(57)【要約】本発明は、ラテラルフローアッセイストリップ、レーザー誘起落射蛍光検出装置およびＬＥＤ検出装置を含む、血中のヘモグロビンと糖化ヘモグロビンとを同時に検出する装置、ならびにこれを用いて免疫学的方法で血中のヘモグロビンと糖化ヘモグロビンとを同時に簡便に定量する方法を提供する。2011509404.tif 000003
2011509404.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持台(backing card)、サンプルパッド、クロマトグラフィー媒体、および吸収パッドを含むラテラルフローアッセイストリップであって、
前記支持台は前記ストリップ内の構成要素全体を支持し、前記支持台の各端部には前記サンプルパッドと前記吸収パッドが互いに重ならないように接着されており；前記サンプルパッドは、前記吸収パッドが接着された方向の端部で、試料が最初にアプライされる前記クロマトグラフィー媒体の一方の端部と重なり；前記クロマトグラフィー媒体の他方の端部は前記吸収パッドと重なり、前記クロマトグラフィー媒体上には前記サンプルパッドから所定の距離をおいてキャプターが固定されており、前記キャプターは、前記試料内の分析物の一つと実質的に同一であり、そのため前記試料内の分析物との競合的免疫反応によって抗原−抗体反応を介して結合し；かつ、前記キャプターは糖化ヘモグロビンである、ラテラルフローアッセイストリップ。
【請求項２】
結合体放出パッドをさらに含むラテラルフローアッセイストリップであって、
結合体放出パッドの一方の端部が前記サンプルパッドと重なり、結合体放出パッドの他方の端部が前記クロマトグラフィー媒体と重なり、かつ分析物の一つと抗原−抗体反応によって選択的に結合することが可能なデテクターが結合体放出パッドの表面に吸着された、
請求項１に記載のラテラルフローアッセイストリップ。
【請求項３】
前記デテクターは抗糖化ヘモグロビン抗体である、請求項２に記載のラテラルフローアッセイストリップ。
【請求項４】
前記デテクターは落射蛍光で標識された抗糖化ヘモグロビン抗体である、請求項３に記載のラテラルフローアッセイストリップ。
【請求項５】
抗原−抗体反応によって検出される抗原分析物と色素によって検出される色素分析物とを同時に定量することが可能な一体型定量アッセイシステムであって、請求項１または２記載のラテラルフローアッセイストリップ、前記ストリップ上のキャプター固定区域からの蛍光シグナルを検出するためのレーザー誘起落射蛍光検出装置、および色素分析物を検出するためのＬＥＤ検出装置を含む、システム。
【請求項６】
前記ＬＥＤ検出装置が４５８〜６１２ｎｍの範囲の光源を使用する、請求項５に記載の一体型定量アッセイシステム。
【請求項７】
前記デテクターが抗糖化ヘモグロビン抗体である、請求項５に記載の一体型定量アッセイシステム。
【請求項８】
前記抗原分析物が糖化ヘモグロビンであり、前記色素分析物がグリコシル化ヘモグロビンまたは非グリコシル化ヘモグロビンである、請求項５に記載の一体型定量アッセイシステム。
【請求項９】
試料中の抗原分析物と色素分析物とを同時に定量する方法であって、
ラテラルフロー定量アッセイストリップが、支持台、サンプルパッド、クロマトグラフィー媒体、および吸収パッドを含み、前記支持台は前記ストリップ内の構成要素全体を支持し、前記支持台の各端部には前記サンプルパッドと前記吸収パッドが互いに重ならないように接着されており；前記サンプルパッドは、前記吸収パッドが接着された方向の端部で、試料が最初にアプライされる前記クロマトグラフィー媒体の一方の端部と重なり；前記クロマトグラフィー媒体の他方の端部は前記吸収パッドと重なり、前記クロマトグラフィー媒体上には前記サンプルパッドから所定の距離をおいてキャプターが固定されており、前記キャプターは、前記試料内の分析物の一つと実質的に同一であり、そのため前記試料内の分析物との競合的免疫反応によって抗原−抗体反応を介して結合し、
前記ラテラルフローアッセイストリップの前記サンプルパッド上に、抗原分析物と色素分析物とを含有することが予想される試料をアプライし、前記試料が前記クロマトグラフィー媒体に沿って展開するにつれて、アプライ前に前記試料に所定量のデテクターを添加することによる免疫反応によってデテクター−抗原分析物の結合体が形成されるように流体試料が前記クロマトグラフィー媒体を通って移動し、前記クロマトグラフィー媒体上に固定されたキャプターと前記デテクター−抗原分析物結合体および／または遊離デテクターとの間で結合体が形成されるように競合的免疫反応が起こり、その後、前記クロマトグラフィー媒体上に固定された前記キャプターに結合した前記デテクターの量をレーザー誘起落射蛍光検出装置によって測定し、かつ別途、前記クロマトグラフィー媒体上の前記色素分析物の量をＬＥＤ検出装置によって測定する、方法。
【請求項１０】
試料中の抗原分析物と色素分析物とを同時に定量する方法であって、
ラテラルフロー定量アッセイストリップが、支持台、サンプルパッド、クロマトグラフィー媒体、吸収パッド、および結合体放出パッドを含み、前記支持台は前記ストリップ内の構成要素全体を支持し、前記支持台の各端部には前記サンプルパッドと前記吸収パッドが互いに重ならないように接着されており；前記サンプルパッドは、前記吸収パッドが接着された方向の端部で、試料が最初にアプライされる前記クロマトグラフィー媒体の一方の端部と重なり；前記クロマトグラフィー媒体の他方の端部は前記吸収パッドと重なり、前記クロマトグラフィー媒体上には前記サンプルパッドから所定の距離をおいてキャプターが固定されており、前記キャプターは、前記試料内の分析物の一つと実質的に同一であり、そのため前記試料内の分析物との競合的免疫反応によって抗原−抗体反応を介して結合し、前記結合体放出パッドの一方の端部が前記サンプルパッドと重なり、前記結合体放出パッドの他方の端部が前記クロマトグラフィー媒体と重なり、かつ分析物の一つと抗原−抗体反応によって選択的に結合することが可能なデテクターが前記結合体放出パッドの表面に吸着され、
