(57)【要約】  本発明は、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞の培養体を、同定、獲得及び／又は定量する方法に関する。また、このような細胞の数を増やす、並びにこのような細胞を選別する方法も考慮される。さらに本発明は、膵臓内分泌前駆体表現型を有する細胞独特のサブセットの選択を可能にする、選択的細胞表面マーカーＤＤＲ１に関する。またさらに、本発明はこのような細胞から選択される単離された細胞及びその組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞を同定する方法であって、該方法が、膵臓細胞を含む細胞個体群をＤＤＲ１結合試薬と接触させることを含む方法。
【請求項２】
膵臓細胞を含む細胞個体群をＤＤＲ１結合試薬と接触させ、ＤＤＲ１結合試薬と結合しない細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞のフラクション中の、ＤＤＲ１結合試薬と結合した細胞を分離することを含む、管／内分泌前駆体細胞、膵臓内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞の培養体を得る方法。
【請求項３】
請求項２の方法に従い、精製された細胞を得、ついで、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞において、それらの分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞の培養体を得る方法。
【請求項４】
請求項２に従い、精製された細胞を得、ついで、得られた細胞型(類)の増殖を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞の数を増やす方法。
【請求項５】
請求項４に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞において、細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞の数を増やす方法。
【請求項６】
少なくとも一の膵臓ホルモンの生成に欠損がある哺乳動物に、膵臓内分泌機能を提供する方法であって、細胞が請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法により得られたもので、該方法が、哺乳動物において、少なくとも一の膵臓ホルモンを測定可能な量生成するのに十分な量の得られた細胞を、哺乳動物にインプラントする工程をさらに含む方法。
【請求項７】
ａ）ＤＤＲ１結合試薬と細胞とを接触させ；ｂ）細胞表面マーカーとして、ＤＤＲ１を示す細胞(ＤＤＲ１ポジティブ細胞)の量を測定することによる、ＤＤＲ１ポジティブ細胞を定量する方法。
【請求項８】
インビトロプロトコルを最適化する方法であって、ＤＤＲ１発現細胞(ＤＤＲ１ポジティブ細胞)の数が、定期的にモニターされる方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法により得られた管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び請求項３又は５ないし８のいずれか１項に記載の方法により得られた十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される、単離された細胞。
【請求項１０】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法により得られた、単離された内分泌前駆体細胞。
【請求項１１】
請求項３又は５ないし８のいずれか１項に記載の方法により得られた、単離され、十分に分化した内分泌細胞。
【請求項１２】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法により得られた管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群からの一又は複数の細胞から選択される単離された細胞を含有する組成物。
【請求項１３】
細胞表面マーカーとしての、ＤＤＲ１タンパク質を発現する細胞を同定又は選択するためのＤＤＲ１結合試薬の使用。
【請求項１４】
膵臓内分泌細胞の培養体を得るための、細胞表面マーカーとしてのＤＤＲ１タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓内分泌前駆体表現型を有する細胞独特のサブセットの同定、選択及び／又は定量を可能にする、選択的細胞表面マーカーＤＤＲ１に関する。
一態様においては、膵臓内分泌前駆体細胞及び初期の内分泌細胞を含む組成物、細胞培養体及び細胞個体群、並びに成熟した内分泌細胞を生成させ、内分泌前駆体細胞及び初期の内分泌細胞を検出する方法が考慮される。いくつかの態様においては、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞及び／又は十分に分化した内分泌細胞を含む組成物、細胞培養体及び細胞個体群、並びに成熟した内分泌細胞を生成させ、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞を検出する方法が考慮される。
【背景技術】
【０００２】
ベータ細胞移植には、１型糖尿病の処置が改善されるとの大きな期待が寄せられているが、まずは多くの障害を克服する必要がある。これらのなかには、ドナー島の不足がある。ベータ細胞から誘導される胚性幹(ＥＳ)細胞は、原則的には、無制限の数の移植用ベータ細胞を供給可能であるが、完全に機能するベータ細胞を作製するための信頼のおけるプロトコルは、未だ開発されていない。胚性幹細胞からの確定的内胚葉(ＤＥ)細胞の形成が、例えば、  国際公開第２００５／１１６０７３、国際公開第２００５／０６３９７１及び米国特許第２００６／０１４８０８１において、マウス及びヒトＥＳ細胞の双方で報告されている。例えば、ＤＥ細胞からの膵臓内胚葉(ＰＥ)細胞の効率的生成は、糖尿病を処置するためのインスリン生成ベータ細胞の作製にとっては有利である。
【０００３】
成人の膵島細胞を培養する試みにおいて、目的は、膵臓ベータ細胞又は島に分化可能な、膵臓及び膵臓内分泌前駆体細胞を単離することが切望されている。膵臓内分泌前駆体細胞の単離における重要な段階の一つは、膵臓内分泌前駆体細胞に対して特異的な、認識可能な細胞マーカーを同定することである。いくつかの態様において、腺房系列からの膵臓内分泌系列の単離における重要な段階の一つは、膵臓管／内分泌細胞、膵臓内分泌前駆体細胞、及び膵臓の初期の内分泌細胞に対して特異的な、認識可能な細胞マーカーを同定することである。細胞内及び細胞外マーカーの双方が、この目的のために調査される。細胞内マーカー、特に成熟した島細胞において成長した胚細胞からのものは、前駆体マーカーとして、広範囲にわたって研究されている。転写因子、例えばＰｄｘ１、Ｎｇｎ３、Ｐａｘ６、及びＩｓｌ-１が研究されている。それらは、胚発育中に、膵臓内分泌細胞になるようにプログラムされた細胞において発現している。しかしながら、これらの細胞内マーカーは細胞外マーカーよりも実用的価値が低く、これは、それらのマーカーの発現の分析には、細胞内でのレポーター遺伝子を遺伝的に設計することによる、細胞の永続的修飾又は細胞を殺すことが必要であるからである。
同定されると、細胞外マーカーは、マーカーを発現する細胞が滅菌条件下で選別可能で、生存し続けるという利点を提供する。上皮細胞付着分子、例えばＥｐ-ＣＡＭ及びインテグリンは、膵臓島前駆体マーカーとして研究されている。例えば、Cirulliら, J. Cell Biol. 140: 1519-1534 (1998);及び Cirulliら, J. Cell Biol. 150: 1445-1460 (2000)を参照のこと。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図１は、ヒトＤＤＲ１のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ配列アラインメントを示す。「-」により示されるアミノ酸位置は、欠失したアミノ酸位置を称する。「＊」により示されるアミノ酸位置は、アイソフォームが同一のアミノ酸を有する位置を示す。３つのアイソフォームがヒトには存在する。Ｃが最も長く、Ａ、ついでＢが続く。しかしながら、細胞外サイドでのアミノ酸配列は、Ａ、Ｂ及びＣで同一である。膜貫通ドメインはボールド体で強調している(ａａ４１７-４３９)。細胞外部分はアミノ酸１-４１６である。
【図２】図２は、マウスＤｄｒ１のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ配列アラインメントを示す。「-」により示されるアミノ酸位置は、欠失したアミノ酸位置を称する。「＊」により示されるアミノ酸位置は、アイソフォームが同一のアミノ酸を有する位置を示す。２つのアイソフォームがマウスには存在する。１が最も長い。しかしながら、細胞外サイドでのアミノ酸配列は、１と２で同一である。膜貫通ドメインはボールド体で強調している(ａａ４１５-４３７)。細胞外部分はアミノ酸１-４１４である。
【図３】図３は、膵臓細胞の発育経路の略図を示す。  図３Ａは、略図として、典型的な８μｍのマウスｅ１５．５膵臓組織切片を示す。マウスの膵臓において、細胞は同時に分化しない。よって、発達段階の異なる細胞が、付与された時間で観察可能である。ｅ１５．５での２つの主要なドメイン、中心及び末梢が観察される。中心ドメインには、初期の内分泌細胞、内分泌前駆体、及び管／内分泌前駆体に発育する細胞が含まれる。この中心ドメインは、外分泌系列の細胞を含まない。腺房系列の細胞は末梢ドメインに見出される。末梢ドメインにおける細胞はＰｔｆ１ａ＋及びＰｄｘ１＋であるが、Ｎｋ６．１−、Ｄｄｒ１−ではない。中心ドメインおいて、細胞はＰｄｘ１＋であるが、多くのＰｄｘ１＋細胞のなかでも、いつかの細胞はベータ-細胞系列のものである。ベータ-細胞系列のこのような細胞のいくつかは、インスリンに対してポジティブである。匹敵する細胞及びその局在性がヒト膵臓で見出されると仮定される。  図３Ｂは、細胞が通過する種々の段階の略図を示す。膵臓において、細胞は、多分化能性の膵臓前駆体プール、すなわちＰｄｘ１＋／Ｎｋｘ６．１＋／Ｐｔｆ１ａ＋の一部となり始める。細胞によりなされる運命の最初の選択は、外分泌(Ｐｔｆ１ａ＋)又は管／内分泌系列(Ｐｄｘ１＋及びＮｋｘ６．１＋、又はＰｄｘ１＋、Ｎｋｘ６．１＋、及びＤｄｒ１＋並びにＰｔｆ１ａ−)のいずれに進むかである。これらの細胞のいくつかは、管系列の運命をとるであろう。膵臓細胞がＤｄｒ１＋である場合、内分泌運命又は管運命を選択する可能性があり、よって、後にＮｇｎ３を活性化させる可能性がある。細胞がＮｇｎ３を活性化させたら、それは内分泌前駆体細胞である。また、Ｎｇｎ３＋細胞はＰｄｘ１＋でもある。Ｎｇｎ３発現は、内分泌前駆体細胞内でのみ一時的に生じ、特定の段階を介して内分泌分化プログラムを誘発し、そこではＮｅｕｒｏＤ、Ｐａｘ６、Ａｒｘ(アルファ細胞内）、及びＰａｘ４(ベータ細胞内)を含む他の転写因子が活性化される。これらの転写因子は、一部、ホルモン遺伝子活性化の原因であり、初期の内分泌細胞がホルモンに対してポジティブになった場合、それらのほとんどは、Ｎｇｎ３に対して既にネガティブであるが、一方でＰａｘ６＋ではない。この時点から、細胞は、以前及び未来の運命決定インプットに応じて、十分に分化した内分泌細胞型(アルファ-、ベータ-、デルタ-、ｐｐ-、及びグレリン-細胞)の一つに発育していく。
【図４】図４は、ＦＡＣＳを介し、ＤＤＲ１を使用する、マウス胚膵臓細胞の選別の結果を示す。図４Ａは、１０μｇ／ｍｌの一次抗体として、マウス抗-Ｄｄｒ１を使用する結果を示す。図４Ｂは、１０μｇ／ｍｌの一次抗体として、アイソタイプ(ＩｇＧ２ａ)の負の対照体を使用する結果を示す。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、膵臓内分泌細胞の内分泌前駆体の同定及び選択に、細胞外マーカーＤＤＲ１／Ｄｄｒ１を使用することを開示する。いくつかの態様において、本発明は、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞を同定する方法に関し、該方法は、ＤＤＲ１結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させることを含む。
いくつかの態様において、本発明は、ＤＤＲ１結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＤＲ１結合試薬と結合しない細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞のフラクション中の、ＤＤＲ１結合試薬と結合した細胞を分離することを含む：管／内分泌前駆体細胞、膵臓内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞の培養体を得る方法に関する。
【０００６】
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載された方法に従い、精製された細胞を得、ついで、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞において、それらの分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む：管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞の培養体を得る方法に関する。
【０００７】
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載された方法に従い、精製された細胞を得、ついで、得られた細胞型(類)の増殖を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む：管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞の数を増やす方法に関する。
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載された方法に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞において、細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む：管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞の数を増やす方法に関する。
【０００８】
いくつかの態様において、本発明は、少なくとも一の膵臓ホルモンの生成に欠損がある哺乳動物に、膵臓内分泌機能を提供する方法に関し、ここで細胞はここに記載された方法により得られたもので、該方法は：哺乳動物において、少なくとも一の膵臓ホルモンを測定可能な量生成するのに十分な量の得られた細胞を、哺乳動物にインプラントする工程をさらに含む。
いくつかの態様において、本発明は、ａ）ＤＤＲ１結合試薬と細胞とを接触させ；ｂ）細胞表面マーカーとして、ＤＤＲ１を示す細胞(ＤＤＲ１ポジティブ細胞)の量を測定する；ことによる、ＤＤＲ１ポジティブ細胞を定量する方法に関する。
いくつかの態様において、本発明は、インビトロプロトコルを最適化する方法に関し、ここでＤＤＲ１発現細胞(ＤＤＲ１ポジティブ細胞)の数は、定期的にモニターされる。
【０００９】
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載された方法により得られた、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される単離された細胞に関する。
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載された方法により得られた、単離された内分泌前駆体細胞に関する。
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載された方法により得られた、単離され、十分に分化した内分泌細胞に関する。
【００１０】
いくつかの実施態様において、本発明は、ここに記載された方法により得られた、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群からの一又は複数の細胞から選択される、単離された細胞を含有する組成物に関する。
いくつかの態様において、本発明は、細胞表面マーカーとしての、ＤＤＲ１タンパク質を発現する細胞を同定又は選択するための、ＤＤＲ１結合試薬の使用に関する。
いくつかの態様において、本発明は、膵臓内分泌細胞の培養体を得るための、細胞表面マーカーとしての、ＤＤＲ１タンパク質の使用に関する。
【００１１】
本発明の一態様は、ＤＤＲ１結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＤＲ１結合試薬と結合しない細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞のフラクション中の、ＤＤＲ１結合試薬と結合した細胞を分離することを含む：膵臓内分泌前駆体細胞及び／又は初期の内分泌細胞及び／又は膵臓ホルモン分泌細胞の培養体を得る方法に関する。
また本発明の他の態様は、上述した方法に従い、精製された細胞を得、ついで、膵臓内分泌細胞及び／又は膵臓ホルモン分泌細胞及び／又は初期の内分泌細胞及び／又は成熟した内分泌細胞において、それらの分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む：膵臓内分泌細胞及び／又は膵臓ホルモン分泌細胞及び／又は初期の内分泌細胞及び／又は成熟した内分泌細胞の培養体を得る方法に関する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、上述した方法に従い、精製された細胞を得、ついで、得られた細胞型(類)の増殖を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む：膵臓内分泌前駆体細胞及び／又は初期の内分泌細胞及び／又は膵臓ホルモン分泌細胞の数を増やす方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、上述した方法に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、膵臓内分泌細胞及び／又は膵臓ホルモン分泌細胞及び／又は初期の内分泌細胞及び／又は成熟した内分泌細胞において、細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む：膵臓内分泌細胞及び／又は膵臓ホルモン分泌細胞及び／又は初期の内分泌細胞及び／又は成熟した内分泌細胞の数を増やす方法に関する。
【００１３】
さらなるの態様において、本発明は、少なくとも一の膵臓ホルモンの生成に欠損がある哺乳動物に、膵臓内分泌機能を提供する方法に関し、該方法は、該哺乳動物において、測定可能な量の、少なくとも一の膵臓ホルモンが生成するのに十分な量、上述にて論議された本発明の方法のいずれかにより得られた細胞をインプラントする工程をさらに含む。
さらなる態様において、本発明は、ａ）ＤＤＲ１結合試薬と細胞とを接触させ；ｂ）細胞表面マーカーとして、ＤＤＲ１を示す細胞(ＤＤＲ１ポジティブ細胞)の量を測定することによる、膵臓細胞を含む細胞の培養体をモニターする方法に関する。
