(57)【要約】本開示は、電離放射線および抗ＤＬＬ４抗体またはＤＬＬ４結合断片を投与することによって、癌、腫瘍、および新生物を治療する方法を提供する。【選択図】図８Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける癌を治療する方法であって、治療上有効量の電離放射線および抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片を投与することを含み、前記抗ＤＬＬ４抗体または前記ＤＬＬ４結合断片は、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する、方法。
【請求項２】
ヒトにおける腫瘍細胞増殖または腫瘍血管新生を低減または阻害する方法であって、治療上有効量の電離放射線および抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片を投与することを含み、前記抗ＤＬＬ４抗体または前記ＤＬＬ４結合断片は、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する、方法。
【請求項３】
ヒトにおける悪性腫瘍細胞浸潤または転移を低減する方法であって、治療上有効量の電離放射線および抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片を投与することを含み、前記抗ＤＬＬ４抗体または前記ＤＬＬ４結合断片は、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する、方法。
【請求項４】
ヒトにおける新生物を低減または阻害する方法であって、治療上有効量の電離放射線および抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片を投与することを含み、前記抗ＤＬＬ４抗体または前記ＤＬＬ４結合断片は、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する、方法。
【請求項５】
電離放射線の少なくとも１回線量での治療後に対象における腫瘍再成長を遅延させる方法であって、前記対象に、治療上有効量の抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片を投与することを含み、前記抗ＤＬＬ４抗体または前記ＤＬＬ４結合断片は、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する、方法。
【請求項６】
前記癌、腫瘍、または新生物は、結腸直腸癌、転移性結腸癌、結腸癌、直腸癌、膠芽腫、乳癌、非小細胞肺癌、頭頚部癌、腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌、または前立腺癌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、ヒトである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、
配列番号１に記載されるＣＤＲ１、配列番号２に記載されるＣＤＲ２、および配列番号３に記載されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインと、
配列番号４に記載されるＣＤＲ１、配列番号５に記載されるＣＤＲ２、および配列番号６に記載されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインと、
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、
配列番号７に記載される重鎖可変ドメインと、
配列番号８に記載される軽鎖可変ドメインと、
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片の用量は、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、週２回投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、電離放射線の最初の線量の投与後に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、前記電離放射線の最初の線量の投与前に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、前記電離放射線の最初の線量の投与と同じ日に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
電離放射線の総線量は、約４５Ｇｙ〜約８０Ｇｙである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記電離放射線は、約１．５〜約３．５Ｇｙ／日の分割線量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記電離放射線は、一時緩和的であり、前記電離放射線の総線量は、約８Ｇｙ〜約６０Ｇｙである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記電離放射線は、約３〜約８Ｇｙ／日の分割線量で投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法は、化学療法薬を投与することを更に含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１１年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／４９８，２００号からの優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、抗ＤＬＬ４抗体、またはＤＬＬ４結合断片を、放射線療法と組み合わせて使用する、癌、腫瘍、および新生物治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、腫瘍血管新生のための重要な刺激因子である。ＶＥＧＦ経路を標的とすることは、前臨床マウス異種移植モデルにおいて、腫瘍血管密度を低減し、腫瘍成長を遅らせる。ヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、ベバシズマブは、多様な固形腫瘍に対する化学療法方式に組み込まれてきており、全体的な生存期間および無増悪生存期間における中程度の改善をもたらす（Ｅｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９，１５（１６）：５０２０−５）。しかしながら、ＶＥＧＦ遮断への耐性は、よくあることである（Ｅｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９，１５（１６）：５０２０−５、Ｂｅｒｇｅｒｓ＆Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８，８（８）：５９２−６０３、Ｋｅｒｂｅｌ  ＲＳ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００８，３５８（１９）：２０３９−４９）。最近、これは、血管新生を調節する別の経路、すなわち、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）またはノッチシグナル伝達に関係することが示された（Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４４（７１２２）：１０３２−７、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４４（７１２２）：１０８３−７、Ｂｅｎｅｄｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２００９，１３７（６）：１１２４−３５、Ｌｉ＆Ｈａｒｒｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００５，８（１）：１−３、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７，６７（２３）：１１２４４−５３、Ｈｏｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００９，５（２）：１６８−７７）。
【０００４】
哺乳動物において、４つのノッチ受容体（ノッチ１〜４）、および５つのノッチリガンド（ジャグド１、２、ならびにデルタ様１、３、および４）が存在する。ノッチの細胞外サブユニットへのリガンド結合は、ＴＮＦ−アルファ変換酵素（ＴＡＣＥ）およびガンマ−セクレターゼ等の酵素によるタンパク質分解開裂を触発し、それが核に移行し、転写因子に結合する、ノッチ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）の創出をもたらし、最終的に下流標的遺伝子の活性化をもたらす（Ｂｒａｙ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００６，７：６７８）。新しい証拠は、複数のノッチ経路構成要素が脈管構造において発現されること、および正常なノッチシグナル伝達における異常が血管表現型をもたらし得ることを示唆する。例えば、ジャグド１およびノッチ３における突然変異は、血管の欠陥を示す２つの障害である、それぞれ皮質下梗塞および白質脳症を伴う、アラジール症候群および常染色体優性脳動脈症をもたらす。更に、マウスにおけるノッチ１およびＤＬＬ４の遺伝子欠失は全て、血管異常を伴う胚性致死をもたらす。加えて、マウスにおけるＤＬＬ４の単一の対立遺伝子の欠失は、ほとんどの遺伝的背景において重度の血管の欠陥を伴う胚性致死をもたらす（Ｄｕａｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００４，１８：２４７４、Ｇａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００４，１０１：１５９４９）。この表現型は、以前はＶＥＧＦ−Ａについて報告されるのみであったが、ＤＬＬ４もまた、血管発達において重要な役割を果たし得ることを示唆する。
【０００５】
ノッチ経路は、主にノッチリガンドＤＬＬ４およびジャグド１を通じる、腫瘍血管新生の重要な調節因子である。それは、乳癌および結腸癌を含む広範なヒト癌において上方調節される（Ｓｔｙｌｉａｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６，６６（３）：１５１７−２５、Ｃａｌｌａｈａｎ＆Ｅｇａｎ，Ｊ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ２００４，９（２）：１４５−６３、Ｒｅｅｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５，６５（１８）：８５３０−７、Ｒｅｅｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．２００８，３３（６）：１２２３−９、Ｓｉｋａｎｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０，７０（４）：１４６９−７８）。血管新生に対する影響に加えて、ノッチシグナル伝達はまた、複数の腫瘍型からの癌幹細胞（「ＣＳＣ」）にも関連付けられている（Ｄｏｎｔｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎ．Ｒｅｓ．２００４，６：Ｒ６０５、Ｗｉｌｓｏｎ＆Ｒａｄｔｋｅ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００６，５８０：２８６０）。癌幹細胞は、多様な造血器腫瘍および固形腫瘍から単離されており（Ａｌ−Ｈａｊｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００３，１００：３９８３、Ｌａｐｉｄｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９４，１７：６４５、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ２００６，８６：１２０３）、腫瘍細胞の小集団上のＤＬＬ４の存在は、ＤＬＬ４がまた、癌幹細胞生物学においても関与し得ること、およびＤＬＬ４アンタゴニストが、これらの細胞型との相互作用を通じて抗腫瘍効果を部分的に媒介し得ることを更に示唆する。
【０００６】
ＤＬＬ４は、動脈発達に非常にに関与する。その発現は、正常な組織内において主に内皮細胞に制限され、それは、腫瘍脈管構造において上方調節される（Ｄｕａｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００４，１８（２０）：２４７４−８、Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５，６５（１９）：８６９０−７、Ｊｕｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．２０１０，１７６（４）：２０１９−２８、Ｊｕｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９，１０１（１０）：１７４９−５７、Ｍａｉｌｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００１，６９（２−３）：１３５−４４）。ＤＬＬ４は、結腸腺腫および腺癌の悪性上皮細胞において発現される（Ｊｕｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９，１０１（１０）：１７４９−５７）。その発現はまた、ヒト腎明細胞癌ならびに乳癌および膀胱癌からの腫瘍の脈管構造に対しても報告されている（Ｍａｉｌｈｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２００１，６９：１３５、Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５，６５：８６９０、Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６，１２：４８３６）。また、最近の研究は、ＤＬＬ４が、ヒト膠芽腫における小さな割合の腫瘍細胞上で発現され得ることを示唆した（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６７，１１２４４）。腫瘍細胞におけるＤＬＬ４の過剰発現は、宿主間質／内皮細胞における活性化されたノッチシグナル伝達を引き起こして、腫瘍内の増加した血管サイズおよび改善された血管機能をもたらし、それが今度は増加した腫瘍成長速度をもたらす（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７，６７（２３）：１１２４４−５３）。逆に、ＤＬＬ４の阻害は、非生産的な血管新生および腫瘍成長の抑制を引き起こす（Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４４（７１２２）：１０３２−７、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４４（７１２２）：１０８３−７、Ｂｅｎｅｄｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００９，１３７（６）：１１２４−３５、Ｌｉ＆Ｈａｒｒｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００５，８（１）：１−３、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７，６７（２３）：１１２４４−５３、Ｈｏｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００９，５（２）：１６８−７７）。
【０００７】
腫瘍成長に対するＤＬＬ４シグナル伝達を遮断することは、腫瘍細胞株が免疫不全マウスにおいて皮下で成長させられる、癌の複数の前臨床モデルにおける腫瘍成長を低減することが報告されている（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４４（７１２２）：１０８３−７、Ｎｏｇｕｅｒａ−Ｔｒｏｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４４（７１２２）：１０３２−７）。抗腫瘍効果は、低酸素の増加に付随する、腫瘍における機能不全の血管の密度の増加に関連付けられた。中和抗体によるＤＬＬ４遮断もまた、恐らくは減少した腫瘍細胞増殖および癌幹細胞（ＣＳＣ）周期、ならびに腫瘍血管新生機能障害に起因して、化学療法と組み合わされたとき、ヒト乳および結腸異種移植モデルにおける腫瘍成長および再発を有意に遅延させた（Ｈｏｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００９，５（２）：１６８−７７）。故に、ＤＬＬ４はまた、腫瘍脈管構造の発達においても役割を果たし得る。
【０００８】
電離放射線（ＩＲ）もまた、腫瘍脈管構造を妨害することができる。高い単回線量（１５Ｇｙ）のＩＲの送達は、照射野内の内皮細胞を焼灼するのに十分であり、それはその後の腫瘍血管新生を予防し、骨髄由来細胞（主にＣＤ１１ｂ＋）の動員によって媒介される脈管形成が、腫瘍再成長が生じ得る前に必要とされる（Ａｈｎ＆Ｂｒｏｗｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００８，１３（３）：１９３−２０５、Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１０，１０７（１８）：８３６３−８）。ＣＤ１１ｂ＋遮断ｍＡｂの投与は、ＣＤ１１ｂ＋骨髄単球動員を干渉し、それは、焼灼線量の腫瘍照射後の腫瘍再成長を遅延させる（Ａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１０，１０７（１８）：８３６３−８）。ＢＭＤＣは、間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）を介して動員され、ＳＤＦ−１−ＣＸＣＲ４相互作用の薬理的遮断は、腫瘍照射後の腫瘍再成長を干渉する（Ｋｉｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１０，１２０（３）：６９４−７０５、Ｋｏｚｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１０，７０（１４）：５６７９−８５）。腫瘍血管新生がより低いＩＲ線量で焼灼されないため（それ故に、脈管形成は、腫瘍成長に必須でない）、より低い線量のＩＲもまた腫瘍へのＣＤ１１ｂ＋動員を誘導するかどうか、または何が腫瘍脈管構造へのその相対的寄与であるかは、未だに知られていない。臨床的放射線療法において、単回線量ＩＲは、一般的に、定位放射線手術を例外として、腫瘍血管新生の焼灼を引き起こすのに十分に高い線量で与えられない。
【０００９】
電離放射線（ＩＲ）の効果を増大させるために、腫瘍血管新生を標的とするための複数のアプローチが使用されている。放射線療法へのＶＥＧＦの追加は、複数の前臨床異種移植モデルにおいて腫瘍成長遅延を増大させる（Ｇｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９，５９（１４）：３３７４−８、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００，６０（１９）：５５６５−７０）。しかしながら、Ｌｅｅらが、酸素正常状態または低酸素状態のＬＳ１７４Ｔ異種移植腫瘍に対して、抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂをＩＲ（２０〜４０Ｇｙ）と組み合わせたとき、腫瘍成長遅延に対する効果は、せいぜい相加的であり、例外は、最も高い線量のＩＲ（４０Ｇｙ）および低酸素状態の腫瘍のみで見られた（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００，６０（１９）：５５６５−７０）。ＶＥＧＦ経路遮断によって誘導される腫瘍再酸素化の重要性に起因して、２つの治療法が一緒に使用されるとき、ＩＲのタイミングおよび順序付けは重要であり得る（Ｗｉｎｋｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００４，６（６）：５５３−６３、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４，１０（２４）：８５８７−９３）。
