤であり、このことから、ウイルス生活環のこの段階を阻害することにより、治療に有効な薬剤が得られることが示唆される。結果として、それは薬物を発見するための魅力的な標的である。
【００１０】
現在、ＨＣＶ感染の処置に現在利用可能である認可されている治療法の数は少ない。ＨＣＶの処置及びＨＣＶ ＮＳ５Ｂポリメラーゼの阻害のための新規及び既存のアプローチが概説されている：R. G. Gish, Sem. Liver. Dis., 1999 19:5; Di Besceglie, A. M. and Bacon, B. R., Scientific American, October: 1999 80-85; G. Lake-Bakaar, Current and Future Therapy for Chronic Hepatitis C Virus Liver Disease, Curr. Drug Targ. Infect Dis. 2003 3(3):247-253; P. Hoffmann et al., Recent patents on experimental therapy for hepatitis C virus infection (1999-2002), Exp. Opin. Ther. Patents 2003 13(11):1707-1723; F. F. Poordad et al. Developments in Hepatitis C therapy during 2000-2002, Exp. Opin. Emerging Drugs 2003 8(1):9-25; M. P. Walker et al., Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis C, Exp. Opin. Investig. Drugs 2003 12(8):1269-1280; S.-L. Tan et al., Hepatitis C Therapeutics: Current Status and Emerging Strategies, Nature Rev. Drug Discov. 2002 1:867-881; R. De Francesco et al. Approaching a new era for hepatitis C virus therapy: inhibitors of the NS3-4A serine protease and the NS5B RNA-dependent RNA polymerase, Antiviral Res. 2003 58:1-16; Q. M. Wang et al. Hepatitis C virus encoded proteins: targets for antiviral therapy, Drugs of the Future 2000 25(9):933-8-944; J. A. Wu and Z. Hong, Targeting NS5B-Dependent RNA Polymerase for Anti-HCV Chemotherapy Cur. Drug Targ.-Inf. Dis .2003 3:207-219。
【００１１】
ウイルスのゲノム構成及びウイルスタンパク質の機能の解明が進展したにも関わらず、ＨＣＶ複製及び病気発生の基本的な局面は依然として不明である。ＨＣＶの複製を実験的に行なう上での大きな挑戦は、感染性ウイルス粒子の産生を行なえる有効な細胞培養系がないことである。一次細胞培養及び特定のヒト細胞株の感染が報告されているが、このような系で産生されるウイルスの量及びＨＣＶ複製のレベルは低すぎて、詳細な分析が行なえない。
【００１２】
ヒト肝細胞腫の細胞株Ｈｕｈ-７において最低の効率で複製する選択可能なサブゲノムＨＣＶ ＲＮＡの作製が報告されている。Lohman et alは、タンパク質コード領域のＣ−ｐ７又はＣ−ＮＳ２領域を欠失させることにより、クローニングされた全長ＨＣＶコンセンサスゲノム（遺伝子型１ｂ）から誘導されたレプリコン（Ｉ３７７/ＮＳ３−３’）の作製を報告した（Lohman et al., Science 1999 285: 110-113）。このレプリコンは、以下のエレメントを含んでいた：（ｉ）キャプシドコード領域の１２アミノ酸に融合したＨＣＶ５’−ＵＴＲ；（ｉｉ）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＰＴＩＩ）；（ｉｉｉ）ＮＰＴＩＩ遺伝子の下流に挿入され、ＨＣＶタンパク質ＮＳ２又はＮＳ３からＮＳ５Ｂまでの翻訳を指令する、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳ、及び（ｉｖ）３’−ＵＴＲ。Ｈｕｈ−７細胞のトランスフェクション後、ＨＣＶ ＲＮＡの複製を支持する細胞のみが、ＮＰＴＩＩタンパク質を発現し、薬物４１８に対する耐性を示した。このようなＧ４１８耐性コロニーから得られた細胞株は、かなりのレベルのレプリコンＲＮＡ及びウイルスタンパク質を含んでいたが、トランスフェクトされた１０６個のＨｕｈ−７細胞の中でＨＣＶ複製を支持していたのは唯１個であった。
