(57)【要約】【課題】診断マーカー及び治療標的を正確に同定するためのマイクロアレイ研究については、遺伝子発現のどの変化がタンパク質分析により検証されるのかを決定する必要がある。さらに機能的読取の進歩が、マイクロアレイ分析の生物学的意義を決定するために必要とされる。【解決手段】末梢血中の少なくとも一つのマイクロＲＮＡを検出することによる、肺癌の診断、予後診び治療のための方法が開示されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が一つ以上の肺癌随伴疾患を有する、又は発症するリスクがあるかどうかを決定する方法であって、
該対象からの末梢血サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定すること：を含み、
対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較し、該サンプル中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化は、該対象が一つ以上の肺癌随伴疾患を有しているか、又は発症するリスクがあることを示す、前記方法。
【請求項２】
該末梢血サンプルが、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び血清の一つ以上を含む、請求項１の方法。
【請求項３】
該一つ以上の肺癌随伴疾患が、気管支肺胞癌（ＢＡＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌及び肺扁平上皮癌を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
該末梢血サンプルが全血を含み、そして少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が：
ｍｉＲ
ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ
ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３，５ｐ
ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ｂ＊
ｈｓａ−ｍｉＲ−４９０Ｎｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−００７−２−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−０２１−ｐｒｅｃ−１７Ｎｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂＮｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−３４５Ｎｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１７−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−３２３Ｎｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−２−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２  
ｈｓａ−ｍｉＲ−４２５Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−０９６−ｐｒｅｃ−７Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ａ−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−３３９Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１４１−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−３２１Ｎｏ１
の増加したｍｉＲ発現から成る、表１に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である、請求項１の方法。
【請求項５】
該ｍｉＲが、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ及びｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３５ｐ：の一つ以上である、請求項４の方法。
【請求項６】
該末梢血サンプルが全血を含み、そして少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が：
ｍｉＲ
ｈｓａ−ｍｉＲ−１−２Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−５１１−２Ｎｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−２Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−２−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１Ｎｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＊Ｎｏ２
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−ｖｌ−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−１−ｌＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−ｌ００Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−０２１−ｐｒｅｃ−１７Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａＮｏ１
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−０１７−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−００ｌｂ−２−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＊Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−２０ｂＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−２０２−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−０２０−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−３８３Ｎｏ１
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−ｖ２−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ａＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６Ｎｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−０１８−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−２０６−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−００９−ｌＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−００７−３−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３−２−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１９−２Ｎｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−０１６ａ−ｃｈｒ１３
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６−ｐｒｅｃ−Ｘ
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１９６−１−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０６ｂＮｏ１
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−ｌ−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０７−ｐｒｅｃ−ｌ０
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−ｌ−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−１４４−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０Ｎｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０３−ｐｒｅｃ−５＝１０３−ｌ
ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−２Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−００ｌｂ−１−ｐｒｅｃｌ
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２５ｂ−２−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３０ａ−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−０３０ｂ−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３２−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−４５ｐ
ｈｓａ−ｍｉＲ−３７４Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−０１５ａ−２−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−５１７ａ
ｈｓａ−ｍｉＲ−０１６ｂ−ｃｈｒ３
ｈｓａ−ｍｉＲ−０１７−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８−ｐｒｅｃ
の減少したｍｉＲ発現から成る、表１に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である、請求項１の方法。
【請求項７】
該ｍｉＲが、
ｍｉＲ
ｈｓａ−ｍｉＲ−１−２Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−５１１−２Ｎｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−２Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−２−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１Ｎｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＊Ｎｏ２
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−ｖｌ−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−１−１Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３−ｐｒｅｃＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−ｌ００Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−ｐｒｅｃ
ｈｓａ−ｍｉＲ−０２１−ｐｒｅｃ−１７Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａＮｏ１
ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉＮｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＊Ｎｏ１
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６Ｎｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ−ｐｒｅｃＮｏ２
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６Ｎｏ１
の一つ以上である、請求項６の方法。
【請求項８】
該末梢血サンプルが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、そして
少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｈｓａ−ｍｉＲ−６３０の減少したｍｉＲ発現から成る、表２に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である、請求項１の方法。
【請求項９】
該サンプルが末梢血単核細胞を含み、そして
少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４５の増加したｍｉＲ発現から成る、表２に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である、請求項１の方法。
【請求項１０】
該末梢血サンプルが血清を含み、そして
少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２の増加したｍｉＲ発現から成る、表３に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である、請求項１の方法。
【請求項１１】
該サンプルが血清を含み、そして
少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が：ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２の減少したｍｉＲ発現から成る、表３に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である、請求項１の方法。
【請求項１２】
該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、表４に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である、請求項１の方法。
【請求項１３】
該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、表５に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である、請求項１の方法。
【請求項１４】
該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物が、表６に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である、請求項１の方法。
【請求項１５】
該方法が肺癌を有する対象の予後を決定するために使用され：
該対象からのサンプル中の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定すること；を含み、
該ｍｉＲ遺伝子産物が肺癌の予後不良と関連し；そして
対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較して、該サンプル中の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化が予後不良を示す、請求項１の方法。
【請求項１６】
末梢血サンプルで一つ以上の肺癌随伴疾患を検出する方法であって、該方法が：
肺癌に関連した少なくとも一つのバイオマーカーの変化した発現についてサンプルを分析すること；及び
該少なくとも一つのバイオマーカーの変化した発現と該サンプル中の肺癌の存在又は不存在を相関させること；を含み、
該少なくとも一つのバイオマーカーが、表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから選択される、前記方法。
【請求項１７】
一つ以上の肺癌随伴疾患を有していると疑われる対象を早期診断する方法であって、該方法が：
該対象から末梢血サンプルを入手すること；
肺癌と関連した少なくとも一つのバイオマーカーの変化した発現についてサンプルを分析すること； 
該少なくとも一つのバイオマーカーの変化した発現と該対象における肺癌の存在を相関させること：を含み、
該少なくとも一つのバイオマーカーが、表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから選択される、前記方法。
【請求項１８】
一つ以上の肺癌随伴疾患を有する対象を治療する方法であって、表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーと相補的な核酸を含む、治療的に有効量の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーと相補的な核酸を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
