(57)【要約】  （１）無機ナノ粒子コア、（２）無機ナノ粒子コアに結合した、第１の鎖長を有する第１の配位子であって、電荷を有する第１の配位子、及び（３）無機ナノ粒子コアに結合した、第２の鎖長を有する第２の配位子であって、親水性である第２の配位子を含んでなるナノ構造体が提供される。第２の鎖長が第１の鎖長より長い結果、第１の配位子のモルパーセント量の変化がナノ構造体の流体力学的直径を実質的に変化させない。これらのナノ構造体の製造方法並びに炎症状態の磁気共鳴イメージング及び管理におけるそれの使用も提供される。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機ナノ粒子コア、
無機ナノ粒子コアに結合した、第１の鎖長を有する第１の配位子であって、帯電している第１の配位子、及び
無機ナノ粒子コアに結合した、第２の鎖長を有する第２の配位子であって、親水性である第２配位子
を含んでなるナノ構造体であって、
第２の鎖長が第１の鎖長より長い結果、第１の配位子のモルパーセント量の変化がナノ構造体の流体力学的直径を実質的に変化させない、ナノ構造体。
【請求項２】
無機ナノ粒子コアが超常磁性酸化鉄を含む、請求項１記載のナノ構造体。
【請求項３】
無機ナノ粒子コアが約１〜約１００ｎｍの範囲内の直径を有する、請求項１記載のナノ構造体。
【請求項４】
無機ナノ粒子コアが約１〜約１０ｎｍの範囲内の直径を有する、請求項１記載のナノ構造体。
【請求項５】
約１〜約５００ｎｍの流体力学的直径を有する、請求項１記載のナノ構造体。
【請求項６】
約１〜約１００ｎｍの流体力学的直径を有する、請求項１記載のナノ構造体。
【請求項７】
約２〜約３０ｎｍの流体力学的直径を有する、請求項１記載のナノ構造体。
【請求項８】
第１の配位子及び第２の配位子が、カルボキシレート、スルホネート、ホスフェート、シラン及びこれらの混合物から選択される官能基によって無機ナノ粒子コアに結合している、請求項１記載のナノ構造体。
【請求項９】
第１の配位子が負に帯電している、請求項１記載のナノ構造体。
【請求項１０】
第１の配位子が下記式Ｉの構造から導かれる、請求項９記載のナノ構造体。
【化１】
2011516279.tif 000009
【請求項１１】
第１の配位子が正に帯電している、請求項１記載のナノ構造体。
【請求項１２】
第１の配位子が下記式ＩＩの構造から導かれる、請求項１１記載のナノ構造体。
【化２】
2011516279.tif 000010
【請求項１３】
第２の配位子がＰＥＧポリマーを含む、請求項１記載のナノ構造体。
【請求項１４】
ＰＥＧポリマーが約５００〜５０００ダルトンの範囲内の分子量を有する、請求項１３記載のナノ構造体。
【請求項１５】
約−５０ｍＶ乃至約＋５０ｍＶの範囲内の非ゼロζ電位を有する、請求項１記載のナノ構造体。
【請求項１６】
約−２５ｍＶ乃至約＋２５ｍＶの範囲内の非ゼロζ電位を有する、請求項１５記載のナノ構造体。
【請求項１７】
約−５ｍＶ乃至約−１５ｍＶの範囲内のζ電位を有する、請求項１６記載のナノ構造体。
【請求項１８】
約＋５ｍＶ乃至約＋１５ｍＶの範囲内のζ電位を有する、請求項１６記載のナノ構造体。
【請求項１９】
請求項１記載のナノ構造体の製造方法であって、
無機ナノ粒子コアを、電荷を有する第１の配位子と反応させる段階であって、第１の配位子はカルボキシレート、スルホネート、ホスフェート及びトリアルコキシシランからなる群から選択される官能基を介してナノ粒子コアに結合する段階、並びに
ナノ粒子コアを親水性の第２の配位子と反応させる段階であって、第２の配位子はカルボキシレート、スルホネート、ホスフェート及びトリアルコキシシランから選択される官能基を介してナノ粒子コアに結合する段階
を含んでなり、第１の配位子＋第２の配位子と無機ナノ粒子コアとのモル比が約１：１〜約２０：１である、方法。
【請求項２０】
無機ナノ粒子コアが超常磁性酸化鉄を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
第１の配位子が下記式Ｉの構造から導かれる、請求項１９記載の方法。
【化３】
2011516279.tif 000011
【請求項２２】
第１の配位子が下記式ＩＩの構造から導かれる、請求項１９記載の方法。
【化４】
2011516279.tif 000012
【請求項２３】
第２の配位子が下記式ＩＩＩの構造から導かれる、請求項１９記載の方法。
【化５】
2011516279.tif 000013
【請求項２４】
哺乳動物における炎症状態のイメージング方法であって、
哺乳動物内に請求項１記載のナノ構造体を導入する段階、
請求項１記載のナノ構造体を炎症組織に移行させる段階、及び
磁気共鳴を用いて炎症組織のイメージングを行う段階
を含んでなる方法。
【請求項２５】
さらに、炎症状態を管理する段階を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物がヒトである、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
さらに、炎症状態のイメージング前、その後又はその前後に哺乳動物を処置して炎症を低減させる段階、及びその結果を用いて炎症状態を管理する段階を含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
導入段階が、薬剤を局所適用、血管内注射、筋肉内注射又は間質内注射によって投与することを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
約０．１〜約５０ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇのナノ構造体がヒトに投与される、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
約０．１〜約２．５ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇのナノ構造体がヒトに投与される、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
炎症状態がマクロファージ蓄積に関連している、請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
炎症状態が、自己免疫状態、血管状態、神経学的状態及びこれらの組合せからなる群から選択される状態である、請求項２４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノ構造体、ナノ構造体の製造方法、及び哺乳動物における炎症状態のイメージング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気共鳴イメージング用のナノ粒子系イメージング剤を開発する際に繰り返して起こる問題は、総合ナノ粒子サイズに顕著な影響を及ぼすことなしにＭＲ活性ナノ粒子の表面電荷を制御することである。ナノ粒子は非常に大きい表面エネルギーを有するのが通例であり、その結果として極めて容易に凝集体を形成する。表面安定化配位子の不存在下で製造されたナノ粒子は、溶液中で容易に凝集体を形成する。この凝集体は、ナノ粒子の表面に配位子を結合することで防止できる。これらの配位子は、立体反発又は静電反発によって凝集を防止できる。
【０００３】
通例、ナノ粒子の表面電荷は、ナノ粒子の表面に結合する安定化配位子が異なれば変化し得る。異なる帯電安定化配位子は異なる長さを有することが多く、その結果として、配位子の違いはナノ粒子の総合サイズに影響を及ぼす。
【０００４】
