(57)【要約】本発明は、新規なスピンゴモナス属バクテリア菌株ＫＭＫ−００１を液体培地で培養して、前記バクテリア菌株の培養液に液体培地で別に培養した新規なアスペルギルス属菌株ＫＭＣ−９０１を加えて混合培養するスピンゴモナスバクテリア−アスペルギルスカビの混合培養法、それから生合成された新規なグリオニトリン（Ｇｌｉｏｎｉｔｒｉｎｓ）、及び前記グリオニトリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分とする製薬組成物に関するものである。前記グリオニトリンは、癌細胞に対して強い細胞毒性効果があり、スピンゴモナス属新規バクテリア菌株ＫＭＫ−００１を含む１０種の有害菌に対する抗生効果を示すことから抗癌剤または抗生剤に有用に用いることができる。【選択図】図１
2011502532.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＫＣＣＭ１０８８８Ｐで寄託されたスピンゴモナス属バクテリア。
【請求項２】
受託番号ＫＣＣＭ１０８８９Ｐで寄託されたアスペルギルス属カビ。
【請求項３】
請求項１に記載のスピンゴモナス属バクテリア菌株を液体培養した培養液に、別に液体培養した請求項２に記載のアスペルギルス属カビ菌株または菌株を含んだ培養液を加えて培養する工程を含む菌複合体の混合培養方法。
【請求項４】
スピンゴモナス属バクテリア菌株及びアスペルギルス属カビ菌株を１０００：１．０〜１０００：０．１の割合で混合することを特徴とする請求項３に記載の混合培養方法。
【請求項５】
請求項３に記載の混合培養方法で培養された菌複合体の培養液。
【請求項６】
請求項３に記載の混合培養方法で培養された菌複合体の培養液から分離される下記化学式１または化学式２で表わされる化合物：
【化１】
2011502532.tif 000012
ｎは、イオウの個数を示し、１〜４であり、
【化２】
2011502532.tif 000013
Ｘは水素、またはＣ１〜Ｃ５アルキル基であり、互いに同じかまたは異なり、すべての非対称炭素での異性体を含む。
【請求項７】
下記化学式３または化学式４で表わされることを特徴とする請求項６に記載の化合物：
【化３】
2011502532.tif 000014
【化４】
2011502532.tif 000015
【請求項８】
ｎが、３または４であることを特徴とする請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
請求項５に記載の培養液、または請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物を含む抗癌剤。
【請求項１０】
癌が、胃癌、肝癌、大腸癌、肺癌または前立腺癌であることを特徴とする請求項９に記載の抗癌剤。
【請求項１１】
請求項５に記載の培養液、または請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物を含む抗菌剤。
【請求項１２】
請求項１に記載のスピンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）バクテリア、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サルモネラ・ティフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、アスペルギルス−フミガーツフまたはＴ．ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）菌株に対する抗菌効果を示すことを特徴とする請求項１１に記載の抗菌剤。
【請求項１３】
１）請求項１に記載のスピンゴモナス属バクテリア菌株を液体培養した培養液に請求項２に記載のアスペルギルス属カビ菌株または菌株を含んだ培養液を加えて培養する工程を含む菌複合体の混合培養方法によって得た培養液に、有機溶媒または吸着樹脂を加えて抽出する工程；
２）工程１）の抽出物を減圧乾燥後、カラムクロマトグラフィーを用いて分画物を得る工程；及び
３）工程２）の分画物をカラムクロマトグラフィーを通じて請求項６に記載のグリオニトリンを精製する方法。
【請求項１４】
請求項５に記載の培養液または請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物の抗癌剤の製造における使用。
【請求項１５】
請求項５に記載の培養液または請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物を有効成分として含む癌予防用及び健康改善用の健康食品。
【請求項１６】
請求項５に記載の培養液または請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物を有効成分として含む癌予防用及び健康改善用の健康食品。
【請求項１７】
請求項５に記載の培養液または請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物を有効成分として含む菌性疾患予防用及び健康改善用の健康食品。
【請求項１８】
請求項５に記載の培養液または請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物の治療的有効量を個体に投与する工程を含む癌の予防及び治療の方法。
【請求項１９】
請求項５に記載の培養液または請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物の治療的有効量を個体に投与する工程を含む菌性疾患の予防及び治療の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なスピンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）バクテリア菌株ＫＭＫ−００１を液体培地で培養して、前記バクテリア菌株の培養液に、液体培地で別に培養した新規なアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）菌株ＫＭＣ−９０１を加えて混合培養するスピンゴモナスバクテリア−アスペルギルスカビの混合培養法、それから生合成された新規なグリオニトリン、及び前記グリオニトリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む製薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物から新物質を獲得するために多くの研究が進行されてきているが、基地物質の反覆的な分離による時間と費用、労働力の浪費は、天然物から生理活性を有する新物質開発技術の効率性増進に大きな阻害要因として作用している。新薬開発において非常に重要な要素のひとつである新物質の獲得において、大きく効率性を高めることができると期待される「混合培養法を用いた新物質開発技術」は、最近アメリカのスクリップス海洋研究所において現代科学技術で新しく見直されてペスタロン（ｐｅｓｔａｌｏｎｅ）（Ｍｅｒｃｅｄｅｓ  Ｃｕｅｔｏ等．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２００１年，第６４巻，ｐ．１４４４−１４４６）、リバテレノン（ｌｉｂｅｒｔｅｌｌｅｎｏｎｅ）（Ｏｈ，Ｄ．−Ｃ．等．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５年，第１３巻，ｐ．５２６７−５２７３）、エメリセラミド（ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａｍｉｄｅ）（Ｏｈ，Ｄ，−Ｃ．等．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．２００７年，第７０巻，ｐ．５１５−５２０）などの新物質を開発するのに成功した。これらペスタロン、リバテレノン及びエメリセラミド等は、試験管内で強力な抗癌及び抗菌活性を示すので新しい抗癌及び抗生剤開発に対する可能性を提示している。アメリカスクリップス海洋研究所で開発された混合培養法は、カビの培養液に少量のバクテリア培養液を加えて混合培養する技術であり、本発明で提示するバクテリア培養液に少量のカビ培養液を加える混合培養技術とは大きな差が見られる。
