(57)【要約】  本発明は、糖尿病性腎症のための医薬組成物及びその調製、並びに糖尿病性腎症のための医薬の調製における適用に関する。本医薬組成物は、活性成分としての７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンのうちの少なくとも一方から構成され、活性成分の重量％は、０．１〜９９．５％である。更に、本医薬組成物は、主に糖尿病性腎症の予防及び治癒に使用される。豊富な材料、糖尿病性腎症の予防及び治癒に対する顕著な効果及び便利な使用のため、患者にとって新たな選択薬剤となる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分としての、７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンのうちの少なくとも一方、並びに、従来の薬剤担体から構成され、活性成分が０．１〜９９．５重量％の割合で含まれる、糖尿病性腎症のための医薬組成物。
【請求項２】
活性成分が、５〜７０重量％の割合で含まれる、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
医薬組成物が、活性成分としての７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン、並びに従来の薬剤担体から構成され、７−ヒドロキシクマリンと７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの重量比が、１：４〜４：１の範囲である、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
従来の薬剤担体が、希釈剤、賦形剤、充填剤、接着剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、吸収担体、潤滑剤、風味剤及び甘味料のうちの少なくとも１つを含み、賦形剤が水であり、充填剤が、デンプン、スクロース又はラクトースであり、接着剤が、セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドンからなる群より選択されるうちの少なくとも１つであり、湿潤剤がグリセリンであり、崩壊剤が、寒天、炭酸カルシウム又は重炭酸ナトリウムであり、吸収促進剤が第四級アンモニウム化合物であり、界面活性剤がパルミチルアルコールであり、吸収担体が、カオリン粘土又は石けん粘土であり、潤滑剤が、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム又はポリエチレングリコールである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ペレット剤、カプセル剤、顆粒剤、滴下剤又は経口液剤のような臨床投与形態に調製することができる、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンのうちの少なくとも一方を従来の薬剤担体と混合すること、および、医薬組成物を得るために、特定の調製方法に従って調製することを含む、請求項１記載の医薬組成物の調製方法。
【請求項７】
糖尿病性腎症のための医薬組成物の調製における７−ヒドロキシクマリン及び／又は７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伝統的な漢方薬の調製の分野に関し、特に糖尿病性腎症のための医薬組成物とその調製及び適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真性糖尿病及びその慢性合併症は、ヒトの健康及び生活の質に深刻な影響を与えてきた。近年、患者の数が増加しており、全ての年齢群において糖尿病性腎症の発症率は、世界中で、２０００年は２．８％であり、２０３０年には４．４％になると予測され、このことは、糖尿病患者の数が２０００年の１億７千百万人から２０３０年には３億３千３百万人に増加することを意味する。発症率が毎年増加しているので、中国における患者の数は、インドに次いで第２位である。したがって、糖尿病及びその合併症の予防及び治癒は、最近は非常に重要な話題になっている。糖尿病性腎症（ＤＮ）は、糖尿病の重要な合併症の１つであり、腎不全の最終段階をもたらす疾患の第１位である。世界保険機構のデータにより示されているように、Ｉ型糖尿病患者の約３０％及びＩＩ型糖尿病患者の２５％〜４０％は、血中グルコースが管理されないとＤＮ患者に進行する。潜伏期のため及びより早い時期にＤＮを発見することが困難であるため、腎臓罹患の症状が現れたときには、逆転することができない。糖尿病が１年間続けば、腎臓の濾過機能が破壊され、微量のタンパク尿として表れる。疾患の経過が長引くとタンパク尿は増加し、血中の毒素を排除する腎臓の能力が徐々に減衰し、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）をもたらし、患者は、血液透析又は腎臓移植により生命を維持するしかなくなる。したがって、ＤＮの機構を徹底的に解明すること、並びに予防及び治癒の手段を充実させて完成させることがどうしても必要である。
【０００３】
