(57)【要約】  植物においてヒトタンパク質を生成する、特に、穀類の胚乳において組み換え型ヒトリソソーム酵素を生成する方法は、ヒトタンパク質を発現させ且つ植物の胚乳に局在させ、最終的に胚芽によって吸収されず、胚乳における大量のヒトタンパク質の存在が種子の生存率及び発芽速度に負の影響を与えないように植物の形質転換をする第１工程を備えている。第１工程において、ヒトタンパク質をコードしている遺伝子の上流の胚乳特異的プロモータ、及び新しく合成されるヒトタンパク質の組織特異的な蓄積のために、ヒトタンパク質を胚乳細胞の内質細網の内腔の中に同時翻訳的な移行をするためのシグナルペプチドを用いる。また、植物の種子の胚乳の中にヒトタンパク質を蓄積する第２工程を備えている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトタンパク質、特に、組み換え型ヒトリソソーム酵素を発現させ且つ植物の胚乳に局在させ、最終的に胚芽によって吸収されず、胚乳における大量の前記ヒトタンパク質の存在が種子の生存率及び発芽速度に負の影響を与えないように植物の形質転換を行う第１工程と、
植物の種子の胚乳の中に前記ヒトタンパク質を蓄積する第２工程とを備え、
前記第１工程において、前記ヒトタンパク質をコードしている遺伝子の上流の胚乳特異的プロモータ、及び新しく合成される前記ヒトタンパク質の組織特異的な蓄積のために、前記ヒトタンパク質を胚乳細胞の内質細網の内腔の中に同時翻訳的な移行をするためのシグナルペプチドを用いることを特徴とする植物において前記ヒトタンパク質を生成する、特に、植物の胚乳において前記組み換え型ヒトリソソーム酵素を生成する方法。
【請求項２】
前記ヒトタンパク質は、胚乳のタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶｓ）又はタンパク質小体（ＰＢｓ）に蓄積されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）天然型又は人工の前記胚乳特異的プロモータと、
（ii）天然型又は人工の５’ＵＴＲと、
（iii）前記ヒトタンパク質を胚乳細胞の質内細網の内腔の中に向け、特異的な組織に前記ヒトタンパク質を蓄積することを決定するのに適する前記シグナルペプチドをコードしている天然型又は人工のヌクレオチド配列と、
（iv）前記ヒトタンパク質の成熟型をコードしている天然型又は人工のヌクレオチド配列と、
（ｖ）天然型又は人工の３’ＵＴＲとを備えている植物の形質転換ための発現ベクターを構築し、
植物の形質転換のために前記発現ベクターを用いることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現ベクターのヌクレオチド配列は、SEQ ID No:1に示されている配列であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記発現ベクターを細菌株に導入し、前記細菌株を直接又は間接に植物の形質転換のために用いることを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌株は、Escherichia coli、Agrobacterium tumefaciens及びAgrobacterium rhizogenesを含む群に属することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
形質転換される植物は、穀類であることを特徴とする請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載する方法。
【請求項８】
前記細菌株をイネ（Oryza sativa ssp.japonica,近交系CR W3）の胚形成のカルスの形質転換のために用いることを特徴とする請求項５〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性β−グルコシダーゼであることを特徴とする請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性α−グルコシダーゼであることを特徴とする請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
形質転換された植物の種子の産業的な製造を行う第３工程をさらに備えていることを特徴とする請求項１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第３工程は、多くのタンパク質混入物を含む繊維状の構成物、胚芽及びアリューロン層を除去するために、収穫された成熟した種子の籾殻を取り、精白することを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
組み換え型の前記ヒトタンパク質を精製する第４工程をさらに備えていることを特徴とする請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第４工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過を含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第４工程は、類似の化学組成、構造及び／又は機能を有するクロマトグラフィ用の樹脂を適用すること、溶出条件を部分的に改変すること、及び検体を樹脂に２度通過させることとを含むことを特徴とする請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
（i）天然型又は人工の胚乳特異的プロモータと、
（ii）天然型又は人工の５’ＵＴＲと、
（iii）組み換え型ヒトタンパク質を胚乳細胞の質内細網の内腔の中に向け、特異的な組織に前記ヒトタンパク質を蓄積することを決定するのに適するシグナルペプチドをコードしている天然型又は人工のヌクレオチド配列と、
（iv）前記ヒトタンパク質の成熟型をコードしている天然型又は人工のヌクレオチド配列と、
（ｖ）天然型又は人工の３’ＵＴＲとを備え、
植物の胚乳で前記ヒトタンパク質、特に、組み換え型ヒトリソソーム酵素を発現するための植物の形質転換に適するヌクレオチド配列。
【請求項１７】
前記（ｉ）のプロモータは、イネのグルテリン４プロモータ（GluB4pro）であることを特徴とする請求項１６に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１８】
前記（ii）の５’ＵＴＲ領域は、ＬＬＴＣＫであるリーダー配列であることを特徴とする請求項１６又は１７に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１９】
前記（iii）のヌクレオチド配列は、質内細網の中にグルテリン４の前駆体を向けるためにイネに用いられるシグナルペプチドをコードしているPSGluB4配列であることを特徴とする請求項１６〜１８のうちのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２０】
前記（iv）のヌクレオチド配列は、ヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型をコードしているGCase配列であることを特徴とする請求項１６〜１９のうちのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２１】
前記（v)の３’ＵＴＲは、ＮＯＳターミネータ又はGluB4遺伝子のターミネータであることを特徴とする請求項１６〜２０のうちのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２２】
SEQ ID No:1に示す配列である請求項１６〜２１のうちのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２３】
請求項１６〜２２のうちのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列。
【請求項２４】
請求項１６〜２２のうちのいずれか１項に記載の配列、又はそれらと相補的な請求項２３に記載の配列のうちの１つ又はそれ以上のヌクレオチドの欠損、挿入、変化及び塩基転換といった変異の過程から派生したヌクレオチド配列。
【請求項２５】
種子の胚乳に特異的にヒト酸性β−グルコシダーゼが合成及び蓄積されるのに適し、SEQ ID No:1に示されている配列と異なるプロモータ、質内細網にタンパク質を向けるための配列並びに翻訳されない５’領域及び３’領域を有する、又はこれらの配列と相補的な配列を有するヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型をコードしている請求項１６〜２２のうちのいずれか１項に記載の配列の組み合わせ。
【請求項２６】
ヒトにおいて同義の変異又は多型が存在するためSEQ ID No:1に示されている配列と異なる配列により成熟型の前記ヒトリソソーム酵素をコードしている配列を有する請求項１６に記載の前記（i）、（ii）、（iii）、（iv）及び（v）の要素の組み合わせ、又はそれらの相補的な配列の組み合わせ。
【請求項２７】
ヒト酸性β−グルコシダーゼと異なるリソソーム酵素の成熟型又は前駆体をコードしている配列を有する請求項１６に記載の前記（i）、（ii）、（iii）、（iv）及び（v）の要素の組み合わせ、又はそれらの相補的な配列の組み合わせ。
【請求項２８】
前記ヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性α−グルコシダーゼである請求項２７に記載の組み合わせ。
【請求項２９】
形質転換された植物は、穀類であることを特徴とする請求項１６〜２８に記載の配列。
【請求項３０】
請求項１６〜２９のうちのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む、植物において前記ヒトタンパク質を発現する、特に、植物の胚乳において組み換え型の前記ヒトリソソーム酵素を発現するベクター。
【請求項３１】
前記ヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性β−グルコシダーゼであることを特徴とする請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
前記ヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性α−グルコシダーゼであることを特徴とする請求項３０に記載のベクター。
【請求項３３】
プラスミドであることを特徴とする請求項３０〜３２のうちのいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４】
前記ヒトタンパク質、特に、前記ヒトリソソーム酵素の生成のための植物の形質転換のために用いる請求項３０〜３３のうちのいずれか１項に記載のベクターの用途。
【請求項３５】
請求項３０〜３３のうちのいずれか１項に記載のベクターを含む細菌株。
【請求項３６】
Escherichia coli、Agrobacterium tumefaciens及びAgrobacterium rhizogenesを含む群から選択される請求項３５に記載の細菌株。
【請求項３７】
請求項３０〜３３のうちのいずれか１項に記載のベクターを用いて形質転換された植物細胞。
【請求項３８】
穀類細胞であることを特徴とする請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
栽培されたイネ種（Oryza sativa L.）に属する請求項３８に記載の細胞。
【請求項４０】
トウモロコシ（Zea mays L.）、大麦（Hordeum vulgare L.）及び小麦（Triticum spp.）といったGraminaceaeファミリに属する請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
請求項３０〜３３のうちのいずれか１項に記載のベクターに由来する発現カセットを含むことを特徴とする前記ヒトタンパク質、特に、前記ヒトリソソーム酵素の発現のために形質転換された植物の種子。
【請求項４２】
形質転換された植物は、穀類に属することを特徴とする請求項４１に記載の種子。
【請求項４３】
形質転換された植物は、栽培されたイネ種（Oriza sativa L.）に属することを特徴とする請求項４１又は４２に記載の種子。
【請求項４４】
請求項３０〜３３のうちのいずれか１項に記載のベクターにより形質転換されたことを特徴とする前記ヒトタンパク質、特に、前記ヒトリソソーム酵素の発現のために形質転換された植物。
【請求項４５】
穀類であることを特徴とする請求項４４に記載の形質転換された植物。
【請求項４６】
栽培されたイネ種（Oriza sativa L.）に属する請求項４４又は４５に記載の形質転換された植物。
【請求項４７】
自家受精、自然若しくは人工の交雑又は請求項４４〜４６のうちのいずれか１項に記載の形質転換された植物から選択される形質転換系統により得られた子孫。
【請求項４８】
治療的用途で用いられる請求項４１〜４３のうちのいずれか１項に記載の種子。
【請求項４９】
酵素補充療法の薬剤の生成のための請求項４１〜４３のうちのいずれか１項に記載の種子の用途。
【請求項５０】
ゴーシェ病、糖原病II型、ファブリー病、ニーマンピック病Ｂ型及びムコ多糖症Ｉ型、II型、IV型の酵素補充療法のための薬剤の生成のためであることを特徴とする請求項４９に記載の種子の用途。
【請求項５１】
酵素補充療法に用いるための請求項４１〜４３のうちのいずれか１項に記載の種子。
【請求項５２】
ゴーシェ病、糖原病II型、ファブリー病、ニーマンピック病Ｂ型及びムコ多糖症Ｉ型、II型、IV型の酵素補充療法に用いるための請求項５１に記載の種子。
【請求項５３】
添付した図面と関連して、前記に記載している植物においてヒトタンパク質を生成する、特に、穀類の胚乳において組み換え型ヒトリソソーム酵素を生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトタンパク質、特に、組み換え型ヒトリソソーム酵素の酸性β−グルコシダーゼ（E.C.3.2.1.45）を植物、具体的に穀類の形質転換及び遺伝子操作により生成する方法に関する。産業用の種子の製造は、胚芽及びアリューロン層の除去により行われ得る、すなわち、種子中の一部には多くの脂質及びタンパク質混入物が含まれるため、本発明において用いる植物種は、Oryza sativa L.（イネ）であることが好ましい。
【０００２】
同様の技術は、欠損又は不完全な機能性が病気の状態を引き起こす他のヒトリソソーム酵素の胚乳特異的な発現のためにも用いられ得る。
【背景技術】
【０００３】
希少病とは、人口における発生率及び罹患率が低い疾患の異質性の群をいう。それらは慢性的な経過を示し、重篤な結果又は致命的となる。
【０００４】
希少病には、リソソーム病が含まれ、この病気は特定のリソソーム酵素又はキャリアタンパク質の不足により起こる。この病気の分類には、ゴーシェ病、糖原病II型、ファブリー病、ニーマンピック病Ｂ型及びムコ多糖症Ｉ型、II型、IV型等が含まれる。これらの病気に対する治療的アプローチは、欠損した酵素の静脈内投与（酵素補充療法、ＥＲＴ）である。例えば、ゴーシェ病は、ヒト酸性β−グルコシダーゼを定期的に一生投与されることにより治療され得る。しかしながら、この治療は非常に高額であり、全ての患者に用いることができない。ＥＲＴの高いコストは、ヒト又は哺乳動物の細胞の培養による酸性β−グルコシダーゼの生成の困難性により実質的に決定している。
【０００５】
遺伝子操作された植物は、植物の栽培が比較的安価な材料とその分野において既に存在する農業基盤とを用いるため、培養技術的及び経済的な観点から、リソソーム酵素、特に、組み換え型酸性β−グルコシダーゼの生成のための代替法に用いられる。
【０００６】
ＷＯ−Ａ−９７／１０３５３号公報（ＷＯ’３５３）において、ヒト酸性β−グルコシダーゼを含むリソソーム酵素の合成は、植物の葉を用いる、特に、タバコ（Nicotiana tabacum L.）のようなバイオマスとなる種の葉を用いることについてのみ報告されている。ＷＯ’３５３は、疑義のある方法が記載されており、その方法において、葉には多くの水分が含まれており（これは所望のタンパク質を分散させる。）、タンパク質混入物、ポリフェノール、ゴム、侵出物及び有毒のアルカロイドが多く存在し、これらが酵素の抽出及び精製の工程を複雑にする。さらに、通常の植物の代謝の改変により引き起こされる植物毒性現象は防ぐことはできず、これらの現象は不意に起こり、考え得る方法により解決できないため、特に問題となる。
【０００７】
ＷＯ’３５３において、酸性β−グルコシダーゼの発現は、ＭｅＧａプロモータ（障害誘導性のトマトＨＭＧ２プロモータに由来する。）又はＣａＭＶ ３５Ｓプロモータを含む発現ベクターを用いて、タバコを形質転換させることによって行っている。後者のプロモータは、公知であり、恒常型の遺伝子の転写制御をするための配列として広く用いられている。ＷＯ’３５３において、他の恒常性又は誘導性プロモータが前記の目的と同一の目的のために用いられることは可能であると述べられている。
【０００８】
障害誘導性プロモータが関わる限り、ＷＯ’３５３において、それらの使用は、葉に厳しく制限され、酸性β−グルコシダーゼを発現させるために植物に予め傷を付けなければならない。予め傷を付けることは、コストを増大させ、その生成工程の管理をより複雑とし、液胞又は他の細胞コンパートメント内の常在性のタンパク質分解酵素により一部の酵素が分解され、また、細菌及び菌類による傷つけられた材料がひどく汚染されることとなる。
【０００９】
ＷＯ’３５３において実質的に考慮された光誘導性プロモータは、透過光照射の欠損及び／又は光合成組織において通常存在する転写因子の欠損により、種子、特に、穀類の種子のような葉肉以外の組織において効果的に遺伝子を発現しない。恒常性プロモータに関しては、全ての例においてＣａＭＶ ３５Ｓプロモータ及びその代表的な観点について述べられている。しかしながら、実験において、異質のタンパク質の合成について除外する限り、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモータによる転写効率は種子ではわずかに低いだけである。この結果によると、穀類のような単子葉植物の場合ではより価値があり、このプロモータは葉の組織においても遺伝子発現レベルを高くするためにはあまり適用できない。
【００１０】
ＷＯ−Ａ−０３／０７３８３９（ＷＯ’８３９）において、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモータの制御下におけるβ−グルコシダーゼの変異型をコードしている遺伝子は、種子中で特異的な抗体を用いた免疫学的試験において検出できるレベルを発現しなかったことが報告されている。
【００１１】
従って、ＷＯ’８３９及びＷＯ’３５３には、葉肉と異なる組織、具体的に、種子においてヒト酸性β−グルコシダーゼ又は他のリソソーム酵素の生成を行うための方法が実質的に示されていないといえる。
【００１２】
さらに、後の実験（Reggi等.2005,Plant Mol Biol 57:101-113）により、タバコの葉におけるβ−グルコシダーゼの生成に関してＷＯ’３５３が提示する方法では、産業的に用いることができるレベルよりも低い酵素量が得られることが証明された。
【００１３】
さらに、ＷＯ’３５３に提示されているように、葉のバイオマスから精製され得る酵素量は、酵素活性として表した場合はより低く、また、特に恒常性プロモータを用いるような葉における発現系では技術的に制約がある。
【００１４】
ＷＯ’８３９において、種子中でのリソソーム酵素の生成は可能であり、その方法を用いて達成される発現レベルは産業上で利用するのに十分であると報告されている。さらに、その酵素はアポプラスト（すなわち、やや酸性ｐＨであることを特徴とする細胞外のコンパートメント。）に蓄積されるため、安定した状態で長い間保存され得ることが述べられている。しかしながら、ＷＯ’８３９は、単子葉植物におけるリソソーム酵素、特に酸性β−グルコシダーゼの生成、並びに種子において酸性β−グルコシダーゼのような酵素の組織での発現及び細胞内での局在化に関する問題及び制限を回避する方法、最小化する方法及び克服する方法について提示していない。実際のところ、これらの問題は、無視され又は気にされず、全く論じられていない。
【００１５】
実際に、ＷＯ’８３９におけるリソソーム酵素の生成のための発現ベクターの構築の全ての例は、双子葉植物の貯蔵タンパク質プロモータを用いることを提示している。リソソーム酵素の発現に関する例では、酸性β−グルコシダーゼの変異型に制限され、用いられる宿主植物は常にタバコ（Nicotiana tabacum L.）である。ＷＯ’８３９において、形質転換されたタバコ又はその子孫の種子における酸性β−グルコシダーゼの蓄積により起こる植物毒性について示されていないため、提示された方法は、リソソーム酵素、特に、酸性β−グルコシダーゼの生成に関する問題を解決するのに有効であるといっている。
【００１６】
しかしながら、後に、ＷＯ’８３９と同一の遺伝子領域を用いて形質転換されたタバコにより産生された種子において行われた実験は、β−グルコシダーゼの蓄積が種子の生存率の重大な変動を決定することを明らかとした。特に、酵素濃度を２００Ｕ／ｋｇ（種子の質量）に予め近づけた状態において（１Ｕは３７℃、ｐＨ５．９において１分間に１μｍｏｌの４−メチルウンベリフェリル−Ｄ−グルコシドを遊離する酵素の量である。）、低い生存率と発芽阻害による生殖異常とがみられる。さらに、５００Ｕ／ｋｇ（種子の質量）程度以上では、種子の生存率は完全に損なわれる。
【００１７】
出願人により行われたさらなる実験により、ＷＯ’８３９と同一の遺伝子領域を用いて形質転換されたタバコの種子の生存率は、公知の方法により回復させることはできないことが示された。電子顕微鏡により行われた出願人の実験は、酵素の産業的な生成のために理論上用いることが可能な遺伝子組み換え型系統から得られる子孫が生存することは不可能であることを証明するために、生存不能な種子の組織崩壊及び細胞膜系の崩壊を示した。ＷＯ’８３９の遺伝子を用いて発現したタンパク質の貯蔵領域は、実際にＷＯ’８３９において考えられていた領域（アポプラスト領域）と一致せず、胚の柔細胞の液胞の内部であることが電子顕微鏡により示された。ＷＯ’８３９と同様に、ＷＯ−Ａ−００／０４１４６（ＷＯ’１４６）の特許出願には、ヒトラクトフェリンの発現及び植物の種子中の一般的な酵素活性を有するタンパク質の発現について提示されており、機能的活性酵素の生成、特にリソソーム酵素の生成については全く提示されていない。ＷＯ’１４６において、酵素の効果的な生成工程及び安定性に関する問題について示す事項が提示されておらず、その酵素の構造及び機能は、完全に無視されている。
【００１８】
一般に、産業的な酵素量の生成のために必要な植物の系統は、インビトロにおける選り抜きの植物の繁殖により得ることができるが、この方法を用いることは、比較的に短時間で田畑に移植される多くの植物のために必要な生成サイクルを複雑にすることを避けられない。イタリアのヒトβ−グルコシダーゼの需要を満足させるために遺伝子組み換え型タバコの種子を６０トン生産する計画のために、少なくとも１５０ヘクタールの土地を出資すること、また何よりも、インビトロにおける生成、温室順応及び少なくとも９００万のタバコの苗の畑への移植が必要とされた。