それで、本発明者等は、初めてスピンゴモナスバクテリアとアスペルギルスカビの混合培養法を開発し、それから産生した新規な化合物であるグリオニトリンが、強力な抗癌及び抗生効果があることを明らかにして本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、新規なスピンゴモナスソックバクテリア、新規なアスペルギルスカビ、前記スピンゴモナスソックバクテリアとアスペルギルスカビの混合培養法、それから産生した新規な化合物グリオニトリン、及び前記グリオニトリンまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む抗癌剤または抗菌剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記目的を達成するために、本発明は、受託番号ＫＣＣＭ１０８８８Ｐで寄託されたスピンゴモナス属バクテリアを提供する。
また、本発明は、受託番号ＫＣＣＭ１０８８９Ｐで寄託されたアスペルギルス属カビを提供する。
また、本発明は、前記スピンゴモナス属バクテリアを液体培養した培養液に別に液体培養した前記のアスペルギルス属カビ菌株または菌株を含んだ培養液を加えて培養する工程を含む菌複合体の混合培養方法を提供する。
また、本発明は、前記混合培養方法で培養された菌複合体の培養液を提供する。
また、本発明は、前記混合培養方法で培養された菌複合体の培養液から分離される下記化学式１または化学式２で表わされる化合物を提供する。
【０００５】
【化１】
2011502532.tif 000003
【０００６】
ｎは、イオウの個数であり１〜４で；及び
【０００７】
【化２】
2011502532.tif 000004
【０００８】
Ｘは、水素またはアルキル基であり、互いに同じかまたは異なり、すべての非対称炭素での異性体を含む。
また、本発明は、前記混合培養方法で培養された菌複合体の培養液または前記化合物を含む抗癌剤を提供する。
また、本発明は、前記混合培養方法で培養された菌複合体の培養液または前記化合物を含む抗菌剤を提供する。
また、本発明は、前記培養液及びそれから抽出した化合物の抗癌剤の製造における使用を提供する。
また、本発明は、前記培養液及びそれから抽出した化合物の抗菌剤の製造における使用を提供する。
また、本発明は、前記培養液及びそれから抽出した化合物を含む癌予防用及び健康改善用の健康食品を提供する。
また、本発明は、前記培養液及びそれから抽出した化合物を含む菌感染予防用及び健康改善用の健康食品を提供する。
また、本発明は、前記培養液及びそれから抽出した化合物の治療的有効量を個体に投与する工程を含む癌治療方法を提供する。
同時に、本発明は、前記培養液及びそれから抽出した化合物の治療的有効量を個体に投与する工程を含む菌感染治療方法を提供する。
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、受託番号ＫＣＣＭ１０８８８Ｐで寄託されたスピンゴモナス属バクテリア菌株ＫＭＫ−００１を提供する。
本発明者等は、インコク鉱山内部で酸性度（ｐＨ）３．０の水を採取後、遠心分離して沈殿物を得た。前記沈殿物を生理食塩水に懸濁して希釈した後、培地に接種後、培養しながら単一菌株を分離及び選別して液体培地に接種した後、再び培養した。確保された菌株種の分析は、染色体ＤＮＡを分離して下記のような１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を分析して決定し、その結果、菌株ＫＭＫ−００１は、スピンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ａ１ＸＸｙｌ１−５）と９８．０％の相同性を示すことを確認して、前記ＫＭＫ−００１がスピンゴモナス属に属する新規種であることが分かった。ＫＭＫ−００１は、ツァベックドックス培地で黄色粘液性コロニーを形成して、生長のために硝酸塩と硫酸塩を必須的に要求することを確認して、グラム陰性カン菌であることが分かった（図１及び図２参照）。前記菌株ＫＭＫ−００１は、韓国微生物保存センターに２００７年１１月７日付けで寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ１０８８８Ｐ）。
本発明の新規な菌株ＫＭＫ−００１の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を下記に示す：
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG AACGAACGCT GGCGGCATGC CTAATACATG CAAGTCGAAC GATCACTTCG GTGGTAGTGG CGCACGGGTG CGTAACGCGT GGGAATCTGC CCTTGGGTTC GGAATAACAG TTGGAAACGA CTGCTAATAC CGGATGATGA CGTAAGTCCA AAGATTTATC GCCCAAGGAT GAGCCCGCGT AGGATTAGCT AGTTGGTGAG GTAAAGGCTC ACCAAGGCAA CGATCCTTAG CTGGTCTGAG AGGATGATCA GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTA GGGAATATTG GACAATGGGG GCAACCCTGA TCCAGCAATG CCGCGTGAGT GATGAAGGCC TTAGGGTTGT AAAGCTCTTT TACCCGAGAT GATAATGACA GTATCGGGAG AATAAGCTCC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGGAGGGAG CTAGCGTTGT TCGGAATTAC TGGGCGTAAA GCGCACGTAG GCGGCGATTT AAGTCAGAGG TGAAAGCCCG GGGCTCAACC CCGGAACTGC CTTTGAGACT GGATTGCTAG AATCTTGGAG AGGCGGGTGG AATTCCGAGT GTAGAGGTGA AATTCGTAGA TATTCGGAAG AACACCAGTG GCGAAGGCGG CCCGCTGGAC AAGTATTGAC GCTGAGGTGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGATA ACTAGCTGCC GGGGCACATG GTGTTTCGGT AGCGCAGCTA ACGCATTAAG TTATCCGCCT GGGGAGTACG GTCGCAAGAT TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCTGC ACAAGCGGTG GAGCATGTGG TTTAATTCGA AGCAACGCGC AGAACCTTAC CAACGTTTGA CATCCCTATC GCGGATCGTG GAGACACTTT CCTTCAGTTC GGCTGGATAG GTGACAGGTG CTGCATGGCT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCA ACCCTCGCCT TTAGTTGCCA GCATTTAGTT GGGTACTCTA AAGGAACCGC CGGTGATAAG CCGGAGGAAG GTGGGGATGA CGTCAAGTCC TCATGGCCCT TACGCGTTGG GCTACACACG TGCTACAATG GCGACTACAG TGGGCAGCCA CTCCGCGAGG AGGAGCTAAT CTCCAAAAGT CGTCTCAGTT CGGATTGTTC TCTGCAACTC AAGAGCATGA AGGCGGAATC GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC CCAGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ATGGGAGTTG GATTCACCTG AAGGCGCTGC GCTAACTCGC AAGAGAGGCA GGCGACCACG GTGGGTTTAG CGACTGGGGT GAAGTCGTAA CAAGGTAGCC GTAGGGGAAC CTGCGGCTGG ATCACCTCCT T（配列番号１）
