(57)【要約】本発明は、抗EMR1抗体、およびこのような抗体を使用してEMR1関連疾患を治療する方法を提供する。2014523867.tif 000044
【特許請求の範囲】
【請求項１】
EMR1の上皮細胞成長因子様ドメイン-6(ELD-6)に選択的に結合する、重鎖および軽鎖を含む単離された抗EMR1抗体。
【請求項２】
EMR1との結合についてモノクローナル抗体1E7と競合する、請求項1記載の抗EMR1抗体。
【請求項３】
EMR1との結合について、モノクローナル抗体1E7と同じCDR配列を有するモノクローナル抗体と競合する、請求項1記載の抗EMR1抗体。
【請求項４】
EMR1配列
2014523867.tif 000039
の全てまたは一部に結合する、請求項1記載の抗EMR1抗体。
【請求項５】
VHCDR3アミノ酸配列IYYRGFDX1を含み、そこで、X1はQ、S、K、またはVである、請求項1記載の抗EMR1抗体。
【請求項６】
アミノ酸配列(D/S/N)FG(M/I)Hを有するVHCDR1および/またはアミノ酸配列
2014523867.tif 000040
を有するVHCDR2をさらに含む、請求項5記載の抗EMR1抗体。
【請求項７】
VHVセグメントがヒト生殖細胞系列VHVセグメントアミノ酸配列に対して少なくとも85％の同一性を有する、請求項6記載の抗EMR1抗体。
【請求項８】
ヒト生殖細胞系列VHJセグメントFR4アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するFR4領域を有する、請求項7記載の抗EMR1抗体。
【請求項９】
VHが図1に示したVセグメント配列を有する、請求項6記載の抗EMR1抗体。
【請求項１０】
VHが図1に示した配列を有する、請求項6記載の抗EMR1抗体。
【請求項１１】
VLCDR3アミノ酸配列
2014523867.tif 000041
を含む、請求項2〜10のいずれか一項記載の抗EMR1抗体。
【請求項１２】
VLが、アミノ酸配列
2014523867.tif 000042
を有するCDR1および/またはアミノ酸配列R(V/G)SNRASを有するCDR2を含む、請求項11記載の抗EMR1抗体。
【請求項１３】
ヒト生殖細胞系列κVセグメントアミノ酸配列またはλVセグメントアミノ酸配列に対して少なくとも85％の同一性を有するVLVセグメントを有する、請求項12記載の抗EMR1抗体。
【請求項１４】
ヒト生殖細胞系列κJセグメントFR4アミノ酸配列またはλJセグメントFR4アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVLFR4を有する、請求項13記載の抗EMR1抗体。
【請求項１５】
VLが図1に示したVセグメント配列を有する、請求項12記載の抗体。
【請求項１６】
VLが図1に示した配列を有する、請求項12記載の抗体。
【請求項１７】
(a)SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、もしくはSEQ ID NO:11の重鎖CDR、およびSEQ ID NO:17の軽鎖CDR;
(b)SEQ ID NO:9の重鎖CDRおよびSEQ ID NO:18の軽鎖CDR;
(c)SEQ ID NO:6の重鎖CDRおよびSEQ ID NO:15の軽鎖CDR;
(d)SEQ ID NO:7の重鎖CDRおよびSEQ ID NO:16の軽鎖CDR;
(e)SEQ ID NO:11の重鎖CDRおよびSEQ ID NO:21もしくはSEQ ID NO:22の軽鎖CDR;または
(f)SEQ ID NO:9の重鎖CDRおよびSEQ ID NO:21の軽鎖CDR
を有する、請求項1記載の抗EMR1抗体。
【請求項１８】
重鎖可変領域が図1に示した配列を有する、重鎖および軽鎖を有する抗EMR1抗体。
【請求項１９】
軽鎖可変領域が図1に示した配列を有する、重鎖および軽鎖を有する抗EMR1抗体。
【請求項２０】
重鎖可変領域が図1に示した配列を有し、かつ軽鎖可変領域が図1に示した配列を有する、重鎖および軽鎖を有する抗EMR1抗体。
【請求項２１】
IgGである、請求項1〜20のいずれか一項記載の抗EMR1抗体。
【請求項２２】
ヒトγ-1またはγ-3定常領域を有する、請求項21記載の抗EMR1抗体。
【請求項２３】
ヒトγ-2またはγ-4定常領域を有する、請求項21記載の抗EMR1抗体。
【請求項２４】
約10nM未満のKDを有する、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２５】
1nM未満のKDを有する、請求項24記載の抗体。
【請求項２６】
治療抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の抗体。
【請求項２７】
低フコシル化またはアフコシル化された重鎖定常領域を有する前記請求項のいずれか一項記載の抗EMR1抗体を含む、抗体調製物。
【請求項２８】
生理学的に許容される担体および請求項1〜26のいずれか一項記載の抗体または請求項27記載の抗体調製物を含む、薬学的組成物。
【請求項２９】
好酸球に選択的に結合し、かつ抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)を媒介する抗EMR1抗体を投与する工程を含む、ヒト対象において好酸球を枯渇させる方法。
【請求項３０】
抗体が増強したADCC活性を有する、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
抗体がアフコシル化されている、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
抗体がEMR1のELD-6に結合する、請求項29、30、または31記載の方法。
【請求項３３】
抗体がEMR1配列
2014523867.tif 000043
の全てまたは一部に結合する、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
患者における好酸球レベルを下げる方法であって、以下の工程を含む方法:
請求項1〜25のいずれか一項記載の抗体または請求項27記載の調製物の抗体を患者に投与する工程であって、患者が、慢性閉塞性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性喘息を含む喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、胃食道逆流疾患、鼻ポリープ症、好酸球性胃腸炎、好酸球性胃炎、好酸球性食道炎、好酸球性大腸炎、チャーグ・ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、偶発性血管浮腫、オンコセルカ属皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、寄生虫感染症に起因する好酸球性肺疾患、好酸球性脂肪組織炎、好酸球増加を伴う偶発性血管浮腫(グライヒ症候群)、骨髄-リンパ節肉芽腫および前部ブドウ膜炎を伴う急性好酸球性間質性腎炎および腎不全、サムター症候群、気管支喘息、アスピリン不耐症、慢性副鼻腔炎、NARES(好酸球増加症候群を伴う非アレルギー性鼻炎)、薬物誘発性もしくは毒素誘発性の肺臓炎、急性好酸球性白血病、ならびに慢性好酸球性白血病からなる群より選択される疾患を有する、工程。
【請求項３５】
患者が慢性閉塞性肺疾患または好酸球性喘息を有する、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
患者が慢性閉塞性肺疾患を有する、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
請求項1〜25のいずれか一項記載の抗EMR1抗体を患者に投与する工程を含む、鼻ポリープ除去後に患者における鼻ポリープの再発を阻止または低減する方法。
【請求項３８】
好酸球依存性疾患を有する患者において、好酸球を標的とする治療の効力を評価する方法であって、以下の工程を含む方法:
患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を、請求項1〜25のいずれか一項記載の抗EMR1抗体と接触させる工程;
抗体と好酸球との結合を検出する工程、および
好酸球レベルを決定する工程であって、治療前のレベルと比較した患者における好酸球レベルの低下が治療効力を示す、工程。
【請求項３９】
好酸球を標的とする治療が、好酸球に選択的に結合しかつADCCを媒介する治療用抗EMR1抗体を投与する工程を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
治療用抗EMR1抗体が請求項1〜25のいずれか一項記載の抗体である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
好酸球依存性疾患を有し、かつ好酸球を枯渇させる治療剤による治療の候補である患者をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法:
患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を、請求項1〜25のいずれか一項記載の抗EMR1抗体と接触させる工程;
抗体と好酸球との結合を検出する工程、および
患者における好酸球レベルを決定し、それによって、治療の候補である患者をスクリーニングする工程。
【請求項４２】
好酸球依存性疾患を有し、かつ好酸球を枯渇させる治療剤による治療の候補である患者を特定する方法であって、以下の工程を含む方法:
患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を抗IL-5受容体抗体と接触させる工程;
抗体と好酸球との結合を検出する工程、
患者における好酸球レベルを決定する工程、
正常と比較して好酸球レベルが高い患者を選択する工程;および
好酸球に選択的に結合しかつADCCを媒介する抗EMR1抗体を投与する工程。
【請求項４３】
好酸球依存性疾患を有し、かつ好酸球を枯渇させる治療剤による治療の候補である患者を特定する方法であって、以下の工程を含む方法:
患者に由来する血清試料に存在する可溶性IL-5受容体スプライスバリアント(sIL-5R)のレベルを決定する工程;
正常と比較してsIL-5Rのレベルが高い患者を選択する工程;および
好酸球に選択的に結合しかつADCCを媒介する抗EMR1抗体を投与する工程。
【請求項４４】
sIL-5Rのレベルを決定する工程が、増幅反応を用いてsIL-5R mRNAのレベルを検出する工程を含む、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
sIL-5Rのレベルを決定する工程が、イムノアッセイを用いてsIL-5Rタンパク質のレベルを検出する工程を含む、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
抗EMR1抗体が請求項1〜25のいずれか一項に記載されているものである、請求項42、43、44、または45記載の方法。
【請求項４７】
EMR1に選択的に結合しかつ患者に対するADCC活性を有する抗EMR1抗体を投与する工程を含む治療の効力を評価する方法であって、以下の工程を含む方法:
患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を、請求項1〜25のいずれか一項に記載の抗EMR1抗体と接触させる工程;
抗体と好酸球との結合を検出する工程、および
好酸球レベルを決定する工程であって、治療前のレベルと比較した患者における好酸球レベルの低下が治療効力を示す、工程。
【請求項４８】
患者が、慢性閉塞性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性喘息を含む喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、胃食道逆流疾患、鼻ポリープ症、好酸球性胃腸炎、好酸球性胃炎、好酸球性食道炎、好酸球性大腸炎、チャーグ・ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、偶発性血管浮腫、オンコセルカ属皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、寄生虫感染症に起因する好酸球性肺疾患、好酸球性脂肪組織炎、好酸球増加を伴う偶発性血管浮腫(グライヒ症候群)、骨髄-リンパ節肉芽腫および前部ブドウ膜炎を伴う急性好酸球性間質性腎炎および腎不全、サムター症候群、気管支喘息、アスピリン不耐症、慢性副鼻腔炎、NARES(好酸球増加症候群を伴う非アレルギー性鼻炎)、薬物誘発性もしくは毒素誘発性の肺臓炎、急性好酸球性白血病、ならびに慢性好酸球性白血病からなる群より選択される疾患を有する、請求項40〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
患者が慢性閉塞性肺疾患または好酸球性喘息を有する、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
患者が慢性閉塞性肺疾患を有する、請求項49記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2011年5月27日に出願された米国仮出願第61/491,095号の恩典を主張する。米国仮出願第61/491,095号はその全体が、全ての目的のために参照により組み入れられる
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
受容体EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様1(EMR1)はヒト好酸球性顆粒球上で発現するが、好塩基球、単球、マクロファージ、および骨髄系樹状細胞を含む他の白血球上で発現しない。EMR1は、TM7タンパク質の接着クラス内にあるサブファミリーであるEGF-TM7ファミリーに属する。他のEGF-TM7ファミリーメンバーには、CD97ならびにEMR2、EMR3およびEMR4が含まれる。好酸球はアレルギー性疾患および様々な炎症障害の発生に関与し、血液および組織における好酸球増加の拡大は症状の存在および重篤度に関連する。従って、EMR1は、好酸球が疾患の病態において役割を果たす疾患の望ましい治療標的である。
【０００３】
EMR1に結合する抗体は公知である(例えば、Hamann et al., Eur. J. Immunol 37:2797-2802, 2007（非特許文献1）を参照されたい)。しかしながら、選択的にEMR-1を標的とし、好酸球を枯渇させる治療抗体の開発が必要とされている。本発明は、この必要に対処する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hamann et al., Eur. J. Immunol 37:2797-2802, 2007
【発明の概要】
【０００５】
発明の簡単な概要
本発明は、EMR1に選択的に結合する新たな抗EMR1抗体の発見に一部基づく。従って、1つの局面において、本発明は、EMR1の上皮細胞成長因子様ドメイン-6(ELD-6)に選択的に結合する、単離された抗EMR1抗体を提供する。一部の態様において、抗体は、EMR1との結合において、モノクローナル抗体1E7のVH配列およびVL配列(それぞれ、SEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:24)を有する抗体と競合する。一部の態様において、抗体は、EMR1配列
2014523867.tif 000002
の全てまたは一部に結合する。
【０００６】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、VHCDR3アミノ酸配列IYYRGFDX1を含む。式中、X1はQ、S、K、またはVである。一部の態様において、抗体は、VHCDR3アミノ酸配列IYYRGFDX1を含む。式中、X1はQ、S、またはVである。一部の態様において、抗体は、アミノ酸配列(D/S/N)FG(M/I)Hを有するVHCDR1および/またはアミノ酸配列
2014523867.tif 000003
を有するVH CDR2をさらに含む。一部の態様において、VHは、図1に示したVセグメントアミノ酸配列を有する。一部の態様において、抗体は、図1に示したVH領域のアミノ酸配列を有するVHを有する。
【０００７】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、VLCDR3アミノ酸配列
2014523867.tif 000004
を含む。一部の態様において、抗体は、VLCDR3アミノ酸配列
2014523867.tif 000005
を含む。一部の態様において、VLは、アミノ酸配列
2014523867.tif 000006
を有するCDR1および/またはアミノ酸配列R(V/G)SNRASを有するCDR2を含む。一部の態様において、VLは、図1に示したVセグメントアミノ酸配列を有する。一部の態様において、抗体は、図1に示したVL領域のアミノ酸配列を有するVLを有する。
【０００８】
さらに、本発明は、CDR3を除いた時に、ヒト生殖細胞系列配列に対して少なくとも80％、典型的に少なくとも90％、またはそれより大きな配列同一性を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗EMR1抗体を提供する。従って、このような抗体は、例えば、ヒト生殖細胞系列VHVセグメントに対して、少なくとも80％、または少なくとも85％、86％、87％、88％、または89％;典型的には少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH、およびヒトJHセグメントのFR4と少なくとも85％または少なくとも90％同一のFR4;ならびにヒト生殖細胞系列VκVセグメントまたはVλVセグメントに対して、少なくとも80％または少なくとも85％、86％、87％、88％、または89％;典型的には少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVL、およびヒトJκセグメントまたはJλセグメントのFR4と少なくとも85％または少なくとも90％同一のFR4を有してもよい。
【０００９】
本発明はまた、重鎖可変領域が図1に示した配列を有する、重鎖および軽鎖を有する抗EMR1抗体を提供する。
【００１０】
一部の態様において、軽鎖可変領域が図1に示した配列を有する、重鎖および軽鎖を有する抗EMR1抗体。
【００１１】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、以下の配列:SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17; SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:17; SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:17; SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:18; SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:15; SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:16; SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:21; SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:22; SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:21;またはSEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:17を含む、VH領域およびVL領域を有する。
【００１２】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:24のアミノ酸配列を含むVL領域を有する。
【００１３】
本発明の抗EMR1抗体の一部の態様において、VH領域もしくはVL領域またはVH領域およびVL領域の両方のアミノ酸配列はN末端にメチオニンを含む。
【００１４】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、IgG、例えば、IgG1またはIgG3;またはIgG2またはIgG4である。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、重鎖定常領域が低フコシル化またはアフコシル化されている、本明細書に記載の抗EMR1抗体を含む抗体調製物を提供する。
【００１６】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、約10nM未満のKDを有する。一部の態様において、抗体は1nM未満のKDを有する。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、対象、例えば、ヒトにおいて好酸球を枯渇させる方法であって、霊長類好酸球、例えば、ヒト好酸球に選択的に結合する低フコシル化またはフコシル化された抗EMR1抗体を投与する工程を含む、方法を提供する。
【００１８】
一部の態様において、本発明は、対象において好酸球レベルを下げる方法であって、本明細書に記載の本発明の抗EMR1抗体を対象に投与する工程であって、対象が、EMR1依存性疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性喘息を含む喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、胃食道逆流疾患、鼻ポリープ症、好酸球性胃腸炎、好酸球性胃炎、好酸球性食道炎、好酸球性大腸炎、チャーグ・ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、偶発性血管浮腫(episodic angiodema)、オンコセルカ属皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、寄生虫感染症に起因する好酸球性肺疾患、好酸球性脂肪組織炎、好酸球増加を伴う偶発性血管浮腫(グライヒ症候群)、骨髄-リンパ節肉芽腫および前部ブドウ膜炎を伴う急性好酸球性間質性腎炎および腎不全、サムター症候群、気管支喘息、アスピリン不耐症、慢性副鼻腔炎、NARES(好酸球増加症候群を伴う非アレルギー性鼻炎)、薬物誘発性もしくは毒素誘発性の肺臓炎、および急性または慢性の好酸球性白血病からなる群より選択される疾患を有する工程を含む、方法を提供する。一部の態様において、対象は慢性閉塞性肺疾患を有する。一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、ポリープの再発を阻止または低減するために鼻ポリープ除去後に対象に投与される。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、好酸球によって媒介される疾患の治療の治療効力をモニタリングする方法および好酸球を枯渇の標的とする治療方法による治療の候補である対象を特定する方法を提供する。従って、一部の態様において、本発明は、好酸球依存性疾患を有する患者において、好酸球を標的とする治療の効力を評価する方法であって、患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を、EMR1に選択的に結合する抗EMR1抗体、例えば、ELD-6ドメインに選択的に結合する抗EMR1抗体と接触させる工程;抗体と好酸球との結合を検出する工程、および好酸球レベルを決定する工程であって、治療前のレベルと比較した患者における好酸球レベルの低下が治療効力を示す工程を含む、方法を提供する。抗EMR1抗体は、本明細書に記載の任意の抗EMR1抗体でよい。一部の態様において、効力について評価を受けている治療方法は、好酸球に選択的に結合し、抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)または補体依存性細胞傷害(CDC)活性を媒介する抗EMR1抗体を投与する工程を含む治療である。一部の態様において、抗EMR1抗体は、本明細書に記載の本発明の抗体のいずれか一つである。
【００２０】
さらに、本発明は、好酸球依存性疾患を有し、好酸球を枯渇させる治療剤による治療の候補である患者をスクリーニングする方法であって、患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を、抗EMR1抗体、例えば、EMR1のELD-6に選択的に結合する抗EMR1抗体と接触させる工程;抗体と好酸球との結合を検出する工程、および患者における好酸球レベルを決定し、それによって、治療の候補である患者をスクリーニングする工程を含む、方法を提供する。典型的な態様において、EMR1のELD-6に選択的に結合する抗EMR1抗体は、本明細書に記載の本発明の抗体である。
【００２１】
本発明はまた、好酸球依存性疾患を有し、好酸球を枯渇させる治療剤による治療の候補である患者を特定する方法であって、患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を抗IL-5受容体抗体と接触させる工程;抗体と好酸球との結合を検出する工程、患者における好酸球レベルを決定する工程、正常と比較して好酸球レベルが高い患者を選択する工程;および好酸球に選択的に結合し、ADCCを媒介する治療用抗EMR1抗体を投与する工程を含む、方法を提供する。典型的な態様において、治療用抗EMR1抗体は、本明細書に記載の本発明の抗EMR1抗体である。
【００２２】
他の態様において、本発明は、好酸球依存性疾患を有し、好酸球を枯渇させる治療剤による治療の候補である患者を特定する方法であって、患者に由来する血清試料に存在する可溶性IL-5受容体スプライスバリアント(sIL-5R)のレベルを決定する工程;正常と比較してsIL-5Rのレベルが高い患者を選択する工程;および好酸球に選択的に結合し、ADCCを媒介する抗EMR1抗体を投与する工程を含む、方法を提供する。sIL-5Rのレベルを決定する工程は、血清中のsIL-5Rタンパク質または核酸を検出する任意の方法を用いて実施することができる。一部の態様において、前記方法は、増幅反応を用いてsIL-5R核酸レベルを検出する工程を含む。一部の態様において、前記方法は、イムノアッセイを用いてsIL-5Rタンパク質のレベルを検出する工程を含む。一部の態様において、患者に投与される抗EMR1抗体は、本明細書に記載の抗EMR1抗体である。
【００２３】
本発明はまた、EMR1に選択的に結合し、患者に対するADCC活性を有する抗EMR1抗体を投与する工程を含む治療の効力を評価する方法であって、患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を、本明細書に記載の抗EMR1抗体のいずれか一つの抗EMR1抗体と接触させる工程;抗体と好酸球との結合を検出する工程、および好酸球レベルを決定する工程であって、治療前のレベルと比較した患者における好酸球レベルの低下が治療効力を示す工程を含む、方法を提供する。
【００２４】
選択的に好酸球を標的とする療法の効力を評価する、および/または選択的に好酸球を標的とする療法の候補である対象をスクリーニングする方法は、任意の好酸球依存性疾患を有する患者において実施することができる。一部の態様において、患者は、慢性閉塞性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性喘息を含む喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、胃食道逆流疾患、鼻ポリープ症、好酸球性胃腸炎、好酸球性胃炎、好酸球性食道炎、好酸球性大腸炎、チャーグ・ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、偶発性血管浮腫、オンコセルカ属皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、寄生虫感染症に起因する好酸球性肺疾患、好酸球性脂肪組織炎、好酸球増加を伴う偶発性血管浮腫(グライヒ症候群)、骨髄-リンパ節肉芽腫および前部ブドウ膜炎を伴う急性好酸球性間質性腎炎および腎不全、サムター症候群、気管支喘息、アスピリン不耐症、慢性副鼻腔炎、NARES(好酸球増加症候群を伴う非アレルギー性鼻炎)、薬物誘発性もしくは毒素誘発性の肺臓炎、または急性もしくは慢性の好酸球性白血病を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１−１】本発明の抗EMR1抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列の例を示す。抗体の例も示される。
【図１−２】図1-1の続きである。
【図２】EMR1のドメイン構造の概要を示す。
【図３】ウエスタンブロットによる抗EMR1モノクローナル抗体c1E7とEMR1 EGF様ドメイン-6(ELD-6)欠失変異体との結合を示すデータの一例を提供する。図3Aは、比色抗ヒトFcウエスタンブロットにおける一過的トランスフェクション上清からのデータを示す。両方の遺伝子構築物、EMR1-ELDおよびEMR1-ELD-del6を発現させ、発現タンパク質をブロット膜に転写した。図3Bは、c1E7抗体を用いてプローブされ、ECL基質を用いて発色された、ブロット膜上にある同じ上清のアリコートを示す。モノクローナル抗体c1E7は、ウエスタンブロット分析によって評価された時に欠失変異体に結合しない。このことから、c1E7の結合にはELD-6が必要なことが分かる。
【図４】ForteBioによる抗EMR1モノクローナル抗体c1E7と様々なEMR1領域を表すペプチドとの結合を示すデータを提供する。ヒトEMR1-ELDのC末端配列のELD-6領域にあるペプチド6および7をc1E7による結合について試験した。
【図５】非フコシル化抗体が強力なADCC活性を媒介することを示すデータを提供する。好酸球(85,000個の細胞)およびNK細胞を10μg/ml、1μg/ml、および0.1μg/mlの抗体c1E7と組み合わせ、ADCC活性について分析した。ヒトIgG1アイソタイプ対照抗体を10μg/mlで分析した。左パネル:非フコシル化c1E7;右パネル フコシル化c1E7。
【図６】モノクローナル抗体19-1E7重鎖可変領域配列に基づいて抗EMR1抗体の重鎖を操作するための重鎖CDR2/FR3カセット構築を図示する。比較のために、生殖細胞系列Vh3-33セグメントの重鎖CDR2を示した。
【図７】モノクローナル抗体19-1E7軽鎖可変領域配列に基づいて抗EMR1抗体の軽鎖を操作するための軽鎖CDR1/FR1カセット構築を図示する。比較のために、生殖細胞系列VkII A3セグメントの軽鎖CDR2を示した。
【図８】抗原結合を助けるHCDR3(パネルA)およびLCDR3(パネルB)親和性成熟変化を示す。一番上にある参照配列に下線を引き、抗原結合を助けるCDR3変化はイタリック体で示した。
【図９】A)5mg/kgまたはB)1mg/kg抗EMR1抗体が投与されたカニクイザル動物の循環好酸球数を示す例示的なデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本明細書で使用する「EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様1」または「EMR1」とは、EGF-TM7ファミリーのメンバーである受容体をいう。EMR1は、7回膜貫通領域を有するドメインをC末端に有する。このタンパク質のN末端にはセリン/スレオニンリッチドメインによって膜貫通ドメインから分けられた6個のEGF様ドメイン(本明細書ではELD-1、ELD-2、ELD-3、ELD-4、ELD-5、およびELD-6と呼ぶ)がある。ヒトEMR1のUniProtKB/Swiss-Prot識別子はQ14246である。ヒトEMR1は19p13.3に位置する。「EMR1」という用語は、その遺伝子座において生じる多型変種を含む。ヒトEMR1細胞外ドメインタンパク質配列の一例をSEQ ID NO:25に示した。
【００２７】
本発明において「EMR1抗体」または「抗EMR1抗体」は、EMR1に特異的に結合する抗体をいうために同義に用いられる。
【００２８】
本明細書で使用する「活性アイソタイプを有する抗体」とは、免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に結合するヒトFc領域を有する抗体をいう。「活性アイソタイプ」には、IgG1、IgG3、IgM、IgA、およびIgEが含まれる。この用語は、Fcエフェクター機能を調節する改変、例えば、変異または糖組成および/もしくはグリコシル化レベルに対する変化を含むヒトFc領域を有する抗体を包含する。
【００２９】