前記ラテラルフローアッセイストリップの前記サンプルパッド上に、抗原分析物と色素分析物とを含有することが予想される試料をアプライし、前記試料が前記クロマトグラフィー媒体に沿って展開するにつれて、デテクター−抗原分析物の結合体が形成されるように試料が前記結合体放出パッドを通過し、前記クロマトグラフィー媒体上に固定されたキャプターと前記デテクター−抗原分析物結合体および／または遊離デテクターとの間で結合体が形成されるように競合的免疫反応が起こり、その後、前記クロマトグラフィー媒体上に固定された前記キャプターに結合した前記デテクターの量をレーザー誘起落射蛍光検出装置によって測定し、かつ別途、前記クロマトグラフィー媒体上の前記色素分析物の量をＬＥＤ検出装置によって測定する、方法。
【請求項１１】
前記デテクターが蛍光物質で標識される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
測定された色素分析物の濃度に対する抗原分析物の濃度の比率を算出することにより、前記試料中の前記抗原分析物を定量する工程をさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原分析物が糖化ヘモグロビンであり、前記色素分析物がグリコシル化ヘモグロビンまたは非グリコシル化ヘモグロビンである、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記デテクターが抗糖化ヘモグロビン抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記キャプターが糖化ヘモグロビンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記キャプターが糖化ヘモグロビンである、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液に存在する糖化ヘモグロビンを高感度で定量することが可能なラテラルフロー定量アッセイシステムおよびその方法に係り、特に、糖化ヘモグロビンと総ヘモグロビンとを同時に定量することが可能な一体型定量アッセイ方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、ブドウ糖が体内の細胞に入ることができず、体内で使用されないため、血液内に過多な血糖が残存して多様な合併症を誘発する、一種の異常炭水化物代謝疾患である。糖尿病は３つのタイプに分類される。その代表的なものは、インスリン依存性糖尿病と呼ばれる１型糖尿病であって、膵ベータ細胞が自己免疫反応により損傷し、インスリンホルモンを合成または分泌する機能を失うタイプである。インスリン非依存性糖尿病と呼ばれる２型糖尿病は、インスリンに対する末梢インスリン抵抗性や、障害性のインスリン分泌障害などによって特徴づけられる。３型糖尿病は、一般に妊娠中に発生し得る妊娠性糖尿病である。１型糖尿病と妊娠性糖尿病は稀であるが、２型糖尿病は、最も多く見られるもので、先進国の糖尿疾患の９０〜９５％を占めることが知られている。
【０００３】
糖尿病は尿糖値または血糖値の測定によって診断できるが、尿糖の測定は信頼性に乏しく、血糖の測定もいくつかの要因、例えば食事や運動などの影響を受けるために、不正確である。よって、糖尿病を診断またはモニターするために、主として、血液中の糖化ヘモグロビンを測定する方法が用いられる。
【０００４】
１９８６年、米国糖尿病学会（ＡＤＡ）で、全てのタイプの糖尿病をモニターするために、年間２回ずつの糖化ヘモグロビン測定を推奨したことにより、糖化ヘモグロビンは、血糖調節の安定な指標として受け入れられ始め、１９９３年にＤＣＣＴ(Direct Control and Complication Trial)で糖化ヘモグロビンレベルと糖尿病合併症との直接的な関係が報告されて以来、糖尿病を管理するために一般的に用いられるようになっている。
【０００５】
ＡＤＡ(American Diabetes Association)では、ＤＣＣＴおよびＵＫＰＤＳ(United Kingdom Prospective Diabetes Study)の報告書に基づいて、糖化ヘモグロビンの数値を７％以内に管理することを勧めており、糖化ヘモグロビンの数値が８％以上の場合、糖尿病治療を再評価、および必要な修正を行うよう勧めている。２００１年、米国内分泌学会では標的糖化ヘモグロビン６．５％以下を推奨値としたが、これは６．５％以上のときにも糖尿病性の網膜症が増加するというＵＫＰＤＳの報告結果を参照したものである。１９９９年、ＩＤＦ(International Diabetes Federation)も同様に糖化ヘモグロビン６．５％を推奨値とした。
【０００６】
ＤＣＣＴよって６．５年間行われた、１４４１名の患者の臨床実験による結果によると、厳格な血糖調節を達成することによって、微細血管合併症を相当減少させることができる。したがって、患者または医師は厳格な血糖値の調節を考慮する必要性がある。
【０００７】
成人のヘモグロビンは、９７％のヘモグロビンＡ、２．５％のヘモグロビンＡ２および０．５％のヘモグロビンＦの３種から構成されている。これらの中でも、ヘモグロビンＡは、１４１個のアミノ酸を有する２つのα鎖と１４６個のアミノ酸を有する２つのβ鎖の、４つのポリペプチド鎖から構成される。クロマトグラフィー法によって分析すると、ヘモグロビンＡは９６％の主要なヘモグロビンと５〜６％の微量のヘモグロビンから構成され、これらのヘモグロビンをヘモグロビンＡ１または糖化ヘモグロビンと呼ぶ。糖化された形態は、β鎖Ｎ末端のバリン残基にグルコースが結合した構造であり、８０％がヘモグロビンＡ１であり、残部はヘモグロビンＡ１ａとヘモグロビンＡ１ｂである。
