(57)【要約】  本発明は、血液凝固因子インヒビターとして有用な、式(Ｉ)Ｘ１-Ｘ２-Ｘ３-Ｘ４-Ｘ５-（Ｘ６）ｎ-（Ｘ７）ｍ-Ｙを有する新規の化合物に関する。化合物(Ｉ)は血栓症の処置、又は血液凝固因子の液状製剤、特にＦＶＩＩａ、第ＶＩＩ因子変異体、又は第ＶＩＩ因子誘導体の液状製剤の安定剤として使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（Ｉ）：
Ｘ１-Ｘ２-Ｘ３-Ｘ４-Ｘ５-(Ｘ６)ｎ(Ｘ７)ｍ-Ｙ  （Ｉ）
［上式中、Ｘ１は低級アルコキシカルボニル、低級アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、シクロアルキルアルキルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アリールアルキルオキシカルボニル、又はヘテロアリールアルキルオキシカルボニル、低級アルキルアミノカルボニル、低級アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アリールアルキルアミノカルボニル、又はヘテロアリールアルキルアミノカルボニル、低級アルカノイル、低級アルケノイル、低級アルカジエニル、アルキノイル、シクロアルカノイル、シクロアルキルアルカノイル、シクロアルケニルアルカノイル、アロイル、アリールアルカノイル、又はヘテロアリールアルカノイルを表し、該基は場合によりハロゲン、ヒドロキシル、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、又はシアノと置換され；
Ｘ２は、４−アミジノ−Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ホモＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｂ、又はＤａｐを表し；
Ｘ３は、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、（α−Ｍｅ）Ｇｌｕ、１−アミノシクロブタン−トランス−１，３−ジカルボン酸、又は１−アミノシクロブタン−シス−１，３−ジカルボン酸を表し；
Ｘ４は、Ａｒｇ、ホモＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｐｈｇ、Ｇｌｕ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、Ｎβ−［アミジノ］−Ｄａｐ、又はＮγ−［アミジノ］Ｄａｂを表し；
Ｘ５は、Ｐｈｇ、Ｄ−Ｐｈｇ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｉｂ、Ｔｒｐ、Ａｂｕ、Ａｌｌｅ、Ｃｈａ、Ｈｐｈ、Ｎｌｅ、又はＮｖａを表し；
Ｘ６は、Ａｒｇ、ホモＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｈｉｓ  又はＬｙｓ（ｍＰｅｇ（１−１０ｋ）−ＣＯ）を表し；
Ｘ７は、一般式-ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)１-１０-(ＣＨ２)１-５-Ｃ(=Ｏ)-のジラジカルを表し；
Ｙは、ＮＨ２またはＯＨを表し；及び
ｎは０または３−６であり、ｍは０−２０であるが、但しｎとｍは同時にゼロであってはならない］
の化合物、その任意の及び全ての立体異性体、前記式Ｉの化合物の任意比率における２以上の混合物、その生理学的に許容可能な塩類、及びそのプロドラッグ。
【請求項２】
Ｘ１が低級アルコキシカルボニル、低級アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、シクロアルキルアルキルオキシカルボニル、低級アルキルアミノカルボニル、低級アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアルキルアミノカルボニル、低級アルカノイル、低級アルケノイル、アルキノイル、シクロアルカノイル、又はシクロアルキルアルカノイルを表し、該基が場合によりハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、又は低級アルキルチオと置換される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｘ１が  メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロピルオキシカルボニル、２−（メトキシ）エトキシカルボニル、２−（メチルチオ）エトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２−クロロアリルオキシカルボニル、プロパルギルオキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、シクロブチルオキシカルボニルｌ、シクロペンチルオキシカルボニル、シクロプロピルメチルオキシカルボニル、メチルアミノカルボニル、ジメチルアミノカルボニル、エチルアミノカルボニル、ジエチルアミノカルボニル、プロピルアミノカルボニル、イソプロピルアミノカルボニル、アリルアミノカルボニル、シクロブチルアミノカルボニル、シクロペンチルアミノカルボニル、シクロプロピルメチルアミノカルボニル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ペンタノイル、３−シクロプロピルプロピオニル、ｐｅｎｔ−４−エノイル、２−メチル−４−ペンテノイル、４−ヘキセノイル、３−シクロペンテン−１−オイル、４，５，５−トリフルオロペント−４−エノイル、又はヘキサ−２，４−ジエノイルを表す、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘ１がプロピルオキシカルボニルを表す、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ２が４−アミジノ−Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ホモＡｒｇ、ＯｒｎまたはＬｙｓを表す、請求項１から４の何れか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ２が４−アミジノ−Ｐｈｅを表す、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘ３がＧｌｕを表す、請求項１から６の何れか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｘ４がＡｒｇ、ホモＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｄａｂ、又はＤａｐを表す、請求項１から７の何れか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘ４がＡｓｎまたはＧｌｎを表す、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘ５がＰｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｃｈａ、Ｇｌｙ、又はＴｒｐを表す、請求項１から９の何れか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｘ５がＰｈｅ、Ｃｈａ、又はＴｒｐを表す、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｘ６がＨｉｓ、Ａｒｇ、ホモＡｒｇまたはＯｒｎを表す、請求項１から１１の何れか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘ６がＡｒｇを表す、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘ７は-ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)-又は-ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)３-Ｃ(=Ｏ)-を表す、請求項１から１３の何れか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
ｎは３から６であって、ｍは０である、請求項１から１４の何れか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
ｎは３であって、ｍは０である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
ｎは０であって、ｍは１から２０である、請求項１から１４の何れか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
ｎは０であって、ｍは５である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
ｎは０であって、ｍは１０である、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
化合物は、
プロピルオキシカルボニル-(４-アミジノ-Ｐｈｅ)-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)]５-ＮＨ２;
プロピルオキシカルボニル-(４-アミジノ-Ｐｈｅ)-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)]１０-ＮＨ２;
プロピルオキシカルボニル-(４-アミジノ-Ｐｈｅ)-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[Ａｒｇ]３-ＮＨ２;
プロピルオキシカルボニル-ホモＡｒｇ-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)]５-ＮＨ２;
プロピルオキシカルボニル-ホモＡｒｇ-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)]１０-ＮＨ２;
プロピルオキシカルボニル-ホモＡｒｇ-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[Ａｒｇ]３-ＮＨ２、
それらの任意の及び全ての立体異性体、式Ｉの当該化合物の任意の比率における２以上の混合物、その生理学的に許容可能な塩類及びそのプロドラックのリストから選択される、請求項１から１９の何れか一項に記載の化合物。
【請求項２１】
１又は複数の請求項１から２０の何れか一項に記載の化合物又はその生理学的に許容可能な塩類；及び第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項２２】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、野生型ヒト第ＶＩＩａ因子；第ＶＩＩ因子変異体及び第ＶＩＩ因子誘導体から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記第ＶＩＩ因子変異体がＰＥＧ化第ＶＩＩ因子である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を更に含む、請求項２１から２３の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
液状の、水性組成物である、請求項２１から２４の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む組成物を調整する方法であって、
請求項１から２０の何れか一項に記載の化合物又はその生理学的に許容可能な塩類を、該第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む試料に添加すること；又は
請求項１から２０の何れか一項に記載の化合物又はその生理学的に許容可能な塩類を含む試料に、該第ＶＩＩ因子ポリペプチドを添加すること
を含む方法。
【請求項２７】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、野生型ヒト第ＶＩＩａ因子；第ＶＩＩ因子変異体及び第ＶＩＩ因子誘導体から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第ＶＩＩ因子変異体がＰＥＧ化第ＶＩＩ因子である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物又はその塩類及び／又は前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが液状の、水性媒体に存在する、請求項２６から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項２６から２９の何れか一項に記載の方法により調整される医薬組成物。
【請求項３１】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドを阻害する方法であって、
請求項１から２０の何れか一項に記載の化合物又はその生理学的に許容可能な塩類を、該第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む試料に添加すること；又は
請求項１から２０の何れか一項に記載の化合物又はその生理学的に許容可能な塩類を含む試料に、該第ＶＩＩ因子ポリペプチドを添加すること
を含む方法。
【請求項３２】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、野生型ヒト第ＶＩＩａ因子；第ＶＩＩ因子変異体及び第ＶＩＩ因子誘導体から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第ＶＩＩ因子変異体がＰＥＧ化第ＶＩＩ因子である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記化合物又はその塩類及び／又は前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが液状の、水性媒体に存在する、請求項３１から３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが効果的である病状又は疾患を治療するための医薬の製造のための、請求項２１から２５又は３０の何れか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３６】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが効果的である病状又は疾患を治療するための医薬の製造のための、前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドと組合わせた、請求項１から２０の何れか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３７】
前記病状又は疾患が、出血性疾患；広範囲にわたる組織損傷を被った患者における出血；及び外科的止血の可能性が限られている器官における出血から選択される、請求項３５又は３６に記載の使用。
【請求項３８】
出血性疾患が、インヒビターを有するか又は有さない先天性血友病Ａ、後天性血友病Ａ、インヒビターを有するか又は有さない先天性血友病Ｂ、後天性血友病Ｂ、第ＸＩ凝固因子欠乏症、第ＶＩＩ凝固因子欠乏症、フォン・ヴィルブランド病、血小板異常又は血小板欠乏症、及び血小板減少症の処置から選択される、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
広範囲にわたる組織損傷を被った患者における出血が、手術又は外傷に関連した出血、脊髄又は心臓手術に関連した出血、整形外科手術、又は腹腔鏡手術、穿通性又は鈍的外傷、頭部外傷、脳内出血、誘発性止血不全(induced defective haemostasis)に関連した出血、抗凝固治療又は抗線維素溶解治療に関連した出血、及び任意の原因による非制御の過度の出血から選択される、請求項３７に記載の使用。
【請求項４０】
外科的止血の可能性が限られている器官における出血が、脳、内耳領域、眼、肝臓、肺、腫瘍組織、及び胃腸管における出血、並びに出血が拡散している場合(出血性胃炎及び大量の子宮出血)から選択される、請求項３７に記載の使用。
【請求項４１】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの安定化のための請求項１から２０の何れか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固カスケードに関係するプロテアーゼの新規インヒビター及びそれらの調製方法に関し、更にセリンプロテアーゼとビタミンＫ依存性ポリペプチドのような血液凝固因子の安定剤としての前記インヒビターの使用に関する。特に、本発明は、液状の水性組成物中における化学的および／または物理的分解に対する第ＶＩＩａ因子または他の第ＶＩＩ因子ポリペプチドを安定化に関する。  
【発明の背景】
【０００２】
セリンプロテアーゼ第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、血液凝固プロセスに関係する血漿糖タンパク質の１つである。ＦＶＩＩは、主に一本鎖チモーゲンとして血漿に存在し、別のプロテアーゼ（ＦＸａ）によって切断されて、その二本鎖活性型形態である第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）となる。  
組織因子／第ＶＩＩａ因子（ＴＦ／ＦＶＩＩａ）複合体は、血栓事象の主要誘因である。この複合体は、血液凝固の外因経路の一部であり、第ＩＸ因子及び第Ｘ因子の活性化に介在し、最終的にトロンビンの生成に至る。  
【０００３】
第ＶＩＩａ因子は、血友病と出血の治療のための有益な治療薬であることが解っている。保存及び送達の両方に適している第ＶＩＩａ因子の投与形態を有することが望ましい。理想的には、薬剤製品は液体として、保存され及び投与される。あるいは、薬剤製品は凍結乾燥にされて、次に患者に使用する前に適切な希釈液を加えることによって再構成される。薬剤製品は、例えば６ヵ月以上の長期間の保存を可能にするために充分な安定性を有することが望ましい。  