本発明の方法で単離されたＤＤＲポジティブ細胞は、種々の膵臓内分泌細胞型に分化する可能性を有している。重要な態様において、ＤＤＲポジティブ細胞は、インスリン生成細胞ににおいてさらに分化し−このことは、膵臓ポリペプチド及び／又はスマトスタチン及び／又はグルカゴン生成細胞を含む、細胞の培養体が生成されるように、又はインスリン生成細胞が単独で得られるように実施されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ＤＤＲ１は、管／内分泌前駆体細胞から初期の内分泌細胞までの分化段階から膵臓細胞に存在する。従って、ＤＤＲ１は、分化段階における、膵臓細胞の細胞外マーカーを提供し、ここで細胞は、管／内分泌系列に関連している。膵臓細胞の同定、富化、及び／又は単離に細胞外マーカーＤＤＲ１を使用すると、十分に分化した内分泌細胞になる可能性はあるが、外分泌細胞になる可能性が失われた細胞が提供される。
【００１５】
膵臓内分泌細胞−及びそれらの前駆体
膵臓においては、いくつかの異なった種類の膵臓細胞が見出される。膵臓細胞には、例えば、多能性の膵臓前駆体細胞、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は十分に分化した内分泌細胞が含まれる。これらの細胞型の概略は、図３に見出すことができる。
ここで使用される場合、「膵臓管／内分泌前駆体細胞」(「管／内分泌前駆体細胞」とも称される)は、膵臓外分泌細胞において発育する可能性を失い、Ｐｔｆ１ａを発現せず、ホルモン発現をしないが、膵臓内分泌細胞又は膵臓ホルモン分泌細胞細胞に分化する可能性を有し、通常、これらの細胞の表現型特徴の少なくとも一部を共有する細胞のことである。
【００１６】
いくつかの態様において、ここで使用される場合、「膵臓内分泌前駆体細胞」(「膵臓内分泌前駆体」及び「内分泌前駆体」とも称される)とは、ホルモン発現をしないが、膵臓内分泌細胞又は膵臓ホルモン分泌細胞に分化する可能性を有し、通常、これらの細胞の表現型特徴の少なくとも一部を共有する細胞のことである。いくつかの態様において、ここで使用される場合、「膵臓内分泌前駆体細胞」(「膵臓内分泌前駆体」及び「内分泌前駆体」とも称される)とは、Ｎｇｎ３タンパク質発現細胞であるが、ホルモン発現はせず、膵臓内分泌細胞又は膵臓ホルモン分泌細胞に分化する可能性を有し、通常、これらの細胞の表現型特徴の少なくとも一部を共有する細胞のことである。
【００１７】
いくつかの態様において、ここで使用される場合、「膵臓初期の内分泌細胞」(「初期の内分泌細胞」とも称される)とは、膵臓内分泌ホルモン(インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド)の一つの発現を開始させるが、成人膵臓のランゲルハンス島に見出される、十分に成熟した膵臓内分泌細胞の特徴全てを共有してはいない細胞のことである。いくつかの態様において、ここで使用される場合、「膵臓初期の内分泌細胞」(「初期の内分泌細胞」とも称される)とは、Ｎｇｎ３を活性化するが、成人膵臓のランゲルハンス島に見出される、十分に分化した膵臓内分泌細胞の特徴全て、例えばグルカゴンに対する反応性を共有してはおらず、膵臓内分泌ホルモン(インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及びグレリン)の一つに対してポジティブな内分泌細胞のことである。
【００１８】
いくつかの態様において、ここで交換可能に使用される場合、「膵臓内分泌細胞」、「膵臓ホルモン発現細胞」とは、次のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも一を発現可能な細胞を称する。いくつかの態様において、ここで交換可能に使用される場合、「膵臓内分泌細胞」、又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、次のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及びグレリンの少なくとも一を発現可能な細胞を称する。いくつかの態様において、ここで使用される場合、「膵臓ホルモン分泌細胞」とは、次のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも一を分泌可能な細胞を称する。いくつかの態様において、ここで使用される場合、「膵臓ホルモン分泌細胞」とは、次のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及びグレリンの少なくとも一を分泌可能な細胞を称する。
【００１９】
いくつかの態様において、「膵臓ホルモン発現細胞」及び「膵臓ホルモン分泌細胞」は、初期から十分に分化した表現型までの範囲で、「膵臓内分泌細胞」とみなされる。
ここで使用される場合、「膵臓の十分に分化した内分泌細胞」(「十分に分化した内分泌細胞」、「膵臓の成熟した内分泌細胞」又は「膵臓の成人内分泌細胞」とも称される)とは、成人膵臓のランゲルハンス島に見出される、十分に分化した膵臓内分泌細胞の全ての特徴を共有する細胞のことである。ここで使用される場合、「ベータ細胞系列」とは、転写因子ＰＤＸ１、及び次の転写因子：Ｎｇｎ-３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、ＩｓＩ-１、Ｈｎｆ-３ ベータ、ＭａｆＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の少なくとも一に対して、ポジティブな遺伝子発現を有する細胞を称する。ベータ細胞系列に特徴的な細胞発現マーカーにはベータ細胞が含まれる。
ここで使用される場合、「マーカー」は、関心ある細胞内で、差異的に発現する核酸又はポリペプチド分子である。文中で、差異的発現とは、ポジティブマーカーに対してはレベルの上昇、ネガティブマーカーに対してはレベルの低下を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、関心ある細胞が、当該技術で公知の種々の任意の方法を使用し、同定及び他の細胞と区別できるように、他の細胞と比較して、関心ある細胞内で十分に高い又は低いことである。
【００２０】
本発明の一態様において、膵臓内分泌細胞はインスリン生成細胞である。本発明のいくつかの態様において、膵臓内分泌細胞は、場合によっては、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及び／又はグレリン生成細胞の方向に分化した細胞と共に、インスリン生成細胞である。ここで使用される場合、「インスリン生成細胞」とは、検出可能な量のインスリンを生成又は分泌する細胞を称する。いくつかの態様において、ここで使用される場合、「インスリン生成細胞」とは、検出可能な量のインスリンを生成及び保管又は分泌可能な細胞を称する。「インスリン生成細胞」は、個々の細胞又は細胞の収集物であってよい。
【００２１】
本発明のいくつかの態様において、膵臓ＤＤＲ１＋本発明の方法により得られた細胞  は、管／内分泌前駆体細胞を含む。本発明の他の態様において、膵臓ＤＤＲ１＋本発明の方法により得られた細胞は、内分泌前駆体細胞を含む。本発明のいくつかの態様において、膵臓ＤＤＲ１＋本発明の方法により得られた細胞は、初期の内分泌細胞を含む。本発明のいくつかの態様において、膵臓ＤＤＲ１＋本発明の方法により得られた細胞は、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞を含有する。このような細胞は、１）内分泌細胞内で成熟可能な非分裂細胞、２）成熟前に、制限された回数増殖可能な分裂細胞、３）細胞分割を受け、一つの培養容器から他の容器に継代可能な分裂細胞であってよい。細胞表面マーカーとしてＤＤＲ１を示す膵臓細胞を増殖させるための培養は、検出可能なＤＤＲ１細胞表面発現に加え、インスリン生成膵臓ベータ細胞を含む、成熟した膵臓内分泌細胞に分化可能な、膵臓前駆体細胞の培養と称される。通常、細胞の「継代」は、部分的コンフルエント状態から、コンフルエント状態までの、播種した培養容器の転移状態を称し、それらが培養容器から取り出された時点で、低密度にて、培養容器に再播種される。しかしながら、細胞はコンフルエンスに達する前に継代されてもよい。典型的には、継代により、コンフルエンスに達するまで成長するため、細胞個体群が増殖する結果となる。細胞個体群の増殖は、当初の播種密度に依存するが、典型的には、１〜１０、１〜５、１〜３、又は１〜２回の増殖である。よって、一般的に継代では、培養中に、複数回細胞分裂可能である細胞が必要である。
【００２２】
膵臓細胞を含む細胞個体群
ここで使用される場合、「膵臓細胞を含む細胞個体群」なる用語は、膵臓内分泌前駆体細胞、初期の膵臓内分泌細胞、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン分泌細胞、胎児膵臓細胞、成人膵臓細胞、及び他の非膵臓細胞からなる群から選択される、一又は複数の細胞型を含む細胞個体群を称する。いくつかの態様において、ここで使用される場合、「膵臓細胞を含む細胞個体群」とは、腺房細胞、中心-腺房細胞、管細胞、複数の強力な膵臓前駆体細胞、管／内分泌前駆体細胞、膵臓内分泌前駆体細胞、初期の膵臓内分泌細胞、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン分泌細胞、胎児膵臓細胞、成人膵臓内分泌細胞、及び他の非膵臓細胞からなる群から選択される、一又は複数の細胞型を含む細胞個体群を称する。細胞の「個体群」とは、出発細胞に特定の単離及び培養手順により得られる、複数の細胞を称する。細胞個体群の特性は、一般的に、特定の特性を有する個々の細胞のパーセンテージ(例えば、特定のマーカーでポジティブ染色される細胞のパーセンテージ)、又は全個体群で測定した場合の特性のバルク平均値(例えば、細胞個体群から作製された溶菌液中のｍＲＮＡ量、又はＮｇｎ３、Ｐａｘ６、インスリン又はグルカゴン等、組織化学的マーカーに対してポジティブな細胞のパーセント年齢)により定められる。
【００２３】
本発明の一態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は、胎児膵臓を含む、膵臓から得られる。本発明のいくつかの態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は、胎児膵臓又は成人膵臓を含む、膵臓から得られる。一態様において、膵臓は哺乳動物、例えばヒトからのものである。
【００２４】
本発明の他の態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は体細胞個体群である。本発明のいくつかの態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は、体細胞個体群から得られる。本発明のさらなる態様において、体細胞個体群は、胚様幹(ＥＳ、例えば多能性)細胞への脱分化を誘発する。このような脱分化細胞は、人工多能性幹細胞(ＩＰＳ)とも称される。
さらなる態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は胚性幹(ＥＳ、例えば多能性)細胞である。さらなる態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は、胚性幹(ＥＳ、例えば多能性)細胞から得られる。いくつかの態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は多能性細胞、例えばＥＳ様細胞である。
さらなる態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は、分化した胚幹(ＥＳ又は多能性)細胞である。分化は、胚様体及び／又は単層細胞培養、又はその組合せで生じる。
【００２５】
本発明の一態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は哺乳動物由来のものである。本発明の一態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群はヒト由来のものである。本発明のいくつかの態様において、細胞個体群は、膵臓内分泌系列に向かって分化している。
本発明の一態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は、一又は複数の提供膵臓から得られる。ここに記載された方法は、提供膵臓の年齢に依存しない。従って、胎児から成人の年齢範囲のドナーから単離された膵臓物質を使用することができる。
【００２６】
膵臓がドナーから収集されると、典型的にはプロセシングされて、種々の方法を使用して培養される、個々の細胞又は細胞の小グループが生じる。このような方法では、収集した膵臓組織を、酵素消化用に浄化し、調製することが必要である。収集された組織の実質が膵臓細胞物質のより小さな単位に解離されるように、酵素的プロセシングが使用されて、結合組織が消化される。収集された膵臓組織は一又は複数の酵素で処理され、収集された器官の全体的構造から、膵臓細胞物質、部分構造、及び個々の膵臓細胞が分離される。コラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼ(Liberase)調製物(米国特許第５８３０７４１号及び同５７５３４８５号を参照)、及び他の酵素が、ここに記載の方法に使用されると考えられる。
【００２７】
さらに、単離された原物質は、一又は複数の所望の細胞個体群に富むようにプロセシングすることができる。いくつかの態様において、培養用に解離した未分画の膵臓組織は、さらなる分離をすることなく、本発明の培養方法に直接使用することもできる。しかしながら、培養用に解離した未分画の膵臓組織は、さらなる分離をすることなく、本発明の培養方法に直接使用することができ、中間細胞個体群が生じるであろう。一実施態様において、単離された膵臓細胞物質は、密度勾配を介した遠心分離により精製される(例えば、Nycodenz、Ficoll、又はPercoll）。例えば、米国特許第５７３９０３３号に記載された勾配法は、島において、プロセシングされた膵臓物質を富ませるための手段として使用可能である。ドナー源から収集された細胞混合物は、典型的には異種性であり、よってアルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、管細胞、腺房細胞、通性前駆体細胞、及び他の膵臓細胞型を含有する。
【００２８】
典型的な精製手順により、多くの層又は界面において、単離された細胞物質の分離に至る。典型的には、２つの界面が形成される。上部界面は島に富み、典型的には、懸濁液に１０〜１００％の島細胞を含有する。
第２の界面は、典型的には、島、腺房、及び管細胞を含む細胞の混合個体群である。低層はペレットであり、傾斜の底部に形成される。
この層は、典型的には、主として腺房細胞、いくつかの捕捉された島、及びいくつかの管細胞を含有している。管状樹状成分(ductal tree components)を、さらなるマニピュレ−ション用に、別に収集することもできる。
さらなるマニピュレーション用に選択されたフラクションの細胞支持層は、選択される勾配フラクション、及び各単離の最終結果に応じて変化するであろう。
【００２９】
島細胞が所望の細胞型である場合、単離されたフラクション内で島細胞に適切に富む個体群は、少なくとも１０％〜１００％の島細胞を含有する。他の膵臓細胞型及び濃度も、富化後に収集可能である。例えば、ここに記載の培養方法は、使用される精製勾配に応じて、第２の界面、ペレット、又は他のフラクションから単離された細胞を用いて、使用することができる。
【００３０】
一態様において、中間膵臓細胞培養体は、島に富む(上部)フラクションから作製される。しかしながら、さらに、典型的には、島、腺房、及び管細胞、又は管状樹木成分、腺房細胞、及びいくつかの捕捉された島細胞の混合細胞個体群を含有する、より異種性の第２の界面及び底層フラクションは、それぞれ、培養に使用することができる。双方の層は、ここに記載のＤＤＲ１ポジティブ個体群を生じさせることのできる細胞を含有しており、各層は、開示された方法を用いた使用に対し、特定の利点を有する。
【００３１】
本発明の一態様において、細胞個体群は幹細胞の個体群である。本発明の他の態様において、細胞個体群は、膵臓内分泌系列に向かって分化した幹細胞の個体群である。
幹細胞は、単細胞レベルで、自己再生前駆体、非再生前駆体、及び末端で分化する細胞を含む子孫細胞を生成するために、自己再生し分化するといった、それらの能力により定められる未分化細胞である。また幹細胞は、複数の胚葉(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)から、種々の細胞系列の機能的細胞においてインビトロで分化する、並びに、移植後、複数の胚様組織を生じせしめ、胚胎盤への注射後、全てではないならば、ほとんどの組織に対してかなり寄与する能力により特徴付けられる。
【００３２】
幹細胞は、それらの発育可能性により：(１)全ての胚及び胚外細胞型を生成可能であることを意味する全能性；(２)全ての胚細胞型を生成可能であることを意味する多能性；(３)全てではないが、特定の組織、器官、又は生理学的システムにおける細胞系列のサブセットを生成可能(例えば、造血幹細胞(ＨＳＣ)は、ＨＳＣ(自己再生)、血液細胞制限少能性(oligopotent)前駆体、及び血液の通常の成分である全ての細胞型及び成分(例えば、血小板)を含む子孫を生成可能)であることを意味する多分化能性；(４)多分化能性幹細胞よりもさらに制限された細胞系列のサブセットを生成可能であることを意味する少能性；及び(５)単一の細胞系列(例えば、精子形成幹細胞)のみを生成可能であることを意味する単能性に分類される。
【００３３】
幹細胞から膵臓細胞を得るためのプロトコルは、限定されるものではないが、D'Amour, K. Aら. (2006), Nat Biotechnol 24, 1392-401; Jiang, Jら. (2007), Stem Cells  25, 1940-53;及びKroon, Eら. (2008), Nat Biotechnol, 2008年2月20日, [Epub印刷準備中]により記載されたプロトコルに例証される。
体細胞、又はＥＳ様細胞等、多能性細胞への脱分化が誘発される体細胞から、膵臓細胞を得るためのプロトコルは、限定されるものではないが、Aoi, Tら. (2008), Science, 2008年2月14日, [Epub印刷準備中]; D'Amour, K. Aら. (2006), Nat Biotechnol 24, 1392-401; Jiang, Jら. (2007), Stem Cells 25, 1940-53; Kroon, Eら. (2008), Nat Biotechnol, 2008年2月20日, [Epub印刷準備中]; Takahashi, Kら. (2007), Cell 131, 861-72; Takahashi, K., 及びYamanaka, S. (2006), Cell 126, 663-76; 及びWernig, Mら. (2007), Nature 448, 318-24により記載されたプロトコルに例証される。
【００３４】
分化とは、特定化していない(「非コミット」)、又はあまり特定化していない細胞が、特定化細胞、例えば神経細胞又は筋肉細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した又は分化誘発性細胞は、細胞の系列内のより特定化された(「コミットされた」)位置をとるものである。分化のプロセスに適用される場合、「コミットされる」なる用語は、正常な環境下で、特定の細胞型又は細胞型のサブセットに分化し続け、正常な環境下で、異なる細胞型への分化が不可能であるか、あまり分化していない細胞型への復帰が不可能な分化経路における点まで進行した細胞を意味する。脱分化とは、細胞が、細胞系列内であまり特定化されていない(又は、コミットされていない)位置に復帰するプロセスを称する。ここで使用される場合、細胞の系列は、細胞の遺伝、すなわち細胞がどこから来て、細胞が何を生成するのかを定める。細胞系列を、発育及び分化の遺伝概略図の細胞に配する。系列特異的マーカーは、関心ある細胞系列の表現型に特異的に関連した特徴を称し、関心ある系列の非コミット細胞の分化を評価するのに使用することができる。
