(57)【要約】  本発明は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１に関連し、グリホサート、アリールオキシアルカノアートおよびグルホシネートの除草剤に対する抵抗性を付与する複数の特性を含む、新規な発現カセットおよび形質転換インサートを含む。本発明は、部分的に、抵抗性雑草を抑制する方法、および、除草剤耐性植物を育種する方法にも関連する。一部の実施形態では、前記イベント配列は、他の形質、例えば、他の除草剤耐性遺伝子および／または害虫阻害性タンパク質が積み重ねられ得る。本発明はさらに、部分的に、大豆および関連する植物材料中のイベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の検出のための、エンドポイントＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲアッセイに関連する。一部の実施形態は、植物材料の高いスループットの接合性アッセイを行い得る。他の実施形態は、本主題の発明のイベントを含む大豆株の接合性を独特に特定し、前記大豆株を独特に育種するのに使用され得る。これらのアッセイを行うのに有用なキットおよび条件も提供される。
2014523251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆のゲノムＤＮＡのセグメント中に遺伝子組換えインサートを含み、前記セグメントが、配列番号１および配列番号２を含む、遺伝子組換え大豆植物体。
【請求項２】
アクセッションＮｏ．ＰＴＡ−１１９９３で、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託された、代表的な種子に存在する、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含むゲノムを含む、大豆種子。
【請求項３】
前記セグメント中に前記遺伝子組換えインサートを含む、請求項１に記載の植物体の大豆種子。
【請求項４】
大豆のゲノムＤＮＡのセグメント中に遺伝子組換えインサートを含み、前記セグメントが、配列番号１および配列番号２を含む、請求項２に記載の種子を生長させることにより産出された大豆植物体。
【請求項５】
イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む、請求項４に記載の大豆植物体の子孫植物体。
【請求項６】
前記セグメント中に除草剤耐性遺伝子を含む、請求項１に記載の大豆植物体の除草剤耐性子孫植物体。
【請求項７】
大豆植物用の発現カセットを製造する方法であって、作動可能にプロモータに結合され、配列番号１および配列番号２を含む大豆ゲノムＤＮＡのセグメント内に挿入された、異種性ポリヌクレオチドを産生する工程を含む、前記方法。
【請求項８】
花粉、胚珠、花、シュート、根および葉からなる群から選択され、前記インサートを含む、請求項４に記載の植物体の部分。
【請求項９】
単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記分子が、少なくとも１５個のヌクレオチドを含み、ストリンジェントな洗浄条件下において、配列番号１および配列番号２からなる群から選択される核酸配列とのハイブリダイゼーションを維持する、前記分子。
【請求項１０】
単離されたポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号３〜２１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
大豆ゲノムを修飾する方法であって、前記大豆ゲノムのＤＮＡセグメント内に導入遺伝子を挿入する工程を含み、前記ＤＮＡセグメントが、配列番号１を含む５’末端、および、配列番号２のヌクレオチド残基を含む３’末端を含む、前記方法。
【請求項１２】
大豆植物を育種する方法であって、配列番号１および配列番号２を含む、大豆ゲノムＤＮＡの前記セグメント中に遺伝子組換えインサートを含む第１の大豆植物を、第２の大豆植物と交雑させて、ゲノムを含む第３の大豆植物を産生する工程と、前記ゲノムにおける前記セグメント中に前記遺伝子組換えインサートの存在に関して、前記第３の植物をアッセイする工程とを含む、前記方法。
【請求項１３】
前記方法が、前記大豆植物内に除草剤耐性形質を遺伝子移入するのに使用され、前記第１の大豆植物が、配列番号１９および配列番号２０を含み、前記第３の大豆植物が、前記ゲノムにおける、配列番号１９および配列番号２０の少なくとも１つの存在についてアッセイされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
雑草を抑制する方法であって、少なくとも１つのアリールオキシアルカノアート、グリホサート、ビアラホス、ホスフィノトリシンまたはグルホシネートの除草剤をフィールドに散布する工程を含み、前記フィールドが、請求項１の植物体を含み、前記遺伝子組換えインサートが、配列番号１８の残基１２４７〜１１５０７を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記除草剤が、同時に、または／および、連続して選択および散布される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アリールオキシアルカノアート除草剤が、２，４−Ｄ；２，４−ＤＢ；ＭＣＰＡ；およびＭＣＰＢからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、少なくとも１つの更なる除草剤を前記フィールドに散布する工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの更なる除草剤が、ジカンバである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、前記除草剤の散布の１４日以内に前記フィールドに種子を播く工程を含み、前記植物体が前記種子から生長する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの更なる除草剤が、同じ生長時期内に散布される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの更なる除草剤が、前記植物体表面上に散布される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０を含む核酸分子に、少なくとも９５％の同一性を含むポリヌクレオチドを含む、安定的に形質転換された双子葉植物。
【請求項２３】
前記双子葉植物が、ダイズ（Glycine max）由来である、請求項２２に記載の安定的に形質転換された双子葉植物。
【請求項２４】
請求項１の植物体から製造される粉末またはオイル製品。
【請求項２５】
アリールオキシアルカノアート除草剤、グリホサート除草剤およびグルホシネート除草剤からなる群から選択される少なくとも１つの除草剤に抵抗性であり、前記遺伝子組換えインサートが、配列番号１８の残基１２４７〜１１５０７を含む、請求項１に記載の大豆植物体。
【請求項２６】
発現カセットを含む植物細胞であって、配列番号１および配列番号２に隣接される、または、配列番号１および配列番号２を含む遺伝子座において、１５番染色体内に遺伝子導入で挿入され、前記発現カセットが、
ａ．グリホサート除草剤耐性遺伝子を発現する第１の植物転写ユニット；
ｂ．アリールオキシアルカノアート除草剤耐性遺伝子を発現する第２の植物転写ユニット；および、
ｃ．グルホシネート除草剤耐性遺伝子を発現する第３の植物転写ユニットを含む、
前記植物細胞。
【請求項２７】
ＡＴＣＣアクセッションＮｏ．ＰＴＡ−１１９９３で寄託された種子に存在する、ｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のジャンクション配列を、前記ジャンクション配列に特異的に結合し、または、前記ジャンクション配列を増幅するプローブまたは少なくとも１つのプライマーにより検出する工程を含み、前記ジャンクション配列が、配列番号１９の残基１２４６〜１２４７または配列番号２０の残基１７６〜１７７を含む、試料中のイベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を特定するための方法。
【請求項２８】
さらに、少なくとも２つのプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を使用して、前記試料中に存在する核酸から、ＤＮＡフラグメントを増幅する工程を含み、前記第１のプライマーが、配列番号１８内の挿入配列もしくはその相補体に特異的に結合し、および、第２のプライマーが、配列番号１および配列番号２からなる群から選択されるフランキング配列内の配列に特異的に結合する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＡＴＣＣアクセッションＮｏ．ＰＴＡ−１１９９３で寄託された種子に存在する、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む大豆植物のイベント接合性を判定するための方法であって、前記イベントが、導入遺伝子構築物を含み、前記導入遺伝子構築物が、５’フランキング大豆ゲノムＤＮＡおよび３’フランキング大豆ゲノムＤＮＡに隣接され、前記方法が、
前記大豆植物からのゲノムＤＮＡのＤＮＡ試料を取得する工程；
ａ．ＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に供された場合、イベント増幅産物を産生する、前記導入遺伝子構築物に特異的に結合する第１のイベントプライマー、および、前記５’大豆ゲノムフランキングＤＮＡまたは前記３’大豆ゲノムフランキングＤＮＡに特異的に結合する第２のイベントプライマー
ｂ．ＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に供された場合、内因性大豆参照遺伝子由来の参照増幅産物を産生する参照フォワードプライマーおよび参照リバースプライマー
ｃ．前記イベント増幅産物とハイブリダイズする蛍光イベントプローブ
ｄ．前記参照増幅産物とハイブリダイズする蛍光参照プローブ
と、前記ＤＮＡ試料とを接触させることにより、接触試料を産生する工程；
蛍光ベースのエンドポイントＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲ条件に、前記接触試料を供する工程；
前記イベント増幅産物にハイブリダイズする前記蛍光イベントプローブを定量化する工程；
前記参照増幅産物にハイブリダイズする前記蛍光参照プローブを定量化する工程；
ハイブリダイズした蛍光参照プローブに対する、ハイブリダイズした蛍光イベントプローブの量を比較する工程：ならびに、
ハイブリダイズした蛍光イベントプローブとハイブリダイズした蛍光参照プローブとの蛍光比を比較することにより、ｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の接合性を判定する工程を含む、
前記方法。
【請求項３０】
前記５’フランキングＤＮＡが、配列番号１を含み、前記３’フランキングＤＮＡが、配列番号２を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のイベントプライマーが、配列番号２１に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記参照遺伝子が、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７からなる群から選択される配列を含むか、または、前記配列にハイブリダイズする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記イベントプローブが、配列番号１４を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記イベントプライマーが、配列番号１２および配列番号１３である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記イベントプライマーが、配列番号１２および配列番号１３からなり、前記参照プライマーが、配列番号１５および配列番号１６からなり、前記イベントプローブが、配列番号１４からなり、ならびに、前記参照プローブが、配列番号１７からなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のイベントプライマー、前記第２のイベントプライマー、前記参照フォワードプライマー、前記参照リバースプライマー、前記イベントプローブおよび前記参照プローブを含む、請求項２９に記載の方法を行うためのキット。
【請求項３７】
配列番号１、配列番号２、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０およびそれらの相補体からなる群から選択される配列に、少なくとも９５％の同一性を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年７月１３日に出願された米国仮出願番号第６１／５０７，４４４号および２０１１年８月５日に出願された米国仮出願番号第６１／５１５，６３４号の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。これらの出願は、全ての目的について、その全体が参照により本願明細書に組み込まれる。
【０００２】
幅広いスペクトルの除草剤である、グリホサート（Ｎ−ホスホノメチルグリシン）は、植物細胞において、必須の芳香族アミノ酸を生成するシキミ酸代謝経路における酵素である、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）を阻害する。ＥＰＳＰＳの阻害は、効果的にタンパク質合成を妨害し、これにより、影響を受けた植物細胞を枯死させる。グリホサートは、植物細胞に対して非選択的であるため、雑草および作物の両方を枯死させる。このため、作物をグリホサートに抵抗性に修飾し、所望の植物をグリホサートへの曝露に生存させ得る場合、農業生産に有用である。
【０００３】
組換えＤＮＡ技術は、グリホサート抵抗性の変異ＥＰＳＰ合成酵素を単離するのに使用されてきた。このようなグリホサート抵抗性の変異ＥＰＳＰ合成酵素は、植物に形質転換され、形質転換された植物にグリホサート抵抗性を付与し得る。例として、グリホサート耐性遺伝子が、米国特許第５，６３３，４３５号に記載のアグロバクテリウム株ＣＰ４から単離された。この参考文献および全ての引用された参考文献は、参照により本願明細書に組み込まれる。
【０００４】
他のグリホサート耐性遺伝子は、変異の導入により作製されてきた。これらは、Ｃｏｍａｉにより単離され、米国特許第５，０９４，９４５号、同第４，７６９，０６１号および同第４，５３５，０６０号に記載されている、ＡｒｏＡ遺伝子を含む。米国特許第５，３１０，６６７号に記載のように、１つの変異体が、アミノ酸部位８０と１２０との間のグリシン残基をアラニン残基に置換することにより、使用されてきた。二重変異体が、米国特許第６，２２５，１１４号および同第５，８６６，７７５号に記載されており、そこでは、上記変異に加えて、第２の変異（１７０位と２１０位との間のアラニン残基に関するスレオニン残基）が、野生型ＥＰＳＰＳ遺伝子内に導入された。
【０００５】
他の取り組みは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｘ６３３７４によりコードされるアミノ酸配列の残基１０２（スレオニンをイソロイシンに変更）および残基１０６（プロリンをセリンに変更）での変異を有する、修飾トウモロコシＥＰＳＰＳ遺伝子の導入により、グリホサート抵抗性トウモロコシの産生をもたらした。米国特許第６，５６６，５８７号および同第６，０４０，４９７号を参照のこと。
【０００６】
大豆においてグリホサートに対する抵抗性を提供するイベントとしては、例えば、大豆イベントＧＳＴ  ４０−３−２（Ｐａｄｇｅｔｔｅら、１９９５）および、大豆イベントＭＯＮ８９７８８（米国特許第７，６０８，７６１号）が挙げられる。
【０００７】
グリホサート耐性作物系の幅広い採用およびグリホサートの用途拡大は、近年、グリホサート抵抗性の蔓延および抑制しがたい雑草の原因となってきた。栽培者がグリホサート抵抗性雑草またはより抑制しがたい雑草種へのシフトに直面する区域において、栽培者は、見逃された雑草を抑制するであろう他の除草剤をタンク混合する、または、他の除草剤に変更することにより、グリホサートの除草剤スペクトルにおけるギャップを補償し得る。
【０００８】
除草剤である、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）は、グリホサートに対する耐性または抵抗性であり得る、広葉または双子葉の雑草のスペクトルの拡大を期待して、グリホサートと併せて使用され得る。６０年より長く除草剤として使用されてきた２，４−Ｄは、幅広いスペクトルの一年生、二年生および多年生の広葉雑草の、幅広いスペクトルの発芽後抑制を提供する。トウモロコシ、大豆および綿花では、２，４−Ｄ（５６０〜１１２０ｇ ａｅ／ｈａ量）が、主要な雑草、例えば、ブタクサ（Ambrosia artemisiifolia）、オオブタクサ（Ambrosia trifida）、オオモミ（Xanthium strumarium）、アカザ（Chenopodium album）、ヘリアンサス・アナス（Helianthus annuus）、アサガオ属の一種（Ipomoea sp.）、イチビ（Abutilon theophrasti）、ヒメムスカシヨモギ（Conyza Canadensis）およびエビスグサ（Senna obtusifolia）を抑制する。２，４−Ｄは、複数の主要な雑草、例えば、アメリカサナエタデ（Polygonum pensylvanicum）、ハルタデ（Polygonum persicaria）、セウヨウトゲアザミ（Cirsium arvense）、セイヨウタンポポ（Taraxacum officinale）ならびにヒユ属の一種（Amaranthus sp.）、例えば、ホソバイヌビユ（Amaranthus rudis）およびオオホナガアサゲイトウ（Amaranthus palmeri）の部分的な抑制を提供する。
【０００９】
２，４−Ｄの更なる使用に対する制限は、双子葉作物、例えば、大豆または綿花に対するその選択性が非常に低いことである。このため、２，４−Ｄは、典型的には、（一般的には、とうてい）感受性の双子葉作物に使用されない。さらに、飼料用作物における２，４−Ｄの使用は、発生し得る作物傷害の性質により制限される。グリホサートとの組み合わせにおける２，４−Ｄは、無耕作大豆および綿花の種まき前に、より強力な下火処理を提供するのに使用されてきた。しかしながら、２，４−Ｄに対するこれらの双子葉種の感受性のために、これらの下火処理は、種まき前の少なくとも１４〜３０日に行わなければならない（Ａｇｒｉｌｉａｎｃｅ、２００５）。
【００１０】
２，４−Ｄを分解するその能力に関して広範囲にわたって研究されてきた１つの生命体は、無機化経路における最初の工程を触媒する酵素（ＴｆｄＡ）をコードするｔｆｄＡ遺伝子を含む、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）である（米国特許第６，１５３，４０１号およびＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｍ１６７３０を参照のこと）。ＴｆｄＡは、α−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ反応を介した、２，４−Ｄ酸のジクロロフェノール（ＤＣＰ）への変換を触媒する（Ｓｍｅｊｋａｌら、２００１）。ＤＣＰは、２，４−Ｄと比較して、ほとんど除草剤活性を有しない。ｔｆｄＡは、通常２，４−Ｄに対して感受性の双子葉植物（例えば、綿花およびタバコ）に、２，４−Ｄ抵抗性を付与する遺伝子組換え植物に使用されてきた（Ｓｔｒｅｂｅｒら（１９８９）、Ｌｙｏｎら（１９８９）、Ｌｙｏｎ（１９９３）および米国特許第５，６０８，１４７号）。
【００１１】
２，４−Ｄを分解可能なタンパク質をコードする、数多くのｔｆｄＡ種の遺伝子が、環境から特定され、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに寄託されてきた。多くのホモログは、ＴｆｄＡに類似し（＞８５％のアミノ酸同一性）、ＴｆｄＡに対して類似の酵素特性を有する。しかしながら、ＴｆｄＡに対する明らかにより低い同一性（２５〜５０％）を有し、さらに、α−ケトグルタル酸ジオキシゲナーゼＦｅ（ＩＩ）ジオキシゲナーゼに関連する特徴的な残基を有する、数多くのホモログが存在する。このため、多岐にわたるＴｆｄＡタンパク質の基質特異性は、明らかでない。
【００１２】
ｔｆｄＡに対する低い相同性（＜３５％）を有する２，４−Ｄ分解遺伝子の一例は、
デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）由来のａａｄ−１２遺伝子である（Ｓｃｈｌｅｉｎｉｔｚら（２００４）およびＷｅｓｔｅｎｄｏｒｆら（２００２））。ａａｄ−１２遺伝子は、特定のフェノキシオーキシン除草剤、例えば、制限されず、フェノキシアルカノアート除草剤（例えば、フェノキシ酢酸除草剤、例えば、２，４−ＤおよびＭＣＰＡ；ならびに、フェノキシブタン酸除草剤、例えば、２，４−ＤＢおよびＭＣＰＢ）およびピリジルオキサアルカン酸除草剤（例えば、ピリジルオキシ酢酸除草剤、例えば、トリクロピルおよびフルロキリピル）ならびに、例えば、活性成分の酸、塩またはエステル型に対する耐性を付与するために、植物に使用されてきた、Ｓ−光学異性体特異的α−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼをコードする（例えば、国際公開第２００７／０５３４８２号）。
