(57)【要約】  発明は、阻害性抗第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子抗体及びそれらの使用方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト第ＸＩＩ因子に対してよりもヒト第ＸＩＩａ−β因子に対して２倍以上高い結合親和性を有し、そしてヒト第ＸＩＩａ因子のアミド分解活性を完全に阻害することができる、抗第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
１：０.２の、抗体に対する第ＸＩＩａ−α因子のモル比で使用されたとき、第ＸＩＩａ−α因子（ＦＸＩＩａ−α）を５０％より大きく阻害する、抗第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントであって、抗体はマウスＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａと結合し；そして（ａ）配列番号２の位置３９８のアスパラギン残基はリジンと置換され；又は（ｂ）配列番号２の位置４３８のイソロイシン残基はアラニンと置換される、配列番号２を含むポリペプチドへの抗体の結合レベルは、該置換のない配列番号２を含む対応するポリペプチドへのタンパク質の結合レベルより低い、上記の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
抗体は、配列番号４の配列と８５％以上同一である重鎖可変（ｖＨ）領域を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
抗体は、配列番号５の配列と８５％以上同一である軽鎖可変（ｖＬ）領域を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６】
抗体は、配列番号６の配列と少なくとも８０％同一の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７の配列と少なくとも６０％同一の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９の配列と少なくとも８０％同一の重鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７】
抗体は、配列番号１１と少なくとも５０％同一の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項８】
ヒト第ＸＩＩａ−β因子を１０-7Ｍより多いＫDで結合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項９】
ヒト第ＸＩＩａ−β因子に結合するためにインフェスチンと競合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１０】
抗体はヒトＩｇＧ又はその変異体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１１】
ＩｇＧはＩｇＧ４である、請求項１０に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントをコードする核酸。
【請求項１３】
適したプロモーター配列に操作可能に連結される、請求項１２に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含んでなる細胞株又は酵母細胞。
【請求項１５】
抗体を発現させるのに適切な条件下で請求項１４に記載の細胞株又は酵母細胞を培養するステップ、及び培養上清から抗体を精製するステップを含んでなる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はそのフラグメントを生産する方法。
【請求項１６】
医療用の請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
血栓の形成及び／又は安定化、及びそれによる３次元の管腔内血栓成長を予防することによって、又は管腔内血栓を予防し及び／又は処置することによって、静脈、動脈又は毛細血管の血栓形成、心臓における血栓形成、血栓塞栓症、ヒト又は動物対象の血液の人工表面との接触中及び／又は後の血栓形成から成る群から選択される障害を予防し及び処置する；間質性肺疾患、炎症、神経系炎症性疾患、補体活性化、線維素溶解、血管新生及びＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ誘導キニン形成又はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ仲介補体活性化に関連する疾患から成る群から選択される障害を予防し及び処置する；のに用いる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
静脈又は動脈の血栓形成が、脳卒中、心筋梗塞、深部静脈血栓症、門脈血栓症、血栓塞栓症、腎静脈血栓症、頚静脈血栓症、脳静脈洞血栓症、バッド・キアリ（Ｂｕｄｄ−Ｃｈｉａｒｉ）症候群又はパジェット・シュレッター（Ｐａｇｅｔ−Ｓｃｈｒｏｅｔｔｅｒ）病である、請求項１７に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ誘導キニン形成に関連する疾患は、遺伝性血管浮腫、肺の細菌感染症、トリパノソーマ感染症、低血圧ショック、膵臓炎、シャーガス病、関節性痛風、関節炎、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）及び敗血症から成る群から選択される、請求項１７に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
間質性肺疾患は、線維増殖性及び／又は特発性肺線維症である、請求項１７に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
請求項１７に記載の抗体であって、ここで、血液の人工表面との接触中及び／又は後の血栓形成は、前記ヒト又は動物対象で行われる医療処置中及び／又は後に起こり、そしてここで該抗体は該医療処置前及び／又は中及び／又は後に投与され、そして更に、ここで
（ｉ）人工表面は対象の少なくとも８０％の血液量に曝露され、そして人工表面は少なくとも０.２ｍ2であり又は
（ｉｉ）人工表面は対象の体外での採血容器であり又は
（ｉｉｉ）人工表面はステント、弁、管腔内カテーテル、又は体内血液ポンプ支援システムである、上記抗体。
【請求項２２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントでコーティングされた医療デバイスであって、デバイスは心肺バイパス装置、血液酸素化用体外膜型酸素化システム、血液ポンプ支援デバイス、血液透析デバイス、血液の体外濾過デバイス、採血で用いるリポジトリ、管腔内カテーテル、ステント、人工心臓弁、及び／又はチュービング、カニューレ、遠心ポンプ、弁、ポート、及び／又はダイバータを含む該デバイスのいずれか１つのための付属品である、上記医療デバイス。
【請求項２３】
医療処置を受ける患者へ投与のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントであって、医療処置は：
（ａ）心臓、
（ｂ）大動脈、大動脈弓、頚動脈、冠動脈、腕頭動脈、椎骨脳底動脈循環、頭蓋内動脈、腎動脈、肝動脈、腸間膜動脈、及び／又は心臓への頭蓋の動脈系の血管：から選択される少なくとも１つの血管、
（ｃ）患者が既知の中隔欠損を有する場合の静脈血管；
の少なくとも１つとの接触を含み；
そして医療処置は、少なくとも１つの標的臓器中に虚血をもたらし得る体内の少なくとも１つの該血管中での少なくとも１つの塞栓の解放、及び医療処置の前、中、及び／又は後に、抗体又はその抗原結合フラグメントの投与を含む、上記の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
進行性網膜症、視力を脅かす網膜症の合併症、黄斑浮腫、非増殖性網膜症、増殖性網膜症、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症、及び網膜外傷を含む、網膜血管透過性亢進を伴う病態の予防又は処置のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明は、阻害性抗第ＸＩＩ／ＸＩＩＡ因子モノクローナル抗体及びそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）は、約８０ｋＤａの分子量を有する血清糖タンパク質である。負荷電表面への露出による自己活性化以外に、第ＸＩＩ因子は、加えてタンパク質分解的切断によってカリクレインで活性化されてα−第ＸＩＩａ因子を形成し、次いで更に、例えばトリプシンによってβ−第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ−β）に変換される。α−第ＸＩＩａ因子は、接触結合ドメインを含有する約５０ｋＤａのＮ末端重鎖、及び触媒中心を含有する約２８ｋＤａのＣ末端軽鎖から構成される。重鎖及び軽鎖はジスルフィド結合によって連結される。ＦＸＩＩａ−βは、ジスルフィド結合によって結合される完全軽鎖及び２０００Ｄａの重鎖から成る約３０ｋＤａのＦＸＩＩの活性型である。
【０００３】
血管壁損傷は血液中の血小板の突然の接着及び凝集を誘発し、続いて血漿凝固系の活性化及びフィブリン含有血栓の形成をもたらす。これらのイベントは、外傷後失血を制限するのに重要であり、しかしまた病的血管を閉塞し重要臓器の虚血及び梗塞をもたらし得る。カスケードモデルでは、血液凝固は、血漿フィブリノーゲンをフィブリンに変換しそして血小板を活性化する、トロンビンの生成を完結させる制限タンパク質分解によるチモーゲンの活性化にかかわる一連の反応によって進行する。順々に（in turn）、コラーゲン又はフィブリン付着性血小板は、凝固プロテアーゼ複合体の集合及び活性化を伝播させるそれらの外面上で凝固促進性リン脂質（例えばホスファチジルセリン）を露出することを介して、そして血小板受容体と凝固因子間の直接相互作用により、数桁の大きさのトロンビン生成を容易にする。
【０００４】
血管系の外因性（血管壁）か又は内因性（血行性）成分によって誘発される凝固のための２つの集合経路が存在する。「外因性」経路は、管腔表面に不存在であるがしかし血管の内皮下層に強く発現され、そして組織損傷を介して接近可能又は放出される必須凝固補因子として、内在性膜タンパク質組織因子（ＴＦ）と血漿第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の複合体によって開始される。循環微小胞中に発現されるＴＦはまた、活性化血小板の表面上でトロンビン生成を持続させることにより血栓伝播に寄与し得る。「内因性」又は接触活性化経路は、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ、ハーゲマン因子）が、高分子量キニノーゲン及び血漿カリクレインにかかわる反応中に負荷電表面と接触するときに開始される。ＦＸＩＩは、グリコサミノグリカン及びコラーゲン、スルファチド、ヌクレオチド、ポリホスフェート及びガラス又は重合体のような他の可溶性ポリアニオン又は非生理的材料など、内皮下マトリックスの高分子成分によって活性化できる。最も強力な接触アクチベータの１つはカオリンであり、そしてこの反応は、主要臨床的血液凝固試験、「内因性」経路を介して凝固能力を測定する、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）の機構的基礎を成す。血小板によって伝播される反応において、活性化ＦＸＩＩは次いでＦＸＩをＦＸＩａに活性化し、そしてその結果ＦＸＩａは第ＩＸ因子を活性化する。そのＦＶＩＩＩａが既にトレースのＦＸａ及び／又はトロンビンによって活性されている、ＦＶＩＩＩａ及びＦＩＸａ（テナーゼ複合体）の複合体は、続いてＦＸを活性化する。
【０００５】
インビトロでのその高い血液凝固誘導能にもかかわらず、ＦＸＩＩトリガー内因性凝固経路の（病態）生理学的意義は、ＦＸＩＩの並びに高分子量キニノーゲン及び血漿カリクレインの遺伝性欠損が出血性合併症と関連しないという事実によって疑問視されている。ＴＦ及びＦＶＩＩのような外因性経路成分を欠くヒトマウスは大量出血をするという観察と併せて、これは出血の停止がインビボで外因性カスケードを限定的に必要とするという現在の仮説をもたらしている（非特許文献１）。
【０００６】
病的状態では、凝固カスケードは不適切に活性化され得て次いで血管内部に止血血栓の形成をもたらす。それにより、血管は閉塞され得てそして遠位臓器への血管供給は制限される。この過程は血栓症として、そして血栓が塞栓する場合には高い死亡率と関連する血栓塞栓症として公知である。また、血液と接触する人工器官の使用は、内因性凝固カスケードの活性化のために厳しく制限される。人工器官の表面の好適なコーティングは、ある場合には該問題を回避し得る、しかし別の場合にはその機能を損ない得る。そのような人工器官の例は、血液透析器、心肺バイパス回路、心臓弁、血管ステント及び留置カテーテルである。そのようなデバイスが使用される場合、ヘパリンのような抗凝固薬が表面でのフィブリン形成を防止するために投与される。しかしながら、一部の人々は、血小板凝集及び生命にかかわる血栓に至るヘパリン誘発血小板減少症（ＨＩＴ）を引き起こし得る、ヘパリン不耐容性である。更に、クリニックで使用される全抗凝固薬の固有の短所は、重大な出血イベントのリスク増加である。従って、そのような合併症を伴わず、そして罹患患者で又は出血リスクの増加なしに血栓症を防止する、優れた予防／治療概念として使用されることができる、新しいタイプの抗凝固薬に対する強い必要性が存在する。
【０００７】
半世紀以上の間、血液凝固第ＸＩＩ因子の欠損は、特発性又は損傷関連出血の増加と関連しないことが公知である（非特許文献２）。実際に、ａＰＴＴ（凝固の内因性経路を検討する臨床的血液凝固試験）において測定された病理学的数値によって容易に検出されるが、ＦＸＩＩを欠損しているヒトは大きな外科的処置中でも異常な出血を患わない（非特許文献３）。対照的に、ＦＸＩＩの欠損は静脈血栓症のリスク増加を伴なっていた（非特許文献４、５）。この考え方を支持する研究及び症例報告は肺塞栓症で死亡したJohn Hageman氏のＦＸＩＩ欠損症の初発症例を参照する。ＦＸＩＩ欠損がプロトロンビンリスクと関連するという仮説は、その原報がＦＸＩＩ欠損症を血栓症と関係させた、幾つかの症例報告の最近の再評価によって取り組まれている（非特許文献６）。ほとんどの場合、著者らは、ＦＸＩＩと無関係に血栓性イベントに関与し得る第ＸＩＩ因子欠損症と併せて同時に起こる先天性又は後天性プロトロンビンリスクファクターを同定した。よく特性化された患者（非特許文献７）及びＦＸＩＩ欠損の家族（非特許文献８）を用いた最大の疫学研究は、ＦＸＩＩ欠損症及びいずれのプロ又は抗血栓リスクの相関はないことを示した。
【０００８】
驚くべきことに及び当業者の通説と対照的に、第ＸＩＩ因子駆動凝固経路はインビボで動脈血栓形成に関与し、しかし正常の組織特異的止血に必要ではない（非特許文献９、１０、特許文献１）。予想外に、これらの結果は病的血栓形成の過程において第ＸＩＩ因子を中心位置に入れる。それ故ＦＸＩＩ活性化又はＦＸＩＩ活性を妨害しそしてブロックすることができる物質は、病的動脈血栓形成及びその臨床的帰結をブロックするのに適切であり得る。
【０００９】
特許文献１では、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに対する抗体の使用又はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの阻害剤の使用が提案されている。有力な阻害剤として、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、Ｃ１阻害剤、アプロチニン、α−Ｉプロテアーゼ阻害剤、アンチペイン（［（Ｓ）−ｌ−カルボキシ−２−フェニルエチル］−カルバモイル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｖａｌ−アルギナール）、Ｚ−Ｐｒｏ−プロアルデヒド−酢酸ジメチル、ＤＸ８８(非特許文献１１)、ロイペプチン、ロイペプチン、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｐｙｒ−ＣＮのようなプロリルオリゴペプチダーゼの阻害剤、トウモロコシトリプシンインヒビター、ウシ膵トリプシン阻害剤の変異体、エコチン（ecotin）、黄色単独抗凝固タンパク質、セイヨウカボチャイソ阻害剤を含むセイヨウカボチャトリプシン阻害剤−Ｖ及びハマダリン（Hamadarin） (非特許文献１２により開示) が提案されている。
【００１０】
