(57)【要約】  本発明は、YKL-40レベルを測定し、この測定を、アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患を患う個体の生存の予後として使用する方法に関する。当該方法は、治療を最適化するために個体を分類すること、又は治療中、前、後において個体を監視することのために使用し得る。当該個体が患うのはいかなる種類の心血管疾患又は障害でもよい。当該方法はまた、診断上または予後上、有意なレベルのYKL-40分子が生体試料中に存在するかどうかを検出し決定する。YKL-40のレベルはさらに、疾患の再発を予測することにも使用し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患を患う個体を、生存の予後に基づいて分類するための方法であって、前記個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、および、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む方法。
【請求項２】
アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患を患う個体の健康状態を、生存の予後に関して監視するための方法であって、前記個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、および、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む方法。
【請求項３】
当該個体がアテローム硬化性冠動脈疾患を患う、請求項1又は請求項2記載の方法。
【請求項４】
当該心臓疾患が安定冠動脈疾患である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
当該YKL-40の参照レベルが、複数の健康な個体からの試料におけるYKL-40レベルを測定することにより得られる平均レベルである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
当該参照レベルが、約80μg/lのカットオフ値である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
当該YKL-40の参照レベルが、複数のカットオフ値の組である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
当該複数のカットオフ値の組が、以下のカットオフ値の一つまたは複数の中から選択される、請求項7記載の方法:約80μg/l、約90μg/l、約100μg/l、約110μg/l、約120μg/l、約130μg/l、約140μg/l、約150μg/l、約160μg/l、約170μg/l、約180μg/l、約190μg/l、約200μg/l、約210μg/l、および約220μg/l。
【請求項９】
当該生存の予後が、心筋梗塞を患う危険性の予後である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
YKL-40レベルが、イムノアッセイを使用して測定される、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
イムノアッセイが、競合的イムノアッセイである、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
イムノアッセイが、放射線同位体、酵素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子、およびコロイド状金属から成る群から選択される検出標識を利用してYKL-40を測定する、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
イムノアッセイが、モノクローナル抗体を使用してYKL-40を測定する、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
イムノアッセイが、ポリクローナル抗体を使用してYKL-40を測定する、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
YKL-40レベルがPCRに基づくアッセイで測定される、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
YKL-40レベルが、別のバイオマーカーのレベルと共に測定される、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
当該別のバイオマーカーが、C反応性タンパク質(CRP)、脳性ナトリウム利尿タンパク質(BNP)、インターロイキン、腫瘍壊死因子-アルファ、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子-1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド(P-III-NP)、単球走化性タンパク質-1、フィブリンD-ダイマー、ミオシン軽鎖-1 (MLC-1)、P-セレクチン、およびCKMBから成る群から選択される、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
YKL-40レベルが、ディップスティックの使用により測定される、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
当該生体試料が、血液、血清、又は血漿である、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
当該個体がヒトである、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患を患う個体からの生体試料中のYKL-40のレベルをYKL-40の参照レベルと比較することにより見いだされる当該個体の生存の予後に基いて、当該個体を分類及び/又は監視するための器具。
【請求項２２】
試料中のYKL-40のレベルを測定するための手段、および、当該YKL-40の測定レベルを少なくとも一つのYKL-40の参照レベルと比較するための手段を含む、請求項21に記載の器具。
【請求項２３】
当該器具がディップスティックである、請求項21又は22記載の器具。
【請求項２４】
カットオフ値に相当する単一の参照レベルを含む、請求項21〜23のいずれかに記載の器具。
【請求項２５】
YKL-40の測定レベルを、YKL-40の複数のカットオフ値の組と比較するための手段を含む、請求項21〜23のいずれかに記載の器具。
【請求項２６】
生体試料中のYKL-40を検出するための手段、YKL-40の測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較するための手段、およびYKL-40レベルに基いて個体を分類及び/又は監視するやり方についての説明書を含むキット。
【請求項２７】
好ましくはC反応性タンパク質、ホモシステイン、脳性ナトリウム利尿タンパク質、インターロイキン、腫瘍壊死因子-アルファ、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子-1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド(P-III-NP)、単球走化性タンパク質-1、フィブリンD-ダイマー、増殖分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク質関連ホスホリパーゼA2、マトリックスメタロプロテイナーゼ、およびCKMBから成る群から選択される追加のバイオマーカー、さらに好ましくはC反応性タンパク質、脳性ナトリウム利尿タンパク質、及び/又はホモシステインから成る群から選択される追加のバイオマーカーを検出する手段をさらに含む、請求項26に記載のキット。
【請求項２８】
請求項21〜25のいずれかに記載の少なくとも一つの器具を含む、請求項26又は27記載のキット。
【請求項２９】
冠動脈疾患を患う個体を治療する方法であって、前記個体からの生体試料中のYKL-40のレベルを測定すること、および、当該測定レベルに基いて薬剤を選択すること、および、十分量の前記薬剤を前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項３０】
当該疾患が安定冠動脈疾患である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
請求項5〜8のいずれかに記載の一つ以上の参照レベルと比較することにより比較が行われる、請求項29又は30記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体(individual)の生存の予後マーカーとして、バイオマーカーYKL-40を検出する方法に関する。当該個体はどのような種類の心血管疾患または心血管障害を患っていてもよく、観察されるYKL-40のレベルにより、その個体を生存予後(survival prognosis)に基いて分類(classification)および/または監視(monitoring)することが可能となる。
【背景技術】
【０００２】
当該出願または本出願において引用された全ての特許文献および非特許文献の全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０００３】
世界保健機関によれば、心血管疾患は、世界的に第一位の死亡原因であり、死亡の主要な原因であり続けるであろうと予測されている。2005年には推定1750万人が心血管疾患で亡くなっており、これは全世界における死の30%に当たる。これらの死の内、760万件が心臓発作によるものであり、570万件が脳卒中によるものであった。もし適切な措置がなされなければ、2015年までには、毎年推定2000万人が心血管疾患(主に心臓発作および脳卒中)で死亡することとなるであろう。
【０００４】
心血管疾患は、心臓および血管の障害により引き起こされ、冠動脈心疾患(心臓発作)、冠動脈疾患、血圧上昇(高血圧)、末梢血管疾患、リウマチ性心疾患、先天性心疾患、心不全その他を含む。心血管障害が検出された時点では、その根底にある要因(アテローム性動脈硬化であることが最も多い)は、既に何十年にも渡って進行してきた後の進行型となってしまっていることがあり得る。心血管疾患の主要な原因は、喫煙、運動不足、および不健康な食生活である。
【０００５】
心血管疾患の治療は、各々の患者における疾患の特定の形態に依存する。抗狭心症薬および血圧低下薬、アスピリン、ならびにスタチン系コレステロール低下薬剤などの薬が有益であり得る。損傷した血管を再開させる、修復する、または取り替えるために、例えばバイパス手術、経皮的冠動脈形成術、およびペースメーカー取り付け等のような、手術または血管形成術を行う必要性が認められることがしばしばあり得、最後の手段としては心臓移植がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】Bunn, et al., U.S. Pat. No. 5,213,961
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Albert CM, Ma J, Rifai N, Stampfer MJ, Ridker PM. Prospective study of C-reactive protein, homocysteine, and plasma lipid levels as predictors of sudden cardiac death. Circulation. 2002;105:2595-9.
【非特許文献２】Boot RG, van Achterberg TAE, van Aken BE, Renkema GH, Jacobs MJHM, Aerts JMFG, et al. Strong induction of members of the chitinase family of proteins in atherosclerosis. Chitotriosidase and human cartilage gp-39 expressed in lesion macrophages. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1999;19:687-94.
【非特許文献３】Coligan, et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991).
【非特許文献４】De Ceuninck F, Gaufillier S, Bonnaud A, Sabatini M, Lesur, C, Pastoureau P. YKL-40 (Cartilage gp-39) induces proliferative events in cultured chondrocytes and synoviocytes and increases glycosaminoglycan synthesis in chondrocytes. Biochem Biophys Res Commun 2001;285:926-31.
【非特許文献５】Fiore CE, Tamborino C. YKL-40 and graft rejection. Am J Med 2000;108:688-9.
【非特許文献６】Gluud C, Als-Nielsen B, Damgaard M, et al. Clarithromycin for two weeks for stable coronary heart disease: six-year follow-up of the CLARICOR randomized trial and updated meta-analysis of antibiotics for coronary heart disease. Resubmitted 2007.
【非特許文献７】Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
【非特許文献８】Harvey S, Weisman M, O'Dell J, et al. Chondrex: new marker of joint disease. Clin Chem 1998;44:509-16.
【非特許文献９】Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Acad.Press, 1990.
【非特許文献１０】Jespersen CM, Als-Nielsen B, Damgaard M, et al. Randomised placebo controlled multicentre trial to assess short term clarithromycin for patients with stable coronary heart disease: CLARICOR trial. BMJ 2006;332:22-7
【非特許文献１１】Jialal I, Devaraj S. Role of C-reactive protein in the assessment of cardiovascular risk. Am J Cardiol 2003;91:200-2.
【非特許文献１２】Johansen JS, Baslund B, Garbarsch C, Garbarsch C, Hansen M, Stoltenberg M, et al. YKL-40 in giant cells and macrophages from patients with giant cell arteritis. Artritis Rheum 1999;42:2624-30.
【非特許文献１３】Johansen JS, Christoffersen P, M?ller S, Price PA, Henriksen JH, Garbarsch C, et al. Serum YKL-40 is increased in patients with hepatic fibrosis. J Hepatol 2000;32:911-20.
【非特許文献１４】Johansen JS, Milman N, Hansen M, Garbarsch C, Price PA, Graudal N. Increased serum YKL-40 in patients with pulmonary sarcoidosis. A potential marker of disease activity? Respiratory Medicine 2005;99:396-402.
【非特許文献１５】Johansen JS, Jensen BV, Roslind A, Nielsen D, Price PA. Review. Serum YKL-40, a new prognostic biomarker in cancer patients? Review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006;15:194-202.
【非特許文献１６】Junker N, Johansen JS, Hansen LT, Lund EL, Kristjansen PG. Regulation of YKL-40 expression during genotoxic or microenvironmental stress in human glioblastoma cells. Cancer Sci 2005;96:183-90.
【非特許文献１７】Kamal SM, Turner B, He Q, Rasenack J, Bianchi L, Al Tawil A, et al. Progression of fibrosis in hepatitis C with and without schistosomiasis: correlation with serum markers of fibrosis. Hepatology 2006;43:771-9.
【非特許文献１８】Kohler and Milstein, Nature, 256:495, 1975
【非特許文献１９】Kohsaka, et al., Nuc.Acids Res., 21:3469-3472, 1993
【非特許文献２０】Langone, et al. eds. (Acad. Press, 1981).
【非特許文献２１】Lindahl B, Toss H, Siegbahn A, Venge P, Wallentin L. Markers of myocardial damage and inflammation in relation to long-term mortality in unstable coronary artery disease. N Engl J Med 2000;343:1139-47.
【非特許文献２２】Ling H, Recklies AD. The chitinase 3-like protein human cartilage glycoprotein 39 inhibits cellular responses to the inflammatory cytokines interleukin-1 and tumour necrosis factor-alpha. Biochem J 2004;380:651-9.
【非特許文献２３】Millis AJT, Hoyle M, Kent L. In vitro expression of a 38,000 dalton heparin-binding glycoprotein by morphologically differentiated smooth muscle cells. J Cell Physiol 1986;127:366-72.
【非特許文献２４】Mueller C, Buettner HJ, Hodgson JM, Marsch S, Perruchoud AP, Roskamm H, Neumann FJ. Inflammation and long-term mortality after non?ST-elevation acute coronary syndrome treated with a very early invasive strategy in 1042 consecutive patients. Circulation 2002;105:1412-5.
【非特許文献２５】Nishikawa KC, Millis AJT. gp38k (CHI3L1) is a novel adhesion and migration factor for vascular cells. Exp Cell Res 2003;287:79-87.
【非特許文献２６】N?jgaard C, Johansen JS, Christensen E, Skovgaard LT, Price PA, Becker U, et al. Serum levels of YKL-40 and PIIINP as prognostic markers in patients with alcoholic liver disease. J Hepatol 2003;39:179-86.
【非特許文献２７】Recklies AD, White C, Ling H. The chitinase 3-like protein human cartilage 39 (HC-gp39) stimulates proliferation of human connective-tissue cells and activates both extracellular signal-regulated kinase-and protein kinase B-mediated signalling pathways. Biochem J 2002;365:119-26
【非特許文献２８】Recklies AD, Ling H, White C, Bernier SM. Inflammatory cytokines induce production of CHI3L1 by articular chondrocytes. J Biol Chem. 2005;280:41213-21.
【非特許文献２９】Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980.
【非特許文献３０】Renkema GH, Boot RG, Au FL, et al. Chitotriosidase, a chitinase, and the 39-kDa human cartilage glycoprotein, a chitin-binding lectin, are homologues of family 18 glycosyl hydrolases secreted by human macrophages. Eur J Biochem 1998;251:504-9.
【非特許文献３１】Ridker PM, Stampfer MJ, Rifai N. Novel risk factors for systemic atherosclerosis:a comparison of C-reactive protein, fibrinogen, homocysteine, lipoprotein(a), and standard cholesterol screening as predictors of peripheral arterial disease. JAMA 2001;285:2481-5.
【非特許文献３２】Ridker PM, Rifai N, Rose L, Buring JE, Cook NR. Comparison of C-reactive protein and low-density lipoprotein cholesterol levels in the prediction of first cardiovascular events. N Engl J Med 2002;347:1557-65.
【非特許文献３３】Salacinski, et al., Anal. Biochem., 117:136-146, 1981
【非特許文献３４】Shackelton LM, Mann DM, Millis AJT. Identification of a 38-kDa heparin-binding glycoprotein (gp38k) in differentiating vascular smooth muscle cells as a member of a group of proteins associated with tissue remodelling. J Biol Chem 1995;270:13076-83.
【非特許文献３５】Vind I, Johansen JS, Price PA, Munkholm P. Serum YKL-40, a potential new marker of disease activity in patients with inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol 2003;38:599-605.
