(57)【要約】  本発明は、特に、ヒトへの使用に合わせて作製された抗体治療薬および予防薬の提供に関する。本発明は、トランスジェニックマウスもしくはラットまたはトランスジェニックマウスもしくはラットの細胞のようなライブラリー、脊椎動物および細胞を提供する。さらに、本発明は、抗体または抗体をコードするヌクレオチド配列を単離するために脊椎動物を使用する方法に関する。本発明は、抗体、重鎖、ポリペプチド、ヌクレオチド配列、医薬組成物および使用も提供する。
2014529998.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト遺伝子セグメントJH6*02と、1または複数のVH遺伝子セグメントと、1または複数のD遺伝子セグメントとを定常領域の上流に含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(場合によりマウスまたはラット)または脊椎動物細胞であって、重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントが、ヒトJH6*02とDセグメントおよびVHセグメントとの組換えにより生成される抗体重鎖をマウスが生成できるように定常領域に作動可能に連結している非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【請求項２】
脊椎動物が、標的抗原で免疫化されており、重鎖の可変ドメインが、VHとDとJH6*02との間の組換えの生成物であり、HCDR3の長さが、少なくとも20アミノ酸である、請求項1に記載の脊椎動物。
【請求項３】
ヒト遺伝子セグメントJH6*02と、1または複数のVH遺伝子セグメントと、1または複数のD遺伝子セグメントとを定常領域の上流に含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物細胞(場合によりマウス細胞またはラット細胞)であって、重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントが、ヒトJH6*02とDセグメントおよびVHセグメントとの組換えにより生成される抗体重鎖を(例えば後続の子孫細胞において)生成するために定常領域に作動可能に連結している非ヒト脊椎動物細胞。
【請求項４】
前記重鎖を発現する子孫抗体生成細胞に分化できるES細胞である、請求項3に記載の細胞。
【請求項５】
重鎖遺伝子座が、JH6*02遺伝子セグメントの5'に作動可能に接続したヒトJH6*02組換えシグナル配列(RSS)を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項６】
RSSが、配列番号238、または配列番号238の22マー配列と少なくとも70%同一である配列を挟む同一の9マーおよび7マーの配列を有する配列である、請求項5に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項７】
RSSおよびJH6*02が、配列番号237のとおりに提供される、請求項6に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項８】
JH6*02が、ゲノム中の唯一のJH6タイプ遺伝子セグメントである、請求項1から7のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項９】
JH6*02が、遺伝子座中で定常領域に最も近いJH遺伝子セグメントである、請求項1から8のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１０】
遺伝子座が、ヒトD遺伝子セグメントD3-9;D4-17;D3-10;D2-2;D5-24;D6-19;D3-22;D6-13;D5-12;D1-26;D1-20;D5-18;D3-16;D2-21;D1-14;D7-27;D1-1;D6-25;D2-14;およびD4-23の1、複数または全てを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１１】
遺伝子座が、ヒトD遺伝子セグメントD3-9、D3-10、D6-19、D4-17、D6-13、D3-22、D2-2、D2-25およびD3-3の1、複数または全てを含む、請求項10に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１２】
遺伝子座が、複数のヒトD遺伝子セグメントを含み、JH6*02が、最も3'側のヒトD遺伝子セグメントに関してヒト生殖系列配置にある、請求項1から11のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１３】
遺伝子座が、V3-21、V3-13、V3-7、V6-1、V1-8、V1-2、V7-4-1、V1-3、V1-18、V4-4、V3-9、V3-23、V3-11およびV3-20から選択されるIGHV遺伝子セグメントの1、複数または全てを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１４】
遺伝子座が、ヒトD3-9*01、D3-10*01、D6-19*01、D6-13*01、D1-26*01、IGHV1-8*01、IGHV4-61*01、IGHV6-1*01、IGHV4-4*02、IGHV1-3*01、IGHV3-66*03、IGHV3-7*01およびIGHV3-9*01の1、複数または全てを含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１５】
請求項3から14のいずれか一項に記載の細胞の子孫である抗体生成細胞(例えばB細胞)であって、ヒトJH6*02とDセグメントおよびVHセグメントとの組換えにより生成される再構成可変領域を含む重鎖遺伝子座を含む抗体生成細胞。
【請求項１６】
ヒトJH6*02とDセグメントおよびVHセグメントとの組換えにより生成される再構成可変領域を含む重鎖を含む標的抗原特異的抗体を発現するB細胞またはハイブリドーマである、請求項15に記載の細胞。
【請求項１７】
抗体重鎖が、標的抗原と特異的に結合する、請求項1から16のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１８】
抗体重鎖が、少なくとも20アミノ酸のHCDR3長さを有する、請求項1から17のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１９】
抗体重鎖が、JH6*02と、請求項13もしくは14に記載のヒトVH遺伝子セグメントおよび/または請求項10、11もしくは14に記載のD遺伝子セグメントとの組換えの生成物である、請求項1から18のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２０】
全ての内因性非ヒト脊椎動物重鎖可変領域遺伝子セグメントが、ゲノムにおいて不活性化されている、請求項1から19のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２１】
ゲノムが、前記重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、請求項1から20のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２２】
少なくとも20アミノ酸のHCDR3を含む、請求項1、2、5から14および17から21のいずれか一項に記載の脊椎動物から単離された重鎖(例えば抗体に含まれる)。
【請求項２３】
HCDR3が、ヒトJH6*02と、請求項13もしくは14に記載のヒトVH遺伝子セグメントおよび/または請求項10、11もしくは14に記載のD遺伝子セグメントとの組換えの生成物である、請求項22に記載の重鎖。
【請求項２４】
請求項22または23に記載の重鎖のVH可変ドメインと同一のVH可変ドメインを有し、ヒト定常領域またはヒト-マウスキメラ定常領域を含む重鎖(例えば抗体に含まれる)。
【請求項２５】
標的抗原に特異的なVH可変ドメインを有する、請求項22、23または24に記載の重鎖。
【請求項２６】
標的抗原に特異的な重鎖、VHドメインまたは抗体を生成するための方法であって、請求項1、2、5から14および17から21のいずれか一項に記載の非ヒト脊椎動物を抗原で免疫化する工程と、標的抗原に特異的な重鎖、VHドメインもしくは抗体または重鎖、VHドメインもしくは抗体を生成する細胞を単離する工程とを含み、重鎖、VHドメインまたは抗体が、ヒトJH6*02とVH遺伝子セグメントおよびD遺伝子セグメントとの組換えに由来するHCDR3を含む方法。
【請求項２７】
請求項26に記載の方法を行う工程であって、遺伝子座の定常領域が、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)定常領域である工程と、次いで、単離重鎖または抗体の非ヒト定常領域をヒト定常領域で置き換える工程とを含む、ヒト重鎖または抗体を生成するための方法。
【請求項２８】
請求項26または27に記載の方法により生成される重鎖、VHドメインまたは抗体。
【請求項２９】
請求項22、23または28に記載の重鎖のVHドメインと同一の重鎖VHドメインを発現するB細胞またはハイブリドーマ。
【請求項３０】
請求項22、23もしくは28に記載の重鎖のVHドメインをコードするかまたは請求項22、23、24、25もしくは28に記載の重鎖をコードする核酸。
【請求項３１】
請求項30に記載の核酸を含み、場合により宿主細胞(例えばCHO細胞またはHEK293細胞)中にあるベクター(例えばCHO細胞またはHEK293細胞ベクター)。
【請求項３２】
請求項22から25および28のいずれか一項に記載の抗体、重鎖またはVHドメイン(例えば抗体に含まれる)を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、重鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【請求項３３】
医学において使用するための、請求項22から25および28のいずれか一項に記載の抗体、重鎖またはVHドメイン(例えば抗体に含まれる)。
【請求項３４】
同じタイプの少なくとも3つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも3つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも3つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、ヒト遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【請求項３５】
同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項３６】
同じタイプの少なくとも2つの異なるヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒト遺伝子セグメントを含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、第3の遺伝子セグメントが、前記2つの異なる遺伝子セグメントの一方とシスにある非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【請求項３７】
ヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、複数のものが、同じタイプの少なくとも2つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含み、前記異なる遺伝子セグメントの第1の遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なる遺伝子セグメントの第2の遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2の遺伝子セグメントを含まない集団。
【請求項３８】
同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【請求項３９】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも3つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも3つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも3つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、ヒト遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである方法。
【請求項４０】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含む方法。
【請求項４１】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒト遺伝子セグメントを含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、第3の遺伝子セグメントが、前記2つの異なる遺伝子セグメントの一方とシスにある方法。
【請求項４２】
増進されたヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントレパートリーを提供する方法であって、ヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)を提供する工程を含み、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を提供する工程を含み、前記異なる遺伝子セグメントの第1の遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なる遺伝子セグメントの第2の遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2の遺伝子セグメントを含まない方法。
【請求項４３】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する方法。
【請求項４４】
前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される、請求項34から43のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項４５】
遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項34から44のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項４６】
遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、請求項34から45のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項４７】
個体が、遺伝的に関連していない、請求項46に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項４８】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にて提供される方法。
【請求項４９】
異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
個体が、遺伝的に関連していない、請求項48に記載の方法。
【請求項５１】
異なるセグメントの少なくとも1つが、ヒト生殖系列遺伝子セグメントの合成変異体である、請求項1から50のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項５２】
前記遺伝子セグメントのそれぞれが、10以上の異なるヒト集団において生じる、請求項34から51のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項５３】
前記遺伝子セグメントのそれぞれが、5%以上のヒト頻度を有する、請求項1から52のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項５４】
前記遺伝子セグメントのそれぞれが、10以上の異なるヒト集団において生じる、請求項53に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項５５】
前記遺伝子セグメントのそれぞれが、1000 Genomesデータベースにおいて、50より多い個体において生じる、請求項34から54のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項５６】
前記遺伝子セグメントのそれぞれが、(i)5%以上のヒト頻度を有し、(ii)10以上の異なるヒト集団において生じる、請求項1から55のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項５７】
同じタイプの第1および第2のヒトIg遺伝子座遺伝子セグメント(例えば第1および第2のヒトJH6遺伝子セグメント;または第1および第2のIgG2遺伝子セグメント;または第1および第2のヒトJλ7遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、第1の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)〜7(表12-1〜表12-3)および9(表14-1〜14-3)〜14(表24-1〜表24-6)(例えばIGHJ6-a)のいずれか1つから選択される遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列(例えばIGHJ6 ref;配列番号244)である、非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【請求項５８】
ゲノムが、前記タイプの第3のヒト遺伝子セグメントを含み、第3の遺伝子セグメントが、第1および第2の遺伝子セグメントとは異なる、請求項57に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項５９】
第1および第2の遺伝子セグメントが、同じ染色体上でシスにあり、場合により、第3の遺伝子セグメントも、前記染色体上でシスにある、請求項57または58に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項６０】
遺伝子セグメントが、内因性非ヒトIg遺伝子座への標的化挿入である、請求項59に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項６１】
第1および第2の遺伝子セグメントが、異なる染色体上でトランスにある、請求項57または58に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項６２】
第1の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)〜7(表12-1〜表12-3)および9(表14-1〜14-3)〜14(表24-1〜表24-6)のいずれか1つから選択される遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列である、請求項57から61のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項６３】
同じタイプの第1および第2のヒトIgH遺伝子座遺伝子セグメント(例えば第1および第2のヒトJH6遺伝子セグメント;または第1および第2のIgG2遺伝子セグメント;または第1および第2のヒトJλ7遺伝子セグメント)を含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、第1の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)〜7(表12-1〜表12-3)および9(表14-1〜14-3)〜14(表24-1〜表24-6)(例えばIGHJ6-a)のいずれか1つから選択される遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列(例えば配列番号244)であり、第1の遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第2の遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供される集団。
【請求項６４】
第1の脊椎動物のゲノムが、第2の遺伝子セグメントを含まない、請求項63に記載の集団。
【請求項６５】
集団が、同じタイプの第3のヒト遺伝子セグメントを含み、第3の遺伝子セグメントが、第1および第2の遺伝子セグメントとは異なり、場合により、第1および第3の遺伝子セグメントが、第1の脊椎動物のゲノムに存在する、請求項63または64に記載の集団。
【請求項６６】
遺伝子セグメントが、それぞれのゲノム中の内因性非ヒトIg遺伝子座への標的化挿入である、請求項63、64または65に記載の集団。
【請求項６７】
第1の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)〜7(表12-1〜表12-3)および9(表14-1〜14-3)〜14(表24-1〜表24-6)のいずれか1つから選択される遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列である、請求項63から66のいずれか一項に記載の集団。
【請求項６８】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの第1および第2のヒトIg遺伝子座遺伝子セグメント(例えば第1および第2のヒトJH6遺伝子セグメント;または第1および第2のIgG2遺伝子セグメント;または第1および第2のヒトJλ7遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、第1の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)〜7(表12-1〜表12-3)および9(表14-1〜14-3)〜14(表24-1〜表24-6)(例えばIGHJ6-a)のいずれか1つから選択される遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列(例えば配列番号244)である方法。
【請求項６９】
請求項63から66のいずれか一項に記載の集団を提供する工程を含む、増進されたヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントレパートリーを提供する方法。
【請求項７０】
同じタイプの少なくとも3つのヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2遺伝子セグメント)を含むゲノムを有し、ヒトD遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアント(例えばD2-2refおよびD2-2a)である、請求項34に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項７１】
同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性D遺伝子セグメント(例えばD2-2refおよびD2-2a)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する、請求項35に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項７２】
同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2refおよびD2-2a)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2ref、D2-2aまたはD2-2b)を含むゲノムを有し、第3のDが、前記2つの異なるD遺伝子セグメントの一方とシスにある、請求項36に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項７３】
ヒトD遺伝子セグメントのレパートリーを含み、複数のものが、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2遺伝子セグメント)を含み、前記異なるD遺伝子セグメントの第1のD遺伝子セグメント(例えばD2-2ref)が、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なるD遺伝子セグメントの第2のD遺伝子セグメント(例えばD2-2a)が、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2のD遺伝子セグメントを含まない、請求項37に記載の非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)。
【請求項７４】
同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性D遺伝子セグメント(例えばヒトD2-2遺伝子セグメント)を含むゲノムを有し、D遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項38に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項７５】
請求項39に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも3つのヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、ヒトD遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアント(例えばD2-2refおよびD2-2a)である方法。
【請求項７６】
請求項40に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性D遺伝子セグメント(例えばヒトD2-2遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含む方法。
【請求項７７】
請求項41に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2refおよびD2-2a)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2ref、D2-2aまたはD2-2b)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、第3のDが、前記2つの異なるD遺伝子セグメントの一方とシスにある方法。
【請求項７８】
請求項42に記載の増進されたヒト免疫グロブリンD遺伝子セグメントレパートリーを提供する方法であって、ヒトD遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)を提供する工程を含み、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2refおよびD2-2a)を提供する工程を含み、前記異なるD遺伝子セグメントの第1のD遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なるD遺伝子セグメントの第2のD遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2のD遺伝子セグメントを含まない方法。
【請求項７９】
請求項43に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性D遺伝子セグメント(例えばD2-2refおよびD2-2a)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、D遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する方法。
【請求項８０】
前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される、請求項70、71もしくは74に記載の脊椎動物もしくは細胞、または請求項75、77もしくは79に記載の方法。
【請求項８１】
D遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項70、71もしくは71に記載の脊椎動物もしくは細胞、または請求項75から78および80のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
D遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、請求項70から73のいずれか一項に記載の脊椎動物もしくは細胞、または請求項75から78および81のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
個体が、遺伝的に関連していない、請求項82に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項８４】
異なるDセグメントの少なくとも1つが、ヒト生殖系列D遺伝子セグメントの合成変異体である、請求項70から83のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項８５】
請求項48に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、少なくとも2つのヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2refおよびD2-2a)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、D遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIgH遺伝子座にて提供される方法。
【請求項８６】
ゲノムが、ヒトD遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いバリアントヒトD遺伝子セグメントとを含み、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なD遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない、請求項70から74および80から84のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項８７】
集団が、ヒトD遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いバリアントヒトD遺伝子セグメントとを含み、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なD遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない、請求項73に記載の集団。
【請求項８８】
ヒトD遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いバリアントヒトD遺伝子セグメントとを含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なD遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない非ヒト脊椎動物または非ヒト細胞。
【請求項８９】
ヒトJH遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いバリアントヒトD遺伝子セグメントとを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なD遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない集団。
【請求項９０】
D2-2refとD2-2a;または
D2-21refとD2-21a;または
D3-10refとD3-10a;または
D3-16refとD3-16a;または
D2-8refとD2-8a;または
D3-3refとD3-3a;または
D4-23refとD4-23a;または
D6-13refとD6-13a;または
D3-9refとD3-9a;または
D4-4refとD4-4a;または
D7-27refとD7-27a
から選択される第1および第2のD遺伝子セグメントを含み、
場合により、第1および/または第2のD遺伝子セグメントが、2以上のコピーで存在する、請求項88に記載の脊椎動物もしくは細胞または請求項89に記載の集団。
【請求項９１】
ヒト遺伝子セグメントD2-2refおよびD2-2aと、D3-3refおよびD3-3aと、場合によりD2-15も含む、請求項90に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項９２】
ヒト遺伝子セグメントを含むVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、D遺伝子レパートリーが、
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD2-2遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-2遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD2-21遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-21遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD3-10遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-10遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD3-16遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-16遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD2-8遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-8遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD3-3遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-3遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD4-23遺伝子セグメントにより提供される複数のD4-23遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD6-13遺伝子セグメントにより提供される複数のD6-13遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD3-9遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-9遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD4-4遺伝子セグメントにより提供される複数のD4-4遺伝子セグメント;および
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD7-27遺伝子セグメントにより提供される複数のD7-27遺伝子セグメント
の1または複数を含み、
場合により、D遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項71に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【請求項９３】
ヒト遺伝子セグメントを含むVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、D遺伝子レパートリーが、
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD2-2遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-2遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD2-21遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-21遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD3-10遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-10遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD3-16遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-16遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD2-8遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-8遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD3-3遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-3遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD4-23遺伝子セグメントにより提供される複数のD4-23遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD6-13遺伝子セグメントにより提供される複数のD6-13遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD3-9遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-9遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD4-4遺伝子セグメントにより提供される複数のD4-4遺伝子セグメント;および
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD7-27遺伝子セグメントにより提供される複数のD7-27遺伝子セグメント
の1または複数を含み、
場合により、D遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項71に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【請求項９４】
ヒト遺伝子セグメントを含むVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、D遺伝子レパートリーが、
少なくとも3つの異なるD2-2遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-2遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD2-21遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-21遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD3-10遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-10遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD3-16遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-16遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD2-8遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-8遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD3-3遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-3遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD4-23遺伝子セグメントにより提供される複数のD4-23遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD6-13遺伝子セグメントにより提供される複数のD6-13遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD3-9遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-9遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD4-4遺伝子セグメントにより提供される複数のD4-4遺伝子セグメント;および
少なくとも3つの異なるD7-27遺伝子セグメントにより提供される複数のD7-27遺伝子セグメント
の1または複数を含み、
場合により、D遺伝子セグメントが、2または3の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、
場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される、請求項70に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞またはB細胞)。
【請求項９５】
異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、請求項92、93または94に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項９６】
個体が、遺伝的に関連していない、請求項92から95のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項９７】
異なるDセグメントの少なくとも1つが、ヒト生殖系列D遺伝子セグメントの合成変異体である、請求項92から96のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項９８】
ヒトVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、D遺伝子レパートリーが、
少なくとも2つの異なるD2-2遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD2-2遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD2-21遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD2-21遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD3-10遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD3-10遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD3-16遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD3-16遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD2-8遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD2-8遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD3-3遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD3-3遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD4-23遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD4-23遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD6-13遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD6-13遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD3-9遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD3-9遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD4-4遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD4-4遺伝子セグメント;および
少なくとも2つの異なるD7-27遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD7-27遺伝子セグメント;
の1または複数を含み、
D遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項74に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞またはB細胞)。
【請求項９９】
ヒト個体が、異なるヒト集団からである、請求項98に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１００】
D遺伝子セグメントの1または複数が、ヒト生殖系列D遺伝子セグメントのバリアントであり、バリアント遺伝子セグメントが、ヒト生殖系列D遺伝子セグメントによりコードされる対応するアミノ酸配列から1、2または3アミノ酸異なるアミノ酸配列をコードするが、ただし、前記対応するアミノ酸配列が停止コドンを含まない場合に、バリアントによりコードされる前記アミノ酸配列が、停止コドンを含まない、請求項70から99のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１０１】
ヒト生殖系列D遺伝子セグメントによりコードされる対応する前記アミノ酸配列が、親水性または疎水性配列(J Mol Biol. 1997年7月25日;270(4):587〜97頁; Corbett SJら;表2に従う)である、請求項100に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１０２】
前記バリアントと前記生殖系列ヒトD遺伝子セグメントとを含み、場合により、バリアントおよび生殖系列ヒトD遺伝子セグメントが、同じ染色体上でシスにある、請求項100または101に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１０３】
生殖系列ヒトD遺伝子セグメントが、D2、D3、D5またはD6ファミリー遺伝子セグメント、場合によりD2-2、D2-15、D3-3、D3-9、D3-10、D3-22、D5-5、D5-18、D6-6、D6-13、D6-19遺伝子セグメントである、請求項100から102のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１０４】
複数のD2-2遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の
106,382,687位および
106,382,711位
に相当する1または複数のヌクレオチド位置にて互いに異なるD2-2遺伝子セグメントを含む、請求項70から103のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１０５】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,382,687位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D2-2refの配列からさらなる変異がないヒトD2-2遺伝子セグメントを含む、請求項104に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１０６】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,382,687位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D2-2aの配列からさらなる変異がないヒトD2-2遺伝子セグメントを含む、請求項104または105に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１０７】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,382,711位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、D2-2bの配列からさらなる変異がないヒトD2-2遺伝子セグメントを含む、請求項104から106のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１０８】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,382,711位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D2-2refの配列からさらなる変異がないヒトD2-2遺伝子セグメントを含む、請求項104から107のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１０９】
複数のD7-27遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の106,331,767位に相当するヌクレオチド位置にて互いに異なるD7-27遺伝子セグメントを含む、請求項70から108のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１１０】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,331,767位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D7-27refの配列からさらなる変異がないヒトD7-27遺伝子セグメントを含む、請求項109に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１１１】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,331,767位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、D7-27aの配列からさらなる変異がないヒトD7-27遺伝子セグメントを含む、請求項109または110に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１１２】
複数のD4-23遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の106,350,740位に相当するヌクレオチド位置にて互いに異なるD4-23遺伝子セグメントを含む、請求項70から111のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１１３】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,350,740位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、D4-23refの配列からさらなる変異がないヒトD4-23遺伝子セグメントを含む、請求項112に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１１４】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,350,740位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、D4-23aの配列からさらなる変異がないヒトD4-23遺伝子セグメントを含む、請求項112または113に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１１５】
複数のD2-21遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の106,354,418位に相当するヌクレオチド位置にて互いに異なるD2-21遺伝子セグメントを含む、請求項70から113のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１１６】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,354,418位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、D2-21refの配列からさらなる変異がないヒトD2-21遺伝子セグメントを含む、請求項115に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１１７】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,354,418位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、D2-21aの配列からさらなる変異がないヒトD2-21遺伝子セグメントを含む、請求項115または116に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１１８】
複数のD3-16遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の106,354,418位に相当するヌクレオチド位置にて互いに異なるD3-16遺伝子セグメントを含む、請求項70から117のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１１９】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,361,515位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D3-16refの配列からさらなる変異がないヒトD3-16遺伝子セグメントを含む、請求項118に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１２０】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,361,515位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D3-16aの配列からさらなる変異がないヒトD3-16遺伝子セグメントを含む、請求項118または119に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１２１】
複数のD6-13遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の106,367,013位に相当するヌクレオチド位置にて互いに異なるD6-13遺伝子セグメントを含む、請求項70から120のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１２２】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,367,013位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D6-13refの配列からさらなる変異がないヒトD6-13遺伝子セグメントを含む、請求項121に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１２３】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,367,013位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D6-13aの配列からさらなる変異がないヒトD6-13遺伝子セグメントを含む、請求項121または122に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１２４】
複数のD3-10遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の
106,370,370位および
106,370,371位
に相当する1または複数のヌクレオチド位置にて互いに異なるD3-10遺伝子セグメントを含む、請求項70から123のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１２５】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,370位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D3-10refの配列からさらなる変異がないヒトD3-10遺伝子セグメントを含む、請求項124に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１２６】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,370位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D3-10aの配列からさらなる変異がないヒトD3-10遺伝子セグメントを含む、請求項124または125に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１２７】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,371位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、D3-10refの配列からさらなる変異がないヒトD3-10遺伝子セグメントを含む、請求項124、125または126に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１２８】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,371位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、D3-10bの配列からさらなる変異がないヒトD3-10遺伝子セグメントを含む、請求項124から127のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１２９】
複数のD3-9遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,567位に相当するヌクレオチド位置にて互いに異なるD3-9遺伝子セグメントを含む、請求項70から128のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１３０】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,567位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、D3-9refの配列からさらなる変異がないヒトD3-9遺伝子セグメントを含む、請求項129に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１３１】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,567位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D3-9aの配列からさらなる変異がないヒトD3-9遺伝子セグメントを含む、請求項129または130に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１３２】
複数のD2-8遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の
106,373,085位
106,373,086位および
106,373,089位
に相当する1または複数のヌクレオチド位置にて互いに異なるD2-8遺伝子セグメントを含む、請求項70から131のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１３３】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,373,085位に相当する位置にてシトシンを含むヒトD2-8遺伝子セグメントを含む、請求項132に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１３４】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,373,085位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D2-8bの配列からさらなる変異がないヒトD2-8遺伝子セグメントを含む、請求項132または133に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１３５】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,373,086位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D2-8refの配列からさらなる変異がないヒトD2-8遺伝子セグメントを含む、請求項132、133または134に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１３６】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,373,086位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D2-8refの配列からさらなる変異がないヒトD2-8遺伝子セグメントを含む、請求項132から135のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１３７】
複数のD4-4遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の
106,379,086位および
106,379,089位
に相当する1または複数のヌクレオチド位置にて互いに異なるD4-4遺伝子セグメントを含む、請求項70から136のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１３８】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,379,086位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D4-4refの配列からさらなる変異がないヒトD4-4遺伝子セグメントを含む、請求項137に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１３９】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,379,086位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D4-4aの配列からさらなる変異がないヒトD4-4遺伝子セグメントを含む、請求項137または138に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１４０】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,379,089位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D4-4refの配列からさらなる変異がないか、またはヒト第14染色体上の106,379,086位に相当する位置にてシトシンを含むヒトD4-4遺伝子セグメントを含む、請求項137、138または139に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１４１】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,373,089位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D4-4aの配列からさらなる変異がないヒトD4-4遺伝子セグメントを含む、請求項137から140のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１４２】
複数のD3-3遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の
106,380,241位および
106,380,246位
に相当する1または複数のヌクレオチド位置にて互いに異なるD3-3遺伝子セグメントを含む、請求項70から141のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１４３】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,380,241位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D3-3refの配列からさらなる変異がないヒトD3-3遺伝子セグメントを含む、請求項142に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１４４】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,380,241位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D3-3aの配列からさらなる変異がないヒトD3-3遺伝子セグメントを含む、請求項142または143に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１４５】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,380,246位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、D3-3refの配列からさらなる変異がないヒトD3-3遺伝子セグメントを含む、請求項142、143または144に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１４６】
複数のものが、ヒト第14染色体上の106,380,246位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D3-3aの配列からさらなる変異がないヒトD3-3遺伝子セグメントを含む、請求項142から145のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１４７】
同じタイプの少なくとも3つのヒトJH遺伝子セグメント(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)を含むゲノムを有し、ヒトJH遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである、請求項34に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項１４８】
同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性JH遺伝子セグメント(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する、請求項35に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項１４９】
同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトJH遺伝子セグメント(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒトJH遺伝子セグメントを含むゲノムを有し、第3のJHが、前記2つの異なるJH遺伝子セグメントの一方とシスにある、請求項36に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項１５０】
複数のものが、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトJH遺伝子セグメント(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)を含み、前記異なるJH遺伝子セグメントの第1のものが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なるJH遺伝子セグメントの第2のものが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2のJH遺伝子セグメントを含まない、請求項37に記載のヒトJH遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)。
【請求項１５１】
同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性JH遺伝子セグメント(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)を含むゲノムを有し、JH遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項38に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項１５２】
請求項39に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも3つのヒトJH遺伝子セグメント(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、ヒトJH遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである方法。
【請求項１５３】
請求項40に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性JH遺伝子セグメント(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含む方法。
【請求項１５４】
請求項41に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトJH遺伝子セグメント(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒトJH遺伝子セグメントを含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、第3のJHが、前記2つの異なるJH遺伝子セグメントの一方とシスにある方法。
【請求項１５５】
請求項42に記載の増進されたヒト免疫グロブリンJH遺伝子セグメントレパートリーを提供する方法であって、ヒトJH遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)を提供する工程を含み、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトJH遺伝子セグメント(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)を提供する工程を含み、前記異なるJH遺伝子セグメントの第1のJH遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なるJH遺伝子セグメントの第2のJH遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2のJH遺伝子セグメントを含まない方法。
【請求項１５６】
請求項43に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性JH遺伝子セグメント(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、JH遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する方法。
【請求項１５７】
前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される、請求項147、149もしくは151に記載の脊椎動物もしくは細胞、または請求項152、154、155もしくは156に記載の方法。
【請求項１５８】
JH遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項147、148もしくは149に記載の脊椎動物もしくは細胞、または請求項152、153、154もしくは155に記載の方法。
【請求項１５９】
JH遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、請求項147、148もしくは149に記載の脊椎動物もしくは細胞、または請求項152、153、154もしくは155に記載の方法。
【請求項１６０】
個体が、遺伝的に関連していない、請求項159に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項１６１】
異なるJHセグメントの少なくとも1つが、ヒト生殖系列JH遺伝子セグメントの合成変異体である、請求項147から160のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項１６２】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つのヒトJH遺伝子セグメント(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、JH遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIgH遺伝子座にて提供される方法。
【請求項１６３】
ゲノムが、ヒトJH遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いヒトJH遺伝子セグメントとを含み、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なJH遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない、請求項147から149および151のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１６４】
集団が、ヒトJH遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いヒトJH遺伝子セグメントとを含み、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なJH遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない、請求項150に記載の集団。
【請求項１６５】
ヒトJH遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いヒトJH遺伝子セグメントとを含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なJH遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない非ヒト脊椎動物または非ヒト細胞。
【請求項１６６】
ヒトJH遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いヒトJH遺伝子セグメントとを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なJH遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない集団。
【請求項１６７】
前記JH遺伝子セグメントの少なくとも1つが、配列番号1、2、3または4である、請求項165に記載の脊椎動物または請求項166に記載の集団。
【請求項１６８】
前記JH遺伝子セグメントの少なくとも1つが、配列番号1であり、前記補足的なJH遺伝子セグメントの1、2またはそれより多くが、請求項178から196のいずれか一項に記載のバリアントである、請求項167に記載の脊椎動物または集団。
【請求項１６９】
前記JH遺伝子セグメントの少なくとも1つが、配列番号2であり、前記補足的なJH遺伝子セグメントの1、2またはそれより多くが、請求項198から209のいずれか一項に記載のバリアントである、請求項167または168に記載の脊椎動物または集団。
【請求項１７０】
前記JH遺伝子セグメントの少なくとも1つが、配列番号2であり、前記補足的なJH遺伝子セグメントの1、2またはそれより多くが、請求項212から217のいずれか一項に記載のバリアントである、請求項167、168または169に記載の脊椎動物または集団。
【請求項１７１】
ヒト遺伝子セグメントを含むVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、JH遺伝子レパートリーが、
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるJH1遺伝子セグメントにより提供される複数のJH1遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるJH2遺伝子セグメントにより提供される複数のJH2遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるJH3遺伝子セグメントにより提供される複数のJH3遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるJH4遺伝子セグメントにより提供される複数のJH4遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるJH5遺伝子セグメントにより提供される複数のJH5遺伝子セグメント;または
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるJH6遺伝子セグメントにより提供される複数のJH6遺伝子セグメント
を含み、
場合により、JH遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項148に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【請求項１７２】
ヒト遺伝子セグメントを含むVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、JH遺伝子レパートリーが、
