(57)【要約】  本発明は、ヒトゲノムなどの少量の複合核酸を配列決定するため、および、例えば、配列決定エラーを低減し、ハプロタイプフェージングを実施するために、得られた配列情報を解析するための方法および組成物を提供する。
2014523233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物の複合核酸を配列決定する方法であって、
（ａ）複合核酸のサンプルを分注して、各アリコートが一定量の複合核酸を含む複数のアリコートを生成することと、
（ｂ）各アリコートからの前記一定量の複合核酸を配列決定して、各アリコートから１種または複数のリードを生成することと
（ｃ）各アリコートからの前記１種または複数のリードをアセンブルして、７０パーセント以上のコールレートで、メガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、複合核酸のアセンブルされた配列を生成することと
を含む、方法。
【請求項２】
複合核酸が哺乳類ゲノムであり、アセンブルされた配列が７０パーセント以上のゲノムコールレートおよび７０パーセント以上のエキソームコールレートを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複合核酸が少なくとも１ギガベースを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複合核酸が二本鎖である、分注する前に二本鎖複合核酸の一本鎖を分離することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
各アリコート中の前記一定量の複合核酸を断片化して、複合核酸の断片を生成することを含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
各アリコート中の複合核酸の断片をアリコート特異的タグでタグ付けすることを含み、アリコート特異的タグによって、タグ付けされた断片が出自するアリコートが決定可能である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
タグがポリヌクレオチドである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
タグがエラー修正コードまたはエラー検出コードを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タグがリード−ソロモンエラー修正コードを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列決定する前に、アリコートをプールすることを含む、請求項１または請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
配列が配列の一定位置にベースコールを含む、ベースコールが２種以上のアリコートから出自する場合に、前記ベースコールを真実と同定することを含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
生物が個体生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
アセンブルされた配列において複数の配列変異体を同定することと、配列変異体をフェージングすることとを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
複合核酸のサンプルが生物の１〜２０個の細胞または細胞から単離したゲノムＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルが１ｐｇから１０ｎｇの間の複合核酸を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
各アリコート中の前記一定量の複合核酸を増幅することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
複合核酸が、ゲノム、エキソーム、トランスクリプトーム、メチローム、異なる生物のゲノムの混合物、ある生物の異なる細胞種のゲノムの混合物およびそのサブセットからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
アセンブルされた配列が８０×以下のカバレッジを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
７０パーセント以上のコールレートで、メガベースあたり１より少ない偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、哺乳類の複合核酸のアセンブルされた配列。
【請求項２０】
生物の複合核酸を配列決定する方法であって、
（ａ）１ｐｇ〜１０ｎｇの複合核酸を含むサンプルを用意することと、
（ｂ）複合核酸を増幅して、増幅された核酸を生成することと、
（ｃ）増幅された核酸を配列決定して、複合核酸の少なくとも７０パーセントのコールレートを有する配列を生成することと
を含む、方法。
【請求項２１】
複合核酸が未精製である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
多重置換増幅によって複合核酸を増幅することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
複合核酸を少なくとも１０００倍増幅することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
サンプルが、複合核酸を含む１〜２０個の細胞を含む、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
複合核酸および細胞夾雑物を含む前記細胞を溶解することと、細胞夾雑物の存在下で複合核酸を増幅することとを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞が、高等生物の血液からの循環非血液細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
アセンブルされた配列が７０パーセントのコールレートを有する、請求項２０から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
配列がメガベースあたり２以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）サンプルを分注して、各アリコートが一定量の複合核酸を含む複数のアリコートを生成することと、
（ｂ）各アリコート中の前記一定量の複合核酸を増幅して、各アリコート中の増幅された核酸を生成することと、
（ｃ）各アリコートからの増幅された核酸を配列決定して、各アリコートから１種または複数のリードを生成することと、
（ｄ）リードをアセンブルして、配列を生成することと
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
（ｅ）各アリコート中の増幅された核酸を断片化して、各アリコート中の増幅された核酸の断片を生成することと、
（ｆ）各アリコート中の増幅された核酸の断片をアリコート特異的タグでタグ付けして、各アリコート中のタグ付けした断片を生成することと
を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
配列の一定位置のベースコールが２種以上のアリコートからのリード中に存在する場合に、前記ベースコールが真実として認められる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
生物の特徴に関して情報価値がある、配列中の配列変異を同定することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
メガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体および少なくとも７０パーセントのコールレートを有するアセンブルされた全ヒトゲノム配列であって、１ｐｇ〜１０ｎｇの間のヒトゲノムＤＮＡを配列決定することによって生成される、アセンブルされた全ヒトゲノム配列。
【請求項３４】
複数の染色体を含む個体生物のゲノムの配列変異体をフェージングする方法であって、
（ａ）前記複数の染色体各々のベクターフリー断片の混合物を含むサンプルを用意することと、
（ｂ）ベクターフリー断片を配列決定して、複数の配列変異体を含むゲノム配列を生成することと、
（ｃ）配列変異体をフェージングすることと
を含む、方法。
【請求項３５】
配列変異体の少なくとも７０パーセントをフェージングすることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ゲノム配列がゲノムの少なくとも７０パーセントのコールレートを有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
サンプルが１ｐｇ〜１０ｎｇのゲノムを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
サンプルが個体生物の１〜２０個の細胞を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
メガベースあたり１より少ない偽の単一ヌクレオチド変異体を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
複数の染色体を含む個体生物のゲノムの配列変異体をフェージングする方法であって、
（ａ）前記複数の染色体の断片を含むサンプルを用意することと、
（ｂ）断片を配列決定して、断片をベクター中にクローニングせずに、複数の配列変異体を含む全ゲノム配列を生成することと、
（ｃ）配列変異体をフェージングすることと
を含む、方法。
【請求項４１】
配列変異体をフェージングすることが全ゲノム配列のアセンブリの間に起こる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ヒトゲノムを配列決定する方法であって、
（ａ）ヒトゲノムＤＮＡのサンプルを分注して、各アリコートが一定量のＤＮＡを含む複数のアリコートを生成することと、
（ｂ）各アリコートからの前記一定量のＤＮＡを配列決定して、各アリコートから１種または複数のリードを生成することと、
（ｃ）各アリコートからの前記１種または複数のリードをアセンブルして、第１のアセンブルされた配列を生成することと、
（ｄ）第１のアセンブルされた配列における複数の配列変異体を同定することと、
（ｅ）配列変異体のうち少なくとも３種をフェージングすることと、
（ｆ）エラーとして、前記少なくとも２種のその他の配列変異体のフェージングと一致しない配列変異体を同定し、それによって第２のアセンブルされた配列を生成することと
を含み、第２のアセンブルされた配列が、７０パーセント以上のコールレートでメガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、方法。
【請求項４３】
ヒトゲノムを配列決定する方法であって、
（ａ）ヒトゲノムＤＮＡのサンプルを分注して、各アリコートが一定量のＤＮＡを含む複数のアリコートを生成することと、
（ｂ）各アリコート中の前記一定量のＤＮＡを断片化して、各アリコート中のＤＮＡ断片を生成することと、
（ｃ）各アリコート中のＤＮＡ断片をアリコート特異的タグでタグ付けし、それによって、タグ付けされたＤＮＡ断片が出自するアリコートが決定可能となることと、
（ｄ）各アリコートからのタグ付けされたＤＮＡ断片を配列決定して、各アリコートから１種または複数のリードを生成することと、
（ｅ）各アリコートからの前記１種または複数のリードをアセンブルして、７０パーセント以上のコールレートでメガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含むアセンブルされた配列を生成することと
を含み、前記アセンブルされた配列の一定位置の塩基が、予備的ベースコールに基づいて、２種以上のアリコートからの位置にコールされる、方法。
【請求項４４】
ヒトゲノムを配列決定する方法であって、
（ａ）ヒトゲノムＤＮＡのサンプルを分注して、各アリコートが一定量のＤＮＡを含む複数のアリコートを生成することと、
（ｂ）各アリコート中の前記一定量のＤＮＡを断片化して、各アリコート中のＤＮＡ断片を生成することと、
（ｃ）各アリコート中のＤＮＡ断片をアリコート特異的タグでタグ付けし、アリコート特異的タグによって、タグ付けされたＤＮＡ断片が出自するアリコートが決定可能となることと、
（ｄ）各アリコートからの前記一定量のＤＮＡを配列決定して、各アリコートから１種または複数のリードを生成することと、
（ｅ）各アリコートからの前記１種または複数のリードをアセンブルして、第１のアセンブルされた配列を生成することと、
（ｆ）（ｉｉ）前記第１のアセンブルされた配列の一定位置に、２種以上のアリコートからの前記一定位置についての予備的ベースコールに基づいて、塩基をコールすること、ならびに
（ｉｉｉ）前記第１のアセンブルされた配列中の複数の配列変異体を同定すること、配列変異体のうち少なくとも３つをフェージングすること、および少なくとも２種のその他の配列変異体のフェージングと一致しない配列変異体をエラーと同定することによって、
第１のアセンブルされた配列中のエラーを低減して、第２のアセンブルされた配列を生成することと
を含み、第２のアセンブルされた配列が７０パーセント以上のコールレートでメガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／５１７，１９６号の優先権の利益を主張し、これは参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、２０１１年８月２５日に出願された米国仮特許出願第６１／５２７，４２８号の優先権の利益を主張し、これは参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本出願は、２０１１年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／５４６，５１６号の優先権の利益を主張し、これは参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０００４】
本出願は、２０１２年４月１３日に出願された米国特許出願第１３／４４７，０８７号の優先権を主張し、これは参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００５】
複合核酸の解析の改善された技術、特に、例えば、配列正確性を改善する方法および核酸増幅によって導入された多数のエラーを有する配列を解析する方法が必要である。
【０００６】
さらに、高等生物のゲノムへの親の寄与を決定するための改善された方法、すなわち、ヒトゲノムのハプロタイプフェージングが必要である。計算法および実験的フェージングを含めたハプロタイプフェージングの方法は、Browning and Browning, Nature Reviews Genetics 12:703-7014, 2011に概説されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、とりわけ、少量の複合核酸（本明細書において定義されるような）を配列決定するための、またエラーを低減し、ハプロタイプフェージングを実施するために得られた配列情報を解析するための方法および組成物を提供する。一例として、複合核酸を、例えば、５〜２０個のヒト細胞からのゲノムＤＮＡで始め、１０００倍より多く増幅させた後でさえ、完全にハプロタイプである高度に正確な全ゲノム配列が製造された。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によれば、生物（例えば、単一の、個体生物であろうと、２頭以上の個体を含む集団であろうと、ヒトなどの哺乳類）の複合核酸を配列決定するための方法が提供され、このような方法は、（ａ）複合核酸のサンプルを分注して、各アリコートが一定量の複合核酸を含む複数のアリコートを生成することと、（ｂ）各アリコートからの一定量の複合核酸を配列決定して、各アリコートから１種または複数のリードを生成することと、（ｃ）各アリコートからのリードをアセンブルして、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０または９５パーセント以上のコールレートで、メガベースあたり１、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０８、０．０６、０．０４以下またはそれより少ない偽の単一ヌクレオチド変異体を含む複合核酸のアセンブルされた配列を生成することとを含む。複合核酸が、哺乳類（例えば、ヒト）ゲノムである場合には、アセンブルされた配列は、所望により、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０または９５パーセント以上のゲノムコールレートおよび少なくとも７０、７５、８０、８５、９０または９５パーセント以上のエキソームコールレートを有する。一実施形態によれば、複合核酸は、少なくとも１ギガベースを含む。特定の実施形態では、複合核酸は、複数の異なる染色体を含むゲノムである。
【０００９】
本発明の一態様によれば、（ａ）１ｐｇ〜１０ｎｇの複合核酸を含むサンプルを提供することと、（ｂ）複合核酸を増幅して、増幅された核酸を得ることと、（ｃ）増幅された核酸を配列決定して、複合核酸の少なくとも７０パーセントのコールレートを有する配列を生成することとを含む、生物の複合核酸を配列決定するための方法が提供される。
【００１０】
本発明の一態様では、（ａ）ヒトゲノムＤＮＡのサンプルを分注して、各アリコートが一定量のＤＮＡを含む複数のアリコートを生成することと、（ｂ）各アリコートからの前記一定量のＤＮＡを配列決定して、各アリコートから１種または複数のリードを生成することと、（ｃ）各アリコートからの前記１種または複数のリードをアセンブルして、第１のアセンブルされた配列を生成することと、（ｄ）第１のアセンブルされた配列における複数の配列変異体を同定することと、（ｅ）配列変異体のうち少なくとも３種をフェージングすることと、（ｆ）前記少なくとも２種のその他の配列変異体のフェージングと一致しない配列変異体をエラーと同定し、それによって第２のアセンブルされた配列を生成することとを含み、第２のアセンブルされた配列が７０パーセント以上のコールレートでメガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、ヒトゲノムである複合核酸を配列決定するための方法が提供される。
【００１１】
本発明の一態様によれば、（ａ）ヒトゲノムＤＮＡのサンプルを分注して、各アリコートが一定量のＤＮＡを含む複数のアリコートを生成することと、（ｂ）各アリコート中の前記一定量のＤＮＡを断片化して、各アリコート中のＤＮＡ断片を生成することと、（ｃ）各アリコート中のＤＮＡ断片をアリコート特異的タグでタグ付けし、それによって、タグ付けされたＤＮＡ断片が出自するアリコートが決定可能となることと、（ｄ）各アリコートからのタグ付けされたＤＮＡ断片を配列決定して、各アリコートから１種または複数のリードを生成することと、（ｅ）各アリコートからの前記１種または複数のリードをアセンブルして、７０パーセント以上のコールレートでメガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含むアセンブルされた配列を生成することとを含み、前記アセンブルされた配列の一定位置に、２種以上のアリコートからの前記一定位置についての予備的ベースコールに基づいて、塩基がコールされる、ヒトゲノムである複合核酸を配列決定するための方法が提供される。
【００１２】
本発明の一態様によれば、（ａ）ヒトゲノムＤＮＡのサンプルを分注して、各アリコートが一定量のＤＮＡを含む複数のアリコートを生成することと、（ｂ）各アリコート中の前記一定量のＤＮＡを断片化して、各アリコート中のＤＮＡ断片を生成することと、（ｃ）各アリコート中のＤＮＡ断片をアリコート特異的タグでタグ付けし、それによって、タグ付けされたＤＮＡ断片が出自するアリコートが決定可能となることと、（ｄ）各アリコートからの前記一定量のＤＮＡを配列決定して、各アリコートから１種または複数のリードを生成することと、（ｅ）各アリコートからの前記１種または複数のリードをアセンブルして、第１のアセンブルされた配列を生成することと、（ｆ）（ｉ）前記第１のアセンブルされた配列の一定位置に、２種以上のアリコートからの前記一定位置についての予備的ベースコールに基づいて、塩基をコールすること、ならびに（ｉｉ）前記第１のアセンブルされた配列中の複数の配列変異体を同定すること、配列変異体のうち少なくとも３つをフェージングすること、および少なくとも２種のその他の配列変異体のフェージングと一致しない配列変異体をエラーと同定することによって、第１のアセンブルされた配列中のエラーを低減して、第２のアセンブルされた配列を生成することとを含み、第２のアセンブルされた配列が、７０パーセント以上のコールレートでメガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、ヒトゲノムである複合核酸を配列決定するための方法が提供される。
【００１３】
このような方法の一実施形態によれば、複合核酸は、二本鎖であり、方法は、分注する前に二本鎖複合核酸の一本鎖を分離することを含む。
【００１４】
別の実施形態によれば、このような方法は、各アリコート中の複合核酸の量を断片化して、複合核酸の断片を生成することを含む。一実施形態によれば、このような方法は、各アリコート中の複合核酸の断片をアリコート特異的タグ（またはアリコートのセットに特異的なタグ）でタグ付けし、それによって、タグ付けされた断片が出自するアリコートが決定可能となることをさらに含む。一実施形態では、このようなタグは、例えば、それだけには限らないが、リード−ソロモンエラー修正コードを含めたエラー修正コードまたはエラー検出コードを含むタグを含むポリヌクレオチドである。
【００１５】
別の実施形態によれば、このような方法は、配列決定する前にアリコートをプールすることを含む。その他の実施形態では、アリコートは、プールされない。
【００１６】
このような方法の別の実施形態によれば、配列は、配列の一定位置にベースコールを含み、このような方法は、ベースコールが２種以上のアリコートから出自するか、または２種以上のアリコートから出自する３種以上のリードから出自する場合にベースコールを真実と同定することを含む。
【００１７】
別の実施形態によれば、このような方法は、アセンブルされた配列中で複数の配列変異体を同定することと、配列変異体をフェージングすることとを含む。
【００１８】
このような方法の別の実施形態によれば、複合核酸のサンプルは、生物の１〜２０個の細胞または精製されていても、精製されていなくてもよい細胞から単離されたゲノムＤＮＡを含む。別の実施形態によれば、サンプルは、１ｐｇ〜１００ｎｇの間、例えば、約１ｐｇ、約６ｐｇ、約１０ｐｇ、約１００ｐｇ、約１ｎｇ、約１０ｎｇもしくは約１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、または１ｐｇ〜１ｎｇまたは１ｐｇ〜１００ｐｇまたは６ｐｇ〜１００ｐｇを含む。参照目的には、単一ヒト細胞は、およそ６．６ｐｇのゲノムＤＮＡを含有する。
【００１９】
別の実施形態によれば、このような方法は、各アリコート中の複合核酸の量を増幅することを含む。
【００２０】
このような方法の別の実施形態によれば、複合核酸は、ゲノム、エキソーム、トランスクリプトーム、メチローム、異なる生物のゲノムの混合物、ある生物の異なる細胞種のゲノムの混合物およびそのサブセットからなる群から選択される。
【００２１】
このような方法の別の実施形態によれば、アセンブルされた配列は、８０ｘ、７０ｘ、６０ｘ、５０ｘ、４０ｘ、３０ｘ、２０ｘ、１０ｘまたは５ｘのカバレッジを有する。長いリードでは、低いカバレッジが使用され得る。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、７０パーセント以上のコールレートで、メガベースあたり１より少ない偽の単一ヌクレオチド変異体を含む、哺乳類の複合核酸のアセンブルされた配列が提供される。
【００２３】
このような方法によれば、複合核酸は精製されていない。別の実施形態によれば、このような方法は、多重置換増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって複合核酸を増幅することを含む。別の実施形態によれば、このような方法は、複合核酸を少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００または１００，０００倍またはそれ以上に増幅することを含む。このような方法の別の実施形態によれば、サンプルは、複合核酸を含む１〜２０個の細胞（または細胞核）を含む。別の実施形態によれば、このような方法は、複合核酸および細胞夾雑物を含む細胞（または核）を溶解することと、細胞夾雑物の存在下で複合核酸を増幅することとを含む。このような方法の別の実施形態によれば、細胞は、高等生物の血液からの循環非血液細胞である。このような方法の別の実施形態によれば、アセンブルされた配列は、少なくとも７０、７５、８０、８５、９０または９５パーセント以上のコールレートを有する。このような方法の別の実施形態によれば、配列は、メガベースあたり、２、１、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０８、０．０６、０．０４またはそれより少ない偽の単一ヌクレオチド変異体を含む。別の実施形態によれば、このような方法は、サンプルを分注して、各アリコートが一定量の複合核酸を含む複数のアリコートを生成することと、各アリコート中の前記一定量の複合核酸を増幅して、各アリコート中の増幅された核酸を生成することと、各アリコートからの増幅された核酸を配列決定して、各アリコートから１種または複数のリードを生成することと、リードをアセンブルして、配列を生成することとをさらに含む。
【００２４】
別の実施形態によれば、このような方法は、各アリコート中の増幅された核酸を断片化して、各アリコート中の増幅された核酸の断片を生成することと、各アリコート中の増幅された核酸の断片をアリコート特異的タグでタグ付けして、各アリコート中のタグ付けされた断片を生成することとをさらに含む。このような方法の別の実施形態によれば、配列の一定位置でのベースコールは、２種以上のアリコート、または、一部の実施形態では、３種以上のアリコート、４種以上のアリコート、５種以上のアリコートもしくは６種以上のアリコートからのリード中に存在する場合に真実と認められる。このような方法の別の実施形態によれば、配列の一定位置のベースコールは、２種以上のアリコートからのリード中に３回以上存在する場合に真実と認められる。別の実施形態によれば、このような方法は、生物の特徴（例えば、医学的状態）に関して情報価値がある、配列中の配列変異を同定することをさらに含む。別の実施形態によれば、細胞は、それだけには限らないが、母体の血液からの胎児細胞を含めた高等生物の血液（またはその他のサンプル）からの循環非血液細胞および癌を有する患者の血液からの癌細胞である。本発明の別の実施形態によれば、複合核酸は、循環核酸（ＣＮＡ）である。したがって、評価されるべき生物の特徴は、癌の存在および癌に関する情報を、生物が妊娠しているかどうか、妊娠個体によって保有される胎児に関する性別または遺伝情報を含み得る。例えば、このような方法は、疾患の見込み、医療診断または予後などと相関している、単一塩基変異、挿入、欠失、コピー数変異、構造変異または再構成などを同定するのに有用である。本発明の別の実施形態によれば、（ａ）胚の約１〜２０個の間の細胞を用意することと、（ｂ）前記細胞のゲノムＤＮＡを配列決定することによって生成される、少なくとも８０パーセントのコールレートを有するアセンブルされた配列を得ることと、（ｃ）アセンブルされた配列を参照配列と比較して、胚の遺伝子状態を評価することとを含む、胚の遺伝子状態（例えば、性別、父系性、遺伝子異常または疾病素因と関連している遺伝子型の有無など）を評価するための方法が提供される。例えば、このような方法は、疾患の見込み、医療診断または予後などと相関している、単一塩基変異、挿入、欠失、コピー数変異、構造変異または再構成などを同定するのに有用である。別の実施形態によれば、（ａ）胚の約１〜２０個の間の細胞を用意することと、（ｂ）前記細胞のゲノムＤＮＡを配列決定することによって生成される、少なくとも８０パーセントのコールレートを有するアセンブルされた配列を得ることと、（ｃ）アセンブルされた配列を参照配列と比較して、胚の遺伝子状態を評価することとを含む、胚の遺伝子状態（例えば、性別、父系性、遺伝子異常または疾病素因と関連している遺伝子型の有無など）を評価するための方法が提供される。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、アセンブルされた全ヒトゲノム配列が提供され、配列は、メガベースあたり１以下の偽の単一ヌクレオチド変異体および少なくとも７０パーセントのコールレートを含み、配列は、１ｐｇ〜１０ｎｇの間のヒトゲノムＤＮＡを配列決定することによって生成される。
【００２６】
本発明の別の態様によれば、複数の染色体を含む個体生物のゲノムの配列変異体をフェージングするための方法が提供され、方法は、（ａ）前記複数の染色体各々のベクターフリー断片の混合物を含むサンプルを用意することと、（ｂ）ベクターフリー断片を配列決定して、複数の配列変異体を含むゲノム配列を生成することと、（ｃ）配列変異体をフェージングすることとを含む。一実施形態によれば、このような方法は、配列変異体のうち少なくとも７０、７５、８０、８５、９０または９５パーセントまたはそれ以上をフェージングすることを含む。このような方法の別の実施形態によれば、ゲノム配列は、ゲノムの少なくとも７０パーセントのコールレートを有する。このような方法の別の実施形態によれば、サンプルは、個体生物の１ｐｇ〜１０ｎｇのゲノム、または１〜２０個の細胞を含む。このような方法の別の実施形態によれば、ゲノム配列は、メガベースあたり１より少ない偽の単一ヌクレオチド変異体を有する。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、複数の染色体を含む個体生物のゲノムの配列変異体をフェージングするための方法が提供され、方法は、前記複数の染色体の断片を含むサンプルを用意することと、断片を配列決定して、断片をベクター中にクローニングせずに、複数の配列変異体を含む全ゲノム配列を生成することと、配列変異体をフェージングすることとを含む。このような方法の一実施形態によれば、配列変異体をフェージングすることは、全ゲノム配列のアセンブリの間に起こる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、配列決定システムの例を示す。
【図２】図２は、配列決定機器および／またはコンピュータシステム中か、またはそれとともに使用され得るコンピューティングデバイスの例を示す。
【図３】図３は、ＬＦＲアルゴリズムの全体構造を示す。
【図４】図４は、近くのヘテロ接合性ＳＮＰの対解析を示す。
【図５】図５は、仮説の選択および仮説へのスコアの割り当ての例を示す。
【図６】図６は、グラフ構築を示す。
【図７】図７は、グラフ最適化を示す。
【図８】図８は、コンティグアラインメントを示す。
【図９】図９は、親を利用したユニバーサルフェージングを示す。
【図１０】図１０は、天然のコンティグ分離を示す。
【図１１】図１１は、ユニバーサルフェージングを示す。
【図１２】図１２は、ＬＦＲを使用するエラー検出を示す。
【図１３】図１３は、少数のリードにもかかわらず確信のあるヘテロ接合性ＳＮＰコールがなされ得る、偽陰性の数を低減する方法の一例を示す。
【図１４】図１４は、ハプロタイプ分解的なクローンカバレッジを使用する、ヒト胚におけるＣＴＧリピート拡大の検出を示す。
【図１５】図１５は、実施例１に記載される多重置換増幅（ＭＤＡ）プロトコールを使用した、精製ゲノムＤＮＡ標準（１．０３１、８．２５および６６ピコグラム［ｐｇ］）およびＰＶＰ４０の１または１０個の細胞の増幅を示すグラフである。
【図１６】図１６は、２種のＭＤＡプロトコールを使用する増幅から得られたＧＣバイアスに関するデータを示す。全プレートにわたる平均サイクル数を求め、個々のマーカー各々からそれを差し引いて「Δサイクル」数を計算した。Δサイクルを、各マーカーの周囲の１０００塩基対のＧＣ含量に対してプロットして、各サンプルの相対ＧＣバイアスを示した（図示せず）。各Δサイクルの絶対値を合計して、「Δの合計」測定値を作成した。低いΔの合計およびＧＣ含量に対するデータの相対的に平坦なプロットは、よく表された全ゲノム配列をもたらす。Δの合計は、本発明者らのＭＤＡ法について６１であり、ＳｕｒｅＰｌｅｘによって増幅されたＤＮＡについては２８７であり、これは、本発明者らのプロトコールがＳｕｒｅＰｌｅｘプロトコールよりもかなり少ないＧＣバイアスをもたらしたということを示す。
【図１７】図１７は、サンプル７Ｃおよび１０Ｃのゲノムカバレッジを示す。カバレッジは、ハプロイドゲノムカバレッジに正規化された１００キロベースカバレッジウィンドウの１０メガベース移動平均を使用してプロットした。コピー数１および３の破線は、それぞれ、ハプロイドおよび三倍体コピー数を表す。両胚とも男性であり、ＸおよびＹ染色体のハプロイドコピー数を有する。全染色体または染色体の大きなセグメントのその他の喪失または獲得は、これらのサンプルでは明らかではなかった。
【図１８】図１８は、本発明の方法において使用するためのバーコードアダプター設計の実施形態の概略図である。ＬＦＲアダプターは、独特の５’バーコードアダプターと、一般的な５’アダプターと、一般的な３’アダプターとからなる。一般的なアダプターは、３’断片とライゲーションできない３’ジデオキシヌクレオチドを用いて両方とも設計されており、これによって、アダプター二量体形成が排除される。ライゲーション後、アダプターのブロックされた部分を除去し、ブロックされていないオリゴヌクレオチドと置換する。残存するニックを、その後のＴａｑポリメラーゼを用いるニックトランスレーションおよびＴ４リガーゼを用いるライゲーションによって回復させる。
【図１９】図１９は、累積ＧＣカバレッジプロットを示す。ＬＦＲおよび標準ライブラリーのＧＣの累積カバレッジを、プロットして、ＧＣバイアスの相違を比較した。サンプルＮＡ１９２４０（ａおよびｂ）について、３種のＬＦＲライブラリー（複製１「Ａ」、複製２「Ｂ」および１０細胞「Ｃ」）および全ゲノム（ｃ）およびコーディングのみの部分（ｄ）の両方について１種の標準ライブラリーがプロットされている。すべてのＬＦＲライブラリーにおいて、高ＧＣ領域中のカバレッジの喪失が明らかであり、これは、高割合のＧＣリッチ領域を含有するコーディング領域（ｂおよびｄ）においてより明白である。
【図２０】図２０は、ゲノムアセンブリ間のハプロタイプ解析性能の比較を示す。標準およびＬＦＲがアセンブルされたライブラリーの変異体コールを組み合わせ、指定されている場合を除きフェージングのための遺伝子座として使用した。ＬＦＲフェージング率は、親のフェージングされたヘテロ接合性ＳＮＰの算出に基づいていた。＊親のゲノムデータのない個体については（ＮＡ１２８９１、ＮＡ１２８９２およびＮＡ２０４３１）、フェージング率は、フェージングされたヘテロ接合性ＳＮＰの数を、真実であると予測されるヘテロ接合性ＳＮＰ数（フェージングされるよう試みられるＳＮＰの数−５０，０００の予測されたエラー）で除することによって算出した。Ｎ５０算出は、ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ３６（ＮＡ１９２４０  １０個の細胞および高カバレッジならびにＮＡ２０４３１高カバレッジの場合にはｂｕｉｌｄ３７）ヒト参照ゲノムに対するすべてのコンティグの合計のアセンブルされた長さに基づいている。ハプロイド断片カバレッジは、一本鎖に変性され、その後、３８４ウェルプレート中に分散されているすべてのＤＮＡの結果としての細胞数よりも４倍大きい。不十分な量の出発ＤＮＡによって、ＮＡ２０４３１ゲノムにおけるより低いフェージング効率が説明される。＃１０個の細胞のサンプルを、１０個を超える細胞を含有するよう個々の十分なカバレッジによって測定し、これは、これらの細胞が、収集の間に種々のステージの細胞周期にあるという結果である可能性が高い。フェージング率は、８４％〜９７％の範囲であった。