【００３５】
いくつかの態様において、ここで使用される場合、「分化する」又は「分化」とは、未熟な状態から、あまり未熟でない状態へと、細胞が発育していくプロセスを称する。他の態様において、ここで使用される場合、「分化する」又は「分化」とは、未分化の状態から分化した状態へ、又は未熟な状態から成熟した状態へと、細胞が発育していくプロセスを称する。一態様において、例えば未分化の膵臓細胞は増殖し、Ｐｄｘ-１等の特徴的マーカーを発現可能である。いくつかの態様において、初期の未分化胚膵臓細胞は増殖し、Ｐｄｘ１等の特徴的マーカーを発現可能である。一態様において、成熟又は分化した膵臓細胞は増殖せず、高レベルの膵臓内分泌ホルモンを分泌しない。いくつかの態様において、成熟又は分化した膵臓細胞は増殖せず、高レベルの膵臓内分泌ホルモン又は消化酵素を分泌しない。一態様において、例えば成熟したベータ細胞は、高レベルでインスリンを分泌する。いくつかの態様において、例えば成熟したベータ細胞は、グルコースに反応して、高レベルでインスリンを分泌する。細胞の相互作用及び成熟における変化は、細胞が未分化細胞のマーカーを失うか、又は分化した細胞のマーカーを獲得するために生じる。一態様において、単一のマーカーの損失又は獲得は、細胞が「成熟又は分化した」ことを示す。いくつかの態様において、単一のマーカーの損失又は獲得は、細胞が「成熟又は十分に分化した」ことを示す。「分化因子」なる用語は、インスリン生成ベータ細胞をも含む、成熟した内分泌細胞へのそれらの分化を高めるために、膵臓細胞に添加される化合物を称する。例示的な分化因子には、肝細胞増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、エキセンディン-４、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、神経成長因子、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、及びグルカゴン様ペプチド１が含まれる。本発明の一態様において、細胞分化は、一又は複数の分化因子を含有する培地において、細胞を培養することを含む。
【００３６】
一態様において、膵臓内分泌系列に特徴的なマーカーは、Ｎｇｎ-３、ＮｅｕｒｏＤ、島−１、Ｐｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、ＭａｆＡ、ＭａｆＢ、Ａｒｘ、Ｂｒｎ４、Ｐａｘ-４、及びＰａｘ-６、Ｇｌｕｔ２、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド(ＰＰ)からなる群から選択される。いくつかの態様において、膵臓内分泌系列に特徴的なマーカーは、Ｎｇｎ-３、ＮｅｕｒｏＤ、島-１、Ｐｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、ＭａｆＡ、ＭａｆＢ、Ａｒｘ、Ｂｒｎ４、Ｐａｘ-４及びＰａｘ-６、Ｇｌｕｔ２、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド(ＰＰ)及びグレリンからなる群から選択される。一実施態様において、膵臓内分泌細胞は、次のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及びＰＰの少なくとも一を発現可能である。いくつかの実施態様において、膵臓内分泌細胞は、次のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、ＰＰ及びグレリンの少なくとも一を発現可能である。本発明での使用に適しているのは、膵臓内分泌系列に特徴的なマーカーの少なくとも一を発現可能な細胞である。本発明の一態様において、膵臓内分泌系列に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。また、膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【００３７】
本発明の一態様において、膵臓内分泌細胞はベータ細胞系列に特徴的なマーカーを発現する細胞である。ベータ細胞系列に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｐｄｘ１、及び次の転写因子：Ｎｇｎ-３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、ＩｓＩ-１、Ｈｎｆ-３ベータ、ＭａｆＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の少なくとも一を発現する。本発明の一態様において、ベータ細胞系列に特徴的なマーカーを発現する細胞はベータ細胞である。本発明の一態様において、膵臓内分泌細胞は、マーカーＮｋｘ６．１を発現する細胞である。本発明の他の態様において、膵臓内分泌細胞はマーカーＰｄｘ１を発現する細胞である。本発明のさらなる態様において、膵臓内分泌細胞はマーカーＮｋｘ６．１及びＰｄｘ１を発現する細胞である。
【００３８】
ここで使用される場合、「Ｐｄｘ１」とは、膵臓発育に係るホメオドメイン転写因子を称する。一態様において、ここで使用される場合、「Ｐａｘ-４」はベータ細胞に特異的な因子であり、ここで使用される場合、「Ｐａｘ-６」は膵島細胞(に特異的な)転写因子であり；双方とも、島発育に関連している。いくつかの態様において、ここで使用される場合、「Ｐａｘ-４」はベータ細胞に特異的な因子であり、ここで使用される場合、「Ｐａｘ-６」は膵島細胞に特異的な転写因子であり；双方とも、島発育に関連している。「Ｈｎｆ-ベータ」は、転写因子の肝臓の核内因子に属し、高度に保存されたＤＮＡ結合ドメインと２つの短いカルボキシ末端ドメインにより特徴付けられる。また、「Ｈｎｆ-３ベータ」は「ＦｏｘＡ２」としても公知である。ここで使用される場合、「ＮｅｕｒｏＤ」は、神経発生に係る塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス(ｂＨＬＨ)転写因子である。ここで使用される場合、「Ｎｇｎ-３」は、塩基ループ-ヘリックス-ループ転写因子のニューロゲンファミリーのメンバーである。ここで使用される場合、「Ｎｋｘ-２．２」及び「Ｎｋｘ-６．１」は、Ｎｋｘ転写因子ファミリーのメンバーである。ここで使用される場合、「島-１」又は「ＩｓＩ-１」は、転写因子のＬＩＭ／ホメオドメインファミリーのメンバーであり、発育している膵臓において発現する。ここで使用される場合、「ＭａｆＡ」は、膵臓で発現する転写因子であり、インスリンの生合成及び分泌に係る遺伝子の発現をコントロールする。
【００３９】
Ｎｋｘ６．１及びＰｄｘ１は、成人膵臓で見出される全ての細胞型(例えば、腺房、管、及び内分泌細胞)で発育可能な初期の膵臓多分化能性細胞において、Ｐｔｆ１ａと共に同時発現する。この細胞個体群において、Ｎｇｎ３を一時的に発現する細胞個体群が見出された。細胞がＮｇｎ３を発現又は発現していると、それは、後にランゲルハンス島を形成する、内分泌細胞(一つのタイプはインスリン生成ベータ細胞である)を生成する、内分泌系列の一部である。Ｎｇｎ３が存在しないと、膵臓発育中に、内分泌細胞は形成されない。発育進行時、Ｎｋｘ６．１及びＰｄｘ１は、今はＰｔｆ１ａ発現を欠く、膵臓のさらに中央のドメインにおいて同時発現し、Ｎｋｘ６．１及びＰｄｘ１ポジティブ細胞は、もはや腺房細胞を生成できない。このＮｋｘ６．１及びＰｄｘ１ポジティブ細胞個体群において、有意な数の細胞が、一過性にＮｇｎ３を同時発現し、発生の初期におけるように内分泌系列に対してそれらをマークする。
【００４０】
ＤＤＲ１
ここで使用される場合、「ＤＤＲ１タンパク質」又は「Ｄｄｒ１タンパク質」とは、ＤＤＲ／ＴＫＴ型タンパク質キナーゼ、ジスコイジンドメインレセプターファミリー、メンバー１を称する。ここで使用される場合、本用語は、全てが大文字で書かれている「ＤＤＲ１」、又は最初の文字のみが大文字である「Ｄｄｒ１」があってよく、ヒト及びマウスを含む任意の哺乳動物からの、ジスコイジンドメインレセプターファミリー、メンバー１を意味する。いくつかの態様においては、マウス又はラット等の哺乳動物からのＤＤＲ１が、本発明での使用を考慮される。いくつかの態様においては、ニワトリ等の脊椎動物からのＤＤＲ１が、本発明での使用を考慮される。ＤＤＲ１はＩ型からＩＶ型までを含む、色々なタイプのコラーゲンにより活性化される。ＤＤＲ１タンパク質にコラーゲンが結合すると自己リン酸化し、チロシンキナーゼの活性化が遅延化するが、持続的になる。ＤＤＲ１は細胞対細胞の相互作用、又は認識においても機能する。８７６、９１３及び９１９アミノ酸の異なるタンパク質アイソフォームに帰する、少なくとも３つのｍＲＮＡ変異体が、ヒトにおいては報告されている。マウスには２つのアイソフォーム、それぞれ８７４及び９１１アミノ酸が報告されている。ＤＤＲ１タンパク質は、ヒトの乳房、卵巣、食道、及び小児脳腫瘍で過剰発現することが示されている。タンパク質は細胞内レセプターチロシンキナーゼ活性を有し、種々のタイプのコラーゲンにより活性化される。その自己リン酸化は、今までテストされた全てのコラーゲン(Ｉ型からＶＩ及びＸＩ型)でなされている。
【００４１】
いくつかの態様において、用語「ＤＤＲ１タンパク質」は、７０、例えば８０、８５、９０、９２、９４パーセント同一のタンパク質を含む。いくつかの態様において、用語  ＤＤＲ１タンパク質は、９５、例えば９６、９７、９８又は９９パーセント同一のタンパク質を含む。パーセント同一性は、２つの配列を整列させ、整列した同一残基の数から異なる残基の数を引き、さらに長い配列の全残基数で割り、１００を掛けることで決定される。
【００４２】
ここで使用される場合、「ヒトＤＤＲ１タンパク質」は、位置３０．９９-３１．０１Ｍｂの染色体ｃ６＿ＣＯＸ＿、又は位置６ｐ２１．３の染色体６において、自然に生じる。ヒトＤＤＲ１タンパク質アイソフォームａは、ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿０５４６９９．２を有する。ヒトＤＤＲ１タンパク質アイソフォームｂは、ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿００１９４５．３を有する。ヒトＤＤＲ１タンパク質アイソフォームｃは、ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿０５４７００．２を有する。
【００４３】
ここで使用される場合、「マウスＤｄｒ１タンパク質」は、位置３５．２９-３５．３１  Ｍｂ又は１７Ｃ；１７ ２１．５ｃＭの染色体１７において自然に生じる。マウスＤＤＲ１タンパク質アイソフォーム１は、ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿０３１６１０．２を有する。マウスＤＤＲ１タンパク質アイソフォーム２は、ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿７６６５５０．１を有する。
【００４４】
用語「アイソフォーム」及び「アイソタイプ」は、ここでは交換可能に使用され、例えば単一のヌクレオチド多型を故に、形成された同じタンパク質の異なる形態を称し、ここで異なる形態のタンパク質は、関連遺伝子から生成されてもよいし、スプライシングにより同じ遺伝子から生じたものであってもよい。ここで使用される場合、用語「ＤＤＲ１結合試薬」とは、ＤＤＲ１タンパク質、又はＤＤＲ１タンパク質に共有結合する分子に特異的に結合する化合物、例えば抗体、その抗体フラグメント、分子から誘導された合成抗体、ＤＤＲ１結合抗体(例えば、合成分子は、ｓｃＦＶ、多重特異性抗体等であってよい)からのＣＤＲを含むもの、レクチン、及びコラーゲンタイプ又はそのフラグメントを称する。
【００４５】
一態様において、ＤＤＲ１結合試薬は、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体である。一態様において、ＤＤＲ１結合試薬は、ＤＤＲ１タンパク質に転写後結合する、天然の炭水化物に特異的に結合する抗体であり；実施例１に示すように、炭水化物は、ＤＤＲ１アミノ酸配列の多くの特定部位に出現しやすいようである。他の態様において、ＤＤＲ１結合試薬は、ＤＤＲ１タンパク質に結合する天然の炭水化物構造体に特異的に結合するレクチンである。他の対応において、ＤＤＲ１結合試薬は、ＤＤＲ１タンパク質のリガンドである。さらなる実施態様において、リガンドは、コラーゲンＩ-ＸＩ、トランスサイレチン、膜貫通４サブファミリー、メンバー１(ＴＭ４ＳＦ１)からなる群から選択される。他の態様において、ＤＤＲ１結合試薬は、細胞膜の細胞外又は細胞内側において、ＤＤＲ１と相互作用する、無毒の蛍光標識された分子である。「ＤＤＲ１に結合するオリゴ糖」は、ＤＤＲ１タンパク質に共有結合する多糖類分子である。好ましい実施態様において、オリゴ糖はアルギニン残基を介して結合している。用語「レクチン」は、特定の炭水化物分子を認識するタンパク質を称する。好ましい実施態様において、炭水化物は、ＤＤＲ１タンパク質分子に結合するオリゴ糖の全て又は一部である。「リガンド」は、タンパク質により特異的に結合する分子である。また、本用語は、タンパク質に結合する分子、例えばタンパク質に特異的に結合する抗体も含む。いくつかの態様において、リガンドは、タンパク質に共有結合する分子、例えば炭水化物又はオリゴ糖に結合する。
【００４６】
好ましい実施態様において、ＤＤＲ１結合試薬は、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体である。また、用語「ＤＤＲ１結合試薬」は、ＤＤＲ１タンパク質により特異的に結合する化合物、例えばコラーゲン及びコラーゲンフラグメントを含む。本用語は、抗体及びそのフラグメント、並びにいくつかの種の成分からなるキメラ抗体、さらには完全に合成された抗体様分子、例えばｓｃＦＶ、及び抗体との結合特異性を有する他の合成分子を含む(自然に生じるＣＤＲ配列を含む結果として)。
ＤＤＲ１結合試薬は、細胞表面マーカーとして、ＤＤＲ１タンパク質を発現する細胞の同定又は選択に使用される。
【００４７】
「細胞表面マーカーとしてＤＤＲ１を示す」細胞は、ここに記載のＤＤＲ１に特異的に結合する試薬、及び方法、例えばＦＡＣＳ、免疫細胞化学、免疫吸着、及びパニングを使用し、細胞個体群から細胞を選択又は取り出し可能な、細胞表面に十分な量のＤＤＲ１を示す細胞である。いくつかの態様において、本方法はＭＡＣＳである。好ましい実施態様において、ＤＤＲ１抗体は、「細胞表面マーカーとしてＤＤＲ１を示す」細胞を選択するのに使用される。
一態様において、ＤＤＲ１結合試薬は、蛍光染料、例えばＰＥ、ｃｙ２、ｃｙ３、ｃｙ５、又はＡｌｅｘａ４８８から選択されるもので標識される。他の態様において、ＤＤＲ１結合試薬は、ハプテン、例えばＤＩＧ、ビオチン、エピトープ、例えばＦＬＡＧ、ＨＡ、又はＭｙｃで標識される。
【００４８】
同定方法
いくつかの態様において、本発明は、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞を同定する方法に関し、該方法は、膵臓細胞を含む細胞個体群とＤＤＲ１結合試薬とを接触させることを含む。さらなる態様においては、ＤＤＲ１結合試薬に結合する細胞、すなわちＤＤＲ１ポジティブ細胞の数／比率が測定されてよい。いくつかの態様において、本発明は、膵臓管／内分泌前駆体細胞を同定する方法に関し、該方法は、膵臓細胞を含む細胞個体群とＤＤＲ１結合試薬とを接触させることを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌前駆体細胞を同定する方法に関し、該方法は、膵臓細胞を含む細胞個体群とＤＤＲ１結合試薬とを接触させることを含む。いくつかの態様において、本発明は、初期の内分泌細胞を同定する方法に関し、該方法は、膵臓細胞を含む細胞個体群とＤＤＲ１結合試薬とを接触させることを含む。
【００４９】
いくつかの態様において、本発明は、ａ）細胞とＤＤＲ１結合試薬とを接触させ；ｂ）細胞表面マーカーとしてＤＤＲ１を示す細胞(ＤＤＲ１ポジティブ細胞)の量を測定することによる、膵臓細胞を含むＤＤＲ１ポジティブ細胞を定量する方法に関する。
【００５０】
当業者であれば、ＤＤＲ１タンパク質を検出するための多くの方法があることを認識しているであろう。例えば、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体を、ＤＤＲ１の検出に使用することができる。ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体は、当業者に公知であり、例えば、R&D Systems、Research Diagnostics, Inc； Abcam；Ancell Immunology Research Products；eBioscience；アイオワ大学のハイブリドーマバンク；及びZymed Laboratories, Inc.、Abnova Corporation、-Affinity BioReagents BioLegend、GeneTex Lifespan Biosciences、MBL International Novus Biologicals、Proteintech Group, Inc、Santa Cruz Biotechnology, Incから商業的に入手可能である。ＤＤＲ１の細胞外部分を認識する抗体は、細胞を選別するために、本発明で使用されてよい。いくつかの態様において、ＤＤＲ１の細胞外部分の種々のエピトープを認識する種々の抗体は、単独で又は組合せて使用されてよい。細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインにおける、ＤＤＲ１の任意の部分を認識可能な任意のＤＤＲ１結合試薬が、ＤＤＲ１の発現をモニターするのに使用可能である。いくつかの態様において、当業者であれば、ＤＤＲ１タンパク質の検出に関する上述した記載が、本発明のマーカーとして使用されると考えられる他の細胞外タンパク質にも適用されるであろうと、自覚している。
【００５１】
多くの異なる蛍光分子、例えばフルオレセイン、ｃｙ２、ｃｙ３、ｃｙ５、ＰＥ、Ａｌｅｘａ４８８、又はローダミンが、抗体とのコンジュゲートに利用される。当業者であれば、いくつかの例において、１以上の細胞外マーカーが、蛍光分子にコンジュゲートする種々の抗体を使用することにより検出可能であることを承知している。ＦＡＣＳ分析は、関心ある１以上の胞外マーカーを同定する条件下で、実施することができる。
【００５２】
「抗体」又は「抗体群」は、抗原に特異的に結合し、認識する、免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントからのフレームワーク領域を有するポリペプチドを称する。抗体(免疫グロブリンとしても公知)は、脊椎動物の血液又は他の体液に見出され、細菌又はウイルス等の、外来体を同定し、中和する免疫システムに使用されるタンパク質である。全ての抗体の一般的構造はかなり類似しているが、タンパク質の先端の小さな領域は、極めて多様であり、わずかに異なる先端構造を有する数百万の抗体の存在が可能になる。この領域は高頻度可変領域として知られている。これらの各変異体は、抗原として公知の種々の標的に結合可能である。この非常に多様な抗体により、等しく多様な抗原を認識する免疫系が可能となる。抗体により認識される、抗原の唯一の部分は、エピトープと称される。これらのエピトープは、高度に特異的な相互作用において、それらの抗体と結合し、いわゆる固定が誘発され、抗体は、生物体を構成する数百万の種々の分子の中から、唯一特定の抗原を同定し、結合することができるようになる。
【００５３】
