(57)【要約】  メガヌクレアーゼ由来の標的化対象転写エフェクター（転写活性化因子および転写抑制因子）を記載する。また、該エフェクターをコードする核酸、および遺伝子発現を調節するための該エフェクターの使用方法を記載する。標的化対象転写エフェクターは、（ｉ）標的認識部位に結合するエンドヌクレアーゼ切断活性のないメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン；および（ｉｉ）転写エフェクタードメインを含むものであり得る。【選択図】図６
2011519558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）標的認識部位に結合する不活性メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン；および（ｉｉ）転写エフェクタードメインを含む標的化対象転写エフェクターであって、目的遺伝子に対する該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインの結合により、該転写エフェクターが該目的遺伝子に標的化される、標的化対象転写エフェクター。
【請求項２】
さらに、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインと該転写エフェクタードメインを連接するドメインリンカーを含む、請求項１に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項３】
該ドメインリンカーがポリペプチドを含む、請求項２に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項４】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが、エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする少なくとも１つの点変異によって天然型メガヌクレアーゼを改変したものである、請求項１に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項５】
さらに核局在シグナルを含む、請求項１に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項６】
転写エフェクタードメインが転写活性化因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
転写エフェクタードメインが転写抑制因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、少なくとも一方の認識配列片側部位に対し、野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５からなる群より選択されるＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ認識配列の片側部位と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列片側部位に対して特異性を有し；
前記組換えメガヌクレアーゼが、表１の少なくとも１つの修飾と、前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾とを含む、
請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項９】
前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾がＱ４７Ｅである、請求項８に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項１０】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、少なくとも一方の認識配列片側部位に対し、野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択されるＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ認識配列の片側部位と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列片側部位に対して特異性を有し；
前記組換えメガヌクレアーゼが、表２の少なくとも１つの修飾と、前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾とを含む、
請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項１１】
前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾がＤ２２Ｎである、請求項１０に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項１２】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、認識配列に対し、野生型Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：９のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの残基３〜１８６に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：１０および配列番号：１１のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識配列と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列に対して特異性を有し；
前記組換えメガヌクレアーゼが、表３の少なくとも１つの修飾と、前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾とを含む、
請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項１３】
前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾がＤ４４ＮまたはＤ１４５Ｎである、請求項１２に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項１４】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、少なくとも一方の認識配列片側部位に対し、野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：１３および配列番号：１４からなる群より選択されるＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ認識配列の片側部位と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列片側部位に対して特異性を有し；
前記組換えメガヌクレアーゼが、表４の少なくとも１つの修飾と、前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾とを含む、
請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項１５】
前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾がＥ６６Ｑである、請求項１４に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項１６】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、少なくとも一方の認識配列片側部位に対し、野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５からなる群より選択されるＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ認識配列の片側部位と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列片側部位に対して特異性を有し；
ここで：
（１）−１位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＱ７０、Ｃ７０、Ｌ７０、Ｙ７５、Ｑ７５、Ｈ７５、Ｈ１３９、Ｑ４６およびＨ４６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＡに対するＹ７５、Ｌ７５、Ｃ７５、Ｙ１３９、Ｃ４６およびＡ４６からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ７０、Ｅ７０、Ｅ７５、Ｅ４６およびＤ４６からなる群より選択される修飾によって；
（ｄ）センス鎖のＣに対するＨ７５、Ｒ７５、Ｈ４６、Ｋ４６およびＲ４６からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｅ）センス鎖の任意の塩基に対するＧ７０、Ａ７０、Ｓ７０およびＧ４６からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（２）−２位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＱ７０、Ｔ４４、Ａ４４、Ｖ４４、１４４、Ｌ４４およびＮ４４からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ７０、Ｄ７０、Ｋ４４およびＲ４４からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＧに対するＨ７０、Ｄ４４およびＥ４４からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｄ）センス鎖のＡもしくはＴに対して、Ｃ４４を含む修飾によって
改変されている；および／または
（３）−３位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＱ６８およびＣ２４からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ６８、Ｆ６８、Ｋ２４およびＲ２４からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＴに対するＭ６８、Ｃ６８、Ｌ６８およびＦ６８からなる群より選択される修飾によって；
（ｄ）センス鎖のＡもしくはＣに対するＨ６８を含む修飾によって；
（ｅ）センス鎖のＣもしくはＴに対するＹ６８を含む修飾によって；もしくは
（ｆ）センス鎖のＧもしくはＴに対するＫ６８を含む修飾によって
改変されている；および／または
（４）−４位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ７７およびＫ２６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＥ２６およびＲ７７からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＣもしくはＴに対するＳ７７を含む修飾によって；もしくは
（ｄ）センス鎖の任意の塩基に対するＳ２６を含む修飾によって
改変されている；および／または
（５）−５位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ４２を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＲ４２を含む修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＡもしくはＧに対して、Ｃ２８およびＱ４２からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｄ）センス鎖の任意の塩基に対するＭ６６およびＫ６６からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または  
（６）−６位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＣ４０、Ｉ４０、Ｖ４０、Ｃ７９、Ｉ７９、Ｖ７９およびＱ２８からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ４０およびＲ２８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＲ４０を含む修飾によって
改変されている；および／または
（７）−７位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ３８、Ｋ３０およびＲ３０からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＫ３８、Ｒ３８およびＥ３０からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＴに対するＩ３８およびＬ３８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｄ）センス鎖のＡもしくはＧに対して、Ｃ３８を含む修飾によって；もしくは
（ｅ）センス鎖の任意の塩基に対するＨ３８、Ｎ３８およびＱ３０からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（８）−８位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＬ３３、Ｖ３３、Ｉ３３、Ｆ３３およびＣ３３からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ３３およびＤ３３からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ３３からなる修飾によって；
（ｄ）センス鎖のＡもしくはＣに対するＲ３２を含む修飾によって；もしくは
（ｅ）センス鎖のＡもしくはＧに対して、Ｒ３３を含む修飾によって
改変されている；および／または
（９）−９位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ３２を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＲ３２およびＫ３２からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＴに対するＬ３２、Ｖ３２、Ａ３２およびＣ３２からなる群より選択される修飾によって；
（ｄ）センス鎖のＣもしくはＴに対するＤ３２およびＩ３２からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｅ）センス鎖の任意の塩基に対するＳ３２、Ｎ３２、Ｈ３２、Ｑ３２およびＴ３２からなる群より選択される修飾によって改変されている、
請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項１７】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、少なくとも一方の認識配列片側部位に対し、野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択されるＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ認識配列の片側部位と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列片側部位に対して特異性を有し；
ここで：
（１）−１位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＫ７５、Ｑ７７、Ａ４９、Ｃ４９およびＫ７９からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＣ７７、Ｌ７７およびＱ７９からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ７７、Ｒ７７、Ｅ４９およびＥ７９からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（２）−２位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＱ７５、Ｋ８１、Ｃ４７、Ｉ４７およびＬ４７からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ７５、Ｄ７５、Ｒ４７、Ｋ４７、Ｋ８１およびＲ８１からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ７５、Ｅ４７およびＥ８１からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（３）−３位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＱ７２、Ｃ２６、Ｌ２６、Ｖ２６、Ａ２６およびＩ２６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ７２、Ｙ７２、Ｈ２６、Ｋ２６およびＲ２６からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＴに対するＫ７２、Ｙ７２およびＨ２６からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（４）−４位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＫ２８、Ｋ８３およびＱ２８からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＲ８３およびＫ８３からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＫ２８およびＱ８３からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（５）−５位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＧに対するＲ４５およびＥ２８からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するを含む修飾  Ｑ２８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＣに対するＲ２８を含む修飾によって
改変されている；および／または
（６）−６位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＫ４３、Ｖ８５、Ｌ８５およびＱ３０からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ４３、Ｅ８５、Ｋ３０およびＲ３０からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＲ４３、Ｋ４３、Ｋ８５、Ｒ８５、Ｅ３０およびＤ３０からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（７）−７位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ３２およびＥ４１からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＲ３２、Ｒ４１およびＫ４１からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＴに対するＫ３２、Ｍ４１、Ｌ４１およびＩ４１からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（８）−８位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＫ３２およびＫ３５からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ３２を含む修飾によってからなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ３２、Ｋ３５およびＲ３５からなる修飾によって
改変されている；および／または
（９）−９位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＮ３４およびＨ３４からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＳ３４、Ｃ３４、Ｖ３４、Ｔ３４およびＡ３４からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ３４、Ｒ３４およびＨ３４からなる群より選択される修飾によって改変されている、
請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項１８】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、認識配列に対し、野生型Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：９のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの残基３〜１８６に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：１０および配列番号：１１のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識配列と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列に対して特異性を有し；
ここで：
（１）４位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＫ５０を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＫ５７、Ｍ５７およびＱ５０からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＥ５０、Ｒ５７およびＫ５７からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（２）５位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＫ４８、Ｑ１０２からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＥ４８、Ｋ１０２およびＲ１０２からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＴに対するＱ４８、Ｃ１０２、Ｌ１０２およびＶ１０２からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（３）６位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するを含む修飾  Ｋ５９からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＲ５９およびＫ５９からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｂ）センス鎖のＧに対するＫ８４およびＥ５９からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（４）７位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＲ４６、Ｋ４６およびＥ８６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＫ８６、Ｒ８６およびＥ４６からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＣ４６、Ｌ４６およびＶ４６からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（５）８位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ８８、Ｒ６１およびＨ６１からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＫ８８、Ｑ６１およびＨ６１からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＫ６１、Ｓ６１、Ｖ６１、Ａ６１およびＬ６１からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（６）９位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＣ９８、Ｖ９８およびＬ９８からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＲ９８およびＫ９８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＥ９８およびＤ９８からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（７）１０位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＫ９６およびＲ９６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＤ９６およびＥ９６からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＣ９６およびＡ９６からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（８）１１位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＱ９０を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＫ９０およびＲ９０からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＥ９０を含む修飾によって
改変されている；および／または
（９）１２位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＱ１９３を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ１６５、Ｅ１９３およびＤ１９３からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ１６５およびＲ１６５からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（１０）１３位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＱ１９３、Ｃ１６３およびＬ１６３からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＥ１９３、Ｄ１９３、Ｋ１６３およびＲ１９２からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＣ１９３およびＬ１９３からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（１１）１４位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＫ１６１およびＱ１９２からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＡに対するＬ１９２およびＣ１９２からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ１４７、Ｋ１６１、Ｒ１６１、Ｒ１９７、Ｄ１９２およびＥ１９２からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｄ）センス鎖のＴに対するＫ１６１およびＱ１９２からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（１２）１５位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＣ１５１、Ｌ１５１およびＫ１５１からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＫ１５１を含む修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＣに対するＥ１５１を含む修飾によって
改変されている；および／または
（１３）１７位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＧ１５２およびＱ１５０からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＫ１５２およびＫ１５０からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＮ１５２、Ｓ１５２、Ｄ１５２、Ｄ１５０およびＥ１５０からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または  
（１４）１８位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＨ１５５およびＹ１５５からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＲ１５５およびＫ１５５からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＫ１５５およびＣ１５５からなる群より選択される修飾によって改変されている、
請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項１９】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、少なくとも一方の認識配列片側部位に対し、野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：１３および配列番号：１４からなる群より選択されるＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ認識配列の片側部位と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列片側部位に対して特異性を有し；
ここで：
（１）−１位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＣ９２、Ａ９２およびＶ９２からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＱ１１６およびＱ９２からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＥ１１６およびＥ９２からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（２）−２位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＱ１１７、Ｃ９０、Ｌ９０およびＶ９０からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＫ１１７、Ｒ１２４、Ｋ１２４、Ｅ１２４、Ｅ９０およびＤ９０からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＣに対するＥ１１７、Ｄ１１７、Ｒ１７４、Ｋ１２４、Ｋ９０、Ｒ９０およびＫ６８からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または  
（３）−３位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＣ７０、Ｖ７０、Ｔ７０、Ｌ７０およびＫ７０からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＱ７０を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＫ７０からなる修飾によって
改変されている；および／または
（４）−４位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ１２６、Ｄ１２６、Ｒ８８、Ｋ８８およびＫ７２からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＫ１２６、Ｌ１２６およびＱ８８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＱ１２６、Ｎ１２６、Ｋ８８、Ｌ８８、Ｃ８８、Ｃ７２、Ｌ７２およびＶ７２からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（５）−５位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＧに対するＥ７４、Ｋ１２８、Ｒ１２８およびＥ１２８からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＣ１２８、Ｌ１２８、Ｖ１２８およびＴ１２８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＣ７４、Ｌ７４、Ｖ７４およびＴ７４からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（６）−６位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＫ８６、Ｃ８６およびＬ８６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＤ８６、Ｅ８６、Ｒ８４およびＫ８４からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ１２８、Ｒ１２８、Ｒ８６、Ｋ８６およびＥ８４からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（７）−７位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＲ７６、Ｋ７６およびＨ７６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＥ７６およびＲ８４からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＴに対するＨ７６およびＱ７６からなる修飾によって
改変されている；および／または
（８）−８位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＹ７９、Ｒ７９およびＱ７６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＤ７９、Ｅ７９、Ｄ７６およびＥ７６からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＲ７９、Ｋ７９、Ｋ７６およびＲ７６からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（９）−９位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＫ７８、Ｖ７８、Ｌ７８、Ｃ７８およびＴ７８からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＤ７８およびＥ７８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＨ７６およびＱ７６からなる修飾からなる群より選択される修飾によって改変されている、
請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項２０】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｅ８０、Ｄ１３７、Ｉ８１、Ｌ１１２、Ｐ２９、Ｖ６４もしくはＹ６６のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＫもしくはＲによる置換；または
（ｂ）Ｔ４６、Ｔ１４０もしくはＴ１４３のＫもしくはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって増大している、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項２１】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｋ３４、Ｋ４８、Ｒ５１、Ｋ８２、Ｋ１１６もしくはＫ１３９のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｉ８１、Ｌ１１２、Ｐ２９、Ｖ６４、Ｙ６６、Ｔ４６、Ｔ１４０もしくはＴ１４３のＤもしくはＥによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって低下している、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項２２】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｅ１４７、Ｉ８５、Ｇ８６もしくはＹ１１８のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＫもしくはＲによる置換；または
（ｂ）Ｑ４１、Ｎ７０、Ｓ８７、Ｔ８８、Ｈ８９、Ｑ１２２、Ｑ１３９、Ｓ１５０もしくはＮ１５２のＫもしくはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって増大している、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項２３】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｋ３６、Ｒ５１、Ｋ１２３、Ｋ１４３もしくはＲ１４４のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｉ８５、Ｇ８６、Ｙ１１８、Ｑ４１、Ｎ７０、Ｓ８７、Ｔ８８、Ｈ８９、Ｑ１２２、Ｑ１３９、Ｓ１５０もしくはＮ１５２のＤもしくはＥによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって低下している、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項２４】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：９のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの残基３〜１８６に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｄ２０１、Ｌ１９、Ｌ８０、Ｌ９２、Ｙ１５１、Ｙ１８８、Ｉ１９１、Ｙ１９９もしくはＹ２２２のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＫもしくはＲによる置換；または
（ｂ）Ｎ１５、Ｎ１７、Ｓ８１、Ｈ８４、Ｎ９４、Ｎ１２０、Ｔ１５６、Ｎ１５７、Ｓ１５９、Ｎ１６３、Ｑ１６５、Ｓ１６６、Ｎ１９４もしくはＳ２０２のＫまたはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって増大している、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項２５】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：９のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの残基３〜１８６に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｋ２０、Ｋ２３、Ｋ６３、Ｋ１２２、Ｋ１４８、Ｋ１５３、Ｋ１９０、Ｋ１９３、Ｋ１９５もしくはＫ２２３のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｌ１９、Ｌ８０、Ｌ９２、Ｙ１５１、Ｙ１８８、Ｉ１９１、Ｙ１９９、Ｙ２２２、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｓ８１、Ｈ８４、Ｎ９４、Ｎ１２０、Ｔ１５６、Ｎ１５７、Ｓ１５９、Ｎ１６３、Ｑ１６５、Ｓ１６６、Ｎ１９４もしくはＳ２０２のＤまたはＥによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって低下している、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項２６】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｄ２５もしくはＤ１２８のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＫもしくはＲによる置換；または
（ｂ）Ｓ６８、Ｎ７０、Ｈ９４、Ｓ１１７、Ｎ１２０、Ｎ１２９もしくはＨ１７２のＫもしくはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって増大している、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項２７】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｋ２１、Ｋ２８、Ｋ３１、Ｒ１１２、Ｒ１１４もしくはＲ１３０のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｓ６８、Ｎ７０、Ｈ９４、Ｓ１１７、Ｎ１２０、Ｎ１２９もしくはＨ１７２のＤもしくはＥによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって低下している、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項２８】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼ単量体を含み、該組換えメガヌクレアーゼ単量体が、二量体形成に対し、参照メガヌクレアーゼ単量体とは改変された親和性を有し、
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
二量体形成のための親和性が、
（ａ）Ｋ７、Ｋ５７もしくはＫ９６のＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｅ８もしくはＥ６１によるＫもしくはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項２９】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体を含み、該組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体が、
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第１ポリペプチドであって；
二量体形成のための親和性が、Ｋ７、Ｋ５７またはＫ９６のＤまたはＥによる置換に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている第１ポリペプチド；と
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第２ポリペプチドであって；
二量体形成のための親和性が、Ｅ８またはＥ６１のＫまたはＲによる置換に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている第２ポリペプチドと
を含む、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項３０】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼ単量体を含み、該組換えメガヌクレアーゼ単量体が、二量体形成に対し、参照メガヌクレアーゼ単量体とは改変された親和性を有し、
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
二量体形成のための親和性が、
（ａ）Ｒ３０２のＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｄ２０、Ｅ１１もしくはＱ６４のＫまたはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項３１】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体を含み、該組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体が、
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第１ポリペプチドであって；
二量体形成のための親和性が、Ｒ３０２のＤまたはＥによる置換に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている第１ポリペプチド；と
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第２ポリペプチドであって；
二量体形成のための親和性が、Ｄ２０、Ｅ１１またはＱ６４のＫまたはＲによる置換に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている第２ポリペプチドと
を含む、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項３２】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼ単量体を含み、該組換えメガヌクレアーゼ単量体が、二量体形成に対し、参照メガヌクレアーゼ単量体とは改変された親和性を有し、
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
二量体形成のための親和性が、
（ａ）Ｒ９３のＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｅ１５２のＫもしくはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項３３】
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体を含み、該組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体が、
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第１ポリペプチドであって；
二量体形成のための親和性が、Ｒ９３のＤまたはＥによる置換に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている第１ポリペプチド；と
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第２ポリペプチドであって；
二量体形成のための親和性が、Ｅ１５２のＫまたはＲによる置換に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている第２ポリペプチドと
を含む、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項３４】
該組換えメガヌクレアーゼ単量体またはヘテロ二量体が、さらに、表１から選択される少なくとも１つの修飾を含む、請求項１〜７いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクター。
【請求項３５】
請求項１〜３４いずれか一項に記載の標的化対象転写エフェクターをコードする核酸。
【請求項３６】
請求項３５に記載の核酸を被検体に導入することを含み、該核酸にコードされるポリペプチドが標的部位に結合し、目的遺伝子の転写に影響を及ぼす、治療を必要とする被検体の疾患または病状を治療するための方法。
【請求項３７】
請求項１〜３４に記載の標的化対象転写エフェクターを被検体に導入することを含み、該ポリペプチドが標的部位に結合し、目的遺伝子の転写に影響を及ぼす、治療を必要とする被検体の疾患または病状を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および核酸組換え技術の分野に関する。特に、本発明は、改変されたＤＮＡ認識配列特異性および／または改変された親和性を有する合理的に設計された、非天然型のメガヌクレアーゼに関する。また、本発明は、かかるメガヌクレアーゼの作製方法、および組換え核酸の作製方法、およびかかるメガヌクレアーゼが利用される生物に関する。
【０００２】
（関連出願の参照）
本出願は、２００８年４月２８日に出願された米国特許仮出願第６１／０４８，４９９号の優先権の利益を主張するものであり、この仮出願の開示は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
（連邦政府による補助）
本発明は、一部において、米国立衛生研究所の総合医科学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）による助成金２Ｒ０１−ＧＭ−０４９８７１２、５Ｆ３２−ＧＭ０７２３２２および５  ＤＰ１  ＯＤ０００  １２２によって補助された。したがって、米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【背景技術】
【０００４】
ゲノム操作は、ゲノム内の特定の遺伝子配列の挿入、欠失、置換あるいは他の様式での操作が可能であることが必要とされ、数多くの治療的および生物工学的適用用途を有する。ゲノム修飾のための有効な手段の開発は、依然として、遺伝子療法、農業科学技術および合成生物学における主要な目的である（Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３；Ｔｚｆｉｒａら（２００５），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５６７−９；ＭｃＤａｎｉｅｌら（２００５），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４７６−８３）。ＤＮＡ配列の挿入または修飾のための一般的な方法は、ゲノム標的に相同な配列にフランキングしているトランスジェニックＤＮＡ配列を導入すること、および成功裡の相同組換え事象を選択またはスクリーニングすることを伴うものである。トランスジェニックＤＮＡによる組換えが起こることは稀であるが、ゲノムＤＮＡ内の標的部位での二本鎖切断によって刺激され得る。ＤＮＡ二本鎖切断をもたらすのに数多くの方法が使用されており、放射線照射および化学的処理が挙げられる。これらの方法によって組換えは効率的に刺激されるが、二本鎖切断はゲノム内でランダムに散在し、これは高度に変異原性および毒性であり得る。現在、遺伝子修飾を、染色体バックグラウンド内の特殊な部位に標的化できないことが、成功裡のゲノム操作に対する大きな障害となっている。
【０００５】
この目的を達成するためのアプローチの１つは、ゲノム内の単一の部位のみに存在するのに充分に大きい配列に対して特異性を有するヌクレアーゼを使用し、標的遺伝子座内の二本鎖切断部における相同組換えを刺激することである（例えば、Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３参照）。このストラテジーの有効性は、さまざまな生物において、遺伝子工学的に作製されたジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ制限酵素の非特異的ヌクレアーゼドメインとのキメラ融合体を用いて実証されている（Ｐｏｒｔｅｕｓ（２００６），Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３：４３８−４６；Ｗｒｉｇｈｔら（２００５），Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４４：６９３−７０５；Ｕｒｎｏｖら（２００５），Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−５１）。このような人工ジンクフィンガーヌクレアーゼは、部位特異的組換えを刺激するが、ヌクレアーゼドメインの調節不足に起因する非特異的切断活性が残ったままであり、意図しない部位での切断が高頻度で起こる（Ｓｍｉｔｈら（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：３３６１−９）。かかる意図しない切断により、処置生物に変異および毒性が引き起こされることがあり得る（Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３）。