【００１３】
グルホシネート−アンモニウム（「グルホシネート」）は、除草剤のホスホノトリシン分類における、非浸透性で、非選択的な除草剤である。幅広い範囲の広葉およびイネ科雑草の発芽後抑制に最初に使用された、グルホシネートにおける活性成分であるＬ−ホスホノトリシンは、植物におけるアンモニア解毒に必要な酵素である、グルタミン合成酵素の不可逆的な阻害により雑草を抑制する。グルホシネート除草剤は、例えば、商品名ＩＧＮＩＴＥ（登録商標）およびＬＩＢＥＲＴＹ（登録商標）で、市販されている。
【００１４】
土壌細菌ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離された酵素である、ホスホノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）は、アセチル化により、Ｌ−ホスホノトリシンの、その不活性型への変換を触媒する。ＰＡＴを発現する遺伝子の植物最適化型は、グルホシネート除草剤に耐性を付与するために、大豆に使用されてきた。このようなグルホシネート抵抗性大豆の一例は、イベントＡ５５４７−１２７である。ごく最近、グルホシネート耐性形質との組み合わせにおける、グルホシネート除草剤の使用が、ＡＬＳ抵抗性およびグリホサート抵抗性雑草を効果的に管理するための非選択的な手段として提案されてきた。
【００１５】
植物における異種性または外来性の遺伝子の発現は、外来性遺伝子が、染色体に挿入される箇所に影響を受ける。これは、例えば、クロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）または転写制御因子（例えば、エンハンサ）の近接が、組み込み部位に近いためであり得る（Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988）。同じ型の遺伝子組換え植物（または他の生命体）における同じ遺伝子は、種々のイベントの中でも、発現レベルに広い変動を示し得る。発現の空間的または時間的パターンにおける差も存在し得る。例えば、種々の植物組織における導入遺伝子の相対発現における差は、導入された遺伝子構築物に存在する転写制御因子から予期されるパターンに対応しない場合がある。
【００１６】
このため、所定の目的に関する満足の行くレベルに、当該導入された遺伝子を発現するイベントを特定するために、多くの場合、多数のイベントが、作製およびスクリーニングされる。商業目的のために、数百から数千の種々のイベントを産生し、所望の導入遺伝子の発現レベルおよびパターンを有する、１つのイベントについて、それらのイベントをスクリーニングするのが一般的である。導入遺伝子発現の所望のレベルおよび／またはパターンを有するイベントは、従来の育種法を使用する有性外部交雑による他の遺伝的背景における導入遺伝子を遺伝子移入するのに有用である。このような交配種の子孫は、元の形質転換体の導入遺伝子発現特徴を維持する。この戦略は、現場での生長条件に十分適応した、多くの品種における信頼性のある遺伝子発現を確保するのに使用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第５，６３３，４３５号
【特許文献２】米国特許第５，０９４，９４５号
【特許文献３】米国特許第４，７６９，０６１号
【特許文献４】米国特許第４，５３５，０６０号
【特許文献５】米国特許第５，３１０，６６７号
【特許文献６】米国特許第６，２２５，１１４号
【特許文献７】米国特許第５，８６６，７７５号
【特許文献８】米国特許第６，５６６，５８７号
【特許文献９】米国特許第６，０４０，４９７号
【特許文献１０】米国特許第７，６０８，７６１号
【特許文献１１】米国特許第６，１５３，４０１号
【特許文献１２】米国特許第５，６０８，１４７号
【特許文献１３】国際公開第２００７／０５３４８２号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本主題の発明は、部分的に、雑草抵抗性を管理するための効果的な手段を提供し得る。前記手段は、除草剤耐性技術の有用性を維持するのに役立つ。本主題の発明は、雑草抑制の選択肢において、素晴らしい柔軟性および利便性を、栽培者に提供し得る。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
より具体的には、本発明は、部分的に、アクセッションＮｏ．ＰＴＡ−１１９９３で、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託された代表的な種子を有する、ｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１と命名された大豆（ダイズ（Glycine max））イベント（「イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１」）およびそれ由来の子孫に関連する。本主題の発明は、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む大豆植物体を含む（ならびに、配列番号１と配列番号２との間に遺伝子組換えインサートを含む大豆植物体を含む）。
【００２１】
本主題のイベントおよび寄託された種子に存在する遺伝子組換えインサートは、３つの除草剤耐性遺伝子：ａａｄ−１２、２ｍＥｐｓｐｓおよびｐａｔの遺伝子を含む。デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）由来のａａｄ−１２遺伝子は、アリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１２）タンパク質をコードする。タンパク質は、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸およびピリジルオキシアセテートの除草剤に対する耐性を付与する。トウモロコシから単離された修飾ＥＰＳＰＳ配列である、２ｍｅｐｓｐｓ遺伝子は、グリホサート除草剤に対する耐性を付与するタンパク質を産生する。土壌細菌ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）由来のｐａｔ遺伝子は、除草剤グルホシネートに対する耐性を付与する。
【００２２】
本発明の他の態様は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む、子孫植物体、大豆、種子ならびに／または、植物体および種子および子孫の再生可能な部分、ならびに、それらのいずれかから製造された食品および飼料製品を含む。本発明は、制限されず、花粉、胚珠、花、シュート、根および葉を含む、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の植物体の部分、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む、栄養細胞、花粉細胞および他の植物細胞の核も含む。本発明は、さらに、複数の除草剤、例えば、フェノキシオーキシンおよび／またはアリールオキシアルカノアート除草剤、グリホサートおよび／またはグルホシネートに対する耐性を有する、大豆植物体に関連する。このような大豆植物体は、種々の他の非選択的および選択的除草剤、例えば、制限されず、ジカンバ、イミダゾリノンおよびＨＰＰＤ除草剤に対する耐性を付与する遺伝子と積み重ねられてもよい。本発明は、さらに、新規な遺伝子構成のイベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１、および、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む大豆植物体の農業生産力の態様を含む。
【００２３】
この発明は、部分的に、植物育種および除草剤耐性植物に関連する。この発明は、大豆細胞のゲノム内の特定のサイトに挿入された、本願明細書に記載のポリヌクレオチドを含む大豆植物における、新規な形質転換イベントを含む。
【００２４】
一部の実施形態では、イベント／ポリヌクレオチドは、他の形質、例えば、農業形質および／または害虫阻害タンパク質等と積み重ねられ得る。ただし、本主題の発明は、本願明細書に記載の１つのイベントを有する植物体を含む。
【００２５】
更なる形質は、植物ゲノム内、または、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１と同じ遺伝子座内に、例えば、植物育種、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む遺伝子導入植物の再形質転換、または、相同的組換えを介した標的組み込みによる新たな形質の付加により、積み重ねられてもよい。
【００２６】
他の実施形態は、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の遺伝子組換えインサートおよび／またはフランキング配列の一部または全部の切除を含む。切除に基づいて、別のインサートおよび／または更なるインサートが、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の特定の染色体サイトに、標的され得る。例示のインサートが、この方法において、主題の大豆イベントの例示となるインサートと交換され得るか、または、更なるインサートが積み重ねられ得る。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、１５番染色体上に位置する大豆染色体標的サイトを包含する。一部の実施形態では、標的サイトは、異種性核酸を含む。一部の実施形態では、大豆染色体標的サイトは、配列番号１および配列番号２で説明されたフランキング配列間に位置する。
【００２８】
一実施形態では、本発明は、１５番染色体上の位置に異種性核酸を挿入する工程を含む、遺伝子導入大豆植物を製造する方法を包含する。別の実施形態では、異種性核酸は、１５番染色体上の、本願明細書に記載の種々の例示したポリヌクレオチドセグメントの近くまたは同セグメント間に挿入される。
【００２９】
さらに、本主題の発明は、（例えば、大豆の）試料における、主題のイベントの存在を検出するためのアッセイを提供する。アッセイは、大豆ゲノム内に挿入される組換え構築物のＤＮＡ配列、および、挿入サイトに隣接するゲノム配列に基づき得る。アッセイを行うのに有用なキットおよび条件も、提供される。
【００３０】
このため、本主題の発明は、部分的に、（遺伝子組換え大豆株における、）例示したインサートおよびそのボーダー領域全体のＤＮＡ配列のクローニングおよび分析に関連する。これらの配列は、他に存在しない。これらのインサートおよびボーダー（およびジャンクション）配列に基づいて、イベント特異的プライマーが生成されることができ、これを生成させた。ＰＣＲ分析は、これらのイベントが、これらのイベント特異的プライマーセットにより産生されたＰＣＲ増幅産物の分析により特定され得ることを説明した。したがって、これらおよび他の関連する手順は、本主題の発明のイベントを含む大豆株を独特に特定するのに使用され得る。
【００３１】
本主題の発明は、部分的に、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の検出のための、エンドポイントＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲアッセイにも関連する。一部の実施形態は、接合性分析が可能なアッセイを対象にする。本主題の発明は、さらに、部分的に、接合性を判定するのに使用するための、ＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫ２８６２９２．１）参照遺伝子の使用に関連する。これらおよび他の関連する手順は、独特に、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の接合性を特定し、イベントを含む大豆株を育種するのに使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、ｐＤＡＢ８２６４のプラスミドマップである。
【図２】図２は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の５’および３’ボーダー配列を確認するためのプライマー配置を説明する模式図である。
【図３】図３は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の形質転換されていないゲノムＤＮＡを確認するためのプライマー配置を説明する模式図である。
【図４】図４は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のＴＡＱＭＡＮ  ＰＣＲアッセイ検出に関する、プライマー配置を説明する模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
配列の簡単な説明
配列番号１は、本主題の大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１に関する、５’フランキングボーダー配列を提供する。
配列番号２は、本主題の大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１に関する、３’フランキングボーダー配列を提供する。
配列番号３は、プライマー４２３２＿ＷＦ１を提供する。
配列番号４は、プライマー４２３２＿ＷＦ３を提供する。
配列番号５は、プライマー４２３２＿ＷＦ４を提供する。
配列番号６は、プライマー４２３２＿ＷＲ１を提供する。
配列番号７は、プライマー４２３２＿ＷＲ２を提供する。
配列番号８は、プライマー４２３２＿ＷＲ３を提供する。
配列番号９は、プライマー４２３２＿ＷＲ４を提供する。
配列番号１０は、プライマーＥＤ＿ｖ１＿Ｃ１を提供する。
配列番号１１は、プライマーＰＡＴ＿１１を提供する。
配列番号１２は、プライマー４２３２＿３’Ｆを提供する。
配列番号１３は、プライマー４２３２＿３’Ｒを提供する。
配列番号１４は、プローブ４２３２＿３’Ｐを提供する。
配列番号１５は、プライマーＧＭＳ１１６Ｆを提供する。
配列番号１６は、プライマーＧＭＳ１１６Ｒを提供する。
配列番号１７は、プローブＧＭＳ１１６Ｐプローブを提供する。
配列番号１８は、ｐＤＡＢ８２６４  Ｔ鎖インサートおよび部分的な５’および３’ゲノムフランキング配列を提供する。
配列番号１９は、本主題の大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１に関する、５’ゲノム〜インサート配列（そのジャンクションを含む）を提供する。
配列番号２０は、本主題の大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１に関する、３’インサート〜植物ジャンクションを提供する。
配列番号２１は、プラスミドｐＤＡＢ８２６４に関する配列を提供する。
【００３４】
本願明細書に記載の本発明は、大豆細胞のゲノム内の特定の遺伝子座に挿入された、複数の除草剤耐性遺伝子の発現用のカセットを含む、大豆植物体（大豆）の新規な形質転換イベントを含む。具体的には、ｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１イベントを含む、新規な大豆株が開発された。この遺伝子組換えイベントは、複数の除草剤、例えば、フェノキシオーキシンおよび／またはアリールオキシアルカノアート除草剤、グリホサートおよび／またはグルホシネートに対する耐性を提供する。複数の除草剤に対する耐性は、栽培者が、その個々の雑草群を最も良好に管理するために、除草剤の最適な組み合わせを選択することを可能にする。
【００３５】
例示した、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む遺伝子組換えインサートは、３つの異なる除草剤耐性遺伝子：（１）合成ａａｄ−１２遺伝子；（２）野生型のＥＰＳＰＳポリペプチドと比較して、アミノ酸残基１０２（スレオニンからイソロイシン）および１０６（プロリンからセリン）での変異を含むタンパク質をコードし、グリホサート除草剤に対する抵抗性または耐性を付与する、トウモロコシ由来の修飾ＥＰＳＰＳ配列；ならびに、（３）グルホシネート除草剤に対する耐性または抵抗性を付与するｐａｔ遺伝子の発現用の遺伝要素を含む。ａａｄ−１２遺伝子は、デルフチア・アシドボランス（Delftia acidovorans）由来であり、α−ケトグルタル酸部分、例えば、フェノキシアルカノアート除草剤（例えば、フェノキシ酢酸除草剤、例えば、２，４−ＤおよびＭＣＰＡ；フェノキシブタン酸除草剤、例えば、２，４−ＤＢおよびＭＣＰＢ）およびピリジルオキシアルカン酸除草剤（例えば、ピリジルオキシ酢酸除草剤、例えば、トリクロピルおよびフルロキリピル）ならびに、例えば、活性成分の酸、塩またはエステル型を有する除草剤を非活性化可能な、アリールオキシアルカノアートジオキシゲナーゼ（ＡＡＤ−１２）タンパク質酵素をコードする。
【００３６】
本主題の発明は、試料中の本主題のイベントの存在を検出するためのアッセイも提供する。本主題の発明の態様は、本願明細書で例示され、または、示唆された、任意の診断核酸分子、具体的には、本主題のフランキング配列の全体または部分に基づく分子の、設計および／または製造をする方法を含む。
【００３７】
この発明は、部分的に、植物育種および除草剤耐性植物に関連する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、他の形質（例えば、他の除草剤耐性遺伝子および／または、害虫阻害性タンパク質もしくは阻害性ＲＮＡ配列等をコードする遺伝子）と「積み重ね」られ得る。ただし、本主題の発明は、本願明細書に記載の１つのイベントを含む植物体も含む。
【００３８】
より具体的には、本主題の発明は、部分的に、遺伝子組換え大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１、これらのイベントを含む植物株、ならびに、このインサートおよび／またはそのボーダー領域のＤＮＡ配列のクローニングおよび分析に関連する。本主題の発明の植物株は、本願明細書に開示および示唆の配列を使用して検出され得る。
【００３９】
一部の実施形態では、本願明細書に例示または記載のポリヌクレオチドセグメント（例えば、配列番号１および配列番号２、ならびに／または、例えば、図２に示される、それらの間のインサート等）が、切除され、続けて、更なるポリヌクレオチド配列で再標的化され得る。
【００４０】
一部の実施形態では、この発明は、除草剤耐性大豆株およびその特定に関連する。本主題の発明は、部分的に、有性交雑の子孫が、当該イベントを含むかどうかを判定するために、本主題のイベントの存在を検出することに関連する。加えて、イベントを検出するための方法は、例えば、組換え作物等に由来の食品の市場導入前に必要な規制を遵守し、標識するために含まれ、有用である。任意の周知の核酸検出法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または核酸プローブを使用するＤＮＡハイブリダイゼーションにより、本主題のイベントの存在を検出することが可能である。イベント特異的ＰＣＲアッセイは、本願明細書に記載される（例えば、別の例に関して、Windels et al.(Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459462, 1999)を参照のこと)。これらの例の一部は、インサートとフランキングＤＮＡとの間のジャンクションにまたがるプライマーセットを使用することに関連する。
【００４１】
本願明細書では、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１、ならびに、安定性のためのその選択および特徴付け、ならびに、何世代にもわたって植物全体および分子レベルでの発現が例示されている。イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の両フランキング配列は、本願明細書において、配列番号１および配列番号２として、シークエンスされ、記載されている。イベント特異的アッセイが開発された。イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１は、同種交雑およびハイブリッドの大豆株において、フェノキシオーキシン、グリホサートおよびグルホシネートの除草剤に対する耐性を付与されるであろう、エリートな品種に遺伝子移入され得る。
【００４２】
本主題のＥＰＳＰＳ遺伝子は、変異５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）をコードする。野生型のＥＰＳＰＳ遺伝子は、最初は、トウモロコシ（Zea mays）から単離され、その配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｘ６３３７４で寄託された。米国特許第６，５６６，５８７号（具体的には、その配列番号３）も参照のこと。
【００４３】