一つ以上の肺癌随伴疾患のため化学放射線治療を受けている患者の末梢血サンプルと、化学放射線治療を受けていない患者のサンプルを比較する方法であって：
表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群より選択される少なくとも一つのバイオマーカーの異なった発現を比較することを含む、前記方法。
【請求項２１】
患者の一つ以上の肺癌随伴疾患のステージ分類を比較する方法であって：
該患者から末梢血サンプルを入手すること；及び表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群より選択される少なくとも一つのバイオマーカーの異なった発現を比較することを含む、前記方法。
【請求項２２】
一つ以上の肺癌随伴疾患を抑制することを、それらを必要とする対象において行う方法であって：
表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲの少なくとも一つを投与することを含む、前記方法。
【請求項２３】
一つ以上の肺癌随伴疾患を患っている対象においてそれらの疾患を治療する方法であって、ここで対照細胞と比較して該対象の癌細胞においては少なくとも一つのｍｉＲが下方調節又は上方調節されており：
該癌細胞において該少なくとも一つのｍｉＲが下方調節されている場合、該対象の癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも一つの単離されたｍｉＲの有効量を該対象に投与すること；又は、
該癌細胞において該少なくとも一つのｍｉＲが上方調節されている場合、該対象の癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも一つのｍｉＲの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与すること；を含み、
該ｍｉＲが表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群より選択される、前記方法。
【請求項２４】
対象の一つ以上の肺癌随伴疾患を治療する方法であって：
対照サンプルと比較した、該対象から入手した末梢血サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲの量を決定すること、ここで該ｍｉＲは表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから選択され；及び
該対象における肺癌の増殖が抑制されるように、
（ｉ）もし、該対象において発現された該ｍｉＲの量が対照細胞中で発現されたｍｉＲの量よりも少なければ、少なくとも一つの単離されたｍｉＲの有効量を該対象に投与することにより；又は
（ｉｉ）もし、該対象において発現された該ｍｉＲの量が対照細胞中で発現されたｍｉＲの量よりも多ければ、該少なくとも一つのｍｉＲの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することにより；
該対象におけるｍｉＲ活性の量を変化させることを含む、前記方法。
【請求項２５】
抗肺癌随伴疾患剤を同定する方法であって：
癌細胞に試験剤を提供すること；及び
該肺癌細胞中での減少した発現レベルと関連した少なくとも一つのｍｉＲのレベルを測定すること；を含み、
適した対照細胞と比較し、該肺癌細胞中の該ｍｉＲのレベルの増加は、該試験剤が抗癌剤であることを示し；該ｍｉＲが、表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群より選択される、前記方法。
【請求項２６】
対象における病的状態、又は病的状態を発症するリスクを評価する方法であって：
該対象からのサンプル中の一つ以上のマーカーの発現プロファイルを測定することを含み、
該対象からのサンプルにおける発現プロファイルと正常サンプルの発現プロファイルとの相違は、一つ以上の肺癌随伴疾患又はそれらへの素因を示し、そして
該マーカーが表１、表２又は表３にリストした一つ以上のｍｉＲを少なくとも含む、前記方法。
【請求項２７】
表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群から選択された一つ以上のｍｉＲを含む組成物。
【請求項２８】
一つ以上の肺癌随伴疾患を試験するための試薬であって、表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲのヌクレオチド配列、又は該マーカーのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含んでいるポリヌクレオチドを含む、前記試薬。
【請求項２９】
一つ以上の肺癌随伴疾患を試験するための試薬であって、表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲによりコードされたタンパク質を認識する抗体を含む、前記試薬。
【請求項３０】
一つ以上の肺癌随伴疾患を予防する、診断する及び／又は治療するための療法の有効性を評価する方法であって：
その有効性が評価されている療法を患者に供すること；及び
表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲを評価することにより、一つ以上の肺癌随伴疾患を治療する又は予防することについて試験されている治療の有効性のレベルを決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項３１】
該候補治療剤が、医薬組成物、栄養機能組成物及びホメオパシー組成物の一つ以上を含む、前の請求項の方法。
【請求項３２】
該評価されている療法が、ヒト対象での使用のためである、前の請求項の方法。
【請求項３３】
製品であって：表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲから選択される、一つ以上の肺癌随伴疾患のためのマーカーへ結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む、前記製品。
【請求項３４】
一つ以上の肺癌随伴疾患を治療する療法剤の候補化合物をスクリーニングするためのキットであって：表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲの一つ以上の試薬、及び少なくとも一つのｍｉＲを発現している細胞を含む、前記キット。
【請求項３５】
該ｍｉＲの存在が、少なくとも一つのｍｉＲと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される、前の請求項のキット。
【請求項３６】
一つ以上の肺癌随伴疾患のためのスクリーニング試験であって：
表１、表２又は表３にリストした一つ以上のｍｉＲと、こうしたｍｉＲの基質及び試験剤を接触させること；及び
該試験剤が該ｍｉＲの活性を変調するかどうかを決定すること；
を含む、前記スクリーニング試験。
【請求項３７】
全ての工程がインビトロで実施される、前の請求項のスクリーニング試験。
【請求項３８】
個体の一つ以上の肺癌随伴疾患に関連する合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重度を限定する医薬の製造のための、一つ以上の肺癌随伴応答シグナル伝達経路を妨害する剤の使用であって、該剤が、表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲを含む、前記使用。
【請求項３９】
一つ以上の肺癌随伴疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重度を限定する方法を、それらを必要とする個体において行う方法であって：
少なくとも一つ以上の肺癌随伴疾患応答カスケードを妨害する剤を該個体に投与することを含み、該剤が、表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲを含む、前記方法。
【請求項４０】
個体の一つ以上の肺癌随伴疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重度を限定する医薬の製造のための、少なくとも一つ以上の肺癌随伴疾患応答カスケードを妨害する剤の使用であって、該剤が、表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲを含む、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照及び連邦政府支援の研究に関する宣言
[0001]本出願は、その開示が本明細書に組み入れられる、２００７年１１月３０日に出願された米国仮出願番号第６１／００４，８６３号の優先権を主張する。本発明は政府支援を得ずに行われ、政府は本発明に権利を有しない。
【０００２】
[0002]本発明は、末梢血中の少なくとも一つのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）を検出することによる、肺癌の診断、予後及び治療のためのある種の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]肺癌は、米国の男性及び女性において癌死の主な原因であり、＜１５％の低い５年生存率しか有していない。ここ数年において、疫学統計は、肺癌の大多数が元喫煙者及び非喫煙者で診断されたことを明らかした。
【０００４】
[0004]最近、肺癌の症例及び死亡数はわずかに減少しているにもかかわらず、２００８年において、２１５，０２０の新規症例及び１６１，８４０の死亡例が見積もられている。肺癌の早期発見のための確立されたスクリーニング検査はなく、２５％未満の対象しか外科的に治療可能な疾患（ステージＩ及びＩＩ）を示していない。加えて、切除可能な早期疾患の５年生存は７０〜８０％に達するが、疾患の再発率は受け入れ難いほど高いままである。
【０００５】
[0005]肺癌は、類似の形態学にも関わらず、異なる増殖率、転移能及び療法への応答を示す、不均質性疾患の群を表すことがますます認識されている。喫煙経験者間での肺癌の高い発生率を考えると、リスク層別化及び早期治療可能疾患の同定が極めて重要である。
【０００６】
[0006]臨床的及び病理的には、肺癌は、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の大きく二つの異なるカテゴリーに分類される。小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）は全肺癌の約２０％に相当し、速い成長速度及び初期診断での広範囲にわたる疾患により特性付けられる。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（肺癌の８０％を占める）は、同様の様式で挙動する及び臨床的に治療される、少なくとも三つの異なる病理学的疾患単位（腺癌、扁平上皮癌及び大細胞癌）の集合である。ＮＳＣＬＣはＳＣＬＣよりも遅発性の傾向があり、そして化学療法に対する応答性が悪い。ＳＣＬＣの主力治療は、化学療法プラスマイナス放射線治療であり、一方、ＮＳＣＬＣの主な治療法は放射線療法及び／又は化学療法の慎重な追加を伴った手術である。
【０００７】
[0007]マイクロＲＮＡ（ＭｉＲＮＡ、ｍｉＲ）は、動物、植物及びウイルスを含む多くの生物において発現される小さな非翻訳ＲＮＡ（およそ２１〜２５ｎｔ長）のファミリーである。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの分解か又はタンパク質翻訳の抑制のための遺伝子を標的とする。単一のｍｉＲＮＡが複数の遺伝子を標的とすることができ、一方、単一の遺伝子が複数のｍｉＲＮＡにより標的とされることもある。ほとんどのｍｉＲＮＡの機能が依然として不明であるにもかかわらず、いくつかの研究は、それらが遺伝子調節、アポトーシス、造血発生及び細胞分化の維持を含む主要な生物学的機能に不可欠であろうことを示唆している。ｍｉＲＮＡの５０％以上が、癌において欠失され又は増幅されていることが知られている染色体領域に位置していると推定されている。
【０００８】
[0008]肺癌におけるｍｉＲＮＡの知識が明らかになり始めている。これまでに、研究者は複数のｍｉＲ−ｌｅｔ−７ファミリー遺伝子が、Ｃ．エレガンスにおいて線虫ＲＡＳ遺伝子（ｌｅｔ−６０）の３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）を標的にし得ることを同定した。ｌｅｔ−７の過剰発現は、ＲＡＳタンパク質の発現を抑制し、そしてｌｅｔ−７相補的部位がヒトＮＲＡＳ及びＫＲＡＳ３’−ＵＴＲで観察されている。ＲＡＳシグナル伝達は、肺癌においてヒトｌｅｔ−７ゲノム領域の欠失を開始させるのを助けると考えられている。実際、１４３の切除された肺癌症例中での減少したｌｅｔ−７発現は、予後不良と相関していた。
【０００９】
[0009]最近、ｍｉＲＮＡチップ分析の使用を介して、研究者は１０４対の原発性肺癌及び対応する非癌性組織における異なるｍｉＲＮＡプロファイルを示した。加えて、五つの異なるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１５５、１７−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−２、１４５及び２１）の発現が変化しており、腺癌を有する対象間での予後を予測した。
【００１０】
[00010]ゲノムプラットフォームは、疾患の組織学的サブカテゴリー、新規分子標的、予後診断ツール及び療法への応答を同定することにおいて強力なツールとなってきた。しかしながら、肺癌の研究の再現性における改善はあったが、マイクロアレイ分析を利用した組織学的分類における可変性が残っている。加えて、ゲノム研究は遺伝子発現又は生物学的関連性における検証の欠如に取り組んでいない。分析のいくつかのプラットフォームを組み入れるシステムアプローチが、肺癌における分子不均質をより明確化するために必要とされる。
【００１１】
[00011]しかしながら、診断マーカー及び治療標的を正確に同定するためのマイクロアレイ研究については、遺伝子発現のどの変化がタンパク質分析により検証されるのかを決定する必要がある。さらに機能的読取の進歩が、マイクロアレイ分析の生物学的意義を決定するために必要とされる。
【００１２】
[00012]正常対照から肺癌対象を識別するために有用である、末梢血のゲノム解析で使用し得る特異的バイオマーカーのシグネチャーセットが本明細書に示される。
【発明の概要】
【００１３】
[00013]最初の広範な側面において、対象が肺癌を有するか又は発症するリスクがあるかどうかを診断する方法が提供される。該方法は、該対象からの末梢血試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した、該試験サンプル中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化は、該対象が肺癌を有するか又は発症するリスクがあることを示す。
【００１４】
[00014]別の側面において、疾患の診断及び予後についての非侵襲的バイオマーカーとして、末梢血における遺伝子発現パターンを使用する方法が、本明細書において提供される。
【００１５】
[00015]別の広範な側面において、一つ以上の肺癌随伴疾患（lung cancer associated disease）を有する対象の予後を決定する方法が、本明細書において提供される。
[00016]以下の好ましい態様の詳細な説明を、付随する図面を照らし合わせて読むことにより、本発明の多様な目的及び利点が当業者には明らかになるであろう。
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
診断マーカー及び治療標的を正確に同定するためのマイクロアレイ研究については、遺伝子発現のどの変化がタンパク質分析により検証されるのかを決定する必要がある。さらに機能的読取の進歩が、マイクロアレイ分析の生物学的意義を決定するために必要とされる。
【発明が解決するための手段】
【００１７】
対象が肺癌を有するか又は発症するリスクがあるかどうかを診断する方法が提供される。該方法は、該対象からの末梢血試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した、該試験サンプル中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化は、該対象が肺癌を有するか又は発症するリスクがあることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】[00017]進行した肺癌を有する対象（腫瘍ｎ＝４）及び正常対照（正常Ｎ＝３）からの全末梢血ｍｉＲＮＡを示しているタイル。緑は相対的に高発現を表し、赤は相対的に低発現を表す。
【図２】[00018]正常対象（ｎ＝３）及び進行した無処置肺癌を有する対象（ｎ＝４）の全末梢血におけるＭｉＲ−１２６発現のＲＴ−ＰＣＲ（＊ｐ＜．０５）。
【図３Ａ】[00019]ヒト肺癌におけるｍｉＲ−１５５のインサイツハイブリダイゼーション。  [00020]  図３Ａ：未成熟ＭｉＲ−１５５は腺癌の核に局在する（矢印）。
【図３Ｂ】ヒト肺癌におけるｍｉＲ−１５５のインサイツハイブリダイゼーション。[00021]同一の腺癌サンプルにおいてｍｉＲ−１５５の成熟形の発現が検出されないことは、障害されたプロセシングを示唆する。
【図３Ｃ】ヒト肺癌におけるｍｉＲ−１５５のインサイツハイブリダイゼーション。[00022]気管支肺胞細胞癌（ＢＡＣ）の核にある未成熟ｍｉＲ−１５５（矢印）。
【図３Ｄ】ヒト肺癌におけるｍｉＲ−１５５のインサイツハイブリダイゼーション。[00023]成熟ｍｉＲ−１５５は細胞質に局在する。
