(57)【要約】  薬理学的な塩溶液中に有効量のアルデヒドを含む細胞増殖抑制組成物が多数の癌細胞株の増殖を抑制するのに有効であることを示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的に許容可能な塩の水溶液中に懸濁されたアルデヒドを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記アルデヒドがホルムアルデヒドであることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物において、前記塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項２に記載の組成物において、前記ホルムアルデヒドが、０．００００４体積％から１．１体積％の濃度で溶液中に懸濁されていることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項２に記載の組成物において、前記ホルムアルデヒドが、０．０００１２体積％から０．１２体積％の濃度で溶液中に懸濁されていることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項２に記載の組成物において、前記ホルムアルデヒドが、０．００００４体積％から０．０６９体積％の濃度で溶液中に懸濁されていることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項３に記載の組成物において、前記塩化ナトリウムの濃度が０．９％であることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項３に記載の組成物において、前記塩化ナトリウムの濃度が０．１％及び２．０％であることを特徴とする組成物。
【請求項９】
医薬品組成物を調製する方法において：
薬学的に許容可能な塩の水溶液中にアルデヒドを懸濁させるステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記アルデヒドがホルムアルデヒドであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法において、前記塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法において、前記ホルムアルデヒドが０．００００４％から１．１％の濃度で溶液中に懸濁されていることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法において、前記塩化ナトリウムの濃度が０．９％であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項９に記載の方法において、前記医薬品組成物が癌又は癌腫瘍の治療用のものであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
癌又は癌腫瘍の治療に用いることを特徴とする、薬学的に許容可能な塩の水溶液中に懸濁されたアルデヒドを含む組成物の使用。
【請求項１６】
請求項１５に記載の使用において、前記アルデヒドがホルムアルデヒドであることを特徴とする使用。
【請求項１７】
請求項１５に記載の使用において、前記塩が塩化ナトリウムであることを特徴とする使用。
【請求項１８】
請求項１６に記載の使用において、前記ホルムアルデヒドが、０．００００４体積％から１．１体積％の濃度で溶液中に懸濁されていることを特徴とする使用。
【請求項１９】
請求項１６に記載の使用において、前記ホルムアルデヒドが、０．０００１２体積％から０．１２体積％の濃度で溶液中に懸濁されていることを特徴とする使用。
【請求項２０】
請求項１６に記載の使用において、前記ホルムアルデヒドが、０．００００４体積％から０．０６９体積％の濃度で溶液中に懸濁されていることを特徴とする使用。
【請求項２１】
請求項１７に記載の使用において、前記塩化ナトリウムの濃度が０．９％であることを特徴とする使用。
【請求項２２】
請求項１７に記載の使用において、前記塩化ナトリウムが０．１％及び２．０％の濃度であることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年２月９日に提出した米国仮特許出願第６１／０６５，１７２号の利益を主張する。参照することによってその出願の全体を本明細書中に組み込む。
【０００２】
開示されている装置及び方法は、癌細胞の増殖抑制に関する。より詳細には、薬理学的食塩水中に有効量のアルデヒドを含む細胞増殖抑制組成物であって、多数の癌細胞株の増殖を抑制するのに有効な組成物を開示する。
【０００３】
本出願は、２００８年２月９日に提出した米国仮特許出願第６１／０６５，１７２号の利益を主張する。参照することによってその出願の全体を本明細書中に組み込む。
【背景技術】
【０００４】
アルデヒドは、以前から、顕微鏡検査用の癌組織サンプルを調製するために、及び、ある場合には併用療法としても用いられてきた。
【０００５】
例えば、国際公開公報第０２／２８３４５号は、特定のクラスの化学療法薬剤を投与するときにＤＮＡ付加物が生じることを教示している。アドリアマイシンは、一例であるが、「クラス」は、他において一般に「アントラサイクリン又はアントラキノン」と呼ばれ、これらの付加物の形成が細胞毒性に関連しているとされており、アルデヒドの存在を必要とする。この出願において、発明者らは、追加アルデヒドの放出によって化学療法剤のインビボにおける能力を高めるように、化学療法剤とアルデヒドを放出する薬剤とを同時に投与することを開示している。いくつかの実施形態においては、このアルデヒドがホルムアルデヒドである。
【０００６】
米国特許第６，６７７，３０９号は、アントラサイクリンとアルデヒド放出剤との接合体を教示する。
【０００７】
国際公開公報第２００５／１２０５７７号は、向精神薬ではない第１成分と、ホルムアルデヒド分子を放出できる第２成分とで構成される接合体を教示する。
【０００８】