植物において異種性遺伝子の高い発現を得るために、遺伝子が植物細胞においてより効率的に発現されるように、遺伝子を再設計するのが好ましい場合がある。野生型植物のＥＰＳＰＳ核酸配列の修飾は、植物細胞において発現された際に、このような抵抗性を提供し得る。‘５８７特許に記載のように、ＥＰＳＰＳポリペプチドを野生型ポリペプチドと比較した場合、タンパク質における、残基１０２でのスレオニンをイソロイシンに置換、および、１０６位でのプロリンをセリンに置換する修飾は、その結果、本主題のインサートに使用される、二重変異ＥＰＳＰＳポリペプチド（２ｍＥＰＳＰＳ）である。植物細胞において発現された場合、グリホサートに対する耐性を提供する。または、「２ｍｅｐｓｐｓ遺伝子」またはＤＭＭＧとも呼ばれる、本主題のＥＰＳＰＳ遺伝子は、双子葉植物および単子葉植物の両方、ならびに、具体的には、大豆における発現を改善するために最適化され得る。コドン使用頻度は、タンパク質が、単子葉植物および双子葉植物の両方の使用頻度に向けてバイアスを有するコドンによりコードされるように、好ましいヘミコット（hemicot）コドン使用頻度に基づいて選択、すなわち再設計され得る。有害な配列および余分な制限サイトは、２ｍｅｐｓｐｓコーディング配列の転写／翻訳の効率を向上し、ＤＮＡ操作工程を容易にするために除去され得る。本主題の単子葉遺伝子のヘミコット最適化されたバージョンは、発明の名称を「OPTIMIZED EXPRESSION OF GLYPHOSATE RESISTANCE ENCODING NUCLEIC ACID MOLECULES IN PLANT CELLS」とする、２０１０年１２月３日に出願された、米国仮出願（番号第６１／４１９，７０３号）に、より詳細に説明されている。
【００４４】
本願明細書において先に参照したように、植物ゲノムへの導入遺伝子の導入および組み込みは、一部の偶発的な事象を含む（このため、所定の挿入に関して、「イベント」の名称で表される）。すなわち、数多くの形質転換技術、例えば、アグロバクテリウム形質転換、「遺伝子銃」およびＷＨＩＳＫＥＲＳに関して、ゲノムにおいて、導入遺伝子が挿入されるであろう箇所を予測できない。このため、インサートの両側における、フランキング植物ゲノムＤＮＡを特定することは、所定の挿入イベントを有する植物を特定するのに、重要であり得る。例えば、ＰＣＲプライマーは、インサートおよび宿主ゲノムのジャンクション領域にまたがる、ＰＣＲ増幅産物を産生するように設計され得る。このＰＣＲ増幅産物は、挿入イベントの固有または区別できる種類を特定するのに使用され得る。
【００４５】
植物細胞のゲノム内に、インサートを導入する過程中に、インサートおよび／またはゲノムフランキング配列に、一部の欠損または他の変化が起こることは、珍しくない。このため、本願明細書で提供されるプラスミド配列の関連するセグメントは、一部の小さな変異を含んでもよい。同じことは、本願明細書で提供されるフランキング配列にも当てはまる。このため、一部の範囲における、本主題のフランキングおよび／またはインサートの配列との同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物体は、本主題の発明の範囲内である。本発明の配列についての同一性は、本願明細書に例示または記載の配列と、少なくとも６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、およびより好ましくは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であり得る。本願明細書で提供される、ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション条件は、本主題の発明のこのような植物体およびポリヌクレオチド配列を規定するのにも使用され得る。完全なインサート配列に加えて、フランキング配列を含む配列は、寄託された種子を参照して、確認され得る。
【００４６】
「イベント」が、最初の偶発的な事象である場合、この開示の一環として、イベントを含む大豆株の少なくとも２，５００個の種子が寄託され、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０により、制限されることなく（ただし、特許権の対象である）、公衆に利用可能にされた。寄託は、ＡＣＴＴ寄託Ｎｏ．ＰＴＡ−１１９９３として指定されている。ダイズ（Glycine max）の種子（大豆種子Glycine max L.：ｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１）、１００パック（１パックあたりに２５個の種子）が、２０１１年７月１１日に寄託された。寄託は、２０１１年７月２６日に検証され、その日に種子は、生存していた。この寄託は、特許手続上の種子の寄託に関するブダペスト条約の条件に基づいてなされ、同条約下で維持されるであろう。寄託は、公衆の預託機関であるＡＴＣＣの預託機関において、３０年の期間、または最新の要求後５年間、または特許の有効期間のいずれか長い方の間、制限されずに維持され、その期間中に生育不能となる場合には、置き替えられるであろう。
【００４７】
寄託された種子は、本主題の発明の一部である。明らかに、大豆植物体は、これらの種子から生長し得る。このような植物体は、本主題の発明の一部である。本主題の発明は、これらの植物体およびその子孫を検出するのに有用な、これらの大豆植物体に含まれるＤＮＡ配列にも関連する。本主題の発明の検出方法およびキットは、検査の最終目的に応じて、これらのイベントの任意の１つ、２つまたは３つ全てさえも特定することを対象とし得る。
【００４８】
本願明細書では、定義および例示が、本発明を説明するのに役立ち、本発明の実施に当業者を導くために提供される。特に断らない限り、用語は、関連する分野における当業者による従来からの使用に基づいて理解されるものである。３７  ＣＦＲ  １．８２２で説明されるＤＮＡ塩基に関する用語体系が使用される。
【００４９】
本願明細書で使用する時、「子孫」の用語は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む親植物の任意の世代の子孫を提供する。
【００５０】
遺伝子組換え「イベント」は、異種性ＤＮＡ、すなわち、当該導入遺伝子を含む核酸構築物による植物細胞の形質転換、植物のゲノム中の導入遺伝子の挿入に起因する植物群の再生、および、特定のゲノム位置への挿入により特徴付けられる特定の植物体の選択により産生される。「イベント」の用語は、異種性ＤＮＡを含む、元の形質転換体および形質転換体の子孫を意味する。「イベント」の用語は、ゲノム／導入遺伝子ＤＮＡを含む、形質転換体と別の品種との間での有性外部交雑により産生される子孫も意味する。反復親への戻し交雑後でも、形質転換された親からの挿入された導入遺伝子ＤＮＡおよびフランキングゲノムＤＮＡ（ゲノム／導入遺伝子ＤＮＡ）が、交雑の子孫において、同じ染色体位置に存在する。「イベント」の用語は、挿入されたＤＮＡを含む一方の親株（例えば、元の形質転換体および自系接合に起因する子孫）と、挿入されたＤＮＡを含まない親株との有性交雑の結果として、当該導入遺伝子を含む、挿入されたＤＮＡを受け取る子孫に伝達すると期待されるであろう、挿入されたＤＮＡおよび、挿入されたＤＮＡにすぐ隣接するフランキングゲノム配列を含む、元の形質転換体およびその子孫も意味する。
【００５１】
「ジャンクション配列」は、ゲノムに挿入されたＤＮＡが、挿入点に隣接する大豆の本来のゲノムに結合される位置にわたる。植物ゲノム材料における、一方または他方のジャンクション配列の特定または検出は、イベントに関して診断するのに十分である。本願明細書に記載の大豆イベントおよび類似の長さのフランキングＤＮＡにおける挿入にわたるＤＮＡ配列が含まれる。このような診断配列の具体的な例は、本願明細書において提供されるが、挿入のジャンクションまたは挿入およびゲノム配列のジャンクションと重複する他の配列も、診断に関するものであり、本主題の発明に基づいて使用され得る。
【００５２】
本主題の発明は、部分的に、このようなフランキング、ジャンクションおよびインサート配列を使用するイベント特定に関連する。関連するＰＣＲプライマーおよび増幅産物は、本発明に含まれる。本主題の発明に基づいて、挿入されたＤＮＡおよびそのボーダーにわたる、増幅産物を使用するＰＣＲ分析法は、本主題の独占所有権のある遺伝子組換え大豆株由来の、商品化された遺伝子組換え大豆品種または株を検出または特定するのに使用され得る。
【００５３】
バイナリープラスミドである、ｐＤＡＢ８２６４（配列番号２１）は、図１に説明される遺伝要素を含む。下記遺伝要素（Ｔ鎖ボーダー配列は、含まれない）は、ｐＤＡＢ８２６４のＴ鎖領域内に含まれる。表１に、遺伝要素の残基番号が、本願明細書に開示の配列番号２１に関して提供される。
【表１】
2014523251.tif 000003
2014523251.tif 000004
【００５４】
配列番号１９および２０は、それぞれ、以下により詳細に記載される、インサート配列の５’および３’部分を含む、５’および３’のフランキング配列である。したがって、配列番号１９および２０は、インサートおよびゲノムＤＮＡの、５’および３’「ジャンクション」または「トランジション」配列を含む。配列番号１９に関して、残基１〜１２４６は、５’ゲノムフランキング配列であり、残基１２４７〜１５５０は、インサートの５’末端の残基である。配列番号２０に関して、残基１〜１７６は、インサートの３’末端の残基であり、残基１７７〜６８０は、３’ゲノムフランキング配列である。このため、インサートの５’末端に関するジャンクション配列またはトランジションは、配列番号１９の残基１２４６〜１２４７に存在する。このため、インサートの３’末端に関するジャンクション配列またはトランジションは、配列番号２０の残基１７６〜１７７に存在する。本主題の発明のポリヌクレオチドは、例えば、５、１０、２０、５０、１００、１５０もしくは２００個、または、それ以上の塩基、および、ジャンクション配列の両側における、その間の任意の増分を含むものを含む。このため、ジャンクション配列にわたるプライマーは、例えば、フランキング配列とハイブリダイズするであろう５〜１０個の塩基、および、インサート配列とハイブリダイズするであろう５〜１０個の塩基を含み得る。プローブおよび増幅産物は、同様に設計され得るが、多くの場合、プライマーより長いであろう。
【００５５】
本主題の配列（例えば、フランキング配列）は、固有である。これらのインサートおよびボーダー配列に基づいて、イベント特異的プライマーが作製された。ＰＣＲ分析は、これらの大豆株が、これらのイベント特異的プライマーセットにより産生されたＰＣＲ増幅産物の分析により、種々の大豆遺伝子型において特定され得ることを説明した。このため、これらおよび他の関連する手順は、独特に、これらの大豆株を特定するのに使用され得る。本願明細書で特定された配列は、固有である。
【００５６】
本主題の発明における検出技術は、植物育種との併用で、子孫において、当該１またはそれ以上の更なる形質を付与するための取り組みにおいて、当該イベントを含む親植物が別の植物株と交雑された後に、子孫植物が所定のイベントを含むことを判定するのに特に有用である。これらのＰＣＲ分析法は、特に商品化された遺伝子組換え大豆種子に関する、大豆育種計画および品質管理に役立つ。これらの遺伝子組換え大豆株に関するＰＣＲ検出キットも、すぐに製造され、使用され得る。これも、製品登録および製品管理に役立ち得る。
【００５７】
さらに、フランキング大豆／ゲノム配列は、各インサートのゲノム位置を具体的に特定するのに使用され得る。この情報は、各イベントに特異的な分子マーカー系を製造するのに使用され得る。これらは、促進された育種戦略および結合データを確立するのに使用され得る。
【００５８】
さらに、フランキング配列情報は、導入遺伝子組み込み過程、ゲノム組み込みサイト特性、イベントの分類、導入遺伝子およびそのフランキング配列の安定性ならびに、（特に、遺伝子サイレンシング、導入遺伝子のメチル化パターン、位置効果および潜在的な発現関連因子、例えば、ＭＡＲＳ［マトリクス結合領域］等に関連する）遺伝子発現を、研究および特徴付けするのに使用され得る。
【００５９】
本主題の開示を踏まえると、本主題の発明が、２０１１年７月１１日に本主題のイベントに関して寄託され、ＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．ＰＴＡ−１１９９３で利用可能な種子を含むことが明らかなはずである。本主題の発明は、この日にこのアクセッション番号でＡＴＣＣに寄託された種子から生長した除草剤耐性大豆植物体も含む。本主題の発明は、さらに、植物体の一部、例えば、葉、組織試料、植物体に実った種子、花粉、粉末（大豆粉）等（それらは、配列番号１および配列番号２に隣接する、遺伝子組換えインサートを含む）を含む。本主題の発明は、さらに、本主題の植物のいずれか由来の非全能細胞（例えば、上記列記したこのような植物体の部分由来の細胞）を含む。
【００６０】
さらに、本主題の発明は、寄託された種子から生長した植物体、好ましくは、除草剤抵抗性大豆植物体の子孫および／または子孫植物体を含む。植物体は、本願明細書に記載の、検出可能な野生型ゲノムＤＮＡ／インサートＤＮＡジャンクション配列を含むゲノムを有する。本願明細書で使用する時、「大豆」の用語は、ダイズ（Glycine max）を意味し、大豆植物として栽培され得る、その全ての品種を含む。
【００６１】
本発明は、さらに、少なくとも一方の親として本主題の発明の植物を使用して交雑を行う方法を含む。例えば、本主題の発明は、本願明細書で例示した植物の一方または両方のいずれかの親を有するＦ１ハイブリッド植物を含む。本主題の発明のこのようなＦ１ハイブリッドに実った種子も、本主題の発明の範囲内である。この発明は、例示した植物と、異なる（例えば、自殖親）植物とを交雑し、得られたハイブリッド種子を収穫することにより、Ｆ１ハイブリッド種子を製造するための方法を含む。本主題の発明は、雌親または雄親のいずれかである、例示となる植物体を含む。得られた植物体の特徴は、親植物の注意深い考察により改善され得る。
【００６２】
本主題の発明の除草剤耐性大豆植物体は、まず、本願明細書で言及した株のいずれか１つの種子から生長した大豆植物体からなる第１の親大豆植物体と、第２の親大豆植物体とを有性交雑することにより、複数の第１の子孫植物体を産生し；ついで、除草剤に抵抗性である（または、本主題の発明の少なくとも１つのイベントを有する）、第１の子孫植物体を選択し；第１の子孫植物体を自殖させることにより、複数の第２の子孫植物体を産生し；および、ついで、第２の子孫植物体から、除草剤に対する抵抗性である（または、本主題の発明の少なくとも１つのイベントを有する）植物体を選択することにより育種し得る。これらの工程は、さらに、第１の子孫植物体または第２の子孫植物体の第２の親大豆植物体または第３の親植物体への戻し交雑を含み得る。ついで、本主題の発明の大豆種子を含む大豆作物またはその子孫は、植えられ得る。
【００６３】
２つの異なる遺伝子組換え植物も、２つの、独立して分離している、追加された外因性遺伝子を含む子孫を産生するために、交配させられ得ることも理解される。適切な子孫の自殖は、両方の追加された外因性遺伝子に関してホモ接合性である植物を産生し得る。栄養繁殖の場合、親植物への戻し交雑および、非遺伝子組換え植物との外部交雑も検討される。一般的に、異なる形質および作物に使用される他の育種法は、当分野において公知である。戻し交雑育種は、反復親である、望ましいホモ接合性の栽培品種または同系交配株において、単純に遺伝的で、非常に遺伝性の形質に関する遺伝子を移動させるのに使用されてきた。移動させる形質の供給源は、ドナー親と呼ばれる。得られた植物は、反復親（例えば、栽培品種）の特性、および、ドナー親から移動された望ましい形質を有することが期待される。最初の交雑後、ドナー親の表現型を有する個体が選択され、反復親に対して、繰り返し交雑（戻し交雑）される。得られた植物は、反復親（例えば、栽培品種）の特性、および、ドナー親から移動された望ましい形質を有することが期待される。
【００６４】
本発明のＤＮＡ分子は、マーカー支援育種（ＭＡＢ）法における分子マーカーとして使用され得る。本発明のＤＮＡ分子は、当分野において公知のように、遺伝的に結合された農学的に有用な形質を特定する方法に使用され得る（例えば、ＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー、ＲＡＰＤマーカー、ＳＮＰ、ＳＳＲ）。除草剤抵抗性形質は、本主題の発明の大豆植物との交雑の子孫（または、その子孫、および、任意の他の大豆栽培品種または品種）において、ＭＡＢ法を使用して追跡され得る。ＤＮＡ分子は、この形質に関するマーカーであり、当分野において周知のＭＡＢ法は、本主題の発明の少なくとも１つの大豆株、またはその子孫が、親または原種である、大豆植物体における除草剤抵抗性形質を追跡するのに使用され得る。本発明の方法は、本主題のイベントを有する任意の大豆品種を特定するのに使用され得る。
【００６５】
本主題の方法は、除草剤耐性大豆植物体を製造する方法であって、前記方法は、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を、大豆栽培品種に遺伝子移入する工程を含む。より具体的には、本発明の方法は、本主題の発明の２つの植物、または、本主題の発明の１つの植物と任意の他の植物とを交雑させる工程を含む。好ましい方法は、さらに、本主題の発明に基づいて検出可能なイベントに関して、子孫を分析することにより、交雑の子孫を選択する工程を含む。例えば、本主題の発明は、他の望ましい形質、例えば、農学的特質、例えば、種々の実施例において本願明細書で検証されたものを含む植物による育種サイクルにより、本主題のイベントを追跡するのに使用され得る。本主題のイベントおよび所望の形質を含む植物は、例えば、育種の更なるラウンドにおいて、検出され、特定され、選択され、および素早く使用され得る。本主題のイベント／形質も、害虫抵抗性形質および／または更なる除草剤耐性形質と、育種により組み合わせられ、本主題の発明に基づいて追跡され得る。後者の一実施形態は、除草剤であるジカンバに対する抵抗性をコードする遺伝子と組み合わせられた、本主題のイベントを含む植物である。
【００６６】
このため、本主題の発明は、例えば、グリホサート抵抗性（例えば、抵抗性植物または細菌のグリホサートオキシダーゼ（ＧＯＸ））、グリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）をコードする更なる形質、グルホシネート抵抗性に関する更なる形質（例えば、ビアラホス抵抗性（ｂａｒ））、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）阻害性除草剤抵抗性（例えば、イミダゾリノン［例えば、イマゼタピル］、スルホニル尿素、トリアゾロピリミジンスルホナミド、ピリミジニルチオベンゾアート、および他の化学物質［Ｃｓｒ１、ＳｕｒＡ等］）を付与する形質、ブロモキシニル抵抗性形質（例えば、Ｂｘｎ）、ジカンバ除草剤に対する抵抗性に関する形質（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１３５８７９号を参照のこと）、ＨＰＰＤ（４−ヒドロキシルフェニル−ピルビン酸−ジオキシゲナーゼ）酵素の阻害剤に対する抵抗性に関する形質、フィトエン脱飽和酵素（ＰＤＳ）の阻害剤に対する抵抗性に関する形質、光化学系ＩＩ阻害性除草剤（例えば、ｐｓｂＡ）に対する抵抗性に関する形質、光化学系Ｉ阻害性除草剤に対する抵抗性に関する形質、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼＩＸ（ＰＰＯ）阻害性除草剤（例えば、ＰＰＯ−１）に対する抵抗性に関する形質、フェニル尿素除草剤（例えば、ＣＹＰ７６Ｂ１）対する抵抗性に関する形質と組み合わせられ得る。１つ以上のこのような形質は、本主題の発明と組み合わせられて、雑草のシフトおよび／または複数分類の除草剤に対する抵抗性を効果的に抑制、遅延および／または予防する能力を提供し得る。
【００６７】
本主題の発明に使用されるａａｄ−１２遺伝子が、フェノキシ酢酸オーキシン除草剤（例えば、２，４−ＤＢ、ＭＣＰＢ等）に変換される化合物に対する抵抗性も提供することが、当業者に理解されるであろう。２，４−ＤＢ除草剤に存在する酪酸部分は、β−酸化により、植物毒性の２，４−ジクロロフェノキシ酢酸に変換される。同様に、ＭＣＰＢは、β−酸化により、植物毒性のＭＣＰＡに変換される。酪酸除草剤は、それ自体は非除草性であるが、感受性の植物内でのβ−酸化により、その各酸型に変換されて、植物毒性の酢酸型の除草剤を産生する。急速なβ酸化ができない植物は、酪酸除草剤により害されない。しかしながら、急速なβ酸化が可能で、酪酸除草剤を酢酸型に変換し得る植物は、引き続いて、ＡＡＤ−１２により保護される。
【００６８】
除草剤を散布する方法は、当分野において周知である。このような散布は、２またはそれ以上の除草剤のタンク混合を含み得る。本主題の発明に基づいて使用するのに好ましい除草剤は、グリホサート、グルホシネートおよびフェノキシオーキシン除草剤（例えば、２，４−Ｄ；２，４−ＤＢ；ＭＣＰＡ；ＭＣＰＢ）の組み合わせである。他の好ましい組み合わせとしては、グリホサートと２，４−Ｄまたはグルホシネートと２，４−Ｄの混合物が挙げられる。これら３種類の除草剤は、本主題の開示の利益を有する当業者に明らかであろう、有利な組み合わせに使用され得る。１またはそれ以上の本主題の除草剤は、本主題の発明の種子を播く前に、フィールド／区画に散布され得る。このような散布は、例えば、本主題の発明の種子を播く１４日以内であり得る。１またはそれ以上の本主題の除草剤は、種まき後発芽前にも散布され得る。１またはそれ以上の本主題の除草剤は、（雑草を抑制するために）地面、または、雑草の表面上、および／または、本主題の発明の遺伝子組換え植物の表面上にも散布され得る。本主題の３つの除草剤は、例えば、１つの除草剤に対して耐性であるが、別のものには耐性であり得ない雑草を抑制または予防するのに、交代され、または、組み合わせで使用され得る。本主題の３種類の除草剤に関する種々の散布時間が、当分野において公知であろうように、種々の方法で使用され得る。