少なくとも3つの異なるJH1遺伝子セグメントにより提供される複数のJH1遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるJH2遺伝子セグメントにより提供される複数のJH2遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるJH3遺伝子セグメントにより提供される複数のJH3遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるJH4遺伝子セグメントにより提供される複数のJH4遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるJH5遺伝子セグメントにより提供される複数のJH5遺伝子セグメント;または
少なくとも3つの異なるJH6遺伝子セグメントにより提供される複数のJH6遺伝子セグメント
を含み、
場合により、JH遺伝子セグメントが、2または3つの異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、
場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される、請求項147に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞またはB細胞)。
【請求項１７３】
異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、請求項171または172に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１７４】
個体が、遺伝的に関連していない、請求項171から173のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１７５】
異なるJHセグメントの少なくとも1つが、ヒト生殖系列JH遺伝子セグメントの合成変異体である、請求項171から174のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１７６】
ヒトVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、JH遺伝子レパートリーが、
少なくとも2つの異なるヒトJH1遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のJH1遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJH2遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のJH2遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJH3遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のJH3遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJH4遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のJH4遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJH5遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のJH5遺伝子セグメント;または
少なくとも2つの異なるヒトJH6遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のJH6遺伝子セグメント
を含み、
JH遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項151に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞またはB細胞)。
【請求項１７７】
ヒト個体が、異なるヒト集団からである、請求項176に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項１７８】
複数のJH5遺伝子セグメントを含み、複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の
106,330,024位
106,330,027位
106,330,032位
106,330,041位
106,330,044位
106,330,045位
106,330,062位
106,330,063位
106,330,065位
106,330,066位
106,330,067位
106,330,068位および
106,330,071位
に相当する1または複数の位置にてヌクレオチド変異を含む、請求項147から151、157から161および163から177のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１７９】
複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,067位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異がない、請求項178に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１８０】
バリアントが、(i)ヒト第14染色体上の106,330,071位(場合により、さらなる変異はグアニンである);(ii)ヒト第14染色体上の106,330,066位(場合により、さらなる変異はグアニンである);および/または(iii)ヒト第14染色体上の106,330,068位(場合により、さらなる変異はチミンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む、請求項179に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１８１】
複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,071位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異がない、請求項178、179または180に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１８２】
バリアントが、(i)ヒト第14染色体上の106,330,063位(場合により、さらなる変異はアデニンである);および/または(ii)ヒト第14染色体上の106,330,067位(場合により、さらなる変異はグアニンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む、請求項181に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１８３】
複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,045位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異がない、請求項178から182に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１８４】
複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,044位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異がない、請求項178から183に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１８５】
バリアントが、(i)ヒト第14染色体上の106,330,066位(場合により、さらなる変異はグアニンである);および/または(ii)ヒト第14染色体上の106,330,068位(場合により、さらなる変異はチミンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む、請求項184に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１８６】
複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,066位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異がない、請求項178から185に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１８７】
バリアントが、(i)ヒト第14染色体上の106,330,067位(場合により、さらなる変異はグアニンである);および/または(ii)ヒト第14染色体上の106,330,068位(場合により、さらなる変異はチミンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む、請求項186に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１８８】
複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,068位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異がない、請求項178から185に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１８９】
バリアントが、(i)ヒト第14染色体上の106,330,067位(場合により、さらなる変異はグアニンである);および/または(ii)ヒト第14染色体上の106,330,066位(場合により、さらなる変異はグアニンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む、請求項188に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１９０】
複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,027位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異がない、請求項178から189に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１９１】
複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,024位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異がない、請求項178から190に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１９２】
複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,032位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異がない、請求項178から191に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１９３】
複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,041位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異がない、請求項178から192に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１９４】
複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,063位に相当する位置にてアデニンまたはチミンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異がない、請求項178から193に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１９５】
バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,071位(場合により、さらなる変異はグアニンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む、請求項194に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１９６】
複数のものが、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,330,062位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異がない、請求項178から195に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１９７】
ゲノムが、配列番号1を、場合により、バリアントの1、2またはそれより多くと同じIg遺伝子座にてシスに含む、請求項178から196に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１９８】
複数のJH6遺伝子セグメントを含み、複数のものが、配列番号2のヒトJH6遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の
106,329,411位
106,329,413位
106,329,414位
106,329,417位
106,329,419位
106,329,426位
106,329,434位
106,329,435位および
106,329,468位
に相当する1または複数の位置にてヌクレオチド変異を含む、請求項147から151、157から161および96から130のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項１９９】
複数のJH6遺伝子セグメントを含み、複数のものが、配列番号2のヒトJH6遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,329,435位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、配列番号2の配列からさらなる変異がない、請求項198に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２００】
バリアントが、(i)ヒト第14染色体上の106,329,468位(場合により、さらなる変異はグアニンである);(ii)ヒト第14染色体上の106,329,419位(場合により、さらなる変異はアデニンである);(iii)ヒト第14染色体上の106,329,434位(場合により、さらなる変異はシトシンである)および/またはヒト第14染色体上の106,329,414位(場合により、さらなる変異はグアニンである);(iv)ヒト第14染色体上の106,329,426位(場合により、さらなる変異はアデニンである);(v)ヒト第14染色体上の106,329,413位(場合により、さらなる変異はアデニンである);(vi)ヒト第14染色体上の106,329,417位(場合により、さらなる変異はチミンである);(vii)ヒト第14染色体上の106,329,411位(場合により、さらなる変異はチミンである);(viii)ヒト第14染色体上の106,329,451位(場合により、さらなる変異はアデニンである);(ix)ヒト第14染色体上の106,329,452位(場合により、さらなる変異はシトシンである);および/または(x)ヒト第14染色体上の106,329,453位(場合により、さらなる変異はシトシンである);相当する位置にてさらなる変異を含む、請求項199に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２０１】
バリアントが、ヒト第14染色体上の106,329,451位に相当する位置にてアデニンであるさらなる変異;ヒト第14染色体上の106,329,452位に相当する位置にてシトシンであるさらなる変異;およびヒト第14染色体上の106,329,453位に相当する位置にてシトシンであるさらなる変異を含む、請求項200に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２０２】
複数のJH6遺伝子セグメントを含み、複数のものが、配列番号2のヒトJH6遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,329,468位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、配列番号2の配列からさらなる変異がない、請求項147から151、157から161および163から201のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２０３】
バリアントが、ヒト第14染色体上の106,329,435位に相当する位置にてさらなる変異を含む(場合により、さらなる変異はグアニンである)、請求項202に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２０４】
複数のJH6遺伝子セグメントを含み、複数のものが、配列番号2のヒトJH6遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,329,417位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、配列番号2の配列からさらなる変異がない、請求項147から151、157から161および163から203のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２０５】
バリアントが、ヒト第14染色体上の106,329,435位に相当する位置にてさらなる変異を含む(場合により、さらなる変異はグアニンである)、請求項204に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２０６】
複数のJH6遺伝子セグメントを含み、複数のものが、配列番号2のヒトJH6遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,329,434位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、配列番号2の配列からさらなる変異がない、請求項147から151、157から161および163から205のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２０７】
バリアントが、(i)ヒト第14染色体上の106,329,414位(場合により、さらなる変異はグアニンである);(ii)ヒト第14染色体上の106,329,435位(場合により、さらなる変異はグアニンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む、請求項206に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２０８】
複数のJH6遺伝子セグメントを含み、複数のものが、配列番号2のヒトJH6遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,329,411位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、配列番号2の配列からさらなる変異がない、請求項147から151、157から161および163から207のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２０９】
バリアントが、ヒト第14染色体上の106,329,435位に相当する位置にてさらなる変異を含む(場合により、さらなる変異はグアニンである)、請求項208に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２１０】
複数のJH6遺伝子セグメントを含み、複数のものが、請求項107から118のいずれか一項に記載のバリアントのアンチセンス配列であるヒトJH6遺伝子バリアントを含む、請求項147から151、157から161および163から209のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２１１】
ゲノムが、配列番号2を、場合により、JH6バリアントの1、2またはそれより多くと同じIg遺伝子座にてシスに含む、請求項198から210のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２１２】
複数のJH2遺伝子セグメントを含み、複数のものが、配列番号3のヒトJH2遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の
106,331,455位、
106,331,453位および
106,331,409位
に相当する1または複数の位置にてヌクレオチド変異を含む、請求項147から151、157から161および163から211のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２１３】
前記複数のJH2遺伝子セグメントを含み、複数のものが、配列番号3のヒトJH2遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,331,455位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、配列番号3の配列からさらなる変異がない、請求項212に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２１４】
バリアントが、(i)ヒト第14染色体上の106,331,453位(場合により、さらなる変異はアデニンである);および/または(ii)ヒト第14染色体上の106,331,409位(場合により、さらなる変異はアデニンである);(iii)ヒト第14染色体上の106,329,434位(場合により、さらなる変異はアデニンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む、請求項213に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２１５】
複数のJH2遺伝子セグメントを含み、複数のものが、配列番号3のヒトJH2遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,331,453位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、配列番号3の配列からさらなる変異がない、請求項147から151、157から161および163から214のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２１６】
バリアントが、ヒト第14染色体上の106,331,409位に相当する位置にてさらなる変異を含む(場合により、さらなる変異はアデニンである)、請求項215に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２１７】
複数のJH2遺伝子セグメントを含み、複数のものが、配列番号3のヒトJH2遺伝子バリアントを含み、バリアントが、ヒト第14染色体上の106,331,409位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、配列番号3の配列からさらなる変異がない、請求項147から151、157から161および163から216のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２１８】
複数のJH2遺伝子セグメントを含み、複数のものが、請求項188から193のいずれか一項に記載のバリアントのアンチセンス配列であるヒトJH2遺伝子バリアントを含む、請求項147から151、157から161および163から217のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２１９】
ゲノムが、配列番号3を、場合により、JH2バリアントの1、2またはそれより多くと同じIg遺伝子座にてシスに含む、請求項212から218のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２２０】
ゲノムが、配列番号1〜3および請求項178から219のいずれか一項に記載のバリアントから選択される2つ以上の異なるJH遺伝子セグメントを含み、場合により、前記JH遺伝子セグメントが、同じ免疫グロブリンIg遺伝子座にてシスにある、請求項147から151、157から161および163から219のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【請求項２２１】
同じタイプの少なくとも3つのヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を含むゲノムを有し、ヒトJL遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである、請求項34に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項２２２】
同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性JL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する、請求項35に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項２２３】
同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒトJL遺伝子セグメントを含むゲノムを有し、第3のJLが、前記2つの異なるJL遺伝子セグメントの一方とシスにある、請求項36に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項２２４】
複数のものが、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を含み、前記異なるJL遺伝子セグメントの第1のJL遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なるJL遺伝子セグメントの第2のJL遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2のJL遺伝子セグメントを含まない、請求項37に記載のヒトJL遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)。
【請求項２２５】
同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性JL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を含むゲノムを有し、JL遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項38に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【請求項２２６】
請求項39に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも3つのヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、ヒトJL遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである方法。
【請求項２２７】
請求項40に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性JL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含む方法。
【請求項２２８】
請求項41に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒトJL遺伝子セグメントを含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、第3のJLが、前記2つの異なるJL遺伝子セグメントの一方とシスにある方法。
【請求項２２９】
請求項42に記載の増進されたヒト免疫グロブリンJL遺伝子セグメントレパートリーを提供する方法であって、ヒトJL遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)を提供する工程を含み、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を提供する工程を含み、前記異なるJL遺伝子セグメントの第1のJL遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なるJL遺伝子セグメントの第2のJL遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2のJL遺伝子セグメントを含まない方法。
【請求項２３０】
請求項43に記載の非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性JL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、JL遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する方法。
【請求項２３１】
前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される、請求項221、223もしくは225に記載の脊椎動物もしくは細胞、または請求項226、228、229もしくは230に記載の方法。
【請求項２３２】
JL遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項221、222もしくは223に記載の脊椎動物もしくは細胞、または請求項226、227、228もしくは229に記載の方法。
【請求項２３３】
JL遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、請求項221、222もしくは223に記載の脊椎動物もしくは細胞、または請求項226、227、228もしくは229に記載の方法。
【請求項２３４】
個体が、遺伝的に関連していない、請求項233に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項２３５】
異なるJLセグメントの少なくとも1つが、ヒト生殖系列JL遺伝子セグメントの合成変異体である、請求項221から234のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【請求項２３６】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つのヒトJL遺伝子セグメント(例えば、Jκ1)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、JL遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIgL遺伝子座にて提供される方法。
【請求項２３７】
ゲノムが、ヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足されるそれぞれ1、2またはそれより多いヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントとを含み、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的な遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない、請求項221から223および225のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２３８】
集団が、ヒトJL遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足されるそれぞれ1、2またはそれより多いヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントとを含み、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的な遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない、請求項224に記載の集団。
【請求項２３９】
ヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足されるそれぞれ1、2またはそれより多いヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントとを含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的な遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない非ヒト脊椎動物または非ヒト細胞。
【請求項２４０】
ヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足されるそれぞれ1、2またはそれより多いヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントとを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的な遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない集団。
【請求項２４１】
ヒト遺伝子セグメントを含むVLおよびJL遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、JL遺伝子レパートリーが、
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ1遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ2遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ3遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ4遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ5遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ1遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ2遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ2遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ3遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ3遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ4遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ4遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ5遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ5遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ6遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ6遺伝子セグメント;または
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ7遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ7遺伝子セグメント
を含み、
場合により、JL遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項222に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【請求項２４２】
ヒト遺伝子セグメントを含むVLおよびJL遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、JL遺伝子レパートリーが、
少なくとも3つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ1遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ2遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ3遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ4遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ5遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるヒトJλ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ1遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるヒトJλ2遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ2遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるヒトJλ3遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ3遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるヒトJλ4遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ4遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるヒトJλ5遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ5遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるヒトJλ6遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ6遺伝子セグメント;または
少なくとも3つの異なるヒトJλ7遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ7遺伝子セグメント
を含み、
場合により、JL遺伝子セグメントが、2または3の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し;
場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される、請求項221に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞またはB細胞)。
【請求項２４３】
異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、請求項241または242に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２４４】
個体が、遺伝的に関連していない、請求項241から243のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２４５】
異なるJLセグメントの少なくとも1つが、ヒト生殖系列JL遺伝子セグメントの合成変異体である、請求項241から244のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２４６】
ヒトVLおよびJL遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、JL遺伝子レパートリーが、
場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある、少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ1遺伝子セグメント;
場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある、少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ2遺伝子セグメント;
場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある、少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ3遺伝子セグメント;
場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある、少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ4遺伝子セグメント;
場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある、少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ5遺伝子セグメント;
場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある、少なくとも2つの異なるヒトJλ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ1遺伝子セグメント;
場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある、少なくとも2つの異なるヒトJλ2遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ2遺伝子セグメント;
場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある、少なくとも2つの異なるヒトJλ3遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ3遺伝子セグメント;
場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある、少なくとも2つの異なるヒトJλ4遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ4遺伝子セグメント;
場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある、少なくとも2つの異なるヒトJλ5遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ5遺伝子セグメント;
場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある、少なくとも2つの異なるヒトJλ6遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ6遺伝子セグメント;または
場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある、少なくとも2つの異なるヒトJλ7遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ7遺伝子セグメント
を含み、
JL遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、請求項225に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞またはB細胞)。
【請求項２４７】
ヒト個体が、異なるヒト集団からである、請求項246に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２４８】
(a)抗原特異的重鎖可変ドメインを提供する工程と、
(b)可変ドメインをヒト重鎖定常領域と組み合わせて、可変ドメインおよび定常領域を(N末端からC末端方向に)含む抗体重鎖を生成する工程と
を含み、
ヒト重鎖定常領域が、IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMaまたはIGHMb定常領域である、抗体重鎖を生成する方法。
【請求項２４９】
可変ドメインが、ヒト可変ドメインである、請求項248に記載の方法。
【請求項２５０】
可変ドメインが、抗原で免疫化された非ヒト脊椎動物から予め選択されている、請求項248または249に記載の方法。
【請求項２５１】
定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する工程と、可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を定常領域配列の5'にてベクターに挿入する工程と、ベクターを宿主細胞に挿入して、宿主細胞により重鎖を発現する工程とを含み、可変ドメインおよびヒト定常領域を含む重鎖(例えば抗体の一部として)を単離する工程をさらに含む、請求項248から250のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５２】
重鎖をコードするヌクレオチド配列を得る工程をさらに含む、請求項248から251のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５３】
ヒト重鎖を含む抗体であって、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと、IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMaまたはIGHMb定常領域である定常領域とを含む抗体。
【請求項２５４】
リーダー配列と、抗原に特異的なヒト可変ドメインと、IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMaまたはIGHMb定常領域であるヒト定常領域とを(N末端からC末端方向に)含むポリペプチドであって、(i)リーダー配列が、天然ヒト可変ドメインリーダー配列でなく、かつ/または(ii)可変ドメインが、マウスAID-パターン体細胞変異もしくはマウス末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン接合部変異を含むポリペプチド。
【請求項２５５】
リーダー配列とヒト抗体重鎖とを(5'から3'の方向に)コードするヌクレオチド配列であって、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと、IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMaまたはIGHMb定常領域である定常領域とを含み、リーダー配列が、重鎖の発現を作動可能であり、リーダー配列が、天然ヒト可変ドメインリーダー配列でないヌクレオチド配列。
【請求項２５６】
プロモーターとヒト抗体重鎖とを(5'から3'の方向に)コードするヌクレオチド配列であって、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと、IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMaまたはIGHMb定常領域である定常領域とを含み、プロモーターが、重鎖の発現を作動可能であり、プロモーターが、天然ヒトプロモーターでないヌクレオチド配列。
【請求項２５７】
可変ドメインが、マウスAID-パターン体細胞変異またはマウス末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン接合部変異を含む、請求項253から256のいずれか一項に記載の抗体、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列。
【請求項２５８】
請求項255、256または257に記載の核酸を含み、場合により宿主細胞(例えばCHO細胞またはHEK293細胞)中にあるベクター(例えばCHO細胞またはHEK293細胞ベクター)。
【請求項２５９】
請求項253、254および257のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチドを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、抗体鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【請求項２６０】
ヒト患者における医学的状態の処置および/または防止において使用するための、請求項253、254および257のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチド。
【請求項２６１】
ヒト患者における医学的状態の処置および/または防止用の医薬品の製造のための、請求項253、254および257のいずれか一項に記載の抗体またはポリペプチドの使用。
【請求項２６２】
ヒトが、集団番号l〜l4から選択されるヒト集団のメンバーであり、集団には、以下のように番号を付す(集団ラベルは、l000 Genomesプロジェクト命名法に従う):
l=ASW;
2=CEU;
3=CHB;
4=CHS;
5=CLM;
6=FIN;
7=GBR;
8=IBS;
9=JPT;
10=LWK;
11=MXL;
12=PUR;
13=TSI;
14=YRI
、請求項260または261に記載の抗体、ポリペプチドまたは使用。
【請求項２６３】
定常領域が、
(i)IGHA1a定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜14のいずれかから選択される;
(ii)IGHA2a定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜14のいずれかから選択される;
(iii)IGHA2b定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜14のいずれかから選択される;
(iv)IGHG2a定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜9および11〜13のいずれかから選択される;
(v)IGHG3a定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜14のいずれかから選択される;
(vi)IGHG3b定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜8および11〜13のいずれかから選択される;
(vii)IGHG4a定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜9および11〜13のいずれかから選択される;
(viii)IGHMa定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜14のいずれかから選択される;または
(ix)IGHMb定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜14のいずれかから選択される;
(ここで集団には、以下のように番号を付す(集団ラベルは、l000 Genomesプロジェクト命名法に従う):
1=ASW;
2=CEU;
3=CHB;
4=CHS;
5=CLM;
6=FIN;
7=GBR;
8=IBS;
9=JPT;
10=LWK;
11=MXL;
12=PUR;
13=TSI;
14=YRI。
)、請求項262に記載の抗体、ポリペプチドまたは使用。
【請求項２６４】
ヒト抗体重鎖可変ドメインヌクレオチド配列の挿入のためのクローニング部位の3'にIGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4refまたはIGHG4a定常領域ヌクレオチド配列を含み、そのことにより、このような可変ドメイン配列を挿入すると、ベクターが宿主細胞中に存在する場合にヒト抗体重鎖を発現できるように、ベクターがプロモーターとリーダー配列と可変ドメイン配列と定常領域配列とを(5'から3'の方向に)含むようになるベクター(例えばCHO細胞またはHEK293細胞ベクター)。
【請求項２６５】
超ヒト免疫グロブリン重鎖ヒトVHおよび/またはDおよび/またはJ遺伝子レパートリーを有するゲノムを含む非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)。
【請求項２６６】
ゲノムが、複数のヒト免疫グロブリンVH遺伝子セグメントと、1または複数のヒトD遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含むトランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、複数のVH遺伝子セグメントが、自然のヒトレパートリーより多くの機能的VH遺伝子セグメントからなり、場合により、ゲノムが、前記トランスジェニック重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、請求項265に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２６７】
VH遺伝子レパートリーが、第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のVH遺伝子セグメントと、それに補足される第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数の異なるVH遺伝子セグメントとからなり、場合により、個体が、関連せず、場合により、DおよびJセグメントが、第1のヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、第2の個体のゲノム配列からのVH遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)に列挙するVH遺伝子セグメントから選択される、請求項266に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２６８】
トランスジェニック遺伝子座が、26より多い機能的ヒトVH遺伝子セグメントを含み、場合により、遺伝子座が、少なくとも27または28の機能的ヒトVH遺伝子セグメントを含む(例えば、遺伝子座が、前記第1の個体の完全機能的VHレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVH遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVH遺伝子セグメントとを含む)、請求項267に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２６９】
トランスジェニック遺伝子座が、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のVH遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のVH遺伝子セグメントとを含み、第2のVH遺伝子セグメントが、第1のVH遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、遺伝子座が、第1のVH遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含む、請求項267または268に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２７０】
ゲノムが、複数のヒト免疫グロブリンVH遺伝子セグメントと、複数のヒトD遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含む、ある(または前記)トランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、複数のD遺伝子セグメントが、自然のヒトレパートリーより多くの機能的D遺伝子セグメントを含み、場合により、ゲノムが、前記トランスジェニック重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、請求項265から269のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２７１】
D遺伝子レパートリーが、ある(または前記)第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のD遺伝子セグメントと、それに補足されるある(または前記)第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数の異なるD遺伝子セグメントとからなり、場合により、個体が、関連せず、場合により、Jセグメントが、第1のヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、第2の個体のゲノム配列からのD遺伝子セグメントが、Table 2(表7-1〜表7-5)に列挙するD遺伝子セグメントから選択される、請求項270に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２７２】
トランスジェニック遺伝子座が、26より多い機能的ヒトD遺伝子セグメントを含み、場合により、遺伝子座が、少なくとも27または28の機能的ヒトD遺伝子セグメントを含む(例えば、遺伝子座が、前記第1の個体の完全機能的Dレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のD遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のD遺伝子セグメントとを含む)、請求項271に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２７３】
トランスジェニック遺伝子座が、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のD遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のD遺伝子セグメントとを含み、第2のD遺伝子セグメントが、第1のD遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、遺伝子座が、第1のD遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含む、請求項271または272に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２７４】
ゲノムが、複数のヒト免疫グロブリンVH遺伝子セグメントと、1または複数のヒトD遺伝子セグメントと、複数のヒトJH遺伝子セグメントとを含む、ある(または前記)トランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、複数のJ遺伝子セグメントが、自然のヒトレパートリーより多くの機能的J遺伝子セグメントを含み、場合により、ゲノムが、前記トランスジェニック重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、請求項265から273のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２７５】
J遺伝子レパートリーが、ある(または前記)第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のJ遺伝子セグメントと、それに補足されるある(または前記)第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数の異なるJ遺伝子セグメントとからなり、場合により、個体が、関連せず、場合により、Dセグメントが、第1のヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、第2の個体のゲノム配列からのJ遺伝子セグメントが、Table 3(表8-1〜表8-3)に列挙するJ遺伝子セグメントから選択される、請求項274に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２７６】
トランスジェニック遺伝子座が、26より多い機能的ヒトJ遺伝子セグメントを含み、場合により、遺伝子座が、少なくとも27または28の機能的ヒトJ遺伝子セグメントを含む(例えば、遺伝子座が、前記第1の個体の完全機能的Jレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJ遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJ遺伝子セグメントとを含む)、請求項275に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２７７】
トランスジェニック遺伝子座が、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のJ遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のJ遺伝子セグメントとを含み、第2のJ遺伝子セグメントが、第1のJ遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、遺伝子座が、第1のJ遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含む、請求項275または276に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２７８】
超ヒト免疫グロブリン軽鎖ヒトVL遺伝子レパートリーを有するゲノムを含み、場合により、請求項265から277のいずれか一項に記載のものである、非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)。
【請求項２７９】
ゲノムが、
(i)複数のヒト免疫グロブリンVκ遺伝子セグメントと1または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含むトランスジェニック免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子座であって、複数のVκ遺伝子セグメントが、自然のヒトレパートリーより多くの機能的Vκ遺伝子セグメントからなり、場合により、ゲノムが、前記トランスジェニックカッパ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性であるトランスジェニック免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子座、および/あるいは
(ii)複数のヒト免疫グロブリンVλ遺伝子セグメントと1または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含むトランスジェニック免疫グロブリンラムダ軽鎖遺伝子座であって、複数のVλ遺伝子セグメントが、自然のヒトレパートリーより多くの機能的Vλ遺伝子セグメントからなり、場合により、ゲノムが、前記トランスジェニックラムダ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性であるトランスジェニック免疫グロブリンラムダ軽鎖遺伝子座
を含む、請求項278に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２８０】
(i)Vκ遺伝子レパートリーが、第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のVκ遺伝子セグメントと、それに補足される第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVκ遺伝子セグメントとからなり、場合により、個体が、関連せず、場合により、Jセグメントが、第1のヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、第2の個体のゲノム配列に由来するVκ遺伝子セグメントが、Table 4(表9-1〜表9-13)に列挙するVκ遺伝子セグメントから選択され、
(ii)Vλ遺伝子レパートリーが、第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のVλ遺伝子セグメントと、それに補足される第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVλ遺伝子セグメントとからなり、場合により、個体が、関連せず、場合により、Jセグメントが、第1のヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、第2の個体のゲノム配列に由来するVλ遺伝子セグメントが、Table 5(表10-1〜表10-12)に列挙するVλ遺伝子セグメントから選択される、
請求項279に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２８１】
カッパ軽鎖トランスジェニック遺伝子座が、26より多い機能的ヒトVκ遺伝子セグメントを含み、場合により、遺伝子座が、少なくとも27または28の機能的ヒトVκ遺伝子セグメントを含み(例えば、遺伝子座が、前記第1の個体の完全機能的Vκレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVκ遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVκ遺伝子セグメントとを含む);
ラムダ軽鎖トランスジェニック遺伝子座が、26より多い機能的ヒトVλ遺伝子セグメントを含み、場合により、遺伝子座が、少なくとも27または28の機能的ヒトVλ遺伝子セグメントを含む(例えば、遺伝子座が、前記第1の個体の完全機能的Vλレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVλ遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVλ遺伝子セグメントとを含む)、
請求項280に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２８２】
カッパ軽鎖トランスジェニック遺伝子座が、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のVκ遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のVκ遺伝子セグメントとを含み、第2のVκ遺伝子セグメントが、第1のVκ遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、遺伝子座が、第1のVκ遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含み、
ラムダ軽鎖トランスジェニック遺伝子座が、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のVλ遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のVλ遺伝子セグメントとを含み、第2のVλ遺伝子セグメントが、第1のVλ遺伝子セグメントの多型バリアントであり、遺伝子座が、第1のVλ遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含む、
請求項280または281に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２８３】
ゲノムが、複数のヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントと、複数のヒトJL遺伝子セグメントとを含む、ある(または前記)トランスジェニック免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含み、複数のJ遺伝子セグメントが、自然のヒトレパートリーより多くの機能的J遺伝子セグメントからなり、場合により、ゲノムが、前記トランスジェニック重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、請求項278から282のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２８４】
(i)Jκ遺伝子レパートリーが、ある(または前記)第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のJκ遺伝子セグメントと、それに補足されるある(または前記)第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJκ遺伝子セグメントとからなり、場合により、個体が、関連せず、場合により、Vκセグメントが、第1のヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、第2の個体のゲノム配列に由来するJκ遺伝子セグメントが、Table 6(表11-1〜表11-2)に列挙するJκ遺伝子セグメントから選択され、
(ii)Jκ遺伝子レパートリーが、ある(または前記)第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のJλ遺伝子セグメントと、それに補足されるある(または前記)第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJλ遺伝子セグメントとからなり、場合により、個体が、関連せず、場合により、Vλセグメントが、第1のヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、第2の個体のゲノム配列に由来するJλ遺伝子セグメントが、Table 7(表12-1〜表12-3)に列挙するJλ遺伝子セグメントから選択される、
請求項283に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２８５】
(i)トランスジェニック軽鎖遺伝子座が、26より多い機能的ヒトJκ遺伝子セグメントを含み、場合により、遺伝子座が、少なくとも27または28の機能的ヒトJκ遺伝子セグメントを含み(例えば、遺伝子座が、前記第1の個体の完全機能的Jκレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJκ遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJκ遺伝子セグメントとを含む);かつ/あるいは
(ii)トランスジェニック軽鎖遺伝子座が、26より多い機能的ヒトJλ遺伝子セグメントを含み、場合により、遺伝子座が、少なくとも27または28の機能的ヒトJλ遺伝子セグメントを含む(例えば、遺伝子座が、前記第1の個体の完全機能的Jλレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJλ遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJλ遺伝子セグメントとを含む)、
請求項284に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２８６】
(i)カッパ軽鎖トランスジェニック遺伝子座が、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のJκ遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のJκ遺伝子セグメントとを含み、第2のJκ遺伝子セグメントが、第1のJκ遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、遺伝子座が、第1のJκ遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含み、
(ii)ラムダ軽鎖トランスジェニック遺伝子座が、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のJλ遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のJλ遺伝子セグメントとを含み、第2のJκ遺伝子セグメントが、第1のJλ遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、遺伝子座が、第1のJλ遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含む、
請求項284または285に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項２８７】
抗体のレパートリーを集合的にコードするゲノムを有する抗体生成トランスジェニック細胞のライブラリーであって、
(a)第1のトランスジェニック細胞が、第1の免疫グロブリン遺伝子によりコードされる鎖を有する第1の抗体を発現し、遺伝子が、第1のヒト未再構成免疫グロブリン遺伝子セグメントの組換えの後に生成される第1の可変ドメインヌクレオチド配列を含み、
(b)第2のトランスジェニック細胞が、第2の免疫グロブリン遺伝子によりコードされる鎖を有する第2の抗体を発現し、第2の遺伝子が、第2のヒト未再構成免疫グロブリン遺伝子セグメントの組換えの後に生成される第2の可変ドメインヌクレオチド配列を含み、第1抗体および第2の抗体が、同一でなく、
(c)第1および第2の遺伝子セグメントが、異なり、それぞれ第1および第2のヒト個体のゲノム配列に由来し、個体が、異なり、場合により、関連せず、
(d)細胞が、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)細胞である
ライブラリー。
【請求項２８８】
工程(c)において、個体が、関連しない、請求項287に記載のライブラリー。
【請求項２８９】
第1および第2のヒト個体が、それぞれ第1および第2の人種集団のメンバーであり、集団が、異なり、場合により、人種集団が、1000 Genomesデータベースにおいて同定されるものから選択される、請求項265から288のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞またはライブラリー。
【請求項２９０】
第2の個体のゲノム配列に由来するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、第2の人種集団内で低頻度である(場合により希である)、請求項289に記載の脊椎動物、細胞またはライブラリー。
【請求項２９１】
第1の可変領域ヌクレオチド配列が、第1のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントと第1のJ遺伝子セグメントと場合により第1のD遺伝子セグメントとの組換えにより生成され、第1のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、V遺伝子セグメントであり、V、DおよびJセグメントが、第1のヒト集団、場合により第1のヒト集団の1個体のゲノムに由来する、請求項289または290に記載のライブラリー。
【請求項２９２】
第2の可変領域ヌクレオチド配列が、第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントと第2のJ遺伝子セグメントと場合により第2のD遺伝子セグメントとの組換えにより生成され、第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、第2の集団に由来するV遺伝子セグメントであり、Dおよび/またはJセグメントが、第1のヒト集団に由来し、場合により、DおよびJ遺伝子セグメントが、第1のヒト集団の1個体のゲノムに由来する、請求項291に記載のライブラリー。
【請求項２９３】
第1および第2のV遺伝子セグメントと組み換えられたDおよびJセグメントの全てが、第1のヒト集団に由来するDおよびJセグメントであり、場合により、DおよびJ遺伝子セグメントが、第1のヒト集団の1個体のゲノムに由来する、請求項292に記載のライブラリー。
【請求項２９４】
第1および第2の人種集団が、ヨーロッパ系祖先の人種集団、東アジア系の人種集団、西アフリカ系祖先の人種集団、アメリカ系祖先の人種集団および南アジア系祖先の人種集団からなる群から選択される、請求項289から293のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞またはライブラリー。
【請求項２９５】
第1および第2の人種集団が、北ヨーロッパ系祖先の人種集団;または西ヨーロッパ系祖先の人種集団;またはトスカナ系祖先の人種集団;または英国系祖先の人種集団;またはアイスランド系祖先の人種集団;またはフィンランド系祖先の人種集団;またはイベリア系祖先の人種集団;または日本系祖先の人種集団;または中国系祖先の人種集団;またはベトナム系祖先の人種集団;またはヨルバ族系祖先の人種集団;またはルイヤ系祖先の人種集団;またはガンビア系祖先の人種集団;またはマラウィ系祖先の人種集団;または土着アメリカ人系祖先の人種集団;またはアフリカ系カリブ人系祖先の人種集団;またはメキシコ系祖先の人種集団;またはプエルトリコ系祖先の人種集団;またはコロンビア系祖先の人種集団;またはペルー系祖先の人種集団;またはアーホム族系祖先の人種集団;またはカーヤドゥサ系祖先の人種集団;またはレディ系祖先の人種集団;またはマラータ族系祖先の人種集団;またはパンジャブ族系祖先の人種集団からなる群から選択される、請求項294に記載の脊椎動物、細胞またはライブラリー。
【請求項２９６】
第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、第1のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、第2の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)〜7(表12-1〜表12-3)および9(表14-1〜14-3)〜14(表24-1〜表24-6)のいずれかにおける遺伝子セグメントからなる群から選択され、例えば、第2の遺伝子セグメントが、VH1-69の多型バリアントである、請求項287に記載のライブラリー。
【請求項２９７】
第1および第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントがともに、(i)VH遺伝子セグメント;(ii)Dセグメント;(iii)Jセグメント(場合によりともにJHセグメント、ともにJκセグメントまたはともにJλセグメント);(iv)定常領域(場合によりともにガンマ定常領域、場合によりともにCガンマ-1定常領域);(v)CH1領域;(vi)CH2領域;または(vii)CH3領域である、請求項287から296のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項２９８】
ライブラリーが、ナイーブであり、場合により、102から109細胞までのライブラリーサイズを有する、請求項287から297のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項２９９】
ライブラリーが、所定の抗原に対して選択されており、場合により、102から109細胞までのライブラリーサイズを有する、請求項287から298のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項３００】