国際公開公報第２００５／０３４８５６号は、「化学的トリガー」で「保護されている」アルデヒドに結合した治療薬剤を有する接合体であって、更にターゲット基を含んでいてもよい接合体を教示する。言い換えれば、化学的トリガーが、接合体が所望の位置に到達するまで、接合体をプロドラッグ形態に維持する。いくつかのケースにおいては、ターゲット分子を用いて接合体を所望の治療位置に導く。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の第１態様に従って、薬学的に許容可能な食塩水に懸濁されたアルデヒドを含む医薬品組成物を提供する。すなわち、薬学的に許容可能な塩の水性溶液に懸濁されたアルデヒドを含む医薬品組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、大細胞肺癌ＬＸＦＬ５２９のコロニー形成の阻害の写真である。
【図２】図２は、より強力な図１のコロニー形成を表す。
【図３】図３は、細胞増殖抑制剤の平均グラフ分析を表す。
【図４】図４は、マウス１頭当たり１００μｌを毎日２回筋肉内に投与した後の、マウス体重に対する細胞増殖抑制剤の効果を表す。Ａ：経時的なグループ平均相対体重。Ｂ：第１４日における個々の相対体重。
【図５】図５は、４つのヒト腫瘍細胞株に対する細胞増殖抑制化合物の濃度効果カーブを表す。
【図６】図６は、細胞増殖抑制化合物（第１サイクル）を用いた３日間の治療後の細胞株ＭＡＸＦ４０１ＮＬのインビトロにおける増殖を表す。
【図７】図７は、細胞増殖抑制化合物（第２サイクル）を用いた３日間の治療後の細胞株ＭＡＸＦ４０１ＮＬのインビトロにおける増殖を表す。
【００１１】
別段の定めがない限り、ここで用いるすべての技術的用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。好ましい方法及び材料をここに記載するが、本発明の実施又は試験においてここに記載されているものと類似又は同等のあらゆる方法及び材料を用いることもできる。以下の刊行物のすべては、本明細書中で参照することによって組み込まれている。
【００１２】
ここに記載されているのは、水性食塩水溶液に懸濁されたアルデヒドを含む抗癌性又は細胞増殖抑制用組成物である。便宜上、いくつかの事例においてこの組成物を「細胞増殖抑制剤」と称する。
【００１３】
ここで用いているように、「アルデヒド」は、末端のカルボニル基又はアルデヒド基を含むあらゆる有機化合物を意味する。好ましい実施形態において、アルデヒドは、天然アルデヒドである。より好ましい実施形態においては、天然アルデヒドがホルムアルデヒドである。
【００１４】
本発明の一実施形態においては、後述する薬学的に許容可能な食塩水を提供することによって細胞増殖抑制組成物を調製する。次いで、０．００００４％から１．１％の濃度で溶液中にホルムアルデヒドを懸濁させる。代替的に、薬理学的食塩水に懸濁したホルムアルデヒドの最終濃度は、０．０００１２％から０．１２％であってもよい。ここで論じるように、この方法によって調製した細胞増殖抑制組成物は癌の治療に用いることができる。
【００１５】
組成物中のホルムアルデヒドの濃度は、０．００００４％から１．１％であってもよい。代替的に、この濃度は０．０００１２％から０．１２％であってもよい。組成物中のホルムアルデヒドの最大濃度は１．１％である。本発明者らは、これより高い濃度においては、毒性によって内部臓器の機能低下が生じ、ほとんど効果がないか又は全く効果がない組成物となることを指摘する。例えば、より高濃度のホルムアルデヒドを注入すると、注入部位に潰瘍が生じる可能性がある。上で論じたように、この範囲の最低の濃度は０．００００４％であり、これよりも濃度が低いと効果がないと考えられる。
【００１６】
好ましい実施形態において、ホルムアルデヒド源は、ホルマリン、例えば医療グレードのホルマリン、例えば４０質量％のホルムアルデヒドを含む４０％ホルマリンである。当業者に理解されるように、本発明において別の薬学的に許容可能なホルムアルデヒド源を用いてもよい。
【００１７】
好ましくは、食塩水は、生理学的に許容可能な食塩水又は生理的食塩水、例えば、０．１％〜２．０％又は０．１％〜１．９％又は０．１％〜１．８％又は０．１％〜１．７％又は０．１％〜１．６％又は０．１％〜１．５％又は０．１％〜１．４％又は０．１％〜１．３％又は０．１％〜１．２％又は０．１％〜１．１％又は０．１％〜１．０％又は０．１％〜０．９％又は０．２％〜２．０％又は０．３％〜２．０％又は０．４％〜２．０％又は０．５％〜２．０％又は０．６％〜２．０％又は０．７％〜２．０％又は０．８％〜２．０％又は０．９％〜２．０％又は０．５−１．５％又は０．５％〜１．３％又は０．６％〜１．４％又は０．６％〜１．２％又は０．７％〜１．３％又は０．７％〜１．１％又は０．８％〜１．２％又は０．８％〜１．０％又は０．９％の塩化ナトリウム溶液、又は、リンゲル液、又は、生理食塩水である。好ましくは、生理的食塩水は、投与しようとする患者の生理的なｐＨであるか又はそれに近いｐＨである。すなわち、薬学的に許容可能な食塩水又は生理食塩水のｐＨは、７．２〜７．６である。
【００１８】
好ましい実施形態において、生理的食塩水に懸濁した０．００００４％から１．１％のホルムアルデヒドを含む細胞増殖抑制組成物を提供する。好ましい実施形態において、生理的食塩水中のホルムアルデヒドの濃度は、０．０００１２体積％から０．１２体積％である。いくつかの実施形態において、生理的食塩水は、ＮａＣｌ溶液、食塩水又はリンゲル液である。いくつかの実施形態においては、食塩水が０．１％〜２．０％又は０．９％の注射用塩化ナトリウムである。
【００１９】
本発明の一実施形態においては、０．９％塩化ナトリウム水溶液を提供することによって細胞増殖抑制組成物を調製する。次いで、代替的に、０．００００４％から１．１％の濃度でホルムアルデヒドを溶液中に懸濁させる。薬理学的な食塩水に懸濁されたホルムアルデヒドの最終濃度は、０．０００１２％から０．１２％であってもよい。ここで論じるように、細胞増殖抑制組成物を癌の治療に用いてもよい。
【００２０】
以下に論じるように、細胞増殖抑制組成物は、嫌気呼吸を行う細胞を好気呼吸に「変換」するのに有効であり、それによって癌細胞の増殖又は成長速度を低下又は抑制させるが、既に好気呼吸を行っている細胞に対してはほとんど効果がないか又は全く効果がないと予想される。
【００２１】
