(57)【要約】  本発明は、水分活性が0.5未満である、生体物質、油及び生体高分子を含有する保存安定組成物及びその製造方法に関する。当該組成物における生体物質は、顕著な安定性、及び温度、湿度及び酸素劣化への耐性を達成する。本発明の利点には、安定化、さらなる処理、保存、及び後日のプロバイオティック細菌の放出、及び生存能力の維持能力がある。さらに、当該組成物及び方法は、単純であり、低エネルギー要請であり、且つ得られる産物は調製物及び食品に容易に組み込まれるので、プロバイオティック物質等の生体物質の作製及び市販のためにより実質的である。
2011502505.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体物質、油及び生体高分子を含有し、水分活性が0.7未満の保存安定組成物であって、当該組成物を環境温度で保存する場合、組成物中の生体物質が生存可能な状態を維持する、組成物。
【請求項２】
水分活性が0.4未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
水分活性が0.2未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物における生体物質の生存能力の損失が、25℃で少なくとも１ヶ月保存した場合、２log超まで減少しない、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物における生体物質が、相対湿度60％、25℃で、少なくとも３日間保存した場合、生存能力の損失が50％未満である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記生体物質が、少なくとも１つの微生物を含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記生体物質が、少なくとも１つの細菌又は真菌を含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記細菌が偏性嫌気性菌である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記細菌が、ラクトバチルス、ビフィドバクテリウム、ストレプトコッカス（エンテロコッカス）、及びその組み合わせからなる群から選択される属のプロバイオティック細菌である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物における細菌の細胞濃度が、１グラム当たり105細胞〜1012細胞の範囲である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記油が食用油である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記油が植物油である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記油が、オリーブ油、ナタネ油、ヒマワリ種子油、加水分解油、及びその組み合わせから選択されてもよい、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
油に対する乾燥生体物質の比率が、およそ１：１０〜１０：１である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記生体高分子がゴムである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ゴムの分子量が5,000〜50,000,000であることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記生体高分子が、寒天、アルギン酸塩、カシア（cassia）、ダンマー、ペクチン、ベータ−グルカン、グルコマンナン、マスチック、チクル、オオバコ、トウヒ、ジェラン、グアー、ローカストビーン、キサンタン、及びその組み合わせからなる群から選択されるゴムである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
生体高分子に対する生体物質が、生体物質およそ１部対生体高分子0.25又は１部の比率である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
さらに抗酸化剤を含んでなる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗酸化剤が、乾燥生体物質１グラム対抗酸化剤５〜100μLの比率で含まれるトコフェロールである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記乾燥物質が、米粉、コーンスターチ粉、ポテトスターチ粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、二酸化ケイ素、リン酸カルシウム、セルロース、ポリエチレングリコール、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記乾燥物質が、組成物１部対乾燥剤１部の比率で含まれる、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
密閉バッグ内に、標準気圧条件下で保存される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の保存安定組成物を含む食物。
【請求項２５】
前記食物が実質的に乾燥しており、環境温度で保存される、請求項２４に記載の食物。
【請求項２６】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の保存安定組成物を含む栄養補助食品。
【請求項２７】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の保存安定組成物を含む食物原料。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物に覆われるブラン・フレーク。
【請求項２９】
安定化生体物質を含む保存安定組成物の製造方法であって、当該方法は、
（ａ）乾燥生体物質を用意するステップ；
（ｂ）少なくとも１つの油で、前記乾燥生体物質を被覆し、油被覆物質を形成させるステップ；
（ｃ）少なくとも１つの生体高分子物質で、前記油被覆物質を被覆し、前記組成物を作製するステップ；によるものであり、
ここで環境温度で保存する場合、当該組成物における生体物質は生存可能な状態を維持する、方法。
【請求項３０】
環境温度、湿度及び大気で行われる、請求項２９に記載される方法。
【請求項３１】
前記乾燥生体物質は、乾燥により前処理される、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記乾燥生体物質は、粒子サイズがおよそ2 mm未満の粉末である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記粒子サイズが200μm未満である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ステップ（ａ）の乾燥生体物質の水分活性が0.7及び未満である、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記水分活性が0.4未満である、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記生体物質が、少なくとも１つの微生物を含有する、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記生体高分子は、粒子サイズが2 mm未満の粉末である、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記生体高分子がゴムである、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ゴムの分子量が5,000〜50,000,000であることを特徴とする、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
少なくとも１つの抗酸化剤が、ステップ（ｂ）と（ｃ）との間で添加される、請求項２９〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つの乾燥剤が、ステップ（ｃ）の後に添加される、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
方法において使用される乾燥剤の水分活性が0.4未満である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ステップ（ａ）で選択される乾燥細胞１グラム当たり、１段階当たり、乾燥剤が１〜10グラムの比率で添加される、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記乾燥剤が、複数の段階において、ステップ（ｃ）の組成物に対して添加される、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ａ）において選択される乾燥細胞１グラム当たり、計20グラムの乾燥剤が使用される、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
十分な乾燥剤を添加し、粗いクランブル（crumble）を形成させる、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記作製される組成物が、押し出し型剤、錠剤、顆粒、丸薬、及びペレットからなる群から選択される形態にさらに処理される、請求項２９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
処理前後の細胞数の損失の差異が、２log未満である、請求項２９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記作製される組成物が物質で被覆される、請求項２９〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記作製される組成物が、密閉バッグ内において保存される、請求項２９〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