【０００４】
液体として完成した製剤を維持するべきであるか又はそれを凍結乾燥にするべきかどうかは、通常その形態でのタンパク質薬剤の安定性を基に判断される。タンパク質安定性は、なかでもイオン強度、ｐＨ、温度、繰り返される凍結／解凍、及びせん断力への暴露のような要因によって影響を受ける場合がある。活性タンパク質は、２〜３例を挙げると、例えば変性および／または凝集（可溶性及び不溶性凝集体形成）による物理的不安定性の結果として、及び例えば加水分解、アミド分解および／または酸化の方の不安定性を含む化学的不安定性の結果として失われる可能性がある。そのうえ、セリンプロテアーゼである第ＶＩＩａ因子の場合、自己触媒のための断片化が生じる場合がある（自己タンパク質分解；酵素性、自己触媒性分解）。タンパク質医薬品の安定性の一般的概説については、Manning, et al., Pharmaceutical Research 6:903-918 (1989)を参照されたい。
【０００５】
タンパク質の不安定性の生じる可能性が広く認識される一方で、特定のタンパク質の特定の不安定性の問題を予測することは一般に非常に難しい。これらの不安定性のいずれかが、減少された活性、増大された毒性および／または増大された免疫原性を有するタンパク質の副産物または誘導体の形成に結果としてなることがある。実際、タンパク質沈殿は、血栓症、剤形及び用量の非均質性及びシリンジの詰まりにつながる可能性がある。さらにまた、例えばＮ末端基の特定のグルタミン酸残基のγカルボキシル化及び糖鎖の付加のような翻訳後修飾は、保管の際に修飾に影響されやすい潜在的部位を提供する。
【０００６】
したがって、タンパク質の任意の組成物の安全性及び有効性は、その安定性に直接関連する。液状形態の安定性を維持することは、分子運動の非常に増大された潜在性及びそれによる分子相互作用の増大された可能性のため、一般に凍結乾燥された形態の安定性を維持することとは異なる課題である。また、増大されたタンパク質濃度における凝集体形成の傾向のため、濃縮形態の安定性を維持することは、上記とは異なる課題である。第ＶＩＩａ因子は、いくつかの経路、特に凝集（二量化／オリゴマー形成）、酸化及び自己分解性切断（ペプチド主鎖の切り取りまたは「重鎖分解」）によって分解を受ける。さらにまた、沈殿が生じることがある。
【０００７】
これらのプロセスの多くは、タンパク質から水を除くことによって、有意に遅くなる。しかしながら、第ＶＩＩａ因子の水性組成物の開発は再構成によるエラーを取り除き、それにより投薬の正確性を増大する効果を有し、同様に臨床における製品の使用を単純化し、それにより患者のコンプライアンスを増大する効果を有する。理想的には、第ＶＩＩａ因子の組成物は、広範囲のタンパク質濃度において６ヵ月以上間安定しているべきである。これにより投与方法をフレキシブルにすることができる。一般に、より高い濃度の形態は低用量での投与を可能にし、それは患者の視点からたいへん望ましい。液状組成物は、投与と使用の容易性に関して、冷凍乾燥させた製品に勝る多数の利点を有する。  
【０００８】
液状組成物を開発する場合、多数の要因が考慮される。短期間、すなわち６ヵ月未満で、液体安定性は一般に、全体の構造変化（例えば変性と凝集）を回避することによって決まる。これらのプロセスは多くのタンパク質について文献に記載されており、安定化剤の多数の例が存在する。あるタンパク質の安定化に効果的な薬剤は、実際に別のタンパク質を不安定化するために作用することは、周知である。タンパク質が全体的な構造変化に対して安定化されたならば、長期安定性（例えば６ヵ月を超える）のための液状組成物を開発することは、そのタンパク質に特異的な種類の分解からタンパク質をさらに安定化することにかかっている。より多くの特異的種類の分解は、例えば、ジスルフィド結合スクランブリング、特定残基の酸化、脱アミドおよび／または環化を含みうる。個々の分解種を正確に指摘することは必ずしも可能ではないが、興味があるタンパク質を比類なく安定化させるために特定の賦形剤の能力を監視するために微妙な変化を監視するアッセイが開発されている。  
【０００９】
現在、唯一市販されている組換えにより産生された第ＶＩＩ因子ポリペプチド組成物は、使用前に再構成される冷凍乾燥された第ＶＩＩａ因子の製剤である；それは、比較的低濃度の第ＶＩＩａ因子（例えば約０．６ｍｇ／ｍｌ）を含む。１バイアル（１．２ｍｇ）のノボセブン（登録商標）（ノボノルディスク  エーエス、デンマーク）は、１．２ｍｇの組換えヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩＡ）、５．８４ｍｇのＮａＣｌ、２．９４ｍｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、２．６４ｍｇのグルシルグリシン（ＧｌｙＧｌｙ）、０．１４ｍｇのポリソルベート８０及び６０．０ｍｇのマンニトールを含む；それは、２．０ｍｌの注射用蒸留水（ＷＦＩ）の付加によって、ｐＨ５．５に再構成される。再構成された場合、タンパク質溶液は室温で２４時間の使用のために安定している。したがって、液状の使用調整済みまたは濃縮された第ＶＩＩ因子製品は、現在市販されていない。  
【００１０】
第ＶＩＩ因子インヒビター／安定剤を含む第ＶＩＩ因子ポリペプチドの液状製剤は、以前に記載されている。WO2005016365は第ＶＩＩ因子ポリペプチド、緩衝剤及び  -Ｃ(=Ｎ-Ｚ１-Ｒ１)-ＮＨ-Ｚ２-Ｒ２のモチーフを含む少なくとも一つの安定化剤（ｉｉｉ）（例えばベンズアミジン化合物及びアルギニンのようなグアニジン化合物）を含んで成る液状、水性医薬組成物を記載する。  
【００１１】
したがって、液状（特に水性液体）の又は固体の投与形態の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの分解を阻害する薬剤を開発することが非常に望まれており、本発明の課題である。上に概説したような化学的および／または物理的分解プロセスの許容可能な対照を提供する第ＶＩＩ因子ポリペプチドの水性液状医薬組成物を提供できることが望ましい。したがって、活性型第ＶＩＩ因子ポリペプチドの酵素活性を阻害するか又は減少させる他に、本発明の目的は（ｉ）それらの阻害作用において可逆性であり、（ｉｉ）最終製品に存在するほんのわずかな濃度を必要するために十分に強力であり、（ｉｉｉ）存在するレベルで非毒性であり、及び（ｉＶ）存在する第ＶＩＩ因子ポリペプチドの実質的阻害を可能にする生理学的条件で水性媒体に十分に可溶性である薬剤を開発することである。  
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、式（Ｉ）
Ｘ１-Ｘ２-Ｘ３-Ｘ４-Ｘ５-(Ｘ６)ｎ-(Ｘ７)ｍ-Ｙ          （Ｉ）
［上式中、Ｘ１は低級アルコキシカルボニル，低級アルケニルオキシカルボニル，アルキニルオキシカルボニル，シクロアルキルオキシカルボニル，シクロアルキルアルキルオキシカルボニル，アリールオキシカルボニル，アリールアルキルオキシカルボニル，又はヘテロアリールアルキルオキシカルボニル，低級アルキルアミノカルボニル，低級アルケニルアミノカルボニル，アルキニルアミノカルボニル，シクロアルキルアミノカルボニル，シクロアルキルアルキルアミノカルボニル，アリールアミノカルボニル，アリールアルキルアミノカルボニル，又はヘテロアリールアルキルアミノカルボニル，低級アルカノイル，低級アルケノイル，低級アルカジエニル，アルキノイル，シクロアルカノイル，シクロアルキルアルカノイル，シクロアルケニルアルカノイル，アロイル，アリールアルカノイル，又はヘテロアリールアルカノイルを表し、該基は，ハロゲン，ヒドロキシル，低級アルキル，低級アルコキシ，低級アルキルチオ，又はシアノに場合により置換され；Ｘ２は、４−アミジノ−Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ホモＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、Ｄａｂ又はＤａｐを表し；Ｘ３は、Ｇｌｕ，Ａｓｐ，（α−Ｍｅ）Ｇｌｕ，１−アミノシクロブタン−トランス−１，３−ジカルボン酸，又は１−アミノシクロブタン−シス−１，３−ジカルボン酸を表し；Ｘ４はＡｒｇ，ホモＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｒｐ，Ｐｈｅ，Ｐｈｇ，Ｇｌｕ，Ｄ−Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｄ−Ａｓｐ，Ｄａｂ，Ｄａｐ，Ｎβ−［アミジノ］−Ｄａｐ，又はＮγ−［アミジノ］Ｄａｂを表し；Ｘ５は、Ｐｈｇ，Ｄ−Ｐｈｇ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ａｉｂ，Ｔｒｐ，Ａｂｕ，Ａｌｌｅ，Ｃｈａ，Ｈｐｈ，Ｎｌｅ，又はＮｖａを表し；Ｘ６はＡｒｇ，ホモＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ｏｒｎ，又はＬｙｓ(ｍＰｅｇ(１-１０ｋ)-ＣＯ)を表し；Ｘ７は、一般式-ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)１-１０-(ＣＨ２)１-５-Ｃ(=Ｏ)-のジラジカルを表し；ＹはＮＨ２またはＯＨを表し；及びｎは０または３−６であり、ｍは０−２０であり、但し任意の及び全てのｎとｍは同時にゼロであってはならない］の化合物、
その任意の及び全ての立体異性体、前記式Ｉの化合物の任意比率における２以上の混合物、その生理学的に許容可能な塩類、及びそのプロドラッグを含むものを提供する。
【００１３】
本発明の発明者は、一般式（Ｉ）の化合物が血液凝固カスケードに関係するプロテアーゼのインヒビターであって、第ＶＩＩ因子ポリペプチド製剤、特に第ＶＩＩａ因子の水溶液製剤の安定化添加物として使用できるということを発見した。血液凝固ＶＩＩ因子、またはそのアナログまたは誘導体（「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」）は、少なくとも一つの式（Ｉ）の安定化剤と共に液状の、水性医薬組成物として調製された場合、改良された安定性を示し、それにより、実際の使用の前におよび／またはその間、長期にわたる保存を可能にする。  
【００１４】
本発明は、更に（ｉ）式（Ｉ）の化合物の調製のための方法；（ｉｉ）ＦＶＩＩポリペプチド、例えば野生型ＦＶＩＩａ、ｒｈＦＶＩＩａまたはそのアナログまたはその誘導体と、式（Ｉ）の化合物とを含む医薬組成物；（ｉｉｉ）ＦＶＩＩポリペプチド、例えば野生型ＦＶＩＩａ、ｒｈＦＶＩＩａまたはそのアナログと、式（Ｉ）の化合物とを含む医薬組成物を調製する方法；（ｉｖ）ＦＶＩＩポリペプチド、例えばその野生型ＦＶＩＩａ、ｒｈＦＶＩＩａまたはそのアナログまたは誘導体を阻害する方法；（ｖ）出血、血友病またはＦＶＩＩポリペプチドによる治療が有益な他の疾患の治療または症状を治療するための医薬組成物の製造のための、ＦＶＩＩポリペプチド（例えば野生型ＦＶＩＩａ、ｒｈＦＶＩＩａまたはそのアナログ）と組合わせた式（Ｉ）の化合物の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
上述したように、本発明は、液状(特に水性液体)又は固体状の投与形態における、セリンプロテアーゼ類、例えば第ＶＩＩ因子ポリペプチドの分解を阻害する新規の式(Ｉ)の化合物(上述を参照)を提供する。さらに、本発明は、上に概説したような、化学的及び／又は物理的分解プロセスのコントロールをもたらすセリンプロテアーゼ類、特に第ＶＩＩ因子ポリペプチドの液状の水性医薬組成物を提供する。第ＶＩＩ因子又はそのアナログ(「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」)は、少なくとも一の式(Ｉ)の化合物と共に、液状の水性医薬組成物として製剤される場合、改善された安定性を示し、よって、実際の使用前、長期間(例えば、６ヶ月又はそれ以上)の保存が可能となる。
【００１６】
式(Ｉ)の化合物は、可逆的に第ＶＩＩａ因子を阻害可能であり、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する製剤又は組成物、特に水性製剤又は組成物において、安定剤として使用されうる(以下参照)。これに関連して、本発明の化合物は、しばしば、水又は他の水性媒体中において好ましい溶解度を示す。
【００１７】
本文脈において、「アルキル」なる用語は、直鎖状又は分枝状鎖の飽和した一価の炭化水素基を示すことを意図している。「アルキレン」なる用語は、対応するジラジカルを示す。「低級アルキル」は、Ｃ１-６-アルキルとも称される、１〜６の炭素原子を有するアルキルである。Ｃ１-６アルキル基には、例えばメチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、ｎ-ペンチル、２-メチルブチル、３-メチルブチル、４-メチルペンチル、ｎ-ヘキシル、１,１-ジメチルプロピル、１,２-ジメチルプロピル、２,２-ジメチルプロピル(ネオペンチル)及び１,２,２-トリメチルプロピルが含まれる。
【００１８】
「アルコキシ」なる用語は、直鎖状又は分枝状又は環状の立体配置のいずれかにおけるアルキル基が、エーテル酸素を介して結合しており、エーテル酸素からの自由原子価結合(アルキル-Ｏ-)を有している基を示すことを意図している。「低級アルコキシ」は、Ｃ１-６-アルコキシとも称される、アルキル基が１〜６の炭素原子を有するアルコキシ基である。直鎖状アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシ及びヘキソキシである。分枝状アルコキシ基の例には、イソプロポキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、イソペントキシ及びイソヘキトキシが含まれる。環状アルコキシの例には、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ及びシクロヘキシルオキシが含まれる。
【００１９】
「アルコキシカルボニル」なる用語は、カルボニル基を通し、エーテル酸素を介して結合したアルコキシ基を含む一価の置換基(アルキル-Ｏ-Ｃ(=Ｏ)−)；例えばメトキシカルボニル、カルベトキシ、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ｎ-ブトキシカルボニル、sec-ブトキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、３-メチルブトキシカルボニル、ｎ-ヘキソキシカルボニル等を示すことを意図している。「低級アルコキシカルボニル」は、Ｃ１-６-アルコキシカルボニルとも称され、アルキル基が１〜６の炭素原子を有するアルコキシカルボニル基である。
【００２０】
「アルケニル」なる用語は、２〜１５の数の炭素原子と、少なくとも一の二重結合を有する、オレフィン性不飽和の分枝状又は直鎖状基を示すことを意図している。このような基の例には、限定されるものではないが、ビニル、１-プロペニル、２-プロペニル、アリル、イソ-プロペニル、１,３-ブタジエニル、１-ブテニル、ヘキセニル、ペンテニル等が含まれる。
【００２１】
ここで使用される場合「アルカノイル」なる用語は、１〜２０の炭素の、直鎖状及び分枝状鎖であるアルカノイル基を示すことを意図している。
ここで使用される場合「アルケノイル」なる用語は、少なくとも一の炭素-炭素二重結合を含む１〜２０の炭素の、直鎖状及び分枝状鎖であるアルケノイル基を示すことを意図している。
「アルカジエニル」なる用語は、２のオレフィン性結合と２０までの炭素原子を有する、直鎖状鎖又は分枝状炭化水素残基を示すことを意図している。
【００２２】
本文脈において、「シクロアルキル」なる用語は、環状の飽和した一価の炭化水素基を示すことを意図している。「低級シクロアルキル」は、Ｃ１-６-シクロアルキルとも称される、３〜６の炭素原子を有するシクロアルキルである。Ｃ１-６-シクロアルキル基には、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、２-メチル-シクロペンチル、及びシクロヘキシルが含まれる。
「アミジノ」なる用語は-Ｃ(=ＮＨ)ＮＨ２を意味し、「グアニジノ」なる用語は-ＮＨ-Ｃ(=ＮＨ)ＮＨ２を意味する。
【００２３】
ここで使用される場合「アリール」なる用語は、例えば６〜８員の原子を有する、単環又は多環の炭素環式芳香環基、又は例えば１０〜２２員の原子を有する芳香環系基を示すことを意図している。またアリールは、炭素環系の一部に水素化された誘導体を含むものを意図しており、少なくとも一の環は芳香族である。このような部分的に水素化された誘導体の具体例には、１,２,３,４-テトラヒドロナフチル、フルオレニル、及び１,４-ジヒドロナフチルが含まれる。
【００２４】
ここで使用される場合「ヘテロアリール」なる用語は、例えば５〜１３員の原子を有する複素環式芳香環基、又は例えば１３〜２１員の原子を有する芳香環系基で、窒素、酸素及び硫黄から選択される一又は複数のヘテロ原子を有するものを意味することを意図しており、ここでＮ-オキシド及び一酸化硫黄及び二酸化硫黄は、許容可能な複素環式芳香族置換基、例えばフリル、チエニル、チオフェニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾロルイソキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、１,２,３-トリアゾリル、１,２,４-トリアゾリル、ピラニル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、１,２,３-トリアジニル、１,２,４-トリアジニル、１,３,５-トリアジニル、１,２,３-オキサジアゾリル、１,２,４-オキサジアゾリル、１,２,５-オキサジアゾリル、１,３,４-オキサジアゾリル、１,２,３-チアジアゾリル、１,２,４-チアジアゾリル、１,２,５-チアジアゾリル、１,３,４-チアジアゾリル、テトラゾリル、チアジアジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフリル、ベンゾチエニルインダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、プリニル(purinyl)、キナゾリニル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル(naphthyridinyl)、プテリジニル、カルバゾリル、アゼピニル、ジアゼピニル、アクリジニル等である。またヘテロアリールは、複素環系の部分的に水素化された誘導体を含むことを意図しており、但し、ヘテロ原子を有する少なくとも一の環は芳香族である。このような部分的に水素化された誘導体の例には、２,３-ジヒドロベンゾフラニル、ピロリニル、ピラゾリニル、インドリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリニル、及びオキサゼピニルが含まれる。