【図２１】図２１は、ＬＦＲハプロタイプ解析アルゴリズムを示す。（ａ）変異抽出：アリコートタグがつけられたリードから変異を抽出する。１０塩基のリード−ソロモンコードは、エラー修正によってタグ回復を可能にする。（ｂ）ヘテロ接合性ＳＮＰ対結合性評価：共有されるアリコートのマトリックスは、特定の区域内の各ヘテロ接合性ＳＮＰ対について計算される。ループ１は、１つの染色体上のすべてのヘテロ接合性ＳＮＰ全体にわたっている。ループ２は、ループ１中のヘテロ接合性ＳＮＰの区域中にある染色体上のすべてのヘテロ接合性ＳＮＰ全体にわたっている。この区域は、ヘテロ接合性ＳＮＰの予測される数および予測される断片長によって制約される。（ｃ）グラフ作成：方向のないグラフを、ヘテロ接合性ＳＮＰに対応するノードおよびそれらのＳＮＰ間の関係の最良の仮説の配向および強度に対応する結合を用いて作成する。（本明細書において、「ノード」とは、ポリヌクレオチド配列中のベースコールまたはその他の配列変異体（例えば、ヘテロまたはインデル）に相当する１種または複数の値を有し得るデータ［データ項目またはデータオブジェクト］である）。配向は、二元性である。図２１は、それぞれ、ヘテロ接合性ＳＮＰ対間の反対方向にされた関係、および反対方向にされていない関係を表す。強度は、共有されるアリコートマトリックスの要素に関してファジー論理演算を使用することによって定義される。（ｄ）グラフ最適化：グラフを最小全域木によって最適化する。（ｅ）コンティグ作製：各部分木を、第１のヘテロ接合性ＳＮＰを変更せずに維持することおよび第１のヘテロ接合性ＳＮＰへのそのパスに基づいて部分木上のその他のヘテロ接合性ＳＮＰを反転することまたは反転しないことによってコンティグへと減少させる。各コンティグへの親１（Ｐ１）および親２（Ｐ２）の指定は、任意である。染色体レベルの木中のギャップは、その染色体上の異なる部分木／コンティグの境界を規定する。（ｆ）ＬＦＲコンティグの親染色体へのマッピング：親の情報を使用して、各コンティグのＰ１およびＰ２ハプロタイプ上に母または父標識をおく。
【図２２】図２２は、複製ＬＦＲライブラリー間のハプロタイプ不一致を示す。サンプルＮＡ１２８７７およびＮＡ１９２４０からの２種の複製ライブラリーを、すべての共有されるフェージングされたヘテロ接合性ＳＮＰ遺伝子座で比較した。最もフェージングされた遺伝子座が２種のライブラリー間で共有されるので、これは包括的比較である。
【図２３】図２３は、ＬＦＲによって可能となるエラー低減を示す。単独またはＬＦＲコールと組み合わせた標準ライブラリーヘテロ接合性ＳＮＰコールを、複製ＬＦＲライブラリーによって独立にフェージングした。一般に、ＬＦＲは、およそ１０倍多い偽陽性変異体コールを導入した。これは、ｐｈｉ２９に基づいた多重置換増幅の際の不正確な塩基の確率的組込みの結果として起こった可能性が最も高い。ヘテロ接合性ＳＮＰコールが、フェージングされる必要があり、３以上の独立ウェル中に見られる場合には、エラー低減は、目覚しく、結果は、エラー修正を行わない標準ライブラリーよりも良好であることが重要である。ＬＦＲは、標準ライブラリーからも同様にエラーを除去し、コール正確性をおよそ１０倍改善できる。
【図２４】図２４は、コールがない位置でのＬＦＲ再コーリングを示す。コールがない位置を救出するＬＦＲの可能性を実証するために、標準ソフトウェアによってコールされない（非コール）染色体１８上の３つの例示位置を選択した。それらを、ＬＦＲコンティグの一部であるＣ／Ｔヘテロ接合性ＳＮＰを用いてフェージングすることによって、これらの位置が部分的にかまたは完全にコールされる。共有されるウェル（対中の２つの塩基の各々について少なくとも１つのリードを有するウェル；遺伝子座の評価される対について１６対の塩基がある）の分布によって、３つのＮ／Ｎ位置のＡ／Ｎ、Ｃ／ＣおよびＴ／Ｃコールへの再コーリングが可能となり、Ｃ−Ａ−Ｃ−ＴおよびＴ−Ｎ−Ｃ−Ｃをハプロタイプとして定義する。ウェル情報を使用することによって、ウェル情報がない場合よりも約３倍少ない２〜３の予測されるウェル中に見られる場合に、ＬＦＲが、わずか２〜３のリードを用いて対立遺伝子を正確にコールすることが可能となる。
【図２５】図２５は、解析されたサンプル各々の中の複数の有害な変異を有する遺伝子の数を示す。
【図２６】図２６は、ＮＡ２０４３１における対立遺伝子発現の相違およびＴＦＢＳ変更ＳＮＰを有する遺伝子を示す。発現において有意な対立遺伝子の相違を実証した遺伝子の包括的でないリストのうち、６種の遺伝子が、ＴＦＢＳを変更し、対立遺伝子間で見られる発現の相違と相関するＳＮＰを有すると見出された。すべての位置は、ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  ３７に関連して与えられている。「ＣＤＳ」は、コード配列を表し、「ＵＴＲ３」は、３’非翻訳領域を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書において、および添付の特許請求の範囲において、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に他を示すのでない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「ポリメラーゼ」への言及は、１種の物質またはこのような物質の混合物を指し、「方法」への言及は、当業者に公知の同等の工程および／または方法への言及を含むなど。
【００３０】
別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるすべての刊行物は、刊行物中に記載され、目下記載される本発明と関連して使用される可能性のあるデバイス、組成物、製剤および方法論を説明および開示する目的で、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３１】
値の範囲が提供される場合には、その範囲の上限と下限の間の中間の値は各々、文脈が明確に他を示さない限り、下限の単位の１０分の１まで、および記載される任意のその他のものまたはその記載される範囲中の中間の値は、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立に、同様に本発明内に包含されるより小さい範囲中に含まれる場合もあり、記載された範囲中の任意の具体的に除外される限界の影響下にある場合もある。記載された範囲が、限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明中に含まれる。
【００３２】
以下の説明では、本発明のより完全な理解を提供するよう、多数の具体的な詳細が示されている。しかし、本発明が、これらの具体的な詳細のうち１種または複数を用いずに実施され得ることは当業者には明らかであろう。その他の例では、当業者に周知の特徴および手順は、本発明を曖昧にすることを避けるために説明されていない。
【００３３】
本発明は、主に特定の実施形態を参照して記載されるが、本開示内容を読むと、その他の実施形態が当業者に明らかとなると想定され、このような実施形態は、本発明の方法内に含有されるものとする。
【００３４】
複合核酸を配列決定する方法
概要
本発明の一態様によれば、複合核酸を配列決定する方法が提供される。本発明の特定の実施形態によれば、極めて少量のこのような複合核酸、例えば、１ｐｇ〜１０ｎｇを配列決定するための方法が提供される。増幅後でさえ、このような方法は、高いコールレートおよび正確性を特徴とするアセンブルされた配列をもたらす。その他の実施形態によれば、複合核酸の配列決定においてエラーを同定および排除するために、分注が使用される。別の実施形態によれば、ＬＦＲが複合核酸の配列決定に関連して使用される。
【００３５】
本発明の実施は、特に断りのない限り、当技術分野の技術の範囲内にある、有機化学、高分子技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術および説明を使用し得る。このような従来の技術として、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび標識を使用するハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。適した技術の具体的な例示は、本明細書において以下の実施例を参照することによって行われ得る。しかし、その他の同等の従来の手順ももちろん使用され得る。このような従来の技術および説明は、Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I〜IV),、Using Antibodies: A Laboratory Manual,Cells: A Laboratory Manual、PCR Primer: A Laboratory ManualおよびMolecular Cloning: A Laboratory Manual （すべてCold Spring Harbor Laboratory Pressから）、Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, New York, Gait, "Oligonucleotides Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London、Nelson and Cox (2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.およびBerg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y.などの標準実験マニュアルに見出すことができ、それらのすべてが、すべての目的について参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【００３６】
本発明の組成物および方法を使用して、標的核酸を配列決定するための全体的な方法が本明細書に、および例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１０５０５２号およびＵＳ２００７０９９２０８および米国特許出願第１１／６７９，１２４号（ＵＳ２００９／０２６４２９９として公開された）；同１１／９８１，７６１号（ＵＳ２００９／０１５５７８１）；同１１／９８１，６６１号（ＵＳ２００９／０００５２５２）；同１１／９８１，６０５号（ＵＳ２００９／００１１９４３）；同１１／９８１，７９３号（ＵＳ２００９−０１１８４８８）；同１１／４５１，６９１号（ＵＳ２００７／００９９２０８）；同１１／９８１，６０７号（ＵＳ２００８／０２３４１３６）；同１１／９８１，７６７号（ＵＳ２００９／０１３７４０４）；同１１／９８２，４６７号（ＵＳ２００９／０１３７４１４）；同１１／４５１，６９２号（ＵＳ２００７／００７２２０８）；同１１／５４１，２２５号（ＵＳ２０１０／００８１１２８；同１１／９２７，３５６号（ＵＳ２００８／０３１８７９６）；同１１／９２７，３８８号（ＵＳ２００９／０１４３２３５）；同１１／９３８，０９６号（ＵＳ２００８／０２１３７７１）；同１１／９３８，１０６号（ＵＳ２００８／０１７１３３１）；同１０／５４７，２１４号（ＵＳ２００７／００３７１５２）；同１１／９８１，７３０号（ＵＳ２００９／０００５２５９）；同１１／９８１，６８５号（ＵＳ２００９／００３６３１６）；同１１／９８１，７９７号（ＵＳ２００９／００１１４１６）；同１１／９３４，６９５号（ＵＳ２００９／００７５３４３）；同１１／９３４，６９７号（ＵＳ２００９／０１１１７０５）；同１１／９３４，７０３号（ＵＳ２００９／０１１１７０６）；同１２／２６５，５９３号（ＵＳ２００９／０２０３５５１）；同１１／９３８，２１３号（ＵＳ２００９／０１０５９６１）；同１１／９３８，２２１号（ＵＳ２００８／０２２１８３２）；同１２／３２５，９２２号（ＵＳ２００９／０３１８３０４）；同１２／２５２，２８０号（ＵＳ２００９／０１１１１１５）；同１２／２６６，３８５号（ＵＳ２００９／０１７６６５２）；同１２／３３５，１６８号（ＵＳ２００９／０３１１６９１）；同１２／３３５，１８８号（ＵＳ２００９／０１７６２３４）；同１２／３６１，５０７号（ＵＳ２００９／０２６３８０２）、同１１／９８１，８０４号（ＵＳ２０１１／０００４４１３）；および同１２／３２９，３６５号；公開国際特許出願番号ＷＯ２００７１２０２０８、ＷＯ２００６０７３５０４およびＷＯ２００７１３３８３１に記載され、それらのすべては、すべての目的について参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。参照ポリヌクレオチド配列と比較されたポリヌクレオチド配列中の変異をコールするための例示的方法およびポリヌクレオチド配列アセンブリ（または再アセンブリ）のための例示的方法は、例えば、すべての目的のためにその全文が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公報第２０１１−０００４４１３号、（出願番号第１２／７７０，０８９号）において提供されている。Drmanac et al., Science 327,78-81, 2010も参照のこと。"Identification Of DNA Fragments And Structural Variations"と題された同時���属関連出願番号第６１／６２３，８７６号および"Processing and Complex Nucleic Acid Sequence Data"と題された第１３／４４７，０８７号も、同様に、その全文が、すべての目的のために参照により組み込まれる。
【００３７】
本方法は、サンプルから標的核酸を抽出することおよび断片化することを含む。一般に、１種または複数のアダプターを含む標的核酸鋳型を製造するために、断片化された核酸が使用される。標的核酸鋳型は、増幅方法に付されて、普通、表面上に配置される核酸ナノボールを形成する。配列決定適用は、普通、コンビナトリアルプローブアンカーライゲーション（「ｃＰＡＬ」）法を含めたライゲーション技術によって配列決定することによって本発明の核酸ナノボール上で実施され、これは、以下にさらに詳細に記載される。本発明の核酸コンストラクト中に単一ヌクレオチド多型（「ＳＮＰ」）を含むなどの特定の配列（核酸ナノボールならびに直鎖および環状核酸鋳型を含む）を検出するために、ｃＰＡＬおよびその他の配列決定法も使用され得る。上記で参照された特許出願およびDrmanac et al.による引用論文は、例えば、アダプター設計、環状ライブラリーコンストラクトを製造するためのゲノムＤＮＡ断片へのアダプターの挿入、ＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）を製造するためのこのようなライブラリーコンストラクトの増幅、固相支持体上でのＤＮＢのアレイの製造、ｃＰＡＬ配列決定などを含めた核酸鋳型の調製に関するさらなる詳細な情報を提供し、これらは本明細書に開示された方法に関連して使用される。
【００３８】
本明細書において、用語「複合核酸」とは、同一でない核酸またはポリヌクレオチドの大きな集団を指す。特定の実施形態では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ；エキソームＤＮＡ（ゲノム中のエキソンのセットを含有する転写される配列が濃縮された全ゲノムＤＮＡのサブセット）；トランスクリプトーム（すなわち、細胞もしくは細胞集団中で製造されるすべてのｍＲＮＡ転写物のセットまたはこのようなｍＲＮＡから製造されたｃＤＮＡ）、メチローム（すなわち、ゲノム中のメチル化部位およびメチル化パターンの集団）；ミクロビオーム；異なる生物のゲノムの混合物、ある生物の異なる細胞種のゲノムの混合物；および前述の種類の複合核酸のサブセットを含めた、多数の異なる核酸分子を含むその他の複合核酸混合物（例として、それだけには限らないが、ミクロビオーム、異種移植片、正常および腫瘍細胞の両方を含む固形腫瘍生検などが挙げられる）である。一実施形態では、このような複合核酸は、少なくとも１ギガベース（Ｇｂ）（２倍体ヒトゲノムは、およそ６Ｇｂの配列を含む）を含む完全配列を有する。
【００３９】
複合核酸の限定されない例として、ヒト血液または限定されるものではないが、リンパ液、髄液、腹水、乳、尿、便および気管支肺胞洗浄を含めたその他の体液中を循環する核酸であり、例えば、細胞を含まない（ＣＦ）か、または細胞と結合している核酸のいずれかとして区別され得る（Pinzani et al.，Methods, 50:302-307, 2010に概説されている）「循環核酸」（ＣＮＡ）、例えば、妊娠している母体の血流中の循環胎児細胞（例えば、Kavanagh et al., J. Chromatol. B 878:1905-1911, 2010参照のこと）または癌患者の血流からの循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）（例えば、Allard et al., Clin Cancer Res. 10:6897-6904, 2004参照のこと）が挙げられる。別の例として、例えば、生検などからの単一細胞または少数の細胞（例えば、胚盤胞の栄養外胚葉から切り取って調べられる胎児細胞；固形腫瘍の穿刺吸引からの癌細胞など）からのゲノムＤＮＡがある。別の例として、組織中、血液またはその他の体液などの中の病原体、例えば、細菌細胞、ウイルスまたはその他の病原体がある。
【００４０】
本明細書において、用語「標的核酸」（またはポリヌクレオチド）または「対象とする核酸」とは、本明細書に記載される方法による処理および配列決定に適した任意の核酸（またはポリヌクレオチド）を指す。核酸は、一本鎖である場合も、二本鎖である場合もあり、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその他の既知核酸を含み得る。標的核酸は、限定されるものではないが、ウイルス、細菌、酵母、植物、魚、爬虫類、両生類、鳥および哺乳類（それだけには限らないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、サルおよびその他の非ヒト霊長類およびヒトを含む）を含めた任意の生物のものであり得る。標的核酸は、１頭の個体から得たものであっても、または複数の個体（すなわち、集団）から得たものであってもよい。核酸が得られるサンプルは、細胞の混合物、または生物の混合物でさえよい、混合物からの核酸、ヒト細胞および細菌細胞を含むヒト唾液サンプル；マウス細胞と、翻訳されたヒト腫瘍からの細胞とを含むマウス異種移植片などを含有し得る。
【００４１】
標的核酸は、増幅されない場合も、当技術分野で公知の任意の適した核酸増幅法によって増幅される場合もある。標的核酸は、細胞性および細胞内夾雑物（脂質、タンパク質、炭水化物、配列決定されるべきもの以外の核酸など）を除去するために、当技術分野で公知の方法に従って精製される場合も、精製されない、すなわち、それだけには限らないが、処理および配列決定のために、その核酸を放出するよう破壊される無傷の細胞を含めた、少なくとも一部の細胞性および細胞内夾雑物を含む場合もある。標的核酸は、当技術分野で公知の方法を使用して任意の適したサンプルから得ることができる。このようなサンプルとして、それだけには限らないが、組織、単離細胞または細胞培養物、体液（それだけには限らないが、血液、尿、血清、リンパ、唾液、肛門および膣分泌物、汗および精液を含む）；空気、農業、水および土壌サンプルなどが挙げられる。一態様では、本発明の核酸コンストラクトは、ゲノムＤＮＡから形成される。
【００４２】
ショットガン配列決定では高カバレッジが望まれるが、これは、それが、ベースコーリングおよびアセンブリにおいてエラーを克服し得るからである。本明細書において、アセンブルされた配列中の任意の所与の位置について、用語「配列カバレッジ重複性」、「配列カバレッジ」または簡単に「カバレッジ」とは、その位置を表すリードの数を意味する。それは、元のゲノムの長さ（Ｇ）、リードの数（Ｎ）および平均読み取り長さ（Ｌ）からＮ×Ｌ／Ｇとして算出され得る。カバレッジはまた、各参照位置の塩基の集計を行うことによって直接算出され得る。全ゲノム配列について、カバレッジは、アセンブルされた配列中のすべての塩基の平均として表される。配列カバレッジは、塩基が読まれる（上記のように）回数の平均数である。例えば、最終のアセンブルされた配列中の各塩基が、平均４０のリードで表されることを意味する「４０×カバレッジ」におけるように、「倍カバレッジ」として表されることが多い。
【００４３】
本明細書において、用語「コールレート」は、例えば、参照ゲノムなどの適した参照配列を通常参照して、完全にコールされている複合核酸の塩基のパーセントの比較を意味する。したがって、全ヒトゲノムについては、「ゲノムコールレート」（または簡単に「コールレート」）は、全ヒトゲノム参照を参照して完全にコールされるヒトゲノムの塩基のパーセントである。「エキソームコールレート」は、エキソーム参照を参照して完全にコールされるエキソームの塩基のパーセントである。エキソーム配列は、配列決定に先立って、ＤＮＡサンプルから対象とするゲノム領域を選択的に捕獲する種々の公知の方法によって濃縮されているゲノムの一部を配列決定することによって得られ得る。あるいは、エキソーム配列は、エキソーム配列を含む全ヒトゲノムを配列決定することによって得られ得る。したがって、全ヒトゲノム配列は、「ゲノムコールレート」および「エキソームコールレート」の両方を有し得る。試みられた塩基の総数に対する、Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ指定を得る塩基の数を反映する「生リードコールレート」もある（時々、用語「カバレッジ」は、「コールレート」の代わりに使用されるが、意味は、文脈から明らかであろう）。
【００４４】
複合核酸の断片の調製
核酸単離。標的ゲノムＤＮＡは、例えば、Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、前掲に開示されるような従来の技術を使用して単離される。いくつかの場合には、特に、特定の工程において少量のＤＮＡが使用される場合には、少量のサンプルＤＮＡのみが利用可能であり、例えば、容器壁などへの非特異的結合による喪失の危険がある場合にはいつも、サンプルＤＮＡと混合され、使用される、担体ＤＮＡ、例えば、非関連環状合成二本鎖ＤＮＡを提供することが有利である。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ゲノムＤＮＡまたはその他の複合核酸は、個々の細胞または少数の細胞から、精製を伴ってか、または伴わずに得られる。
【００４６】
ＬＦＲには長い断片が望ましい。ゲノム核酸の長い断片は、いくつかの異なる方法によって単離できる。一実施形態では、細胞を溶解し、無傷の核を穏やかな遠心分離工程によってペレットにする。次いで、ゲノムＤＮＡを数時間のプロテイナーゼＫおよびＲＮアーゼ消化によって放出させる。材料は、例えば、一定期間（すなわち、２〜１６時間）の透析および／または希釈によって、残存する細胞性廃棄物の濃度を低下させるよう処理してもよい。このような方法は、多数の破壊的プロセス（エタノール沈殿法、遠心分離およびボルテックス処理など）を使用する必要がないので、ゲノム核酸は、大部分は無傷のままであり、１５０キロベースを超える長さを有する大部分の断片が得られる。いくつかの実施形態では、断片は、約５〜約７５０キロベースの長さである。さらなる実施形態では、断片は、約１５０〜約６００、約２００〜約５００、約２５０〜約４００および約３００〜約３５０キロベースの長さである。ＬＦＲに使用され得る最小断片は、少なくとも２ヘテロ（およそ２〜５ｋｂ）を含有するものであり、出発核酸調製の操作に起因するせん断によって制限され得るが、最大の理論上の大きさはない。より大きな断片を生成する技術の結果、より少ないアリコートが必要となり、より短い断片をもたらすものは、より多くのアリコートを必要とし得る。
【００４７】
ＤＮＡを単離したら、個々のウェルに分注する前に、材料、特に、各断片の末端からの配列の喪失を避けるよう注意深く断片化するが、これはこのような材料の喪失が、最終ゲノムアセンブリにおいてギャップをもたらし得るからである。一実施形態では、配列喪失は、互いにおよそ１００ｋｂの距離でｐｈｉ２９ポリメラーゼなどのポリメラーゼの出発部位を作り出す、ニックを入れる頻度の低い酵素の使用によって避けられる。ポリメラーゼは、新規ＤＮＡ鎖を作り出すので、それが古い鎖を置換して、ポリメラーゼ開始部位の付近に重複する配列を作り出す。結果として、配列の欠失は極めて少なくなる。
【００４８】
５’エキソヌクレアーゼの制御された使用（例えば、ＭＤＡによる増幅の前または増幅中）は、単細胞からの元のＤＮＡの多重複製を促進し、したがってコピーをコピーすることによる初期エラーの増幅を最小にし得る。
【００４９】
その他の実施形態では、長いＤＮＡ断片が、例えば、アガロースゲルプラグ中のアガロース中、オイル中に細胞を単離することまたは特別にコーティングされたチューブおよびプレートを使用することを含めた容器に対するＤＮＡのせん断または吸収を最小にする方法で単離および操作される。
【００５０】
いくつかの実施形態では、分注する前に単細胞から断片化されたＤＮＡをさらに複製することは、アダプターを一本鎖プライミングオーバーハングとライゲーションすることおよびアダプター特異的プライマーおよびｐｈｉ２９ポリメラーゼを使用して、長い断片各々から２コピーを作製することによって達成され得る。これは、単細胞から４細胞の価値のあるＤＮＡを作製し得る。
【００５１】
断片化。次いで、標的ゲノムＤＮＡを、酵素消化、せん断または超音波処理を含めた従来の技術によって所望の大きさに分画するか、または断片化し、後者の２種は本発明において特に使用される。
【００５２】
標的核酸の断片の大きさは、使用される供給源標的核酸およびライブラリー構築法に応じて変わり得るが、標準的な全ゲノム配列決定については、このような断片は、通常、５０〜６００ヌクレオチドの長さの範囲である。別の実施形態では、断片は、３００〜６００または２００〜２０００ヌクレオチドの長さである。さらに別の実施形態では、断片は、１０〜１００、５０〜１００、５０〜３００、１００〜２００、２００〜３００、５０〜４００、１００〜４００、２００〜４００、３００〜４００、４００〜５００、４００〜６００、５００〜６００、５０〜１０００、１００〜１０００、２００〜１０００、３００〜１０００、４００〜１０００、５００〜１０００、６００〜１０００、７００〜１０００、７００〜９００、７００〜８００、８００〜１０００、９００〜１０００、１５００〜２０００、１７５０〜２０００および５０〜２０００ヌクレオチドの長さである。ＬＦＲには、より長い断片が有用である。
【００５３】
さらなる実施形態では、特定の大きさまたは特定の範囲の大きさの断片が単離される。このような方法は、当技術分野で周知である。例えば、ゲル画分を使用して、例えば、５００塩基対＋５０塩基対の、一定範囲の塩基対内の特定の大きさの断片の集団を製造することができる。
【００５４】
多くの場合には、溶解および抽出の際に生じたせん断力によって、所望の範囲の断片が生成するので、抽出されたＤＮＡの酵素消化は必要ではない。さらなる実施形態では、制限エンドヌクレアーゼを使用する酵素的断片化によってより短い断片（１〜５ｋｂ）が作製され得る。なおさらなる実施形態では、約１０〜約１，０００，０００ゲノムと同等のＤＮＡが、断片の集団が全ゲノムに及ぶことを確実にする。重複する断片のこのような集団から作製された核酸鋳型を含有するライブラリーは、したがって、その配列が、同定され、アセンブルされると、全ゲノムの配列のほとんどまたはすべてを提供する標的核酸を含む。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態では、断片を調製するために、制御された無作為の酵素的（「ＣｏＲＥ」）断片化法が使用される。ＣｏＲＥ断片化は、酵素的エンドポイントアッセイであり、酵素的断片化の欠点（基質または酵素濃度の変異に対する感度および消化時間に対する感度を含む）の多くを伴わずに、酵素的断片化の利点（少量および／または小容積のＤＮＡでそれを使用する能力など）を有する。
【００５６】
一態様では、本発明は、本明細書においてＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ（ＣｏＲＥ）断片化と呼ばれる断片化法を提供し、これは、単独または当技術分野で公知のその他の機械的および酵素的断片化法と組み合わせて使用され得る。ＣｏＲＥ断片化は、一連の３つの酵素的工程を含む。第１に、核酸は、増幅産物の両鎖中のＴの位置の規定の、制御可能な割合での、ｄＵＴＰまたはＵＴＰの置換をもたらすよう、一定割合のデオキシウラシル（「ｄＵ」）またはウラシル（「Ｕ」）が添加されたｄＮＴＰの存在下で実施される増幅方法に付される。本発明のこの工程では、任意の適した増幅方法が使用され得る。特定の実施形態では、両鎖上の特定の点においてｄＵＴＰまたはＵＴＰ置換を有する増幅産物を作製するために、ｄＴＴＰに対して規定の割合のｄＵＴＰまたはＵＴＰが添加されたｄＮＴＰの存在下での多重置換増幅（ＭＤＡ）が使用される。
【００５７】
ウラシル部分の増幅および挿入後、普通、ＵＤＧ、ＥｎｄｏＶＩＩＩおよびＴ４ＰＮＫの組合せによってウラシルを切り出して、機能的５’リン酸および３’ヒドロキシル末端を有する単一塩基ギャップを作製する。ＭＤＡ産物中のＵの頻度によって規定される平均間隔で単一塩基ギャップが作製される。すなわち、ｄＵＴＰの量が多いほど、得られる断片は短い。当業者には明らかであろうが、化学的にか、またはその他の酵素的に感受性の高いヌクレオチドなど、切断を同様にもたらし得る修飾されたヌクレオチドとのヌクレオチドの選択的置換をもたらすその他の技術も使用され得る。
【００５８】
ギャップのある核酸の、エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼでの処理は、反対側の鎖上のニックが収束するまで、核酸の長さに沿ったニックの「翻訳」または「転位」をもたらし、それによって二本鎖の切断を作り出し、相対的に均一な大きさの二本鎖断片の相対的な集団が得られる。ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）のエキソヌクレアーゼ活性は、ニックに隣接する短いＤＮＡ鎖を切り出し、一方で、ポリメラーゼ活性が、その鎖中のニックおよびその後のヌクレオチドを「埋める」（本質的に、Ｔａｑは鎖に沿って移動し、エキソヌクレアーゼ活性を使用して塩基を切り出、同一塩基を付加し、酵素が末端に到達するまでニックが鎖に沿って転位される結果となる）。
【００５９】
二本鎖断片の大きさ分布は、酵素処理の期間または程度によってというよりも、ＭＤＡ反応において使用されたｄＵＴＰまたはＵＴＰに対するｄＴＴＰの割合の結果であるので、このＣｏＲＥ断片化法は、高い程度の断片化再現性を示し、すべて同様の大きさである二本鎖核酸断片の集団をもたらす。
【００６０】
断片末端修復および修飾。特定の実施形態では、断片化後、標的核酸をさらに修飾して、それらを本発明の方法のマルチプルアダプターの挿入のために準備する。
【００６１】
物理的断片化後、標的核酸は、高い頻度で、平滑末端およびオーバーハング末端の組合せならびに末端のリン酸およびヒドロキシル化学構造の組合せを有する。この実施形態では、標的核酸を、いくつかの酵素で処理して、特定の化学構造を有する平滑末端を作製する。一実施形態では、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰを使用して、オーバーハングの任意の５’一本鎖を埋めて、平滑末端を作製する。３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（常にではないが、一般には、５’活性のものと同一の酵素、例えば、Ｔ４ポリメラーゼ）を使用して、３’オーバーハングを除去する。適したポリメラーゼとして、それだけには限らないが、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ１、クレノウ断片、逆転写酵素、野生型ｐｈｉ２９ポリメラーゼを含めたｐｈｉ２９関連ポリメラーゼおよびこのようなポリメラーゼの誘導体、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。これらの技術を使用して、平滑末端を作製でき、これらはさまざまな適用において有用である。
【００６２】
さらなる任意選択の実施形態では、標的核酸が互いにライゲーションすることを避けるために末端の化学構造を変更する。例えば、ポリメラーゼに加えて、平滑末端を作製するプロセスにプロテインキナーゼを使用し、その３’ホスファターゼ活性を利用することによって、３’リン酸基をヒドロキシル基に変換してもよい。このようなキナーゼとして、それだけには限らないが、Ｔ４キナーゼなどの市販のキナーゼならびに市販されていないが、所望の活性を有するキナーゼを挙げることができる。
【００６３】
同様に、ホスファターゼを使用して、末端リン酸基をヒドロキシル基に変換してもよい。適したホスファターゼとして、それだけには限らないが、当技術分野で公知である、アルカリホスファターゼ（ウシ腸ホスファターゼを含む）、南極ホスファターゼ、アピラーゼ、ピロホスファターゼ、無機（酵母）熱安定性無機ピロホスファターゼなどが挙げられる。
【００６４】
これらの修飾は、本発明の方法の後の工程において標的核酸が互いにライゲーションすることを防ぎ、したがって、標的核酸の末端にアダプター（および／またはアダプターアーム）がライゲーションされる工程の間に、標的核酸がアダプターとライゲーションするがその他の標的核酸とはライゲーションしないことを確実にする。標的核酸は、所望の配向でアダプターにライゲーションされ得る。末端を修飾することによって、標的核酸が互いにライゲーションする、および／またはアダプターが互いにライゲーションするという望ましくない立体配置を避ける。各アダプター−標的核酸ライゲーションの配向はまた、アダプターおよび標的核酸両方の末端の化学構造の制御によって制御され得る。このような修飾は、未知立体配置でライゲーションしている種々の断片を含有する核酸鋳型の生成を防ぎ、ひいては、このような望ましくない鋳型から配列同定およびアセンブリにおいてエラーを低減および／または除去し得る。
【００６５】
ＤＮＡを断片化後に変性させて、一本鎖断片を製造してもよい。
【００６６】
増幅。一実施形態では、断片化後に（実際には、本明細書において概説された任意の工程の前または後）、断片化された核酸の集団に増幅工程を適用し、すべての断片の十分に高い濃度が、その後の工程に利用可能であるということを確実にすることができる。本発明の一実施形態によれば、本明細書に記載される方法によって配列決定するための十分な核酸を製造するために、このような複合核酸が増幅される、高等生物のものを含めた少量の複合核酸を配列決定するための方法が提供される。本明細書に記載される配列決定法は、十分な増幅を用いた出発材料と同等のゲノムの画分を用いた場合でさえ、高コールレートで高度に正確な配列を提供する。細胞は、およそ６．６ピコグラム（ｐｇ）のゲノムＤＮＡを含むということは留意されたい。本発明の方法によって、ヒトなどの高等生物を含めた生物の単細胞または少数の細胞から得られた全ゲノムまたはその他の複合核酸を実施することができる。高等生物の複合核酸を配列決定することは、例えば、２００ｎｇ、４００ｎｇ、６００ｎｇ、８００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、１０μｇまたはそれ以上の量の複合核酸を製造するよう当技術分野で公知の任意の核酸増幅法によって増幅される、１ｐｇ、５ｐｇ、１０ｐｇ、３０ｐｇ、５０ｐｇ、１００ｐｇまたは１ｎｇの複合核酸を出発材料として使用して達成できる。本発明者らはまた、ＧＣバイアスを最小にする核酸増幅プロトコールを開示する。しかし、増幅およびその後のＧＣバイアスの必要性は、１個の細胞または少数の細胞を単離することと、それらを当技術分野で公知の適した培養条件下で十分な時間培養することと、出発細胞（単数または複数）の後代を配列決定のために使用することとによってさらに簡単に低減され得る。