また、本発明は、受託番号ＫＣＣＭ１０８８９Ｐで寄託されたアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）カビ菌株ＫＭＣ−９０１を提供する。前記菌株ＫＭＣ−９０１は、韓国微生物保存センターに２００７年１１月７日付けで寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ１０８８９Ｐ）。
前記菌株ＫＭＣ−９０１の菌集落は、初期には白色の羊毛模様を帯びながら時間が経つにつれて中央部分の青緑領域が濃くなりながら広くなり、再び灰色の中央部分が形成されて、アスペルギルス−フミガーツフ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）カビの菌集落と同一な形態を帯びている（図３参照）（チョン・ガジン、微生物図鑑、第３巻：ｐ．１９２−１９４、２００７年）。ＫＭＣ−９０１の菌糸体は隔壁を有していて、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属カビの特徴的な分生子頭を示した（図４参照）（チョン・ガジン、微生物図鑑、２００７年，第３巻，ｐ．１９２−１９４）。また、ＫＭＣ−９０１をツァベックドックス培地で液体培養して産生される二次代謝産物を高速液体クロマトグラフィー質量分析機（ＨＰＬＣ−ＭＳ）及び核磁気共鳴分光器（ＮＭＲ）を用いて分析した結果、アスペルギルス−フミガーツフの特徴的な成分であるグリオトキシンＡ（Ｇｌｉｏｔｏｘｉｎ）及びシューロチンＡ（Ｐｓｅｕｒｏｔｉｎ  Ａ）の存在が確認された（Ｉｇａｒａｓｈ，Ｙ．等．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，２００４年，第５７巻，ｐ．７４８−７５４）。前記形態学的及び化学的特徴を通じて菌株ＫＭＣ−９０１は、アスペルギルス−フミガーツフに属するカビであると決定し、アスペルギルス−フミガーツフＫＭＣ−９０１と名付けた。
また、本発明は、前記スピンゴモナス属新規バクテリア菌株を液体培養した培養液に別に液体培養されたアスペルギルス属カビ菌株または菌株を含んだ培養液を加えて培養する工程を含む菌複合体の混合培養方法を提供する。
前記混合培養方法は、スピンゴモナス属新規なバクテリア菌株及びアスペルギルス属カビ菌株を１０００：１．０〜１０００：０．１の割合で混合することが好ましく、１０  ００：０．５の割合で混合することがさらに好ましいが、これに限定されない。
本発明者等は、新規バクテリア菌株ＫＭＫ−００１とカビ菌株ＫＭＣ−９０１は、それぞれ液体培地に接種した後、培養した。スピンゴモナス属菌株ＫＭＫ−００１の培養液１リットルにカビ菌株ＫＭＣ−９０１を含んだ培養液５００マイクロリットルを加えて混合培養し、高速液体クロマトグラフィーを用いて混合培養液を分析して新しい化合物の産生有無を確認した。バクテリア菌株ＫＭＫ−００１及びカビ菌株ＫＭＣ−９０１をそれぞれ１５日間単一培養した培養液の分析の結果、グリオニトリン等は全く存在しなかったが、ＫＭＫ−００１とＫＭＣ−９０１を１５日間混合培養した培養液は、保持時間１８．０７２分のピークでグリオニトリンＡを、１８．７６７分のピークでグリオニトリンＢを示した。ＫＭＫ−００１とＫＭＣ−９０１の混合培養２日目から隔日で混合培養液を分析した結果、グリオニトリン等は混合培養８日目から産生され始めた。
また、本発明は、前記混合培養方法で培養された菌複合体の培養液を提供する。
また、本発明は、前記混合培養方法で培養された菌複合体の培養液から分離される下記の化学式１または化学式２で表わされる化合物を提供する。
前記化合物は、新規な化合物として本発明者によってグリオニトリン（Ｇｌｉｏｎｉｔｒｉｎｓ）と命名された。
【０００９】
【化３】
2011502532.tif 000005
【００１０】
ｎは、イオウの個数を示し、１〜４である。
【００１１】
【化４】
2011502532.tif 000006
【００１２】
Ｘは、水素、またはＣ１〜Ｃ５アルキル基であり、互いに同じかまたは異なり、すべての非対称炭素での異性体を含む。
本発明の前記グリオニトリン化合物は、下記の工程を含む方法によって製造される。
１）スピンゴモナス属菌株ＫＭＫ−００１の培養液１リットルに５００マイクロリットルのカビ菌株ＫＭＣ−９０１を含んだ培養液を加えて混合培養した後、培養液に有機溶媒または吸着樹脂を加えて抽出する工程；
２）工程１）の抽出物を減圧乾燥した後、カラムクロマトグラフィーを用いて分画物を得る工程；及び
３）工程２）の分画物からさらにカラムクロマトグラフィーを用いて化合物を分離精製する工程。
前記製造方法において、工程１）の混合培養は、１０日〜２０日間培養することが好ましく、１２日〜１８日間培養することがさらに好ましいが、これに限定されない。前記有機溶媒は、酢酸エチル、ブタノール、塩化メチレンまたはクロロホルムを使用することが好ましいが、これに限定されない。前記抽出は、超臨界抽出、高圧抽出または超音波抽出法などの抽出装置を用いた方法、または、ＸＡＤ及びＨＰ−２０を含んだ吸着樹脂を用いる方法に代替可能であるが、これに限定されない。抽出時、溶媒を混合培養液分量の１ないし３倍添加して抽出することが好ましく、２倍添加して抽出することがさらに好ましい。常温で抽出することが好ましいが、これに限定するものではない。併せて、抽出回数は、１〜５回が好ましく、３回反覆抽出することがさらに好ましいが、これに限定されるものではない。
前記製造方法において、工程２）の減圧乾燥は、回転真空濃縮機（Ｒｏｔａｒｙ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を使用することが好ましいが、これに限定されない。前記減圧乾燥時の温度は、２０〜４０℃が好ましく、３０℃がさらに好ましいがこれに限定されない。
前記製造方法において、工程２）または工程３）のカラムクロマトグラフィーは、シリカゲル、セパデックス、ＲＰ−１８、ポリアミド、トヨパール（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）及びＸＡＤ樹脂からなる群から選択された充填剤を用いたカラムを用いたカラムクロマトグラフィーを遂行して活性化合物を分離及び精製することができる。カラムクロマトグラフィーは、必要に応じて適切な充填剤を選択して数回実施することができ、溶媒にクロロホルム（ＣＨＣｌ３）−メタノール、エチルアセテート−メタノール、ジクロロメタン−メタノール、メタノール−水またはアセトニトリル−水を用いることができるが、これに限定されない。
本発明者等は、前記酢酸エチル抽出液を減圧乾燥して得た抽出物を逆相カラムクロマトグラフィーを用いて六個の分画に分けた。溶離条件は、水とアセトニトリルを使用し、２０％アセトニトリル／水で始めて、２０％ずつアセトニトリルの含量を増加させ、１００％メタノールを最終流出溶媒に使用した。これから得られた分画物を高速液体クロマトグラフィー法を用いて主成分を分析した結果、６０％アセトニトリル／水分画物から新規なグリオニトリンを確認した。前記分画物にさらに酢酸エチル及び塩化メチレンを溶媒に使用して９０％塩化メチレン／酢酸エチル及び６０％塩化メチレン／酢酸エチルのアイソクラティック溶媒溶離条件で順相液体クロマトグラフィー法を通じて精製した。保持時間１０分に下記化学式３で表わされるグリオニトリンＡと保持時間１５分に化学式４で表わされるグリオニトリンＢをそれぞれ得た。