【００１９】
工程管理及び経済的な問題に関して、遺伝子組み換え型の種子を散布する、又は幅の狭い列に播くことにより結果が全く異なることは明らかであり、後者の操作では、生存可能な種子のみを用いて実施でき、より高い植物の密度を達成できるという観点から、標準的なタバコの収穫高と比較して単位面積当たり４倍〜６倍高い種子の生成量を可能とする。直接に種子を播くことにより得られる植物の密度と同様の密度を達成することは、移植によってはあり得ず、生産的な観点から、そのコストを補うには不十分であり、実際に、植物の生産量と単位面積当たりの植物数とは反比例する。マイクロプロパゲーションのコストに関して、それぞれの植物が個々に論じられるべきであり、それぞれのタバコにより生産される種子の量を非常に少ない量（数グラム）に合わせると、リソソーム酵素の生成のための宿主として用いられる植物の利点が非常に減少する。
【００２０】
本発明の目的は、植物、特に単子葉植物において、ヒトタンパク質を生成するための工程を行うことであり、特に、穀類の胚乳中で組み換え型のヒトリソソーム酵素を生成することにある。新規に発明した方法は、公知技術における適当な困難性を克服する。特に、本発明によると、種子中において、組織発現及びリソソーム酵素、特にヒト酸性β−グルコシダーゼ及びヒト酸性α−グルコシダーゼの細胞内の局在に有効であり、タンパク質の抽出及び生成を容易化し、植物毒性現象のリスクが除かれ、種子の生存率に影響せず、経済的により用いやすく、生成工程の管理が非常に容易となり、酵素の部分的な分解のリスクが除かれ、細菌及び菌類の混入のレベルが顕著に減少する。
【００２１】
出願人は本分野の現状の問題を克服するために、また、前記の目的及び他の目的と利点とを得るために本発明を発案し、試験し、具体化した。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、独立項において明らかとされ、また、特徴づけられ、その関連する従属項には、本発明の他の特徴又は主な発明の思想の変形が提示されている。
【００２３】
前記の目的に従って、植物においてヒトタンパク質を生成する方法、特に、植物の胚乳において組み替え型ヒトリソソーム酵素を生成する方法は、
ヒトタンパク質を発現させ且つ植物の胚乳に局在させ、最終的に胚芽によって吸収されず、胚乳における大量のヒトタンパク質の存在が種子の生存率及び発芽速度に負の影響を与えないように植物の形質転換を行う第１工程と、
植物の種子の胚乳の中にヒトタンパク質を蓄積する第２工程とを備え、
第１工程において、ヒトタンパク質をコードしている遺伝子の上流の胚乳特異的プロモータ、及び新しく合成されるヒトタンパク質の組織特異的な蓄積のために、ヒトタンパク質を胚乳細胞の内質細網の内腔の中に同時翻訳的な移行をするためのシグナルペプチドを用いる。
【００２４】
本発明は、種子の胚に属しない貯蔵組織に異質性のタンパク質が蓄積することを許容する。また、本発明は、種子の胚に属しない貯蔵組織に高い植物毒性及び破壊の可能性があるタンパク質が蓄積されると、発育の最後に自然にアポトーシスが起こることが好ましい。さらに、種子の給水及び発芽の後に強い加水分解活性を受ける非生存組織に植物毒性タンパク質が潜在的に蓄積されることも可能である。
【００２５】
これらの潜在的な危険タンパク質は、細胞膜に接触する又は細胞膜を横切ることなく、タンパク質貯蔵液胞又はタンパク質小体に貯蔵され得る。本発明は、タンパク質輸送、安定性、生化学的活性及び治療的利用において潜在的に有害でないならば、役に立たない付加されたアミノ酸の存在により特徴づけられるタンパク質の非標準的な変異体でなく、意図されるアミノ酸配列通りに正確に生成されることを可能とする。その合成されたタンパク質は、タンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶｓ）又はタンパク質小体（ＰＢｓ）を有する胚乳に貯蔵されることが好ましい。ＰＳＶｓ又はＰＢｓから抽出可能なタンパク質は類似しているため、前記の細胞内コンパートメントの１つ又はその他における前記タンパク質の局在は、本発明の有効性には無関係である。
【００２６】
本発明の一実施形態は、以下の要素を有する配列を備えている植物の形質転換のための発現ベクターの構築を含む。
（ｉ）天然型又は人工の前記胚乳特異的プロモータ、
（ii）天然型又は人工の５’ＵＴＲ、
（iii）ヒトタンパク質を胚乳細胞の質内細網の内腔の中に向け、特異的な組織にヒトタンパク質を蓄積することを決定するのに適するシグナルペプチドをコードしている天然型又は人工のヌクレオチド配列、
（iv）ヒトタンパク質の成熟型をコードしている天然型又は人工のヌクレオチド配列、
及び（ｖ）天然型又は人工の３’ＵＴＲ。
【００２７】
また、植物の形質転換のためにこのようなベクターを用いる。
【００２８】
発現ベクターのヌクレオチド配列は、SEQ ID No:1に示す配列が好ましい。
【００２９】
本発明の一実施形態において、発現ベクターを細菌株に導入し、それを直接又は間接に植物の形質転換のために用いる。
【００３０】
前記細菌株は、Escherichia coli、Agrobacterium tumefaciens及びAgrobacterium rhizogenesを含む群に属することが好ましい。形質転換される植物は、穀類であることが好ましい。
【００３１】
好ましい一実施形態において、前記細菌株を、イネ（Oryza sativa ssp.aponica, 近交系CR W3）の胚形成するカルスの形質転換のために用いる。好ましい変形例において、ヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性β−グルコシダーゼである。他の変形例において、ヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性α−グルコシダーゼである。
【００３２】
実際に、本発明は、分子量、構造及び機能が酸性β−グルコシダーゼと全く異なるヒト酸性α−グルコシダーゼの前駆体の有意な量の合成、抽出及び精製にも同様に有効である。
【００３３】
一実施形態において、本発明は種子の産業的な製造を行う第３工程を含む。
【００３４】
一解決法において、産業的な製造は、多くのタンパク質混入物を含む繊維状の構成物、胚芽及びアリューロン層を除去するために、収穫された成熟した種子の籾殻を取り、精白することを含む。
【００３５】
さらに、一実施形態において、本発明は、組み換え型ヒトタンパク質の精製を行う第４工程を含む。この精製工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過の順に行われることが好ましい。さらに、その精製工程は、以下に記載する実施例に示すものと類似の化学組成、構造及び／又は機能を有するクロマトグラフィ用の樹脂を適用すること、溶出条件を部分的に改変すること、及び検体を樹脂に２度通過させること、例えば、カラムから溶出した分画を再びカラムに通すことを代替的に又は付加的に含んでもよい。本発明における酵素は、１００Ｕ／ｋｇ（種子の質量）以上の量において、また、５００Ｕ／ｋｇ（種子の質量）においてさえも精製される。さらに、精製された酵素は、強い活性を有し、欠損、付加又はアミノ酸の置換がなく、結果として、これらの観点においては、ヒトの天然型の対応物と完全に同等である。さらに、胚乳における酵素の蓄積は、種子の生存率又は発芽速度を変化させない。酵素の生成のために用いられる分子カセットは、子孫への正常な遺伝、及びホモ接合体による遺伝又は他の形質転換系列と交叉することによる遺伝のようなメンデルの法則に従う遺伝のどちらの場合も酵素の生成を増大させるのに有利である。
【００３６】
本発明に関する方法は、公知技術とは逆に、遺伝子組み換え型、例えば、産業的に適当な量のヒト酸性β−グルコシダーゼを生産できるイネを得ることを可能とし、このイネは通常の表現型（肉眼及び顕微鏡の両方のレベル）と違いがなく、特に、異常な繁殖又は種子の生存率及び発芽速度の変化がなく、酵素濃度が５００Ｕ／ｋｇ（種子の質量）以上であり、明らかに革新的で且つ有利である。また、この方法は、ヒトの天然型の対応物と比較してアミノ酸配列に変化がないように維持されている完全な活性型として、酵素を抽出及び精製できる。
【００３７】
植物の胚乳でヒトタンパク質、特に、組み換え型ヒトリソソーム酵素を発現することを目的とする植物の形質転換をするのに適するヌクレオチド配列は本発明に該当し、そのヌクレオチド配列は、以下の要素を含む。
（i）天然型又は人工の胚乳特異的プロモータ、
（ii）天然型又は人工の５’ＵＴＲ、
（iii）組み換え型ヒトタンパク質を胚乳細胞の質内細網の内腔の中に向け、特異的な組織にヒトタンパク質を蓄積することを決定するのに適するシグナルペプチドをコードしている天然型又は人工のヌクレオチド配列、
（iv）ヒトタンパク質の成熟型をコードしている天然型又は人工のヌクレオチド配列、
及び（ｖ）天然型又は人工の３’ＵＴＲ。
【００３８】
本発明の一実施形態において、前記（i）のプロモータは、イネのグルテリン４プロモータ（GluB4pro）であり、その配列はSEQ ID No:2に示されている。
【００３９】
好ましい一実施形態において、前記（ii）の５’ＵＴＲは、ＬＬＴＣＫとして知られているリーダー配列であり、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６４５９０に提示され、SEQ ID No:3に示されている。さらに、一実施形態において、（iii）の要素のヌクレオチド配列は、SEQ ID No:4に示されているPSGluB4の配列であり、質内細網の中にグルテリン４前駆体を向けるためにイネに用いられるシグナルペプチドをコードしている。他の実施形態において、（iv）の要素のヌクレオチド配列は、GCase配列であり、SEQ ID No:5に示されているようにヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型がコードされている。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態において、（v）の要素の３’ＵＴＲはＮＯＳターミネータであり、SEQ ID No:6に示されている配列である。この代わりに、GluB4のターミネータが用いられてもよい。発現カセットの全体のヌクレオチド配列は、典型的には、SEQ ID No:1と同一である。前記の配列と相補的な配列も本発明に該当する。前記の配列又はそれらと相補的な配列のうちの１つ又はそれ以上のヌクレオチドの欠損、挿入、変化及び塩基転換のような変異の過程から派生した配列も本発明に該当する。種子の胚乳に特異的にヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型が合成及び蓄積されるのに適し、SEQ ID No:1に示されている配列と異なるプロモータ、質内細網にタンパク質を向けるための配列並びに翻訳されない５’領域及び３’領域を有する、又はこれらの配列と相補的な配列を有するヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型をコードしている前記の配列の組み合わせは本発明に該当する。
【００４１】
ヒトにおいて変異又は多型が存在するためSEQ ID No:1と異なる配列により成熟型酵素をコードしている前記に記載（i）、（ii）、（iii）、（iv）及び（v）の要素の組み合わせ、又はそれらの相補的な配列を有する組み合わせも本発明に該当する。
【００４２】
さらに、他のリソソーム酵素の成熟型又は前駆体をコードしている配列を有する前記の（i）、（ii）、（iii）、（iv）及び（v）の要素の組み合わせ、又はそれらの相補的な配列を有する組み合わせも本発明に該当する。
【００４３】
さらに、前記の組み合わせにおいて、ヒト酸性α−グルコシダーゼをコードしている場合も本発明に該当する。前記の配列で形質転換された植物が穀類である場合も本発明に該当する。前記のヌクレオチド配列を含み、植物においてヒトタンパク質を発現させる、特に、植物の胚乳においてヒトリソソーム酵素を発現するためのベクターも本発明に該当する。発現ベクターは、典型的にはプラスミドである。
【００４４】
好ましい解決法において、ヒトリソソーム酵素はヒト酸性β−グルコシダーゼである。
【００４５】
その代わりに、ヒトリソソーム酵素はヒト酸性α−グルコシダーゼであってもよい。
【００４６】
タンパク質、特に、ヒトリソソーム酵素を生成するための植物の形質転換のために前記の発現ベクターを用いることも本発明に該当する。
【００４７】
前記の発現ベクターを含む細菌株も本発明に該当する。その細菌株は、Escherichia coli、Agrobacterium tumefaciens及びAgrobacterium rhizogenesを含む群から選択されることが好ましい。
【００４８】
前記の発現ベクターを用いて形質転換された植物細胞も本発明に該当する。
【００４９】
本発明に係る解決法において、それらの細胞は穀類の細胞であり、イネ種（Oryza sativa L）に属することが好ましい。それは、食物として用いることに適さないイネの種類であることが好ましい。そのため、デンプン及びその副産物の抽出及び生成のために産業的に用いることができる糯種イネを用いることも本発明に該当する。
【００５０】
その代わりに、細胞が、例えば、トウモロコシ（Zea mays L）、オオムギ（Hordeum vulgare L）及びコムギ（Triticum spp）といったGraminaceaeファミリに属してもよい。
【００５１】
前記の発現ベクターを含み、ヒトタンパク質、特に、ヒトリソソーム酵素を発現するために形質転換された植物の種子も本発明に該当する。
【００５２】
本発明の解決法において、形質転換された植物の種子は穀類に属し、その形質転換された植物はイネ種であるOryza sativa Lに属することが好ましい。
【００５３】
本発明に関して保護される範囲は、ヒトタンパク質、特に、ヒトリソソーム酵素の発現のために、前記の発現ベクターを用いて形質転換された植物を含む。このような植物は穀類であり、イネ種であるOryza sativa Lに属することが好ましい。
【００５４】
自家受精若しくは交雑により得られた子孫、又は前記の形質転換された植物から選択された形質転換系統も本発明に該当する。
【００５５】
本発明には、治療用に用いるための前記の種子も該当する。さらに、本発明には、ＥＲＴ用薬剤の生産のために前記の種子を用いることも該当する。特に、ゴーシェ病、糖原病II型、ファブリー病、ニーマンピック病Ｂ型及びムコ多糖症Ｉ型、II型、IV型といった病気のための酵素補充療法に用いることが該当する。本発明には、酵素補充療法に用いるための前記の種子も該当する。特に、本発明には、ゴーシェ病、糖原病II型、ファブリー病、ニーマンピック病Ｂ型及びムコ多糖症Ｉ型、II型、IV型といった病気のための酵素補充療法に用いる前記の種子も該当する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
添付した図面に関連する非制限的な例である以下に記載する好ましい実施形態により、本発明の前記の特徴及び他の特徴を明らかとする。
【図１】ヒト酸性β−グルコシダーゼの胚乳特異的な生成のために用いられる最終的な発現ベクターであるpSV2006[GluB4pro/LLTCK/PSGluB4/GCase/NOSter]を示す模式図である。
【図２Ａ】GluB4プロモータの下流のLLTCKリーダー配列の再帰的ＰＣＲによる合成の方法を示す模式図である。
【図２Ｂ】GCase及びHPT II遺伝子にアニーリングする一対のプライマーを用いて、推定上形質転換された植物から抽出されたゲノムＤＮＡから得られた２本鎖のＰＣＲ産物の電気泳動解析の結果を示し、レーン１は１ｋｂラダー（ＮＥＢ）であり、レーン２は陰性対照（ＮＣ）、すなわち、形質転換されていない植物から抽出されたゲノムＤＮＡであり、レーン３は陽性対照（ＰＣ）、すなわち、pSV2006[GluB4pro/LLTCK/PSGluB4/GCase/NOSter]ベクターであり、レーン４〜１６は検体である。
【図３Ａ】GCaseの形質転換体の種子から抽出試験の過程において得られたタンパク質抽出物に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示し、レーン１〜５は精白したイネの検体から連続的に抽出した抽出物を順次流しており、レーン６及び７は精白する際の廃棄物から連続的に抽出した抽出物である。
【図３Ｂ】GCaseの形質転換体の種子から抽出試験の過程において得られたタンパク質抽出物に対してウエスタンブロットを行った結果を示し、レーン１〜５は精白したイネの検体から連続的に抽出した抽出物を順次流しており、レーン６及び７は精白する際の廃棄物から連続的に抽出した抽出物であり、陽性対照（ＰＣ）は精製されたイミグルセラーゼの１００ｎｇであり、精白したイネに含まれる組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼのほとんどは、３つの穀類抽出物を用いて回収できることを示している。
【図４Ａ】GCaseの形質転換体の種子から抽出試験の過程において得られたタンパク質抽出物に対してウエスタンブロットを行った結果を示し、レーン１はPrecision Plus Protein stanndardマーカー（BioRad）であり、レーン２は陽性対照（ＰＣ、１００ｎｇのイミグルセラーゼ）であり、レーン３は陰性対照（ＮＣ、近交系CR W3である形質転換していないイネから抽出されたタンパク質）であり、レーン４〜１０は異なる主要な形質転換体の種子から抽出されたタンパク質である。
【図４Ｂ】GCaseの形質転換植物から抽出された種子のタンパク質の２次元電気泳動の後のウエスタンブロットにより検出されたヒト酸性β−グルコシダーゼの３つのグリコフォームを示す図である。
【図５Ａ】形質転換をしていないイネの種子の薄片の透過型電子顕微鏡（１２５００倍）により得られた免疫局在を示す図である。
【図５Ｂ】GCaseの形質転換体の種子の薄片の透過型電子顕微鏡（１２５００倍）により得られた免疫局在を示す図であり、タンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶｓ）にのみ組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼの蓄積があることを示している。
【図６Ａ】組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼを含む溶出ピークを示すＨＩＣクロマトグラムの例を示す図である。
【図６Ｂ】組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼを含む溶出ピークを示すＩＥＣクロマトグラムの例を示す図である。
【図７】ＮＣ（形質転換していない植物）及びGCase形質転換体に関する異なるクロマトグラフィの所定量を用いて行われた４−ＭＵＧ試験において記録された蛍光強度を示すグラフであり、また、関連するウエスタンブロットの結果であり、ＥＸは生の抽出物であり、Ｒはフロースルーしたものであり、Ｅは溶出したものであり、ＰＣは陽性対照（イミグルセラーゼ）であり、ＩＥＣを用いて、真のGCase活性（Ｅ２〜Ｅ３）は内在性のGCase様物質（Ｅ６）と分けることが可能であることを示している。
【図８Ａ】ゲル濾過を用いて最終の精製工程を行った後の組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼに対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ａに対応するウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図９】ＨＩＣ及びＩＥＣにより精製されたGCase検体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって得られたマススペクトルを示す図である。
【図１０】最初に人工的に合成された断片からｐＵＣ１８に構築されるＧＡＡ遺伝子を示す模式図である。
【図１１】最終的な発現ベクターであるpSV2006[GluB4pro/LLTCK/GAA/NOSter]を構築するのに用いられた方法を示す模式図である。
【図１２】異なるＧＡＡ形質転換体から得られた総タンパク質抽出物に対して行われたウエスタンブロットの結果を示し、レーン１のＭはPrecision Plus Protein standardマーカー（BioRad）であり、レーン２のＮＣは形質転換されていない植物から抽出された種子のタンパク質であり、レーン３のＰＣは１００ｎｇのマイオザイムであり、レーン４〜１０は異なる主な形質転換体から得られた種子のタンパク質抽出物である。
【図１３】抗ＧＡＡ抗体を用いて成熟型種子の胚乳の金免疫標識法の結果を示す図であり、ＧＡＡはタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶｓ）において特異的に検出され、タンパク質小体（ＰＢｓ）において検出されないことを示している。陰性対照（形質転換されていない植物による種子の生成物）においては何も検出されなかった（データは示さない）。倍率は１６０００倍である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明は、特に、イネ（Oryza sativa L.）の種子の胚乳においてヒト酸性β−グルコシダーゼを生成するための方法であり、この方法は、
ヒトタンパク質を発現させ且つ植物の胚乳に局在させ、最終的に胚芽によって吸収されず、胚乳における大量のヒトタンパク質の存在が種子の生存率及び発芽速度に負の影響を与えないように植物の形質転換を行う第１工程と、
植物の種子の胚乳の中にヒトタンパク質を蓄積する第２工程とを備え、
第１工程において、ヒトタンパク質をコードしている遺伝子の上流の胚乳特異的プロモータ、及び新しく合成されるヒトタンパク質の組織特異的な蓄積のために、ヒトタンパク質を胚乳細胞の内質細網の内腔の中に同時翻訳的な移行をするためのシグナルペプチドを用いる。
【００５８】
その植物の形質転換を行う方法において、以下の要素を含む発現ベクターを用いる。
（i）天然型又は人工の胚乳特異的プロモータ、
（ii）天然型又は人工の５’ＵＴＲ、
（iii）組み換え型ヒトタンパク質を胚乳細胞の質内細網の内腔の中に向け、特異的な組織にヒトタンパク質を蓄積することを決定するのに適するシグナルペプチドをコードしている天然型又は人工のヌクレオチド配列、
（iv）ヒトタンパク質の成熟型をコードしている天然型又は人工のヌクレオチド配列、
及び（ｖ）天然型又は人工の３’ＵＴＲ。
【００５９】
発現ベクターに含まれるヌクレオチド配列は、例えば、SEQ ID No:1に示す配列である。
【００６０】
GluB4にコードされたタンパク質は、種子の胚乳の中により均一に分布するため、Graminaceae植物、特に、イネの公知の胚乳特異的なプロモータとして、本発明ではGluB4遺伝子のプロモータ（SEQ ID No:2の配列）を用いることが好ましい。さらに、GluB4プロモータは、GluB4以外のグロブリン、プロラミン又はグルテリン等のイネの胚乳の中における他の貯蔵タンパク質をコードしている遺伝子のプロモータと比較してより高い転写活性を有する。
【００６１】
