(57)【要約】  全ての乳癌の３分の１は、エストロゲンレセプターアルファ（ＥＲα）ネガティブであり、総合的に予後が不十分であり、現在入手可能な内分泌療法に対して良好に応答しない。Ｗｎｔ−５ａタンパク質またはそのペプチド、例えば、組み換えＷｎｔ−５ａタンパク質またはＷｎｔ−５ａシグナリングタンパク質を有するＷｎｔ−５ａ誘導ヘキサペプチド（Ｆｏｘｙ−５）の使用は、ＥＲα発現の回復を可能にし、且つ、選択的エストロゲンレセプターモジュレータ、例えば、タモキシフェンまたはアロマターゼインヒビターなどによる前記乳癌の治療を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エストロゲンレセプターα活性を欠くことにより特徴づけられる乳癌のサブタイプの治療のための薬学的組成物の製造のためのＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチドの使用。
【請求項２】
請求項１に記載の使用であって、前記乳癌が、エストロゲンレセプターαネガティブ患者における乳癌である使用。
【請求項３】
請求項１または２に記載の使用であって、前記治療がまた、内分泌治療をも含む使用。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の使用であって、当該治療がまた選択的エストロゲンレセプターモジュレータでの治療をも含む使用。
【請求項５】
請求項４に記載の使用であって、前記選択的エストロゲンレセプターモジュレータがタモキシフェンである使用。
【請求項６】
請求項１〜３の何れか１項に記載の使用であって、当該治療がまた、アロマターゼインヒビターでの治療をも含む使用。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の使用であって、前記Ｗｎｔ５−αタンパク質が組み換えタンパク質である使用。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の使用であって、前記Ｗｎｔ５−αペプチドが以下の配列の１を有する使用：
ＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号２
ＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号３
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号４
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号５
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号６
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号７
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号８
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号９
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１０
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１１
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１２
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１３
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１４
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１５。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか１項に記載の使用であって、前記Ｗｎｔ５−αペプチドが以下の配列の１を有し：
ＭＤＧＣＥＬ  配列番号１
ＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号２
ＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号３
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号４
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号５
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号６
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号７
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号８
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号９
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１０
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１１
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１２
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１３
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１４
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１５
且つ、そのホルミル化誘導体として存在する使用。
【請求項１０】
エストロゲンレセプターα活性を欠くことにより特徴づけられる乳癌のサブタイプの治療において使用するためのＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチド。
【請求項１１】
エストロゲンレセプターαネガティブ患者において乳癌の治療において使用するためのＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチド。
【請求項１２】
請求項１０または１１に従うＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチドであって、当該治療がまた内分泌治療をも含むＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチド。
【請求項１３】
請求項１０〜１２の何れか１項に記載のＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチドであって、当該治療がまた選択的エストロゲンレセプターモジュレータによる治療を含むＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチドであって、前記選択的エストロゲンレセプターモジュレータがタモキシフェンであるＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチド。
【請求項１５】
請求項１０〜１２の何れか１項に記載のＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチドであって、当該治療がまたアロマターゼインヒビターによる治療をも含むＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチド。
【請求項１６】
請求項１０〜１５の何れか１項に記載のＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチドであって、前記Ｗｎｔ５−αタンパク質が組み換えタンパク質であるＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチド。
【請求項１７】
請求項１０〜１６の何れか１項に記載のＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチドであって、前記Ｗｎｔ５−αペプチドが以下の配列の１を有するＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチド：
ＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号２
ＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号３
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号４
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号５
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号６
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号７
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号８
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号９
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１０
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１１
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１２
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１３
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１４
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１５。
【請求項１８】
請求項１０〜１６の何れか１項に記載のＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチドであって、前記Ｗｎｔ５−αペプチドが以下の配列の１を有し：