【０００６】
植物および真菌のゲノムに一般的に見られる１５〜４０塩基対の切断部位を認識する一群の天然ヌクレアーゼは、毒性の低い択一的ゲノム操作法を提供するものであり得る。かかる「メガヌクレアーゼ」または「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、多くの場合、寄生型ＤＮＡエレメント（第１群自己スプライシング性イントロンおよびインテインなど）と会合している。該ヌクレアーゼは、天然で、染色体内で二本鎖切断を生成させることにより、宿主ゲノム内の特定の位置での相同組換えまたは遺伝子挿入を促進し、これにより、細胞内ＤＮＡ修復機構が漸増される（Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６），Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９−９５）。メガヌクレアーゼは、一般的に、４つのファミリー：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓボックスファミリーおよびＨＮＨファミリーに分類される。これらのファミリーは、触媒活性および認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーの構成員は、１コピーまたは２コピーいずれかの保存ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有することを特徴とする（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７−３７７４参照）。単一コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼはホモ二量体を形成するが、２コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有する構成員は単量体として見出される。同様に、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー構成員はＧＩＹ−ＹＩＧモジュールを有し、該モジュールは７０〜１００残基長であり、４つの非バリアント残基を有する、そのうちの２つは活性に必要とされる４つまたは５つの保存配列モチーフを含む。（Ｖａｎ  Ｒｏｅｙら（２００２），Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：８０６−８１１参照）。Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスメガヌクレアーゼは、数百アミノ酸残基を含む領域において高度に保存された一連のヒスチジンとシステインを特徴とする（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７−３７７４参照）。ＮＨＮファミリーの場合、その構成員は、アスパラギン残基に囲まれた２対の保存ヒスチジンを含むモチーフによって規定される（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７−３７７４参照）。メガヌクレアーゼの４つのファミリーは、保存された構造エレメントに関して、従って、ＤＮＡ認識配列特異性および触媒活性に関して互いに大きく離れている。
【０００７】
天然のメガヌクレアーゼは、主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー由来のものが、植物、酵母、ショウジョウバエ、哺乳動物細胞およびマウスにおいて、部位特異的ゲノム修飾を有効に促進させるために使用されているが、このアプローチは、メガヌクレアーゼ認識配列が保存されている相同遺伝子（Ｍｏｎｎａｔら（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５：８８−９３）または認識配列が導入された事前に遺伝子操作されたゲノム（Ｒｏｕｅｔら（１９９４），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８０９６−１０６；Ｃｈｉｌｔｏｎら（２００３），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３３：９５６−６５；Ｐｕｃｈｔａら（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５０５５−６０；Ｒｏｎｇら（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：１５６８−８１；Ｇｏｕｂｌｅら（２００６），Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．８（５）：６１６−６２２）のいずれかの修飾に限定されている。
【０００８】
ヌクレアーゼ刺激型遺伝子修飾の体系的な実施には、ゲノム内の既存の部位における標的ＤＮＡ切断に対してカスタマイズされた特異性を有する遺伝子工学的に作製された酵素の使用が必要とされ、したがって、メガヌクレアーゼを、医学的または生物工学的に関連のある部位における遺伝子修飾の促進のために適合させることに大きな関心が集まっている（Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３；Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１；Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２）。
【０００９】
Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ由来のメガヌクレアーゼＩ−ＣｒｅＩは、葉緑体の染色体内の２２塩基対認識配列を認識して切断し、かつ、メガヌクレアーゼ再設計のための魅力的な標的を提示するＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーの構成員である。この酵素の野生型は、各単量体が完全長の認識配列内の９塩基対と直接接触するホモ二量体である。遺伝子選択手法を用いて、Ｉ−ＣｒｅＩにおいて、塩基の優先性を改変する変異が、この認識配列内の単一の位置において（Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１；Ｃｈａｍｅｓら（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅｌ７８；Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３８７０−９）、またはより最近では該認識配列内の３つの位置において（Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−５８）同定された。Ｉ−ＣｒｅＩタンパク質−ＤＮＡ界面には、ＤＮＡの塩基と直接接触する９個のアミノ酸と、修飾界面内で潜在的接触を形成し得る少なくとも５つのさらなる位置が含まれる。この界面の大きさにより、劇的に改変された切断部位を有する酵素を選択するために構築された配列ライブラリーにおいて、充分なサンプル抽出が行なえそうにないコンビナトリアルな複雑さがもたらされる。
【００１０】
転写の調節の欠陥は、数多くの疾患状態（例えば、癌）の基礎となっている。例えば、Ｎｅｂｅｒｔ（２００２）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １８１−１８２：１３１−４１を参照のこと。かかる欠陥を補正するための現行のストラテジーの主な目的は、充分な作用特異性を得ることである。例えば、Ｒｅｉｄら（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ４：１３０−１３７を参照のこと。設計されたジンクフィンガータンパク質転写因子（ＺＦＰ  ＴＦ）は、天然の転写制御機構に匹敵し、したがって、遺伝子発現を厳密に調節するための魅力的なツールを提供する。例えば、米国特許第６，６０７，８８２号および同第６，５３４，２６１；ならびにＢｅｅｒｌｉら（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１４９５−５００；Ｚｈａｎｇら（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３３８５０−６０；Ｓｎｏｗｄｅｎら（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：２１５９−６６；Ｌｉｕら（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１１３２３−３４；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら（２００３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  ＡｃａｄＳｃｉ  ＵＳＡ  １００：１６１５−２０；Ｂａｒｔｓｅｖｉｃｈら（２０００）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５８：１−１０；Ｒｅｎら（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６：２７−３２；Ｊａｍｉｅｓｏｎら（２００３），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２：３６１−３６８）を参照のこと。遺伝子発現の正確な制御は、遺伝子機能の理解（標的の確認）のため、ならびに疾患を処置するための治療薬の開発のために重要である。例えば、Ｕｒｎｏｖ  ＆  Ｒｅｂａｒ（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６４：９１９−２３を参照のこと。
【００１１】
しかしながら、多くの疾患状態では、このようなタンパク質または任意の他の遺伝子調節手法が、ゲノム内の単一の遺伝子に対して特異的でなければならない場合があり得るが、これは、ヒトゲノムの大きさおよび複雑さを考えると、困難な基準である。
【００１２】
実際、ｓｉＲＮＡ（Ｄｏｅｎｃｈら（２００３），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １７：４３８−４２；Ｊａｃｋｓｏｎら（２００３），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：１８）およびアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ（Ｃｈｏら（２００１），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９８１９−２３）を用いた最近の研究は、単一遺伝子特異性の取得において期待外れであり、ゲノム（例えば、ヒトゲノム）内の単一の特定の遺伝子の外因性調節を得る作業の大変さが明らかになった。
【００１３】
内因性遺伝子発現をより良好に調節するために、ゲノム内の特定の遺伝子座に転写エフェクター（例えば、活性化因子または抑制因子）を厳密に標的化することを容易にする分子の必要性が依然として存在している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６，６０７，８８２号
【特許文献２】米国特許第６，５３４，２６１号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｐｏｒｔｅｕｓら（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：９６７−７３
【非特許文献２】Ｔｚｆｉｒａら（２００５），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５６７−９
【非特許文献３】ＭｃＤａｎｉｅｌら（２００５），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４７６−８３
【非特許文献４】Ｐｏｒｔｅｕｓ（２００６），Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３：４３８−４６
【非特許文献５】Ｗｒｉｇｈｔら（２００５），Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４４：６９３−７０５
【非特許文献６】Ｕｒｎｏｖら（２００５），Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：６４６−５１
【非特許文献７】Ｓｍｉｔｈら（２０００），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：３３６１−９
【非特許文献８】Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６），Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９−９５
【非特許文献９】Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７−３７７４参照
【非特許文献１０】Ｖａｎ  Ｒｏｅｙら（２００２），Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：８０６−８１１参照
【非特許文献１１】Ｍｏｎｎａｔら（１９９９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５５：８８−９３
【非特許文献１２】Ｒｏｕｅｔら（１９９４），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８０９６−１０６
【非特許文献１３】Ｃｈｉｌｔｏｎら（２００３），Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３３：９５６−６５
【非特許文献１４】Ｐｕｃｈｔａら（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：５０５５−６０
【非特許文献１５】Ｒｏｎｇら（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：１５６８−８１
【非特許文献１６】Ｇｏｕｂｌｅら（２００６），Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．８（５）：６１６−６２２
【非特許文献１７】Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１
【非特許文献１８】Ｅｐｉｎａｔら（２００３），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２９５２−６２
【非特許文献１９】Ｃｈａｍｅｓら（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅｌ７８
【非特許文献２０】Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３８７０−９
【非特許文献２１】Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−５８
【非特許文献２２】Ｎｅｂｅｒｔ（２００２）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １８１−１８２：１３１−４１
【非特許文献２３】Ｒｅｉｄら（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ４：１３０−１３７
【非特許文献２４】Ｂｅｅｒｌｉら（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１４９５−５００
【非特許文献２５】Ｚｈａｎｇら（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３３８５０−６０
【非特許文献２６】Ｓｎｏｗｄｅｎら（２００２）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １２：２１５９−６６
【非特許文献２７】Ｌｉｕら（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１１３２３−３４
【非特許文献２８】Ｒｅｙｎｏｌｄｓら（２００３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  ＡｃａｄＳｃｉ  ＵＳＡ  １００：１６１５−２０
【非特許文献２９】Ｂａｒｔｓｅｖｉｃｈら（２０００）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５８：１−１０
【非特許文献３０】Ｒｅｎら（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １６：２７−３２
【非特許文献３１】Ｊａｍｉｅｓｏｎら（２００３），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２：３６１−３６８
【非特許文献３２】Ｕｒｎｏｖ  ＆  Ｒｅｂａｒ（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６４：９１９−２３
【非特許文献３３】Ｄｏｅｎｃｈら（２００３），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １７：４３８−４２
【非特許文献３４】Ｊａｃｋｓｏｎら（２００３），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：１８
【非特許文献３５】Ｃｈｏら（２００１），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：９８１９−２３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、一部において、メガヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と結合するとＤＮＡ塩基およびＤＮＡ主鎖との接触を行ない、それにより、該酵素自身の特異性および活性に影響を及ぼすＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメガヌクレアーゼ内の特定のアミノ酸残基の同定および特性評価に基づく。この知見を用いて、以下に詳述するように、メガヌクレアーゼの認識配列特異性および／またはＤＮＡ結合親和性が改変され得るアミノ酸置換を同定し、天然型メガヌクレアーゼでは認識されない所望のＤＮＡ配列を認識することができる非天然型のメガヌクレアーゼの合理的設計および開発を行なった。かかる非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、細胞内プロセスをインビボおよびインビトロで調節するために、調節ドメインまたはエフェクタードメインとともに使用され得る。特に、非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、インビボまたはインビトロでの遺伝子発現の調節のための標的化対象転写活性化因子を提供するために、転写エフェクタードメインとともに使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一態様において、本発明は、
（ｉ）標的認識部位に結合する不活性メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン；および（ｉｉ）転写エフェクタードメインを含む標的化対象転写エフェクターであって、目的遺伝子に対する該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインの結合により、該転写エフェクターが該目的遺伝子に標的化される、標的化対象転写エフェクターを提供する。
【００１８】
一実施形態において、標的化対象転写エフェクターは、さらに、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインと該転写エフェクタードメインを連接するドメインリンカーを含む。ドメインリンカーは、ポリペプチドを含むものであり得る。
【００１９】
一部の実施形態において、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは、エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする少なくとも１つの点変異によって天然型メガヌクレアーゼを改変したものである。
【００２０】
標的化対象転写エフェクターは、さらに核局在シグナルを含むものであり得る。
【００２１】
一部の実施形態において、転写エフェクタードメインは転写活性化因子または転写抑制因子である。
【００２２】
一部の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、少なくとも一方の認識配列片側部位に対し、野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５からなる群より選択されるＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ認識配列の片側部位と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列片側部位に対して特異性を有し；
前記組換えメガヌクレアーゼが、表１の少なくとも１つの修飾と、前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾とを含む。
【００２３】
一実施形態では、前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾がＱ４７Ｅである。
【００２４】
一部の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、少なくとも一方の認識配列片側部位に対し、野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択されるＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ認識配列の片側部位と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列片側部位に対して特異性を有し；
前記組換えメガヌクレアーゼが、表２の少なくとも１つの修飾と、前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾とを含む。
【００２５】
一実施形態では、前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾がＤ２２Ｎである。
【００２６】
一部の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、認識配列に対し、野生型Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：９のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの残基３〜１８６に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：１０および配列番号：１１のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識配列と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列に対して特異性を有し；
前記組換えメガヌクレアーゼが、表３の少なくとも１つの修飾と、前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾とを含む。
【００２７】
一実施形態では、前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾がＤ４４ＮまたはＤ１４５Ｎである。
【００２８】
一部の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、少なくとも一方の認識配列片側部位に対し、野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：１３および配列番号：１４からなる群より選択されるＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ認識配列の片側部位と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列片側部位に対して特異性を有し；
前記組換えメガヌクレアーゼが、表４の少なくとも１つの修飾と、前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾とを含む。
【００２９】
一実施形態では、前記エンドヌクレアーゼ切断活性を低減または無効にする修飾がＥ６６Ｑである。
一部の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、少なくとも一方の認識配列片側部位に対し、野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５からなる群より選択されるＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ認識配列の片側部位と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列片側部位に対して特異性を有し；
ここで：
（１）−１位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＱ７０、Ｃ７０、Ｌ７０、Ｙ７５、Ｑ７５、Ｈ７５、Ｈ１３９、Ｑ４６およびＨ４６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＡに対するＹ７５、Ｌ７５、Ｃ７５、Ｙ１３９、Ｃ４６およびＡ４６からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ７０、Ｅ７０、Ｅ７５、Ｅ４６およびＤ４６からなる群より選択される修飾によって；
（ｄ）センス鎖のＣに対するＨ７５、Ｒ７５、Ｈ４６、Ｋ４６およびＲ４６からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｅ）センス鎖の任意の塩基に対するＧ７０、Ａ７０、Ｓ７０およびＧ４６からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（２）−２位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＱ７０、Ｔ４４、Ａ４４、Ｖ４４、Ｉ４４、Ｌ４４およびＮ４４からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ７０、Ｄ７０、Ｋ４４およびＲ４４からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＧに対するＨ７０、Ｄ４４およびＥ４４からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｄ）センス鎖のＡもしくはＴに対して、Ｃ４４を含む修飾によって
改変されている；および／または
（３）−３位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＱ６８およびＣ２４からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ６８、Ｆ６８、Ｋ２４およびＲ２４からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＴに対するＭ６８、Ｃ６８、Ｌ６８およびＦ６８からなる群より選択される修飾によって；
（ｄ）センス鎖のＡもしくはＣに対するＨ６８を含む修飾によって；
（ｅ）センス鎖のＣもしくはＴに対するＹ６８を含む修飾によって；もしくは
（ｆ）センス鎖のＧもしくはＴに対するＫ６８を含む修飾によって
改変されている；および／または
（４）−４位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ７７およびＫ２６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＥ２６およびＲ７７からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＣもしくはＴに対するＳ７７を含む修飾によって；もしくは
（ｄ）センス鎖の任意の塩基に対するＳ２６を含む修飾によって
改変されている；および／または
（５）−５位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ４２を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＲ４２を含む修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＡもしくはＧに対して、Ｃ２８およびＱ４２からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｄ）センス鎖の任意の塩基に対するＭ６６およびＫ６６からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（６）−６位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＣ４０、Ｉ４０、Ｖ４０、Ｃ７９、Ｉ７９、Ｖ７９およびＱ２８からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ４０およびＲ２８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＲ４０を含む修飾によって
改変されている；および／または
（７）−７位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ３８、Ｋ３０およびＲ３０からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＫ３８、Ｒ３８およびＥ３０からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＴに対するＩ３８およびＬ３８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｄ）センス鎖のＡもしくはＧに対して、Ｃ３８を含む修飾によって；もしくは
（ｅ）センス鎖の任意の塩基に対するＨ３８、Ｎ３８およびＱ３０からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（８）−８位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＬ３３、Ｖ３３、Ｉ３３、Ｆ３３およびＣ３３からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ３３およびＤ３３からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ３３からなる修飾によって；
（ｄ）センス鎖のＡもしくはＣに対するＲ３２を含む修飾によって；もしくは
（ｅ）センス鎖のＡもしくはＧに対して、Ｒ３３を含む修飾によって
改変されている；および／または
（９）−９位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ３２を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＲ３２およびＫ３２からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＴに対するＬ３２、Ｖ３２、Ａ３２およびＣ３２からなる群より選択される修飾によって；
（ｄ）センス鎖のＣもしくはＴに対するＤ３２およびＩ３２からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｅ）センス鎖の任意の塩基に対するＳ３２、Ｎ３２、Ｈ３２、Ｑ３２およびＴ３２からなる群より選択される修飾によって改変されている。
【００３０】
一部の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、少なくとも一方の認識配列片側部位に対し、野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：７および配列番号：８からなる群より選択されるＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼ認識配列の片側部位と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列片側部位に対して特異性を有し；
ここで：
（１）−１位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＫ７５、Ｑ７７、Ａ４９、Ｃ４９およびＫ７９からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＣ７７、Ｌ７７およびＱ７９からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ７７、Ｒ７７、Ｅ４９およびＥ７９からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（２）−２位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＱ７５、Ｋ８１、Ｃ４７、Ｉ４７およびＬ４７からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ７５、Ｄ７５、Ｒ４７、Ｋ４７、Ｋ８１およびＲ８１からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ７５、Ｅ４７およびＥ８１からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（３）−３位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＱ７２、Ｃ２６、Ｌ２６、Ｖ２６、Ａ２６およびＩ２６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ７２、Ｙ７２、Ｈ２６、Ｋ２６およびＲ２６からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＴに対するＫ７２、Ｙ７２およびＨ２６からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（４）−４位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＫ２８、Ｋ８３およびＱ２８からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＲ８３およびＫ８３からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＫ２８およびＱ８３からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（５）−５位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＧに対するＲ４５およびＥ２８からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＱ２８を含む修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＣに対するＲ２８を含む修飾によって
改変されている；および／または
（６）−６位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＫ４３、Ｖ８５、Ｌ８５およびＱ３０からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ４３、Ｅ８５、Ｋ３０およびＲ３０からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＲ４３、Ｋ４３、Ｋ８５、Ｒ８５、Ｅ３０およびＤ３０からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（７）−７位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ３２およびＥ４１からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＲ３２、Ｒ４１およびＫ４１からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＴに対するＫ３２、Ｍ４１、Ｌ４１およびＩ４１からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（８）−８位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＫ３２およびＫ３５からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ３２を含む修飾によってからなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ３２、Ｋ３５およびＲ３５からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（９）−９位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＮ３４およびＨ３４からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＳ３４、Ｃ３４、Ｖ３４、Ｔ３４およびＡ３４からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ３４、Ｒ３４およびＨ３４からなる群より選択される修飾によって改変されている。
【００３１】
一部の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、認識配列に対し、野生型Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：９のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの残基３〜１８６に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：１０および配列番号：１１のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼ認識配列と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列に対して特異性を有し；
ここで：
（１）４位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＫ５０を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＫ５７、Ｍ５７およびＱ５０からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＥ５０、Ｒ５７およびＫ５７からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（２）５位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＫ４８、Ｑ１０２からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＥ４８、Ｋ１０２およびＲ１０２からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＴに対するＱ４８、Ｃ１０２、Ｌ１０２およびＶ１０２からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（３）６位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＫ５９を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＲ５９およびＫ５９からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｂ）センス鎖のＧに対するＫ８４およびＥ５９からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（４）７位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＲ４６、Ｋ４６およびＥ８６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＫ８６、Ｒ８６およびＥ４６からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＣ４６、Ｌ４６およびＶ４６からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（５）８位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ８８、Ｒ６１およびＨ６１からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＫ８８、Ｑ６１およびＨ６１からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＫ６１、Ｓ６１、Ｖ６１、Ａ６１およびＬ６１からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（６）９位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＣ９８、Ｖ９８およびＬ９８からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＲ９８およびＫ９８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＥ９８およびＤ９８からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（７）１０位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＫ９６およびＲ９６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＤ９６およびＥ９６からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＣ９６およびＡ９６からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（８）１１位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＱ９０を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＫ９０およびＲ９０からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＥ９０を含む修飾によって
改変されている；および／または
（９）１２位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＱ１９３を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＥ１６５、Ｅ１９３およびＤ１９３からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ１６５およびＲ１６５からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（１０）１３位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＱ１９３、Ｃ１６３およびＬ１６３からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＥ１９３、Ｄ１９３、Ｋ１６３およびＲ１９２からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＣ１９３およびＬ１９３からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（１１）１４位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＫ１６１およびＱ１９２からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＡに対するＬ１９２およびＣ１９２からなる群より選択される修飾によって；
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ１４７、Ｋ１６１、Ｒ１６１、Ｒ１９７、Ｄ１９２およびＥ１９２からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｄ）センス鎖のＴに対するＫ１６１およびＱ１９２からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（１２）１５位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＣ１５１、Ｌ１５１およびＫ１５１からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＫ１５１を含む修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＣに対するＥ１５１を含む修飾によって
改変されている；および／または
（１３）１７位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＧ１５２およびＱ１５０からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＫ１５２およびＫ１５０からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＮ１５２、Ｓ１５２、Ｄ１５２、Ｄ１５０およびＥ１５０からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（１４）１８位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＨ１５５およびＹ１５５からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＲ１５５およびＫ１５５からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＫ１５５およびＣ１５５からなる群より選択される修飾によって改変されている。
【００３２】
一部の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、少なくとも一方の認識配列片側部位に対し、野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと対比して改変された特異性を有し、
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
配列番号：１３および配列番号：１４からなる群より選択されるＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ認識配列の片側部位と少なくとも１つの塩基対が異なる認識配列片側部位に対して特異性を有し；
ここで：
（１）−１位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＣ９２、Ａ９２およびＶ９２からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＱ１１６およびＱ９２からなる群より選択される修飾によって；ｏｒ
（ｃ）センス鎖のＧに対するＥ１１６およびＥ９２からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（２）−２位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＱ１１７、Ｃ９０、Ｌ９０およびＶ９０からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＫ１１７、Ｒ１２４、Ｋ１２４、Ｅ１２４、Ｅ９０およびＤ９０からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＣに対するＥ１１７、Ｄ１１７、Ｒ１７４、Ｋ１２４、Ｋ９０、Ｒ９０およびＫ６８からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（３）−３位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＣ７０、Ｖ７０、Ｔ７０、Ｌ７０およびＫ７０からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＱ７０を含む修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＫ７０からなる修飾によって
改変されている；および／または
（４）−４位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＥ１２６、Ｄ１２６、Ｒ８８、Ｋ８８およびＫ７２からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＫ１２６、Ｌ１２６およびＱ８８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＱ１２６、Ｎ１２６、Ｋ８８、Ｌ８８、Ｃ８８、Ｃ７２、Ｌ７２およびＶ７２からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（５）−５位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＧに対するＥ７４、Ｋ１２８、Ｒ１２８およびＥ１２８からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＴに対するＣ１２８、Ｌ１２８、Ｖ１２８およびＴ１２８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＡに対するＣ７４、Ｌ７４、Ｖ７４およびＴ７４からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（６）−６位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＫ８６、Ｃ８６およびＬ８６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＤ８６、Ｅ８６、Ｒ８４およびＫ８４からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＫ１２８、Ｒ１２８、Ｒ８６、Ｋ８６およびＥ８４からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（７）−７位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＣに対するＲ７６、Ｋ７６およびＨ７６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＧに対するＥ７６およびＲ８４からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＴに対するＨ７６およびＱ７６からなる修飾によって
改変されている；および／または
（８）−８位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＡに対するＹ７９、Ｒ７９およびＱ７６からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＤ７９、Ｅ７９、Ｄ７６およびＥ７６からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対するＲ７９、Ｋ７９、Ｋ７６およびＲ７６からなる群より選択される修飾によって