【００１０】
電離放射線が、内皮細胞におけるノッチ経路ならびにヒト乳癌および神経膠腫に影響を及ぼし得ることを示唆する証拠もまた存在する（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００６，９８（２４）：１７７７−８５、Ｓｃｈａｒｐｆｅｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ．２００９，７３（２）：５０６−１３、Ｉｍａｉｚｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０，５（６）：ｅ１１０８４、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００９，２８（１）：１７−２８）。抗ＶＥＧＦ療法に耐性である腫瘍は、遮断モノクローナル抗体またはＤＬＬ４細胞外ドメイン−ＦＣデコイタンパク質による、ＤＬＬ４遮断に応答性である。（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４４（７１２２）：１０８３−７、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７，６７（２３）：１１２４４−５３．）しかしながら、ＩＲと組み合わせた腫瘍およびその脈管構造内のＤＬＬ４遮断を検査する公開報告は、何ら存在しない。
【００１１】
したがって、癌、新生物疾患、腫瘍細胞成長もしくは増殖、腫瘍転移、または関連する病態の治療または阻害のためにＤＬＬ４遮断がＩＲと一緒に使用される、併用療法を提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【００１２】
本発明によると、本発明の幾つかの実施形態は、治療上有効量の電離放射線および抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片を投与することを含む、ヒトにおける癌を治療する方法を提供し、その抗ＤＬＬ４抗体またはＤＬＬ４結合断片は、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する。
【００１３】
本発明の他の実施形態では、治療上有効量の電離放射線および抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片を投与することを含む、ヒトにおける腫瘍細胞増殖または腫瘍血管新生を低減または阻害する方法が提供され、その抗ＤＬＬ４抗体またはＤＬＬ４結合断片は、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する。
【００１４】
さらに他の実施形態では、治療上有効量の電離放射線および抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片を投与することを含む、ヒトにおける悪性腫瘍細胞浸潤または転移を低減する方法が提供され、その抗ＤＬＬ４抗体またはＤＬＬ４結合断片は、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する。
【００１５】
他の実施形態は、治療上有効量の電離放射線および抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片を投与することを含む、ヒトにおける新生物を低減または阻害する方法を提供し、その抗ＤＬＬ４抗体またはＤＬＬ４結合断片は、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する。
【００１６】
幾つかの実施形態では、対象に、治療上有効量の抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片を投与することを含む、電離放射線の少なくとも１回線量での治療後に対象における腫瘍再成長を遅延させる方法であり、その抗ＤＬＬ４抗体またはＤＬＬ４結合断片は、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する。
【００１７】
幾つかの実施形態では、癌、腫瘍、または新生物は、結腸直腸癌、転移性結腸癌、結腸癌、直腸癌、膠芽腫、乳癌、非小細胞肺癌、頭頚部癌、腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌、または前立腺癌である。
【００１８】
幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、ヒトである。
【００１９】
幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、配列番号１に記載されるＣＤＲ１、配列番号２に記載されるＣＤＲ２、および配列番号３に記載されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインと、配列番号４に記載されるＣＤＲ１、配列番号５に記載されるＣＤＲ２、および配列番号６に記載されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインとを含む。
【００２０】
幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、配列番号７に記載される重鎖可変ドメインと、配列番号８に記載される軽鎖可変ドメインとを含む。
【００２１】
幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片の用量は、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇである。
【００２２】
幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、週２回投与される。
【００２３】
幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、電離放射線の最初の線量の投与後に投与される。
【００２４】
幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、電離放射線の最初の線量の投与前に投与される。
【００２５】
幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、電離放射線の最初の線量の投与と同じ日に投与される  
【００２６】
幾つかの実施形態では、電離放射線の総線量は、約４５Ｇｙ〜約８０Ｇｙである。
【００２７】
幾つかの実施形態では、電離放射線は、約１．５〜約３．５Ｇｙ／日の分割線量で投与される。
【００２８】
幾つかの実施形態では、電離放射線は、一時緩和的であり、電離放射線の総線量は、約８Ｇｙ〜約６０Ｇｙである。
【００２９】
幾つかの実施形態では、電離放射線は、約３〜約８Ｇｙ／日の分割線量で投与される。
【００３０】
幾つかの実施形態では、本方法は、化学療法薬を投与することを更に含む。
【００３１】
前述の概要および次の詳細な説明の双方は、例および説明となるものにすぎず、特許請求される本発明を制限しないことを理解されたい。
【００３２】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図は、本発明の複数の実施形態を例示し、その記述と一緒に本発明の原則を説明する機能を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】ヒト結腸直腸癌細胞株のＤＬＬ４免疫ブロットを図示する。
【図１Ｂ】漸増量のＤＢＺで処置され、次いでノッチ１およびＮ１ＩＣＤについてブロットされたＬＳ１７４Ｔ細胞（左パネル）、ＤＢＺまたはＤＬＬ４  ｍＡｂで処置され、次いでＪａｇ１またはＤＬＬ４についてブロットされた細胞（右パネル）、ならびにノッチ２、３、および４受容体についてブロットされた無処置ＬＳ１７４Ｔ細胞（下パネル）の免疫ブロットを図示する。
【図１Ｃ】ＢＳＡまたはＤＬＬ４コーティングプレート上で、ＤＭＳＯ（ビヒクル）、アイソタイプＩｇＧ１、ＤＢＺ、またはＤＬＬ４  ｍＡｂの存在下で２４時間インキュベートされた、ＬＳ１７４Ｔノッチｌｕｃ細胞におけるルシフェラーゼ活性の倍率変化を図示する。上パネルは、棒グラフ形態で変化を提示する一方で、下パネルは、ノッチルシフェラーゼ活性の「ヒートマップ」を示す。
【図２Ａ】５日間の培養後にＤＢＺまたはＤＬＬ４  ｍＡｂと共にインキュベートされたＬＳ１７４Ｔ細胞の総細胞数における、対ビヒクルでの倍率変化を図示する。標準誤差バーが示される。
【図２Ｂ】偽照射または５Ｇｙ線量のＩＲのいずれかと組み合わせて、ビヒクル、ＤＢＺ、またはＤＬＬ４  ｍＡｂで処置されたＬＳ１７４Ｔ細胞から得られた光単位を図示する。５０ｎＭの組換えＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に２時間インキュベートされたＬＳ１７４Ｔ細胞は、陽性対照を提供する。
【図３Ａ】細胞が偽照射された、または２、４、もしくは６Ｇｙ線量のＩＲで照射されたときの、ビヒクル、ＤＢＺ（左パネル）、またはＤＬＬ４  ｍＡｂ（右パネル）とのインキュベーション後のＬＳ１７４Ｔ細胞の生存率を図示する。生存率は、プロットされ、データは、線形二次方程式にモデル化され、平均および標準誤差バーが示される。
【図３Ｂ】ＬＳ１７４Ｔノッチｌｕｃ細胞を偽照射した、または２、４、もしくは６Ｇｙ線量のＩＲで照射した２４時間後の、ルシフェラーゼ活性の倍率変化を図示する。「＊」は、ｐ＜０．０５を表す。
【図４】腫瘍生物発光（左画像）およびルシフェラーゼ活性の変化パーセント（棒グラフ）を提示する。腫瘍生物発光を、ビヒクル、ＤＢＺ、５Ｇｙ  ＩＲ、または５Ｇｙ  ＩＲおよびＤＢＺ処置の前およびその２４時間後（上の画像パネルおよび棒グラフ）、ならびにビヒクル、ＤＬＬ４  ｍＡｂ、５Ｇｙ  ＩＲ、または５Ｇｙ  ＩＲおよびＤＬＬ４  ｍＡｂの前およびその２４時間後（下の画像パネルおよび棒グラフ）に測定した。画像パネルにおける腫瘍に重なる「ヒートマップ」は、相対的ノッチ活性を表示する。「＊」は、ｐ＜０．０５を表し、「＊＊」は、ｐ＜０．０１を表す。
【図５】腫瘍体積に対する治療法の効果を図示する。２つの左グラフは、Ｘ軸上の矢頭によって示される治療クール対Ｙ軸上の正規化腫瘍体積を示す生存グラフである。上の生存グラフは、ビヒクル（円形、Ｎ＝７）、ＤＢＺ（正方形、Ｎ＝８）、５Ｇｙ  ＩＲ（三角形、Ｎ＝１０）、および５Ｇｙ  ＩＲとＤＢＺ（逆三角形、Ｎ＝９）での処置を比較する。下の生存グラフは、ビヒクル（円形、Ｎ＝７）、ＤＬＬ４  ｍＡｂ（正方形、Ｎ＝７）、５Ｇｙ  ＩＲ（三角形、Ｎ＝８）、および５Ｇｙ  ＩＲとＤＬＬ４  ｍＡｂ（逆三角形、Ｎ＝８）を比較する。右の棒グラフは、標準偏差と共に、腫瘍が開始体積の４倍に到達する（ＲＴＶ４）平均時間を図示する。点線は、ビヒクル処置腫瘍についてのＲＴＶ４を示し、それぞれの棒がこの線を上回る程度は、腫瘍成長遅延に対応する。「＊＊＊」は、統計的に有意な差異（ｐ＜０．００１）を表し、「ｎｓ」は、有意でない差異を表す。
【図６】腫瘍灌流のマイクロバブル造影超音波分析を示す。上パネルは、１日目および５日目に撮られた画像を提示する。棒グラフは、ビヒクル群に対して正規化された相対的腫瘍血流値を提示する。平均および標準誤差は、３つの独立した実験から導出した。「＊＊」は、ビヒクルと比べたｐ＜０．０１を表す。
【図７Ａ】抗ＣＤ３１によるＩＨＣ染色（左パネル）および棒グラフでＣｈａｌｋｌｅｙ血管数を提示する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１。
【図７Ｂ】抗ＣＤ３１−ＰＥ抗体の静脈内注射後のマウスから得られた腫瘍切片の、共焦点顕微鏡ｚスタック画像から生成された３Ｄ腫瘍脈管構造再構築を示す。
【図７Ｃ】ＥＦ５  ＩＨＣ染色および算出された平均低酸素面積を提示する。左パネルは、１５０倍で示される群からの腫瘍切片における、低酸素マーカーＥＦ５に対する染色を示す。スケールバーは、２００μｍを示す。付随する棒グラフは、１群当たり最低３つの腫瘍についての視野全ての平均スコアとして算出された、各腫瘍の平均低酸素面積を提示する。「＊＊」は、ビヒクルと比較したｐ＜０．００１を表す。
【図７Ｄ】Ｋｉ−６７  ＩＨＣ染色およびＫｉ−６７陽性細胞の算出された割合を提示する。左パネルは、４００倍で示される群からの腫瘍切片のＫｉ−６７染色を示す。スケールバーは、５０μｍを示す。付随する棒グラフは、１群当たり最低３つの腫瘍を使用して、６つの高倍率視野から決定された、Ｋｉ−６７陽性細胞の割合を標準誤差と共に提示する。「＊＊」は、ビヒクルと比べたｐ＜０．０１を表す。
【図７Ｅ】示される群からの腫瘍についてのＨ＆Ｅ染色および算出された壊死百分率を提示する。左パネルにおけるＨ＆Ｅ画像は、２０倍で示される。スケールバーは、１０００μｍを示す。壊死の領域は、黒で輪郭を描かれる。付随する棒グラフは、標準誤差と共に、１群当たり最低３つの腫瘍についての低倍率で推定される腫瘍壊死の百分率を示す。ビヒクルと比べて＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８Ａ】ＤＬＬ４、Ｊａｇ１、ノッチ１〜４受容体の発現についての、無処置ＬＳ１７４ＴおよびＦａＤｕ細胞のウェスタンブロットを提示する。
【図８Ｂ】ＦａＤｕ腫瘍体積に対する治療法の効果を図示する。生存グラフは、ビヒクル（円形、Ｎ＝）、ＤＬＬ４  ｍＡｂ（正方形、Ｎ＝５）、５Ｇｙ  ＩＲ（三角形、Ｎ＝５）、および５Ｇｙ  ＩＲとＤＬＬ４  ｍＡｂ（逆三角形、Ｎ＝５）についての、Ｘ軸上の矢頭によって示される治療クール対Ｙ軸上の正規化腫瘍体積を示す。右の棒グラフは、標準偏差と共に、腫瘍が開始体積の４倍に到達する（ＲＴＶ４）平均時間を図示する。点線は、ビヒクル処置腫瘍についてのＲＴＶ４を示し、それぞれの棒がこの線を上回る程度は、腫瘍成長遅延に対応する。ビヒクルと比べて「＊＊＊」は、ｐ＜０．００１を表し、「＊＊」は、ｐ＜０．０１を表す。
【図９Ａ】腫瘍灌流のマイクロバブル造影超音波分析を示す。上のパネルは、１日目および７日目に撮られた画像を提示する。棒グラフは、ビヒクル群に対して正規化された相対的腫瘍血流値を提示する。平均および標準誤差は、３つの独立した実験から導出した。「＊＊」は、ビヒクルと比べたｐ＜０．０１を表す。
【図９Ｂ】単独でまたはＩＲと組み合わせてのいずれかでの、ＤＢＺまたはＤＬＬ４  ｍＡｂの効果についての造影動力学（総造影シグナルおよび速度）分析を示す。
【図９Ｃ】腫瘍灌流のマイクロバブル造影超音波分析を示す。上のパネルは、１日目および３日目に撮られた画像を提示する。棒グラフは、ビヒクル群に対して正規化された相対的腫瘍血流値を提示する。平均および標準誤差は、３つの独立した実験から導出した。「＊」は、ビヒクルと比べたｐ＜０．０５を表す。
【図１０Ａ】示されるように処置されたマウスからの腫瘍切片の、ＴＵＮＥＬ染色の４００倍で撮られた画像を示す。
【図１０Ｂ】抗ＣＤ３１、抗Ｋｉ−６７、および抗ＥＦ５抗体による灌流試験からの腫瘍の免疫組織化学染色、ならびに結果として生じるＣｈａｌｋｌｅｙ血管数、Ｋｉ−６７陽性細胞の割合、および低酸素領域を提示する。ビヒクルと比べて「＊」は、ｐ＜０．０５を表し、「＊＊」は、ｐ＜０．０１を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
これから本発明の実施形態への参照が詳細に行われる。
【００３５】
本発明の一態様により、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する治療上有効量の抗体を、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせて投与することによって、動物における癌を治療する方法が提供される。本方法は、癌に対する治療を必要とする動物を選択することと、動物に、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する治療上有効量の抗体を投与することとを含んでもよい。一実施形態では、本発明は、電離放射線およびＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する治療上有効量の抗体を投与することによって、ヒトにおける癌を治療する方法を提供する。
【００３６】
別の態様により、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する治療上有効量の抗体を、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせて投与することによって、動物における、腫瘍細胞増殖または腫瘍血管新生を低減または阻害する方法が提供される。本方法は、腫瘍細胞増殖または血管新生を低減または阻害することを必要とする動物を選択することと、動物に、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する治療上有効量の抗体を投与することとを含んでもよい。一実施形態では、本発明は、治療上有効量の電離放射線およびＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する抗体を投与することによって、ヒトにおける腫瘍細胞増殖または腫瘍血管新生を低減または阻害する方法を提供する。
【００３７】
別の態様により、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する治療上有効量の抗体を、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせて投与することによって、動物における悪性腫瘍細胞浸潤または転移を低減する方法が提供される。本方法は、悪性腫瘍細胞浸潤または転移を低減することを必要とする動物を選択することと、動物に、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する治療上有効量の抗体を投与することとを含んでもよい。一実施形態では、本発明は、治療上有効量の電離放射線およびＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する抗体を投与することによって、ヒトにおける悪性腫瘍細胞浸潤または転移を低減する方法を提供する。
【００３８】
別の態様により、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する治療上有効量の抗体を、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせて投与することによって、動物における新生物を低減または阻害する方法が提供される。本方法は、新生物を治療することを必要とする動物を選択することと、動物に、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する治療上有効量の抗体を投与することとを含んでもよい。一実施形態では、本発明は、治療上有効量の電離放射線およびＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する抗体を投与することによって、ヒトにおける新生物を低減または阻害する方法を提供する。
【００３９】
悪性腫瘍は、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、直腸の癌、肛門管の癌、膵臓癌、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆汁性（胆管癌）、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、または類表皮癌から選定されてもよい。
【００４０】
治療可能な増殖性または血管新生性疾患には、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、胆嚢癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、直腸の癌、肛門管の癌、膵臓癌、卵巣、食道癌、頭頚部癌、中皮腫、肉腫、胆汁性（胆管癌）、小腸腺癌、小児悪性腫瘍、類表皮癌等の新生物疾患、および慢性骨髄性白血病を含む白血病が含まれる。