【００６７】
このような増幅方法として、それだけには限らないが、多重置換増幅（ＭＤＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーション鎖反応（オリゴヌクレオチドリガーゼ増幅ＯＬＡと呼ばれることもある）、サイクリングプローブ技術（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＣＰＴ）、鎖置換アッセイ（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｓｓａｙ）（ＳＤＡ）、転写媒介性増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＭＡ）、核酸配列をベースとする増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＣＡ）（環状化断片のための）および侵入的切断技術（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が挙げられる。
【００６８】
増幅は、断片化後または本明細書に概説された任意の工程の前もしくは後に実施され得る。
【００６９】
ＧＣバイアスが低減されたＭＤＡ増幅プロトコール。一態様では、本発明は、ライブラリー構築および配列決定に先立って、アリコートあたり約１０ＭｂのＤＮＡが、出発ＤＮＡの量に応じて、例えば、およそ３０，０００倍に正確に増幅されるサンプルの調製の方法を提供する。
【００７０】
本発明のＬＦＲ法の一実施形態によれば、ＬＦＲは、ゲノム核酸、普通は、ゲノムＤＮＡを５’エキソヌクレアーゼで処理して３’一本鎖オーバーハングを作製することで始まる。このような一本鎖オーバーハングは、ＭＤＡ開始部位として働く。エキソヌクレアーゼの使用はまた、増幅の前の熱またはアルカリ変性工程の必要性を排除し、断片の集団にバイアスを導入しない。別の実施形態では、アルカリ変性を５’エキソヌクレアーゼ処理と組み合わせ、これは、いずれかの処理単独で見られるものよりも大きいバイアスの低減をもたらす。５’エキソヌクレアーゼを用いて、および所望により、アルカリ変性を用いて処理されたＤＮＡを、次いで、サブゲノム濃度に希釈し、上記で論じたように、いくつかのアリコート中に分散させる。アリコート中、例えば、複数のウェル中に分離した後、各アリコート中の断片を増幅する。
【００７１】
一実施形態では、ｐｈｉ２９に基づく多重置換増幅（ＭＤＡ）を使用する。多数の研究によって、ｐｈｉ２９に基づくＭＤＡによって導入される、望まない増幅バイアス、バックグラウンド生成物形成およびキメラアーチファクトの範囲が調べられているが、これらの欠点（ｓｈｏｒｔ  ｃｏｍｉｎｇｓ）の多くは、増幅の極端な条件下（１００万倍超）で起こった。一般に、ＬＦＲは、実質的に低いレベルの増幅を使用し、長いＤＮＡ断片（例えば、約１００ｋｂ）を用いて出発し、効率的なＭＤＡおよびより許容されるレベルの増幅バイアスおよびその他の増幅関連問題をもたらす。
【００７２】
本発明者らは、ＭＤＡと関連している問題を克服するために、プロトコールをさらに改善するために、種々の添加物（例えば、ＤＮＡ修飾酵素、糖および／またはＤＭＳＯのような化学物質）を使用し、および／または、ＭＤＡの反応条件の異なる構成要素が低減されるか、増大されるか、または置換される改善されたＭＤＡプロトコールを開発した。キメラを最小にするために、キメラ形成の一般的な機序であるＤＮＡ鎖を伸長するための不正確な鋳型として作用することから、置換された一本鎖ＤＮＡのアベイラビリティーを低減するよう試薬を含めてもよい。ＭＤＡによって導入されたカバレッジバイアスの主要な供給源は、ＧＣリッチ対ＡＴリッチ領域間の増幅における相違によって引き起こされる。これは、ＭＤＡ反応において異なる試薬を使用することによって、および／またはプライマー濃度を調整して、ゲノムのすべての％のＧＣ領域中を均一にプライムするための環境を作ることによって修正され得る。いくつかの実施形態では、ＭＤＡのプライミングにおいてランダムヘキサマーを使用する。その他の実施形態では、バイアスを低減するためにその他のプライマー設計が使用される。さらなる実施形態では、ＭＤＡの前またはその間の５’エキソヌクレアーゼの使用が、特に、長いセグメントの複製（すなわち、一部の癌細胞において）および複合リピートを特徴とする領域を配列決定するのに有用であるより長い（すなわち、２００ｋｂ〜１Ｍｂ）断片を用いる場合に、低バイアスの上首尾のプライミングを開始するのに役立ち得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、１０，０００倍ほどにサンプルを調製するのに必要なＭＤＡ増幅ラウンド数を低減し、ＭＤＡに起因するバイアスおよびキメラ形成をさらに低減する、改善された、より効率的な断片化および連結工程が使用される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ＭＤＡ反応は、ＣｏＲＥ断片化のための調製において、増幅産物中にウラシルを導入するよう設計される。いくつかの実施形態では、ランダムヘキサマーを使用する標準ＭＤＡ反応を使用して、各ウェルにおいて断片を増幅する。あるいは、ランダム８マープライマーを使用して、断片の集団における増幅バイアス（例えば、ＧＣバイアス）を低減してもよい。さらなる実施形態では、また、ＭＤＡ反応にいくつかの異なる酵素を添加して、増幅のバイアスを低減してもよい。例えば、低濃度の非前進型５’エキソヌクレアーゼおよび／または一本鎖結合性タンパク質を使用して、８マーの結合部位を作製してもよい。ベタイン、ＤＭＳＯおよびトレハロースなどの化学物質も、バイアスを低減するために使用できる。
【００７５】
各アリコート中の断片を増幅した後、増幅産物を、所望により、断片化の別のラウンドに付してもよい。いくつかの実施形態では、ＣｏＲＥ法を使用して、増幅後に各アリコート中の断片をさらに断片化する。このような実施形態では、各アリコート中の断片のＭＤＡ増幅は、ＭＤＡ産物中にウラシルを組み込むよう設計される。ＭＤＡ産物を含有する各アリコートを、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）と、ＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩと、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとの混合物を用いて処理し、ウラシル塩基を切り出し、機能的５’リン酸および３’ヒドロキシル基を有する単一塩基ギャップを作製する。Ｔａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼの使用によるニックトランスレーションは、二本鎖平滑末端切断をもたらし、ＭＤＡ反応に添加されるｄＵＴＰの濃度に応じて一定の大きさの範囲のライゲーション可能な断片をもたらす。いくつかの実施形態では、使用されるＣｏＲＥ法は、重合によってウラシルを除去することおよびｐｈｉ２９による鎖置換を含む。ＭＤＡ産物の断片化はまた、超音波処理または酵素処理によって達成され得る。この実施形態において使用され得る酵素処理として、それだけには限らないが、ＤＮアーゼＩ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、小球菌ヌクレアーゼなどが挙げられる。
【００７６】
ＭＤＡ産物の断片化後、得られた断片の末端を修復してもよい。多数の断片化技術が、オーバーハング末端を有する末端ならびに３’および５’ヒドロキシル基ならびに／または３’および５’リン酸基などの後のライゲーション反応では有用ではない官能基を有する末端をもたらし得る。平滑末端を有するよう修復される断片を有することが有用であり得る。標的配列の「重合」を防ぐためにリン酸およびヒドロキシル基を付加または除去するよう末端を修飾することもまた望ましいことであり得る。例えば、ホスファターゼを使用して、すべての末端がヒドロキシル基を含有するようリン酸基を排除してもよい。次いで、各末端を、所望の成分間のライゲーションを可能にするよう選択的に変更してもよい。断片の一方の末端を、アルカリホスファターゼを用いる処理によって「活性化」してもよい。次いで、ＬＦＲ法における同一アリコートから来た断片を同定するために、断片をアダプターでタグ付けしてもよい。
【００７７】
各アリコート中の断片のタグ付け。増幅後、各断片が出自するアリコートを同定するために、各アリコート中のＤＮＡをタグ付けする。さらなる実施形態では、各アリコート中の増幅されたＤＮＡを、さらに断片化し、その後、同一アリコートからの断片がすべて、同一タグを含むよう、アダプターでタグ付けする；例えば、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００７／００７２２０８参照のこと。
【００７８】
一実施形態によれば、アダプターは、２つのセグメントで設計される。１つのセグメントは、すべてのウェルに共通しており、本明細書においてさらに記載される方法を使用して、平滑末端が断片と直接ライゲーションする。「共通の」アダプターは、２つのアダプターアームとして付加される。一方のアームは、断片の５’末端とライゲーションされる平滑末端であり、もう一方のアームは、断片の３’末端とライゲーションされる平滑末端である。タギングアダプターの第２のセグメントは、各ウェルに独特である「バーコード」セグメントである。このバーコードは、一般に、独特の配列のヌクレオチドであり、特定のウェル中の各断片に、同一のバーコードが与えられる。したがって、すべてのウェルからのタグ付けされた断片が、配列決定適用のために再度組み合わされる場合に、同一ウェルからの断片が、バーコードアダプターの同定によって同定され得る。バーコードは、共通アダプターアームの５’末端にライゲーションされる。共通アダプターおよびバーコードアダプターは、断片に、逐次ライゲーションされても、同時にライゲーションされてもよい。本明細書においてさらに詳細に記載されるように、共通アダプターおよびバーコードアダプターの末端を、各アダプターセグメントが、正しい配向で、適切な分子とライゲーションするよう修飾してもよい。このような修飾は、断片が互いにライゲーションできないことおよびアダプターセグメントが唯一、示された配向でライゲーションできることを確実にすることによって、アダプターセグメントまたは断片の「重合」を防ぐ。
【００７９】
さらなる実施形態では、各ウェルにおいて断片をタグ付けするために使用されるアダプターに、３セグメント設計が使用される。この実施形態は、バーコードアダプターセグメントが２つのセグメントに分かれている点を除いて、上記のバーコードアダプター設計と同様である。この設計によって、異なるバーコードセグメントを一緒にライゲーションして、完全バーコードセグメントを形成することによって、コンビナトリアルバーコードアダプターセグメントが作製されるのを可能にすることによって、より広い範囲の可能性あるバーコードが可能となる。このコンビナトリアル設計は、作製されることを必要とするフルサイズバーコードアダプターの数を低減しながら、可能性あるバーコードアダプターのより大きなレパートリーを提供する。さらなる実施形態では、各アリコートの独特の同定は、８〜１２塩基対のエラー補正バーコードを用いて達成される。いくつかの実施形態では、ウェルと同数（上記の限定されない例では、３８４および１５３６）のアダプターが使用される。さらなる実施形態では、アダプターを作製することと関連する費用が、２セットの４０のハーフバーコードアダプターに基づく新規コンビナトリアルタギングアプローチによって低減される。
【００８０】
一実施形態では、ライブラリー構築は、２種の異なるアダプターを使用することを含む。ＡおよびＢアダプターは、異なるハーフバーコード配列を各々が含有し、数千の組合せを生じるよう容易に修飾される。さらなる実施形態では、バーコード配列を同一アダプター上に組み込む。これは、Ｂアダプターを、各々が、ライゲーションに使用される共通の重複配列によって分けられたハーフバーコード配列を有する２つの部分に切断することによって達成できる。２つのタグ成分は、各々４〜６塩基を有する。８塩基（２×４塩基）タグセットは、６５，０００種のアリコートに独特にタグ付けすることができる。１個の追加の塩基（２×５塩基）によって、エラー検出が可能となり、リード−ソロモン設計を使用して１０，０００種以上のアリコートにおける実質的なエラー検出および修正を可能にするために、１２塩基タグ（２×６塩基、１２００万種の独特のバーコード配列）を設計してもよい（参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０１９９１５５として公開された米国特許出願第１２／６９７，９９５号）。２×５塩基および２×６塩基タグの両方とも、最適の解読効率を達成するために縮重塩基（すなわち、「ワイルドカード」）の使用を含み得る。
【００８１】
各ウェル中の断片をタグ付けした後、すべての断片を組合せるか、またはプールして、単一集団を形成する。次いで、これらの断片を使用して、配列決定のための核酸鋳型またはライブラリーコンストラクト作製してもよい。これらのタグ付けされた断片から作製された核酸鋳型は、各断片に付着しているバーコードタグアダプターによって、特定のウェルに属するとして同定可能となる。
【００８２】
ロングフラグメントリード（Ｌｏｎｇ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｒｅａｄ）（ＬＦＲ）技術
概説
個体のヒトゲノムは、天然では２倍体であり、相同染色体の半分が各親に由来する。各個体染色体で変異が生じる状況は、ゲノムの遺伝子およびその他の転写領域の発現および調節に対して重大な影響を有し得る。さらに、遺伝子の一方または両方の対立遺伝子内で２つの潜在的に有害な突然変異が起こるかどうかを調べることは、最も臨床的に重要なことである。
【００８３】
全ゲノム配列決定のための現在の方法は、費用効率の高い方法で親染色体を別個にアセンブルする能力および変異が同時に生じる文脈（ハプロタイプ）を記述する能力を欠く。シミュレーション実験は、染色体レベルのハプロタイプ解析には、少なくとも７０〜１００ｋｂの範囲にわたる対立遺伝子連鎖情報が必要であるということを示す。これは、長いＤＮＡ分子の均一な増幅が困難であることによるおよび配列決定における連鎖情報の喪失のために１０００塩基未満のリードに制限される、増幅されたＤＮＡを使用する既存の技術をもってしては達成され得ない。メイトペア技術は、延長されたリード長の同等物を提供し得るが、このようなＤＮＡライブラリーの作製における非効率性のために（数ｋｂより長い長さのＤＮＡを環状化する困難さのために）１０ｋｂ未満に制限される。このアプローチはまた、すべてのヘテロ接合体を連鎖させるのに極度のリードカバレッジを必要とする。
【００８４】
１００ｋｂ超のＤＮＡ断片の単一分子配列決定は、そのような長い分子を処理することが実現可能であれば、単一分子配列決定の正確性が高ければ、検出／機器費用が低ければ、ハプロタイプ解析にとって有用である。これは、１００ｋｂの断片に関しては言うまでもなく、短い分子で高収率で達成することも極めて困難である。
【００８５】
最も最近のヒトゲノム配列決定は、数百ナノグラムのＤＮＡで出発し、短いリード長（＜２００ｂｐ）、高度に並列処理されたシステムで実施された。これらの技術は、多量のデータを迅速に、経済的に作成することにおいて優れている。残念ながら、小さいメイト−ギャップサイズ（５００ｂｐ〜１０ｋｂ）と組み合わされることが多い短いリードは、数キロベースを超えるほとんどのＳＮＰフェージング情報を排除する（McKernan et al., Genome Res. 19:1527,2009）。さらに、複数の処理工程において、せん断の結果としての断片化を伴わずに長いＤＮＡ断片を維持することは極めて困難である。
【００８６】
現在のところ、３人のゲノム、すなわち、Ｊ．Ｃｒａｉｇ  Ｖｅｎｔｅｒによるもの（Levy et al., PLoS Biol. 5:e254, 2007）である、グジャラート系インド人（ＨａｐＭａｐサンプルＮＡ２０８４７；Kitzman et al., Nat. Biotechnol. 29:59, 2011）および２人のヨーロッパ人（Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  Ｏｎｅ［ＭＰ１］；Suk et al., Genome Res., 2011; http://genome.cshlp.org/content/early/2011/09/02/gr.125047.111.full.pdf；およびＨａｐＭａｐサンプルＮＡ１２８７８；Duitama et al., Nucl. Acids Res. 40:2041-2053, 2012）が配列決定され、２倍体としてアセンブルされている。すべてが、ヒト参照ゲノムの構築の際に使用された細菌人工染色体（ＢＡＣ）配列決定と同様のプロセス（Venter et al., Science 291:1304, 2001; Lander et al., Nature 409:860, 2001）で長いＤＮＡ断片をコンストラクト中にクローニングすることを含んでいた。これらのプロセスは、長いフェージングされたコンティグを作製するが（３５０ｋｂ［Levy et al., PLoS Biol. 5:e254, 2007］、３８６ｋｂ［Kitzman et al., Nat. Biotechnol. 29:59-63, 2011］および１Ｍｂ［Suk et al., Genome Res. 21:1672-1685, 2011］のＮ５０）、それらは、多量の初期ＤＮＡ、大規模なライブラリー処理を必要とし、日常的な臨床環境において使用するには費用がかかりすぎる。
【００８７】
さらに、全染色体ハプロタイプ解析は、分裂中期染色体の直接単離によって実証されている（Zhang et al., Nat. Genet. 38:382-387, 2006; Ma et al., Nat. Methods 7:299-301, 2010; Fan et al., Nat. Biotechnol. 29:51-57, 2011; Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:12-17, 2011）。これらの方法は、長い範囲のハプロタイプ解析にとっては優れているが、全ゲノム配列決定にはまだ使用されておらず、全分裂中期染色体の調製および単離を必要とし、これは、一部の臨床サンプルにとっては、挑戦的なものであり得る。
【００８８】
ＬＦＲ法は、これらの制限を克服する。ＬＦＲは、ＤＮＡ調製およびタギングを含み、関連アルゴリズムおよびソフトウェアとともに、大幅に低減された実験および計算費用で、２倍体ゲノムにおける親染色体の分離された配列の正確なアセンブリ（すなわち、完全ハプロタイプ解析）を可能にする。
【００８９】
ＬＦＲは、母方および父方成分の両方のゲノムの任意の所与の領域が、同一アリコート中に表される可能性が低いような、多数の異なるアリコートにわたるゲノムＤＮＡ（またはその他の核酸）の長い断片の物理的分離に基づいている。各アリコート中に独特の識別子を入れることおよび多数のアリコートを集合体中で解析することによって、ＤＮＡ配列データを２倍体ゲノムにアセンブルすることができる、例えば、各親の染色体の配列を決定することができる。ＬＦＲは、大断片（例えば、ＢＡＣ）ライブラリーを使用するハプロタイプ解析アプローチにおけるように、複合核酸の断片をベクターにクローニングすることを必要としない。ＬＦＲは、生物の個々の染色体の直接単離も必要としない。最後に、ＬＦＲは、個体生物で実施でき、ハプロタイプフェージングを達成するために生物の集団を必要としない。
【００９０】
エラー低減および本明細書において詳述されるその他の目的のためにＬＦＲを使用するための技術。ＬＦＲ法は、米国特許出願第１２／３２９，３６５号および同１３／４４７，０８７号、米国特許公開ＵＳ２０１１−００３３８５４号および同２００９−０１７６２３４号および米国特許第７，９０１，８９０号、同７，８９７，３４４号、同７，９０６，２８５号、同７，９０１，８９１号および同７，７０９，１９７号に記載されており、そのすべてが参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【００９１】
本明細書において、用語「ベクター」とは、外来ＤＮＡの断片が挿入されるプラスミドまたはウイルスベクターを意味する。ベクターは、外来ＤＮＡを、適した宿主細胞に導入するために使用され、ここで、ベクターおよび挿入された外来ＤＮＡは、例えば、機能的複製起点または自立複製配列がベクター中に存在するために複製する。本明細書において、用語「クローニング」とは、ＤＮＡの断片のベクターへの挿入および適した宿主細胞における挿入された外来ＤＮＡを有するベクターの複製を指す。
【００９２】
ＬＦＲは、本明細書において詳細に論じられた配列決定法と一緒に、より一般には、短リード法および長リード法の両方を含めた当技術分野で公知の任意の配列決定技術とともの前処理法として使用され得る。ＬＦＲはまた、例えば、トランスクリプトーム、メチロームなどの解析を含めた種々の種類の解析とともに使用され得る。極めて少ないインプットＤＮＡしか必要としないので、ＬＦＲは、１個または少数の細胞の配列決定およびハプロタイプ解析に使用され得、これは、癌、出生前診断および個人化医療にとって特に重要であり得る。これは、家族性遺伝病の同定などを容易にし得る。２倍体サンプルにおいて２セットの染色体からのコールを区別することを可能にすることで、ＬＦＲはまた、低カバレッジでの、変異体および非変異体位置の高信頼性コーリングを可能にする。ＬＦＲのさらなる適用は、癌ゲノムにおける大規模な再構成の解明および代替スプライシング転写物の全長配列決定を含む。
【００９３】
ＬＦＲは、このような複合核酸のせん断および過度の断片化を伴わずに、このような複合核酸を放出するために穏やかに破壊される、細胞および組織を含む、精製されているか、またはされていない、それだけには限らないが、ゲノムＤＮＡを含めた複合核酸を処理および解析するために使用され得る。
【００９４】
一態様では、ＬＦＲは、およそ１００〜１０００ｋｂの長さの仮想リード長をもたらす。
【００９５】
さらに、ＬＦＲはまた、任意の短リード技術の計算の要求および関連費用を著しく低減し得る。重要なことに、ＬＦＲは、それが全体の収率を低減する場合には、延長配列決定リード長の必要性を除去する。ＬＦＲのさらなる利益は、現在の配列決定技術に起因し得るエラーまたは疑わしいベースコール、普通、１００ｋｂに１つまたはヒトゲノムあたり３０，０００の偽陽性およびヒトゲノムあたり同様の数の未検出変異体の相当な（１０〜１０００倍）低減である。このエラーの著しい低減によって、検出された変異体のフォローアップ確認の必要性が最小化され、診断適用のためのヒトゲノム配列決定の採用が促進される。
【００９６】
すべての配列決定プラットフォームに適用され得ることに加え、ＬＦＲをベースとする配列決定は、それだけには限らないが、癌ゲノムにおける構造転位の研究、メチル化部位のハプロタイプを含めた全メチローム解析および植物において見られるもののような複雑な倍数体ゲノムでさえの、メタゲノミクスまたは新規ゲノム配列決定のためのデノボアセンブリ適用を含めた任意の適用に適用され得る。
【００９７】
ＬＦＲは、親のまたは関連する染色体のまさにコンセンサス配列に対立するものとして（その高い類似性および長い反復配列の存在およびセグメント複製にもかかわらず）個々の染色体の実際の配列を生成する能力を提供する。この種のデータを作製するためには、一般に、１００ｋｂ〜１Ｍｂなどの長いＤＮＡ範囲にわたって配列の連続性が確立される。
【００９８】
本発明のさらなる態様は、全染色体ハプロタイプおよび構造変異マッピングおよびヒトゲノムあたり３００未満のエラーに修正する偽陽性／陰性エラーのＬＦＲデータを効率的に使用するためのソフトウェアおよびアルゴリズムを含む。
【００９９】
さらなる態様において、本発明のＬＦＲ技術は、各アリコート中のＤＮＡの複雑性を、使用されるアリコートおよび細胞の数に応じて１００〜１０００倍低減する。＞１００ｋｂの長さのＤＮＡにおける複雑性低減およびハプロタイプ分離は、より効率的な、費用効率のよい（費用において最大１００倍の低減）アセンブルにおいて役立ち、ヒトおよびその他の２倍体ゲノムにおけるその他のすべての変異を検出し得る。
【０１００】
本明細書に記載されるＬＦＲ法は、当技術分野で公知の任意の配列決定法を使用して２倍体ゲノムを配列決定するための前処理工程として使用できる。さらなる実施形態では、本明細書に記載されるＬＦＲ法が、例えば、それだけには限らないが、合成によるポリメラーゼベースの配列決定（例えば、ＨｉＳｅｑ  ２５００系、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ライゲーションベースの配列決定（例えば、ＳＯＬｉＤ  ５５００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、イオン半導体配列決定（例えば、Ｉｏｎ  ＰＧＭまたはＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ゼロモード導波管（例えば、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）、ナノ細孔配列決定（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ピロ配列決定（例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）またはその他の配列決定技術を含めた任意の数の配列決定プラットフォームで使用され得る。これらの配列決定技術のうち一部は、短リード技術であるが、その他のものは、長いリード、例えば、ＧＳ  ＦＬＸ＋（４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；最大１０００ｂｐ）、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ； およそ１０００ｂｐ）およびナノ細孔配列決定（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．；１００ｋｂ）をもたらす。ハプロタイプフェージングには、より長いリードが有利であり、これは、かなり少ない計算しか必要としないが、高いエラー率を有する傾向があり、このような長いリード中のエラーは、ハプロタイプフェージングの前に本明細書に示される方法に従って同定され、修正される必要があり得る。
【０１０１】
本発明の一実施形態によれば、ＬＦＲの基本工程は、（１）複合核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）の長い断片を、各アリコートがゲノムに相当するＤＮＡの画分を含有するアリコートに分離することと、（２）各アリコート中のゲノム断片を増幅することと、（３）増幅されたゲノム断片を断片化して、ライブラリー構築に適した大きさの短い断片（一実施形態では、例えば、約５００塩基の長さ）を作製することと、（４）短い断片にタグ付けして、短い断片が出自するアリコートの同定を可能にすることと、（５）タグ付けされた断片をプールすることと、（６）プールされた、タグ付けされた断片を配列決定することと、（７）得られた配列データを解析して、データをマッピングおよびアセンブルし、ハプロタイプ情報を得ることとを含む。一実施形態によれば、ＬＦＲは、各ウェル中にハプロイドゲノムの１０〜２０％を有する３８４ウェルプレートを使用し、各断片の母方および父方対立遺伝子両方の理論上１９〜３８×の物理的カバレッジが得られる。１９〜３８×の初期ＤＮＡ重複性によって、完全ゲノムカバレッジおよび高い変異体コーリングおよびフェージング正確性が確実になる。ＬＦＲは、複合核酸の断片のベクターへのサブクローニングまたは個々の染色体（例えば、分裂中期染色体）を単離する必要性を回避し、十分に自動化され得、そのためにハイスループットの費用効率の高い適用に適したものになる。
【０１０２】
本明細書において、用語「ハプロタイプ」とは、一緒に伝達される染色体上の隣接位置（遺伝子座）の対立遺伝子の組合せ、あるいは、統計学的に関連している染色体対の単一染色体上の１セットの配列変異体を意味する。どのヒト個体も、２セットの染色体を有し、一方は父方であり、もう一方は母方である。普通、ＤＮＡ塩基配列決定法は、遺伝子型情報、ＤＮＡのセグメントにそって正しく並べられていない対立遺伝子の配列のみをもたらす。遺伝子型のハプロタイプを推測することによって、正しく並べられていない対各々中の対立遺伝子が、各々、ハプロタイプと呼ばれる２つの別個の配列に分離される。ハプロタイプ情報は、疾患関連研究を含めた多数の異なる種類の遺伝子解析にとって必要であり、これによって、集団祖先に関して推測される。
【０１０３】
本明細書において、用語「フェージング」（または解明）とは、配列データを２セットの親染色体またはハプロタイプに分類することを意味する。ハプロタイプフェージングとは、インプットとして、１個体または１つの集団、すなわち、２以上の個体の１セットの遺伝子型を受け取り、各個体の、一方が父方であり、もう一方が母方である１対のハプロタイプをアウトプットするという問題を指す。フェージングは、配列データをゲノムの一定領域またはリードまたはコンティグ中のわずか２種の配列変異体にわたって解明することを含み得、これは、局所フェージングまたはマイクロフェージングと呼ばれることもある。一般に、約１０種を超える配列変異体またはさらに全ゲノム配列さえも含む長いコンティグのフェージングも含む場合があり、これは、「ユニバーサルフェージング」と呼ばれ得る。所望により、配列変異体のフェージングは、ゲノムアセンブリの間に行われる。
【０１０４】
複合核酸のゲノム相当物のアリコート画分
ＬＦＲプロセスは、各アリコートが、ハプロイドゲノムの画分を含有するような、多数のアリコートへの長い断片でのゲノムの確率的物理的分離に基づいている。各プール中のゲノムの画分が減少するにつれ、同一プール中に両親の染色体からの対応する断片を有する統計的見込みは、著しく減少する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ゲノム相当物の１０％が、マルチウェルプレートの各ウェルに分注される。その他の実施形態では、複合核酸のゲノム相当物の１％〜５０％が、各ウェル中に分注される。上記のように、アリコートおよびゲノム相当物の数は、アリコートの数、元の断片の大きさまたはその他の因子に応じて変わり得る。所望により、二本鎖核酸（例えば、ヒトゲノム）を変性させ、その後分注し、したがって、一本鎖相補体は、異なるアリコートに分配され得る。
【０１０６】
例えば、アリコートあたり０．１ゲノム相当物（およそ０．６６ピコグラムすなわちｐｇのＤＮＡ、ヒトゲノムあたりおよそ６．６ｐｇで）で、２種の断片が重複する１０％の機会およびそれらの断片が別個の親の染色体に由来する５０％の機会があり、これは、アリコート中の塩基対の９５％が重複していないこと、すなわち、特定のアリコートが、母方および父方染色体両方に由来する断片をアリコートが含有するので、所与の断片について役に立たないという全部で５％の機会をもたらす。役に立たないアリコートは、このようなアリコートに起因する配列データが、ヘテロの対間の連結性行列中に増大した量の「ノイズ」すなわち、不純物を含有するので、同定され得ない。ファジー推論システム（Ｆｕｚｚｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ）（ＦＩＳ）によって、特定の程度の不純物に対する頑強性が可能となる、すなわち、不純物にかかわらず正しい連結を行い得る（特定の程度まで）。より少量のゲノムＤＮＡでさえ、特に、マイクロ−またはナノ液滴またはエマルジョンという状況で使用され得、これでは、各液滴は、１種のＤＮＡ断片（例えば、ゲノムＤＮＡの単一の５０ｋｂの断片またはおよそ１．５×１０−５ゲノム相当物）を含み得る。ゲノム相当物の５０パーセントでさえ、アリコートの大部分が情報価値がある。高レベル、例えば、ゲノム相当物の７０パーセントで、情報価値があるウェルが同定され、使用され得る。本発明の一態様によれば、複合核酸のゲノム相当物の０．００００１５、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、１５、２０、２５、４０、５０、６０または７０パーセントが、各アリコート中に存在する。
【０１０７】
当然のことではあるが、希釈係数は、断片の元の大きさに応じて変わり得る。すなわち、ゲノムＤＮＡを単離するための穏やかな技術を使用して、おおよそ１００ｋｂの断片を得ることができ、次いで、これを分注する。より大きな断片を可能にする技術は、より少ないアリコートの必要性をもたらし、より短い断片をもたらすものは、より多い希釈を必要とし得る。
【０１０８】
本発明者らは、ＤＮＡ精製を伴わない同一反応において６つの酵素的工程のすべてを成功裏に実施し、これは小型化および自動化を促進し、ＬＦＲをさまざまなプラットフォームおよびサンプル調製法に適応させることを実現可能にする。
【０１０９】
一実施形態によれば、各アリコートは、マルチウェルプレート（例えば、３８４ウェルプレート）の別個のウェル中に含有される。しかし、当技術分野で公知の任意の適当な種類の容器またはシステムを使用してアリコートを保持してもよく、または本明細書に記載されるように、マイクロ液滴またはエマルジョンを使用してＬＦＲプロセスを実施してもよい。本発明の一実施形態によれば、容積は、マイクロリットル未満のレベルに低減される。一実施形態では、自動化ピペッティングアプローチが、１５３６ウェル形式で使用され得る。
【０１１０】
一般に、アリコートの数が、例えば１５３６に、増大するにつれ、ゲノムのパーセントは、ハプロイドゲノムのおよそ１％に低減し、同一ウェル中の母方および父方ハプロタイプの散在的存在が減少するので、ハプロタイプの統計的支持は著しく増大する。結果として、アリコートあたり自然な頻度の混合ハプロタイプを有する多数の小アリコートによって、より少ない細胞の使用が可能となる。同様に、より長い断片（例えば、３００ｋｂまたはそれ以上）は、ヘテロ接合性遺伝子座を欠くセグメントにまたがるのに役立つ。
【０１１１】
５０〜１００ｎｌの非接触ピペッティングを提供するナノリットル（ｎｌ）分配ツール（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ  Ｎａｎｏ  Ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ  ｈｅａｄ、ＴＴＰ  ＬａｂＴｅｃｈ  Ｍｏｓｑｕｉｔｏおよびその他のもの）を、迅速で低費用のピペッティングに使用して、１０のゲノムライブラリーを並列にできる。アリコート数の増大（３８４ウェルプレートと比較して）は、各ウェル内のゲノムの複雑性の大きな低減をもたらし、計算の全体費用を１０倍を超えて低減し、データの品質を高める。さらに、このプロセスの自動化は、スループットを増大し、ライブラリーの製造の実際的な費用を低下させる。
【０１１２】
マイクロ液滴およびエマルジョンを含めたより少ないアリコート容積を使用するＬＦＲ
なおさらなる費用低減およびその他の利点は、マイクロ液滴を使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、ＬＦＲは、エマルジョンまたはマイクロ流体デバイスにおいてコンビナトリアルタギングを用いて実施される。１０，０００アリコートにおけるピコリットルレベルへの容積の低減は、より少ない試薬および計算費用によってさらに大きな費用低減を達成し得る。
【０１１３】