治療薬としてのＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａの理想的阻害剤は−一方でＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに対して高い阻害活性を示す−出血リスクを増加させず、非免疫原性であり得てそしてできるだけ控えめに−理想的にはただ１回だけ投与する必要がある。Ｚ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−アルデヒド−酢酸ジメチルのような小分子阻害剤は、投与後ほんの短い半減期を有し得て、それ故複数回の注射を必要とし、又は経口可能な徐放性形態に発展される必要がありその後また長期間にわたって定常的に投与される必要があり得る。Ｃ１阻害剤のようなヒト血漿タンパク質は、即座にすべての必要条件を満たし得て、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに対して相対的に高い阻害活性を有して、一方で出血リスクを増加させず、ヒトタンパク質として非免疫原性でありそしてまた著しく長い半減期を有する。驚くべきことにたった今、血栓症のインビボモデルにおいて、ヒトＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤の最有力候補としてＣ１阻害剤は、閉塞を防止するのに使用奏功され得ないことが見出された。ヒト血漿由来の別の提案ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤即ちＡＴＩＩＩ阻害剤は、出血リスクが増加する可能性があるので少なくとも第２の必要条件を満たし得ない（非特許文献１３）。
【００１１】
特許文献２では、Kazalタイプセリンプロテアーゼ阻害剤のインフェスチン（lnfestin）若しくはそのドメイン、又はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤としてインフェスチンホモログに基づく改変Kazalタイプセリンプロテアーゼ阻害剤が提案されている。このサブセットから選択された、半減期の延長のためヒトアルブミンに融合した組換インフェスチン−４（ｒＨＡ−インフェスチン−４）が開発され、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに対して高い阻害活性を示した。その上、この物質は（生理的）止血を障害することなく抗血栓効果を示し、一方でヒトアルブミンへ融合後に有用な半減期を示した（非特許文献１４）。しかしながら、免疫原性は進展中減少したが、ヒトで免疫原性反応のリスクは尚存在する。更に、尚一層長い半減期は更なる有利な効果を有し得る。それ故、血栓症及び類似の障害の処置及び／又は予防のための改良薬剤の必要性は依然として存在する。従って、本発明の目的は、そのような必要性を満たすことである。そのような改良薬剤の候補は、阻害活性を有する改良抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体である。
【００１２】
第ＸＩＩ因子に対する抗体は開示されている。非特許文献１５ はヒト第ＸＩＩ因子に対するモノクローナル抗体Ｂ７Ｃ９を開示した。この抗体は表面媒介凝固活性をブロックしたが、しかし第ＸＩＩａ因子のアミド分解活性をブッロクしなかった。非特許文献１６は、第ＸＩＩ因子の活性化を阻止したがしかし活性化抗ＦＸＩＩ（ＦＸＩＩａ）の凝固又はアミド分解活性を阻止しなかった、ヒト第ＸＩＩ因子に対するモノクローナル抗体を開示した。非特許文献１７は、凝固活性を阻害した、しかしＦＸＩＩのアミド分解活性を阻止しなかった、モノクローナル抗体Ｆ１及びＦ３を開示した。特許文献３は、ＦＸＩＩの軽鎖（Ｂ６Ｆ５、Ｃ６Ｂ７、Ｄ２Ｅ１０）に対して産生されるモノクローナル抗体を提供する。これらの抗体は凝固活性を阻害するが、しかしＦＸＩＩａのアミド分解活性の部分的阻害を示すだけである。特許文献４は、ＦＸＩＩにわたってＦＸＩＩａ−βを選択的に結合するモノクローナル抗体の産生、及び血中のＦＸＩＩａ−βを特異的に検出するイムノアッセイの開発を記載する。特許文献４の実施例７から、抗体がＦＸＩＩａのアミド分解活性を阻害しないことは明らかである。特許文献５は、血漿中の固有のＦＸＩＩに結合し、そして血漿中の接触系の活性化、並びにＦＸＩＩａのアミド分解活性を阻害する抗ＦＸＩＩ抗体ＯＴ−２を伴う敗血症の処置を記載する。
【００１３】
本発明の目的は、−ＦＸＩＩａに対して高い阻害活性を示す一方で−出血リスクを増加させず、免疫原性でなく、そして長い半減期を有する改良抗体の開発であった。ＦＸＩＩはフィブリノーゲンタイプ及びＥＧＦ様ドメインを含むマルチドメイン構造を有することから(非特許文献１８によるレビュー)、ＦＸＩＩは、ＦＸＩＩａとして、即ち活性化に続く酵素としてのその役割に加えて更なる重要な生理機能を有する可能性があると考えられた。新たな研究は現在、ＦＸＩＩが血管新生に至る細胞増殖及び成長に寄与することを示している(非特許文献１９によるレビュー)。従って、ＦＸＩＩのこれらの機能（及び恐らく他の現在まで未知の）を妨害しないために、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに対する治療抗体は、ＦＸＩＩと比べてＦＸＩＩａに対して、例えばＦＸＩＩａ−βに対して明らかなより高い親和性を有することが好ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２００６０６６８７８
【特許文献２】ＷＯ２００８０９８７２０Ａ１
【特許文献３】ＷＯ８９１１８６５
【特許文献４】ＷＯ９００８８３５
【特許文献５】ＷＯ９１１７２５８
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Mackman, N. 2004. 止血、血栓症、及び血管の発生における組織因子の役割. Thromb. Vasc. Biol. 24, 101 5-1 022
【非特許文献２】Ratnoff OD & Colopy JE 1955.血漿の血餅促進画分の欠損を伴う家族性出血性形質。 J Clin Invest 34:602-613
【非特許文献３】Colman RW. 止血及び血栓症。基本方針＆診療(eds. Colman RW, Hirsch J, Mader VJ, Clowes AW, & George J) 103-122 (Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001)
【非特許文献４】Kuhli C et al. 2004. 第ＸＩＩ因子欠損: 網膜静脈閉塞症の血栓形成リスクファクター。 Am. J. Ophthalmol. 137:459-464
【非特許文献５】Halbmayer WM et al. 1993. 第ＸＩＩ因子(ハーゲマン因子) 欠損: 血栓塞栓症の発症のリスクファクター。 再発静脈又は動脈血栓塞栓症及び心筋梗塞後の患者におけるＦＸＩＩ欠損の発生率。Wien. Med. Wochenschr. 143:43-50
【非特許文献６】Girolami A et al. 2004.重度（ホモ接合性）ＦＸＩＩ欠損症患者に見られる偶発性静脈血栓症は恐らく関連リスクファクターに因る：２１名の患者の罹患率の研究及び文献レビュー。J. Thromb. Thrombolysis 17:139-143
【非特許文献７】Koster T et al. 1994. John Hageman因子及び深部静脈血栓症: Leiden thrombophilia Study. Br. J. Haematol. 87:422-424
【非特許文献８】Zeerleder S et al. 1999.先天性第ＸＩＩ因子欠損症における血栓塞栓症合併症の罹患率の再評価-スイスの１４家族から７３名に関する研究。Thromb. Haemost. 82:1240-1246
【非特許文献９】Renne T et al. 2005. 第ＸＩＩ因子を欠くマウスにおける欠損血栓形成。J. Exp. Med. 202:271-281;
【非特許文献１０】Kleinschnitz C et al. 2006.血液凝固第ＸＩＩ因子ターゲッティングは止血を妨害することなしに脳虚血において病的血栓症の保護をもたらす。J. Exp. Med. 203, 513-518
【非特許文献１１】Dyax Inc., 300 Technology Square, Cambridge, MA 02139, USA; cited in: Williams A and Baird LG.2003. ＤＸ−８８及びＨＡＥ：開発展望。Transfus Apheresis Sci. 29:255-258
【非特許文献１２】lsawa H et al. 2002. 蚊の唾液タンパク質は第ＸＩＩ因子及び高分子量キニノーゲンに結合することにより血漿接触系の活性を阻害する。J. Biol. Chem. 277:27651-27658
【非特許文献１３】Warren BL et al. 2001. 重病患者のケア。重度敗血症における高用量アンチトロンビンＩＩＩ: ランダム化比較試験。JAMA 286:1869-1878
【非特許文献１４】Hagedorn et al. 2010. 第ＸＩＩａ因子阻害剤の組換ヒトアルブミンインフェスチン−４抗体は出血に影響を与えることなく閉塞性動脈血栓形成を停止する。Circulation. 121:1510-1517
【非特許文献１５】Pixley et al (J Biol Chem (1987) 262, 10140-10145)
【非特許文献１６】Small et al (Blood (1985), 65, 202-210)
【非特許文献１７】Nuijens et al (J. Biol. Chem. (1989) 264, 12941-12949)
【非特許文献１８】Stavrou and Schmaier (2010) Thromb. Res., 125:210-215
【非特許文献１９】Schmaier and LaRusch (2010) Thromb. Haemost., 104:915-918
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
従って、発明の１つの態様は、ヒト第ＸＩＩ因子に対してよりもヒト第ＸＩＩａ−β因子に対して２倍以上高い結合親和性を有し、そしてヒト第ＸＩＩａ因子のアミド分解活性を阻害できる、抗第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子モノクローナル抗体、又はその抗原結合フラグメントである。発明の別の態様は、１：０.２の抗体に対する第ＸＩＩａ−α因子のモル比で使用されたとき、ヒトＸＩＩａ−α因子を５０％より大きく阻害する、抗第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００１７】
好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、１つ又はそれ以上の下記の特徴を有する；
−それはマウスＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａを結合する；
−（ａ）配列番号２の位置３９８のアスパラギン残基はリジンと置換され；又は（ｂ）配列番号２の位置４３８のイソロイシン残基はアラニンと置換される、配列番号２を含んでなるポリペプチド又はその関連フラグメントへの抗体の結合レベルは、前記置換のない配列番号２を含んでなる対応するポリペプチド又はその関連フラグメントへのタンパク質の結合レベルより低い；
−それは配列番号４の配列と８５％以上同一の重鎖可変（ｖＨ）領域を含む；
−それは配列番号５の配列と８５％以上同一の軽鎖可変（ｖＬ）領域を含む；
−それは配列番号６の配列と少なくとも８０％同一の重鎖ＣＤＲ１、及び／又は配列番号７の配列と少なくとも６０％同一の重鎖ＣＤＲ２、及び／又は配列番号９の配列と少なくとも８０％同一である重鎖ＣＤＲ３を含む；
−それは配列番号１１と少なくとも５０％同一の軽鎖ＣＤＲ１、及び／又は配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は配列Ａ−Ｘ1−Ｗ−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｒ−Ｘ6−Ｘ7の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ここでＸ1はＡ又はＳであり得て、Ｘ5はＬ又はＶであり得て、他のＸnｓはいずれのアミノ酸であってよい（配列番号１４）。
−それはヒト第ＸＩＩａ−β因子を１０-8Ｍより多いＫDで結合する。
−それはヒト第ＸＩＩａ−β因子に結合するためにインフェスチンと、特にインフェスチン−４と競合する。
−それはヒトＩｇＧ又はその変異体、好ましくはＩｇＧ４又はその変異体である。
【００１８】
発明の別の実施態様は、発明の抗体、又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸である。
【００１９】
発明の尚別の実施態様は、適したプロモーター配列に操作可能に連結される、発明の抗体、又はその抗原結合フラグメントをコード化する核酸を含むベクターである。
【００２０】
発明の更なる態様は、発明のベクターを含んでなる細胞株又は酵母細胞である。
【００２１】
発明の別の態様は、抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させるのに、適切な条件下で発明の細胞株又は酵母細胞を培養すること、及び培養上清から抗体又はその抗原結合フラグメントを精製することを含んでなる、発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法である。
【００２２】
発明の尚別の態様は、医療用抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００２３】
発明の更なる態様は、血栓の形成及び／又は安定化、及びそれによる３次元の管腔内血栓成長を予防することによって、又は管腔内血栓を予防し、及び／又は処置することによって静脈、動脈又は毛細血管の血栓形成、心臓における血栓形成、血栓塞栓症、ヒト又は動物対象（subject）の血液の人工表面との接触中及び／又は後の血栓形成から成る群から選択される障害を予防し及び処置する；間質性肺疾患、炎症、神経系炎症性疾患、補体活性化、線維素溶解、血管新生及びＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ誘導キニン形成又はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ仲介補体活性化に関連する疾患から成る群から選択される障害を予防し及び処理する；のに使用するための抗体又はその抗原結合フラグメントである。発明の尚別の態様は、静脈、動脈又は毛細血管の血栓形成、心臓における血栓形成、ヒト又は動物対象の血液の人工表面との接触中及び／又は後の血栓形成、血栓塞栓症から成る群から選択される障害に関連するヒト又は動物対象の管腔内血栓；間質性肺疾患、炎症、神経系炎症性疾患、補体活性化、線維素溶解、血管新生及びＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ誘導キニン形成又はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ仲介補体活性化に関連する疾患の処置に用いる抗体又はその抗原結合フラグメントである。好ましくは、静脈又は動脈の血栓形成は、脳卒中、心筋梗塞、深部静脈血栓症、門脈血栓症、腎静脈血栓症、頚静脈血栓症、脳静脈洞血栓症、バッド・キアリ（Ｂｕｄｄ−Ｃｈｉａｒｉ）症候群又はパジェット・シュレッター（Ｐａｇｅｔ−Ｓｃｈｒｏｅｔｔｅｒ）病である。好ましくは、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ誘導キニン形成に関連する疾患は、遺伝性血管浮腫、肺の細菌感染症、トリパノソーマ感染症、低血圧ショック、膵臓炎、シャーガス病、関節性痛風、関節炎、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）及び敗血症の群から選択される。
【００２４】
好ましくは、間質性肺疾患は線維増殖性及び／又は特発性肺線維症である。
【００２５】
好ましくは、血栓形成は、上記ヒト又は動物対象で行われる医療処置中及び／又は後に、ヒト又は動物対象の血液の人工表面との接触中及び／又は後に起こり、そして前記抗体又はその抗原結合フラグメントは該医療処置前及び／又は中及び／又は後に投与され、そして更に、
（ｉ）人工表面は対象の少なくとも８０％の血液量に曝露され、そして人工表面は少なくとも０.２ｍ2であり又は
（ｉｉ）人工表面は対象の体外での採血容器であり又は
（ｉｉｉ）人工表面は、ステント、弁、管腔内カテーテル、又は体内血液ポンプ支援システム（system for internal assisted pumping of blood）である。
【００２６】