【００６９】
さらに、本主題のイベントは、１またはそれ以上の更なる除草剤耐性形質、１またはそれ以上の更なる入力（例えば、害虫抵抗性、真菌抵抗性もしくはストレス耐性等）または出力（例えば、収量向上、オイルプロファイルの改善、繊維品質の改善等）の形質と、遺伝子組換えおよび非遺伝子組換えの両方で、積み重ねられ得る。このため、本主題の発明は、かなり多くの農学的有害生物を柔軟に、コスト効率よく抑制する能力を有する、改善された作物品質の完全な農学的パッケージを提供するのに使用され得る。
【００７０】
相同組換えにより、植物細胞の特定の染色体サイト内に、ポリヌクレオチド配列を組み込む方法は、当分野で説明されてきた。例えば、米国特許出願公開第２００９／０１１１１８８号に記載のサイト特異的組み込みは、染色体標的へのドナーポリヌクレオチド配列の導入を媒介する、リコンビナーゼまたはインテグラーゼの使用を説明している。さらに、国際公開第２００８／０２１２０７号Ａ１には、ゲノムの特定の位置に、１またはそれ以上のポリヌクレオチド配列を組み込むための、ジンクフィンガー媒介性の相同組換えが記載されている。リコンビナーゼ、例えば、米国特許第６，７２０，４７５号に記載のＦＬＰ／ＦＲＴ、または、米国特許第５，６５８，７７２号に記載のＣＲＥ／ＬＯＸの使用は、特定の染色体サイト内に、ポリヌクレオチド配列を組み込むのに使用され得る。最後に、特定の染色体位置内のドナーポリヌクレオチドを標的にするためのメガヌクレアーゼの使用が、Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060に記載された。
【００７１】
植物細胞内へのサイト特異的組み込みに関する種々の方法は、一般的に公知であり、適用可能である（Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159）。さらに、複数の原核生物および低級の真核生物において、特定されてきたサイト特異的組換え系が、植物における使用に適用され得る。このような系としては、例えば、制限されず、酵母チゴサッカロミセス・ルーキシィ（Zygosaccharomyces rouxii）のｐＳＲ１プラスミド由来のＲ／ＲＳリコンビナーゼ系（Araki et al.(1985)J. Mol. Biol. 182:191-203）および、ファージＭｕのＧｉｎ／ｇｉｘ系（Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230:170-176）が挙げられる。
【００７２】
本発明の一部の実施形態では、新たな導入遺伝子を、既存の遺伝子組換えイベントに近接して組み込むか、または、積み重ねるのが望ましくあり得る。遺伝子組換えイベントは、固有の特徴、例えば、単独挿入サイト、正常なメンデル分離および安定した発現ならびに、優れた組み合わせの効果、例えば、複数の環境ロケーションにおける、および、同ロケーションにわたる、除草剤耐性および農業生産力に基づいて選択された好ましいゲノム遺伝子座を考慮され得る。新たに組み込まれた導入遺伝子は、既存の形質転換体における導入遺伝子の発現特徴を維持すべきである。さらに、新たに組み込まれたイベントの検出および確認のためのアッセイの開発が、ゲノムフランキング配列および新たに組み込まれたイベント染色体位置が既に特定されている場合、克服され得る。最後に、既存の導入遺伝子に結合される、特定の染色体位置への新たな導入遺伝子の組み込みは、従来の育種法を使用する有性外部交雑による、他の遺伝的背景への導入遺伝子の遺伝子移入を促進するであろう。
【００７３】
本発明の一部の実施形態では、遺伝子組換えイベント由来のポリヌクレオチド配列を切除するのが望ましくあり得る。例えば、米国仮特許出願第６１／２９７，６２８号に記載の導入遺伝子の切除は、染色体に組み込まれた遺伝子組換えイベント由来の遺伝子発現カセットからなる、ポリヌクレオチド配列を除去するための、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用を説明する。除去されるポリヌクレオチド配列は、選択的マーカーであり得る。ポリヌクレオチド配列の切除および除去に基づいて、修飾された遺伝子組換えイベントは、ポリヌクレオチド配列の挿入により、再標的され得る。ポリヌクレオチド配列の切除および、修飾された遺伝子組換えイベントの後の再標的は、選択的マーカーの再利用、または、特定の遺伝子の発現の原因となる植物トランスクリプトームへの意図しない変化を克服する能力等の利点を提供する。
【００７４】
本主題の発明は、本願明細書において、異種性核酸の挿入に優れた、大豆ゲノム中の１５番染色体上の特異的サイトを開示する。１５番染色体上の挿入／標的サイトの位置を特定および／または標的するのに有用でもあり得る、５’フランキング配列および３’フランキング配列も開示される。このため、本主題の発明は、この予め確立された標的サイト、または、この標的サイト付近に当該異種性核酸を導入する方法を提供する。本主題の発明は、開示の標的サイトまたはこのようなサイトの概ね近傍に挿入された、任意の異種性ヌクレオチド配列を含む大豆種子および／または大豆植物体も包含する。このような標的組み込みを達成するための１つの選択肢は、本願明細書に例示のｐａｔ発現カセットの代わりに異なるインサートを切除および／または置換することである。この一般的な認識では、標的の相同組換えが、例えば、制限されず、本主題の発明に基づいて使用され得る。
【００７５】
本願明細書で使用する時、遺伝子イベントまたは形質の「積み重ね」は、１つの遺伝子組換え株に所望の形質を組み合わせることである。植物育種家は、それぞれが所望の形質を有する親の間で交雑させ、ついで、これらの所望の形質の両方を有する子孫を特定することにより、遺伝子組換え形質を積み重ねる。遺伝子を積み重ねるための別の方法は、形質転換中に同時に、２またはそれ以上の遺伝子を、植物の細胞核内に移動させることによる。遺伝子を積み重ねるための別の方法は、当該別の遺伝子により、遺伝子組換え植物を再形質転換することによる。例えば、遺伝子の積み重ねは、２またはそれ以上の異なる形質、例えば、２またはそれ以上の異なる害虫形質、害虫抵抗性形質と疾患抵抗性形質、２またはそれ以上の除草剤抵抗性形質および／または害虫抵抗性形質と除草剤抵抗性形質を組み合わせるのに使用され得る。当該遺伝子に加えて、選択的マーカーの使用も、遺伝子積み重ねを検討され得る。
【００７６】
「相同組換え」は、２つのヌクレオチド配列が相互作用して（組換えられて）、新たな組換えＤＮＡ配列を形成し得ることにより、類似のヌクレオチド配列を含む対応するサイトを有する、ヌクレオチド配列の任意のペア間での反応を意味する。本願明細書では、類似するヌクレオチド配列のサイトは、それぞれ「相同配列」と呼ばれる。一般的に、相同配列が長くなる場合に、相同組換えの頻度は向上する。このため、相同組換えは、同一性がより低い２つのヌクレオチド配列間で起こり得るが、２つの配列間の相違が大きくなる場合、組換えの頻度（または、効率）は低下する。組換えは、ドナーおよび標的分子それぞれ上の１つの相同配列を使用して達成され得る。これにより、「単独のクロスオーバー」組換え生成物を産生する。または、２つの相同配列が、標的およびドナーヌクレオチド配列それぞれ上に置かれてもよい。標的についての２つの相同配列を有するドナー上の２つの相同配列間での組換えは、「二重クロスオーバー」組換え生成物を産生する。ドナー分子上の相同配列が、操作される配列（例えば、当該配列）に隣接する場合、標的分子による二重クロスオーバー組換えは、組換え生成物をもたらすであろう。組換え生成物では、当該配列は、標的分子上の相同配列間に元からあったＤＮＡ配列を置き替える。二重クロスオーバー組換えイベントによる、標的とドナーとの間のＤＮＡ配列の交換は、「配列置換」と呼ばれる。
【００７７】
本主題のイベントは、ほとんど全ての広葉およびイネ科雑草を抑制するであろう、除草剤の組み合わせに対する耐性をもたらす、３つの異なる除草剤耐性タンパク質の遺伝子組換え発現を可能にする。このマルチ除草剤耐性形質の発現カセット／遺伝子組換えインサートは、例えば、他の除草剤耐性形質（例えば、グリホサート抵抗性、グルホシネート抵抗性、イミダゾリノン抵抗性、ジカンバ抵抗性、ＨＰＰＤ抵抗性、ブロモキシニル抵抗性等）ならびに、害虫抵抗性形質（例えば、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ３４／４５、Ｃｒｙ１Ｂｅ、Ｃｒｙ１Ｃａ、Ｃｒｙ１Ｄａ、Ｃｒｙ１Ｅａ、Ｃｒｙ１Ｆａ、植物殺虫性タンパク質（「ＶＩＰＳ」）（ＶＩＰ３Ａ等を含む））と積み重ねられ得る。さらに、本主題の発明の発現カセット／遺伝子組換えインサートにおける除草剤耐性タンパク質は、第２の遺伝子または遺伝子群で遺伝的に操作された植物の初代形質転換体の選択を支援するための、１またはそれ以上の選択的マーカーとして役立ち得る。
【００７８】
これらの組み合わせの形質は、除草剤（例えば、グリホサート）に対する新たに獲得した抵抗性または固有の耐性により、雑草（および類似）種を抑制する新規な方法を生じさせる。このため、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を使用して、雑草を抑制するための新規な方法は、本発明の範囲内である。
【００７９】
作物内に積み重ねられるか、または、個々に形質転換された、本主題の遺伝子組換え形質の使用は、フェノキシ、ピリジルオキシ、グリホサートおよび／またはグルホシネートの除草剤に対する耐性を付与するための遺伝子を含まない、他の除草剤耐性の自生作物を抑制するためのツールを提供する。
【００８０】
本主題の好ましい植物体または種子は、そのゲノムに、本願明細書で特定したインサート配列と併せて、本願明細書に記載のように、インサートの両側に、少なくとも２００〜５００個以上の連続的なフランキングヌクレオチドを含む。特に断らない限り、フランキング配列への言及は、配列番号１および配列番号２に関して特定されたものを意味する。改めて、本主題のイベントは、挿入されたＤＮＡに隣接する本主題のフランキングゲノム配列間に挿入された異種性ＤＮＡを含む。これらのフランキング配列の全部または一部は、イベントを含む親株の有性交雑の結果として、挿入されたＤＮＡを受け取る子孫に移動させられることが期待され得る。
【００８１】
本主題の発明は、本主題の発明の植物体の再生細胞の組織培養を含む。このような組織培養から再生された植物体も含まれる。具体的には、植物体は、例示した品種の全ての形態学的および生理学的特性を発現可能である。本主題の好ましい植物体は、寄託された種子から生長した植物の、全ての生理学的および形態学的特性を有する。この発明は、さらに、このような種子および、当該品質形質を有する種子の子孫を含む。
【００８２】
植物体もしくは種子またはそれらの部分の操作（例えば、変異、更なるトランスフェクションおよび更なる育種）は、「本質的に派生した」品種と呼ばれ得るものの創作をもたらす。植物新品種保護国際同盟（ＵＰＯＶ）は、品種が保護された品種から本質的に派生したかを判定するための下記のガイドラインを提供してきた。
［Ａ］品種は、下記の場合、別の品種（「原品種」）から本質的に派生したとみなされるべきである：
（ｉ）当該品種が、主として原品種からまたはそれ自体主として原品種から派生した品種から派生し、かつ、原品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせから生じた本質的特性の発現を維持していること；
（ｉｉ）原品種から明確に区別することができ；かつ、
（ｉｉｉ）派生させる行為から生じた差異を除くほか、原品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせから生じた本質的特性の発現において原品種に合致すること。
【００８３】
１９９２年１０月３０日、ＵＰＯＶ、国際機関による第６回会合、Ｇｅｎｅｖａ；連合の事務局により作成された記録文書。
【００８４】
本願明細書で使用する時、「株」は、少なくとも１つの形質に関する個体間の遺伝的ばらつきがほとんどないか、または遺伝的ばらつきがない植物のグループである。このような株は、自家受粉および選択の複数世代、または、組織もしくは細胞培養技術を使用する単独の親由来の栄養繁殖により作製され得る。
【００８５】
本願明細書で使用する時、「栽培品種」および「品種」の用語は、同義語であり、商業生産に使用される株を意味する。
【００８６】
「安定性」または「安定な」とは、所定の要素に関して、要素が、何世代にもわたって、好ましくは、少なくとも３世代にわたって、実質的に同じレベル、例えば、好ましくは±１５％、より好ましくは±１０％、最も好ましくは±５％で維持されることを意味する。安定性は、温度、ロケーション、ストレスおよび種まきのタイミングにより影響を受ける場合がある。フィールド条件下での次の世代の比較は、類似の方法で要素を生じさせるべきである。
【００８７】
「商業的実用性」は、従来の耕作機械を使用する農家により、作物が生産され、記載の成分によるオイルが、従来の粉砕および抽出装置を使用して種子から抽出され得るように、良好な植物の生長力および高い生殖能力を有することと規定される。商業的に有用であるために、種子重量、オイル含量、１エーカーあたりに生産される合計オイルにより測定される場合、収量は、同じ区画で生長した高品質な価値を有する形質を有しない、他に比較可能な商業的な大豆品種の平均収率の１５％以内である。
【００８８】
「農学的にエリート」とは、本主題のイベントによる除草剤耐性に加えて、望ましい農学的特徴、例えば、収率、成熟度、疾患抵抗性等を有する株を意味する。本主題の発明のイベントを含む植物において、以下の実施例で説明するように、個々または任意の組み合わせで取得された農学的な形質は、本主題の発明の範囲内である。任意および全てのこれらの農学的特徴およびデータポイントは、このような植物を規定するのに使用される特徴の範囲における、一点、またはどちらかの端部もしくは両端部のいずれかとして、このような植物を特定するのに使用され得る。
【００８９】
この開示を踏まえると、検出キットの好ましい実施形態が、「ジャンクション配列」もしくは「トランジション配列」（大豆ゲノムスランキング配列が、インサート配列と一致する）を対象にし、および／またはこれを含む、プローブおよび／またはプライマーを含み得ることを、当業者は認識するであろう。例えば、このことは、表１に示したように、一方または両方のジャンクション配列（インサートは、フランキング配列と一致する）を特定するために設計された、ポリヌクレオチドプローブ、プライマーおよび／または増幅産物を含む。１つの一般的な設計は、フランキング領域にハイブリダイズする１つのプライマー、および、インサートにハイブリダイズする１つのプライマーを有することである。このようなプライマーは、多くの場合、長さが少なくとも約１５個の残基である。この配置により、プライマーは、本主題の発明のイベントの存在を示す検出可能な増幅産物を産生／増幅するのに使用され得る。これらのプライマーは、上記に示したジャンクション配列にまたがる（および含む）増幅産物を産生するのに使用され得る。
【００９０】
フランキング配列に「タッチダウン」するプライマーは、典型的には、ジャンクションを越える約２００塩基程度を越えてハイブリダイズするようには設計されない。このため、典型的なフランキングプライマーは、インサートの開始からフランキング配列内の２００塩基以内のいずれかの鎖の少なくとも１５残基を含むように設計されるであろう。すなわち、上記特定したジャンクション配列の一方または両方からの、１００から２００〜５００程度の塩基以内の残基からの（またはハイブリダイズする）適切なサイズ配列を含むプライマーは、本主題の発明の範囲内である。インサートプライマーは、同様に、インサート上のいずれかの場所に設計され得るが、上記特定したジャンクション配列からの、１００から２００〜５００程度以内の、インサート上の残基（例えば、相補体）が、例えば、このようなプライマー設計について、非排他的に使用され得る。
【００９１】
プライマーおよびプローブが、標準的なハイブリダイゼーションおよび／またはＰＣＲの条件の範囲下において、本願明細書で例示した配列のセグメントにハイブリダイズするように設計され得ることも、当業者は認識するであろう。プライマーおよびプローブは、例示した配列に完全に相補的ではない。すなわち、ある程度のミスマッチは、容認され得る。おおよそ２０塩基のプライマーに関して、例えば、典型的には、ミスマッチの塩基が、増幅産物の反対側である、プライマーの内部または末端にある場合、１つまたは２つ程度のヌクレオチドは、反対側の鎖に結合するのに必要ではない。種々の適切なハイブリダイゼーション条件が、以下に提供される。合成ヌクレオチド類似体、例えば、イノシンも、プローブに使用され得る。ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブならびにＤＮＡおよびＲＮＡプローブも、使用され得る。重要なことは、このようなプローブおよびプライマーは、本主題の発明のイベントの存在に関して診断的（独特に特定および区別可能）であることである。
【００９２】
例えば、小さなシークエンシングエラーをもたらす、ＰＣＲ増幅におけるエラーが発生し得ることがあることに留意すべきである。すなわち、特に示さない限り、本願明細書に列記した配列は、大豆ゲノムＤＮＡからの長い増幅産物を産生し、ついで、増幅産物をクローニングおよびシークエンスすることにより決定された。ゲノムＤＮＡからのシークエンシングに対して十分な増幅産物を生成するために必要である多くのラウンドの増幅を考えると、この方法において産生され、決定された配列において、わずかな差異および小さな食い違いを発見することは珍しいことではない。これらの種類の一般的なシークエンシングエラーまたは食い違いにより必要となる任意の調節は、本発明の範囲内であることを、当業者は認識し、気づくはずである。
【００９３】
例えば、配列が、イベントの作製中に挿入された場合、一部のゲノム配列が欠損されることは珍しいことではないことにも留意すべきである。このため、本主題のフランキング配列と、ＧＥＮＢＡＮＫ等に列記されたゲノム配列との間に、一部の差異も表れ得る。
【００９４】
「インサート」の構成は、図面に示され、以下の実施例においてより詳細に記載される。これらの構成のＤＮＡポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、本発明の方法における、ＤＮＡプライマーまたはプローブとして使用され得る。
【００９５】
本発明の一部の実施形態では、大豆植物由来の植物体および種子等において、導入遺伝子／ゲノム挿入領域の存在を検出するための組成物および方法が提供される。本願明細書で提供された本主題の導入遺伝子／ゲノム挿入領域ジャンクション配列、本願明細書で特定したジャンクション配列を含むセグメント、ならびに、このように例示した任意の配列の構成およびそれらの任意のセグメントを含むＤＮＡ配列が提供される。挿入領域ジャンクション配列は、ゲノム内に挿入された異種性ＤＮＡと、挿入サイトに隣接する大豆細胞由来のＤＮＡとの間のジャンクションをまたぐ。このような配列は、所定のイベントに関して診断的であり得る。
【００９６】
これらのインサートおよびボーダー配列に基づいて、イベント特異的プライマーが、産生され得る。ＰＣＲ分析は、本主題の発明の大豆株が、これらのイベント特異的プライマーセットにより産生されたＰＣＲ増幅産物の分析により、異なる大豆の遺伝子型に特定され得ることを説明した。これらおよび他の関連する手順は、独特に、これらの大豆株を特定するのに使用され得る。このため、このようなプライマーペアから派生したＰＣＲ増幅産物は、他に存在せず、これらの大豆株を特定するのに使用され得る。
【００９７】
一部の実施形態では、新規な導入遺伝子／ゲノム挿入領域の連続的なフラグメントを含むＤＮＡ配列は、この発明の態様である。導入遺伝子インサート配列の十分な長さのポリヌクレオチド、ならびに、１またはそれ以上のこれらの大豆植物に関して診断的な増幅産物生成物の産生に関するプライマー配列として有用である、１またはそれ以上の前述の大豆植物および／または配列からの、大豆ゲノム配列の十分な長さのポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列が含まれる。
【００９８】
関連する実施形態は、本願明細書で特定したＤＮＡ配列の、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個以上の連続的なヌクレオチドの導入遺伝子部分を含むＤＮＡ配列、またはそれらの相補体、ならびに、これらの配列からの類似する長さのフランキング大豆ＤＮＡ配列（例えば、配列番号１および配列番号２ならびにそのセグメント）またはそれらの相補体に関連する。このような配列は、ＤＮＡ増幅法におけるＤＮＡプライマーとして有用である。これらのプライマーを使用して産生された増幅産物は、本願明細書で言及した大豆イベントのいずれかに関して、診断的である。したがって、本発明は、このようなＤＮＡプライマーおよび相同プライマーにより産生された増幅産物も含む。
【００９９】
