(57)【要約】本発明は、認知障害を有するヒトまたは動物を治療するための材料および方法に関する。1つの態様において、前記方法は、有効量の1つまたは複数の種類の炎症メディエーター、例えば、fms関連チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド、インターロイキン-6(IL-6)、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-3(IL-3)、エリスロポエチン(EPO)、血管内皮増殖因子A(VEGF-A)、低酸素誘導性転写因子(HIF-1α)、インシュリン様増殖因子-1(IGF-1)、腫瘍壊死因子(TNF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、幹細胞因子(SCF)、ダルベポエチン(ARANESP)、およびメタロプロテイナーゼを、治療を必要とする動物またはヒトに投与する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の1つまたは複数の種類の、血液脳関門を通過できる炎症メディエーター、または完全長もしくは非変異体の炎症メディエーターと実質的に同じ生物学的活性を示すその機能的断片もしくは変異体、または該炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド、または該炎症メディエーターの産生を誘導する化合物もしくは剤を、ヒトまたは動物に投与する工程を含む、ヒトまたは動物における認知障害を治療するための方法。
【請求項２】
前記炎症メディエーターが、fms関連チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド、インターロイキン-6(IL-6)、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-3(IL-3)、エリスロポエチン(EPO)、血管内皮増殖因子A(VEGF-A)、低酸素誘導性転写因子(HIF-1α)、インシュリン様増殖因子-1(IGF-1)、腫瘍壊死因子(TNF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、幹細胞因子(SCF)、ダルベポエチン(ARANESP)、もしくはメタロプロテイナーゼ、または完全長もしくは非変異体の炎症メディエーターと実質的に同じ生物学的活性を示すその機能的断片もしくは変異体の1つまたは複数を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記炎症メディエーターが、GM-CSF、または完全長もしくは非変異体GM-CSFと実質的に同じ生物学的活性を示すその機能的断片もしくは変異体を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記炎症メディエーターがGM-CSFの生物学的等価物を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記炎症メディエーターが、治療されたヒトまたは動物の血漿または脳におけるアミロイドβレベルを減らすことができる、請求項1記載の方法。
【請求項６】
GM-CSFが、治療されたヒトまたは動物の血漿または脳における神経のもつれを減らすことができる、請求項3記載の方法。
【請求項７】
認知障害がアルツハイマー病によって引き起こされる、またはアルツハイマー病に起因する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記炎症メディエーターが頭蓋内に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記炎症メディエーターが頭蓋内注入によって投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記炎症メディエーターが非神経細胞または非神経組織に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
治療前にヒトまたは動物を認知障害について評価する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
組成物が、薬学的に許容される担体、希釈剤、または溶質を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドが発現構築物の中に入れて提供される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
発現構築物が神経細胞においてポリヌクレオチドの発現をもたらす、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
神経細胞がヒト細胞である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記炎症メディエーターの産生を誘導する化合物または剤がEPOまたはHIF-1αである、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
認知障害が、脳卒中、ダウン症候群、ボクサー認知症、外傷性脳損傷、AIDS関連認知症、レヴィー小体病、もしくはピック病によって引き起こされる、またはこれらに起因する、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
i)G-CSFおよび/またはGM-CSFならびにii)ダルベポエチンおよび/またはEPOがヒトまたは動物に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
前記請求項のいずれか一項において定義された、1つまたは複数の種類の炎症メディエーター、ポリヌクレオチド、または組成物を1つまたは複数の容器の中に含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2008年8月5日に出願された米国特許仮出願第61/086,351号の恩典を主張する。米国特許仮出願第61/086,351号は、全ての図、表、核酸配列、アミノ酸配列、および図面を含めて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
記憶消失は、加齢によく付随するものとして長く認識されてきた。最近、知り合った人の名前または短い買い物リストの内容を思い出せないことはだれにでもよくあることであり、この経験は、年をとるにつれてよく見られるようである。
【０００３】
この数十年にわたって、医学界は高齢者の記憶消失の考え方を変えてきた。これらの問題は、以前は、加齢に必ず付随するものとして考えられ、「老化」または「物忘れ」と呼ばれることも多い。近年、医師らは記憶消失の考え方を変えてきており、現在では、ある程度の記憶障害は病理学的なものであり、従って、脳に影響を及ぼす疾患プロセスを示しているとみなされている。この判断を下すためにほとんどの医師らが使用する閾値は、正常で独立した機能が不可能な程度まで記憶消失が進行していることである。例えば、自分のお金をうまく管理できない場合、または自分の基本的欲求に対応できない場合。この程度の認知障害が認知症と呼ばれるようになってきた。
【０００４】
しかしながら、多くの高齢者は記憶問題を訴えることがあるが、なんとかして全ての日常作業を独立して行う。通常、十分に機能する能力は、これらの困難を埋め合わせること、例えば、カレンダー、または思い出すためのノート、リストなどにかなり頼ることに基づいている。場合によっては、これらの記憶困難は、記憶消失の悪化が差し迫っている徴候である。
【０００５】
主観的記憶問題の症候群は「軽度認知障害」(MCI)として一般に知られるようになったが、「認知症ではない認知障害(Cognitive Impairment, Not Dementia)」(CIND)を含めて他の用語も用いられてきた。MCI患者は記憶困難を訴える。典型的には、訴えには、最近会った人の名前を覚えることが難しい、流れるような会話を覚えることが難しい、物を間違った場所に置く傾向が増えた、または類似の問題が含まれる。多くの場合、患者はこれらの困難をよく知っており、ノートおよびカレンダーにかなり頼ることで埋め合わせている。最も重要なことに、MCIの診断は、以前に必要としていたものより多くの介助を他人から受けることなく、患者が全ての日常活動をうまく行うことができることに頼っている。
【０００６】
いくつかの研究によってMCI患者の認知能力が調べられている。これらから、一般的に、正式な記憶試験において、MCI患者の年齢群にある他の個体と比較した時でも、MCI患者の成績はかなり悪いことが証明された。MCI患者はまた、物または人の名前を言う(物の名前を見つけ出す)および複雑なプランニングタスクなど他の思考分野において軽度の困難を示す。これらの問題は、アルツハイマー病に関連する神経心理学的知見に似ているが、これより重篤でない。場合によっては、注意深い質問から、趣味の遂行などの日常活動の軽度の困難が明らかになることも分かっている。
【０００７】
いくつかの研究によって、高齢者の記憶愁訴は、将来、認知症を発症するリスクが通常より高いことと関連していることが証明された。最も一般的には、MCI患者が発症するリスクのある認知症のタイプはアルツハイマー病であるが、他の認知症、例えば、血管性認知症または前頭側頭型認知症も起こり得る。しかしながら、これらの愁訴のある患者の中には認知症を発症しないものもいることも明らかである。
【０００８】
ある特徴が、進行する可能性が高いことと関連している。これらには、よく知っている情報提供者(例えば、配偶者、子供、または親しい友人)による記憶困難の確認、客観的記憶試験での悪い成績、および日常作業、例えば、趣味または財務を遂行する能力の変化、緊急事態の処理、または自身の衛生の対応が含まれる。
【０００９】
多くのうつ病患者も記憶について不平を言うので、これらの研究の多くにおいて管理しなければならない要因の1つは、うつ病であった。いくつかの研究から、脳の画像(PETまたはMRIスキャン)における萎縮(縮小)または代謝低下の特定の測定値は、将来、認知症を発症する機会を高めることが示唆されている。
【００１０】
これらの前記の要因は認知症を発症する機会を高めるが、どのMCI患者が認知症を発症するか、発症しないかを確実に予測するのは現在、不可能である。従って、これらの測定値の多く、特に、脳画像からの測定値は、依然として、研究にしか有用でないとみなされている。
【００１１】
進行性の知能消失で最も広く知られている神経障害の1つがアルツハイマー病(AD)である。世界中で、約2000万人がアルツハイマー病に罹患している。ADは、臨床上、初期の記憶消失と、一般的に認知障害と呼ばれる判断および推理の障害である失見当識が続き、最終的に、完全な認知症が起こることを特徴とする。AD患者は、最終的には、疾患発症から4〜12年後に、ひどく衰弱した運動不能の状態に陥る。
【００１２】
ADの重要な病理学的証拠は、ニューロン変性と関連がある、細胞外アミロイド斑および細胞内tauのもつれが脳に存在することである(Ritchie and Lovestone (2002))。細胞外アミロイド斑は、アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)が代謝されることで生成した不溶性アミロイドβペプチド1-42の増加に起因すると考えられている。β、γ分泌の後に、これらのアミロイドβ1-42ペプチドは、主に健常者において産生されるアミロイドβ1-40ペプチドより容易にアミロイド線維を形成する。アミロイドβペプチドは神経毒性カスケードを支配してるように見える。すなわち、アミロイドβ原線維がP301L tauトランスジェニックマウスの脳に注射された時に、神経原線維変化の形成を増強することが実験から分かっている(Gotz et al.(2001))。実際には、様々なアミロイドβペプチドがアミロイドβペプチド1-42、1-40、1-39、1-38、1-37として特定されており、これらは斑に見出され、脳脊髄液中にもよく見られる。
【００１３】
アミロイドβペプチドは、膜結合型APPから、βセクレターゼおよびγセクレターゼによって、それぞれ位置671および711または713で切断された後に生成(または処理)される。さらに、高活性のβセクレターゼは、位置1から位置11まで切断を変える。αセクレターゼ活性によりアミロイドβ前駆体タンパク質が切断されるとAβ1-17が生成され、40または42でのγセクレターゼ活性により非病理学的なp3ペプチドが生成される。βセクレターゼは膜結合型アスパルチルプロテアーゼBACEとして特定されたのに対して、γセクレターゼは、プレセニリン1(PSl)またはプレセニリン2(PS2)、ニカストリン(nicastrin)、Anterior Pharynx Defective 1(APH1)、およびプレセニリンエンハンサー2(PEN2)を含むタンパク質複合体である。これらのタンパク質のうち、プレセニリンはγセクレターゼの触媒活性を構成すると広く考えられているが、他の成分は複合体の成熟および局在化において役割を果たしている。αセクレターゼの情報が依然として有名であるが、一部の結果はプロテアーゼADAM10およびTACEを指し示しており、これらは重複機能を有する可能性がある。
【００１４】
AD症例のごく一部(最も早期に発症するAD)は、プレセニリン1および2(PS1;PS2)ならびにアミロイドβ前駆体タンパク質(APP)をコードする遺伝子の常染色体優性変異によって引き起こされ、APP、PS1、およびPS2が変異するとアミロイドβ前駆体タンパク質の代謝が変化して、このような高レベルのアミロイドβ1-42が脳において生成されることが分かっている。遅発型AD患者ではPS1、PS2、およびアミロイドβ前駆体タンパク質の変異は特定されていないが、病理学的特徴は早期発症型AD患者と極めて類似している。これらの高レベルのアミロイドβペプチドは、年齢とともに累進的に、アミロイドβ前駆体タンパク質処理の妨害から生じるか(例えば、高いコレステロールレベルはアミロイドβペプチド生成を増強する)、またはアミロイドβペプチド異化の低下から生じる可能性がある。従って、遅発型AD患者におけるADは、脳におけるアミロイドペプチドレベルの異常増加によって引き起こされることも一般に受け入れられている。アルツハイマー患者におけるこれらのアミロイドβペプチド、さらに具体的には、アミロイドβペプチド1-42のレベルは、健常者におけるこれらのペプチドレベルと比較して高い。
【発明の概要】
【００１５】
発明の簡単な概要
本発明は、認知障害を有するヒトまたは動物を治療するための材料および方法を提供する。前記方法は、有効量の、血液脳関門を通過できる炎症メディエーターを投与する工程を含む。1つの態様において、炎症メディエーターは、脳における認知反応を高める、および/または神経保護効果を発揮する。本発明の範囲内で意図される炎症メディエーターには、fms関連チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド、インターロイキン-6(IL-6)、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-3(IL-3)、エリスロポエチン(EPO)、血管内皮増殖因子A(VEGF-A)、低酸素誘導性転写因子(HIF-1α)、インシュリン様増殖因子-1(IGF-1)、腫瘍壊死因子(TNF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、幹細胞因子(SCF)、ダルベポエチン(ARANESP)、およびメタロプロテイナーゼが含まれるが、これに限定されない。1つの態様において、炎症メディエーターは、GM-CSFまたはその機能的断片もしくは変異体である。特定の態様において、認知障害は、アルツハイマー病によって引き起こされる、またはアルツハイマー病に起因する。さらに、GM-CSFの産生を哺乳動物において誘導することができる化合物を本発明に従って使用することができ、これは後で脳の認知反応を高めることも意図される。1つの態様において、炎症メディエーターは、ヒトまたは動物の非神経細胞または非神経組織に投与または送達される。