培養された、又は単離された細胞における、タンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術で標準的なものであり、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)、ノーザンブロット法、及びインサイツハイブリダイゼーション(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら編、補足)を参照)、及びイムノアッセイ、例えば切片物質の免疫組織化学分析、ウエスタンブロット法、、及び無傷抗体で使用しやすいマーカーについては、フローサイトメトリー分析(ＦＡＣＳ)(例えば、Harlow及びLane, Using Antibodies : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)を参照）が含まれる。一態様において、核酸マーカーはｍＲＮＡである。また、内分泌細胞分化の、従来からの組織化学マーカーを使用してもよい。免疫組織化学により研究される細胞は、顕微鏡検査用のガラスチャンバースライドにおいて培養されてよい。また、従来からの組織培養で増殖した細胞は、培養体から手動で取り出され、切片化用にパラフィンに包埋されてよい。また、従来からの組織培養で増殖した細胞は、手動で、酵素的に、又は酵素を含有しない細胞解離バッファーを使用して、培養体から取り出され、切片化用にパラフィン又はTissueTechに包埋されるか、包埋の前に、媒体において再度インキュベートされてもよい。細胞分化マーカーは多様であり、従来からの免疫組織化学で検出することができる。一般的に適用されるプロトコルは以下の通りである。
【００５４】
いくつかの態様において、チャンバースライド内の細胞を、ＰＢＳを用いて、非常に優しくすすぎ、４％のパラホルムアルデヒド溶液において、４５分、固定する。ついで、細胞をＰＢＳですすぎ、使用するまで、＋５で保管する。使用する日、細胞を、等級付けされたシリーズのエタノール(７０％から出発して、９６％、ついで９９％、ついで再度９９％、ついで９６％、最後に７０％、各濃度で５分のインキュベートを使用)に浸透させ、ついで室温にて、ＴＮＢ(Perkin ElmerからのＴＳＡ(チラミド(Tyramide)シグナル増幅)キット又は正常な血清を含有するブロックバッファーにおいてインキュベートする。一次抗体を適切な希釈度に調製し、細胞に添加し、保湿チャンバー内で、室温(ＲＴ)にて一晩(Ｏ／Ｎ)インキュベートする。一次抗体のインキュベートに続き、細胞をＰＢＳですすぐ。適切な希釈度に調製された蛍光二次抗体を細胞に添加し、暗所でインキュベートする。細胞核を対比染色するために、二次抗体と共にＤＡＰＩ染料をインキュベートしてもよい。ついで、細胞をすすぎ、過度の流体を除去し、スライドのチャンバー部分を取り除き、スライドにカバーガラスを載せる。スライドを乾燥させ、蛍光顕微鏡、例えば共焦点顕微鏡を使用する研究まで、暗所で保管する。いくつかの態様では、染色方法は、スライドのチャンバー部分を取り除いてから始められる。バッファーを用いて、細胞を非常に優しくすすぎ、パラホルムアルデヒド溶液において固定する。ついで、細胞を、室温にて、正常な血清を含有するブロック溶液においてインキュベートする。ブロック溶液において、非イオン性の洗浄剤を用い、細胞を浸透させる。一次抗体を適切な希釈度に調製し、細胞に添加し、インキュベートする。一次抗体のインキュベートに続き、細胞をバッファーですすぐ。適切な希釈度に調製された二次抗体を細胞に添加し、暗所でインキュベートする。インキュベートの後、細胞をすすぎ、Hoechst染料を使用して、核を対比染色する。過度の流体を除去し、スライドを搭載し、カバースライドで覆う。別法として、過度の流体を除去し、スライドを搭載し、カバーガラスで覆う。スライドを乾燥させ、暗所で保管する。
【００５５】
また、ＨＲＰ法を使用し、細胞を、免疫細胞化学用に調製することもできる。簡単には、細胞をパラフィンに包埋し、パラフィン切片とスライドを、３７℃で一晩、乾燥させるものである。細胞を脱パラフィンし、過酸化水素水に浸漬し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害する。０．０１のクエン酸バッファー(ｐＨ６．０)で１５分、スライドをゆで、所定のエピトープを回復させる。スライドをバッファーですすぎ、保湿チャンバー内で、室温にて、正常な血清を使用してブロックする。
【００５６】
いくつかの態様においては、一次抗体をサンプルに添加し、保湿チャンバー内でインキュベートする。スライドを洗浄し、ビオチン-二次抗体と共にインキュベートする。スライドをバッファーで再度すすぎ、アビジン-ＨＲＰと共にインキュベートする。スライドを再度すすぎ、ＴＳＡ試薬と共にインキュベートし、一次抗体を可視化する。いくつかの態様において、ＴＳＡは、チラミドシグナル増幅の略語である。スライドを表示用に搭載する。
【００５７】
また、ＨＲＰ(西洋ワサビペルオキシダーゼ)法を使用し、細胞を、免疫細胞化学用に調製することもできる。二次抗体として、ビオチン結合したものを使用する。ついで、スライドをＰＢＳですすぎ、アビジン-ＨＲＰと共にインキュベートする。スライドを再度すすぎ、ＴＳＡ試薬と共にインキュベートし、一次抗体を可視化する。蛍光顕微鏡、例えば共焦点顕微鏡を使用し、スライドを視覚的研究用に搭載する。いくつかの態様において、展開を、色素原試薬、例えばＡＥＣを使用して実施してもよい。いくつかの態様において、展開を、従来からの光学顕微鏡により可視化してもよい。
【００５８】
組織切片におけるタンパク質を同定するために、組織を４％のＰＦＡ(パラホルムアルデヒド)Ｏ／Ｎで固定し、ついて３０％のスクロースＯ／Ｎで凍結保護し、TissueTechに包埋する。ついで、切片を凍結状態で切断し、ＰＢＳ(リン酸緩衝食塩水)ですすぎ、０．０１Ｍのクエン酸バッファー(ｐＨ６．０)において１５分、マイクロ波処理し、エピトープを回復させる。ついで、このような切片は、上述した方法のいずれかを使用して染色可能であるが、等級付けされたエタノール処理は除く。ＨＲＰベースアッセイを使用するケースにおいては、過酸化水素水を使用し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害する。いくつかの態様においては、ついで、例えばパラフィン切片を使用する場合は、切片をミクロトームで切断する。
【００５９】
分析用ＦＡＣＳ選別を、生存している細胞、又はリリー固定液(Lillys fixative)において４５分、固定化された細胞において実施する。上清を除去するために、１０ｍｌのｖ-チューブにおいて、室温で５分、１３００ｒｐｍにより、細胞をペレット化する。ついで、この細胞を、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳにおいて洗浄する。固定された細胞用：細胞を、二次抗体が生じた動物から、１０％血清(最終濃度)に達するまで、血清を添加することにより細胞をブロックし、１時間ブロックしておく。ついで、細胞をペレット状にし、上清を除去する。一次抗体の溶液を添加し、室温、Ｏ／Ｎでインキュベートする。次の日、細胞を１０ｍｌのｖ-チューブにおいて２ｘ５分洗浄する。二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートする。細胞を、１０ｍｌのｖ-チューブにおいて、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳにて、２ｘ５分洗浄する。最後に、細胞をＦＡＣＳでアッセイする。生存細胞：一次抗体の溶液を添加し、４℃で１時間インキュベートする。細胞を１０ｍｌのｖ-チューブにおいて２ｘ５分洗浄する。二次抗体を添加し、４℃で３０分インキュベートする。細胞を、１０ｍｌのｖ-チューブにおいて、０．１％のＢＳＡと共にＰＢＳにて、２ｘ５分洗浄する。最後に、細胞をＦＡＣＳでアッセイする。
【００６０】
管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞の同定は、細胞個体群とＤＤＲ１結合試薬とを接触させ、染色を評価することにより達成され得る。特定の実施態様において、内分泌前駆体細胞の同定は、細胞個体群とＤＤＲ１結合試薬とを接触させ、染色を評価することにより達成され得る。他の特定の実施態様において、内分泌前駆体細胞の同定は、細胞個体群とＤＤＲ１結合試薬とを接触させ、染色を評価することにより達成され得る。この分析は、蛍光標識細胞分取(ＦＡＣＳ）、免疫組織化学(ＩＨＣ）、ウエスタンブロット法、ＰＣＲ、又はＥＬＩＳＡ等の方法を使用して実施されてよい。
【００６１】
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の方法により得られた管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される、単離された細胞に関する。いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の方法により得られた、単離された内分泌前駆体細胞に関する。さらなる態様において、単離された細胞は内分泌前駆体細胞である。いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の方法により得られた、単離された内分泌前駆体細胞に関する。
【００６２】
いくつかの態様において、本発明は、細胞表面マーカーとしての、ＤＤＲ１タンパク質を発現する細胞を同定又は選択するための、ＤＤＲ１結合試薬の使用に関する。いくつかの態様において、本発明は、膵臓内分泌細胞の培養体を得るための、細胞表面マーカーとしての、ＤＤＲ１タンパク質の使用に関する。さらなる態様において、一又は複数のさらなる細胞表面マーカーは、膵臓内分泌細胞の培養体を得るために、同時に又は逐次使用される。さらなる態様において、さらなる細胞表面マーカーは、プロミニン(prominin)１(ＣＤ１３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆからなる群から選択される。
【００６３】
分離方法
いくつかの態様において、本発明は、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の培養体を得る方法に関し、該方法は、ＤＤＲ１結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＤＲ１結合試薬と結合しない細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞のフラクション中の、ＤＤＲ１結合試薬と結合した細胞を分離することを含む。いくつかの態様において、本発明は、培養体を得る方法に関し、該方法は、ＤＤＲ１結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＤＲ１結合試薬と結合しない細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞のフラクション中の、ＤＤＲ１結合試薬と結合した細胞を分離することを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌前駆体細胞を含む培養体を得る方法に関し、該方法は、ＤＤＲ１結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＤＲ１結合試薬と結合しない細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞のフラクション中の、ＤＤＲ１結合試薬と結合した細胞を分離することを含む。
【００６４】
いくつかの態様において、分離工程は、蛍光標識細胞分取(ＦＡＣＳ)によりなされる。他の態様において、分離工程は、パニングによりなされる。いくつかの態様において、分離工程は、磁気活性化細胞分取(ＭＡＣＳ)によりなされる。
【００６５】
ＤＤＲ１に特異的に結合する蛍光標識された分子、最も一般的には、抗体は、蛍光標識細胞分取(ＦＡＣＳ)と併せて、ＤＤＲ１ポジティブ細胞を選択するのに使用される。簡単には、一態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は、蛍光標識された抗体と共にインキュベートされ、抗体結合後に、細胞がＦＡＣＳにより分析される。細胞選別機は、液体に懸濁した単細胞を、蛍光光度計に通過させる。蛍光量を測定し、対照となる未標識の細胞よりも検出的に高い蛍光レベルを有する細胞を、ポジティブ細胞として選択する。
【００６６】
また、ＦＡＣＳは、蛍光を測定することに基づき、細胞個体群を物理的に分離するために使用することもできる。流れる細胞は、その強度及び方向が蛍光シグナルの測定される強度に応じて変化する電磁場により偏向する。標識されたＤＤＲ１ポジティブ細胞は分離容器において偏向可能で、よって未標識のＤＤＲ１ネガティブ細胞から分離される。
【００６７】
膵臓細胞を含む細胞個体群が膵臓から単離される態様において、細胞は、まず一又は複数の継代用に培養され、ＤＤＲ１特異的抗体で標識される。ついで、細胞はＦＡＣＳを使用してスキャニングされ、ＤＤＲ１ネガティブ細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞が分離される。この例では、標識された抗体を用いたＦＡＣＳ分析を論議しているが、ＤＤＲ１に特異的に結合する他の分子、例えばレクチン及びコラーゲン、及び他のＤＤＲ１結合パートナー、例えば上述にて列挙したものを、本発明の実施に使用することができる。
【００６８】
他の態様において、ＤＤＲ１ネガティブ細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞を分離する方法は、固体状支持体に、ＤＤＲ１ポジティブ細胞を親和吸着させることによりなされる。
また、ＤＤＲ１ポジティブ細胞は、固体状支持体に結合し、ＤＤＲ１に特異的に結合する分子を使用することにより、ＤＤＲ１ネガティブ細胞から分離することができる。当業者であれば、ＤＤＲ１特異的抗体が、抗体結合分子、例えばプロテインＧ又はプロテインＡを介して、固体状支持体に結合可能であり、又は固体状支持体に直接コンジュゲート可能であることを認識しているであろう。ＤＤＲ１抗体が結合した固体状支持体は、例えばStem Cell Technologiesから、磁気ビーズであるStemSep及びEasySepTMを、商業的に入手可能である。分離工程は、磁気活性化細胞分取(ＭＡＣＳ)を使用して、実施されてよい。
【００６９】
さらに、ＤＤＲ１ポジティブ細胞は、パニング技術を介して、ＤＤＲ１ネガティブ細胞から分離することもできる。パニングは、ＤＤＲ１結合試薬で固体状支持体を被覆し、適切な条件下、適切な時間、表面で膵臓細胞をインキュベートすることによりなされる。平坦面、例えば培養皿は、ＤＤＲ１結合試薬で被覆される。
膵臓細胞は表面に添加され、ＤＤＲ１結合試薬との結合が可能になる。
ついで、培養皿が洗浄され、皿からＤＤＲ１ネガティブ細胞が除去される。好ましい実施態様において、ＤＤＲ１特異的抗体は、膵臓細胞個体群において、ＤＤＲ１ポジティブ細胞用の培養皿及び「パン」を被覆するために使用される。
【００７０】
一態様において、細胞は、Ｐｔｐｒｎ／ＩＡ２-ポジティブ及びＰｔｐｒｎ-ネガティブ細胞に細胞を分離することにより、ＤＤＲ１による選択の前後に精製されてもよい。他の態様において、細胞は、Ａｂｃｃ８／Ｓｕｒ１-ポジティブ及びＡｂｃｃ８／Ｓｕｒ１-ネガティブ細胞に分離されてもよい。他の態様において、細胞は、(Ｇｌｕｔ２又はＧｌｕｔ１)-ポジティブ及び(Ｇｌｕｔ２又はＧｌｕｔ１)-ネガティブ細胞に分離されてもよい。他の態様において、細胞は、Ｓｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８-ポジティブ及びＳｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８-ネガティブ細胞に分離されてもよい。
【００７１】
それで、本発明は、膵臓細胞を含む細胞個体群が、Ｐｔｐｒｎ-ポジティブフラクション及び／又はＡｂｃｃ８-ポジティブフラクション及び／又はＧｌｕｔ-２／１-ポジティブフラクション及び／又はＳｌｃ３０ａ８-ポジティブフラクションである実施態様を含む。また、本発明の方法により得られた膵臓内分泌細胞の培養体は、さらにＰｔｐｒｎ-ポジティブ／ネガティブフラクション及び／又はＡｂｃｂ９-ポジティブ／ネガティブフラクション及び／又はＧｌｕｔ-２／１-ポジティブ／ネガティブフラクション及び／又はＳｌｃ３０ａ８-ポジティブ／ネガティブフラクションに分離されてもよい。
当業者であれば、ＤＤＲ１についてはっきりと提示されてはいるが、分離方法に関して上述した部分の詳細は、他の細胞外タンパク質に適用されてもよいことは理解しているであろう。こような細胞外タンパク質には、ＤＤＲ１、プロミニン１(ＣＤ３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆからなる群から選択されるタンパク質が含まれる。
【００７２】
ベータ細胞への胚性幹(ＥＳ)細胞の分化中、他の細胞型、例えば神経細胞、及び非膵臓内胚葉が生成されることが予期される。ＥＳ細胞は、アクチビンＡにより内胚葉細胞、ついで膵臓細胞に分化可能である。膵臓の運命が獲得されたならば、望ましい細胞を単離することができる。ついで、場合によっては一又は複数の付加的なマーカーと組合せて、ＤＤＲ１は、細胞の所望するサブセットを単離するためのマーカーとして使用することができる。また、ＤＤＲ１結合試薬は、膵臓細胞以外の他の内胚葉細胞にも結合する。ＤＤＲ１結合試薬は、膵臓細胞に加えて、食道から前胃、及び小腸の内分泌細胞に結合するであろう。ＤＤＲ１結合試薬は、分化した神経細胞には結合しない。
【００７３】
同定、富化、及び／又は選択のための種々の方法が、例えば以下の実施例のように利用できる：膵臓内胚葉を含む確定的内胚葉への分化が誘導されたＥＳ細胞に、ＤＤＲ１＋細胞を単離するためのマーカーとしてのＤＤＲ１を使用することができる。この工程により、管／内分泌前駆体細胞、膵臓内分泌前駆体細胞、及び／又は膵臓の初期の内分泌前駆体細胞と命名される細胞のＥＳ-誘導プールの直接単離ができるようになる。さらに、このような細胞のインビトロで媒介される分化において、例えばマーカーとしての、Ｐｔｐｒｎ／ＩＡ２-、Ａｂｃｃ８／Ｓｕｒ１-、又はＳｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８-ポジティブ細胞の二次的使用を、初期及び十分に分化した内分泌細胞を単離させるのに使用することができる。
【００７４】
本発明のいくつかの態様において、場合によっては、及び／又は付加的なマーカーと組合せて、マーカーとしてＤＤＲ１を使用することで、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞を、低比率、例えば２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満の他の細胞型と共に含む、又は他の細胞型、例えば、膵臓細胞以外の内胚葉細胞を含まない細胞個体群が提供される。
【００７５】
一実施態様において、実質的には他の細胞型を含まない、膵臓内分泌細胞を含有する組成物が、生成されてよい。いくつかの実施態様においては、実質的には他の細胞型を含まない、膵臓管／内分泌前駆体細胞、膵臓内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞を含有する組成物が、生成されてよい。いくつかの実施態様において、実質的には他の細胞型を含まない、膵臓内分泌前駆体細胞を含有する組成物が、生成されてよい。いくつかの実施態様において、実質的には他の細胞型を含まない、膵臓内分泌前駆体細胞を含有する組成物が、生成されてよい。本発明のいくつかの態様において、表現「実質的に含まない」は、細胞培養体又は細胞個体群が、細胞の全数に対して、膵臓管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞及び十分に分化した内分泌細胞と比べて、他の細胞型を２０％少なく含有することと理解される。本発明のいくつかの態様において、表現「実質的に含まない」は、細胞培養体又は細胞個体群が、細胞の全数に対して、膵臓管／内分泌前駆体細胞より、他の細胞型を２０％少なく含有することと理解される。本発明のいくつかの態様において、表現「実質的に含まない」は、細胞培養体又は細胞個体群が、細胞の全数に対して、膵臓内分泌前駆体細胞より、他の細胞型を２０％少なく含有することと理解される。本発明のいくつかの態様において、表現「実質的に含まない」は、細胞培養体又は細胞個体群が、細胞の全数に対して、膵臓の初期の内分泌細胞より、他の細胞型を２０％少なく含有することと理解される。