請求項２９〜５０のいずれか１項に記載の方法により作製される製品。
【請求項５２】
請求項２９〜５０のいずれか１項に記載の方法により作製される組成物を含む食品。
【請求項５３】
請求項２９〜５０のいずれか１項に記載の方法により作製される組成物を含む食物原料。
【請求項５４】
請求項２９〜５０のいずれか１項に記載の方法により作製される組成物を含む栄養補助食品。
【請求項５５】
請求項２９〜５０のいずれか１項に記載の方法により作製される組成物に覆われるブラン・フレーク。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥生体物質の安定化に関する。より具体的には、本発明は、生体物質を含む組成物、及び前記生体物質が安定である組成物を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
対応出願の記述
本出願は、ニュージーランド特許出願第555022号に関連する分野の仮出願に基づき、その全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
生体物質は、熱、湿気等に関して、好ましい条件以外で保存した場合、不安定になる傾向がある。当該物質を安定化することは、食物、農業産物、研究物質等、後の使用のための製品を製造する場合に決定的に重要である。
【０００４】
以下の議論では、プロバイオティック細菌に関する安定性問題について記載するが、当該問題は細菌に限定されるものではなく、むしろプロバイオティクスの例が例示する、解決すべき課題の一部である。
【０００５】
プロバイオティクスは、生存可能な微生物製剤であり、腸内の天然ミクロフローラを保存することにより哺乳類の健康を促進させる。プロバイオティクスは、腸粘膜に付着し、腸管にコロニー形成し、それにより有害な微生物がそこに付着するのを防ぐと考えられる。その作用のための必須要件は、消化管の粘膜に、適切且つ実施可能な状態で到達し、特に胃内の低ｐＨにより破壊されないことである。
【０００６】
活性な生体物質、特に食物の運搬に関連する既知の問題は、生存可能な状態又は安定な状態で使用されるまでの、当該物質のメンテナンスである。当該プロバイオティックがその胃に活性を送達するよう、生存能力は胃を通過して継続する必要もある。最終的に、特に環境温度で保存される場合に長期間の保存では、多くの生体物質を生存可能な条件で維持できないため、保存安定性も重要である。
【０００７】
現在のところ、細菌性生体物質は、長期間、市販するのに有用な数の生存率を確保する、高濃度の細菌製品を必要とする。これは、生存能力の保存を、冷凍及び／又は凍結乾燥を用いてある程度まで抑えることにより達成している。さらに、微生物製品には、接種投与の送達しか必要としないものもあるが、プロバイオティクスを含む他の微生物製品では、その製品の成功のためにより高い最小投薬濃度の送達が必須である。
【０００８】
発明者等は、通常の安定性についての問題に加えて、乾燥状態のプロバイオティック細菌は、環境条件において劣化に対して特に感受性が高いという、さらなる問題を有することを発見した。これは、当該乾燥細菌の高含水性によるもので、これにより、湿気及び／又は暖かい環境において、当該細菌は急速にその生存能力を失うことになる。
【０００９】
このような応用のための安定化の重要性を例示するために、プロバイオティック細菌の単離種を組み込むペットフードについての記載がある国際公開第01/90311号（Nestlel)を参照する。当該細菌は、約２時間、ｐＨ範囲が約3.4〜約4.2（胃胆汁酸条件）で、少なくとも１×106cfu/ml生産できる必要がある。この'311公報においては、安定化の方法は特に提供されておらず、むしろ細菌がその特性により選択される。発明者等の経験では、なんらかの安定化状態でない場合、当該プロバイオティック細菌は、特に使用前に室温で保存すると、生存能力を急速に１×106cfu/ml未満まで失うことになる。
【００１０】
プロバイオティクスを生存させて送達することの重要性も教示する別の特許出願には、国際公開第2005/060709号（Proctor and Gamble）がある。この'709出願は、切除及び洗浄した哺乳類の消化管からの単離により得られる、ビフィドバクテリア（Bifidobacteria）のプロバイオティック種を含む組成物を記載する。当該'709公報は、ビフィドバクテリアがＧ１経路の通過後に生存能力を維持できることが必要であるので、当該細菌を安定化する重要性を認識している。経口で摂取されるこの細菌が生きた培養物であるため、及び食道及び胃の通過後、腸及び腸管において発生するコロニー形成のためにこれが所望される。非生細胞又は精製されたその単離物の経口投与は、一時的な利益をもたらすが、細胞が生きていない場合、これらは成長することも、インサイチュ（in situ）でのプロバイオティック効果を連続的に送達することもできないことに留意されたい。当該'709公報は、本発明の乳酸細菌がｐＨ2.5の培地で１時間（胃酸消化と同じ）懸濁後、生存能力を維持することが好ましいと記載する。慎重な処理、例えば窒素流入、及び処理中及び保存中の密閉容器の使用等以外の安定化法に関しては、ほとんど特定のものを教示していない。送達方法は、ビスケット又はキブル（kibble）、処理された穀物食餌、ヨーグルト、グレイビー（gravies）、チューズ（chews）、おやつ等の乾燥動物食物内のプロバイオティック等が記載されているのみである。
【００１１】
安定性の問題に取り組もうとした方法は、国際公開第2005/030229号（Crittendon）に記載されるものである。この'299公報において、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）プロバイオティック種は、フィルム形成性のタンパク質−炭水化物−油エマルション内にマイクロカプセル化される。カプセル化ステップは、非冷凍保存及び胃腸管通過の間、当該細菌を保護するためであると記載される。当該マイクロカプセルは、小さく（15〜20μm）、水分活性が低く（0.2〜0.3）、人工腸液に細菌を急速に放出すると記載される。'299公報の方法を用いて作製される乾燥マイクロカプセルの、非冷凍保存（25℃、50％相対湿度）での保存期限は、非カプセル化細菌のものより有意に高かった。'299公報は、5週にわたっておよそ２logの損失を教示するものであるが、これは本発明者等の経験によればまだ理想的ではない。
【００１２】
本発明者等はこの損失は、微生体物質が、水溶液に懸濁され（再水和）、その後高温で噴霧乾燥したされたことに起因すると理解する。再水和及び水性環境への暴露は、これが、細菌を劣化させる傾向を高めるために望ましくない。さらに、噴霧乾燥は、高エネルギーであるために、比例して製造コストがかかる。さらに、噴霧乾燥は、上昇した温度に細菌をさらす可能性があるが、細菌は十分安定化されておらず、生存能力が損失することもある。
【００１３】
'299公報に記載される従来技術は、徐放医薬化合物へのカプセル化；ゴム又はアルギン酸塩へのカプセル化；難消化スターチをゴムと組み合わせたものへのカプセル化；又はタンパク質及び脂質がなんらかの保護をされる日常の食物、などのプロバイオティック細菌を保護するさらなる手法を概説する。
【００１４】
上記の１つの例には、国際公開第02/15702号として公開された出願人の以前の特許出願が含まれており、これは参照により本明細書に組み込まれる。国際公開第02/15702号は、生体高分子ゴムの使用による安定なバイオマトリクスゲルを作製する方法を記載する。これは、安定化剤を提供するのに有用であるが、原料は、初め液体生物製剤であり、水性成分をさらに有するので、ゲルが常に好ましい送達メカニズムであるわけではない。
【００１５】
バイオティクスには、処理の間と胃腸管への送達の間に保護が必要なものもある。プロバイオティクスは、水又は酸素感受性の可能性があり、処理、保存及び移動の間の生存能力を維持するための保護を必とするものもある。例えば、欧州特許第1213347号は、水を吸収するマトリクス物質と混合することにより、酵母と微生物を乾燥及び保存する方法を開示する。
【００１６】
その他の従来技術法には以下のものがある。
米国特許第5,422,121号は、結腸で分解可能な親水基と多糖を有する高分子を形成するフィルムを組み込むコーティングを開示する。当該コーティングは、結腸へ送達する投薬に有用である。
【００１７】
米国特許第5,840,860号は、短鎖脂肪酸を、炭水化物乾燥剤に共有結合させることにより、これらの結腸への送達を開示する。
【００１８】
米国特許第6,060,050号は、ビフィドバクテリア等のプロバイオティック細菌と、乾燥剤等の高アミローススターチとの組み合わせを開示しており、これは大腸又は胃腸管（Ｇ１管）のその他の領域において、増殖もしくはメンテナンス培地としても機能する。
【００１９】
米国特許出願第2003/0096002号は、微生物の制御放出における使用のためのマトリクスを開示する。当該マトリクスは、疎水性ワックスと、多糖類、スターチ、藻類誘導体又は高分子から選択される放出調整剤とで形成される。
【００２０】
米国特許第6,413,494号は、ペクチン等の多糖類からなる、結腸薬物送達媒体を開示する。
【００２１】
プロバイオティック細菌に関する一般的文献に記載される通り、プロバイオティクスのために作られた多数の栄養機能表示がある。これらは特に腸機能に重点を置くものであり、腸癌、過敏性腸症候群及び炎症性腸疾患（例えば、クローン病）の治療を含む。これらの条件の重要性を考慮すると、安定化プロバイオティック剤の調製及び送達は、重要なステップである。特に、プロバイオティック細菌にとって、当該方法は、当該細菌の過度の感受性に対処できなければならず、また、胃を通ってＧ１管へ、生存細菌の生存能力を維持しなければならない。上記議論から理解されるはずであるが、プロバイオティック細菌を安定化する際に直面する課題は、他種の生体物質にも発生するため、プロバイオティクスに対処する組成物及び方法は、その他の生体物質に有用であってもよい。
【００２２】
前述の課題に対処すること、又は少なくとも有用な選択を公にすることが本発明の目的である。
【００２３】