【０００８】
タンパク質のアミノ基に糖残基が非酵素的な反応で結合することを糖化といい、この反応は非常に緩慢で不可逆な反応である。糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンと血糖との結合によって絶え間なく形成されており、ヘモグロビンと糖化ヘモグロビンの比率は赤血球の血糖への露出の程度によって決定される。具体的に、糖化過程ではヘモグロビンＡのバリン残基にブドウ糖が結合してヘモグロビンＡ１ｃ前駆体を形成し、これは、アマドリ転位反応によって、安定なケトアミン形態を形成する。この際、血糖値が高くなると、循環ブドウ糖とヘモグロビンとの接触頻度が高くなり、その結果、糖化ヘモグロビンの比率も増加する。よって、糖化ヘモグロビンの比率は血糖値を反映する。また、赤血球の寿命は６０〜１２０日程度なので、糖化ヘモグロビン測定は、長期間の血糖の調整をモニタリングすることに有用である。
【０００９】
血液内の糖化ヘモグロビンを測定するための多様な測定法が開発されてきた。現在応用されている方法としては、イオン交換クロマトグラフィー法、親和性クロマトグラフィー法、電気泳動法、複合比色分析法などがある。これらの方法は、使用方法が難しく、複雑で熟練した技術が要求される。また、使い捨て臨床分析システムの技術開発の動向を考察すると、遠隔、在宅またはポイント・オブ・ケア検査での使用のために非常に有用な定量分析システムが提示されており、例えば視覚的検出法、光学的検出法、および電気化学的検出法などがある。
【００１０】
近年、糖化ヘモグロビンのＮ末端ペプチド残基を認識することが可能なモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が開発されて以来（米国特許第４，６４７，６５４号）、これを用いて糖化ヘモグロビンを定量する免疫学的方法に関する多くの研究が進行中である。免疫学的方法は、糖化ヘモグロビンを認識する抗体を用いるため、特異性および感度が高いという利点がある。免疫学的方法を用いて糖化ヘモグロビンの量を決定するときには、糖化ヘモグロビンのグリコシル化特定部位を高感度で認識することが可能な抗体を製作することが必須要件である。血中の糖化ヘモグロビンのグリコシル化部位は、外部に露出されていないので、まず、抗体がこの部位を認識し得るように糖化ヘモグロビンを修飾しなければならず、次に、全ヘモグロビンを分光学的方法で測定するためにヘモグロビンをメトヘモグロビンに転換しなければならない。メトヘモグロビンは、特定の波長を吸収する特性があるので、分光学的な方法で吸収率を測定して全ヘモグロビンの量を定量することができるとともに、修飾された糖化ヘモグロビンを免疫学的方法で測定して血中の糖化ヘモグロビンの量を測定することができる。
【００１１】
免疫学的装置は、その原理によってフロースルー(Flow Through)方式とラテラルフロー(Lateral Flow)方式に分けられる。フロースルー方式は、抗体が共有結合している多孔性マトリクスの表面に検体を添加して検体内の分析物質を固定化抗体と結合させ、しかる後に、二次捕獲抗体を添加し、酵素基質を用いて直接視覚で検出する方式である。ラテラルフロー方式には２つのタイプあり、一つのデバイスに全分析過程を含有する方式と、流体試料が標識抗体の固定されている多孔性マトリクスを通過しながら標識抗体と結合する方式がある。
【００１２】
ラテラルフロータイプは、試料がアプライされる試料パッド、探知用抗体がコートされている放出パッド、試料中の要素が、個々に分離され、抗原−抗体反応を受けるために移動する現像用メンブレンまたはストリップ、および試料が引き続き装置中を移動できるようにするために、液体を常に吸収する吸収パッドから構成されている。このような既存のラテラルフロー分析法は、妊娠診断、癌診断、微生物検出などの多様な分野で広く簡便に使われているが、肉眼で判断を行うことができないため、正確な量を確認することは難しく、その適用は制限されている。
【００１３】
ＨｂＡｌｃに対する抗体を用いる免疫学的検査は、一般的に反応系の混濁度検査方法を利用する。この際、糖化ヘモグロビンのβ鎖のＮ末端部分のみがＨｂＡｌｃの特異的な抗原決定部位なので、抗原−抗体複合体の凝集反応は起こらない。よって、多数の抗原決定基を有するポリハプテンを抗体と反応させて不溶性免疫複合体を作り、これを測定する混濁度検査方法を使用する。混濁度のシグナルは、試料中の糖化ヘモグロビンの濃度に対して反比例する。しかしながら、このような検査方式は、多様な処理過程を含むため、専門化した検査室および自動化装備が必要であるという欠点がある。
【００１４】
韓国公開特許第２００４−００１８８９３号では、糖化ヘモグロビンに対する抗体を含んでいる緩衝溶液、ヘモグロビンに対する抗体を含むストリップ、および洗浄溶液からなる糖化ヘモグロビン検出キットについて開示している。前記キットは、半定量分析システムに関するもので、糖化ヘモグロビンに対する抗体に染料を添加し、ＨｂＡ１ｃが存在する場合の色相変化を肉眼または色相対照表によって比較することによって決定するので、糖化ヘモグロビンの量を正確に定量することができない。
【００１５】
また、分析物の定量化が可能なＲＩＡ法またはＥＬＩＳＡ法では、酵素で処理し、洗浄するなどのいくつかの複雑な段階を経なければならない。よって、早くて簡便であるうえ、高感度で定量化することが可能な一般分析法が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述したように、抗体を用いて糖化ヘモグロビンの量を定量する既存のアッセイ装置は感度が低く、イムノアッセイは、このような定量のために酵素処理および洗浄を含む複数の複雑な段階を必要とする。そこで、本発明者らは、鋭意努力した結果、糖化ヘモグロビンと総ヘモグロビンとを同時に定量することが可能な一体型定量アッセイシステム、および、より速く簡便に高感度で定量化することができる方法を提供し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