【００７６】
いくつかの実施態様において、本発明は、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞及び／又は十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の管／内分泌前駆体細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の内分泌前駆体細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の初期の内分泌細胞からなる方法に関する。
【００７７】
いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉由来であり、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞及び／又は十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉由来であり、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の管／内分泌前駆体細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉由来であり、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の内分泌前駆体細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉由来であり、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の初期の内分泌細胞からなる方法に関する。
【００７８】
いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉及び／又は神経由来の細胞を含み、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞及び／又は十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉及び／又は神経由来の細胞を含み、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の管／内分泌前駆体細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉及び／又は神経由来の細胞を含み、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の内分泌前駆体細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉及び／又は神経由来の細胞を含み、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉又は神経由来の細胞を含む場合、ＤＤＲ１結合試薬が、一又は複数の付加的な結合試薬と組合せて、同時に又は逐次使用され、ここで出発細胞個体群が内胚葉及び／又は神経由来の細胞を含む方法に関する。本発明のいくつかの実施態様において、付加的な結合試薬は、プロミニン１(ＣＤ１３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆ結合試薬からなる群から選択される。
【００７９】
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法により得られた、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される、単離された細胞に関する。いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法により得られた、単離された管／内分泌前駆体細胞に関する。いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法に定められた方法により得られた、単離された内分泌前駆体細胞に関する。いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法に定められた方法により得られた、単離された初期の内分泌細胞に関する。いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法に定められた方法により得られた、単離され、十分に分化した内分泌細胞に関する。
【００８０】
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法に定められた方法により得られた、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群からの一又は複数の細胞から選択される、単離された細胞を含有する組成物に関する。いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法に定められた方法により得られた、単離された内分泌前駆体細胞を含有する組成物に関する。いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法に定められた方法により得られた、単離され、十分に分化した内分泌細胞を含有する組成物に関する。
【００８１】
細胞分化マーカー
いくつかの態様において、本発明は、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含有する細胞培養体を得る方法に関し、該方法は：ここに記載の方法に従い、精製された細胞を得、ついで、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞において、膵臓細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、本発明は、管／内分泌前駆体細胞を含有する培養体を得る方法に関し、該方法は：上述した方法に従い、精製された細胞を得、ついで、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞において、膵臓細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌前駆体細胞を含有する培養体を得る方法に関し、該方法は：ここに記載の方法に従い、精製された細胞を得、ついで、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞において、膵臓細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。
【００８２】
膵臓細胞個体群を同定するのに使用可能な、多くの細胞マーカーが存在する。単離され、培養されたドナーー細胞は、分化した膵臓細胞の種々の表現型及び遺伝子型の兆候を示し始める。表現型及び遺伝子型の兆候の例には、調節された(例えば、アップレギュレーション又はダウンレギュレーション)通性前駆体細胞個体群に存在する、種々の分子マーカーが含まれる。これらの分子マーカーには、膵臓の通性幹細胞のマーカーであると仮定されている、ＣＫ-１９又はＰｄｘ１／Ｎｋｘ６．１／Ｐｔｆ１ａトリプルポジティブ細胞が含まれる。
【００８３】
典型的には、哺乳動物幹細胞は、多くの発育段階を介して進行し、最終的な発育終点になるまで成熟する。多くの場合、発育段階は、発育している細胞に存在していない又は存在しているマーカーを同定することにより決定することができる。ヒト内分泌細胞は同様の方式で発育するため、細胞用表現型から偽性島表現型へとそれらが移行する場合の細胞を同定するために、種々のマーカーを使用することができる。
【００８４】
本発明の方法により増殖又は分化が誘発された細胞におけるマーカー発現は、正常なヒトの膵臓の発育におけるマーカー発現のシーケンスと、ある程度の類似性を有している。発育のかなりの初期、始原上皮細胞は、ホメオドメイン核内因子である、Ｐｄｘ-１、初期の細胞マーカーを発現する。細胞が発育すると、それらは出芽し、管を形成し始める。これらの細胞はサイトケラチン１９、上皮管細胞のマーカーを発現し、一時的には、発育的に内分泌細胞に至るＰｄｘ-１を発現する。これらの細胞は内分泌細胞に向かって発育し続けており、それらは、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、又は膵臓ポリペプチドを発現する能力を獲得する。最終的に分化した細胞は一つのみを発現でき、アルファ細胞(グルカゴン)、ベータ細胞(インスリン)、デルタ細胞(ソマトスタチン)、及びＰＰ-細胞となる。ここで使用されたＤＤＲ１ポジティブ細胞個体群は、発育の十分に分化した段階未満であり、成熟した内分泌細胞に分化する可能性、及び増殖する能力を保持していると信じられている。細胞が、発育経路における前駆体の実例であるか、単にインビトロマニピュレーションの結果であるかにかかわらず、ＤＤＲ１ポジティブ細胞は、増殖し、また最終的には内分泌ホルモンを発現し、又は膵臓の初期の内分泌細胞からさらに成熟した内分泌細胞型へと成熟し、よって任意のタイプの島細胞における欠点を矯正するために使用される可能性を有していると信じられている。
【００８５】
ここで使用されるＤＤＲ１ポジティブ細胞個体群は、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞の主要なカテゴリーに分割可能であると、信じられている。
ＤＤＲ１の細胞外発現は、膵臓の種々のドメインで変化し、膵臓内分泌細胞の発育段階中に変化する可能性がある。図３の略図を参照。
【００８６】
ＤＤＲ１は、膵臓内胚葉のいくつかの細胞で発現する。ＤＤＲ１は多分化能性Ｐｄｘ１＋／Ｎｋｘ６．１＋／Ｐｔｆ１ａ＋膵臓前駆体細胞では発現しない。ＤＤＲ１は外分泌系列では発現しない。ＤＤＲ１は管／内分泌前駆体細胞で発現することは明らかである。よって、ＤＤＲ１は、管／内分泌前駆体細胞の同定、富化、及び／又は単離に使用可能である。ＤＤＲ１は内分泌前駆体細胞で発現する。よって、ＤＤＲ１は、内分泌前駆体細胞の同定、富化、及び／又は単離に使用可能である。ＤＤＲ１は、内分泌前駆体細胞において、高、中又は低レベルで発現する可能性がある。よって、ＤＤＲ１は、内分泌前駆体細胞の同定、富化、及び／又は単離に使用可能である。ＤＤＲ１は、初期の内分泌細胞において、高、中又は低レベルで発現する可能性がある。よって、ＤＤＲ１は、初期の内分泌細胞の同定、富化、及び／又は単離に使用可能である。従って、ＤＤＲ１は、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞を、同定、富化及び／又は単離するのに使用されてよい。特に、多くのタンパク質、例えばＰｔｐｒｎ／ＩＡ２、Ａｂｃｃ８／Ｓｕｒ１、及びＳｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８は、初期の内分泌細胞及び／又は十分に分化した内分泌細胞の同定、富化及び／又は単離に使用可能であるが、ＤＤＲ１のみが、内分泌前駆体細胞の同定、富化及び／又は単離に使用され得る。
【００８７】
ＤＤＲ１ポジティブ細胞は、また最終的には内分泌ホルモンを発現し、又は膵臓の初期の内分泌細胞からさらに成熟した内分泌細胞型へと成熟し、よって任意のタイプの島細胞における欠点を矯正するために使用される可能性を有している細胞に分化可能な、発育経路における前駆体の具体例であると信じられている。
さらに、ＤＤＲ１ポジティブ細胞個体群は、発育の十分に分化した段階未満であり、十分に分化した内分泌細胞に分化する可能性、及び増殖する能力を保持していると信じられている。ＤＤＲ１ポジティブ細胞は、増殖し、また最終的には内分泌ホルモンを発現し、又は膵臓の初期の内分泌細胞からさらに成熟した内分泌細胞型へと成熟し、よって任意のタイプの島細胞における欠点を矯正するために使用される可能性を有している細胞に分化可能な、発育経路における前駆体の具体例であると信じられている。
【００８８】
関心あるマーカーは、膵臓において、時間-及び組織-特異的パターンで発現する分子である(Hollingsworth, Ann N Y Acad Sci 880: 38-49 (1999)を参照)。これらの分子マーカーは、一般的に３つのカテゴリー：転写因子、ノッチ経路マーカー、及び中間径フィラメントマーカーに分けられる。転写因子マーカーの例には、Ｐｄｘ-１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｋｘ-６．１、Ｉｓｌ-１、Ｐａｘ-６、Ｐａｘ-４、Ｎｇｎ-３、及びＨＥＳ-１が含まれる。
【００８９】
ノッチ経路マーカーの例には、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｌｌ１、及びＲＢＰｊｋが含まれる。中間径フィラメントマーカーの例には、ＣＫ１９及びネスチンが含まれる。膵臓ベータ細胞の前駆体のマーカーの例には、Ｐｄｘ-１、Ｐａｘ-４、Ｎｇｎ-３、及びＨｂ９が含まれる。いくつかの態様において、成熟した膵臓ｆｌ細胞のマーカーの例には、インスリン、ソマトスタチン、ｇｌｐ-９、及びグルカゴンが含まれる。いくつかの態様において、成熟した膵臓ベータ細胞のマーカーの例には、インスリン、Ｐｔｐｒｎ／ＩＡ２、Ａｂｃｃ８／Ｓｕｒ１、及びＳｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８が含まれる。
【００９０】
インスリンｍＲＮＡ発現
膵臓細胞の同一性、分化又は成熟度の特徴付けに使用され得る一つのマーカーは、インスリンｍＲＮＡのレベルである。例えば、本発明の中間細胞個体群は、定められた範囲でインスリンｍＲＮＡ発現を示す。インスリンｍＲＮＡを定量する方法には、ノーザンブロット法、ヌクレアーゼプロテクション、及びプライマー伸長法が含まれる。
【００９１】
一実施態様において、ＲＮＡを、培養された細胞の個体群から抽出し、プロインスリンメッセージの量を、定量的逆転写ＰＣＲにより測定する。逆転写の後、インスリンｃＤＮＡを、インスリンｃＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションしたプライマーを使用し、増幅した生成物の量が、サンプル中に存在するｍＲＮＡの量に関連する増幅条件下で、サンプルから、特異的かつ定量的に増幅させる(例えば、 Zhouら, J Biol Chem 272: 25648-51 (1997)を参照)。動力学的定量手順は、出発ｍＲＮＡレベルを正確に測定可能であるため、好ましい。
【００９２】
インスリンｍＲＮＡの量を、構造的に発現したｍＲＮＡ、例えばアクチンに対して、頻繁に正常化し、アクチンに特異的なプライマーを使用し、同様のＲＮＡサンプルから特異的に増幅させる。よって、インスリンｍＲＮＡの発現レベルは、アクチンｍＲＮＡ増幅生成物に対する、インスリンｍＲＮＡ増幅生成物の比率、又は単純に、インスリン：アクチンのｍＲＮＡ比率として報告される。他の膵臓ホルモン(例えば、ソマトスタチン又はグルカゴン)をコードするｍＲＮＡの発現は、同様の方法で定量される。また、インスリン及びアクチンのｍＲＮＡレベルは、インサイツハイブリダイゼーションにより測定され、ついでインスリン：アクチンのｍＲＮＡ比率の測定に使用することができる。インサイツハイブリダイゼーション法は、当業者に公知である。
【００９３】
増殖方法
いくつかの態様において、本発明は、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の数を増やす方法に関し、該方法は：上述した方法に従い、精製された細胞を得、ついで、得られた細胞型(類)の増殖を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、本発明は、数を増加させる方法に関し、該方法は：上述した方法に従い、精製された細胞を得、ついで、内分泌前駆体細胞の増殖を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌前駆体細胞の数を増加させる方法に関し、該方法は：上述した方法に従い、精製された細胞を得、ついで、内分泌前駆体細胞の増殖を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。
【００９４】
いくつかの態様において、本発明は、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の数を増やす方法に関し、該方法は：上述した方法に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞において、膵臓細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。さらなる他の態様において、本発明は、管／内分泌前駆体細胞の数を増やす方法に関し、該方法は：上述した方法に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、内分泌前駆体細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。さらなる他の態様において、本発明は、内分泌前駆体細胞の数を増やす方法に関し、該方法は：上述した方法に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、内分泌前駆体細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。さらなる他の態様において、本発明は、初期の内分泌細胞の数を増やす方法に関し、該方法は：上述した方法に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、初期の内分泌細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。
【００９５】
胎児／成人組織から誘導された膵臓細胞及び幹細胞を増殖させるプロトコルは、限定されるものではないが、Heimberg, Hら. (2000), Diabetes 49, 571-9; Heremans, Yら. (2002), J Cell Biol 159, 303-12; Miralles, Fら. (1998), Development 125, 1017-24; 及びMiralles, Fら. (1999), Dev Dyn 214, 116-26に記載のプロトコルにより例証される。
【００９６】
機能アッセイ
ベータ細胞の重要な機能の一つは、グルコースレベルに応じて、そのインスリン分泌を調製することである。典型的には、静的グルコース刺激(ＳＧＳ)アッセイは、種々のグルコースレベルに応じてインスリンを分泌可能であるかどうかを同定するために、増殖する粘着性膵臓細胞において実施される。細胞は、ほぼコンフルエントになるまで、適切な基質において培養される。ＳＧＳテストの３日前、培養培地を、インスリンを欠き、及び、１ｇ／Ｌのグルコースのみを含有する以外は同様の特性の培地に置き換える。３日間、毎日培地を交換し、４日目にＳＧＳテストを実施する。
【００９７】
