(57)【要約】  本発明は、癌の診断における新規な単離された抗ＣＸＣＲ４抗体の使用に関する。特に、ＣＸＣＲ４発現に関連する腫瘍形成性障害の診断および／または予後のための方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣＲ４発現腫瘍の存在および／または位置の検出において使用するための、下記を含んでなる抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体：
ｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖、および
ｉｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖。
【請求項２】
下記から選択される、請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体：
ａ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、配列番号８の配列を含んでなる軽鎖可変領域とを有する抗体、
ｂ）配列番号７の配列を含んでなる重鎖可変領域と、次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを有する抗体、または
ｃ）配列番号７の配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号８の配列を含んでなる軽鎖可変領域とを有する抗体。
【請求項３】
ＣＸＣＲ４の発現に関連する腫瘍形成性障害のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ診断または予後において使用するための、請求項１または２に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体。
【請求項４】
前記抗体がｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を持たない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体。
【請求項５】
被験体におけるＣＸＣＲ４発現腫瘍の存在および／または位置をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで検出するための方法であって、
（ａ）前記被験体由来の生体サンプルを、ＣＸＣＲ４と特異的に結合することができる抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と接触させる工程、および
（ｂ）前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と、前記生体サンプルとの結合を検出する工程
を含んでなり、
前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体が、ｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、ｉｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなる、方法。
【請求項６】
被験体におけるＣＸＣＲ４を発現する細胞の割合をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで検出するための方法であって、
（ａ）前記被験体由来の生体サンプルを、ＣＸＣＲ４と特異的に結合することができる抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と接触させる工程、および
（ｂ）前記生体サンプルにおいてＣＸＣＲ４を発現する細胞の割合を定量する工程
を含んでなり、
前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体が、ｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、ｉｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項７】
被験体由来のＣＸＣＲ４発現腫瘍におけるＣＸＣＲ４の発現レベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定するための方法であって、
（ａ）前記被験体由来の生体サンプルを、ＣＸＣＲ４と特異的に結合することができる抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と接触させる工程、および
（ｂ）前記生体サンプルにおいて前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体とＣＸＣＲ４との結合レベルを定量する工程
を含んでなり、
前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体が、ｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、ｉｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項８】
前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体とＣＸＣＲ４との結合レベルが、優先的には蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）により測定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＸＣＲ４発現腫瘍のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ診断または予後の方法であって、
（ａ）ＣＸＣＲ４の発現レベルを請求項７または８の記載に従って決定する工程、および
（ｂ）工程（ａ）の発現レベルを、正常組織またはＣＸＣＲ４非発現組織からのＣＸＣＲ４の参照発現レベルと比較する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１０】
被験体の腫瘍スコアをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定するための方法であって、
（ａ）前記被験体由来の生体サンプルを、ＣＸＣＲ４と特異的に結合することができる抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と接触させる工程、
（ｂ）前記生体サンプルにおいて前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と、ＣＸＣＲ４との結合レベルを定量する工程、および
（ｃ）前記被験体からの、前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の定量された結合レベルを適当な尺度と比較することにより、腫瘍をスコア化する工程
を含んでなり、
前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体が、ｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、ｉｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項１１】
前記適当な尺度が、染色強度と陽性細胞の割合である２つのパラメーターに基づく、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記適当な尺度が、無反応性を０とし、および６７〜１００％の割合の強い反応性を８とする０〜８の尺度である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
下記の工程を含んでなる、被験体由来の腫瘍の状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定するための方法：
（ａ）被験体由来の腫瘍を、請求項１０、１１または１２のいずれか一項の記載に従ってスコア化する工程、および
（ｂ）スコアが３〜８である場合に、腫瘍の状態が［ＣＸＣＲ４（＋）］であると決定する工程、または
（ｃ）スコアが０〜２である場合に、腫瘍の状態が［ＣＸＣＲ４（−）］であると決定する工程。
【請求項１４】
前記適当な尺度が、腫瘍細胞の膜無反応性を０とし、１０％を超える腫瘍細胞における強い完全な反応性を３＋とする０〜３＋の尺度である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１５】
下記の工程を含んでなる、被験体由来の腫瘍の状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定するための方法：
（ａ）被験体由来の腫瘍を、請求項１０、１１、または１４の記載に従ってスコア化する工程、および
（ｂ）スコアが２＋または３＋である場合に、腫瘍の状態が［ＣＸＣＲ４（＋）］であると決定する工程、または
（ｃ）スコアが０または１＋である場合に、腫瘍の状態が［ＣＸＣＲ４（−）］であると決定する工程。
【請求項１６】
下記工程を含んでなる、腫瘍形成性障害が、抗ＣＸＣＲ４抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体による処置に感受性があるか否かを決定するための方法：
（ａ）被験体の腫瘍のＣＸＣＲ４状態を、請求項１３または１５の記載に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定する工程、および
（ｂ）前記状態がＣＸＣＲ４（＋）である場合に、前記腫瘍形成性障害は抗ＣＸＣＲ４抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体による処置に感受性があると決定する工程。
【請求項１７】
下記工程を含んでなる、治療量のＣＸＣＲ４阻害剤の投与から利益を受ける、または受けないと予測される癌患者を選択するための方法：
（ａ）前記ＣＸＣＲ４の発現レベルを請求項７または８に記載の方法に従って決定する工程、
（ｂ）前工程ａ）の発現レベルを参照発現レベルと比較する工程、および
（ｃ）（ａ）で得られた発現レベルの参照発現レベルに対する比が１より大きい場合に、その患者をＣＸＣＲ４阻害剤の治療的投与から利益を受けると予測されるとして選択する工程、または
（ｄ）（ａ）で得られた発現レベルの参照発現レベルに対する比が１以下である場合に、その患者をＣＸＣＲ４阻害剤の治療的投与から利益を受けると予測されないとして選択する工程。
【請求項１８】
下記工程を含んでなる、ＣＸＣＲ４に関連する腫瘍形成性障害に罹患している被験体において、前記障害を緩和するように計画された治療計画の有効性をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定するための方法：
（ａ）前記処置の第一の時点に相当する第一の生体サンプルにおいて、ＣＸＣＲ４の第一の発現レベルを請求項７または８の記載に従って決定する工程、
（ｂ）前記処置の後の第二の時点に相当する第二の生体サンプルにおいて、ＣＸＣＲ４の第二の発現レベルを請求項７または８の記載に従って決定する工程、
（ｃ）工程（ａ）で得られた前記第一の発現レベルの、工程（ｂ）で得られた前記第二の発現レベルに対する比を計算する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）の比が１より大きい場合に、前記治療計画の有効性が高いと決定する工程、または
（ｅ）工程（ｃ）の比が第二の発現レベル以下であるか、または統計学的に同等である場合に、前記治療計画の有効性が低いと決定する工程。
【請求項１９】
ＣＸＣＲ４に関連する腫瘍形成性障害に罹患している被験体において、前記障害を緩和するように設計された治療計画が、ＣＸＣＲ４阻害剤を前記被験体に投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
下記の少なくとも一つを含んでなる、ＣＸＣＲ４発現腫瘍の存在および／または位置を検出するためのキット：
ａ）ｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、ｉｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなる抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体、
ｂ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、配列番号８の配列を含んでなる軽鎖可変領域とを有する抗体、
ｃ）配列番号７の配列を含んでなる重鎖可変領域と、次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを有する抗体、
ｄ）配列番号７の配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号８を含んでなる軽鎖可変領域とを有する抗体。
一つ
【請求項２１】
前記抗体が標識されている、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記抗体と、ＣＸＣＲ４との間の結合の程度を検出するための試薬をさらに含んでなる、請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記抗体と、ＣＸＣＲ４との間の結合のレベルを定量するための試薬をさらに含んでなる、請求項２０または２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
ｉ）前記抗体と、ＣＸＣＲ４との間の結合の程度を検出するための試薬、および
ｉｉ）ＣＸＣＲ４発現レベルをスコア化するために有用な陽性および陰性対照サンプル
をさらに含んでなる、請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項２５】
ネズミ抗体に特異的なポリクローナル抗体をさらに含んでなり、前記ポリクローナル抗体は好ましくは標識されている、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
ｉ）前記抗体と、ＣＸＣＲ４との間の結合の程度を検出するために有用な試薬、
ｉｉ）ＣＸＣＲ４阻害剤に対する感受性と相関させた対照レベル、および／または
ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４阻害剤に対する耐性と相関させた対照レベル
をさらに含んでなる、請求項２０または２１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、患者における増殖性疾患の予後および／または診断および／または治療モニタリングの分野に関する。より詳細には、本発明は、ＣＸＣＲ４と特異的に結合することができる抗体、ならびにＣＸＣＲ４の発現に関連する病的過剰増殖性腫瘍形成性障害を検出および診断するための前記抗体の使用、および対応する方法を含んでなる。特定の実施形態では、前記障害は、通常より高いＣＸＣＲ４の発現に関連する腫瘍形成性障害、またはＣＸＣＲ４の過剰発現と関係がある他の任意の病態である。本発明は最後に、ある特定の癌の予後および／または診断および／または治療モニタリングのための、少なくともこのような抗体を含んでなる生成物および／または組成物またはキットを含んでなる。
【０００２】
ケモカインは、特に免疫反応中に、ケモカイン勾配として知られるリガンドの化学的勾配に沿った白血球の遊走を制御する小型の分泌型ペプチドである(Zlotnick A. et al., 2000)。ケモカインは、それらのＮＨ２末端システイン残基の位置に基づいてＣＣおよびＣＸＣという２つの主要なサブファミリーに分かれ、Ｇタンパク質共役受容体と結合し、その２つの主要なサブファミリーはＣＣＲおよびＣＸＣＲと呼ばれている。これまでに５０を超えるヒトケモカインと１８のケモカイン受容体が見出されている。
【０００３】
多くの癌が、腫瘍の免疫細胞浸潤ならびに腫瘍細胞の増殖、生存、遊走および血管新生に影響を与える複雑なケモカインネットワークを有する。免疫細胞、内皮細胞および腫瘍細胞はそれら自体ケモカイン受容体を発現し、ケモカイン勾配に応答することができる。ヒト癌生検サンプルおよびマウス癌モデルの研究により、癌細胞のケモカイン受容体発現が転移能の上昇に関連することが示されている。異なる種類の癌に由来する悪性細胞ではケモカイン受容体発現プロフィールが異なるが、ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）が最も多く見られる。上皮、間葉および造血起源の少なくとも２３種類の異なる種類のヒト癌細胞がＣＸＣＲ４受容体を発現する(Balkwill F. et al., 2004)。