ＭＤＧＣＥＬ  配列番号１
ＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号２
ＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号３
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号４
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号５
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号６
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号７
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号８
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号９
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１０
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１１
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１２
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１３
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１４
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１５
且つ、そのホルミル化誘導体として存在するＷｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチド。
【請求項１９】
Ｗｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチドの治療学的活性量を、エストロゲンレセプターαを欠くヒトに対して、前記レセプターを回復することによって前記エストロゲンレセプターα活性を誘導するために十分な時間に亘り投与することにより、エストロゲンレセプターα活性を回復する方法。
【請求項２０】
乳癌に罹患し、且つエストロゲンレセプターα活性を欠くヒトにおける内分泌後治療を容易または促進するための方法であって、Ｗｎｔ５−αタンパク質またはそのペプチドの治療学的に十分な量が、エストロゲンレセプターα活性を誘導するために十分な時間に亘り投与される方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法であって、前記内分泌後治療が、選択的エストロゲンレセプターモジュレータによる治療である方法。
【請求項２２】
請求項２１の方法であって、当該選択的エストロゲンレセプターモジュレータがタモキシフェンである方法。
【請求項２３】
請求項２０の方法であって、前記内分泌後治療が、アロマターゼインヒビターによる治療である方法。
【請求項２４】
請求項２０または２２の方法であって、Ｗｎｔ５−αペプチドが以下の配列を有する群の１または１以上であり：
ＭＤＧＣＥＬ  配列番号１
ＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号２
ＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号３
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号４
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号５
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号６
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号７
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号８
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号９
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１０
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１１
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１２
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１３
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１４
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１５
且つ、そのホルミル化誘導体として存在する方法。
【請求項２５】
請求項２０または２２の方法であって、当該Ｗｎｔ５−αペプチドが以下の配列を有する群の１または１以上である方法；
ＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号２
ＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号３
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号４
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号５
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号６
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号７
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号８
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号９
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１０
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１１
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１２
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１３
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１４
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ  配列番号１５。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エストロゲンレセプターαネガティブ乳癌細胞におけるエストロゲンレセプターα発現および活性、およびそれによるエストロゲンレセプターモジュレータ、例えば、タモキシフェンなどに対する感受性の確立または回復に関する。
【背景技術】
【０００２】
＜発明の背景＞
乳癌は、依然として世界的に女性の最も一般的な疾患の１つである。検出および治療における進歩にも拘わらず、多くの患者において、当該疾患は転移に進行する。核ホルモンレセプター、エストロゲンレセプターアルファ（ＥＲα）についてネガティブな患者は、とりわけ不十分な予後となる（１）。乳癌患者の臨床的な同齢集団の分析は、ＥＲα発現の減少とＷｎｔ−５発現の減少の間に統計学的な有意な関連が明らかになっている（２）。乳癌におけるＷｎｔ−５ａ発現の減少は、翻訳で生じ、転写レベルでは生じないことが示されている。従って、Ｗｎｔ−５ａはＥＲαレベルの調節が可能であり、その逆ではないことが仮説とされた。現在の研究において、乳癌における、そのようなこれらの２つの重要なタンパク質の関係の調査は確立されている。
【０００３】
Ｗｎｔ−５ａは、Ｗｎｔ分子の大きなファミリーの一員であり、その発現の変化が、乳癌、大腸癌、肝細胞癌およびメラノーマを含む癌と関係している。乳癌において、Ｗｎｔ−５ａは、上皮細胞の接着の増大と遊走の減少が、それの転移過程と回復患者の結果に対する関連を説明することが明らかにされている（２）。ホルミル化で誘導されたヘキサペプチド、Ｆｏｘｙ−５は、乳癌細胞の接着および遊走におけるＷｎｔ−５ａの影響を模倣可能であり、以前に開発された。このペプチドがＷｎｔ−５ａシグナリングの影響の全てを維持する見込みがないと同時に、本発明者らはこのペプチドが、明らか且つ直接な治療学的可能性を有すると考える。Ｗｎｔ−５ａから誘導されたペプチドは以前に、即ち、ＷＯ２００６／１３００８２およびＷＯ０１／３２７０８に開示されている。
【０００４】
ＥＲαネガティブ乳癌患者の不十分な予後の原因である１つの要素は、乳癌の治療のために使用される主要な薬物であるタモキシフェンでの治療を含む内分泌療法が、ＥＲαネガティブ患者においては無効であるということである（１）。タモキシフェンは、選択的エストロゲンレセプターモジュレータ（ＳＥＲＭ）と呼ばれ、幾つかの組織においてアゴニストとして作用し、他の組織においてはアンタゴニストとして作用する。タモキシフェンは、ＥＲαに対して結合することにより作用し、高次構造的な変化を引き起こし、遺伝子および細胞増殖によって制御されるエストロゲンの転写の変化を生じるコアクチベータの補充を妨げると考えられる。従って、ＥＲα発現を欠いた患者において、タモキシフェンは大部分が無効である。内分泌療法はまた、アロマターゼインヒビター、例えば、アナストロゾール（anastrozole）、エクゼメスタン（exemestane）レトロゾール（letrozole）などでの治療も含む。しかしながら、アロマターゼインヒビターによる治療は、選択的エストロゲンレセプターモジュレータについて上述した理由と同じ理由により、ＥＲα発現を欠く患者においては大部分が無効である。
【０００５】