【非特許文献３６】Volck B, Price PA, Johansen JS, S?rensen O, Benfield T, Calafat J, et al. YKL-40, a mammalian member of the chitinase family, is a matrix protein of specific granules in human neutrophils. Proc Assoc Am Phys 1998;110:351-60.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それが薬の投与であるか、手術であるか、その他のことであるかに関わらず、また、その処置が治癒的であるか緩解的であるかにも関わらず、個々の患者にとって最善である治療を施すことにより、あらゆる治療の有効性を改善することとなる。心血管疾患または心血管障害で苦しむ個体を、生存予後に基づいて分類することは、最善の治療を選択し、施される治療の効果を向上させ、生存率を改善し、再発の危険性を低下させ、心血管疾患発症後のクオリティ・オブ・ライフを高める上で役に立つ。さらに、この個体群を監視する能力は、最も効果的な即時の(immediate)および経過観察の(follow-up)治療を選択する上で助けとなり、また、心血管疾患または障害の発症後に必要となるライフスタイルの可能性についてのカウンセリングの際に手引きとなる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ここで記述する本発明は、心血管疾患または心血管障害、特にアテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患等、を患う個体から採られた試料におけるバイオマーカーYKL-40の分子またはその断片のレベルの測定に基づく生存予後に従って、前記個体を分類および/または監視することに関連する。当該個体の状態を分類および/または監視するためには、観察されたYKL-40レベルを参照レベルと比較する。さらに、YKL-40のレベルは、疾患再発の危険性を予測することにも使用できる。
【００１０】
YKL-40は、生存率についての新規の予後バイオマーカーである。YKL-40のレベルは、血清、血液、血漿サンプル等、あらゆる種類の生体試料において測定することができ、測定されるYKL-40は、タンパク質、その断片もしくはペプチド、またはYKL-40をコードする遺伝子の他のあらゆる転写産物であり得る。
【００１１】
特にアテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患などの、心血管疾患を患う個体を、その生存の予後に基づいて分類するための方法を提供することが本発明の一つの目的であり、当該方法は、前記個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、及び、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む。
【００１２】
アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患などの、心血管疾患を患う個体の健康状態を、その生存の予後に関連して監視するための方法を提供することも、本発明のさらなる一つの目的であり、当該方法は、前記個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、及び、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む。YKL-40の参照レベルは、本明細書に記述されるようないかなる参照レベルでもよく、特に「参照レベル」という節に記述されたようなものであってよい。本発明の当該方法についてのさらなる詳細は、前述の「個体の分類」に関する第一の方法を記述した文章において明らかとなるであろう。従って、特に断り書きがない限り、本発明の第一の方法に関連して言及された特色はいずれも、必要な変更を加えた上で、本発明のこのもう一つの方法にも適用される。
【００１３】
生体試料中のYKL-40を検出する方法、および、YKL-40レベルによって個体を分類および/または監視するやり方についての説明書、を含むキットを提供することは、本発明の一つの追加的な目的である。
【００１４】
本発明はさらに、生体試料中のYKL-40を検出する方法、および、YKL-40レベルによって個体を分類および/または監視するやり方についての説明書、ならびに、追加のバイオマーカーを検出するための方法、を含むキットから成る一実施態様を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】YKL-40調査における個体の人口統計学的データ。
【図２】ハザード比。
【図３】介入指標および危険因子を含めたハザード比。
【図４】カットオフ値分類に基く生存曲線。
【図５】分類に基く生存曲線。
【図６】AおよびB  上から見たディップスティック実施態様。
【図７】死亡、心血管疾患性の死、および心筋梗塞までの時間に対する、f(YKL-40)単独の、または、危険因子プラス選択された治療の指標との組み合わせによる、効果。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
［定義］
発明についての論考を簡明化するために、以下の定義を提供する。従ってそれらは発明を限定するものとして解釈されるべきでなく、発明の範囲は付随の請求項および下記の詳細な説明によって規定される。
【００１７】
緩解:  向上させる、又は改善させること;疾患状態に関連して、ある病状の重症度又は進行が緩和すること(病状の鎮静または治癒を含む)、あるいは、付随する痛みの軽減など、自覚的に重症度が緩和すること。
【００１８】
抗体:  YKL-40タンパク質のエピトープ決定部分に結合する能力を有する、免疫グロブリン分子、ならびに、FabおよびF(ab')2などの、免疫グロブリン分子の活性部位または断片。抗体は例えば、無傷の免疫グロブリン分子であるか、または免疫的活性を維持したその断片である。
【００１９】
抗原:  免疫原性を有する、全長YKL-40分子またはYKL-40分子断片。
【００２０】
生体試料:  個体から採られた試料。
【００２１】
バイオマーカー:  例えば特定の病理学的または生理学的状態などの特定の生物学的属性の分子指標。本明細書においては「マーカー」という用語もこれと同義として用いる。
【００２２】
心血管疾患:  心血管疾患という用語は、心臓または血管(動脈および静脈)に関わる疾患の種類を表す。この用語は、心血管系に影響するあらゆる疾患、及び心血管疾患の結果として起きることも指し、本明細書ではそのような意味として用いられる。心血管疾患には多くの種類があり、それは以下のものを含むがこれらに限定されない:急性冠症候群、急性心筋梗塞(AMI/STEMI/ST上昇)、心筋梗塞(心臓発作)、不安定狭心症/UAP/非ST上昇心筋梗塞、動脈瘤、狭心症、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患(CAD)、虚血性心疾患、虚血心筋、不整脈、心房細動、心不整脈、心室頻拍、心室細動、心臓死および心臓突然死、心筋症、うっ血性心不全、心不全、弛緩性および収縮期性心室機能不全、拡張型心筋症、血圧上昇(高血圧)、肥大型心筋症、心弁膜疾患、僧帽弁逸脱、僧帽弁逆流および/または狭窄、大動脈弁逆流および/または狭窄、心筋炎ならびに静脈血栓塞栓症。
【００２３】
疾患状態:  個体における疾病または傷害。
【００２４】
障害:  多くの場合先天性である、個体における疾病または傷害。
【００２５】
hnRNA:  ヘテロ核RNA
【００２６】
個体:  一つの種(ここでは好ましくは哺乳類種)の一個のメンバー。
【００２７】
mAb:  モノクローナル抗体
【００２８】
哺乳類:  ここではヒトとヒト以外のものの両方を含む。
【００２９】
mRNA:  メッセンジャーRNA
【００３０】
患者:  疾患または障害を患うあらゆる個体。
【００３１】
RNA:  自然界に由来する、もしくは自然界から単離された、または合成された、あらゆるRNA。
【００３２】
安定冠動脈疾患:  「安定冠動脈疾患」という用語は、心筋(心臓の筋肉)に酸素や栄養分を供給する冠動脈の壁にアテローム性のプラークが蓄積することにより引き起こされる冠動脈疾患またはアテローム硬化性心臓疾患のことを指し、当該疾患は安定したその疾患の症状または徴候の原因をもたらす。
【００３３】
実質的に純粋:  YKL-40について述べるのに使われる場合、この用語は、自然界においてYKL-40と共に存在する他の分子から本質的に分離された、実質的に無傷な分子のことを指す。
【００３４】
［個体の分類］
心血管疾患は、世界的に、第一の死亡原因である。アテローム性動脈硬化は心血管疾患の主要な原因であり、アテローム性動脈硬化発生を助長する生活スタイルが全世界に拡がっているため、心血管疾患は将来においても第一の死亡原因であり続けるであろうと予測される。従って、心血管疾患に苦しむ個体に最善の治療を提供することは、その個体にとってだけではなく、さらに多数のそういった患者を処置することになるであろう医療機関にとっても、関心の対象である。
【００３５】
最善の治療とは、それぞれの個体に合わせた治療のことである。例えば、冠動脈疾患(CAD)(高い死亡率を伴う疾患である)を患う人々は、同じ治療に対して異なった反応をすることが知られてきたが、致死的なことが起こる前に、所与の治療の効果を監視したり、これらの患者を区別する方法は、存在していなかった。本発明は、各々の個体を生存の予後に基づいて分類することができる分類システム、および、当該個体を時間経過とともに監視する方法の両方を提供するため、この問題を解決するものである。当該分類および監視は、分類/監視される個体から採られた生体試料におけるYKL-40レベルを測定すること、および、そこで見出されたレベルを参照レベルと比較すること、に基く。これにより当該個体の生存の予後が可能となり、従って、当該個体が受けるべき治療の程度を決定し、また、施された治療が十分であるか不適切であるかを判断することの助けとなる。
【００３６】
生存予後に基づいた分類により各々の個体に合った治療を施すことは、施されたその治療の緩解的効果および治癒的効果の両方を向上させ、患者の全体としての生存率を改善し、再発の危険性を低減させ、心血管疾患の発症後のクオリティ・オブ・ライフを高めることとなる。さらに、投与される薬剤の量をすぐに調整できることから、経済的な利点もある。また、この個体群を監視することが可能であるということは、最も効果的な即時のおよび経過観察の治療を選択する上で助けとなり、また、心血管疾患または障害の発症後に必要となるライフスタイルの可能性についてのカウンセリングの際に手引きとなる。
【００３７】
実施例において見られるように、YKL-40のレベルの統計学的な増加は、死亡の危険性の増加の指標である。従ってYKL-40は、そのレベルが測定された個体における生存の予後を可能とするバイオマーカーである。当該予後は、臨床技術分野の当業者に知られる、健康状態についての他の徴候と相関させることができる。YKL-40のレベルが統計学的に有意な水準で増加した場合は、死亡または生存率低下の予後を出し得る。
【００３８】
個体を監視することが望まれる場合、例えば疾患の緩解など治療の有効性を検証するような場合、治療前に(バックグラウンド決定のため)、および治療継続中において定期的に、当該個体から採られる生体アッセイ試料(血液、血清、その他)中のYKL-40レベルを測定するべきである。YKL-40レベルの低下または増加は一時的なものであり得るので、規則的な間隔を置いて(例えば毎週)、また、それぞれの治療の前後において、当該アッセイを行うことが好ましい。治療の過程、病気の重症度、およびその他の臨床的な可変要素によって、通常の技術を有する臨床従事者は、疾患を監視し及び/又は特定の個体を治療する目的でYKL-40レベルをアッセイするための適切なスケジュールを決定することができるであろう。
【００３９】
［参照レベル］
YKL-40のレベルの統計学的な増加は、生存に関する指標であり、ここで記述されるように、心臓疾患を患う個体の分類および/または監視において使用し得る。ある個体においてYKL-40レベルが上昇したかどうかは、測定された値を参照レベルに相関させることにより断定し得る。参照レベルの計算の基礎を形成する個体群は、様々な年齢の健康な個体の群であってもよいし、特定の年齢の群であってもよい。健康な個体とは、サンプリングの時点で心臓関連の疾患または障害を持つと診断されていない個体である。
【００４０】
特定の年齢の個体群は、同じ年に生まれた、または同じ10年間の内に生まれた、または他のいかなるグループ化による個体群であってもよく、例えば、0から10歳、10から20歳、20から30歳、30から40歳、40から50歳、50から60歳、60から70歳、70から80歳、80から90歳、90から100歳、等であってよい。当該間隔は2年の年齢幅に渡るものであってよく、3、4、または5年の年齢幅に渡るものであってよく、6、7、8、9、10年の年齢幅(上記のように)であってもよく、12年、15年、20年またはそれ以上の年齢幅であってもよい。さらに、当該間隔の端は開放されていてもよく、例えば当該個体は20、30、40、50、60またはその他の年齢を上回る年齢である、とし得る。
【００４１】
YKL-40の参照レベルを得るためにサンプリングされる様々な年齢の、または特定の年齢の個体群は、さらに、心臓疾患もしくは障害などの病気を患う個体(その症状を示している、もしくは示していない)であってもよいし、または、以前そのような疾患もしくは障害を患っていたが治癒したとみなされている個体であってもよい。当該心臓疾患または障害は、例えば、冠動脈疾患または上記のいずれかの心臓疾患もしくは障害であり得る。参照レベルの計算の基礎を形成する個体群は、さらに、両性が混じった個体群であってもよいし、同性の個体群であってもよい。参照レベルはまた、現在心臓疾患または障害を患っているのと同じ個体から得られたものであってもよく、例えば、当該疾患または障害が診断される前(発病前)および/または当該疾患または障害の症状が確立される前(発症前)に得られた一つ以上の試料において測定されたYKL-40レベルであってもよい。
【００４２】
YKL-40レベルに基く個体の分類は、実施例に記載された結果に従って行うことができる。それらにおいて見られるように、YKL-40レベルの上昇とハザード比の上昇との間には相関がある。ハザード比は死亡の危険性の上昇を示し、当業者に知られた方法で計算される。本実施例において、生存解析におけるハザード比は、説明変数であるところの不安定狭心症、心筋梗塞、心臓死、または全ての死(total death)の、イベント発症(event)のハザード(hazard)または危険性(risk)に対する効果である。従って、YKL-40がある値をとる場合のハザード比は、例えば心筋梗塞(MI)、心血管疾患性の死、または全ての原因の死亡の危険性の上昇を示す。
【００４３】
分類の一つの方法は、カットオフ値を参照値として使用することである。カットオフ値は、典型的には多数の個体を二つの群に分ける値である。すなわち、特定のカットオフ値を上回るYKL-40レベルを有する個体群と、そのカットオフ値を下回るYKL-40レベルを有する個体群である。当該カットオフ値は、任意の種類の生体試料において測定される生理的なYKL-40レベルを表すいかなる値であってもよく、当業者によって選択される。
【００４４】
当該カットオフ値は、個体が危険性増加の状態にあるか否かについてのイエス/ノー指標として使用し得る。危険性増加とは、心臓疾患などの疾患の危険性の増加であり得る。具体的にはそれはアテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患であり得、具体的にはその個体が過去または現在において患っている心臓疾患であり得、あるいはそれは、上昇したYKL-40レベル/カットオフ値を超えるYKL-40レベルで示される生存の短さの危険性の増加であり得る。
【００４５】
本発明による方法の一実施態様においては、YKL-40の参照レベルは、約80μg/lのカットオフ値であり、例えば特に82μg/lである。本明細書中の実施例において見られるように、本発明者は、驚くべきことに、約80μg/l を下回るYKL-40値はハザード比と相関しない一方、前記値を上回るYKL-40レベルは、心血管疾患性の死、心筋梗塞(MI)、および全ての死因の死亡のハザード比と相関することを見出した。従って、当該個体からの生体試料においてYKL-40のレベルを測定しその測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較することにより、約80μg/lを超えるYKL-40レベルを、アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患(例えば安定冠動脈疾患)を患う個体をその生存の予後に基いて分類するために使用することができることを、本発明者は見出したのである。
【００４６】
本発明による方法において言及される生存の予後とは、具体的には心血管疾患性の死をとげることについての予後であり得、より好ましくは、心筋梗塞を患う危険性についての予後であり得る。
【００４７】
カットオフ値は従って以下の値の群から選択されるいずれかの値、またはこれらの値の間にあるいかなる値であってもよい:80μg/lの血清YKL-40、90μg/l、95μg/l、100μg/l、105μg/l、110μg/l、115μg/l、120μg/l、125μg/l、130μg/l、140μg/l、150μg/l、160μg/l、170μg/l、180μg/l、190μg/lおよび/または200μg/lの血清YKL-40。本発明による方法の一実施態様においては、カットオフ値は以下の値のいずれかである:100μg/lの血清YKL-40、105μg/l、106μg/l、107μg/l、108μg/l、109μg/l、110μg/l、110μg/l、111μg/l 112μg/l、113μg/l、114μg/l 、115μg/l、120μg/lの血清YKL-40。一つの特定の実施態様においては、カットオフ値は110マイクロg/lの血清YKL-40である。
【００４８】
上述した約80μg/lというカットオフ値に加え、個体をそのYKL-40レベルに基いてさらに分類することができ、これは例えば以下の組のカットオフ値によって行い得る。ここで、YKL-40値(即ちカットオフ値)の増加は、問題となる心臓疾患の程度がより重症/進行性であることを示す:約80μg/l、約90μg/l、約100μg/l、約110μg/l、約120μg/l、約130μg/l、約140μg/l、約150μg/l、約160μg/l、約170μg/l、約180μg/l、約190μg/l、約200μg/l、約210μg/l、および約220μg/l。