改変されている；および／または
（９）−９位の特異性が：
（ａ）センス鎖のＴに対するＫ７８、Ｖ７８、Ｌ７８、Ｃ７８およびＴ７８からなる群より選択される修飾によって；
（ｂ）センス鎖のＣに対するＤ７８およびＥ７８からなる群より選択される修飾によって；もしくは
（ｃ）センス鎖のＧに対する
Ｒ７８、Ｋ７８およびＨ７８からなる群より選択される修飾によって改変されている。
【００３３】
一実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｅ８０、Ｄ１３７、Ｉ８１、Ｌ１１２、Ｐ２９、Ｖ６４もしくはＹ６６のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＫもしくはＲによる置換；または
（ｂ）Ｔ４６、Ｔ１４０もしくはＴ１４３のＫもしくはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって増大している。
【００３４】
別の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｋ３４、Ｋ４８、Ｒ５１、Ｋ８２、Ｋ１１６もしくはＫ１３９のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｉ８１、Ｌ１１２、Ｐ２９、Ｖ６４、Ｙ６６、Ｔ４６、Ｔ１４０もしくはＴ１４３のＤもしくはＥによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって低下している。
【００３５】
一実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｅ１４７、Ｉ１８５、Ｇ８６もしくはＹ１１８のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＫもしくはＲによる置換；または
（ｂ）Ｑ４１、Ｎ７０、Ｓ８７、Ｔ８８、Ｈ８９、Ｑ１２２、Ｑ１３９、Ｓ１５０もしくはＮ１５２のＫもしくはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって増大している。
【００３６】
別の実施形態では、
該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｋ３６、Ｒ５１、Ｋ１２３、Ｋ１４３もしくはＲ１４４のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｉ８５、Ｇ８６、Ｙ１１８、Ｑ４１、Ｎ７０、Ｓ８７、Ｔ８８、Ｈ８９、Ｑ１２２、Ｑ１３９、Ｓ１５０もしくはＮ１５２のＤもしくはＥによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって低下している。
【００３７】
一実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：９のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの残基３〜１８６に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｄ２０１、Ｌ１９、Ｌ８０、Ｌ９２、Ｙ１５１、Ｙ１８８、Ｉ１９１、Ｙ１９９もしくはＹ２２２のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＫもしくはＲによる置換；または
（ｂ）Ｎ１５、Ｎ１７、Ｓ８１、Ｈ８４、Ｎ９４、Ｎ１２０、Ｔ１５６、Ｎ１５７、Ｓ１５９、Ｎ１６３、Ｑ１６５、Ｓ１６６、Ｎ１９４もしくはＳ２０２のＫまたはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって増大している。
【００３８】
別の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：９のＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの残基３〜１８６に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｋ２０、Ｋ２３、Ｋ６３、Ｋ１２２、Ｋ１４８、Ｋ１５３、Ｋ１９０、Ｋ１９３、Ｋ１９５もしくはＫ２２３のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｌ１９、Ｌ８０、Ｌ９２、Ｙ１５１、Ｙ１８８、Ｉ１９１、Ｙ１９９、Ｙ２２２、Ｎ１５、Ｎ１７、Ｓ８１、Ｈ８４、Ｎ９４、Ｎ１２０、Ｔ１５６、Ｎ１５７、Ｓ１５９、Ｎ１６３、Ｑ１６５、Ｓ１６６、Ｎ１９４もしくはＳ２０２のＤまたはＥによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって低下している。
【００３９】
一実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｄ２５もしくはＤ１２８のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＫもしくはＲによる置換；または
（ｂ）Ｓ６８、Ｎ７０、Ｈ９４、Ｓ１１７、Ｎ１２０、Ｎ１２９もしくはＨ１７２のＫもしくはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって増大している。
【００４０】
別の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼを含み、該組換えメガヌクレアーゼが、二本鎖ＤＮＡに対し、野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼと対比して改変された結合親和性を有し、
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
ＤＮＡ結合親和性が、
（ａ）Ｋ２１、Ｋ２８、Ｋ３１、Ｒ１１２、Ｒ１１４もしくはＲ１３０のＨ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｓ６８、Ｎ７０、Ｈ９４、Ｓ１１７、Ｎ１２０、Ｎ１２９もしくはＨ１７２のＤもしくはＥによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって低下している。
【００４１】
一実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼ単量体を含み、該組換えメガヌクレアーゼ単量体が、二量体形成に対し、参照メガヌクレアーゼ単量体とは改変された親和性を有し、
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
二量体形成のための親和性が、
（ａ）Ｋ７、Ｋ５７もしくはＫ９６のＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｅ８もしくはＥ６１によるＫもしくはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている。
【００４２】
別の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体を含み、該組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体が、
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第１ポリペプチドであって；
二量体形成のための親和性が、Ｋ７、Ｋ５７またはＫ９６のＤまたはＥによる置換に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている第１ポリペプチド；と
配列番号：１のＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの残基２〜１５３に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第２ポリペプチドであって；
二量体形成のための親和性が、Ｅ８またはＥ６１のＫまたはＲによる置換に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている第２ポリペプチドと
を含む。
【００４３】
一実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼ単量体を含み、該組換えメガヌクレアーゼ単量体が、二量体形成に対し、参照メガヌクレアーゼ単量体とは改変された親和性を有し、
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
二量体形成のための親和性が、
（ａ）Ｒ３０２のＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｄ２０、Ｅ１１もしくはＱ６４のＫまたはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている。
【００４４】
別の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体を含み、該組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体が、
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第１ポリペプチドであって；
二量体形成のための親和性が、Ｒ３０２のＤまたはＥによる置換に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている第１ポリペプチド；と
配列番号：６のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの残基６〜１６０に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第２ポリペプチドであって；
二量体形成のための親和性が、Ｄ２０、Ｅ１１またはＱ６４のＫまたはＲによる置換に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている第２ポリペプチドと
を含む。
【００４５】
一実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼ単量体を含み、該組換えメガヌクレアーゼ単量体が、二量体形成に対し、参照メガヌクレアーゼ単量体とは改変された親和性を有し、
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有するポリペプチドを含み；
二量体形成のための親和性が、
（ａ）Ｒ９３のＤもしくはＥによる置換；または
（ｂ）Ｅ１５２のＫもしくはＲによる置換
に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている。
【００４６】
別の実施形態では、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体を含み、該組換えメガヌクレアーゼヘテロ二量体が、
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第１ポリペプチドであって；
二量体形成のための親和性が、Ｒ９３のＤまたはＥによる置換に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている第１ポリペプチド；と
配列番号：１２のＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの残基５〜２１１に対して少なくとも８５％の配列類似性を有する第２ポリペプチドであって；
二量体形成のための親和性が、Ｅ１５２のＫまたはＲによる置換に対応する少なくとも１つの修飾によって改変されている第２ポリペプチドと
を含む。
【００４７】
一部の実施形態では、該組換えメガヌクレアーゼ単量体またはヘテロ二量体が、さらに、表１から選択される少なくとも１つの修飾を含む。
【００４８】
別の態様において、本発明は、標的化対象転写エフェクターをコードする核酸を提供する。
【００４９】
また別の態様において、本発明は、標的化対象転写エフェクターをコードする核酸を被検体に導入することを含み、該核酸にコードされるポリペプチドが標的部位に結合し、目的遺伝子の転写に影響を及ぼす、治療を必要とする被検体の疾患または病状を治療するための方法を提供する。
【００５０】
さらに別の態様において、本発明は、
請求項１〜３４に記載の標的化対象転写エフェクターを被検体に導入することを含み、該ポリペプチドが標的部位に結合し、目的遺伝子の転写に影響を及ぼす、治療を必要とする被検体の疾患または病状を治療するための方法を提供する。
【００５１】
本発明のこれらおよび他の態様および実施形態は、以下の発明の詳細な説明に基づくことは、当業者には自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１（Ａ）】結晶学的データに基づいた、Ｉ−ＣｒｅＩホモ二量体と、その天然型二本鎖認識配列との相互作用を示す。この概略図は、ホモ二量体（２つの楕円で示す）によって結合される認識配列（配列番号：２および配列番号：３）を示す（例示目的だけのために示すことを意図する（ｕｎｗｏｕｎｄ））。各ＤＮＡ片側部位の塩基に−１から−９まで番号付し、認識表面を形成するＩ−ＣｒｅＩのアミノ酸残基を１文字アミノ酸表記で示し、番号は残基の位置を示す。黒実線：ＤＮＡ塩基に対する水素結合。点線：設計酵素ではさらなる接触を形成するが、野生型複合体のＤＮＡとは接触しないアミノ酸位置。矢印：ＤＮＡ主鎖と相互作用し、切断活性に影響を及ぼす残基。
【図１（Ｂ）】図１（Ａ）の右側の切断片側部位の−４位のＡ−Ｔ塩基対の野生型接触を示す。具体的には、残基Ｑ２６は、塩基Ａと相互作用していることを示す。残基Ｉ７７は、該塩基対に近接しているが、特異的に相互作用しない。
【図１（Ｃ）】残基Ｉ７７がＥ７７に修飾されたＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの非天然型の合理的に設計されたバリアントとの相互作用を示す。この変更の結果、Ｇ−Ｃ塩基対が−４位において好ましい。Ｑ２６と塩基Ｇとの相互作用は水分子によって媒介され、これは、図１（Ａ）の左側の切断片側部位で結晶学的に観察された。
【図１（Ｄ）】残基Ｑ２６がＥ２６に修飾され、残基Ｉ７７がＲ７７に修飾されたＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの非天然型の合理的に設計されたバリアントとの相互作用を示す。この変更の結果、Ｃ−Ｇ塩基対が−４位において好ましい。
【図１（Ｅ）】残基Ｑ２６がＡ２６に修飾された、残基Ｉ７７がＱ７７に修飾されたＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの非天然型の合理的に設計されたバリアントとの相互作用を示す。この変更の結果、Ｔ−Ａ塩基対が−４位において好ましい。
【図２（Ａ）】野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ（ＷＴ）と本明細書に記載の１１種類の非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体の各々での１つの認識配列の比較を示す。ＷＴ認識配列と対比したとき保存されている塩基には陰影をつけている。９ｂｐの片側部位を太字で示す。ＷＴ：野生型（配列番号：４）；ＣＦ：ほとんどの症例の嚢胞性線維症の原因であるヒトＣＦＴＲ遺伝子のΔＦ５０８対立遺伝子（配列番号：２５）；ＭＹＤ：筋緊張性ジストロフィと関連しているヒトＤＭキナーゼ遺伝子（配列番号：２７）；ＣＣＲ：ヒトＣＣＲ５遺伝子（主要なＨＩＶ共受容体）（配列番号：２６）；ＡＣＨ：軟骨無形成症と相関しているヒトＦＧＦＲ３遺伝子（配列番号：２３）；ＴＡＴ：  ＨＩＶ−１  ＴＡＴ／ＲＥＶ遺伝子（配列番号：１５）；ＨＳＶ：ＨＳＶ−１  ＵＬ３６遺伝子（配列番号：２８）；ＬＡＭ：バクテリオファージλ  ｐ０５遺伝子（配列番号：２２）；ＰＯＸ：痘瘡（スモールポックス）ウイルスｇｐ００９遺伝子（配列番号：３０）；ＵＲＡ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３遺伝子（配列番号：３６）；ＧＬＡ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＧＬ２遺伝子（配列番号：３２）；ＢＲＰ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＢＰ−１遺伝子（配列番号：３３）。
【図２（Ｂ）】野生型Ｉ−ＣｒｅＩ（ＷＴ）および１１種類の非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体の各々の、認識部位を有するプラスミドとのインキュベーションの結果を示す（この１２種のすべての酵素で、６時間、３７℃）。切断の割合を各ボックス内に示す。
【図３】野生型および非天然型の合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩホモ二量体の切断パターンを示す。（Ａ）野生型Ｉ−ＣｒｅＩ。（Ｂ）Ｉ−ＣｒｅＩ  Ｋ１１６Ｄ。（Ｃ〜Ｌ）非天然型の、本明細書に記載の合理的に設計されたメガヌクレアーゼ。酵素は、対象の切断片側部位（２７の対応単一塩基対変異型）のパリンドロームを有する１組のプラスミドとともにインキュベートした。棒グラフは、３７℃で４時間における切断割合（Ｆ）を示す。黒いバー：表１に基づいて予測される切断パターン。灰色のバー：予測切断パターンから外れているＤＮＡ部位。白四角は、目的認識部位内のを示す。また、２時間にわたる切断の時間推移も示す。ＣおよびＬにおける白丸時間推移プロットは、Ｅ８０Ｑ変異のないＣＣＲ１およびＢＲＰ２酵素による切断に対応する。該切断部位は、図２（Ａ）に記載の酵素のヘテロ二量体の５’（左の欄）および３’（右の欄）の片側部位に対応する。
【図４】Ｅｎｄｏ−ＴＮＦによるＤＮＡ認識を示す。精製Ｅｎｄｏ−ＴＮＦｓｃをｐＵＣ−１９プラスミド基質（ＳｅａＩで線状化）とともに３７℃で２時間インキュベートした。レーン１および２：分子量マーカー。レーン３および４：ブランクプラスミド（レーン３）または野生型Ｉ−ＣｒｅＩ部位を有するプラスミド（レーン４）とともにインキュベートしたＥｎｄｏ−ＴＮＦｓｃ。レーン５〜７：、バッファーのみ（レーン５）、Ｅｎｄｏ−ＴＮＦｓｃ（レーン６）、または不活性化Ｅｎｄｏ−ＴＮＦＫＯとともにインキュベートしたＥｎｄｏ−ＴＮＦｓｃ認識部位を有する線状化プラスミド。レーン６の０．９および１．８ｋｂの長さのバンドは、目的認識部位のＥｎｄｏ−ＴＮＦｓｃによる切断を示す。
【図５】Ｅｎｄｏ−ＴＮＦＫＯを用いた、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイの結果を示す。培養ＨＥＫ  ２９３細胞を、ＧＦＰまたはＥｎｄｏ−ＴＮＦＫＯのいずれかでトランスフェクトし、ＣｈＩＰアッセイを行なった。ＰＣＲは、投入細胞ライセート（Ｉｎ）から単離したＤＮＡ、またはＩ−ＣｒｅＩ抗血清（ＩＰ）もしくはウシ胎仔血清（−ＡＢ）により免疫沈降させた細胞ライセートから単離したＤＮＡにおいて、ＴＮＦ−αに特異的なプライマーを用いて行なった。
【図６】ＣＣＲ２ＲＥＰ転写抑制因子の活性を示す。Ａ）この実験で使用した転写レポーターの概略図。大腸菌Ｌａｃ−Ｚ遺伝子は、５’末端にＣＣＲ２ＲＥＰ認識配列を有する５’切断型ＣＭＶプロモーターにより駆動する。Ｂ）（Ａ）のレポーター発現カセットを有するプラスミドを使用し、ＣＣＲ２ＲＥＰ遺伝子を有するプラスミドでのトランスフェクションの２４時間後の培養ＨＥＫ  ２９３細胞を、ＣＭＶプロモーターまたはブランクｐＣＩプラスミド（ＣＣＲ２ＲＥＰなし）の制御下でトランスフェクトした。あるいはまた、トランスフェクション効率（ＧＦＰ）について標準化するため、細胞をＧＦＰ発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を回収し、Ｌａｃ−Ｚ活性についてアッセイした。ＣＣＲ２ＲＥＰ発現プラスミドでトランスフェクトした細胞では、ｍｏｃｋ−トランスフェクト対照と対比すると、Ｌａｃ−Ｚ活性の約２．６倍の低下がもたらされたことがわかった。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
１．１  序論
本発明は、一部において、二本鎖ＤＮＡ認識配列に結合するとＤＮＡの塩基との特異的接触およびＤＮＡ主鎖との非特異的接触を行ない、それにより、該認識配列の特異性および自身のＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすメガヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーにおける特定のアミノ酸の同定および特性評価に基づく。この知見を用いて、以下に詳述するように、メガヌクレアーゼにおいて、自身の特異性および／または親和性が改変され得るアミノ酸置換を同定し、天然型メガヌクレアーゼでは認識されない所望のＤＮＡ配列を認識することができる、および／または天然型メガヌクレアーゼと対比したとき特異性および／または親和性が増大または低下している、非天然型のメガヌクレアーゼの合理的設計および開発を行なった。また、本発明は、二量体を形成するために会合している単量体間の界面の残基が、ヘテロ二量体の形成が促進されるように修飾された、非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼを提供する。最後に、配列特異的ＤＮＡ結合能が破壊されることなく、メガヌクレアーゼの触媒活性が低減または解消されるように改変され得る特定の残基を同定した。したがって、このような改変された非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、エフェクタードメインをゲノム内の所望の遺伝子座に標的化するためのＤＮＡ結合タンパク質として使用され得る。
【００５４】
一般的な内容として、本発明は、（１）二本鎖ＤＮＡ認識配列内の個々の塩基に対する配列特異的結合、または（２）二本鎖ＤＮＡ分子のホスホジエステル主鎖に対する非配列特異的結合を担う部位に、改変されたアミノ酸残基を含む、非天然型の合理的に設計されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの作製方法を提供する。ＤＮＡ主鎖に対する結合に関与するアミノ酸の改変により、該酵素の活性が改変され得るだけでなく、二本鎖ＤＮＡに対する全体的な結合親和性が増大または低下することにより、認識配列に対する結合の特異性または縮重の度合いも改変され得る。最後に、触媒活性が低減または解消されるように、特定の残基が改変され得る。このような改変された非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、エフェクタードメインをゲノム内の所望の遺伝子座に標的化するためのＤＮＡ結合タンパク質として使用され得る。
【００５５】
以下に詳述するように、非天然型のメガヌクレアーゼの合理的設計方法は、ＤＮＡの認識／結合を担うアミノ酸の同定、および適切なアミノ酸変更を選択するための一連の規則の適用を含む。メガヌクレアーゼの配列特異性に関して、該規則は、メガヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体におけるメガヌクレアーゼのアミノ酸側鎖とＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖内の塩基間の距離に関する立体面の考慮事項、ならびに該当位置におけるアミノ酸側鎖の官能基と所望のＤＮＡの塩基との非共有結合性化学的相互作用に関する考慮事項の両方を含む。
【００５６】
最後に、ホモ二量体としてＤＮＡに結合する天然メガヌクレアーゼのほとんどは、擬パリンドローム認識配列または完全パリンドローム認識配列を認識する。長鎖のパリンドロームは稀であることが予測されるため、目的のゲノム部位のパリンドローム配列が見出される尤度は極めて低い。そのため、この酵素を、目的のゲノム部位が認識されるように再設計する場合は、異なる片側部位を認識し、非パリンドロームハイブリッド認識配列を切断するためにヘテロ二量体化することができる２つの酵素単量体を設計することが必要である。したがって、一部の態様において、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸位置が異なる単量体を二量体化し、ヘテロ二量体に形成した非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼを提供する。一部の場合では、両方の単量体を合理的に設計し、非パリンドローム認識配列を認識するヘテロ二量体を形成する。２種類の異なる単量体の混合により、３種類までの活性形態のメガヌクレアーゼ二量体：２種類のホモ二量体とヘテロ二量体がもたらされ得る。あるいはまたさらに、一部の場合において、ホモ二量体またはヘテロ二量体の形成の尤度を増大または低下させるために、二量体を形成するために単量体が相互作用し得る界面のアミノ酸残基を改変する。あるいはまたさらに、一部の場合において、ヘテロ二量体の形成を補助するため、単量体ドメイン間にポリペプチドなどのリンカーを付加する。
【００５７】
したがって、一態様において、本発明は、ＤＮＡ結合に対する自身の特異性および／または親和性が改変されるアミノ酸変更を含む非天然型のＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを合理的に設計するための方法を提供する。別の態様において、本発明は、この方法によって得られる非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼ、およびエフェクタードメインをゲノム内の特定の遺伝子座に標的化するための配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質としての該メガヌクレアーゼの使用を提供する。別の態様において、本発明は、非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼとエフェクタードメインとのかかる融合分子を、インビボまたはインビトロでの遺伝子発現の調節に使用する方法を提供する。別の態様において、本発明は、本発明によって提供される融合分子を投与することによって、遺伝子発現が増大または低下することにより治療され得る病状の治療方法を提供する。
【００５８】
１．２  参考文献および定義
本明細書において言及している特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立するものである。本明細書に挙げた発行済米国特許、特許出願、外国の公開特許出願、および参考文献（ＧｅｎＢａｎｋデータベース配列を含む）は、引用により、各々が、引用により組み込まれて、あたかも具体的に個々に示されているのと同程度に本明細書に組み込まれる。
【００５９】
本明細書で用いる場合、用語「メガヌクレアーゼ」は、認識配列の二本鎖ＤＮＡに結合し、１２塩基対より大きいエンドヌクレアーゼをいう。天然型メガヌクレアーゼは、単量体（例えば、Ｉ−ＳｃｅＩ）であっても、二量体（例えば、Ｉ−ＣｒｅＩ）であってもよい。メガヌクレアーゼという用語は、本明細書で用いる場合、単量体メガヌクレアーゼ、二量体メガヌクレアーゼ、または二量体メガヌクレアーゼ形成のために会合しているその単量体をいうために使用され得る。用語「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、用語「メガヌクレアーゼ」と同義的である。メガヌクレアーゼは、触媒的に活性なものであってもよく（すなわち、認識配列の二本鎖ＤＮＡに結合して切断することができる）、合理的設計によって不活性化されたものであってもよい。本明細書に記載の実施形態のほとんどでは、メガヌクレアーゼは不活性化されたものであるが、不活性メガヌクレアーゼを開発する際に、触媒的に活性なメガヌクレアーゼを中間体および対照として使用してもよい。
【００６０】
本明細書で用いる場合、用語「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は、天然で二量体である単一のＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むメガヌクレアーゼ、または天然で単量体である２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むメガヌクレアーゼのいずれかをいう。用語「モノＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は、本明細書において、単一のＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むメガヌクレアーゼをいうために用い、用語「ジＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ」は、本明細書において、２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むメガヌクレアーゼをいうために用い、両者を識別することが必要な場合に用いる。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを含むジＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの２つの各構造ドメインは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットと称することがあり得る。
【００６１】
本明細書で用いる場合、用語「合理的に設計された」は、天然に存在しないこと、および／または遺伝子操作されていることを意味する。本明細書に記載の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは野生型または天然型メガヌクレアーゼと、アミノ酸配列または一次構造が異なるものであり得、また、二次、三次または四次構造が異なるものであってもよい。また、本明細書に記載の合理的に設計されたメガヌクレアーゼは野生型または天然型メガヌクレアーゼと、認識配列特異性、親和性および／または活性が異なるものである。
【００６２】
タンパク質に関して本明細書で用いる場合、用語「組換え」は、該タンパク質をコードする核酸に対する遺伝子操作手法の適用の結果として改変されたアミノ酸配列を有すること、および該タンパク質を発現する細胞または生物を意味する。核酸に関する場合、用語「組換え」は、遺伝子操作手法の適用の結果として改変された核酸配列を有することを意味する。遺伝子操作手法としては、限定されないが、ＰＣＲおよびＤＮＡクローニング手法；トランスフェクション、形質転換および他の遺伝子導入手法；相同組換え；部位特異的変異誘発；ならびに遺伝子融合が挙げられる。この定義によれば、天然型タンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、異種宿主におけるクローニングおよび発現によって産生させたタンパク質は、組換えとはみなされない。
【００６３】
組換えタンパク質に関して本明細書で用いる場合、用語「修飾」は、参照配列（例えば、野生型）と対比したときの組換え配列におけるアミノ酸残基の任意の挿入、欠失または置換を意味する。
【００６４】
本明細書で用いる場合、用語「遺伝子修飾された」は、細胞または生物あるいはその祖先のゲノムＤＮＡ配列が、組換え手法によって意図的に修飾されていることをいう。本明細書で用いる場合、用語「遺伝子修飾された」は、用語「トランスジェニック」を包含する。
【００６５】
本明細書で用いる場合、用語「野生型」は、メガヌクレアーゼの任意の天然に存在する形態をいう。用語「野生型」は、該酵素の天然の最も一般的な対立遺伝子バリアントを意味するのではなく、天然に見られる任意の対立遺伝子バリアントを意味することを意図する。野生型メガヌクレアーゼは、組換えメガヌクレアーゼまたは非天然型のメガヌクレアーゼとは区別される。
【００６６】
本明細書で用いる場合、用語「認識配列片側部位」または単に「片側部位」は、単量体であるモノＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼまたはジＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼの一方のＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットによって認識される二本鎖ＤＮＡ分子の状態の核酸配列を意味する。
【００６７】
本明細書で用いる場合、用語「認識配列」は、モノＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ二量体またはジＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体のいずれかによって結合される１対の片側部位をいう。この２つの片側部位は、該酵素によって特異的に認識されない塩基対によって分断されていてもよく、そうでなくてもよい。Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩおよびＩ−ＣｅｕＩの場合、各単量体の認識配列片側部位は９塩基対の範囲に及び、該２つの片側部位は、特異的に認識されないが実際の切断部位（これは、４塩基対突出端を有する）を構成する４塩基対によって分断されている。したがって、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩおよびＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼ二量体の組合せ認識配列は、通常、４塩基対切断部位にフランキングする２つの９塩基対片側部位を含む２２塩基対の範囲に及ぶ。各片側部位の塩基対を−９から−１と表示し、−９位が切断部位から最も遠位であり、−１位は中央の４塩基対（これは、Ｎ１〜Ｎ４と表示する）と隣接している。−９から−１への方向（すなわち、切断部位に向かう方向）の５’→３’の向きである各片側部位の鎖を「センス」鎖と表示し、反対の鎖を「アンチセンス鎖」と表示するが、いずれの鎖もタンパク質をコードしないものであり得る。したがって、一方の片側部位の「センス」鎖は他方の片側部位のアンチセンス鎖である。例えば、図１（Ａ）参照。ジＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体であるＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの場合、認識配列は、ほぼ１８ｂｐの非パリンドローム配列であり、特異的に認識されない中央塩基対がない。慣用的に、２つの鎖の一方を「センス」鎖と称し、他方を「アンチセンス」鎖と称するが、いずれの鎖もタンパク質をコードしないものであり得る。不活性化されており、したがってＤＮＡを切断しないメガヌクレアーゼであっても、切断部位と対比したときの塩基対に対して、この慣用的な番号付けが本明細書において維持される。
【００６８】
本明細書で用いる場合、用語「特異性」は、メガヌクレアーゼが、認識配列と称する塩基対の特定の配列のみの、または特定の認識配列の組のみの二本鎖ＤＮＡ分子を認識できる能力を意味する。認識配列の組とは、特定の保存された位置または配列モチーフを共有しているが、１つ以上の位置が縮重している場合があり得るものである。高度に特異的なメガヌクレアーゼは、１つまたは非常に少数の認識配列に結合し得るものである。触媒的に活性なメガヌクレアーゼでは、特異性は、切断アッセイにて実施例１に記載のようにして測定され得る。不活性メガヌクレアーゼでは、結合アッセイが代用され得る。本明細書で用いる場合、メガヌクレアーゼは、参照メガヌクレアーゼ（例えば、野生型）によって結合されない認識配列に結合する場合、または認識配列の結合親和性が参照メガヌクレアーゼと対比したとき、有意な（１０倍以上の）量、増大もしくは低下している場合、「改変された」特異性を有する。
【００６９】
本明細書で用いる場合、用語「縮重」は「特異性」の反対を意味する。高度に縮重したメガヌクレアーゼとは、多数の多様な認識配列に結合し得るものである。メガヌクレアーゼは、配列の縮重を、片側部位内の単一の位置に有するものであってもよく、片側部位内の多数の位置（さらには全部の位置）に有するものであってもよい。かかる配列の縮重は、（ｉ）メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメイン内の任意のアミノ酸が、認識配列内の１つ以上の位置の任意の塩基との特異的接触を行なうことができないこと、（ｉｉ）メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメイン内の１つ以上のアミノ酸が、認識配列内の１つ以上の位置の１つより多くの塩基との特異的接触を行なうことができること、および／または（ｉｉｉ）充分な非特異的ＤＮＡ結合親和性に起因し得る。「完全」縮重位置は、４つの塩基の任意もものによって占有され得、片側部位において「Ｎ」で表示され得る。「部分」縮重位置は、４つの塩基のうちの２つまたは３つ（例えば、いずれかのプリン（Ｐｕ）、いずれかのピリミジン（Ｐｙ）、またはＧでないもの）によって占有され得る。
【００７０】
メガヌクレアーゼに関して本明細書で用いる場合、用語「ＤＮＡ結合親和性」または「結合親和性」は、メガヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子（例えば、認識配列または自由裁量の配列）と非共有結合する傾向を意味する。結合親和性は、解離定数ＫＤによって測定され得る（例えば、ＷＴ認識配列に対するＩ−ＣｒｅＩのＫＤは、ほぼ０．１ｎＭである）。本明細書で用いる場合、メガヌクレアーゼは、参照認識配列に対する組換えメガヌクレアーゼのＫＤが、参照メガヌクレアーゼと対比したとき、有意な（１０倍以上の）量、増大もしくは減少している場合、「改変された」結合親和性を有する。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合親和性は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフト、または免疫沈降アッセイ、ならびに当該技術分野で知られた任意の他の方法によって測定され得る。
【００７１】
メガヌクレアーゼ単量体に関して本明細書で用いる場合、用語「二量体形成のための親和性」は、メガヌクレアーゼ単量体が、参照メガヌクレアーゼ単量体と非共有結合する傾向を意味する。二量体形成のための親和性は、同じ単量体（すなわち、ホモ二量体の形成）または参照野生型メガヌクレアーゼなどの異なる単量体（すなわち、ヘテロ二量体の形成）を用いて測定され得る。結合親和性は、解離定数ＫＤによって測定され得る。本明細書で用いる場合、メガヌクレアーゼは、参照メガヌクレアーゼ単量体  に対する該組換えメガヌクレアーゼ単量体のＫＤが、参照メガヌクレアーゼ単量体と対比したとき、有意な（１０倍以上の）量、増大もしくは低下している場合、二量体形成のための「改変された」親和性を有する。
【００７２】
本明細書で用いる場合、用語「パリンドローム」は、同一の片側部位の逆方向反復からなる認識配列をいう。しかしながら、この場合、パリンドローム配列は、該酵素と接触しない中央の４塩基対に対してパリンドロームである必要はない。二量体メガヌクレアーゼの場合、パリンドロームＤＮＡ配列は、２つの単量体が同一の片側部位との接触を行なうホモ二量体によって認識される。
【００７３】
本明細書で用いる場合、用語「擬パリンドローム」は、同一でない、または不完全なパリンドローム片側部位の逆方向反復からなる認識配列をいう。この場合、擬パリンドローム配列は、中央の４塩基対に対してパリンドロームである必要がないだけでなく、２つの片側部位間のパリンドローム配列から逸脱したものであってもよい。擬パリンドロームＤＮＡ配列は、２つの同一の酵素単量体が異なる片側部位との接触を行なう野生型ホモ二量体メガヌクレアーゼによって認識される天然のＤＮＡ部位に典型的である。
【００７４】
本明細書で用いる場合、用語「非パリンドローム」は、メガヌクレアーゼの２つの非関連片側部位で構成された認識配列をいう。この場合、非パリンドローム配列は、中央の４塩基対または２つの単量体片側部位のいずれかに対してパリンドロームである必要はない。非パリンドロームＤＮＡ配列は、ジＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ、高度に縮重したモノＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ（例えば、Ｉ−ＣｅｕＩ）、または同一でない片側部位を認識するモノＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ単量体のヘテロ二量体のいずれかによって認識される。
【００７５】
本明細書で用いる場合、用語「活性」は、本明細書に記載のメガヌクレアーゼが特定の認識配列を切断する速度をいう。かかる活性は、二本鎖ＤＮＡのホスホジエステル結合の加水分解を伴う測定可能な酵素反応である。特定のＤＮＡ基質に対して作用するメガヌクレアーゼの活性は、該特定のＤＮＡ基質に対するメガヌクレアーゼの親和性またはアビディティによって影響され、該基質はまた、ＤＮＡとの配列特異的相互作用と非配列特異的相互作用の両方に影響される。不活性メガヌクレアーゼには、この活性がない。
【００７６】
本明細書で用いる場合、「不活性な」、「不活性化された」または「触媒活性のない」メガヌクレアーゼは、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインであって、野生型酵素の切断部位を、同じ切断条件下で野生型酵素と比べて少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、もしくは少なくとも１０００倍低い速度で切断するもの、または野生型酵素の切断部位を全く切断しないものをいう。野生型酵素の切断部位の切断が観察され得ない場合、かかる切断は「無効にされた」という。
【００７７】
本明細書で用いる場合、用語「相同組換え」は、相同ＤＮＡ配列を修復鋳型として使用し、二本鎖ＤＮＡ切断が修復される天然の細胞内プロセスをいう（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６参照）。相同ＤＮＡ配列は、内因性の染色体配列であってもよく、細胞に送達された外因性核酸であってもよい。したがって、触媒的に活性なメガヌクレアーゼは標的配列内の認識配列を切断するために使用され得、標的配列との相同性または相当な配列類似性を有する外因性核酸を細胞内に送達し、相同組換えによる修復のための鋳型として使用してもよい。標的配列と有意に異なるものであり得る外因性核酸のＤＮＡ配列は、これにより、染色体配列内に組み込まれる。相同組換えのプロセスは、主に真核生物において起こる。用語「相同性」は、本明細書において「配列類似性」に相当する語句として用いるが、血統的または系統発生的関係による同一性が必要とされることを意図しない。
【００７８】
本明細書で用いる場合、用語「非相同末端連接」は、二本鎖ＤＮＡ切断が、２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接的な連接によって修復される天然の細胞内プロセスをいう（例えば、Ｃａｈｉｌｌら（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８−１９７６参照）。非相同末端連接によるＤＮＡ修復は、エラープローンであり、多くの場合、修復部位に鋳型にならない（ｕｎｔｅｍｐｌａｔｅｄ）ＤＮＡ配列の付加または欠失がもたらされる。したがって、触媒的に活性なメガヌクレアーゼは、非相同末端連接によって、標的配列内のメガヌクレアーゼ認識配列に二本鎖切断をもたらし、遺伝子を破壊するために（例えば、塩基挿入、塩基欠失、またはフレームシフト変異の導入によって）使用され得る。標的配列との相同性または相当な配列類似性のない外因性核酸は、非相同末端連接によって、メガヌクレアーゼ刺激型二本鎖ＤＮＡ切断部位に捕捉され得る（例えば、Ｓａｌｏｍｏｎら（１９９８），ＥＭＢＯＪ．１７：６０８６−６０９５参照）。非相同末端連接のプロセスは、真核生物および原核生物（細菌など）のどちらでも起こる。
【００７９】
本明細書で用いる場合、用語「目的配列」は、タンパク質、ＲＮＡまたは調節エレメント（例えば、エンハンサー、サイレンサーもしくはプロモーター配列）のいずれをコードするものであれ、触媒的に活性なメガヌクレアーゼタンパク質を用いて、ゲノム内に挿入され得る、またはゲノムＤＮＡ配列と交換するために使用され得る任意の核酸配列を意味する。目的配列は、該目的配列から発現されるタンパク質またはＲＮＡのタグ化を可能にする異種ＤＮＡ配列を有するものであってもよい。例えば、タンパク質は、例えば限定されないが、エピトープ（例えば、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ）もしくは他のリガンド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）を含むタグでタグ化され得る。さらに、目的配列は、当該技術分野で知られた手法による融合タンパク質をコードするものであってもよい（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  １９９９参照）。一部の場合において、目的配列は、触媒的に活性なメガヌクレアーゼによって切断のために認識されるＤＮＡ配列にフランキングしている。したがって、フランキング配列が切断され、該活性なメガヌクレアーゼによって切断されたゲノムの認識配列内への目的配列の適正な挿入が可能になる。一部の場合において、相同組換えによって標的配列が目的配列で有効に交換されるように、目的配列全体はゲノム内の標的配列に相同であるか、または相当な配列類似性を有する。他の実施形態において、相同組換えによって目的配列がゲノム内の標的配列の遺伝子座に挿入されるように、目的配列は標的配列と相同性または相当な配列類似性を有するＤＮＡ配列にフランキングしている。一部の実施形態において、活性なメガヌクレアーゼが目的配列によって修飾された後、標的配列を切断できないように、目的配列は、該メガヌクレアーゼ認識配列における変異または他の修飾以外、標的配列と実質的に同一である。
【００８０】
本明細書で用いる場合、用語「標的化対象転写エフェクター」は、野生型メガヌクレアーゼと対比したとき修飾された非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼを含む第１ドメインと、天然または非天然転写エフェクタードメインを含む第２ドメインとを含む非天然タンパク質をいう。第１ドメインは、野生型メガヌクレアーゼと対比したとき、ＤＮＡ結合特異性、ＤＮＡ結合親和性および／またはヘテロ二量体の形成能に関して修飾されており、ＤＮＡの切断能に関して不活性化された、非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼを含む。かかる不活性メガヌクレアーゼを「メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン」と称する。第２ドメインは、天然または非天然転写エフェクタードメインを含む。また、かかる転写エフェクタードメインは、遺伝子発現の増大または低減のいずれかのために、細胞の転写機構と直接または間接的に相互作用し得る。標的化対象転写エフェクターの第１と第２のドメインは、一緒に融合されてもよく、フレキシブルリンカーを介して連結されてもよい。
【００８１】
本明細書で用いる場合、用語「ドメインリンカー」は、合理的に設計されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインとエフェクタードメイン（例えば、転写エフェクタードメイン）を共有結合によって連接し、該ペプチド間の連続的連結を形成する化学結合主鎖を有し、該主鎖に沿って複数の自由回転結合を有する化学的部分を意味する。一部の特定の実施形態において、本明細書に記載のドメインリンカーは、少なくとも約１３Åの主鎖長（すなわち、該ペプチド間の連続的連結を形成する結合長の和）を有する。一部の実施形態において、ドメインリンカーは、複数のアミノ酸残基を含むが、そうである必要はない。具体的な実施形態において、ドメインリンカーは、３〜１５個のアミノ酸残基を含むポリペプチドリンカーである。かかるドメインリンカーは、ほぼ１３〜６５Åの主鎖長を有する。
【００８２】
ドメインリンカーは、実質的に線状、生化学的に不活性、親水性および／またはプロテアーゼによって非切断可能であり得るが、分岐型ドメインリンカー、または反応性部分、疎水性残基およびプロテアーゼ切断部位を有するリンカーも、一部の特定の実施形態では適当であり得る。また、ドメインリンカーは、生理学的条件下で二次構造にならないように設計され得る。したがって、例えば、該ドメインリンカー配列は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンおよびプロリンからなる群より選択される複数の残基で構成されたものであり得る。
【００８３】
一部の実施形態において、ドメインリンカーは、本質的にグリシン残基とセリン残基からなる。また、より大きな芳香族残基を含むドメインリンカーも包含され得るが、立体障害の原因となり得る。同様に、電荷を有するアミノ酸を含めてもよいが、相互作用して二次構造が形成されることがあり得、無極性アミノ酸を含めてもよいが、可溶性が低下することがあり得る。このような基準の１つ以上を満たすものでないドメインリンカーは、一部の実施形態において、少なくとも有効であると示されることがあり得る。
【００８４】
ドメインリンカーの化学合成について、有機合成の当業者であれば、上記の要件を満たす多種多様なリンカーが設計されよう。したがって、性質ならびに連接する末端（すなわち、Ｎ−および／またはＣ−末端）に応じて、リンカーに対し、融合させる（例えば、一端または両端の天然型アミノ酸、Ｄ−異性体アミノ酸、または修飾アミノ酸（サルコシンもしくはＤ−アラニンなど）を使用）２つのタンパク質の選択された末端に該リンカーが連接され得るような適切な末端基を選択する。
【００８５】
一部の実施形態において、ドメインリンカーとしては、有機酸、アルデヒド、アルコール、チオール、アミンなどのポリマーまたはコポリマーが挙げられる。例えば、ヒドロキシ−、アミノ−、またはジ−カルボン酸（グリコール酸、乳酸、セバシン酸、もしくはサルコシンなど）のポリマーまたはコポリマーが使用され得る。あるいはまた、飽和または不飽和炭化水素、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、糖類などのポリマーまたはコポリマーが使用され得る。かかるドメインリンカーの一例は、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）から入手可能なポリエチレングリコール（例えば、末端にＤ−アラニンを有するもの、または有しないもの）である。このようなリンカーは、任意選択で、アミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能性結合を有するものであってもよい。他の例としては、非天然型アミノ酸（例えば、Ｄ−異性体など）のポリマーまたはコポリマーが挙げられる。一部の特定の非天然型アミノ酸は、本発明との関連において好都合であり得る特徴を有する。例えば、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）により、有利な可溶性特性を示しつつ、水素結合の形成および二次構造の形成が最小限になることが予測され得、したがって、ポリサルコシンリンカー（例えば、末端にリシンを有するもの、または有しないもの）が使用され得る。これらおよび他の多くのドメインリンカーが、当業者によって、従来の化学合成手法を用いて容易に使用されよう。
【００８６】
あるいはまた、ドメインリンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデル設計することができるコンピュータプログラムを用いて（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ  ＆  Ｂｅｒｇ（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３），Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ  ＆  Ｂｅｒｇ（１９９４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１０９９−１１１０３）、またはファージディスプレイ法によって合理的に設計され得る。
【００８７】
他の実施形態において、非共有結合による方法を使用し、エフェクタードメインと結合させたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインを有する分子を作製することができる。
【００８８】
調節ドメインに加え、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインを、精製、発現のモニタリング、または細胞内および細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）局在のモニタリングを容易にするために、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、およびＦＬＡＧエピトープなどの融合タンパク質として発現させてもよい。