【００１３】
類似の選択可能なＨＣＶレプリコンが、ＨＣＶ-Ｈ遺伝子型１ａ感染性クローンに基づいて作製された（Blight et al., Science 2000 290:1972-74）。ＨＣＶ−Ｈ由来レプリコンは、効率的なＨＣＶ複製を確立できなかった。このことから、もっと以前に作製された前記のLohmann (1999)のレプリコンは、そのような実験で使用された特定の遺伝子型１ｂのコンセンサスｃＤＮＡクローンに依存していたことが示唆される。前記のBlight et al.は、ＰＣＲに基づいた遺伝子アセンブリ手順を行なうことにより、前記のLohmann (1999)により作製されたレプリコンの構造物を再現し、Ｇ４１８耐性Ｈｕｈ-７細胞コロニーを得た。独立したＧ４１８耐性細胞クローンをシークエンスすることにより、高いレベルのＨＣＶ複製には、宿主細胞に対するレプリコンの適応が必要とされるかどうかを判定した。ＨＣＶ非構造タンパク質ＮＳ５Ａ中にクラスター形成する、複数の独立した適合突然変異が同定された。付与される突然変異により、インビトロでの複製能力は増強され、形質導入効率は、トランスフェクトされた細胞の０．２％〜１０％であり、これに対して、当技術分野においてより以前に作製されたレプリコンでは、例えば、Ｉ３７７/ＮＳ３−３’レプリコンの形質導入効率は０．０００１％であった。
【００１４】
本発明は、ユニーク制限酵素部位が、ＮＳ３遺伝子のプロテアーゼドメインの５’及び３’末端に導入されているため、ＨＣＶ感染患者の試料から得られたＮＳ３プロテアーゼ配列をシャトルベクターにクローニングすることができ、得られたレプリコンを、複製適応度及びＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤に対する感受性について評価することができるような、新規なＨＣＶレプリコンシャトルベクターの開発を特徴とする。個々のＨＣＶ感染患者は、典型的には、ＮＳ５Ｂ ＲＮＡポリメラーゼのエラー頻度の高さから、遺伝子的に多様なウイルス集団を含んでいるため、本発明のシャトルベクターの使用により、特定の患者由来のＮＳ３プロテアーゼ変異体の特徴、及び、薬物処理に対するこれらの変異体の感受性又は耐性を明らかにできるだろう。
【００１５】
従って、本発明は、ＮＳ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の５’末端から５’へ１０ヌクレオチドと、３’へ１０ヌクレオチドとの間に配置されたユニーク（unique）制限酵素配列；ＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列；ＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列の３’末端から、５’へ１０ヌクレオチドと、３’へ１０ヌクレオチドとの間に配置されたユニーク制限酵素配列；ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列；ＮＳ４Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；ＮＳ４Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；ＮＳ５Ａタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列；ＮＳ５Ｂタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をこの順番で含む、ＨＣＶポリヌクレオチド配列を含むＨＣＶレプリコンシャトルベクターを提供する。本発明の１つの態様において、ＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、ＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインが機能しないように改変又は欠失されている。
【００１６】
本発明の別の態様において、ＮＳ３タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の５’末端におけるユニーク制限酵素配列は、ＥｃｏＲＶを認識し、ＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列の３’末端におけるユニーク制限酵素配列はＡｓｉＳＩを認識する。本発明の更に別の態様において、ＨＣＶレプリコンシャトルベクターは、配列番号３又は配列番号６から選択されたＨＣＶポリヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