【００４９】
あるいは、これに基いた一つの例として、20単位ごとに増加するYKL-40レベルによって個体をグループ化することができ、これはすなわち次のようになる:グループ0の個体は血清YKL-40レベルが90μg/l (マイクログラム/リットル)であり、グループ1の個体は血清YKL-40レベルが100μg/l +/- 10μg/lであり、グループ2の個体は血清YKL-40レベルが120μg/l +/- 10μg/lであり、グループ3の個体は血清YKL-40レベルが140μg/l +/- 10μg/lであり、グループ4の個体は血清YKL-40レベルが160μg/l +/- 10μg/lであり、グループ5の個体は血清YKL-40レベルが180μg/l +/- 10μg/lであり、グループ6の個体は血清YKL-40レベルが200μg/l +/- 10μg/lであり、グループ7の個体は血清YKL-40レベルが220μg/l +/- 10μg/lであり、グループ8の個体は血清YKL-40レベルが240μg/l +/- 10μg/lであり、グループ9の個体は血清YKL-40レベルが260μg/l +/- 10μg/lであり、グループ10の個体は血清YKL-40レベルが280μg/l +/- 10μg/lであり、グループ11の個体は血清YKL-40レベルが300μg/l +/- 10μg/lであり、グループ12の個体は血清YKL-40レベルが320μg/l +/- 10μg/lであり、グループ13の個体は血清YKL-40レベルが340μg/l +/- 10μg/lであり、グループ14の個体は血清YKL-40レベルが350μg/l超である。この例では血清YKL-40レベルが使用されたが、しかし、他の生体試料から得られたYKL-40レベル、また、タンパク質、RNA、または明細書中に言及されるその他の形で測定されたYKL-40レベルも、本発明の範囲に含まれる。さらに、グループ間の増加幅は2μg/l毎であってもよく、例えば4、5、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、80、95、90または100μg/l毎のYKL-40量であってもよい。好ましくは、当該増加幅は、20または30μg/l毎のYKL-40であり、これは血清中で測定された場合のものである。20または30μg/l毎のYKL-40の増加幅は、50μg/l血清YKL-40を起点にしてもよい。
【００５０】
上記の例に代えて、上で示したものより低い血清YKL-40レベルを起点として個体の分類を行ってもよく、例えば、グループ0は血清YKL-40レベルが40μg/l +/- 5μg/lである個体を含み、そしてグループ1個体は血清YKL-40レベルが50μg/l +/- 5μg/lであり、グループ2個体は血清YKL-40レベルが60μg/l +/- 5μg/lであり、グループ3個体は血清YKL-40レベルが70μg/l +/- 5μg/lであり、グループ4個体は血清YKL-40レベルが80μg/l +/- 5μg/lであり、グループ5個体は血清YKL-40レベルが90μg/l +/- 5μg/lであり、グループ6個体は血清YKL-40レベルが100μg/l +/- 5μg/lである、等となる。分類目的のための好ましいグループ化のやり方は、分類される個体の年齢だけでなく、疾患状態、将来的な治療などにも関係し得る。
【００５１】
分類体系のさらなる例を下の表に示す。この実施態様においては、生体試料において測定されたYKL-40の濃度範囲によってグループを規定している。この例における範囲は25μg/lの増加幅に渡るが、5、10、15または20μg/l等、より小さな増加幅であってもよく、あるいは、30、35、40、45または50、60、70、80、90もしくは100μg/l等、より大きな増加幅であってもよい。
【００５２】
【表１】
2011510308.tif 000002
【００５３】
上記および下記の分類グループの全てにおいて、YKL-40レベルがより高ければ、心血管疾患がより重症/進行性であり、生存予後がより悪い、ということが当てはまる。
【００５４】
YKL-40の測定レベルと比較するために、健康な個体における正常なYKL-40値を参照レベルとして使用することが好ましい。そのような正常値が使用される場合、さらに、年齢に関する調整や、例えば重症度による分類を含ませることも可能である。従って、好ましくは、同時係属する「不特定疾患の汎用マーカーとしてのYKL-40」という名称の出願の、特に「参照レベル」という節に記述されたように、健康な個体から得られた年齢調整済み参照レベルを、本発明による方法において参照レベルとして使用し得る。
【００５５】
血清中のYKL-40レベルと、付随するハザード比との関係により、当該個体は、算出されたハザード比に基いて分類することもできる。個体群をパーセンタイルによって分類することもでき、それによれば、群全体を100%として、YKL-40レベルが最も低い10%がグループ1、二番目に低い10%がグループ2、等となる。パーセンタイルは1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、12.5%、13%、14%、15%、20%、25%、30%、33%または35%パーセンタイル・グループによるものであってよく、上記のものの間にある又はそれらよりも大きないかなるパーセンタイルであってもよい。10%パーセンタイル・グループの例が実施例に示されている。
【００５６】
本発明は、アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患を患う個体をその生存の予後に基いて分類する方法を提供し、当該方法は、前記個体から採られた生体試料においてYKL-40のレベルを測定すること、および、当該測定レベルをカットオフ値と比較すること、を含む。当該カットオフ値は一つのYKL-40レベルであり、例えば、血清YKL-40のレベル等、生体試料中のYKL-40のレベルである。当該YKL-40レベルは、本明細書中に記載された一つ以上のYKL-40レベルのいずれであってもよい。生存の予後とは、具体的には心血管疾患性の死をとげることについての予後であり得、より好ましくは、心筋梗塞を患う危険性についての予後であり得る。
【００５７】
本発明の特定の一実施態様は、アテローム硬化性の冠動脈疾患を患う個体を、心筋梗塞を患う危険性の予後に基いて分類するための方法に関し、当該方法は、当該個体から採られた生体試料中のYKL-40レベルを測定すること、当該測定レベルを一つ以上のカットオフ値と比較することを含み、ここで当該一つ以上のカットオフ値の一つは好ましくは約80μg/lの値である。
【００５８】
本発明はさらに、生存の予後に基いて個体を分類するための方法を提供し、当該方法は、当該個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、および当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む。統計学的に有意な増加は、当該個体の生存期間がより短いことの指標である。当該個体は、心血管疾患など、何らかの種類の疾患を患っている場合があり得る。具体的には、当該個体は冠動脈疾患を患っている場合があり得る。
【００５９】
［個体の監視］
本発明は、YKL-40レベルから測定される生存の予後に基いて個体を監視することに関連する。測定されたYKL-40レベルに基いて個体を監視することは、個体の一般的な健康状態の指標として、および/または施された治療の有効性の指標として、使用し得る。当該個体または患者は、心血管疾患または心血管障害など、疾患または障害を患っている場合があり得る。具体的には、当該個体または患者は冠動脈疾患を患っている場合があり得る。
【００６０】
心血管障害および疾患を患う個体において、YKL-40レベルを死亡の予後として監視することは、それぞれの個体にとって最も適した治療を施すことを促進する。効果的な治療を施すことは、その治療の緩解的効果および治癒的効果の両方を向上させ、当該個体の生存の可能性を向上させ、再発の危険性を減少させる。従って、YKL-40は、安定冠動脈疾患の患者における医学的治療の充足性(sufficiency)を監視するために使用することができ、これにより、これらの患者における非致死および致死心血管イベントの高い発生率を減少させることに役立つ。さらに、最も効果的な治療を施すことは、治療のコスト/利益を評価する上でも焦点となる。
【００６１】
従って、生存の予後に関連して個体の健康状態を監視するための方法を提供することは本発明の一態様であり、当該方法は、当該個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、および、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較することを含み、ここで、統計学的に有意な増加は、当該個体の生存期間がより短いことの指標である。
【００６２】
本発明はさらに、冠動脈疾患を患う個体を治療する方法に関し、当該方法は、当該個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、および、当該測定レベルに基いて薬物を選択し、十分な量の当該薬物を当該個体に投与することを含む。当該冠動脈疾患は好ましくは安定冠動脈疾患であり、当該比較は、好ましくは、本明細書に記載されるように一つ以上の参照レベルと比較することにより行われる。
【００６３】
［心臓疾患および障害］
心血管疾患という用語は、心臓または血管(動脈および静脈)に関わる疾患の種類を指す。この用語は、心血管系に影響を与えるあらゆる疾患、および心血管疾患の結果として生ずる事項を指し、本明細書においてそのように用いられるが、アテローム性動脈硬化に関して使用されることが一般的である。多くの種類の心血管疾患が存在し、それは以下のものを含む:急性冠症候群、急性心筋梗塞(AMI/STEMI/ST上昇)、心筋梗塞(心臓発作)、不安定狭心症/UAP/非ST上昇心筋梗塞、動脈瘤、狭心症、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患(CAD)、虚血性心疾患、虚血心筋、不整脈、心房細動、心不整脈、心室頻拍、心室細動、心臓死および心臓突然死、心筋症、うっ血性心不全、心不全、弛緩性および収縮期性心室機能不全、拡張型心筋症、血圧上昇(高血圧)、肥大型心筋症、心弁膜疾患、僧帽弁逸脱、僧帽弁逆流および/または狭窄、大動脈弁逆流および/または狭窄、心筋炎ならびに静脈血栓塞栓症。これらの全てが本発明に関係する。
【００６４】
本発明において特に重要なのが以下の疾患であり、これらは下でさらに詳細に記述される:アテローム硬化性の冠動脈疾患(CAD)、アテローム硬化性の冠動脈心疾患、アテローム硬化性の心血管疾患、虚血性心筋疾患、虚血性冠動脈疾患、虚血性心不全、虚血性心臓疾患、虚血性心不整脈、非致死急性心筋梗塞、冠動脈性突然死(心臓死)、致死および非致死急性心筋梗塞、急性冠症候群、急性心筋梗塞/AMI/STEMI/ST上昇、心房細動、心不整脈、心筋症、うっ血性心不全、虚血心筋 、心筋梗塞、不安定狭心症/UAP/非ST上昇、心筋梗塞、心室頻拍ならびに心室細動。本発明において最も重要なのが、アテローム性動脈硬化に関連したあらゆる心臓/心血管疾患または障害である。
【００６５】
安定狭心症は、典型的には活動またはストレスに付随して起こる胸の痛みまたは不快感として記述することができ、そこでは、同程度のまたは一定の量の活動またはストレスにより、痛みまたは不快感の発症が誘発される。不安定狭心症(UAP)は、予期せず起こる、または、突然に重症度もしくは頻度を増す狭心症として記述することができる。発作は、睡眠中や休息中など、誘発要因がない状態で起こり得、ニトログリセリンに反応しないことがあり、異常に長い時間に渡ることもあり得る。不安定狭心症は、急性心筋梗塞へと至る初期段階であるとも考えられ、それはさらに心血管疾患性の死につながり得る。しかしながらUAPは、生理学的に測定できる実際的なパラメータが無いため、記録するのが難しいことが多い。急性心筋梗塞はさらに心電図(ECG/EKG)の表れ方により分類することができ、即ち、非ST部分上昇心筋梗塞(NSTEMI)またはST部分上昇心筋梗塞(STEMI)に分けられる。
【００６６】
本発明の特定の一実施態様は、アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患を患う個体をその生存の予後に基いて分類する方法を提供し、ここで当該心臓疾患は不安定狭心症ではなく、当該方法は、前記個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、及び、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む。当該参照レベルは、本明細書、特に「参照レベル」という節に記載されるような、いずれかの参照レベルである。
【００６７】
本発明のもう一つの特定の実施態様は、アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患を患う個体の健康状態を、生存予後に基づいて監視するための方法に関し、ここで当該心臓疾患は不安定狭心症ではなく、当該方法は、前記個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、及び、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む。当該参照レベルは、本明細書、特に「参照レベル」という節に記載されるような、いずれかの参照レベルである。
【００６８】
［アテローム性動脈硬化］
アテローム性動脈硬化は動脈血管に影響を及ぼす疾患である。それは動脈の壁における慢性的な炎症反応であり、リポタンパク質の堆積によるところが大きい。それは動脈中に複数のプラークが形成することにより引き起こされる。アテローム性動脈硬化は二つの主だった問題を引き起こす。第一に、アテローム性のプラークは、動脈拡大により長期間代償されるものの、やがてはプラーク破綻および動脈の狭窄を起こすに至り、それによって、当該動脈とつながる器官への血液供給が不十分となる。代償性の動脈拡大が過剰ならば、動脈瘤という結果をもたらす。これらの合併症は慢性的であり、ゆっくりと進行し、累積的である。最も一般的には、柔らかいプラークが突然破綻し、血栓の形成を引き起こし、それが急速に(5分以内に)血流の遅速化または停止をもたらし、その動脈に血液を供給されていた組織が死ぬことに至る。この破滅的な現象が梗塞である。最も一般的に認識されるシナリオの一つは、冠動脈の冠動脈血栓症であり、これは心筋梗塞(心臓発作)を引き起こす。非常に進行した疾患におけるもう一つの一般的なシナリオは、脚への血液供給が不十分になることによる跛行であり、典型的にはこれは、狭窄症および血栓により狭まった動脈瘤セグメントの両方の組み合わせによる。アテローム性動脈硬化は全身に及ぶプロセスであるため、同様の現象は、脳、腸管、腎臓、脚などにつながる動脈においても起こる。
【００６９】
炎症はアテローム発生およびアテローム血栓性の事象において重要な役割を有し、心筋梗塞、卒中、および心血管性死の発生に関連している。さらに、損傷に晒された血管付随組織は全て、コラーゲン代謝回転の変化および炎症を伴う修復反応を示す。YKL-40は炎症を有する組織において局所的にマクロファージおよび好中球により産生されるという発見で示されるように、YKL-40は例えば冠動脈疾患などの心血管疾患および障害を有する個体における急性および慢性炎症の新規のバイオマーカーである。
【００７０】
［冠動脈疾患］
冠動脈疾患(CAD)は、西洋世界において最も一般的な形態の心臓疾患である。冠動脈疾患は、アテローム硬化性冠動脈疾患、冠動脈性心臓疾患(HAD)、アテローム硬化性冠動脈心疾患、アテローム硬化性心血管疾患、虚血性心臓疾患、およびアテローム硬化性心臓疾患とも呼ばれ、心筋に酸素と栄養を供給する動脈の壁にアテローム性のプラークが蓄積することの最終結果である。冠動脈性心臓疾患の症状および徴候は進行した状態の疾患においては認識されるが、冠動脈性心疾患の個体のほとんどは、疾患が進行して最初の症状(「突然」心発作であることがしばしばである)がついに現れるまでの数十年間、疾患の証拠となるものを示さない。何十年にも渡って進行した末に、これらのアテローム性プラークのあるものが破綻し、(血液凝固系の活性化と相まって)心筋への血流を制限し始めることになり得る。
【００７１】
冠動脈疾患は異なった程度において起こる。それは、心筋に供給する単一の冠動脈、または血管、に影響を及ぼすこともあるし、2つの血管、3つの血管、またはそれより多くの血管に影響を及ぼすこともあり得る。影響を受ける血管の数が多いほど、疾患の重症度も上がる。疾患の重症度は、さらに、影響が及んだ血管が末端血管(end vessel)であるか側副血管(collateral vessel)であるかに依存する。側副血管は、組織の一領域、例えば心筋の一領域に、他の血管と共に供給する血管であり、つまり同じ組織領域に2つ以上の血管が供給していることになる。末端血管は、例えば心筋の特定の一領域など、一つの特定の組織領域に単独で供給する血管である。従って、末端血管が影響を受けた場合の方が、側副血管が影響を受けた場合よりも疾患の重症度が高い。
【００７２】
本発明による方法の一つの好ましい実施様態においては、個体はアテローム硬化性冠動脈疾患を患っており、さらに好ましい実施様態においては、当該心臓疾患は安定冠動脈疾患である。
【００７３】
［急性冠症候群］
急性冠症候群(ACS)は、徴候と症状の一群(通常は胸痛およびその他の組み合わせ)であり、心臓への血流が急激に減少すること(心虚血)の結果だと解釈される。これを起こす最も一般的な原因は、心外膜の冠動脈におけるアテローム硬化性プラークの破損である。急性冠症候群は、多くの場合、アテローム性動脈硬化によって冠状動脈にある程度の損傷があることを反映する。急性冠症候群のサブタイプには、不安定狭心症(UA、心筋の損傷を伴わない)、および、心筋の損傷を伴う、二つの形態の心筋梗塞(心臓発作)が含まれる。これらのタイプは、心電図(ECG/EKG)の表れ方に従って、非ST部分上昇心筋梗塞(NSTEMI)およびST部分上昇心筋梗塞(STEMI)と名づけられる。
【００７４】