【０００４】
ケモカイン受容体４（フシン(fusin)、ＣＤ１８４、ＬＥＳＴＲまたはＨＵＭＳＴＲとしても知られている）は、３５２または３６０のアミノ酸を含んでなる２種類のアイソフォームとして存在する。アイソフォームａはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１００８５４０として表されるアミノ酸配列を有し、アイソフォームｂはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００３４５８として表されるアミノ酸配列を有する。残基Ａｓｎ１１はグリコシル化されており、残基Ｔｙｒ２１は硫酸基の付加によって修飾されており、Ｃｙｓ１０９および１８６は受容体の細胞外部分でジスルフィド架橋により結合している(Juarez J. et al., 2004)。
【０００５】
この受容体は、様々な種類の正常組織、ナイーブ、非記憶Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、好中球、内皮細胞、一次単球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞によって、また、低レベルではあるが心臓、結腸、肝臓、腎臓および脳において発現される。ＣＸＣＲ４は、白血球輸送、Ｂ細胞リンパ球生成および骨髄造血に重要な役割を果たす。
【０００６】
ＣＸＣＲ４受容体は、限定されるものではないが、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、結腸癌(Ottaiano A. et al., 2004)、乳癌(Kato M. et al., 2003)、前立腺癌(Sun Y.X. et al., 2003)、肺癌［小細胞および非小細胞癌(Phillips R.J. et al., 2003)］、卵巣癌（Scotton C.J. et al., 2002）、膵臓癌(Koshiba T. et al., 2000)、腎臓癌、脳腫瘍(Barbero S et al., 2002)、膠芽腫およびリンパ腫を含む多数の癌で過剰発現される。
【０００７】
これまでに記載されているＣＸＣＲ４受容体のユニークなリガンドは、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）またはＣＸＣＬ１２である。ＳＤＦ−１は、リンパ節、骨髄、肝臓、肺において多量に、また少量であるが腎臓、脳および皮膚によっても分泌される。ＣＸＣＲ４はまた、拮抗性のケモカイン、ヒトＩＩＩ型ヘルペスウイルスによってコードされるウイルスマクロファージ炎症性タンパク質ＩＩ（ｖＭＩＰ−ＩＩ）によっても認識される。
【０００８】
ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１軸は、癌において重要な役割を果たしており、転移を生じる遊走、浸潤に直接関与している。実際に、癌細胞はＣＸＣＲ４受容体を発現し、それらは遊走して体循環へと入る。次いで、癌細胞は、高レベルのＳＤＦ−１を産生する臓器の血管床に拘束され、そこで増殖し、血管新生を誘導し、転移腫瘍を形成する(Murphy PM., 2001)。この軸は、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）経路の活性化(Barbero S. et al., 2003)および血管新生(Romagnani P., 2004)を介する細胞増殖にも関与している。実際に、ＣＸＣＲ４受容体およびそのリガンドＳＤＦ−１は、ＶＥＧＦ−Ａ発現を刺激することによって明らかに血管新生を促進し、次いで、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１の発現を増強する(Bachelder R.E. et al., 2002)。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、腫瘍の低酸素領域に蓄積し、刺激されて、腫瘍細胞と協同して血管新生を促進することも知られている。低酸素症は、ＴＡＭを含む様々な細胞種におけるＣＸＣＲ４の発現を選択的にアップレギュレートすることが観察された(Mantovani A. et al., 2004)。ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１軸は、ＣＸＣＲ４＋造血幹／前駆細胞（ＨＳＣ）の輸送／ホーミングを調節し、新血管形成において一役を担っている可能性があることが最近になって証明された。ＨＳＣの他に、機能性ＣＸＣＲ４は、他の組織由来の幹細胞（組織コミット幹細胞(tissue-committed stem cell)＝ＴＣＳＣ）でも発現されるので、ＳＤＦ−１は臓器／組織再生に必要なＣＸＣＲ４＋ＴＣＳＣの化学誘引に中枢的役割を果たしている可能性があるが、これらのＴＣＳＣは癌発生の細胞起源でもあり得る（癌幹細胞理論）ことを示す証拠がある。癌の幹細胞起源は、ヒト白血病について、また最近では脳腫瘍および乳癌などの数種の固形腫瘍について実証されている。白血病、脳腫瘍、小細胞肺癌、乳癌、肝芽腫、卵巣癌および子宮頸癌など、正常なＣＸＣＲ４＋組織／臓器特異的幹細胞に由来する可能性のある数例のＣＸＣＲ４＋腫瘍がある(Kucia M. et al., 2005)。
【０００９】
ＣＸＣＲ４受容体に干渉することによる癌転移の標的化が、ＣＸＣＲ４受容体に対するモノクローナル抗体を用いることによってｉｎ  ｖｉｖｏで実証された(Muller A. et al., 2001)。簡単に述べれば、ＣＸＣＲ４受容体に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ  １７３  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＳＣＩＤマウスでの同所性乳癌モデル（ＭＤＡ−ＭＢ２３１）においてリンパ節転移の数を有意に減少させることが示された。もう一つの研究(Phillips R.J et al., 2003)でも、ＳＤＦ−１に対するポリクローナル抗体を用いる同所性肺癌モデル（Ａ５４９）における転移でのＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４軸の決定的役割が示されたが、この研究では、腫瘍増殖にも血管新生にも効果はなかった。いくつかの他の研究では、ＣＸＣＲ４の二本鎖ｓｉＲＮＡ(Liang Z. et al., 2005)、生体安定性ＣＸＣＲ４ペプチド拮抗薬(Tamamura H. et al., 2003)を用いるｉｎ  ｖｉｖｏでの転移か、またはＡＭＤ３１００(Rubin J.B. et al., 2003、 De Falco V. et al., 2007)もしくはＭａｂ（特許ＷＯ２００４／０５９２８５Ａ２）のようなＣＸＣＲ４の小分子拮抗薬を用いるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍増殖のいずれかの抑制も記載されている。従って、ＣＸＣＲ４は、癌に対するバリデート済みの治療標的である。
【００１０】
もう一つのケモカイン受容体であるケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）も、腫瘍学における興味深い標的として記載されている。実際に、ＣＸＣＲ２は、数種の腫瘍細胞で自己分泌細胞増殖シグナルを伝達し、血管新生を促進することにより間接的に腫瘍増殖に影響を及ぼすこともできる(Tanaka T. et al. 2005)。
【００１１】
ＣＸＣＲ２ケモカイン受容体は、３６０個のアミノ酸を包含する。それは、主として内皮細胞内で、特に新血管形成中に発現する。いくつかのケモカインは、ＥＲＬ＋血管新生誘発ケモカインに属するＣＸＣＲ２受容体であるＣＸＣＬ５、−６、−７、ＩＬ−８、ＧＲＯ−α、−βおよびγと結合する。ＣＸＣＲ２受容体は、ＣＸＣＲ４受容体と配列相同性を有しており、配列同一性は３７％、配列相同性４８％である。ＣＸＣＲ２／リガンド軸は、転移(Singh RK. et al., 1994)、細胞増殖(Owen J.D. et al., 1997)などのいくつかの腫瘍増殖機構およびＥＲＬ＋ケモカイン介在血管新生(Strieter R.M. et al., 2004)に関与している。最後に、腫瘍関連マクロファージおよび好中球は、炎症誘導性の腫瘍増殖の重要な要素であり、ＣＸＣＬ５、ＩＬ−８およびＧＲＯ−αなどのケモカインは、好中球動員を誘発する。
【００１２】
Ｇタンパク質共役受容体（これらの中にケモカイン受容体がある）の機能を調節するための一般機構として二量体化が明らかになっている(Wang J. and Norcross M., 2008)。ケモカイン結合に応答するホモおよびヘテロ二量体化は、多数のケモカイン受容体によるシグナル伝達の開始および変更に必要とされることが示されている。受容体二量体またはオリゴマーはおそらくケモカイン受容体の基本機能単位であるという概念を裏付ける証拠が増えてきている。ケモカイン受容体二量体はリガンドの非存在下で見出されており、ケモカインは、受容体二量体のコンフォメーション変化を誘導する。ＣＸＣＲ４は、ホモ二量体を形成することが知られているが、例えば、δ−オピオイド受容体（ＤＯＲ）(Hereld D., 2008)またはＣＣＲ２(Percherancier Y. et al., 2005)とのヘテロ二量体を形成することも知られている。後者の例では、ＣＸＣＲ４のトランスメンブラン領域由来のペプチドは、二量体のリガンド誘導コンフォメーション遷移を遮断することにより活性化を阻害した(Percherancier Y. et al., 2005)。別の研究では、ＣＸＣＲ４のトランスメンブラン領域の合成ペプチドであるＣＸＣＲ４−ＴＭ４ペプチドが、ＣＸＣＲ４ホモ二量体のプロモーター間のエネルギー移動を減少させ、悪性細胞におけるＳＤＦ−１誘導性の遊走およびアクチン重合を阻害することが示された(Wang J. et al., 2006)。さらに最近では、ＣＸＣＲ７はＣＸＣＲ４と機能的ヘテロ二量体を形成し、ＳＤＦ−１誘導性のシグナル伝達を増強することも記載れている(Sierro F. et al., 2007)。構成的ヘテロ二量体の他の例としては、ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２の相互作用を示すとともに、それぞれのホモ二量体を形成する研究が挙げられる。それらのいずれについても別のＧＰＣＲ（α（１Ａ）−アドレナリン受容体）との相互作用は見られなかったが、このことはＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２の相互作用の特異性を示し(Wilson S. et al., 2005)。
【００１３】
上述のように、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２受容体は、興味深い腫瘍標的である。これらの受容体に干渉することで、腫瘍細胞の増殖、血管新生、腫瘍細胞の遊走および浸潤、腫瘍による好中球およびマクロファージの動員を減少させることにより、また、ＣＸＣＲ４癌幹細胞を阻害することにより、腫瘍増殖および転移が極めて効率的に阻害されるはずである。
【００１４】
ＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体の両方に結合してそれにコンフォメーション変換を誘発し、強い抗腫瘍活性を有する２つのモノクローナル抗体（５１５Ｈ７および４１４Ｈ５と呼ばれる）が従前に同定されている（ ＷＯ２０１０／０３７８３１参照）。さらに、本出願者は、このようなＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体の存在を証明している。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、腫瘍形成性障害の診断または予後ツールとして使用することができる、癌モデルにおいていずれのｉｎ  ｖｉｖｏ活性も欠く少なくとも一つの試薬、特に、ＣＸＣＲ４の発現を特徴とするものまたは異常なＣＸＣＲ４発現により媒介されるものを提供することを目的とする。
【００１６】
公開特許出願 ＷＯ２０１０／１２５１６２号は、５１５Ｈ７および３０１ａＥ５と呼ばれる２つの抗ＣＸＣＲ４モノクローナル抗体、ならびにＨＩＶ治療の分野におけるそれらの使用を開示している。
【００１７】
驚くことに、本発明者らは、今般、前記抗体３０１ａＥ５（本明細書では３０１Ｅ５Ｔとも呼ばれ、またはより好ましくは、寄託ハイブリドーマＩ−３８５９を参照：本出願に関しては、これらの用語は同等である）は、強い抗腫瘍活性を提供する他の抗体５１５Ｈ７（ ＷＯ２０１０／０３７８３１号に記載の通り）とは対照的に癌治療の分野においてｉｎ  ｖｉｖｏ活性を持たないことを実証した。特に、Ｉ−３８５９は、ＣＸＣＲ４リガンドと受容体との結合を妨げない。
【００１８】
さらに、本出願者らは、抗体Ｉ−３８５９が、
ｉ）単量体としてのＣＸＣＲ４を認識できること、
ｉｉ）ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体としてのＣＸＣＲ４を認識できること、
ｉｉｉ）ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体としてのＣＸＣＲ４を認識できること、
ｉｖ）細胞溶解液からＣＸＣＲ４を免疫沈降できること、
ｖ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によりＣＸＣＲ４発現細胞の表面でＣＸＣＲ４を認識できること、および
ｖｉ）免疫組織化学法によりＣＸＣＲ４を認識できること
を見出した。
【００１９】
抗体Ｉ−３８５９に関してこれまでに開示されたことのないこれらの新規な特性のために、本発明者らは、前記抗体がＣＸＣＲ４発現細胞、特に、ＣＸＣＲ４発現腫瘍細胞を同定するために使用可能であることを見出した。
【００２０】
よって、本発明は、ＣＸＣＲ４発現疾患の存在および／または位置を検出するための前記抗体の使用に関する。本発明は、次いで、ＣＸＣＲ４発現疾患の、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、診断および／または予後に利用することができる。好ましくは、前記ＣＸＣＲ４発現疾患は癌である。
【００２１】
本発明の抗体Ｉ−３８５９のもう一つの有利な特性は、それが治療用モノクローナル抗体５１５Ｈ７のエピトープに近接したエピトープを認識するということである。より詳細には、実験例に示されるように、Ｉ−３８５９は、治療用抗体５１５Ｈ７のそのエピトープへの結合と競合することができる。よって、前記Ｉ−３８５９抗体は、例えば５１５Ｈ７  Ｍａｂで処置すべき患者を選択するために使用することができる。特に、本発明の抗体Ｉ−３８５９は、患者の細胞表面に存在するＣＸＣＲ４のコンフォメーションが抗体５１５Ｈ７により認識されるコンフォメーションと類似している（すなわち、前記患者は５１５Ｈ７抗体に基づく療法に感受性があることを示す）ことを確認するために使用することができる。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例および図面を含む説明の中で明らかとなる。図面の説明を以下に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、Ｉ−３８５９  ＭａｂはＣＸＣＲ４単量体および二量体の両方を免疫沈降させることを示す。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、Ｉ−３８５９  ＭａｂはＣＸＣＲ４ホモ二量体（Ａ）およびＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体（Ｂ）の両方を調節することを示す。
【図３】図３は、ＦＡＣＳ分析により、Ｉ−３８５９  Ｍａｂは細胞膜におけるＣＸＣＲ４を認識することを示す。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、ＦＡＣＳ分析により、Ｉ−３８５９  Ｍａｂは、細胞膜におけるＣＸＣＲ４との結合に関して、抗ＣＸＣＲ４  ５１５Ｈ７治療用Ｍａｂとの競合状態に入ることを示す。
【図５】図５は、Ｉ−３８５９  Ｍａｂは無胸腺ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植腫瘍成長モデルに対して影響が無いことを示す。
【図６】図６は、ＲＡＭＯＳ異種移植腫瘍に対する、ａ）Ｉ−３８５９およびｂ）ｍＩｇＧ１を用いたＩＨＣ染色を示す。
【図７】図７は、ＫＡＲＰＡＳ２９９異種移植腫瘍に対する、ａ）Ｉ−３８５９およびｂ）ｍＩｇＧ１を用いたＩＨＣ染色を示す。
【発明の具体的説明】
【００２４】