【００１６】
本発明はまた、本明細書に記載の有効量の炎症メディエーターを投与する工程を含む、認知機能に関連する記憶問題または関連認知症を有するヒトまたは動物において認知障害の進行を遅延または阻害するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】マウスにおける認知性疾患行動試験のための代表的な放射状水迷路装置の写真を示す。図1は、装置を見下ろした時の迷路の図を示す。
【図２】マウスにおける認知性疾患行動試験のための代表的な放射状水迷路装置の写真を示す。図2は、動物行動試験に使用した装置の実物を示す。
【図３】GMCSF干渉試験-ブロック1(図3)を示す。
【図４】GMCSF干渉試験-ブロック2(図4)を示す。
【図５】図5Aおよび図5Bは、マウス海馬において不溶性アミロイドβレベルが減少することを示す。図5Cは、GM-CSF血漿中濃度が増加すると共に、マウス海馬において可溶性アミロイドβレベルが増加することを示す。
【図６】図6Aは、GM-CSF(左半球)およびaCSF(右半球)の海馬内注射を示す。代表的な冠状組織を14μmの凍結切片にし、MabTechα-Aβ/Alexa546で染色した。画像は、10Xで撮影した約145枚の写真のモンタージュである。白いスポットはアミロイド斑免疫標識を示す(4匹全てのマウスの代表的な切片モンタージュについては、図13A〜13Dを参照されたい)。図6B:マウス一匹(n=4マウス)につき5枚の定量した切片から計算した、測定した4つ全ての斑パラメータにおいて見られた全体の斑低下。エラーバーは±SEMである。統計的有意性は対応スチューデントt検定によって得られた。P値(面積:P<1.11E-07;周囲(Perimeter):P<1.41E-06;フェレー径(Feret Diameter):P<2.36E-09;総密度(Integrated Density):P<1.11E-07)。
【図７】皮下GM-CSF注射を毎日行った後の行動分析を示す。図7A-7Dは、標準的な放射状水迷路エラーを示す。試験の個々のブロック(図7Aおよび7B)において、および4日間全ての試験にわたって(図7Cおよび7D)、Tg対照マウス(n=8)は、NT対照マウス(n=8)と比較して作業記憶試験T4およびT5において大幅に機能低下したことが分かる。GM-CSF治療Tgマウス(n=7)は、個々のブロックの間に、および全体にわたって、作業記憶試験T4およびT5において、NT対照マウスと同様に、またはNT対照マウスより良好に動作した。GM-CSF治療NTマウス(n=9)は、NT対照と同様に、またはNT対照より良好に動作したが(ブロック1のT4についてNT+GMCSF群対NT群の成績が有意に良好であったことに留意のこと、図7A)、この効果は全体的に見て有意でなかった。統計的有意性は一方向ANOVAによって確かめた(**他の全ての群に対して、P<0.05またはこれ以上の有意性;†Tg+GM-CSFおよびNT+GM-CSFに対して、P<0.05またはこれ以上の有意性)。図7Eは、認知的干渉タスク(Cognitive Interference Task)全体(4日間)を示す。Tg対照マウスは、評価した4つ全ての認知測定においてNTマウスと比較して機能低下していることを示す。GM-CSF治療Tgマウスは、Tg対照と比較して、有意に良好な3回試験想起(A1〜A3)および遅延想起(delayed recall)(A5)を示し、4つ全ての認知測定においてNTマウスと同様に動作した。NTマウスのGM-CSF治療は、NT対照と比較して有意に良好な成績をもたらさなかったが、NTマウスにおける有益なGM-CSF効果の傾向は全体的に見て明らかであった。統計的有意性は一方向ANOVAによって確かめた(*TgはNT+GM-CSFと有意差がある。**Tgは他の全ての群と有意差がある)。図7Fは、認知的干渉タスクを示す。順向干渉試験(最初の2日)。GM-CSF治療TgマウスはTg対照より有意に良好に動作し、NTおよびGM-CSF治療NTマウスと同等に動作した。統計的有意性は一方向ANOVAによって確かめた(**他の全ての群に対してP<0.05またはこれ以上の有意性)。
【図８】皮下GM-CSF注射マウスにおけるアミロイド沈着を示す。図8A-8Dは、抗Aβ抗体(クローン4G8)で免疫標識した5μmパラフィン包埋冠状切片の顕微鏡写真である。写真は、GM-CSF治療Tg群または生理食塩水治療Tg群の平均に最も近いアミロイド負荷の代表例である。スケールバー=50μm。図8Eは、生理食塩水治療(n=6)に対する、GM-CSF治療マウス(n=5)1匹につき平均5枚の切片からのアミロイド負荷のパーセントを示す。統計的有意性は両側等分散的スチューデントt検定によって確かめた:嗅内皮質(*P<0.026)および海馬(P=0.12)。
【図９】皮下GM-CSF注射マウスにおけるシナプトフィジン免疫染色を示す。図9A〜9Dは、抗シナプトフィジン抗体で免疫標識した5μmパラフィン包埋冠状切片の顕微鏡写真である。写真は、GM-CSF治療群または生理食塩水治療群の平均に最も近いシナプトフィジン免疫染色の代表例である。スケールバー=50μm。図9Eは、生理食塩水治療マウス(n=6)に対する、GM-CSF治療マウス(n=5)1匹につき平均5枚の切片からのシナプトフィジン免疫反応性のパーセントを示す。数は少ないが、2つの群の差は、両側等分散的スチューデントt検定によって統計的に有意であった:CA1(P<0.0013)、CA3(P<0.0023)。
【図１０】マウス間のアミロイド斑負荷の有意な変化を示す。M-CSFの両側脳室内注入後の、ほぼ同じ年齢のPS/APPマウス(誕生日に従って連続して番号を付けた)。マウス番号148、160、171、および211にはM-CSFを与え、マウス164、170、176、および177にはaCSFを与えた。注入は2週間続いた。14μmの凍結切片にし、6E10/Alexa488およびHoechstで染色した。明るい緑色のスポットはアミロイド斑を示す。写真を5Xで撮影した。
【図１１】M-CSF(左半球)およびaCSF(右半球)の海馬内注射を示す。図11Aにおいて、画像は約145枚の10X写真のモンタージュであり、4匹全てのM-CSF注射マウスの前方海馬から後方に見られた効果の代表例である。M-CSFが注射された半球は、半球間でアミロイド沈着差を示さなかった。図11B:この写真は、生理食塩水灌流後に見られたようなM-CSF注射左半球の拡大を示す。注射部位での小さな隆起に留意されたい。図11Cは、M-CSF注射部位にある針跡に形成した嚢胞または腫瘍様増殖を示す画像である。14μmの凍結切片にし、6E10/Alexa488およびHoechstで染色した。明るい緑色の染色は非特異的であり、アミロイド斑を示さない。写真を20Xで撮影した。
【図１２】G-CSF(左半球)およびaCSF(右半球)の海馬内注射を示す。アミロイド斑は白いスポットとして示した。脳を、わずかな角度をなして切片にしたが、アミロイド斑の外観観察は、G-CSFを注射した左半球全体にわたっておおむね低下していることを示す。14μmの凍結切片にし、6E10/IR800で染色した。Licor Odysseyでスキャンし、視覚化のために拡大した。切片に1から6まで番号を付けた。これらは前方から後方に対応する。
【図１３】GM-CSF(左半球)およびaCSF(右半球)の海馬内注射を示す。注射部位の近くにある各マウスの代表的な切片。組織切片をMabTechα-Aβ/Alexa488で染色した。白いスポットはアミロイド斑免疫標識を示す。画像は、10Xで撮影した約145枚の写真のモンタージュである。図13A〜13Cは、14μm凍結切片からのものである。図13Dは、5μmパラフィン包埋切片からのものである。
【図１４】aCSFを注射した反対側右半球に対する、GM-CSFを注射した左半球におけるアミロイド沈着低下の定量を示す。マウス1匹につき5枚の切片を定量した。切片モンタージュにはそれぞれ140枚以上の10X写真が含まれ、これらのうち、一半球につき15〜25枚の写真を選択して定量した。切片一枚あたりの写真は全て、Zeiss Axiocam Mrmカメラ(Oberkochen, Germany)の付いたZeiss Imager.Z1蛍光顕微鏡により、Axiovision4.7ソフトウェアを用いて、同じ露光で撮影した。それぞれの図は、マウス1匹あたりのおよび全体での、有意性のある、5枚の切片/マウスからの全体値または平均値を示す。エラーバーは±SEMである:(図14A〜14B)斑面積(図14C〜14D)周囲値(図14E)平均フェレー径(図14F)平均総密度。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、認知障害を有するヒトまたは動物を治療するための方法を提供する。前記方法は、有効量の、血液脳関門を通過できる1つまたは複数の種類の炎症メディエーター、(炎症メディエーターがポリペプチドである場合)前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド、あるいは前記炎症メディエーターまたは前記ポリヌクレオチドを含む組成物を、ヒトまたは動物に投与する工程を含む。認知障害は進行性認知障害でもよい。特定の態様において、認知障害は、アルツハイマー病によって引き起こされる、またはアルツハイマー病に起因する。1つの態様において、認知障害は、脳卒中、ダウン症候群、ボクサー認知症、外傷性脳損傷、AIDS関連認知症、レヴィー小体病、またはピック病によって引き起こされる、またはこれらに起因する。1つの態様において、炎症メディエーターは、脳における認知反応および/または神経保護効果を高める。1つの態様において、炎症メディエーター、または炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチドは、ヒトに由来するか、またはヒト配列のものである。
【００１９】
本発明の範囲内で意図される炎症メディエーターには、fms関連チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド、インターロイキン-6(IL-6)、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-3(IL-3)、エリスロポエチン(EPO)、血管内皮増殖因子A(VEGF-A)、低酸素誘導性転写因子(HIF-1α)、インシュリン様増殖因子-1(IGF-1)、腫瘍壊死因子(TNF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、幹細胞因子(SCF)、ダルベポエチン(ARANESP)、およびメタロプロテイナーゼ、または完全長もしくは非変異体炎症メディエーターと実質的に同じ生物学的活性を示すその機能的断片もしくは変異体が含まれるが、これに限定されない。典型的に、ヒトの認知障害を治療するためには、炎症メディエーターは、ヒトタンパク質またはこれをコードするポリヌクレオチドの配列を有する。本明細書に記載の炎症メディエーターのヒト配列は当技術分野において公知である(例えば、GenBankアクセッション番号NM_013520.3、NM_000799.2、NM_000759.2、Ml1220.1、NM_181054.2、NG_011713.1、NG_008851.1、NM_000588.3、NG_011640.1、NM_000757.4、NG_012099.1、NM_04530.4、NG_011468.1、NG_007462.1、およびNG_008732.1を参照されたい)。1つの態様において、炎症メディエーターは、GM-CSF、またはGM-CSF生物学的活性を示すその機能的断片もしくは変異体である。特定の態様において、GM-CSFはヒトGM-CSFである。1つの態様において、GM-CSFならびにダルベポエチンおよび/またはEPOが、認知障害を治療するための本発明の方法において投与される。別の態様において、G-CSFならびにダルベポエチンおよび/またはEPOが投与される。さらに、本発明の炎症メディエーター、例えば、GM-CSFの産生を哺乳動物において誘導することができる化合物を本発明に従って使用することができ、これは後で脳の認知反応を高めることも意図される。このような化合物の例には、EPOおよびHIF-1α(Fisher(2003))が含まれるが、これに限定されない。1つの態様において、炎症メディエーターは、ヒトまたは動物の非神経組織に投与または送達される。
【００２０】
1つの態様において、本発明の炎症メディエーター、前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド、または前記炎症メディエーターもしくは前記ポリヌクレオチドを含む組成物は、有効量で、皮下にまたは注入により、頭蓋内に、経口で、非経口で、経鼻的に、吸入を介して、くも膜下腔内に、筋肉内に、舌下に、または他の任意の公知で許容可能な薬物送達法によって、このような療法を必要とするヒトまたは動物に送達される。
【００２１】
本発明はまた、認知機能に関連する記憶問題または関連する認知症を有するヒトまたは動物における認知障害の進行を遅延または阻害するための方法に関する。1つの態様において、本発明の方法は、有効量の本発明の炎症メディエーター、前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド、または前記炎症メディエーターもしくは前記ポリヌクレオチドを含む組成物を、ヒトまたは動物に投与する工程を含む。
【００２２】
本発明の炎症メディエーター、前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド、および/またはこれらを含む組成物は、現在、当業者に知られている、または将来、当業者に知られる任意の適切な方法および技法によってインビボで適用することができる。本発明の化合物は、生理学的にまたは薬学的に許容される形に処方されてもよく、例えば、経口、経鼻、経腸、および非経口の投与経路を含む、当技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与されてもよい。本明細書で使用する「非経口」という用語は、皮下投与、皮内投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、および胸骨内投与、例えば、注射による投与を含む。当業者により決定できるように、本発明の炎症メディエーターの投与は単回投与でもよく、連続してもよく、異なる間隔をおいてもよい。
【００２３】
本発明の炎症メディエーター、前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド、およびこれらを含む組成物はまた、リポソーム技術、徐放性カプセル、移植可能なポンプ、および生分解性容器を用いて投与することができる。これらの送達方法は、有利なことに、長期間にわたって均一の投与量を提供することができる。本発明の炎症メディエーターはまた、これらの塩誘導体の形または結晶の形で投与することもできる。
【００２４】