【００２５】
「アリール」及び「ヘテロアリール」の例には、限定されるものではないが、フェニル、ビフェニルイル、インデニル、フルオレニル、フェナントレニル、アズレニル(azulenyl)、ナフチル(１-ナフチル、２-ナフチル)、アントラセニル(anthracenyl)(１-アントラセニル、２-アントラセニル、３-アントラセニル)、チエニル(２-チエニル、３-チエニル)、フリル(２-フリル、３-フリル)、インドリル、オキサジアゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサトリアゾリル、チアトリアゾリル、キナゾリン、フルオレニル、キサンテニル、イソインダニル(isoindanyl)、ベンズヒドリル、アクリジニル、チアゾリル、ピロリル(１-ピロリル、２-ピロリル、３-ピロリル)、ピラゾリル(１-ピラゾリル、３-ピラゾリル、４-ピラゾリル、５-ピラゾリル)、イミダゾリル(１-イミダゾリル、２-イミダゾリル、４-イミダゾリル、５-イミダゾリル)、トリアゾリル(１,２,３-トリアゾール-１-イル、１,２,３-トリアゾール-４-イル  １,２,３-トリアゾール-５-イル、１,２,４-トリアゾール-３-イル、１,２,４-トリアゾール-５-イル)、オキサゾリル(２-オキサゾリル、４-オキサゾリル、５-オキサゾリル)、イソオキサゾリル(イソオキサゾ-３-イル、イソオキサゾ-４-イル、イソオキサゾ-５-イル)、イソチアゾリル(イソチアゾ-３-イル、イソチアゾ-４-イル、イソチアゾ-５-イル)  チアゾリル(２-チアゾリル、４-チアゾリル、５-チアゾリル)、ピリジル(２-ピリジル、３-ピリジル、４-ピリジル)、ピリミジニル(２-ピリミジニル、４-ピリミジニル、５-ピリミジニル、６-ピリミジニル)、ピラジニル、ピリダジニル(３-ピリダジニル、４-ピリダジニル、５-ピリダジニル)、キノリル(２-キノリル、３-キノリル、４-キノリル、５-キノリル、６-キノリル、７-キノリル、８-キノリル)、イソキノリル(１-イソキノリル、３-イソキノリル、４-イソキノリル、５-イソキノリル、６-イソキノリル、７-イソキノリル、８-イソキノリル)、ベンゾ[ｂ]フラニル(２-ベンゾ[ｂ]フラニル、３-ベンゾ[ｂ]フラニル、４-ベンゾ[ｂ]フラニル、５-ベンゾ[ｂ]フラニル、６-ベンゾ[ｂ]フラニル、７-ベンゾ[ｂ]フラニル)、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル(２-(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル)、３-(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル)、４-(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル)、５-(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル)、６-(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル)、７-(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]フラニル))、ベンゾ[ｂ]チオフェニル(ベンゾ[ｂ]チオフェン-２-イル、ベンゾ[ｂ]チオフェン-３-イル、ベンゾ[ｂ]チオフェン-４-イル、ベンゾ[ｂ]チオフェン-５-イル、ベンゾ[ｂ]チオフェン-６-イル、ベンゾ[ｂ]チオフェン-７-イル)、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェニル(２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェン-２-イル、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェン-３-イル、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェン-４-イル、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェン-５-イル、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェン-６-イル、２,３-ジヒドロ-ベンゾ[ｂ]チオフェン-７-イル)、インドリル(１-インドリル、２-インドリル、３-インドリル、４-インドリル、５-インドリル、６-インドリル、７-インドリル)、インダゾール(１-インダゾリル、３-インダゾリル、４-インダゾリル、５-インダゾリル、６-インダゾリル、７-インダゾリル)、ベ��ズイミダゾリル(１-ベンズイミダゾリル、２-ベンズイミダゾリル、４-ベンズイミダゾリル、５-ベンズイミダゾリル、６-ベンズイミダゾリル、７-ベンズイミダゾリル、８-ベンズイミダゾリル)、ベンゾキサゾリル(２-ベンゾキサゾリル、３-ベンゾキサゾリル、４-ベンゾキサゾリル、５-ベンゾキサゾリル、６-ベンゾキサゾリル、７-ベンゾキサゾリル)、ベンゾチアゾリル(２-ベンゾチアゾリル、４-ベンゾチアゾリル、５-ベンゾチアゾリル、６-ベンゾチアゾリル、７-ベンゾチアゾリル)、カルバゾリル(１-カルバゾリル、２-カルバゾリル、３-カルバゾリル、４-カルバゾリル)、５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン(５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-１-イル、５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-２-イル、５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-３-イル、５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-４-イル、５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-５-イル)、１０,１１-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン(１０,１１-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-１-イル、１０,１１-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-２-イル、１０,１１-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-３-イル、１０,１１-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-４-イル、１０,１１-ジヒドロ-５Ｈ-ジベンズ[ｂ,ｆ]アゼピン-５-イル)、ベンゾ[１,３]ジオキソール(dioxole)(２-ベンゾ[１,３]ジオキソール、４-ベンゾ[１,３]ジオキソール、５-ベンゾ[１,３]ジオキソール、６-ベンゾ[１,３]ジオキソール、７-ベンゾ[１,３]ジオキソール)、及びテトラゾリル(５-テトラゾリル、Ｎ-テトラゾリル)が含まれる。
【００２６】
本願明細書において使われる「Ｌｙｓ(ｍＰｅｇ(１-１０ｋ)-ＣＯ）」なる用語は、側鎖のアミノ基が、分子量１−１０ｋＤａのメトキシ−ポリ（エチレングルコール）−誘導化カルボン酸（ＭｅＯ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)ｎ-(ＣＨ２)ｍ-ＣＯ２Ｈ）［ｍ及びｎは可変整数である］によりアシル化されたリジンを意味することを意図する。ｎの典型的な値は２０−２００、例えば２０−１００または５０−１５０または８０−１２０または１２０−２００であり；ｍの典型的な値は１−５である。式（Ｉ）の化合物は、例えばＬｙｓ(ｍＰｅｇ(１-１０ｋ)-ＣＯ)により、ＰＥＧ化されることができる。式（Ｉ）の化合物のＰＥＧ化は、ＦＶＩＩの溶解性を改良することができる。ＦＶＩＩが式（Ｉ）のＰＥＧ化された化合物に結合している場合、Ｐｅｇ鎖はタンパク質分子間の相互作用を減らし、したがってそれらが凝集及び沈澱することを防止する。
【００２７】
本願明細書において使用する「プロドラッグ」なる用語は、バイオ加水分解性アミド及びバイオ加水分解性エステル、アセタール類、アミナール類、カルバメート類、チオアミナル類、チオアセタール類及びヒドラゾン類を含んでおり、更には、ａ）本発明にかかる化合物を含む当該プロドラッグにおいてバイオ加水分解性官能性である化合物、及びｂ）所与の官能基で生物学的に還元又は酸化されて、本発明に係る薬剤物質を生じ得る化合物を含む。これらの官能基の例は、１,４-ジヒドロピリジン、Ｎ-アルキルカルボニル-１,４-ジヒドロピリジン、１,４-シクロヘキサジエン、tert-ブチルなどを含む。また、本発明は、式（Ｉ）の化合物のプロドラッグを含む。
【００２８】
式（Ｉ）の化合物に存在する不斉原子(Stereogenic atom)は、互いに独立にＲ立体配置またはＳ立体配置を有することができる。式（Ｉ）の化合物は、純粋なエナンチオマーまたはエナンチオマーの混合物（例えばラセミ化合物）、または純粋なジアステレオマーまたはジアステレオマーの混合物であってもよい。また、本発明は、式（Ｉ）の化合物の全ての互変異性型を含む。
【００２９】
本願明細書において、「薬学的に許容可能な塩」なる用語は、患者に有害でない塩類を示すことを目的とする。このような塩類は、薬学的に許容可能な酸付加塩類、薬学的に許容可能な金属塩、アンモニウム及びアルキル化アンモニウム塩を含む。酸付加塩類は、無機酸及び有機酸の塩類を含む。適切な無機酸の代表例は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸などを含む。適切な有機酸の代表例は、ギ酸，酢酸，トリクロロ酢酸，トリフルオロ酢酸，プロピオン酸，安息香酸，桂皮酸，クエン酸，フマル酸，グルコール酸，乳酸，マレイン酸，リンゴ酸，マロン酸，マンデル酸，シュウ酸，ピクリン酸，ピルビン酸，サリチル酸，スクシン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，酒石酸，アスコルビン酸，パモン酸，ビスメチレンサリチル酸，エタンジスルホン酸，グルコン酸，シトラコン酸，アスパラギン酸，ステアリン酸，パルミチン酸，ＥＤＴＡ，グルコール酸，ｐ−アミノ安息香酸，グルタミン酸，ベンゼンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸などを含む。薬学的に許容可能な無機または有機酸付加塩類の更なる例は、J. Pharm. Sci. 66, 2 (1977)に列挙されている薬学的に許容可能な塩類を含む。J. Pharm. Sci. 66, 2 (1977)は本願明細書に引用により組み込まれる。金属塩の例としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム塩などが挙げられるが、これに限定されるものではない。アンモニウム及びアルキル化アンモニウム塩の例は、アンモニウム，メチルアンモニウム，ジメチルアンモニウム，トリメチルアンモニウム，エチルアンモニウム，ヒドロキシエチルアンモニウム，ジエチルアンモニウム，ブチルアンモニウム，メトラメチルアンモニウム塩等を含む。また、本発明は、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩類を含む。
【００３０】
本願明細書において使用する「溶媒和物」なる用語は、ある溶質と溶媒によって形成される所定の化学量論的複合体である。溶媒は、例えば、水、エタノールまたは酢酸であってもよい。
【００３１】
ある実施態様において、本発明は、Ｘ１が低級アルコキシカルボニル，低級アルケニルオキシカルボニル，アルキニルオキシカルボニル，シクロアルキルオキシカルボニル，シクロアルキルアルキルオキシカルボニル，アリールオキシカルボニル，アリールアルキルオキシカルボニル，又はヘテロアリールアルキルオキシカルボニル，低級アルキルアミノカルボニル，低級アルケニルアミノカルボニル，アルキニルアミノカルボニル，シクロアルキルアミノカルボニル，シクロアルキルアルキルアミノカルボニル，アリールアミノカルボニル，アリールアルキルアミノカルボニル，又はヘテロアリールアルキルアミノカルボニル，低級アルカノイル，低級アルケノイル，低級アルカジエニル，アルキノイル，シクロアルカノイル，シクロアルキルアルカノイル，シクロアルケニルアルカノイル，アロイル，アリールアルカノイル，又はヘテロアリールアルカノイルを表し、該基が場合によりハロゲン，ヒドロキシル，低級アルキル，低級アルコキシ，低級アルキルチオ，又はシアノで置換される、式（Ｉ）の化合物に関する。別の実施態様において、Ｘ１は低級アルコキシカルボニル，低級アルケニルオキシカルボニル，アルキニルオキシカルボニル，シクロアルキルオキシカルボニル，シクロアルキルアルキルオキシカルボニル，低級アルキルアミノカルボニル，低級アルケニルアミノカルボニル，アルキニルアミノカルボニル，シクロアルキルアミノカルボニル，シクロアルキルアルキルアミノカルボニル，低級アルカノイル，低級アルケノイル，アルキノイル，シクロアルカノイル，又はシクロアルキルアルカノイルを表し，該基が場合によりハロゲン，低級アルキル，低級アルコキシ，又は低級アルキルチオで置換される。更に別の実施態様において、Ｘ１はメトキシカルボニル，エトキシカルボニル，プロピルオキシカルボニル，２−（メトキシ）エトキシカルボニル，２−（メチルチオ）エトキシカルボニル，イソプロポキシカルボニル，アリルオキシカルボニル，２−クロロアリルオキシカルボニル，プロパルギルオキシカルボニル，イソブトキシカルボニル，シクロブチルオキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル，シクロプロピルメチルオキシカルボニル，メチルアミノカルボニル，ジメチルアミノカルボニル，エチルアミノカルボニル，ジエチルアミノカルボニル，プロピルアミノカルボニル，イソプロピルアミノカルボニル，アリルアミノカルボニル，シクロブチルアミノカルボニル，シクロペンチルアミノカルボニル，シクロプロピルメチルアミノカルボニル，アセチル，プロピオニル，ブチリル，ペンタノイル，３−シクロプロピルプロピオニル，ｐｅｎｔ−４−エノイル，２−メチル４−ペンテノイル，４−ヘキセノイル，３−シクロペンテン−１−オイル，４，５，５−トリフルオロペント−４−エノイル，又はヘキサ−２，４−ジエノイルを表す。ある実施態様において、Ｘ１はプロピルオキシカルボニルを表す。
【００３２】
いくつかの実施態様において、本発明は式（Ｉ）の化合物であって、Ｘ２は４−アミジノＰｈｅ，Ａｒｇ，ホモＡｒｇ，Ｏｒｎ，Ｌｙｓ，Ｄａｂ，又はＤａｐを表すものに関する。他の実施態様において、Ｘ２は、４−アミジノＰｈｅ、Ａｒｇ、ホモＡｒｇ、ＯｒｎまたはＬｙｓを表す。さらに別の実施態様において、Ｘ２は、４−アミジノＰｈｅを表す。
【００３３】
いくつかの実施態様において、本発明は式（Ｉ）の化合物であって、Ｘ３は  Ｇｌｕ，Ａｓｐ，（α−Ｍｅ）Ｇｌｕ，１−アミノシクロブタン−トランス−１，３−ジカルボン酸、又は１−アミノシクロブタン−シス−１，３−ジカルボン酸を表すものに関する。別の実施態様において、Ｘ３はＧｌｕを表す。
【００３４】
いくつかの実施態様において、本発明は式（Ｉ）の化合物であって、Ｘ４はＡｒｇ，ホモＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｒｐ，Ｐｈｅ，Ｐｈｇ，Ｇｌｕ，Ｄ−Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｄ−Ａｓｐ，Ｄａｂ，Ｄａｐ，Ｎβ−［アミジノ］−Ｄａｐ，又はＮγ−［アミジノ］Ｄａｂを表すものに関する。他の実施態様において、Ｘ４はＡｒｇ，ホモＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｄａｂ，又はＤａｐを表す。さらに他の実施態様において、Ｘ４はＡｓｎまたはＧｌｎを表す。
【００３５】
いくつかの実施態様において、本発明は式（Ｉ）の化合物であって、Ｘ５はＰｈｇ，Ｄ−Ｐｈｇ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ａｉｂ，Ｔｒｐ，Ａｂｕ，Ａｌｌｅ，Ｃｈａ，Ｈｐｈ，Ｎｌｅ，又はＮｖａを表す。他の実施態様において、Ｘ５はＰｈｅ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｃｈａ，Ｇｌｙ，又はＴｒｐを表す。さらに他の実施態様において、Ｘ５はＰｈｅ，Ｃｈａ，又はＴｒｐを表す。
【００３６】
いくつかの実施態様において、本発明は式（Ｉ）の化合物であって、Ｘ６はＡｒｇ，ホモＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ｏｒｎ，又はＬｙｓ(ｍＰｅｇ(１-１０ｋ)-ＣＯ)を表すものに関する。他の実施態様において、Ｘ６はＨｉｓ，Ａｒｇ，ホモＡｒｇ，又はＯｒｎを表す。さらに別の実施形態では、Ｘ６はＡｒｇを表す。
【００３７】
いくつかの実施態様において、本発明は式（Ｉ）の化合物であって、Ｘ７は一般式-ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)１-１０-(ＣＨ２)１-５-Ｃ(=Ｏ)-のジラジカルを表す。さらに他の実施態様において、Ｘ７は-ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)-又は-ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)３-Ｃ(=Ｏ)-を表す。
【００３８】