本発明において「ADCC活性を有する」および「ADCCを媒介する」という用語は同義に用いられる。本発明において、「増強した抗体依存性細胞媒介細胞傷害」または「増強したADCC」を有する抗体とは、ADCCが、改変前の抗体と比較して、例えば、少なくとも2倍、典型的に少なくとも5倍、好ましくは少なくとも10倍増えるように、オリゴ糖の改変または変異などによって改変された抗体をいう。ADCCは周知のアッセイを用いて測定される。例えば、本発明において、ADCCは、典型的には、抗EMR1抗体の存在下で、患者由来エフェクター細胞または正常末梢血由来エフェクター細胞と好酸球標的細胞が、選択されたエフェクター:標的細胞比で、通常、10〜100の比でインキュベートされるインビトロアッセイによって測定される。抗体依存性の細胞死滅は、一般的に4〜24時間のインキュベーション期間後に、例えば、LDHなどの細胞内酵素の放出を確かめることによって測定される。
【００３０】
「Fc領域」とは、第1の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域をいう。従って、Fcとは、IgA、IgD、およびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにIgEおよびIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのN末端側にある可動性ヒンジをいう。IgAおよびIgMの場合、FcはJ鎖を含むことがある。IgGの場合、Fcは、免疫グロブリンドメインCγ2およびCγ3ならびにCγ1とCγとの間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変化する場合があることが当技術分野において理解される。しかしながら、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.)のようにEUインデックスに従う番号付けを用いて、残基C226またはP230からそのカルボキシル末端まで含むと定義されている。「Fc領域」という用語は、単離において、この領域を指してもよく、抗体または抗体断片の状況において、この領域を指してもよい。「Fc領域」は、Fc領域の天然に存在する対立遺伝子変種ならびにエフェクター機能を調節する改変を含む。Fc領域は、生物学的機能を変えない変種も含む。例えば、生物学的機能を大幅に失うことなく、免疫グロブリンのFc領域のN末端またはC末端から1つまたは複数のアミノ酸を欠失することができる。このような変種は、活性にほとんど影響を及ぼさないように当技術分野において公知の通則に従って選択することができる(例えば、Bowie, et al., Science 247:306-1310, 1990を参照されたい)。
【００３１】
「平衡解離定数」または「親和性」という用語は(KD)と略され、解離速度定数(kd,time-1)を会合速度定数(ka, time-1, M-1)で割ったものをいう。平衡解離定数は、当技術分野において任意の公知の方法を用いて測定することができる。本発明の抗体は高親和性抗体である。このような抗体のKDは、37℃で行われる表面プラズモン共鳴分析によって求められた時、約50nM未満であり、多くの場合、約10nM未満である。従って、一部の態様において、本発明の抗体のKDは(表面プラズモン共鳴を用いて測定された時)、約50nM未満、典型的に約25nM未満、またはさらに10nM未満、例えば、約5nMまたは約1nMである。本発明の状況において、例えば、低い数値のKDによって証明されるように、高い親和性を有するのであれば、親和性は「優れている」。
【００３２】
タンパク質またはペプチドについて言及している時、抗原もしくは標的に「特異的に(もしくは選択的に)結合する」または「特異的に(もしくは選択的に)免疫反応性の」という句は、抗体が関心対象の抗原または標的に結合する結合反応をいう。本発明の状況において、抗体は、他の抗原に対する親和性より少なくとも100倍大きな親和性でEMR1に結合する。
【００３３】
本明細書で使用する「抗体」とは、結合タンパク質と機能上定義され、かつ抗体産生動物の免疫グロブリンコード遺伝子のフレームワーク領域に由来すると当業者によって認められたアミノ酸配列を含むと構造上定義されたタンパク質をいう。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる1つもしくは複数のポリペプチドからなってもよい。認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、次に、これらは、それぞれ、免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを定義する。
【００３４】
典型的なIgG免疫グロブリン(抗体)構造単位は四量体からなることが知られている。それぞれの四量体は2つの同じポリペプチド鎖対からなり、各対は1本の「軽」(約25kD)および1本の「重」鎖(約50〜70kD)を有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識を担う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
【００３５】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、結合特異性を保持している抗体断片を含む。例えば、特徴がはっきりした多数の抗体断片がある。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域にあるジスルフィド結合のC末端側で抗体を消化して、ジスルフィド結合によって軽鎖とVH-CH1がつながっているFabの二量体であるF(ab') 2を生成する。F(ab') 2を、ヒンジ領域にあるジスルフィド結合を破壊する穏やかな条件下で還元し、それによって、F(ab') 2二量体をFab'単量体に変換することができる。Fab'単量体は本質的にヒンジ領域の一部を有するFabである(他の抗体断片のさらに詳細な説明については、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を参照されたい)。インタクトな抗体の消化の点で様々な抗体断片が定義されているが、当業者であれば、化学的に、または組換えDNA法を用いて断片を新規合成できることを理解するだろう。従って、本明細書で使用する抗体という用語は、抗体全体を改変することによって生成された、または組換えDNA法を用いて合成された抗体断片も含む。
【００３６】
抗体は、連続したポリペプチドを形成するように可変重鎖領域および可変軽鎖領域が(直接、またはペプチドリンカーを介して)つながって一緒になった単鎖抗体を含む、VH-VL二量体を含む。または、抗体は別の断片でもよい。例えば、組換え法を用いて、可溶性タンパク質として、またはディスプレイ方法から得られた断片として他の断片も作製することもできる。従って、抗体は、ダイアボディ、ミニ抗体、およびラクダ由来抗体などの重鎖二量体も含んでよい。
【００３７】
本明細書で使用する「V領域」とは、CDR3およびフレームワーク4を含めて、フレームワーク1、CDR1、フレームワーク2、CDR2、およびフレームワーク3のセグメントを含む、抗体可変領域ドメインをいう。これらのセグメントは、B細胞分化中に重鎖V領域遺伝子および軽鎖V領域遺伝子の再編成の結果としてVセグメントに付加される。本明細書で使用する「Vセグメント」とは、V遺伝子によってコードされるV領域(重鎖または軽鎖)の領域をいう。重鎖可変領域のVセグメントは、FR1-CDR1-FR2-CDR2およびFR3をコードする。本発明の目的のために、軽鎖可変領域のVセグメントはFR3からCDR3まで及ぶと定義される。
【００３８】
本明細書で使用する「Jセグメント」という用語は、CDR3のC末端部分およびFR4を含む、コードされる可変領域の部分配列をいう。生殖細胞系列Jセグメントは免疫グロブリンJ遺伝子セグメントによってコードされる。
【００３９】
本明細書で使用する「相補性決定領域(CDR)」とは、軽鎖可変領域および重鎖可変領域によって確立された4つの「フレームワーク」領域の間にある、各鎖における3つの超可変領域をいう。CDRは主に抗原エピトープとの結合を担う。各鎖のCDRは、典型的には、N末端から連続番号が振られているCDR1、CDR2、およびCDR3と呼ばれ、典型的には、特定のCDRが位置する鎖によっても特定される。従って、VHCDR3は、VHCDR3が見出される抗体重鎖の可変ドメインに位置するのに対して、VLCDR1は、VLCDR1が見出される抗体軽鎖の可変ドメインに由来するCDR1である。
【００４０】
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成要素である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域の組み合わせであり、三次元空間内でCDRを配置および整列するのに役立つ。
【００４１】
CDRおよびフレームワーク領域のアミノ酸配列は、当技術分野において周知の様々な定義、例えば、Kabat、Chothia、国際ImMunoGeneTicsデータベース(IMGT)、およびAbMを用いて決定することができる(例えば、Johnson et al., 前記; Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883; Chothia C. et al, 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani et al, J.Mol.Biol 1997, 273(4)を参照されたい)。抗原結合部位の定義も以下:Ruiz et al, IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000);およびLefranc,M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan 1;29(1):207-9 (2001); MacCallum et al, Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996);およびMartin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin, et al, Methods Enzymol, 203, 121-153, (1991); Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992);およびRees et al, In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996に記載されている。
【００４２】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体が結合する、抗原上の部位をいう。エピトープは、連続アミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって近接する非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝露されても保持されるのに対して、三次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒で処理されると失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間コンホメーションにおいて少なくとも3個、さらに通常は少なくとも5個または8〜10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間コンホメーションを決定する方法には、例えば、X線結晶学および2次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)を参照されたい。
【００４３】
本明細書で使用する「キメラ抗体」とは、(a)抗原結合部位(可変領域)が、異なるもしくは変化したクラス、エフェクター機能、および/もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などと連結されるように、定常領域またはその一部が変化、置換、または交換されている;あるいは(b)可変領域またはその一部が、異なるまたは変化した抗原特異性を有する可変領域またはその一部;あるいは別の種に由来する対応する配列または別の抗体クラスもしくはサブクラスに由来する対応する配列を用いて変化、置換、または交換されている、免疫グロブリン分子をいう。
【００４４】
本明細書で使用する「ヒト化抗体」とは、ドナー抗体に由来するCDRがヒトフレームワーク配列にグラフトされた免疫グロブリン分子をいう。ヒト化抗体はまた、フレームワーク配列中にドナー由来の残基を含んでもよい。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含むことができる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されるCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。ヒト化は、「超ヒト化(superhumanizing)」抗体(Tan et al., J. Immunol. 169:1119, 2002)ならびに「リサーフェシング(resurfacing)」 (例えば、Staelens et al., Mol. Immunol. 43:1243, 2006;およびRoguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:969, 1994)などの技法を含む、当技術分野において公知の方法 (例えば、Jones et al., Nature 321:522-525; 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992; 米国特許第4,816,567号)を用いて行うことができる。
【００４５】
本発明の状況において「Humaneered(商標)」抗体とは、参照抗体の結合特異性を有する操作されたヒト抗体をいう。本発明において使用するための操作された「Humaneered(商標)」ヒト抗体は、ドナー免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリン分子を有する。典型的には、このような抗体は、参照抗体の重鎖のCDR3領域に由来する結合特異性決定基(BSD)をコードするDNA配列を、ヒトVHセグメント配列とつなぎ、参照抗体に由来する軽鎖CDR3 BSDをヒトVLセグメント配列とつなぐことによって操作される。このような方法は、米国特許出願公開第20050255552号および米国特許出願公開第20060134098号に記載されている。
【００４６】
本発明の状況において用いられる「結合特異性決定基」または「BSD」という用語は、抗体の結合特異性を決定するのに必要な、CDR領域内にある最小限の連続アミノ酸配列または非連続アミノ酸配列をいう。本発明において、最小限の結合特異性決定基は、抗体の重鎖および軽鎖のCDR3配列の一部または完全長の中にある。
【００４７】
本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト化抗体およびHumaneered(商標)抗体、ならびに公知の技法を用いて産生されたヒトモノクローナル抗体を包含する。
【００４８】
本明細書で使用する「治療」抗体とは、好酸球を死滅させることが望ましい疾患を治療するために患者に投与されるヒト抗体またはキメラ抗体をいう。
【００４９】
「低フコシル化された」抗体調製物とは、N結合型オリゴ糖鎖の50％未満が、CH2ドメインに取り付けられたα1,6-フコースを含有する抗体調製物をいう。典型的には、「低フコシル化された」抗体調製物において、N結合型オリゴ糖鎖の約40％未満、約30％未満、約20％未満、約10％未満、または5％未満、または1％未満が、CH2ドメインに取り付けられたα1,6-フコースを含有する。
【００５０】
「アフコシル化された」および「非フコシル化された」という用語は、IgG重鎖のCH2ドメインに取り付けられた炭水化物中にα1,6-フコースを欠く抗体をいうために本明細書において同義に用いられる。
【００５１】
「異種の」という用語は、核酸の一部に関して用いられる時、核酸が、通常、天然における同じ互いとの関連性をもって見出されない2つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には2つ以上の配列を用いて、例えば、新しい機能的核酸を作るように並べられた無関係の遺伝子から組換えにより生成される。同様に、異種タンパク質は、多くの場合、天然における同じ互いとの関連性をもって見出されない2つ以上の部分配列をいう。
【００５２】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる時、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質またはネイティブな核酸もしくはタンパク質の変化の導入によって改変されていること、あるいは細胞が、このように改変された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、ネイティブな(非組換え)型の細胞内に見出されない遺伝子を発現するか、または別の方法で異常発現された、過小発現された、または全く発現されないネイティブな遺伝子を発現する。本明細書において「組換え核酸」という用語は、最初にインビトロで形成された核酸、一般的に、核酸の操作によって、例えば、天然では通常見出されない形でポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いた核酸の操作によって最初にインビトロで形成された核酸を意味する。このように、異なる配列の機能的連結が達成される。従って、直鎖の形をした単離された核酸、または通常つながっていないDNA分子を連結することによってインビトロで形成された発現ベクターは両方とも本発明の目的では組換えとみなされる。組換え核酸が作られ、宿主細胞または生物に再導入されたら、非組み換えにより、すなわち、インビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製すると理解される。しかしながら、このような核酸は組換えにより生成されたら、後で非組み換えにより複製されるが、依然として本発明の目的では組換えとみなされる。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え法を用いて作られた、すなわち、前記で示されたような組換え核酸の発現によって作られたタンパク質である。
【００５３】
本明細書で使用する「EMR1依存性疾患」とは、EMR1を発現する細胞が、疾患を治療する療法の標的となっている疾患をいう。
【００５４】
本明細書で使用する「治療剤」とは、疾患に罹患している患者に治療に有効な用量で投与された時に、疾患の症状および疾患に関連する合併症を治癒させる、または少なくとも部分的に抑える薬剤をいう。
【００５５】
2つ以上のポリペプチド(または核酸)配列の状況において「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、BLASTもしくはBLAST2.0配列比較アルゴリズムと下記のデフォルトパラメータを用いて測定された時に、または手作業のアラインメントおよび目視検査(例えば、NCBIウェブサイトを参照されたい)によって用いて測定された時に、同じ2つ以上の配列もしくは部分配列、または特定のパーセントの同じアミノ酸残基(もしくはヌクレオチド)(例えば、比較ウィンドウもしくは指定された領域にわたって最大限一致するように比較もしくは整列された時に、特定の領域にわたって少なくとも60％の同一性、好ましくは、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはさらに高い同一性)を有する2つ以上の配列もしくは部分配列をいう。少なくとも60％の同一性を共有する配列は「実質的に同一」と呼ばれる。「実質的に同一の」配列はまた、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列、ならびに天然に存在する変種、例えば、多型変種または対立遺伝子変種および人工変種も含む。下記のように、好ましいアルゴリズムはギャップなどを明らかにすることができる。好ましくは、タンパク質配列同一性は、長さが少なくとも約25アミノ酸の領域にわたって、またはより好ましくは、長さが50〜100アミノ酸の領域にわたって、またはタンパク質配列の長さにわたって存在する。
【００５６】
本明細書で使用する「比較ウィンドウ」は、ある配列と、同じ数の連続した位置の参照配列が最適に整列された後に2つの配列が比較され得る、典型的には20〜600、通常は約50〜約200、さらに通常は約100〜約150からなる群より選択される連続した位置の数の1つのセグメントを参照することを含む。比較のために配列を整列する方法は当技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所ホモロジーアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法(search for similarity method)によって、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIの中にあるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)のコンピュータによる実行によって、または手作業のアラインメントおよび目視検査によって行うことができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds. 1995 補遺を参照されたい)。
【００５７】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例には、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されているBLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムが含まれる。本発明の核酸およびタンパク質のパーセント配列同一性を決定するために、BLASTおよびBLAST2.0が本明細書に記載のパラメータと共に用いられる。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)では、デフォルトとして、ワード長(wordlength)(W)11、期待値(expectation)(E)10、M=5、N=-4、および両鎖比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムでは、デフォルトとして、ワード長3、および期待値(E)10、およびBLOSUM62スコアリング行列(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい)、アライメント(B)50、期待値(E) 10、M=5、N=-4、および両鎖比較を使用する。
【００５８】
2つのポリペプチドが実質的に同一であるとは、第1のポリペプチドが、第2のポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応するということを示す。従って、例えば、2つのペプチドが保存的置換だけしか異ならない場合、典型的には、ポリペプチドは第2のポリペプチドと実質的に同一である。
【００５９】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然の状態で見出された時に通常付随する成分を実質的または本質的に含まない材料をいう。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学法を用いて確かめられる。調製物に存在する優勢な種であるタンパク質は実質的に精製されている。「精製された」という用語は、一部の態様において、電気泳動ゲル内でタンパク質が本質的に1つのバンドを生じさせることを意味する。好ましくは、「精製された」という用語は、タンパク質が少なくとも85％純粋、より好ましくは少なくとも95％純粋、最も好ましくは少なくとも99％純粋であることを意味する。
【００６０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体をいうために本明細書において同義に用いられる。これらの用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、天然に存在する対応するアミノ酸の人工化学ミメティックであるアミノ酸重合体、ならびに天然に存在するアミノ酸重合体、改変された残基を含有するアミノ酸重合体、および天然に存在しないアミノ酸重合体に適用される。
【００６１】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックをいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後で改変されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合しているα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。このような類似体は、改変されたR基(例えば、ノルロイシン)または改変されたペプチドバックボーンを有してもよいが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸ミメティックとは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物をいう。
【００６２】
アミノ酸は、IUPAC-IUB生化学命名委員会(Biochemical Nomenclature Commission)により勧告された、一般に知られている三文字記号または一文字記号によって本明細書において言及されることがある。同様に、ヌクレオチドは、一般に受け入れられている一文字暗号によって言及されることがある。
【００６３】
「保存的に改変された変種」はアミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変種とは、同一のもしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一のもしくは関連する配列、例えば、天然に連続する配列をいう。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が、ほとんどのタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、あるコドンによってアラニンが指定される全ての位置において、コードされるポリペプチドが変化することなく、そのコドンを、記載の対応するコドンのうちの別のコドンに変えることができる。このような核酸バリエーションは、保存的に改変されたバリエーションの一種である「サイレントバリエーション」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列が核酸のサイレントバリエーションも示す。当業者であれば、ある特定の状況において、機能的に同一の分子を生じるように、(メチオニンの通常、一つしかないコドンであるAUG、およびトリプトファンの通常、一つしかないコドンであるTGGを除く)核酸中のそれぞれのコドンを改変できることを理解するだろう。従って、多くの場合、ポリペプチドをコードする核酸のサイレントバリエーションが、発現産物に関する記載の配列に含まれるが、実際のプローブ配列に関する記載の配列には含まれない。
【００６４】
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コードされている配列において1個のアミノ酸またはごくわずかな割合のアミノ酸を変える、付加する、または欠失する、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、変化によってアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸に置換された場合、「保存的に改変された変種」だと理解するだろう。機能的に類似するアミノ酸を示す保存的置換表は当技術分野において周知である。このような保存的に改変された変種は本発明の多型変種、種間ホモログ、および対立遺伝子に加わるものであり、これらを排除しない。典型的には、保存的置換は、以下:1)アラニン(A)、グリシン(G);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);7)セリン(S)、スレオニン(T);および8)システイン(C)、メチオニン(M)のように相互に行われる(例えば、Creighton, Protein (1984)を参照されたい)。
【００６５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り複数の指示物を含む。
【００６６】
I.序論
本発明は、高親和性でEMR1に結合する抗体、好ましくは、EMR1、例えば、EMR1のELD-6ドメインに選択的に結合し、他のEGF-TM7ファミリーメンバーなどの他のタンパク質と交差反応しない抗体に関する。EMR1のドメイン構造を図2に示した。本発明の一部の態様において、抗体は、ELD-6ドメインに存在する領域
2014523867.tif 000007
(SEQ ID NO:1のアミノ酸残基271〜288)の中の直鎖エピトープに結合する。
【００６７】
本発明の抗体はEMR1と高親和性結合を示す。抗体の親和性は、結合活性および親和性を決定する周知のアッセイを用いて評価することができる。このような技法には、ELISAアッセイならびに表面プラズモン共鳴または干渉法を使用する結合測定が含まれる。例えば、親和性は、ForteBio (Mountain View, CA) Octetバイオセンサーを用いたバイオレイヤー干渉法によって確かめることができる。
【００６８】
一部の態様において、本発明の抗体は、EMR1配列
2014523867.tif 000008
の全てまたは一部に結合する。一部の態様において、本発明の抗体は、EMR1との結合においてモノクローナル抗体1E7抗体と競合する、すなわち、1E7抗体のVH領域およびVL領域(それぞれ、SEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:24)を有する抗体と競合する。他の態様において、本明細書に記載の抗体、例えば、図1に提供された表に示されたVH領域およびVL領域の組み合わせを含む異なる抗体を、別の抗体がEMR1との結合において競合するかどうか評価するための参照抗体として使用することができる。試験抗体の存在下で参照抗体と抗原との結合が少なくとも30％、通常、少なくとも約40％、50％、60％、または75％、多くの場合、少なくとも約90％低減すれば、試験抗体は参照抗体の結合を完全に阻害するとみなされる。結合を評価するために、ELISAならびに当技術分野において公知の他のアッセイ、例えば、イムノブロットを含む多くのアッセイを使用することができる。
【００６９】
別の局面において、本発明は、好酸球を枯渇させる方法であって、抗EMR1抗体を好酸球の枯渇を必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。一部の態様において、抗体はEMR1に特異的に結合し、アフコシル化されている。一部の態様において、投与される抗体調製物は低フコシル化されている。一部の態様において、抗EMR1抗体はEMR1のELD-6ドメインに結合する。一部の態様において、抗体は、領域
2014523867.tif 000009
の中の直鎖エピトープに結合する。
【００７０】
本発明の抗体は、ヒト生殖細胞系列VH配列およびVL配列に対して高度のアミノ酸配列同一性を有する可変領域を含む。
【００７１】
典型的には、BSDを除くCDR3の一部および完全なFR4はヒト生殖細胞系列配列からなる。一部の態様において、BSDを除くCDR3-FR4配列は、各鎖において2個以下のアミノ酸だけヒト生殖細胞系列配列と異なる。一部の態様において、BSDを除くCDR3-FR4配列は、各鎖において1個以下のアミノ酸だけヒト生殖細胞系列配列と異なる。一部の態様において、Jセグメントはヒト生殖細胞系列Jセグメントを含む。ヒト生殖細胞系列配列は、例えば、公的利用可能な国際ImMunoGeneTicsデータベース(IMGT)およびV-base(ワールドワイドウェブ上のvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)を介して決定することができる。
【００７２】
ヒト生殖細胞系列Vセグメントレパートリーは、51個の重鎖V領域、40個のκ軽鎖Vセグメント、および31個のλ軽鎖Vセグメントからなり、合計3,621個の生殖細胞系列V領域ペアが生じる。さらに、これらのVセグメントのほとんどについて安定した対立遺伝子変種があるが、生殖細胞系列レパートリーの構造多様性へのこれらの変種の寄与は限られている。全てのヒト生殖細胞系列Vセグメント遺伝子の配列は公知であり、MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, United Kingdomによって提供されているV-base データベースにおいて評価することができる(Chothia et al., 1992, J Mol Biol 227:776-798; Tomlinson et al., 1995, EMBO J 14:4628-4638;およびWilliams et al., 1996, J Mol Biol 264:220-232も参照されたい)。