GluB4プロモータは、そのリーダー配列と共に、糯種イネの近交系CR W3（Ente Nazionale Risi, Milanにより選択された。）からＰＣＲにより単離される。天然型のリーダー配列は、より短く、遺伝子発現に正の影響を与えるＣＡＡ及びＣＴの繰り返し配列が欠損しているため、ＬＬＴＣＫとして知られ、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６４５９０に提示され、SEQ ID No:3に示されている５’ＵＴＲ（De Amicis等.2007, Transgenic Res 16:731-738）を代わりに用いる。
【００６２】
GluB4pro/LLTCKの配列は、PSGluB4/GCaseと結合される。PSGluB4は、内質細網に入るようにイネグルテリン４前駆体に用いられるシグナルペプチドをコードしている配列である（SEQ ID No:4）。GCaseはヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型をコードしている配列である（SEQ ID No:5）。その成熟型は天然型のシグナルペプチドが欠乏した前駆体タンパク質からなる。
【００６３】
クローニング又は配列の結合のために用いられる制限酵素の認識配列の導入により生じる成熟型タンパク質のＮ末端に異質なアミノ酸が付加されることを防ぐために、PSGluB4配列及び成熟型GCaseをコードしている配列の初めの部分に対応するＤＮＡ領域（天然型のHind III制限酵素領域まで）は、人工的に合成される。
【００６４】
ＬＬＴＣＫと関連する転写開始コドンの認識を良好にするために、また、稀なコドン又はコドンの中において不都合な構成が起こることを避けるために、計画的に導入された変異により、前記のような合成により生じるPSGluB4の配列は、イネの天然型における配列と同義ではあるが、一致はしない。逆に、GCaseの初めの部分は、ヒトの天然型の配列と変わりないように維持されているため、全体のGCaseの配列は、GenBankの登録No M16328のヌクレオチドの553番目と2046番目との間と正確に一致する。Hind III領域からのGCaseの残存領域をコードする配列と前記の合成配列とを結合した後に、全配列は、先にクローニングされたpSV2006の２成分ベクターであるGluB4pro/LLTCKの３’末端に結合される。pSV2006はpCAMBIA 1300プラスミド（www.cambia.org）から出願人により開発されたものである。ヒト酸性β−グルコシダーゼのコンストラクトのために用いられるポリアデニル化シグナルはNOSter、すなわち、Agrobacterium tumefaciensのノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータである。ＮＯＳターミネータ配列は、SEQ ID No:6に示されている。
【００６５】
最終的なベクターであるpSV2006[GluB4pro/LLTCK/PSGluB4/GCase/NOSter]（図１）の構築をし、全ての配列を確認した後に、このベクターは、エレクトロポレーションによりAgrobacterium tumefaciensのEHA105株に導入される。その後、その菌株は胚形成するイネカルス（Oryza sativa ssp.japonica, 近交系CR W3）の形質転換のために用いる。選択的な培地における植物の形質転換及び再分化の全ての工程は正常に完了した。光、温度及び湿度が同一の条件であるチャンバにおいて形質転換及び植物の生長の制御を行った間、異なることは見られなかった。遺伝子組み換え型植物における雌花と雄花との受精及び花の欠損の割合は、近交系CR W3である形質転換していない植物と比較する。全ての初代の形質転換体は、ヒト酸性β−グルコシダーゼの発現のレベルに関係なく、平均９５％以上の生存率の種子を生成した。さらに、発芽速度はその種の最大値と同等であった（４日〜６日以内であり、生存する種子のほとんどが一次根及び子葉鞘を発生させている。）。初代の形質転換体と同様に、その子孫も正常に生長し、組み換え型のヒト酸性β−グルコシダーゼを含む種子を生成した。酵素をコードしている遺伝子の存在は、全ての推定上形質転換された植物におけるＰＣＲ解析により証明され（図２Ｂ）、自家受粉により得られた最も良い初代の形質転換体の子孫を、１５０以上無作為に採取した。これらの解析において、陰性対照及び陽性対照には、それぞれ形質転換されていないCR W3植物の総ＤＮＡ及び発現ベクターのミニプレップによる抽出物を用いた。さらに、それぞれ試験されたＤＮＡ抽出物の増幅についても、イネの葉緑体のＤＮＡ領域に対して設計された特異的なプライマーを用いることにより証明された。概して、イネのゲノムはヒト酸性β−グルコシダーゼをコードしている配列を用いて形質転換され、また、その遺伝子組み換えは、子孫に遺伝していることが証明された。子孫への遺伝は、自家受粉による子孫のみでなく、形質転換された植物と陰性対照又は他の形質転換された植物とを交配することにより生じた子孫においても証明された。ヒト酸性β−グルコシダーゼのメッセンジャーＲＮＡの生成を確かめるために、未成熟型のイネの種子（開花後１０日〜１５日）を収集し、それを用いて総ＲＮＡを抽出した。その後に、以下の操作を行った。
ａ．ＰＣＲによるゲノムＤＮＡの混入物の除去。
ｂ．ＲＴ−ＰＣＲによるヒト酸性β−グルコシダーゼのメッセンジャーＲＮＡの増幅。
ｃ．ＲＴ−ＰＣＲによるグルテリン４のメッセンジャーＲＮＡの増幅。
その全ての場合において、現れたGCase遺伝子は正常に発現し、グルテリン４貯蔵タンパク質をコードする遺伝子と同一の発現パターンを示した。期待どおり、陰性対照の総ＲＮＡを用いた際は、グルテリン４遺伝子の増幅のみが認められた。
【００６６】
また、組み換え型タンパク質を免疫局在化し、透過型電子顕微鏡により観察するために未成熟型の種子を用いた。この観察により、ヒト酸性β−グルコシダーゼが胚乳細胞のタンパク質貯蔵液胞にのみ蓄積されていることを証明された。同一の解析をCR W3の対照の種子に対して行った際には、そのような結果は見られず、これにより、この解析法の多大な有効性と我々が用いた抗GCase抗体の絶対の特異性が証明された。最も良い組み換え型の系統を選択するために、また、組み換え型タンパク質の精製方法を開発するために、有効性と共に、信頼性及び感度が高い蛍光定量的な試験を用いてβ−グルコシダーゼの活性を測定できる可能性を有する前記の特異的抗体の用いた。抽出及び精製工程に関して、プロトコールは、未精製のタンパク質抽出物及び組み換え型酸性β−グルコシダーゼの単離及び精製といった、予備的な製造のために開発された。その精製プロトコールは、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、カチオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）及びゲル濾過（ＧＦ）といった３つの連続的な工程からなる。種子の籾殻を取り、精白することは、GCaseの最小の損失で、タンパク質混入物の多くを除去するために絶対的に有利であり、その損失は抽出工程の際にも非常に低くなる。内在性のGCase様酵素の除去は、GCase様の活性により、カチオン交換クロマトグラフィの最後に適用される非連続的な溶出工程によって行われる。このクロマトグラフィは、さらに、サンプルの洗練の役割があるゲル濾過を通るタンパク質混入物を減少させる。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、精製されたタンパク質は、基本的にイミグルセラーゼ（Cerezyme, Genzyme Corp.）と同一の移動度を示し、約６０ｋｄの分子量を示した。ウエスタンブロットにおいて、精製されたタンパク質は、ウサギにより産生された抗イミグルセラーゼ抗体により強く検出された。精製されたタンパク質は、酵素学的活性、特に、蛍光発生基質である４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコシドを効率的に加水分解することを示し、イミグルセラーゼと同一の動的反応を示した。２次元電気泳動では、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に行われたウエスタンブロットにおいて繰り返し検出された単一のバンドを少なくとも３つのグリコフォームに分けた。さらなる解析では、イネの胚乳において生成される組み換え型のヒト酸性β−グルコシダーゼの完全性を証明し、そのアミノ酸配列とヒトの天然型の対応物のアミノ酸配列との同一性を証明した。Ｎ末端のミクロシークエンシングは、そのアミノ酸配列の最初のノナペプチドがヒトの天然型の酸性β−グルコシダーゼのＮ末端のＡＲＰＣＩＰＫＳＦと一致することを証明した。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより行われたペプチドマスフィンガープリント法により、そのタンパク質のＣ末端は、完全に保存され、また、５番目のＮグリコシル化領域においてはグリカン鎖が見られないといった天然型の酵素と類似である部分が証明された。しかしながら、そのタンパク質の第１〜第４のＮグリコシル化領域では、グリカン鎖がみられた。その第１のＮグリコシル化領域におけるＮグリカンの存在は、タンパク質の酵素学的活性のために必須である。
【実施例】
【００６８】
（第１の実施例）GCaseの発現のための分子カセットの構築
以下に、イネにおいてヒト酸性β−グルコシダーゼを胚乳特異的に発現する方法を記載する。同様の方法が他の胚乳特異的なプロモータ及び／又は内質細網の中にタンパク質を向けるための配列の存在により特徴づけられるコンストラクトの変異体を作製するために用いられ得る。
【００６９】
グルテリン４プロモータ（GluB4pro）の単離
Oryza sativa（GenBank acc.NoAY427571）のグルテリン４プロモータを単離するために、CR W3のゲノムＤＮＡのＰＣＲを行った。このＰＣＲにおいて、以下のプライマーを用いた。
GluB4pro順方向プライマー：SEQ ID No:7に示している。
GluB4pro逆方向プライマー：SEQ ID No:8に示している。
【００７０】
後のクローニングのために、GluB4pro順方向プライマーは、アンプリコンの５’末端にSph I及びEco RI領域を導入するように設計され、同様に、GluB4pro逆方向プライマーは、ＰＣＲ産物の３’末端にXba I領域を導入するように設計された。
条件：９５℃で２分間の後、（９５℃で４５秒間、６３℃で４０秒間及び７２℃で２分間）のサイクルを４０回繰り返し、その後、７２℃で５分間とした。
【００７１】
これにより増幅された産物は、pGEM-T（Promega）の中に入れクローニングし、完全なシークエンシングを行った。
【００７２】
GluB4プロモータにおいて天然型のリーダー配列からLLTCKを有する人工のリーダー配列への置換
イネのグルテリン４プロモータ（GluB4pro）の天然型のリーダー配列を合成されたＬＬＴＣＫリーダー配列（De Amicis等.2007, Transgenic Res 16:731-738）に置換するために、図２Ａの模式図に従って、適当なプライマー（１つの順方向プライマー及び３つの逆方向プライマー）を用いて３度の連続するＰＣＲを行った。第１のＰＣＲにおいては、pGET-T[GluB4pro]プラスミドを鋳型として用い、後の２つのＰＣＲにおいては、先の反応による産物を鋳型とした。順方向プライマー１は、Bfr I領域で始まり、GluB4pro配列の３’末端に接してアニールする。逆方向プライマー１は、リーダー領域の少し上流のGluB4proの３’領域にアニールする。アニールしない部分は、初めのＬＬＴＣＫの合成に寄与する。逆方向プライマー２は、その後の断片にアニールし、ＬＬＴＣＫリーダー配列の第２の領域の合成を行う。逆方向プライマー３は、ＬＬＴＣＫ配列の終結部分を導入し、また、３’末端にXba I領域を有する。ＰＣＲ反応をAccu Taq（Sigma）ＤＮＡポリメラーゼを用いて行い、温度条件は以下のようにして行った。
条件：９８℃で２分間の後、（９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で１分間）のサイクルを第１及び第２のＰＣＲでは１５回、第３のＰＣＲでは２５回繰り返し、その後、６８℃で１０分間とした。
【００７３】
最終のＰＣＲ産物をpGEM-Tの中に入れクローニングし、酵素による切断及びシークエンシングにより確認した。pGluB4proの天然型のリーダー配列を人工のＬＬＴＣＫリーダー配列に置換するために、Bfr I及びXba Iの制限酵素領域を用いた。ベクターと挿入断片とをT4 DNAリガーゼを用いて結合し、その結果生じたpGEM-T[GluB4/pro/LLTCK]をＰＣＲ及び制限酵素による切断により確認した。
【００７４】
天然のシグナルペプチドからSPGluB4への置換
イネにおけるGCase発現を増大させるために、グルテリン４のシグナルペプチド（SPGluB4）をコードしているヌクレオチド配列は、イネのコドンを基にして最適化され、ヒト酸性β−グルコシダーゼ（GCase）の成熟型をコードしている配列の前に配置される。その成熟型酵素のＮ末端に異質のアミノ酸が付加されることを防ぐために、結合される末端に偽の制限酵素領域を付加することを避けた。その問題を解決するために、SPGluB4配列、及び天然型のHind III領域までのGCaseの初めの領域である５’末端にXba I領域を含む人工の断片を生成し、pUC57（Fermentas）の中に入れクローニングした。シークエンシングによる確認の後に、pGEM-T[GCase]、すなわち、GenBank No M16328に提示されたヒト酸性β−グルコシダーゼをコードしている全体の配列を含むプラスミドの中の天然型のシグナルペプチドをコードしている断片の代わりに前記の確認した断片を入れ、クローニングした。挿入断片及びベクターのバックボーンのそれぞれを生成するために、pUC57[SPGluB4]及びpGEM-T[GCase]の両方をXba I及びHind IIIを用いて切断した。pGEM-T[SPGluB4/GCase]を作製するために、これらの部分をT4 DNA ligaseを用いて結合し、制限酵素による切断により確認した。
【００７５】
イネにおけるヒト酸性β−グルコシダーゼの発現のための分子カセットの構築
GluB4pro/LLTCK及びSPGluB4/GCaseに対応する領域を、Agrobacterium tumefaciensのＮＯＳポリアデニル化配列を含むpUC18（Pharmacia）由来のプラスミドであるpUC18[NOSter]の中に入れてサブクローニングする２つの工程を行った。この目的のために、それぞれの領域の５’末端及び３’末端に導入された制限酵素による切断領域を用い、すなわち、GluB4pro/LLTCKにはSph I及びXba Iを、SPGluB4/GCaseにはXba I及びSac Iを用いた。
【００７６】
pSV2006[GluB4pro/LLTCK/SPGluB4/GCase/NOSter]ベクターの作製
最終的な発現ベクターを得るために、pSV2006（pCAMBIA 1300由来）を用いた。Eco RIによる切断により、pSV2006の本来の発現カセット及びpUC18[GluB4pro/LLTCK/SPGluB4/GCase/NOSter]に含まれるコンストラクトを除去した。最終的な発現ベクター（図１）を得るために、前記処理後のpSV2006と挿入断片とを互いに結合し、そのベクターの特異性を解析した後に、そのベクターをエレクトロポレーションによりAgrobacterium tumefaciensであるEHA 105株の中に導入した。遺伝子操作されたAgrobacterium tumefaciens株を、Oryza sativa ssp.japonicaである近交系CR W3の形質転換のために用いた。
【００７７】
（第２の実施例）Agrobacterium tumefaciensを介するイネの形質転換
イネの形質転換は、C.Huge（Rice Research Group, Institute of Plant Science, Leiden University）及びE.Guiderdoni（Biotrop program,Cirad, Montpellier, France）により改変されたHieiのプロトコール（Hiei等,1994）に従って行った。その方法の主な工程を以下に簡単に示す。
【００７８】
胚形成のカルスの作製
イネの形質転換は、胚盤由来の胚形成のカルスを用いて行った。胚盤組織からカルスの増殖を誘導するために、イネの種子の籾殻を取り、潜在的な病原体及び雑菌の汚染を除去するために消毒し、無菌の蒸留水により数回洗浄し、無菌の吸い取り紙により乾燥させ、カルス誘導培地（ＣＩＭ）を含むペトリ皿に移した。そのペトリ皿を２８℃の暗所で７日間培養した後に、実生から胚盤を切り取り、それを２８℃の暗所で１４日間ＣＩＭにおいて培養した。その培養の後、カルスの塊を小さな白いカルスを基にして選択した。それらを新しいＣＩＭに移し、形質転換するのに適する胚形成のカルスを生成するために１０日間培養した。
【００７９】
カルスとAgrobacterium tumefaciensとの共培養
形質転換のためのAgrobacterium tumefaciensの十分な量を得るために、前記の発現ベクターを有する菌株をＬＢ寒天培地において３０℃で３日間培養した。Agrobacterium細胞の層を収集し、Ｏ．Ｄ．６００が１．００（約３〜５×１０９cells/mL）になるまで、それを液体共培養培地（ＣＣＭＬ）において再懸濁した。最も良いカルス、すなわち、密であり、白色であり、直径が２ｍｍであるカルスを細菌の懸濁液に浸した。そのカルスを無菌のワットマン紙に吸湿させた後、縁が高いペトリ皿（Sarstedt）で２０％の濃度となるように共培養培地（ＣＣＭＳ）に移し、２５℃の暗所で３日間培養した。
【００８０】
ハイグロマイシン耐性カルスの選択
共培養培地における培養が終了した後に、カルスを選択培地 I（ＳＭ I）に移し、２８℃の暗所で２週間培養した。その後、カルスを選択培地 II（ＳＭ II）に移し、前記と同一の条件でさらに１週間培養した。
【００８１】
形質転換されたカルスからの植物の再生
形質転換された植物の再生を適当なホルモン刺激により行った。胚形成のハイグロマイシン耐性カルスを選択し、それを前再生培地（ＰＲＭ）に移し、縁の高いペトリ皿の中において２８℃で１週間培養した。その後、カルスを再生培地（ＲＭ）が入った１つのペトリ皿当たり８個〜１０個となるように移した。それを明るい場所において２８℃で３週間〜４週間置き、植物の再生を起こさせた。植物がカルスから分離するのに十分に生長した後（高さが３ｃｍ以上）、それらを２５ｍＬの発根培地（ＲＯＴ）を含む培養管に移した。その培養管は、２８℃の明るい場所で約３週間置いた。その再生工程の最後に、泥炭を用いて鉢植えし、金属ハロゲンランプのOsram Powerstar HQI-BT400W/D（明が１６時間、暗が８時間の光周期）を用いた条件下で２４℃、湿度８５％に制限された人工気象室において成熟するように生長させた。
【００８２】
（第３の実施例）GCaseコンストラクトを用いて形質転換されたイネの種子からの総タンパク質の抽出
遺伝子組み換え型イネの種子をまずSatake TO-92（Satake Corporation,Japan）を用いて籾殻を取り、精白した。その後、精白したイネの種子を製粉し、生じた粉を抽出緩衝液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝５．５）の中で均質化した。なお、その際の緩衝液の体積（ｍＬ）と粉の重量（ｇ）との比率を１０：１．５とした。それを４℃で１時間置いた後、それを１４０００×ｇで４５分間遠心分離を行った。上清を回収した後、残った沈殿物に対して、前記と同一の方法を用いてさらに２度抽出を行った。精白した種子及び精白の際の廃棄物から得られたタンパク質抽出物に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３Ａ）とウエスタンブロット（図３Ｂ）との両方の解析を行った。これらの解析により、組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼのほとんどが精白した種子に含まれ、３度の連続の抽出により効率良く回収され得ることが証明された。
【００８３】
（第４の実施例）GCaseを形質転換した種子の総タンパク質抽出物のウエスタンブロット及び２次元電気泳動
Mini Protean II装置（BioRad）及び厚さが７５ｍｍの１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemli, 1970）により、総タンパク質抽出物を分離した。検体を流す前に、検体にβ−メルカプトエタノールを加えずに、検体を１００℃で５分間変性させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、Trans-Blot SD装置（BioRad）を用いて１５Ｖで３０分間、タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（ミリポアのPVDF, Immobilon-P）に転写した。その後、市販のイミグルセラーゼを用いて２羽のウサギに免疫化することにより生成した抗GCaseポリクローナル抗体と、検体とをハイブリダイズした。ハイブリダイズの条件は、ブロッキング液（PBSに7.5% p/v Oxoid skim milkを溶解した。）により１０００倍に希釈した抗体を用いて室温で１時間反応させた。PBS Tween 0.1% v/vで洗浄した後、抗ウサギＨＲＰ結合２次抗体（SIGMA, １：１００００の希釈倍率）を用いて室温で１時間反応させた。その後、ECL Plus（GE Healthcare）を用いて化学発光させた。陽性のタンパク質バンドの分子量を測定するために、Precision Plus Protein standard（BioRad)をＨＲＰ結合Precision Strepactin抗体（BioRad）と共に用いた（図４Ａ）。
【００８４】
約２００μｇの種子の総タンパク質を含む２つの検体を等電点電気泳動法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。第１の解析は、PROTEAN IEF focusing system（BioRad）及び非直線的なｐＨ３〜１０の範囲における７ｃｍのReady Strip IPG（BioRad）を用いて行った。タンパク質抽出物を、2D Clean-Up kit（GE Healthcare）を用いて沈殿させ、１３０μＬのDeStreak Rehydratation溶液（GE Healthcare）及び0.6% Byolites ampholytes 3-10（BioRad）を用いて再懸濁した。その後の条件は以下のようにする。
工程１：２５０Ｖで１５分間
工程２：４０００Ｖで２時間
工程３：２００００Ｖ-hourで約２４時間。
【００８５】