特定の理論に縛られることを意図するものではないが、本発明者らは、ホルムアルデヒドは、薬学的に許容可能な水性塩溶液、例えば、限定されるものではないが、０．９％ＮａＣｌ水溶液と混合されると、組成物が身体内の細胞構造内の代謝に入り込むことを可能にする転換を受け、それによって、腫瘍内に結合したホルムアルデヒドを放出させ、腫瘍の増殖を停止させ、次いで、腫瘍自体を減少させる、すなわち、腫瘍自体のサイズを小さくすると考えている。
【００２２】
一般に癌細胞は栄養物質として乳酸の形成を含む嫌気性グルコース呼吸を行うことをオットワールブルクが以前に発見したことに注目すべきである。ワールブルクによれば、細胞から無気呼吸を行う癌細胞への「再生」は、細胞の自律的存在をもたらす。細胞の再生は、組織において、例えば、限定されるものではないが、酸性度、エネルギー消費量、呼吸などの前癌病変を生じさせる。従って、正常細胞又は前癌細胞から癌細胞への変化の一段階は、細胞が嫌気性グルコース呼吸のみを行うようになることである。
【００２３】
細胞の生物学的呼吸は２段階で達成される。第１段階は（酸素を用いない）嫌気性のものであり、第２段階は（酸素を用いる）好気性のものである。解糖（呼吸の嫌気性段階）は、ピルビン酸を乳酸に転換して終了する。呼吸の嫌気性段階によって、グルコース１分子に対してわずか２分子のＡＴＰ分子のみが得られる。生物学的呼吸（好気性）の第２段階によって、１分子のグルコースに対して３８分子のＡＴＰ合成が得られる。従って、酸素呼吸する生命体は、炭水化物のエネルギーを嫌気性生物よりも１９倍有効に利用する。
【００２４】
腫瘍学の既存の治療法への代替として、例えば、免疫強化、生物の酸素処理、高熱、光力学療法、腫瘍の脈管封鎖、従来的治療、放射線治療、特殊タンパクの生成、腫瘍誘発遺伝子の阻害、発明者が腫瘍学的病状を治療する他のアプローチであると考えられるナノテクノロジーなどの使用などの条件は、腫瘍細胞又は癌細胞の代謝を嫌気呼吸から好気呼吸に変化させる可能性がある。
【００２５】
このことを考慮して、本発明者らは、すべての臓器、組織及び液体媒質中に最小限の量で含まれている天然代謝産物の１つであるホルムアルデヒドを用いた。ホルムアルデヒドは、一般に、代謝プロセスの結果として細胞内で作られ、酵素系によって容易に不活性化される（Ｌ．Ｖ．Ｍｉｒｅｔｓｋａｙａ，Ｐ．Ｙａ．Ｓｈｖａｒｔｓｍａｎ．Ｃｙｔｏｌｏｇｙ．−１９８２．−Ｖｏｌｕｍｅ  ＸＸＩＶ．−Ｎｏ  ９．１０５９頁）。特に、ホルムアルデヒドは、リブロースモノリン酸サイクルの重要な酵素であるヘクスロースリン酸合成酵素の合成を促進する。更に、ホルムアルデヒドのモノ炭素ラジカルは、様々な化合物の生合成に積極的に関与している。ホルムアルデヒドは免疫調節特性及び抗ウイルス性特性も有する。
【００２６】
このことを考慮して、ここで論じるように、本発明者らは、ホルムアルデヒド含む薬剤及び／又は組成物による細胞代謝プロセスに対する効果を研究した。
【００２７】
例えば、ここに記載されている細胞増殖抑制組成物を有効な量でウサギに注入することによって、例えばアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼなどの動物生命体におけるアミノ酸代謝に関連する酵素活性が著しく上昇する。これによって、次に、タンパク合成におけるアラニン及びアスパラギンの利用が低下する。この低下は、被検体の血清中のタンパク量の低下によって証明される。
【００２８】
例えば、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の上昇は、ピルビン酸レベルの上昇をもたらし、ミトコンドリアにおける酸化的脱炭酸反応によってそのピルビン酸からアセチルＣｏＡが生成される。有意量のアセチルＣｏＡは、二炭素酸及び三炭素酸のサイクル中に「燃え尽き」て、水素化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及びフラビンアデニンジヌクレオチドを多量に生じさせる。この水素化ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド及びフラビンアデニンジヌクレオチドは、ミトコンドリアにおけるＡＴＰ合成の酸化に関連して用いられる。
【００２９】
また、クレアチンホスホキナーゼ活性の上昇は、細胞のエネルギー貯蔵の増加を表す。同時に、乳酸脱水素酵素活性の低下が生じ、その低下は、呼吸の好気的過程が嫌気性呼吸よりも優越していることを表す。このことは、解糖で生成される多量のピルビン酸の大部分が酸化的脱炭酸に供されて、細胞の有機成分の酸化の好気的段階で用いられるアセチルＣｏＡが多量に作られることを意味する。過剰なアセチルＣｏＡは、様々な脂質の合成、特にコレステロールの合成に用いられ、その合成は、被検体の血液中の通常コレステロール値の著しい上昇として検出可能である。
【００３０】
従って、ここに記載されている細胞増殖抑制組成物は、細胞における好気呼吸を活性化すると考えられ、次に、そのことによって様々な腫瘍細胞株における細胞静止作用が説明される。すなわち、上で論じたように、一般的に癌細胞は無気呼吸を行い、それに対して、正常細胞又は非癌細胞は好気呼吸を行う。しかしながら、有効量の細胞増殖抑制化合物を投与することによって、これらの細胞が無気呼吸から好気呼吸に転換される。更に、ここで論じるように、細胞増殖抑制組成物は、好気呼吸を行う正常細胞に対してほとんど効果がないか又は全く効果がないと予想される。
【００３１】
代替的に、本発明者らは、ホルムアルデヒドが、遊離したリジン及びアルギニンアミド基と容易に反応し、このプロセス中に、カルボニル基がオキシ基に変わり、アミド基がイミノ基に変わり、イミノ基の水素と水酸基の酸素とが、水酸基の水素とイミノ基の窒素と同様に、分子内水素結合を形成することができることに注目する。それと同時に、メチルカルビノールアミン中間段階：
ＨＣＯＨ＋ＮＨ２−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−→Ｈ２Ｃ（ＯＨ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−→ＨＣＨ＝Ｎ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ−＋Ｈ２Ｏ
（ここで、ＮＨ２−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯはタンパク分子の断片である）からイミン（シッフ塩基）が作られる。
【００３２】