一実施形態では、ＬＦＲは、３８４ウェル形式においてウェルあたり１０マイクロリットル（μｌ）容量の試薬を使用する。このような容積は、例えば、１５３６ウェル形式において市販の自動化ピペッティングアプローチを使用することによって低減され得る。さらなる容量低減は、５０〜１００ｎｌの非接触ピペッティングを提供するナノリットル（ｎｌ）分配ツール（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ  Ｎａｎｏ  Ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ  ｈｅａｄ、ＴＴＰ  ＬａｂＴｅｃｈ  Ｍｏｓｑｕｉｔｏおよびその他のもの）を使用して達成され得、これを、数十のゲノムライブラリーを並行して作製するための迅速で低費用のピペッティングに用いることができる。アリコート数の増大は、各ウェル内のゲノムの複雑性の大きな低減をもたらし、計算の全体費用を低減し、データの品質を高める。さらに、このプロセスの自動化は、スループットを増大し、ライブラリーの製造の費用を低下させる。
【０１１４】
さらなる実施形態では、各アリコートの独特の同定は、８〜１２塩基対のエラー修正バーコードを用いて達成される。いくつかの実施形態では、ウェルと同数のアダプターが使用される。
【０１１５】
さらなる実施形態では、新規コンビナトリアルタギングアプローチが、２セットの４０のハーフバーコードアダプターに基づいて使用される。一実施形態では、ライブラリー構築は、２種の異なるアダプターを使用することを含む。ＡおよびＢアダプターは、異なるハーフバーコード配列を各々が含有し、数千の組合せを生じるよう容易に修飾される。さらなる実施形態では、バーコード配列を同一アダプター上に組み込む。これは、Ｂアダプターを、各々が、ライゲーションに使用される共通の重複配列によって分けられたハーフバーコード配列を有する２つの部分に切断することによって達成できる。２つのタグ成分は、各々４〜６塩基を有する。８塩基（２×４塩基）タグセットは、６５，０００種のアリコートに独特にタグ付けすることができる。１個の追加の塩基（２×５塩基）によって、エラー検出が可能となり、リード−ソロモン設計を使用して１０，０００種以上のアリコートにおける実質的なエラー検出および修正を可能にするために、１２塩基タグ（２×６塩基、１２００万種の独特のバーコード配列）を設計してもよい。例示的実施形態では、２×５塩基および２×６塩基タグの両方とも、縮重塩基（すなわち、「ワイルドカード」）の使用を含み、最適の解読効率を達成するために使用される。
【０１１６】
ピコリットルレベルへの容積の低減は（例えば、１０，０００アリコートにおける）、試薬および計算費用のさらに大きな低減を達成し得る。いくつかの実施形態では、このレベルの費用低減および大規模な分注は、ＬＦＲプロセスの、エマルジョンまたはマイクロ流体型デバイスへのコンビナトリアルタギングとの組合せによって達成される。ＤＮＡ精製を伴わずに同一反応においてすべての酵素工程を実施する能力は、このプロセスを小型化および自動化する能力を促進し、さまざまなプラットフォームおよびサンプル調製法への適応性をもたらす。
【０１１７】
一実施形態では、ＬＦＲ法は、エマルジョン型デバイスとともに使用される。ＬＦＲをエマルジョン型デバイスに適応させるための第１の工程は、液滴あたり単一の独特のバーコードを有するコンビナトリアルバーコードタグ付けされたアダプターのエマルジョン試薬を調製することである。１００のハーフバーコード２セットが、１０，０００アリコートを独特に同定するのに十分である。しかし、ハーフバーコードアダプターの数を３００超に増大させると、同一組合せのバーコードを含有する任意の２種のアリコートの見込みが低い、サンプルＤＮＡと組み合わされるバーコード液滴の無作為付加が可能となり得る。コンビナトリアルバーコードアダプター液滴は、数千のＬＦＲライブラリーのための試薬として、単一チューブ中に作製され、保存され得る。
【０１１８】
一実施形態では、本発明は、１０，０００〜１００，０００またはそれ以上のアリコートライブラリーに拡大される。さらなる実施形態では、ＬＦＲ法は、最初のハーフバーコードアダプターの数を増大することによって、このようなスケールアップに適応される。次いで、これらのコンビナトリアルアダプター液滴は、ハプロイドゲノムの１％未満に相当するライゲーション準備のできたＤＮＡを含有する液滴と１対１で融合される。液滴あたり１ｎｌおよび１０，０００液滴の控えめな見積もりを使用して、これは、全ＬＦＲライブラリーについて１０μｌの総容量に相当する。
【０１１９】
最近の研究はまた、増幅（例えば、ＭＤＡによる）後のＧＣバイアスの改善およびナノリットルサイズへの反応容積の低減によるバックグラウンド増幅の低減を示唆した。
【０１２０】
現在、数種のマイクロ流体デバイス（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｌｏｇｉｃ、Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ、ＮＣによって販売されるデバイス）またはピコ／ナノ液滴作製、融合（３０００／秒）および収集機能を有し、ＬＦＲのこのような実施形態において使用され得るピコ／ナノ液滴（例えば、ＲａｉｎＤａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）がある。その他の実施形態では、約１０〜２０ナノリットルの液滴を、改善されたナノピペッティングもしくは超音波液滴放出技術（例えば、ＬａｂＣｙｔｅ  Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、または最大９２１６の個々の反応ウェルを操作できるマイクロ流体デバイス（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡによって製造されるもの）を使用して、３０７２〜６１４４形式（計算費用節約および少数の細胞からゲノムＤＮＡを配列決定する能力を失わない、６０μｌの依然として費用効率の高い総ＭＤＡ容量）またはそれ以上でプレート中またはガラススライド上に置く。アリコートの数を増大することは、各ウェル内のゲノムの複雑性の大きな低減をもたらし、計算の全体費用を低減し、データの品質を高める。さらに、このプロセスの自動化は、スループットを増大し、ライブラリーの製造の費用を低下させる。
【０１２１】
増幅
一実施形態によれば、ＬＦＲプロセスは、ゲノムＤＮＡの、５’エキソヌクレアーゼでの短い処理で始まり、３’一本鎖オーバーハングを作製し、これはＭＤＡ開始部位として働く。エキソヌクレアーゼの使用によって、増幅の前の熱またはアルカリ変性の必要性が排除され、バイアスを断片の集団に導入しない。アルカリ変性を、５’エキソヌクレアーゼ処理と組合せてもよく、これは、バイアスのさらなる低減をもたらす。次いで、ＤＮＡをゲノム濃度以下に希釈し、分注する。分注後、各ウェル中の断片を、例えば、ＭＤＡ法を使用して増幅する。特定の実施形態では、ＭＤＡ反応は、改変ｐｈｉ２９ポリメラーゼをベースとする増幅反応であるが、別の既知増幅方法が使用される場合もある。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ＭＤＡ反応は、ウラシルを増幅産物中に導入するよう設計される。いくつかの実施形態では、ランダムヘキサマーを使用する標準ＭＤＡ反応が使用されて、各ウェル中の断片を増幅する。多数の実施形態では、断片の集団において増幅バイアスを低減するために、ランダムヘキサマーよりも、ランダム８マープライマーが使用される。さらなる実施形態では、増幅のバイアスを低減するために、ＭＤＡ反応にいくつかの異なる酵素も付加され得る。例えば、低濃度の非前進型５’エキソヌクレアーゼおよび／または一本鎖結合タンパク質を使用して、８マーの結合部位を作製してもよい。ベタイン、ＤＭＳＯおよびトレハロースなどの化学物質も、同様の機序によってバイアスを低減するために使用できる。
【０１２３】
断片化
一実施形態によれば、各ウェル中のＤＮＡの増幅後、増幅産物を断片化のラウンドに付す。いくつかの実施形態では、増幅後、各ウェル中の断片をさらに断片化するために上記のＣｏＲＥ法を使用する。ＣｏＲＥ法を使用するために、各ウェル中の断片を増幅するために使用されるＭＤＡ反応は、ＭＤＡ産物中にウラシルを組み込むよう設計される。ＭＤＡ産物の断片化はまた、超音波処理または酵素処理によって達成され得る。
【０１２４】
ＭＤＡ産物を断片化するためにＣｏＲＥ法が使用される場合には、増幅されたＤＮＡを含有する各ウェルを、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）と、ＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩと、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとの混合物を用いて処理して、ウラシル塩基を切り出し、機能的５’リン酸および３’ヒドロキシル基を有する単一塩基ギャップを作製する。Ｔａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼの使用によるニックトランスレーションは、二本鎖平滑末端切断をもたらし、ＭＤＡ反応に添加されるｄＵＴＰの濃度に応じて一定の大きさの範囲のライゲーション可能な断片をもたらす。いくつかの実施形態では、使用されるＣｏＲＥ法は、重合によってウラシルを除去することおよびｐｈｉ２９による鎖置換を含む。
【０１２５】
ＭＤＡ産物の断片化後、得られた断片の末端を修復してもよい。このような修復は、多数の断片化技術が、オーバーハング末端を有する末端ならびに３’および５’ヒドロキシル基ならびに／または３’および５’リン酸基などの後のライゲーション反応では有用ではない官能基を有する末端をもたらし得るので必要であり得る。本発明の多数の態様では、平滑末端を有するよう修復される断片を有することは、有用であり、いくつかの場合には、リン酸およびヒドロキシル基の正しい配向が存在せず、したがって、標的配列の「重合」を妨げるよう、末端の化学構造を変更することが望ましい場合もある。末端の化学構造にわたる制御は、当技術分野で公知の方法を使用して提供され得る。例えば、いくつかの状況では、すべての末端がヒドロキシル基を含有するよう、ホスファターゼの使用によって、すべてのリン酸基が排除される。次いで、各末端を、所望の成分間のライゲーションを可能にするよう選択的に変更してもよい。次いで、断片の一方の末端を、いくつかの実施形態では、アルカリホスファターゼを用いる処理によって「活性化」してもよい。
【０１２６】
断片化後、および、所望により末端修復後、断片をアダプターでタグ付けする。
【０１２７】
タグ付け
一般に、タグアダプターアームは、２つのセグメントで設計される。１つのセグメントは、すべてのウェルに共通しており、本明細書においてさらに記載される方法を使用して、平滑末端が断片と直接ライゲーションする。第２のセグメントは、各ウェルに独特であり、「バーコード」配列を含有し、その結果、各ウェルの内容物は組み合わされる場合に、各ウェルからの断片が同定され得る。
【０１２８】
一実施形態によれば、「共通」アダプターは、２つのアダプターアームとして付加され、一方のアームは、断片の５’末端とライゲーションされる平滑末端であり、もう一方のアームは、断片の３’末端とライゲーションされる平滑末端である。タギングアダプターの第２のセグメントは、各ウェルに独特である「バーコード」セグメントである。このバーコードは、一般に、独特の配列のヌクレオチドであり、特定のウェル中の各断片には、同一バーコードが与えられる。したがって、すべてのウェルからのタグ付けされた断片が、配列決定適用のために再度組み合わされる場合に、同一ウェルからの断片が、バーコードアダプターの同定によって同定され得る。バーコードは、共通アダプターアームの５’末端にライゲーションされる。共通アダプターおよびバーコードアダプターは、断片に、逐次ライゲーションされても、同時にライゲーションされてもよい。共通アダプターおよびバーコードアダプターの末端を、各アダプターセグメントが、正しい配向で、適切な分子とライゲーションするよう修飾してもよい。このような修飾は、断片が互いにライゲーションできないことおよびアダプターセグメントが唯一、示された配向でライゲーションできることを確実にすることによって、アダプターセグメントまたは断片の「重合」を防ぐ。
【０１２９】
さらなる実施形態では、各ウェルにおいて断片をタグ付けするために使用されるアダプターに、３セグメント設計が使用される。この実施形態は、バーコードアダプターセグメントが２つのセグメントに分かれている点を除いて、上記のバーコードアダプター設計と同様である。この設計によって、異なるバーコードセグメントを一緒にライゲーションして、完全バーコードセグメントを形成することによって、コンビナトリアルバーコードアダプターセグメントが作製されるのを可能にすることによって、より広い範囲の可能性あるバーコードが可能となる。このコンビナトリアル設計は、作製されることを必要とするフルサイズバーコードアダプターの数を低減しながら、可能性あるバーコードアダプターのより大きなレパートリーを提供する。
【０１３０】
一実施形態によれば、各ウェル中の断片をタグ付けした後、すべての断片を組み合わせて、単一集団を形成する。次いで、これらの断片を使用して、配列決定のための本発明の核酸鋳型を作製できる。これらのタグ付けされた断片から作製された核酸鋳型は、各断片と結合しているバーコードタグアダプターによって、特定のウェルから出自したものと同定可能である。同様に、タグを配列決定する際、結合しているゲノム配列も、そのウェルから出自したものと同定可能である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＬＦＲ法は、すべての目的について参照によりその全文が本明細書に組み込まれる２００６年６月１３日に出願された、米国特許出願第１１／４５１，６９２号（ＵＳ２００７／００７２２０８として公開された）に記載されるように、複数のレベルまたは層の断片化／分注を含まない。すなわち、一部の実施形態は、単一ラウンドの分注のみを使用し、同様に、各アリコートのための別個のアレイを使用するのではなく、単一アレイのためにアリコートを再プールすることを可能にする。
【０１３２】
複合核酸の供給源として１個または少数の細胞を使用するＬＦＲ
一実施形態によれば、個々の細胞または少数の細胞のゲノム（または細胞から単離された同様の数の核）を解析するために、ＬＦＲ法が使用される。この場合においてＤＮＡを単離するためのプロセスは、上記の方法と同様であるが、より少ない容量で起こり得る。
【０１３３】
上記で論じたように、細胞からゲノム核酸の長い断片を単離することは、いくつかの異なる方法によって達成され得る。一実施形態では、細胞を溶解し、穏やかな遠心分離工程を用いて無傷の核をペレットにする。次いで、ゲノムＤＮＡを、数時間のプロテイナーゼＫおよびＲＮアーゼ消化によって放出させる。次いで、いくつかの実施形態では、この材料を、残存する細胞性廃棄物の濃度を低下させるよう処理してもよく、このような処理は、当技術分野で周知であり、それだけには限らないが、一定時間（例えば、２〜１６時間）の透析および／または希釈を挙げることができる。核酸を単離するこのような方法は、多数の破壊的プロセス（エタノール沈殿、遠心分離およびボルテックス処理など）を含まず、ゲノム核酸は、大部分は無傷のままであり、１５０キロベースを超える長さを有する大部分の断片が得られる。いくつかの実施形態では、断片は、約１００〜約７５０キロベースの長さである。さらなる実施形態では、断片は、約１５０〜約６００、約２００〜約５００、約２５０〜約４００および約３００〜約３５０キロベースの長さである。
【０１３４】
ＤＮＡを単離したら、個々のウェルに分注する前に、材料の喪失を避けるよう、特に、各断片の末端からの配列の喪失を避けるよう注意深く断片化されなければならないが、これは、このような材料の喪失が、最終ゲノムアセンブリにおいてギャップをもたらし得るからである。いくつかの場合には、配列喪失は、互いにおよそ１００ｋｂの距離でｐｈｉ２９ポリメラーゼなどのポリメラーゼの出発部位を作り出す、あまりニックを入れない酵素の使用によって避けられる。ポリメラーゼは、新規ＤＮＡ鎖を作り出すので、それが古い鎖を置換して、最終結果としてポリメラーゼ開始部位の付近に重複する配列が存在し、その結果、配列の欠失は極めて少なくなる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、５’エキソヌクレアーゼの制御された使用（ＭＤＡ反応の前またはその間のいずれか）は、単細胞からの元のＤＮＡの多重複製を促進し、従ってコピーをコピーすることによる初期エラーの増幅を最小にし得る。
【０１３６】
一態様では、本発明の方法は、単細胞から高品質のゲノムデータをもたらす。ＤＮＡの喪失がないと仮定すると、多くの調製物から得られた相当な量のＤＮＡを使用する代わりに少数の細胞（１０個以下）の細胞で出発することは利点がある。１０個未満の細胞で出発することおよび実質的にすべてのＤＮＡを忠実に分注することによって、ゲノムの任意の所与の領域の長い断片中の均一なカバレッジが確実になる。５個以下の細胞で出発することによって、リードの総数を１２０Ｇｂ（６Ｇｂの２倍体ゲノムの２０倍のカバレッジ）を超えて増大せずに、各アリコート中の各１００ｋｂのＤＮＡ断片あたり４倍以上のカバレッジが可能となる。しかし、２、３個の細胞から配列決定するためには、多数のアリコート（１０，０００以上）およびより長いＤＮＡ断片（＞２００ｋｂ）が、さらにより重要であるが、これは、任意の所与の配列にとって、出発細胞数と同じだけ多数の重複断片があるだけであり、一アリコートにおける両親染色体からの重複断片の出現は、情報の壊滅的な喪失であり得るからである。
【０１３７】
ＬＦＲは、出発インプットゲノムＤＮＡに値する約１０個のみの細胞で出発して優れた結果をもたらし、１個の単細胞でさえ、ＬＦＲを実施するのに十分なＤＮＡを提供するのでこの問題によく適している。ＬＦＲにおける第１の工程は、一般に、低バイアスの全ゲノム増幅であり、これは、単細胞ゲノム解析において特に役立ち得る。取り扱いにおけるＤＮＡ鎖切断およびＤＮＡ喪失のために、単一分子配列決定法でさえ、単細胞からのある程度のＤＮＡ増幅を必要とする可能性が高い。単細胞を配列決定する困難さは、全ゲノムを増幅しようとすることから生じる。ＭＤＡを使用して細菌で実施された研究は、最終のアセンブルされた配列においてゲノムのおよそ半分の喪失に悩まされ、配列決定された領域にわたってカバレッジの相当高い量の変動があった。これは、ニックを有する初期ゲノムＤＮＡおよび末端の複製され得ず、したがって、ＭＤＡプロセスの間、失われている鎖切断の結果として部分的に説明され得る。ＬＦＲは、ＭＤＡに先立ってゲノムの長い重複する断片を作製することによってこの問題に対する解決法を提供する。本発明の一実施形態によれば、これを達成するために、細胞からゲノムＤＮＡを単離するために穏やかなプロセスが使用される。次いで、大部分は無傷のゲノムＤＮＡを、高頻度でニックを入れるニッカーゼを用いて軽く処理し、その結果、半無作為にニックの入ったゲノムが得られる。次いで、ｐｈｉ２９の鎖置換能を使用して、ニックから重合し、極めて長い（＞２００ｋｂ）の重複断片を作製する。次いで、これらの断片を、ＬＦＲの出発鋳型として使用する。
【０１３８】
ＬＦＲを使用するメチル化解析
さらなる態様において、本発明の方法および組成物は、ゲノムメチル化解析に使用される。ゲノム全体のメチル化解析のために現在利用可能ないくつかの方法がある。１つの方法は、ゲノムＤＮＡの重硫酸塩処理および反復エレメントまたはメチル化特異的制限酵素断片化によって得られたゲノムの画分を配列決定することを含む。この技術は、総メチル化に関する情報をもたらすが、遺伝子座特異的データは提供しない。次に高レベルの分解能は、ＤＮＡアレイを使用し、チップ上の特徴の数によって制限される。最後に、最高の分解能の、最も費用のかかるアプローチは、重硫酸塩処理と、それに続く全ゲノムの配列決定を必要とする。ＬＦＲを使用して、ゲノムのすべての塩基を配列決定し、ヒトゲノム中のシトシン位置ごとのメチル化のレベルに関するデジタル情報（すなわち、５塩基配列決定）を用いて完全な２倍体ゲノムをアセンブルすることが可能である。さらに、ＬＦＲによって、ハプロタイプを配列決定するために１００ｋｂまたはそれ以上のメチル化された配列が、連結されるのを防ぐことを可能にし、メチル化ハプロタイプ解析、現在利用可能であるいかなる方法をもってしても達成不可能である情報を提供する。
【０１３９】
一つの制限されない例示的実施形態では、ゲノムＤＮＡをまず分注し、ＭＤＡのために変性させる方法においてメチル化状態が得られる。次いで、ＤＮＡを、重硫酸塩を用いて処理する（変性ＤＮＡを必要とする工程）。残存する調製物は、例えば、２００６年６月１３日に出願された（ＵＳ２００７／００７２２０８として公開された）米国出願番号第１１／４５１，６９２号および２００８年１２月１５日に出願された（ＵＳ２００９／０３１１６９１として公開された）同１２／３３５，１６８号に記載される方法をたどり、それらは各々、すべての目的について、特に、ロングフラグメントリード技術の断片の混合物の核酸解析に関連するすべての技術について参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
一態様では、ＭＤＡは、リードの任意の所与のシトシン位置５０％について、独立に、亜硫酸水素塩によって影響を受けていない（すなわち、シトシンの反対側の塩基、グアニンが重硫酸塩によって影響を受けていない）とし、５０％がメチル化状態を提供する特定の断片の各鎖を増幅する。アリコートあたりのＤＮＡ複雑性の低減は、情報価値のあまりない、ほとんどが３塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ）のリードの正確なマッピングおよびアセンブリに役立つ。
【０１４１】
亜硫酸水素塩処理は、ＤＮＡを断片化すると報告されている。しかし、変性および重硫酸塩バッファーの注意深い滴定によって、ゲノムＤＮＡの過剰の断片化を避けることができる。ＬＦＲでは、シトシンのウラシルへの５０％変換が許容され、ＤＮＡの亜硫酸水素塩への曝露の低減を可能にして、断片化を最小にすることができる。いくつかの実施形態では、分注後のある程度の断片化はハプロタイプ解析に影響を及ぼさないので許容される。
【０１４２】
癌ゲノムの解析のためのＬＦＲの使用
９０％を超える癌が、異数性と呼ばれる、ヒトゲノムの領域において大幅な喪失または獲得を有するということが示唆されており、一部の個々の癌は、一部の染色体の４コピーを超えて含有すると観察されている。染色体および染色体内の領域のコピー数のこの増大した複雑性のために、癌ゲノムを配列決定することが実質的により困難になる。ＬＦＲ技術の、ゲノムの極めて長い（＞１００ｋｂ）断片を配列決定し、アセンブルする能力は、それを完全癌ゲノムの配列決定によく適しているものにする。
【０１４３】
複数のアリコートにおいて標的核酸を配列決定することによるエラー低減
一実施形態によれば、ＬＦＲに基づくフェージングが実施されず、標準配列決定アプローチが使用される場合さえ、標的核酸は、各々が一定量の標的核酸を含有する複数のアリコートに分けられる。各アリコートでは、標的核酸を断片化し（断片化が必要とされる場合には）、断片を、アリコート特異的タグ（またはタグのアリコート特異的セット）を用いてタグ付けし、その後増幅する。あるいは、組織サンプルを扱う場合には、１個または複数の細胞を、いくつかのアリコートの各々に分配し、その後、細胞破壊、断片化、アリコート特異的タグを用いて断片にタグ付けすることおよび増幅を行ってもよい。いずれの場合にも、各アリコートから増幅されたＤＮＡを別個に配列決定することも、プールし、プール後に配列決定することもできる。このアプローチの利点は、増幅（各アリコートにおいて起こるその他の工程）の結果として導入されるエラーを同定し、修正できることである。例えば、配列データの特定の位置（例えば、参照に対して）のベースコール（例えば、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴなどの特定の塩基を同定する）は、ベースコールが、２種以上のアリコート（またはその他の閾値数）からの配列データ中に、または予測されるアリコートの実質的過半数中に（例えば、少なくとも５１、７０または８０パーセントに）存在する場合に真実と認められ得、これでは、分母は、特定の位置にベースコールを有するアリコートに制限され得る。ベースコールは、ヘテロまたは可能性あるヘテロの一方の対立遺伝子を変更することを含み得る。特定の位置のベースコールは、１種のみのアリコート（またはアリコートのその他の閾値数）において、またはアリコートの実質的少数において（例えば、１０、５もしくは３アリコート未満、または２０もしくは１０パーセントなどの相対的数字を用いた尺度として）存在する場合には、偽と認められ得る。閾値は、予め決定してもよく、または配列決定データに基づいて動的に決定してもよい。特定の位置のベースコールは、予測されるアリコートの実質的少数において、および実質的過半数において（例えば、４０〜６０パーセントにおいて）存在しない場合に、「コールなし」と変換され／認められ得る。いくつかの実施形態および実装では、何がアリコートの実質的少数または実質的過半数と考慮され得るかを特性決定するために、種々のパラメータ（例えば、分布、確率および／またはその他の関数または統計における）が使用され得る。このようなパラメータの例として、それだけには限らないが、特定の塩基を同定するベースコールの数、特定の位置のコールされた塩基カバレッジまたは総数、特定のベースコールを含む配列データを生じさせた個別のアリコートの数および／または同一性、特定の位置に少なくとも１つのベースコールを含む配列データを生じさせた個別のアリコートの総数、特定の位置の参照塩基などのうち１種または複数が挙げられる。一実施形態では、特定のベースコールについての上記のパラメータの組合せは、特定のベースコールのスコア（例えば、確率）を決定するための関数へのインプットであり得る。スコアは、ベースコールが認められる（例えば、閾値を上回る）、エラーである（例えば、閾値を下回る）、またはコールなしである（例えば、ベースコールのスコアのすべてが閾値を下回る場合）かどうかを決定する一部として、１種または複数の閾値に対して比較できる。ベースコールの決定は、その他のベースコールのスコアに応じて変わり得る。
【０１４４】
１つの基本例として、Ａのベースコールが、対象とする位置のリードを含有するアリコートの３５％超（スコアの一例）において見られ、Ｃのベースコールが、これらのアリコートの３５％超において見られ、その他のベースコールが各々、２０％未満のスコアを有する場合には、その位置は、ＡおよびＣからなるヘテロと考えられ得、おそらくは、その他の判定基準（例えば、対象とする位置のリードを含有するアリコートの最小数）の影響を受ける。したがって、各スコアは、別の関数（例えば、比較またはファジー論理を使用し得る発見法）へのインプットであり、位置のベースコール（単数または複数）の最終決定を提供し得る。
【０１４５】
別の例として、ベースコールを含有する特定の数のアリコートを、閾値として使用してもよい。例えば、癌サンプルを解析する場合、低有病率体細胞突然変異があり得る。このような場合には、ベースコールは、その位置をカバーする１０％未満のアリコートにおいて現れ得るが、ベースコールは、依然として正しいと考えられ得、おそらくは、その他の判定基準の影響を受ける。したがって、種々の実施形態は、絶対数または相対数または両方（例えば、比較またはファジー論理へのインプットとして）を使用し得る。また、アリコートのこのような数は、関数（上記の）へのインプットならびに各数に対応する閾値であり得、関数はスコアを提供し得、これも１種または複数の閾値と比較して特定の位置のベースコールについて最終決定できる。
【０１４６】
エラー修正関数のさらなる例は、生リード中のエラーを配列決定することに関し、これはその他の変異体コールおよびそのハプロタイプと一致しない推定変異体コールにつながる。それぞれのハプロタイプに属する９および８アリコート中に変異体Ａの２０リードが見られ、６ウェル中に変異体Ｇの７リードが見られる（そのうち５または６が、Ａ−リードを有するアリコートと共有される）場合には、２倍体ゲノムについては、各ハプロタイプの位置に１種の変異体のみが存在し得るので、論理は変異体Ｇを配列決定エラーとして拒絶し得る。変異体Ａは、実質的により多くのリードで支持され、Ｇ−リードは、Ａ−リードのアリコートに実質的に追随し、このことは、それらがＡの代わりにＧを間違って読むことによって生じる可能性が最も高いことを示す。Ｇリードは、ほぼ例外なく、Ａとは別のアリコートにあり、このことは、Ｇ−リードが間違ってマッピングされていることおよびそれらが混入ＤＮＡから来たことを示し得る。
【０１４７】
ショートタンデムリピートを有する領域中の拡大を同定すること
ＤＮＡ中のショートタンデムリピート（ＳＴＲ）は、強い周期パターンを有するＤＮＡのセグメントである。ＳＴＲは、２以上のヌクレオチドのパターンが反復され、反復配列が互いに直接隣接する場合に生じ、リピートは、完全である場合も、不完全である場合もある、すなわち、周期的モチーフと対応しない２、３の塩基対があり得る。パターンは、一般に、２〜５塩基対（ｂｐ）の範囲の長さである。ＳＴＲは、通常、非コード領域中、例えば、イントロン中に位置する。ショートタンデムリピート多型（ＳＴＲＰ）は、相同ＳＴＲ遺伝子座が、個体間のリピート数の点で異なる場合に生じる。ＳＴＲ解析は、法医学的目的で遺伝子プロフィールの決定のために使用されることが多い。遺伝子のエキソン中に生じるＳＴＲはヒト疾患と結びついている超可変領域を表し得る（Madsen et al, BMC Genomics 9:410, 2008）。
【０１４８】
ヒトゲノム（その他の生物のゲノム）では、ＳＴＲは、トリヌクレオチドリピート、例えば、ＣＴＧまたはＣＡＧリピートを含む。トリヌクレオチドリピート拡大はまた、トリプレットリピート拡大としても知られ、ＤＮＡ複製の際の翻訳スリップによって引き起こされ、ハンチントン病などのトリヌクレオチドリピート障害として分類される特定の疾患と関連している。一般に、拡大が大きいほど、疾患を引き起こし、疾患の重度を増大する可能性がより高い。この性質が、これらのリピートの拡大による、トリヌクレオチドリピート障害において見られる「表現促進」という特徴、すなわち、罹患家族の後に続く世代を通して疾患の発症の年齢の低下する傾向および症状の重度の増大する傾向をもたらす。トリヌクレオチドリピートの拡大の同定は、トリヌクレオチドリピート障害の発症の年齢および疾患進行の正確な予測にとって有用であり得る。
【０１４９】
トリヌクレオチドリピートなどのＳＴＲの拡大は、次世代配列決定法を使用して同定するのが困難であり得る。このような拡大は、ライブラリーにおいてマッピングされない、失われているか、または過小評価されて場合がある。ＬＦＲを使用して、ＳＴＲ領域における配列カバレッジの大幅な低下を確かめることが可能である。例えば、ＳＴＲを有する領域は、このようなリピートを含まない領域と比較して低レベルのカバレッジを特徴的に有し、領域の拡大がある場合には、その領域においてカバレッジの大幅な低下があり、カバレッジ対ゲノム中の位置のプロットにおいて観察可能である。
【０１５０】
図１４は、罹患胚におけるＣＴＧリピート拡大の検出の一例を示す。ＬＦＲを使用して、胚の親のハプロタイプを決定した。平均正規化クローンカバレッジ対位置のプロットにおいて、拡大されたＣＴＧリピートを有するハプロタイプは、拡大領域を超えるＤＮＢを有さないか、または極めて少数のＤＮＢしか有さず、これが、領域中のカバレッジの低下につながる。低下はまた、両ハプロタイプの組み合わされた配列カバレッジにおいて検出され得る。しかし、１種のハプロタイプの低下は同定することはより困難であり得る。例えば、配列カバレッジが、平均で約２０である場合には、拡大領域を有する領域は、罹患ハプロタイプが、拡大領域においてゼロカバレッジを有する場合には、例えば、１０への大幅な低下を有する。したがって、５０％の低下が起こる。しかし、２種のハプロタイプの配列カバレッジが比較される場合には、カバレッジは、正常ハプロタイプでは１０であり、罹患ハプロタイプでは０であり、１０の低下であるが、１００％の全体のパーセンテージ低下である。または、組み合わされた配列カバレッジについて２：１である（正常対拡大領域におけるカバレッジ）相対量を解析できるが、無限またはゼロ（割合が形成される方法に応じて）である１０：０（ハプロタイプ１対ハプロタイプ２）であり、したがって、大きな違いである。
【０１５１】
配列データの診断的使用
本発明の方法を使用して作製された配列データは、さまざまな目的について有用である。実施形態によれば、本発明の配列決定法は、例えば、胚もしくは胎児の性別などの患者のまたは胚もしくは胎児の特徴もしくは医学的状態または例えば、嚢胞性繊維症、鎌形赤血球貧血、マルファン症候群、ハンチントン舞踏病およびヘモクロマトーシスまたは乳癌などの種々の癌を含めた、遺伝的成分を有する疾患の存在もしくは予後に関して情報価値がある、複合核酸の配列、例えば、全ゲノム配列中の配列変異を同定するために使用される。別の実施形態によれば、本発明の配列決定法は、患者（それだけには限らないが、胎児または胚を含む）からの１から２０個の間の細胞で始まり、配列に基づいて患者の特徴を評価する配列情報を提供するために使用される。
【０１５２】
癌診断法
全ゲノム配列決定は、疾患の遺伝的基礎の評価において価値あるツールである。遺伝的基礎があるいくつかの疾患、例えば、嚢胞性繊維症が知られている。
【０１５３】
全ゲノム配列決定の１つの適用は、癌を理解することである。癌ゲノミクスに対する、次世代配列決定の最も重要な影響は、単一患者の対応する腫瘍および正常ゲノムならびに所与の癌の種類の複数の患者サンプルを、再配列決定し、解析し、比較する能力であった。全ゲノム配列決定を使用して、生殖系列感受性遺伝子座、体細胞単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、小さい挿入および欠失（インデル）突然変異、コピー数変異（ＣＮＶ）および構造変異体（ＳＶ）を含めた、配列変異の全範囲を考えることができる。
【０１５４】
一般に、癌ゲノムは、体細胞ゲノム変更が上に重ねられた患者の生殖系列ＤＮＡからなる。配列決定によって同定される体細胞突然変異は、「ドライバー」または「パッセンジャー」突然変異のいずれかとして分類できる。いわゆるドライバー突然変異は、細胞に増殖または生存優位性を付与することによって、直接、腫瘍進行の一因となる突然変異である。パッセンジャー突然変異は、細胞分裂、ＤＮＡ複製および修復におけるエラーの間に獲得された中立的体細胞突然変異を包含し、これらの突然変異は、細胞が表現型的に正常でありながら、または腫瘍性変化の兆候後に獲得される場合もある。
【０１５５】
歴史的に、癌の分子機構を解明しようと試みられており、いくつかの「ドライバー」突然変異またはＨＥＲ２／ｎｅｕ２などのバイオマーカーが同定されている。このような遺伝子に基づき、既知遺伝子変更を有する腫瘍を特異的に標的とするための治療計画が開発されている。このアプローチの最良に定義された例は、トラスツズマブ（ヘルセプチン）による乳癌細胞においてＨＥＲ２／ｎｅｕのターゲッティングである。しかし、癌は、単純な単一遺伝子疾患ではなく、代わりに、個体間で異なり得る遺伝子変更の組合せを特徴とする。結果として、ゲノムのこれらのさらなる混乱が、一部の薬物療法を、特定の個体にとって無効にし得る。
【０１５６】
全ゲノム配列決定のための癌細胞は、全腫瘍の生検（少数の癌のマイクロ生検を含む）、患者の血流もしくはその他の体液から単離された癌細胞または当技術分野で公知の任意のその他の供給源から得ることができる。
【０１５７】
着床前遺伝子診断
本発明の方法の１つの適用は、着床前遺伝子診断のためである。生まれた赤ちゃんの約２〜３％は、いくつかの種類の主要な先天性欠損症を有する。遺伝物質（染色体）の異常な分離によるいくつかの問題のリスクは、母体の年齢とともに増大する。約５０％の確率で、これらの種類の問題は、ダウン症候群によるものであり、これは染色体２１の３番目のコピーである（トリソミー２１）。他の半分は、トリソミー、点突然変異、構造変異、コピー数変異などを含めた他の種類の染色体異常に起因する。これらの染色体の問題のうち多くは、重篤に罹患した赤ちゃんまたは出産まででさえ生存しない赤ちゃんとなる。
【０１５８】