発明のまだ更なる態様は、発明の抗体又はその抗原結合フラグメントでコーティングされた医療デバイスであり、ここでデバイスは心肺バイパス装置、血液酸素化用体外膜型酸素化システム、血液ポンプ支援デバイス、血液透析デバイス、血液の体外濾過デバイス、採血で用いるリポジトリ、管腔内カテーテル、ステント、人工心臓弁、及び／又はチュービング、カニューレ、遠心ポンプ、弁、ポート、及び／又はダイバータを含む上記デバイスのいずれか１つのための付属品である。
【００２７】
発明の別の態様は、医療処置を受ける患者へ投与のために用いる抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで医療処置は：
（ａ）心臓、
（ｂ）大動脈、大動脈弓、頚動脈、冠動脈、腕頭動脈、椎骨脳底動脈循環、頭蓋内動脈、腎動脈、肝動脈、腸間膜動脈、及び／又は心臓への頭蓋の動脈系の血管から選択される少なくとも１つの血管、
（ｃ）患者が既知の中隔欠損を有する場合の静脈血管；
の少なくとも１つとの接触を含み、
そして医療処置は、少なくとも１つの標的臓器中に虚血をもたらし得る体内の少なくとも１つの上記血管中の少なくとも１つの塞栓（embolus）の解放、及び医療処置の前、中及び／又は後の抗体又はその抗原結合フラグメントの投与を含む。
【００２８】
発明の更なる態様は、進行性網膜症、視力を脅かす網膜症の合併症、黄斑浮腫、非増殖性網膜症、増殖性網膜症、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症、及び網膜外傷を含む、血管透過性増加、特に、網膜血管透過性亢進を伴う病態の予防又は処置で用いる抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００２９】
発明の別の態様は、発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを含んでなる医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＦＸＩＩａアミド分解阻害剤インフェスチン４を用いる抗ＦＸＩＩａファージ競合ＥＬＩＳＡ。コンペティター（ｒＨＡ−Ｉｎｆ４）の濃度はＸ−軸で示される。アッセイに使用されるファージ発現Ｆａｂ抗体又はインフェスチン４（ｐＴａｃＩｎｆ４）の固定濃度は、ファージタイトレーションＥＬＩＳＡを用いて測定された。
【図２】完全ヒトＩｇＧとしてモノクローナル抗体３Ｆ７によるヒトＦＸＩＩａアミド分解活性の濃度依存性阻害。抗ヒトＧＣＳＦ受容体モノクローナル抗体Ｃ１．２（完全ヒトＩｇＧ４）は、アッセイの陰性対照として用いられ、そしてｒＨＡ−インフェスチンは陽性対照として用いられた。
【図３】親和性成熟に使用される３Ｆ７重鎖停止鋳型。ＣＤＲ領域は網掛け灰色で、そしてランダム化された各ライブラリー中のアミノ酸位置は「ｘ」で表される。
【図４】親和性成熟に使用される停止鋳型。ＣＤＲ領域は網掛け灰色で、そしてランダム化された各ライブラリー中のアミノ酸位置は「ｘ」で表される。
【図５】モノクローナル抗体３Ｆ７及びＯＴ−２によるヒトＦＸＩＩａのアミド分解活性の濃度依存性阻害。
【図６Ａ】マウス、ラット及びヒトＦＸＩＩの触媒ドメインのアラインメント、及び抗体３Ｆ７の潜在的エピトープを同定するために、触媒トリアド（*）及び導入された突然変異（！）を形成する残基の同定。
【図６Ｂ】３Ｆ７の種々の突然変異体への結合を示すウェスタンブロット。
【図７】ＭＡｂ３Ｆ７による処置後のＦｅＣｌ3誘発血栓の閉塞率（ｎ＝５−２５／群）。
【図８】ａＰＴＴに対するＭＡｂ３Ｆ７の効果（ｎ＝５−２５／群；平均±ＳＤ）。
【図９】ＰＴに対するＭＡｂ３Ｆ７の効果（ｎ＝５−２５／群；平均±ＳＤ）。
【図１０】ＦＸＩＩａ活性に対するＭＡｂ３Ｆ７の効果（ｎ＝５−２５／群；平均±ＳＤ）。
【図１１】止血までの時間に対するＭＡｂ３Ｆ７の効果。データは平均値(＋ＳＤ)で表される。統計解析：ｐ＞０.０５（Kruskal-Wallis検定）Ｎ＝１０／群。
【図１２】総失血に対するＭＡｂ３Ｆ７の効果。データは平均値(＋ＳＤ)で表される。統計解析：ｐ＞０.０５（Kruskal-Wallis検定）Ｎ＝１０／群。
【図１３】止血までの時間に対するＭＡｂ３Ｆ７の効果。水平線は中央値を表す。統計解析：ｐ＞０.０５（Kruskal-Wallis検定）Ｎ＝１０／群。
【図１４】総失血に対するＭＡｂ３Ｆ７の効果。水平線は中央値を表す。統計解析：ｐ＞０.０５（Kruskal-Wallis検定）Ｎ＝１０／群。
【図１５】ＯＴ−２、ＭＡｂ３Ｆ７のａＰＴＴ及びＭＡｂ３Ｆ７の親和性成熟バージョンの比較。
【図１６】異なる抗体によるヒト第ＦＸＩＩａ−α因子の阻害の比較。
【００３１】
配列のリスト
配列番号１：ヒトＦＸＩＩ配列
配列番号２：マウスＦＸＩＩ配列
配列番号３：ラットＦＸＩＩ配列
配列番号４：３Ｆ７ｖＨ配列
配列番号５：３Ｆ７ｖＬ配列
配列番号６：３Ｆ７重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）
配列番号７：３Ｆ７重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）
配列番号８：種々の３Ｆ７重鎖ＣＤＲ２
配列番号９：３Ｆ７重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）
配列番号１０：種々の３Ｆ７重鎖ＣＤＲ３
配列番号１１：３Ｆ７軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）
配列番号１２：３Ｆ７軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）
配列番号１３：３Ｆ７軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）
配列番号１４：種々の３Ｆ７軽鎖ＣＤＲ３
配列番号１５：３Ｆ７重鎖停止鋳型Ｈ１
配列番号１６：オリゴヌクレオチド変異原性トリマーミックス３Ｆ７  Ｈ１
配列番号１７：３Ｆ７重鎖停止鋳型Ｈ２
配列番号１８：オリゴヌクレオチド変異原性トリマーミックス３Ｆ７  Ｈ２
配列番号１９：３Ｆ７重鎖停止鋳型Ｈ３.１
配列番号２０：オリゴヌクレオチド変異原性トリマーミックス３Ｆ７  Ｈ３.１
配列番号２１：３Ｆ７重鎖停止鋳型Ｈ３.２
配列番号２２：オリゴヌクレオチド変異原性トリマーミックス３Ｆ７  Ｈ３.２
配列番号２３：３Ｆ７軽鎖停止鋳型Ｌ１
配列番号２４：オリゴヌクレオチド変異原性トリマーミックス３Ｆ７  Ｌ１
配列番号２５：３Ｆ７軽鎖停止鋳型Ｌ３.１
配列番号２６：オリゴヌクレオチド変異原性トリマーミックス３Ｆ７  Ｌ３.１
配列番号２７：３Ｆ７軽鎖停止鋳型Ｈ３.２
配列番号２８：オリゴヌクレオチド変異原性トリマーミックス３Ｆ７  Ｌ３.２
配列番号２９：ＶＲ１１９重鎖ＣＤＲ２
配列番号３０：ＶＲ１１２重鎖ＣＤＲ２
配列番号３１：ＶＲ１１５重鎖ＣＤＲ２
配列番号３２：ＶＲ１１０重鎖ＣＤＲ２
配列番号３３：ＶＲ１０７重鎖ＣＤＲ２
配列番号３４：ＶＲ１０８重鎖ＣＤＲ２
配列番号３５：ＶＲ１０３重鎖ＣＤＲ２
配列番号３６：ＶＲ１０１重鎖ＣＤＲ２
配列番号３７：ＶＲ１０９重鎖ＣＤＲ２
配列番号３８：ＶＲ９９重鎖ＣＤＲ２
配列番号３９：ＶＲ１４９重鎖ＣＤＲ３
配列番号４０：ＶＲ１６７重鎖ＣＤＲ３
配列番号４１：ＶＲ１４８重鎖ＣＤＲ３
配列番号４２：ＶＲ１５９重鎖ＣＤＲ３
配列番号４３：ＶＲ１６０重鎖ＣＤＲ３
配列番号４４：ＶＲ２４軽鎖ＣＤＲ１
配列番号４５：ＶＲ０６軽鎖ＣＤＲ１
配列番号４６：ＶＲ１６軽鎖ＣＤＲ１
配列番号４７：ＶＲ０５軽鎖ＣＤＲ１
配列番号４８：ＶＲ１２軽鎖ＣＤＲ１
配列番号４９：ＶＲ１０軽鎖ＣＤＲ１
配列番号５０：ＶＲ１４軽鎖ＣＤＲ１
配列番号５１：ＶＲ１７軽鎖ＣＤＲ１
配列番号５２：ＶＲ３１軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５３：ＶＲ２９軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５４：ＶＲ２７軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５５：ＶＲ３９軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５６：ＶＲ４６軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５７：ＶＲ４１軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５８：ＶＲ３８軽鎖ＣＤＲ３
配列番号５９：ＶＲ５８軽鎖ＣＤＲ３
配列番号６０：ＶＲ６２軽鎖ＣＤＲ３
配列番号６１：ＶＲ５３軽鎖ＣＤＲ３
配列番号６２：ＶＲ５２軽鎖ＣＤＲ３
配列番号６３：ＶＲ６３軽鎖ＣＤＲ３
配列番号６４：配列決定プライマーＣＨ１Ｒｅｖ
配列番号６５：配列決定プライマーｐＬａｃＰＣＲｆｗ
配列番号６６：配列決定プライマーＧｌｌｌｓｔｕｍｐｒｅｖ
配列番号６７：配列決定プライマーＫｐａＣＬｆｗｄ
配列番号６８：配列決定プライマーＬｄａＣＬｆｗｄ
配列番号６９：配列決定プライマーＰＵＣｒｅｖ
配列番号７０：配列決定プライマー３２５４
配列番号７１：配列決定プライマーＳｅｑＣＬｌａｍｂｄａ
配列番号７２：配列決定プライマーＳｅｑＣＨ１
配列番号７３：ＶＲ１１５のｖＨ配列
配列番号７４：ＶＲ１１２のｖＨ配列
配列番号７５：ＶＲ２４のｖＬ配列
配列番号７６：ＶＲ１１０のｖＨ配列
配列番号７７：ＶＲ１１９のｖＨ配列
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の目的は、−ＦＸＩＩａに対して高い阻害活性を示す一方で−出血リスクを増加させず、非免疫原性で、そして長い半減期を有する改良抗体の開発であった。
【００３３】
従って、発明の１つの態様は、ヒト第ＸＩＩ因子に対してよりも、ヒト第ＸＩＩａ因子に対して、好ましくはヒト第ＸＩＩａ−β因子に対して２倍以上高い結合親和性を有し、そしてヒト第ＸＩＩａ因子のアミド分解活性を完全に阻害できる、抗第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００３４】
発明の別の態様は、ヒト第ＸＩＩ因子に対してよりも、ヒト第ＸＩＩａ因子に対して、好ましくはヒト第ＸＩＩａ−β因子に対して２倍以上高い結合親和性を有し、そしてヒト第ＸＩＩａ因子のアミド分解活性を完全に阻害できる、そしてＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａに結合するためにＩｇＧ４として発現される配列番号４及び７５の配列を含んでなる抗体と競合する、抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００３５】
好ましくは抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト第ＸＩＩ因子に対してよりも、ヒト第ＸＩＩａ因子に対して、好ましくはヒト第ＸＩＩａ−β因子に対して、３倍以上、より好ましくは４倍以上、尚より好ましくは５倍以上、６倍以上、８倍以上、１０倍以上、１２倍以上、１４倍以上、１６倍以上、最も好ましくは１８倍以上高い結合親和性を有する。
【００３６】
好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、１００ｎＭ未満、より好ましくは５０ｎＭ未満、尚より好ましくは４０ｎＭ未満、又は尚更に３０ｎＭ未満の濃度で、ＦＸＩＩａのアミド分解活性を完全に阻害する。好ましくは抗体又はその抗原結合フラグメントは、１ｐＭと１００ｎＭ間の濃度で、より好ましくは５ｐＭと５０ｎＭ間の濃度で完全に阻害する。好ましくはＦＸＩＩａのアミド分解活性のアッセイは実施例１（５）に記載のように実施される。
【００３７】
発明の別の態様は、１：０.２の抗体に対するＦＸＩＩａ−αのモル比で使用されるとき、第ＸＩＩａ−α因子を、好ましくはヒト第ＸＩＩａ−α因子を、４０％より大きく、好ましくは５０％より大きく、尚より好ましくは６０％より大きく阻害する、抗第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子モノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントである。あるいは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、１：０.５の抗体に対するＦＸＩＩａ−αのモル比で、第ＸＩＩａ−α因子を、好ましくはヒト第ＸＩＩａ−α因子を、８０％より大きく、好ましくは８５％より大きく、より好ましくは９０％より大きく阻害する；最も好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、１：０.５のモル比でＦＸＩＩａ−αの完全阻害を実現する。好ましくは抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも本明細書に記載の抗体３Ｆ７に少なくとも匹敵するヒトＦＸＩＩａに対する親和性を有する。
【００３８】
好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、マウスＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａを結合する；より好ましくは、（ａ）配列番号２の位置３９８のアスパラギン残基はリジンと置換され；又は（ｂ）配列番号２の位置４３８のイソロイシン残基はアラニンと置換される、配列番号２を含んでなるポリペプチド又はその関連フラグメントへの抗体の結合レベルは、前記置換のない配列番号２を含む対応するポリペプチド又はその関連フラグメントへのタンパク質の結合レベルより低い。配列番号２のポリペプチドの関連フラグメントは触媒中心を含む；例は軽鎖、ＦＸＩＩａ−β、ＦＸＩＩａ−α、又は完全ＦＸＩＩである。
【００３９】
好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４の配列と８５％以上同一の、より好ましくは配列番号４の配列と８８％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、尚より好ましくは９８％、又は更に９９％同一の重鎖可変（ｖＨ）領域を含む。発明の好ましい実施態様は、配列番号４、７３、７４、７６又は７７の配列の重鎖可変領域を含む抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００４０】
好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５の配列と８５％以上同一の、より好ましくは配列番号５の配列と８８％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、尚より好ましくは９８％、又は更に９９％同一の軽鎖可変（ｖＬ）領域を含む。発明の好ましい実施態様は、配列番号５又は７５の配列の軽鎖可変領域を含んでなる抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００４１】
発明の好ましい実施態様は、上記のｖＬ領域と組み合わせた上記のｖＨ領域による抗体又はその抗原結合フラグメントである。下記のｖＨ／ｖＬの組み合わせによる抗体が最も好ましい。
（ａ）配列番号５又は配列番号７５のｖＬ領域と組み合わせた配列番号４のｖＨ領域；
（ｂ）配列番号５又のｖＬ領域と組み合わせた配列番号４、７３、７４、７６又は７７のいずれかのｖＨ領域。
【００４２】
好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６の配列と少なくとも８０％同一の重鎖ＣＤＲ１、好ましくは配列番号６の重鎖ＣＤＲ１、及び／又は配列番号７の配列と少なくとも６０％同一の重鎖ＣＤＲ２、及び／又は配列番号９の配列と少なくとも８０％同一の重鎖ＣＤＲ３を含む。より好ましくは、重鎖ＣＤＲ２は配列ＧＩＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5Ｘ6ＴＶＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８参照）を有し、ここでＸ1はＲ、Ｎ又はＤであり、Ｘ2はＰ、Ｖ、Ｉ又はＭであり、Ｘ3はＳ、Ｐ又はＡであり、Ｘ4はＧ、Ｌ、Ｖ、又はＴであり、Ｘ5はいずれのアミノ酸であってよく、好ましくは、Ｘ5はＧ、Ｙ、Ｑ、Ｋ、Ｒ、Ｎ又はＭであり、そしてＸ6はＴ、Ｇ、又はＳであり、及び／又は重鎖ＣＤＲ３は配列ＡＬＰＲＳＧＹＬＸ1Ｘ2Ｘ3Ｘ4ＹＹＹＹＡＬＤＶ（配列番号１０参照）を有し、ここでＸ1はＩ、Ｍ又はＶであり、Ｘ2はＳ又はＫであり、Ｘ3はＰ、Ｋ、Ｔ又はＨであり、そしてＸ4はＨ、Ｎ、Ｇ、又はＱである。
【００４３】
好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１と少なくとも５０％同一である軽鎖ＣＤＲ１、及び／又は配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は配列ＡＸ1ＷＸ2Ｘ3Ｘ4Ｘ5ＲＸ6Ｘ7(配列番号１４で示される)の軽鎖ＣＤＲ３を含み、ここでＸ1はＡ又はＳであり、Ｘ5はＬ又はＶであり、Ｘ6はＧ、Ｌ、又はＫであり、そしてＸ2、Ｘ3、Ｘ4及びＸ7はいずれのアミノ酸であってよく、好ましくはＸ2はＤ、Ｙ、Ｅ、Ｔ、Ｗ、Ｅ又はＳであり、Ｘ3はＡ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、Ｑ、又はＥであり、Ｘ4はＳ、Ｄ、Ｐ、Ｅ、Ｑ、又はＲであり、そしてＸ7はＶ、Ａ、Ｄ、Ｔ、Ｍ、又はＧである。