【００８９】
本明細書で用いる場合、用語「単鎖メガヌクレアーゼ」は、アミノ酸リンカーを用いて共有結合により連接し、単一のポリペプチドにした１対のモノＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを含む非天然型のメガヌクレアーゼをいう。例えば、Ｉ−ＣｒｅＩ由来の１対の合理的に設計されたメガヌクレアーゼがアミノ酸リンカーを用いて連接され得、第１の合理的に設計されたメガヌクレアーゼ単量体と第２の合理的に設計されたメガヌクレアーゼ単量体を連接して単鎖ヘテロ二量体が作製され得る（例えば、実施例５参照）。単鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、単鎖メガヌクレアーゼの認識配列が非パリンドロームであるような異なる片側部位を認識する１対の合理的に設計されたメガヌクレアーゼサブユニットを含む。
【００９０】
アミノ酸配列および核酸配列の両方に関して本明細書で用いる場合、用語「類似性パーセント」および「配列類似性」は、２つの配列の類似性の度合いの尺度をいい、アラインメントしたアミノ酸残基間またはヌクレオチド間の類似性が最大になるようにし、かつ同一または類似した残基またはヌクレオチドの数、残基またはヌクレオチドの総数、ならびに配列アラインメント内のギャップの存在および長さの関数である該配列のアラインメントに基づいたものである。標準的なパラメータを用いるさまざまなアルゴリズムおよびコンピュータプログラムが配列類似性の測定に利用可能である。本明細書で用いる場合、配列類似性は、アミノ酸配列ではＢＬＡＳＴｐプログラム、および核酸配列ではＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて測定され、どちらもＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手可能であり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎら（１９９６），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３  ８９−３４０２）；Ｚｈａｎｇら（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１−２）：２０３−１４に記載されている。本明細書で用いる場合、２つのアミノ酸配列の類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムの以下のパラメータ：ワードサイズ＝３；ギャップ開始ペナルティ＝−１１；ギャップ伸張ペナルティ＝−１；および置換行列（ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２に基づいたスコアである。本明細書で用いる場合、２つの核酸配列類似性パーセントは、ＢＬＡＳＴｎアルゴリズムの以下のパラメータ：ワードサイズ＝１１；ギャップ開始ペナルティ＝−５；ギャップ伸張ペナルティ＝−２；マッチリワード（ｍａｔｃｈ  ｒｅｗａｒｄ）＝１；およびミスマッチペナルティ＝−３に基づいたスコアである。
【００９１】
２つのタンパク質またはアミノ酸配列の修飾に関して本明細書で用いる場合、用語「〜に対応する」は、第１のタンパク質における特定の修飾が、第２のタンパク質における修飾と同じアミノ酸残基の置換であること、および２つのタンパク質を標準配列アラインメントに供したとき（例えば、ＢＬＡＳＴｐプログラム）第１のタンパク質における修飾のアミノ酸位置が、第２のタンパク質における修飾のアミノ酸位置に対応する、またはアラインメントされることを示すために用いる。したがって、残基ＸとＹが配列アラインメントにおいて互いに対応する場合、ＸとＹが異なる数である場合があり得るという事実にもかかわらず、第１のタンパク質のアミノ酸「Ａ」に対する残基「Ｘ」の修飾は、第２のタンパク質のアミノ酸「Ａ」に対する残基「Ｙ」の修飾に対応する。
【００９２】
本明細書で用いる場合、ある可変量に対する数値範囲の記載は、該範囲内の任意の値である該可変量を用いて本発明が実施され得ることをいうものとする。したがって、本質的に不連続である可変量では、該可変量は、該数値範囲内の該範囲の両端を含む任意の整数値であり得る。同様に、本質的に連続している可変量では、該可変量は、該数値範囲内の該範囲の両端を含む任意の実数値であり得る。一例として、限定されないが、０〜２の値を有すると記載した可変量には、該可変量が本質的に不連続である場合は０、１または２の値が採用され得、該可変量が本質的に連続している場合は０．０、０．１、０．０１、０．００１の値、または任意の他の０以上２以下の実数値が採用され得る。
【００９３】
本明細書で用いる場合、特に記載のない限り、「または（もしくは）」という語は、「いずれか／または（もしくは）」という排他的意味ではなく、「および／または」という包括的意味で用いている。
２．１  改変された配列特異性を有する合理的に設計されたメガヌクレアーゼ
【００９４】
本発明の一態様において、組換えＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメガヌクレアーゼを合理的に設計するための方法を提供する。この態様において、組換えメガヌクレアーゼは、まず、片側部位の各位置における塩基の優先性が改変され得るアミノ酸置換を予測することにより、合理的に設計される。このような置換は、所望の切断特異性を有するメガヌクレアーゼを作製するために、個々に、または組合せにおいて実験により確認され得る。
【００９５】
本発明によれば、塩基の優先性に所望の変更をもたらし得るアミノ酸置換は、メガヌクレアーゼのＤＮＡ認識配列の核酸塩基およびＤＮＡホスホジエステル主鎖との接触を行なうことに参与し得る参照メガヌクレアーゼ（例えば、野生型メガヌクレアーゼ、または非天然型参照メガヌクレアーゼ）のアミノ酸側鎖、ならびに該接触部の空間的および化学的性質を調べることにより予測される。このようなアミノ酸としては、限定されないが、参照ＤＮＡ片側部位との接触に関与する側鎖が挙げられる。一般的に、この測定には、メガヌクレアーゼとその二本鎖ＤＮＡ認識配列との複合体の構造の知識、または高度に類似した複合体（例えば、同じメガヌクレアーゼと択一的なＤＮＡ認識配列間、またはメガヌクレアーゼの対立遺伝子もしくは系統発生的バリアントとそのＤＮＡ認識配列間）の構造の知識を有することが必要とされる。
【００９６】
原子座標データによって示されるポリペプチドまたは２つ以上のポリペプチドの複合体の３次元構造は、いくつかの様式で得られ得る。例えば、タンパク質構造の測定は、限定されないが、Ｘ線結晶学的検査、ＮＭＲ、およびコンピュータシミュレーションなどの手法を用いて行なわれ得る。別のアプローチは、対象のメガヌクレアーゼまたは関連メガヌクレアーゼの既存の構造座標のデータベースを解析することである。かかる構造のデータは、多くの場合、３次元座標の形態のデータベースで入手可能である。多くの場合、このようなデータは、オンラインデータベースから得られ得る（例えば、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂのＲＣＳＢ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）。
【００９７】
構造の情報は、例えば、タンパク質またはタンパク質複合体の規則正しい２次元または３次元アレイ（例えば、結晶）によって得られたＸ線または電子の回折パターンを解析することにより、実験によって得ることができる。コンピュータによる方法を使用し、回折データを３次元空間の原子座標に変換する。例えば、Ｘ線結晶学的検査の視野を用いて、メガヌクレアーゼを含む、多くのタンパク質−ＤＮＡ複合体に関する３次元構造の情報が得られている（例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７−３７７４参照）。
【００９８】
また、核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、溶液中での分子の原子間距離を測定するために使用されている。コンピュータ使用による方法と組み合わせた多次元ＮＭＲ法は、漸増サイズのポリペプチドの原子座標の測定において成功裡である（例えば、Ｔｚａｋｏｓら（２００６），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３５：１９−４２参照）。
【００９９】
あるいはまた、タンパク質／ＤＮＡの既知の一次構造および、入手可能な場合は二次、三次および／または四次構造に基づいたアルゴリズム、ならびにアミノ酸側鎖、核酸塩基および結合相互作用の既知の物理化学的性質を適用することにより、コンピュータ使用によるモデル設計が使用され得る。かかる方法は、任意選択で、反復的アプローチ、または実験的誘導制約を含むものであり得る。かかるコンピュータソフトウェアの一例は、Ａｄａｍｓら（１９９９），Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５５（Ｐｔ  １）：１８１−９０に記載されたＣＮＳプログラムである。タンパク質構造内のアミノ酸の空間的配置を推定する、およびタンパク質のアミノ酸側鎖と種々の標的分子との相互作用を推定する、さまざまな他のコンピュータプログラムが開発されている（例えば、米国特許第６，９８８，０４１号参照）。
【０１００】
したがって、本発明の一部の実施形態において、コンピュータ使用によるモデルを使用し、ＤＮＡ核酸塩基と特異的に相互作用する、および／または非特異的ホスホジエステル主鎖相互作用を助長する具体的なアミノ酸残基が同定される。例えば、潜在的メガヌクレアーゼ−ＤＮＡ相互作用の全体性（ｔｏｔａｌｉｔｙ）のコンピュータモデルは、適当なソフトウェアプログラム、例えば限定されないが、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（商標）２．０（Ａｖａｔａｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＡＢ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）、グラフ表示プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓら（１９９１），Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ａ４７：１１０）、グラフ表示プログラムＧＲＡＳＰ（商標）（Ｎｉｃｈｏｌｌｓら（１９９１），ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１（４）：２８１  ｆｆ）、またはグラフ表示プログラムＩＮＳＩＧＨＴ（商標）（ＴＳＩ，Ｉｎｃ．，Ｓｈｏｒｅｖｉｅｗ，ＭＮ）を用いて作成され得る。タンパク質−ＤＮＡ複合体の３次元構造表示の作成、視聴および操作に適したコンピュータハードウェアは、市販されており、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ，Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ）。
【０１０１】
具体的には、メガヌクレアーゼとその二本鎖ＤＮＡ認識配列間の相互作用は、当該技術分野で知られた方法を用いて解像され得る。例えば、結晶が生成された多成分複合体構造の３次元構造の表示またはモデルは、分子置換またはＳＩＲ／ＭＩＲ（単一／多重同形置換）（例えば、Ｂｒｕｎｇｅｒ（１９９７），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２７６：５５８−５８０；ＮａｖａｚａおよびＳａｌｕｄｊｉａｎ（１９９７），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２７６：５８１−５９４；ＴｏｎｇおよびＲｏｓｓｍａｎｎ（１９９７），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２７６：５９４−６１１；ならびにＢｅｎｔｌｅｙ（１９９７），Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２７６：６１１−６１９参照）などの手法を用いて調べることができ、ソフトウェアプログラム、例えば、ＡＭｏＲｅ／Ｍｏｓｆｌｍ（Ｎａｖａｚａ（１９９４），Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ａ５０：１５７−１６３；ＣＣＰ４（１９９４），Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０：７６０−７６３）またはＸＰＬＯＲ（Ｂｒｕｎｇｅｒら（１９９２），Ｘ−ＰＬＯＲ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１．Ａ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｘ−ｒａｙ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ＮＭＲ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ参照）などを用いて行なわれ得る。
【０１０２】
タンパク質構造および潜在的メガヌクレアーゼ−ＤＮＡ相互作用を調べることにより、酵素活性と特異性に影響を及ぼすために変更させ得るアミノ酸に関する合理的選択が可能になる。決定は、特定の塩基またはＤＮＡホスホジエステル主鎖とのアミノ酸側鎖相互作用に関するいくつかの要素に基づく。適切なアミノ酸置換の決定に使用される化学的相互作用としては、限定されないが、ファンデルワールス力、立体障害、イオン結合、水素結合、および疎水性相互作用が挙げられる。認識配列に対する特異性を、ならびに全体的な結合親和性および活性をある程度まで増大または低下させるため、メガヌクレアーゼと潜在的認識配列片側部位内の特定の塩基との特定の相互作用に有利または不利いずれかであるアミノ酸置換が選択され得る。また、全体的な活性を増大または低下させるため、およびある程度まで特異性を低下または増大させるため、二本鎖ＤＮＡのホスホジエステル主鎖に対する結合親和性を増大させるか、または低下させるかのいずれかであるアミノ酸置換が選択され得る。
【０１０３】
したがって、具体的な実施形態において、メガヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体の３次元構造が測定され、ＤＮＡ認識配列片側部位内の各塩基対の「接触表面」が画定される。一部の実施形態において、接触表面は、対のいずれかの塩基上の主溝水素結合ドナーまたはアクセプターから９．０Å以内にβ−炭素を有し、残基が野生型メガヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体において塩基接触を行なうかどうかとは無関係にＤＮＡ側に向いた側鎖を有する該酵素のアミノ酸を含む。他の実施形態において、残基は、野生型メガヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体との接触を行なわない場合、除外され得るか、または残基は、考慮対象の残基の数もしくは実体を改変する設計者の裁量によって組み入れられるか、もしくは除外され得る。一例において、後述するように、野生型Ｉ−ＣｒｅＩ片側部位の−２、−７、−８および−９位の塩基では、接触表面は、野生型酵素−ＤＮＡ複合体において実際に相互作用するアミノ酸位置に限定した。しかしながら、−１、−３、−４、−５および−６位では、接触表面は、野生型接触には関与しないが、異なるアミノ酸で置換すると塩基と接触する可能性があるさらなるアミノ酸位置を含むように規定した。
【０１０４】
認識配列片側部位は、典型的には、ＤＮＡの一方の鎖のみに関して説明しているが、メガヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡの主溝内に結合し、両方の鎖上の核酸塩基との接触を行なうことに注意されたい。また、「センス」および「アンチセンス」鎖の表示は、メガヌクレアーゼの結合および認識に関して完全に自由裁量である。ある位置における配列特異性は、塩基対一方の構成員との相互作用、または塩基対の両方の構成員との相互作用の組合せのいずれかによって得られ得る。したがって、例えば、Ｘ位においてＡ／Ｔ塩基対の存在が有利となるようにするためには（ここで、塩基Ａは「センス」鎖上に存在し、塩基Ｔは「アンチセンス」鎖上に存在する）、Ｘ位でセンス鎖に接触するように充分に近接しており、かつＡの存在が有利となるような残基を選択する、および／またはＸ位でアンチセンス鎖に接触するように充分に近接しており、Ｔの存在が有利となるような残基を選択する。本発明によれば、残基のβ−炭素が該当塩基の最も近接した原子の９Å以内に存在している場合、充分に近接している残基が考慮される。
【０１０５】
したがって、例えば、ＤＮＡセンス鎖の９Å以内であるが、アンチセンス鎖からは９Åより離れたβ−炭素を有するアミノ酸が、センス鎖のみとの潜在的相互作用に考慮される。同様に、ＤＮＡアンチセンス鎖の９Å以内であるが、センス鎖からは９Åより離れたβ−炭素を有するアミノ酸が、アンチセンス鎖のみとの潜在的相互作用に考慮される。両方のＤＮＡ鎖の９Å以内であるβ−炭素を有するアミノ酸は、いずれかの鎖との潜在的相互作用に考慮される。
【０１０６】
各接触表面について、潜在的アミノ酸置換は、４つのＤＮＡ塩基の１つ以上と有利に相互作用する能力の予測に基づいて選択される。この選択プロセスは、２つの一次基準：（ｉ）アミノ酸の側鎖サイズ（これは、種々の核酸塩基との立体相互作用に影響を及ぼす）、および（ｉｉ）アミノ酸の側鎖の化学的性質（これは、種々の核酸塩基との静電的相互作用と結合相互作用に影響を及ぼす）に基づくものである。
【０１０７】
側鎖サイズに関して、接触表面内のアミノ酸β−炭素が塩基から＜６Åである場合は、短鎖および／または小分子の側鎖を有するアミノ酸が選択され得、接触表面内のアミノ酸β−炭素が塩基から＞６Åである場合は、長鎖および／または大分子の側鎖を有するアミノ酸が選択され得る。接触表面内のアミノ酸β−炭素が塩基から５〜８Åである場合は、中間サイズの側鎖を有するアミノ酸が選択され得る。
【０１０８】
比較的短鎖で小分子の側鎖を有するアミノ酸は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、アスパラギン酸（Ｄ）、アスパラギン（Ｎ）およびプロリン（Ｐ）が含まれる第１群に割り当てられ得る。しかしながら、プロリンは、相対的に非柔軟性であるため、多くの場合、あまり使用されないことが予測される。また、グリシンは、ペプチド主鎖に不要な柔軟性を導入するため、および非常にサイズが小さいことから、より大きい残基に置換すると有効な接触の尤度が低下するため、多くの場合、あまり使用されないことが予測される。他方、グリシンは、縮重位置を助長するための一部の場合において使用され得る。相対的に中間の長さおよびサイズ側鎖を有するアミノ酸は、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）およびグルタミン（Ｑ）が含まれる第２群に割り当てられ得る。比較的長鎖および／または大分子の側鎖を有するアミノ酸は、リシン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、およびトリプトファン（Ｗ）が含まれる第３群に割り当てられ得る。しかしながら、トリプトファンは、相対的に非柔軟性であるため、多くの場合、あまり使用されないことが予測される。また、リシン、アルギニンおよびメチオニンの側鎖柔軟性により、これらのアミノ酸が、遠い距離または中間距離からの塩基接触を行なうことが可能になり、第２群と第３群の両方に含まれることの正当な理由となる。これらの群を、以下に表形式でも示す。
【表１】
2011519558.tif 000003
【０１０９】
側鎖の化学的性質に関して、種々のアミノ酸を、種々の核酸塩基との潜在的相互作用（例えば、ファンデルワールス力、イオン結合、水素結合、および疎水性相互作用）に関して評価し、メガヌクレアーゼと、二本鎖ＤＮＡ認識配列片側部位内の特定の位置の特定の塩基との特定の相互作用に有利または不利いずれかである残基を選択する。一部の場合において、１つ以上の完全または一部縮重位置を有する片側部位を作製することが望ましい場合があり得る。かかる場合では、２つ以上の塩基の存在が有利な残基、または１つ以上の塩基が不利な残基が選択され得る。例えば、一部縮重塩基の認識は、センスまたはアンチセンス位置でのピリミジンの立体障害によってなされ得る。
【０１１０】
グアニン（Ｇ）塩基の認識は、該塩基のＮ７およびＯ６と水素結合を形成する塩基性側鎖を有するアミノ酸を用いて行なわれる。シトシン（Ｃ）特異性は、Ｃ以外のすべての塩基上に存在する主溝の電気陰性基との相互作用が不利である負電荷を有する側鎖によって付与される。チミン（Ｔ）認識は、疎水性側鎖と主溝の塩基上のメチル基との疎水性相互作用およびファンデルワールス相互作用を用いて合理的に設計される。最後に、アデニン（Ａ）塩基は、カルボキサミド側鎖ＡｓｎおよびＧｌｎまたはヒドロキシル側鎖Ｔｙｒを使用し、塩基のＮ７およびＮ６との１対の水素結合によって認識される。最後に、Ｈｉｓは、Ｎ７との水素結合に寄与することにより、プリン塩基（ＡまたはＧ）に対する特異性を付与するために使用され得る。ＤＮＡ認識のためのこのような直接的な（ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ）規則を用いて接触表面を推定することができ、特定の塩基対位置の塩基の一方または両方が、合理的に設計された接触部によって認識される。
【０１１１】
したがって、種々の核酸塩基との結合相互作用、および接触が行なわれ得る位置において有利である塩基に基づき、各アミノ酸残基は、有利である種々の塩基（すなわち、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＡ）に対応する１つ以上の異なる群に割り当てられ得る。したがって、Ｇ群には、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）およびヒスチジン（Ｈ）が含まれ、Ｃ群には、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）が含まれ、Ｔ群には、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、システイン（Ｃ）、トレオニン（Ｔ）、メチオニン（Ｍ）およびフェニルアラニン（Ｆ）が含まれ、Ａ群には、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｎ）、チロシン（Ｙ）およびヒスチジン（Ｈ）が含まれる。ヒスチジンは、Ｇ群とＡ群の両方に見られること；セリン（Ｓ）は、いずれの群にも含まれないが、縮重位置が有利となるように使用されること；ならびにプロリン、グリシンおよびトリプトファンは、主に立体面の考慮事項のため、いずれの特定の群にも含まれないことに注意されたい。これらの群を、以下に表形式でも示す。
【表２】
2011519558.tif 000004
【０１１２】
したがって、本発明によれば、メガヌクレアーゼの認識配列片側部位内の所与のＸ位に所望の変更をもたらすため、（１）少なくとも、野生型または参照メガヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体の３次元構造の該当する部分、およびＸ位の接触表面を画定するアミノ酸残基側鎖を調べる；（２）接触表面を構成する少なくとも１つの残基のβ−炭素と、Ｘ位の塩基対の少なくとも１つの塩基間の距離を調べる；ならびに（３）（ａ）塩基から＜６Åである残基には、Ｇ群、Ｃ群、Ｔ群またはＡ群のうち、所望の変更を促すのに適切な１群の構成員である第１群および／または第２群の残基を選択する、および／または（ｂ）塩基から＞６Åである残基には、Ｇ群、Ｃ群、Ｔ群またはＡ群のうち、所望の変更を促すのに適切な１群の構成員である第２群および／または第３群の残基を選択する。解析および修飾のために、接触表面を構成する１つより多くのかかる残基が選択され得、一部の実施形態において、かかる残基の各々を分析し、複数の残基を修飾する。同様に、接触表面に含まれる残基のβ−炭素と、Ｘ位の塩基対の２つの各塩基間の距離が測定され得、残基が両方の塩基の９Å以内であれば、対の２つの塩基に影響を及ぼす異なる置換が行なわれ得る（例えば、一方の鎖の近位の塩基に影響を及ぼすための第１群の残基、または他方の鎖の遠位の塩基に影響を及ぼすための第３群の残基）。あるいはまた、対の両方の塩基と相互作用し得る残基置換の組合せにより、特異性に影響を及ぼすことができる（例えば、Ｔ／Ａを選択するため、センス鎖に接触するＴ群の残基を、アンチセンス鎖に接触するＡ群の残基と組み合わせる）。最後に、残基の多数の択一的修飾は、経験的（例えば、組換えメガヌクレアーゼを作製し、その配列認識を試験することにより）、またはコンピュータの使用（例えば、修飾型酵素のメガヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体のコンピュータモデル設計を行なうことにより）のいずれかによって確認され、数ある択一的修飾の中から選択され得る。
【０１１３】
野生型または参照メガヌクレアーゼの１つ以上の所望のアミノ酸修飾が選択されたら、合理的に設計されたメガヌクレアーゼが、当該技術分野でよく知られた組換えによる方法および手法によって作製され得る。一部の実施形態において、非ランダムまたは部位特異的変異誘発手法を使用し、特定の配列修飾を作出する。非ランダム変異誘発手法の非限定的な例としては、オーバーラッピングプライマーＰＣＲ（例えば、Ｗａｎｇら（２００６），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４（２）：５１７−５２７参照）、部位特異的変異誘発（例えば、米国特許第７，０４１，８１４号参照）、カセット変異誘発（例えば、米国特許第７，０４１，８１４号参照）、およびＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，ＣＡ）から市販されているＡｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ（登録商標）ＩＩ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓキットの製造業者のプロトコルが挙げられる。
【０１１４】
合理的に設計されたメガヌクレアーゼによる特定のＤＮＡ配列の認識および切断は、当業者にわかる任意の方法によってアッセイされ得る（例えば、米国特許公開公報第２００６／００７８５５２号参照）。一部の特定の実施形態において、メガヌクレアーゼ切断の測定は、インビトロ切断アッセイによって行なわれる。かかるアッセイでは、アッセイ対象のメガヌクレアーゼの目的の認識配列を含むポリヌクレオチド基質のインビトロ切断、および一部の特定の実施形態では、一方または両方の片側部位の１つ以上の塩基が異なる塩基に変更された目的の認識配列の変異型が使用される。典型的には、ポリヌクレオチド基質は、合成してベクター内にクローニングした標的部位を含む二本鎖ＤＮＡ分子である。ポリヌクレオチド基質は線状であっても環状であってもよく、典型的には、認識配列を１つだけ含む。メガヌクレアーゼをポリヌクレオチド基質とともに適切な条件下でインキュベートし、得られたポリヌクレオチドを、切断生成物を同定するための既知の方法（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）によって分析する。線状の二本鎖ＤＮＡ基質に単一の認識配列が存在する場合、メガヌクレアーゼ活性は、２つのバンド（生成物）の出現および最初の完全長基質バンドの消失によって検出される。一実施形態において、メガヌクレアーゼ活性は、例えば、Ｗａｎｇら（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２５：３７６７−３７７６に記載のようにしてアッセイされ得る。
【０１１５】
他の実施形態では、メガヌクレアーゼの切断パターンはインビボ切断アッセイを用いて測定される（例えば、米国特許公開公報第２００６／００７８５５２号参照）。特別な実施形態では、該インビボ試験は、単鎖アニーリング組換え試験（ＳＳＡ）である。この種の試験は当業者には既知である（Ｒｕｄｉｎら（１９８９），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：５１９−５３４；Ｆｉｓｈｍａｎ−Ｌｏｂｅｌｌら（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：４８０−４）。
【０１１６】
当業者には自明であるように、メガヌクレアーゼ酵素のＤＮＡの認識および結合に関与しているドメイン以外のドメインに対して、活性が完全に失われることなく、さらなるアミノ酸置換、挿入または欠失が行なわれ得る。置換は、構造的または機能的に  拘束された位置における、類似したアミノ酸残基の同類置換であってもよく、構造的または機能的にあまり拘束されていない位置における非同類置換であってもよい。かかる置換、挿入および欠失は、当業者により、必要以上に努力せずに常套的な実験手法によって同定され得る。したがって、一部の実施形態において、本明細書に記載の組換えメガヌクレアーゼは、いずれかの箇所に、参照メガヌクレアーゼ配列と８５％〜９９％（例えば、８５％、８７．５％、９０％、９２．５％、９５％、９７．５％、９９％）の配列類似性を有するタンパク質を含む。各野生型Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩタンパク質に関して、最もＮ末端側およびＣ末端側の配列は、Ｘ線結晶学的試験において明白に見えず、これは、これらの位置が構造的または機能的に拘束されていないことを示す。したがって、このような残基は、配列類似性の計算から除外され得、以下の参照メガヌクレアーゼ配列：Ｉ−ＣｒｅＩでは配列番号：１の残基２〜１５３、Ｉ−ＭｓｏＩでは配列番号：６の残基６〜１６０、Ｉ−ＳｃｅＩでは配列番号：９の残基３〜１８６、およびＩ−ＣｅｕＩでは配列番号：１２の残基５〜２１１が使用され得る。
【０１１７】
２．２  ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーメガヌクレアーゼ
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼファミリーは、多様な系統発生的宿主生物群に由来する２００より多くの構成員で構成されている。このファミリーの構成員はすべて、１コピーまたは２コピーの高度に保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフとともに、特定のＤＮＡ配列の切断に関与している他の構造モチーフを有する。単一コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフを有する該酵素（すなわち、モノＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ）は、二量体として機能を果たすが、２コピーの該モチーフを有する該酵素（すなわち、ジＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼ）は、単量体として機能を果たす。
【０１１８】
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーの構成員はすべて、比較的長い配列（＞１２ｂｐ）を認識して切断し、４ヌクレオチドの３’突出端をもたらす。また、このような酵素は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフに加えて、いくつかの構造モチーフ（例えば、タンパク質−ＤＮＡ界面に逆平行β−鎖の類似した配置）を共有している。このような  保存された構造モチーフ内のアミノ酸は、ＤＮＡ塩基との相互作用を担い、認識配列特異性を付与する。該ファミリーの一部の構成員（例えば、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩおよびＩ−ＣｅｕＩ）間において、Ｘ線結晶学的検査により、全体的な構造類似性が明らかになった。したがって、このファミリーの構成員は、該酵素の全体的な活性または配列特異性を変更するため、かかる構造モチーフ内の特定のアミノ酸を修飾することができ、対応する修飾により、他のファミリー構成員でも同様の結果が得られる妥当に予測され得る。一般的に、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７−３７７４を参照のこと。
【０１１９】
２．２．１  Ｉ−ＣｒｅＩ由来の合理的に設計されたメガヌクレアーゼ
一態様において、本発明は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼに基づいた、または由来する非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼに関する。Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列を、配列番号：１（これは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＰＯ５７２５に対応する）に示す。ＰＤＢ一意名（ＰＤＢ  ＩＤ）１ＢＰ７を有する結晶構造による野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼの２つの認識配列片側部位を以下に示す：
位置  −９−８−７−６−５−４−３−２−１
５’−ＧＡＡＡＣＴＧＴＣＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＴＴＧ−３’  配列番号：２
３’−ＣＴＴＴＧＡＣＡＧＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＡＡＣ−５’  配列番号：３
位置  −１−２−３−４−５−６−７−８−９
この天然認識配列は、中央の４塩基対の外側であっても完全パリンドロームでないことに注意のこと。２つの認識配列片側部位を、それぞれのセンス鎖において太字で示す。
【０１２０】
また、野生型Ｉ−ＣｒｅＩは、以下の完全パリンドローム（中央のＮ１〜Ｎ４塩基を除く）配列も認識して切断する：
位置  −９−８−７−６−５−４−３−２−１
５’−ＧＡＡＡＣＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＴＴＧ−３’  配列番号：４
３’−ＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＡＣＴＣＴＧＴＣＡＡＡＣ−５’  配列番号：５
位置  −１−２−３−４−５−６−７−８−９
【０１２１】
配列番号：４および配列番号：５のパリンドローム配列は、該酵素が天然のＤＮＡ配列よりも、この部位に高い親和性で結合して効率的に切断するため、野生型Ｉ−ＣｒｅＩの良好な基質とみなされる。以下の開示内容の解釈上、および特に、本明細書に示す実験結果に関して、野生型Ｉ−ＣｒｅＩによって切断されるこのパリンドローム配列を「ＷＴ」と称する（例えば、図２（Ａ）参照）。２つの認識配列片側部位を、それぞれのセンス鎖において太字で示す。
【０１２２】
図１（Ａ）は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼホモ二量体と二本鎖ＤＮＡ認識配列の相互作用を示し、図１（Ｂ）は、野生型酵素と一例の野生型認識配列での、該酵素のアミノ酸残基と、一方の片側部位の−４位の塩基間の特異的相互作用を示し、図１（Ｃ）〜（Ｅ）は、片側部位の−４位に改変された特異性を有する本明細書に記載の３種類の合理的に設計されたメガヌクレアーゼでの、該酵素のアミノ酸残基と、一方の片側部位の−４位の塩基間の特異的相互作用を示す。
【０１２３】
したがって、片側部位の任意の特定の塩基位置における塩基の優先性は、本明細書に開示した方法を使用し、その他の３つの各塩基対に対して合理的に改変され得る。まず、特定の塩基位置の野生型認識表面を調べる（例えば、メガヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体共結晶構造を解析することにより；またはメガヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体のコンピュータモデル設計により）。次に、既存および潜在的接触残基を、周辺アミノ酸位置のβ−炭素と特定の塩基位置の各ＤＮＡ鎖上の核酸塩基間の距離に基づいて調べる。例えば、限定されないが、図１（Ａ）に示すように、−４位のＩ−ＣｒｅＩ野生型メガヌクレアーゼ−ＤＮＡ接触残基は、アンチセンスＤＮＡ鎖の塩基Ａと水素結合する２６位のグルタミンを含む。また、残基７７は、潜在的にＤＮＡセンス鎖の−４位の塩基と接触し得ると確認された。残基２６のβ−炭素は、アンチセンスＤＮＡ鎖の塩基ＡのＮ７から５．９Å離れており、残基７７のβ−炭素は、センス鎖のＴのＣ５−メチルから７．１５Å離れている。本明細書に記載の距離および塩基の化学的性質の規則によると、センス鎖のＣは７７位のグルタミン酸と水素結合し得、アンチセンス鎖のＧは２６位のグルタミンと結合し得る（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ結晶構造において観察されるように、水分子によって媒介）（図１（Ｃ）参照）；センス鎖のＧは７７位のアルギニンと水素結合し得、アンチセンス鎖のＣは２６位のグルタミン酸と水素結合し得る（図１（Ｄ）参照）；センス鎖のＡは７７位のグルタミンと水素結合し得、アンチセンス鎖のＴは２６位のアラニンと疎水性接触部を形成し得る（図１（Ｅ）参照）。塩基特異的接触が７７位によってもたらされる場合、特異性に対するその影響が低減または除去するために、野生型接触Ｑ２６が置換され得る（例えば、セリン残基で）。あるいはまた、２６位と７７位の相補的変異を組み合わせると、特定の塩基対が指定され得る。（例えば、Ａ２６によりアンチセンス鎖のＴが指定され、Ｑ７７によりセンス鎖のＡが指定される（図１（Ｅ））。このような残基置換の予測はすべて、実験によって確認した。
【０１２４】
したがって、本発明によれば、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する相当な数のアミノ酸修飾が確認され、これらは、単独または組合せで、ＤＮＡ認識配列片側部位内の個々の塩基において、このような非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼが野生型酵素とは異なる片側部位を有するような改変された特異性を有する組換えメガヌクレアーゼがもたらされる。Ｉ−ＣｒｅＩのアミノ酸修飾および認識配列片側部位特異性において得られた変更を表１に示す。
【表３】
2011519558.tif 000005
【０１２５】
２．２．２  Ｉ−ＭｓｏＩ由来の合理的に設計されたメガヌクレアーゼ
別の態様において、本発明は、Ｍｏｎｏｍａｓｔｉｘ種のＩ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼに基づいた、または由来する非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼに関する。Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列を、配列番号：６（これは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＬ３４３８７に対応する）に示す。ＰＤＢ一意名（ＰＤＢ  ＩＤ）１Ｍ５Ｘを有する結晶構造による野生型Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼの２つの認識配列片側部位を以下に示す：
位置  −９−８−７−６−５−４−３−２−１
５’−ＣＡＧＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＴＣＣ−３’  配列番号：７
３’−ＧＴＣＴＴＧＣＡＧＣＡＣＴＣＴＧＴＣＡＡＧＧ−５’  配列番号：８
位置  −１−２−３−４−５−６−７−８−９
認識配列は、中央の４塩基対の外側であっても完全パリンドロームでないことに注意のこと。２つの認識配列片側部位を、それぞれのセンス鎖において太字で示す。
【０１２６】
本発明によれば、Ｉ−ＭｓｏＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する相当な数のアミノ酸修飾が同定され、これらは、単独または組合せで、ＤＮＡ認識配列片側部位内の個々の塩基において、このような非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼが野生型酵素とは異なる認識配列を有するような改変された特異性を有する組換えメガヌクレアーゼがもたらされ得る。Ｉ−ＭｓｏＩのアミノ酸修飾および認識配列片側部位特異性において予測される変更を表２に示す。
【表４】
2011519558.tif 000006
【０１２７】
２．２．３  Ｉ−ＳｃｅＩ由来の合理的に設計されたメガヌクレアーゼ
別の態様において、本発明は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＩ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼに基づいた、または由来する非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼに関する。Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列を配列番号：９（これは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ０９８４３に対応する）に示す。ＰＤＢ一意名（ＰＤＢ  ＩＤ）１Ｒ７Ｍを有する結晶構造による野生型Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼの認識配列を以下に示す：
センス  ５’−ＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡＧ−３’  配列番号：１０
アンチセンス  ３’−ＡＡＴＧＧＧＡＣＡＡＴＡＧＧＧＡＴＣ−５’  配列番号：１１
位置  １  ２  ３  ４  ５  ６  ７  ８  ９  １０  １１  １２  １３  １４  １５  １６  １７  １８
認識配列は非パリンドロームであり、片側部位を分断する４塩基対は存在しないことに注意のこと。
【０１２８】
本発明によれば、Ｉ−ＳｃｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する相当な数のアミノ酸修飾が同定され、これらは、単独または組合せで、ＤＮＡ認識配列内の個々の塩基において、このような非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼが野生型酵素とは異なる認識配列を有するような改変された特異性を有する組換えメガヌクレアーゼがもたらされ得る。Ｉ−ＳｃｅＩのアミノ酸修飾および認識配列特異性において予測される変更を表３に示す。
【表５】
2011519558.tif 000007
【０１２９】
２．２．４  Ｉ−ＣｅｕＩ由来の合理的に設計されたメガヌクレアーゼ
別の態様において、本発明は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｅｕｇａｍｅｔｏｓのＩ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼに基づいた、または由来する非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼに関する。Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの野生型アミノ酸配列を配列番号：１２（これは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ３２７６１に対応する）に示す。ＰＤＢ一意名（ＰＤＢ  ＩＤ）２ＥＸ５を有する結晶構造による野生型Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼの２つの認識配列片側部位を以下に示す：
位置  −９−８−７−６−５−４−３−２−１
５’−ＡＴＡＡＣＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＴＡＧＣＧＡＡ−３’  配列番号：１３
３’−ＴＡＴＴＧＣＣＡＧＧＡＴＴＣＣＡＴＣＧＣＴＴ−５’  配列番号：１４
位置  −１−２−３−４−５−６−７−８−９
認識配列は、Ｉ−ＣｅｕＩがホモ二量体であることにもかかわらず、Ｉ−ＣｅｕＩ認識界面における天然の縮重のため、中央の４塩基対の外側であっても非パリンドロームであることに注意のこと（Ｓｐｉｅｇｅｌら（２００６），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １４：８６９−８０）。２つの認識配列片側部位を、それぞれのセンス鎖において太字で示す。
【０１３０】
本発明によれば、Ｉ−ＣｅｕＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対する相当な数のアミノ酸修飾が同定され、これらは、単独または組合せで、ＤＮＡ認識配列片側部位内の個々の塩基において、このような非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼが野生型酵素とは異なる認識配列を有し得るような改変された特異性を有する組換えメガヌクレアーゼがもたらされる。Ｉ−ＣｅｕＩのアミノ酸修飾および認識配列特異性において予測される変更を表４に示す。
【表６】
2011519558.tif 000008
【０１３１】
２．２．５  任意選択で除外される組換えメガヌクレアーゼ
一部の実施形態において、本発明は、先行技術において報告されたもの、および択一的方法によって開発されたものである一部の特定の組換えメガヌクレアーゼを包含しないことを意図する。このような除外されるメガヌクレアーゼとしては、Ａｒｎｏｕｌｄら（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３−５８；Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１−４１；Ｃｈａｍｅｓら（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：ｅｌ７８；Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：３８７０−９；およびＡｓｈｗｏｒｔｈら（２００６），Ｎａｔｕｒｅ  ４４１（７０９３）：６５６−６５９（これらの全開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されたもの、例えば、Ｃ３３、Ｒ３３、Ａ４４、Ｈ３３、Ｋ３２、Ｆ３３、Ｒ３２、Ａ２８、Ａ７０、Ｅ３３、Ｖ３３、Ａ２６およびＲ６６から選択される単一の置換を有するＩ−ＣｒｅＩ系の組換えメガヌクレアーゼが挙げられる。また、Ａ６８／Ｎ７０／Ｎ７５およびＤ４４／Ｄ７０／Ｎ７５から選択される３つの置換、またはＫ４４／Ｔ６８／Ｇ６０／Ｎ７５およびＲ４４／Ａ６８／Ｔ７０／Ｎ７５から選択される４つの置換を有するＩ−ＣｒｅＩ系の組換えメガヌクレアーゼも除外される。最後に、具体的に、Ｌ２８とＲ８３の対の置換を有するＩ−ＭｓｏＩ系の組換えメガヌクレアーゼも除外する。これらの置換または置換の組合せを、本明細書では、「除外修飾」と称する。
【０１３２】
２．２．６  認識配列片側部位に多数の変更を有する合理的に設計されたメガヌクレアーゼ
別の態様において、本発明は、ＤＮＡ認識配列片側部位内の２つ以上の位置における片側部位優先性を改変するため、上記のセクション２．２．１〜２．２．４に記載のアミノ酸修飾を２つ以上組み合わせることにより作製される非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼに関する。例えば、限定されないが、より充分に後述するように、酵素ＤＪ１をＩ−ＣｒｅＩから、修飾Ｒ３０／Ｅ３８（−７位のＣに有利）、Ｒ４０（−６位のＧに有利）、Ｒ４２（−５位のＧに有利）、およびＮ３２（−９位のの完全縮重に有利）を組み込むことにより誘導した。合理的に設計されたＤＪ１メガヌクレアーゼは、野生型がＡ−７Ａ−６Ａ−５に優先性であるのに対して、Ｃ−７Ｇ−６Ｇ−５を不変的に認識し、−９位のＡに対して高い許容性を有する。
【０１３３】
異なる塩基位置に影響を及ぼす残基置換の組合せが可能なことは、一部において、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼのモジュラー型の性質のためである。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ認識界面における塩基接触のほとんどは、個々のアミノ酸側鎖によって行なわれ、該界面には、相対的に、隣接塩基と相互作用する側鎖間に相互連結または水素結合性網目がない。このため、一般的に、隣接塩基における側鎖相互作用に影響を及ぼすことなく、１つの塩基位置と相互作用する残基の操作が可能である。また、上記のセクション２．２．１〜２．２．４に記載の変異の相加的性質も、これらの変異を同定するために使用される方法の直接的な結果である。該方法により、単一の塩基と直接相互作用する側鎖置換が予測される。一般的に、側鎖間の相互連結または水素結合性網目は回避し、認識界面内の置換の独立性を維持する。
【０１３４】
側鎖置換の一部の特定の組合せは、完全に、または一部において互いに非適合性である。非適合性のアミノ酸の対または組を合理的に設計されたメガヌクレアーゼに組み込んだ場合、得られる酵素の触媒活性は低下しているか、解消されている。典型的には、このような非適合性は、導入されたアミノ酸の側鎖間の立体障害によるものであり、活性は、この障害を特定して除くことにより回復され得る。具体的には、大分子側鎖（例えば、第２群または第３群のアミノ酸）を有する２つのアミノ酸を、メガヌクレアーゼ構造内で互いに隣接するアミノ酸位置（例えば、Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの場合は、３２位と３３位、２８位と４０位、２８位と４２位、４２位と７７位、または６８位と７７位）に組み込んだ場合、これらの２つのアミノ酸が互いに障害となり、酵素活性が低下するということが起こり得る。この障害は、非適合性アミノ酸の一方または両方を、小分子側鎖（例えば、第１群または第２群）を有するアミノ酸に置換することにより解消される。例えば、合理的に設計されたＩ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼにおいて、Ｋ２８は、Ｒ４０とＲ４２の両方に障害となる。酵素活性を最大にするためには、Ｒ４０とＲ４２を、２８位のセリンまたはアスパラギン酸と組み合わせるのがよい。
【０１３５】
本明細書に記載のようにして同定されるアミノ置換の組合せは、野生型メガヌクレアーゼ（または事前に修飾されたメガヌクレアーゼ）の特異性を、元の認識配列から目的の核酸（例えば、ゲノム）内に存在し得る所望の認識配列に、合理的に改変するために使用され得る。例えば、図２Ａは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ認識配列ＷＴ（配列番号：４）の「センス」鎖、ならびに合理的に設計されたメガヌクレアーゼに有用であり得るいくつかの他の配列を示す。ＷＴ認識配列と所望の認識配列間の保存された塩基には陰影をつけている。本発明によれば、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とする組換えメガヌクレアーゼは、このような所望の認識配列ならびに  任意の他の配列の各々に対して、本明細書に記載の適当なアミノ酸置換によって合理的に設計され得る。
【０１３６】
３．改変されたＤＮＡ結合親和性を有する合理的に設計されたメガヌクレアーゼ
上記のように、本明細書に記載の組換えメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合親和性は、ＤＮＡのホスホジエステル主鎖と接触表面を形成する一部の特定のアミノ酸を改変することモジュレートされ得る。該接触表面は、ＤＮＡ主鎖から９Å以内にβ−炭素を有し、かつ野生型メガヌクレアーゼ−ＤＮＡ複合体内のＤＮＡ主鎖との接触を行なうどうかとは無関係にＤＮＡ側に向いた側鎖を有する該酵素のアミノ酸を含む。ＤＮＡ結合は酵素活性に必要な前駆体であるため、ＤＮＡ結合親和性の増大／低下は、それぞれ酵素活性の増大／低下を引き起こすことが示されている。しかしながら、ＤＮＡ結合親和性の増大／低下はまた、メガヌクレアーゼ配列特異性の低下／増大も引き起こすこと示されている。したがって、活性および特異性はどちらも、ホスホジエステル主鎖接触を修飾することによりモジュレートされ得る。
【０１３７】
具体的には、酵素活性を増大させる／酵素特異性を低下させるために：