公知のナノ粒子系薬剤は、デキストラン、デンプン又は炭水化物のような生体適合性コーティングによって安定化された酸化鉄コアを含んでいた。通例、酸化鉄コアの直径は約３〜約１０ｎｍの範囲内にあり、コア及びコーティングを合わせた直径は約１０〜約１００ｎｍの範囲内にある。Ｆｅｒｉｄｅｘ．ＲＴＭ．及びＲｅｓｏｖｉｓｔ．ＲＴＭ．のような公知ナノ構造体は、負に帯電していて短い血中滞留時間（約１時間未満のヒト血中半減期）を有し、取込みが遅い組織へのアクセスが妨げられる。したがって、短い血中滞留時間を有する薬剤は、かかる組織及び内皮下腔（例えば、血管内膜）のイメージングのためにはあまり適さない。既存の超常磁性粒子造影剤もまた、広いサイズ分布、アグロメレーション、不安定性及び毒性のような様々な不利益を有している。
【０００５】
デキストランコーティング及び１５〜３０ｎｍの直径を有するＣｏｍｂｉｄｅｘ．ＲＴＭ．は、各種の動物疾患モデル及びヒトにおける磁気共鳴イメージングに関して評価されている。小さいサイズを有するので、Ｃｏｍｂｉｄｅｘ．ＲＴＭ．は長い血中滞留時間（２４〜３６時間のヒト血中半減期）を有している。
【０００６】
炎症組織のイメージングで使用するために炎症応答細胞によって効率よくインターナライズ（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）されかつ炎症部位にトラフィック（ｔｒａｆｆｉｃｋ）され得る、適当な溶解性、生体適合性、サイズ及びコーティング特性をもったナノ構造体に対するニーズが今なお存在している。インビボ用途のために設計されたナノ粒子の生体分布特性がナノ粒子の総合サイズ及び表面電荷によって強く影響を受けることを考えれば、ナノ粒子のサイズを変化させずにナノ粒子の表面電荷を変化させ得ることは望ましい。これは、様々な表面電荷をもった同一サイズのナノ粒子によれば、ナノ粒子の生体分布に対する表面電荷の効果をサイズ効果からデカップル（ｄｅｃｏｕｐｌｅ）することができるからである。
【発明の概要】
【０００７】
若干の態様では、本明細書中に開示される実施形態によれば、（１）無機ナノ粒子コア、（２）無機ナノ粒子コアに結合した、第１の鎖長を有する第１の配位子であって、電荷を有する第１の配位子、及び（３）無機ナノ粒子コアに結合した、第２の鎖長を有する第２の配位子であって、親水性である第２の配位子を含んでなるナノ構造体が提供される。第２の鎖長が第１の鎖長より長い結果、第１の配位子のモルパーセント量の変化がナノ構造体の流体力学的直径を実質的に変化させない。
【０００８】
他の態様では、本明細書中に開示される実施形態によれば、これらのナノ構造体の製造方法が提供される。本方法は、（１）無機ナノ粒子コアを、電荷を有する第１の配位子と反応させる段階であって、第１の配位子はカルボキシレート、スルホネート、ホスフェート及びトリアルコキシシランからなる群から選択される官能基を介してナノ粒子コアに結合する段階、並びに（２）無機ナノ粒子コアを親水性の第２の配位子と反応させる段階であって、第２の配位子はカルボキシレート、スルホネート、ホスフェート及びトリアルコキシシランから選択される官能基を介して無機ナノ粒子コアに結合する段階を含んでなる。第１の配位子＋第２の配位子と無機ナノ粒子コアとのモル比は約１：１〜約２０：１である。
【０００９】
さらに他の態様では、本明細書中に開示される実施形態によれば、哺乳動物における炎症状態のイメージング方法が提供される。本方法は、哺乳動物において上述のナノ構造体をインビボ又はエクスビボの炎症細胞中に導入する段階、炎症細胞を炎症組織に移行させる段階、及び磁気共鳴を用いて炎症組織のイメージングを行う段階を含んでなる。
【００１０】
有利には、本明細書中に開示されるナノ構造体は、炎症状態の可視化及び管理に際して使用できる磁気共鳴イメージング剤として有用であり得る。
【００１１】
上述の記載は、以下に示す本発明の詳細な説明が一層よく理解できるようにするため、本発明の特徴をむしろ大まかに概説したものである。本発明の追加の特徴及び利点は以下に記載するが、これらは本発明の特許請求の範囲の主題をなしている。
【００１２】
本発明及びその利点を一層完全に理解するためには、添付の図面を参照しながら以下の説明を考察されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、シラン結合した短い帯電配位子Ｌ１及び長い親水性配位子Ｌ２を有する磁気共鳴（ＭＲ）イメージング剤の一般構造を示している。
【図２】図２は、正に帯電した配位子を有する例示的なＭＲイメージング剤を示している。
【図３】図３は、負に帯電した配位子を有する例示的なＭＲイメージング剤を示している。
【図４】図４Ａ〜４Ｆは、注射前（Ａ及びＢ）、ＰＥＧ−ＳＡ剤注射から２４時間後（Ｃ及びＤ）並びにＰＥＧ−ＡＥＰＴＥＳ剤注射から２４時間後（Ｅ及びＦ）のＴ２*重み付きＭＲ画像（Ａ、Ｃ及びＥ）及びＴ１重み付きＭＲ画像を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下の説明では、本発明の実施形態の完全な理解を可能にするため、特定の数量、サイズなどの具体的な細部が記載される。しかし、本発明がかかる具体的な細部なしでも実施できることは当業者にとって自明であろう。多くの場合、かかる考慮事項などに関する細部は省略されている。これは、かかる細部が本発明の完全な理解を得るためには不必要であると共に、関連分野の当業者の技術の範囲内にあるからである。
【００１５】
図面全般について述べれば、図示は本発明の特定の実施形態を説明するためのものであって、本発明をそれに限定する意図はないことが理解されよう。
【００１６】
若干の実施形態では、本開示はイメージング剤として有用であり得るナノ構造化材料に関する。図１を参照すれば、かかる目的のためのナノ構造体１００は無機ナノ粒子コア１１０を含んでいる。無機ナノ粒子コアは、一般に、磁気共鳴（ＭＲ）活性実在物（即ち、ＭＲ用信号源）として役立ち得ると共に、ナノ構造体１００の総合電荷／サイズ／極性に影響を与える化学的修飾のためのプラットホームとして役立ち得る任意の材料である。ナノ構造体１００の電荷及びサイズは、一般に無機ナノ粒子コア１１０に結合される配位子によって左右される。これらの配位子は、最小限として第１の配位子１２０及び第２の配位子１３０を含んでいる。第１の配位子１２０は第１の鎖長を有し、無機ナノ粒子コア１１０に共有結合し得る。第１の配位子１１０は、正又は負に帯電したものであり得る。第２の配位子１３０は第２の鎖長を有し、無機ナノ粒子コア１１０に共有結合し得る。第２の配位子１３０は親水性であり得ると共に、第２の鎖長は第１の鎖長より長い結果、第１の配位子１２０のモルパーセント量の変化がナノ構造体１００の流体力学的直径（ＤH）１４０を実質的に変化させない。このように、一方の長さが他方の長さから十分に異なる少なくとも２種の配位子を組み込むことにより、流体力学的直径１４０を実質的に変化させずに帯電配位子の量を変化させることができる。図１では、第１の配位子１２０及び第２の配位子１３０はシラン部分を介して結合しているように示されているが、無機ナノ粒子コア１１０に対するシラン結合は、以下に一層詳しく記載されるように１つの例示的な実施形態にすぎない。
【００１７】
本明細書中に使用される用語の大部分は当業者にとって認識し得るものであろうが、それでも本開示の理解を助けるために以下の定義を示す。しかし、明確に定義されない場合、用語は当業者によって現在容認されている意味を有するものと解釈すべきであることを理解すべきである。
【００１８】
本明細書中で定義される「ナノスケール」とは、一般に１μｍ未満の寸法をいう。
【００１９】
本明細書中で定義される「ナノ構造体」とは、一般に少なくとも１つの寸法がナノスケールである構造体をいう。特に、本明細書中に開示されるナノ構造体は磁気共鳴イメージングにおいて有用であり得る。
【００２０】