【００４４】
発明の好ましい実施態様は、上記の軽鎖ＣＤＲと組み合わせた上記の重鎖ＣＤＲを含む抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００４５】
より好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、表１に示される重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）及び軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）の組み合わせを含み、ここで、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の下部カラムの数字は、それぞれの配列番号である。
【００４６】
【表１】
2014523253.tif 000002
【００４７】
好ましくは、発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト第ＸＩＩａ−β因子を、１０-7Ｍより多い、より好ましくは３ｘ１０-8Ｍより多い、より好ましくは１０-8Ｍより多い、より好ましくは３ｘ１０-9Ｍより多い、最も好ましくは１０-9Ｍ又は更に５ｘ１０-10ＭのＫDで結合する。
【００４８】
好ましくは、発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、インフェスチンと、特にインフェスチン−４とヒト第ＸＩＩａ−β因子への結合に対して競合する。
【００４９】
抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＡ、及びそのいずれものサブタイプを含む、いずれのアイソタイプであってよい。好ましくは、発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ又はその変異体、好ましくはヒトＩｇＧ４又はその変異体である。抗体のタイプを変更する方法は当技術分野で周知である。ｖＨ又はｖＬ領域をコード化する核酸分子は分離され、そして異なるクラスの免疫グロブリン分子の定常領域から、それぞれ異なるｃH又はｃLをコード化する核酸配列に操作可能に連結される。
【００５０】
本開示は、抗体の定常領域を含んでなる本明細書に記載のタンパク質及び／又は抗体を包含する。
【００５１】
本開示のタンパク質を産生するのに有用な定常領域の配列は、多くの異なる供給源から得られ得る。幾つかの例では、タンパク質の定常領域又はその部分はヒト抗体から由来する。定常領域又はその部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含むいずれのタンパク質クラス、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むいずれのアイソタイプから由来されてよい。１つの例では、定常領域はヒトアイソタイプＩｇＧ４又は安定化ＩｇＧ４定常領域である。
【００５２】
１つの例では、定常領域のＦｃ領域は、例えば、ネイティブ又は野生型ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３Ｆｃ領域と比べて、エフェクター機能を誘発する能力の低下を有する。１つの例では、エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）である。タンパク質を含有するＦｃ領域エフェクター機能レベルを評価する方法は、当技術分野において周知である。
【００５３】
１つの例では、Ｆｃ領域はＩｇＧ４Ｆｃ領域（即ちＩｇＧ４定常領域由来）、例えば、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域である。好適なＩｇＧ４Ｆｃ領域の配列は、当業者には明らかであり得て及び／又は公的に入手可能データベースで得られる（例えば、National Center for Biotechnology Informationから入手可能）。
【００５４】
１つの例では、定常領域は安定化ＩｇＧ４定常領域である。用語「安定化ＩｇＧ４定常領域」は、当然のことながら、Ｆａｂアーム交換若しくはＦａｂアーム交換又は半抗体の形成を受ける傾向、又は半抗体を形成する傾向を減少するために修飾されているＩｇＧ４定常領域を意味する。「Ｆａｂアーム交換」は、ＩｇＧ４重鎖及び付着軽鎖（半分子）が別のＩｇＧ４分子からの重鎖−軽鎖ペアと交換される、ヒトＩｇＧ４の１タイプのタンパク質修飾をいう。このように、ＩｇＧ４分子は、２つの別個の抗原を認識する２つの別個のＦａｂアームを獲得し得る（二重特異性分子をもたらす）。Ｆａｂアーム交換は自然にインビボで起こり、そして精製血液細胞又は還元グルタチオンのような還元剤によってインビトロで誘導されることができる。「半抗体」は、ＩｇＧ４抗体が各々単一重鎖及び単一軽鎖を含有する２つの分子を形成するように解離するときに生じる。
【００５５】
１つの例では、安定化ＩｇＧ４定常領域は、Kabat (Kabat et al., 免疫学的に関心のあるタンパク質の配列 Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 and/or 1991)の系により、ヒンジ領域の位置２４１においてプロリンを含む。この位置は、ＥＵ付番方式(Kabat et al., 免疫学的に関心のあるタンパク質の配列Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 and Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 63, 78-85, 1969) により、ヒンジ領域の位置２２８に対応する。ヒトＩｇＧ４では、この残基は一般的にセリンである。セリンのプロリンとの置換に続いて、ＩｇＧ４ヒンジ領域は配列ＣＰＰＣを含む。この点において、当業者には当然のことながら、「ヒンジ領域」は、抗体の２つのＦａｂアームに運動性を与えるＦｃ及びＦａｂ領域を結合する抗体重鎖定常領域のプロリンリッチ部分である。ヒンジ領域は重鎖間ジスルフィド結合に関与するシステイン残基を含む。それは一般的に、Kabatの付番方式によればヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２２６からＰｒｏ２４３まで及ぶと考えられる。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に入れることにより、ＩｇＧ１配列と位置合わせされ得る（例えばＷＯ２０１０／０８０５３８を参照されたい）。
【００５６】
安定化ＩｇＧ４抗体の更なる例は、ヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域中の位置４０９（ＥＵ付番方式による）のアルギニンが、リジン、トレオニン、メチオニン、又はロイシンと置換される（例えば、ＷＯ２００６／０３３３８６に記載される）抗体である定常領域のＦｃ領域は、加えて又は代わりに４０５（ＥＵ付番方式による）に対応する位置でアラニン、バリン、グリシン、イソロイシン及びロイシンから成る群から選択される残基を含む。選択的に、ヒンジ領域は位置２４１にプロリンを含む（即ち、ＣＰＰＣ配列）（上記のように）。
【００５７】
別の例では、Ｆｃ領域は、エフェクター機能を低下させているように修飾された領域、即ち「非免疫賦活Ｆｃ領域」である。例えば、Ｆｃ領域は、２６８、３０９、３３０及び３３１から成る群から選択される１つ又はそれ以上の位置における置換を含んでなる、ＩｇＧ１のＦｃ領域である。別の例では、Ｆｃ領域は、１つ又はそれ以上の下記の変化Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ及びＧ２３６の欠失及び／又は１つ又はそれ以上の下記の変化Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓを含んでなる、ＩｇＧ１のＦｃ領域である (Armour et al., Eur J Immunol. 29:2613-2624, 1999; Shields et al., J Biol Chem. 276(9):6591-604, 2001)。非免疫賦活Ｆｃ領域の更なる例は、例えば、Dall'Acqua et al., J Immunol. 177: 1129-1138, 2006; and/or Hezareh J Virol ;75: 12161-12168, 2001)に記載される。
【００５８】
別の例では、Ｆｃ領域は、例えば、ＩｇＧ４抗体からの少なくとも１つのＣH２ドメイン及びＩｇＧ１抗体からの少なくとも１つのＣH３ドメインを含んでなるキメラＦｃ領域であり、ここでＦｃ領域は、２４０、２６２、２６４、２６６、２９７、２９９、３０７、３０９、３２３、３９９、４０９及び４２７（ＥＵ付番）から成る群から選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸位置における置換を含む（例えば、ＷＯ２０１０／０８５６８２に記載）。例示的置換は、２４０Ｆ、２６２Ｌ、２６４Ｔ、２６６Ｆ、２９７Ｑ、２９９Ａ、２９９Ｋ、３０７Ｐ、３０９Ｋ、３０９Ｍ、３０９Ｐ、３２３Ｆ、３９９Ｓ、及び４２７Ｆを含む。
【００５９】
本開示はまた抗体の更なる修飾を考慮する。
【００６０】
例えば、抗体はタンパク質の半減期を増加させる１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、抗体は、新生児のＦｃ領域（ＦｃＲｎ）に対するＦｃ領域の親和性を増加させる１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでなるＦｃ領域を含む。例えば、Ｆｃ領域は、エンドソームにおけるＦｃ／ＦｃＲｎ結合を容易にするために、より低いｐＨ、例えば、約ｐＨ６.０でＦｃＲｎへの親和性を増加させている。１つの例では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ（及びそれ故Ｆｃ領域包含分子）の細胞リサイクルに続く血液への放出を容易にする約ｐＨ７.４でのその親和性と比べて、約ｐＨ６でＦｃＲｎに対する親和性を増加させている。これらのアミノ酸置換は、血液からのクリアランスを減少させることにより、タンパク質の半減期を延長するのに有用である。
【００６１】
例示的アミノ酸置換は、ＥＵ付番方式により、Ｔ２５０Ｑ及び／又はＭ４２８Ｌ又はＴ２５２Ａ、Ｔ２５４Ｓ及びＴ２６６Ｆ又はＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ又はＨ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆを含む。更なる又は代わりのアミノ酸置換は、例えば、ＵＳ２００７０１３５６２０又はＵＳ７０８３７８４に記載される。
【００６２】
より好ましくは、発明の抗体は、ヒト血清中で抗体の半減期増加をもたらす、より低いｐＨ、例えば約ｐＨ６でヒト新生児のＦｃ受容体ＦｃＲｎへの結合増強のために改変されたヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４である。ＦｃＲｎ結合を最適化するための最適Ｆｃ変異体をスクリーニングする方法が記載されている（例えばZalevsky et al (2010) Nature Biotech 28, 157-159）。
【００６３】
発明の他の好ましい抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＡ、及びそのいずれものサブタイプなどの哺乳動物のアアイソタイプの定常領域などの、哺乳動物の免疫グロブリン定常領域を含む。好ましくは、抗体は、マウスＩｇＧ、ブタＩｇＧ、雌牛ＩｇＧ、ウマＩｇＧ、ネコＩｇＧ、イヌＩｇＧ及び霊長類ＩｇＧ又はその変異体、を含む哺乳動物ＩｇＧである。これらの抗体はキメラ抗体であってもよく、ここでは発明のヒト可変領域は選択種の免疫グロブリンの定常領域と組み合わされる。あるいは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、本明細書に記載のヒトＣＤＲ領域を選択種の免疫グロブリンからの骨格残基に移植することによって生産され得る。
【００６４】
好ましくは、発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、それらの成熟形態、即ちシグナルペプチドなしである；しかしながら、シグナルペプチドを含む抗体又はその抗原結合フラグメントもまた発明に含まれる。
【００６５】
抗原結合フラグメントは、ＦＸＩＩａを結合する能力を維持する発明の抗体のいずれのフラグメントであってよい。好ましい抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体、単鎖Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質、又は単鎖Ｆｖフラグメントの二量体である。発明に含まれる抗体はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体、マウス化抗体又は二重特異性抗体である。これらのフラグメント及び抗体を生産する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Harlow & Lane: 抗体、実験マニュアル, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい）。
【００６６】
発明の抗体の抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質又はファージ粒子も、発明に含まれる。抗原結合フラグメントは、例えば、ヒト血清アルブミン又はその変異体と融合され得る。当業者は抗原結合フラグメントに対する融合パートナーとして使用されることができる他のタンパク質をよく知っているであろう。抗体又はその抗原結合フラグメントはまた、ヘキサヒスチジンタグのようなタグにも融合され得る。タグは、それが必要なときに抗体又はその抗原結合フラグメントから除去できるように、切断可能リンカーペプチドを備えられ得る。
【００６７】
発明の別の態様は、発明の抗体、又はその抗原結合フラグメントをコード化する核酸である。好ましくは、核酸はまた、シグナルペプチドをコード化する領域を含み、好ましくは、核酸は重鎖のシグナルペプチドをコード化する領域、及び軽鎖のシグナルペプチドをコード化する領域を含む。
【００６８】
発明によって提供されるポリペプチドをコード化する核酸分子は、提供アミノ酸配列、遺伝コード及び公的データベースで利用可能な配列を用いて、当業者によって容易に生産できる。また、多様な機能的に等価の核酸は容易に生産でき、そしてそれ故また本発明に含まれる。核酸分子は、いずれの好適な方法によって、例えば直接化学合成によって製造できる。ＤＮＡを調製する方法は当技術分野で周知である。
【００６９】
発明の尚別の態様は、発現レベルを増加させるためのエンハンサーエレメントのような更なる調節エレメントを含み得る、適したプロモーター配列に操作可能に連結され又は好適な発現カセットに組み込まれる、発明の抗体、又はその抗原結合フラグメントをコード化する核酸を含むベクターである。好ましくは強いプロモーターが使用される。大腸菌に発現のために、Ｔ７、ｌａｃ、ｔｒｐ又はラムダプロモーターのようなプロモーターが、好ましくはリボソーム結合部位及び転写終結シグナルと併せて使用され得る。哺乳動物細胞では、ＳＶ４０、ＣＭＶ又は免疫グロブリンプロモーターは、高発現レベルをもたらすように使用できる。好ましくは、ベクターは哺乳動物細胞発現ベクター、より好ましくはLonza's GSシステム（商標）又はSelexis Genetic Elements（商標）システムから選択されるベクターである。好ましくは、ベクターはまた、ｇｐｔ、ｎｅｏ、ａｍｐ又はｈｙｇ遺伝子などの選択可能なマーカー配列、及びグルタミンシンテターゼ又はＤＨＦＲのような遺伝子増幅系を含有する。別の好ましいベクターは、酵母発現ベクター、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓで最適化された発現ベクターである。ベクターはまた、ウイルスベクター、例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、又はレトロウイルスに基づくベクターであってもよい。ベクターはまた昆虫細胞に発現用のバキュロウイルスであってもよい。
【００７０】