遺伝医学および（臨床）遺伝学では、着床前遺伝子診断（ＰＧＤまたはＰＩＧＤ）（胚スクリーニングとしても知られる）とは、着床に先立って胚で、時には、受精に先立って卵母細胞でさえ実施される手順を指す。ＰＧＤは、両親が選択的妊娠中絶を避けることを可能にできる。用語着床前遺伝子スクリーニング（ＰＧＳ）は、特定の疾患を探すのではなく、例えば、疾患につながり得る遺伝子状態によるリスクにある胚を同定するためにＰＧＤ技術を使用する手順を示すために使用される。受精の前に生殖細胞で実施される手順は、代わりに、卵母細胞選択または精子選択の方法と呼ばれ得るが、これらの方法および目的は、ＰＧＤと部分的に重複する。
【０１５９】
着床前遺伝子プロファイリング（ＰＧＰ）とは、妊娠の成功のために最大の機会を有すると思われる胚の選択を実施するための補助的生殖技術の方法である。母方年齢が高齢の女性のために、また繰り返しｉｎ  ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）に失敗した患者のために使用される場合には、ＰＧＰは、異数性、相互転座およびロバートソン型転座ならびに染色体逆位または欠失などのその他の異常などの染色体異常の検出のためのスクリーニングとして主に実施される。さらに、ＰＧＰは、種々の疾患状態を含めた特徴の遺伝子マーカーを調べることができる。ＰＧＰの使用の背後にある原理は、数的染色体異常によって、妊娠喪失のほとんどの症例が説明され、ヒト胚の多くの割合が異数体であるということが知られているので、正倍数体胚の選択的置換は、ＩＶＦ治療の成功の機会を増大するはずであるということである。全ゲノム配列決定は、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）、定量的ＰＣＲおよびＳＮＰマイクロアレイのような包括的染色体解析法のこのような方法の代替法を提供する。全ゲノム配列決定全体は、例えば、単一塩基変化、挿入、欠失、構造変異およびコピー数変異に関する情報を提供し得る。
【０１６０】
ＰＧＤは、種々の発生段階から得られた細胞で実施され得るので、生検手順はそれに応じて変わる。生検は、それだけには限らないが、未受精および受精卵母細胞（極体、ＰＢについて）を含めたすべての着床前段階で、３日目卵割期胚（卵割球について）でおよび胚盤胞（栄養外胚葉細胞について）で実施され得る。
【０１６１】
配列決定システムおよびデータ解析
いくつかの実施形態では、ＤＮＡサンプル（例えば、全ヒトゲノムを表すサンプル）の配列決定は、配列決定システムによって実施され得る。配列決定システムの２つの例が図１に示されている。
【０１６２】
図１Ａおよび１Ｂは、本明細書に記載された実施形態に従う核酸配列解析のための技術および／または方法を実施するよう設定されている例示的配列決定システム１９０のブロック図である。配列決定システム１９０は、例えば、配列決定機器１９１などの１種または複数の配列決定機器、コンピュータシステム１９７などの１種または複数のコンピュータシステムおよびデータレポジトリ１９５などの１種または複数のデータレポジトリなどの複数のサブシステムを含みうるか、それと関連している場合もある。図１Ａに例示される実施形態では、システム１９０の種々のサブシステムは、１種または複数のネットワーク１９３を通じて通信によって接続され得る、これは、リモートシステム間の情報交換を促進するよう設定されている、パケット交換またはその他の種類のネットワークインフラストラクチャデバイス（例えば、ルーター、スイッチなど）を含み得る。図１Ｂに例示される実施形態では、配列決定システム１９０は、種々のサブシステム（例えば、配列決定機器（単数または複数）１９１、コンピュータシステム（単数または複数）１９７およびおそらくはデータレポジトリ１９５など）が、通信によっておよび／または機能的に結合しており、配列決定デバイス内に組み込まれている構成要素である配列決定デバイスである。
【０１６３】
一部の動作状況では、図１Ａおよび１Ｂに例示される実施形態のデータレポジトリ１９５および／またはコンピュータシステム（単数または複数）１９７が、クラウドコンピューティング環境１９６内に設定され得る。クラウドコンピューティング環境では、有用性およびオンデマンドとして使用するために、データレポジトリを含むストレージデバイスおよび／またはコンピュータシステムを含むコンピューティングデバイスが配置され、例示され得、したがって、クラウドコンピューティング環境は、サービスとして、任意のストレージ関連および／または計算タスクを実施するのに必要な、インフラストラクチャ（例えば、物理的および仮想機械、ロー／ブロックストレージ、ファイアウォール、ロードバランサ、アグリゲータ、ネットワーク、ストレージクラスターなど）、プラットフォーム（例えば、オペレーティングシステム、プログラミング言語実行環境、データベースサーバー、ウェブサーバー、アプリケーションサーバーなどを含み得るコンピューティングデバイスおよび／またはソルーションスタック）およびソフトウェア（例えば、アプリケーション、アプリケーションプログラミングインターフェースまたはＡＰＩなど）を提供する。
【０１６４】
種々の実施形態では、本明細書に記載された技術は、上記のサブシステムおよび構成要素のうちいくつかまたはすべて（例えば、配列決定機器、コンピュータシステムおよびデータレポジトリなど）を種々の立体配置およびフォームファクタで含む、種々のシステムおよびデバイスによって実施され得、したがって、図１Ａおよび１Ｂに例示される例示的実施形態および立体配置は、限定的な意味というよりも例示と考えられるべきものであるということは留意されたい。
【０１６５】
配列決定機器１９１は、生体サンプルの断片に由来する標的核酸１９２を受け取るよう、また標的核酸での配列決定を実施するよう設定されており、動作可能である。配列決定を実施できる任意の適した機械が使用され得、ここで、このような機械は、それだけには限らないが、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ライゲーションによる配列決定、合成による配列決定、単一分子配列決定、任意選択の配列検出、電磁配列検出、電圧変化配列検出およびＤＮＡから配列決定リードを作製するのに適している、任意のその他の現在公知であるか、後に開発される技術を含む種々の配列決定技術を使用し得る。種々の実施形態では、配列決定機器は、標的核酸を配列決定し得、ギャップを含む場合も、含まない場合もあり、メイトペア（またはペアエンド）である場合も、そうではない場合もある配列決定リードを作製し得る。図１Ａおよび１Ｂに示されるように、配列決定機器１９１は、標的核酸１９２を配列決定し、配列決定リード１９４を獲得し、これを、（一時的および／または永久）保存のために１種または複数のデータレポジトリ１９５に、および／または１種または複数のコンピュータシステム１９７による処理のために送る。
【０１６６】
データレポジトリ１９５は、ディスクのアレイ（例えば、ＳＣＳＩアレイなど）、ストレージクラスターまたは任意のその他の適したストレージデバイス組織として設定され得る、１種または複数のストレージデバイス（例えば、ハードディスクドライブ、光ディスク、ソリッドステートドライブなど）に実装され得る。データレポジトリのストレージデバイス（単数または複数）は、システム１９０に取り付け可能である（例えば、図１Ｂに示されるように）および／または例えば、グリッド、ストレージクラスター、ストレージエリアネットワーク（ＳＡＮ）および／またはネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）などの適した方法で通信によって相互接続され得る（例えば、図１Ａに示されるように）、システム１９０の内部の／不可欠の構成要素として、または外部構成要素として（例えば、外部ハードドライブまたはディスクアレイなど）設定され得る。種々の実施形態および実装では、データレポジトリは、ファイルとして情報を保存する１種または複数のファイルシステムとして、データレコードで情報を保存する１種または複数のデータベースとして、および／または任意のその他の適したデータストレージ組織としてストレージデバイスに実装され得る。
【０１６７】
コンピュータシステム１９７は、立体配置データおよび／またはオペレーティングシステム（ＯＳ）ソフトウェアとともに、本明細書に記載される技術および方法の一部またはすべてを実施できる、および／または配列決定機器１９１の操作を制御できる、汎用プロセッサ（例えば、中央処理装置またはＣＰＵ）、メモリおよびコンピュータ論理１９９を含む１種または複数のコンピューティングデバイスを含み得る。例えば、本明細書に記載される方法のいずれも（例えば、エラー修正、ハプロタイプフェージングなどのための）、方法の種々の工程を実施するために論理１９９を実行するよう設定され得るプロセッサを含むコンピューティングデバイスによって、全体にまたは部分的に実施され得る。さらに、方法工程は、番号が付けられた工程として示され得るが、本明細書に記載される方法の工程は、同時に（例えば、コンピューティングデバイスのクラスターによって並行して）または異なる順序で実施され得るということは理解される。コンピュータ論理１９９の機能性は、単一集積モジュールとして実装される場合も（例えば、集積論理において）、またはいくつかのさらなる機能性を提供し得る２種以上のソフトウェアモジュールに組み合わされる場合もある。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、コンピュータシステム１９７は、単一コンピューティングデバイスであり得る。その他の実施形態では、コンピュータシステム１９７は、グリッド、クラスターに、またはクラウドコンピューティング環境に通信によっておよび／または機能的に相互接続され得る複数のコンピューティングデバイスを含み得る。このような複数のコンピューティングデバイスは、コンピューティングノード、ブレードまたは任意のその他の適したハードウェア立体配置などの種々のフォームファクタで設定され得る。このような理由で、図１Ａおよび１Ｂ中のコンピュータシステム１９７は、限定的な意味というよりも例示と考えられるべきものである。
【０１６９】
図２は、配列決定機器（単数または複数）および／またはコンピュータシステム（単数または複数）の一部として種々のデータ処理および／または制御機能性を実施するための命令を実行するよう設定され得る、例示的コンピューティングデバイス２００のブロック図である。
【０１７０】
図２では、コンピューティングデバイス２００は、直接的にか、またはバス２７５などの１種または複数のシステムバスを介して間接的に相互接続されている、いくつかの構成要素を含む。このような構成要素は、それだけには限らないが、キーボード２７８、永続的ストレージデバイス（単数または複数）２７９（例えば、固定ディスク、ソリッドステートディスク、光ディスクなどといった）および１種または複数のディスプレイデバイス（例えば、ＬＣＤモニター、フラットパネルモニター、プラズマスクリーンなどといった）が連結され得るディスプレイアダプター２８２を含み得る。Ｉ／Ｏコントローラー２７１と連結する周辺機器およびインプット／アウトプット（Ｉ／Ｏ）デバイスは、それだけには限らないが、１種または複数のシリアルポート、１種または複数のパラレルポートおよび１種または複数のユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）を含めた当技術分野で公知の任意の数の手段によってコンピューティングデバイス２００に接続され得る。コンピューティングデバイス２００をネットワーク（例えば、インターネットまたはローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）など）に接続するために、外部インターフェース（単数または複数）２８１（ネットワークインターフェースカードおよび／またはシリアルポートを含み得る）を使用してもよい。外部インターフェース（単数または複数）２８１はまた、例えば、配列決定機器または任意のその構成要素などの種々の外部デバイスからの情報を受け取ることができるいくつかのインプットインターフェースを含み得る。システムバス２７５を介した相互接続によって、１種または複数のプロセッサ（例えば、ＣＰＵ）２７３が、接続された各構成要素と通信し、システムメモリ２７２からの、および／またはストレージデバイス（単数または複数）２７９からの命令、ならびに種々の構成要素間の情報の交換を実行する（および／またはその実行を制御する）ことが可能となる。システムメモリ２７２および／またはストレージデバイス（単数または複数）２７９は、プロセッサ（単数または複数）２７３によって実行される一連の命令ならびにその他のデータを保存する、１種または複数のコンピュータによって読み取り可能な一時的でないストレージメディアとして実施され得る。このようなコンピュータによって読み取り可能な一時的でないストレージメディアとして、それだけには限らないが、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリメモリ（ＲＯＭ）、電磁媒体（例えば、ハードディスクドライブ、ソリッドステートドライブ、サムドライブ、フロッピーディスクなどといった）、コンパクトディスク（ＣＤ）またはデジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）などの光媒体、フラッシュメモリなどが挙げられる。種々のデータ値およびその他の構造化または非構造化情報は、ある構成要素またはサブシステムから別の構成要素またはサブシステムへのアウトプットであり得、ディスプレイアダプター２８２および適したディスプレイデバイスを介してユーザーに示され得、外部インターフェース（単数または複数）２８１を通ってネットワークでリモートデバイスもしくはリモートデータレポジトリに送られ得るか、または（一時的におよび／もしくは永久的に）ストレージデバイス（単数または複数）２７９に保存され得る。
【０１７１】
コンピューティングデバイス２００によって実施される方法および機能性のいずれも、モジュール式にまたは一体的に、ハードウェアおよび／またはコンピュータソフトウェアを使用する論理の形で実装され得る。本明細書において、「論理」とは、１種または複数のコンピューティングデバイスの１種または複数のプロセッサ（例えば、ＣＰＵ）によって実行されると、１種もしくは複数の機能性を実施するよう、および／または１種もしくは複数の結果もしくはその他の論理素子によって使用されるデータの形でデータを戻すよう動作可能である一連の命令を指す。種々の実施形態および実装では、任意の所与の論理は、１種または複数のプロセッサ（例えば、ＣＰＵ）によって実行可能である１種もしくは複数のソフトウェア構成要素として、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）および／もしくはフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などの１種もしくは複数のハードウェア構成要素として、または１種もしくは複数のソフトウェア構成要素および１種もしくは複数のハードウェア構成要素の任意の組合せとして実装され得る。任意の特定の論理のソフトウェア構成要素（単数または複数）は、それだけには限らないが、独立型のソフトウェアアプリケーションとして、クライエント−サーバーシステムにおけるクライエントとして、クライエント−サーバーシステムにおけるサーバーとして、１種または複数のソフトウェアモジュールとして、１種または複数の機能のライブラリーとして、ならびに１種または複数のスタティックおよび／またはダイナミックリンクライブラリーとして実装され得る。実行の際、任意の特定の論理の命令は、１種または複数のコンピュータプロセス、スレッド、ファイバーおよびそれだけには限らないが、メモリ、ＣＰＵ時間、ストレージスペースおよびネットワーク帯域を含み得る割り当てられたコンピューティング資源であり得る、１種または複数のコンピューティングデバイスのハードウェアでインスタンスが作成され得る任意のその他の適したランタイムエンティティとして実施され得る。
【０１７２】
ＬＦＲプロセスのための技術およびアルゴリズム
ベースコーリング
本発明の組成物および方法を使用して標的核酸を配列決定するための全体的な方法が、本明細書および例えば、すべての目的についてその全文が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１０／０１０５０５２−Ａ１号；公開特許出願番号ＷＯ２００７１２０２０８、ＷＯ２００６０７３５０４、ＷＯ２００７１３３８３１およびＵＳ２００７０９９２０８および米国特許出願第１１／６７９，１２４号；同１１／９８１，７６１号；同１１／９８１，６６１号；同１１／９８１，６０５号；同１１／９８１，７９３号；同１１／９８１，８０４号；同１１／４５１，６９１号；同１１／９８１，６０７号；同１１／９８１，７６７号；同１１／９８２，４６７号；同１１／４５１，６９２号；同１１／５４１，２２５号；同１１／９２７，３５６号；同１１／９２７，３８８号；同１１／９３８，０９６号；同１１／９３８，１０６号；同１０／５４７，２１４号；同１１／９８１，７３０号；同１１／９８１，６８５号；同１１／９８１，７９７号；同１１／９３４，６９５号；同１１／９３４，６９７号；同１１／９３４，７０３号；同１２／２６５，５９３号；同１１／９３８，２１３号；同１１／９３８，２２１号；同１２／３２５，９２２号；同１２／２５２，２８０号；同１２／２６６，３８５号；同１２／３２９，３６５号；同１２／３３５，１６８号；同１２／３３５，１８８号および同１２／３６１，５０７号に記載されている。Drmanac et al., Science 327,78-81, 2010も参照のこと。ロングフラグメントリード（Ｌｏｎｇ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｒｅａｄ）（ＬＦＲ）法は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１２／８１６，３６５号、同１２／３２９，３６５号、同１２／２６６，３８５号および同１２／２６５，５９３号に、また米国特許第７，９０６，２８５号、同７，９０１，８９１号および同７，７０９，１９７号に開示されている。さらなる詳細および改善が、本明細書において提供される。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、データ抽出は、２種の画像データ、すなわち表面上のすべてのＤＮＢの位置の境界を画定する明視野像および各配列決定サイクルの間に獲得される蛍光画像のセットに頼る。データ抽出ソフトウェアを使用し、明視野像を用いてすべての対象を同定でき、次いで、このような対象各々のために、ソフトウェアを使用して、各配列決定サイクルの平均蛍光値を計算できる。任意の所与のサイクルについて、その塩基が、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴであるかどうか問い合わせを行うための、異なる波長で撮られた４種の画像に対応する４つのデータ点がある。これらの生データ点（本明細書において「ベースコール」とも呼ばれる）がひとまとめにされ、各ＤＮＢの不連続の配列決定リードが得られる。
【０１７４】
コンピューティングデバイスは、同定された塩基の集団をアセンブルして、標的核酸の配列情報を提供および／または標的核酸中の特定の配列の存在を同定できる。例えば、コンピューティングデバイスは、種々の論理を実行することによって、本明細書に記載された技術およびアルゴリズムに従って同定された塩基の集団をアセンブルし得、このような論理の一例として、Ｊａｖａ、Ｃ＋＋、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎおよび任意のその他の適した従来のおよび／またはオブジェクト指向のプログラミング言語などの任意の適したプログラミング言語で書かれたソフトウェアコードがある。１種または複数のコンピュータプロセスの形態で実行される場合には、このような論理は、永続的ストレージ上の種々の構造中に、および／または揮発性メモリに保存され得る構造化または非構造化データを読み、書きおよび／またはそうでなければ処理し得、このようなストレージ構造の例として、それだけには限らないが、ファイル、テーブル、データベース、レコード、アレイ、リスト、ベクター、変数、メモリおよび／またはプロセッサレジスタ、オブジェクト指向のクラスからインスタンスが作成される永続的および／またはメモリデータオブジェクトならびに任意のその他の適したデータ構造が挙げられる。いくつかの実施形態では、同定された塩基は、複数のＤＮＢで実施された複数の配列決定サイクルから得られた重複配列のアラインメントによって完全配列にアセンブルされる。本明細書において、用語「完全配列」とは、部分または全ゲノムの配列ならびに部分または全標的核酸を指す。さらなる実施形態では、１種または複数のコンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理によって実施されるアセンブリ法は、重複する配列を「つなぎ合わせ」て完全配列を提供するために使用され得るアルゴリズムを使用する。さらなる実施形態では、同定された配列を完全な配列へアセンブルすることを補助するために参照テーブルが使用される。参照テーブルは、最適の生物で既存の配列決定データを使用してコンパイルされ得る。例えば、ヒトゲノムデータは、ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｆｓｅｑ／ｒｅｌｅａｓｅにおける全米バイオテクノロジー情報センターによって、またはｗｗｗ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／ｒｅｓｅａｒｃｈｈｕｒｅｆ／におけるｔｈｅ  Ｊ．Ｃｒａｉｇ  Ｖｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって評価され得る。ヒトゲノム情報のすべてまたはサブセットを使用して、特定の配列決定クエリーの参照テーブルを作製できる。さらに、ヒトゲノム内の変異は、それに含有される情報の起源に応じて参照データに傾斜し得るので、特定の参照テーブルは、特定の民族性、地理的遺伝形質を有するヒト、宗教的または文化的に規定された集団からの遺伝子配列を含めた特定の集団に由来する実験データから構築され得る。
【０１７５】
本明細書において論じられる本発明の実施形態のいずれにおいても、核酸鋳型および／またはＤＮＢの集団は、全ゲノムまたは全標的ポリヌクレオチドを実質的に網羅するためにいくつかの標的核酸を含み得る。本明細書において、「実質的に網羅する」とは、解析されるヌクレオチド（すなわち、標的配列）の量が、標的ポリヌクレオチドの少なくとも２コピー、または別の態様では、少なくとも１０コピー、または別の態様では、少なくとも１２コピー、または別の態様では、少なくとも１００コピーの相当物を含有することを意味する。標的ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ断片およびｃＤＮＡ断片を含めたＤＮＡ断片ならびにＲＮＡ断片を含み得る。標的ポリヌクレオチド配列を再構築する工程の手引きは、参照により組み込まれる以下の参考文献中に見出すことができる：Lander et al, Genomics, 2: 231-239 (1988); Vingron et al, J. Mol. Biol., 235: 1-12 (1994)；および同様の参考文献。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、４つの画像、各色色素のものを、配列決定される複合ヌクレオチドの問い合わされた各位置について作製する。色素およびバックグラウンド強度間のクロストークについて調整することによって、画像中の各スポットの位置および４色各々の得られた強度を決定する。定量的モデルを、得られた四次元データセットにフィッティングすることができる。所与のスポットについて塩基が、どの程度上手く４種の強度がモデルにフィットするかを反映するクオリティスコアとともにコールされる。
【０１７７】
各フィールドの４つの画像のベースコーリングは、１種または複数のコンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理によって、いくつかの工程で実施できる。第１に、画像強度を、修飾された形態学的「画像オープン」操作を使用してバックグラウンドについて修正する。ＤＮＢの位置は、カメラピクセル位置とぴったりと合うので、強度抽出は、バックグラウンドが修正された画像からのピクセル強度の簡単なリードアウトとして行う。次いで、これらの強度を、以下に記載されるように、光学および生物学的シグナルクロストーク両方のいくつかの供給源について修正する。次いで、修正された強度を、各ＤＮＢについて、４つの可能性あるベースコール結果の一連の４つの可能性を最終的にもたらす確率的モデルに渡す。次いで、いくつかの測定基準を組み合わせて、予めフィッティングされたロジスティック回帰を使用してベースコールスコアを計算する。
【０１７８】
強度修正：生物学的および光学クロストークのいくつかの供給源を、１種または複数のコンピューティングデバイスによって実行されるコンピュータ論理として実装される線形回帰モデルを使用して修正する。線形回帰は、より計算コストが高く、得られた結果が同様のクオリティを有するデコンボリューション法よりも好ましいものであった。光学クロストークの供給源として、４種の蛍光色素スペクトル間のフィルターバンドオーバーラップおよび近接近での光回折による隣接するＤＮＢ間の横クロストークが挙げられる。クロストークの生物学的供給源として、以前のサイクルの不完全な洗浄、プローブ合成エラーおよび隣接する位置のプローブ「スリッピング」混入シグナル、アンカーから「外側の」（より離れた）塩基を問い合わせる場合の不完全なアンカー伸長が挙げられる。線形回帰を使用して、隣接するＤＮＢいずれかの強度または以前のサイクルもしくはその他のＤＮＢ位置からの強度を使用して予測され得るＤＮＢ強度の一部を決定する。次いで、クロストークのこれらの供給源によって説明され得る強度の一部を、元の抽出された強度から差し引く。回帰係数を決定するために、線形回帰モデルの左側の強度は、主に「バックグラウンド」強度、すなわち、回帰が実施されている所与の塩基がコールされないＤＮＢの強度のみからなる必要がある。これは、元の強度を使用して行われるプレコーリング工程を必要とする。特定のベースコールを有さないＤＮＢ（合理的な信頼をもって）が選択されると、コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理は、クロストーク供給源の同時回帰を実施する：
【０１７９】
【数１】
2014523233.tif 000003
【０１８０】
隣接するＤＮＢクロストークを上記の回帰を使用して両方修正する。また、各ＤＮＢを、利用可能なＤＮＢ位置すべてにわたってすべての隣接するものを含む線形モデルを使用して、その特定の区域について修正する。
【０１８１】
ベースコール確率：最大強度を使用して塩基をコールすることは、異なる形の４種の塩基のバックグラウンド強度分布の主な原因とならない。このような可能性ある相違に対処するために、バックグラウンド強度の実験による確率分布に基づいて確率的モデルを開発した。強度が修正されると、コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理は、最大強度を使用していくつかのＤＮＢをプレコールし（特定の信頼度閾値を通過するＤＮＢ）、これらのプレコールされたＤＮＢを使用して、バックグラウンド強度分布（所与の塩基がコールされないＤＮＢの強度の分布）を導く。このような分布を得る際に、コンピューティングデバイスは、各ＤＮＢについて、バックグラウンド強度である強度の実験による確率を説明するその分布の下でのテイル確率を計算できる。したがって、各ＤＮＢおよび４種の強度各々について、コンピューティングデバイスまたはその論理は、バックグラウンドであるその確率（
【０１８２】
【数２】
2014523233.tif 000004
）を得、保存することができる。次いで、コンピューティングデバイスは、これらの確率を使用してすべての可能性あるベースコール結果の確率を計算できる。可能性あるベースコール結果は、ＤＮＢによって二重に占有され得るか、または一般に、多重に占有され得る、または占有され得ないスポットを説明する必要もある。計算された確率を、その先の確率（多重に占有されるか、または空のスポットの低い先の）と組み合わせることによって、１６の可能性ある結果の確率が生じる：
【０１８３】
【数３】
2014523233.tif 000005
【０１８４】
次いで、これらの１６の確率を組み合わせて、４種の可能性あるベースコールの４種の確率の減少したセットを得ることができる。すなわち：
【０１８５】
【数４】
2014523233.tif 000006
【０１８６】
スコア計算：ロジスティック回帰を使用して、スコア計算式を導いた。コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理をロジスティック回帰にフィッティングして、インプットとしていくつかの測定基準を使用してベースコールの結果をマッピングした。測定基準は、コールされた塩基と次に高い塩基の間の確率比、ベースコールされた塩基強度、ベースコール強度の指標変数およびフィールドのクラスタリングクオリティ全体を説明する測定基準を含んでいた。すべての測定基準を、一致したコールと不一致のコール間の対数オッズ比と共線的であるよう変換した。モデルを、クロス確認を使用してリファインした。最終ロジスティック回帰係数を用いるロジット関数を使用して、製造におけるスコアを計算した。
【０１８７】
マッピングおよびアセンブリ
さらなる実施形態では、リードデータは、コンパクトバイナリフォーマットでコード化され、塩基およびクオリティスコアの両方を含む。クオリティスコアは、塩基正確性と相関している。配列アセンブリソフトウェアを含めた解析ソフトウェア論理はスコアを使用して、リードを用いて個々の塩基から得られた証拠の寄与を決定できる。
【０１８８】
リードは、ＤＮＢ構造のために「ギャップが入る」ことがある。ギャップの大きさは、酵素消化について回る変動性のために変わる（普通＋／−１塩基）。ｃＰＡＬのランダムアクセス性のために、リードは、時々、そうでなければハイクオリティのＤＮＢ中に読まれない塩基（「コールなし」）を有し得る。リード対は対にする。
【０１８９】
リードデータを参照配列に対してアラインできるマッピングソフトウェア論理を使用して、本明細書に記載された配列決定法によって作成されたデータをマッピングできる。このようなマッピング論理は、１種または複数のコンピューティングデバイスによって実行されると、一般に、個々のゲノム変異、リードエラーまたは読まれない塩基によって引き起こされるものなどの参照配列からの小さい変異に寛容となる。この性質によって、ＳＮＰの直接再構築が可能となることが多い。大規模構造変化または高密度変異の領域を含めた大きな変異のアセンブリを支持するために、ＤＮＢの各アームを別個にマッピングし、メイトペア形成制約をアラインメント後に適用してもよい。
【０１９０】
本明細書において、用語「配列変異体」または簡単に「変異体」とは、それだけには限らないが、１個または複数の塩基の置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または置換（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、１個または複数の塩基の挿入または欠失（「インデル」とも呼ばれる）、逆位、変換、複製またはコピー数変異（ＣＮＶ）、トリヌクレオチドリピート拡大、構造変異（ＳＶ；例えば、染色体内または染色体間再配列、例えば、転座）などを含めた任意の変異体を含む。２倍体ゲノムでは、「異型接合性」または「ヘテロ」とは、遺伝子対中の特定の遺伝子の２種の異なる対立遺伝子である。２種の対立遺伝子は、異なる突然変異体または突然変異体と対を形成している野生型対立遺伝子であり得る。また、本方法を、非２倍体生物の解析、このような生物がハプロイド／一倍体であるか（Ｎ＝１、ここで、Ｎ＝染色体のハプロイド数）、倍数体または異数体であるどうかにおいて使用してもよい。
【０１９１】
配列リードのアセンブリは、いくつかの実施形態では、ＤＮＢリード構造（コールされない塩基を有する、対になった、ギャップの入ったリード）を支援するソフトウェア論理を利用して、いくつかの実施形態では、ヘテロ接合体部位のフェージングのために、本発明の配列情報作製ＬＦＲ法では活用されないこともある２倍体ゲノムアセンブリを作製できる。
【０１９２】
本発明の方法を使用して、参照配列中に存在しない新規セグメントを再構築できる。いくつかの実施形態では、証拠（Ｂａｙｅｓｉａｎ）推論とＢｒｕｉｊｉｎグラフをベースとするアルゴリズムの組合せを利用するアルゴリズムが使用され得る。いくつかの実施形態では、各データセットに対して実験的に較正された統計的モデルが使用され、事前のフィルタリングまたはデータトリミングを伴わずに、すべてのリードデータが使用されることが可能となり得る。大規模構造変異（それだけには限らないが、欠失、転座などを含む）およびコピー数変異も、対をなすリードを利用することによって検出され得る。
【０１９３】
ＬＦＲデータのフェージング
図３は、ＬＦＲデータのフェージングにおける主な工程を説明する。これらの工程は以下のとおりである：
【０１９４】
（１）ＬＦＲデータを使用するグラフ構築：１種または複数のコンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理によって、方向のないグラフを作成し、これでは、頂点は、ヘテロ接合性ＳＮＰを表し、エッジは、それらのヘテロ接合性ＳＮＰ間の接続を表す。エッジは、接続の配向および強度からなる。１種または複数のコンピューティングデバイスは、ストレージ構造中にこのようなグラフを保存し得、これとして、それだけには限らないが、ファイル、テーブル、データベースレコード、アレイ、リスト、ベクター、変数、メモリおよび／またはプロセッサレジスタ、オブジェクト指向のクラスからインスタンスが作成される永続的および／またはメモリデータオブジェクトならびに任意のその他の適した一時的および／または永続的データ構造が挙げられる。
【０１９５】
（２）メイトペアデータを使用するグラフ構築：工程２は、工程１と同様であり、これでは、接続は、ＬＦＲデータとは対照的にメイトペアデータに基づいて行われる。接続がなされるためにＤＮＢは、同一リード中の対象とする２つのヘテロ接合性ＳＮＰを用いて見出されなければならない（同一アームまたはメイトアーム）。
【０１９６】
（３）グラフ組合せ：コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理は、上記のグラフの各々が、Ｎ×Ｎ疎行列によることを表し、ここで、Ｎは、その染色体上の候補ヘテロ接合性ＳＮＰの数である。２つのノードは、上記の方法の各々において１つの接続のみを有し得る。２つの方法が組み合わされる場合には、２つのノードについて最大２つの接続があり得る。したがって、コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理は、１つの接続を、最適の接続として選択するための選択アルゴリズムを使用し得る。これらの研究のために、メイトペアデータのクオリティは、ＬＦＲデータのものよりも大幅に劣るということを発見した。したがって、ＬＦＲ由来の接続のみを使用した。
【０１９７】
（４）グラフトリミング：間違った接続の一部を除去するために、一連の発見法を考案し、コンピューティングデバイスによって保存されたグラフデータに適用した。より正確には、ノードは、一方の方向で少なくとも２つの接続およびもう一方の方向で１つの接続という条件を満たさなければならず、そうでなければ、排除する。
【０１９８】
（５）グラフ最適化：コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理によって、最小全域木（ＭＳＴ）を作製することによってグラフを最適化した。エネルギー関数を−｜強度｜に設定した。このプロセスの間に、可能であれば、低強度エッジは、より強いパスとの競合のために排除される。したがって、ＭＳＴは、最強の最も信頼性のある接続の天然の選択を提供する。
【０１９９】