従って、ＥＲαネガティブ乳癌患者のための新たな治療アプローチが示唆されている：ＥＲαネガティブ患者を治療するための真新しい治療法の代わりに、これらの患者を現行の有効で、認可され、且つ広く入手可能な治療管理様式、例えば、タモキシフェンなどに対する応答に感受性を持たせ得るとしたらどうであろう。そのような思考の転換が、現在進行中であり、当該患者のある遺伝子の発現は、上方制御されたＥＲαのために修正され、これらの患者が再度有効に治療できるかどうかが示唆されている（３）。研究者らは、完全長ＥＲαプラスミドのトランスフェクション、またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）インヒビター、例えば、５−ａｚａ−ｄＣおよびトリコスタチンＡなどでの処置を用いてＥＲαネガティブ乳癌細胞においてＥＲα発現を回復してきた（３−６）。しかしながら、これらの戦略の何れも、直接的な臨床的な使用の可能性はない。
【発明の概要】
【０００６】
＜本発明の概要＞
全乳癌の３分の１がエストロゲンレセプターアルファ（ＥＲα）ネガティブであり、総合的に予後が不十分であり、現在入手可能な内分泌療法に対して良好に応答しないという事実に基づく観点から、新たな治療戦略が必要である。従って、組み換えＷｎｔ−５ａまたはＷｎｔ−５ａ誘導ヘキサペプチド、Ｆｏｘｙ−５、のＥＲαネガティブ乳癌細胞に対する投与が、それらのＥＲαの発現を上方制御できるかどうか、並びに、それらに選択的エストロゲンレセプターモジュレータまたはアロマターゼインヒビターに対する感受性を与える可能性があるかどうかを検討した。天然の細胞表面レセプターリガンド、またはこのリガンドを模倣するヘキサペプチドを使用することによってＥＲα発現を再構成することにより、選択的エストロゲンレセプターモジュレータ、例えば、タモキシフェン、またはアロマターゼインヒビター、例えば、アナストロゾール（anastrozole）などによる現行の内分泌療法に対する感受性が乳癌細胞に与えられたことが発見され、従って、乳癌の臨床的な対応の重要な進歩が示唆される。Ｗｎｔ−５ａ模倣ヘキサペプチドおよび現在入手可能なＥＲαモジュレータの調和性の治療は、ＥＲαネガティブな腫瘍を有する乳癌患者のための新たな有益な治療戦略を構成する。
【０００７】
本発明の１つの側面は、エストロゲンレセプターα活性を欠くことにより特徴づけられる乳癌のサブタイプの治療において使用するための薬学的組成物の製造のためのＷｎｔ−５ａタンパク質またはそのペプチドの使用に関する。
【０００８】
本発明の更なる側面は、エストロゲンレセプターα活性を欠くことにより特徴づけられる乳癌のサブタイプの治療において使用するためのＷｎｔ−５ａタンパク質またはそのペプチドに関する。
【０００９】
本発明の更なるもう１つの側面は、乳癌の治療において使用するためのＷｎｔ−５ａタンパク質またはそのペプチドに関する。
【００１０】
本発明のもう１つの側面は、エストロゲンレセプターαネガティブ患者における乳癌の治療において使用するためのＷｎｔ−５ａタンパク質またはそのペプチドに関する。
【００１１】
本発明の更なる側面は、エストロゲンレセプターαを欠くヒトに対して、前記エストロゲンレセプターα活性を前記レセプターの回復により誘導するために十分な時間に亘って、Ｗｎｔ−５ａタンパク質またはそのペプチドの治療学的活性量を投与することによってエストロゲンレセプターα活性を回復する方法に関する。
【００１２】
本発明のもう１つの側面は、乳癌に罹患し、且つエストロゲンレセプターα活性を欠くヒトにおける内分泌後治療を促進または増強する方法であって、Ｗｎｔ−５ａタンパク質またはそのペプチドの治療学的有効量が、エストロゲンレセプターα活性を誘導するために十分な時間に亘り投与される方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１：実験細胞系におけるＥＲα、フリッズルド５（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ５）、ＰＲおよびＷｎｔ−５ａの基底発現。
【００１４】
Ａ：培養において成長した細胞からのタンパク質溶解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって目的とするタンパク質について分析した。チューブリン発現をローディングコントロールとして使用した。Ｂ：ＲＮＡを細胞株から抽出し、ｃＤＮＡ合成に供し、且つ我々が目的とする遺伝子についてＲＴ−ＰＣＲに供した。我々の研究のために目的とされる遺伝子の全てを発現していることが知られているＴ４７Ｄヒト乳癌細胞株をポジティブコントロールとしてタンパク質およびｍＲＮＡ分析の両方のために使用した。β−アクチン発現をハウスキーピング遺伝子として使用した。ネガティブコントロールは水コントロールを表す。
【図２】図２：Ｗｎｔ−５ａシグナリングはＥＲα発現を回復する。
【００１５】
乳癌細胞を６ウェルプレートで成長させ、組み換えＷｎｔ−５ａタンパク質（ｒＷ５ａ）、Ｗｎｔ−５ａ誘導Ｆｏｘｙ−５ペプチド（Ｆ５）、組み換えＷｎｔ−３ａタンパク質（ｒＷ３ａ）、またはホルミル化されたランダムヘキサペプチド（Ｒｄｍ）で２４または４８時間に亘り刺激した。処理に続いて、細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に移し、ＥＲα発現についてブロットした。Ａ：組み換えＷｎｔ−５ａ、Ｆｏｘｙ−５、Ｗｎｔ−３ａ、Ｒｄｍで刺激されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞。Ｂ：組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５で刺激されたＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞。Ｃ：組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５で刺激された４Ｔ１細胞。ポジティブコントロール（Ｐｏｓ）は、ＥＲαの正確なバンドサイズを確認するために含ませた。２つの異なるポジティブコントロールを使用した：ＥＲαを発現することが知られているＴ４７Ｄ細胞溶解産物と、完全長ＥＲαプラスミドで一過性にトランスフェクションされ、極度に高いＥＲα発現を生じるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（最上段、右パネル、第３段、右パネル）。
【図３】図３：Ｗｎｔ−５ａシグナリングはＥＲα転写を回復する。
【００１６】
乳癌細胞を６ウェルプレートにおいて成長させ、組み換えＷｎｔ−５ａタンパク質（ｒＷ５ａ）またはＷｎｔ−５ａ誘導Ｆｏｘｙ−５ペプチド（Ｆ５）で６、１２、１８または２４時間に亘り刺激した。終了時点でＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成し、ＥＲαおよびハウスキーピング遺伝子、β−アクチンについてＲＴ−ＰＣＲを行った。Ａ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞、Ｂ：ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞。ポジティブコントロール（Ｐｏｓ）は、ＥＲαを発現するＴ４７Ｄ細胞から抽出されたＲＮＡである。ネガティブコントロールは水コントロールを表す。
【図４】図４：Ｗｎｔ−５ａシグナリングはＥＲαプロモーターを脱メチル化する。
【００１７】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を通常培地で成長させ、未処理のままにするか、またはｒＷｎｔ−５ａタンパク質（ｒＷｎｔ−５ａ、０．６μｇ／ｍｌ）若しくはＷｎｔ−５ａ誘導Ｆｏｘｙ−５ペプチド（Ｆ５、１００μＭ）で４８時間に亘り刺激するかの何れかを行った。ＭＣＦ−７細胞を同時間に亘り成長させ、未処理のままにした。ＤＮＡを各サンプルから抽出し、亜硫酸水素塩修飾に供した。亜硫酸水素塩処理されたＤＮＡを、ＥＲαプロモーター領域のためのプライマーでのネステットＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を用いてＥＲαプロモーターの亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシング（ＢＧＳ）に供した。ＰＣＲ産物をクローニングして、１０のランダムクローンをシーケンシングした。塗潰し（黒）の円は問題のシトシンでのメチル化を表し、中空（白）の円は、未メチル化のシトシンまたはｒＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５処置に続いて脱メチル化されたシトシンの何れかを表す。数値は、転写開始部位（＋１）に相対するＣｐＧジヌクレオチドの位置を表す。ＴＡＴＡボックスは、−１７位と＋１３位の間に位置する。
【図５】図５：ＥＲαは活性であり、下流の転写が可能である。
【００１８】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、６ウェルプレートで成長させ、Ｗｎｔ−５ａタンパク質（ｒＷ５ａ）またはＷｎｔ−５ａ誘導Ｆｏｘｙ−５ペプチド（Ｆ５）で、２４または４８時間に亘り刺激した。Ａ：処理に続き、細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に移し、ホスホ−ＥＲα発現についてブロッティングした。ポジティブコントロール（Ｐｏｓ）はＥＲαを発現しているＴ４７Ｄ細胞からの細胞溶解産物を示す。ＢおよびＣ：またＲＮＡを刺激された細胞から抽出し、サンプルをセミネステットＲＴ−ＰＣＲ（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ  ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）（Ｂ）およびｐＳ２（Ｃ）ｍＲＮＡについて試験した。ポジティブコントロール（Ｐｏｓ）はＥＲαを発現するＴ４７Ｄ細胞から抽出されたＲＮＡである。ネガティブコントロールは水コントロールを表す。ＰＣＲ結果は、３つの個別の試験を代表するものである。
【図６】図６：ＥＲαの上方制御は以前には非感受性乳癌細胞をタモキシフェン処理に対する感受性を与える。