本明細書で引用される、任意の特許又は特許出願等の全ての参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。いずれの文献も従来技術を構成するものであるとは認められない。当該文献の議論は、その筆者が確認したことを述べるものであり、及び出願人が引用された文書の正確さ及び適切性に異議を申し立てる権利を保有する。本明細書に多数の従来技術文献について言及されているが、この文献は、ニュージーランド及び任意の他の国において、これらの文書の任意のものが、当業界の技術常識の一部を形成すると認められるものではない。
【００２４】
変動する法的権限の下、「含んでなる」の用語は、排他的又は包括的のいずれかを意味すると考えてもよいと解される。本明細書の目的に応じて、特に断りのない限り、「含んでなる」の用語は、包括的意味を有するべきであり、すなわち、それが直接的に言及する列挙した成分だけでなく、他の不特定の成分又は要素の包括を意味することになる。この原理は、「含んだ」又は「含むこと」の用語が、方法又はプロセスにおける１又は複数のステップとの関連で使用される場合にも用いられる。
【００２５】
本発明のさらなる態様及び利点は、単に例として示す次の記載から明らかになるはずである。
【発明の概要】
【００２６】
本発明の１つの態様によれば、生体物質、油及び生体高分子を含有し、水分活性が0.7未満である保存安定組成物であって、当該組成物を環境温度で保存する場合、組成物中の生体物質が生存可能な状態を維持する、組成物を提供する。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、安定化生体物質を含む、保存安定組成物の製造方法であって、当該方法は、
（ａ）乾燥生体物質を得るステップ；
（ｂ）少なくとも１つの油で、前記乾燥生体物質を被覆し、油被覆物質を形成させるステップ；
（ｃ）少なくとも１つの生体高分子原料で、前記被覆物質を被覆し、前記組成物を作製するステップ；によるものであり、
ここで、環境温度で保存する場合、当該組成物における生体物質は、生存可能な状態を維持する方法を提供する。
【００２８】
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記の通りの保存安定組成物を含む食物を提供する。
好ましくは、当該食物は、実質的に乾燥しており、環境温度及び湿度で保存される。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記の通りの保存安定組成物を含む栄養補助食品を提供する。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記の通りの保存安定組成物を含む食物原料を提供する。
【００３１】
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記の通りの組成物に覆われるブラン・フレークを提供する。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記の通りの組成物を含む粉ミルクを提供する。
【００３３】
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記の通りの組成物を含む特殊調製粉乳（infant formula）を提供する。
【００３４】
本発明のさらなる態様によれば、実質的に上記の通りの組成物を含む動物用食物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、調製又は未調製のラクトバチルス・アシドフィルスについて、閉鎖包装における異なる温度及び相対湿度で保存した場合の、細胞生存率（％）を示すグラフである。
【図２】図２は、調製又は未調製のラクトバチルス・アシドフィルスについて、開放包装における異なる温度及び相対湿度で保存した場合の、細胞生存率（％）を示すグラフである。
【図３】図３は、調製（黒四角）又は未調製（白四角）のビフィドバクテリウム・ラクティスについて、25℃で保存した場合の、細胞生存率（％）を示すグラフである。
【図４】図４は、調製（黒四角）又は未調製（白四角）のビフィドバクテリウム・ラクティスについて、30℃で保存した場合の、細胞生存率（％）を示すグラフである。
【図５】図５は、調製（黒四角）又は未調製（白四角）のラクトバチルスＣＧについて、25℃で保存した場合の、細胞生存率（％）を示すグラフである。
【図６】図６は、調製（黒四角）又は未調製（白四角）のラクトバチルスＣＧについて、30℃で保存した場合の、細胞生存率（％）を示すグラフである。
【図７】図７は、調製物に含まれるラクトバチルスについて、２ヶ月にわたる30℃の生存率（％）を示すものであり、ここで第一の棒は、１ヶ月後の生存率（％）であり、第二の棒は、２ヶ月後の生存率（％）である。調製物は、以下の通りに標識される：「ＩＩ６」は、凍結乾燥細菌に対し、２部の油と0.34部の生体高分子を含有する調製物であり；「Ｉｈ６」は、２部の油と0.68部の生体高分子を含有する調製物であり；「ｈＩ６」は、３部の油と0.34部の生体高分子を含有する調製物であり；「ｈｈ６」は、３部の油と0.68部の生体高分子を含有する調製物である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
好ましくは「安定」なる用語、又は文法的同種のものは、処理及び保存の間に市販に有用である十分な生存能力を保持する生体物質のことを言う。より具体的には、安定性は、
（ａ）25℃〜30℃で少なくとも１ヶ月、密閉環境で保存した場合、生存能力の損失が２log未満の生物生存能力、及び／又は
（ｂ）非密閉又は密閉環境で、相対湿度60％及び温度25℃〜30℃で、少なくとも３日間保存した場合、生存能力の損失が50％未満である生体物質
と定義されてもよい。
【００３７】
より好ましくは、当該生物生存能力は、密閉環境で、25℃〜30℃で、少なくとも１ヶ月保存した場合、生存能力における損失が１log未満であってもよい。
【００３８】
理解される通り、上記の安定性は、特別な条件下で処理を行う必要性を回避するので、処理における大きな利点となってもよい。長期保存安定性は、製品輸送及び販売にとって有用であってもよい。
【００３９】
好ましくは、「環境の」なる用語は、通常の室温、湿度及び大気圧のことを言う。より具体的には、この用語は、およそ10〜50℃、より好ましくは15〜25℃、及び相対湿度が、0％〜70％、より好ましくは40〜80％、及び標準気圧のことを言う。
【００４０】
好ましくは、実質的に上記の通りの方法は、環境条件で行われてもよい。さらに、それは処理の間又は処理後、酸素を含まない環境を使用する必要もないが、これは任意になされてもよい。
【００４１】
上記組成物及び方法の開発における重要な態様は、当該プロセスを通して水性物質及び環境を避けること、及び生体物質に温度上昇を受けさせる、又は当該生体物質を再水和することなく、水分活性の低減が非常に重要であるという認識であった。発明者等が想到した解決法は、他の成分を用いて生体物質を改変し、より親水性の低い（及びより疎水性の高い）最終物質を提供することであった。
【００４２】
疎水性の増加は、より好適な組成物を作製する際に非常に有利であってもよい。湿度は、乾燥生体物質を処理して取り扱う際に重要な問題である。プロバイオティック細菌を含む偏性嫌気性菌等の物質には、たとえ一度乾燥しても、湿度及び酸素に対して非常に感受性が高いものがある。当該物質を処理する際に、生存能力の許容されない損失のために通常できるはずのない条件で処理することができる、湿度及び酸素に対する耐性が、当該組成物の性質を変化させることにより開発されている。例えば、従来技術は、本発明に必要でない、処理中に窒素流入と密閉容器の使用について教示する。
【００４３】
好ましくは、ステップ（ａ）の乾燥生体物質は、水分活性が0.7未満であってもよい。より好ましくは、当該水分活性は0.4未満であってもよい。さらにより好ましくは、当該水分活性は0.2未満であってもよい。これは低水分活性であり、その結果、当該生体物質は、組成物の低水分活性環境にほとんど関係なく安定化される。
【００４４】
好ましくは、当該乾燥生体物質を、フリーズドライ又は凍結乾燥により前処理してもよい。あるいは、その他の乾燥処理を、本発明における安定化の前で使用してもよく、例えば噴霧又は空気乾燥がある。
【００４５】
噴霧乾燥及び空気乾燥させた生体物質は、本発明の安定化方法に影響を与えないが、これらの方法は、この方法における安定化より前に、凍結乾燥等の他の方法よりも大きな割合で、生存能力を低減させる可能性があるため、それほど望ましくない。
【００４６】
好ましくは、乾燥生体物質は粉末であってもよい。好ましくは、当該粉末の粒子径は、およそ2 mm未満、より好ましくは200μm未満である。より小さいサイズの粒子が好ましいが、これがより良好な混合と均一性のために必須なわけではない。
【００４７】
好ましくは、当該生体物質は、少なくとも１つの微生物を含んでもよい。
【００４８】
好ましくは、当該生体物質は、それが細胞組織と相互作用するように、生物活性剤であってもよい。
【００４９】
好ましい実施態様によれば、当該生体物質は、少なくとも１つの細菌又は真菌、例えば酵母を含んでもよい。
【００５０】
ある実施態様によれば、当該生体物質は、グラム陰性菌を含んでもよい。グラム陰性菌は、セラチア、シュードモナス、キサントモナス、リゾビウム、及びその組み合わせから選択されてもよい。
【００５１】
別の実施態様によれば、当該生体物質は、グラム陽性菌を含んでもよい。グラム陽性菌には、プロバイオティック細菌及びスタフィロコッカス属細菌があってもよい。
【００５２】
さらなる実施態様によれば、当該生体物質は、偏性嫌気性細菌を含んでもよい。偏性嫌気性細菌には、プロバイオティック細菌及びバクテロイド属細菌があってもよい。特に好ましい実施態様によれば、当該生体物質は、プロバイオティック細菌又は真菌を含んでもよい。本明細書の目的によれば、「プロバイオティック」なる用語は、生存能力のある細菌及び真菌、例えば宿主の健康に利益な影響を及ぼす酵母等のことを言う。
【００５３】
プロバイオティック細菌には、ラクトコッカス、ストレプトコッカス、ペディオコッカス、エンテロコッカス、ロイコノストック、カルノバクテリウム、プロピオニバクテリウム、ラクトバチルス、又はビフィドバクテリウムに属するものがある。