イムノアッセイの利点と定量分析の必要性を考慮し、本発明者らは、糖化ヘモグロビンレベルを測定するための現場分析用装置を開発することにより、簡単な方法で効果的に血中糖化ヘモグロビンレベルを定量して糖尿病の早期診断を達成した。したがって、本発明は糖尿疾患者における合併症の予防または危険性を最小化するための方法、ならびに患者または医師にグルコースレベルの厳格な管理の維持における利便性を提供することを目的とする。
【００１８】
本発明の他の目的は、糖化ヘモグロビンと総ヘモグロビンとを同時に定量することが可能な一体型定量アッセイシステム、すなわち糖化ヘモグロビンを定量することが可能なラテラルフローアッセイストリップ、抗原分析物を定量するレーザー誘起落射蛍光検出装置、および色素分析物を定量するＬＥＤ検出装置を含む一体型定量アッセイシステムを提供することにある。
【００１９】
本発明の別の目的は、免疫反応の特異性および選択性を用いて試料中の抗原分析物を定量する方法を提供することにあり、この方法において、抗原分析物および所定のデテクターを含む試料が、ラテラルフローアッセイストリップに沿って移動し、試料中のデテクターと媒体上に固定されたキャプターとの競合的な抗原抗体反応が起こる間、標識されたデテクターにより発生したシグナルを測定し、かつラテラルフローアッセイストリップ上の色素分析物の量を別途測定して、色素分析物の量に対する抗原分析物の比率を算出する。
【発明の効果】
【００２０】
上述したように、本発明に係るラテラルフローアッセイストリップ、レーザー誘起落射蛍光検出装置、およびＬＥＤ検出装置からなる一体型定量アッセイシステムは、抗原−抗体反応によって効果的に糖化ヘモグロビンを定量することが可能な方法を提供するので、グルコースレベルの厳格な管理が必要な患者に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係る血中ヘモグロビンレベルを定量するための一体型定量アッセイシステムの模式図である。
【図２】本発明に係るラテラルフロー定量アッセイストリップの模式図である。
【図３】図３Ａはレーザー誘起落射蛍光装置を用いた糖化ヘモグロビン測定用光学系の模式図、図３ＢはＬＥＤを用いた総ヘモグロビン測定用光学系の模式図である。
【図４】ＬＥＤ検出装置を用いたヘモグロビンの標準曲線である。
【図５】糖化ヘモグロビンの標準曲線である。
【図６】既知の大型設備と本発明に係る定量アッセイシステムとの性能を比較した結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００２２】
１００：ラテラルフロー定量アッセイストリップ
１０１：支持台（Backing card）
１０２：サンプルパッド
１０３：結合体放出パッド
１０４：クロマトグラフィー媒体
１０５：吸収パッド
１０６：抗原分析物測定区域
１０７：色素分析物測定区域
１０８：窓
１０９：サンプルホルダー
１１０：ストリップハウジング
２００：レーザー誘起落射蛍光検出装置
２０１：レーザー
２０２：レーザービーム用形状制御用レンズ
２０３：集光レンズ
２０４：蛍光フィルター
２０５：コンデンサレンズ
２０６：空間フィルター
２０７：光学的検出器
３００：ＬＥＤ検出装置
３０１：ＬＥＤ光源
３０２：口径
３０３：光検出器
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の第１の様態では、本発明は、支持台、サンプルパッド、クロマトグラフィー媒体、および吸収パッドを含むラテラルフローアッセイストリップであって、前記支持台がストリップの構成物全体を支持し、支持台の両端にはそれぞれサンプルパッドと吸収パッドが互いに重なり合わないように接着されており；前記サンプルパッドは吸収パッドに接着される方向の端がクロマトグラフィー媒体の一方の端に重なり、そこに試料が最初にアプライされ；前記クロマトグラフィー媒体の他方の端は吸収パッドに重なり、前記クロマトグラフィー媒体上には前記サンプルパッドから所定の距離をおいてキャプターが固定されている、ラテラルフロー定量アッセイストリップを提供する。好ましくは、前記ストリップは、前記サンプルパッドとクロマトグラフィー媒体との間に、蛍光標識されたデテクターが吸着された結合体放出パッドをさらに含むことができる。さらに好ましくは、このようなストリップは、ストリップの汚染を防止するために、試料適用位置、落射蛍光検出区域、およびＬＥＤ検出区域を除いたストリップ全体を覆うストリップハウジングをさらに含むことができる。
【００２４】
本願において、用語「流体試料」または「試料」は、分析物、またはデテクターおよび分析物を含む分析対象化合物または組成物を意味し、本発明で使用される流体試料または試料は、クロマトグラフィー媒体を通って移動することができる、液相物質、または液体に似た流動性物質をいう。
【００２５】
本願において、用語「分析物」は、試料中の分析対象化合物を意味し、抗原分析物および色素分析物を包含する。また、本願において、用語「色素分析物」および「抗原分析物」は、それぞれタンパク質およびグリコシル化タンパク質を意味し、特にヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンを意味する。抗原分析物は抗原−抗体反応に関与し、色素分析物と抗原分析物の両方は本発明に係るＬＥＤによってシグナルを発生させる。
【００２６】
本願において、用語「デテクター」は、前記言及された抗原分析物に対する抗体、好ましくは糖化ヘモグロビンに対する抗体を意味し、さらに好ましくは蛍光物質で標識されている抗体を意味する。
【００２７】