【００１９】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を６ウェルプレートで成長させ、組み換えＷｎｔ−５ａタンパク質（ｒＷ５ａ）またはＷｎｔ−５ａ誘導Ｆｏｘｙ−５ペプチド（Ｆ５）で２４または４８時間に亘り刺激した。細胞をタモキシフェンで最後の２０時間について処理をし、それらのアポトーシス応答を異なる方法により測定した。Ａ：処理された細胞をヘキスト（Hoechst）で染色し、処置当たりの核に形態学的な変化を示すアポトーシス細胞を視覚的に評価した。矢印はアポトーシス細胞を強調する。スケールバーは１０μＭを表す。Ｂ：ｒＷ５ａ、Ｆ５およびタモキシフェン、またはタモキシフェン単独での処理に続き、細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に移し、切断されたカスパーゼ３についてブロットした。Ｃ：処理された細胞をそれらの相対的なカスパーゼ３活性について蛍光分光学的に評価した。グラフは、６つの個別の試験を表す。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１。Ｄ：また、ＭＴＴアッセイを、ｒＷｎｔ−５ａ、Ｆ５およびタモキシフェンまたはタモキシフェン単独で処理（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７細胞）されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において行い、細胞増殖阻害を評価した。グラフは、６の個別の試験の平均について、エラーバーにより示した標準偏差と共に示す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６ｃｏｎｔ】なし
【図７】図７：ＥＲαにより直接に制御された遺伝子の発現は、タモキシフェン処理により失われる。
【００２０】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を６ウェルプレートで成長させ、組み換えＷｎｔ−５ａ（ｒＷ５ａ）またはＷｎｔ−５ａ誘導Ｆｏｘｙ−５ペプチド（Ｆ５）で２４または４８時間に亘り刺激した。ＥＲαリガンドエストラジオールを最後の２２時間に添加し、サンプルの部分集合に対してタモキシフェンを最後の２０時間に添加した。ＲＮＡを最終時点で抽出し、ｃＤＮＡ合成し、カテプシンＤ（ＣＡＴＤ）、ＥＲ結合フラグメント関連抗原９（ＥＢＡＧ９）およびハウスキーピング遺伝子、β−アクチンについてＲＴ−ＰＣＲに供した。
【図８】図８：Ｆｏｘｙ−５はインビボにおいてＥＲαを上方制御する。
【００２１】
２．５Ｘ１０４の４Ｔ１乳癌細胞を８週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウスの乳房脂肪パッド中に接種した。その動物をその後、ＰＢＳ単独、Ｒｄｍコントロールペプチド（２０μｇ）またはＦｏｘｙ−５（２０μｇ）の何れかで４日目毎に、２５日間処理した。ＲＮＡを、各群の４動物からの初代乳房腫瘍から抽出し、マウスＥＲαについてＲＴ−ＰＣＲに供した。各処理群からの２動物からの初代腫瘍サンプルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
＜本発明の詳細な説明＞
特に、本発明は、Ｗｎｔ−５ａタンパク質、例えば、組み換えＷｎｔ−５ａタンパク質、またはそのペプチドのエストロゲンレセプターα活性を促進または回復するための使用に関する。特にこれは、患者がエストロゲンレセプターαネガティブである場合の乳癌の治療において興味深い。エストロゲンレセプターα活性の促進または回復の後、その患者に対して内分泌療法、例えば、選択的エストロゲンレセプターモジュレータ、例えば、タモキシフェンなどでの治療、またはアロマターゼインヒビター、例えば、アナストロゾールなどでの治療を用いることが可能である。乳癌の治療のために選択的エストロゲンモジュレータ、例えば、タモキシフェン、またはアロマターゼインヒビターを使用する場合、その結果は、エストロゲンレセプターαネガティブ患者において、Ｗｎｔ５−αタンパク質、例えば、組み換えＷｎｔ−５ａタンパク質またはそのペプチドなどの本発明に従う使用なしでは頻繁に不成功に終わる。
【００２３】
好ましいその態様において、Ｗｎｔ５−αペプチドは以下の配列またはそのホルミル化誘導体の１つを有する１または１以上である：
ＭＤＧＣＥＬ（配列番号１）
ＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号２）
ＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号４）
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号５）
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号６）
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号７）
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号８）
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号９）
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１０）
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１１）
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１２）
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１３）
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１４）
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１５）
これらのペプチドの２または２以上の組み合わせの使用も可能である。
【００２４】
＜方法＞
細胞培養
５つの乳癌細胞株をこの研究において使用した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７、Ｔ４７−Ｄおよび４Ｔ１細胞は、全てザ・アメリカン・タイプ・ティッシュ・コレクション（the American Type Tissue Collection（ATCC））から入手し、ＡＴＣＣの推奨に従って成長させた。４Ｔ１細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補足したＲＰＭＩ培地（Ｒ８７５８）中で成長させた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ−７細胞株は１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭにおいて成長させた。全ての細胞用培地は、５Ｕ／ｍＬのペニシリン、０．５Ｕ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンを含有した。細胞は、また、記載されるように幾つかの実験については、フェノールレッドを欠き、且つ５％の炭処理されたＦＣＳで補足された「ホルモン非含有培地（hormone free media）」において成長された。全ての細胞は、３７℃で、５％ＣＯ２を含む加湿チャンバー内でインキュベートされた。
【００２５】
組み換えＷｎｔ−５ａ、組み換えＷｎｔ−３ａ、Ｆｏｘｙ−５またはホルミル化ランダムペプチドによる刺激
細胞の刺激は、組み換えＷｎｔ−５ａ（０．６μｇ／ｍＬ）および組み換えＷｎｔ−３ａ（０．１μｇ／ｍＬおよびコントロール実験においては０．６μｇ／ｍＬ）（R&D Systems Abington, UK）を用いて示される通りの時間に亘り行った。Ｗｎｔ−５ａ誘導ホルミル化ヘキサペプチド、本発明者らの研究室において設計されたＦｏｘｙ−５（ホルミル化−ＭＤＧＣＥＬ）（配列番号１）およびホルミル化ランダムヘキサペプチド（ホルミル化−ＭＳＡＤＶＧ）（配列番号１６）は、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｐｒｅｓｔｏ（Lelystad, The Netherlands）またはＩｎｂｉｏｌａｂｓ（Tallinn, Estonia）の何れかにより合成された。ペプチドを、ＲＰ−ＨＰＬＣおよび質量分析法により精製し、＞９５％の純度のペプチドを３回合成した。細胞は、示される通りの時間に亘り、１００μＭの濃度のＦｏｘｙ−５またはランダムペプチドで処理された。他の全ての薬品は、他に記載のない限り、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（St. Louis, MO）から購入した。
【００２６】
Ｗｎｔ５−α活性を有することが知られたペプチドまたはそのホルミル化誘導体は
ＭＤＧＣＥＬ（配列番号１）
ＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号２）
ＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号３）
ＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号４）
ＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号５）
ＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号６）
ＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号７）
ＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号８）
ＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号９）
ＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１０）
ＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１１）
ＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１２）
ＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１３）
ＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１４）