本発明の炎症メディエーターおよび前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチドは、生理学的に許容されるおよび/または薬学的に許容される組成物を調製するための公知の方法に従って処方することができる。製剤は、当業者に周知の、かつ当業者に容易に入手可能な多くの情報源において詳述されている。例えば、E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Scienceは、本発明と共に使用することができる製剤について述べている。一般的に、本発明の組成物は、組成物の有効な投与を容易にするために、有効量の化合物が適切な担体と組み合わされるように処方される。本発明の方法において用いられる組成物はまた様々な形をとってもよい。これらの形には、例えば、固体、半固体、および液体の剤形、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液体溶液または懸濁液、坐剤、注射および注入可能な溶液、ならびにスプレーが含まれる。好ましい形は、目的の投与方法および治療用途によって決まる。組成物はまた、好ましくは、当業者に公知の従来の生理学的に許容される担体および希釈剤を含む。本発明の化合物と共に使用するための担体または希釈剤の例には、エタノール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、アルミナ、デンプン、生理食塩水、ならびに等価な担体および希釈剤が含まれる。望ましい治療処置のために、このような投与量を投与するために、本発明の組成物は、担体または希釈剤を含む組成物全体の重量に基づいて、約0.1重量％〜99重量％、特に、1〜15重量％の1つまたは複数の種類の本発明の全ての炎症メディエーターを含んでもよい。
【００２５】
本発明の炎症メディエーター、前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド、およびこれらを含む組成物は、細胞と直接接触させて、または担体手段を介して細胞に送達することができる。炎症メディエーターおよび組成物を細胞に送達するための手段は当技術分野において公知であり、例えば、リポソーム部分の中への組成物のカプセル化を含む。本発明の炎症メディエーターおよび組成物を細胞に送達するための他の手段は、標的細胞への送達に標的化されたタンパク質または核酸への炎症メディエーターの取り付けを含む。米国特許第6,960,648号および米国特許出願公開第20030032594号および同第20020120100号は、別の組成物に結合することができ、組成物が生体膜を通過するのを可能にするアミノ酸配列を開示する。米国特許出願公開第20020035243号はまた、細胞内送達のために生物学的部分が細胞膜を通過するための組成物について述べている。炎症メディエーターはまたポリマーに組み込むことができる。この例には、頭蓋内送達にはポリ(D-Lラクチド-co-グリコリド)ポリマー;(GLIADELにおいて使用したような)20:80モル比のポリ[bis(p-カルボキシフェノキシ)プロパン:セバシン酸];コンドロイチン;キチン;およびキトサンが含まれる。
【００２６】
本発明の炎症メディエーターおよび前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチドは単独で投与することができるが、これらの炎症メディエーターはまた薬学的組成物の一部として投与することもできる。従って、本発明は、1つまたは複数の種類の炎症メディエーターと、少なくとも1つの種類の薬学的に許容される担体を含む組成物をさらに提供する。薬学的組成物は、様々な投与経路、例えば、経腸経路、非経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、局所経路、皮下経路などに合わせることができる。当業者により決定できるように、投与は連続してもよく、異なる間隔をおいてもよい。
【００２７】
炎症メディエーターおよび炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチドの投与に適した他の製剤には、例えば、滅菌注射水溶液が含まれる。例えば、滅菌注射水溶液は、抗酸化物質、緩衝液、静菌剤、および製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質;ならびに懸濁剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性の無菌懸濁液を含んでもよい。製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルに入れて提供されてもよく、使用前に滅菌液体担体、例えば、注射用水の状態のみ必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存されてもよい。滅菌した散剤、顆粒、錠剤などから即時注射溶液および懸濁液を調製することができる。特に、前記の成分に加えて、本発明の組成物は、問題となっている製剤のタイプを考慮して、当技術分野において従来よりある他の剤を含んでもよいことが理解されるはずである。
【００２８】
本発明の炎症メディエーター、前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド、およびその組成物は、任意で、薬学的に許容される担体、例えば、不活性希釈剤と組み合わせて、1つまたは複数の解剖学的部位に局所投与されてもよい。本発明の炎症メディエーターおよびその組成物は、任意で、薬学的に許容される担体、例えば、不活性希釈剤、または経口送達用の同化可能な食用の担体と組み合わせて、全身投与、例えば、静脈内投与または経口投与されてもよい。これらは、硬ゼラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセルに入れられてもよく、圧縮されて錠剤にされてもよく、患者の食事と共に直接取り入れられてもよい。経口治療投与の場合、炎症メディエーターは、1つまたは複数の種類の賦形剤と組み合わされてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤、エアゾールスプレーなどの形で用いられてもよい。
【００２９】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどはまた以下を含有してもよい。結合剤、例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチン;賦形剤、例えば、リン酸二カルシウム;崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸など;潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム;および甘味剤、例えば、スクロース、フルクトース、ラクトース、もしくはアスパルテーム、または着香剤、例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはサクランボフレーバーを添加してもよい。単位剤形がカプセルの場合、前記のタイプの材料に加えて、液体担体、例えば、植物油またはポリエチレングリコールを含有してもよい。様々な他の材料がコーティングとして存在してもよく、固体単位剤形の物理的形態を他の方法で改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、ゼラチン、ろう、シェラック、または糖などでコーティングされてもよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてスクロースまたはフルクトース、防腐剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素および着香剤、例えば、サクランボフレーバーまたはオレンジフレーバーを含有してもよい。もちろん、全ての単位剤形の調製において用いられる材料は全て薬学的に許容され、かつ使用される量で実質的に無毒でなければならない。さらに、活性化合物は徐放性の調製物および装置に組み込まれてもよい。
【００３０】
本発明の炎症メディエーター、および前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド、および組成物は、その薬学的に許容される塩または類似体を含めて、注入または注射によって静脈内に、筋肉内に、または腹腔内に投与することができる。活性薬剤またはその塩の溶液は水に溶解して調製されてもよく、任意で、無毒の界面活性剤と混合されてもよい。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、およびその混合物、ならびに油に溶解して調製することができる。通常の保管条件および使用条件の下では、これらの調製物は、微生物の増殖を阻止する防腐剤を含有してもよい。
【００３１】
注射または注入に適した薬学的剤形には、滅菌した水溶液もしくは分散液、または滅菌した注射用もしくは注入用の溶液もしくは分散液の即時調製に合わせられた、任意で、リポソームの中にカプセル化された、活性成分を含む滅菌散剤が含まれ得る。最終的な剤形は、無菌で、液体であり、製造条件および保管条件下で安定していなければならない。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、植物油、無毒のグリセリルエステル、ならびにその適切な混合物を含有する、溶媒または液体分散媒でもよい。例えば、リポソームを形成することによって、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、または界面活性剤を用いることによって、適当な流動性を維持することができる。任意で、微生物の活動は、様々な他の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって阻止することができる。多くの場合、等張性の剤、例えば、糖、緩衝液、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって可能になる。
【００３２】
滅菌注射液は、必要な量の本発明の炎症メディエーターを、必要に応じて前記の様々な他の成分と共に、適切な溶媒に組み込み、その後に、濾過滅菌することによって調製することができる。滅菌注射液の調製のための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌された溶液に存在する活性成分および任意のさらなる望ましい成分の粉末を生じる真空乾燥法および凍結乾燥法である。
【００３３】
局所投与の場合、本発明の炎症メディエーターおよび前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチドは液体または固体として適用されてもよい。しかしながら、一般的に、これらを、固体または液体でもよい皮膚科学的に許容される担体と組み合わせた組成物として皮膚に局所投与することが望ましい。炎症メディエーターは、製剤、例えば、軟膏、クリーム、ローション剤、溶液、チンキ剤などにして適用することができる。薬理学的物質を真皮部位に送達するための薬物送達系も使用することができ、例えば、米国特許第5,167,649号に記載されている。
【００３４】
有用な固体担体には、超微粒子状の固体、例えば、タルク、クレー、結晶セルロース、シリカ、アルミナなどが含まれる。有用な液体担体には、任意で、無毒の界面活性剤の助けを借りて、化合物を有効なレベルで溶解または分散することができる、水、アルコールもしくはグリコール、または水-アルコール/グリコールのブレンドが含まれる。所定の用途のために特性を最適化するために、補助剤、例えば、芳香剤およびさらなる抗菌剤を添加してもよい。結果として得られる液体組成物は吸収パッドから適用されてもよく、包帯および他の包帯材に含浸させるのに用いられてもよく、例えば、ポンプタイプまたはエアゾールスプレーを用いて患部に噴霧されてもよい。
【００３５】
例えば、使用者の皮膚に直接適用するために、増粘剤、例えば、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸の塩およびエステル、脂肪アルコール、改変セルロースまたは改変無機質材料も液体担体と共に使用して、塗り広げることができるパスタ剤、ゲル、軟膏、石けんなどを形成することができる。炎症メディエーターを皮膚に送達するのに使用することができる有用な皮膚科学的組成物の例は、米国特許第4,608,392号;米国特許第4,992,478号;米国特許第4,559,157号;および米国特許第4,820,508号に開示される。
【００３６】
本発明の炎症メディエーター、前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド、および薬学的組成物の有用な投与量は、これらのインビトロ活性および動物モデルにおけるインビボ活性を比較することによって決定することができる。マウスおよび他の動物における有効投与量をヒトにあてはめて推定するための方法は当業者に公知である。例えば、米国特許第4,938,949号を参照されたい。
【００３７】
本発明はまた、本発明の炎症メディエーターまたは前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチドを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、薬学的組成物に関する。ある量の化合物を含む、経口投与、局所投与、または非経口投与に合わせられた薬学的組成物は、本発明の好ましい態様を構成する。本発明の文脈において患者、特に、ヒトに投与される用量は、致死毒性を生じることなく、好ましくは、許容されるレベルを超える副作用または罹患率を引き起こすことなく、妥当な時間枠にわたって患者において治療応答を実現するのに十分なものでなければならない。当業者であれば、投与量が、被験体の状態(健康状態)、被験体の体重、併用療法の種類、もしあれば、治療の頻度、治療比、ならびに病理学的状態の重篤度および段階を含む様々な要因によって決まることが分かるだろう。
【００３８】
望ましい治療処置のために、このような投与量を投与するために、一部の態様において、本発明の薬学的組成物は、担体または希釈剤を含む組成物全体の重量に基づいて、約0.1重量％〜45重量％、特に、1〜15重量％の1つまたは複数の種類の全ての化合物を含んでもよい。例示的には、投与される活性成分の投与量レベルは、動物体重で、静脈内、0.01〜約20mg/kg;腹腔内、0.01〜約100mg/kg:皮下、0.01〜約100mg/kg;筋肉内、0.01〜約100mg/kg;経口、0.01〜約200mg/kg、好ましくは、約1〜100mg/kg;点鼻、0.01〜約20mg/kg;およびエアゾール剤、0.01〜約20mg/kgでもよい。
【００３９】
本発明はまた、本発明の炎症メディエーターをコードするヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド発現構築物に関する。1つの態様において、ポリヌクレオチドは、ヒトGM-CSF、または完全長または非変異体GM-CSFと実質的に同じ活性を示す、その断片もしくは変異体をコードする。
【００４０】
本明細書において使用する「発現構築物」という用語は、機能的に連結された核酸配列を転写する核酸配列の組み合わせを指す。本明細書で使用する「機能的に連結された」という用語は記載の成分の近位を指し、ここで、成分は、意図されたやり方で機能する関係にある。一般的に、機能的に連結された成分は連続した関係にある。
【００４１】
本発明の発現構築物はまた、一般的に、発現構築物が発現される意図された宿主細胞において機能する調節エレメントを含む。従って、当業者であれば、例えば、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、植物宿主細胞、昆虫宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、およびヒト宿主細胞において使用するために調節エレメントを選択することができる。調節エレメントには、プロモーター、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサー、およびポリアデニル化エレメントが含まれる。