本発明は、本願明細書で言及した大豆イベントに対応する試料中にＤＮＡの存在を検出する方法も含む。このような方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、少なくとも１つのこれらの大豆イベントからのＤＮＡを用いた核酸増幅反応に使用される場合にイベントに関して診断的な増幅産物を産生するプライマーセットと接触させる工程；（ｂ）核酸増幅反応を行うことにより、増幅産物を産生する工程；ならびに、（ｃ）増幅産物を検出する工程を含み得る。
【０１００】
本主題の発明の更なる検出方法は、イベントに対応する試料中にＤＮＡの存在を検出する方法を含む。前記方法は、（ａ）ＤＮＡを含む試料を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、少なくとも１つの大豆由来のＤＮＡとハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、対照大豆植物（当該イベントを含まないＤＮＡ）とハイブリダイズしないプローブと接触させる工程；（ｂ）試料およびプローブを、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供する工程；ならびに、（ｃ）ＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーションを検出する工程を含む。
【０１０１】
更なる実施形態では、本主題の発明は、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む大豆植物体を製造する方法を含む。前記方法は、（ａ）第１の親大豆株（株の植物体に除草剤抵抗性形質を付与する、本発明の発現カセットを含む）と、第２の親大豆株（この除草剤耐性形質を欠く）とを有性交雑することにより、複数の子孫植物体を産生する工程；および（ｂ）分子マーカーの使用により、子孫植物体を選択する工程を含む。このような方法は、場合により、子孫植物体を、第２の親大豆株に戻し交雑して、除草剤耐性形質を含む、何世代にもわたって同じ特徴を示す大豆植物体を産生する、更なる工程を含んでもよい。
【０１０２】
本発明の別の態様に基づいて、イベントとの交雑の子孫における接合性を判定する方法が提供される。前記方法は、大豆ＤＮＡを含む試料を、本主題の発明のプライマーセットと接触させる工程を含む。プライマーは、少なくとも１つの大豆イベント由来のゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応に使用される場合、少なくとも１つの大豆イベントに関して診断的な第１の増幅産物を産生する。このような方法は、さらに、核酸増幅反応を行うことにより、第１の増幅産物を産生し；第１の増幅産物を検出し；および、大豆ＤＮＡを含む試料を、プライマーセットと接触させることを含む（大豆植物体からのゲノムＤＮＡとの核酸増幅反応に使用される場合、プライマーセットは、大豆ゲノム領域に相同な野生型の大豆ゲノムＤＮＡ含む第２の増幅産物を産生し；および、核酸増幅反応を行うことにより、第２の増幅産物を生成する）。前記方法は、さらに、第２の増幅産物を検出し、および、試料中の第１の増幅産物と第２の増幅産物とを比較することを含む。両増幅産物の存在は、試料が、導入遺伝子挿入に関して、ヘテロ接合性であることを示す。
【０１０３】
ＤＮＡ検出キットは、本願明細書に開示の組成物およびＤＮＡ検出の分野において周知の方法を使用して開発され得る。キットは、試料中における本主題の大豆イベントＤＮＡの特定に有用であり、このＤＮＡを含む大豆植物を育種するための方法に適用され得る。キットは、例えば、本願明細書に開示の増幅産物に相同的もしくは相補的なＤＮＡ配列、または、本主題のイベントの導入遺伝子の遺伝要素に含まれるＤＮＡに相同的または相補的なＤＮＡ配列を含む。これらのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ増幅反応に使用され、または、ＤＮＡハイブリダイゼーション法におけるプローブとして使用され得る。キットは、検出法の実行に必要な試薬および材料を含んでもよい。
【０１０４】
「プローブ」は、従来の検出可能な標識またはレポータ分子（例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤または酵素）を付着する、単離された核酸分子である。このようなプローブは、標的核酸の鎖に相補的であり、本発明の場合、大豆植物体からでも、または、イベント由来のＤＮＡを含む試料からでも、大豆イベントの１つからのゲノムＤＮＡの鎖に相補的である。本発明に基づくプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するのに使用され得るポリアミドおよび他のプローブ材料も含む。「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが非天然の状態にあり、例えば、操作可能にヘテロ接合性のプロモータに結合されることを示唆する。同様に、「精製された」タンパク質は、タンパク質が非天然の状態にあることを示唆する。
【０１０５】
「プライマー」は、核酸ハイブリダイゼーションにより相補的な標的ＤＮＡ鎖にアニールされて、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間のハイブリッドを形成し、ついで、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼにより、標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される、単離され／合成された核酸である。本発明のプライマーペアは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の従来の核酸増幅法により、標的核酸配列の増殖に関するその使用を意味する。
【０１０６】
プローブおよびプライマーは、一般的には、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９または５００個以上の長さのポリヌクレオチドである。このようなプローブおよびプライマーは、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、特異的に標的配列にハイブリダイズする。好ましくは、本発明に基づくプローブおよびプライマーは、標的配列に完全な配列類似性を有するが、標的配列とは異なり、標的配列にハイブリダイズする能力を保持するプローブが、従来の方法により設計されてもよい。
【０１０７】
プローブおよびプライマーの調製および使用をする方法は、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989に記載されている。ＰＣＲ−プライマーペアは、例えば、その目的を意図したコンピュータプログラムを使用することにより、公知の配列から派生され得る。
【０１０８】
本願明細書に開示のフランキングＤＮＡおよびインサート配列に基づくプライマーおよびプローブは、開示の配列を、従来の方法、例えば、このような配列の再クローニングおよびシークエンシングにより、確認（および、必要であれば、補正）するのに使用され得る。
【０１０９】
本発明の核酸プローブおよびプライマーは、ストリンジェントな条件下で、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅法は、試料中における導入遺伝子イベント由来のＤＮＡの存在を特定するのに使用され得る。核酸分子およびそのフラグメントは、特定の環境下において、他の核酸分子に、特異的にハイブリダイズ可能である。本願明細書で使用する時、２つの核酸分子は、２つの核酸分子が、逆平行の、二本鎖核酸構造を形成可能である場合、互いに特異的にハイブリダイズ可能であると言われる。核酸分子は、核酸分子が完全な相補性を示す場合、別の核酸分子の「相補体」であると言われる。本願明細書で使用する時、分子は、分子の１つの各ヌクレオチドが、他のもののヌクレオチドに相補的である場合、「完全な相補性」を示すと言われる。２つの分子は、２つの分子が、少なくとも従来の「低ストリンジェントな」条件下において、互いにアニールされたままであることを許容するための十分な安定性を有して、互いにハイブリダイズし得る場合、「最小限に相補的」であると言われる。同様に、分子は、分子が、従来の「高ストリンジェントな」条件下において、互いにアニールされたままであることを許容するための十分な安定性を有して、互いにハイブリダイズし得る場合、「相補的」であると言われる。従来のストリンジェントな条件は、Sambrook et al., 1989により記載されている。このため、完全な相補性からの出発は、このような出発が、二本鎖構造を形成する、分子の能力を完全に不可能にしない限り、許容される。核酸分子が、プライマーまたはプローブとして役立つために、使用される具体的な溶媒および塩濃度下において、安定的な二本鎖構造を形成可能であるように、配列において十分に相補的であることのみが必要である。
【０１１０】
本願明細書で使用する時、実質的に相同な配列は、高いストリンジェントな条件下で比較される、核酸配列の相補体に、特異的にハイブリダイズするであろう、核酸配列である。「ストリンジェントな条件」の用語は、Sambrook et al., 1989, 9.52-9.55に記載の特異的なハイブリダイゼーション手順により、核酸プローブの標的核酸（すなわち、当該特定の核酸配列）へのハイブリダイゼーションに関して機能的に規定される。Sambrook et al., 1989, 9.47-9.52および9.56-9.58も参照のこと。したがって、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡフラグメントの相補的なストレッチとの二本鎖分子を選択的に形成する、その機能に使用されてもよい。
【０１１１】
想定される用途に応じて、標的配列に対するプローブの選択性の度合いの変化を達成するための、ハイブリダイゼーションの各種条件が使用され得る。高い選択性を要求する用途に関して、典型的には、例えば、エンドポイントＴＡＱＭＡＮおよびリアルタイムＰＣＲ用途に関して、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件が使用されるであろう。約６０℃から約７５℃の温度で、１．５ｍＭから約４．０ｍＭ ＭｇＣｌ２が選択されるであろう。ストリンジェンシーの向上に関して、保持時間を変化させ得る。他のハイブリダイゼーション技術に関して、典型的には、比較的低い塩および／または高い温度条件、例えば、約０．０２Ｍから約０．１５Ｍ ＮａＣｌで、約５０℃から約７０℃の温度により提供される条件が、使用されるであろう。ストリンジェントな条件は、例えば、高ストリンジェントな洗浄バッファー（０．２× ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃）で、少なくとも２回、ハイブリダイゼーションフィルタを洗浄することを含む。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切にストリンジェントな条件（例えば、約４５℃での、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続けて、５０℃での２．０× ＳＳＣで洗浄される）が、当業者に公知である。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃での約２．０× ＳＳＣの低ストリンジェンシーから、５０℃での約０．２× ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択され得る。さらに、洗浄工程における温度は、室温である２２℃での低いストリンジェントな条件から、約６５℃での高いストリンジェントな条件まで上昇され得る。温度および塩の両方が、変動されてもよく、または、温度もしくは塩濃度のいずれかが、一定に保持され、一方、他方の値は、変化されてもよい。このような選択的な条件は、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間に任意のミスマッチがあれば、ほとんど許容されない。ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の検出は、当業者に周知であり、米国特許第４，９６５，１８８号および同第５，１７６，９９５号の教示が、ハイブリダイゼーション分析法の典型例である。
【０１１２】
特に好ましい実施形態では、本発明の核酸は、高ストリンジェントな条件下において、本願明細書に例示され、または、示唆された、相補体およびそのフラグメントを含む１またはそれ以上のプライマー（もしくは増幅産物または他の配列）に、特異的にハイブリダイズするであろう。本発明の一態様では、本発明のマーカー核酸分子は、例示された配列または相補体および／もしくはそのフラグメントの１つにおいて、本願明細書で説明された核酸配列を有する。
【０１１３】
本発明の別の態様では、本発明のマーカー核酸分子は、このような核酸配列と、８０％と１００％との間または９０％と１００％との間の配列同一性を共有する。本発明の更なる態様では、本発明のマーカー核酸分子は、このような配列と、９５％と１００％との間の配列同一性を共有する。このような配列は、遺伝的交雑の子孫を特定するための植物育種法におけるマーカーとして使用されてもよい。標的ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に公知のかなり多くの方法により検出され得る。これらは、制限されず、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグおよび化学発光タグを含み得る。
【０１１４】
特定の増幅プライマーペアを使用する（例えば、ＰＣＲによる）標的核酸配列の増幅に関して、「ストリンジェントな条件」は、プライマーペアが、対応する野生型配列（または、その相補体）を有するプライマーが結合して、好ましくは固有の増幅生成物である増幅産物を産生するであろう、標的核酸配列のみにハイブリダイズすることを許容する条件である。
【０１１５】
「（標的配列）に特異的」の用語は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、標的配列を含む試料における標的配列にのみにハイブリダイズすることを示す。
【０１１６】
本願明細書で使用する時、「増幅されたＤＮＡ」または「増幅産物」（amplicon）は、核酸テンプレートの一部である、標的核酸配列の核酸増幅の生成物を意味する。例えば、有性交雑に起因する大豆植物体が本発明の大豆植物体由来の遺伝子組換えイベントのゲノムＤＮＡを含むかどうかを判定するために、大豆植物の組織試料から抽出されたＤＮＡが、挿入された異種性ＤＮＡの挿入サイトに隣接する植物のゲノムにおける、フランキング配列から派生したプライマー、および、イベントＤＮＡの存在に関して診断的な増幅産物を産生するための、挿入された異種性ＤＮＡから派生した第２のプライマーを含むプライマーペアを使用する、核酸増幅法に供され得る。増幅産物は、イベントに関して診断的な長さであり、イベントに関して診断的な配列を有する。増幅産物の長さは、プライマーペアと１つのヌクレオチド塩基対との組み合わせられた長さ、および／または、プライマーペアと、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、���６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９または５００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００以上のヌクレオチド塩基対（上記列記した増分のプラスまたはマイナスのいずれか）との組み合わせられた長さからの範囲であり得る。または、プライマーペアは、インサートヌクレオチド配列全体を含む増幅産物を産生するために、挿入されたＤＮＡの両側のフランキング配列から派生され得る。植物ゲノム配列から派生した数多くのプライマーペアが、挿入されたＤＮＡ配列から距離を置いて配置されてもよい。この距離は、１つのヌクレオチド塩基対から、約２万個のヌクレオチド塩基対までの範囲であり得る。「増幅産物」の用語の使用は、具体的には、ＤＮＡ熱増幅反応において形成され得る、プライマー二量体を除外する。
【０１１７】
核酸増幅は、当分野において公知の種々の核酸増幅法のいずれか、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により達成され得る。各種の増幅法が当分野において公知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号に記載されている。ＰＣＲ増幅法は、２２ｋｂ以下のゲノムＤＮＡを増幅するのに開発されてきた。これらの方法および、ＤＮＡ増幅の分野において公知の他の方法が、本発明の実施に使用され得る。主題の大豆イベント由来の、前記ヘテロ接合性の導入遺伝子ＤＮＡインサートの配列またはフランキングゲノム配列は、本願明細書で提供された配列から派生したプライマーを使用して、イベント由来のこのような配列を増幅し、続けて、ＰＣＲ増幅産物またはクローンされたＤＮＡの標準的なＤＮＡシークエンスにより、検証され（および、必要であれば補正され）得る。
【０１１８】
これらの方法により産生される増幅産物は、複数の技術により検出され得る。アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイドによる染色は、ＤＮＡ増幅産物を検出する一般的な周知の方法である。別のこのような方法は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、隣接するフランキングゲノムＤＮＡ配列と挿入されたＤＮＡ配列との両方を重複するように設計される、遺伝子ビット解析（Genetic Bit Analysis）である。オリゴヌクレオチドは、マイクロウェルプレートのウェルに固定化される。（挿入された配列における１つのプライマーと、隣接するフランキングゲノム配列における１つとを使用する）当該領域のＰＣＲ後に、一本鎖ＰＣＲ生成物が、固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼおよび、予測される次の塩基に特異的な標識化ｄｄＮＴＰを使用する一塩基伸長反応用のテンプレートとしての役割を果たし得る。読み出しは、蛍光またはＥＬＩＳＡベースでもよい。シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長の成功による、インサート／フランキング配列の存在を示す。
【０１１９】
別の方法は、Ｗｉｎｇｅにより記載された（Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000）、パイロシークエンシング技術である。この方法では、オリゴヌクレオチドが、隣接するゲノムＤＮＡとインサートＤＮＡジャンクションに重複するように設計される。オリゴヌクレオチドは、当該領域（挿入された配列における１つのプライマーと、フランキングゲノム配列における１つ）由来の一本鎖ＰＣＲ生成物にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルフェートおよびルシフェリンの存在下で、インキュベートされる。ＤＮＴＰが個々に添加され、取り込みは、測定される光シグナルをもたらす。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基もしくは多塩基伸長の成功による、導入遺伝子インサート／フランキング配列の存在を示す。
【０１２０】
蛍光分極法は、本発明の増幅産物を検出するのに使用され得る別の方法である。この方法後に、オリゴヌクレオチドが、ゲノムフランキングと挿入されたＤＮＡジャンクションに重複するように設計される。オリゴヌクレオチドは、当該領域（挿入されたＤＮＡにおける１つのプライマーと、フランキングゲノムＤＮＡ配列における１つ）由来の一本鎖ＰＣＲ生成物にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下で、インキュベートされる。一塩基伸長が、ｄｄＮＴＰの取り込みをもたらす。取り込みは、蛍光計を使用する極性の変化として測定され得る。極性の変化は、増幅、ハイブリダイゼーションおよび一塩基伸長の成功による、導入遺伝子インサート／フランキング配列の存在を示す。
【０１２１】
ＴＡＱＭＡＮ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ）は、ＤＮＡ配列の存在を検出および定量化する方法である。簡潔に、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが、ゲノムフランキングとインサートＤＮＡジャンクションに重複するように設計される。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（インサートＤＮＡ配列における１つのプライマーと、フランキングゲノム配列における１つ）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下において、サイクルされる。特異的な増幅中に、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部分から蛍光部分を除去および放出する。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功による、フランキング／導入遺伝子インサート配列の存在を示す。
【０１２２】