【００７３】
II.抗EMR1抗体重鎖の例
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体の重鎖可変領域は、以下のエレメント:
1)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3を含むヒト重鎖Vセグメント配列
2)X1がQ、S、K、またはVであるアミノ酸配列IYYRGFDX1を含むCDRH3領域;および
3)ヒト生殖細胞系列J遺伝子セグメントによって提供されるFR4
を含む重鎖V領域を含む。
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体の重鎖可変領域CDR3(CDRH3)はIYYRGFDQを含む。一部の態様において、本発明の抗体のCDRH3はIYYRGFDSを含む。一部の態様において、本発明の抗体のCDRH3はIYYRGFDVを含む。一部の態様において、本発明の抗体のCDRH3はIYYRGFDKを含む。
【００７４】
Vセグメントは、典型的には、ヒト生殖細胞系列Vセグメント、例えば、ヒトVh3サブクラスに対して少なくとも85％、90％、95％、またはそれより大きな同一性を有する。従って、一部の態様において、Vセグメントは、生殖細胞系列セグメントVh3 3-33配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれより大きな同一性を有する。一部の態様において、Vセグメントは、Vh3 3-33に由来する15個以下の残基だけ異なる。一部の態様において、本発明の抗体の重鎖のVセグメントは、フレームワーク領域において、VセグメントVh3-33フレームワーク領域と比較して10個以下の残基だけ異なる。
【００７５】
一部の態様において、本発明の抗体は、図1に示したEMR1抗体VH領域のVセグメントの1つに対して、少なくとも90％の同一性、または少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するVセグメントを含む。一部の態様において、パーセント同一性はVセグメントのフレームワーク領域と比較して決定され、パーセント同一性からCDR(CDR1およびCDR2)を排除する。
【００７６】
本発明の抗体のFR4配列は、ヒトJH1、JH2、JH3、JH4、JH5、もしくはJH6遺伝子生殖細胞系列セグメント、あるいはヒト生殖細胞系列JHセグメント、例えば、ヒト生殖細胞系列JH6セグメントのFR4領域と比較して高度のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも80％もしくは少なくとも90％の同一性を有する配列、または3個以下、典型的には2個以下のアミノ酸残基において異なる配列によって提供される。一部の態様において、Jセグメントはヒト生殖細胞系列JH6配列に由来し、FR4は、配列
2014523867.tif 000010
を有する。重鎖のヒトFR4は、ネイティブなIgG抗体において長さが11アミノ酸である。FR4に対応するJセグメントの領域は、公知の抗体構造および公知のFR4配列に基づいて容易に決定することができる。
【００７７】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体のVH領域のVセグメントは、図1に示したようにCDR1および/またはCDR2を有する。一部の態様において、抗体は、X1がD、S、またはNであり;X2がMまたはIであるX1FGX2Hを含む重鎖CDR1(CDRH1)を有する。一部の態様において、X1はQである。一部の態様において、CDRH1は、配列
2014523867.tif 000011
を有する。
【００７８】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、X1がD、N、またはYである、
2014523867.tif 000012
を含む重鎖CDR2(CDRH2)を有する。一部の態様において、CDRH2は、
2014523867.tif 000013
を含む。一部の態様において、CDRH2は、
2014523867.tif 000014
を含む。一部の態様において、CDRH2は、
2014523867.tif 000015
を含む。
【００７９】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、X1がQ、S、K、またはVであるアミノ酸配列IYYRGFDX1を有するCDRH3;X1がD、S、またはNであり;X2がMまたはIであるアミノ酸配列X1FGX2Hを有するCDRH1;X1がD、N、またはYであるアミノ酸配列
2014523867.tif 000016
を有するCDRH2を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDVを有するCDRH3;アミノ酸配列SFGMHまたはNFGMHを有するCDRH1;および配列
2014523867.tif 000017
を有するCDRH2を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDQを有するCDRH3;アミノ酸配列SFGMHまたはNFGMHを有するCDRH1;およびアミノ酸配列
2014523867.tif 000018
を有するCDRH2を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDSを有するCDRH3;アミノ酸配列SFGMHを有するCDRH1;および配列
2014523867.tif 000019
を有するCDRH2を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDSを有するCDRH3;アミノ酸配列NFGMHを有するCDRH1;および配列
2014523867.tif 000020
を有するCDRH2を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDSを有するCDRH3;アミノ酸配列SFGIHを有するCDRH1;および配列
2014523867.tif 000021
を有するCDRH2を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDSを有するCDRH3;アミノ酸配列DFGIHを有するCDRH1;および配列
2014523867.tif 000022
を有するCDRH2を有する。
【００８０】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、配列
2014523867.tif 000023
を有するVH領域CDR3ならびに図1に示したVH領域のいずれかのCDR1および/またはCDR2を有してもよい。
【００８１】
一部の態様において、本発明の抗体のVH領域Vセグメントは、図1に示したVセグメント配列を有する。
【００８２】
一部の態様において、本発明の抗体は、図1に示したVH領域配列を有する。
【００８３】
III.抗EMR1抗体軽鎖の例
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体の軽鎖は、以下のエレメント:
1)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3を含むヒト軽鎖Vセグメント配列、
2)X1がF、V、T、またはNであり;X2がS、V、G、またはTであり;X3がV、L、またはPであるアミノ酸配列X1QGX2HX3PLTを有するCDRL3領域;および
3)ヒト生殖細胞系列J遺伝子セグメントによって提供されるFR4
を含む、軽鎖V領域を含む。一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体の軽鎖可変領域は、X1がF、V、T、またはNであり;X2がS、V、G、またはTであり;X3がV、L、またはPであるX1QGX2HX3PLTを含むCDR3(CDRL3)を有する。一部の態様において、CDRL3は、配列
2014523867.tif 000024
を有する。
【００８４】
VL領域はVλVセグメントまたはVκVセグメントのいずれかを含む。相補するVH領域との結合を助けるVκ配列の例を図1の中の表に示した。VκまたはVλは任意のサブクラスのものでよい。
【００８５】
Vκセグメントは、任意のサブクラスのもの、例えば、VκII配列、例えば、VκII A3サブクラスのものでよい。一部の態様において、セグメントは、ヒト生殖細胞系列Vκ配列、例えば、VκII A3配列に対して少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、もしくは95％、またはそれより大きな配列同一性を有する。一部の態様において、Vκセグメントは、VκII A3のフレームワーク領域と比較して10個以下または5個以下のフレームワーク残基だけ異なってもよい。他の態様において、本発明の抗体のVL領域Vセグメントは、図1に示したEMR1 VL領域の軽鎖Vセグメント配列に対して少なくとも85％の同一性、または少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の同一性を有する。一部の態様において、パーセント同一性はVセグメントのフレームワーク領域に対するものであり、CDRを除く。
【００８６】
本発明の抗体のVL領域のFR4配列は、例えば、ヒト生殖細胞系列Jセグメント、あるいはヒト生殖細胞系列JセグメントのFR4領域に対して高度のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも80％もしくは少なくとも90％の同一性を有する配列、またはヒト生殖細胞系列FR4領域に由来する3個以下もしくは2個以下のアミノ酸において異なる配列によって提供される。一部の態様において、Jセグメントはヒト生殖細胞系列Jκ5配列である。一部の態様において、抗体のFR4は配列FGQGTREIKを有する。軽鎖のヒトFR4はネイティブなIgG抗体において長さが10アミノ酸である。FR4に対応するJセグメントの領域は、公知の抗体構造および公知のFR4配列に基づいて容易に決定することができる。
【００８７】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体の軽鎖可変領域は、図1に示したCDRL3、ならびにX1がRまたはKであり;X2がLまたはIであり;X3がVまたはLであり;X4がNまたはYであり;X5がNまたはTであるアミノ酸配列
2014523867.tif 000025
を有するCDR1(CDRL1)を有する。一部の態様において、CDRL1は、配列
2014523867.tif 000026
を有する。一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体の軽鎖可変領域は、図1に示したCDRL3、およびX1がVまたはGであるアミノ酸配列RX1SNRASを含むCDR2(CDRL2)を有する。一部の態様において、X1はVである。一部の態様において、X1はGである。
【００８８】
一部の態様において、VL領域のVセグメントは、図1に示したようにCDR1および/またはCDR2を有する。従って、本発明の抗体は、
2014523867.tif 000027
のCDR1配列;および/またはアミノ酸配列RVSNRASもしくはRGSNRASを有するCDR2を有してもよい。
【００８９】
特定の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、図1に示したVL領域のVセグメントの1つに示したようにVL領域CDR1およびCDR2を組み合わせて、ならびに
2014523867.tif 000028
を含むVL領域CDR3配列を有してもよい。一部の態様において、このような抗EphA3抗体は、FGQGTRLEIKであるVL領域FR4領域を含んでもよい。
【００９０】
一部の態様において、本発明の抗体のVL領域Vセグメントは、図1に示したVセグメント配列を有する。
【００９１】
典型的な態様において、本発明の抗体は、図1に示したVL領域配列を有する。
【００９２】
抗EMR1抗体の例
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、X1がF、V、T、またはNであり;X2がS、V、G、またはTであり;X3がV、L、またはPであるアミノ酸配列X1QGX2HX3PLTを有するCDRL3;X1がRまたはKであり;X2がLまたはIであり;X3がVまたはLであり;X4がNまたはYであり;X5がNまたはTであるアミノ酸配列
2014523867.tif 000029
を有するCDRL1;X1がVまたはGであるアミノ酸配列RX1SNRASを有するCDRL2を有する。一部の態様において、このような抗体は、X1がQ、S、K、またはVであるアミノ酸配列IYYRGFDX1を有するCDRH3;X1がD、S、またはNであり;X2がMまたはIであるアミノ酸配列X1FGX2Hを有するCDRH1;X1がD、N、またはYであるアミノ酸配列
2014523867.tif 000030
を有するCDRH2を有してもよい。
【００９３】
一部の態様において、本発明の抗体は、X1がQ、S、K、またはVであるアミノ酸配列IYYRGFDX1を有するCDRH3;およびX1がF、V、T、またはNであり;X2がS、V、G、またはTであり;X3がV、L、またはPであるアミノ酸配列X1QGX2HX3PLTを有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDSを有するCDRH3およびアミノ酸配列FQGSHVPLTを有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDQを有するCDRH3およびアミノ酸配列FQGSHVPLTを有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDVを有するCDRH3およびアミノ酸配列FQGSHVPLTを有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDKを有するCDRH3およびアミノ酸配列FQGSHVPLTを有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDQを有するCDRH3およびアミノ酸配列FQGSHPPLTを有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDVを有するCDRH3およびアミノ酸配列FQGSHPPLTを有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDVを有するCDRH3およびアミノ酸配列SQGSHVPLTを有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDQを有するCDRH3およびアミノ酸配列SQGSHVPLTを有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDQを有するCDRH3およびアミノ酸配列VQGTHVPLTを有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDVを有するCDRH3およびアミノ酸配列VQGTHVPLTを有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDQを有するCDRH3およびアミノ酸配列NQGTHVPLTを有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDVを有するCDRH3およびアミノ酸配列NQGTHVPLTを有するCDRL3を有する。
【００９４】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、図1の重鎖の1つのCDR1、CDR2、およびCDR3ならびに図1に示した軽鎖の1つのCDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:8の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:17の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:4の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:17の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:9の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:17の軽鎖 CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:9の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:18の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:6の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:15の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:7の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:16の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:11の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:21の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:11の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:22の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:9の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:21の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:11の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:17の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。
【００９５】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、以下の配列ペア:SEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:24; SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17; SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:17; SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:17; SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:18; SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:15; SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:16; SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:21; SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:22; SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:21;またはSEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:17を含む、VH領域およびVL領域を有する。
【００９６】
IV.抗EMR1抗体の調製
本発明の抗EMR1抗体は、組換え発現、化学合成、および抗体四量体の酵素消化を含むが、これに限定されない当技術分野において公知の任意の手段によって産生することができる。完全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組換え産生によって入手することができる。組換え発現は、当技術分野において公知の任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などに由来してもよい。
【００９７】
ヒト生殖細胞系列配列に類似したV領域配列を有する抗体を単離する方法は以前に説明されている(米国特許出願公開第20050255552号および同第20060134098号)。抗体ライブラリーを、哺乳動物細胞、酵母細胞、または原核細胞を含む適切な宿主細胞内で発現させることができる。一部の細胞系における発現の場合、細胞外培地への分泌を誘導するために、N末端にシグナルペプチドを導入することができる。抗体は、シグナルペプチドを用いて、またはシグナルペプチドを用いずに大腸菌などの細菌細胞から分泌することができる。シグナルを用いずに大腸菌から抗体断片を分泌させる方法は米国特許出願第20070020685号に記載されている。
【００９８】
一部の態様において、本発明のEMR1結合抗体を作製するために、本明細書に記載のVH領域、例えば、図1に示したVH領域が、本明細書に記載のVL領域、例えば、図1に示したVL領域の1つと組み合わされ、適切な発現系において多数の形式のいずれかで発現される。従って、抗体は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において、宿主細胞内で、または分泌によって、scFv、Fab、Fab'(免疫グロブリンヒンジ配列を含有する)、F(ab') 2、(2つのFab'分子のヒンジ配列間のジスルフィド結合形成によって形成される)、免疫グロブリン全体もしくは切断型免疫グロブリンとして、または融合タンパク質として発現されてもよい。任意で、メチオニン残基が、N末端に、例えば、シグナルを用いない発現系において産生されたポリペプチドのN末端に存在してもよい。
【００９９】
抗体は、原核生物発現系および真核生物発現系を含む任意の数の発現系を用いて産生することができる。一部の態様において、発現系は、CHO細胞発現系などの哺乳動物細胞発現である。このような多くの系が商業的供給業者から広く入手可能である。抗体がVH領域およびVL領域を含む態様では、VH領域およびVL領域は、1種類のベクターを用いて、例えば、ジシストロニック発現単位において発現されてもよく、異なるプロモーターの制御下で発現されてもよい。他の態様において、VH領域およびVL領域は別個のベクターを用いて発現されてもよい。本明細書に記載のVH領域またはVL領域は任意でN末端にメチオニンを含んでもよい。
【０１００】
本発明の抗体は、Fab、Fab'、F(ab') 2、scFv、またはdABを含む任意の数の形式で産生することができる。本発明の抗体はまたヒト定常領域も含んでよい。軽鎖の定常領域はヒトκ定常領域またはヒトλ定常領域でもよい。重鎖定常領域は、多くの場合、γ鎖定常領域、例えば、γ-1、γ-2、γ-3、またはγ-4定常領域である。他の態様において、抗体はIgAまたはIgMでもよい。
【０１０１】
本発明の一部の態様において、完全な軽鎖を形成するために、抗体VL領域、例えば、図1に示したVL領域はヒトκ定常領域と組み合わされる。
【０１０２】
本発明の一部の態様において、VH領域はヒトγ定常領域、例えば、ヒトγ-1定常領域と組み合わされる。任意の適切なγ-1アロタイプを選択することができる。
【０１０３】
一部の態様において、例えば、抗体が断片である場合、インビボでの半減期を延長するために、別の分子、例えば、ポリエチレングリコール(ペグ化)または血清アルブミンと結合体化することができる。抗体断片のペグ化の例は、Knight et al., Platelets 15:409, 2004 (アブシキシマブの場合); Pedley et al., Br. J. Cancer 70:1126, 1994 (抗CEA 抗体の場合); Chapman et al., Nature Biotech. 17:780, 1999;およびHumphreys, et al., Protein Eng. Des. 20:227,2007)に示される。
【０１０４】
一部の態様において、本発明の抗体はFab'またはaF(ab') 2の形をとる。  
【０１０５】
完全長軽鎖は、VL領域をヒトκ定常領域またはヒトλ定常領域と融合することによって作製される。どちらの定常領域も全ての軽鎖に使用することができる。しかしながら、典型的な態様では、κ定常領域はVκ可変領域と組み合わされて用いられ、λ定常領域はVλ可変領域と共に用いられる。
【０１０６】
Fab'の重鎖は、本発明のVH領域と、ヒト重鎖定常領域配列、最初の定常(CH1)ドメインおよびヒンジ領域の融合によって作製されたFd'断片である。重鎖定常領域配列は任意の免疫グロブリンクラスに由来してもよいが、多くの場合、IgGに由来し、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4に由来してもよい。本発明のFab'抗体はまたハイブリッド配列でもよく、例えば、ヒンジ配列は、ある免疫グロブリンサブクラスに由来してもよく、CH1ドメインは異なるサブクラスに由来してもよい。
【０１０７】
本発明において用いられる抗体は非常に多くの形式をとることができる。一部の態様において、抗体は、Fc領域、例えば、ヒトFc領域を含んでもよい。例えば、このような抗体には、EMR1に結合し、活性アイソタイプを有するIgG抗体が含まれる。一部の態様において、抗体は、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv、scFv、またはシングルドメイン抗体(「dAb」)などの結合断片でもよい。例えば、一部の態様において、抗体はF(ab') 2でもよい。本発明において使用することができる抗体の他の例示的な態様には、活性化ナノボディまたは活性化ラクダ抗体が含まれる。さらに、このような抗体は当業者に周知の方法によって組換え操作されてもよい。前述のように、このような抗体は、公知の技法を用いて産生することができる。当業者により理解されるように、一部の態様において、抗体が、一価であり得る形式、例えば、FvまたはFab形式をとる場合、三価抗体または四価抗体などの多価抗体として用いられてもよい。多価抗体を作製する方法は公知である(例えば、King et al., Cancer Res. 54:6176-6185, 1994を参照されたい)。
【０１０８】
一部の態様において、本発明において使用するための抗体には、エフェクター機能を有する、例えば、免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に結合するFc定常領域がある。例示的な「エフェクター機能」には、C1q結合;補体依存性細胞傷害(CDC);Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC);食作用;細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)のダウンレギュレーションなどが含まれる。このようなエフェクター機能は、一般的に、Fc領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わされることを必要とし、公知のアッセイ(例えば、下記で引用される参考文献を参照されたい)を用いて評価することができる。
【０１０９】
活性アイソタイプを有し、好酸球上のFc受容体に結合する抗EMR1抗体はADCCによって細胞死を誘導することができる。
【０１１０】
Fc領域は、天然に存在するIgG1、またはIgG3、IgM、IgA、およびIgEを含む他の活性アイソタイプに由来してもよい。「活性アイソタイプ」は、Fc領域が、Fc受容体との結合を増やす改変または別の方法で抗体の効力を改善する改変を含む抗体を含む。このようなFc定常領域は、Fc受容体との結合を増やす改変、例えば、変異、グリコシル化レベルに対する変化などを含んでもよい。当技術分野において公知のFc領域を改変する多くの方法がある。例えば、米国特許出願公開第20060039904号は、1つまたは複数のFcリガンド(例えば、FcγR、C1q)との改変された結合親和性を含む、増強したエフェクター機能を有するFc受容体変種について説明する。さらに、このようなFc変種はADCCおよび/またはCDC活性が変化している。他のFc変種には、Ghetie et al., Nat Biotech. 15:637-40, 1997; Duncan et al., Nature 332:563-564, 1988; Lund et al., J. Immunol 147:2657-2662, 1991; Lund et al., Mol Immunol 29:53-59, 1992; Alegre et al., Transplantation 57:1537-1543, 1994; Hutchins et al., Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984, 1995; Jefferis et al., Immunol Lett. 44:111-117, 1995; Lund et al., FASEB J 9:115-119, 1995; Jefferis et al., Immunol Lett 54:101-104, 1996; Lund et al., J Immunol 157:4963-4969, 1996; Armour et al., Eur J Immunol 29:2613-2624, 1999; Idusogie et al., J Immunol 164:4178-4184, 200; Reddy et al., J Immunol 164:1925-1933, 2000; Xu et al., Cell Immunol 200:16-26, 2000; Idusogie et al., J Immunol 166:2571-2575, 2001; Shields et al., J Biol Chem 276:6591-6604, 2001; Jefferis et al., Immunol Lett 82:57-65. 2002; Presta et al., Biochem Soc Trans 30:487-490, 2002; Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005-4010, 2006;米国特許第5,624,821号;同第5,885,573号;同第5,677,425号;同第6,165,745号;同第6,277,375号;同第5,869,046号;同第6,121,022号;同第5,624,821号;同第5,648,260号;同第6,194,551号;同第6,737,056号;同第6,821,505号;同第6,277,375号;同第7,335,742号;および同第7,317,091号;ならびにPCT公報WO94/2935;WO99/58572;WO00/42072;WO02/060919、およびWO04/029207によって開示される変種が含まれる。
【０１１１】
グリコシル化は、炭水化物(糖)が巨大分子に酵素的に連結されて、グリカンが生成される翻訳後修飾の一種である。本発明の状況において、炭水化物は、1つまたは複数のN結合を介して(アスパラギン側鎖またはアルギニン側鎖の窒素を介して)抗体Fc領域に取り付けられる。しかしながら、O結合(セリン側鎖、スレオニン側鎖、チロシン側鎖、ヒドロキシリジン側鎖、またはヒドロキシプロリン側鎖のヒドロキシ酸素を介して)も可能である。一般的に、IgG抗体は、CH2ドメインの残基Asn297にある保存されたN結合型グリコシル化部位を有するのに対して、一部のクラスおよびサブクラス、例えば、一部の種のIgDおよびIgAは、多くの場合、ヒンジ領域にO結合型糖も有する。糖は、典型的には、複合高マンノース分枝糖である。N結合の場合、アミノ酸側鎖窒素に直接取り付ける糖は典型的にN-アセチルグルコサミンである。
【０１１２】