遊離したアミド基が結合することによって、水素イオンを受け取る能力が損なわれる。細胞内成分中の水素の自由イオンの濃度はやや増加する。すなわち、ｐＨが酸性方向に移動する。大部分の解糖酵素の最適ｐＨはアルカリ環境において生じるので、炭水化物の酸化生物的酸化の割合が増加する。
【００３３】
さらに、後のイミノ基のプロトン化は、水素結合の開始のための条件を作る。リジンアミノ酸化学基の一部としてのアミド基は、ほとんど同じように相互作用する。本発明者らの見解では、遊離したアルギニンアミド基は、機能的活性においてＮ−末端タンパクアミド基及びラジカルリジンアミド基と異ならず、同種の反応性を有する。そのような相互作用は、タンパク分子の立体構造を変化させることによって、そのタンパク分子の物理的性質／化学的性質を変化させる。核タンパクとしての染色体の一部であるヒストンタンパクは、リジンとアルギニンとからなるジアミノモノカルボン酸の大量に含む。ホルムアルデヒドの付加反応後の水素結合の形成は、ＤＮＡのカルボキシル基とヒストンの遊離アミドゲンとの間の分子間ファンデルワールス相互作用を阻害する。その結果、元の転写領域が消失してもよく、細胞タンパクの量及び質を変化させる新しい転写領域（遺伝子のＲＮＡコピーの形成）が生じる。要約すると、遺伝子型を変えないで表現型変異を達成する可能性がある。
【００３４】
ここで用いているように、「有効量」は、下記：未治療の又はコントロールの又は疑似治療した同じ細胞齢及び同一条件の癌細胞（例えば腫瘍）の集団と比較して、癌細胞の集団において好気呼吸を増加させること；未治療の又はコントロールの又は疑似治療した同じ細胞齢及び同一条件の癌細胞の集団と比較して、例えば腫瘍などの癌細胞の集団の成長速度又は増殖を低下又は抑制させること；未治療の又はコントロールの又は疑似治療した同じ細胞齢及び同一条件の癌細胞の集団と比較して、腫瘍体積増加速度を低下させること；未治療の又はコントロールの又は疑似治療した同じ細胞齢及び同一条件の癌細胞集団と比較して、寛解をより長い期間にすること；及び、未治療の又はコントロールの又は疑似治療した同じ細胞齢及び同一条件の癌細胞の集団と比較して、癌に関連した症状の１つ以上の重症度を低下させること、の１つ以上を達成するのに充分な細胞増殖抑制組成物の量である。
【００３５】
下に示す実施例で言及しているように、本発明の細胞増殖抑制組成物は、インビトロ試験において、大細胞肺癌、腎癌、結腸癌、膀胱癌、胃癌、頭頚部癌、肝臓癌、腺肺癌、肺小細胞癌、乳癌、子房癌、膵癌、前立腺癌、並びに、黒色腫、胸膜中皮腫、及び、肉腫に対して有効であることが示されている。従って、以下に論じるように、本発明の細胞増殖抑制組成物は、種々様々な癌タイプに適した治療であり、細胞集団の嫌気性呼吸の増加を特徴とするあらゆる疾病又は疾患の治療法として用いることができることが示された。
【００３６】
従って、そのような治療を必要とする患者、すなわち、癌又は癌があると疑われているか又は癌を発病するリスクがあると診察された患者に本発明の細胞増殖抑制組成物を用いて癌又は癌腫を治療又は予防してもよい。ここで論じるように、適合する癌は、限定されないが、大細胞肺癌、腎癌、結腸癌、膀胱癌、胃癌、頭頚部癌、肝臓癌、腺肺癌、肺小細胞癌、乳癌、子房癌、膵癌、前立腺癌、並びに、黒色腫、胸膜中皮腫、及び、肉腫を含む。従って、以下に論じるように、本発明の細胞増殖抑制組成物は、種々様々な癌タイプに適した治療であり、細胞集団の嫌気性呼吸の増加を特徴とするあらゆる疾病又は疾患の治療法として用いることができることが示された。
【００３７】
以下で実施例によって本発明をさらに説明するが、本発明は、実施例によって必ずしも限定されない。
【００３８】
略語
本明細書中で用いられている略語には、以下のもの：体重減少（ＢＷＬ）、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、日数（ｄ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、グラム（ｇｍ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、Ｔ／Ｃ値＝１００−ｘに到する抑制濃度（ＩＣｘ）、筋肉内投与（ｉｍ）、免疫調節化合物（本研究の試験化合物、すなわち、細胞増殖抑制化合物）（細胞増殖抑制化合物）、イスコーブ修飾されたダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、浸透性（ｉｎｆ．）、キログラム（ｋｇ）、リットル（Ｌ）、ミリグラム（ｍｇ）、中分化型（ｍｄ）、ミリリットル（ｍＬ）、ミリグラム（ｍｇ）、マイクログラム（μｇ）、ミリリットル（ｍｌ）、マイクロリットル（μｌ）、マイクロメートル（μｍ）、利用不可能（ｎ．ａ．）、決定しなかった（ｎ．ｄ．）、米国海軍医学研究所（ＮＭＲＩ）、非小細胞（ＮＳＣ）、乳（ｐａｐ）、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、低分化型（ｐｄ）、ルーズベルト公園記念研究所（ＲＰＭＩ）、コントロール値に対する試験値（Ｔ／Ｃ値）、単位（Ｕ）、非分化型（ｕｄ）、体積対体積（ｖ／ｖ）、高分化型（ｗｄ）、不使用（ｗ／ｏ）、体積当たり重量（ｗ／ｖ）が含まれる。
【００３９】
実施例１
クローン形成法を用いて２７のヒト腫瘍異種移植片において上記細胞増殖抑制組成物の抗腫瘍効果をインビトロで評価した。腫瘍試験パネルは、膀胱癌、結腸癌、胃癌、頭部癌及び頸部癌、肝臓頭癌、非小細胞肺癌（腺細胞癌及び大細胞癌）、小細胞肺癌、乳房癌、子房癌、膵臓癌、前立腺癌、及び、腎癌、並びに、黒色腫、胸膜中皮腫、及び、肉腫、の１５個の様々なヒト腫瘍タイプの１〜４つのモデルで構成されていた。０．００１％から１００．０％の６つの濃度で細胞増殖抑制組成物を試験した。治療していないコントロールに対するコロニー形成の阻害として抗腫瘍の効果を記録した（Ｔ／Ｃ値）。
【００４０】
細胞増殖抑制組成物は、本明細書において「細胞増殖抑制剤」とも呼び、濃度依存的態様で腫瘍コロニー形成を抑制した。平均ＩＣ７０値は０．４６２％と測定され、平均ＩＣ５０値は０．１９５％と測定された。細胞増殖抑制剤の平均を超える活性は、大細胞肺癌（ＬＸＦＬ５２９）、肺小細胞癌（ＬＸＦＳ６１５、ＬＸＦＳ６５０）、乳癌（ＭＡＸＦ４０１）、黒色腫（ＭＥＸＦ９８９）及び前立腺癌（ＰＲＸＦＭＲＩＨ１５７９）の腫瘍モデルに対して見られた。感受性が高い腫瘍は、肺小細胞癌ＬＸＦＳ６５０及び黒色腫ＭＥＸＦ９８９であった。これらの腫瘍モデルにおけるＩＣ７０値は、平均ＩＣ７０値と比較して１／１００よりも小さかった。