【００５４】
プロバイオティクスとして使われるビフィドバクテリアには、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム（Bifidobacterium thermophilum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）がある。プロバイオティクスとして使用されるビフィドバクテリウムの特定の種には、ビフィドバクテリウム・ブレベ・ヤクルト種、ビフィドバクテリウム・ブレベＲ０７０、ビフィドバクテリウム・ラクティスＢｂ１２、ビフィドバクテリウム・ロンガムＲ０２３、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＲ０７０、ビフィドバクテリウム・インファンティスＲ０３３、ビフィドバクテリウム・ロンガムＢＢ５３６及びビフィドバクテリウム・ロンガムＳＢＴ−２９２８がある。
【００５５】
プロバイオティクスとして使用される乳酸菌（Lactobacilli）には、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ビレヴィス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・セロビオサス（Lactobacillus cellobiosus）、ラクトバチルス・クチスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・クルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・フェルメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルスＣＧ（ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）又はラクトバチルス・カゼイ亜種ラムノサス）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ジョンソニイ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）及びラクトバチルス・サリバルス（Lactobacillus salivarus）がある。ラクトバチルス・プランタラム２９９ｖ種は、サワードウ（sour dough）起源である。ラクトバチルス・プランタラム自身は、ヒト起源である。ラクトバチルスの他のプロバイオティック種は、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＢＧ２ＦＯ４、ラクトバチルス・アシドフィルスＩＮＴ−９、ラクトバチルス・プランタラムＳＴ３１、ラクトバチルス・レウテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ジョンソニイＬＡ１、ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＦＢ１７４８、ラクトバチルス・カゼイ・シロタ、ラクトバチルス・アシドフィルスＮＣＦＭ、ラクトバチルス・アシドフィルスＤＤＳ−１、ラクトバチルス・デルブリュッキ（Lactobacillus delbrueckii）亜種デルブリュッキ、ラクトバチルス・デルブリュッキ亜種ブルガリクス２０３８型、ラクトバチルス・アシドフィルスＳＢＴ−２０２６、ラクトバチルス・ブレヴィス、ラクトバチルス・サリバリウスＵＣＣ１１８及びラクトバチルス・・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）Ｆ１９がある。
【００５６】
プロバイオティクスとして使用されるか又は開発されるラクトコッカスには、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス（cremoris）（ストレプトコッカス・クレモリス）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスＮＣＤＯ７１２、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスＮＩＡＩ５２７、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスＮＩＡＩ１０６１、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス・ビオバル・ディアセチラクティス（biovar diacetylactis）ＮＩＡＩ８Ｗ及びラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス・ビオバル・ディアセチラクティスＡＴＣＣ１３６７５がある。
【００５７】
ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）は、グラム陽性通気性嫌気性菌である。これは、非運動性、非芽胞形成性、及びホモ発酵性の、チトクローム−、オキシダーゼ−、及びカタラーゼ−陰性生物である。ストレプトコッカス・サーモフィルスは、ビリダンス群のアルファ−溶血性種である。これはまた、乳酸菌（ＬＡＢ）としても分類される。ストレプトコッカス・サーモフィルスは、乳及び乳製品にある。これは、プロバイオティックであり、ヨーグルト製品に使用される。ストレプトコッカス・サリバルス亜種サーモフィルス１１３１型は、プロバイオティック種である。エンテロコッカスは、連鎖球菌ファミリーのグラム陽性の通気性嫌気性コッカス（球菌）である。これらは、卵形とする球形であり、対になるか、短鎖で存在する。エンテロコッカスは、カタラーゼ陰性で、非芽胞形成性であり、通常、非運動性である。エンテロコッカスは、ヒト及び動物の腸管ミクロフローラの一部である。エンテロコッカス・ファエシウム（Enterococcus faecium）ＳＦ６８は、下痢の管理において使用されているプロバイオティック種である。主要なプロバイオティック酵母は、サッカロマイセス・ブラウディ（Saccharomyces boulardii）である。サッカロマイセス・ブラウディは、サッカロマイセス・セレビシアエ・ハンセンＣＢＳ５２９６及びＳ.ブラウディとしても知られる。Ｓ.ブラウディは、通常、非病原性酵母である。Ｓ.ブラウディは、抗生剤としての使用と関連する下痢の治療に使われている。
【００５８】
好ましくは、乾燥原料における細菌又は真菌の初期細胞濃度は、１グラム当たり105細胞〜1012細胞、より好ましくは、１グラム当たり107細胞〜1010細胞であってもよい。
【００５９】
好ましくは、ステップ（ｂ）の油は、食用油である。ある実施態様によれば、当該油は、限定するものではないが、例えば魚油及び藻類油であってもよい。別の実施態様によれば、当該油は、植物油である。好ましい実施態様よれば、当該植物油は、オリーブ油、ナタネ油、ヒマワリ種子油、加水分解油、及びその組み合わせから選択されてもよい。上記油は、限定するものではないが、本発明の範囲から逸脱せずに、類似する化学的及び物理的特徴を有するその他の油を、使用してもよいことは理解されるべきである。油は、生体物質を、湿度から保護するために有用であってもよく、乾燥生体物質の親水性特性を、疎水性特性に変化させることを支援し、生体物質を安定化することも支援する。
【００６０】
ある好ましい実施態様によれば、使用される油は、限定するものではないが、コールドプレスしたバージンオイル等の高レベルの抗酸化性を有してもよい。高レベルの抗酸化性を有する油の使用は、生体物質が環境に暴露されるとき、酸化的劣化反応により、生存能力の損失の阻止を支援してもよい。
【００６１】
好ましくは、十分な油を、乾燥生体物質を十分に被覆するために添加してもよい。ある好ましい実施態様によれば、油に対する乾燥生体物質の比率は、重量で１：１０〜１０：３であってもよい。より好ましい実施態様によれば、油に対する生体物質の比率は、１：１〜１：４であってもよい。さらに好ましい実施態様によれば、当該比率は、およそ１：２であってよい。
【００６２】
好ましくは、ステップ（ｃ）の生体高分子原料は、天然又は合成のゴムであってよい。
【００６３】
好ましくは、使用される生体高分子ゴムは、5,000〜50,000,000の分子量を有することを特徴としてもよい。当該生体高分子ゴムは、酵素的劣化に耐性であり、及び剪断、熱、及びＵＶ劣化に耐性であることを特徴としてもよい。好ましい実施態様によれば、組成物に混合する場合、当該ゴムは、ゲルを作製するよう偽塑性特性を有してもよい。
【００６４】
１つの好ましい実施態様によれば、当該生体高分子は、寒天、アルギン酸塩、カシア（cassia）、ダンマー、ペクチン、ベータ−グルカン、グルコマンナン、マスチック、チクル、オオバコ、トウヒ、ジェラン、グアー、ローカストビーン、キサンタン、及びその組み合わせからなる群から選択されるゴムであってもよい。上記ゴムは、例として提供され、その他の同等の化学的及び物理的特性を有するゴム、例えば、同等の膨張及び吸湿特性を有するもの等であってもよい。好ましくは、使用される生体高分子は、粉末状態であってよい。好ましくは、当該粉末の粒子径は、2 mm未満である。
【００６５】
好ましくは、当該生体高分子は、生体物質１部に対し生体高分子0.25〜１部の比率で添加されてよい。より好ましくは、当該比率は、生体原料１部対生体高分子2/3又は0.66部であってよい。
【００６６】
さらなる実施態様によれば、少なくとも１つの抗酸化剤を、酸化性油に加えて添加してよい。ある実施態様によれば、当該酸化剤は、混合トコフェロール（ビタミンＥ)でもよい。
【００６７】
好ましくは、抗酸化剤は、乾燥生体物質１グラムに対し、製品の仕様明細書に従って調製した5〜100μLの混合トコフェロール抗酸化剤となる比率で添加してよい。好ましい実施態様によれば、当該比率は、乾燥生体物質１グラムに対し、40μLの混合トコフェロール抗酸化剤でよい。好ましくは、抗酸化剤は、油で被覆後だが、生体高分子の添加前に添加する。
【００６８】
抗酸化剤において油豊富な抗酸化剤、及びビタミンＥ等のその他の化合物の使用は、酸化の防止を促進するために有利であってもよいことは、理解されるべきである。プロバイオティック細菌は、胃腸管の嫌気性環境で活発になるため、保存等の好気性環境においては速やかに劣化する。通常これに対処する方法は、限定された期間物質を保管し、可能な限り酸素暴露を回避するだけの、真空密閉環境での保存を必要とする。化合物を含有する抗酸化剤を導入する方法を用いる、プロバイオティック細菌を安定化することにより、得られる組成物は、生体物質の酸化劣化に対する耐性を呈する。