【００４２】
本発明の発現構築物は、本発明の炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーター配列を含んでもよい。プロモーターは、当技術分野において公知の標準的な技法を用いてポリヌクレオチドに組み込むことができる。複数コピーのプロモーターまたは複数のプロモーターを、本発明の発現構築物において使用することができる。好ましい態様において、プロモーターは、天然遺伝子環境にある転写開始点からの距離とほぼ同じ、転写開始点からの距離に配置されてもよい。プロモーター活性が大幅に減少するのでなければ、この距離はある程度変化してもよい。転写開始点は、典型的には、発現構築物に含まれる。
【００４３】
動物細胞において発現させるために、本発明の発現構築物は、ポリヌクレオチド配列を転写させることができる適切なプロモーターを含んでもよい。細胞が哺乳動物細胞であれば、プロモーター、例えば、アクチンプロモーター、メタロチオネインプロモーター、NF-κBプロモーター、EGRプロモーター、SREプロモーター、IL-2プロモーター、NFATプロモーター、オステオカルシンプロモーター、SV40初期プロモーターおよびSV40後期プロモーター、Lckプロモーター、BMP5プロモーター、TRP-1プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス長末端反復配列プロモーター、STATプロモーター、または免疫グロブリンプロモーターを、発現構築物において使用することができる。昆虫細胞において発現させるために、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターを、本発明の発現構築物と共に使用することができる。酵母細胞における本発明の発現構築物と使用するのに適したプロモーターには、3-ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、メタロチオネインプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼ-2プロモーター、およびヘキソキナーゼプロモーターが含まれるが、これに限定されない。
【００４４】
原核生物系において発現させるために、本発明の発現構築物は、プロモーター、例えば、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp)プロモーター、λPLプロモーター、β-ラクタマーゼプロモーター、ラクトースプロモーター、phoAプロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター、またはtacプロモーター(de Boer et al. 1983)を含んでもよい。
【００４５】
発現構築物を植物細胞に入れようとするのであれば、植物ウイルスプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S(強化型CaMV 35Sプロモーター(例えば、米国特許第5,106,739号を参照されたい))または19Sプロモーターを使用することができる。植物プロモーター、例えば、プロリフェラ(prolifera)プロモーター、Ap3プロモーター、熱ショックプロモーター、A.チュマファシエンス(A.tumafaciens)のT-DNA 1'-または2'-プロモーター、ポリガラクツロナーゼプロモーター、ペチュニア(petunia)に由来するカルコン合成酵素A(CHS-A)プロモーター、タバコPR-1aプロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、alc A遺伝子プロモーター、pin2プロモーター(Xu et al., 1993)、トウモロコシWipIプロモーター、トウモロコシtrpA遺伝子プロモーター(米国特許第5,625,136号)、トウモロコシCDPK遺伝子プロモーター、およびルビスコSSUプロモーター(米国特許第5,034,322号)も使用することができる。種子特異的プロモーター、例えば、β-ファセオリン遺伝子(インゲンマメ)に由来するプロモーターまたはグリシニン遺伝子(ダイズ)に由来するプロモーター、およびその他も使用することができる。本発明のポリヌクレオチドと使用するために、構成的プロモーター(例えば、CaMV、ユビキチン、アクチン、またはNOSプロモーター)、組織特異的ロモーター(例えば、トマトに由来するE8プロモーター)、発生調節型プロモーター、および誘導性プロモーター(例えば、熱、光、ホルモン、または化学物質によって誘導することができるプロモーター)が意図される。
【００４６】
本発明の発現構築物は、任意で、転写終結配列、翻訳終結配列、シグナルペプチド配列、および/またはエンハンサーエレメントを含んでもよい。転写終結領域は、典型的は、真核生物またはウイルスの遺伝子配列の3'非翻訳領域から得ることができる。効率的な終結のために、転写終結配列をコード配列の下流に配置することができる。シグナルペプチドは、機能的に連結されたペプチドを、特定の細胞小器官区画からタンパク質作用部位および細胞外環境までの広範囲の翻訳後細胞目的地に移動するのを担う情報をコードする、短いアミノ末端配列のグループである。本発明の炎症メディエーターと共に使用するために、機能的に連結されたシグナルペプチド配列を用いることによって、目的の細胞目的地および/または細胞外目的地にポリペプチドを標的化することが意図される。化学的エンハンサーは、遺伝子転写を高めるシス作用エレメントであり、これも発現構築物に含めることができる。化学的エンハンサーエレメントは当技術分野において公知であり、CaMV35Sエンハンサーエレメント、サイトメガロウイルス(CMV)初期プロモーターエンハンサーエレメント、およびSV40エンハンサーエレメントが含まれるが、これに限定されない。構造遺伝子によってコードされるmRNAのポリアデニル化を誘導するDNA配列もまた発現構築物に含めることができる。
【００４７】
ポリヌクレオチドベクターに挿入するために、独特の制限酵素部位を、発現構築物の5'末端および3'末端に含めることができる。本明細書で使用する「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと結合した時に複製することができ、細胞間でポリヌクレオチド配列を移動することができる、任意の遺伝因子、例えば、プラスミド、コスミド、染色体、ファージ、ウイルスなどを指す。ベクターは、選択された宿主細胞においてベクターが複製するのを可能にするヌクレオチド配列を含む。多数のベクターが発現および/またはクローニングに利用することができ、pBR322、pUCシリーズ、M13シリーズ、およびpBLUESCRIPTベクター(Stratagene, La Jolla, CA)が含まれるが、これに限定されない。
【００４８】
本発明のポリヌクレオチド、ベクター、および発現構築物は、当技術分野において公知の方法によって細胞に導入することができる。このような方法には、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、細胞融合、リン酸カルシウム沈殿、およびバイオリスティック法が含まれる。1つの態様において、本発明のポリヌクレオチドまたは発現構築物は、ウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)、単純ヘルペスウイルス(HSV)、パピローマウイルス、アデノウイルス、およびエプスタイン-バーウイルス(EBV)を介してインビボで導入することができる。本発明と共に使用することができる弱毒型または欠損型のウイルスベクターは当技術分野において公知である。典型的には、欠損ウイルスは細胞に導入された後に感染することができない。本発明のポリヌクレオチド、ベクター、および発現構築物はまた、リポフェクション(合成カチオン脂質から調製されたリポソームを介したDNAトランスフェクション)(Felgner et al, 1987)を介してインビボで導入することができる。合成カチオン性脂質(LIPOFECTIN, Invitrogen Corp., La Jolla, CA)を用いると、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、および発現構築物を封入するリポソームを調製することができる。本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または発現構築物はまた、当技術分野において公知の方法、例えば、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、およびバイオリスティック法を用いて裸のDNAとしてインビボで導入することもできる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、本明細書において例示された範囲を含む、より具体的な同一性および/または類似性の範囲によって定義することもできる。配列同一性は、典型的には、60％超、好ましくは75％超、より好ましくは80％超、さらにより好ましくは90％超であり、95％を超えてもよい。配列の同一性および/または類似性は、本明細書において例示された配列と比較して、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％でもよい。特別の定めのない限り、本明細書で使用する、2つの配列のパーセント配列同一性および/または類似性は、Karlin and Altschul(1993)のように改良されたKarlin and Altschul(1990)のアルゴリズムを用いて決定することができる。このようなアルゴリズムは、Altschul et al(1990)のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。BLAST検索は、望ましいパーセント配列同一性を有する配列を得るように、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて行うことができる。比較のためにギャップの付いたアラインメントを得るために、Altschul et al(1997)に記載のように、Gapped BLASTを使用することができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム(NBLASTおよびXBLAST)のデフォルトパラメータを使用することができる。NCBI/NIHウェブサイトを参照されたい。
【００５０】
本発明はまた、本発明の炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド配列と、標準的なストリンジェントな条件下および標準的な方法(Maniatis, T. et al, 1982)の下で、ハイブリダイゼーションするのに十分な相同性のある配列を有する(本発明の炎症メディエーターをコードする)ポリヌクレオチド分子も意図する。本明細書で使用する、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな」条件は、ハイブリダイゼーションが、典型的には、6xSSPE、5xデンハルト溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml変性DNAの中で、DNAハイブリッドの融解温度(Tm)より20〜25℃低い温度で一晩行われる条件を指す。融解温度は、以下の式(Beltz, G. A. et al, 1983):
Tm=81.5℃+16.6 Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％ホルムアミド)-600/二重鎖の長さ(塩基対)
で表される。
【００５１】
洗浄は、典型的には、以下の通りに行われる。
(1)室温、15分、1xSSPE、0.1％SDSを2回(低ストリンジェンシー洗浄)。
(2)Tm-20℃、15分、0.2xSSPE、0.1％SDSを1回(中等度ストリンジェンシー洗浄)。
【００５２】
本明細書で使用する、「核酸」および「ポリヌクレオチド配列」という用語は、一本鎖または二本鎖の形をしたデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、特に限定のない限り、天然ヌクレオチドと同じように機能することができる、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む。ポリヌクレオチド配列には、RNAに転写されるDNA鎖配列およびタンパク質に翻訳されるRNA配列が含まれる。ポリヌクレオチド配列には、完全長配列ならびに完全長配列に由来するさらに短い配列が含まれる。ある特定のポリヌクレオチド配列には、天然配列の縮重コドン、または特定の宿主細胞においてコドン優先を生じるように導入され得る配列が含まれることが理解される。本発明の範囲内にあるポリヌクレオチド配列には、本発明の炎症メディエーターをコードする配列と特異的にハイブリダイズする配列がさらに含まれる。ポリヌクレオチドには、センス鎖およびアンチセンス鎖が個々の鎖としてまたは二重鎖で含まれる。
【００５３】
本発明はまた、炎症メディエーターおよび/もしくは前記炎症メディエーターをコードするポリヌクレオチド、または炎症メディエーターを含む組成物、または本発明の炎症メディエーターの産生を誘導する化合物もしくは剤を、1つまたは複数の容器に含むキットに関する。本発明のキットは、任意で、薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含んでもよい。本発明のキットは、fms関連チロシンキナーゼ3(Flt3)リガンド、インターロイキン-6(IL-6)、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-3(IL-3)、エリスロポエチン(EPO)、血管内皮増殖因子A(VEGF-A)、低酸素誘導性転写因子(HIF-1α)、インシュリン様増殖因子-1(IGF-1)、腫瘍壊死因子(TNF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)、およびメタロプロテイナーゼの1つまたは複数を含んでもよい。1つの態様において、本発明のキットは、本明細書に記載の他の1つまたは複数の成分、賦形剤、または補助剤を含む。1つの態様において、本発明のキットは、キットの炎症メディエーターまたは組成物の投与方法について述べている説明書または包装材料を含む。キットの容器は、任意の適切な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属などからなる容器、および任意の適切なサイズ、形状、または配置の容器でよい。1つの態様において、キットの中で、本発明の炎症メディエーターは固体として、例えば、錠剤、丸剤、または散剤の形で提供される。別の態様において、キットの中で、本発明の炎症メディエーターは液体または溶液として提供される。1つの態様において、キットは、液体または溶液の形で本発明の化合物および/または剤を含むアンプルまたは注射器を備える。
【００５４】
本発明はまた、認知障害の緩和におけるGM-CSFの活性およびその生物学的活性を刺激する化合物を特定するための方法に関する。
【００５５】
本発明はまた、認知障害の緩和におけるGM-CSFの活性およびその生物学的活性を競合阻害する化合物を特定するための方法に関する。
【００５６】