本明細書中で使用される「ζ電位」、「表面電位」及び「表面電荷」という用語並びに「ζ」という略語は、粒子の表面付近における静電ポテンシャルの測定値をいう。ζ電位は溶媒及び溶媒のイオン強度によって影響を受けるので、本明細書中に報告されるすべてのζ電位値は、特記しない限り、１０ｍＭ  ＮａＣｌ水溶液を溶媒として用いて測定されている。したがって、本発明の陽イオン性ナノ構造体は約０〜約＋６０ｍＶのζ電位を示す。
【００２１】
本明細書中で使用される「鎖長」とは、無機ナノ粒子コアに結合された配位子の最長原子鎖をいう。
【００２２】
本明細書中で使用される「流体力学的直径」及び「流体力学的サイズ」という用語並びに「ＤH」という略語は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した場合にナノ粒子の拡散係数に等しい拡散係数を有する球状粒子の直径をいう。ＤH値は、測定すべき薬剤を分散させた媒質に応じて変化し得る。したがって、特記しない限り、本明細書中に記載されるＤH値は、薬剤をｍＭ  ＮａＣｌ水溶液中に分散させたＤＬＳを用いて測定された。
【００２３】
無機ナノ粒子コア１１０は、磁気共鳴信号を与えると共に、ナノ構造体のサイズ及び電荷を変化させるための化学的修飾を施すことができる任意の材料であり得る。かかる構造体には、常磁性材料、超常磁性材料などがある。超常磁性無機ナノ粒子コアには、（１）酸化鉄（例えば、ヘマタイト、フェライト及びマグネタイト）、（２）一般式ＭＦｅ2Ｏ4（式中、Ｍは特に限定されないがマンガン、コバルト、銅、ニッケル及びマグネシウムをはじめとする金属である。）を有する混合スピネル型フェライト、並びに（３）これらの組合せがある。若干の実施形態では、無機ナノ粒子コアは超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）薬剤を含んでいる。ナノ構造体は、一般式[Ｆｅ2+Ｏ3]x[Ｆｅ2+Ｏ3(Ｍ2+Ｏ)]1-x（式中、１≧ｘ≧０である。）を有する超常磁性酸化鉄結晶質構造体を含み得る。Ｍ2+は、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、マグネシウム、銅又はこれらの組合せのような二価金属イオンであり得る。金属イオン（Ｍ2+）が第一鉄イオン（Ｆｅ2+）であって、ｘ＝０の場合、ナノ構造体はマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）であり、ｘ＝１の場合、ナノ構造体はマグヘマイト（Ｆｅ2Ｏ3、γ−Ｆｅ2Ｏ3）である。
【００２４】
一般に超常磁性は、不対スピンの結晶含有領域が磁区といわれる熱力学的に独立した単一ドメイン粒子と見なし得る程度に大きい場合に生じる。これらの磁区は、それの個々の不対電子の和より大きい正味の磁気双極子を示す。磁場が印加されていなければ、すべての磁区がランダムに配向していて正味の磁化はない。外部磁場の印加はすべての磁区の双極子モーメントを再配向させ、その結果として正味の磁気モーメントが生じる。若干の実施形態では、ナノ構造体は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析で示されるようにスピネル型結晶構造を示す。
【００２５】
無機ナノ粒子コアは、一実施形態では約１〜約１００ｎｍ、別の実施形態では約１〜約１０ｎｍの範囲内の直径を有する概して球状の形状を有し得る。無機ナノ粒子コアに関しては、完全な球状の幾何学的形状からはずれる不規則性が通例存在することは当業者に認められている。
【００２６】
様々な実施形態に従えば、無機ナノ粒子コアに結合した配位子は少なくとも、電荷を有する第１の配位子及び帯電していないが一般に親水性を有する第２の配位子を含んでいる。若干の実施形態では、かかる親水性配位子は構造体全体に生体適合性を付与すべきである。生体適合性を付与し得る化学構造の例には、特に限定されないが、ＰＥＧ誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリＬ−リシンなどがある。生体適合性は、一般に水への溶解性並びに非毒性を含んでいる。
【００２７】
第２の親水性配位子は、帯電配位子の量の変化がナノ構造体の総合サイズ（本明細書中では流体力学的直径と表現される）を顕著に変化させないように、第１の帯電配位子より長い鎖長を有するべきである。これらのイメージング剤の生体分布を効果的に調査するため、そのサイズを顕著に変化させずにナノ構造体全体の電荷を変化させ得ることが望ましい。
【００２８】
第１の配位子は、例えばカルボキシレート、スルホネート、ホスフェート及びシランを含む各種の官能基によって無機ナノ粒子コアに結合することができる。図１〜３は、シラン化学による無機ナノ粒子コアへの配位子結合の例を示している。与えられた無機ナノ粒子コアの官能基と係合する他の共有結合モチーフは、当業者には容易に認められよう。例えば、無機ナノ粒子コア上のペンダントＯＨ基に関しては、スルフィネート、スルフィット、ホスフィネート、ホスホネート、チオスルフェート、さらにはエーテル結合も可能である。無機ナノ粒子コアに結合する官能基及び配位子の官能性末端（即ち、帯電基又は親水基）は、２つの部分を連結する介在基を介して連結できる。介在基の構造は実質的に変化し得るが、当業者には、ナノ構造体の総合特性が悪影響を受けないようにかかる結合基について最小のサイズを使用することの利益が理解されよう。
【００２９】
若干の実施形態では、第１の配位子は負に帯電していてよい。例えば、下記式Ｉの化合物から導かれる第１の配位子を用いて、図２に示されるナノ構造体２００を生み出すことができる。
【００３０】
【化１】
2011516279.tif 000002
【００３１】
シランＩを結合し、次いで無水物部分を加水分解すれば、負に帯電した第１の配位子２２０のジカルボキシレート構造が得られる。ナノ構造体２００は、ＰＥＧ部分を有する第２の配位子２３０を導入することで完成する。配位子の結合順序は重要でなかろう。例えば、第１の配位子２２０及び第２の配位子２３０は任意の順序で無機ナノ粒子コア２１０に結合でき、さらには同時に導入することもできる。
【００３２】
第１の配位子は正に帯電していてよい。例えば、下記式ＩＩの化合物から導かれる第１の配位子を用いて、図３に示されるナノ構造体３００を生み出すことができる。
【００３３】
【化２】
2011516279.tif 000003
【００３４】
シランＩＩを結合し、続いてアミノ官能基をプロトン付加すれば、正に帯電した第１の配位子３２０が得られる。ナノ構造体３００は、ＰＥＧ部分を有する第２の配位子３３０を導入することで完成する。この場合にも、配位子の結合順序は重要でなかろう。例えば、第１の配位子３２０及び第２の配位子３３０は任意の順序で無機ナノ粒子コア３１０に結合でき、さらには同時に導入することもできる。
【００３５】
若干の実施形態では、第２の配位子はＰＥＧポリマーを含んでいる。ＰＥＧポリマーは、一般に約５００〜約５０００ダルトンの範囲内の分子量を有する。第２の配位子の一部として有用であると証明できる他の他のホモポリマー及びコポリマーには、ポリビニルピロリドン、ポリＬ−リシンなどがある。
【００３６】
第１の配位子の量及び電荷タイプを変化させることで、約−５０ｍＶ乃至約＋５０ｍＶの範囲内の非ゼロ表面電荷をナノ構造体上に導入できる。若干の実施形態では、表面電荷は約−２５ｍＶ乃至約＋２５ｍＶの範囲内の非ゼロ表面電荷を有する。他の実施形態では、表面電荷は約−５ｍＶ乃至約−１５ｍＶの範囲内にあり、さらに他の実施形態では、表面電荷は約＋５ｍＶ乃至約＋１５ｍＶの範囲内にある。当業者には、標的化すべき組織タイプ、血中半減期、細胞取込み速度及びクリアランス経路のような因子に応じて表面電荷を調整し得ることの価値が理解されよう。