前記第1および第2の細胞が、それぞれ第1および第2の祖先非ヒト脊椎動物細胞の子孫であり、第1の祖先細胞が、前記第1のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むゲノムを含み、第2の祖先細胞が、前記第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むゲノムを含む、請求項287から299のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項３０１】
抗体のレパートリーを集合的にコードするゲノムを有する抗体生成トランスジェニック細胞のライブラリーであって、請求項300に記載の第1および第2の祖先細胞を含むライブラリー。
【請求項３０２】
請求項265から301のいずれか一項に記載のライブラリーと融合パートナー細胞との融合により生成されるハイブリドーマ細胞のライブラリーであって、場合により、ハイブリドーマライブラリーが102から109細胞までのサイズを有するライブラリー。
【請求項３０３】
(a)トランスジェニック非ヒト脊椎動物細胞における未再構成ヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントとヒトDおよびヒトJセグメントとの組換えと、場合により前記細胞における親和性成熟との後に生成されるヌクレオチド配列によりコードされる重鎖であって、遺伝子セグメントの1つが、第1のヒト人種集団の個体のゲノムに由来し、他の2つの遺伝子セグメントが、第2の異なるヒト人種集団の個体のゲノムに由来し、抗体が、前記非ヒト脊椎動物の重鎖定常領域(例えばげっ歯類、マウスまたはラット重鎖定常領域)を含む重鎖;および/あるいは
(b)トランスジェニック非ヒト脊椎動物細胞における未再構成ヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントとヒトJセグメントとの間の組換えと、場合により前記細胞における親和性成熟との後に生成されるヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖であって、遺伝子セグメントの1つが、第1のヒト人種集団(場合により、(a)における第1の集団と同じ)の個体のゲノムに由来し、他の遺伝子セグメントが、第2の異なるヒト人種集団(場合により、(a)における第2の集団と同じ)の個体のゲノムに由来し、抗体が、前記非ヒト脊椎動物の軽鎖定常領域(例えばげっ歯類、マウスまたはラット軽鎖定常領域)を含む軽鎖
を有し、
(c)場合により、抗体のそれぞれの可変ドメインが、ヒト可変ドメインであり、
(d)場合により、重鎖定常領域が、ガンマタイプ定常領域である、
単離抗体。
【請求項３０４】
請求項303に記載の抗体をコードする単離ヌクレオチド配列であって、場合により、抗体発現ベクター中、場合により宿主細胞中で提供される配列。
【請求項３０５】
請求項303に記載の抗体の非ヒト脊椎動物定常領域をヒト抗体定常領域で置き換える工程を含む、ヒト抗体を生成する方法。
【請求項３０６】
請求項303に記載の抗体、または請求項305に記載の方法に従って生成される抗体と、希釈剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物であって、IV針もしくはシリンジに接続された容器またはIVバッグにおいて提供される医薬組成物。
【請求項３０７】
請求項287から302のいずれか一項に記載の第2の抗体または請求項303に記載の単離抗体を発現する抗体生成細胞。
【請求項３０８】
トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座(例えば重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)であって、前記遺伝子座が、免疫グロブリン定常領域の上流に作動可能に接続した請求項287から302のいずれか一項に記載の第1および第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントに従う免疫グロブリン遺伝子セグメント(場合によりVセグメント)を含み、場合により、ゲノムが、前記トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座についてホモ接合性であり、
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的V遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的D遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的J遺伝子セグメントを含む非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【請求項３０９】
非ヒト脊椎動物定常領域とヒト可変領域とを有するキメラ抗体のレパートリーまたはキメラ軽鎖もしくは重鎖を生成するために、非ヒト脊椎動物定常領域の上流に作動可能に接続した複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)であって、
トランスジェニック遺伝子座が、1または複数のヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントと、場合により1または複数のヒトD遺伝子セグメントとを含み、前記遺伝子セグメントの第1のもの(場合によりVセグメント)および前記遺伝子セグメントの第2のもの(場合によりVセグメント)が、異なり、それぞれ第1および第2のヒト個体のゲノムに由来し、個体が、異なり、場合により、関連せず、
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的V遺伝子セグメントを含み、
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的D遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的J遺伝子セグメントを含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【請求項３１０】
第1および第2のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)であって、それぞれの遺伝子座が、非ヒト脊椎動物定常領域とヒト可変領域とを有するキメラ抗体のレパートリーまたはキメラ軽鎖もしくは重鎖を生成するために、非ヒト脊椎動物定常領域の上流に作動可能に接続した複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含み、
(i)第1のトランスジェニック遺伝子座が、1または複数のヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントと、場合により1または複数のヒトD遺伝子セグメントとを含み、(ii)第2のトランスジェニック遺伝子座が、1または複数のヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントと、場合により1または複数のヒトD遺伝子セグメントとを含み、(iii)前記第1の遺伝子座の第1の(場合によりV)遺伝子セグメントおよび前記第2の遺伝子遺伝子座の第2の(場合によりV)遺伝子セグメントが、異なり、それぞれ第1および第2のヒト個体のゲノムに由来し、個体が、異なり、場合により、関連せず、
場合により、第1および第2の遺伝子座が、前記ゲノムにおける異なる染色体(場合により同じ染色体番号を有する染色体)上にあり、
場合により、それぞれの免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的V遺伝子セグメントを含み、
場合により、それぞれの免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的D遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、それぞれの免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的J遺伝子セグメントを含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【請求項３１１】
免疫グロブリン遺伝子セグメントが、請求項23から37のいずれか一項に記載のとおりである、請求項309または310に記載の非ヒト脊椎動物または細胞。
【請求項３１２】
ゲノムが、第3の免疫グロブリン遺伝子セグメント(場合によりVセグメント)を含み、第3の遺伝子セグメントが、第1(および場合により第2)の遺伝子セグメントが由来する個体とは異なるヒト個体に由来し、場合により、第1、第2および第3の遺伝子セグメントが、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの多型バリアントである、請求項308、309、310または311に記載の非ヒト脊椎動物または細胞。
【請求項３１３】
脊椎動物または細胞のゲノムが、第1、第2および場合により第3の遺伝子セグメントについてホモ接合性であり、第1、第2および場合により第3の遺伝子セグメントのコピーが、共通非ヒト脊椎動物定常領域の上流に作動可能に接続した同じ染色体上に一緒に提供される、請求項308から312のいずれか一項に記載の非ヒト脊椎動物または細胞。
【請求項３１４】
第1、第2および場合により第3の遺伝子セグメントのそれぞれが、V遺伝子セグメントである、請求項308から313のいずれか一項に記載の非ヒト脊椎動物または細胞。
【請求項３１５】
ライブラリーが、非ヒト脊椎動物のコレクション(場合によりげっ歯類、マウスまたはラットのコレクション)により提供され、場合により、前記コレクションの第1のメンバーが、前記第1の抗体を生成するが、前記第2の抗体を生成せず、コレクションの第2のメンバーが、前記第2の抗体を生成する(が、場合により、第1の抗体を生成しない)、請求項287から302のいずれか一項に記載のライブラリー。
【請求項３１６】
請求項287から302および315のいずれか一項に記載の細胞のライブラリーから発現される抗体のレパートリー。
【請求項３１７】
請求項265から286のいずれか一項に記載の細胞(例えばES細胞)を構築するための方法であって、
(a)ある(または前記)第1のヒト個体のゲノム配列の機能的VおよびJ(および場合によりD)遺伝子セグメントを同定する工程と、
(b)ある(または前記)第2のヒト個体のゲノム配列の1または複数の機能的Vおよび/またはDおよび/またはJ遺伝子セグメントを同定する工程であって、これらのさらなる遺伝子セグメントが、第1の個体のゲノム配列において見出されない工程と、
(c)トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を細胞において構築する工程であって、(a)および(b)の遺伝子セグメントが、定常領域に作動可能に接続した遺伝子座において提供される工程と
を含む方法。
【請求項３１８】
細胞が、工程(a)〜(c)に従って構築される重鎖遺伝子座および/または工程(a)〜(c)に従って構築される軽鎖遺伝子座(カッパおよび/またはラムダ遺伝子座)を含む、請求項317に記載の方法。
【請求項３１９】
細胞が、前記またはそれぞれのトランスジェニック遺伝子座についてホモ接合性であり、場合により、前記細胞に対して内因性の遺伝子座からの抗体発現が、不活性化されている、請求項317または318に記載の方法。
【請求項３２０】
工程(b)における遺伝子セグメントが、1000 Genomes、Ensembl、GenbankおよびIMGTデータベースから選択される免疫グロブリン遺伝子データベースから同定される、請求項317から319のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２１】
第1および第2のヒト個体が、それぞれ第1および第2の人種集団のメンバーであり、集団が、異なり、場合により、第2の個体のゲノム配列に由来するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、第2の人種集団内で低頻度である(場合により希である)、請求項317から320のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２２】
トランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)を作製する方法であって、
(a)請求項317から321のいずれか一項に記載の方法を行うことによりES細胞(例えばマウスC57BL/6N、C57BL/6J、129S5または129Sv株ES細胞)を構築する工程と、
(b)ES細胞をドナー非ヒト脊椎動物胚盤胞(例えばマウスC57BL/6N、C57BL/6J、129S5または129Sv株胚盤胞)に注入する工程と、
(c)胚盤胞を、里親非ヒト脊椎動物母(例えばC57BL/6N、C57BL/6J、129S5または129Sv株マウス)に移植する工程と、
(d)前記母から子を得る工程であって、子のゲノムが、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を含む工程と
を含む方法。
【請求項３２３】
請求項322に記載の方法により作製されるトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)またはその子孫。
【請求項３２４】
請求項323に記載の非ヒト脊椎動物の集団。
【請求項３２５】
所定の抗原(例えば細菌またはウイルス病原体抗原)と結合する抗体を単離する方法であって、
(a)請求項265から286、289、290、294、295、308から314および323に記載の脊椎動物(場合によりマウスまたはラット)を提供する工程と、
(b)前記脊椎動物を前記抗原(場合により、抗原は、感染性疾患病原体の抗原である)で(例えば標準的なプライム・ブースト法を用いて)免疫化する工程と、
(c)脊椎動物からBリンパ球を回収し、抗原と結合する抗体を発現する1または複数のBリンパ球を選択する工程と、
(d)場合により、前記選択したBリンパ球またはその子孫を、場合によりそこからハイブリドーマを生成することにより不死化させる工程と、
(e)Bリンパ球により発現される抗体(例えばおよびIgGタイプ抗体)を単離する工程と、
(f)場合により、抗体の誘導体またはバリアントを生成する工程と
を含む方法。
【請求項３２６】
工程(e)の後に、前記Bリンパ球から前記抗原と結合する前記抗体をコードする核酸を単離する工程と、場合により、抗体の重鎖定常領域ヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列に交換して、場合により、前記抗体の可変領域の親和性成熟を行う工程と、場合により、前記核酸を発現ベクターおよび場合により宿主に挿入する工程とをさらに含む、請求項325に記載の方法。
【請求項３２７】
トランスジェニック重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを含む非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または細胞(例えばマウス細胞またはラット細胞)であって、遺伝子座が、非ヒト脊椎動物定常領域(例えばマウス定常領域、例えばCmuおよび/またはCガンマ)の上流に作動可能に接続した少なくとも42(場合により少なくとも43、44、45、46、47、48、49、50)の機能的ヒトVH遺伝子セグメントと、1または複数の機能的ヒトD遺伝子セグメントと、1または複数の機能的ヒトJH遺伝子セグメントとを含む非ヒト脊椎動物または細胞。
【請求項３２８】
遺伝子座が、少なくとも23の機能的ヒトD遺伝子セグメントおよび/または少なくとも6の機能的ヒトJH遺伝子セグメント、場合により、少なくとも機能的VH、DおよびJHセグメントの完全ヒトレパートリー(場合により、同じヒト個体のゲノム配列に由来する)を含む、請求項327に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項３２９】
トランスジェニック重鎖免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを含む非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または細胞(例えばマウス細胞またはラット細胞)であって、遺伝子座が、同じヒト個体のゲノム配列に由来する機能的VH、DおよびJHセグメントの完全ヒトレパートリーと、それに補足される前記ヒト個体のゲノム配列において見出されない1または複数のさらなる機能的ヒトVH、Dおよび/またはJH遺伝子セグメントとを含む非ヒト脊椎動物または細胞。
【請求項３３０】
さらなるVH、DおよびJHセグメントのそれぞれが、(i)第2の異なる個体に由来する遺伝子セグメントであって、場合により、第1および第2の個体が、異なる人種集団のメンバーである遺伝子セグメント;(ii)ヒト遺伝子セグメントの変異体(場合により、5、10または15までの変異を有するヒト生殖系列遺伝子セグメント);ならびに(iii)異なるヒト個体のゲノム配列またはヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの異なる多型バリアント(例えば生殖系列ヒトVH、DまたはJH遺伝子セグメントのバリアント)に由来する第1および第2のヌクレオチド配列を含むハイブリッドヒト遺伝子セグメントからなる群から選択される、請求項329に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項３３１】
ゲノムが、前記重鎖導入遺伝子についてホモ接合性であり、場合により、内因性免疫グロブリン重鎖発現が、不活性化されている、請求項328から330のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項３３２】
トランスジェニックカッパ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを含む非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または細胞(例えばマウス細胞またはラット細胞)であって、遺伝子座が、非ヒト脊椎動物定常領域(例えばマウス定常領域)の上流に作動可能に接続した少なくとも39の機能的ヒトVκ遺伝子セグメントと、1または複数の機能的ヒトJκ遺伝子セグメントとを含む非ヒト脊椎動物または細胞。
【請求項３３３】
遺伝子座が、少なくとも機能的VκおよびJκセグメント(場合により、同じヒト個体のゲノム配列に由来する)の完全ヒトレパートリーを含む、請求項332に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項３３４】
トランスジェニックカッパ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを含む非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または細胞(例えばマウス細胞またはラット細胞)であって、遺伝子座が、同じヒト個体のゲノム配列に由来する機能的VκおよびJκセグメントの完全ヒトレパートリーと、それに補足される前記ヒト個体のゲノム配列において見出されない1または複数のさらなる機能的ヒトVκおよび/またはJκ遺伝子セグメントとを含む非ヒト脊椎動物または細胞。
【請求項３３５】
さらなるVκおよびJκセグメントのそれぞれが、(i)第2の異なる個体に由来する遺伝子セグメントであって、場合により、第1および第2の個体が、異なる人種集団のメンバーである遺伝子セグメント;(ii)ヒト遺伝子セグメントの変異体(場合により、5、10または15までの変異を有するヒト生殖系列遺伝子セグメント);ならびに(iii)異なるヒト個体のゲノム配列またはヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの異なる多型バリアント(例えば生殖系列ヒトVκまたはJκ遺伝子セグメントバリアント)に由来する第1および第2のヌクレオチド配列を含むハイブリッドヒト遺伝子セグメントからなる群から選択される、請求項334に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項３３６】
ゲノムが、前記カッパ軽鎖導入遺伝子についてホモ接合性であり、場合により、内因性免疫グロブリンカッパ軽鎖発現が、不活性化されている、請求項332から335のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項３３７】
トランスジェニックラムダ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを含む非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または細胞(例えばマウス細胞またはラット細胞)であって、遺伝子座が、非ヒト脊椎動物定常領域(例えばマウス定常領域)の上流に作動可能に接続した少なくとも32の機能的ヒトVラムダ遺伝子セグメントと、1または複数の機能的ヒトJラムダ遺伝子セグメントとを含む非ヒト脊椎動物または細胞。
【請求項３３８】
遺伝子座が、少なくとも機能的VラムダおよびJラムダセグメント(場合により、同じヒト個体のゲノム配列に由来する)の完全ヒトレパートリーを含む、請求項337に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項３３９】
トランスジェニックラムダ軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを含む非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または細胞(例えばマウス細胞またはラット細胞)であって、遺伝子座が、同じヒト個体のゲノム配列に由来する機能的VラムダおよびJラムダセグメントの完全ヒトレパートリーと、それに補足される前記ヒト個体のゲノム配列において見出されない1または複数のさらなる機能的ヒトVラムダおよび/またはJラムダ遺伝子セグメントとを含む非ヒト脊椎動物または細胞。
【請求項３４０】
さらなるVラムダおよびJラムダセグメントのそれぞれが、(i)第2の異なる個体に由来する遺伝子セグメントであって、場合により、第1および第2の個体が、異なる人種集団のメンバーである遺伝子セグメント;(ii)ヒト遺伝子セグメントの変異体(場合により、5、10または15までの変異を有するヒト生殖系列遺伝子セグメント);ならびに(iii)異なるヒト個体のゲノム配列またはヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの異なる多型バリアント(例えば生殖系列ヒトVラムダまたはJラムダ遺伝子セグメントのバリアント)に由来する第1および第2のヌクレオチド配列を含むハイブリッドヒト遺伝子セグメントからなる群から選択される、請求項339に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項３４１】
ゲノムが、前記ラムダ軽鎖導入遺伝子についてホモ接合性であり、場合により、内因性免疫グロブリンラムダ軽鎖発現が、不活性化されている、請求項337から340のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【請求項３４２】
合成免疫グロブリン遺伝子ハプロタイプを含むトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座であって、ハプロタイプが、第1および第2のヒト遺伝子セグメント(それぞれV、DまたはJである)と、スイッチ領域と、定常領域とを含み、
a)第2の遺伝子セグメントが、第1の遺伝子セグメントの多型バリアントであるか、または
b)第1および第2の遺伝子セグメントが、異なる第1および第2の人種集団(例えば1000 Genomesデータベースに従う)からの個体のゲノム配列にそれぞれ由来し、第2の遺伝子セグメントが、第1の集団(例えば1000 Genomesデータベースに従う)において見出されず、場合により、第2の遺伝子セグメントが、第2の集団において低頻度で生じ(または希であり)、
定常領域および場合によりスイッチ領域が、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)定常およびスイッチ領域(例えばマウスもしくはラットCmu;マウスもしくはラットSmu;マウスもしくはラットCガンマ;またはマウスもしくはラットSガンマ)であるトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座。
【請求項３４３】
導入遺伝子が、(a)第1および第2の遺伝子セグメントの多型バリアントであるかまたは(b)第2の集団のゲノム配列に由来するか(および場合により該集団において低頻度または希な遺伝子である)もしくは第3のヒト人種集団からである第3のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメント(V、DまたはJ)を含み、第3の遺伝子セグメントが、第1の集団(例えば1000 Genomesデータベースに従う)において見出されない、請求項342に記載のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座。
【請求項３４４】
請求項342または343に記載の導入遺伝子を含む非ヒト脊椎動物または細胞であって、場合により、前記導入遺伝子についてホモ接合性である非ヒト脊椎動物または細胞。
【請求項３４５】
中国人患者への投与用の単離抗体であって、抗体が、ヒト重鎖を含み、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと定常領域とを含み、定常領域が、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中の定常領域(例えばIGHG定常領域)から選択されるヒト定常領域であり、
(i)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)における前記ヒト遺伝子セグメントの組換えに由来するか、または(ii)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)AID-パターン変異および非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン変異を含む単離抗体。
【請求項３４６】
定常領域が、IGHG1a、IGHG2a、IGHG3a、IGHG3bまたはIGHG4a定常領域である、請求項345に記載の抗体。
【請求項３４７】
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のVHから選択される、請求項345または346に記載の抗体。
【請求項３４８】
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、D遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のDから選択される、請求項345、346または347に記載の抗体。
【請求項３４９】
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、JH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のJHから選択される、請求項345、346、347または348に記載の抗体。
【請求項３５０】
請求項347から349のいずれか一項に記載の可変ドメインと同一の単離VHドメインであって、場合により、そのC末端にてポリペプチド(例えば抗体Fc)と融合している単離VHドメイン。
【請求項３５１】
請求項345から350のいずれか一項に記載の抗体または可変ドメインを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、抗体鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【請求項３５２】
中国人患者への投与用の単離抗体であって、抗体が、ヒト重鎖を含み、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと定常領域とを含み、可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のVHから選択され、
(i)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)における前記ヒト遺伝子セグメントの組換えに由来するか、または(ii)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)AID-パターン変異および非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン変異を含む単離抗体。
【請求項３５３】
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、D遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のDから選択される、請求項352に記載の抗体。
【請求項３５４】
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、JH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のJHから選択される、請求項352または353に記載の抗体。
【請求項３５５】
請求項352から354のいずれか一項に記載の可変ドメインと同一の単離VHドメインであって、場合により、そのC末端にてポリペプチド(例えば抗体Fc)と融合している単離VHドメイン。
【請求項３５６】
請求項352から355のいずれか一項に記載の抗体または可変ドメインを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、抗体鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【請求項３５７】
中国人患者における疾患または医学的状態の治療および/または予防のための抗体重鎖またはVHドメイン(例えば抗体の一部として提供される)であって、重鎖が、以下の工程:
(a)非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)から抗原特異的抗体重鎖またはVHドメインを選択する工程であって、重鎖またはVHドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のVHから選択される工程、ならびに
(b)場合により、重鎖の可変ドメインをヒト定常領域と組み合わせることにより重鎖をヒト化するか、または場合により、ヒト定常領域を組み合わせることにより、選択されたVHドメインをヒト化する工程
により生成される重鎖である(またはそのような重鎖のコピーである)抗体。
【請求項３５８】
ヒト定常領域が、請求項345または346に記載のとおりである、請求項357に記載の抗体重鎖またはVHドメイン。
【請求項３５９】
中国人患者における疾患または医学的状態の治療および/または予防のための医薬品において使用するための、請求項357または358に記載の抗体重鎖またはVHドメイン。
【請求項３６０】
中国人患者における疾患または医学的状態を処置および/または防止する方法であって、患者に、治療または予防有効量の請求項357または358に記載の抗体重鎖またはVHドメインを投与する工程を含む方法。
【請求項３６１】
ヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の患者への投与用の単離抗体であって、抗体が、ヒト重鎖を含み、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと定常領域とを含み、定常領域が、少なくとも5%の累積頻度でそれぞれヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中の定常領域(例えばIGHG定常領域)から選択され、
(i)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)における前記ヒト遺伝子セグメントの組換えに由来するか、または(ii)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)AID-パターン変異および非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン変異を含む単離抗体。
【請求項３６２】
定常領域が、IGHG1a、IGHG2a、IGHG3a、IGHG3bまたはIGHG4a定常領域であり、患者が、ヨーロッパ系祖先の患者である、請求項361に記載の抗体。
【請求項３６３】
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で前記集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のVHから選択される、請求項361または362に記載の抗体。
【請求項３６４】
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、D遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で前記集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のDから選択される、請求項361、362または363に記載の抗体。
【請求項３６５】
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、JH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で前記集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のJHから選択される、請求項361、362、363または364に記載の抗体。
【請求項３６６】
請求項363から365のいずれか一項に記載の可変ドメインと同一の単離VHドメインであって、場合により、そのC末端にてポリペプチド(例えば抗体Fc)と融合している単離VHドメイン。
【請求項３６７】
請求項361から366のいずれか一項に記載の抗体または可変ドメインを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、抗体鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【請求項３６８】
ヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系またはアメリカ系祖先の患者への投与用の単離抗体であって、抗体が、ヒト重鎖を含み、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと定常領域とを含み、可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度でそれぞれヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のVHから選択され、
(i)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)における前記ヒト遺伝子セグメントの組換えに由来するか、または
(ii)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)AID-パターン変異および非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン変異を含む単離抗体。
【請求項３６９】
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、D遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で前記集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のDから選択される、請求項368に記載の抗体。
【請求項３７０】
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、JH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で前記集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のJHから選択される、請求項368または369に記載の抗体。
【請求項３７１】
請求項368から370のいずれか一項に記載の可変ドメインと同一の単離VHドメインであって、場合により、そのC末端にてポリペプチド(例えば抗体Fc)と融合している単離VHドメイン。
【請求項３７２】
請求項368から371のいずれか一項に記載の抗体または可変ドメインを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、抗体鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【請求項３７３】
ヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の患者における疾患または医学的状態の治療および/または予防のための抗体重鎖またはVHドメイン(例えば抗体の一部として提供される)であって、重鎖が、以下の工程:
(a)非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)から抗原特異的抗体重鎖またはVHドメインを選択する工程であって、重鎖またはVHドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で前記集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のVHから選択される工程、ならびに
(b)場合により、重鎖の可変ドメインをヒト定常領域と組み合わせることにより重鎖をヒト化するか、または場合により、ヒト定常領域を組み合わせることにより、選択されたVHドメインをヒト化する工程
により生成される重鎖である(またはそのような重鎖のコピーである)抗体。
【請求項３７４】
ヒト定常領域が、請求項361または362に記載のとおりである、請求項373に記載の抗体重鎖またはVHドメイン。
【請求項３７５】
前記祖先の患者における疾患または医学的状態の治療および/または予防のための医薬品において使用するための、請求項373または374に記載の抗体重鎖またはVHドメイン。
【請求項３７６】
ヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の患者における疾患または医学的状態を処置および/または防止する方法であって、患者に、治療または予防有効量の請求項373または374に記載の抗体重鎖またはVHドメインを投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、ヒトへの使用に合わせて作製された抗体治療薬および予防薬の提供に関する。
【０００２】
本発明は、トランスジェニックマウスもしくはラットまたはトランスジェニックマウスもしくはラットの細胞のようなライブラリー、脊椎動物および細胞を提供する。さらに、本発明は、抗体または抗体をコードするヌクレオチド配列を単離するために脊椎動物を用いる方法に関する。本発明は、抗体、重鎖、ポリペプチド、ヌクレオチド配列、医薬組成物および使用も提供する。
【背景技術】
【０００３】
最先端の技術は、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を含む、非ヒト脊椎動物(例えば、マウスおよびラット)および細胞を提供し、このような遺伝子座は、ヒト可変性(V)、多様性(D)および/または連結(J)セグメント、場合によりヒト定常領域を含む。あるいは、トランスジェニック遺伝子座において、宿主脊椎動物の内因性定常領域(例えば、マウスまたはラット定常領域)が提供される。このようなトランスジェニック脊椎動物を構築する方法ならびに抗原免疫処置後に抗体およびその核酸を作製するためのこれらの使用は、当技術分野で公知である、例えば、その開示内容が本明細書に明確に組み込まれる、US7501552(Medarex)、US5939598(Abgenix)、US6130364(Abgenix)、WO02/066630(Regeneron)、WO2011004192(Genome Research Limited)、WO2009076464、WO2009143472およびWO2010039900(Ablexis)を参照のこと。当技術分野におけるこのようなトランスジェニック遺伝子座は、種々の量のヒトV(D)Jレパートリーを含む。既存のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座は、単一ヒトDNA供給源に基づいている。したがって、このようなトランスジェニック遺伝子座を有する非ヒト脊椎動物中のヒト抗体可変領域の多様性の可能性は、制限されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】US7501552
【特許文献２】US5939598
【特許文献３】US6130364
【特許文献４】W002/066630
【特許文献５】W02011004192
【特許文献６】W02009076464
【特許文献７】W02009143472
【特許文献８】W02010039900
【特許文献９】EP0937140
【特許文献１０】WO2011066501
【特許文献１１】EP1034260
【特許文献１２】EP1204740
【特許文献１３】PCT/GB2010/051122
【特許文献１４】US6673986
【特許文献１５】EP1399559
【特許文献１６】US6586251
【特許文献１７】US5859301
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Osoegawa K、Mammoser AG、Wu C、Frengen E、Zeng C、Catanese JJ、de Jong PJ;Genome Res. 2001年3月;11(3):483〜96頁;「A bacterial artificial chromosome library for sequencing the complete human genome」
【非特許文献２】Osoegawa, K.、Woon, P.Y.、Zhao, B.、Frengen, E.、Tateno, M.、Catanese, J.Jおよびde Jong, P.J. (1998);「An Improved Approach for Construction of Bacterial Artificial Chromosome Libraries」; Genomics 52、1〜8頁
【非特許文献３】N A Rosenbergら(Science、2002年12月20日:第298巻、第5602号、2342〜2343頁)
【非特許文献４】国際HapMapプロジェクト、Nature、2003年12月18日;426(6968):789〜96頁
【非特許文献５】Harlow, E.およびLane, D. 1998、第5版、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY
【非特許文献６】PasqualiniおよびArap、Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101:257〜259頁
【非特許文献７】Sambrook, JおよびRussell, D. (2001、第3版) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY)
【非特許文献８】Liu, Lら;Journal of Virology. 2011. 85:8467〜8476頁
【非特許文献９】PLoS One. 2012;7(5):e36750、Epub 2012年5月9日;「Human peripheral blood antibodies with long HCDR3s are established primarily at original recombination using a limited subset of germline genes」;Briney BSら
【非特許文献１０】PLoS One. 2011年3月30日;6(3):e16857;「Comparison of antibody repertoires produced by HIV-1 infection, other chronic and acute infections, and systemic autoimmune disease」;Breden Fら
【非特許文献１１】RogozinおよびDiaz;「Cutting Edge: DGYW/WRCH Is a Better Predictor of Mutability at G:C Bases in Ig Hypermutation Than the Widely Accepted RGYW/WRCY Motif and Probably Reflects a Two-Step Activation-Induced Cytidine Deaminase-Triggered Process」;Journal of Immunology;2004年3月15日、第172巻、第6号、3382〜3384頁
【非特許文献１２】Annu. Rev. Biochem. 2007. 76:1〜22頁;Javier M. Di NoiaおよびMichael S. Neuberger、「Molecular Mechanisms of Antibody Somatic Hypermutation」
【非特許文献１３】Curr Opin Immunol. 1995年4月;7(2):248〜54頁、「Somatic hypermutation」、Neuberger MSおよびMilstein C
【非特許文献１４】Auerbach W、Dunmore JH、Fairchild-Huntress Vら;Establishment and chimera analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-derived mouse embryonic stem cell lines. Biotechniques 2000; 29:1024〜8、30、32頁
【非特許文献１５】Mol Immunol. 2003年12月;40(9):585〜93頁;「Differential binding to human Fcgamma RIIa and Fcgamma RIIb receptors by human IgG wild type and mutant antibodies」; Armour KLら
【非特許文献１６】Nat Rev Genet. 2001年10月;2(10):769〜79頁; Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics; Copeland NG、Jenkins NA、Court DL
【非特許文献１７】Camacho C.、Coulouris G.、Avagyan V.、Ma N.、Papadopoulos J.、Bealer K.およびMadden T.L.(2008)「BLAST+: architecture and applications.」BMC Bioinformatics 10:421頁
【非特許文献１８】J Mol Biol. 1997年7月25日;270(4):587〜97頁; Corbett SJら;表2
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、ヒトの本来の抗体遺伝子の使用における多様性(および共通性)に対処するために、これらのトランスジェニック非ヒト脊椎動物のゲノム(および、よって、これらの抗体および抗体鎖生成物)を作製することが望ましいと考えた。本発明者らは、抗体に基づく治療薬物および予防薬物のヒトへの使用によりよく対処するためにこのことを行うことを望んだ。
【０００７】
トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座およびこれらを有する非ヒト脊椎動物において、ならびにこのような動物の免疫処置後に生じた抗体において、新規の、潜在的に拡大されたレパートリーおよびヒト可変領域の多様性を提供することも、望ましいものであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、無数の異なるヒト集団およびヒト個体からの2000を超える試料にわたる自然抗体遺伝子セグメント分布の広範なバイオインフォマティクス分析から発展した。本発明者らは、非ヒト脊椎動物系およびそれにより得られる抗体をより完全に理解して設計して、ヒトの医療的治療薬全体によりよく対処するため、および合理的設計を可能にして、ヒトの特定の人種集団に対処するためにこの莫大な課題に着手した。このような合理的設計を用いて、本発明者らは、ヒトバイオインフォマティクス分析に基づいて、トランスジェニック非ヒト脊椎動物、ならびに、単離抗体、抗体鎖、および、意図的に含められた遺伝子セグメントを利用する生成物を産生するような様式でこれらを発現する細胞を構築した。実施例は、この趣旨で本発明者らが多くの細胞および抗体を単離した、実行された実験を示す。
【０００９】
本発明は、広く合成され、人種多様性がある超ヒト免疫グロブリン遺伝子レパートリーにも関する。本発明は、よって、新規でかつ潜在的に拡張された合成免疫グロブリン多様性を提供し、よって、多様性のプールを提供し、このプールから、ヒト抗体治療薬のリードを選択できる。この拡張されたプールは、さらなる親和性の成熟(例えばファージまたはリボソームディスプレイのような骨の折れるin vitro技術を用いる)を必要とせずに抗原を標的にするための比較的高い親和性もしくは改善された生物物理的特徴のような所望の特徴を有する抗体を見出そうとする場合、または従来の抗体結合部位が到達できない、抗体を用いて対処することが以前は困難であった標的および新しいエピトープに対処しようとする場合に有用である
【００１０】
本発明は、特定のヒト集団のメンバーに共通する可変遺伝子使用に偏る可能性がある多様性も提供し、該多様性は、このような集団内の疾患または状態を処置および/または防止するための抗体を作製するために有用である。抗体レパートリーを偏らせることができることにより、特定のヒト集団における疾患または医学的状態をより効率的に処置および/または予防する目的をもった抗体治療薬を作製することが可能になる。
【００１１】
本発明者らは、抗体治療薬(および抗体ツール試薬)をそこから作製できる新規で潜在的に拡張された抗体多様性を提供するために、共通性のない供給源からの免疫グロブリン遺伝子セグメントをトランスジェニック遺伝子座において提供することの可能性に気付いた。このことは、トランスジェニックヒト-マウス/ラット技術の潜在能力を、今まで可能であったものとは異なる、そしておそらくより大きい抗体配列空間を照合する可能性に広げる。
【００１２】
トランスジェニック抗体遺伝子座ならびに抗体および抗体鎖の合理的設計において、本発明者らは、比較的長いHCDR3長さ(少なくとも20アミノ酸)が、エピトープに対処するために頻繁に所望されることにも気付いた。例えば、自然に存在する抗体は、感染性疾患病原体に感染したヒトから単離されているが、このような抗体はHCDR3の長さが長い。これに関して、中和抗体が見出されている。HCDR3の長さが長いことは、感染性疾患病原体のみに限定されるのでなく、他の抗原(例えば受容体裂溝(receptor cleft)または酵素活性部位)に対処するために望ましいと考えられ、よって、本発明者らは、長いHCDR3抗体および重鎖を生成できるトランスジェニック遺伝子座を工学的に操作する可能性が全般的に望ましいことに気付いた。本発明者らは、1000 Genomesプロジェクトからの2000を超えるヒトDNA試料についてのバイオインフォマティクスという重労働と、合理的配列選択とを行って、特定のヒト遺伝子セグメントバリアントJH6*02を含めることが、長いHCDR3抗体および鎖を生成するために望ましいことを同定した。
【００１３】
さらなる合理的設計およびバイオインフォマティクスにより導かれて、本発明者らは、特定のヒト定常領域バリアントが、多くの多様なヒト集団にわたって保存されていることに気付いた。本発明者らは、このことにより、ヒト定常領域(または合成バージョンのヒト定常領域)を任意に選択するのではなく、このような特定の定常領域を生成物において用いることにより、抗体、鎖および可変ドメインをヒト化するという選択を行うことができることに気付いた。本発明のこの態様は、特定のヒト人種集団に対して抗体に基づく薬物を作製することを可能にし、そのことにより、従来行われていたよりも密接に薬物を患者(およびよって疾患背景)にマッチさせることができる。最先端の技術では、異なるヒト人種集団の患者では機能しない任意に選択された(1つ(しばしば未知である)の人種集団からおそらく導かれたか、または自然に存在しない)ヒト定常領域を用いて抗体がヒト化されることが問題になり得る。このことは重要である。なぜなら、定常領域は、例えば抗体再利用、細胞および補体の動員ならびに細胞殺傷のための抗体エフェクター機能を提供することにおいて主要な役割を有するからである。
【００１４】
このために、本発明の第1の構成において、以下が提供される。
【００１５】
第1の構成
超ヒト免疫グロブリン重鎖ヒトVHおよび/またはDおよび/またはJ遺伝子レパートリーを有するゲノムを含む非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)。
【００１６】
超ヒト免疫グロブリン軽鎖ヒトVL遺伝子レパートリーを有するゲノムを含み、場合により、第1の構成による、非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)。
【００１７】
トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座(例えば重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)であって、前記遺伝子座が、免疫グロブリン定常領域の上流に作動可能に接続した下で言及する第1および第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントに従う免疫グロブリン遺伝子セグメント(場合によりVセグメント)を含み、場合により、ゲノムが、前記トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座についてホモ接合性であり、
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的V遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的D遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的J遺伝子セグメントを含む非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【００１８】
非ヒト脊椎動物定常領域とヒト可変領域とを有するキメラ抗体のレパートリーまたはキメラ軽鎖もしくは重鎖を生成するために、非ヒト脊椎動物定常領域の上流に作動可能に接続した複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)であって、
トランスジェニック遺伝子座が、1または複数のヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントと、場合により1または複数のヒトD遺伝子セグメントとを含み、前記遺伝子セグメントの第1の遺伝子セグメント(場合によりVセグメント)および前記遺伝子セグメントの第2の遺伝子セグメント(場合によりVセグメント)が、異なり、それぞれ第1および第2のヒト個体のゲノムに由来し、個体が、異なり、場合により、関連せず、
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的V遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的D遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的J遺伝子セグメントを含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【００１９】
第1および第2のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)であって、それぞれの遺伝子座が、非ヒト脊椎動物定常領域とヒト可変領域とを有するキメラ抗体のレパートリーまたはキメラ軽鎖もしくは重鎖を生成するために、非ヒト脊椎動物定常領域の上流に作動可能に接続した複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含み、
(i)第1のトランスジェニック遺伝子座が、1または複数のヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントと、場合により1または複数のヒトD遺伝子セグメントとを含み、(ii)第2のトランスジェニック遺伝子座が、1または複数のヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントと、場合により1または複数のヒトD遺伝子セグメントとを含み、(iii)前記第1の遺伝子座の第1の(場合によりV)遺伝子セグメントおよび前記第2の遺伝子遺伝子座の第2の(場合によりV)遺伝子セグメントが、異なり、それぞれ第1および第2のヒト個体のゲノムに由来し、個体が、異なり、場合により、関連せず、
場合により、第1および第2の遺伝子座が、前記ゲノムにおける異なる染色体(場合により同じ染色体番号を有する染色体)上にあり、
場合により、それぞれの免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的V遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、それぞれの免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的D遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、それぞれの免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的J遺伝子セグメントを含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【００２０】
本発明による細胞(例えばES細胞)を構築するための方法であって、
(a)ある(または前記)第1のヒト個体のゲノム配列の機能的VおよびJ(および場合によりD)遺伝子セグメントを同定する工程と、
(b)ある(または前記)第2のヒト個体のゲノム配列の1または複数の機能的Vおよび/またはDおよび/またはJ遺伝子セグメントを同定する工程であって、これらのさらなる遺伝子セグメントが、第1の個体のゲノム配列において見出されない工程と、
(c)トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を細胞において構築する工程であって、(a)および(b)の遺伝子セグメントが、定常領域の上流に作動可能に接続した遺伝子座において提供される工程と
を含む方法。
【００２１】
一実施形態では、工程(b)における遺伝子セグメントは、1000 Genomes、Ensembl、GenbankおよびIMGTデータベースから選択される免疫グロブリン遺伝子データベースから同定される。
【００２２】
本文を通して、Genbankとは、Genbankリリース番号185.0または191.0のことをいい、1000 Genomesデータベースは、フェーズ1、リリースv3、2012年3月16日であり、Ensemblデータベースは、アセンブリGRCh37.p8(10/04/2012)であり、IMGTデータベースは、www.imgt.orgで利用可能である。
【００２３】
一実施形態では、第1および第2のヒト個体は、それぞれ第1および第2の人種集団のメンバーであり、ここで、該集団は、異なり、場合により、第2の個体のゲノム配列に由来するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、第2の人種集団内で低頻度である(場合により希である)。
【００２４】
本発明のこの構成は、トランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)を作製する方法であって、
(a)上記の方法を行うことによりES細胞(例えばマウスC57BL/6N、C57BL/6J、129S5または129Sv株ES細胞)を構築する工程と、
(b)ES細胞をドナー非ヒト脊椎動物胚盤胞(例えばマウスC57BL/6N、C57BL/6J、129S5または129Sv株胚盤胞)に注入する工程と、
(c)胚盤胞を、里親非ヒト脊椎動物母(例えばC57BL/6N、C57BL/6J、129S5または129Sv株マウス)に移植する工程と、
(d)前記母から子を得る工程であって、子のゲノムが、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を含む工程と
を含む方法も提供する。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、本発明による非ヒト脊椎動物を免疫化する工程を含む、所定の抗原(例えば細菌またはウイルス病原体抗原)と結合する抗体を単離する方法を提供する。
【００２６】
第2の構成
抗体のレパートリーを集合的にコードするゲノムを有する抗体生成トランスジェニック細胞のライブラリーであって、
(a)第1のトランスジェニック細胞が、第1の免疫グロブリン遺伝子によりコードされる鎖を有する第1の抗体を発現し、遺伝子が、第1のヒト未再構成免疫グロブリン遺伝子セグメントの組換えの後に生成される第1の可変ドメインヌクレオチド配列を含み、
(b)第2のトランスジェニック細胞が、第2の免疫グロブリン遺伝子によりコードされる鎖を有する第2の抗体を発現し、第2の遺伝子が、第2のヒト未再構成免疫グロブリン遺伝子セグメントの組換えの後に生成される第2の可変ドメインヌクレオチド配列を含み、第1抗体および第2の抗体が、同一でなく、
(c)第1および第2の遺伝子セグメントが、異なり、それぞれ第1および第2のヒト個体のゲノム配列に由来し、個体が、異なり、場合により、関連せず、
(d)細胞が、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)細胞である
ライブラリー。
【００２７】
一実施形態では、第1および第2のヒト個体は、それぞれ第1および第2の人種集団のメンバーであり、集団が、異なり、場合により、人種集団が、1000 Genomesデータベースにおいて同定されるものから選択される。
【００２８】
別の実施形態では、第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、第1のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、第2の遺伝子セグメントは、以下のTable 1(表6-1〜表6-30)〜7(表12-1〜表12-3)および9(表14-1〜14-3)〜14(表24-1〜表32)のいずれかにおける遺伝子セグメントからなる群から選択され(例えばTable 13(表23-1〜23-226)またはTable 14(表24-1〜表32)から選択される)、例えば第2の遺伝子セグメントは、VH1-69の多型バリアントである。
【００２９】
第3の構成
(a)トランスジェニック非ヒト脊椎動物細胞における未再構成ヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントとヒトDおよびヒトJセグメントとの組換えと、場合により前記細胞における親和性成熟との後に生成されるヌクレオチド配列によりコードされる重鎖であって、遺伝子セグメントの1つが、第1のヒト人種集団の個体のゲノムに由来し、他の2つの遺伝子セグメントが、第2の異なるヒト人種集団の個体のゲノムに由来し、抗体が、前記非ヒト脊椎動物の重鎖定常領域(例えばげっ歯類、マウスまたはラット重鎖定常領域)を含む重鎖;および/あるいは
(b)トランスジェニック非ヒト脊椎動物細胞における未再構成ヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントとヒトJセグメントとの間の組換えと、場合により前記細胞における親和性成熟との後に生成されるヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖であって、遺伝子セグメントの1つが、第1のヒト人種集団(場合により、(a)における第1の集団と同じ)の個体のゲノムに由来し、他の遺伝子セグメントが、第2の異なるヒト人種集団(場合により、(a)における第2の集団と同じ)の個体のゲノムに由来し、抗体が、前記非ヒト脊椎動物の軽鎖定常領域(例えばげっ歯類、マウスまたはラット軽鎖定常領域)を含む軽鎖
を有し、
(c)場合により、抗体のそれぞれの可変ドメインが、ヒト可変ドメインであり、
(d)場合により、重鎖定常領域が、ガンマタイプ定常領域である、
単離抗体。
【００３０】
本発明は、抗体をコードする単離ヌクレオチド配列であって、場合により、抗体発現ベクター中、場合により宿主細胞中で提供される配列も提供する。
【００３１】
本発明は、第3の構成の抗体の非ヒト脊椎動物定常領域をヒト抗体定常領域で置き換える工程を含む、ヒト抗体を生成する方法も提供する。
【００３２】
本発明は、第3の構成による抗体、または上記の方法に従って生成される抗体と、希釈剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物であって、IV針もしくはシリンジに接続された容器またはIVバッグにおいて提供される組成物も提供する。
【００３３】
本発明は、上記構成のいずれか一つに記載の第2の抗体を発現する抗体生成細胞も提供する。
【００３４】
代替の構成では、本発明は、合成遺伝子セグメントを提供するための第1および第2の免疫グロブリン遺伝子セグメントのヌクレオチド配列の組み合わせ(例えば特定のヒト生殖系列VHまたはVL遺伝子セグメントの2以上の多型バリアント)を企図する。このような合成遺伝子セグメントを一実施形態で用いてトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を構築し、ここで、該合成遺伝子セグメントは、定常領域の上流に作動可能に接続した1または複数のヒト可変およびJ領域(および場合により1または複数のヒトD領域)との組み合わせで提供される。非ヒト脊椎動物のゲノムまたは細胞(例えばマウスまたはラット細胞、例えばES細胞)において提供される場合、本発明は、超ヒト遺伝子セグメント多様性を提供する。組み合わされる配列は、特定の抗原(例えば赤血球凝集素のようなインフルエンザ抗原)に対して産生されたヒト抗体において一般的に用いられることが観察されている遺伝子セグメントから選択できる。配列を組み合わせることにより、合成遺伝子セグメントはin vivoで組み換えられて、前記抗原が媒介する疾患または状態(例えばインフルエンザ)の処置および/または防止に適切な抗体を生成できる。
【００３５】
第4の構成
ヒト遺伝子セグメントJH6*02と、1または複数のVH遺伝子セグメントと、1または複数のD遺伝子セグメントとを定常領域の上流に含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(場合によりマウスまたはラット)または脊椎動物細胞であって、重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントが、ヒトJH6*02とDセグメントおよびVHセグメントとの組換えにより生成される抗体重鎖をマウスが生成できるように定常領域に作動可能に連結している非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【００３６】
ヒト遺伝子セグメントJH6*02と、1または複数のVH遺伝子セグメントと、1または複数のD遺伝子セグメントとを定常領域の上流に含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物細胞(場合によりマウス細胞またはラット細胞)であって、重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントが、ヒトJH6*02とDセグメントおよびVHセグメントとの組換えにより生成される抗体重鎖を(例えば後続の子孫細胞において)生成するために定常領域に作動可能に連結している非ヒト脊椎動物細胞。
【００３７】
少なくとも20アミノ酸のHCDR3を含む、本発明の脊椎動物から単離された重鎖(例えば抗体に含まれる)。
【００３８】
標的抗原に特異的な重鎖、VHドメインまたは抗体を生成するための方法であって、本発明による非ヒト脊椎動物を抗原で免疫化する工程と、標的抗原に特異的な重鎖、VHドメインもしくは抗体または重鎖、VHドメインもしくは抗体を生成する細胞を単離する工程とを含み、重鎖、VHドメインまたは抗体が、ヒトJH6*02とVH遺伝子セグメントおよびD遺伝子セグメントとの組換えに由来するHCDR3を含む方法。
【００３９】
前記方法により生成される重鎖、VHドメインまたは抗体。
【００４０】
前記重鎖のVHドメインと同一の重鎖VHドメインを発現するB細胞またはハイブリドーマ。
【００４１】
請求項22、23もしくは28に記載の重鎖のVHドメインをコードするかまたは前記重鎖をコードする核酸。
【００４２】
前記核酸を含み、場合により宿主細胞(例えばCHO細胞またはHEK293細胞)中にあるベクター(例えばCHO細胞またはHEK293細胞ベクター)。
【００４３】
前記抗体、重鎖またはVHドメイン(例えば抗体に含まれる)を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、重鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【００４４】
医学において使用するための、上記の抗体、重鎖またはVHドメイン(例えば抗体に含まれる)。
【００４５】
ヒトにおける医学的状態を処置および/または防止するための医薬品の製造における、上記の抗体、重鎖またはVHドメイン(例えば抗体に含まれる)の使用。
【００４６】
第5の構成
(a)抗原特異的重鎖可変ドメインを提供する工程と、
(b)可変ドメインをヒト重鎖定常領域と組み合わせて、可変ドメインおよび定常領域を(N末端からC末端方向に)含む抗体重鎖を生成する工程と
を含み、
ヒト重鎖定常領域が、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4refまたはIGHG4a定常領域である、抗体重鎖を生成する方法。
【００４７】
ヒト重鎖を含む抗体であって、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4refまたはIGHG4a定常領域である定常領域とを含む抗体。場合により、可変ドメインはマウスAID-パターン体細胞変異を含む。
【００４８】
リーダー配列と、抗原に特異的なヒト可変ドメインと、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4refまたはIGHG4a定常領域であるヒト定常領域とを(N末端からC末端方向に)含むポリペプチドであって、(i)リーダー配列が、天然ヒト可変ドメインリーダー配列でなく、かつ/または(ii)可変ドメインが、マウスAID-パターン体細胞変異および/もしくはマウス末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン接合部変異を含むポリペプチド。
【００４９】
リーダー配列とヒト抗体重鎖とを(5'から3'の方向に)コードするヌクレオチド配列であって、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4refまたはIGHG4a定常領域である定常領域とを含み、リーダー配列が、重鎖の発現を作動可能であり、リーダー配列が、天然ヒト可変ドメインリーダー配列でないヌクレオチド配列。
【００５０】
プロモーターとヒト抗体重鎖とを(5'から3'の方向に)コードするヌクレオチド配列であって、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4refまたはIGHG4a定常領域である定常領域とを含み、プロモーターが、重鎖の発現を作動可能であり、プロモーターが、天然ヒトプロモーターでないヌクレオチド配列。
【００５１】
ヒト抗体重鎖可変ドメインヌクレオチド配列の挿入のためのクローニング部位の3'にIGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4refまたはIGHG4a定常領域ヌクレオチド配列を含み、そのことにより、このような可変ドメイン配列を挿入すると、ベクターが宿主細胞中に存在する場合にヒト抗体重鎖を発現できるように、ベクターがプロモーターとリーダー配列と可変ドメイン配列と定常領域配列とを(5'から3'の方向に)含むようになるベクター(例えばCHO細胞またはHEK293細胞ベクター)。
【００５２】
第6の構成
同じタイプの少なくとも3つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも3つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも3つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、ヒト遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【００５３】
同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【００５４】
同じタイプの少なくとも2つの異なるヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒト遺伝子セグメントを含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、第3の遺伝子セグメントが、前記2つの異なる遺伝子セグメントの一方とシスにある非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【００５５】
ヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、複数のものが、同じタイプの少なくとも2つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含み、前記異なる遺伝子セグメントの第1の遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なる遺伝子セグメントの第2の遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2の遺伝子セグメントを含まない集団。
【００５６】
同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【００５７】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも3つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも3つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも3つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、ヒト遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである方法。
【００５８】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含む方法。
【００５９】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒト遺伝子セグメントを含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、第3の遺伝子セグメントが、前記2つの異なる遺伝子セグメントの一方とシスにある方法。
【００６０】
増進されたヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントレパートリーを提供する方法であって、ヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)を提供する工程を含み、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を提供する工程を含み、前記異なる遺伝子セグメントの第1の遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なる遺伝子セグメントの第2の遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2の遺伝子セグメントを含まない方法。
【００６１】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する方法。
【００６２】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にて提供される方法。
【００６３】
同じタイプの第1および第2のヒトIg遺伝子座遺伝子セグメント(例えば第1および第2のヒトJH6遺伝子セグメント;または第1および第2のIgG2遺伝子セグメント;または第1および第2のヒトJλ7遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、第1の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)および9(表14-1〜表14-3)〜14(表24-1〜表32)(例えばTable 13(表23-1〜表23-226)またはTable 14(表24-1〜表32)から選択される)(例えばIGHJ6-a)のいずれか1つから選択される遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列である、非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【００６４】
同じタイプの第1および第2のヒトIg遺伝子座遺伝子セグメント(例えば第1および第2のヒトJH6遺伝子セグメント;または第1および第2のIgG2遺伝子セグメント;または第1および第2のヒトJλ7遺伝子セグメント)を含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、第1の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)および9(表14-1〜表14-3)〜14(表24-1〜表32)(例えばTable 13(表23-1〜表23-226)またはTable 14(表24-1〜表32)から選択される)(例えばIGHJ6-a)のいずれか1つから選択される遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列であり、第1の遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第2の遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供される集団。
【００６５】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの第1および第2のヒトIg遺伝子座遺伝子セグメント(例えば第1および第2のヒトJH6遺伝子セグメント;または第1および第2のIgG2遺伝子セグメント;または第1および第2のヒトJλ7遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、第1の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)および9(表14-1〜表14-3)〜14(表24-1〜表32)(例えばTable 13(表23-1〜表23-226)またはTable 14(表24-1〜表32)から選択される)(例えばIGHJ6-a)のいずれか1つから選択される遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列である方法。