【００６９】
さらなる実施態様によれば、当該組成物を、少なくとも１つの乾燥物質を添加することによりさらに調製してもよい。本明細書の目的によれば、「乾燥剤（desiccant）」なる用語は、非常に乾燥した物質、及び当該組成物に対して化学的に不活性な粉末に使用され、これらを包含することになる。本発明者等により開発された実施態様によれば、乾燥剤は、米粉、コーンスターチ粉、ポテトスターチ粉、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、二酸化ケイ素、リン酸カルシウム、セルロース、ポリエチレングリコール、及びその組み合わせから選択されてよい。上記の列挙が例として提供され、その最終的な応用に応じて、当業界の一般的な乾燥剤を添加してもよいことは、当業者に理解されるべきであり、例えば食品への応用では、食品安全な乾燥物質が必要とされる。
【００７０】
乾燥物質を添加する場合、好ましくは、ステップ（ｃ）から得られる組成物１部に対して、乾燥剤が0.5から４部の比率となるよう含んでもよい。より好ましくは、当該比率は、ステップ（ｃ）から得られる組成物１部に対して、乾燥剤１部であってよい。
【００７１】
乾燥剤が使用される場合、好ましくは、水分活性を0.4未満、より好ましくは0.1未満に低減させるため、当該乾燥剤を予備乾燥させてもよい。ある実施態様によれば、これは、およそ4〜18時間の空気乾燥により達成してもよい。これは、限定されると解されるべきではなく、本発明の範囲を逸脱しない限り他の乾燥方法が使用されてもよい。好ましくは空気乾燥は、その単純なプロセス要件によるものであるが、最小の調製時間であり、及び40℃超の温度とする必要性を回避するよう操作できてもよい。40℃超の温度は、本発明の範囲を逸脱することなく使用してもよいことは、理解されるべきである。
【００７２】
本発明者らが発見した利点は、乾燥物質は組成物水分活性をさらに低減させるのに役立つ可能性がある点である。発明者の経験によれば、最終組成物における水分活性は、感作槽物の使用により、およそ0.04〜0.08の低さまで低減されてもよい。
【００７３】
好ましくは、使用される場合、当該乾燥剤は多段階で添加される。ある例によれば、乾燥剤は、使用される乾燥細胞１グラム当たり、１段階当たりに添加物が１〜10グラムとなる比率で添加してもよい。好ましくは、乾燥細胞１グラム当たり、計最大20グラムの乾燥剤を使用してよい。
【００７４】
ある実施態様によれば、使用される乾燥剤の量は、組成物において所望される最終産物の稠度（consistency）に基づいてもよい。例えば、発明者の経験によれば、少量の乾燥剤の添加によって粗いクランブル（crumble）となり、乾燥剤がより多く添加されると、当該組成物はより粉末様になる。
【００７５】
作製された組成物は、押し出されても、又は錠剤にプレスしても、顆粒、丸薬又はペレットにしてもよい。発明者等は、１つの例として、最初の20又は40グラムの添加物の添加で、押し出しのための良好な稠度にするのに十分であることを発見している。さらなる実施態様によれば、当該調製物は、例えば物質を被覆することにより、その物質に塗布してもよい。例として、調製物は、シリアル製品での使用のためのブラン・フレークを被覆してもよい。
【００７６】
好ましくは、調製される組成物は、密閉環境において保存してもよい。例として、当該組成物を、バッグ又は密閉ポリスチレン容器に保存してもよい。これは、湿度又は酸化劣化による攻撃から組成物を保護するために役立つ。
【００７７】
組成物は、密閉された真空にする必要がなくてもよいことが、本発明者等により発見された利点である。従来方法と異なり、密閉前に容器からの酸素の除去は、必須ではなく、生存能力にほとんど影響を与えていないようである。
【００７８】
従来方法と異なり、プロセスが、特別な温度、湿度又は不活性雰囲気下で行われる必要がなくてもよいことが、上記方法のさらなる利点である。例として、発明者等は、有効性が、処理前後の生存能力ある細胞レベルの割合の測定値である場合、良好なプロセス効率であることを発見している。発明者等の研究において、処理前後の細胞数の差異は、通常２log未満の損失であり、より好ましくは、１log未満の損失である。発明者等の経験によれば、少なくともビフィドバクテリウム属の細菌について測定した有効性が80％超であるあり、この損失は非常に少ない。
【００７９】
本発明において述べられる別の因子が、酸化及びこの発生の予防であってもよい。酸化の予防は、特別な方法のための必要性を回避するために、有用であってもよく、例えば、包装の真空化又は窒素流入を必要としない。
【００８０】
本発明のさらなる利点は、当該組成物が、経口投与のための錠剤又はカプセル等の応用における使用のために、さらに容易に再水和してもよい。さらに、食品安全で使用される物質のために、安定化調製物は、クラッカー、パン、乾燥ペットフード等の食物に添加又はこれらを被覆してもよく、その後、包装され、後の要請される使用のために販売される。
【００８１】
重要なことに、生存能力は、処理の前後で顕著には減少せず、これは、水性物質を利用し、処理中の生存能力の顕著な低下を呈するクリッテンドン（Crittendon）の方法等の従来方法の改善点である。この分野における発明者等の研究によれば、プロバイオティック細菌は、12ヶ月超の安定であると予測され、これは細胞濃度を元のレベルの２log未満に減少させることがない。
【００８２】
上記の記載から、従来技術を超える利点を提供する方法及び組成物を提供すると解されるべきである。
さらにプロセスを安定化し、保存し、その後日にプロバイオティック細菌を放出し、生存能力を保持する能力；
疎水性特性に変換される親水性特性；
非常に低い残存水分活性と、それによる高安定な環境；
酸化反応からの保護；及び
プロバイオティック物質の作製及び市販のためにより実質的な方法、当該方法は、単純であり、エネルギー要請が低く、且つ得られる組成物は、調製物及び食物に簡単に組み込まれるからである。
【００８３】
本発明のさらなる態様は、単に例として提供される以下の記載から、及び添付の図面を参照することにより明らかになるはずである。
【実施例】
【００８４】
ここで記載する実施例は、様々な乾燥生体物質を安定化する方法、及び観察された安定性の結果を示す。
【００８５】
実施例１
本実施例において、安定化生体物質を作製する一般的方法を記載する。当該方法には、以下のステップが含まれる。
１．油を乾燥生体物質（例えば細胞）と混合する。この例として、油は、１部の細胞に対し２部の油の比率で添加される、コールドプレスしたエクストラ・バージンオイルである。本ステップの目的は、乾燥細胞粒子を油で完全に被覆することである。オリーブオイルが使われるが、植物油等の他の油を使用してもよい。
２．任意に、抗酸化剤をステップ１の混合物、例えば、調製ビタミンＥ／混合トコフェロールに添加してよい。さらなる抗酸化剤の添加は必須ではないが、有利になってもよい。混合トコフェロールは、製品の推奨の通りに調製する。
３．その後、生体高分子原料を添加する。この例として、ジェラン、又はジェランとグアーゴムの組み合わせ等のゴムを使用する。その他のゴムを使用してもよく、例えば、キサンタン、ローカストビーン及びその他の類似特性を有するものがある。当該ゴムを、乾燥細胞１グラムに対し生態高分子0.66グラムのおおよその比率で添加する。当該ゴムは、固体粒子状態である。
【００８６】
上記の方法によれば、当該調製物は、環境温度、標準的な実験室条件での相対湿度がおよそ50％である無菌条件下で、調製される。冷却し、低湿度条件が必要とされる従来の方法とは異なり、上記以上の特別な取り扱い条件は必要ないことに留意すべきである。
【００８７】
得られる生成物は、環境温度で安定であり、真空密閉は必須ではないが、密閉バッグに包装してもよい。
【００８８】
製剤は、粉ミルク等の最終製品を形成するその他の物質と混合してもよく、あるいは朝食用シリアル製品におけるブラン・フレーク等の基質（substrate）を被覆してもよい。
【００８９】
実施例２
実施例１に記載の方法は、さらに１又は複数の乾燥剤を添加するステップを任意に含んでもよい。
【００９０】
スターチ（コーンスターチ）、米粉、パセリ（Paselli）ＢＣ（ポテトスターチ）又はこれらの乾燥剤の組み合わせが含まれる乾燥剤を、ステップ３の混合物１部に対して１部の添加物の比率で添加してもよい。乾燥剤の添加は、当該方法に必須ではないことは、本発明の上の記載から明らかである。この例として、（１又は複数の）乾燥剤は、ステップ３の剤の混物に添加する前に、およそ80℃以下の温度で一晩オーブン乾燥し、その後、調製物の製造で使用する前に環境温度まで冷却することにより調製される。この調製ステップの目的は、（１又は複数の）乾燥剤の水分活性を、およそ0.1未満まで低減することである。連続した４つの別々の段階において、バルクに（１又は複数の）乾燥剤を添加し、段階的に当該粉末の水分活性を低減させる。（１又は複数の）乾燥剤は、使用される乾燥細胞の１グラム当たり、１段階当たり１〜10グラム（好ましくは５グラムずつ）の比率で添加する。全部で、乾燥細胞１グラム当たり、（１又は複数の）乾燥剤を最大20グラムまで使用してよい。
【００９１】
各段階の間、当該混合物は、段階１後では粗いクランブル状態であったものから、第４段階後には、微細粉末の質感かクランブルに変形する。
【００９２】
本発明の上の記載にある通り、（１又は複数の）乾燥剤の使用は必須ではないし、４つの段階全てに乾燥剤を添加することが必須でもない。例えば、特に添加物を最初の20又は40グラム添加後に、当該混合物を錠剤、顆粒、丸薬又はペレットとして押し出すこともできる。この例の目的として、使用される異なる成分の重量による総比率は、表１に示す通りである。
【００９３】
表１．最終調製物のおおよその組成
【００９４】
【表１】
2011502505.tif 000003
【００９５】
実施例３
この試験では、ビフィドバクテリウム・インファンティス種を用いる３つの異なる調製物を安定化させ、真空パックされ、密閉されたアルミホイルのバッグで保存した場合の保存安定性を試験した。
【００９６】