クワ（Morus alba L.）の乾燥根皮層である桑白皮（Cortex Mori）は、甘味があり、冷感性であって、肺から熱を除去し、喘息を緩和し、利尿を誘導して浮腫を軽減する機能を有する。桑白皮は、通常、肺の熱に起因する呼吸困難症及び咳、水症及び膨張に起因する乏尿症、顔面の筋肉及び皮膚の腫脹に使用される。最近の薬理学研究は、桑白皮が、血糖及び血圧の低下、利尿、咳の予防及び喘息の緩和、抗ＨＩＶ、抗腫瘍などの活性を有することを示した。血糖を低下する活性成分である１−デオキシノジリマイシン及びモランＡが桑白皮から単離されて以来、ますます多くの研究者たちが、血糖を低下する新たな活性成分を桑白皮から探しており、次いで糖尿病のために新たな薬剤の改善を探求している。桑白皮の主要な活性成分は、フラボン、アルカノイド、多糖類、クマリン（ウンベリフェロン、スコポレチン）などである。研究者たちは、フラボン、アルカノイド及び多糖類が全て血糖を下げる効果を有し、アルカノイドが最も良好に機能することを実証した。桑白皮中のクマリンは、通常、利尿、咳の予防及び喘息の緩和に使用されており、現在までのところ、どの文献も糖尿病性腎症に対する効果を報告していない。国内及び海外の研究報告書によると、クマリンは、抗ＨＩＶ、抗腫瘍、血圧低下、抗不整脈、抗骨粗鬆症、痛覚消失、喘息の緩和、抗生作用などの生物活性を有する。したがって、糖尿病性腎症を治療することは、クマリンにとって医療分野における新たな適用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の目的は、糖尿病性腎症のための医薬組成物及びその調製を提供することであり、ここで本医薬組成物の活性成分はクマリンである。
【０００５】
上記の目的を達成するための技術的解決は以下である：
活性成分としての７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンのうちの少なくとも一方、並びに従来の薬剤担体から構成され、活性成分が０．１〜９９．５重量％の割合で含まれる、糖尿病性腎症のための医薬組成物。
【０００６】
好ましくは、活性成分は、５〜７０重量％の割合で含まれる。
【０００７】
好ましくは、本医薬組成物は、活性成分としての７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン、並びに従来の担体から構成され、７−ヒドロキシクマリンと７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの重量比は、１：４〜４：１の範囲である。
【０００８】
本発明の医薬組成物に使用される従来の薬剤担体は、医薬分野の従来の薬剤担体である。例えば、希釈剤及び賦形剤は水であり、充填剤は、デンプン、スクロース、ラクトースなどであり、接着剤は、セルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン又はポリビニルピロリドンであり、湿潤剤はグリセリンであり、崩壊剤は、寒天、炭酸カルシウム又は重炭酸ナトリウムのいずれかであり、吸収促進剤は、第四級アンモニウム化合物であり、界面活性剤は、パルミチルアルコールであり、吸収担体は、カオリン粘土又は石けん粘土であり、潤滑剤は、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム又はポリエチレングルコールである。加えて、風味剤、甘味料などの他の佐剤を組成物に加えることもできる。
【０００９】
通常の調製方法を使用することによって、本発明の医薬組成物を通常の投与形態に調製することができるが、この投与形態は主に、ペレット剤、カプセル剤、顆粒剤、滴下剤（dripping pill）、経口液剤などの経口調合剤である。
【００１０】
医薬組成物の用量は、投与方法及び疾患の重篤度によって調整することができる。通常、診療所の経口基準用量は、１０〜７０mg/dである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンのうちの少なくとも一方を従来の薬剤担体と混合することと、医薬組成物を得るために、特定の調製方法に従って調製することを含む、糖尿病性腎症のための医薬組成物を調製する方法を提供することである。
【００１２】
本医薬組成物は、薬剤学の分野における通常の調製方法に従って調製することができる。例えば、活性成分を複数の担体と混合し、次に所望の投与形態に調製する。
【００１３】
本発明は、糖尿病性腎症のための医薬組成物の調製における７−ヒドロキシクマリン及び／又は７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの適用も提供する。
【発明の効果】
【００１４】
１．本発明は、桑白皮から単離されたクマリンが血糖を低下する機能を有することを初めて証明したが、このことは、糖尿病及び糖尿病の合併症の患者のための新たな薬剤を提供することを意味する。
【００１５】
２．本発明の医薬組成物は、糖尿病性腎症に対して、桑白皮の水抽出物よりもはるかに有効である。加えて、確定した活性成分及び容易な品質管理のおかげで、不確定な活性成分、粗悪な品質管理、多くの毒性副作用などのような伝統的な漢方薬の欠点を克服する。
【００１６】
３．本医薬組成物の材料は豊富にあり、滴下剤、注入用粉末調合剤、ペレット剤のような経口投与形態にすることが容易であり、使用するのに都合が良い。
【００１７】