【図４Ａ】[00024]ｍｉＲ−１２６トランスフェクションは、Ｃｒｋタンパク質発現を変化させる。  [00025]  図４Ａ：Ｈ１７０３（非小細胞癌）細胞のｐｒｅｍｉＲ−１２６トランスフェクションは、ｍｉＲ−１２６ｍＲＮＡ発現を１０００〜５０００倍増加させ、ＣｒｋＩＩタンパク質を減少させる。
【図４Ｂ】ｍｉＲ−１２６トランスフェクションは、Ｃｒｋタンパク質発現を変化させる。[00026]Ｃｒｋ  ｍＲＮＡに変化なし（図４Ｂ）。ウエスタンブロットを二重に実施し、すべてのＲＴ−ＰＣＲ結果は、二重に実施された２回の独立した実験からの平均＝／−Ｓ．Ｅ．を示している（＊ｐ＜．０５  スクランブル対ｐｒｅ−ｍｉＲ）。１８Ｓを内部標準として使用した。
【図４Ｃ】ｍｉＲ−１２６トランスフェクションは、Ｃｒｋタンパク質発現を変化させる。ＣｒｋＩタンパク質はウエスタンでは検出されなかった。１００ｎＭのＬＮＡ  ｍｉＲ−１２６アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨ２２６細胞のトランスフェクションは、スクランブルｐｒｅ−ｍｉＲトランスフェクションと比較してｍｉＲ−１２６発現が１０分の１に減少した（図４Ｃ）。ウエスタンブロットを二重に実施し、すべてのＲＴ−ＰＣＲ結果は、二重に実施された２回の独立した実験からの平均＝／−Ｓ．Ｅ．を示している（＊ｐ＜．０５  スクランブル対ｐｒｅ−ｍｉＲ）。１８Ｓを内部標準として使用した。
【図４Ｄ】ｍｉＲ−１２６トランスフェクションは、Ｃｒｋタンパク質発現を変化させる。デンシトメトリーにより測定されたＣｒｋＩＩタンパク質発現は増加したが（＊ｐ＜．０５）、ｍＲＮＡは変化しなかった（図４Ｄ）。ウエスタンブロットを二重に実施し、すべてのＲＴ−ＰＣＲ結果は、二重に実施された２回の独立した実験からの平均＝／−Ｓ．Ｅ．を示している（＊ｐ＜．０５  スクランブル対ｐｒｅ−ｍｉＲ）。１８Ｓを内部標準として使用した。
【図５】[00027]  図５Ａ〜５Ｇ：肺のヒト扁平上皮癌における、ｍｉＲ−１２６についてのインサイツハイブリダイゼーション及びＣｒｋについての免疫組織化学を示している代表的像。１のケースにおいて、Ｃｒｋ発現（赤色）がほとんどの腫瘍細胞内で明らかであり（図５Ａ）、一方、ｍｉＲ−１２６発現は腫瘍細胞に隣接する切片では観察されないが（図５Ｂ）、ｍｉＲ−１２６は正常気管支上皮で検出された（図５Ｃ）（青色シグナル）。第２のケースにおいて、Ｃｒｋは腫瘍内で検出不能であるが（図５Ｄ）、一方、腫瘍内にｍｉＲ−１２６の強い発現（青色）があり（図５Ｅ）；正常組織において、Ｃｒｋは内皮（図５Ｆ）及び気管支上皮（図５Ｇ）に局在している（全ての像は、１０００ｘである図５Ｆ及び２００ｘである図５Ｇを除いて４００ｘである）。
【図６】[00028]末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の正常（Ｎ＝５）レベルと比較した肺癌（Ｎ＝５）中のｍｉＲ−１２６の相対的発現を示しているグラフ。（ｐ＜．０５）
【図７】[00029]血清中の正常（Ｎ＝５）レベルと比較した肺癌（Ｎ＝５）中のｍｉＲ−ｌｅｔ７ａの相対的発現を示しているグラフ。（ｐ＜．０５）
【図８】[00030]血清中の正常（Ｎ＝５）レベルと比較した肺癌（Ｎ＝５）中のｍｉＲ−１２６の相対的発現を示しているグラフ。（ｐ＜．０５）
【図９−１】[00031]Ｈ１７０３増殖、接着、遊走及び浸潤に対するｍｉＲ−１２６過剰発現の効果。  [00032]  図９Ａ：[00032]対照、スクランブルｐｒｅ−ｍｉＲ及びｐｒｅ−ｍｉＲ１２６細胞は、９６時間にわたって類似の増殖速度を示した。２回の独立した増殖アッセイを三重に実施した。Ｈ１７０３増殖、接着、遊走及び浸潤に対するｍｉＲ−１２６過剰発現の効果。[00033]ｍｉＲ−１２６過剰発現細胞は、減少した接着（図９Ｂ）、遊走（図９Ｃ）及び浸潤（図９Ｄ）を示した。
【図９−２】図９Ｃ：Ｈ１７０３増殖、接着、遊走及び浸潤に対するｍｉＲ−１２６過剰発現の効果。[00033]ｍｉＲ−１２６過剰発現細胞は、減少した接着（図９Ｂ）、遊走（図９Ｃ）及び浸潤（図９Ｄ）を示した。図９Ｃ及び図９Ｄの像は、盲検ランダム視野（blinded random field）の代表像である（ｐ＜．０５）。全ての実験において、ｍｉＲ−１２６過剰発現がＲＴ−ＰＣＲにより確認され、適切な誘導は確実である。結果は、三重に実施された四つの視野の平均を示している（＊ｐ＜．０５  スクランブル対ｐｒｅ−ｍｉＲ）。
【図９−３】図９Ｄ：Ｈ１７０３増殖、接着、遊走及び浸潤に対するｍｉＲ−１２６過剰発現の効果。[00033]ｍｉＲ−１２６過剰発現細胞は、減少した接着（図９Ｂ）、遊走（図９Ｃ）及び浸潤（図９Ｄ）を示した。図９Ｃ及び図９Ｄの像は、盲検ランダム視野（blinded random field）の代表像である（ｐ＜．０５）。全ての実験において、ｍｉＲ−１２６過剰発現がＲＴ−ＰＣＲにより確認され、適切な誘導は確実である。結果は、三重に実施された四つの視野の平均を示している（＊ｐ＜．０５  スクランブル対ｐｒｅ−ｍｉＲ）。
【図１０Ａ】[00034]ＮＳＣＬＣ組織におけるｍｉＲ−１２６及びＣｒｋ発現：ヒト非小細胞肺癌及び非病変部隣接肺（扁平上皮１〜１３及び腺癌１４〜１９）の１９対の試験は、非病変部隣接正常（Ｎ）肺と比較して腫瘍（Ｔ）でのｍｉＲ−１２６  ｍＲＮＡ発現の減少を示した（図１０Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、二重に実施された２回の独立した実験からの平均＝／−Ｓ．Ｅを示している（＊ｐ＜．０５  腫瘍対非病変部肺）。１８Ｓを内部標準として使用した。
【図１０Ｂ】[00034]ＮＳＣＬＣ組織におけるｍｉＲ−１２６及びＣｒｋ発現：これら同一サンプル中のＣｒｋ  ｍＲＮＡ発現は不定であり、１９の腫瘍の内の７が非病変部隣接肺よりも高いＣｒｋ発現を示した（図１０Ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、二重に実施された２回の独立した実験からの平均＝／−Ｓ．Ｅを示している（＊ｐ＜．０５  腫瘍対非病変部肺）。１８Ｓを内部標準として使用した。
【図１１−１】[00035]図１１（実際の数字は図９下部を示す）−表４は、オリゴプローブ、前駆体配列、成熟ｍＲＮＡ、活性部位上にプローブがあるかどうか、Entrez- Gene ＩＤ、基準配列番号、ｍｉＲ塩基ステムループ 寄託番号、ｍｉＲ塩基成熟配列寄託番号、注、オリゴ配列、成熟ｍｉＲＮＡ配列、及びステムループ配列を示す。
【図１１−２】図１１−表４の続き。
【図１１−３】図１１−表４の続き。
【図１１−４】図１１−表４の続き。
【図１１−５】図１１−表４の続き。
【図１１−６】図１１−表４の続き。
【図１１−７】図１１−表４の続き。
【図１１−８】図１１−表４の続き。
【図１１−９】図１１−表４の続き。
【図１１−１０】図１１−表４の続き。
【図１１−１１】図１１−表４の続き。
【図１１−１２】図１１−表４の続き。
【図１１−１３】図１１−表４の続き。
【図１１−１４】図１１−表４の続き。
【図１１−１５】図１１−表４の続き。
【図１１−１６】図１１−表４の続き。
【図１１−１７】図１１−表４の続き。
【図１２−１】[00036]表５は血清中に検出されたｍｉＲＮＡを示す。
【図１２−２】図１２−表５の続き。
【図１２−３】図１２−表５の続き。
【図１２−４】図１２−表５の続き。
【図１２−５】図１２−表５の続き。
【図１２−６】図１２−表５の続き。
【図１２−７】図１２−表５の続き。
【図１２−８】図１２−表５の続き。
【図１２−９】図１２−表５の続き。
【図１３−１】[00037]表６は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中に検出されたｍｉＲＮＡを示す。
【図１３−２】図１３−表６の続き。
【図１３−３】図１３−表６の続き。
【図１３−４】図１３−表６の続き。
【図１３−５】図１３−表６の続き。
【図１３−６】図１３−表６の続き。
【図１３−７】図１３−表６の続き。
【図１３−８】図１３−表６の続き。
【図１３−９】図１３−表６の続き。
【図１３−１０】図１３−表６の続き。
【図１３−１１】図１３−表６の続き。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
[00038]本発明は、一部、炎症性応答に関与し、及び／又は血液中で変化した発現レベルを有する特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の同定に基づいている。本発明はさらに、一部、これらのｍｉＲＮＡと特定の診断、予後及び療法的特色との関連に基づいている。
【００２０】
[00039]第一の広範な側面において、対象が一つ以上の肺癌随伴疾患を有しているか、又は発症するリスクがあるかどうかを決定する方法が本明細書において提供される。該方法は、一般的に：該対象からの末梢血サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較し、該サンプル中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化は、該対象が一つ以上の肺癌随伴疾患を有しているか、又は発症するリスクがあることを示す。
【００２１】
[00040]ある態様において、該末梢血サンプルは、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び血清の一つ以上を含む。
[00041]ある態様において、該一つ以上の肺癌随伴疾患は、気管支肺胞癌（ＢＡＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺腺癌、肺扁平上皮癌及び小細胞癌を含む。
【００２２】
[00042]ある態様において、該末梢血サンプルは全血を含み、そして少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、正常対照と比較して増加した発現を有する、本明細書の表１に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である。ある態様において、該ｍｉＲは、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１８ｆ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−３ｐ及びｈｓａ−ｍｉＲ−５１６−５ｐ：の一つ以上である。
【００２３】
[00043]ある態様において、該末梢血サンプルは全血を含み、そして少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、正常対照と比較して減少した発現を有する、本明細書の表１に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である。ある態様において、該ｍｉＲは、ｈｓａ−ｍｉＲ−１−２Ｎｏ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１１−２Ｎｏ２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０１−２Ｎｏ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−２−ｐｒｅｃＮｏ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５１Ｎｏ２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＊Ｎｏ２、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｄ−ｖｌ−ｐｒｅｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１−ｌＮｏ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２３−ｐｒｅｃＮｏ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−ｌ００Ｎｏ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５０−ｐｒｅｃ、ｈｓａ−ｍｉＲ−０２１−ｐｒｅｃ−１７Ｎｏ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４ａＮｏ１、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉＮｏ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６＊Ｎｏ１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６Ｎｏ２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ｃ−ｐｒｅｃＮｏ２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２６Ｎｏ１の一つ以上である。
【００２４】
[00044]別の側面において、該末梢血サンプルは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、そして少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３０：の減少したｍｉＲ発現から成る、表２に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である。
【００２５】
[00045]別の側面において、該サンプルは末梢血単核細胞を含み、そして少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４８７ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−６３６、ｈｓａ−ｍｉＲ−３２０及びｈｓａ−ｍｉＲ−１４５：の増加したｍｉＲ発現から成る、表２に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である。
【００２６】
[00046]別の側面において、該末梢血サンプルは血清を含み、そして少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９２の増加したｍｉＲ発現から成る、表３に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である。
【００２７】
[00047]別の側面において、該サンプルは血清を含み、そして少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、ｈｓａ−ｍｉＲ−５３２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９７、ｈｓａ−ｍｉＲ−３４２：の減少したｍｉＲ発現から成る、表３に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である。
【００２８】
[00048]別の側面において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、表４に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である。
[00049]別の側面において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、表５に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である。
【００２９】
[00050]別の側面において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、表６に示した群より選択される一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物である。
[00051]別の側面において、該方法は、肺癌を有する対象の予後を決定するために使用され、該対象からのサンプル中の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、該ｍｉＲ遺伝子産物は肺癌の予後不良と関連しており；そして、対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較して、該サンプル中の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化は、予後不良を示す。
【００３０】
[00052]別の側面において、末梢血サンプルで一つ以上の肺癌随伴疾患を検出する方法が本明細書に提供され、該方法は、肺癌に関連した少なくとも一つのバイオマーカーの変化した発現についてサンプルを分析すること；及び該少なくとも一つのバイオマーカーの変化した発現と該サンプル中の肺癌の有無を相関させること：を含み、該少なくとも一つのバイオマーカーは、表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから選択される。
【００３１】
[00053]別の側面において、一つ以上の肺癌随伴疾患を有していると疑われる対象を早期診断する方法が本明細書に提供され、該方法は、該対象からサンプルを入手すること；肺癌と関連した少なくとも一つのバイオマーカーの変化した発現についてサンプルを分析すること；該少なくとも一つのバイオマーカーの変化した発現と該対象における肺癌の存在を相関させること：を含み、該少なくとも一つのバイオマーカーは、表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから選択される。
【００３２】
[00054]別の側面において、一つ以上の肺癌随伴疾患を有する対象を治療する方法が本明細書に提供され、表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーと相補的な核酸を含む、治療的に有効量の組成物を投与することを含む。