発明の更なる態様は発明のベクターを含む細胞株又は酵母細胞である。好ましくは、細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、又はＮＳ０のような骨髄腫細胞株などの哺乳動物細胞株である。別の実施態様は、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、又はHighFive(商標)細胞などのバキュロウイルスと共に使用するための昆虫細胞である。尚別の細胞は、サッカロミセス属、例えばＳ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、又はＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母細胞である。大腸菌のような細菌宿主細胞もまた可能である。それぞれの宿主細胞にＤＮＡを導入する方法は当技術分野において周知である。例えば、宿主細胞が哺乳動物細胞株であるとき、リポフェクション又はエレクトロポレーションなどの技術が使用され得る。
【００７１】
発明の別の態様は、発明の細胞株又は酵母細胞のような宿主細胞を、抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させるのに適切な条件下に培養することを含む、発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法である。その抗原結合フラグメントの抗体は次いで精製され得る。好ましくは、抗体又はその抗原結合フラグメントは宿主細胞によって分泌され、そして次いで培養上清から容易に精製できる。抗体を精製する技術は当技術分野において周知であり、そして硫酸アンモニウム沈殿、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの技術を含む。
【００７２】
大腸菌に発現されるとき、抗体又はその抗原結合フラグメントは封入体中で産生され得る。封入体を分離し及び発現タンパク質をリフォールディングする方法は当技術分野において周知である。
【００７３】
発明の尚別の態様は、医療用の発明の抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００７４】
発明の更なる態様は、ヒト及び動物対象における血栓の形成及び／又は安定化の予防に使用するための抗体又はその抗原結合フラグメントである。３次元の管腔内血栓成長は低減され又は更に予防される。このように、発明のこの態様は、静脈、動脈又は毛細血管血栓形成、心臓における血栓形成、人工表面とヒト又は動物対象の血液を接触中及び／又は後の血栓形成及び血栓塞栓症から成る群から選択される障害の予防及び処置において、血栓の形成及び／又は安定化及びそれによる３次元の管腔内血栓成長を予防し及び／又は処置することによって、用いる抗体又はその抗原結合フラグメントに関する。発明の尚別の態様は、静脈、動脈又は毛細血管血栓形成、心臓における血栓形成、人工表面とヒト又は動物対象の血液を接触中及び／又は後の血栓形成又は血栓塞栓症から成る群から選択される障害に関連する、ヒト又は動物対象における管腔内血栓の処置に用いる抗体又はその抗原結合フラグメントである。好ましくは、静脈又は動脈血栓形成は、脳卒中、心筋梗塞、深部静脈血栓症、門脈血栓症、血栓塞栓症、腎静脈血栓症、頚静脈血栓症、脳静脈洞血栓症、バッド・キアリ（Ｂｕｄｄ−Ｃｈｉａｒｉ）症候群又はパジェット・シュレッター（Ｐａｇｅｔ−Ｓｃｈｒｏｅｔｔｅｒ）病である。
【００７５】
発明の更なる態様は、炎症、神経系炎症性疾患、間質性肺炎、補体活性化、線維素溶解、血管新生及びＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ誘導キニン形成又はＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ仲介補体活性化に関連する疾患の予防及び／又は処置に用いる抗体又はその抗原結合フラグメントである。好ましくは、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ誘導キニン形成に関連する疾患は、遺伝性血管浮腫、肺の細菌感染症、トリパノソーマ感染症、低血圧ショック、膵臓炎、シャーガス病、関節性痛風、関節炎、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）及び敗血症の群から選択される。
【００７６】
好ましくは、間質性肺疾患は線維増殖性及び／又は特発性肺線維症である。
【００７７】
発明の態様はまた、抗体又はその抗原結合フラグメントの治療的有効量を、それを必要とする対象に投与することによる、対象の上記病態又は疾患のいずれもの処置方法である。
【００７８】
種々の病態における抗体又はその抗原結合フラグメントの有益な効果は、例えば、好適な動物モデル、例えばマウスモデルを用いることによって検証できる。抗体又はその抗原結合フラグメントで処置した動物と対照群の比較により、抗体による各疾患の処置の有益な効果は実証できる。あるいは、患者血漿サンプルについて、関連パラメータを試験できる。例えば、遺伝性血管浮腫患者における疾患関連症候群を処置又は防止するのに有益な効果は、例えばHan et al (2002) J. Clin. Invest. 109:1057-1063に記載のように、マウスモデルを用いることによって試験できる。患者血漿サンプルを用いたインビトロ試験もまた想定できる；処置又は非処置の患者血漿サンプルはブラジキニン及び／又は高分子量キニノーゲンレベルで比較され得る。抗体はブラジキニン生成を低減し、及び／又は高分子量キニノーゲンレベルの減少を防止しよう。
【００７９】
好ましくは、血栓形成は上記ヒト又は動物対象で行われる医療処置中及び／又は後に、人工表面とヒト又は動物対象の血液を接触中及び／又は後に起こり、そして前記抗体又はその抗原結合フラグメントは上記医療処置前及び／又は中及び／又は後に投与され、そして更にここで、
（ｉ）人工表面は対象の少なくとも８０％の血液量に曝露され、そして人工表面は少なくとも０.２ｍ2であり又は
（ｉｉ）人工表面は対象の体外での採血容器であり又は
（ｉｉｉ）人工表面は、ステント、弁、管腔内カテーテル、又は体内血液ポンプ支援システムである。
【００８０】
好ましくは、前記ヒト又は動物対象の出血リスクは、
（ｉ）増加せず；及び／又は
（ｉｉ）下記によって測定される。
ａ）Dukeによる耳又は指先出血時間を介して、そしてここで該耳又は指先出血時間は１０分より長くなく又は
ｂ）Ivyの方法により、そしてここで出血時間は１０分より長くなく又は
ｃ）Markの方法により、そして出血時間は４分より長くない。
【００８１】
医療処置は、
ｉ）心肺バイパスを必要とするいかなる処置又は
ｉｉ）体外膜型酸素化を介する血液酸素化又は
ｉｉｉ）内部支援血液ポンプ又は
ｉｖ）血液透析又は
ｖ）血液体外濾過又は
ｖｉ）動物又はヒト対象で後期使用のためのいかなるリポジトリへの採血又は
ｖｉｉ）１つ又は複数の管腔内カテーテルの使用又は
ｖｉｉｉ）１つ又は複数のステントの使用又は
ｉｘ）１つ又は複数の人工心臓弁の使用
であってよい。
【００８２】
発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、心肺バイパスを必要とする医療処置、又は動物若しくはヒト対象で後期使用のためのいずれものリポジトリへの採血を含む医療処置の前、後及び／又は中に投与され得る。それはまた人工表面にコーティングされることにより投与され得る。医療処置が供血にかかわる場合、従って抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下のようにされ得る
ｉ）供血過程前及び／又は中に供血者に投与又は
ｉｉ）採血リポジトリ中の血液と混合又は
ｉｉｉ）血液がヒト又は動物受血者に投与される前、中、及び／又は後に受血者に投与する。
【００８３】
好ましくは、医療処置の前及び／又は中及び／又は後に抗体又はその抗原結合フラグメント以外に加えられる、ヘパリン又はその誘導体及び／又はヒルジン又はその誘導体の量は、前記抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体又はその抗原結合フラグメントが投与されないとき、上記医療処置の前及び／又は中に通常投与されるヘパリン又はその誘導体及び／又はヒルジン又はその誘導体の量と比べて、低減され又は更に完全に削除される。
【００８４】
好ましくは、ヘパリン又はその誘導体の術後アンタゴニズム及び／又はヒルジン又はその誘導体の術後アンタゴニズムに続くプロトロンビンリスクは、防止され又は低減される；プロトロンビンリスクはまたプロタミンの投与によって引き起こされ得る。
【００８５】
発明の更なる態様は、ポンプヘッド症候群の予防又は処置のための発明の抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００８６】
発明の尚更なる態様は、発明の抗体又はその抗原結合フラグメントでコーティングされた医療デバイスであり、ここでデバイスは心肺バイパス装置、血液酸素化用体外膜型酸素化システム、血液ポンプ支援デバイス、血液透析デバイス、血液の体外濾過デバイス、採血で用いるリポジトリ、管腔内カテーテル、ステント、人工心臓弁、及び／又はチュービング、カニューレ、遠心ポンプ、弁、ポート、及び／又はダイバータを含む上記デバイスのいずれか１つのための付属品である。
【００８７】
発明の別の態様は、医療処置を受ける患者へ投与のために用いる抗体又はその抗原結合フラグメントであって、ここで医療処置は：
（ａ）心臓、
（ｂ）大動脈、大動脈弓、頚動脈、冠動脈、腕頭動脈、椎骨脳底動脈循環、頭蓋内動脈、腎動脈、肝動脈、腸間膜動脈、及び／又は心臓への頭蓋の動脈系の血管から選択される少なくとも１つの血管、
（ｃ）患者が既知の中隔欠損を有する場合の静脈血管；
の少なくとも１つとの接触を含み、
そしてここで医療処置は、少なくとも１つの標的臓器に虚血をもたらし得る体内の少なくとも１つの上記血管中の少なくとも１つの塞栓の解放、及び医療処置の前、中、及び／又は後の抗体又はその抗原結合フラグメントの投与を含む。
【００８８】
血栓は気泡、オイル、脂肪、コレステロール、凝固血液、及び／又はデブリから構成され得る。
【００８９】
標的臓器は：
（ａ）脳、及びここで患者は、下記を有し、有していて、又はそのリスクがあり：
（ｉ）無症状性脳虚血又は
（ｉｉ）非血栓溶解性物質に起因する脳卒中；及び／又は
（ｂ）心臓、腎臓、肝臓；及び／又は胃腸管臓器：であってよい。
【００９０】
好ましくは、医療処置は、少なくとも１つ又はそれ以上の前記血管の内部との接触又は遮断を含む。
【００９１】
好ましくは、医療処置は、いずれか１つ又はそれ以上のカテーテル、ステント、バルーン、グラフト、及び／又は造影剤を投与することを含む血管処置である。
【００９２】
好ましくは、医療処置は血管外科であり及び／又は診断的な血管処置である。より好ましくは、医療処置は、冠動脈造影、頚動脈ステント留置術、経皮的冠動脈インターベンション、頚動脈内膜剥離術、心臓血管外科、又は狭窄腎動脈拡張術である。
【００９３】
発明の別の態様は、血管透過性増加、特に、進行性網膜症、視力を脅かす網膜症の合併症、黄斑浮腫、非増殖性網膜症、増殖性網膜症、網膜浮腫、糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症、及び網膜外傷を含む、網膜血管透過性亢進に関連する病態の予防又は処置で用いる抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００９４】
発明の別の態様は、発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物である。抗体又はその抗原結合フラグメントは、医薬組成物を製造する公知の方法により製剤化できる。例えば、それは１つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤又は医薬品添加剤と混合できる。例えば、滅菌水又は生理食塩水が使用され得る。ｐＨ緩衝溶液、粘度低減剤、又は安定化剤などの他の物質も含まれてよい。
【００９５】
多種多様の薬学的に許容される医薬品添加剤及び担体が当技術分野で公知である。そのような医薬担体及び医薬品添加剤並びに好適な医薬製剤は、種々の刊行物（例えば「ペプチド及びタンパク質の医薬製剤開発」, Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) 又は「医薬品添加剤便覧」, 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000) A. Gennaro (2000) 「Remington: 薬剤学の科学及び実際」, 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; 薬剤剤形及びドラッグデリバリーシステム(1999) H. C. Ansel et
al., eds 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; 及び医薬品添加剤便覧(2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assocを参照されたい）に十分記載されている。特に、発明の抗体を含む医薬組成物は、凍結乾燥又は安定な可溶性形態で製剤化できる。ポリペプチドは、当技術分野で公知の種々の手順によって凍結乾燥され得る。凍結乾燥製剤は、注射用滅菌水又は滅菌生理食塩水溶液などの１つ又はそれ以上の薬学的に許容される賦形剤の添加による、使用に先立って再構成される。
【００９６】
発明の医薬組成物は、薬用量でそして当技術分野で周知の技術によって投与できる。投与の量及びタイミングは、所望の目的を実現するために処置医又は獣医によって決定され得る。投与経路は安全で治療的に有効な用量を治療しようとする対象の血液に送達するいずれの経路であってよい。可能な投与経路は、全身、局所、経腸及び静脈内、動脈内、皮下、皮内、腹腔内、経口、経粘膜、硬膜外、又は髄腔内などの非経口経路を含む。
【００９７】
有効な薬用量及び投与経路は、対象の年齢及び体重などの要因によって、そして抗体又はその抗原結合フラグメントの性質及び治療範囲によって決定される。薬用量の決定は公知方法によって測定され、過度の実験は必要ではない。
【００９８】
治療上有効な投与量は、処置を必要とする患者又は対象にプラスの治療効果をもたらす発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの用量である。治療上有効な投与量は、約０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ、約１〜５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜２ｍｇ／ｋｇ又は約０．１〜１ｍｇ／ｋｇの範囲内である。処置は単一用量又は複数用量を与えることを含んでよい。複数用量が必要な場合、それらは、毎日、１日おきに、毎週、隔週、毎月、隔月又は必要に応じて投与され得る。抗体又はその抗原結合フラグメントを緩徐又は持続放出する保管場所（depository）もまた使用され得る。治療上有効な投与量は、対象のＦＸＩＩａを、少なくとも５０％だけ、好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９９％又は更に１００％だけ阻害する用量であってよい。
【００９９】
発明の更なる態様は、上記の抗体（又はその抗原結合フラグメント）の親和性成熟抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【０１００】
定義
特に明示しない限り、すべての用語は慣用的な用法に従って使用される。
【０１０１】
最も広い意味での「抗体」は、抗原上のエピトープを特異的に認識する免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである。抗体は通常２つの同一重鎖及び２つの同一軽鎖から構成され、その各々はそのＮ末端に可変領域（ｖH及びｖL領域）を有する。通常ｖＨ及びｖＬ領域は抗原結合部位を形成するために組み合わせ得る。しかしながら、ただ１つの可変領域が存在しそして抗原に結合する場合の、単一ドメイン抗体もまた記載されている。
【０１０２】
通常、抗体は、ジスルフィド結合によって連結された２つの重鎖及び２つの軽鎖を含有する。５つの主要アイソタイプの抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ）があり、そのうちの幾つかは基本抗体構造の多量体として生じる。アイソタイプは重鎖の定常領域によって決定される。２つのタイプの軽鎖、λとκが存在する。
【０１０３】
本明細書で使用される用語「抗体」は、完全抗体（intact body）、並びに抗原結合を保持する変異体及びその部分を含む。これは、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント、又はジスルフィド安定化Ｆｖフラグメントなどの抗体のフラグメントを含む。このように、本文書中の用語「抗体又はその抗原結合フラグメント」はただ予備的であり、用語「抗体」単独は、既に抗体又はその抗原結合フラグメントをカバーすることを目的としている。
【０１０４】