【０１３８】
（ｉ）  該酵素とＤＮＡ主鎖間の静電的反発を解除する。同定アミノ酸が、負電荷を有するＤＮＡ主鎖と反発することが予測され得る負電荷を有する側鎖を有する場合（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、反発は、無電荷または正の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸に置換することにより解消され得る（立体障害の影響を前提とする）。実験によって確認された一例は、Ｉ−ＣｒｅＩのグルタミン酸８０のグルタミンへの変異である。
【０１３９】
（ｉｉ）該酵素とＤＮＡ主鎖間に静電的求引相互作用を導入する。接触表面の任意の位置において、正の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシンまたはアルギニン）の導入により、結合親和性が増大すると予測される（立体障害の影響を前提とする）。
【０１４０】
（ｉｉｉ）該酵素とＤＮＡ主鎖間に水素結合を導入する。接触表面のアミノ酸が、ＤＮＡ主鎖と相互作用するには長すぎる、および／または非柔軟性すぎるために、ＤＮＡ主鎖と水素結合を行なわない場合、適切な長さおよび柔軟性を有し、水素結合供与し得る極性アミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、リシン、システイン、またはアルギニン）が導入され得る（立体障害の影響を前提とする）。
【０１４１】
具体的には、酵素活性低下させる／酵素特異性を増大させるために：
【０１４２】
（ｉ）該酵素とＤＮＡ主鎖間に静電的反発を導入する。接触表面の任意の位置において、を有するアミノ酸負電荷を有する側鎖（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸）の導入により、結合親和性が低下することが予測される（立体障害の影響を前提とする）。
【０１４３】
（ｉｉ）該酵素とＤＮＡ間の静電的求引を解除する。接触表面の任意のアミノ酸が、負電荷を有するＤＮＡ主鎖と相互作用する正の電荷を有する側鎖を有する場合（例えば、リシンまたはアルギニン）、この有利な相互作用は、無電荷または負電荷を有する側鎖を有するアミノ酸に置換することにより解消され得る（立体障害の影響を前提とする）。実験によって確認された一例は、Ｉ−ＣｒｅＩのリシン１１６のアスパラギン酸への変異である。
【０１４４】
（ｉｉｉ）該酵素とＤＮＡ主鎖間の水素結合を解除する。接触表面の任意のアミノ酸がＤＮＡ主鎖と水素結合を行なう場合、これを、側鎖が適切に官能性付与されていないか、または必要な長さ／柔軟性特性がないために同様の水素結合を行なわないと予測され得るアミノ酸に置換するとよい。
【０１４５】
例えば、Ｉ−ＣｒｅＩ系の一部の組換えメガヌクレアーゼにおいて、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ内の８０位のグルタミン酸は、リシンまたはグルタミンのいずれかに改変し、活性を増大させる。別の実施形態では、Ｉ−ＣｒｅＩの６６位のチロシンをアルギニンまたはリシンに変更し、メガヌクレアーゼの活性を増大させる。また別の実施形態では、酵素活性を、Ｉ−ＣｒｅＩの３４位のリシンをアスパラギン酸に変更すること、６６位のチロシンをアスパラギン酸に変更すること、および／または１１６位のリシンをアスパラギン酸に変更することにより低下させる。
【０１４６】
組換えメガヌクレアーゼの活性は、該組換え酵素が特定の認識配列に対して、無活性から非常に高活性までのいずれかとなるようにモジュレートされ得る。例えば、ＤＪ１組換えメガヌクレアーゼは、２６位にグルタミン酸変異を有する場合、完全に活性が失われる。しかしながら、２６位におけるグルタミン酸置換と８０位におけるグルタミン置換の組合せにより、認識配列片側部位内の−４位のグアニンに対して高い特異性および活性を有する組換えメガヌクレアーゼがもたらされる（図１（Ｄ）参照）。
【０１４７】
本発明によれば、ホスホジエステルＤＮＡ主鎖に近接した種々の位置のアミノ酸を、メガヌクレアーゼの活性と特異性の両方が同時に影響されるように変更することができる。この酵素特異性と活性の「チューニング」は、アミノ酸とホスホジエステル主鎖により行なわれる接触の数を増加または減少させることによって行なわれる。ホスホジエステル主鎖とのさまざまな接触は、アミノ酸側鎖によって助長され得る。一部の実施形態において、イオン結合、塩橋、水素結合および立体障害によって、アミノ酸側鎖とホスホジエステル主鎖との結合に影響を及ぼす。例えば、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼでは、１１６位のリシンのアスパラギン酸への改変により、−８位と−９位の核酸塩基対間の塩橋が解除され、酵素切断速度が低下し、特異性が増大する。
【０１４８】
各野生型Ｉ−ＣｒｅＩ（配列番号：１）、Ｉ−ＭｓｏＩ（配列番号：６）、Ｉ−ＳｃｅＩ（配列番号：９）およびＩ−ＣｅｕＩ（配列番号：１２）メガヌクレアーゼの主鎖接触表面を形成する残基の実体を、以下の表５に示す。
【表７】
2011519558.tif 000009
【０１４９】
該酵素の親和性を増大させ、それにより、より活性／低特異性にするため：
（１）負電荷を有する（ＤもしくはＥ）、疎水性（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｙ）、または無電荷／極性（Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ）のいずれかである対応酵素に対して、表５のアミノ酸を選択する。
（２）アミノ酸が負電荷を有するか、または疎水性である場合、無電荷／極性（効果は少ない）または正の電荷を有する（ＫまたはＲ、より効果的）のものに変異させる。
（３）アミノ酸が無電荷／極性である場合、正の電荷を有するものに変異させる。
【０１５０】
該酵素の親和性を低下させ、それにより、低い活性／より特異性にするため：
（１）正の電荷を有する（ＫもしくはＲ）、疎水性（Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｙ）、または無電荷／極性（Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ）のいずれかである対応酵素に対して、表５のアミノ酸を選択する。
（２）アミノ酸が正の電荷を有するものである場合、無電荷／極性（効果は少ない）または負電荷を有する（より効果的）ものに変異させる。
（３）アミノ酸が疎水性または無電荷／極性である場合、負電荷を有するものに変異させる。
【０１５１】
４．合理的に設計されたヘテロ二量体メガヌクレアーゼ
別の態様において、本発明は、２つの単量体の会合によって形成されるヘテロ二量体である合理的に設計された非天然型のメガヌクレアーゼを提供し、該単量体は、一方が野生型であり得、一方または両方が非天然型または組換え形態であり得る。例えば、野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼは、通常、各々が擬パリンドローム認識配列の一方の片側部位に結合する２つの単量体で構成されたホモ二量体である。ヘテロ二量体組換えメガヌクレアーゼは、異なる片側部位を認識する２つのメガヌクレアーゼを結合することにより、例えば、２つのメガヌクレアーゼを細胞内で同時発現させることにより、または２つのメガヌクレアーゼを溶液中で混合することにより作製され得る。ヘテロ二量体の形成は、該２つの単量体の各々の二量体への会合に影響するアミノ酸を改変することにより、ホモ二量体の形成よりも有利となり得る。特別な実施形態では、該２つの単量体の界面の一部の特定のアミノ酸を、第１単量体では、負電荷を有するアミノ酸（ＤまたはＥ）から正電荷を有するアミノ酸（ＫまたはＲ）に、第２単量体では、正電荷を有するアミノ酸から負電荷を有するアミノ酸に改変する（表６）。例えば、Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼの場合では、第１単量体において７位と５７位のリシンをグルタミン酸に変異させ、第２単量体において８位と６１位のグルタミン酸をリシンに変異させる。このプロセスの結果、第１単量体が二量体界面において正の電荷を有する残基を過剰に有し、第２単量体は、二量体界面において負電荷を有する残基を過剰に有する１対の単量体が得られる。したがって、第１および第２単量体は、界面において改変アミノ酸間の静電的相互作用のため、その同一の単量体対よりも優先的に会合する。
【表８】
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【０１５２】
あるいはまたさらに、該２つの単量体の界面の一部の特定のアミノ酸を、ホモ二量体の形成が立体的に障害されるように改変してもよい。具体的には、一方の単量体の二量体界面のアミノ酸を、ホモ二量体を立体的に障害する、より大分子でバルキーな残基で置換する。第２単量体の二量体界面のアミノ酸は、第１単量体のバルキーな残基を代償するため、およびヘテロ二量体内の衝突（あれば）を解除するために、任意選択で、より小分子の残基で置換してもよく、修飾しなくてもよい。
【０１５３】
別の択一的または付加的実施形態において、イオン結合または水素結合を、ヘテロ二量体の界面の疎水性コアに含めてもよい。具体的には、該界面のコアにおいて、一方の単量体の疎水性残基が、正電荷を有する残基で置換され得る。また、野生型ホモ二量体において、第１単量体の置換疎水性残基と相互作用する第２単量体の疎水性残基は、負電荷を有する残基で置換され得る。したがって、この２つの置換された残基が、イオン結合または水素結合を形成し得る。同時に、疎水性の界面に含まれた満足でない電荷による静電的反発は、ホモ二量体の形成に不利となるはずである。
【０１５４】
最後に、上記のように、ヘテロ二量体の各単量体は、ＤＮＡ認識領域において、各々が、異なるＤＮＡ片側部位を有し、結合された二量体のＤＮＡ認識配列が非パリンドロームとなるように置換された、異なるアミノ酸を有するものであり得る。
【０１５５】
５．メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインとしての合理的に設計された不活性メガヌクレアーゼ
非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼの触媒活性は、触媒作用に関与するアミノ酸を変異させることにより低下または解消され得る（例えば、Ｉ−ＣｒｅＩにおけるＱ４７のＥへの変異、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００１），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４３：１４０１５−１４０２６参照）；Ｉ−ＳｃｅＩにおけるＤ４４またはＤ１４５のＮへの変異；Ｉ−ＣｅｕＩにおけるＥ６６のＱへの変異；Ｉ−ＭｓｏＩにおけるＤ２２のＮへの変異）。この不活性化型のメガヌクレアーゼは、次いで、別のタンパク質に由来するエフェクタードメインに、例えば、限定されないが、転写活性化因子（例えば、ＧＡＬ４トランス活性化ドメインもしくはＶＰ１６トランス活性化ドメイン）、転写抑制因子（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌタンパク質由来のＫＲＡＢドメイン）、ＤＮＡメチラーゼドメイン（例えば、Ｍ．ＣｖｉＰＩもしくはＭ．ＳｓｓＩ）、またはヒストンアセチルトランスフェラーゼドメイン（例えば、ＨＤＡＣ１もしくはＨＤＡＣ２）に融合され得る。遺伝子工学的に作製されたＤＮＡ結合ドメイン、最も注目すべきは遺伝子工学的に作製されたジンクフィンガードメインと、エフェクタードメインとからなるキメラタンパク質は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｐａｐｗｏｒｔｈら（２００６），Ｇｅｎｅ  ３６６：２７−３８参照）。
【０１５６】
一部の実施形態において、メガヌクレアーゼはまた、核局在シグナルも含む（例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳ（配列番号３８）、これは、メガヌクレアーゼドメインのＮ末端に付加され得る）。メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは、パリンドロームまたは擬パリンドロームＤＮＡ配列を認識するモノＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼドメインを含むものであり得る。あるいはまた、非パリンドロームＤＮＡ配列に結合し得る、ジＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼドメインまたはヘテロ二量体を形成し得るモノＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼドメイン（モノＬＡＧＬＩＤＡＤＧドメインがヘテロ二量体化するように遺伝子工学的に操作されたものか否かとは無関係に）を含むものであってもよい。最後に、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは、Ｉ−ＣｒｅＩ由来の１対のモノＬＡＧＬＩＤＡＤＧサブユニットが単一のポリペプチドに連接された単鎖メガヌクレアーゼを含むものであってもよい。後者の実施形態は、非パリンドロームＤＮＡ部位の認識に有用である。
【０１５７】
６．メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインの認識部位
目的遺伝子の発現に影響を及ぼすためには、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン（「メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン」）は、遺伝子内または遺伝子プロモーター内のＤＮＡ部位を認識できるものである。目的が遺伝子の活性化である場合、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは、遺伝子転写の開始点の上流に存在するプロモーター内のＤＮＡ部位を認識できるものである。目的が遺伝子抑制である場合、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは、プロモーターまたは（ｏｆ）遺伝子自体のいずれかの、転写開始部位の上流または下流に存在するＤＮＡ部位を認識できるものである。一部の実施形態において、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは、転写開始部位から２，０００塩基以内のＤＮＡ部位を認識する。一部の実施形態において、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは、転写開始部位から５００塩基以内のＤＮＡ部位を認識する。遺伝子発現の抑制が意図されるメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインの場合、該メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが、可能な限り転写開始部位に近接しているＤＮＡ部位を認識するものである場合が有用であり得る。
【０１５８】
多くの目的遺伝子の転写開始部位が当該技術分野で知られており、科学文献またはデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／）など）において容易に見い出すことができる。あるいはまた、目的遺伝子の転写開始部位は、ＲＴ−ＰＣＲまたは当該技術分野で知られた他の方法により、実験によって調べてもよい（例えば、Ｏｈａｒａら（１９９０），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６９９７−７００２参照）。
【０１５９】
一部の実施形態において、標的化対象転写エフェクターの目的が、真核生物細胞内における天然遺伝子の発現制御である場合、メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは、クロマチンの到達可能な領域に存在することが事前にわかっている認識配列に結合するように設計され得る。特定の認識配列の到達可能性は、ＤＮａｓｅＩ超感受性解析によって判定され得る。かかる解析は、多くの目的遺伝子に対して行なわれており、科学文献においてよく知られている。かかるデータがまだ公に入手可能でない場合、ＤＮａｓｅＩ感受性は、標準的なプロトコルを使用し、実験によって判定され得る（例えば、ＬｕおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（２００４），Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：７７−８６）。あるいはまた、既知の天然転写因子の認識配列内または該配列付近の認識配列に結合するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが作製され得る。多くの天然転写因子によって認識されるＤＮＡ配列は、当該技術分野で知られている（例えば、ＴＲＡＮＳＦＡＣデータベース、ｗｗｗ．ｇｅｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ｃｏｍ参照）。かかるＤＮＡ配列が遺伝子のプロモーター内に見られる場合、一般的に、該部位ならびに直接フランキングしている領域は、クロマチン構造において到達可能であると考えられる。
【０１６０】
合理的に設計されたメガヌクレアーゼに由来するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが、特定のＤＮＡ配列に結合するか否かを調べるための方法がいくつか存在している。ＤＮＡ結合親和性をインビトロで測定するための方法は、当該技術分野で知られており、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ；例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９９），Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．参照）などの手法が挙げられる。また、クロマチン免疫沈降などの一般的な実験手法を用いて、特定のメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインが特定のＤＮＡ配列にインビボで結合するか否かを調べることも可能である（例えば、Ａｐａｒｉｃｉｏら（２００５），Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２１−３参照；実施例５も参照）。
【０１６１】
７．転写エフェクタードメイン
転写エフェクタードメインは、直接または間接的に、細胞内転写機構と相互作用することにより、遺伝子発現に影響を及ぼす。エフェクタードメインは、天然の転写因子の一部として見られ得るものであり、遺伝子転写を活性化する能力または抑制する能力のいずれかによって識別される。多くの転写活性化因子ドメインが当該技術分野で知られており、ＧＡＬ４活性化ドメイン（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＧＡＬ４  タンパク質のアミノ酸７６８〜８８１を含む、配列番号：３９）およびヘルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン（ＨＳＶ−Ｉ  ＶＰ１６タンパク質のアミノ酸４１３〜４９０を含む、配列番号：４０）が挙げられる。また、転写抑制因子ドメインも当該技術分野で知られており、抑制因子ドメインのＫＲＡＢ（Ｋｒｕｐｐｅｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｂｏｘ）ファミリーが挙げられる。ＫＲＡＢドメインは自然界に遍在しており、典型的には、ＣｙＳ２ＨｉＳ２ジンクフィンガー転写因子の成分として見られる（例えば、Ｈｕｎｔｌｅｙら（２００６），Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１６：６６９−６７７参照）。例えば、本発明の一部の実施形態に適したＫＲＡＢドメインの一例は、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  Ｋｉｄ−１タンパク質のアミノ酸１２〜７４を含むものである（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ０２９７５、配列番号：４１）。
【０１６２】
転写エフェクタードメインは、メガヌクレアーゼ由来ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合され得る。Ｉ−ＣｒｅＩ由来メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインの場合、エフェクタードメインをＣ末端に融合させることが好ましい。また、短鎖のフレキシブルアミノ酸「ドメインリンカー」を、ＤＮＡ結合ドメインとエフェクタードメイン間に付加することが好ましい場合があり得る。適当な実施形態としては、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）ｎ（ここで、ｎ＝１〜５）の形態のリンカーが挙げられる。タンパク質ドメインを連接するためのグリシンおよびセリンアミノ酸を多く含むフレキシブルリンカーの使用は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｍａｃｋら（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７０２１−７０２５；Ｕｅｄａら（２０００），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４１：１５９−１７０；Ｂｒｏｄｅｌｉｕｓら（２００２），２６９：３５７０−３５７７；Ｋｉｍら（１９９６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１１５６−１１６０）。短鎖のフレキシブルアミノ酸リンカー以外のドメインリンカーもまた、上記のようにして使用され得る。
【０１６３】
８．転写の調節
本明細書に記載の標的化対象転写エフェクターは、単離された細胞または生物において遺伝子発現を制御するために使用され得る。ほとんどの適用用途では、標的化対象転写エフェクターは、原核生物または真核生物細胞内の天然プロモーター／遺伝子に結合して調節するように作製される。しかしながら、一部の場合では、細胞内に導入された外因性プロモーター／遺伝子に結合して調節する標的化対象転写エフェクターを作製することが望ましい場合があり得る。かかる外因性プロモーター／遺伝子は、細胞内の染色体外（例えば、プラスミド上）に存在し得るものであるか、または細胞のゲノム内に組み込まれ得る（例えば、ウイルスの形質導入によって）ものである。一部の実施形態において、標的化対象転写エフェクターは、ウイルス（例えば、ＨＩＶまたはＨＳＶ−１）の遺伝子に結合して調節し、ウイルスの病原性が低下するように作製され得る。例えば、標的化対象転写エフェクターは、宿主ゲノム内への組込み、複製、潜伏期間からの出現、ウイルス粒子の形成、細胞逸出、または宿主の防御の回避に必要なウイルス遺伝子の発現を低減させるために使用され得る。
【０１６４】
標的化対象転写エフェクターは細胞に、タンパク質として、または該タンパク質をコードする核酸の形態で送達され得る。一般に、標的化対象転写エフェクターが目的遺伝子の発現に奏する効果は、該標的化対象転写エフェクター自体が細胞内に存在している限り持続する。したがって、タンパク質形態の標的化対象転写エフェクターの送達によって遺伝子転写にもたらされる効果は一過性（例えば、数日）であることが予測され得る。非複製性核酸（例えば、非複製性プラスミドＤＮＡ）に担持された標的化対象転写エフェクター遺伝子を細胞に送達すると、目的遺伝子の転写はより長期間（例えば、数日から数週間）になることが予測され得る。複製性核酸（例えば、複製性プラスミドまたはゲノムに組み込まれたウイルス）に担持された標的化対象転写エフェクター遺伝子の送達では、目的遺伝子の発現が最も長期間となり、永続的となり得ることが予測され得る。
【０１６５】
本開示は、細胞内内在遺伝子を高い有効性を伴って特異的に認識するように遺伝子工学的に作製された標的化対象転写エフェクターを提供する。したがって、本開示は、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼを主体とする標的化対象転写エフェクターが、天然クロマチン環境に存在する細胞内内在遺伝子の発現を調節するために使用され得ることを示すものである。
【０１６６】
一部の実施形態において、該調節方法では、遺伝子の転写を活性化または抑制するために、標的化対象認識配列に対して約２５ｎＭ未満のＫｄを有する標的化対象転写エフェクターが使用される。標的化対象転写抑制因子は、細胞内内在遺伝子の転写を２０％以上低下させるために使用され得、標的化対象転写活性化因子は、細胞内内在遺伝子の転写を２０％以上増大させるために使用され得る（投与後の標的化対象転写エフェクターの第１半減期中の転写物の数の変化によって測定）。
【０１６７】
９．標的化対象転写エフェクターの適用
遺伝子発現を調節するための本明細書に記載の方法により、新規なヒトおよび哺乳動物の治療的適用、例えば、遺伝子疾患；癌；真菌、原生動物、細菌およびウイルス感染；虚血；血管疾患；関節炎；免疫学的障害；などの治療が可能になるとともに、機能的ゲノミクスアッセイための手段、および改変された表現型（例えば、疾患抵抗性、果実熟成、糖および油分組成、収量ならびに色）を有する植物を開発するための手段が提供される。
【０１６８】
本明細書に記載のように、標的化対象転写活性化因子は、選択した任意の内在遺伝子の発現の調節のために、任意の適当な標的部位を認識するように設計され得る。調節のための適当な内在遺伝子の例としては、ＶＥＧＦ、ＣＣＲ５、ＥＲα、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＨＢＶ  Ｃ、Ｓ、Ｘ、およびＰ、ＬＤＬ−Ｒ、ＰＥＰＣＫ、ＣＹＰ７、フィブリノゲン、ＡｐｏＢ、Ａｐｏ  Ｅ、Ａｐｏ（ａ）、レニン、ＮＦ−κβ、Ｉ−κβ、ＴＮＦ−α、ＦＡＳリガンド、アミロイド前駆体タンパク質、心房性ナトリウム利尿（ｎａｔｕｒｅｔｉｃ）因子、ｏｂ−レプチン、ｕｃｐ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、ＰＤＧＦ、ＰＡＦ、ｐ５３、Ｒｂ、胎児ヘモグロビン、ジストロフィン、ユートロフィン（ｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦ受容体ｆｉｔおよびｆｌｋ、トポイソメラーゼ、テロメラーゼ、ｂｃｌ−２、サイクリン、アンギオスタチン、ＩＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＳＴＡＴＳ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＴＨ、ＰＴＩ−１、ポリガラクツロナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼ、ＦＡＤ２−１、Δ−１２デサチュラーゼ、Δ−９デサチュラーゼ、Δ−１５デサチュラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、デンプンシンターゼ、セルロースシンターゼ、スクロースシンターゼ、老化関連遺伝子、重金属キレート剤、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ、ウイルス遺伝子、原生動物遺伝子、真菌遺伝子、ならびに細菌遺伝子が挙げられる。一般に、調節される適当な遺伝子としては、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、分裂促進因子、化学走性因子、癌活性因子、受容体、カリウムチャネル、Ｇ−タンパク質、シグナル形質導入分子、および他の疾患関連遺伝子が挙げられる。
【０１６９】
遺伝子発現の転写因子調節における一般的な主題は、一般的に必要とされることがプロモーターとの単純な結合および充分な近接だけであることである。プロモーターに対する厳密な位置、向きおよび制限内であれば距離は、あまり重要ではない。この特徴により、人工転写因子の構築のための部位の選択に相当な柔軟性が許容される。したがって、標的化対象転写エフェクターによって認識される標的部位は、標的化対象転写エフェクターによる遺伝子発現の活性化または抑制が可能であり、任意選択で調節ドメインに連結された、標的遺伝子内の任意の適当な部位であり得る。考えられ得る標的部位としては、転写開始部位に隣接した領域、下流の領域または上流の領域が挙げられる。また、エンハンサー領域、抑制因子部位、ＲＮＡポリメラーゼ休止部位、および特定の調節部位（例えば、ＳＰ−１部位、低酸素応答エレメント、核受容体認識エレメント、ｐ５３結合部位）、ｃＤＮＡコード領域内または発現配列ｔａｇ（ＥＳＴ）コード領域内の部位に存在する標的部位。
【０１７０】
別の実施形態において、標的化対象転写活性化因子は、後述するように、少なくとも１つ以上の調節ドメインに連結させる。調節ドメインの例としては、転写因子の抑制または活性化ドメイン（ＫＲＡＢおよびＶＰ１６など）、共抑制ドメインおよび共活性化ドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ならびにエンドヌクレアーゼ（Ｆｏｋｌなど）が挙げられる。遺伝子発現の抑制では、典型的には、遺伝子の発現は、約２０％低下（すなわち、非標的化対象転写活性化因子の８０％に発現がモジュレート）、約５０％低下（すなわち、非標的化対象転写活性化因子の５０％に発現がモジュレート）、または約７５〜１００％低下（すなわち、非標的化対象転写活性化因子の２５％〜０％に発現がモジュレート）される。遺伝子発現の活性化では、典型的には、発現は、約２０％活性化（すなわち、非標的化対象転写活性化因子の１２０％に発現がモジュレート）、約５０％活性化（すなわち、非標的化対象転写活性化因子の１５０％に発現がモジュレート）、約１００％活性化（すなわち、非標的化対象転写活性化因子の２００％に発現がモジュレート）、約５〜１０倍活性化（すなわち、非標的化対象転写活性化因子の５００〜１０００％に発現がモジュレート）され、少なくとも１００倍まで、またはそれ以上活性化される。
【０１７１】
標的化対象転写エフェクター（活性化因子および抑制因子）の発現はまた、ｔｅｔ調節系およびＲＵ−４８６系に代表される系によっても制御され得る（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ  ＆  Ｂｕｊａｒｄ（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７；Ｏｌｉｇｉｎｏら（１９９８），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：４９１−４９６；Ｗａｎｇら（１９９７），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１；Ｎｅｅｒｉｎｇら（１９９６），Ｂｌｏｏｄ  ８８：１１４７−１１５５；およびＲｅｎｄａｈｌら（１９９８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７−７６１参照）。このような系は、標的化対象転写エフェクター活性化因子および抑制因子の発現に対して小分子制御をもたらし、したがって、目的の標的遺伝子（１つまたは複数）に対して小分子制御をもたらす。この有益な特徴は、細胞培養物モデル、遺伝子療法剤、およびトランスジェニック動植物において使用され得る。
【０１７２】
分子生物学、生化学、クロマチンの構造および解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、バイオインフォマティクス、ゲノミクスならびに関連分野における慣用的な手法の実施は、当業者には充分わかり、例えば、以下の参考文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的改訂版；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓシリーズ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，第３版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９８；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第３０４巻，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９９；ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１１９巻，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９（これらはすべて、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる）に論考されている。
【０１７３】
「遺伝子」は、本開示の解釈上、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節するあらゆるＤＮＡ領域（かかる調節配列がコード配列および／または転写された配列に隣接している場合であれ、隣接していない場合であれ）を包含する。したがって、遺伝子は、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列（リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位など）、エンハンサー、サイレンサー、遮断因子（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位ならびに遺伝子座制御領域を包含する。
【０１７４】
さらに、プロモーターは、通常の細胞内プロモーターであってもよく、例えば、感染性微生物（例えば、細菌またはウイルスなど）のプロモーターであってもよい。例えば、レトロウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）は、修飾型ジンクフィンガー結合ポリペプチドの標的となり得るプロモーター領域である。レンチウイルス群（これには、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）１および２、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１または２などの病原体が含まれる）の構成員に由来するプロモーターは、本明細書に記載の修飾型ジンクフィンガー結合ポリペプチドによる転写モジュレーションのために標的化され得るウイルスプロモーター領域の一例である。
【０１７５】
標的化対象転写エフェクターによる遺伝子発現のモジュレーションレベルを測定するため、標的化対象転写エフェクターと接触させた細胞を、例えば標的化対象転写エフェクターなしの対照細胞と比較し、阻害または活性化の程度を調べる。対照試料の相対遺伝子発現活性値を１００％とする。
【０１７６】
「プロモーター」は、転写を指令する一連の核酸制御配列と定義する。本明細書で用いる場合、プロモーターは、典型的には、転写開始部位付近の必要な核酸配列を含むもの、例えば、一部の特定のＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合では、ＴＡＴＡエレメント、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＳＰ−１部位などを含むものである。
【０１７７】
また、本明細書で用いる場合、プロモーターは、任意選択で、転写開始部位から数千塩基対もの位置に存在する遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。プロモーターは、多くの場合、ＤＮＡ結合部分（例えば、ポリペプチド、例えば、核受容体、Ｇａｌ４、ｌａｃリプレッサーなど）によるトランス活性化に応答性であるエレメントを有する。
【０１７８】
「転写活性化因子」および「転写抑制因子」は、転写をモジュレートする能力を有するタンパク質またはタンパク質の機能性断片をいう。かかるタンパク質としては、例えば、転写因子および補因子（例えば、ＫＲＡＢ、ＭＡＤ、ＥＲＤ、ＳＩＤ、核因子κＢサブユニットｐ６５、初期成長応答因子１、および核ホルモン受容体、ＶＰ１６、ＶＰ６４）、エンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、レコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどが挙げられる。
【０１７９】
活性化因子および抑制因子としては、共活性化因子および共抑制因子が挙げられる（例えば、Ｕｔｌｅｙら（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：４９８−５０２参照）。
【０１８０】
「融合分子」は、２つ以上のサブユニット分子が物理的に連接または連結された（例えば、共有結合により）分子である。サブユニット分子は、同じ化学種の分子であってもよく、異なる化学種の分子であってもよい。第１の型の融合分子の例としては、限定されないが、融合ポリペプチド（例えば、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインと転写エフェクタードメインとの融合体）および融合核酸（例えば、本明細書に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸）が挙げられる。第２の型の融合分子の例としては、限定されないが、ＤＮＡ結合タンパク質と核酸との融合体が挙げられる。
【０１８１】
１０．調節ドメインを含む標的化対象転写エフェクター
一部の実施形態において、本発明は、（ｉ）目的遺伝子内の標的部位に結合するように遺伝子操作された、エンドヌクレアーゼ切断活性のない遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン；および（ｉｉ）調節ドメインを含む標的化対象転写エフェクターを提供し、該標的化対象調節因子は標的部位に結合して、所望の機能を調節する。遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上の調節ドメインと、択一的に２つ以上の調節ドメイン（該２つ以上のドメインは、２コピーの同じドメインまたは２つの異なるドメインである）と共有結合または非共有結合され得る。該調節ドメインは、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインに、例えば、融合タンパク質の一部としてのアミノ酸リンカーによって共有結合され得る。また、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは調節ドメインと、非共有結合性二量体化ドメイン（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質）によって結合させてもよい（例えば、Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５４：５３９（１９９１），Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−１２８（１９９６）；Ｋｌｅｍｍら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｋｌｅｍｍら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｈｏら，Ｎａｔｕｒｅ．３８２：８２２−８２６（１９９６）；およびＰｏｍｅｒａｎｚら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：９６５（１９９８）参照）。調節ドメインは、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインと、該遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインの任意の適当な位置（例えば、Ｃ末端またはＮ末端）で結合させ得る。
【０１８２】
遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインに付加される一般的な調節ドメインとしては、例えば、転写因子由来のエフェクタードメイン（活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子）、サイレンサー、核ホルモン受容体、癌遺伝子転写因子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリー構成員など）；ＤＮＡ修復酵素ならびにその関連因子および修飾因子；ＤＮＡ再編成酵素ならびにその関連因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびその修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにその関連因子および修飾因子が挙げられる。
【０１８３】
調節ドメインが得られ得る転写因子ポリペプチドとしては、転写の調節および基礎転写に関与しているものが挙げられる。かかるポリペプチドとしては、転写因子、そのエフェクタードメイン、共活性化因子、サイレンサー、核ホルモン受容体が挙げられる（例えば、転写に関与しているタンパク質および核酸エレメントの概説については、Ｇｏｏｄｒｉｃｈら，Ｃｅｌｌ  ８４：８２５−３０（１９９６）を参照のこと；転写因子一般については、Ｂａｒｎｅｓ  ＆  Ａｄｃｏｃｋ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ．２５  Ｓｕｐｐｌ．２：４６−９（１９９５）およびＲｏｅｄｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７３：１６５−７１（１９９６）に概説されている）。転写因子専門のデータベースも知られている（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２６９：６３０（１９９５）参照）。核ホルモン受容体転写因子は、例えば、Ｒｏｓｅｎら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：４８５５−７４（１９９５）に記載されている。転写因子のＣ／ＥＢＰファミリーは、Ｗｅｄｅｌら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．１９３：１７１−８５（１９９５）に概説されている。核ホルモン受容体による転写調節を媒介する共活性化因子および共抑制因子は、例えば、Ｍｅｉｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３４（２）：１５８−９（１９９６）；Ｋａｉｓｅｒら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：３４２−５（１９９６）；およびＵｔｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ．３９４：４９８−５０２（１９９８））に概説されている。ＧＡＴＡ転写因子（これは、造血の調節に関与している）は、例えば、Ｓｉｍｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１：９−１１（１９９５）；Ｗｅｉｓｓら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏ．２３：９９−１０７に記載されている。ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）ならびにその関連ＴＡＦポリペプチド（ＴＡＦ３０、ＴＡＦ５５、ＴＡＦ８０、ＴＡＦ１１０、ＴＡＦ１５０およびＴＡＦ２５０が挙げられる）は、Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  ＆  Ｔｊｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：４０３−９（１９９４）およびＨｕｒｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：６９−７５（１９９６）に記載されている。転写因子のＳＴＡＴファミリーは、例えば、Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−８（１９９６）に概説されている。疾患に関与している転写因子は、Ａｓｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５６１−９（１９９６）に概説されている。
【０１８４】
一実施形態において、ヒトＫＯＸ−１タンパク質由来のＫＲＡＢ抑制ドメインが転写抑制因子として使用される（Ｔｈｉｅｓｅｎら，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ．２：３６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎら，ＰＮＡＳ．９１：４５０９−４５１３（１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２９０８−２９１４（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌら，ＰＮＡＳ．９１：４５１４−４５１８（１９９４））。別の実施形態では、ＫＲＡＢ共抑制因子であるＫＡＰ−１が、ＫＲＡＢとともに使用される（Ｆｒｉｅｄｍａｎら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：２０６７−２０７８（１９９６））。あるいはまた、ＫＡＰ−１は、単独で、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインとともに使用され得る。転写抑制因子としての機能を果たす他の転写因子および転写因子ドメインとしては、ＭＡＤ（例えば、Ｓｏｍｍｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６６３２−６６４２（１９９８）；Ｇｕｐｔａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１６：１１４９−１１５９（１９９８）；Ｑｕｅｖａら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１６：９６７−９７７（１９９８）；Ｌａｒｓｓｏｎら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１５：７３７−７４８（１９９７）；Ｌａｈｅｒｔｙら，Ｃｅｌｌ．８９：３４９−３５６（１９９７）；およびＣｕｌｔｒａｒｏら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：２３５３−２３５９（１９９７）；ＦＫＨＲ（横紋筋肉腫遺伝子におけるフォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｉｎ  ｒｈａｐｄｏｓａｒｃｏｍａ  ｇｅｎｅ）；Ｇｉｎｓｂｅｒｇら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：３５４２−３５４６（１９９８）；Ｅｐｓｔｅｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４１１８−４１３０（１９９８））；ＥＧＲ−１（初期成長応答遺伝子産物−１；Ｙａｎら，ＰＮＡＳ．９５：８２９８−８３０３（１９９８）；ならびにＬｉｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））；ｅｔｓ２リプレッサー因子抑制因子ドメイン（ＥＲＤ；Ｓｇｏｕｒａｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４７８１−４７９３（（１９９５）参照）；およびＭＡＤ  ｓｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ；Ａｙｅｒら，Ａｌｌｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５７７２−５７８１（１９９６））が挙げられる。
【０１８５】
一実施形態において、ＨＳＶ  ＶＰ１６活性化ドメインが転写活性化因子として使用される（例えば、Ｈａｇｍａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５９５２−５９６２（１９９７）参照）。活性化ドメインを供給し得る他の転写因子としては、ＶＰ６４活性化ドメイン（Ｓｅｉｐｅｌら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４９６１−４９６８（１９９６））；核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）参照）；核因子κＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ  ＆  Ｂａｒｉｋ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）およびＤｏｙｌｅ  ＆  Ｈｕｎｔ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．８：２９３７−２９４２（１９９７））；およびＥＧＲ−１（初期成長応答遺伝子産物−１；Ｙａｎら，ＰＮＡＳ．９５：８２９８−８３０３（１９９８）；およびＬｉｕら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））が挙げられる。
【０１８６】
遺伝子調節に関与しているキナーゼ、ホスファターゼ、およびポリペプチドを修飾する他のタンパク質もまた、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ−結合ドメインの調節ドメインとして有用である。かかる修飾因子は、多くの場合、例えばホルモンによって媒介される転写の切り替えのオンまたはオフに関与している。
【０１８７】
転写調節に関与しているキナーゼは、Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４２：４５９−６７（１９９５），Ｊａｃｋｓｏｎら，Ａｄｖ．Ｓｅｃｏｎｄ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２８：２７９−８６（１９９３），ａｎｄ  Ｂｏｕｌｉｋａｓ，Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．５：１−７７（１９９５）に概説されており、一方、ホスファターゼは、例えば、Ｓｃｈｏｎｔｈａｌ，Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．６：２３９−４８（１９９５）に概説されている。核チロシンキナーゼは、Ｗａｎｇ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：３７３−６（１９９４）に記載されている。
【０１８８】
記載のように、有用なドメインはまた、癌遺伝子の遺伝子産物から（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリー構成員）、ならびにその関連因子および修飾因子からも得られ得る。癌遺伝子は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，第２版，Ｔｈｅ  Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５に記載されている。ｅｔｓ転写因子は、Ｗａｓｌｙｌｋら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：７−１８（１９９３）ａｎｄ  Ｃｒｅｐｉｅｕｘら，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．５：６１５−３８（１９９４）に概説されている。Ｍｙｃ癌遺伝子は、例えば、Ｒｙａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：７１３−２１（１９９６）に概説されている。ｊｕｎおよびｆｏｓ転写因子は、例えば、Ｔｈｅ  Ｆｏｓ  ａｎｄ  Ｊｕｎ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ，Ａｎｇｅｌ  ＆  Ｈｅｒｒｌｉｃｈ編（１９９４）に記載されている。ｍａｘ癌遺伝子は、Ｈｕｒｌｉｎら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５９：１０９−１６に概説されている。ｍｙｂ遺伝子ファミリーは、Ｋａｎｅｉ−Ｉｓｈｉｉら，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：８９−９８（１９９６）に概説されている。ｍｏｓファミリーは、Ｙｅｗら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：１９−２５（１９９３）に概説されている。