本発明の更なる態様は、ＨＣＶに感染した被験体から試料を得る工程、ユニーク制限酵素配列を含むセンス鎖プライマー、及び異なるユニーク制限酵素配列を含むアンチセンス鎖プライマーを用いて、試料中に存在する複数のＨＣＶ疑似種からＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅する工程、前記のＰＣＲ増幅されたポリヌクレオチド配列をＨＣＶレプリコンシャトルベクターにクローニングすることにより、キメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを作製する工程、前記のキメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを鎖状化し、前記の鎖状化されたポジティブミドをインビトロ転写にかけることにより、キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡを作製する工程、及び、Ｈｕｈ７細胞株を前記のＨＣＶレプリコンＲＮＡでトランスフェクトし、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で前記のＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製レベルを測定する工程を含む、被験体のＨＣＶ感染を制御するＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の効力を評価するための方法を提供する。
【００１８】
本発明の他の更なる態様は、ＨＣＶに感染した被験体から試料を得る工程、ユニーク制限酵素配列を含むセンス鎖プライマー、及び異なるユニーク制限酵素配列を含むアンチセンス鎖プライマーを用いて、試料中に存在する複数のＨＣＶ疑似種からＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインをコードするポリヌクレオチド配列をＰＣＲ増幅する工程、前記のＰＣＲ増幅されたポリヌクレオチド配列をＨＣＶレプリコンシャトルベクターにクローニングすることにより、キメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを作製する工程、前記のポジティブミドを細胞内に形質転換することにより、複数の形質転換細胞のコロニーを作製する工程、前記のコロニーをプールし、プールされたコロニーからキメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを単離する工程、前記キメラＨＣＶレプリコンポジティブミドを鎖状化し、前記の鎖状化されたポジティブミドをインビトロ転写にかけることにより、キメラＨＣＶレプリコンＲＮＡを作製する工程、及び、Ｈｕｈ７細胞株を前記のＨＣＶレプリコンＲＮＡでトランスフェクトし、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の存在下又は非存在下で前記ＨＣＶレプリコンＲＮＡの複製レベルを測定する工程を含む、被験体のＨＣＶ感染を制御するＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の効力を評価するための方法を提供する。
【００１９】
本発明の前記及び他の利点及び特徴、並びに、それを達成するための方法は、例示的な態様を示す添付の実施例と併せて、以下の本発明の詳細な説明を考慮すればより容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ＨＣＶレプリコンシャトルベクターの成分の図解である。
【図２】図２は、ＮＳ３プロテアーゼレプリコンシャトルベクター（Ａ）pSC_1b_NS3/プロテアーゼ_EcoRV_AsiSI（配列番号３）；（Ｂ）pSC_1b_NS3/プロテアーゼ/LacZ_EcoRV_AsiSI（配列番号６）のポジティブミド図を示す。
【図３】図３は、pSC_1b_NS3/プロテアーゼ_EcoRV_AsiSI、並びに、ＨＣＶ遺伝子型１ａ又は遺伝子型１ｂに由来する患者由来のＮＳ３プロテアーゼを含むレプリコンの複製能を示す。ＲＬＵは、トランスフェクションから９６時間後に観察されたホタルルシフェラーゼシグナルのレベルを示す。
【００２１】
本発明で使用される用語は、以下に定義されている。
【００２２】
用語「ＨＣＶレプリコン」とは、自分自身のコピーの作製を指令することのできる、Ｃ型肝炎ウイルス由来の核酸のことをいう。本明細書で使用される用語「レプリコン」には、ＲＮＡ並びにＤＮＡ、及びそのハイブリッドが含まれる。例えば、ＨＣＶレプリコンを構成する一本鎖ＲＮＡ転写物を作製するために、二本鎖ＤＮＡ形のＨＣＶゲノムを使用することができる。ＨＣＶレプリコンには、完全長ＨＣＶゲノム、又はＨＣＶサブゲノム構造物（これは「サブゲノムレプリコン」とも呼ばれる）が含まれ得る。例えば、本明細書で記載されたＨＣＶのサブゲノムレプリコンは、ウイルスの非構造タンパク質に関する遺伝子の大半を含んでいるが、構造タンパク質をコードする遺伝子の大半を欠失している。サブゲノムレプリコンは、ウイルスサブゲノムの複製、サブゲノムレプリコンの複製に必要な、全てのウイルス遺伝子の発現を、ウイルス粒子を産生することなく、指令することができる。