【００６６】
本構成の一態様では、本発明は、以下にさらに記載するヒトD遺伝子セグメントバリアントに関する。
【００６７】
本構成の一態様では、本発明は、以下にさらに記載するヒトV遺伝子セグメントバリアントに関する。
【００６８】
本構成の一態様では、本発明は、以下にさらに記載するヒトJ遺伝子セグメントバリアントに関する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】マウスゲノムにV遺伝子セグメントを付加するためのリコンビニアリングされた(recombineered)BACベクターを生成するためのプロトコールを模式的に示す。
【図２】マウスゲノムにV遺伝子セグメントを付加するためのリコンビニアリングされたBACベクターを生成するためのプロトコールを模式的に示す。
【図３】マウスゲノムにV遺伝子セグメントを付加するためのリコンビニアリングされたBACベクターを生成するためのプロトコールを模式的に示す。
【図４】逐次的リコンビナーゼ媒介カセット交換(sRMCE)を用いてマウスゲノムにV遺伝子セグメントを付加するためのプロトコールを模式的に示す。
【図５Ａ】(4部にわたる):可変(V)コード領域だけを示す13のIGHV1-69バリアントのアラインメント。VH1-69バリアント*01とは異なるヌクレオチドを適当な位置に示し、同一のヌクレオチドはダッシュで印を付す。ヌクレオチド変化がアミノ酸の差をもたらす場合、対応するトリプレットの上にコードされるアミノ酸を示す。箱で囲んだ領域は、示すとおり、CDR1、CDR2およびCDR3に相当する。
【図５Ｂ】図５Ａ参照。
【図５Ｃ】図５Ａ参照。
【図５Ｄ】図５Ａ参照。
【図６】遺伝子セグメント多様性および本発明に従ってバリアントをシスに含むことの効果を模式的に示す。(a)正常な人における状況:同じ染色体上の組換えは、バリアントの組み合わせを制限し、例えば抗体遺伝子V4-4は、バリアント1内でのみ組み換えることができて、例えばV4-4-D-J6またはV4-4-D-J2Aを形成する。同様に、バリアントV4-4Aは、バリアント1からのJ6またはJ2Aと組み換えることができず、バリアント2からのJ遺伝子とのみ連結できて、V4-4A-D-J6AおよびV4-4A-D-J2を形成する。V4-4-J2/J6複雑度=4。(b)トランスジェニックマウスにおける状況:1つのバリアントのみが提供されるので、ゲノムは制限される。V4-4-J6/J2複雑度=2。(c)本発明の超マウス(Supra mouse):バリアントがシスに付加され、よって、全ての組み合わせにおいて組み換えることができ、レパートリーを拡張できる。例えば、V4-4は、J6A、J6、J2AまたはJ2と組み合わせることができ、同様に、V4-4Aは、これらの同じJ遺伝子と組み換えることができる。V4-4-J6/J2複雑度=8(これは、この単純な例において、人の2倍および単一バリアントを有するマウスの4倍である)。
【図７】ヒトJH6*02バリアントのアラインメント。JH6*01とは異なるヌクレオチドを適当な位置に示し、同一のヌクレオチドはダッシュで印を付す。ヌクレオチド変化がアミノ酸の差をもたらす場合、コードされるアミノ酸を上に示す。受託番号(例えばJ00256)を、IMGTバリアント名の左に示す。
【図８】多様な種からのJH配列のアラインメント。
【図９】コドン表。
【図１０】BACデータベース抜粋。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
表の簡単な説明
Table 1(表6-1〜表6-30):ヒトIgH V多型バリアント
Table 2(表7-1〜表7-5):ヒトIgH D多型バリアント
Table 3(表8-1〜表8-3):ヒトIgH J多型バリアント
Table 4(表9-1〜表9-13):ヒトIg Vκ多型バリアント
Table 5(表10-1〜表10-12):ヒトIg Vλ多型バリアント
Table 6(表11-1〜表11-2):ヒトIgH Jκ多型バリアント
Table 7(表12-1〜表12-3):ヒトIgH Jλ多型バリアント
Table 8(表13-1〜表13-2):1000 Genomesプロジェクトヒト集団
Table 9(表14-1〜表14-3):感染性疾患病原体に対するヒト抗体応答における免疫グロブリン遺伝子使用
Table 10A(表15-1〜表15-3):ヒトIgH JH5バリアント出現率
Table 10B(表16-1〜表16-3):非同義ヒトIgH JH5バリアント
Table 11A(表17-1〜表17-2):ヒトIgH JH6バリアント出現率
Table 11B(表18-1〜表19-2):非同義ヒトIgH JH6バリアント
Table 12A(表21):ヒトIgH JH2バリアント出現率
Table 12B(表22-1〜表22-2):非同義ヒトIgH JH2バリアント
Table 13(表23-1〜表23-226):バリアント頻度分析およびヒト集団分布
Table 14(表24-1〜表32):高頻度ヒトバリアント分布
Table 15(表33-1〜表35-2):ヒト遺伝子セグメント使用:ナイーブ非ヒト脊椎動物からの重鎖レパートリー
Table 16(表36-1〜表38-2):ヒト遺伝子セグメント使用:免疫化非ヒト脊椎動物からの重鎖レパートリー
Table 17(表39-1〜表40-2):ヒト遺伝子セグメント使用:抗原特異的ハイブリドーマからの重鎖レパートリー
Table 18(表41-1〜表41-18):配列相関関係表
Table 19(表42):ヒトガンマ定常領域サブタイプと相関する機能のまとめ
Table 20(表43-1〜表46):ヒト集団にほとんど普及していない遺伝子セグメント
Table 21(表47-1〜表47-8):ゲノムおよび配列情報
【００７１】
本発明で用いるためのJH6*02およびその他のヒトDNA配列の適切な供給源は、当業者にとって直ちに明確である。例えば、同意したヒトドナー(例えば本明細書中の実施例のとおりの頬スワブ試料)からDNA試料を回収することが可能であり、該試料から、本発明の遺伝子座の構築に用いるための適切なDNA配列を得ることができる。ヒトDNAのその他の供給源は、当業者に知られるように、商業的に入手可能である。代わりに、当業者は、本明細書に開示するヒトIg遺伝子セグメント配列の1または複数のデータベースを参照することにより、遺伝子セグメント配列を構築できる。
【００７２】
本発明によるヒトV、DおよびJ遺伝子セグメントの供給源の例は、Roswell Park Cancer Institute(RPCI)/Invitrogenから得られる細菌人工染色体(RPCI-11 BAC)である。以下のBACについて記載しているhttp://bacpac.chori.org/hmale11.htmを参照されたい。
【００７３】
「RPCI-11ヒト男性BACライブラリー」
RPCI-11ヒト男性BACライブラリー(Osoegawaら、2001)は、Kazutoyo Osoegawaにより開発された改良クローニング技術(Osoegawaら、1998)を用いて構築された。該ライブラリーは、Kazutoyo Osoegawaにより作製された。構築は、National Human Genome Research Institute(NHGRI、NIH)からの助成金から資金を受けた(#1R01RG01165-03)。このライブラリーは、新しいNHGRI/DOE「大規模DNA配列決定におけるヒト対象についてのガイドライン」に従って作製された。
「男性の血液を二重盲検選択プロトコールにより得た。男性血液DNAを、ランダムに選択した1名のドナー(10名の男性ドナーのうち)から単離した。」
・Osoegawa K、Mammoser AG、Wu C、Frengen E、Zeng C、Catanese JJ、de Jong PJ;Genome Res. 2001年3月;11(3):483〜96頁;「A bacterial artificial chromosome library for sequencing the complete human genome」;
・Osoegawa, K.、Woon, P.Y.、Zhao, B.、Frengen, E.、Tateno, M.、Catanese, J.Jおよびde Jong, P.J. (1998);「An Improved Approach for Construction of Bacterial Artificial Chromosome Libraries」; Genomics 52、1〜8頁。
【００７４】
超ヒト免疫グロブリン遺伝子レパートリー
本発明は、広く合成され、人種多様性がある超ヒト免疫グロブリン遺伝子レパートリーに関する。ヒト免疫グロブリンレパートリーは、自然に見出されるものを超えており(すなわち「超ヒト」)、例えば、自然のヒトレパートリーよりも多様性が高いか、または自然でない様式で、共通性のない供給源からのヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの組み合わせを含む。つまり、本発明のレパートリーは、「超ヒト」免疫グロブリンレパートリーであり、本発明は、キメラ抗体(これらを、組換えDNA技術を用いて完全ヒト単離抗体に変換する可能性がある)を生成するためにトランスジェニック細胞および非ヒト脊椎動物においてこれらを用いることに関する。本発明は、よって、新規で潜在的に拡張された合成免疫グロブリン多様性を提供し、該多様性は、多様性のプールを提供し、このプールから、抗体治療薬のリード(抗体治療薬および抗体ツール試薬)を選択できる。このことは、トランスジェニックヒト-マウス/ラット技術の潜在能力を、今まで可能であったものとは異なる、そしておそらくより大きい抗体配列空間を照合する可能性に広げる。このために、一実施形態では、本発明は、SUPERHUMAN MOUSE(商標)(すなわちSUPRA-MOUSE(商標))およびSUPERHUMAN RAT(商標)(すなわちSUPRA-RAT(商標))を提供する。
【００７５】
この考えを発展させることにおいて、本発明者らは、HapMapプロジェクト、1000 Genomesプロジェクトおよび様々なその他の免疫グロブリン遺伝子データベース(詳細について以下を参照されたい)のような努力によって当業者が現在利用可能である莫大な遺伝子資源を調べる可能性に気付いた。よって、いくつかの実施形態では、本発明者らは、本発明においてこれらのゲノム配列決定における発展を用いて、合成により生成され、人種多様性がある人工免疫グロブリン遺伝子レパートリーを作製することに気付いた。一態様では、本発明者らは、このようなレパートリーが、親和性および/もしくは生物物理学的特徴が改良された抗体の生成のために有用であり、かつ/またはこのようなレパートリーにより生成されるエピトープ特異性の範囲が新規であり、従来は従来のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座により相互作用可能であったかもしくは対処することが困難であったエピトープに対する抗体を提供することに気付いた。
【００７６】
本発明は、トランスジェニックマウスもしくはラットまたはトランスジェニックマウスもしくはラット細胞のようなライブラリー、脊椎動物および細胞を提供する。さらに、本発明は、抗体または抗体をコードするヌクレオチド配列を単離するために脊椎動物を用いる方法に関する。本発明は、抗体、ヌクレオチド配列、医薬組成物および使用も提供する。
【００７７】
変動分析
本発明者らは、遺伝子変動分析の能力を活用する方法および抗体遺伝子座設計に気付いた。参照ヒトゲノムは、ヒト試料の実験作業および遺伝子分析のための基礎を提供する。参照ヒトゲノムは、少数の個体からのゲノムを編纂したものであり、ゲノムのいずれの1つのセグメントについても、2つの染色体の一方についての高い質の単一参照ゲノムが利用可能である。参照ゲノムは、一連の非常に大きい挿入クローンから組み立てられたので、これらのクローンのアイデンティティはわかっている。したがって、ヒトゲノムDNAを用いる実験作業は、参照配列が由来したクローンについて通常行われる。
【００７８】
個別のヒトは配列が異なり、最近では、いくつかの個体、例えばJames WatsonおよびCraig Venterのゲノムが配列決定されている。これらの個体のゲノム配列の比較は、ゲノムのコード部分および非コード部分の両方におけるこれらの配列と参照ゲノムとの間の差を明らかにし、およそ1000塩基のうち1つが異なる。いくつかのバリアントは重要であり、個体間の差に貢献する。極端な場合では、これらは遺伝性疾患をもたらす。変動は、例えば処置に対する患者の応答の望ましくない低下をもたらす、ヒト患者に投与された薬物に対する応答の違いに関わることができる。
【００７９】
1000-Genomesプロジェクトは、ヒトゲノムにおける最も高頻度な変動を同定することを目的とする。この公共ドメインプロジェクトは、多様な人種群からの1000を超える個体のゲノムを配列決定し、これらの配列を参照と比較し、バリアントのカタログを組み立てることを含んだ。このことにより、バリアントをコード領域にアノテートできたが、この配列はDNAの大きいクローンに由来しなかったので、二倍体個体からの配列の分析は、母系遺伝染色体と父系遺伝染色体との間の変動の分布を区別できない。1より多いバリアントがタンパク質コード遺伝子において同定される場合、各バージョンのタンパク質においてバリアントのパターンの分布を明らかにすることができない。例えば、2つのバリアントがある個体における同じタンパク質の異なる位置で検出されるならば、これは、2つのバリアントを有する1コピーに起因して他のものには起因しないか、または各コピーが1つだけのバリアントを有し得る。実際のタンパク質の配列を明らかにするために、1000-Genomeプロジェクトは、母-父-子のトリオを配列決定した。このことにより、配列バリアントを「位相決定する」ことが可能になり、言い換えると、一方または他方の親から受け継いだ配列のブロックを同定し、バリアントの絡まりを解くができる。
【００８０】
1000-genomeセット内の変動をさらに理解するために、1000-genomeデータセット内の位相決定されたデータからのDNAの領域から著しいバリアント(非同義アミノ酸変化と定義される)を同定できるツールが開発された。このツールは、オンラインhttp://www.1000genomes.org/variation-pattern-finderで利用可能になった。このツールにより、研究者は、特定の座標間で範囲が定められた非同義変動をダウンロードできる。ダウンロードしたファイルは、個別の遺伝子型として構成されるが、データは位相決定されるので、ハプロタイプ情報および異なる集団における特定のハプロタイプの頻度は抽出できる。
【００８１】
重鎖および軽鎖からのC、V、DおよびJ遺伝子の個別のヒトコードセグメントについて1000-genomeデータを本発明者らが分析した結果、これらのセグメントにおいて著しい変動があることが明らかになる。個体は、2つの異なる重鎖対立遺伝子と、カッパおよびラムダ遺伝子座の両方にて異なる軽鎖対立遺伝子とを有する。それぞれの対立遺伝子から作製できる抗体のレパートリーは異なる。この変動が、あるいくつかの抗原に対するよりよいまたは異なる免疫応答に貢献する。
【００８２】
免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座を用いて従来作製されたヒト化マウスは、1つのタイプのみの免疫グロブリン遺伝子座を含有する。これらのマウスが完全ヒト重鎖遺伝子座を含有していたとしても、変動は、典型的なヒトに含まれるものよりも小さい。なぜなら、1セットだけのC、V、DおよびJ遺伝子が利用可能であるが、典型的なヒトは2セットを有するからである。
【００８３】
本発明者らは、in vivoヒト抗体および可変領域生成のためにトランスジェニック非ヒト脊椎動物および細胞を構築する場合にこの制限について改良を加える方法を考案した。
【００８４】
マウスは、V、DおよびJセグメントの異なるレパートリーをそれぞれが有するように工学的に操作された2つの異なる遺伝子座を有するように作製できる。これは、単一マウスまたは2以上の別々のマウス株において可能であり、通常のヒトにおいて見出されるレパートリーと類似するか、または該レパートリーを超えることがある。このようなマウスを工学的に操作することは、1セットの対立遺伝子だけを有する今までのヒト化マウスについて記載されたレパートリーを超えることになる。
【００８５】
しかし、本発明者らは、このことも制限を有することに気付いた。なぜなら、異なる遺伝子座は、遺伝子座間でV、DおよびJバリアントをシャッフルするように通常は相互作用しないからである。この同じ制限は、ヒトにおいても固有であり、よって、この系は、全ての組み合わせにおいてバリアントを組み換える利点を利用していない。
【００８６】
ヒトにおける通常のレパートリーを超え、C、V、DおよびJバリアントの組み合わせの利点を生かすために、本発明者らは、一実施形態では、これらを同じ染色体上でシスに提供することを決定した。図6を参照されたい。これらの遺伝子座は、通常の数より多いJ、DまたはV遺伝子を有することを特徴とすることがある。例えば、J遺伝子についてn=6であるが、1つのJ6バリアントと1つのJ2バリアントを含めることにより、これがn=8に増加する。このことは、例えばDおよびV遺伝子についてのさらなるバリアントと組み合わせることができる。1000-Genomesデータベースの詳細な分析により、本発明者らは、ヒト可変領域のますます多様性が高い新しい合成レパートリーを発現するためのマウスにおけるトランスジェニック重鎖および軽鎖遺伝子座の設計に構築できる候補多型ヒトバリアント遺伝子セグメント、例えばJH遺伝子セグメント(例えば実施例を参照されたい)のコレクションを考案した。さらに、本発明の実施形態のように自然に存在するヒトバリアント遺伝子セグメントを利用することにより、このことは、ヒト患者との適合性に対処する。なぜなら、本発明者らの分析は、ヒト人種集団の間で自然に保存され、時折非常に普及している候補バリアントを引き出したからである。さらに、このことにより、特定のヒト人種集団によりよく対処する抗体に基づく薬物を提供するために本発明の構成を作ることができる。
【００８７】
本発明の任意の構成に従う例では、異なるヒト集団からの遺伝子セグメントが用いられる遺伝子座(ならびに細胞およびこれらを含む脊椎動物)が提供される。このことは、より多様なヒト患者によりよく対処するために抗体遺伝子多様性を増加するために望ましい。ある例では、遺伝子セグメントは、それぞれ第1および第2の異なるヒト集団からであり、よって、第2の遺伝子セグメントは、第2のヒト集団で見出されるが、第1のヒト集団においては見出されない(または希である)。「希な」とは、例えば、遺伝子セグメントが、1000 Genomesデータベースにおける第1の集団において5、4、3、2もしくは1またはゼロの個体で見出されることを意味する。例えば、第1の遺伝子セグメントは、本明細書中のTable 13(表23-1〜表23-226)または14(表24-1〜表32)を参照することにより第1の集団に存在すると示されることがあり、第2の遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜表23-226)を参照することにより第2の集団に存在するが、第1の集団に存在しないと示されることがある。場合により、第1の遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜表23-226)または14(表24-1〜表32)を参照することにより第2の集団に存在すると示されることもある。
【００８８】
V遺伝子セグメントを用いる本発明のいずれの構成または態様でも、これは、場合により天然リーダー配列とともに用いてよい。例えば、ゲノムDNA(例えば実施例におけるようにBACから)の使用は、本発明の遺伝子座およびゲノムに組み込まれたそれぞれのV遺伝子セグメントについて天然リーダーを用いることを意味する。代替では、当業者は、V遺伝子セグメントの1または複数と一緒に非天然リーダー配列を挿入することを望むことがある。同様に、V遺伝子セグメントを用いる本発明のいずれの構成または態様でも、これは、場合により天然5'UTR配列とともに用いてよい。例えば、ゲノムDNA(例えば実施例におけるようにBACから)の使用は、本発明の遺伝子座およびゲノムに組み込まれたそれぞれのV遺伝子セグメントについて天然5'UTR配列を用いることを意味する。代替では、当業者は、天然5'UTR配列を排除することを望むことがある。
【００８９】
本発明は、第1の構成において、以下のものを提供する。
(a)超ヒト重鎖遺伝子レパートリー
超ヒト免疫グロブリン重鎖ヒトVHおよび/またはDおよび/またはJ遺伝子レパートリーを有するゲノムを含む非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)。
【００９０】
一態様では、本発明の細胞は、胚性幹細胞である。例えば、ES細胞は、マウスC57BL/6N、C57BL/6J、129S5または129Sv株に由来する。一態様では、非ヒト脊椎動物は、げっ歯類、適切にはマウスであり、本発明の細胞は、げっ歯類細胞またはES細胞、適切にはマウスES細胞である。本発明のES細胞は、当該技術において公知の技術を用いて動物を作製するために用いることができ、該技術は、ES細胞を胚盤胞に注入し、その後、キメラ胚盤胞を雌に移植して、育種してかつ要求される挿入を有するホモ接合性組換え体について選択できる子孫を生成することを含む。一態様では、本発明は、ES細胞由来組織および宿主胚由来組織を含むトランスジェニック動物に関する。一態様では、本発明は、遺伝子改変された後続世代動物に関し、該動物は、VDJおよび/またはVJ領域についてのホモ接合性組換え体を有する動物を含む。
【００９１】
自然のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントレパートリーは、以下のものからなる(例えばwww.imgt.orgを参照されたい):
VH:合計-125;機能的-41
DH:合計-27;機能的-23
JH:合計-8;機能的-6
Vκ:合計-77;機能的-38
Jκ:合計-5;機能的-5
Vラムダ:合計-75;機能的-31
Jラムダ:合計-7;機能的-5。
【００９２】
一実施形態では、脊椎動物または細胞ゲノムは、複数のヒト免疫グロブリンVH遺伝子セグメントと、1または複数のヒトD遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含むトランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、ここで、複数のVH遺伝子セグメントは、自然のヒトレパートリーより多くの機能的VH遺伝子セグメントからなり、場合により、ゲノムは、前記トランスジェニック重鎖遺伝子座についてホモ接合性である。
【００９３】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、VH遺伝子レパートリーは、第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のVH遺伝子セグメントと、それに補足される第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数の異なるVH遺伝子セグメントとからなる。場合により、DおよびJセグメントは、第1のヒト個体のゲノム配列に由来する。場合により、第2の個体のゲノム配列からのVH遺伝子セグメントは、Table 1(表6-1〜表6-30)、13(表23-1〜表23-226)または14(表24-1〜表32)に列挙するVH遺伝子セグメントから選択される。このようにして、遺伝子座は、D遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【００９４】
場合により、個体は関連しない。例えば、個体のうちの1つが同じ世代または1、2、3もしくは4世代前の世代において他の個体の家系図に出現しないならば、本発明の任意の構成または態様の関係において個体は「関連しない」。代わりに、例えば、現在の世代または1、2、3もしくは4世代前の世代においてこれらが共通の祖先を有さないならば、これらは関連しない。
【００９５】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、トランスジェニック遺伝子座は、41より多い、よって、自然のヒト機能的レパートリーより多くの機能的ヒトVH遺伝子セグメント種を含む。場合により、遺伝子座は、少なくとも42、43、44、45、46、47、48、49または50の機能的ヒトVH遺伝子セグメント種を含む(例えば、遺伝子座は、前記第1の個体の完全機能的VHレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVH遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVH遺伝子セグメントとを含む)。このようにして、遺伝子座は、治療用およびツール抗体選択に用いるための新規な遺伝子および抗体多様性を作製するために有用なVH遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【００９６】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、トランスジェニック遺伝子座は、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のVH遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のVH遺伝子セグメントとを含み、ここで、該第2のVH遺伝子セグメントは、第1のVH遺伝子セグメントの多型バリアントである。例えば、VH遺伝子セグメントは、以下の実施例に示すように、VH1-69の多型バリアントである。場合により、遺伝子座は、第1のVH遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば、第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含む。このようにして、遺伝子座は、VH遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【００９７】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、ゲノム(超ヒトVH多様性の代わりにまたは超ヒトVH多様性に加えて)は、複数のヒト免疫グロブリンVH遺伝子セグメントと、複数のヒトD遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含むトランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、ここで、複数の該D遺伝子セグメントは、自然のヒトレパートリーより多くの機能的D遺伝子セグメントからなる。場合により、ゲノムは、前記トランスジェニック重鎖遺伝子座についてホモ接合性である。
【００９８】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、D遺伝子レパートリーは、ある(または前記)第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のD遺伝子セグメントと、それに補足されるある(または前記)第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数の異なるD遺伝子セグメントとからなる。場合により、個体は、関連しない。場合により、Jセグメントは、第1のヒト個体のゲノム配列に由来する。場合により、第2の個体のゲノム配列からのD遺伝子セグメントは、Table 2(表7-1〜表7-5)、13(表23-1〜表23-226)または14(表24-1〜表32)に列挙するD遺伝子セグメントから選択される。このようにして、遺伝子座は、D遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【００９９】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、トランスジェニック遺伝子座は、23より多い機能的ヒトD遺伝子セグメント種を含み、場合により、該遺伝子座は、少なくとも24、25、26、27、28、29、30または31の機能的ヒトD遺伝子セグメント種を含む(例えば、遺伝子座は、前記第1の個体の完全機能的Dレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のD遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のD遺伝子セグメントとを含む)。このようにして、遺伝子座は、D遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【０１００】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、トランスジェニック遺伝子座は、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のD遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のD遺伝子セグメントとを含み、ここで、該第2のD遺伝子セグメントは、第1のD遺伝子セグメントの多型バリアントである。場合により、遺伝子座は、第1のD遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば、第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含む。このようにして、遺伝子座は、D遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【０１０１】
脊椎動物または細胞の一実施形態では(超ヒトVHおよび/もしくはJH多様性の代わりにまたは超ヒトVHおよび/もしくはJH多様性に加えて)、ゲノムは、複数のヒト免疫グロブリンVH遺伝子セグメントと、1または複数のヒトD遺伝子セグメントと、複数のヒトJH遺伝子セグメントとを含むある(または前記)トランスジェニック免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、ここで、複数の該J遺伝子セグメントは、自然のヒトレパートリーより多くの機能的J遺伝子セグメントからなり、場合により、該ゲノムは、前記トランスジェニック重鎖遺伝子座についてホモ接合性である。
【０１０２】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、JH遺伝子レパートリーは、ある(または前記)第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のJ遺伝子セグメントと、それに補足されるある(または前記)第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数の異なるJ遺伝子セグメントとからなる。場合により、個体は、関連しない。場合により、Dセグメントは、第1のヒト個体のゲノム配列に由来する。場合により、第2の個体のゲノム配列からのJ遺伝子セグメントは、Table 3(表8-1〜表8-3)、13(表23-1〜表23-226)または14(表24-1〜表32)に列挙するJ遺伝子セグメントから選択される。このようにして、遺伝子座は、JH遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【０１０３】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、トランスジェニック遺伝子座は、6より多い機能的ヒトJH遺伝子セグメントを含む。場合により、遺伝子座は、少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15または16の機能的ヒトJH遺伝子セグメントを含む(例えば、遺伝子座は、前記第1の個体の完全機能的JHレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJH遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJH遺伝子セグメントとを含む)。このようにして、遺伝子座は、JH遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【０１０４】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、トランスジェニック遺伝子座は、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のJH遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のJH遺伝子セグメントとを含み、ここで、該第2のJH遺伝子セグメントは、第1のJH遺伝子セグメントの多型バリアントである。場合により、遺伝子座は、第1のJH遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば、第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含む。このようにして、遺伝子座は、JH遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【０１０５】
(b)超ヒト軽鎖遺伝子レパートリー
本発明の第1の構成は、以下も提供する:
超ヒト免疫グロブリン軽鎖ヒトVL遺伝子レパートリーを有するゲノムを含む非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)。場合により、脊椎動物または細胞は、第1の構成の態様(a)に従う重鎖導入遺伝子を含む。よって、超ヒト多様性は、細胞および脊椎動物における重鎖および軽鎖の両方の免疫グロブリン遺伝子セグメントにおいて提供される。例えば、細胞または脊椎動物のゲノムは重鎖および軽鎖導入遺伝子についてホモ接合性であり、内因性抗体発現は、不活性化される。このような脊椎動物は、所定の抗原で免疫化して、抗原と結合し、超ヒト遺伝子セグメントレパートリー内の組換えに起因するヒト可変領域を有する1または複数の選択された抗体を生成するために有用である。このことは、新規な抗体および遺伝子配列空間を潜在的に提供し、ここから治療的、予防的およびツールの抗体が選択される。
【０１０６】
第1の構成の態様(b)の一実施形態では、脊椎動物または細胞ゲノムは、以下を含む:
(i)複数のヒト免疫グロブリンVκ遺伝子セグメントと1または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含むトランスジェニック免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子座であって、複数のVκ遺伝子セグメントが、自然のヒトレパートリーより多くの機能的Vκ遺伝子セグメントからなり、場合により、ゲノムが、前記トランスジェニックカッパ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性であるトランスジェニック免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子座、および/あるいは
(ii)複数のヒト免疫グロブリンVλ遺伝子セグメントと1または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含むトランスジェニック免疫グロブリンラムダ軽鎖遺伝子座であって、複数のVλ遺伝子セグメントが、自然のヒトレパートリーより多くの機能的Vλ遺伝子セグメントからなり、場合により、ゲノムが、前記トランスジェニックラムダ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性であるトランスジェニック免疫グロブリンラムダ軽鎖遺伝子座。
【０１０７】
このようにして、遺伝子座は、VL遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【０１０８】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、以下のとおりである。
(i)Vκ遺伝子レパートリーは、ある第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のVκ遺伝子セグメントと、それに補足されるある第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVκ遺伝子セグメントとからなり、場合により、個体は、関連せず、場合により、Jセグメントは、第1のヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、第2の個体のゲノム配列に由来するVκ遺伝子セグメントは、Table 4(表9-1〜表9-13)、13(表23-1〜表23-226)または14(表24-1〜表32)に列挙するVκ遺伝子セグメントから選択され、
(ii)Vλ遺伝子レパートリーは、ある第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のVλ遺伝子セグメントと、それに補足されるある第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVλ遺伝子セグメントとからなり、場合により、個体は、関連せず、場合により、Jセグメントは、第1のヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、第2の個体のゲノム配列に由来するVλ遺伝子セグメントは、Table 5(表10-1〜表10-12)に列挙するVλ遺伝子セグメントから選択される。
【０１０９】
このようにして、遺伝子座は、VL遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【０１１０】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、以下のとおりである。
-カッパ軽鎖トランスジェニック遺伝子座は、38より多い機能的ヒトVκ遺伝子セグメント種を含み、場合により、遺伝子座は、少なくとも39、40、41、42、43、44、45、46、47または48の機能的ヒトVκ遺伝子セグメント種を含み(例えば、遺伝子座は、前記第1の個体の完全機能的Vκレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVκ遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVκ遺伝子セグメントとを含む);
-ラムダ軽鎖トランスジェニック遺伝子座は、31より多い機能的ヒトVλ遺伝子セグメント種を含み、場合により、遺伝子座は、少なくとも32、33、34、35、36、37、38、39、40または41の機能的ヒトVλ遺伝子セグメント種を含む(例えば、遺伝子座は、前記第1の個体の完全機能的Vλレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVλ遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のVλ遺伝子セグメントとを含む)。
【０１１１】
このようにして、遺伝子座は、VL遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【０１１２】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、以下のとおりである。
-カッパ軽鎖トランスジェニック遺伝子座は、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のVκ遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のVκ遺伝子セグメントとを含み、第2のVκ遺伝子セグメントは、第1のVκ遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、遺伝子座は、第1のVκ遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含み、
-ラムダ軽鎖トランスジェニック遺伝子座は、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のVλ遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のVλ遺伝子セグメントとを含み、第2のVλ遺伝子セグメントは、第1のVλ遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、遺伝子座は、第1のVλ遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含む。
【０１１３】
このようにして、遺伝子座は、VL遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【０１１４】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、ゲノムは、複数のヒト免疫グロブリンVL遺伝子セグメントと、複数のヒトJL遺伝子セグメントとを含む、ある(または前記)トランスジェニック免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含み、複数のJ遺伝子セグメントは、自然のヒトレパートリーより多くの機能的J遺伝子セグメントを含み、場合により、ゲノムは、前記トランスジェニック重鎖遺伝子座についてホモ接合性である。
【０１１５】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、以下のとおりである。
(i)Jκ遺伝子レパートリーは、ある(または前記)第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のJκ遺伝子セグメントと、それに補足されるある(または前記)第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJκ遺伝子セグメントとからなり、場合により、個体は、関連せず、場合により、Vκセグメントは、第1のヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、第2の個体のゲノム配列に由来するJκ遺伝子セグメントは、Table 6(表11-1〜表11-2)、13(表23-1〜表23-226)または14(表24-1〜表32)に列挙するJκ遺伝子セグメントから選択され、
(ii)Jκ遺伝子レパートリーは、ある(または前記)第1のヒト個体のゲノム配列に由来する複数のJλ遺伝子セグメントと、それに補足されるある(または前記)第2の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJλ遺伝子セグメントとからなり、場合により、個体は、関連せず、場合により、Vλセグメントは、第1のヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、第2の個体のゲノム配列に由来するJλ遺伝子セグメントは、Table 7(表12-1〜表12-3)、13(表23-1〜表23-226)または14(表24-1〜表32)に列挙するJλ遺伝子セグメントから選択される。
【０１１６】
このようにして、遺伝子座は、JL遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【０１１７】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、以下のとおりである。
(i)トランスジェニック軽鎖遺伝子座は、5より多い機能的ヒトJκ遺伝子セグメント種を含み、場合により、遺伝子座は、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の機能的ヒトJκ遺伝子セグメントを含み(例えば、遺伝子座は、前記第1の個体の完全機能的Jκレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJκ遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJκ遺伝子セグメントとを含む);かつ/あるいは
(ii)トランスジェニック軽鎖遺伝子座は、5より多い機能的ヒトJλ遺伝子セグメントを含み、場合により、遺伝子座は、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14または15の機能的ヒトJλ遺伝子セグメントを含む(例えば、遺伝子座は、前記第1の個体の完全機能的Jλレパートリーと、それに補足される第2のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJλ遺伝子セグメントと、場合により、第3のヒト個体のゲノム配列に由来する1または複数のJλ遺伝子セグメントとを含む)。
【０１１８】
このようにして、遺伝子座は、JL遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【０１１９】
脊椎動物または細胞の一実施形態では、以下のとおりである。
(i)カッパ軽鎖トランスジェニック遺伝子座は、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のJκ遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のJκ遺伝子セグメントとを含み、第2のJκ遺伝子セグメントは、第1のJκ遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、遺伝子座は、第1のJκ遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含み、
(ii)ラムダ軽鎖トランスジェニック遺伝子座は、第1の個体のゲノム配列に由来する第1のJλ遺伝子セグメントと、第2の個体のゲノム配列に由来する第2のJλ遺伝子セグメントとを含み、第2のJκ遺伝子セグメントは、第1のJλ遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、遺伝子座は、第1のJλ遺伝子セグメントのさらなる多型バリアント(例えば第3のヒト個体のゲノム配列に由来するバリアント)を含む。
【０１２０】
このようにして、遺伝子座は、JL遺伝子セグメントの超ヒトレパートリーを提供する。
【０１２１】
第1の構成のさらなる態様を、以下に記載する。
【０１２２】
本発明は、第2の構成において、以下のものを提供する。
抗体のレパートリーを集合的にコードするゲノムを有する抗体生成トランスジェニック細胞のライブラリーであって、
(a)第1のトランスジェニック細胞が、第1の免疫グロブリン遺伝子によりコードされる鎖(例えば重鎖)を有する第1の抗体を発現し、遺伝子が、第1のヒト未再構成免疫グロブリン遺伝子セグメント(例えばVH)の組換えの後に生成される第1の可変ドメインヌクレオチド配列を含み、
(b)第2のトランスジェニック細胞が、第2の免疫グロブリン遺伝子によりコードされる鎖(例えば重鎖)を有する第2の抗体を発現し、第2の遺伝子が、第2のヒト未再構成免疫グロブリン遺伝子セグメント(例えばVH)の組換えの後に生成される第2の可変ドメインヌクレオチド配列を含み、第1抗体および第2の抗体が、同一でなく、
(c)第1および第2の遺伝子セグメントが、異なり、それぞれ第1および第2のヒト個体のゲノム配列に由来し、個体が、異なり、場合により、関連せず、
(d)細胞が、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)細胞(例えばB細胞またはハイブリドーマ)である
ライブラリー。
【０１２３】
一実施形態では、ライブラリーは、in vitroで提供される。別の実施形態では、ライブラリーは、1または複数のトランスジェニック非ヒト脊椎動物によりin vivoで提供される。例えば、前記またはそれぞれの脊椎動物は、本発明の第1の構成の任意の態様に従う。
【０１２４】
一実施形態では、ライブラリーは、10〜109の抗体、例えば10、20、30、40、50、100もしくは1000〜108;または10、20、30、40、50、100もしくは1000〜107;または10、20、30、40、50、100もしくは1000〜106;または10、20、30、40、50、100もしくは1000〜105;または10、20、30、40、50、100もしくは1000〜104の抗体からの抗体レパートリーをコードする。ある例では、ライブラリーは、少なくとも103、104、105、106、107、108、109または1010の抗体の抗体レパートリーをコードする。
【０１２５】
第1の可変ドメインヌクレオチド配列は、第1のヒト未再構成免疫グロブリン遺伝子セグメントと1または複数の他の免疫グロブリン遺伝子セグメント(例えばヒト免疫グロブリン遺伝子セグメント)との組換えの後に生成される。例えば、第1の遺伝子セグメントがVHである場合、第1の可変ドメインヌクレオチド配列(VHドメイン)は、VHとヒトDおよびJHセグメントとのin vivoでの組換えと、場合により体細胞超変異との後に、第1のトランスジェニック細胞またはその祖先において生成される。例えば、第1の遺伝子セグメントがVLである場合、第1の可変ドメインヌクレオチド配列(VLドメイン)は、VLとヒトJLセグメントとのin vivoでの組換えと、場合により体細胞超変異との後に、第1のトランスジェニック細胞またはその祖先において生成される。
【０１２６】
第2の可変ドメインヌクレオチド配列は、第2のヒト未再構成免疫グロブリン遺伝子セグメントと1または複数の他の免疫グロブリン遺伝子セグメント(例えばヒト免疫グロブリン遺伝子セグメント)との組換えの後に生成される。例えば、第2の遺伝子セグメントがVHである場合、第2の可変ドメインヌクレオチド配列(VHドメイン)は、VHとヒトDおよびJHセグメントとのin vivoでの組換えと、場合により体細胞超変異との後に、第2のトランスジェニック細胞またはその祖先において生成される。例えば、第2の遺伝子セグメントがVLである場合、第2の可変ドメインヌクレオチド配列(VLドメイン)は、VLとヒトJLセグメントとのin vivoでの組換えと、場合により体細胞超変異との後に、第2のトランスジェニック細胞またはその祖先において生成される。
【０１２７】
第1および第2の遺伝子セグメントは、それぞれ第1および第2のヒト個体のゲノム配列に由来する。一例では、このような遺伝子セグメントは、前記個体から採取した試料細胞から、当業者に知られる標準的な分子生物学的技術を用いて単離またはクローニングされる。遺伝子セグメントの配列は、(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15までのヌクレオチド変化を導入することにより)本発明において用いる前に変異されることがある。別の例では、遺伝子セグメントは、データベース(以下の手引きを参照されたい)において候補ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを同定することにより導き、本発明において用いるための遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列を、データベース配列を参照することにより(例えば、参照配列と同一または参照配列に対して5、6、7、8、9、10、11、12、13、14もしくは15までのヌクレオチド変化を有する変異体であるように)作製する。当業者は、データベースを参照することによりまたは細胞試料から得ることによりヌクレオチド配列を得る方法を認識している。
【０１２８】
本発明の任意の構成の脊椎動物、細胞またはライブラリーの一実施形態では、第1および第2のヒト個体は、それぞれ第1および第2の人種集団のメンバーであり、ここで、該集団は、異なる。よって、このことは、本発明のとおりに、トランスジェニック遺伝子座、細胞および脊椎動物において超ヒト遺伝子多様性を提供する。
【０１２９】
ヒト集団
場合により、人種集団は、データベースの1000 Genomesプロジェクトにおいて同定されるものから選択される。この点について、1000 Genomesデータベースが基づく人種集団の詳細を提供するTable 8(表13-1〜表13-2)を参照されたい。
【０１３０】
N A Rosenbergら(Science、2002年12月20日:第298巻、第5602号、2342〜2343頁)は、異なる地理的祖先のヒト集団の遺伝子構造を研究した。合計で52の集団から試料を採取し、これらは、以下の集団であった:
アフリカ系祖先
(ムブティピグミー(Mbuti Pygmies)、ビアカピグミー(Biaka Pygmies)、サン民族およびニジェール-コードファン語族(バントゥー、ヨルバまたはマンデカ集団)、
ユーラシア系祖先
(ヨーロッパ系祖先(オークニー諸島民、アディゲイ族、バスク人、フランス人、ロシア人、イタリア人、サルデーニャ人、トスカナ人)、中東系祖先(モザバイト(Mozabite)、ベドウィン、ドルーズ人、パレスチナ人)、
中央/南アジア系祖先(バロシル(Balochl)、ブラフル(Brahul)、マクラニ(Makrani)、シンド族、パタン人、ブルショー(Burusho)、ハザラ、ウイグル、カラシュ人)。
東アジア系祖先
(漢民族、ダル(Dal)、ダウル族、フーゼン(Hezhen)、ラフ族、ミャオ族、オロケン(Oroqen)、シェ(She)、ツージア(Tujia)、ツー(Tu)、シボ(Xibo)、イ族、モンゴル人(Mongola)、ナーシー族、カンボジア人、日本人、ヤクート族)、オセアニア系祖先(メラネシア人、パプア人);または
アメリカ系祖先
(カリティアナ(Karitiana)、スルイ(Surui)、コロンビア人、マヤ族、ピマ族)。
【０１３１】
国際HapMapプロジェクト、Nature、2003年12月18日;426(6968):789〜96頁は、HapMapプロジェクトの目的が、アフリカ、アジアおよびヨーロッパの地域からの祖先を有する集団からのDNA試料中の百万以上の配列バリアントの遺伝子型、それらの頻度およびそれらの間の結びつきの程度を決定することによりヒトゲノムにおけるDNA配列変動の一般的なパターンを決定することであることを開示している。異なる地理的祖先の関係するヒト集団は、ヨルバ族、日本人、中国人、北ヨーロッパおよび西ヨーロッパ人集団を含む。より具体的には、以下のとおりである:
北または西ヨーロッパ系祖先のユタ集団(Centre d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH)により1980年に採取された試料);
ナイジェリア、イバダンからのヨルバ系祖先の集団;
日本系祖先の集団;および
中国からの漢民族中国系祖先の集団。
【０１３２】
以前の文献を引用して、著者らは、ヒト集団の標本を作製するために、祖先地理学は妥当な基礎であることを示唆する。
【０１３３】
ヒト集団(ここから本発明において用いた集団を選択した)の適切な試料は、以下のとおりである:
(a)ヨーロッパ系祖先
(b)北ヨーロッパ系祖先;西ヨーロッパ系祖先;トスカナ系祖先;英国系祖先、フィンランド系祖先またはイベリア系祖先。
(c)より具体的に、北および/または西ヨーロッパ系祖先のユタ住民の集団;イタリアのトスカナ人集団;イングランドおよび/またはスコットランドの英国人集団;フィンランドのフィンランド人集団;またはスペインのイベリア人集団。
【０１３４】
(a)東アジア系祖先
(b)日本系祖先;中国系祖先またはベトナム系祖先。
(c)より具体的に、日本、東京の日本人集団;中国、北京の漢民族中国人集団;シーサンパンナの中国系ダイ(Dai)集団;ベトナム、ホーチミンシティのキン(Kinh)集団;またはUSA、コロラド、デンバーの中国人集団。
【０１３５】
(a)西アフリカ系祖先
(b)ヨルバ族系祖先;ルイヤ(Luhya)系祖先;ガンビア系祖先;またはマラウィ系祖先。
(c)より具体的に、ナイジェリア、イバダンのヨルバ族集団;ケニヤ、ウェブエのルイヤ集団;ガンビア、西州のガンビア人集団;またはマラウィ、ブランティアのマラウィ人集団。
【０１３６】
(a)アメリカの集団
(b)土着アメリカ人系祖先;アフリカ系カリブ人系祖先;メキシコ系祖先;プエルトリコ系祖先;コロンビア系祖先;またはペルー系祖先。
(c)より具体的に、南西USのアフリカ系祖先の集団;MS、ジャクソンのアフリカ系アメリカ人集団;バルバドスのアフリカ系カリブ人集団;CA、ロサンジェルスのメキシコ系祖先の集団;プエルトリコのプエルトリコ人集団;コロンビア、メデリンのコロンビア人集団;またはペルー、リマのペルー人集団。
【０１３７】
(a)南アジア系祖先
(b)アーホム族系祖先;カーヤドゥサ(Kayadtha)系祖先;レディ(Reddy)系祖先;マラータ族;またはパンジャブ族系祖先。
(c)より具体的に、インド、アッサム州のアーホム族集団;インド、カルカッタのカーヤドゥサ集団;インド、ハイデラバードのレディ集団;インド、ボンベイのマラータ族集団;またはパキスタン、ラホールのパンジャブ族集団。
【０１３８】
本発明のいずれの構成においても、一実施形態では、各ヒト集団は、上の「(a)」を付した集団から選択される。
【０１３９】
本発明のいずれの構成においても、別の実施形態では、各ヒト集団は、上の「(b)」を付した集団から選択される。
【０１４０】
本発明のいずれの構成においても、別の実施形態では、各ヒト集団は、上の「(c)」を付した集団から選択される。
【０１４１】
本発明の脊椎動物のライブラリー、細胞またはライブラリーの一実施形態では、第1および第2の人種集団は、ヨーロッパ系祖先の人種集団、東アジア系の人種集団、西アフリカ系祖先の人種集団、アメリカ系祖先の人種集団および南アジア系祖先の人種集団からなる群より選択される。
【０１４２】
本発明の脊椎動物のライブラリー、細胞またはライブラリーの一実施形態では、第1および第2の人種集団は、北ヨーロッパ系祖先の人種集団;または西ヨーロッパ系祖先の人種集団;またはトスカナ系祖先の人種集団;または英国系祖先の人種集団;またはアイスランド系祖先の人種集団;またはフィンランド系祖先の人種集団;またはイベリア系祖先の人種集団;または日本系祖先の人種集団;または中国系祖先の人種集団;またはベトナム系祖先の人種集団;またはヨルバ族系祖先の人種集団;またはルイヤ系祖先の人種集団;またはガンビア系祖先の人種集団;またはマラウィ系祖先の人種集団;または土着アメリカ人系祖先の人種集団;またはアフリカ系カリブ人系祖先の人種集団;またはメキシコ系祖先の人種集団;またはプエルトリコ系祖先の人種集団;またはコロンビア系祖先の人種集団;またはペルー系祖先の人種集団;またはアーホム族系祖先の人種集団;またはカーヤドゥサ系祖先の人種集団;またはレディ系祖先の人種集団;またはマラータ族系祖先の人種集団;またはパンジャブ族系祖先の人種集団からなる群から選択される。
【０１４３】
本発明の脊椎動物、細胞またはライブラリーの任意の構成の一実施形態では、第2の個体のゲノム配列に由来するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、第2の人種集団内で低頻度である(場合により希である)。場合により、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、例えば1000 Genomesデータベースにおけるように第2のヒト集団において0.5%〜5%、場合により0.5%未満のマイナー対立遺伝子頻度(MAF)(累積頻度)を有する。
【０１４４】
本発明の脊椎動物、細胞またはライブラリーの任意の構成の一実施形態では、第1の可変領域ヌクレオチド配列は、第1のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントと、第1のJ遺伝子セグメントと、場合により第1のD遺伝子セグメントとの組換えにより生成され、ここで、該第1のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、V遺伝子セグメントであり、V、DおよびJセグメントは、第1のヒト集団、場合により第1のヒト集団の1個体のゲノムに由来する。
【０１４５】
本発明の脊椎動物のライブラリー、細胞またはライブラリーの一実施形態では、第2の可変領域ヌクレオチド配列は、第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントと、第2のJ遺伝子セグメントと、場合により第2のD遺伝子セグメントとの組換えにより生成され、ここで、該第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、第2の集団に由来するV遺伝子セグメントであり、Dおよび/またはJセグメントは、第1のヒト集団に由来し、場合により、DおよびJ遺伝子セグメントは、第1のヒト集団の1個体のゲノムに由来する。
【０１４６】
本発明の脊椎動物のライブラリー、細胞またはライブラリーの一実施形態では、第1および第2のV遺伝子セグメントと組み換えられたDおよびJセグメントの全ては、第1のヒト集団に由来するDおよびJセグメントであり、場合により、DおよびJ遺伝子セグメントは、第1のヒト集団の1個体のゲノムに由来する。
【０１４７】
ライブラリーの一実施形態では、第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、第1のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントの多型バリアントであり、場合により、第2の遺伝子セグメントは、Table 1(表6-1〜表6-30)〜7(表12-1〜表12-3)および9(表14-1〜表14-3)〜14(表24-1〜表32)のいずれかにおける遺伝子セグメントからなる群より選択される(例えばTable 13(表23-1〜表23-226)または14(表24-1〜表32)から選択される)。
【０１４８】
ライブラリーの一実施形態では、第1および第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、ともに(i)VH遺伝子セグメント;(ii)Dセグメント;(iii)Jセグメント(場合によりともにJHセグメント、ともにJκセグメントまたはともにJλセグメント);(iv)定常領域(場合によりともにガンマ定常領域、場合によりともにCガンマ-1定常領域);(v)CH1領域;(vi)CH2領域;または(vii)CH3領域である。
【０１４９】
ライブラリーは、例えばナイーブであり、場合により、10または102から109細胞までのライブラリーサイズを有する。例えば、10、20、30、40、50、100もしくは1000から108まで;または10、20、30、40、50、100もしくは1000から107まで;または10、20、30、40、50、100もしくは1000から106まで;または10、20、30、40、50、100もしくは1000から105まで;または10、20、30、40、50、100もしくは1000から104細胞まで。
【０１５０】
ライブラリーは、例えば、所定の抗原に対して選択されており、場合により、10または102から109細胞までのライブラリーサイズを有する。例えば、10、20、30、40、50、100もしくは1000から108まで;または10、20、30、40、50、100もしくは1000から107まで;または10、20、30、40、50、100もしくは1000から106まで;または10、20、30、40、50、100もしくは1000から105まで;または10、20、30、40、50、100もしくは1000から104細胞まで。
【０１５１】
本発明のライブラリーの一実施形態では、前記第1および第2の細胞は、それぞれ第1および第2の祖先非ヒト脊椎動物細胞の子孫であり、ここで、該第1の祖先細胞は、前記第1のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むゲノムを含み、該第2の祖先細胞は、前記第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むゲノムを含む。
【０１５２】
本発明は、抗体のレパートリーを集合的にコードするゲノムを有する抗体生成トランスジェニック細胞のライブラリーをさらに提供し、ここで、該ライブラリーは、上記の第1および第2の祖先細胞を含む。
【０１５３】
本発明は、本発明のライブラリー(例えばB細胞ライブラリー)と融合パートナー細胞との融合により生成されるハイブリドーマ細胞のライブラリーをさらに提供し、場合により、10または102から109細胞までのライブラリーサイズを有する。例えば、10、20、30、40、50、100もしくは1000から108まで;または10、20、30、40、50、100もしくは1000から107まで;または10、20、30、40、50、100もしくは1000から106まで;または10、20、30、40、50、100もしくは1000から105まで;または10、20、30、40、50、100もしくは1000から104細胞まで。ハイブリドーマの生成は、当業者に公知である。融合パートナーの例は、SP2/0-g14(ECACCから入手可能)、P3X63-Ag8.653(LGC Standardsから入手可能;CRL-1580)、NS1およびNS0細胞である。PEG融合またはエレクトロフュージョンは、簡便であるので、実行できる。
【０１５４】
本発明は、第3の構成において、以下のものを提供する。
(a)トランスジェニック非ヒト脊椎動物細胞における未再構成ヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントとヒトDおよびヒトJセグメントとの組換えと、場合により前記細胞における親和性成熟との後に生成されるヌクレオチド配列によりコードされる重鎖であって、遺伝子セグメント(例えばVH)の1つが、第1のヒト人種集団の個体のゲノムに由来し、他の2つの遺伝子セグメント(例えばDおよびJH)が、第2の(例えば、それぞれ第2の、第3の)異なるヒト人種集団の個体のゲノムに由来し、抗体が、前記非ヒト脊椎動物の重鎖定常領域(例えばCガンマ)(例えばげっ歯類、マウスまたはラット重鎖定常領域)を含む重鎖;および/あるいは
(b)トランスジェニック非ヒト脊椎動物細胞における未再構成ヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントとヒトJセグメントとの間の組換えと、場合により前記細胞における親和性成熟との後に生成されるヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖であって、遺伝子セグメント(例えばVL)の1つが、第1のヒト人種集団(場合により、(a)における第1の集団と同じ)の個体のゲノムに由来し、他の遺伝子セグメント(例えばJL)が、第2の異なるヒト人種集団(場合により、(a)における第2の集団と同じ)の個体のゲノムに由来し、抗体が、前記非ヒト脊椎動物の軽鎖定常領域(例えばげっ歯類、マウスまたはラット軽鎖定常領域)を含む軽鎖
を有し、
(c)場合により、抗体のそれぞれの可変ドメインが、ヒト可変ドメインであり、
(d)場合により、重鎖定常領域が、ミューまたはガンマタイプ定常領域である、
単離抗体。
【０１５５】
本発明は、第3の構成の抗体をコードする単離ヌクレオチド配列も提供し、ここで、場合により、該配列は、抗体発現ベクターにおいて、場合により宿主細胞において提供される。適切なベクターは、哺乳動物発現ベクター(例えばCHO細胞ベクターまたはHEK293細胞ベクター)、酵母ベクター(ピキア・パストリス(Picchia pastoris)における発現のためのベクター)、または細菌発現ベクター、例えば大腸菌(E. coli)発現のためのベクターである。
【０１５６】
本発明は、第3の構成の抗体の非ヒト脊椎動物定常領域を、ヒト抗体定常領域(例えばtable 13(表23-1〜表23-226)または18(表41-1〜表41-18)に開示するCバリアント)で置き換える工程を含む、ヒト抗体を生成するための方法も提供する。当業者は、このことを行うための標準的な分子生物学的技術を認識している。例えば、標準的な免疫化について、Harlow, E.およびLane, D. 1998、第5版、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY;ならびにPasqualiniおよびArap、Proceedings of the National Academy of Sciences (2004) 101:257〜259頁を参照されたい。抗体の可変領域をヒト定常領域に連結することは、当業者に明らかなように、従来の組換えDNAおよびRNA技術を用いることのような当該技術において容易に利用可能である技術により行うことができる。例えばSambrook, JおよびRussell, D. (2001、第3版) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab. Press、Plainview、NY)を参照されたい。
【０１５７】
一実施形態では、方法は、抗体の変異体または誘導体をさらに作製する工程を含む。
【０１５８】
本発明は、第3の構成に従う抗体または本発明のヒト抗体と、希釈剤、賦形剤または担体とを含む医薬組成物も提供し、場合により、組成物は、IV針もしくはシリンジに接続された容器またはIVバッグにおいて提供される。
【０１５９】
本発明は、第3の構成の第2の抗体または本発明の単離抗体を発現する抗体生成細胞(例えば哺乳動物細胞、例えばCHOもしくはHEK293;酵母細胞、例えばピー・パストリス;細菌細胞、例えば大腸菌;B細胞;またはハイブリドーマ)も提供する。
【０１６０】
本発明の第1の構成は、以下も提供する:
トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座(例えば重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)であって、前記遺伝子座が、第3の構成に関連して上に記載した第1および第2のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメント(場合によりVセグメント)に従う免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。遺伝子セグメントは、免疫グロブリン定常領域の上流に作動可能に接続し、場合により、ゲノムは、前記トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座についてホモ接合性である。
【０１６１】
場合により、免疫グロブリン遺伝子座は、自然のヒト補体より多くの機能的V遺伝子セグメントを含み、かつ/または
場合により、免疫グロブリン遺伝子座は、自然のヒト補体より多くの機能的D遺伝子セグメントを含み、かつ/または
場合により、免疫グロブリン遺伝子座は、自然のヒト補体より多くの機能的J遺伝子セグメントを含む。
【０１６２】
このようにして、超ヒト免疫グロブリン遺伝子レパートリーは、本発明に従うトランスジェニック非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞において提供される。
【０１６３】
本発明の第1の構成は、以下も提供する:
非ヒト脊椎動物定常領域とヒト可変領域とを有するキメラ抗体のレパートリーまたはキメラ軽鎖もしくは重鎖を生成するために、非ヒト脊椎動物定常領域の上流に作動可能に接続した複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)であって、
トランスジェニック遺伝子座が、1または複数のヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントと、場合により1または複数のヒトD遺伝子セグメントとを含み、前記遺伝子セグメントの第1の遺伝子セグメント(場合によりVセグメント)および前記遺伝子セグメントの第2の遺伝子セグメント(場合によりVセグメント)が、異なり、それぞれ第1および第2のヒト個体のゲノムに由来し、個体が、異なり、場合により、関連せず、
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的V遺伝子セグメントを含み、
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的D遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的J遺伝子セグメントを含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【０１６４】
このようにして、超ヒト免疫グロブリン遺伝子レパートリーは、本発明に従うトランスジェニック非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞において提供される。
【０１６５】
本発明の第1の構成は、以下も提供する:
第1および第2のトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または脊椎動物細胞(場合によりES細胞または抗体生成細胞)であって、それぞれの遺伝子座が、非ヒト脊椎動物定常領域とヒト可変領域とを有するキメラ抗体のレパートリーまたはキメラ軽鎖もしくは重鎖を生成するために、非ヒト脊椎動物定常領域の上流に作動可能に接続した複数のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを含み、
(i)第1のトランスジェニック遺伝子座が、1または複数のヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントと、場合により1または複数のヒトD遺伝子セグメントとを含み、(ii)第2のトランスジェニック遺伝子座が、1または複数のヒト免疫グロブリンV遺伝子セグメントと、1または複数のヒトJ遺伝子セグメントと、場合により1または複数のヒトD遺伝子セグメントとを含み、(iii)前記第1の遺伝子座の第1の(場合によりV)遺伝子セグメントおよび前記第2の遺伝子遺伝子座の第2の(場合によりV)遺伝子セグメントが、異なり、それぞれ第1および第2のヒト個体のゲノムに由来し、個体が、異なり、場合により、関連せず、
場合により、第1および第2の遺伝子座が、前記ゲノムにおける異なる染色体(場合により同じ染色体番号を有する染色体)上にあり、
場合により、それぞれの免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的V遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、それぞれの免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的D遺伝子セグメントを含み、かつ/あるいは
場合により、それぞれの免疫グロブリン遺伝子座が、自然のヒト補体より多くの機能的J遺伝子セグメントを含むトランスジェニック非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【０１６６】
このようにして、超ヒト免疫グロブリン遺伝子レパートリーは、本発明に従うトランスジェニック非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞において提供される。
【０１６７】
第1の構成のこれらの実施形態では、免疫グロブリン遺伝子セグメントは、場合により、第3の構成について記載したとおりである。
【０１６８】
第1の構成のこれらの実施形態では、ゲノムは、場合により、第3の免疫グロブリン遺伝子セグメント(場合によりVセグメント)を含み、該第3の遺伝子セグメントは、第1(および場合により第2)の遺伝子セグメントが由来する個体とは異なるヒト個体に由来し、場合により、第1、第2および第3の遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメント(例えばVH1-69、さらなる説明について実施例を参照されたい)の多型バリアントである。
【０１６９】
第1の構成のこれらの実施形態では、脊椎動物または細胞のゲノムは、場合により、第1、第2および場合により第3の遺伝子セグメントについてホモ接合性であり、ここで、第1、第2および場合により第3の遺伝子セグメントのコピーは、共通の非ヒト脊椎動物定常領域の上流に作動可能に接続した同じ染色体上で一緒に提供される。
【０１７０】
例えば、第1、第2および場合により第3の遺伝子セグメントのそれぞれは、V遺伝子セグメントである。
【０１７１】
一例では、本発明のライブラリーは、非ヒト脊椎動物のコレクション(場合によりげっ歯類、マウスまたはラットのコレクション)により提供され、場合により、前記コレクションの第1のメンバーは、前記第1の抗体を生成するが、前記第2の抗体を生成せず、コレクションの第2のメンバーは、前記第2の抗体を生成する(が、場合により前記第1抗体を生成しない)。よって、脊椎動物においてトランスジェニック遺伝子座を構築するための供給源として異なるヒトゲノムを用いて非ヒト脊椎動物を作製することが企図される。例えば、第1の脊椎動物は、第1(および場合により第2)のヒト集団または個体からだけの遺伝子セグメントを有するトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み、第2の脊椎動物は、第3(および場合により第4)のヒト集団または個体からだけの遺伝子セグメントを有するトランスジェニック重鎖遺伝子座を含み、場合により、第3およびさらなる脊椎動物は、ユニークまたはオーバーラップするヒト集団ゲノムに基づいて同様に構築できる。しかし、トランスジェニック脊椎動物の混合集団として提供される場合、混合集団は、自然のヒトレパートリーにおいて見出されるよりも大きいヒト免疫グロブリン遺伝子の集合的プールを提供する。これは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有する従来のトランスジェニックマウスおよびラットを用いて可能であるものを超えて抗体および遺伝子配列空間を拡大するために有用である。上で説明したように、これらは、単一ヒトゲノムに基づいていた。
【０１７２】
一実施形態では、非ヒト脊椎動物のコレクションは、上で言及した同じ集団属「(a)」の下に一緒にグループ分けされるヒト集団に限定されるヒト免疫グロブリン遺伝子を有する。これは、集団属(a)に普及したヒト抗体可変領域を生成するように偏っており、よって前記集団のメンバーのための抗体治療薬/予防薬を作製するために有用な遺伝子レパートリーを提供する。代わりに、異なるヒト集団からの遺伝子セグメントが本発明に従う単一導入遺伝子において(必ずしも脊椎動物のコレクションにおいてではない)提供される場合、異なるヒト集団は、例えば、上で言及した同じ集団属「(a)」の下に一緒にグループ分けされる。
【０１７３】
本発明は、本発明に従う細胞のライブラリーから発現される抗体のレパートリーも提供する。
【０１７４】
本発明の任意の構成の非ヒト脊椎動物または細胞では、トランスジェニック遺伝子座の定常領域は、一例では、前記脊椎動物の内因性定常領域(例えば非ヒト脊椎動物自体と同じ株のマウスまたはラットからの例えば内因性マウスまたはラット定常領域)である。
【０１７５】
本発明は、細胞(例えばES細胞)を構築するための方法であって、
(a)ある(または前記)第1のヒト個体のゲノム配列の機能的VおよびJ(および場合によりD)遺伝子セグメントを同定する工程と、
(b)ある(または前記)第2のヒト個体のゲノム配列の1または複数の機能的Vおよび/またはDおよび/またはJ遺伝子セグメントを同定する工程であって、これらのさらなる遺伝子セグメントが、第1の個体のゲノム配列において見出されない工程と、
(c)トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を細胞において構築する工程であって、(a)および(b)の遺伝子セグメントが、定常領域の上流に作動可能に接続した遺伝子座において提供される工程と
を含む方法も提供する。
【０１７６】
場合により、細胞は、工程(a)〜(c)に従って構築される重鎖遺伝子座および/または工程(a)〜(c)に従って構築される軽鎖遺伝子座(カッパおよび/またはラムダ遺伝子座)を含む。
【０１７７】
場合により、細胞は、前記またはそれぞれのトランスジェニック遺伝子座についてホモ接合性であり、場合により、前記細胞に対して内因性の遺伝子座からの抗体発現は、不活性化されている。このことは、機能的抗体遺伝子レパートリー、よって抗体生成を、ヒト可変領域を有する抗体に制限するために有用である。
【０１７８】
場合により、工程(b)における遺伝子セグメントは、1000 Genomes、Ensembl、GenbankおよびIMGTデータベースから選択される免疫グロブリン遺伝子データベースから同定される。