開示された方法から利益を得る哺乳動物種には、霊長類、例えば、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サル;家畜化された動物(例えば、ペット)、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ベトナムポットベリーブタ(Vietnamese pot-bellied pig)、ウサギ、およびフェレット;家畜、例えば、ウシ、バッファロー、バイソン、ロバ、ブタ、ヒツジ、およびヤギ;典型的に動物園で見られる珍しい動物、例えば、クマ、ライオン、トラ、パンサー、ゾウ、カバ、サイ、キリン、レイヨウ、ナマケモノ、ガゼル、シマウマ、ヌー、プレーリードッグ、コアラ、カンガルー、オポッサム、アライグマ、パンダ、ハイエナ、アザラシ、アシカ、ゾウアザラシ、カワウソ、ネズミイルカ、イルカ、およびクジラが含まれるが、これに限定されない。開示された方法から利益を得る可能性のある他の種には、魚類、両生類、鳥類、およびハ虫類が含まれる。本明細書で使用する「患者」および「被験体」という用語は同義に用いられ、このようなヒトおよび非ヒト種を含むことが意図される。同様に、本発明のインビトロ方法は、このようなヒトおよび非ヒト種の細胞に対して行うことができる。
【００５７】
以下の用語は、以下に示された意味を有することが意図され、本発明の説明の理解において有用であり、本発明の範囲を限定することが意図されない。
【００５８】
「神経細胞」という用語は、中枢神経系または末梢神経系に由来する感覚細胞、伝達細胞(transmittal cell)、および運動細胞、例えば、ニューロン、グリア細胞、星状細胞などを含む、神経(例えば、脳、脊髄)由来の任意の細胞を意味する。
【００５９】
「アミロイドβペプチド」という用語は、アミロイドβ前駆体タンパク質(APP)から処理されたアミロイドβペプチドを意味する。最も一般的なペプチドには、アミロイドβペプチド1-40、1-42、11-40および11-42が含まれる。主流でないアミロイドβペプチドの他の種として、yが2〜17であるy-42およびxが24〜39および41である1-xが述べられている。
【００６０】
「担体」という用語は、中間の、大量の、および/または使用可能な形を薬学的組成物に付与するために、薬学的組成物の処方において用いられる無毒材料を意味する。担体は、このような材料、例えば、賦形剤、安定剤、またはpH緩衝水溶液の1つまたは複数を含んでもよい。生理学的に許容される担体の例には、リン酸、クエン酸、および他の有機酸を含む、水性または固体の緩衝成分;アスコルビン酸を含む抗酸化物質;低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン;グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール;塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム;ならびに/または非イオン界面活性剤、例えば、TWEEN、ポリエチレングリコール(PEG)、およびプルロニックス(PLURONlCS)が含まれる。
【００６１】
「接触する」または「接触」という用語は、インビトロ系でもインビボ系でも、少なくとも2つの部分を一緒にすることを意味する。
【００６２】
「状態」または「疾患」という用語は、症状(すなわち、病気)が明らかに認められること、あるいは異常臨床指標(例えば、生化学的指標)、あるいはこのような症状もしくは異常臨床指標が発生する遺伝的リスクもしくは環境リスク、またはこのような症状もしくは異常臨床指標が発生する傾向が現われていることを意味する。
【００６３】
「内因性」という用語は、動物が天然で産生する材料を意味するものとする。例えば、「キナーゼ」という用語に関するが、これに限定されない、内因性は、動物、例えば、哺乳動物(ヒトなどがあるが、これに限定されない)またはウイルスによって天然に産生されたことを意味するものとする。対照的に、この文脈において非内因性という用語は、動物、例えば、哺乳動物(ヒトなどがあるが、これに限定されない)またはウイルスによって天然に産生されていないことを意味するものとする。両用語とも、「インビボ」系および「インビトロ」系の両方について述べるために使用することができる。例えば、スクリーニングアプローチでは、内因性キナーゼまたは非内因性キナーゼはインビトロスクリーニング系に関するものでもよいが、これに限定されない。さらなる例として、かつ非限定的に、哺乳動物のゲノムが非内因性の構成的に活性化されるキナーゼを含むように操作されている場合、インビボ系による候補化合物のスクリーニングが実行可能である。
【００６４】
「応答」という用語と関連して「阻害する」もしくは「阻害」または「抑制する」もしくは「抑制」もしくは「抑制的」という用語は、化合物の存在下での応答が、化合物の非存在下とは反対に減少した、または阻止されたことを意味する。
【００６５】
「リガンド」という用語は、内因性の天然受容体に特異的な内因性の天然分子を意味する。
【００６６】
本明細書で使用する「薬学的に許容されるプロドラッグ」という用語は、適切な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、炎症、アレルギー反応のある患者の組織と接触させて使用するのに適し、妥当なベネフィット/リスク比に見合い、本発明の化合物の所期の使用に有効な、本発明において有用な化合物のプロドラッグを意味する。「プロドラッグ」という用語は、インビボで変換して、本発明において有用な有効な化合物またはその薬学的に許容される塩、水和物、もしくは溶媒和化合物を生じる化合物を意味する。この変換は、様々な機構、例えば、血中での加水分解によって起こってもよい。代謝により切断可能な基を有する化合物には、代謝により切断可能な基が存在したために親化合物に付与されていた溶解度および/または吸収速度が上昇した結果としてバイオアベイラビリティが改善し得るという利点がある。従って、このような化合物はプロドラッグとして作用する。参照により本明細書に組み入れられる、Bundgaard (1985)、Widder et al.(1985)、Krogsgaard-Larsen and Bandaged(1991)、Bundgard(1992)、Nielsenw and Bundgaard(1988)、Nakeya el al.(1984)、Higuchi and Stella(1987)において、徹底した議論がなされている。プロドラッグの一例はエステルプロドラッグである。「エステルプロドラッグ」は、代謝手段(例えば、加水分解)によってインビボで、本発明による阻害剤化合物に変換可能な化合物を意味する。例えば、カルボキシ基を含有する化合物のエステルプロドラッグは、インビボで加水分解することによって、対応するカルボキシ基に変換することができる。
【００６７】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の無毒の、無機および有機の酸添加塩および塩基添加塩を指す。これらの塩は、本発明において有用な化合物を最終的に単離および精製する間にインサイチューで調製することができる。
【００６８】
「薬学的賦形剤」という用語は、ペプチドの生物学的活性作用または体内への吸収度を増強することができる、本発明に添加することができる無毒の補助剤または化合物を指す。
【００６９】
「ポリペプチド」という用語は、天然アミノ酸または合成アミノ酸およびその誘導体のいずれか1つからなるタンパク質に関する。本発明において、ポリペプチドは、例えば、GM-CSFタンパク質またはその生物学的に活性な等価物のアミノ酸配列を意味することがある。場合によっては、ペプチドの生物学的活性を変えることなく、天然アミノ酸のいずれか1つを機能的アミノ酸で置換することができる。例えば、ペプチドは、アミノ酸からなる配列特異的および長さ特異的な短いオリゴマーである。これらのよく知られた生体分子は生細胞において広範に存在し、細胞受容体リガンド、内因性抗生物質、およびさらには肺界面活性物質の成分を含む無数の役割を果たす。生理活性ペプチドが果たす役割はそれぞれ、典型的には、独特の三次元構造に対応する。このように、自然は進化によって生理活性ペプチドの配列および活性を精緻なものにしてきた。当然、薬学的リード化合物として、これらの分子を利用することに大きな関心があった。多くの場合、第二世代の薬物療法では、非天然ペプチドミメティックの作製に焦点が合わせられてきた。これらの「ペプチドミメティック」は、アミド結合アイソスターおよび/または鎖延長もしくはヘテロ原子の組み込みを含む天然ペプチドバックボーンの改変を用いることによってペプチド一次構造を模倣する、どのオリゴマーに基づくものでよい。ペプチドミメティックオリゴマーは、多くの場合、プロテアーゼ耐性であり、ペプチド類似体と比較して免疫原性が低く、バイオアベイラビリティが改善されている場合がある。一次構造模倣に加えて、配列特異的ペプチドミメティックオリゴマーの選択されたサブセット、いわゆる「フォルダマー(foldamer)」は、詳細に明らかにされた二次構造エレメント、例えば、へリックス、ターン、およびスモールシート様構造を示す。ペプチドの生理活性またはその生物学的等価物が正確な3-D構造に付随する場合、バイオミメティックオリゴマーが折り畳まれる能力が必須な場合がある。単純なペプチドミメティックの例には、アザペプチド、オリゴカルバメート、およびオリゴウレアが含まれ、一般的なフォルダマーの例には、β-ペプチド、γ-ペプチド、オリゴ(フェニレンエチレン)、ビニローグスルホノペプチド、およびポリ-N置換グリシン(ペプトイド)が含まれる。従って、本発明の炎症メディエーター、例えば、GM-CSFポリペプチドのペプチドミメティックは本発明の範囲内である。
【００７０】
「溶媒和化合物」という用語は、本発明において有用な化合物と1つまたは複数の種類の溶媒分子との物理的結合を意味する。この物理的結合は水素結合を含んでもよい。ある特定の場合において、例えば、1つまたは複数の種類の溶媒分子が結晶固体の結晶格子に組み込まれた時に、溶媒和化合物を単離することができる。「溶媒和化合物」は、溶相および単離可能な溶媒和化合物の両方を含む。代表的な溶媒和化合物には、水和物、エタノール付加物、およびメタノール付加物が含まれる。
【００７１】
「有効量」または「治療的有効量」という用語は、医師または他の臨床家が求めている被験体の生物学的応答または医学的応答を誘発する化合物または剤の量を意味する。特に、ニューロン障害の治療に関して、「有効量」という用語は、被験体における認知障害を緩和することができる医用薬剤の有効量を意味することが意図される。
【００７２】
平均的なマウスの典型的な重量は約.025kgであり、代謝率はヒトの約7.2倍である。平均的なヒトの典型的な体重は約70kgである。標準体重および代謝率を調整することによって、本明細書に記載の本発明の医用薬剤の療法に有効な用量を得ることができるのは当業者の範囲内である。例えば、本発明の範囲内にある有効量は、ある期間にわたって、必要に応じて認知作用を実現するように、約5mcg/日以内のマウス相当量であり、ヒトでは約2mg/日以内である。または、ヒトでの有効量は約50mcg/日〜約2mg/日の範囲内にあってもよく、または50mcg/日、または100mcg/日、または250mcg/日、または500mcg/日、または750mcg/日、または1mg/日、または1.25mg/日、または1.5mg/日、または2mg/日、または2.25mg/日、または2.5mg/日でもよく、または、必要に応じて、個体の体重、代謝、および代謝要求に合わせて、少なくとも、このような個体の有効な認知作用を実現するように調整されてもよい。
【００７３】
「治療する」という用語は、障害、疾患、もしくは状態の発症を逆転もしくは予防する目的で、または障害、疾患、もしくは状態の異常を変化させ、それにより、このような障害、疾患、または状態の1つまたは複数の症状を含む、障害、疾患、または状態を緩和する目的で行われる介入を意味する。予防は、予防的措置または予防措置を指す。「治療する」という用語が前記で定義されているように、本明細書で使用する関連する用語である「治療」は、障害、症状、疾患、または状態を治療する行為を指す。
【００７４】
Flt3リガンドは、FLT3チロシンキナーゼ受容体のリガンドであり、初期造血細胞の増殖を調節する小さな増殖因子グループに属する。Flt3リガンドの複数のアイソフォームが特定されている。主な型は膜貫通型であり、細胞表面上で生物学的に活性がある。膜貫通アイソフォームはタンパク分解されると可溶型が生じ、これも生物学的に活性がある。Flt3リガンドは、チロシンキナーゼ受容体Flt3を発現する細胞に結合する。Flt3リガンドは単独で増殖を刺激することができないが、他のコロニー刺激因子(CSF)およびインターロイキンと良好に協力して増殖および分化を誘導する。
【００７５】
インターロイキン6(IL-6)は、最初に、RNA刺激フィブロブラストイド(fibroblastoid)細胞の培地中に発見された多機能性24kDaタンパク質である。IL-6は、IL-1、TNF、PDGF、IFN-β、TNF-α、NGF、IL-17によってアップレギュレートされ、グルココルチコイド、IL-4、TGF-βによってダウンレギュレートされる。IL-6は、感染および細胞損傷後に起こる応答に直接関与するように見え、急性期応答の調節においてIL-1およびTNF-αと同じくらい重要であることが判明している。IL-6はまた体脂肪量の調節に結びつけられてきた。IL-6は、線維芽細胞、活性化T細胞、活性化単球またはマクロファージ、および内皮細胞によって産生されると報告されている。IL-6は、線維芽細胞、骨髄球系前駆細胞、T細胞、B細胞、および肝細胞を含む様々な細胞に作用する。さらに、IL-6は、Tリンパ球の増殖においてIL-2と相互作用するように見える。IL-6は、多分化能性造血前駆細胞に対するIL-3の増殖効果を増強する。
【００７６】
マクロファージ遊走阻止因子(MIF)は、当初、マクロファージのランダムな遊走を阻害するTリンパ球由来因子とも呼ばれ、ほぼ30年間、謎のサイトカインであった。近年、脳下垂体前葉の産物としてのMIFの発見、ならびに生理活性のある組換えMIFタンパク質のクローニングおよび発現がインビボでの重要な生物学的役割の定義につながってきた。MIFは、グルココルチコイドによって刺激されたマクロファージおよびTリンパ球から放出されるという独特の特性を有する。MIFは、一旦、放出されると、インビトロでは、LPS刺激単球によるTNFα、IL-1β、IL-6、およびIL-8の産生に対するグルココルチコイドの阻害効果を克服し、インビボでは、致死性内毒血症に対するステロイドの保護効果を抑制する。MIFはまた、インビトロでは、IL-2およびIFN-γの産生を回復させることによってT細胞増殖のグルココルチコイド阻害を弱める。この観察から、免疫系内でのMIFの中心的な役割が特定され、炎症応答および免疫応答の制御の理解における重要なギャップが埋められた。グルココルチコイドは、長い間、感染または組織浸潤に対するストレス応答の不可欠な成分であり、炎症応答および免疫応答を調節するのに役立つとみなされてきた。MIFは、グルココルチコイドの阻害効果を反対調節することができ、従って、炎症および免疫の宿主制御において重要な役割を果たしていると特定された最初のメディエーターである。
【００７７】
腫瘍壊死因子(TNF)は、腫瘍細胞の壊死(死)を誘導し、広範囲の炎症誘発作用を有する、それぞれ157アミノ酸を有するタンパク質スーパーファミリーのメンバーである。腫瘍壊死因子は、脂質代謝、凝固、インスリン抵抗性、および血管を裏打ちする内皮細胞の機能に影響を及ぼす多機能性サイトカインである。
【００７８】