【００４１】
対象
本研究においては、２７の腫瘍異種移植片において抗癌性活性について細胞増殖抑制剤をインビトロで調査した。クローン形成法を用いて可能な腫瘍タイプ選択性を調査した。
【００４２】
クローン形成法（＝腫瘍コロニー分析、ＴＣＡ）によって、軟寒天中で増殖する腫瘍幹細胞のコロニー形成の阻害を調べた。腫瘍の増殖、転移及び浸透能力の原因となる腫瘍幹細胞を、ヌードマウスで増殖するヒト腫瘍異種移植片から直接的に調製した。従って、クローン形成法は、永久腫瘍細胞株を用いたインビトロ分析でよりもインビボ状態をより反映するものであり、抗癌剤のインビボにおけるさらなる評価のための高度に予測できる試験であることがわかっている。
【００４３】
溶媒及び濃度
細胞増殖抑制剤を６つの濃度で試験した。下に示すように、試験したうちで最も高い濃度は０．００４％であり、この濃度が、細胞増殖抑制剤１００％とした試験セットにおいて許容した溶媒の最大濃度であった。体積対体積で１０％の食塩水を追加したＩＭＤＭも、コントロール溶媒として用いた。
試験で示された適正濃度        細胞増殖抑制剤中のホルムアルデヒド濃度
１００％                      ０．００４％
１０％                        ０．０００４％
１％                          ０．００００４％
０．１％                      ４×１０−６
０．０１％                    ４×１０−７
０．００１％                  ４×１０−８
【００４４】
腫瘍モデル
異種移植片の由来は、以前に記載されている（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．１：３３３−３４１；Ｓｃｈｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２６：９０１−９０５；Ｆｉｅｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４０：８０２−８２０）。合計２７個のヒト腫瘍異種移植片において細胞増殖抑制剤を試験した。腫瘍試験パネルは、膀胱癌、結腸癌、胃癌、頭部癌及び頸部癌、肝臓頭癌、非小細胞肺癌（腺細胞癌及び大細胞癌）、小細胞肺癌、乳房癌、子房癌、膵臓癌、前立腺癌、及び、腎癌、並びに、黒色腫、胸膜中皮腫、及び、肉腫の１５個の様々なヒト腫瘍タイプの１〜４つのモデルで構成されていた。
【００４５】
腫瘍コロニー分析
ヒト腫瘍異種移植片からの単個細胞浮遊液の調製
胸腺形成不全ヌードマウス（ＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕ系統）において皮下で連続継代で成長する固体ヒト腫瘍異種移植片を無菌条件下で除去し、機械でバラバラにし、次いで、コラゲナーゼタイプＩＶ（４１Ｕ／ｍｌ）（シグマ）、デオキシリボヌクレアーゼＩ（１２５Ｕ／ｍｌ）（ロッシュ）、ヒアルロニダーゼタイプＩＩＩ（１００Ｕ／ｍｌ）（シグマ）、及び、ディスパーゼＩｌ（１．０Ｕ／ｍｌ）（ロッシュ）からなる酵素カクテルを用いてＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジーズ）中で３７℃で４５分間培養した。細胞を、網目サイズが２００μｍのふるい及び網目サイズが５０μｍのふるいに通し、無菌ＰＢＳバッファーで２回洗浄した。トリパンブルー排除（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を用いたノイバウアー血球計算器で生存細胞のパーセンテージを計測した。
【００４６】
ヒト腫瘍異種移植片からの細胞の養殖方法
クローン形成法は、Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ及びＳａｌｍｏｎによって導入された修正２層軟寒天分析による２４ウェルフォーマットで行った。下端層は、（２０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（シグマ）、０．０１％（ｗ／ｖ）のゲンタミシン（ライフテクノロジーズ）、及び、０．７５％（ｗ／ｖ）の寒天が追加された）０．２ｍｌ／ウェルのＩＭＤＭ（ライフテクノロジーズ）からなっていた。２×１０４〜４×１０４個の細胞を、０．４％（ｗ／ｖ）の寒天を加えた０．２ｍｌの同じ培地中に加え、２４マルチウェルディッシュにおいて下端層上に被覆させた。０．２ｍｌの培地に連続暴露（薬剤重層）で試験化合物を塗布した。各ディッシュは、６個の処理していないコントロールウェル、及び、薬剤処理したグループを６つの濃度において３個ずつ含んでいた。培養物を、７．５％の酸素を含む加湿雰囲気下において３７℃で６〜１８日間培養し、倒立顕微鏡を用いてコロニー増殖を詳細に観察した。この期間内中にインビトロでの腫瘍増殖によって、５０μｍを超える直径を有するコロニーが形成された。最大のコロニーが形成された時に、自動イメージ解析システム（ＯＭＮＩＣＯＮ３６００，Ｂｉｏｓｙｓ  ＧｍｂＨ）で計算を行った。評価の２４時間前に、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（１ｍｇ／ｍｌ、１００μｌ／ウェル）（シグマ）の無菌性水性溶液を用いて活性コロニーを染色した。
【００４７】
データ評価
以下の品質管理基準が満たされていれば、分析が完全に評価可能であるとみなす。
−２４マルチウェルのコントロールウェルにおける平均個数において、５０μｍを超えるコロニー直径を有するコロニーが２０個より多い。
−各プレートのコントロールウェルにおける変動係数が５０％以下である。
−陽性標準化合物である５−フルオロウラシル（１．０ｍｇ／ｍｌの細胞毒性濃度における５−ＦＵ）は、コントロール３０％よりも少ないようにコロニー数を減少させなければならない。あるいは、第０日又は第２日における初期プレート菌数が、最終的なコントロール菌数の２０％よりも少なければならない。
【００４８】