本発明の第一の面は、ＣＸＣＲ４と高親和性で特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント（断片）もしくは誘導体に関し、前記抗体はいずれのｉｎ  ｖｉｖｏ活性も欠いている。前記単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＸＣＲ４発現により媒介される病的過剰増殖性腫瘍形成性障害の診断または予後のための方法に使用することができる。特に、前記単離された抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ画像法に使用することができる。好ましくは、本発明の単離された抗体はヒトＣＸＣＲ４と結合する。
【００２５】
好ましい実施形態では、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＸＣＲ４発現腫瘍の存在の検出において使用するために提供され、この場合、前記抗体は、配列番号１〜６のアミノ酸配列を含んでなるＣＤＲまたはその配列が最適なアラインメントの後に配列１〜６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する少なくとも一つのＣＤＲから選択される少なくとも一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる。
【００２６】
より好ましくは、本発明は、遺伝子組換えまたは化学合成により得られた、本発明による抗体、それらの抗原結合フラグメントまたは誘導体を含んでなる。
【００２７】
好ましい実施形態によれば、本発明による抗体、またはその誘導化合物もしくは抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体からなることを特徴とする。
【００２８】
本明細書において「モノクローナル抗体」とは、ほぼ均一な抗体の集団に由来する抗体を意味する。より詳細には、ある集団の個々の抗体は、最小限の割合で見出すことができる少数の潜在的な天然に存在する突然変異以外は同一である。言い換えれば、モノクローナル抗体は、単一細胞クローン（例えば、ハイブリドーマ、均一抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた真核生物宿主細胞、均一抗体をコードするＤＮＡ分子でトランスフェクトされた原核生物宿主細胞など）の増殖から生じる均一抗体からなり、一般に一つかつただ１種のクラスおよびサブクラスの重鎖と、ただ１タイプの軽鎖を特徴とする。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一抗原に対するものである。さらに、典型的には様々な決定基またはエピトープに対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体の調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一エピトープに対するものである。
【００２９】
典型的なＩｇＧ抗体は、２本の同じ重鎖と２本の同じ軽鎖がジスルフィド結合により連結されたものから構成される。各重鎖および軽鎖は、定常領域と可変領域を含む。各可変領域は、抗原のエピトープとの結合を主要に担う、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」と呼ばれる３つのセグメントを含む。これらのセグメントは通常、Ｎ末端から順番に符番してＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる。これらの可変領域のより保存性の高い部分は「フレームワーク領域」と呼ばれる。
【００３０】
３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲが存在する。用語ＣＤＲは、本明細書において、場合に応じて、抗体が認識する抗原またはエピトープに対する抗体の親和性により結合を担うアミノ酸残基の大部分を含む、またはこれらの領域の一つ、またはこれらの領域のいくつか、もしくはさらには全部を示すために用いられる。
【００３１】
本発明によれば、抗体のＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義される。ＩＭＧＴによるＣＤＲからＫａｂａｔによるＣＤＲを推定することは、当業者には自明である。ＫａｂａｔによるＣＤＲは、本発明の範囲の一部とみなされるべきである。
【００３２】
ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、抗原受容体、鎖型、または種に関わらず可変領域を比較するために定義されたものである[Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)］。ＩＭＧＴ独自ナンバリングでは、保存されているアミノ酸は常に同じ位置になる：例えばシステイン２３（１ｓｔ−ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ−ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）である。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：１〜２６番、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５番、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４番およびＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８番）および相補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５およびＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７の標準化された境界を定める。ギャップは非占有位置を表すので、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長（かぎ括弧中に示されドットで区切られる、例えば［８．８．１３］）は重要な情報となる。ＩＭＧＴ独自ナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓと呼ばれる２次元グラフィック表示[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)]およびＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢの３次元構造[Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)］に用いられる。
【００３３】
より詳細には、第一の面によれば、本発明は、ｉ）ＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義される下記のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３（ここで、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号１の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号２の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号３の配列を含んでなる）のうちの少なくとも一つを含んでなる重鎖、および／またはｉｉ）ＩＭＧＴナンバリングシステムにより定義される下記のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３（ここで、ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号４の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号５の配列を含んでなり、ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号６の配列を含んでなる）のうちの少なくとも一つを含んでなる軽鎖を含んでなる、ＣＸＣＲ４と特異的に結合することができる抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体に関する。
【００３４】
さらに別の実施形態では、本発明はまた、
ＩＭＧＴにより定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３、または最適なアラインメントの後にそれぞれ配列番号１、２もしくは３の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖、および
ＩＭＧＴにより定義される次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３、または最適なアラインメントの後にそれぞれ配列番号４、５もしくは６の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖
を含んでなる抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体として記載することもできる。
【００３５】
本発明の意味において、２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の「同一性割合」とは、最適なアラインメントの後に得られる、比較する２つの配列間で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を意味し、この割合は純粋に統計学的なものであり、その２配列間の違いはそれらの長さに沿ってランダムに分布している。２つの核酸配列またはアミノ酸配列の比較は従来から、それらを最適にアラインした後に配列を比較することによって行われ、この比較はセグメントによって、または「アラインメントウインドウ」の使用によって行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手による比較の他、Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482]のローカル・ホモロジー・アルゴリズム、Neddleman and Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443]のローカル・ホモロジー・アルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]の類似性検索法、またはこれらのアルゴリズムを用いたコンピューターソフトウエア（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、または匹敵するソフトウエアＢＬＡＳＴ  ＮＲもしくはＢＬＡＳＴ  Ｐによる）によって行うことができる。
【００３６】
２つの核酸配列またはアミノ酸配列間の同一性割合は、２つの最適にアラインされた配列を比較することにより決定され、ここで、比較する核酸配列またはアミノ酸配列は、２つの配列間での最適なアラインメントのための参照配列と比較して付加または欠失を持ち得る。同一性割合は、２つの配列間で、アミノ酸またはヌクレオチド残基が同一の箇所の数を決定し、この同一箇所の数をアラインメントウィンドウ内の箇所の総数で割り、その商に１００を掛けて２つの配列間の同一性割合を得ることにより計算される。
【００３７】
例えば、サイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlで利用可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｅｃｓ」(Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250)をデフォルトパラメーター（特にパラメーター「オープン・ギャップ・ペナルティ」：５、「エクステンション・ギャップ・ペナルティ」：２について、選択されるマトリックスは、例えばプログラムによって提案される「ＢＬＯＳＵＭ６２」マトリックスである）とともに使用することができ、このプログラムにより、比較する２つの配列間の同一性割合が直接計算される。
【００３８】
参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を示すアミノ酸配列の場合、好ましい例として、参照配列、特定の修飾、特に少なくとも一つのアミノ酸の欠失、付加もしくは置換、末端切断または伸張を含むものが挙げられる。１以上の連続または不連続アミノ酸の置換の場合、被置換アミノ酸が「同等な」アミノ酸により置換される置換が好ましい。ここで、「同等なアミノ酸」という表現は、対応する抗体および以下に定義される具体例の生物活性を改変することなく、構造アミノ酸の一つを置換し得る任意のアミノ酸を示すものとする。
【００３９】
同等なアミノ酸は、置換されるアミノ酸とのそれらの構造的相同性に基づくか、または生成され得る種々の抗体間の生物活性の比較試験の結果に基づいて決定することができる。
【００４０】
非限定的例として、下表１に、対応する修飾抗体の生物活性に有意な改変を生じずに実施し得る可能性のある置換をまとめる。なお、同じ条件下で逆の置換も当然可能である。
【００４１】
【表１】
2014523920.tif 000002
【００４２】
さらに別の実施形態によれば、本発明は、アミノ酸配列番号７の配列、もしくは最適なアラインメントの後に配列番号７の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる重鎖可変領域配列を含んでなり、かつ／または配列番号８のアミノ酸配列、もしくは最適なアラインメントの後に配列番号８の配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性を有する配列を含んでなる軽鎖可変領域配列を含んでなる、抗体Ｉ−３８５９、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の一つに関する。
【００４３】
特に、前記抗原結合誘導体は、少なくとも一つのＣＤＲがグラフトされたペプチド足場を含んでなる結合タンパク質からなり、前記ＣＤＲは、最初の抗体のパラトープ認識特性を全部または一部保存するような方法でグラフトされる。好ましい実施形態では、前記抗原結合タンパク質は、ペプチド足場と前記少なくとも一つのＣＤＲの融合タンパク質である。
【００４４】
本発明に記載される６つのＣＤＲ配列のうちの１以上の配列は、様々な免疫グロブリン足場形成時に存在していてもよい。この場合、タンパク質配列は、グラフトしたＣＤＲの適正な折り畳みに適したペプチド骨格を再形成することができ、それらにパラトープ抗原認識特性を保存させることができる。
【００４５】
当業者であれば、ＣＤＲグラフトのためのタンパク質足場のタイプを選択する手段を知っている。より詳細には、選択されるには、このような足場は下記の基準：
・良好な系統発生的保存、
・三次元構造が既知であること（例えば、結晶学、ＮＭＲ分光法、または当業者に知られている他の任意の技術により決定される）、
・小サイズ、
・転写後修飾が少ないかまたは全くないこと、および／または
・産生、発現および精製が容易であること
をできるだけ多く満たさなければならないことが知られている(Skerra A., J. Mol. Recogn., 2000, 13:167-187)。
【００４６】
このようなタンパク質足場の起源は、限定されるものではないが、フィブロネクチンおよび優先的にはフィブロネクチンＩＩＩ型領域１０、リポカリン、アンチカリン(Skerra A., J. Biotechnol, 2001, 74(4):257-75)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のプロテインＡの領域Ｂに由来するプロテインＺ、チオレドキシンＡ、または「アンキリンリピート」(Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No. 4, 1700-1705)、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」および「テトラトリコペプチドリピート」などのリピートモチーフを有するタンパク質から選択される構造であり得る。このようなタンパク質モチーフは当技術分野で広く同定されており、従って当業者に周知である。
【００４７】
上記のように、このようなペプチド足場は、元の抗体に起源する１〜６つのＣＤＲを含んでなる。必要ではないが、好ましくは、当業者は重鎖から少なくとも一つのＣＤＲを選択し、前記は抗体の特異性を主要に担うことが知られている。１以上の適切なＣＤＲの選択は当業者には自明であり、当業者ならば次に好適な既知の技術を選択することもできる(Bes et al. , FEBS letters 508, 2001, 67-74)。