本願において、用語「キャプター」は、試料中の抗原分析物と同一の物質または化合物を意味し、あるいはグリコシル化タンパク質、好ましくはヒトの糖化ヘモグロビンである抗原分析物のデテクター認識部位と同一の構造を持つ部分を含む物質を意味する。キャプターはストリップ上に固定され、ストリップに沿って移動する試料中の遊離デテクターを特異的かつ選択的に捕捉することができる。
【００２８】
本願において、用語「落射蛍光」は、クロマトグラフィーを用いたラテラルフローアッセイストリップの抗原分析物検出区域に固定された、蛍光標識されたデテクター−分析物結合体から放出される蛍光、または蛍光標識されたデテクターから放出される蛍光をいう。
【００２９】
本願において、用語「吸着」は、クロマトグラフィー媒体、またはストリップを構成するパッドに濃縮物質が付着していることを意味する。これはクロマトグラフィーの移動相を伝わって移動することができるが、適切な処理によって固定化されることも可能である。
【００３０】
本願において、「固定」または「固定化」は、試料または試薬をクロマトグラフィー媒体またはストリップに保持することを意味し、特に、試料または試薬がクロマトグラフィーの移動相または溶媒に溶けず、前記移動相が移動しても一緒に移動せず、固定された位置で動かない状態を意味する。
【００３１】
別の様態として、本発明は、第１の様態に係るラテラルフローアッセイストリップ、前記ラテラルフローアッセイストリップ上の蛍光物質の落射蛍光を測定することにより抗原分析物の量を決定するレーザー誘起落射蛍光検出装置、および前記ラテラルフローアッセイストリップ上の色素分析物の量を決定するＬＥＤ（発光ダイオード）検出装置を含む、試料中の抗原分析物および色素分析物の量を同時に定量することが可能な一体型ラテラルフロー定量アッセイシステムを提供する。
【００３２】
具体的には、前記落射蛍光検出装置において、光がレーザーのレーザービーム用形状制御用レンズを通過し、励起フィルターが照射され、反射した光が集光レンズを通過して平行光を形成する。この平行光は蛍光フィルターを通過して散乱光を除去し、その後純粋な蛍光成分光のみがコンデンサレンズに入る。このコンデンサレンズによって純粋な蛍光成分光が空間フィルターの中心に集束する。前記空間フィルターにおいて、純粋な蛍光成分光以外の光が除去される。光は光学的検出器に入る。光検出器に接続されたアナログデジタルコンバータ（ＡＤＣ）により変換されたデジタル信号は中央処理装置（ＣＰＵ）へ送られ、基準となる蛍光強度を有する結合体の蛍光強度と比較した相対的な値として分析物の量が決定される。
【００３３】
ＬＥＤ検出装置において、ＬＥＤ光源による光の吸収または散乱する量が色素分析物の量によって異なるという原理に基づいて、色素分析物の量が決定される。特に、分析物がＬＥＤ光源により照射され、分析物によって散乱した光が光軸の前方に位置した空間フィルターによってフィルタリングされる。色素分析物による散乱した光のみが光学的検出器に供給される。光学的検出器で検出された光信号は、ＡＤＣを介してＣＰＵへ送られて、試料中の色素分析物の量が決定される。
【００３４】
さらに別の様態により、本発明は、本発明に係る一体型ラテラルフロー定量アッセイシステムを用いて血液中の糖化ヘモグロビンの量を測定する方法を提供する。
【００３５】
具体的には、ラテラルフローアッセイストリップのサンプルパッド上に、抗原分析物および色素分析物を含有すると予想される試料をアプライし、かつ試料のアプライ前または移動中に試料に所定量のデテクターを添加することにより、一次免疫応答によってデテクター−抗原分析物の結合体が形成されるように、流体試料がクロマトグラフィー媒体を通って移動する。試料がクロマトグラフィー媒体に沿って展開するにつれて、結合体を形成するように、サンプルパッドから所定の距離に位置したクロマトグラフィー媒体上に固定されたキャプターと前記デテクター−抗原分析物結合体および／またはデテクター単一体との間で、競合的に二次免疫応答が生じる。競合反応の後、クロマトグラフィー媒体上に固定されたキャプターに結合するデテクターの量と、これとは別途にクロマトグラフィー媒体上の色素分析物の量とをそれぞれ測定し、次に試料中の分析物に対する抗原分析物の比率を決定して抗原分析物を定量する。
【００３６】
好ましくは、前記所定量のデテクターは蛍光物質で標識されており、前記デテクターは、ストリップへの試料アプライ前に、液体試料に混合される。あるいは、前記デテクターは、ラテラルフローアッセイストリップが結合体放出パッドを含む場合、結合体放出パッドに予め吸着される。アプライされた試料がクロマトグラフィー媒体に沿って移動し、前記結合体放出パッドを通過する間、前記デテクターは、液体試料に溶解および／または混合される。その後、デテクターが試料中の抗原分析物と結合して、蛍光物質で標識されたデテクター−抗原分析物結合体を形成する。試料中に抗原分析物がないまたは足りない場合に、デテクターは、単一体の形でクロマトグラフィー媒体に沿って移動する。
【００３７】
前記キャプターは、クロマトグラフィー媒体上に、試料の適用地点から試料の展開方向に所定の間隔（以下、「抗原分析物検出区域」という）で固定される。キャプターが固定されている領域に到達すると、キャプターが、デテクター単一体および／またはデテクター−抗原分析物結合体と結合し、デテクター−キャプター結合体を形成する。最後に、蛍光物質で標識されたデテクターを検出できるレーザー誘起落射蛍光検出装置は、抗原分析物の量、すなわちデテクターに結合した糖化ヘモグロビンの量を測定するために、前記抗原分析物検出区域から発生するシグナルを収集する。
【００３８】
一方、クロマトグラフィー媒体上のヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンの量は、色素分析物を検出できるＬＥＤによって測定される。色素分析物に対する抗原分析物の比率を算出して、試料中の抗原分析物の量を定量する。