急性心筋梗塞(AMIまたはMI)は、より一般的には心臓発作として知られ、心臓の一部への血液供給が中断された時に起こる医学的な状態であり、それは最も一般的には不安定プラークが破綻することにより起こる。個体にとって急性心筋梗塞の結末は致死的でもあり得るし、非致死的でもあり得る。結果として起こる虚血または酸素不足は、心臓組織の損傷および潜在的にはその死をも引き起こす。重要な危険因子は、過去におけるアテローム硬化性冠動脈心疾患および/または狭心症などの血管性疾患の経験、過去における心臓発作または卒中、過去における何らかの異常心拍または失神の発症、老齢-特に40歳を超えた男性および50歳を超えた女性、喫煙、過剰なアルコール消費、ある種の薬物の乱用、トリグリセリドのレベルの上昇、LDL(「低密度リポタンパク質」)の上昇およびHDL(「高密度リポタンパク質」)の低下、糖尿病、高血圧、肥満、並びに、ある種の人々における慢性的に高レベルなストレスである。
【００７５】
ACSは安定狭心症とは区別するべきであり、後者は労作時に発生し安静状態では回復する。安定狭心症とは対照的に、不安定狭心症は突然発症し、それはしばしば、安静状態もしくは最小限の労作状態において起こり、または、その個体が以前狭心症を経験した時よりも低い程度の労作において起こる(「クレッシェンド狭心症」)。新たに発症する狭心症も、冠動脈に新たな問題が生じたことを示唆することから、不安定狭心症とみなされる。
【００７６】
不安定狭心症または心筋梗塞を患う一以上の個体を、当該個体から採られた試料におけるYKL-40レベルの増加として測定される生存の予後に基いて分類および/または監視する方法を提供することは、本発明の一つの目的である。より好ましいのは、心筋梗塞(MI)を患う一以上の個体を分類/監視することである。不安定狭心症はMIの初期段階だと考えられる。
【００７７】
［虚血性心筋症］
虚血性心筋症(虚血性心臓疾患(IHD)としても知られ、虚血性心筋疾患、虚血性冠動脈疾患、虚血性心不全、虚血性心臓疾患、虚血性心不整脈、および虚血心筋と関連する)は、心筋への酸素輸送が不十分なことによる心臓の筋肉の虚弱化であり、冠動脈疾患(冠動脈のアテローム性動脈硬化)が最も一般的な原因である。貧血症および睡眠時無呼吸は虚血心筋に貢献し得る比較的一般的な状態であり、甲状腺機能亢進症は高拍出性心不全に伴う二次的現象である「相対的」虚血を引き起こし得る。虚血性心筋症の個体は典型的には心筋梗塞(心臓発作)の経歴を持つが、長期に渡る虚血は心筋に十分な損傷を与え、心筋梗塞が不在であっても臨床的に有意な心筋症を誘発し得る。典型的な症状例では、心筋梗塞の影響を受けた心臓の領域が、初めは壊死性となりながら死に、その後瘢痕組織に置き換わる(線維症)。この線維性の組織は無動である。それはもはや筋肉ではなく、心臓のポンプとしての機能に貢献することができない。もし心臓の無動領域が十分に大きければ、心臓のうち影響を受けた側(即ち、左側または右側)は心不全に陥り、この心不全が虚血性心筋症の機能上の帰着点である。安定虚血性心臓疾患の症状には狭心症、および許容可能な運動量の減少が含まれる。不安定IHDは、安静時における胸痛その他の症状、または急速に悪化する狭心症として現れる。IHDの診断は、心電図、血液検査（心臓性のマーカー）、心臓負荷試験、または冠血管造影図による。治療は、症状とリスクとによって、薬物を用いたもの、経皮的冠動脈形成術(血管形成術)または冠動脈バイパス手術(CABG)であり得る。多くの疾患が心筋症に帰着し得る。これらは、ヘモクロマトーシス、アミロイドーシス、糖尿病、甲状腺機能亢進症、リソソーム蓄積症、および筋ジストロフィーなどのような疾患を含む。
【００７８】
上記のいずれかの虚血性心筋症を患う一以上の個体を、その生存の予後に基いて分類および/または監視するための方法を提供することは、本発明の一つの目的であり、当該方法は、前記個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、及び、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む。当該参照レベルは、本明細書、特に「参照レベル」という節に記載されるようないずれかのYKL-40レベルであり得る。YKL-40のレベルは、例えばイムノアッセイやPCRに基くアッセイなど、本明細書に開示されるアッセイの種類のいずれで測定してもよく、特に血清、血漿、または血液試料など、いずれの種類の生体試料において測定してもよい。
【００７９】
［心不全］
うっ血性心不全(Congestive heart failure) (CHF)、うっ血性心不全(congestive cardiac failure) (CCF)または単に心不全と呼ばれるものは、身体に十分な量の血液を満たす又は送り出すという心臓の能力を損なうような、あらゆる構造的または機能的な心臓障害により引き起こされ得る状態である。それは、心静止(asystole)として知られる「心拍の休止」と混同すべきではなく、また、正常な心機能の休止に続いて血行動態の崩壊ひいては死に至るところのものである心停止(cardiac arrest)とも混同すべきではない。最初の又はそれに続く評価において、全ての個体が容量過負荷(volume overload)を有するわけではないので、より古い用語である「うっ血性心不全」よりも「心不全」という用語の方が好ましい。心不全は、広く受け入れられた定義の欠如、および診断の難しさのため、診断されないことがしばしばあり、特に状態が「軽度」とみなされる場合にそのことが当てはまる。
【００８０】
心不全を患う一以上の個体を、その生存の予後に基いて分類および/または監視するための方法を提供することは、本発明の一つの目的であり、当該方法は、前記個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、及び、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む。
【００８１】
［心停止］
心停止は、心呼吸停止、心肺停止、または循環停止としても知られ、収縮期において心臓が効果的に収縮できないことによる、正常な血液循環の急激な休止である。「停止した」血液循環は、身体の全ての部分への酸素の輸送を妨げる。低酸素脳症、または脳への酸素供給の欠乏は、意識の消失および正常な呼吸の停止を引き起こす(しかし死戦期呼吸はそれでもまだ起こり得る)。心停止が5分間以上無処置であると、脳損傷が起こる可能性が高いが、低体温療法のような新しい治療法によりこの時間は伸びつつある。生存率および神経学的回復率を改善させるためには、即時に対処することが最重要である。心停止は、個体によっては十分に早く処置さえすれば持ち返すことができる可能性のある、医学的な緊急事態である。予期せぬ心停止が死に至った場合、これは心臓突然死と(SCD)と呼ばれ、あるいは冠状動脈突然死と名づけられる。心停止に対する主要な救急療法は、最終的な医学的処置が可能となるまでの間循環の援助を提供する心肺蘇生法(一般的にはCPRとして知られる)であり、これは心臓が示しているリズムによって変わるが、しばしば除細動を必要とする。
【００８２】
心停止と心臓突然死の根底にある原因として最も頻繁に見られるのは冠動脈疾患であり、原因の他のカテゴリーは以下のものを含む:非アテローム硬化性冠動脈異常、心室筋の肥大、並びに不整脈原性右室心筋症、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋梗塞、心筋緻密化障害(non-compaction cardiomyopathy)を含む心筋疾患および心不全、炎症性、浸潤性、腫瘍性、および退行性(degenerative)のプロセス、心臓弁の疾患、先天性心疾患、例えばQT延長症候群のような第一次的な電気生理学的異常(primary electrophysiological abnormalities)(先天性のものと後天性のものの両方)、洞不全症候群、ブルガダ症候群、カテコールアミン作動性の多形性心室性頻拍、神経液性および中枢神経系の影響に関連するリズム不安定性、乳幼児突然死症候群および子供の突然死、心臓震盪、静脈還流量に対する力学的な干渉、大動脈解離、並びに毒性/代謝性の撹乱。
【００８３】
うっ血性心不全を患う個体を、その生存の予後に基いて監視および/または分類するための方法を提供することは本発明の一つの目的であり、当該方法は、前記個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、及び、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む。当該生体試料は、血液、血清または血漿試料であり得る。
【００８４】
［心不整脈］
心不整脈は、心臓の電気的な活動が不規則であるか又は正常な状態よりも速く若しくは遅くなる、一群の状態のいずれかである。不整脈の内のあるものは生命を脅かす医学的緊急事態であり、心停止と突然死を引き起こし得る。他のものは、例えば異なった心拍動が自覚されること、すなわち動悸、のような不快な症状を引き起こし、患者を悩まし得る。あるものは至極軽症であり、正常とみなされることもあり得る。本発明に関係する一般的な心不整脈のリストは以下のものを含むがこれらに限定されない:心房調律、心房性期外収縮(PACs)、移動性心房ペースメーカー、多源性心房頻脈、上室性頻拍(SVT)、心房粗動、心房細動(Afib)、心室調律 、心室性期外収縮(PVC)、頻拍性心室調律、心室頻拍 (VT)、心室細動(VF)、多形性心室性頻拍、心室の過剰拍動、心房性心室性不整脈、房室結節性リエントリ性頻拍、房室回帰性頻脈、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ラウン・ギャノン・レバイン症候群、接合部不整脈、接合部調律、接合部頻拍、早発性接合部複合体(premature junctional complex)、心ブロック(AVブロックとしても知られる)、第1度心ブロック(PR延長としても知られる)、第2度心ブロック、タイプ1第2度心ブロック(モービッツI型またはヴェンケバッハ型としても知られる)、タイプ2第2度心ブロック(モービッツII型としても知られる)、第3度心ブロック(完全心ブロックとしても知られる)、および、三叉神経調律のような比較的稀な不整脈。
【００８５】
本発明に特に関連が深いのは以下の不整脈である:心室頻拍、心室細動、および心房細動。これらの各々は下でさらに説明される。
【００８６】
心室頻拍(V-tachまたはVT)は、心臓の心室の一つに由来する頻拍、すなわち心臓リズムが速くなることである。これは心室細動および突然死につながり得るため、命を脅かす可能性を有する不整脈である。心室頻拍は、その形態、発症の持続時間、または症状に基いて分類することができる。VTには、適当な心拍出量を伴うものもあり、無症状ですらあり得る。通常は心臓はこの律動を中期-長期に渡って許容することができず、脈欠損VTまたはVFへと確実に悪化し得る。
【００８７】
心室細動(V-fiBまたはVF)は、心臓の心室の心筋に非協調的な収縮が見られる状態である。その結果として心臓は適切に血液を送り出すことができなくなる。すぐに低酸素症が起こり、20から30秒以内に意識喪失が後に続く。心室細動は医学的な緊急事態である。この不整脈が数秒間以上続くと、血液循環が止まる―脈拍、血圧および呼吸の欠如がその証拠となる―そして最終的には死に至る。心室細動は心停止および心臓突然死の一原因である。
【００８８】
心房細動(AFまたはafib)は、心臓の二つの上部チェンバー(心房)に関連する心不整脈である。それは変則的に不規則である(irregularly irregular)と定義され、脈をとる時にしばしばそのように同定される。心房細動は最も一般的な不整脈である。年齢と共にリスクは上昇し、80歳を超える人の8%はAFを有する。心房細動においては、通常ならば洞房結節により産出される電気的インパルスが心房における乱れた活動に置き換えられ、心拍を産生する心室にインパルスが不規則に伝導することとなる。その結果が不規則な心拍である。これは持続的でもあり得るし(持続性(persistent)もしくは永続性(permanent)AF)、または正常な心臓リズムの期間の合間に断続的に現れることもあり得る(発作性AF)。心房細動は自然と慢性状態になる傾向がある。慢性的なAFは、死の危険性の増加につながる。心房細動はしばしば無症状であり、一般的にそれ自体は命を脅かすことはないが、動悸、失神、胸痛、又はうっ血性心不全をもたらすことがあり得る。心房細動を有する個体は卒中になる確率が有意に高く(通常の個体群の約2から7倍)、AFは卒中の主要な原因の一つである。
【００８９】
心不整脈を患う個体を、その生存の予後に基いて監視および/または分類するための方法を提供することは本発明の一つの目的であり、当該方法は、前記個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、及び、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む。当該参照レベルは、本明細書、特に「参照レベル」という節に記載されたようないずれかのYKL-40レベルであり得る。本発明と特に関連が深いのは、心室頻拍、心室細動および心房細動などの心不整脈である。当該生体試料は血液、血清または血漿試料であり得、アッセイ方法はイムノアッセイであり得る。
【００９０】
［クロス指標(Cross indications)および長寿命］
心血管疾患に罹患する危険性は、年齢、喫煙、高コレステロール血症(コレステロールのレベルが高いこと)、糖尿病および高血圧症(血圧が高いこと)に伴って増加する。上記のいずれかの指標を有する個体を、当該個体から採られた生体試料から測定されたYKL-40レベルに基いて監視および分類する手段を提供することは、本発明の一つの目的である。参照レベルは、本明細書、特に「参照レベル」という節に記載されたようないずれかのYKL-40レベルであり得る。さらに、YKL-40は長寿命の指標のバイオマーカーとして使用し得る。血清YKL-40のレベルがより低いほど、生存の予後がより良いこととなる。
【００９１】
本発明の一実施態様は、一以上の個体をその生存の予後に基いて分類および/または監視する方法であり、当該方法は、当該個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、および当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む。当該参照レベルは、本明細書、特に「参照レベル」という節に記載されたようないずれかのYKL-40レベルであり得る。一つの追加的な実施態様では、キットにおいて、この分類および/または監視の行い方についての説明書が、生体試料中のYKL-40を検出および定量化するのに必要な要素と共に含まれる。
【００９２】
［YKL-40］
YKL-40は、そのN末端の3アミノ酸であるチロシン(Y)、リジン(K)およびロイシン(L)、ならびに分子量が約40 kDaであることに基いてそう名付けられている(Johansen et al. 1992)。ヒトYKL-40の完全長のアミノ酸配列(SEQ ID NO: 2)およびそのコード配列(SEQ ID NO: 1)は、GenBankにおいて受入番号M80927として見出される。ヒトYKL-40は383アミノ酸長の単一のポリペプチド鎖を含み、系統学的に高度に保存されたヘパリン結合およびキチン結合血漿糖タンパク質の一つである。ヒトYKL-40と、いくつかの他の哺乳類からのホモログとの間の配列同一性は以下の通りである:ブタ(84%配列同一性)、ウシ(83%)、ヤギ(83%)、ヒツジ(83%)、モルモット、ラット(80%)およびマウス(73%)。YKL-40は「哺乳類キチナーゼ様タンパク質」の一員であるが、キチナーゼ活性は有しない。インビトロのYKL-40発現は、正常なヒト単球においては不在であるが、マクロファージ分化の後期段階において活性化された単球および好中球により強く誘導され、血管平滑筋細胞、癌細胞および関節炎の軟骨細胞によって強く誘導される。インビボにおいては、YKL-40のmRNAおよびタンパク質は、アテローム硬化性プラークのような炎症を有する組織におけるマクロファージの亜集団、巨細胞関節炎(giant cell arthritis)を有する個体の関節炎性血管(arthritic vessels)、炎症を有する滑膜、サルコイド病変(sarcoid lesions)、および腫瘍周囲のマクロファージによって発現される。
【００９３】
YKL-40の誘導を支配する分子的プロセスおよびその詳細な機能は知られていない。YKL-40は分泌タンパク質であり、そのことは、作用する場所が細胞外である可能性が最も高いことを示唆する。しかしながら、YKL-40 に特異的な細胞表面受容体や可溶性受容体はまだ同定されていない。YKL-40は線維芽細胞および軟骨細胞に対する増殖因子であり、IGF-1と相乗的に作用し、TNFおよびIL-6により制御されており、NF-kappaBの持続的な活性化を必要とする(Millis et al., 1986)。線維芽細胞のYKL-40処置は、AKTのリン酸化によるTNFおよびIL-1に対する炎症性反応に対抗することができ、それによりASK1媒介シグナル伝達経路を減弱させる(Junker et al., 2005; Nojgaard et al., 2003)。これがメタロプロテイナーゼおよびIL-8の発現レベルの減少につながる(Junker et al., 2005; Nojgaard et al., 2003)。さらに、YKL-40はI型、II型およびIII型コラーゲンに結合し、I型コラーゲン線維形成の速度を調節する(Kamal et al., 2006)。これらの観察は、YKL-40が炎症性の環境において、細胞外マトリックスの分解を制限し、それにより組織再構築をコントロールしながら、保護的な役割を果たし得ることを示唆する。YKL-40はまた、血管内皮細胞に対する化学誘引物質としても働き、その遊走を刺激し、血管平滑筋細胞の遊走および接着を促進するため(Nishikawa et al., 2003; Boot et al., 1999)、血管新生において役割を有することが示唆される。YKL-40はまた線維芽細胞に対する増殖因子でもあり(Vind et al., 2003; Shackelton et al., 1995; Renkema et al., 1998, De Ceunicnck et al., 2001, Recklies et al., 2002, Ling et al., 2004, Recklies et al., 2005)、組織再構築のあいだ細胞外マトリックスを保護する、抗異化作用(anti-catabolic effect)を有する。それに加え、アテローム硬化性プラークにおけるマクロファージ、特に、病変(lesion)のより奥深くに浸入したマクロファージが、YKL-40のmRNAを発現し、最も高いYKL-40発現はアテローム性動脈硬化の初期病変におけるマクロファージに見られる(Boot et al., 1999)。さらに、YKL-40の血漿濃度または血清濃度はいくつかの炎症性疾患において上昇するため、YKL-40は急性期タンパク質とみなすこともできる。