【００４１】
本発明の別の態様により、哺乳動物における癌の治療のための薬の製造のための、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する抗体の使用が提供される。一実施形態では、その使用は、電離放射線と組み合わされる。
【００４２】
本発明の別の態様により、哺乳動物における癌の治療のための薬として使用するための、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する抗体が提供される。一実施形態では、その使用は、電離放射線と組み合わされる。
【００４３】
別の態様により、動物における腫瘍細胞増殖または腫瘍血管新生の低減または阻害のための薬の製造のための、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する抗体の使用が提供される。一実施形態では、その使用は、電離放射線と組み合わされる。
【００４４】
別の態様により、動物における腫瘍細胞増殖または腫瘍血管新生の低減または阻害のための薬として使用するための、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する抗体が提供される。一実施形態では、その使用は、電離放射線と組み合わされる。
【００４５】
別の態様により、動物における悪性腫瘍細胞浸潤または転移を低減するための薬の製造のための、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する抗体の使用が提供される。一実施形態では、その使用は、電離放射線と組み合わされる。
【００４６】
別の態様により、動物における悪性腫瘍細胞浸潤または転移を低減するための薬として使用するための、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する抗体が提供される。一実施形態では、その使用は、電離放射線と組み合わされる。
【００４７】
別の態様により、動物における新生物を低減または阻害するための薬の製造のための、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する抗体の使用が提供される。一実施形態では、その使用は、電離放射線と組み合わされる。
【００４８】
別の態様により、動物における新生物を低減または阻害するための薬として使用するための、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する抗体が提供される。一実施形態では、その使用は、電離放射線と組み合わされる。
【００４９】
一実施形態では、本発明は、ＤＬＬ４に単独でまたは一部依存する腫瘍を有する患者において、ＤＬＬ４に拮抗する際の使用に好適である。
【００５０】
一実施形態では、本発明は、癌、腫瘍、または新生物がＤＬＬ４を発現する患者において、ＤＬＬ４に拮抗する際の使用に好適である。
【００５１】
別の実施形態では、本発明は、癌、腫瘍、または新生物がＤＬＬ４を発現しない患者において、ＤＬＬ４に拮抗する際の使用に好適である。
【００５２】
本発明の別の態様により、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、ＤＬＬ４の生物学的活性に拮抗する抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、それらから本質的になる、またはそれらからなる、薬学的組成物が提供される。一実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体は、完全ヒト抗体である。一実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体は、米国特許第２０１０／０１９６３８５号もしくは国際公開第２０１０／０３２０６０号に記載される、４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、２１Ｈ３、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４抗体から選定されるか、またはそれらの抗体、またはそれらのＤＬＬ４結合断片の組み合わせである。一実施形態では、抗体は、抗体を電離放射線と組み合わせて投与するための指示書を含む、キット中の薬学的組成物として提供される。
【００５３】
一実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号３に記載される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、可変重鎖アミノ酸配列と、それぞれ、配列番号４、配列番号５、および配列番号６に記載される、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、可変軽鎖アミノ酸配列とを含む。
【００５４】
別の実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号７の配列を含む、重鎖ポリペプチドを含む。別の実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体、またはその抗原結合部分は、配列番号８の配列を含む、軽鎖ポリペプチドを更に含む。幾つかの実施形態では、抗体は、完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００５５】
別の実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体またはＤＬＬ４結合断片は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にて、番号ＰＴＡ−９５０１の下で２００８年９月１７日に寄託された、Ｍａｂ２１Ｈ３ＶＨと表記されるプラスミドにおけるポリヌクレオチドによってコードされる抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む、可変重鎖アミノ酸配列を含む。
【００５６】
別の実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体またはＤＬＬ４結合断片は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）にて、番号ＰＴＡ−９５００の下で２００８年９月１７日に寄託された、Ｍａｂ２１Ｈ３ＶＬＯＰと表記されるプラスミドにおけるポリヌクレオチドによってコードされる抗体のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つを含む、可変軽鎖アミノ酸配列を含む。
【００５７】
当業者がＣＤＲ決定を容易に遂行し得ることに留意する。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｍｄ．（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３を参照されたい。Ｋａｂａｔは、多数の種の抗体アイソタイプからの免疫グロブリン鎖の複数の配列アライメントを提供する。整列された配列は、単一の付番方式であるＫａｂａｔ付番方式に従って付番される。Ｋａｂａｔ配列は、１９９１年の公開以来更新されており、電子配列データベースとして入手可能である（最新のダウンロード可能バージョンは１９９７年）。任意の免疫グロブリン配列を、Ｋａｂａｔに従って、Ｋａｂａｔ参照配列とのアライメントを行うことによって付番することができる。したがって、Ｋａｂａｔ付番方式は、免疫グロブリン鎖を付番するための統一方式を提供する。
【００５８】
幾つかの実施形態では、ＤＬＬ４に特異的に結合する抗体の投与後に、過剰の循環抗体を血液から除去するために、清澄剤が投与される。
【００５９】
他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、抗ＤＬＬ４抗体は、ＤＬＬ４誘導性細胞接着、浸潤、血管新生、増殖、および／または細胞内シグナル伝達からもたらされる症状を治療することにおいて有用である。更なる実施形態は、本明細書に記載される抗体および方法を使用して、黒色腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、直腸の癌、肛門管の癌、および膵臓癌等の、新生物疾患を含む、細胞接着、浸潤、血管新生、および／または増殖関連疾患を治療することを伴う。
【００６０】
一実施形態では、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、抗ＤＬＬ４抗体は、腫瘍の発達が、増殖して、更なる腫瘍幹細胞、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および乳房腫瘍の両方を効率的に生じる能力を有する幹細胞の小集団に依存する、固形腫瘍を治療する際の治療効果を有する。
【００６１】
本明細書に開示される第２の治療法と抗ＤＬＬ４抗体を組み合わせて使用することを含む方法に関する、更なる実施形態、特長等は、下に更に詳細に提供される。
【００６２】
定義
別途規定されない限り、本明細書で使用される科学用語および学術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈上他の解釈を要する場合を除き、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質化学およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、ならびにそれらの技法は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。
【００６３】
標準的な技法が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）に使用される。酵素反応および精製技法は、製造業者の仕様に従って、または当該技術分野で一般的に遂行されるように、もしくは本明細書に記載されるように行われる。前述の技法および手順は、一般に、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書全体を通じて引用され、論じられる種々の一般のおよびより具体的な参考文献に記載されるように行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１））を参照されたく、それは参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される、分析化学、合成有機化学、ならびに創薬および製薬化学に関連して利用される命名法、ならびにそれらの検査手技および検査法は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。標準的な技法が、化学合成、化学分析、医薬調製、製剤化、および送達、ならびに患者の治療のために使用される。
【００６４】
本開示に従い利用されるとき、次の用語は、別途指定されない限り、次の意味を有するように理解されるものとする：
【００６５】
本明細書で使用される「および／または」という用語は、他方を含むまたは含まない、２つの明記される特長または構成要素の各々の具体的な開示として受け取るべきである。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、ちょうどあたかも各々が個々に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の具体的な開示として受け取るべきである。
【００６６】
「ＤＬＬ４」という用語は、デルタ様タンパク質４前駆体、ショウジョウバエデルタ相同体４、ｈｄｅｌｔａ２、ＭＧＣ１２６３４４、またはＵＮＱ１８９５／ＰＲＯ４３４１としても知られる、ＤＬＬ４タンパク質である分子を指す。
【００６７】
「ＤＬＬ４の生物学的活性のアンタゴニスト」は、ＤＬＬ４の活性を排除する、低減する、または有意に低減することが可能である。「ＤＬＬ４の生物学的活性のアンタゴニスト」は、ＤＬＬ４シグナル伝達を排除する、低減する、または有意に低減することが可能である。「ＤＬＬ４の生物学的活性のアンタゴニスト」は、血管新生および／または増殖を排除または有意に低減し得る。
【００６８】
例として、ＤＬＬ４の生物学的活性のアンタゴニストは、ＤＬＬ４に結合する抗体またはその断片であってもよい。本発明の方法の実施において使用するのに好適な抗ＤＬＬ４抗体の例は、実施例に記載され、また、Ｖｅｈｅ  Ｂｅｄｉａｎ、Ｄａｖｉｄ  Ｊｅｎｋｉｎｓ、およびＩａｎ  Ｆｏｌｔｚによる米国特許第２０１０／０１９６３８５号、「ＤＬＬ４に向けられる標的型結合剤およびその使用」にも記載され、それはまた、国際公開第２０１０／０３２０６０号としても公開されている。それらの刊行物の各々は、参照によりその全体が組み込まれる。故に、ＤＬＬ４の生物学的活性のアンタゴニストはＤＬＬ４に特異的に結合する、任意の単離された抗体、またはその結合断片であってもよく、その抗体は、次のものを含む、次の特性のうちの１つ以上を示す。２００ｐＭ未満のＫＤでヒトＤＬＬ４に結合する、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）ＤＬＬ４と交差反応する、マウスＤＬＬ４と弱く交差反応する、ほぼ同等の親和性でカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ）ＤＬＬ４に結合する、ＤＬＬ１またはジャグド１に有意に結合しない、２Ｄ培養において対照と比較してＨＵＶＥＣ細胞増殖の８５％を上回る逆ＤＬＬ４刺激性阻害を示す、２Ｄ培養において０．０８μｇ／ｍＬの濃度で対照と比べてＨＵＶＥＣ細胞管形成の５０％超の阻害を示す、およびｔ＝０の対照と比べて４時間で５０％未満の内在化を示す。
【００６９】
本発明において使用するのに好適な抗ＤＬＬ４抗体の一例は、米国特許第２０１０／０１９６３８５号または国際公開第２０１０／０３２０６０号に記載される、ヒト抗体２１Ｈ３ＲＫである。２１Ｈ３ＲＫは、ヒトジャグド１またはヒトＤＬＬ１への極小の結合を示す、ヒト抗ヒトＤＬＬ４抗体である。ＩｇＧ１形式で試験されたとき、それは、体外でのＨＵＶＥＣ増殖および内皮細胞管形成の両方の有効な阻害剤であった。２１Ｈ３ＲＫもまた、体内で血管新生のスフェロイドベースのアッセイを使用して試験されたとき、活性であった。２１Ｈ３ＲＫエピトープは、ＤＬＬ４のアミノ酸１４７〜２２４（ＡＡ１８７〜２０１）内に局在化している、ＤＬＬ４のＤＳＬおよびＥＧＦ１ドメインにマッピングされた。２１Ｈ３ＲＫの重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、米国特許第２０１０／０１９６３８５号の配列番号３０に記載されるが、２１Ｈ３ＲＫの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、配列番号５０に記載される。
【００７０】
本発明において使用するのに好適な抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片の別の例は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号３に記載される、ＣＤＲ１：ＮＹＧＩＴ、ＣＤＲ２：ＷＩＳＡＹＮＧＮＴＮＹＡＱＫＬＱＤ、およびＣＤＲ３：ＤＲＶＰＲＩＰＶＴＴＥＡＦＤＩアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメインと、それぞれ、配列番号４、配列番号５、および配列番号６に記載される、ＣＤＲ１：ＳＧＳＳＳＮＩＧＳＹＦＶＹ、ＣＤＲ２：ＲＮＮＱＲＰＳ、およびＣＤＲ３：ＡＡＷＤＤＳＬＳＧＨＷＶアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメインとを含む、抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片である。一実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体またはそのＤＬＬ４結合断片は、配列番号７に記載される重鎖可変ドメインと、配列番号８に記載される軽鎖可変ドメインとを含む。
【００７１】
配列番号７：
2014523421.tif 000003
【００７２】
配列番号８：
2014523421.tif 000004
【００７３】
本発明において使用するのに好適な、代替的な（または更なる）抗ＤＬＬ４抗体のさらに他の例としては、米国特許第２０１０／０１９６３８５号または国際公開第２０１０／０３２０６０号に記載される、抗体４Ｂ４、２Ｈ１０、２１Ｆ７、２１Ｈ３、１２Ａ１、１７Ｆ３、９Ｇ８、２０Ｇ８、１Ｅ４、３Ａ７、４Ｂ３、１Ｄ４、またはそれらの抗体もしくはそれらの結合断片の組み合わせが挙げられる。それらの抗体または結合断片のいずれもまた、２１Ｈ３ＲＫ抗体と、またはそのＤＬＬ４結合断片と組み合わせて使用され得る。
【００７４】
ＤＬＬ４ポリペプチドに関する「活性な」または「活性」は、天然ＤＬＬ４ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有する、ＤＬＬ４ポリペプチドの部分を指す。本明細書で使用されるとき、「生物学的」は、天然ＤＬＬ４ポリペプチドの活性からもたらされる生物学的機能を指す。ＤＬＬ４生物学的活性は、例えば、ＤＬＬ４誘導性細胞接着および浸潤、ならびに／または血管新生および／もしくは増殖を含む。
【００７５】
別途明記されない限り、抗体は、オリゴクローナル、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、触媒抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってもよい。「ヒト抗体」は、ヒトに由来する抗体、または抗原攻撃に応答してヒト抗体を産生するように操作されたトランスジェニック生物から得られる抗体である。ヒト抗体はまた、その重鎖および軽鎖がヒトＤＮＡの１つ以上の源に由来するヌクレオチド配列によってコードされる、抗体である。完全ヒト抗体は、遺伝子もしくは染色体トランスフェクション法、ファージディスプレイ技術（例えば、米国特許第５，９６９，１０８号）、または体外活性化Ｂ細胞（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号）によって構築することができる。抗体は、任意の種からのものであってよい。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、「抗体（単数および複数）」（免疫グロブリン）という用語は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、およびキメラ抗体を包含する。「抗体（単数および複数）」という用語は、ポリペプチド、またはその内表面形状および電荷分布が抗原鎖の抗原決定基の特長に相補的である、３次元結合空間を有する、ポリペプチド鎖の折り畳みから形成される少なくとも１つの結合ドメインからなる、ポリペプチドの群を指す。天然抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動する。各重鎖および軽鎖はまた、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、続いて幾つかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）および他方の端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと揃えられ、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと揃えられる。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、ラムダ鎖またはカッパ鎖のいずれかとして分類される。カッパ軽鎖の可変ドメインはまた、ＶＫとして本明細書で表される。「可変領域」という用語はまた、重鎖または軽鎖の可変ドメインを説明するように使用され得る。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間のインターフェースを形成すると考えられる。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。かかる抗体は、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス等を含むが、これらに限定されない、任意の哺乳動物に由来してもよい。