一部の態様において、Fc領域のグリコシル化は改変されてもよい。例えば、改変は、例えば、抗体配列内の1つまたは複数のグリコシル化部位を変えることによるアグリコシル化(aglycosylation)でもよい。このようなアプローチは米国特許第5,714,350号および同第6,350,861号にさらに詳述されている。グリコシル化タイプが変化したFc領域、例えば、フコシル残基量が低減した低フコシル化Fc変種、またはフコシル残基を欠くアフコシル化Fc変種、または分岐GlcNAc構造が増加したFc変種も作ることができる。このような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成することができる。ラットミエローマ細胞ならびに酵母および植物を含む、グリコシル化機構が変化した細胞が当技術分野において説明されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによって、グリコシル化が変化した抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。Umana et al., Nat. Biotechnol 17:176-180, 1999は、ADCCを10倍にする分岐GlcNacについて説明している。Umanaは、このような分岐分子は低フコシル化をもたらすことを指摘している。Davies, et al., Biotechnol. Bioeng. 74:288-294, 2001は、抗CD20抗体のADCCを増加させる、(分岐GlcNac構造を引き起こす)酵素β1-4-N-アセチルグルコサミン転移酵素III(GnTIII)を挿入したCHO細胞について説明している。米国特許(Umana)第6,602,684号は、分岐GlcNac糖タンパク質を生じるように操作された細胞について説明している。
【０１１３】
抗体調製物のフコシル化を低減する方法の例は、IgG1を産生するフコシル化欠損CHO細胞(Lec13)について説明し、フコース欠損IgG1とヒトFcgammaRIIIAとの結合が50倍まで改善され、ADCCを増加させたことについてさらに説明している、Shields et al., J Biol Chem 277:26733-26740, 2002に示されている。さらに、Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003は、YB2/0およびCHO細胞において産生されたIgGを比較している。YB2/0細胞はフコシル化が減少し、分岐GlcNac含有量が増加した。Niwa et al., Clinc. Cancer Res. 1-:6248-6255, 2004は、抗CD20抗体を、YB2/0細胞において作られた抗体(低フコシル化)と比較し、後者においてADCCの増大を観察した。アフコシル化抗体を産生する技法の例は、例えば、Kanda et al., Glycobiology 17:104-118, 2006において示されている。米国特許第6,946,292号(Kanda)は、アフコシル化抗体を産生するフコシルトランスフェラーゼノックアウト細胞について説明している。米国特許第7,214,775号およびWO00/61739は、100％の抗体がアフコシル化されている抗体調製物について説明している。
【０１１４】
グリコシル化を改変する他の技法も公知である。例えば、米国特許出願公開第20070248600号; 第20070178551号(操作された下等真核生物細胞(酵母)を用いて「ヒト」グリコシル化構造を生じるGlycoFi技術法); 第20080060092号(操作された植物を用いて「ヒト」グリコシル化構造を生じるBiolex技術法); 第20060253928号(「ヒト」抗体を産生するための植物操作についても説明している)を参照されたい。
【０１１５】
フコースを低減するためのさらなる技法には、ProBioGen技術(von Horsten et al., Glycobiology, (advance access publication July 23, 2010); Potelligent(商標)技術(Biowa, Inc. Princeton, N.J.);およびGlycoMAb(商標)グリコシル化操作技術(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)が含まれる。
【０１１６】
抗体のN結合型オリゴ糖含有量は当技術分野において公知の方法によって分析することができる。以下は、このような方法の一例である。抗体を酵素N-グリコシダーゼF(Roche;TaKaRa)による消化に供する。放出された炭水化物を、陽イオンモードでマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)によって分析する(Papac et al., Glycobiol. 8:445-454, 1998)。次いで、単糖組成物を、改良された高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)(Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003)によって特徴付ける。
【０１１７】
本発明の一部の態様において、抗体は、免疫原性を低減するように、例えば、抗体が反復投与に適するようにさらに操作される。免疫原性が低減した抗体を作製する方法には、ヒト化法およびヒューマニアリング(humaneering)法ならびに改変法、例えば、T細胞エピトープを除去するように、抗体が、例えば、1つまたは複数のフレームワーク領域においてさらに操作される脱免疫化(de-immunization)が含まれる。
【０１１８】
V.EMR1が標的である疾患の治療のための抗EMR1抗体の投与
本発明はまた、抗EMR1抗体を投与することによって、EMR1発現細胞、例えば、好酸球を死滅させることが望ましい疾患を有する患者を治療する方法を提供する。一部の態様において、患者は、慢性閉塞性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性喘息を含む喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、胃食道逆流疾患、鼻ポリープ症、好酸球性胃腸炎、好酸球性胃炎、好酸球性食道炎、好酸球性大腸炎、チャーグ・ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、偶発性血管浮腫、オンコセルカ属皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、寄生虫感染症に起因する好酸球性肺疾患、好酸球性脂肪組織炎、好酸球増加を伴う偶発性血管浮腫(グライヒ症候群)、骨髄-リンパ節肉芽腫および前部ブドウ膜炎を伴う急性好酸球性間質性腎炎および腎不全、サムター症候群、気管支喘息、アスピリン不耐症、慢性副鼻腔炎、NARES(好酸球増加症候群を伴う非アレルギー性鼻炎)、薬物誘発性もしくは毒素誘発性の肺臓炎、または急性もしくは慢性の好酸球性白血病などがあるが、これに限定されない、好酸球増加に関連したアレルギー性および/またはアトピー性の応答を有する。一部の態様において、患者は慢性閉塞性肺疾患を有する。一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、ポリープの再発を阻止または低減するために鼻ポリープ除去後に対象に投与される。
【０１１９】
本発明の方法は、疾患に適した投与計画を用いて、薬学的組成物として抗EMR1抗体を治療有効量で患者に投与する工程を含む。組成物は、様々な薬物送達系における使用に合わせて処方することができる。適切な製剤のために、1種類または複数種の生理学的に許容される賦形剤または担体も組成物に含めることができる。本発明において使用するための適切な製剤は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins, 2005に見られる。
【０１２０】
抗EMR1抗体は、患者への注射に適した溶液、例えば、注射用滅菌等張水溶液に溶解して提供される。抗体は、許容される担体に溶解して適切な濃度で溶解または懸濁される。一部の態様において、担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水など水性である。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要に応じて補助的な薬学的物質、例えば、pH調整剤および緩衝剤、張性調整剤などを含有してもよい。
【０１２１】
本発明の薬学的組成物は、疾患または疾患の症状およびその合併症を治癒させる、または少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で、好酸球によって媒介される疾患を有する患者、例えば、アレルギー性喘息または慢性閉塞性肺疾患を有する患者に投与される。これを達成するのに十分な量は「治療に有効な用量」と定義される。治療に有効な用量は、療法に対する患者の応答をモニタリングすることによって求められる。治療に有効な用量を示す典型的なベンチマークには、患者における疾患の症状の寛解が含まれる。この使用に有効な量は、疾患の重篤度、および年齢、体重、性別、投与経路などの他の要因を含む患者の健康の一般状態に左右されるだろう。患者によって必要および許容される投与量および頻度に応じて、単回投与または複数回投与の抗体を投与することができる。いかなる事象においても、前記方法は、患者を効果的に治療するのに十分な量の抗EMR1抗体を提供する。
【０１２２】
抗体は、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、または腹腔内経路を含むが、これに限定されない任意の適切な経路を介して注射または注入によって投与することができる。一部の態様において、抗体はガス注入によって投与されてもよい。例示的な態様において、抗体は、注射用滅菌等張食塩水に溶解して10mg/ml、4℃で保管されてもよく、患者への投与前に100mlまたは200mlの0.9％注射用塩化ナトリウムで希釈される。一部の態様において、抗体は0.01〜25mg/kgの用量で1時間にわたって静脈内注入によって投与される。他の態様において、抗体は静脈内注入によって15分〜2時間の期間にわたって投与される。さらに他の態様において、投与手順は皮下ボーラス注射を介するものである。
【０１２３】
患者に有効な療法を提供するために抗体の用量が選択され、0.01mg /kg体重未満〜約25mg/kg体重の範囲内または1mg〜2g/患者の範囲内にある。好ましくは、用量は、0.1〜10mg/kgまたは約50mg〜1000mg/患者の範囲内にある。用量は、抗体の薬物動態(例えば、循環中の抗体の半減期)および薬力学的応答(例えば、抗体の治療効果の期間)に応じて、1日1回〜3ヶ月に1回または6ヶ月に1回の範囲内でよい適切な頻度で繰り返されてもよい。一部の態様において、約7〜約25日のインビボ半減期および抗体投与が1週間に1回〜3ヶ月に1回または6ヶ月に1回繰り返される。他の態様において、抗体は1ヶ月に約1回投与される。
【０１２４】
好酸球を枯渇させる本発明の抗EMR1抗体は、1種類または複数種のさらなる治療剤、例えば、炎症を減少させる薬剤、例えば、コルチコステロイド;IL-5遮断剤;非ステロイド性抗炎症薬、および他の公知の薬剤と共に投与されてもよい。
【０１２５】
VI.診断方法および予後判定方法
診断目的および予後判定目的にも抗EMR1抗体が用いられてもよい。このような抗体には、マウスモノクローナル抗体、例えば、19-4G9、18-2G11、もしくは4262-5(表1を参照されたい);EMR1のELD-6に選択的に結合する抗体;または本明細書に記載のVH領域および/もしくはVL領域を有する抗体が含まれるが、これに限定されない。例えば、患者に由来する細胞におけるEMR1レベルの検出などの臨床分析のためにVH領域および/またはVL領域が用いられてもよい。本発明のVH領域またはVL領域はまた、例えば、抗Id抗体を産生するのにも用いられてもよい。
【０１２６】
一部の態様において、対象は、好酸球を選択的に枯渇させる薬剤、例えば、本発明の抗EMR1抗体による治療の候補かどうか確かめるために評価されてもよい。対象からの生物学的試料が、関心対象の組織および/または末梢血における好酸球の存在について評価される。例えば、患者に喘息または好酸球性肺疾患があるのであれば、痰または洗浄試料が分析されてもよい。好酸球性胃炎症障害を有する、または好酸球性胃炎症障害を有すると疑われる患者は、炎症胃腸組織を評価できるように生検を受けてもよい。他の態様において、血液試料が、正常を上回る好酸球レベルの存在について評価されてもよい。
【０１２７】
一部の態様において、好酸球を選択的に枯渇させる抗EMR1抗体、例えば、本明細書に記載のELD-6に結合する抗体による治療の候補である患者を特定するために、IL-5受容体(IL-5R)が評価されてもよい。IL-5Rは好酸球上および好塩基球上で発現している(例えば、Miyiajima et al., Blood 82:1960-1974, 1993を参照されたい)。IL-5R抗体を用いて、血中または関心対象の組織試料中の好酸球レベルを決定する様々な免疫学的方法を使用することができる。一部の態様において、可溶性IL-5R(sIL-5-R)であるIL-5Rスプライスバリアントの存在が好酸球性疾患と関連付けられ(Semic-Jusufagic, et al., Pediatr Allergy Immunol. 21:1052-1058, 2010)、本発明の治療用抗EMR1抗体による治療の候補である患者を特定するために用いられてもよい。この可溶性スプライスバリアントは、ELISAによって、またはsIL5r RNAを検出する方法、例えば、RT-PCR(Perez et al., BMC Biotechnology 3:17, 2003)を用いて検出することができる。
【０１２８】
炎症疾患またはアレルギー性疾患を有し、好酸球が上昇している患者は、本発明の抗EMR1抗体によって治療することができる。本発明の状況において、血液試料中のレベルが正常を上回っている時、または組織試料が、正常を上回る好酸球浸潤レベルを有すると示された時に、患者の好酸球は上昇している。正常レベルは、好酸球性疾患のない患者において確かめることができる。
【実施例】
【０１２９】
実施例1.EMR1特異的モノクローナル抗体の特定
精製ヒトEMR1-Fc融合タンパク質で免疫したマウスに由来する脾臓B細胞をSP2/0-Ag14細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞株を作製した。モノクローナル株に由来する抗体を含有する上清を、組換えヒトEMR1との結合についてELISAによって試験した。EMR1に結合した抗体を、ヒト好酸球との結合についてフローサイトメトリーによって試験した。バフィーコート血液に由来する多形核細胞に富む画分をフィコール勾配遠心分離法によって入手し、残存している赤血球を塩化アンモニウム(ACK溶解緩衝液)で溶解した。好酸球を、MACS好酸球単離キット(Miltenyi)を用いて負の選択によって単離し、非特異的IgG結合をブロックするために10μg/mlラットIgGおよび2％BSAとインキュベートした後に、抗EMR1抗体またはアイソタイプ対照抗体を添加した。結合した抗体をFACSCaliburフローサイトメーターにおいて検出するために、抗マウスFITC抗体を使用した。
【０１３０】
抗EMR1抗体と他の末梢血細胞タイプとの結合を以下の通りフローサイトメトリーによって分析した。末梢血単核球画分(PBMC)を、フィコール密度遠心分離法によってバフィーコート調製物から単離し、非特異的結合をブロックするために10μg/mlラットIgGおよび2％BSAで処理した後に、5μg/mlの抗EMR1抗体で処理した。洗浄後、細胞を抗マウスフィコエリトリンとインキュベートし、洗浄し、顆粒球(強い側方散乱光)集団からT細胞を検出するために抗CD3-FITCと、B細胞を検出するために抗CD20-FITCと、NK細胞を検出するために抗CD56-FITCと、単球を検出するために抗CD14-FITCと、好塩基球を検出するために抗IgE受容体-FITCと、または好中球を検出するために抗CD16-FITCと別々の試料をインキュベートした。洗浄後、フローサイトメトリー分析から死細胞を除くためにヨウ化プロピジウムを添加した。抗体19-1E7、19-4G9、4262-5、および18-2G11は好酸球に選択的に結合し、リンパ球、単球、好中球、好塩基球に検出可能に結合しなかった(表1を参照されたい)。4種類のさらなる抗EMR1抗体が好酸球および単球に結合し、これらのクローンの1つ(19-3D2)は好塩基球に結合した。
【０１３１】
抗体19-1E7および抗体4262-5もマクロファージとの結合について試験した。単球からマクロファージへの分化を誘導するために、バフィーコート調製物から単離されたPBMCを、10％FBS、IL3、およびGM-CSFを含むRPMI1640培地に10日間プレートした。次いで、付着マクロファージを収集し、ブロックし、前記のようにEMR1についてプローブした。抗CD14-FITCを用いてマクロファージを染色した。付着CD14+マクロファージへの結合は観察されなかった。
【０１３２】
（表１）抗EMR1モノクローナル抗体とヒト末梢血細胞との結合。エオシン=好酸球、Neut=好中球、Mon=単球、Mac=マクロファージ、Bas=好塩基球
2014523867.tif 000031
【０１３３】
実施例2.キメラ19-1E7(c1E7)抗体の作製
マウスハイブリドーマ19-1E7に由来する重鎖V領域および軽鎖V領域を、Chardes et al., FEBS Letters 452:386-394 (2007)に記載のプライマーセットを用いてRT-PCRによってクローニングした。19-1E7重鎖可変領域および軽鎖可変領域の可変領域配列を以下に示した。CDR配列には下線を引いた。
2014523867.tif 000032
【０１３４】
さらなるPCRを用いてV重鎖領域およびVκ領域を増幅し、大腸菌からの発現および分泌のために発現ベクターへのクローニングに適した制限酵素部位を組み込んだ。V領域を発現ベクターにクローニングし(EM5と名付け)、大腸菌内でFab断片として発現および分泌させた。EM5 FabはELISAアッセイにおいてEMR1-Fc抗原に結合した。19-1E7重鎖可変領域および軽鎖可変領域をpEE12.4哺乳動物発現ベクター内でヒトγ-1Fcおよびκ定常領域とも組み合わせて、キメラ19-1E7 IgG1k抗体を作製した(c1E7と名付けた)。c1E7発現プラスミドを、炭水化物含有フコースを有するIgGを産生するためにCHOK1SV細胞株にトランスフェクトし、フコースの無いIgGを産生するためにMS704-PF CHO細胞株にトランスフェクトした。
【０１３５】
トランスフェクションのために、2μgのpEE12.4 c1E7 DNAを、100μlのOpti-MEM I培地に溶解した6μlのFugene HD(Roche 04709691001)と室温で20分間インキュベートした後に、6ウェルプレート1ウェルあたり1.5x106個の細胞でプレートしたCHO細胞に滴下し、一晩インキュベートした。次いで、トランスフェクト細胞を、HTサプリメント、GSサプリメント(Sigma 58672C)および50μM MSX(Sigma M5379)ならびに10mg/Lフェノールレッド(Sigma P0290)を含むEX-CELL 325 PF CHO Protein-Free Mediumで希釈し、96ウェルプレートに0.2ml/ウェルでプレートした。ウエスタンブロット(以下を参照されたい)による初回スクリーニング後に、トランスフェクト細胞株を拡大し、HTサプリメント、GSサプリメント、および25μM MSXを含むEX-CELL 325 PF CHO Protein-Free培地中で継代培養した。細胞を加湿インキュベーター内で37℃、5％CO2で増殖させた。分泌されたIgGを、フコシル化キメラ1E7(c1E7)を調製するためにはCHOK1SVトランスフェクタントクローンから、非フコシル化c1E7を調製するためにはMS704-PFトランスフェクタントからプロテインAアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
【０１３６】
実施例3.抗EMR1キメラモノクローナル抗体19-1E7が結合する直鎖エピトープの特定
モノクローナル抗体19-1E7はヒトおよびカニクイザルEMR1に結合し、CD97にもEMR2にも結合しない。抗体が結合する、EMR1上の結合部位を特定するために、エピトープマッピングを行った。還元条件下でのキメラ1E7(c1E7)抗体を用いたEMR1の初回ウエスタンブロット分析から、c1E7は、SDS含有緩衝液中での煮沸による還元および変性による影響を受けないEMR1上の直鎖エピトープに結合することが示唆された。単量体EMR1を生成するために、EMR1-Fcをパパインで処理し、放出されたFcタグをプロテインAカラムによって捕捉した。単量体EMR1をカルボキシペプチダーゼYでさらに消化し、図3に示したように、作製されたタンパク質断片を、c1E7抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。ウエスタンブロット分析から、c1E7は、タンパク質C末端にある約100残基を欠くEMR1に結合しないことが分かった。図3に示したように、c1E7抗体は、ELD-6の無いEMR1欠失変異体に結合しなかった。エピトープをさらに定義するために、ELD-6の54アミノ酸をカバーする3つの重複ペプチドを、c1E7との結合について、ForteBio Octet計器を用いたバイオレイヤー干渉法によって分析した。SEQ ID NO:1のELD-6位置268-316にまたがるように使用したペプチドは、以下:
2014523867.tif 000033
であった。
【０１３７】
結合分析の結果を図4に示した。これから、抗体はペプチド1に結合することが分かる。ペプチド1にまたがる、さらに2つのペプチド(4および5)をForteBioによって分析した。これらの配列は、以下:
2014523867.tif 000034
であった。バイオレイヤー干渉法結合データはc1E7とペプチド4との結合を示したが、ペプチド5との結合を示さなかった。ペプチド4にまたがる、さらに2つのペプチド(6および7)をForteBioによって分析した。これらの配列は、以下:
2014523867.tif 000035
であった。ForteBioデータは、c1E7とペプチド7との結合を示したが、ペプチド6との結合を示さなかった(図4)。エピトープマッピング分析から、c1E7エピトープは、以下の配列領域:
2014523867.tif 000036
の中にあることが分かった。
【０１３８】
（表２）c1E7と、EMR1 ELD6にまたがるペプチドとの結合
2014523867.tif 000037
【０１３９】
実施例4.キメラ1E7抗体のADCC活性
抗EMR1抗体を、好酸球標的細胞に対する抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)活性について試験した。実施例1に記載のように単離されたヒト好酸球を、10％FCSおよび0.1nM IL-5を含むRPMI1640培地に入れて一晩維持した。同じバフィーコート調製物から、NK細胞を、フィコール勾配のPBMC層およびNK細胞単離キット(Miltenyi)を用いた負の選択から単離した。単離されたNK細胞を、10％FCSおよび30ng/ml IL-2を含むRPMI 1640中で一晩、増殖および拡大させた。好酸球およびNK細胞を1:1標的:エフェクター細胞比で組み合わせ、5％CO2、37℃で一晩、抗EMR1抗体とインキュベートした。ADCC活性を、Cytotox 96 Cytotoxicity assay kit(Promega)を用いてLDH放出によって測定した(図5)。
【０１４０】
非フコシル化c1E7は、フコースを含有するc1E7抗体より高いADCC活性を示した。非フコシル化キメラ1E7をキメラ1E7と比較すると、非フコシル化1E7については10μg/mlおよび1μg/mlで完全に近い細胞傷害が示され、フコシル化抗体によるADCC活性は10μg/mlまでの濃度で検出できなかった。
【０１４１】
実施例5.ヒト生殖細胞系列配列と極めて相同なV領域配列を有する操作された抗体を得るための1E7の操作
1E7抗体は、(ヒト配列を含むように操作された)HUMANEERED(商標)であった。
【０１４２】
エピトープフォーカス(epitope-focused)ライブラリーを、BSDおよびヒト生殖細胞系列Jセグメント配列を含有する独特のCDR3-FR4領域と連結されたヒトVセグメントライブラリー配列から構築した。完全長Vh(Vh3およびVh4) セグメントライブラリーならびにVk(VkII)セグメントライブラリーを、最初にマウスVセグメントの一部だけがヒト配列ライブラリーによって置換される「カセット」ライブラリーを構築するための基礎として使用した。Vh鎖およびVk鎖のために、いくつかのタイプのカセットライブラリーを構築した。フレームワーク2領域内の共通重複配列を用いたオーバーラップエクステンションPCRによって、V重鎖用のカセットおよびVκ鎖用のカセットを作った。このように、ヒトVh3サブクラスおよびVh4サブクラス用に「最前部」ヒトカセットライブラリー、「中央」ヒトカセットライブラリー、およびFR3ヒトカセットライブラリーを構築した。ヒトVkIIサブクラス用に「最前部」カセットライブラリー、「中央」カセットライブラリー、およびFR3カセットライブラリーを構築した。
【０１４３】
さらに、操作されたCDRからなるCDRカセットライブラリーを構築した。CDRカセットライブラリーでは、アミノ酸バリエーションがCDR PCRプライマーに導入され、部分的なCDR配列と単一のフレームワーク配列のライブラリーまたはヒト脾臓Vセグメントライブラリーに由来するフレームワーク配列のライブラリーと一緒に変種が同時増幅される。重鎖CDR2カセットライブラリーの構築を図6に図示した。参照CDR2の最初の6個の残基(とY変種)が保持された(四角で囲んだ)。これらは5'PCRプライマーによってコードされる。3'PCRプライマーはヒト生殖細胞系列Vh3 FR3に相補的である。プライマーを用いて、選択された単一のヒトVh3 FR3(脾臓mRNAに由来する)を増幅し、操作されたCDR2ライブラリーに付加した。連続したオーバーラップエクステンションPCR反応を用いて、「最前部」およびCDR3-FR4カセットを取り付けて、機能的な操作された重鎖V領域ライブラリーを構築した。
【０１４４】
軽鎖FR1-CDR1用の第2のCDRカセットライブラリー戦略を図7に示した。CDR1のいくつかの位置にあるアミノ酸変種をコードするリバースプライマーを合成した。カセットプライマーおよびフォワードプライマーを用いて、ヒト脾臓cDNAからFR1-CDR1ライブラリーをPCR増幅した。機能的な操作された軽鎖V領域ライブラリーを構築するために、オーバーラップエクステンションPCR反応を用いて、FR1-CDR1カセットをFR2-CDR2-CDR3カセットに取り付けた。
【０１４５】
抗原との結合を助けたヒトV重鎖カセットおよびVκカセットをコロニーリフト結合アッセイによって特定し、親和性による順番をELISAで確かめた。重鎖変種のコロニーリフト結合スクリーニングによって、EMR1-Fc組換え融合タンパク質抗原結合を助けたFR1-CDR1、CDR2-FR3、およびFR3-CDR3-FR4カセットが特定された。軽鎖変種のコロニーリフト結合スクリーニングによって、抗原結合を助けたFR1-CDR1、「中央」、およびFR3-CDR3-FR4カセットが特定された。抗原に結合する完全に操作された高親和性Fabを選択するために、オーバーラップエクステンションPCRによって各鎖の機能カセットを組換えし、その後に、コロニーリフト結合アッセイによってスクリーニングした。
【０１４６】
高親和性の完全に操作されたFabのプールの特定後、CDR3親和性成熟ライブラリーを構築した。操作されたFabクローンのパネルの共通CDR3 BSD配列を、縮重PCRプライマーを用いて変異させて、ライブラリーを作製した。これらの変異誘発ライブラリーを、コロニーリフト結合およびELISAアッセイを用いてスクリーニングした。選択されたFabの親和性をELISAおよびForteBioキネティック分析によってランク付けした。キメラFabと比較した時に、抗原に対する類似した、または改善された親和性を助けた変異を特定し、図8に示した。抗原結合を助けた、または改善した重鎖CDR3変異および軽鎖CDR3変異は、それぞれのCDRのBSD領域を定義するのに役立つ。
【０１４７】
実施例6.抗EMR1抗体を用いた好酸球の枯渇
単一用量の非フコシル化c1E7抗体を、2種類の用量レベル;1mg/kgおよび5mg/kgで雄カニクイザルの2つの群(n=2)にi.v.投与した。投与56日後まで採取した血液試料から白血球および好酸球を計数した。図9では、A)5mg/kgおよびB)1mg/kg抗体が投与された動物について、循環好酸球数を総白血球に対するパーセントとして表した。(データは各群の2匹の動物からの平均である)。5mg/kgの抗体を投与して2時間以内に、かつ1mg/kg c1E7で処置された動物では(投与8時間後に採取した)最初の血液試料の時間までに、循環から好酸球は枯渇された。好酸球数は、1mg/kg群では投与して28日後までに正常範囲に戻った。5mg/kg群では好酸球数の回復はもっと後になって生じた。平均好酸球数は42日以内に正常に戻った。総白血球は抗体処置の影響を受けなかった。従って、抗体は、選択的かつ可逆的な強力な循環好酸球枯渇を示した。
【０１４８】
以下の実施例は例示にすぎず、限定を目的としない。当業者であれば、本質的に似た結果を得るために変化または変更することができる様々な重要でないパラメータを容易に理解するだろう。
【０１４９】
本明細書において引用された全ての特許、特許出願、アクセッション番号、および他の公開された参照資料は、本明細書において引用された全ての特許、特許出願、アクセッション番号、および他の公開された参照資料と関連する保護対象(subject matter)の開示のために、その全体が本明細書に参照により組み入れられる。
【０１５０】
SEQ ID NO:25 EMR1細胞外ドメインアミノ酸配列
以下は、GenBankアクセッション番号CAA57232.1からのEMR1細胞外ドメインアミノ酸配列の一例である。
2014523867.tif 000038
【図１−１】
2014523867.tif 000045
【図１−２】
2014523867.tif 000046
【図２】
2014523867.tif 000047
【図３】
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【図４】
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【図５】
2014523867.tif 000050
【図６】
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【図７】
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【図８】
2014523867.tif 000053
【図９】
2014523867.tif 000054
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月22日(2014.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2011年5月27日に出願された米国仮出願第61/491,095号の恩典を主張する。米国仮出願第61/491,095号はその全体が、全ての目的のために参照により組み入れられる
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
受容体EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様1(EMR1)はヒト好酸球性顆粒球上で発現するが、好塩基球、単球、マクロファージ、および骨髄系樹状細胞を含む他の白血球上で発現しない。EMR1は、TM7タンパク質の接着クラス内にあるサブファミリーであるEGF-TM7ファミリーに属する。他のEGF-TM7ファミリーメンバーには、CD97ならびにEMR2、EMR3およびEMR4が含まれる。好酸球はアレルギー性疾患および様々な炎症障害の発生に関与し、血液および組織における好酸球増加の拡大は症状の存在および重篤度に関連する。従って、EMR1は、好酸球が疾患の病態において役割を果たす疾患の望ましい治療標的である。
【０００３】
EMR1に結合する抗体は公知である(例えば、Hamann et al., Eur. J. Immunol 37:2797-2802, 2007（非特許文献1）を参照されたい)。しかしながら、選択的にEMR-1を標的とし、好酸球を枯渇させる治療抗体の開発が必要とされている。本発明は、この必要に対処する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hamann et al., Eur. J. Immunol 37:2797-2802, 2007
【発明の概要】
【０００５】
発明の簡単な概要
本発明は、EMR1に選択的に結合する新たな抗EMR1抗体の発見に一部基づく。従って、1つの局面において、本発明は、EMR1の上皮細胞成長因子様ドメイン-6(ELD-6)に選択的に結合する、単離された抗EMR1抗体を提供する。一部の態様において、抗体は、EMR1との結合において、モノクローナル抗体1E7のVH配列およびVL配列(それぞれ、SEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:24)を有する抗体と競合する。一部の態様において、抗体は、EMR1配列
2014523867.tif 000055
(SEQ ID NO:30)の全てまたは一部に結合する。