【００２３】
基本的なＨＣＶレプリコンは、ＨＣＶ５’非翻訳（ＵＴＲ）領域、ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質コード領域、及びＨＣＶ３’−ＵＴＲを含む、サブゲノム構造物である。他の核酸領域、例えば、ＨＳＣ ＮＳ２、ＨＣＶ構造タンパク質、及び非ＨＣＶ配列などの領域も存在し得る。
【００２４】
ＨＣＶ５’−ＵＴＲ領域は、タンパク質翻訳のための内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び複製に必要とされるエレメントを提供する。ＨＣＶ５’−ＵＴＲ領域は、ＨＣＶコアコード領域中内に約３６ヌクレオチド伸長している天然ＨＣＶ５’−ＵＴＲ、及びその機能的誘導体を含む。５’−ＵＴＲ領域は、選択タンパク質、リポータータンパク質、又はＨＣＶポリタンパク質をコードする配列より下流の部位などの様々な位置に存在し得る。
【００２５】
ＨＣＶ５’−ＵＴＲ−ＰＣ領域の他に、レプリコン内には非ＨＣＶ ＩＲＥＳエレメントが存在していてもよい。非ＨＣＶ ＩＲＥＳエレメントは、ＨＣＶポリタンパク質をコードしている領域のすぐ上流を含め、様々な位置に存在し得る。使用できる非ＨＣＶ ＩＲＥＳエレメントの例は、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ポリオウイルスＩＲＥＳ、及びウシウイルス性下痢症ウイルスＩＲＥＳである。
【００２６】
ＨＣＶ３’−ＵＴＲは、ＨＣＶの複製を補助する。ＨＣＶ３’ＵＴＲは、天然ＨＣＶ３’−ＵＴＲ及びその機能的誘導体を含む。天然３’−ＵＴＲは、ポリＵトラクト及び約１００ヌクレオチドの追加領域を含む。
【００２７】
ＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質コード領域は、細胞中で様々なタンパク質へとプロセシングされ得るポリタンパク質を提供する。適切なＮＳ３−ＮＳ５Ｂポリタンパク質配列（レプリコンの一部であってもよい）には、ＮＳ３−ＮＳ５Ｂのプロセシングにより機能的な複製機械を生じるような、様々なＨＣＶ株に存在する配列及びその機能的等価体が含まれる。適切なプロセシングは、例えば、ＮＳ５Ｂ ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをアッセイすることにより測定することができる。
【００２８】
「ベクター」は、ポジティブミド、ファージ、又はコスミドなどのＤＮＡ片に別の一片のＤＮＡセグメントが付着し得、これにより、付着したＤＮＡセグメントの複製、発現、又は組込みがもたらされるような、前記ＤＮＡ片である。「シャトルベクター」は、ＤＮＡセグメントを、ベクター内の特定の制限酵素部位に挿入、又は同部位から切り出すことができるベクターのことをいう。シャトルベクターに挿入されたＤＮＡセグメントは、一般に、対象のポリペプチド又はＲＮＡをコードしており、この制限酵素部位は、転写及び翻訳のためにＤＮＡセグメントが適切なリーディングフレーム内に確実に挿入されるように設計されている。
【００２９】
様々なベクターを使用して、核酸分子を発現させることができる。このようなベクターには、染色体、エピソーム、及びウイルスに由来するベクター、例えば、細菌性ポジティブミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来（酵母人工染色体を含む）、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクターが含まれる。ベクターはまた、これらの供給源の組合せ、例えばポジティブミドとバクテリオファージ遺伝的エレメントに由来するベクター、例えば、コスミドとファージミドに由来し得る。原核宿主及び真核宿主に適切なクローニングベクター及び発現ベクターは、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USAに記載されている。
【００３０】
適切な核酸分子を含むベクターを、公知の技術を使用して増殖又は発現させるための適切な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞には、細菌細胞（これには、大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセス（Streptomyces）、及びサルモネラ菌（Salmonella typhimurium）が含まれるがこれに限定されるわけではない）、真核細胞（これには、酵母、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Drosophila）、動物細胞、例えば、Ｈｕｈ−７、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＭＴ−２Ｔ、ＣＥＭ−ＳＳ、及びＣＨＯ細胞、及び植物細胞が含まれるがこれに限定されるわけではない）が含まれ得る。