使用する原料は、供給業者から入手し、−20℃で保存した密閉ホイル包装した状態で受け取った、Ｂ.インファンティス細胞を含むフリーズドライ粉末であった。当該フリーズドライ粉末は、水分活性がおよそ0.4であり、初期細胞数がおよそ1.2×1011cfu/gであった。
【００９７】
３つの異なる調製物を、以下の通り調製した。
【００９８】
調製物１（Ｆ１）
（ａ）１グラムのフリーズドライ粉末を、２グラムのエクストラバージンオリーブオイルと混合した。
（ｂ）40μlの調製抗酸化剤（混合トコフェロール）を添加した。
（ｃ）0.33グラムの生体高分子（ジェランゴム）を添加した。
（ｄ）20グラムのオーブン乾燥した米粉（パセリＢＣ（１：１））である添加物を、５グラムずつバルク添加し、ここで当該米粉の添加前の水分活性（Ａｗ）が0.024であった。
【００９９】
調製物２（Ｆ２）
（ａ）１グラムのフリーズドライ粉末を、２グラムのサラダ及び料理用油と混合した。
（ｂ）40μlの調製抗酸化剤（混合トコフェロール）を添加した。
（ｃ）0.17グラムのジェランゴム及び0.17グラムのグアーゴムを添加し、生体高分子とした。
（ｄ）20グラムのオーブン乾燥した米粉（パセリＢＣ（１：１））である添加物を、５グラムずつバルク添加し、ここで当該米粉の添加前の水分活性（Ａｗ）が0.024であった。
【０１００】
調製物３（Ｆ３)
（ａ）１グラムのフリーズドライ粉末を、２グラムのサラダ及び料理用油と混合した。
（ｂ）40μlの調製抗酸化剤（混合トコフェロール）を添加した。
（ｃ）0.17グラムのジェランゴム及び0.17グラムのグアーゴムを添加し、生体高分子とした。
（ｄ）20グラムのオーブン乾燥した米粉（パセリＢＣ（１：１））である添加物を、５グラムずつバルク添加し、ここで当該米粉の添加前の水分活性（Ａｗ）が0.031であった。
【０１０１】
得られた混合物は、微細クランブルの質感であった。
【０１０２】
各調製物から５グラムのサンプルを、真空パックしたホイル小袋に入れ、25℃で保存し、経時で安定性試験をした。試験時には、当該小袋を、破いてサンプル採取をし、強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）での嫌気性培養により、細胞密度及び水分活性を測定した。水分活性は、保存前の調製物についても測定した。
【０１０３】
結果
以下の表に示す通り、混合後及び保存後の水分活性は、ほとんど変化しなかった。両方の事例における水分活性は、非常に低かった（全て0.1未満）。記載の通り、実際には水分活性は経時で減少する。これは、任意の残存する自由水が、経時で、調製物の成分により取り込まれるためであると考える。
【０１０４】
表２  サンプルの水分活性の測定値−Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３
【０１０５】
【表２】
2011502505.tif 000004
【０１０６】
以下の表３に示す安定性の結果は、少なくとも２ヶ月の期間にわたって、細菌細胞数の損失が１log未満であることを示した。当該プロセスの効果は優れており、混合後の平均数を用いると、初期細胞数の89％が調製後にも存在した。
【０１０７】
表３  安定性の測定値−２ヶ月−Ｂ.インファティス−Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３
【０１０８】
【表３】
2011502505.tif 000005
【０１０９】
上記試験は、安定性向上結果に差がない状態で、異なる生体高分子を上記の方法で使用できることを示す。さらに、上記試験は、安定性向上結果に差がない状態で、異なる油を上記の方法で使用できることを示す。
【０１１０】
実施例４
この試験では、より長期間（６ヶ月）にわたり安定化がもたらされることを試験する目的で、異なる調製物をＢ.インファティス種を安定化して使用した。また、当該フリーズドライ粉末の水分活性は、およそ0.4であった。
【０１１１】
調製物を以下にしたがって作製した。
【０１１２】
調製物４（Ｆ４）
（ａ）１グラムのフリーズドライ粉末を、２グラムのエクストラバージンオリーブオイルと混合した。
（ｂ）40μlの調製抗酸化剤（混合トコフェロール）を添加した。
（ｃ）0.17グラムのジェランゴム及び0.17グラムのグアーゴムを添加し、生体高分子とした。
（ｄ）20グラムのオーブン乾燥した米粉（パセリＢＣ（１：１））である添加物を、５グラムずつバルク添加し、ここで当該米粉の添加前の水分活性（Ａｗ）が0.024であった。得られた混合物は、微細クランブルの質感であった。
【０１１３】
その後10グラムのサンプルを真空パックしたホイル小袋に入れ、25℃で保存し、経時安定性の試験をした。試験時には、当該小袋を、破いてサンプル採取をし、強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）での嫌気性培養により、細胞密度を測定した。
【０１１４】
結果
以下の表４に示される通り、この結果から、６ヶ月以上の期間にわたり、当該細菌細胞数は、もとの（ｔ＝０）細菌細胞数の１log以内のままであり、当該方法が細菌を十分に安定化させることが示された。
【０１１５】
表４  安定性の測定値−６ヶ月−Ｂ.インファンティス−Ｆ４
【０１１６】
【表４】
2011502505.tif 000006
【０１１７】
上記の実施例は、安定化の結果に差がない状態で、当該方法にさらなる変更がなされ、当該安定性は、少なくとも６ヶ月維持されることを示す。
【０１１８】
実施例５
この試験では、別の細菌種を試験する。ラクトバチルス種細菌を用いる２つの調製物を、安定化し、真空バックしたアルミホイルバッグで保存した場合の保存安定性を試験した。
【０１１９】
原料は、供給業者から入手し、4℃で保存した密閉ホイル包装した状態で受け取った、ラクトバチルスのフリーズドライ細胞であった。当該フリーズドライ粉末は、水分活性がおよそ0.279であった。
【０１２０】
２つの調製物を、以下の通りに調製した。
【０１２１】
調製物５（Ｆ５）
（ａ）１グラムのフリーズドライ粉末を、２グラムのエクストラバージンオリーブオイルと混合した。
（ｂ）40μlの調製抗酸化剤（混合トコフェロール）を添加した。
（ｃ）0.33グラムの生体高分子（ジェランゴム）を添加した。
（ｄ）20グラムのオーブン乾燥したポテトスターチを、５グラムずつバルク添加し、ここで当該粉の添加前の水分活性（Ａｗ）は0.116であった。
【０１２２】
調製物６（Ｆ６）
（ａ）１グラムのフリーズドライ粉末を、２グラムのエクストラバージンオリーブオイルと混合した。
（ｂ）40μlの調製抗酸化剤（混合トコフェロール）を添加した。
（ｃ）0.17グラムのジェランゴム及び0.17グラムのグアーゴムを添加し、生体高分子とした。
（ｄ）20グラムのオーブン乾燥した粉（パセリＢＣ（１：１））を、５グラムずつバルク添加し、ここで当該粉の添加前の水分活性（Ａｗ）は0.024であった。得られた混合物は、微細クランブルの質感であった。
【０１２３】
各調製物から10グラムのサンプルを、真空パックしたホイル小袋に入れ、25℃で保存し、経時で安定性試験をした。試験時には、当該小袋を、破いてサンプル採取をし、強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）での嫌気性培養により、細胞密度を測定した。保存前後の調製物の水分活性は、調製物Ｆ６についても試験した。
【０１２４】
結果
以下の表５に示す通り、混合後及び保存後の水分活性にはほとんど変化がなかった。両方の事例における水分活性は、非常に低かった（全て0.1未満）。
【０１２５】
表５  水分活性の測定値−ラクトバチルス−Ｆ６
【０１２６】
【表５】
2011502505.tif 000007
【０１２７】
以下の表６で示す安定性の結果は、少なくとも２ヶ月の期間にわたり、細菌細胞数における損失は１log未満であることを示した。
【０１２８】
表６  安定性の測定値−ラクトバチルス−Ｆ５、Ｆ６
【０１２９】
【表６】
2011502505.tif 000008
【０１３０】
上記の試験から、向上した安定性の結果に差がない状態で、異なる細菌種を当該方法において使用できることが確認された。
【０１３１】
実施例６
この試験では、細菌種を試験した。Ｂ.インファティスの代わりにビフィドバクテリウム種を用いた異なる調製物を、安定化し、真空パックしたアルミホイルバッグに保存した場合の保存安定性を試験した。原料は、供給業者から入手し、4℃で保存した密閉ホイル包装した状態で受け取った、ビフィドバクテリウムのフリーズドライ細胞であった。当該フリーズドライ粉末は、水分活性がおよそ0.532であった。
【０１３２】
２つの調製物を以下の通りに調製した。
調製物７（Ｆ７）
（ａ）１グラムのフリーズドライ粉末を、２グラムのエクストラバージンオリーブオイルと混合した。
（ｂ）40μlの調製抗酸化剤（混合トコフェロール）を添加した。
（ｃ）0.33グラムの生体高分子（ジェランゴム）を添加した。
（ｄ）20グラムのオーブン乾燥したポテトスターチ粉末を、５グラムずつバルク添加し、ここで、当該ポテトスターチの添加前の水分活性（Ａｗ）は0.116であった。
【０１３３】
調製物８（Ｆ８）
（ａ）１グラムのフリーズドライ粉末を、２グラムのエクストラバージンオリーブオイルと混合した。
（ｂ）40μlの調製抗酸化剤（混合トコフェロール）を添加した。
（ｃ）0.17グラムのジェランゴム及び0.17グラムのグアーゴムを添加し、生体高分子とした。
（ｄ）20グラムのオーブン乾燥した米粉（パセリＢＣ（１：１））を、５グラムずつバルク添加し、ここで当該米粉の添加前の水分活性（Ａｗ）は0.024であった。得られた混合物は、微細クランブルの質感であった。
【０１３４】
各調製物から10グラムのサンプルを、真空パックしたホイル小袋に入れ、25℃で保存し、経時で安定性試験をした。試験時には、当該小袋を、破いてサンプル採取をし、強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）での嫌気性培養により、細胞密度を測定した。水分活性は、保存の前後で試験した。
【０１３５】
結果
以下の表７に示す通り、混合後及び保存後の水分活性は、ほとんど変化しなかった。両方の事例における水分活性は、非常に低かった（全て0.1未満）。
【０１３６】
表７  水分活性の測定値−ビフィドバクテリウム−Ｆ７、Ｆ８
【０１３７】