本発明の一実施態様において、ＹはＮＨ２を表し、別の実施態様ではＯＨを表す。
いくつかの実施態様において、本発明は式（Ｉ）であって、ｎが０または３−６であり、ｍが０−２０であるるが、但しｎとｍは同時にゼロに成らない化合物に関する。他の実施態様において、ｎは３−６であり、ｍは０である。さらに別の実施形態では、ｎは３であり、ｍは０である。他の実施態様において、ｎは０であり、ｍは１−２０である。さらに別の実施形態では、ｎは０であり、ｍは５である。なお更なる実施態様において、ｎは０であり、ｍは１０である。
【００３９】
更なる実施態様において、式（Ｉ）を有する化合物は、
プロピルオキシカルボニル-(４-アミジノ-Ｐｈｅ)-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)]５-ＮＨ２;プロピルオキシカルボニル-(４-アミジノ-Ｐｈｅ)-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)]１０-ＮＨ２;プロピルオキシカルボニル-(４-アミジノ-Ｐｈｅ)-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[Ａｒｇ]３-ＮＨ２;プロピルオキシカルボニル-ホモＡｒｇ-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)]５-ＮＨ２;プロピルオキシカルボニル-ホモＡｒｇ-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)]１０-ＮＨ２;プロピルオキシカルボニル-ホモＡｒｇ-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[Ａｒｇ]３-ＮＨ２、それらの任意の及び全ての立体異性体、式Ｉの当該化合物の任意の比率における２以上の混合物、その生理学的に許容可能な塩類及びそのプロドラックのリストから選択される。  
【００４０】
式Ｉの化合物は、第ＶＩＩ因子ポリペプチド（それらの活性型において）の可逆的インヒビターである。好ましくは、それらは第ＶＩＩ因子ポリペプチドの特異的なインヒビターである。本願明細書において使用する場合、第ＶＩＩａ因子活性の阻害に関して使われる特異的用語は、式Ｉの化合物が血液凝固に関係する他の特定のプロテアーゼおよび／または例えば、第Ｘａ因子、プラスミン、トロンビン、第ＩＸａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩａ因子及び組織−プラスミノーゲンアクティベータ（ｔＰＡ）（同じ濃度のインヒビターを使用する）を含む線維素溶解経路の活性を実質的に阻害することなしに第ＶＩＩ因子活性を阻害できることを意味する。  
【００４１】
本願明細書は、第ＶＩＩ因子ポリペプチド及び血液凝固および／または線維素溶解経路に関係する他の特定のプロテアーゼのための阻害定数（Ｋｉ）を決定するアッセイ及び方法（下記参照）を記載する。
【００４２】
本発明の好ましい実施態様において、式Ｉの化合物は、以下の１又は複数を呈する：
Ｋｉ（第Ｘａ因子）の１／１０未満（１／２０未満、１／５０未満、１／１００未満、１／２００未満、１／５００未満、１／２から１／１０、１／１０から１／２０、１／１０から１／５０、１／２０から１／１００、１／５０から１／２００、１／１００から１／５００、１／１００から１／１０００、１／２００から１／１０００）のａＫｉ（活性型第ＶＩＩ因子ポリペプチド）（同濃度のインヒビターを使用）；
Ｋｉ（プラスミン）の１／１０未満（１／２０未満、１／５０未満、１／１００未満、１／２００未満、１／５００未満、１／２から１／１０、１／１０から１／２０、１／１０から１／５０、１／２０から１／１００、１／５０から１／２００、１／１００から１／５００、１／１００から１／１０００、１／２００から１／１０００）のａＫｉ（活性型第ＶＩＩ因子ポリペプチド）（同濃度のインヒビターを使用）；
Ｋｉ（トロンビン）の１／１０又はそれ未満（１／２０又はそれ未満、１／５０又はそれ未満、１／１００又はそれ未満、１／２００又はそれ未満、１／５００又はそれ未満、１／２から１／１０、１／１０から１／２０、１／１０から１／５０、１／２０から１／１００、１／５０から１／２００、１／１００から１／５００、１／１００から１／１０００、１／２００から１／１０００）のａＫｉ（活性型第ＶＩＩ因子ポリペプチド）（同濃度のインヒビターを使用）；
Ｋｉ（第ＩＸａ因子）の１／１０又はそれ未満（１／２０又はそれ未満、１／５０又はそれ未満、１／１００又はそれ未満、１／２００又はそれ未満、１／５００又はそれ未満、１／２から１／１０、１／１０から１／２０、１／１０から１／５０、１／２０から１／１００、１／５０から１／２００、１／１００から１／５００、１／１００から１／１０００、１／２００から１／１０００）のａＫｉ（活性型第ＶＩＩ因子ポリペプチド）（同濃度のインヒビターを使用）；
Ｋｉ（第ＸＩａ因子）の１／１０又はそれ未満（１／２０又はそれ未満、１／５０又はそれ未満、１／１００又はそれ未満、１／２００又はそれ未満、１／５００又はそれ未満、１／２から１／１０、１／１０から１／２０、１／１０から１／５０、１／２０から１／１００、１／５０から１／２００、１／１００から１／５００、１／１００から１／１０００、１／２００から１／１０００）のａＫｉ（活性型第ＶＩＩ因子ポリペプチド）（同濃度のインヒビターを使用）；
Ｋｉ（第ＸＩＩａ因子）の１／１０又はそれ未満（１／２０又はそれ未満、１／５０又はそれ未満、１／１００又はそれ未満、１／２００又はそれ未満、１／５００又はそれ未満、１／２から１／１０、１／１０から１／２０、１／１０から１／５０、１／２０から１／１００、１／５０から１／２００、１／１００から１／５００、１／１００から１／１０００、１／２００から１／１０００）のａＫｉ（活性型第ＶＩＩ因子ポリペプチド）（同濃度のインヒビターを使用）；
Ｋｉ（ｔＰＡ）の１／１０又はそれ未満（１／２０又はそれ未満、１／５０又はそれ未満、１／１００又はそれ未満、１／２００又はそれ未満、１／５００又はそれ未満、１／２から１／１０、１／１０から１／２０、１／１０から１／５０、１／２０から１／１００、１／５０から１／２００、１／１００から１／５００、１／１００から１／１０００、１／２００から１／１０００）のａＫｉ（活性型第ＶＩＩ因子ポリペプチド）（同濃度のインヒビターを使用）。
【００４３】
第ＶＩＩ因子ポリペプチド  
本願明細書で使用する「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」または「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第ＶＩＩａ因子（すなわち米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）のアミノ酸配列１−４０６を含む任意のタンパク質、その変異体、加えて第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、第ＶＩＩ因子誘導体及び第ＶＩＩ因子コンジュゲートを意味する。これは、野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して同等あるいは改良された生物学的活性を示すＦＶＩＩ変異体、第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、第ＶＩＩ因子誘導体及び第ＶＩＩ因子コンジュゲートを含む。
【００４４】
「第ＶＩＩ因子」なる用語は、未切断（チモーゲン）形態の第ＶＩＩ因子ポリペプチド、加えてそれら各々の生物活性形態（第ＶＩＩａ因子と呼ばれる）を生ずるためにタンパク質加水分解処理されたものを含むことを意図する。典型的に、第ＶＩＩ因子は、第ＶＩＩａ因子を生ずるために、残基１５２と１５３の間で切断される。第ＶＩＩ因子のこのような変異体は、安定性、リン脂質結合性、特異的活性の変化などを含む、ヒト第ＶＩＩ因子とは異なる特性を呈することができる。
【００４５】
上記の定義の範囲内の「第ＶＩＩ因子」または「第ＶＩＩａ因子」は、個体ごとに存在するか又は生じることがある天然アリル変異を含む。また、グルコシル化または他の翻訳後修飾の程度及び位置は、選択された宿主細胞及び宿主細胞環境の性質によって異ってもよい。
本願明細書において使用する「野生型ヒトＦＶＩＩａ」は、米国特許第４７８４９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００４６】
本願明細書において使用する「第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド」は、野生型第ＶＩＩａ因子の活性に対して、第ＶＩＩａ因子の生物学的活性がかなり修飾された（例えば減少された）変異体を含む。これらのポリペプチドは、ポリペプチドの生理活性を修飾または破壊する特定のアミノ酸配列の変化が導入された第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子が挙げられるが、これに限定されるものではない。    
【００４７】
本願明細書において使われる「第ＶＩＩ因子誘導体」なる用語は、親ペプチドの１又は複数のアミノ酸が、遺伝的におよび／または化学的におよび／または酵素的に、例えばアルキル化、グルコシル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成またはアミド形成等によって修飾されている、野生型第ＶＩＩ因子に比較して実質的に同じか、又は改良された生物学的活性を呈するポリペプチドを指すことを意する。これは、ＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子、システインＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子及びその変異体を含むが、これらに限定されるものではない。第ＶＩＩ因子誘導体の非限定的な例は、ＷＯ０３／３１４６４、米国特許出願ＵＳ２００４００４３４４６、ＵＳ２００４００６３９１１、ＵＳ２００４０１４２８５６、ＵＳ２００４０１３７５５７、ＵＳ２００４０１３２６４０、ＷＯ２００７０２２５１２及びＵＳ  ２００７０１０５７５５（Neose Technologies社）に開示されているグリコＰｅｇ化ＦＶＩＩ誘導体；  ＷＯ０１／０４２８７、米国特許出願２００３０１６５９９６、ＷＯ０１／５８９３５、ＷＯ０３／９３４６５（Maxygen ApS）及びＷＯ０２／０２７６４、米国特許出願２００３０２１１０９４（ミネソタ大学）に開示されている第ＶＩＩ因子コンジュゲートを含む。
【００４８】
ＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子は、１又は複数のＰＥＧ部分が取り付けられた任意の第ＶＩＩａ因子を含む。ＰＥＧ分子は、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基または炭化水素部分を含む第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意の部分に取り付けられることができる。
【００４９】
「システインＰＥＧ化ヒト第ＶＩＩａ因子」なる用語は、第ＶＩＩａ因子配列変異体を形成するためにヒト第ＶＩＩａ因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートされたＰＥＧ分子を有する第ＶＩＩａ因子を指す。  
【００５０】
「ＰＥＧ化」なる用語は、本発明に関して「ＰＥＧ部分による官能化」と同義である。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの官能基化を表す１又は複数のＰＥＧ部分は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドのポリペプチド主鎖の任意の部分に、又は第ＶＩＩ因子ポリペプチドの不可欠な部分であるオリゴ糖（グリコＰＥＧ化第ＶＩＩ因子ポリペプチド）に、共有結合により連結されるある。グリコＰＥＧ化第ＶＩＩ因子は、出願人のより初期の出願ＷＯ２００４／０００３６６Ａ１及びＷＯ２００５／０１４０３５Ａ１に完全に記載されている。これについて、ＰＥＧ部分は、典型的には少なくとも３００Ｄａ（例えば３００−１００，０００Ｄａ）；例えば５，０００−５０，０００Ｄａ；例えば約１０，０００から約４５，０００Ｄａ；例えば約３５，０００から約４５，０００、または約４０．０００Ｄａ；または５００−２０，０００Ｄａ、または５００−１５，０００Ｄａ、または２，０００−１５，０００Ｄａ、または３，０００−１５，０００Ｄａ、または３，０００−１２，０００Ｄａ、または約１０．０００Ｄａの分子量を有する。ＰＥＧ部分は、直鎖状又は分枝状であってもよい。  
【００５１】
「改良された生物学的活性」なる用語は、ｉ）組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同じであるか又は増大したタンパク質分解性活性を有するＦＶＩＩポリペプチド、又はｉｉ）組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同じであるか又は増大されたＴＦ結合活性を有するＦＶＩＩポリペプチド、又はｉｉｉ）組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同じであるか又は増大された血漿中半減期を有するＦＶＩＩポリペプチドを指す。
組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して実質的に同じであるか又は増大されたタンパク質分解活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の非限定的例は、Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩａ，Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩａ(Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第５５８０５６０号に開示されている増大されたタンパク分解性安定性を呈する第ＶＩＩａ因子変異体；残基２９０と２９１の間または残基３１５と３１６の間でタンパク質加水分解で切断された第ＶＩＩａ因子(Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；第ＶＩＩａ因子で酸化型(Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９（ＷＯ０２／０７７２１８に対応する）に開示のＦＶＩＩ変異体；及びＷＯ０２／３８１６２（スクリップス研究所）に開示の増大されたタンパク分解安定性を呈している第ＶＩＩ因子変異体；ＷＯ９９／２０７６７、米国特許ＵＳ６０１７８８２及びＵＳ６７４７００３、米国特許出願２００３０１００５０６（ミネソタ大学）及びＷＯ００／６６７５３、ＵＳ特許出願ＵＳ２００１００１８４１４、ＵＳ２００４２２０１０６及びＵＳ２００１３１００５、米国特許ＵＳ６７６２２８６及びＵＳ６６９３０７５（ミネソタ大学）に開示されている修飾Ｇｌａ−ドメインを有し増強された膜結合性を示すＦＶＩＩ変異体；及びＷＯ０１／５８９３５、米国特許ＵＳ６８０６０６３、米国特許出願２００３００９６３３８(Maxygen ApS)、ＷＯ０３／９３４６５(Maxygen ApS)、ＷＯ０４／０２９０９１(Maxygen ApS)、ＷＯ０４／０８３３６１(Maxygen ApS)及びＷＯ０４／１１１２４２(Maxygen ApS)及びＷＯ０４／１０８７６３(Canadian Blood Services)に開示されている第ＶＩＩ因子変異体を含む。
【００５２】
野生型第ＶＩＩａ因子と比較して増大した生物学的活性を有するＦＶＩＩ変異体の非極限的例は、ＷＯ０１／８３７２５、ＷＯ０２／２２７７６、ＷＯ０２／０７７２１８、ＷＯ０３／０２７１４７、ＷＯ０４／０２９０９０、ＷＯ０５／０７５６３５、及び欧州特許出願第０５１０８７１３．８号(Novo Nordisk A/S)、ＷＯ０２／３８１６２(Scripps Research Institute)；及びＪＰ  ２００１０６１４７９に開示される増大された活性を有する第ＶＩＩａ因子変異体（Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)を含む。
【００５３】
第ＶＩＩ因子の変異体の例は、Ｐ１０Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３２Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｐ１０Ｑ／Ｋ３２Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ、及びＳ３３６Ｇ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ  −ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ���Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／���２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｄ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ  −ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ
１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ−ＦＶＩＩ、Ｓ５２Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ−第ＶＩＩ因子；Ｒ１５２Ｅ−第ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ−第ＶＩＩ因子、Ｔ１０６Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｖ２５３Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｇ２９１Ｎ−ＦＶＩＩ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ−ＦＶＩＩ；及びアミノ酸配列２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎに置換、付加または欠失を有する第ＶＩＩ因子；アミノ酸配列３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓに置換、付加または欠失を有する第ＶＩＩ因子；及びアミノ酸配列１５３Ｉｌｅから２２３Ａｒｇに置換、付加または欠失を有する第ＶＩＩ因子を含むが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