【００３９】
以下、ラテラルフローアッセイストリップ、レーザー誘起落射蛍光検出装置、およびＬＥＤ検出装置からなる一体型ラテラルフロー定量アッセイシステム、ならびにこれを用いて血液中の総ヘモグロビンの量および糖化ヘモグロビンの量を同時に測定する方法について、図面を参照して詳細に説明する。
【００４０】
図１は本発明の好適な実施例に係るラテラルフローアッセイストリップを示す斜視図であって、前記ストリップは支持台１０１、サンプルパッド１０２、結合体放出パッド１０３、クロマトグラフィー媒体１０４、および吸収パッド１０５を含む。次に、ラテラルフローアッセイストリップを構成する各構成要素について詳細に説明する。
【００４１】
支持台
支持台１０１は、ストリップの全ての構成要素を支持しており、支持台が省略される場合にはクロマトグラフィー媒体１０４自体が支持台であってもよい。支持台は、通常、不水溶性、非多孔性および剛体の材料は、試料を展開し支持台上に置かれたパッドと等しい長さと幅を有するが、パッドより大きいまたは小さい大きさを有してもよい。支持台の準備において、多様な天然および合成の有機および無機材料を使用することができるが、但し、前記材料から作成された支持台は、吸収物質の毛細管作用を妨害したり、分析物と非特異的に結合したり、分析物とデテクターの反応を妨害したりしてはならない。支持台として使用可能な代表的な重合体の例は、以下に限定されないが、ポリエチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチラート）、ガラス、セラミック、金属などを含む。
【００４２】
支持台上において、接着剤によって各種パッドが接着される。適切な接着剤の選択は、ストリップの性能を改善しかつストリップの寿命を延長する。本発明により、感圧接着剤（pressure-sensitive adhesive）（ＰＳＡ）が代表的にはラテラルフローアッセイストリップに使用される。典型的なラテラルフローアッセイストリップにおける各種パッドの接着は、接着剤がパッドの孔内に浸透するにつれて達成され、これによりパッドと一緒に支持台を結合する。このような結合に関して、正常的な条件の下での接着剤の流動能力を「コールドフロー(cold flow)」という。ＰＳＡをパッドに塗る場合では加熱をしないので、ある程度のコールドフローはパッドと支持台間の結合に必須である。コールドフローの程度があまり低ければ、ストリップの貯蔵期間中に一緒に結合しているパッドまで接着剤が移動し、それにより孔を詰まらせるか、あるいは疎水性のしみが形成されるか、あるいはパッドを再び湿らすという問題につながる。接着剤のコールドフローに関連したこのような問題は直接キャスティング(direct-casting)膜を使用することにより解決できる。例えば、直接キャスティング膜は、支持プラスチックシートによって、接着剤が膜の孔に入り込むことを予防するので、貯蔵期間中に接着剤の上下移動を予防することができる。
【００４３】
サンプルパッド
サンプルパッド１０２はストリップの一方の端部に位置し、サンプルパッドの一方の端部は、クロマトグラフィー媒体１０４と、または結合体放出パッド１０３をさらに含む場合には結合体放出パッドの一部と重なり合う。
【００４４】
基本的に、サンプルパッドは、分析物が含有された流体試料を受け入れるように働く。このような機能に加えて、サンプルパッドは試料中の不溶性粒子をろ過する機能を持つことができる。このような観点から、本発明のサンプルパッドは、ろ過機能を提供することができるセルロースろ過紙またはガラス繊維ろ過紙が好ましい。通常は、Ｓ＆Ｓ社によって製造されるセルロースろ過紙（等級９０３）を使用する。
【００４５】
サンプルパッドは、試料中の分析物がそれに非特異的に吸着されるのを防ぐために、試料の成分がクロマトグラフィー媒体を通って容易に移動し得るために、反応の感度を維持するために、かつ、蛍光物質で標識されたデテクターと試料の成分との間に起こり得る所望しない非特異的反応を防止するために、前処理することが好ましい。サンプルパッドの前処理は、通常、不活性タンパク質または界面活性剤で処理することによって行われる。例えば、不活性タンパク質による前処理を、０．１〜１０％ＢＡＳ（ウシ血清アルブミン）含有０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ６〜９）中の０．１％〜１０％脱脂粉乳の溶液、および／または０．１％〜１０％カゼイン溶液にパッド材料を浸すことによって行ってもよい。界面活性剤による前処理を、トリトンＸ−１００またはツイーン２０にパッドを浸すことによって行ってもよい。しかし、これらの前処理段階は、分析物および試料の種類によって決定される。
【００４６】
結合体放出パッド(conjugate releasing pad)
ラテラルフローアッセイストリップは、選択的に結合体放出パッド１０３を含むことができる。その際、結合体放出パッドの一方の端部はサンプルパッド１０２と重なり合い、結合体放出パッドの他方の端部はクロマトグラフィー媒体１０４と重なり合うように、結合体放出パッドを支持台１０１に接着させる。
【００４７】
結合体放出パッドには、試料中の分析物と反応して結合体を形成することが可能な、蛍光物質で標識されたデテクターが、接着させられるが固定されない。試料中の分析物と反応することによって結合体を形成した後、それは、クロマトグラフィー媒体を通って試料と一緒に移動することができる。
【００４８】
結合体放出パッドに試薬を付着させる方法は、既に行われている公知の方法を含んでもよい。その具体的な例としては、含浸(impregnation process)、乾燥または凍結乾燥工程を挙げるが、これらに限定されない。
【００４９】