【００９４】
YKL-40の生物学的作用を媒介する細胞受容体は知られていないが、細胞質のシグナル伝達経路が活性化されることから、YKL-40は細胞膜上のシグナル伝達構成要素と相互作用することが示唆される。
【００９５】
YKL-40遺伝子の転写産物のいずれかを検出することは本発明の一つの目的である。従って、当該遺伝子の転写産物は、hnRNA、mRNA、全長タンパク質、断片化タンパク質、またはYKL-40タンパク質のペプチドであり得る。一つまたは複数のタンパク質、RNA転写物、断片および/またはペプチドが同時に検出され得ると理解される。さらに、例えばYKL-40タンパク質およびその断片またはペプチドの抗体検出のようなイムノアッセイ、ならびに、RT-PCRによるRNAの検出のようなPCRベースの検出法など、使用可能なあらゆる手段によって転写産物を検出することは、本発明の一態様である。
【００９６】
［YKL-40と心臓疾患］
本発明は、生体試料中のYKL-40レベルを測定することおよびそこで見出される値を一つ以上の参照レベルと比較することに基く生存の予後に基いて個体を分類および/または監視する方法を開示する。当該個体は健康な個体であってもよいし、上述のいずれかの心臓疾患を患う個体であってもよい。本発明に特に関連が深いのは、アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患または障害である。
【００９７】
下の記述および実施例で示される結果により確証されるように、心臓疾患を患う個体においてはYKL-40レベルが上昇する。これらの結果において見られるように、YKL-40のレベルがより高ければ、その個体の生存についての予後はより短いものとなる。
【００９８】
従ってYKL-40は、驚くべきことに、そのレベルによって個体の生存についての予後が得られる、新規のバイオマーカーであることが見出された。
【００９９】
実施例において記述されるように、慢性の冠動脈疾患を有する個体においては、コントロールと比較して、血清YKL-40レベルが増加している。従って、冠動脈疾患を有する個体において、YKL-40は慢性的な心筋虚血における変化および/または血管新生についての新規のバイオマーカーであり、生存の予後マーカーとして、または(例えば心筋梗塞などの)新たなイベントについての予後マーカーとして働く。実施例から確認されるように、血清YKL-40の上昇に伴い、心血管疾患性の死についての無イベント生存率(event-free survival)が明確に減少する。最も高い血清YKL-40(グループVI、血清YKL-40 ≧ 256μg/l)においては心血管疾患死亡率は8.0%であり、低い血清YKL-40(グループI、血清YKL-40＜110μg/l)においては2.6%であった(図5C)。これは、YKL-40レベルの高低に基いて分類した個体間では、心血管疾患死亡率が3倍を超えるほど異なることを意味する。全ての原因の死について見ればこの連関はさらに明確である(図5D)。最も高い血清YKL-40を有していた患者の18.4%が2.6年以内に死亡し、それに比べて、低い血清YKL-40を有していた患者の場合は5.3%であり、その差はほとんど3.5倍である。
【０１００】
個体から採取された試料におけるYKL-40レベルを測定することにより見出されるその生存の予後に基いて当該個体を分類および/または監視する方法は本発明の一つの目的である。具体的には、冠動脈疾患(CAD)を患う個体を、当該個体の生存の予後に基いて分類および/または監視するための方法を提供することは、本発明の一つの目的である。さらに具体的には、当該方法は、少なくとも一つの血管、例えば2つの血管、例えば3つの血管、例えば4つの血管、例えば5つの血管、または例えば6つの血管に影響を及ぼすCADを患う個体に関する。さらに、影響を受けた血管が末端血管または側副血管であり得、また、もし2つ以上の血管に影響が及んだなら、影響を受けた血管は末端血管および側副血管の組み合わせであり得ることは、本発明の一態様である。
【０１０１】
CADの程度は、影響が及んだ血管の数によって判断することはできない。CADの程度はむしろ、当該個体中の影響を受けた血管において存在するアテローム性動脈硬化の程度に関係している。同様に、複数の血管が影響を受けたCADを患う個体の方が、単一の血管が影響を受けた個体よりも症状が少ない、ということもあり得る。
【０１０２】
実施例において見られるように、YKL-40レベルの上昇は心筋梗塞についての予後バイオマーカーでもある。驚くべきことに、YKL-40はMIと心血管疾患性の死との両方に有意に連関していることが見出された。MIが心血管疾患性の死の主要な原因であることは以前に確証されている。従って、心筋梗塞(MI)を患う個体を、その生存の予後に基いて分類および/または監視するための方法を提供することは、本発明の一つの目的である。
【０１０３】
実施例に記述されるように、急性ST上昇型心筋梗塞(STEMI)の翌日には、コントロールと比較して血清YKL-40レベルが増加している。従って、冠動脈疾患を有する個体において、YKL-40は慢性的な心筋虚血における変化および/または血管新生についての新規のバイオマーカーであり、生存の予後マーカーとして働く。従って、急性冠症候群を患う個体を、当該個体の生存の予後に基いて分類および/または監視するための方法を提供することは、本発明の一つの目的である。具体的には、致死的または非致死的な、非ST部分上昇心筋梗塞(NSTEMI)またはST部分上昇心筋梗塞(STEMI)を患う個体を分類および/または監視する方法を提供することは、本発明の一つの目的である。
【０１０４】
2.6年という比較的短い追跡調査期間において、血清YKL-40のHRがいかに高く、MI(急性心筋梗塞)については1.83、心血管疾患性の死については3.28、全ての原因の死については3.75であるということが、実施例において記述される。これらのHR値は高く、YKL-40のバイオマーカーとしての強さを示すものである。
【０１０５】
［YKL-40の検出］
本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは、YKL-40の機能的誘導体(functional derivatives)、YKL-40ペプチド、およびそれらをコードするヌクレオチドを含む。「機能的誘導体」は、ある分子の「断片」、「バリアント」、「類似体」、または「化学的誘導体」を意味する。分子、例えば本発明のいずれかのDNA配列の「断片」は、その分子のあらゆるヌクレオチド・サブセットを含む。そのような分子の「バリアント」とは、当該分子の全体または断片に対して実質的に類似性を有する、自然に起こる分子のことを指す。分子の「類似体」とは、当該分子の全体または断片に対して実質的に類似性を有する、非天然分子のことを指す。
【０１０６】
両分子のアミノ酸の配列が実質的に同様であるならば、一つの分子はもう一つの分子に「実質的に類似」すると言われる。実質的に類似するアミノ酸分子は類似した生物学的活性を有する。従って、もし二つの分子が類似した活性を有するならば、例え一方の分子が他方には見られない追加的なアミノ酸残基を含んでいても、あるいはアミノ酸残基の配列が同一でなかったとしても、それらはここで言うところのバリアントとみなされる。
【０１０７】
さらに、通常の分子には無い追加的な化学的部分(chemical moieties)を含む場合、その分子は通常の分子に対して「化学的誘導体」であると言われる。そのような部分は、当該分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善し得る。あるいは当該部分は、当該分子の毒性を減少させたり、望ましくない何らかの副作用を除去または減弱させたりなどし得る。そのような効果を媒介することができる部分は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980に開示されている。
【０１０８】
YKL-40の一次アミノ酸配列のわずかな改変は、ここに記載されたYKL-40ペプチドと比較して実質的に類似した活性を有するタンパク質およびペプチドをもたらし得る。そのような改変は、部位特異的変異誘発によるもののような意図的なものでもあり得るし、自然発生的なものでもあり得る。これらの改変により産生された全てのペプチドは、YKL-40の生物学的活性を維持している限り、本発明に含まれる。さらに、一つまたは複数のアミノ酸の欠失によっても、生物学的活性を著しく変えることなく分子の構造を改変することをもたらし得る。このことは、より広範な有用性を有する、より小さな活性分子の開発につながり得る。例えば、酵素が望ましい触媒活性または抗原活性を発揮するためには不要であり得るようなアミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸を除去することができる。
【０１０９】
下に記述される本発明のイムノアッセイおよび治療的方法においては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれでも使用し得る。抗YKL-40抗体は市販されているものが入手可能であり、または、ここで開示されているようにして、もしくは当該技術分野の公知のやり方で、産生してもよい。ポリクローナル抗体は、実質的に純粋なYKL-40または抗原性のYKL-40ペプチドを用いて、適切な非ヒト哺乳類に複数の皮下または筋肉内注射を施すことにより産生し得る。YKL-40ペプチドで免疫化した動物の抗体反応の規模を、従来的な技術によって測定することにより、当該ペプチドの抗原性を測定することができる。一般的には、抗YKL-40抗体を産生するために使用されるYKL-40ペプチドは、YKL-40に対する親和性が比較的高い抗体の高タイターにおける産生を誘導するようなものであるべきである。
【０１１０】
所望ならば、免疫化ペプチドは、当該技術分野では周知である技術を用いた結合(conjugation)により、担体タンパク質とカップリングさせることができる。一般的に使用される、ペプチドに化学的にカップリングさせられるそのような担体は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、および破傷風トキソイドを含む。カップリングされたペプチドは、その後、動物(例えばマウスまたはウサギ)を免疫化するのに用いられる。YKL-40は哺乳類の種間で保存されていることがあり得るので、YKL-40タンパク質の免疫原性を増強するために担体タンパク質を使用することが好ましい。
【０１１１】
当該哺乳動物から採られた血液試料から、抗体が得られる。ポリクローナル抗体を産生するために使用される技術は当該技術分野において既知であり、例えば、Methods of Enzymology, "Production of Antisera With Small Doses of Immunogen: Multiple Intradermal Injections", Langone, et al. eds. (Acad. Press, 1981)を参照されたい。動物により生成されたポリクローナル抗体は、例えば当該抗体を産生するのに使用したペプチドを結合させたマトリックスに結合させ、また、溶出させることにより、さらに精製することができる。当業者ならば、免疫学分野において一般的である、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を精製および/または濃縮するための様々な技術を知っているはずであり、例えば、Coligan, et al., Unit 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991)を参照されたい。
【０１１２】
しかしながら、産生されるYKL-40抗体はモノクローナル抗体(「mAb」)であることが好ましい。モノクローナル抗体を調製するためには、マウスまたはラットを免疫化することが好ましい。本発明で使用される「抗体」という用語は、無傷の分子、および、エピトープ決定部位に結合する能力を有するその断片、例えばFabおよびF(ab')2を含む。また、この文脈において、「本発明のmAb」という用語は、YKL-40に対する特異性を有するモノクローナル抗体のことを指す。
【０１１３】
mAbを分泌するハイブリドーマを作製するために使用される一般的な方法はよく知られている(Kohler and Milstein, 1975)。当該技術は、簡潔に述べると、Kohler and Milsteinにより記述されているように、黒色腫、奇形癌腫、または、子宮頸癌、神経膠腫、もしくは胚癌(試料は手術検体から得られる)を有する5人の別個の癌患者の局所的(regional)流入領域リンパ節からリンパ球を単離し、当該細胞をプールし、SHFP-1と融合させることを含んでいた。癌細胞株に結合する抗体を産生するものについて、ハイブリドーマをスクリーニングした。
【０１１４】
mAbの中にYKL-40特異的なものがあることの確認は、比較的ルーチン的であるスクリーニング技術(例えば酵素結合免疫吸着測定法、すなわち「ELISA」など)を使用して、興味を引くmAbの素反応(elementary reaction)パターンを決定することにより、達成することができる。あるmAbを評価して、それが本発明のmAbと同じ特異性を有するかどうかを、過度の実験をすることなく決定することは、上記のように単離されたYKL-40に本発明のmAbが結合することを、当該試験されるmAbが妨げるかどうかを判定することによっても可能であり、もし当該試験されるmAbが本発明のmAbと競合する(これは本発明のmAbによる結合が減少することにより示される)ならば、これら二つのモノクローナル抗体は、おそらく同じまたは密接に関連するエピトープに結合するものである。あるmAbが本発明のmAbの特異性を有するかどうかを判定する更にもう一つのやり方は、通常ならば当該mAbと反応性を有する抗原と、本発明のmAbとを事前にインキュベーションして、試験されるそのmAbが当該抗原に結合する能力が抑制されるかどうかを判定することである。もし当該試験されるmAbが抑制されるならば、ほぼ間違いなく、それは本発明のmAbと同じまたは密接に関連するエピトープ特異性を有する。
【０１１５】
イムノアッセイの手順
イムノアッセイの手順は、疾患を有する個体のYKL-40のレベルを、健康なヒトに見られ得る正常レベルおよび/または当該個体において測定されるバックグラウンドレベルから区別し得るように定量的でなければならない。検出可能な標識(直接的または間接的)を使用した固相上の競合およびサンドイッチ・アッセイが従って好ましい。当該標識が、抗体によるYKL-40抗原への結合を示す検出可能なシグナルを提供する。抗体または抗原は、検出可能なシグナルを提供するために当該技術分野で知られるあらゆる標識により標識化し得、それらは放射性同位体、酵素、蛍光分子、化学発光分子、生物発光分子および金コロイドを含む。既知のアッセイ手順の中では、ラジオイムノアッセイ(RIA)がその感度から最も好ましい。従って、放射性同位体は好ましい標識である。
【０１１６】
抗体に直接結合させることができる、またはYKL-40抗原に間接的に結合させることができる金属性イオンの例は、当業者には周知であり、125I、111In、97Ru、67Ga、68Ga、72As、89Zr、90Yおよび201Tlを含む。抗原結合特異性を損なうことなく容易に付着(attachment)させることができることから、125I(ナトリウム塩、英国Amersham社)が好ましい。125Iを用いたYKL-40の標識化は、Salacinski, et al. (1981)に記述された方法に従って行い得る。125I標識を提供するために使用するヨードゲン(1,3,4,6-テトラクロロ-3α, 6α-ジフェニルグリコールウリル)は、イングランド国チェスターのPierce and Warriner社から購入できる。
【０１１７】
本発明のラジオイムノアッセイにおいては、標準試料(standards)または試料を、実質的に等容量のYKL-40抗血清およびYKL-40トレーサーと共にインキュベートして使用する。標準試料または試料は一般的には二回繰り返して(in duplicate)アッセイされる。本発明のアッセイの感度(検出限界)は約10μg/lである。この文脈における感度とは、ゼロ結合の値の標準偏差の二倍に相当する検出可能な質量、として定義される。標準曲線は一般的には20から100μg/lの間で直線的である。以下の実施例に記述されるアッセイにおける、アッセイ内およびアッセイ間の分散係数は、それぞれ<6.5%および<12%である。
【０１１８】
RIAほど感度が良いとは限らないものの、放射性同位体以外の標識を使用したアッセイ手順にも一定の利点があり、好ましいRIA形式に代わるものとして利用され得ることは、当業者には理解されることである。例えば、ELISAマイクロタイター・プレート・リーダーおよび多くの研究室や臨床検査室において利用可能である試薬を用いて、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を容易に自動化し得る。蛍光、化学発光および生物発光標識は視覚的に検出できるという利点を有するが、アッセイにおいて抗体に結合された抗原の量を定量化するという点では放射性同位体ほど有用ではない。
【０１１９】
PCRに基くアッセイ
さらに、生体試料中のYKL-40の存在を検出し定量化するためにイムノアッセイ以外の手段を利用し得ることは、当業者には理解されることである。例えば、YKL-40をコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で知られる定量的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プロトコールを使用して検出し得る。定量的PCRを行う上で好ましい方法は、一つ以上の塩基対の突然変異が導入されており標的YKL-40遺伝子テンプレートとは配列またはサイズが異なるようにしてある競合的テンプレートを使用して実行される、競合的PCR技術である。プライマーの内の一つはビオチン化されるか、または好ましくはアミノ化され、それにより、結果として生じるPCR産物の一方の鎖(普通はアンチセンス鎖)を、適切な反応物(reactant)が堅固に結合した固相支持体に、アミノ-カルボキシル、アミノ-アミノ、ビオチン-ストレプトアビジン、またはその他の適度に強固な結合を介して固定化することができる。最も好ましくは、当該PCR産物、固相支持体および反応物間の結合は共有結合であり、それにより結合は変性条件下でも確実に切断に耐えられることとなる。