【００７７】
「抗体（単数または複数）」という用語は、本発明の抗体の結合断片を含み、例となる断片には、１本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、１本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物学的活性を示す抗体断片、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）、二量体可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、細胞内抗体、線状抗体、１本鎖抗体分子、ならびに上のいずれかの抗体断片およびエピトープ結合断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものであり得る。
【００７８】
「ｍＡｂ」という用語は、モノクローナル抗体を指す。
【００７９】
全抗体の断片は、結合抗原の機能を行うことができることが示されている。結合断片の例としては、（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，４８４−４９０）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）ＶＨまたはＶＬドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９）、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８，５５２−５５４、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１，４８４−４９０）；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）サブ２断片、すなわち２つの連結Ｆａｂ断片を含む二価の断片；（ｖｉｉ）２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成することを可能にする、ＶＨドメインおよびＶＬドメインがペプチドリンカーによって連結される、１本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３）；（ｖｉｉｉ）二重特異性１本鎖Ｆｖ二量体（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５号）；ならびに（ｉｘ）「二重特異性抗体」、すなわち遺伝子融合によって構築される多価または多重特異性断片（国際公開第９４／１３８０４号、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．（１９９３）ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８）が挙げられる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または二重特異性抗体分子は、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって安定化されてもよい（Ｒｅｉｔｅｒ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６）。ＣＨ３ドメインに接合されるｓｃＦｖを含むミニボディがまた、作製されてもよい（Ｈｕ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１）。結合断片の他の例としては、Ｆａｂ’があり、それは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステイン、および定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を担持するＦａｂ’断片である、Ｆａｂ’−ＳＨを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における少数の残基の付加の分だけＦａｂ断片とは異なる。
【００８０】
抗体の「結合断片」は、組換えＤＮＡ技法によって、または無傷抗体の酵素開裂もしくは化学開裂によって産生される。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および１本鎖抗体が含まれる。「二重特異性」または「二重機能性」抗体以外の抗体は、同一であるその結合部位の各々を有することが理解される。抗体は、過剰の抗体が、対抗受容体に結合する受容体の量を、少なくとも約２０％、４０％、６０％、または８０％、およびより通常には約８５％を超えて低減するとき（体外競合結合アッセイにおいて測定される）、対抗受容体への受容体の接着を実質的に阻害する。
【００８１】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンへの特異的結合が可能である、任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面群からなり、特定の３次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有し得るが、常にそうとは限らない。抗体は、解離定数が１μΜ以下、１００ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下であるとき、抗原に「特異的に結合する」といわれる。
【００８２】
「アイソタイプ」という用語は、抗体の重鎖または軽鎖定常領域の分類を指す。抗体の定常ドメインは、抗原への結合に関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。重鎖定常領域のアミノ酸配列に応じて、所与のヒト抗体または免疫グロブリンは、免疫グロブリンの５つの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てることができる。これらのクラスのうちの幾つかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１（ガンマ１）、ＩｇＧ２（ガンマ２）、ＩｇＧ３（ガンマ３）、およびＩｇＧ４（ガンマ４）、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２に更に分割されてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスの構造および３次元構成は、周知である。種々のヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびＩｇＭのみが、補体を活性化することが知られる。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、ヒトにおいて媒介することが知られる。ヒト軽鎖定常領域は、２つの主要なクラス、すなわちカッパおよびラムダに分類され得る。
【００８３】
所望される場合、ＤＬＬ４に特異的に結合する抗体のアイソタイプは、例えば、異なるアイソタイプの生物学的特性を活用するために、スイッチングすることができる。例えば、幾つかの状況において、抗体が、補体を結合し、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与する能力を有することが望ましい可能性がある。同様の能力を有する、抗体の幾つかのアイソタイプが存在し、それには限定なしに、次のものが含まれる：マウスＩｇＭ、マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３。他の実施形態では、抗体が、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に結合し、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に関与する能力を有することが望ましい可能性がある。同様の能力を有する、抗体の幾つかのアイソタイプが存在し、それには限定なしに、次のものが含まれる：マウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ１、およびヒトＩｇＧ３。抗体は、当該技術分野で既知である従来の技法を使用して、アイソタイプスイッチングを受けることができることが理解されるであろう。かかる技法には、とりわけ、直接組換え技法（例えば、米国特許第４，８１６，３９７号を参照されたい）、細胞間融合技法（例えば、米国特許第５，９１６，７７１号および同第６，２０７，４１８号を参照されたい）の使用が含まれる。
【００８４】
例として、本明細書で論じられる抗ＤＬＬ４抗体は、完全ヒト抗体である。抗体が、ＤＬＬ４への所望の結合を保有した場合、それは、（抗体の特異性およびその親和性のうちの幾つかを規定する）同じ可変領域を依然として保有しながら、容易にアイソタイプスイッチングを受けて、ヒトＩｇＭ、ヒトＩｇＧ１、またはヒトＩｇＧ３アイソタイプを生成することが可能であろう。するとかかる分子は、補体に結合し、ＣＤＣに関与する能力を有する、かつ／またはエフェクター細胞上のＦｃ受容体に結合し、ＡＤＣＣに関与する能力を有するであろう。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、「哺乳動物」は、哺乳動物と見なされる任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、「動物」は、哺乳動物と見なされる動物を包含する。好ましくは、動物は、ヒトである。
【００８７】
「患者」という用語は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。
【００８８】
「薬剤」という用語は、本明細書で、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、または生体物質から作製される抽出物を表すように使用される。
【００８９】
本明細書で使用される「医薬品または医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ  ｏｒ  ｄｒｕｇ）」という用語は、患者に適切に投与されるとき、所望の治療効果を誘導可能である、化学化合物または組成物を指す。本明細書における他の化学用語は、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．，Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５））（参照により本明細書に組み込まれる）によって例証される、当該技術分野における従来の使用法に従って使用される。
【００９０】
本明細書で使用される「治療上有効」量は、何らかの改善または便益を対象に提供する量である。換言すると、「治療上有効」量は、少なくとも１つの臨床的症状における何らかの緩和、軽減、および／または減少を提供する量である。本発明の方法によって治療することができる障害に関連する臨床的症状は、当業者に周知である。更に、当業者であれば、何らかの便益が対象に提供される限り、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。
【００９１】
本発明の実施形態は、他の抗体もしくは化学療法薬または放射線療法と組み合わせた、疾患に対する治療として有用である抗ＤＬＬ４抗体の滅菌医薬製剤を含む。かかる製剤は、天然ＤＬＬ４の、ノッチ１またはノッチ４受容体への結合を阻害し、それによって、例えば、血清または組織ＤＬＬ４発現が異常に亢進されるような、病的状態を効果的に治療する。抗ＤＬＬ４抗体は、好ましくは、ノッチ１またはノッチ４受容体への天然ＤＬＬ４結合を強力に阻害するのに十分な親和性を保有し、好ましくは、ヒトにおける頻繁でない投薬を可能にするのに十分な作用持続期間を有する。長期的な作用持続期間は、皮下または筋肉内注射等の代替の非経口経路による、頻度のより低い、より利便的な投薬スケジュールを可能にするであろう。
【００９２】
滅菌製剤は、抗体の凍結乾燥および再構成の前または後に、例えば、滅菌濾過膜を通じる濾過によって作り出すことができる。抗体は通常、凍結乾燥形態でまたは溶液中で保管されるであろう。治療用抗体組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって穿通可能な栓等の製剤の回収を可能にするアダプターを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に、配置される。
【００９３】
抗体投与の経路は、例えば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、髄腔内、吸入、もしくは病変内経路による、注射もしくは注入、腫瘍部位への直接注射、または下に注記される徐放系による、既知の方法に従う。幾つかの実施形態では、抗体は、注入によってまたはボーラス注射によって、継続的に投与される。
【００９４】
治療上用いられるべき抗体の有効量は、例えば、治療上の目的、投与経路、および患者の病態に依存するであろう。したがって、治療専門家は、最適な治療効果を得るために、必要に応じて、投薬量を滴定し、投与経路を修正することが好ましい。典型的に、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで、抗体を投与するであろう。この治療の進行は、従来のアッセイによって、または本明細書に記載されるアッセイによって、簡便に監視される。
【００９５】
本明細書に記載される抗体は、薬学的に許容される担体と混合して作製することができる。
【００９６】
所与の患者のための抗体製剤の投薬量は、担当医師によって、重症度および疾患の種類、体重、性別、食生活、投与の時間および経路、他の薬物治療、ならびに他の関連性のある臨床的要因を含む、薬物の作用を修正することが知られる種々の要因を考慮して、決定されるであろう。治療上有効な投薬量は、体外方法または体内方法のいずれによって決定されてもよい。
【００９７】
治療上用いられるべき本発明の抗体の有効量は、例えば、治療上の目的、投与経路、および患者の病態に依存するであろう。したがって、治療専門家が、最適な治療効果を得るために、必要に応じて、投薬量を滴定し、投与経路を修正することが好ましい。典型的な１日投薬量は、上述の要因に応じて、患者の体重の約０．０００１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇから、最大１００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１００００ｍｇ／ｋｇ、またはそれを超える範囲であり得る。投薬量は、上述の要因に応じて、患者の体重の０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜２ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．７５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、または０．０１〜０．１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。例えば、本発明の抗体は、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で投与されてもよい。典型的に、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで、抗体を投与するであろう。この治療の進行は、従来のアッセイによって、または本明細書に記載されるように、簡便に監視される。
【００９８】
本明細書における組成物および方法による治療的実体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）の投与は、改善された伝達、送達、耐性等を提供するために製剤中に組み込まれる、好適な担体、賦形剤、および他の薬剤と共に行われるであろうことが理解されるであろう。Ｂａｌｄｒｉｃｋ  Ｐ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｇｕｉｄａｎｃｅ．”Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２（２）：２１０−８（２０００）、Ｗａｎｇ  Ｗ．“Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２０３（１−２）：１−６０（２０００）、Ｃｈａｒｍａｎ  Ｗ  Ｎ“Ｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｄｒｕｇｓ，ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｓｏｍｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ．”  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８９（８）：９６７−７８（２０００）、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８−３１１（１９９８）、ならびに薬剤師に周知の製剤、賦形剤、および担体に関連する更なる情報については、その中の引用もまた参照されたい。
【００９９】
本発明の抗体の投薬は、反復されてもよく、投薬の頻度は、いずれの望ましくない作用も最小限に抑えながら、治療上の便益を最大限にするように、調整されてもよい。例えば、本発明の抗体は、毎日、隔日に、週２回、または毎週投与されてもよい。幾つかの非限定的な投薬スケジュールは、具体的な治療法の文脈において、および実施例において、本開示の別の箇所で提供される。
【０１００】
記載される抗ＤＬＬ４抗体は、放射線療法、更なる抗体もしくは他の生物学に基づく治療法、従来の外科手術、または化学療法のうちの１つ以上と組み合わせて適用されてもよい。
【０１０１】
本発明の一態様では、抗ＤＬＬ４抗体療法は、放射線療法とも称される、放射線治療と併用される。種々の種類の放射線療法が利用可能であり、特定の放射線療法の選択は、一般に、治療対象の癌、腫瘍、または新生物の性質に依存する。放射線療法の３つの主な種類は、体外照射療法（ＥＢＲＴまたはＸＲＴ）または遠隔放射線療法、近接照射療法または密封線源放射線療法、および全身放射性同位体療法（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）または非密封線源放射線療法である。その差異は、放射線源の位置に関係し、すなわち体外は、身体の外側であり、近接照射療法は、治療されている領域に正確に配置される密封放射性線源を使用し、全身放射性同位体は、注入または経口摂取によって与えられる。近接照射療法は、放射性線源の一時的または永続的配置を使用することができる。
【０１０２】
体内施与される放射線療法は、放射性核種を抗体、ホルモン、もしくは他の標的分子に、またはビーズ、ロッド、シード、もしくは除去可能なカテーテル等の移植可能な物質に連結することによって、遂行することができる。使用され得る放射性核種（放射性同位体）には、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１０３Ｐｄ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５３Ｓｍ、１９２Ｉｒが含まれる。
【０１０３】