各重鎖及び軽鎖は可変領域及び定常領域から成る。可変領域は、相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれるフレークワーク残基及び超可変領域を含有する。フレークワーク残基及び超可変領域の範囲はKabatによって決定される; Kabatデータベースはオンラインで入手可能である (Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C (1991)  免疫学的に興味のあるタンパク質の配列, 5th edn. U.S. Department of Health and Human services, NIH, Bethesda, MD)。ＣＤＲ領域はエピトープへの結合に重要であり、それ故抗体の特異性を決定する。
【０１０５】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、又は単一抗体を発現するように改変される細胞株によって産生される抗体である。
【０１０６】
「キメラ抗体」は、異なる種から定常領域へ移植された１つの種からの可変領域をもつ抗体である。「ヒト化」抗体は、異なる種からのＣＤＲ領域、例えばマウスモノクローナル抗体がヒト抗体のフレームワークに移植される場合の抗体である。同じように、「マウス化」抗体は、異なる種からのＣＤＲ領域、例えばヒトモノクローナル抗体がマウス抗体のフレームワークに移植される場合の抗体である。ヒト抗体は、全体としてヒトから由来する抗体、即ちヒトフレームワーク中のヒトＣＤＲ及びヒトへの投与に好適ないずれもの定常領域である。
【０１０７】
「生殖細胞系列化」抗体は、フレームワーク残基に変化をもたらした体細胞変異がゲノム中に存在する元の配列に逆転される場合の抗体である。
【０１０８】
「抗原結合フラグメント」は、抗体が結合する抗原のエピトープを特異的に結合する能力を保持する抗体のいずれかのフラグメントをいう。これらは限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、又は単鎖Ｆｖフラグメントを含む。
【０１０９】
「結合親和性」はその抗原への抗体の親和性をいう。それは、種々の技術、例えば表面プラズモン共鳴ベーステクノロジー（BiaCore）によって測定されることができる。
【０１１０】
「エピトープ」は抗原決定基であり、それは抗体が抗原上に接触させる残基又は特定の化学構造によって規定される。
【０１１１】
「配列同一性」はアミノ酸配列の類似性に関する。２つの配列の最も可能なアラインメントが作製され、そして配列同一性は同一残基の百分率によって決定される。標準方法は、配列のアラインメントで、例えば、Needleman and Wunsch (J Mol Biol (1970) 48, 443), Smith and Waterman (Adv Appl Math (1981) 2, 482), Pearson and Lipman (Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85, 2444)のアルゴリズム、及びその他で使用可能である。好適なソフトウェア、例えばＧＣＧソフトウェア一式(Devereux et al (1984), Nucl Acids
Res 12, 387)が市販され、ここではアラインメントは、例えば、デフォルトパラメータを備えたＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴ、又はその後継を用いて作成できる。Altschul et al
(J. Mol. Biol. (1990) 215, 403)による原記載である、しかしギャップドアラインメント(Blast 2)を含むように更にリファインされた、EBI, NCBIなどの種々の情報源から入手可能なBlastアルゴリズムはまた、アラインメントを作成し得てそして２つの配列間の％同一性を算出し得る。
【０１１２】
「特異的結合」は、実質的に単一の抗原だけに結合することをいう。
【０１１３】
「ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ」は、第ＸＩＩ因子及び活性化第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）の一方又は両方をいう。このように、「ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ阻害剤」はＦＸＩＩ及びＦＸＩＩａの一方又は両方の阻害剤を含む。更に、抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ抗体は、ＦＸＩＩ及びＦＸＩＩａの一方又は両方に結合しそして阻害する抗体を含む。
【０１１４】
「インフェスチン」は、シャーガス病を引き起こすことが知られる寄生虫、クルーズトリパノソーマの主要媒介昆虫として、吸血性昆虫Ｔｒｉａｔｏｍａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓの中腸から由来するセリンプロテアーゼ阻害剤のクラスである (Campos ITN et al. 32 Insect Biochem. Mol. Bio. 991-997, 2002; Campos ITN et al. 577 FEBS Lett. 512-516, 2004)。この昆虫は、摂取した血液の凝固を阻止するためにこの阻害剤を使用する。インフェスチン遺伝子は、凝固経路において種々の因子を阻止することができるタンパク質をもたらす４ドメインをコード化する。特に、ドメイン４はＦＸＩＩａの強い阻害剤であるタンパク質(インフェスチン−４)をコード化する。インフェスチン−４は出血性合併症のないマウスに投与されている（ＷＯ２００８／０９８７２０）。インフェスチン−４はヒト血清アルブミンに結合されている（ｒＨＡ−インフェスチン−４）。
【０１１５】
「ＦＸＩＩａのアミド分解活性の完全阻害」は、いかなる阻害剤の存在なしでの対照実験で認められる活性の、８０％又はそれ以上の、好ましくは９０％又はそれ以上の、より好ましくは９５％又はそれ以上の阻害を意味する。「第ＸＩＩａ因子の活性」は、ＦＸＩＩａ−α及びＦＸＩＩａ−βなどの第ＸＩＩａ因子の全形態の活性を含む。
【０１１６】
用語「処置」又は「処置すること」又は「治療法」は広く解釈される予定で；対象又は患者におけるいずれの疾患関連症状の又は関連バイオマーカーレベルの改善が含まれ得る。
【実施例】
【０１１７】
下記の実施例は、発明のある実施態様を説明するが、しかし発明を例示されている実施態様に限定することを目的とするものではない。使用された技術は当業者に周知の標準実験手順に基づくものであり、そして標準実験マニュアルに記載されている。
【０１１８】
目的
ヒトＦＸＩＩａのアミド分解活性を効果的に阻害できる、ＤＹＡＸのＦａｂ−ベースファージディスプレイライブラリーから完全ヒト抗体を分離すること。
【０１１９】
材料
ｒＨＡ−インフェスチン−４（ＦＸＩＩａアミド分解活性の阻害剤）は、Drs. Thomas Weimer, Holger Lind, and Stefan Schmidbauer (CSL Behring)によって提供された。ヒトＦＸＩＩ、ＦＸＩＩａ、及びＦＸＩＩａ−βはEnzyme Research Laboratories (supplied by Banksia Scientific, Qld, Australia)から購入した。発色基質Ｓ−２３０３はChromogenix (supplied by Abacus ALS) 製であった。スルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン及びＴＭＢ基質溶液はPierce製であった。酵素及びＭ１３−ＫＯ７ヘルパーファージはNew England Biolabs製であった。MaxisorpイムノプレートはNunc製であった。Dynabeads M-280 ストレプトアビジンはInvitrogen Corp製であった。Twin tecスカーテッド９６ウェルＰＣＲプレートはEppendorf製であった。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼはScientifix製であった。ExoSAP-ItはGE Healthcareから提供された。BigDyeターミネーター配列決定キットはApplied Biosystems製であった。抗ヒトＦＸＩＩ抗体（ＯＴ−２）はSanquin (Amsterdam, Netherlands)製であった。
【０１２０】
〔実施例１〕ファージディスプレイ選択
１）ファージパンニング法
ヒトＦａｂベースファージディスプレイライブラリー(Dyax Corp. Cambridge, MA)を用いて、ビオチニル化ＦＸＩＩａ−βをスクリーニングした。各選択ラウンドを開始するのに先立って、抗体ライブラリーを、ＰＢＳ中５００μＬの４％ミルクと室温（ＲＴ）で１時間プレインキュベートした。１００μＬアリコートのＭ２８０ストレプトアビジンビーズを３μｇのビオチニル化ＦＸＩＩａ−βで４℃にて一夜コーティングし、その後ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）中で３回、そしてKingFisher磁粉処理器(Thermo Fisher Scientific)を用いてＰＢＳ中で１回洗浄した。ビーズをDynal磁性粒子分離機（ＭＰＳ）(Invitrogen Corp.)を用いて集め、ＰＢＳ中１ｍＬの２％ミルクで再懸濁し、そしてＲＴで１時間転倒した。ブロックビーズはＭＰＳを用いて集め、そしてラウンド１は、５．５ｘ１０12コロニー形成単位（ｃｆｕ）のファージを１ｍＬの全容積中固定化ＦＸＩＩａ−βとインキュベートすることによって、ＲＴで２０分間行った。インキュベーション後ビーズを集めて、そしてKingfisherを用いてＰＢＳＴで１０回洗浄し、続いてＰＢＳ中で２回手動洗浄した。最後に、ビーズを５００μＬＰＢＳ中で再懸濁しそしてラウンド１の生産量（トータルで凡そ０．５ｘ１０8ｃｆｕ）と命名した。ラウンド１の生産量ファージは、次いで６ｍｌのＴＧ１培養液を半分（２５０μＬ）のビーズと３７℃において２５０ｒｐｍで振盪して３０分間感染することにより増幅した。１ｍＬの感染培養液を除去して４℃で保存し、そして２．５ｘ１０10ｐｆｕのＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを残りの５ｍＬの培養液に加え、続いて振盪せずに３７℃において更なるインキュベーションを行った。増幅は３０ｍＬの２ｘＹＴ培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシン含有）の添加及び３０℃のインキュベーションによって完了させた。増幅後、細菌ペレットは４０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によって回収し、そしてファージは１：５容積のＮａＣｌ−ＰＥＧ溶液（２０％ＰＥＧ８０００、２．５ＭＮａＣｌ）の添加及び６０分間氷上でインキュベーション後に得られた培地から沈殿させた。沈殿物は１ｍＬＰＢＳで再懸濁し、細菌デブリはベンチトップ遠心機を用いて８０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより除き、そしてファージは再び上記のように沈殿させた。最終のファージペレットはＰＢＳ中１ｍＬの全量で再懸濁し、そして次のラウンドの選択のために投入量として使用するように力価決定した。 ラウンド２及び３はラウンド１で記載のように実施した。ラウンド３に続いて、クローンのパイロット規模選択を、そしてＦＸＩＩａ−βへの結合のための予備解析をＥＬＩＳＡによって行った。
【０１２１】
２）ラウンド３のファージディスプレイ選択からのクローンのパイロット規模選別及びＥＬＩＳＡ解析
ラウンド３生産量クローンの予備スクリーニングはＦａｂファージＥＬＩＳＡによって行われた。コロニーは選別し、そして２％グルコース及び１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１２０μＬの２ｘＹＴ培地へ植菌した。これらは３７℃において２５０ｒｐｍで振盪(Infors Supershaker) し、そして「マスタープレート」と命名した。これらの培養液を使用して深いウェルプレート中に１００μＬの２ｘＹＴ／１００μｇ／ｍＬアンピシリンを植菌し、そしてプレートを３７℃において７００ｒｐｍで凡そ０．５のＯＤ６００までインキュベートした。次いで１００μＬのヘルパーファージを０．５ｘ１０10ｐｆｕの最終濃度まで加え、そしてプレートを振盪せずに３７℃で３０分間インキュベートした。２ｘＹＴ  培地（１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシン含有）をレスキュー培養液に加えて、２５μｇ／ｍＬのカナマイシンの最終濃度をもたらし、続いて振盪（６５０ｒｐｍ）しながら３０℃で一夜インキュベーションした。得られた培養液は３０分間６００ｇでスピンし、そして上清をファージＥＬＩＳＡに使用した。
【０１２２】
Ｆａｂ−ファージＥＬＩＳＡのために、Nuncイムノプレートを、１μｇ／ｍＬのＰＢＳ中ＦＸＩＩａの１００μＬ／ウェルで４℃において一夜コーティングした。ＰＢＳ単独でコーティングした陰性対照ウェルもまた含めた。次いでウェルを２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴにより３７℃において２時間ブロックし、そしてＰＢＳＴ中で３ｘ洗浄した。５０μＬの１％スキムミルク／ＰＢＳＴ及び５０μＬのファージ培養上清を各ウェルに加えて、そしてプレートを振盪しながら室温で２時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳＴで５回手動洗浄し、そして１％ミルク／ＰＢＳＴで１／５０００に希釈した１００μＬの抗Ｍ１３ｍＡｂを各ウェルに加えて、続いて振盪しながらＲＴで３０分間インキュベーションした。次いでプレートを前述のように洗浄し、そして１００μＬのＴＭＢ基質を各ウェルに加え、次いでプレートを振盪しながらＲＴで１０分間インキュベートした。反応を５０μＬの２Ｍリン酸の添加によって停止し、そして４５０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダ(Wallac Victor)で読み取った。１２クローンがシングルウェルＥＬＩＳＡにおいて陽性発現し、そして競合ＥＬＩＳＡで更に試験した。
【０１２３】
３）ラウンド３の選択からのクローンの解析：競合ファージＥＬＩＳＡ
シングルウェルＦａｂファージＥＬＩＳＡでＦＸＩＩａに反応性を認めた１２クローンを、更に競合ＥＬＩＳＡにおいてＦＸＩＩａへの反応性を試験した。簡潔には、培養上清（前項を参照）のファージタイターを先ずタイトレーションＥＬＩＳＡを用いて決定した。タイトレーションＥＬＩＳＡのために、Nuncイムノプレートを、４℃において１μｇ／ｍＬのＰＢＳ中ＦＸＩＩａの１００μＬ／ウェルで一夜コーティングした。ＰＢＳ単独でコーティングした陰性対照ウェルをも含めた。次いでウェルを２００μＬの５％スキムミルク／ＰＢＳＴにより３７℃において２時間ブロックし、そしてＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３ｘ洗浄した。５０μＬのファージ上清を１％スキムミルク／ＰＢＳＴで４倍直列に希釈して、そして各希釈の１００μＬをブロックプレートに加えた。振盪しながらＲＴで１.５ｈｒインキュベーション後、次いでプレートをＰＢＳＴで５回手動洗浄し、そしてＥＬＩＳＡプロトコールの残りは本質的に前項に記載のように続けた。データはＳ字曲線当てはめによりKaleidaGraphソフトウェアを用いてプロットし、そしてＥＣ50値を記録した。
【０１２４】
競合ＥＬＩＳＡのために、Nunc９６ウェルイムノプレートをコーティングし、そして上記のようにブロックした。ファージ濃度はタイトレーションＥＬＩＳＡから決定されたレベルで固定し、そしてコンペティタータンパク質（ｒＨＡ−インフェスチン−４）を直列に希釈した。簡潔には、コンペティタータンパク質の４倍連続希釈を、最初のウェルで１００μＬの２倍コンペティター（即ち所望の１００ｎＭ濃度に対して２００ｎＭ）を有することにより、残りのウェルで７５μＬ希釈緩衝液（１％スキムミルク／ＰＢＳＴ）によって行い、そしてプレートの下方へ２５μＬのコンペティターを連続的に希釈した。７５μＬの２ｘファージストック（タイトレーションＥＬＩＳＡから決定される希釈）を各ウェルに加え、そして各ウェルからの１００μＬをコーティング及びブロックプレートに移し、そしてＥＬＩＳＡプロトコールは上記のように続けた。遺伝子ＩＩＩ融合としてファージ発現インフェスチンドメイン４（Ｉｎｆ４）を競合ＥＬＩＳＡにおける陽性対照として使用した。３Ｆ７及び３Ｈ４と命名したファージクローンは、対照Ｉｎｆ４−ファージと等しいＥＣ50値で競合を示し、そして更なる解析のために選択した（図１）。競合ＥＬＩＳＡの結果は、ｒＨＡ−インフェスチン−４が３Ｆ７及び３Ｈ４Ｆａｂ−ファージと競合でき、そしてＦＸＩＩａ上の類似の領域に最も結合する可能性があることを示す。他のすべてのファージクローンは、ＦＸＩＩａに結合できる一方で、ｒＨＡ−インフェスチン−４（図１中にクローン３Ｇ５で表される）によって競合されず、そしてそれ故にＦＸＩＩａの触媒ドメイン内の類似領域に結合する可能性はないようであった。