【００４８】
本発明による抗体の抗原結合フラグメントとは、例えば、フラグメントＦｖ、ｓｃＦｖ（ｓｃ＝一本鎖）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ−Ｆｃもしくはダイアボディー、またはポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコールの付加（ＰＥＧ化）（ＰＥＧ化フラグメントは、Ｆｖ−ＰＥＧ、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ、Ｆａｂ−ＰＥＧ、Ｆ（ａｂ’）２−ＰＥＧおよびＦａｂ’−ＰＥＧと呼ばれる）などの化学修飾によって、またはリポソーム、ミクロスフェアもしくはＰＬＧＡへの封入によって半減期が延長された任意の断片と理解されるべきであり、該断片は、特に一般的な様式で、断片が生じる抗体の活性を部分的にであっても発揮することができる本発明の特徴的ＣＤＲの少なくとも一つを有する。
【００４９】
好ましくは、前記抗原結合フラグメントは、それらが由来する抗体の可変重鎖または軽鎖の部分配列を含んでなるか、または含み、該部分配列は、それが由来する抗体と同じ結合特異性および十分な親和性を保持するのに十分なものであり、それが由来する抗体の親和性の好ましくは少なくとも１／１００、より好ましくは少なくとも１／１０に相当する。
【００５０】
このような抗原結合フラグメントは、それが由来する抗体の配列の少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは６個、７個、８個、１０個、１５個、２５個、５０個または１００個の連続するアミノ酸を含む。
【００５１】
好ましくは、これらの抗原結合フラグメントは、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、ｓｃＦｖ−Ｆｃまたはダイアボディーのタイプであり、一般にフラグメントが生じる抗体と同じ結合特異性を有する。本発明によれば、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、ペプシンまたはパパインを含む酵素消化などの方法によって、および／または化学還元によるジスルフィド架橋の切断によって上記抗体から得ることができる。抗体フラグメントは、これもまた当業者に公知の組換え遺伝学的技術によって、または例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓなどによって販売されているものなどの自動ペプチド合成装置によるペプチド合成によって得ることもできる。
【００５２】
本発明に従ってモノクローナル抗体を分泌することができるネズミハイブリドーマは、２００７年１０月２２日にＩ−３８５９としてＣＮＣＭ、パスツール研究所、パリ、フランスに寄託された。前記ハイブリドーマは、Ｂａｌｂ／Ｃ免疫誘導マウス脾細胞と骨髄腫Ｓｐ  ２／０−Ａｇ  １４系統を融合させることにより得られたものである。
【００５３】
本明細書で３０１ａＥ５またはＩ−３８５９と呼ばれるモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、前記ハイブリドーマにより分泌されることを特徴とする。
【００５４】
抗体Ｉ−３８５９はまた、その核酸配列によって、すなわち、配列番号９の配列によりコードされるＣＤＲ−Ｈ１、配列番号１０の配列によりコードされるＣＤＲ−Ｈ２および配列番号１１の配列によりコードされるＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖、ならびに／または配列番号１２の配列によりコードされるＣＤＲ−Ｌ１、配列番号１３の配列によりコードされるＣＤＲ−Ｌ２および配列番号１４の配列によりコードされるＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖を含んでなるとして記載することもできる。
【００５５】
抗体Ｉ−３８５９は、配列番号１５の核酸配列によりコードされる重鎖、もしくは最適なアラインメントの後に配列番号１５と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性割合を示す核酸配列、ならびに／または配列番号１６の核酸配列、もしくは最適なアラインメントの後に配列番号１６と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性割合を示す核酸配列によりコードされる軽鎖を含んでなる。
【００５６】
本明細書において互換的に使用される用語「核酸」、「核酸配列（nucleic sequence）」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、修飾されたまたはされていない、核酸のフラグメントまたは領域を定義する、非天然ヌクレオチドを含むまたは含まない、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは前記ＤＮＡの転写産物のいずれかである、ヌクレオチドの正確な配列を意味する。
【００５７】
「最適アライメント後に、好ましい配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性割合を示す核酸配列」とは、詳しくは、参照核酸配列に対して、特に規則的な欠失、切断、伸張、キメラ融合および／または置換などのある種の修飾を示す核酸配列を意味する。好ましくは、これらは、参照配列と同じアミノ酸配列をコードする配列であり、これは、遺伝コードの縮重、または好ましくは高ストリンジェント条件、特に以下に定義される条件下で、参照配列と特異的にハイブリダイズし得る相補的配列に関するものである。
【００５８】
高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは、温度およびイオン強度に関する条件がハイブリダイゼーションを２つの相補的ＤＮＡフラグメントの間で保持できるように選択されることを意味する。単に説明として、上記のポリヌクレオチドフラグメントを定義するためのハイブリダイゼーション段階の高ストリンジェント条件は、下記の通りであるのが有利である。
【００５９】
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは、（１）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムの溶液に相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート溶液、５％デキストラン硫酸および１％サケ精子ＤＮＡを含有するリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中、４２℃で３時間のプレハイブリダイゼーション、（２）プローブの長さに応じた温度（すなわち、長さが１００ヌクレオチドを超えるプローブでは４２℃）で２０時間の主ハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ＋２％ＳＤＳ中、２０℃で２０分２回の洗浄、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、２０℃で２０分１回の洗浄の二段階で行う。最後の洗浄は、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中、長さが１００ヌクレオチドを超えるプローブでは６０℃で３０分間行う。定義されたサイズのポリヌクレオチドについて上記した高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、当業者によって、Sambrook, et al. (Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory、 3rd edition, 2001)に記載の手順に従って、より長いまたは短いオリゴヌクレオチドに対して適合させることができる。
【００６０】
別の面において、本発明は、ＣＸＣＲ４の発現に関連する腫瘍形成性障害ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ診断または予後のための、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体に関する。
【００６１】
よって、本発明は、ＣＸＣＲ４の発現に関連する腫瘍形成性障害のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ診断の予後の方法であって、本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体とＣＸＣＲ４との結合を試験する工程を含んでなる方法に関する。
【００６２】
特に、本発明は、ＣＸＣＲ４の発現に関連する腫瘍形成性障害のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断または予後のための、抗体Ｉ−３８５９、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の使用を提供する。
【００６３】
重要なこととしては、前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を持たない。この特性は、患者のスクリーニング、または前記患者に対する影響もしくは結果を持たない抗体による処置の進行のモニタリングを可能とするので、診断適用に明らかに有利である。この特性は、それが患者に対して有害な作用を持たないので、本発明の抗体を処置すべき患者をスクリーニングするための好ましいツールとする。本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ＣＸＣＲ４の発現に関連する種々の病態の検出、診断、および病期分類を含む、様々な医学目的または研究目的に使用が見出せる。
【００６４】
本明細書において疾患を「診断する」とは、ＣＸＣＲ４の発現に関連するまたはＣＸＣＲ４の発現に媒介される病的過剰増殖性腫瘍形成性障害の存在を同定または検出する、前記疾患の進行をモニタリングする、およびＣＸＣＲ４の発現に関連する障害の指標となる細胞またはサンプルを同定または検出する方法を意味する。
【００６５】
本明細書において「予後」とは、疾患からの回復の見込み、または疾患の確率的発症もしくは転帰の予測を意味する。例えば、被験体からのサンプルが本発明の抗体による染色に対して陰性であれば、その被験体の「予後」は、サンプルがＣＸＣＲ４染色に対して陽性である場合よりも良好である。以降にさらに詳細に示されるように、サンプルは適当な尺度でＣＸＣＲ４発現レベルに関してスコア化することができる。
【００６６】
前記抗体は、検出可能／定量可能なシグナルを得るために免疫複合体または標識抗体の形態で存在することができる。好適な標識または他の適当な検出可能な生体分子もしくは化学物質と併用する場合、本発明の抗体はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ診断および予後適用に特に有用である。
【００６７】
イムノアッセイで使用するための標識は一般に当業者に公知であり、酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質および発色物質（金コロイドまたはラテックスビーズなどの有色粒子を含む）が含まれる。好適なイムノアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。様々なタイプの標識およびそれらの標識を本発明の抗体に結合させる方法は、以下に示されるものなど、当業者に周知である。
【００６８】
本明細書において用語「ＣＸＣＲ４の発現に関連する腫瘍形成性障害」とは、障害に罹患している被験体における高レベルのＣＸＣＲ４（異常）の存在が、障害または障害の悪化に関与する因子の病態生理学の原因であることが示されている、またはそのことが疑われる、疾患およびその他の障害を含むことを意図する。あるいは、このような障害は、例えば、障害に罹患している被験体の罹患細胞または組織の細胞表面上のＣＸＣＲ４レベルの増加を証拠とし得る。このＣＸＣＲ４レベルの増加は、本発明の抗体Ｉ−３８５９を用いて検出することができる。
【００６９】
特定の実施形態では、「発現の増強」とは、ＣＸＣＲ４に関する場合、対照に比べて発現の統計学的に有意な増強を示す（ＲＮＡ発現またはタンパク質発現により測定される）タンパク質または遺伝子の発現レベルを意味する。
【００７０】
本発明の好ましい面は、被験体においてＣＸＣＲ４発現腫瘍の存在をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで検出するための方法である、前記方法は、
（ａ）前記被験体由来の生体サンプルを本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と接触させる工程、および
（ｂ）前記抗体と前記生体サンプルとの結合を検出する工程
を含んでなる。
【００７１】
本発明の抗体の結合は、当業者に利用可能な様々なアッセイにより検出することができる。これらのアッセイを実施するためのいずれの好適な手段も本発明の範囲内に含まれるが、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法および免疫組織化学（ＩＨＣ）が特に挙げられる。
【００７２】
別の実施形態では、本発明は、被験体においてＣＸＣＲ４発現腫瘍の位置をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで検出するための方法に関し、前記方法は、
ａ）被験体由来の生体サンプルを本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と接触させる工程、および
ｂ）前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と前記サンプルとの結合を検出する工程
を含んでなる。
【００７３】
発現腫瘍の存在の検出については、当業者に公知の多くの技術が使用可能である。好ましい方法としては、ＩＨＣおよびＦＡＣＳが含まれる。
【００７４】
本発明はまた、被験体においてＣＸＣＲ４を発現する細胞の割合をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで検出するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）被験体由来の生体サンプルを本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と接触させる工程、および
（ｂ）前記生体サンプルにおいてＣＸＣＲ４を発現する細胞の割合を定量する工程
を含んでなる。
【００７５】
本発明の別の面は、被験体由来のＣＸＣＲ４発現腫瘍におけるＣＸＣＲ４の発現レベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）被験体由来の生体サンプルを本発明の抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と接触させる工程、および
（ｂ）前記生体サンプルにおいて抗体とＣＸＣＲ４との結合のレベルを定量する工程
を含んでなる。
【００７６】
当業者に自明であるように、抗体とＣＸＣＲ４との結合のレベルは、当業者に周知のいずれの手段によって定量してもよい。好ましい方法には、ＥＬＩＳＡアッセイ、免疫蛍光、ＩＨＣ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはＦＡＣＳなどの免疫酵素法の使用が含まれる。
【００７７】
好ましくは、生体サンプルは、ヒト起源の血清、全血細胞、組織サンプルまたは生検などの体液である。サンプルは例えば生検組織を含んでもよく、これを好都合にはＣＸＣＲ４の発現に関連する病的過剰増殖性腫瘍形成性障害の存在に関してアッセイすることができる。
【００７８】
本発明のさらに別の面は、被験体由来の腫瘍においてＣＸＣＲ４の発現レベルをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）被験体由来のサンプルを本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と接触させる工程、および
（ｂ）サンプルにおける前記抗体、またはその抗原結合フラグメントまたは誘導体とＣＸＣＲ４との結合のレベルを定量する工程
を含んでなる。
【００７９】