（６）コンティグビルディング：最小全域木が、コンピュータによって読み取り可能なメディアに作製および／または保存されると、コンピューティングデバイスまたはその論理は、１つのノード（ここでは、第１のノード）を絶えず有するすべてのノードを再設定できる。この第１のノードは、アンカーノードである。ノードの各々について、次いで、コンピューティングデバイスは、アンカーノードへのパスを見出す。試験ノードの配向は、パス上のエッジの配向の集合体である。
【０２００】
（７）ユニバーサルフェージング：上記の工程後、コンピューティングデバイスまたはその論理によって、先の工程（単数または複数）において作り上げられている各コンティグをフェージングする。ここで、この部分の結果は、プレフェージングされた（ｐｒｅ−ｐｈａｓｅｄ）、フェージングに向き合っている（ｏｐｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｐｈａｓｅｄ）と呼ばれ、これは最終フェージングではないことを示す。第１のノードは、アンカーノードとして任意に選択されたので、全コンティグのフェージングは、親の染色体と必ずしも一致しない。ユニバーサルフェージングのために、トリオ情報が利用可能である、コンティグ上の２、３のヘテロ接合性ＳＮＰを使用する。次いで、これらのトリオヘテロ接合性ＳＮＰを使用して、コンティグのアラインメントを同定する。ユニバーサルフェージング工程の最後に、すべてのコンティグは適切に標識されており、したがって、染色体レベルのコンティグとして考えられ得る。
【０２０１】
コンティグ作製
コンティグを作製するために、各ヘテロ接合性ＳＮＰ対について、コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理によって２つの仮説が調べられる：フォワード配向およびリバース配向。フォワード配向とは、２つのヘテロ接合性ＳＮＰが、それらが元々列挙されている同一方向で接続している（最初にアルファベット順に）ことを意味する。リバース配向とは、２つのヘテロ接合性ＳＮＰが、その元の列挙の逆の順序で接続していることを意味する。図４は、ヘテロ接合性ＳＮＰ対に対するフォワードおよびリバース配向の割り当てを含む隣接するヘテロ接合性ＳＮＰの対解析を表す。
【０２０２】
各配向は、対応する仮説の妥当性を示す数的支持を有する。この支持は、図５に示される連結性行列の１６セルの関数であり、これは、仮説の選択の一例およびそれに対するスコアの割り当てを示す。関数を単純化するために、１６の変数を３：エネルギー１、エネルギー２および不純物に減らす。エネルギー１およびエネルギー２は、各仮説に対応する２つの最高値セルである。不純物は、マトリックス中のセルの合計（仮説に対応する２より大きい）に対する、その他のセルすべての合計の割合である。２つの仮説間の選択は、対応するセルの合計に基づいて行われる。より多い合計を有する仮説が、勝利仮説である。以下の計算のみを使用して、その仮説の強度を割り当てる。強い仮説とは、エネルギー１およびエネルギー２について高い値および不純物について低い値を有するものである。
【０２０３】
３つの測定基準エネルギー１、エネルギー２および不純物が、ファジー推論システムに供給され（図６）、０から１の間（０および１を含む）の単一の値−スコア−にその効果が低減される。ファジー推論システム（ＦＩＳ）は、１種または複数のコンピューティングデバイスによって実行され得るコンピュータ論理として実装される。
【０２０４】
最大予測されるコンティグ長（例えば、２０〜５０Ｋｂ）までの合理的な距離内にある各ヘテロ接合性ＳＮＰ対に対して、接続性操作が行われる。図６は、グラフ構築を示し、一部の例示的接続性および３つの隣接するヘテロ接合性ＳＮＰの強度を表す。
【０２０５】
ファジー推論エンジンのルールは、以下のとおりに定義される：
（１）エネルギー１が小さく、エネルギー２が小さい場合は、スコアは、極めて少ない。
（２）エネルギー１が中程度であり、エネルギー２が小さい場合は、スコアは、小さい。
（３）エネルギー１が中程度であり、エネルギー２が中程度である場合には、スコアは、中程度である。
（４）エネルギー１が大きく、エネルギー２が小さい場合には、スコアは、中程度である。
（５）エネルギー１が大きく、エネルギー２が中程度である場合には、スコアは大きい。
（６）エネルギー１が大きく、エネルギー２が大きい場合には、スコアは、極めて大きい。
（７）不純物が小さい場合には、スコアは大きい。
（８）不純物が中程度である場合には、スコアは小さい。
（９）不純物が大きい場合には、スコアは極めて小さい。
【０２０６】
各変数について、小さい、中程度および大きいの定義は、異なっており、その特定のメンバーシップ関数によって支配される。
【０２０７】
ファジー推論システム（ＦＩＳ）を各変数セットに曝露した後に、インプットセットのルールに対する寄与が、ファジー論理システムによって伝播され、アウトプットで単一（脱ファジー化された）数が作製される−スコア。このスコアは、０から１の間で制限され、１は、最高のクオリティを示す。
【０２０８】
ＦＩＳを各ノード対に適用した後、コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理は、完全なグラフを構築する。図７は、このようなグラフの一例を示す。ノードは、勝利仮説の配向に従って色が付けられる。各接続の強度は、対象とするヘテロ接合性ＳＮＰ対に対するＦＩＳの適用に由来する。予備的グラフが構築されると（図７の上部プロット）、コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理によって、グラフが最適化され（図７の下部プロット）、それを木に低減する。この最適化プロセスは、元のグラフから最小全域木（ＭＳＴ）を作製することによって行われる。ＭＳＴは、各ノードから任意のその他のノードへの独特のパスを保証する。
【０２０９】
図７は、グラフ最適化を示す。この適用では、各コンティグ上の第１のノードがアンカーノードとして使用され、その他のノードすべては、そのノードへ方向付けられる。各ヒットは、配向に応じて、アンカーノードの配向に対応するために反転しなくてはならないか、そうではない。図８は、所与の実施例のコンティグアラインメントプロセスを示す。このプロセスの最後に、フェージングされたコンティグが利用可能になる。
【０２１０】
フェージングのプロセス中のこの時点で、２種のハプロタイプが分離される。これらのハプロタイプのうち一方は、母から来たものであり、一方は父から来たものであることはわかっているが、どちらがどちらの親から来たものであるのか正確にはわかっていない。フェージングの次の工程で、コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理は、各ハプロタイプに正しい親の標識（母／父）を割り当てようとする。このプロセスは、ユニバーサルフェージングと呼ばれる。そうするためには、親に対する、少なくとも２、３のヘテロ接合性ＳＮＰ（コンティグ上の）の関連性を知る必要がある。この情報は、トリオ（母−父−子供）フェージングを行うことによって得ることができる。トリオの配列決定されたゲノムを使用して、親の関連性がわかっている一部の遺伝子座が同定される−より詳しくは、少なくとも１つの親が、同形接合体である場合。次いで、これらの関連性を、コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理によって使用して、全コンティグに正しい親の標識（母／父）を割り当てる、すなわち、親を利用したユニバーサルフェージングを実施する（図９）。
【０２１１】
高い正確性を保証するために、以下を実施してもよい：（１）可能であれば（例えば、ＮＡ１９２４０の場合には）、複数の供給源からトリオ情報を獲得すること（例えば、内部および１０００個のゲノム）およびこのような供給源の組合せを使用すること；（２）コンティグが、少なくとも２つの既知トリオフェージングされた遺伝子座を含むことを必要とすること；（３）列を成す一連のトリオミスマッチを有する（セグメントエラーを示す）コンティグを排除すること；（４）トリオ遺伝子座の末端に単一のトリオミスマッチを有する（潜在的セグメントエラーを示す）コンティグを排除すること。
【０２１２】
図１０は、天然のコンティグ分離を示す。親のデータが使用されようとなかろうと、コンティグは、天然には、特定の点を越えて継続しないことが多い。コンティグ分離の理由は、以下である：（１）特定の領域における普通より多いＤＮＡ断片化または増幅の欠如、（２）低いヘテロ接合性ＳＮＰ密度、（３）参照ゲノム上のポリＮ配列および（４）ＤＮＡリピート領域（ミスマッピングする傾向がある）。
【０２１３】
図１１は、ユニバーサルフェージングを示す。ユニバーサルフェージングの主要な利点の１つは、全染色体の「コンティグ」を得る能力である。これは、各コンティグが（ユニバーサルフェージング後に）正しい親の標識を有するハプロタイプを保持するために可能である。したがって、母の標識を保持するすべてのコンティグを、同一ハプロタイプ上においてもよい、同様の操作を、父のコンティグにも行ってもよい。
【０２１４】
ＬＦＲ法の主要な利点のもう１つのものは、ヘテロ接合性ＳＮＰコーリングの正確性を著しく増大する能力である。図１２は、ＬＦＲ法の使用に起因するエラー検出の２つの例を示す。第１の例は、図１２（左）に示されており、これでは、連結性行列は、予測される仮説のいずれも支持しない。これは、ヘテロ接合性ＳＮＰの一方が、真にヘテロ接合性ＳＮＰではないことを示すものである。この例では、Ａ／Ｃヘテロ接合性ＳＮＰは、実際には、同形接合体遺伝子座（Ａ／Ａ）であり、これはアセンブラーによってヘテロ接合性遺伝子座として間違って標識された。このエラーは同定でき、排除または（この場合には）修正できる。第２の例は、図１３（右）に示されており、これでは、この場合の連結性行列は、両仮説を同時に支持する。これは、ヘテロ接合性ＳＮＰコールが真実ではないという兆候である。
【０２１５】
「健常な」ヘテロ接合性ＳＮＰ接続マトリックスとは、２つの高いセルのみを有するものである（予測されるヘテロ接合性ＳＮＰ位置で、すなわち、直線上ではなく）。すべてのその他の可能性が可能性ある問題を指摘し、排除されるか、または対象とする遺伝子座の代替ベースコールを作製するために使用され得る。
【０２１６】
ＬＦＲ法の別の利点は、弱い支持で（例えば、バイアスまたはミスマッチ率のためにＤＮＢをマッピングすることが困難である場合）ヘテロ接合性ＳＮＰをコールする能力である。ＬＦＲ法は、ヘテロ接合性ＳＮＰに対して追加の制約を必要とするので、非ＬＦＲアセンブラーにおいてヘテロ接合性ＳＮＰコールが必要とする閾値は低減され得る。図１３は、少数のリードにもかかわらず、確信のあるヘテロ接合性ＳＮＰコールがなされ得るこの場合の一例を実証する。図１３（右）では、正常なシナリオ下で、少数の支持リードは、任意のアセンブラーが、対応するヘテロ接合性ＳＮＰを確信をもってコールするのを妨げた。しかし、連結性行列は、「クリーン」であり、ヘテロ接合性ＳＮＰコールをこれらの遺伝子座に、より確信をもって割り当てることができる。
【０２１７】
スプライシング部位においてＳＮＰに注釈をつけること
転写されたＲＮＡ中のイントロンは、それらがｍＲＮＡになる前にスプライシングされる必要がある。スプライシングのための情報は、これらのＲＮＡの配列内に埋め込まれており、コンセンサスに基づいている。スプライシング部位コンセンサス配列中の突然変異は、多数のヒト疾患の原因である（Faustino and Cooper, Genes Dev. 17:419-437, 2011）。スプライシング部位の大部分は、エキソンの周囲の固定位置の簡単なコンセンサスに一致する。これに関して、スプライシング部位突然変異に注釈を付けるようプログラムを開発した。このプログラムでは、コンセンサススプライシング位置モデル（www.life.umd.edu/labs/mount/RNAinfo）を使用した。パターン：エキソンの５’末端領域中のＣＡＧ｜Ｇ（「｜」は、エキソンの始まりを表す）および同じエキソンの３’末端領域中のＭＡＧ｜ＧＴＲＡＧ（「｜」は、エキソンの最後を表す）について探索を実施する。ここで、Ｍ＝｛Ａ，Ｃ｝、Ｒ＝｛Ａ，Ｇ｝。さらに、スプライシングコンセンサス位置を、２種に分類する：モデルに対するコンセンサスが１００％必要とされる場合はＩ型；モデルに対するコンセンサスが、＞５０％の場合において保存される場合にはＩＩ型。おそらく、Ｉ型位置にあるＳＮＰ突然変異は、スプライシングを失敗させるのに対し、ＩＩ型位置にあるＳＮＰは、スプライシング事象の効率を低下させるだけとなる。
【０２１８】
スプライシング部位突然変異に注釈を付けるためのプログラム論理は、２つの部分を含む。パートＩでは、インプット参照ゲノムからのモデル位置配列を含有するファイルを作成する。パート２では、配列決定プロジェクトからのＳＮＰを、これらのモデル位置配列と比較し、任意のＩ型およびＩＩ型突然変異を報告する。プログラム論理は、イントロン中心の代わりにエキソン中心である（ゲノムの構文解析における利便性のために）。所与のエキソンについて、その５’末端に、本発明者らは、コンセンサス「ｃＡＧｇ」を探す（位置−３、−２、−１、０について。０は、エキソンの開始を意味する）。大文字は、Ｉ型位置を意味し、小文字は、ＩＩ型位置を意味する）。エキソンの３’末端では、コンセンサス「ｍａｇＧＴｒａｇ」について探索を実施する（位置配列−３、−２、−１、０、１、２、３、４について）。これらの必要条件を確信させないゲノムリリースからのエキソンは、簡単に無視される（すべての場合の約５％）。これらのエキソンは、その他の小さいクラスのスプライシング部位コンセンサスに分類され、プログラム論理によって調査されない。配列決定されたゲノムからの任意のＳＮＰを、これらのゲノム位置でモデル配列と比較する。Ｉ型の任意のミスマッチが報告される。ＩＩ型位置のミスマッチは、突然変異がコンセンサスから逸脱する場合に報告される。
【０２１９】
上記のプログラム論理は、悪いスプライシング部位突然変異の大部分を検出する。報告される悪いＳＮＰは、確かに問題のあるものである。しかし、このプログラムによって検出されないスプライシングの問題を引き起こす多数のその他の悪いＳＮＰがある。例えば、上記のコンセンサスを確信させないヒトゲノム内の多数のイントロンがある。また、イントロンの中央の二分枝点における突然変異も、スプライシングの問題を引き起こし得る。これらのスプライシング部位突然変異は報告されない。
【０２２０】
転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）に影響を及ぼすＳＮＰの注釈。放出されたヒトゲノム配列（ビルド３６またはビルド３７のいずれか）からＴＦＢＳを見出すためにＪＡＳＰＡＲモデルが使用される。ＪＡＳＰＡＲ  Ｃｏｒｅは、行列としてモデル化される、脊椎動物の１３０のＴＦＢＳの位置頻度データの収集物である（Bryne et al., Nucl. Acids Res. 36:D102-D106, 2008; Sandelin et al., Nucl. Acids Res. 23:D91-D94, 2004）。これらのモデルは、JASPARウェブサイト(http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl?rm=browse&db=core&tax_group=vertebrates)からダウンロードされる。これらのモデルは、ウェブサイトからダウンロードされる。これらのモデルは、以下の式を使用して位置重み行列（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ）（ＰＷＭ）に変換される：ｗｉ＝ｌｏｇ２［（ｆｉ＋ｐ  Ｎｉ１／２）／（Ｎｉ＋Ｎｉ１／２）／ｐ］（式中、ｆｉは、位置Ｉの特定の塩基の観察された頻度であり；Ｎｉは、位置での総観察結果であり；ｐは、現在のヌクレオチドのバックグラウンド頻度であり、これは０．２５をデフォルトする（bogdan.org.ua/2006/09/11/position-frequency-matrix-to-position-weight-matrix-pfm2pwm.html;Wasserman and Sandelin, Nature Reviews, Genetics 5:P276-287, 2004））。特定のプログラム、ｍａｓｔ（meme.sdsc.edu/meme/mast-intro.html）は、ＴＦＢＳ部位についてゲノム内の配列セグメントを検索するために使用される。参照ゲノムにおいてＴＦＢＳ部位を抽出するためにプログラムを実行した。工程の概略は以下のとおりである：（ｉ）各遺伝子についてｍＲＮＡを用いて、ゲノムから推定ＴＦＢＳ含有領域を抽出し［−５０００、１０００］、０は、ｍＲＮＡ出発位置である。（ｉｉ）推定ＴＦＢＳ含有配列について、すべてのＰＷＭモデルのｍａｓｔ検索を実行する。（ｉｉｉ）所与の閾値を超えるヒットを選択する。（ｉｖ）複数のまたは重複するヒットを有する領域について、１ヒットのみ、最高ｍａｓｔ検索スコアを有するものを選択する。
【０２２１】
適したコンピュータによって読み取り可能なメディアにおいて作製および／または保存された参照ゲノムからのＴＦＢＳモデルヒットを用いて、コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理によって、ヒット領域内に位置するＳＮＰを同定できる。これらのＳＮＰは、モデルおよびヒットスコアにおける変化に影響を与える。第２のプログラムは、ＳＮＰを含有するセグメントが、ＰＷＭモデルに２回、１回は参照のため、２回目はＳＮＰ置換を有するもののために遭遇するように、ヒットスコアにおけるこのような変化を計算するために書かれた。セグメントヒットスコアを、３を超えて低下させるＳＮＰは、悪いＳＮＰとして同定される。
【０２２２】
２つの悪いＳＮＰを有する遺伝子の選択。悪いＳＮＰを有する遺伝子は、２つのカテゴリーに分類される：（１）転写されたＡＡ−配列に影響を及ぼすものおよび（２）転写結合部位に影響を及ぼすもの。ＡＡ−配列に影響を及ぼすために、以下のＳＮＰサブカテゴリーが含まれる：
【０２２３】
（１）ナンセンスまたはノンストップ変異。これらの突然変異は、末端切断型タンパク質または拡張されたタンパク質のいずれかを引き起こす。いずれの状況でも、タンパク質産物の機能は、完全に失われているか、あまり効率的ではないかのいずれかである。
【０２２４】
（２）スプライシング部位変異。これらの突然変異は、イントロンのスプライシング部位が破壊される（モデルによって特定のヌクレオチドの１００％であることが必要とされる位置について）か、または大きく減少される（モデルによって特定のヌクレオチドの＞５０％であることが必要とされる部位について）ようにする。ＳＮＰは、スプライシング部位ヌクレオチドを、プライシング部位コンセンサス配列モデルによって予測されるようにコンセンサスの５０％未満である別のヌクレオチドに突然変異させる。これらの突然変異は、末端切断型で、エキソンが失われている、またはタンパク質産物量が大きく減少しているタンパク質を製造する可能性が高い。
【０２２５】
（３）ＡＡ変異のＰｏｌｙｐｈｅｎ２注釈。タンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こすが、その長さには変化を引き起こさないＳＮＰ、Ｐｏｌｙｐｈｅｎ２（Adzhubei et al., Nat. Methods 7:248-249, 2010）を、主要な注釈ツールとして使用した。Ｐｏｌｙｐｈｅｎ２は、ＳＮＰに「良性」、「未知」「損傷を与える可能性がある」および「おそらく損傷を与える」を用いて注釈をつける。「損傷を与える可能性がある」および「おそらく損傷を与える」は両方とも、「悪いＳＮＰ」として同定された。Ｐｏｌｙｐｈｅｎ２によって割り当てられるこれらのカテゴリーは、Ｐｏｌｙｐｈｅｎ２ソフトウェアの構造予測に基づいている。
【０２２６】
転写結合部位突然変異のために、ＴＦＢＳ−結合部位のスクリーニングとして参照ゲノムに基づいてモデルのｍａｘＳｃｏｒｅの７５％を使用した。ｍａｘＳｃｏｒｅの＜＝７５％である領域中の任意のモデル−ヒットを除去する。残存するものについて、ＳＮＰが、ヒット−スコアを３以上低下させる場合には、有害なＳＮＰと考えられる。
【０２２７】
２つのクラスの遺伝子が報告される。クラス１遺伝子は、少なくとも２つの悪いＡＡに影響を及ぼす突然変異を有していたものである。これらの突然変異は単一対立遺伝子上のすべてである場合も（クラス１．１）、または２種の個別の対立遺伝子上に広がっている場合も（クラス１．２）ある。クラス２遺伝子は、クラス１セットの上位集合である。クラス２遺伝子は、ＡＡに影響を及ぼすか、ＴＦＢＳ部位に影響を及ぼすかに関係なく、少なくとも２つの悪いＳＮＰを含有する遺伝子である。しかし、必要条件は、少なくとも１つのＳＮＰがＡＡに影響を及ぼすことである。クラス２遺伝子は、クラス１中にあるものか、または１つの有害なＡＡ突然変異および１つまたは複数の有害なＴＦＢＳに影響を及ぼす変異を有するもののいずれかである。クラス２．１とは、すべてのこれらの有害な突然変異が、単一対立遺伝子からのものであることを意味するのに対し、クラス２．２とは、有害なＳＮＰが２つの個別の対立遺伝子からのものであることを意味する。
【０２２８】
前述の技術およびアルゴリズムは、所望により、配列決定に先立つＬＦＲ処理とともに複合核酸を配列決定するための方法（配列決定と組み合わせたＬＦＲは、「ＬＦＲ配列決定」と呼ばれることもある）に適用可能であり、これは、以下の通り詳細に記載される。複合核酸を配列決定するためのこのような方法は、コンピュータ論理を実行する、１種または複数のコンピューティングデバイスによって実施され得る。このような論理の一例として、Ｊａｖａ、Ｃ＋＋、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎならびに任意のその他の適した従来のおよび／またはオブジェクト指向のプログラミング言語などの任意の適したプログラミング言語で書かれたソフトウェアコードがある。１種または複数のコンピュータプロセスの形態で実行される場合には、このような論理は、永続的ストレージ上の種々の構造中に、および／または揮発性メモリに保存され得る構造化または非構造化データを読み、書きおよび／またはそうでなければ処理し得、このようなストレージ構造の例として、それだけには限らないが、ファイル、テーブル、データベース、レコード、アレイ、リスト、ベクター、変数、メモリおよび／またはプロセッサレジスタ、オブジェクト指向のクラスからインスタンスが作成される永続的および／またはメモリデータオブジェクトならびに任意のその他の適したデータ構造が挙げられる。
【０２２９】
ロングリード配列決定における正確性の改善
特定のロングリード技術（例えば、ナノ細孔配列決定）を使用するＤＮＡ塩基配列決定法では、ロング（例えば、１０〜１００ｋｂ）リード長が利用可能であるが、一般に、高い偽陰性および偽陽性率を有する。このようなロングリード技術から得られた配列の最終正確性は、以下の一般的なプロセスに従ってハプロタイプ情報（完全または部分フェージング）を使用して大幅に増強され得る。
【０２３０】
第１にコンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理によって、リードを互いにアラインする。多数のヘテロ接合性コールが、重複中に存在すると予測される。例えば、２００〜５００ｋｂの断片が最小１０％重複する場合には、これは、＞１０ｋｂの重複をもたらし、これはおおよそ、１０のヘテロ接合性遺伝子座に翻訳され得る。あるいは、各ロングリードを参照ゲノムにアラインし、それによって、リードの複数のアラインメントが暗黙のうちに得られる。
【０２３１】
複数のリードアラインメントが達成されると、重複領域が考慮され得る。重複は多数の（例えば、Ｎ＝１０）ヘテロ遺伝子座を含み得るという事実は、ヘテロの組み合わせを考慮するために利用され得る。このコンビナトリアル様式が、ハプロタイプについて可能性の大きな空間（４Ｎまたは４＾Ｎ；Ｎ＝１０の場合には、４Ｎ＝約１００万）をもたらす。Ｎ次元空間中のこれらの４Ｎ点のうち、２点のみが、生物学的に実行可能な情報、すなわち、２つのハプロタイプに相当するものを含有すると予測される。言い換えると、４Ｎ／２（ここで、１ｅ６／２または約５００，０００）のノイズ抑制比を有する。実際には、特に、配列はすでにアラインされているので（したがって、よく似ている）、また、各遺伝子座は、普通、３以上の可能性ある塩基を保持しない（それが本当のヘテロである場合）ので、この４Ｎ空間の多くが縮重している。結果として、この空間の下限は、実際には２Ｎ（Ｎ＝１０である場合は、２Ｎ＝約１０００）。したがって、ノイズ抑制比は、２Ｎ／２（ここで、１０００／２＝５００）のみとなり得るが、これでも依然として全く目覚しいものである。偽陽性および偽陰性の数が増えるにつれ、空間の大きさが２Ｎ〜４Ｎに拡大し、これは、次に、より高いノイズ抑制比をもたらす。言い換えれば、ノイズが増えるにつれ、自動的により抑制される。したがって、アウトプット生成物は、極めて少量（むしろ一定の）のノイズしか保有しないと予測され、インプットノイズとはほとんど独立している。（代償は、よりノイズの多い条件における収率損失である。）もちろん、これらの抑制比は、（１）エラーが組織的である（またはその他のデータ特異性）、（２）アルゴリズムが最適ではない、（３）重複部分が短いまたは（４）カバレッジ重複性が小さい場合には変更される。Ｎは、１より大きい任意の整数、例えば、２、３、５、１０またはそれ以上である。
【０２３２】
大きな初期エラー率を有し得るロングリード配列決定法の正確性を増大するために以下の方法が有用である。
【０２３３】
第１に、コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理によって、２、３のリード、例えば、５つのリードをアラインする。リードが約１００ｋｂであり、共有される重複は、１０％であると仮定すると、これは、５つ以上のリード、例えば、１０〜２０のリードにおいて１０ｋｂの重複をもたらす。また、１Ｋｂ毎にヘテロがあると仮定する。したがって、この共通領域中に合計１０個のヘテロがある。
【０２３４】
次に、コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理によって、部分（例えば、ちょうどゼロ以外のエレメント）または上記の１０の候補へテロのα１０可能性（ここで、αは、２〜４の間である）の全行列中が満たされる。一実施では、この行列のα１０個のうち２個のみのセルが、高い密度であるはずである（例えば、予め決定され得るか、または動的であり得る閾値によって測定されるように）。これらは、真実のヘテロに対応するセルである。これら２個のセルは、実質的にノイズがない中心と考えられ得る。残りは、特に、エラーが組織的ではない場合には、ほとんど０、時々１メンバーシップを含有するはずである。エラーが組織的である場合には、クラスタリング事象があり得（例えば、ちょうど０または１よりも多くを有する第３のセル）、これは、タスクをより困難にする。しかし、この場合でさえ、偽クラスターのクラスターメンバーシップは、２つの予測されるクラスターのものよりも大幅に弱いはずである（例えば、絶対量または相対量によって測定されるように）。この場合における代償は、出発点が、アラインされたより多数の配列を含むはずであり、これは、より長いリードまたはより大きなカバレッジ重複性を有すること直接的に関連する。
【０２３５】
上記の工程は、重複しているリードの間で２つの実行可能なクラスターが観察されると仮定する。多数の偽陽性については、これは、当てはまらない。この場合には、α次元空間、予測される２つのクラスターは不明確となる、すなわち、それらは、高密度を有する単一点である代わりに、対象とするセルの周囲のＭ個の点の不明確なクラスターとなり、ここで、対象とするこれらのセルは、クラスターの中心にあるノイズを含まない中心である。これによって、各リードにおいて正確な配列が表されていないという事実にもかかわらずクラスタリング法が予測された点の局所性を獲得することが可能となる。クラスター事象はまた、クラスターが不明確である（すなわち、３以上の中心があり得る）場合にも起こり得るが、上記と同様の方法で、スコア（例えば、クラスターのセルの総カウント）を使用して、２倍体生物の２つの真実のクラスターからより弱いクラスターを区別することができる。種々の領域について、本明細書に記載されるように、２つの真実のクラスターを使用して、コンティグを作製でき、コンティグを２つの群に対応させて、複合核酸の大きな領域についてハプロタイプを形成することができる。
【０２３６】
最後に、コンピューティングデバイスまたはそのコンピュータ論理集団に基づく（既知）ハプロタイプを使用して、実際のクラスターの発見において信頼度を増大し、および／または追加の手引きを提供できる。この方法を可能にする方法は、観察された各ハプロタイプに重みを提供し、観察されていないハプロタイプに小さいがゼロではない値に提供することである。そうすることによって、対象とする集団において観察されている天然のハプロタイプに向けたバイアスを達成する。
【０２３７】
未修正のエラーを有するタグ配列データを有するリードを使用すること
本明細書において論じられるように、本発明の一実施形態によれば、複合核酸のサンプルをいくつかのアリコート（例えば、マルチウェルプレート中のウェル）に分け、増幅し、断片化する。次いで、アリコート特異的タグを断片にライゲーションして、複合核酸の特定の断片が出自するアリコートを同定する。タグは、所望により、エラー修正コード、例えば、リード−ソロモンエラー修正（またはエラー検出）コードを含む。断片が配列決定される場合には、複合核酸配列のタグおよび断片の両方が配列決定される。タグ配列中にエラーがある場合には、断片が出自するアリコートを同定することまたはエラー修正コードを使用して配列を修正することは不可能であり、全リードが廃棄され、多くの配列データの喪失につながり得る。正しいおよび修正されたタグ配列データを含むリードは、正確性は高いが、収率が低く、一方、修正され得ないタグ配列データを含むリードは正確性は低いが収率は高い。代わりに、このような配列データを、特定のタグの特定のアリコートとの結合の同一性によって出自のアリコートを同定するための、このようなデータを必要とするもの以外のプロセスに使用する。正しい（または修正された）タグ配列データを有するリードを必要とするプロセスの例として、それだけには限らないが、サンプルまたはライブラリーマルチプレックス化、フェージングまたはエラー修正または正しい（または修正可能な）タグ配列を必要とする任意のその他のプロセスが挙げられる。修正され得ないタグ配列データを有するリードを使用し得るプロセスの例として、それだけには限らないが、マッピング、参照をベースとするおよび局所デノボアセンブリ、プールをベースとする統計学（例えば、対立遺伝子頻度、デノボ突然変異の位置など）を含めた任意のその他のプロセスが挙げられる。
【０２３８】
ロングリードを仮想ＬＦＲに変換すること
ＬＦＲのために設計されるアルゴリズム（フェージングアルゴリズムを含む）は、ランダム仮想タグ（均一分布を有する）を、（１０〜１００ｋｂ）の長い断片の各々に割り当てることによってロングリードに使用できる。仮想タグは、各コードの真実の均一分布を可能にする利益を有する。ＬＦＲは、コードのプーリングにおける相違およびコードのデコーディング効率における相違のために、このレベルの均一性を達成できない。３：１（最大１０：１）の割合は、ＬＦＲにおける任意の２種のコードの表現において容易に観察され得る。しかし、仮想ＬＦＲプロセスは、任意の２つのコードの間で真実の１：１比をもたらす。
【０２３９】
前述の記載を考慮して、本発明の一態様によれば、１種または複数の生物、すなわち、個体生物または生物の集団の複合核酸（例えば、全ゲノム）の配列を決定するための方法が提供される。このような方法は、（ａ）１種または複数のコンピューティングデバイスで、複合核酸の複数のリードを受け取ることと、（ｂ）コンピューティングデバイスを用いて、リードから複合核酸のアセンブルされた配列を作製することとを含み、アセンブルされた配列は、７０、７５、８０、８５、９０または９５パーセント以上のコールレートで、メガベースあたり１．０、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５または０．０４未満の偽の単一ヌクレオチド変異体を含み、ここで、方法は、１種または複数のコンピューティングデバイスによって実施される。一部の態様では、コンピュータによって読み取り可能な一時的でないストレージメディアは、１種または複数のコンピューティングデバイスによって実行されると、１種または複数のコンピューティングデバイスにこのような方法の工程を実施させる命令を含む１種または複数の一連の命令を保存する。
【０２４０】
このような方法が、ハプロタイプフェージングを含む一実施形態によれば、方法は、アセンブルされた配列中の複数の配列変異体を同定することおよび配列変異体（例えば、７０、７５、８０、８５、９０、９５パーセント以上の配列変異体）をフェージングして、フェージングされた配列、すなわち、配列変異体がフェージングされている配列を作製することをさらに含む。このようなフェージング情報は、エラー修正の状況において使用できる。例えば、一実施形態によれば、このような方法は、少なくとも２種の（または３種以上の）フェージングされた配列変異体のフェージングと一致しない配列変異体を、エラーとして同定することを含む。
【０２４１】
別のこのような実施にしたがって、このような方法では、複合核酸の複数のリードを受け取る工程は、複数のアリコート各々から複数のリードを受け取り、各アリコートが複合核酸の１種または複数の断片を含む、コンピューティングデバイスおよび／またはそのコンピュータ論理を含む。このような断片の出自のアリコートに関する情報は、エラーを修正するために、またはそうでなければ「コールなし」であったであろう塩基をコールするのに有用である。１つのこのような実施にしたがって、このような方法は、前記アセンブルされた配列の一定位置に、２種以上のアリコートからのその位置についての予備的ベースコールに基づいて、塩基をコールするコンピューティングデバイスおよび／またはそのコンピュータ論理を含む。例えば、方法は、前記アセンブルされた配列の一定位置に、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種または５種以上のアリコートからの予備的ベースコールに基づいて、塩基をコールすることを含み得る。いくつかの実施形態では、このような方法は、ベースコールを、それが少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種のアリコートまたは５種以上のアリコートに存在する場合に真実と同定することを含み得る。いくつかの実施形態では、このような方法は、ベースコールを、それが、アセンブルされた配列中のその位置についての予備的ベースコールが作製されるアリコートの少なくとも大多数（または少なくとも６０％、少なくとも７５％または少なくとも８０％）に存在する場合に真実と同定することを含み得る。別のこのような実施によれば、このような方法は、ベースコールを、それが、２種以上のアリコートからのリード中に３回以上存在する場合に真実と同定するコンピューティングデバイスおよび／またはそのコンピュータ論理を含む。
【０２４２】
別のこのような実施によれば、リードが出自するアリコートを、各断片と結合しているアリコート特異的タグ（またはアリコート特異的タグのセット）を同定することによって決定する。このようなアリコート特異的タグは、所望により、エラー修正またはエラー検出コード（例えば、リード−ソロモンエラー修正コード）を含む。本発明の一実施形態によれば、断片および結合しているアリコート特異的タグを配列決定する際、得られたリードは、タグ配列データおよび断片配列データを含む。タグ配列データが正しい、すなわち、タグ配列がアリコート同定のために使用されるタグの配列に対応する場合には、あるいは、タグ配列データがエラー修正コードを使用して修正され得る１種または複数のエラーを有する場合には、このようなタグ配列データを含むリードを、すべての目的について、特に、それだけには限らないが、ハプロタイプフェージング、サンプルマルチプレックス化、ライブラリーマルチプレックス化、フェージングまたは正しいタグ配列データに基づく任意のエラー修正プロセス（例えば、特定のリードの出自のアリコートを同定することに基づくエラー修正プロセス）を含む、タグ配列データを必要とし、第１のアウトプットを製造する第１のコンピュータプロセス（例えば、１種または複数のコンピューティングデバイスで実行されている）のために使用できる。タグ配列が不正確であり、修正され得ない場合には、このような不正確なタグ配列データを含むリードは、廃棄されないが、代わりに、それだけには限らないが、マッピング、アセンブリおよびプールに基づく統計学および第２のアウトプットを製造するものを含めた、タグ配列データを必要としない第２のコンピュータプロセス（例えば、１種または複数のコンピューティングデバイスによって実行されている）において使用される。