【０１８９】
操作されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ修復酵素ならびにその関連因子および修飾因子から得られる調節ドメインを含むものであってもよい。ＤＮＡ修復系は、例えば、Ｖｏｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：３８５−９５（１９９２）；Ｓａｎｃａｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２９：６９−１０５（１９９５）；Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．１７：１−１９（１９９５）；およびＷｏｏｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１３５−６７（１９９６）に概説されている。
【０１９０】
ＤＮＡ再編成酵素ならびにその関連因子および修飾因子もまた、調節ドメインとして使用され得る（例えば、Ｇａｎｇｌｏｆｆら，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ．５０：２６１−９（１９９４）；Ｓａｄｏｗｓｋｉ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：７６０−７（１９９３）参照）。
【０１９１】
同様に、調節ドメインは、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ）ならびにその関連因子および修飾因子に由来するものであってもよい。ヘリカーゼは、Ｍａｔｓｏｎら，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１６：１３−２２（１９９４）に概説されており、メチルトランスフェラーゼは、Ｃｈｅｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：４−１０（１９９５）に記載されている。クロマチン関連タンパク質およびその修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）（ヒストンデアセチラーゼなど）（Ｗｏｌｆｆｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７２：３７１−２（１９９６））もまた、選択された遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインに付加されるドメインとして有用である。一実施形態において、調節ドメインは、転写抑制因子としての機能を果たすＤＮＡメチルトランスフェラーゼである（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｗｙｎｇａｅｒｔら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２６：２８３−２８９（１９９８）；Ｆｌｙｎｎら，Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．２７９：１０１−１１６（１９９８）；Ｏｋａｎｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２５３６−２５４０（１９９８）；およびＺａｒｄｏ  ＆  Ｃａｉａｆａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６５１７−１６５２０（１９９８）参照）。
【０１９２】
また、クロマチンおよびＤＮＡの構造、運動および局在ならびにその関連因子および修飾因子を制御する因子；微生物（例えば、原核生物、真核生物およびウイルス）に由来する因子、ならびにこれに結合する、または修飾する因子は、キメラタンパク質を得るために使用され得る。一実施形態において、レコンビナーゼおよびインテグラーゼが調節ドメインとして使用される。一実施形態において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼが転写活性化因子として使用される（例えば、Ｊｉｎ  ＆  Ｓｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９８）；Ｗｏｌｆｆｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７２：３７１−３７２（１９９６）；Ｔａｕｎｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７２：４０８−４１１（１９９６）；およびＨａｓｓｉｇら，ＰＮＡＳ．９５：３５１９−３５２４（１９９８）参照）。別の実施形態では、ヒストンデアセチラーゼが転写抑制因子として使用される（例えば、Ｊｉｎ  ＆  Ｓｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９８）；Ｓｙｎｔｉｃｈａｋｉ  ＆  Ｔｈｉｒｅｏｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４４１４−２４４１９（１９９８）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２８３１−２８４１（１９９８）；およびＭａｒｔｉｎｅｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２３７８１−２３７８５（１９９８）参照）。
【０１９３】
別の好適な抑制ドメインは、メチル結合ドメインタンパク質２Ｂ（ＭＢＤ−２Ｂ）である（ＭＢＤタンパク質の説明については、Ｈｅｎｄｒｉｃｈら（１９９９）Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ．１０：９０６−９１２も参照のこと）。別の有用な抑制ドメインは、ｖ−ＥｒｂＡタンパク質（下記参照）と関連しているものである。例えば、Ｄａｍｍら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ．３３９：５９３−５９７；Ｅｖａｎｓ（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．４：２６−２８；Ｐａｉｎら（１９９０）Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．２：２８４−２９４  ；Ｓａｐら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ．３４０：２４２−２４４；Ｚｅｎｋｅら（１９８８）Ｃｅｌｌ．５２：１０７−１１９；およびＺｅｎｋｅら（１９９０）Ｃｅｌｌ．６１：１０３５−１０４９を参照のこと。さらなる例示的な抑制ドメインとしては、限定されないが、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ、下記（ｉｎｆ７ａ）参照）、ＳＩＤ、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＭＢＤ様タンパク質、ＤＮＭＴファミリーの構成員（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、ＭｅＣＰ１およびＭｅＣＰ２が挙げられる。例えば、Ｂｉｒｄら（１９９９）Ｃｅｌｌ．９９：４５１−４５４；Ｔｙｌｅｒら（１９９９）Ｃｅｌｌ．９９：４４３−４４６；Ｋｎｏｅｐｆｉｅｒら（１９９９）Ｃｅｌｌ．９９：４４７−４５０；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８−３４２を参照のこと。さらなる例示的な抑制ドメインとしては、限定されないが、ＲＯＭ２およびＡｔＨＤ２Ａが挙げられる。例えば、Ｃｈｅｒｎら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．８：３０５−３２１；およびＷｕら（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：１９−２７を参照のこと。
【０１９４】
核ホルモン受容体（ＮＨＲ）スーパーファミリーの一部の特定の構成員（例えば、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）およびレチノイン酸は、受容体（ＲＡＲ）が挙げられる）は、現在既知の数ある中で、最も強力な転写調節因子である。Ｚｈａｎｇら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏ．６２：４３９−４６６（２０００）およびＳｕｃｏｖら，Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１０（２−３）：１６９−１８４（１９９５）。コグネートリガンドの非存在下では、これらのタンパク質は、高い特異性および親和性で調節遺伝子座（例えば、エンハンサーおよびプロモーター）内の短鎖のＤＮＡ（例えば、１２〜１７塩基対）に結合し、隣接する遺伝子のロバストな転写抑制をもたらす。
【０１９５】
調節作用の効力は、遺伝子サイレンシングを誘導する２つの相違する機能経路：（ｉ）共抑制因子Ｎ−ＣｏＲとヒストンデアセチラーゼＨＤＡＣ３との複合体の標的化による抑制性クロマチンの局在型ドメインの作出（Ｇｕｅｎｔｈｅｒら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１４：１０４８−１０５７（２０００）；Ｕｍｏｖら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：４０７４−４０９０（２０００）；Ｌｉら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９、４３４２−４３５０（２０００）およびＵｎｄｅｒｈｉｌｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４０４６３−４０４７０（２０００））と、（ｉｉ）基礎転写機構の機能の直接障害を伴うことがあり得るクロマチン非依存性経路（Ｕｒｎｏｖら，上掲）（Ｆｏｎｄｅｌｌら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７（７Ｂ）：１４００−１４１０（１９９３）およびＦｏｎｄｅｌｌら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６：２８１−２８７（１９９６）の同時使用によってもたらされる。
【０１９６】
存在しているそのリガンドの濃度が非常に低い（例えば、ナノモル）場合、この受容体はコンホメーション変化を受け、共抑制因子の放出、異なる類型の補助分子（例えば、共活性化因子）の漸増、強力な転写活性化をもたらす。Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３（３）：２５５−２７５（１９９９）。
【０１９７】
該受容体タンパク質の転写の制御（例えば、抑制および活性化）を担う部分は、ＤＮＡ結合を担う部分から物理的に離れていることがあり得るが、他のポリペプチド（例えば、他のＤＮＡ結合ドメイン）とテザーリングされると充分な機能性が保持される。したがって、核ホルモン受容体転写制御ドメインは、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインと、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインによって該受容体の転写調節活性が目的の染色体領域（例えば、遺伝子）に標的化され得るように融合され得る。
【０１９８】
さらに、ＴＲおよび他の核ホルモン受容体の構造は、自然に、または組換え手法でのいずれかによって、ホルモンに対する応答能がすべて失われる（したがって、転写活性化を駆動する能力が失われる）が、転写抑制をもたらす能力は保持されるように改変され得る。このアプローチは、癌タンパク質ｖ−ＥｒｂＡの転写調節特性によって例示される。ｖ−ＥｒｂＡタンパク質は、幼鶏の未成熟赤血球前駆体のトリ赤芽球症ウイルスによる白血病性形質転換に必要とされる２つのタンパク質の１つである。ＴＲは、赤血球生成の主要な調節因子である（Ｂｅｕｇら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１２８８（３）：Ｍ３５−４７（１９９６）；特に、リガンドに結合していない状態では、細胞周期の停止および分化状態に必要とされる遺伝子を抑制する。したがって、未成熟赤芽球への甲状腺ホルモンの投与により、急速な分化がもたらされる。ｖ−ＥｒｂＡ癌タンパク質は、ＴＲを大きく変異させた型である；この変異としては：（ｉ）１２アミノ末端アミノ酸の欠失；（ｉｉ）ｇａｇ癌タンパク質との融合；（ｉｉｉ）親ＴＲと対比すると該タンパク質ＤＮＡ結合特異性が改変され、レチノイドＸ受容体とヘテロ二量体化する能力が障害されるＤＮＡ結合ドメインにおけるいくつかの点変異；（ｉｖ）甲状腺ホルモンへの結合能が有効に解消される、該タンパク質のリガンド結合ドメインの多重点変異；および（ｖ）転写活性化に必須のカルボキシ末端のアミノ酸鎖の欠失が挙げられる。Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１４２３（１）：Ｆ１５−３３（１９９９）。この変異の結果、ｖ−ＥｒｂＡは、天然型ＴＲ標的遺伝子への結合能を保持し、結合すると有効な転写抑制因子となる（Ｕｍｏｖら，上掲  ；Ｓａｐら，Ｎａｔｕｒｅ．３４０：２４２−２４４（１９８９）；およびＣｉａｎａら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７（２４）：７３８２−７３９４（１９９９）。しかしながら、ＴＲとは対照的に、ｖ−ＥｒｂＡは、甲状腺ホルモンに対して完全に非感受性であり、したがって、任意の濃度の甲状腺ホルモンまたはレチノイド（媒体に内因性であれ、研究者により添加されたものであれ）の攻撃に直面しても、転写抑制を維持している。
【０１９９】
ｖ−ＥｒｂＡのこの機能的性質は、その抑制ドメインが異種の合成ＤＮＡ結合ドメインに融合された場合も保持される。したがって、一態様において、ｖ−ＥｒｂＡまたはその機能性断片が、抑制ドメインとして使用される。さらなる実施形態では、ＴＲまたはその機能性ドメインが、リガンド（例えば、３，５，３’−トリヨード−Ｌ−サイロニンまたはＴ３）の非存在下で抑制ドメインとして、および／またはリガンドの存在下で活性化ドメインとして使用される。
【０２００】
したがって、ＴＲは、活性（活性化または抑制）がリガンドの存在または非存在（それぞれ）に依存性である切り替え可能な機能性ドメイン（すなわち、二元機能性ドメイン）として使用され得る。
【０２０１】
さらなる例示的な抑制ドメインは、ＤＡＸタンパク質およびその機能性断片から得られるものである。Ｚａｚｏｐｏｕｌｏｓら，Ｎａｔｕｒｅ．３９０：３１１−３１５（１９９７）。特に、アミノ酸２４５〜４７０を含むＤＡＸ−１のＣ末端部分は、抑制活性を有することが示されている。Ａｌｔｉｎｃｉｃｅｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２７５：７６６２−７６６７（２０００）。さらなる例示的な抑制ドメインは、ＲＢＰ１タンパク質およびその機能性断片である。Ｌａｉら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２０９１−２１００（１９９９）；Ｌａｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：６６３２−６６４１（１９９９）；Ｌａｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：２９１８−２９３２（２００１）およびＷＯ０１／０４２９６。完全長のＲＢＰ１ポリペプチドは、１２５７個のアミノ酸を含む。ＲＢＰ１の例示的な機能性断片は、アミノ酸１１１４〜１２５７を含むポリペプチド、およびアミノ酸２４３〜４５２を含むポリペプチドである。
【０２０２】
転写因子のＴＩＥＧファミリーの構成員は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３として知られている３つの抑制ドメインを含む。ＴＩＥＧファミリータンパク質による抑制は、少なくとも一部において、ｍＳＩＮ３Ａヒストンデアセチラーゼ複合体の漸増によって行なわれる。Ｃｏｏｋら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２９，５００−２９，５０４；Ｚｈａｎｇら（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：５０４１−５０４９。このような抑制ドメイン（またはその機能性断片）のいずれか、または全部を単独で、またはさらなる抑制ドメイン（またはその機能性断片）と組み合わせてＤＮＡ結合ドメインに融合させ、外因性の標的化対象抑制因子分子を作製することができる。
【０２０３】
さらに、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ＵＬ３４のオープンリーディングフレームの産物は、特定のＨＣＭＶ遺伝子（例えば、ＵＳ３遺伝子）の転写抑制因子としての機能を果たす。ＬａＰｉｅｒｒｅら（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６０６２−６０６９。したがって、ＵＬ３４遺伝子産物またはその機能性断片は、ジンクフィンガー結合ドメインも含む融合ポリペプチドの一成分として使用され得る。かかる融合体をコードする核酸もまた、本明細書に開示した方法および組成物において有用である。
【０２０４】
また別の例示的な抑制ドメインは、ＣＤＦ−１転写因子および／またはその機能性断片である。例えば、ＷＯ９９／２７０９２を参照のこと。
【０２０５】
タンパク質のＩｋａｒｏｓファミリーは、少なくとも一部において転写抑制により、リンパ球発生の調節に関与している。したがって、Ｉｋａｒｏｓファミリー構成員（例えば、Ｉｋａｒｏｓ、Ａｉｏｌｏｓ）またはその機能性断片は、抑制ドメインとして使用され得る。例えば、Ｓａｂｂａｔｔｉｎｉら（２００１）ＥＭＢＯＪ．２０：２８１２−２８２２を参照のこと。
【０２０６】
酵母Ａｓｈｌｐタンパク質は、転写抑制ドメインを含む。Ｍａｘｏｎら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１４９５−１５００。したがって、Ａｓｈｌｐタンパク質、その機能性断片、およびＡｓｈｌｐホモログ（例えば、脊椎動物、哺乳動物および植物の細胞に見られるものなど）は、本明細書に開示した方法および組成物における使用のための抑制ドメインとして供され得る。
【０２０７】
さらなる例示的な抑制ドメインとしては、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ、例えば、クラスＩ  ＨＤＡＣ、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ、ＳＩＲ−２ホモログ）、ＨＤＡＣ相互作用性タンパク質（例えば、ＳＩＮ３、ＳＡＰ３０、ＳＡＰ１５、ＮＣｏＲ、ＳＭＲＴ、ＲＢ、ｐｌ０７、ｐｌ３０、ＲＢＡＰ４６／４８、ＭＴＡ、Ｍｉ−２、Ｂｒｇｌ、Ｂｒｍ）、ＤＮＡ−シトシンメチルトランスフェラーゼ（例えば、Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ）、メチル化ＤＮＡに結合するタンパク質（例えば、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＭｅＣＰ２、ＤＭＡＰ１）、タンパク質メチルトランスフェラーゼ（例えば、リシンおよびアルギニンメチラーゼ、ＳｕＶａｒホモログ（Ｓｕｖ３９Ｈ１など））、ポリコーム型抑制因子（例えば、Ｂｍｉ−１、ｅｅｄｌ、ＲＩＮＧ１、ＲＹＢＰ、Ｅ２Ｆ６、Ｍｅｌｌ８、ＹｙｌおよびＣｔＢＰ）、ウイルス系抑制因子（例えば、アデノウイルスＥｌｂ  ５５Ｋタンパク質、サイトメガロウイルスＵＬ３４タンパク質、ウイルス系癌遺伝子（ｖ−ｅｒｂＡなど））、ホルモン受容体（例えば、Ｄａｘ−１、エストロゲン受容体、甲状腺ホルモン受容体）、ならびに天然型ジンクフィンガータンパク質（例えば、ＷＴ１、ＫＡＰ１）と関連している抑制ドメインに由来するものが挙げられる。さらなる例示的な抑制ドメインとしては、ポリコーム複合体およびそのホモログの構成員、ＨＰＨ１、ＨＰＨ２、ＨＰＣ２、ＮＣ２、ｇｒｏｕｃｈｏ、Ｅｖｅ、ｔｒａｍｔｒａｋ、ｍＨＰ１、ＳＩＰ１、ＺＥＢ１、ＺＥＢ２、およびＥｎｘｌ／Ｅｚｈ２が挙げられる。このような場合ではすべて、完全長タンパク質または機能性断片のいずれかが、ジンクフィンガー結合ドメインとの融合のための抑制ドメインとして使用され得る。さらに、前述のタンパク質の任意のホモログもまた、抑制ドメインとして使用され得、前述の任意のタンパク質と相互作用するタンパク質（またはその機能性断片）もまた、抑制ドメインとして使用され得る。
【０２０８】
さらなる抑制ドメインおよび例示的な機能性断片は、以下のとおりである。Ｈｅｓｌは、ショウジョウバエヘアリー遺伝子産物のヒトホモログであり、アミノ酸９１０〜１０１４を含む機能性断片を含む。特に、ＷＲＰＷ（ｔｒｐ−ａｒｇ−ｐｒｏ−ｔｒｐ）モチーフが抑制ドメインとしての機能を果たし得る。Ｆｉｓｈｅｒら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：２６７０−２６７７。
【０２０９】
ＴＬＥ１、ＴＬＥ２およびＴＬＥ３タンパク質は、ショウジョウバエｇｒｏｕｃｈｏ遺伝子産物のヒトホモログである。抑制活性を有するこのタンパク質の機能性断片は、アミノ酸１〜４００に存在する。Ｆｉｓｈｅｒら，上掲。
【０２１０】
Ｔｂｘ３タンパク質は、アミノ酸５２４〜７２１の機能性抑制ドメインを有する。Ｈｅら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１０，２１２−１０，２１７。Ｔｂｘ２遺伝子産物は、ｐ１４／ｐ１６遺伝子の抑制に関与しており、Ｔｂｘ３の抑制ドメインに相同なアミノ酸５０４〜７０２の領域を含む。したがって、Ｔｂｘ２および／またはこの機能性断片は、抑制ドメインとして使用され得る。Ｃａｒｒｅｉｒａら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５，０９９−５，１０８。
【０２１１】
ヒトＥｚｈ２タンパク質は、ショウジョウバエのｚｅｓｔｅのｅ７１ｈａ７１ｃｅｒのホモログであり、ｅｅｄｌポリコーム型抑制因子を漸増させる。Ｅｚｈ２タンパク質のアミノ酸１〜１９３を含む領域は、ｅｅｄｌと相互作用して転写を抑制し得る。；したがって、Ｅｚｈ２および／またはこの機能性断片は、抑制ドメインとして使用され得る。Ｄｅｎｉｓｅｎｋｏら（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：５６３４−５６４２。
【０２１２】
ＲＹＢＰタンパク質は、ポリコーム複合体構成員およびＹＹ１転写因子と相互作用する共抑制因子である。ＲＹＢＰのアミノ酸４２〜２０８を含む領域は、機能性抑制ドメインであると同定されている。Ｇａｒｃｉａら（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：３４０４−３４１８。
【０２１３】
ＲＩＮＧフィンガータンパク質ＲＩＮＧ  １  Ａは、２つの異なる脊椎動物ポリコーム型複合体の構成員であり、ポリコーム複合体の種々の成分に対する多重結合部位を含み、転写抑制活性を有する。したがって、ＲＩＮＧ  １  Ａまたはその機能性断片は、抑制ドメインとして供され得る。Ｓａｔｊｉｎら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：４１０５−４１１３。
【０２１４】
Ｂｍｉ−１タンパク質は、脊椎動物ポリコーム複合体の構成員であり、転写サイレンシングに関与している。該タンパク質は、種々のポリコーム複合体成分に対する多重結合部位を含む。したがって、Ｂｍｉ−１およびその機能性断片は、抑制ドメインとして有用である。Ｇｕｎｓｔｅｒら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：２３２６−２３３５；Ｈｅｍｅｎｗａｙら（１９９８）Ｏｎｃｏｇｅｎ．１６：２５４１−２５４７。
【０２１５】
Ｅ２Ｆ６タンパク質は、哺乳動物Ｂｍｉ−１含有ポリコーム複合体の構成員であり、ＲＹＢＰ、Ｂｍｉ−１およびＲＩＮＧ１Ａを漸増させ得る（ｃａｐａｂｌｅ  ｏｒ）転写抑制因子である。アミノ酸１２９〜２８１を含むＥ２Ｆ６の機能性断片は、転写抑制ドメインとしての機能を果たす。したがって、Ｅ２Ｆ６  およびその機能性断片は、抑制ドメインとして使用され得る。Ｔｒｉｍａｒｃｈｉら（２００１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１５１９−１５２４。
【０２１６】
ｅｅｄｌタンパク質は、少なくとも一部において、ヒストンデアセチラーゼ  （例えば、ＨＤＡＣ２）の漸増によって転写を抑制する。抑制活性は、該タンパク質のＮ末端領域とＣ末端領域の両方に存在する。したがって、ｅｅｄｌおよびその機能性断片は、抑制ドメインとして使用され得る。ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌａｇら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２３：４７４−４７８。
【０２１７】
ＣＴＢＰ２タンパク質は、少なくとも一部において、ＨＰＣ２−ポリコーム複合体の漸増によって転写を抑制する。したがって、ＣＴＢＰ２およびその機能性断片は、抑制ドメインとして有用である。Ｒｉｃｈａｒｄら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９：７７７−７８７。
【０２１８】
ニューロン拘束性サイレンサー因子は、ニューロン特異的遺伝子の発現を抑制するタンパク質である。したがって、ＮＲＳＦまたはその機能性断片は、抑制ドメインとして供され得る。例えば、米国特許第６，２７０，９９０号を参照のこと。
【０２１９】
任意の抑制因子または抑制因子と相互作用する分子が機能性ドメインとして好適であることは、当業者には明白であろう。抑制性複合体および／または抑制活性（例えば、ヒストン脱アセチル化）を標的遺伝子に漸増させ得る本質的に任意の分子が該融合タンパク質の抑制ドメインとして有用である。
【０２２０】
さらなる例示的な活性化ドメインとしては、限定されないが、ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１  ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２ＡおよびＥＲＦ−２が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｙｒら（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９−３４７；Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄら（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２３：２５５−２７５；Ｌｅｏら（２０００）Ｇｅｎｅ  ２４５：１−１１；Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ−Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７−８９；ＭｃＫｅｎｎａら（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３−１２；Ｍａｌｉｋら（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７−２８３；およびＬｅｍｏｎら（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９−５０４を参照のこと。さらなる例示的な活性化ドメインとしては、限定されないが、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６，−７、および−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰならびにＴＲＡＢ１が挙げられる。例えば、Ｏｇａｗａら（２０００）Ｇｅｎｅ．２４５：２１−２９；Ｏｋａｎａｍｉら（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．１：８７−９９；Ｇｏｆｆら（１９９１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：２９８−３０９；Ｃｈｏら（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：４１９−４２９；Ｕｌｍａｓｏｎら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：５８４４−５８４９；Ｓｐｒｅｎｇｅｒ−Ｈａｕｓｓｅｌｓら（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２２：１−８；Ｇｏｎｇら（１９９９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３−４４；およびＨｏｂｏら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１５３４８−１５３５３を参照のこと。
【０２２１】
任意の活性化因子または活性化因子と相互作用する分子が機能性ドメインとして好適であることは、当業者には明白であろう。活性化性複合体および／または活性化活性（例えば、ヒストンアセチル化）を標的遺伝子に漸増させ得る本質的に任意の分子が該融合タンパク質の活性化ドメインとして有用である。
【０２２２】
融合分子における機能性ドメインとしての使用に適した遮断因子ドメイン、クロマチンリモデリングタンパク質（ＩＳＷＩ含有ドメインなど）および／またはメチル結合ドメインタンパク質は、例えば、同一出願人所有のＷＯ０１／８３７９３；ＷＯ０２／２６９５９；ＷＯ０２／２６９６０およびＷＯ０２／４４３７６に記載されている。
【０２２３】
さらなる実施形態において、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは、二元機能性ドメイン（ＢＦＤ）に融合される。二元機能性ドメインは、活性がＢＦＤと第２の分子との相互作用に依存する転写調節ドメインである。第２の分子は、ＢＦＤの機能特性に影響を及ぼし得る任意の型の分子、例えば限定されないが、化合物、小分子、ペプチド、タンパク質、多糖または核酸であり得る。例示的なＢＦＤは、エストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメインである。ＥＲリガンド結合ドメインは、エストラジオールの存在下では転写活性化因子としての機能を果たすが、エストラジオールの非存在下およびタモキシフェンまたは４−ヒドロキシ−タモキシフェンの存在下では、転写抑制因子としての機能を果たす。ＢＦＤの別の例は甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）リガンド結合ドメインであり、これは、リガンドの非存在下では転写抑制因子としての機能を果たし、甲状腺ホルモン（Ｔ３）の存在下では、転写活性化因子としての機能を果たす。
【０２２４】
さらなるＢＦＤは、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）リガンド結合ドメインである。デキサメタゾンの存在下では、このドメインは転写活性化因子としての機能を果たすが、ＲＵ４８６の存在下では、転写抑制因子としての機能を果たす。さらなる例示的なＢＦＤは、レチノイン酸受容体のリガンド結合ドメインである。リガンドの存在下では、全−トランス−レチノイン酸のレチノイン酸受容体は、いくつかの共活性化因子複合体を漸増させて転写を活性化する。リガンドの非存在下では、レチノイン酸受容体は、転写共活性化因子を漸増させることができない。さらなるＢＦＤは当業者にはわかる。例えば、米国特許第５，８３４，２６６号および同第５，９９４，３１３号ならびにＷＯ９９／１０５０８を参照のこと。
【０２２５】
核受容体に由来する別の類型の機能性ドメインは、機能性活性が非天然リガンドによって調節されるものである。このようなドメインは、多くの場合、天然型受容体の変異型または修飾型であり、「切り替え可能な」ドメインと称されることがある。例えば、プロゲステロン受容体（ＰＲ）の一部の特定の変異型は、その天然リガンドと相互作用することができず、したがって、プロゲステロンによる転写活性化を受けることができない。しかしながら、一部の特定のこのような変異型は、プロゲステロン以外の小分子（その一例は、抗黄体ホルモンのミフェプリストンである）と結合することにより活性化され得る。かかる非天然だが機能的にコンピテントなリガンドは抗ホルモンと表示されている。例えば、米国特許第５，３６４，７９１号；同第５，８７４，５３４号；同第５，９３５，９３４号；Ｗａｎｇら，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：８１８０−８１８４；Ｗａｎｇら，（１９９７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１を参照のこと。
【０２２６】
したがって、標的化対象の遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン、機能性ドメイン、およびこの型の変異型ＰＲリガンド結合ドメインを含む融合体は、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインを、選択した遺伝子内またはその近傍に結合するように設計することにより、選択した内在遺伝子のミフェプリストン依存性活性化または抑制のために使用され得る。該融合に活性化ドメインを含めた場合は、遺伝子発現のミフェプリストン依存性活性化が得られ、該融合体に抑制ドメインを含めた場合は、遺伝子発現のミフェプリストン依存性抑制が得られる。また、かかる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供され、かかるポリヌクレオチドを含むベクターならびにかかるポリヌクレオチドおよびベクターを含む細胞も提供される。ＰＲ以外の受容体の修飾型または変異型もまた、切り替え可能なドメインとして使用され得ることは、当業者には明白であろう。例えば、Ｔｏｒａら（１９８９）ＥＭＢＯＪ．８：１９８１−１９８６を参照のこと。
【０２２７】
１１．発現ベクター
選択した標的化対象転写エフェクターをコードする核酸は、典型的には、複製および／または発現のため（例えば、Ｋｄの測定のため）の原核生物または真核生物の細胞内での形質転換のために、中間ベクター内にクローニングされる。中間ベクターは、典型的には、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸の保存もしくは操作のため、またはタンパク質生成のための、原核生物ベクター（例えば、プラスミド）またはシャトルベクターまたは昆虫ベクターである。また、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸も、典型的には、植物細胞、動物細胞（例えば、ヒトもしくは他の哺乳動物細胞）、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞への投与のために、発現ベクター内にクローニングされる。
【０２２８】
クローニングされた遺伝子または核酸の発現を得るため、遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、転写を指令するプロモーターを含む発現ベクター内にサブクローニングされる。
【０２２９】
適当な細菌系および真核生物系プロモーターは、当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版  １９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒｔｉｓｆｅｉ−ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９９４）に記載されている。ＺＦＰを発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌、バチルス種およびサルモネラ属において利用可能である（Ｐａｌｖａら，Ｇｅｎｅ．２２：２２９−２３５（１９８３））。かかる発現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該技術分野でよく知られており、これも市販されている。
【０２３０】
標的化対象転写エフェクター核酸の発現を指令するために使用されるプロモーターは、具体的な適用用途に依存する。例えば、標的化対象転写エフェクターの発現および精製には、強力な構成的プロモーターが使用され得る。対照的に、標的化対象転写エフェクターが遺伝子調節のためにインビボで投与される場合、該標的化対象転写エフェクターの具体的な用途に応じて構成的または誘導性いずれかのプロモーターが使用され得る。また、標的化対象転写エフェクターの投与のためのプロモーターは、ＨＳＶ  ＴＫ（または同様の活性を有するプロモーター）などの弱いプロモーターであってもよい。また、プロモーターは、トランス活性化に応答性であるエレメント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃ抑制因子答エレメント、ならびに小分子制御系（ｔｅｔ調節型の系およびＲＵ−４８６系など）を含むものであってもよい（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ  ＆  Ｂｕｊａｒｄ，ＰＮＡＳ．８９：５５４７（１９９２）；Ｏｌｉｇｉｎｏら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：４９１−４９６（１９９８）；Ｗａｎｇら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１（１９９７）；Ｎｅｅｒｉｎｇら，Ｂｌｏｏｄ．８８：１１４７−１１５５（１９９６）；およびＲｅｎｄａｈｌら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７−７６１（１９９８）参照）。
【０２３１】
プロモーターに加え、発現ベクターは、原核生物または真核生物いずれかである宿主細胞内での核酸の発現に必要とされるさらなるエレメントをすべて含む転写単位または発現カセットを含むものであってもよい。発現カセットは、例えば標的化対象転写エフェクターをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターと、例えば、効率的な転写物のポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位または翻訳終結に必要とされるシグナルとを含むものであり得る。
【０２３２】
カセットのさらなるエレメントとしては、例えば、エンハンサー、および異種スプライシング型イントロンシグナルが挙げられ得る。
【０２３３】
遺伝情報を細胞内に輸送するために使用される具体的な発現ベクターは、標的化対象転写エフェクターの意図される用途（例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物内などにおける発現）に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、プラスミド（ｐＢＲ３２２系プラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなど）、ならびに市販の融合発現系（ＧＳＴおよびＬａｃＺなど）が挙げられる。一般的な融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質「ＭＢＰ」である。かかる融合タンパク質は、標的化対象転写エフェクターの精製ために使用される。また、エピトープタグを組換えタンパク質に付加すると、発現のモニタリング、および細胞内および亜細胞内局在（例えば、ｃ−ｍｙｃまたはＦＬＡＧ）のモニタリングのための単離方法が簡便となり得る。
【０２３４】
真核生物のウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、多くの場合、真核生物発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン‐バーウイルス由来のベクターにおいて使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴ０１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核生物の細胞内での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指令下でのタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
【０２３５】
一部の発現系は、安定的にトランスフェクトされた細胞株の選択のためのマーカー（チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸還元酵素など）を有する。高収率発現系もまた、好適である（標的化対象転写エフェクターコード配列が、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指令下での、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターの使用など）。
【０２３６】
また、発現ベクターに典型的に含まれるエレメントとしては、大腸菌において機能を果たすレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域内の特殊な制限部位が挙げられる。
【０２３７】
大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫の細胞株の作製には、標準的なトランスフェクション法が使用され、タンパク質は、次いで、標準的な手法を用いて精製される（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編，１９９０）参照）。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換は、標準的な手法に従って行なわれる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｄ．Ｉ３２：３４９−３５１（１９７７）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＆  Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編，１９８３参照）。
【０２３８】
宿主細胞内への外来ヌクレオチド配列の導入には、任意のよく知られた手順が使用され得る。該手順としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソームと組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）の両方、ならびにクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞内に導入するための任意のその他のよく知られた方法の使用が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，上掲参照）。必要なことは、使用される具体的な遺伝子操作手順によって、少なくとも１つの遺伝子が、選択したタンパク質を発現し得る宿主細胞内に成功裡に導入され得ることだけである。
【０２３９】
１２．遺伝子発現の調節を調べるためのアッセイ
さまざまなアッセイを用いて、標的化対象転写エフェクターによる遺伝子発現の調節レベルを調べることができる。具体的な標的化対象転写エフェクターの活性は、さまざまなイン（ｉｌｌ）ビトロおよびインビボアッセイを使用し、例えば、タンパク質またはｍＲＮＡレベル、産生物レベル、酵素活性、腫瘍成長；レポーター遺伝子の転写活性化または抑制；セカンドメッセンジャーレベル（例えば、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、ＤＡＧ、Ｃａ２＋）；サイトカインおよびホルモン生成レベル；ならびに新生血管形成を、例えば、イムノアッセイ（例えば、抗体を用いたＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学的アッセイ）、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護、ノザンブロット（ｎｏｒｔｈｅｒｎｓ）、インサイチュハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ試験）、比色分析アッセイ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍成長アッセイ、表現型のアッセイなどを用いて測定することにより評価され得る。
【０２４０】
標的化対象転写エフェクターは、インビトロ活性について、培養細胞（例えば、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞など）を用いて試験され得る。多くの場合、まず、標的化対象転写エフェクターが、レポーター遺伝子とともに一過性発現系を用いて試験され、次いで、標的内在遺伝子の調節が細胞および動物においてインビボとエキソビボの両方で試験される。標的化対象転写エフェクターは、細胞内で組換え発現させてもよく、動物内に移植した細胞内で組換え発現させてもよく、トランスジェニック動物において組換え発現させてもよいとともに、タンパク質として、後述する送達媒体を用いて動物または細胞に投与され得る。細胞は、固定化させてもよく、溶液中に存在させてもよく、動物に注射してもよく、トランスジェニック動物もしくは非トランスジェニック動物に天然型で存在させてもよい。
【０２４１】
遺伝子発現のモジュレーションは、本明細書に記載のインビトロまたはインビボアッセイの１つを用いて試験される。試料またはアッセイ物を標的化対象転写エフェクターで処理し、試験化合物なしの対照試料と比較し、モジュレーションの程度を調べる。上記のように、内在遺伝子発現の調節のためには、標的化対象転写エフェクターは、典型的には、２００ｎＭ以下、または１００ｎＭ以下、または５０ｎＭ以下、または２５ｎＭ以下のＫｄを有するものである。
【０２４２】
標的化対象転写エフェクターの効果は、上記の任意のパラメータを調べることにより測定され得る。標的化対象転写エフェクターの影響の評価には、任意の適当な遺伝子発現、表現型または生理学的変化が使用され得る。また、インタクトな細胞または動物を用いて機能の影響を調べると、腫瘍成長、新生血管形成、ホルモン放出、既知遺伝マーカーとまだ特性評価されていない遺伝マーカーの両方に対する転写の変化（例えば、ノザンブロットまたはオリゴヌクレオチドアレイ試験）、細胞代謝の変化（細胞成長またはｐＨ変化など）、および細胞内セカンドメッセンジャー（ｃＧＭＰなど）の変化などのさまざまな効果が測定され得る。
【０２４３】
内在遺伝子発現の標的化対象転写エフェクター調節のアッセイは、インビトロで行なわれ得る。有用なインビトロアッセイ形式の一例では、培養細胞における内在遺伝子発現の標的化対象転写エフェクター調節が、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてタンパク質産生を調べることにより測定される。試験試料は、ブランクベクターで処理した対照細胞、または別の遺伝子に標的化させる無関連標的化対象転写エフェクターと比較される。
【０２４４】
別の実施形態において、内在遺伝子発現の標的化対象転写エフェクター調節は、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルを測定することにより、インビトロで測定される。遺伝子発現レベルは、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、またはハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノザンハイブリダイゼーション）、ＲＮａｓｅ保護、ドットブロッティングを使用し、増幅を用いて測定される。一実施形態において、ＲＮａｓｅ保護が使用される。タンパク質またはｍＲＮＡのレベルは、直接または間接的標識検出剤、例えば、本明細書に記載の蛍光もしくは放射性標識核酸、放射能または酵素標識抗体などを用いて検出される。
【０２４５】
あるいはまた、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ＣＡＴまたはｐ−ｇａｌなど）に作動可能に連結させた標的遺伝子プロモーターを用いて、レポーター遺伝子系が作出され得る。レポーター構築物は、典型的には、培養細胞内にコトランスフェクトされる。
【０２４６】
選択した標的化対象転写エフェクターでの処理後、レポーター遺伝子の転写、翻訳または活性の量が、当業者にはわかる標準的な手法に従って測定される。
【０２４７】
内在遺伝子発現の標的化対象転写エフェクター調節のモニタリングに有用なアッセイ形式の別の例は、インビボで行なうものである。このアッセイは、腫瘍促進遺伝子、腫瘍の支持（新生血管形成など）に関与している遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ）の発現を阻害する標的化対象転写エフェクター、または癌抑制遺伝子（ｐ５３など）を活性化する標的化対象転写エフェクターを調べるのに特に有用である。このアッセイでは、選択した標的化対象転写エフェクターを発現している培養腫瘍細胞を、免疫抵抗性減弱マウス（無胸腺マウス、放射線照射マウス、またはＳＣＩＤマウスなど）に皮下注射する。適当な長さの時間（例えば、４〜８週間）後、腫瘍成長を、例えば、体積または２つの最大寸法によって測定し、対照と比較する。統計学的に有意に縮小した（例えば、スチューデントのＴ検定を使用）腫瘍を、成長が阻害されたという。あるいはまた、腫瘍新生血管形成の程度も測定され得る。内皮細胞特異的抗体を用いたイムノアッセイを使用し、腫瘍の血管新生および腫瘍内の血管の数について染色を行なう。血管の数が統計学的に有意に減少した（例えば、スチューデントのＴ検定を使用）腫瘍を、新生血管形成が阻害されたという。
【０２４８】
また、インビボでの内在遺伝子発現の調節を調べるための一部の実施形態では、トランスジェニック動物および非トランスジェニック動物が使用される。トランスジェニック動物は、典型的には、選択した標的化対象転写エフェクターを発現するものである。あるいはまた、選択したＺＦＰを一過的に発現する動物、または標的化対象転写エフェクターを送達媒体にて投与した動物を使用してもよい。内在遺伝子発現の調節は、本明細書に記載のアッセイいずれか１つを用いて試験される。
【０２４９】
１３．融合タンパク質をコードする核酸
慣用的なウイルス系および非ウイルス系遺伝子導入法を用いて、標的化対象転写エフェクターをコードする核酸を、哺乳動物の細胞または標的組織に導入することができる。かかる方法を使用し、標的化対象転写エフェクターをコードする核酸を細胞にインビトロで投与することができる。
【０２５０】
標的化対象転写エフェクターをコードする核酸は、インビボまたはエキソビボ遺伝子療法での使用のために投与され得る。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、および送達媒体（リポソームなど）と複合体形成させた核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが挙げられ、これらは、細胞に送達後、エピソームとなるか、ゲノムに組み込まれるかのいずれかである。遺伝子療法処置の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｉｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ．１１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ．１１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ．１１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ．３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ．５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａら，ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｅｈｍ（編）（１９９５）；ならびにＹｕら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１：１３−２６（１９９４）を参照のこと。