【００３７】
本開示は、上述したナノ構造体の製造方法を提供する。かかる方法は、一般に、無機ナノ粒子コアを、カルボキシレート、スルホネート、ホスフェート又はトリアルコキシシラン結合基を介して電荷を有する第１の配位子と反応させる段階、及びナノ粒子コアを同様な結合基（同じ結合基である必要はない）を介して親水性の第２の配位子と反応させる段階を含んでいる。配位子の導入の順序は重要でなく、さらには名目上同時に導入することもできる。第１の配位子＋第２の配位子と無機ナノ粒子コアとのモル比は、約１：１〜約２０：１の範囲内にあり得る。モル比は標的化表面電位及び最終ナノ構造体のための用途に依存する。通例、無機ナノ粒子コアは超常磁性酸化鉄である。
【００３８】
表面電荷が望ましくは負である場合、導入される第１の配位子は下記式Ｉの構造から導くことができる。
【００３９】
【化３】
2011516279.tif 000004
【００４０】
ナノ構造体の表面電荷が望ましくは正である場合、導入される第１の配位子は下記式ＩＩの構造から導くことができる。
【００４１】
【化４】
2011516279.tif 000005
【００４２】
親水基を有する第２の配位子は、例えば下記式ＩＩＩの構造によって導入することができる。
【００４３】
【化５】
2011516279.tif 000006
【００４４】
最後に、本開示は、哺乳動物における炎症状態のイメージング方法であって、哺乳動物において上述のナノ構造体をインビボ又はエクスビボの炎症細胞中に導入する段階を含む方法も提供する。かかる方法は、炎症細胞を炎症組織に移行させる段階、及び磁気共鳴を用いて炎症組織のイメージングを行う段階を含んでいる。可視化方法と共に、炎症状態の管理を統合することもできる。
【００４５】
本明細書中に記載されるナノ構造体は、起こり得る毒性を最小限に抑えるため、生理学的に許容されるキャリヤー中に分散させることができる。即ち、ナノ構造体は約６〜約８のｐＨを有する生体適合性溶液中に分散させることができる。若干の実施形態では、ナノ構造体は約７〜約７．４のｐＨを有する生体適合性溶液中に分散させる。他の実施形態では、ナノ構造体は約７．４のｐＨを有する生体適合性溶液中に分散させる。
【００４６】
ナノ構造体は、化合物を水性媒質中に懸濁又は溶解するために製薬業界で常用されている添加剤と混合することができ、次いで懸濁液又は溶液を当業界で公知の技法によって滅菌できる。ナノ構造体又はその薬学的に許容される塩は、選択された投与経路に適合した各種の形態で（ヒト被験体を含む）被験体に投与できる。即ち、ナノ構造体は、局所適用（即ち、組織又は粘膜への投与）、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射及び／又は皮下注射によって導入できる。注射のために適する形態には、無菌水溶液又は水性分散液、並びに無菌注射用溶液、分散液、リポソーム製剤又はエマルジョン製剤を調製するための無菌粉末がある。いずれの場合にも、形態は無菌であり、注射器による投与を可能にする程度の流動性を有するべきである。吸入用途のために適する形態には、無菌エアゾル中に分散させたナノ構造体がある。局所投与のために適する形態には、クリーム、ローション、軟膏などがある。
【００４７】
若干の実施形態では、好ましい量のナノ構造体を被験体に簡便に送達しかつ所望形態の容器にパッケージするため、ナノ構造体は濃縮される。かくして、若干の実施形態では、ナノ構造体は生理学的に許容される溶液中に分散させ、薬剤のＦｅ含有量として被験体の体重１ｋｇ当たり約０．１〜約５０ｍｇ（即ち、約０．１〜約５０ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇ  ｂｗ）の濃度でナノ構造体を投与することを容易にする容器内に小分けされる。他の実施形態では、ナノ構造体は、約０．５〜約２．５ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇ  ｂｗの濃度でナノ構造体を投与することを容易にするようにしてパッケージされる。
【００４８】
若干の実施形態では、開示されるナノ構造体は、局所適用、血管内注射、筋肉内注射又は間質内注射を含む様々な方法によって被験体に直接投与することができる。若干の実施形態では、約０．１〜約５０ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇのナノ構造体が被験体に投与される。他の実施形態では、約０．５〜約２．５ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇの薬剤が被験体に投与される。同様に、開示されるナノ構造体を含む炎症応答細胞を、血管内注射、筋肉内注射又は間質内注射を含む様々な方法によって被験体に投与することもできる。
【００４９】
若干の実施形態では、ナノ構造体又はナノ構造体を含む炎症応答細胞を投与してから約３時間後又はそれ以内に標的組織のイメージングが行われる。別の実施形態では、ナノ構造体又はナノ構造体を含む炎症応答細胞を被験体に投与してから約２４時間後又はそれ以内に標的組織のイメージングが行われる。他の実施形態では、ナノ構造体又はナノ構造体を含む炎症応答細胞を被験体に投与してから約５日後又はそれ以内に標的組織のイメージングが行われる。
【００５０】
別の一連の実施形態では、本発明は、ナノ構造体を用いて炎症応答細胞の浸潤及び蓄積に関連する状態のイメージング方法を提供する。ナノ構造体をエクスビボの炎症応答細胞中に導入し、続いて被験体中に導入することができる。即ち、炎症応答細胞を被験体から抜き取り、ナノ構造体を炎症応答細胞中に導入し、ナノ構造体を含む炎症応答細胞を被験体に投与した後にイメージングを行う。ナノ構造体を炎症応答細胞中に導入する段階は、任意には、例えば磁気ビーズ、密度剤及び／又は遠心を用いて炎症応答細胞を分離する段階を含み得る。特定の実施形態では、炎症応答細胞は、血液中を循環する単球、組織中のマクロファージ細胞、樹枝状細胞（ＤＣ）、多核単球（ＰＮＭ）、好酸球、好中球及びＴ細胞からなる。
【００５１】
炎症応答細胞の浸潤及び蓄積に関連する状態の管理方法は、被験体を処置して炎症を低減させる前、その後又はその前後に標的組織のイメージングを行うことを含み得る。かくして、炎症応答細胞の浸潤及び蓄積に関連する状態の開示管理方法は、（ａ）標的組織のイメージングを行って炎症状態に関する基線情報又は診断情報を得る段階、（ｂ）被験体を処置する段階、及び（ｃ）被験体のイメージングを１回以上行って炎症状態に関する追加の情報を得る段階を含み得る。医療専門家は、最初に炎症組織の特定決定を行い又は事後に炎症組織を評価するための他の技法に頼ることで、処置の前後に被験体のイメージングを行わないことを選択できる。かくして、代替実施形態では、炎症応答細胞の浸潤及び蓄積に関連する状態の管理方法は、磁気共鳴以外の技法によって同定された炎症状態を処置する段階、及び処置に続いて標的組織のイメージングを行う段階を含んでいる。同様に、別の代替実施形態では、炎症応答細胞の浸潤及び蓄積に関連する状態の開示管理方法は、被験体又は標的組織のイメージングを行って炎症状態に関する情報を得る段階、及び続いて標的組織の再イメージングを行うことなしに炎症状態を処置する段階を含み得る。
【００５２】
疾患管理が処置の効果を判定することに向けられる場合、かかる方法は、処置の適用前に対象組織のイメージングを行って処置前評価を得る段階、次いで処置を適用する段階、及び処置に続いて対象組織のイメージングを１回以上行って対象組織の処置後評価を得る段階を含んでいる。処置前評価及び処置後評価を比較することで、炎症応答細胞の浸潤及び蓄積に関連する状態に関して炎症の低減又はその他の症状の軽減の有無を判定することができる。処置の効果を判定する方法はさらに、処置前評価及び処置後評価の比較に基づき、特定の処置を止めるか否かを決定する段階、並びに処置の頻度、強度及び／又は用量を増加するか否かを決定する段階を含み得る。