４．本医薬組成物は、糖尿病における糸球体の損傷の予防又は治癒において際立った効果を有する。本医薬組成物は、顕著に血清クレアチニンの上昇を防ぎ、糖尿病のラットの尿量及び尿タンパク質を低下することができ、このことは、本医薬組成物が糖尿病性腎症の予防及び治癒に対して顕著な効果があることを証明している。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、高グルコース下で培養したラット糸球体毛細血管間細胞の肥大に対する変化を示す（ＨＥ、２００×）；  図中、  Ａ：正常対照群；  Ｂ：ブドウ糖（２５mmol/L）群；  Ｃ：桑白皮の水抽出物（０．１g/L）；  Ｄ：７−ヒドロキシクマリン（１μmol/L)；  Ｅ：７−ヒドロキシクマリン（０．１μmol/L)；  Ｆ：７−ヒドロキシクマリン（０．０１μmol/L)；  Ｇ：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（１μmol/L)；  Ｈ：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．１μmol/L)；  Ｉ：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．０１μmol/L)；  Ｊ：７−ヒドロキシクマリン：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．０６：０．０３μmol/L)；  Ｋ：７−ヒドロキシクマリン：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．０５：０．０５μmol/L)；  Ｌ：７−ヒドロキシクマリン：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．０３：０．０６μmol/L)。
【図２】７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、高グルコース下で培養したラット糸球体毛細血管間細胞の細胞外マトリックス増殖に対する効果を示す（ＰＡＳ、２００×）；  図中、  Ａ：正常対照群；  Ｂ：ブドウ糖（２５mmol/L）群；  Ｃ：桑白皮の水抽出物（０．１g/L）；  Ｄ：７−ヒドロキシクマリン（１μmol/L)；  Ｅ：７−ヒドロキシクマリン（０．１μmol/L)；  Ｆ：７−ヒドロキシクマリン（０．０１μmol/L)；  Ｇ：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（１μmol/L)；  Ｈ：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．１μmol/L)；  Ｉ：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．０１μmol/L)；  Ｊ：７−ヒドロキシクマリン：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．０６：０．０３μmol/L）；  Ｋ：７−ヒドロキシクマリン：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．０５：０．０５μmol/L)；  Ｌ：７−ヒドロキシクマリン：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．０３：０．０６μmol/L)。
【図３】７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、高グルコース下で培養したラット糸球体毛細血管間細胞のＣＴＧＦ発現に対する効果を示す（ＣＴＧＦ、２００×）。；  図中、  Ａ：正常対照群；  Ｂ：ブドウ糖（２５mmol/L）群；  Ｃ：陰性対照（ＣＴＧＦ抗体なし）；  Ｄ：桑白皮の水抽出物（０．１g/L）；  Ｅ：７−ヒドロキシクマリン（１μmol/L)；  Ｆ：７−ヒドロキシクマリン（０．１μmol/L)；  Ｇ：７−ヒドロキシクマリン（０．０１μmol/L)；  Ｈ：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（１μmol/L)；  Ｉ：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．１μmol/L)；  Ｊ：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．０１μmol/L)；  Ｋ：７−ヒドロキシクマリン：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．０６：０．０３μmol/L)；  Ｌ：７−ヒドロキシクマリン：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．０５：０．０５μmol/L)；  Ｍ：７−ヒドロキシクマリン：７−ヒドロキ−６−メトキシシクマリン（０．０３：０．０６μmol/L)。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明において糖尿病性腎症に使用されるクマリンは、７−ヒドロキシクマリン（Ａ）及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン（Ｂ）であり、これらの構造を下記に示す：
【化１】
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【００２０】
これらの２つのクマリン化合物は、多くの植物中に広範囲に分布しており、化学合成によっても得ることができる。