結合体放出パッドは、迅速なろ過速度と良好な粒子接着能力とを有することが好ましい。このような材料としては、ポリエステルなどの合成素材およびガラス繊維フィルターが使用できる。一般に、ガラスの主成分であるガラス繊維およびポリエステルを使用することができ、本願の実施例ではＳ＆Ｓ社によって製造されるガラス繊維を使用した。これらは、生物学的に不活性で、天然材料より精巧な繊維材料を持っているため、水性試薬または試料がアプライされるときに歪んだり膨張したりしない。好ましくは、分析物が、蛍光物質で標識されたデテクターに非特異的に結合するのを防止するとともに、結合体の放出と移動が円滑に行われることができるように、結合体放出パッドを界面活性剤などの試薬で前処理する。
【００５０】
結合体放出パッドを、その性能および安定性の向上のために、安定化剤および遮断剤により前処理することができる。安定化剤の例としてはスクロース、トレハロースなどの糖類を挙げることができる。遮断剤としてはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ゼラチン、カゼイン、および脱脂粉乳などのタンパク質類を挙げるができるが、これらに限定されない。
【００５１】
クロマトグラフィー媒体
クロマトグラフィー媒体１０４の両端部には、サンプルパッド１０２と吸収パッド１０５が重なっている。結合体放出パッドをさらに含む場合には、結合体放出パッド１０３と吸収パッド１０５が互いに重なり合わないように配置されている。
【００５２】
クロマトグラフィー媒体は支持台１０１に付着できる。他の方法として、クロマトグラフィー媒体はそれ自体が支持台であってよい。
【００５３】
クロマトグラフィー媒体の材料は、流体試料および分析物が毛細管作用によって迅速に移動し、その上に固定されたキャプターに到達できるようにするものであればいずれでもよく、均一な特性を持つことが好ましい。一般に、クロマトグラフィー媒体は、少なくとも０．１μ、好ましくは１．０μの孔径を有する多孔性物質を意味し、それを通って毛細管作用を介して水性媒体は容易に移動することができる。このような材料は、一般に、親水性または疎水性であってよい。その例としては、無機粉末（例えば、ろ過紙およびクロマトグラフィー紙などの繊維含有紙）、合成または改変された天然重合体（例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレートなど）が含まれ、単独で、あるいは他の物質と組み合わせて使用できる。セラミック物質もまた、用いることができる。
【００５４】
また、クロマトグラフィー媒体は、多作用性であり、あるいはキャプターとの共有結合を可能とするために多作用性に改変してもよい。
【００５５】
前述した性質を有するクロマトグラフィー媒体の例には、Ｓ＆Ｓ社のＡＥ９８、ＡＥ９９およびＡＥ１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＨＦ０９０、ＨＦ１２０、ＨＦ１３５、ＨＦ１８０およびＨＦ２４０、ならびにＳａｒｔｏｒｉｕｓ社のＣＮ９０、ＣＮ１４０およびＣＮ２００が含まれる。好ましいクロマトグラフィー媒体はＣＮ９０膜（Ｓａｔｏｒｉｕｓ社製）である。ＣＮ９０膜は、流速の変化幅が±３秒と最も小さいため、再現性に優れる。また、ＣＮ９０膜は、蛍光物質の増幅が優れているため、単位面積（ｃｍ３）当りリガンドが結合可能な結合能が１０〜３０μｇでも十分である。
【００５６】
クロマトグラフィー媒体上には、糖化ヘモグロビンレベルの測定のために抗体またはＨｂＡｌｃ抗原がキャプターとして特定の区域（抗原分析物検出区域）に添加されている。よって、前記区域から発生する蛍光シグナルをレーザー誘起落射蛍光検出装置によって測定することにより、糖化ヘモグロビンを定量することができる。
【００５７】
吸収パッド(absorption pad)
吸収パッド１０５は、ラテラルフローアッセイストリップのサンプルパッドの端部から最も遠いところに位置し、クロマトグラフィー媒体の一端と重なり合っている。
【００５８】
吸収パッドは、毛細管作用によってクロマトグラフィー媒体に沿って移動してきた試料を物理的に吸収し、未反応物質を除去するための手段である。すなわち、吸収パッドは、ラテラルフローアッセイストリップの端部に位置し、試料および試薬の移動を調節および促進し、ポンプまたはこれを収容する貯蔵所として作用する。試料および試薬の速度は吸収パッドの質および大きさによって異なってよい。通常使用される吸収パッドはセルロースろ過紙、不織物、布またはセルロースアセテートなどの水吸収材質から形成されたものである。
【００５９】
図２は本発明に係る一体型定量アッセイシステムを示す。本発明に係る一体型定量アッセイシステムは、上述したラテラルフローアッセイストリップ１００、レーザー誘起落射蛍光検出装置２００、ＬＥＤ検出装置３００および駆動装置を含む。また、本発明に係る一体型定量アッセイシステムに使用されるレーザー誘起落射蛍光検出装置２００およびＬＥＤ検出装置３００の模式図をそれぞれ図３−Ａと図３−Ｂに示した。以下、前記一体型定量アッセイシステムを構成するレーザー誘起落射蛍光検出装置およびＬＥＤ検出装置について詳細に説明する。
【００６０】
レーザー誘起落射蛍光検出装置
レーザー誘起落射蛍光検出装置（図３−Ａ）は、レーザー２０１、レーザービーム形状制御用レンズ２０２、励起フィルター、集光レンズ２０３、蛍光フィルター２０４、コンデンサレンズ２０５、空間フィルター２０６、光検出器２０７、アナログデジタルコンバータ（ＡＤＣ）、および中央処理装置（ＣＰＵ）を含んでなる。レーザー誘起落射蛍光検出装置は、本発明者による韓国登録特許第１０−０６３９７７６号で使用されたレーザー誘起落射蛍光検出装置と同一のものを使用することができる。レーザー誘起落射蛍光検出装置は、以下のように操作される。光の点または線形に加工されたレーザー光源の光が励起フィルターを通過した後、試料の所定の位置に入射し、この位置でターゲット物質に付いている蛍光物質が蛍光を発光する。蛍光は、集光レンズ、蛍光フィルターおよびコンデンサレンズを通過し、蛍光成分は、空間フィルターの中心に集束する。平行光は、光検出器に到達し、デジタルシグナルはアナログデジタルコンバータ（ＡＤＣ）および中央処理装置（ＣＰＵ）によって換算されて出力される。