テストの前に、培養培地を、グルコース及びインスリン分析用に収集しておいてもよい。テスト用の細胞を調製するために、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水(ＤＰＢＳ)＋０．５％ＢＳＡで、細胞を２回洗浄し、各洗浄と共に、５分インキュベートし、ついで、ＤＰＢＳ単独で１回、さらに５分インキュベートする。洗浄後、３７℃のインキュベーターにおいて３０分、６０ｍｇ／ｄｌのグルコース(ＫＲＢ-６０)を含有する、１０ｍｌ(１００ｍｍの皿において)又は５ｍｌ(６０ｍｍの皿において)のクレブスリンゲルＳＧＳ液と共にインキュベートする。ついで、このインキュベートを繰り返す。
【００９８】
ＳＧＳアッセイを予め作製しておくために、細胞を、３ｍｌ(１００ｍｍの皿)又は４ｍｌ(Ｔ７５フラスコ)又は２ｍｌ(６０ｍｍの皿ｄｉｓｈ)のＫＲＢ-６０において、３７℃で２０分インキュベートする。培地を吸引してスパンさせ、ＬＧ-１(低グルコース刺激工程)としてインスリンアッセイ用に収集する。ついで、ＫＲＢ-４５０＋テオ(４５０ｍｇ／ｄｌのグルコースと１０ｍＭのスレオフィリンを含有するＫＲＢ)を、上述した同じ容量で添加し、上述した同様の条件下で細胞を培養する。ＨＧ(高グルコース刺激)として、インスリンアッセイ用に上清を収集する。ついで、細胞を、ＫＲＢ-６０と共に、再度インキュベートし、ＬＧ-２として、別の時間にはＬＧ-３として培地を収集する。インスリン分析用に培地を収集し、インスリン含有量がラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は他の適切なアッセイにより測定されるまで、−２０℃で保管する。
【００９９】
ＳＧＳテストの結果は、多くの場合、ＨＧインスリン値をＬＧ-１インスリン値で割ったものと定義される、刺激指標として表される。一般的に、約２以上の刺激指標は、ＳＧＳアッセイにおいてポジティブの結果であるとみなされ、他の値(例えば、１．５、２．５、３．０、３．５等)は、特定の細胞個体群を定めるために使用され得る。
【０１００】
治療方法
いくつかの態様において、本発明は、少なくとも一の膵臓ホルモンの生成に欠損がある哺乳動物に、膵臓内分泌機能を提供する方法に関し、ここで細胞は上述した任意の方法により得られたものであり、該方法は、哺乳動物において、少なくとも一の膵臓ホルモンを測定可能な量生成するのに十分な量の得られた細胞を、哺乳動物にインプラントする工程をさらに含む。
いくつかの態様において、膵臓ホルモンの量は、移植後の日より早くには測定されない。いくつかの態様において、分化した膵臓細胞を使用して移植を実施した場合、ベータ細胞機能、例えば膵臓ホルモン及び血糖値の測定は、移植直後、例えば移植後１２時間経過前、２４時間経過前、又は３６時間経過前に実施すべきである。
いくつかの態様において、膵臓ホルモンの量は、インビボ成熟の後、例えば移植後少なくとも１、２、３又は４週間に測定される。いくつかの態様において、未熟な膵臓細胞を含む膵臓細胞を使用する移植を実施した場合は、ベータ細胞機能の測定、例えば膵臓ホルモン及び血糖値のこのような測定は、移植後少なくとも２週間、例えば４週間、少なくとも６週間、又は少なくとも８週間に実施すべきである。当業者であれば、ＤＤＲ１選択細胞又はさらに培養され分化した細胞が、インプラント用の再生可能な資源であり、哺乳動物における膵臓機能を回復させると認識しているであろう。
【０１０１】
ＤＤＲ１ポジティブ膵臓細胞は、哺乳動物において、まずインプラント前に分化する。また、ＤＤＲ１選択細胞は前駆体状態でインプラントされ、体内で分化可能である。使用者が望むのであれば、ＤＤＲ１細胞は、インプラント前にカプセル化することができる。
哺乳動物において、インプラント前のＤＤＲ１ポジティブ膵臓細胞の分化は、グルコース反応性インスリン生成ベータ細胞を含む、十分に分化した内分泌細胞、すなわち単離されたランゲルハンス島のベータ細胞と同等のものからなる群から選択される分化の状態のものであってよい。いわゆるエドモントンプロトコルを使用する単離されたランゲルハンス島のインプラント例は、Shapiro AM (2000), N Engl J Med.; 343(4):230-8に見出すことができる。
【０１０２】
ＤＤＲ１により選択される細胞は、前駆体状態、すなわち未熟な細胞、例えば膵臓管／内分泌前駆体細胞、膵臓前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞からなる群から選択され、体内で分化可能な細胞を含む細胞個体群でインプラントされてもよい。一実施態様において、ＤＤＲ１により選択される細胞は、膵臓前駆体細胞の前駆体状態でインプラントされてもよい。いくつかの実施態様において、ＤＤＲ１により選択される細胞は、膵臓前駆体細胞の前駆体状態でインプラントされてもよい。従って、ＤＤＲ１ポジティブ細胞は、移植に直接使用されてもよい。この状況において、インビボ環境により、ＤＤＲ１＋細胞の治療用ベータ細胞への分化が引き起こされると予測される。移植用に未熟な膵臓細胞を使用する例は、Kroon E ら. (2008), Nat Biotechnol, 2008年2月20日 [Epub印刷準備中]に記載されている。
【０１０３】
ＤＤＲ１ポジティブ細胞のカプセル化により、カプセル中に、細胞凝集体が形成される結果となる。カプセル化により、１型糖尿病の宿主に膵臓細胞を移植することが可能となり、同時に、宿主動物の免疫反応を最小にすることができる。カプセル化膜の空隙率により、インスリンのような生体材料の、カプセルからの分泌が可能となり、同時に、外来細胞に対する宿主の免疫系へのアクセスが制限される。
カプセル化の方法は当該技術で公知であり、以下の参照：van Schelfgaarde & de Vos, J. Mol. Med. 77: 199-205 (1999), Uludagら. Adv. DrugDel Rev. 42: 29-64 (2000)、及び米国特許第５７６２９５９号、同５５５０１７８号、及び同５５７８３１４号に開示されている。
カプセル化の方法は、参照としてここに導入される、出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／４１６１６に詳細に記載されている。
【０１０４】
哺乳動物へのインプラント又は移植、ついで、内分泌機能のモニタリングは、島移植に一般的に使用される方法に従い実施されてよい；例えば、Ryanら, Diabetes, 50: 710-19(2001); Peckら, Ann Med 33: 186-92 (2001); Shapiroら, NEngl JMed 343 (4): 230-8(2000); Carlssonら, Ups J Med Sci 105 (2): 107-23 (2000)及びKuhtreiber, WM, Cell Encapsulation Technology and Therapeutics, Birkhauser, Boston, 1999を参照。インプラントの好ましい部位には、腹膜腔、肝臓、及び腎臓カプセルが含まれる。いくつかの態様において、当業者であれば、意図する受容者用のマイクロカプセルの適切な用量を決定することができるであろう。いくつかの態様において、当業者であれば、意図する受容者用の、十分に分化したベータ細胞又はマイクロカプセルの適切な用量を決定することができるであろう。用量は、受容者が必要とするインスリンに依存する。マイクロカプセルにより分泌されるインスリンレベルは、免疫学的に、又は生物活性量により決定することができる。用量を決定する場合、受容者の体重を考慮に入れることができる。カプセル化された細胞に対する受容者の反応をモニターしている場合、必要であるならば、1以上のインプラントを実施することもできる。よって、カプセル化された細胞の用量に対する指針として、インプラントに対する反応性を使用することができる(Ryanら, Diabetes 50: 710-19 (2001))C。
【０１０５】
受容者に移植された膵臓細胞の機能は、グルコースに対する受容者の反応をモニターすることにより測定することができる。膵臓細胞のインプラントにより、血糖値をコントロールすることができる。さらに、膵臓内分泌ホルモン、インスリン、Ｃ-ペプチド、グルカゴン、及びソマトスタチンのレベルが増加したという証拠により、移植細胞の機能に示すことができる。
受容者における、カプセル化された細胞の機能は、グルコースに対する受容者の反応をモニターすることにより測定することができる。カプセル化された細胞のインプラントにより、血糖値をコントロールすることができる。さらに、膵臓内分泌ホルモン、インスリン、Ｃ-ペプチド、グルカゴン、及びソマトスタチンのレベルが増加したという証拠により、カプセル化された細胞の機能を示すことができる。
【０１０６】
当業者であれば、血糖のコントロールは、種々の方法でモニター可能であると、認識しているであろう。例えば、血糖は、体重とインスリン必要量から、直接測定することができる。経口グルコース負荷試験を付与することもできる。腎臓機能は、他の代謝パラメーターから測定することもできる(Soon-Shiong, Pら, PNAS USA 90: 5843-5847 (1993); Soon-Shiong, Pら, La71cet 343: 950-951 (1994))。
【０１０７】
ここで使用される場合、用語「インスリン生成内分泌膵臓細胞」は、インスリンを生成し、血糖依存方式でインスリンを分泌する細胞を称する。
他の実施態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は、(この発明の)培養源から単離される。ついで、単離された細胞は、例えば、さらなる培養に使用されるか、又は米国特許第５７６２９５９号のマイクロカプセル化法に従いマイクロカプセル化される。
【０１０８】
用語「このような機能を必要とする哺乳動物に膵臓機能を付与する」とは、それ自身、このようなホルモンを生成できない哺乳動物の体内で、膵臓ホルモンを生成する方法を称する。一実施態様において、膵臓ホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及びグレリンからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、インスリンは糖尿病の哺乳動物の体内で生成される。膵臓機能は、この開示の方法により生成された、インスリンを生成する膵臓細胞を、哺乳動物にインプラント又は移植することにより提供される。インプラントされた凝集体の数は、哺乳動物に、測定可能な量のインスリンを生成するのに十分な量とされる。インスリンは、ウエスタンブロット法、又はインスリン機能、例えば血糖値の維持度合いのアッセイを含む、当業者に公知の他の検出方法により測定可能である。また、インスリンは、Ｅｌｉｓａアッセイ又はラジオイムノアッセイにより測定可能である。
【０１０９】
またインスリンは、血中のＣ-ペプチドを検出することにより測定することができる。インスリンは、等モル量のＣ-ペプチドと同時分泌され、よって、インスリン分泌活性は、血中のＣ-ペプチドを検出することにより測定することができる。他の好ましい実施態様において、膵臓機能の提供は、体外で生成されるインスリンへの、哺乳動物の依存性を低減又は除去するのに十分である。
【０１１０】
「カプセル化」とは、細胞が、生体融合性のある無細胞物質、例えばアルギン酸ナトリウム及びポリリジンで取り囲まれるプロセスを称する。好ましくは、糖類及び小分子量のタンパク質のような小分子が、カプセル化された細胞周囲の環境から取り込まれるか、又はそこに分泌可能である。同時に、より大きな分子によりカプセル化された細胞、及び免疫細胞へのアクセスは制限される。
「インプラント」は、受容者に細胞をグラフトする又は配置することである。それには、カプセル化した細胞又は非カプセル化が含まれる。細胞は、当該技術で公知の方法により、皮下、筋肉内、門脈内、又は腹腔内に配することができる。
【０１１１】
一態様において、分離工程は蛍光標識細胞分取により実施される。他の態様において、分離工程はパニングにより実施される。他の態様において、分離工程は流動床により実施される。
【０１１２】
また本発明は、細胞表面マーカーとしての、ＤＤＲ１タンパク質を発現する細胞を同定又は選択するための、ＤＤＲ１結合剤の使用に関する。いくつかの態様において、本発明は、ＤＤＲ１結合試薬として、分析の同じ工程(類)にかけられる、一又は複数の付加的な結合試薬と組合せて、細胞表面マーカーとしての、ＤＤＲ１タンパク質を発現する細胞を同定又は選択するための、ＤＤＲ１結合試薬の同時又は逐次使用に関する。本発明の特定の態様において、付加的な結合試薬は、プロミニン(ＣＤ１３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆ結合試薬からなる群から選択される。また本発明は、膵臓内分泌前駆体細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞、又は初期の内分泌細胞の培養体を得るための、細胞表面マーカーとしてのＤＤＲ１タンパク質の使用に関する。いくつかの態様において、本発明は、一又は複数の付加的な結合試薬と組合せて、膵臓内分泌前駆体細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞、又は初期の内分泌細胞の培養体を得るための、細胞表面マーカーとしての、ＤＤＲ１タンパク質の同時又は逐次使用に関する。いくつかの実施態様において、付加的な結合試薬は、ＤＤＲ１結合試薬として、分析の同じ工程(類)にかけられてもよい。本発明の特定の態様において、付加的な結合試薬は、プロミニン(ＣＤ１３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆ結合試薬からなる群から選択される。本発明の他の態様において、付加的な結合試薬は、初期の、及び十分に分化した内分泌細胞を単離するのに使用可能な、Ｐｔｐｒｎ／ＩＡ２、Ａｂｃｃ８／Ｓｕｒ１、及びＳｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８結合試薬からなる群から選択される。
【０１１３】
また本発明は、このような機能を必要とする哺乳動物に、膵臓機能を提供することによる、１型糖尿病を処置する方法に関する。
一実施態様において、膵臓内分泌細胞を含有し、他の細胞型を実質的に含有しない組成物が生成され得る。本発明の一態様において、細胞培養体又は細胞個体群に対して、表現「実質的に含有しない」とは、細胞培養体又細胞個体群が、細胞の全数に対して、膵臓内分泌前駆体細胞より、他の細胞型を２０％少なく含有することと理解される。
【０１１４】
インビトロプロトコルの最適化
本発明のいくつかの態様において、膵臓細胞を含むインビトロ培養体は、ＤＤＲ１の発現について、定期的にモニターされる。本発明のいくつかの態様において、一又は複数の付加的なマーカーが、同時又は逐次的に、ＤＤＲ１と組合せて使用されてよい。いくつかの態様において、付加的なマーカーは、プロミニン(ＣＤ１３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆからなる群から選択される。ＤＤＲ１の発現には、内分泌細胞になることに関連しているが、Ｎｇｎ３タンパク質の発現の前、中又は後の発育段階にある細胞を含む。
胚性幹細胞の分化の最適化について、十分に分化した内分泌細胞に向かった膵臓細胞の発育の種々の段階を同定するマーカーを有することが、非常に重要である。ＤＤＲ１は、今までは、他のマーカーを使用して検出可能でなかった、細胞分化の重要かつ特定の段階を特定するために、単独で、又は組合せて使用されてよい。ＤＤＲ１は、一又は複数の付加的なマーカーと組合せて使用されてよい。
ＤＤＲ１を発現する細胞は、上述した方法、例えばＦＡＣＳ又はＭＡＣＳを使用し、同定、富化、及び／又は単離することができる。
ＤＤＲ１＋細胞を単離することで、例えばＥＳ細胞-誘導性の限定的内胚葉細胞個体群から、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞及び／又は内分泌前駆体細胞の純粋な培養体の生成に、かなりの利点が提供される。よって、より純粋な内分泌細胞個体群に向かっての、さらなる増殖及び／又は分化にかけることのできる培養体が得られる。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：マウスＤｄｒ１及びヒトＤＤＲ１の生物情報学的分析
ヒトにおけるＤＤＲ１の３つのアイソタイプ(図１)、及びマウスに見出される２つのアイソタイプ(図２)間でのアミノ酸差異を研究するために、タンパク質のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ  (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)を使用して整列させた。 細胞外及び膜貫通ドメインを見出すために、全てのアイソタイプを、ＣＢＳ(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)にて、膜貫通プレディクターＴＭＨＭＭサーバーｖ．２．０に通した(データは、マウスＤｄｒ１の最も長い形態：アイソフォーム１）、及びヒトＤＤＲ１の最も長い形態：アイソフォームｃのみを示す)。これにより、３つ全てのヒトアイソタイプは、同じ場所、すなわちアミノ酸４１７-４３９(図１のボールド体)に膜貫通ドメインを有し、２つのマウスアイソタイプはアミノ酸４１５-４３７(図２のボールド体)にドメインをすることが示された。これにより、ＤＤＲ１の３つのヒトアイソタイプとＤｄｒ１の２つのマウスアイソタイプが、それぞれ細胞外側に同じアミノ酸配列を有していることが確認された。特に、結果には、マウスＤｄｒ１、アイソフォーム１が、細胞外側にアミノ酸１-４１４を有する、単一の膜貫通タンパク質であることが示されている。さらに、結果には、ヒトＤＤＲ１、アイソフォームｃが、細胞外側にアミノ酸１-４１６を有する、単一の膜貫通タンパク質であることが示された。
【０１１６】
ＤＤＲ１／Ｄｄｒ１結合試薬により結合可能な修飾についての情報を得るために、ｃｂｓにて、ヒトＤＤＲ１(アイソタイプｃ)及びマウスＤｄｒ１(アイソタイプ１)を、翻訳後プレディクターサーバーに通した。結果には、細胞外側において、マウスＤＤＲ１、アイソタイプ１のリジンのイプシロンアミノ基のグリコシル化が、アミノ酸位置３１にある予測修飾であることが示された。また結果には、細胞外側において、ヒトＤＤＲ１、アイソタイプｃのリジンのイプシロンアミノ基のグリコシル化が、アミノ酸位置３０及び２４３にある予測修飾であることが示された。さらに結果には、細胞外側において、マウスＤＤＲ１、アイソタイプ１のムチン型のＧａｌＮＡｃ Ｏ-グリコシル化が、アミノ酸位置３７７及び３９１にある予測修飾であることが示された。またさらに結果には、細胞外側において、ヒトＤＤＲ１、アイソタイプｃのムチン型のＧａｌＮＡｃ Ｏ-グリコシル化が、アミノ酸位置３７９及び３９３にある予測修飾であることが示された。これらにより、いくつかの翻訳後修飾が予測されることが示された。
【０１１７】
細胞外及び膜貫通ドメイン、並びに翻訳後予測に関連し、いくつかの修飾を示す結果は、ＤＤＲ１／Ｄｄｒ１結合試薬に対する標的として使用可能な、ＤＤＲ１／Ｄｄｒ１の細胞外側に存在した。さらに、結果には、ＤＤＲ１／Ｄｄｒ１アイソタイプ間の差異が、細胞内側にのみ見出され、従って、アイソタイプ間の変化は、同定可能な細胞では、細胞外ドメインに影響を与えないであろうことが示された。
【０１１８】
実施例２：ｅ１５．５マウス腸において発現するアイソタイプの研究
ＰＣＲを、ｅ１５．５マウス腸組織(膵臓、胃、十二指腸及び脾臓を含む)のｃＤＮＡ  において実施した。標準的条件下(９７℃１８０秒、ついで９６℃３０秒を３５サイクル、５５℃３０秒、及び７２℃３０秒)、アイソフォーム１と比較して、アイソフォーム２に欠けている３７アミノ酸の側面にあるプライマーを用い、ＰＣＲを実施した。