ＬＧＴＱＧＲＬＣＮＫＴＳＥＧＭＤＧＣＥＬ（配列番号１５）
である。これらのペプチドは、単独または２または２以上の混合物において使用されてよい。
【００２７】
細胞溶解およびウェスタンブロット分析
細胞は、トリトン溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１％のトリトンＸ−１００、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＮａＦ）に新鮮なロイペプチン（１μｇ／ｍＬ）、ペファブロック（Pefabloc（２ｍＭ））、アプロチニン（２０μｇ／ｍＬ）およびＮａ３ＶＯ４（４ｍＭ）が添加された中で溶解された。溶解産物は１５分間氷上でインキュベートされ、次に１０分間に亘る８０００ｇでの遠心により前洗浄（pre-cleared）された。細胞溶解産物は、８〜１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でサイズに応じて分離され、引き続いて、ＰＶＤＦまたはニトロセルロース膜に電気的に移動した。膜を１時間に亘って室温で、５％のミルクを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０１％）中でブロックした。膜を第１抗体と共に、４℃で一晩、３％のミルクを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０１％）中でインキュベートし、次に、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０１％）中で３回１０分間に亘り洗浄した。タンパク質の可視化は、西洋ワサビペルオキシダーゼに対して複合化されている第２抗体の膜への添加により行われ、これは次いで、１時間に亘り、室温で、３％のミルクを含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０１％）中でインキュベートされた。膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．０１％）中で１０分間に亘り３回洗浄し、次にＥＣＬ中でインキュベートし、ハイパーフィルム（hyperfilm）で展開した。スキャンおよびデンシトメトリーは、バイオ・ラド（Bio-Rad、Hercules CA)ＧＳ−８００デンシトメーターを用い、クウォンティティ・ワン・ソフトウェア（Quantity One software）で行った。
【００２８】
抗体
抗体は、以下の希釈で使用した：エストロゲンレセプターα：ＨＣ−２０（Santa Cruz Biotechnology）１：１０００、Ｗｎｔ−５ａ：ヒトとマウスの間で１００％の相同性を有するＷｎｔ−５ａ配列に対する我々の研究室において開発された抗体１：１０００（２）、プロゲステロンレセプター：６Ａ１、ＡおよびＢアイソフォーム（Cell Signaling Technology）の両方の検出、フリッズルド５（Frizzled 5）：（Ｕｐｓｔａｔｅ）１：１０００、切断されたカスパーゼ３：Ａｓｐ１７５（Cell Signaling Technology）１：１０００、ホスホ−ＥＲα（Ｓｅｒ１１８）：１６Ｊ４（Cell Signaling Technology）１：１０００、チューブリン：ＤＭ１Ａ（Santa Cruz Biotechnology）１：１００００。全ての 第２抗体は、ダコ・ケミカル（Dako Chemicals）からであり、以下の希釈で使用された：ヤギ抗ウサギ１：１００００、ヤギ抗マウス１：７５００、ウサギ抗ヤギ１：７５００。
【００２９】
ＲＮＡ抽出
ＲＮＡ抽出は、各サンプルに対して５００μＬのＴＲＩｚｏｌの添加により、指摘されたクリーンなＲＮＡ領域において行った。１００μＬのクロロホルムを次に加え、サンプルを４℃で２５０ｇで１０分間遠心した。２５０μＬのイソプロパノールを清澄な上相に対して添加し、サンプルを１５分間、４℃で１６０００ｇで遠心した。上精を除去し、ペレットを７５％のエタノールで洗浄し、ＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。ＲＮＡを、３７℃でＤＮａｓｅ１（Sigma）で処理した。ＲＮＡ濃度は、ナノドロップ・スペクトロフォトメータ  ＮＤ−１０００（Nanodrop Spectrophotometer ND-1000（Bio-Rad（Hercules CA）））を使用して測定した。
【００３０】
ｃＤＮＡ合成＆逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
ｃＤＮＡは、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（Fermentas）を使用し、ＭＪ・ミニ・パーソナル・サーマルサイクラー（MJ Mini Personal Thermal Cycler （Bio-Rad（Hercules CA）））において１μｇの総ＲＮＡから合成した。全てのＲＴ−ＰＣＲを、指摘されたクリーンＰＣＲフードにおいて行った。ＲＴ−ＰＣＲは、サンプル当たり、５μＬの１０倍の緩衝液、５μＬの２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１μＬの１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μＬのフォワードプライマー、１μＬのリバースプライマーおよび０．２μＬのＴａｑポリメラーゼ（Fermentas（Ontario, Canada））を含むマスター混合物を使用して行った。プロゲステロンレセプター（ＰＲ）の検出のために、セミネステットＲＴ−ＰＣＲを行い、感受性を増大し、それによって１０μＬの最初のＰＣＲ反応産物を、第２の内部リバースプライマーを伴う第２のＰＣＲ反応に加えた。ＡおよびＢアイソフォームの両方をこれらのプライマーにより増幅する。
【００３１】
プライマー配列は以下の通りであった。
【００３２】
ERα フォワード: 5’ CAC CCT GAA GTC TCT GGA AG 3’ (配列番号17)、
ERα リバース: 5’ GGC TAA AGT GGT GCA TGA TG 3’ (配列番号18)、
Cathepsin D フォワード: 5’ GTA CAT GAT CCC CTG TGA GAA GGT 3’ (配列番号19)、
カテプシン D リバース: 5’ GGG ACA GCT TGT AGC CTT TC 3’(配列番号20)、
EBAG9 フォワード: 5’ GAT GCA CCC ACC AGT GTA AAG A 3’ (配列番号21)、
EBAG9 リバース: 5’ AAT CAG GTT CCA TTG TTC CAA AG 3’ (配列番号22)、
βアクチンフォワード: 5’ TTC AAC ACC CCA GCC ATG TA 3’ (配列番号23)、
βアクチン リバース: 5’ TTG CCA ATG GTG ATG ACC TG 3’ (配列番号24)、
Wnt-5a フォワード: 5’ GGA TTG TTA AAC TCA ACT CTC 3’ (配列番号25)、
Wnt-5a リバース: 5’ ACA CCT CTT TCC AAA CAG GCC 3’ (配列番号26)、
PR フォワード: 5’ TCA TTA CCT CAG AAG ATT TAT TTA ATC 3’ (配列番号27)、
PR リバース 1: 5’ ATT GAA CTT TTT AAA TTT TCG ACC TC 3’ (配列番号28)、
PR リバース 2: 5’ATT TTA TCA ACG ATG CAG TCA TTT C 3’ (配列番号29)。
【００３３】
全てのＲＴ−ＰＣＲは、少なくとも３回行い、リバース転写酵素を欠くコントロールをルーチン的に含ませ、ＤＮＡコンタミネーションを排除した。
【００３４】
アポトーシス細胞の分析のための核染色
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をカバーガラス上に置き、接着させた。Ｗｎｔ−５ａ（０．６μｇ／ｍＬ）またはＦｏｘｙ−５（１００μＭ）を２４または４８時間に亘り添加した。細胞を次に、最後の２０時間にタモキシフェン（５μＭ）で処理した。ＭＣＦ−７細胞をポジティブコントロールとして使用した。その細胞を１５分間、氷冷したパラ−ホルムアルデヒド（４％）中で固定し、洗浄し、１０分間、１０μｇ／ｍＬのヘキスト33342染色（Invitrogen）を暗所でインキュベートした。その細胞をＰＢＳで洗浄し、ダコ・サイトメーション・フルオレッセント・マウンティング・メディウム（Dako Cytomation fluorescent mounting medium）でマウントした。その形態をニコンＥ８００エクリプス顕微鏡で６０倍の対物レンズを用いて分析した。
【００３５】
ＤＮＡ抽出＆亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシング（BGS）
ＤＮＡを標準的手順に従って細胞から抽出した。１μｇのＤＮＡを次に、ＥｐｉＴｅｃｔ亜硫酸水素塩キット（Qiagen）を使用して亜硫酸水素塩処理し、ネステットＰＣＲにより、ＥＲαプロモーター領域のためのプライマーで増幅した。ＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を使用してクローニングした。１０のランダムクローンをＡＢＩ３７３０ＤＮＡアナライザー（Applied Biosystems）を使用してシーケンシングした。
【００３６】
カスパーゼ３活性アッセイ
カスパーゼ３活性は、蛍光分光測定により測定した。蛍光ペプチドＤＥＶＤ−ａｍｃ（Upstate Biotech）を基質として使用した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、６ウェルプレートで成長させ、組み換えＷｎｔ−５ａタンパク質（０．６μｇ／ｍＬ）またはＦｏｘｙ−５ペプチド（１００μＭ）で２４または４８時間刺激した。細胞を次に１μＭの濃度のタモキシフェン（Sigma）で２０時間処理した。浮遊および接着細胞をカスパーゼ溶解緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、１３０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１０ｍＭのＮａＰＰｉ）中で溶解し、５０μＬのトリプリケートを、２００μＬのＨＥＰＥＳ緩衝液および３μＬのＤＥＶＤ−ａｍｃと共に反応ウェルに添加した。反応物を３７℃で１時間インキュベートし、ＦＬＵＯｓｔａｒプレートリーダー（BMG Lab technologies）で分析した。各溶解産物の総タンパク質含量をクーマシー・プラス・プロテイン・アッセイ（Coomassie Plus Protein Assay）を使用して測定し、適宜、平均を読み出し、補正した。実験は６回行い、結果を平均した。