【０１２０】
いったんPCR産物のアミノ化またはビオチン化された鎖が固定化されたら、結合していない方の相補鎖をアルカリ変性洗浄により分離し、反応環境中から除去する。標的および競合的核酸に対応する配列特異的オリゴヌクレオチド(「SSO」)は検出タグにより標識化される。それからSSOは、引きはがされた遊離(unbound)センス鎖による競合が無い中、当該アンチセンス鎖とハイブリダイズされる。適切なアッセイ試薬が加えられ、使用される検出タグおよび固相支持体に適したELISA測定手段(好ましくはELISAマイクロプレート・リーダー)により、ハイブリダイゼーションの度合いが測定される。標的テンプレートおよび競合的テンプレートを含むテンプレートを増幅したPCR反応から別個に得られた標準曲線を使用し、測定値を比較して標的核酸の量を導き出す。定量的であること、PCRのサイクル数に依存しないこと、および、SSO標識とPCR産物中の相補鎖との競合による影響を受けないこと、という点において、この方法は利点を有する。
【０１２１】
あるいは、ポリメライゼーション工程の一部およびハイブリダイゼーション工程の全てを固相支持体上で行うこともできる。この方法においては、固相支持体上に捕われるのは、PCR産物の鎖ではなく、ヌクレオチド・ポリメライゼーションのプライマー(好ましくはオリゴヌクレオチド)である。それから、標的核酸PCR産物および競合的核酸PCR産物が溶液中で当該固相支持体に加えられ、ポリメライゼーション工程が行われる。上記の変性条件下、ポリメライゼーション産物中の結合していないセンス鎖が除去される。
【０１２２】
適切な測定手段(好ましくはELISAリーダー)および上記の標準曲線を使用して、標識化されたオリゴヌクレオチドSSOプローブを検出することにより、標的核酸対競合的核酸の比を決定することができる。この方法は極めて効率が良いため、ポリメライゼーション工程において連鎖反応は不要であり得、当該方法を実行するのに必要な時間が短縮される。ポリメライゼーションの最終産物をハイブリダイゼーションのために反応チューブから固相支持体に移す必要もなく、従ってそれらを損失したり損傷したりする可能性も制限されるため、当該方法の精度もまた高められる。しかしながら、特定の試料においてもし必要ならば、別個の反応チューブ中でPCRを行って標的および競合的核酸を増幅し、続いて最終的なポリメライゼーションを固相支持体上で行うこともできる。
【０１２３】
当業者に知られた、結合されたPCR産物の形成を示す、別個の検出可能なシグナルを提供することができる分子(例えば、標的および競合的PCR産物の形成を示して異なる色を生ずる標識化ヌクレオチド発色団)を、当該反応の最後の数サイクル中に、反応液に加えることができる。ELISAまたは他の適切な測定手段、および、固定化されたハイブリダイゼーション・プライマーの3'末端にカップリングされた検出タグと反応する試薬によっても、標的核酸と競合的核酸との間の比を決定することができる。この方法は、従来的な非競合的PCRプロトコールを行うことによって、特定の遺伝子が試料中に存在するかどうかを(定量化はせずに)検知することにも適用し得る。
【０１２４】
上記の方法において使用するための適切なプライマーの選び方は、当業者には既知であるか、または、当業者により容易に確立され得る。上で記述した技術についてのさらなる詳細については、Kohsaka, et al., Nuc.Acids Res., 21:3469-3472, 1993、Bunn, et al. 米国特許No. 5,213,961、およびInnis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Acad.Press, 1990の開示を参照し得、これらの開示は、定量的PCRプロトコールに関する最新技術を説明するという目的のみのために、本明細書に組み入れられる。
【０１２５】
酵素アッセイ
YKL-40は加水分解性の酵素であると見られ、従って、YKL-40の基質が検出可能な形態に加水分解される酵素アッセイに基いて、機能的なYKL-40タンパク質またはタンパク質断片のレベルを測定し得る。
【０１２６】
［ディップスティック(Dipstick)］
YKL-40を検出する一つの特定の方法は、迅速で定性的および/または定量的な試験の系が固形支持体上に備え付けられた、生体試料におけるYKL-40レベルを決定するための器具(device:機器、装置、器具、用具)に関わる。
【０１２７】
当該試験系は、イムノアッセイ、PCRに基くアッセイ、または酵素アッセイなど、上述のアッセイ系のいずれかを利用し得る。イムノアッセイが本試験系においては好ましい。
【０１２８】
当該固形支持体は、上記のアッセイのいずれか(特にイムノアッセイ)を行う上で使用されるいかなる固相であってもよく、ディップスティック、膜、吸収パッド、ビーズ、マイクロタイター・ウェル、試験チューブ、その他が含まれる。訓練の経験が乏しい又は全く無い試験員や自己試験する患者が手軽に使用できるような試験器具が好ましい。そのような好ましい試験器具はディップスティックおよび膜アッセイ系を含む。そのような従来型の試験系の調製および使用は、特許、医学、および科学文献において広く記述されている。スティックが使用される場合、当該スティックの一方の端に抗YKL-40抗体を結合させ、その抗体を帯びた方の端を生体試料中または生体試料上に浸すことができるようにする。あるいは、ピペット、滴下具(dropper)、ピンセット、その他により、試料を、抗体コーティングされたディップスティックもしくは膜に付けてもよいし、または、身体からスティック上に試料を直接噴きかけてもよい。
【０１２９】
本実施態様においては、液状である、または液状に転換できる生体試料が好ましい。液体として身体から得ることができる生体試料が特に好ましい。その例は以下のものを含み、それらに限定されない:血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、滑液、精液、および唾液。
【０１３０】
YKL-40に対する抗体は、例えばIgA、IgGもしくはIgM、Fabフラグメント、またはそれに類するものなど、いかなるアイソタイプでもあり得る。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得、Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988(この文献は参照により本明細書に組み込まれる)で一般的に記述されているような方法によって産生し得る。イムノアッセイについてのセクションも参照のこと。抗体は、直接的または間接的な手段により固形支持体に付加できる。間接的な結合においては、YKL-40結合部位が支持体への結合に使用されないため、YKL-40結合部位をアッセイ液に最大限さらすことができる。ポリクローナル抗体はYKL-40の異なった複数のエピトープを認識できるためアッセイの感度を増強するので、ポリクローナル抗体を使用してもよい。あるいはYKL-40に対するモノクローナル抗体を使用してもよい。
【０１３１】
YKL-40抗体を固形支持体に結合させた後、当該固形支持体を非特異的にブロックすることが好ましい。周辺域の非特異的ブロッキングは、全ウシ血清アルブミンもしくは誘導体化したウシ血清アルブミン、または他の動物からのアルブミン、動物の全血清、カゼイン、無脂肪乳、およびそれに類するものによって行い得る。
【０１３２】
YKL-40特異的抗体が結合した固形支持体上に試料を加え、YKL-40が前記抗体を介して固形支持体に結合するようにする。過剰および未結合の試料成分を取り除き、好ましくは当該固形支持体を洗浄して、抗体-抗原の複合体が固形支持体上に保持されるようにする。例えばTween-20、Tween-80またはドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤を含み得る洗浄液を用いて固形支持体を洗浄してもよい。
【０１３３】
YKL-40を固形支持体に結合させた後、YKL-40に反応する第2の抗体を加える。第2の抗体は(好ましくは可視化標識により)標識化されていてもよい。標識は、可溶性でも粒子性でもよく、染色された免疫グロブリン結合物質、単純色素もしくは色素ポリマー、染色されたラテックスビーズ、色素含有リポソーム、染色された細胞もしくは生物、または、金属性、有機、無機、もしくは色素固形物を含み得る。標識は、当該技術分野で周知の様々な手段によって、YKL-40抗体に結合させることができる。本発明のある実施態様においては、標識は、シグナル発生システムとカップリングすることができる酵素である。可視化標識の例は、アルカリホスファターゼ、ベータ・ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、およびビオチンを含む。酵素-色素原または酵素-基質-色素原の組み合わせは多く知られており、酵素を介したアッセイに使用される。
【０１３４】
試料と同時に、既知量のYKL-40を用いて、対応する工程を実施してもよく、そのような工程は当該アッセイの標準(standard)となり得る。
【０１３５】
固形支持体を再び洗浄して未結合の標識化抗体を取り除き、標識化抗体を可視化し定量化する。標識の蓄積は一般的には視覚的に評価される。この視覚的検出は、使用される標識によって例えば赤色、黄色、茶色、緑色など、異なる複数の色の検出を可能とし得る。標識の蓄積は、例えば反射率解析機、ビデオ映像解析機およびそれに類するもの等、光学的検出装置によって検出することもできる。蓄積した標識の視覚的な強度は、試料中のYKL-40の濃度と相関し得る。蓄積した標識の視覚的強度とYKL-40の量とを相関させることは、当該視覚的強度を一連の参照標準(reference standards)と比較することにより行い得る。当該標準は、当該未知試料と同じようにしてアッセイされたものであることが好ましく、当該試料と平行して(同じまたは別の固形支持体上で)アッセイされたものであることが更に好ましい。使用される標準試料の濃度は、溶液1リットルあたり約1μgのYKL-40から、溶液1リットルあたり約1mgのYKL-40にいたるまでの範囲であり得、血清試料を試験するための範囲は50μg/lから400μg/lのYKL-40であることが好ましい。色の強度の比較による未知試料の定量化がより正確になるよう、いくつかの異なった濃度のYKL-40標準を使用することが好ましい。200μg/lのYKL-40と同様の色の強度である場合と比較して、110μg/lのYKL-40と同様の色の強度は陰性(negative)だとみなされる。
【０１３６】
ここで記述されたディップスティックまたはその他の固形支持体ベースの試験系のような器具をこのように使用し、一つ以上の標準/コントロール・フィールドとの比較により生体試料中のYKL-40の概量を決定することができる。このようにして、当該YKL-40の濃度は、当該器具の標準/コントロール・フィールドに塗布されたYKL-40の2種類の濃度の間の範囲に収まるものであることが確かめられる。あるいは、YKL-40の濃度が、YKL-40についての一つのカットオフ値よりも高いか低いかを判定することもでき、この場合、カットオフ値として選ばれた濃度がディップスティックのコントロール・フィールドに塗布されることになる。
【０１３７】
個体から得られた生体試料中のYKL-40のレベルをYKL-40の参照レベルと比較することにより見出される生存の予後に基いて当該個体を分類および/または監視するための器具を提供することは、本発明の一つの目的である。当該器具中および/または器具上には、複数の参照レベル/標準が利用可能であってもよいし、または、単一の参照レベル/標準が利用可能であってもよい。後者においては、当該器具は、個体から得られた生体試料中のYKL-40のレベルを、YKL-40のカットオフ値と比較することにより見出される生存の予後に基いて、当該個体を分類および/または監視するためのものである。上で論じたように、YKL-40のあらゆるカットオフ値(濃度)を使用し得る。
【０１３８】
本発明による器具の一つの特定の実施態様は、試料中のYKL-40のレベルを測定する手段、および、YKL-40の測定レベルを少なくとも一つのYKL-40の参照レベルと比較する手段、を含む器具に関する。当該参照レベルは、好ましくは、例えば約80μg/lのカットオフ値のような単一の参照レベルであり得、あるいは、YKL-40の複数のカットオフ値の組であり得る。この場合、当該器具は、YKL-40の測定レベルを一組のYKL-40のカットオフ値と比較するための手段を含む。
【０１３９】
加えて、もし治療が有効ならばYKL-40レベルは減少するはずであるため、当該アッセイは、治療中に患者のYKL-40レベルを監視することにも使用し得る。当業者には自明であるように、患者の試料を一つ以上の段階希釈に付し、当該患者の試料中のYKL-40のレベルを、標準のセットの一つと比較できるようにすることが必要となり得る。患者のYKL-40測定値はその後、希釈倍数(dilution factor)で補正される。
【０１４０】
もし各工程の後に容器を清浄および洗浄するならば、複数の工程の各々を、例えば試験チューブのような一つの同じ容器の中で行うことも可能であるが、迅速かつ簡便に場所を選ばずにアッセイを行える、本発明による最適の方法は、それぞれの工程のために3つの別個の容器を使用することであり、一つは試料に、もう一つは洗浄に、そしてもう一つは検出標識の発色(developing)に使用される。
【０１４１】
従って、生体試料が採られる個体のYKL-4の参照レベルに基く分類において使用するための生体試料のYKL-40レベルを、ディップスティック(図6Aおよび6B)を用いて測定することは、本発明の一つの目的である。
【０１４２】
本発明に従ってYKL-40をアッセイすることに必要な全ての材料と試薬は、一つのキットの中に一緒に収めることができる。一般的にはこれは、既知の濃度のYKL-40を含有する一つ以上の溶液、洗浄液、基質に対する酵素の直接的または間接的な作用により色または陰影を変える色素原の溶液、検出できるように標識と結合された抗YKL-40抗体、前記の溶液を移すためのピペット、前記の溶液のための試験チューブ、および、固形支持体(特に、当該試験チューブに挿入できるようにしてあり、表面にYKL-40に対するポリクローナル抗体を帯びたもの)、を含む。当該キットはまた、一つまたは複数の試料を同時にまたは個別にアッセイすることに使用するための、抗YKL-40抗体を有する一つ以上の固形支持体、および、標識を発色させるために必要な試薬を含み得る。標準試料として使用するためのYKL-40も提供され、それを未知の試料と一緒にそのつどにアッセイできるようにしてあることが好ましい。そのようなキットは、個々の試薬のための個別の入れ物を含む。
【０１４３】
上記の試験キットにおいては、試薬は貯蔵ボトルから供給されるようになっていてもよいし、または、一つ若しくは複数の試験チューブに試薬もしくはコントロールが予め満たされていてもよい。
【０１４４】
キットの構成成分は、乾燥または凍結乾燥の状態でも提供され得る。試薬や成分が乾燥状態で提供される場合、一般的には、適切な溶媒を加えることによって再構成が行われる。当該溶媒がもう一つの入れ物に入れられて提供されることも考えられる。
【０１４５】
本発明のキットはまた、典型的には、市販するためにバイアルやチューブのような試薬を密閉する手段を含み、例えば、射出成形 やブロー成形のプラスチック容器に所望のバイアルが保持される。当該キットにはまた、アッセイのやり方についての一連の説明書きが含まれる。
【０１４６】
別の実施態様においては、当該ディップスティックおよび/またはキットはYKL-40以外のバイオマーカーをアッセイするための手段を含み、これらのバイオマーカーとしては、非限定的な以下の群の中のいずれか一つ以上が例として挙げられる:C反応性タンパク質(CRP)、脳性ナトリウム利尿タンパク質(BNP)、インターロイキン、腫瘍壊死因子-アルファ、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子-1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド(P-III-NP)、単球走化性タンパク質-1、フィブリンD-ダイマー、増殖分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク質関連ホスホリパーゼA2、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ペントラキシン3、分泌型ホスホリパーゼA2グループIIA、細胞間接着分子-1、心臓型脂肪酸結合タンパク質(H-FABP)、ミオシン軽鎖-1 (MLC-1)、P-セレクチン、およびCKMB。好ましくは、当該ディップスティックおよび/またはキットは、C反応性タンパク質および/または脳性ナトリウム利尿タンパク質および/またはホモシステインをアッセイするための手段を含む。
【０１４７】
［他のバイオマーカー］
YKL-40は、全死亡および心臓死についての独立したバイオマーカーであり、そのように使用することができる。しかしながら、YKL-40は、例えばC反応性タンパク質(CRP)、脳性ナトリウム利尿タンパク質(BNP)、インターロイキン、腫瘍壊死因子-アルファ、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子-1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド(P-III-NP)、単球走化性タンパク質-1、フィブリンD-ダイマー、増殖分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク質関連ホスホリパーゼA2、マトリックスメタロプロテイナーゼ、ペントラキシン3、分泌型ホスホリパーゼA2グループIIA、細胞間接着分子-1、心臓型脂肪酸結合タンパク質(H-FABP)、ミオシン軽鎖-1 (MLC-1)、P-セレクチン、およびCKMBのような、他の既知のバイオマーカーと組み合わせて使用することもできる。前述のバイオマーカーの内、例えばUPARと可溶性UPAR、細胞間接着分子-1と可溶性細胞間接着分子-1、等のように、可溶性および不溶性の形態のタンパク質は両方とも本発明に関係する。上述のマーカーはいずれも、そのレベルを、例えば血液、血清、血漿、または組織試料などの生体試料において測定することができ、また、例えばイムノアッセイやPCRに基くアッセイまたは複数の種類のアッセイの組み合わせなどのような、あらゆる利用可能な手段によって測定し得る。
【０１４８】