【０１２５】
４）クローン３Ｆ７の解析：配列解析
Ｆａｂクローン３Ｆ７及び３Ｈ４のアミノ酸配列を決定するために、５ｍＬの一夜培養を５μＬの「マスタープレート」培養液を用いて開始し、そしてプラスミドをQiagen miniprepキットを用いて分離した。ＦａｂカセットＤＮＡは、ＣＨ１Ｒｅｖ及びｐＬａｃＰＣＲｆｗプライマーを用いて配列決定した（表２）。配列決定反応及び電気泳働を、メルボルン大学の病理部のＤＮＡ配列決定施設で実施した。配列はＳｅｑＭａｎ(Lasergene)を用いて解析しそして１００％同一であることを認め、それ故にＦＸＩＩａへの結合に対してインフェスチン−４と競合する能力を備えた単一抗体（３Ｆ７）をパンニングから得た。
【０１２６】
【表２】
2014523253.tif 000003
【０１２７】
【表３】
2014523253.tif 000004
【０１２８】
５）クローン３Ｆ７の解析：３Ｆ７ｍＡｂによるＦＸＩＩａ阻害
３Ｆ７ｍＡｂがＦＸＩＩａアミド分解活性をインビトロアッセイで阻害するかを評価するために、３Ｆ７Ｆａｂ−ファージを完全長ヒトＩｇＧ４／λ抗体へ再フォーマットし、そして実施例３に記載されたプロトコールを用いて精製した。簡潔に、１μｇ／ｍＬのＦＸＩＩａを、ｒＨＡ−インフェスチン−４、３Ｆ７ｍＡｂ又は対照ｍＡｂ（抗ヒトＧＣＳＦＲ抗体Ｃ１．２）の存在又は不存在下に、１６０μＬの容量で３７℃において５分間Nuncイムノプレートでインキュベートした。４０μＬの基質（４ｍＭのＳ−２３０２）を加えて、そしてプレートを更に３７℃において１５分間インキュベートした。反応を４０μＬの２０％酢酸の添加によって停止し、そして色変化を４５０ｎｍでプレートリーダにおいて検出した。データはＳ字曲線当てはめによるKaleidaGraphソフトウェアを用いてプロットし、そしてＥＣ50値を記録した。図２に示すように、３Ｆ７抗体がＦＸＩＩａアミド分解活性を効果的に阻害することを見出した。
【０１２９】
〔実施例２〕３Ｆ７抗体の親和性成熟
３Ｆ７の親和性成熟の目的は、親抗体よりも高い親和性のヒトＦＸＩＩａに結合できる３Ｆ７ｍＡｂ変異体を同定し、そして特性化することであった。より高い親和性変異体は、ＦＸＩＩａアミド分解活性の阻害改善を示す可能性を有する。Ｆａｂ−ファージ親和性成熟ライブラリーの生成方法（下記のライブラリー構築参照）は、次いでトランスフォーメーションのための二本鎖型を作るように伸長するｓｓＤＮＡ鋳型にアニーリングする縮退オリゴヌクレオチドによって決まる。ライブラリーのサイズはトランスフォーメーション効率、及び使用プライマーの縮重によって決まる。使用プライマー（下記参照）は１９のアミノ酸の組み合わせ(システインなしで)をカバーした。一度に６アミノ酸残基をターゲッティングするライブラリーをデザインした。６残基に対して三量体オリゴヌクレオチドを用いる理論的多様性は１９6＝４．７ｘ１０7である。
【０１３０】
１）親和性成熟ライブラリーのデザイン
各ファージミドに対して、生殖細胞系停止鋳型は、ＣＤＲ−Ｌ２を除いた全ＣＤＲ中の１８コドン（６アミノ酸残基）をＴＡＡ停止コドンと交換することによって作成した。構築物の線形デザインは以下：ＮｃｏＩ−ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＳａｌＩのとおりである。ファージディスプレイのための残存エレメントを含有するファージディスプレイｐＴａｃベクターへのクローニングのために、側面ＮｃｏＩ及びＳａｌＩ部位が含まれた。３Ｆ７Ｈ１、３Ｆ７Ｈ２、３Ｆ７Ｈ３．１及び３Ｆ７Ｈ３．２（重鎖可変領域）及び３Ｆ７Ｌ１、３Ｆ７Ｌ３．１、３Ｆ７Ｌ３．２（軽鎖可変領域）と命名した停止鋳型バージョンをGeneArtによって作り出し、それぞれ図３及び４に示す。
【０１３１】
２）ライブラリー構築
ライブラリーは、ｐＴａｃ−３Ｆ７Ｆａｂの「停止鋳型」バージョンを用いてSidhu et
al. (新規な結合ペプチドの選択のためのファージディスプレイ。Methods in Enzymology, 2000, vol. 238, p.333-336) によって記載された方法を用いて構築した。各停止鋳型は、所望の部位で停止コドンを同時に修復し突然変異を導入するためにデザインした変異原性オリゴヌクレオチド(表４)を用いて、Kunkel変異誘発法(Kunkel et al., 表現型選択なしに迅速そして効率的な部位特異的変異誘発。Methods in Enzymology, 1987, vol. 154, p. 367-382) のための鋳型として使用した。変異誘発反応を、エレクトロポレーションによって大腸菌ＳＳ３２０に導入し、そしてファージ産生はＭ１３−ＫＯ７ヘルパーファージの添加で開始した。３０℃で一夜増殖後、ファージをＰＥＧ／ＮａＣｌを用いる沈殿によって回収した。変異誘発効率を各ライブラリーからランダムに選別した１２クローンの配列決定によって評価し、そして５０から１００％まで変動した。各ライブラリーは０．７５−３．７５ｘ１０9の個別のクローンを含有した。プライマー３２５４（表２）を用いてライブラリーＬ１、Ｌ３．１及びＬ３．２からクローンの配列を決定し、そしてプライマーＳｅｑＣＬλ（表２）を用いてライブラリーＨ１、Ｈ２、Ｈ３．１及びＨ３．２からクローンの配列を決定した。
【０１３２】
【表４】
2014523253.tif 000005
【０１３３】
３）ライブラリーパンニング
ライブラリーを、ビオチニル化ＦＸＩＩａ−βの濃度を減少させながら５ラウンドの選択を通して繰り返した。標的濃度は、ラウンド１の４０ｎＭからラウンド５の４ｐＭまで各ラウンドとともに１０倍低減した。パンニングはビオチニル化ＦＸＩＩａ−βにより溶液中で実施した。ファージサンプルは、ＰＢＳＴ中４％ミルク（又は標的のないブランクサンプルを作るのに４％ミルク／ＰＢＳＴ単独）で希釈した抗原とＲＴで１時間回転しながらインキュベートした。Dynal M-280 ストレプトアビジン磁性ビーズを、５％スキムミルク／ＰＢＳで水平振盪しながら３７℃で３０分間ブロックした。ビーズを、ＭＰＳを用いて集め、そしてファージ／抗原混合物を３０分間加えた。次いでビーズをＰＢＳＴ (KingFisher Long Wash)中で１０回洗浄し、続いてＰＢＳ中で手動洗浄した。最後にビーズを、５００μＬの５０ｍＭＤＴＴ中で再懸濁し、そして中水平振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。溶出ファージを集めて、そして１７０μＬの中性緩衝液（０．３５１ｇＬ−システイン＋５ｍｇＢＳＡを１ＭのＴｒｉｓでｐＨ８の５ｍＬに作り上げた）に加えた。３３０μＬの溶出ファージを次のラウンドの投入量として使用した。各ラウンドの選択の濃縮度は、標的vs．ブランクサンプルについて選択された溶出ファージとして算出した。
【０１３４】
４）３Ｆ７親和性成熟のクローンの解析
パンニングの完了の時点で、多くのファージクローンを各濃縮ライブラリーから選択し、そして上記に詳述したプライマーを用いて配列決定した（ライブラリー構築）。次いで各ライブラリーから特有のクローンを配列に基づいて選択し、そして結合解析のために完全ヒトＩｇＧ４／λ抗体に再フォーマットした。親和性成熟変異体を先ず、親の３Ｆ７と比べて結合親和性を評価するために未精製細胞培養上清としてBiacoreを用いてスクリーニングした（実施例４（１）に記載）。表５は３Ｆ７よりもＦＸＩＩａ−βに対して高い結合親和性を有することが見出された抗体をリストアップする。最も高い親和性クローンは、重鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ１領域から由来する傾向があった。
【０１３５】
【表５】
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【０１３６】
【表６】
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【０１３７】
推定結合親和性スクリーニングからの結果を基に、次いでベストの５ｍＡｂを精製し、そして詳細な結合親和性解析にかけた（実施例４(２)に記載）。表６に示すように、これらのクローンは親の３Ｆ７と比べて２４〜５７倍の結合親和性の改善を示した。
【０１３８】
【表７】
2014523253.tif 000008
【０１３９】
〔実施例３〕発明のファージ由来抗体のＩｇＧ生産及び精製
１）哺乳動物発現ベクター構築
哺乳動物発現ベクターは、全軽鎖（可変及び定常ドメイン）及び既述のｐＲｈＧ４ベクターへの選択ファージ由来Ｆａｂ構築物からの重鎖の可変ドメインを、クローニングすることにより標準分子生物学を用いて構築した(Jostock et al 2004.Ｆａｂ−オン−ファージディスプレイライブラリーから由来の機能性ヒトＩｇＧの迅速生成。J Immunol Methods, 289; 65-80) 。
【０１４０】
２）細胞培養
無血清懸濁液適合２９３−Ｔ細胞はGenechoice Incから得た。細胞はペニシリン／ストレプトマイシン／フンギゾン試薬 (Invitrogen)を補充したFreeStyle(商標)発現培地 (Invitrogen)中で培養した。トランスフェクションに先立って、細胞は８％ＣＯ2の雰囲気の加湿インキュベータ中３７℃に維持した。
【０１４１】
３）一過性トランスフェクション
２９３−Ｔ細胞を用いた哺乳動物発現ベクターの一過性トランスフェクションを、メーカー使用説明書に従って２９３フェクチントランスフェクション試薬(Invitrogen)を用いて行った。軽鎖及び重鎖発現ベクターを２９３−Ｔ細胞と組み合わせてそして同時トランスフェクトした。細胞（１０００ｍｌ）は、１ｘ１０6生細胞／ｍｌの最終濃度でトランスフェクトし、そしてCellbag２Ｌ(Wave Biotech/GE Healthcare) 中で、2/10 Wave Bioreactor system 2/10 or 20/50 (Wave Biotech/GE Healthcare)で８％ＣＯ2の雰囲気により３７oＣにおいて５日間インキュベートした。培養条件は８°の角度で３５振動／分であった。Pluronic(登録商標)F-68 (Invitrogen)を、０．１％ｖ／ｖの最終濃度まで，トランスフェクション後４時間に加えた。２４時間トランスフェクション後細胞培養に、トリプトンN1 (Organotechnie, France) を０．５％ｖ／ｖの最終濃度まで補充した。細胞培養上清は２５００ｒｐｍの遠心分離によって回収し、そして次いで精製に先立って０．４５μＭフィルター(Nalgene)を通した。
【０１４２】
４）タンパク質発現の解析
５日後培養上清を、４−２０％トリス−グリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して、そして抗体をクマージーブルー試薬で染色することにより可視化した。
【０１４３】
５）抗体精製
モノクローナル抗体は、タンデムプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー及び脱塩カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。Hitrap MabSelect sure (１ｍｌ, GE Healthcare, UK)及びDesalting (HiPrep 26/10, GE Healthcare, UK) レジンを、メーカー推奨法に従ってAKTA express (GE Healthcare, UK)を用いて展開した。簡潔に、プロテインＡアフィニティカラムの平衡を１Ｘ  ＭＴ−ＰＢＳ緩衝液中で行った。濾過細胞培養ならし培地（５００ｍｌ）を１ｍｌ／分でカラムに適用し、そして１Ｘ  ＭＴ−ＰＢＳ（１０ｍｌ）及び１０ｍＭＴｒｉｓ、０．５Ｍアルギニン、１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ７．２（８０ｍｌ）で連続的に洗浄した。次いで結合抗体を０．１ＭＮａアセタートのｐＨ３．０（８ｍｌ）で溶出しそして直ちに脱塩カラムにかけた。抗体濃度は対照抗体標準との比較によりクロマトグラフィーで測定した。タンパク質分画はプールして、そして０．２２μｍフィルターを用いた滅菌濾過に先立って、Amicon UltraCel 50K 遠心力装置(Millipore)を用いて濃縮した。
【０１４４】
抗体の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析し、ここでは還元サンプル緩衝液(Invitrogen, CA)中で２μｇタンパク質を、Novex NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen, CA)上に負荷し、そしてメーカー使用説明書に従って、クマージー染色を用いて可視化する前にNuPAGE MES SDS実施緩衝液により、XCell SureLock Mini-Cell (Invitrogen, CA)中で２００Ｖの定電圧を４０分間かけた。
【０１４５】
〔実施例４〕抗体親和性測定−Biacore解析
１）未精製抗体上清からの推定結合親和性
抗ヒト（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）マウス吸着，Invitrogen, ＣａｔＮｏ．Ｈ１０５００）を、アミンカップリング化学を用いてＣＭ−５センサ表面に化学的に固定化した。培養上清を捕獲前に実施緩衝液で１／６０に希釈した。抗体は、８００反応単位（ＲＵ）の平均捕獲を示す１８０秒間捕獲した。次いでＦＸＩＩａ−βをゼロ及び１００ｎＭで１８０秒間注入し、そして１８０秒間解離した。全アッセイは、セ氏３７℃でBiacoreA100機器で実施し、そしてデータは１：１動力学モデルに適合した。
【０１４６】
２）詳細な結合親和性解析
抗ヒト（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（γ）マウス吸着，Invitrogen, ＣａｔＮｏ．Ｈ１０５００）又は抗マウスＦｃ特異抗体(Jackson Immuno Research Labs inc. Cat No. 515-005-071) を、アミンカップリング化学を用いてＣＭ−５センサ表面上に化学的に固定化した。次いで固定化抗体を用いて溶液から抗ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａのｍＡｂを捕獲した。
【０１４７】
ヒトＦＸＩＩ又はＦＸＩＩａ−βは次いで、詳細な結合動力学のために種々の濃度で捕獲抗体にわたって注入した。参照フローセルからの反応（ここでｍＡｂは捕獲されず、さもなければ同じように処理される）は差し引いた。次いでブランク注入からの反応は得られたセンサグラムから差し引いた。
【０１４８】
最終修正反応は、物質輸送限定を表す用語を含み、１：１動力学を記述するモデルへの非線形回帰を用いて適合した。Ｒｍａｘ値を、捕獲ｍＡｂレベルの若干の偏差を説明するために局所的に適合した。会合速度（ｋａ）、解離速度（ｋｄ）及び平行解離定数（ＫＤ）を決定した。
【０１４９】
詳細な結合動力学のために、ＦＸＩＩを、０、１５．１、３１．２５、６２．５、１２５、２５０、及び５００ｎＭで二重に注入し、そしてＦＸＩＩａ−βを、０、１．２５、２．５、５、１０、２０及び４０ｎＭで，１０ｎＭと二重に注入した。
【０１５０】
３Ｆ７抗体に対して、１００ｍＭＨ3ＰＯ4の９０秒注入による各サイクル後に再生を実施した。ｍａｂＯＴ−２に対して、ｐＨ１．７で、２５ｍＭグリシンの６０秒注入、それに続いてｐＨ８．６で、２５ｍＭグリシンの３０秒注入による各サイクル後に再生を実施した。全アッセイは２５℃で行われた。
【０１５１】
〔実施例５〕ＦＸＩＩａアミド分解活性の他の抗体阻害剤と３Ｆ７の比較
関連科学文献のレビューは、ＦＸＩＩ活性を調節することができる多くの抗体が記載されているが、これらの大部分は重鎖へ指向してそしてＦＸＩＩの初期接触活性化を阻止するか、又は軽鎖に指向してそしてＦＸＩＩアミド分解活性をただ部分的に阻止するように見えることを示した。本検討の目的は、３Ｆ７をＦＸＩＩａのアミド分解活性を完全にブロックすることが特許請求されている抗体ＯＴ−２と比較することであった(Dors et al.,ガラス結合第ＸＩＩ因子によるＦＸＩＩ欠損血漿中のカリクレイン−Ｃ１−インヒビター複合体の生成に基づく機能性ＦＸＩＩの新規高感度アッセイ法。Thrombosis and Haemostasis, 1992, vol. 67, p. 644-648; Citarella et al．，組換欠失変異体を用いるヒト第ＸＩＩ因子の構造／機能解析。European Journal of Biochemistry, 1996, vol. 238, p. 240-249) 。
【０１５２】
１）３Ｆ７及びＯＴ−２抗体によるＦＸＩＩａアミド分解活性の阻害
３Ｆ７及びＯＴ−２抗体の活性を、実施例１（５）に本質的に記載のインビトロＦＸＩＩａアミド分解活性アッセイで比較した。両抗体はＦＸＩＩａのアミド分解活性を完全にブッロクすることができた（図５）。