【００３７】
ＭＴＴ増殖アッセイ
細胞増殖を製造元の説明書に従ってＭＴＴアッセイ（Vybrant）により測定した。短くＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７細胞を９６ウェルプレートで成長させ、次に未処理のままにするか、ｒＷｎｔ−５ａ（０．６μｇ／ｍＬ）またはＦｏｘｙ−５ペプチド（１００μＭ）で２４または４８時間刺激するかの何れかを行った。細胞を次に、５μＭのタモキシフェン（Sigma）で最後の２０時間処理した。全細胞を次に、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）でラベルし、３７℃で４時間インキュベートし、吸光度をバイオラド６８０マイクロプレートリーダー（Biorad）で測定した。生吸光度を９回反復して５７０ｎｍで測定し、適宜、平均を読み出し、補正した。実験は６回行い、結果を平均した。
【００３８】
インビボ研究
２．５Ｘ１０４の４Ｔ１の乳癌細胞を８週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウスの乳房脂肪パッド中に接種し、それを引き続いて、ＰＢＳ単独、Ｒｄｍコントロールペプチド（２０μｇ）またはＦｏｘｙ−５（２０μｇ）の何れかで、本発明者らによって出版物において記載された通りに、以前４日目毎に、２５日間処理した（９）。ＲＮＡを各群の４動物からの新鮮な凍結初代乳癌腫瘍から抽出し、マウスＥＲαについてＲＴ−ＰＣＲに供した。
【００３９】
統計学的解析
グラフ・パッド・ソフトウェア（Graph Pad software）を使用し、両側独立ｔ検定（The two-tailed unpaired t test）を用いて、カスパーゼ３活性アッセイの有意差を測定した。以下の記号を使用して統計学的有意差を示した：＊ｐ＜０．０１，＊＊ｐ＜０．００１。
【００４０】
結果
以前の研究が、臨床的な乳癌同齢集団において行われ、ＥＲαの発現を欠く乳癌患者は、またＷｎｔ−５ａ発現も欠くことを示した（２）。従って、実験的なアプローチは、３人のヒトと１匹のマウス細胞株における重要なタンパク質の内因性の発現を測定することから始まった（図１ａ）。ＥＲα、Ｗｎｔ−５ａ、フリッズルド５およびＰＲ（ＡおよびＢアイソフォームの両方）をｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で発現することが知られることから、ヒトＴ４７Ｄ乳癌細胞株をポジティブコントロールとして使用した。ＥＲα、Ｗｎｔ−５ａおよびＰＲの発現を欠くＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８および４Ｔ１細胞は、まだそれらはＷｎｔ−５ａレセプター、フリッズルド５、を発現したことで、Ｗｎｔ−５ａシグナリングの誘導がこれらの細胞株において可能であることが示された。ＭＣＦ７細胞は試験された全てのタンパク質を発現した。次に、これらの遺伝子の発現は、ヒト乳癌細胞においてｍＲＮＡレベルで特徴づけられた（図１ｂ）。ＥＲαおよびＰＲのｍＲＮＡが、ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ細胞において検出された。Ｗｎｔ−５ａのｍＲＮＡが全ての細胞株において検出され、本発明者らおよび他の研究室からの以前のデータが確かめられ、Ｗｎｔ−５ａ発現が後転写レベルで修飾されることが示唆された。これはまた、乳癌腫瘍が高レベルのＷｎｔ−５ａｍＲＮＡを発現することを示す他からの臨床的データと一致する（７）。
【００４１】
次に、Ｗｎｔ−５ａシグナリングの回復が乳癌細胞株におけるＥＲα発現レベルに影響するのか否かを測定するために調べた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を通常培地中で６ウェルプレートに播種し、組み換えＷｎｔ−５ａタンパク質で２４および４８時間刺激した。ＥＲαポジティブ乳癌細胞株を実験のこのセットにおいてポジティブコントロールとして使用して、比較するべき標準発現としてよりも、寧ろ、主にウェスタンブロットにおけるＥＲαを表す正確なバンドを決定した。ＥＲαタンパク質のレベルの増加は、２４時間後に観察した（図２ａ、最上段左パネル）。次に、次に、本研究室において開発されたＷｎｔ−５ａ誘導ペプチド、Ｆｏｘｙ−５がＥＲα発現の上方制御をすることが可能であるか否かを調査した。
【００４２】
これは、その例（図２ａ、最上段左パネル）であることを証明した。次に、この効果の特異性を、当該細胞を組み換えＷｎｔ−３ａタンパク質およびホルミル化ランダムヘキサペプチドで刺激することにより検討した。これらの刺激の何れもがＥＲαのレベルの増加を導かなかった（図２ａ、最下段パネル）。組み換えＷｎｔ−５ａおよびＦｏｘｙ−５刺激を次に、２つの他のＥＲαネガティブ乳癌細胞株において繰り返した。ＥＲαレベルは、組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５の何れかでの２４および４８時間の刺激の後にＭＤＡ−ＭＢ−４６８（図２ｂ）および４Ｔ１（図２ｃ）乳癌細胞株の両方において上方制御された。
【００４３】
このＥＲα上方制御が転写または翻訳レベルで生じるのか否かを測定するために、ＥＲαタンパク質が最初に検出されたときに、２４時間よりも早い時点でＥＲαのｍＲＮＡの上方制御が生じるか否かを検討した。ヒト乳癌細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８を組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５で、６、１２、１８および２４時間刺激し、それにより、ＥＲαｍＲＮＡが検出可能となる時点を決定した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞におけるＥＲαｍＲＮＡは、組み換えＷｎｔ−５ａ刺激の１２時間後、Ｆｏｘｙ−５刺激の６時間後に検出された（図３）。
【００４４】
我々は次に、ＥＲαのＣｐＧアイランドを隅から隅までの亜硫酸水素塩ゲノムシーケンシング（ＢＧＳ）を使用してメチル化パターンを徹底的に分析した（図４）。この分析により、我々は、ｒＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙの何れかで刺激された５ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、ＣｐＧアイランドの特異的な領域が脱メチル化されることを明らかにした（図４）。同じ領域は、未処理のＭＣＦ−７細胞、ＥＲαポジティブ乳癌細胞株と比較した。Ｗｎｔ−５ａシグナリングの開始に続く脱メチル化の２つの主な領域があり、それらの１つは、ＴＡＴＡボックスおよび転写開始部位の近くにあった（１０）。特に、転写開始部位に対して＋４２、＋６５、＋１６５、＋１９２、＋１９５、＋３７５位で劇的な脱メチル化があり、同様にそれはＨＤＡＣおよびＤＮＭＴインヒビターを使用する研究においても見られた（３，４）。
【００４５】
次に、上方制御されたＥＲαが機能的に活性であるか否かを決定するために検討した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株が、これらの実験のために利用し、これを多くの方法で検討した。最初に、組み換えＷｎｔ−５ａおよびＦｏｘｙ−５で刺激された溶解産物をリン酸化されたＥＲαの存在について試験した。ＥＲαは多くの部位でリン酸化される。セリン１１８の部位を調査のために選択し、そのためこの部位でのリン酸化が最も頻繁にＥＲα活性の指標として使用される。リン酸化されたＥＲαが、組み換えＷｎｔ−５ａおよびＦｏｘｙ−５の何れかで刺激された細胞において検出された（図４５）。プロゲステロンレセプターは、活性なＥＲαを示す下流転写標的である。そのため、９６時間までに亘る組み換えＷｎｔ−５ａおよびＦｏｘｙ−５の何れかによる刺激に続いてその転写を調べた。ＰＲ  ｍＲＮＡは、組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５の何れかによる刺激の９６時間後に検出された（図５ｂ）。
【００４６】
ひとたび、組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５が、ＥＲαを上方制御し、それが実際に活性があり、且つ下流シグナリングを可能であったことが確立されたならば、ＥＲαネガティブ乳癌細胞におけるデータの臨床的な適合は、選択的エストロゲンレセプターモジュレータに対して正常に反応しない細胞が、タモキシフェンを使用して探索される（１、４）。細胞は、組み換えＷｎｔ−５ａおよびＦｏｘｙ−５で２４および４８時間で刺激されるか、または刺激されず、且つタモキシフェンが実験の最後の２０時間に亘り添加された。タモキシフェンの活性機序は未だに完全に明瞭にされていないが、しかしながら、ＥＲαポジティブ乳房上皮細胞の治療が、視覚的またはアポトーシス経路における重要なタンパク質の分析によって評価されるアポトーシスを生じることが知られている（３）。組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５での２４および４８時間の刺激に続くタモキシフェンに対する応答において、第１に、ヘキスト染色が行われ、続いて、（クロマチンの凝縮および断片化として観察される）核の形態的な変化を示すアポトーシス細胞が直接に観察される（図６ａ）。アポトーシスにおけるタモキシフェンの真の影響が過小評価されているために、アポトーシス細胞死の大部分が剥離するという事実が、このアッセイを最適以下にする。アッセイの感受性を改善し、且つこのアポトーシスがカスパーゼ経路により生じているのか否かを決定するために、次に本発明者らは、切断されたカスパーゼ３の発現について、溶媒単独、または組み換えＷｎｔ−５ａ若しくはＦｏｘｙ−５およびタモキシフェンの何れかで刺激された細胞からの溶解産物を調査した。