【００１３】
【化５】
2011502532.tif 000007
【００１４】
【化６】
2011502532.tif 000008
【００１５】
前記分離した化合物は、ＭＳ及び核分光器を用いて分析して化学構造を解明し、グリオニトリンＡは、分子量３５３であり、分子式がＣ１３Ｈ１１Ｎ３Ｏ５Ｓ２の無定形薄黄色粉末状で、グリオニトリンＢは、分子量３８３であり、分子式がＣ１５Ｈ１７Ｎ３Ｏ５Ｓ２の無色の粘液性半固型物質であることを確認した。また、前記グリオニトリンＡを水、アセトニトリル水溶液、メタノール水溶液またはＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）溶液に室温で放置した時、三硫化物（グリオニトリンＣ）及び四硫化物（グリオニトリンＤ）が生成され、これらの化学構造を解明した。
また、本発明は、前記混合培養方法で培養された菌複合体の培養液またはグリオニトリンを含む抗癌剤を提供する。
前記癌は、胃癌、肝癌、大腸癌、肺癌または前立腺癌であることを特徴とする。
前記グリオニトリンの癌細胞毒性は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，米国）から分譲受けたＡＧＳ（胃癌、ＡＴＣＣ細胞コード−ＣＲＬ−１７３９ＴＭ）、ＨｅｐＧ２（肝臓癌、ＨＢ−８０６５ＴＭ）、ＨＣＴ１１６（大腸癌、ＣＣＬ−２４７ＴＭ）、Ａ５４９（肺癌、ＣＣＬ−１８５ＴＭ）及びＤＵ１４５（前立腺癌、ＨＴＢ−８１ＴＭ）癌細胞株を使用して評価した。
本発明者等は、グリオニトリンの癌細胞に対する細胞毒性効果を調べるため、試験管内でＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）分析法を用いて生きている癌細胞量を測定する方法を行なった。前記の結果、グリオニトリンは、胃癌（ＡＧＳ）、肝癌（ＨｅｐＧ２）、大腸癌（ＨＣＴ−１１６）、肺癌（Ａ５４９）及び前立腺癌（ＤＵ−１４５）に強力な抗癌効果があることを確認した。したがって、本発明の前記菌複合体の培養液またはグリオニトリンは、抗癌剤に用いられることが分かる。
また、本発明は、前記混合培養方法で培養された菌複合体の培養液またはグリオニトリンを含む抗菌剤を提供する。
前記抗菌剤は、スピンゴモナス属バクテリア菌株に対する抗菌効果があることを特徴とする。
本発明者等は、グリオニトリンの抗菌効果を調べるため、ディスク拡散実験を通じてグリオニトリンのバクテリア菌株に対する抗菌効果を確認した。前記菌株を塗抹した寒天培地に試験群であるグリオニトリンと陽性対照群であるアンピシリンをそれぞれ吸収させたディスクを培養した後、観察した。前記結果、グリオニトリンを吸収させたディスクでバクテリアは、黄色を帯びてグリオニトリンによってバクテリアが生長することができない領域がディスク周辺の無色円形で現われ、対照群で使用したアンピシリンと類似の抗菌効果を示すことを確認した。
本発明者等は、グリオニトリンＡとＢの抗菌効果を調べるため、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，米国）から分譲を受けたマイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｅｕｔｅｕｓ）ＩＦＣ  １２７０８、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６６３３、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＡＴＣＣ３８５１、サルモネラ・ティフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１  ４０２８及び３種のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）であるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  ４３３００、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ７００７８７及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ７００７８８に対して評価した。前記の結果、グリオニトリンＢはすべての試験群で抗菌作用がない一方、グリオニトリンＡは４種の非耐性菌で陽性対照群に使用したアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）と類似の強力な抗菌作用を示した。特に、グリオニトリンＡは、３種のＭＲＳＡ菌には、陽性対照群に使用したアンピシリン（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）の抗菌作用より１５倍以上の強力なメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対する抗菌作用を示した。また、アスペルギルス−フミガーツフ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＨＩＣ６０９４とＴ．ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）ＩＦＯ９１８５に対するグリオニトリンＡとＢの抗真菌作用を評価した結果、前記抗菌作用と類似にグリオニトリンＢは抗真菌効果がない一方、グリオニトリンＡは抗真菌効果を示した。
したがって、本発明の前記菌複合体の培養液またはグリオニトリンは、抗菌剤に用いられることが分かる（表３及び図６参照）。
本発明の抗癌剤または抗菌剤は、化学式１または化学式２で表わされる化合物に薬学的に許容可能な塩を含むことができる。前記薬学的に許容可能な塩は、遊離酸によって形成された付加塩が有用である。相応しい遊離酸としては、有機酸と無機酸を使用することができ、無機酸としては、塩酸、臭素酸、硫酸及びリン酸などを使用することができ、有機酸では、クエン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、ギ酸、プロピオン酸、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、ベンゾ酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、グリコール酸、コハク酸、４−トルエンスルホン酸、ガラクツロン酸、エンボン酸、グルタミン酸またはアスパラギン酸などを使用することができる。さらに、薬学的に許容可能な塩だけではなく、通常の方法によって調剤され得るすべての塩、水和物及び溶媒化物をすべて含むことができる。
本発明の抗癌剤または抗菌剤は、化学式１または化学式２で表わされる化合物の中で一つ以上を選択的に含むことができ、前記成分に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。