従って、他のバイオマーカーのレベルと組み合わせたYKL-40レベルに基づいて個体を分類および監視するための手段を提供することは本発明の一態様であり、これら他のバイオマーカーは、以下のものから成る非限定的な群から選択される:C反応性タンパク質(CRP)、脳性ナトリウム利尿タンパク質(BNP)、インターロイキンおよび腫瘍壊死因子-アルファ、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子-1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド(P-III-NP)、単球走化性タンパク質-1、フィブリンD-ダイマー、増殖分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク質関連ホスホリパーゼA2、マトリックスメタロプロテイナーゼ、およびCKMB。これらの追加的なバイオマーカーの内、C反応性タンパク質、脳性ナトリウム利尿タンパク質、およびホモシステインが特に重要である。
【０１４９】
本発明による方法の一つの好ましい実施態様においては、YKL-40レベルは、もう一つのバイオマーカーのレベルと共に測定される。好ましくは、当該別のバイオマーカーは、以下のものから成る群から選択される:C反応性タンパク質(CRP)、脳性ナトリウム利尿タンパク質(BNP)、インターロイキン、腫瘍壊死因子-アルファ、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子-1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド(P-III-NP)、単球走化性タンパク質-1、フィブリンD-ダイマー、ミオシン軽鎖-1 (MLC-1)、P-セレクチン、およびCKMB。
【０１５０】
上述の実施態様は、必要な医学的および/またはサンプリング機器、ならびに、当該機器についての使用説明書および任意のアッセイの行い方についての説明書と共に、キットに含まれ得る。
【０１５１】
［生体試料］
生体試料は、個体から採られる試料である。従って、生体試料は、以下のものから成る群から選択される試料であり得る:組織、骨、血液、血清、および血漿試料。本発明に特に関連があるのは、血液、血清および血漿の試料である。特定の疾患もしくは障害、または一般的な健康状態(いずれにおいてもYKL-40レベルの増加が生存についての予後となる)を分類または監視することに使用する上で、どのアッセイ試料源が最も適切かは、当業者ならば容易に決定することができる。
【０１５２】
［個体］
ここで言う個体とは、ある生物種の一個の構成員のことを指し、ここでは哺乳類種であることが好ましい。あらゆる哺乳類種が本発明の対象であるが、以下の種が特に重要である:マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、およびヒト。本発明における個体は、最も好ましくはヒトである。本明細書において、個体は患者(patients)または被験者(subjects)とも呼ばれ得る。
【０１５３】
［キット(Kit of parts)］
本発明のもう一つの実施態様は、キットを含み、ここで当該キットは、少なくとも、個体から採られた生体試料中のYKL-40のレベルを評価するための要素と、そのやり方についての説明書とを含む。前記の要素は、例えばイムノアッセイのような、YKL-40レベルを検出する方法、または特異的にYKL-40検出をするイムノアッセイを行うために必要な複数の構成部分であり得る。当該キットは任意で、生体試料のYKL-40を検出しそのレベルを測定するためのPCRベースのアッセイを行うための要素を、追加としてまたは替わりとして、含み得る。当該キットはさらに、例えば注射器、バイアルその他のような、生体試料を採るための機器を含み得る。当該キットは、一回使用または繰り返し使用のために包装され得るし、その構成要素は、一度使用した後に捨てられるようなディスポーザブルのものであってもよいし、または、繰り返し使用できるような品質のものであってもよい。
【０１５４】
本発明のキットの特定の一実施態様は、生体試料中のYKL-40を検出するための手段、YKL-40の測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較するための手段、および、YKL-40レベルに基いて個体を分類および/または監視するやり方についての説明書、を含むキットに関する。
【０１５５】
当該キットの一実施態様においては、YKL-40レベルの検出および測定用であることに加え、例えばC反応性タンパク質(CRP)、ホモシステイン、脳性ナトリウム利尿タンパク質(BNP)、インターロイキン、腫瘍壊死因子-アルファ、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子-1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド(P-III-NP)、およびCKMBのような、一つ以上の追加的なバイオマーカーを検出するための手段をさらに含み得る。好ましくは、そのような、YKL-40以外のバイオマーカーの検出法を含むキットは、生体試料中のC反応性タンパク質、脳性ナトリウム利尿タンパク質および/またはホモシステインのレベル検出および/または測定するための要素を含む。
【０１５６】
本発明によるキットはさらに、上で記述した少なくとも一つの器具を含み得る。
【０１５７】
図面の詳細な説明
【０１５８】
図1 YKL-40調査における個体の人口統計学的データ。データ入力時における、患者のYKL-40濃度上昇に基いた人口統計学的特徴。血清YKL-40パーセンタイルによるグループ分け。数値は数(パーセント)または中央値(IQR、四分位範囲)で表される。6グループ間の統計学的比較は傾向検定(tests for trend)を使用して行った。MI、急性心筋梗塞。n.a. 該当なし。グループ I: YKL-40<110μg/l; II: 110μg/l≦YKL-40<129μg/l; III: 129μg/l≦YKL-40<153μg/l; IV: 153μg/l≦YKL-40<19lμg/l; V: 191μg/l≦YKL-40<256μg/l; およびVI: YKL-40: 256μg/l ≦ YKL-40。
【０１５９】
図2 ハザード比。2.6年の追跡調査期間における、イベント(不安定狭心症、急性心筋梗塞(MI)、心血管疾患性の死、および全ての死因の死亡)までの時間についての4つのコックス分析から得られた、6つの血清YKL-40グループそれぞれについての、95% 信頼限界を伴ったハザード比(HRs)。介入指標(intervention indicator)(クラリスロマイシンまたはプラシーボ)が共変量(co-variate)として含まれた。P値: * 0.01<P<0.05; ** 0.0005≦P<0.01;および ***P<0.0005。グループI<50% パーセンタイル: YKL-40<110μg/l; II 50%≦YKL-40<60% パーセンタイル: 110μg/l≦YKL-40<129μg/l; III 60%≦YKL-40<70% パーセンタイル: 129μg/l≦YKL-40<153μg/l; IV 70%≦YKL-40<80% パーセンタイル: 153μg/l≦YKL-40 <19lμg/l; V 80%≦YKL-40<90% パーセンタイル: 191μg/l ≦YKL-40<256μg/l; およびVI≧90% パーセンタイル YKL-40: 256μg/l ≦YKL-40。
【０１６０】
図3 介入指標および危険因子を含むハザード比。
2.6年の追跡調査期間における、心筋梗塞(MI)、心血管疾患性の死、および全ての原因の死までの時間についての、多変量モデルにおける3つのコックス分析から得られた、6つの血清YKL-40グループそれぞれについての、95% 信頼限界を伴ったハザード比(HRs)。介入指標(クラリスロマイシンまたはプラシーボ)および他の危険因子(性別、急性心筋梗塞の経歴、年齢(<60; ≧60歳)、喫煙状況、高血圧、および糖尿病)が共変量として含まれた。P値: * 0.01<P<0.05; ** 0.0005≦P<0.01;および ***P<0.0005。グループI<50%パーセンタイル: YKL-40<110μg/l; II 50%≦YKL-40<60%パーセンタイル: 110μg/l≦YKL-40<129μg/l; III 60%≦YKL-40<70%パーセンタイル: 129μg/l≦YKL-40<153μg/l; IV 70%≦YKL-40<80%パーセンタイル: 153μg/l≦YKL-40<19lμg/l; V 80%≦YKL-40<90%パーセンタイル: 191μg/l≦YKL-40<256μg/l; およびVI≧90%パーセンタイル YKL-40: 256μg/l≦YKL-40。
【０１６１】
図4 カットオフ値分類による生存曲線。YKL-40値が110μg/l以上または未満である患者の、2.6年の追跡調査における不安定AP(図4A)およびMI(図4B)についての無イベント生存率。
【０１６２】
図5 分類に従った生存曲線。6つの血清YKL-40グループのそれぞれについての、2.6年間の追跡調査における、無イベント生存率。
I:<50%パーセンタイル: YKL-40<110μg/l;
II: 50%≦YKL-40<60%パーセンタイル: 110μg/l≦YKL-40<129μg/l;
III: 60%≦YKL-40<70%パーセンタイル: 129μg/l≦YKL-40<153μg/l;
IV: 70%≦YKL-40<80%パーセンタイル: 153μg/l≦YKL-40 <19lμg/l;
V: 80%≦YKL-40<90%パーセンタイル: 191μg/l≦YKL-40<256μg/l; およびVI:≧90%パーセンタイル: 256μg/l≦YKL-40。
調べられたイベントは:図5A) 不安定狭心症、図5B) MI、図5C) 心血管疾患性の死、および図5D) 全ての原因の死。
【０１６３】
図6  AおよびB  上から見たディップスティック実施態様。生体試料に使用するためのアッセイ・フィールド(2.)、および一つのコントロールもしくは標準フィールド(図6Aにおける3.)または複数のコントロールもしくは標準フィールド(図6Bにおける4a.から4e.まで)を有するディップスティック支持体素材(1.)。単一の(3.について)もしくは複数の(例えば漸増または漸減する順番で、一つのフィールドにつき一つの濃度で)YKL-40濃度をコントロールもしくは標準フィールドに適用し、図6Aに描かれたスティックで陽性(positive)/陰性(negative)の表示ができるようにしたり、または図6Bの(テスト後に試料/アッセイ・フィールドと最も似る)コントロール・フィールドの試料と比較して、生体試料中のYKL-40濃度を概測できるようにしたりすることができる。
【０１６４】
図7 死亡までの時間、心血管疾患性の死までの時間、およびMIまでの時間に対する、f(YKL-40)単独の、または、危険因子との組み合わせ及び危険因子プラス選択された治療の指標(selected indicators of treatment)との組み合わせによる、効果。血清YKL-40レベルが82μg/l未満では、いずれのイベントのHRの対数も血清YKL-40と相関を示さず、この値より上においてはYKL40の対数とHRの対数との間に直線的相関があったため、次の変換式を用いて血清YKL-40を変換した:Y = log(max(82, 血清YKL-40/μg/l))。
【実施例】
【０１６５】
YKL-40レベルと、個体の生存、心血管疾患および障害の治療の進行、ならびに前記疾患を患う個体の監視との関連を示す実施例を、以下に提供する。しかしながら、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものとみなすべきではなく、本発明の範囲は添付の請求項によって規定される。
【０１６６】
実施例において、「AP」は狭心症(angina pectoris)の略記であり、「HR」はハザード比(hazard ratio)を、「MI」は心筋梗塞(myocardial infarction)を、「AMI」は急性心筋梗塞(acute myocardial infarction)を、「min.」は分(minutes)を、「hrs」および「h」は時間(hours)を指し、測定ユニット(例えば「ml」)は標準的な略記法により示される。
【０１６７】
[実施例1]
患者
患者は、以前に論文発表された、一日一回500 mgの経口的クラリスロマイシン(Klacid Uno(登録商標)、英国アボット)または対応するプラシーボで2週間処置された安定冠動脈疾患の患者についての、無作為化され、プラシーボのコントロールを伴い、複数のセンターが関与した(multicentre)、CLARICOR治験に含まれていた(Jespersen et al., 2006)。当該患者(18歳から85歳まで)は1993年から1999年までに心筋梗塞または狭心症(ICDコード 209-219)の診断を受け、1999年8月の時点で生存していた。4373人の患者が当該調査への参加条件を満たし、1999年10月5日から2000年4月15日の間に無作為化された。以前記述されたように(Jespersen et al., 2006)、心筋梗塞、狭心症、経皮的冠動脈形成術、または冠血管バイパス手術の経験があれば、参加条件を満たすとされた。4350人の患者が血液を提供し、4298人の患者についてはYKL-40を測定するための血清が得られた。無作為化の際に、患者は、過去の心筋梗塞、狭心症、経皮的冠動脈形成術、冠血管バイパス手術、動脈性高血圧、糖尿病、喫煙、および医学的治療についての情報を電子的記録に入力した。
【０１６８】
追跡調査
追跡調査のための患者の来院は計画しなかった。死亡についての情報は、住民の生存状態について記録するデンマーク中央住民登録簿から得た。致死的(fatal)および非致死的来院についての情報は、病院へのすべての身体の受け入れ(somatic hospital admissions)のデータベースであるデンマーク国立病院登録簿から得た。これらの登録簿における登録率は100%である。これらの登録簿に基き、コーディネイト・センターが死亡証明書および病院記録の写しを収集し、追跡期間の最初の2.6年間は関連の可能性があるイベントをそれぞれ別個にイベント委員会に転送し、追跡期間の残りの6年間においては収集された全ての死亡証明書を転送した(別の文書に記載された通りである(Jespersen et al., 2006, Gluud et al., 2007))。
【０１６９】
エンドポイント
バイオマーカーについての本調査においては、無作為化の時点から再来院するまでの以下のことについて調べた: I. 死亡、心血管疾患性の死、非致死的MI、不安定狭心症、II. 非致死的MIまたは不安定狭心症、および、III. 非致死的MI、不安定狭心症、または死亡までの時間。心筋梗塞の診断をするためには、心筋酵素(クレアチンキナーゼ-アイソザイムMBまたはトロポニン)の増加、および、心電図における、心筋虚血または心筋梗塞を示す有意なSTの変化が必要条件とされた。酵素の大きな変化を伴わない、長期間続く胸痛または安静時の胸痛は、不安定狭心症として分類した。
【０１７０】
倫理
本調査は、地方倫理委員会(KF 01-076/99)、デンマーク医学庁(2612-975)、およびデンマーク・データ保護庁(199-1200-174)の認可を受け、ヘルシンキ宣言に従って行われた。参加者は文書によるインフォームド・コンセントを提出した。
【０１７１】
YKL-40分析
YKL-40の血清中濃度は、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレート・ウェル、ビオチン化されたFabモノクローナル・キャプチャー抗体、およびアルカリホスファターゼ標識ポリクローナル検出抗体を使用して、市販の2部位(two-site)サンドイッチ式酵素結合免疫吸着測定法アッセイ(ELISA) (Quidel社、カリフォルニア州サンディエゴ) (Harvey 1998)によって、繰り返しを伴って測定された。ELISAの収率(recovery)は102%である(Harvey et al.,1998、および個人的な観察)。検出限界は20μg/Lである(Harvey et al, 1998)。アッセイ内CVsは5.0% (平均YKL-40濃度40μg/L, n=40)、3.9% (平均104μg/L, n=40)および3.8% (平均155μg/L, n=40)である。アッセイ間CVsは5.3% (平均42μg/L, n=277)および6.3% (平均151μg/L, n=277(個人的な観察))である。
【０１７２】
統計学的分析
イベントまでの時間の分布は、カプラン-マイヤーの方法により計算し、ブレズロウの検定を使用して有意差について比較した。イベントまでの時間に対するの一つ以上の共変量の影響を分析するために、コックス分析を使用した。変数として、共変量、時間、および時間と共変量との相互作用を含む拡張されたコックス分析を、コックス・モデルの比例性の仮定(proportionality assumption)をテストするために使用した。後者のテストは、共変量の群のlog-log図の目視による評価により補完した。血清YKL-40の分布およびlog (YKL-40)の分布は、シャピロ・ウィルクW検定による評価ではガウス分布とは有意に異なったため、患者群間の血清YKL-40レベルの比較には、ノンパラメトリック検定(2つの群についてはマン・ホイットニー検定および2つを超える群についてはクラスカル・ウォリス検定)を使用した。当該分析はSPSSバージョン15.0を用いて行った。
【０１７３】
特定されたイベントまでの時間が、患者の血清YKL-40と有意に関係するかを調べるために、血清YKL-40分布の10のパーセンタイルをカットオフ範囲として用いて、YKL-40の血清中濃度をカテゴリー変数に変換した。10の群のカプラン-マイヤー生存曲線を、有意差に関して比較した。心血管疾患性の死に対するクラリスロマイシンの影響(19)を相殺するために、介入指標が層別化変数(stratifying variable)として含められた。もしも同じ結論が得られたならば、当該分析を介入グループ層上にプールした。YKL-40グループと平均生存時間との間の関係が単調減少関数であるかどうかを最後に評価した。
コックス・モデルの、血清YKL-40とハザード比(HR)の対数との間の直線関係の前提は、log HRと血清YKL-40パーセンタイル・グループの血清YKL-40平均値との間の関係を調べることにより評価した。第1のグループを、HRについての標準として用いた。
【０１７４】