薬剤効果は、コロニー形成のパーセンテージによって表され、処理したウェルの平均コロニー数と処理しなかったコントロールの平均コロニー数とを比較することによって得られる（試験対コントロールの値で表される相対的コロニー数、Ｔ／Ｃ値［％］）
2011524334.tif 000002
【００４９】
コロニー形成をそれぞれ５０％（Ｔ／Ｃ＝５０％）及び７０％（Ｔ／Ｃ＝３０％）抑制するのに必要な薬剤濃度であるＩＣ５０値及びＩＣ７０値は、相対的コロニー数に対して化合物濃度をプロットすることによって決定した。下記式に従って平均ＩＣ５０値及び平均ＩＣ７０値を計算した。
2011524334.tif 000003
上記式において、ｘは特定腫瘍モデル、ｎは試験を行った腫瘍モデルの総数である。調べた用量範囲内において（化合物の活性が高すぎたか又は低すぎて）ＩＣ５０値及びＩＣ７０値を決定することができなかった場合には、試験をした最低濃度又は最高濃度を計算に用いた。
【００５０】
平均グラフ分析において、試験を行った全腫瘍について得た平均ＩＣ５０値（ＩＣ７０値）に対する、各腫瘍タイプにおける試験化合物について得たＩＣ５０値（ＩＣ７０値）の分布を示す（図２に示す）。各ＩＣ５０値（ＩＣ７０値）を対数目盛軸上のバーで表す。左方向へのバーは、平均値よりも低いＩＣ５０値（ＩＣ７０値）を示している（高感受性腫瘍モデルを示す）。右方向へのバーは、より高い値を示している（高耐性抗腫瘍モデルを示す）。従って、平均グラフ分析は、化合物の抗増殖効果の特徴を表している。
【００５１】
結果
様々な腫瘍タイプの固体ヒト腫瘍異種移植片に由来する２７の細胞懸濁液において、細胞増殖抑制剤が腫瘍幹細胞の増殖を抑制する能力を検討した。細胞製剤は、表１に記載されている細胞型に応じて、処理しなかったコントロールウェルにおいて、６〜２０日以内に１２３〜８６０個のコロニーを形成した。
【００５２】
処理しなかったコントロールのデータ出力は、想定の範囲内であった。増殖抑制のポジティブコントロールとして用いた５−フルオロウラシルは、良好な抗腫瘍活性を示した。細胞増殖抑制剤のインビトロ試験の結果を表２及び図１にまとめる。表２は、各試験濃度における全体的インビトロ奏効率（すなわち、細胞増殖抑制剤の増殖抑制活性）を示している。コロニー形成を、処理していないコントロールの３０％未満に抑制することを抗腫瘍活性と定義した。
【００５３】
濃度依存的な腫瘍コロニー形成の阻害が認められた。濃度と反応との関係は、０．１〜１．０％の範囲において局所的に非常に急激であった。細胞増殖抑制剤は、０．００１％の濃度で、２７個の腫瘍モデルのうちの１個のモデル（４％）において７０％超のコロニー形成抑制を達成した。０．０１％及び０．１％の細胞増殖抑制剤は、２７個のうち２個の腫瘍（７％）において活性であり、１．０％は２７個のうち２３個の腫瘍（８５％）において活性であり、１０．０％は２７個のうち２５個の腫瘍（９３％）において活性であり、１００．０％は２７個のうち２７個の腫瘍（１００％）において活性であった（表３）。平均ＩＣ５０は０．１９５％と決定され、平均ＩＣ７０は０．４６２％と決定された（図２）。
【００５４】
平均グラフ分析から細胞増殖抑制剤の抗腫瘍の選択性プロファイルを得た（図２）。本研究において感受性が最も高い腫瘍は、肺小細胞癌ＬＸＦＳ６５０（ＩＣ７０＜０．００１％）及び黒色腫ＭＥＸＦ９８９（ＩＣ７０＝０．００４％）であった。さらに、平均よりも高い細胞増殖抑制剤の活性は、大細胞肺癌ＬＸＦＬ５２９（ＩＣ７０＝０．１６２％）、肺小細胞癌ＬＸＦＳ６１５（ＩＣ７０＝０．３１％）、乳癌ＭＡＸＦ４０１（ＩＣ７０＝０．２４３％）及び前立腺癌ＰＲＸＦ  ＭＲＩＨ１５７９（ＩＣ７０＝０．２３４％）においてみられた（図１）。従って、総合的な抗腫瘍効果は、２個中２個の肺小細胞癌、３個中１個の黒色腫、３個中１個の乳癌、４個中１個の非小細胞肺癌、及び、２個中１個の前立腺癌においてみられた。
【００５５】
検討及び結論
本研究において、細胞増殖抑制剤は、腫瘍幹細胞がインビトロにおいて５０μｍを超える直径を有するコロニーに成長するのを抑制する能力を特徴とする。
【００５６】
全体的に、これらの腫瘍におけるコロニー形成の濃度依存的阻害から明らかなように、上記化合物は、様々な異なる腫瘍において活性を示した。各腫瘍に対する選択性は充分に顕著であった。感受性が最も高い腫瘍モデルにおけるＩＣ７０値は、平均ＩＣ７０値と比較して１／１００よりも小さかった。
【００５７】
実施例２
腫瘍がないヌードマウスにおける細胞増殖抑制組成物（細胞増殖抑制剤）の耐用性の評価
オスのＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスに１頭当たり１００μｌの筋肉内投薬を１日２回で２週間行い、細胞増殖抑制組成物（細胞増殖抑制剤）の耐用性を試験した。死亡率及び体重変化を記録し、０．９％ＮａＣｌ溶液を投与した溶媒コントロールマウスについて得たデータと比較した。グループの規模は、４頭の細胞増殖抑制剤処理マウス及び３頭の溶媒コントロールマウスであった。２週間後にマウスを解剖して血球計数に供した。
【００５８】
細胞増殖抑制剤は非常に耐用性が高かった。死亡数はゼロであり、体重減少の中央値の最大値は、第１４日において１．７％と記録された。その点において、溶媒コントロールマウスの相対的体重の中央値が６％増加した。検死及び血液細胞分析によって全体的な異常は認められなかった。
【００５９】
結論として、１頭あたり１００μｌの細胞増殖抑制剤を筋肉内に１日２回投与したマウスにおいては、重篤な副作用が生じないと考えられる。
【００６０】
研究の対象は、腫瘍がないＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスに１頭あたり１００μｌで１日２回の筋肉内投薬を行って細胞増殖抑制剤の耐用性を分析することであった。この研究には：死亡率及び体重減少で決定した耐用性の評価；終了時の解剖；及び、投与期間の最後における血液細胞の分析が含まれていた。
【００６１】
動物情報
具体的情報
マウス系統：      ＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕ
マウスの総数      無作為抽出した７頭のオス
ランダム化における体重範囲      ２６．６〜３２．８ｇ
ランダム化における近似の年齢：  ４〜６週齢
【００６２】
動物の健康