【００３１】
ベクターには、一般に、組換えベクター構造物を含む細胞の部分集団の選択を可能とする、選択マーカーが含まれる。マーカーは、本明細書で記載された核酸分子を含む同ベクターに含まれてもいても、又は、別のベクター上にあってもよい。マーカーには、原核宿主細胞ではテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子、真核宿主細胞ではジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性遺伝子が含まれる。しかしながら、表現型形質について選択性を与える任意のマーカーが有効であろう。
【００３２】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」は、一般に、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドのことをいい、これは、修飾されていないＲＮＡ又はＤＮＡであっても修飾されているＲＮＡ又はＤＮＡであってもよい。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖と二本鎖領域の混合したＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖と二本鎖領域の混合したＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖であり得るか、又は一本鎖と二本鎖領域の混合したＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるがこれに限定されるわけではない。更に、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む、３本鎖領域のことをいう。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短いポリヌクレオチドも包含し、これはオリゴヌクレオチドとも呼ばれる。
【００３３】
更に、用語「ＤＮＡ分子」は、分子の一次構造及び二次構造だけのことをいい、任意の特定の３次元形態に限定されない。従って、この用語には、とりわけ鎖状ＤＮＡ分子（例えば制限酵素断片）、ウイルス、ポジティブミド、及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論する際に、本明細書では、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’の配列だけを示すという通常の慣例に従って、配列が記載され得る。
【００３４】
「ＲＮＡ分子」は、その一本鎖形態又は二本鎖ヘリックス形態におけるリボヌクレオチドの多量体形態のことをいう。特定のＲＮＡ分子の構造を議論する際に、本明細書では、５’から３’に配列を示すという通常の慣例に従って、配列が記載され得る。
【００３５】
用語「制限酵素配列」は、細菌酵素により認識され切断される特定の二本鎖ＤＮＡ配列のことをいい、その酵素の各々が、特定のヌクレオチド配列において又はその配列の近くにおいて二本鎖ＤＮＡを切断する。制限酵素「ＥｃｏＲＶ」は、配列
【表１】
2011505159.tif 000002
を認識し、指定されたヌクレオチド位置
【表２】
2011505159.tif 000003
において二本鎖ＤＮＡを切断する。制限酵素「ＡｓｉＳＩ」は、配列
【表３】
2011505159.tif 000004
を認識し、認識配列上のＴ残基の後を切断する。
【００３６】
本明細書で使用された用語「プライマー」は、ＲＮＡ又はＤＮＡであり、一本鎖又は二本鎖であり、生物系に由来するか、制限酵素による消化により作製されるか、又は、合成的に作製された、オリゴヌクレオチドのことをいい、これは適切な環境に置かれると、鋳型依存性核酸合成の開始剤として機能的に作用することができる。適切な核酸鋳型、適切な核酸のヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補因子、及び条件（例えば適切な温度及びｐＨ）が提示されると、ポリメラーゼまたは類似の活性の作用によるヌクレオチドの付加によりその３’末端においてプライマーが伸長されて、プライマー伸長産物が生成される。プライマーは、適用される具体的な条件及び必要条件に応じて長さを変更してもよい。例えば、ＰＣＲ反応では、プライマーは、典型的には、１５〜２５ヌクレオチド長又はそれ以上の長さである。プライマーは、所望の伸長産物の合成を開始させるためには、所望の鋳型に対して十分な相補性を有していなければならない、すなわち、ポリメラーゼ又は類似の酵素による合成の開始に使用するためにプライマーの３’−ヒドロキシル部分が適切に並置されるように、所望の鋳型鎖と十分にアニーリングできなければならない。プライマー配列が、所望の鋳型に対して正確な相補性を示す必要はない。例えば、非相補性ヌクレオチド配列（例えば、制限酵素認識配列）を、他の点では相補的なプライマーの５’末端に付着させてもよい。又は、プライマー配列が、所望の鋳型鎖の配列に対して十分な相補性を有しており、これにより伸長産物の合成のための鋳型−プライマー複合体が機能的であるならば、非相補性塩基がオリゴヌクレオチドプライマー配列内に散在されていてもよい。