本発明の抗癌剤または抗菌剤は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能で一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。すなわち、本発明の抗癌剤または抗菌剤は、実際の臨床投与時に経口及び非経口のさまざまな剤形で投与することができ、製剤化する場合には、普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤及び界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤できる。経口投与のための固形製剤では、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤及びカプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、本発明の製薬組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース及びゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウム、スチレート、タルクのような滑剤なども使用できる。経口投与のための液状製剤では、懸濁剤、内用液剤、乳剤及びシロップ剤などが該当し、よく使用される単純希釈剤の水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、芳香剤及び保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤では、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐薬が含まれる。非水性溶剤と懸濁溶剤では、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐薬の基剤では、ハードファット、マクロゴ−ル、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール及びゼラチンなどを使用することができる。本発明の抗癌剤または抗菌剤は、非経口投与時に、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射を用いることができる。
本発明の抗癌剤または抗菌剤の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択され得る  
また、本発明は、前記培養液及びそれから抽出した化合物の抗癌剤及び抗菌剤の製造における使用を提供する。
本発明の混合培養方法で培養された菌複合体の培養液またはグリオニトリンは、抗癌剤及び抗菌剤の製造に有用に用いることができる。前記抗癌剤及び抗菌剤は、薬学的に許容可能な塩だけではなく、通常の方法によって製造され得るすべての塩、水和物及び溶媒化物をすべて含むことができる。このような製薬組成物製造に、本発明の前記培養液及びそれから抽出した化合物は、薬理効果を付与する核心組成物として使用される。前述のように、グリオニトリンは、抗癌及び抗菌効果があるので、これを用いて製造した化合物は、抗癌及び抗菌効果を有することを予測することは、当業者に自明である。
また、本発明は、前記培養液及びそれから抽出した化合物を含む癌または菌感染の予防用及び健康改善用の健康食品を提供する。
本発明の混合培養方法で培養された菌複合体の培養液またはグリオニトリンを食品添加物に使用する場合、前記混合培養方法で培養された菌複合体の培養液またはグリオニトリンをそのまま添加するか他の食品または食品成分とともに使用することができ、一般的方法によって適切に使用することができる。一般的に、食品または飲料の製造時に本発明の組成物は、原料に対して０．１〜１５重量部、０．１〜１０重量部の量で添加することが好ましい。しかし、健康及び衛生を目的にしたりまたは健康調節を目的にしたりする長期摂取の場合には、前記の量は、上記の範囲以下であり得、安全性の面で何らの問題がないので、有効成分は前記範囲以上の量でも使用することができる。
下記の食品種類には、特別な制限はない。本発明の混合培養方法で培養された菌複合体の培養液またはグリオニトリンを添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがあり、一般的意味での健康食品をすべて含む。
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のような単糖類、マルトース、スクロースのような二糖類、及びデキストリン、シクロデキストリンのような多糖体、キリシトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。甘味料は、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる、前記天然炭水化物の割合は、本発明の混合培養方法で培養された菌複合体の培養液またはグリオニトリンが、１００ｍｌ当たり一般的に０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。
前記外に混合培養方法で培養された菌複合体の培養液またはグリオニトリンは、様々な営養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。その他に、本発明の混合培養方法で培養された菌複合体の培養液またはグリオニトリンは、天然フルーツジュース、フルーツジュース飲料及び野菜飲料製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立的にまたは組み合わせて使用することができる。このような添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明の混合培養方法で培養された菌複合体の培養液またはグリオニトリン１００重量部当り０．０１〜１重量部の範囲で選択することが一般的である。
同時に、本発明は、前記培養液及びそれから抽出した化合物の治療的有効量を個体に投与する工程を含む抗癌または抗菌治療方法を提供する。
前記対象は、ヒトまたはヒトを除いた哺乳動物であることが好ましく、前記哺乳動物は、マウス、ラット、ギニーピッグ、ブタ、ウサギ、サル及びチンパンジーからなる群から選択することが好ましいが、これに限定されるものではない。
前記投与方法では、経口投与するか非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）でき、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である。投薬単位は、例えば、個別投薬量の１、２、３または４倍で、または１／２、１／３または１／４倍を含むことができる。個別投薬量は、有効薬物が１回に投与される量を含むことが好ましく、これは通常１日投与量の全部、１／２、１／３または１／４倍に該当する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の新規なスピンゴモナス属バクテリア−アスペルギルスカビ混合培養法は、新物質を獲得するための非常に有用な技術として期待され、前記混合培養法を通じて産生された新規な化合物であるグリオニトリンは、癌細胞に対する強い細胞毒性効果を示し、菌株ＫＭＫ−００１を含む１０種の有害菌株に対する抗菌作用を示すことから、抗癌剤または抗生剤開発のための候補物質として有用に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】新規なスピンゴモナス属バクテリア菌株のＣＤＡ培地での形態を示す写真。
【図２】前記菌株のグラム染色された形態を示す顕微鏡写真。
【図３】アスペルギルス−フミガーツフカビ菌株のＫＭＣ−９０１ＣＤＡ培地での形態を示す写真。
【図４】前記菌株の隔壁を有する菌糸体及び分生子柄の端の子嚢を示した顕微鏡写真。
【図５】バクテリア菌株ＫＭＫ−００１とカビ菌株ＫＭＣ−９０１の混合培養液の菌株をグラム染色した形態を示す顕微鏡写真。
【図６】グリオニトリンの前記菌株に対する抗菌作用を示す写真：   左側は、アンピシリンを吸収させたディスク；及び   右側はグリオニトリンを吸収させたディスク。
【図７】バクテリア菌株ＫＭＫ−００１を１５日間単一培養した培養液の分析クロマトグラムを示す写真。
【図８】カビ菌株ＫＭＣ−９０１を１５日間単一培養した培養液の分析クロマトグラムを示す写真。
【図９】ＫＭＫ−００１及びＫＭＣ−９０１を１５日間混合培養した培養液の分析クロマトグラムを示す写真。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明を下記実施例及び製剤例によって詳しく説明する。