インターロイキン-1(IL-1)は、これまでに述べられた1番目のサイトカインの1つである。この最初の発見は、発熱を誘導する、リンパ球を制御する、骨髄細胞数を増やす、骨関節の変性を引き起こすことができる因子としてのものであった。現時点で、IL-1は、特に、内因性発熱物質、リンパ球活性化因子、ヘモポエチン(haemopoetin)-1および単核細胞因子を含む、他のいくつかの名前で知られていた。実際には、IL-1が、現在、IL-1αおよびIL-1βと呼ばれる2つの異なるタンパク質からなることを科学者らが確かめたのは1984〜1985年ごろであった。
【００７９】
インターロイキン-3(IL-3)は152アミノ酸タンパク質であり、通常、グリコシル化されており、造血細胞内での20α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ合成を誘導するTリンパ球由来因子として最初に見出された。IL-3は活性化T細胞によって分泌され、GM-CSFおよびIL-5が共有する共通βc受容体サブユニットと共にヘテロ二量体化するIL-3受容体に結合する。IL-3はGM-CSFと同様に機能し、ヒトIL-3遺伝子は、5番染色体上に、GM-CSF遺伝子から9キロベース離れて位置する。IL-3は、多くの造血細胞型の増殖を支持し、様々な細胞活性、例えば、細胞増殖、分化、およびアポトーシスに関与することが示されている。
【００８０】
エリスロポエチン(EPO)は、主に、腎臓皮質の管周囲線維芽細胞によって産生される30.4kDA糖タンパク質ホルモンであり、赤血球がアポトーシスしないように、ならびに他の増殖因子(IGF-1、IL-3、およびGM-CSF)との協力作用により赤血球前駆細胞の増殖および成熟を促進するように働く。血液酸素化は、低酸素誘導因子と呼ばれる、構成的に合成される転写因子によりEPO発現を調節すると考えられている。EPOはまた、神経保護特性および血管形成特性を有すると報告されている。
【００８１】
血管内皮増殖因子A(VEGF-A)は、血小板由来増殖因子ファミリーに属し、脈管形成および血管形成に関与する多機能性タンパク質である。VEGF-Aは低酸素細胞において産生され、HIF-1α発現によって放出されて、細胞表面受容体VEGFR-1(Flt-1)またはVEGFR-2(KDR/Flk-1)に結合して、それに応じて様々な機能を誘導する。VEGF-Aは、内皮細胞有糸分裂誘発および遊走、血管拡張を刺激し、単球系列造血細胞の走化性因子であることが示されている。
【００８２】
低酸素誘導性転写因子α(HIF-1α)は、利用可能な細胞酸素の変化に応答する転写因子である。HIF-1αは、正常酸素圧条件では、HIFプロリル-ヒドロキシラーゼによってプロリルヒドロキシル化されるとプロテアソームによって急速に分解され、その後に、ユビキチン結合を誘導する。低酸素状態はこのプロリルヒドロキシル化を阻止し、HIF-1αは安定化し、低酸素生存を促進するいくつかの遺伝子、例えば、EPOおよびVEGFをアップレギュレートするように作用する。従って、HIF-1αは、これらの遺伝子のアップレギュレーションによって脈管形成および血管形成を増大させる。
【００８３】
インシュリン様増殖因子1(IGF-1)は、インシュリンと分子構造が似ている70アミノ酸ポリペプチドタンパク質ホルモンであり、主に肝臓によって産生される。IGF-1は、IGF-1受容体(IGF-R)およびインシュリン受容体(IR)に結合し、細胞増殖および抗アポトーシスAKTシグナル伝達経路の強力なアクチベーターである。全生物で産生されるが、その発現は乳児期および老年期では最も低く、IGF-RおよびIRは、アルツハイマー病(AD)では低下し、神経変性と相関関係があると報告されている。IGF-1はまた、インシュリンおよびEPOによるシグナル伝達の欠損に起因する血管合併症により、ADの正の危険因子である2型糖尿病の発病にも結びつけられている。
【００８４】
顆粒球コロニー刺激因子(G-CSFまたはGCSF)はコロニー刺激因子ホルモンである。これは、多くの異なる組織が産生して、顆粒球および幹細胞を産生するように骨髄を刺激する、糖タンパク質、増殖因子、またはサイトカインである。次いで、G-CSFは、G-CSFを血液に放出するように骨髄を刺激する。G-CSFはまた、好中球前駆体および成熟好中球の生存、増殖、分化、および機能を刺激する。G-CSFはコロニー刺激因子3(CSF-3)とも知られている。
【００８５】
顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)は、マクロファージ、T細胞、マスト細胞、内皮細胞、および線維芽細胞によって分泌されるタンパク質である。GM-CSFは、白血球増殖因子として機能するサイトカインである。GM-CSFは幹細胞を刺激して、顆粒球(好中球、好酸球、および好塩基球)、単球ならびに樹状細胞を産生する。単球は循環から出て、組織に遊走し、マクロファージに成熟する。従って、マクロファージは免疫/炎症カスケードの一部であり、これにより、少数のマクロファージが活性化されると、マクロファージの数が急速に増加する。これは、感染に立ち向かうのに重要なプロセスである。活性型タンパク質は細胞外でホモ二量体として見られる。
【００８６】
マクロファージコロニー刺激因子(M-CSFまたはCSF-1)は、造血単核球細胞が増殖し、マクロファージまたは他の関連細胞型、例えば、破骨細胞に分化するように影響を及ぼし、成熟マクロファージ、破骨細胞、およびミクログリアを活性化する分泌型サイトカインである。最近、M-CSFは、AD患者において発現が低いことが報告されており、ADのアミロイドーシスマウス動物モデルに末梢投与すると、アミロイド沈着および認知機能が寛解した。
【００８７】
メタロプロテイナーゼ(またはメタロプロテアーゼ)は、活性部位の中の最も顕著な官能基の性質により分類される、プロテイナーゼグループに由来する酵素ファミリーを構成する。メタロプロテイナーゼには2つのサブグループ:メタロエキソペプチダーゼと呼ばれるエキソペプチダーゼおよびメタロエンドペプチダーゼと呼ばれるエンドペプチダーゼがある。周知のメタロエンドペプチダーゼには、ADAMタンパク質およびマトリックスメタロプロテイナーゼが含まれる。
【００８８】
ダルベポエチンは、EPOより長い血漿半減期を有する新規のエリスロポエチン刺激因子(NESP)であり、5つのアミノ酸位置しか天然ヒトEPOと変わらない。ダルベポエチンはまた、赤血球形成の赤芽球バースト形成細胞およびコロニー形成赤芽球単位(colony-forming erythroid unit)から正赤芽球段階への成熟および増殖においてGM-CSFと協力作用すると予想されている(Fisher(2003))。赤血球形成は、ニューロン細胞の酸素化のために、および赤血球表面上の補体受容体1(CR1)の発現を介して補体結合循環アミロイドβタンパク質を除去するために、アルツハイマー病において重要である(Rogers el al.(2006); Cadman and Puttfarcken(1997); Helmy el al.(2006))。
【００８９】
幹細胞因子(SCF)は、単独で、または他のサイトカイン、例えば、GM-CSF、G-CSF、およびEPOと組み合わせて、原始的な多分化能造血幹細胞および単分化能造血幹細胞の増殖および発生を刺激することが報告されているサイトカインである(Fisher(2003))。SCFはまた、成熟顆粒球の機能を刺激するように作用する(Czygier el al.(2007))。
【００９０】
本明細書において言及または引用された全ての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、本明細書の明確な開示と相反しない程度まで、全ての図および表を含めて、これらの全体が、参照により組み入れられる。
【００９１】
以下は、本発明を実施するための手順を例示する実施例である。これらの実施例は限定するものと解釈すべきでない。特に定めのない限り、全てのパーセントは重量パーセントであり、全ての溶媒混合物比は体積比である。
【実施例】
【００９２】
実施例1
放射状水迷路試験
モーリス水迷路およびプラットフォーム認識試験の両方に関与する同じプールを用いて、作業(短期)記憶を放射状水迷路(RAWM)タスクにおいて評価した。このタスクでも、モーリス迷路試験と同じ透明なプラットフォームおよび視覚的手掛かり(visual cue)を用いた。
【００９３】
空間作業記憶の放射状水迷路タスクのために、アルミニウムインサートを100cm円形プールに入れて、中心の円形水泳領域から出ている6放射状に分布したスイムアームを作った。いろいろ取り揃えた2-Dおよび3-D視覚的手掛かりがプールを取り囲んだ。8日間の治療前試験および4日間の治療後試験にわたる5回試験/日のために、6つのスイムアームのどれが浸水エスケーププラットフォーム(9cm直径)を備えるかを突き止める前のエラーの数を確かめた。4回目の試験(T4:最終習得試験)と5回目の試験(T5;記憶保持試験)との間には30分の時間遅れがあった。プラットフォームの位置は異なるアームに対して毎日変更し、5回の試験のそれぞれについて異なる開始アームが残りの5本のスイムアームよりセミランダムに選択された。各試験(最大60秒)の間に、マウスは、間違ったアームに泳いだ時には、その試験の開始アームに戻され、浸水プラットフォームを突き止めるのに必要な秒数を記録した。マウスが60秒試験内にプラットフォームを見つけなかった場合、30秒の間にプラットフォームに誘導した。試験4および試験5の間のエラーの数およびプラットホームへたどり着くまでの時間(escape latency)の両方が作業記憶の指標とみなされ、AD患者の評価において臨床的に用いられる特定の項目の標準的な登録(registration)/想起試験と時間的に似ている。
【００９４】
治療後、RAWM試験(4日間)が完了した後に、全てのマウスを新規の認知的干渉タスクにおいて、6日間、さらに評価した。このタスクは、2種類の部屋の中にある2つの放射状水迷路装置および3種類の視覚的手掛かりを伴った。このタスクでは、異なる組の手掛かりによる干渉の後に、最初の組の手掛かりを想起して、放射状水迷路タスクを首尾良く解決できるように、動物が一組の視覚的手掛かりを覚えることを必要とした。5つ一組の行動測定を調べた。行動測定は、A1〜A3(RAWM「A」で行った最初の3回の試験からの3回試験想起の複合スコア)、「B」(RAWM「B」の1回の試験から得られた順向干渉測定)、A4(RAWM「A」の1回の試験から得られた逆向干渉測定)、および「A5」(A4からA5までの20分の遅れの後に、RAWM「A」の1回の試験から得られた遅延想起測定)であった。標準的なRAWMタスクと同様に、この干渉タスクでは、プラットフォームの位置は、使用した両RAWM装置について異なるアームに対して毎日変更し、両RAWM装置について、毎日、異なる開始アームを使用した。A1およびB試験の場合、最初に、プラットフォームを自分で見つけるために動物に1分間与えた後に、動物をプラットフォームに誘導した。次いで、各事例において実際の試験を行った。
【００９５】
マウス組換えGM-CSFを、PS/APPマウスを用いた各実験において使用した。注射1回につき5μgを生理食塩水に溶解して再構成し、以下で概略するように試験期間にわたって治療マウスに皮下注射した。
コホート1:29匹のマウス、F8 White Generation、DOB 04/20-05/07/2007
8匹のAPPマウス、21匹の非トランスジェニックマウス
プレテストRAWM:マウス1歳
8日間のRAWM:04/25-05/02/2008
プレテストから注射開始まで15日間の遅れ
治療開始05/17/2008
ポストテストRAWMの前に10日間の注射(5μg/日 s.c.)。全試験期間にわたって毎日注射した。
ポストテストRAWM開始 05/27/2008-05/30/2008;05/31/2008-06/01/2008は試験がなかったが、毎日注射を続けた。干渉RAWMの開始 06/02/2008-06/07/2008。
さらなるマウスを試験に加えた=コホート2
8匹のマウス:F8 Bright Orange、DOB 05/27/2007、3匹のAPP/PS1、4匹のAPP
F7 Light Blue、DOB 06/27/2007、1匹のAPP
プレテストRAWM
8日間のRAWM:05/12-05/19/2008
コホート1の17日後に開始
プレテストから注射開始まで15日間の遅れ
治療開始06/03/2008
ポストテストRAWM前に10日間の注射(5μg/日 s.c.)。全試験期間にわたって毎日注射した。
ポストテストRAWM開始06/12/2008-06/15/2008;06/16/2008-06/17/2008は試験がなかったが、毎日注射を続けた。干渉RAWMの開始06/18/2008-06/23/2008
【００９６】
結果:
図3、4、および7はGM-CSF試験の結果を示す。図7A-7D:標準的なRAWMエラー(4日間の試験;2回の2日間ブロック)。試験のブロック1および2について、未治療APPトランスジェニック群は、作業記憶試験T4およびT5において、全ての群または他のほとんどの群と比較して明らかな機能低下を示す。治療後、試験の全日にわたる成績から、未治療APPトランスジェニック群は他の3つ全ての群と比較してかなり機能低下していることが明らかになった。他の3つの群は互いに同じように動作した。
【００９７】
図7E:GM-CSF干渉試験-全体
未治療APPトランスジェニック群は、即時想起試験(A1〜A3)において、他の3つ全ての群と比較して非常に機能が低下していた。未治療APPトランスジェニック群は、順向干渉試験(試験B)および逆向干渉試験(試験A4)の両方について、GM-CSF治療非トランスジェニック同腹仔対照と比較してかなり成績が低かった。APPトランスジェニックGM-CSF治療群は、これらの試験において、治療および未治療非トランスジェニック同腹仔対照群と同じように動作した。未治療APPトランスジェニック群は、遅延想起試験(A5)において、他の3つ全ての群と比較して非常に機能が低下していた。他の3つの群は成績が互いに異ならなかった。
【００９８】
図3および4:GM-CSF干渉試験-ブロック1およびブロック2
両ブロックの間に、未治療APPトランスジェニック群は、他の3つ全ての群と比較して即時想起(A1〜A3)が機能低下し、遅延想起(A5)が機能低下していた。他の3つの群は成績が互いに異ならなかった。ブロック1の間に、APP未治療トランスジェニック群は順向干渉成績の選択的な機能低下を示した(試験B)。他の全ての群は、この試験の間にかなり良好に動作し、成績は互いに同一であった。両ブロックの間に、未治療APPトランスジェニック群は、GM-CSF治療非トランスジェニック同腹仔群と比較して逆向干渉(A4)において機能低下していた。
【００９９】
未治療APPトランスジェニック群は、他の3群と比較して、作業記憶、順向干渉、逆向干渉、および遅延想起が一貫して機能低下していることは、標準的なRAWM試験およびRAWM干渉試験の両方から明らかである。対照的に、GM-CSF治療APPトランスジェニック群の成績は、GM-CSF治療または未治療の非トランスジェニック同腹仔の成績と統計的に差がない。未治療APPトランスジェニック群の成績は、他の3群と比較して、複数の認知測定にわたってかなり悪かったことがはっきりと分かる。
【０１００】