【表７】
2011502505.tif 000009
【０１３８】
以下の表８に示す安定性の結果は、少なくとも２ヶ月にわたる期間で、細菌細胞数における損失が１log未満であることを示した。
【０１３９】
表８  安定性の測定値−ビフィドバクテリウム−Ｆ７、Ｆ８
【０１４０】
【表８】
2011502505.tif 000010
【０１４１】
向上した安定性の結果に差がない状態で、異なる細菌種が本方法で使用できることが、上記の試験でさらに確認された。
【０１４２】
実施例７
上記の通り、真空密閉環境において保存した場合、当該方法は、生体物質を安定化するように働く。この試験では、フリーズドライＢ.インファティス種を安定化し、その後、ポリスチレン容器に、およそ１／３の調製物を入れ、その後、酸素排気もしくは窒素ガスを流入することなく密閉した。この目的は、包装が保存安定性に効果があるか、そして真空密閉を処理の間回避することができるか、を決定するためである。
【０１４３】
Ｂ.インファティスのフリーズドライ細胞は、供給業者から入手し、これは−20℃で保存した密閉ホイル包装した状態送達された。当該フリーズドライ粉末は、水分活性がおよそ0.4であった。
【０１４４】
２つの調製物を以下の通りに調製した。
【０１４５】
調製物９（Ｆ９）
（ａ）１グラムのフリーズドライ粉末を、２グラムのエクストラバージンオリーブオイルと混合した。
（ｂ）40μlの調製抗酸化剤（混合トコフェロール）を添加した。
（ｃ）0.17グラムのジェランゴム及び0.17グラムのグアーゴムを添加し、生体高分子とした。
（ｄ）20グラムのオーブン乾燥した米粉（パセリＢＣ（１：１））を、５グラムずつバルク添加し、当該米粉の添加前の水分活性（Ａｗ）は0.024であった。
【０１４６】
調製物１０（Ｆ１０）
（ａ）１グラムのフリーズドライ粉末を、２グラムのサラダ及び料理用油と混合した。
（ｂ）40μlの調製抗酸化剤（混合トコフェロール）を添加した。
（ｃ）0.17グラムのジェランゴム及び0.17グラムのグアーゴムを添加し、生体高分子とした。
（ｄ）20グラムのオーブン乾燥した米粉（パセリＢＣ（１：１））である添加物を、５グラムずつバルク添加し、ここで当該米粉の添加前の水分活性（Ａｗ）は0.024であった。
【０１４７】
最終水分活性を測定してから、各調製物から取った10グラムのサンプルを、ポリスチレン容器、調製物をおよそ１／３の深さまで充填し、その後密閉し（真空ではない）、25℃で保存した。強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）での嫌気性培養により、間隔をおいて細胞密度を測定した。保存後の水分活性も測定した。
【０１４８】
結果
以下の表９に示す通り、混合後及び保存後の水分活性は、ほとんど変化しなかった。両方の事例における水分活性は、非常に低かった（全て0.1未満）。
【０１４９】
表９  水分活性の測定値−真空なし−Ｂ.インファティス−Ｆ９、Ｆ１０
【０１５０】
【表９】
2011502505.tif 000011
【０１５１】
以下の表１０に示す安定性の結果は、少なくとも４週間にわたり、細菌細胞数の損失が１log未満であることを示し、当該細菌を本発明の方法を用いて安定化すると、このステップは、細菌安定性にほとんど影響を及ぼさないので真空包装は必要ないことが示された。
【０１５２】
表１０−安定性測定値−真空なし−Ｂ.インファンティス−Ｆ９、Ｆ１０
【０１５３】
【表１０】
2011502505.tif 000012
【０１５４】
上記の試験は、真空包装が、安定性の維持に必須ではないことを示す。
【０１５５】
実施例８
実施例７の調製物９を使用する別の試験で、実施例７に記載された観察された安定性を確認するため、より長期間にわたって試験した。
【０１５６】
結果
以下の表１１に示す安定性の結果は、少なくとも６ヶ月の期間にわたり細菌細胞数の損失が１log未満であり、当該細菌を本発明の方法を用いて安定化すると、真空包装は細菌の安定性に最小限の影響しか及ぼさないことが示された。
【０１５７】
表１１  安定性の測定値−真空なし−Ｂ.インファティス−長期間−Ｆ９
【０１５８】
【表１１】
2011502505.tif 000013
【０１５９】
上記の試験から、真空包装は安定性の維持に必須ではないことが示される。
【０１６０】
実施例９
異なる細菌を用いる結果を決定するために、細菌を別のビフィドバクテリウム種と置換する点のみ変更して、実施例７における調製物９（Ｆ９）と同じことを行った。当該新規な調製物を「Ｆ１１」とする。
【０１６１】
結果
以下の表１２に示す安定性の結果は、少なくとも12週の期間にわたって、細菌細胞数の損失が１log未満であり、本発明の方法を用いて細菌を安定化すると、真空包装は細菌の安定性にわずかしか影響をおよぼさないことを示した。結果は、同じ発見が、異なる生体物質にも適用されることを示す。
【０１６２】
表１２  安定性の測定値−真空なし−ビフィドバクテリウム−Ｆ１１
【０１６３】
【表１２】
2011502505.tif 000014
【０１６４】
様々な生体物質にとっても、真空包装は安定性の維持に必須でないことが、上記の試験から確認された。
【０１６５】
実施例１０
異なる細菌（調製物１２又はＦ１２とする）を用いて、もし存在すれば安定性への影響を決定するために、実施例７における調製物８の方法を、当該細菌をラクトバチルス種で置換した点のみ変更して同じことを行った。この実施例では、De Man, Rogosa及びSharpe Agar (MRS-Agar)＋Ｌ−システイン−ＨＣｌ（0.05％）で嫌気性培養により、細菌密度を測定した。
【０１６６】
結果
以下の表１３に示される安定性の結果は、少なくとも１２ヶ月にわたって、細菌細胞数における損失が１log未満であり、本発明の方法を用いて細菌を安定化すると、細菌の安定性に包装はわずかしか影響を及ぼさないことを示した。この結果はまた、同じ発見が、異なる生体物質に適用されることも示す。
【０１６７】
表１３  安定性の測定値−真空なし−ラクトバチルス−Ｆ１２
【０１６８】
【表１３】
2011502505.tif 000015
【０１６９】
真空包装は、安定性を維持するために必須ではないことが、上記の試験により確認された。
【０１７０】
実施例１１
上記試験は、25℃でのサンプルの保存についての安定性の見込みを示している。もし存在すれば、湿度の効果を確認するために、さらなる試験を行った。
【０１７１】
Ｂ.インファティスのフリーズドライ細胞を、供給業者から入手し、これは−20℃で保存された密閉ホイル包装で送達された。当該フリーズドライ粉末の水分活性は、およそ0.4であった。
【０１７２】
１つの調製物を以下の通りに調製した。
【０１７３】
調製物１３（Ｆ１３）
（ａ）１グラムのフリーズドライ粉末を、２グラムのエクストラバージンオリーブオイルと混合した。
（ｂ）40μlの調製抗酸化剤（混合トコフェロール）を添加した。
（ｃ）0.17グラムのジェランゴム及び0.17グラムのグアーゴムを添加し、生体高分子とした。
（ｄ）20グラムのオーブン乾燥した米粉（パセリＢＣ（１：１））である添加物を、５グラムずつバルク添加し、ここで、当該米粉の添加前の水分活性（Ａｗ）は0.024であった。
【０１７４】
最終水分活性を測定してから、調製細菌及び未調製細菌（ＵＦ１）のサンプルを、相対湿度を60℃に設定するデシケーターに密封し、25℃に維持した環境で保存した。
【０１７５】
細菌密度を、強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）での嫌気性培養により測定した。
【０１７６】
結果
表１４に示す通り、湿度の上昇は、安定性に影響を及ぼしたが、その比率は非常に異なった。未処理サンプルは、３日以内にほとんど全ての初期生存能力が失われ、生存能力を急速に失った。対照的に、調製サンプルは、湿度暴露で６日後でも、多数の生存する細菌が存在し、非常に高い安定性を示した。
【０１７７】
表１４−安定性の測定値−湿度の影響−Ｂ.インファンティス−Ｆ１３、ＵＦ１
【０１７８】
【表１４】
2011502505.tif 000016
【０１７９】
未処理のサンプルの初期の低い測定値は、未処理のままである場合、細菌が非常に不安定であることを示す。未処理サンプルは、１日後でさえ、顕著な劣化を示す。調製細菌は、たとえ湿度条件下でも、未処理細菌と比較して明確に向上した安定性を有する。
【０１８０】
上記結果はまた、細菌を安定化するためには、低い水分活性に達することの重要性を示す。フリーズドライを行っても、なお急速に細菌数が減少する場合、上記例に示される通り、安定化のために従来から使用される通常のフリーズドライは十分である。湿度劣化について発見されたこの結果でも、従来技術に対するさらに顕著な向上であり、製品の製造及び取り扱いにおいて有用であると解されるべきである。例えば、さらなる処理の間、調製品の短期間の湿度暴露は、生存能力を有害に変化させるべきではないが、現在これが非常に重要な問題である。
【０１８１】
実施例１２
もし存在すれば保存環境の効果を決定するため、ラクトバチルス・アシドフィルスのフリーズドライ乾燥細胞を、ジェラン及びグアーゴムを用いて実施例１の通りに調製した。
【０１８２】
保存環境の効果を評価するため、調製サンプルを、制御湿度環境（20％、30％、40％及び50％相対湿度）及び温度（20℃、30℃、40℃及び50℃）に２時間暴露させ、その後半分のサンプルを環境に対して開放した状態にし、他方の半分をホイル小袋に密封した。開放及び密封の両方の事例で、最初の２日間、同じ温度及び湿度でインキュベーションした。１週間後、サンプル当たりの細菌密度を測定した。
【０１８３】
結果
図１及び２は、調製ラクトバチルス・アシドフィルスの生存率は、サンプルが暴露された保存湿度及び温度で、開放又は密閉包装における未調製ラクトバチルス・アシドフィルスのものより大きかった。この例は、試験する条件において、たとえ環境に暴露された場合でも、細菌を安定化するための方法の能力を示している。理解されるように、上記方法を行うことにより、乾燥細菌を、特に温暖で湿度のある環境においてさらに処理し、保存し、及び以前は考えられていなかった開封後の保存期間を有するようにすることができる。
【０１８４】
実施例１３
細菌の別の種の使用を例示するために、ビフィドバクテリウム・ラクティスのフリーズドライ細胞を、ジェラン及びグアーゴムを用いて実施例１の通りに調製した。サンプルを、25℃及び30℃で保存することにより未調製細胞と比較し、細胞生存率をモニタリングした。