分子ビーコンは、配列検出における使用に関して説明されてきた。簡潔に、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが、フランキングゲノムとインサートＤＮＡジャンクションに重複するように設計される。ＦＲＥＴプローブの独特な構造は、蛍光およびクエンチング部分をごく近接して維持する二次構造を含むＦＲＥＴプローブをもたらす。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（インサートＤＮＡ配列における１つのプライマーと、フランキングゲノム配列における１つ）が、熱安定性ポリメラーゼおよびｄＮＴＰの存在下において、サイクルされる。ＰＣＲ増幅の成功後、標的配列へのＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションは、プローブの二次構造の除去と、蛍光およびクエンチング部分の空間的な分離をもたらす。蛍光シグナルが生じる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功による、フランキングゲノム／導入遺伝子インサート配列の存在を示す。
【０１２３】
挿入に優れた大豆ゲノムにおける位置が開示されてきた。本主題の発明は、少なくとも１つの非ａａｄ１２／ｐａｔ／２ｍｅｐｓｐｓコード配列を、このゲノム位置の概ね近くにもしくは近く付近に含む、大豆種子および／または大豆植物体も含む。１つの選択肢は、本願明細書に例示されたインサートに代えて、異なるインサートを置換することである。これらの一般的な関心において、例えば、標的相同組換えが、本主題の発明に基づいて使用され得る。この種の技術は、例えば、国際公開第０３／０８０８０９号および、対応して公開された米国出願（米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号）の主題である。このため、本主題の発明は、本願明細書において、配列番号１および配列番号２として特定されたフランキング配列の全部または認識可能部分に隣接した、（例示されたインサートのマルチコピーに代えて、または、マルチコピーと共に）異種性インサートを含む植物体および植物細胞を含む。例示したインサートまたはそのいずれかの相補体の更なるコピー（または更なる複数のコピー）も、これ／これらの方法における挿入に関して、標的とされ得る。
【０１２４】
本願明細書で参照され、または、引用された、全ての特許、特許出願、仮出願および刊行物は、それらが本明細書の明確な教示と不一致でない程度まで、その内容が参照により本願明細書に組み込まれる。
【０１２５】
下記実施例は、本発明を実施するための手順を示し、本発明の特定の好ましい実施形態を説明するために含まれる。これらの実施例は、限定して解釈されるべきでない。下記実施例に開示の技術は、その実施に関して好ましい方式を説明するのに使用される具体的な取り組みを表すことが、当業者により理解されるべきである。ただし、当業者は、本開示を踏まえれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果をまだ得られるうちは、多くの変更が、これらの具体的な実施形態になされ得ることを理解する。特に断らない限り、全ての割合は、重量によるものであり、全ての溶媒混合割合は、特に断らない限り、体積によるものである。
【０１２６】
特に断らない限り、下記の略称が使用される。
ｂｐ      塩基対
℃        セ氏温度
ＤＮＡ    デオキシリボ核酸
ＤＩＧ    ジゴキシゲニン
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ｋｂ      キロベース
μｇ      マイクログラム
μＬ      マイクロリットル
ｍＬ      ミリリットル
Ｍ        モル量
ＯＬＰ    重複プローブ
ＰＣＲ    ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＴＵ    植物転写ユニット
ＳＤＳ    ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＯＰ    標準操作手順
ＳＳＣ    塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムの混合物を含むバッファー溶液、ｐＨ７．０
ＴＢＥ    トリス塩基、ホウ酸およびＥＤＴＡの混合物を含むバッファー溶液、ｐＨ８．３
Ｖ        ボルト
【実施例】
【０１２７】
実施例１：２ｍＥＰＳＰＳおよびＡＡＤ−１２大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の形質転換および選択
大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む遺伝子組換え大豆（ダイズ（Glycine max））を、大豆子葉節外植片のアグロバクテリウム媒介性形質転換により発生させた。選択的マーカーｐａｔ  ｖ６、および当該遺伝子であるａａｄ−１２  ｖ１および２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１をＴ鎖ＤＮＡ領域内に含むバイナリーベクターｐＤＡＢ８２６４（図１）を運ぶ、武装解除したアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄら、１９９３）を、形質転換を開始するのに使用した。
【０１２８】
アグロバクテリウム媒介性形質転換を、Ｚｅｎｇら（２００４）の改良した手順を使用して行った。簡潔に、大豆種子（cv Maverick）を、基礎培地上に発芽させ、子葉節を単離し、アグロバクテリウムに感染させた。シュート開始、シュート伸長および発根の培地に、アグロバクテリウムを除去するために、セフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンを補った。形質転換されなかったシュートの生長を阻害するために、グルホシネート選択を採用した。選択されたシュートを、根を発達させるために発根培地に移し、ついで、小植物の馴化用の土壌ミックスに移した。
【０１２９】
選択した小植物の末端小葉が、推定上の形質転換体に関するスクリーニングのために、グルホシネートを塗った葉であった。スクリーニングされた小植物を温室に移し、馴化させ、ついで、耐性を再確認するために、グルホシネートを葉に塗布し、推定上の形質転換体とみなした。スクリーニングされた植物体をサンプリングし、選択的マーカー遺伝子および／または当該遺伝子を確認するための分子分析を行った。Ｔ０植物を、温室において自家受粉させ、Ｔ１種子を生じさせた。
【０１３０】
このイベントである、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を、独立して形質転換された分離株から生じさせた。Ｔ１植物を、戻し交雑し、次の世代にわたって、エリート品種に遺伝子移入した。イベントを、その固有の特徴、例えば、１つの挿入サイト、正常なメンデル分離および安定した発現ならびに、有効性の優れた組み合わせ、例えば、除草剤耐性および農業生産力に基づいて選択した。下記実施例には、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を特徴付けるのに使用されるデータが含まれる。
【０１３１】
実施例２：大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１におけるタンパク質発現の特徴付け
大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１において発現された、組換えＡＡＤ−１２、２ｍＥＰＳＰＳおよびＰＡＴのタンパク質の生化学的特性を特徴付けた。定量的酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、タンパク質の生化学的特性を特徴付け、大豆イベントにおけるこれらのタンパク質の発現を確認するのに使用され得る、当分野において公知の生化学アッセイである。
【０１３２】
実施例２．１：植物組織におけるＰＡＴタンパク質の発現
ＰＡＴタンパク質のレベルを、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１において決定した。可溶性で、抽出可能なＰＡＴタンパク質を、定量的酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を使用して、大豆葉の組織から測定した。
【０１３３】
大豆組織の試料を、試験植物から単離し、発現分析用に調製した。ＰＡＴタンパク質を、界面活性剤であるＴｗｅｅｎ−２０を含み（ＰＢＳＴ）、１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む、リン酸緩衝生理食塩水で、大豆植物組織から抽出した。植物組織を遠心分離し；水性上清を収集し、必要な場合、適切なバッファーで希釈し、サンドイッチフォーマットにおいて、ＰＡＴ  ＥＬＩＳＡキットを使用して分析した。キットを、製造者の提示したプロトコル（Ｅｎｖｉｒｏｌｏｇｉｘ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＭＥ）に従って使用した。このアッセイは、発現されたＰＡＴタンパク質を測定した。
【０１３４】
大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１における、発現安定性ならびに、垂直的（世代間）および水平的（世代内の系統間）の両方の遺伝性を研究するために、検出分析を行った。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のＴ３からＴ５の世代までにおいて、発現は、全ての系統にわたって安定し、一貫していた。
【０１３５】
実施例２．２：植物組織におけるＡＡＤ−１２および２ｍＥＰＳＰＳのタンパク質の発現
ＡＡＤ−１２および２ｍＥＰＳＰＳのタンパク質のレベルを、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１において決定した。可溶性で、抽出可能なタンパク質を、定量的酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を使用して、大豆葉の組織から測定した。
【０１３６】
大豆組織の試料を、試験植物から単離し、発現分析用に調製した。ＡＡＤ−１２および２ｍＥＰＳＰＳのタンパク質を、界面活性剤であるＴｗｅｅｎ−２０を含み（ＰＢＳＴ）、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、リン酸緩衝生理食塩水で、大豆植物組織から抽出した。植物組織を遠心分離し；水性上清を収集し、必要な場合、適切なバッファーで希釈し、サンドイッチフォーマットにおいて、ＡＡＤ−１２およびＧＡ２１  ＥＬＩＳＡキットをそれぞれ使用して分析した。キットを、製造者の提示したプロトコル（ＡＡＤ−１２：カタログ番号２０−０１６１、Ｂｅａｃｏｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｃｏ、Ｍａｉｎｅ；２ｍＥＰＳＰＳ：カタログ＃７０２０１００、Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）に従って使用した。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のＴ４からＴ６の世代までにおいて、ＡＡＤ−１２および２ｍＥＰＳＰＳの発現は、全ての系統にわたって安定し、一貫していた。
【０１３７】
実施例２．３：発現効率研究
Ｖ３植物段階でのフィールド発現レベル研究を、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１について行った。発現レベル研究を、全ての散布処理および散布しなかったプロットについて行った。これらの実験を、先に記載のプロトコルを使用して完了させた。発現値は、全ての散布処理ならびに、除草剤の種々の組み合わせ（表２）で散布しおよび散布しなかったプロットに関して、同様であった。明らかな傷害は、研究の任意のポイントでの植物において観察されなかった。
【表２】
2014523251.tif 000005
【０１３８】
実施例３：大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のインサートおよびフランキングボーダー領域におけるＤＮＡ配列のクローニングおよび特徴付け
ゲノム挿入サイトを特徴付け、説明するために、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のフランキングゲノムＴ−ＤＮＡボーダー領域の配列を決定した。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のゲノム配列は、１，２４６ｂｐの５’フランキングボーダー配列（配列番号１）および、５０４ｂｐの３’フランキングボーダー配列（配列番号２）を含むことが確認された。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１ボーダー配列に基づくＰＣＲ増幅について、ボーダー領域が大豆由来であったこと、および、ジャンクション領域が大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１に関する固有の配列であることを検証した。ジャンクション領域を、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のイベント特異的特定に使用し得る。加えて、Ｔ鎖挿入サイトを、野生型の形質転換されていない大豆のゲノム由来の、特定されたフランキングボーダー配列の領域に対応するゲノムフラグメントを増幅することにより特徴付けた。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１と、野生型ゲノム配列との比較により、元の遺伝子座からの約３８ｂｐの欠損が証明された。全体としては、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のインサートおよびボーダー配列の特徴付けにより、Ｔ鎖の完全なコピーが、大豆ゲノムに存在したことが示された。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０１３９】
実施例３．１：大豆ゲノム配列の確認
５’および３’フランキングボーダーを、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の導入遺伝子が、大豆ゲノムの１５番染色体に挿入されていることを示す、１５番染色体由来のダイズ（Glycine max）全ゲノムショットガン配列に整列させた。大豆ゲノム由来の大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１導入遺伝子の挿入サイトを確認するために、ＰＣＲを、種々のペアのプライマー（図２、表３、表４および表５）により行った。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１、および他の遺伝子組換えまたは非遺伝子組換えの大豆株由来のゲノムＤＮＡを、テンプレートとして使用した。このため、５’ボーダー配列が正しいかを確認するために、２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１特異的プライマー、例えば、ＥＤ＿ｖ１＿Ｃ１、および、クローニングされた５’末端ボーダー配列および／または大豆ゲノム１５番染色体上のそのアライメント配列に基づいて設計され、４２３２−ＷＦ１、４２３２−ＷＦ３および４２３２−ＷＦ４と命名されたプライマーを、２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１遺伝子から５’末端ボーダー配列にまたがるＤＮＡセグメントを増幅するのに使用した。同様に、クローニングされた３’末端ボーダー配列の確認のために、ｐａｔ特異的プライマー、例えば、ＰＡＴ＿１１ならびに、クローニングされた３’末端ボーダー配列および／または大豆ゲノム１５番染色体上のそのアライメント配列に基づいて設計され、４２３２−ＷＲ１、４２３２−ＷＲ２、４２３２−ＷＲ３および４２３２−ＷＲ４と命名された４つのプライマーを、ｐａｔ遺伝子から３’末端ボーダー配列にまたがるＤＮＡセグメントを増幅するのに使用した。予測されたサイズのＤＮＡフラグメントが、各プライマーペア、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のフランキングボーダー上に配置される１つのプライマー、および、１つの導入遺伝子特異的プライマーにより、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のゲノムＤＮＡからのみ増幅されたが、他の遺伝子組換え大豆株または非遺伝子組換え対照由来のＤＮＡ試料からは増幅されなかった。その結果は、クローニングされた５’および３’ボーダー配列が、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１に関するＴ鎖インサートのフランキングボーダー配列であることを示す。
【０１４０】
大豆ゲノムにおけるＴ鎖ＤＮＡ挿入のゲノムサイトをさらに確認するために、大豆ボーダー配列にまたがるＰＣＲ増幅を、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１に関するＴ鎖インサートを含まないゲノムＤＮＡについて完了した。５’末端ボーダー配列に基づいて設計された１つのプライマー、４２３２−ＷＦ１ならびに、３’末端ボーダー配列に関する２つのプライマー、４２３２−ＷＲ１および４２３２−ＷＲ２を、ｐＤＡＢ８２６４  Ｔ鎖が組み込まれた、５’末端ボーダー配列および３’末端ボーダー配列のＤＮＡセグメントを増幅するのに使用した。予測された通り、４２３２−ＷＦ１および４２３２−ＷＲ１のプライマーペアによるＰＣＲ増幅により、非遺伝子組換え大豆対照および他の大豆遺伝子組換え株のゲノムＤＮＡから、おおよそ２．４ｋｂのＤＮＡフラグメントが増幅されたが、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１からは増幅されなかった。同様に、４２３２−ＷＦ１および４２３２−ＷＲ２のプライマーペアにより完了したＰＣＲ反応により、非遺伝子組換え大豆対照および他の大豆遺伝子組換え株のゲノムＤＮＡから、おおよそ２．５ｋｂのＤＮＡフラグメントが産生されたが、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１からは産生されなかった。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の、特定された５’および３’ボーダー配列を、１５番染色体由来のダイズ（Glycine max）全ゲノムショットガン配列と整列させることにより、元のゲノム遺伝子座から３８ｂｐの欠損が証明された（図３）。これらの結果は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の導入遺伝子が、大豆ゲノムの１５番染色体のサイト内に挿入されたことを説明した。
【０１４１】
実施例４：サザンブロットによる大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の特徴付け
サザンブロット分析を、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の組み込みパターンを確立するのに使用した。これらの実験から、大豆ゲノム内のａａｄ−１２  ｖ１および２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１導入遺伝子の組み込みおよび完全性を説明するデータを生成した。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を、プラスミドｐＤＡＢ８２６４由来のａａｄ−１２  ｖ１および２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１  ＰＴＵの１つのコピーを含む、全長の、単純な組み込みイベントとして特徴付けた。
【０１４２】
サザンブロットデータは、全長Ｔ鎖フラグメントが、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のゲノム内に挿入されたことを示唆した。詳細なサザンブロット分析を、ｐＤＡＢ８２６４のＴ鎖組み込み領域に含まれる、ａａｄ−１２  ｖ１および２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１の遺伝子に特異的なプローブ、ならびに、プラスミド内に配置された切断サイトを有し、大豆ゲノムＤＮＡを含むプラスミドのジャンクションをまたぐ、プラスミドまたはフラグメントに対して内部にハイブリダイズするフラグメント（ボーダーフラグメント）を産生する、説明的な制限酵素を使用して行った。制限酵素とプローブとの組み合わせに関する、サザンハイブリダイゼーションから示された分子量は、イベントに固有であり、その特定パターンを確立した。これらの分析は、プラスミドフラグメントが、ａａｄ−１２  ｖ１および２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１  ＰＴＵの再配列なしに、大豆ゲノムＤＮＡ内に挿入されたことも示した。