「電離放射線」（ＩＲ）という用語は、Ｘ線、ガンマ線（例えば、ラジウム、ウラン、またはコバルト６０によって放射される）、および粒子線放射線（例えば、プロトン、中性子、パイ中間子または重イオン）を指す。放射線治療線量は、Ｘ線またはガンマ放射線を利用するとき、約０．０１〜１００グレイ（「Ｇｙ」）の範囲内、約０．１〜８０Ｇｙの範囲内、約１〜１０Ｇｙの範囲内、０．５〜１０Ｇｙの範囲内、または１〜５Ｇｙの範囲内であってもよい。一般に、放射線の複数回線量投与が、治療クールにわたって患者に投与される。完全な治療クールにわたる放射線治療の総線量は、１〜１００Ｇｙ、１〜９０Ｇｙ、１〜８０Ｇｙ、１〜７０Ｇｙ、１〜６０Ｇｙ、１〜５０Ｇｙ、１〜４０Ｇｙ、１〜３０Ｇｙ、１〜２０Ｇｙ、１〜１０Ｇｙ、１〜５Ｇｙ、８〜１００Ｇｙ、８〜９０Ｇｙ、８〜８０Ｇｙ、８〜７０Ｇｙ、８〜６０Ｇｙ、８〜５０Ｇｙ、８〜４０Ｇｙ、８〜３０Ｇｙ、８〜２０Ｇｙ、８〜１０Ｇｙ、１０〜１００Ｇｙ、１０〜９０Ｇｙ、１０〜８０Ｇｙ、１０〜７０Ｇｙ、１０〜６０Ｇｙ、１０〜５０Ｇｙ、１０〜４０Ｇｙ、１０〜３０Ｇｙ、１０〜２０Ｇｙ、２０〜１００Ｇｙ、２０〜９０Ｇｙ、２０〜８０Ｇｙ、２０〜７０Ｇｙ、２０〜６０Ｇｙ、２０〜５０Ｇｙ、２０〜４０Ｇｙ、２０〜３０Ｇｙ、３０〜１００Ｇｙ、３０〜９０Ｇｙ、３０〜８０Ｇｙ、３０〜７０Ｇｙ、３０〜６０Ｇｙ、３０〜５０Ｇｙ、３０〜４０Ｇｙ、４０〜１００Ｇｙ、４０〜９０Ｇｙ、４０〜８０Ｇｙ、４０〜７０Ｇｙ、４０〜６０Ｇｙ、４０〜５０Ｇｙ、５０〜１００Ｇｙ、５０〜９０Ｇｙ、５０〜８０Ｇｙ、５０〜７０Ｇｙ、５０〜６０Ｇｙ、６０〜１００Ｇｙ、６０〜９０Ｇｙ、６０〜８０Ｇｙ、６０〜７０Ｇｙ、７０〜１００Ｇｙ、７０〜９０Ｇｙ、７０〜８０Ｇｙ、８０〜１００Ｇｙ、８０〜９０Ｇｙ、９０〜１００Ｇｙの範囲内であっても、約１Ｇｙ、約５Ｇｙ、約８Ｇｙ、約１０Ｇｙ、約２０Ｇｙ、約３０Ｇｙ、約４０Ｇｙ、約５０Ｇｙ、約６０Ｇｙ、約７０Ｇｙ、約８０Ｇｙ、約９０Ｇｙ、または約１００Ｇｙであってもよい。有効量は、治療されている癌の種類および病期に応じて変動する。治癒的（根治）症例について、固形上皮腫瘍に対する典型的な線量は、約６０〜約８０Ｇｙの範囲である一方で、リンパ腫腫瘍は、２０〜４０Ｇｙで、典型的に１．８〜２Ｇｙ分割により治療される。補助線量は、典型的に、４５〜６０Ｇｙ前後であり、１．８〜２Ｇｙ分割による。一時緩和的治療法について、線量は、典型的に３０〜６０Ｇｙ前後であり、典型的に約３〜８Ｇｙ／分割、例えば、約５Ｇｙ／分割の、５〜１０分割による。例えば、一時緩和的治療法は、単回線量として投与される約８Ｇｙの総線量を含んでもよく、またはそれは、５Ｇｙ分割により投与される２０Ｇｙの総線量を含んでもよく、またはそれは、３Ｇｙ分割により投与される３０Ｇｙの総線量を含んでもよい。患者が化学療法を受容しているかどうか、放射線療法が外科手術の前それとも後に行われているか、および外科手術の成功度合いを含む、多くの他の要因が、線量を選択するときに考慮されてもよい。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、放射線は、１日当たり２〜８、２〜６、３〜５、４〜６、または約５Ｇｙの線量で送達されるであろう。更に、それは、１分当たり０．２５〜６Ｇｙの速度で送達されてもよい。電離放射線は、１日に２〜２０Ｇｙの総線量による、または１日当たり０．１〜６Ｇｙの範囲で、最大３０日間の、異なる日の分割によるものであってもよい。使用され得る分割線量の他の例は、特定の治療法の文脈において、本明細書に記載される。成人のための典型的な分割スケジュールは、１日当たり１．８〜２Ｇｙ、週５日である。小児のために、典型的な分割サイズは、１日当たり１．５〜１．８Ｇｙであってもよい。幾つかの症例においては、治療クールの終わり近くで、特に、頭頚部腫瘍等の、それらがより小さいときにより迅速に再生する腫瘍に対して、１日当たり２分割が使用される。他の分割スケジュールには、肺癌に対する、連続過分割加速放射線療法（ＣＨＡＲＴ）、および乳癌に対する、加速部分乳房照射（ＡＰＢＩ）が含まれる。ＣＨＡＲＴは、１日当たり３回のより小さい分割量からなる。ＡＰＢＩは、通常、全乳房照射と比較して、１日当たり２回の５日間にわたる高線量分割を伴い、ここで単回のより小さい分割量は、週５回、６〜７週間の期間にわたって与えられる。通常の線量が１日当たり２〜３回与えられる、加速分割もまた使用され得る。
【０１０５】
放射線は、任意の誘導手順によって腫瘍に向けられてもよく、典型的には、治療の直前に撮られるコンピュータ断層撮影（またはＣＴ）画像を伴う。患者の身体は、しばしば、放射線が向けられるべき場所を示すように、皮膚上に印を付けられる。幾つかの施設において、患者はまた、腫瘍が先のＣＴ走査によって示される場所にあることを確認しようとするための追加措置として、身体の型の中に横たわるように位置付けられる。腫瘍のいずれの部分も外すことを回避するために、腫瘍の辺縁が、一般に放射線標的領域に含まれる。
【０１０６】
Ｃａｒｌｏｓ  Ａ  Ｐｅｒｅｚ＆Ｌｕｔｈｅｒ  Ｗ  Ｂｒａｄｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．ＪＢ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ，Ｐｈｉｌａ，１９９２は、本発明において使用することができる放射線療法プロトコルおよびパラメータを記載する。膠芽腫について、Ｓｉｍｐｓｏｎ  Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ（１９９３）２６：２３９−２４４は、本発明の方法において有用な臨床プロトコルを記載する。同様に、Ｂｏｒｇｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ（１９８０）６：１−９は、本発明の方法において有用な臨床プロトコルを記載する。抗血管新生療法を、放射線療法を含む臨床プロトコルに組み込むための他の考慮事項は、Ｓｅｎａｎ＆Ｓｍｉｔ，Ｔｈｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，（２００７）１２：４５６−７７に論じられる。
【０１０７】
併用療法を伴う実施形態では、連帯治療は、治療の個々の構成要素の同時、順次、または別個の投薬を用いて達成されてもよい。投薬スケジュールの例が、実施例を含めて、本明細書に提示される。抗ＤＬＬ４抗体が、別の産物、またはその薬学的に許容される塩と併用されるとき、それは、本明細書に記載される投薬量範囲内で使用され、その他の薬学的活性剤は、その認可される投薬量範囲内で使用される。
【０１０８】
「並行に」という用語は、本明細書で、投与の少なくとも一部が時間的に重複する、２つ以上の治療剤の投与を指すように使用される。したがって、並行投与は、１つ以上の薬剤（複数可）の投与が、１つ以上の他の薬剤（複数可）の投与を中止した後も継続するときの投薬レジメンを含む。更に、「併用」療法または治療は、同時療法を必要としない（しかしそれを除外しない）。例えば、放射線療法が抗ＤＬＬ４抗体治療と組み合わされる実施形態では、放射線療法は、抗ＤＬＬ４抗体治療に先行してもよく、それは、抗ＤＬＬ４抗体治療と並行して投与されてもよく、それは、抗ＤＬＬ４抗体治療と同じ日に投与されてもよく、またはそれは、抗ＤＬＬ４抗体治療の後に投与されてもよい。治療順序に関する更なる詳細は、具体的な治療法の文脈において、および実施例において提供される。
【０１０９】
一実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体およびＩＲ等の放射線療法との併用療法または治療は、相乗効果をもたらす。併用療法は、２つの治療法によってもたらされる転帰が、各治療法によって別個に達成される転帰の合計よりも大きい場合、「相乗的」である。２つの治療法が相乗的であるかどうかを決定するために使用され得る転帰は、実施例におけるものを含めて、本明細書に記載されるものである。例えば、相乗作用は、体内モデルにおいて、腫瘍が治療前のサイズに再成長するために必要とされる時間の遅延、減少した腫瘍血管新生、増加した腫瘍壊死、増加した腫瘍低酸素、減少した転移（その数またはそれまでの時間）、減少した腫瘍体積、減少した腫瘍細胞数、または増加した生存時間から選定される、１つ以上の基準を使用して評価されてもよい。
【０１１０】
本発明の方法は、癌、腫瘍、および他の新生物疾患を治療するために有用である。
【０１１１】
哺乳動物における「癌」は、細胞の異常な、無制御の成長によって引き起こされる、幾つかの病態のいずれかを指す。「癌細胞」と称される、癌を引き起こす能力を有する細胞は、無制御な増殖、不死性、転移能、急速な成長率および増殖率、ならびにある特定の典型的な形態的特長等の、幾つかの特徴的な特性を保有する。しばしば、癌細胞は、腫瘍の形態であろうが、かかる細胞はまた、哺乳動物内に単独で存在する場合もあり、または白血病細胞等の非腫腫瘍形成性癌細胞であり得る。転移は、癌が、それが原発腫瘍として最初に生じた場所から、体内の離れた場所まで拡散するプロセスである。原発腫瘍の拡散からもたらされる癌は、転移、または転移性癌と称されてもよい。癌は、（例えば、臨床的または放射線学的手段によって）腫瘍（単数または複数）の存在を検出すること、腫瘍内のまたは別の生体試料からの（例えば、組織生検からの）細胞を検査すること、癌を示す血液マーカー（例えば、ＣＡ１２５、ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＡＦＰ、ＨＣＧ、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  １５−３、ＣＡ  ２７−２９、ＬＤＨ、ＮＳＥ、およびその他）を測定すること、および癌を示す遺伝子型（例えば、ＴＰ５３、ＡＴＭ等）を検出することを含むが、これらに限定されない、幾つかの方法のいずれにおいても検出することができる。しかしながら、上の検出方法のうちの１つ以上における陰性結果は、必ずしも癌の不在を示すわけではなく、例えば、癌治療に対する完全奏功を示した患者は、その後の再発からも明らかなように、依然として癌を有する場合がある。
【０１１２】
本明細書で使用される「新生物」は、細胞、腫瘍、悪性腫瘍、いぼ、ポリープ、非固形腫瘍、嚢胞および他の腫瘍の任意の異常成長を指す。新生物の部位は、新生細胞、血管内皮、またはマクロファージおよび白血球等等の免疫系細胞を含むが、これらに限定されない、多様な細胞型を含有し得る。
【０１１３】
新生物疾患には、黒色腫、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、膠芽腫、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、および膵臓癌が含まれるが、これらに限定されない。ヒトにおける例となる癌には、膀胱腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、ＣＮＳ癌（例えば、神経膠腫腫瘍）、子宮頸癌、膣癌、絨毛癌、結腸、直腸、肛門管癌、結合組織癌、消化器系の癌；子宮内膜癌、食道癌；眼癌；頭頚部の癌；胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌；上皮内新生物；腎臓癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；黒色腫；骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば、唇、舌、口、および咽頭）；卵巣癌；膵臓癌、網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌、腎臓癌、呼吸器系の癌；肉腫、皮膚癌；胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、精巣癌、甲状腺癌；子宮癌、泌尿器系の癌、ならびに他の癌および肉腫が含まれる。治療することができる腫瘍および新生物の更なる例には、説明および実施例における他の箇所に記載される種類の腫瘍および新生物がある。
【０１１４】
加えて、実施形態は、イヌ、ネコ、および他のペットにおける、癌、腫瘍、新生物、および悪性障害の治療を含む。かかる障害には、リンパ肉腫、骨肉腫、乳腺腫瘍、肥満細胞腫、脳腫瘍、黒色腫、腺扁平細胞癌、カルチノイド肺腫瘍、気管支腺腫瘍、細気管支腺癌、線維腫、粘液軟骨腫、肺肉腫、神経肉腫、骨腫、乳頭腫、網膜芽細胞腫、ユーイング肉腫、ウィルムス腫瘍、バーキットリンパ腫、小神経膠腫、神経芽細胞腫、破骨細胞腫、口腔新生物、繊維肉腫、骨肉腫および横紋筋肉腫、生殖扁平上皮細胞癌、可移植性性器腫瘍、精巣腫瘍、精上皮腫、セルトリ細胞腫瘍、血管外皮細胞腫、組織球腫、緑色腫（例えば、顆粒球性肉腫）、角膜乳頭腫、角膜扁平上皮細胞癌、血管肉腫、胸膜中皮腫、基底細胞腫瘍、胸腺腫、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）腫瘍、副腎癌、口腔乳頭腫症、血管内皮腫および嚢胞腺腫、濾胞性リンパ腫、腸管リンパ肉腫、線維肉腫および肺扁平上皮細胞癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、癌、腫瘍、または新生物を有する患者は、１つ以上の従来の癌治療法が既に奏功しなかった場合があるか、または従来の治療法が禁忌となる場合がある。それらの実施形態のうちの幾つかにおいて、患者は以前に、放射線療法で治療されたことがない、化学療法で治療されたことがない、抗体療法で治療されたことがない、ホルモン療法で治療されたことがない、腫瘍または新生物減量術を受けたことがない、または抗ＤＬＬ４抗体および放射線療法での最初の治療前にそれらの療法のうちの１つ以上の組み合わせを有したことがない。
【０１１６】
他の実施形態では、癌、腫瘍、または新生物を有する患者は、以前に、癌、腫瘍、または新生物に対して治療されたことがない場合がある。これらの患者において、単独でまたは放射線療法との併用療法の一部としてのいずれかによる、抗ＤＬＬ４抗体での治療は、癌、腫瘍、または新生物に対する初期の治療においてであってもよい。
【０１１７】
放射線療法、化学療法、抗体療法、ホルモン療法、または減量術での治療に加えて、抗ＤＬＬ４抗体が、癌、腫瘍、または新生物を有する患者に投与される実施形態において、抗ＤＬＬ４抗体は、仮に他の治療が単独で施与された場合に得られたであろう転帰を改善する。「改善された転帰」は、増加した無病生存時間、増加した無増悪生存時間、または増加した全体的な生存時間によって判断されてもよい。「無病生存（ＤＦＳ）」は、患者が、癌の復活なしに、治療の開始からまたは最初の診断から約１年間、約２年間、約３年間、約４年間、約５年間、約１０年間等の規定の一定期間にわたって、生存して留まることを指す。ＤＦＳの分析に使用される事象は、癌の局所、局部、および遠隔再発、続発癌の出現、ならびに前の事象（例えば、乳癌再発または第２の原発癌）を伴わない任意の原因による患者の死亡を含むことができる。これらの基準を同様に使用して、治療法の組み合わせが相乗的であるかどうかを決定してもよい。抗ＤＬＬ４抗体および放射線療法を含む併用治療の有効性を示す更なる基準は、実施例に記載される。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ．Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ（２０１１）７９（５）：１４８７−９５に記載される、神経系の放射線壊死の症状または重症度の低減もまた、ＩＲと組み合わせた抗ＤＬＬ４抗体の投与後の改善された転帰の尺度として使用され得る。
【０１１９】
故に、一態様では、本発明は、抗ＤＬＬ４抗体を電離放射線（ＩＲ）と組み合わせて投与することによって、結腸直腸癌を治療する方法を提供する。幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体の最初の線量は、ＩＲの最初の線量の後に投与される。他の実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体の最初の線量は、ＩＲの前に投与される。さらに他の実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体の最初の線量およびＩＲの最初の線量は、同じ日に投与される。幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体は、既存のプロトコルに組み込まれ、それは、抗血管新生剤での治療に加えて、またはその代わりに使用される。故に、一実施形態では、本明細書に記載される線量での抗ＤＬＬ４抗体は、Ｋｏｕｋｏｕａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２００９）１５（２２）：７０６９−７６に記載されるプロトコルにおいて、ベバシズマブの代わりに使用され、ここで結腸直腸癌は、進行性の、手術不可能な結腸直腸癌であり、治療スケジュールは、アミホスチン、カペシタビン（毎日６００ｍｇ／ｍ２、５日／週）により補助される、少分割（３．４Ｇｙ／分割×１５）スプリットコース加速放射線療法（およそ６７Ｇｙの生物学的線量当量）を含む。一実施形態では、治療は、抗ＤＬＬ４抗体の追加を伴わない同じプロトコルと比較して、改善された全体的な生存時間、または改善された全体的な生存率、または改善された無増悪生存時間をもたらす。
【０１２０】
別の態様では、本発明は、抗ＤＬＬ４抗体を電離放射線（ＩＲ）と組み合わせて投与することによって、膵臓癌を治療する方法を提供する。幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体の最初の線量は、ＩＲの最初の線量の後に投与される。他の実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体の最初の線量は、ＩＲの前に投与される。さらに他の実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体の最初の線量およびＩＲの最初の線量は、同じ日に投与される。幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体は、既存のプロトコルに組み込まれる。故に、一実施形態では、電離放射線および抗ＤＬＬ４抗体は、ゲムシタビンと組み合わせて投与される。別の実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体は、抗血管新生剤での治療に加えて、またはその代わりに使用される。例えば、一実施形態では、本明細書に記載される線量およびスケジュールでの抗ＤＬＬ４抗体は、Ｐｉｃｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｏｎｃｏｌ．（２０１１）２２：３４８〜５４に記載されるプロトコルに追加され、ここで膵臓癌は、切除された膵臓腺癌であり、治療スケジュールは、５．５週周期の分割（１．８Ｇｙ／分割×２８）放射線療法（およそ５０Ｇｙの生物学的線量当量）を５日／週、５．５週間にわたって；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）を継続的に３８日間連続で１７５ｍｇ  ｍ２／日で注入；シスプラチン（静脈内３０ｍｇ／ｍ２）を毎週、５．５週周期の各週の最初の日に；インターフェロンアルファ−２ｂ（３百万単位）を皮下により、５．５週周期の各週の１、３、および５日目に与えることを含む。更なる周期の５−ＦＵが、合間に２週間の休止を用いながら追加されてもよい。一実施形態では、治療は、抗ＤＬＬ４抗体の追加を伴わない同じプロトコルと比較して、改善された全体的な生存時間、または改善された全体的な生存率、または改善された無増悪生存時間をもたらす。
【０１２１】
さらに別の態様では、本発明は、抗ＤＬＬ４抗体を電離放射線（ＩＲ）と組み合わせて投与することによって、多形膠芽腫等の脳癌を治療する方法を提供する。幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体の最初の線量は、ＩＲの最初の線量の後に投与される。他の実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体の最初の線量は、ＩＲの前に投与される。さらに他の実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体の最初の線量およびＩＲの最初の線量は、同じ日に投与される。幾つかの実施形態では、抗ＤＬＬ４抗体は、既存のプロトコルに組み込まれ、それは、抗血管新生剤での治療に加えて、またはその代わりに使用される。故に、一実施形態では、本明細書に記載される線量での抗ＤＬＬ４抗体は、Ｌａｉ  ｅ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１１）２９（２）：１４２−４８に記載されるプロトコルにおいて、ベバシズマブの代わりに使用され、ここで脳癌は、新たに診断された多形膠芽腫であり、治療スケジュールは、１０ｍｇ／ｋｇの隔週の抗体療法を静脈内投与、および７５ｍｇ／ｍ２テモゾロミド（ＴＭＺ）を、分割（２．０Ｇｙ／分割×３０；およそ６０Ｇｙ）を含む６週間の放射線療法期（外科手術の３〜６週間後に開始）中に経口投与することを含む。放射線療法の完了後、抗体療法を２週間毎で継続する。最後のＴＭＺ用量から２週間の最低限の間隔の後、患者は、隔週、抗体で、および４週間毎に、各２８日周期の最初の５日間１５０〜２００ｍｇ／ｍ２／日のＴＭＺで、進行するまで、または最大で２４周期にわたって治療され、その時点で、非進行患者は、抗体療法を進行するまで２週間毎で継続する。別の実施形態では、ベバシズマブが保持され、抗ＤＬＬ４抗体が、本明細書に記載される線量およびスケジュールでプロトコルに追加される。さらに別の実施形態では、放射線と組み合わせた抗ＤＬＬ４抗体は、再発性膠芽腫における疾患進行時に、Ｂｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ（２０１１）Ｊａｎ  ７：６：２に記載される放射線療法プロトコルのうちの１つを用いて使用される。一実施形態では、治療は、抗ＤＬＬ４抗体の追加を伴わない同じプロトコルと比較して、改善された全体的な生存時間、または改善された全体的な生存率、または改善された無増悪生存時間をもたらす。