【０１７９】
場合により、第1および第2のヒト個体は、それぞれ第1および第2の人種集団のメンバーであり、集団が、異なり、場合により、第2の個体のゲノム配列に由来するヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントが、第2の人種集団内で低頻度である(場合により希である)。
【０１８０】
本発明は、トランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)を作製する方法であって、
(a)上記の方法を行うことによりES細胞(例えばマウスC57BL/6N、C57BL/6J、129S5または129Sv株ES細胞)を構築する工程と、
(b)ES細胞をドナー非ヒト脊椎動物胚盤胞(例えばマウスC57BL/6N、C57BL/6J、129S5または129Sv株胚盤胞)に注入する工程と、
(c)胚盤胞を、里親非ヒト脊椎動物母(例えばC57BL/6N、C57BL/6J、129S5または129Sv株マウス)に移植する工程と、
(d)前記母から子を得る工程であって、子のゲノムが、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を含む工程と
を含む方法も提供する。
【０１８１】
本発明は、前記方法により作製されたトランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)またはその子孫を提供する。本発明は、そのような非ヒト脊椎動物の集団も提供する。
【０１８２】
ES細胞を胚盤胞にマイクロインジェクションすることおよびその後にトランスジェニックマウスを作製することは、最先端の技術における通常のプラクティスであり、当業者は、このことを行うために有用な技術を認識している。C57BL/6N、C57BL/6J、129S5または129Svマウス株およびES細胞は、容易にかつ公共で入手可能である。
【０１８３】
本発明は、所定の抗原(例えば細菌またはウイルス病原体抗原)と結合する抗体を単離する方法であって、
(a本発明による脊椎動物(場合によりマウスまたはラット)を提供する工程と、
(b)前記脊椎動物を前記抗原(場合により、抗原は、感染性疾患病原体の抗原である)で(例えば標準的なプライム・ブースト法を用いて)免疫化する工程と、
(c)脊椎動物からBリンパ球を回収し、抗原と結合する抗体を発現する1または複数のBリンパ球を選択する工程と、
(d)場合により、前記選択したBリンパ球またはその子孫を、場合によりそこからハイブリドーマを生成することにより不死化させる工程と、
(e)Bリンパ球により発現される抗体(例えばおよびIgGタイプ抗体)を単離する工程と、
(f)場合により、抗体の誘導体またはバリアントを生成する工程と
を含む方法も提供する。
【０１８４】
本発明は、場合により、工程(e)の後に、前記Bリンパ球から前記抗体をコードする核酸を単離する工程と、場合により、抗体の重鎖定常領域ヌクレオチド配列を、ヒトまたはヒト化重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列に交換して、場合により、前記抗体の可変領域の親和性成熟を行う工程と、場合により、前記核酸を発現ベクターおよび場合により宿主に挿入する工程とをさらに含む。
【０１８５】
バイオインフォマティクス分析および免疫グロブリン遺伝子セグメントの選択
上記の変動分析についての議論も参照されたい。
【０１８６】
当業者は、IMGT(www.imgt.org)、GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)のようなヒト抗体遺伝子配列の供給源を熟知している。データベース操作のためのバイオインフォマティクスツールも、例えば1000 Genomesプロジェクト/EBI(www.1000genomes.org)から公共で利用可能なように、当業者が容易に利用可能であり、熟知している。
【０１８７】
抗体遺伝子セグメント配列の供給源として、当業者ならば、以下の利用可能なデータベースおよび資源(その更新情報を含めて)を承知するであろう:-
【０１８８】
1.1.Kabatデータベース(G. Johnson and T. T.Wu、2002; http://www.kabatdatabase.com)。1966年にE. A. KabatおよびT. T. Wuによって作製された、Kabatデータベースは、抗体、T細胞受容体、主要組織適合複合体(MHC)クラスIおよびII分子および免疫学上注目されるその他のタンパク質のアラインされた配列を公表している。検索可能なインターフェイスが、SeqhuntIIツールによって提供され、配列アラインメント、配列サブグループ分類および可変性プロットの作製のために、ユーティリティーの範囲が入手可能である。特に、本発明において使用するためのヒト遺伝子セグメントに関して、参照により本明細書に組み込まれる、Kabat、E. A.、Wu, T. T.、Perry, H.、Gottesman, K.、and Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th ed.、NIH Publication No. 91- 3242、Bethesda、MDも参照のこと。
【０１８９】
1.2.KabatMan(A. C. R. Martin、2002; http://www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html)。これは、Kabat配列データベースに単純なクエリを行うウェブインターフェイスである。
【０１９０】
1.3.IMGT、International ImMunoGeneTics Information System(登録商標);M.-P. Lefranc、2002; http://imgt.cines.fr)。IMGTは、全ての脊椎動物種の抗体、T細胞受容体およびMHC分子を専門にする統合情報システムである。ヌクレオチドおよびタンパク質配列、オリゴヌクレオチドプライマー、遺伝子マップ、遺伝子多型、特異性および二次元(2D)および三次元(3D)構造を含む標準化されたデータの共通のポータルを提供する。IMGTは、3種の配列データベース(IMGT/LIGM-DB、IMGT/MHC-DB、IMGT/PRIMERDB)、1種のゲノムデータベース(IMGT/遺伝子-DB)、1種の3D構造データベース(IMGT/3D構造-DB)および様々なウェブ資源(「IMGT Marie-Paule page」)および対話型ツールを含む。
【０１９１】
1.4 V-BASE(I. M. Tomlinson、2002;http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)。V-BASEは、1000を超える公開配列からまとめられた全てのヒト抗体生殖系列可変領域配列の包括的ディレクトリである。再配列された抗体V遺伝子のその最も近い生殖系列遺伝子セグメントへの割り当てを可能にするアラインメントソフトウェアDNAPLOT(Hans-Helmar AlthausおよびWerner Mullerによって開発された)の一バージョンを含む。
【０１９２】
1.5. Antibodies-Structure and Sequence(A. C. R. Martin、2002; http://www.bioinf.org.uk/abs)。このページには、抗体構造および配列に関する有用な情報が要約されている。Kabat抗体配列データ、抗体、結晶構造およびその他の抗体関連情報との関連性に関する一般的な情報とのクエリインターフェイスを提供する。タンパク質データバンク(Protein Databank)(PDB)に寄託された全ての抗体構造の自動サマリーも分配する。抗体可変領域の種々の番号付けスキームの徹底的な説明および比較が特に注目される。
【０１９３】
1.6.AAAAA-AHo's Amazing Atlas of Antibody Anatomy(A. Honegger、2001; http://www.unizh.ch/〜antibody)。この資源は、構造分析、モデリングおよび操作のためのツールを含む。抗体およびT細胞-受容体配列の包括的構造アラインメントの統一スキームを採用し、抗体分析およびグラフ表示のためのExcelマクロを含む。
【０１９４】
1.7. WAM-Web Antibody Modeling(N. Whitelegg and A. R. Rees、2001; http://antibody.bath.ac.uk)。イギリス、バース大学のCenter for Protein Analysis and Designによって主催されている。確立された理論的方法の組合せを使用して抗体Fv配列の3Dモデルを構築するためのAbMパッケージ(Oxford Molecularによって以前は市販されていた)に基づいて、このサイトはまた、最新の抗体構造情報も含む。
【０１９５】
1.8. Mike's Immunoglobulin Structure/Function Page (M. R. Clark、2001; http://www.path.cam.ac.uk/〜mrc7/mikeimages.html)。これらのページは、免疫グロブリン構造および機能に関する教材を提供し、多数のカラー画像、モデルおよび動画によって示されている。抗体ヒト化およびMike Clark's Therapeutic Antibody Human Homology Projectに関するさらなる情報が、利用可能であり、これは、臨床有効性および抗免疫グロブリン反応を、治療抗体の可変領域配列と関連付けることを目的とする。
【０１９６】
1.9. The Antibody Resource Page(The Antibody Resource Page、2000; http://www.antibodyresource.com)。このサイトは、自身を「抗体研究および供給者の完全なガイド」と説明している。アミノ酸配列決定ツール、ヌクレオチド抗体配列決定ツールおよびハイブリドーマ/細胞培養データベースへのリンクが提供されている。
【０１９７】
1.9. Humnization bY Design (J. Saldanha、2000; http://people.cryst.bbk.ac.uk/〜ubcg07s)。この資源は、抗体ヒト化技術に関する概要を提供する。最も有用な特徴は、ヒト化構築物の設計結果、フレームワーク選択、フレームワーク復帰突然変異および結合親和性に関する情報を含めた、40種を超える公開ヒト化抗体の検索可能なデータベース(配列およびテキストによって)である。
【０１９８】
Antibody Engineering Methods and Protocols、Ed. Benny K C Lo,Methods in Molecular Biology(商標),Human Pressも参照のこと。http://www.blogsua.com/pdf/antibody-engineering-methods-and-protocolsantibody-engineering-methods-and-protocols.pdfも同様。
【０１９９】
ゲノム配列変動データの供給源として、当業者ならば、以下の利用可能なデータベースおよび資源(その更新情報を含めて)を承知するであろう:
1.HapMap(The International HapMap Consortium. 2003;http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en)。HapMapプロジェクトは、異なる個体の遺伝子配列を比較して、共通遺伝子バリアントを含有する染色体領域を同定することを目的とする国際プロジェクトである。HapMap wwwサイトは、集団レベルの頻度データまで掘り下げるオプションを含む、染色体領域およびその中のバリアントを同定するためのツールを提供する。
【０２００】
2.1000 Genomes(The 1000 Genomes Project Consortium 2010;http://www.1000genomes.org/)。この情報源は、>1%のゲノムバリアントを同定する目的を持って、25の異なる集団の群のうちの1つからの2500の身元不詳個体についての完全ゲノム配列を提供する。このサイトにより、オンラインツールを利用してデータを調べ(例えば「変動パターンファインダ」)および個別の集団の群についてのバリアントデータをダウンロードすることができる。
【０２０１】
3.日本SNPデータベース(H.Hagaら、2002;http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index.html)。190,562のヒト遺伝子バリアントを同定する研究に基づいて、このサイトは、データを検索してまとめるために有用な特徴を有するゲノムバリアントの命名法をつくる。
【０２０２】
免疫グロブリン遺伝子中で、特定のヒト人種集団とともに分離される低頻度または希なバリアントとして分類されるバリアントを同定することが可能である。この分析のために、低頻度免疫グロブリン遺伝子セグメントは、「マイナー対立遺伝子頻度」(MAF)(累積頻度)が0.5%〜5%の間のものとして分類され、希なバリアントは、特定のヒト集団においてMAFが0.5%未満と分類されるものである。
【０２０３】
以下のバイオインフォマティクスプロトコールは、本発明で用いるためのヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントを同定するために構想される:
(a)対象の遺伝子セグメントを含有する1または複数のゲノム領域(「標的ゲノム領域」)を同定し、1000 Genomesプロジェクトまたは国際HapMapプロジェクト(または別の選択された好みのヒト遺伝子データベース)のいずれかにより用いられる、構築された配列アセンブリとマッチする座標を用いて、ゲノム座標を算出する。
【０２０４】
(b)(a)において予め同定されたゲノム領域にマッピングされるゲノムバリアントを同定する。それぞれの超集団および好ましくは部分集団(そのようなデータが入手可能である場合)について、バリアントについてのバリアント頻度を引き出す。HapMap WWWサイトで容易に入手可能なツールおよび1000GenomesプロジェクトについてのVWCツールがこの工程のために有用である。
【０２０５】
(c)標的ゲノム領域からのゲノムバリアントのリストをフィルタにかけて、「非同義」一塩基多型(SNP)またはゲノム「挿入もしくは欠失」(indel)のいずれかとして分類されるバリアントだけを含有するようにする。さらにフィルタにかけて、エキソン配列だけに存在するものを含むようにする。
【０２０６】
(d)超集団のそれぞれ(例えば「ヨーロッパ系祖先」「東アジア系祖先」、「西アフリカ系祖先」、「アメリカ系」および「南アジア系祖先」)について同定されたバリアントのそれぞれについての集団頻度データを相関させて、2未満の超集団とともに分離されるバリアントを同定する。さらに、全ての同定されたバリアントを、部分集団のそれぞれ(例えば「ヨーロッパ系祖先」超集団は、「CEU-北または西ヨーロッパ系祖先のユタ住民」、「TSIイタリアのトスカナ人」および「イングランドおよびスコットランドからの英国人」のような群に細分化できる)と相関させ、超集団内のバリアントの希少さについての第2のスコアを生成する。
【０２０７】
(e)特定の部分集団への分離を示す1または複数の遺伝子セグメントを、本発明による合成遺伝子座の構築のために収集する。
【０２０８】
本文を通しての一実施形態では、「生殖系列」は、規範的な生殖系列遺伝子セグメント配列のことをいう。
【０２０９】
1000 Genomesデータベースの詳細な分析により、本発明者らは、候補多型抗体遺伝子セグメントバリアント、例えばヒトバリアントJH遺伝子セグメント(例えば実施例4を参照されたい)のコレクションを考案し、これは、ヒト可変領域の多様性が増加した新しい合成レパートリーを発現するためのマウスにおけるトランスジェニック重鎖遺伝子座の設計に構築できる。このために、本発明は、以下の実施形態を提供する。
【０２１０】
本発明は、以下の第4の構成を提供する。
【０２１１】
ヒトJH6*02バリアントの選択
ヒトJH6*02に基づくトランスジェニックIgH遺伝子座、非ヒト脊椎動物、細胞および抗体
上で説明したように、トランスジェニックIg重鎖遺伝子座の設計において、本発明者らは、多くのヒト集団のうちの遺伝子分布について分析する1000 Genomesプロジェクト(www.1000genomes.orgを参照されたい)から入手可能な莫大な量のデータ、特にIg遺伝子セグメントについてのデータを考慮した。本発明者らは、IMGTデータベース(www.imgt.orgを参照されたい)およびEnsembl(www.ensembl.orgを参照されたい)において開示されるヒト遺伝子セグメントも認識していた。本発明者らは、これらのデータベースおよび本明細書に開示する他のデータベースを含む当該技術において知られるヒトIg遺伝子セグメント情報のその他の供給源において示される多数のヒト遺伝子セグメントのうちどのヒト遺伝子セグメントを含めるかについて選択する必要があった。ヒトJH遺伝子セグメントを選択する場合、本発明者らは、ヒトJH6が比較的長いアミノ酸配列をコードすることを認識していたので、本発明者らは、これを含めて、比較的長いHCDR3領域を有するIgH鎖を生成する機会を増加させることが望ましいと考えた。長いHCDR3(IMGT命名法によると少なくとも20アミノ酸)を有する抗体は、HIV、インフルエンザウイルス、マラリアおよびアフリカトリパノソーマを含む様々な病原体を効率的に中和することが示されている。比較的アクセスしにくいエピトープに到達するための長いHCDR3を有する、自然に存在するラクダ科(例えばラマまたはラクダ)の重鎖のみの抗体も参照される(例えばEP0937140を参照されたい)。長いHCDR3は、微細な特異性を与える、抗体表面のはるか上方にある伸長ループ構造を有するユニークな安定サブドメインを形成できる。いくつかの場合では、長いHCDR3自体は、エピトープ結合および中和のために十分である(Liu, Lら;Journal of Virology. 2011. 85:8467〜8476頁(本明細書に参照により組み込まれている))。長いHCDR3のユニークな構造により、HCDR3は、病原体表面上のアクセスしにくい構造内の同族エピトープまたは広範なグリコシル化と結合できる。ヒト末梢血では、約3.5%のナイーブB抗体または1.9%のメモリーB IgG抗体が、24より多いアミノ酸の長さのHCDR3を含有する(PLoS One. 2012;7(5):e36750、Epub 2012年5月9日;「Human peripheral blood antibodies with long HCDR3s are established primarily at original recombination using a limited subset of germline genes」;Briney BSら(本明細書に参照により組み込まれている))(図1)。使用分析は、これらの抗体が、ヒトD2-2、D3-3またはD2-15を有するヒトJH6を用いる嗜好性があることを示す(Brinley, BSら、図2〜5)。PLoS One. 2011年3月30日;6(3):e16857;「Comparison of antibody repertoires produced by HIV-1 infection, other chronic and acute infections, and systemic autoimmune disease」;Breden Fら(本明細書に参照により組み込まれている)も参照されたい。抗体の全てのHCDR3のうち約20%がJH6を用いる。しかし、24より多いアミノ酸のHCDR3を有する抗体において、70%がJH6を用いる(Brinley, BSら、図2)。
【０２１２】
長いヒトHCDR3を有する抗体および重鎖を作製できる遺伝子改変非ヒト脊椎動物および細胞、ならびに長いHCDR3がよりよくアクセスできる標的エピトープに対処できる、そのような脊椎動物および細胞から選択できる抗体、鎖およびVHドメインに対する必要性が、当該技術において存在している。
【０２１３】
本発明者らは、よって、本発明のこの構成において、IgH遺伝子座設計における必須のヒト遺伝子セグメントとしてヒトJH6遺伝子セグメントを含めることを選択した。いくつかの異なる自然に存在するヒトJH6バリアントが知られている(例えばJH6*01〜*04など;IMGT命名法)。本発明者らは、どのヒトJH6バリアントをトランスジェニックIgH遺伝子座設計に含めるべきかを決定する際に、このことを考慮した。いくつかのヒトJH6バリアントのアラインメントを図7に示す(www.imgt.orgから;ダッシュは同一ヌクレオチドを示す;*01バリアントに対するヌクレオチド変化は、下線を付したヌクレオチドにより示し、対応するアミノ酸変化は、下線を付したアミノ酸により示す;Genbank受託番号(リリース185.0)は、J、X、MまたはAの接頭辞を付して示す)。本発明者らは、ヒトゲノムDNA試料の配列決定、公共IgH DNAデータベースの検閲およびバリアント配列に基づく通知された選択を、どのJH6バリアントを用いるかについての合理的な選択に到達するための手段として用いた。
【０２１４】
1000 Genomesデータベースは、ヒトJH6*03を参照配列として用いるが、これは、トランスジェニックIgH遺伝子座を構築することを望む当業者にとって可能な選択である。本発明者らは、JH6*03中の6位がTACコドンによりコードされるチロシン(Y)であるが、いくつかのその他の自然に存在するヒトバリアントは、GGTコドンによりコードされるグリシン(G)を有することに気付いた(例えば本明細書の図7)(グリシンは、より大きいYYGXDXモチーフの一部を形成するYYGモチーフとして存在する)。このことの潜在的な重要性を理解するために、本発明者らは、他の脊椎動物種からのJH配列の分析を行った。本発明者らは、驚くべきことに、YYGおよびYYGXDXモチーフが多くの脊椎動物種にわたって保存されていることに気付いた(図7および図8を参照されたい)。よって、このことは、本発明者らに、このモチーフを保存することが望ましいことを示唆し、このことに手引きされて、本発明において用いるためにJH6バリアントを選択した。
【０２１５】
本発明者らがそれぞれYまたはGをコードするTACコドンとGGTコドンとについて考慮したときに、別のヒントが得られた。本発明者らは、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ(AID)の作用に与えるこれらのヌクレオチド配列の影響について考慮した。本発明者らは、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ(AID)が多段機構でIg体細胞超変異(SHM)を開始すると考えられることを熟知しており、遺伝子座を道理的に設計する際にこの活性に対処した。AIDはDNA中のCからUへの脱アミノ化を触媒して、C塩基における変異を作製する。ホットスポットモチーフ内にあるシチジンは、優先的に脱アミノ化される。あるいくつかのモチーフは、AID活性についてのホットスポットである(DGYW、WRC、WRCY、WRCH、RGYW、AGY、TAC、WGCW(ここで、W=AまたはT、Y=CまたはT、D=A、GまたはT、H=AまたはCまたはTおよびR=AまたはG)。JH6*03中の6位にてYをコードするTACコドンの存在は、AID変異ホットスポットを創出し(シチジンはAIDの基質である)、これらのホットスポットは、前の文章で下線を付したモチーフである。本発明者らは、このことの影響について考慮し、そのように考慮する際に、シチジンにてAID活性が創出する可能性がある変異体を考慮した。図9を参照する。本発明者らは、TACコドンの3番目の塩基での変異が3つの可能性のある結果、すなわちY、停止または停止を生じることに注目した。よって、遺伝子コード中で可能な3つの停止コドンのうち(他のものはTGAによりコードされる、図9を参照されたい)、2つはJH6*03中で6位をコードするTACコドン中のシチジンの変異によりもたらされる。本発明者らは、よって、このことが、JH6*03に基づくトランスジェニック遺伝子座における非生産的IgH可変領域の生成の機会を増加させ得ると考えた。さらに、本発明者らは、代わりにGGTコドンを提供すること(他のヒトJH6バリアントのように)が、3番目の塩基の変異が停止コドンを決して生じず(図9を参照されたい)、さらに、6位にてグリシンがコードされたままであり、よって保存される(本発明者らは、該グリシンが、種にわたって保存されているYYGおよびYYGXDXモチーフ中にあることにも注目した)ので好ましいと考えられることに注目した。
【０２１６】
JH6*03を用いることに反対することを決定して、本発明者らは、他の可能なヒトバリアントから選択する必要があった。MDVモチーフは、ヒトJH6に基づいてHCDR3のC末端にあり、隣接するフレームワーク4(FW4)は、WGQモチーフで開始する(JH6*01によりコードされる示した配列を参照する;図7)。遺伝子座設計について選択する際に、本発明者らは、生成されるIgH鎖およびそれを含む抗体においてこのHCDR3/FW4接合部を最大限に保存することを望んだ。本発明者らは、重鎖可変ドメインの機能性および立体構造のためにこのことが望ましいと信じた。本発明者らは、いくつかの場合では、免疫原性を最小限にするためにこのことが望ましいと考えた(ヒトへの薬学的使用のために適切である)。これらの考慮と一貫して、本発明者らは、接合部構成を保存するためにin vivoでのSHMの結果としてのHCDR3/FW4接合部周囲の変異を最小限にする選択を行うことを望んだ。RogozinおよびDiaz;「Cutting Edge: DGYW/WRCH Is a Better Predictor of Mutability at G:C Bases in Ig Hypermutation Than the Widely Accepted RGYW/WRCY Motif and Probably Reflects a Two-Step Activation-Induced Cytidine Deaminase-Triggered Process」;Journal of Immunology;2004年3月15日、第172巻、第6号、3382〜3384頁を参照されたい。DGYWモチーフの例は、GGCAである。本発明者らは、バリアント配列を分析する際に、このことが頭にあった。
【０２１７】
これらの考慮を頭に入れて、本発明者らは、ヒトJH6*02をIgH遺伝子座設計のための必須のヒトJH6として用いることを具体的に決定した。JH6*01は必須のJH6遺伝子セグメントとして却下した。なぜならヌクレオチド配列GGGCAA(GおよびQをコードする)は、AID認識ホットスポットであるGGCAモチーフを含有するからである。本発明者らは、JH6*04も、GおよびK(それぞれ11位および12位)をコードする配列GGCAAAの存在のためにこのようなモチーフを含有することに気付いた。本発明者らは、*02バリアントが*01バリアント中にあるGの代わりにCを有し(Cは、望みどおりに同義の変化である(すなわちCDR3/FW4接合部の周囲のコードされるアミノ酸配列を変更しない))、これがGGCA AIDホットスポットモチーフも提供しないことにも気付いた。本発明者らは、よって、必須のJH6はこのC塩基を有するべきであると決定し、このことによっても、本発明者らがヒトJH6*02バリアントを用いることになった。
【０２１８】
本明細書における発明の任意の構成の一例では、遺伝子座またはゲノムに含まれる唯一のJH6種は、ヒトJH6*02である。
【０２１９】
本発明者らは、9名の同意した成人の頬スワブから9つの匿名のDNA試料を得た。IgH遺伝子座DNAについての配列決定を行って、自然のJH6バリアント使用について確認した。9名全てのヒトのゲノムがJH6*02バリアント遺伝子セグメントを含有したことが見出された。9名のヒトのうち7名において、ゲノムはJH6*02についてホモ接合性であった(すなわち、それぞれの第14染色体は、IgH遺伝子座におけるそのJH6遺伝子セグメントとしてJH6*02を有した)。本発明者らは、有名な科学者であるCraig VenterおよびJim Watsonのゲノムからの公共で利用可能な配列情報も調べた。これらのゲノムもともにJH6*02を含有した。このバリアントがヒトにおいて共通することが示された。
【０２２０】
そこで、本発明者らは、
(i)いくつかの脊椎動物種にわたって保存されているYYGおよびYYGXDXモチーフを含有し;
(ii)もたらされるTACコドン(停止コドンの危険性があるAIDホットスポット)が1つ少なく、YYGおよびYYGXDXモチーフを保存するコドンの代わりの選択がもたらされ;
(iii)HCDR3/FW4接合部の領域においてGGCA AIDホットスポットが回避され;かつ
(iv) JH6*02バリアントがヒトにおいて共通して出現する(よって保存され受け入れられる)
ことに基づいてヒトJH6*02を選択した。
【０２２１】
本発明者らは、実験室実施例においてこの根拠について試験して、外来(非ヒト脊椎動物)の背景においてヒトJH6*02が抗体遺伝子セグメント組換えおよび重鎖生成に望ましく参加できるかを調べ、さらに、ヒトJH6*02に基づく長いHCDR3をこのような非ヒト系においてin vivo(ナイーブおよび免疫化された背景において)で生成できるかを評価した。マウスのようないくつかの非ヒト背景において、YYGおよびYYGXDXモチーフが保存されていないことがわかり、よって、本発明者らは、このような外来の背景においてJH6*02(YYGおよびYYGXDXモチーフを有する)が正しく機能してVDJ組換えおよび抗原に対する選択に参加できるかを試験することが重要であると結論付けた。
【０２２２】
よって、実施例においてさらに説明するように、本発明者らは、ES細胞においてトランスジェニックJH6*02含有IgH遺伝子座を構築し、該ES細胞(ナイーブおよび一連の異なるタイプの標的抗原で免疫化した)からトランスジェニック非ヒト脊椎動物を作製し、JH6*02に基づく抗体および重鎖配列ならびにこれらを発現するB細胞を単離し、選択したJH6*02バリアントに基づく抗原特異的抗体を発現するハイブリドーマを作製した。本発明者らは、JH6*02バリアントが広範に用いられ、多くの異なる重鎖(抗原特異的重鎖を含む)において少なくとも20アミノ酸のHCDR3の生成に貢献し得ることを見出した。選択したバリアントは、全ての背景(ナイーブ、免疫化および抗原特異的)において、少なくとも20アミノ酸のHCDR3の生成のために他のJH遺伝子セグメントを超えて好ましく用いられた。
【０２２３】
よって、本発明は、ヒトJH6*02(IMGT命名法)を必須のJH遺伝子セグメントとして含むIgH遺伝子座を提供する。一実施形態では、遺伝子座は、ヒトJH6*02の下流(すなわち3')にある非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)定常領域遺伝子セグメントと、ヒトJH6*02の上流(すなわち5')にある1または複数のVH遺伝子セグメント(例えば複数のヒトVH遺伝子セグメント)および1または複数のD遺伝子セグメント(例えば複数のヒトD遺伝子セグメント)とを含む。例えば、遺伝子座は、ベクター(例えばDNAベクター、例えば酵母人工染色体(YAC)、BACまたはPAC)に含まれる。このようなベクター(例えばYAC)は、ヒトJH6*02とVHおよびD遺伝子セグメントとの組換えの生成物である可変ドメインを有する少なくとも1つの鎖を含むIgH鎖の発現のために遺伝子座が細胞ゲノムに組み込まれるように、標準的な技術(例えば前核注入)を用いて非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)細胞に導入できる。
【０２２４】
別の例では、遺伝子座(例えば完全ヒト、ラットもしくはマウスの定常領域またはヒト/マウスキメラ定常領域を有する)を、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)細胞のゲノム中にもたらすことができる。例えば、細胞は、ES細胞または抗体生成細胞(例えば単離B細胞、iPS細胞またはハイブリドーマ)である。
【０２２５】
別の例では、本発明は、ヒトJH6*02遺伝子セグメントを含む本発明のIgH遺伝子座を含む非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)を提供し、ここで、該遺伝子座は、ヒトJH6*02とVHおよびD遺伝子セグメントとの組換えの生成物である可変ドメインを有するIgH鎖を発現できる。実施例に示すように、本発明者らは、ヒトJH6*02に基づくVHドメインを有するこのようなIgH鎖を生成するこのようなマウスを生成することに成功した。本発明者らは、一連の標的抗原に曝露する前(ナイーブ)および後(免疫化)にマウスからのIgH鎖を単離して配列決定し、IMGT IgH遺伝子セグメント配列との比較により、単離された鎖(およびこれらを含有する抗体)がJH6*02に基づいて生成されていることを確認した。このような鎖は、ナイーブマウスにおいておよび免疫化マウスからの抗原特異的抗体において見出された。JH6*02に基づく抗体を発現するB細胞を免疫化マウスから単離し、JH6*02に基づく抗原特異的抗体を発現するハイブリドーマをB細胞から作製した。本発明者らは、よって、ヒトJH6*02の使用に基づいて本発明の遺伝子座、脊椎動物、細胞およびハイブリドーマを提供し、JH6*02に基づく抗体およびこれらを発現するB細胞が、脊椎動物の免疫化の後にうまく生成および単離できることを示したが、このことは、ハイブリドーマが、例えば患者への投与のため、例えばヒト医薬のためのJH6*02に基づくVHドメインを有する抗体の良好な供給源であることに相当する。さらに、JH6*02に基づくVHドメインを有し、比較的長いHCDR3(例えば20アミノ酸)を有する抗原特異的抗体を生成および単離できることが見出された。
【０２２６】
よって、本発明は、以下の項目のとおりの実施形態を提供する。
1.ヒト遺伝子セグメントJH6*02と、1または複数のVH遺伝子セグメントと、1または複数のD遺伝子セグメントとを定常領域の上流に含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(場合によりマウスまたはラット)または脊椎動物細胞であって、重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントが、ヒトJH6*02とDセグメントおよびVHセグメントとの組換えにより生成される抗体重鎖をマウスが生成できるように定常領域に作動可能に連結している非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【０２２７】
別の例では、本発明は、以下を提供する。
V3-21、V3-13、V3-7、V6-1、V1-8、V1-2、V7-4-1、V1-3、V1-18、V4-4、V3-9、V3-23、V3-11およびV3-20から選択されるヒトIGHV遺伝子セグメントの1、複数または全て(例えばV3-21*03、V3-13*01、V3-7*01、V6-1*01、V1-8*01、V1-2*02、V7-4-1*01、V1-3*01、V1-18*01、V4-4*01、V3-9*01およびV3-23*04の1、複数または全て)を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(場合によりマウスまたはラット)または脊椎動物細胞。これらのセグメントは、ナイーブレパートリーにおいて、少なくとも20アミノ酸の長さを有するHCDR3を生成するように生産的であることが見出された。ある実施形態では、遺伝子座は、ヒトJH6、例えばJH6*02を含む。
【０２２８】
本発明は、少なくとも20アミノ酸のHCDR3サイズを有するHCDR3、VHドメイン、抗体重鎖または抗体も提供する。場合により、HCDR3またはVHドメイン(または重鎖もしくは抗体のVHドメイン)は、マウスAID-パターン体細胞超変異および/またはマウスdTd-パターン変異を含む。このことは、例えば、マウスAIDおよび/またはマウスTdT(例えば内因性AIDまたはTdT)を含むマウスにおいてVHドメインが生成される場合にもたらすことができる。Annu. Rev. Biochem. 2007. 76:1〜22頁;Javier M. Di NoiaおよびMichael S. Neuberger、「Molecular Mechanisms of Antibody Somatic Hypermutation」(特に図1およびマウスにおけるAIDホットスポットについての関連する議論);ならびにCurr Opin Immunol. 1995年4月;7(2):248〜54頁、「Somatic hypermutation」、Neuberger MSおよびMilstein C(特にマウスにおけるホットスポットについての議論)(これらの開示は本明細書に参照により組み込まれている)も参照されたい。
【０２２９】
これらのセグメントは、ナイーブレパートリーにおいて、ヒトJH6*02との組換えにおいて少なくとも20アミノ酸の長さを有するHCDR3を生成するように生産的であることが見出された。
【０２３０】
ある例では、脊椎動物は、ナイーブである。別の実施形態では、脊椎動物は、代わりに、標的抗原で免疫化されている。
【０２３１】
ある例では、以下に言及する脊椎動物または細胞は、標的抗原での免疫化により抗体重鎖を生成できる。ある例では、脊椎動物は、標的抗原に特異的な抗体重鎖を生成する免疫化脊椎動物であり、ここで、重鎖の可変ドメインは、VHとDとJH6*02との間の組換えの生成物である。例えば、Dは、ヒトD3-3、D2-15、D3-9;D4-17;D3-10;D2-2;D5-24;D6-19;D3-22;D6-13;D5-12;D1-26;D1-20;D5-18;D3-16;D2-21;D1-14;D7-27;D1-1;D6-25;D2-14およびD4-23から選択される(例えばD3-9*01;D4-17*01;D3-10*01;D2-2*02;D5-24*01;D6-19*01;D3-22*01;D6-13*01;D5-12*01;D1-26*01;D1-20*01;D5-18*01;D3-16*02;D2-21*02;D1-14*01;D7-27*02;D1-1*01;D6-25*01;D2-15*01;およびD4-23*01から選択される)。例えば、Dは、ヒトD3-9またはD3-10である。ある例では、HCDR3の長さは、少なくとも20アミノ酸(例えば20、21、23または24)である。
【０２３２】
脊椎動物または細胞のある例では、ゲノムは、さらなるヒトJH遺伝子セグメント(例えばJH2、3、4および5遺伝子セグメント)を含む。
【０２３３】
脊椎動物または細胞のある例では、ゲノムは、定常領域(例えばヒトまたはマウスのラムダまたはカッパ定常領域)の上流の1または複数のヒトV遺伝子セグメントと1または複数のヒトJ遺伝子セグメントとを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。
【０２３４】
重鎖の再構成および発現のために、遺伝子座は、当業者に知られるように、J遺伝子セグメントと定常領域との間にEμおよびSμのような制御エレメントを含む。一例では、マウスEμおよびSμは、重鎖遺伝子座中で、JH6*02と定常領域との間に含まれる(すなわち遺伝子座は、5'から3'の順序でJH6*02とEμとSμと定常領域とを含む)。ある例では、EμおよびSμは、マウス129由来ゲノムのEμおよびSμである(例えば129Sv由来ゲノム、例えば129Sv/EV(例えば129S7Sv/Ev(例えばBaylor College of Medicine、Texas、USAから得ることができるAB2.1またはAB2.2細胞から)または129S6Sv/Ev)))。別の例では、EμおよびSμは、マウスC57BL/6由来ゲノムのEμおよびSμである。この点で、遺伝子座は、AB2.1、AB2.2、VGF1、CJ7およびFH14から選択される細胞のゲノムのIgH遺伝子座中で構築できる。VGF1細胞は、Auerbach W、Dunmore JH、Fairchild-Huntress Vら;Establishment and chimera analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-derived mouse embryonic stem cell lines. Biotechniques 2000; 29:1024〜8、30、32頁(本明細書に参照により組み込まれている)において樹立され記載されている。
【０２３５】
さらにまたは代わりに、定常領域(または少なくともCμまたはCμとそのガンマ定常領域)は、直前の段落に記載するゲノムの定常領域である(またはCμまたはCμとそのガンマ定常領域)。
【０２３６】
JH6*02および他のヒトDNA配列の適切な供給源は、当業者に容易に明らかである。例えば、同意したヒトドナー(例えば本明細書の実施例に記載するとおりに頬スワブ試料)からDNA試料を回収し、該試料から、本発明の遺伝子座の構築に用いるための適切なDNA配列を得ることができる。ヒトDNAの他の供給源は、当業者に知られるように商業的に入手可能である。代わりに、当業者は、本明細書に開示するヒトIg遺伝子セグメント配列の1または複数のデータベースを参照することにより遺伝子セグメント配列を構築できる。
【０２３７】
2.脊椎動物が、標的抗原で免疫化されており、重鎖の可変ドメインが、VHとDとJH6*02との間の組換えの生成物であり、HCDR3の長さが、少なくとも20アミノ酸(例えば20、21、23または24)である、項目1に記載の脊椎動物。
【０２３８】
場合により、免疫化脊椎動物は、標的抗原に特異的な抗体重鎖を生成し、ここで、該重鎖の可変ドメインは、VHとDとJH6*02との間の組換えの生成物であり、HCDR3の長さは、少なくとも20アミノ酸(例えば20、21、23または24)である。
【０２３９】
3.ヒト遺伝子セグメントJH6*02と、1または複数のVH遺伝子セグメントと、1または複数のD遺伝子セグメントとを定常領域の上流に含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物細胞(場合によりマウス細胞またはラット細胞)であって、重鎖遺伝子座中の遺伝子セグメントが、ヒトJH6*02とDセグメントおよびVHセグメントとの組換えにより生成される抗体重鎖を(例えば後続の子孫細胞において)生成するために定常領域に作動可能に連結している非ヒト脊椎動物細胞。
【０２４０】
4.前記重鎖を発現する子孫抗体生成細胞に分化できるES細胞である、項目3に記載の細胞。
【０２４１】
5.重鎖遺伝子座が、JH6*02遺伝子セグメントの5'に作動可能に接続したヒトJH6*02組換えシグナル配列(RSS)を含む、項目1から4のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０２４２】
例えば、天然RSS-JH6*02配列を用いて、RSSとそれらのJH遺伝子セグメントとの間の自然の対形成を有利に維持できる。この点で、以下の配列を用いる:
ggtttttgtggggtgaggatggacattctgccattgtgattactactactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccg tctcctcag(配列番号238)
【０２４３】
RSSは、一般的な構造、すなわち9マー(例えば上記で最初の下線を付した配列)と、その後の22bpのスペーサーと、次いで7マー(例えば上記で2番目に下線を付した配列)を有する。スペーサーは、通常、23bp+/-1であるが、9マーおよび7マーはより保存されている。
【０２４４】
6.RSSが、配列番号238、または配列番号238の22マー配列と少なくとも70%同一である配列を挟む同一の9マーおよび7マーの配列を有する配列である、項目5に記載の脊椎動物または細胞。
【０２４５】
7. RSSおよびJH6*02が、配列番号237のとおりに提供される、項目6に記載の脊椎動物または細胞。
【０２４６】
8.JH6*02が、ゲノム中の唯一のJH6タイプ遺伝子セグメントである、項目1から7のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０２４７】
9.JH6*02が、遺伝子座中で定常領域に最も近いJH遺伝子セグメントである、項目1から8のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０２４８】
10.遺伝子座が、ヒトD遺伝子セグメントD3-9;D4-17;D3-10;D2-2;D5-24;D6-19;D3-22;D6-13;D5-12;D1-26;D1-20;D5-18;D3-16;D2-21;D1-14;D7-27;D1-1;D6-25;D2-14;およびD4-23の1、複数または全てを含む、項目1から9のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０２４９】
例えば、遺伝子座は、ヒトD遺伝子セグメントD3-9*01;D4-17*01;D3-10*01;D2-2*02;D5-24*01;D6-19*01;D3-22*01;D6-13*01;D5-12*01;D1-26*01;D1-20*01;D5-18*01;D3-16*02;D2-21*02;D1-14*01;D7-27*02;D1-1*01;D6-25*01;D2-15*01;およびD4-23*01の1、複数または全てを含む。
【０２５０】
11.遺伝子座が、ヒトD遺伝子セグメントD3-9、D3-10、D6-19、D4-17、D6-13、D3-22、D2-2およびD2-25の1、複数または全てを含む、項目10に記載の脊椎動物または細胞。
【０２５１】
これらのDセグメントは、ヒトJH6*02との組換えにおいて少なくとも20アミノ酸の長さのHCDR3を生成するように生産的であることが見出された。
【０２５２】
ある例では、遺伝子座は、ヒトD遺伝子セグメントD3-9、D3-10、D6-19、D4-17、D6-13およびD3-22の1、複数または全て(例えばD3-9*01、D3-10*01、D6-19*01、D4-17*01、D6-13*01およびD3-22*01の1、複数または全て)を含む。これらのDセグメントは、ナイーブレパートリーにおいて、ヒトJH6*02との組換えにおいて少なくとも20アミノ酸の長さのHCDR3を生成するように生産的であることが見出された。
【０２５３】
ある例では、遺伝子座は、ヒトD遺伝子セグメントD3-10、D6-19およびD1-26の1、複数または全て(例えばD3-10*01、D6-19*01およびD1-26*01の1、複数または全て)を含む。これらのDセグメントは、免疫化レパートリーにおいて、ヒトJH6*02との組換えにおいて少なくとも20アミノ酸の長さのHCDR3を生成するように生産的であることが見出された。
【０２５４】
ある例では、遺伝子座は、ヒトD遺伝子セグメントD3-9およびD3-10の1、複数または全て(例えばD3-9*01およびD3-10*01の1、複数または全て)を含む。これらのDセグメントは、抗原特異的レパートリーにおいて、ヒトJH6*02との組換えにおいて少なくとも20アミノ酸の長さのHCDR3を生成するように生産的であることが見出された。
【０２５５】
12.遺伝子座が、複数のヒトD遺伝子セグメントを含み、JH6*02が、最も3'側のヒトD遺伝子セグメント(または遺伝子座に含まれるヒトDセグメントの全て)に関してヒト生殖系列配置にある、項目1から11のいずれかに記載の脊椎動物または細胞。
【０２５６】
ある例では、最も3'側のD遺伝子セグメントは、D7-27である。ある例では、遺伝子座は、生殖系列ヒトIgH遺伝子座に存在する(例えばIMGTデータベースに示されるとおり)D1-1からD7-27までのヒトD遺伝子セグメントの全てを含む。
【０２５７】
代わりにまたはさらに、JH6*02は、Eμ、Sμおよび定常領域(例えばCμ)の1、複数または全てに関してヒト生殖系列配置にある。
【０２５８】
13.遺伝子座が、V3-21、V3-13、V3-7、V6-1、V1-8、V1-2、V7-4-1、V1-3、V1-18、V4-4、V3-9、V3-23、V3-11およびV3-20から選択されるIGHV遺伝子セグメントの1、複数または全てを含む、項目1から12のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０２５９】
ある例では、遺伝子座は、ヒトIGHV遺伝子セグメントV3-21、V3-13、V3-7、V6-1、V1-8、V1-2、V7-4-1、V1-3、V1-18、V4-4、V3-9、V3-23の1、複数または全て(例えばV3-21*03、V3-13*01、V3-7*01、V6-1*01、V1-8*01、V1-2*02、V7-4-1*01、V1-3*01、V1-18*01、V4-4*01、V3-9*01およびV3-23*04の1、複数または全て)を含む。これらのセグメントは、ナイーブレパートリーにおいて、ヒトJH6*02との組換えにおいて少なくとも20アミノ酸の長さのHCDR3を生成するように生産的であることが見出された。
【０２６０】
ある例では、遺伝子座は、ヒトIGHV遺伝子セグメントV3-7、V3-11、およびV4-4の1、複数または全て(例えばV3-7*01、V3-11*01およびV4-4*02の1、複数または全て)を含む。これらのセグメントは、免疫化パートリーにおいて、ヒトJH6*02との組換えにおいて少なくとも20アミノ酸の長さのHCDR3を生成するように生産的であることが見出された。
【０２６１】
ある例では、遺伝子座は、ヒトIGHV遺伝子セグメントV4-4、V1-8、V3-9、V3-11およびV3-20の1、複数または全て(例えばV4-4*02、V1-8*01、V3-9*01、V3-11*01およびV3-20(例えば*d01)の1、複数または全て)を含む。これらのセグメントは、抗原特異的レパートリーにおいて、ヒトJH6*02との組換えにおいて少なくとも20アミノ酸の長さのHCDR3を生成するように生産的であることが見出された。
【０２６２】
14.遺伝子座が、ヒトD3-9*01、D3-10*01、D6-19*01、D6-13*01、D1-26*01、IGHV1-8*01、IGHV4-61*01、IGHV6-1*01、IGHV4-4*02、IGHV1-3*01、IGHV3-66*03、IGHV3-7*01およびIGHV3-9*01の1、複数または全てを含む、項目1から13のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０２６３】
これらは、JH6*02と非常に高頻度に組み合わさって、生産的重鎖および抗体を生成する遺伝子セグメントである。
【０２６４】
例えば、遺伝子座は、ヒトIGHV1-8*01、D3-9*01およびD3-10*01の1、複数または全てを含む。これらの遺伝子セグメントは、JH6*02とともに、10より多い抗体において少なくとも20アミノ酸のHCDR3を生成するように生産的である。
【０２６５】
15.項目3から14のいずれか1つに記載の細胞の子孫である抗体生成細胞(例えばB細胞)であって、ヒトJH6*02とDセグメントおよびVHセグメント(例えばJH6*02とヒトVH3-11(例えばVH3-11*01)およびD3-9;VH3-20(例えばVH3-20*01)およびD3-10;VH4-4(例えばVH4-4*02)およびD3-10;VH3-9(例えばVH3-9*01)およびD3-10;またはVH1-8(例えばVH1-8*01)およびD310)との組換えにより生成される再構成可変領域を含む重鎖遺伝子座を含む抗体生成細胞。
【０２６６】
このような可変領域は、本発明の非ヒト脊椎動物または細胞におけるin vivo体細胞超変異の生成物であり得る。
【０２６７】
16.ヒトJH6*02とDセグメントおよびVHセグメント(例えばJH6*02とヒトVH3-11(例えばVH3-11*01)およびD3-9;VH3-20(例えばVH3-20*01)およびD3-10;VH4-4(例えばVH4-4*02)およびD3-10;VH3-9(例えばVH3-9*01)およびD3-10;またはVH1-8(例えばVH1-8*01)およびD310)との組換えにより生成される再構成可変領域を含む重鎖を含む標的抗原特異的抗体を発現するB細胞またはハイブリドーマである、項目15に記載の細胞。
【０２６８】
このような可変領域は、本発明の非ヒト脊椎動物または細胞におけるin vivo体細胞超変異の生成物であり得る。
【０２６９】
17.抗体重鎖が、標的抗原と特異的に結合する、項目1から16のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０２７０】
18.抗体重鎖が、少なくとも20アミノ酸のHCDR3長さを有する、項目1から17のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０２７１】
場合により、HCDR3の長さは、少なくとも21、22、23、24、25、26、27、28、29または30アミノ酸である。さらに、一例では、長さは、35、34、33、32または31アミノ酸以下である。例えば、HCDR3の長さは、20、21、22、23または24アミノ酸である。
【０２７２】
19.抗体重鎖が、JH6*02と、項目13もしくは14に記載のヒトVH遺伝子セグメントおよび/または項目10、11もしくは14に記載のD遺伝子セグメントとの組換えの生成物である、項目1から18のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０２７３】
20.全ての内因性非ヒト脊椎動物重鎖可変領域遺伝子セグメントが、ゲノムにおいて不活性化されている(例えば遺伝子セグメント欠失または逆位により)、項目1から19のいずれかに記載の脊椎動物または細胞。
【０２７４】
21.ゲノムが、前記重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、項目1から20のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０２７５】
22.少なくとも20アミノ酸のHCDR3を含む、請求項1、2、5から14および17から21のいずれか一項に記載の脊椎動物から単離された重鎖(例えば抗体に含まれる)。
【０２７６】
23.HCDR3が、ヒトJH6*02と、項目13もしくは14に記載のヒトVH遺伝子セグメントおよび/または項目10、11もしくは14に記載のD遺伝子セグメントとの組換えの生成物である、項目22に記載の重鎖。
【０２７７】
ある例では、重鎖はキメラであり、C領域は非ヒトである。ある例では、重鎖はヒトであり、C領域はヒトである。
【０２７８】
24.項目22または23に記載の重鎖のVH可変ドメインと同一のVH可変ドメインを有し、ヒト定常領域またはヒト-マウスキメラ定常領域(例えばCH1がヒトであり、他の定常ドメインが、マウスである)を含む重鎖(例えば抗体に含まれる)。
【０２７９】
25.標的抗原に特異的なVH可変ドメインを有する、項目22、23または24に記載の重鎖。
【０２８０】
26.標的抗原に特異的な重鎖、VHドメインまたは抗体を生成するための方法であって、項目1、2、5から14および17から21のいずれか一項に記載の非ヒト脊椎動物を抗原で免疫化する工程と、標的抗原に特異的な重鎖、VHドメインもしくは抗体または重鎖、VHドメインもしくは抗体を生成する細胞を単離する工程とを含み、重鎖、VHドメインまたは抗体が、ヒトJH6*02とVH遺伝子セグメントおよびD遺伝子セグメントとの組換えに由来するHCDR3を含む方法。
【０２８１】
27.項目26に記載の方法を行う工程であって、遺伝子座の定常領域が、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)定常領域である工程と、次いで、単離重鎖または抗体の非ヒト定常領域をヒト定常領域で置き換える工程(例えば抗体をコードする核酸を工学的に操作することにより)とを含む、ヒト重鎖または抗体を生成するための方法。
【０２８２】
28.項目26または27に記載の方法により生成される重鎖、VHドメインまたは抗体。
【０２８３】
場合により、HCDR3の長さは、本明細書で記載するように、少なくとも20アミノ酸である。
【０２８４】
29.項目22、23または28に記載の重鎖のVHドメインと同一の重鎖VHドメインを発現するB細胞またはハイブリドーマ。
【０２８５】
30.項目22、23もしくは28に記載の重鎖のVHドメインをコードするかまたは項目22、23、24、25もしくは28に記載の重鎖をコードする核酸。
【０２８６】
31.項目30に記載の核酸を含み、場合により宿主細胞(例えばCHO細胞またはHEK293細胞)中にあるベクター(例えばCHO細胞またはHEK293細胞ベクター)。
【０２８７】
32.項目22から25および28のいずれか一項に記載の抗体、重鎖またはVHドメイン(例えば抗体に含まれる)を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、重鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【０２８８】
33.医学において使用するための(例えばヒト医薬)、項目22から25および28のいずれか一項に記載の抗体、重鎖またはVHドメイン(例えば抗体に含まれる)。
【０２８９】
例えば、遺伝子座は、以下のヒトVH遺伝子セグメントを含む。
IGHV6-1
IGHV3-7
IGHV1-8
IGHV3-9
IGHV3-11
IGHV3-13
IGHV1-18
IGHV3-30
IGHV4-31
IGHV4-39
IGHV4-59
【０２９０】
場合により、(i)および/または(ii)も含む。
(i)
IGHV1-2
IGHV2-5および
IGHV3-21
(ii)
IGHV1-2
IGHV2-5
IGHV3-21
IGHV1-24
【０２９１】
例えば、遺伝子座は、以下のヒトVH遺伝子セグメントバリアントを含む。
IGHV6-1*01
IGHV3-7*01
IGHV1-8*01
IGHV3-9*01
IGHV3-11*01
IGHV3-13*01
IGHV1-18*01
IGHV3-30*18
IGHV4-31*03
IGHV4-39*01および
IGHV4-59*01;
【０２９２】
場合により、(iii)または(iv)も含む。
(ii)
IGHV1-2*04
IGHV2-5*10および
IGHV3-21*03
(iv)
IGHV1-2*02
IGHV2-5*01
IGHV3-21*01および
IGHV1-24*01
【０２９３】
例えば、遺伝子座は、以下のヒトJH遺伝子セグメントバリアントを含む。
IGHJ2*01
IGHJ3*02
IGHJ4*02
IGHJ5*02および
IGHJ6*02
【０２９４】
例えば、遺伝子座は、以下のヒトD遺伝子セグメント
IGHD1-1
IGHD2-2
IGHD3-9
IGHD3-10
IGHD5-12
IGHD6-13
IGHD1-14
IGHD2-15
IGHD3-16
IGHD4-17
IGHD6-19
IGHD2-21
IGHD5-24
IGHD1-26および
IGHD7-27
および場合により(v)または(vi)も含む。
(v)
IGHD3-3
(vi)
IGHD3-3
IGHD4-4
IGHD5-5
IGHD6-6
IGHD1-7
IGHD2-8および
IGHD2-8
【０２９５】
本発明は、第5の構成において以下を提供する。
ヒトへの使用および抗体ヒト化に合わせて作製された定常領域
さらなる合理的設計およびバイオインフォマティクスにより導かれて、本発明者らは、特定のヒト定常領域バリアントが多くの多様なヒト集団にわたって保存されていることに気付いた。本発明者らは、このことが、ヒト定常領域(または合成バージョンのヒト定常領域)を任意に選択するのではなく、このような特定の定常領域を生成物において用いることにより、抗体、鎖および可変ドメインをヒト化するという選択の可能性を広げることができることに気付いた。本発明のこの態様は、特定のヒト人種集団に対して抗体に基づく薬物を作製することを可能にし、そのことにより、従来行われていたよりも密接に薬物を患者(およびよって疾患背景)にマッチさせることができる。最先端の技術では、異なるヒト人種集団の患者では機能しない任意に選択された(1つ(しばしば未知である)の人種集団からおそらく導かれたか、または自然に存在しない)ヒト定常領域を用いて抗体がヒト化されることが問題になり得る。このことは重要である。なぜなら、定常領域は、例えば抗体再利用、細胞および補体の動員ならびに細胞殺傷のための抗体エフェクター機能を提供することにおいて主要な役割を有するからである。
【０２９６】
WO2011066501においてさらに論じられるように、ヒトIgGサブタイプIgG1、IgG2、gG3およびIgG4は、抗体依存性細胞傷害性(ADCC、例えばIgG1およびIgG3)、抗体依存性細胞食作用(ADCP、例えばIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4)、および補体依存性細胞傷害性(CDC、例えばIgG1、IgG3)のような、免疫機能を動員するための異なる能力を示す。このような免疫機能のサブタイプ特異的な連関は、異なる免疫細胞上のFc受容体についての選択性、およびC1qと結合し、膜侵襲複合体(MAC)のアセンブリを活性化する能力に基づく。様々なタイプのうち、Fcγ受容体(例えばFcγRI、FcγRIIa/b/c、FcγRIIIa/b)についての相対的親和性はIgG1およびIgG3について高いが、IgG2(FcγRIIa 131H多型に制限される)について最小限の親和性があり、IgG4は、FcγRIについて測定可能な親和性だけを有する。比較配列分析および共結晶構造を用いて、受容体結合についての鍵となる接触残基を、下部ヒンジおよびCH2領域にわたるアミノ酸残基に対してマッピングした。標準的なタンパク質工学技術を用いて、Fc受容体および補体のC1q成分についての抗体調製物の親和性をいくらか増進または低減させることに成功した。
【０２９７】
アイソタイプのうち、IgG2は、Fc受容体のファミリーとの結合能力が最も低い。IgG2を開始点として用いて、エフェクター機能が減衰しているがFcRn結合、長期安定性および低免疫原性を保持する変異体を見出すことを試みた。この性質の改良された変異体は、安全性が保持された改良された抗体治療薬を提供できる。細胞表面標的と結合するヒトIgG1治療用抗体は、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)または補体依存性細胞傷害性(CDC)により標的細胞の細胞溶解を媒介できるエフェクター細胞を従事させることができる。これらの機構は、抗体FcドメインのCH2領域と免疫エフェクター細胞上のFcγR受容体または補体カスケードの第1の成分であるC1qとの相互作用により生じる。Table 19(表42)は、異なるヒトガンマサブタイプの活性を示す。当業者は、したがって、対象のヒトにおける疾患背景に依存して活性を促進または弱めることを選択できる。例えば、古典的経路による比較的高い補体活性化活性およびヒト患者におけるFcγR1認識を有する完全ヒト重鎖および抗体を単離することを望む場合に、ヒトガンマ-1定常領域の使用が望ましい。Mol Immunol. 2003年12月;40(9):585〜93頁;「Differential binding to human Fcgamma RIIa and Fcgamma RIIb receptors by human IgG wild type and mutant antibodies」; Armour KLら(これは、本明細書に参照により組み込まれている)も参照されたい。
【０２９８】
IgG2定常領域は、ヒトにおけるサイトカインまたは可溶性標的と結合するための本発明に従う抗体および重鎖を生成するために適切である。なぜなら、IgG2は、本質的にFcγRI、III-サイレント、FcγRIIa-活性であり、ほとんど補体活性を有さないからである。
【０２９９】
IgG1定常領域は、ヒト治療薬のために広い利用性を有する。なぜなら、IgG1抗体および重鎖は、FcγRI、II、III-活性であり、補体活性を有するからである。このことは、当該技術において知られるようにして工学的に操作することにより活性化されたヒトガンマ-1定常領域を用いることにより増進できる。
【０３００】
本発明者らの研究は、よって、異なるアイソタイプのヒト定常領域のコレクションを同定し、キメラ抗体鎖をヒト化する(またはdAbもしくはラクダVHHのようなVドメインを定常領域にコンジュゲートする)場合に、該コレクションから情報に基づいた選択を行うことができる。コレクションは、1000 Genomesデータベースのバイオインフォマティクス分析に基づいて同定され、本発明者らは、いくつかのヒト人種集団にわたって頻繁に生じる提供領域バリアント、および個別の集団において比較的高い頻度で出現する(バリアントを含むゲノムを有する個体の数により評価される)定常領域バリアントを選択した。このことに基づいて無数の可能性がある配列を整理することにより、本発明者らは、自然に存在し、ヒト定常領域を有する抗体、重鎖および他の抗体に基づくフォーマットを合理的に設計する場合に用いることができるヒト定常領域バリアントのコレクションを提供する。特に、このことは、キメラ重鎖をヒト化して可変および定常領域がともにヒトである完全ヒト鎖を生成する場合に有用である。このことは、抗体に基づく薬物を受けるヒト患者との適合性のために有用である。
【０３０１】
このために、本発明は、以下の態様を提供する。
【０３０２】
1.(a)抗原特異的重鎖可変ドメイン(例えばVH(例えばヒトVHまたはdAb)またはVHHまたはヒト化重鎖可変ドメイン)を提供する工程と、
(b)可変ドメインをヒト重鎖定常領域と組み合わせて、可変ドメインおよび定常領域を(N末端からC末端方向に)含む抗体重鎖を生成する工程と
を含み、
ヒト重鎖定常領域が、IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMaまたはIGHMb定常領域である
抗体重鎖を生成する方法。
【０３０３】
工程(b)は、例えば対応するヌクレオチド配列を用いる組換えDNA技術を用いて行うことができる。
【０３０４】
本構成の任意の態様に従う定常領域について、ゲノムDNAまたは等価物(すなわちイントロンとエキソンと場合により例えば天然または非天然リーダー配列を有する5'UTR配列とを有する)を定常領域のために用いることができる。例えば、本明細書の配列番号365以降に開示する「ゲノム」配列のいずれか。代わりに、(例えば天然または非天然リーダー配列を有する)イントロンレス配列、例えば本明細書で配列番号365以降に開示する「CDS」配列のいずれかを用いることができる。
【０３０５】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHAref定常領域である。
【０３０６】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHA1a定常領域である。
【０３０７】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHA2a定常領域である。
【０３０８】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHA2b定常領域である。
【０３０９】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHG1ref定常領域である。
【０３１０】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHG2ref定常領域である。
【０３１１】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHG2a定常領域である。
【０３１２】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHG3ref定常領域である。
【０３１３】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHG3a定常領域である。
【０３１４】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHG3b定常領域である。
【０３１５】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHG4ref定常領域である。
【０３１６】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHG4a定常領域である。
【０３１７】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHDref定常領域である。
【０３１８】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHEref定常領域である。
【０３１９】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHMref定常領域である。
【０３２０】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHMa定常領域である。
【０３２１】
場合により、本発明の本構成の任意の態様について、ヒト重鎖定常領域は、IGHMb定常領域である。
【０３２２】
場合により、重鎖または重鎖を含有する抗体の誘導体(例えば変異体またはコンジュゲート)が生成される。例えば、毒性搭載物をコンジュゲートできる(例えば腫瘍学用途のため)。例えば、1または複数の変異を当業者に知られるようにして導入して、Fcエフェクター機能を不活性化または増進できる。
【０３２３】
2.可変ドメインが、ヒト可変ドメインである、態様1に記載の方法。
【０３２４】
ヒト可変ドメインは、例えば、トランスジェニック非ヒト脊椎動物におけるヒトVH、DおよびJH遺伝子セグメントの組換えの生成物である。代わりに、可変ドメインは、当該技術において知られるようにして、ヒトVHライブラリーからin vitroディスプレイ技術を用いて、例えばファージディスプレイ、リボソームディスプレイまたは酵母ディスプレイを用いて同定される。
【０３２５】
別の実施形態では、可変ドメインは、例えば非ヒト(例えばマウスまたはラット)CDRとともにヒトフレームワークを含む、ヒト化可変ドメインである。ヒト化技術は当該技術において標準的であり、当業者が容易に熟知している。
【０３２６】
3.可変ドメインが、抗原で免疫化された非ヒト脊椎動物から予め選択されている、態様1または2に記載の方法。
【０３２７】
例えば、脊椎動物(例えばマウスまたはラット)ゲノムは、ヒト可変ドメインおよび非ヒト脊椎動物定常領域を含む重鎖の発現のために遺伝子座が再構成されるように、非ヒト脊椎動物定常領域の上流に作動可能に接続したヒト可変領域(ヒトV、DおよびJH遺伝子セグメント)を含むキメラ重鎖遺伝子座を含む。
【０３２８】
代替の実施形態では、可変ドメインは、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイまたは酵母ディスプレイのようなin vitro技術を用いて選択される。この場合、可変ドメインは、定常領域とともにまたはなしで提示され得るが、ただし、これは、本発明のとおりにヒト定常領域と後で組み合わされる。
【０３２９】
4.定常領域をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター(例えばCHOまたはHEK293ベクターのような哺乳動物発現ベクター)を提供する工程と、可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を定常領域配列の5'にてベクターに挿入する工程と、ベクターを宿主細胞に挿入して、宿主細胞により重鎖を発現する工程とを含み、可変ドメインおよびヒト定常領域を含む重鎖(例えば抗体の一部として)を単離する工程をさらに含む、態様1から3のいずれかに記載の方法。
【０３３０】
ベクターは、ベクターが宿主細胞、例えばCHOまたはHEK293細胞に保有された場合に重鎖の発現を実現するために十分な調節エレメントを含む。
【０３３１】
5.重鎖をコードするヌクレオチド配列を得る工程をさらに含む、態様1から4のいずれかに記載の方法。
【０３３２】
6.ヒト重鎖を含む抗体であって、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと、IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMaまたはIGHMb定常領域である定常領域とを含む抗体。
【０３３３】
7.リーダー配列と、抗原に特異的なヒト可変ドメインと、IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMaまたはIGHMb定常領域であるヒト定常領域とを(N末端からC末端方向に)含むポリペプチドであって、(i)リーダー配列が、天然ヒト可変ドメインリーダー配列でなく(例えば、リーダー配列は、別のヒトリーダー配列または非ヒトリーダー配列である)、かつ/または(ii)可変ドメインが、マウスAID-パターン体細胞変異もしくはマウス末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン接合部変異を含むポリペプチド。
【０３３４】
8.リーダー配列とヒト抗体重鎖とを(5'から3'の方向に)コードするヌクレオチド配列であって、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと、IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMaまたはIGHMb定常領域である定常領域とを含み、リーダー配列が、(例えば哺乳動物CHOまたはHEK293細胞における)重鎖の発現を作動可能であり、リーダー配列が、天然ヒト可変ドメインリーダー配列でない(例えば、リーダー配列は、別のヒトリーダー配列または非ヒトリーダー配列である)ヌクレオチド配列。
【０３３５】
ある例では、リーダー配列は、
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACCGCCACCGGCGTGCACAGC
(これは、
MGWSCIILFLVATATGVHS
と翻訳される)である。
【０３３６】
9.プロモーターとヒト抗体重鎖とを(5'から3'の方向に)コードするヌクレオチド配列であって、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと、IGHAref、IGHA1a、IGHA2a、IGHA2b、IGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4ref、IGHG4a、IGHDref、IGHEref、IGHMref、IGHMaまたはIGHMb定常領域である定常領域とを含み、プロモーターが、重鎖の発現(例えば哺乳動物CHOまたはHEK293細胞における)を作動可能であり、プロモーターが、天然ヒトプロモーターでないヌクレオチド配列。
【０３３７】
一実施形態では、プロモーター配列は、ヒトIGK 3-15プロモーターである。
【０３３８】
10.可変ドメインが、マウスAID-パターン体細胞変異またはマウス末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン接合部変異を含む、態様6から9のいずれかに記載の抗体、ポリペプチドまたはヌクレオチド配列。
【０３３９】
例えば、本発明の本構成の任意の態様では、マウスAID-パターン体細胞変異および/またはマウス末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン接合部変異をもたらすある方法は、非ヒト脊椎動物または細胞から可変ドメインを選択することである。例えば、本明細書に開示する脊椎動物または細胞。
【０３４０】
11.態様8、9または10に記載の核酸を含み、場合により宿主細胞(例えばCHO細胞またはHEK293細胞)中にあるベクター(例えばCHO細胞またはHEK293細胞ベクター)。
【０３４１】
12.態様6、7および10のいずれかに記載の抗体またはポリペプチドを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、抗体鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【０３４２】
13.ヒト患者における医学的状態の処置および/または防止において使用するための、態様6、7および10のいずれかに記載の抗体またはポリペプチド。
【０３４３】
14.ヒト患者における医学的状態の処置および/または防止用の医薬品の製造のための、態様6、7および10のいずれかに記載の抗体またはポリペプチドの使用。
【０３４４】
15.ヒトが、集団番号l〜l4から選択されるヒト集団のメンバーであり、集団には、以下のように番号を付す(集団ラベルは、l000 Genomesプロジェクト命名法に従う):
1=ASW;
2=CEU;
3=CHB;
4=CHS;
5=CLM;
6=FIN;
7=GBR;
8=IBS;
9=JPT;
10=LWK;
11=MXL;
12=PUR;
13=TSI;
14=YRI
、態様13または14に記載の抗体、ポリペプチドまたは使用。
【０３４５】
16.定常領域が、
(i)IGHA1a定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜14のいずれかから選択される;
(ii)IGHA2a定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜14のいずれかから選択される;
(iii)IGHA2b定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜14のいずれかから選択される;
(iv)IGHG2a定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜9および11〜13のいずれかから選択される;
(V)IGHG3a定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜14のいずれかから選択される;
(vi)IGHG3b定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜8および11〜13のいずれかから選択される;
(vii)IGHG4a定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜9および1〜13のいずれかから選択される;
(viii)IGHMa定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜14のいずれかから選択される;
(ix)IGHMb定常領域であり、ヒト集団が、集団番号1〜14のいずれかから選択される;
(ここで集団には、以下のように番号を付す(集団ラベルは、l000 Genomesプロジェクト命名法に従う):
1=ASW;
2=CEU;
3=CHB;
4=CHS;
5=CLM;
6=FIN;
7=GBR;
8=IBS;
9=JPT;
10=LWK;
11=MXL;
12=PUR;
13=TSI;
14=YRI。
)、態様15に記載の抗体、ポリペプチドまたは使用。
【０３４６】
17.ヒト抗体重鎖可変ドメインヌクレオチド配列の挿入のためのクローニング部位の3'にIGHG1ref、IGHG2ref、IGHG2a、IGHG3ref、IGHG3a、IGHG3b、IGHG4refまたはIGHG4a定常領域ヌクレオチド配列を含み、そのことにより、このような可変ドメイン配列を挿入すると、ベクターが宿主細胞中に存在する場合にヒト抗体重鎖を発現できるように、ベクターがプロモーターとリーダー配列と可変ドメイン配列と定常領域配列とを(5'から3'の方向に)含むようになるベクター(例えばCHO細胞またはHEK293細胞ベクター)。
【０３４７】
本発明は、第6の構成において以下を提供する。
同じゲノム中のシスまたはトランスの複数のバリアント
本発明者らの分析により、Table 13(表23-1〜表23-226)およびTable 14(表14-1〜表32)に示す自然に存在するヒト抗体遺伝子セグメントバリアントの群が明らかになった。このことは、非ヒト脊椎動物および細胞において、自然のヒト補体より多くの特定のヒト遺伝子セグメントを含有するトランスジェニックゲノムを生成する可能性を明らかにした。一例では、このことは、一方または両方の各Ig遺伝子座(例えばマウスゲノムまたはマウス細胞ゲノムにおいてIgHを有する一方または両方の染色体)上に自然のヒト補体より多くの特定の遺伝子セグメントタイプを提供することにより達成できる。
【０３４８】
このために、本発明の本構成は、以下(番号を付した段落に示すとおり)を提供する。