試験サンプル中に存在するＣＸＣＲ４の量の決定がひと度行われれば、それらの結果を、ＣＸＣＲ４の発現に関連する過剰増殖性腫瘍形成性障害を持たない個体からであること以外は試験サンプルと同様の方法で得られた対照サンプルの結果と比較することができる。このＣＸＣＲ４のレベルが試験サンプルで有意に高ければ、それが由来する被験体が前記障害を有するかまたは発症する高い可能性があると結論付けることができる。
【００８０】
本発明は、より詳細には、ＣＸＣＲ４発現腫瘍のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ診断または予後の方法に関し、前記方法は、（ｉ）ＣＸＣＲ４の発現レベルを上記のように決定する工程、および（ｉｉ）工程（ｉ）の発現レベルを正常組織またはＣＸＣＲ４非発現組織からの参照ＣＸＣＲ４の発現レベルと比較する工程を含んでなる。
【００８１】
標的化抗腫瘍療法の開発に関して、免疫組織学的技術を用いた診断により、受容体の発現レベルに関するｉｎ  ｓｉｔｕ情報が得られ、従って、このような処置に必要な受容体発現レベルに従って、処置に感受性のある患者を選択することができる。
【００８２】
病期決定は潜在的予後値を持ち、最適な療法を計画するための基準を提供する。Simpson et al , J. Clin. Oncology 18 :2059 (2000)。例えば、固形腫瘍に対する治療選択は腫瘍の病期分類に基づき、通常、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  （ＡＪＣＣ）からの腫瘍／結節／転移（ＴＮＭ）検査を用いて実施される。この検査および病期分類システムは、その患者において固形癌が診断された時点の病期に関していくつかの数値情報を与えるが、それは不正確で不十分であると一般に認知されている。特に、腫瘍進行の最初期段階は同定できない。
【００８３】
本発明は、被験体の腫瘍スコアをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）前記被験体由来の生体サンプルを、ＣＸＣＲ４と特異的に結合することができる抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体と接触させる工程、
（ｂ）前記生体サンプルにおいて前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体とＣＸＣＲ４との結合レベルを定量する工程、および
（ｃ）前記被験体からの、前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体の定量された結合レベルを適当な尺度と比較することにより、腫瘍をスコア化する工程
を含んでなり、
前記抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体は、ｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、ｉｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなることを特徴とする。
【００８４】
好ましい実施形態では、診断のための抗体は、組織サンプルがホルマリン固定、ホルモル置換固定、Ｇｌｙｃｏ−ｆｉｘｘ固定、パラフィン包埋および／または凍結された場合にも標的受容体と結合することができる。
【００８５】
従来のいずれのハザード分析法を用いて、ＣＸＣＲ４の予後値を評価してもよい。代表的な分析法としてＣｏｘ回帰分析があり、これは打ち切り例の存在下で生存率または時間−事象データをモデル化するためのセミパラメトリック法である(Hosmer and Lemeshow, 1999、 Cox, 1972)。例えば生命表またはＫａｐｌａｎ−Ｍｅｙｅｒなどの他の生存率分析とは対照的に、Ｃｏｘでは、モデルに予測因子変量（共変量）を含むことができる。例えばＣｏｘなどの従来の分析方法を用いて、原発腫瘍におけるＣＸＣＲ４発現の状態と、疾病再発（無病生存期間、もしくは転移性疾患までの期間）または疾病を原因とする死亡までの期間（全生存期間）のいずれかの時間−発生との相関に関する仮説を検証することができる。Ｃｏｘ回帰分析は、Ｃｏｘ比例ハザード分析としても知られている。この方法は、患者生存期間に対して腫瘍マーカーの予後値を検定するための標準法である。多変量様式を用いる場合には、いくつかの共変量の効果を、独立した予後値を有する個々の共変量、すなわち、最も有用なマーカーが同定できるように並行して検定する。陰性または陽性の「ＣＸＣＲ４状態」という用語はまた、［ＣＸＣＲ４（−）］または［ＣＸＣＲ４（＋）］とも表すことができる。
【００８６】
サンプルは、癌の診断またはモニタリング中に「スコア化」することができる。スコア化は、その最も単純な形で、免疫組織化学によるサンプルの目視検査により判断してカテゴリー的陰性または陽性であり得る。より定量的なスコア化には、染色強度およびサンプリングされた染色「陽性」細胞の割合の２つのパラメーターを判断することを含む。
【００８７】
本発明の意味の範囲内で「ＣＸＣＲ４状態」は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＦＡＣＳ、または当業者に公知の他の方法などの任意の方法により測定されるＣＸＣＲ４の発現レベルの決定に基づく、ＣＸＣＲ４陽性［ＣＸＣＲ４（＋）］またはＣＸＣＲ４陰性［ＣＸＣＲ４（−）］クラスへの腫瘍の分類に関する。
【００８８】
本発明の一実施形態では、標準化を保証するために、サンプルをＣＸＣＲ４発現レベルに関して異なる尺度でスコア化することができ、それらのほとんどは反応生成物の強度および陽性細胞の割合の評価に基づくものである(Payne et al., Predictive markers in breast cancer - the present, Histopathology 2008, 52, 82-90)。
【００８９】
本発明による方法のより好ましい実施形態では、前記スコア化は、２つのパラメーター、すなわち、染色強度および陽性細胞の割合に基づく適当な尺度を使用することを含んでなる。
【００９０】
第一の例として、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のＩＨＣ評価に関するＱｕｉｃｋ  Ａｌｌｒｅｄスコア化と同様に、サンプルは、反応性強度に関するスコアと染色細胞の割合に関するスコアを組み合わせた０〜８の全体尺度で、ＣＸＣＲ４発現レベルに関してスコア化することができる(Harvey JM, Clarck GM, Osborne CK, Allred DC、 J. Clin. Oncol. 1999、 17、 1474-1481)。より詳細には、反応性強度の第一の基準は、「無反応性」を０とし、「強い反応性」を３とする０〜３の尺度でスコア化される。反応性比率の第二の基準は、「無反応性」を０とし、「６７〜１００％の割合の反応性」を５とする０〜５の尺度でスコア化される。この反応性強度スコアと反応性割合スコアを足して合計スコア０〜８とする。
【００９１】
合計スコア０〜２は陰性とみなされ、合計スコア３〜８は陽性とみなされる。
【００９２】
この尺度によれば、本明細書で使用される腫瘍の陰性または陽性「ＣＸＣＲ４状態」とは、Ａｌｌｒｅｄ尺度でそれぞれスコア０〜２または３〜８に相当するＣＸＣＲ４の発現レベルを意味する。
【００９３】
下表２は、ＩＨＣ結果をＡｌｌｒｅｄ方法に従って解釈するための指針を示す。
【００９４】
【表２】
2014523920.tif 000003
【００９５】
好ましい実施形態では、本発明による方法は、適当な尺度、すなわち、無反応性を０とし、６７〜１００％の割合の強い反応性とする０〜８の尺度を意味する。
【００９６】
本発明の別の実施形態には、被験体由来の腫瘍の状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定する方法が記載され、前記方法は、（ａ）被験体由来の腫瘍をＡｌｌｒｅｄ尺度に従ってスコア化する工程、および（ｂ）Ａｌｌｒｅｄスコアが３〜８である場合に、腫瘍の状態が［ＣＸＣＲ４（＋）］であると決定する工程、または（ｃ）Ａｌｌｒｅｄスコアが０〜２である場合に、腫瘍の状態が［ＣＸＣＲ４（−）］であると決定する工程を含んでなる。
【００９７】
本発明の特定の面では、Ａｌｌｒｅｄスコアが３である場合、腫瘍は［ＣＸＣＲ４（＋）］である。
【００９８】
本発明の特定の面では、Ａｌｌｒｅｄスコアが４である場合、腫瘍は［ＣＸＣＲ４（＋）］である。
【００９９】
本発明の特定の面では、Ａｌｌｒｅｄスコアが５である場合、腫瘍は［ＣＸＣＲ４（＋）］である。
【０１００】
本発明の特定の面では、Ａｌｌｒｅｄスコアが６である場合、腫瘍は［ＣＸＣＲ４（＋）］である。
【０１０１】
本発明の特定の面では、Ａｌｌｒｅｄスコアが７である場合、腫瘍は［ＣＸＣＲ４（＋）］である。
【０１０２】
本発明の特定の面では、Ａｌｌｒｅｄスコアが８である場合、腫瘍は［ＣＸＣＲ４（＋）］である。
【０１０３】
本発明の別の特定の面では、Ａｌｌｒｅｄスコアが３〜８である場合、腫瘍は［ＣＸＣＲ４（＋）］である。
【０１０４】
第二の例として、例えばＨＥＲ−２受容体のＩＨＣ評価のための従来のスコア化と同様に、染色強度（優先的には、膜染色）と染色を呈する細胞の割合を統合して０〜３＋の組合せ尺度とするやや簡単なスコア化法で、サンプルをＣＸＣＲ４発現レベルに関してスコア化することができる。
【０１０５】
簡略化尺度と呼ばれるこの尺度では、０および１＋は陰性であり、２＋および３＋は陽性染色を表す。しかしながら、スコア１＋〜３＋は、各陽性スコアがスコア０（陰性）と比べた場合に再発および致死的病勢の有意に高いリスクに関連している可能性があるので陽性と記録することができるが、これらの陽性スコア間の強度の増加がさらなるリスク軽減をもたらし得る。
【０１０６】
一般に言えば、本明細書で使用される腫瘍の陰性または陽性の「ＣＸＣＲ４状態」は、それぞれ簡略化尺度でスコア０〜１＋または２＋〜３＋に相当するＣＸＣＲ４の発現レベルを意味する。浸潤性腫瘍の完全な周辺膜反応性だけが考慮されるべきであり、多くの場合、「金網」の様相に似ていた。現行の指針の下では、ＣＸＣＲ４に関してボーダーライン（スコア２＋または３＋）としてスコア化されたサンプルはさらなる評価を受ける必要がある。非限定例として、対照が予測通りではなく、人為的結果がほとんどのサンプルに関わり、サンプルが正常な乳管（内部対照）の強い膜性陽性を有して過剰な抗原賦活を示唆する場合には、ＩＨＣ分析は棄却し、繰り返すか、またはＦＩＳＨまたは他の任意の方法によって試験すべきである。
【０１０７】
より明瞭にするために、下表３にこれらのパラメーターをまとめる。
【０１０８】
【表３】
2014523920.tif 000004
【０１０９】
好ましい実施形態では、本発明による方法は、適当な尺度、すなわち、腫瘍細胞の膜反応性無しを０とし、１０％を超える腫瘍細胞の強い完全な反応性を３＋とする、０〜３＋の尺度に関する。
【０１１０】
より詳細には、上記のように、前記適当な尺度は、腫瘍細胞の膜反応性無しを０とし、１０％を超える腫瘍細胞のかろうじて認知できる膜反応性を１＋とし、１０％を超える腫瘍細胞の弱〜中程度の完全な膜反応性を２＋とし、および１０％を超える腫瘍細胞の強い完全な反応性を３＋とする、０〜３の尺度である。
【０１１１】
本発明の別の実施形態には、被験体由来の腫瘍の状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定する方法が記載され、前記方法は、（ａ）被験体由来の腫瘍を上記のような簡略化尺度に従ってスコア化する工程、および（ｂ）スコアが２＋または３＋である場合に、腫瘍の状態が［ＣＸＣＲ４（＋）］であると決定する工程、または（ｃ）スコアが０または１＋である場合に、腫瘍の状態が［ＣＸＣＲ４（−）］であると決定する工程を含んでなる。
【０１１２】
本発明の特定の面では、スコアが２＋である場合、腫瘍は［ＣＸＣＲ４（＋）］である。
【０１１３】
本発明の特定の面では、スコアが３＋である場合、腫瘍は［ＣＸＣＲ４（＋）］である。
【０１１４】
本発明の別の特定の面では、スコアが２＋または３＋である場合、腫瘍は［ＣＸＣＲ４（＋）］である。
【０１１５】
一般に、本発明による試験またはアッセイの結果は、様々な形式のいずれで提示してもよい。これらの結果は定性的に提示することができる。例えば、試験報告は特定のポリペプチドが検出されたか否かだけを、おそらくは検出限界の表示も添えて示すことができる。これらの結果は半定量的に表示してもよい。例えば、種々の範囲を定義してもよく、それらの範囲には定量的情報の特定の程度を示すスコア（例えば、使用尺度に応じて０〜３＋または０〜８）を割り付けることができる。このようなスコアは、例えば、ＣＸＣＲ４が検出される細胞の数、シグナル強度（ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ４保持細胞の発現レベルを示し得る）などの種々の因子を反映することができる。これらの結果は、例えば、ポリペプチド（ＣＸＣＲ４）が検出される細胞の割合、タンパク質濃度などとして、定量的に表示することができる。
【０１１６】
当業者に認識されるように、試験により提供される出力のタイプは、その試験の技術的限界およびそのポリペプチドの検出に関連する生物学的有意性によって異なる。例えば、ある種のポリペプチドの場合、純粋に定性的な出力（例えば、そのポリペプチドがある特定の検出レベルで検出されるか否か）が、有意な情報を与える。より定量的な出力（例えば、サンプル中のポリペプチドの発現レベルの、正常レベルに対する比率が検定される）が必要な場合もある。
【０１１７】
本発明はまた、腫瘍形成性障害が抗ＣＸＣＲ４抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体による処置に感受性があるかどうかを決定するための方法も提供し、前記方法は、
（ａ）被験体の腫瘍のＣＸＣＲ４状態を本発明の方法に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで決定する工程、および
（ｂ）前記状態がＣＸＣＲ４（＋）である場合に、前記腫瘍形成性障害は抗ＣＸＣＲ４抗体、またはそのａフラグメントまたは誘導体による処置に感受性があると決定する工程
を含んでなる。
【０１１８】
別の面において、本発明は、被験体において病的過剰増殖性腫瘍形成性障害またはＣＸＣＲ４の発現に関連する病態に対する感受性を診断する方法に関し、前記方法は、
（ａ）サンプルにおけるＣＸＣＲ４保持細胞の有無を決定する工程、および
（ｂ）前記ＣＸＣＲ４保持細胞の有無に基づいて病態または病態に対する感受性を診断する工程
を含んでなる。
【０１１９】
本発明の方法において、ＣＸＣＲ４発現細胞の検出またはＣＸＣＲ４レベルの増加は一般に、ＣＸＣＲ４介在障害を有する、またはそれを呈する疑いのある患者の指標となる。
【０１２０】
よって、本発明は、癌を発症する個体のリスクを予測するための方法を提供し、前記方法は、組織サンプルにおいてＣＸＣＲ４の発現レベルを検出することを含んでなり、この場合、高レベルのＣＸＣＲ４発現が癌を発症する高いリスクの指標となる。
【０１２１】
ＣＸＣＲ４発現は数種の癌の進行した腫瘍病期と有意に関連していることが見出された(Schimanski et al., J Clin Oncol, ASCO Annual Meeting Proceedings Part I., 24(18S): 14018, 2006、 Lee et al., Int J Oncol., 34(2):473-480, 2009、 Pagano, Tesi di dottorato, Universita degli Studi di Napoli Federico II, 2008)。よって、本発明はまた、腫瘍の侵襲性を評価するための方法にも関する。本明細書において「腫瘍の侵襲性」とは、急速に増殖し、急速に拡散する傾向にある腫瘍を意味する。
【０１２２】
一実施形態において、前記方法は、
（ａ）腫瘍サンプルの細胞により発現されたＣＸＣＲ４のレベルを決定する工程、および
（ｂ）後の時点で同じ個体から採取した同等の組織サンプルにおいて発現されたＣＸＣＲ４のレベルを決定する工程、
（ｃ）工程（ａ）で得られた発現レベルと、工程（ｂ）で得られた比の間の比を決定する工程
を含んでなり、腫瘍サンプルにおけるＣＸＣＲ４発現の経時的な比が、癌進行のリスクに関する情報を提供する。
【０１２３】
好ましい実施形態では、工程（ａ）で得られたレベルの、工程（ｂ）で得られたレベルに対する比が１より大きい場合に、侵襲性を示す。別の実施形態では、比が１以下の場合に、非侵襲性を示す。
【０１２４】
本発明の別の面は、ＣＸＣＲ４標的療法の投与に応答したＣＸＣＲ４発現のモニタリングである。このようなモニタリングは、前記療法がＣＸＣＲ４のダウンレギュレーションおよび／または分解を誘発する場合に極めて有用であり得る。
【０１２５】
特に、細胞表面でのＣＸＣＲ４発現のモニタリングは、臨床試験および「個別化」療法の際に処置の有効性を評価するための重要なツールとなり得る。
【０１２６】
よって、本出願は、被験体にとって適当な治療計画を決定するための方法を提供する。