これらの終わりに、２つの異なる平衡緩衝液を用いて洗浄した。すなわち、平衡緩衝液 I（2% DTT、2% SDS、50mM Tris-HCl、6M 尿素、30% グリセロール及び0.002% ブロモフェノールブルー,pH8.8）で１５分間洗浄し、平衡緩衝液 II（2.5% ヨードアセトアミド、2% SDS、50mM Tris-HCl、6M 尿素、30% グリセロール及び0.002% ブロモフェノールブルー,pH8.8）で２０分間洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの標準的なプロトコールに従って、検体を２つの分離ゲルにおいて第２の次元に流した。１つの電気泳動ゲルをColloidal Coomassie Blue（0.08% クマシーブルー R-250、1.6% オルト−リン酸、8% 硫酸アンモニウム及び20% メタノール）を用いて染色し、他方のゲルはウエスタンブロットにより解析した（図４Ｂ）。これらの全行程は、形質転換していないCR W3の種子から得られたタンパク質検体に対しても並行して行った。
【００８６】
（第５の実施例）免疫局在化によるGCase貯蔵領域の決定
乳熱後期の形質転換された種子を収穫し、籾殻を取り、断片が１ｍｍの厚さになるように切断し、０．２％グルタルアルデヒドを用いて室温で１時間固定した。それを０．１５Ｍリン酸緩衝液により洗浄した後、無水エタノールの濃度勾配（２５％〜１００％）を用いて脱水を行った。脱水した検体をLR White Resin（London Resin Co.）に包埋し、６０℃で２４時間重合した。それをLKB Nova microtome（Reichter）を用いて切片（厚さ２μｍ〜３μｍ）とし、これをニッケルメッシュグリッド（Electron Microscopy Science）に置き、ヤギ標準血清溶液（Aurion）をbuffer C（0.05M Tris-HCl,pH7.6, 0.2% BSA）により１：３０の希釈倍率で希釈した溶液に１５分間浸した後に、抗GCase１次抗体をbuffer Cにより１：５００の希釈倍率で希釈した溶液を用いて室温で１時間ハイブリダイズした。0.1% Tween 20 w/vを含むbuffer B（0.5M Tris-HCl,pH7.6,0.9% NaCl）を用いて数回洗浄した後（６回×５分）、コロイド金が結合した２次抗体（15nm, Aurion）をbuffer E（0.02M Tris-HCl,pH8.2, 0.9% NaCl, 1% BSA）により１：４０の希釈倍率で希釈した溶液に切片を室温で１時間浸した。ハイブリダイズの最後に、切片を洗浄した後、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛を用いて染色し（Reynolds,1963）、Philips CM 10透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて切片を観察した。
【００８７】
その結果は、種子の胚乳のタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶｓ）にのみGCaseが存在することを示し、また、抗GCaseポリクローナル抗体はGCaseを強く且つ鮮明なシグナルにより同定し、有意なバックグラウンドは見られなかった。形質転換されていないイネの種子に対しても同一の解析を行った結果、基質と結合した交差反応領域は見られず、抗GCase抗体の高い特異性が証明された。
【００８８】
（第６の実施例）イネの種子から抽出した組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼの精製
この精製のために、産業的な規模のプロトコールを開発した。そのプロトコールは、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）を用いて捕獲する初期段階（図６Ａ）、イオン交換クロマトグラフィ（ＨＩＣ）を基にする中間段階（図６Ｂ）及びゲル濾過を用いて洗練する最終段階を基とする。全てのクロマトグラフィの段階は、AKTA Prime system（GE Healthcare）を用いて行った。
【００８９】
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）
この段階は、５ｍＬのHiTrap Octyl FF（GE Healthcare）を用いて行った。この段階の最初に、１倍量のローディング緩衝液（50mM酢酸ナトリウム、350mM NaCl及び100mM 硫酸アンモニウム,pH5.5）を用いてカラムを平衡化し、カラムに検体を流す前に、３Ｍ硫酸アンモニウム溶液を硫酸アンモニウムの最終濃度が１００ｍＭになるように精製させる抽出物に加え、その後に、その抽出物を０．２ｍｍフィルタ（Millipore）に通して濾過した。その検体を１ｍＬ／ｍｉｎの流速でカラムに流した。カラムを５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む３倍量のローディング緩衝液を用いて、ベースラインが平坦となるまで洗浄した。その後、５０ｍＭ酢酸ナトリウムに含まれる６６％エチレングリコールを用いて溶出を行った。この段階の最後に、カラムを２０％エタノールを用いて洗浄及び再生化を行った。
【００９０】
イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）
ＩＥＣのために、カチオン樹脂を含む５ｍＬのHitrap SP FF（GE Healthcare）を用いた。カラムを５０ｍＭ酢酸ナトリウム（溶液Ａ）により平衡化した後、ＨＩＣから溶出された分画を溶液Ａにより１：１の希釈倍率で希釈し、それをカラムに流した。カラムを洗浄した後、溶液Ａの中に１Ｍ溶液の１５％、２０％及び１００％に相当するＮａＣｌ量を順に増やすことによる断続的な勾配溶出を行った。その後に、カラムを２０％エタノールで再生化した。それぞれのクロマトグラフィ操作から回収された所定の分量に対して免疫解析を行い、２０％ＮａＣｌを含む溶液により組み換え型のヒト酸性β−グルコシダーゼを溶出できることを証明した。形質転換されていない種子のタンパク質抽出物から得られた溶出分画に対して酵素活性試験を行うことにより、このクロマトグラフィ段階において、GCase様活性を起こす原因となる内在性の構成物からヒト酸性β−グルコシダーゼが分離したことが示された。特に、２０％ＮａＣｌにおいて、その内在性の構成物はカラムに効率的に保持されていることが示された（図７）。
【００９１】
ゲル濾過
ゲル濾過のために、HiPREP 16/60 Sephacryl S-100 High Resolution column（GE Healthcare）及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムと２００ｍＭ ＮａＣｌにより構成された溶出緩衝液（ｐＨ５．５）を用いた。最初にそのカラムを２倍量の溶出緩衝液を用いて洗浄し、ＩＥＣにおいて溶出された検体を０．３ｍＬ／ｍｉｎの流速で流した。所望のピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより解析した（図８Ａ及び図８Ｂ）。
【００９２】
（第７の実施例）GCaseの酵素活性の測定
組み換え型のヒトGCaseの活性を４−ＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリル β−Ｄ−グルコシド, SIGMA）を基質として用いて測定した。反応混合液は、７５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ph5.9）、 0.125% w/vタウロコール酸及び３ｍＭ ４−ＭＵＧを含む。反応は３００μＬの試験溶液に１０μＬの検体を入れ、３７℃で１時間行った。その反応を０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ（ph10.0）を１６９０μＬ加えることにより終了させた。酵素活性は、励起波長が３６５±７ｎｍで且つ放出波長が４６０±１５ｎｍとした蛍光光度計を用いて測定した。１分間当たり１μｍｏｌｅの基質が酵素により遊離する量を１ユニット（Ｕ）として定義した。異なる検体の量は、市販のイミグルセラーゼの公知の量と比較して測定した。蛍光光度の測定により、イネの胚乳で生成されたヒトGCaseは、活性を有し、市販のイミグルセラーゼと同一の動的反応により特徴付けられることが証明された。
【００９３】
（第８の実施例）組み換え型GCaseのＮ末端配列の同定
GCaseのＮ末端配列の正確さを、タンパク質ミクロシークエンシングにより確認した。このために、酵素の所定の分量をＨＩＣ及びＩＥＣを用いて精製し、それをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、Trans-Blot Semi-Dry装置を用いてＰＶＤＦ膜に転写した（転写条件：１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液及び１０％メタノール,pH11.0を用い２５Ｖで３０分間行った。）。この転写の後に、転写膜を５０％メタノールに溶解した０．２５％（w/v）クマシーブルーR-250を用いて５分間染色し、水により洗浄し、所望のタンパク質に対応するバンドを可視化するために５０％メタノールにより１０分間脱染した。ミクロシークエンシングをエドマン分解法（Edman,1950）に従って行った。この解析により、ヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型のＮ末端配列と完全に一致するノナペプチド（ＡＲＰＣＩＰＫＳＦ）の存在が示された。従って、イネのグルテリン４シグナルペプチドは小胞体膜により認識され、内部移行段階の際に正確に移行されることが結論づけられた。
【００９４】
（第９の実施例）精製GCaseのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析
トリプシンによるタンパク質の切断
ゲル電気泳動と、０．２５％（w/v）クマシーブルーR-250水溶液、５０％メタノール及び１０％氷酢酸を用いた染色との後に、組み換え型GCaseに対応するタンパク質のバンドを切り出し、それを３００μＬの１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３と１００％アセトニトリル（ＡＣＲ）とが50:50（v/v）の比である溶液を用いて３７℃で洗浄し、すりつぶし、１００μＬのＡＣＮにより脱水した。続いて、ジスルフィド結合を還元するために、そのタンパク質のバンドを２０ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３を５０μＬ用いて５６℃で１時間処理し、５０ｍＭ ＩＡＡ（ヨードアセトアミド）を含む１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３を５０μＬ用いて３０分間アルキル化を行った。さらに、そのタンパク質のバンドを３００μＬの１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３を用いて洗浄した後、２０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３と１００％ ＡＣＮとが50:50（v/v）の比である溶液を３００μＬ用いて洗浄し、１００μＬのＡＣＮを添加し再び脱水した。その後、タンパク質のバンドを１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３及び５０ｎｇ／μＬ トリプシン（Promega）を含む切断緩衝液を５μＬ〜１０μＬ用いて再水和し、その３０分後に２０μＬの２０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３を加えた。それを３７℃で一晩の間温置した後、トリプシンによるペプチドを含む緩衝液を移し、２％ ギ酸と６０％ ＡＣＮとの溶液（50:50 v/v）を検体に加えることにより、さらにペプチド抽出を行った。２つの抽出物を一緒にプールし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析（Perkin Elmer）のために用いた。
【００９５】
Ｃ１８樹脂によるペプチド精製
トリプシンによる切断物をC18 zip-tip（Millipore）を用いて精製及び脱塩した。そのチップは１０μＬの１００％ ＡＣＮで４回洗浄し、１０μＬの０．１％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で３回洗浄した。その活性化させたチップに検体を加え、０．１％ ＴＦＡで洗浄した後、C18 zip-tipの逆相の樹脂に結合したペプチドを１００％ ＡＣＮと０．１％ ＴＦＡとが70:30（v/v）の比である溶液を１０ｍＬ用いて溶出した。
【００９６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス分光法を用いたペプチドマスフィンガープリント法によりタンパク質の同定
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析のための検体の調製は、１μＬの精製したペプチドに金属の台に置かれた１μＬのＣＨＣＡ樹脂（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）濃縮溶液加えることにより行った。この解析（図９）により、第６の実施例において記載した方法を用いて精製されたタンパク質がヒト酸性β−グルコシダーゼと確かに一致することが証明された。特に、この同定は、１０−３２のスコア及び認識されたペプチドと５３％が等しいカバー度を用いて得られた。有意なレベルはスコアが１０−６以下で且つカバー度が３０％以上の範囲であるため、それらの結果は絶対的な保証となる。興味深いことに、そのタンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおいて認識されたペプチドの中で見つけられた（全リストである［表１］を参照。）。
【００９７】
【表１】
2011516036.tif 000002
【００９８】
（第１０の実施例）ＧＡＡ発現ベクターの作製
本実施例では、ヒト酸性α−グルコシダーゼのイネの胚乳特異的な発現のための方法を記載する。特に、最終的な発現ベクターであるpSV2006[GluB4pro/LLTCK/GAA/NOSter]の調製について示す。このベクターは、前記のpSV2006[GluB4pro/LLTCK/GCase/NOSter]ベクターのGCase遺伝子をGAA遺伝子に置換することにより作製された。
【００９９】
ヒト酸性α−グルコシダーゼをコードしている配列（GenBank ACC. No NM 000152）は、イネの胚乳において導入遺伝子の発現レベルを増大させるために改変されており、新規のGAAをコードしている配列は、イネのコドンを基に書き直されている。さらに、天然のGAAシグナルペプチドをPSGluB4と置換し、すなわち、小胞体内腔に組み換え型GCaseを向けるためのものと同一の移行ペプチドを用いた。GAAをコードしている配列は２８５０ｂｐの長さであるため、３つの断片（Ａ、Ｂ及びＣ）に分けて人工的に合成した。明らかに方向付けられた様式でこれらの断片を構築するために、それらの端部に同義の点変異を生じさせることにより制限酵素領域を導入した。pSV2006の中にGAA遺伝子の全てを入れることを容易にするために、第１の断片の５’末端及び第３の断片の３’末端のそれぞれにXba I領域及びSac I領域を導入した。３つのGAA断片の構築をpUC18ベクターの中で行い（図１０）、全配列（SEQ ID No:9）を確認した後、その遺伝子をXba I及びSac Iを用いた切断によりpUC18から切り出し、pSV2006[GluB4pro/LLTCK/GCase/NOSter]の中のGCase遺伝子と置換してクローニングし、最終的な発現ベクターであるpSV2006[GluB4pro/LLTCK/PSGlub4/GAA/NOSter]（図１１）を得た。
【０１００】
（第１１の実施例）ＧＡＡタンパク質抽出物のウエスタンブロット
すり鉢及びすりこぎを用いて、籾殻を取った５つの種子を３５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の１ｍＬ中で轢いた。その後の結果物を氷上で１時間撹拌し、続いて、それを４℃で４５分間、１５０００×ｇで遠心分離を行った。その後の上清（２０μｇの可溶性タンパク質）をPrecision Protein Standard（BioRad）と共に１０％ポリアクリルアミドゲルに流した。そのゲルをTrans blot SD装置（BioRad）を用いて０．２μｍＰＶＤＦ膜（Millipore）に転写した。その転写膜に７．５％の脱脂粉乳を含むＰＢＳ緩衝液（Oxoid）を用いて室温で１時間ブロッキングを行った。洗浄後、凍結乾燥されたαアルグルコシダーゼ（Myozyme, Genzyme Corp）を抗原として用いて生成したウサギポリクローナル抗体の１次抗体を前記のブロッキング緩衝液で１：５０００の希釈倍率で希釈し、これに転写膜を室温で１時間浸した。その後、ＨＲＰ結合２次抗体（Sigma Aldrich）を１：１００００の希釈倍率で希釈し、これに転写膜を室温で１時間浸した。最終の洗浄後に、転写膜にECL plus（GE Healthcare Bio-Science）を用いて化学発光させた（図１２）。
【０１０１】
（第１２の実施例）イネの胚乳における組み換え型ＧＡＡの免疫局在化
この方法は、GCaseコンストラクトを用いて形質転換されたイネの種子について説明した方法とほとんど類似している。
【０１０２】
簡単に説明すると、開花から約１０日〜１５日の未成熟なイネの種子を脱水し、LR White Resin（London Resin Co.Ltd.,Hamshire,UK）に包埋した。そのブロックを６０℃で２４時間重合した。その後、それをultramicrotome LKB Nova（Reichter）を用いて極度に薄い切片とし、免疫局在化のためにニッケルグリッド（Electron Microscopy Science）の上に載せた。その切片を標準ヤギ抗血清（Aurion）をbuffer Cにより１：３０の希釈倍率で希釈した溶液に１５分間浸し、その後、抗ＧＡＡ血清（ウエスタンブロット解析において用いたものと同一のもの）をbuffer Cにより１：１００の希釈倍率で希釈した溶液に室温で１．５時間浸した。洗浄後、１５ｎｍのコロイド金が結合したヤギから作製された抗ウサギ抗体（Aurion）を０．９％ ＮａＣｌ及び１％ ＢＳＡを含む０．０２Ｍ  Tris-HCl,pH8.2により１：４０の希釈倍率で希釈した溶液に切片を１時間浸した。その後、０．１％クエン酸鉛（Reynolds,1963）を用いて切片を染色し、Philips CMIO透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて観察した。同一の操作を形質転換されていないイネ由来の検体においても行った。
【０１０３】
GCase形質転換の種子の切片において観察されたように、GAA形質転換の種子の胚乳の免疫金標識により組み換え型酵素がタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶｓ）の中に特異的に局在していることが示された（図１３）。タンパク質小体又は陰性対照のCR W3において、シグナルは検出されなかった。
【０１０４】
（第１３の実施例）ＧＡＡタンパク質抽出物のＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを行う前に、第１１の実施例において示したようにウサギから生成された２ｍＬの抗GAA抗血清抗体を、１ｍＬのHitrap rProtein A FFカラム（GE Healthcare）により精製した。その後、以下に示すプロトコールのようにEZ-Link Maleimide activated Horseradish peroxidase kit（Pierce）を用いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を精製されたＩｇＧｓに結合させた。１００μＬのMaleimide conjugation緩衝液を2-MEAの６ｍｇバイアルに加え、その溶液にＩｇＧ検体を加え、これを３７℃で９０分間温置した。室温で平衡化した後、IgG/2-MEA溶液を脱塩カラムに通し、３０ｍＬのMaleimide conjugation緩衝液を用いて前平衡化を行った。続いて、Maleimide conjugation緩衝液をカラムに加え、０．５ｍＬの分画を回収した。タンパク質のピークを位置づけるために、それぞれの分画の２８０ｎｍの吸光度を測定し、還元されたＩｇＧを含む分画をプールし、それを活性化されたＨＲＰのバイアルに加えた。この反応を室温で１時間行った。その後、Maleimide coating緩衝液（ＰＢＳ及びＥＤＴＡを含む。）とsuperdex 200 10/300 GLカラムとを用いてゲル濾過を行った。溶出されたピークを０．８５μｇ／μＬの濃度となるまでAmicon Ultra-10（Millipore）により濃縮した。ＨＲＰが結合した抗ＧＡＡ抗体の質をＥＬＩＳＡにより試験した。このため、１ｍｇ／ｍＬのMyozyme抗原をプレートにコーティングし、ブロッキングした後、そこに異なる希釈倍率で希釈した前記の抗体を加え、３７℃で３０分間温置した。その後に、ＴＭＢ基質（3,3',5,5''-テトラメチルベンジジン）を用いて検出を行い、抗原の最も低い検出限界は、ＨＲＰが結合した抗ＧＡＡ抗体を１：１０００の希釈倍率で希釈したものを用いた際に得られた。
【０１０５】
この抗体を以下に示すような未精製のタンパク質抽出物に対してサンドウィッチＥＬＩＳＡを行うために用いた。ＥＬＩＳＡプレートのマイクロウェルの中に、１５ｎｇ／μＬの精製された抗ＧＡＡ抗体を１００μＬ加え、４℃で一晩置くことによりコーティングを行った。
【０１０６】
３％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングを行い、PBS 0.1% Tween-20を用いてリンスした後、種子から抽出した総タンパク質（PBS 0.1% Tween-20及び1% BSAにより１：１０又は１：１００の希釈倍率）を加え、３７℃で３０分間温置した。その後、３回洗浄し、ＨＲＰが結合した抗ＧＡＡ抗体をPBS 0.1% Tween-20及び1% BSAにより１：４０の希釈倍率で希釈したもの加え３７℃で３０分間温置した。４回洗浄した後、ＴＭＢ基質を用いて検出した。
【０１０７】
公知の量の標準Myozymeを用いて行われたＥＬＩＳＡ試験に基づいて、ＧＡＡの初代形質転換体から得られた種子のタンパク質検体は、総可溶性タンパク質の０．５％に相当する平均的なＧＡＡ含量を示した。
【０１０８】
本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の部分又は工程の改変及び／又は付加することは、植物においてヒトタンパク質、特に、前記に記載した穀類の胚乳において組み換え型ヒトリソソーム酵素を生成する方法のために行われてもよいことは明らかである。
【０１０９】
また、本発明は、特定の実施例を参考に説明したが、植物においてヒトタンパク質を生成する、特に、特許請求の範囲において明らかとした特徴を有する穀類において組み換え型ヒトリソソーム酵素を生成する方法と同等な当業者が必ず達成できると考えられる他の多くの方法は、それに関して特許請求の範囲に定義された保護範囲内となることは明らかである。
【図１】
2011516036.tif 000003
【図２Ａ】