1.同じタイプの少なくとも3つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも3つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも3つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、ヒト遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【０３４９】
例えば、ゲノムは、重鎖または軽鎖をそれぞれ発現するために、定常領域の上流にV、DおよびJ遺伝子セグメント(重鎖遺伝子座の可変領域のため)またはVおよびJ遺伝子セグメント(軽鎖遺伝子座の可変領域のため)を含む可変領域を含む。
【０３５０】
代替では、当業者は、ヒト遺伝子セグメントの1つのバリアントタイプの数コピーを提供することにより、野生型ヒト補体より多くの特定の遺伝子セグメントタイプを提供することを選択できる。よって、
同じタイプの少なくとも3つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも3つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも3つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、該ヒト遺伝子セグメントが、同一バリアントである非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞
が提供される。
【０３５１】
例えば、ゲノムは、重鎖または軽鎖をそれぞれ発現するために、定常領域の上流にV、DおよびJ遺伝子セグメント(重鎖遺伝子座の可変領域のため)またはVおよびJ遺伝子セグメント(軽鎖遺伝子座の可変領域のため)を含む可変領域を含む。
【０３５２】
2.同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【０３５３】
代替では、当業者は、ヒト遺伝子セグメントの1つのバリアントタイプの数コピーを提供することにより、野生型ヒト補体より多くの特定の遺伝子セグメントタイプを提供することを選択できる。よって、
同じバリアントタイプの少なくとも2つの非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトJH6*02遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)
が提供される。
【０３５４】
3.同じタイプの少なくとも2つの異なるヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒト遺伝子セグメントを含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、第3の遺伝子セグメントが、前記2つの異なる遺伝子セグメントの一方とシスにある非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【０３５５】
代替では、当業者は、ヒト遺伝子セグメントの1つのバリアントタイプの数コピーを提供することにより、野生型ヒト補体より多くの特定の遺伝子セグメントタイプを提供することを選択できる。よって、
同じバリアントタイプの少なくとも2つの異なるヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトJH6*02遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じバリアントタイプの第3のヒト遺伝子セグメントを含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、該第3の遺伝子セグメントが、前記2つの異なる遺伝子セグメントの一方とシスにある非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞
が提供される。
【０３５６】
4.ヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、複数のものが、同じタイプの少なくとも2つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含み、前記異なる遺伝子セグメントの第1の遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なる遺伝子セグメントの第2の遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2の遺伝子セグメントを含まない集団。
【０３５７】
5.同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【０３５８】
6.非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも3つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも3つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも3つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも3つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、ヒト遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである方法。
【０３５９】
7.非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含む方法。
【０３６０】
8.非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒト遺伝子セグメントを含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、第3の遺伝子セグメントが、前記2つの異なる遺伝子セグメントの一方とシスにある方法。
【０３６１】
9.増進されたヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントレパートリーを提供する方法であって、ヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)を提供する工程を含み、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を提供する工程を含み、前記異なる遺伝子セグメントの第1の遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なる遺伝子セグメントの第2の遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2の遺伝子セグメントを含まない方法。
【０３６２】
10.非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する方法。
【０３６３】
11.前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される、段落1から10のいずれかに記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０３６４】
12.遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、段落1から11のいずれかに記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０３６５】
13.遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、段落1から12のいずれかに記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０３６６】
14.個体が、遺伝的に関連していない、段落13に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０３６７】
15.非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つのヒト可変領域遺伝子セグメント(例えば少なくとも2つのヒトVH6-1遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトJH6遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトVκ1-39遺伝子セグメント、少なくとも2つのヒトD2-2遺伝子セグメントまたは少なくとも2つのヒトJκ1遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にて提供される方法。
【０３６８】
16.異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、段落15に記載の方法。
【０３６９】
17.個体が、遺伝的に関連していない、段落15に記載の方法。
【０３７０】
18.異なるセグメントの少なくとも1つが、ヒト生殖系列遺伝子セグメントの合成変異体である、段落1から17のいずれかに記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０３７１】
19.前記遺伝子セグメントのそれぞれが、10以上の異なるヒト集団において生じる、段落1から18のいずれかに記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０３７２】
20.前記遺伝子セグメントのそれぞれが、5%以上の(例えば10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、または95%以上の)ヒト頻度を有する、段落1から19のいずれかに記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０３７３】
この点で、当業者は、Table 14(表24-1〜表32)に示す情報を手引きとすることができる。
【０３７４】
頻度は、例えば、1000 Genomesデータベースにおける累積頻度であり得る。
【０３７５】
21.前記遺伝子セグメントのそれぞれが、10以上の異なるヒト集団において生じる、段落20に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０３７６】
22.前記遺伝子セグメントのそれぞれが、1000 Genomesデータベースにおいて、50より多い個体において生じる、段落1から21のいずれかに記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０３７７】
23.前記遺伝子セグメントのそれぞれが、(i)5%以上の(例えば10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、または95%以上の)ヒト頻度を有し、(ii)10以上の異なるヒト集団において生じる、段落1から10のいずれかに記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０３７８】
この点で、当業者は、Table 14(表24-1〜表32)に示す情報を手引きとすることができる。
【０３７９】
頻度は、例えば、1000 Genomesデータベースにおける累積頻度であり得る。
【０３８０】
24.同じタイプの第1および第2のヒトIg遺伝子座遺伝子セグメント(例えば第1および第2のヒトJH6遺伝子セグメント;または第1および第2のIgG2遺伝子セグメント;または第1および第2のヒトJλ7遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、第1の遺伝子セグメントが、Table 14(表24-1〜表24-6)(例えばIGHJ6-a)のいずれか1つから選択される遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列(例えばIGHJ6 ref;配列番号244)である、非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【０３８１】
Table 14(表24-1〜表32)は、一般的に生じる自然のヒトバリアントを列挙する。これらが多くのヒト集団にわたって生じ、よってヒトの抗体に基づく薬物のために広い利用性を有用に有することがわかる。
【０３８２】
例えば、遺伝子セグメントを、標的化挿入として内因性非ヒト脊椎動物Ig遺伝子座に提供する。代わりに、当該技術において知られるようにしてランダム組み込み(例えばYACを用いて)を行うことができる。
【０３８３】
例えば、ゲノムは、重鎖または軽鎖をそれぞれ発現するために、定常領域の上流にV、DおよびJ遺伝子セグメント(重鎖遺伝子座の可変領域のため)またはVおよびJ遺伝子セグメント(軽鎖遺伝子座の可変領域のため)を含む可変領域を含む。
【０３８４】
別の実施形態では、本発明により、当業者は、非ヒト脊椎動物または細胞のゲノムに組み合わせるための、2以上の異なる、自然に存在するヒト遺伝子セグメントバリアントを選択することができる。1または複数の希な遺伝子セグメントを用いて、レパートリーの多様性を増加させることが望ましいことがある。さらにまたは代わりに、同じタイプの高頻度および希なバリアントの混合物を含めて、レパートリー多様性を提供することが望ましいことがある。該バリアントをさらにまたは代わりに選択して、Table 13(表23-1〜表23-226)またはTable 14(表24-1〜表32)に示す情報により示されるように、1または複数の特定のヒト集団に遺伝子セグメントを含めるように作製することができる。
【０３８５】
よって、本発明は、
同じタイプの第1および第2のヒトIg遺伝子座遺伝子セグメント(例えば第1および第2のヒトJH6遺伝子セグメント;または第1および第2のIgG2遺伝子セグメント;または第1および第2のヒトJλ7遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、該遺伝子セグメントが、Table 13(表23-1〜表23-226)またはTable 14(表24-1〜表32)から選択される遺伝子セグメントであり、場合により、該遺伝子セグメントの1または複数が、Table 14(表24-1〜表32)に出現する(例えばIGHJ6-a)か、または参照配列(例えばIGHJ6 ref;配列番号244)である非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞
を提供する。
【０３８６】
25.ゲノムが、前記タイプの第3のヒト遺伝子セグメントを含み、第3の遺伝子セグメントが、第1および第2の遺伝子セグメントとは異なる、段落24に記載の脊椎動物または細胞。
【０３８７】
26.第1および第2の遺伝子セグメントが、同じ染色体上でシスにあり、場合により、第3の遺伝子セグメントも、前記染色体上でシスにある、段落24または25に記載の脊椎動物または細胞。
【０３８８】
27.遺伝子セグメントが、内因性非ヒトIg遺伝子座への標的化挿入である、段落26に記載の脊椎動物または細胞。
【０３８９】
例えば、遺伝子セグメントは、重鎖遺伝子セグメントであり、非ヒト遺伝子座は、IgH遺伝子座である。例えば、遺伝子セグメントは、軽鎖(カッパまたはラムダ)遺伝子セグメントであり、非ヒト遺伝子座は、IgL遺伝子座である。
【０３９０】
28.第1および第2の遺伝子セグメントが、異なる染色体上でトランスにある、段落24または25に記載の脊椎動物または細胞。
【０３９１】
よって、染色体は、同じタイプである(例えばともにマウス第6染色体またはラット第4染色体)。
【０３９２】
29.第1の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)〜7(表12-1〜表12-3)および9(表14-1〜14-3)〜14(表24-1〜表24-6)のいずれか1つから選択される(例えばTable 13(表23-1〜表23-226)またはTable 14(表24-1〜表32)から選択される)遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列である、段落24から28のいずれかに記載の脊椎動物または細胞。
【０３９３】
30.同じタイプの第1および第2のヒトIg遺伝子座遺伝子セグメント(例えば第1および第2のヒトJH6遺伝子セグメント;または第1および第2のIgG2遺伝子セグメント;または第1および第2のヒトJλ7遺伝子セグメント)を含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、第1の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)〜7(表12-1〜表12-3)および9(表14-1〜14-3)〜14(表24-1〜表24-6)(例えばTable 13(表23-1〜表23-226)またはTable 14(表24-1〜表32))(例えばIGHJ6-a)のいずれか1つから選択される遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列(例えば配列番号7)であり、第1の遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第2の遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供される集団。
【０３９４】
31.第1の脊椎動物のゲノムが、第2の遺伝子セグメントを含まない、段落30に記載の集団。
【０３９５】
32.集団が、前記タイプの第3のヒト遺伝子セグメントを含み、第3の遺伝子セグメントが、第1および第2の遺伝子セグメントとは異なり、場合により、第1および第3の遺伝子セグメントが、第1の脊椎動物のゲノムに存在する、段落30または31に記載の集団。
【０３９６】
33.遺伝子セグメントが、それぞれのゲノム中の内因性非ヒトIg遺伝子座への標的化挿入である、段落30、31または32に記載の集団。
【０３９７】
例えば、遺伝子セグメントは、重鎖遺伝子セグメントであり、非ヒト遺伝子座は、IgH遺伝子座である。例えば、遺伝子セグメントは、軽鎖(カッパまたはラムダ)遺伝子セグメントであり、非ヒト遺伝子座は、IgL遺伝子座である。
【０３９８】
34.第1の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)〜7(表12-1〜表12-3)および9(表14-1〜14-3)〜14(表24-1〜表24-6)(例えばTable 13(表23-1〜表23-226)またはTable 14(表24-1〜表32))のいずれか1つから選択される遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列である、段落30から33のいずれか一項に記載の集団。
【０３９９】
35.非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの第1および第2のヒトIg遺伝子座遺伝子セグメント(例えば第1および第2のヒトJH6遺伝子セグメント;または第1および第2のIgG2遺伝子セグメント;または第1および第2のヒトJλ7遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、第1の遺伝子セグメントが、Table 1(表6-1〜表6-30)〜7(表12-1〜表12-3)および9(表14-1〜14-3)〜14(表24-1〜表24-6)(例えばTable 13(表23-1〜表23-226)またはTable 14(表24-1〜表32))(例えばIGHJ6-a)のいずれか1つから選択される遺伝子セグメントであり、第2の遺伝子セグメントが、対応する参照配列(例えば配列番号7)である方法。
【０４００】
36.段落30から33のいずれか一項に記載の集団を提供する工程を含む、増進されたヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントレパートリーを提供する方法。
【０４０１】
ほとんどの集団に普及していないバリアント
別の態様では、あるいくつかのヒト遺伝子セグメントバリアントが、1または少数の集団に比較的頻繁に出現し得るが、多くの異なるヒト集団にわたって普及して見出されないことが注目される。特定の生殖系列遺伝子セグメントレパートリーが、集団がしばしば曝露される抗原(例えば疾患病原体抗原)への曝露の繰り返しにより、個別のヒト人種集団において進化したという考え方がある。曝露の反復および変異は、集団において抗原(病原体)に対して効果的な応答をもたらすことができる遺伝子セグメントバリアントの進化を導いたと考えられ、このことが、(抗原に頻繁に遭遇していないと考えられる他のヒト人種集団とは逆に)これらの集団における遺伝子セグメントの保存を説明できる。このことを頭に入れて、本発明者らは、分析から、少数のヒト集団において比較的普及しているが、多くの集団にわたって普及していない遺伝子セグメントバリアントを同定した。本発明者らは、このような遺伝子セグメントの1または複数を本発明の構成(例えばトランスジェニックIg遺伝子座、脊椎動物および細胞中に)に含めることが、少数のヒト集団が曝露されるようになると考えられる抗原(例えば疾患原因抗原または病原体)に対処できる抗体、Ig鎖および可変ドメインを生成するために有用であることに気付いた。このような生成物は、このような集団のメンバーにおいて疾患または医学的状態を処置および/または防止するために有用である。この態様は、少数の集団において共通するが、他のヒト集団において将来または比較的近い将来進化により、より普及した疾患原因病原体になる感染性疾患病原体(すなわち、問題の遺伝子セグメントバリアントに対してTable 13(表23-1〜表23-226)に列挙していないもの)に対処するためにも有用であり得る。このために、1000 Genomesデータベースから、本発明者らは、Table 20(表43-1〜表46)に列挙する遺伝子セグメントバリアントを同定した。
【０４０２】
よって、本明細書に記載する任意の構成または態様に従って、本発明で用いる遺伝子セグメントの1、複数または全ては、Table 20A(表43-1〜表43-9)、20B(表44)、20C(表45)または20D(表46)に列挙する遺伝子セグメントであり得る。
【０４０３】
複数のJH遺伝子セグメントバリアント
本構成の具体的な用途は、以下のとおりの複数のヒトJH遺伝子セグメントを提供することである。
【０４０４】
同じタイプの少なくとも3つのヒトJH遺伝子セグメント(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)を含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、ヒトJH遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【０４０５】
ある例では、本発明の任意の細胞は、単離細胞である。「単離」細胞は、その生成環境(例えば自然または組換え)の成分から同定、単離および/または回収されたものである。好ましくは、単離細胞は、その生成環境からの全ての他の成分と会合しておらず、例えば、そのことにより、細胞は、FDAにより承認され得るまたは承認された標準で抗体を生成できる。組換えトランスフェクション細胞に起因するようなその生成環境の混入成分は、得られた抗体の研究、診断または治療上の使用に典型的に干渉し、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドを、(1)例えばLowry法により決定されるように抗体が95重量%を超えるまで、いくつかの実施形態では、99重量%を超えるまで;(2)スピンカップシーケンサーの使用によりN末端もしくは内部アミノ酸配列を少なくとも15残基まで得るために十分な程度まで、または(3)クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて、非還元もしくは還元条件下でのSDS-PAGEにより均一になるまで精製する。通常は、しかし、単離細胞は、少なくとも1つの精製工程により調製される。
【０４０６】
同じタイプ(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)の少なくとも2つの異なる非内因性JH遺伝子セグメント(例えばヒト遺伝子セグメント)を同じIg(例えばIgH、例えば内因性IgH、例えばマウスまたはラットIgH)遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。ある例では、ゲノムは、前記異なるJH遺伝子セグメントを含むヒトVH、DおよびJHレパートリーを含む。場合により、非内因性JH遺伝子セグメントは、非マウスまたは非ラット、例えばヒトJH遺伝子セグメントである。ある例では、非内因性遺伝子セグメントの1または複数または全ては、合成である。
【０４０７】
同じタイプ(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)の少なくとも2つの異なるヒトJH遺伝子セグメントを同じIg(例えばIgH、例えば内因性IgH、例えばマウスまたはラットIgH)遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒトJH遺伝子セグメントを含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、該第3のJHが、前記2つの異なるJH遺伝子セグメントの一方とシスにある非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。
【０４０８】
ヒトJH遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、該複数のものが、同じタイプ(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)の少なくとも2つの異なるヒトJH遺伝子セグメントを含み、前記異なるJH遺伝子セグメントの第1のJH遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なるJH遺伝子セグメントの第2のJH遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2のJH遺伝子セグメントを含まない集団。
【０４０９】
同じタイプ(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)の少なくとも2つの異なる非内因性(例えばヒト)JH遺伝子セグメントを含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、該JH遺伝子セグメントが、少なくとも3世代(例えば3、4、5または6世代)にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する非ヒト脊椎動物または非ヒト脊椎動物細胞。場合により、非内因性JH遺伝子セグメントは、ヒトJH遺伝子セグメントである。ある例では、非内因性遺伝子セグメントの1または複数または全ては、合成である。
【０４１０】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプ(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)の少なくとも3つのヒトJH遺伝子セグメントを含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、ヒトJH遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである方法。
【０４１１】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプ(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)の少なくとも2つの異なる非内因性(例えばヒト)JH遺伝子セグメントを、同じIg(例えばIgH、例えば内因性IgH、例えばマウスまたはラットIgH)遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含む方法。場合により、非内因性JH遺伝子セグメントは、非マウスまたは非ラット、例えばヒトJH遺伝子セグメントである。ある例では、非内因性遺伝子セグメントの1または複数または全ては、合成である。
【０４１２】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプ(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)の少なくとも2つの異なるヒトJH遺伝子セグメントを同じIg(例えばIgH、例えば内因性IgH、例えばマウスまたはラットIgH)遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒトJH遺伝子セグメントを含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、該第3のJHが、前記2つの異なるJH遺伝子セグメントの一方とシスにある方法。
【０４１３】
増進されたヒト免疫グロブリンJH遺伝子セグメントレパートリーを提供する方法であって、ヒトJH遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の集団を提供する工程を含み、同じタイプ(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)の少なくとも2つの異なるヒトJH遺伝子セグメントを提供する工程を含み、前記異なるJH遺伝子セグメントの第1のJH遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なるJH遺伝子セグメントの第2のJH遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2のJH遺伝子セグメントを含まない方法。
【０４１４】
非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプ(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)の少なくとも2つの異なる非内因性(例えばヒト)JH遺伝子セグメントを含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、該JH遺伝子セグメントが、少なくとも3世代(例えば3、4、5または6世代)にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する方法。場合により、非内因性JH遺伝子セグメントは、ヒトJH遺伝子セグメントである。ある例では、非内因性遺伝子セグメントの1または複数または全ては、合成である。
【０４１５】
本発明の脊椎動物もしくは細胞または方法のある例では、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つは、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される。
【０４１６】
本発明の脊椎動物もしくは細胞または方法のある例では、JH遺伝子セグメントは、少なくとも3世代(例えば3、4、5または6世代)にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する。
【０４１７】
本発明の脊椎動物もしくは細胞または方法のある例では、JH遺伝子セグメントは、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、異なるヒト個体は、異なるヒト集団からである。
【０４１８】
本発明の脊椎動物もしくは細胞または方法のある例では、個体は、遺伝的に関連しない(例えば3、4、5または6世代戻る)。
【０４１９】
本発明の脊椎動物もしくは細胞または方法のある例では、異なるJHセグメントの少なくとも1つは、ヒト生殖系列JH遺伝子セグメントの合成変異体である。
【０４２０】
本発明は、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプ(JH1、JH2、JH3、JH4、JH5またはJH6)の少なくとも2つのヒトJH遺伝子セグメントを含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、該JH遺伝子セグメントが、少なくとも3世代(例えば3、4、5または6世代)にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノム中の同じIgH遺伝子座にて提供される方法も提供する。
【０４２１】
本発明の本実施形態の脊椎動物もしくは細胞または方法のある例では、ゲノムは、ヒトJH遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いヒトJH遺伝子セグメントとを含み、ここで、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なJH遺伝子セグメントは、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない。
【０４２２】
本発明の集団のある例では、集団は、ヒトJH遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いヒトJH遺伝子セグメントとを含み、ここで、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なJH遺伝子セグメントは、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない。
【０４２３】
ヒトJH遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いヒトJH遺伝子セグメントとを含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なJH遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない非ヒト脊椎動物または非ヒト細胞。
【０４２４】
ヒトJH遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いヒトJH遺伝子セグメントとを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なJH遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない集団。
【０４２５】
脊椎動物または集団のある例では、前記JH遺伝子セグメントの少なくとも1つは、配列番号1、2、3または4である。例えば、前記JH遺伝子セグメントの少なくとも1つは、配列番号1であり、前記補足的なJH遺伝子セグメントの少なくとも1、2またはそれ以上は、上記の例のいずれかに従うバリアントである。例えば、前記JH遺伝子セグメントの少なくとも1つは、配列番号2であり、前記補足的なJH遺伝子セグメントの少なくとも1、2またはそれ以上は、上記の例のいずれか1つに従うバリアントである。例えば、前記JH遺伝子セグメントの少なくとも1つは、配列番号2であり、前記補足的なJH遺伝子セグメントの少なくとも1、2またはそれ以上は、上記の例のいずれか1つに従うバリアントである。
【０４２６】
ある実施形態では、本発明の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞は、ヒト遺伝子セグメントを含むVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、該JH遺伝子レパートリー(例えばヒトJH遺伝子セグメントレパートリー)は、
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるJH1遺伝子セグメントにより提供される複数のJH1遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるJH2遺伝子セグメントにより提供される複数のJH2遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるJH3遺伝子セグメントにより提供される複数のJH3遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるJH4遺伝子セグメントにより提供される複数のJH4遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるJH5遺伝子セグメントにより提供される複数のJH5遺伝子セグメント;および/または
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるJH6遺伝子セグメントにより提供される複数のJH6遺伝子セグメント
を含み、場合により、該JH遺伝子セグメントは、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する。
【０４２７】
場合により、前記少なくとも2つの異なるJH遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントまたはヒト遺伝子セグメントに由来する合成遺伝子セグメントである。
【０４２８】
場合により、Ig遺伝子座は、IgH遺伝子座、例えば内因性遺伝子座、例えばマウスまたはラットIgH遺伝子座である。
【０４２９】
ある実施形態では、本発明の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞は、ヒト遺伝子セグメントを含むVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、該JH遺伝子レパートリー(例えばヒトJH遺伝子セグメントレパートリー)は、
少なくとも3つの異なるJH1遺伝子セグメントにより提供される複数のJH1遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるJH2遺伝子セグメントにより提供される複数のJH2遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるJH3遺伝子セグメントにより提供される複数のJH3遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるJH4遺伝子セグメントにより提供される複数のJH4遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるJH5遺伝子セグメントにより提供される複数のJH5遺伝子セグメント;および/または
少なくとも3つの異なるJH6遺伝子セグメントにより提供される複数のJH6遺伝子セグメント
を含み、場合により、該JH遺伝子セグメントは、2または3の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、
場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つは、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される。
【０４３０】
場合により、前記少なくとも3つの異なるJH遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントまたはヒト遺伝子セグメントに由来する合成遺伝子セグメントである。
【０４３１】
場合により、Ig遺伝子座は、IgH遺伝子座、例えば内因性遺伝子座、例えばマウスまたはラットIgH遺伝子座である。
【０４３２】
場合により、脊椎動物または細胞において、異なるヒト個体は、異なるヒト集団からである。
【０４３３】
場合により、脊椎動物または細胞において、個体は、遺伝的に関連しない(例えば3、4、5または6世代戻る)。
【０４３４】
場合により、脊椎動物または細胞において、異なるJHセグメントの少なくとも1つは、ヒト生殖系列JH遺伝子セグメントの合成変異体である。
【０４３５】
本発明による非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞またはB細胞)のある実施形態では、脊椎動物または細胞ゲノムは、ヒトVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含み、該JH遺伝子レパートリー(例えばヒトJH遺伝子レパートリー)は、
少なくとも2つの異なるヒトJH1遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のJH1遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJH2遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のJH2遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJH3遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のJH3遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJH4遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のJH4遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJH5遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のJH5遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJH6遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のJH6遺伝子セグメント
を含み、ここで、該JH遺伝子セグメントは、少なくとも3世代(例えば3、4、5または6世代)にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する。
【０４３６】
場合により、前記少なくとも2つの異なるJH遺伝子セグメントは、ヒト遺伝子セグメントまたはヒト遺伝子セグメントに由来する合成遺伝子セグメントである。
【０４３７】
場合により、Ig遺伝子座は、IgH遺伝子座、例えば内因性遺伝子座、例えばマウスまたはラットIgH遺伝子座である。
【０４３８】
場合により、脊椎動物または細胞において、ヒト個体は、異なるヒト集団からである。
【０４３９】
JH5
ある実施形態は、複数のJH5遺伝子セグメントを含むゲノムを有する本発明の脊椎動物、細胞または集団を提供し、ここで、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の
106,330,024位
106,330,027位
106,330,032位
106,330,041位
106,330,044位
106,330,045位
106,330,062位
106,330,063位
106,330,065位
106,330,066位
106,330,067位
106,330,068位および
106,330,071位
に相当する1または複数の位置にてヌクレオチド変異を含む。
【０４４０】
脊椎動物、細胞または集団において、場合により、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,067位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異はない。
【０４４１】
場合により、バリアントは、(i)ヒト第14染色体上の106,330,071位(場合により、さらなる変異はグアニンである);(ii)ヒト第14染色体上の106,330,066位(場合により、さらなる変異はグアニンである);および/または(iii)ヒト第14染色体上の106,330,068位(場合により、さらなる変異はチミンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む。
【０４４２】
場合により、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,071位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異はない。
【０４４３】
場合により、バリアントは、(i)ヒト第14染色体上の106,330,063位(場合により、さらなる変異はアデニンである);および/または(ii)ヒト第14染色体上の106,330,067位(場合により、さらなる変異はグアニンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む。
【０４４４】
場合により、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,045位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異はない。
【０４４５】
場合により、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,044位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異はない。
【０４４６】
場合により、バリアントは、(i)ヒト第14染色体上の106,330,066位(場合により、さらなる変異はグアニンである);および/または(ii)ヒト第14染色体上の106,330,068位(場合により、さらなる変異はチミンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む。
【０４４７】
場合により、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,066位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異はない。
【０４４８】
場合により、バリアントは、(i)ヒト第14染色体上の106,330,067位(場合により、さらなる変異はグアニンである);および/または(ii)ヒト第14染色体上の106,330,068位(場合により、さらなる変異はチミンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む。
【０４４９】
場合により、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,068位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異はない。
【０４５０】
場合により、バリアントは、(i)ヒト第14染色体上の106,330,067位(場合により、さらなる変異はグアニンである);および/または(ii)ヒト第14染色体上の106,330,066位(場合により、さらなる変異はグアニンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む。
【０４５１】
場合により、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,027位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異はない。
【０４５２】
場合により、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,024位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異はない。
【０４５３】
場合により、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,032位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異はない。
【０４５４】
場合により、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,041位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異はない。
【０４５５】
場合により、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,063位に相当する位置にてアデニンまたはチミンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異はない。
【０４５６】
場合により、バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,071位(場合により、さらなる変異はグアニンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む。
【０４５７】
場合により、該複数のものは、配列番号1のヒトJH5遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,330,062位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、配列番号1の配列からさらなる変異はない。
【０４５８】
場合により、ゲノムは、配列番号1を、場合により、バリアントの1、2またはそれより多くと同じIg遺伝子座にてシスに含む。
【０４５９】
JH6
ある実施形態は、複数のJH6遺伝子セグメントを含むゲノムを有する本発明の脊椎動物、細胞または集団を提供し、ここで、該複数のものは、配列番号2のヒトJH6遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の
106,329,411位
106,329,413位
106,329,414位
106,329,417位
106,329,419位
106,329,426位
106,329,434位
106,329,435位および
106,329,468位
に相当する1または複数の位置にてヌクレオチド変異を含む。
【０４６０】
場合により、脊椎動物、細胞または集団のゲノムは、複数のJH6遺伝子セグメントを含み、ここで、該複数のものは、配列番号2のヒトJH6遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,329,435位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、配列番号2の配列からさらなる変異はない。
【０４６１】
場合により、バリアントは、(i)ヒト第14染色体上の106,329,468位(場合により、さらなる変異はグアニンである);(ii)ヒト第14染色体上の106,329,419位(場合により、さらなる変異はアデニンである);(iii)ヒト第14染色体上の106,329,434位(場合により、さらなる変異はシトシンである)および/またはヒト第14染色体上の106,329,414位(場合により、さらなる変異はグアニンである);(iv)ヒト第14染色体上の106,329,426位(場合により、さらなる変異はアデニンである);(v)ヒト第14染色体上の106,329,413位(場合により、さらなる変異はアデニンである);(vi)ヒト第14染色体上の106,329,417位(場合により、さらなる変異はチミンである);(vii)ヒト第14染色体上の106,329,411位(場合により、さらなる変異はチミンである);(viii)ヒト第14染色体上の106,329,451位(場合により、さらなる変異はアデニンである);(ix)ヒト第14染色体上の106,329,452位(場合により、さらなる変異はシトシンである);および/または(x)ヒト第14染色体上の106,329,453位(場合により、さらなる変異はシトシンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む。
【０４６２】
場合により、バリアントは、ヒト第14染色体上の106,329,451位に相当する位置にてアデニンであるさらなる変異;ヒト第14染色体上の106,329,452位に相当する位置にてシトシンであるさらなる変異;およびヒト第14染色体上の106,329,453位に相当する位置にてシトシンであるさらなる変異を含む。
【０４６３】
脊椎動物、細胞または集団は、場合により、複数のJH6遺伝子セグメントを含み、ここで、該複数のものは、配列番号2のヒトJH6遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,329,468位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、配列番号2の配列からさらなる変異はない。
【０４６４】
場合により、バリアントは、ヒト第14染色体上の106,329,435位に相当する位置にてさらなる変異を含む(場合により、さらなる変異はグアニンである)。
【０４６５】
脊椎動物、細胞または集団は、場合により、複数のJH6遺伝子セグメントを含み、ここで、該複数のものは、配列番号2のヒトJH6遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,329,417位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、配列番号2の配列からさらなる変異はない。
【０４６６】
場合により、バリアントは、ヒト第14染色体上の106,329,435位に相当する位置にてさらなる変異を含む(場合により、さらなる変異はグアニンである)。
【０４６７】
脊椎動物、細胞または集団は、場合により、複数のJH6遺伝子セグメントを含み、ここで、該複数のものは、配列番号2のヒトJH6遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,329,434位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、配列番号2の配列からさらなる変異はない。
【０４６８】
場合により、バリアントは、(i)ヒト第14染色体上の106,329,414位(場合により、さらなる変異はグアニンである);および/または(ii)ヒト第14染色体上の106,329,435位(場合により、さらなる変異はグアニンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む。
【０４６９】
脊椎動物、細胞または集団は、場合により、複数のJH6遺伝子セグメントを含み、ここで、該複数のものは、配列番号2のヒトJH6遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,329,411位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、配列番号2の配列からさらなる変異はない。
【０４７０】
場合により、バリアントは、ヒト第14染色体上の106,329,435位に相当する位置にてさらなる変異を含む(場合により、さらなる変異はグアニンである)。
【０４７１】
場合により、脊椎動物、細胞または集団は、複数のJH6遺伝子セグメントを含み、該複数のものは、上記のバリアントのアンチセンス配列であるヒトJH6遺伝子バリアントを含む。
【０４７２】
場合により、ゲノムは、配列番号2を、場合により、JH6バリアントの1、2またはそれより多くと同じIg遺伝子座にてシスに含む。
【０４７３】
JH2
ある実施形態は、複数のJH2遺伝子セグメントを含むゲノムを有する本発明の脊椎動物、細胞または集団を提供し、ここで、該複数のものは、配列番号3のヒトJH2遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の
106,331,455位
106,331,453位および
106,331,409位
に相当する1または複数の位置にてヌクレオチド変異を含む。
【０４７４】
脊椎動物、細胞または集団は、場合により、複数のJH2遺伝子セグメントを含み、ここで、該複数のものは、配列番号3のヒトJH2遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,331,455位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、配列番号3の配列からさらなる変異はない。
【０４７５】
場合により、バリアントは、(i)ヒト第14染色体上の106,331,453位(場合により、さらなる変異はアデニンである);および/または(ii)ヒト第14染色体上の106,331,409位(場合により、さらなる変異はアデニンである);(iii)ヒト第14染色体上の106,329,434位(場合により、さらなる変異はアデニンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む。
【０４７６】
脊椎動物、細胞または集団は、場合により、複数のJH2遺伝子セグメントを含み、ここで、該複数のものは、配列番号3のヒトJH2遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,331,453位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、配列番号3の配列からさらなる変異はない。
【０４７７】
場合により、バリアントは、ヒト第14染色体上の106,331,409位(場合により、さらなる変異はアデニンである)に相当する位置にてさらなる変異を含む。
【０４７８】
脊椎動物、細胞または集団は、場合により、複数のJH2遺伝子セグメントを含み、ここで、該複数のものは、配列番号3のヒトJH2遺伝子バリアントを含み、該バリアントは、ヒト第14染色体上の106,331,409位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、配列番号3の配列からさらなる変異はない。
【０４７９】
場合により、脊椎動物、細胞または集団は、複数のJH2遺伝子セグメントを含み、該複数のものは、上記のバリアントのアンチセンス配列であるヒトJH2遺伝子バリアントを含む。
【０４８０】
場合により、ゲノムは、配列番号3を、場合により、JH2バリアントの1、2またはそれより多くと同じIg遺伝子座にてシスに含む。
【０４８１】
場合により、脊椎動物、細胞または集団ゲノムは、配列番号1〜3および上記のバリアントから選択される2以上の異なるJH遺伝子セグメントを含み、場合により、前記JH遺伝子セグメントは、同じ免疫グロブリンIg遺伝子座にてシスにある。
【０４８２】
複数のヒトD遺伝子セグメントバリアント
本構成の具体的な用途は、以下のとおりの複数のヒトD遺伝子セグメントを提供することである(項目番号154から開始する番号を付した項目に示すとおり)。
【０４８３】
154. 同じタイプの少なくとも3つのヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2遺伝子セグメント)を含むゲノムを有し、ヒトD遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアント(例えばD2-2refおよびD2-2a)である、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【０４８４】
本発明の第6の構成の任意の態様のある例では(V、D、JまたはC)、バリアントの1または複数または全ては、自然に存在するヒト遺伝子セグメントである。
【０４８５】
本発明の第6の構成の任意の態様のある例では(V、D、JまたはC)、バリアントの1または複数は、ヒト遺伝子セグメントの合成バリアントである。
【０４８６】
155. 同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性D遺伝子セグメント(例えばD2-2refおよびD2-2a)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【０４８７】
156. 同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2refおよびD2-2a)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2ref、D2-2aまたはD2-2b)を含むゲノムを有し、第3のDが、前記2つの異なるD遺伝子セグメントの一方とシスにある、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【０４８８】
157. ヒトD遺伝子セグメントのレパートリーを含み、複数のものが、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2遺伝子セグメント)を含み、前記異なるD遺伝子セグメントの第1のD遺伝子セグメント(例えばD2-2ref)が、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なるD遺伝子セグメントの第2のD遺伝子セグメント(例えばD2-2a)が、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2のD遺伝子セグメントを含まない、非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)。
【０４８９】
158. 同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性D遺伝子セグメント(例えばヒトD2-2遺伝子セグメント)を含むゲノムを有し、D遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【０４９０】
159. 非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも3つのヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2遺伝子セグメント)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、ヒトD遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアント(例えばD2-2refおよびD2-2a)である方法。
【０４９１】
160. 非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性D遺伝子セグメント(例えばヒトD2-2遺伝子セグメント)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含む方法。
【０４９２】
161. 非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2refおよびD2-2a)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2ref、D2-2aまたはD2-2b)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、第3のDが、前記2つの異なるD遺伝子セグメントの一方とシスにある方法。
【０４９３】
162. 増進されたヒト免疫グロブリンD遺伝子セグメントレパートリーを提供する方法であって、ヒトD遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)を提供する工程を含み、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトD遺伝子セグメント(例えばD2-2refおよびD2-2a)を提供する工程を含み、前記異なるD遺伝子セグメントの第1のD遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なるD遺伝子セグメントの第2のD遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2のD遺伝子セグメントを含まない方法。
【０４９４】
163. 非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性D遺伝子セグメント(例えばD2-2refおよびD2-2a)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、D遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する方法。
【０４９５】
164. 前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される、項目154、156もしくは158に記載の脊椎動物もしくは細胞、または項目159、161もしくは163に記載の方法。
【０４９６】
165. D遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、項目154、155もしくは156に記載の脊椎動物もしくは細胞、または項目159から162および164のいずれか一項に記載の方法。
【０４９７】
166. D遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、項目154から157のいずれか一項に記載の脊椎動物もしくは細胞、または項目159から162および165のいずれか一項に記載の方法。
【０４９８】
167. 個体が、遺伝的に関連していない、項目166に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０４９９】
168. 異なるDセグメントの少なくとも1つが、ヒト生殖系列D遺伝子セグメントの合成変異体である、項目154から167のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０５００】
169. 非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つのヒトD遺伝子セグメント(D2-2refおよびD2-2a)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、D遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIgH遺伝子座にて提供される方法。
【０５０１】
170. ゲノムが、ヒトD遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いバリアントヒトD遺伝子セグメントとを含み、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なD遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない、項目154から158および164から168のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０５０２】
171. 集団が、ヒトD遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いバリアントヒトD遺伝子セグメントとを含み、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なD遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない、項目157に記載の集団。
【０５０３】
172. ヒトD遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いバリアントヒトD遺伝子セグメントとを含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なD遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない非ヒト脊椎動物または非ヒト細胞。
【０５０４】
173. ヒトJH遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足される1、2またはそれより多いバリアントヒトD遺伝子セグメントとを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的なD遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない集団。
【０５０５】
174. D2-2refとD2-2a;または
D2-21refとD2-21a;または
D3-10refとD3-10a;または
D3-16refとD3-16a;または
D2-8refとD2-8a;または
D3-3refとD3-3a;または
D4-23refとD4-23a;または
D6-13refとD6-13a;または
D3-9refとD3-9a;または
D4-4refとD4-4a;または
D7-27refとD7-27a
から選択される第1および第2のD遺伝子セグメントを含み、
場合により、第1および/または第2のD遺伝子セグメントが、2以上のコピーで存在する、項目172に記載の脊椎動物もしくは細胞または項目173に記載の集団。
【０５０６】
例えば、第1の遺伝子セグメントの2または3コピーと、場合により、第2の遺伝子セグメントの1、2または3コピーとが提供される。コピーは、シスまたはトランスに配置できる。
【０５０７】
175. ヒト遺伝子セグメントD2-2refおよびD2-2aと、D3-3refおよびD3-3aと、場合によりD2-15も含む、項目174に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５０８】
ある例では、脊椎動物、細胞または集団は、ヒトD3-3、D2-15、D3-9;D4-17;D3-10;D2-2;D5-24;D6-19;D3-22;D6-13;D5-12;D1-26;D1-20;D5-18;D3-16;D2-21;D1-14;D7-27;D1-1;D6-25;D2-14およびD4-23から選択される(例えばD3-9*01;D4-17*01;D3-10*01;D2-2*02;D5-24*01;D6-19*01;D3-22*01;D6-13*01;D5-12*01;D1-26*01;D1-20*01;D5-18*01;D3-16*02;D2-21*02;D1-14*01;D7-27*02;D1-1*01;D6-25*01;D2-15*01;およびD4-23*01から選択される)1または複数のDセグメントを、前記選択されたセグメントの参照配列とともに含む。これらは、HCDR3の長さが少なくとも20アミノ酸である可変ドメインにおいて見出された(本明細書の実施例を参照されたい)。
【０５０９】
176.ヒト遺伝子セグメントを含むVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、D遺伝子レパートリーが、
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD2-2遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-2遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD2-21遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-21遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD3-10遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-10遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD3-16遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-16遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD2-8遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-8遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD3-3遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-3遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD4-23遺伝子セグメントにより提供される複数のD4-23遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD6-13遺伝子セグメントにより提供される複数のD6-13遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD3-9遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-9遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD4-4遺伝子セグメントにより提供される複数のD4-4遺伝子セグメント;および
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるD7-27遺伝子セグメントにより提供される複数のD7-27遺伝子セグメント
の1または複数を含み、
場合により、D遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、項目155に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【０５１０】
177.ヒト遺伝子セグメントを含むVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、D遺伝子レパートリーが、
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD2-2遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-2遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD2-21遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-21遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD3-10遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-10遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD3-16遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-16遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD2-8遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-8遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD3-3遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-3遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD4-23遺伝子セグメントにより提供される複数のD4-23遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD6-13遺伝子セグメントにより提供される複数のD6-13遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD3-9遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-9遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD4-4遺伝子セグメントにより提供される複数のD4-4遺伝子セグメント;および
前記ゲノムにおいてトランスにある少なくとも2つの異なるD7-27遺伝子セグメントにより提供される複数のD7-27遺伝子セグメント
の1または複数を含み、
場合により、D遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、項目155に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【０５１１】
178.ヒト遺伝子セグメントを含むVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、D遺伝子レパートリーが、
少なくとも3つの異なるD2-2遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-2遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD2-21遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-21遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD3-10遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-10遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD3-16遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-16遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD2-8遺伝子セグメントにより提供される複数のD2-8遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD3-3遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-3遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD4-23遺伝子セグメントにより提供される複数のD4-23遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD6-13遺伝子セグメントにより提供される複数のD6-13遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD3-9遺伝子セグメントにより提供される複数のD3-9遺伝子セグメント;
少なくとも3つの異なるD4-4遺伝子セグメントにより提供される複数のD4-4遺伝子セグメント;および
少なくとも3つの異なるD7-27遺伝子セグメントにより提供される複数のD7-27遺伝子セグメント
の1または複数を含み、
場合により、D遺伝子セグメントが、2または3の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、
場合により、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2または3の前記異なる遺伝子セグメントが提供される、項目154に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞またはB細胞)。
【０５１２】
179.異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、項目176、177または178に記載の脊椎動物または細胞。
【０５１３】
180.個体が、遺伝的に関連していない、項目176から179のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０５１４】
181.異なるDセグメントの少なくとも1つが、ヒト生殖系列D遺伝子セグメントの合成変異体である、項目176から180のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０５１５】
182.ヒトVH、DおよびJH遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、D遺伝子レパートリーが、