【００３３】
[00055]別の側面において、表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群から選択される、少なくとも一つのバイオマーカーと相補的な核酸を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
【００３４】
[00056]別の側面において、一つ以上の肺癌随伴疾患のため化学放射線治療を受けている患者の末梢血サンプルと、化学放射線治療を受けていない患者のサンプルを比較する方法が本明細書に提供され：表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーの異なった発現を比較することを含む。
【００３５】
[00057]別の側面において、患者の一つ以上の肺癌随伴疾患のステージ分類を比較する方法が本明細書に提供され：該患者から末梢血サンプルを入手すること；及び表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群から選択される少なくとも一つのバイオマーカーの異なった発現を比較することを含む。
【００３６】
[00058]別の側面において、一つ以上の肺癌随伴疾患を抑制するための方法を、それを必要とする対象において行うこと本明細書に提供され：表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲの少なくとも一つを投与することを含む。
【００３７】
[00059]別の側面において、一つ以上の肺癌随伴疾患を患っている対象においてそれらの疾患を治療する方法が本明細書に提供され、ここで対照細胞と比較して該対象の癌細胞においては少なくとも一つのｍｉＲが下方調節又は上方調節されており：該癌細胞において該少なくとも一つのｍｉＲが下方調節されている場合、該対象の癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも一つの単離されたｍｉＲの有効量を該対象に投与すること；又は、該癌細胞において該少なくとも一つのｍｉＲが上方調節されている場合、該対象の癌細胞の増殖が抑制されるように、少なくとも一つのｍｉＲの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することを含み；該ｍｉＲは表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群より選択される。
【００３８】
[00060]別の側面において、対象の一つ以上の肺癌随伴疾患を治療する方法が本明細書に提供され：対照サンプルと比較した、該対象から入手した末梢血サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲの量を決定すること、ここで該ｍｉＲは表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから選択され；及び、該対象における肺癌の増殖が抑制されように、（ｉ）もし、該対象において発現された該ｍｉＲの量が対照細胞中で発現されたｍｉＲの量よりも少なければ、少なくとも一つの単離されたｍｉＲの有効量を該対象に投与することにより；又は（ｉｉ）もし、該対象において発現された該ｍｉＲの量が対照細胞中で発現されたｍｉＲの量よりも多ければ、該少なくとも一つのｍｉＲの発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することにより；該対象におけるｍｉＲ活性の量を変化させることを含む。
【００３９】
[00061]別の側面において、抗肺癌随伴疾患剤を同定する方法が本明細書に提供され：癌細胞に試験剤を提供すること、及び該肺癌細胞中での減少した発現レベルと関連した少なくとも一つのｍｉＲのレベルを測定することを含み、適した対照細胞と比較し、該肺癌細胞中の該ｍｉＲのレベルの増加は、該試験剤が抗癌剤であることを示し；該ｍｉＲは、表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群より選択される。
【００４０】
[00062]別の側面において、対象における病的状態、又は病的状態を発症するリスクを評価する方法が本明細書に提供され：該対象からのサンプル中の一つ以上のマーカーの発現プロファイルを測定することを含み、該対象からのサンプルにおける発現プロファイルと正常サンプルの発現プロファイルとの相違は、一つ以上の肺癌随伴疾患又はそれらへの素因を示し、そして該マーカーは表１、表２又は表３にリストした一つ以上のｍｉＲを少なくとも含む。
【００４１】
[00063]別の側面において、表１、表２又は表３にリストしたｍｉＲから成る群から選択される一つ以上のｍｉＲを含む組成物が本明細書に提供される。
[00064]別の側面において、一つ以上の肺癌随伴疾患を試験するための試薬が本明細書に提供され、該試薬は、表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲのヌクレオチド配列、又は該ｍｉＲのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含んでいるポリヌクレオチドを含む。
【００４２】
[00065]別の側面において、一つ以上の肺癌随伴疾患を試験するための試薬が本明細書に提供され、該試薬は、表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲによりコードされたタンパク質を認識する抗体を含む。
[00066]別の側面において、一つ以上の肺癌随伴疾患を予防する、診断する及び／又は治療するための療法の有効性を評価する方法が本明細書に提供され：その有効性が評価されている療法を患者に供すること；そして表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲを評価することにより、一つ以上の肺癌随伴疾患を治療する又は予防することについて、試験されている治療の有効性のレベルを決定すること；を含む。
【００４３】
[00067]ある態様において、該候補治療剤は：医薬組成物、栄養機能組成物及びホメオパシー組成物の一つ以上を含む。
[00068]ある態様において、評価されている療法は、ヒト対象での使用のためである。
【００４４】
[00069]別の側面において、製品が本明細書に提供され：表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲから選択される、一つ以上の肺癌随伴疾患のためのマーカーへ結合する少なくとも一つの捕捉試薬を含む。
【００４５】
[00070]別の側面において、一つ以上の肺癌随伴疾患を治療する療法剤の候補化合物をスクリーニングするためのキットが本明細書に提供され、該キットは：表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲの一つ以上の試薬、及び少なくとも一つのｍｉＲを発現している細胞を含む。
【００４６】
[00071]ある態様において、該ｍｉＲの存在は、少なくとも一つのｍｉＲと特異的に結合する抗体又は抗体断片を含む試薬を使用して検出される。
[00072]別の側面において、一つ以上の肺癌随伴疾患のためのスクリーニング試験が本明細書に提供され：表１、表２又は表３にリストした一つ以上のｍｉＲと、こうしたｍｉＲの基質及び試験剤を接触させること、及び該試験剤が該ｍｉＲの活性を変調するかどうかを決定すること；を含む。
【００４７】
[00073]ある態様において、全ての工程はインビトロで実施される。
[00074]別の側面において、個体における一つ以上の肺癌随伴疾患に関連する合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重度を限定する医薬の製造のための、一つ以上の肺癌関連応答シグナル伝達経路を妨害する剤の使用が本明細書に提供され、該剤は、表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲを含む。
【００４８】
[00075]別の側面において、一つ以上の肺癌随伴疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重度を限定する方法を、それらを必要とする個体で行うことが本明細書において提供され：少なくとも一つ以上の肺癌随伴疾患応答カスケードを妨害する剤を該個体に投与することを含み、該剤は、表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲを含む。
【００４９】
[00076]別の側面において、個体の一つ以上の肺癌随伴疾患合併症を治療する、予防する、逆行させる、又は重度を限定する医薬の製造のための、少なくとも一つ以上の肺癌随伴疾患応答カスケードを妨害する剤の使用が本明細書に提供され、該剤は、表１、表２又は表３にリストした少なくとも一つのｍｉＲを含む。
【００５０】
[00077]実施例
[00078]本発明の例示として働くが、本発明を制限するものではない以下の非制限的実施例を参照することにより、本発明をより良く理解することができる。
【００５１】
[00079]従って、本発明は、対象が肺癌を有する、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する方法を包含する。一つの側面に従うと、該対象からの試験サンプル中の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルが、対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較される。対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較して、該試験サンプル中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（例えば、増加、減少）は、該対象が肺癌を有する、又は発症するリスクがあることを示す。ある態様において、該試験サンプルは末梢血を含む。
【００５２】
[00080]理論に束縛されるものではないが、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは末梢血で検出可能であり、対象における肺癌を評価することに有用であると発明者には考えられる。該ｍｉＲＮＡ発現プロファイルは、後期疾患を有する対象と早期肺癌を有する対象を識別するため、及びさらに肺癌を有しない現／元経験者を識別するために有用であることも本明細書に示される。
【００５３】
[00081]また、末梢血中のマイクロＲＮＡは、原発腫瘍生物学を反映すると本発明者により考えられており、肺癌疾患進行／再発の診断、サーベイランス及び療法への応答をモニターすることにおいて有用である。
【００５４】
[00082]本発明者は、確認された肺癌を有する対象の末梢血において、はっきりと異なるｍｉＲＮＡ発現プロファイル（即ち、ｍｉＲシグネチャ又はバイオマーカー）をここに同定した。
【００５５】
[00083]特定の側面において、本発明者は、進行した肺癌を有する対象及び肺癌を有さない非喫煙者対象の組の両方の末梢血中のｍｉＲＮＡの存在を同定した。最初の目的変数なしのクラスター分析は、二つの群を区別するｍｉＲＮＡの存在を示した。
【００５６】
[00084]ｍｉＲＮＡプロファイリングは、生物学的に関連する標的を同定するために有用なツールである。末梢血中のｍｉＲＮＡの役割は依然として不明であるが、末梢血ｍｉＲＮＡプロファイリングは、肺癌においてはっきりと異なる分子シグネチャを同定するために、そしてこうしたプロファイルを腫瘍生物学と相関させるために有用であることを本発明者は考えている。これらのシグネチャは、例えば、マイクロアレイ／プロテオミクスプラットフォーム及びＣＴスキャンのような他のモダリティーを補足するために使用することができ；それ故、肺癌診断及び治療のための個別化されたアプローチを支援している。
【００５７】
[00085]本発明者は、末梢血中に同定されたマイクロＲＮＡは、原発腫瘍生物学を反映し、そして疾患検出のための、療法への応答を決定するための、及び肺癌のサーベイランス、及び／又は肺癌のなんらかの再発をモニタリングするためのバイオマーカーとして有用であることもここに考えている。さらに、該ｍｉＲＮＡは分子経路のはっきりと異なるネットワークを示すのに有用であり、それは順に、新規治療標的を同定することにおいて有用である。
【００５８】
[00086]本明細書の実施例で示したように、元／現及び非喫煙者からの肺腫瘍に存在する、はっきりと異なるｍｉＲＮＡシグネチャがある。これらのシグネチャは、生物学的標的及び経路を同定するために有用である。
【００５９】
[00087]ｍｉＲＮＡシグネチャが、肺癌を有する喫煙及び非喫煙個体及びマッチした対照で同定された。腫瘍中のはっきり異なるｍｉＲＮＡ発現パターンの存在は以下の群で評価すべきである：１−現又は元喫煙者である非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する切除可能な対象；２−非喫煙者である非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する切除可能な対象；及び３−健常対照。
【００６０】
[00088]腫瘍及び末梢血両方におけるはっきり異なるｍｉＲＮＡシグネチャの存在は、肺癌を有する現／元喫煙及び非喫煙者と対照を区別するのに役立つ。また、末梢血ｍｉＲＮＡ発現パターンも原発腫瘍シグネチャを反映する。
【００６１】
[00089]肺癌特異的ｍｉＲＮＡ
[00090]癌におけるｍｉＲＮＡの発現変化の原因は、まだ十分に明らかにされていない。しかしながら、少なくとも一つの五つの主な機構が近年同定されている：１）癌関連ゲノム領域でのｍｉＲＮＡ位置；２）エピジェネティック（epigenetic）調節；３）ダイサー及びドローシャのようなｍｉＲＮＡプロセシングタンパク質及び遺伝子の破壊；４）ｍｉＲＮＡ−ｍｉＲＮＡ相互作用；及び５）癌遺伝子及び癌抑制遺伝子によるｍｉＲＮＡ発現の標的化。
【００６２】
[00091]マイクロＲＮＡバイオジェネシス（biogenesis）及び標的化
[00092]ｍｉＲＮＡは、タンパク質コード遺伝子のイントロン内又は非コードＲＮＡのイントロン又はエクソン内のような、いくつかのゲノム位置に位置することができる。核内において、ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより、数百〜数千のヌクレオチド長範囲の長い一次転写産物、一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）に転写される。
【００６３】
[00093]核にある間、ドローシャはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの両鎖を切断して、ｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）と称される７０〜１００ヌクレオチドステムループを放出する。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは引き続いてエクスポーチン５／ＲａｎＧＴＰにより核から細胞質へ輸送される。細胞質へ輸送されるとすぐに、ｄｓＲＢＤと共同して、第二のＲＮａｓｅＩＩＩ（ダイサーと称される）がｐｒｅ−ｍｉＲＮＡを切断し、およそ２２ヌクレオチドのＲＮＡ二重鎖（成熟ｍｉＲＮＡ及びその相補的ｍｉＲＮＡ＊）を放出する。
【００６４】
[00094]ｍｉＲＮＡ含有リボ核タンパク質粒子（ｍｉＲＮＰ）のタンパク質複合体に進入するため、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖の一つの鎖のみが放出され、他の鎖は分解される。ｍｉＲＮＰがｍｉＲＮＡを標的ＲＮＡに導き、翻訳抑制か又はｍＲＮＡ分解によりタンパク質発現を調節する。ｍｉＲＮＡはタンパク質コード転写体の３’−非翻訳領域中の標的部位に結合する。翻訳の抑制及びｍＲＮＡ分解は、ｍｉＲＮＡの５’末端の「種（seed）」領域と標的部位間の塩基対形成に依存する。ほとんどのｍｉＲＮＡは複数の標的を有し、それ故、数百〜数千の遺伝子を調節する能力を有する。
【００６５】
[00095]本発明者は、進行したＮＳＣＬＣを有する４人の対象及び３人の正常対照のコホートにおいて、全末梢血ｍｉＲＮＡ発現を試験した。確認された進行（ステージ３Ｂ、ＩＶ）非小細胞肺癌を有する４人の対象及び３人の健常対照対象からの全末梢血を試験した。これらの個体のｍｉＲＮＡチップ分析は、正常と比較して肺癌対象の末梢血で上方か又は下方調節されている９３のｍｉＲＮＡの存在を示した（データは示されていない）。２倍変化のカットオフを使用して、有意なｍｉＲＮＡを示した。
【００６６】
[00096]本発明者は、進行した肺癌を有する対象及び既知の肺癌を有しない非喫煙者の組の両方の末梢血においてｍｉＲＮＡの存在を同定した。
[00097]加えて、最初の目的変数なしのクラスター分析は、疾患の極端における個体の二つの群（進行した肺癌を有する喫煙者及び疾患のない非喫煙者）間を識別するｍｉＲＮＡの存在を示した。しかしながら、これらの結果は、喫煙歴又は合併している疾患に起因しうる変化を考慮に入れていないことに注意すべきである。
【００６７】
[00098]ヒト肺癌組織中の局在化しているｍｉＲＮＡ及び特異的標的は、インビトロモデルに基づいた関連細胞タイプを開発する、及び鍵となる生物学的経路を決定するための重要なステップである。
【００６８】
[00099]本発明者は、肺腫瘍中の局在化ｍｉＲＮＡについての方法としてインサイツハイブリダイゼーションを示した。本発明者は、成熟ｍｉＲ−１５５は腺癌には存在していないが、気管支肺胞癌（ＢＡＣ）に存在していることを観察した。この発見は、両方のｍｉＲＮＡ調節に相違が存在していてもよいことを示唆し、肺癌のこれらサブタイプにおいて生物学的関連を有していると考えられる。