2011516036.tif 000004
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図１２】
2011516036.tif 000020
【図１３】
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【配列表】
2011516036000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月17日(2010.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】穀類の胚乳において組み換え型ヒトリソソーム酵素を生成する方法
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換え型ヒトリソソーム酵素、特に、酸性β−グルコシダーゼ（E.C.3.2.1.45）及び酸性−α−グルコシダーゼ（E.C.3.2.1.20）を植物、具体的に穀類の形質転換及び遺伝子操作により生成する方法に関する。産業用の種子の製造は、胚芽及びアリューロン層の除去により行われ得る、すなわち、種子中の一部には多くの脂質及びタンパク質混入物が含まれるため、本発明において用いる植物種は、Oryza sativa L.（イネ）であることが好ましい。
【０００２】
同様の技術は、欠損又は不完全な機能性が病気の状態を引き起こす他のヒトリソソーム酵素の胚乳特異的な発現のためにも用いられ得る。
【背景技術】
【０００３】
希少病とは、人口における発生率及び罹患率が低い疾患の異質性の群をいう。それらは慢性的な経過を示し、重篤な結果又は致命的となる。
【０００４】
希少病には、リソソーム病が含まれ、この病気は特定のリソソーム酵素又はキャリアタンパク質の不足により起こる。この病気の分類には、ゴーシェ病、糖原病II型、ファブリー病、ニーマンピック病Ｂ型及びムコ多糖症Ｉ型、II型、IV型等が含まれる。これらの病気に対する治療的アプローチは、欠損した酵素の静脈内投与（酵素補充療法、ＥＲＴ）である。例えば、ゴーシェ病は、ヒト酸性β−グルコシダーゼを定期的に一生投与されることにより治療され得る。しかしながら、この治療は非常に高額であり、全ての患者に用いることができない。ＥＲＴの高いコストは、ヒト又は哺乳動物の細胞の培養による酸性β−グルコシダーゼの生成の困難性により実質的に決定している。
【０００５】
リソソーム加水分解酵素は、多くの理由のため生成することが困難である。
【０００６】
第１に、細胞内においてエネルギーの節約のため、それらは少量だけ必要とされ、フィードバック機構に基づく制御過程によりそれらの過剰発現が防がれている。制御過程は種の間で非常によく保存されており、遺伝的に形質転換された生物において組み換え型リソソーム酵素の有意な量を生成することは妨げられる。公知の例として、動物細胞におけるヒトβ−グルコシダーゼの生成において、ＴＣＰ８０タンパク質がヒトβ−グルコシダーゼのメッセンジャーＲＮＡとポリソームとの結合を変化させることにより、効率的に翻訳を阻害する。
【０００７】
第２に、リソソーム酵素は、重要な細胞のコンポーネントの範囲を越える異化機能を有し、宿主細胞から正常に除去されなければ、細胞にダメージを与える又は細胞死を引き起こす。実際に、これらの酵素は、リソソームに移動する不活性な前駆体として合成され、そこでそれらは活性型に変えられ、そこに局在し続ける。動物細胞の培養において、組み換え型リソソーム酵素はリソソームに局在する又は培養培地に分泌され、両方の場合ともに生産量又はコストに関して最適以下である。植物において、植物はリソソームを有さないため、組み換え型リソソーム酵素の局在領域は、不確定である。一方、植物細胞のリソソーム酵素の置き違えは、細胞の生存率又は代謝の観点において、きわめて有害である。実際に、これらの酵素は必須の細胞コンポーネントを越える異化機能を発揮し、例えば、β−グルコシダーゼは細胞膜系の構成要素である糖脂質を切断できる。
【０００８】
この問題が十分に解決されると、遺伝子操作された植物は、植物の栽培が比較的安価な材料とその分野において既に存在する農業基盤とを用いるため、技術的及び経済的な観点から、リソソーム酵素、特に、組み換え型酸性β−グルコシダーゼの生成のための代替法に用いられる。
【０００９】
ＷＯ−Ａ−９７／１０３５３号公報（ＷＯ’３５３）において、ヒト酸性β−グルコシダーゼ及びその変異型を含むリソソーム酵素の合成は、植物の葉を用いる、特に、タバコ（Nicotiana tabacum L.）のようなバイオマスとなる種の葉を用いる場合についてのみ報告されている。ＷＯ’３５３は、疑義のある方法が記載されており、その方法において、葉には多くの水分が含まれており（これは所望のタンパク質を分散させる。）、タンパク質混入物、ポリフェノール、ゴム、侵出物及び有毒のアルカロイドが多く存在し、これらが酵素の抽出及び精製の工程を複雑にする。
【００１０】
ＷＯ’３５３において、酸性β−グルコシダーゼの発現は、ＭｅＧａプロモータ（障害誘導性のトマトＨＭＧ２プロモータに由来する。）又はＣａＭＶ ３５Ｓプロモータを含む発現ベクターを用いて、タバコを形質転換させることによって行っている。後者のプロモータは、公知であり、恒常型の遺伝子の転写制御をするための配列として広く用いられている。ＷＯ’３５３において、他の恒常性又は誘導性プロモータが前記の目的と同一の目的のために用いられることは可能であると述べられている。
【００１１】
障害誘導性プロモータが関わる限り、ＷＯ’３５３において、それらの使用は、葉に厳しく制限され、酸性β−グルコシダーゼを発現させるために植物に予め傷を付けなければならない。予め傷を付けることは、コストを増大させ、その生成工程の管理をより複雑とし、液胞又は他の細胞コンパートメント内の常在性のタンパク質分解酵素により一部の酵素が分解され、また、細菌及び菌類による傷つけられた材料がひどく汚染されることとなる。
【００１２】
ＷＯ’３５３において実質的に考慮された光誘導性プロモータは、透過光照射の欠損及び／又は光合成組織において通常存在する転写因子の欠損により、種子、特に、穀類の種子のような葉肉以外の組織において効果的に遺伝子を発現しない。恒常性プロモータに関しては、全ての例においてＣａＭＶ ３５Ｓプロモータ及びその代表的な観点について述べられている。しかしながら、実験において、異質のタンパク質の合成について除外する限り、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモータによる転写効率は種子ではわずかに低いだけである。この結果によると、穀類のような単子葉植物の場合ではより価値があり、このプロモータは葉の組織においても遺伝子発現レベルを高くするためにはあまり適用できない。
【００１３】
ＷＯ−Ａ−０３／０７３８３９（ＷＯ’８３９）において、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモータの制御下におけるβ−グルコシダーゼの変異型をコードしている遺伝子は、種子中で特異的な抗体を用いた免疫学的試験において検出できるレベルを発現しなかったことが報告されている。
【００１４】
従って、ＷＯ’８３９及びＷＯ’３５３には、葉肉と異なる組織、具体的に、種子においてヒト酸性β−グルコシダーゼ又は他のリソソーム酵素の生成を行うための方法が実質的に示されていないといえる。
【００１５】
さらに、後の実験（Reggi等.2005,Plant Mol Biol 57:101-113）により、タバコの葉におけるβ−グルコシダーゼの生成に関してＷＯ’３５３が提示する方法では、産業的に用いることができるレベルよりも低い酵素量が得られることが証明された。
【００１６】
さらに、ＷＯ’３５３に提示されているように、葉のバイオマスから精製され得る酵素量は、酵素活性として表した場合はより低く、また、特に恒常性プロモータを用いるような葉における発現系では技術的に制約がある。
【００１７】
ＷＯ’８３９において、植物におけるβ−グルコシダーゼの生成の際に生じる問題を解決する試みが提示されている。特に、ＷＯ’８３９は、７Ｓ大豆グロブリンプロモータと７Ｓ大豆グロブリンシグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列とに適当に連結されたβ−グルコシダーゼの変異型をコードしている遺伝子を含む発現ベクターを用いて、タバコの形質転換を行った結果について示している。免疫学的試験により、所望のポリペプチドは、実際に、生の種子の抽出物から検出された。
【００１８】
ＷＯ’８３９において、形質転換されたタバコ又はその子孫の種子におけるβ−グルコシダーゼの蓄積により起こる植物毒性について示されていないため、提示された方法は、植物におけるリソソーム酵素、特に、β−グルコシダーゼの生成に関する問題を解決するのに有効であるといっている。
【００１９】
しかしながら、形質転換されたタバコにより産生された種子において行われた実験は、β−グルコシダーゼの蓄積が種子の生存率の重大な変動を決定することを明らかとした。特に、酵素濃度を２００Ｕ／ｋｇ（種子の質量）に予め近づけた状態において（１Ｕは３７℃、ｐＨ５．９において１分間に１μｍｏｌの４−メチルウンベリフェリル−Ｄ−グルコシドを遊離する酵素の量である。）、低い生存率と発芽阻害による生殖異常とがみられる。さらに、５００Ｕ／ｋｇ（種子の質量）程度以上では、種子の生存率は完全に損なわれる。
【００２０】
出願人により行われたさらなる実験により、ＷＯ’８３９と同一の遺伝子領域を用いて形質転換されたタバコの種子の生存率は、公知の方法により回復させることはできないことが示された。電子顕微鏡により行われた出願人の実験は、酵素の産業的な生成のために理論上用いることが可能な遺伝子組み換え型系統から得られる子孫が生存することは不可能であることを証明するために、生存不能な種子の組織崩壊及び細胞膜系の崩壊を示した。β−グルコシダーゼの変異型の貯蔵領域は、タバコの胚の柔細胞の内部のタンパク質貯蔵液胞と一致することが電子顕微鏡により引き続き示された。
【００２１】
一般に、産業的な酵素量の生成のために必要な植物の系統は、インビトロにおける選り抜きの植物の繁殖により得ることができるが、この方法を用いることは、比較的に短時間で田畑に移植される多くの植物のために必要な生成サイクルを複雑にすることを避けられない。イタリアのヒトβ−グルコシダーゼの需要を満足させるために遺伝子組み換え型タバコの種子を６０トン生産する計画のために、少なくとも１５０ヘクタールの土地を出資すること、また何よりも、インビトロにおける生成、温室順応及び少なくとも９００万のタバコの苗の畑への移植が必要とされた。
【００２２】
工程管理及び経済的な問題に関して、遺伝子組み換え型の種子を散布する、又は幅の狭い列に播くことにより結果が全く異なることは明らかであり、後者の操作では、生存可能な種子のみを用いて実施でき、より高い植物の密度の観点から、標準的なタバコの収穫高と比較して単位面積当たり４倍〜６倍高い種子の生成量を可能とする。直接に種子を播くことにより得られる植物の密度と同様の密度を達成することは、移植によってはあり得ず、生産的な観点から、そのコストを補うには不十分であり、実際に、植物の生産量と単位面積当たりの植物数とは反比例する。マイクロプロパゲーションのコストに関して、それぞれの植物が個々に論じられるべきであり、それぞれのタバコにより生産される種子の量を非常に少ない量（数グラム）に合わせると、リソソーム酵素の生成のための宿主として用いられる植物の利点が非常に減少する。
【００２３】
このため、ＷＯ’８３９では、以下の本質的な問題を解決していないままである。
【００２４】
リソソーム酵素は植物に望まれない植物毒性効果を及ぼし、特に植物の繁殖にその効果を及ぼし、提示された技術を適用するには、扱いにくく且つ高価な方法を採用することが強いられる。その生産系では、生まれた子孫の性的な繁殖及び栽培の自然な過程により維持及び増殖をすることはできない。治療のために用いる活性物質の製造管理及び品質管理規則（ＧＭＰ）に対応する現存の国内法及び国際法に従って、マスターシードバンク及びワーキングシードバンクを確立することは不可能である。生産経路の再建をするたびに、その際に形質転換された植物（数グラム）により生産された種子を毎回再試験し、選択された種子をバルク化することが必要であり、これは明らかにＥＭＡ又はＦＤＡのような全ての監督機関により容認されない。生産系統の凍結保存と同様にインビトロにおける繁殖は、植物のゲノムの中に導入された遺伝子コンストラクトの変異又は不安定化を引き起こし得る。
【００２５】
ＷＯ’８３９におけるリソソーム酵素の生成のための発現ベクターの構築の例は、全て双子葉植物のタンパク質プロモータを用いることを示している。リソソーム酵素の実際の発現に関する例では、酸性β−グルコシダーゼの変異型に制限され、また、用いられている宿主植物は常にタバコ（Nicotiana tabacum L.）である。
【００２６】
これについて熟慮すると、ＷＯ’８３９は植物におけるリソソーム酵素、特にβ−グルコシダーゼの生成のために何も教示しておらず、また、種子における酸性β−グルコシダーゼのような酵素の組織での発現及び細胞内での局在化に関する問題及び制限を回避する方法、最小化する方法及び克服する方法について提示していない。
【００２７】
ＷＯ’８３９に提示されていることに従って、種子からリソソーム酵素を抽出及び精製するには、さらなる問題が含まれている。ＷＯ’８３９に従って、種子を液体窒素により均質化するべきであり、その結果物である未精製の抽出物を限外濾過及びＨＰＬＣにより部分的に精製するべきである。これらの方法に新規性はなく、産業的には適用できず、実際に、緩衝液の体積が２、３Ｌよりもわずかに多いと、液体窒素を用いて緩衝液中で粉砕された種子を検体とすることはできず、同様に、未精製抽出物の体積が大きいと、膜の詰まりにより限外濾過はできない。また、ＨＰＬＣの工程は、小さい検体のみ工程を進めることができるため、産業的には適用できない。このため、ＷＯ’８３９には、治療的用途に適する精製型のリソソーム酵素の産業的な生成のための教示は含まれていない。実際に、ＷＯ’８３９において、種子から酵素を生成した事実は、実験室規模でさえも提示されていない。結論として、その前提にも拘わらず、ＷＯ’８３９は植物においてβ−グルコシダーゼを生成するための解決法を構成しておらず、他のリソソーム酵素についても構成しておらず、当業者がＷＯ’８３９の発明を適用すると少なくとも産業的規模ではほぼ間違いなく失敗するだろう。
【００２８】
ＷＯ’８３９と同様に、特許出願ＷＯ−Ａ−００／０４１４６（ＷＯ’１４６）には、ヒトラクトフェリンの発現及び植物の種子中の一般的な酵素活性を有するタンパク質の発現について提示されており、機能的活性酵素の生成、特にリソソーム酵素の生成については全く提示されていない。ＷＯ’１４６において、酵素の効果的な生成工程について示す事項が提示されておらず、その酵素の安定性、構造及び機能に関する問題については、完全に無視されている。
【００２９】
本発明の目的は、穀類の胚乳において組み換え型ヒトリソソーム酵素を生成する方法、特に、イネの胚乳において酸性β−グルコシダーゼ及び酸性α−グルコシダーゼを生成する方法を実現することにある。新規に発明した方法は、公知技術における適当な困難性を克服する。特に、本発明によると、種子中において、組織発現及びリソソーム酵素、特にヒト酸性β−グルコシダーゼ及びヒト酸性α−グルコシダーゼの細胞内の局在に有効であり、治療的用途に適するリソソーム酵素を生成でき、植物毒性現象のリスクが除かれ、種子の生存率に影響せず、マスターシードバンク及びワーキングシードバンクを作ることを可能とし、性的な繁殖による生産系の維持及び増殖を可能とし、酵素の抽出及び精製を容易にし、経済的により用いやすく、生成工程の管理が非常に容易となり、酵素の部分的な分解のリスクが除かれ、細菌及び菌類の混入のレベルが顕著に減少する。
【００３０】
出願人は本分野の現状の問題を克服するために、また、前記の目的及び他の目的と利点とを得るために本発明を発案し、試験し、具体化した。
【発明の概要】
【００３１】
本発明は、独立項において明らかとされ、また、特徴づけられ、その関連する従属項には、本発明の他の特徴又は主な発明の思想の変形が提示されている。
【００３２】
前記の目的に従って、穀類の胚乳において治療的用途に適する組み替え型ヒトリソソーム酵素を生成する方法は、
（i）リソソーム酵素をコードしている遺伝子の上流の胚乳特異的プロモータであるイネグルテリン４プロモータ（GluB4pro）、（ii）５’領域のＬＬＴＣＫであるリーダー配列、（iii）胚乳細胞の内質細網の内腔の中に新規に合成されたリソソーム酵素が同時翻訳的な移行をするのに適し、且つ、特定の細胞コンパートメントの中にリソソーム酵素を蓄積することを決定するのに適し、内質細網の中にグルテリン４前駆体を向けるためにイネに用いられるシグナルペプチドをコードしているPSGluB4、（iv）ヒトリソソーム酵素の成熟型をコードしているヌクレオチド配列、及び（v）天然型又は人工の３’ＵＴＲを備えているヌクレオチド配列を含む穀類の形質転換のための発現ベクターを構築する工程と、
ヒトリソソーム酵素を発現させ且つ植物の胚乳に局在させ、最終的に胚芽によって吸収されず、胚乳における大量の前記タンパク質の存在が種子の生存率及び発芽速度に負の影響を与えないように、発現ベクターを用いて穀類の植物を形質転換する工程と、
穀類の植物の種子の胚乳の中に前記リソソーム酵素を蓄積する工程とを備えている。
【００３３】
本発明は、種子の胚に属しない貯蔵組織に異質性の組み換え型ヒトリソソーム酵素が蓄積することを許容する。また、本発明は、種子の胚に属しない貯蔵組織に高い植物毒性及び破壊の可能性がある組み換え型ヒトリソソーム酵素が蓄積されると、発育の最後に自然にアポトーシスが起こることが好ましい。さらに、種子の給水及び発芽の後に強い加水分解活性を受ける非生存組織に植物毒性タンパク質が潜在的に蓄積されることも可能である。
【００３４】
これらの潜在的な危険タンパク質は、細胞膜に接触する又は細胞膜を横切ることなく、タンパク質貯蔵液胞又はタンパク質小体に貯蔵され得る。本発明は、タンパク質輸送、安定性、生化学的活性及び治療的利用において潜在的に有害でないならば、役に立たない付加されたアミノ酸の存在により特徴づけられるタンパク質の非標準的な変異体でなく、意図されるアミノ酸配列通りに正確に生成されることを可能とする。その合成されたタンパク質は、タンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶｓ）又はタンパク質小体（ＰＢｓ）を有する胚乳に貯蔵されることが好ましい。ＰＳＶｓ又はＰＢｓから抽出可能なタンパク質は類似しているため、前記の細胞内コンパートメントの１つ又はその他における前記タンパク質の局在は、本発明の有効性には無関係である。
【００３５】
本発明の一実施形態は、以下の要素を有する配列を備えている穀類植物の形質転換のための発現ベクターの構築を含む。
（i）リソソーム酵素をコードしている遺伝子の上流の胚乳特異的プロモータであるイネグルテリン４プロモータ（GluB4pro）、
（ii）５’領域のＬＬＴＣＫであるリーダー配列、
（iii）胚乳細胞の内質細網の内腔の中に新規に合成されたリソソーム酵素が同時翻訳的な移行をするのに適し、且つ、特定の細胞コンパートメントの中にリソソーム酵素を蓄積することを決定するのに適し、内質細網の中にグルテリン４前駆体を向けるためにイネに用いられるシグナルペプチドをコードしているPSGluB4、
（iv）ヒトリソソーム酵素の成熟型をコードしているヌクレオチド配列、
及び（v）天然型又は人工の３’ＵＴＲ。
【００３６】
また、穀類植物の形質転換のためにこのようなベクターを用いる。
【００３７】
発現ベクターのヌクレオチド配列は、SEQ ID No:1に示す配列が好ましい。
【００３８】
本発明の一実施形態において、発現ベクターを細菌株に導入し、それを直接又は間接に植物の形質転換のために用いる。
【００３９】
細菌株は、Escherichia coli、Agrobacterium tumefaciens及びAgrobacterium rhizogenesを含む群に属することが好ましい。
【００４０】
好ましい一実施形態において、前記の細菌株を、イネ（Oryza sativa ssp.aponica, 変異体CR W3）の胚形成するカルスの形質転換のために用いる。好ましい変形例において、ヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性β−グルコシダーゼである。他の変形例において、ヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性α−グルコシダーゼである。
【００４１】
実際に、本発明は、分子量、構造及び機能が酸性β−グルコシダーゼと全く異なるヒト酸性α−グルコシダーゼの前駆体の有意な量の合成、抽出及び精製にも同様に有効である。
【００４２】
一実施形態において、本発明は種子の産業的な製造を行う第３工程を含む。
【００４３】
一解決法において、産業的な製造は、多くのタンパク質混入物を含む繊維状の構成物、胚芽及びアリューロン層を除去するために、収穫された成熟した種子の籾殻を取り、精白することを含む。
【００４４】
さらに、一実施形態において、本発明は、組み換え型ヒトリソソーム酵素の精製を行う第４工程を含む。この精製工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及びゲル濾過の順に行われることが好ましい。さらに、その精製工程は、以下に記載する実施例に示すものと類似の化学組成、構造及び／又は機能を有するクロマトグラフィ用の樹脂を適用すること、溶出条件を部分的に改変すること、及び検体を樹脂に２度通過させること、例えば、カラムから溶出した分画を再びカラムに通すことを代替的に又は付加的に含んでもよい。本発明における組み換え型ヒトリソソーム酵素は、１００Ｕ／ｋｇ（種子の質量）以上の量において、また、５００Ｕ／ｋｇ（種子の質量）においてさえも精製される。さらに、精製された酵素は、強い活性を有し、欠損、付加又はアミノ酸の置換がなく、結果として、これらの観点においては、ヒトの天然型の対応物と完全に同等である。さらに、胚乳における酵素の蓄積は、種子の生存率又は発芽速度を変化させない。酵素の生成のために用いられる分子カセットは、子孫への正常な遺伝、及びホモ接合体による遺伝又は他の形質転換系列と交叉することによる遺伝のようなメンデルの法則に従う遺伝のどちらの場合も酵素の生成を増大させるのに有利である。
【００４５】
本発明に関する方法は、公知技術とは逆に、遺伝子組み換え型、例えば、産業的に適当な量の治療的用途に適する組み換え型ヒトリソソーム酵素、特に、ヒト酸性α−グルコシダーゼ又はヒト酸性β−グルコシダーゼを生産できるイネを得ることを可能とし、このイネは通常の表現型（肉眼及び顕微鏡の両方のレベル）と違いがなく、特に、異常な繁殖又は種子の生存率及び発芽速度の変化がなく、酵素濃度が５００Ｕ／ｋｇ（種子の質量）以上であり、明らかに革新的で且つ有利である。また、この方法は、ヒトの天然型の対応物と比較してアミノ酸配列に変化がないように維持されている完全な活性型として、酵素を抽出及び精製できる。
【００４６】
穀類の胚乳で治療的用途に適する組み換え型ヒトリソソーム酵素を発現するのに適するヌクレオチド配列は本発明に該当し、そのヌクレオチド配列は、以下の要素を含む。
（i）リソソーム酵素をコードしている遺伝子の上流の胚乳特異的プロモータであるイネグルテリン４プロモータ（GluB4pro）、