【０１２２】
実施例
次の実施例は、行われた実験および達成された結果を含めて、例示目的のために提供されるにすぎず、本明細書の教示を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１２３】
実施例１から実施例６に記載される試験は、ノッチリガンドであるＤＬＬ４を内在性で発現する、ヒト結腸直腸癌異種移植系を利用して、腫瘍灌流および成長に対する、（ＧＳＩを介した）広範囲のノッチ遮断または選択的ＤＬＬ４−ノッチ遮断と、電離放射線（ＩＲ）との相互作用を探索した。
【０１２４】
統計的分析
別途注記されない限り、データは、平均および標準誤差として提示される。統計的有意性を、一元配置分散分析を使用して、Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定を用いてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍプログラムバージョン４．０（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア，ＵＳＡ）において決定し、ｐ＜０．０５の値を統計的に有意と見なした。
【実施例１】
【０１２５】
ノッチシグナル伝達阻害剤および細胞株
【０１２６】
ノッチシグナル伝達阻害剤
複数の抗ＤＬＬ４抗体の産生は、Ｖｅｈｅ  Ｂｅｄｉａｎ、Ｄａｖｉｄ  Ｊｅｎｋｉｎｓ、およびＩａｎ  Ｆｏｌｔｚによる米国特許第２０１０／０１９６３８５号、「ＤＬＬ４に向けられる標的型結合剤およびその使用」に詳述され、それはまた、国際公開第２０１０／０３２０６０号としても公開されている。それらの刊行物の各々は、参照によりその全体が組み込まれる。それらの抗ＤＬＬ４抗体のうちの１つである、ヒト抗体２Ａ５を、これに続く実施例において使用したが（ここでそれは「ＤＬＬ４  ｍＡｂ」と称される）、その使用は、例となるものにすぎない。
【０１２７】
ジベンザゼピン（ＤＢＺ）は、事実上全てのノッチシグナル伝達を遮断するために使用され得る、γ−セクレターゼ阻害剤である。しかしながら、γ−セクレターゼは、ノッチ受容体に加えて、広範な潜在的基質を有する（Ｆｏｒｔｉｎｉ  ＭＥ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００２，３（９）：６７３−８４）。
【０１２８】
細胞株
無傷ノッチシグナル伝達に対するモデル結腸直腸癌細胞株を特定および検証するために、Ｏｎｃｏｍｉｎｅ（ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｏｒｇ）を使用して、ＤＬＬ４発現に対するＷｏｏｓｔｅｒ細胞株パネルをスクリーニングした（データは示されず）。ＤＬＬ４発現は、ＬＳ１７４Ｔ、ＨＣＴ−１５、およびＣＯＬＯ  ２０１を含む、複数の結腸直腸腺癌細胞株において予測された。ＬＳ１７４Ｔ、ＬＳ１８０（ＬＳ１７４Ｔをもたらす細胞株）、ＣＯＬＯ  ２０５（ＣＯＬＯ  ２０１と同じ患者に由来する細胞株）、ＨＣＴ−１５ヒト結腸腺癌細胞株、およびＦａＤｕヒト下咽頭扁平上皮細胞癌細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した（それぞれ、ＣＬ−１８８、ＣＬ−１８７、ＣＣＬ−２２２、ＣＣＬ−２２５、ＨＴＢ−４３）。細胞株を、１０％ウシ胎児血清（Ｌｏｎｚａ）、およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１０％ＤＭＥＭ）を補充した、４．５ｇ／Ｌグルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地中で培養し、インキュベーター中で５％  ＣＯ２と共に３７℃で維持した。それらがおよそ８０％培養密度に到達したとき、それらを継代し、それらを定期的に試験してマイコプラズマ汚染の不在を確実にした（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ，Ｌｏｎｚａ）。細胞形態を定期的に確認して、細胞株の相互汚染の不在を確実にした。
【実施例２】
【０１２９】
ＤＬＬ４は、主要なノッチシグナル伝達リガンドである
【０１３０】
結腸直腸腺癌株ＣＯＬＯ  ２０５、ＬＳ１７４Ｔ、ＬＳ１８０、およびＨＣＴ−１５を、ＤＬＬ４および他のノッチ受容体の発現について、ウェスタンブロッティングによって分析した。細胞を、リン酸緩衝食塩水で１回すすぎ、次いで、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）、およびホスファターゼ阻害剤（１ｍＭ  ＮａＦ、２．５ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム）を含有する、氷冷ＲＩＰＡ溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）中に溶解させ、１分間超音波処理し、溶解物を１６，５００ＲＰＭで、４℃で１０分間、遠心分離によって清澄化した。タンパク質溶解物濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって決定し、２５〜３０μｇの溶解物を、ＳＤＳ試料緩衝液（５８ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１．７１％ＳＤＳ、０．８３％β−メルカプトエタノール、グリセロール６％、０．００２％ブロモフェノールブルー）中、１００℃で５分間変性させ、タンパク質を、Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動的に分解した。タンパク質を、ポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に湿式転写し、膜を、ＴＢＳＴ（１０ｍＭトリス塩基、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中の５％脱脂粉乳中で、室温で１時間遮断し、次いで５％乳／ＴＢＳＴ中の一次抗体と共に、４℃で一晩、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。ＴＢＳＴの３回の洗浄を、各々１０分間行い、続いて対応する二次抗体を、５％乳／ＴＢＳＴ中、西洋ワサビペルオキシダーゼに室温で１時間複合体化し、続いて３回の１０分間のＴＢＳＴ洗浄を行った。ウェスタンブロットを、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で可視化し、続いてＸ線フィルム（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）への曝露を行った。一次抗ＤＬＬ４、抗ジャグド１、抗ノッチ１  ＩＣＤ、抗ノッチ１、２、および３ラビットポリクローナル抗体を、１：１０００希釈で使用し（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ノッチ４ラビットポリクローナルを、１：２００希釈で使用し、抗β−アクチンヤギポリクローナルを、１：６０００希釈で使用した（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【０１３１】
ＤＬＬ４は、ＣＯＬＯ  ２０５、ＬＳ１７４Ｔ、およびＬＳ１８０中で高度に発現され、ＨＣＴ−１５中で、低レベルで発現された（図１Ａ）。ＬＳ１７４Ｔ細胞はまた、４つ全てのノッチ受容体を発現した（図１Ｂ、左上および下パネル）。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、ＤＭＳＯまたはＤＢＺ（２または２０ｎＭ）と共にインキュベートし、次いでノッチ１およびノッチ１ＩＣＤについて免疫ブロットしたとき、ガンマ−セクレターゼ阻害剤ＤＢＺは、Ｎ１ＩＣＤの産生を用量依存性様態で阻害した（図１Ｂ、左パネル）。均等な負荷量を、免疫ブロッティングによりβ−アクチンについて確認した。ＬＳ１７４Ｔ細胞の、ＤＢＺ（２０ｎＭ）またはＤＬＬ４  ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）での一晩の処置は、ＤＬＬ４発現の上方調節をもたらした（図１Ｂ、右パネル）。ＤＢＺおよびＤＬＬ４  ｍＡｂは、ＤＬＬ４タンパク質レベルにおける増加を引き起こしたが、それは、ノッチシグナル伝達がＤＬＬ４発現を負に調節し得ることを示唆している（図１Ｂ、右上のパネル）。ＬＳ１７４Ｔ細胞はまた、ジャグド１を発現するが、ＤＬＬ４とは対照的に、このノッチリガンドの発現は、ＤＢＺまたはＤＬＬ４  ｍＡｂによって影響を受けない（図１Ｂ、右上のパネル）。
【０１３２】
安定なノッチレポーター細胞株を生成するために、ＬＳ１７４Ｔ細胞を、複数のノッチＲＢＰ−ｊＫ応答要素がホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現を主導する（ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ミニマルプロモーターを含有するレンチウイルスに感染させた。安定なプールされた株を、ピューロマイシン選択（２μｇ／ｍＬ）によって樹立させた。結果として生じるＬＳ１７４Ｔノッチｌｕｃ細胞を次いで、組換えＤＬＬ４に応答したルシフェラーゼ活性について、阻害剤の存在または不在下で査定した。簡潔に述べると、ノッチルシフェラーゼレポーターを安定に発現する細胞株を、以前に記載されたように（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２００８，７５（２）：１４４−５４）ＢＳＡまたは組換えＤＬＬ４（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）であらかじめコーティングされた２４ウェル皿上で、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、マウスアイソタイプＩｇＧ１（１μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＤＢＺ（２０ｎＭ）、またはＤＬＬ４  ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）を含有する、１０％ＤＭＥＭ中に２４時間播種した。ノッチルシフェラーゼ活性を査定するために、Ｄ−ルシフェリン（１５０μｇ／ｍＬ、Ｇｏｌｄ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、培地に２分間添加し、発光読み取りをＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ２００（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で捕捉し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３．０ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
【０１３３】
図１Ｃに示されるように、基底レベルおよびＤＬＬ４誘導性ノッチ活性は、ＤＢＺによっておよびＤＬＬ４  ｍＡｂによって抑止された。棒グラフは、ノッチルシフェラーゼ活性（ＤＬＬ４コーティングプレートをＢＳＡコーティングプレートに対して正規化）の倍率変化を示し、標準誤差が示される。「＊」は、ＤＭＳＯ対照と比較した有意な差異（ｐ＜０．０１）を表す。図１ｃの下パネルは、ノッチルシフェラーゼ活性の「ヒートマップ」を示す。ＤＬＬ４  ｍＡｂは、ＤＢＺと同等の様態でノッチ活性を阻害したが、それはＤＬＬ４がこれらの細胞における主要なノッチシグナル伝達リガンドであることを示している。
【実施例３】
【０１３４】
ノッチ遮断は、増殖またはアポトーシスに影響を及ぼさない
【０１３５】
ガンマ−セクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）は、ある特定の腫瘍細胞の増殖を減少させること、およびアポトーシスを促進するが報告されている（Ｓｕｗａｎｊｕｎｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ２００８，１９（５）：４７７−８６、Ｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０，７０（６）：２４７６−８４、Ｆａｎ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００９，２８（１）：５−１６、Ｒａｓｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９，１００（１２）：１８７９−８８、Ｃｕｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００５，２４（４２）：６３３３−４４）。ＬＳ１７４Ｔ細胞を、ビヒクル、ＤＢＺ（２０ｎＭ）、またはＤＬＬ４  ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）と共に三重でインキュベートし、５日後、細胞の総数をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ−１００（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ）により計数し、ビヒクル処置試料において計数された細胞の総数で除して、倍率変化を得た。平均および標準誤差をプロットした。この実例において、ＤＢＺは、増殖を、無処置ＬＳ１７４Ｔ細胞と比べておよそ２５％減少させたが、これは、統計的に有意でなかった（ｐ＝０．０６５）（図２Ａ）。同様に、ＤＬＬ４  ｍＡｂは、増殖の統計的に有意な低減を引き起こさなかった（図２Ａ）。
【０１３６】
アポトーシスが培養物中で誘導されたかどうかをアッセイするために、ＬＳ１７４Ｔ細胞を、ビヒクル、ＤＢＺ（２０ｎＭ）、またはＤＬＬ４  ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）を有する白壁９６ウェル中に三重で播種し、偽照射したか、または５Ｇｙ線量のＩＲで照射した。アポトーシスの陽性対照として、ＬＳ１７４Ｔ細胞を、５０ｎＭ組換えＴＲＡＩＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に２時間インキュベートした。アポトーシスを、製造業者の指示によりＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７アッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して定量化した。ＴＲＡＩＬ処置がアポトーシスの大幅な増加をもたらした一方で、ＤＢＺおよびＤＬＬ４  ｍＡｂによるノッチ遮断は、単独であろうとＩＲ処置と組み合わせてであろうと、体外で有意に増加したアポトーシスをもたらさなかった（図２Ｂ）。
【実施例４】
【０１３７】
ノッチシグナル伝達は、電離放射線によって阻害されるが、ノッチ遮断は、放射線増感に寄与しない
【０１３８】
ＧＳＩは、神経膠腫幹細胞を放射線感作することが報告されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００９，２８（１）：１７−２８）。したがって、ＤＢＺまたはＤＬＬ４遮断によるノッチ阻害を、体外でのＬＳ１７４Ｔ細胞の放射線増感について試験した。クローン原性生存アッセイのために、細胞を計数し、ビヒクル（ＤＭＳＯ）、ＤＢＺ（２０ｎＭ）、またはＤＬＬ４  ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ）を含有する１０％ＤＭＥＭ中、低密度で、三重で播種し、次いで偽照射したか、または２、４、もしくは６Ｇｙ線量のＩＲにより、ＩＢＬ６３４セシウム照射器（ＣＩＳ  Ｂｉｏｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して、０．６６Ｇｙ／分の線量率で照射した。１４〜２１日後、コロニーをクリスタルバイオレットで染色し、計数した。以前に記載されたように（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌ．２００８，８８（２）：２５８〜６８）、生存率をプロットし、データを線形二次方程式にモデル化した。
【０１３９】
ＤＢＺまたはＤＬＬ４  ｍＡｂ遮断によるノッチ阻害は、体外でＬＳ１７４Ｔ細胞を有意に放射線増感しなかった（図３Ａ）。平均および標準誤差バーが示される。しかしながら、２４時間後に測定すると、偽ＩＲ対照と比較して、６Ｇｙ線量のＩＲ後にノッチ活性の有意な低減が存在した（「＊」は、ｐ＜０．０５を表す）（図３Ｂ）。ノッチ活性の低減は、細胞数の低減に起因していなかった（データは示されず）。このＩＲの線量はまた、ウェスタンブロッティングによって査定されたとき、ＤＬＬ４およびＮ１  ＩＣＤレベルの低減ももたらしたが（データは示されず）、それはＩＲによるノッチ活性の結果として生じる抑制を部分的に説明し得る。故に、ＩＲはノッチシグナル伝達を下方調節するが、この経路は、ＬＳ１７４Ｔ結腸直腸癌細胞の関連において、ＩＲ後のクローン原性生存における関連性のある役割を果たさない。
【実施例５】
【０１４０】
広範囲のノッチ阻害およびＤＬＬ４遮断は、ＩＲと協同する
【０１４１】
この一連の実験は、腫瘍異種移植モデルにおいて、広範囲のノッチ阻害剤またはＤＬＬ４の、ＩＲと協同する能力を検査した。マウスを伴う全ての実験を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｘｆｏｒｄ機関ガイドラインに従って、英国内務省によって発行されるプロジェクトライセンスの制限内で、ならびに癌研究における動物の愛護および使用についてのガイドライン（Ｗｏｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１０２（１１）：１５５５−７７）に準拠して行った。ＬＳ１７４Ｔノッチルシフェラーゼ細胞株を、皮下異種移植片として、ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスにおいて成長させた。以前に、他の者によって、ＬＳ１７４Ｔ異種移植片が、患者の結腸癌試料に酷似する異種腫瘍脈管構造を有することが示されていることから（Ｅｌ  Ｅｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７，６７（２４）：１１８９６−９０５、Ｆｏｌａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．２０１０，８０（１）：８９−９８）、これは抗血管新生療法を調査するための関連性のある前臨床モデルである。ノッチ阻害は、非機能的な血管新生を促進することができ、それは、理論上、事前に与えられる場合、増加した腫瘍低酸素に起因して、ＩＲの有効性を減少し得る。同様に、ＤＬＬ４遮断は、腫瘍低酸素を増加させることが知られ、それは、ＩＲの効果に拮抗し得る。したがって、この最初の実験のために、ＤＢＺ処置およびＤＬＬ４  ｍＡｂ処置の両方を、組み合わせた群について、ＩＲに続くように順序付けた。
【０１４２】