したがって、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの置換変異体は、位置Ｐ１０、Ｋ３２、Ｌ３０５、Ｍ３０６、Ｄ３０９、Ｌ３０５、Ｌ３０５、Ｆ３７４、Ｖ１５８、Ｍ２９８、Ｖ１５８、Ｅ２９６、Ｋ３３７、Ｍ２９８、Ｍ２９８、Ｓ３３６、Ｓ３１４、Ｋ３１６、Ｋ３１６、Ｆ３７４、Ｓ５２、Ｓ６０、Ｒ１５２、Ｓ３４４、Ｔ１０６、Ｋ１４３、Ｎ１４５、Ｖ２５３、Ｒ２９０、Ａ２９２、Ｇ２９１、Ｒ３１５、Ｖ３１７における置換及びアミノ酸配列Ｔ２３３からＮ２４０又はＲ３０４からＣ３２９又はＩ１５３からＲ２２３あるいはそれらの組合せにおける置換、付加または欠失、特にＰ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｌ３０５Ｖ、Ｍ３０６Ｄ、Ｄ３０９Ｓ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｔ、Ｆ３７４Ｐ、Ｖ１５８Ｔ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ、Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３３７Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｍ２９８Ｋ、Ｓ３３６Ｇ、Ｓ３１４Ｅ、Ｋ３１６Ｈ、Ｋ３１６Ｑ、Ｆ３７４Ｙ、Ｓ５２Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｒ１５２Ｅ、Ｓ３４４Ａ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１４３Ｎ、Ｎ１４５Ｔ、Ｖ２５３Ｎ、Ｒ２９０Ｎ、Ａ２９２Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ｒ３１５Ｎ、Ｖ３１７Ｔのような変異体、アミノ酸配列Ｔ２３３からＮ２４０又はＲ３０４からＣ３２９又はＩ１５３からのＲ２２３又はその組合せにおける置換、付加又は欠失を含む。
【００５５】
血液凝固における第ＶＩＩ因子（第ＶＩＩａ因子として）の生物学的活性は、（ｉ）組織因子（ＴＦ）に結合する能力及び（ｉｉ）第ＩＸ因子又第Ｘ因子のタンパク質分解性切断を触媒して活性化第ＩＸ因子又は第Ｘ因子（それぞれ第ＩＸａ因子又第Ｘａ因子）を産生する能力に由来する。ヒト第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、例えば米国特許第５９９７８６４号に記載されている第ＶＩＩ因子欠乏血漿とトロンボプラスチンを使用して、血液凝固を促進するための調製物の能力を測定するアッセイによって定量化することができる。このアッセイにおいて、生物学的活性は、コントロール試料に比較して、減少した凝固時間として表され、１単位／ｍｌの第ＶＩＩ因子活性を含むプールされたヒト血清標準との比較によって「第ＶＩＩ因子単位」に変換される。あるいは、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、一工程の凝固アッセイを用いて、特定の活性についてアッセイされてもよい（「凝血活性」）。この目的のため、試験される試料は５０ｍＭのＰＩＰＥＳバッファー（ｐＨ７．５）、０．１％のＢＳＡに希釈され、４０μｌは、４０μｌの第ＶＩＩ因子欠乏血漿及び１０ｍＭのＣａ２＋を含む８０μｌのヒト組換え組織因子と共にインキュベートされる。凝固時間（凝血時間）は、測定されて、パラレルラインアッセイの対照標準を用いた標準曲線と比較される。あるいは、第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（ｉ）脂質膜と第Ｘ因子に埋め込まれたＴＦを含む系において第Ｘａ因子を産生するに第ＶＩＩａ因子の能力を測定すること(Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；（ｉｉ）水溶液系において第Ｘ因子の加水分解を測定すること；（ｉｉｉ）表面プラスモン共鳴に基づく計測器を使用して、ＴＦに対するその物理的結合性を測定すること(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997) 及び（ｉｖ）合成基質の加水分解を測定することによって、定量化される。  
【００５６】
上記の１又は複数の凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイまたはＴＦ結合実験アッセイにおいて試験する場合、活性型（ＦＶＩＩａ）において、野生型第ＶＩＩａ因子に比較して、実質的に同じであるか又は改良された生物学的活性を有する第ＶＩＩ因子変異体は、同じ細胞型で産生された第ＶＩＩａ因子の特異的活性の少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、更により好ましくは少なくとも約７５％及び最も好ましくは少なくとも約９０％を示すものを含む。    
【００５７】
いくつかの実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドはヒト第ＶＩＩａ因子（ｈＦＶＩＩａ）、好ましくは組換えにより作成されたヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＶＩＩａ）である。他の実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子配列変異体である。いくつかの実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩ因子とは異なるグルコシル化を有する。いくつかの実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは第ＶＩＩ因子誘導体であり、特にグリコＰＥＧ化された第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含むＰＥＧ化第ＶＩＩ因子ポリペプチド）である。特定の実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、グリコＰＥＧ化第ＶＩＩ因子ポリペプチドである。ある実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、５．０００−５０．０００Ｄａ、例えば約１０．０００ｄａ（「１０Ｋ−ＰＥＧ」）または約４０．０００ｄａ（「４０Ｋ−ＰＥＧ」））の分子量を有するＰＥＧ部分によって官能化されている。特定の実施態様では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ＰＥＧ部分が約１０．０００Ｄａ（「１０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ」）の分子量または約４０．０００Ｄａ（「４０Ｋ−ＰＥＧ−ｒＦＶＩＩａ」）の分子量を有するグリコＰＥＧ化されたヒトＦＶＩＩａである。
【００５８】
様々な実施態様（例えば第ＶＩＩ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子関連のポリペプチドまたはその第ＶＩＩ因子配列変異体である）において、本願明細書に記載の通り「インビトロ・タンパク質分解アッセイ」（アッセイ２）で試験する場合、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然ヒト第ＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比率は少なくとも約１．２５、好ましくは少なくとも２．０または４．０、最も好ましくは少なくとも約８．０である。いくつかの実施態様において、特定の変異体において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは第ＶＩＩ因子関連のポリペプチドであり、ここで「インビトロ加水分解アッセイ」（下記のアッセイ１を参照）で試験される場合、前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然ヒト第ＶＩＩａ因子（野生型第ＶＩＩａ因子）の活性との間の比率は少なくとも約１．２５であり；他の実施態様では、比率は少なくとも約２．０であり；更なる実施態様では、比率は少なくとも約４．０である。
【００５９】
本発明の化合物を調製する方法
本発明のペプチドは、ペプチド合成のよく知られている技術、例えばMerrifield, J. Am. Chem. Soc., 15: 2149-2154(1963)に最初に記載されているような固相合成技術に従い合成されてよい。他のペプチド合成技術は、例えば、M. Bodanszkyら,(1976) Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 第2版；Kent及びClark-Lewis, Synthetic Peptides in Biology and Medicine, p. 295-358, eds. Alitalo, Kら Science Publishers,(Amsterdam, 1985)；並びに当業者に知られている他の参考文献に見出され得る。
本発明の式(Ｉ)の化合物は、一般的に以下に記載の手順により調製されうる：
【００６０】
ペプチド合成
ペプチドを、Ｆｍｏｃ保護基の脱保護のＮＭＰ及びＵＶモニタリングにおいて、ＨＢＴＵ-媒介性カップリングを使用し、製造者から供給されているＦａｓｔＭｏｃ ＵＶプロトコルを用い、０．２５ｍｍｏｌスケールにてアプリド・バイオシステム(Applied Biosystems)４３３Ａペプチド合成器でＦｍｏｃ法を使用し、ワン(Wang)樹脂(ペプチド酸)又はＦｍｏｃ保護されたリンク(Rink)アミド樹脂(Novabiochem)(ペプチドアミド)において合成した。使用する保護されたアミノ酸誘導体を、ＡＢＩ４３３Ａ合成器に適切な、事前計量されたカートリッジに供給された標準Ｆｍｏｃ-アミノ酸(Anaspec)とした。ペプチドカルバメートについては、アルコール又はフェノールの炭酸スクシンイミジルを用いてペプチドを処理することにより、支持体からペプチドを切断した後、固相又は溶液にカルバモイル基を導入し、ＭｅＣＮにおいて、ＤＩＰＥＡ及び炭酸ジスクシンイミジルを用いて、対応するアルコール又はフェノールを処理することにより調製した(Goshら, Tetrahedron Lett 1992, 33(20)、2781-2784)。ペプチド尿素については、イソシアナートを用いて、樹脂に結合したペプチドを処理することにより、アミノカルボニル基を固相に導入した。アシル化されたペプチドの場合では、Ｆｍｏｃ-保護されたアミノ酸を用いてアシル化するのと同様のプロトコルを使用し、対応するカルボン酸を使用して最後のアシル化を実施した。従来からの方法の手段、例えばトリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシラン(９５：２．５：２．５)の混合物と共に室温で攪拌することにより、ペプチドを樹脂から切断することができる。従来からのプロトコルを使用し、全ての生成物を、予備ＨＰＬＣにより精製し、内部標準を使用して、ＵＶ-吸収又は１Ｎ ＮＭＲにより定量した。
【００６１】
医薬製剤及び第ＶＩＩ因子ポリペプチドの投与
一般的に、本発明の水性で液状の第ＶＩＩ因子ポリペプチド製剤又は組成物(本発明の水性医薬組成物)は、−水性製剤が出発から水性液体に存在する、又は水もしくは他の水性担体又はビヒクルを添加し、実質的に固体状の製剤(例えば、凍結乾燥された調製物)を溶解／再構成させることにより生成されるかにかかわらず−非経口的、すなわち静脈内、皮下、又は筋肉内、もしくは連続又はパルス注入による投与に適している。
【００６２】
ヒト患者における使用について、非経口投与用の本発明の第ＶＩＩ因子ポリペプチド組成物は、適切な濃度の式(Ｉ)の化合物又はその生理学的に耐性のある塩に加えて、好ましくは製薬的に許容可能な水性担体と組合せて、好ましくは溶解させて、通常は第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する。多様な水性担体、例えば水、緩衝水、０．４％の生理食塩水、０．３％のグリシン等を使用してもよい。また、本発明の第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、損傷部位に送達する又は標的とするリポソーム調製物に製剤されてもよい。リポソーム調製物は、一般的に、例えば米国特許第4,837,028号、米国特許第4,501,728号、及び米国特許第4,975,282号に記載されている。組成物は、従来からよく知られている滅菌技術により滅菌されてもよい。得られた水溶液は、使用用に包装されてよく、又は無菌条件下で濾過される、凍結乾燥されてよく、凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌水又滅菌水溶液(担体、ビヒクル)と組合せられる。本組成物は、生理条件に近づける、及び／又は組成物の化学的及び／又は物理的安定性を高めるために必要な、製薬的に許容可能な補助物質をさらに含有していてもよい。これらには：ｐＨ調節剤及び／又は緩衝剤、例えばシタラート(クエン酸ナトリウム又はクエン酸カリウム)、アセテート(酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム又は酢酸カルシウム)、ヒスチジン(Ｌ-ヒスチジン)、マラート、ホスファート(リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム)、酒石酸、コハク酸、ＭＥＳ(２-Ｎ-モルホリノ-エタンスルホン酸)、ＨＥＰＥＳ(４-(２-ヒドロキシ-エチル)-ピペラジン-１-エタン-スルホン酸)、イミダゾール、トリス[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]、ラクタート、及びグルタマートが含まれる。バッファー濃度は、溶液の好ましいｐＨを維持するように選択される。また緩衝剤は、混合物が特定の範囲のｐＨ値が提供できるように、２又はそれ以上の緩衝剤の混合物、例えばこのような薬剤２つの混合物であってよい。一実施態様では、バッファーはシタラートと、少なくとも一のバッファーアセテート(酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、又は酢酸カルシウム)、ヒスチジン(Ｌ-ヒスチジン)、マラート、ホスファート(リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム)、酒石酸、コハク酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、トリス、ラクタート、及びグルタマートとの混合物である。緩衝剤(類)の全体的な濃度は、典型的には、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、例えば約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、多くの場合は約１ｍＭ〜約２５ｍＭ、例えば約２ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である。
【００６３】
カルシウム塩：組成物は−最初から液状、フリーズドライ又は再構成された形態にかかわらず−場合によってはカルシウム塩を含有していてもよい。カルシウム塩は低濃度、例えば約０．１ｍＭ〜約５ｍＭで存在していてもよく；また中程度の濃度、例えば約５ｍＭ〜約１５ｍＭで存在していてもよく；又は高濃度、例えば約１５ｍＭ〜約１０００ｍＭで存在していてもよい。一態様では、カルシウム塩は：塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、及びカルシウムラエブラート(laevulate)、及び２又はそれ以上のそれらの混合物から選択される。また、組成物におけるカルシウムイオンの濃度は、０．１ｍＭ以下であってよい。
【００６４】
浸透圧調節剤(製剤の浸透圧に寄与する浸透圧修正物質)は、例えばアミノ酸、小ペプチド(例えば２〜５のアミノ酸残基を有するもの)、中性塩、単糖類又は二糖類、多糖類、糖アルコール、又はこれらの物質の少なくとも２の混合物である。特定の例には、限定されるものではないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム、スクロース、グルコース及びマンニトールが含まれる。浸透圧調節剤の濃度は、製剤に存在する他の成分に応じて、等張に近づくように調節される。一般的に、浸透圧調節剤は、存在する他の成分に応じて、約１〜約５００ｍＭ、例えば約１〜約３００ｍＭ、多くの場合は約１０〜約２００ｍＭ、例えば約２０〜約１５０ｍＭの濃度で導入される。中性塩、例えば塩化ナトリウム又は塩化カリウムが使用されてもよい。「中性塩」なる用語は、実質的に酸性でも塩基性でもない、すなわち溶解した際に、製剤のｐＨにほとんど又は全く影響を及ぼさない塩を示す。
【００６５】
適切なポリソルベート又はトゥイーンＴＭ型の界面活性剤、典型的には特に非イオン性界面活性剤(例えば、ポリソルベートＴＭ２０又は８０、又はトゥイーンＴＭ８０)、又はプルロニック(Pluronic)ＴＭ型のポロキサマー(例えば、ポロキサマーＴＭ１８８又は４０７)。導入される界面活性剤の量は、典型的には約０．００５〜約１％重量／重量(ｗ／ｗ)の範囲であってよく、約０．００５〜約０．１％ｗ／ｗ、例えば約０．００５〜０．０２％ｗ／ｗの量が典型的には好ましい。いくつかの状況で、比較的高濃度、例えば約０．５％ｗ／ｗまでであることが、タンパク質の安定性を維持するのに好ましい。しかしながら、現実実務で使用される界面活性剤のレベルは、通例、臨床診療により制限される。