【０１４３】
実施例４．１：大豆葉試料の収集およびゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）単離
ゲノムＤＮＡを、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む個々の大豆植物体から収集した葉組織から抽出した。さらに、ｇＤＮＡを、従来の大豆植物である、Ｍａｖｅｒｉｃｋから単離した。Ｍａｖｅｒｉｃｋは、ａａｄ−１２  ｖ１および２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１遺伝子を含まない、実体株の代表である遺伝的背景を含む。個々のゲノムＤＮＡを、標準的なＣＴＡＢ法（Ｓｏｍｂｒｏｏｋら（１９８９））に従って、凍結乾燥した葉組織から抽出した。抽出後、そのＤＮＡを、ＰＩＣＯ  ＧＲＥＥＮ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、分光蛍光計により定量した。ついで、ＤＮＡを、アガロースゲル上で可視化して、ＰＩＣＯ  ＧＲＥＥＮ分析から濃度を確認し、ＤＮＡ品質を決定した。
【０１４４】
実施例４．２：ＤＮＡ消化および分離
大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のサザンブロット分子特徴付けのために、１０マイクログラム（１０μｇ）のゲノムＤＮＡを消化した。大豆ｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１および非遺伝子組換え大豆株であるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ１μｇあたり、おおよそ５ユニットの選択された制限酵素および対応する反応バッファーを、各ＤＮＡ試料に添加することにより消化した。各試料を、おおよそ３７℃で一晩、インキュベートした。制限酵素であるＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｓｉＩおよびＰａｃＩを、消化用に個々に使用した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。さらに、陽性ハイブリダイゼーション対照試料を、プラスミドＤＮＡであるｐＤＡＢ８２６４と、非遺伝子組換え大豆品種であるＭａｖｅｒｉｃｋ由来のゲノムＤＮＡとを組み合わせることにより調製した。プラスミドＤＮＡ／ゲノムＤＮＡ混合物を、試験試料と同じ手順および制限酵素を使用して消化した。消化後、一晩でインキュベートし、２５μＬ ＱＵＩＫ−ＰＲＥＣＩＰ  ＰＬＵＳ溶液（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を添加し、消化されたＤＮＡ試料を、イソプロパノールで沈殿させた。沈殿したＤＮＡペレットを、１５μＬ １×充填バッファー（０．０１％ ブロモフェノールブルー、１０．０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０．０％ グリセロール、１．０ｍＭ トリスｐＨ７．５）に再懸濁した。ついで、ＤＮＡ試料および分子サイズマーカーを、０．４× ＴＡＥバッファーを含む０．８５％ アガロースゲルにより、３５ボルトで、おおよそ１８〜２２時間電気泳動して、フラグメント分離を達成した。ゲルを、エチジウムブロマイドで染色し、ＤＮＡを、紫外線（ＵＶ）光下において可視化した。
【０１４５】
実施例４．３：サザントランスファーおよび膜処理
サザンブロット分析を、基本的に、Ｍｅｍｅｌｉｎｋら（１９９４）による記載の通りに行った。簡潔に、ＤＮＡフラグメントの電気泳動分離および可視化後、ゲルを、０．２５Ｍ ＨＣｌで、おおよそ２０分間脱プリン化し、ついで、変性溶液（０．４Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）に、おおよそ３０分間曝し、続けて、変性溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ トリスｐＨ７．５）に、少なくとも３０分間曝した。サザントランスファーを、１０× ＳＳＣを含むウィッキングシステムを使用して、ナイロン膜上に一晩で行った。トランスファー後、ＤＮＡを、ＵＶ架橋により、膜に結合させた後、２× ＳＳＣ溶液で膜を簡単に洗浄した。この処理により、ハイブリダイゼーション用のサザンブロット膜を生成した。
【０１４６】
実施例４．４：ＤＮＡプローブ標識およびハイブリダイゼーション
ナイロン膜に結合したＤＮＡフラグメントを、標識プローブを使用して検出した。遺伝子素子に特異的なプライマーを使用して、プラスミドｐＤＡＢ８２６４から増幅されたＤＮＡフラグメント内に、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ヌクレオチド、［ＤＩＧ−１１］−ｄＵＴＰのＰＣＲベースの取り込みにより、プローブを産生した（表６）。ＰＣＲ合成によるＤＮＡプローブの産生は、ＰＣＲ  ＤＩＧ  ＰＲＯＢＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、製造者が推奨する手順に従って行った。
【０１４７】
標識プローブを、アガロースゲル電気泳動により分析して、その品質および量を決定した。ついで、所望の量の標識プローブを、基本的に、ＤＩＧ  ＥＡＳＹ  ＨＹＢ溶液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に記載の通りの手順を使用する特異的フラグメントの検出用のナイロン膜上の標的ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに使用した。簡潔に、固定されたＤＮＡを含むナイロン膜ブロットを、２× ＳＳＣで簡単に洗浄し、ハイブリダイゼーションボトル中で２０〜２５ｍＬ 予め温めたＤＩＧ  ＥＡＳＹ  ＨＹＢ溶液で、おおよそ４５〜５５℃で、約２時間、ハイブリダイゼーションオーブンにおいて、プレハイブリダイズした。ついで、プレハイブリダイゼーション溶液をデカントし、おおよそ５分間の水浴でのボイルにより変性した、所望の量の特異的プローブを含む、約１５ｍＬの予め温めたＤＩＧ  ＥＡＳＹ  ＨＹＢ溶液で置き替えた。ついで、ハイブリダイゼーション工程を、ハイブリダイゼーションオーブンにおいて、おおよそ４５〜５５℃で、一晩行った。
【０１４８】
プローブハイブリダイゼーションの終了時に、プローブを含むＤＩＧ  ＥＡＳＹ  ＨＹＢ溶液を、清浄なチューブにデカントし、おおよそ−２０℃で保存した。これらのプローブを、製造者の推奨する手順に基づいて、二回再利用できた。膜のブロットを、簡単にゆすぎ、低ストリンジェンシー洗浄バッファー（２× ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）により、清浄なプラスチック容器において、室温でおおよそ５分間、２回洗浄し、続けて、高ストリンジェンシー洗浄バッファー（０．１× ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ）により、それぞれおおよそ６５℃で、１５分間、２回洗浄した。膜のブロットを、ＤＩＧ  ＷＡＳＨ  ＡＮＤ  ＢＬＯＣＫバッファーセット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）からの、１× マレイン酸バッファーで、おおよそ５分間、簡単に洗浄した。続けて、これを、１× ブロッキングバッファーにおいて２時間ブロッキングし、１× ブロッキングバッファー中の抗ＤＩＧ−ＡＰ（アルカリホスファターゼ）抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）においても、最短で３０分間インキュベートした。１× 洗浄バッファーで２〜３回洗浄後、特異的ＤＮＡプローブを、膜のブロットに結合したままにし、ＤＩＧ標識ＤＮＡ標準を、ＣＤＰ−ＳＴＡＲ  ＣＨＥＭＩＬＵＭＩＮＥＳＣＥＮＴ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を使用して、製造者の推奨に従って可視化した。ブロットを、１またはそれ以上の時点の間、化学発光フィルムに曝し、ハイブリダイズしたフラグメントを検出し、分子サイズ標準を可視化した。フィルムを、ＡＬＬ−ＰＲＯ  １００  ＰＬＵＳフィルム現像液（Ｋｏｎｉｃａ  Ｍｉｎｏｌｔａ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）により現像し、画像をスキャンした。検出されたバンドの数およびサイズを、各プローブに関して実証した。記載のように、ＤＩＧ検出後に可視化可能な、ＤＩＧ標識ＤＮＡ分子量マーカーＩＩ（ＤＩＧ  ＭＷＭ  ＩＩ）およびＤＩＧ標識ＤＮＡ分子量マーカーＶＩＩ（ＤＩＧ  ＭＷＭ  ＶＩＩ）を、サザンブロット上にハイブリダイズしているフラグメントのサイズを決定するのに使用した。
【表６】
2014523251.tif 000009
【０１４９】
実施例４．５：サザンブロットの結果
ａａｄ−１２  ｖ１および２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１  ＰＴＵの公知の制限酵素サイトに基づく、特定の消化およびプローブによる、予測および観察されたフラグメントサイズは、表７に与えられる。２種類のフラグメント：公知の酵素サイトが、プローブ領域に隣接し、ａａｄ−１２  ｖ１および２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１  ＰＴＵの挿入領域内に完全に含まれる、内部フラグメント、ならびに、公知の酵素サイトが、プローブ領域の少なくとも一方の端部に位置し、第２のサイトが、大豆ゲノム中に予測されるボーダーフラグメントを、これらの消化およびハイブリダイゼーションから特定した。ほとんどの場合、ＤＮＡフラグメント組み込みサイトが各イベントに固有であるため、ボーダーフラグメントのサイズは、イベントにより変動する。ボーダーフラグメントは、組み込まれたＤＮＡと比較して制限酵素サイトを配置し、ＤＮＡ挿入数を評価するための手段を提供する。サザンブロット分析を、プラスミドｐＤＡＢ８２６４からの低コピー、無傷のａａｄ−１２  ｖ１および２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１  ＰＴＵが、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の大豆ゲノム内に挿入されたことを示唆するデータを生成する、複数世代の大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１で完了した。
【表７】
2014523251.tif 000010
2014523251.tif 000011
【０１５０】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩは、プラスミドｐＤＡＢ８２６４における固有の制限サイトに結合し、同制限サイトを切断する。続けて、これらの酵素を、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１におけるａａｄ−１２  ｖ１遺伝子インサートを特徴付けるために選択した。ＨｉｎｄＩＩＩまたはＮｃｏＩそれぞれの消化後に、＞４０７８ｂｐまたは＞３６９０ｂｐのボーダーフラグメントが、プローブとハイブリダイズすると予測された（表７）。ＨｉｎｄＩＩＩまたはＮｃｏＩそれぞれを使用した場合、約４１００ｂｐおよび約６７００の単独のａａｄ−１２  ｖ１ハイブリダイゼーションバンドが観察された。それらのサイズのバンドに対するプローブのハイブリダイゼーションは、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のゲノムにおいて、ａａｄ−１２  ｖ１遺伝子用の、１つの挿入サイトの存在を示唆する。制限酵素ＮｓｉＩを、ａａｄ−１２  ｖ１植物転写ユニット（ＰＴＵ：プロモータ／遺伝子／ターミネータ）を含むフラグメントを放出するのに選択した（表７）。ＮｓｉＩ消化後に、予測された約４９００ｂｐのフラグメントが、プローブにより観察された。ｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１試料の酵素消化、続けて、プローブハイブリダイゼーションにより得られた結果は、プラスミドｐＤＡＢ８２６４由来の無傷のａａｄ−１２  ｖ１  ＰＴＵが、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のゲノム内に挿入されたことを示した。
【０１５１】
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩおよびＮｓｉＩは、プラスミドｐＤＡＢ８２６４における制限サイトに結合し、同制限サイトを切断する。続けて、これらの酵素を、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１における２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１遺伝子インサートを特徴付けるために選択した。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩおよびＮｓｉＩそれぞれの消化後に、＞４２６０ｂｐ、＞３７４９または＞５１９９ｂｐのボーダーフラグメントが、プローブとハイブリダイズすると予測された（表７）。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩおよびＮｓｉＩそれぞれを使用した場合、約５３００ｂｐ、１８０００および約７５００ｂｐの単独の２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１ハイブリダイゼーションバンドが観察された。このサイズのバンドに対するプローブのハイブリダイゼーションは、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のゲノムにおいて、２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１遺伝子用の、１つの挿入サイトの存在を示唆する。制限酵素ＰａｃＩを、２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１植物転写ユニット（ＰＴＵ：プロモータ／遺伝子／ターミネータ）を含むフラグメントを放出するのに選択した（表７）。ＰａｃＩ消化後に、予測された約６７００ｂｐのフラグメントが、プローブにより観察された。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１試料の酵素消化、続けて、プローブハイブリダイゼーションにより得られた結果は、プラスミドｐＤＡＢ８２６４由来の無傷の２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１  ＰＴＵが、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の大豆ゲノム内に挿入されたことを示した。
【０１５２】
実施例４．６：バックボーン配列の不存在
サザンブロット分析を、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１に、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子（ｓｐｅｃＲ）、Ｏｒｉ  Ｒｅｐ要素および複製開始タンパク質ｔｒｆＡ（ｔｒｆＡ要素）が存在しないことを検証するためにも行った。スペクチノマイシン抵抗性、Ｏｒｉ  Ｒｅｐ要素またはｔｒｆＡ要素に対する特異的なハイブリダイゼーションは、適切な陽性（ＭａｖｅｒｉｃｋのゲノムＤＮＡに追加されたｐＤＡＢ８２６４プラスミドＤＮＡ）および陰性（ＭａｖｅｒｉｃｋのゲノムＤＮＡ）の対照がサザン分析用に含まれる場合、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１試料において予測されない。ＨｉｎｄＩＩＩまたはＮｃｏＩ消化およびｓｐｅｃＲ特異的プローブによるハイブリダイゼーション後、約９３００ｂｐまたは約５２００ｂｐの１つの予測されたサイズのバンドがそれぞれ、陽性対照試料（ＭａｖｅｒｉｃｋのゲノムＤＮＡに追加されたｐＤＡＢ８２６４）において観察された。ｓｐｅｃＲプローブは、陰性対照および大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の試料に、ハイブリダイズしなかった。同様に、ＮｃｏＩ消化およびＯｒｉＲｅｐ特異的プローブによるハイブリダイゼーション後、約７４００ｂｐの１つの予測されたサイズのバンドが、陽性対照試料（ＭａｖｅｒｉｃｋのゲノムＤＮＡに追加されたｐＤＡＢ８２６４）において検出されたが、陰性対照および大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の試料からは検出されなかった。さらに、ＨｉｎｄＩＩＩ消化およびｔｒｆＡ特異的プローブによるハイブリダイゼーション後、約９，３００ｂｐの１つの予測されたサイズのバンドが、陽性対照試料（ＭａｖｅｒｉｃｋのゲノムＤＮＡに追加されたｐＤＡＢ８２６４）において検出されたが、陰性対照および大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の試料からは検出されなかった。これらのデータは、スペクチノマイシン抵抗性遺伝子、Ｏｒｉ  Ｒｅｐ要素および複製開始タンパク質ｔｒｆＡが、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１に存在しないことを示す。
【０１５３】
実施例５：農学的および収量のフィールド試験ならびに除草剤耐性
反復的な農学的試験を、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の農学的特徴を評価するのに行った。フィールド試験の大部分において、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む大豆品種を栽培する、米国全体を通して区別できる地理的ロケーションで植えた。３セットの実験を完了した。第１シリーズの実験は、除草剤を噴霧しなかった大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１植物と比較して、除草剤２，４−Ｄおよびグリホサートを噴霧した大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１植物の農学的効率を比較した。第２シリーズの実験は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１植物の農学的効率を、近い同質遺伝子系統のＭａｖｅｒｉｃｋ対照植物と比較した。最後に、第３シリーズの実験を、グルホシネートの散布に対する、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１植物の耐性を検証するために完了させた。
【０１５４】
第１の実験は、噴霧しなかった大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１植物に対して、２，４−Ｄジメチルアミン塩（Ｗｅｅｄａｒ  ６４、Ｎｕｆａｒｍ、Ｂｕｒｒ  Ｒｉｄｇｅ、ＩＬ）を１１２０ｇ ａｅ／ｈで噴霧され、および、グリホサート（Ｄｕｒａｎｇｏ、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を１１２０ｇ ａｅ／ｈａで噴霧された、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１植物を比較した。除草剤処理を、Ｖ３およびＲ２生長段階で適用した。噴霧および非噴霧のセクションからなるフィールド試験を、２つの別々の生長年に関して、完全な乱塊法計画として配置した。２０１０年のフィールド試験は、各ブロックにおける２５エントリーあたりに、２回の反復からなった。２０１１年のフィールド試験は、各ブロックにおける２６エントリーあたりに、４回の反復からなった。両実験に関して、各プロットは、２列、長さ１２．５フィートからなり、プロット間の２．５フットのレーンにより、３０インチ離して植えた。季節を通して、フィールドプロットを、通常の農耕法下において維持し、雑草がない状態にしておいた。季節を通して、多くの農学的特徴を測定した。データを収集した時のこれらの特徴および生長段階を、表８に列記した。
【表８】
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【０１５５】
生長時期の最後に、全てのロケーションからのデータを組み合わせ、ロケーションをまたぐ分析を行った。データ分析を行い、分析からの最小二乗法を、種々の作物特徴に関して、表９に報告する。明らかな入口効果が測定された変数に関して、噴霧されたおよび噴霧されていない大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１植物間の比較を行うために、後の平均分離を、スチューデントＴ検定を使用して行った。有意性を決定するための確率水準を、ｐ＝０．０５に設定した。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１は、２，４−Ｄとグリホサートとのタンク混合に対して耐性を示した。対照的に、２，４−Ｄとグリホサートとのタンク混合を噴霧されたＭａｖｅｒｉｃｋ植物は、除草剤処理に対する耐性がなかった。