【０００６】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、VHCDR3アミノ酸配列IYYRGFDX1(SEQ ID NO:31)を含む。式中、X1はQ、S、K、またはVである。一部の態様において、抗体は、VHCDR3アミノ酸配列IYYRGFDX1(SEQ ID NO:32)を含む。式中、X1はQ、S、またはVである。一部の態様において、抗体は、アミノ酸配列(D/S/N)FG(M/I)H(SEQ ID NO:33)を有するVHCDR1および/またはアミノ酸配列
2014523867.tif 000056
(SEQ ID NO:34)を有するVH CDR2をさらに含む。一部の態様において、VHは、図1に示したVセグメントアミノ酸配列を有する。一部の態様において、抗体は、図1に示したVH領域のアミノ酸配列を有するVHを有する。
【０００７】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、VLCDR3アミノ酸配列
2014523867.tif 000057
(SEQ ID NO:35)を含む。一部の態様において、抗体は、VLCDR3アミノ酸配列
2014523867.tif 000058
(SEQ ID NO:36)を含む。一部の態様において、VLは、アミノ酸配列
2014523867.tif 000059
(SEQ ID NO:37)を有するCDR1および/またはアミノ酸配列R(V/G)SNRAS(SEQ ID NO:38)を有するCDR2を含む。一部の態様において、VLは、図1に示したVセグメントアミノ酸配列を有する。一部の態様において、抗体は、図1に示したVL領域のアミノ酸配列を有するVLを有する。
【０００８】
さらに、本発明は、CDR3を除いた時に、ヒト生殖細胞系列配列に対して少なくとも80％、典型的に少なくとも90％、またはそれより大きな配列同一性を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗EMR1抗体を提供する。従って、このような抗体は、例えば、ヒト生殖細胞系列VHVセグメントに対して、少なくとも80％、または少なくとも85％、86％、87％、88％、または89％;典型的には少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH、およびヒトJHセグメントのFR4と少なくとも85％または少なくとも90％同一のFR4;ならびにヒト生殖細胞系列VκVセグメントまたはVλVセグメントに対して、少なくとも80％または少なくとも85％、86％、87％、88％、または89％;典型的には少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVL、およびヒトJκセグメントまたはJλセグメントのFR4と少なくとも85％または少なくとも90％同一のFR4を有してもよい。
【０００９】
本発明はまた、重鎖可変領域が図1に示した配列を有する、重鎖および軽鎖を有する抗EMR1抗体を提供する。
【００１０】
一部の態様において、軽鎖可変領域が図1に示した配列を有する、重鎖および軽鎖を有する抗EMR1抗体。
【００１１】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、以下の配列:SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17; SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:17; SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:17; SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:18; SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:15; SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:16; SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:21; SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:22; SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:21;またはSEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:17を含む、VH領域およびVL領域を有する。
【００１２】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、SEQ ID NO:23のアミノ酸配列を含むVH領域およびSEQ ID NO:24のアミノ酸配列を含むVL領域を有する。
【００１３】
本発明の抗EMR1抗体の一部の態様において、VH領域もしくはVL領域またはVH領域およびVL領域の両方のアミノ酸配列はN末端にメチオニンを含む。
【００１４】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、IgG、例えば、IgG1またはIgG3;またはIgG2またはIgG4である。
【００１５】
さらなる局面において、本発明は、重鎖定常領域が低フコシル化またはアフコシル化されている、本明細書に記載の抗EMR1抗体を含む抗体調製物を提供する。
【００１６】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、約10nM未満のKDを有する。一部の態様において、抗体は1nM未満のKDを有する。
【００１７】
さらなる局面において、本発明は、対象、例えば、ヒトにおいて好酸球を枯渇させる方法であって、霊長類好酸球、例えば、ヒト好酸球に選択的に結合する低フコシル化またはフコシル化された抗EMR1抗体を投与する工程を含む、方法を提供する。
【００１８】
一部の態様において、本発明は、対象において好酸球レベルを下げる方法であって、本明細書に記載の本発明の抗EMR1抗体を対象に投与する工程であって、対象が、EMR1依存性疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性喘息を含む喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、胃食道逆流疾患、鼻ポリープ症、好酸球性胃腸炎、好酸球性胃炎、好酸球性食道炎、好酸球性大腸炎、チャーグ・ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、偶発性血管浮腫(episodic angiodema)、オンコセルカ属皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、寄生虫感染症に起因する好酸球性肺疾患、好酸球性脂肪組織炎、好酸球増加を伴う偶発性血管浮腫(グライヒ症候群)、骨髄-リンパ節肉芽腫および前部ブドウ膜炎を伴う急性好酸球性間質性腎炎および腎不全、サムター症候群、気管支喘息、アスピリン不耐症、慢性副鼻腔炎、NARES(好酸球増加症候群を伴う非アレルギー性鼻炎)、薬物誘発性もしくは毒素誘発性の肺臓炎、および急性または慢性の好酸球性白血病からなる群より選択される疾患を有する工程を含む、方法を提供する。一部の態様において、対象は慢性閉塞性肺疾患を有する。一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、ポリープの再発を阻止または低減するために鼻ポリープ除去後に対象に投与される。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、好酸球によって媒介される疾患の治療の治療効力をモニタリングする方法および好酸球を枯渇の標的とする治療方法による治療の候補である対象を特定する方法を提供する。従って、一部の態様において、本発明は、好酸球依存性疾患を有する患者において、好酸球を標的とする治療の効力を評価する方法であって、患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を、EMR1に選択的に結合する抗EMR1抗体、例えば、ELD-6ドメインに選択的に結合する抗EMR1抗体と接触させる工程;抗体と好酸球との結合を検出する工程、および好酸球レベルを決定する工程であって、治療前のレベルと比較した患者における好酸球レベルの低下が治療効力を示す工程を含む、方法を提供する。抗EMR1抗体は、本明細書に記載の任意の抗EMR1抗体でよい。一部の態様において、効力について評価を受けている治療方法は、好酸球に選択的に結合し、抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)または補体依存性細胞傷害(CDC)活性を媒介する抗EMR1抗体を投与する工程を含む治療である。一部の態様において、抗EMR1抗体は、本明細書に記載の本発明の抗体のいずれか一つである。
【００２０】
さらに、本発明は、好酸球依存性疾患を有し、好酸球を枯渇させる治療剤による治療の候補である患者をスクリーニングする方法であって、患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を、抗EMR1抗体、例えば、EMR1のELD-6に選択的に結合する抗EMR1抗体と接触させる工程;抗体と好酸球との結合を検出する工程、および患者における好酸球レベルを決定し、それによって、治療の候補である患者をスクリーニングする工程を含む、方法を提供する。典型的な態様において、EMR1のELD-6に選択的に結合する抗EMR1抗体は、本明細書に記載の本発明の抗体である。
【００２１】
本発明はまた、好酸球依存性疾患を有し、好酸球を枯渇させる治療剤による治療の候補である患者を特定する方法であって、患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を抗IL-5受容体抗体と接触させる工程;抗体と好酸球との結合を検出する工程、患者における好酸球レベルを決定する工程、正常と比較して好酸球レベルが高い患者を選択する工程;および好酸球に選択的に結合し、ADCCを媒介する治療用抗EMR1抗体を投与する工程を含む、方法を提供する。典型的な態様において、治療用抗EMR1抗体は、本明細書に記載の本発明の抗EMR1抗体である。
【００２２】
他の態様において、本発明は、好酸球依存性疾患を有し、好酸球を枯渇させる治療剤による治療の候補である患者を特定する方法であって、患者に由来する血清試料に存在する可溶性IL-5受容体スプライスバリアント(sIL-5R)のレベルを決定する工程;正常と比較してsIL-5Rのレベルが高い患者を選択する工程;および好酸球に選択的に結合し、ADCCを媒介する抗EMR1抗体を投与する工程を含む、方法を提供する。sIL-5Rのレベルを決定する工程は、血清中のsIL-5Rタンパク質または核酸を検出する任意の方法を用いて実施することができる。一部の態様において、前記方法は、増幅反応を用いてsIL-5R核酸レベルを検出する工程を含む。一部の態様において、前記方法は、イムノアッセイを用いてsIL-5Rタンパク質のレベルを検出する工程を含む。一部の態様において、患者に投与される抗EMR1抗体は、本明細書に記載の抗EMR1抗体である。
【００２３】
本発明はまた、EMR1に選択的に結合し、患者に対するADCC活性を有する抗EMR1抗体を投与する工程を含む治療の効力を評価する方法であって、患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を、本明細書に記載の抗EMR1抗体のいずれか一つの抗EMR1抗体と接触させる工程;抗体と好酸球との結合を検出する工程、および好酸球レベルを決定する工程であって、治療前のレベルと比較した患者における好酸球レベルの低下が治療効力を示す工程を含む、方法を提供する。
【００２４】
選択的に好酸球を標的とする療法の効力を評価する、および/または選択的に好酸球を標的とする療法の候補である対象をスクリーニングする方法は、任意の好酸球依存性疾患を有する患者において実施することができる。一部の態様において、患者は、慢性閉塞性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性喘息を含む喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、胃食道逆流疾患、鼻ポリープ症、好酸球性胃腸炎、好酸球性胃炎、好酸球性食道炎、好酸球性大腸炎、チャーグ・ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、偶発性血管浮腫、オンコセルカ属皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、寄生虫感染症に起因する好酸球性肺疾患、好酸球性脂肪組織炎、好酸球増加を伴う偶発性血管浮腫(グライヒ症候群)、骨髄-リンパ節肉芽腫および前部ブドウ膜炎を伴う急性好酸球性間質性腎炎および腎不全、サムター症候群、気管支喘息、アスピリン不耐症、慢性副鼻腔炎、NARES(好酸球増加症候群を伴う非アレルギー性鼻炎)、薬物誘発性もしくは毒素誘発性の肺臓炎、または急性もしくは慢性の好酸球性白血病を有する。
[本発明1001]
EMR1の上皮細胞成長因子様ドメイン-6(ELD-6)に選択的に結合する、重鎖および軽鎖を含む単離された抗EMR1抗体。
[本発明1002]
EMR1との結合についてモノクローナル抗体1E7と競合する、本発明1001の抗EMR1抗体。
[本発明1003]
EMR1との結合について、モノクローナル抗体1E7と同じCDR配列を有するモノクローナル抗体と競合する、本発明1001の抗EMR1抗体。
[本発明1004]
EMR1配列
2014523867.tif 000060
の全てまたは一部に結合する、本発明1001の抗EMR1抗体。
[本発明1005]
VHCDR3アミノ酸配列IYYRGFDX1を含み、そこで、X1はQ、S、K、またはVである、本発明1001の抗EMR1抗体。
[本発明1006]
アミノ酸配列(D/S/N)FG(M/I)Hを有するVHCDR1および/またはアミノ酸配列
2014523867.tif 000061
を有するVHCDR2をさらに含む、本発明1005の抗EMR1抗体。
[本発明1007]
VHVセグメントがヒト生殖細胞系列VHVセグメントアミノ酸配列に対して少なくとも85％の同一性を有する、本発明1006の抗EMR1抗体。
[本発明1008]
ヒト生殖細胞系列VHJセグメントFR4アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するFR4領域を有する、本発明1007の抗EMR1抗体。
[本発明1009]
VHが図1に示したVセグメント配列を有する、本発明1006の抗EMR1抗体。
[本発明1010]
VHが図1に示した配列を有する、本発明1006の抗EMR1抗体。
[本発明1011]
VLCDR3アミノ酸配列
2014523867.tif 000062
を含む、本発明1002〜1010のいずれかの抗EMR1抗体。
[本発明1012]
VLが、アミノ酸配列
2014523867.tif 000063
を有するCDR1および/またはアミノ酸配列R(V/G)SNRASを有するCDR2を含む、本発明1011の抗EMR1抗体。
[本発明1013]
ヒト生殖細胞系列κVセグメントアミノ酸配列またはλVセグメントアミノ酸配列に対して少なくとも85％の同一性を有するVLVセグメントを有する、本発明1012の抗EMR1抗体。
[本発明1014]
ヒト生殖細胞系列κJセグメントFR4アミノ酸配列またはλJセグメントFR4アミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するVLFR4を有する、本発明1013の抗EMR1抗体。
[本発明1015]
VLが図1に示したVセグメント配列を有する、本発明1012の抗体。
[本発明1016]
VLが図1に示した配列を有する、本発明1012の抗体。
[本発明1017]
(a)SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、もしくはSEQ ID NO:11の重鎖CDR、およびSEQ ID NO:17の軽鎖CDR;
(b)SEQ ID NO:9の重鎖CDRおよびSEQ ID NO:18の軽鎖CDR;
(c)SEQ ID NO:6の重鎖CDRおよびSEQ ID NO:15の軽鎖CDR;
(d)SEQ ID NO:7の重鎖CDRおよびSEQ ID NO:16の軽鎖CDR;
(e)SEQ ID NO:11の重鎖CDRおよびSEQ ID NO:21もしくはSEQ ID NO:22の軽鎖CDR;または
(f)SEQ ID NO:9の重鎖CDRおよびSEQ ID NO:21の軽鎖CDR
を有する、本発明1001の抗EMR1抗体。
[本発明1018]
重鎖可変領域が図1に示した配列を有する、重鎖および軽鎖を有する抗EMR1抗体。
[本発明1019]
軽鎖可変領域が図1に示した配列を有する、重鎖および軽鎖を有する抗EMR1抗体。
[本発明1020]
重鎖可変領域が図1に示した配列を有し、かつ軽鎖可変領域が図1に示した配列を有する、重鎖および軽鎖を有する抗EMR1抗体。
[本発明1021]
IgGである、本発明1001〜1020のいずれかの抗EMR1抗体。
[本発明1022]
ヒトγ-1またはγ-3定常領域を有する、本発明1021の抗EMR1抗体。
[本発明1023]
ヒトγ-2またはγ-4定常領域を有する、本発明1021の抗EMR1抗体。
[本発明1024]
約10nM未満のKDを有する、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1025]
1nM未満のKDを有する、本発明1024の抗体。
[本発明1026]
治療抗体である、前記本発明のいずれかの抗体。
[本発明1027]
低フコシル化またはアフコシル化された重鎖定常領域を有する前記本発明のいずれかの抗EMR1抗体を含む、抗体調製物。
[本発明1028]
生理学的に許容される担体および本発明1001〜1026のいずれかの抗体または本発明1027の抗体調製物を含む、薬学的組成物。
[本発明1029]
好酸球に選択的に結合し、かつ抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)を媒介する抗EMR1抗体を投与する工程を含む、ヒト対象において好酸球を枯渇させる方法。
[本発明1030]
抗体が増強したADCC活性を有する、本発明1029の方法。
[本発明1031]
抗体がアフコシル化されている、本発明1029の方法。
[本発明1032]
抗体がEMR1のELD-6に結合する、本発明1029、1030、または1031の方法。
[本発明1033]
抗体がEMR1配列
2014523867.tif 000064
の全てまたは一部に結合する、本発明1032の方法。
[本発明1034]
患者における好酸球レベルを下げる方法であって、以下の工程を含む方法:
本発明1001〜1025のいずれかの抗体または本発明1027の調製物の抗体を患者に投与する工程であって、患者が、慢性閉塞性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性喘息を含む喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、胃食道逆流疾患、鼻ポリープ症、好酸球性胃腸炎、好酸球性胃炎、好酸球性食道炎、好酸球性大腸炎、チャーグ・ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、偶発性血管浮腫、オンコセルカ属皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、寄生虫感染症に起因する好酸球性肺疾患、好酸球性脂肪組織炎、好酸球増加を伴う偶発性血管浮腫(グライヒ症候群)、骨髄-リンパ節肉芽腫および前部ブドウ膜炎を伴う急性好酸球性間質性腎炎および腎不全、サムター症候群、気管支喘息、アスピリン不耐症、慢性副鼻腔炎、NARES(好酸球増加症候群を伴う非アレルギー性鼻炎)、薬物誘発性もしくは毒素誘発性の肺臓炎、急性好酸球性白血病、ならびに慢性好酸球性白血病からなる群より選択される疾患を有する、工程。
[本発明1035]
患者が慢性閉塞性肺疾患または好酸球性喘息を有する、本発明1034の方法。
[本発明1036]
患者が慢性閉塞性肺疾患を有する、本発明1035の方法。
[本発明1037]
本発明1001〜1025のいずれかの抗EMR1抗体を患者に投与する工程を含む、鼻ポリープ除去後に患者における鼻ポリープの再発を阻止または低減する方法。
[本発明1038]
好酸球依存性疾患を有する患者において、好酸球を標的とする治療の効力を評価する方法であって、以下の工程を含む方法:
患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を、本発明1001〜1025のいずれかの抗EMR1抗体と接触させる工程;
抗体と好酸球との結合を検出する工程、および
好酸球レベルを決定する工程であって、治療前のレベルと比較した患者における好酸球レベルの低下が治療効力を示す、工程。
[本発明1039]
好酸球を標的とする治療が、好酸球に選択的に結合しかつADCCを媒介する治療用抗EMR1抗体を投与する工程を含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
治療用抗EMR1抗体が本発明1001〜1025のいずれかの抗体である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
好酸球依存性疾患を有し、かつ好酸球を枯渇させる治療剤による治療の候補である患者をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含む方法:
患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を、本発明1001〜1025のいずれかの抗EMR1抗体と接触させる工程;
抗体と好酸球との結合を検出する工程、および
患者における好酸球レベルを決定し、それによって、治療の候補である患者をスクリーニングする工程。
[本発明1042]
好酸球依存性疾患を有し、かつ好酸球を枯渇させる治療剤による治療の候補である患者を特定する方法であって、以下の工程を含む方法:
患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を抗IL-5受容体抗体と接触させる工程;
抗体と好酸球との結合を検出する工程、
患者における好酸球レベルを決定する工程、
正常と比較して好酸球レベルが高い患者を選択する工程;および
好酸球に選択的に結合しかつADCCを媒介する抗EMR1抗体を投与する工程。
[本発明1043]
好酸球依存性疾患を有し、かつ好酸球を枯渇させる治療剤による治療の候補である患者を特定する方法であって、以下の工程を含む方法:
患者に由来する血清試料に存在する可溶性IL-5受容体スプライスバリアント(sIL-5R)のレベルを決定する工程;
正常と比較してsIL-5Rのレベルが高い患者を選択する工程;および
好酸球に選択的に結合しかつADCCを媒介する抗EMR1抗体を投与する工程。
[本発明1044]
sIL-5Rのレベルを決定する工程が、増幅反応を用いてsIL-5R mRNAのレベルを検出する工程を含む、本発明1043の方法。
[本発明1045]
sIL-5Rのレベルを決定する工程が、イムノアッセイを用いてsIL-5Rタンパク質のレベルを検出する工程を含む、本発明1043の方法。
[本発明1046]
抗EMR1抗体が本発明1001〜1025のいずれかのものである、本発明1042、1043、1044、または1045の方法。
[本発明1047]
EMR1に選択的に結合しかつ患者に対するADCC活性を有する抗EMR1抗体を投与する工程を含む治療の効力を評価する方法であって、以下の工程を含む方法:
患者に由来する好酸球を含む生物学的試料を、本発明1001〜1025のいずれかの抗EMR1抗体と接触させる工程;
抗体と好酸球との結合を検出する工程、および
好酸球レベルを決定する工程であって、治療前のレベルと比較した患者における好酸球レベルの低下が治療効力を示す、工程。
[本発明1048]
患者が、慢性閉塞性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性喘息を含む喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、胃食道逆流疾患、鼻ポリープ症、好酸球性胃腸炎、好酸球性胃炎、好酸球性食道炎、好酸球性大腸炎、チャーグ・ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、偶発性血管浮腫、オンコセルカ属皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、寄生虫感染症に起因する好酸球性肺疾患、好酸球性脂肪組織炎、好酸球増加を伴う偶発性血管浮腫(グライヒ症候群)、骨髄-リンパ節肉芽腫および前部ブドウ膜炎を伴う急性好酸球性間質性腎炎および腎不全、サムター症候群、気管支喘息、アスピリン不耐症、慢性副鼻腔炎、NARES(好酸球増加症候群を伴う非アレルギー性鼻炎)、薬物誘発性もしくは毒素誘発性の肺臓炎、急性好酸球性白血病、ならびに慢性好酸球性白血病からなる群より選択される疾患を有する、本発明1040〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
患者が慢性閉塞性肺疾患または好酸球性喘息を有する、本発明1048の方法。
[本発明1050]
患者が慢性閉塞性肺疾患を有する、本発明1049の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１−１】本発明の抗EMR1抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1〜11)および軽鎖可変領域のアミノ酸配列(SEQ ID NO:12〜22)の例を示す。抗体の例も示される。
【図１−２】図1-1の続きである。
【図２】EMR1のドメイン構造の概要を示す。
【図３】ウエスタンブロットによる抗EMR1モノクローナル抗体c1E7とEMR1 EGF様ドメイン-6(ELD-6)欠失変異体との結合を示すデータの一例を提供する。図3Aは、比色抗ヒトFcウエスタンブロットにおける一過的トランスフェクション上清からのデータを示す。両方の遺伝子構築物、EMR1-ELDおよびEMR1-ELD-del6を発現させ、発現タンパク質をブロット膜に転写した。図3Bは、c1E7抗体を用いてプローブされ、ECL基質を用いて発色された、ブロット膜上にある同じ上清のアリコートを示す。モノクローナル抗体c1E7は、ウエスタンブロット分析によって評価された時に欠失変異体に結合しない。このことから、c1E7の結合にはELD-6が必要なことが分かる。
【図４】ForteBioによる抗EMR1モノクローナル抗体c1E7と様々なEMR1領域を表すペプチドとの結合を示すデータを提供する。ヒトEMR1-ELDのC末端配列のELD-6領域にあるペプチド6および7をc1E7による結合について試験した。
【図５】非フコシル化抗体が強力なADCC活性を媒介することを示すデータを提供する。好酸球(85,000個の細胞)およびNK細胞を10μg/ml、1μg/ml、および0.1μg/mlの抗体c1E7と組み合わせ、ADCC活性について分析した。ヒトIgG1アイソタイプ対照抗体を10μg/mlで分析した。左パネル:非フコシル化c1E7;右パネル フコシル化c1E7。
【図６】モノクローナル抗体19-1E7重鎖可変領域配列(SEQ ID NO:26)に基づいて抗EMR1抗体の重鎖を操作するための重鎖CDR2/FR3カセット構築を図示する。比較のために、生殖細胞系列Vh3-33セグメントの重鎖CDR2(SEQ ID NO:27)を示した。
【図７】モノクローナル抗体19-1E7軽鎖可変領域配列(SEQ ID NO:28)に基づいて抗EMR1抗体の軽鎖を操作するための軽鎖CDR1/FR1カセット構築を図示する。比較のために、生殖細胞系列VkII A3セグメントの軽鎖CDR1(SEQ ID NO:29)を示した。
【図８】抗原結合を助けるHCDR3(パネルA;それぞれSEQ ID NO:40、39、41、および42)およびLCDR3(パネルB;それぞれSEQ ID NO:54、61、58、88、56、89、および62)親和性成熟変化を示す。一番上にある参照配列に下線を引き、抗原結合を助けるCDR3変化はイタリック体で示した。
【図９】A)5mg/kgまたはB)1mg/kg抗EMR1抗体が投与されたカニクイザル動物の循環好酸球数を示す例示的なデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本明細書で使用する「EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様1」または「EMR1」とは、EGF-TM7ファミリーのメンバーである受容体をいう。EMR1は、7回膜貫通領域を有するドメインをC末端に有する。このタンパク質のN末端にはセリン/スレオニンリッチドメインによって膜貫通ドメインから分けられた6個のEGF様ドメイン(本明細書ではELD-1、ELD-2、ELD-3、ELD-4、ELD-5、およびELD-6と呼ぶ)がある。ヒトEMR1のUniProtKB/Swiss-Prot識別子はQ14246である。ヒトEMR1は19p13.3に位置する。「EMR1」という用語は、その遺伝子座において生じる多型変種を含む。ヒトEMR1細胞外ドメインタンパク質配列の一例をSEQ ID NO:25に示した。
【００２７】
本発明において「EMR1抗体」または「抗EMR1抗体」は、EMR1に特異的に結合する抗体をいうために同義に用いられる。
【００２８】
本明細書で使用する「活性アイソタイプを有する抗体」とは、免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に結合するヒトFc領域を有する抗体をいう。「活性アイソタイプ」には、IgG1、IgG3、IgM、IgA、およびIgEが含まれる。この用語は、Fcエフェクター機能を調節する改変、例えば、変異または糖組成および/もしくはグリコシル化レベルに対する変化を含むヒトFc領域を有する抗体を包含する。
【００２９】
本発明において「ADCC活性を有する」および「ADCCを媒介する」という用語は同義に用いられる。本発明において、「増強した抗体依存性細胞媒介細胞傷害」または「増強したADCC」を有する抗体とは、ADCCが、改変前の抗体と比較して、例えば、少なくとも2倍、典型的に少なくとも5倍、好ましくは少なくとも10倍増えるように、オリゴ糖の改変または変異などによって改変された抗体をいう。ADCCは周知のアッセイを用いて測定される。例えば、本発明において、ADCCは、典型的には、抗EMR1抗体の存在下で、患者由来エフェクター細胞または正常末梢血由来エフェクター細胞と好酸球標的細胞が、選択されたエフェクター:標的細胞比で、通常、10〜100の比でインキュベートされるインビトロアッセイによって測定される。抗体依存性の細胞死滅は、一般的に4〜24時間のインキュベーション期間後に、例えば、LDHなどの細胞内酵素の放出を確かめることによって測定される。
【００３０】
「Fc領域」とは、第1の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域をいう。従って、Fcとは、IgA、IgD、およびIgGの最後の2つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにIgEおよびIgMの最後の3つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのN末端側にある可動性ヒンジをいう。IgAおよびIgMの場合、FcはJ鎖を含むことがある。IgGの場合、Fcは、免疫グロブリンドメインCγ2およびCγ3ならびにCγ1とCγとの間のヒンジを含む。Fc領域の境界は変化する場合があることが当技術分野において理解される。しかしながら、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.)のようにEUインデックスに従う番号付けを用いて、残基C226またはP230からそのカルボキシル末端まで含むと定義されている。「Fc領域」という用語は、単離において、この領域を指してもよく、抗体または抗体断片の状況において、この領域を指してもよい。「Fc領域」は、Fc領域の天然に存在する対立遺伝子変種ならびにエフェクター機能を調節する改変を含む。Fc領域は、生物学的機能を変えない変種も含む。例えば、生物学的機能を大幅に失うことなく、免疫グロブリンのFc領域のN末端またはC末端から1つまたは複数のアミノ酸を欠失することができる。このような変種は、活性にほとんど影響を及ぼさないように当技術分野において公知の通則に従って選択することができる(例えば、Bowie, et al., Science 247:306-1310, 1990を参照されたい)。
【００３１】