【００６６】
酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、シスチン、シススタチオニン(cysstathionine)、メチオニン、グルタチオン、又はシステイン又はメチオニンを含有するペプチド；メチオニン、特にＬ-メチオニンが、典型的には非常に適した酸化防止剤である。酸化防止剤は、典型的には、約０．１〜約２ｍｇ／ｍｌの濃度で導入される。
【００６７】
保存料(微生物の成長を遅らせるために製剤に含有せしめられ、よって、例えばＦＶＩＩポリペプチドの「多用途」包装を可能にする)。保存料の例には、フェノール、ベンジルアルコール、オルト-クレゾール、メタ-クレゾール、パラ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。保存料は、典型的には、ｐＨの範囲及び保存料の種類に応じて、約０．１〜約２ｍｇ／ｍｌの濃度で導入される。
【００６８】
組成物における第ＶＩＩ因子ポリペプチドの濃度は、典型的には約０．０１％ｗ／ｗ〜約２％ｗ／ｗ(すなわち、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ)、例えば約０．０５％ｗ／ｗ〜約１．５％ｗ／ｗ(すなわち、約０．５ｍｇ／ｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ)、例えば約０．０５％ｗ／ｗ〜約１％ｗ／ｗ(すなわち、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ)で広範囲に変化させることができ、主として、選択された特定の投与方式に従い、流体容量、粘度等に基づき選択されるであろう。第ＶＩＩａ因子の場合、濃度は、しばしばｍｇ／ｍｌ又は国際単位／ｍｌ(ＩＵ／ｍｌ)で表される。通常、１ｍｇのＦＶＩＩａ  は、４３０００-５６０００ＩＵ又はそれ以上に相当する。
【００６９】
本発明の液状の水性医薬組成物における、本発明の式(Ｉ)の化合物(又は化合物類)の濃度は、典型的には、少なくとも１μＭであろう。所望する(又は必要な)濃度は、典型的には選択される化合物(又は化合物類)、特に第ＶＩＩ因子ポリペプチドに対する選択された化合物(類)の結合親和性に依存する。種々の実施態様では、式(Ｉ)の化合物は、少なくとも５μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも２０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１５０μＭ、少なくとも２５０μＭ、少なくとも５００μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも２ｍＭ、少なくとも４ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも８ｍＭ、少なくとも９ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも１５ｍＭ、又は少なくとも２０ｍＭ、例えば１−１００００μＭ、１０−１００００μＭ、２０−１００００μＭ、５０−１００００μＭ、１０−５０００μＭ、１０−２０００μＭ、２０−５０００μＭ、２０−２０００μＭ、５０−５０００μＭ、０．１−１００ｍＭ、０．１−７５ｍＭ、０．１−５０ｍＭ、０．１−１０ｍＭ、０．２−７５ｍＭ、０．２−５０ｍＭ、０．２−２０ｍＭ、０．５−７５ｍＭ、又は０．５−５０ｍＭの範囲の濃度で存在してよい。
【００７０】
種々の実施態様では、式(Ｉ)の化合物とＦＶＩＩポリペプチドとのモル比は：０．１以上、０．５以上、１以上、２以上、５以上、１０以上、２５以上、１００以上、２５０以上、１０００以上、２５００以上、又は５０００以上、例えば０．１−１００００、０．１−５０００、０．１−２５００、０．１−１０００、０．１−２５０、０．１−１００、０．１−２５、０．１−１０、０．５−１００００、０．５−５０００、０．５−２５００、０．５−１０００、０．５−２５０、０．５−１００、０．５−２５、０．５−１０、１−１００００、１−５０００、１−２５００、１−１０００、１−２５０、１−１００；１−２５；１−１０、１０−１００００、１０−５０００、１０−２５０、１０００−１００００、又は１０００−５０００の範囲であってよい。
【００７１】
非経口的に投与可能な組成物を調製する方法は、当業者にとっては公知であるか又は明らかであり、さらなる詳細は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, Easton, PA(1990)に記載されている。
【００７２】
熟考した治療介入に関連した処置(例えば外科的処置)について、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、典型的には、治療介入の実施前の２４時間以内、その後７日又はそれ以上で投与される。
【００７３】
血液凝固剤としての投与は、ここに記載されているような多様な経路によりなすことができる。第ＶＩＩ因子ポリペプチド(例えば、ｒｈＦＶＩＩａ)の用量は、被験者の体重及び病状の重症度に応じて、充填及び維持量として、７０ｋｇの患者に対しては、通常約０．０５ｍｇ／日〜５００ｍｇ／日、好ましくは約１ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日、より好ましくは約１０ｍｇ／日〜約１７５ｍｇ／日の範囲である。
【００７４】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する組成物は、予防的及び／又は治療的処置のために投与されてよい。治療的適用において、組成物は、上述した病状を既に患っている被験者に、病状及びその合併症を治癒、軽減、又は部分的に停止させるのに十分な量で投与される。このことを達成するのに適した量は、「治療的有効量」と定義される。当業者に理解されているように、この目的にとって有効な量は、病状又は損傷の重症度、並びに体重及び被験者の一般的健康状態に依存するであろう。
【００７５】
ＦＶＩＩポリペプチド(例えば、ｒｈＦＶＩＩａ)の医薬組成物は、一般的に、生死にかかわるか又は潜在的に生死にかかわる医学的病状又は状態に関して使用され、このような環境においては−異物の量を最小にすることに関連した一般的利点に鑑み、ヒト第ＶＩＩ因子ポリペプチドの免疫原性の一般的欠如を考慮すると−非常に過剰の当該第ＶＩＩ因子ポリペプチドを投与することが可能であり、また処置医に所望されるかもしれない、ということを念頭に置くべきである。
【００７６】
予防的適用において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する組成物は、患者自身の凝固能力を高めるために、病気の状態又は損傷を受け易い、そうでなければそのような危険性にある被験者に投与される。このような目的で使用される用量(「予防的有効量」と称されてもよい)は、今度の場合も、被験者の体重及び一般的な健康状態に依存するが、７０キログラムの被験者に対しては、一般的には約０．０５ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、より一般的には約１．０ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日の範囲である。
【００７７】
特に、ヒト被験者にｒｈＦＶＩＩａを投与する場合には、用量レベルは、一般的に投与毎に約９０-１２０μｇ／ｋｇ体重の範囲にある。しかしながら、幾分高用量、例えば１５０μｇ／ｋｇ体重より過度の用量、ある場合には約２５０−３００μｇ／ｋｇの用量が好ましい。
【００７８】
当該問題の組成物の単一又は複数回投与は、処置医により選択される用量レベル及び投与計画を使用して実施されてよい。日常保守レベルが要求されている外来患者用には、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、例えば携帯用ポンプシステムを使用し、連続注入により投与されてよい。
【００７９】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの局所投与、例えば局所適用は、例えば噴霧、灌流により、ダブルバルーンカテーテル又はステントを使用することにより、コートバルーンカテーテルに対しヒドロゲルの形態で、移植血管又はステントに導入することにより、又は他の十分に確立された方法により実施されてよい。いずれにしろ、当該問題の医薬組成物は、被験者を効果的に処置するのに適した量の第ＶＩＩ因子ポリペプチドを提供すべきである。
【００８０】
液状の製薬用調製物は、２℃〜８℃の範囲の温度で保存された場合、典型的には少なくとも６ヶ月、好ましくは３６ヶ月安定しているべきである。多くの場合、高含有量のインヒビターが必要とされているが、液状の製薬用調製物は、高温でさえ、例えば周囲温度、特に２０℃〜３０℃で安定しているのが好ましいと理解されるべきである。
【００８１】
「安定」なる用語は、２℃〜８℃で６ヶ月保存した後、最初の液状の製薬用調製物が、その最初の生物活性の少なくとも５０％を保持していることを示すことを意図している。好ましくは、液状の製薬用調製物は、２〜８℃で６ヶ月保存した後、最初の活性の少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を保持している。
【００８２】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドに関し、「安定」なる用語は、(ｉ)２℃〜８℃で６ヶ月保存した後、最初の液状の製薬用調製物が、一工程の凝血アッセイ(アッセイ４)で測定した場合に、最初の生物活性の少なくとも５０％を保持している、(ｉｉ)２℃〜８℃で６ヶ月保存した後、最初の液状の製薬用調製物が、重鎖分解生成物を全く含有していない(すなわち、第ＶＩＩ因子ポリペプチドのみがパーセンテージ算定に入る)と仮定して、重鎖分解生成物の含有量が最大で４０％(ｗ／ｗ)であることを示すことを意図している。好ましくは、最初の液状の製薬用調製物は、２〜８℃で６ヶ月保存した後、最初の活性の少なくとも少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を保持している。また好ましくは、最初の液状の製薬用調製物中の重鎖分解生成物の含有量は、最大で３０％(ｗ／ｗ)、最大で２５％(ｗ／ｗ)、最大で２０％(ｗ／ｗ)、最大で１５％(ｗ／ｗ)、最大で１０％(ｗ／ｗ)、最大で５％(ｗ／ｗ)、又は最大で３％(ｗ／ｗ)である。
【００８３】
よって、上で概要を述べたように、「安定化された組成物」とは、物理的安定性が増加、化学的安定性が増加、又は物理的及び化学的安定性が増加した組成物を意味する。一般的に、組成物は、有効期限に達するまで、使用及び保存中に(推奨される使用及び保存条件で)安定していなければならない。
【００８４】
一実施態様では、ＦＶＩＩポリペプチドと式(Ｉ)の化合物を含有する医薬組成物は、(２-８℃の)保存で６ヶ月以上、周囲温度での使用で１週間以上安定している。さらなる実施態様では、ＦＶＩＩポリペプチドと式(Ｉ)の化合物を含有する医薬組成物は、(２-８℃の)保存で２４ヶ月以上、周囲温度での使用で４週間以上安定している。さらなる他の実施態様では、ＦＶＩＩポリペプチドと式(Ｉ)の化合物を含有する医薬組成物は、(２−８℃の)保存で３６ヶ月以上、周囲温度での使用で６週間以上安定している。
【００８５】
理解されるように、ここで定められた液状の水性医薬組成物は、医薬の分野で使用することができる。よって、特に本発明は、薬剤、特に第ＶＩＩ因子ポリペプチドが有効である病状又は疾患を処置する薬剤として使用される、ここで定められた液状の水性医薬組成物を提供する。
【００８６】
従って、本発明は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが有効である病状又は疾患を処置する薬剤を調製するための、ここで定められた液状の水性医薬組成物の使用、並びに第ＶＩＩ因子ポリペプチドが有効である病状又は疾患を処置するための方法、ここで定められた液状の水性医薬組成物を有効量、それを必要とする被験者に投与することを含む方法を提供する。
【００８７】
本発明の調製物は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドが有効である病状又は疾患、限定されるものではないが、凝固因子欠乏症に起因するものを含む出血性疾患(例えば、インヒビターを有する又は有さない先天性血友病Ａ、後天性血友病Ａ、インヒビターを有する又は有さない先天性血友病Ｂ、後天性血友病Ｂ、第ＸＩ凝固因子欠乏症、第ＶＩＩ凝固因子欠乏症)、フォン・ヴィルブランド病、血小板異常又は血小板欠乏症(例えば、血小板数の低下)、又は血小板減少症の処置に使用されてよい。ここで使用される場合、「出血性疾患」なる用語は、出血に表れる、細胞又は分子由来の任意の欠損、先天的、獲得又は誘発されるものを表す。第ＶＩＩ因子ポリペプチドが有効である病状又は疾患には、限定されるものではないが、脊髄又は心臓手術、整形外科手術(例えば、腰、肘、膝)、又は腹腔鏡手術、穿通性又は鈍的外傷、穿通性頭部外傷を含む頭部外傷、脳内出血に関連した出血、誘発性止血不全(induced defective haemostasis)に関連した出血、例えば抗凝固治療又は抗線維素溶解治療に関連した出血、及び任意の原因による制御できない過度の出血を含む、手術又は外傷に関連した広範囲にわたる組織損傷を被った被験者における出血も含まれる。広範囲にわたる組織損傷の場合、正常な止血メカニズムは、即時止血の要求に圧倒され、他の正常な止血メカニズムにかかわらず、出血が生じるおそれがある。さらに、外科的止血の可能性が制限されている器官、例えば脳、内耳領域、眼、肝臓、肺、腫瘍組織、及び胃腸管における出血、並びに出血が拡散している場合(出血性胃炎及び大量の子宮出血)も含まれる。これら全ての状況に共通しているのは、外科的手法(縫合、クリップ等)による止血が困難であるということである。
【００８８】
「有効量」なる用語は、所望する応答を達成するための用量を設定する有資格者により決定される有効な用量である。用量を考慮するための要因には、作用強度、生物学的利用能、所望する薬物動態／薬力学的プロフィール、処置状況、患者関連の要因(例えば、体重、健康状態、年齢等)、同時投与される薬物(例えば、抗凝固剤)の存在、投与時間、又は医療実施者に公知の他の要因が含まれる。
【００８９】
「処置」なる用語は、病気、病状又は疾患に抗することを目的として、被験者、例えば哺乳動物、特にヒトを管理及び世話することとして定義され、徴候又は合併症の発症を予防し、又は徴候又は合併症を軽減し、又は病気、病状又は疾患を排除するために、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを投与することを含む。第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する本発明の医薬組成物は、このような処置を必要とする被験者に、非経口的に投与されてよい。非経口的投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジ等の手段により実施することができる。また、非経口投与は注入ポンプ等の手段により実施することもできる。
重要な実施態様では、医薬組成物は、当該技術で公知の方法による、皮下、筋肉内、又は静脈内注射に適している。
【００９０】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドと、一又は複数の本発明の化合物(Ｉ)を含有する医薬組成物は、一又は複数の凝固因子、例えば制限するものではないが、第ＸＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子Ｉ、第ＩＸ因子、他の第ＶＩＩ因子ポリペプチド、又はＦＥＩＢＡＴＭをさらに含有するか、又は併用して使用され得る。
【００９１】
本発明のさらなる態様
ある程度、上に既に示されているように、本発明のさらなる態様には、以下のものが含まれる：
本発明の一又は複数の化合物、又はその生理学的に耐性のある塩；及び第ＶＩＩ因子ポリペプチド(例えば、野生型ヒトＦＶＩＩａ、例えばｒｈＦＶＩＩａ)を含有する医薬組成物(例えば、液状の水性医薬組成物)。
本発明の化合物又はその生理学的に耐性のある塩を、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有するサンプルに添加し；又は第ＶＩＩ因子ポリペプチドを、本発明の化合物又はその生理学的に耐性のある塩を含有するサンプルに添加することを含む、第ＶＩＩ因子ポリペプチド(例えば、野生型ヒトＦＶＩＩａ、例えばｒｈＦＶＩＩａ)を含有する組成物を調製する方法；この種の方法において、本化合物又はその塩、及び／又は第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、液状の水性媒体に存在していてもよい。
【００９２】
本発明の方法により調製された医薬組成物；
本発明の化合物又はその生理学的に耐性のある塩を、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有するサンプルに添加し；又は第ＶＩＩ因子ポリペプチドを、本発明の化合物又はその生理学的に耐性のある塩を含有するサンプルに添加することを含む、第ＶＩＩ因子ポリペプチド(例えば、野生型ＦＶＩＩａ、例えばｒｈＦＶＩＩａ)を阻害する方法；この種の方法において、本化合物又はその塩、及び／又は第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、液状の水性媒体に存在していてもよい。
当該問題の第ＶＩＩ因子ポリペプチドが有効である病状又は疾患を処置する薬剤を製造するための、本発明の医薬組成物の使用。
【００９３】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、同程度で出典明示によりここに援用される。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、いかなる方法であっても、本発明を限定するものとは解釈されない。