結果には、Ｄｄｒ１アイソフォーム１(９１１ａａ)が、ｅ１５．５マウス腸において、アイソフォーム２よりも高い発現レベルを示すことが示された。アイソフォーム１がテンプレートである場合は３２８ｂｄ、又はアイソフォーム２がテンプレートであるならば２１５ｂｐのいずれかで、アイソフォーム２に欠けている３７アミノ酸についてコードする配列のいずれかの側に位置するＰＣＴプライマーが増幅した。ｅ１５．５腸組織からのｃＤＮＡがテンプレートとして使用される。半定量用ゲルから、双方のアイソフォームが腸で発現し、アイソフォーム１はアイソフォーム２よりも高レベルで発現することが観察された。
Ｄｄｒ１アイソフォーム１及び２に相当する、２つのバンドが観察された。よって、双方のＤｄｒ１アイソフォームはマウス腸において発現する。
【０１１９】
実施例３：マウスにおけるＤｄｒ１の発現パターンの研究
マウス膵臓における、Ｄｄｒ１についてのインサイツハイブリダイゼーションを、製造者の使用説明書に従い、Rocheからの試薬を使用するインビトロ転写により生成した、ジゴキシゲニン標識ｃＲＮＡプローブを使用して実施した。凍結切片を解凍し、ハイブリダイゼーション溶液に１ｎｇ／μｌまで希釈させた変性ｃＲＮＡプローブを、切片に直接添加した。切片をカバースリップで覆い、６５℃の保湿チャンバー内に一晩配した。スライドを、洗浄溶液にて、６５℃で洗浄し、続いて室温でＭＡＢＴにおいて数回洗浄した。溶液を１時間ブロックし、ＡＰコンジュゲートヒツジ-抗-ＤＩＧ(Roche)と共に、一晩インキュベートした。切片をＭＡＢＴで洗浄し、ついでＮＴＭＴで平衡にした。ＮＴＭＴにおいて、ＮＢＴ／ＢＣＩＰを用い、ＡＰ活性を可視化した。
【０１２０】
Ｄｄｒ１に対するＩＳＨシグナルがますます制限されるにつれ、胚が年をとっていくことが観察された。ｅ１２．５においては、膵臓の全ての細胞がＩＳＨシグナルに対してポジティブであるが、ｅ１８．５では、内分泌細胞を形成することが明らかとなったもののみがポジティブであった。
【０１２１】
免疫組織化学法(ＩＨＣ)を切片において実施し、４℃で一晩、４％のＰＦＡにおいて、胚を固定し、ＰＢＳに３０％のスクロースが入ったもので平衡化し、組織-Ｔｅｋ ＯＣＴ化合物において凍結した。ＰＢＳで切片を洗浄し、０．５％のＴＮＢ(PerkinElmer)において少なくとも１時間ブロックした。インスリン、グルカゴン、Ｎｋｘ６．１、及びＤｄｒ１(R&D systems、ｃａｔ：ＡＦ２３９６）に対する一次抗体を、０．５％のＴＮＢに希釈し、一晩適用した。ＰＢＳでの数回の洗浄の１時間後、二次抗体を適用し、スライドを２０％グリセロールに配した。二次抗体は、Jackson ImmunoResearch(Ｃｙ３コンジュゲートロバ-抗-ウサギ及びロバ-抗-モルモット及びＣｙ５コンジュゲートロバ-抗-マウス）から購入した。ＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡレーザー走査顕微鏡(Carl Zeiss)により、画像を収集し、蛍光シグナルにＺｅｉｓｓ ＬＳＭソフトウェアを用い、疑似色を割り当てた。
【０１２２】
ＩＳＨシグナルについて観察されるように、Ｄｄｒ１の発現は、発育進行において、ますます制限され、成人においては、膵臓Ｄｄｒ１は、ＩＨＣにより容易に検出可能ではなかった。 これらの結果は共に、Ｄｄｒ１が、膵臓の発育を通して、胚の年齢に応じて程度が変化しつつ、内分泌前駆体、ホルモンポジティブ細胞を標識することを示した。
【０１２３】
結果には、Ｄｄｒ１が、マウス膵臓において、膵臓内分泌前駆体細胞個体群をマークすることが示された。特に、ＩＳＨにより、ｅ１２．５、ｅ１５．５、及びｅ１８．５で分析された後、Ｄｄｒ１が１２．５の初期には膵臓の全ての細胞をマークし、ＩＳＨシグナルは、ｅ１５．５では真ん中部分に制限され、最後に、１８．５では、Ｄｄｒ１ ＩＳＨシグナルが終了し、形成される内分泌細胞が明らかになったという結果が示された。特にｅ１５．５でＩＨＣを使用すると、Ｄｄｒ１及びＮｋｘ６．１の間に、かなりの重複が観察された。Ｄｄｒ１は腺房細胞(Ｎｋｘ６．１に対してネガティブ）をマークしなかった。ｅ１５．５で、Ｎｋｘ６．１ポジティブ細胞個体群は膵臓内分泌前駆体個体群を含み、グルカゴン生成細胞ではなく、新たにベータ細胞を形成した。ｅ１５．５Ｄで、ＩＨＣを使用して測定される場合、２、３の例外を除き、Ｄｄｒ１を発現する細胞は、インスリン、グルカゴン、又はグレリンを発現しなかった。ｅ１８．５にて、ＩＨＣは、Ｄｄｒ１が、初期の内分泌細胞からなる形成されたランゲルハンス島と、該形成された島の近傍の管様構造体で発現し、Ｎｋｘ６．１ポジティブ細胞のほとんどが、Ｄｄｒ１に対してポジティブであることを示した。さらに、Ｄｄｒ１について、ｅ１８．５でＩＨＣを使用すると、インスリン及びグルカゴンにより、Ｄｄｒ１が、インスリン及びグルカゴンを発現する初期の内分泌細胞と同時発現するが、２、３のインスリン及びグルカゴン細胞は、Ｄｄｒ１に対してネガティブであり、Ｄｄｒ１ポジティブ細胞も形成された島の近傍の管様構造体で見出されることが明らかとなった。特に、成人の膵臓において、Ｄｄｒ１は発現しなかったが、Ｎｋｘ６．１、インスリン及びグルカゴンは、容易に検出された。
【０１２４】
ｅ１５．５において、Ｄｄｒ１は、Ｎｋｘ６．１と著しく重複していることが示された。この時、Ｎｋｘ６．１に対してポジティブな細胞は、成長したマウスにおいて、いくつかの管細胞及び内分泌細胞を生じると思われる。よって、Ｄｄｒ１は、内分泌前駆体、初期の内分泌細胞、及びおそらく管細胞前駆体を標識化する。また、ｅ１８．５において、Ｄｄｒ１はＮｋｘ６．１と同時発現するが、ｅ１５．５と比較して、より多くの細胞がＤｄｒ１＋／Ｎｋｘ６．１−である。しかしながら、ホルモンポジティブ細胞は、ｅ１５．５と比較して、かなり高い程度で、Ｄｄｒ１を同時発現した。この発現パターンにより、膵臓内分泌前駆体細胞に対する精製タグとして、Ｄｄｒ１は優れているとされる。
【０１２５】
実施例４：蛍光染色により可視化されるｅ１５．５マウス膵臓における、Ｄｄｒ１の局在化
ｅ１５．５マウス膵臓において、Ｄｄｒ１の局在化を測定するために、蛍光染色を実施した。マウスｅ１５．５の胚を収集し、ＰＢＳに４％のパラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)が入ったものにおいて、一晩(Ｏ／Ｎ)固定した。ＰＢＳに３０％のスクロースが入ったもので組織を平衡にし、TissueTechに包埋した。８μｍ切片に切断し、−８０℃で保管した。切片を室温(ＲＴ)で解凍し、ＰＢＳで洗浄し、０．０１Ｍのクエン酸バッファーでマイクロ波処理し、ＰＢＳに１％のＨ２Ｏ２が入ったものと共に、３０分インキュベートし、ついで、０．５％のＴＮＢブロック試薬(Perkin-Elmerからのもの)を用いてブロックした。ついで、１：１５０のヤギ抗-Ｄｄｒ１(R&D systems、ＡＦ２３９６)、１：１０００のウサギ抗-グレリン(C.Tomasetto, 1882)、１：４０００のウサギ抗-Ｎｇｎ３(BCBC Abcore、２３６９Ａ)、１：４５０のウサギ抗-Ｋｉ-６７(NeoMarker、ＲＢ０８１−０Ａ)、及び１：２５０のウサギ抗-Ｐｃｎａ(Santa Cruz、ｓｃ-７９０７)を添加し、室温でＯ／Ｎインキュベートした。次の日、スライドをＰＢＳで洗浄し、ビオチニル化した抗-ヤギ抗体と、ロバ抗-ウサギ-ｃｙ５を添加し、４５分インキュベートした。ＰＢＳにおいてスライドを洗浄後、ストレプトアビジン-ＨＲＰを添加し、１５分、インキュベートした。ついで、スライドをＰＢＳで洗浄した。最終的に、ＴＳＡ-ｃｙ３を添加して、染色を展開し、スライドをＰＢＳで洗浄して配した。
【０１２６】
ｅ１５．５マウス胚におけるＤｄｒ１の局在化は、隣接した切片において、蛍光染色により可視化された。Ｄｄｒ１並びにＮｋｘ６．１は、膵臓の中心ドメインで、強く広範囲発現しており、この時点で他の細胞型の中でも、内分泌前駆体を含むことが示された。Ｄｄｒ１及びＮｋｘ６．１は隣接する内胚葉、すなわち十二指腸又は後胃においては発現しなかった。膵臓からさらに距離がある、前胃、食道、及び肺の一部、並びに小腸では、Ｄｄｒ１は発現した。一般的に、Ｄｄｒ１は、神経管の中心部分である程度発現することは別にして、神経組織では発現しなかった。
【０１２７】
結果には、約９０％のＮｇｎ３ポジティブ細胞が、蛍光染色で可視化されたｅ１５．５膵臓において、Ｄｄｒ１を同時発現することがさらに示された。
結果には、蛍光染色で可視化された場合に、細胞増殖のマーカーであるＫｉ-６７についてポジティブであるため、ｅ１５．５膵臓において、約１０-２０％のＤｄｒ１ポジティブ細胞が増殖していることがさらに示された。
結果には、ｅ１５．５で、Ｄｄｒ１は、管から十二指腸への接合部に近接した主な膵臓管のほとんど全ての細胞で発現したことがさらに示された。特にＤｄｒ１は膵臓でのみ発現しており、主な膵臓管のＤｄｒ１ポジティブ細胞と、十二指腸のＤｄｒ１ネガティブ細胞とのはっきりとした境界が、蛍光染色による可視化により観察された。
【０１２８】
実施例５：ＦＡＣＳを介してＤＤＲ１を使用するベータＴＣ３細胞の選別
生存しているベータＴＣ３のＤｄｒ１選別を、ＦＡＣＳにより実施した。ベータＴＣ３細胞をトリプシンで処理し、洗浄した。上清を除去するために、１０ｍｌのチューブにおいて、室温で５分、１４００ｒｐｍにて細胞をペレット状にした。次に、この細胞を、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。一次抗体溶液を添加し、＋４℃で４５分、インキュベートした。次に、この細胞を、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。二次抗体を添加し、＋４℃で３０分、インキュベートした。０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ(１．８ｍｌ使用)で、細胞を３ｘ５分、洗浄した。最後に、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄された、リリー固定液で、４５分、細胞を固定し、ＦＡＣＳによりアッセイした。特に、１：５０のマウス抗-Ｄｄｒ１(R&D Systems、ＭＡＢ２３９６)を使用し、ロバ抗-マウス-ｃｙ２(Jackson ImmunoResearch)(１：３００)と共に展開させた。
【０１２９】
二次ロバ抗-マウスＣｙ２抗体のみと共にインキュベートされた染色ベータＴＣ３細胞のＦＡＣＳを実施することで、いくつかの蛍光シグナルに帰した。一次マウスＩｇＧａ  アイソタイプコントロール抗体の添加により、二次抗体単独(すなわち、バックグラウンド)に関しても、ほぼ同じ蛍光になった。しかしながら、マウス抗-Ｄｄｒ１抗体を添加すると蛍光は際だって増加し、Ｄｄｒ１タンパク質が、ＦＡＣＳにおけるタグとして使用可能であることが示された。
【０１３０】
ＥＳ細胞は分化して、膵臓細胞になることができるが、多くの非膵臓細胞は、例えば内胚葉細胞(後胃及び十二指腸）、種々の神経細胞、及び間葉系細胞が混入した培養体中に存在する。例えばＦＡＣＳ選別により、Ｄｄｒ１に対してポジティブ、又はＤｄｒ１に対してネガティブな個体群における、このような細胞混合物を選別することで(ベータＴＣ３細胞に対してなされたように)、膵臓の管／内分泌前駆体、内分泌前駆体、及び／又は初期の内分泌細胞が、他の細胞型に対して精製されるであろう。また、種々の膵臓細胞型(腺房、管及び内分泌)の中でも、腺房細胞はＤｄｒ１ネガティブ個体群に存在するであろう。よって、Ｄｄｒ１は、膵臓の管／内分泌前駆体、内分泌前駆体、及び／又は初期の内分泌細胞を、膵臓の他の細胞型から精製するための、タグとしても使用可能である。しかしながら、ＣＤ１３３及びＣＤ４９ｆ等の他のマーカーを使用する二重選別を実施すると、所望の細胞の収率がさらに増加するかもしれない。
【０１３１】
実施例６：ＦＡＣＳを介してＤＤＲ１を使用するマウス胚性膵臓細胞の選別
いくつかのｅ１５．５マウスの胚からの膵臓を、マイクロ分析した。単細胞を得るために、１４００ｒｐｍにて、３６℃で５分、時々ペレット化しつつ、組織をトリプシン処理した。ついで、血清を含有しない１０ｍｌの培地に、細胞を再懸濁させた。トリプシンを洗浄しきるために、血清を含有しない１０ｍｌの培地で３回、細胞を洗浄し、インキュベーターにおいて１．５時間、培地において再度インキュベートした。その後、０．１％のＢＳＡを含有する１０ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄し、６つのチューブに分けた。第１のチューブには、１０μｇ／ｍｌのマウス抗-Ｄｄｒ１(R&D Systems、ＭＡＢ２３９６)抗体を入れた。第２のチューブには、１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ(ＩｇＧ２ａ)ネガティブコントロール抗体を入れた。第３のチューブには、２．５μｇ／ｍｌのマウス抗-Ｄｄｒ１(R&D Systems、ＭＡＢ２３９６)抗体を入れた。第４のチューブには、２．５μｇ／ｍｌのアイソタイプ(ＩｇＧ２ａ)ネガティブコントロール抗体を入れた。第５及び第６のチューブには何の抗体も入れなかった。ついで、細胞を４℃で４５分インキュベートし、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。１：３００の二次ロバ抗-マウス-ｃｙ２抗体を、第６のチューブ以外の全てのチューブに添加した。ついで、細胞を４℃で３０分、インキュベートした。その後、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄し、最終的に、リリー固定液において３０分、細胞を固定し、ついで０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳにおいて分析した。
【０１３２】
結果を図４に示す。図４Ａは、一次抗体として、１０μｇ／ｍｌのマウス抗-Ｄｄｒ１を使用した結果を示す。図４Ｂは、一次抗体として、１０μｇ／ｍｌのアイソタイプ(ＩｇＧ２ａ)ネガティブコントロールを使用した結果を示す。特定のＤｄｒ１抗体により、細胞の下位個体群が明確に標識化されることが観察された。よって、Ｄｄｒ１は、一次マウス膵臓細胞において、ＦＡＣＳにて使用可能である。これにより、Ｄｄｒ１結合試薬が、管／内分泌細胞、内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞の単離に使用可能であることが示される。
【０１３３】
実施例７：ＦＡＣＳを使用する、ＤＤＲ１を介して単離された胎児膵臓誘導性細胞におけるインスリン生成の検出
本実験の目的は、ｅ１５．５膵臓から生じたＤｄｒ１ポジティブ細胞が、何の細胞型であるのかを決定することである。
ｅ１５．５から細胞を調製し、次の修正がある以外は、実施例６に記載したようにして、Ｄｄｒについて染色する：１０ｕｇ／ｍｌのマウス抗-Ｄｄｒ１(R&D Systems、ＭＡＢ２３９６)抗体を使用する。二次抗体及び洗浄後、細胞を固定せず、しかしＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％のＦＣＳ＋Ｐ／Ｓを含有する２つのチューブに、ＦＡＣＳＡｒｉａｎにおいて、生存している状態で選別する。Ｄｄｒ１ポジティブ細胞を、一方のチューブに選別する。Ｄｄｒ１ネガティブ細胞を他方のチューブに選別する。その後、Kroon, Eら. (2008), Nat Biotechnol, 2008年2月20日, [Epub印刷準備中]に記載されたようにして、腎臓の下にカプセルをインプラントする。腎臓の下で、３０-６０日間、カプセルをインビボ成熟させた後、移植された細胞を収集し、リリー固体液で固定し、包埋し、切片化する。インプラントの切片を、１：１００のマウス抗-インスリン(Biolabs、ＨＵＩ-１８)、１：１００のマウス抗-グルカゴン(Biolabs、Ｇｌｕ-００１)、及び１：５００のウサギ-抗-アミラーゼ(Sigma、Ａ８２７３)、ウサギ抗-Ｎｋｘ６．１(Hagedorn、＃１７４．４  １：７００)、Ｇｔ-Ｐｄｘ１(Chris Wright、１：１００００）、１：５００のウサギ抗-ソマトスタチン(Dako、Ａ０５６６)、１：３００のウサギ抗-ＰＰ(Dako、Ａ０１６９)；１：３００のヤギ抗-グレリン(Santa Cruz Biotechnology、ＳＣ-１０３６８）、１：２００のウサギ抗-Ｃ-ペプチド(Acris、ＢＰ３０２)について染色した。一次抗体を検出するために、二次-ｃｙ２、ｃｙ３及びｃｙ５抗体を使用するであろう：
Ｄｄｒ１ポジティブ個体群を有するインプラントは、インスリン／グルカゴン発現細胞を含んでおり、Ｄｄｒ１ネガティブ細胞を有するインプラントは、アミラーゼポジティブ細胞を含んでいるであろうと予期される。
【０１３４】
実施例８：ＦＡＣＳを使用する、ＤＤＲ１を介して単離されたＥＳ誘導性細胞におけるインスリン生成の検出
本実験の目的は、胚幹細胞から生じたＤｄｒ１ポジティブ細胞が、何の細胞型であるのかを決定することである。
胚幹細胞を単離し、段階４に達するまで、Kroon, Eら. (2008), Nat Biotechnol, 2008年2月20日, [Epub印刷準備中]に記載されたプロトコルに従い、分化させてよい。ついで、ＥＳ誘導性細胞を調製し、次の修正がある以外は、実施例６に記載したようにして、Ｄｄｒについて染色する：１０ｕｇ／ｍｌのマウス抗-Ｄｄｒ１(R&D Systems、ＭＡＢ２３９６)抗体を使用する。二次抗体及び洗浄後、細胞を固定せず、しかしＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％のＦＣＳ＋Ｐ／Ｓを含有する２つのチューブに、ＦＡＣＳＡｒｉａｎにおいて、生存している状態で選別する。Ｄｄｒ１ポジティブ細胞を、一方のチューブに選別する。Ｄｄｒ１ネガティブ細胞を他方のチューブに選別する。その後、Kroon, Eら. (2008), Nat Biotechnol, 2008年2月20日, [Epub印刷準備中]に記載されたようにして、腎臓の下にカプセルをインプラントする。実施例７に記載したようにして、移植片を処理し、ＩＨＣにより染色する。
Ｄｄｒ１ポジティブ個体群を有するインプラントは、インスリン／グルカゴン発現細胞を含んでおり、Ｄｄｒ１ネガティブ細胞を有するインプラントは、アミラーゼポジティブ細胞を含んでいるであろうと予期される。
【０１３５】
実施例９：ＤＤＲ１、場合によってはＮｇｎ３の発現を定量することによる、幹細胞の分化についてのインビトロプロトコルの最適化
幹細胞、例えばＥＳ細胞の分化を最適化するために、十分に分化した内分泌細胞への、膵臓細胞の種々の発育段階を同定するマーカーを有することが非常に重要である(図３を参照）。ＤＤＲ１は、今までは、他のマーカーを使用して検出可能でなかった、細胞分化の重要かつ特定の段階を特定するために、又は一又は複数の付加的なマーカーと組合せて、又は単独で使用されてよい。
いくつかの態様において、幹細胞の分化についてのインビトロプロトコルを最適化する方法は、最適な培養条件をスクリーニングする方法である。
【０１３６】
いくつかの態様において、幹細胞の分化についてのインビトロプロトコルを最適化する方法は、以下の工程を含む：
ａ）１)細胞個体群とＤＤＲ１結合試薬とを接触させ、２)細胞表面マーカーとしてＤＤＲ１を示す細胞(ＤＤＲ１ポジティブ細胞)の量を測定することによる、ＤＤＲ１ポジティブ細胞の定量；
ｂ）場合によっては、ＤＤＲ１結合試薬と結合しない細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞のフラクション中の、ＤＤＲ１結合試薬と結合した細胞を分離。
ｃ）場合によっては、得られた細胞型(類)の増殖を容易にする条件下にて、ＤＤＲ１ポジティブ細胞を含む細胞個体群を培養することによる、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞の数を増加。
ｄ）管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞において、それらの分化を容易にする条件下にて、ＤＤＲ１ポジティブ細胞を含む細胞個体群を培養。