【０２５１】
標的化対象転写エフェクターをコードする核酸の非ウイルス系送達方法としては、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤増強型ＤＮＡ取込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン系脂質および中性脂質としては、Ｆｅｉｇｎｅｒ，ＷＯ９１／１７４２４およびＷＯ９１／１６０２４のものが挙げられる。送達は、細胞（エキソビボ投与）に対するものであっても、標的組織（インビボ投与）に対するものであってもよい。
【０２５２】
脂質の調製：核酸複合体（例えば、脂質免疫複合体などの標的化対象リポソーム）は、当業者には既知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号および同第４，９４６，７８７号参照）。
【０２５３】
標的化対象転写エフェクターをコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルス系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化させ、ウイルスの有効負荷量を核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用するものである。ウイルスベクターは、直接患者に（インビボ）投与してもよく、細胞をインビトロで処理するために使用し、この修飾細胞を患者に（エキソビボ）投与してもよい。標的化対象転写エフェクターの送達のための慣用的なウイルス系の系としては、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴および単純疱疹ウイルスベクターが挙げられ得る。ウイルスベクターは、現在、標的細胞および組織内への最も効率的で用途の広い遺伝子導入法である。
【０２５４】
宿主ゲノム内への組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法によって可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期発現がもたらされる。また、高い形質導入効率が、多くの種々の細胞型および標的組織において観察されている。
【０２５５】
レトロウイルスの親和性は、外来エンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的標的集団を拡大培養することにより改変され得る。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染することができ、典型的には、高いウイルス力価が得られるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、シス作用性の長末端反復配列を含み、６〜１０ｋｂまでの外来配列のパッケージング容量を有する。ベクター（治療用遺伝子を標的細胞内に組み込み、永続的な導入遺伝子の発現をもたらすために使用）の複製およびパッケージングには、最小限のシス作用性のＬＴＲで充分である。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬ  Ｖ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）系のもの、およびその組合せが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００参照）。
【０２５６】
標的化対象転写エフェクターの一過性発現が好ましい適用用途では、アデノウイルス系の系が典型的に使用される。アデノウイルス系ベクターは、多くの細胞型で非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂が必要とされない。かかるベクターにより、高い力価および発現レベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系内で大量に産生され得る。また、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ作製において、ならびにインビボおよびエキソビボ遺伝子療法処置のため、標的核酸を有する細胞の形質導入に使用される（例えば、Ｗｅｓｔら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、いくつかの刊行物、例えば、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ．８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）に記載されている。
【０２５７】
特に、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが、現在、臨床試験での遺伝子導入に利用可能であり、レトロウイルスベクターがはるかに最も多くの場合に使用されている系である。
【０２５８】
このようなウイルスベクターにはすべて、ヘルパー細胞株内に挿入される遺伝子による欠陥ベクターの相補を伴って形質導入剤を得るアプローチが使用される。ｐＬＡＳＮとＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスベクターの一例である（Ｄｕｎｂａｒら，Ｂｌｏｏｄ．８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈら，ＰＮＡＳ．９４：２２  １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法の治験で使用された最初の治療用ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターで観察された（Ｅｌｌｅｍら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７）。
【０２５９】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、非病原性の欠陥パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルス系の有望な択一的遺伝子送達系である。あらゆるベクターは、導入遺伝子発現カセットにフランキングしているＡＡＶの１４５ｂｐの逆位末端反復配列のみを保持しているプラスミドから誘導される。形質導入細胞のゲノム内への組込みによる効率的な遺伝子導入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である（Ｗａｇｎｅｒら，Ｌａｎｃｅｔ．３５１：９１１７  １７０２−３（１９９８），Ｋｅａｒｎｓら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。
【０２６０】
複製欠陥組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高い力価で産生され得、いくつかの異なる細胞型に容易に感染するため、主に結腸癌の遺伝子療法に使用されている。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅｌａ、ＥｌｂおよびＥ３遺伝子と置き換えられ、続いて、複製欠陥体であるベクターが、欠失遺伝子の機能がトランスに供給されるヒト２９３細胞中で増殖するように遺伝子工学的に作製される。Ａｄベクターは、多くの型の組織、例えば、肝臓、腎臓および筋肉系組織に見られるものなどの非分裂分化細胞にインビボで形質導入することができる。
【０２６１】
慣用的なＡｄベクターは、大きな担持能を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の一例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫処置のためのポリヌクレオチド療法が関与するものであった（Ｓｔｅｒｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例としては、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．２４：１  ５−１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７  １０８３−１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）が挙げられる。
【０２６２】
パッケージング細胞は、宿主細胞への感染能を有するウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞としては、ＨＥＫ  ２９３細胞（これは、アデノウイルスをパッケージングする）、およびＷ２細胞またはＰＡ３１７細胞（これらは、レトロウイルスをパッケージングする）が挙げられる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージングさせるプロデューサー細胞株によって生成させる。該ベクターは、典型的には、パッケージングおよびその後の宿主内への組込みに必要とされる最小限のウイルス由来配列を含み、他のウイルス由来配列は、発現対象タンパク質の発現カセットで置き換える。ウイルス機能の欠如は、パッケージング細胞株によってトランスにもたらされる。例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノム内への組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、その他のＡＡＶ遺伝子（すなわち、ｒｅｐとｃａｐ）をコードしているがＩＴＲ配列のないヘルパープラスミドを含む細胞株内にパッケージングされる。また、この細胞株を、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染させる。ヘルパーウイルスにより、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現が促進される。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のため有意な量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる夾雑は例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスの方が感受性である加熱処理によって低減され得る。
【０２６３】
多くの遺伝子療法適用用途では、遺伝子療法ベクターが高度の特異性を伴って特定の組織型に送達されることが望ましい。ウイルスベクターは、典型的には、リガンドを、ウイルス外表面上のウイルスコートタンパク質との融合タンパク質として発現させることにより所与の細胞型に対して特異性を有するように修飾される。リガンドは、目的の細胞型に存在することがわかっている受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら，ＰＮＡＳ  ９２：９７４７−９７５１（１９９５）では、モロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合させたヒトヘレグリンを発現するように修飾され得、この組換えウイルスが、ヒト上皮成長因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することが報告された。この原理は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスと、受容体を発現する標的細胞の他の対に拡張することができる。例えば、事実上、選択された任意の細胞受容体に対して特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）をディスプレイさせるための糸状ファージを遺伝子工学的に作製することができる。上記の記載は、主にウイルスベクターに適用しているが、非ウイルスベクターにも同じ原理が適用され得る。かかるベクターは、特定の標的細胞による取込みに有利であると考えられる特定の取込み配列を含むように遺伝子工学的に作製することができる。
【０２６４】
遺伝子療法ベクターは、個々の患者への、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または経表面適用（後述）による投与によってインビボ送達され得る。あるいはまた、ベクターを個々の患者から採取した細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検材料）または万能ドナー造血幹細胞などの細胞にエキソビボ送達した後、細胞を患者に再移植（通常、該ベクターが組み込まれた細胞を選択後）してもよい。
【０２６５】
診断、研究または遺伝子療法のためのエキソビボ細胞トランスフェクション（例えば、宿主生物へのトランスフェクト細胞の再注入による）は、当業者には既知である。一実施形態において、細胞は、被検体生物から単離され、標的化対象転写エフェクター核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトされ、被検体生物（患者など）に再注入して戻される。エキソビボトランスフェクション適した種々の細胞型は、当業者には既知である（例えば、患者からの細胞の単離および培養の仕方の論考については、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版  １９９４））およびそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。
【０２６６】
一実施形態において、幹細胞が、細胞トランスフェクションおよび遺伝子療法のためのエキソビボ手順に使用される。幹細胞の使用の利点は、インビトロで他の細胞型に分化させ得ること、または哺乳動物（該細胞のドナーなど）に導入され得、この場合、骨髄中に生着することである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ｙおよびＴＮＦ−ａなどのサイトカインを使用し、ＣＤ３４＋細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法は、既知である（Ｉｎａｂａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）参照）。
【０２６７】
形質導入および分化のための幹細胞は、既知の方法を用いて単離される。
【０２６８】
例えば、幹細胞は骨髄細胞から、不必要な細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（パンＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、ならびにｌａｄ（分化した抗原提示細胞）など）に結合する抗体、などを用いた骨髄細胞のパニングにより単離される（Ｉｎａｂａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）参照）。
【０２６９】
また、治療用標的化対象転写エフェクター核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）を生物に直接投与し、インビボで細胞に形質導入してもよい。あるいはまた、ネイキッドＤＮＡを投与してもよい。投与は、分子を導入して最終的に血液または組織細胞と接触させるために通常使用される任意の経路によるものである。かかる核酸の適当な投与方法が、当業者に利用可能であり、既知である。１つ以上の経路を用いて特定の組成物を投与してもよいが、多くの場合、特定の経路により、別の経路よりも迅速で有効な反応がもたらされ得る。
【０２７０】
薬学的に許容され得る担体は、一部において、投与される具体的な組成物、ならびに該組成物を投与するために使用される具体的な方法によって決定される。したがって、後述するように、医薬組成物の多種多様な適当な製剤が得られ得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，１９８９参照）。
【０２７１】
１４．送達媒体
標的化対象転写エフェクターなどのポリペプチド化合物の投与における重要な要素は、該ポリペプチドが、確実に、細胞の原形質膜または細胞内区画（核など）の膜を横切る能力を有するようにすることである。細胞膜は、脂質−タンパク質二重層で構成されており、この膜は、小分子の非イオン性親油性化合物に対しては自由透過性であり、極性化合物、巨大分子および治療用または診断用薬剤に対しては本質的に不透過性である。しかしながら、標的化対象転写エフェクターなどのポリペプチドをトランスロケーションする能力を有するタンパク質および他の化合物（リポソームなど）は、細胞膜を通過することが報告されている。
【０２７２】
例えば、「膜トランスロケーションポリペプチド」は、膜トランスロケーション担体として作用する能力を有する両親媒性または疎水性アミノ酸の部分配列を有する。一実施形態において、ホメオドメインタンパク質は、細胞膜を通過してトランスロケーションする能力を有する。ホメオドメインタンパク質の最も短いインターナリゼーション可能なペプチドであるＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａは、該タンパク質のアミノ酸４３位〜５８位までの第３ヘリックスであることがわかった（例えば、Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：６２９−６３４（１９９６）参照）。別の部分配列であるシグナルペプチドのｈ（疎水性の）ドメインは、同様の細胞膜トランスロケーション特性を有することがわかった（例えば、Ｌｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１  ４２５５−１４２５８（１９９５）参照）。
【０２７３】
該タンパク質の細胞内への取込みを助長するためにタンパク質に連結させ得るペプチド配列の例としては、限定されないが：ＨＩＶのｔａｔタンパク質の１１アミノ酸ペプチド；ｐｌ６タンパク質のアミノ酸８４〜１０３に対応する２０残基ペプチド配列（Ｆａｈｒａｅｕｓら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．６：８４（１９９６）参照）；Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａの６０アミノ酸長のホメオドメインの第３ヘリックス（Ｄｅｒｏｓｓｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４（１９９４））；シグナルペプチドのｈ領域（カポジ線維芽細胞増殖因子（Ｋ−ＦＧＦ）ｈ領域など）（Ｌｉｎら，上掲）；またはＨＳＶ由来のＶＰ２２トランスロケーションドメイン（Ｅｌｌｉｏｔ  ＆  Ｏ‘Ｈａｒｅ，Ｃｅｌｌ．８８：２２３−２３３（１９９７））が挙げられる。また、細胞内取込みの向上をもたらす他の適当な化学的部分を標的化対象転写エフェクターに化学的に連結させてもよい。
【０２７４】
毒素分子もまた、細胞膜を通過してポリペプチドを輸送する能力を有する。多くの場合、かかる分子は、少なくとも２つの部分（「バイナリー毒素」と称する）：トランスロケーションまたは結合ドメインまたはポリペプチド、および別個の毒素ドメインまたはポリペプチドで構成されている。典型的には、トランスロケーションドメインまたはポリペプチドが細胞受容体に結合し、次いで、毒素が該細胞内に輸送される。いくつかの細菌毒素、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｓａｇｅｎｓ  ｉｏｔａ毒素、ジフテリア毒素（ＤＴ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、百日咳毒素（ＰＴ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｉｔｔｈｒａｃｉｓ毒素、および百日咳アデニル酸シクラーゼ（ＣＹＡ）が、ペプチドを細胞サイトゾルに内部またはアミノ末端融合体として送達するための試行に使用された（Ａｒｏｒａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：３３３４−３３４１（１９９３）；Ｐｅｒｅｌｌｅら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６１：５１４７−５１５６（１９９３）；Ｓｔｅｎｍａｒｋら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１３：１０２５−１０３２（１９９１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，ＰＮＡＳ．９０：３５３０−３５３４（１９９３）；Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｉら，Ａｂｓｔｒ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：２９５（１９９５）；Ｓｅｂｏら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３８５１−３８５７（１９９５）；Ｋｌｉｍｐｅｌら，ＰＮＡＳ．８９：１０２７７−１０２８１（１９９２）；およびＮｏｖａｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７１８６−１７１９３  １９９２））。
【０２７５】
細胞内への連結ポリペプチドのインターナリゼーションを助長するアミノ酸配列は、無作為化ペプチド配列のライブラリーから選択してもよい。例えば、Ｙｅｈら（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．７（５）：Ｓ４６１（Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃１１９１）を参照のこと。かかる「インターナリゼーションペプチド」を、標的化対象転写エフェクターに融合させると、細胞内への該タンパク質の進入が助長され得る。
【０２７６】
かかる部分配列は、上記のように、細胞膜を通過して標的化対象転写エフェクターをトランスロケーションするために使用され得る。ＺＦＰは簡便に、かかる配列に融合され得る、またはかかる配列で誘導体化され得る。
【０２７７】
典型的には、トランスロケーション配列は、融合タンパク質の一部として提供される。任意選択で、標的化対象転写エフェクターとトランスロケーション配列を連結させるためにリンカーが使用され得る。任意の適当なリンカー（例えば、ペプチドリンカー）が使用され得る。
【０２７８】
また、標的化対象転写エフェクターは動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）内に、リポソームおよびリポソーム誘導体（イムノリポソームなど）によって導入され得る。用語「リポソーム」は、１層以上の同心円状に規則正しく配列され、水相が封入された脂質二重層で構成された小胞をいう。水相には、典型的には、細胞に送達する化合物、すなわち、標的化対象転写エフェクターが含まれる。
【０２７９】
リポソームは原形質膜と融合し、それにより、薬物がサイトゾル内に放出される。あるいはまた、リポソームは、輸送小胞内で細胞による食作用または取込みを受ける。エンドソームまたはファゴソーム内に入ると、リポソームは、分解するか、または輸送小胞の膜と融合するかのいずれかにより、その内容物を放出する。
【０２８０】
リポソームによる現行の薬物送達法では、リポソームは、最終的に透過性となり、内包している化合物（本件では、標的化対象転写エフェクター）を標的組織または細胞に放出する。全身送達または組織特異的送達では、これは、例えば、リポソーム二重層が体内の種々の因子の作用によって経時的に分解する受動的様式によってなされ得る。あるいはまた、活性薬物の放出は、リポソーム小胞において透過性の変化を誘導する薬剤の使用を伴うものである。
【０２８１】
リポソーム膜は、環境が該リポソーム膜付近で酸性になると不安定化されるように構築され得る（例えば、ＰＮＡＳ．８４：７８５１（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８：９０８（１９８９）参照）。リポソームは、例えば、標的細胞によってエンドサイトーシスを受けると不安定化され、その内容物を放出する。この不安定化は、融合誘導（ｆｕｓｏｇｅｎｅｓｉｓ）と称される。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、多くの「融合誘導」系の基礎である。
【０２８２】
かかるリポソームは、典型的には、標的化対象転写エフェクターと脂質成分、例えば、中性および／またはカチオン系脂質を含み、任意選択で、受容体認識分子（所定の細胞表面受容体またはリガンド（例えば、抗原）に結合する抗体など）を含む。リポソームの調製には、例えば、Ｓｚｏｋａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ  ９：４６７（１９８０）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、同第４，９４６，７８７号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９１／１７４２４、Ｄｅａｍｅｒ  ＆  Ｂａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．４４３：６２９−６３４（１９７６）；Ｆｒａｌｅｙら，ＰＮＡＳ．７６：３３４８−３３５２（１９７９）；Ｈｏｐｅら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．８１２：５５−６５（１９８５）；Ｍａｙｅｒら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｌｌｙｓ．Ａｃｔａ．８５８：１６１−１６８（１９８６）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら，ＰＮＡＳ．８５：２４２−２４６（１９８８）；Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（Ｏｓｔｒｏ（編），１９８３，第１章）；Ｈｏｐｅら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９（１９８６）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）およびＬａｓｉｃ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｆｒｏｍ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３））に記載のような、さまざまな方法が利用可能である。適当な方法としては、例えば、超音波処理、押出し、高圧／ホモジネーション、マイクロフルイダイゼーション、デタージェント透析、小分子リポソーム小胞のカルシウム誘導型融合、およびエーテル融合法（これらはすべて、当該技術分野でよく知られている）が挙げられる。
【０２８３】
一部の特定の実施形態において、リポソームを、特定の細胞型、組織などに特異的な標的化部分を用いて標的化することが望ましい。さまざまな標的化部分（例えば、リガンド、受容体、およびモノクローナル抗体）を用いたリポソームの標的化が、これまでに報告されている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号参照）。
【０２８４】
標的化部分の例としては、新生物と関連している抗原（前立腺癌特異的抗原およびＭＡＧＥなど）に特異的なモノクローナル抗体が挙げられる。また、腫瘍は、癌遺伝子（ｒａｓまたはｃ−ｅｒｂＢ２など）の活性化または過剰発現によってもたらされる遺伝子産物を検出することにより診断され得る。さらに、多くの腫瘍は、通常、胎児組織によって発現される抗原（アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）および癌胎児抗原（ＣＥＡ）など）を発現している。ウイルス感染部位は、種々のウイルス抗原、例えば、Ｂ型肝炎のコア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン‐バーウイルス抗原、ヒト免疫不全１型ウイルス（ＨＩＶｌ）抗原ならびにパピローマウイルス抗原などを用いて診断され得る。炎症は、炎症部位で発現される表面分子によって特異的に認識される分子（例えば、インテグリン（例えば、ＶＣＡＭ−１）、セレクチン受容体（例えば、ＥＬＡＭ−１）などを用いて検出され得る。
【０２８５】
標的化剤をリポソームにカップリングさせるには、標準的な方法が使用され得る。このような方法は、一般的に、リポソーム内への脂質成分、例えば、ホスファチジルエタノールアミン（これは、標的化剤の結合のために活性化され得る）、または誘導体化された親油性化合物（脂質誘導体化ブレオマイシンなど）の組込みを伴う。抗体に標的化されるリポソームは、例えば、プロテインＡが組み込まれたリポソームを用いて構築され得る（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６３３７−１６３４２（１９９０）およびＬｅｏｎｅｔｔｉら，ＰＮＡＳ．８７：２４４８−２４５１（１９９０）参照）。
【０２８６】
１５．投薬
治療的適用用途のためには、患者に投与される用量は、本開示との関連において、患者に経時的に有益な治療応答がもたらされるのに充分な用量であるべきである。また、具体的な投薬レジメンは、実験設定（例えば、機能的ゲノミクス試験、および細胞または動物モデル）において表現型の変化を調べるのに有用であるものがよい。該用量は、使用される具体的な遺伝子工学的に作製されたＤＮＳ結合ドメインの有効性とＫｄ、標的細胞の核容積、および患者の体調、ならびに治療対象の患者の体重または体表面積によって決定される。また、用量サイズは、具体的な患者における具体的な化合物またはベクターの投与に随伴する有害な副作用（あれば）の存在、性質および程度によっても決定される。
【０２８７】
標的部位へのほぼ９９％結合のための標的化対象転写エフェクターの最大治療有効投薬量は、約１．５×１０５未満〜１．５×１０６コピーの具体的な標的化対象転写エフェクター分子／細胞の範囲であると計算される。この結合レベルのための標的化対象転写エフェクター数／細胞は以下のように、ＨｅＬａ細胞核容積を用いて計算される（ほぼ１０００μｍ３または１０−１２Ｌ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｌｔｍａｎ  ＆  Ｋａｔｚ編（１９７６））。ＨｅＬａ核は比較的大型であるため、この投薬量数値は、必要に応じて、標的細胞の核容積を用いて再計算される。また、この計算は、標的化対象転写エフェクター結合に対する他の部位による競合が考慮されていない。また、この計算は、本質的に全部の標的化対象転写エフェクターが核に局在していると仮定している。１００×Ｋｄの値は、標的部位へのほぼ９９％結合の計算に使用され、１０×Ｋｄの値は、標的部位へのほぼ９０％結合の計算に使用される。
【０２８８】
また、標的化対象転写エフェクターをコードする発現ベクターの適切な用量も、プロモーターからの標的化対象転写エフェクター発現の平均速度と、細胞内での標的化対象転写エフェクターの分解の平均速度を考慮することにより計算され得る。野生型または変異型ＨＳＶ  ＴＫなどの弱いプロモーターは、上記のようにして使用され得る。標的化対象転写エフェクターの用量（単位：マイクログラム）は、使用される具体的な標的化対象転写エフェクターの分子量を考慮することにより計算される。
【０２８９】
疾患の治療または予防において投与する標的化対象転写エフェクターの有効量の決定の際には、医師が、標的化対象転写エフェクターまたは標的化対象転写エフェクターをコードする核酸の循環血漿レベル、標的化対象転写エフェクターの毒性の可能性、疾患の進行、ならびに抗標的化対象転写エフェクター抗体の生成を評価する。投与は、単回用量または分割用量によって行なわれ得る。
【０２９０】
１６．医薬組成物および投与
標的化対象転写エフェクター、および標的化対象転写エフェクターをコードする発現ベクターは、遺伝子発現のモジュレーションのため、および治療的または予防的適用用途（例えば、癌、虚血、糖尿病性網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、乾癬、ＨＩＶ感染、鎌状赤血球貧血、アルツハイマー病、筋ジストロフィ、神経変性疾患、血管疾患、嚢胞性線維症、脳卒中など）のために、患者に直接投与され得る。標的化対象転写エフェクター遺伝子療法によって阻害され得る微生物の例としては、病原性細菌、例えば、クラミジア、リケッチア細菌、ミコバクテリア、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、肺炎球菌、髄膜炎菌およびコノコッカス（ｃｏｎｏｃｏｃｃｉ）、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、破傷風、ボツリヌス、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症、およびライム病細菌；感染性の真菌、例えば、アスペルギルス、カンジダ種；原生動物（胞子虫など）（例えば、形質胞体）、根足虫綱（例えば、エントアメーバ属）ならびに鞭毛虫上綱類（Ｔｉｊｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｎａｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａなど）；ウイルス疾患、例えば、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、またはＣ型）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−６、ＨＳＶ−１１、ＣＭＶ、およびＥＢＶ）、ＨＩＶ、エボラ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナ（ｃｏｒｎｏ）ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、およびアルボウイルス脳炎ウイルスなどが挙げられる。
【０２９１】
治療有効量の投与は、標的化対象転写エフェクターを処置対象の組織に導入して最終的に接触させるために通常使用されている任意の経路によるものである。標的化対象転写エフェクターは、任意の適当な様式で、任意選択で、薬学的に許容され得る担体とともに投与される。かかるモジュレーターの適当な投与方法が、当業者に利用可能であり、既知である。１つ以上の経路を用いて特定の組成物を投与してもよいが、多くの場合、特定の経路により、別の経路よりも迅速で有効な反応がもたらされ得る。
【０２９２】
薬学的に許容され得る担体は、一部において、投与される具体的な組成物、ならびに該組成物を投与するために使用される具体的な方法によって決定される。したがって、医薬組成物の多種多様な適当な製剤が得られ得る（例えば、Ｒｅｍｉｓａｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｆｎｃａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版  １９８５）参照）。
【０２９３】
標的化対象転写エフェクターは、単独または他の適当な成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤に作製され得る（すなわち、「噴霧され」得る）。
【０２９４】
エアロゾル製剤は、加圧された許容され得る噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に配置され得る。
【０２９５】
非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮内および皮下経路によるものなど）に適した製剤としては、水性および非水性の等張性滅菌注射用液（これには、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および製剤を対象レシピエントの血液と等張性にする溶液が含有され得る）、ならびに水性および非水性の滅菌懸濁剤（これには、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤が含有され得る）が挙げられる。開示した組成物は、例えば、静脈内注入、経口、経表面、腹腔内、膀胱腔内または髄腔内によって投与され得る。化合物の製剤は、単回用量または反復用量の密封容器（アンプルおよびバイアルなど）にて提示され得る。注射用液剤および懸濁剤は、前述の種類の滅菌粉末剤、顆粒剤および錠剤から調製され得る。
【０２９６】
植物標的化対象転写エフェクターにおける遺伝子発現の調節は、植物の形質、例えば、疾患抵抗性の増大、構造多糖類および貯蔵多糖類の修飾、香り、タンパク質および脂肪酸、果実熟成、収量、色、栄養特性、貯蔵能の改善などを操作するために使用され得る。特に、作物種を油分生成の向上のために操作すること（例えば、脂肪種子中に生成される脂肪酸の修飾）は重要である。
【０２９７】
種油は、主に、脂肪酸のグリセロールエステルであるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）で構成されている。このような植物油の商品は、主に、６種類の主要作物（大豆、油やし、菜種、ヒマワリ、綿実およびピーナッツ）で占められている。植物油は、大部分（９０％）が、マーガリン、ショートニング、サラダ油および揚げ油として人間が消費するのに使用される。残りの１０％は、潤滑油、油脂化学物質、バイオ燃料、洗剤および他の工業適用用途などの非食品適用用途のために使用される。
【０２９８】
このような各適用用途に使用される油類の所望の特性は、特に、鎖長およびＴＡＧを構成する脂肪酸中に存在する二重結合の数に関して広く異なる。このような特性は、膜流動性および温度感受性を制御するために植物によって操作される。同じ特性が、標的化対象転写エフェクターを用いて制御することができ、食品用途および工業的用途のための改善された特性を有する油類が得られる。
【０２９９】
脂肪種子作物のＴＡＧ中の主な脂肪酸は、は１６〜１８炭素長であり、０〜３個の二重結合を含むものである。パルミチン酸（１６：０［１６炭素：０二重結合］）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、およびリノレン酸（１８：３）が主体である。二重結合の数、または飽和度によって、得られる油類の融解温度、反応性、調理性および健康に対する寄与が決定される。
【０３００】
オレイン酸（１８：１）のリノール酸（１８：２）（さらに、これは１８：３形成の前駆体である）への変換を担う酵素は、Ａ１２−オレイン酸デサチュラーゼ（ω−６デサチュラーゼとも称される）である。脂肪酸脱飽和経路におけるこの工程のブロックにより、ポリ不飽和油脂を消費してオレイン酸の蓄積がもたらされるはずである。
【０３０１】
一実施形態において、標的化対象転写エフェクターは、大豆においてＦＡＤ２−１遺伝子の発現を調節するために使用される。ミクロソームＡ６デサチュラーゼをコードする２つの遺伝子が、最近、大豆からクローニングされ、これらはＦＡＤ２−１およびＦＡＤ２−２と呼ばれている（Ｈｅｐｐａｒｄら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１０：３１１−３１９（１９９６））。ＦＡＤ２−１（Δ１２デサチュラーゼ）は、大豆種子におけるオレイン酸脱飽和の大部分を制御しているようである。したがって、標的化対象転写エフェクターは、植物においてＦＡＤ２−１の遺伝子発現をモジュレートするために使用され得る。具体的には、標的化対象転写エフェクターは、大豆中でオレイン酸（１８：１）の蓄積を増大させるため、該脂肪種子においてＦＡＤ２−１遺伝子の発現を阻害するために使用され得る。さらに、標的化対象転写エフェクターは、任意の他の植物遺伝子、例えば、他の植物由来のΔ−９デサチュラーゼ、Δ−１２デサチュラーゼ、Δ−１５デサチュラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、デンプンシンターゼ、セルロースシンターゼ、スクロースシンターゼ、老化関連遺伝子、重金属キレート剤、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼ、植物ウイルス遺伝子、植物真菌病原体遺伝子、および植物細菌病原体遺伝子の発現をモジュレートするために使用され得る。
【０３０２】
また、植物細胞の形質転換に適した組換えＤＮＡベクターが、タンパク質（例えば、標的化対象転写エフェクター）をコードする核酸を植物細胞に送達するために使用される。多種多様な高等植物種を形質転換するための手法は、よく知られており、科学技術文献に記載されている（例えば、Ｗｅｉｓｉｎｇら  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−４７７（１９８８）参照）。所望の標的化対象転写エフェクターをコードするＤＮＡ配列は、形質転換植物の目的組織内で標的化対象転写エフェクターの転写を指令する転写および翻訳開始調節配列と結合される。
【０３０３】
例えば、再生植物のすべての組織内で標的化対象転写エフェクターの発現を指令する植物プロモーター断片が使用され得る。かかるプロモーターを「構成的」プロモーターと本明細書においてと称し、これは、ほとんどの環境条件下および発生段階または細胞分化段階で活性である。構成的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎａ  ｔｕｒｎａｆａｃｉｅｆａｓのＴ−ＤＮＡに由来する１‘−または２‘−プロモーター、および当業者には既知である種々の植物遺伝子に由来する他の転写開始領域が挙げられる。
【０３０４】
あるいはまた、植物プロモーターは、標的化対象転写エフェクターの発現を、特定の組織内で指令するものであってもよく、あるいは、より厳格な環境制御または発生制御下にあるものであってもよい。
【０３０５】
かかるプロモーターを、本明細書では「誘導性」プロモーターと称する。誘導性プロモーターによる転写に影響し得る環境条件の例としては、嫌気性条件または光の存在が挙げられる。
【０３０６】
発生制御下のプロモーターの例としては、一部の特定の組織（果実、種子または花など）のみにおいて転写を開始させるプロモーターが挙げられる。例えば、ポリガラクツロナーゼプロモーターの使用により、果実において標的化対象転写エフェクターの発現が指令され得、ＣＨＳ−Ａ（ペチュニア由来カルコンシンターゼＡ）プロモーターにより、植物の花においてＺＦＰの発現が指令され得る。
【０３０７】
標的化対象転写エフェクター配列を含むベクターは、典型的には、植物細胞に選択可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含む。例えば、マーカーは、殺生物剤耐性、特に抗生物質耐性（カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシンに対する耐性など）、または除草剤耐性（クロロスルフロン（ｃｈｌｏｒｏｓｕｆｏｒｏｎ）もしくはＢａｓｔａに対する耐性など）をコードするものであり得る。
【０３０８】
かかるＤＮＡ構築物は所望の植物宿主のゲノム内に、さまざまな慣用的な手法によって導入され得る。例えば、ＤＮＡ構築物は植物細胞のゲノムＤＮＡ内に直接、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの手法を用いて導入され得るか、またはＤＮＡ構築物は、植物組織に直接、微粒子銃法（ＤＮＡ粒子ボンバードメントなど）を用いて導入され得る。あるいはまた、ＤＮＡ構築物を適当なＴ−ＤＮＡフランキング領域と結合させ、慣用的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクター内に導入してもよい。細胞が細菌に感染すると、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主のビルレンス機能によって、該構築物および隣接マーカーの植物細胞ＤＮＡ内への挿入が指令される。
【０３０９】
マイクロインジェクション手法は、当該技術分野で知られており、科学文献および特許文献に充分記載されている。ポリエチレングリコール沈澱を用いたＤＮＡ構築物の導入は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら  ＥＭＢＯＪ．３：２７１７−２７２２（１９８４）に記載されている。
【０３１０】
エレクトロポレーション手法は、Ｆｒｏｍｍら  ＰＮＡＳ．８２：５８２４（１９８５）に記載されている。微粒子銃形質転換手法は、Ｋｌｅｉｎら  Ｎａｔｕｒｅ．３２７：７０−７３（１９８７）に記載されている。
【０３１１】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性形質転換手法は、科学文献に充分記載されている（例えば、Ｈｏｒｓｃｈら  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２３３：４９６−４９８（１９８４）；およびＦｒａｌｅｙら  ＰＮＡＳ．８０：４８０３（１９８３）参照）。
【０３１２】
上記の任意の形質転換手法によって誘導される形質転換植物細胞を培養すると、形質転換遺伝子型を有し、したがって、所望の標的化対象転写エフェクター制御表現型を有する完全体の植物に再生され得る。かかる再生手法は、組織培養物増殖培地中の特定の植物ホルモンの操作に依存し、典型的には、ＺＦＰヌクレオチド配列と一緒に導入された殺生物剤および／または除草剤マーカーに依存する。培養プロトプラストからの植物の再生は、Ｅｖａｎｓら，Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐｐ．１２４−１７６（１９８３）；およびＢｉｎｄｉｎｇ，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，ｐｐ．２１−７３（１９８５）に記載されている。また、再生は、植物カルス、外植片、器官またはその一部分からも得られ得る。かかる再生手法は、Ｋｌｅｅら  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｌａｙｓ．３８：４６７−４８６（１９８７）に一般的に記載されている。
【０３１３】
また、標的化対象転写エフェクターの機能的ゲノミクスアッセイは、遺伝子発現の表現型の結果および機能を調べるためのアッセイにも使用される。集中的な大量配列決定作業とともに解析手法の最近の進歩によって、これまで入手可能であったよりも多くのさらなる分子標的を同定および特性評価する機会がもたらされた。遺伝子およびその機能に関するこの新たな情報により、基礎生物学の理解が加速され、治療的介入のための多くの新たな標的が提示されよう。一部の場合において、解析ツールは、新たなデータの生成と同じペースに追いついていない。一例は、全般的な識別的遺伝子発現の測定における最近の進歩によって示される。
【０３１４】
遺伝子発現マイクロアレイ、識別的ｃＤＮＡクローニング頻度、サブトラクティブハイブリダイゼーションおよび識別的ディスプレイ法に代表されるこのような方法は、異なる組織内で、または特定の刺激に応答して上方調節または下方調節される遺伝子を非常に迅速に同定することができる。次第に、かかる方法が、例えば、形質転換、腫瘍進行、炎症応答、神経系障害などの生物学的プロセスを調べるために使用されてきている。現在、所与の生理現象と相関している識別的に発現される遺伝子の長いリストが非常に容易に作製され得るが、個々の識別的発現遺伝子とその現象との因果関係を示すことは困難である。現在のところ、機能を識別的発現遺伝子に帰属させるための単純な方法は、識別的遺伝子発現のモニタリング能と同じペースに追いついていない。
【０３１５】
慣用的な分子アプローチを使用し、完全長ｃＤＮＡをクローニングし、これを哺乳動物発現ベクター内にサブクローニングし、該組換えベクターで適切な宿主細胞をトランスフェクトすることにより、候補遺伝子の過剰発現が行なわれ得る。
【０３１６】
このアプローチは直接的であるが、特に、最初の候補遺伝子が単純な発現配列タグ（ＥＳＴ）で示される場合は、たいへんな作業である。「慣用的な」方法による候補遺伝子の発現下では、さらにもっと問題である。
【０３１７】
アンチセンス法および標的化対象リボザイムに依存する方法は信頼性が低く、少数割合の選択された標的でのみ成功裡である。相同組換えによる遺伝子ノックアウトは、組換え誘導性幹細胞ではかなり充分に有用であるが、体細胞由来の細胞株では非常に非効率的である。いずれの場合も、効率的に有用であるためには、組換えのために、大きな同系ゲノムＤＮＡクローン（１０ｋｂ程度）を単離しなければならない。
【０３１８】
標的化対象転写エフェクター手法は、使用すると、識別的遺伝子発現試験が迅速に解析され得る。遺伝子工学的に作製された標的化対象転写エフェクターは、任意の内在標的遺伝子を上方調節または下方調節するために容易に使用され得る。遺伝子特異的ＤＮＡ結合ドメインの作成には、ほとんど配列情報が必要とされない。このため、標的化対象転写エフェクター手法は、特性評価が不充分な、識別的に発現され遺伝子の長いリストの解析に理想的である。各候補遺伝子に対するジンクフィンガー系のＤＮＡ結合ドメインが簡単に構築され得、キメラを上方調節および下方調節する人工転写因子が作製され得、モデル系において、ある時点での候補遺伝子のオンまたはオフの切り替えによる試験下の表現型（形質転換、サイトカインに対する応答など）に対する上方調節または下方調節の結果が試験され得る。
【０３１９】
ゲノムデータに機能情報を付加するために、遺伝子工学的に作製された標的化対象転写エフェクターを使用するこの具体例は、一例にすぎない。遺伝子（１つま複数）の特定の上方調節または下方調節の恩恵を被り得る任意の実験状況が、遺伝子工学的に作製された標的化対象転写エフェクターの信頼性と使用の容易性の恩恵を被り得る。
【０３２０】
また、より慣用的な方法によって得られ得るよりもさらに大きな実験的制御が、標的化対象転写エフェクターによって付与され得る。これは、遺伝子工学的に作製された標的化対象転写エフェクターの作製および／または機能が、小分子制御下に置かれているためである。このアプローチの例は、Ｔｅｔ−Ｏｎ系、エクジソン調節型の系、および変異型プロゲステロン受容体を含むキメラ因子が組み込まれた系によって示される。このような系はすべて、間接的に小分子制御を、任意の内在目的遺伝子または任意の導入遺伝子に対して、標的化対象転写エフェクター調節因子の機能および／または発現を小分子制御下に置くことにより付与し得るものである。
【０３２１】
１７．トランスジェニック動物
標的化対象転写エフェクター手法のさらなる適用は、トランスジェニック動物における遺伝子発現の操作である。細胞株の場合と同様、内在遺伝子の過剰発現またはトランスジェニック動物（トランスジェニックマウスなど）への異種遺伝子の導入は、かなり直接的なプロセスである。標的化対象転写エフェクター手法は、試験下の遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンを作製する必要性が回避され得るため、このような型の方法における改善法である。
【０３２２】
同様に、細胞系の場合と同様、トランスジェニック動物における遺伝子発現の慣用的な下方調節は、技術的困難性によって障害される。相同組換えによる遺伝子ノックアウトは、現在、最も一般的に適用されている方法である。この方法では、ノックアウトする遺伝子の比較的長いゲノムクローン（約１０ｋｂ）が必要とされる。典型的には、選択可能なマーカーを、遺伝子破壊をもたらす目的遺伝子のエキソン内に挿入し、非相同組換えに対して相同な組換えを選択するために、第２の反対の選択可能なマーカーを相同性領域外に入れる。この構築物を胚性幹細胞内にトランスフェクトすると、組換え体が培地中で選択される。
【０３２３】
組換え幹細胞を、非常に初期段階の胚と結合させ、キメラ動物を作製する。キメラ現象生殖細胞系に拡張された場合、戻し交配することにより、ホモ接合型ノックアウト動物が単離され得る。該手法が成功裡に適用された場合、ほぼ１年でノックアウト動物が作出され得る。残念ながら、多くの場合、２つの一般的な問題；胚致死および発生代償（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）によって、該ノックアウト手法の成功裡の適用が妨げられる。胚致死は、ノックアウトする遺伝子が発生に不可欠な役割を果たしている場合に、もたらされる。これは、キメラ現象の欠如、生殖細胞系への伝達の欠如、またはホモ接合型の戻し交配体が得られないことにより明示され得る。遺伝子は、成体の動物においてよりも発生中において、有意に異なる生理学的役割を果たし得る。したがって、胚致死は、遺伝子標的が成体における治療的介入のための標的として有用であることを却下するための理論的説明とみなされない。
【０３２４】
胚致死は、たいていは、単に、目的遺伝子が、マウスモデルにおいて慣用的な方法を用いて容易に研究され得ないことを意味する。