但し、下記実施例及び製剤例は、本発明を具体的に例示するものであり、本発明の内容が下記の実施例及び製剤例に限定されるのではない。
＜実施例１＞混合培養に適用されるバクテリア及びカビ菌株探索及び選別
本発明者等は、江原道江陵市林谷面林谷鉱山内部で酸性度（ｐＨ）３．０の水を採取した後、遠心分離して沈殿物を得た。前記沈殿物を生理食塩水に懸濁して希釈した後、ＹＭ寒天培地（ＹＭＡ）とツァベックドックス寒天培地（ＣＤＡ）に接種した後、２５℃で１０日間培養しながら単一菌株を分離して３００余個の菌株を確保した。この中から混合培養に使用する細菌とカビ菌株をそれぞれ選択してツァベックドックス液体培地に接種した後、２５℃振蕩培養器で５〜７日間培養した。確保された菌株種の分析は、染色体ＤＮＡを分離して１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を分析して決定し、その結果、菌株ＫＭＫ−００１は、スピンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ａ１ＸＸｙｌ１−５）と９８．０％の相同性を示した。これは、ＫＭＫ−００１が、スピンゴモナス属に属する新規種であることが分かる。ＫＭＫ−００１は、ツァベックドックス培地（ＤＩ  ｗａｔｅｒ  １Ｌ内、サッカロース３０ｇ、硝酸ナトリウム３ｇ、リン酸二カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、塩化カリウム０．５ｇ、硫酸鉄０．０１ｇ）で黄色粘液性コロニーを形成して、生長のために硝酸塩と硫酸塩を必要とするグラム陰性カン菌であることを確認した（図１及び図２参照）。前記菌株ＫＭＫ−００１は、韓国微生物保存センターに、２００７年１１月７日付けで寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ１０８８８Ｐ）。
また、本発明者等は、江原道太白市チャンソン炭鉱垂直抗道１５０メートル地下に留まった水と石炭の懸濁液を採取した後、遠心分離沈殿物を得た。前記沈殿物を滅菌精製水に懸濁して希釈した後、ツァベックドックス寒天培地（ＣＤＡ）に接種した後、２５℃で１４日間培養しながら単一カビ菌株を分離してカビ菌株ＫＭＣ−９０１を確保した。単一菌株に分離されたＫＭＣ−９０１を再びツァベックドックス寒天培地（ＣＤＡ）で培養して生長形態及び色を観察し、菌糸体、菌糸の隔壁、分生子柄及び子嚢を観察して種を同定した。また、菌株ＫＭＣ−９０１が産生する成分の化学的分析の結果を種同定のための資料に使用した。菌株ＫＭＣ−９０１の菌集落は、初期には白色の羊毛模様を帯びながら時間が経つほど中央部分の青緑領域が濃くなりながら広まって、再び灰色の中央部分が形成されて、アスペルギルス−フミガーツフカビの菌集落と同一な形態を帯びた（図３参照）。ＫＭＣ−９０１の菌糸体は、隔壁を有していて、アスペルギルス属カビの特徴的な分生子頭を示した（図４参照）。また、ＫＭＣ−９０１をツァベックドックス培地で液体培養して産生される二次代謝産物を高速液体クロマトグラフィー質量分析機（ＨＰＬＣ−ＭＳ）及び核磁気共鳴分光器（ＮＭＲ）を用いて分析した結果、アスペルギルス−フミガーツフの特徴的な成分であるグリオトキシンＡ（Ｇｌｉｏｔｏｘｉｎ）及びシューロチンＡ（Ｐｓｅｕｒｏｔｉｎ  Ａ）の存在が確認された。したがって、前記形態学的及び化学的特徴を通じて菌株ＫＭＣ−９０１は、アスペルギルス−フミガーツフに属するカビであると決定し、アスペルギルス−フミガーツフＫＭＣ−９０１と名付けた。前記菌株ＫＭＣ−００９は、それぞれ韓国微生物保存センターに、２００７年１１月７日付けで寄託した（受託番号：ＫＣＣＭ１０８８９Ｐ）。
＜実施例２＞スピンゴモナス属新規菌株ＫＭＫ−００１とアスペルギルス属菌株ＫＭＣ−９０１の混合培養
本発明者等は、新規バクテリア菌株ＫＭＫ−００１とカビ菌株ＫＭＣ−９０１をそれぞれツァベックドックス液体培地に接種した後、２５℃振蕩培養器で３日間培養した。二つの菌株は、大量培養のために１リットル三角フラスコの０．５リットルのツァベックドックス液体培地で培養し、２日経過後、スピンゴモナス属菌株ＫＭＫ−００１の培養液にカビ菌株ＫＭＣ−９０１を２５０マイクロリットル加えた後、混合培養した。菌株を含んだ混合培養液を顕微鏡で観察して、図５のようにカビの菌糸体周辺に小さなバクテリア菌株が一緒に存在することを持続的に確認した（図５参照）。
また、持続的に高速液体クロマトグラフィー法を用いて混合培養液から新しい化合物の産生有無を分析した。分析条件［器機：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＬＣ／ＭＳ  ｓｙｓｔｅｍ；溶出速度：０．７ｍｌ／分；溶出液：１０％アセトニトリル／水から１００％アセトニトリルまで３０分間アセトニトリルの組成を増加させる；カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  ５ｕ  Ｃ１８（２）４．６×１５０分；検出機：ＤＡＤ紫外線検出機（２５４ｎｍ）］の高速液体クロマトグラフィーの分析結果、図７ないし図９にみられるように、バクテリア菌株ＫＭＫ−００１及びカビ菌株ＫＭＣ−９０１をそれぞれ１５日間単一培養した培養液ではグリオニトリン等は全く存在しなかったが、ＫＭＫ−００１及びＫＭＣ−９０１を１５日間混合培養した培養液では、保持時間１８．０７２分のピークであるグリオニトリンＡと１８．７６７分のピークであるグリオニトリンＢを示した。ＫＭＫ−００１及びＫＭＣ−９０１の混合培養日２日目から隔日で混合培養液を分析した結果、グリオニトリン等は、混合培養８日目から産生され始めた。
＜実施例３＞グリオニトリンの分離精製方法
本発明者等は、前記＜実施例２＞で獲得した培養液を酢酸エチルを用いて培養液から有機化合物等を抽出した。抽出液を回転真空濃縮機（Ｒｏｔａｒｙ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）を使用して３０℃で減圧乾燥して得た抽出物を逆相カラムクロマトグラフィーを用いて六個の分画に分けた。溶離条件は、水とアセトニトリルを使用し、２０％アセトニトリル／水から始めて２０％ずつアセトニトリルの含量を増加させ、１００％メタノールを最終流出溶媒に使用した。前記高速液体クロマトグラフィー法を使用して得られた分画物の主成分を分析した結果、６０％アセトニトリル／水分画物で混合培養を通じて新たに産生された新規物質グリオニトリンの存在が確認された。前記分画物を酢酸エチルと塩化メチレンを溶媒に使用して９０％塩化メチレン／酢酸エチル及び６０％塩化メチレン／酢酸エチルのアイソクラティック溶媒溶離条件を有して順相液体クロマトグラフィー法を通じて精製して保持時間１０分にグリオニトリンＡと保持時間１５分にグリオニトリンＢを得た。
＜実施例４＞グリオニトリンの器機分析
本発明者等は、器機分析を用いてグリオニトリンＡとグリオニトリンＢを化学式を決定した。分離したグリオニトリンＡを水またはＤＭＳＯ溶液上で室温に放置する時、三硫化物（グリオニトリンＣ）と四硫化物（グリオニトリンＤ）が生成され、それらの化学構造を下記のようなＭＳ資料及び核磁気分光機資料を分析して解明した。前記水素と炭素核磁気分光機スペクトルは、それぞれ５００ＭＨｚと１２５ＭＨｚで測定され、グリオニトリンＡはクロロホルム−ｄ溶媒で測定され、グリオニトリンＢはメタノール−ｄ４溶媒で測定された。
【００１９】
【表１】
2011502532.tif 000009
【００２０】
＜グリオニトリンＣ＞
ESI-MS: m/z 386 [M+H]+;
1H NMR(500 MHz,CDCl3): 3.40 (3H,s),3.46(1H,dd,J=19.0,1.0 Hz),4.29(1H,dd,J=19,1.0 Hz),4.42(1H,br d,J=12.5 Hz),4.80(1H,br d,J=12.5 Hz),7.44(1H,br d,J=8.5 Hz),8.10(1H,dd,J=8.5,2.0 Hz),8.89(1H,d,J=2.0 Hz).