その全ての可能性のある変形例における、上述した要素の任意の組合せは、ここで特に示され、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、本発明に含まれる。
【００９４】
本発明で記載されて使用されている「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似指示対象なる用語は、ここで他に示されず、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーすると解釈される。
ここで他に示されない限りは、ここでの値の範囲の記述は、単に、範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に称する省略方法として提供することを意図しているものであって、ここで個々に列挙されているかのように、それぞれの別個の値が明細書に導入される。特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の要因又は測定値に関して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。ここに記載されている全ての方法は、ここで他に示されず、又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、任意の適切な順番で実施することができる。
ここに提供される任意かつ全ての実施例、又は例示的言語（「例えば」、「等」）の使用は、単に本発明をより例証することを意図しており、他に示されない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明確に記載していない限りは、明細書中の如何なる語句も、任意の要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解すべきではない。
【００９５】
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
特に明記せず、文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、成分又は成分類に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含める」等の用語を使用する、本発明の任意の側面又は実施態様のここでの記載は、特定の成分又は成分類「からなる」、「本質的になる」、又は「実質的に含有する」といった本発明の類似した側面又は実施態様を支持することを意図したものである(例えば、特定の成分を含有するここに記載の組成物は、特に明記しない又は文脈においてはっきりと矛盾していない限りは、その成分からなる組成
この発明は、適用される法律に容認される最大範囲まで、ここに提供される請求項又は側面に列挙された主題事項の全ての修正点及び等価物を含む。
【００９６】
【実施例】
【００９７】
以下の略語を使用する：
Ａｂｕ：                          α-アミノ酪酸
Ａｃ：                            アセチル
Ａｉｂ                            α-アミノイソ酪酸
Ａｌｌｅ                          アロ-イソロイシン
Ａｌｌｏｃ                        アリルオキシカルボニル
４-アミジノ-Ｐｈｅ                ４-アミジノ-フェニルアラニン、
Ｈ２Ｎ-ＣＨ(ＣＨ２-Ｃ６Ｈ４-Ｃ(=ＮＨ)ＮＨ２)-
ＣＯ２Ｈ
Ｂｏｃ：                          tert-ブチルオキシカルボニル
ｔ-Ｂｕ                           tert-ブチル
Ｃｈａ                            β-シクロヘキシルアラニン、
(１Ｓ)-１-アミノ-２-シクロヘキシルプロピオン酸
ＤＣＭ：                          ジクロロメタン、塩化メチレン
ＤＩＰＥＡ又はＤＩＥＡ            ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：                          Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：                        ジメチルスルホキシド
ＥＤＡＣ：                        Ｎ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)カル                                  ボジイミドヒドロクロリド
ＥＬＳ：                          蒸発光散乱
Ｅｔ：                            エチル
Ｆｍｏｃ                          ９Ｈ-フルオレン-９-イルメトキシカルボニル
ＨＢＴＵ                          ２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾール-１-イル−)-１,１,                                  ３,３ テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホス                                  ファート
ＨＯＢｔ：                        Ｎ-ヒドロキシベンゾトリアゾール、１-ヒドロキシ                                  ベンゾトリアゾール
ホモＡｒｇ：                      ホモアルギニン、Ｎ-イプシロン-アミジノリジン、                                  Ｈ２Ｎ-ＣＨ((ＣＨ２)４-ＮＨ-Ｃ(=ＮＨ)ＮＨ２)Ｃ                                  Ｏ２Ｈ
Ｈｐｈ：                          ホモフェニルアラニン
Ｍｅ：                            メチル
Ｎｌｅ                            ノルロイシン、α-アミノカプロン酸
ＮＭＰ：                          Ｎ-メチルピロリドン
Ｎｖａ                            ノルバリン、α-アミノ吉草酸
ＨＰＬＣ：                        高圧液体クロマトグラフィー
ＬＣＭＳ：                        質量分析と連結された液体クロマトグラフィー
Ｌｙｓ(ｍＰｅｇ(１-１０ｋ)-ＣＯ)：メトキシ-ポリ(エチレングリコール)-誘導化カルボ                                  ン酸(ＭｅＯ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)ｎ-(ＣＨ２)ｍ-ＣＯ２                                                                        Ｈ)で、側鎖アミノ基がアシル化されたリジン
ＮＭＰ：                          Ｎ-メチル-２-ピロリジノン
Ｐｈｇ                            (Ｓ)-フェニルグリシン、Ｌ-フェニルグリシン
Ｐｍｃ：                          ２,２,５,７,８-ペンタメチルクロマン-６-スルホ                                  ニル
ｒ.ｔ.                            室温
Ｓｕ：                            スクシンイミジル
ＴＦＡ：                          トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ：                          トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ：                          トリチル
【００９８】
一般的方法
手順
(１)酵素阻害−一般
ＦＶＩＩａ又は他の酵素／因子、例えば第Ｘａ因子、トロンビン、プラスミン、又はトリプシンを阻害する式(Ｉ)の化合物の能力は、当該問題の酵素の活性を５０％まで阻害する式(Ｉ)の化合物の濃度、すなわち阻害定数Ｋｉに関連するＩＣ５０値を決定することにより評価される。このＩＣ５０値は適切な発色基質を用いて決定され、式(Ｉ)の化合物の濃度のｌｏｇに対して、加水分解の相対速度(阻害されていない対照体と比較)をプロットした後、線形回帰により算出される。阻害定数Ｋｉを算出するために、基質と競合するＩＣ５０値の補正を、次の式：
Ｋｉ＝ＩＣ５０／｛１＋(基質濃度／Ｋｍ)｝
を使用して考慮し、ここでＫｍはミカエリス・メンテン定数である[Chen及びPrusoff, Biochem. Pharmacol. 22(1973)、3099-3108;I. H. Segal, Enzyme Kinetics, 1975, John Wiley & Sons, New York, 100-125：双方の文献とも、出典明示によりその全体がここに援用される]。
【００９９】
(１)ａ  第ＶＩＩａ因子(ＦＶＩＩａ)アッセイ
第ＶＩＩａ因子／組織因子活性に対する、式(Ｉ)の化合物の阻害活性[阻害定数Ｋｉ(ＦＶＩＩａ)として表される]は、本質的に以前に記載されている[J. A. Ostrem et al., Biochemistry 37(1998) 1053-1059、参照は、出典明示によりその全体がここに援用される)ような発色アッセイを使用して決定されてよい。動態アッセイを、動態プレートリーダー(Molecular Devices Spectramax 250)を使用する、半領域のマイクロタイタープレート(Costar Corp., Cambridge, Mass.)において、２５℃で実施する。典型的なアッセイにおいて、２５μｌのｒｈＦＶＩＩａ及びＴＦ(それぞれの最終濃度、５ｎＭ及び１０ｎＭ)を、１０％のＤＭＳＯ／ＴＢＳ-ＰＥＧバッファー(５０ｍＭのトリス、１５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のＰＥＧ８０００、ｐＨ８．１５)において、４０μｌの阻害希釈液と組合せる。１５分のプレインキュベート後、３５μｌの発色基質Ｓ-２２８８(Ｄ-Ｉｌｅ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド、Pharmacia Hepar Inc., 最終濃度５００ｍＭ)を添加することにより、アッセイを開始する。本発明の化合物は、３ｍＭ〜＜１μＭの範囲のＩＣ５０-値で、ＦＶＩＩａ／ＴＦを阻害する。
以下のアッセイ(１)ｂ-ｅ及び(２)ａ-ｃを、式(Ｉ)の化合物による、ある種の他の凝固酵素及び他のセリンプロテアーゼの阻害可能性を調査し、よって、式(Ｉ)の化合物の特異性を決定するために使用してもよい。
【０１００】
(１)ｂ  第Ｘａ因子アッセイ
このアッセイ用に、組成５０ｍＭのトリス-Ｃｌ、ｐＨ７．８、２００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％(ｗ／ｖ)のＰＥＧ-８０００、０．０２％(ｗ／ｖ)のＮａＮ３)のＴＢＳ-ＰＥＧバッファーを使用する。ＴＢＳ-ＰＥＧバッファーに２５μｌのヒト第Ｘａ因子(Enzyme Research Laboratories, Inc.;South Bend, Ind.)が入ったもの；ＴＢＳ-ＰＥＧバッファーに４０μｌの１０％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯが入ったもの(阻害されていない対照体)、又はＴＢＳ-ＰＥＧに１０％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯが入ったものに希釈された、種々の濃度のテストされる化合物；及びＴＢＳ-ＰＥＧに基質Ｓ-２７６５[Ｎ(α)-ベンジルオキシカルボニル-Ｄ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ｌ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド；Kabi Pharmacia, Inc.；Franklin, Ohio]が入ったものを、コスター(Costar)マイクロタイタープレートの適切なウェルにおいて組合せることにより、ＩＣ５０を決定する。
【０１０１】
１０分間、式(Ｉ)の化合物と酵素とをプレインキュベートすることにより、アッセイを実施する。ついで、最終容量が１００μｌになるように基質を添加することにより、アッセイを開始する。経時変化の線形部分(通常は、基質添加後１．５分)の間、２５℃で、バイオ-テック(Bio-tek)装置動態プレートリーダー(Ceres UV900HDi)を使用し、４０５ｎｍの吸光度における変化によって、発色基質の加水分解の初期速度を測定する。酵素濃度は０．５ｎＭであり、基質濃度は１４０μＭである。
【０１０２】
(１)ｃ  トロンビンアッセイ
同様に、ＴＢＳ-ＰＥＧバッファーをこのアッセイで使用する。使用した基質がＳ-２３６６(Ｌ-ＰｙｒｏＧｌｕ-Ｌ-Ｐｒｏ-Ｌ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド；Kabi)であり、酵素がヒトトロンビン(Enzyme Research Laboratories, Inc.；South Bend, Ind.)であることを除けば、第Ｘａ因子アッセイで上述したようにして、ＩＣ５０を決定する。酵素濃度は１７５μＭである。
【０１０３】
(１)ｄ  プラスミンアッセイ
同様に、ＴＢＳ-ＰＥＧバッファーをこのアッセイで使用する。使用した基質がＳ-２２５１(Ｄ-Ｖａｌ-Ｌ-Ｌｅｕ-Ｌ-Ｌｙｓ-ｐ-ニトロアニリド；Kabi)であり、酵素がヒトプラスミン(Kabi)であることを除けば、第Ｘａ因子アッセイで上述したようにして、ＩＣ５０を決定する。酵素濃度は５ｎＭであり、基質濃度は３００μＭである。
【０１０４】
(１)ｅ  トリプシンアッセイ
１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有するＴＢＳ-ＰＥＧバッファーをこのアッセイで使用する。使用した基質がＢＡＰＮＡ(ベンゾイル-Ｌ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド；Sigma Chemical Co.;St. Louis, Mo.)であり、酵素がウシ膵臓トリプシン(ＸＩＩＩ型、ＴＰＣＫ処理；Sigma)であることを除けば、第Ｘａ因子アッセイで上述したようにして、ＩＣ５０を決定する。酵素濃度は５０ｎＭであり、基質濃度は３００μＭである。
【０１０５】
(２)ａ  ＦＩＸａ及びｔＰＡに対するアミド分解アッセイ
酵素及び基質はAmerican Diagnosticaからのものである；ＦＩＸａ(カタログ番号４４９ｂ)、ＦＩＸａ基質(カタログ番号２９９Ｆ)、ｔＰＡ(カタログ番号１７０)、及びｔＰＡ基質(カタログ番号４４４ＬＦ)。基質２９９Ｆ及び４４４ＬＦの加水分解を、３６０ｎｍ励起及び４４０ｎｍ発光のスペクトラマックス(Spectramax)蛍光光度計で追随し、基質２５１及びＳ-２２８８の加水分解を４０５ｎｍのスペクトラマックス分光光度計で追随する。
５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％のトゥイーン８０からなるバッファーにおいて、全てのアッセイを実施する。１０、２０、５０、１００、２００μＭ濃度で、インヒビターを使用する。１００μＭの基質を使用してＦＩＸａアッセイを実施し、１０μＭの基質を使用してｔＰＡアッセイを実施する。
【０１０６】
(２)ｂ  ＦＸＩａ及びＦＸＩＩａに対するアミド分解アッセイ
酵素ＦＸＩａ及びＦＸＩＩａはAmerican Diagnosticaからのものである；ＦＸＩａ(カタログ番号４０１１ａ)、ＦＸＩＩａ(カタログ番号４１２ＨＡ)及びトリプシン(カタログ番号２０４６５)はLife Technologyからのものである。使用した発色基質(Chromogenix)は、ＦＸＩａ用には２２８８、ＦＸＩＩａ用には２７６５である。発色基質の加水分解を、酵素に応じて５-２０秒の間隔で１０-２０分、４０５ｎｍのスペクトラマックス分光光度計で追随する。
５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％のＢＳＡからなるバッファーにおいて、全てのアッセイを実施する。例外として、ＦＩＸａアッセイについては、最終濃度が４０％になるまで、エチレングリコールをさらに添加する。本アッセイにおいては、各インヒビター濃度：２５、５０、１００、５００μＭに対して、５０、１００、２００、５００、１０００μＭの基質濃度が使用される。
【０１０７】
(２)ｃ  データ分析
単一の基質濃度でのアッセイ実施について、ＫＩは、いくつかの異なるインヒビター濃度で測定される値を線形フィッティングさせることにより、式Ｖ０／ＶＩ＝１＋Ｉ／ＫＩ(Ｓ＜＜Ｋｍで有効)を使用して決定される。Ｖ０はインヒビターが存在しない場合の加水分解速度であり、ＶＩはインヒビターが存在する場合の加水分解速度であり、Ｉはインヒビター濃度である。各インヒビター濃度について、１／ｖ対１／ｓの二重逆数プロットから、勾配(Ｋｍ(ａｐｐ)／Ｖ)を決定する。これに、インヒビター濃度に対するＫｍ(ａｐｐ)／Ｖのプロットが続く。Ｋｉは、ｉ軸における直線の切片として決定される。
【０１０８】
ＦＶＩＩａにおける式(Ｉ)の化合物の安定化効果
ＦＶＩＩａにおける式(Ｉ)の化合物の安定化効果を測定するために、ＦＶＩＩポリペプチド、例えばＦＶＩＩａの生物活性を、一工程の凝固アッセイを使用して測定してよい。この目的において、テストされるサンプルは、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ-バッファー(ｐＨ７．５)、０．１％のＢＳＡで希釈され、この溶液の４０μｌを、４０μｌのＦＶＩＩ-欠損血漿、及び１０ｍＭのＣａ２＋と合成リン脂質を含有する８０μｌのヒト組換えＴＦと共にインキュベートする。凝固時間を測定し、平行線アッセイにおいて参照標準体を使用し、標準体曲線と比較する。