【００６９】
[000100]方法
[000101]明確にするために、肺腺癌に関連した喫煙は、＞年間２０箱喫煙歴の対象に制限した。現又は元喫煙者であった。＜１００の生涯タバコ歴の対象のみが「非喫煙者」に含まれた。ＢＡＣを有するほとんどの対象が非喫煙者であろうと考えられるが、患者群をこの臨床的特徴により限定しなかった。頻度マッチングは、三つの群、即ち、年齢について補充して実施した。
【００７０】
[000102]全国データと一致して、およそ１３％の対象が喫煙未経験と報告したことが見出された。また全国データと一致して、肺癌の対象のおよそ４０〜４５％が腺癌を有していた。ＢＡＣに関しては、かなりの数の対象がＢＡＣ特色を有していたが、腫瘍登録は、２０００〜２００６年に７６の対象が粘液性又は非粘液性ＢＡＣと診断されたことを報告している。
【００７１】
[000103]サンプルは液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保存した。肺癌の病歴又は肺癌の現診断（過去の胸部Ｘ線）のない現及び元喫煙者は、健康な非喫煙者の群を評価することに加えて研究した。該対象は年齢、性別及び内科的合併疾患についてほぼマッチしていた。
【００７２】
[000104]サンプルサイズ及び検出力計算（power calculation）
[000105]切除可能／切除不可能な現／元喫煙者群と、対照及び非喫煙者群を、全末梢血マイクロＲＮＡ発現レベルの相違について比較した。仮説試験は、以前に興味を引いたマイクロＲＮＡ（予備的データで観察された９３マイクロＲＮＡ及びYanaihara et al., 2006にリストされた４３マイクロＲＮＡ）対探査全ヒトマイクロＲＮＡに分離した。
【００７３】
[000106]１２５の以前に興味を引いたマイクロＲＮＡについては、Lehman and Romano (2005）の一般化ファミリーワイズエラー率（generalized familywise error rate）（ＧＦＷＥＲ）アプローチを使用して四つの偽陽性を回避した。８０（２０の対照、４０の切除可能な現／元喫煙者及び２０の切除可能な非喫煙者）のサンプルサイズは、予備的データで観察された中央値標準偏差を与える＞８０％の検出力で、発現の２倍の相違を検出することを可能にする。
【００７４】
[000107]全ゲノムの探査については、およそ１８０のマイクロＲＮＡがチップ上で試験可能であった。０．０５のＧＦＷＥＲを使用し、１０の偽陽性が認められた。三つの群について８０のサンプルを用い、８０％検出力で１．９の倍数変化を検出した。バックグラウンド補正、フィルタリング及び規格化法を、技術的な偏りを回避するために実施した。Ｔ検定を、差次的に発現されたマイクロＲＮＡを検出するために実施した。差次的に発現についての可変性及び統計検定の推定を改善するため、縮小分散推定法を用いた。ｐ値は、ノンパラメトリック法（Westfall and Young, 1993）によって評価した。
【００７５】
[000108]血液処理
[000109]血液サンプルは、対象が外科的切除を行ったかどうかにかかわらず入手した（即ち、手術、放射線療法、化学療法又は非処置が予定されている対象が、血液サンプルを得るのに適格である）。全血液サンプル（５ｃｃ）を二つの別々のPAX-GENE（市販）チューブに採取した。サンプルは次ぎに、全血ＲＮＡのための改良トリゾール抽出プロトコールで処理した。
【００７６】
[000110]血清及びＰＢＭＣ中での分析のため、ｍｉＲＮＡ解析のための第二の方法を用いた。第二の方法の場合、１８ｃｃの末梢血からの血清分画より、十分なＲＮＡ（５〜１０μｇ）を得ることが可能であった。末梢血はＥＤＴＡ−チューブに採取した。血液を滅菌ＰＢＳで１：２に希釈し、次ぎにFicoll-Histopaque（ｄ＝１．０７７）上に層積し、遠心分離した。得られた血漿は、トリゾールを使用して直接的にＲＮＡ分離に供した。リンパ球及び単核球を含有する単核細胞層はＲＮＡ単離に先だって、滅菌ＰＢＳで１回洗浄した。好中球は、デキストラン硫酸沈降により赤血球ペレットから分離した。ＲＢＣはＲＮＡ抽出に先だって、低張溶解に供されるであろう。
【００７７】
[000111]マイクロＲＮＡ分析
[000112]全血ｍｉＲＮＡ発現は、ＯＳＵ−ＣＣＣマイクロアレイ施設を介してのｍｉＲＮＡチップにより、及び既知のｍｉＲＮＡについてはＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＲＮＡは、全血、ＰＢＭＣ、血清及び肺組織から分離し、処理した。該マイクロアレイ設備は、５７８のｍｉＲＮＡ前駆体配列（３２９ヒト、２４９マウス及び３シロイヌナズナ）に対するプローブを含有するマイクロＲＮＡＣＨＩＰ  ｖ３を利用している。５μｇの全ＲＮＡは、第一鎖ｃＤＮＡの発生、続いての各ＯＳＵ−ＣＣＣ  ｍｉＲＮＡチップへのアレイハイブリダイゼーションにより調製した。完了したら、ｍｉＲＮＡ標的を、Sanger miRBase 7.0(Target scan. Pictar)を利用して同定した。
【００７８】
[000113]図１は、ｍｉＲＮＡシグネチャが肺癌を有する個体及びマッチした対照で同定されたことを示すｍｉＲＮＡバイオジェネシスを図示している。該ｍｉＲＮＡは、確認された肺癌を有する個体の末梢血で検出可能である。
【００７９】
[000114]末梢血ｍｉＲＮＡプロファイル
[000115]末梢血ｍｉＲＮＡプロファイルは、療法に先立って確認された肺癌を有する個体と肺癌を有しない個体間を識別するために有用である。
【００８０】
[000116]全末梢血ｍｉＲＮＡを、ＳＡＭ（マイクロアレイの有意性分析）ソフトウェアーを使用して分析し、二つのクラス（肺癌を有する対象（腫瘍）対確認された肺癌又は肺疾患がない対象（正常）の末梢血）において統計的に有意なｍｉＲＮＡを同定した。
【００８１】
[000117]実施例１
[000118]末梢全血マイクロＲＮＡ発現は、以前に報告されている特異的マイクロＲＮＡについての原発性腫瘍発現と相関する。
【００８２】
[000119]肺腫瘍及び進行した肺癌を有する対象からの末梢血サンプルの両方で下方調節されているｍｉＲＮＡが同定された。ｍｉＲＮＡが対象の群の末梢血中で変化したことを示している表１を参照されたい。
【００８３】
[000120]表１は、全血中の、正常レベルと比較して肺癌で増加した及び減少したｍｉＲＮＡを示している。スコア（ｄ）、変化倍数及びｑ値（％）が示されている。
[000121]
【００８４】
【表１】
2011505143.tif 000002
【００８５】
【表２】
2011505143.tif 000003
【００８６】
【表３】
2011505143.tif 000004
【００８７】
[000122]実施例２
[000123]加えて、ＲＴ−ＰＣＲにより特異的ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−１２６）の全末梢血発現パターンを確認し（図２参照）、そして非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（ｎ＝４）の場合、正常対照（ｎ＝３）と比較した。
【００８８】
[000124]実施例３
[000125]インサイツハイブリダイゼーションは、哺乳類組織中のｍｉＲＮＡ位置を同定するために有用である。
【００８９】
[000126]肺組織のＭｉＲＮＡ発現プロファイルは、肺癌と正常肺組織を識別する。インサイツハイブリダイゼーション研究は、ヒト肺癌組織サンプル中の潜在的ｍｉＲＮＡを位置付けるために使用した。一つの非制限的実施例において、ｍｉＲ−１５５はいくつかの固形及び血液悪性腫瘍での発現が増加している。肺癌において、増加したｍｉＲ−１５５発現は悪い生存率と相関する。
【００９０】
[000127]しかしながら、肺癌におけるｍｉＲ−１５５発現の位置及び調節はまだ分かっていない。本明細書で示したように、ｍｉＲ−１５５未成熟形が腺癌中の癌性細胞の核において同定されたが、成熟形は容易には同定されていない（図３Ａ、３Ｂ参照）。
【００９１】
[000128]理論に束縛されるわけではないが、このことは、ＮＳＣＬＣにおける調節の潜在的機構としての、ｍｉＲ−１５５のプロセシング障害を示していると考えられる。気管支肺胞細胞癌においては、ｍｉＲ−１５５の未熟及び成熟形の両方が高レベルで存在していた（図３Ｃ、３Ｄ参照）。この発見は、肺癌のサブタイプにおけるマイクロＲＮＡ発現に存在する不均質性の例を表している。
【００９２】
[000129]図４Ａ〜４Ｄは、ＭｉＲ−１２６トランスフェクションがＣｒｋタンパク質発現を変化させることを示す。Ｃｒｋは肺癌を含むいくつかの悪性腫瘍で関係付けられているアダプタータンパク質、そしてｍｉＲ−１２６の予測される標的である。図４Ａは、Ｈ１７０３細胞のｐｒｅｍｉＲ−１２６トランスフェクションが、ｍｉＲ−１２６ｍＲＮＡ発現を１０００〜５０００倍増加させ、ＣｒｋＩＩタンパク質を減少させることを示している。
【００９３】
[000130]図４Ｂ〜４Ｄは、Ｃｒｋ  ｍＲＮＡに変化がないことを示している（図４Ｂ）。ＣｒｋＩタンパク質はウエスタンでは検出されなかった。１００ｎＭのＬＮＡ  ｍｉＲ−１２６アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨ２２６細胞（扁平上皮）のトランスフェクションは、スクランブルｐｒｅ−ｍｉＲトランスフェクションと比較してｍｉＲ−１２６発現が１０分の１に減少し（図４Ｃ）、デンシトメトリーにより測定されたＣｒｋＩＩタンパク質発現は増加したが（＊ｐ＜．０５）、ｍＲＮＡは変化しなかった（図４Ｄ）。ウエスタンブロットを二重に実施し、すべてのＲＴ−ＰＣＲ結果は、二重に実施された２回の独立した実験からの平均＝／−Ｓ．Ｅ．を示している（＊ｐ＜．０５  スクランブル対ｐｒｅ−ｍｉＲ）。１８Ｓを内部標準として使用した。
【００９４】
[000131]実施例４
[000132]標的ＭｉＲＮＡサイレンシングは、細胞表現型に生じた変化を試験するために有用である。
【００９５】
[000133]図５Ａ〜５Ｇは、肺のヒト扁平上皮癌における、ｍｉＲ−１２６についてのインサイツハイブリダイゼーション及びＣｒｋについての免疫組織化学を示している代表的像を示している。１のケースにおいて、Ｃｒｋ発現（赤色）がほとんどの腫瘍細胞内で明らかであり（図５Ａ）、一方、ｍｉＲ−１２６発現は腫瘍細胞に隣接する切片では観察されないが（図５Ｂ）、ｍｉＲ−１２６は正常気管支上皮で検出された（図５Ｃ）（青色シグナル）。第２のケースにおいて、Ｃｒｋは腫瘍内で検出不能であるが（図５Ｄ）、一方、腫瘍内にｍｉＲ−１２６の強い発現（青色）があり（図５Ｅ）；正常組織において、Ｃｒｋは内皮（図５Ｆ）及び気管支上皮（図５Ｇ）に局在している（全ての像は、１０００ｘである図５Ｆ及び２００ｘである図５Ｇを除いて４００ｘである）。
【００９６】
[000134]ｍｉＲ−１２６は、キナーゼシグナル伝達及びインビトロでの足場非依存性増殖を活性化することが示されているシグナル伝達アダプタータンパク質、ＣＲＫを含む複数の予測標的を有する。
【００９７】
[000135]実施例５
[000136]肺癌の早期発見のためのスクリーニング試験
[000137]本発明まで、肺癌の早期発見のための確立されたスクリーニング試験はなく、対象の２５％未満しか外科的に治療可能疾患（ステージＩ及びＩＩ）を有していない。加えて、疾患再発は受け入れ難いほど高い。最近の疫学統計は、肺癌の大多数が現在、元及び非喫煙者で診断されていることを明らかにした。タバコを吸ったことがない対象において気管支肺胞癌（ＢＡＣ）又は非ＢＡＣ腺癌の発症を導く、はっきり異なった遺伝的及びエピジェネティック事象についてはほとんど知られていない。
【００９８】
[000138]肺癌特異的ｍｉＲＮＡ
[000139]組織／細胞及び疾患モデルのｍｉＲＮＡ機能を決定する戦略には：ａ）インビトロ標的化過剰発現の効果を決定すること、及び疾患表現型に対する選択された肺癌特異的マイクロＲＮＡのサイレンシング、及びｂ）選択された肺癌特異的マイクロＲＮＡの調節及びプロセシングを同定することが含まれる。
【００９９】
[000140]実施例６
[000141]表２は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）での正常レベルと比較して、肺癌で増加した及び減少したｍｉＲＮＡを示している。表２は、Ｃｌ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｎｌ、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４及びＮ５の癌（Ｃ）及び正常（Ｎ）について、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で観察されたｍｉＲＮＡに関して、デルタＣＴ（内部標準１８ｓマイナスサンプル）として表されたデータを示している。
【０１００】
[000142]
【０１０１】
【表４】
2011505143.tif 000005
【０１０２】
[000143]実施例７
[000144]表３は、血清での正常レベルと比較して、肺癌で増加した及び減少したｍｉＲＮＡを示している。これらはデルタＣＴ（内部標準１８Ｓマイナスサンプル）として表されている。表３は、Ｃｌ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ５、Ｎｌ、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４及びＮ５の癌（Ｃ）及び正常（Ｎ）について、血清で観察されたｍｉＲＮＡに関するデータを示している。
【０１０３】
[000145]
【０１０４】
【表５】
2011505143.tif 000006
【０１０５】
[000146]実施例８
[000147]図６は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中の正常レベルと比較した肺癌中のｍｉＲ−１２６の相対的発現を示しているグラフである。．
[000148]また、血清中の正常レベルと比較した肺癌中のｍｉＲ−ｌｅｔ７ａの相対的発現を示しているグラフを含む、図７を参照されたい。図８は、血清中の正常レベルと比較した肺癌中のｍｉＲ−１２６の相対的発現を示しているグラフを含む。
【０１０６】
[000149]実施例９
[000150]図９Ａ〜９Ｄ：Ｈ１７０３増殖、接着、遊走及び浸潤に対するｍｉＲ−１２６過剰発現の効果。
【０１０７】
[000151]図９Ａ：対照、スクランブルｐｒｅ−ｍｉＲ及びｐｒｅ−ｍｉＲ１２６細胞は、９６時間にわたって類似の増殖速度を示した。２回の独立した増殖アッセイを三重に実施した。
【０１０８】
[000152]図９２Ｂ〜９２Ｄ：ｍｉＲ−１２６過剰発現細胞は、減少した接着（図９Ｂ）、遊走（図９Ｃ）及び浸潤（図９Ｄ）を示した。図９Ｃ及び図９Ｄの像は、盲検ランダム視野の代表像である（ｐ＜．０５）。全ての実験において、ｍｉＲ−１２６過剰発現がＲＴ−ＰＣＲにより確認され、適切な誘導は確実である。結果は、三重に実施された四つの視野の平均を示している（＊ｐ＜．０５  スクランブル対ｐｒｅ−ｍｉＲ）。
【０１０９】
[000153]実施例１０
[000154]図１０Ａ〜１０Ｂ：ＮＳＣＬＣ組織におけるｍｉＲ−１２６及びＣｒｋ発現：ヒト非小細胞肺癌及び非病変部隣接肺（扁平上皮１〜１３及び腺癌１４〜１９）の１９対の試験は、非病変部隣接正常（Ｎ）肺と比較して腫瘍（Ｔ）でのｍｉＲ−１２６  ｍＲＮＡ発現の減少を示した（図１０Ａ）。これら同一サンプル中のＣｒｋ  ｍＲＮＡ発現は不定であり、１９の腫瘍の内の７が非病変部隣接肺よりも高いＣｒｋ発現を示した（図１０Ｂ）。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、二重に実施された２回の独立した実験からの平均＝／−Ｓ．Ｅを示している（＊ｐ＜．０５  腫瘍対非病変部肺）。１８Ｓを内部標準として使用した。
【０１１０】
[000155]選択された未成熟及び成熟ｍｉＲＮＡの局在化についてのインサイツハイブリダイゼーション
[000156]腫瘍形成に結び付けられるｍｉＲＮＡは、肺癌細胞タイプに依存して、調節及び生物学的関連性が異なっているとここで考えられる。現／元喫煙者及び非喫煙者からの肺腫瘍におけるｍｉＲＮＡ発現のはっきりと異なったシグネチャがあることがここで考えられる。さらに、肺腫瘍発生に関連するｍｉＲＮＡの群を同定した。
【０１１１】
[000157]実施例１１
[000158]リアルタイムＰＣＲを使用するｍｉＲＮＡ解析
[000159]５００の成熟ヒトｍｉＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲによりプロファイル作製することができ、肺癌を有する患者及び正常対照からの血液中で異なって発現されたｍｉＲＮＡを発見した。以前に公表された逆転写条件を使用し、５００の既知ヒト成熟ｍｉＲＮＡのためのループ化プライマーの混合物（Mega Plex kit，Applied Biosystems）でのプライミングにより、ＲＮＡ（５０ｎｇ）をｃＤＮＡに変換し得る。内部標準ｓｎｏＲＮＡ  Ｕ３８Ｂ及びＵ４３ならびに１８Ｓ及び７Ｓ  ｒＲＮＡに対するプライマーをプライマー混合物に含ませることができる。発現は、３８４ウェル反応プレートを備えたApplied Biosystems 7900HTリアルタイムＰＣＲ装置を使用してプロファイル作製し得る。
【０１１２】
[000160]液体取り扱いロボット及びZymak Twister robotを、スループットを増加させる、及びエラーを減少させるために使用し得る。リアルタイムＰＣＲは標準条件を使用して実施し得る。最適内部標準は、ＧＯＬＤクラスの平均２−ＣＴを比較することにより決定し得る。この内部標準は、相対的遺伝子発現を計算するために使用し得る。各ｍｉＲＮＡの相対的発現は、式２−ΔＣＴ（式中、ΔＣＴ＝ＣＴｍｉＲＮＡ−ＣＴ内部標準）から計算し得る。
【０１１３】
[000161]ＰＣＲに基づいた相対的ｍｉＲＮＡ発現は、次ぎにｔ検定を使用して分析し得る。−ΔＣＴデータは、階層的クラスター分析の方法を使用して分析することができ、ヒートマップにプロットした。ＡＮＯＶＡのような追加の統計分析を実施することができ、肺癌及び正常レベル間で異なって発現されているｍｉＲＮＡが決定される。