【０１２７】
ＣＸＣＲ４のレベルの増加または減少は、ＣＸＣＲ４に関連する癌の進展の指標となる。よって、ＣＸＣＲ４を発現する細胞の数の増加または様々な組織もしくは細胞中に存在するＣＸＣＲ４の濃度の変化を測定することにより、ＣＸＣＲ４に関連する悪性腫瘍の改善を目的とする特定の治療計画が有効であるか否かを決定することができる。
【０１２８】
従って、本発明はまた、ＣＸＣＲ４に関連する腫瘍形成性障害に罹患している被験体において、前記障害を緩和するように計画された治療計画の有効性を決定するための方法を対象とし、前記方法は、
（ａ）前記処置の第一の時点に相当する第一の生体サンプルにおいて、ＣＸＣＲ４の第一の発現レベルを決定する工程、
（ｂ）前記処置の後の第二の時点に相当する第二の生体サンプルにおいて、ＣＸＣＲ４の第二の発現レベルを決定する工程、
（ｃ）工程（ａ）で得られた前記第一の発現レベルの、工程（ｂ）で得られた前記第二の発現レベルに対する比を計算する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）の比が１より大きい場合に、前記治療計画の有効性が高いと決定する工程、または
（ｅ）工程（ｃ）の比が１以下である場合に、前記治療計画の有効性が低いと決定する工程
を含んでなる。
【０１２９】
好ましい実施形態では、ＣＸＣＲ４に関連する腫瘍形成性障害に罹患している被験体において前記障害を緩和するように計画された前記治療計画は、前記被験体にＣＸＣＲ４阻害剤を投与することを含む。
【０１３０】
本発明の別の好ましい実施形態は、治療量のＣＸＣＲ４阻害剤の投与から利益を受けるまたは受けないと予測される癌患者を選択するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）ＣＸＣＲ４の発現レベルを本発明の方法に従って決定する工程、
（ｂ）工程ａ）で得られた発現レベルを参照発現レベルと比較する工程、および
（ｃ）（ａ）で得られた発現レベルの参照発現レベルに対する比が１より大きい場合に、その患者を治療量のＣＸＣＲ４阻害剤の投与から利益を受けると予測されるとして選択する工程、または
（ｄ）（ａ）で得られた発現レベルの参照発現レベルに対する比が１以下である場合に、その患者を治療量のＣＸＣＲ４阻害剤の投与から利益を受けると予測されないとして選択する工程
を含んでなる。
【０１３１】
本明細書の意味において、「ＣＸＣＲ４阻害剤」という表現は、ＣＸＣＲ４と結合してリガンドの結合を阻害することができる任意の化合物または分子を包含することを意図する。非限定例として、ＣＸＣＲ４阻害剤には、ＡＭＤ３１００およびＡＭＤ３４６５が含まれる。使用可能な他のＣＸＣＲ４阻害剤としては、限定されるものではないが、ＣＴＣＥ−０２１４、ＣＴＣＥ−９９０８、ＣＰ−１２２１（直鎖ペプチド、環状ペプチド、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびペプチド模倣化合物）、Ｔ１４０および類似体、４Ｆ−ベンゾイル−ＴＮ２４００３、ＫＲＨ−１１２０、ＫＲＨ−１６３６、ＫＲＨ−２７３１、ポリフェムシン類似体、ＡＬＸ４０−４Ｃが挙げられる。さらに他のＣＸＣＲ４阻害剤がＷＯ０１／８５１９６、ＷＯ９９／５０４６１、ＷＯ０１／９４４２０、およびＷＯ０３／０９０５１２（これらはそれぞれ引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されている。
【０１３２】
好ましい実施形態では、ＣＸＣＲ４阻害剤はモノクローナル抗体５１５Ｈ７からなる。
【０１３３】
最も好ましい実施形態では、前記ＣＸＣＲ４阻害剤はモノクローナル抗体５１５Ｈ７（ＷＯ２０１０／０３７８３１）である。
【０１３４】
また、単量体および／またはホモ二量体としてのＣＸＣＲ４の発現に関連する腫瘍形成性障害のｉｎ  ｖｉｖｏ画像法を提供することも本発明の目的である。このような方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍を位置決定するため、ならびにその浸潤性をモニタリングするために有用である。同様に、前記方法は、単量体／ホモ二量体ＣＸＣＲ介在癌を有すると従前に診断された患者において進行および／または処置に対する応答をモニタリングするためにも有用である。
【０１３５】
一実施形態において、本発明は、被験体においてＣＸＣＲ４発現腫瘍の位置を検出するための方法に関し、前記方法は、
ａ）抗体Ｉ−３８５９、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を前記被験体に投与する工程、および
ｂ）前記抗体の結合を検出する工程
を含んでなり、前記結合が腫瘍の存在を示す。
【０１３６】
別の実施形態では、本発明は、被験体においてＣＸＣＲ発現する腫瘍の位置を検出するための方法に関し、前記方法は、
（ａ）抗体Ｉ−３８５９、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を被験体に投与する工程、および
（ｂ）前記抗体の結合を検出する工程
を含んでなり、前記結合が腫瘍の位置を示す。
【０１３７】
発現腫瘍の存在の検出については、当業者に知られている多くの技術を使用することができる。しかしながら、好ましい手段はＩＨＣおよびＦＡＣＳである。
【０１３８】
別の面において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ造影試薬を提供し、前記試薬は、本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を含んでなり、前記抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体は、好ましくは標識され、より好ましくは放射性標識される。前記試薬は、ＣＸＣＲ４介在癌に罹患している患者に、薬学上有効な担体と組み合わせて投与することができる。
【０１３９】
本発明はまた、ＣＸＣＲ４介在癌に罹患している患者の医学的画像法における前記試薬の使用を企図する。
【０１４０】
本発明の方法は、
（ａ）前記患者に画像法に有効な量の造影試薬を投与する工程、および
（ｂ）前記試薬を検出する工程
を含んでなる。
【０１４１】
一実施形態において、本発明の方法は、前記患者におけるＣＸＣＲ４発現腫瘍の存在の検出を可能とする。別の実施形態では、本発明の方法は、前記患者におけるＣＸＣＲ４発現腫瘍の位置の検出を可能とする。
【０１４２】
好ましい実施形態では、造影剤は、標的化部分と活性部分を含んでなる。
【０１４３】
本明細書において用語「標的化部分」とは、細胞表面のＣＸＣＲ４を特異的に認識して結合する薬剤を意味する。特定の実施形態では、標的化部分は、ＣＸＣＲ４と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントまたは誘導体である。具体的には、この標的化部分は、上記のような抗体またはそのフラグメントまたは誘導体である。好ましくは、標的化部分はＩ−３８５９抗体である。
【０１４４】
本明細書において「活性部分」とは、前記造影試薬のｉｎ  ｖｉｖｏ検出を可能とする薬剤である。本発明による活性部分としては、特に、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）、銅−６７（Ｃｕ−６７）、スカンジウム−４７（Ｓｃ−４７）、ルテチウム(Luthetium)−７７（Ｌｕ−１７７）、銅−６４（Ｃｕ−６４）、イットリウム−８６（Ｙ−８６）またはヨウ素−１２４（Ｉ−１２４）などの放射性元素が含まれる。
【０１４５】
造影剤は、ヒトなどの哺乳動物における診断使用に有効な量で投与され、次いで、造影剤の局在および蓄積が検出される。造影剤の局在および蓄積は、放射性核種画像法、ラジオシンチグラフィー、核磁気共鳴画像法、コンピューター断層撮影法、陽電子放射型断層撮影法、コンピューター体軸断層撮影法、Ｘ線または磁気共鳴画像法、蛍光検出、および化学発光検出により検出することができる。
【０１４６】
標的化抗腫瘍療法の開発については、免疫組織学的技術による診断によって、受容体の発現レベルに関するｉｎ  ｓｉｔｕ情報が得られる（例えば、腫瘍の大きさおよび／または位置など）。よって、この診断により、このような処置に必要な受容体の発現レベルに従って、処置に感受性のある患者を選択することができる。
【０１４７】
より詳細には、ＣＸＣＲ４発現レベルは、優先的には蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）により測定される。
【０１４８】
ＦＡＣＳ分析は、免疫学および血液学において、ヘテロな細胞懸濁液内の種々の細胞集団の存在を評価するためにもっぱら使用される。ＦＡＣＳ分析に利用可能なモノクローナル抗体の数は極めて多く、それらを種々の蛍光色素と結合させ、容易な多重抗原染色が可能である。免疫表現型は、血液性悪性腫瘍の診断において不可欠なパラメーターである。ＦＡＣＳ分析は、血液性悪性腫瘍の疑いのある骨髄、末梢血サンプルおよび組織生検の分析に使用される(Martinez A. Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 2003 56B 8-15)。例えば、Fiedler W et al. (Fiedler W. Blood 2003 102 2763-2767)は、ＡＭＬ患者を、ＶＥＧＦ受容体１および２、ｃ−キット、ＳＣＦ受容体およびｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３（ＦＬＴ３）のリン酸化を阻害する小分子ＳＵ５４１６による処置の前に、ｃ−キット発現に関してスクリーニングするためのＦＡＣＳ分析の使用を報告している。
【０１４９】
「生体サンプル」は、被験体から採取され得るいずれのサンプルであってもよい。このようなサンプルは、本発明のバイオマーカーの発現レベルの決定を可能としなければならない。よって、サンプルの性質は、腫瘍の性質に依存する。活性化型のＡｋｔおよび／またはＥｒｋタンパク質の検出による前記バイオマーカーの発現レベルの決定に好ましい生体サンプルとしては、癌が液性腫瘍の場合には、血液サンプル、血漿サンプル、またはリンパ液サンプルなどのサンプルが含まれる。「液性腫瘍」とは、本明細書では、血液または骨髄の腫瘍、すなわち、白血病および多発性骨髄腫などの血液性悪性腫瘍を意味する。好ましくは、生体サンプルは血液サンプルである。実際に、このような血液サンプルは、患者からの全く無害な採血によって得ることができ、従って、ＣＸＣＲ４阻害剤応答または不応表現型の非侵襲的診断を可能とする。
【０１５０】
本明細書において「生体サンプル」はまた、癌が固形癌である場合には、被験患者の固形癌サンプルも含む。このような固形癌サンプルに対して、当業者は本発明のバイオマーカーのレベルの、いずれのタイプの測定も実施することができる。場合によっては、本発明による方法は、患者から固形癌サンプルを採取する予備工程をさらに含んでなり得る。「固形癌サンプル」とは、腫瘍組織サンプルを意味する。癌患者であっても、腫瘍部位の組織は非腫瘍性の健康な組織をなお含んでいる。よって、「癌サンプル」は、患者から採取された腫瘍組織に限定されるできである。前記「癌サンプル」は、生検サンプルまたは外科的切除療法から採取されたサンプルであり得る。
【０１５１】
一面によれば、患者由来のサンプルは癌細胞または癌組織である。
【０１５２】
このサンプルは、当業者に公知の方法によって採取可能であり、必要であれば調製することができる。
【０１５３】
本発明において癌細胞または癌組織は特に限定されない。
【０１５４】
本明細書において用語「癌」とは、典型的には調節を欠いた細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を意味するか、または表す。本明細書において用語「癌」および「癌性」とは、該疾患の総ての病期を包含することを意味する。よって、本明細書において「癌」は、良性腫瘍および悪性腫瘍の両方を含み得る。癌の例としては、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ形悪性腫瘍が挙げられる。より具体的には、本発明による癌は、扁平上皮細胞癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌肺および肺扁平上皮癌を含む）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)（消化管癌および消化管間質癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌(kidney or renal cancer)、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、表在拡大型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、肢端黒子型黒色腫、結節性黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球型（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、およびワルデンストロームマクログロブリン血症）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）、および移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症に関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、メイグス症候群、脳ならびに頭頸部癌、および関連の転移を含んでなる群から選択される。
【０１５５】
好ましい実施形態では、前記癌は、前立腺癌、骨肉腫、肺癌、乳癌、子宮内膜癌、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌および結腸癌から選択される。より好ましい実施形態では、前記癌は、リンパ腫細胞、白血病細胞または多発性骨髄腫細胞を含んでなる。
【０１５６】
ＣＸＣＲ４の発現レベルは有利には、対照細胞またはサンプルにおけるレベル（「参照レベル」または「参照発現レベル」とも呼ばれる）に対して比較または測定される。「参照レベル」、「参照発現レベル」、「対照レベル」および「対照」は、本明細書では互換的に使用される。「対照レベル」とは、一般に疾病または癌を含まない比較可能な対照細胞において測定される、独立したベースラインレベルを意味する。癌患者であっても、腫瘍部位の組織は非腫瘍性の健康な組織をなお含んでいるので、前記対照細胞は同じ個体に由来してもよい。前記対照細胞はまた、正常なまたは罹患もしくは試験サンプルが得られた個体とは同じ疾患を呈さない別の個体に由来してもよい。本発明の範囲内で用語「参照レベル」とは、患者の癌細胞含有サンプルにおけるＣＸＣＲ４発現の試験レベルを評価するために使用されるＣＸＣＲ４発現の「対照レベル」を意味する。例えば、患者の生体サンプルにおけるＣＸＣＲ４レベルがＣＸＣＲ４の参照レベルよりも高い場合には、それらの細胞はＣＸＣＲ４の高レベルの発現または過剰発現を有するとみなされる。参照レベルは複数の方法によって決定することができる。従って、発現レベルは、ＣＸＣＲ４保有細胞、あるいはまたＣＸＣＲ４発現細胞の数とは独立にＣＸＣＲ４発現レベルを定義することができる。従って、各患者の参照レベルはＣＸＣＲ４の参照比によって規定することができ、この場合、この参照比は、本明細書に記載される参照レベルを決定するための方法のいずれによって決定してもよい。
【０１５７】
例えば、対照は所定の値であってもよく、様々な形態を採り得る。対照は、中央値または平均値などの単一のカットオフ値であってもよい。「参照レベル」は、どの患者にも個々に等しく適用可能な単一の数値であってもよく、または参照レベルは、患者の特定の部分集団によって異なってもよい。よって、例えば、同じ癌でも年齢が高い人は若い人とは異なる参照レベルを持つ場合があり、また、同じ癌でも女性は男性とは異なる参照レベルを持つ場合がある。あるいは、「参照レベル」は、試験する新生細胞の組織と同じ組織からの非腫瘍形成性癌細胞におけるＣＸＣＲ４の発現レベルを測定することにより決定することもできる。同様に、「参照レベル」は、患者の新生細胞におけるＣＸＣＲ４の、同じ患者内の非腫瘍細胞におけるＣＸＣＲ４レベルに対する特定の比であってもよい。「参照レベル」はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞のＣＸＣＲ４レベルであってもよく、これらの培養細胞は腫瘍細胞を模倣するように操作することがきるか、または参照レベルを正確に決定する発現レベルをもたらす他の任意の方法で操作することができる。他方、「参照レベル」は、ＣＸＣＲ４レベルが上昇していない群とＣＸＣＲ４レベルが上昇している群などの比較群に基づいて設定することができる。比較群のもう一つの例は、特定の疾患、病態または症状を有する群とその疾患を有さない群であろう。この所定の値は、構成／配置された、例えば、集団が低リスク群、中リスク群および高リスク群などの群に均等に（または不均等に）分けられる場合には調整することができる。