【００２１】
本発明を以下の実施態様において更に説明する。
【００２２】
〔実施例１：７−ヒドロキシクマリンの調製〕
１０kgの桑白皮乾燥根皮層を微細粉末に粉砕し、１００Lの水を加え、還流下で２時間に３回抽出する。抽出物をまとめ、真空下で特定の容量に濃縮し、Ｄ１０１マクロ孔質樹脂に加え、水、次に９５％ＥｔＯＨで溶離し、９５％ＥｔＯＨ溶離液を収集し、真空下で濃縮し、次にシリカゲルに加え、石油、石油−酢酸エーテル１００：１、石油−酢酸エーテル５０：１、石油−酢酸エーテル２０：１のそれぞれにより溶離する。琥珀色の粉末が石油−酢酸エーテル２０：１の溶離により得られ、アセトンによる数回の再結晶によって純粋な試料がもたらされる。その構造は、赤外線スペクトル、紫外線スペクトル、核磁気共鳴及び質量スペクトルによって、７−ヒドロキシクマリン（ウンベリフェロン）であると同定された。分子式：Ｃ９Ｈ６Ｏ３；分子量：１６２。ＨＰＬＣにより検出した純度は＞９９％であり、構造を下記に示す：
【化２】
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【００２３】
〔実施例２：７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの調製〕
１０kgの桑白皮の乾燥根皮層を微細粉末に粉砕し、１００Lの水を加え、還流下で２時間に３回抽出する。抽出物をまとめ、真空下で特定の容量に濃縮し、Ｄ１０１マクロ孔質樹脂に加え、水、次に９５％ＥｔＯＨで溶離し、９５％ＥｔＯＨ溶離液を収集し、真空下で濃縮し、次にシリカゲルに加え、石油、石油−酢酸エーテル１００：１、石油−酢酸エーテル５０：１のそれぞれにより溶離する。琥珀色の粉末が石油−酢酸エーテル５０：１の溶離によって得られ、アセトンによる数回の再結晶によって純粋な試料がもたらされる。その構造は、赤外線スペクトル、紫外線スペクトル、核磁気共鳴及び質量スペクトルによって、７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン（スコポレチン）であると同定された。分子式：Ｃ１０Ｈ８Ｏ４；分子量：１９２。ＨＰＬＣにより検出した純度は＞９９％であり、構造を下記に示す：
【化３】
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【００２４】
〔実施例３：医薬組成物（活性成分：７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン）のカプセル剤の調製〕
工程：
Ａ  ４．２ｇのミツロウを取り、１２５ｇのエファモルを加え、８０℃の湯浴で溶融及び混合し、室温（２５℃）に冷却し、次に十分な量のジブチルヒドロキシアニソールを加え、均一に混合する。
Ｂ  １００メッシュの篩にかけた０．２５ｇの７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン及び５ｇのレシチンを加え、２５０ｇのエファモルを加え、均一に混合してカプセル剤のコア液とし、１０００個のカプセル剤を調製する。
【００２５】
この実施例で調製したカプセル剤は、高血糖症及び糖尿病性腎症に対して十分な効果を発揮する。
【００２６】
〔実施例４：医薬組成物（活性成分：７−ヒドロキシクマリン）の滴剤の調製〕
１５ｇの７−ヒドロキシクマリンを取り、微細粉末に粉砕し、２００メッシュの篩にかけ、１５ｇの溶融ポリグリコール６０００基材に加え、均一に撹拌し、チラーとしてジメチルベンゼンシリコーン油を用いて滴剤（drop pill）を調製し、乾燥して完成させる。本滴剤は、血清クレアチニンを上昇させ、尿クレアチニンを下降させる疾患、及び糖尿病性腎症に対して十分な効果を発揮する。
【００２７】
〔実施例５：医薬組成物（活性成分：７−ヒドロキシクマリン又は７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン）のペレット粒剤の調製〕
粒剤１個あたりの構成成分：
７−ヒドロキシクマリン又は７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン      １２mg
ラクトース                                                        １７５mg
トウモロコシデンプン                                                ５０mg
ステアリン酸マグネシウム                                              ３mg
【００２８】
調製方法：活性成分、ラクトース及びデンプンを混合し、水で均一に湿潤し、混合物を篩にかけ、乾燥し、再び篩にかけ、ステアリン酸マグネシウムを加え、次に混合物を砕いて、粒剤１個当たり２４０mgで活性成分が１２mgの錠剤にする。本ペレット粒剤（pellet pill）は、高尿タンパク質の疾患及び糖尿病性腎症に対して十分な効果を発揮する。
【００２９】
〔実施例６：医薬組成物（活性成分：７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン）の分散性錠剤の調製〕