【００５３】
疾患管理が処置の全体的又は全身的適用ではなく炎症組織に局限された処置（例えば、外科手術又は放射線療法）を含む場合、疾患管理方法は、炎症組織の空間位置確認を行って処置（例えば、切除又は照射）すべき特定領域を画定する段階を含み得る。
【００５４】
上記に記載された方法は、炎症状態のイメージング前、その後又はその前後において、炎症を低減させるための処置で使用できる。イメージングの結果は、炎症状態の管理で使用できる。特に対象となる炎症状態はマクロファージ蓄積に関連するものであって、特に限定されないが、自己免疫状態、血管状態、神経学的状態及びこれらの組合せを含む。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、上記に開示された実施形態の一部を一層詳しく例示するために示される。当業者であれば、以下の実施例中に開示される技法は、本発明の実施のための例示的な形態をなす技法を表していることが理解されるはずである。しかし当業者であれば、本開示に照らせば、開示された特定の実施形態に数多くの変更を加えることができ、それでも本発明の技術思想及び技術的範囲から逸脱せずに同様又は類似の結果が得られることが理解されるはずである。
【００５６】
【化６】
2011516279.tif 000007
【００５７】
５ｎｍ  ＳＰＩＯナノ粒子の合成
２５ｍＬの三つ口シュレンク（Ｓｃｈｌｅｎｋ）フラスコに、１３０ｍｍビグルー（Ｖｉｇｒｅｕｘ）カラム上に堆積した凝縮器、及び熱電対を取り付けた。凝縮器には窒素入口を取り付け、系中に窒素を流した。シュレンクフラスコ及びビグルーカラムはガラスウールで断熱した。トリメチルアミン−Ｎ−オキシド（Ａｌｄｒｉｃｈ社、０．５７０ｇ、７．６ｍｍｏｌ）及びオレイン酸（Ａｌｄｒｉｃｈ社：９９＋％、０．５６５ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのジオクチルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ社：９９％）中に分散させた。分散物を約２０℃／分の速度で８０℃に加熱した。混合物が約８０℃に達した後、シュレンク継手を通して２６５μＬのＦｅ(ＣＯ)5（Ａｌｄｒｉｃｈ社：９９．９９９％、２．０ｍｍｏｌ）を撹拌溶液中に急速に注入した。溶液は、白色の「霧」を激しく発生しながら、即座に黒色になった。溶液を急速に約１２０〜１４０℃に加熱した。６〜８分以内に、反応ポットは１００℃に冷却し、その温度に保ちながら７５分間撹拌した。約１００℃で７５分間撹拌した後、温度を約２０℃／分の速度で約２８０℃に高めた。溶液を７５分間撹拌した後、加熱マントル及びガラスウールを取り除いて反応物を室温に戻した。
【００５８】
ＰＥＧ−７５０（モノメチルエーテル）トリメトキシシランカルバメートの合成
ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）に溶解したＰＥＧ−７５０（モノメチルエーテル）（５０．４９ｇ、６６．０ｍｍｏｌ）を含む溶液に、３−イソシアナトプロピルトリメトキシシラン（１２．５４ｇ、６１．１ｍｍｏｌ）を添加し、次いでジブチルスズジラウレート（３．８６ｇ、６．１１ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液を室温で１６時間撹拌し、溶媒を真空中で除去した。得られた残留物をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中に再懸濁し、ヘキサン（４×１００ｍＬ）で洗浄した。ＭｅＯＨ層から溶媒を真空中で除去したところ、５９．３ｇ（１００％）の生成物がオフホワイトのろう状固体として残った。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  ３．５８−３．５３（ｍ，６８Ｈ），３．４７（ｓ，９Ｈ），３．３７（ｓ，３Ｈ），３．１６（ｍ，２Ｈ），１．６１（ｍ，２Ｈ），０．６２（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ；13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  １５６．４，７２．５，７１．７，７０．３，６９．４，６３．５，６１．３，５８．７，５０．０，４９．６，４３．１，２２．９，６．０ｐｐｍ；ＩＲ（塩プレート上でニート）２８７１，１７１９，１５３３，１４５６，１３４８，１２７３，１２４９，１１０８，９５１，８２１，７３３，７０１ｃｍ-1。
【００５９】
ＰＥＧ−１９００（モノメチルエーテル）トリメトキシシランカルバメートの合成
ＣＨ2Ｃｌ2（５０ｍＬ）に溶解したＰＥＧ−１９００（モノメチルエーテル）（２０．０ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を含む溶液に、３−イソシアナトプロピルトリメトキシシラン（１．８３ｍＬ、９．５５ｍｍｏｌ）を添加し、次いでジブチルスズジラウレート（０．６０３ｇ、０．９５５ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で１４日間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残ったオフホワイトの固体をＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（４×１００ｍＬ）で洗浄した。次いで、ＭｅＯＨを真空中で除去したところ、２０．１０ｇ（１００％）の生成物がオフホワイトの固体として得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ  ４．２１（ｍ，２Ｈ），３．５４−３．８２（ｍ，１６６Ｈ），３．４９（ｓ，９Ｈ），３．３１（ｓ，３Ｈ），３．１６（ｍ，２Ｈ），１．６２（ｍ，２Ｈ），０．６４（ｍ，２Ｈ）；ＩＲ（塩プレート上でニート）２８７５，１７１９，１４５２，１２６７，１１０２，７３７ｃｍ-1。
【００６０】
ＰＥＧ−ＳＡ（ＰＥＧ−ＳＡ；５：１）被覆ＳＰＩＯの合成
ヘキサデカン中のＳＰＩＯ（１１．２ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬ）を乾燥ＴＨＦで１ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬに希釈し、一晩超音波処理した。ＰＥＧ−７５０モノメチルエーテルトリメトキシシランカルバメート（１０．６９ｇ、１０．７４ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの上記ＳＰＩＯ溶液（１００ｍｇ  Ｆｅ、１．７９ｍｍｏｌ）に溶解した。この暗色透明溶液に３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物（ＳＡ）（０．６０１ｍＬ、２．１１ｍｍｏｌ）を添加し、一晩超音波処理した。１Ｍ  ＨＣｌ（０．２４ｍＬ）を撹拌しながら滴下し、混合物をさらに６時間超音波処理した。水（２．０ｍＬ）を添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。次いで、トリス／ＮａＣｌ緩衝液（１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ約７）を混合物（１００ｍＬ）に添加した。すべての色が水性層中に移行するのが認められ、水性層をＴＨＦ（４×１００ｍＬ）で洗浄した。相分離を容易にするための必要に応じてヘキサン（約５ｍＬ）を添加した。残留する有機揮発分を、穏やかに加熱しながら真空中で除去した。６つの１００ｋＤａ分子量カットオフ遠心フィルターを４０００×ｇで使用しながら、得られた暗色の水溶液を１５０ｍＭ食塩水（４×７ｍＬ／管）、１：１  ＩＰＡ／１５０ｍＭ食塩水（５×７ｍＬ／管）及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（５×７ｍＬ／管）で洗浄することで精製した。最終の洗浄後、暗褐色の水溶液を１５０ｍＭ  ＮａＣｌで約５ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬの濃度に希釈した。ＤＬＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）ＤH＝１９．０ｎｍ、ζ電位（１０ｍＭ  ＮａＣｌ）ζ＝−１０．０ｍＶ。