ドイツ動物保健福祉法（Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚｇｅｓｅｔｚ）のガイドラインに従ってすべての試験を行った。
【００６３】
無作為化する前に動物の健康状態を調査することによって、健康状態が良好な動物だけが試験手順に入るように確実に選択した。
【００６４】
試験；動物のグループ化及び無作為化
この研究は、細胞増殖抑制剤を投与する試験グループ及び溶媒コントロールグループを含む１つの試験からなっていた。グループの規模は、４頭のマウス（試験グループ）又は３頭のマウス（溶媒コントロールグループ）であった。１５日間連続でマウスに投薬し、最終用量投与の１日後にマウスを屠殺した。観察期間中に、マウスの死亡率及び臨床的症状をモニターし、週２回体重を測定した。最後に、マウスを解剖し、（血液細胞分析用に）血液サンプル及び（結合用に）臓器サンプルを採取した。ベットメド研究所で血液細胞分析を行った。第２９週に血液細胞分析を行った。無作為化データに関する概略を表３に示す。無作為化の日を第０日とした。第０日は、投薬の第１日でもある。
【００６５】
動物の個体識別
耳クリップを用いて動物に任意の番号を付した。試験開始時に、各ケージを、試験番号、無作為化の日付、マウス系統、性別及び各マウス番号を示す記録カードで標識した。グループ識別を無作為化した後に、試験化合物、投薬量、スケジュール及び投与経路を追加決定した。
【００６６】
居住環境
飼育方法
別々に換気されるケージ、テクニプラストＲにマウスを収容した。グループの規模に従って、マクロロンＭタイプＩＩＩケージ（１ケージ当たり最大８頭のマウス）又はマクロロンＭタイプＩＩロングケージ（１ケージ当たり最大５頭のマウス）にマウスを収容した。使用前にケージを１２１℃で殺菌し、週２回交換した。ケージの内部温度を２５℃±１℃に維持し、相対湿度を６０％±１０％に維持した。マウスを自然の日光サイクル下で保持した。
【００６７】
飼料及び給水
アルトロミンエクストルデート１４３９ラット／マウス飼料を動物に与えた。アルトロミンＧｍｂＨ（Ｌａｇｅ，ドイツ）からこの飼料を購入した。１２１℃で３０分間水を殺菌した。０．９ｇ／ｌの滅菌ソルビン酸カリウムを加えた後、１Ｎ  ＨＣｌでｐＨを２に調整した。毎日水消費量を視覚的にモニターし、ボトルを週２回交換した。食料及び水を無制限に与えた。
【００６８】
床敷
Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ＆Ｓｏｈｎｅ  Ｆａｓｅｒｓｔｏｆｆｗｅｒｋｅ（Ｅｌｌｗａｎｇｅｎ−Ｈｏｌｚｍｕｈｌｅ，ドイツ）で生産される無塵動物用床敷Ｌｉｇｎｏｃｅｌ  ＦＳ１４をｓｓｎｉｆｆ  Ｓｐｅｚｉａｌｄｉａｔｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｓｏｅｓｔ，ドイツ）から購入した。この床敷を週２回新しいものに交換した。
【００６９】
無塵床敷を、生物学的汚染又は真菌汚染、及び、リン酸エステル、ヒ素、カドミウム、鉛及び水銀の量について３カ月ごとに、そのメーカーが分析する。Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  農業省  キール，ドイツでこれらの分散分析を行った。品質証明は、Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ＆Ｓｏｈｎｅ  Ｆａｓｅｒｓｔｏｆｆｗｅｒｋｅ（Ｅｌｌｗａｎｇｅｎ−Ｈｏｌｚｍｕｈｌｅ，ドイツ）に委託されている。
治療手順
投与経路
すべての処理を筋肉内で行った。
【００７０】
薬剤投薬量及び治療投薬計画
ホルムアルデヒド濃度が０．１２％である細胞増殖抑制剤及び溶媒をマウス１頭あたり１００μｌで１日２回与えた。月曜日から金曜日までは、１日２回の投与間の時間的間隔は約６時間であった。土曜日及び日曜日には、この時間間隔が短かった。１日２回の投与うちの１回を右歯面に注射し、別の１回を左歯面に注射した。
【００７１】
観察
死亡率
毎日死亡率チェックを行った。
体重
週２回マウスの体重を測定した。各マウスの相対体重は、第Ｘ日の個別体重（ＢＷｘ）を第０日の個別体重（ＢＷ０）で除算し、１００％を乗算することによって求められる。グループの相対体重の中央値は、問題になっているその日に生きていたマウスの重量だけを考慮して同様に計算した。
2011524334.tif 000004
【００７２】
終了工程、解剖及び採血サンプル
第１５日（すなわち、最終投薬日の翌日）に、舌下から出血させてＥＤＴＡチューブ内に血液を回収した。さらに、血一滴を顕微鏡スライド上に延ばすことによって、マウス１頭当たり２個の血液スミアを調製した。次いで、マウスを頸椎脱臼によって屠殺し、標準的なプロトコルで解剖した。臓器を２４時間以内に１０％緩衝ホルマリン中に回収し、次いで、７０％エタノール中に移して保存した。同日に、血液及び血液スミアを、周囲温度（＜２０℃）においてＶｅｔ  Ｍｅｄ  Ｌａｂｏｒ  ＧｍｂＨ，Ｍｏｅｒｉｃｋｅ−ｓｔｒａｓｓｅ  ２８／３，Ｄ−７１６３６  Ｌｕｄｗｉｇｓｂｕｒｇ（ドイツ）に送付して分析した。次いで、翌日に血球計数を行った。
【００７３】
結果及び検討
死亡率及び体重変化
結果を表４及び図３にまとめる。細胞増殖抑制剤による治療は、非常に耐用性であった。細胞増殖抑制剤で処理したすべてのマウスが生き残り、すべての溶媒コントロールマウスも生き残った。最大体重損失の中央値は最小限であった（第１４日に記録された１．７％）。これに対して、溶媒コントロールグループについて観察された最大の体重減少中央値は、０．７％（第３日）であった。第１４日、すなわち、２週間投与期間の最後に、細胞増殖抑制剤で処理した４頭のマウスのうちの１頭のマウスにおいて体重が増加した（マウス＃６９４６、約９．５％の体重増加）。その一方で、残り３頭のマウスは、初期体重から体重が１〜７．５％減少した。これに対して、３頭の溶媒コントロールマウスは、初期体重から体重が２．５〜７．５％増加した。グループの規模が小さかったので、体重変化におけるこれらの相違は統計的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５、マンホイットニーウィルコクスンによる両側Ｕ−ランク試験）。細胞増殖抑制剤を１日２回２週間筋肉内に投薬した後に、注射部位で炎症が生じなかったことにも注目すべきである。