【０１８５】
結果
図３及び４は、未調製ビフィドバクテリウム・ラクティス（白四角）は、調製したもの（黒四角）ほど生存しないことを示す。前の例と同様に、この実施例は、安定化の効果が様々な細菌種において反復可能であることを示している。
【０１８６】
実施例１４
細菌の別の種の使用を例示するために、ラクトバチルス・ラムノサスＣＧ（ＬＣＧ）種のフリーズドライ細胞を、ジェラン及びグアーゴムを用いて実施例１の通りに調製した。サンプルを、25℃及び30℃で保存することにより、未調製細胞と比較し、細胞生存率をモニタリングした。
【０１８７】
結果
期待通り、図５及び図６は、未調製ラクトバチルスＣＧ（白四角）は、調製したもの（黒四角）ほど生存しないことを示す。この例も、本発明の方法は様々な細菌に使用できることを示す。
【０１８８】
実施例１５
一連の調査は、各種の代替物質が、プロバイオティック細菌の安定化に対して内因性の可能性を有するかを確認するために行われたため、観察された結果は混乱していた。
【０１８９】
原料
３つのラクトバチルス種（Ｌ.ラムノサス、Ｌ.アシドフィルス、Ｌ.カゼイ）のフリーズドライ細胞を、120mlのエクストラバージンオリーブオイルに懸濁させた。このサンプルを２つの３×20mlサンプルに分け、30℃及び37℃、30％の相対湿度、開放バイアルで保存した。
【０１９０】
コントロールサンプルは、スキムミルク粉で希釈した同じラクトバチルス種のフリーズドライ粉末で120グラムにした。当該サンプルを２つの３×20グラムサンプルに分け、30℃及び37℃、30％の相対湿度、開放バイアルで保存した。
【０１９１】
両方の事例において、１グラムのサンプルを除去し、０、２及び４週でコロニー形成単位を測定した。
【０１９２】
結果
全ての事例において、フリーズドライ細菌は安定ではなく、油中又はミルク粉末中に懸濁させ、30℃又は37℃及び30％相対湿度で保存した場合、わずか２週間後で、その損失は許容できなかった（２〜５logの損失）。全ての結果を以下の表１５〜１７に示す。
【０１９３】
表１５  油又はミルク粉末中、30℃及び37℃及び30％相対湿度での、Ｌ.ラムノサス凍結乾燥粉末の平均（ｎ＝３）安定性（cfu/g又はcfu/mL）
【０１９４】
【表１５】
2011502505.tif 000017
【０１９５】
表１６  油又はミルク粉末中、30℃及び37℃及び30％相対湿度での、Ｌ.アシドフィルス凍結乾燥粉末の平均（ｎ＝３）安定性（cfu/g又はcfu/mL）
【０１９６】
【表１６】
2011502505.tif 000018
【０１９７】
表１７  油又はミルク粉末中、30℃及び37℃及び30％相対湿度での、Ｌ.カゼイ凍結乾燥粉末の平均（ｎ＝３）安定性（cfu/g又はcfu/mL）
【０１９８】
【表１７】
2011502505.tif 000019
【０１９９】
結果は、油又はミルク粉末のいずれかのみに起因する内因性の安定性はほとんどなく、そのかわり、本発明における安定性は、複数の因子の組み合わせによる可能性がある。
【０２００】
実施例１６
この技術の詳細な記載、例えば発生する物理的変化の記載等を提供する。
【０２０１】
プロセスは、非常に透明で低粘度の油を、この例では微細顆粒クリーム様の茶色の質感を有する乾燥生物粉末に添加することにより始まる。２つの成分を、乾燥生体物質１部に対して、油が１〜４部の比率で混合する。
混合時は、薄い茶色のペースト状態である。
【０２０２】
この例では、オフホワイト色の粉末である生体高分子粉末を、当該オイルと乾燥物質の混合物に添加し、ざらざらした、もろい、湿った様子で、茶色の粉末を形成する。生体高分子粉末は、１部の生体物質に対し、0.25〜１部の生体高分子の比率で添加する。この段階で、生体物質は安定であると考えられる。
【０２０３】
さらなる選択肢を示す。ざらざらした、もろい、湿った様子の粉末を、その後、ラクトース（この例では白色粉末）等の希釈剤に添加してもよい。得られる混合物は、混合後に作製される流動性を有する粉末であり、これは顆粒状のオフホワイト色の乾燥した外観である。
【０２０４】
得られた流動性を有する粉末は、上記の通り安定であり、取り扱いが容易であるという利点を有し、これはさらなる処理のための利点となってもよい。
【０２０５】
別の実施態様によれば、ざらざらした、もろい、湿った様子の粉末を、ブラン・フレーク等の物質に被覆して、被覆フレークとしてもよい。
【０２０６】
実施例１７
この例では、サンプルの物理的安定性について試験した。
サンプルを実施例１２の通りに調製し、20％、30％、40％又は50％の相対湿度、及び20℃、30℃、40℃又は50℃で、開放容器において保存した。保存後、未調製物質は、劇的な変色及び凝結性を示し、黄茶色に変わった。対照的に、調製サンプルは、変化を示さず、オフホワイトのままであり、当該物質は良好な流動特性を保持していた。
【０２０７】
実施例１８
この例では、幅広いゴムが本発明に関連して使用してもよいという発明者の理解を確認するため、様々なゴムの使用を試験した。
【０２０８】
実験は、以下の結果の表に記載の通り、単一のゴム又は２つのゴムを用いて、６種類の調製物を調製することにより行った。各々の調製物について再現した（ｎ＝２）。より詳細には、当該調製物を、以下のステップにより調製した。
（ａ）フリーズドライＳ.インファティス（１グラム）をエクストラバージンオリーブオイル（２グラム）と混合する。
（ｂ）抗酸化剤（混合トコフェロール、40μl）を添加する。
（ｃ）生体高分子ゴムを、以下の表で記載する、単独（0.34g）又は２つ（それぞれ0.17ｇ）の組み合わせのいずれかの粉末として添加する。
（ｄ）80℃で２4時間予備調整した、米粉とパセリＢＣの１：１比率混合物である乾燥剤20グラムを添加する。
（ｅ）得られた調製物をホイルバッグに真空包装し、当該バッグ及び調製物を25℃で保存する。
（ｆ）生存細胞数及び水分活性を、それぞれの調製物について、ｔ＝０、１週及び２週で試験する。
【０２０９】
測定結果を以下の表１８に示す。
【０２１０】
表１８  異なる生体高分子を用いた、25℃、油中のＢ.インファティス・フリーズドライ粉末の安定性（cfu/g）及び水分活性
【０２１１】
【表１８】
2011502505.tif 000020
【０２１２】
上記の結果は、ジェランゴム及びグアーゴムで観察されたものと同じ結果で、キサンタンゴム及びローカストビーンゴム等の他の生体高分子を使用できることを示す。
【０２１３】
実施例１９
30℃での安定性を例示し、もし存在すれば、油の生体高分子に対する比率が安定性に与える影響を決定するために、さらなる例をここで提供する。
【０２１４】
安定化粉末を次の操作により作製した。
（ａ）２グラムのフリーズドライ・ラクトバチルス・アシドフィルス細胞を、４グラム又は６グラムのオリーブオイルと混合し、80μLのビタミンＥを添加する。
（ｂ）0.34グラムのジェランゴムと0.34グラムのグアーゴムを検量し、一緒に混合するか、0.68グラムのジェランゴムを検量するか、0.68グラムのグアーゴムを検量する。
（ｃ）当該ゴムを、フリーズドライ細胞と油の混合物と混合する。
（ｄ）40グラムの米粉とポテトスターチの１：１比率混合物を添加する。
（ｅ）得られた混合物を、80℃で24時間、又は30℃、飽和ＭｇＣｌ2溶液中、水分活性0.3で平衡化するまで乾燥する。
（ｆ）飽和ＭｇＣｌ2溶液中で６日間保存した後、５グラムのサンプルを真空密閉ホイルに包装する。
（ｇ）30℃で保存し、cfu/gを１ヶ月ごとにモニタリングする。
【０２１５】
図７に示すように、30℃での生存率は、上記の25℃で観察された結果をよく一致した。さらに、過剰な油を含有する調製物についてわずかな改善が観察された。
【０２１６】
実施例２０
本発明の安定化フリーズドライ粉末の使用を示す例をここで提供する。
【０２１７】
初めに、プロバイオティック物質を含有する基本の安定化粉末を以下の操作により作製する。
（ａ）２グラムのフリーズドライプロバイオティック物質を、４グラムのオリーブオイルと混合し、80μlのビタミンＥを混合する。
（ｂ）0.34グラムのジェランゴムと0.34グラムのグアーゴムを検量する。当該ゴムと、ステップ（ａ）のフリーズドライ細菌と油の混合物と混合する。
（ｃ）40グラムの米粉とポテトスターチの１：１比率混合物を添加する。その後プロバイオティック含有調製物を以下の通りに調製することができる。
【０２１８】
プロバイオティック含有ミルク粉末
安定化フリーズドライプロバイオティック粉末  １０ｇ
ミルク粉末  100ｇまで
【０２１９】
プロバイオティック含有特殊調製粉乳
安定化フリーズドライプロバイオティック粉末  ５ｇ
特殊調製粉乳  100ｇまで
【０２２０】
イヌ用プロバイオティック粉末
ビタミンＡ  5000ＩＵ
ビタミンＣ  ４ｇ
ビタミンＥ  800ＩＵ
ビタミンＢ複合体  0.1ｇ
ブロメライン  0.1ｇ
グルタミン  1.5ｇ
アルギニン  １ｇ
セレン  75mcg
パンクレアチン  0.01ｇ
安定化フリーズドライプロバイオティック粉末  ９ｇ
スターチ  25ｇまで
【０２２１】
上記の例は、その安定性が、長期間顕著に一定であり、乾燥環境で、さらには湿度にさらされる環境において保存した場合にも、この方法が同様に安定性を非常に向上させるような、乾燥生体物質、特に乾燥細菌を安定化する方法を提供することを示す。非密閉環境条件で処理される場合でも、当該安定性は維持されるため、特別な取り扱い特性を必要とする従来の方法を超える、顕著な改善点を提供する。
【０２２２】
本発明の態様は、単に例として記載されており、添付の請求の範囲で定義されるその範囲を逸脱することなく、それに修正及び付加をしてもよいと解されるべきである。
【図１】
2011502505.tif 000021
【図２】
2011502505.tif 000022
【図３】
2011502505.tif 000023
【図４】
2011502505.tif 000024
【図５】
2011502505.tif 000025
【図６】
2011502505.tif 000026
【図７】
2011502505.tif 000027
【国際調査報告】
2011502505.tif 000028
2011502505.tif 000029
2011502505.tif 000030