【０３２５】
発生代償は、ノックアウトする遺伝子産物が関連遺伝子産物で置換されることである。遺伝子は、多くの場合、広範なファミリーに存在する。発生過程における選択または導入により、場合によっては、あるファミリー構成員の別の変異型構成員での置換が引き起こされることがあり得る。この型の機能性置換は、成体動物では起こり得ない。発生代償の典型的な結果は、成体における該遺伝子機能の消去により、その他の場合では生理学的変化が引き起こされ得るノックアウトマウスの表現型の欠如であり得る。これは、一種の偽陰性結果であり、多くの場合、慣用的なノックアウトマウスモデルの解釈を混乱させる。
【０３２６】
胚致死を回避するためのいくつかの新たな方法が開発されている。このような方法は、ｅｒｅレコンビナーゼとｌｏｘ  ＤＮＡ認識エレメントを使用するアプローチに代表される。認識エレメントは目的遺伝子内に、相同組換えを用いて挿入すると（上記のようにして）、発生後の成体マウスにおいてレコンビナーゼの発現が誘導される。これにより、標的遺伝子の一部分の欠失が引き起こされ、発生の複雑性が回避される。この方法は、たいへんな労力を要し、レコンビナーゼの不均一な導入によりキメラ現象が起こらない。
【０３２７】
遺伝子発現を操作するための標的化対象転写エフェクターの使用は、先のセクションに記載の小分子調節系が使用される成体動物に限定され得る。ジンクフィンガー系抑制因子の発現および／または機能は、発生中はスイッチがオフされ得、成体動物では自在にスイッチがオンされ得る。このアプローチは、モジュールのみを発現する標的化対象転写エフェクターの付加に依存する。相同組換えは必要とされない。標的化対象転写エフェクター抑制因子はトランス優性であるため、生殖細胞系への伝達またはホモ接合性に関する問題はない。この問題は、特性評価が不充分な遺伝子候補（ｃＤＮＡまたはＥＳＴクローン）からマウスモデルまで進展させるために必要とされる時間と労力に劇的に影響する。この能力の使用により、治療的介入のための遺伝子標的が迅速に同定および／または確認され、新規なモデル系が作製され、複雑な生理現象（発生、造血、形質転換、神経機能など）の解析が可能になり得る。キメラ標的化対象マウスは、Ｈｏｇａｎら，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）；Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＣａｐｅｃｃｈｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４４：１２８８（１９８９）に従って得ることができる。
【実施例】
【０３２８】
本発明の実施形態を、以下の実施例によってさらに説明する。本実施例は、限定であると解釈されるべきでない。当業者には、常套的な範囲内の実験手法を用いて、本明細書に記載の具体的な物質および手順に対する数多くの均等物を認識し、または確認することができよう。かかる均等物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲の範囲に包含されるものとする。以下の実施例１〜４は、Ｉ−ＣｒｅＩを基礎とする非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼを具体的に示すが、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＣｅｕＩおよび他のＬＡＧＬＩＤＡＤＧメガヌクレアーゼを基礎とする非天然型の合理的に設計されたメガヌクレアーゼも、同様に、本明細書記載のようにして作製および使用され得る。
【実施例１】
【０３２９】
ＨＩＶ−１  ＴＡＴ遺伝子を認識するメガヌクレアーゼの合理的設計
１．合理的なメガヌクレアーゼ設計
１対のメガヌクレアーゼを、ＨＩＶ−１  ＴＡＴ遺伝子に見られるＤＮＡ部位５‘−ＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＴＣＡＧＡＡＣＡＧＴＣＡ−３‘（配列番号：１５）を認識して切断するように合理的に設計した。表１に従い、２つのメガヌクレアーゼＴＡＴ１およびＴＡＴ２を、それぞれ、片側部位５‘−ＧＡＡＧＡＧＣＴＣ−３‘（配列番号：１６）および５‘−ＴＧＡＣＴＧＴＴＣ−３‘（配列番号：１７）に結合するように、以下の塩基接触（非ＷＴ接触は太字である）を用いて設計した。
【表９】
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【表１０】
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【０３３０】
この２つの酵素を、後述するようにして、クローニングし、大腸菌内で発現させ、対応するＤＮＡ認識配列に対する酵素活性についてアッセイした。どちらの場合も、合理的に設計されたメガヌクレアーゼは、不活性であることがわかった。次いで、ＤＮＡ主鎖との接触を改善するためにＥ８０をＱに変異させた各々の第２世代を作製した。第２世代のＴＡＴ２酵素は、その目的の認識配列に対して活性であるが、第２世代のＴＡＴ１酵素は不活性なままであることがわかった。野生型Ｉ−ＣｒｅＩの共結晶構造の目視検査により、ＴＡＴ１は、Ｒ４０とＫ２８間の立体崩壊のために不活性であることが示された。この崩壊を軽減するため、Ｑ８０変異を維持したまま、Ｋ２８をより小分子の側鎖（Ａ、Ｓ、ＴまたはＣ）を有するアミノ酸に変異させたＴＡＴ１バリアントを作製した。このような酵素を大腸菌内で産生させ、アッセイすると、Ｓ２８およびＴ２８を有するＴＡＴ１バリアントは、ともに、−７位において所望の塩基優先性を維持したまま、目的の認識配列に対して活性であるがことがわかった。
【０３３１】
２．組換えメガヌクレアーゼの構築
再設計したＩ−ＣｒｅＩ酵素に対する変異を、変異原性プライマーを用いて、オーバーラッピングＰＣＲストラテジーに導入した。１次ＰＣＲで生成されたＩ−ＣｒｅＩの組換えＤＮＡ断片を二次ＰＣＲ内に加え、完全長組換え核酸を作製した。組換えＩ−ＣｒｅＩ構築物はすべて、精製用に該遺伝子の３‘末端に融合させた６ヒスチジンタグを有するｐＥＴ２１ａベクター内にクローニングした（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。核酸配列はすべて、サンガーのジデオキシヌクレオチド配列決定法を用いて確認した（Ｓａｎｇｅｒら（１９７７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７４（１２）：５４６３−７参照）。
【０３３２】
野生型Ｉ−ＣｒｅＩおよびすべての遺伝子工学的に作製されたメガヌクレアーゼは、以下の方法を用いて発現させ、精製した。ｐＥＴ２１ａベクター内にクローニングした構築物で化学的にコンピテントなＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換し、２００μｇ／ｍｌのカルバニシリンを含めた標準的な２ＸＹＴプレート上に平板培養した。一晩培養後、形質転換された細菌コロニーをプレートから掻き集め、５０ｍｌの２ＸＹＴ培地への播種に使用した。細胞を、振盪しながら３７℃で、光学密度０．９（６００ｎｍの波長で）に達するまで培養した。次いで、培養温度を３７℃から２２℃に下げた。１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加によって、タンパク質の発現を誘導し、細胞を攪拌下で２時間半インキュベートした。次いで、６０００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞をペレット化した。ペレットを、ボルテックスによって、１ｍｌの結合バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ８．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭイミダゾール）中に再懸濁させた。次いで、細胞を、１２パルスの超音波処理（５０％出力）によって破壊し、１４，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって、細胞残屑をペレット化した。細胞上清みを４ｍｌの結合バッファー中で希釈し、２００μｌニッケル含有金属キレート化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷した。
【０３３３】
続いて、カラムを、４ｍｌの洗浄バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，６０ｍＭ  イミダゾール）および０．２ｍｌの溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，４００ｍＭ  イミダゾール）で洗浄した。メガヌクレアーゼ酵素を、さらに０．６ｍｌの溶出バッファーで溶出させ、Ｖｉｖｏｓｐｉｎ使い捨て濃縮器（ＩＳＣ，Ｉｎｃ．，Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，ＵＴ）を用いて５０〜１３０μｌに濃縮した。Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、該酵素を、アッセイおよび保存用のＳＡバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に入れ替えた。該酵素の濃度を、２８０ｎｍにおける吸光度によって測定した（吸光係数２３，５９０Ｍ−１ｃｍ−１を使用）。次いで、該酵素の純度および分子量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって確認した。
【０３３４】
ヘテロ二量体酵素を、２つのタンパク質を独立して精製し、これらをインビトロで混合すること、または大腸菌内での２つのタンパク質のタンデム発現のための人工オペロンを構築することのいずれかによって作製した。前者の場合、精製メガヌクレアーゼを溶液中で１：１で混合し、４２℃で２０分間プレインキュベートした後、ＤＮＡ基質を添加した。後者の場合は、２つの遺伝子を、ｐＥＴ−２１ａ発現ベクター内に逐次クローニングした（ＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを使用）。転写中の読み取りエラーを抑制するため、オペロン内の第１遺伝子の末端に２つの停止コドンを付加する。１２塩基対の核酸スペーサーおよびｐＥＴ２１ベクター由来のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列により、人工オペロン内において第１遺伝子と第２遺伝子を隔離した。
【０３３５】
３．切断アッセイ
上記のように精製した酵素はすべて、メガヌクレアーゼ認識配列を含む線状の二本鎖ＤＮＡ基質とのインキュベーションによる活性についてアッセイした。認識配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に対応する合成オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、ｐＵＣ１９プラスミドのＳｍａＩ部位内に、平滑端ライゲーションによってクローニングした。クローニングされた結合部位の配列を、サンガーのジデオキシヌクレオチド配列決定法によって確認した。プラスミド基質はすべて、メガヌクレアーゼ消化と同時に、ＸｍｎＩ、ＳｃａＩまたはＢｐｍＩにより線状化した。酵素消化物は、５μｌの０．０５μＭ  ＤＮＡ基質、２．５μｌの５μＭ組換えＩ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼ、９．５μｌのＳＡバッファー、および０．５μｌのＸｍｎＩ、ＳｃａＩまたはＢｐｍＩを含むものであった。消化物を、３７℃または一部のメガヌクレアーゼ酵素では４２℃のいずれかで４時間インキュベートした。０．３ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫおよび０．５％ＳＤＳを添加することにより消化を停止させ、３７℃で１時間インキュベートした。消化物を、１．５％アガロースにて解析し、臭化エチジウム染色によって可視化した。
【０３３６】
メガヌクレアーゼの片側部位優先性を評価するため、合理的に設計されたメガヌクレアーゼを、目的の片側部位の完全パリンドロームならびに片側部位内で考えられ得る２７個の単一塩基対置換の各々に対応する１組のＤＮＡ基質とともにインキュベートした。このようにして、各酵素の目的の片側部位からの逸脱がどれだけ許容されるかを調べることが可能であった。
【０３３７】
４．認識配列特異性
精製組換えＴＡＴ１およびＴＡＴ２メガヌクレアーゼは、野生型メガヌクレアーゼ認識配列とは相違するＤＮＡ配列を認識した（図２（Ｂ））。野生型Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼは、ＷＴ認識配列を切断するが、ＴＡＴ１の目的配列もＴＡＴ２の目的配列も切断しない。ＴＡＴ１およびＴＡＴ２も同様に、その目的の認識配列は切断するが、野生型配列は切断しない。次いで、メガヌクレアーゼを、片側部位優先性および全体的な特異性について評価した（図３）。野生型Ｉ−ＣｒｅＩは、その天然片側部位における単一塩基対置換に対して高度に許容性であることがわかった。対照的に、ＴＡＴ１およびＴＡＴ２は、高度に特異的であり、ＴＡＴ１の場合は−１、−２、−３、−６および−８位、ＴＡＴ２の場合は−１、−２および−６位の塩基置換に対して完全に非許容性であることがわかった。
【実施例２】
【０３３８】
ＤＮＡ結合親和性が改変されたメガヌクレアーゼの合理的設計
１．親和性が増大および活性が増大した合理的に設計されたメガヌクレアーゼ
メガヌクレアーゼＣＣＲ１およびＢＲＰ２を、それぞれ、片側部位５‘−ＡＡＣＣＣＴＣＴＣ−３‘（配列番号：１８）および５‘−ＣＴＣＣＧＧＧＴＣ−３‘（配列番号：１９）を切断するように合理的に設計した。これらの酵素は、表１に従い、実施例１のようにして作製した。
【表１１】
2011519558.tif 000013
【表１２】
2011519558.tif 000014
【０３３９】
どちらの酵素も、実施例１のようにして大腸菌内で発現させ、精製し、アッセイした。どちらの第１世代の酵素も、その目的の認識配列を、野生型Ｉ−ＣｒｅＩがその天然認識配列を切断するよりもかなり低い速度で切断することがわかった。この活性の低下軽減するため、ＣＣＲ１およびＢＲＰ２のＤＮＡ結合親和性を、両酵素においてＥ８０をＱに変異させることにより増大させた。これらのＣＣＲ１およびＢＲＰ２の第２世代型は、その目的の認識配列を、かなり増大した触媒速度で切断することがわかった。
【０３４０】
２．ＤＮＡ結合親和性が低下および活性が低下したが特異性が増大した合理的に設計されたメガヌクレアーゼ
野生型Ｉ−ＣｒｅＩは、その片側部位に対する置換に対して高度に許容性であることがわかった（図３（Ａ））。より特異的な酵素を作製する取り組みにおいて、ＤＮＡ結合親和性を低下させるため、通常、ＤＮＡ主鎖内のリン酸基との塩橋を構成する該酵素の１１６位のリシンをアスパラギン酸に変異させた。この合理的に設計された酵素は、野生型認識配列をかなり低下した活性を伴って切断するが、該組換え酵素は野生型よりも特異性が相当高いことがわかった。Ｋ１１６Ｄバリアントの片側部位優先性を実施例１のようにして評価すると、該酵素は、−１、−２および−３位において、その天然片側部位からの逸脱に対して完全に非許容性であることがわかり、片側部位の残りの６位置において、少なくとも部分的に塩基優先性を示した（図３（Ｂ））。
【実施例３】
【０３４１】
合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体
１．溶液中で形成した合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体による非パリンドロームＤＮＡ部位の切断
２つのメガヌクレアーゼＬＡＭ１とＬＡＭ２を、それぞれ、片側部位５‘−ＴＧＣＧＧＴＧＴＣ−３‘（配列番号：２０）および５‘−ＣＡＧＧＣＴＧＴＣ−３‘（配列番号：２１）を切断するように合理的に設計した。この２つの酵素のヘテロ二量体は、バクテリオファージλｐ０５遺伝子に見られるＤＮＡ配列５‘−ＴＧＣＧＧＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＣＡＧＣＣＴＧ−３‘（配列番号：２２）を認識すると予測した。
【表１３】
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【表１４】
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【０３４２】
ＬＡＭ１およびＬＡＭ２を、個々に、実施例１に記載のようにしてクローニングし、大腸菌内で発現させ、精製した。次いで、この２つの酵素を１：１で混合し、４２℃で２０分間インキュベートし、これらがサブユニット交換および再平衡を行なうようにした。得られた酵素溶液（ＬＡＭ１ホモ二量体、ＬＡＭ２ホモ二量体、およびＬＡＭ／ＬＡＭ２ヘテロ二量体の混合物であると予測される）を、バクテリオファージλゲノム内に見られるＬＡＭ１片側部位の完全パリンドローム、ＬＡＭ２片側部位の完全パリンドローム、およびバクテリオファージλゲノムに見られるハイブリッド部位の非パリンドロームに対応する３つの異なる認識配列とともにインキュベートした。精製ＬＡＭ１酵素単独は、ＬＡＭ１パリンドローム部位を切断するが、ＬＡＭ２パリンドローム部位もＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位も切断しない。同様に、精製ＬＡＭ２酵素単独は、ＬＡＭ２パリンドローム部位を切断するが、ＬＡＭ１パリンドローム部位もＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位も切断しない。しかしながら、ＬＡＭ１とＬＡＭ２の１：１混合物は３つのＤＮＡ部位をすべて切断する。ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位の切断は、２つの相違する再設計メガヌクレアーゼを溶液中で混合すると、非パリンドロームＤＮＡ部位を切断し得るヘテロ二量体酵素が形成され得ることを示す。
【０３４３】
２．共発現によって形成されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体による非パリンドロームＤＮＡ部位の切断
上記のＬＡＭ１およびＬＡＭ２酵素をコードする遺伝子を、実施例１に記載のようにしてオペロン内に配置し、大腸菌内で同時発現させた。この共発現酵素を実施例１のようにして精製し、酵素混合物を、上記の３つの潜在的認識配列とともにインキュベートした。共発現酵素混合物は、ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位を含む３つの部位すべてを切断することがわかった。これは、２つの相違する合理的に設計されたメガヌクレアーゼを共発現させると、非パリンドロームＤＮＡ部位を切断し得るヘテロ二量体酵素が形成され得ることを示す。
【０３４４】
３．タンパク質−タンパク質界面を修飾したメガヌクレアーゼヘテロ二量体による非パリンドロームＤＮＡ部位の優先的切断
非パリンドロームＤＮＡ部位の切断が必要とされる適用用途では、異なる（パリンドローム）ＤＮＡ部位を認識して切断するホモ二量体の形成は最小限であるが、酵素ヘテロ二量体の形成は促進されることが望ましい。この目的のため、７、５７および９６位のリシンをグルタミン酸に変更したＬＡＭ１酵素のバリアントを作製した。次いで、この酵素を、８および６１位のグルタミン酸をリシンに変更したＬＡＭ２のバリアントとともに、上記のようにして共発現させ、精製した。この場合、ＬＡＭ１ホモ二量体の形成は、一方の単量体ではＥ７、Ｅ５７およびＥ９６間、および他方の単量体ではＥ８およびＥ６１間の静電的反発のため、低減されると予測した。同様に、ＬＡＭ２ホモ二量体の形成は、一方の単量体ではＫ７、Ｋ５７およびＫ９６間、および他方の単量体ではＫ８およびＫ６１間の静電的反発のため、低減されると予測した。逆に、ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ヘテロ二量体は、ＬＡＭ１ではＥ７、Ｅ５７およびＥ９６間、およびＬＡＭ２ではＫ８およびＫ６１間の静電的求引のため、有利であると予測した。界面を修飾した２つのメガヌクレアーゼを上記のようにして共発現させ、アッセイすると、ＬＡＭ１／ＬＡＭ２ハイブリッド部位は、２つのパリンドローム部位よりも優先的に切断されることがわかった。これは、メガヌクレアーゼタンパク質−タンパク質界面における置換により、ヘテロ二量体の優先的形成が誘導され得ることを示す。
【実施例４】
【０３４５】
生理学的ＤＮＡ配列を切断するさらなる合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体
１．遺伝子療法に関連するＤＮＡ配列を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体
ヒトＦＧＦＲ３遺伝子内の軟骨無形成症を引き起こす変異である配列５‘−ＣＴＧＧＧＡＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧ−３‘（配列番号：２３）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＡＣＨ１／ＡＣＨ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表１５】
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【表１６】
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【０３４６】
ヒト成長ホルモン遺伝子のプロモーター内の配列５‘−ＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣ−３‘（配列番号：２４）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＨＧＨ１／ＨＧＨ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表１７】
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【表１８】
2011519558.tif 000020
【０３４７】
ヒトＣＦＴＲ遺伝子のΔＦ５０８対立遺伝子内の配列５‘−ＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＣＴ−３‘（配列番号：２５）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＣＦ１／ＣＦ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表１９】
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【表２０】
2011519558.tif 000022
【０３４８】
ヒトＣＣＲ５遺伝子（ＨＩＶ共受容体）内の配列５‘−ＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＴＧＡＧＡＴＧＣＣＴ−３‘（配列番号：２６）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＣＣＲ１／ＣＣＲ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表２１】
2011519558.tif 000023
【表２２】
2011519558.tif 000024
【０３４９】
ヒトＤＭキナーゼ遺伝子の３‘非翻訳領域内の配列５‘−ＧＡＣＣＴＣＧＴＣＣＴＣＣＧＡＣＴＣＧＣＴＧ−３‘（配列番号：２７）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＭＹＤｌ／Ｍ  ＹＤ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表２３】
2011519558.tif 000025
【表２４】
2011519558.tif 000026
【０３５０】
２．病原体ゲノム内のＤＮＡ配列を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体
単純疱疹ウイルス−１および単純疱疹ウイルス−２のＵＬ３６遺伝子内の配列５‘−ＣＴＣＧＡＴＧＴＣＧＧＡＣＧＡＣＡＣＧＧＣＡ−３‘（配列番号：２８）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＨＳＶ１／ＨＳＶ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表２５】
2011519558.tif 000027
【表２６】
2011519558.tif 000028
【０３５１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓゲノム内の配列５‘−ＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＡＴＧＧＡＣＡＧＴＴＴＡ−３‘（配列番号：２９）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＡＮＴ１／ＡＮＴ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表２７】
2011519558.tif 000029
【表２８】
2011519558.tif 000030
【０３５２】
痘瘡（スモールポックス）ウイルスｇｐ００９遺伝子内の配列５‘−ＡＡＡＡＣＴＧＴＣＡＡＡＴＧＡＣＡＴＣＧＣＡ−３‘（配列番号：３０）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＰＯＸ１／ＰＯＸ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて設計された。
【表２９】
2011519558.tif 000031
【表３０】
2011519558.tif 000032
【０３５３】
エプスタイン‐バーウイルスＢＡＬＦ２遺伝子内の擬パリンドローム配列５‘−ＣＧＧＧＧＴＣＴＣＧＴＧＣＧＡＧＧＣＣＴＣＣ−３‘（配列番号：３１）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼホモ二量体（ＥＢＢ１／ＥＢＢ１）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表３１】
2011519558.tif 000033
【表３２】
2011519558.tif 000034
【０３５４】
３．植物ゲノム内のＤＮＡ配列を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎｎａ  ＧＬ２遺伝子内の配列５‘−ＣＡＣＴＡＡＣＴＣＧＴＡＴＧＡＧＴＣＧＧＴＧ−３‘（配列番号：３２）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＧＬＡ１／ＧＬＡ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表３３】
2011519558.tif 000035
【表３４】
2011519558.tif 000036
【０３５５】
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎｎａ  ＢＰ１遺伝子内の配列５‘−ＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧ−３‘（配列番号：３３）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＢＲＰ１／ＢＲＰ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表３５】
2011519558.tif 000037
【表３６】
2011519558.tif 000038
【０３５６】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｃｈｅｌａｔａｓｅ遺伝子内の配列５‘−ＴＡＡＡＡＴＣＴＣＴＡＡＧＧＴＣＴＧＴＧＣＡ−３‘（配列番号：３４）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＭＧＣ１／ＭＧＣ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表３７】
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【表３８】
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【０３５７】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ＣＹＰ８２Ｅ４遺伝子内の配列５‘−ＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＧＡＧＣＡＴＴＡＡ−３‘（配列番号：３５）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＣＹＰ／ＨＧＨ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表３９】
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【表４０】
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【０３５８】
４．酵母ゲノム内のＤＮＡ配列を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３遺伝子内の配列５‘−ＴＴＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＡＣＧＣＡＴ−３‘（配列番号：３６）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＵＲＡ１／ＵＲＡ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表４１】
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【表４２】
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【０３５９】
５．認識配列特異性
上記に概略を示したこの実施例の合理的に設計されたメガヌクレアーゼを、実施例１のようにしてクローニングし、大腸菌内で発現させ、精製した。次いで、各精製メガヌクレアーゼを、その対応するヘテロ二量体化パートナー（例えば、ＡＣＨ１とＡＣＨ２、ＨＧＨ１とＨＧＨ２など）と１：１で混合し、各メガヌクレアーゼヘテロ二量体の目的の非パリンドロームＤＮＡ認識配列を含む線状ＤＮＡ基質とともにインキュベートした。図３に示されるように、合理的に設計された各メガヌクレアーゼヘテロ二量体は、その目的のＤＮＡ部位を切断する。
【実施例５】
【０３６０】
ヒトゲノム内の部位を認識する遺伝子工学的に作製されたＤＮＡ結合ドメインの作製
１．標的化対象転写エフェクターでの関節リウマチの標的化
関節リウマチ（ＲＡ）は、滑膜関節が標的化され、主に、関節破壊を特徴とする慢性の炎症性疾患である。疾患の罹患率は高く、成人において１％にもなると推定されており、罹患個体の生活の質は大きく低下する。該疾患の厳密な原因は、まだ確定されていないが、滑膜炎症および関節破壊の免疫学的根拠は、充分理解されている。滑膜腔内の活性化された単球およびマクロファージによって、高レベルのサイトカイン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）など）が産生される。このような炎症促進性サイトカインにより、最終的にマトリックスメタロプロテイナーゼおよび破骨細胞の生成に至る事象のカスケードが誘導され、これは、軟骨および骨に対して重度の損傷をもたらす。
【０３６１】
ＲＡの治療剤としてのＴＮＦ−αアンタゴニスト。ここ数十年、ＲＡに対する唯一の治療選択肢は、スルファサラジン、シクロスポリンＡ、およびメトトレキサートなどの疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）であった。しかしながら、数年前、炎症性関節炎の動物モデルでの試験において、新たな類型の治療用薬剤であるＴＮＦ−αアンタゴニストがもたらされた。現在、臨床使用に利用可能なＴＮＦ−αアンタゴニストには３種類あり、２つのは抗ＴＮＦ抗体（インフリキシマブとアダリムマブ）であり、３つ目は可溶性のＴＮＦ−受容体融合タンパク質（エタネルセプト）である。これらのアンタゴニストは、ＴＮＦ−αの下流作用を有効にブロックし、ＲＡの臨床徴候の低減において好成績であることが示されている。また、この類型の薬物は、現在、他の病状、例えば、乾癬、強直性脊椎炎、および血管炎を治療するために使用されている。ＴＮＦ−αアンタゴニストは、臨床的に好成績ではあるが、重篤な有害効果、例えば、結核リスクの増大、リンパ腫発生率の増大、自己免疫応答、および脱髄症候群を伴う。これらの有害効果は、おそらく、ＴＮＦ−αの全身性阻害によるものである。これらの副作用の重篤性を考慮すると、ＲＡおよび他のリウマチ性疾患を治療するための択一的および／または相補的なストラテジーを開発することは、相当な労力である。
【０３６２】
転写レベルでのＴＮＦ−αの標的化。現行のＴＮＦ−αのインヒビターは、この重要なサイトカインを、タンパク質レベルまたはＲＮＡレベルのいずれかで標的化するものである。ここでは、本発明者らは、ＴＮＦ−α遺伝子に特有のＤＮＡ配列を認識する転写抑制因子を遺伝子工学的に作製することにより、ＴＮＦ−αを転写レベルで標的化することを提案する。このアプローチは、ＴＮＦ−αを阻害する現行の手法よりもいくつかの大きな利点を有する。第１に、ＴＮＦ−α遺伝子内の特殊な部位を認識するＤＮＡ結合タンパク質を遺伝子工学的に作製することにより、オフターゲット効果の可能性が大きく低減される。小分子インヒビターは、典型的には、多くの巨大分子に存在し得る小モチーフに結合するが、本発明者らが設計したＤＮＡ結合タンパク質は、ゲノム内の特殊なＤＮＡ配列に標的化される。第２に、ＴＮＦ−αを完全にブロックするのではなく、このタンパク質の発現の低下を目指すことにより、本発明者らのアプローチでは、この重要なサイトカインのある程度の発現が許容される。ベースラインレベルのＴＮＦ−α発現を許容することにより、ＴＮＦ−αの全身性阻害によって引き起こされる有害効果のリスクが低減されるはずである（例えば、抗ＴＮＦ−α抗体により）。第３に、遺伝子工学的に作製された転写因子では、細胞内にはＴＮＦ−αプロモーターが２コピーしか存在せず、したがって、遺伝子工学的に作製された転写因子の標的は２つしかないため、最小限の有効用量は有意に少ないはずである。ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで作用するインヒビターでは、標的が数百も数千も存在するが、これらは、必ずしも高レベルのインヒビターを必要としない。
【０３６３】
２．ＴＮＦＳＣメガヌクレアーゼの作製および評価
ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）遺伝子内の転写開始部位から４３６ｂｐ下流の配列５‘−ＡＡＴＧＧＡＧＡＣＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧ−３‘（配列番号：４２）を切断する合理的に設計されたメガヌクレアーゼヘテロ二量体（ＴＮＦ１／ＴＮＦ２）が作製され得る。例えば、メガヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｒｅＩメガヌクレアーゼを基礎とし、上記のようにして、以下の接触残基および認識配列片側部位を用いて合理的に設計された。
【表４３】
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【表４４】
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【０３６４】
次いで、ＴＮＦ１およびＴＮＦ２メガヌクレアーゼ単量体を、Ｎ末端ＴＮＦ１単量体（Ｌ１５５で終結）を、Ｃ末端ＴＮＦ２（Ｋ７から開始）と３８アミノ酸リンカー（配列番号：３７）を用いて連接することにより、単鎖メガヌクレアーゼ内に配置した。また、ＳＶ４０核局在シグナル（配列番号：３８）をＮ末端に付加した。得られた合理的に設計された単鎖メガヌクレアーゼを「Ｅｎｄｏ−ＴＮＦｓｃ」（配列番号：４３）と称する。Ｅｎｄｏ−ＴＮＦｓｃを、実施例１に記載のようにして大腸菌内で発現させ、精製した。次いで、この精製メガヌクレアーゼを、その目的の認識配列（配列番号：４２）を有するプラスミド基質とともにインキュベートし、切断活性を実施例１のようにして測定した。この結果を図４に示す。
【０３６５】
３．Ｅｎｄｏ−ＴＮＦＫＯＤＮＡ結合ドメインの作製および評価
Ｅｎｄｏ−ＴＮＦｓｃのＤＮＡ切断活性を、５７位と２４４位のアミノ酸グルタミンをグルタミン酸に変異させることにより解消させた。ＴＮＦｓｃのＱ５７とＱ２４４は、野生型Ｉ−ＣｒｅＩのＱ４７に対応する。得られたタンパク質Ｅｎｄｏ−ＴＮＦＫＯ（配列番号：４４）を、上記のようにして大腸菌内で発現させ、精製し、切断活性について試験した。ＤＮＡ切断活性は検出されなかった（図４）。次いで、Ｅｎｄｏ−ＴＮＦＫＯを哺乳動物の発現ベクター（ｐＣＩ，Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングした。このプラスミドを用いてＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクトし、ヒトＴＮＦ−α遺伝子内の目的の認識配列に対するＥｎｄｏ−ＴＮＦＫＯタンパク質の結合を、クロマチン免疫沈降により、標準的なプロトコル（例えば、以下のプロトコル）を用いて確認した。
【０３６６】
クロマチン免疫沈澱プロトコル（ＣｈＩＰ）
１）Ｔ−７５フラスコ内のＨＥＫ  ２９３細胞を所望のプラスミドでＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて製造業者の使用説明書に従ってトランスフェクトする。
２）トランスフェクションの２４時間後、１．８ｍＬの架橋混合物（１１％ホルムアルデヒド、１００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ８．０）を添加する。室温で１０分間インキュベートする。
３）１．８ｍＬの１．２５Ｍのグリシンを添加することにより、架橋反応をクエンチする。
４）培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄する。
５）プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）を含む７５０μＬの溶解バッファー（１％ＳＤＳ，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）を添加する。４℃で５分間インキュベートする。
６）１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブ内に細胞を掻き集める。
７）ほぼ５００〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片が生成されるまで超音波処理する。
８）タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって定量する。
９）１００μｇのライセートを溶解バッファー中で総容量１ｍＬまで希釈する。
１０）希釈ライセートを５０μＬのプロテインＧ−セファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ）で、振盪しながら４℃で１時間、予備清澄化する。
１１）１０μＬのＣｒｅ抗血清または対照として１０μＬのＦＢＳ（ウシ胎仔血清）を使用し、タンパク質／ＤＮＡ複合体を免疫沈降させる。４℃一晩振盪させる。
１２）５０μＬのプロテインＧ−セファロースビーズを添加し、４°で１時間振盪させる。
１３）プロテアーゼインヒビターを含む洗浄バッファー１（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．１％ＳＤＳ，１５０ｍＭ  ＮａＣＬ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）中で、ビーズを３回洗浄する。
１４）プロテアーゼインヒビターを含む最終洗浄バッファー（１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．１％ＳＤＳ，５００ｍＭ  ＮａＣＬ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）中でビーズを１回洗浄する。
１５）ＬｉＣＬバッファー（０．２５Ｍ  ＬｉＣｌ，１％ＮＰ４ｏ，１％デオキシコレート，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）中で最終時点の洗浄を行なう。
１６）１５０μＬの溶出バッファー（１％ＳＤＳ，１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）、プロテイナーゼＫ（５００μｇ／ｍＬ）およびＲＮａｓｅ  Ａ（５００μｇ／ｍｌ）を添加することにより、免疫複合体を溶出させ、３７℃で３０分間インキュベートする。
１７）６５℃で最低４時間インキュベートすることにより逆架橋を行なう。
１８）ＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋスピンカラムにて回収する。５０μＬずつ溶出させる。
１９）所望の標的に対してＰＣＲを行なう。
【０３６７】
図５は、このＣｈＩＰ解析の結果を示す。これにより、Ｅｎｄｏ−ＴＮＦＫＯタンパク質が、実際にＴＮＦ−α遺伝子内の目的部位に結合することが確認される。したがって、Ｅｎｄｏ−ＴＮＦＫＯは、ヒトＴＮＦ−α遺伝子発現を調節することが意図される標的化対象転写エフェクターの作製のための好適なＤＮＡ結合ドメインである。特に、ＴＮＦ−α抑制因子は、Ｅｎｄｏ−ＴＮＦＫＯをＫＲＡＢ抑制因子ドメイン（例えば、配列番号：４１）に、グリシンおよびセリン残基を多く含む短鎖（３〜１５アミノ酸）リンカーを一緒に用いて連結することにより作製され得る。かかる転写因子は、ヒト細胞に送達され得、ＴＮＦ−α遺伝子の転写抑制能力は、ＲＴ−ＰＣＲによってＴＮＦ−α転写物レベルを評価することにより、またはＥＬＩＳＡによってＴＮＦ−αタンパク質レベルを評価することにより測定され得る。
【実施例６】
【０３６８】
合理的に設計されたメガヌクレアーゼ由来の標的化対象転写活性化因子
１．ＣＣＲ２ＫＯＤＮＡ結合ドメインの作製
ＣＣＲ２メガヌクレアーゼのＤＮＡ接触性アミノ酸を、実施例４に提示している。ＣＣＲ２メガヌクレアーゼホモ二量体は、パリンドロームＤＮＡ配列５‘−ＡＧＧＣＡＴＣＴＣＧＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＣＴ−３‘（配列番号：４５）を認識する。ＣＣＲ２ＫＯメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインを、ｉ）ＤＮＡ切断活性を解消するためにＱ４７をＥ（Ｑ４７Ｅ）に変異させ、ｉｉ）Ｎ末端核局在シグナル（配列番号：３８）を付加することにより作製した。
【０３６９】
２．遺伝子工学的に作製されたＣＣＲ２ＲＥＰ転写因子の作製
Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  Ｋｉｄ−１タンパク質由来のＫＲＡＢドメイン（配列番号：４１）をＣＣＲ２ＫＯのＣ末端に、９アミノ酸リンカー（ＧＳＳＧＳＳＧＳＳ）を用いて融合させた。得られた標的化対象転写活性化因子を、ＣＣＲ２ＲＥＰ（配列番号４６）と称する。
【０３７０】
３．転写抑制因子としてのＣＣＲ２ＲＥＰの評価
大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子を、哺乳動物の発現ベクターｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）内のＰｓｔＩとＮｏｔＩの間に挿入した。このプラスミドにおいて、ＬａｃＺ発現は、切断型ＣＭＶプロモーター（基準ＣＭＶプロモーターの３‘側４４２ｂｐに対応する、配列番号：４７）によって駆動される。次いで、ＣＣＲ２認識配列（配列番号：４５）を、このプロモーターの５‘末端に挿入した（図６Ａ参照）。
【０３７１】
まず、ＨＥＫ  ２９３細胞（１×１０５）を、ｐＣＩブランクベクターまたはＣＣＲ２ＲＥＰ遺伝子を有するｐＣＩのいずれかで、構成的ＣＭＶプロモーターの制御下、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を製造業者の使用説明書に従って（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後、トランスフェクション複合体を取り出し、新鮮培地に入れ替えた。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＬａｃＺレポータープラスミドで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて再度トランスフェクトした。トランスフェクション効率の指標として、さらに細胞を両時点で、ｐＣＩ  ｅＧＦＰでトランスフェクトした。レポータープラスミドでのトランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳ洗浄し、バッファー１（０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁させ、超音波処理によって溶解させ、遠心分離によって清澄化した。
【０３７２】
トランスフェクト細胞のライセートを標準的なｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）アッセイに供した（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖ．Ｂ．Ｃｈａｎｄａ編．第２巻．２００４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）。簡単には、各ライセートのアリコートを１．５ｍＬ容エッペンドルフチューブ内で、３００μＬのＺバッファー（６０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４，４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，１０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）中で希釈した。１００μＬのＯＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ）を添加し、チューブをボルテックスし、３７°の水浴内に入れた。１時間後、５００μＬの１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３で反応を停止させ、４２０ｎｍにおける吸光度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計を用いて測定し、標準的な方程式を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を求めた。
【０３７３】
この実験の結果を図６Ｂに示す。ＣＣＲ２ＲＥＰを発現する細胞では、ブランクベクターでトランスフェクトした細胞よりも約２．６倍低いＬＡＣ−Ｚ活性をもたらされることがわかった。この結果は、標的化対象転写エフェクターが、合理的に設計されたメガヌクレアーゼから作製され得ることを示す。
【０３７４】
均等物：当業者には、常套的な範囲内の実験手法を用いて、本明細書に具体的に記載した具体的な実施形態に対する数多くの均等物を認識し、または確認することができよう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲の範囲に包含されるものとする。
【０３７５】
本明細書において挙げた刊行物および特許出願はすべて、引用により、個々の各刊行物または特許出願が、引用によりその全体が本明細書に組み込まれて、あたかも具体的に個々に示されているかのように、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０３７６】
配列表
配列番号：１（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＰＯ５７２５）
配列番号：２（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列）
配列番号：３（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列）
配列番号：４（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列）
配列番号：５（野生型Ｉ−ＣｒｅＩ認識配列）
配列番号：６（野生型Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＬ３４３８７）
配列番号：７（野生型Ｉ−ＭｓｏＩ、認識配列）
配列番号：８（野生型Ｉ−ＭｓｏＩ、認識配列）
配列番号：９（野生型Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＣＡＡ０９８４３）
配列番号：１０（野生型Ｉ−ＳｃｅＩ、認識配列）
配列番号：１１（野生型Ｉ−ＳｃｅＩ、認識配列）
配列番号：１２（野生型Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ３２７６１）
配列番号：１３（野生型Ｉ−ＣｅｕＩ、認識配列）
配列番号：１４（野生型Ｉ−ＣｅｕＩ、認識配列）
配列番号：１５（ＨＩＶ−１  ＴＡＴ遺伝子、部分配列）
配列番号：１６（合理的に設計されたＴＡＴ１認識配列片側部位）
配列番号：１７（合理的に設計されたＴＡＴ２認識配列片側部位）
配列番号：１８（合理的に設計されたＣＣＲ１認識配列片側部位）
配列番号：１９（合理的に設計されたＢＲＰ２認識配列片側部位）
配列番号：２０（合理的に設計されたＬＡＭ１認識配列片側部位）
配列番号：２１（合理的に設計されたＬＡＭ２認識配列片側部位）
配列番号：２２（バクテリオファージλ  ｐ０５遺伝子内のＬＡＭ１／ＬＡＭ２認識配列）
配列番号：２３（ヒトＦＧＦＲ３遺伝子内の潜在的認識配列）
配列番号：２４（ヒト成長ホルモンプロモーター内の潜在的認識配列）
配列番号：２５（ヒトＣＦＴＲ遺伝子ΔＦ５０８対立遺伝子内の潜在的認識配列）
配列番号：２６（ヒトＣＣＲ５遺伝子内の潜在的認識配列）
配列番号：２７（ヒトＤＭキナーゼ遺伝子３‘ＵＴＲ内の潜在的認識配列）
配列番号：２８（単純疱疹ウイルス−１および単純疱疹ウイルス−２のＵＬ３６遺伝子内の潜在的認識配列）
配列番号：２９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓゲノム内の潜在的認識配列）
配列番号：３０（痘瘡（スモールポックス）ウイルスｇｐ００９遺伝子内の潜在的認識配列）
配列番号：３１（エプスタイン‐バーウイルスＢＡＬＦ２遺伝子内の潜在的認識配列）
配列番号：３２（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎｎａ  ＧＬ２遺伝子内の潜在的認識配列）
配列番号：３３（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎｎａ  ＢＰ１遺伝子内の潜在的認識配列）
配列番号：３４（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｃｈｅｌａｔａｓｅ遺伝子内の潜在的認識配列）
配列番号：３５（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ＣＹＰ８２Ｅ４遺伝子内の潜在的認識配列）
配列番号：３６（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＵＲＡ３遺伝子内の潜在的認識配列）
配列番号：３７（Ｉ−ＣｒｅＩ単鎖リンカーアミノ酸配列）
配列番号：３８（ＳＶ４０核局在シグナル）
配列番号：３９（ＧＡＬ４活性化ドメインアミノ酸配列）
配列番号：４０（ＶＰ１６活性化ドメインアミノ酸配列）
配列番号：４１（Ｋｉｄ−１  ＫＲＡＢ抑制因子ドメインアミノ酸配列）
配列番号：４２（ＴＮＦＳＣ認識配列）
配列番号：４３（Ｅｎｄｏ−ＴＮＦＳＣアミノ酸配列）
配列番号：４４（Ｅｎｄｏ−ＴＮＦＫＯアミノ酸配列）
配列番号：４５（ＣＣＲ２ホモ二量体認識配列）
配列番号：４６（ＣＣＲ２ＲＥＰアミノ酸配列）
配列番号：４７（切断型ＣＭＶプロモーター配列）
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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