少なくとも2つの異なるD2-2遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD2-2遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD2-21遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD2-21遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD3-10遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD3-10遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD3-16遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD3-16遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD2-8遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD2-8遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD3-3遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD3-3遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD4-23遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD4-23遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD6-13遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD6-13遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD3-9遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD3-9遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるD4-4遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD4-4遺伝子セグメント;および
少なくとも2つの異なるD7-27遺伝子により、場合により前記ゲノムにおいてシスに提供される複数のD7-27遺伝子セグメント
の1または複数を含み、
D遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、項目158に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞またはB細胞)。
【０５１６】
183.ヒト個体が、異なるヒト集団からである、項目182に記載の脊椎動物または細胞。
【０５１７】
184.D遺伝子セグメントの1または複数が、ヒト生殖系列D遺伝子セグメントのバリアントであり、バリアント遺伝子セグメントが、ヒト生殖系列D遺伝子セグメントによりコードされる対応するアミノ酸配列から1、2または3アミノ酸異なるアミノ酸配列をコードするが、ただし、前記対応するアミノ酸配列が停止コドンを含まない場合に、バリアントによりコードされる前記アミノ酸配列が、停止コドンを含まない、項目154から183のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５１８】
場合により、バリアントおよび生殖系列D遺伝子セグメントは、リーディングフレーム2(IMGT番号付け)中の各アミノ酸配列をコードする。Brineyら、2012を参照されたい。
【０５１９】
185.ヒト生殖系列D遺伝子セグメントによりコードされる対応する前記アミノ酸配列が、親水性または疎水性配列(J Mol Biol. 1997年7月25日;270(4):587〜97頁; Corbett SJら;Table 2(表7-1〜表7-5)に従う)である、項目184に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５２０】
186.前記バリアントと前記生殖系列ヒトD遺伝子セグメントとを含み、場合により、バリアントおよび生殖系列ヒトD遺伝子セグメントが、同じ染色体上でシスにある、項目184または185に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５２１】
187.生殖系列ヒトD遺伝子セグメントが、D2、D3、D5またはD6ファミリー遺伝子セグメント、場合によりD2-2、D2-15、D3-3、D3-9、D3-10、D3-22、D5-5、D5-18、D6-6、D6-13、D6-19遺伝子セグメントである、項目184から186のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５２２】
これらのDセグメントは、3つ全てのリーディングフレームにおいて使用可能である。
【０５２３】
場合により、これらのヒト生殖系列D遺伝子セグメントの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または全てのバリアントを用いる。
【０５２４】
188.複数のD2-2遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の
106,382,687位および
106,382,711位
に相当する1または複数のヌクレオチド位置にて互いに異なるD2-2遺伝子セグメントを含む、項目154から187のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５２５】
189.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,382,687位に相当する位置にてチミンを含むヒトD2-2遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含み、場合により、D2-2refの配列からのさらなる変異がない、項目188に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５２６】
190.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,382,687位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D2-2aの配列からさらなる変異がないヒトD2-2遺伝子セグメントを含む、項目188または189に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５２７】
191.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,382,711位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、D2-2bの配列からさらなる変異がないヒトD2-2遺伝子セグメントを含む、項目188から190のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５２８】
192.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,382,711位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D2-2 refの配列からさらなる変異がないヒトD2-2遺伝子セグメントを含む、項目188から191のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５２９】
193.複数のD7-27遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の106,331,767位に相当するヌクレオチド位置にて互いに異なるD7-27遺伝子セグメントを含む、項目154から192のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５３０】
194.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,331,767位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D7-27refの配列からさらなる変異がないヒトD7-27遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目193に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５３１】
195.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,331,767位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、D7-27aの配列からさらなる変異がないヒトD7-27遺伝子セグメントを含む、項目193または194に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５３２】
196.複数のD4-23遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の106,350,740位に相当するヌクレオチド位置にて互いに異なるD4-23遺伝子セグメントを含む、項目154から195のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５３３】
197.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,350,740位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、D4-23refの配列からさらなる変異がないヒトD4-23遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目196に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５３４】
198.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,350,740位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、D4-23aの配列からさらなる変異がないヒトD4-23遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目196または197に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５３５】
199.複数のD2-21遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の106,354,418位に相当するヌクレオチド位置にて互いに異なるD2-21遺伝子セグメントを含む、項目154から197のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５３６】
200.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,354,418位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、D2-21refの配列からさらなる変異がないヒトD2-21遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目199に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５３７】
201.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,354,418位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、D2-21aの配列からさらなる変異がないヒトD2-21遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目199または200に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５３８】
202.複数のD3-16遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の106,354,418位に相当するヌクレオチド位置にて互いに異なるD3-16遺伝子セグメントを含む、項目154から201のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５３９】
203.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,361,515位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D3-16refの配列からさらなる変異がないヒトD3-16遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目202に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５４０】
204.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,361,515位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D3-16aの配列からさらなる変異がないヒトD3-16遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目202または203に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５４１】
205.複数のD6-13遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の106,367,013位に相当するヌクレオチド位置にて互いに異なるD6-13遺伝子セグメントを含む、項目154から204のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５４２】
206.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,367,013位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D6-13refの配列からさらなる変異がないヒトD6-13遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目205に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５４３】
207.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,367,013位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D6-13aの配列からさらなる変異がないヒトD6-13遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目205または206に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５４４】
208.複数のD3-10遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の
106,370,370位および
106,370,371位
に相当する1または複数のヌクレオチド位置にて互いに異なるD3-10遺伝子セグメントを含む、項目154から207のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５４５】
209.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,370位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D3-10refの配列からさらなる変異がないヒトD3-10遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目208に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５４６】
210.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,370位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D3-10aの配列からさらなる変異がないヒトD3-10遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目208または209に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５４７】
211.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,371位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、D3-10refの配列からさらなる変異がないヒトD3-10遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目208、209または210に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５４８】
212.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,371位に相当する位置にてグアニンを含み、場合により、D3-10bの配列からさらなる変異がないヒトD3-10遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目208から211のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５４９】
213.複数のD3-9遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,567位に相当するヌクレオチド位置にて互いに異なるD3-9遺伝子セグメントを含む、項目154から212のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５５０】
214.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,567位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、D3-9refの配列からさらなる変異がないヒトD3-9遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目213に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５５１】
215.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,370,567位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D3-9aの配列からさらなる変異がないヒトD3-9遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目213または214に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５５２】
216.複数のD2-8遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の
106,373,085位;
106,373,086位および
106,373,089位
に相当する1または複数のヌクレオチド位置にて互いに異なるD2-8遺伝子セグメントを含む、項目154から215のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５５３】
217.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,373,085位に相当する位置にてシトシンを含む、ヒトD2-8遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目216に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５５４】
218.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,373,085位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D2-8bの配列からさらなる変異がないヒトD2-8遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目216または217に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５５５】
219.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,373,086位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D2-8refの配列からさらなる変異がないヒトD2-8遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目216、217または218に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５５６】
220.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,373,086位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D2-8refの配列からさらなる変異がないヒトD2-8遺伝子セグメントを含む、項目216から219のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５５７】
221.複数のD4-4遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の
106,379,086位および
106,379,089位
に相当する1または複数のヌクレオチド位置にて互いに異なるD4-4遺伝子セグメントを含む、項目154から220のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５５８】
222.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,379,086位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D4-4refの配列からさらなる変異がないヒトD4-4遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目221に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５５９】
223.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,379,086位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D4-4aの配列からさらなる変異がないヒトD4-4遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目221または222に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５６０】
224.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,379,089位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D4-4refの配列からさらなる変異がないか、またはヒト第14染色体上の106,379,086位に相当する位置にてシトシンを含むヒトD4-4遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目221、222または223に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５６１】
225.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,373,089位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D4-4aの配列からさらなる変異がないヒトD4-4遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目221から224のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５６２】
226.複数のD3-3遺伝子セグメントを含み、複数のものが、ヒト第14染色体上の
106,380,241位および
106,380,246位
に相当する1または複数のヌクレオチド位置にて互いに異なるD3-3遺伝子セグメントを含む、項目154から225のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５６３】
227.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,380,241位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D3-3refの配列からさらなる変異がないD3-3遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目226に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５６４】
228.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,380,241位に相当する位置にてシトシンを含み、場合により、D3-3aの配列からさらなる変異がないヒトD3-3遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目226または227に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５６５】
229.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,380,246位に相当する位置にてアデニンを含み、場合により、D3-3refの配列からさらなる変異がないヒトD3-3遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目226、227または228に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５６６】
230.複数のものが、ヒト第14染色体上の106,380,246位に相当する位置にてチミンを含み、場合により、D3-3aの配列からさらなる変異がないヒトD3-3遺伝子セグメント(場合により2コピーおよび/またはホモ接合性状態にある)を含む、項目226から229のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または集団。
【０５６７】
複数のヒトJL遺伝子セグメントバリアント
本構成の具体的な用途は、以下のとおりの複数のヒトJL遺伝子セグメント(Jκおよび/またはJλ)を提供することである(段落番号80から開始する番号を付した段落に示すとおり)。
【０５６８】
80.同じタイプの少なくとも3つのヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を含むゲノムを有し、ヒトJL遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【０５６９】
81.同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性JL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【０５７０】
82.同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒトJL遺伝子セグメントを含むゲノムを有し、第3のJLが、前記2つの異なるJL遺伝子セグメントの一方とシスにある、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【０５７１】
83.ヒトJL遺伝子セグメントのレパートリーを含み、複数のものが、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を含み、前記異なるJL遺伝子セグメントの第1のJL遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なるJL遺伝子セグメントの第2のJL遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2のJL遺伝子セグメントを含まない、非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)。
【０５７２】
84.同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性JL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を含むゲノムを有し、JL遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト脊椎動物細胞(例えばES細胞またはB細胞)。
【０５７３】
85.非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも3つのヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、ヒトJL遺伝子セグメントの少なくとも2つが、互いに同一でないバリアントである方法。
【０５７４】
86.非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性JL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を同じIg遺伝子座にてシスに含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含む方法。
【０５７５】
87.非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を同じIg遺伝子座にてトランスに含み、場合により、同じタイプの第3のヒトJL遺伝子セグメントを含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、第3のJLが、前記2つの異なるJL遺伝子セグメントの一方とシスにある方法。
【０５７６】
88.増進されたヒト免疫グロブリンJL遺伝子セグメントレパートリーを提供する方法であって、ヒトJL遺伝子セグメントのレパートリーを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)を提供する工程を含み、同じタイプの少なくとも2つの異なるヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を提供する工程を含み、前記異なるJL遺伝子セグメントの第1のJL遺伝子セグメントが、集団の第1の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、前記異なるJL遺伝子セグメントの第2のJL遺伝子セグメントが、集団の第2の脊椎動物のゲノムにおいて提供され、第1の脊椎動物のゲノムが、第2のJL遺伝子セグメントを含まない方法。
【０５７７】
89.非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つの異なる非内因性JL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、JL遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する方法。
【０５７８】
90.前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される、段落80、82もしくは84に記載の脊椎動物もしくは細胞、または段落85、82もしくは89に記載の方法。
【０５７９】
91.JL遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、段落80、81もしくは82に記載の脊椎動物もしくは細胞、または段落85、86もしくは87に記載の方法。
【０５８０】
92.JL遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、段落80、81もしくは82に記載の脊椎動物もしくは細胞、または段落85、86もしくは87に記載の方法。
【０５８１】
93.個体が、遺伝的に関連していない、段落92に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０５８２】
94.異なるJLセグメントの少なくとも1つが、ヒト生殖系列JL遺伝子セグメントの合成変異体である、段落80から93のいずれか一項に記載の脊椎動物、細胞または方法。
【０５８３】
95.非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)のヒト免疫グロブリン遺伝子多様性を増進する方法であって、同じタイプの少なくとも2つのヒトJL遺伝子セグメント(例えばJκ1)を含むゲノムを有する脊椎動物を提供する工程を含み、JL遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIgL遺伝子座にて提供される方法。
【０５８４】
96.ゲノムが、ヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足されるそれぞれ1、2またはそれより多いヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントとを含み、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的な遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない、段落80から82および84のいずれか1つに記載の脊椎動物または細胞。
【０５８５】
97.集団が、ヒトJL遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足されるそれぞれ1、2またはそれより多いヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントとを含み、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的な遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない、段落83に記載の集団。
【０５８６】
98.ヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足されるそれぞれ1、2またはそれより多いヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントとを含むゲノムを有する非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)または非ヒト細胞(例えばES細胞またはB細胞)であって、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的な遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない非ヒト脊椎動物または非ヒト細胞。
【０５８７】
99.ヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントタイプの実質的に完全な機能的レパートリーと、それに補足されるそれぞれ1、2またはそれより多いヒトJκおよび/またはJλ遺伝子セグメントとを含む非ヒト脊椎動物の集団(例えばマウスまたはラット)であって、前記実質的に完全な機能的レパートリーおよび補足的な遺伝子セグメントが、ヒト個体の生殖系列ゲノムにおいて一緒に見出されない集団。
【０５８８】
100.ヒト遺伝子セグメントを含むVLおよびJL遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、JL遺伝子レパートリーが、
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ1遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ2遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ3遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ4遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ5遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ1遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ2遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ2遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ3遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ3遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ4遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ4遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ5遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ5遺伝子セグメント;
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ6遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ6遺伝子セグメント;または
前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスにある少なくとも2つの異なるヒトJλ7遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ7遺伝子セグメント
を含み、
場合により、JL遺伝子セグメントが、2以上の異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、段落81に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞。
【０５８９】
101.ヒト遺伝子セグメントを含むVLおよびJL遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、JL遺伝子レパートリーが、
少なくとも3つ(例えば3、4、5、6または7)の異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ1遺伝子セグメント;
少なくとも3つ(例えば3、4、5、6または7)の異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ2遺伝子セグメント;
少なくとも3つ(例えば3、4、5、6または7)の異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ3遺伝子セグメント;
少なくとも3つ(例えば3、4、5、6または7)の異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ4遺伝子セグメント;
少なくとも3つ(例えば3、4、5、6または7)の異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJκ5遺伝子セグメント;
少なくとも3つ(例えば3、4、5、6または7)の異なるヒトJλ1遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ1遺伝子セグメント;
少なくとも3つ(例えば3、4、5、6または7)の異なるヒトJλ2遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ2遺伝子セグメント;
少なくとも3つ(例えば3、4、5、6または7)の異なるヒトJλ3遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ3遺伝子セグメント;
少なくとも3つ(例えば3、4、5、6または7)の異なるヒトJλ4遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ4遺伝子セグメント;
少なくとも3つ(例えば3、4、5、6または7)の異なるヒトJλ5遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ5遺伝子セグメント;
少なくとも3つ(例えば3、4、5、6または7)の異なるヒトJλ6遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ6遺伝子セグメント;または
少なくとも3つ(例えば3、4、5、6または7)の異なるヒトJλ7遺伝子セグメントにより提供される複数のヒトJλ7遺伝子セグメント
を含み、
場合により、JL遺伝子セグメントが、2または3の異なるヒト個体のゲノム配列に由来し、
場合により、前記異なる遺伝子セグメントの少なくとも2または3つが、前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される、段落80に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞またはB細胞)。
【０５９０】
102.異なるヒト個体が、異なるヒト集団からである、段落104または105に記載の脊椎動物または細胞。
【０５９１】
103.個体が、遺伝的に関連していない段落104から106のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０５９２】
104.異なるJLセグメントの少なくとも1つが、ヒト生殖系列JL遺伝子セグメントの合成変異体である、段落104から107のいずれか一項に記載の脊椎動物または細胞。
【０５９３】
105.ヒトVLおよびJL遺伝子レパートリーを含むゲノムを含み、JL遺伝子レパートリーが、
少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のヒトJκ1遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のヒトJκ2遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のヒトJκ3遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のヒトJκ4遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJκ1遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のヒトJκ5遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJλ1遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のヒトJλ1遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJλ2遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のヒトJλ2遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJλ3遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のヒトJλ3遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJλ4遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のヒトJλ4遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJλ5遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のヒトJλ5遺伝子セグメント;
少なくとも2つの異なるヒトJλ6遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のヒトJλ6遺伝子セグメント;または
少なくとも2つの異なるヒトJλ7遺伝子セグメントにより、場合により前記ゲノムにおいて同じIg遺伝子座にてシスに提供される複数のヒトJλ7遺伝子セグメント;
を含み、
JL遺伝子セグメントが、少なくとも3世代にわたって遺伝的に関連していない異なるヒト個体のゲノム配列に由来する、段落84に記載の非ヒト脊椎動物または脊椎動物細胞(場合によりES細胞またはB細胞)。
【０５９４】
106.ヒト個体が、異なるヒト集団からである、段落109に記載の脊椎動物または細胞。
【０５９５】
当業者は、標準的な分子生物学的技術を用いて、本発明で用いるための免疫グロブリン遺伝子セグメントの合成の組み合わせ(例えばV、Dおよび/またはJ)を含むベクターを提供して、ベクターを用いてトランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座を構築できることを認識している(例えば当該技術において知られるような相同組換えおよび/またはリコンビナーゼ媒介カセット交換を用いて、例えばUS7501552(Medarex)、US5939598(Abgenix)、US6130364(Abgenix)、W002/066630(Regeneron)、W02011004192(Genome Research Limited)、W02009076464、W02009143472およびW02010039900(Ablexis)(これらの開示は、本明細書に明示的に組み込まれている)を参照されたい)。例えば、遺伝子セグメントのこのような合成の組み合わせは、大腸菌における標準的なリコンビニアリング技術を用いて作製して、合成の組み合わせを有するBACベクターを構築した後に、相同組換えまたはRMCE(例えばcre/lox部位特異的組換えを用いる)を用いて胚性幹細胞に挿入できる。リコンビニアリングの詳細は、www.genebridges.comならびにEP1034260およびEP1204740(これらの開示は、本明細書に明示的に組み込まれている)で見出すことができる。
【０５９６】
一実施形態では、所定の遺伝子セグメント、例えば感染性疾患病原体の抗原のような抗原に対する自然のヒト免疫応答において一般的に用いられることが知られているものに対して脊椎動物(および得られるリード抗体)の免疫応答を偏らせることが有用である。例えば、VH1-69は、インフルエンザウイルスに対してヒトにおいて抗体を生成するために一般的に用いられる。よって、2以上の多型DNAバージョンのVHセグメントVH1-69を本発明の遺伝子座に含めることが可能である。以下の実施例は、自然に存在するVH1-69多型バリアントに基づいてVH1-69遺伝子セグメントレパートリーを拡大することにより多様性が拡大されたこのようなトランスジェニック遺伝子座をどのようにして構築できるかを示す。
【０５９７】
本発明の任意の構成の一実施形態では、ゲノムは、完全内因性抗体の発現を妨げるかまたは低減するように改変されている。このことを行うために適切な技術の例は、PCT/GB2010/051122、US7501552、US6673986、US6130364、W02009/076464、EP1399559およびUS6586251(これらの開示は、本明細書に参照により組み込まれている)で見出すことができる。一実施形態では、内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座の非ヒト脊椎動物VDJ領域および場合により内因性軽鎖免疫グロブリン遺伝子座(ラムダおよび/またはカッパ遺伝子座)のVJ領域は、不活性化されている。例えば、非ヒト脊椎動物VDJ領域の全体または一部は、哺乳動物の内因性重鎖免疫グロブリン遺伝子座の逆位により不活性化される(場合により、逆位領域は、内因性Ig遺伝子座の上流または下流に移動される)(例えばW02011004192(この開示は、本明細書に参照により組み込まれている)を参照されたい)。例えば、非ヒト脊椎動物VJ領域の全体または一部は、哺乳動物の内因性カッパ鎖免疫グロブリン遺伝子座の逆位により不活性化される(場合により、逆位領域は、内因性Ig遺伝子座の上流または下流に移動される)。例えば、非ヒト脊椎動物VJ領域の全体または一部は、哺乳動物の内因性ラムダ鎖免疫グロブリン遺伝子座の逆位により不活性化される(場合により、逆位領域は、内因性Ig遺伝子座の上流または下流に移動される)。一実施形態では、内因性重鎖遺伝子座は、内因性カッパおよびラムダ遺伝子座の一方または両方と同様に、このようにして不活性化される。
【０５９８】
さらにまたは代わりに、脊椎動物は、成熟宿主BおよびTリンパ球の生成を妨げる遺伝的背景、場合によりRAG-1欠損および/またはRAG-2欠損背景において作製される。RAG-1欠損動物の作製の技術について、US5859301を参照されたい。
【０５９９】
よって、本明細書における発明の任意の構成または態様の一実施形態では、内因性重鎖および軽鎖発現は、不活性化される。
【０６００】
一実施形態では、それぞれの前記遺伝子座定常領域は、重鎖内因性非ヒト脊椎動物(場合により宿主マウスまたはラット)定常領域である。
【０６０１】
一実施形態では、それぞれの前記遺伝子座定常領域は、軽鎖内因性非ヒト脊椎動物(場合により宿主マウスまたはラット)定常領域である。
【０６０２】
本発明は、本発明による少なくとも1の脊椎動物(例えばマウスまたはラット)の免疫化により調製されるモノクローナルまたはポリクローナル抗体組成物を提供し、ここで、場合により、抗原は、感染性疾患病原体(例えば細菌またはウイルス病原体抗原)の抗原であり、場合により、全ての脊椎動物を免疫化するために同じ抗原を用い、場合により、1または複数の抗体は、IgGタイプ(例えばIgG1)である。
【０６０３】
本発明は、例えば1または複数の定常領域が変更された(例えばヒト定常領域のような異なる定常領域で置き換えられたかまたはFcエフェクター機能を増進もしくは除去するように変異された)、本発明の方法により生成されるモノクローナルもしくはポリクローナル抗体混合物、またはその誘導体抗体もしくは混合物も提供する。本発明のある態様では、モノクローナルまたはポリクローナル抗体混合物は、ヒトにおける疾患または状態の治療および/または予防のために、例えば感染性疾患の処置および/または防止のために提供され、ここで、場合により、各抗体は、感染性疾患病原体の抗原、好ましくは同じ抗原と結合する。
【０６０４】
本発明のある態様では、ヒトにおける疾患または状態、例えば感染性疾患の処置および/または防止のための医薬品の製造における、本発明に従う単離モノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはその変異体もしくは誘導体抗体の使用が提供され、ここで、該感染性疾患は、細菌またはウイルス病原体により引き起こされる疾患である。
【０６０５】
変異体抗体の例は、本発明の方法により得ることができるかまたは得られた単離抗体(例えばIgGタイプ、例えばIgG1タイプの抗体)に比べて、15または10までのアミノ酸変異を可変領域に有するものである。誘導体の例は、定常領域をヒト定常領域のような異なる定常領域で置き換えるように改変されたもの、またはFcエフェクター機能を増進もしくは除去するように変異されたものである。
【０６０６】
感染性疾患の例は、細菌またはウイルス病原体により引き起こされるかまたは媒介される疾患である。例えば、感染性疾患は、ヘモフィラス・インフルエンザ(Haemophilus influenza)、大腸菌、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ヘルペス科のウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、HIVおよびインフルエンザウイルスからなる群から選択される病原体により引き起こされる疾患からなる群から選択される。
【０６０７】
感染性疾患に対する抗体の作製のための免疫グロブリン遺伝子座への目的に合わされた(Tailoring)V(D)Jの組み込み
本発明者らは、感染性疾患病原体の抗原のような抗原に対する自然のヒト免疫応答に基づく治療および/または予防用抗体の製造のための脊椎動物、細胞、方法などを提供することが望ましいことに気付いた。この点で、文献は、ヒトにおける抗感染応答を産生するために頻繁に用いられる免疫グロブリン遺伝子セグメントについて観察している(Table 9(表14-1〜表14-3))。
【０６０８】
上記の種々の構成、態様、実施形態および実施例では、本発明は、当業者に、感染性疾患を治療および/または予防するために抗体を作製する適用のためにレパートリーを目的に合わせるか、または偏らせる方法で、免疫グロブリン遺伝子セグメントを選択する可能性を提供する。本発明者らは、得られた抗体の所望の適用に従って、本発明において使用するために以下の遺伝子セグメントの群を分類した。
【０６０９】
リストA:
病原体によって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3、Kv325、VκI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VκIIファミリーメンバー、VκIIIファミリーメンバー、VκI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VκII A2(場合により、A2aバリアント)、VκA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントからなる群から選択されるVL遺伝子セグメント。
(b)VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII 4A、VλII 2.1、VλVII 4A、Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントから選択されるVλ遺伝子セグメント。
(c)Kv325、VκI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VκIIファミリーメンバー、VκIIIファミリーメンバー、VκI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VκII A2(場合により、A2aバリアント)、VκA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVκ遺伝子セグメント。
(d)VH遺伝子セグメント  VHIII遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメント。
(e)Jλ2、Jλ3およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJλ遺伝子セグメント。
(f)Dk1、Dxp'1、Dn4r、D2rおよびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるD遺伝子セグメント。
【０６１０】
リストA1:
細菌病原体によって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4Aおよびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントから選択されるVλ遺伝子セグメント。
(b)VκI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VκIIファミリーメンバー、VκIIIファミリーメンバー、VκI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VκII A2(場合により、A2aバリアント)、VκA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVκ遺伝子セグメント。
(c)VH遺伝子セグメント  VH3遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbファミリーメンバー)、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)、VH H11およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメント。
(d)Jλ2、Jλ3およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJλ遺伝子セグメント。
(e)JH2、JH3、JH4およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJH遺伝子セグメント。
【０６１１】
リストA1.1:
Hインフルエンザによって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλVII4A、VλII2.1、VλVII 4Aおよびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントから選択されるVλ遺伝子セグメント。
(b)VκIIファミリーメンバー、VκIIIファミリーメンバー、VκI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)、VκII A2(場合により、A2aバリアント)、VκA27(Humkv325)およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVκ遺伝子セグメント。
(c)VH遺伝子セグメント  VH3遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIbファミリーメンバー)、VHIII9.1(VH3-15)、VHIII VH26(VH3-23)、VH3-21、LSG6.1、LSG12.1、DP77(V3-21)およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメント。
(d)Jλ2、Jλ3およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJλ遺伝子セグメント。
リストA1.2:
大腸菌(E Coli)または髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)によって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VH遺伝子セグメント  VH3遺伝子ファミリーメンバー(場合により、VHIIIaまたはVHIIIbメンバー)、VHIII9.1(VH3-15)、VHH11、VHIII VH26(VH3-23)それらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメント、例えば、VHIII9.1+JH3;またはVHH11+JH4;またはVHIII VH26+JH2。
(b)VκI遺伝子ファミリーメンバー、kI-15A(KL012)およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVκ遺伝子セグメント。
(c)VλII遺伝子ファミリーメンバー、VλII2.1およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVλ遺伝子セグメント。
(d)JH2、JH3、JH4およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJH遺伝子セグメント。
【０６１２】
A2:
ウイルス性病原体によって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VHIII遺伝子ファミリーメンバー、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII VH26(VH3-23)、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3、Hv1051、71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVH遺伝子セグメント。
(b)Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントから選択されるVλ遺伝子セグメント。
(c)Kv325およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVκ遺伝子セグメント。
(d)JH3、JH5、JH6およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJH遺伝子セグメント。
(e)Dk1、Dxp'1、Dn4r、D2rおよびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるD遺伝子セグメント。
(f)Jλ2、Jλ3およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJλ遺伝子セグメント。
【０６１３】
A2.1:
ヘルペスウイルス(Herpes Virus)ファミリー(例えば、VZVまたはHSV)によって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VHIII遺伝子ファミリーメンバー、VHIV遺伝子ファミリーメンバー、VHIII-VH26(VH3-23)、VH1GRR、ha3h2、VHI-ha1c1、VHIII-VH2-1、VH4.18、ha4h3およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVH遺伝子セグメント。
(b)Vλ1遺伝子ファミリーメンバー、Vλ3遺伝子ファミリーメンバー、IGLV1S2、Vλ3-cML70、lalh2、lalvl、la3h3およびそれらと少なくとも80%同一の遺伝子セグメントから選択されるVλ遺伝子セグメント。
(c)JH3、JH5、JH6およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJH遺伝子セグメント。
(d)Dk1、Dxp'1、Dn4r、D2rおよびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるD遺伝子セグメント。
(e)Jλ2、Jλ3およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるJλ遺伝子セグメント。
【０６１４】
A2.2:
CMVによって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)Hv1051およびそれと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVH遺伝子セグメント。
(b)Kv325およびそれと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVκ遺伝子セグメント。
【０６１５】
A2.3:
HIVによって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)71-2、Hv1f10、VH4.11、71-4、VH251、VH1-69およびそれらと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVH遺伝子セグメント。
【０６１６】
A2.4:
インフルエンザウイルスによって発現される抗原と結合する抗体の免疫グロブリン遺伝子セグメント
(a)VH1-69およびそれと少なくとも80%同一である遺伝子セグメントから選択されるVH遺伝子セグメント。
【０６１７】
したがって、
感染性疾患を治療および/または予防するために抗体または抗体混合物を作製するよう望む場合には、本発明の任意の構成、態様、方法、実施例または実施形態において使用されるV、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントの1または複数または全ては、リストA1から選択され得る。したがって、例えば、本発明の第1の構成の(a)では、列挙される重鎖V遺伝子セグメントは、場合により、そのリスト中のDを含むリストA中のVH遺伝子セグメントから選択される。
【０６１８】
細菌病原体によって引き起こされるか、または媒介される感染性疾患を治療および/または予防するために抗体または抗体混合物を作製するよう望む場合には、本発明の任意の構成、態様、方法、実施例または実施形態において使用されるV、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントの1または複数または全ては、リストA1から選択され得る。
【０６１９】
ウイルス性病原体によって引き起こされるか、または媒介される感染性疾患を治療および/または予防するために抗体または抗体混合物を作製するよう望む場合には、本発明の任意の構成、態様、方法、実施例または実施形態において使用されるV、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントの1または複数または全ては、リストA2から選択され得る。
【０６２０】
Hインフルエンザによって引き起こされるか、または媒介される感染性疾患を治療および/または予防するために抗体または抗体混合物を作製するよう望む場合には、本発明の任意の構成、態様、方法、実施例または実施形態において使用されるV、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントの1または複数または全ては、リストA1.1から選択され得る。
【０６２１】
大腸菌または髄膜炎菌によって引き起こされるか、または媒介される感染性疾患を治療および/または予防するために抗体または抗体混合物を作製するよう望む場合には、本発明の任意の構成、態様、方法、実施例または実施形態において使用されるV、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントの1または複数または全ては、リストA1.2から選択され得る。
【０６２２】
ヘルペスウイルスファミリー(例えば、VZVまたはHSV)によって引き起こされるか、または媒介される感染性疾患を治療および/または予防するために抗体または抗体混合物を作製するよう望む場合には、本発明の任意の構成、態様、方法、実施例または実施形態において使用されるV、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントの1または複数または全ては、リストA2.1から選択され得る。
【０６２３】
CMVによって引き起こされるか、または媒介される感染性疾患を治療および/または予防するために抗体または抗体混合物を作製するよう望む場合には、本発明の任意の構成、態様、方法、実施例または実施形態において使用されるV、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントの1または複数または全てのは、リストA2.2から選択され得る。
【０６２４】
HIVによって引き起こされるか、または媒介される感染性疾患を治療および/または予防するために抗体または抗体混合物を作製するよう望む場合には、本発明の任意の構成、態様、方法、実施例または実施形態において使用されるV、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントの1または複数または全ては、リストA2.3から選択され得る。
【０６２５】
インフルエンザウイルスによって引き起こされるか、または媒介される感染性疾患を治療および/または予防するために抗体または抗体混合物を作製するよう望む場合には、本発明の任意の構成、態様、方法、実施例または実施形態において使用されるV、Dおよび/またはJ遺伝子セグメントの1または複数または全ては、リストA2.4から選択され得る。
【０６２６】
場合により、本発明の遺伝子座中の各VHセグメントは、リストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択される。
【０６２７】
場合により、本発明の遺伝子座中の各VLセグメントは、リストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択される。
【０６２８】
場合により、本発明の遺伝子座中の各Dセグメントは、リストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択される。
【０６２９】
場合により、本発明の遺伝子座中の各JLセグメントは、リストA1、A2、A1.1、A1.2、A2.1、A2.2、A2.3またはA2.4から選択される。
【０６３０】
特定の祖先の患者の治療および予防のための抗体
本明細書に記載する網羅的なバイオインフォマティクス分析の実行に着手した本発明者らは、この分析の収穫により、患者の祖先(すなわち遺伝子型)に対して特異的に作製された抗体およびVHドメインに基づく薬物を生成するために有用な特定の遺伝子セグメントを同定できることに気付いた。つまり、トランスジェニック非ヒト脊椎動物(例えばトランスジェニックIgH遺伝子座を有するマウスまたはラット)においてin vivoで作製され、特に患者の集団のメンバーにおいて比較的普及した遺伝子セグメント、すなわち同じヒト祖先の個体に由来することに基づいて抗体を選択できる。バリアント分布は異なる集団にわたって異なるので(Table 13(表23-1〜23-226)を参照されたい)、このことはおそらく、これらの集団における有用なバリアント遺伝子タイプの進化、適応および保存の影響を反映する。よって、本発明に従って抗体に基づく薬物を作製することにより、ヒトの特定の集団のためによりよい薬物を作製する目的を持って、集団の遺伝子の偏りに対して薬物をマッチさせることができる。よりよくとは、例えば、より有効である、よりよく中和する、標的抗原親和性がより高い、免疫原性がより低い、薬物に対する患者の反応がより低いなどを意味し得る。このことは、薬物研究および開発プロセスにおいて標準であるように、経験的に決定できる。
【０６３１】
よって、本発明は、以下の実施形態を提供する(項目345以降の番号を付す):
345. 中国人患者への投与用の単離抗体であって、抗体が、ヒト重鎖を含み、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと定常領域とを含み、定常領域が、少なくとも1または5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中の定常領域(例えばIGHG定常領域)から選択されるヒト定常領域であり、
(i)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)における前記ヒト遺伝子セグメントの組換えに由来するか、および/または(ii)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)AID-パターン変異および非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン変異を含む単離抗体。
【０６３２】
別の実施形態では、本発明は、
中国人患者への投与用の単離抗体であって、該抗体が、ヒト重鎖を含み、該重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと定常領域とを含み、該定常領域が、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団に存在する定常領域(例えばIGHG定常領域)から選択されるヒト定常領域であり、
(i)該可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)における前記ヒト遺伝子セグメントの組換えに由来し、かつ/または(ii)該可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)AID-パターン変異および非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン変異を含む
単離抗体を提供する。
【０６３３】
ある例では、定常領域は、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、定常領域は、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６３４】
346. 定常領域が、IGHG1a、IGHG2a、IGHG3a、IGHG3bまたはIGHG4a定常領域である、項目345に記載の抗体。
【０６３５】
347. 可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のVHから選択される、項目345または346に記載の抗体。
【０６３６】
別の実施形態では、本発明は、
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、該VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団に存在するVHから選択される、項目345または346に記載の抗体
を提供する。
【０６３７】
ある例では、遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６３８】
348.可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、D遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のDから選択される、項目345、346または347に記載の抗体。
【０６３９】
別の実施形態では、本発明は、
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、該D遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団に存在するDから選択される、項目345、346または347に記載の抗体
を提供する。
【０６４０】
ある例では、遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６４１】
349.可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、JH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のJHから選択される、項目345、346、347または348に記載の抗体。
【０６４２】
別の実施形態では、本発明は、
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、該JH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団に存在するJHから選択される、項目345、346、347または348に記載の抗体
を提供する。
【０６４３】
ある例では、遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６４４】
350.項目347から349のいずれか一項に記載の可変ドメインと同一の単離VHドメインであって、場合により、そのC末端にてポリペプチド(例えば抗体Fc)と融合している単離VHドメイン。
【０６４５】
ある実施形態では、標識(例えば患者におけるイメージング用)または毒素(例えば患者におけるがん処置のためのような放射活性毒性搭載物)または半減期延長部分(例えばヒト血清アルブミンのPEG)とコンジュゲートしたコンジュゲートの一部である、項目347から349のいずれか1つに記載の可変ドメインと同一の単離VHドメインが提供される。
【０６４６】
351. 項目345から350のいずれか一項に記載の抗体または可変ドメインを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、抗体鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【０６４７】
352. 中国人患者への投与用の単離抗体であって、抗体が、ヒト重鎖を含み、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと定常領域とを含み、可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のVHから選択され、
(i)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)における前記ヒト遺伝子セグメントの組換えに由来するか、および/または(ii)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)AID-パターン変異および非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン変異を含む単離抗体。
【０６４８】
別の実施形態では、本発明は、
中国人患者への投与用の単離抗体であって、該抗体が、ヒト重鎖を含み、該重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと定常領域とを含み、該可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、該VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団に存在するVHから選択され、
(i)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)における前記ヒト遺伝子セグメントの組換えに由来し、かつ/または(ii)該可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)AID-パターン変異および非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン変異を含む
単離抗体を提供する。
【０６４９】
353.可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、D遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のDから選択される、項目352に記載の抗体。
【０６５０】
別の実施形態では、本発明は、
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、該D遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団に存在するDから選択される、項目352に記載の抗体
を提供する。
【０６５１】
ある例では、遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６５２】