【０１０９】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物活性を測定するのに適したアッセイ
本発明で有用な第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、インビトロテストにおけるサンプルの予備試験として実施することが可能な、適切なアッセイにより選択され得る。よって、本明細書は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性についての簡単なテスト(「インビトロ加水分解アッセイ」と題される)を開示する。
【０１１０】
第１代の凝血アッセイ
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性は、本質的に、国際公開第９２／１５６８６号又は米国特許第５９９７８６４号に記載されているような一工程凝血アッセイを使用して測定されてよい。簡単には、テストされるサンプルは、５０ｍＭのトリス(ｐＨ７．５)、０．１％のＢＳＡで希釈され、１００μＬを、１００μＬの第ＶＩＩ因子欠損血漿、及び１０ｍＭのＣａ２＋を含有する２００μＬのトロンボプラスチンＣと共にインキュベートする。凝血時間を測定し、参照標準体、又は連続希釈された正常なヒトクエン酸血漿のプールを使用し、標準体曲線と比較する。
【０１１１】
インビトロ加水分解アッセイ(アッセイ１)  
天然(野生型)第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩ因子ポリペプチド(双方とも、以後「第ＶＩＩａ因子」と称する)は、特異性活性についてアッセイされてよい。またそれらは平行にアッセイされて、それらの特異性アッセイと直接比較してもよい。アッセイはマクロタイタープレート(Max-iSorp, Nunc, Denmark)において実施される。発色基質Ｄ-Ｉｌｅ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(Ｓ-２２８８、Chromogenix, Sweden)、最終濃度１ｍＭ、を、０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、及び１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４に第ＶＩＩａ因子(最終濃度１００ｎＭ)が入ったものに添加する。４０５ｎｍでの吸光度を、スペクトラマックスＴＭ３４０プレートリーダー(Molecular Devices, USA)にて、連続的に測定する。酵素を含有しないブランクウェルにおける吸光度を減算した後、２０分のインキュベートの間に発生した吸光度を使用し、第ＶＩＩ因子ポリペプチドと野生型第ＶＩＩａ因子の活性の比率を算出する。：
比率＝(Ａ４０５ｎｍでの第ＶＩＩ因子ポリペプチド)／(Ａ４０５ｎｍでの野生型第ＶＩＩａ因子)
それに基づき、天然第ＶＩＩａ因子より低い、同程度、又は高い活性を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、例えば第ＶＩＩ因子ポリペプチドと同定され、ここで第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然第ＶＩＩ因子(野生型ＦＶＩＩ)の活性との比率は、約１．０対１．０超である。
【０１１２】
また、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性は、１００-１０００ｎＭの濃度に適した、生理的基質、例えば第Ｘ因子(「インビトロタンパク質分解アッセイ」)を使用して測定されてもよく、ここで生成した第Ｘａ因子は、適切な発色基質(例えば、Ｓ-２７６５)を添加した後に測定される。さらに、活性アッセイは生理的温度で実施される。
【０１１３】
インビトロタンパク質分解アッセイ(アッセイ２)
天然(野生型)第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩａ因子ポリペプチド(双方とも、以後「第ＶＩＩａ因子」と称する)を平行してアッセイし、それぞれの特異的活性を直接比較する。アッセイはマイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)において実施する。０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１００μＬに、第ＶＩＩａ因子(１０ｎＭ)及び第Ｘ因子(０．８マイクロＭ)が入ったものを、１５分インキュベートする。ついで、０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ、及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、５０μＬを添加することにより、第Ｘ因子切断を停止させる。生成した第Ｘａ因子の量を、発色基質Ｚ-Ｄ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド(Ｓ-２７６５、 Chromogenix, Sweden)、最終濃度０．５ｍＭを添加することにより測定する。４０５ｎｍでの吸光度を、スペクトラマックスＴＭ３４０プレートリーダー(Molecular Devices, USA)にて、連続的に測定する。ＦＶＩＩａを含有しないブランクウェルの吸光度を減算した後、１０分間で発生した吸光度を使用し、第ＶＩＩ因子ポリペプチドと野生型第ＶＩＩａ因子のタンパク質分解活性の比率を算出する。
比率＝(４０５ｎｍでの第ＶＩＩａ因子ポリペプチド)／(４０５ｎｍでの野生型第ＶＩＩａ因子)
それに基づき、天然第ＶＩＩａ因子より低い、同程度、又は高い活性を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、例えば第ＶＩＩ因子ポリペプチドと同定され、ここで第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と天然第ＶＩＩ因子(野生型ＦＶＩＩ)の活性との比率は、約１．０対１．０超である。
【０１１４】
トロンビン生成アッセイ(アッセイ３)
トロンビンを生成する第ＶＩＩ因子ポリペプチドの能力は、生理学的濃度(血友病Ａを模倣する場合は、第ＶＩＩＩ因子を引く)で、インヒビターと全ての関連する凝固因子、及び活性化した血小板を含有するアッセイ(アッセイ３)において測定可能である(参照としてここに導入される、Monroeら(1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547のp. 543に記載)。
【０１１５】
一工程凝固アッセイ(凝血アッセイ)(アッセイ４)
また、一工程凝固アッセイ(アッセイ４)を使用することにより、特異的活性(「凝血アッセイ」)について、第ＶＩＩ因子ポリペプチドをアッセイしてもよい。この目的のために、テストされるサンプルは、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ-バッファー(ｐＨ７．２)、１％のＢＳＡで希釈され、４０μｌが、４０μｌの第ＶＩＩ因子欠損血漿、及び１０ｍＭのＣａ２＋と合成リン脂質を含有する８０μｌのヒト組換え組織と共にインキュベートする。凝固時間(凝血時間)を測定し、平行線アッセイにおいて参照標準体を使用し、標準体曲線と比較する。
【０１１６】
重鎖分解生成物、酸化形態及び凝集体の含有量
酸化形態及び重鎖分解生成物の含有量を、以下に記載するようにして、ＲＰ-ＨＰＬＣにより測定する：粒子径５μｍ及び孔サイズ３００Åを有する、特許権のある４．５ｘ２５０ｍｍのブチル結合シリカカラムにおいて、逆相ＨＰＬＣを実施した。カラム温度：７０℃。Ａバッファー：０．１％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸。Ｂバッファー：０．０９％ｖ／ｖのトリフルオロ酢酸、８０％ｖ／ｖのアセトニトリル。３０分、Ｘから(Ｘ＋１３)％Ｂの直線状勾配を用い、カラムを溶出させた。約２６分の保持時間で、ＦＶＩＩａが溶出されるように、Ｘを調節した。流速：１．０ｍＬ／分。検出：２１４ｎｍ。充填：２５μｇのＦＶＩＩａ。
凝集体の含有量を、未変性のサイズ排除ＨＰＬＣにより測定する：未変性のサイズ排除クロマトグラフィーを、移動相として、０．２Ｍの硫酸アンモニウム、５％の２-プロパノールｐＨ７．０を使用し、ウォーターズ・プロテイン・パック(Waters Protein Pak)３００ＳＷカラム、７，５ｘ３００ｍｍで実施した。流速：０．５ｍｌ／分。検出：２１５ｎｍ。充填：２５μｇのＦＶＩＩａ。
【０１１７】
ＮＭＲ分析
ＮＭＲスペクトルを、ブルカー(Bruker)３００ＭＨｚ及び４００ＭＨｚ機器において記録した。ＨＰＬＣ-ＭＳをパーキン・エルマー(Perkin Elmer)機器(ＡＰＩ１００)において実施した。
ＨＰＬＣ分析
メルク-ヒタチ(Merck-Hitachi)(HibarＴＭ RT 250-4, LichrosorbＴＭ RP 18, ５．０μｍ、４．０ｘ２５０ｍｍ、勾配溶出、３０分以内に２０％〜８０％の水に入ったアセトニトリル、１．０ｍｌ/分、２５４ｎｍで検出)のＨＰＬＣ-システム及びウォーターズ(Waters)(SymmetryＴＭ, C18, ３．５μｍ、３．０ｘ１５０ｍｍ、勾配溶出、１５分以内に５％〜９０％の水に入ったアセトニトリル、１．０ｍｌ／分、２１４ｎｍで検出)を使用した。
【０１１８】
ペプチド合成
ペプチドを、Ｆｍｏｃ保護基の脱保護のＮＭＰ及びＵＶモニタリングにおいて、ＨＢＴＵ-媒介性カップリングを使用し、製造者から供給されているＦａｓｔＭｏｃ ＵＶプロトコルを用い、０．２５ｍｍｏｌスケールにてアプリド・バイオシステム４３３Ａペプチド合成器でＦｍｏｃ法を使用し、ワン樹脂(ペプチド酸)又はＦｍｏｃ保護されたリンクアミド樹脂(Novabiochem)(ペプチドアミド)において合成した。使用する保護されたアミノ酸誘導体を、ＡＢＩ４３３Ａ合成器に適切で、事前計量されたカートリッジに供給された標準Ｆｍｏｃ-アミノ酸(Anaspec)とした。保護された（Ｆｍｏｃ又はＢｏｃ）４−アミジノ−Ｐｈｅは商業的に入手可能であったか、又は文献(Pearson et al., J. Med. Chem. 1996, 39, 1372-1382)の手順を使用して調整した。ペプチドカルバメートについては、アルコール又はフェノールの炭酸スクシンイミジルを用いてペプチドを処理することにより、支持体からペプチドを切断した後、固相又は溶液にカルバモイル基を導入し、ＭｅＣＮにおいて、ＤＩＰＥＡ及び炭酸ジスクシンイミジルを用いて、対応するアルコール又はフェノールを処理することにより調製した(Goshら, Tetrahedron Lett 1992, 33(20)、2781-2784)。ペプチド尿素については、イソシアナートを用いて、樹脂に結合したペプチドを処理することにより、アミノカルボニル基を固相に導入した。アシル化されたペプチドの場合では、Ｆｍｏｃ-保護されたアミノ酸を用いてアシル化するのと同様のプロトコルを使用し、対応するカルボン酸を使用して最後のアシル化を実施した。
【０１１９】
樹脂からペプチドを切断する手段
トリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシラン(９５：２．５：２．５)の混合物と共に室温で１８０分攪拌することにより、ペプチドを樹脂から切断した。切断混合物を濾過し、窒素流により、油になるまで、濾液を濃縮した。ジエチルエーテル(４５ｍｌ)を用い、この油から粗ペプチドを沈殿させ、ジエチルエーテル(各４５ｍｌ)を用いて３回洗浄した。
【０１２０】
精製：
Ｃ-１８シリカと共に包装された２０ｍｍｘ２５０ｍｍカラムにおいて、準分取ＨＰＬＣにより、粗ペプチドを精製した。ペプチドに応じて、１又は２の次の精製システムを使用した。
【０１２１】
ＴＦＡ：
乾燥後、粗ペプチドを、５ｍｌの５０％酢酸／Ｈ２Ｏに溶解させ、Ｈ２Ｏを用いて２０ｍｌに希釈し、注入し、０．１％のＴＦＡ中、４０-６０％のＣＨ３ＣＮ勾配のあるものを用いて、４０℃で５０分、１０ｍｌ／分で溶出させた。ペプチドを含有するフラクションを収集した。水を用いて溶出液を希釈した後、精製されたペプチドを凍結乾燥させた。
【０１２２】
硫酸アンモニウム：
濃Ｈ２ＳＯ４でｐＨ２．５に調節された、０．０５Ｍ(ＮＨ４)２ＳＯ４に４０％のＣＨ３ＣＮが入ったものを用いて、カラムを平衡にした。乾燥後、粗ペプチドを、５ｍｌの５０％酢酸／Ｈ２Ｏに溶解させ、Ｈ２Ｏを用いて２０ｍｌに希釈し、注入し、０．０５Ｍ(ＮＨ４)２ＳＯ４中、４０-６０％のＣＨ３ＣＮ勾配のあるものを用いて、４０℃で５０分、１０ｍｌ／分で溶出させた。ペプチドを含有するフラクションを収集し、Ｈ２Ｏを用いて希釈し、０．１％のＴＦＡで平衡にされた、セップ-パック(Sep-Pak)(登録商標)Ｃ１８カートリッジ(Waters part. #:51910)に通した。ついで、０．１％のＴＦＡを含有する７０％のＣＨ３ＣＮで溶出させ、水を用いて溶出液を希釈した後、精製されたペプチドを凍結乾燥することにより単離した。
得られた最終生成物を、分析用ＲＰ-ＨＰＬＣ(保持時間)及びＬＣＭＳにより特徴付けた。
【０１２３】
２１４ｎｍでのＵＶ検出、バイダック(Vydac)２１８ＴＰ５４  ４．６ｍｍ ｘ ２５０ｍｍ Ｃ-１８シリカカラム(The Separations Group, Hesperia, USA)を使用し、４２℃で１ｍｌ／分溶出させる、ＲＰ-ＨＰＬＣ分析を実施した。２つの異なる溶出条件を使用した：
Ａ１：濃Ｈ２ＳＯ４でｐＨ２．５に調節された、０．１Ｍ(ＮＨ４)２ＳＯ４からなるバッファーでカラムを平衡にし、５０分、同様のバッファーで０％〜６０％のＣＨ３ＣＮ勾配により溶出させる。
Ｂ１：０．１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏでカラムを平衡にし、５０分、０％のＣＨ３ＣＮ／０．１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏから６０％のＣＨ３ＣＮ／０．１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏの勾配により溶出させる。
Ｂ１：０．１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏでカラムを平衡にし、５０分、０％のＣＨ３ＣＮ／０．１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏから９０％のＣＨ３ＣＮ／０．１％のＴＦＡ／Ｈ２Ｏの勾配により溶出させる。
【０１２４】
ヒューレット・パッカード・シリーズ(Hewlett Packard series)１１００Ｇ１３１２ＡＢｉｎポンプ、ヒューレット・パッカード・シリーズ１１００カラムコンパートメント、ヒューレット・パッカード・シリーズ１１００ Ｇ１３１５Ａ ＤＡＤダイオードアレイ検出器、ヒューレット・パッカード・シリーズ１１００ＭＳＤ、及びセデレ(Sedere)７５蒸発光散乱検出器で、HP Chemstationソフトウェアで制御されるものからなるセットアップにおいて、ＬＣＭＳを実施した。ＨＰＬＣポンプを、
Ａ：水に１０ｍＭのＮＨ４ＯＨが入ったもの
Ｂ：９０％のアセトニトリルに、１０ｍＭのＮＨ４ＯＨが入ったもの
を収容する２つの溶出容器に連結させる。
Ａ及びＢの勾配で溶出させるカラムに、適切な用量(好ましくは２０μｌ)のサンプルを注入することにより、２３℃で分析を実施した。
【０１２５】
実施例
実施例１  プロピルオキシカルボニル-(４-アミジノ-Ｐｈｅ)-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)]５-ＮＨ２
2011510043.tif 000002
ＬＣＭＳ：  1/2［Ｍ（Ｈ＋）２］  ＝  ＥＬＳによる純度７０８．９８％。
実施例２  プロピルオキシカルボニル-ホモＡｒｇ-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)]５-ＮＨ２
2011510043.tif 000003
ＬＣＭＳ：  ＭＨ＋  ＝ＥＬＳによる純度１３９６．１００％。
実施例３    プロピルオキシカルボニル-(４-アミジノＰｈｅ)-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-ＮＨ２
2011510043.tif 000004
ＬＣＭＳ：  ＭＨ＋  ＝  ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）による純度１１５７．９１％。
実施例４    プロピルオキシカルボニル-(４-アミジノ-Ｐｈｅ)-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-[ＨＮ-(ＣＨ２-ＣＨ２-Ｏ)２-(ＣＨ２)-Ｃ(=Ｏ)]１０-ＮＨ２
2011510043.tif 000005
実施例５    第ＶＩＩａ因子分子の安定化
溶液中の第ＶＩＩａ因子分子における、本発明によって記載されている化合物の安定効果を研究するために、安定性実験は、４０Ｋ-ＰＥＧ-ｒＦＶＩＩａについて実施した。
研究された製剤は、０、１、１０または３０ｍＭのｎ-プロピルオキシカルボニル-Ｐｈｅ(４-アミジノ)-Ｇｌｕ-Ａｓｎ-Ｃｈａ-(ＯＥＧ)５-ＮＨ２を含み、全ては２０ｍｇ／ｍｌの４０Ｋ-ＰＥＧ-ｒＦＶＩＩａ、２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ７．０、６％のショ糖、２０ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍｌのメチオニンを含む。試料は、２５℃で３ヶ月インキュベートされ、上記の「一工程凝固アッセイ」（アッセイ４）（「一般的方法」のセクションを参照）を使用して凝血活性について分析された。
以下の表は、初期値に対する測定された活性を示す：
2011510043.tif 000006
３ヵ月後の０ｍＭのインヒビターを有する試料の活性は、アッセイで測定するにはあまりにも低かった。
明らかに、結果は、１ｍＭの濃度より上のインヒビターの存在下で、最大効果で、顕著な安定化を示す。
【国際調査報告】
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