＜グリオニトリンＤ＞
ESI-MS: m/z 440 [M+Na]+;
1H NMR(500 MHz,CDCl3): 3.21(3H,s),3.48(1H,br dd,J=18.5,1.0 Hz),4.02(1H,br dd,J=18.5,1.0 Hz),4.12(1H,br d,J=12.5 Hz),4.40(1H,br d,J= 12.5 Hz),7.52(1H,br d,J=8.5 Hz),8.18(1H,dd,J=8.5,2.0 Hz),9.18(1H,d,J=2.0 Hz).
＜実施例５＞グリオニトリンの癌細胞に対する細胞毒性効果とバクテリア菌株ＫＭＫ−００１に対する抗菌効果測定
本発明者等は、グリオニトリンの癌細胞に対する細胞毒性評価は、試験管内でＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）分析法を用いて生きている癌細胞の量を測定する方法を行なった。グリオニトリンの癌細胞毒性は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，米国）から分譲受けたＡＧＳ（胃癌、ＡＴＣＣ細胞コード−ＣＲＬ−１７３９ＴＭ）、ＨｅｐＧ２（肝臓癌、ＨＢ−８０６５ＴＭ）、ＨＣＴ１１６（大腸癌、ＣＣＬ−２４７ＴＭ）、Ａ５４９（肺癌、ＣＣＬ−１８５ＴＭ）及びＤＵ１４５（前立腺癌、ＨＴＢ−８１ＴＭ）癌細胞株を用いて評価した。９６ウェルプレートに胃癌（ＡＧＳ）、肝癌（ＨｅｐＧ２）、大腸癌（ＨＣＴ−１１６）、肺癌（Ａ５４９）及び前立腺癌（ＤＵ−１４５）細胞株をそれぞれ１×１０４細胞程度１００マイクロリットルずつ加えて３７℃で２４時間ＣＯ２培養器で培養する。以後、既存の培地を除去後、グリオニトリンと混合した新しい培地に入れ替えて３７℃で培養する。２４時間後、ＭＴＴ溶液を１０マイクロリットルずつ入れて、３７℃で１時間培養した後、生きている細胞内で還元酵素によって形成されたホルマゾン量を４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
前記結果、表２にみられるようにグリオニトリンＡまたはＢは、前記癌細胞株に対して高い細胞毒性効果があることが分かる。
また、本発明者等は、グリオニトリンＡ及びＢのＫＭＫ−００１菌株に対する抗菌効果を、ディスク拡散実験を通じて確認した。ＫＭＫ−００１をツァベックドックス寒天培地に塗抹した後、グリオニトリンを吸収させた滅菌ディスクを同じ培地に乗せた後、２５℃で５日間培養した。陽性対照群にグリオニトリンの代わりにアンピシリンを吸収させた滅菌ディスクを前記のような条件で培養した。前記結果、グリオニトリンは、アンピシリンと類似の抗菌効果を示すことを確認した（図６参照）。
また、本発明者等は、グリオニトリンＡとＢの抗菌効果をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，米国）から分譲を受けたマイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｅｕｔｅｕｓ）ＩＦＣ  １２７０８、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６６３３、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＡＴＣＣ３８５１、サルモネラ・ティフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１  ４０２８及び３種のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）であるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ  ４３３００、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ７００７８７及びスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡＴＣＣ７００７８８に対して評価した。グリオニトリンＢはすべての試験群で抗菌作用がない一方、グリオニトリンＡは４種の非耐性菌で０．７８−３．１３μｇ／ｍｌの最小抑制濃度（ＭＩＣ）で陽性対照群に使用したアンピシリンと類似の強力な抗菌作用を示した。特に、グリオニトリンＡは、３種のＭＲＳＡ菌には、０．７８μｇ／ｍｌのＭＩＣ濃度で陽性対照群に使用したアンピシリンの抗菌作用より１５倍以上の強力なメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対する抗菌作用を示した（表３参照）。前記７種のバクテリア菌株に対するグリオニトリンの最小抑制濃度を測定するために前記７種のバクテリアを標準培地（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂｒｏｔｈ）（Ｄｉｆｃｏ）で２４時間培養した。以後、既存の培地を除去した後、各々の菌株を１０５のコロー形成単位（ｃｆｕ）／ｍｌを含んだ培地を１００マイクロリットルずつ取って９６ウェルプレートに加え、グリオニトリンを濃度別に希釈して加えた後、３７℃で２４時間培養した。２４時間後、６００ｎｍで光学密度（Ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定した。
また、本発明者等は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，米国）から分譲を受けたアスペルギルス−フミガーツフＨＩＣ６０９４とＴ．ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）ＩＦＯ９１８５に対するグリオニトリンＡとＢの抗真菌作用を評価した。前記の抗菌作用と類似にグリオニトリンＢは抗真菌効果がない一方、グリオニトリンＡは、１２．５μｇ／ｍｌの最小抑制濃度（ＭＩＣ）を示した（表３参照）。前記２種の真菌に対するグリオニトリンの最小抑制濃度を測定するために、前記２種の真菌の胞子を各々１ミリリットル当り１０５の胞子数になるように滅菌蒸留水に懸濁してサブロー・グルコース（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ）液体培地（Ｄｉｆｃｏ）を用いてミリリットル当り１０３の細胞数になるようにした。以後、９６ウェルプレートに１０２の細胞数程度１００マイクロリットルずつ加えてグリオニトリンを濃度別で加えた後、４８時間２８℃で培養した。カビの成長が観察されないグリオニトリンの濃度を最小抑制濃度とした。
【００２３】
【表３】
2011502532.tif 000011
【００２４】
前記結果、表３に見られようにグリオニトリンＡは、前記有害菌に対して高い抗菌効果があることが分かる。
下記に本発明組成物のための製剤例を例示する。
＜製剤例１＞散剤の製造
化学式３または化学式４の化合物                               ２０ｍｇ
乳糖                                                   １００ｍｇ
タルク                                                   １０ｍｇ
前記成分を混合して気密包に充填して散剤を製造する。
＜製剤例２＞錠剤の製造
化学式３または化学式４の化合物                                １０ｍｇ
とうもろこし澱粉                                         １００ｍｇ
乳糖                                                    １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                                       ２ｍｇ
前記成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造する。