【０１５８】
参照レベルはまた、同じ癌を有する患者集団におけるＣＸＣＲ４レベルの比較によって決定することもできる。これは例えばヒストグラム分析によって達成することができ、この分析では、患者の全コホートをグラフ表示し、第一軸はＣＸＣＲ４レベルを表し、第二軸はその腫瘍細胞が所与のレベルでＣＸＣＲ４を発現するコホートの患者数を表す。同等または類似のＣＸＣＲ４レベルを有するコホートの亜集団を特定することにより、２以上の独立した患者群を決定することができる。次に、これらの独立した群を最もよく識別するレベルに基づいて、参照レベルの決定を行うことができる。参照レベルはまた、２以上のマーカー（そのうちの一つがＣＸＣＲ４である）のレベルを表すこともできる。２以上のマーカーは、例えば各マーカーのレベルの値の比によって表すことができる。
【０１５９】
同様に、見かけ上健康な集団は、ＣＸＣＲ４の発現に関連する病態を有することが知られている集団が有するであろうものとは異なる「正常な」範囲を有する。従って、選択される所定の値は、ある個体が属するカテゴリーを考慮することができる。適当な範囲およびカテゴリーは、当業者ならば慣例の実験だけを用いて選択することができる。「上昇した」、「増加した」とは、選択された対照に比べて高いことを意味する。一般に、対照は、適当な年齢層の見かけ上健康な正常個体に基づく。
【０１６０】
また、本発明による対照は、所定の値の他、試験材料と並行して試験される材料のサンプルであってよいことも理解されよう。例としては、同じ被験体から同時に得られた組織または細胞、例えば、単一の生検の一部、または被験体由来の単一の細胞サンプルの一部が挙げられる。
【０１６１】
別の実施形態では、本発明は、標識されかつｉｎ  ｖｉｖｏでＣＸＣＲ４と結合する上記モノクローナル抗体またはそのフラグメントと、薬学上許容される担体とを含んでなる、ＣＸＣＲ４の発現に関連する腫瘍形成性障害のｉｎ  ｖｉｖｏ画像法のための医薬組成物に関する。
【０１６２】
本発明の別の面において、このような診断または予後法に有用なキットが提供され、前記キットは本発明の抗体、またはそのフラグメントまたは誘導体を含んでなる。
【０１６３】
ＣＸＣＲ４発現腫瘍の存在および／または位置を検出するために有用なキットは、
ａ）ｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、ｉｉ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを含んでなる抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体、
ｂ）次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号１の配列を有するＣＤＲ−Ｈ１、配列番号２の配列を有するＣＤＲ−Ｈ２および配列番号３の配列を有するＣＤＲ−Ｈ３を含んでなる重鎖と、配列番号８の配列を含んでなる軽鎖可変領域とを有する抗体、
ｃ）配列番号７の配列を含んでなる重鎖可変領域と、次の３つのＣＤＲ、それぞれ配列番号４の配列を有するＣＤＲ−Ｌ１、配列番号５の配列を有するＣＤＲ−Ｌ２および配列番号６の配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含んでなる軽鎖とを有する抗体、
ｄ）配列番号７の配列を含んでなる重鎖可変領域と、配列番号８の配列を含んでなる軽鎖可変領域とを有する抗体
のうちの少なくとも一つを含み得る。
【０１６４】
所定量の試薬の組合せを診断アッセイの実施に関する説明書とともに含んでなるパッケージされた材料、例えばキットも本発明の範囲内にある。本キットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばＥＬＩＳＡにおいて、ＣＸＣＲ４を検出および定量するための抗体を含有する。本発明の抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばＥＬＩＳＡにおいて、ＣＸＣＲ４を検出および定量するためのキット内に提供することができる。抗体を酵素で標識する場合、本キットは、酵素が必要とする基質および補因子（例えば、検出可能な発色団または蛍光団を提供する基質前駆体）を含む。さらに、安定剤、バッファー（例えば、ブロックバッファーまたは溶解バッファー）などの他の添加剤を含んでもよい。このようなキットは、バイアル、試験管などの１以上の容器を収容するための区画化された受器を含んでなってよく、このような容器は本発明の独立した要素を保持する。例えば、一つの容器は不溶性または部分的可溶性の担体と結合された第一の抗体を含んでよい。第二の容器は、可溶性の検出可能なように標識された第二の抗体を凍結乾燥形態または溶液として含有してよい。受器はまた、検出可能なように標識された第三の抗体を凍結乾燥形態または溶液として保持する第三の容器も含んでよい。この性質のキットは、本発明のサンドイッチアッセイで使用可能である。ラベルまたは添付文書により、本組成物の説明ならびに意図されるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは診断使用に関する説明を提供してもよい。
【０１６５】
種々の試薬の相対量は、試薬溶液中で、アッセイの感受性を実質的に最適化する濃度を提供するように広範囲で変更可能である。特に、これらの試薬は、賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥品として提供することができ、溶解時に適当な濃度の試薬溶液となる。
【０１６６】
本発明のなおさらなる面では、本明細書で詳細に示されるモノクローナル抗体またはその結合フラグメントは、検出可能な部分で標識されたものが提供され、これにより、上述の抗原を有する細胞を診断または同定するために、例えばキットとしてそれらをパッケージし、使用することができる。このような標識の限定されない例としては、フルオレセインイソチオシアネートなどの蛍光団、発色団、放射性核種、ビオチンまたは酵素が挙げられる。このような標識された抗体または結合フラグメントは、例えば、抗原の組織学的局在、ＥＬＩＳＡ、細胞選別、ならびにＣＸＣＲ４およびこの抗原を保持する細胞を検出または定量するための他の免疫学的技術に使用可能である。
【０１６７】
また、細胞からのＣＸＣＲ４の精製または免疫沈降に対する陽性対照として有用なキットも提供される。ＣＸＣＲ４の単離および精製のため、このキットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合された本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含有し得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばＥＬＩＳＡにおいて、ＣＸＣＲ４を検出および定量するための抗体を含有するキットを提供することができる。このキットは、容器と、容器上のまたは容器に添えられたラベルまたは添付文書を含んでなる。この容器は、少なくとも本発明の抗体Ｉ−３８５９、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体を含んでなる組成物を保持する。例えば、希釈剤およびバッファー、対照抗体を含む付加的な容器が含まれてもよい。このラベルまたは添付文書は、本組成物の説明ならびに意図されるｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは診断使用に関する説明を提供し得る。
【０１６８】
より詳細には、本発明は、本発明の方法により腫瘍のＣＸＣＲ４状態を決定するためのキットに関する。好ましい実施形態では、実施例に記載するように、本発明は、ＩＨＣおよび／またはＦＡＣＳ法により腫瘍のＣＸＣＲ４状態を決定するためのキットに関する。
【０１６９】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも上記の抗体Ｉ−３８５９、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体（該抗体は標識されている）を含んでなるキットからなる。
【０１７０】
好ましい実施形態では、本発明によるキットは、前記抗体Ｉ−３８５９とＣＸＣＲ４の間の結合の程度を検出するために有用な試薬をさらに含んでなる。
【０１７１】
別の好ましい実施形態では、ＣＸＣＲ４発現腫瘍においてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでＣＸＣＲ４の発現レベルを決定するために有用な本発明のキットは、前記標識抗体とＣＸＣＲ４の間の結合のレベルを定量するために有用な試薬をさらに含んでなる。
【０１７２】
さらに別の実施形態では、本発明によるキットは、ｉ）前記標識抗体とＣＸＣＲ４の間の結合の程度を検出するために有用な試薬、およびｉｉ）ＣＸＣＲ４発現レベルのスコア化に有用な陽性および陰性対照サンプルをさらに含んでなる。
【０１７３】
前記キットはネズミ抗体に特異的なポリクローナル抗体をさらに含んでなってもよく、好ましくは、前記のネズミ抗体に特異的なポリクローナル抗体は標識されている。
【０１７４】
本発明の特定の実施形態によれば、ＣＸＣＲ４阻害剤の治療的投与から利益を受けるまたは利益を受けないと予測される癌患者をｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択するためのキットは、ｉ）前記抗体とＣＸＣＲ４の間の結合の程度を検出するために有用な試薬、ｉｉ）ＣＸＣＲ４阻害剤に対する感受性と相関させた対照レベル、および／またはｉｉｉ）ＣＸＣＲ４阻害剤に対する耐性と相関させた対照レベルを含んでなり得る。
【０１７５】
本発明はまた、好ましくは標識された、特に放射性標識された本発明による抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは誘導体から構成されるｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおける診断試薬、および医学的画像法における、特に、ＣＸＣＲ４の細胞発現または過剰発現に関連する癌の検出のためのその使用にも関する。
【実施例】
【０１７６】
実施例１：  抗ＣＸＣＲ４  Ｉ−３８５９モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の作製
ＣＸＣＲ４に対するモノクローナル抗体を作製するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスを組換えＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４細胞および／またはＣＸＣＲ４細胞外Ｎ末端およびループに相当するペプチドで免疫した。初回免疫時に６〜１６週齢のマウスをフロイントの完全アジュバント中の抗原で皮下（ｓ．ｃ．）免疫した後、フロイントの不完全アジュバント中の抗原で２〜６回ｓ．ｃ．免疫を行った。後眼窩採血により免疫応答をモニタリングした。血清をＥＬＩＳＡ（下記の通り）によりスクリーニングし、より高力価の抗ＣＸＣＲ４抗体を有するマウスを融合に用いた。マウスの静脈内に抗原を追加免疫し、２日後に犠牲にし、脾臓を摘出した。
【０１７７】
ＥＬＩＳＡ
抗ＣＸＣＲ４抗体を産生するマウスを選択するために、免疫マウスからの血清をＥＬＩＳＡにより検査した。簡単に述べると、マイクロタイタープレートを、ＢＳＡに結合された精製［１−４１］Ｎ末端ペプチド、５μｇ相当のペプチド／ｍＬ、１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ中０．５％ゼラチン  ２５０μＬ／ウェルでブロックした。ＣＸＣＲ４免疫マウスからの血漿の希釈液を各ウェルに加え、３７℃で２時間インキュベートした。これらのプレートをＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰに結合されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＴＭＢ基質で発色させ、５分後に１００μＬ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより反応を停止させた。最も高力価の抗ＣＸＣＲ４抗体を生成したマウス抗体の作製に用いた。
【０１７８】
ＣＸＣＲ４に対するＭａｂを産生するハイブリドーマの作製
最も高い力価の抗ＣＸＣＲ４抗体を生成したＢａｌｂ／ｃマウスから単離したマウス脾細胞を、ＰＥＧを用いて、マウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／Ｏと融合させた。細胞をマイクロタイタープレートにおよそ１×１０５／ウェルで再播種した後、ｕｌｔｒａ  ｃｕｌｔｕｒｅ培地＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム＋１×ＨＡＴを含有する選択培地で２週間インキュベートした。次に、ウェルをＥＬＩＳＡにより、抗ＣＸＣＲ４モノクローナルＩｇＧ抗体に関してスクリーニングした。その後、抗体を分泌するハイブリドーマを限界希釈法により少なくとも２回サブクローニングし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、さらなる分析のために抗体を作製した。
【０１７９】
実施例２：  Ｉ−３８５９  ＭａｂはＣＸＣＲ４単量体およびホモ二量体の両方を免疫沈降させる
ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４細胞ペレットを、１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有する２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．５で洗浄した後、溶解バッファー（１００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０％グリセロール、１％ＣＨＡＰＳＯおよび１０μＬ／ｍＬプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．５）に懸濁させた。細胞をＰｏｔｔｅｒ  Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーで破砕した。可溶化した膜を１０５０００ｇにて＋４℃で１時間の遠心分離により回収した後、＋４℃で一晩、Ｉ３８５９  Ｍａｂ結合セファロース４Ｂビーズとともにインキュベートし、混合物をガラスカラムに注ぎ、溶解バッファーで洗浄した。Ｉ３８５９  Ｍａｂによって捕捉されたタンパク質を溶出させ、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂを一次抗体として用いるウエスタンブロットにより分析した。注目する画分をプールし、濃縮し、ＷＢ分析および分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離（４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）の両方に使用した。
【０１８０】
銀染色の後、目的のバンドをゲルから切り出し、自動タンパク質消化システム、ＭａｓｓＰＲＥＰステーション（Ｗａｔｅｒｓ、ミルフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いてゲル内消化を施した。これらのゲルスポットを５０μＬの２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ、シュタインハイム、ドイツ）および５０μＬのアセトニトリル（Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ  Ｒｅａｃｔｉｆｓ−ＳＤＳ、ヴァル・ド・ルイユ、フランス）で２回洗浄した。システイン残基を２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中に調製した１０ｍＭ  ＤＴＴ  ５０μＬにより、６０℃で１時間還元し、２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中に調製した５５ｍＭヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）５０μＬにより、室温で２０分間アルキル化した。これらのゲルスポットをアセトニトリルで脱水した後、室温で、２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中１２．５ｎｇ／μｌ修飾ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）１０μＬを加えることにより、これらのタンパク質をゲル内で一晩消化した。生じたペプチドを、５％ギ酸を含有する６０％アセトニトリル（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ、ゼールツェ、デンマーク）３５μＬで抽出した後、余分なアセトニトリルを除去し、ｎａｎｏ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを行った。ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析中に回収された質量データを処理し、＊．ｍｇｆファイルに変換し、ＭＡＳＣＯＴ（商標）検索エンジンにかけた。検索はＭＳおよびＭＳ／ＭＳモードにて測定許容差０．２５Ｄａで実施した。