「平衡解離定数」または「親和性」という用語は(KD)と略され、解離速度定数(kd,time-1)を会合速度定数(ka, time-1, M-1)で割ったものをいう。平衡解離定数は、当技術分野において任意の公知の方法を用いて測定することができる。本発明の抗体は高親和性抗体である。このような抗体のKDは、37℃で行われる表面プラズモン共鳴分析によって求められた時、約50nM未満であり、多くの場合、約10nM未満である。従って、一部の態様において、本発明の抗体のKDは(表面プラズモン共鳴を用いて測定された時)、約50nM未満、典型的に約25nM未満、またはさらに10nM未満、例えば、約5nMまたは約1nMである。本発明の状況において、例えば、低い数値のKDによって証明されるように、高い親和性を有するのであれば、親和性は「優れている」。
【００３２】
タンパク質またはペプチドについて言及している時、抗原もしくは標的に「特異的に(もしくは選択的に)結合する」または「特異的に(もしくは選択的に)免疫反応性の」という句は、抗体が関心対象の抗原または標的に結合する結合反応をいう。本発明の状況において、抗体は、他の抗原に対する親和性より少なくとも100倍大きな親和性でEMR1に結合する。
【００３３】
本明細書で使用する「抗体」とは、結合タンパク質と機能上定義され、かつ抗体産生動物の免疫グロブリンコード遺伝子のフレームワーク領域に由来すると当業者によって認められたアミノ酸配列を含むと構造上定義されたタンパク質をいう。抗体は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる1つもしくは複数のポリペプチドからなってもよい。認められている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、またはεとして分類され、次に、これらは、それぞれ、免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEを定義する。
【００３４】
典型的なIgG免疫グロブリン(抗体)構造単位は四量体からなることが知られている。それぞれの四量体は2つの同じポリペプチド鎖対からなり、各対は1本の「軽」(約25kD)および1本の「重」鎖(約50〜70kD)を有する。各鎖のN末端は、主に抗原認識を担う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖をいう。
【００３５】
本明細書で使用する「抗体」という用語は、結合特異性を保持している抗体断片を含む。例えば、特徴がはっきりした多数の抗体断片がある。従って、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域にあるジスルフィド結合のC末端側で抗体を消化して、ジスルフィド結合によって軽鎖とVH-CH1がつながっているFabの二量体であるF(ab') 2を生成する。F(ab') 2を、ヒンジ領域にあるジスルフィド結合を破壊する穏やかな条件下で還元し、それによって、F(ab') 2二量体をFab'単量体に変換することができる。Fab'単量体は本質的にヒンジ領域の一部を有するFabである(他の抗体断片のさらに詳細な説明については、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を参照されたい)。インタクトな抗体の消化の点で様々な抗体断片が定義されているが、当業者であれば、化学的に、または組換えDNA法を用いて断片を新規合成できることを理解するだろう。従って、本明細書で使用する抗体という用語は、抗体全体を改変することによって生成された、または組換えDNA法を用いて合成された抗体断片も含む。
【００３６】
抗体は、連続したポリペプチドを形成するように可変重鎖領域および可変軽鎖領域が(直接、またはペプチドリンカーを介して)つながって一緒になった単鎖抗体を含む、VH-VL二量体を含む。または、抗体は別の断片でもよい。例えば、組換え法を用いて、可溶性タンパク質として、またはディスプレイ方法から得られた断片として他の断片も作製することもできる。従って、抗体は、ダイアボディ、ミニ抗体、およびラクダ由来抗体などの重鎖二量体も含んでよい。
【００３７】
本明細書で使用する「V領域」とは、CDR3およびフレームワーク4を含めて、フレームワーク1、CDR1、フレームワーク2、CDR2、およびフレームワーク3のセグメントを含む、抗体可変領域ドメインをいう。これらのセグメントは、B細胞分化中に重鎖V領域遺伝子および軽鎖V領域遺伝子の再編成の結果としてVセグメントに付加される。本明細書で使用する「Vセグメント」とは、V遺伝子によってコードされるV領域(重鎖または軽鎖)の領域をいう。重鎖可変領域のVセグメントは、FR1-CDR1-FR2-CDR2およびFR3をコードする。本発明の目的のために、軽鎖可変領域のVセグメントはFR3からCDR3まで及ぶと定義される。
【００３８】
本明細書で使用する「Jセグメント」という用語は、CDR3のC末端部分およびFR4を含む、コードされる可変領域の部分配列をいう。生殖細胞系列Jセグメントは免疫グロブリンJ遺伝子セグメントによってコードされる。
【００３９】
本明細書で使用する「相補性決定領域(CDR)」とは、軽鎖可変領域および重鎖可変領域によって確立された4つの「フレームワーク」領域の間にある、各鎖における3つの超可変領域をいう。CDRは主に抗原エピトープとの結合を担う。各鎖のCDRは、典型的には、N末端から連続番号が振られているCDR1、CDR2、およびCDR3と呼ばれ、典型的には、特定のCDRが位置する鎖によっても特定される。従って、VHCDR3は、VHCDR3が見出される抗体重鎖の可変ドメインに位置するのに対して、VLCDR1は、VLCDR1が見出される抗体軽鎖の可変ドメインに由来するCDR1である。
【００４０】
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成要素である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域の組み合わせであり、三次元空間内でCDRを配置および整列するのに役立つ。
【００４１】
CDRおよびフレームワーク領域のアミノ酸配列は、当技術分野において周知の様々な定義、例えば、Kabat、Chothia、国際ImMunoGeneTicsデータベース(IMGT)、およびAbMを用いて決定することができる(例えば、Johnson et al., 前記; Chothia & Lesk, 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196, 901-917; Chothia C. et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342, 877-883; Chothia C. et al, 1992, structural repertoire of the human VH segments J. Mol. Biol. 227, 799-817; Al-Lazikani et al, J.Mol.Biol 1997, 273(4)を参照されたい)。抗原結合部位の定義も以下:Ruiz et al, IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000);およびLefranc,M.-P. IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res. Jan 1;29(1):207-9 (2001); MacCallum et al, Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography, J. Mol. Biol., 262 (5), 732-745 (1996);およびMartin et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989); Martin, et al, Methods Enzymol, 203, 121-153, (1991); Pedersen et al, Immunomethods, 1, 126, (1992);およびRees et al, In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996に記載されている。
【００４２】
「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体が結合する、抗原上の部位をいう。エピトープは、連続アミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって近接する非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒に曝露されても保持されるのに対して、三次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒で処理されると失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間コンホメーションにおいて少なくとも3個、さらに通常は少なくとも5個または8〜10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間コンホメーションを決定する方法には、例えば、X線結晶学および2次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)を参照されたい。
【００４３】
本明細書で使用する「キメラ抗体」とは、(a)抗原結合部位(可変領域)が、異なるもしくは変化したクラス、エフェクター機能、および/もしくは種の定常領域、またはキメラ抗体に新たな特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などと連結されるように、定常領域またはその一部が変化、置換、または交換されている;あるいは(b)可変領域またはその一部が、異なるまたは変化した抗原特異性を有する可変領域またはその一部;あるいは別の種に由来する対応する配列または別の抗体クラスもしくはサブクラスに由来する対応する配列を用いて変化、置換、または交換されている、免疫グロブリン分子をいう。
【００４４】
本明細書で使用する「ヒト化抗体」とは、ドナー抗体に由来するCDRがヒトフレームワーク配列にグラフトされた免疫グロブリン分子をいう。ヒト化抗体はまた、フレームワーク配列中にドナー由来の残基を含んでもよい。ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含むことができる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、移入されるCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。ヒト化は、「超ヒト化(superhumanizing)」抗体(Tan et al., J. Immunol. 169:1119, 2002)ならびに「リサーフェシング(resurfacing)」 (例えば、Staelens et al., Mol. Immunol. 43:1243, 2006;およびRoguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:969, 1994)などの技法を含む、当技術分野において公知の方法 (例えば、Jones et al., Nature 321:522-525; 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, 1992; 米国特許第4,816,567号)を用いて行うことができる。
【００４５】
本発明の状況において「Humaneered(商標)」抗体とは、参照抗体の結合特異性を有する操作されたヒト抗体をいう。本発明において使用するための操作された「Humaneered(商標)」ヒト抗体は、ドナー免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する免疫グロブリン分子を有する。典型的には、このような抗体は、参照抗体の重鎖のCDR3領域に由来する結合特異性決定基(BSD)をコードするDNA配列を、ヒトVHセグメント配列とつなぎ、参照抗体に由来する軽鎖CDR3 BSDをヒトVLセグメント配列とつなぐことによって操作される。このような方法は、米国特許出願公開第20050255552号および米国特許出願公開第20060134098号に記載されている。
【００４６】
本発明の状況において用いられる「結合特異性決定基」または「BSD」という用語は、抗体の結合特異性を決定するのに必要な、CDR領域内にある最小限の連続アミノ酸配列または非連続アミノ酸配列をいう。本発明において、最小限の結合特異性決定基は、抗体の重鎖および軽鎖のCDR3配列の一部または完全長の中にある。
【００４７】
本明細書で使用する「ヒト」抗体は、ヒト化抗体およびHumaneered(商標)抗体、ならびに公知の技法を用いて産生されたヒトモノクローナル抗体を包含する。
【００４８】
本明細書で使用する「治療」抗体とは、好酸球を死滅させることが望ましい疾患を治療するために患者に投与されるヒト抗体またはキメラ抗体をいう。
【００４９】
「低フコシル化された」抗体調製物とは、N結合型オリゴ糖鎖の50％未満が、CH2ドメインに取り付けられたα1,6-フコースを含有する抗体調製物をいう。典型的には、「低フコシル化された」抗体調製物において、N結合型オリゴ糖鎖の約40％未満、約30％未満、約20％未満、約10％未満、または5％未満、または1％未満が、CH2ドメインに取り付けられたα1,6-フコースを含有する。
【００５０】
「アフコシル化された」および「非フコシル化された」という用語は、IgG重鎖のCH2ドメインに取り付けられた炭水化物中にα1,6-フコースを欠く抗体をいうために本明細書において同義に用いられる。
【００５１】
「異種の」という用語は、核酸の一部に関して用いられる時、核酸が、通常、天然における同じ互いとの関連性をもって見出されない2つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には2つ以上の配列を用いて、例えば、新しい機能的核酸を作るように並べられた無関係の遺伝子から組換えにより生成される。同様に、異種タンパク質は、多くの場合、天然における同じ互いとの関連性をもって見出されない2つ以上の部分配列をいう。
【００５２】
「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して用いられる時、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種の核酸もしくはタンパク質またはネイティブな核酸もしくはタンパク質の変化の導入によって改変されていること、あるいは細胞が、このように改変された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、ネイティブな(非組換え)型の細胞内に見出されない遺伝子を発現するか、または別の方法で異常発現された、過小発現された、または全く発現されないネイティブな遺伝子を発現する。本明細書において「組換え核酸」という用語は、最初にインビトロで形成された核酸、一般的に、核酸の操作によって、例えば、天然では通常見出されない形でポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いた核酸の操作によって最初にインビトロで形成された核酸を意味する。このように、異なる配列の機能的連結が達成される。従って、直鎖の形をした単離された核酸、または通常つながっていないDNA分子を連結することによってインビトロで形成された発現ベクターは両方とも本発明の目的では組換えとみなされる。組換え核酸が作られ、宿主細胞または生物に再導入されたら、非組み換えにより、すなわち、インビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製すると理解される。しかしながら、このような核酸は組換えにより生成されたら、後で非組み換えにより複製されるが、依然として本発明の目的では組換えとみなされる。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え法を用いて作られた、すなわち、前記で示されたような組換え核酸の発現によって作られたタンパク質である。
【００５３】
本明細書で使用する「EMR1依存性疾患」とは、EMR1を発現する細胞が、疾患を治療する療法の標的となっている疾患をいう。
【００５４】
本明細書で使用する「治療剤」とは、疾患に罹患している患者に治療に有効な用量で投与された時に、疾患の症状および疾患に関連する合併症を治癒させる、または少なくとも部分的に抑える薬剤をいう。
【００５５】
2つ以上のポリペプチド(または核酸)配列の状況において「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、BLASTもしくはBLAST2.0配列比較アルゴリズムと下記のデフォルトパラメータを用いて測定された時に、または手作業のアラインメントおよび目視検査(例えば、NCBIウェブサイトを参照されたい)によって用いて測定された時に、同じ2つ以上の配列もしくは部分配列、または特定のパーセントの同じアミノ酸残基(もしくはヌクレオチド)(例えば、比較ウィンドウもしくは指定された領域にわたって最大限一致するように比較もしくは整列された時に、特定の領域にわたって少なくとも60％の同一性、好ましくは、少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはさらに高い同一性)を有する2つ以上の配列もしくは部分配列をいう。少なくとも60％の同一性を共有する配列は「実質的に同一」と呼ばれる。「実質的に同一の」配列はまた、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列、ならびに天然に存在する変種、例えば、多型変種または対立遺伝子変種および人工変種も含む。下記のように、好ましいアルゴリズムはギャップなどを明らかにすることができる。好ましくは、タンパク質配列同一性は、長さが少なくとも約25アミノ酸の領域にわたって、またはより好ましくは、長さが50〜100アミノ酸の領域にわたって、またはタンパク質配列の長さにわたって存在する。
【００５６】
本明細書で使用する「比較ウィンドウ」は、ある配列と、同じ数の連続した位置の参照配列が最適に整列された後に2つの配列が比較され得る、典型的には20〜600、通常は約50〜約200、さらに通常は約100〜約150からなる群より選択される連続した位置の数の1つのセグメントを参照することを含む。比較のために配列を整列する方法は当技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所ホモロジーアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法(search for similarity method)によって、これらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIの中にあるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)のコンピュータによる実行によって、または手作業のアラインメントおよび目視検査によって行うことができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, eds. 1995 補遺を参照されたい)。
【００５７】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例には、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されているBLASTおよびBLAST2.0アルゴリズムが含まれる。本発明の核酸およびタンパク質のパーセント配列同一性を決定するために、BLASTおよびBLAST2.0が本明細書に記載のパラメータと共に用いられる。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)では、デフォルトとして、ワード長(wordlength)(W)11、期待値(expectation)(E)10、M=5、N=-4、および両鎖比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムでは、デフォルトとして、ワード長3、および期待値(E)10、およびBLOSUM62スコアリング行列(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)を参照されたい)、アライメント(B)50、期待値(E) 10、M=5、N=-4、および両鎖比較を使用する。
【００５８】
2つのポリペプチドが実質的に同一であるとは、第1のポリペプチドが、第2のポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応するということを示す。従って、例えば、2つのペプチドが保存的置換だけしか異ならない場合、典型的には、ポリペプチドは第2のポリペプチドと実質的に同一である。
【００５９】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然の状態で見出された時に通常付随する成分を実質的または本質的に含まない材料をいう。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学法を用いて確かめられる。調製物に存在する優勢な種であるタンパク質は実質的に精製されている。「精製された」という用語は、一部の態様において、電気泳動ゲル内でタンパク質が本質的に1つのバンドを生じさせることを意味する。好ましくは、「精製された」という用語は、タンパク質が少なくとも85％純粋、より好ましくは少なくとも95％純粋、最も好ましくは少なくとも99％純粋であることを意味する。
【００６０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体をいうために本明細書において同義に用いられる。これらの用語は、1つまたは複数のアミノ酸残基が、天然に存在する対応するアミノ酸の人工化学ミメティックであるアミノ酸重合体、ならびに天然に存在するアミノ酸重合体、改変された残基を含有するアミノ酸重合体、および天然に存在しないアミノ酸重合体に適用される。
【００６１】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸ミメティックをいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後で改変されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合しているα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。このような類似体は、改変されたR基(例えば、ノルロイシン)または改変されたペプチドバックボーンを有してもよいが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸ミメティックとは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物をいう。
【００６２】
アミノ酸は、IUPAC-IUB生化学命名委員会(Biochemical Nomenclature Commission)により勧告された、一般に知られている三文字記号または一文字記号によって本明細書において言及されることがある。同様に、ヌクレオチドは、一般に受け入れられている一文字暗号によって言及されることがある。
【００６３】
「保存的に改変された変種」はアミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変種とは、同一のもしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一のもしくは関連する配列、例えば、天然に連続する配列をいう。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が、ほとんどのタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。従って、あるコドンによってアラニンが指定される全ての位置において、コードされるポリペプチドが変化することなく、そのコドンを、記載の対応するコドンのうちの別のコドンに変えることができる。このような核酸バリエーションは、保存的に改変されたバリエーションの一種である「サイレントバリエーション」である。ポリペプチドをコードする本明細書の全ての核酸配列が核酸のサイレントバリエーションも示す。当業者であれば、ある特定の状況において、機能的に同一の分子を生じるように、(メチオニンの通常、一つしかないコドンであるAUG、およびトリプトファンの通常、一つしかないコドンであるTGGを除く)核酸中のそれぞれのコドンを改変できることを理解するだろう。従って、多くの場合、ポリペプチドをコードする核酸のサイレントバリエーションが、発現産物に関する記載の配列に含まれるが、実際のプローブ配列に関する記載の配列には含まれない。
【００６４】
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コードされている配列において1個のアミノ酸またはごくわずかな割合のアミノ酸を変える、付加する、または欠失する、核酸配列、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、変化によってアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸に置換された場合、「保存的に改変された変種」だと理解するだろう。機能的に類似するアミノ酸を示す保存的置換表は当技術分野において周知である。このような保存的に改変された変種は本発明の多型変種、種間ホモログ、および対立遺伝子に加わるものであり、これらを排除しない。典型的には、保存的置換は、以下:1)アラニン(A)、グリシン(G);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);7)セリン(S)、スレオニン(T);および8)システイン(C)、メチオニン(M)のように相互に行われる(例えば、Creighton, Protein (1984)を参照されたい)。
【００６５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り複数の指示物を含む。
【００６６】
I.序論
本発明は、高親和性でEMR1に結合する抗体、好ましくは、EMR1、例えば、EMR1のELD-6ドメインに選択的に結合し、他のEGF-TM7ファミリーメンバーなどの他のタンパク質と交差反応しない抗体に関する。EMR1のドメイン構造を図2に示した。本発明の一部の態様において、抗体は、ELD-6ドメインに存在する領域
2014523867.tif 000065
(SEQ ID NO:30)(SEQ ID NO:1のアミノ酸残基271〜288)の中の直鎖エピトープに結合する。
【００６７】
本発明の抗体はEMR1と高親和性結合を示す。抗体の親和性は、結合活性および親和性を決定する周知のアッセイを用いて評価することができる。このような技法には、ELISAアッセイならびに表面プラズモン共鳴または干渉法を使用する結合測定が含まれる。例えば、親和性は、ForteBio (Mountain View, CA) Octetバイオセンサーを用いたバイオレイヤー干渉法によって確かめることができる。
【００６８】
一部の態様において、本発明の抗体は、EMR1配列
2014523867.tif 000066
(SEQ ID NO:30)の全てまたは一部に結合する。一部の態様において、本発明の抗体は、EMR1との結合においてモノクローナル抗体1E7抗体と競合する、すなわち、1E7抗体のVH領域およびVL領域(それぞれ、SEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:24)を有する抗体と競合する。他の態様において、本明細書に記載の抗体、例えば、図1に提供された表に示されたVH領域およびVL領域の組み合わせを含む異なる抗体を、別の抗体がEMR1との結合において競合するかどうか評価するための参照抗体として使用することができる。試験抗体の存在下で参照抗体と抗原との結合が少なくとも30％、通常、少なくとも約40％、50％、60％、または75％、多くの場合、少なくとも約90％低減すれば、試験抗体は参照抗体の結合を完全に阻害するとみなされる。結合を評価するために、ELISAならびに当技術分野において公知の他のアッセイ、例えば、イムノブロットを含む多くのアッセイを使用することができる。
【００６９】
別の局面において、本発明は、好酸球を枯渇させる方法であって、抗EMR1抗体を好酸球の枯渇を必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。一部の態様において、抗体はEMR1に特異的に結合し、アフコシル化されている。一部の態様において、投与される抗体調製物は低フコシル化されている。一部の態様において、抗EMR1抗体はEMR1のELD-6ドメインに結合する。一部の態様において、抗体は、領域
2014523867.tif 000067
(SEQ ID NO:30)の中の直鎖エピトープに結合する。
【００７０】
本発明の抗体は、ヒト生殖細胞系列VH配列およびVL配列に対して高度のアミノ酸配列同一性を有する可変領域を含む。
【００７１】
典型的には、BSDを除くCDR3の一部および完全なFR4はヒト生殖細胞系列配列からなる。一部の態様において、BSDを除くCDR3-FR4配列は、各鎖において2個以下のアミノ酸だけヒト生殖細胞系列配列と異なる。一部の態様において、BSDを除くCDR3-FR4配列は、各鎖において1個以下のアミノ酸だけヒト生殖細胞系列配列と異なる。一部の態様において、Jセグメントはヒト生殖細胞系列Jセグメントを含む。ヒト生殖細胞系列配列は、例えば、公的利用可能な国際ImMunoGeneTicsデータベース(IMGT)およびV-base(ワールドワイドウェブ上のvbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)を介して決定することができる。
【００７２】
ヒト生殖細胞系列Vセグメントレパートリーは、51個の重鎖V領域、40個のκ軽鎖Vセグメント、および31個のλ軽鎖Vセグメントからなり、合計3,621個の生殖細胞系列V領域ペアが生じる。さらに、これらのVセグメントのほとんどについて安定した対立遺伝子変種があるが、生殖細胞系列レパートリーの構造多様性へのこれらの変種の寄与は限られている。全てのヒト生殖細胞系列Vセグメント遺伝子の配列は公知であり、MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, United Kingdomによって提供されているV-base データベースにおいて評価することができる(Chothia et al., 1992, J Mol Biol 227:776-798; Tomlinson et al., 1995, EMBO J 14:4628-4638;およびWilliams et al., 1996, J Mol Biol 264:220-232も参照されたい)。
【００７３】
II.抗EMR1抗体重鎖の例
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体の重鎖可変領域は、以下のエレメント:
1)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3を含むヒト重鎖Vセグメント配列
2)X1がQ、S、K、またはVであるアミノ酸配列IYYRGFDX1(SEQ ID NO:31)を含むCDRH3領域;および
3)ヒト生殖細胞系列J遺伝子セグメントによって提供されるFR4
を含む重鎖V領域を含む。
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体の重鎖可変領域CDR3(CDRH3)はIYYRGFDQ(SEQ ID NO:39)を含む。一部の態様において、本発明の抗体のCDRH3はIYYRGFDS(SEQ ID NO:40)を含む。一部の態様において、本発明の抗体のCDRH3はIYYRGFDV(SEQ ID NO:41)を含む。一部の態様において、本発明の抗体のCDRH3はIYYRGFDK(SEQ ID NO:42)を含む。
【００７４】
Vセグメントは、典型的には、ヒト生殖細胞系列Vセグメント、例えば、ヒトVh3サブクラスに対して少なくとも85％、90％、95％、またはそれより大きな同一性を有する。従って、一部の態様において、Vセグメントは、生殖細胞系列セグメントVh3 3-33配列に対して少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％、またはそれより大きな同一性を有する。一部の態様において、Vセグメントは、Vh3 3-33に由来する15個以下の残基だけ異なる。一部の態様において、本発明の抗体の重鎖のVセグメントは、フレームワーク領域において、VセグメントVh3-33フレームワーク領域と比較して10個以下の残基だけ異なる。
【００７５】