【０２４３】
別の実施形態によれば、このような方法は、ショートタンデムリピートを含む領域中の複合核酸の領域の第１のフェージングされた配列を提供するコンピューティングデバイスおよび／またはそのコンピュータ論理；領域の第１のフェージングされた配列のリード（例えば、普通のまたはメイトペアリード）を、領域の第２のフェージングされた配列のリードと比較する（例えば、配列カバレッジを使用して）コンピューティングデバイスおよび／またはそのコンピュータ論理；比較に基づき、第１のフェージングされた配列または第２のフェージングされた配列の１種におけるショートタンデムリピートの拡大を同定するコンピューティングデバイスおよび／またはそのコンピュータ論理をさらに含む。
【０２４４】
別の実施形態によれば、方法は、生物の少なくとも一方の親から遺伝子型データを得、リードおよび遺伝子型データから複合核酸のアセンブルされた配列を製造するコンピューティングデバイスおよび／またはそのコンピュータ論理をさらに含む。
【０２４５】
別の実施形態によれば、方法は、複合核酸の第１の領域について複数のリードをアラインし、それによって、アラインされたリード間の重複を作製することと、重複内のＮ個の候補へテロを同定することと、２Ｎ〜４Ｎの可能性の空間またはその選択された部分空間をクラスタリングし、それによって複数のクラスターを作製することと、同定されたクラスターが各々、実質的にノイズのない中心を含む、最高密度を有する２つのクラスターを同定することと、複合核酸の１種または複数のさらなる領域について前述の工程を反復することとを含む工程を実施する、コンピューティングデバイスおよび／またはそのコンピュータ論理をさらに含む。
【０２４６】
別の実施形態によれば、このような方法は、一定量の複合核酸を用意することと、複合核酸を配列決定して、リードを生成することとをさらに含む。
【０２４７】
別の実施形態によれば、このような方法では、複合核酸は、ゲノム、エキソーム、トランスクリプトーム、メチローム、異なる生物のゲノムの混合物および生物の異なる細胞種のゲノムの混合物からなる群から選択される。
【０２４８】
本発明の別の態様によれば、前述の方法のいずれかによって製造されるアセンブルされたヒトゲノム配列が提供される。例えば、１種または複数のコンピュータによって読み取り可能な一時的でないストレージメディアは、前述の方法のいずれかによって製造されるアセンブルされたヒトゲノム配列を保存する。別の態様によれば、コンピュータによって読み取り可能な一時的でないストレージメディアは、１種または複数のコンピューティングデバイスによって実行されると、１種または複数のコンピューティングデバイスに、前述の方法の一部またはすべてを実施させる命令を含む、１種または複数の一連の命令を保存する。
【０２４９】
本発明の別の態様によれば、全ヒトゲノム配列を決定するための方法が提供され、このような方法は、（ａ）１種または複数のコンピューティングデバイスで、ゲノムの複数のリードを受け取ることと、（ｂ）１種または複数のコンピューティングデバイスを用いて、７０％以上のゲノムコールレートで、ギガベースあたり６００未満の偽のヘテロ接合性単一ヌクレオチド変異体を含むリードからゲノムのアセンブルされた配列を生成することとを含む。一実施形態によれば、ゲノムのアセンブルされた配列は、７０％以上のゲノムコールレートおよび７０％以上のエキソームコールレートを有する。一部の態様では、コンピュータによって読み取り可能な一時的でないストレージメディアは、１種または複数のコンピューティングデバイスによって実行されると、１種または複数のコンピューティングデバイスに本明細書に記載された本発明の方法のいずれかを実施させる命令を含む１種または複数の一連の命令を保存する。
【０２５０】
本発明の別の態様によれば、全ヒトゲノム配列を決定する方法が提供され、このような方法は、（ａ）１種または複数のコンピューティングデバイスで、各アリコートがゲノムの１種または複数の断片を含む複数のアリコート各々から複数のリードを受け取ることと、（ｂ）１種または複数のコンピューティングデバイスを用いて、７０％以上のゲノムコールレートでギガベースあたり１０００未満の偽の単一ヌクレオチド変異体を含むリードから、ゲノムのフェージングされた、アセンブルされた配列を生成することとを含む。一部の態様では、コンピュータによって読み取り可能な一時的でないストレージメディアは、１種または複数のコンピューティングデバイスによって実行されると、１種または複数のコンピューティングデバイスにこのような方法を実施させる命令を含む１種または複数の一連の命令を保存する。
【０２５１】
本発明は、特定の態様および実施を参照して開示されているが、本発明のその他の実施形態および変形形態が、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱せずにその他の当業者によって考案され得ることは明らかである。
【実施例１】
【０２５２】
ＤＮＡ増幅方法の比較
着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）は、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）受精（ＩＶＦ）によって作製された胚（普通、サイクルあたり平均で１０個）の、未来の母に移される前の遺伝子スクリーニングからなる出生前診断の形である。普通、母方年齢が高齢の女性（＞３４歳）または遺伝病が伝達されるリスクのあるカップルに適用される。遺伝子スクリーニングに使用される現在の技術として、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、競合ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、染色体異常の検出のためのアレイＣＧＨおよびＳＮＰアレイならびにＰＣＲおよび遺伝子欠陥の検出のためのＳＮＰアレイがある。単一遺伝子欠陥のためのＰＧＤは、現在、各患者にとって独特の特注設計されたアッセイからなり、バックアップとして、また制御するため、および汚染をモニタリングするための連鎖解析を用いる特定の突然変異検出を含むことが多い。普通、１個の細胞を、発生の３日目の各胚から生検によって得、結果は５日目に与えられ、これは、胚が移植され得る最後である。胚盤胞（５日目胚）の栄養外胚葉から得られた３〜１５個の細胞の生検からなる胚盤胞生検とそれに続く胚凍結が適用されるようになってきた。胚は、潜在力の大幅な喪失を伴わずに、無期限に凍結されたままであり得、これは、全ゲノム配列決定に適しており、生検がある場所で得られ、次いで、全ゲノム配列決定のために別の場所に移すことを可能にする。胚盤胞生検の全ゲノム配列決定は、この技術によって同定され得る単一遺伝子欠陥およびその他の遺伝子異常についての「ユニバーサル」ＰＧＤ試験を可能にする。
【０２５３】
従来の卵巣刺激および卵子回収後に、ＰＧＤ試験における精子混入を避けるために、卵子を細胞質内精子注射（ＩＣＳＩ）によって受精させた。３日目まで成長させた後、胚を、微細ガラス針を使用して生検によって得、各胚から１個の細胞を回収した。各卵割球を清潔な試験管に個別に加え、分子等級のオイルで蓋をし、ＰＧＤ実験室まで氷上で輸送した。サンプルを、遺伝子ＤＭＰＫ中のＣＴＧリピート拡大の突然変異および２種の連鎖マーカーを増幅するよう設計された試験を使用して、到着後直ちに処理した。
【０２５４】
臨床ＰＧＤ試験および胚移植後、使用されなかった胚をＩＶＦ診療所に供与し、新規ＰＧＤ試験様式の開発に使用した。８種の胚盤胞を供与し、これらの実験に使用した。
【０２５５】
胚盤胞生検は、細胞あたりおよそ６．６ピコグラム（ｐｇ）のゲノムＤＮＡを提供する。増幅によって、全ゲノム配列決定に十分なＤＮＡが提供される。図１５は、本発明者らのプロトコール（以下に記載される）を使用するＭＤＡによる、１．０３１ｐｇ、８．２５ｐｇおよび６６ｐｇの精製ゲノムＤＮＡ標準およびＰＶＰ４０の１個または１０個の細胞の増幅の結果を示す。ＭＤＡ反応は、特定の配列決定法に必要なＤＮＡの量を得るために、必要な限り（例えば、３０分から１２０分）行ってよい。増幅程度が大きいほど、より多くのＧＣバイアスが結果として生じることが予測される。
【０２５６】
ＧＣバイアスの導入を最小にしながら、全ゲノム配列解析に十分な品質の鋳型ＤＮＡを作製するための方法を同定するために、２つのＤＮＡ増幅方法を比較した。本発明者らは、本発明者らのプロトコールを、アレイＣＧＨのためによく使用されるＳｕｒｅＰｌｅｘ増幅システム（Ｒｕｂｉｃｏｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）および改変ＭＤＡと比較した。
【０２５７】
１０〜２０個の細胞の生検を、筋緊張性ジストロフィーのＲ−１ＭＴ突然変異の影響を受けた胚から入手した。サンプルを溶解し、ＤＮＡを単一試験管中で変性させ、次いで、本発明者らのプロトコールおよび製造業者の命令に従ってＳｕｒｅＰｌｅｘキットを使用するＭＤＡによって増幅した。両増幅方法によっておよそ２μｇのＤＮＡを作製した。全ゲノム配列解析に先立って、増幅されたサンプルを、ゲノム中に広がる９６種の独立ｑＰＣＲマーカーを用いてスクリーニングして、最も少ない量のバイアスを有するサンプルを選択した。図１６は、結果を示す。手短には、本発明者らは、全プレートにわたる平均サイクル数を決定し、個々のマーカー各々からそれを差し引き、「Δサイクル」数を計算した。Δサイクルを、各マーカーの周囲の１０００塩基対のＧＣ含量に対してプロットして、各サンプルの相対ＧＣバイアスを示した。サンプルの全体の「ノイズ」のを感じ取るために、各Δサイクルの絶対値を合計して、「Δの合計」測定値を作成した。低いデルタの合計およびＧＣ含量に対するΔの相対的に平坦なプロッティングは、本発明者らの経験ではよく表された全ゲノム配列をもたらす。本発明者らのＭＤＡ法のΔの合計は、６１であり、ＳｕｒｅＰｌｅｘによって増幅されたＤＮＡについては２８７であり、これは、本発明者らのプロトコールが、ＳｕｒｅＰｌｅｘプロトコールよりもかなり少ないＧＣバイアスをもたらしたことを示す。
【実施例２】
【０２５８】
着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）において使用するための胚盤胞生検の完全ゲノム配列決定
本明細書に記載されるように、改変多重置換増幅（ＭＤＡ）（Dean et al.(2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99, 5261-5266）を使用して、全ゲノム配列解析にとって十分な鋳型ＤＮＡ（およそ１μｇ）を作製した。手短には、５日齢の胚盤胞各々から５〜２０個の細胞を単離し、凍結し、それらが単離された実験室からドライアイス上において輸送した。サンプルを解凍し、溶解して、ゲノムＤＮＡを放出させた。ゲノムＤＮＡを細胞夾雑物から精製せず、１μｌの４００  ｍＭ  ＫＯＨ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡの添加によってＤＮＡをアルカリ変性させた。胚のゲノムＤＮＡは、配列決定にとって十分な量のＤＮＡ（約１μｇ）を作製するためにｐｈｉ２９ポリメラーゼに基づく多重置換増幅（ＭＤＡ）反応を使用して増幅した全ゲノムとした。アルカリ変性の１分後、変性ＤＮＡにチオ保護されたランダム８マーを添加した。２分後、混合物を中和し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５０μＭ  ｄＮＴＰ（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）および１２ユニットのｐｈｉ２９ポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の最終濃度を含有するマスター混合物を添加して、１００μｌの総反応容量を作製した。ＭＤＡ反応物を３７℃で４５分間インキュベートし、６５℃で５分間不活化した。ＭＤＡ反応によっておよそ２μｇのＤＮＡが作製された。次いで、この増幅されたＤＮＡを断片化し、上記のようにライブラリー構築および配列決定に使用した。
【０２５９】
筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）は、筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）をコードする遺伝子の３’−非翻訳領域におけるトリヌクレオチドリピート拡大、シトシン−チミン−グアニン（ＣＴＧ）ｎによって引き起こされる常染色体優性疾患である。本発明者は、ＤＭＰＫ  ＣＴＧリピート領域中のクローンカバレッジを調べた。本明細書に記載された配列決定技術は、通常、約４００ｂｐに広がる３５ｂｐペアエンドリードをもたらす。罹患していない個体および１種の未知サンプルについては、４００ｂｐは、両対立遺伝子のこのＣＴＧリピート領域に広がるのに十分であり、およそ２のコピー数をもたらす。罹患個体および１種の未知サンプルでは、約１のコピー数が観察され、これは、４００ｂｐのペアエンドには広がるのにリピート拡大が大きすぎることを示唆し、罹患していない対立遺伝子のみがこの領域においてカバレッジを有する。
【０２６０】
以下の表１は、ＰＧＤ胚サンプルのマッピングおよびアセンブリについての概略情報を提供する。すべての変異およびマッピング統計学は、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）バージョン３７ヒトゲノム参照アセンブリに関するものである。サンプル２Ａ、５Ｂおよび５Ｃの増幅は、品質が悪く、その結果、コールされるゲノムが少なく、ｆ同定されるＳＮＰの総数が低減する。サンプル５Ｂおよび５Ｃは、同一胚から得られた別個の生検である。サンプルＮＡ２０５０２を、ライブラリー調製に先立って任意の増幅を伴わない標準手順に従って処理した。
【０２６１】
図１７は、２種のサンプル（７Ｃおよび１０Ｃ）のゲノムカバレッジを示す。カバレッジを、ハプロイドゲノムカバレッジに対して正規化された１００キロベースカバレッジウィンドウの１０メガベース移動平均を使用してプロットした。コピー数１および３の破線は、それぞれ、ハプロイドおよび三倍体コピー数を表す。両胚とも男性であり、ＸおよびＹ染色体のハプロイドコピー数を有する。これらのサンプルでは、全染色体または染色体の大きなセグメントのその他の喪失または獲得は明らかではなかった。
【０２６２】
８５％のゲノムカバレッジを達成する最も不十分な実施のサンプルおよびゲノムの９５％をカバーする最良のサンプル、数マイクログラムの精製された、増幅されていないヒトゲノムＤＮＡを使用する上記の方法（「標準配列決定」）による標準全ゲノム配列決定法と同様のレベル。一般に、カバレッジは、標準配列決定と比較して「ノイジー」であったが、１０メガベースの移動平均を使用することによって、全染色体および染色体アーム増幅および欠失の正確な検出が可能となる。本発明者らはまた、多数の多型が検出され得ることおよびＤＭＰＫ突然変異を別として、特定の疾患の発症のリスクを胚盤胞移植選択に使用できることを実証する。
【０２６３】
この実施例では、出発ゲノムＤＮＡを過度に増幅して（必要なもののおよそ１０倍）、十二分な量のゲノムＤＮＡが配列決定に利用可能であることを確実にした。増幅の程度の低減は、配列カバレッジおよび配列決定品質を改善すると予測される。増幅はまた、生検組織（または癌生検またはニードル吸引物、胎児または血流から単離された癌細胞（単数または複数）など）といったその他の出発材料）が培養において増殖するのを可能にすることによって低減され得る。このアプローチは、プロセスの全体所要時間に幾分かを加える。しかし、少数の利用可能な細胞を培養することは、染色体複製の細胞プロセスにおいてゲノムＤＮＡの高い忠実性の「増幅」をもたらす。
【０２６４】
ＤＭＰＫ突然変異は、トリヌクレオチドリピート疾患であるので、約４００ｂｐ長のメイトペアリードを使用する現在の配列決定法を使用して突然変異を解析することは困難である。より長いメイトペアリード（例えば、１キロベース以上）を使用して、これらの領域にわたって広がり、ひいては、配列決定してもよく、その結果、リピートの大きさが正確に決定される。
【実施例３】
【０２６５】
１０〜２０個のヒト細胞からの臨床上正確なゲノム配列決定およびハプロタイプ解析
この実施例では、長いヒトゲノムＤＮＡ（５０％  ６０〜５００ｋｂの長さ）の６５〜１３０ｐｇ（１０〜２０個の細胞）を、３８４のアリコートに分け、増幅し、断片化し、各アリコートにおいてタグ付けした。ＤＮＡクローニングまたは分裂中期染色体の分離を伴わずに、配列決定した後、２倍体（フェージングした）ゲノムをアセンブルした。１０個のＬＦＲライブラリーを使用して、７種の個別のゲノムから約３．３テラベース（Ｔｂ）のマッピングされたリードを作製した。最大９７％のヘテロ接合性の単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）をコンティグにアセンブルし、ここで、カバーされる塩基の５０パーセント（Ｎ５０）がヨーロッパ人民族性のサンプルについて約５００ｋｂまたアフリカ人サンプルについて約１Ｍｂより長いコンティグになった。複製ライブラリー間の大規模比較では、ＬＦＲハプロタイプは、高度に正確であり、１０メガベース（Ｍｂ）あたり１つの偽陽性ＳＮＶを有するとわかった。１００ピコグラム（ｐｇ）のＤＮＡでの出発および１０，０００倍のインビトロ増幅にもかかわらず、非ＬＦＲゲノムと比較して、正確性のこの２０〜３０倍の増大（Drmanac et al., Science 327:78, 2010; Roach et al., Am. J. Hum. Genet. 89:382-397, 2011）が達成されるが、これはほとんどのエラーが真実のハプロタイプとは一致しないからである。本発明者らは、１０〜２０個のヒト細胞からの、費用効率の高い、臨床上正確なゲノム配列決定およびハプロタイプ解析を実証した。
【０２６６】
ＬＦＲ技術は、臨床的に関連する費用およびスケールでの、別個の親染色体の完全な配列決定およびアセンブリを可能にする全分裂中期染色体のクローニングまたは単離を伴わない、費用効率の高いＤＮＡ前処理工程である。本発明者らは、上記に詳細に記載されるショートリード配列決定技術を使用したが、ＬＦＲは、任意の配列決定法の前の前処理工程としての使用のために適応され得る。
【０２６７】
ＬＦＲは、長い範囲でフェージングされたＳＮＰを作製できるが、これは、それが１０〜１０００ｋｂの長さの断片の単一分子配列決定と概念上同様であるからである。これは、フォスミドクローンの分注と同様に、任意のＤＮＡクローニング工程を伴わない、対応する親のＤＮＡ断片の物理的に個別のプールへの確率的分離と、それに続いて断片化して、より短い断片を作製することとによって達成される（Kitzman et al., Nat. Biotechnol. 29:59-63, 2011; Suk et al., Genome Res. 21:1672-1685, 2011）。各プールへのゲノムの分画が、ハプロイドゲノムよりも少なく低減するので、同一プール中に両親染色体からの対応する断片を有する統計的見込みは、著しく減少する。同様に、より多くの個々のプールが調べられるほど、母方および父方相同体からの断片が別個のプールにおいて解析される回数は多い。
【０２６８】
例えば、各ウェルに０．１ゲノム相当物を有する３８４ウェルプレートは、各断片の母方および父方対立遺伝子の理論上１９×カバレッジをもたらす。約１９×というこのような高い初期ＤＮＡ重複性は、約３×（Kitzman et al., Nat. Biotechnol 29:59-63, 2011）〜約６×（Suk et al., Genome Res. 21:1672-1685, 2011）の範囲のカバレッジをもたらすフォスミドプールを使用する戦略を使用して達成されるものよりも完全なゲノムカバレッジおよび高い変異体コーリングおよびフェージング正確性をもたらす。
【０２６９】
ハイスループット法でＬＦＲライブラリーを調製するために、本発明者らは、同一の３８４ウェルプレートにおいて、すべてＬＦＲ特異的工程を実施する自動化プロセスを開発した。以下は、プロセスの概観である。第１に、改変されたｐｈｉ２９に基づく多重置換増幅（ＭＤＡ；Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:5261, 2002）を使用する高度均一な増幅を実施して、各断片を約１０，０００倍複製する。次いで、介在する精製工程を伴わない各ウェル内での酵素工程のプロセスによって、ＤＮＡを断片し、バーコードアダプターとライゲーションする。手短には、長いＤＮＡ分子を、制御されたランダムな酵素による断片化（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔｉｎｇ）（ＣｏＲＥ）によって処理して、平滑末端の３００〜１，５００ｂｐの断片にする。ＣｏＲＥは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼＩＶによってＭＤＡの際に所定の頻度で組み込まれているウリジン塩基を除去することによってＤＮＡを断片化する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼ１を用いた、得られた単一塩基ギャップからのニックトランスレーションは、断片を分解し、平滑末端を作製する。次いで、各バーコードの配列および濃度の相違によって引き起こされる任意のバイアスを低減するよう設計されている（図１８）、独特の１０塩基リード−ソロモンエラー修正バーコードアダプター（参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／０９１１０７として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２３０８３）を、高収率、低キメラ形成プロトコール（Drmanac et al., Science 327:78, 2010）を使用して各ウェル中の断片化されたＤＮＡにライゲーションする。最後に、すべて３８４のウェルを組み合わせ、ライゲーションされたアダプターに共通のプライマーを使用する不飽和ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、ショートリード配列決定プラットフォームに十分な鋳型を作製する。以下は、本発明者らが使用したＬＦＲプロトコールに関するより詳細を提供する。
【０２７０】
高分子量ＤＮＡを、ＲｅｃｏｖｅｒＥａｓｅ  ＤＮＡ単離キット（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を製造業者のプロトコールに従って使用して細胞系統ＧＭ１２８７７、ＧＭ１２８７８、ＧＭ１２８８５、ＧＭ１２８８６、ＧＭ１２８９１、ＧＭ１２８９２  ＧＭ１９２４０およびＧＭ２０４３１（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）から精製した。高分子量ＤＮＡを部分的にせん断して、Ｒａｉｎｉｎ  Ｐ１０００ピペットを使用するピペッティング２０〜４０回による操作により従うようにする。０．５×ＴＢＥバッファーを用いる１％アガロースゲル上で、ＢｉｏＲａｄ  ＣＨＥＦ−ＤＲ  ＩＩを以下のパラメータ：６Ｖ／ｃｍ、５０〜９０秒の傾斜を付けたスイッチ時間および合計２０時間の実行とともに使用して、２００ｎｇのゲノムＤＮＡを解析した。５００ｎｇの酵母染色体ＰＦＧマーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびラムダラダーＰＦＧマーカー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用して、精製ゲノムＤＮＡの長さを決定した。
【０２７１】
さらに、不死化細胞株ＧＭ１９２４０（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｄｅｎ，ＮＪ）を、細胞培養の標準環境条件下で１０％  ＦＢＳを補給したＲＰＭＩにおいて増殖させた。個々の細胞を、ミクロマニピュレーター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２００倍の倍率下で単離し、１０ｕｌのｄＨ２Ｏを有する１．５ｍｌのマイクロチューブ中に入れた。１ｕｌの２０ｍＭ  ＫＯＨおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて細胞を変性させた。次いで、変性細胞をＬＦＲプロセスに入れた。
【０２７２】
種々の細胞株の各々からのＤＮＡを希釈し、２０ｍＭ  ＫＯＨおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液中、５０ｐｇ／ｕｌの濃度で変性させた。室温で１分インキュベートした後、１２０ｐｇの変性ＤＮＡを回収し、３２ｕｌの１ｍＭ  ３’チオ保護ランダムオクタマー（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）に加えた。２分後、混合物をｄＨ２Ｏで４００ｕｌの容量にし、１ｕｌを３８４ウェルプレートの各ウェルに分配した。各ウェルに１μｌの２×ｐｈｉ２９ポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に基づく多重置換増幅（ＭＤＡ）混合物を加えて、およそ３〜１０ナノグラムのＤＮＡ（１０，０００〜２５，０００倍の増幅）を作製した。ＭＤＡ反応物は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、４ｍＭ  ＤＴＴ、２５０μＭ  ｄＮＴＰ（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、１０μＭの２’−デオキシウリジン５’−トリホスフェート（ｄＵＴＰ）（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）および０．２５ユニットのｐｈｉ２９ポリメラーゼからなっていた。
【０２７３】
次いで、制御されたランダムな酵素による断片化（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）（ＣｏＲＥ）を実施した。ＭＤＡ反応物を、０．０３１ユニットのエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）、０．０３９ユニットのウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）および０．０７８ユニットのエンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）の混合物とともに、３７℃で１２０分、インキュベートすることによって、過剰のヌクレオチドを不活化し、ウラシル塩基を除去した。ＳＡＰを、６５℃で１５分間熱不活化した。０．１ナノモルのｄＮＴＰ（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を添加した同一バッファー中で、０．１ユニットの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を用いる６０分の室温でのニックトランスレーションによって、ギャップを分解し、ＤＮＡを、３００〜１，３００塩基対の断片に断片化した。大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１を、６５℃で１０分間熱不活化した。残存する５’リン酸を、０．０３１ユニットのＳＡＰ（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）とともに、３７℃で６０分間インキュベートすることによって除去した。ＳＡＰを、６５℃で１５分間熱不活化した。
【０２７４】
次いで、タグ付けされたアダプターライゲーションおよびニックトランスレーションを実施した。２部分方向性ライゲーションアプローチを使用して、各ウェルに独特の１０塩基のＤＮＡバーコードアダプターを断片化されたＤＮＡと結合した。およそ０．０３ｐｍｏｌの断片化ＭＤＡ産物を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、２．５％  ＰＥＧ８０００、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ｒＡＴＰ、１００倍モル過剰の５’リン酸化（５’ＰＯ４）および３’ジデオキシ末端（３’ｄｄ）共通Ａｄ１（図１８）および７５ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を７μｌの総容量で含有する反応物中で、室温で４時間インキュベートした。Ａｄ１は、独特のバーコードアダプターとのハイブリダイゼーションおよびライゲーションのための共通オーバーハングを含有していた。４時間後、各ウェルに２００倍モル過剰の独特の５’リン酸化されたタグ付きアダプターを加え、１６時間インキュベートさせた。３８４ウェルを、約２．５ｍｌの総容量に組み合わせ、２．５ｍｌのＡＭＰｕｒｅビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）の添加によって精製した。１ラウンドのＰＣＲを実施して、一方の側に５’アダプターおよびタグを有し、もう一方の側に３’平滑末端を有する分子を作製した。上記の５’アダプターと同様に、３’アダプターをライゲーション反応物中に加えた。ライゲーションによって作製されたニックを塞ぐために、ＤＮＡを、０．３３μＭのＡｄ１  ＰＣＲ１プライマー、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ｒＡＴＰ、１００μＭ  ｄＮＴＰを含有する反応物中で、６０℃で５分間インキュベートして、３’ジデオキシ末端化Ａｄ１オリゴを、３’−ＯＨ末端化Ａｄ１  ＰＣＲ１プライマーと交換する。次いで、反応物を３７℃に冷却し、９０ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）および２１６００ユニットのＴ４  ＤＮＡリガーゼの添加後、３７℃でさらに３０分間インキュベートして、Ａｄ１  ＰＣＲ１プライマー３’−ＯＨ末端からのＴａｑによって触媒されるニックトランスレーションによって機能性５’−ＰＯ４ｇＤＮＡ末端を作製し、Ｔ４  ＤＮＡライゲーションによって得られた修復されたニックを塞いだ。この時点で、材料を標準ＤＮＡナノアレイ配列決定法に組み込んだ。
【０２７５】
ＲＮＡ−Ｓｅｑデータは、１５０〜２００ｂｐの平均インサートサイズを有する配列決定ライブラリーを調製するためにＯｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−Ｓｅｑキット（ＮｕＧｅｎ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）およびＳＰＲＩＷｏｒｋ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を使用して、全ＲＮＡから出発して導いた。７５ｂｐのペアエンド配列決定反応を、個別化遺伝医学のセンター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）のＨｉＳｅｑ  ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で実施した。ｂｏｗｔｉｅ  ｖ０．１２．７（Langmead et al., Genome Biol. 10:R25, 2009）を使用してｔｏｐｈａｔ  ｖ１．２．０（Trapnell et al., Bioinformatics 25:1105-1111, 2009）を用いて、ペアエンドリードをアセンブルし、参照のためのｈｇ１９および既知ＳＮＰに注釈を付けるためのｄｂＳＮＰバージョン１３２とともに、ＧＡＴＫ  ＵｎｉｆｉｅｄＧｅｎｏｔｙｐｅｒ  ｖ１．１（http://www.broadinstitute.org/gsa/wiki/index.php/GATK_release_1.1）を使用して単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）をコールした。ＳＮＶを、ＲｅｆＳｅｑから得た遺伝子に、ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ  ｖ１．０．３（http://cufflinks.cbcb.umd.edu/tutorial.html）によって同定されるトランスクリプトームにおけるアイソフォームの両方にマッピングした。
【０２７６】
同時発現される対立遺伝子のハプロタイプを同定するために、同一ＬＦＲコンティグ上および同一遺伝子上の両方に生じ、少なくとも１つのその他のヘテロ接合性ＳＮＶを有するヘテロ接合性ＳＮＶについて、データを選別した。転写物が対立遺伝子特異的発現を示す場合には、ＬＦＲフェージングされたハプロタイプ上で発現されるヘテロ接合性対立遺伝子はすべて、もう一方のハプロタイプ上のその対応物よりも高い、またはすべてより低いリード数を有するはずである。ここで、本発明者らは、より高く発現されるハプロタイプを、そのヘテロ対立遺伝子の大部分が、その対応物よりも高い発現を示すものと同定する。ヘテロ接合性は、その発現が、その含有ハプロタイプと一致する場合に「一致した」とカウントされる。ハプロタイプ大多数がない関係の場合には、ヘテロ接合性ＳＮＶの半分を、一致するとカウントする。さらに、仮にも考えられるには、ヘテロ接合性ＳＮＶは、少なくとも２０倍のＲＮＡ−Ｓｅｑリードカバレッジを有する必要がある。ヘテロ接合性ＳＮＶは、二項式試験を使用してＡＳＥおよびカバレッジを無作為に選択する確率を比較することによって、ＧＡＴＫ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｒからのノイズについてさらに選別される。
【０２７７】
エラー修正目的について、各ＤＮＢに、未知エラー位置の１塩基エラー修正能またはエラー位置が既知である場合の２塩基エラー修正能を有する、１０塩基のリード−ソロモンコードを用いてタグ付けした（参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０１９９１５５として公開された、米国特許出願第１２／６９７，９９５号）。これらの３８４コードは、上記の特性を有する４０９６のリード−ソロモンコードの包括的セットから選択した（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第１２／６９７，９９５号）。このセットから得た各コードは、セット中の任意のその他のコードに対して３の最小ハミング距離を有する。この研究については、エラーの位置が未知であると仮定される。
【０２７８】