【０１１４】
[000162]図１１−表４は、オリゴプローブ、前駆体配列、成熟ｍＲＮＡ、活性部位上にプローブがあるかどうか、Entrez- Gene ＩＤ、基準配列番号、ｍｉＲ塩基ステムループ 寄託番号、ｍｉＲ塩基成熟配列寄託番号、注、オリゴ配列、成熟ｍｉＲＮＡ配列、及びステムループ配列のリストを示す。
【０１１５】
[000163]実施例１２
[000164]図１２−表５は、血清中に検出されたｍｉＲＮＡを示す。
[000165]実施例１３
[000166]図１３−表６は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中に検出されたｍｉＲＮＡを示す。
【０１１６】
[000167]定義及び使用例
[000168]本明細書において相互交換的に使用される、「ｍｉＲ遺伝子産物」、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲ」又は「ｍｉＲＮＡ」とは、プロセッシングされていない又はプロセッシングされたｍｉＲ遺伝子からのＲＮＡ転写体を指す。ｍｉＲ遺伝子産物はタンパク質に翻訳されないので、用語「ｍｉＲ遺伝子産物」はタンパク質を含んでいない。プロセッシングされていないｍｉＲ遺伝子転写体は「ｍｉＲ前駆体」とも称され、そして典型的には約７０〜１００ヌクレオチド長のＲＮＡ転写体を含む。ｍｉＲ前駆体は、ＲＮＡｓｅ（例えば、ダイサー、アルゴノート又はＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ（例えば、大腸菌ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ））での消化により、活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子にプロセッシングし得る。この活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、「プロセッシングされた」ｍｉＲ遺伝子転写体又は「成熟」ｍｉＲＮＡとも称される。
【０１１７】
[000169]活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、天然のプロセッシング経路（例えば、無傷の細胞又は細胞溶解物を使用して）を介して、又は合成プロセッシング経路（例えば、ダイサー、アルゴノート又はＲＮＡａｓｅ  ＩＩＩのような単離されたプロセッシング酵素を使用して）によりｍｉＲ前駆体から得ることが可能である。活性１９〜２５ヌクレオチドＲＮＡ分子は、ｍｉＲ前駆体からプロセッシングされることなく、生物学的に又は化学合成により直接的に生成し得ることも理解されている。マイクロＲＮＡが名称で本明細書において参照される場合、特に示されない限り、該名称は前駆体及び成熟形の両方に対応する。
【０１１８】
[000170]本方法は、対象からのサンプル中の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを決定すること、及び対照に対する該サンプル中の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを比較することを含む。本明細書において使用される「対象」は、こうした障害を有する、又は有していると疑われるいずれの哺乳類でもあり得る。好ましい態様において、該対象はこうした障害を有している、又は有していると疑われるヒトである。
【０１１９】
[000171]少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対象から得られた生物学的サンプルの細胞中で測定し得る。
[000172]別の態様において、サンプルを対象から取り出すことが可能であり、そしてＤＮＡを標準技術により抽出し及び単離し得る。例えば、ある態様において、該サンプルは、放射線療法、化学療法及びホルモン療法又は他の療法的治療に先立って対象から得ることができる。対応する対照サンプル又は対照基準サンプル（例えば、対照サンプルの集団から得られる）は、対象の罹患していないサンプルから、正常ヒト個体又は正常個体の集団から、又は患者のサンプル中の大多数の細胞に対応している培養細胞から得ることが可能である。対照サンプルは、対象のサンプルからの細胞中の所与のｍｉＲ遺伝子から産生されるｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対照サンプルの細胞からの対応するｍｉＲ遺伝子産物レベルと比較できるように、対象からのサンプルと同様に処理し得る。もしくは、基準サンプルは、試験サンプルとは別に（例えば、異なった時に）得ること及び処理することができ、試験サンプルからの細胞中の所与のｍｉＲ遺伝子から産生されるｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、基準サンプルからの対応するｍｉＲ遺伝子産物レベルと比較し得る。
【０１２０】
[000173]一つの態様において、試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い（即ち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「上方調節」されている）。本明細書で使用するｍｉＲ遺伝子産物の発現が「上方調節」されているとは、対象からの細胞又は組織サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物の量が、対照（例えば、標準サンプル、対照細胞サンプル、対照組織サンプル）中の同一遺伝子産物の量よりも多い場合である。
【０１２１】
[000174]別の態様において、試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い（即ち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「下方調節」されている）。本明細書で使用するｍｉＲ遺伝子産物の発現が「下方調節」されているとは、対象からのサンプル中遺伝子から産生されるｍｉＲ遺伝子産物の量が、対照サンプル中の同一遺伝子から産生される量よりも少ない場合である。対照及び正常サンプル中の相対的ｍｉＲ遺伝子発現は、一つ以上のＲＮＡ発現標品に対して決定し得る。該標品は、例えば、ゼロｍｉＲ遺伝子発現レベル、標準細胞株中でのｍｉＲ遺伝子発現レベル、患者の影響を受けていないサンプル中のｍｉＲ遺伝子発現レベル、又は正常ヒト対照の集団（例えば、対照基準標品）について以前に得られているｍｉＲ遺伝子発現の平均レベルを含むことが可能である。
【０１２２】
[000175]該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、当業者には公知である多様な技術（例えば、定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、溶液ハイブリダイゼーション検出）を使用して測定し得る。特定の態様において、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対象から得られた試験サンプルからのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供し、標的オリゴデオキシヌクレオチドを一つ以上のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ（例えば、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ）、試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そして試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルを対照サンプルから発生させたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することにより測定する。対照サンプルと比較し、試験サンプルにおける少なくとも一つのｍｉＲＮＡのシグナルの変化は、該対象が特定の障害を有している、又は特定の障害になるリスクにあることを示す。
【０１２３】
[000176]マイクロアレイは既知のｍｉＲＮＡ配列から発生させた遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブからも調製し得る。該アレイは各ｍｉＲＮＡについて二つの異なったオリゴヌクレオチドプローブを含むことができ、一つは活性成熟配列を含んでおり、そして他はｍｉＲＮＡの前駆体に対して特異的である。該アレイは、ハイブリダイゼーションストリンジェンシー条件のための対照として働き得る、ヒトオルソログとわずか数塩基が異なっている一つ以上のマウス配列のような対照も含むことができる。両方の種からのｔＲＮＡ及び他のｔＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）もマイクロチップ上にプリントすることができ、特異的ハイブリダイゼーションのための内部の、比較的に安定な陽性対照を提供している。非特異的ハイブリダイゼーションのための一つ以上の適切な対照も該マイクロチップ上に含ませることができる。この目的のためには、いずれの既知のｍｉＲＮＡとも、いずれの相同性も存在しないことに基づいて配列が選択される。
【０１２４】
[000177]該マイクロアレイは当該技術分野で公知の技術を使用して製作することができる。例えば、適切な長さの（例えば、４０ヌクレオチド）のプローブオリゴヌクレオチドが、Ｃ６位で５’−アミン修飾され、商業的に入手可能なマイクロアレイシステム、例えば、GeneMachine OmniGrid（商標）100 Microarrayer 及びAmersham CodeLink（商標）活性化スライド、を使用してプリントされる。標的ＲＮＡに対応する標識ｃＤＮＡオリゴマーは、標識プライマーで標的ＲＮＡを逆転写することにより調製される。第一鎖合成に続いて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させてＲＮＡ鋳型を分解する。このようにして調製された標識標的ｃＤＮＡを、ハイブリダイズ条件下（例えば、２５℃で１８時間の６Ｘ  ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミド、続いて３７℃で４０分の０．７５Ｘ  ＴＮＴ（トリス  ＨＣｌ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ  ２０）中での洗浄）、マイクロアレイチップにハイブリダイズさせる。固定化されたプローブＤＮＡがサンプル中の相補的標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置でハイブリダイゼーションが起こる。標識標的ｃＤＮＡは、結合が起こったアレイ上の正確な位置に印を付け、自動的な検出及び定量化を可能にする。出力はハイブリダイゼーション事象のリストから成っており、特異的ｃＤＮＡ配列の相対的存在量、そしてそれ故、患者サンプル中の対応する相補的ｍｉＲの相対量を示している。一つの態様に従うと、標識ｃＤＮＡオリゴマーは、ビオチン標識プライマーから調製されたビオチン標識ｃＤＮＡである。該マイクロアレイは次ぎに、例えば、ストレプトアビジン−Alexa647 コンジュゲートを使用するビオチン含有転写体の直接検出により処理され、慣用的スキャニング法を利用してスキャンする。アレイ上の各スポットのイメージ強度は、患者サンプル中の対応するｍｉＲの存在量に比例している。
【０１２５】
[000178]該アレイの使用は、ｍｉＲＮＡ発現検出にいくつかの利点を有する。第一に、数百の遺伝子の全体的発現が、同一サンプル中で一つの時点で同定し得る。第二に、オリゴヌクレオチドプローブの注意深い設計を介して、成熟及び前駆体分子の両方の発現を同定し得る。第三に、ノーザンブロット分析と比較し、該チップは少量のＲＮＡしか必要とせず、及び２．５μｇの総ＲＮＡを使用して再現性のある結果を提供する。比較的限られた数のｍｉＲＮＡ（種当たり数百）は、それぞれに特有のオリゴヌクレオチドプローブを有するいくつかの種のための共通マイクロアレイの構築を可能にする。こうしたツールは、多様な条件下、各々の既知ｍｉＲについての種を越えた発現の分析を可能にするであろう。
【０１２６】
[000179]特異的ｍｉＲの定量的発現レベルアッセイのための使用に加えて、ｍｉＲＮｏｍｅ、好ましくは全ｍｉＲＮｏｍｅのかなりの部分に対応するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含有するマイクロチップは、ｍｉＲ発現パターンの分析のためのｍｉＲ遺伝子発現プロファイリングを実施するために用いることができる。固有のｍｉＲシグニチァーは、確立された疾患マーカーと、又は直接的に疾患状態と関連させることができる。
【０１２７】
[000180]本明細書に記載した発現プロファイリング法に従うと、特定の障害を有していると疑われる対象からのサンプルの総ＲＮＡが定量的に逆転写されて、サンプル中のＲＮＡに相補的な標識標的オリゴデオキシヌクレオチドの組を提供する。標的オリゴデオキシヌクレオチドは次ぎに、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイへハイブリダイズされて、サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供する。結果は、サンプル中のｍｉＲＮＡの発現パターンを示している、サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルである。該ハイブリダイゼーションプロファイルは、マイクロアレイ中のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドに対する、サンプルに由来する標的オリゴデオキシヌクレオチドへの結合からのシグナルを含む。該プロファイルは、結合の存在又は不存在（シグナル対ゼロシグナル）として記録することができる。より好ましくは、記録された該プロファイルは、各ハイブリダイゼーションからのシグナルの強度を含む。該プロファイは、正常対照サンプル又は基準サンプルから発生されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較される。シグナルの変化は、対象中の特定の障害の存在、又は該障害を発症する傾向を示す。
【０１２８】
[000181]ｍｉＲ遺伝子発現を測定するための他の技術も当業者の範囲内であり、ＲＮＡ転写及び分解の速度を測定するための多様な技術が含まれる。
[000182]本発明は、対象が予後不良の特定の障害を有するか、又は発症するリスクがあるかどうかを診断する方法も提供する。この方法において、特定の障害の予後不良に関連している少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、該対象から得られた試験サンプルからのＲＮＡを逆転写し、標的オリゴデオキシヌクレオチドの組を提供することにより測定される。標的オリゴデオキシヌクレオチドは次に、一つ以上のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ）とハイブリダイズさせ、試験サンプルについてのハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そして該試験サンプルハイブリダイゼーションプロファイルを、対照サンプルから発生させたハイブリダイゼーションプロファイルと比較する。対照サンプルと比較して、試験サンプル中の少なくとも一つのｍｉＲＮＡシグナルの変化は、該対象が予後不良の特定の障害を有するか、又は発症するリスクがあることを示す。
【０１２９】
[000183]いくつかの例において、サンプル中の複数の異なったｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを同時に決定することが望ましいであろう。他の例においては、特定の障害に相関するすべての既知のｍｉＲ遺伝子の転写体の発現レベルを決定することが望ましいであろう。数百のｍｉＲ遺伝子又は遺伝子産物についての特異的発現レベルを評価することは多大な時間を必要とし、そして大量の総ＲＮＡ（例えば、各ノーザンブロットについて少なくとも２０μｇ）及び放射性同位元素を必要とするオートラジオグラフィー技術を要求する。
【０１３０】
[000184]これらの制限を克服するため、ｍｉＲ遺伝子の組に特異的であるオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド）プローブの組を含有するように、マイクロチップフォーマット（即ち、マイクロアレイ）でオリゴライブラリーを構築することができる。こうしたマイクロアレイを使用し、ＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドの組を発生させ、及びそれらをマイクロアレイ上のプローブオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション又は発現プロファイルを発生させることにより、生物学的サンプル中の複数のマイクロＲＮＡ発現レベルを決定し得る。試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルは次ぎに対照サンプルのものと比較することが可能であり、どのマイクロＲＮＡが変化した発現レベルを有しているのかを決定する。本明細書で使用する「プローブオリゴヌクレオチド」又は「プローブオリゴデオキシヌクレオチド」は、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であるオリゴヌクレオチドを指す。「標的オリゴヌクレオチド」又は「標的オリゴデオキシヌクレオチド」は、検出されるべき分子を指す（例えば、ハイブリダイゼーションを介して）。「ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド」又は「ｍｉＲに対して特異的なプローブオリゴヌクレオチド」は、特異的ｍｉＲ遺伝子産物又は特異的ｍｉＲ遺伝子産物の逆転写体にハイブリダイズするように選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１３１】