【００６１】
ＰＥＧ−ＳＡ（ＰＥＧ−ＳＡ；２：１）被覆ＳＰＩＯの合成
ヘキサデカン中のＳＰＩＯ（１１．２ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬ）を乾燥ＴＨＦで１ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬに希釈し、一晩超音波処理した。ＰＥＧ−７５０モノメチルエーテルトリメトキシシランカルバメート（８．５２ｇ、８．７８ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの上記ＳＰＩＯ溶液（１００ｍｇ  Ｆｅ、１．７９ｍｍｏｌ）に溶解した。この暗色透明溶液に３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物（ＳＡ）（１．３１ｍＬ、４．３３ｍｍｏｌ）を添加し、一晩超音波処理した。１Ｍ  ＨＣｌ（０．２４ｍＬ）を撹拌しながら滴下し、混合物をさらに６時間超音波処理した。水（２．０ｍＬ）を添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．４）を混合物（１００ｍＬ）に添加した。すべての色が水性層中に移行するのが認められ、水性層をＴＨＦ（４×１００ｍＬ）で洗浄した。相分離を容易にするための必要に応じてヘキサン（約５ｍＬ）を添加した。残留する有機揮発分を、穏やかに加熱しながら真空中で除去した。６つの１００ｋＤａ分子量カットオフ遠心フィルターを４０００×ｇで使用しながら、得られた暗色の水溶液を水（１×７ｍＬ／管）で洗浄することで精製した。得られた溶液をＮＨ4ＯＨでｐＨ１０に調整し、室温で３日間撹拌した。６つの１００ｋＤａ分子量カットオフ遠心フィルターを４０００×ｇで使用しながら、得られた暗褐色の水溶液を１：１  ＩＰＡ／ＰＢＳ（５×７ｍＬ／管）及びＰＢＳ（５×７ｍＬ／管）で洗浄することで精製した。最終の洗浄後、暗褐色の水溶液をＰＢＳで約５ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬの濃度に希釈した。ＤＬＳ（ＰＢＳ）ＤH＝２０．１ｎｍ、ζ電位（１０ｍＭ  ＮａＣｌ）ζ＝−１０．６ｍＶ。
【００６２】
ＰＥＧ−ＳＡ（ＰＥＧ−ＳＡ；１：１）被覆ＳＰＩＯの合成
ヘキサデカン中のＳＰＩＯ（１１．２ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬ）を乾燥ＴＨＦで１ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬに希釈し、一晩超音波処理した。ＰＥＧ−７５０モノメチルエーテルトリメトキシシランカルバメート（６．３６ｇ、６．５６ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの上記ＳＰＩＯ溶液（１００ｍｇ  Ｆｅ、１．７９ｍｍｏｌ）に溶解した。この暗色透明溶液に３−（トリエトキシシリル）プロピルコハク酸無水物（ＳＡ）（２．００ｍＬ、６．５６ｍｍｏｌ）を添加し、一晩超音波処理した。１Ｍ  ＨＣｌ（０．２４ｍＬ）を撹拌しながら滴下し、混合物をさらに６時間超音波処理した。水（２．０ｍＬ）を添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ＝７．４）を混合物（１００ｍＬ）に添加した。すべての色が水性層中に移行するのが認められ、水性層をＴＨＦ（４×１００ｍＬ）で洗浄した。相分離を容易にするための必要に応じてヘキサン（約５ｍＬ）を添加した。残留する有機揮発分を、穏やかに加熱しながら真空中で除去した。６つの１００ｋＤａ分子量カットオフ遠心フィルターを４０００×ｇで使用しながら、得られた暗色の水溶液を水（１×７ｍＬ／管）で洗浄することで精製した。得られた溶液をＮＨ4ＯＨでｐＨ１０に調整し、室温で３日間撹拌した。１００ｋＤａ分子量カットオフ遠心フィルターを４０００×Ｇで使用しながら、得られた暗褐色の水溶液を１：１  ＩＰＡ／ＰＢＳ（５×７ｍＬ／管）及びＰＢＳ（５×７ｍＬ／管）で洗浄することで精製した。最終の洗浄後、暗褐色の水溶液をＰＢＳで約５ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬの濃度に希釈した。ＤＬＳ（ＰＢＳ）ＤH＝２０．１ｎｍ、ζ電位（１０ｍＭ  ＮａＣｌ）ζ＝−３０．５ｍＶ。
【００６３】
ＰＥＧ−ＡＥＡＰＴＥＳ（ＰＥＧ−ＡＥＡＰＴＥＳ；５：１）被覆ＳＰＩＯの合成
ヘキサデカン中のＳＰＩＯ（１１．２ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬ）を無水テトラヒドロフランで１ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬの濃度に希釈し、この溶液をＶＷＲ  １５０Ｔモデルソニケーター中で一晩超音波処理した。ＰＥＧ７５０モノメチルエーテルトリメトキシシランカルバメート（１５．９ｇ、１６．１ｍｍｏｌ）をＳＰＩＯ溶液（１５０ｍＬ、２．６８ｍｍｏｌ）に溶解し、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（０．８６ｍＬ、３．２２ｍｍｏｌ）を添加し、暗色の混合物を１７時間超音波処理した。１．２Ｍ  ＨＣｌ（０．３ｍＬ）を添加し、混合物をさらに９時間超音波処理した。水（３ｍＬ、２％（ｖ／ｖ））を添加し、反応混合物を室温で１５時間撹拌し、次いで１０ｍＭトリス／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ水溶液（１５０ｍＬ）で奪活した。層を分離し、暗色の水性層をテトラヒドロフラン中５％ヘキサン（６×１００ｍＬ）で抽出した。残った水性混合物をさらに減圧下３０℃で１時間濃縮した。１００ｋＤａ分子量カットオフフィルターを４０００×ｇで使用しながら、ＳＰＩＯ溶液を無菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（４×）、１：１  イソプロパノール／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（４×）及び無菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（５×）で洗浄することで精製した。残った濃縮溶液を無菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ３）で希釈し、Ｐｅｒｌ試薬（Ｋ4Ｆｅ(ＣＮ)6水溶液；５０ｍｇ／ｍＬ）を用いて鉄濃度をＵＶ吸収により測定した。最終の濃度は１０ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬを目標とした。ＤH（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３）＝１８．２ｎｍ、ζ電位（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）ζ＝１０．６ｍＶ。