【００７４】
解剖及び血液細胞分析
結果を表４及び表５にまとめる。３頭の溶媒コントロールマウスのいずれもが脂肪質と評価されなかった一方で、細胞増殖抑制剤処理を行った４頭のうちの３頭が脂肪質であると評価されたこと以外は、１日２回の細胞増殖抑制剤による処理を２週間行った後の終了時のすべての主要臓器のマクロ検査によって一貫した異常はみられなかった。同様に、血液細胞分析後に全体的異常は検出されなかった。分析したサンプルが少数であったので、細胞増殖抑制剤で誘導されて生じ得る分葉好中球数増加、及び、リンパ球数の生じ得る減少は、独立試験で確認する必要がある。この点において、有効な血球数は、処理を行ったマウスの免疫状態に対して、細胞増殖抑制剤が明らかな影響を及ぼさなかったことを示している。
【００７５】
結論
１日２回マウス１頭当たり１００μｌで筋肉内に与えた細胞増殖抑制剤は、非常に耐用性であった。この用量レベルで与える細胞増殖抑制剤には副作用がないと考えられる。
【００７６】
実施例３−ヒト腫瘍細胞株における細胞増殖抑制化合物（細胞増殖抑制化合物）の抗腫瘍活性の評価
専用の細胞株パネル（ＬＸＦ５２９Ｌ、ＭＡＸＦ４０１ＮＬ、ＬＸＦＡ２８９Ｌ、ＯＶＸＦ８９９Ｌ）の４つのヒト腫瘍細胞株を用いて、単層増殖及び細胞毒性の分析によって細胞増殖抑制化合物の抗腫瘍活性を測定した。
【００７７】
表６に示すように、乳癌細胞株ＭＡＸＦ４０１ＮＬは、０．１２７％（ｖ／ｖ）のＩＣ５０値を示し、感受性が最も高い細胞株であることがわかった。
【００７８】
第２ステップにおいて、０．３％（細胞毒性が発現する濃度）の細胞増殖抑制化合物及び０．１％（細胞毒性が発現しない濃度）の細胞増殖抑制化合物でＭＡＸＦ４０１ＮＬ細胞を３日間連続的に処理した。処理後に、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、１ウェル当たり７１０００個の細胞密度で（細胞増殖抑制化合物を含んでいない）２４ウェル細胞培養プレートに撒いた。毎日細胞をカウントして、細胞株の増殖速度に対する細胞増殖抑制化合物による前処理の影響を調査した（増殖動態の第１サイクル）。同時に、前処理した細胞を、標準的な細胞培養条件下で継代させ、１週間後に第２サイクルにおいて増殖速度を測定した。
【００７９】
図５から明らかなように、０．１％の細胞増殖抑制化合物による前処理は、細胞株ＭＡＸＦ４０１ＮＬの増殖速度をわずかに低下させた。４日後に、処理していないグループにおける生細胞の数は、７１，０００個から３６９，５００個に増加し、０．１％で前処理を行ったグループでは細胞が７１，０００個から２７７，０００個になった（２５％の抑制）。０．３％で前処理を行ったグループにおいては、生細胞の明らかな抑制がみられた。しかしながら、大部分の細胞は、おそらく０．３％細胞増殖抑制化合物で前処理を行った後の後生的ダメージによって、撒いた後にプレートの底部に付着していなかった。更に、細胞がプレートの底部に付着していなかったので、このグループを継代することは不可能であった。従って、０．３％の細胞増殖抑制化合物グループは、増殖動態の第２サイクルに用いることができなかった。興味深いことに、細胞カウントの第１サイクルと同様に、第２サイクルにおいて４日後に細胞増殖が３０％抑制されたことがわかった（処理していないコントロールグループにおいて細胞が２６４，５００個であり、０．１％で処理したグループにおいては細胞が１８６，０００個であった）。
【００８０】
結論として、０．１２７％（ｖ／ｖ）から０．６５７％（ｖ／ｖ）の範囲内のＩＣ５０値で試験したように、細胞増殖抑制化合物は４個のヒト腫瘍細胞株において濃度依存的活性を示した。乳癌細胞株ＭＡＸＦ４０１ＮＬにおける試験によって、０．１％の細胞増殖抑制化合物による前処理を行った後に細胞増殖がわずかに抑制されることが示された。
【００８１】
細胞増殖抑制化合物で前処理したＭＡＸＦ４０１ＮＬ細胞における試験において、増殖速度がわずかに低下したことが示された。未処理コントロールと比べて、第１継代においては２５％低下し、第２継代においては３０％低下した。これは、細胞増殖抑制化合物によって初期に誘導されて癌細胞の代謝が変化したこと、及び、それらの細胞から正常な細胞状態（非腫瘍形成性）に明らかに転換されたことの証拠である。
【００８２】
従って、上に論じたように、細胞増殖抑制組成物は、おそらく、代謝を変更すること、すなわち、グルコース酸化／分解のバランスを好気性から嫌気性に移すことによって、癌細胞を非癌細胞又は正常細胞に転換する。
【００８３】
本発明の好ましい実施形態を上述したが、その実施形態を様々に変形してもよいことが認識及び理解されるであろう。また、添付されている特許請求の範囲は、本発明の精神及び範囲に含まれ得る変形をすべて包含するように意図されている。
【００８４】
【表１】
2011524334.tif 000005
【００８５】
【表２】
2011524334.tif 000006
【００８６】
【表３】
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【００８７】
【表４】
2011524334.tif 000008
【００８８】
【表５】
2011524334.tif 000009
【００８９】
【表６】
2011524334.tif 000010
【００９０】
本発明の基本的な特性及び特徴の全部は、本明細書に記載されていているが、特定の実施形態を参照して、変形、様々な変化及び置換の自由があることは、先の開示において意図されている。また、ある事例において、本発明のいくつかの特徴は、記載されている本発明の範囲から外れずに、他の特徴の対応する使用を伴わずに使用されるであろうことは明らかである。当業者が本発明の精神又は範囲から外れないようにそのような置換、修飾及び変形をなしてもよいことは、理解されるであろう。従って、そのような変形及び変形のすべては、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に包含される。
【図１】
2011524334.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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