一部の態様において、本発明の抗体は、図1に示したEMR1抗体VH領域のVセグメントの1つに対して、少なくとも90％の同一性、または少なくとも91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するVセグメントを含む。一部の態様において、パーセント同一性はVセグメントのフレームワーク領域と比較して決定され、パーセント同一性からCDR(CDR1およびCDR2)を排除する。
【００７６】
本発明の抗体のFR4配列は、ヒトJH1、JH2、JH3、JH4、JH5、もしくはJH6遺伝子生殖細胞系列セグメント、あるいはヒト生殖細胞系列JHセグメント、例えば、ヒト生殖細胞系列JH6セグメントのFR4領域と比較して高度のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも80％もしくは少なくとも90％の同一性を有する配列、または3個以下、典型的には2個以下のアミノ酸残基において異なる配列によって提供される。一部の態様において、Jセグメントはヒト生殖細胞系列JH6配列に由来し、FR4は、配列
2014523867.tif 000068
(SEQ ID NO:43)を有する。重鎖のヒトFR4は、ネイティブなIgG抗体において長さが11アミノ酸である。FR4に対応するJセグメントの領域は、公知の抗体構造および公知のFR4配列に基づいて容易に決定することができる。
【００７７】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体のVH領域のVセグメントは、図1に示したようにCDR1および/またはCDR2を有する。一部の態様において、抗体は、X1がD、S、またはNであり;X2がMまたはIであるX1FGX2H(SEQ ID NO:33)を含む重鎖CDR1(CDRH1)を有する。一部の態様において、X1はQ(SEQ ID NO:44)である。一部の態様において、CDRH1は、配列DFGMH(SEQ ID NO:45), DFGIH(SEQ ID NO:46), SFGMH(SEQ ID NO:47), SFGIH(SEQ ID NO:48), NFGMH(SEQ ID NO:49),またはNFGIH(SEQ ID NO:50)を有する。
【００７８】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、X1がD、N、またはYである、
2014523867.tif 000069
(SEQ ID NO:34)を含む重鎖CDR2(CDRH2)を有する。一部の態様において、CDRH2は、
2014523867.tif 000070
(SEQ ID NO:51)を含む。一部の態様において、CDRH2は、
2014523867.tif 000071
(SEQ ID NO:52)を含む。一部の態様において、CDRH2は、
2014523867.tif 000072
(SEQ ID NO:53)を含む。
【００７９】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、X1がQ、S、K、またはVであるアミノ酸配列IYYRGFDX1(SEQ ID NO:31)を有するCDRH3;X1がD、S、またはNであり;X2がMまたはIであるアミノ酸配列X1FGX2H(SEQ ID NO:33)を有するCDRH1;X1がD、N、またはYであるアミノ酸配列
2014523867.tif 000073
(SEQ ID NO:34)を有するCDRH2を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDV(SEQ ID NO:41)を有するCDRH3;アミノ酸配列SFGMH(SEQ ID NO:47)またはNFGMH(SEQ ID NO:49)を有するCDRH1;および配列
2014523867.tif 000074
(SEQ ID NO:53)を有するCDRH2を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDQ(SEQ ID NO:39)を有するCDRH3;アミノ酸配列SFGMH(SEQ ID NO:47)またはNFGMH(SEQ ID NO:49)を有するCDRH1;およびアミノ酸配列
2014523867.tif 000075
(SEQ ID NO:53)を有するCDRH2を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDS(SEQ ID NO:40)を有するCDRH3;アミノ酸配列SFGMH(SEQ ID NO:47)を有するCDRH1;および配列
2014523867.tif 000076
(SEQ ID NO:51)を有するCDRH2を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDS(SEQ ID NO:40)を有するCDRH3;アミノ酸配列NFGMH(SEQ ID NO:49)を有するCDRH1;および配列
2014523867.tif 000077
(SEQ ID NO:53)を有するCDRH2を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDS(SEQ ID NO:40)を有するCDRH3;アミノ酸配列SFGIH(SEQ ID NO:48)を有するCDRH1;および配列
2014523867.tif 000078
(SEQ ID NO:52)を有するCDRH2を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDS(SEQ ID NO:40)を有するCDRH3;アミノ酸配列DFGIH(SEQ ID NO:46)を有するCDRH1;および配列
2014523867.tif 000079
(SEQ ID NO:51)を有するCDRH2を有する。
【００８０】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、配列
2014523867.tif 000080
(SEQ ID NO:31)を有するVH領域CDR3ならびに図1に示したVH領域のいずれかのCDR1および/またはCDR2を有してもよい。
【００８１】
一部の態様において、本発明の抗体のVH領域Vセグメントは、図1に示したVセグメント配列を有する。
【００８２】
一部の態様において、本発明の抗体は、図1に示したVH領域配列を有する。
【００８３】
III.抗EMR1抗体軽鎖の例
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体の軽鎖は、以下のエレメント:
1)FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3を含むヒト軽鎖Vセグメント配列、
2)X1がF、V、T、またはNであり;X2がS、V、G、またはTであり;X3がV、L、またはPであるアミノ酸配列X1QGX2HX3PLT(SEQ ID NO:35)を有するCDRL3領域;および
3)ヒト生殖細胞系列J遺伝子セグメントによって提供されるFR4
を含む、軽鎖V領域を含む。一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体の軽鎖可変領域は、X1がF、V、T、またはNであり;X2がS、V、G、またはTであり;X3がV、L、またはPであるX1QGX2HX3PLT(SEQ ID NO:35)を含むCDR3(CDRL3)を有する。一部の態様において、CDRL3は、配列FQGSHVPLT(SEQ ID NO:54), SQGSHVPLT(SEQ ID NO:55), NQGSHVPLT(SEQ ID NO:56), FQGSHTPLT(SEQ ID NO:57), FQGVHVPLT(SEQ ID NO:58), FQSSHVPLT(SEQ ID NO:59), SQGSHVPLT(SEQ ID NO:60), FQGSHPPLT(SEQ ID NO:61),またはVQGTHVPLT(SEQ ID NO:62)を有する。
【００８４】
VL領域はVλVセグメントまたはVκVセグメントのいずれかを含む。相補するVH領域との結合を助けるVκ配列の例を図1の中の表に示した。VκまたはVλは任意のサブクラスのものでよい。
【００８５】
Vκセグメントは、任意のサブクラスのもの、例えば、VκII配列、例えば、VκII A3サブクラスのものでよい。一部の態様において、セグメントは、ヒト生殖細胞系列Vκ配列、例えば、VκII A3配列に対して少なくとも80％の配列同一性、または少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、もしくは95％、またはそれより大きな配列同一性を有する。一部の態様において、Vκセグメントは、VκII A3のフレームワーク領域と比較して10個以下または5個以下のフレームワーク残基だけ異なってもよい。他の態様において、本発明の抗体のVL領域Vセグメントは、図1に示したEMR1 VL領域の軽鎖Vセグメント配列に対して少なくとも85％の同一性、または少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％の同一性を有する。一部の態様において、パーセント同一性はVセグメントのフレームワーク領域に対するものであり、CDRを除く。
【００８６】
本発明の抗体のVL領域のFR4配列は、例えば、ヒト生殖細胞系列Jセグメント、あるいはヒト生殖細胞系列JセグメントのFR4領域に対して高度のアミノ酸配列同一性、例えば、少なくとも80％もしくは少なくとも90％の同一性を有する配列、またはヒト生殖細胞系列FR4領域に由来する3個以下もしくは2個以下のアミノ酸において異なる配列によって提供される。一部の態様において、Jセグメントはヒト生殖細胞系列Jκ5配列である。一部の態様において、抗体のFR4は配列FGQGTREIK(SEQ ID NO:63)を有する。軽鎖のヒトFR4はネイティブなIgG抗体において長さが10アミノ酸である。FR4に対応するJセグメントの領域は、公知の抗体構造および公知のFR4配列に基づいて容易に決定することができる。
【００８７】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体の軽鎖可変領域は、図1に示したCDRL3、ならびにX1がRまたはKであり;X2がLまたはIであり;X3がVまたはLであり;X4がNまたはYであり;X5がNまたはTであるアミノ酸配列
2014523867.tif 000081
(SEQ ID NO:37)を有するCDR1(CDRL1)を有する。一部の態様において、CDRL1は、配列RSSQSIVHSNGNNYLE (SEQ ID NO:64), KSSQSIVHSNGNNYLE (SEQ ID NO:65), RSSQSLVHSNGNNYLE (SEQ ID NO:66), KSSQSLVHSNGNNYLE (SEQ ID NO:67), RSSQSLVHSNGYTYLE (SEQ ID NO:68), RSSQSLVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:69), RSSQSLVHSNGYNYLE (SEQ ID NO:70), KSSQSLVHSNGYTYLE (SEQ ID NO:71), KSSQSLVHSNGYTYLE (SEQ ID NO:72), KSSQSLVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:73), KSSQSLVHSNGYNYLE (SEQ ID NO:74), KSSQSLVHSNGYTYLE (SEQ ID NO:75), KSSQSILHSNGYTYLE (SEQ ID NO:76),またはKSSQSLLHSNGYTYLE (SEQ ID NO:77)を有する。一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体の軽鎖可変領域は、図1に示したCDRL3、およびX1がVまたはGであるアミノ酸配列RX1SNRAS(SEQ ID NO:38)を含むCDR2(CDRL2)を有する。一部の態様において、X1はV(SEQ ID NO:78)である。一部の態様において、X1はG(SEQ ID NO:79)である。
【００８８】
一部の態様において、VL領域のVセグメントは、図1に示したようにCDR1および/またはCDR2を有する。従って、本発明の抗体は、RSSQSIVHSNGNNYLE (SEQ ID NO:64), KSSQSIVHSNGNNYLE (SEQ ID NO:65), RSSQSLVHSNGNNYLE (SEQ ID NO:66), KSSQSLVHSNGNNYLE (SEQ ID NO:67), RSSQSLVHSNGYTYLE (SEQ ID NO:68), RSSQSLVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:69), RSSQSLVHSNGYNYLE (SEQ ID NO:70), KSSQSLVHSNGYTYLE (SEQ ID NO:71), KSSQSLVHSNGYTYLE (SEQ ID NO:72), KSSQSLVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:73), KSSQSLVHSNGYNYLE (SEQ ID NO:74), KSSQSLVHSNGYTYLE (SEQ ID NO:75), KSSQSILHSNGYTYLE (SEQ ID NO:76),またはKSSQSLLHSNGYTYLE (SEQ ID NO:77)のCDR1配列;および/またはアミノ酸配列RVSNRAS(SEQ ID NO:78)もしくはRGSNRAS(SEQ ID NO:79)を有するCDR2を有してもよい。
【００８９】
特定の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、図1に示したVL領域のVセグメントの1つに示したようにVL領域CDR1およびCDR2を組み合わせて、ならびにFQGSHVPLT (SEQ ID NO:54), SQGSHVPLT (SEQ ID NO:55), NQGSHVPLT (SEQ ID NO:56), FQGSHTPLT (SEQ ID NO:57), FQGVHVPLT (SEQ ID NO:58), FQSSHVPLT (SEQ ID NO:59), SQGSHVPLT (SEQ ID NO:60), FQGSHPPLT (SEQ ID NO:61),またはVQGTHVPLT (SEQ ID NO:62)を含むVL領域CDR3配列を有してもよい。一部の態様において、このような抗EphA3抗体は、FGQGTRLEIK(SEQ ID NO:80)であるVL領域FR4領域を含んでもよい。
【００９０】
一部の態様において、本発明の抗体のVL領域Vセグメントは、図1に示したVセグメント配列を有する。
【００９１】
典型的な態様において、本発明の抗体は、図1に示したVL領域配列を有する。
【００９２】
抗EMR1抗体の例
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、X1がF、V、T、またはNであり;X2がS、V、G、またはTであり;X3がV、L、またはPであるアミノ酸配列X1QGX2HX3PLT(SEQ ID NO:35)を有するCDRL3;X1がRまたはKであり;X2がLまたはIであり;X3がVまたはLであり;X4がNまたはYであり;X5がNまたはTであるアミノ酸配列
2014523867.tif 000082
(SEQ ID NO:37)を有するCDRL1;X1がVまたはGであるアミノ酸配列RX1SNRAS(SEQ ID NO:38)を有するCDRL2を有する。一部の態様において、このような抗体は、X1がQ、S、K、またはVであるアミノ酸配列IYYRGFDX1(SEQ ID NO:31)を有するCDRH3;X1がD、S、またはNであり;X2がMまたはIであるアミノ酸配列X1FGX2H(SEQ ID NO:33)を有するCDRH1;X1がD、N、またはYであるアミノ酸配列
2014523867.tif 000083
(SEQ ID NO:34)を有するCDRH2を有してもよい。
【００９３】
一部の態様において、本発明の抗体は、X1がQ、S、K、またはVであるアミノ酸配列IYYRGFDX1(SEQ ID NO:31)を有するCDRH3;およびX1がF、V、T、またはNであり;X2がS、V、G、またはTであり;X3がV、L、またはPであるアミノ酸配列X1QGX2HX3PLT(SEQ ID NO:35)を有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDS(SEQ ID NO:40)を有するCDRH3およびアミノ酸配列FQGSHVPLT(SEQ ID NO:54)を有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDQ(SEQ ID NO:39)を有するCDRH3およびアミノ酸配列FQGSHVPLT(SEQ ID NO:54)を有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDV(SEQ ID NO:41)を有するCDRH3およびアミノ酸配列FQGSHVPLT(SEQ ID NO:54)を有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDK(SEQ ID NO:42)を有するCDRH3およびアミノ酸配列FQGSHVPLT(SEQ ID NO:54)を有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDQ(SEQ ID NO:39)を有するCDRH3およびアミノ酸配列FQGSHPPLT(SEQ ID NO:61)を有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDV(SEQ ID NO:41)を有するCDRH3およびアミノ酸配列FQGSHPPLT(SEQ ID NO:61)を有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDV(SEQ ID NO:41)を有するCDRH3およびアミノ酸配列SQGSHVPLT(SEQ ID NO:55)を有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDQ(SEQ ID NO:39)を有するCDRH3およびアミノ酸配列SQGSHVPLT(SEQ ID NO:55)を有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDQ(SEQ ID NO:39)を有するCDRH3およびアミノ酸配列VQGTHVPLT(SEQ ID NO:62)を有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDV(SEQ ID NO:41)を有するCDRH3およびアミノ酸配列VQGTHVPLT(SEQ ID NO:62)を有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDQ(SEQ ID NO:39)を有するCDRH3およびアミノ酸配列NQGTHVPLT(SEQ ID NO:81)を有するCDRL3を有する。一部の態様において、本発明の抗体は、アミノ酸配列IYYRGFDV(SEQ ID NO:41)を有するCDRH3およびアミノ酸配列NQGTHVPLT(SEQ ID NO:81)を有するCDRL3を有する。
【００９４】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、図1の重鎖の1つのCDR1、CDR2、およびCDR3ならびに図1に示した軽鎖の1つのCDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:8の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:17の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:4の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:17の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:9の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:17の軽鎖 CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:9の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:18の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:6の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:15の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:7の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:16の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:11の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:21の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:11の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:22の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:9の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:21の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。一部の態様において、抗体は、SEQ ID NO:11の重鎖CDR1、CDR2、およびCDR3ならびにSEQ ID NO:17の軽鎖CDR1、CDR2、およびCDR3を有する。
【００９５】
一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、以下の配列ペア:SEQ ID NO:23およびSEQ ID NO:24; SEQ ID NO:8およびSEQ ID NO:17; SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:17; SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:17; SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:18; SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:15; SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:16; SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:21; SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:22; SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:21;またはSEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:17を含む、VH領域およびVL領域を有する。
【００９６】
IV.抗EMR1抗体の調製
本発明の抗EMR1抗体は、組換え発現、化学合成、および抗体四量体の酵素消化を含むが、これに限定されない当技術分野において公知の任意の手段によって産生することができる。完全長モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマまたは組換え産生によって入手することができる。組換え発現は、当技術分野において公知の任意の適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞などに由来してもよい。
【００９７】
ヒト生殖細胞系列配列に類似したV領域配列を有する抗体を単離する方法は以前に説明されている(米国特許出願公開第20050255552号および同第20060134098号)。抗体ライブラリーを、哺乳動物細胞、酵母細胞、または原核細胞を含む適切な宿主細胞内で発現させることができる。一部の細胞系における発現の場合、細胞外培地への分泌を誘導するために、N末端にシグナルペプチドを導入することができる。抗体は、シグナルペプチドを用いて、またはシグナルペプチドを用いずに大腸菌などの細菌細胞から分泌することができる。シグナルを用いずに大腸菌から抗体断片を分泌させる方法は米国特許出願第20070020685号に記載されている。
【００９８】
一部の態様において、本発明のEMR1結合抗体を作製するために、本明細書に記載のVH領域、例えば、図1に示したVH領域が、本明細書に記載のVL領域、例えば、図1に示したVL領域の1つと組み合わされ、適切な発現系において多数の形式のいずれかで発現される。従って、抗体は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞において、宿主細胞内で、または分泌によって、scFv、Fab、Fab'(免疫グロブリンヒンジ配列を含有する)、F(ab') 2、(2つのFab'分子のヒンジ配列間のジスルフィド結合形成によって形成される)、免疫グロブリン全体もしくは切断型免疫グロブリンとして、または融合タンパク質として発現されてもよい。任意で、メチオニン残基が、N末端に、例えば、シグナルを用いない発現系において産生されたポリペプチドのN末端に存在してもよい。
【００９９】
抗体は、原核生物発現系および真核生物発現系を含む任意の数の発現系を用いて産生することができる。一部の態様において、発現系は、CHO細胞発現系などの哺乳動物細胞発現である。このような多くの系が商業的供給業者から広く入手可能である。抗体がVH領域およびVL領域を含む態様では、VH領域およびVL領域は、1種類のベクターを用いて、例えば、ジシストロニック発現単位において発現されてもよく、異なるプロモーターの制御下で発現されてもよい。他の態様において、VH領域およびVL領域は別個のベクターを用いて発現されてもよい。本明細書に記載のVH領域またはVL領域は任意でN末端にメチオニンを含んでもよい。
【０１００】
本発明の抗体は、Fab、Fab'、F(ab') 2、scFv、またはdABを含む任意の数の形式で産生することができる。本発明の抗体はまたヒト定常領域も含んでよい。軽鎖の定常領域はヒトκ定常領域またはヒトλ定常領域でもよい。重鎖定常領域は、多くの場合、γ鎖定常領域、例えば、γ-1、γ-2、γ-3、またはγ-4定常領域である。他の態様において、抗体はIgAまたはIgMでもよい。
【０１０１】
本発明の一部の態様において、完全な軽鎖を形成するために、抗体VL領域、例えば、図1に示したVL領域はヒトκ定常領域と組み合わされる。
【０１０２】
本発明の一部の態様において、VH領域はヒトγ定常領域、例えば、ヒトγ-1定常領域と組み合わされる。任意の適切なγ-1アロタイプを選択することができる。
【０１０３】
一部の態様において、例えば、抗体が断片である場合、インビボでの半減期を延長するために、別の分子、例えば、ポリエチレングリコール(ペグ化)または血清アルブミンと結合体化することができる。抗体断片のペグ化の例は、Knight et al., Platelets 15:409, 2004 (アブシキシマブの場合); Pedley et al., Br. J. Cancer 70:1126, 1994 (抗CEA 抗体の場合); Chapman et al., Nature Biotech. 17:780, 1999;およびHumphreys, et al., Protein Eng. Des. 20:227,2007)に示される。
【０１０４】
一部の態様において、本発明の抗体はFab'またはaF(ab') 2の形をとる。  
【０１０５】
完全長軽鎖は、VL領域をヒトκ定常領域またはヒトλ定常領域と融合することによって作製される。どちらの定常領域も全ての軽鎖に使用することができる。しかしながら、典型的な態様では、κ定常領域はVκ可変領域と組み合わされて用いられ、λ定常領域はVλ可変領域と共に用いられる。
【０１０６】
Fab'の重鎖は、本発明のVH領域と、ヒト重鎖定常領域配列、最初の定常(CH1)ドメインおよびヒンジ領域の融合によって作製されたFd'断片である。重鎖定常領域配列は任意の免疫グロブリンクラスに由来してもよいが、多くの場合、IgGに由来し、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4に由来してもよい。本発明のFab'抗体はまたハイブリッド配列でもよく、例えば、ヒンジ配列は、ある免疫グロブリンサブクラスに由来してもよく、CH1ドメインは異なるサブクラスに由来してもよい。
【０１０７】
本発明において用いられる抗体は非常に多くの形式をとることができる。一部の態様において、抗体は、Fc領域、例えば、ヒトFc領域を含んでもよい。例えば、このような抗体には、EMR1に結合し、活性アイソタイプを有するIgG抗体が含まれる。一部の態様において、抗体は、Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv、scFv、またはシングルドメイン抗体(「dAb」)などの結合断片でもよい。例えば、一部の態様において、抗体はF(ab') 2でもよい。本発明において使用することができる抗体の他の例示的な態様には、活性化ナノボディまたは活性化ラクダ抗体が含まれる。さらに、このような抗体は当業者に周知の方法によって組換え操作されてもよい。前述のように、このような抗体は、公知の技法を用いて産生することができる。当業者により理解されるように、一部の態様において、抗体が、一価であり得る形式、例えば、FvまたはFab形式をとる場合、三価抗体または四価抗体などの多価抗体として用いられてもよい。多価抗体を作製する方法は公知である(例えば、King et al., Cancer Res. 54:6176-6185, 1994を参照されたい)。
【０１０８】
一部の態様において、本発明において使用するための抗体には、エフェクター機能を有する、例えば、免疫エフェクター細胞上に存在するFc受容体に結合するFc定常領域がある。例示的な「エフェクター機能」には、C1q結合;補体依存性細胞傷害(CDC);Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC);食作用;細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)のダウンレギュレーションなどが含まれる。このようなエフェクター機能は、一般的に、Fc領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わされることを必要とし、公知のアッセイ(例えば、下記で引用される参考文献を参照されたい)を用いて評価することができる。
【０１０９】
活性アイソタイプを有し、好酸球上のFc受容体に結合する抗EMR1抗体はADCCによって細胞死を誘導することができる。
【０１１０】