処方用量である９５ｇの７−ヒドロキシクマリン、１９０ｇの７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン、４０ｇのラクトース、７０ｇの微晶質セルロース、５．２５ｇのポリビニルピロリドン、２．５ｇのアスパルテーム、６ｇのポリビドン及び４ｇの重炭酸カリウム、を正確に計量し、主剤及び佐剤を等量ずつ増やして十分に混合し、８０メッシュの篩で２回篩にかけ、混合物を適切な容器に入れ、７５％ＥｔＯＨに溶解した１５％（ｇ／１００ml）ポリエチレン６０００の十分な量を加えて軟質にし、２０メッシュの篩によって砕いて湿潤顆粒にし、ほうろうプレートの上に塗布し、送風オーブンにより７０℃で２時間乾燥し、乾燥した顆粒を正確に計量し、２．２５ｇの残りのポリビニルピロリドン及び１％（w/w）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加え、均一に混合し、φ７mmの円形打抜ダイで１０００個の粒剤に砕いて、１０００個の７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの分散性錠剤を仕上げる。本分散性錠剤は、糖尿病性腎症及びその合併症に対して十分な効果を発揮する。
【００３０】
〔実施例７：医薬組成物（活性成分：７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン）のペレット粒剤の調製〕
活性成分：                    ７０ｇ
微晶質セルロース：          ０．４ｇ
砕いて１０００個の粒剤にする
【００３１】
調製方法：活性成分である５６ｇの７−ヒドロキシクマリンと１４ｇの７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンを微晶質セルロースと混合し、水で均一に湿潤して軟質にし、混合物を顆粒にし、２０メッシュの篩にかけ、８０℃で乾燥し、再び篩にかけ、次に砕いて、粒剤１個あたり７０．４mgであって粒剤１個あたり７０mgの活性成分を有する粒剤にする。本粒剤は、糖尿病性腎症及びその合併症に対して十分な効果を発揮する。
【００３２】
〔実施例８：医薬組成物（活性成分：７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン）のペレット粒剤の調製〕
活性成分：                    ７０ｇ
微晶質セルロース：          ０．４ｇ
砕いて１０００個の粒剤にする
【００３３】
調製方法：活性成分である１４ｇの７−ヒドロキシクマリンと５６ｇの７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンを微晶質セルロースと混合し、水で均一に湿潤して軟質にし、混合物を顆粒にし、２０メッシュの篩にかけ、８０℃で乾燥し、再び篩にかけ、次に砕いて、粒剤１個あたり７０．４mgであって粒剤１個あたり７０mgの活性成分を有する粒剤にする。本粒剤は、糖尿病性腎症及びその合併症に対して十分な効果を発揮する。
【００３４】
本発明において、７−ヒドロキシクマリン及び／又は７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンを、高グルコースで培養したラットの腎臓毛細血管間細胞に対する効果及び糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスに対する治療作用についての実験に適用する。
【００３５】
＜実験１＞
７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、高グルコース下で培養したラット糸球体メサンギウム細胞の肥大及びラット糸球体毛細血管間細胞の細胞外マトリックス増殖に対する効果
糖尿病性腎症に特異的な疾患兆候として糸球体硬化があるが、その重要な理由の一つは、糸球体間質領域の細胞外マトリックスの過度な増大である。メサンギウム細胞は、糸球体腸間膜の主要な構成成分であり、収縮、内分泌、分化増殖、免疫及び食菌作用の多くの機能を有する糸球体の生理学的機能を仲介する重要な役割を果たす。したがって、高グルコース下で培養されたメサンギウム細胞は、糖尿病性腎症における糸球体硬化の研究にとって非常に貴重なモデルである。
【００３６】
１．材料及び薬剤
ラットのメサンギウム細胞の細胞株ＨＢＺＹ−１；ＤＭＥＭ培地（GIBCO）；仔牛血清（Sijiqing serum factory, Hangzhou）；ＣＴＦＧ（Canta Cruz）；ヤギ抗マウスのビオチン化抗体（Jingmei bioengineering Co.,LTD）；即時利用できる免疫組織化学ＳＡＢＣ染色キット（Bost company）；ＤＡＢ発色システム（Gene Tech Biotechnology CompanyLimited）。
【００３７】
ＣＯ２インキュベーター（NAPC05410, PERCISION SCIENTIFIC）；XSZ-D2倒立顕微鏡（Chongqing opticalinstrument factory）；スーパークリーンベンチ（Baisheng technology network system Co., LTD, Suzhou & Purity technology institute, Suzhou city）；臨床用遠心分離機（LDZ5-2, Beijing clinical centrifuge factory）；免疫組織化学用shi box（Maixin biotechnology explotitation company, Fuzhou）。
【００３８】
２．実験方法
２．１  桑白皮の水抽出物の調製