【表９】
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【０１５６】
大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１は、Ｖ３およびＲ２段階の生長発達の両方において、グリホサートおよび２，４−Ｄのタンク混合散布に対する、強い耐性を提供した。除草剤が最初に散布された時、わずかな傷害があったが、植物は、有意に傷害されず、散布後１４日までに傷害応答を生じなかった。１００個の種子重量および疾患の発生率以外の測定された全ての形質は、除草剤で処理された大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１植物と、除草剤で処理されなかった大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１植物との間で、同等であった。このため、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１植物に対する、２，４−Ｄおよびグリホサートのフィールド量の散布は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１植物の農業生産力に有害であろう、農学的特徴または形質の任意の有意義な変化をもたらさない。
【０１５７】
第２の実験は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１と、近い同質遺伝子系統のＭａｖａｒｉｃｋ対照植物との間の選択した農学的特徴に関する農業生産力を比較した。フィールド試験を、２つの別々の生長年に関して、完全な乱塊法計画として配置した。２０１０年のフィールド試験は、各ブロックにおける２５エントリーあたりに、２回の反復からなった。２０１１年のフィールド試験は、各ブロックにおける２６エントリーあたりに、４回の反復からなった。両実験に関して、各プロットは、２列、長さ１２．５フィートからなり、プロット間の２．５フットのレーンにより、３０インチ離して植えた。季節を通して、フィールドプロットを、通常の農耕法下において維持し、雑草がない状態にしておいた。季節を通して、多くの農学的特徴を測定した。データを収集した時のこれらの特徴および生長段階を、表８に列記した。
【０１５８】
生長時期の最後に、全てのロケーションからのデータを組み合わせ、ロケーションをまたぐ分析を行った。データ分析を行い、分析からの最小二乗法を、種々の作物特性に関して、表１０に報告する。明らかな入口効果が測定された変数に関して、Ｍａｖｅｒｉｃｋと大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１との間の比較を行うために、後の平均分離を、スチューデントＴ検定を使用して行った。有意性を決定するための確率水準を、ｐ＝０．０５に設定した。
【表１０】
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【０１５９】
種子の着色以外の測定された全ての形質は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１とＭａｖｅｒｉｃｋとの間で、同等であった。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１植物は、１．３の種子着色評価をもたらしたＭａｖｅｒｉｃｋと比較して、１．８の種子着色評価をもたらした。この差は、生産者にとって重大な差ではなく、作物の性能を損なわず、この差は、作物の性能を損なうであろう、有意義な農学的差異をもたらさないであろう。結果は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１が、同じ農学的特徴に関して、Ｍａｖｅｒｉｃｋとは異なって発展し得ることを示すが、差は、最小限であり、商業的に栽培される大豆の正常な範囲の外側ではない。
【０１６０】
大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のグルホシネート除草剤耐性を試験するために、イベントを、２０１０年の生長時期の間に、インディアナにおける有効性試験において、種まきした。大豆イベントｐＤＡＢ９５８２．８１６．１５．１を産生するために最初に形質転換された、栽培品種Ｍａｖｅｒｉｃｋを、各苗床に種まきし、本実験における対照として含めた。イベントを、試験における同じ段階であり、４回の反復からなる、他のイベントとランダム化した。Ｍａｖｅｒｉｃｋを、非形質転換対照として含めた。試験を、全プロットとしての処理および分割プロットとしてのイベントを含む、改良された分割法として設定した。８２２ｇ ａｅ／ｈａで散布されたグルホシネート処理および非噴霧対照処理を、大豆植物に適用した。処理を、Ｖ５およびＲ２の生長段階に適用した。除草剤耐性を、処理後６時間から７日での、傷害に関して植物を評価することにより測定した。白化、葉の壊死および植物の枯死を目視で探すことにより、傷害を評価した。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１は、グルホシネート除草剤散布に対して、強い耐性を示した。対照的に、Ｍａｖｅｒｉｃｋ植物は、除草剤処理に対する耐性がなかった。
【０１６１】
実施例６：イベント特異的ＴａｑＭａｎアッセイ
イベント特異的ＴＡＱＭＡＮアッセイを、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の存在を検出し、育種群における植物の接合状態を判定するために開発した。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１は、バイナリーベクターｐＤＡＢ８２６４のＴ鎖を含む（図４）。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の特異的な検出のために、特異的ＴＡＱＭＡＮプライマーおよびプローブを、５’（配列番号１９）または３’（配列番号２０）インサート〜植物ジャンクションに配置されるＤＮＡ配列（図４）に基づいて設計した。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１に関する、１つのイベント特異的アッセイを、２つのプライマーと、その５’末端にＦＡＭレポータを含むＡｐｌｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）により合成された標的特異的ＭＧＢプローブとを使用して、３’組み込みジャンクションをまたぐ１３１ｂｐのＤＮＡフラグメントを特異的に検出するために設計した。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１に関する、このＴＡＱＭＡＮ検出法の特異性を、２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１およびａａｄ−１２  ｖ１  ＰＴＵを含む１１種類のイベント、ならびに、対照の非遺伝子組換え大豆品種（Ｍａｖｅｒｉｃｋ）に対して、大豆特異的な内因性参照遺伝子である、ＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９（ダイズ（Glycine max）ｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫ２８６２９２．１）との二重方式において試験した。
【０１６２】
実施例６．１：ｇＤＮＡ単離
１１種類の大豆イベントおよび非遺伝子組換え大豆品種のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料を、この研究において試験した。ゲノムＤＮＡを、改良されたＱｉａｇｅｎ  ＭＡＧＡＴＴＲＡＣＴ  ＰＬＡＮＴ  ＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して抽出した。新鮮な大豆のリーフディスクを、試料あたりに８つ、ｇＤＮＡ抽出に使用した。試料を、ＤＮａｓｅフリー水で希釈し、この研究の目的のための、おおよそ１０ｎｇ／μＬの濃度にした。
【０１６３】
実施例６．２：ＴａｑＭａｎアッセイおよび結果
特異的ＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブを、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１特異的ＴａｑＭａｎアッセイ用に設計した。これらの試薬を、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を検出するために、以下に列記された条件で使用し得る。表１１は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を検出するために特別に開発された、プライマーおよびプローブの配列を列記する。
【表１１】
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【０１６４】
増幅に関するマルチプレックスＰＣＲ条件は、下記：１０μＬの合計反応において、１× Ｒｏｃｈｅ  ＰＣＲバッファー、０．４μＭ イベント特異的フォワードプライマー、０．４μＭ イベント特異的リバースプライマー、０．４μＭ プライマーＧＭＳ１１６Ｆ、０．４μＭ プライマーＧＭＳ１１６Ｒ、０．２μＭ イベント特異的プローブ、０．２μＭ ＧＭＳ１１６プローブ、０．１％ ＰＶＰ、６〜２０ｎｇ ｇＤＮＡの通りである。混合物を、下記条件：ｉ）９５℃で１０分間、ｉｉ）９５℃で１０秒間、ｉｉｉ）６０℃で４０秒間、ｉｖ）工程ｉｉ〜ｉｉｉを４０サイクル繰り返す、ｖ）４０℃を保持、を使用して増幅した。リアルタイムＰＣＲを、ＲＯＣＨＥ  ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ  ４８０において行った。データ分析は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ  ４８０ソフトウェアにより決定されるクロッシングポイント（Ｃｐ値）の測定に基づいた。Ｃｐ値は、蛍光における変化の割合がその最大に達するＰＣＲのサイクル数である。
【０１６５】
大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１用のＴＡＱＭＡＮ検出法を、２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１およびａａｄ−１２  ｖ１  ＰＴＵを含む１１種類のイベント、ならびに、非遺伝子組換え大豆品種に対して、大豆特異的な内因性参照遺伝子である、ＧＭＦＬ０１−２５−Ｊ１９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＫ２８６２９２．１）との二重方式において試験した。アッセイは、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を特異的に検出し、対照（すなわち、２ｍＥＰＳＰＳ  ｖ１およびａａｄ−１２  ｖ１  ＰＴＵを含む１１種類のイベント、ならびに、非遺伝子組換え大豆品種）に起因する任意の偽陽性を産生または増幅しなかった。イベント特異的プライマーおよびプローブを、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の検出に使用することができ、これらの条件および試薬を、接合性アッセイに適用可能である。
【０１６６】
実施例７：大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の予測配列
配列番号１８は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の予測配列を提供する。この配列は、５’ゲノムフランキング配列、ｐＤＡＢ８２６４の予測されたＴ鎖インサートおよび３’ゲノムフランキング配列を含む。配列番号１８に関して、残基１〜１２４６は、５’ゲノムフランキング配列であり、残基１２４７〜１１５０７は、ｐＤＡＢ８２６４のＴ鎖インサートの残基であり、残基１１５０８〜１２０１１は、３’ゲノムフランキング配列である。このため、インサートの５’末端に関するジャンクション配列またはトランジションは、配列番号１８の残基１２４６〜１２４７に存在する。このため、インサートの３’末端に関するジャンクション配列またはトランジションは、配列番号１８の残基１１５０７〜１１５０８に存在する。
【０１６７】
配列番号１８が、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の予測表示であり、配列番号１９、配列番号２０およびｐＤＡＢ８２６４のｔ−鎖のアライメントから組み立てられたことに留意すべきである。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のＴ鎖インサートの実際の配列は、配列番号１８とわずかにずれる場合がある（例えば、残基１２４７〜１１５０７）。植物細胞のゲノム内にＴ鎖インサートを導入する形質転換過程中に、インサートの一部の欠損または他の変化が起こることは、珍しいことではない。さらに、小さなシークエンシングエラーをもたらし得る、ＰＣＲ増幅におけるエラーが起こり得る。例えば、本願明細書で列記したフランキング配列を、大豆ゲノムＤＮＡ由来の増幅産物を産生し、ついで、増幅産物をクローニングおよびシークエンスすることにより決定した。ゲノムＤＮＡからのシークエンシングに対して十分な増幅産物を産生するのに必要である多くのラウンドの増幅を考えると、この方法において産生され、決定された配列において、わずかな差および小さな食い違いを発見することは珍しいことではない。これらの種類の一般的なシークエンシングエラーまたは食い違いにより必要となる任意の調節は、本主題の発明の範囲内であることを、当業者は認識し、気づくはずである。このため、本願明細書で提供されたプラスミド配列の関連するセグメントは、一部の小さな変異を含んでもよい。このため、一部の範囲における、本主題のインサート配列との同一性を有するポリヌクレオチドを含む植物体は、本主題の発明の範囲内である。配列番号１８の配列に対する同一性、または、本願明細書に記載の任意のそのセグメントは、本願明細書に例示または記載の配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列であり得る。インサート配列に加えて、フランキング配列の配列は、寄託された種子を参照して、確認され得る。このため、配列番号１８と、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の実際のＴ鎖インサートとの一部の差が、特定される場合があり、本発明の範囲内である。
【０１６８】
実施例８：標的組み込み用の大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の挿入サイトの使用
フィールド条件下における数世代にわたる、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の導入遺伝子の一致した農業生産力は、１５番染色体上の大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１挿入サイト付近のこれらの特定された領域が、当該他の遺伝子組換え遺伝子の標的組み込みのための、良好なゲノム位置を提供する。このような標的組み込みは、「位置効果」と呼ばれる課題、および、宿主への導入遺伝子の組み込みによるゲノムにおける変異作製のリスクを克服する。このような標的組み込みの更なる利点としては、制限されず、宿主ゲノムにおける重要な遺伝子座内への導入遺伝子の不適切な挿入に起因する異常を示すこともなく、所望のレベルの導入遺伝子発現を示す遺伝子組換え植物体を取得する前にスクリーニングし、試験されなければならない大量の形質転換イベントを減少させることが挙げられる。さらに、このような標的組み込みは、より有能な両遺伝子を有するエリートの植物株の育種を提供する、導入遺伝子の積み重ねを可能にする。
【０１６９】
本開示の教示を使用して、当業者は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１における、同じ挿入サイトに対して、または、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１における、挿入サイトに近接するサイトに対して、さらに、当該核酸を標的にすることができる。このような方法の１つは、国際公開第２００８／０２１２０７号に開示されており、その内容は参照により本願明細書に組み込まれる。
【０１７０】
簡潔に、挿入サイトに対する５’に隣接する２０Ｋｂ以下のゲノム配列、および、挿入サイトに対する３’に隣接する２０Ｋｂ以下のゲノム配列である、配列番号１８は、相同組換えを介して、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のゲノム内に挿入されることが意図される当該１またはそれ以上の遺伝子を、側部に位置させるために使用される。当該１またはそれ以上の遺伝子は、植物における有害作用なしに、一致したレベルの導入遺伝子発現を付与するために、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の挿入サイトに正確に配置され得るか、または、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の挿入サイト付近の２０Ｋｂ以内の箇所に配置され得る。当該１またはそれ以上の遺伝子およびフランキング配列を含むＤＮＡベクターは、当業者に公知の複数の方法の１つ、例えば、制限されず、アグロバクテリウム媒介性形質転換により、植物細胞内に輸送され得る。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の標的サイトへのドナーＤＮＡベクターの挿入は、複数の方法の１つ、例えば、制限されず、組換え向上遺伝子の共発現もしくは上方制御、または、内因性組換え抑制遺伝子の下方制御により、さらに向上され得る。
【０１７１】
さらに、ゲノムにおける特定の配列の二本鎖切断が、相同組換え頻度を向上するのに使用され得ることは、当分野において公知である。このため、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１の挿入サイトおよびそのフランキング領域への挿入は、これらの配列を切断するための天然または設計された配列特異的エンドヌクレアーゼの発現により向上され得る。したがって、本願明細書で提供される教示を使用して、任意の相同な核酸が、配列番号１と配列番号２との間、もしくは、配列番号１および配列番号２の近辺に、ならびに、一部の例では、配列番号１８内もしくは配列番号１８の近辺に位置する標的サイトに挿入され得る。
【０１７２】
実施例９：大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１からのｐａｔ遺伝子発現カセットの切除
選択的マーカー遺伝子発現カセットの除去は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１への標的挿入に有利であり得る。大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１からのｐａｔ選択的マーカーの除去は、後の世代の大豆における、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１のゲノム位置への、ポリ核酸の標的組み込みにおける、ｐａｔ選択的マーカーの再利用を可能にする。
【０１７３】
本開示の教示を使用して、当業者は、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１から、当該ポリ核酸を切除することができる。このような方法の１つは、米国特許出願特願第１３／０１１，６６６号に開示されており、その内容は参照により本願明細書に組み込まれる。
【０１７４】
簡潔に、配列特異的エンドヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、遺伝子発現カセットに隣接する特異的ＤＮＡ配列を認識、結合および切断するように設計される。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、大豆イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１を含む第２の親植物体に対する、遺伝子組換えジンクフィンガーヌクレアーゼ発現カセットを含む親植物体の交雑により、植物細胞内に送達される。得られた子孫を成熟させ、グルホシネートを含む除草剤を葉に塗ることにより、ｐａｔ発現カセットを失ったことに関して分析する。除草剤に対する抵抗性がない得られた子孫を、分子的に確認し、自家受粉に進めた。ｐａｔ発現カセットの切除または除去は、自家受粉から得られた子孫において、分子的に確認される。本願明細書で提供される教示を使用して、任意のヘテロ接合性核酸が、配列番号１と配列番号２との間、好ましくは、配列番号１８内に位置する標的サイトにおける、大豆の１５番染色体から切除され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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