（ii）５’領域のＬＬＴＣＫであるリーダー配列、
（iii）胚乳細胞の内質細網の内腔の中に新規に合成されたリソソーム酵素が同時翻訳的な移行をするのに適し、且つ、特定の細胞コンパートメントの中にリソソーム酵素を蓄積することを決定するのに適し、内質細網の中にグルテリン４前駆体を向けるためにイネに用いられるシグナルペプチドをコードしているPSGluB4、
（iv）ヒトリソソーム酵素の成熟型をコードしているヌクレオチド配列、
及び（v）天然型又は人工の３’ＵＴＲ。
【００４７】
本発明の一実施形態において、イネのグルテリン４プロモータ（GluB4pro）の配列はSEQ ID No:2に示されている。
【００４８】
好ましい一実施形態において、前記（ii）の５’ＵＴＲは、ＬＬＴＣＫとして知られているリーダー配列であり、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６４５９０に提示され、SEQ ID No:3に示されている。本発明において、質内細網の中にグルテリン４前駆体を向けるためにイネに用いられるシグナルペプチドをコードしているPSGluB4のヌクレオチド配列はSEQ ID No:4に示されている。本発明の一実施形態において、（iv）の要素のヌクレオチド配列は、GCase配列であり、SEQ ID No:5に示されているようにヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型がコードされている。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態において、（v）の要素の３’ＵＴＲはＮＯＳターミネータであり、SEQ ID No:6に示されている配列である。この代わりに、GluB4のターミネータが用いられてもよい。本発明の一実施形態において、発現カセットの全体のヌクレオチド配列は、SEQ ID No:1と同一である。前記の配列と相補的な配列も本発明に該当する。前記の配列又はそれらの機能を維持しているそれらと相補的な配列のうちの１つ又はそれ以上のヌクレオチドの欠損、挿入、変化及び塩基転換のような変異の過程から派生した配列も本発明に該当する。種子の胚乳に特異的にヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型が合成及び蓄積されるのに適し、SEQ ID No:1に示されている配列と異なるプロモータ、質内細網にタンパク質を向けるための配列並びに翻訳されない５’領域及び３’領域を有する、又はこれらの配列と相補的な配列を有するヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型をコードしている前記の配列の組み合わせは本発明に該当する。
【００５０】
ヒトにおいて変異又は多型が存在するためSEQ ID No:1と異なる配列により成熟型酵素をコードしている前記に記載（i）、（ii）、（iii）、（iv）及び（v）の要素の組み合わせ、又はそれらの相補的な配列を有する組み合わせも本発明に該当する。
【００５１】
さらに、他のリソソーム酵素の成熟型又は前駆体をコードしている配列を有する前記の（i）、（ii）、（iii）、（iv）及び（v）の要素の組み合わせ、又はそれらの相補的な配列を有する組み合わせも本発明に該当する。
【００５２】
さらに、前記の組み合わせにおいて、ヒト酸性α−グルコシダーゼをコードしている場合も本発明に該当する。前記の配列で形質転換された植物が穀類である場合も本発明に該当する。前記のヌクレオチド配列を含み、植物の胚乳においてヒトリソソーム酵素を発現するためのベクターも本発明に該当する。発現ベクターは、典型的にはプラスミドである。
【００５３】
好ましい解決法において、ヒトリソソーム酵素はヒト酸性β−グルコシダーゼである。
【００５４】
その代わりに、ヒトリソソーム酵素はヒト酸性α−グルコシダーゼであってもよい。
【００５５】
ヒトリソソーム酵素を生成するための植物の形質転換のために前記の発現ベクターを用いることも本発明に該当する。
【００５６】
前記の発現ベクターを含む細菌株も本発明に該当する。その細菌株は、Escherichia coli、Agrobacterium tumefaciens及びAgrobacterium rhizogenesを含む群から選択されることが好ましい。
【００５７】
前記の発現ベクターを用いて形質転換された植物細胞も本発明に該当する。
【００５８】
本発明に係る解決法において、それらの細胞は穀類の細胞であり、イネ種（Oryza sativa L）に属することが好ましい。それは、食物として用いることに適さないイネの種類であることが好ましい。そのため、デンプン及びその副産物の抽出及び生成のために産業的に用いることができる糯種イネを用いることも本発明に該当する。
【００５９】
その代わりに、細胞が、例えば、トウモロコシ（Zea mays L）、オオムギ（Hordeum vulgare L）及びコムギ（Triticum spp）といったGraminaceaeファミリに属してもよい。
【００６０】
前記の発現ベクターを含み、ヒトリソソーム酵素を発現するために形質転換された植物の種子も本発明に該当する。
【００６１】
本発明の解決法において、形質転換された植物の種子は穀類に属し、その形質転換された植物はイネ種であるOryza sativa Lに属することが好ましい。
【００６２】
本発明に関して保護される範囲は、ヒトリソソーム酵素の発現のために、前記の発現ベクターを用いて形質転換された植物を含む。このような植物は穀類であり、イネ種であるOryza sativa Lに属することが好ましい。
【００６３】
自家受精若しくは交雑により得られた子孫、又は前記の形質転換された植物から選択された形質転換系統も本発明に該当する。
【００６４】
本発明には、治療用に用いるための前記の種子も該当する。さらに、本発明には、ＥＲＴ用薬剤の生産のために前記の種子を用いることも該当する。特に、ゴーシェ病、糖原病II型、ファブリー病、ニーマンピック病Ｂ型及びムコ多糖症Ｉ型、II型、IV型といった病気のための酵素補充療法に用いることが該当する。本発明には、酵素補充療法に用いるための前記の種子も該当する。特に、本発明には、ゴーシェ病、糖原病II型、ファブリー病、ニーマンピック病Ｂ型及びムコ多糖症Ｉ型、II型、IV型といった病気のための酵素補充療法に用いる前記の種子も該当する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
添付した図面に関連する非制限的な例である以下に記載する好ましい実施形態により、本発明の前記の特徴及び他の特徴を明らかとする。
【図１】ヒト酸性β−グルコシダーゼの胚乳特異的な生成のために用いられる最終的な発現ベクターであるpSV2006[GluB4pro/LLTCK/PSGluB4/GCase/NOSter]を示す模式図である。
【図２Ａ】GluB4プロモータの下流のLLTCKリーダー配列の再帰的ＰＣＲによる合成の方法を示す模式図である。
【図２Ｂ】GCase及びHPT II遺伝子にアニーリングする一対のプライマーを用いて、推定上形質転換された植物から抽出されたゲノムＤＮＡから得られた２本鎖のＰＣＲ産物の電気泳動解析の結果を示し、レーン１は１ｋｂラダー（ＮＥＢ）であり、レーン２は陰性対照（ＮＣ）、すなわち、形質転換されていない植物から抽出されたゲノムＤＮＡであり、レーン３は陽性対照（ＰＣ）、すなわち、pSV2006[GluB4pro/LLTCK/PSGluB4/GCase/NOSter]ベクターであり、レーン４〜１６は検体である。
【図３Ａ】GCaseの形質転換体の種子から抽出試験の過程において得られたタンパク質抽出物に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示し、レーン１〜５は精白したイネの検体から連続的に抽出した抽出物を順次流しており、レーン６及び７は精白する際の廃棄物から連続的に抽出した抽出物である。
【図３Ｂ】GCaseの形質転換体の種子から抽出試験の過程において得られたタンパク質抽出物に対してウエスタンブロットを行った結果を示し、レーン１〜５は精白したイネの検体から連続的に抽出した抽出物を順次流しており、レーン６及び７は精白する際の廃棄物から連続的に抽出した抽出物であり、陽性対照（ＰＣ）は精製されたイミグルセラーゼの１００ｎｇであり、精白したイネに含まれる組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼのほとんどは、３つの穀類抽出物を用いて回収できることを示している。
【図４Ａ】GCaseの形質転換体の種子から抽出試験の過程において得られたタンパク質抽出物に対してウエスタンブロットを行った結果を示し、レーン１はPrecision Plus Protein stanndardマーカー（BioRad）であり、レーン２は陽性対照（ＰＣ、１００ｎｇのイミグルセラーゼ）であり、レーン３は陰性対照（ＮＣ、変異体CR W3である形質転換していないイネから抽出されたタンパク質）であり、レーン４〜１０は異なる主要な形質転換体の種子から抽出されたタンパク質である。
【図４Ｂ】GCaseの形質転換植物から抽出された種子のタンパク質の２次元電気泳動の後のウエスタンブロットにより検出されたヒト酸性β−グルコシダーゼの３つのグリコフォームを示す図である。
【図５Ａ】形質転換をしていないイネの種子の薄片の透過型電子顕微鏡（１２５００倍）により得られた免疫局在を示す図である。
【図５Ｂ】GCaseの形質転換体の種子の薄片の透過型電子顕微鏡（１２５００倍）により得られた免疫局在を示す図であり、タンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶｓ）にのみ組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼの蓄積があることを示している。
【図６Ａ】組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼを含む溶出ピークを示すＨＩＣクロマトグラムの例を示す図である。
【図６Ｂ】組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼを含む溶出ピークを示すＩＥＣクロマトグラムの例を示す図である。
【図７】ＮＣ（形質転換していない植物）及びGCase形質転換体に関する異なるクロマトグラフィの所定量を用いて行われた４−ＭＵＧ試験において記録された蛍光強度を示すグラフであり、また、関連するウエスタンブロットの結果であり、ＥＸは生の抽出物であり、Ｒはフロースルーしたものであり、Ｅは溶出したものであり、ＰＣは陽性対照（イミグルセラーゼ）であり、ＩＥＣを用いて、真のGCase活性（Ｅ２〜Ｅ３）は内在性のGCase様物質（Ｅ６）と分けることが可能であることを示している。
【図８Ａ】ゲル濾過を用いて最終の精製工程を行った後の組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼに対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ａに対応するウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図９】ＨＩＣ及びＩＥＣにより精製されたGCase検体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって得られたマススペクトルを示す図である。
【図１０】最初に人工的に合成された断片からｐＵＣ１８に構築されるＧＡＡ遺伝子を示す模式図である。
【図１１】最終的な発現ベクターであるpSV2006[GluB4pro/LLTCK/GAA/NOSter]を構築するのに用いられた方法を示す模式図である。
【図１２】異なるＧＡＡ形質転換体から得られた総タンパク質抽出物に対して行われたウエスタンブロットの結果を示し、レーン１のＭはPrecision Plus Protein standardマーカー（BioRad）であり、レーン２のＮＣは形質転換されていない植物から抽出された種子のタンパク質であり、レーン３のＰＣは１００ｎｇのマイオザイムであり、レーン４〜１０は異なる主な形質転換体から得られた種子のタンパク質抽出物である。
【図１３】抗ＧＡＡ抗体を用いて成熟型種子の胚乳の金免疫標識法の結果を示す図であり、ＧＡＡはタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶｓ）において特異的に検出され、タンパク質小体（ＰＢｓ）において検出されないことを示している。陰性対照（形質転換されていない植物による種子の生成物）においては何も検出されなかった（データは示さない）。倍率は１６０００倍である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本発明は、特に、イネ（Oryza sativa L.）の種子の胚乳においてヒト酸性β−グルコシダーゼを生成するための方法であり、この方法は、
組み換え型ヒトリソソーム酵素を発現させ且つ植物の胚乳に局在させ、最終的に胚芽によって吸収されず、胚乳における大量のリソソーム酵素の存在が種子の生存率及び発芽速度に負の影響を与えないように植物の形質転換を行う第１工程と、
植物の種子の胚乳の中にリソソーム酵素を蓄積する第２工程とを備え、
第１工程において、リソソーム酵素をコードしている遺伝子の上流の胚乳特異的プロモータ、及び新しく合成されるリソソーム酵素の組織特異的な蓄積のために、リソソーム酵素を胚乳細胞の内質細網の内腔の中に同時翻訳的な移行をするためのシグナルペプチドを用いる。
【００６７】
その植物の形質転換を行う方法において、以下の要素を含む発現ベクターを用いる。
（i）天然型又は人工の胚乳特異的プロモータ、
（ii）天然型又は人工の５’ＵＴＲ、
（iii）組み換え型リソソーム酵素を胚乳細胞の質内細網の内腔の中に向け、特異的な組織にリソソーム酵素を蓄積することを決定するのに適するシグナルペプチドをコードしている天然型又は人工のヌクレオチド配列、
（iv）ヒトリソソーム酵素の成熟型をコードしている天然型又は人工のヌクレオチド配列、
及び（ｖ）天然型又は人工の３’ＵＴＲ。
【００６８】
発現ベクターに含まれるヌクレオチド配列は、例えば、SEQ ID No:1に示す配列である。
【００６９】
GluB4にコードされたリソソーム酵素は、種子の胚乳の中により均一に分布するため、Graminaceae植物、特に、イネの公知の胚乳特異的なプロモータとして、本発明ではGluB4遺伝子のプロモータ（SEQ ID No:2の配列）を用いることが好ましい。さらに、GluB4プロモータは、GluB4以外のグロブリン、プロラミン又はグルテリン等のイネの胚乳の中における他の貯蔵タンパク質をコードしている遺伝子のプロモータと比較してより高い転写活性を有する。
【００７０】
GluB4プロモータは、そのリーダー配列と共に、糯種イネの変異体CR W3（Ente Nazionale Risi, Milanにより選択された。）からＰＣＲにより単離される。天然型のリーダー配列は、より短く、遺伝子発現に正の影響を与えるＣＡＡ及びＣＴの繰り返し配列が欠損しているため、ＬＬＴＣＫとして知られ、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６４５９０に提示され、SEQ ID No:3に示されている５’ＵＴＲ（De Amicis等.2007, Transgenic Res 16:731-738）を代わりに用いる。
【００７１】
GluB4pro/LLTCKの配列は、PSGluB4/GCaseと結合される。PSGluB4は、内質細網に入るようにイネグルテリン４前駆体に用いられるシグナルペプチドをコードしている配列である（SEQ ID No:4）。GCaseはヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型をコードしている配列である（SEQ ID No:5）。その成熟型は天然型のシグナルペプチドが欠乏した前駆体タンパク質からなる。
【００７２】
クローニング又は配列の結合のために用いられる制限酵素の認識配列の導入により生じる成熟型タンパク質のＮ末端に異質なアミノ酸が付加されることを防ぐために、PSGluB4配列及び成熟型GCaseをコードしている配列の初めの部分に対応するＤＮＡ領域（天然型のHind III制限酵素領域まで）は、人工的に合成される。
【００７３】
ＬＬＴＣＫと関連する転写開始コドンの認識を良好にするために、また、稀なコドン又はコドンの中において不都合な構成が起こることを避けるために、計画的に導入された変異により、前記のような合成により生じるPSGluB4の配列は、イネの天然型における配列と同義ではあるが、一致はしない。逆に、GCaseの初めの部分は、ヒトの天然型の配列と変わりないように維持されているため、全体のGCaseの配列は、GenBankの登録No M16328のヌクレオチドの553番目と2046番目との間と正確に一致する。Hind III領域からのGCaseの残存領域をコードする配列と前記の合成配列とを結合した後に、全配列は、先にクローニングされたpSV2006の２成分ベクターであるGluB4pro/LLTCKの３’末端に結合される。pSV2006はpCAMBIA 1300プラスミド（www.cambia.org）から出願人により開発されたものである。ヒト酸性β−グルコシダーゼのコンストラクトのために用いられるポリアデニル化シグナルはNOSter、すなわち、Agrobacterium tumefaciensのノパリンシンターゼ遺伝子のターミネータである。ＮＯＳターミネータ配列は、SEQ ID No:6に示されている。
【００７４】
最終的なベクターであるpSV2006[GluB4pro/LLTCK/PSGluB4/GCase/NOSter]（図１）の構築をし、全ての配列を確認した後に、このベクターは、エレクトロポレーションによりAgrobacterium tumefaciensのEHA105株に導入される。その後、その菌株は胚形成するイネカルス（Oryza sativa ssp.japonica, 変異体CR W3）の形質転換のために用いる。選択的な培地における植物の形質転換及び再分化の全ての工程は正常に完了した。光、温度及び湿度が同一の条件であるチャンバにおいて形質転換及び植物の生長の制御を行った間、異なることは見られなかった。遺伝子組み換え型植物における雌花と雄花との受精及び花の欠損の割合は、近交系CR W3である形質転換していない植物と比較する。全ての初代の形質転換体は、ヒト酸性β−グルコシダーゼの発現のレベルに関係なく、平均９５％以上の生存率の種子を生成した。さらに、発芽速度はその種の最大値と同等であった（４日〜６日以内であり、生存する種子のほとんどが一次根及び子葉鞘を発生させている。）。初代の形質転換体と同様に、その子孫も正常に生長し、組み換え型のヒト酸性β−グルコシダーゼを含む種子を生成した。酵素をコードしている遺伝子の存在は、全ての推定上形質転換された植物におけるＰＣＲ解析により証明され（図２Ｂ）、自家受粉により得られた最も良い初代の形質転換体の子孫を、１５０以上無作為に採取した。これらの解析において、陰性対照及び陽性対照には、それぞれ形質転換されていないCR W3植物の総ＤＮＡ及び発現ベクターのミニプレップによる抽出物を用いた。さらに、それぞれ試験されたＤＮＡ抽出物の増幅についても、イネの葉緑体のＤＮＡ領域に対して設計された特異的なプライマーを用いることにより証明された。概して、イネのゲノムはヒト酸性β−グルコシダーゼをコードしている配列を用いて形質転換され、また、その遺伝子組み換えは、子孫に遺伝していることが証明された。子孫への遺伝は、自家受粉による子孫のみでなく、形質転換された植物と陰性対照又は他の形質転換された植物とを交配することにより生じた子孫においても証明された。ヒト酸性β−グルコシダーゼのメッセンジャーＲＮＡの生成を確かめるために、未成熟型のイネの種子（開花後１０日〜１５日）を収集し、それを用いて総ＲＮＡを抽出した。その後に、以下の操作を行った。
ａ．ＰＣＲによるゲノムＤＮＡの混入物の除去。
ｂ．ＲＴ−ＰＣＲによるヒト酸性β−グルコシダーゼのメッセンジャーＲＮＡの増幅。
ｃ．ＲＴ−ＰＣＲによるグルテリン４のメッセンジャーＲＮＡの増幅。
その全ての場合において、現れたGCase遺伝子は正常に発現し、グルテリン４貯蔵タンパク質をコードする遺伝子と同一の発現パターンを示した。期待どおり、陰性対照の総ＲＮＡを用いた際は、グルテリン４遺伝子の増幅のみが認められた。
【００７５】
また、組み換え型タンパク質を免疫局在化し、透過型電子顕微鏡により観察するために未成熟型の種子を用いた。この観察により、ヒト酸性β−グルコシダーゼが胚乳細胞のタンパク質貯蔵液胞にのみ蓄積されていることを証明された。同一の解析をCR W3の対照の種子に対して行った際には、そのような結果は見られず、これにより、この解析法の多大な有効性と我々が用いた抗GCase抗体の絶対の特異性が証明された。最も良い組み換え型の系統を選択するために、また、組み換え型リソソーム酵素の精製方法を開発するために、有効性と共に、信頼性及び感度が高い蛍光定量的な試験を用いてβ−グルコシダーゼの活性を測定できる可能性を有する前記の特異的抗体を用いた。抽出及び精製工程に関して、プロトコールは、未精製のタンパク質抽出物及び組み換え型酸性β−グルコシダーゼの単離及び精製といった、予備的な製造のために開発された。その精製プロトコールは、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、カチオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）及びゲル濾過（ＧＦ）といった３つの連続的な工程からなる。種子の籾殻を取り、精白することは、GCaseの最小の損失で、タンパク質混入物の多くを除去するために絶対的に有利であり、その損失は抽出工程の際にも非常に低くなる。内在性のGCase様酵素の除去は、GCase様の活性により、カチオン交換クロマトグラフィの最後に適用される非連続的な溶出工程によって行われる。このクロマトグラフィは、さらに、サンプルの洗練の役割があるゲル濾過を通るタンパク質混入物を減少させる。
【００７６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、精製されたタンパク質は、基本的にイミグルセラーゼ（Cerezyme, Genzyme Corp.）と同一の移動度を示し、約６０ｋｄの分子量を示した。ウエスタンブロットにおいて、精製されたタンパク質は、ウサギにより産生された抗イミグルセラーゼ抗体により強く検出された。精製されたタンパク質は、酵素学的活性、特に、蛍光発生基質である４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコシドを効率的に加水分解することを示し、イミグルセラーゼと同一の動的反応を示した。２次元電気泳動では、通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に行われたウエスタンブロットにおいて繰り返し検出された単一のバンドを少なくとも３つのグリコフォームに分けた。さらなる解析では、イネの胚乳において生成される組み換え型のヒト酸性β−グルコシダーゼの完全性を証明し、そのアミノ酸配列とヒトの天然型の対応物のアミノ酸配列との同一性を証明した。Ｎ末端のミクロシークエンシングは、そのアミノ酸配列の最初のノナペプチドがヒトの天然型の酸性β−グルコシダーゼのＮ末端のＡＲＰＣＩＰＫＳＦと一致することを証明した。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより行われたペプチドマスフィンガープリント法により、そのタンパク質のＣ末端は、完全に保存され、また、５番目のＮグリコシル化領域においてはグリカン鎖が見られないといった天然型の酵素と類似である部分が証明された。しかしながら、そのタンパク質の第１〜第４のＮグリコシル化領域では、グリカン鎖がみられた。その第１のＮグリコシル化領域におけるＮグリカンの存在は、タンパク質の酵素学的活性のために必須である。