[000185]特定のサンプルの「発現プロファイル」又は「ハイブリダイゼーションプロファイル」は、本質的にはサンプルの状態のフィンガープリントである；二つの状態は同様に発現されるいずれの特定の遺伝子も有することができる一方、多数の遺伝子の同時評価は、細胞の状態に独特である遺伝子発現プロファイルの発生を可能にする。即ち、正常サンプルは、対応する障害提示サンプルから区別することができる。こうした障害提示サンプル内の、異なった予後状態（例えば、良好な又は不良な長期生存見通し）を決定することができる。異なった状態にある障害提示サンプルの発現プロファイルを比較することにより、これらの状態の各々においてどの遺伝子が重要であるかに関する情報（遺伝子の上方及び下方調節を含んで）が得られる。
【０１３２】
[000186]障害提示サンプルにおいて異なって発現された配列、ならびに異なった予後結果を生じる異なった発現の同定は、この情報のさまざまな形での使用を可能にする。例えば、特定の治療計画を評価することができる（例えば、特定の対象における長期予後を改善するために化学療法薬剤が作用するかどうかを決定するための）。同様に、既知の発現プロファイルを有する対象からのサンプルを比較することにより、診断を行う又は確認することができる。さらに、これらの遺伝子発現プロファイル（又は個々の遺伝子）は、特定の障害発現プロファイルを抑制する、又は不良な予後プロファイルをより良い予後プロファイルに変換する薬剤候補のスクリーニングを可能にする。
【０１３３】
[000187]細胞中の一つ以上のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化は、特定の障害を導き得るこれらのｍｉＲについての一つ以上の意図された標的の調節解除を生じ得る。それ故、ｍｉＲ遺伝子産物のレベルを変化させることは（例えば、障害提示細胞で上方調節されているｍｉＲのレベルを減少させることにより、障害提示細胞で下方調節されているｍｉＲのレベルを増加させることにより）、該障害を成功裏に治療することができる。
【０１３４】
[000188]従って、本発明は対象における障害を治療する方法を包含し、ここで少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物は、該対象の細胞中で脱調節されている（例えば、下方調節、上方調節）。一つの態様において、試験サンプル中の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照又は基準サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様において、試験サンプル中の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対照サンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。該少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が試験サンプル中で下方調節されている場合、該方法は、対象中の障害提示細胞の増殖が抑制されるように、該少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又は単離された変異体又はそれらの生物学的に活性な断片の有効量を投与することを含む。
【０１３５】
[000189]例えば、ｍｉＲ遺伝子産物が対象の癌細胞において下方調節されている場合、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量を該対象に投与することは、該癌細胞の増殖を抑制し得る。該対象に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、該癌細胞中で下方調節されている内在性野生型ｍｉＲ遺伝子産物と同一でもよいし、又は変異体又はそれらの生物学的に活性な断片でもあり得る。
【０１３６】
[000190]本明細書で定義されるｍｉＲ遺伝子産物の「変異体（variant）」とは、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物と１００％未満の同一性を有し、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の一つ以上の生物活性を有するｍｉＲＮＡを指す。こうした生物活性の例には、限定されるわけではないが、標的ＲＮＡ分子の発現の抑制（例えば、標的ＲＮＡ分子の翻訳を抑制すること、標的ＲＮＡ分子の安定性を変調すること、標的ＲＮＡ分子のプロセシングを抑制すること）、及び癌及び／又は骨髄増殖性障害に関連した細胞プロセス（例えば、細胞分化、細胞増殖、細胞死）の抑制が含まれる。これらの変異体には、種変異体及びｍｉＲ遺伝子中の一つ以上の突然変異（例えば、置換、欠失、挿入）の結果である変異体が含まれる。ある態様において、該変異体は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一である。
【０１３７】
[000191]本明細書で定義された、ｍｉＲ遺伝子産物の「生物学的に活性な断片」とは、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の一つ以上の生物活性を有するｍｉＲ遺伝子産物のＲＮＡ断片を指す。上に記載したように、こうした生物活性の例には、限定されるわけではないが、標的ＲＮＡ分子の発現の抑制、及び癌及び／又は骨髄増殖性障害に関連した細胞プロセスの抑制が含まれる。ある態様において、該生物学的に活性な断片は、少なくとも約５、７、１０、１２、１５、又は１７ヌクレオチド長である。特定の態様において、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、一つ以上の追加の抗癌治療と組み合わせて対象に投与し得る。適した抗癌治療には、限定されるわけではないが、化学療法、放射線療法及びそれらの組み合わせ（例えば、放射線化学療法）が含まれる。
【０１３８】
[000192]該少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞中で上方調節されている場合、該方法は、障害提示細胞の増殖が抑制されるように、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を抑制する化合物の有効量を該対象に投与することを含む。こうした化合物は、本明細書においてｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物と称される。適したｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物の例には、限定されるわけではないが、本明細書に記載した化合物が含まれる（例えば、二本鎖ＲＮＡ、アンチセンス核酸及び酵素的ＲＮＡ分子）。
【０１３９】
[000193] 特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、一つ又はそれより多くの追加の抗癌治療と組み合わせて対象に投与し得る。適した抗癌治療には、限定されるわけではないが、化学療法、放射線療法及びそれらの組み合わせ（例えば、放射線化学療法）が含まれる。
【０１４０】
[000194]本明細書に記載されたように、該少なくとも一つの単離されたｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞中で上方調節されている場合、該方法は、癌細胞の増殖が抑制されるように、該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の有効量を該対象に投与することを含む。
【０１４１】
[000195]本明細書で使用される用語「治療する」、「治療すること」及び「治療」は、疾患又は状態、例えば、癌及び／又は他の状態又は障害に関連する症状を寛解させることを指し、疾患症状の発症を防止する又は遅延すること、及び／又は疾患、障害又は状態の症状の重症度又は頻度を減らすことを含んでいる。用語「対象」、「患者」及び「個体」は、限定されるわけではないが、霊長類、乳牛、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス又は他のウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、げっ歯類又はマウス種を含む哺乳類のような動物を含むことが本明細書において定義される。好ましい態様において、該動物はヒトである。
【０１４２】
[000196]本明細書で使用される「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物は、合成された又はヒトの介在を介して天然の状態から変化された又は取り出されたものである。例えば、合成ｍｉＲ遺伝子産物又はその天然の状態で同時に存在する物質から部分的に又は完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物が、「単離されて」いると考えられる。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は実質的に精製された形態で存在することが可能であり、又は該ｍｉＲ遺伝子産物が送達される細胞内で存在することが可能である。それ故、細胞へ計画的に送達された又は細胞中で発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物と考えられる。ｍｉＲ前駆分子から細胞内部で産生されたｍｉＲ遺伝子産物も「単離された」分子であると考えられる。本発明に従うと、本明細書に記載された該単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、対象（例えば、ヒト）を治療するための医薬の製造に使用し得る。
【０１４３】
[000197]単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、多くの標準技術を使用して得ることが可能である。例えば、該ｍｉＲ遺伝子産物は当該技術分野で公知の方法を使用して化学的に合成して又は組換え的に産生し得る。一つの態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト及び慣用的ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用して化学的に合成される。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の商業的供給元には、例えば、Proligo (Hamburg, Germany), Dharmacon Research (Lafayette, CO, U.S.A.), Pierce Chemical (Perbio Science の一部門, Rockford, IL, U.S.A.), Glen Research (Sterling, VA, U.S.A.), ChemGenes (Ashland, MA, U.S.A.) 及びCruachem (Glasgow, UK)  が含まれる。
【０１４４】
[000198]もしくは、該ｍｉＲ遺伝子産物は、いずれかの適したプロモーターを使用して組換え環状又は直線状ＤＮＡプラスミドから発現し得る。プラスミドからＲＮＡを発現するために適したプロモーターには、例えば、Ｕ６又はＨ１  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列又はサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適したプロモーターの選択は当業者には自明である。本発明の組換えプラスミドは、細胞（例えば、癌細胞、骨髄増殖性障害を示している細胞）中での該ｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能又は調節可能プロモーターも含み得る。
【０１４５】
[000199]組換えプラスミドから発現された該ｍｉＲ遺伝子産物は、標準技術により培養細胞発現システムから単離し得る。組換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、細胞へ送達する、及び細胞中で直接発現することも可能である。
【０１４６】
[000200]該ｍｉＲ遺伝子産物は別の組換えプラスミドから発現することも、又は同一の組換えプラスミドから発現することも可能である。一つの態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物は、単一プラスミドからＲＮＡ前駆分子として発現され、そして該前駆分子は、限定されるわけではないが、癌細胞内に実存するプロセッシングシステムを含む適したプロセッシングシステムにより、機能性ｍｉＲ遺伝子産物にプロセッシングされる。
【０１４７】
[000201]該ｍｉＲ遺伝子産物を発現するために適したプラスミドの選択、遺伝子産物を発現するために該プラスミド内へ核酸配列を挿入する方法、及び組換えプラスミドを問題とする細胞へ送達する方法は当業者には自明である。例えば、その全開示が本明細書において援用される、Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat.Biotechnol, 20:446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296:550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16:948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505; 及び Paul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:505-508  を参照されたい。例えばある態様において、該ｍｉＲ遺伝子産物を発現しているプラスミドは、ＣＭＶ中間初期プロモーター制御下のｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードしている配列を含むことが可能である。本明細書において使用されるプロモーターの「制御下」とは、プロモーターがｍｉＲ遺伝子産物コード配列の転写を開始できるように、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸配列が該プロモーターの３’に位置していることを意味する。
【０１４８】
[000202]該ｍｉＲ遺伝子産物は組換えウイルスベクターからも発現し得る。該ｍｉＲ遺伝子産物が二つの別の組換えウイルスベクターから、又は同一のウイルスベクターから発現できることが企図される。該組換えウイルスベクターから発現されたＲＮＡは、標準技術により培養細胞発現システムから単離することが可能であり、又は細胞（例えば、癌細胞、骨髄増殖性障害を示している細胞）中で直接発現することも可能である。
【０１４９】
[000203]本発明の治療法の他の態様において、ｍｉＲ発現を抑制する少なくとも一つの化合物の有効量を対象に投与し得る。本明細書において使用される「ｍｉＲ発現を抑制する」とは、治療後のｍｉＲ遺伝子産物の前駆体及び／又は活性成熟形の産生が、治療に先だって産生される量よりも少ないことを意味する。当業者は、例えば、本明細書で議論したｍｉＲ転写体レベルを決定するための技術を使用して、細胞においてｍｉＲ発現が抑制されたかどうかを容易に決定し得る。抑制は、遺伝子発現のレベル（即ち、該ｍｉＲ遺伝子産物をコードするｍｉＲ遺伝子の転写を抑制することにより）、又はプロセッシングのレベル（例えば、成熟活性ｍｉＲへのｍｉＲ前駆体のプロセッシングを抑制することにより）で起こり得る。
【０１５０】
[000204]本明細書で使用される、ｍｉＲ発現を抑制する化合物の「有効量」とは、癌及び／又は骨髄増殖性障害を罹患した対象において、細胞の増殖を抑制するために十分な量である。当業者は、該対象のサイズ及び体重；疾患浸透の程度；該対象の年齢、健康状態及び性；投与経路；及び投与が局所的であるか又は全身的であるかどうかのような因子を考慮に入れることにより、所与の対象に投与すべきｍｉＲ発現抑制化合物の有効量を容易に決定し得る。
【０１５１】
[000205]当業者は、本明細書に記載したように、ｍｉＲ発現を抑制する化合物を所与の対象に投与するための適切な投与計画を容易に決定することも可能である。ｍｉＲ遺伝子発現を抑制するために適した化合物には、二本鎖ＲＮＡ（短い又は小さな干渉ＲＮＡ又は「ｓｉＲＮＡ」のような）、アンチセンス核酸、及びリボザイムのような酵素的ＲＮＡ分子が含まれる。これらの化合物の各々は、所与のｍｉＲ遺伝子産物へ標的化すること、及び標的ｍｉＲ遺伝子産物の発現を妨害（例えば、翻訳を抑制することにより、開裂又は分解を誘発することにより）することが可能である。
【０１５２】
[000206]例えば、所与のｍｉＲ遺伝子の発現は、該ｍｉＲ遺伝子産物の少なくとも一部と、少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列相同性を有する単離された二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子で該ｍｉＲ遺伝子のＲＮＡ干渉を誘発することにより抑制し得る。特定の態様において、該ｄｓＲＮＡ分子は、「短い又は小さな干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」である。