【００６４】
ＰＥＧ−ＡＥＡＰＴＥＳ（ＰＥＧ−ＡＥＡＰＴＥＳ；２．５：１）被覆ＳＰＩＯの合成
ヘキサデカン中のＳＰＩＯ（１１．２ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬ）を無水テトラヒドロフランで１ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬの濃度に希釈し、この溶液をＶＷＲ  １５０Ｔモデルソニケーター中で１３時間超音波処理した。ＰＥＧ７５０モノメチルエーテルトリメトキシシランカルバメート（１０．６ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）をＳＰＩＯ溶液（１００ｍＬ、１．７９ｍｍｏｌ）に溶解し、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（１．１４ｍＬ、４．３０ｍｍｏｌ）を添加し、暗色の混合物を１６時間超音波処理した。１．２Ｍ  ＨＣｌ（０．２ｍＬ）を添加し、混合物をさらに２４時間超音波処理した。水（２ｍＬ、２％（ｖ／ｖ））を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌し、次いで１０ｍＭトリス／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ水溶液（１００ｍＬ）で奪活した。層を分離し、暗色の水性層をテトラヒドロフラン中５％ヘキサン（５×１００ｍＬ）で抽出した。残った水性混合物をさらに減圧下４０℃で１５分間濃縮した。１００ｋＤａ分子量カットオフフィルターを４０００×ｇで使用しながら、ＳＰＩＯ溶液を無菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（４×）、１：１  イソプロパノール／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（４×）及び無菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（５×）で洗浄することで精製した。残った濃縮溶液を無菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ３）で希釈し、Ｐｅｒｌ試薬（Ｋ4Ｆｅ(ＣＮ)6水溶液；５０ｍｇ／ｍＬ）を用いて鉄濃度をＵＶ吸収により測定した。最終の濃度は１０ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬを目標とした。ＤH（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３）＝２１．９ｎｍ、ζ電位（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）ζ＝１９．７４ｍＶ。
【００６５】
ＰＥＧ−ＡＥＡＰＴＥＳ（ＰＥＧ−ＡＥＡＰＴＥＳ；１０：１）被覆ＳＰＩＯの合成
ヘキサデカン中のＳＰＩＯ（１１．２ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬ）を無水テトラヒドロフランで１ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬの濃度に希釈し、この溶液をＶＷＲ  １５０Ｔモデルソニケーター中で１５時間超音波処理した。ＰＥＧ７５０モノメチルエーテルトリメトキシシランカルバメート（１１．２ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）をＳＰＩＯ溶液（１０６ｍＬ、１．９０ｍｍｏｌ）に溶解し、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（０．３ｍＬ、１．１４ｍｍｏｌ）を添加し、暗色の混合物を１７時間超音波処理した。１．２Ｍ  ＨＣｌ（０．２１２ｍＬ）を添加し、混合物をさらに８時間超音波処理した。水（２．１ｍＬ、２％（ｖ／ｖ））を添加し、反応混合物を室温で１７時間撹拌し、次いで１０ｍＭトリス／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ水溶液（１００ｍＬ）で奪活した。層を分離し、暗色の水性層をテトラヒドロフラン中５％ヘキサン（５×１００ｍＬ）で抽出した。残った水性混合物をさらに減圧下４０℃で１５分間濃縮した。１００ｋＤａ分子量カットオフフィルターを４０００×ｇで使用しながら、ＳＰＩＯ溶液を無菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（４×）、１：１  イソプロパノール／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（４×）及び無菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（５×）で洗浄することで精製した。残った濃縮溶液を無菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ３）で希釈し、Ｐｅｒｌ試薬（Ｋ4Ｆｅ(ＣＮ)6水溶液；５０ｍｇ／ｍＬ）を用いて鉄濃度をＵＶ吸収により測定した。最終の濃度は１０ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬを目標とした。ＤH（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３）＝２１．８ｎｍ、ζ電位（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）ζ＝３．３９ｍＶ。
【００６６】
ＰＥＧ−テトラメチルアンモニウム（ＰＥＧ−アンモニウム；５：１）被覆ＳＰＩＯの合成
ヘキサデカン中のＳＰＩＯ（１１．２ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬ）を無水テトラヒドロフランで１ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬの濃度に希釈し、この溶液をＶＷＲ  １５０Ｔモデルソニケーター中で１３時間超音波処理した。ＰＥＧ７５０モノメチルエーテルトリメトキシシランカルバメート（７．４２ｇ、７．５２ｍｍｏｌ）をＳＰＩＯ溶液（１０６ｍＬ、１．９０ｍｍｏｌ）に溶解し、Ｎ−トリメトキシシリルプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（メタノール中５０％溶液、０．８３ｍＬ、１．５０ｍｍｏｌ）を添加し、暗色の混合物を１６時間超音波処理した。１．２Ｍ  ＨＣｌ（０．１４ｍＬ）を添加し、混合物をさらに２４時間超音波処理した。水（１．４ｍＬ、２％（ｖ／ｖ））を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌し、次いで１０ｍＭトリス／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ水溶液（７２ｍＬ）で奪活した。層を分離し、暗色の水性層をテトラヒドロフラン中５％ヘキサン（４×１００ｍＬ）で抽出した。残った水性混合物をさらに減圧下４０℃で１５分間濃縮した。１００ｋＤａ分子量カットオフフィルターを４０００×ｇで使用しながら、ＳＰＩＯ溶液を無菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（４×）、１：１  イソプロパノール／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（４×）及び無菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（５×）で洗浄することで精製した。残った濃縮溶液を無菌１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ３）で希釈し、Ｐｅｒｌ試薬（Ｋ4Ｆｅ(ＣＮ)6水溶液；５０ｍｇ／ｍＬ）を用いて鉄濃度をＵＶ吸収により測定した。最終の濃度は１０ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬを目標とした。ＤH（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３）＝２９．６ｎｍ、ζ電位（１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）ζ＝１８．４１ｍＶ。