さらに、海馬におけるGM-CSFレベルとアミロイドβレベルとの間で相関関係があるかどうか確かめるために、マウス群をカフェインで治療し、GM-CSFの血漿レベルを確かめた別の組の実験では、血漿GM-CSFと海馬不溶性A-βレベルとの間には強い逆の相関関係があることが見出された。例えば、図5Aおよび5Bを参照されたい。対照的に、血漿GM-CSFと海馬可溶性A-βレベルとの間には有意な正の相関関係があった(図5Cを参照されたい)。異なる組の実験において動物を用いた、この別の観察研究から、GM-CSFは、何らかの方法で脳から不溶性沈着A-βを除去して、脳の可溶性A-βが増加することが示唆された。恐らく、可溶性A-βの上昇は、血漿へのβ斑除去のための輸送機構である。このことは、GM-CSFの認知的利益の機構を示唆しているのかもしれない。GM-CSFまたはその生物学的等価物の認知的利益の説明となり得る他の機構は可能であり、本明細書に記載のように本発明の範囲内で、脳における新血管新生と、大脳血流の増大、斑およびこれらの関連する炎症の低下、骨髄由来神経発生、または微小血管の斑誘導性虚血に対する神経保護、および結果として生じる酸化ストレスを含む。本明細書において言及したこれらの機構の任意の組み合わせが、認知的利益に対するGM-CSFおよびその生物学的等価物の効果に起因し、本明細書に記載のように本発明の実施の範囲内であることも考慮すべきである。
【０１０１】
実施例2のための材料および方法
CSFの脳内投与に関与するトランスジェニックマウス
PS/APPマウスは、Swiss WebsterおよびC57BL/6がバックグラウンドの、ヘテロ接合性PDGF-hAPP(V717F)マウスとPDGF-hPS1(M146L)を交雑することによって作製した。トランスジーン検出は、比較リアルタイムPCR(Bio-Rad iCycler- Hercules, CA)を用いて行った。このモデルの病原性表現型は、6〜8ヶ月齢からの強いアミロイド斑蓄積である。動物実験に伴う全ての手順は、サウスフロリダ大学の実験動物委員会によって示されたガイドラインに従って行った。
【０１０２】
M-CSFの頭蓋内注入
動物(PS/APP、全て8.8〜9.6ヶ月、25〜35g、両方の性)を1〜2％イソフルランで麻酔し、剪毛し、10％ベタジン溶液で切開部位を洗い、定位固定装置(stereotaxic frame)(Kopf Instruments, Tujunga, CA)に入れた。小さな(4cm)切開を入れ、頭蓋を曝露し、二枚刃カミソリを用いて、動物の背中に沿って皮下ポケットを形成し、この中に浸透圧ミニポンプ(Alzetモデル1004, Durect Corp., Cupertino, CA)を挿入した。頭蓋に2つの穴をあけた(ブレグマから-0.1mm前方-後方、±0.9mm内側-外側。30ゲージカテーテルを、外側心室に対応する3.0mmの深さに注入した)。Alzetポンプから、市販のペデスタルカニューレではなく頭蓋の輪郭に合わせた送達用先端の付いた知的所有権下にあるカテーテルシステム(国際出願番号PCT/US08/73974)が通じている。この完全に皮下に入れられるシステムを用いると、試験物質の両側脳内注入が可能になる。この能力は、各半球への注入を可能にすることによって、動物間のアミロイド沈着が異なるという問題を克服する(図10を参照されたい)。同側に試験物質を送達し、反対側にビヒクルを送達することで、動物一匹一匹そのものが効果的に対照となる。さらに、頭皮は、ペデスタル付きカニューレの使用により見られた、開放創からのマウスに対する慢性炎症および刺激を治癒および軽減する。カニューレが両方とも挿入されたら、Locktite 454接着剤(Plastics One, Roanoke, VA)を用いて、カニューレを頭蓋に貼り、1cm直径ニトリルで固定する。接着剤が硬化した後に、頭皮を6〜7本の絹縫合糸で縫合し、動物に即時用量(immediate dose)のケトプロフェン(10mg/kg)を与え、必要に応じて、さらに48時間、6時間ごとに再度与える。
【０１０３】
M-CSFを、0.12μL/時間の平均流速でAlzetモデル1004を用いて、両側に、14日間、外側心室(5μg/日)に直接注入した。移植前に、ポンプおよびカテーテルには、48時間、37℃の水浴中で呼び水をさした。14日間の後に、動物に、過量(約100mg/kg、i.p.)のペントバルビタールナトリウムを与え、その後に、0.9％冷生理食塩水を経心腔的灌流した。
【０１０４】
CSFの定位注射
4匹のPS/APPマウス(全て10〜12ヶ月齢、25〜35g、両方の性)それぞれに、全部で3回のCSFを(同側)海馬に定位注射(5μg/注射)し、ビヒクル(人工脳脊髄液(aCSF))を対側注射した。頭蓋に2つの穴をあけた(ブレグマから-2.5mm前方-後方、±2.5mm内側-外側。30ゲージ針を2.5mmの深さに注入した)。7日後に、マウスを安楽死させ、0.9％冷生理食塩水を灌流した。この刊行物全体を通して、組換えマウスGM-CSF(rmGM-CSF)、組換えマウスG-CSF(rmG-CSF)、および組換えマウスM-CSF(rmG-CSF)(R&D Systems)を、GM-CSF、G-CSF、およびM-CSFと呼ぶ。
【０１０５】
海馬内注射マウスの免疫組織化学および画像分析
海馬内注射マウスからの灌流脳組織を10％中性緩衝ホルマリンで24〜36時間、固定し、次いで、さらに72時間にわたってスクロース勾配(10〜30％)に通した。次いで、脳を、ヒストスライド(histoslide)(Leica, Heerbruug, Switzerland)のペルチェ(Physitemp, Clifton, NJ)に対して凍結し、14μmの冠状切片を作製した。または、選択した脳を10％中性緩衝ホルマリン固定した後にパラフィン包埋し、5μmの切片を作製し、スライドに付着させた。脱パラフィンおよび抗原賦活(10mMクエン酸ナトリウム緩衝液中で20分間、煮沸)を行った後に、免疫組織化学染色を行った。パラフィン包埋スライドに用いる試薬および抗体の費用を大幅に減らすために、新規の磁気免疫組織化学染色装置を開発した。標準的な免疫組織化学的技法では、アミロイド沈着を免疫標識するために、抗Aβ抗体、すなわち、6E10(1:1000)およびMabTech's(1:5000)と、それに続いて、Alexa488および/または564二次フルオロフォア(1:1000、1:4000-Invitrogen)、ならびにHoechst(Sigma)核染色が用いられた。組織は、Axiovision 4.7ソフトウェアを用いて、Zeiss Axiocam Mrmカメラ(Oberkochen, Germany)の付いたZeiss Imager Z1蛍光顕微鏡で視覚化した。顕微鏡写真を10Xで撮影し、各脳半球の対応する位置からの各領域を選択するためにAxiovision Panarama Moduleでモンタージュにした。マウス一匹につき5枚の冠状切片があり、半球1つにつき15〜25枚の10X写真を分析した(前方-後方位置によって変化した)。アミロイド定量は、ImageJソフトウェアプログラム(米国立衛生研究所で開発され、米国立衛生研究所から入手可能)を用いて行った。簡単に述べると、冠状切片1枚あたりのそれぞれの分析写真の閾値は、ヒストグラム平均からの同じ標準偏差と等しくした。本発明者らは、バックグラウンドアーチファクトを最小限にするために同じ面積閾値を使用し、面積、周囲、フェレー径、および総密度パラメータについて分析した。フェレー径は、ある特定の斑の間で最も長い距離であり、総密度は、面積と斑の画素の中間灰色値との積である。
【０１０６】
GM-CSF治療に関与したトランスジェニックマウスの行動研究
本研究のマウスは、Florida Alzheimer's Disease Research Centerのトランスジェニックマウスコロニーから入手した。変異体APPK670N, M671L遺伝子(APPsw)を有するヘテロ接合性マウスを、ヘテロ接合性PS1(Tg系統6.2)マウスと日常的に交雑して、バックグラウンドが混合C57/B6/SW/SJLの、APPsw/PS1、APPsw、PS1、および非トランスジェニック(NT)遺伝子型からなる子孫を得た。本研究において使用するために、全て12ヶ月齢である11匹のAPPsw、4匹のAPPsw/PS1、および17匹のNTマウスを選択し、作業記憶のRAWMタスクにおいて8日間評価した(以下のプロトコールを参照されたい)。非常に多くの実験から、ADの様々な遺伝子型が認知障害に達したら同様に動作することが明らかになった。従って、15匹のTgマウスを、RAWM成績をかたよらせずに2つの群に分け、2匹のAPPswマウスを各群に含めた。17匹のNTマウスも、RAWM成績をかたよらせずに2つの群に分けた。治療前試験が完了して2週間後に、Tgマウスの一群(n=7)およびNTマウスの一群(n=9)に、GM-CSF(5μg/日皮下投与)を用いる10日間の治療プロトコールを開始したのに対して、対照TgおよびNT群(n=8/群)の動物には、同じ10日間にわたって、毎日、ビヒクル(生理食塩水)治療を皮下に与えた。注射して11日目に、全てのマウスに対して、RAWMタスクにおいて4日間の評価を開始し、休息を2日間与え、その後に、さらに4日間、新規の認知的干渉タスクにおいて試験を行った(以下のプロトコールを参照されたい)。行動試験期間全体を通して、GM-CSFおよび生理食塩水注射は毎日続けた。治療に入って3週間で行動試験が完了した後、全てのマウスを安楽死させ、前記のように脳を固定し、パラフィン包埋した。剖検の際の全組織の注意深い目視検査からは形態異常は認められず、毎日皮下注射に対するマウスの忍容性は良好であった。
【０１０７】
皮下GM-CSF治療マウスの免疫組織化学および画像分析
皮下注射し、行動試験したマウスからの灌流脳組織を10％中性緩衝ホルマリンで24〜36時間、固定し、次いで、パラフィン包埋した。海馬(ブレグマ-2.92mm〜-3.64mm)のレベルで、滑走ミクロトームを用いて、それぞれのマウス脳から5枚の5μm切片(150μm間隔)を作製し、スライドに載せた。免疫組織化学染色は、ジアミノベンジジン反応と対になったVectastain ABC Eliteキット(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を用いて、Aβ免疫組織化学染色のためにビオチン化二次抗体工程を省いた以外は、製造業者のプロトコールに従って行った。免疫組織化学染色には以下の一次抗体:ビオチン化ヒトAβモノクローナル抗体(クローン4G8; 1:200、Covance Research Products, Emeryville, CA)およびウサギシナプトフィジンポリクローナル抗体(未希釈、DAKO, Carpinteria, CA)を使用した。Aβ免疫組織化学染色のために、プレブロッキング工程の前に、脳切片を70％ギ酸で処理した。リン酸緩衝生理食塩水(0.1mM, pH7.4)または正常ウサギ血清(アイソタイプ対照)を一次抗体の代わりに使用し、もしくは負の対照としてABC試薬を使用した。定量画像分析は以前の方法に基づいて行った(Sanchez-Ramos et al.(2009))。画像は、Olympus BX60顕微鏡と付属のデジタルカメラシステム(DP-70, Olympus, Tokyo, Japan)を用いて取得した。デジタル画像は、SimplePCIソフトウェア(Compix Inc., Imaging Systems, Cranberry Township. PA)を用いた定量分析のためにウィンドウズPCに転送した。関心のある解剖領域(海馬および嗅内皮質)の5枚の5μm切片(150μm間隔)の画像を各動物から取得し、染色とバックグラウンドを区別する閾値光学密度を得た。アーチファクトを除くために、関心対象の各領域を手で編集した。Aβ負荷分析のために、データは、取得した全面積(総画素)に対する、取得した免疫標識面積(陽性画素(positive pixel))のパーセントとして報告した。シナプトフィジン免疫反応性を評価するために、全ての画像の形式をグレースケールに変換した後に、海馬のCA1およびCA3領域における各画像からの陽性シグナルの平均強度を、ゼロ(白色)から255(黒色)までの相対数として定量した。各分析は、試料の情報を知らない1人の試験者(T.M.)によって行った。
【０１０８】
行動タスク
各分析は、試料の情報を知らない1人の試験者(N.G.)によって行った。統計解析は、治療群の情報を知らない1人の試験者(M.R.)によって行った。分析が終わるまで、暗号は解読されなかった。
【０１０９】
放射状水迷路
空間作業記憶のRAWMタスクのために(Arendash et al(2001); Ethell et al.(2006); Arendash el al(2007))、アルミニウムインサートを100cm円形プールに入れて、中心の円形水泳領域から出ている6放射状に分布したスイムアームを作った。いろいろ取り揃えた2-Dおよび3-D視覚的手掛かりがプールを取り囲んだ。5回試験/日のために、6つのスイムアームのどれが浸水エスケーププラットフォーム(9cm直径)を備えるかを突き止める前のエラーの数を確かめた。4回目の試験(T4:最終習得試験)と5回目の試験(T5;記憶保持試験)との間には30分の時間遅れがあった。プラットフォームの位置は異なるアームに対して毎日変更し、5回の試験のそれぞれについて異なる開始アームが残りの5本のスイムアームよりセミランダムに選択された。各試験(最大60秒)の間に、マウスは、間違ったアームに泳いだ時には、その試験の開始アームに戻され、浸水プラットフォームを突き止めるのに必要な潜伏時間を記録した。マウスが60秒試験内にプラットフォームを見つけなかった場合、30秒の間にプラットフォームに誘導した。試験4および試験5の間のエラーの数およびプラットホームへたどり着くまでの時間の両方が作業記憶の指標とみなされ、AD患者の評価において臨床的に用いられる特定の項目の標準的な登録/想起試験と時間的に似ている。
【０１１０】
認知的干渉タスク
このタスクは、正常高齢者とMCI患者とAD患者とを区別するために臨床的に最近用いられた認知的干渉タスクを模倣するように(メジャー-フォー-メジャー(measure-for-measure))設計された(Loewenstein et al.(2004))。このタスクは、2種類の部屋の中にある2つのRAWM装置と、標準的なRAWM試験において用いられるものとは異なる2組の視覚的手掛かりを伴った。このタスクでは、異なる組の手掛かり(RAWM-B)による干渉の後に、最初の組の手掛かりを想起してRAWMタスクを首尾良く解決できるように、動物が一組の視覚的手掛かり(RAWM-A)を覚えることが求められる。5つの行動測定を調べた。A1〜A3(RAWM-Aで行った最初の3回の試験からの3回試験想起の複合スコア)、B(RAWM-Bの1回の試験から得られた順向干渉測定)、A4(RAWM-Aの1回の試験から得られた逆向干渉測定)、およびA5(A4からA5までの20分の遅れの後に、RAWM-Aの1回の試験から得られた遅延想起測定)。標準的なRAWMタスクと同様に、この干渉タスクでは、プラットフォームの位置は、両RAWM装置について異なるアームに対して毎日変更した。A1およびB試験の場合、最初に、プラットフォームを自分で見つけるために動物に1分間与えた後に、プラットフォームに誘導した。次いで、各事例において実際の試験を行った。標準的なRAWMタスクと同様に、エスケーププラットフォームを見つけるために動物に試験1回につき60秒与え、試験1回あたりのエラーの数およびプラットホームへたどり着くまでの時間を記録した。
【０１１１】
統計解析
反対側aCSF注射半球に対する同側GM-CSF投与からのアミロイド斑パラメータの統計解析を、対応スチューデントt検定を用いて行った。<0.05のP値が有意であるとみなされた。RAWMデータの統計解析のために、8日間の治療前試験(4回の2日間ブロック)または4日間の治療後試験(2回の2日間ブロック)を、一方向ANOVAを用いて、個々のブロックならびに全てのブロックについて評価した。その後に、群間の事後ペア-バイ-ペア(pair-by-pair)差をフィッシャーLSD(最小有意差)検定によって解いた。認知干渉データの統計解析のために、4日間をまとめて分析したように、2日間ブロックを両方とも別々に分析した。P<0.05の群有意差を求めるために、分析した4つの行動測定それぞれについて一方向ANOVAを使用した後に、事後フィッシャーLSD検定を用いた。皮下GM-CSF投与からのアミロイド斑沈着およびシナプトフィジン染色の統計解析は、両側等分散的スチューデントt検定を用いて行った。<0.05のP値が有意であるとみなした。