【００３７】
本明細書で使用された用語「キメラ」は、共に融合又はスプライシングされた２つ以上の異なる供給源のＤＮＡから得られたＤＮＡ分子を意味する。
【００３８】
本明細書で使用した「疑似種（quasispecies）」は、優性ＨＣＶゲノム配列（すなわち遺伝子型）の微小変異体の集合体を意味し、該微小変異体は、ＨＣＶ複製中の高い突然変異率の結果として、１つの感染被験体において、又は更には単一の細胞クローンにおいて形成されている。
【００３９】
本明細書で使用した「被験体」とは、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーのことをいい、これには、げっ歯類、ウサギ、トガリネズミ、及び霊長類（ヒトを含む）が含まれるがこれに限定されるわけではない。
【００４０】
用語「試料」は、被験体から単離された組織又は液体の試料のことをいい、これには、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸管及び尿生殖器の外部切片、涙液、唾液、乳汁、血球、腫瘍、臓器、及びまた、インビトロの細胞培養構成成分の試料（これには、培養細胞の増殖から得られた馴化培地、推定ウイルス感染細胞、組換え細胞、及び細胞成分が含まれるがこれに限定されるわけではない）が含まれるがこれに限定されるわけではない。
【００４１】
外来性又は異種性ＤＮＡ又はＲＮＡが細胞内に導入された時、そのような外来性又は異種性ＤＮＡ又はＲＮＡにより細胞が「形質転換」又は「トランスフェクト」される。形質転換又はトランスフェクトするＤＮＡ又はＲＮＡは、細胞のゲノムを構成している染色体ＤＮＡに組み込まれていても（共有結合していても）組み込まれていなくてもよい。例えば、原核細胞、酵母、及び哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡは、ポジティブミドなどのエピソームエレメント上に維持されていてもよい。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞とは、形質転換ＤＮＡが染色体中に組み込まれ、これによりそのＤＮＡが染色体の複製を通じて娘細胞に遺伝されるような細胞である。この安定性は、真核細胞が、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集合からなる細胞株又はクローンを確立できることにより実証される。本発明に記載したような哺乳動物細胞を形質転換するＨＣＶレプリコンの場合、ＲＮＡ分子、例えばＨＣＶ ＲＮＡ分子は、半自律的に複製する能力を有する。ＨＣＶレプリコンを有するＨｕｈ−７細胞は、レプリコン上に存在する選択マーカー又はリポーター遺伝子の存在により検出される。
【００４２】
「クローン」は、一般的に有糸分裂の過程により、単一細胞又はコンセンサスの祖先から得られた細胞集団のことをいう。
【００４３】
実施例
以下の調製物及び実施例は、当業者が、本発明をより明瞭に理解でき実践できるようにするために記載されている。それらは本発明を制限するものと捉えるべきではなく、単なる説明及び例示と捉えるべきである。
【００４４】
実施例１
ポジティブミドの作製
ＮＳ３プロテアーゼレプリコンシャトルベクターは、ＨＣＶ ＮＳ３レプリコンシャトルベクターpSC_1b_NS3_EcoRV_XbaIの作製に使用される中間体ベクターである、ＨＣＶレプリコンシャトルベクターpSC_1b_NS3_EcoRVから得られ、これは、２００７年９月２７日に提出された題名「ＨＣＶ ＮＳ３レプリコンシャトルベクター」のChua et al.による米国特許出願USSN 60/995,558に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。レプリコンシャトルベクターの成分が図１に示されており、これには５’−ＵＴＲから、ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂタンパク質、及び３’−ＵＴＲまでのＨＣＶポリヌクレオチド配列が含まれている。該ベクターはまた、ポリオウイルス内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が含まれており、これはホタルルシフェラーゼ遺伝子の翻訳を制御する。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の下流にある、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来のＩＲＥＳは、ＨＣＶ非構造遺伝子（ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、及びＮＳ５Ｂ）の翻訳を制御する。