【００６７】
ＰＥＧ1900−ＡＥＡＰＴＥＳ（ＰＥＧ1900−ＡＥＡＰＴＥＳ；５：１）被覆ＳＰＩＯの合成
ヘキサデカン中のＳＰＩＯ（１１．２ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬ）を乾燥ＴＨＦで１ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬに希釈し、一晩超音波処理した。ＰＥＧ−１９００モノメチルエーテルトリメトキシシランカルバメート（２．３１ｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの上記ＳＰＩＯ溶液（１０ｍｇ  Ｆｅ、０．１７９ｍｍｏｌ）に溶解した。この暗色透明溶液にＮ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＥＡＰＴＥＳ）（０．０５７ｍＬ、０．２１４ｍｍｏｌ）を添加し、一晩超音波処理した。１Ｍ  ＨＣｌ（０．０２４ｍＬ）を撹拌しながら滴下し、混合物をさらに６時間超音波処理した。水（０．２００ｍＬ）を添加し、反応物を室温で一晩撹拌した。次いで、トリス／ＮａＣｌ緩衝液（１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ約７）を混合物（１０ｍＬ）に添加した。すべての色が水性層中に移行するのが認められ、水性層をＴＨＦ（４×１０ｍＬ）で洗浄した。相分離を容易にするための必要に応じてヘキサン（約５ｍＬ）を添加した。残留する有機揮発分を、穏やかに加熱しながら真空中で除去した。１００ｋＤａ分子量カットオフ遠心フィルターを４０００×ｇで使用しながら、得られた暗色の水溶液を１５０ｍＭ食塩水（４×７ｍＬ／管）、１：１  ＩＰＡ／１５０ｍＭ食塩水（５×７ｍＬ／管）及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（５×７ｍＬ／管）で洗浄することで精製した。最終の洗浄後、暗褐色の水溶液を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３で約５ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬの濃度に希釈した。ＤＬＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３）ＤH＝２７．８ｎｍ、ζ電位（１０ｍＭ  ＮａＣｌ）ζ＝７．９ｍＶ。
【００６８】
特性決定
１５０ｍＭ  ＮａＣｌを溶媒として使用しながら、動的光散乱によって流体力学的直径を測定した。精製ＳＰＩＯ溶液を１５０ｍＭ  ＮａＣｌで希釈し、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＺｅｔａＰＡＬＳを用いるＤＬＳ分析に先立って１００ｎｍフィルターに通した。ＳＰＩＯ溶液をＨ2Ｏで１４倍希釈し（最終溶液（１０ｍＭ  ＮａＣｌ））、希釈ＳＰＩＯ溶液を１００ｎｍフィルターに通した後、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＺｅｔａＰＡＬＳを用いてζ電位を測定した。結果を下記表１に示す。
【００６９】
【表１】
2011516279.tif 000008
【００７０】
インビボ実験
無菌のリン酸緩衝生理食塩水中に懸濁した１％カラゲナンの０．１ｍＬを皮下注射することで、雌のＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに肉芽腫を誘発した。注射部位は、尾の基部から約１ｃｍ上方の背面であった。肉芽腫誘発から２〜７日後、物理的に拘束したマウスに尾静脈を通してＳＰＩＯ造影剤を静脈内注射した。ＳＰＩＯ剤は５ｍｇ  Ｆｅ／ｍＬの濃度で生理食塩水に溶解し、注射に先立って滅菌濾過し、エンドトキシンの存在について試験した。薬剤は２０ｍｇ  Ｆｅ／ｋｇ体重の用量で投与した。
【００７１】
ＳＰＩＯ造影剤の注射に先立ってマウスのイメージングを行い、薬剤の注射から約２４時間後に再び行った。マウスのイメージングは、注文製造の３．２ｃｍソレノイド送信／受信ＲＦコイルを使用しながら、臨床用の１．５Ｔ  ＧＥ  Ｓｉｇｎａ  ＭＲスキャナー上で行った。マウスは、齧歯動物用として設計された市販の麻酔装置を使用しながら、ノーズコーンによって酸素中２％イソフルランで麻酔した。２つのパルスシーケンスの各々について、１３の軸方向１ｍｍ画像スライスを採取することで肉芽腫を完全にカバーした。パルスシーケンスパラメーターは下記の通りであった。
Ｔ１重み付き：２Ｄスピンエコー、ＴＥ  １３、ＴＲ  ３２０、マトリックス２５６×１９２、ＦＯＶ  ５、位相ＦＯＶ  ０．７５、厚さ１．０、ＮＥＸ  ３、ＢＷ  ２２．７３。
Ｔ２*重み付き：２Ｄグラジエントエコー、ＴＥ１  ９．８、ＴＥ２  ２５、ＴＲ  ６５０、フリップ角４５、マトリックス２５６×１９２、ＦＯＶ  ５、位相ＦＯＶ  ０．７５、スライス厚さ１．０、ＮＥＸ  ２、ＢＷ  １５．６３。
【００７２】
図４Ａ〜４Ｆは、注射前（Ａ及びＢ）、ＰＥＧ−ＳＡ剤注射から２４時間後（Ｃ及びＤ）並びにＰＥＧ−ＡＥＰＴＥＳ剤注射から２４時間後（Ｅ及びＦ）のＴ２*重み付きＭＲ画像（Ａ、Ｃ及びＥ）及びＴ１重み付きＭＲ画像を示している。肉芽腫中に顕著なＴ２*コントラスト（暗領域）及びＴ１コントラスト（明領域）が認められ、ＳＰＩＯ剤が炎症病巣にコントラストを与え得ることを示している。
【００７３】
上述の実施形態に関して上記に記載した構造、機能及び動作の一部は本発明を実施する上で必須ではなく、例示的な実施形態を完全に説明するためにのみ示されていることが理解されよう。加えて、上記に引用した特許や刊行物に記載された特定の構造、機能及び動作は本発明と組み合わせて実施できるものの、それは本発明を実施する上で必須ではないことも理解されよう。したがって本発明は、請求の範囲で定義される本発明の技術思想及び技術的範囲から実際に逸脱することなく、詳しく記載したものとは異なるやり方で実施できることを理解すべきである。
【符号の説明】
【００７４】
１００  ナノ構造体
１１０  無機ナノ粒子コア
１２０  第１の配位子
１３０  第２の配位子
１４０  流体力学的直径
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年2月4日(2011.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
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