十分な量の桑白皮の乾燥根皮質を粉末に粉砕し、１０倍の水を加え、還流下で２時間毎に３回抽出し、抽出物をまとめ、真空下で濃縮して使用のための特定の容量にする。
【００３９】
２．２  細胞のモデル化及び培養
対数増殖期のラットメサンギウム細胞を取り、５％仔牛血清含有ＤＭＥＭ培地により単細胞懸濁液（５×１０４細胞／ml）を調製し、カバーガラスで覆われた２４ウエルプレートに１ml／ウエル（細胞量：５×１０４／ウエル）で接種し、５％ＣＯ２インキュベーターにより３７℃で２４時間インキュベートし、血清不含有ＤＭＥＭ培地を加え、２４時間インキュベートして、全ての細胞を休止期にする。上清を廃棄し、９００μlのＤＭＥＭ培地及び１００μlの異なる濃度のブドウ糖（各濃度を３回繰り返す）を加え、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間、それぞれインキュベートする。ＨＥ及びＰＡＳで染色した後、モデル化の結果を観察した。その結果は、２５mmol／Lのブドウ糖及び４８時間のインキュベーションが実験のモデルにとって最高の条件であったことを示す。
【００４０】
ポリ−Ｌ−リシンで前処理したカバーガラスを２４ウエル細胞培養プレートに入れてから単細胞懸濁液を加え、次にこれらの細胞を同期段階まで培養する。上清を廃棄し、８００μlのＤＭＥＭ培地、１００μlのブドウ糖（最終濃度は２５mM/Lである）を各薬剤群に加え、次に１００μlの桑白皮の水抽出物（最終濃度は０．１g/Lである）又は７−ヒドロキシクマリン（最終濃度は１、０．１若しくは０．０１μmol/Lである）又は７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン（最終濃度は１、０．１若しくは０．０１μmol/Lである）又は７−ヒドロキシクマリンと７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの混合溶液（最終濃度は０．０６：０．０３、０．０５：０．０５若しくは０．０３：０．０６μmol/Lである）を加える。高グルコース群に９００μlのＤＭＥＭ培地及び１００μlのブドウ糖（最終濃度は２５mmol/Lであった）を加えたとき、正常対照群には１mlのＤＭＥＭ培地を加える。各群で３回繰り返す。次に全ての群を５％ＣＯ２インキュベーターにより３７℃で４８時間インキュベートする。その後、カバーガラスを取り出して、ＨＥ染色、ＰＡＳ染色及び免疫細胞化学染色を行う。
【００４１】
２．３  染色
日常的ＨＥ染色、日常的ＰＡＳ染色、ＣＴＧＦ染色
ＣＴＧＦ染色の工程：細胞で被覆されたカバーガラスを４％パラホルムアルデヒドにより３０分間固定し、内因性ホースラディッシュペルオキシダーゼを、その都度調製した３％Ｈ２Ｏ２メタノール溶液で１０分間不活性化し、蒸留水で３回清浄し、非特異的抗原を、５％ＢＳＡで２０分間ブロックし、抗体ＣＴＧＦ（：５００）を滴加し、４℃で一晩維持し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により２０分間で３回洗浄し、ヤギの抗マウスビオチン化抗体を滴加し、３７℃で３０分間保持し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により５分間で４回洗浄し、５０μlの発色液（１mlの蒸留水に各現像液Ａ、Ｂ、Ｃを滴下し、均一に混合する）を加え、室温で１５分間発色させ、蒸留水で均一に清浄し、ヘマトキシリンで１分間再び軽く染色し、水で洗浄し、脱水し、透明化し、カバーガラスをneutro-gummiで覆い、顕微鏡で染色を観察する。
【００４２】
３  結果及び分析
ラットメサンギウム細胞の肥大変化、細胞外マトリックスの増殖及びＣＴＧＦの発現をそれぞれ観察する。
【００４３】
３．１  ７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、高グルコース下で培養したラット糸球体毛細血管間細胞の肥大に対する変化
図１に示されているように、高グルコース（２５mmol/L）下で培養したラットメサンギウム細胞の肥大は明白であり、桑白皮の水抽出物、７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの単一使用又は共使用は、全て、高グルコースにより誘導されたラットメサンギウム細胞の肥大を有意に抑制することができる。更に、化合物の効果は、抽出物よりも良好であり、共使用は単一使用と比べてより良好であるか又は同等である。
【００４４】
３．２  ７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、高グルコース下で培養したラットメサンギウム細胞の細胞外マトリックス増殖に対する効果
図２に示されているように、高グルコース（２５mmol/L）下で４８時間培養したラットメサンギウム細胞の細胞外マトリックスは増大する（ＰＡＳにより染色された染色区域の領域及び色度が増大する）が、桑白皮の水抽出物、７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの単一使用又は共使用は、全て、高グルコースにより誘導されたラットメサンギウム細胞の細胞外マトリックスを減少することができる。更に、化合物の効果は、抽出物よりも良好であり、共使用は単一使用よりも良好である。
【００４５】