簡潔に述べると、１０×１０６  ＬＳ１７４Ｔノッチｌｕｃ細胞を、マトリゲルと１：１比率で混合し、６〜７週齢のメスＢＡＬＢ／Ｃヌードマウス（ＨａｒｌａｎまたはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）の右脇腹中に皮下注射した。腫瘍体積を、変形楕円式（体積＝長さ×幅２÷２）によって決定した。異種移植腫瘍がおよそ１００ｍｍ３体積に到達したとき、マウスを、ビヒクル群または実験群に無作為化した。ＤＢＺを、０．５％Ｍｅｔｈｏｃｅｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０中に溶解させ、次いで、３日毎に、１日目から開始して総計５回用量にわたって、または１日目のＩＲの３０分後に、腹腔内注射（８．１ｕＭ／ｋｇ）した。抗ＤＬＬ４遮断モノクローナル抗体（ＤＬＬ４  ｍＡｂ）を、１日目から開始して、または１日目のＩＲの３０分後に、腹腔内注射（５ｍｇ／ｋｇ）し、注射を週２回継続した。照射のために、マウスを麻酔し、専用の真ちゅうジグ中に配置して、身体の残りの部分を遮蔽しながら腫瘍を曝露し、腫瘍を、Ｇｕｌｍａｙ  ＲＳ３２０（Ｇｕｌｍａｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｔｄ．）によって発生されるＸ線で、５Ｇｙの線量まで照射した。「ＤＢＺ実験」において、群は、ビヒクル、ＤＢＺ、５Ｇｙ  ＩＲ、およびＤＢＺとの５Ｇｙ  ＩＲであった。「ＤＬＬ４  ｍＡｂ実験」において、群は、ビヒクル、ＤＬＬ４  ｍＡｂ、５Ｇｙ  ＩＲ、およびＤＬＬ４  ｍＡｂとの５Ｇｙ  ＩＲであった。
【０１４３】
体内ノッチ活性
１日目（処置前）および２日目（処置後）に、各群からの３匹のマウスに対して、体内ルシフェラーゼ画像解析を行って、異種移植腫瘍におけるノッチレポーター活性を査定した。このアッセイにおいて、マウスを２％イソフルランにより麻酔し、ＩＶＩＳ  ２００（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）室の中に配置し、麻酔を２％イソフルランにより維持した。画像解析の５分前に、Ｄ−ルシフェリンを、腹腔内注射（１５０ｍｇ／ｋｇ、Ｇｏｌｄ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって与えた。画像取得について、パラメータは、ｆ／ストップ１、ビン（ｂｉｎ）Ｍｅｄ、曝露時間１分間であった。シグナル強度を、腫瘍部位にわたって位置付けられる関心領域内の総光子／秒として定量化した。結果を、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ３．０ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
【０１４４】
図４は、この実験についての画像およびグラフデータを提示する。左上のパネルは、ベースラインおよびビヒクル、ＤＢＺ、５Ｇｙ  ＩＲ、または５Ｇｙ  ＩＲおよびＤＢＺ処置の２４時間後を示す。左下のパネルは、ベースラインおよびビヒクル、ＤＬＬ４  ｍＡｂ、５Ｇｙ  ＩＲ、または５Ｇｙ  ＩＲおよびＤＬＬ４  ｍＡｂ処置の２４時間後を示す。各パネルにおいて、腫瘍に重なる「ヒートマップ」は、相対的ノッチ活性を表示し、それは処置後に低減される。１群当たり３〜５匹のマウスから生成される、ノッチルシフェラーゼ活性の平均倍率変化が、棒グラフ形態で示される（右パネル）。ビヒクル処置マウスは、ノッチルシフェラーゼ活性の変化を何ら示さなかった。ＤＢＺ処置またはＤＢＺおよびＩＲ処置は、活性を、それぞれ、ベースラインの２８±９％および３５±５％まで阻害し、それらは双方とも、ビヒクルと比較して有意であった（ｐ＜０．０１）。単独でのＩＲもまた、腫瘍におけるノッチレポータールシフェラーゼを、ベースラインルシフェラーゼの４４±２１％まで有意に低減した（ｐ＜０．０５）。ノッチシグナル伝達のより選択的な阻害剤を査定するために、異種移植片実験をＤＬＬ４  ｍＡｂにより反復した。体外データと一致して、ＤＬＬ４  ｍＡｂ処置またはＤＬＬ４  ｍＡｂおよびＩＲ処置は、体内ノッチルシフェラーゼ活性を、それぞれ、ベースラインの４１±１４％および３６±３％まで阻害した。
【０１４５】
腫瘍成長遅延
図５は、腫瘍体積が治療クールと比べて日単位で示される、生存グラフを提示する。皮下ＬＳ１７４Ｔノッチｌｕｃ異種移植片を担持するマウスを、腫瘍体積がおよそ１００ｍｍ３（すなわち、１日目）であったとき、ビヒクル群または治療群に無作為化し、腫瘍体積をカリパス測定によって１〜３日毎に決定した。上のグラフに示される「ＤＢＺ実験」において、群は、ビヒクル、ＤＢＺ、５Ｇｙ  ＩＲ、またはＤＢＺとの５Ｇｙ  ＩＲであった。ＤＢＺを、１日目に、次いで３日毎に、総計５回用量にわたって投与した。下のグラフに示される「ＤＬＬ４  ｍＡｂ実験」において、群は、ビヒクル、ＤＬＬ４  ｍＡｂ、５Ｇｙ  ＩＲ、またはＤＬＬ４  ｍＡｂとの５Ｇｙ  ＩＲであった。ＤＬＬ４  ｍＡｂを実験の持続期間にわたって週２回与えた。図５に示される生存グラフにおいて、ＩＲおよびノッチ阻害剤処置のタイミングが、時間軸上の矢頭によって図示される。腫瘍体積を１日目の腫瘍体積と比べて正規化し、平均正規化腫瘍体積および標準偏差を生存曲線上にプロットした。マウスを、それらの正規化腫瘍体積が、各生存曲線上の点線として示される、開始体積の４倍（ＲＴＶ４）に到達したときに屠殺した。各群におけるマウスの総数が、括弧内の凡例として示される。各群についての、腫瘍がＲＴＶ４に到達する平均時間および標準偏差が、棒グラフで示される。点線は、ビヒクル処置腫瘍についてのＲＴＶ４を示し、それぞれの棒がこの線を上回る程度は、腫瘍成長遅延に対応する。
【０１４６】
ＤＢＺ実験についての数値結果が、表１に提示される。
【表１】
2014523421.tif 000005
【０１４７】
ＤＢＺ実験において、ビヒクル群における腫瘍体積がＲＴＶ４に到達する平均時間は、７．１±０．６日間であり、ＤＢＺで処置されたマウスについて、それは９．５±１．４日間であり、統計的に有意でない差異であった。ＩＲ群は、ＲＴＶ４に到達するのに平均１５．１±２．７日間かかり、その腫瘍成長遅延は８±２．８日間であり、それはビヒクルまたはＤＢＺのいずれかよりも有意に長かった（ｐ＜０．００１）。組み合わせたＤＢＺおよびＩＲ処置は、２４．４±１．８日間でＲＴＶ４に到達した（単独で与えられた処置のいずれよりも有意に長い、ｐ＜０．００１）、１７．３±１．９日間の腫瘍成長遅延をもたらした。組み合わせた結果は、腫瘍成長を遅延させることにおいて、個々の処置についての相加的作用を上回った。
【０１４８】
ＤＬＬ４  ｍＡｂ実験についての数値結果が、表２に提示される。
【表２】
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【０１４９】
ＤＬＬ４  ｍＡｂ実験において、ビヒクル群における腫瘍は、６．８±０．２日間でＲＴＶ４に到達した。単剤治療として、ＤＬＬ４遮断は、１６．４±１．４日間でＲＴＶ４に到達し、９．６±１．４日間の成長遅延をもたらした。故に、ＤＬＬ４遮断は、腫瘍成長遅延を延長することにおいて、ＤＢＺよりも有効であった。実際、この実験におけるＩＲ処置は、１７．３８±０．５日間でＲＴＶ４に到達し、１０．６±０．５日間の腫瘍成長遅延をもたらしたため、成長遅延におけるＤＬＬ４処置とＩＲ処置との間の統計的に有意な差異は何ら存在しなかった。併用治療は、４４．３±２．３日間でＲＴＶ４に到達し、３７．５±２．３日間の著しい腫瘍成長遅延をもたらした（ｐ＜０．００１）。これは、ＤＢＺおよびＩＲ併用治療により観察された１７．３±１．９日間の腫瘍成長遅延の２倍を超えた。したがって、広範囲のノッチ阻害剤および選択的ＤＬＬ４阻害剤の両方が、ＩＲと組み合わされたとき相乗的であったが、ＤＬＬ４阻害剤は、より優れた効果をもたらした。
【０１５０】
腫瘍灌流
腫瘍灌流に対する処置効果をリアルタイムで監視するために、各試験群からのＬＳ１７４Ｔノッチｌｕｃ異種移植片を担持する３匹のマウスに対して、１日目に（腫瘍がおよそ１００ｍｍ３であったときの処置前）、または処置後５日目もしくは７日目に、マイクロバブル造影超音波画像解析を行った。腫瘍灌流をＶｅｖｏ  ７７０  Ｍｉｃｒｏ−Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄプラットフォーム（Ｖｉｓｕａｌｓｏｎｉｃｓ）により、ＲＭＶ−７０４プローブを用いて、製造業者の指示に従って造影マイクロバブル（Ｖｅｖｏ  ＭｉｃｒｏＭａｒｋｅｒ  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ）を使用した画像強調によって評価した。各試験のために、新鮮なバイアルを食塩水で調製した。マイクロバブル（１×１０８）を、ボーラスとして５０μＬの体積で、２７ゲージの皮下注射針を介して外側尾静脈中に、直接可視化のもとで注射した。マイクロバブルの投与前に、ベースライン画像配列を、４０ＭＨｚの周波数の造影モードで取得した。これに続いて、マイクロバブル注射の直前にダイナミックシーケンスを４０秒間開始し、総計５５０フレームで取得した。関心領域（ＲＯＩ）を描出し、ベースライン本来の造影強度、および定量的灌流も同様に考慮しながら、取得された画像を加工した。造影動力学分析を、組み込まれている（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）Ｖｅｖｏ  ７７０ソフトウェア（ｖ．２．２３）を使用して行って、マイクロバブル流入の勾配およびマグニチュードを査定した。ＲＯＩから算出された相対的腫瘍血流を、無処置（対照）群に対して正規化した。
【０１５１】
図６、図９Ａ、および図９Ｃは、各腫瘍の輪郭を描く関心領域（ＲＯＩ）内のマイクロバブルの数に比例する、マイクロバブル造影剤（緑色シグナル）によって描写される灌流を示す。各組のマイクロバブル画像について、相対的腫瘍血流値を、ビヒクル（対照）群に対して正規化し、３つの独立した実験から導出した平均および標準誤差を棒グラフで示す。ＤＢＺ実験の１日目および７日目についての結果が、図９Ａに示される。ＤＬＬ４  ｍＡｂ実験について、図６は、１日目および５日目についての結果を提示するが、図９Ｃは、１日目を３日目と比較する。
【０１５２】
ＤＢＺ（図９Ａ、７日目）またはＤＬＬ４  ｍＡｂ（図６、５日目）のいずれかでの処置は、ビヒクル群と比べて、それぞれ３８．９±７．４％および２９．５±３．５％までの、腫瘍灌流の有意な低減をもたらした（ｐ＜０．０１）。我々は、早くも４８時間で、ＤＬＬ４  ｍＡｂ処置によって引き起こされる低減された腫瘍灌流を観察した（図９Ｃ）。３日目、ＤＢＺ実験およびＤＬＬ４  ｍＡｂ実験の両方に対して、造影動力学分析を行ったとき、総造影シグナルおよび１秒当たりの造影シグナル率は、マイクロバブル流入の低減された勾配および大きさによって示されるように、双方について減少した（図９Ｂ）。ＩＲ単独で処置された腫瘍は、腫瘍灌流におけるいずれの有意な変化も示さなかった（図５、９Ａ、および９ＣにおけるＩＲ群を比較されたい）。故に、ＤＬＬ４−ノッチ軸の広範囲のノッチ阻害または中断は、照射腫瘍および未照射腫瘍の両方において腫瘍灌流を顕著に妨害する。
【０１５３】
ＣＤ３１免疫組織化学、血管数、および共焦点顕微鏡
ＤＢＺ実験群およびＤＬＬ４  ｍＡｂ実験群におけるＬＳ１７４Ｔ異種移植片を担持するマウスを、腫瘍体積がＲＴＶ４に到達したときに屠殺し、腫瘍を、抗ＣＤ３１抗体での免疫組織化学（ＩＨＣ）のために切除した。微小血管計数を次いで、腫瘍切片に対して行った。ＩＨＣのために、切除された腫瘍を、４％パラホルムアルデヒド中に即座に配置して４℃で一晩、２５％グルコース中（ＰＢＳ中）に移して４℃で更に２４時間、次いでドライアイス上で冷却されたイソペンタン中で急速冷凍し、薄片化するまで−８０℃の冷凍庫で保管した。ＣＤ３１染色のために、ラット抗マウスＣＤ３１（１：２０希釈、クローンＳＺ３１、Ｄｉａｎｏｖａ）を使用した。抗原性賦活化を、標的賦活化溶液（Ｓ１７００，Ｄａｋｏ）中で、Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ＣＡ）を使用して行った。切片を、ＰＢＳ中０．３％過酸化水素で２０分間、続いてブロッキング緩衝液（下を参照）で３０分間、およびブロッキング緩衝液中の一次抗体で１時間、前処理した。結合した抗体を、ＨＲＰ複合型ラビット抗ラットＩｇＧ（１：１００希釈、Ｄａｋｏ，ＵＫ）で標識し、２，３−ジアミノベンジジン色素原を使用して可視化し、ヘマトキシリンで対比染色した。Ｃｈａｌｋｌｅｙ血管計数を、Ｃｈａｌｋｌｅｙポイントアイピースグラチクルを用いて、１腫瘍につき最低３つの血管「ホットスポット」に対して２人の観察者（Ｓ．Ｋ．ＬおよびＳ．Ｂ．）によって、以前に記載されたように行った（Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．１９９４，２９（１）：１０９−１６）。
【０１５４】
抗ＣＤ３１抗体を使用したＩＨＣが、２００倍で、図７Ａ、左パネルに示される。Ｃｈａｌｋｌｅｙ血管計数を、１群当たり最低３つの腫瘍に対して行って、腫瘍微小血管構造を定量化し、平均値および標準誤差が、図７Ａにおいて棒グラフで示される。ＤＢＺ（ｐ＜０．０５）、ＤＬＬ４  ｍＡｂ（ｐ＜０．００１）、ならびにＤＬＬ４  ｍＡｂおよびＩＲ（ｐ＜０．０５）での処置後に、血管数における有意な増加が存在した。血管数は、ＤＢＺよりも、ＤＬＬ４  ｍＡｂで大幅に増加した（Ｃｈａｌｋｌｅｙ血管計数は、ＤＢＺ処置についての５．９±０．２対ＤＬＬ４  ｍＡｂ処置についての９．９±０．５）。
【０１５５】
腫瘍脈管構造の共焦点顕微鏡および３Ｄ再構築のために、ＤＢＺ実験からのおよびＤＬＬ４  ｍＡｂ実験からのＲＴＶ４に到達したマウスに、抗ＣＤ３１−フィコエリトリン複合体化抗体（０．２ｍｇ／ｍＬの１００μＬ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を外側尾静脈により、屠殺の４分間前に注射した。この分析のために、腫瘍を即座に切除し、中央部分を薄片化し、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を使用して即座に画像解析した。およそ１００μｍの共焦点ｚスタックを、０．５μｍ間隔で１０倍の倍率で、複数の視野上でＰＥを励起するために５４３ｎｍレーザーを使用して撮った。３次元血管再構築を、Ａｍｉｒａ  ＲｅｓｏｌｖｅＲＴソフトウェア（Ｖｉｓａｇｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用して構築した。図７Ｂに示されるように、共焦点顕微鏡および３Ｄ再構築は定性的に、ビヒクルと比較して、ＤＬＬ４  ｍＡｂで処置された腫瘍における、多くの更なる、より小さい、高度に分岐し、蛇行した血管を明らかにした。
【０１５６】
腫瘍低酸素、増殖、および壊死
腫瘍における低酸素を検出するために、マウスに、Ｃｙ３蛍光体（１０μＬ／ｇｍの１０ｍＭを０．９％食塩水中に溶解）に直接複合体化された、低酸素細胞マーカーＥＦ５（クローン：Ｅｌｋ３−５１、Ｄｒ．Ｃ．Ｋｏｃｈ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａによって善意で提供された）に対するマウス抗体を腹腔内注射した。２．５時間後、マウスを屠殺し、腫瘍を切除した。ＩＨＣのために、抗原性賦活化を、抗ＣＤ３１染色について記載されるように行った。切片を、ブロッキング緩衝液で３０分間、続いて一次抗体で、４℃で２４時間、前処理した。染色された切片を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含有する水性封入培地に封入した。染色された腫瘍切片を、視野毎に同時に、２人の独立した観察者（Ｓ．Ｋ．Ｌ．およびＳ．Ｂ．）によって、１５０倍の倍率で観察した。各視野に０〜４のクラススコアを、ＥＦ５染色に対して陽性であった腫瘍面積の百分率に基づいて割り当てた（０、０％；１、０％超〜５％；２、５％超〜１５％；３、１５％超〜３０％；４、３０％超）。各視野についてのスコアは、意見の一致によって合意を得た。壊死の面積（下を参照）を、ＤＡＰＩ染色を使用して特定し、それは低酸素スコアを推定したときには含まれなかった。各視野について得たスコアを、対応する群の区間についての中央値を使用することによって、百分率に変換した。全てのスコア化された視野についての平均を、各腫瘍について算出した。
【０１５７】
結果が、図７Ｃに提示される。左パネルは、１５０倍での腫瘍切片中の、低酸素マーカーＥＦ５に対するＩＨＣ染色を示す。全切片を、視野毎にスコア化して、ＥＦ５免疫染色腫瘍細胞の面積を推定し、各腫瘍の平均低酸素面積を、視野全ての平均スコアとして算出した。棒グラフは、ビヒクル、ＤＬＬ４  ｍＡｂ、ＩＲ、およびＤＬＬ４  ｍＡｂについての低酸素パーセントを提示し、ＩＲが右パネルに示される。アスタリスクは、ビヒクルからの有意な差異を表す（＊＊ｐ＜０．００１）。１群当たり、最低限３つの腫瘍を検査した。有意な低酸素の増加が、単独でまたはＩＲと組み合わせて与えられたに関わらず、ＤＬＬ４  ｍＡｂ処置について観察され、非機能的な血管新生および減少した灌流と一致していた。低酸素の有意な増加は、ＤＢＺでは何ら認められなかった（データは示されず）。
【０１５８】
腫瘍内の細胞増殖を、Ｋｉ−６７染色を使用して検査した。マウス抗ヒトＫｉ−６７（１：１００、クローン２５３１、ＡＢＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）を使用した。抗原性賦活化を、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．０を使用して、９０℃で２０分間行った。切片を、ＰＢＳ中０．３％過酸化水素で２０分前処理した。内在性ビオチンを、製造業者の指示に従ってアビジン／ビオチン遮断キット（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用して遮断し、続いてＭ．Ｏ．Ｍ遮断試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）とのインキュベーションを１時間行った。切片を、ブロッキング緩衝液と共に５分間、続いてブロッキング緩衝液中の一次抗体と共に３０分間、インキュベートした。結合した抗体を、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：５００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）、続いてＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ試薬で標識し、２，３−ジアミノベンジジン色素原を使用して可視化し、ヘマトキシリンで対比染色した。Ｋｉ−６７スコア化のために、陽核の数を、総核の割合として、高倍率顕微鏡視野（４００倍）下で決定し、総計６つの無作為視野に対して行った。スコア化を、壊死の領域を回避して、生存可能な腫瘍領域において行った。
【０１５９】
４００倍での代表的なＫｉ−６７  ＩＨＣ画像が、図７Ｄの左パネルに示される。増殖細胞は、茶（暗）色の核によって識別される。Ｋｉ−６７陽性細胞の、細胞の総数に対する割合を、６つの高倍率視野から決定し、平均値および標準誤差をプロットした。ＤＢＺ実験およびＤＬＬ４  ｍＡｂ実験からの各群におけるＫｉ−６７陽性細胞の割合が、棒グラフで提示される。アスタリスクは、ビヒクルと比べた統計的に有意な変化を表す（「＊＊」は、ｐ＜０．０１を表す）。１群当たり、最低限３つの腫瘍を検査した。ＩＲを用いてまたは用いずにＤＢＺで処置されたマウスから得られた腫瘍において、ならびにＤＬＬ４  ｍＡｂ単独で処置されたマウスからの腫瘍において、増殖は有意に減少した。
【０１６０】
腫瘍における壊死のレベルを、ＥＦ５  ＩＨＣと併せて、ＤＡＰＩ染色を使用して検査した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色もまた、腫瘍切片に対して行い、低倍率下での推定される腫瘍壊死の百分率は、２つの独立した調査者（Ｓ．Ｋ．Ｌ．およびＳ．Ｂ．）からの意見の一致によって合意を得た。代表的なＨ＆Ｅ染色画像が、図７Ｅの左パネルにおいて２０倍で示される。壊死の領域は、黒で輪郭を描かれる。腫瘍壊死の百分率を、低倍率で腫瘍から推定し、平均値および標準誤差をプロットし、結果が、図７Ｅの棒グラフで提示される。
【０１６１】
ビヒクル（６．７±１．７％）と比較して、ＤＢＺ（６．７±１．６％）、およびＩＲ（１５±７．６％）で、増加した腫瘍壊死の傾向が存在し、それは併用治療（２８．３±４．４％）で最も高かった。ＤＬＬ４  ｍＡｂ処置は、ビヒクル処置腫瘍（５．０±０．３％）と比較して、腫瘍壊死における有意かつ顕著な増加（４５±５．０％）をもたらした。その増加は、ＤＬＬ４  ｍＡｂがＩＲと併用されたとき、更に増強された（６３．３±１１．７％）。ＩＲは、腫瘍壊死を有意に増加させなかった（２６．７±３．３％）。併用ＩＲおよびＤＬＬ４  ｍＡｂ処置で見られた腫瘍壊死は、大部分が中央に位置し、血管妨害剤で特徴的に見られる組織学的知見を回想させる。故に、Ｋｉ−６７陽性細胞の割合は、ビヒクルまたはＩＲと比較して、ＤＬＬ４  ｍＡｂおよびＩＲ併用治療について有意に異ならなかったが、残りの生存可能な腫瘍の全体的な量はかなり減少し、それは観察された腫瘍成長遅延を説明する。