【実施例】
【００７７】
（第１の実施例）GCaseの発現のための分子カセットの構築
以下に、イネにおいてヒト酸性β−グルコシダーゼを胚乳特異的に発現する方法を記載する。同様の方法が他の胚乳特異的なプロモータ及び／又は内質細網の中にタンパク質を向けるための配列の存在により特徴づけられるコンストラクトの変異体を作製するために用いられ得る。
【００７８】
グルテリン４プロモータ（GluB4pro）の単離
Oryza sativa（GenBank acc.NoAY427571）のグルテリン４プロモータを単離するために、変異体CR W3のゲノムＤＮＡのＰＣＲを行った。このＰＣＲにおいて、以下のプライマーを用いた。
GluB4pro順方向プライマー：SEQ ID No:7に示している。
GluB4pro逆方向プライマー：SEQ ID No:8に示している。
【００７９】
後のクローニングのために、GluB4pro順方向プライマーは、アンプリコンの５’末端にSph I及びEco RI領域を導入するように設計され、同様に、GluB4pro逆方向プライマーは、ＰＣＲ産物の３’末端にXba I領域を導入するように設計された。
条件：９５℃で２分間の後、（９５℃で４５秒間、６３℃で４０秒間及び７２℃で２分間）のサイクルを４０回繰り返し、その後、７２℃で５分間とした。
【００８０】
これにより増幅された産物は、pGEM-T（Promega）の中に入れクローニングし、完全なシークエンシングを行った。
【００８１】
GluB4プロモータにおいて天然型のリーダー配列からLLTCKを有する人工のリーダー配列への置換
イネのグルテリン４プロモータ（GluB4pro）の天然型のリーダー配列を合成されたＬＬＴＣＫリーダー配列（De Amicis等.2007, Transgenic Res 16:731-738）に置換するために、図２Ａの模式図に従って、適当なプライマー（１つの順方向プライマー及び３つの逆方向プライマー）を用いて３度の連続するＰＣＲを行った。第１のＰＣＲにおいては、pGET-T[GluB4pro]プラスミドを鋳型として用い、後の２つのＰＣＲにおいては、先の反応による産物を鋳型とした。順方向プライマー１は、Bfr I領域で始まり、GluB4pro配列の３’末端に接してアニールする。逆方向プライマー１は、リーダー領域の少し上流のGluB4proの３’領域にアニールする。アニールしない部分は、初めのＬＬＴＣＫの合成に寄与する。逆方向プライマー２は、その後の断片にアニールし、ＬＬＴＣＫリーダー配列の第２の領域の合成を行う。逆方向プライマー３は、ＬＬＴＣＫ配列の終結部分を導入し、また、３’末端にXba I領域を有する。ＰＣＲ反応をAccu Taq（Sigma）ＤＮＡポリメラーゼを用いて行い、温度条件は以下のようにして行った。
条件：９８℃で２分間の後、（９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で１分間）のサイクルを第１及び第２のＰＣＲでは１５回、第３のＰＣＲでは２５回繰り返し、その後、６８℃で１０分間とした。
【００８２】
最終のＰＣＲ産物をpGEM-Tの中に入れクローニングし、酵素による切断及びシークエンシングにより確認した。pGluB4proの天然型のリーダー配列を人工のＬＬＴＣＫリーダー配列に置換するために、Bfr I及びXba Iの制限酵素領域を用いた。ベクターと挿入断片とをT4 DNAリガーゼを用いて結合し、その結果生じたpGEM-T[GluB4/pro/LLTCK]をＰＣＲ及び制限酵素による切断により確認した。
【００８３】
天然のシグナルペプチドからSPGluB4への置換
イネにおけるGCase発現を増大させるために、グルテリン４のシグナルペプチド（SPGluB4）をコードしているヌクレオチド配列は、イネのコドンを基にして最適化され、ヒト酸性β−グルコシダーゼ（GCase）の成熟型をコードしている配列の前に配置される。その成熟型酵素のＮ末端に異質のアミノ酸が付加されることを防ぐために、結合される末端に偽の制限酵素領域を付加することを避けた。その問題を解決するために、SPGluB4配列、及び天然型のHind III領域までのGCaseの初めの領域である５’末端にXba I領域を含む人工の断片を生成し、pUC57（Fermentas）の中に入れクローニングした。シークエンシングによる確認の後に、pGEM-T[GCase]、すなわち、GenBank No M16328に提示されたヒト酸性β−グルコシダーゼをコードしている全体の配列を含むプラスミドの中の天然型のシグナルペプチドをコードしている断片の代わりに前記の確認した断片を入れ、クローニングした。挿入断片及びベクターのバックボーンのそれぞれを生成するために、pUC57[SPGluB4]及びpGEM-T[GCase]の両方をXba I及びHind IIIを用いて切断した。pGEM-T[SPGluB4/GCase]を作製するために、これらの部分をT4 DNA ligaseを用いて結合し、制限酵素による切断により確認した。
【００８４】
イネにおけるヒト酸性β−グルコシダーゼの発現のための分子カセットの構築
GluB4pro/LLTCK及びSPGluB4/GCaseに対応する領域を、Agrobacterium tumefaciensのＮＯＳポリアデニル化配列を含むpUC18（Pharmacia）由来のプラスミドであるpUC18[NOSter]の中に入れてサブクローニングする２つの工程を行った。この目的のために、それぞれの領域の５’末端及び３’末端に導入された制限酵素による切断領域を用い、すなわち、GluB4pro/LLTCKにはSph I及びXba Iを、SPGluB4/GCaseにはXba I及びSac Iを用いた。
【００８５】
pSV2006[GluB4pro/LLTCK/SPGluB4/GCase/NOSter]ベクターの作製
最終的な発現ベクターを得るために、pSV2006（pCAMBIA 1300由来）を用いた。Eco RIによる切断により、pSV2006の本来の発現カセット及びpUC18[GluB4pro/LLTCK/SPGluB4/GCase/NOSter]に含まれるコンストラクトを除去した。最終的な発現ベクター（図１）を得るために、前記処理後のpSV2006と挿入断片とを互いに結合し、そのベクターの特異性を解析した後に、そのベクターをエレクトロポレーションによりAgrobacterium tumefaciensであるEHA 105株の中に導入した。遺伝子操作されたAgrobacterium tumefaciens株を、Oryza sativa ssp.japonicaである変異体CR W3の形質転換のために用いた。
【００８６】
（第２の実施例）Agrobacterium tumefaciensを介するイネの形質転換
イネの形質転換は、C.Huge（Rice Research Group, Institute of Plant Science, Leiden University）及びE.Guiderdoni（Biotrop program,Cirad, Montpellier, France）により改変されたHieiのプロトコール（Hiei等,1994）に従って行った。その方法の主な工程を以下に簡単に示す。
【００８７】
胚形成のカルスの作製
イネの形質転換は、胚盤由来の胚形成のカルスを用いて行った。胚盤組織からカルスの増殖を誘導するために、イネの種子の籾殻を取り、潜在的な病原体及び雑菌の汚染を除去するために消毒し、無菌の蒸留水により数回洗浄し、無菌の吸い取り紙により乾燥させ、カルス誘導培地（ＣＩＭ）を含むペトリ皿に移した。そのペトリ皿を２８℃の暗所で７日間培養した後に、実生から胚盤を切り取り、それを２８℃の暗所で１４日間ＣＩＭにおいて培養した。その培養の後、カルスの塊を小さな白いカルスを基にして選択した。それらを新しいＣＩＭに移し、形質転換するのに適する胚形成のカルスを生成するために１０日間培養した。
【００８８】
カルスとAgrobacterium tumefaciensとの共培養
形質転換のためのAgrobacterium tumefaciensの十分な量を得るために、前記の発現ベクターを有する菌株をＬＢ寒天培地において３０℃で３日間培養した。Agrobacterium細胞の層を収集し、Ｏ．Ｄ．６００が１．００（約３〜５×１０９cells/mL）になるまで、それを液体共培養培地（ＣＣＭＬ）において再懸濁した。最も良いカルス、すなわち、密であり、白色であり、直径が２ｍｍであるカルスを細菌の懸濁液に浸した。そのカルスを無菌のワットマン紙に吸湿させた後、縁が高いペトリ皿（Sarstedt）で２０％の濃度となるように共培養培地（ＣＣＭＳ）に移し、２５℃の暗所で３日間培養した。
【００８９】
ハイグロマイシン耐性カルスの選択
共培養培地における培養が終了した後に、カルスを選択培地 I（ＳＭ I）に移し、２８℃の暗所で２週間培養した。その後、カルスを選択培地 II（ＳＭ II）に移し、前記と同一の条件でさらに１週間培養した。
【００９０】
形質転換されたカルスからの植物の再生
形質転換された植物の再生を適当なホルモン刺激により行った。胚形成のハイグロマイシン耐性カルスを選択し、それを前再生培地（ＰＲＭ）に移し、縁の高いペトリ皿の中において２８℃で１週間培養した。その後、カルスを再生培地（ＲＭ）が入った１つのペトリ皿当たり８個〜１０個となるように移した。それを明るい場所において２８℃で３週間〜４週間置き、植物の再生を起こさせた。植物がカルスから分離するのに十分に生長した後（高さが３ｃｍ以上）、それらを２５ｍＬの発根培地（ＲＯＴ）を含む培養管に移した。その培養管は、２８℃の明るい場所で約３週間置いた。その再生工程の最後に、泥炭を用いて鉢植えし、金属ハロゲンランプのOsram Powerstar HQI-BT400W/D（明が１６時間、暗が８時間の光周期）を用いた条件下で２４℃、湿度８５％に制限された人工気象室において成熟するように生長させた。
【００９１】
（第３の実施例）GCaseコンストラクトを用いて形質転換されたイネの種子からの総タンパク質の抽出
遺伝子組み換え型イネの種子をまずSatake TO-92（Satake Corporation,Japan）を用いて籾殻を取り、精白した。その後、精白したイネの種子を製粉し、生じた粉を抽出緩衝液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝５．５）の中で均質化した。なお、その際の緩衝液の体積（ｍＬ）と粉の重量（ｇ）との比率を１０：１．５とした。それを４℃で１時間置いた後、それを１４０００×ｇで４５分間遠心分離を行った。上清を回収した後、残った沈殿物に対して、前記と同一の方法を用いてさらに２度抽出を行った。精白した種子及び精白の際の廃棄物から得られたタンパク質抽出物に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３Ａ）とウエスタンブロット（図３Ｂ）との両方の解析を行った。これらの解析により、組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼのほとんどが精白した種子に含まれ、３度の連続の抽出により効率良く回収され得ることが証明された。
【００９２】
（第４の実施例）GCaseを形質転換した種子の総タンパク質抽出物のウエスタンブロット及び２次元電気泳動
Mini Protean II装置（BioRad）及び厚さが７５ｍｍの１０％ポリアクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Laemli, 1970）により、総タンパク質抽出物を分離した。検体を流す前に、検体にβ−メルカプトエタノールを加えずに、検体を１００℃で５分間変性させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、Trans-Blot SD装置（BioRad）を用いて１５Ｖで３０分間、タンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（ミリポアのPVDF, Immobilon-P）に転写した。その後、市販のイミグルセラーゼを用いて２羽のウサギに免疫化することにより生成した抗GCaseポリクローナル抗体と、検体とをハイブリダイズした。ハイブリダイズの条件は、ブロッキング液（PBSに7.5% p/v Oxoid skim milkを溶解した。）により１０００倍に希釈した抗体を用いて室温で１時間反応させた。PBS Tween 0.1% v/vで洗浄した後、抗ウサギＨＲＰ結合２次抗体（SIGMA, １：１００００の希釈倍率）を用いて室温で１時間反応させた。その後、ECL Plus（GE Healthcare）を用いて化学発光させた。陽性のタンパク質バンドの分子量を測定するために、Precision Plus Protein standard（BioRad)をＨＲＰ結合Precision Strepactin抗体（BioRad）と共に用いた（図４Ａ）。
【００９３】
約２００μｇの種子の総タンパク質を含む２つの検体を等電点電気泳動法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。第１の解析は、PROTEAN IEF focusing system（BioRad）及び非直線的なｐＨ３〜１０の範囲における７ｃｍのReady Strip IPG（BioRad）を用いて行った。タンパク質抽出物を、2D Clean-Up kit（GE Healthcare）を用いて沈殿させ、１３０μＬのDeStreak Rehydratation溶液（GE Healthcare）及び0.6% Byolites ampholytes 3-10（BioRad）を用いて再懸濁した。その後の条件は以下のようにする。
工程１：２５０Ｖで１５分間
工程２：４０００Ｖで２時間
工程３：２００００Ｖ-hourで約２４時間。
【００９４】
これらの終わりに、２つの異なる平衡緩衝液を用いて洗浄した。すなわち、平衡緩衝液 I（2% DTT、2% SDS、50mM Tris-HCl、6M 尿素、30% グリセロール及び0.002% ブロモフェノールブルー,pH8.8）で１５分間洗浄し、平衡緩衝液 II（2.5% ヨードアセトアミド、2% SDS、50mM Tris-HCl、6M 尿素、30% グリセロール及び0.002% ブロモフェノールブルー,pH8.8）で２０分間洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの標準的なプロトコールに従って、検体を２つの分離ゲルにおいて第２の次元に流した。１つの電気泳動ゲルをColloidal Coomassie Blue（0.08% クマシーブルー R-250、1.6% オルト−リン酸、8% 硫酸アンモニウム及び20% メタノール）を用いて染色し、他方のゲルはウエスタンブロットにより解析した（図４Ｂ）。これらの全行程は、形質転換していないCR W3の種子から得られたタンパク質検体に対しても並行して行った。
【００９５】
（第５の実施例）免疫局在化によるGCase貯蔵領域の決定
乳熱後期の形質転換された種子を収穫し、籾殻を取り、断片が１ｍｍの厚さになるように切断し、０．２％グルタルアルデヒドを用いて室温で１時間固定した。それを０．１５Ｍリン酸緩衝液により洗浄した後、無水エタノールの濃度勾配（２５％〜１００％）を用いて脱水を行った。脱水した検体をLR White Resin（London Resin Co.）に包埋し、６０℃で２４時間重合した。それをLKB Nova microtome（Reichter）を用いて切片（厚さ２μｍ〜３μｍ）とし、これをニッケルメッシュグリッド（Electron Microscopy Science）に置き、ヤギ標準血清溶液（Aurion）をbuffer C（0.05M Tris-HCl,pH7.6, 0.2% BSA）により１：３０の希釈倍率で希釈した溶液に１５分間浸した後に、抗GCase１次抗体をbuffer Cにより１：５００の希釈倍率で希釈した溶液を用いて室温で１時間ハイブリダイズした。0.1% Tween 20 w/vを含むbuffer B（0.5M Tris-HCl,pH7.6,0.9% NaCl）を用いて数回洗浄した後（６回×５分）、コロイド金が結合した２次抗体（15nm, Aurion）をbuffer E（0.02M Tris-HCl,pH8.2, 0.9% NaCl, 1% BSA）により１：４０の希釈倍率で希釈した溶液に切片を室温で１時間浸した。ハイブリダイズの最後に、切片を洗浄した後、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛を用いて染色し（Reynolds,1963）、Philips CM 10透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて切片を観察した。
【００９６】
その結果は、種子の胚乳のタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶｓ）にのみGCaseが存在することを示し、また、抗GCaseポリクローナル抗体はGCaseを強く且つ鮮明なシグナルにより同定し、有意なバックグラウンドは見られなかった。形質転換されていないイネの種子に対しても同一の解析を行った結果、基質と結合した交差反応領域は見られず、抗GCase抗体の高い特異性が証明された。
【００９７】
（第６の実施例）イネの種子から抽出した組み換え型ヒト酸性β−グルコシダーゼの精製
この精製のために、産業的な規模のプロトコールを開発した。そのプロトコールは、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）を用いて捕獲する初期段階（図６Ａ）、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）を基にする中間段階（図６Ｂ）及びゲル濾過を用いて洗練する最終段階を基とする。全てのクロマトグラフィの段階は、AKTA Prime system（GE Healthcare）を用いて行った。
【００９８】
疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）
この段階は、５ｍＬのHiTrap Octyl FF（GE Healthcare）を用いて行った。この段階の最初に、１倍量のローディング緩衝液（50mM酢酸ナトリウム、350mM NaCl及び100mM 硫酸アンモニウム,pH5.5）を用いてカラムを平衡化し、カラムに検体を流す前に、３Ｍ硫酸アンモニウム溶液を硫酸アンモニウムの最終濃度が１００ｍＭになるように精製させる抽出物に加え、その後に、その抽出物を０．２μｍフィルタ（Millipore）に通して濾過した。その検体を１ｍＬ／ｍｉｎの流速でカラムに流した。カラムを５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む３倍量のローディング緩衝液を用いて、ベースラインが平坦となるまで洗浄した。その後、５０ｍＭ酢酸ナトリウムに含まれる６６％エチレングリコールを用いて溶出を行った。この段階の最後に、カラムを２０％エタノールを用いて洗浄及び再生化を行った。
【００９９】
イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）
ＩＥＣのために、カチオン樹脂を含む５ｍＬのHitrap SP FF（GE Healthcare）を用いた。カラムを５０ｍＭ酢酸ナトリウム（溶液Ａ）により平衡化した後、ＨＩＣから溶出された分画を溶液Ａにより１：１の希釈倍率で希釈し、それをカラムに流した。カラムを洗浄した後、溶液Ａの中に１Ｍ溶液の１５％、２０％及び１００％に相当するＮａＣｌ量を順に増やすことによる断続的な勾配溶出を行った。その後に、カラムを２０％エタノールで再生化した。それぞれのクロマトグラフィ操作から回収された所定の分量に対して免疫解析を行い、２０％ＮａＣｌを含む溶液により組み換え型のヒト酸性β−グルコシダーゼを溶出できることを証明した。形質転換されていない種子のタンパク質抽出物から得られた溶出分画に対して酵素活性試験を行うことにより、このクロマトグラフィ段階において、GCase様活性を起こす原因となる内在性の構成物からヒト酸性β−グルコシダーゼが分離したことが示された。特に、２０％ＮａＣｌにおいて、その内在性の構成物はカラムに効率的に保持されていることが示された（図７）。
【０１００】
ゲル濾過
ゲル濾過のために、HiPREP 16/60 Sephacryl S-100 High Resolution column（GE Healthcare）及び２０ｍＭ酢酸ナトリウムと２００ｍＭ ＮａＣｌにより構成された溶出緩衝液（ｐＨ５．５）を用いた。最初にそのカラムを２倍量の溶出緩衝液を用いて洗浄し、ＩＥＣにおいて溶出された検体を０．３ｍＬ／ｍｉｎの流速で流した。所望のピークをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットにより解析した（図８Ａ及び図８Ｂ）。
【０１０１】
（第７の実施例）GCaseの酵素活性の測定
組み換え型のヒトGCaseの活性を４−ＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリル β−Ｄ−グルコシド, SIGMA）を基質として用いて測定した。反応混合液は、７５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（pH5.9）、 0.125% w/vタウロコール酸及び３ｍＭ ４−ＭＵＧを含む。反応は３００μＬの試験溶液に１０μＬの検体を入れ、３７℃で１時間行った。その反応を０．１Ｍグリシン−ＮａＯＨ（pH10.0）を１６９０μＬ加えることにより終了させた。酵素活性は、励起波長が３６５±７ｎｍで且つ放出波長が４６０±１５ｎｍとした蛍光光度計を用いて測定した。１分間当たり１μｍｏｌｅの基質が酵素により遊離する量を１ユニット（Ｕ）として定義した。異なる検体の量は、市販のイミグルセラーゼの公知の量と比較して測定した。蛍光光度の測定により、イネの胚乳で生成されたヒトGCaseは、活性を有し、市販のイミグルセラーゼと同一の動的反応により特徴付けられることが証明された。
【０１０２】
（第８の実施例）組み換え型GCaseのＮ末端配列の同定