３．３  ７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、高グルコース下で培養したラットメサンギウム細胞のＣＴＧＦ発現に対する効果
図３に示されているように、高グルコース（２５mmol/L）下で４８時間培養したラットメサンギウム細胞のＣＴＧＦ発現は増加するが、桑白皮の水抽出物、７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの単一使用又は共使用は、全て、高グルコースにより誘導されたラットメサンギウム細胞のＣＴＧＦ発現を減少することができる。更に、化合物の効果は、抽出物よりも良好であり、共使用は単一使用よりも良好である。
【００４６】
＜実験２＞
７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスに対する治療作用
１．材料及び薬剤
ｄｂ／ｄｂマウス、Ｂ６マウス（南医科大学の実験動物センターから提供された）；Accu-Chek Advantage血糖装置（los diagnose company, America）；SPECTRA max190（America MD company）；クレアチニン検出キット、クーマシーブリリアントブルー検出キット（Jiancheng bioengineering institute, Nangjing,China）。
【００４７】
２  実験方法
２．１  桑白皮の水抽出物の調製
十分な量の桑白皮乾燥根皮質を粉末に粉砕し、１０倍の水を加え、還流下で２時間毎に３回抽出し、抽出物をまとめ、真空下で濃縮して使用のための特定の容量にする。
【００４８】
２．２  動物管理及び投与
実験の期間中、全てのマウスを層流ケージで飼育し、食餌及び水を自由に与える。水及び下側パッドを毎日交換して、ケージを清浄に保ち、水、食餌及び敷パッドは固定されている。１２時間交互に光を照らす。全ての器具及び食餌は毎日滅菌する。
【００４９】
１１０匹の８週齢のマウスを、１群あたり１０匹のマウスで以下の１１群に分ける：モデル群、桑白皮の水抽出物（用量：２０００mg生薬／kg）、７−ヒドロキシクマリン（用量：０．５、１．０及び２．０mg/kg）、７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン（用量：０．５、１．０及び２．０mg/kg）、７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン（０．６：０．３、０．５：０．５及び０．３：０．６）である。更に、１０匹の８週齢のＢ６マウスを正常対照として用いる。各群には、異なる濃度で０．４mlの対応する薬剤又は生理食塩水を、５週間にわたって毎日胃内投与により与える。
【００５０】
３  統計分析
食餌摂取及び水摂取を測定し、体重を毎週量り、血中グルコースを毎週測定する。投与が終了した後、２４時間の尿を収集して尿量を計算し、尿の総タンパク質及びクレアチニンを測定し、マウスを殺処分し、２つの腎臓を取り出して、腎臓指数〔ＲＩ：ＲＩ（‰）＝腎臓重量／体重×１０００〕を計算する。
【００５１】
全ての測定を統計化し、クラス間ｔ−検定により分析して、(平均)±ｓで表す。
【００５２】
４  結果
４．１  ７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの体重に対する効果
表１に示されているように、桑白皮の水抽出物、７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの単一使用又は共使用は、全て、糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの体重の増加を抑制することができる（Ｐ＜０．０５）。更に、７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの効果は、抽出物と比べてより良好であるか又は同等であり、共使用は単一使用よりも良好である。
【００５３】
表１  ７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの体重に対する効果（(平均)±ｓ、ｎ＝１０）
【表１】
2011510098.tif 000006
【００５４】
４．２  ７−ヒドロキシクマリン及び／又は７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの血中グルコースに対する効果
表２に示されているように、最終投与段階における７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの単一使用又は共使用は、全て、糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの血中グルコースを顕著に減少することができる（Ｐ＜０．０５）。更に、７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの効果は、抽出物よりも明らかに良好であり、共使用は単一使用よりも良好である。
【００５５】
表２  ７−ヒドロキシクマリン及び／又は７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの血中グルコースに対する効果（(平均)±ｓ、ｎ＝１０）。
【表２】
2011510098.tif 000007
【００５６】