本発明者らは、Ｗｎｔ−５ａシグナリング細胞において、タモキシフェン単独で処理された細胞よりも高いレベルの切断されたカスパーゼ３を検出した（図６ｂ）。これらの効果を定量するために、本発明者らは、次に蛍光定量的アッセイによりカスパーゼ３の活性について調査した（図６ｃ）。未処理細胞またはタモキシフェン単独で処置された細胞と比較した場合、組み換えＷｎｔ−５ａとタモキシフェンでの細胞の刺激はアポトーシスの程度を２倍に増加し、Ｆｏｘｙ−５およびタモキシフェンでの刺激はアポトーシスの程度を大凡３倍に増加した。我々は、カスパーゼ実験において、ＭＣＦ−７細胞を含めなかったが、これはそれらがカスパーゼ３の発明をしないことが歩行腐れているからである。この試験は、我々に、Ｗｎｔ−５ａシグナリングの誘導とタモキシフェン処理に続いて、アポトーシス経路に駆り立てられた細胞の再現性のある増加を明瞭に観察することを可能にした。また成功したタモキシフェン治療も細胞増殖を阻害する結果を生じることが知られているが、我々は、ＭＴＴ増殖アッセイを用いて我々の細胞を更に分析した（図６Ｄ）。ｒＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５の何れかで処理され、次にタモキシフェンで処理された細胞は、タモキシフェン単独で処理された細胞と比較して、統計学的に有意差のある増殖阻害を示した（図６Ｄ）。ｒＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５の何れも、乳癌細胞の増殖において単独で効果を持つものはなかった。ｒＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５で処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるタモキシフェンの効果は、ＥＲαポジティブＭＣＦ−７細胞株において見られたタモキシフェン誘導性の効果と酷似していた（図６Ｄ）。
【００４７】
次に、ＥＲ結合フラグメント関連抗原９（ＥＢＡＧ９）およびカテプシンＤ（ＣＡＴＤ）遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析した。これらの遺伝子の両方が、ヒトエストロゲン応答性遺伝子であると言われており、それは、これらが直接にＥＲα結合を介して制御され、且つそれらのｍＲＮＡ発現が活性なエストロゲンレセプターを示すからである。以前の実験は、ＥＲαタンパク質が、組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５での刺激の２４〜４８時間後に上方制御されることを示した。従って、ＥＲαが上方制御されるために十分な時間が経過した後に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をホルモン非含有培地において成長させ、リガンドエストラジオールで刺激すると、下流の標的、ＥＢＡＧ９およびカテプシンＤの転写が可能になる。成長の最後の２０時間に亘るタモキシフェンの添加は、レセプターに対するリガンドの結合を阻害し、続いて、下流の標的のＥＲＥ（エストロゲンレセプターエレメント）に対して複合体が結合し、それによりこれらの遺伝子の発現が４８時間の時点でももはや観察されない。サンプルを、組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５の何れかでの前処理に続いて、タモキシフェンを同時処理した場合、エストラジオール誘導性のＣＡＴＤおよびＥＢＡＧ９の発現は、一貫して４８時間で消失した（図７）。幾つかの場合において、カテプシンＤ（ＣＡＴＤ）の発現は２４時間の時点でも消失したが、しかしながら、これは繰り返された実験において様々であった。この結果は、ＥＲαネガティブ乳癌細胞におけるＷｎｔ−５ａシグナリングの回復が、ＥＲα発現の上方制御と活性化をするのみならず、またＥＲα標的遺伝子がタモキシフェン依存性に抑制されることも示す。
【００４８】
乳癌患者のためのＦｏｘｙ−５のポテンシャルな利点の観点において、本発明者らは、インビボ試験をマウス転移乳癌モデル（９）におけるＦｏｘｙ−５媒介性のＷｎｔ−５ａシグナリングの回復の効果について行った。それらは、当該研究からの動物実験の１シリーズからの初代乳房腫瘍について調査し、Ｆｏｘｙ−５がインビボにおいてＥＲαを上方制御するか否かを測定した。乳房脂肪パッドに、急速転移性のＥＲαネガティブ４Ｔ１細胞を接種されたＢａｌｂ／Ｃマウスを、ＰＢＳ単独、ランダムコントロールペプチド（Ｒｄｍ）、またはＦｏｘｙ−５の何れかで４日目毎に２５日間に亘り処理した。ＰＢＳ単独またはＲｄｍコントロールペプチドで処理された動物からの腫瘍とは対照的に、Ｆｏｘｙ−５で処理された動物からの腫瘍は、強いＥＲα発現を示した（図８）。この実験は、Ｆｏｘｙ−５がＥＲαネガティブ乳癌において、インビボでＥＲαを上方制御できることを明瞭に示す。
【００４９】
考察
乳癌の治療に使用される主要な薬物、タモキシフェンは、主としてＥＲαを介してその効果を媒介する。ＥＲαの発現が内分泌療法の臨床的応答に強く関連している。ＥＲαネガティブ乳癌は、タモキシフェンに対して感受性がないばかりではなく、より攻撃性でもあり、且つ総合的に予後が不十分でもある。これ故に、この患者群を対象とする新たな治療方法が重要である。本書類において、本発明者らは、乳房上皮細胞における天然の細胞表面レセプターの関与が、ＥＲαネガティブ乳癌細胞におけるＥＲαの発現を再構築することを初めて報告する。これはＥＲαネガティブ乳癌患者の更なる治療に関して臨床的に高い重要性をもつ。
【００５０】
我々の研究室からの以前の研究は、ＥＲαの状態とＷｎｔ−５ａの発現との関連を臨床的な乳癌同齢集団において示した。Ｗｎｔ−５ａ発現の損失は、乳房腫瘍の組織学的により高いグレードと、ＥＲαの不在とに有意に関連していることが示された（２）。ここにおいて、本発明者らは、３つの異なるＥＲαネガティブ乳癌細胞株を、組み換えＷｎｔ−５ａまたはＷｎｔ−５ａ誘導性Ｆｏｘｙ−５ペプチドの何れかで刺激することがＥＲα発現を増やす結果を導くことを報告する。
【００５１】
ヒト乳癌におけるＥＲαの発現の損失がもっとも頻繁にＥＲαプロモーターのメチル化によるものであることが、現在、認識されている（８）。この研究において使用されたＥＲαとＷｎｔ−５ａ発現を欠くＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、プロモーター領域におけるＣｐＧアイランドのそのようなメチル化のためにサイレンシングされたＥＲαを有すると記載されている。他には、ＨＤＡＣおよびＤＮＭＴインヒビターの添加によるこれらの細胞におけるＥＲαシグナリングを回復しすることが試みられ、Ｗｎｔ−５ａシグナリングを切っ掛けにして本発明者らが観察した同じ結果を生じている（３）。我々の知見は、Ｗｎｔ−５ａシグナリングがＥＲαネガティブ細胞においてＥＲプロモーターをメチル化するために作用するという考え方は一致するが、このＷｎｔ−５ａ誘導性のＥＲα上方制御の背後の連続的発現の機序は調査されるべきままである
上方制御されたＥＲαはまた、Ｓｅｒ１１８残基においてリン酸化され、且つプロゲステロンレセプターの転写を誘導することが可能であり、活性且つシグナル伝達するＥＲαを示す。組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５の両方が、機能的ＥＲαの回復することが可能であるという新規の知見は、我々を、これが選択的エストロゲンレセプターモジュレータ、タモキシフェンを利用する機能性アッセイを行うことにより臨床的に対応するかについて研究することに導く。ＥＲαネガティブ乳癌細胞を、組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５で刺激した、或いは未処理にしておき、次にＥＲαリガンドエストラジオールを添加し、且つ最後にタモキシフェンを添加し、それにより、Ｗｎｔ−５ａシグナリングが以前に非応答性の細胞にタモキシフェン治療に対する感受性を与えるか否かを測定した。これは、４つの方法において評価された。第１に、アポトーシス細胞をヘキスト染色により直接に観察した。第２に、アポトーシスタンパク質カスパーゼ３の発現の増加をウェスタンブロットにより観察したが、カスパーゼ３は、アポトーシスの誘導において切断される。これは、蛍光定量的なカスパーゼ３活性アッセイを使用して定量的に確認した。最後に、ＥＲαの下流標的遺伝子のタモキシフェン誘導性の抑制を観察した。全ての機能性アッセイは、組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５およびタモキシフェンでの刺激に続くアポトーシスの増加に同じ傾向があることを報告した；しかしながら、カスパーゼ３活性アッセイは、最も劇的な増加を示した。これは恐らく、接着細胞と同様に上清中の死細胞を測定するアッセイの設計に帰するものである。
【００５２】
我々の研究室において開発されたＷｎｔ−５ａ誘導性Ｆｏｘｙ−５ホルミル化ヘキサペプチドは、当該実験における組み換えＷｎｔ−５ａと同程度にＥＲα発現を制御することが可能であった。このペプチドは、明白な臨床的ポテンシャルを有し、これは組み換えＷｎｔ−５ａタンパク質を超える患者の使用のための多くの利点を有しているからである。Ｗｎｔ−５ａは、細胞表面ヘパラン硫酸に対して結合する特異的なドメインを有し、生体でのＷｎｔ−５ａの分布を著しく制限するので、乳癌患者に対して直接にＷｎｔ−５ａを投与することは、成功の見込みはない。また、Ｗｎｔ−５ａは、比較的大きなタンパク質であり（４３ｋＤａ）、そのため、小さい分子、例えば、ヘパラン硫酸結合ドメインを欠き、また更にＥＲα発現の機能的効果を模倣できるＦｏｘｙ−５などを利用することの方がより魅力的であろう。
【００５３】
天然の細胞表面レセプターを活性化することによりＥＲα発現を再編成するという新規なアプローチは、腫瘍を現行の内分泌治療に対して応答性にするために、この一般的な疾患の臨床的管理のために著しく重要である。Ｗｎｔ−５ａ模倣ヘキサペプチドと現在入手可能なＥＲαモジュレータとの調和性の治療は、ＥＲαネガティブ腫瘍をもつ乳癌患者のための新規、且つ有益な治療戦略に示し得るものである。
【００５４】
＜参考文献＞
1. Giacinti L, Claudio PP, Lopez M, Giordano A. Epigenetic information and estrogen receptor alpha expression in breast cancer. Oncologist 2006;11:1-8.