354.可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、JH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のJHから選択される、項目352または353に記載の抗体。
【０６５３】
別の実施形態では、本発明は、
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、該JH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団に存在するJHから選択される、項目352または353に記載の抗体
を提供する。
【０６５４】
ある例では、遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６５５】
355.項目352から354のいずれか一項に記載の可変ドメインと同一の単離VHドメインであって、場合により、そのC末端にてポリペプチド(例えば抗体Fc)と融合している単離VHドメイン。
【０６５６】
ある実施形態では、標識(例えば患者におけるイメージング用)または毒素(例えば患者におけるがん処置のためのような放射活性毒性搭載物)または半減期延長部分(例えばヒト血清アルブミンのPEG)とコンジュゲートしたコンジュゲートの一部である、項目352から354のいずれか一項に記載の可変ドメインと同一のVHドメインが提供される。
【０６５７】
356.項目352から355のいずれか一項に記載の抗体または可変ドメインを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、抗体鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【０６５８】
357.中国人患者における疾患または医学的状態の治療および/または予防のための抗体重鎖またはVHドメイン(例えば抗体の一部として提供される)であって、重鎖が、以下の工程:
(a)非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)から抗原特異的抗体重鎖またはVHドメインを選択する工程であって、重鎖またはVHドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のVHから選択される工程、ならびに
(b)場合により、重鎖の可変ドメインをヒト定常領域と組み合わせることにより重鎖をヒト化するか、または場合により、ヒト定常領域を組み合わせることにより、選択されたVHドメインをヒト化する工程
により生成される重鎖である(またはそのような重鎖のコピーである)抗体。
【０６５９】
別の実施形態では、本発明は、
中国人患者における疾患または医学的状態の治療および/または予防のための抗体重鎖またはVHドメイン(例えば抗体の一部として提供される)であって、該重鎖が、以下の工程:
(a)非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)から抗原特異的抗体重鎖またはVHドメインを選択する工程であって、該重鎖またはVHドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、該VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団に存在するVHから選択される工程、ならびに
(b)場合により、重鎖の可変ドメインをヒト定常領域と組み合わせることにより重鎖をヒト化するか、または場合により、ヒト定常領域を組み合わせることにより、選択されたVHドメインをヒト化する工程
により生成される重鎖である(またはそのような重鎖のコピーである)抗体を提供する。
【０６６０】
ある例では、VH遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６６１】
358. ヒト定常領域が、項目345または346に記載のとおりである、項目357に記載の抗体重鎖またはVHドメイン。
【０６６２】
359. 中国人患者における疾患または医学的状態の治療および/または予防のための医薬品において使用するための、項目357または358に記載の抗体重鎖またはVHドメイン。
【０６６３】
360. 中国人患者における疾患または医学的状態を処置および/または防止する方法であって、患者に、治療または予防有効量の項目357または358に記載の抗体重鎖またはVHドメインを投与する工程を含む方法。
【０６６４】
361. ヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の患者への投与用の単離抗体であって、抗体が、ヒト重鎖を含み、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと定常領域とを含み、定常領域が、少なくとも1または5%の累積頻度でそれぞれヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中の定常領域(例えばIGHG定常領域)から選択され、
(i)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)における前記ヒト遺伝子セグメントの組換えに由来するか、または(ii)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)AID-パターン変異および非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン変異を含む単離抗体。
【０６６５】
別の実施形態では、本発明は、
ヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の患者への投与用の単離抗体であって、該抗体が、ヒト重鎖を含み、該重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと定常領域とを含み、該定常領域が、少なくとも1または5%の累積頻度でそれぞれヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の集団に存在する定常領域(例えばIGHG定常領域)から選択されるヒト定常領域であり、
(i)該可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)における前記ヒト遺伝子セグメントの組換えに由来し、かつ/または(ii)該可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)AID-パターン変異および非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン変異を含む
単離抗体を提供する。
【０６６６】
ある例では、定常領域は、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、定常領域は、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６６７】
362.定常領域が、IGHG1a、IGHG2a、IGHG3a、IGHG3bまたはIGHG4a定常領域であり、患者が、ヨーロッパ系祖先の患者である、項目361に記載の抗体。
【０６６８】
363.可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも1または5%の累積頻度で前記集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のVHから選択される、項目361または362に記載の抗体。
【０６６９】
別の実施形態では、本発明は、
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、該VH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団に存在するVHから選択される、項目361または362に記載の抗体
を提供する。
【０６７０】
ある例では、遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６７１】
364.可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、D遺伝子セグメントが、少なくとも1または5%の累積頻度で前記集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のDから選択される、項目361、362または363に記載の抗体。
【０６７２】
別の実施形態では、本発明は、
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、該D遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団に存在するDから選択される、項目361、362または363に記載の抗体
を提供する。
【０６７３】
ある例では、遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６７４】
365.可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、JH遺伝子セグメントが、少なくとも1または5%の累積頻度で前記集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のJHから選択される、項目361、362、363または364に記載の抗体。
【０６７５】
別の実施形態では、本発明は、
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、該JH遺伝子セグメントが、少なくとも5%の累積頻度で中国人集団に存在するJHから選択される、項目361、362、363または364に記載の抗体
を提供する。
【０６７６】
ある例では、遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６７７】
366.項目363から365のいずれか一項に記載の可変ドメインと同一の単離VHドメインであって、場合により、そのC末端にてポリペプチド(例えば抗体Fc)と融合している単離VHドメイン。
【０６７８】
367.項目361から366のいずれか一項に記載の抗体または可変ドメインを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、抗体鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【０６７９】
368.ヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系またはアメリカ系祖先の患者への投与用の単離抗体であって、抗体が、ヒト重鎖を含み、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと定常領域とを含み、可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、それぞれ少なくとも1または5%の累積頻度でヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のVHから選択され、
(i)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)における前記ヒト遺伝子セグメントの組換えに由来するか、または(ii)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)AID-パターン変異および非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン変異を含む単離抗体。
【０６８０】
別の実施形態では、本発明は、以下を提供する。
ヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系またはアメリカ系祖先の患者への投与用の単離抗体であって、抗体が、ヒト重鎖を含み、重鎖が、抗原に特異的な可変ドメインと定常領域とを含み、可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも1または5%の累積頻度でそれぞれヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の集団に存在するVHから選択され、
(i)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)における前記ヒト遺伝子セグメントの組換えに由来するか、または(ii)可変ドメインが、非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)AID-パターン変異および非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ(TdT)-パターン変異を含む単離抗体。
【０６８１】
ある例では、VH遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６８２】
369.可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、D遺伝子セグメントが、少なくとも1または5%の累積頻度で前記集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のDから選択される、項目368に記載の抗体。
【０６８３】
別の例では、
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、該D遺伝子セグメントが、少なくとも1または5%の累積頻度で前記集団に存在するDから選択される、項目368に記載の抗体
を提供する。
【０６８４】
ある例では、D遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６８５】
370.可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、JH遺伝子セグメントが、少なくとも1または5%の累積頻度で前記集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のJHから選択される、項目368または369に記載の抗体。
【０６８６】
別の例では、
可変ドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、該JH遺伝子セグメントが、少なくとも1または5%の累積頻度で前記集団に存在するJHから選択される、項目368または369に記載の抗体
を提供する。
【０６８７】
ある例では、JH遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６８８】
371.項目368から370のいずれか一項に記載の可変ドメインと同一の単離VHドメインであって、場合により、そのC末端にてポリペプチド(例えば抗体Fc)と融合している単離VHドメイン。
【０６８９】
372.項目368から371のいずれか一項に記載の抗体または可変ドメインを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または医薬品(例えばさらなる抗原特異的可変ドメイン、抗体鎖または抗体)と一緒に含む医薬組成物。
【０６９０】
373.ヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の患者における疾患または医学的状態の治療および/または予防のための抗体重鎖またはVHドメイン(例えば抗体の一部として提供される)であって、重鎖が、以下の工程:
(a)非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)から抗原特異的抗体重鎖またはVHドメインを選択する工程であって、重鎖またはVHドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも1または5%の累積頻度で前記集団において見出されるTable 13(表23-1〜表23-226)中のVHから選択される工程、ならびに
(b)場合により、重鎖の可変ドメインをヒト定常領域と組み合わせることにより重鎖をヒト化するか、または場合により、ヒト定常領域を組み合わせることにより、選択されたVHドメインをヒト化する工程
により生成される重鎖である(またはそのような重鎖のコピーである)抗体。
【０６９１】
別の実施形態では、以下が提供される。
ヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の患者における疾患または医学的状態の治療および/または予防のための抗体重鎖またはVHドメイン(例えば抗体の一部として提供される)であって、重鎖が、以下の工程:
(a)非ヒト脊椎動物(例えばマウスまたはラット)から抗原特異的抗体重鎖またはVHドメインを選択する工程であって、重鎖またはVHドメインが、ヒトVH遺伝子セグメントとヒトD遺伝子セグメントおよびヒトJH遺伝子セグメントとの組換えに由来し、VH遺伝子セグメントが、少なくとも1または5%の累積頻度で前記集団に存在するVHから選択される工程、ならびに
(b)場合により、重鎖の可変ドメインをヒト定常領域と組み合わせることにより重鎖をヒト化するか、または場合により、ヒト定常領域を組み合わせることにより、選択されたVHドメインをヒト化する工程
により生成される重鎖である(またはそのような重鎖のコピーである)抗体。
【０６９２】
ある例では、VH遺伝子セグメントは、1000 Genomesデータベースにおいて見出される。ある例では、遺伝子セグメントは、Table 13(表23-1〜23-226)において見出される。
【０６９３】
374. ヒト定常領域が、項目361または362に記載のとおりである、項目373に記載の抗体重鎖またはVHドメイン。
【０６９４】
375. 前記祖先の患者における疾患または医学的状態の治療および/または予防のための医薬品において使用するための、項目373または374に記載の抗体重鎖またはVHドメイン。
【０６９５】
376. ヨーロッパ系、東アジア系、西アフリカ系、南アジア系またはアメリカ系祖先の患者における疾患または医学的状態を処置および/または防止する方法であって、患者に、治療または予防有効量の項目373または374に記載の抗体重鎖またはVHドメインを投与する工程を含む方法。
【０６９６】
本明細書中の実施形態では、中国人患者は、漢民族中国人患者であり得る。
【０６９７】
本明細書中の実施形態では、ヨーロッパ系祖先の患者は、北もしくは西ヨーロッパ系祖先、イタリア系祖先、英国系もしくはスコットランド系祖先、フィンランド系祖先またはイベリア系祖先の患者であり得る。
【０６９８】
本明細書中の実施形態では、東アジア系祖先の患者は、漢民族中国系祖先、日本系祖先、中国系ダイ祖先、ベトナム系祖先またはキン祖先の患者であり得る。
【０６９９】
本明細書中の実施形態では、西アフリカ系祖先の患者は、ヨルバ族系祖先、ルイヤ系祖先、ガンビア系祖先またはマラウィ系祖先の患者であり得る。
【０７００】
本明細書中の実施形態では、アメリカ系祖先の患者は、アフリカ系アメリカ人系祖先、アフリカ系カリブ人系祖先、メキシコ系祖先、プエルトリコ系祖先、コロンビア系祖先またはペルー系祖先の患者であり得る。
【０７０１】
本明細書中の実施形態では、南アジア系祖先の患者は、アーホム族系祖先、カーヤドゥサ系祖先、レディ系祖先、マラータ族系祖先またはパンジャブ族系祖先の患者であり得る。
【０７０２】
任意の態様のある例では、累積頻度は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90または95%である。
【０７０３】
本明細書に記載する具体的な実施形態は、説明のために示され、本発明を限定するのでないことが理解される。本発明の原則的な特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく様々な実施形態において採用できる。当業者は、本明細書に記載する特定の手順の多数の等価物を認識しているか、または単に日常的な研究を用いて確かめることができる。このような等価物は、本発明の範囲内とみなされ、特許請求の範囲によりカバーされる。本明細書で言及する全ての出版物および特許出願は、本発明が関する当業者のレベルを示す。全ての出版物および特許出願は、それぞれ個別の出版物または特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されているのと同じ程度で参照により本明細書に組み込まれている。語句「a」または「an」は、特許請求の範囲および/または明細書において「含み(comprising)」とともに用いる場合、「1」を意味し得るが、「1または複数」、「少なくとも1」および「1または1より多く」の意味とも矛盾しない。特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替のもののみに言及すると明示的に示さない限り、または選択肢が互いに排他的でない限り、「および/または」を意味するために用いるが、本開示は、代替のみおよび「および/または」についての定義を支持する。本出願をとおして、用語「約」は、値が、値を決定するために用いられる装置、方法についての誤差の固有の変動、または研究対象において存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【０７０４】
本明細書および特許請求の範囲において用いる場合、語句「含み」(ならびに「含む(comprise)」および「含む(comprises)」のような含みの任意の形)、「有し(having)」(ならびに「有する(have)」および「有する(has)」のような有しの任意の形)、「含み(including)」(ならびに「含む(includes)」および「含む(include)」のような含みの任意の形)または「含有し(containing)」(ならびに「含有する(contains)」および「含有する(contain)」のような含有しの任意の形)は、包括的または開放的であり得るが、さらなる記載されていない要素または方法工程を排除しない。
【０７０５】
用語「またはそれらの組み合わせ」は、本明細書で用いる場合、該用語に先行する、列挙された項目の全ての順列組み合わせのことをいう。例えば、「A、B、Cまたはそれらの組み合わせ」は、A、B、C、AB、AC、BCまたはABCの少なくとも1つを含むことを意図し、具体的な文脈において順序が重要であるならば、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BACまたはCABも含む。この例を継続すると、BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABBなどのような1または複数の項目または用語の反復を含む組み合わせも明示的に含まれる。当業者は、文脈からそうでないことが明確でない限り、典型的に、任意の組み合わせでの項目または用語の数に制限がないことを理解している。
【０７０６】
本開示の任意の部分は、文脈からそうでないことが明確でない限り、本開示の任意の他の部分と組み合わせて読むことができる。
【０７０７】
本明細書に開示し、請求する組成物および/または方法の全ては、本開示に鑑みて、過度の実験を行うことなく作製および実行できる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態の点で記載したが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載する組成物および/または方法ならびに方法の工程もしくは工程の順序に変動を加えることができることが、当業者に明らかである。当業者に明らかな全てのこのような同様の置換および改変は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【０７０８】
本発明を、以下の非限定的な予言的実施例においてより詳細に記載する。
【０７０９】
(実施例)
(実施例1)
「マウスゲノムに多型V領域を付加するためのリコンビニアリングされたBACベクター」
図1〜図3は、多型V遺伝子領域をゲノムDNAに導入するために用いることができるリコンビニアリング方法(上記の参考文献を参照されたい)を示す。一実施形態では、ヒト重鎖領域からのゲノム断片を、標準的な技術により細菌人工染色体(BAC)ベクターに挿入する。好ましくは、20kbから200kb以上までのサイズの範囲であり得るこのようなBACは、商業的に入手可能なライブラリーの配列検索を含む標準的な技術により、または対象のBACを有するものを同定するためのBACを含有する細菌コロニーとのハイブリダイゼーションにより、BACのライブラリーから単離できる。
【０７１０】
いくつかのVH遺伝子セグメントを有するBACを選択する。図1では、これらは、例えばVH[a]からVH[z]として遺伝子的に同定される。当業者は、適当なゲノム断片を、例えば、5つの内因性活性VH遺伝子セグメントおよび7つのVH偽遺伝子を含むヒトVH5-78〜VH1-68からのおよそ120kbの断片を容易に同定できる。リコンビニアリング技術を用いて、内因性VH遺伝子セグメントは、多型VHまたはVL遺伝子セグメントにより置き換えることができる。本実施例では、2つの工程が必要である。第1の工程は、内因性VH遺伝子セグメントのV領域をコードするエキソンを、ポジティブ-ネガティブ選択オペロン、本実施例では、アンピシリン耐性遺伝子(Amp)およびストレプトマイシン感受性作リボソームタンパク質(rpsL)をコードするオペロンで置き換える。あるいくつかの株の細菌は、ストレプトマイシンに対する耐性によって、rpsL遺伝子の非存在について選択できる。内因性VH遺伝子エキソンを挟む配列に相同なDNAの短い配列を、rpsL-Ampオペロンの5'および3'に配置する。標準的なリコンビニアリング技術(上記の参考文献を参照されたい)による適当な組換え因子の存在下で、オペロン断片とBACとの間の組換えは、アンピシリンに対する耐性によって選択されるオペロン(図1a)での内因性VH遺伝子エキソンの置き換えをもたらす。第2の工程は、同じ相同配列を用いて、挿入されたオペロンを、所望の多型VH遺伝子セグメントで置き換える。本実施例では、ヒトVH1-69遺伝子を挿入する(図1bおよび1c)。特に、VH1-69の*02バリアントを用いる[ref IMGTおよび図5]。多型VH遺伝子セグメントがうまく組み込まれたことは、オペロン、具体的にはrpsL部分の喪失によりストレプトマイシン耐性になった細菌において選択される。
【０７１１】
本実施例では、記載したような2工程プロセスを、内因性VH遺伝子セグメントのそれぞれについて、または多型V遺伝子セグメントで置き換えることを望むだけ多くの内因性遺伝子セグメントについて反復できる(図1d)。
【０７１２】
明らかなように、任意の多型V遺伝子セグメントをこのようにして挿入でき、任意の内因性V遺伝子セグメントは、偽遺伝子を含む標的として作用できる。重鎖および2つの軽鎖遺伝子座のそれぞれにおけるV遺伝子セグメントは、この技術を用いて、BAC挿入断片として利用可能な適当なゲノム断片で置き換えることができる。
【０７１３】
図2は、多型V遺伝子セグメントをコードするゲノム断片を創出するための別の方法を示す。本実施例では、多型V遺伝子セグメントを、他の遺伝子、制御エレメントまたは他の機能を有さないゲノムDNAの領域に挿入する。このような「砂漠」領域は、配列分析およびBACにクローニングされたかまたは現存のBACライブラリーにおいて同定される対応するDNA断片に基づいて選択できる。このようなゲノム断片を用いて開始して、リコンビニアリング技術を用いて、多型V遺伝子セグメントを、例えば10kbの間隔で挿入できる。本実施例では、150kbのゲノム断片が、15までの多型V遺伝子セグメントを収容できる。セグメントの挿入は、2工程プロセスである。第1のリコンビニアリング工程は、rpsL-Ampオペロンを特定の部位に挿入する。特定の部位に相同な配列を用いて、オペロンを挟む。これらをリコンビニアリングシステムにより用いて、エレメントをBACゲノム断片に特異的に挿入し、ポジティブ事象を、アンピシリンに対する耐性によって選択する(図2a)。第2の工程は、同じ配列相同性を用いる同様のリコンビニアリング工程により、ゲノム断片中のオペロンを多型V遺伝子セグメントで置き換える(図2b)。本実施例では、多型VH遺伝子セグメントのエキソンおよびプロモーターエレメントをともに挿入して、rpsL-Ampオペロンの置き換えと、それによるストレプトマイシンに対する耐性とをもたらす(図2c)。
【０７１４】
多型V遺伝子セグメントをゲノム断片の特定の部位に挿入するための2工程技術は、プロモーターエレメントを含むいくつかの多型遺伝子セグメントを有するBACゲノム断片が得られるまで複数回反復できる。図1および2に示す例を組み合わせることができ、ここで、挿入のための技術を用いて、図1に示すように、さらなる多型V遺伝子セグメントをBACゲノム断片に付加できることが明らかである。これらのさらなるセグメントをIGゲノム断片に付加することを選択する場合がある。なぜなら、このような断片は、非ヒト哺乳動物のゲノムに一旦挿入されると、適当なIG遺伝子発現をしやすいからである。ゲノム断片が、エンハンサーのようなエレメントまたはあるいくつかのクロマチン立体構造に貢献するエレメント(これらはともに野生型遺伝子発現において重要である)を有することができることが知られている。
【０７１５】
図3は、多型V遺伝子セグメントを有するゲノム断片を創出するためのさらなる方法を示す。この方法は、短い(50〜150塩基程度、好ましくは100塩基)1本鎖DNA断片がリコンビニアリングを用いて相同配列と組み換わる効率に依存する(Nat Rev Genet. 2001年10月;2(10):769〜79頁; Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics; Copeland NG、Jenkins NA、Court DL)。リコンビニアリングにおいて用いるリコンビナーゼは、相同組換えを開始するために基質としてDNAのこのような短い1本鎖断片と優先的に結合し、これを用いる。効率は10-2ほど高いことがあり、つまり、1つのポジティブ事象は、リコンビニアリングにより得られるおよそ100のランダムに取り上げた(選択していない)クローンのうちで見出すことができる。1本鎖断片に導入された1または複数のヌクレオチド変化がV遺伝子セグメントおよび周辺のゲノムDNAを含有するBAC挿入断片に移動した場合に生じる本実施例におけるポジティブ事象(1または複数の前記ヌクレオチド変化は、BAC上の相同配列にて生じる)。
【０７１６】
多型V遺伝子セグメントは、例えば1もしくは2だけ、または10もしくは15ヌクレオチド変化までで内因性V遺伝子セグメントから異なることができる。このようなヌクレオチド多型の例を図5に示す。多型ヌクレオチド変化を包含する短い1本鎖領域は、標準的な技術を用いて化学的に合成できる。得られた1本鎖DNA断片を細菌に導入し、リコンビニアリング技術により、100のBAC断片のうちおよそ1つが、1本鎖断片の相同組み込みにより多型ヌクレオチドを組み込む(図3a)。所望のヌクレオチド変化を有するBACを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅および配列決定(ともに標準的な技術による)により例えば数百の個別のクローンをスクリーニングすることにより同定できる。本実施例では、2つのヌクレオチド変化が、VH1-69*01遺伝子セグメントをVH1-69*02遺伝子セグメントに変換する(図3b)。
【０７１７】
本プロセスを、単独BACゲノム断片上に含まれる複数の内因性V遺伝子セグメントについて反復できることが明らかである。さらに、図2に示す技術を用いて、現存するV遺伝子セグメントの間の領域への挿入によりさらなる多型V遺伝子セグメントを付加できる。当業者に明らかなように、これらの技術の組み合わせを用いて、多型および内因性の両方のヒトV遺伝子セグメントの多数の変動を創出できる。工学的に操作された多型V遺伝子セグメントおよび内因性ヒトV遺伝子セグメントを有するいくつかの異なるゲノム断片を組み合わせて、さらなる変動を創出できることも明らかである。
【０７１８】
(実施例2)
「改変BACのSRMCEを用いるゲノムへの多型V領域の付加」
実施例1に記載する方法を用いて創出した多型V遺伝子セグメントを有する改変BACを用いて、非ヒト哺乳動物のゲノムを変更できる。これらの変更は、通常の免疫グロブリン領域組換えがヒトV遺伝子セグメントを含むVDJまたはVJ組み合わせをもたらすインタクトなIG遺伝子座をもたらすことができる。このような動物をどのようにして創出できるかの例は、例えばマウス胚性幹(ES)細胞のゲノムを、図4に概説する方策を用いて変更することによる。
【０７１９】
多型V遺伝子セグメントを有するBACをゲノムに組み込むためのある技術は、逐次的リコンビナーゼ媒介カセット交換(SRMCE)である。この技術は、WO2011004192(Genome Research Limited)(これは、本明細書にその全体が参照により組み込まれている)に記載されている。
【０７２０】
SRMCEは、特定の位置に挿入された「着地パッド(landing pad)」で改変された遺伝子座を提供する。この挿入は、相同組換えによりde novoであるか、または以前のBAC挿入の結果によるかのいずれかであり得る。本実施例では、着地パッドを、マウスIGH遺伝子座中で、最も3'側のJ遺伝子セグメントとCμ遺伝子セグメントとの間に挿入し、SRMCE技術による以前のBAC挿入が、5つのヒトV遺伝子セグメントおよび2つのV領域偽遺伝子の付加をもたらす。着地パッドは、図4に示すエレメントを有し、これらは、第2の標的化BAC断片の正しい挿入の選択を可能にする。この挿入の特異性は、許容lox部位の間のcreリコンビナーゼ媒介交換によりもたらされる。lox部位は、適合するlox部位との組換えについてのみ許容性がある。本実施例では、loxP部位は、loxPとのみ組み換わり、lox2272は、lox2272とのみ組み換わる。このことにより、図4bおよび図4cに示すように、BAC断片の挿入の方向付けができる。
【０７２１】
正しい挿入を有するES細胞クローンは、挿入がないクローンまたは非生産的挿入を有するクローンのプールから、ピューロマイシンに対する耐性によって選択される。ピューロマイシンに対する耐性は、活性プロモーターエレメントであるPGKとpuroTKコード領域とが並置していることに起因する。正しい挿入は、接合部のPCR、内部エレメントのPCR、サザンブロッティング、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、配列決定などを含む標準的な技術により確認する。本実施例では、正しいlox2272-lox2272およびloxP-loxP組換えは、挿入前は存在しなかったpiggyBacエレメントの2つのインタクトなセットももたらす。インタクトなpiggyBacエレメントは、図において「PB5'」および「PB3'」と示す逆位反復のセットに含まれる。piggyBacエレメントの適当に方向付けられたセットは、エレメント間の組換えを触媒して、介在配列の欠失とともに両方のエレメントの欠失をもたらすことができるpiggyBacトランスポサーゼの基質である。piggyBac転位後に残存するDNAはインタクトなままであり、piggyBacエレメントのいずれの残余物も有さない。本実施例では、piggyBac転位が成功したES細胞クローンを、薬物FIAUに対して細胞を耐性にする活性puroTKエレメントの喪失により選択する(図4cおよび図4d)。
【０７２２】
本実施例におけるSRMCE方法の最終生成物は、5'側のマウスゲノムの配列と3'側のマウスIGH定常領域遺伝子セグメントとの間に、内因性未改変VH遺伝子セグメントのセットとともにいくつかの多型V遺伝子セグメントが挿入されたIGH遺伝子座である。多型V遺伝子セグメントは、VDJ遺伝子セグメントを産生するB細胞成熟に伴う組換え事象に参加できるように配置されている。これらの遺伝子セグメントは、次いで、転写され、マウス定常領域にスプライシングされる。これらの転写物の翻訳は、多型V遺伝子セグメント、ヒトDH遺伝子セグメント、ヒトJH遺伝子セグメントおよびマウス定常重鎖遺伝子セグメントによりコードされる抗体重鎖の生成をもたらす。
【０７２３】
当業者に公知なように、ES細胞クローンを用いて、該細胞をマウス胚盤胞胚に注入し、注入された胚を適切なレシピエントに移し、その結果得られるキメラ子孫を育種することにより、遺伝子改変マウスの系統を創出できる。改変遺伝子座は、育種により繁殖させることができ、遺伝子交雑に依存してヘテロ接合性またはホモ接合性のいずれかにできる。
【０７２４】
本実施例において示すIGH遺伝子座の構造ならびにB細胞受容体(BCR)および抗体遺伝子再構成に関与する機構についての知識から、多型V遺伝子セグメントと様々なDHおよびJH遺伝子セグメントとの異なる組み合わせの大きいセットがもたらされ、これらが、遺伝子改変動物におけるB細胞の集団における機能的抗体遺伝子の大きいレパートリーに貢献できることが明らかである。本実施例では、いくつかの異なるヒトVH1-69多型を組み込んで、超ヒトVH多様性を提供する。この特定のVH遺伝子セグメントは、感染性疾患病原体(例えばインフルエンザウイルス)と結合する抗体において普及していることが知られているので、本実施例の遺伝子改変を有するマウスの抗体レパートリーは、感染性疾患病原体と結合するものに好ましい偏りを有する抗体を生成すると期待される。言い換えると、レパートリーは、病原体抗原についての親和性が優れた抗体のより大きいサブセットを有する。このような病原体の例は、インフルエンザウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)およびヒト免疫不全性ウイルス1(HIV-1)を含む(下記の表も参照されたい)。
【０７２５】
(実施例3)
「13のVH1-69対立遺伝子のアラインメント」
さらなるV遺伝子セグメント多型を組み込むことにより、より多様性が高い抗体レパートリーを構築するために、V遺伝子セグメントの多型バリアントを利用できることが必要である。このようなバリアントのある供給源は、配列データベースを含む。本実施例では、VH1-69遺伝子セグメントの13の異なるバリアントを提供する。
【０７２６】
これらのバリアント配列および比較を、「IMmunoGeneTics」IMGT情報システム(www.imgt.com)データベースから引き出す。図5は、*01バリアントとのバリアント*02から*13までのアラインメントの図である。VH1-69*01ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、図の上部に示す。残りのバリアントが*01バリアント配列と同一である場合、配列の下にダッシュを挿入する。ヌクレオチドの違いは、適当なバリアントに並んで示し、配列変化がコードされるタンパク質の変化をもたらすならば、アミノ酸変化をトリプレットの上に示す。
【０７２７】
図5は、*01バリアントと比較した、各バリアントについての1から4アミノ酸までの変化を示す。アミノ酸変化は全て、相補性決定領域(CDR)をコードする重鎖タンパク質の一部に生じる。これらの領域は、抗原特異性および抗原についての抗体の親和性を担う。抗体のレパートリーにおいてさらなる多型CDRを提供することは、様々な抗原についての結合の特徴に優れた抗体が得られる可能性を高める。いくつかの報告では、重鎖のVH1-69によりコードされる可変領域が、インフルエンザウイルス、HCVおよびHIV-1抗原と結合する抗体においてしばしば見出されている(上の表を参照されたい)。よって、本実施例の多型V遺伝子セグメントをトランスジェニック動物モデルに実施例1および実施例2の方法を用いて組み込むことにより、これらおよびその他の病原体に関連する抗原と結合するより多くの抗体を含む抗体レパートリーが、前記トランスジェニック動物においてもたらされる可能性が高い。当該技術において知られるように、より大きいレパートリーは、例えばハイブリドーマ技術を用いて、所望の抗原と高い親和性および特異性で結合するモノクローナル抗体を見出す可能性を高める。
【０７２８】
本開示は、よって、これらの実施例において、病原体または他の抗原で免疫化できるトランスジェニックマウスモデルについて記載する。このような免疫化マウスからの血漿B細胞を用いてハイブリドーマライブラリーを作製でき、これを、病原体抗原と結合する抗体の生成についてスクリーニングできる。このライブラリーは、このような抗体を見出すための伝統的なトランスジェニックマウスからのライブラリーより優れている(前記トランスジェニックマウスにおいて多型VH1-69遺伝子セグメントがIGH遺伝子座に付加されていることに鑑みて)。
【０７２９】
これらの実施例は、選択できるヒト多型V遺伝子セグメントまたはこれらを動物モデルに導入するために用いる方法に限定されない。方法を用いて、免疫グロブリンDおよび/またはJセグメントを有するトランスジェニック遺伝子座を構築できる。V、D、Jセグメントは、複数のヒト供給源(場合により1より多いヒト人種集団)からであり得る。
【０７３０】
(実施例4)
1000 Genomesデータベースから選択されるヒトIgH JH遺伝子バリアント
ヒトJH2、5および6バリアントについてデータを示す。Table 10A(表15-1〜15-3)、11A(表17-1〜17-2)および12A(表21)において、様々な集団からのヒトからの試料を列挙し、ここで、本発明者らの配列分析は、IgH JH対立遺伝子の一方または両方に多型が存在することを明らかにする。集団コードは、下記のTable 8(表13-1〜13-2)に説明する。多型は、JH2、5および6参照配列(それぞれ配列番号1、2および3;以下を参照されたい)からのヌクレオチドバリアントである。全ての参照は、Ensemblデータベース(www.ensembl.org)から得た配列である。JH5参照は、このデータベースに開示されるヒトIgH J5-001である。JH6参照は、このデータベースに開示されるヒトIgH J6-001である。JH2参照は、このデータベースに開示されるヒトIgH J2-001である。
【０７３１】
参照ヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列を、次のページに示す。ヒト第14染色体上の対応する位置番号を含む、コードされるアミノ酸配列とのアラインメントも示す。
【０７３２】
バリアント頻度を、Table 10A(表15-1〜15-3)、11A(表17-1〜17-2)および12A(表21)に示し、これらは、1000 Genomesデータベース(2011年10月にて最新のリリース)におけるバリアントの頻度と関連する。
【０７３３】
Table 10B(表16-1〜16-3)、11B(表18-1〜18-2)および12B(表22-1〜22-2)は、1000 Genomesデータベースから本発明者らが整理した、ヒトJHバリアントにおける非同義ヌクレオチド多型を示す。ヒト第14染色体上のヌクレオチド位置に相当する位置番号を、バリアント位置について示す(第14染色体は、ヒトにおけるIgH遺伝子座を有する染色体である)。よって、例えば、Table 11B(表18-1〜18-2)の最初の記載は、バリアントJH5配列における位置に言及する「14:106330027:A/C」であり、ここで、該位置は、ヒト第14染色体上の106,330,027位に相当し、このような位置は、参照配列においてA(アデニン)である。「C」は、本発明者らが、1000 Genomesデータベースにおいて見出されるバリアントにおいてこの位置にてシトシンへの変異を観察したことを示す。この変化は、コードされる配列のアミノ酸レベルの変化を導き(すなわち「非同義」変化)、この場合、バリアントにおけるセリン(参照において見出される)からアラニンへの変化である。
【０７３４】
(実施例5)
ヒト抗体遺伝子セグメントバリアント同定および集団分析
バリアント分析のためのそれぞれの標的遺伝子についてのゲノムコード領域座標を、Ensembl WWWサイト(www.ensembl.org)から、GRCh.p8ヒトゲノムアセンブリからの座標(www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/assembly/grc)を用いて同定した。収集した遺伝子位置座標を用いて、1000 Genomesプロジェクトの公共ftpサイトから、Perl「バリアントパターンファインダ」(VPF-www.1000genomes.org/variation-pettern-finder-api-documentation)を用いてバリアントデータを抽出した。
【０７３５】
VPFにより抽出したデータを、関連する遺伝子型コールを有する全ての非同義(NSS)バリアントを抽出するためのソフトウェアを用いて後処理した。遺伝子型コールを組み立てて、1000 Genomes集団の群と関連するNSSバリアントの群およびこれらの集団における出現の頻度を示すユニークハプロタイプを形成した。
【０７３６】
分析の出力は、Table 13(表23-1〜23-226)のような表をもたらす。この表の本体は、各ハプロタイプと、該遺伝子のユニークID(a〜z、aa〜zzの範囲)、個体およびユニーク集団の群における集団頻度および出現率を順に示す。1または複数の後続の縦列は、該ハプロタイプを形成するそれぞれの位置でのDNA塩基コールを示し、参照配列からの塩基またはバリアント塩基コールの両方を示す。
【０７３７】
Table 13(表23-1〜23-226)は、この様式で構築した。この表は、以下のように読み取ることができる。
【０７３８】
最初の4つの縦列は(左から右に)、(1)ハプロタイプID文字(「ref」は参照-GRCh37ヒト参照アセンブリからの各ゲノム位置でのDNA塩基コールを示す)、(2)異なる集団のうちでのハプロタイプの観察された累積頻度、(3)特定のハプロタイプが観察された個体の数、(4)同定された個体が属するユニーク集団の群の数(実際の集団の群の識別子は、各ハプロタイプについて最も右側の縦列において一連のIDとして示す。例えば、ハプロタイプ「a」は、「3、4、9、13」の一連の集団IDを有する)からなる。
【０７３９】
集団は、以下のように番号付けされる(集団ラベルは、1000 Genomesプロジェクト命名法に従う)
1=ASW;
2=CEU;
3=CHB;
4=CHS;
5=CLM;
6=FIN;
7=GBR;
8=IBS;
9=JPT;
10=LWK;
11=MXL;
12=PUR;
13=TSI;
14=YRI。
【０７４０】
後続の縦列は、単独点バリアントの詳細を示し、以下のフォーマットを有する(上から下に)(1)バリアントのヒトゲノム位置(フォーマット[染色体番号]:[位置]例えば「14:106204113」);(2)DbSNP(www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)で定義されるとおりの点バリアントについての識別子;(3)1またはさらなる横行は、特定の転写物についてのバリアントの結果としてのアミノ酸変化を示し(各横行について最も右側の縦列中にEnsembl転写物IDにより示す)、フォーマットは、IUPACアミノ酸3文字コード(http://pac.iupac.org/publications/pac/pdf/1972/pdf/3104x0639.pdf)を用いて、参照配列におけるアミノ酸、続いて「->」、および参照配列においてバリアントの置換により得られるアミノ酸(例えば、「Gly- >Arg」は、翻訳された参照配列がその位置でグリシンをもたらし、同定されたバリアントの置換が、アルギニンを含有する翻訳タンパク質をもたらすことを意味する)。後続の横行(ハプロタイプあたり1行)は、各位置でのDNA塩基を示し、参照配列とマッチする塩基を白の背景上に黒で示し、参照配列から変動する塩基を、黒の背景上に白の文字で示す。
【０７４１】
最も右側の縦列は、各遺伝子転写物についてのEnsembl転写物ID(例えば「ENST00000390542」)を含み、この縦列の左の列へのアミノ酸変化に関する。転写物は長さが異なるので、各バリアント位置は、その位置でのアミノ酸変化を伴うことがあるか、または伴わない。
【０７４２】
(実施例6)
ヒトJH6*02に基づくトランスジェニックマウス、B細胞、ハイブリドーマ、抗体および重鎖
本発明者らは、機能的ヒト遺伝子セグメントレパートリー(VH2-26からJH6まで、ヒトIgH遺伝子座の構造についてIMGTデータベース;http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php?section=LocusGenes&repertoire=locus&species=human&group=IGKを参照されたい)を分割して、2つの異なるトランスジェニック重鎖対立遺伝子(S2FおよびS3Fと称する)および対応するマウスを生成した。トランスジェニック対立遺伝子をマウスにおいて発現し、重鎖レパートリーを、RNA転写物レベルにて評価した。大規模配列分析を、HCDR3の長さが少なくとも20アミノ酸である可変ドメイン配列におけるものを含むV、DおよびJH遺伝子使用を評価するバイオインフォマティクス法を用いて行った。内因性マウス可変領域遺伝子セグメントを、逆位により不活性化した(WO2011004192(本開示は、本明細書に参照により組み込まれている)に記載する方法のとおりに)。
【０７４３】
ヒトドナーDNA試料の配列決定:保存JH6*02バリアントの同定
9名の匿名の同意したヒトドナーからのDNA試料を、頬スワブを採取することにより得た。
【０７４４】
試料を処理し、QIAamp DNAミニキット(Cat.No.51304、Qiagen)のプロトコールに従ってDNA試料を抽出した。
【０７４５】
JH6領域を増幅するようにPCR反応を設定し、PCR生成物を配列決定した(PCRオリゴ配列:Fwd. 5'-AGGCCAGCAGAGGGTTCCATG-3'(配列番号444)、Rev. 5'-GGCTCCCAGATCCTCAAGGCAC-3'(配列番号445))。
【０７４６】
IMGTアノテート済データベース(http://www.imgt.org/)からのJH6参照配列と比較することにより配列分析を行い、これにより、9つ全てのドナーゲノムがヒトJH6*02バリアントを含有し、このバリアントが、9名のドナーのうち7名においてホモ接合性状態にあることが同定された。本発明者らは、Ensemblヒトゲノムデータベース[http://www.ensembl.org/]にてJim WatsonおよびCraig Venterについて公共で入手可能なゲノム配列も参考にした。これらもヒトJH6*02バリアントを含有した。このことにより、本発明者らは、ヒトJH6*02がヒトにおいて一般的で保存されたバリアントであり、よって本発明によるトランスジェニックIgH遺伝子座の構築のためによい候補であることを確認した。
【０７４７】
適切なヒトDNA配列BACの同定
一連のヒト細菌人工染色体(BAC)クローンを、Ensemble(http://www.ensembl.org/index.html)またはUCSC(http://genome.ucsc.edu/)ヒトデータベース検索から、遺伝子名(IGH)または位置(第14染色体:106026574〜107346185)に基づいて同定した。7つのヒトRP11 BACクローン(図10におけるUCSCデータベースの抜粋を参照されたい、同定されたBACを丸で囲む)を選択し、RP11-1065N8 BACはヒトJH6*02を有していた。全体で、以下のBACを、ヒトIgH遺伝子座DNAの供給源として同定した:RP11-1065N8、RP11-659B19、RP11-141I7、RP-112H5、RP11-101G24、RP11-12F16およびRP11-47P23。
【０７４８】
同様のアプローチを用いて、異なるBACクローン(例えば異なるRP11クローンIDまたはRP11からの異なる供給源)または遺伝子操作したBACを、マウスIGH遺伝子座に挿入してトランスジェニックマウスにおいてヒトレパートリーの異なるセットを得るために選択できる。
【０７４９】
トランスジェニックIgH遺伝子座の構築
第1のIGH BAC(RP11-1065N8)からのヒト重鎖遺伝子セグメントをマウスAB2.1 ES細胞(Baylor College of Medicine)のIGH遺伝子座に挿入して、S1対立遺伝子と称する重鎖対立遺伝子を創出した。挿入したヒト配列は、106494908位から106328951位までのヒト第14染色体の配列に相当し、機能的重鎖遺伝子セグメントVH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2、VH6-1、D1-1、D2-2、D3-9、D3-10、D4-11、D5-12、D6-13、D1-14、D2-15、D3-16、D4-17、D5-18、D6-19、D1-20、D2-21、D3-22、D4-23、D5-24、D6-25、D1-26、D7-27、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5およびJH6(5'から3'の順序)を含み、ここで、JH6をヒトJH6*02バリアントとして選択した。挿入は、マウス第12染色体上の114666435位と114666436位の間で行い、これはマウスCμ領域の上流である。マウスVH、DおよびJH遺伝子セグメントを遺伝子座中に、挿入したヒト重鎖DNAのすぐ上流(5')に保持した。
【０７５０】
第2のBAC(BAC2)からのヒトDNAの逐次的挿入により、S1対立遺伝子中に挿入された最も5'側のVHの上流(5')により多くのヒト機能的VH遺伝子セグメントが挿入された第2の対立遺伝子であるS2を構築した。BAC2からの挿入されたヒト配列は、106601551位から106494909位までのヒト第14染色体の配列に相当し、機能的重鎖遺伝子セグメントVH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7を含む。マウスVH、DおよびJH遺伝子セグメントを遺伝子座中に、挿入したヒト重鎖DNAのすぐ上流(5')に保持した。後続の工程では、これらを逆位にして不活性化し、そのことにより、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントだけが活性なS2Fマウスを生成した。
【０７５１】
第3のBAC(BAC3)からのヒトDNAの逐次的挿入により、S2対立遺伝子中に挿入された最も5'側のVHの上流(5')により多くのヒト機能的VH遺伝子セグメントが挿入された第3の対立遺伝子であるS3を構築した。挿入された配列は、106759988位から106609301位までのヒト第14染色体の配列に相当し、機能的重鎖遺伝子セグメントVH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18およびVH3-15を含む。マウスVH、DおよびJH遺伝子セグメントを、挿入したヒト重鎖DNAのすぐ上流(5')に保持した。後続の工程では、これらを逆位にして不活性化し、そのことにより、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントだけが活性なS3Fマウスを生成した。
【０７５２】
S2FまたはS3F挿入断片のいずれかを内因性重鎖遺伝子座中に有するマウスを、標準的な手順を用いてES細胞から作製した。マウスJH-Cμイントロン中にneoRを含む不活性化配列を挿入することにより(「HA」対立遺伝子を生成するため)、マウスにおいてその他の内因性重鎖遺伝子座を不活性化した。
【０７５３】
免疫化手順
S2FまたはS3F遺伝子型のトランスジェニックマウスを、商業的に得たかまたは抗原1(OVA(Sigma A7641);抗原2(ヒト感染性疾患病原体抗原)および抗原3(ヒト抗原)を用い、完全フロイントアジュバント(Sigma F5881)および10ug/動物CpG(CpGオリゴ;Invivogen、San Diego、California、USA)中でip経路により社内で生成した20〜40ugの組換えタンパク質を用いて予備刺激し、次いで、不完全フロイントアジュバント(Sigma F5506)および10ug/動物CpG中の約半量の抗原を用いて、約2週間ごとの間隔で2回追加免疫した。アジュバントを含まず、PBS中に5〜10ugのタンパク質を含む最終の追加免疫を、2週間後にiv投与した。
【０７５４】
ハイブリドーマ融合手順
最終の追加免疫の3日後に脾臓を取り出し、脾細胞をCpG(25μmの最終濃度)で処理し、次の日まで放置した。細胞を、次いで、BTX ECM2001エレクトロフュージョン装置を用いてSP0/2 Ag14骨髄腫細胞(HPA Cultures Cat No 85072401)と融合させた。融合細胞を放置して20分間回復させ、次いで、T75フラスコに次の日の朝まで播種した。次いで、細胞をスピンダウンし、96ウェル培養プレート上に希釈系列により蒔き、約10日間放置した後にスクリーニングした。培地は、この期間中、1〜3回交換した。
【０７５５】
スクリーニング
上記のハイブリドーマウェルの培養上清を、ユーロピウムクリプテート標識抗マウスIgG(Cisbio抗マウスIgユーロピウムクリプテート)およびビオチンタグ付加標的抗原を、商業的に入手可能なストレプトアビジンコンジュゲートドナー(Cisbio;ストレプトアビジンコンジュゲートD2)とともに用いる均一時間分解蛍光アッセイ(htrf)を用いて、またはIgG特異的384ウェルELISAによりスクリーニングした。htrfにより同定された陽性ウェルを24ウェルプレートにスケール変更するか、またはIgG特異的検出ELISA法を用いて直ちに対比スクリーニングした。最初のELISAスクリーニングにより同定された陽性を、24ウェルプレートに直ちに拡大した。培養物を24ウェル段階に一旦拡大し、集密に到達したら、htrfまたはIgG特異的ELISAを用いて上清を再試験して、標的抗原との結合を確認した。このような確認された培養物の上清も、次いで、BioRad ProteOn XPR36装置を用いる表面プラズモン共鳴により分析した。このために、ハイブリドーマ培養物中で発現された抗体を、バイオセンサチップ表面と共有結合した抗マウスIgG(GE Healthcare BR-1008-38)を有するバイオセンサGLMチップ(BioRad 176-512)上に捕捉した。抗原を、次いで、分析物として用い、捕捉されたハイブリドーマ抗体表面上を通過させた。抗原2および抗原3について、256nM、64nM、16nM、4nMおよび1nMの濃度を典型的に用い、抗原1について、1028nM、256nM、64nM、16nMおよび4nMの濃度を典型的に用い、結合曲線は、0nM注入(すなわち緩衝液だけ)を用いて2重に参照した。速度論および全体的な親和性は、BioRad ProteOn XPR36分析ソフトウェアに固有の1:1モデルを用いて決定した。
【０７５６】
結合親和性が確認されたいずれのクローンも、全RNAの調製およびその後のPCRに用いて、重鎖可変領域配列を回収した。標準的な5'-RACEを行って、S2FおよびS3Fマウスにおけるトランスジェニック重鎖遺伝子座からのRNA転写物を分析した。さらに、マウスにより生成されるおよそ2000の配列の大規模配列分析を行った。
【０７５７】
バイオインフォマティクス分析
分析のための配列を、2つの異なる方法から得た。
第1のものは、脾臓から抽出したRNAからである。マウスIGH遺伝子座のCmu領域に基づくオリゴをPCR鋳型として用いて第1のcDNA鎖を合成した。PCRは、このオリゴをオリゴdT-アンカープライマーとともに用いて行った。PCR生成物をpDriveベクター(Qiagen)にクローニングし、次いで配列決定した。
【０７５８】
第2のものは、エレクトロフュージョンにより作製したハイブリドーマからである。全RNAを対象のハイブリドーマ系統から標準的なトリゾール法を用いて抽出し、長期間の貯蔵のために-80℃に凍結した。標準的なSuperscript III逆転写酵素と、重鎖のための全てのマウスIgGアイソタイプと結合する遺伝子特異的リバースプライマーと、軽鎖増幅のためのマウスカッパ定常領域プライマーとを用いて、100ngの全RNAからcDNAを作製した。次いで、2〜3ulのcDNAを、Pfu DNAポリメラーゼと、ヒト免疫グロブリン可変ドメインのリーダー配列にアニールする一連の縮重フォワードプライマーと、1つのマウスpan-IgGリバースプライマーとを用いるPCR反応において鋳型として用いた。PCR生成物を1%アガロースゲルに泳動させ、およそ350〜450塩基対のバンドを抽出して精製した。次いで、DNAを配列決定した。
【０７５９】
第1の方法からの配列は、ナイーブマウスからのIgMまたは免疫化マウスからのIgGのいずれかであり得る。第2の方法からの試料は、全て免疫化マウスからのIgGであり、免疫化抗原に特異的である。およそ2000の配列を分析した。
【０７６０】
配列は、フォワードおよびリバースの読み取りの対として得た。これらを整えて、読み取りの端からの低品質な塩基コールを除去した(19ヌクレオチドウィンドウが25以上の平均の質スコアを有するまで両端から整えた)。リバース読み取りのリバース相補鎖を得て、フォワード読み取りに対して整列させることにより読み取りを一緒に組み合わせた。アラインメントスコアは、マッチについて5、ミスマッチについて-4、ギャップオープンペナルティは10、ギャップ伸長ペナルティは1であった。次いで、アラインメントを通して見て、塩基を比較することによりコンセンサス配列を作製した。不一致があった場合、配列決定からの最高の質の値を有する塩基を用いた。
【０７６１】
BLAST+(Basic Local Alignment Search Tool)(Camacho C.、Coulouris G.、Avagyan V.、Ma N.、Papadopoulos J.、Bealer K.およびMadden T.L.(2008)「BLAST+: architecture and applications.」BMC Bioinformatics 10:421頁  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20003500)プログラム「blastn」を次いで用いて、各配列で用いられる生殖系列JおよびVセグメントを見出した。30のワードサイズをVマッチングのために用い、15をJマッチングのために用いた。検索したデータベースは、Kyマウスを作製するために用いたBACのNGS配列決定から構築した。
【０７６２】
配列がVおよびJセグメントの両方とマッチするならば、2つの間の配列を、次いで、マウスにおける生殖系列Dセグメントのデータベースと、4のワードサイズならびにオプション「blastn-short」および「ungapped」とともに「blastn」を用いて比較した。これを用いて、可能であればDセグメントを割り当てた。Vセグメント中で保存された「TATTACTGT」配列を、およびJセグメント中で「CTGGGG」を検索することによりCDR3を同定した。これらのモチーフが見つからないならば、4つまでのミスマッチを許容した。CDR3のIMGT定義を用いたので、CDR3長さは、Vにおける「TGT」の後からJにおける「TGG」の前までと算出される。フレームにはまらない接合部(3で割ることができる長さのCDR3ヌクレオチドを有さないもの)を有する配列または停止コドン(「TAA」、「TAG」または「TGA」)を含む配列を除外した。
【０７６３】
マッチするV、JおよびDセグメントのアイデンティティならびにこの割り当てからのCDR3長さを、次いで、下流の分析のために表として保存した。用いたIGHJ6*02の比率はナイーブマウスから免疫化マウスまで増加し、長いHCDR3(20以上のアミノ酸からなると定義される)を有する配列の部分集団において豊富になった:
【０７６４】
【表１】
2014529998.tif 000003
【０７６５】
これは、JH6*02使用の割合が免疫化後に増加するので、JH6*02遺伝子セグメントが免疫化により選択されることを示す。JH6*02は、HCDR3の長さが長い抗体の大多数においても用いられ、このことは、HCDR3の長さが長い抗体と特異的に結合する標的のために望ましい。
【０７６６】
【表２】
2014529998.tif 000004
【０７６７】
【表３】
2014529998.tif 000005
【０７６８】
【表４】
2014529998.tif 000006
【０７６９】
［Table］
Tableにおいて、表記は以下の例に従って記載する。
【０７７０】
【表５】
2014529998.tif 000007
【０７７１】
【表６−１】
2014529998.tif 000008
【０７７２】
【表６−２】
2014529998.tif 000009
【０７７３】
【表６−３】
2014529998.tif 000010
【０７７４】
【表６−４】
2014529998.tif 000011
【０７７５】
【表６−５】
2014529998.tif 000012
【０７７６】
【表６−６】
2014529998.tif 000013
【０７７７】
【表６−７】
2014529998.tif 000014
【０７７８】
【表６−８】
2014529998.tif 000015
【０７７９】
【表６−９】
2014529998.tif 000016
【０７８０】
【表６−１０】
2014529998.tif 000017
【０７８１】
【表６−１１】
2014529998.tif 000018
【０７８２】
【表６−１２】
2014529998.tif 000019
【０７８３】
【表６−１３】
2014529998.tif 000020
【０７８４】
【表６−１４】
2014529998.tif 000021
【０７８５】
【表６−１５】
2014529998.tif 000022
【０７８６】
【表６−１６】
2014529998.tif 000023
【０７８７】
【表６−１７】
2014529998.tif 000024
【０７８８】
【表６−１８】
2014529998.tif 000025
【０７８９】
【表６−１９】
2014529998.tif 000026
【０７９０】
【表６−２０】
2014529998.tif 000027
【０７９１】
【表６−２１】
2014529998.tif 000028
【０７９２】
【表６−２２】
2014529998.tif 000029
【０７９３】
【表６−２３】
2014529998.tif 000030
【０７９４】
【表６−２４】
2014529998.tif 000031
【０７９５】
【表６−２５】
2014529998.tif 000032
【０７９６】
【表６−２６】
2014529998.tif 000033
【０７９７】
【表６−２７】
2014529998.tif 000034
【０７９８】
【表６−２８】
2014529998.tif 000035
【０７９９】
【表６−２９】
2014529998.tif 000036
【０８００】
【表６−３０】
2014529998.tif 000037
【０８０１】
【表７−１】
2014529998.tif 000038
【０８０２】
【表７−２】
2014529998.tif 000039
【０８０３】
【表７−３】
2014529998.tif 000040
【０８０４】
【表７−４】
2014529998.tif 000041
【０８０５】
【表７−５】
2014529998.tif 000042
【０８０６】
【表８−１】
2014529998.tif 000043
【０８０７】
【表８−２】
2014529998.tif 000044
【０８０８】
【表８−３】
2014529998.tif 000045
【０８０９】
【表９−１】
2014529998.tif 000046
【０８１０】
【表９−２】
2014529998.tif 000047
【０８１１】
【表９−３】
2014529998.tif 000048
【０８１２】
【表９−４】
2014529998.tif 000049
【０８１３】
【表９−５】
2014529998.tif 000050
【０８１４】
【表９−６】
2014529998.tif 000051
【０８１５】
【表９−７】
2014529998.tif 000052
【０８１６】
【表９−８】
2014529998.tif 000053
【０８１７】
【表９−９】
2014529998.tif 000054
【０８１８】
【表９−１０】
2014529998.tif 000055
【０８１９】
【表９−１１】
2014529998.tif 000056
【０８２０】
【表９−１２】
2014529998.tif 000057
【０８２１】
【表９−１３】
2014529998.tif 000058
【０８２２】
【表１０−１】
2014529998.tif 000059
【０８２３】
【表１０−２】
2014529998.tif 000060
【０８２４】
【表１０−３】
2014529998.tif 000061
【０８２５】
【表１０−４】
2014529998.tif 000062
【０８２６】
【表１０−５】
2014529998.tif 000063
【０８２７】
【表１０−６】
2014529998.tif 000064
【０８２８】
【表１０−７】
2014529998.tif 000065
【０８２９】
【表１０−８】
2014529998.tif 000066
【０８３０】
【表１０−９】
2014529998.tif 000067
【０８３１】
【表１０−１０】
2014529998.tif 000068
【０８３２】
【表１０−１１】
2014529998.tif 000069
【０８３３】
【表１１−１】
2014529998.tif 000070
【０８３４】
【表１１−２】
2014529998.tif 000071
【０８３５】
【表１２−１】
2014529998.tif 000072
【０８３６】
【表１２−２】
2014529998.tif 000073
【０８３７】
【表１３】
2014529998.tif 000074
【０８３８】
【表１４−１】
2014529998.tif 000075
【０８３９】
【表１４−２】
2014529998.tif 000076
【０８４０】
【表１４−３】
2014529998.tif 000077
【０８４１】
【表１５−１】
2014529998.tif 000078
【０８４２】
【表１５−２】
2014529998.tif 000079
【０８４３】
【表１５−３】
2014529998.tif 000080
【０８４４】
【表１６−１】
2014529998.tif 000081
【０８４５】
【表１６−２】
2014529998.tif 000082
【０８４６】
【表１６−３】
2014529998.tif 000083
【０８４７】
【表１７−１】
2014529998.tif 000084
【０８４８】
【表１７−２】
2014529998.tif 000085
【０８４９】
【表１８−１】
2014529998.tif 000086
【０８５０】
【表１８−２】
2014529998.tif 000087
【０８５１】
【表１９−１】
2014529998.tif 000088
【０８５２】
【表１９−２】
2014529998.tif 000089
【０８５３】
【表２０】
2014529998.tif 000090
【０８５４】
【表２１】
2014529998.tif 000091
【０８５５】
【表２２−１】
2014529998.tif 000092
【０８５６】
【表２２−２】
2014529998.tif 000093
【０８５７】
【表２３−１】
2014529998.tif 000094
【０８５８】
【表２３−２】
2014529998.tif 000095
【０８５９】
【表２３−３】
2014529998.tif 000096
【０８６０】
【表２３−４】
2014529998.tif 000097
【０８６１】
【表２３−５】
2014529998.tif 000098
【０８６２】
【表２３−６】
2014529998.tif 000099
【０８６３】
【表２３−７】
2014529998.tif 000100
【０８６４】
【表２３−８】
2014529998.tif 000101
【０８６５】
【表２３−９】
2014529998.tif 000102
【０８６６】
【表２３−１０】
2014529998.tif 000103
【０８６７】
【表２３−１１】
2014529998.tif 000104
【０８６８】
【表２３−１２】
2014529998.tif 000105
【０８６９】
【表２３−１３】
2014529998.tif 000106
【０８７０】
【表２３−１４】
2014529998.tif 000107
【０８７１】
【表２３−１５】
2014529998.tif 000108
【０８７２】
【表２３−１６】
2014529998.tif 000109
【０８７３】
【表２３−１７】
2014529998.tif 000110
【０８７４】
【表２３−１８】
2014529998.tif 000111
【０８７５】
【表２３−１９】
2014529998.tif 000112
【０８７６】
【表２３−２０】
2014529998.tif 000113
【０８７７】
【表２３−２１】
2014529998.tif 000114
【０８７８】
【表２３−２２】
2014529998.tif 000115
【０８７９】
【表２３−２３】
2014529998.tif 000116
【０８８０】
【表２３−２４】
2014529998.tif 000117
【０８８１】
【表２３−２５】
2014529998.tif 000118
【０８８２】
【表２３−２６】
2014529998.tif 000119
【０８８３】
【表２３−２７】
2014529998.tif 000120
【０８８４】
【表２３−２８】
2014529998.tif 000121
【０８８５】
【表２３−２９】
2014529998.tif 000122
【０８８６】
【表２３−３０】
2014529998.tif 000123
【０８８７】
【表２３−３１】
2014529998.tif 000124
【０８８８】
【表２３−３２】
2014529998.tif 000125
【０８８９】
【表２３−３３】
2014529998.tif 000126
【０８９０】
【表２３−３４】
2014529998.tif 000127
【０８９１】
【表２３−３５】
2014529998.tif 000128
【０８９２】
【表２３−３６】
2014529998.tif 000129
【０８９３】
【表２３−３７】
2014529998.tif 000130
【０８９４】
【表２３−３８】
2014529998.tif 000131
【０８９５】
【表２３−３９】
2014529998.tif 000132
【０８９６】
【表２３−４０】
2014529998.tif 000133
【０８９７】
【表２３−４１】
2014529998.tif 000134
【０８９８】
【表２３−４２】
2014529998.tif 000135
【０８９９】
【表２３−４３】
2014529998.tif 000136
【０９００】
【表２３−４４】
2014529998.tif 000137
【０９０１】
【表２３−４５】
2014529998.tif 000138
【０９０２】
【表２３−４６】
2014529998.tif 000139
【０９０３】
【表２３−４７】
2014529998.tif 000140
【０９０４】
【表２３−４８】
2014529998.tif 000141
【０９０５】
【表２３−４９】
2014529998.tif 000142
【０９０６】
【表２３−５０】
2014529998.tif 000143
【０９０７】
【表２３−５１】
2014529998.tif 000144
【０９０８】
【表２３−５２】
2014529998.tif 000145
【０９０９】
【表２３−５３】
2014529998.tif 000146
【０９１０】
【表２３−５４】
2014529998.tif 000147
【０９１１】
【表２３−５５】
2014529998.tif 000148
【０９１２】
【表２３−５６】
2014529998.tif 000149
【０９１３】
【表２３−５７】
2014529998.tif 000150
【０９１４】
【表２３−５８】
2014529998.tif 000151
【０９１５】
【表２３−５９】
2014529998.tif 000152
【０９１６】
【表２３−６０】
2014529998.tif 000153
【０９１７】
【表２３−６１】
2014529998.tif 000154
【０９１８】
【表２３−６２】
2014529998.tif 000155
【０９１９】
【表２３−６３】
2014529998.tif 000156
【０９２０】
【表２３−６４】
2014529998.tif 000157
【０９２１】
【表２３−６５】
2014529998.tif 000158
【０９２２】
【表２３−６６】
2014529998.tif 000159
【０９２３】
【表２３−６７】
2014529998.tif 000160
【０９２４】
【表２３−６８】
2014529998.tif 000161
【０９２５】
【表２３−６９】
2014529998.tif 000162
【０９２６】
【表２３−７０】
2014529998.tif 000163
【０９２７】
【表２３−７１】
2014529998.tif 000164
【０９２８】
【表２３−７２】
2014529998.tif 000165
【０９２９】
【表２３−７３】
2014529998.tif 000166
【０９３０】
【表２３−７４】
2014529998.tif 000167
【０９３１】
【表２３−７５】
2014529998.tif 000168
【０９３２】
【表２３−７６】
2014529998.tif 000169
【０９３３】
【表２３−７７】
2014529998.tif 000170
【０９３４】
【表２３−７８】
2014529998.tif 000171
【０９３５】
【表２３−７９】
2014529998.tif 000172
【０９３６】
【表２３−８０】
2014529998.tif 000173
【０９３７】
【表２３−８１】
2014529998.tif 000174
【０９３８】
【表２３−８２】
2014529998.tif 000175
【０９３９】
【表２３−８３】
2014529998.tif 000176
【０９４０】
【表２３−８４】
2014529998.tif 000177
【０９４１】
【表２３−８５】
2014529998.tif 000178
【０９４２】
【表２３−８６】
2014529998.tif 000179
【０９４３】
【表２３−８７】
2014529998.tif 000180
【０９４４】
【表２３−８８】
2014529998.tif 000181
【０９４５】
【表２３−８９】
2014529998.tif 000182
【０９４６】
【表２３−９０】
2014529998.tif 000183
【０９４７】
【表２３−９１】
2014529998.tif 000184
【０９４８】
【表２３−９２】
2014529998.tif 000185
【０９４９】
【表２３−９３】
2014529998.tif 000186
【０９５０】
【表２３−９４】
2014529998.tif 000187
【０９５１】
【表２３−９５】
2014529998.tif 000188
【０９５２】
【表２３−９６】
2014529998.tif 000189
【０９５３】
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【１１５６】
【表４７−５】
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【１１５７】
【表４７−６】
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【１１５８】
【表４７−７】
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【１１５９】
【表４７−８】
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【１１６０】
(参考文献)
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2014529998.tif 000398
【図６（ａ）】
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【図６（ｂ）】
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【図６（ｃ）】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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