【００４５】
クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を使用して製造業者の指示に従って、突然変異をpSC_1b_NS3_EcoRV_XbaIに導入した。ＮＳ３遺伝子のプロテアーゼドメインの３’末端（アミノ酸位置Ｓｅｒ１８１に相当）にＡｓｉＳＩ制限酵素配列を導入するために、以下のプライマーを使用した：
【表４】
2011505159.tif 000005
これらの突然変異は、ＮＳ３タンパク質のアミノ酸コード配列を変化させず、これにより、ＮＳ３プロテアーゼシャトルベクターpSC_1b_NS3/プロテアーゼ_EcoRV_AsiSI（配列番号３、図２Ａ）が作製された。ＮＳ３遺伝子のプロテアーゼドメインをコードする配列を、ｐＵＣ１９（GenBankアクセッション番号Ｍ７７７８９）由来のβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）コード配列により置換することにより、別のＮＳ３プロテアーゼレプリコンシャトルベクターが作製された。ｌａｃＺ遺伝子の５’末端にＥｃｏＲＶ制限部位を、３’末端にＡｓｉＳＩ制限部位を、以下のプライマー
【表５】
2011505159.tif 000006
を使用してＰＣＲ増幅により導入し、ベクターpSC_1b_NS3/プロテアーゼ/LacZ_EcoRV_AsiSI（配列番号６、図２Ｂ）を作製した。
【００４６】
ＮＳ３プロテアーゼレプリコンシャトルベクターの複製能は、実施例３に記載した（及び図３に示した）表現型アッセイを使用して評価した。
【００４７】
実施例２
感染患者から増幅させたＮＳ３プロテアーゼドメインＰＣＲ試料の、ＮＳ３プロテアーゼレプリコンシャトルベクターへのクローニング
ＮＳ３遺伝子のプロテアーゼドメインをコードするＤＮＡ配列を、SuperScript IIIシステム（Invitrogen）を使用して製造業者のプロトコルに従って、ＨＣＶ遺伝子型１ａ及び遺伝子型１ｂに感染した患者から得られた血漿由来のＲＮＡの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により作製した。このＲＴ−ＰＣＲ工程に使用されたプライマーは、以下の通りであった：
【表６】
2011505159.tif 000007
【００４８】
最初に５０℃でアニーリングが行なわれ、その後、９４℃での変性、５３℃でのアニーリング、及び６８℃での伸長というＰＣＲサイクルが行なわれた。その後、増幅産物を、Phusion（商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼシステム（New England Biolabs）を用いて、ＮＳ３タンパク質のプロテアーゼドメインの５’及び３’末端にユニーク制限酵素配列を導入するプライマーを使用して２回目のＰＣＲにかけた。患者のＮＳ３遺伝子配列の５’末端近辺にＥｃｏＲＶ制限酵素配列を導入するために使用されるセンスプライマーは、以下の通りであった：
【表７】
2011505159.tif 000008
【００４９】
ＮＳ３遺伝子配列のプロテアーゼドメインの３’末端（アミノ酸位置Ｓｅｒ１８１に相当する）近辺にＡｓｉＳＩ制限酵素配列を導入するために使用されるアンチセンスプライマーは、以下の通りであった：
【表８】
2011505159.tif 000009
【００５０】
９８℃での変性、５３℃でのアニーリング、７２℃での伸長を含むＰＣＲサイクルにより増幅を行なった。次いで、増幅された患者のＮＳ３プロテアーゼＤＮＡを、Qiagen PCR精製カラムを使用して精製し、ＥｃｏＲＶ及びＳｇｆＩ（ＡｓｉＳＩのイソ制限酵素）を用いて消化した。
【００５１】
ＮＳ３プロテアーゼシャトルレプリコンベクターpSC_1b_NS3/プロテアーゼ_EcoRV_AsiSI又はpSC_1b_NS3/プロテアーゼ/LacZ_EcoRV_AsiSIを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ及びＳｇｆＩによる二重の消化により調製した。２５ngのシャトルベクターを、１６℃で１．５時間かけてMightMixライゲーションキット（Takara Bio Inc.）を使用して、消化された患者のアンプリコンとライゲートした。１：２から１：４のベクターと挿入断片の比が慣例的に使用された。５μlの反応液を、５０μlのTop10セル（Invitrogen）中に形質転換し、３７℃での１時間の表現型発現後に播種した。