ｅ）場合によっては、得られた細胞型(類)の増殖を容易にする条件下にて、ＤＤＲ１ポジティブ細胞を含む細胞個体群を培養することによる、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞の数を増加
ｆ）１)細胞個体群とＤＤＲ１結合試薬とを接触させ、２)細胞表面マーカーとしてＤＤＲ１を示す細胞(ＤＤＲ１ポジティブ細胞)の量を測定することによる、ＤＤＲ１ポジティブ細胞の定量；
ｇ）工程ｆ）のＤＤＲ１ポジティブ細胞の量が、工程ａ）のＤＤＲ１ポジティブ細胞の量より多いかどうかを測定；
ｈ）場合によっては、ＤＤＲ１結合試薬と結合しない細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞のフラクション中の、ＤＤＲ１結合試薬と結合した細胞を分離；
ｉ）場合によっては、分化に影響を与える条件を変えることにより、ＤＤＲ１ポジティブ細胞の量を増加させるための培養条件、例えば１）分化因子の濃度又は組合せ、２）成長培地の濃度又は組成、３）成長培地へのサプリメントの濃度又は組成、４）インキュベート時間、及び／又は５）酸素分圧、を調節することを導入；
ｊ）場合によっては、ＤＤＲ１結合試薬と結合しない細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞のフラクション中の、ＤＤＲ１結合試薬と結合した細胞を分離；
ｋ）満足のいく量のＤＤＲ１ポジティブ細胞が得られるまでの、工程ａ）ないしｈ）のシーケンスの繰り返し。
【０１３７】
いくつかの態様において、ＤＤＲ１ポジティブ細胞の量的測定は、自動化された染色システム、例えば蛍光検出を使用して実施されてよい。
管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞の同定は、場合によっては、他の内胚葉マーカーについての付加的な結合試薬(例えば、Ｐｄｘ１結合試薬)と組合せて、ＤＤＲ１結合試薬と細胞個体群とを接触させ、染色を評価することにより達成され得る。結合試薬の選択は、例えばＤＤＲ１は内胚葉をマークするが、膵臓を神経支配する神経細胞はマークしないため、神経細胞が存在するかどうか等、細胞培養体の組成に依存してよい。二重ポジティブである、Ｎｇｎ３及びＤＤＲ１細胞に対する同時染色により、内分泌前駆体群のグルーピングが可能となる。この分析は、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、ＩＨＣ、又はパニング等の方法を使用して実施されてよい。
【０１３８】
本発明の実施態様：
１．管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞を同定する方法であって、該方法が、ＤＤＲ１結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させることを含む方法。
２．ＤＤＲ１結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＤＲ１結合試薬と結合しない細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞のフラクション中の、ＤＤＲ１結合試薬と結合した細胞を分離することを含む：管／内分泌前駆体細胞、膵臓内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞の培養体を得る方法。
３．実施態様２の方法に従い、精製された細胞を得、ついで、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞において、それらの分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む：管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞の培養体を得る方法。
【０１３９】
４．実施態様２に従い、精製された細胞を得、ついで、得られた細胞型(類)の増殖を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む：管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞の数を増やす方法。
５．実施態様４に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞において、細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む：管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞の数を増やす方法。
【０１４０】
６．少なくとも一の膵臓ホルモンの生成に欠損がある哺乳動物に、膵臓内分泌機能を提供する方法であって、細胞が実施態様１-５のいずれか一つの方法により得られたもので、該方法が：哺乳動物において、少なくとも一の膵臓ホルモンを測定可能な量生成するのに十分な量の得られた細胞を、哺乳動物にインプラントする工程をさらに含む方法。
７．膵臓ホルモンの量が、移植後又はインビボ成熟の後の日より早くには測定されない、例えば、移植後少なくとも１、２、３又は４週間で測定される、実施態様６の方法。
８．前記少なくとも一の膵臓ホルモンがインスリンである、実施態様６又は７の方法。
９．哺乳動物がヒトである、実施態様６-８のいずれかの方法。
１０．前記少なくとも一の膵臓ホルモンが、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチド、及びグレリンからなる群から選択される、実施態様１-９のいずれか一つの方法。
【０１４１】
１１．ａ）ＤＤＲ１結合試薬と細胞とを接触させ；ｂ）細胞表面マーカーとして、ＤＤＲ１を示す細胞(ＤＤＲ１ポジティブ細胞)の量を測定する；ことによる、ＤＤＲ１ポジティブ細胞を定量する方法。
１２．インビトロプロトコルを最適化する方法であって、ここでＤＤＲ１発現細胞(ＤＤＲ１ポジティブ細胞)の数が、定期的にモニターされる方法。
【０１４２】
１３．一又は複数の付加的な結合試薬を、ＤＤＲ１結合試薬と組合せて、同時又は逐次使用する、実施態様１-１２のいずれか一つの方法。
１４．付加的な結合試薬が、プロミニン(ＣＤ１３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆ結合試薬からなる群から選択される、実施態様１３の方法。
【０１４３】
１５．ＤＤＲ１ポジティブ細胞が、場合によってはグルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及びグレリン生成細胞からなる群から選択される細胞にさらに分化される細胞と共に、インスリン生成細胞にさらに分化される、実施態様１-１４のいずれか一つの方法。
１６．膵臓細胞を含む細胞個体群が膵臓から得られる、実施態様１-１５のいずれか一つの方法。
１７．膵臓細胞を含む細胞個体群が体細胞個体群である、実施態様１-１５のいずれか一つの方法。
１８．体細胞個体群が、ＥＳ様細胞、特に、ＩＰＳ細胞、胚盤葉上層幹細、又は生殖細胞等の多能性細胞への脱分化を誘発する、実施態様１７の方法。
１９．膵臓細胞を含む細胞個体群が、ＥＳ細胞等の多能性細胞から得られる、実施態様１-１５のいずれか一つの方法。
【０１４４】
２０．膵臓細胞を含む細胞個体群が脊椎動物由来である、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
２１．膵臓細胞を含む細胞個体群が哺乳動物由来である、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
２２．膵臓細胞を含む細胞個体群がヒト由来である、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
２３．膵臓細胞を含む細胞個体群がマウス由来である、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
２４．膵臓細胞を含む細胞個体群がラット由来である、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
２５．膵臓細胞を含む細胞個体群がニワトリ由来である、実施態様２０の方法。
【０１４５】
２６．細胞個体群が膵臓内分泌系列に分化する、実施態様２０-２５のいずれかの方法。
２７．細胞分化が、一又は複数の分化因子(類)を含有する培地において、細胞を培養することを含む、実施態様２６の方法。
【０１４６】
２８．膵臓細胞を含む細胞個体群がベータ細胞-ポジティブフラクションである、実施態様１-２７のいずれか一つの方法。
２９．膵臓細胞を含む細胞個体群がｐｔｐｒｎ／ＩＡ２-ポジティブフラクションである、実施態様１-２７のいずれか一つの方法。
３０．膵臓細胞を含む細胞個体群がＡｂｃｃ８／Ｓｕｒ１-ポジティブフラクションである、実施態様１-２７のいずれか一つの方法。
３１．膵臓細胞を含む細胞個体群がＳｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８-ポジティブフラクションである、実施態様１-２７のいずれか一つの方法。
【０１４７】
３２．上述した実施態様のいずれかの方法により得られた膵臓内分泌細胞の培養体が、ベータ細胞-ポジティブフラクションにさらに分離される、実施態様１-２７のいずれか一つの方法。
３３．上述した実施態様のいずれかの方法により得られた膵臓内分泌細胞の培養体が、Ｐｔｐｒｎ／ＩＡ２-ポジティブフラクションにさらに分離される、実施態様１-２７のいずれか一つの方法。
３４．上述した実施態様のいずれかの方法により得られた膵臓内分泌細胞の培養体が、Ａｂｃｃ８／Ｓｕｒ１-ポジティブフラクションにさらに分離される、実施態様１-２７のいずれか一つの方法。
３５．上述した実施態様のいずれかの方法により得られた膵臓内分泌細胞の培養体が、Ｓｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８-ポジティブフラクションにさらに分離される、実施態様１-２７のいずれか一つの方法。
３６．ＤＤＲ１結合試薬が、ＤＤＲ１に特異的に結合する抗体である、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
【０１４８】
３７．分離又はモニター工程が蛍光標識細胞分取によりなされる、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
３８．分離又はモニター工程が磁気活性化細胞分取によりなされる、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
３９．分離工程がパニングによりなされる、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
４０．細胞が内分泌前駆体細胞である、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
【０１４９】
４１．実施態様１-４０のいずれかに定められた方法により得られた管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び実施態様３又は５-４０のいずれかに定められた方法により得られた十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される、単離された細胞。
４２．実施態様１-４０のいずれかに定められた方法により得られた、単離された内分泌前駆体細胞。
４３．実施態様３又は５-４０のいずれかに定められた方法により得られた、単離され、十分に分化した内分泌細胞。
【０１５０】
４４．実施態様１-４０のいずれかに定められた方法により得られた管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び実施態様３又は５-４０のいずれかに定められた方法により得られた十分に分化した内分泌細胞からなる群からの、一又は複数の細胞から選択される単離された細胞を含有する組成物。
【０１５１】
４５．細胞表面マーカーとしての、ＤＤＲ１タンパク質を発現する細胞を同定又は選択するためのＤＤＲ１結合試薬の使用。
４６．膵臓内分泌細胞の培養体を得るための、細胞表面マーカーとしてのＤＤＲ１タンパク質の使用。
４７．一又は複数のさらなる細胞表面マーカーが、膵臓内分泌細胞の培養体を得るために、同時又は逐次使用される、実施態様４６の使用。
４８．さらなる細胞表面マーカーが、プロミニン(ＣＤ１３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆからなる群から選択される、実施態様４７の使用。
【０１５２】
本発明のさらなる実施態様：
１．ＤＤＲ１結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＤＲ１結合試薬と結合しない細胞から、ＤＤＲ１ポジティブ細胞のフラクション中の、ＤＤＲ１結合試薬と結合した細胞を分離することを含む：膵臓内分泌前駆体細胞及び／又は初期の内分泌細胞及び／又は膵臓ホルモン分泌細胞の培養体を得る方法。
２．実施態様１の方法に従い、精製された細胞を得、ついで、膵臓内分泌細胞及び／又は膵臓ホルモン分泌細胞及び／又は初期の内分泌細胞及び／又は成熟した内分泌細胞において、それらの分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む：膵臓内分泌細胞及び／又は膵臓ホルモン分泌細胞及び／又は初期の内分泌細胞及び／又は成熟した内分泌細胞の培養体を得る方法。
【０１５３】
３．実施態様１に従い、精製された細胞を得、ついで、得られた細胞型(類)の増殖を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む：膵臓内分泌前駆体細胞及び／又は初期の内分泌細胞及び／又は膵臓ホルモン分泌細胞の数を増やす方法。
４．実施態様３に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、膵臓内分泌細胞及び／又は膵臓ホルモン分泌細胞及び／又は初期の内分泌細胞及び／又は成熟した内分泌細胞において、細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む：膵臓内分泌細胞及び／又は膵臓ホルモン分泌細胞及び／又は初期の内分泌細胞及び／又は成熟した内分泌細胞の数を増やす方法。
【０１５４】
５．少なくとも一の膵臓ホルモンの生成に欠損がある哺乳動物に、膵臓内分泌機能を提供する方法であって、細胞が実施態様１-４のいずれか一つの方法により得られたもので、該方法が：哺乳動物において、少なくとも一の膵臓ホルモンを測定可能な量生成するのに十分な量の得られた細胞を、哺乳動物にインプラントする工程をさらに含む方法。
６．前記少なくとも一の膵臓ホルモンが、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドからなる群から選択される、実施態様１-５のいずれか一つの方法。
【０１５５】
７．ａ）ＤＤＲ１結合試薬と細胞とを接触させ；ｂ）細胞表面マーカーとして、ＤＤＲ１を示す細胞(ＤＤＲ１ポジティブ細胞)の量を測定する；ことによる、膵臓細胞を含む細胞の培養体をモニターする方法。
８．ＤＤＲ１ポジティブ細胞が、場合によってはグルカゴン及び／又はソマトスタチ及び／又は膵臓ポリペプチド生成細胞にさらに分化される細胞と共に、インスリン生成細胞にさらに分化される、実施態様１-７のいずれか一つの方法。
【０１５６】
９．膵臓細胞を含む細胞個体群が膵臓から得られる、実施態様１-７のいずれか一つの方法。
１０．膵臓細胞を含む細胞個体群が体細胞個体群である、実施態様１-７のいずれか一つの方法。
１１．体細胞個体群が、ＥＳ様細胞等の多能性様細胞への脱分化を誘発する、実施態様１０の方法。
１２．膵臓細胞を含む細胞個体群が、ＥＳ様細胞等の多能性様細胞である、実施態様１-７のいずれか一つの方法。
【０１５７】
１３．膵臓細胞を含む細胞個体群が哺乳動物由来である、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
１４．膵臓細胞を含む細胞個体群がヒト由来である、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
１５．細胞個体群が膵臓内分泌系列に分化する、実施態様１３又は１４のいずれかの方法。
１６．細胞分化が、一又は複数の分化因子(類)を含有する培地において、細胞を培養することを含む、実施態様１５の方法。
【０１５８】
１７．膵臓細胞を含む細胞個体群がＰｔｐｒｎ-ポジティブフラクションである、実施態様１-１６のいずれか一つの方法。
１８．膵臓細胞を含む細胞個体群がＡｂｃｃ８-ポジティブフラクションである、実施態様１-１６のいずれか一つの方法。
１９．膵臓細胞を含む細胞個体群がＧｌｕｔ-２／１-ポジティブフラクションである、実施態様１-１６のいずれか一つの方法。
２０．膵臓細胞を含む細胞個体群がＳｌｃ３０ａ８-ポジティブフラクションである、実施態様１-１６のいずれか一つの方法。
【０１５９】
２１．上述した実施態様のいずれかの方法により得られた膵臓内分泌細胞の培養体が、Ｐｔｐｒｎ-ポジティブフラクションにさらに分離される、実施態様１-１６のいずれか一つの方法。
２２．上述した実施態様のいずれかの方法により得られた膵臓内分泌細胞の培養体が、Ａｂｃｃ８-ポジティブフラクションにさらに分離される、実施態様１-１６のいずれか一つの方法。
２３．上述した実施態様のいずれかの方法により得られた膵臓内分泌細胞の培養体が、Ｇｌｕｔ-２／１-ポジティブフラクションにさらに分離される、実施態様１-１６のいずれか一つの方法。
２４．上述した実施態様のいずれかの方法により得られた膵臓内分泌細胞の培養体が、Ｓｌｃ３０ａ８-ポジティブフラクションにさらに分離される、実施態様１-１６のいずれか一つの方法。
２５．ＤＤＲ１結合試薬が、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体である、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
【０１６０】
２６．分離工程が蛍光標識細胞分取によりなされる、上述した実施態様のいずれか一つの方法。
２７．分離工程がパニングによりなされる、実施態様１-２６のいずれか一つの方法。
【０１６１】
２８．細胞表面マーカーとしての、ＤＤＲ１タンパク質を発現する細胞を同定又は選択するためのＤＤＲ１結合試薬の使用。
２９．膵臓内分泌細胞の培養体を得るための、細胞表面マーカーとしてのＤＤＲ１タンパク質の使用。
【０１６２】
３０．前記少なくとも一の膵臓ホルモンがインスリンである、実施態様６の方法。
３１．哺乳動物がヒトである、実施態様３０の方法。
【０１６３】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに説明されるかの如く、その全体が出典明示によりここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、決して本発明を限定するものと解するべきではない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解するべきではない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。  この発明は、適用される法律に容認される場合、ここに付加される請求項に列挙された主題事項の全ての修正点及び等価物を含む。
ここに記載の本発明は、バンダービルト大学を通し、ＮＩＨ／ＮＩＤＤＫからの付与(＃５Ｕ０１-ＤＫ０７２４７３)により支持されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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