GCaseのＮ末端配列の正確さを、タンパク質ミクロシークエンシングにより確認した。このために、酵素の所定の分量をＨＩＣ及びＩＥＣを用いて精製し、それをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動を行い、Trans-Blot Semi-Dry装置を用いてＰＶＤＦ膜に転写した（転写条件：１０ｍＭ ＣＡＰＳ緩衝液及び１０％メタノール,pH11.0を用い２５Ｖで３０分間行った。）。この転写の後に、転写膜を５０％メタノールに溶解した０．２５％（w/v）クマシーブルーR-250を用いて５分間染色し、水により洗浄し、所望のタンパク質に対応するバンドを可視化するために５０％メタノールにより１０分間脱染した。ミクロシークエンシングをエドマン分解法（Edman,1950）に従って行った。この解析により、ヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型のＮ末端配列と完全に一致するノナペプチド（ＡＲＰＣＩＰＫＳＦ）の存在が示された。従って、イネのグルテリン４シグナルペプチドは小胞体膜により認識され、内部移行段階の際に正確に移行されることが結論づけられた。
【０１０３】
（第９の実施例）精製GCaseのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析
トリプシンによるタンパク質の切断
ゲル電気泳動と、０．２５％（w/v）クマシーブルーR-250水溶液、５０％メタノール及び１０％氷酢酸を用いた染色との後に、組み換え型GCaseに対応するタンパク質のバンドを切り出し、それを３００μＬの１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３と１００％アセトニトリル（ＡＣＲ）とが50:50（v/v）の比である溶液を用いて３７℃で洗浄し、すりつぶし、１００μＬのＡＣＮにより脱水した。続いて、ジスルフィド結合を還元するために、そのタンパク質のバンドを２０ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３を５０μＬ用いて５６℃で１時間処理し、５０ｍＭ ＩＡＡ（ヨードアセトアミド）を含む１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３を５０μＬ用いて３０分間アルキル化を行った。さらに、そのタンパク質のバンドを３００μＬの１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３を用いて洗浄した後、２０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３と１００％ ＡＣＮとが50:50（v/v）の比である溶液を３００μＬ用いて洗浄し、１００μＬのＡＣＮを添加し再び脱水した。その後、タンパク質のバンドを１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３及び５０ｎｇ／μＬ トリプシン（Promega）を含む切断緩衝液を５μＬ〜１０μＬ用いて再水和し、その３０分後に２０μＬの２０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３を加えた。それを３７℃で一晩の間温置した後、トリプシンによるペプチドを含む緩衝液を移し、２％ ギ酸と６０％ ＡＣＮとの溶液（50:50 v/v）を検体に加えることにより、さらにペプチド抽出を行った。２つの抽出物を一緒にプールし、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析（Perkin Elmer）のために用いた。
【０１０４】
Ｃ１８樹脂によるペプチド精製
トリプシンによる切断物をC18 zip-tip（Millipore）を用いて精製及び脱塩した。そのチップは１０μＬの１００％ ＡＣＮで４回洗浄し、１０μＬの０．１％ ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で３回洗浄した。その活性化させたチップに検体を加え、０．１％ ＴＦＡで洗浄した後、C18 zip-tipの逆相の樹脂に結合したペプチドを１００％ ＡＣＮと０．１％ ＴＦＡとが70:30（v/v）の比である溶液を１０ｍＬ用いて溶出した。
【０１０５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマス分光法を用いたペプチドマスフィンガープリント法によりタンパク質の同定
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ解析のための検体の調製は、１μＬの精製したペプチドに金属の台に置かれた１μＬのＣＨＣＡ樹脂（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）濃縮溶液加えることにより行った。この解析（図９）により、第６の実施例において記載した方法を用いて精製されたタンパク質がヒト酸性β−グルコシダーゼと確かに一致することが証明された。特に、この同定は、１０−３２のスコア及び認識されたペプチドと５３％が等しいカバー度を用いて得られた。有意なレベルはスコアが１０−６以下で且つカバー度が３０％以上の範囲であるため、それらの結果は絶対的な保証となる。興味深いことに、そのタンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおいて認識されたペプチドの中で見つけられた（全リストである［表１］を参照。）。
【０１０６】
【表１】
（第１０の実施例）ＧＡＡ発現ベクターの作製
本実施例では、ヒト酸性α−グルコシダーゼのイネの胚乳特異的な発現のための方法を記載する。特に、最終的な発現ベクターであるpSV2006[GluB4pro/LLTCK/GAA/NOSter]の調製について示す。このベクターは、前記のpSV2006[GluB4pro/LLTCK/GCase/NOSter]ベクターのGCase遺伝子をGAA遺伝子に置換することにより作製された。
【０１０７】
ヒト酸性α−グルコシダーゼをコードしている配列（GenBank ACC. No NM 000152）は、イネの胚乳において導入遺伝子の発現レベルを増大させるために改変されており、新規のGAAをコードしている配列は、イネのコドンを基に書き直されている。さらに、天然のGAAシグナルペプチドをPSGluB4と置換し、すなわち、小胞体内腔に組み換え型GCaseを向けるためのものと同一の移行ペプチドを用いた。GAAをコードしている配列は２８５０ｂｐの長さであるため、３つの断片（Ａ、Ｂ及びＣ）に分けて人工的に合成した。明らかに方向付けられた様式でこれらの断片を構築するために、それらの端部に同義の点変異を生じさせることにより制限酵素領域を導入した。pSV2006の中にGAA遺伝子の全てを入れることを容易にするために、第１の断片の５’末端及び第３の断片の３’末端のそれぞれにXba I領域及びSac I領域を導入した。３つのGAA断片の構築をpUC18ベクターの中で行い（図１０）、全配列（SEQ ID No:9）を確認した後、その遺伝子をXba I及びSac Iを用いた切断によりpUC18から切り出し、pSV2006[GluB4pro/LLTCK/GCase/NOSter]の中のGCase遺伝子と置換してクローニングし、最終的な発現ベクターであるpSV2006[GluB4pro/LLTCK/PSGlub4/GAA/NOSter]（図１１）を得た。
【０１０８】
（第１１の実施例）ＧＡＡタンパク質抽出物のウエスタンブロット
すり鉢及びすりこぎを用いて、籾殻を取った５つの種子を３５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液の１ｍＬ中で轢いた。その後の結果物を氷上で１時間撹拌し、続いて、それを４℃で４５分間、１５０００×ｇで遠心分離を行った。その後の上清（２０μｇの可溶性タンパク質）をPrecision Protein Standard（BioRad）と共に１０％ポリアクリルアミドゲルに流した。そのゲルをTrans blot SD装置（BioRad）を用いて０．２μｍＰＶＤＦ膜（Millipore）に転写した。その転写膜に７．５％の脱脂粉乳を含むＰＢＳ緩衝液（Oxoid）を用いて室温で１時間ブロッキングを行った。洗浄後、凍結乾燥されたαアルグルコシダーゼ（Myozyme, Genzyme Corp）を抗原として用いて生成したウサギポリクローナル抗体の１次抗体を前記のブロッキング緩衝液で１：５０００の希釈倍率で希釈し、これに転写膜を室温で１時間浸した。その後、ＨＲＰ結合２次抗体（Sigma Aldrich）を１：１００００の希釈倍率で希釈し、これに転写膜を室温で１時間浸した。最終の洗浄後に、転写膜にECL plus（GE Healthcare Bio-Science）を用いて化学発光させた（図１２）。
【０１０９】
（第１２の実施例）イネの胚乳における組み換え型ＧＡＡの免疫局在化
この方法は、GCaseコンストラクトを用いて形質転換されたイネの種子について説明した方法とほとんど類似している。
【０１１０】
簡単に説明すると、開花から約１０日〜１５日の未成熟なイネの種子を脱水し、LR White Resin（London Resin Co.Ltd.,Hamshire,UK）に包埋した。そのブロックを６０℃で２４時間重合した。その後、それをultramicrotome LKB Nova（Reichter）を用いて極度に薄い切片とし、免疫局在化のためにニッケルグリッド（Electron Microscopy Science）の上に載せた。その切片を標準ヤギ抗血清（Aurion）をbuffer Cにより１：３０の希釈倍率で希釈した溶液に１５分間浸し、その後、抗ＧＡＡ血清（ウエスタンブロット解析において用いたものと同一のもの）をbuffer Cにより１：１００の希釈倍率で希釈した溶液に室温で１．５時間浸した。洗浄後、１５ｎｍのコロイド金が結合したヤギから作製された抗ウサギ抗体（Aurion）を０．９％ ＮａＣｌ及び１％ ＢＳＡを含む０．０２Ｍ  Tris-HCl,pH8.2により１：４０の希釈倍率で希釈した溶液に切片を１時間浸した。その後、０．１％クエン酸鉛（Reynolds,1963）を用いて切片を染色し、Philips CMIO透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて観察した。同一の操作を形質転換されていないイネ由来の検体においても行った。
【０１１１】
GCase形質転換の種子の切片において観察されたように、GAA形質転換の種子の胚乳の免疫金標識により組み換え型酵素がタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶｓ）の中に特異的に局在していることが示された（図１３）。タンパク質小体又は陰性対照のCR W3において、シグナルは検出されなかった。
【０１１２】
（第１３の実施例）ＧＡＡタンパク質抽出物のＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを行う前に、第１１の実施例において示したようにウサギから生成された２ｍＬの抗GAA抗血清抗体を、１ｍＬのHitrap rProtein A FFカラム（GE Healthcare）により精製した。その後、以下に示すプロトコールのようにEZ-Link Maleimide activated Horseradish peroxidase kit（Pierce）を用いてホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を精製されたＩｇＧｓに結合させた。１００μＬのMaleimide conjugation緩衝液を2-MEAの６ｍｇバイアルに加え、その溶液にＩｇＧ検体を加え、これを３７℃で９０分間温置した。室温で平衡化した後、IgG/2-MEA溶液を脱塩カラムに通し、３０ｍＬのMaleimide conjugation緩衝液を用いて前平衡化を行った。続いて、Maleimide conjugation緩衝液をカラムに加え、０．５ｍＬの分画を回収した。タンパク質のピークを位置づけるために、それぞれの分画の２８０ｎｍの吸光度を測定し、還元されたＩｇＧを含む分画をプールし、それを活性化されたＨＲＰのバイアルに加えた。この反応を室温で１時間行った。その後、Maleimide coating緩衝液（ＰＢＳ及びＥＤＴＡを含む。）とsuperdex 200 10/300 GLカラムとを用いてゲル濾過を行った。溶出されたピークを０．８５μｇ／μＬの濃度となるまでAmicon Ultra-10（Millipore）により濃縮した。ＨＲＰが結合した抗ＧＡＡ抗体の質をＥＬＩＳＡにより試験した。このため、１ｍｇ／ｍＬのMyozyme抗原をプレートにコーティングし、ブロッキングした後、そこに異なる希釈倍率で希釈した前記の抗体を加え、３７℃で３０分間温置した。その後に、ＴＭＢ基質（3,3',5,5''-テトラメチルベンジジン）を用いて検出を行い、抗原の最も低い検出限界は、ＨＲＰが結合した抗ＧＡＡ抗体を１：１０００の希釈倍率で希釈したものを用いた際に得られた。
【０１１３】
この抗体を以下に示すような未精製のタンパク質抽出物に対してサンドウィッチＥＬＩＳＡを行うために用いた。ＥＬＩＳＡプレートのマイクロウェルの中に、１５ｎｇ／μＬの精製された抗ＧＡＡ抗体を１００μＬ加え、４℃で一晩置くことによりコーティングを行った。
【０１１４】
３％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングを行い、PBS 0.1% Tween-20を用いてリンスした後、種子から抽出した総タンパク質（PBS 0.1% Tween-20及び1% BSAにより１：１０又は１：１００の希釈倍率）を加え、３７℃で３０分間温置した。その後、３回洗浄し、ＨＲＰが結合した抗ＧＡＡ抗体をPBS 0.1% Tween-20及び1% BSAにより１：４０の希釈倍率で希釈したもの加え３７℃で３０分間温置した。４回洗浄した後、ＴＭＢ基質を用いて検出した。
【０１１５】
公知の量の標準Myozymeを用いて行われたＥＬＩＳＡ試験に基づいて、ＧＡＡの初代形質転換体から得られた種子のタンパク質検体は、総可溶性タンパク質の０．５％に相当する平均的なＧＡＡ含量を示した。
【０１１６】
本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の部分又は工程の改変及び／又は付加することは、前記に記載した穀類の胚乳において組み換え型ヒトリソソーム酵素を生成する方法のために行われてもよいことは明らかである。
【０１１７】
また、本発明は、特定の実施例を参考に説明したが、特許請求の範囲において明らかとした特徴を有する穀類において組み換え型ヒトリソソーム酵素を生成する方法と同等な当業者が必ず達成できると考えられる他の多くの方法は、それに関して特許請求の範囲に定義された保護範囲内となることは明らかである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）ヒトリソソーム酵素をコードしている遺伝子の上流の胚乳特異的プロモータであるイネグルテリン４プロモータ（GluB4pro）、（ii）５’領域のＬＬＴＣＫであるリーダー配列、（iii）胚乳細胞の内質細網の内腔の中に新規に合成された前記ヒトリソソーム酵素が同時翻訳的な移行をするのに適し、且つ、特定の細胞コンパートメントの中に前記ヒトリソソーム酵素を蓄積することを決定するのに適し、内質細網の中にグルテリン４前駆体を向けるためにイネに用いられるシグナルペプチドをコードしているPSGluB4、（iv）前記ヒトリソソーム酵素の成熟型をコードしているヌクレオチド配列、及び（v）天然型又は人工の３’ＵＴＲを備えているヌクレオチド配列を含む穀類の形質転換のための発現ベクターを構築する工程と、
前記ヒトリソソーム酵素を発現させ且つ胚乳に局在させ、最終的に胚芽によって吸収されず、胚乳における大量の前記ヒトリソソーム酵素の存在が種子の生存率及び発芽速度に負の影響を与えないように、前記発現ベクターを用いて穀類の植物を形質転換する工程と、
前記穀類の植物の種子の胚乳の中に前記ヒトリソソーム酵素を蓄積する工程とを備えていることを特徴とする穀類の胚乳の中において治療的用途に適する組み換え型ヒトリソソーム酵素を生成する方法。
【請求項２】
前記ヒトリソソーム酵素は、胚乳のタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶｓ）又はタンパク質小体（ＰＢｓ）に蓄積されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発現ベクターのヌクレオチド配列は、SEQ ID No:1に示されている配列であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現ベクターを細菌株に導入し、前記細菌株を直接に又は間接に植物の形質転換のために用いることを特徴とする請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌株は、Escherichia coli、Agrobacterium tumefaciens及びAgrobacterium rhizogenesを含む群に属することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌株をイネ（Oryza sativa ssp.japonica,変異体CR W3）の胚形成のカルスの形質転換のために用いることを特徴とする請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性β−グルコシダーゼであることを特徴とする請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性α−グルコシダーゼであることを特徴とする請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
形質転換された穀類の種子の産業的な製造を行う工程をさらに備えていることを特徴とする請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記産業的な製造を行う工程は、多くのタンパク質混入物を含む繊維状の構成物、胚芽及びアリューロン層を除去するために、形質転換された穀類から収穫された成熟した種子の籾殻を取り、精白することを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
疎水性相互作用クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ及びゲルろ過を含む方法により組み換え型の前記ヒトリソソーム酵素を精製する工程をさらに備えていることを特徴とする請求項１〜１０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒトリソソーム酵素を精製する工程は、類似の化学組成、構造及び／又は機能を有するクロマトグラフィ用の樹脂を適用すること、溶出条件を部分的に改変すること、及び検体を樹脂に２度通過させることとを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（i）ヒトリソソーム酵素をコードしている遺伝子の上流の胚乳特異的プロモータであるイネグルテリン４プロモータ（GluB4pro）と、
（ii）５’領域のＬＬＴＣＫであるリーダー配列と、
（iii）胚乳細胞の内質細網の内腔の中に新規に合成された前記ヒトリソソーム酵素が同時翻訳的な移行をするのに適し、且つ、特定の細胞コンパートメントの中に前記ヒトリソソーム酵素を蓄積することを決定するのに適し、内質細網の中にグルテリン４前駆体を向けるためにイネに用いられるシグナルペプチドをコードしているPSGluB4と、
（iv）前記ヒトリソソーム酵素の成熟型をコードしているヌクレオチド配列と、
（v）天然型又は人工の３’ＵＴＲとを備えていることを特徴とする穀類の胚乳の中において治療的用途に適する組み換え型ヒトリソソーム酵素を発現させるための植物の形質転換に適するヌクレオチドの配列。
【請求項１４】
前記（iv）のヌクレオチド配列は、ヒト酸性β−グルコシダーゼの成熟型をコードしている配列である、又はヒト酸性α−グルコシダーゼの成熟型をコードしている配列であることを特徴とする請求項１３のうちのいずれか１項に記載の配列。
【請求項１５】
前記（v)の３’ＵＴＲは、ＮＯＳターミネータ又はGluB4遺伝子のターミネータであることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の配列。
【請求項１６】
SEQ ID No:1に示す配列である請求項１３〜１５のうちのいずれか１項に記載の配列。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のうちのいずれか１項に記載の配列と相補的であること、又は請求項１３〜１６のうちのいずれか１項に記載の配列若しくは該配列と相補的な配列のうちの１つ若しくはそれ以上のヌクレオチドの欠損、挿入、変化若しくは塩基転換といった変異の過程から派生したことを特徴とする配列。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のうちのいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む、穀類の胚乳において治療的用途に適する組み換え型の前記ヒトリソソーム酵素を発現するベクター。
【請求項１９】
前記ヒトリソソーム酵素は、ヒト酸性β−グルコシダーゼ又はヒト酸性α−グルコシダーゼであることを特徴とする請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
前記ヒトリソソーム酵素の生成のための穀類の形質転換のために用いる請求項１８又は１９に記載のベクターの用途。
【請求項２１】
請求項１８又は１９に記載のベクターを有するEscherichia coli、Agrobacterium tumefaciens及びAgrobacterium rhizogenesを含む群から選択される細菌株。
【請求項２２】
請求項１８又は１９に記載のベクターを用いて形質転換された穀類植物細胞。
【請求項２３】
栽培されたイネ種（Oryza sativa L.）に属する請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
トウモロコシ（Zea mays L.）、大麦（Hordeum vulgare L.）及び小麦（Triticum spp.）といったGraminaceaeファミリに属する請求項２２又は２３に記載の細胞。
【請求項２５】
請求項１８又は１９に記載のベクターに由来する発現カセットを含むことを特徴とする治療的用途に適する前記ヒトリソソーム酵素の発現のために形質転換された穀類植物の種子。
【請求項２６】
形質転換された穀類の植物は、栽培されたイネ種（Oriza sativa L.）に属することを特徴とする請求項２５に記載の種子。
【請求項２７】
請求項１８又は１９に記載のベクターにより形質転換されたことを特徴とする治療的用途に適する前記ヒトリソソーム酵素の発現のために形質転換された穀類植物。
【請求項２８】
栽培されたイネ種（Oriza sativa L.）に属する請求項２７に記載の形質転換された穀類植物。
【請求項２９】
自家受精、自然若しくは人工の交雑又は請求項２７又は２８に記載の形質転換された穀類植物から選択される形質転換系統により得られた子孫。
【請求項３０】
酵素補充療法に用いるための請求項２５又は２６に記載の種子。
【請求項３１】
ゴーシェ病、糖原病II型、ファブリー病、ニーマンピック病Ｂ型及びムコ多糖症Ｉ型、II型、IV型の酵素補充療法に用いるための請求項３０に記載の種子。
【国際調査報告】
2011516036.tif 000022
2011516036.tif 000023
2011516036.tif 000024