【０１８１】
図１は、Ｉ−３８５９  Ｍａｂ結合セファロースビーズを用いた免疫沈降後の、溶出濃縮画分のウエスタンブロット分析を示す。見掛けの分子量４３および７５ｋＤａの２つのバンドが、一次抗体として用いた抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂにより染色された。
【０１８２】
Ｉ−３８５９  Ｍａｂ結合セファロースビーズを用いた免疫沈降後の溶出濃縮画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥによっても分離し、銀染色により可視化した。４３および７５ＫＤａのバンをゲルから切り出し（図２Ｂ）、トリプシンで消化し、上記のようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。採集されたピークリストをＭａｓｃｏｔのペプチド配列データベース検索にかけた。ＣＸＣＲ４は下記のように両バンドで同定された。
次の５つのＣＸＣＲ４ペプチドがＭＡＳＣＯＴ（商標）検索エンジンにより７５ｋＤａのバンドで同定された：Ｎ末端ＣＸＣＲ４に含まれる３１〜３８のペプチドＥＥＮＡＮＦＮＫ、細胞内ループ１に含まれる７１〜７７のペプチドＳＭＴＤＫＹＲ、Ｃ末端に含まれる３１１〜３２２のペプチドＴＳＡＱＨＡＬＴＳＶＳＲ、３１２〜３２２のペプチドＳＡＱＨＡＬＴＳＶＳＲ、３１３〜３２２のペプチドＡＱＨＡＬＴＳＶＳＲ。
【０１８３】
９つのＣＸＣＲ４ペプチドがＭＡＳＣＯＴ（商標）検索エンジンにより４３ｋＤａのバンドで同定された：Ｎ末端に含まれる２７〜３０のペプチドＰＣＦＲ、３１〜３８のペプチドＥＥＮＡＮＦＮＫ、細胞内ループ１に含まれる７１〜７７のペプチドＳＭＴＤＫＹＲ、細胞内ループ２に含まれる１３５〜１４３のペプチドＹＬＡＩＶＨＡＴＮおよび１３５〜１４６のペプチドＹＬＡＩＶＨＡＴＮＳＱＲ、Ｃ末端に含まれる３１１〜３１９のペプチドＴＳＡＱＨＡＬＴＳ、３１１〜３２２のペプチドＴＳＡＱＨＡＬＴＳＶＳＲ、３１２〜３２２のペプチドＳＡＱＨＡＬＴＳＶＳＲ、３１３〜３２２のペプチドＡＱＨＡＬＴＳＶＳＲ。
【０１８４】
この試験で得られた結果は明らかに、Ｉ−３８５９  ＭａｂがＣＸＣＲ４を免疫沈降させ得ることを示す。Ｉ−３８５９  Ｍａｂは単量体および二量体の両方としてのＣＸＣＲ４を認識する。
【０１８５】
実施例３：  ＢＲＥＴ分析によれば、Ｉ−３８５９  ＭａｂはＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体の両方を調節する
この機能アッセイは、ＳＤＦ−１および／またはＩ−３８５９  ＭａｂがＣＸＣＲ４受容体に結合する際に誘導される、ＣＸＣＲ４ホモ二量体およびＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体形成のレベルでのコンフォメーション変化の評価を可能とする。
【０１８６】
従来の分子生物学的技術を適用することにより、検討する各相互作用相手のための発現ベクターを、対応する色素（ウミシイタケ(Renilla reniformis)ルシフェラーゼＲｌｕｃおよび黄色蛍光タンパク質ＹＦＰ）との融合タンパク質として構築した。ＢＲＥＴ試験を実施する２日前に、ＨＥＫ２９３細胞を、対応するＢＲＥＴ相手、すなわち、ＣＸＣＲ４ホモ二量体形成を検討するためには［ＣＸＣＲ４／Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ４／ＹＦＰ］をコードする発現ベクターで、また、ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２ヘテロ二量体形成を検討するためには［ＣＸＣＲ４−Ｒｌｕｃ＋ＣＸＣＲ２−ＹＦＰ］で一過性にトランスフェクトした。翌日、細胞を、ポリリシンをプレコーティングした白色９６ＭＷプレートの完全培養培地［１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ］に分注した。細胞をまず、３７℃、ＣＯ２  ５％で培養してプレートに細胞を接着させた。次に、細胞を２００μｌ  ＤＭＥＭ／ウェルで一晩飢餓状態にした。ＢＲＥＴ試験の直前に、ＤＭＥＭを除去し、細胞をＰＢＳで手早く洗浄した。次に、細胞をＰＢＳ中、抗体の存在下または非存在下、３７℃で１５分間インキュベートした後、最終容量５０μｌ中、ＳＤＦ−１を含むまたは含まないセレンテラジンＨ  ５μΜを添加した。３７℃で５分間インキュベートし、さらに室温で５分間インキュベートした後、Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ９４０マルチラベルリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用い、４８５ｎｍおよび５３０ｎｍで発光取得を開始した（１秒／波長／ウェル、室温で１５回反復）。
【０１８７】
ＢＲＥＴ比の計算は、従前に記載されている通りに行った(Angers et al., 2000)：［（放出５３０ｎｍ）−（放出４８５ｎｍ）×Ｃｆ］／（放出４８５ｎｍ）、ここで、同じ試験条件下でＲｌｕｃ融合タンパク質単独を発現する細胞については、Ｃｆ＝（放出５３０ｎｍ）／（放出４８５ｎｍ）。この式を簡単に見れば、ＢＲＥＴ比は、２つのＢＲＥＴ相手が存在する場合に得られる５３０／４８５ｎｍ比を、アッセイ中にＲｌｕｃと融合した相手だけが存在する場合に同じ試験条件下で得られる５３０／４８５ｎｍ比で補正したものに相当することが示される。読み取りやすくするために、結果は基本シグナルに対する割合で表す。
【０１８８】
ＳＤＦ１（３００ｎＭ）を添加すると、ＣＸＣＲ４受容体と融合したアダプターおよびアクセプタータンパク質が空間的に近接することにより、ＢＲＥＴシグナルの約２０％の増強が誘発された。この増強はおそらくは、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体の形成か既存の二量体のコンフォメーション変化かのいずれかを示す（図２Ａ）。Ｉ−３８５９  Ｍａｂは、ＳＤＦ−１により誘発されるＣＸＣＲ４ホモ二量体のコンフォメーション変化を調節することができた（ＳＤＦ−１により誘発されるＢＲＥＴ増強の６９％阻害）。Ｉ−３８５９  Ｍａｂはまた、それ自体により、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４の空間的近接を調節することもできたが、これはＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ４ホモ二量体コンフォメーションへのＩ−３８５９  Ｍａｂの影響を示唆する（図２Ａ）。
【０１８９】
ＣＸＣＲ４およびＣＸＣＲ２受容体の空間的近接によるＢＲＥＴシグナルは、ＳＤＦ１（３００ｎＭ）に応答して約２０％低下した。この結果はＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体形成または既存の二量体のコンフォメーション変化を示唆する（図２Ｂ）。Ｉ−３８５９  Ｍａｂは、ＳＤＦ−１により誘発されるＣＸＣＲ２／ＣＸＣＲ４ヘテロ二量体のコンフォメーション変化を調節することができ、ＳＤＦ−１により誘発されるＢＲＥＴの低下の阻害割合は約１００％であり、また、それ自体により、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２の空間的近接を調節することもでき、これはＣＸＣＲ４／ＣＸＣＲ２ヘテロ二量体コンフォメーションへのＩ−３８５９  Ｍａｂの影響を示唆する（図２Ｂ）。
【０１９０】
実施例４：  ＦＡＣＳ分析によれば、Ｉ−３８５９  Ｍａｂは細胞表面に存在するＣＸＣＲ４を認識する
この試験では、Ｉ−３８５９  ＭａｂとヒトＣＸＣＲ４の特異的結合をＦＡＣＳ分析により検討した。
【０１９１】
ＮＩＨ３Ｔ３、ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｈｅｌａ、およびＵ９３７癌細胞株をＩ−３８５９モノクローナル抗体とともにインキュベートした。次に、これらの細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％ＮａＮ３で洗浄した。次に、Ａｌｅｘａで標識した二次抗体を細胞に加え、４℃で２０分間インキュベートした。その後、これらの細胞を再び２回洗浄した。２回目の洗浄の後、ＦＡＣＳ分析を実施した。これらの結合試験の結果は図３に示され、これらの結果は、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  Ｉ−３８５９がヒトＣＸＣＲ４−ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクト細胞株と結合することを示すが［平均蛍光強度（ＭＦＩ）］、親ＮＩＨ３Ｔ３細胞は認識しない（示されていない）。このＭａｂはまた、ヒト癌細胞株、例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（１０μｇ／ｍｌ濃度でのＭＦＩ＝５９）、Ｕ９３７前骨髄球性癌細胞（１０μｇ／ｍｌ濃度でのＭＦＩ＝２４６）およびＨｅｌａ子宮頸癌細胞（１０μｇ／ｍｌ濃度でのＭＦＩ＝６３３）も認識することができたが、このことはこれらの細胞株が天然にＣＸＣＲ４を過剰発現することを示している。
【０１９２】
実施例５：  ＦＡＣＳ分析によれば、Ｉ−３８５９  Ｍａｂは細胞膜におけるＣＸＣＲ４との結合に関して、抗ＣＸＣＲ４  ５１５Ｈ７治療用Ｍａｂとの競合状態に入る
この試験では、Ｉ−３８５９および５１５Ｈ７  ＭａｂのヒトＣＸＣＲ４への結合の競合をＦＡＣＳ分析により検討した。
【０１９３】
ＮＩＨ３Ｔ３−ｈＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞を、ビオチン化５１５Ｈ７  Ｍａｂ（５μｇ／ｍｌ）［ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＸＣＲ４細胞を認識した（図４Ａ）］およびＩ−３８５９  Ｍａｂまたは５１５Ｈ７  Ｍａｂのいずれか（０〜１ｍｇ／ｍＬ）とともに４℃で１時間インキュベートした。次に、これらの細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０１％ＮａＮ３で洗浄した。次に、標識したストレプトアビジンを細胞に加え、４℃で２０分間インキュベートした。その後、これらの細胞を再び２回洗浄した。２回目の洗浄の後、ＦＡＣＳ分析を実施した。これらの結合試験の結果を図４Ｂに示す。これらの結果は、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  Ｉ−３８５９が、ヒトＣＸＣＲ４−ＮＩＨ３Ｔ３トランスフェクト細胞への結合に関して、抗ＣＸＣＲ４  ５１５Ｈ７治療用Ｍａｂと競合するという［平均蛍光強度（ＭＦＩ）］を示す。予測されたように、非標識５１５Ｈ７  Ｍａｂも、ビオチン化５１５Ｈ７  ＭａｂのＣＸＣＲ４との結合を阻害した。
【０１９４】
実施例６：  無胸腺ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植腫瘍成長モデルでのＩ−３８５９  Ｍａｂ活性の評価
この試験の目的は、抗ＣＸＣＲ４  Ｍａｂ  Ｉ−３８５９の、無胸腺ヌードマウスにおけるＭＤＢ−ＭＢ−２３１異種移植片の成長を阻害する能力を評価することであった。
【０１９５】
ＥＣＡＣＣから入手したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、スコットランド、ＵＫ）、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ＭＤ、ＵＳＡ）を常法により培養した。細胞群を移植４８時間前に分割し、従って、それらの細胞は指数増殖期にあった。ＰＢＳ中、１千万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、７週齢の無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ、フランス）に移植した。移植５日後に、腫瘍は測定可能であり（３４ｍｍ３＜Ｖ３＜４０ｍｍ３）、これらのマウスを匹敵する腫瘍サイズを有する１２個体の群に分けた。マウスを負荷用量２ｍｇ／マウスのＩ−３８５９  Ｍａｂでｉ．ｐ．処置した。次に、マウスに１ｍｇ／用量／マウスのＩ−３８５９  Ｍａｂを週に２回注射した。この試験には、対照群としてＰＢＳ群を導入した。腫瘍体積は、週に２回測定し、式：π／６×長さ×幅×高さにより計算した。統計分析は測定ごとにマン・ホイットニー検定を用いて行った。
【０１９６】
この試験では、処置中に死亡は見られなかった。ＰＢＳ群に比べ、Ｉ−３８５９  Ｍａｂ（１ｍｇ／用量）の３１日目では腫瘍成長の有意な阻害は見られなかった。処置４週間後の平均腫瘍体積は、ＰＢＳに対してＩ−３８５９  Ｍａｂによって減少することは無かった（図５）。
【０１９７】
実施例７：  免疫組織化学的研究（ＩＨＣ）
切片を脱パラフィンし、再水和させ、熱誘導エピトープ賦活化(heat-induced epitope retrieval)のために、３７℃で１０分間、予温プロテアーゼ１バッファー（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）中に置いた。Ｔｒｉｓバッファー生理食塩水−０．０５％ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）（Ｄａｋｏ  Ｓ３００６）で３回洗浄した後、内因性のペルオキシダーゼ活性をペルオキシダーゼブロッキング試薬（Ｄａｋｏ  Ｋ４００７）を用いて５分間ブロックした。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ブロッキング試薬（Ｕｌｔｒａ  Ｖ  ｂｌｏｃｋ−ＴＡ−１２５ＵＢ−  Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）中で５分間インキュベートした後、Ｉ−３８５９（１５μｇ／ｍｌ、クローンＩ−３８５９、Ｐｉｅｒｒｅ  Ｆａｂｒｅ）またはアイソタイプ対照としてのマウスＩｇＧ１／κ（１５ｇ／ｍｌ、Ｘ０９３１、Ｄａｋｏ）とともに４℃で一晩インキュベートした。切片をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、室温で３０分間、ＳｉｇｎａｌＳｔａｉｎ  Ｂｏｏｓｔ  ＩＨＣ検出試薬（ＨＲＰ、Ｍ）とともにインキュベートした。ジアミノベンジジンを用いて褐色反応生成物を発生させた（Ｄａｋｏ  Ｋ３４６８）。これらのスライドをヘマトキシリン中に４分間浸漬して対比染色を行い（Ｄａｋｏ  Ｓ３３０９）、ＰＢＳ中で洗浄した後、Ｆａｒａｍｏｕｎｔ封入剤とカバーガラス中に包埋した。この免疫組織化学的手法において、褐色反応生成物は細胞膜の陽性染色に相関し、褐色反応生成物の欠如は陰性染色および細胞膜が見えないことに相関する。
【０１９８】
Ｉ−３８５９  Ｍａｂは、種々の腫瘍タイプの細胞膜を差次的に染色する。図６および７に２つの異種移植モデルで行った染色を示したが、これには治療用抗ＣＸＣＲ−４  ｈｚ５１５Ｈ７抗体：ＲＡＭＯＳおよびＫＡＲＰＡＳ２９９による抗腫瘍活性が表されている。図６および７に示されるように、検出される発現は、ＫＡＲＰＡＳ２９９（図７）異種移植ではＲＡＭＯＳ（図６）よりも低い。このデータは、フローサイトメトリーによるＣＸＣＲ−４発現の試験とよく相関している。実際に、ＲＡＭＯＳ細胞は、ＫＡＲＰＡＳ２９９細胞よりも約５倍高いレベルのＣＸＣＲ−４を発現する（抗体結合能：ＲＡＭＯＳに対しては２０００００、ＫＡＲＰＡＳ２９９に対しては４００００）。膜染色はＫＡＲＰＡＳ２９９では弱く（図７）、一方、ＲＡＭＯＳでは膜性染色は有意に高い（図６）。
【図１】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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