【００５２】
９６個の独立したコロニーを拾い上げて、５０μg/mlのアンピシリンを補充した２００μlのテリフィック培地（ＴＢ）に接種した。この「ストック」９６穴プレートを３７℃で一晩インキュベートした。次の日、このプレートを使用することによりレプリカプレートを調製した。４８ピンスタンプを使用して、１００μg/mlのカルベニシリンを補充した２枚のＬＢプレートにレプリカ平板培養した。９６個の個々の２００μlの培養液もまた、５０μg/mlのアンピシリンの補充された１．５mlのＴＢ培養液に移され、ＤＮＡ調製のために使用された。３７℃で一晩インキュベートした後、レプリカプレートを、６mlのＬＢと共に広げて、９６クローンの異種のプールを得て、これを使用してＤＮＡのミニ調製を行なった。次いで、このＤＮＡ患者プールをその後のレプリコン表現型アッセイに使用した。３７℃で一晩振とうした後、９６個の個々の１．５mlのＴＢ培養液を遠心分離器で沈殿させ、デカントし、ポジティブミドＤＮＡをQiagen’s Qiaprep 96 Turbo Mini-DNAキットを使用して抽出した。レプリコン表現型アッセイに使用される複合性９６プールに相当するこれらの個々の分子クローンを、シークエンス反応に使用した。
【００５３】
異種クローンプールポジティブミドＤＮＡ又は個々の分子クローンをシークエンスにかけることにより、患者試料の同一性を確認、及び表現型レプリコンアッセイにおける阻害剤に対する感受性を調べた。
【００５４】
実施例３
表現型レプリコンアッセイ
Ａ．インビトロで転写されたＲＮＡの調製
５μgのＤＮＡポジティブミドを、ＳｃａＩ制限酵素（Roche）により鎖状化した。３７℃で一晩消化した後、ＤＮＡを、Qiagen PCR精製キットを使用して精製した。１μgの鎖状ＤＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってT7 RiboMAX Express（Promega）を使用してインビトロでの転写に使用した。３７℃で２時間インキュベートした後、ＤＮａｓｅでの処理を３７℃で３０分間行なうことにより、ＤＮＡ鋳型を除去した。その後、インビトロで転写されたＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってRNeasy spin column（Qiagen）を使用して精製した。
【００５５】
Ｂ．肝細胞腫細胞株
肝細胞腫Lunet Huh-7細胞株を、Glutamax（商標）及び１００mg/mlのピルビン酸ナトリウムの補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃で培養した。培地には、１０％（ｖ/ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ/ｖ）ペニシリン/ストレプトマイシンが更に補充された。全ての試薬は、Invitrogen/Gibco製であった。
【００５６】
Ｃ．一過性レプリコン複製レベルの測定
４百万個のLunet Huh7細胞を、電気穿孔法を使用して５μgのインビトロで転写されたＲＮＡを用いてトランスフェクトした。次いで、細胞を、５％ＦＢＳを含む７．２mlのＤＭＥＭに再懸濁し、５００００細胞/穴で９６穴プレートに播種した（最終容量９０μl）。阻害剤（使用した場合）を、３倍希釈して最終ＤＭＳＯ濃度１％でトランスフェクションの２４時間後に加え、ホタルルシフェラーゼリポーターシグナルを、ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega）を使用して阻害剤を添加してから７２時間後に解読した。化合物を添加しなかった場合のホタルルシフェラーゼシグナルのレベルと比べて、ホタルルシフェラーゼリポーターのレベルの５０％低下が観察された阻害剤の濃度であるＩＣ５０値について評価した。
【００５７】
レプリコンシャトルベクターpSC_1b_NS3/プロテアーゼ_EcoRV_AsiSIの複製能力並びにＨＣＶ遺伝子型１ａ及び遺伝子型１ｂ患者由来ＮＳ３プロテアーゼドメインを含むレプリコンの複製能力を、解読値としてルシフェラーゼシグナルを用いて試験し、結果を図３に示す。ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤であるＢＩＬＮ２０６１、ＶＸ−９５０、及びＮＭ１０７の阻害作用もまた、これらのレプリコンにおいて試験し、結果を表１に示す。
【表９】
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【図３】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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