【０１６２】
ＤＬＬ４  ｍＡｂ処置は、微小血管数および腫瘍低酸素を増加させた。
【０１６３】
ＤＬＬ４  ｍＡｂ処置後に観察された腫瘍灌流変化を、ＩＨＣと直接相関付けるために、我々は、５日目の造影超音波後にＤＬＬ４  ｍＡｂ実験からのマウスを屠殺し、腫瘍血管数、低酸素、および増殖を検査した。この比較についての結果が、図１０Ｂに提示される。代表的なＩＨＣ画像が、記載の通り示される（抗ＣＤ３１：２００倍、スケールバーは１００μｍを示す；抗Ｋｉ−６７：４００倍、スケールバーは５０μｍを示す；抗ＥＦ５：１５０倍、スケールバーは２００μｍを示す）。図１０Ｂにおける左下のパネルは、Ｃｈａｌｋｌｅｙ血管計数の棒グラフを提示する。中央下の棒グラフは、Ｋｉ−６７陽性細胞の割合を示す。低酸素領域百分率が、棒グラフで右側に表示される。
【０１６４】
ＤＬＬ４  ｍＡｂ処置は、ビヒクルと比べて、微小血管数を有意に増加させ（ｐ＜０．０５）、腫瘍灌流を低減し、低酸素を増加させた（ｐ＜０．０５）。興味深いことに、これは、この時点で、有意に減少した腫瘍増殖につながらなかった。比較して、ＤＬＬ４  ｍＡｂおよびＩＲ併用治療は、増加した微小血管数、および増殖の有意な低減（ｐ＜０．０５）の傾向をもたらしたが、腫瘍低酸素は、増加しなかった。これは部分的に、より低い腫瘍増殖、よって、より小さい腫瘍量からもたらされる、減少した酸素消費に起因し得る（すなわち、図５における、ＤＬＬ４  ｍＡｂ単独と比較した、ＤＬＬ４  ｍＡｂおよびＩＲ処置による５日目のより低い平均腫瘍体積に留意されたい）。併用治療による腫瘍壊死の増加は、この早期の時点で有意でなかったが（データは示されず）、それは長期的なＤＬＬ４遮断（５日間超）が、壊死を誘導するために必要とされることを示唆している。
【０１６５】
アポトーシスは、ノッチ遮断またはＩＲ後の細胞死のための主要な経路ではない
ノッチ遮断後の細胞死におけるアポトーシスの役割を検査するために、ＴＵＮＥＬ染色を、Ａｐｏｐｔａｇ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して行った。切片を、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐｈ６．０を使用して、９０℃で２０分間、抗原性賦活化に供した。手順の残りの部分は、製造業者の指示に従って行った。陽性細胞を、２，３−ジアミノベンジジン色素原を使用して可視化し、ヘマトキシリンで対比染色した。ＴＵＮＥＬスコア化を、Ｋｉ−６７スコア化と同じ様態で、１腫瘍当たり６つの無作為視野を利用して、壊死の領域を回避して行った。
【０１６６】
ＴＵＮＥＬ染色のために加工された腫瘍切片からの４００倍での代表的な画像が、図１０Ａに示される。平均して、ビヒクルまたは治療された腫瘍切片について、１視野当たり１％未満のＴＵＮＥＬ陽性細胞が見られた。スケールバーは５０μｍを示す。ＴＵＮＥＬ陽性細胞における有意な差異は、体外での知見と一致して、いずれの処置の結果としても何ら認められなかった。これは、アポトーシスの増加が、観察された腫瘍成長遅延に関与しなかったこと、および分裂死等の他の機構が、細胞死の主要な様式であり得ることを示唆する。
【０１６７】
腫瘍灌流変化を、ＩＨＣと直接相関付けるために、マウスは、５日目の造影超音波後に屠殺されたマウスであり、腫瘍血管数、低酸素、および増殖を検査した（図１０Ｂ）。ＤＬＬ４  ｍＡｂ処置は、ビヒクルと比べて、微小血管数を有意に増加させ（ｐ＜０．０５）、腫瘍灌流を低減し、低酸素を増加させた（ｐ＜０．０５）。興味深いことに、これは、この時点で、有意に減少した腫瘍増殖につながらなかった。比較して、ＤＬＬ４  ｍＡｂおよびＩＲ併用治療は、増加した微小血管数、および増殖の有意な低減（ｐ＜０．０５）の傾向をもたらしたが、腫瘍低酸素は、増加しなかった。これは部分的に、より低い腫瘍増殖、よって、より小さい腫瘍量からもたらされる、減少した酸素消費に起因し得る（すなわち、図５における、ＤＬＬ４  ｍＡｂ単独と比較した、ＤＬＬ４  ｍＡｂおよびＩＲ処置による５日目のより低い平均腫瘍体積に留意されたい）。我々は、この早期の時点で併用治療による腫瘍壊死の有意な増加を認めなかったが（データは示されず）、それは長期的なＤＬＬ４遮断（５日間超）が、壊死を誘導するために必要とされることを示唆している。
【０１６８】
腫瘍切片におけるＤＬＬ４に対するＩＨＣ染色は、我々の体外データと一致して（データは示されず）、ＤＢＺまたはＤＬＬ４  ｍＡｂでのノッチ阻害後の増加したＤＬＬ４発現を明らかにした。
【実施例６】
【０１６９】
ＤＬＬ４遮断は、ＩＲと協同して、腫瘍ＤＬＬ４から独立して腫瘍成長を遅延させる
【０１７０】
腫瘍切片におけるＤＬＬ４に対するＩＨＣ染色は、我々の体外データと一致して（データは示されず）、ＤＢＺまたはＤＬＬ４  ｍＡｂでのノッチ阻害後の増加したＤＬＬ４発現を明らかにした。ＤＬＬ４染色のために、抗ＤＬＬ４モノクローナル抗体クローン２４２（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅマウス（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）において生成）を使用した。この抗体の可変領域は、完全ヒトであり、Ｆｃ−ドメインは、マウスである。クローン２４２は、ヒトＤＬＬ４の細胞外ドメインのＥＧＦ様ドメイン３〜５におけるエピトープに結合する。抗原性賦活化を、標的賦活化溶液（Ｓ１７００，Ｄａｋｏ）中で、Ｄｅｃｌｏａｋｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ＵＳＡ）を使用して行った。切片を、ＰＢＳ中０．３％過酸化水素で２０分間、およびＭ．Ｏ．Ｍ遮断試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．）で１時間、前処理した。切片を、５分間、ブロッキング緩衝液（０．１  Ｍトリス−ＨＣＩ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＴＳＡ遮断試薬ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））と共に、続いてブロッキング緩衝液中の１μｇ／ｍＬの一次抗体と共に３０分間インキュベートした。結合した抗体を、製造業者の指示に従ってＥｎｖｉｓｉｏｎ＋  ＨＲＰマウスキット（Ｄａｋｏ）を使用して可視化し、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１７１】
腫瘍ＤＬＬ４が有意な標的であったかどうかを決定するために、我々は、ＤＬＬ４  ｍＡｂの、ＤＬＬ４を発現しないＦａＤｕ細胞からの異種移植片に対する効果を試験した（図８Ａ）。ＤＬＬ４発現は、ＦａＤｕ細胞のウェスタンブロッティングによって検出不可能であったが、比較して、ＬＳ１７４Ｔ溶解物は、ＤＬＬ４を大量発現した。均等な負荷量を、β−アクチンにより確認した。無処置ヒトＦａＤｕ癌細胞のウェスタンブロッティングにより、ノッチ１〜４受容体、およびジャグド１の発現が確認された（図８Ａ）。
【０１７２】
ＦａＤｕ腫瘍を、ビヒクル、ＤＬＬ４  ｍＡｂ、５Ｇｙ線量のＩＲ、またはＩＲとのＤＬＬ４  ｍＡｂで処置されたヌードマウスにおいて成長させた。異種移植に関する詳細は、前の実験に提示されるが、簡潔に述べると、５×１０６  ＦａＤｕ細胞を、マトリゲルと１：１比率で混合し、６〜７週齢のメスＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの右脇腹中に皮下注射した。腫瘍体積を、変形楕円式（体積＝長さ×幅２÷２）によって決定した。異種移植腫瘍がおよそ１００ｍｍ３体積に到達したとき、マウスを、ビヒクル群または実験群に無作為化した。
【０１７３】
図８Ｂに示される生存グラフにおける矢頭によって図示されるように、ＤＬＬ４  ｍＡｂを実験の持続期間にわたって週２回与えた。腫瘍体積を１日目の腫瘍体積と比べて正規化し、平均正規化腫瘍体積および標準偏差を生存曲線上にプロットした。マウスを、それらの正規化腫瘍体積が、生存曲線上の点線として示される、ＲＴＶ４に到達したときに屠殺した。各群におけるマウスの総数が、括弧内の凡例として示される。図８Ｂの右側の棒グラフは、標準偏差と共に、腫瘍がＲＴＶ４に到達する平均時間を示す。点線は、ビヒクル処置腫瘍についてのＲＴＶ４を示す。故に、それぞれの棒がこの線を上回る程度は、腫瘍成長遅延に対応する。
【０１７４】
数値結果が、表３に提示される。
【表３】
2014523421.tif 000007
【０１７５】
ビヒクル処置群についての平均ＲＴＶ４は、９．８±２．２日間であり、ＩＲで処置されたマウスについて、それは１４．０±１．６日間であり、ＩＲについての４．２±２．７日間の腫瘍成長遅延をもたらした。ＤＬＬ４  ｍＡｂについてのＲＴＶ４は、２８．８±２．６日間であり、１９．０±３．４日間の著しい腫瘍成長遅延をもたした。ＤＬＬ４  ｍＡｂおよびＩＲの併用療法は、４２．６±４．５日間のＲＴＶ４をもたらし、それは３２．８±５．０日間の相乗的な腫瘍成長遅延に対応した。
【０１７６】
考察
ＤＬＬ４−ノッチ遮断は、非生産的な腫瘍血管新生（血管密度における増加、および腫瘍灌流における逆説的減少）を促進し、腫瘍成長遅延をもたらしたが、腫瘍成長遅延の有意な相乗的増大は、それがＩＲと組み合わされたときに、大幅な腫瘍壊死に起因して生じた。更に、内在性ＤＬＬ４を欠くヒト下咽頭扁平上皮細胞癌異種移植片を試験したとき、抗ＤＬＬ４遮断抗体による効果的な成長遅延、およびＩＲとの相乗作用が存在し、腫瘍ＤＬＬ４発現から独立した、腫瘍成長および生存を維持するためのＤＬＬ４−ノッチシグナル伝達の重要な寄与を実証している。まとめて、データは、腫瘍成長を遅延させるためにＤＬＬ４−ノッチシグナル伝達を妨害することの重要性、および腫瘍ＤＬＬ４発現から独立した、異なる腫瘍型におけるこの治療アプローチに対する幅広い関連性を強調する。故に、ＤＬＬ４−ノッチ遮断をＩＲと組み合わせて、非機能的な腫瘍血管新生および壊死を促進することは、固形腫瘍に幅広く適用可能となり、初期相臨床治験における試験のための補助を提供する。
【０１７７】
臨床的放射線療法において、単回線量ＩＲは、定位放射線手術を例外として、腫瘍血管新生の焼灼を引き起こすのに十分に高い線量では一般的に与えられず、故に、腫瘍血管新生を標的とすることは、臨床的状況の大部分において有用な戦略となろう。最初の動物試験に使用された５Ｇｙ線量のＩＲは、臨床的に一般に使用される線量範囲内に十分に入る。例えば、８Ｇｙの範囲の照射の単回線量が、悪性脊髄圧迫、骨転移、またはかさばり圧迫病変（ｂｕｌｋｙ  ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｌｅｓｉｏｎｓ）の治療のためにしばしば使用される。故に、症状および腫瘍制御は、それらの標準的な照射療法の後にノッチ阻害剤を投与することによって改善され得る。他の症例では、ノッチ阻害剤を分割放射線療法スケジュールと組み合わせること、および／または阻害剤およびＩＲの異なる順序付けを使用することが適切であろう。
【０１７８】
内皮細胞と腫瘍細胞との間で開始されるノッチシグナル伝達が腫瘍微小環境を変化させ得るという証拠が存在する。ノッチリガンドであるＤＬＬ４またはジャグド１の、腫瘍細胞上での発現は、隣接した内皮細胞上でのノッチシグナル伝達を触発して、腫瘍血管新生を変化させ、腫瘍成長を増大させる（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００５，８（１）：１−３、Ｌｉ＆Ｈａｒｒｉｓ、Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２００９，１４：３０９４−１１０、Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００５，８（１）：１３−２３）。同様に、間質細胞は、腫瘍細胞におけるノッチシグナル伝達を誘導し得、それは休眠からの腫瘍エスケープ（Ｉｎｄｒａｃｃｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００９，６９（４）：１３１４−２３）、ならびに腫瘍血管内侵入および転移に関連付けられてきた（Ｓｏｎｏｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２０１１，１９（１）：１２５−１３７）。Ｃａｌａｂｒｅｓｅらは、血管周囲のニッチが、脳腫瘍幹細胞の維持のために重要であること、および抗血管新生薬によるこのニッチの妨害が、腫瘍成長を妨げることを報告した（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００７，１１（１）：６９−８２）。同様に、トランスウェル系において成長させられた多形膠芽腫（ＧＢＭ）患者からの腫瘍外植片は、ＧＳＩでの治療後に減少した腫瘍細胞増殖および自己再生を示し、これは放射線の効果を増強したが、これは、血管ニッチの妨害によるノッチ遮断の抗血管新生効果に起因して生じると仮定された（Ｈｏｖｉｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１０，２８（６）：１０１９−２９）。しかしながら、外植片モデルの限界は、体内異種移植系とは異なり、浸潤骨髄由来細胞、または周期的な腫瘍低酸素等の、腫瘍微小血管構造の重要な寄与因子および特性が説明され得ないということである。実際、腫瘍細胞のＤＢＺまたはＤＬＬ４  ｍＡｂによる放射線反応の改善は、体外で何ら存在せず、代わりに、有意な腫瘍成長遅延は、体内でのみ見られた。更なる研究は、ＣＳＣおよびノッチ活性に対する体内マーカーを使用して、ノッチ阻害剤およびＩＲの、これらの腫瘍型に関連してＣＳＣの結末に及ぼす影響を探索することに向けられるであろう。興味深いことに、腫瘍脈管構造へのＧＢＭ  ＣＳＣ分化の役割は、２つのグループによって最近実証されており（Ｒｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０，４６８（７３２５）：８２４−２８、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０，４６８（７３２５）：８２９−３３）、内皮前駆細胞の分化は、γ−セクレターゼ阻害剤によって遮断された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０，４６８（７３２５）：８２９−３３）。
【０１７９】
ＤＬＬ４  ｍＡｂは、腫瘍成長を遅延させることにおいて、単独治療として、またはＩＲと組み合わせてのいずれでも、ＤＢＺよりもかなり有効である。ＤＢＺは、不十分な腹腔内吸収および／または急速な排除（１２時間未満）に起因して、低い血漿中レベルを有することが報告されている（Ｍｉｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ．２００４，８２（１）：３４１−５８）。故に、モノクローナル抗体のより長い血漿半減期は、ＤＬＬ４−ノッチシグナル伝達の継続的で有効な遮断を提供することが予想されるであろう一方で、ＤＢＺからもたらされるノッチ阻害は、投薬間隔の間に衰えることが予想されるであろう。更に、腫瘍ＤＬＬ４発現における増加が、体外および体内の両方でのノッチ遮断に続き、腫瘍表面上のＤＬＬ４の結果として増加したレベルは、理論上、ＤＬＬ４  ｍＡｂとより効果的にシグナル伝達することから遮断され得る。ＧＳＩよりもＤＬＬ４  ｍＡｂを利用することの、別の変換される利点は、それが、増殖性腺窩細胞の杯細胞への変換によって引き起こされる用量制限胃腸毒性を回避するということである（Ｍｉｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ．２００４，８２（１）：３４１−５８、ｖａｎ  Ｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００５，４３５（７０４４）：９５９−６３）。現在の試験における体重減少によって測定されたとき（データは示されず）、ＤＢＺのいかなる有意な毒性も存在しなかったが、ＤＢＺは、これが安全なスケジュールであることが以前に示されたため（Ｊ．Ｌ．Ｌｉ、未公開データ）、３日毎に、最大で５回用量で投与されるのみであった。より頻繁で長期的な投薬が可能であった場合、これはＤＢＺによる改善された腫瘍成長遅延をもたらし得たかもしれない。糖質コルチコイドの並行投与を通じて等の、ＧＳＩ治療からのＧＩ毒性を低減するための試みが行われてきた（Ｒｅａｌ＆Ｆｅｒｒａｎｄｏ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００９，２３（８）：１３７４−７）。
【０１８０】
ノッチ１またはノッチ２受容体に特異的なモノクローナル遮断抗体の開発は、強力な抗腫瘍活性を保持しながら、用量制限ＧＩ毒性を成功裏に回避してきた（杯細胞化生は、ノッチ１遮断およびノッチ２遮断の両方を必要とするように思われる）（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１０；４６４（７２９１）：１０５２−７）。故に、これらの前臨床モデルにおける、ＩＲと組み合わせた、ノッチ１もしくはノッチ２、またはノッチリガンドであるジャグド１もしくはＤＬＬ１に対する遮断ｍＡｂを含む、更なる特異的ノッチ経路阻害剤を検査する将来的な実験が重要となり、これは恐らく、腫瘍微小環境内でのノッチシグナル伝達における冗長性が実証される場合に必要となり得る。顕著なことに、本明細書における異種移植片実験は、ジャグド１を発現し、先験的に、ＤＢＺ治療を介したノッチシグナル伝達のより包括的な阻害は、腫瘍成長を遅延させることにおいてより有効であることが予想された。しかしながら、抗体は、現在の実験においてはるかにより有効であった。腫瘍上でのジャグド１発現がＤＬＬ４の不在下でノッチを活性化しなかったことは驚くべきことであるが、それは、血管新生網膜モデルにおいて見られたように、蓄積されたＤＬＬ４がジャグド１と競合し得たことによるかもしれない（Ｂｅｎｅｄｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２００９、１３７（６）：１１２４−３５）。Ｌｅｅらは、酸素正常状態または低酸素状態のＬＳ１７４Ｔ異種移植腫瘍に対する、ＩＲ（２０〜４０Ｇｙ）との併用抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂを探索したが、腫瘍成長遅延に対する効果は、せいぜい相加的であり、例外は、最も高い線量のＩＲ（４０Ｇｙ）および低酸素状態の腫瘍のみで見られた（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０００，６０（１９）：５５６５−７０）。比較して、同じ異種移植系を使用して、相乗的腫瘍成長遅延が、ＤＬＬ４遮断およびＩＲ後に得られ、これは、より低い、より臨床的に関連性のあるＩＲ線量で生じた。ＤＬＬ４遮断が、前臨床モデルにおいて抗ＶＥＧＦ療法への腫瘍耐性に打ち勝つことが可能であるという以前に報告された知見を考慮すると（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００６，４４４（７１２２）：１０８３−７、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７，６７（２３）：１１２４４−５３）、放射線療法との併用ノッチ阻害およびＶＥＧＦ阻害のこのアプローチを探索することは興味深いであろう。
【０１８１】
現在の研究は、腫瘍異種移植モデルにおける、ＩＲ療法と組み合わされたＤＬＬ４阻害剤についての体内での知見の最初の報告である。その併用は、腫瘍成長遅延を延長し、臨床的に関連性がある。結論として、ＩＲ後にＤＬＬ４阻害剤を使用して、非生産的な血管新生および大幅な腫瘍壊死をもたらすことは、腫瘍成長または再発を低減するための有効なアプローチである。
【０１８２】
本発明の他の実施形態は、本明細書の考慮および本明細書に開示される本発明の実施から、当業者に明らかとなろう。本明細書および実施例は、例となるものにすぎないと見なされることが意図され、本発明の真の範囲および趣旨は、次の特許請求の範囲によって示される。
【図１Ａ】
2014523421.tif 000008
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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