【０１５３】
２）ＦＸＩＩ及び活性化ＦＸＩＩａ−βへの３Ｆ７及びＯＴ−２抗体ｍＡｂのBiacore 解析
両３Ｆ７及びＯＴ−２抗体はＦＸＩＩａのアミド分解活性を完全にブッロクすることが示された一方で、３Ｆ７はこのアッセイで小さいが再現性のある〜２倍高い効力を示した。３Ｆ７及びＯＴ−２抗体がＦＸＩＩａ上で類似エピトープを共有するかどうかを明らかにするために、これらの抗体で競合ＥＬＩＳＡを初めに実施し、そしてそれらがＦＸＩＩａへの結合のために互いと効果的に競合することができることを示した(データは示さず)。
【０１５４】
ＦＸＩＩへのこれらの抗体の比較結合を更に特性化するために、不活性化ＦＸＩＩ及び触媒活性ＦＸＩＩａ−βに対し両抗体を用いたBiacore実験を行った。この実験の結果は
表７に示され、そしてＯＴ−２がＦＸＩＩ又は活性化ＦＸＩＩａ−βに対して同等の結合親和性を示す一方で、３Ｆ７はＦＸＩＩ（ＦＸＩＩａ）の活性型に対して明確な選好性を示すこと明らかにした。これらの結果は、両抗体がＦＸＩＩの軽鎖上で類似領域に結合するように見える一方で、それらは同一であるエピトープを共有するように見えないことを示した。活性化ＦＸＩＩに優先的に結合する３Ｆ７の能力は、薬物動力学的及び／又は薬力学的利点を与える可能性がある。
【０１５５】
【表８】
2014523253.tif 000009
【０１５６】
〔実施例６〕３Ｆ７の結合に関与する主要ＦＸＩＩａ残基の同定
多くの種からＦＸＩＩａの活性を阻害するその能力に対して３Ｆ７をスクリーニングして(データは示されず)、３Ｆ７がラットＦＸＩＩａではなくマウス及びヒトＦＸＩＩａに対して極めて強力であることを明らかにした。この情報を用いて、ＦＸＩＩａ軽鎖内のどの主要残基が３Ｆ７エピトープに関与し得るかを、組換マウスＦＸＩＩ（ウェスタン解析を用いて３Ｆ７によって認識される）を精製すること、及びラットアミノ酸と異なる種々の残基を変異させることにより検討した（図６参照）。結果が示すように、３９８か又は４３８位置の変異は３Ｆ７の結合を停止する。
【０１５７】
１.野生型及び変異型マウス第ＦＸＩＩ因子（Ｍｕ−ＦＸＩＩ）の構築及び発現 
全Ｍｕ−ＦＸＩＩタンパク質 (ジェンバンク信託番号ＮＭ＿０２１４８９)をコード化するｃＤＮＡを、GeneART AG (Regensberg, Germany) から取得した。この ｃＤＮＡを鋳型として用いて、標準ＰＣＲ技術によって下記の別々の残基変化を作製した：ａ）Ｎ３７６Ｄ、ｂ）Ａ３８５Ｄ、ｃ）Ｎ３９８Ｋ、ｄ）Ｗ４２０Ｒ、ｅ）Ｒ４２７Ｈ、ｆ）Ｉ４３８Ａ、ｇ）Ｑ４５０Ｒ、ｈ）ｄｅｌＥ４５１、ｉ）Ｓ４５２Ｇ、ｊ）Ｋ４５３Ｒ、Ｔ４５４Ｋ、ｋ）Ｇ４７２Ｓ、ｌ）Ｎ５１６Ｓ、ｍ）Ｔ５３８Ａ及びｎ）Ａ５８９Ｄ。ｆ）Ｉ４３８Ａを例外として、これらの残基変化は、マウス残基からそのラットオルソログへのスイッチ（ジェンバンク信託番号ＮＭ＿００１０１４００６）に対応する（図６Ａ参照）。ｈ）の場合、これはＧｌｕ４５１の欠失にかかわった。ラットアミノ酸変化Ｅ５５２Ｄ、Ｔ５５５Ｖ及びＡ５５６Ｔにマウスをかかわらせる１つの更なる変異体（ｏ）として、多重変異体が生成した。すべての構築物はＣ末端８ｘＨｉｓ−タグをコード化するために３′末端で改変し、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen, Carlsbad, USA) にクローン化しそして配列はＤＮＡ配列解析によって検証した。
【０１５８】
Freestyle(商標)293懸濁細胞 (Invitrogen) を５ｍｌのFreestyle Expression培地(Invitrogen)中で１．１ｘ１０6細胞／ｍｌに増殖させた。７μＬの２９３Ｆｅｃｔｉｎ(Invitrogen) トランスフェクション試薬を、１６７μＬのOpti-MEM I培地(Invitrogen)で５分間プレインキュベートし、次いで野生型又は変異型Ｍｕ−ＦＸＩＩをコード化する５μｇのプラスミドＤＮＡに加え、そして混合物を更に２０分間インキュベートした。ＤＮＡ−２９３フェクチン複合体を、８％ＣＯ2下に２５０ｒｐｍの振盪インキュベータ中３７℃で６日間培養した細胞に加えた。培養上清を２０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって回収し、そして分析のために４℃で保存した。
【０１５９】
２. ウエスタンブロッティング
組換野生型又は変異体ｍｕ−ＦＸＩＩを含有する上清を等量の２ｘ非還元サンプル緩衝液に加えて、８０℃で１０分間インキュベートし、そして次いでプレキャスト４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル(Invitrogen) 上へ充填し、そして２００Ｖで１時間電気泳動した。次いでタンパク質を電気泳動でニトロセルロースフィルタ上に移動し、そして０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＴＢＳ）によりＴｒｉｓ−緩衝食塩水中５％粉乳で１時間ブロックした。次いでフィルターを３Ｆ７ｍＡｂか又は抗ＨｉｓｍＡｂの３Ｈ３（いずれも５％粉乳でＴＴＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）で１時間インキュベートし、ＴＴＢＳで十分洗浄し、次いでそれぞれ抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ又は抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣで更に１時間インキュベートした（Millipore, USA；いずれも５％粉乳でＴＴＢＳ中０．２５ｍｇ／ｍｌ）。ＴＴＢＳで膜の更なる洗浄に続いて、Ａｂ−ＦＩＴＣ結合タンパク質をTyphoon可変モードアナライザー(GE Healthcare, USA)を用いて可視化した。結果を図６Ｂに示した。３Ｆ７の結合は、マウス配列の残基３９８及び４３８を変異するとき停止することから、これらの２つの残基はｍＡｂ３Ｆ７のエピトープの一部であってよいことを示唆する。
【０１６０】
〔実施例７〕モノクローナル抗体３Ｆ７による静脈内処置によるマウスでのＦｅＣｌ3誘発動脈血栓症の阻止
以前の研究（例えばＷＯ２００６０６６８７８に開示）は、ＦＸＩＩａがマウスにでのＦｅＣｌ3誘発動脈血栓症を阻止したことを示している。この研究の目標は、マウスもまた、凝固因子ＸＩＩａ（ＭＡｂ３Ｆ７）に対する特異的モノクローナル抗体を用いる処置によって動脈血栓症から保護されるかを検討することであった。
【０１６１】
方法
処置群は表８に示された：
【表９】
2014523253.tif 000010
【０１６２】
Charles River Laboratoriesから得た雌性、６〜８週齢で２５〜３９ｇ重のＮＭＲＩ株マウスが，深部麻酔のｔ＝−１５分に表８のリストにある処置溶液の単回ｉ．ｖ．注射を受けた。その後、血栓性閉塞率に対する処置の効果を定量した。ベースライン血流は、超音波流れプローブを露出頚動脈周りに入れることによって測定した。血栓症を開始するために、１０％塩化第２鉄溶液で飽和した濾紙の０．５ｍｍ2（０．５×１．０ｍｍ）パッチを、ｔ＝０分で流れプローブから頚動脈下流に置いた。３分後に濾紙を取り除き、そして血栓性閉塞の発生を測定するために血流を６０分間モニターした。
【０１６３】
６０分の観察時間に続いて、血液サンプルを試験動物から採取した（抗凝固剤：１０％クエン酸）。その後、血漿を標準方法によって調製し、そしてａＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）、ＰＴ（プロトロンビン時間）及びＦＸＩＩａ活性の測定まで冷凍した（−８０℃±１０℃）。
【０１６４】
ａＰＴＴの測定
ａＰＴＴは、５０μＬのPathromtin SL(Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany)に５０μＬの検討血漿サンプル（上記参照）を加えることにより、続いて３７℃で１２０秒のインキュベーションフェーズによって測定した。その後、５０μＬの塩化カルシウム溶液（２５ｍＭ, Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany）を反応開始するために加えた。
【０１６５】
ＰＴの測定
ＰＴは、３７℃で１５秒のインキュベーション後、１００μＬの活性化試薬Thromborel
S (Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany)に５０μＬの
検討血漿サンプル（上記参照）を加えることによって測定した。
【０１６６】
ＦＸＩＩａ活性の測定
ＦＸＩＩａ活性は、ａＰＴＴベースアッセイを用いることによって測定し、そして標準ヒト血漿及びＦＸＩＩ欠損血漿(Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany)の希釈によって得た参照曲線と比較した。イミダゾール緩衝溶液(Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany)で１：５にプレ希釈した、５０μＬの検討血漿サンプル（上記参照）を５０μＬのＦＸＩＩ欠損血漿に加えた。３７℃で３０秒のインキュベーション時間後、５０μＬのPathromtin SL (Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany)を加え、そしてその後溶液を３７℃で１２０秒間インキュベートした。その後、５０μＬの塩化カルシウム溶液（２５ｍＭ, Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany）を反応開始するために加えた。
【０１６７】
３解析のすべてを、それぞれのアッセイ試薬のサプライヤー (Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany)に指示された条件に従って、ＢＣＴ(Behring Coagulation Timer; Siemens HealthCare Diagnostics Products GmbH, Marburg, Germany)で行った。
【０１６８】
結果：
３０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ及び５ｍｇ／ｋｇのＭＡｂ３Ｆ７の静脈内注射は、ＦｅＣｌ3誘発頚動脈閉塞からの完全保護をもたらした（表９、図７）。減少用量（即ち２．５−０．５  ｍｇ／ｋｇ）で、閉塞率は増加し、一方で閉塞までの時間は用量依存性に減少した（表９、図７）。対照と比べて、ＰＴは不変であったが（表１０、図９）、一方でａＰＴＴは高用量で約４倍延長した（表１０、図８）。ＦＸＩＩａ活性は１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量でほとんど完全に阻害され、そして０.５ｍｇ／ｋｇの用量で尚半減した（表１０、図１０）。更に、ＦＸＩＩａ活性はＭＡｂ３Ｆ７の減少用量で用量依存性に増加した一方で、ａＰＴＴは減少した（表１０、図８及び１０）。対照ＭＡｂはＦｅＣｌ3誘発頚動脈閉塞からの保護を示さず、そしてａＰＴＴ、ＰＴ及びＦＸＩＩａ活性値は不変であった（表９、１０、図７〜１０）。
【０１６９】
【表１０】
2014523253.tif 000011
【０１７０】
【表１１】
2014523253.tif 000012
【０１７１】
考察
この研究は、マウスが、５ｍｇ／ｋｇ又はより高い用量においてＭＡｂ３Ｆ７による静脈内処置後の動脈血栓から完全に保護されることを実証した。減少用量では、閉塞率は増加し一方で閉塞までの時間は用量依存性に減少した。対照と比べて、ＰＴは不変であったが、一方ａＰＴＴ及びＦＸＩＩａ活性は用量依存性に延長しそしてそれぞれ減少した。要約すれば、ＭＡｂ３Ｆ７は、顕著な有効性プロファイル及び望ましい用量反応相関を示した。
【０１７２】
〔実施例８〕マウスの水中モデルにおける止血に対する抗ＦＸＩＩａモノクローナル抗体３Ｆ７の効果
実施例７は、ＭＡｂ３Ｆ７が３０−５ｍｇ／ｋｇの用量でマウスのＦｅＣｌ3誘発動脈血栓症を完全に阻止することを実証した。この効果に加えて、ＦＸＩＩａ活性はほとんど完全に阻害され、そしてａＰＴＴはこれらの保護用量で４倍まで延長した。そのような効果が生理的止血に影響を及ぼし得るかの疑問を解明するために、本研究の目的は、最小の完全保護用量（即ち５ｍｇ／ｋｇ）並びに本用量の５倍超用量（即ち２５ｍｇ／ｋｇ）でマウス尾先端出血モデルの止血に対するその効果に関して、ＭＡｂ３Ｆ７を検討することであった。
【０１７３】
方法
【表１２】
2014523253.tif 000013
【０１７４】
止血は水中出血モデルで測定した。簡潔には、尾先端出血パラメータは止血及び失血までの時間を定量化することによって決定した。全失血量は尾先端の沈水に使用された食塩水に存在するヘモグロビンを測定することによって算出した。それに応じて動物のヘモグロビンを考慮に入れた。尾先端カットは深部麻酔下メス形ナイフ（Narcoren）で行い、約３ｍｍの尾先端を摘除した。損傷直後に、尾先端を食塩水に沈水し、水槽を用いてマウスの生理的体温で保持した。出血をモニターする観察期間は３０分であった。全被験物質は観察期間の開始（尾切断）に先立つ５分にｉ．ｖ．で投与した。
【０１７５】
結果
群と関係なく、全動物は観察期間内に止血を示した（表１２）。止血及び全失血までの時間は群間で異ならなかった（表１２及び１３、図１１〜１４；Kruskal-Wallis検定：ｐ＞０．０５）。
【０１７６】
【表１３】
2014523253.tif 000014
【０１７７】
考察
本研究の結果から、ＭＡｂ３Ｆ７の２つの投与量（５及び２５ｍｇ／ｋｇ）は、マウスのＦｅＣｌ3誘発動脈血栓症を強力に阻止し、マウス尾先端出血モデルを用いた生理的出血に無作用であったと結論することができる。
【０１７８】
〔実施例９〕３Ｆ７のａＰＴＴと親和性成熟バージョンの比較
活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）は標準ヒト血漿（ＳＨＰ、Dade Behring）で測定し、ここでは異なる量のそれぞれの阻害剤を２００μＬの総量まで生理食塩水中に加えた。５０μＬのこの溶液を５０μＬのPathromtin SL (Dade Behring)に加え、そして３７℃で１２０秒間インキュベートした。その後、５０μＬの塩化カルシウム溶液（２５ｍＭ）を反応開始するために加えた。
【０１７９】
手順は、メーカーによって推奨される条件に従ってＢＣＳＸＰ(Behring Coagulation System)で行われた。
【０１８０】
ＯＴ−２、ＭＡｂ３Ｆ７及びＭＡｂ３Ｆ７の親和性成熟バージョンのａＰＴＴを比較した。結果は図１５に示す。ＭＡｂ３Ｆ７の親和性成熟バージョンは、ＯＴ−２及び元のＭＡｂ３Ｆ７よりも顕著に活性であった。
【０１８１】
〔実施例１０〕種々の抗体による第ＦＸＩＩａ−α因子の阻害の比較
阻害アッセイは、本質的に上記の実施例１（５）に記載のように行われた。この場合、３Ｆ７、親和性成熟３Ｆ７誘導体及びＯＴ−２は、１：０．１から１：１０まで変動するヒト第ＦＸＩＩａ−α因子に対する異なるモル比で比較した。データは下記の表１４及び図１６に示す。３Ｆ７及び親和性成熟誘導体はＯＴ−２よりも優れた阻害を示し、そして３Ｆ７及びその誘導体よりも最大の阻害を達成するために、より高い量のＯＴ−２が必要であった。
【０１８２】
【表１４】
2014523253.tif 000015
【０１８３】
【表１５】
2014523253.tif 000016
【図１】
2014523253.tif 000017
【図２】
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【図５】
2014523253.tif 000019
【図７】
2014523253.tif 000020
【図８】
2014523253.tif 000021
【図９】
2014523253.tif 000022
【図１０】
2014523253.tif 000023
【図１１】
2014523253.tif 000024
【図１２】
2014523253.tif 000025
【図１３】
2014523253.tif 000026
【図１４】
2014523253.tif 000027
【図３】
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【図４】
2014523253.tif 000029
【図６Ａ】
2014523253.tif 000030
【図６Ｂ】
2014523253.tif 000031
【図１５】
2014523253.tif 000032
【図１６】
2014523253.tif 000033
【配列表】
2014523253000001.app
【国際調査報告】
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2014523253.tif 000035
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