【０１５３】
[000207]少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物、又はｍｉＲ発現を抑制するための少なくとも一つの化合物の投与は、癌及び／又は骨髄増殖性障害を有する対象中の細胞（例えば、癌性細胞、骨髄増殖性障害を示している細胞）の増殖を抑制するであろう。本明細書で使用される「癌性細胞又は骨髄増殖性障害を示している細胞の増殖を抑制する」とは、該細胞を殺す、又は該細胞の増殖を持続的又は一時的に休止させる又は遅らせることを意味する。もし、該ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物の投与後に該対象中のこうした細胞の数が一定に残るか又は減少したら、癌細胞増殖の抑制が推測できる。もし、こうした細胞の絶対数が増加しても、腫瘍増殖の速度が低下したら、癌性細胞又は骨髄増殖性障害を示している細胞の増殖の抑制がまた推測できる。
【０１５４】
[000208]ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、いずれかの適した経腸又は非経口投与経路によっても対象に投与し得る。本方法に適した経腸投与経路には、例えば、経口、直腸又は鼻孔内送達が含まれる。適した非経口投与経路には、例えば、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス投与、静脈内注入、動脈内ボーラス投与、動脈内注入、及び血管系内へのカテーテル点滴注入）；組織周辺及び組織内注射（例えば、腫瘍周囲及び腫瘍内注射、網膜内注射又は網膜下注射）；皮下注入（浸透圧ポンプによるような）を含む皮下注射又はデポジション；カテーテル又は他の設置デバイス（例えば、網膜ペレット又は座剤、又は多孔質、非多孔質又はゲル状物質を含んでなる移植片）による目的の組織への直接適用；及び吸入が含まれる。特に適した投与経路は注射、注入及び腫瘍内への直接注射である。
【０１５５】
[000209]該ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、当該技術分野で公知である技術に従って、対象への投与に先立ってしばしば「医薬（medicament）」と称される医薬組成物として製剤し得る。従って、本発明は癌及び／又は骨髄増殖性障害を治療するための医薬組成物を包含する。
【０１５６】
[000210]本医薬組成物は、医薬として受容可能な坦体と混合された、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物をコードする配列を含む少なくとも一つの核酸）又はそれらの生理学的に受容可能な塩を含む（例えば、０．１〜９０重量％）。ある態様において、本発明の医薬組成物は一つ又はそれより多くの抗癌剤（例えば、化学療法剤）を追加して含む。本発明の医薬製剤は、リポソームで被包されている少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又は、該ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物をコードする配列を含む少なくとも一つの核酸）、及び薬学的に許容できる坦体も含むことができる。
【０１５７】
[000211]本発明の医薬組成物は、慣用的医薬賦形剤及び／又は添加剤も含むことができる。適した医薬賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調節剤、緩衝剤及びｐＨ調整剤が含まれる。適した添加剤には、例えば、生理学的生体適合性緩衝剤（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡ又はＤＴＰＡ−ビスアミドのような）又はカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドのような）の添加又は、随意に、カルシウム又はナトリウム塩（例えば、塩化カルシウム、アスコビル酸カルシウム、グルコン酸カルシウム又は乳酸カルシウム）の添加が含まれる。本発明の医薬組成物は液体形態での使用のために包装することができ、又は凍結乾燥することができる。
【０１５８】
[000212]本発明の固形医薬組成物のためには、慣用的無毒性固体の薬学的に許容できる坦体を使用することができる；例えば、医薬用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなど。
【０１５９】
[000213]例えば、経口投与のための固形医薬組成物は、上に列挙したいずれかの坦体及び賦形剤、及び１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又は、それらをコードする配列を含む少なくとも一つの核酸）を含み得る。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、０．０１〜２０重量％、好ましくはｌ％〜１０重量％の上記のようにリポソーム中に被包された該少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又は、該ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物をコードする配列を含む少なくとも一つの核酸）、及び噴霧剤を含み得る。望むなら坦体も含ませ得る；例えば、鼻腔内送達のためのレシチン。
【０１６０】
[000214]本発明の医薬組成物は、一つ以上の抗癌剤をさらに含み得る。特定の態様において、該組成物は、少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又は、該ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物をコードする配列を含む少なくとも一つの核酸）、及び少なくとも一つの化学療法剤を含む。本発明の方法に適している化学療法剤には、限定されるわけではないが、ＤＮＡアルキル化剤、抗腫瘍抗生物質剤、抗代謝剤、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、ホルモンアンタゴニスト剤、トポイソメラーゼ阻害剤、タンパク質キナーゼ阻害剤、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイクリン阻害剤、カスパーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アンチセンス核酸、三重らせんＤＮＡ、核酸アプタマー及び分子的修飾ウイルス、細菌又は外毒素剤が含まれる。本発明の組成物に適した剤の例には、限定されるわけではないが、シチジンアラビノシド、メトトレキサート、ビンクリスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、デキサメタゾン、アルグラビン、シクロホスファミド、サルコリシン、メチルニトロソ尿素、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ビンブラスチン、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、過酸化水素、オキサリプラチン、イリノテカン、トポテカン、ロイコボリン、カルムスチン、ストレプトゾシン、ＣＰＴ−１１、タキソール、タモキシフェン、ダカルバジン、リツキシマブ、ダウノルビシン、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、イマチニブ、フルダラビン、ドセタキセル及びＦＯＬＦＯＸ４が含まれる。
【０１６１】
[000215]一つの態様において、該方法は、細胞に試験剤を提供すること、及び癌性細胞中で減少した発現に関連する少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定すること、を含む。適した対照のレベル（例えば、対照細胞中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベル）と比較し、該細胞中の該ｍｉＲ遺伝子産物のレベルの増加は、該試験剤が抗癌剤であることを示す。
【０１６２】
[000216]適した剤には、限定されるわけではないが、薬剤（例えば、低分子、ペプチド）及び生体高分子（例えば、タンパク質、核酸）が含まれる。該剤は、組換え的に、合成的に製造することが可能であり、又は天然源から単離する（即ち、精製する）ことができる。細胞へこうした剤を提供するための多様な方法（例えば、トランスフェクション）は当該技術分野では公知であり、こうした方法のいくつかは上に記載されている。少なくとも一つのｍｉＲ遺伝子産物の発現検出するための方法（例えば、ノーザンブロッティング法、インサイツハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、発現プロファイリング）も当該技術分野では公知である。これらの方法のいくつかも本明細書に記載されている。
【０１６３】
[000217]本発明は多様な及び好ましい態様を参照して記載されてきたが、本発明の本質的範囲から離れることなく、多様な変更を行うことができ、そして均等物をそれらの要素と置換することができることを当業者は理解しなければならない。加えて、本発明の本質的範囲から離れることなく、本発明の特定の状況又は材料を本発明の教示に適応させるために多くの修飾を行うことができる。それ故、本発明は、この発明を実施するために企図された、本発明で開示された特定の態様に限定されるものではなく、本発明は特許請求の範囲内に含まれるすべての態様を含むであろうことが意図される。
【０１６４】
[000218]本発明を明らかにする又は本発明の実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で使用した出版物及び他の材料は、本明細書に参照として組み入れられ、便宜上、以下の参照文献に提供されている。
【０１６５】
[000219]参照文献
1. Kopper, L. and J. Timar. 2005. Genomics of lung cancer may change diagnosis, prognosis and therapy. Pathol.Oncol.Res. 11:5-10.
2. Lynch, T. J., D. W. Bell, R. Sordella, S. Gurubhagavatula, R. A. Okimoto, B. W. Brannigan, P. L. Harris, S. M. Haserlat, J. G. Supko, F. G. Haluska, D. N. Louis, D. C. Christiani, J. Settleman, and D. A. Haber. 2004. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. N.EngUMed. 350:2129-2139.
3. Shepherd, F. A., P. J. Rodrigues, T. Ciuleanu, E. H. Tan, V. Hirsh, S. Thongprasert, D. Campos, S. Maoleekoonpiroj, M. Smylie, R. Martins, K. M. van, M. Dediu, B. Findlay,D. Tu, D. Johnston, A. Bezjak, G. Clark, P. Santabarbara, and L. Seymour. 2005. Erlotinib in previously treated non-small-cell lung cancer. N.Engl.J.Med. 353:123-132.
4. Sher, Y. P., J. Y. Shih, P. C. Yang, S. R. Roffler, Y. W. Chu, C. W. Wu, C. L. Yu, and K. Peck. 2005. Prognosis of non-small cell lung cancer subjects by detecting circulating cancer cells in the peripheral blood with multiple marker genes. Clin.Cancer Res. 11:173-179.
5. Nana-Sinkam, S. P. and M. W. Geraci. 2006. MicroRNA in lung cancer. Journal of Thoracic Oncology 1:929-931.
6. Johnson, S. M., H. Grosshans, J. Shingara, M. Byrom, R. Jarvis, A. Cheng, E. Labourier, K. L. Reinert, D. Brown, and F. J. Slack. 2005. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell 120:635-647.
7. Takamizawa, J., H. Konishi, K. Yanagisawa, S. Tomida, H. Osada, H. Endoh, T. Harano, Y. Yatabe, M. Nagino, Y. Nimura, T. Mitsudomi, and T. Takahashi. 2004. Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival. Cancer Res. 64:3753-3756.
8. Yanaihara, N., N. Caplen, E. Bowman, M. Seike, K. Kumamoto, M. Yi, R. M. Stephens, A. Okamoto, J. Yokota, T. Tanaka, G. A. Calin, C. G. Liu, C. M. Croce, and C. C. Harris. 2006. Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosis and prognosis. Cancer Cell 9:189-198. 
【図１】
2011505143.tif 000007
【図２】
2011505143.tif 000008
【図３Ａ】
2011505143.tif 000009
【図３Ｂ】
2011505143.tif 000010
【図３Ｃ】
2011505143.tif 000011
【図３Ｄ】
2011505143.tif 000012
【図４Ａ】
2011505143.tif 000013
【図４Ｂ】
2011505143.tif 000014
【図４Ｃ】
2011505143.tif 000015
【図４Ｄ】
2011505143.tif 000016
【図５】
2011505143.tif 000017
2011505143.tif 000018
【図７】
2011505143.tif 000019
【図８】
2011505143.tif 000020
【図９−１】
2011505143.tif 000021
【図９−２】
2011505143.tif 000022
【図９−３】
2011505143.tif 000023
【図１０Ａ】
2011505143.tif 000024
【図１０Ｂ】
2011505143.tif 000025
【図１１−１】
2011505143.tif 000026
【図１１−２】
2011505143.tif 000027
【図１１−３】
2011505143.tif 000028
【図１１−４】
2011505143.tif 000029
【図１１−５】
2011505143.tif 000030
【図１１−６】
2011505143.tif 000031
【図１１−７】
2011505143.tif 000032
【図１１−８】
2011505143.tif 000033
【図１１−９】
2011505143.tif 000034
【図１１−１０】
2011505143.tif 000035
【図１１−１１】
2011505143.tif 000036
【図１１−１２】
2011505143.tif 000037
【図１１−１３】
2011505143.tif 000038
【図１１−１４】
2011505143.tif 000039
【図１１−１５】
2011505143.tif 000040
【図１１−１６】
2011505143.tif 000041
【図１１−１７】
2011505143.tif 000042
【図１２−１】
2011505143.tif 000043
【図１２−２】
2011505143.tif 000044
【図１２−３】
2011505143.tif 000045
【図１２−４】
2011505143.tif 000046
【図１２−５】
2011505143.tif 000047
【図１２−６】
2011505143.tif 000048
【図１２−７】
2011505143.tif 000049
【図１２−８】
2011505143.tif 000050
【図１２−９】
2011505143.tif 000051
【図１３−１】
2011505143.tif 000052
【図１３−２】
2011505143.tif 000053
【図１３−３】
2011505143.tif 000054
【図１３−４】
2011505143.tif 000055
【図１３−５】
2011505143.tif 000056
【図１３−６】
2011505143.tif 000057
【図１３−７】
2011505143.tif 000058
【図１３−８】
2011505143.tif 000059
【図１３−９】
2011505143.tif 000060
【図１３−１０】
2011505143.tif 000061
【図１３−１１】
2011505143.tif 000062
【配列表】
2011505143000001.xml
【国際調査報告】
2011505143.tif 000109