2. Jonsson M, Dejmek J, Bendahl PO, Andersson T. Loss of Wnt-5a protein is associated with early relapse in invasive ductal breast carcinomas. Cancer Research 2002;62:409-16.
3. Sharma D, Saxena NK, Davidson NE, Vertino PM. Restoration of tamoxifen sensitivity in estrogen receptor-negative breast cancer cells: tamoxifen-bound reactivated ER recruits distinctive corepressor complexes. Cancer Res 2006;66:6370-8.
4. Sharma D, Blum J, Yang X, Beaulieu N, Macleod AR, Davidson NE. Release of methyl CpG binding proteins and histone deacetylase 1 from the Estrogen receptor alpha (ER) promoter upon reactivation in ER-negative human breast cancer cells. Mol Endocrinol 2005;19:1740-51.
5. Bandyopadhyay A, Wang L, Chin SH, Sun LZ. Inhibition of skeletal metastasis by ectopic ERalpha expression in ERalpha-negative human breast cancer cell lines. Neoplasia 2007;9:113-8.
6. Jang ER, Lim SJ, Lee ES, et al. The histone deacetylase inhibitor trichostatin A sensitizes estrogen receptor alpha-negative breast cancer cells to tamoxifen. Oncogene 2004;23:1724-36.
7. Lejeune S, Huguet EL, Hamby A, Poulsom R, Harris AL. Wnt5a cloning, expression, and up-regulation in human primary breast cancers. Clinical Cancer Research 1995;1:215-22.
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9. Safholm A, et al. (2008) A Wnt-5a-Derived Hexapeptide F5 Inhibits Breast Cancer Metastasis In vivo by Targeting Cell Motility. Clin Cancer Res 14:6556-6563.
10. Green S, et al. (1986) Human oestrogen receptor cDNA: sequence, expression and homology to v-erb-A. Nature 320(6058):134-139.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図６ｃｏｎｔ】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年2月23日(2011.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を６ウェルプレートで成長させ、組み換えＷｎｔ−５ａタンパク質（ｒＷ５ａ）またはＷｎｔ−５ａ誘導Ｆｏｘｙ−５ペプチド（Ｆ５）で２４または４８時間に亘り刺激した。細胞をタモキシフェンで最後の２０時間について処理をし、それらのアポトーシス応答を異なる方法により測定した。Ａ：処理された細胞をヘキスト（Hoechst）で染色し、処置当たりの核に形態学的な変化を示すアポトーシス細胞を視覚的に評価した。矢印はアポトーシス細胞を強調する。スケールバーは１０μＭを表す。Ｂ：ｒＷ５ａ、Ｆ５およびタモキシフェン、またはタモキシフェン単独での処理に続き、細胞を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に移し、切断されたカスパーゼ３についてブロットした。Ｃ：処理された細胞をそれらの相対的なカスパーゼ３活性について蛍光分光学的に評価した。グラフは、６つの個別の試験を表す。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７】図７：ＥＲαにより直接に制御された遺伝子の発現は、タモキシフェン処理により失われる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
ひとたび、組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５が、ＥＲαを上方制御し、それが実際に活性があり、且つ下流シグナリングを可能であったことが確立されたならば、ＥＲαネガティブ乳癌細胞におけるデータの臨床的な適合は、選択的エストロゲンレセプターモジュレータに対して正常に反応しない細胞が、タモキシフェンを使用して探索される（１、４）。細胞は、組み換えＷｎｔ−５ａおよびＦｏｘｙ−５で２４および４８時間で刺激されるか、または刺激されず、且つタモキシフェンが実験の最後の２０時間に亘り添加された。タモキシフェンの活性機序は未だに完全に明瞭にされていないが、しかしながら、ＥＲαポジティブ乳房上皮細胞の治療が、視覚的またはアポトーシス経路における重要なタンパク質の分析によって評価されるアポトーシスを生じることが知られている（３）。組み換えＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５での２４および４８時間の刺激に続くタモキシフェンに対する応答において、第１に、ヘキスト染色が行われ、続いて、（クロマチンの凝縮および断片化として観察される）核の形態的な変化を示すアポトーシス細胞が直接に観察される（図６ａ）。アポトーシスにおけるタモキシフェンの真の影響が過小評価されているために、アポトーシス細胞死の大部分が剥離するという事実が、このアッセイを最適以下にする。アッセイの感受性を改善し、且つこのアポトーシスがカスパーゼ経路により生じているのか否かを決定するために、次に本発明者らは、切断されたカスパーゼ３の発現について、溶媒単独、または組み換えＷｎｔ−５ａ若しくはＦｏｘｙ−５およびタモキシフェンの何れかで刺激された細胞からの溶解産物を調査した。本発明者らは、Ｗｎｔ−５ａシグナリング細胞において、タモキシフェン単独で処理された細胞よりも高いレベルの切断されたカスパーゼ３を検出した（図６ｂ）。これらの効果を定量するために、本発明者らは、次に蛍光定量的アッセイによりカスパーゼ３の活性について調査した（図６ｃ）。未処理細胞またはタモキシフェン単独で処置された細胞と比較した場合、組み換えＷｎｔ−５ａとタモキシフェンでの細胞の刺激はアポトーシスの程度を２倍に増加し、Ｆｏｘｙ−５およびタモキシフェンでの刺激はアポトーシスの程度を大凡３倍に増加した。我々は、カスパーゼ実験において、ＭＣＦ−７細胞を含めなかったが、これはそれらがカスパーゼ３を発現しないことが報告されているからである。この試験は、我々に、Ｗｎｔ−５ａシグナリングの誘導とタモキシフェン処理に続いて、アポトーシス経路に駆り立てられた細胞の再現性のある増加を明瞭に観察することを可能にした。ｒＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５の何れも、乳癌細胞の増殖において単独で効果を持つものはなかった。ｒＷｎｔ−５ａまたはＦｏｘｙ−５で処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるタモキシフェンの効果は、ＥＲαポジティブＭＣＦ−７細胞株において見られたタモキシフェン誘導性の効果と酷似していた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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