＜製剤例３＞カプセル剤の製造
化学式３または化学式４の化合物                               １０ｍｇ
結晶性セルロース                                            ３ｍｇ
ラクトース                                            １４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                                  ０．２ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法によって前記の成分を混合してゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造する。
＜製剤例４＞注射剤の製造
化学式３または化学式４の化合物                             １０ｍｇ
マンニトール                                          １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸留水                                      ２９７４ｍｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４、１２Ｈ２Ｏ                                  ２６ｍｇ
通常の注射剤の製造方法によって１アンプル当り（２ｍｌ）前記成分含量で製造する。
＜製剤例５＞液剤の製造
化学式３または化学式４の化合物                              ２０ｍｇ
異性化糖                                                １０ｇ
マンニトール                                              ５ｇ
精製水                                                            適量
通常の液剤の製造方法によって精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させて、レモン香を適量加えた後、前記の成分を混合した後、精製水を加えて全体を１００ｍｌに調節した後、茶色ビンに充填して滅菌して液剤を製造する。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明の新規なスピンゴモナス属バクテリア−アスペルギルスカビ混合培養法は、新物質を獲得するための非常に有用な技術として期待される。前記混合培養法を通じて産生された新規な化合物であるグリオニトリンは、癌細胞に対する強い細胞毒性効果を示し、菌株ＫＭＫ−００１を含む１０種の有害菌株に対する抗菌作用を示している。ゆえに、グリオニトリンとその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む製薬組成物は、抗癌剤または抗生剤開発のための候補物質として有用に用いることができるので、産業的に非常に価値ある発明として用いることができる。
【受託番号】
【００２６】
ＫＣＣＭ  １０８８８Ｐ
ＫＣＣＭ  １０８８９Ｐ
【図１】
2011502532.tif 000016
【図２】
2011502532.tif 000017
【図３】
2011502532.tif 000018
【図４】
2011502532.tif 000019
【図５】
2011502532.tif 000020
【図６】
2011502532.tif 000021
【図７】
2011502532.tif 000022
【図８】
2011502532.tif 000023
【図９】
2011502532.tif 000024
【配列表】
2011502532000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月14日(2010.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＫＣＣＭ１０８８８Ｐで寄託されたスピンゴモナス属バクテリア。
【請求項２】
受託番号ＫＣＣＭ１０８８９Ｐで寄託されたアスペルギルス属カビ。
【請求項３】
請求項１に記載のスピンゴモナス属バクテリア菌株を液体培養した培養液に、別に液体培養した請求項２に記載のアスペルギルス属カビ菌株または菌株を含んだ培養液を加えて培養する工程を含む菌複合体の混合培養方法。
【請求項４】
スピンゴモナス属バクテリア菌株及びアスペルギルス属カビ菌株を１０００：１．０〜１０００：０．１の割合で混合することを特徴とする請求項３に記載の混合培養方法。
【請求項５】
請求項３に記載の混合培養方法で培養された菌複合体の培養液。
【請求項６】
請求項３に記載の混合培養方法で培養された菌複合体の培養液から分離される下記化学式１または化学式２で表わされる化合物：
【化１】
2011502532.tif 000025
ｎは、イオウの個数を示し、１〜４であり、
【化２】
2011502532.tif 000026
Ｘは水素、またはＣ１〜Ｃ５アルキル基であり、互いに同じかまたは異なり、すべての非対称炭素での異性体を含む。
【請求項７】
下記化学式３または化学式４で表わされることを特徴とする請求項６に記載の化合物：
【化３】
2011502532.tif 000027
【化４】
2011502532.tif 000028
【請求項８】
ｎが、３または４であることを特徴とする請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
請求項５に記載の培養液、または請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物を含む抗癌剤。
【請求項１０】
癌が、胃癌、肝癌、大腸癌、肺癌または前立腺癌であることを特徴とする請求項９に記載の抗癌剤。
【請求項１１】
請求項５に記載の培養液、または請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物を含む抗菌剤。
【請求項１２】
請求項１に記載のスピンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）バクテリア、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、サルモネラ・ティフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、アスペルギルス−フミガーツフまたはＴ．ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）菌株に対する抗菌効果を示すことを特徴とする請求項１１に記載の抗菌剤。
【請求項１３】
１）請求項１に記載のスピンゴモナス属バクテリア菌株を液体培養した培養液に請求項２に記載のアスペルギルス属カビ菌株または菌株を含んだ培養液を加えて培養する工程を含む菌複合体の混合培養方法によって得た培養液に、有機溶媒または吸着樹脂を加えて抽出する工程；
２）工程１）の抽出物を減圧乾燥後、カラムクロマトグラフィーを用いて分画物を得る工程；及び
３）工程２）の分画物をカラムクロマトグラフィーを通じて請求項６に記載のグリオニトリンを精製する方法。
【請求項１４】
請求項５に記載の培養液または請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物を有効成分として含む癌予防用及び健康改善用の健康食品。
【請求項１５】
請求項５に記載の培養液または請求項６〜８のいずれか一項に記載の化合物を有効成分として含む菌性疾患予防用及び健康改善用の健康食品。
【国際調査報告】
2011502532.tif 000029
2011502532.tif 000030
2011502532.tif 000031