４．３  ７−ヒドロキシクマリン及び／又は７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの２４時間の尿量、尿総タンパク質及び尿クレアチニンに対する効果
表３に示されているように、桑白皮の水抽出物、７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの単一使用又は共使用は、全て、糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの２４時間の尿量及び尿総タンパク質を減少し、尿中の尿クレアチニンを上昇させることができる（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）。更に、７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリン及び７−ヒドロキシクマリンの効果は、抽出物よりも良好であり、共使用は単一使用よりも良好である。
【００５７】
表３  ７−ヒドロキシクマリン及び／又は７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの２４時間の尿量、尿総タンパク質及び尿クレアチニンに対する効果（(平均)±ｓ、ｎ＝１０）
【表３】
2011510098.tif 000008
【００５８】
４．４  ７−ヒドロキシクマリン及び／又は７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる、糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの腎臓の重量及び腎臓指数に対する効果
表４に示されているように、糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの腎臓の重量及び腎臓指数は、５週間後に増加し、桑白皮の水抽出物、７−ヒドロキシクマリン及び７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの単一使用又は共使用は、全て、糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの腎臓の重量及び腎臓指数を明白に減少することができる。更に、７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンの効果は、抽出物及び７−ヒドロキシクマリンよりも良好であり、共使用は単一使用よりも良好である。
【００５９】
表４  ７−ヒドロキシクマリン及び／又は７−ヒドロキシ−６−メトキシクマリンによる糖尿病性腎症のｄｂ／ｄｂマウスの腎臓の重量及び腎臓指数に対する効果（(平均)±ｓ、ｎ＝１０）。
【表４】
2011510098.tif 000009
【図１Ａ】
2011510098.tif 000010
【図１Ｂ】
2011510098.tif 000011
【図１Ｃ】
2011510098.tif 000012
【図１Ｄ】
2011510098.tif 000013
【図１Ｅ】
2011510098.tif 000014
【図１Ｆ】
2011510098.tif 000015
【図１Ｇ】
2011510098.tif 000016
【図１Ｈ】
2011510098.tif 000017
【図１Ｉ】
2011510098.tif 000018
【図１Ｊ】
2011510098.tif 000019
【図１Ｋ】
2011510098.tif 000020
【図１Ｌ】
2011510098.tif 000021
【図２Ａ】
2011510098.tif 000022
【図２Ｂ】
2011510098.tif 000023
【図２Ｃ】
2011510098.tif 000024
【図２Ｄ】
2011510098.tif 000025
【図２Ｅ】
2011510098.tif 000026
【図２Ｆ】
2011510098.tif 000027
【図２Ｇ】
2011510098.tif 000028
【図２Ｈ】
2011510098.tif 000029
【図２Ｉ】
2011510098.tif 000030
【図２Ｊ】
2011510098.tif 000031
【図２Ｋ】
2011510098.tif 000032
【図２Ｌ】
2011510098.tif 000033
【図３Ａ】
2011510098.tif 000034
【図３Ｂ】
2011510098.tif 000035
【図３Ｃ】
2011510098.tif 000036
【図３Ｄ】
2011510098.tif 000037
【図３Ｅ】
2011510098.tif 000038
【図３Ｆ】
2011510098.tif 000039
【図３Ｇ】
2011510098.tif 000040
【図３Ｈ】
2011510098.tif 000041
【図３Ｉ】
2011510098.tif 000042
【図３Ｊ】
2011510098.tif 000043
【図３Ｋ】
2011510098.tif 000044
【図３Ｌ】
2011510098.tif 000045
【図３Ｍ】
2011510098.tif 000046
【国際調査報告】
2011510098.tif 000047
2011510098.tif 000048
2011510098.tif 000049
2011510098.tif 000050
2011510098.tif 000051
2011510098.tif 000052