結果。ＬＦＲの、正確な２倍体ゲノム配列を決定する力を実証するために、本発明者らは、ヨルバ族人の女性のＨａｐＭａｐサンプルＮＡ１９２４０の３つのライブラリーを作製した。ＮＡ１９２４０は、ＨａｐＭａｐ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（Consortium, Nature 437:1299-1320, 2005; Frazer et al.,  Nature 449:851-861, 2007）、ＨａｐＭａｐ１，０００  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（Nature 467:1061-1073, 2010）および本発明者らの取り組み（http://www.completegenomics.com/sequence-data/download-data/）において、トリオの一部として（ＮＡ１９２４０は、サンプルＮＡ１９２３８およびＮＡ１９２３９の娘である）大規模に調べたられた。結果として、親のサンプルＮＡ１９２３８およびＮＡ１９２３９の重複性配列データに基づいて１７０万のヘテロ接合性ＳＮＰについて高度に正確なハプロタイプ情報が作製され得る。対応する不死化Ｂ細胞株から得た１０個の細胞（６５ｐｇのＤＮＡ）で出発して１個のＮＡ１９２４０  ＬＦＲライブラリーを作製した。６０×の総有効リードカバレッジに基づいて、断片の３８４の個別のプールまたはアリコートを使用して、本発明者らは、ＤＮＡがウェルへの分配前に変性される場合には、出発細胞の最適数は、１０であろうということを推定した（ｄｓＤＮＡの２０個の細胞に相当する；以下の表１）。２つの複製ライブラリーを、推定１００〜１３０ｐｇ（１５〜２０個細胞に相当する）の変性高分子量ゲノムＤＮのから製造した。変性単離ＤＮＡから出発すると、ライブラリーあたりの最適量は約１００ｐｇとなることが決定された。この量は、断片の確率的サンプリングを最小にすることによって、より均一なゲノムカバレッジを達成するよう選択された。
【０２７９】
３種のライブラリーすべてを、ＤＮＡナノアレイ配列決定（Drmanac et al., Science 327:78-81, 2010）を使用して解析した。特別注文のアラインメントアルゴリズム（Drmanac et al., Science 327:78-81， 2010; Carnevali et al., J. Computational Biol., 19, 2011）を使用して、３５塩基のメイトペアリードを参照ゲノムに対してマッピングし、マッピングされたデータの２３０Ｇｂを超える平均が得られ、８０×より高い平均ゲノムカバレッジを有していた（以下の表１）。マッピングされたＬＦＲデータの解析によって、ＭＤＡに起因する２つの個別の特徴：ＧＣリッチ配列のわずかな表現不足（図１９）およびキメラ配列の増加が示された。さらに、１００ｋｂのウィンドウに渡って正規化されたカバレッジは、およそ２倍より可変である。それにもかかわらず、ほとんどすべてのゲノム領域が、十分なリード（５以上）でカバーされ、これは、本発明者らのプロトコールによる１０，０００倍ＭＤＡ増幅は、包括的ゲノム配列決定に使用され得ることを実証する。
【０２８０】
各ライブラリー内のその物理的なウェルの位置に基づいて、グループマッピングされるリードにバーコードを図的に使用し、これは、カバレッジの態度、すなわち、ほとんどリードのないカバレッジを有する長いスパンの間に分散された、カバレッジの低密度の領域を示した。各ウェルの平均で、約６０ｋｂのＮ５０を有する１０ｋｂ〜３００ｋｂ超の長さの範囲の断片中に、１０〜２０％のハプロイドゲノム（３００〜６００Ｍｂ）を含有していた（図２０）。初期断片カバレッジは、染色体間で極めて均一であった。すべての検出された断片から推定されるように、抽出されたＤＮＡから２つのライブラリーを作製するために実際に使用されたＤＮＡの総量は、約６２ｐｇおよび８４ｐｇ（９．４および１２．７個の細胞に相当、図２０）であった。これは、予測された１００〜１３０ｐｇ少なく、幾分かの喪失または検出されていないＤＮＡまたはＤＮＡ定量化の不正確さを示す。興味深いことに、１０細胞ライブラリーは、約９０ｐｇ（１３．６個の細胞）のＤＮＡから作製されると思われ、これは、細胞の一部が、単離の際にＳ相にあることによる可能性が最も高い（図２０）。
【０２８１】
約４０の個々のウェルから得られる低カバレッジリードデータ（２×カバレッジ未満）をまとめるよう設計された、２工程の特別注文のハプロタイプ解析アルゴリズムを使用して、異なるウェル中に位置する同一の親染色体の断片から得られる重複するヘテロ接合性ＳＮＰを、ハプロタイプコンティグとしてアセンブルした（図２１）。その他の実験アプローチとは異なり（Kitzman et al., Nat. Biotechnol. 29:59-63, 2011; Suk et al., Genome Res. 21:1672-1685, 2011; Duitama et al., Nucleic Acids Res. 40:2041-2053, 2012）、LFRは、各初期断片についてハプロタイプを規定しない。代わりに、ＬＦＲは、所与のリードカバレッジおよびアリコートの数についてＤＮＡ断片のインプットを最大にすることによってゲノムの完全な表示を保証する。
【０２８２】
第１の工程では、フェージングされていないＮＡ１９２４０ゲノムアセンブリからのヘテロ接合性ＳＮＰ（http://www.completegenomics.com/sequence-data/download-data/）を、各ＬＦＲライブラリーと組み合わせて、フェージングのためのＳＮＰの包括的セットを作製する。次いで、各染色体についてネットワークを構築し、これでは、ノードは、ヘテロ接合性ＳＮＰコールに対応し、接続は、ＳＮＰの各対間の接続性のスコアと関連していた。接続のスコアとともに、ヘテロ接合性ＳＮＰの各対の最良仮説についての検索の一部として配向も得られた。次いで、この接続の高度に重複性の低密度のネットワークを、ドメイン知識を使用して取り除き、続いて、クラスカルの最小全域木（ＭＳＴ）アルゴリズムを使用して最適化した。この結果、これらのライブラリーについて、９５０〜１２００ｋｂのＮ５０を有する長いコンティグが得られた（図２０）。
【０２８３】
合計およそ２４０万のヘテロ接合性ＳＮＰを、ＬＦＲによって各ライブラリーにおいてフェージングした（図２４）。ＬＦＲは、これらのライブラリーにおいてフェージングすると予測されているヘテロ接合性ＳＮＰのおよそ９０％をフェージングした。１０の細胞ライブラリーが、変異体の９８％にわたって、単離ＤＮＡから作製された２つのライブラリーによってフェージングし、これは、ＬＦＲの少数の単離細胞から作用する力を実証する。リードの数を約１６０×カバレッジに２倍にすることによって、フェージングされたヘテロ接合性ＳＮＰの数が２５８万超にさらに増大し、それによって、フェージング率が９６％に増大した（図２０）。各々、８０×カバレッジを有する複製１および２を組み合わせること（合計７６８の独立ウェル）によって、２６５万超のフェージングされたヘテロ接合性ＳＮＰをもたらし、９７％のフェージング率をもたらした。フェージングのためにＬＦＲライブラリーにおいてコールされるＳＮＰ遺伝子座のみを使用すること（ＬＦＲアルゴリズムの工程１を省くこと）は、大抵は、５〜１５％というフェージングされるＳＮＰの総数の低減をもたらした（図２０）。
【０２８４】
重要なことに、ＬＦＲのみによってフェージングされるＳＮＰの数（わずか１０〜２０個の細胞のＤＮＡから出発して）は、現在のフォスミドアプローチによってフェージングされたＳＮＰの数よりもわずかに高かった（Kitzman et al., Nat. Biotechnol. 29:59-63, 2011; Suk et al., Genome Res. 21:1672-1685, 2011; Duitama et al., Nucleic Acids Res. 40:2041-2053, 2012）。子供たちにおける変異体の大きな画分が、両親によって共有されるので、これは、標準的な親配列を使用することによってフェージングされ得るヘテロ接合性ＳＮＰの実質的に８１％超である（Roach et al., Am. J. Hum. Genet. 89:382-397, 2011）。７６８ウェルのライブラリーに、親由来のハプロタイプデータを加えることによって、フェージング率を９８％に改善する。約１１５，０００（約４％）のフェージングされたヘテロ接合性ＳＮＰは、高カバレッジＬＦＲライブラリーに由来し、標準ライブラリーではコールされず、これは、ＭＤＡ増幅および１６０×カバレッジは、いくつかの領域が、正しくコールされるよう十分なリード（５以上）を得るのに役立つということを示す。高カバレッジＬＦＲフェージング率は、ハプロタイプ完全性対フェージングエラー間のバランスをとるよう調整できる。
【０２８５】
ヨーロッパ人家系のハプロタイプ解析。ＬＦＲの性能のさらなる本発明者らの理解のために、本発明者らは、ヨーロッパ人祖先の家系からさらなるライブラリーを作製した。ＣＥＰＨファミリー１４６３を選択したが、これは、３世代の個体を有し、遺伝の包括的研究を可能にするからである。このファミリーは、公開データ放出の一部として先に研究されている（www.completegenomics.com/sequence-data/download-data/）。各世代の個体からライブラリーを製造した。ＮＡ１２８７７、ＮＡ１２８８５、ＮＡ１２８８６、ＮＡ１２８９１およびＮＡ１２８９２について合計１．６Ｔｂ超の配列データを作製した。一般に、フェージングは、すべてのサンプルにわたって極めて高く、試みられたＳＮＰのおよそ９２％がコンティグにフェージングした（図２０）。２つのＬＦＲライブラリー（図２０）またはＬＦＲを親に基づくフェージングと組み合わせることで、フェージングされるＳＮＰの全体の率が９７％に改善された。すべての解析されるファミリーメンバーにわたるＮ５０コンティグ長は、５００〜６００ｋｂの間であった。この長さは、ＮＡ１９２４０のものよりも大幅に小さい。いくつかの異なる民族のゲノム中にわたるＳＮＰの分布の調査によって、この相違の説明がつく。
【０２８６】
非アフリカ人集団における低異型接合性の起源および影響。ＮＡ１９２４０においてよりもヨーロッパ人家系サンプルにおいて、３０ｋｂ〜３Ｍｂの低異型接合性（ＲＬＨ、１０ｋｂあたり１．４未満のヘテロ接合性ＳＮＰを有する３０ｋｂのゲノム領域として定義される、中程度の密度よりもおよそ７倍低い）のおよそ２倍多い領域があり、これによって、非アフリカ人におけるこれまでに報告された相対的に過剰のホモ接合体（Gibson et al., Hum. Mol. Genet. 15:789-795, 2006; Lohmueller et al., Nature 451:994-997, 2008）が明確になり、５２種の完全ゲノムの解析によってさらに支持される（Nicholas Schork, personal communication）。これらの領域は、フェージングに対する障壁であり、２倍小さいＮ５０コンティグ長をもたらす。ヨーロッパ人ゲノムにおけるコンティグの９０％超が、これらのＲＬＨに終わり、これは非関連個体間で変動する。
【０２８７】
非アフリカ人ゲノム中のすべてのヘテロ接合性ＳＮＰのおよそ３％（すべてのフェージングされないヘテロ接合性ＳＮＰの３０〜６０％）が、これらのＲＬＨに属し、これらのゲノムの極めて大きな画分をカバーする（３０〜４０％）。中国人およびヨーロッパ人のゲノムでは、長いＲＬＨがＭｂあたり約４５のヘテロ接合性ＳＮＰをクラスター化し（ゲノム平均は、ＲＬＨの外側でＭｂあたりおよそ１０００）、これは、彼らが、約３７，０００〜４３，０００年前に共通の祖先を共有していたことを示す（２０年世代あたり６０〜７０ＳＮＰという突然変異率に基づいて；Roach et al., Science 328:636-639, 2010; Conrad et al., Nat. Genet. 43:712-714, 2011）。これは、おそらく、アフリカからのヒトの大量移動の時点での、またはその後の、また１０，０００〜６５，０００年目の最近決定された範囲内の強力な障害によるものである（Li and Durbin, Nature 475:493-496, 2011）。さらに、アフリカ人の女性（ＮＡ１９２４０）と比較した場合に、ヨーロッパ人およびインド人の女性では（ＮＡ１２８８５、ＮＡ１２８９２およびＮＡ２０８４７）、Ｘ染色体上に過剰のＲＬＨが観察され、それぞれ、この染色体の約５０％対１７％をカバーする（これらの同一個体中の全ゲノムについて３０％対１４％）。これは、Ｘ染色体についてのさらに強いアフリカからの障害を示す。可能性ある説明は、実質的により少ない女性がアフリカを離れ、複数の男性と子孫を有したということである。
【０２８８】
これらの観察結果は、数千のさまざまなゲノムにおける、ハプロタイプ解析を含めた全ゲノム変異解析は、ヒト疾患およびその他の極端な表現型に対する、ヒト集団遺伝学および各々＞１００のホモ接合体変異体を含むことが多い、これらの大規模な「近交」領域の影響の深い理解を提供する。さらに、＞１００ｋｂの長さの約２，０００ＲＬＨが、すべての非アフリカ人個体中に存在することを示す。最近の障害または近系交配に起因し得るよう制限された数の高頻度ハプロタイプを有する集団（Gibson et al., Hum. Mol. Genet. 15:789-795, 2006）はまた、両親中に存在する同一ヘテロ接合性ＳＮＰの長いランを有し得、短いＬＦＲコンティグのフェージングまたは割り当てのための親の使用を制限する。したがって、集団史および一部の繁殖パターンは、非アフリカ人の女性のＸ染色体によって示されるようにフェージングを的なものにし得る。これらの要因にもかかわらず、ＬＦＲフェージング性能は、ヨーロッパ人およびアフリカ人個体の両方においてフェージングされた、最大９７％のヘテロ接合性ＳＮＰとおよそ同等であり、すべての集団にわたって翻訳するはずであるという結果。ＬＦＲを、以下に記載される一方の親の標準遺伝子型判定と組み合わせること（上記で論じたように、一部の家族ではより制限される戦略）に加え、３００ｋｂより長い初期ＤＮＡ断片を使用すること、例えば、細胞または事前に精製されたＤＮＡをゲルブロック中に捕捉することによって（Cook、EMBO J. 3:1837-1842, 1984）、すべてのＲＬＨおよびこれらの領域において生じるデノボ突然変異のハプロタイプの約９５％に広がる。これは、４０ｋｂの断片に制限される、現在のフォスミドクローニング戦略を用いた場合には実現可能ではない（Kitzman et al., Nat. Biotechnol. 29:59-63, 2011; Suk et al., Genome Res. 21:1672-1685、2011）。
【０２８９】
ＬＦＲ再現性およびフェージングエラー率解析。ＬＦＲの再現性を理解しようとして、本発明者らは、２種のＮＡ１９２４０複製ライブラリー間のハプロタイプデータを比較した。一般に、ライブラリーは極めて一致しており、両ライブラリーによってフェージングされた約２２０万のヘテロ接合性ＳＮＰにおいて、ライブラリーあたり６４の相違しかない（図２２）。これは、０．００３％のフェージングエラー率または４４Ｍｂ中１エラーに相当する。ＬＦＲはまた、複数の方法によってこれまでに配列決定されている親ゲノムＮＡ１９２３８およびＮＡ１９２３９から作製された保存的であるが、正確な全染色体フェージングと比較した場合に高度に正確であった。１５７万の比較できる個々の遺伝子座中で、ＬＦＲが親のハプロタイプ解析のものと一致しない変異体にフェージングする約６０の例しか見られなかった（不一致の半分が、親のゲノム中のエラーの配列決定による場合は、０．００２％の偽フェージング率）。ＬＦＲデータはまた、ライブラリーあたり約１３５のコンティグ（２．２％）を含有しており、１つまたは複数の反対方向にされたハプロタイプブロックを有していた（図２２）。これらの解析を、サンプルＮＡ１２８７７のヨーロッパ人の複製ライブラリー（図２２）に拡張し、それらを、ＮＡ１２８７７の４人の子供およびその母ＮＡ１２８７８を使用して最近の高品質のファミリーベースの解析（Roach et al., Am. J. Hum. Genet. 89:382-397, 2011）と比較し、各方法が観察された不一致の半分に寄与すると仮定すると同様の結果が得られる。ＮＡ１９２４０およびＮＡ１２８７７ライブラリーでは、いくつかのコンティグが、数十もの反対方向にされたセグメントを有していた。これらのコンティグの大多数は、低異型接合性（ＲＬＨ）の領域、低いリードカバレッジ領域または予想外な多数のウェル中で観察される反復性領域（例えば、テロメア周辺または動原体領域）中に位置する傾向がある。
【０２９０】
親の染色体にハプロタイプコンティグを割り当てること。最もひどいエラーは、ＬＦＲフェージングアルゴリズにこれらの領域中でコンティグを終了させることによって修正され得る。あるいは、これらのエラーは、ＬＦＲアセンブリへの、少なくとも一方の親から得た標準的な高密度アレイ遺伝子型データ（約１００万またはそれ以上のＳＮＰ）の簡単な、低費用の添加で除去され得る。さらに、本発明者らは、親の遺伝子型は、全染色体にわたってＬＦＲによってフェージングされるヘテロ接合性ＳＮＰの９８％を接続することができることを見出した。さらに、このデータによって、ハプロタイプが母方および父方系統に割り当てられること、遺伝子診断に親の刷り込みを組み込むのに有用である情報が可能になる。親のデータが利用可能でない場合は、集団遺伝子型データを使用して、全染色体にわたってＬＦＲコンティグを接続してもよいが、このアプローチはフェージングエラーを増大し得る（Browning and Browning, Nat. Rev. Genet. 12:703-714, 2011）。全染色体ハプロタイプ解析を実証した分裂中期染色体分離などの技術的に挑戦的なアプローチでさえ、何らかの形の親の遺伝子型データなしには親の出自を割り当てることはできない（Fan et al., Nat. Biotechnol. 29:51-57, 2011）。２つの簡単な技術、ＬＦＲおよび親の遺伝子型判定のこの組合せは、正確な、完全な、注釈つきハプロタイプを低費用で提供する。
【０２９１】
フェージングデノボ突然変異。本発明者らの２倍体ゲノム配列決定の完全性および正確性の実証として、本発明者らは、ＮＡ１９２４０のゲノムにおいて最近報告された３５のデノボ突然変異のフェージング（Conrad et al., Nat. Genet. 43:712-714, 2011）を評価した。これらの突然変異のうち３４種は、標準ゲノムまたはＬＦＲライブラリーの１種のいずれかにおいてコールされた。それらのうち、３２種のデノボ突然変異は、２つの複製ＬＦＲライブラリーのうち少なくとも１つにおいてフェージングされた（各親から出自する１６種）。驚くことではないが、２種のフェージングされない変異体は、ＲＬＨ中にある。これらの３２種の変異体のうち、２１種は、Conrad et al.（同書）によってフェージングされ、１８種は、ＬＦＲフェージング結果と一致した。３種の不一致は、これまでの研究におけるエラーによるものである可能性が高く（Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｈｕｒｌｅｓ  ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）、ＬＦＲ正確性を確認するが、報告の実質的な結論に影響を及ぼさない。
【０２９２】
ＬＦＲライブラリーのみを使用する１００ｐｇのＤＮＡからのゲノム配列決定およびハプロタイプ解析。上記の解析は、標準およびＬＦＲライブラリーの両方からのヘテロ接合性ＳＮＰを組み入れた。しかし、１０〜２０個の細胞において見られるものと同等のＤＮＡ量で出発する結果として予測されると仮定すると、ＬＦＲライブラリーのみを使用することが可能である。本発明者らは、ＭＤＡが十分に均一な増幅を提供し、高い（８０×）全体的なリードカバレッジを有し、単独で取られたＬＦＲライブラリーによって、本発明者らの標準ライブラリー変異コーリングアルゴリズムに任意の改変を伴わずに、最大９３％のヘテロ接合性ＳＮＰの検出が可能となることを実証した。ＬＦＲライブラリーのみを使用する可能性を実証するために、本発明者らは、ＮＡ１９２４０複製１ならびに同一ライブラリーからのさらなる２５０Ｇｂのリード（合計５００Ｇｂ）をフェージングした。本発明者らは、それぞれ、フェージングされたＳＮＰの総数の１５％および５％の減少を観察した（図２０）。この結果は、このライブラリーが２００ｐｇという最適量の代わりに６０ｐｇのＤＮＡから作製されたことを考えれば（以下の表１）、また、これまでに記載された、ＭＤＡによるインビトロ増幅の間に組み込まれるＧＣバイアスを考えれば、驚くべきものではない。別の２８５ＧｂのＬＦＲライブラリーは、組み合わされた標準およびＬＦＲライブラリーから得られたすべての変異体の９０％を、単独でコールし、フェージングした（図２０）。フェージングされた総ＳＮＰの低減にもかかわらず、コンティグ長は、影響を受けず長かった（Ｎ５０＞１Ｍｂ）。
【０２９３】
１０個の細胞からの正確なゲノム配列決定のためのＬＦＲによって可能になったエラー低減。相当なエラー率（１００〜１，０００のコールされたキロベース中、約１ＳＮＶ）は、すべての現在の大規模並列化配列決定技術の共通の特性である。これらの率は、診断的用途にはおそらくは高すぎ、新規突然変異を探索する多数の研究を困難にする。偽陽性変異の大半は、母方または父方染色体で起こる可能性が高いというはない。周囲の真の変異との一致した接続性のこの欠如は、最終のアセンブルされたハプロタイプからこれらのエラーを排除するためにＬＦＲによって利用され得る。ヨルバ族人トリオおよびヨーロッパ人家系の両方とも、ＬＦＲのエラー低減力を実証するための優れたプラットフォームを提供する。本発明者らは、両対立遺伝子でヒト参照ゲノムに対応するので、個々の親の各々において高信頼度で報告された、ＮＡ１９２４０およびＮＡ１２８７７（すべてのヘテロ接合性ＳＮＰの＞８５％）中の一連のヘテロ接合性ＳＮＰを定義した。ＮＡ１９２４０には約４４，０００およびＮＡ１２８７７には３０，０００の、この基準を満たすヘテロ接合性ＳＮＰがある。親のゲノム中にそれらが存在しないために、これらの変異は、デノボ突然変異、細胞株特異的体細胞突然変異または偽陽性変異体である。およそ１，０００〜１，５００のこれらの変異体は、サンプルＮＡ１９２４０およびＮＡ１２８７７（図２３）から得た２種の複製ライブラリーの各々において再現性よくフェージングされた。これらの数は、ＮＡ１９２４０におけるデノボおよび細胞株特異的突然変異についてこれまでに報告されたものと同様である（Conrad et al., Nat. Genet. 43:712-714, 2011）。残りの変異体は、初期偽陽性である可能性が高く、そのうち、ライブラリーあたり約５００のみがフェージングされた。これは、フェージングされる変異における偽陽性率の６０倍の低減に相当する。これらの偽変異体のうち約２，４００のみが標準ライブラリー中に存在し、そのうち、約２６０のみがフェージングされる（２０Ｍｂ中＜１偽陽性ＳＮＶ；５７００ハプロイドＭｂ／２６０エラー）。各ＬＦＲライブラリーは、フェージングの前のライブラリー特異的偽陽性コールにおいて、標準法によって配列決定されたゲノムと比較して１５倍の増大を示す。これらの偽陽性ＳＮＶの大多数は、ＭＤＡによって導入されている可能性が高い；希な細胞株変異体のサンプリングは、より小さいパーセンテージトの原因となり得る。１００ｐｇのＤＮＡからＬＦＲライブラリーを作製することおよびＭＤＡ増幅による多数のエラーの導入にもかかわらず、ＬＦＲフェージングアルゴリズムを適用することによって、全体の配列決定エラー率が９９．９９９９９％に低減される（約６００の偽ヘテロ接合性ＳＮＶ／６Ｇｂ）、同じライゲーションに基づく配列決定化学を使用して観察されるエラー率よりもおよそ１０倍低い（Roach et al., Am. J. Human Genet. 89:382-397, 2011）。
【０２９４】
ＬＦＲ情報を用いるベースコーリングの改善。フェージングおよび偽陽性ヘテロ接合性ＳＮＶの排除に加えて、ＬＦＲは、各ベースコールを支持するリードのウェル起源を評価することによって、「コールなし」位置を「救出」できるか、またはその他のコール（例えば、同形接合体参照または同形接合体変異体）を検証できる。実証として、本発明者らは、ＮＡ１９２４０のゲノム中の位置が、コールされないが、隣接するフェージングされたヘテロ接合性ＳＮＰに隣接するものを複製することを見出した。これらの例では、位置は、隣接するフェージングされたＳＮＰとコールなし位置の間の共有されるウェルの存在のために、フェージングされるヘテロ接合性ＳＮＰとして「再コール」され得た（図２４）。ＬＦＲは、すべてのコールなし位置を救出できない場合もあるが、この簡単な実証は、コールなしを救出するためのすべてのゲノム位置のより正確なコーリングにおけるＬＦＲの有用性を強調する。
【０２９５】
アフリカ人および非アフリカ人ゲノム中に存在する高度に多岐にわたるハプロタイプ。ＨａｐＭａｐプロジェクトなどの大規模遺伝子型判定によって可能になるハプロタイプ解析は、集団遺伝学を理解するために非常に重要である。しかし、個体の完全なハプロタイプの解明は、非常に困難であるか、または禁制的に費用がかかるものであった。反復領域の偽マッピングのために蓄積された選別された、クラスター化された偽ヘテロ接合体の高度に正確なハプロタイプ（Li and Durbin, Nature 475:493-496, 2011; Roach et al., Science 328:636-639, 2010）は、個々のゲノムに見られる集団事象の多くの理解に役立つ。実証として、本発明者らは、母方および父方コピー間の高度分岐の領域について、ＮＡ１９２４０のＬＦＲコンティグをスキャンした。７０００の、＞３３ＳＮＶを含有する１０ｋｂ領域を同定し；予測された１０ＳＮＶを上回る３倍の増大。１００万年あたり０．１％の不変の変異および０．１５％の塩基相違（共通の祖先から進化する、ヒトおよびチンパンジーゲノムの１％分岐、約６００万年に基づいて）を仮定して、本発明者らの計算は、このアフリカ人のゲノムに見出されるこれらの領域の約５０Ｍｂ（「非近交系」ゲノムの約２．０％）は、１５０万年にわたって別個に進化してきた可能性があることを示唆する。この推定値は、チンパンジー−ヒト分離が、５００万年未満前である場合には（Hobolth et al., Genome Res. 21:349-356, 2011）１００万年に近い。この全ゲノム解析は、アフリカにおける別個のＨｏｍｏ種の可能性ある異種交配を仮定する、アフリカ人集団における２、３の標的とされるゲノム領域に関するHammer et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108:15123-15128, 2011)による最近の研究と一致する。本発明者らの解析は、ヨーロッパ人非近交系ゲノムの２．１％もまた同様に分岐した配列を、大部分は個別のゲノム位置に有することを示す。これらのうち大多数は、アフリカからのヒトの集団移動の前に導入された可能性が高い。
【０２９６】
個々のゲノムは、両対立遺伝子中に不活化変異を有する多数の遺伝子を含有する。高度に正確な２倍体ゲノムは、ヒトゲノム配列決定が、臨床設定において価値あるものであるために不可欠なものである。診断／予後環境においてＬＦＲが使用され得る方法を実証するために、本発明者らは、ナンセンスおよびスプライシング部位を撹乱する変異についてＮＡ１９２４０のコーディングＳＮＰデータを解析した。本発明者らは、ＰｏｌｙＰｈｅｎ２（Adzhubei et al., Nat. Methods 7:248-249, 2010）を使用してミスセンス変異のすべてをさらに解析して、有害な変化をコードしていた変異のみを選択した。「損傷を与える可能性がある」および「おそらく損傷を与える」は両方とも、すべてのナンセンス突然変異がそうであるようにタンパク質機能に有害であると考えられる。３４８５種の変異体が、これらの判定基準に対応した。フェージングおよび偽陽性を除去した後、１２５２種のみの変異体が残った；情報を誤った方向に導く可能性の重要な低減。本発明者らは、同一遺伝子において少なくとも２つが同時に起きている３１６種のヘテロ接合性変異体のみに調べるリストをさらに低減した。本発明者らは、フェージングデータを使用して、７９遺伝子内で同一対立遺伝子中に起きている１８９種の変異体を同定できた。残りの１２７種のＳＮＰは、各対立遺伝子中に少なくとも１つの有害な変異を有する４７遺伝子にわたって分散していることがわかった（図２５）。２種のＬＦＲライブラリーを組み合わせることによるＮＡ１９２４０のハプロタイプ解析は、この数を６５遺伝子に増大する。この解析をヨーロッパ人家系に拡大することによって、同様の数の遺伝子（両対立遺伝子中にコーディング突然変異を有する３２〜４９）が、有効なタンパク質産物がほとんど発現されない〜全く発現されない点に変更された可能性があることが実証された（図２５）。この解析を、転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を撹乱する変異体に拡大することによって、個体あたりさらに約１００遺伝子を導入する。これらのうち多くは、機能性変化の部分的喪失または喪失なしである可能性が高い。ＬＦＲの高正確性のために、これらの変異体が配列決定エラーの結果である可能性は低い。発見された有害な突然変異の多くは、これらの細胞株の増殖において導入され得る。２、３のこれらの遺伝子は、非関連個体において見出され、これは、それらが、不適切に注釈がつけられる可能性があることまたは組織的マッピングまたは参照エラーの結果であることを示唆する。ＮＡ１９２４０のゲノムは、さらに約１０種の遺伝子を機能カテゴリーは完全に喪失して含有しており；これは、アフリカ人ゲノムに注釈を付けるためにヨーロッパ人参照ゲノムを使用することによって導入されたバイアスによる可能性が最も高い。それにもかかわらず、これらの数は、いくつかフェージングされる個々のゲノムに関する最近の研究において見られるものと同様であり（Suk et al., Genome Res. 21:1672-1685, 2011; Lohmueller et al., Nature 451:994-997, 2008）、最も全身的に健康な個体が、普通の生活に絶対的に必要ではなく、役に立たないタンパク質産物をコードする、少数の遺伝子を有する可能性が高いことを示唆する。本発明者らは、ＬＦＲは、大きなゲノム距離にわたってＳＮＰをハプロタイプ中におくことができ、そこで、それらのＳＮＰのフェージングが、機能の潜在的に完全な喪失を生じさせ得ることを実証した。この種の情報は、患者ゲノムの有効な臨床解釈にとって、また担体スクリーニングにとって決定的となる。
【０２９７】
対立遺伝子発現の相違と関連しているＴＦＢＳ撹乱。シス調節領域およびコード配列の両方を包含する長いハプロタイプは、遺伝子の各対立遺伝子の発現レベルの理解および予測にとって決定的である。ＮＡ２０４３１から得たリンパ球のＲＮＡ配列決定から得た包括的でない発現データの５．６Ｇｂを解析することによって、本発明者らは、対立遺伝子発現において重大な同意を有する少数の遺伝子を同定した。それらの遺伝子の各々において、転写開始部位の上流の調節領域の５ｋｂよび下流の１ｋｂを、３００種の種々の転写因子の結合部位を大幅に変更するＳＮＶについてスキャンした（Sandelin et al., 32:D91-D94, 2004）。６例では（図２６）、２つの対立遺伝子の間の１〜３個の塩基が、各遺伝子において異なり、１種または複数の推定結合部位に重大な影響を引き起こし、観察された対立遺伝子間の発現の相違を説明する可能性があるとわかった。これは、ただ１つのデータセットであるが、転写因子結合に対してこれらの変化どの程度大きな影響を有するかは現在明らかではなく、これらの結果は、ＬＦＲハプロタイプ解析を使用して実現可能になるこの種の大規模研究を用いると（Rozowsky et al., Mol. Syst. Biol. 7:522, 2011）、転写因子結合部位への配列変化の結果は解明され得るということを実証する。
【０２９８】
考察。本発明者らは、ＬＦＲの、ゲノム中のすべての検出されたヘテロ接合性ＳＮＰの最大９７％を、ＤＮＡの長い近接するストレッチに、正確にフェージングする力を実証した（Ｎ５０  ４００〜１５００ｋｂの長さ）。標準ライブラリーから得た候補ヘテロ接合性ＳＮＰを伴わずに、したがって、１０〜２０個のヒト細胞のみを使用してフェージングされた８個のＬＦＲライブラリーは、現在の実施の制限にもかかわらず利用可能なＳＮＰの８５〜９４％にフェージングできる。いくつかの例では、この論文において使用されるＬＦＲライブラリーは、最適未満の出発インプットＤＮＡ（例えば、ＮＡ２０４３１）を有していた。２つの複製ライブラリー（サンプルＮＡ１９２４０およびＮＡ１２８７７）を組み合わせることによって、またはより多くのＤＮＡ（ＮＡ１２８９２）を用いて出発することによって見られるフェージング率改善は、この結論と一致する。さらに、ＧＣリッチ配列の提示不測は、コールされるゲノムの減少をもたらした（標準ライブラリーについて９０〜９３％対＞９６％）。ＭＤＡ法の改善は（例えば、領域特異的プライマーの添加またはその他の工程における収率を改善することによって少ない増幅を使用することによる）、または本発明者らが、ＬＦＲライブラリーにおいて塩基および変異体コーリングを実施する方法では、おそらくは、ウェルへのリードの割り当てを使用することによって、これらの領域のカバレッジの増大に役立つ。さらに、全ゲノム配列決定の費用が低下し続けるにつれ、コールレートおよびフェージングを著しく改善するより高いカバレッジライブラリーがより入手可能になる。
【０２９９】
コンセンサスハプロイド配列は、多数の適用にとって十分であるが、個別化ゲノミクスにとって２つの極めて重要なデータ部分：フェージングされたヘテロ接合性変異体ならびに偽陽性および陰性変異体コールの同定を欠く。個別化ゲノミクスの目標の１つは、疾患を引き起こす変異体を検出することおよび個体がこのような変異体を保持するか、または１種もしくは２種の影響を受けていない対立遺伝子を有するかどうかの決定において極めて確信があることである。母方および父方染色体両方から独立に配列データを提供することによって、ＬＦＲは、１種の対立遺伝子のみがカバーされているゲノムアセンブリ中の領域を検出できる。同様に、ＬＦＲは、独立に、別個のアリコートにおいて、母方および父方染色体を１０〜２０回配列決定するので、偽陽性コールは避けられる。結果は、いくつかのアリコート中で、１種の親の対立遺伝子上の同一塩基位置で、ランダム配列エラーが反復的に生じる統計的低い可能性である。したがって、ＬＦＲは、最初に、インビトロＤＮＡ増幅を使用することおよび得られる多数の避けることができないポリメラーゼエラーにもかかわらず、２、３の（好ましくは、１０〜２０個）ヒト細胞からのゲノムの正確な、費用効率の高い両方の配列決定を可能にする。さらに、数百キロベースにわたってＳＮＰを、複数のメガベース（またはさらには、ＬＦＲを、日常的な、一方または両方の親の遺伝子型判定と統合することによる全染色体）にフェージングすることによって、ＬＦＲは、化合物調節性変異体の効果および対立遺伝子特異的遺伝子発現に対する親の刷り込みおよび種々の組織種における機能を、より正確に予測できる。総合すると、これは、タンパク質機能の獲得または喪失を引き起こし得る可能性あるゲノム変化についての高度に正確なレポートを提供する。どの患者にとっても安価に得られるこの種の情報は、ゲノムデータの臨床使用にとって決定的なものとなる。さらに、細胞から出発する、上首尾の、手ごろな価格のヒトゲノムの２倍体配列決定は、循環腫瘍細胞またはインビトロ受精によって作製された着床前胚などの多様な組織供給源からの微小生検の包括的な、正確な遺伝子スクリーニングの可能性を開く。
【０３００】
本発明は、好ましい実施形態に関連して詳細に記載されるように、多数の異なる形態での実施形態によって満たされるが、本開示内容は、本発明の原理の例示として考えられるべきであって、本発明を、本明細書において例示され、記載される特定の実施形態に制限しようとするものではないということは理解される。当業者によって、本発明の趣旨から逸脱することなく多数の改変がなされ得る。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって測られる。要約および題名は、その目的は、適当な権力者ならびに一般の人々が、本発明の全体的な性質を迅速に決定することを可能にすることであるので、本発明の範囲の制限と解釈されてはならない。以下の特許請求の範囲において、用語「手段（ｍｅａｎｓ）」が使用される限り、本明細書に列挙された特徴または要素のいずれも、米国特許法第１１２条第６項に従うミーンズ−プラス−ファンクション制限と解釈されなければならない。
【０３０１】
【表１】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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