Fc領域は、天然に存在するIgG1、またはIgG3、IgM、IgA、およびIgEを含む他の活性アイソタイプに由来してもよい。「活性アイソタイプ」は、Fc領域が、Fc受容体との結合を増やす改変または別の方法で抗体の効力を改善する改変を含む抗体を含む。このようなFc定常領域は、Fc受容体との結合を増やす改変、例えば、変異、グリコシル化レベルに対する変化などを含んでもよい。当技術分野において公知のFc領域を改変する多くの方法がある。例えば、米国特許出願公開第20060039904号は、1つまたは複数のFcリガンド(例えば、FcγR、C1q)との改変された結合親和性を含む、増強したエフェクター機能を有するFc受容体変種について説明する。さらに、このようなFc変種はADCCおよび/またはCDC活性が変化している。他のFc変種には、Ghetie et al., Nat Biotech. 15:637-40, 1997; Duncan et al., Nature 332:563-564, 1988; Lund et al., J. Immunol 147:2657-2662, 1991; Lund et al., Mol Immunol 29:53-59, 1992; Alegre et al., Transplantation 57:1537-1543, 1994; Hutchins et al., Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984, 1995; Jefferis et al., Immunol Lett. 44:111-117, 1995; Lund et al., FASEB J 9:115-119, 1995; Jefferis et al., Immunol Lett 54:101-104, 1996; Lund et al., J Immunol 157:4963-4969, 1996; Armour et al., Eur J Immunol 29:2613-2624, 1999; Idusogie et al., J Immunol 164:4178-4184, 200; Reddy et al., J Immunol 164:1925-1933, 2000; Xu et al., Cell Immunol 200:16-26, 2000; Idusogie et al., J Immunol 166:2571-2575, 2001; Shields et al., J Biol Chem 276:6591-6604, 2001; Jefferis et al., Immunol Lett 82:57-65. 2002; Presta et al., Biochem Soc Trans 30:487-490, 2002; Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005-4010, 2006;米国特許第5,624,821号;同第5,885,573号;同第5,677,425号;同第6,165,745号;同第6,277,375号;同第5,869,046号;同第6,121,022号;同第5,624,821号;同第5,648,260号;同第6,194,551号;同第6,737,056号;同第6,821,505号;同第6,277,375号;同第7,335,742号;および同第7,317,091号;ならびにPCT公報WO94/2935;WO99/58572;WO00/42072;WO02/060919、およびWO04/029207によって開示される変種が含まれる。
【０１１１】
グリコシル化は、炭水化物(糖)が巨大分子に酵素的に連結されて、グリカンが生成される翻訳後修飾の一種である。本発明の状況において、炭水化物は、1つまたは複数のN結合を介して(アスパラギン側鎖またはアルギニン側鎖の窒素を介して)抗体Fc領域に取り付けられる。しかしながら、O結合(セリン側鎖、スレオニン側鎖、チロシン側鎖、ヒドロキシリジン側鎖、またはヒドロキシプロリン側鎖のヒドロキシ酸素を介して)も可能である。一般的に、IgG抗体は、CH2ドメインの残基Asn297にある保存されたN結合型グリコシル化部位を有するのに対して、一部のクラスおよびサブクラス、例えば、一部の種のIgDおよびIgAは、多くの場合、ヒンジ領域にO結合型糖も有する。糖は、典型的には、複合高マンノース分枝糖である。N結合の場合、アミノ酸側鎖窒素に直接取り付ける糖は典型的にN-アセチルグルコサミンである。
【０１１２】
一部の態様において、Fc領域のグリコシル化は改変されてもよい。例えば、改変は、例えば、抗体配列内の1つまたは複数のグリコシル化部位を変えることによるアグリコシル化(aglycosylation)でもよい。このようなアプローチは米国特許第5,714,350号および同第6,350,861号にさらに詳述されている。グリコシル化タイプが変化したFc領域、例えば、フコシル残基量が低減した低フコシル化Fc変種、またはフコシル残基を欠くアフコシル化Fc変種、または分岐GlcNAc構造が増加したFc変種も作ることができる。このような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞内で抗体を発現させることによって達成することができる。ラットミエローマ細胞ならびに酵母および植物を含む、グリコシル化機構が変化した細胞が当技術分野において説明されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによって、グリコシル化が変化した抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。Umana et al., Nat. Biotechnol 17:176-180, 1999は、ADCCを10倍にする分岐GlcNacについて説明している。Umanaは、このような分岐分子は低フコシル化をもたらすことを指摘している。Davies, et al., Biotechnol. Bioeng. 74:288-294, 2001は、抗CD20抗体のADCCを増加させる、(分岐GlcNac構造を引き起こす)酵素β1-4-N-アセチルグルコサミン転移酵素III(GnTIII)を挿入したCHO細胞について説明している。米国特許(Umana)第6,602,684号は、分岐GlcNac糖タンパク質を生じるように操作された細胞について説明している。
【０１１３】
抗体調製物のフコシル化を低減する方法の例は、IgG1を産生するフコシル化欠損CHO細胞(Lec13)について説明し、フコース欠損IgG1とヒトFcgammaRIIIAとの結合が50倍まで改善され、ADCCを増加させたことについてさらに説明している、Shields et al., J Biol Chem 277:26733-26740, 2002に示されている。さらに、Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003は、YB2/0およびCHO細胞において産生されたIgGを比較している。YB2/0細胞はフコシル化が減少し、分岐GlcNac含有量が増加した。Niwa et al., Clinc. Cancer Res. 1-:6248-6255, 2004は、抗CD20抗体を、YB2/0細胞において作られた抗体(低フコシル化)と比較し、後者においてADCCの増大を観察した。アフコシル化抗体を産生する技法の例は、例えば、Kanda et al., Glycobiology 17:104-118, 2006において示されている。米国特許第6,946,292号(Kanda)は、アフコシル化抗体を産生するフコシルトランスフェラーゼノックアウト細胞について説明している。米国特許第7,214,775号およびWO00/61739は、100％の抗体がアフコシル化されている抗体調製物について説明している。
【０１１４】
グリコシル化を改変する他の技法も公知である。例えば、米国特許出願公開第20070248600号; 第20070178551号(操作された下等真核生物細胞(酵母)を用いて「ヒト」グリコシル化構造を生じるGlycoFi技術法); 第20080060092号(操作された植物を用いて「ヒト」グリコシル化構造を生じるBiolex技術法); 第20060253928号(「ヒト」抗体を産生するための植物操作についても説明している)を参照されたい。
【０１１５】
フコースを低減するためのさらなる技法には、ProBioGen技術(von Horsten et al., Glycobiology, (advance access publication July 23, 2010); Potelligent(商標)技術(Biowa, Inc. Princeton, N.J.);およびGlycoMAb(商標)グリコシル化操作技術(GLYCART biotechnology AG, Zurich, Switzerland)が含まれる。
【０１１６】
抗体のN結合型オリゴ糖含有量は当技術分野において公知の方法によって分析することができる。以下は、このような方法の一例である。抗体を酵素N-グリコシダーゼF(Roche;TaKaRa)による消化に供する。放出された炭水化物を、陽イオンモードでマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)によって分析する(Papac et al., Glycobiol. 8:445-454, 1998)。次いで、単糖組成物を、改良された高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC)(Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278:3466-3473, 2003)によって特徴付ける。
【０１１７】
本発明の一部の態様において、抗体は、免疫原性を低減するように、例えば、抗体が反復投与に適するようにさらに操作される。免疫原性が低減した抗体を作製する方法には、ヒト化法およびヒューマニアリング(humaneering)法ならびに改変法、例えば、T細胞エピトープを除去するように、抗体が、例えば、1つまたは複数のフレームワーク領域においてさらに操作される脱免疫化(de-immunization)が含まれる。
【０１１８】
V.EMR1が標的である疾患の治療のための抗EMR1抗体の投与
本発明はまた、抗EMR1抗体を投与することによって、EMR1発現細胞、例えば、好酸球を死滅させることが望ましい疾患を有する患者を治療する方法を提供する。一部の態様において、患者は、慢性閉塞性肺疾患、慢性好酸球性肺炎、アレルギー性喘息を含む喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、アレルギー性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病、胃食道逆流疾患、鼻ポリープ症、好酸球性胃腸炎、好酸球性胃炎、好酸球性食道炎、好酸球性大腸炎、チャーグ・ストラウス症候群、好酸球性筋痛症候群、好酸球増加症候群、偶発性血管浮腫、オンコセルカ属皮膚炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、寄生虫感染症に起因する好酸球性肺疾患、好酸球性脂肪組織炎、好酸球増加を伴う偶発性血管浮腫(グライヒ症候群)、骨髄-リンパ節肉芽腫および前部ブドウ膜炎を伴う急性好酸球性間質性腎炎および腎不全、サムター症候群、気管支喘息、アスピリン不耐症、慢性副鼻腔炎、NARES(好酸球増加症候群を伴う非アレルギー性鼻炎)、薬物誘発性もしくは毒素誘発性の肺臓炎、または急性もしくは慢性の好酸球性白血病などがあるが、これに限定されない、好酸球増加に関連したアレルギー性および/またはアトピー性の応答を有する。一部の態様において、患者は慢性閉塞性肺疾患を有する。一部の態様において、本発明の抗EMR1抗体は、ポリープの再発を阻止または低減するために鼻ポリープ除去後に対象に投与される。
【０１１９】
本発明の方法は、疾患に適した投与計画を用いて、薬学的組成物として抗EMR1抗体を治療有効量で患者に投与する工程を含む。組成物は、様々な薬物送達系における使用に合わせて処方することができる。適切な製剤のために、1種類または複数種の生理学的に許容される賦形剤または担体も組成物に含めることができる。本発明において使用するための適切な製剤は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins, 2005に見られる。
【０１２０】
抗EMR1抗体は、患者への注射に適した溶液、例えば、注射用滅菌等張水溶液に溶解して提供される。抗体は、許容される担体に溶解して適切な濃度で溶解または懸濁される。一部の態様において、担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水など水性である。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要に応じて補助的な薬学的物質、例えば、pH調整剤および緩衝剤、張性調整剤などを含有してもよい。
【０１２１】
本発明の薬学的組成物は、疾患または疾患の症状およびその合併症を治癒させる、または少なくとも部分的に抑えるのに十分な量で、好酸球によって媒介される疾患を有する患者、例えば、アレルギー性喘息または慢性閉塞性肺疾患を有する患者に投与される。これを達成するのに十分な量は「治療に有効な用量」と定義される。治療に有効な用量は、療法に対する患者の応答をモニタリングすることによって求められる。治療に有効な用量を示す典型的なベンチマークには、患者における疾患の症状の寛解が含まれる。この使用に有効な量は、疾患の重篤度、および年齢、体重、性別、投与経路などの他の要因を含む患者の健康の一般状態に左右されるだろう。患者によって必要および許容される投与量および頻度に応じて、単回投与または複数回投与の抗体を投与することができる。いかなる事象においても、前記方法は、患者を効果的に治療するのに十分な量の抗EMR1抗体を提供する。
【０１２２】
抗体は、静脈内経路、皮下経路、筋肉内経路、または腹腔内経路を含むが、これに限定されない任意の適切な経路を介して注射または注入によって投与することができる。一部の態様において、抗体はガス注入によって投与されてもよい。例示的な態様において、抗体は、注射用滅菌等張食塩水に溶解して10mg/ml、4℃で保管されてもよく、患者への投与前に100mlまたは200mlの0.9％注射用塩化ナトリウムで希釈される。一部の態様において、抗体は0.01〜25mg/kgの用量で1時間にわたって静脈内注入によって投与される。他の態様において、抗体は静脈内注入によって15分〜2時間の期間にわたって投与される。さらに他の態様において、投与手順は皮下ボーラス注射を介するものである。
【０１２３】
患者に有効な療法を提供するために抗体の用量が選択され、0.01mg /kg体重未満〜約25mg/kg体重の範囲内または1mg〜2g/患者の範囲内にある。好ましくは、用量は、0.1〜10mg/kgまたは約50mg〜1000mg/患者の範囲内にある。用量は、抗体の薬物動態(例えば、循環中の抗体の半減期)および薬力学的応答(例えば、抗体の治療効果の期間)に応じて、1日1回〜3ヶ月に1回または6ヶ月に1回の範囲内でよい適切な頻度で繰り返されてもよい。一部の態様において、約7〜約25日のインビボ半減期および抗体投与が1週間に1回〜3ヶ月に1回または6ヶ月に1回繰り返される。他の態様において、抗体は1ヶ月に約1回投与される。
【０１２４】
好酸球を枯渇させる本発明の抗EMR1抗体は、1種類または複数種のさらなる治療剤、例えば、炎症を減少させる薬剤、例えば、コルチコステロイド;IL-5遮断剤;非ステロイド性抗炎症薬、および他の公知の薬剤と共に投与されてもよい。
【０１２５】
VI.診断方法および予後判定方法
診断目的および予後判定目的にも抗EMR1抗体が用いられてもよい。このような抗体には、マウスモノクローナル抗体、例えば、19-4G9、18-2G11、もしくは4262-5(表1を参照されたい);EMR1のELD-6に選択的に結合する抗体;または本明細書に記載のVH領域および/もしくはVL領域を有する抗体が含まれるが、これに限定されない。例えば、患者に由来する細胞におけるEMR1レベルの検出などの臨床分析のためにVH領域および/またはVL領域が用いられてもよい。本発明のVH領域またはVL領域はまた、例えば、抗Id抗体を産生するのにも用いられてもよい。
【０１２６】
一部の態様において、対象は、好酸球を選択的に枯渇させる薬剤、例えば、本発明の抗EMR1抗体による治療の候補かどうか確かめるために評価されてもよい。対象からの生物学的試料が、関心対象の組織および/または末梢血における好酸球の存在について評価される。例えば、患者に喘息または好酸球性肺疾患があるのであれば、痰または洗浄試料が分析されてもよい。好酸球性胃炎症障害を有する、または好酸球性胃炎症障害を有すると疑われる患者は、炎症胃腸組織を評価できるように生検を受けてもよい。他の態様において、血液試料が、正常を上回る好酸球レベルの存在について評価されてもよい。
【０１２７】
一部の態様において、好酸球を選択的に枯渇させる抗EMR1抗体、例えば、本明細書に記載のELD-6に結合する抗体による治療の候補である患者を特定するために、IL-5受容体(IL-5R)が評価されてもよい。IL-5Rは好酸球上および好塩基球上で発現している(例えば、Miyiajima et al., Blood 82:1960-1974, 1993を参照されたい)。IL-5R抗体を用いて、血中または関心対象の組織試料中の好酸球レベルを決定する様々な免疫学的方法を使用することができる。一部の態様において、可溶性IL-5R(sIL-5-R)であるIL-5Rスプライスバリアントの存在が好酸球性疾患と関連付けられ(Semic-Jusufagic, et al., Pediatr Allergy Immunol. 21:1052-1058, 2010)、本発明の治療用抗EMR1抗体による治療の候補である患者を特定するために用いられてもよい。この可溶性スプライスバリアントは、ELISAによって、またはsIL5r RNAを検出する方法、例えば、RT-PCR(Perez et al., BMC Biotechnology 3:17, 2003)を用いて検出することができる。
【０１２８】
炎症疾患またはアレルギー性疾患を有し、好酸球が上昇している患者は、本発明の抗EMR1抗体によって治療することができる。本発明の状況において、血液試料中のレベルが正常を上回っている時、または組織試料が、正常を上回る好酸球浸潤レベルを有すると示された時に、患者の好酸球は上昇している。正常レベルは、好酸球性疾患のない患者において確かめることができる。
【実施例】
【０１２９】
実施例1.EMR1特異的モノクローナル抗体の特定
精製ヒトEMR1-Fc融合タンパク質で免疫したマウスに由来する脾臓B細胞をSP2/0-Ag14細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞株を作製した。モノクローナル株に由来する抗体を含有する上清を、組換えヒトEMR1との結合についてELISAによって試験した。EMR1に結合した抗体を、ヒト好酸球との結合についてフローサイトメトリーによって試験した。バフィーコート血液に由来する多形核細胞に富む画分をフィコール勾配遠心分離法によって入手し、残存している赤血球を塩化アンモニウム(ACK溶解緩衝液)で溶解した。好酸球を、MACS好酸球単離キット(Miltenyi)を用いて負の選択によって単離し、非特異的IgG結合をブロックするために10μg/mlラットIgGおよび2％BSAとインキュベートした後に、抗EMR1抗体またはアイソタイプ対照抗体を添加した。結合した抗体をFACSCaliburフローサイトメーターにおいて検出するために、抗マウスFITC抗体を使用した。
【０１３０】
抗EMR1抗体と他の末梢血細胞タイプとの結合を以下の通りフローサイトメトリーによって分析した。末梢血単核球画分(PBMC)を、フィコール密度遠心分離法によってバフィーコート調製物から単離し、非特異的結合をブロックするために10μg/mlラットIgGおよび2％BSAで処理した後に、5μg/mlの抗EMR1抗体で処理した。洗浄後、細胞を抗マウスフィコエリトリンとインキュベートし、洗浄し、顆粒球(強い側方散乱光)集団からT細胞を検出するために抗CD3-FITCと、B細胞を検出するために抗CD20-FITCと、NK細胞を検出するために抗CD56-FITCと、単球を検出するために抗CD14-FITCと、好塩基球を検出するために抗IgE受容体-FITCと、または好中球を検出するために抗CD16-FITCと別々の試料をインキュベートした。洗浄後、フローサイトメトリー分析から死細胞を除くためにヨウ化プロピジウムを添加した。抗体19-1E7、19-4G9、4262-5、および18-2G11は好酸球に選択的に結合し、リンパ球、単球、好中球、好塩基球に検出可能に結合しなかった(表1を参照されたい)。4種類のさらなる抗EMR1抗体が好酸球および単球に結合し、これらのクローンの1つ(19-3D2)は好塩基球に結合した。
【０１３１】
抗体19-1E7および抗体4262-5もマクロファージとの結合について試験した。単球からマクロファージへの分化を誘導するために、バフィーコート調製物から単離されたPBMCを、10％FBS、IL3、およびGM-CSFを含むRPMI1640培地に10日間プレートした。次いで、付着マクロファージを収集し、ブロックし、前記のようにEMR1についてプローブした。抗CD14-FITCを用いてマクロファージを染色した。付着CD14+マクロファージへの結合は観察されなかった。
【０１３２】
（表１）抗EMR1モノクローナル抗体とヒト末梢血細胞との結合。エオシン=好酸球、Neut=好中球、Mon=単球、Mac=マクロファージ、Bas=好塩基球
2014523867.tif 000084
【０１３３】
実施例2.キメラ19-1E7(c1E7)抗体の作製
マウスハイブリドーマ19-1E7に由来する重鎖V領域および軽鎖V領域を、Chardes et al., FEBS Letters 452:386-394 (2007)に記載のプライマーセットを用いてRT-PCRによってクローニングした。19-1E7重鎖可変領域および軽鎖可変領域の可変領域配列を以下に示した。CDR配列には下線を引いた。
2014523867.tif 000085
【０１３４】
さらなるPCRを用いてV重鎖領域およびVκ領域を増幅し、大腸菌からの発現および分泌のために発現ベクターへのクローニングに適した制限酵素部位を組み込んだ。V領域を発現ベクターにクローニングし(EM5と名付け)、大腸菌内でFab断片として発現および分泌させた。EM5 FabはELISAアッセイにおいてEMR1-Fc抗原に結合した。19-1E7重鎖可変領域および軽鎖可変領域をpEE12.4哺乳動物発現ベクター内でヒトγ-1Fcおよびκ定常領域とも組み合わせて、キメラ19-1E7 IgG1k抗体を作製した(c1E7と名付けた)。c1E7発現プラスミドを、炭水化物含有フコースを有するIgGを産生するためにCHOK1SV細胞株にトランスフェクトし、フコースの無いIgGを産生するためにMS704-PF CHO細胞株にトランスフェクトした。
【０１３５】
トランスフェクションのために、2μgのpEE12.4 c1E7 DNAを、100μlのOpti-MEM I培地に溶解した6μlのFugene HD(Roche 04709691001)と室温で20分間インキュベートした後に、6ウェルプレート1ウェルあたり1.5x106個の細胞でプレートしたCHO細胞に滴下し、一晩インキュベートした。次いで、トランスフェクト細胞を、HTサプリメント、GSサプリメント(Sigma 58672C)および50μM MSX(Sigma M5379)ならびに10mg/Lフェノールレッド(Sigma P0290)を含むEX-CELL 325 PF CHO Protein-Free Mediumで希釈し、96ウェルプレートに0.2ml/ウェルでプレートした。ウエスタンブロット(以下を参照されたい)による初回スクリーニング後に、トランスフェクト細胞株を拡大し、HTサプリメント、GSサプリメント、および25μM MSXを含むEX-CELL 325 PF CHO Protein-Free培地中で継代培養した。細胞を加湿インキュベーター内で37℃、5％CO2で増殖させた。分泌されたIgGを、フコシル化キメラ1E7(c1E7)を調製するためにはCHOK1SVトランスフェクタントクローンから、非フコシル化c1E7を調製するためにはMS704-PFトランスフェクタントからプロテインAアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
【０１３６】
実施例3.抗EMR1キメラモノクローナル抗体19-1E7が結合する直鎖エピトープの特定
モノクローナル抗体19-1E7はヒトおよびカニクイザルEMR1に結合し、CD97にもEMR2にも結合しない。抗体が結合する、EMR1上の結合部位を特定するために、エピトープマッピングを行った。還元条件下でのキメラ1E7(c1E7)抗体を用いたEMR1の初回ウエスタンブロット分析から、c1E7は、SDS含有緩衝液中での煮沸による還元および変性による影響を受けないEMR1上の直鎖エピトープに結合することが示唆された。単量体EMR1を生成するために、EMR1-Fcをパパインで処理し、放出されたFcタグをプロテインAカラムによって捕捉した。単量体EMR1をカルボキシペプチダーゼYでさらに消化し、図3に示したように、作製されたタンパク質断片を、c1E7抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。ウエスタンブロット分析から、c1E7は、タンパク質C末端にある約100残基を欠くEMR1に結合しないことが分かった。図3に示したように、c1E7抗体は、ELD-6の無いEMR1欠失変異体に結合しなかった。エピトープをさらに定義するために、ELD-6の54アミノ酸をカバーする3つの重複ペプチドを、c1E7との結合について、ForteBio Octet計器を用いたバイオレイヤー干渉法によって分析した。SEQ ID NO:1のELD-6位置268-316にまたがるように使用したペプチドは、以下:
2014523867.tif 000086
であった。
【０１３７】
結合分析の結果を図4に示した。これから、抗体はペプチド1に結合することが分かる。ペプチド1にまたがる、さらに2つのペプチド(4および5)をForteBioによって分析した。これらの配列は、以下:
2014523867.tif 000087
であった。バイオレイヤー干渉法結合データはc1E7とペプチド4との結合を示したが、ペプチド5との結合を示さなかった。ペプチド4にまたがる、さらに2つのペプチド(6および7)をForteBioによって分析した。これらの配列は、以下:
2014523867.tif 000088
であった。ForteBioデータは、c1E7とペプチド7との結合を示したが、ペプチド6との結合を示さなかった(図4)。エピトープマッピング分析から、c1E7エピトープは、以下の配列領域:
2014523867.tif 000089
(SEQ ID NO:30)の中にあることが分かった。
【０１３８】
（表２）c1E7と、EMR1 ELD6にまたがるペプチドとの結合
2014523867.tif 000090
【０１３９】
実施例4.キメラ1E7抗体のADCC活性
抗EMR1抗体を、好酸球標的細胞に対する抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)活性について試験した。実施例1に記載のように単離されたヒト好酸球を、10％FCSおよび0.1nM IL-5を含むRPMI1640培地に入れて一晩維持した。同じバフィーコート調製物から、NK細胞を、フィコール勾配のPBMC層およびNK細胞単離キット(Miltenyi)を用いた負の選択から単離した。単離されたNK細胞を、10％FCSおよび30ng/ml IL-2を含むRPMI 1640中で一晩、増殖および拡大させた。好酸球およびNK細胞を1:1標的:エフェクター細胞比で組み合わせ、5％CO2、37℃で一晩、抗EMR1抗体とインキュベートした。ADCC活性を、Cytotox 96 Cytotoxicity assay kit(Promega)を用いてLDH放出によって測定した(図5)。
【０１４０】
非フコシル化c1E7は、フコースを含有するc1E7抗体より高いADCC活性を示した。非フコシル化キメラ1E7をキメラ1E7と比較すると、非フコシル化1E7については10μg/mlおよび1μg/mlで完全に近い細胞傷害が示され、フコシル化抗体によるADCC活性は10μg/mlまでの濃度で検出できなかった。
【０１４１】
実施例5.ヒト生殖細胞系列配列と極めて相同なV領域配列を有する操作された抗体を得るための1E7の操作
1E7抗体は、(ヒト配列を含むように操作された)HUMANEERED(商標)であった。
【０１４２】
エピトープフォーカス(epitope-focused)ライブラリーを、BSDおよびヒト生殖細胞系列Jセグメント配列を含有する独特のCDR3-FR4領域と連結されたヒトVセグメントライブラリー配列から構築した。完全長Vh(Vh3およびVh4) セグメントライブラリーならびにVk(VkII)セグメントライブラリーを、最初にマウスVセグメントの一部だけがヒト配列ライブラリーによって置換される「カセット」ライブラリーを構築するための基礎として使用した。Vh鎖およびVk鎖のために、いくつかのタイプのカセットライブラリーを構築した。フレームワーク2領域内の共通重複配列を用いたオーバーラップエクステンションPCRによって、V重鎖用のカセットおよびVκ鎖用のカセットを作った。このように、ヒトVh3サブクラスおよびVh4サブクラス用に「最前部」ヒトカセットライブラリー、「中央」ヒトカセットライブラリー、およびFR3ヒトカセットライブラリーを構築した。ヒトVkIIサブクラス用に「最前部」カセットライブラリー、「中央」カセットライブラリー、およびFR3カセットライブラリーを構築した。
【０１４３】
さらに、操作されたCDRからなるCDRカセットライブラリーを構築した。CDRカセットライブラリーでは、アミノ酸バリエーションがCDR PCRプライマーに導入され、部分的なCDR配列と単一のフレームワーク配列のライブラリーまたはヒト脾臓Vセグメントライブラリーに由来するフレームワーク配列のライブラリーと一緒に変種が同時増幅される。重鎖CDR2カセットライブラリーの構築を図6に図示した。参照CDR2の最初の6個の残基(とY変種)が保持された(四角で囲んだ)。これらは5'PCRプライマーによってコードされる。3'PCRプライマーはヒト生殖細胞系列Vh3 FR3に相補的である。プライマーを用いて、選択された単一のヒトVh3 FR3(脾臓mRNAに由来する)を増幅し、操作されたCDR2ライブラリーに付加した。連続したオーバーラップエクステンションPCR反応を用いて、「最前部」およびCDR3-FR4カセットを取り付けて、機能的な操作された重鎖V領域ライブラリーを構築した。
【０１４４】
軽鎖FR1-CDR1用の第2のCDRカセットライブラリー戦略を図7に示した。CDR1のいくつかの位置にあるアミノ酸変種をコードするリバースプライマーを合成した。カセットプライマーおよびフォワードプライマーを用いて、ヒト脾臓cDNAからFR1-CDR1ライブラリーをPCR増幅した。機能的な操作された軽鎖V領域ライブラリーを構築するために、オーバーラップエクステンションPCR反応を用いて、FR1-CDR1カセットをFR2-CDR2-CDR3カセットに取り付けた。
【０１４５】
抗原との結合を助けたヒトV重鎖カセットおよびVκカセットをコロニーリフト結合アッセイによって特定し、親和性による順番をELISAで確かめた。重鎖変種のコロニーリフト結合スクリーニングによって、EMR1-Fc組換え融合タンパク質抗原結合を助けたFR1-CDR1、CDR2-FR3、およびFR3-CDR3-FR4カセットが特定された。軽鎖変種のコロニーリフト結合スクリーニングによって、抗原結合を助けたFR1-CDR1、「中央」、およびFR3-CDR3-FR4カセットが特定された。抗原に結合する完全に操作された高親和性Fabを選択するために、オーバーラップエクステンションPCRによって各鎖の機能カセットを組換えし、その後に、コロニーリフト結合アッセイによってスクリーニングした。
【０１４６】
高親和性の完全に操作されたFabのプールの特定後、CDR3親和性成熟ライブラリーを構築した。操作されたFabクローンのパネルの共通CDR3 BSD配列を、縮重PCRプライマーを用いて変異させて、ライブラリーを作製した。これらの変異誘発ライブラリーを、コロニーリフト結合およびELISAアッセイを用いてスクリーニングした。選択されたFabの親和性をELISAおよびForteBioキネティック分析によってランク付けした。キメラFabと比較した時に、抗原に対する類似した、または改善された親和性を助けた変異を特定し、図8に示した。抗原結合を助けた、または改善した重鎖CDR3変異および軽鎖CDR3変異は、それぞれのCDRのBSD領域を定義するのに役立つ。
【０１４７】
実施例6.抗EMR1抗体を用いた好酸球の枯渇
単一用量の非フコシル化c1E7抗体を、2種類の用量レベル;1mg/kgおよび5mg/kgで雄カニクイザルの2つの群(n=2)にi.v.投与した。投与56日後まで採取した血液試料から白血球および好酸球を計数した。図9では、A)5mg/kgおよびB)1mg/kg抗体が投与された動物について、循環好酸球数を総白血球に対するパーセントとして表した。(データは各群の2匹の動物からの平均である)。5mg/kgの抗体を投与して2時間以内に、かつ1mg/kg c1E7で処置された動物では(投与8時間後に採取した)最初の血液試料の時間までに、循環から好酸球は枯渇された。好酸球数は、1mg/kg群では投与して28日後までに正常範囲に戻った。5mg/kg群では好酸球数の回復はもっと後になって生じた。平均好酸球数は42日以内に正常に戻った。総白血球は抗体処置の影響を受けなかった。従って、抗体は、選択的かつ可逆的な強力な循環好酸球枯渇を示した。
【０１４８】
以下の実施例は例示にすぎず、限定を目的としない。当業者であれば、本質的に似た結果を得るために変化または変更することができる様々な重要でないパラメータを容易に理解するだろう。
【０１４９】
本明細書において引用された全ての特許、特許出願、アクセッション番号、および他の公開された参照資料は、本明細書において引用された全ての特許、特許出願、アクセッション番号、および他の公開された参照資料と関連する保護対象(subject matter)の開示のために、その全体が本明細書に参照により組み入れられる。
【０１５０】
SEQ ID NO:25 EMR1細胞外ドメインアミノ酸配列
以下は、GenBankアクセッション番号CAA57232.1からのEMR1細胞外ドメインアミノ酸配列の一例である。
2014523867.tif 000091
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014523867000001.app
【国際調査報告】
2014523867.tif 000092
2014523867.tif 000093
2014523867.tif 000094