追加の分析において、血清YKL-40値が82μg/l未満では、血清YKL-40レベルといずれのイベントのハザード率(HR) の対数との間にも相関が見出されず、この値より上では、YKL-40の対数とHRの対数との間に直線的関係が見出された;次の変換式を用いてYKL-40を変換した:Y (変換された血清YKL-40) = log(max(82, 血清YKL-40/μg/l))。全ての原因の死および心臓死のイベントについては、年齢は直線性の仮定を満たした。MIについては次の変換式を用いた:Y = max(63, 年齢/年)。
変換されたYKL-40が、あるイベントまでの時間に対して有意に影響を有していた場合、既知の危険因子(年齢、性別、過去のMI、喫煙状況、高血圧、糖尿病)について調整して分析を繰り返した。当該影響がもしそれでも有意であったならば、選択された治療の指標を分析に含めた。これらの因子は次のようにして選択された:患者の半分を含む無作為サンプルを選定し、共変量として危険因子および医学的治療の全ての指標(ベータ遮断薬、Ace阻害薬、カルシウム拮抗薬、スタチン、マグニル(magnyl)、長時間持続硝酸薬、ジゴキシン、利尿薬(diuretica)、抗不整脈(anti-arrhytmica))を含む、対応データ素材の分析を行った。当該分析は、p=0.10で変数を除去する尤度比検定を用いた変数減少法(backward elimination)を含んだが、治療指標以外の全ての共変量が分析に残るように強制した。データ素材の残りの半分を使用して当該分析を繰り返した。選択された治療指標は、これら2つの分析の両方において保持されたものである。
【０１７５】
使用された有意水準は0.05であり、全ての検定は両側検定であった。複数の検定の適用による実験ワイズ(experiment wise)第一種過誤の膨張(inflation)を補正する(account for)ためにボンフェローニ補正を使用し、22の検定が行われたため有意水準を0.05/22 =0.0023とした。当該分析はSPSSバージョン15.0を用いて行った。
【０１７６】
結果
被験者の人口統計学的および臨床的特徴と関連した血清YKL-40。
調査に含まれた安定冠動脈疾患を有する患者の人口統計学的データを図1に記す。データ入力時における平均年齢は65歳(30歳から85歳の範囲)であった。参加した4298人の患者の内、31%が女性であり、68 %が過去に急性心筋梗塞を経験していた。当該4298人の患者における血清YKL-40の中央値は110μg/l (20 から3047μg/lの範囲)であった。クラリスロマイシン処置の患者とプラシーボ処置の患者との間には血清YKL-40の差は見出されなかった。以前にMIを経験していた患者と経験していなかった患者との間では血清YKL-40に有意な差は無かった(中央値111μg/l、20から3047μg/lの範囲、に対して、106μg/l、20から2802μg/lの範囲)。
【０１７７】
有意水準1%において、第2から第5パーセンタイルの各々の間のハザード比(HR)は、いずれのイベントについても、最も低いパーセンタイルIと有意に異なわなかったため、最初の5つのパーセンタイルは一つにまとめられ、結果として6つのYKL-40グループが得られた(図1の説明を参照のこと)。YKL-40グループ内の分析では、血清YKL-40の増加は、年齢の増加(P<0.0005)、高血圧(P<0.0005)、および糖尿病(P<0.0005)と連関するが(図1)、性別、過去のMI、またはデータ入力時における喫煙状況とは連関しないことが示された。
【０１７８】
死亡全般、心血管疾患性の死、心筋梗塞(MI)、および不安定狭心症(UAP)の危険因子としての血清YKL-40
2.6年間の追跡期間において、330人の患者(7.6%)において新たな心臓性のイベントが起こり、それには115人の患者における不安定AP (2.6%)および219人におけるMI (5.0%)が含まれていた。
【０１７９】
血清YKL-40が110μg/l 未満の患者を110μg/l超の患者と比較した場合、2.6年間の追跡期間において、高い方のグループは不安定APの発症と有意に連関していなかったが、MIとは有意に連関していた(図4, P=0.002)。上記の分析の後に行われた分析においては、病院の管轄外で登録された心臓性のイベントを考慮に入れた。この再計算によると、2.6年間の追跡期間について次のような数字が得られた:合計390人(9.1%)の患者において新たな心臓性のイベントが起こり、それには120人における不安定AP (2.8%)および270人におけるMI (6.3%)が含まれ、17人の患者はUAPとMIの両方について登録された(0.4%) (図2および3)。合計187人の患者が心血管疾患性の死に見舞われ(4.3%)、全体では377人の患者が死亡した(8.7%)。
【０１８０】
コックス・モデルの比例性の仮定は満たされていた。コックス・モデルの、血清YKL-40とHRの対数との間の直線関係の前提は、いずれの分析においても満たされていなかった。YKL-40カテゴリーと介入指標を含んだコックス分析(図2および3を参照のこと)では、血清YKL-40は、2.6年間の追跡期間におけるMI (0.004)、心血管疾患性の死(p<0.0005)、および全ての原因の死(p<0.0005)を有意に予測したが、不安定APの予測とはなっていなかったことが示された。心血管の危険因子(<60に対する≧60歳、性別、過去のMI、喫煙状況、高血圧、および糖尿病)についての多変量調整は、結果を僅かに変えただけだった(図3)。
【０１８１】
全ての原因の死のHRは、血清YKL-40の増加と有意に連関して増加し、血清YKL-40が110μg/l未満の場合(グループI)と比較して、グループIIにおいては1.45、グループIIIでは1.89、グループIVでは2.37、グループVでは2.59、グループVIでは3.75であった(グループII以外の全てにおいてP<0.0005) (図2)。心血管の危険因子についての多変量調整は、HRを僅かに下げただけであった(図3)。
【０１８２】
6つの血清YKL-40グループのそれぞれについての、2.6年の追跡調査期間における不安定AP、MI、心血管疾患性の死、および全ての原因の死に関する無イベント生存率を、図5 A-Dに略述する。本調査において、時間経過に伴う不安定APの発症率は、血清YKL-40に依存していなかった(図5A)。しかしながら、MIについての場合は、グループIは明らかに他のグループから隔たりがあった。血清YKL-40の増加に伴い、MIと心血管疾患性の死の両方について、無イベント生存率の明らかな低下があった。MIについての無イベント生存率は血清YKL-40の増加に伴って低下し、MIを有する割合は、最も高い血清YKL-40(グループIIからVI)においては7.0%から9.0%の間であり、低い血清YKL-40(グループI)においては5.0%であった(図1B)。心血管疾患死亡率は、最も高い血清YKL-40(グループVI)においては8.0%であり、低い血清YKL-40(グループI)においては2.6%であった(図5C)。この連関は、全ての原因の死についてはさらに明確であった(図5D)。最も高い血清YKL-40を有する患者の18.4%が2.6年以内に死亡したのに対し、低い血清YKL-40を有する患者では5.3%であった。心血管の危険因子についての多変量調整は、MI、心血管疾患性の死、および全ての原因の死についてのHRを僅かに下げただけであった(図3)。予備的なコックス分析では、心臓死に見舞われた患者を除外した場合でも、死までの時間とYKL-40との間には依然として高度に有意な(p< 0.0005)連関があった。心臓死以外の死因の患者を除外した場合でもこれは同様であった(p<0.0005)。
【０１８３】
血清YKL-40値のカットオフ点を82μg/lとした分析においては、Y(変換された血清YKL-40)は、心血管疾患性の死(HR = 1.88、95%信頼区間(C.I.) = 1.54-2.31、p<0.001)、全ての原因の死(HR = 2.01、95% C.I. = 1.75-2.31、p<0.001)、およびMI (HR = 1.38、95% C.I. = 1.13-1.68、p = 0.002)と有意に連関したが、不安定狭心症とは連関しなかった(p=0.85) (図7)。心血管の危険因子(年齢、性別、過去のMI、喫煙状況、高血圧、糖尿病)についての多変量調整の後、Yは、全ての原因の死亡 (HR=1.67, 95% C.I. = 1.43-1.95, p<0.001)および心血管疾患死(HR= 1.51 95% C.I.= 1.20-1.89, p=0.001)の予測に有意に貢献したが、MIは予測しなかった(p=0.26)。全ての危険因子が分析中に残るように強制しながら医学的治療の予測的有意性(predictive significance)を評価した分析(統計学的分析についてのセクションを参照のこと)においては、利尿薬、ジゴキシン、およびスタチンによる処置が、死亡までの時間の分析において保持された。心血管疾患性の死までの時間の分析においては、ジゴキシンによる処置のみが保持された。心血管の危険因子および選択された医学治療指標についての多変量調整の後、Yは、全ての原因の死亡 (HR=1.62, 95% C.I. = 1.37-1.90, p<0.001)および心血管疾患死(HR= 1.52 95% C.I.= 1.20-1.92, p=0.001)の予測に有意に貢献した。
【０１８４】
結論として、血清YKL-40レベルは、安定冠動脈疾患を有する患者における全ての死、心臓死、および心筋梗塞についての、非常に強力なバイオマーカーであることが見出された。追跡調査期間中に不安定狭心症のイベントがあった人数が少なかったため、不安定狭心症とYKL-40とに関しては結果がはっきりしなかった。しかしながら、YKL-40が、例えば安定冠動脈疾患または他のあらゆる心臓疾患もしくは障害(特にアテローム性動脈硬化により引き起こされるもの)を有する個体における医学的治療の充足性を監視すること、および/または、生存についての予後、心血管疾患性の死についての予後、もしくは心筋梗塞を患う危険性についての予後に基いて個体を分類すること、に驚くべきほど適したバイオマーカーであることを、これらの結果は示している。そのような監視または分類は、本明細書に開示された方法により行うことができる:すなわち、当該個体からの生体試料中のYKL-40のレベルを測定し、その測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較することによる。この方法によれば、特に血清のYKL-40レベル(他の生体試料から得られたYKL-40レベルであってもよいが)は、冠動脈疾患または他の心臓疾患を患う個体における高い死亡率を低下させることに役立ち得る。
【０１８５】
考察
この調査は、安定CADを有する患者において、高い血清中YKL-40濃度が、MI、心血管疾患性の死、および全ての原因の死についての有意な予測因子であることを実証した。YKL-40レベルが最も高い患者においては、3倍を超えて増加したハザード比が見られた。これに加えて、高い血清YKL-40は、年齢の増加、高血圧、および糖尿病と連関していたが、性別、過去のMI、またはデータ入力時における喫煙状況とは連関していなかった。これらの変数に関して分析を補正することは、MI、心血管疾患性の死、および全ての原因の死についてのHRに対して大きなインパクトを与えなかった。
【０１８６】
炎症は、アテローム発生およびアテローム血栓性のイベントにおいて重要な役割を果たし、心筋梗塞、卒中、および心血管疾患死の発生と連関している(Jialal et al., 2003; Lindahl et al., 2000; Mueller et al., 2002; Ridker et al., 2001; Ridker et al., 2002; Albert et al., 2002)。YKL-40は、安定冠動脈疾患を有する患者における急性および慢性炎症の新規のバイオマーカーである。このことは、炎症を有する組織において局所的に、マクロファージおよび好中球によってYKL-40が産生される、という発見により支持される(Johansen et al., 2006; Volck et al., 1998; Boot et al., 1999; Johansen et al., 1999; Johansen et al., 2005; Johansen et al., 2000)。YKL-40は、タンパク質インスリン様増殖因子-1との相乗作用により、線維芽細胞および軟骨細胞に対して増殖因子として働き、腫瘍壊死因子-アルファおよびインターロイキン-1(Recklies et al., 2002; Ling et al., 2004)ならびにIL-6(個人的な観察)の異化作用を制限している。
【図１】
2011510308.tif 000003
【図２】
2011510308.tif 000004
【図３】
2011510308.tif 000005
【図４Ａ】
2011510308.tif 000006
【図４Ｂ】
2011510308.tif 000007
【図５Ａ】
2011510308.tif 000008
【図５Ｂ】
2011510308.tif 000009
【図５Ｃ】
2011510308.tif 000010
【図５Ｄ】
2011510308.tif 000011
【図６】
2011510308.tif 000012
【図７】
2011510308.tif 000013
【配列表】
2011510308000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年10月8日(2010.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患を患う個体を、生存の予後に基づいて分類するための方法であって、前記個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、および、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む方法。
【請求項２】
アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患を患う個体の健康状態を、生存の予後に関して監視するための方法であって、前記個体からの生体試料におけるYKL-40のレベルを測定すること、および、当該測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較すること、を含む方法。
【請求項３】
当該個体がアテローム硬化性冠動脈疾患を患う、請求項1又は請求項2記載の方法。
【請求項４】
当該心臓疾患が安定冠動脈疾患である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
当該YKL-40の測定レベルが、80μg/lを超えるレベルである、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
当該参照レベルが、80μg/lのカットオフ値である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
当該YKL-40の参照レベルが、複数のカットオフ値の組である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
当該複数のカットオフ値の組が、以下のカットオフ値の一つまたは複数の中から選択される、請求項7記載の方法:80μg/l、90μg/l、100μg/l、110μg/l、120μg/l、130μg/l、140μg/l、150μg/l、160μg/l、170μg/l、180μg/l、190μg/l、200μg/l、210μg/l、および220μg/l。
【請求項９】
当該生存の予後が、心筋梗塞を患う危険性の予後である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
YKL-40レベルが、別のバイオマーカーのレベルと共に測定される、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
当該別のバイオマーカーが、C反応性タンパク質(CRP)、脳性ナトリウム利尿タンパク質(BNP)、インターロイキン、腫瘍壊死因子-アルファ、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子-1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド(P-III-NP)、単球走化性タンパク質-1、フィブリンD-ダイマー、ミオシン軽鎖-1 (MLC-1)、P-セレクチン、およびCKMBから成る群から選択される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
生体試料中のYKL-40を検出するための手段、YKL-40の測定レベルをYKL-40の参照レベルと比較するための手段、および、アテローム性動脈硬化により引き起こされる心臓疾患を患う個体を、当該個体のYKL-40測定レベルが80μg/lを超える場合に、当該YKL-40測定レベルに基く生存の予後に基づいて分類及び/又は監視するやり方についての説明書、を含むキット。
【請求項１３】
YKL-40以外の追加のバイオマーカーを検出する手段をさらに含む、請求項12に記載のキット。
【請求項１４】
追加のバイオマーカーが、C反応性タンパク質、ホモシステイン、脳性ナトリウム利尿タンパク質、インターロイキン、腫瘍壊死因子-アルファ、ホモシステイン、アミロイドAタンパク質、妊娠関連血漿タンパク質A、トロポニン、可溶性細胞間接着分子-1、可溶性UPAR、III型プロコラーゲンのアミノ末端プロペプチド(P-III-NP)、単球走化性タンパク質-1、フィブリンD-ダイマー、増殖分化因子15、虚血変性アルブミン、リポタンパク質関連ホスホリパーゼA2、マトリックスメタロプロテイナーゼ、およびCKMBから成る群から選択される、請求項13に記載のキット。
【請求項１５】
生体試料中のYKL-40を検出するための手段、及び、YKL-40の測定レベルを少なくとも１つのYKL-40の参照レベルと比較するための手段が、少なくとも１つの器具に含まれている、請求項12〜14のいずれかに記載のキット。
【請求項１６】
当該器具がディップスティックである、請求項15記載のキット。
【請求項１７】
当該器具が、カットオフ値に相当する単一の参照レベルを含む、請求項15又は16に記載のキット。
【請求項１８】
当該器具が、YKL-40の測定レベルをYKL-40の複数のカットオフ値の組と比較するための手段を含む、請求項15又は16に記載のキット。
【国際調査報告】
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