【０１１２】
実施例2
アルツハイマー病は、認知機能および実行機能の低下増大として現われる加齢性の進行性神経変性障害である。アルツハイマー認知症は脳血管機能不全(Humpel and Marksteiner (2005))、脳実質および脈管構造壁におけるアミロイドβ(Aβ)ペプチドの細胞外蓄積(Rhodin et al (2000); Scheuner et al.(1996))(主に、Aβ1-42およびAβ1-40)、ならびに高リン酸化Tauタンパク質からなる神経原線維変化のニューロン内蓄積(Rapoport et al.(2002))と関連している。炎症性タンパク質アポリポタンパク質E(apoE)およびα1-アンチキモトリプシン(ACT)がインビボおよびインビトロでAβペプチドからアミロイドフィラメントへの重合を触媒するので(Wisniewski et al.(1994); Ma el al (1996): Potter et al.(2001); Nilsson et al.(2004); Padmanabhan et al.(2006))、関連する神経炎症はAD 発病の一因となるもしれない(Griffin et al.(1989), Akiyama et al.(2000); Wyss-Coray (2006))。しかしながら、NSAIDはAD異常を逆転または阻止せず、ジストロフィーミクログリア(dystrophic microglia)が神経変性認知症に先行すると示唆されている(Streit et al (2009))。アミロイド斑は、常在型および骨髄由来型の両方で急速に形成し、次いで、ミクログリアにより装飾されることも示されている(Koenigsknecht-Talboo el al.(2008); Meyer-Luehmann et al.(2008))。これにより、アミロイドを除去する能力および意図が示唆されている(Malm et al (2005); Simard and Rivest (2004): Simard et al.(2006))。
【０１１３】
慢性関節リウマチは、炎症性滑膜組織および高度に血管化したパンヌスが形成して、軟骨および骨が回復不可能なほど傷つけられる自己免疫疾患である。この炎症性パンヌスでは、白血球集団が著しく増殖し、フィードフォワード機構において一緒に働く多くの炎症誘発性因子が産生され、これにより、白血球増加、サイトカイン/ケモカイン放出、破骨細胞形成、血管形成、および自己抗体産生(リウマチ因子および抗シトルリン化タンパク質抗体)が増大する(Szekanecz and Koch (2007); van der Voort et al.(2005); Schellekens et al.(2000))。さらに、適応免疫系は、CD4+リンパ球内にTh17表現型を示し、次いで、炎症促進作用の多くの誘導を担うインターロイキン(IL-17) が最終的に産生される(Parsonage et al.(2008); Cox et al.(2008))。さらに、白血球集団の拡大は、コロニー刺激因子:M-CSF(マクロファージ)、G-CSF(顆粒球)、およびGM-CSF(顆粒球-マクロファージ)の局所発現から生じる(Seitz et al.(1994):Leizer et al.(1990); Nakamura et al.(2000))。
【０１１４】
RAにおいてアップレギュレートされた白血球は脳に入り、AD異常の発症および/またはニューロンの機能不全を阻害する可能性があるが、AD患者脳へのリンパ球浸潤は報告されていない。浸潤が無いことは、自然免疫系の活性化がRA患者におけるAD異常の阻止を担っている可能性があることを示唆している。例えば、補体タンパク質がAD脳においてアップレギュレートされ、C3コンバターゼが阻害されると、ADマウスにおけるアミロイド異常が大幅に増大する(Wyss-Coray et al.(2002))。骨髄に由来するミクログリアはアミロイド沈着の制限において重要な役割を果たしているが、この関連性は年齢と共に低下するのに対して、AD異常は増大する(Simard el al.(2006))。El Khouryおよび同僚らは、ミクログリアが、複数のやり方で、すなわち、ケモカイン受容体(CCR2)動員を介したアミロイドーシスの遅延により、そのリガンドである単球走化性タンパク質-1(MCP-1/CCL2)のアップレギュレーションにより、Aβ結合スカベンジャー受容体(CD36、スカベンジャー受容体A、および終末糖化産物の受容体)の発現誘導により、ならびにAβ分解酵素[ネプリライシン、インスリジン、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP9)]の発現誘導により、AD発病を実際に防ぐことを示している。しかしながら、これらの受容体および酵素の発現も年齢と共に減少する(Hickman et al.(2008); El Khoury et al.(2007))。
【０１１５】
自然免疫系とADの相互関係を調べるために、本発明者らは、AD異常に対する、構造的に関係のない3種類のコロニー刺激因子(M-CSF、G-CSF、およびGM-CSF)の効果を研究した。これらのコロニー刺激因子は全てRAにおいてアップレギュレートされる(Seitz et al.(1994); Leizer et al.(1990); Nakamura et al.(2000))。これらのCSFは、これらのそれぞれの白血球の生存を高め、単球前駆体からこれらを増殖および分化させる。M-CSFおよびG-CSFは自然免疫系の特定のサブセットを誘導するのに対して、GM-CSFは全範囲の自然細胞(innate cell)を誘導する。本発明者らは、最初に、PS/APPマウスへの2週間のM-CSFの両側側脳室内注入を用いて、斑沈着に対するM-CSFの効果を調べた。免疫組織化学的分析から、類似年齢のマウス間でアミロイド沈着がかなり異なることが分かった(図10)。これにより、限られたマウスコホートにおいてM-CSFの効果を確かめる能力がかなり損なわれた。新規の両側脳注入カテーテルを開発することによって本発明者らの薬物送達系を改善したが、本発明者らは、実質に注入した組換えペプチドが、注入された半球に局在し続けることを見出した。これらの知見により、片側海馬内ボーラスとしてCSFを投与し、対照としてビヒクルを反対側に注射した。従って、統計的有意性を得るために、多数のトランスジェニックマウスおよび同年齢同腹仔対照が不必要になった。それぞれのCSFを4匹のマウスの海馬に定位注射し、人工脳脊髄液ビヒクル(aCSF)を対側注射した。注射の7日後にマウスを屠殺した。
【０１１６】
著しいことに、M-CSF注射によって、治療した半球全体の腫張が目に見え、切片作製の際の脆弱性が目立ち、あるマウスでは、注射部位に明らかな過形成が生じた(図11C)。乳腺におけるM-CSFおよび/またはその受容体の過剰発現によって、腫瘍形成および過形成が生じた(Kirma et al.(2004))。M-CSF注射半球のアミロイド斑負荷は、対照側と比較して有意に変化しなかった(データ示さず)。しかしながら、Boissonneault at al.(2009)は、M-CSFの長期にわたる腹腔内(i.p.)注射がアミロイド沈着および認知障害を阻止および逆転させることを発表した。著者らはまた、GFP発現骨髄を用いて、M-CSFが骨髄由来ミクログリアのかなりの蓄積を誘導したことも見出した(Boissonneault et al.(2009))。これらのデータと本発明者らのデータとの差異は、異なる研究の長さおよび投与効果を示しており、Boissonneault et al.は、注射1回につき1.3μg M-CSFを長期にわたり腹腔内に送達したのに対して、本発明者らは5μg海馬内ボーラスを与えた。
【０１１７】
M-CSFとは対照的に、G-CSF注射は腫張を誘導せず、中程度のアミロイド沈着低下を示した(図12Aおよび12B)。これは、フェロー研究員による独立した観察によって実証された(Sanchez-Ramos et al.(2009))。しかしながら、対照半球と比較して、GM-CSF注射によってアミロイドが顕著に低下し(図13A〜13D)、従って、後の全ての本発明者らの実験は、ADマウスにおけるGM-CSFの効果の研究に焦点を当てた。アミロイド斑の定量によって、測定した全ての斑パラメータについて、個々のマウスにおける有意な低下および全体的な有意な低下が明らかになった(図6Bおよび図14A〜14D-1)。フェレー径および総密度パラメータは、4匹全てのマウスのGM-CSF注射半球全体にわたって低下した。このことから、全体の斑サイズおよび高密度コアが同時に低下したことが分かる。同じマウスの個々の切片間の、および異なるマウス間の斑沈着のパーセント低下は8〜62％の範囲内で変化した(データ示さず)。これにより、それぞれの脳の全体にわたって、および複数のマウス間でのアミロイド沈着の変動がさらに目立つ。
【０１１８】
これらの異常データに基づいて、本発明者らは、AD異常および認知機能に対する皮下GM-CSF注射の効果を調べた。GM-CSF治療前に、最初に、RAWM試験によって、APPsw+PS1(Tg)マウスは作業記憶について認知機能が低下していると確かめた。非トランスジェニック対照マウス(NT)およびTgマウスを両方とも、認知機能にかたよりのない2つのGM-CSF治療群または生理食塩水治療群にさらに分けた。注射後のRAWM試験によって、Tg対照マウスはNT対照マウスと比較して大幅に機能が低下していることが再確認された。この機能低下は試験の個々のブロックにおいて明らかであったが、4日間全ての試験にわたっても明らかであった(図7A〜7D)。きわだって対照的に、GM-CSF治療Tgマウスは、個々のブロックの間に、または全体で、NT対照マウスと同等に、またはNT対照マウスより良好に動作した。GM-CSF治療NTマウスはNT対照マウスと同等に、またはNT対照よりわずかに良好に動作した(図7A〜7D)。
【０１１９】
認知的干渉タスクにおける評価の前に、マウスを2日間休ませた。このタスクは、軽度認知障害(MCI)患者と高齢者対照とを高い精度で区別するヒト干渉試験を模倣する(Loewenstein et al.(2004))。4日間の試験にわたって評価した4つ全ての認知干渉測定において(図7E)、Tg対照マウスは、NTマウスと比較して明らかに機能が低下しており、GM-CSFで治療したTgマウスは、Tg対照と比較して有意に良好な3回試験想起および遅延想起を示した。実際に、4つ全ての認知測定について、GM-CSF治療トランスジェニックADマウスはNTマウスと同様に動作した。TgマウスにおけるGM-CSF治療の特に強力な効果は、前半の試験中の順向干渉測定について明らかであった(図7F)。ここで、GM-CSF治療TgマウスはTg対照よりかなり良好に動作し、NTマウスの両群と同一に動作した。順向干渉に対する感受性は、MCI患者およびAD患者と高齢者正常とを区別するための、遅延想起および忘却率の従来の測定より感度の高いマーカーであることが報告されている(Loewenstein et al.(2004))。ちなみに、統計的に有意でないが、GM-CSF治療NTマウスでも行動試験の認知が改善される傾向を示した。続いて、本研究のTgマウスからの脳の分析から、対照Tgマウスと比較して、GM-CSF治療によって嗅内皮質(↓55％)および海馬(↓57％)におけるアミロイド負荷が大きく低下したことが明らかになった(図8E)。
【０１２０】
GM-CSF治療Tgマウスの認知機能の改善および皮質アミロイドーシスの低下は、CA1およびCA3におけるシナプトフィジン免疫反応性の増加と一致した(図9A〜9E)。このことから、これらの海馬領域においてシナプス密度が増加したことが分かる。以前の研究から、海馬歯状回(DG)における成人神経幹細胞はGM-CSF受容体を発現し、GM-CSFは用量依存的にこれらの細胞のニューロン分化を増大させることが分かっている(Kruger et al.(2007))。従って、観察されたGM-CSF誘導性の認知改善の一機構が海馬におけるAβ沈着の除去を増強し、CA3に対するDG苔状線維神経支配のニューロン成長/シナプス分化が後に続き、結果として、シェファー側枝からCA1への神経支配/シナプス形成が増大した。嗅内皮質からのAβ沈着の除去はまた、DGおよびCA1における海馬投射部位への貫通路生存率も高める可能性がある。従って、動作(短期)記憶に重要な海馬/嗅内皮質回路の、GM-CSFによる拡大は、アルツハイマーTgマウスにおける作業記憶障害の、GM-CSFによる逆転の基礎をなしているかもしれない。
【０１２１】
実施例3
10〜12ヶ月齢の4匹のPS/APPマウスの、脳の一方の半球にある海馬に5μg rmGM-CSFを定位注射し、ビヒクル(aCSF:人工脳脊髄液)を対側注射した。7日後にマウスを安楽死させ、生理食塩水を灌流し、10％ホルマリンで固定し、14μmの凍結切片にするか、またはパラフィン包埋し、5μmの切片にした。標準的な免疫組織化学的技法では、アミロイド沈着を標識するために、6E10およびMabTech's抗Aβ抗体を使用した。Zeiss ImagerZ1においてAxiovisionソフトウェアを用いて、顕微鏡観察および画像処理を行った。ImageJを使用してアミロイド沈着を定量した。
【０１２２】
10〜12ヶ月齢の16匹のPS/APPマウスおよび16匹の非トランスジェニック同年齢対照の認知機能を、作業記憶パラダイムであるRAWMによってプレテストした。rmGM-CSFの皮下注射(5μg/日)のために、各群から8匹のマウスをセミランダムに選択した。もう半分には、ビヒクル(生理食塩水)を毎日注射した。プレテスト後、毎日注射が始まる前に、15日の休息期間があった。マウスを10日間注射した後に、4日間のRAWMポストテストを行った。2日の休息期間の後に、6日間の認知的干渉タスク試験を行った。試験全体を通して、かつ行動試験を行う1時間以上前に、注射を行った。行動試験および分析は、群の情報を知らない別々のスタッフによって行った。
【０１２３】
結果:
rmGM-CSFのボーラス海馬内注射によって、それぞれの脳半球全体にわたってアミロイド斑沈着が60％も低下した。rmGM-CSF皮下注射では、対照と比較して機能的に低下していることが示されたPS/APPマウスは、標準的なRAWMタスクにおいて、これらの認知障害を有意に逆転させた。認知的干渉タスクにおいて、rmGM-CSFが与えられたPS/APPマウスは、4つ全ての認知測定において非トランスジェニックマウスと類似の結果を示した。しかしながら、アミロイド斑沈着の低下は皮下研究では観察されなかった。
【０１２４】
GM-CSFはインビボでアルツハイマー病様異常を大幅に逆転させ、認知を改善する。
【０１２５】
本明細書に記載の実施例および態様は例示にすぎず、これらを考慮して様々な修正または変更が当業者に示唆され、本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲に含まれるることが理解されるはずである。さらに、本明細書において開示された、任意の発明またはその態様の任意の要素または制限が、本明細書において開示された、任意のおよび/もしくは全ての要素もしくは制限と(個々にもしくは組み合わせて)または他の任意の発明もしくはその態様と組み合わせることができる。このような全ての組み合わせは、非限定的に、本発明の範囲とともにあることが意図される。
【０１２６】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【国際調査報告】
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