【００６１】
レーザー誘起落射蛍光検出装置は、抗原分析物、好ましくは血液中の糖化ヘモグロビンレベルの定量に使用される。レーザー光原から放出された光が、抗原分析物に特異的に結合する蛍光標識デテクターに照射される。放出された蛍光を光学系によって捕集して光デテクターで定量化する。すなわち、流体試料をアプライした後、免疫反応が終わると、駆動装置によってストリップが所定の速度で光源方向に移動し、このスキャニング過程でレーザー誘起蛍光をデテクターによって測定する。好ましくは、ストリップが移動するにつれて、抗原分析物検出区域から発生するシグナルを数回捕集して定量化する。
【００６２】
ＬＥＤ検出装置
分析物内の総ヘモグロビンの量を光学的に測定するために、本発明では、ＬＥＤ検出装置（図３−Ｂ）を使用する。免疫反応に関与する蛍光物質とは異なり、ヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンはもともと赤色を呈するので、緑色ＬＥＤを光源として使用する。すなわち、必要な光源は、４５８〜６１２ｎｍのガウススペクトルプロフィールを持つ緑色ＬＥＤであり、流体試料がアプライされた区域またはクロマトグラフィー媒体上の色素分析物検出区域１０７から放射される光を、シリコンダイオードを用いて測定するように、光学系をデザインする。蛍光を測定する方式と同様にスキャニング方式を使用し、光源から反射される全体光量を短時間内に測定する。
【００６３】
本発明に係るラテラルフローアッセイシステムを用いて試料中の抗原分析物を定量する方法について、図面を参照してより詳細に説明する。
【００６４】
図１は本発明に係るラテラルフロー定量アッセイに使用されるストリップの模式図を示す。本発明に係る抗原分析物の定量は、流体試料を本発明に係るストリップにアプライすることにより始まる。流体試料はサンプルパッド１０２に、好ましくはサンプル投入口１０９を介してアプライされる。試料がサンプルパッドにアプライされると、毛細管作用によって移動し、その移動速度は吸収パッドの質や大きさに応じて変動し得る。この際、試料のアプライ前または移動中に、試料にデテクターが導入されると、一次免疫応答が起って結合体が形成されるが、これは２つの方法によって行われる。一つの方法は以下の通りである：流体試料を試料から採取した後、定量を実施する前に流体試料に直接所定量の標識デテクターを添加し、これにより流体試料中の抗原分析物とデテクターとの一次免疫応答が生じる。得られた流体試料をストリップにアプライする。他の代替方法は、予め蛍光標識されたデテクターを結合体放出パッド１０３に吸着させて製造した結合体放出パッドを含むストリップに液体試料をアプライする方法である。この際、デテクターは、結合体放出パッド上に吸着されているが、溶媒または結合体放出パッドにアプライされた液体試料に溶解および／または混合されて、抗原分析物との一次免疫応答が起こる。上述した方法のいずれも利用できるが、様々な種類のデテクターを適用して分析することが容易であるうえ、総ヘモグロビンレベルの測定も容易なので、第１の方法が好ましい。
【００６５】
デテクターは、流体試料中の他の色素分析物には結合しないが、抗原分析物としての糖化ヘモグロビンに特異的に結合する抗体であって、本発明の出願日の前に開示された多様な方法によって製造できる。好ましくは、マウスモノクローナル抗体を使用することができるが、これに限定されない。また、上述したデテクターを試料に導入する方法と関係なく、シグナル発生源となる蛍光物質で標識されたデテクターを使用することが好ましい。
【００６６】
前記一次免疫応答の結果、蛍光標識されたデテクター−抗原分析物の結合体が形成されてクロマトグラフィー媒体１０４に沿って移動し、抗原分析物に結合しない遊離デテクターは、ストリップに沿って移動して抗原分析物検出区域１０６に到達する。
【００６７】
抗原分析物検出区域は、試料のアプライ地点としてのサンプルパッドから所定の距離に位置しており、所定量のキャプターがそこに固定されている。前記キャプターは、糖化ヘモグロビンであり、あるいは前記デテクターを認識することが可能な化合物であって、抗原分析物検出区域に固定されている。したがってキャプターは、液体試料がストリップに沿って展開されても、液体試料と一緒に移動しない。デテクター−抗原分析物の結合体および／または遊離デテクターを含む試料が、キャプターの固定された領域に到達すると、デテクター、デテクター−抗原分析物結合体、およびキャプターの間で競合的に二次免疫応答が起こり、レーザー誘起落射蛍光検出装置は、前記キャプターが固定された領域（抗原分析物検出区域）で、蛍光標識されたデテクター−キャプター結合体によって発生したシグナルを収集する。
【００６８】
また、試料は、引き続きストリップに沿って移動しながら色素分析物検出区域１０７を通過する。色素分析物検出区域は、特定されていないが、キャプターが固定された区域ではなければストリップ上のいずれの位置でもよい。好ましくは、色素分析物検出区域は、サンプルパッドまたはストリップハウジング１１０に形成された検査窓１０８を介して露出された区域であり得る。色素分析物検出区域では、ヘモグロビンの赤色に反応するＬＥＤによって総ヘモグロビンの量が測定される。その後、抗原分析物検出区域および色素分析物検出区域を通過した試料は吸収パッド１５０に貯蔵される。
【００６９】
抗原分析物の定量のためにはヘモグロビンおよび糖化ヘモグロビンの標準曲線の作成が必要であり、この際全血が使用され、濃度は当該技術分野における公知の任意の方法によって測定することができる。準備された全血検体を本発明に係るストリップにアプライしてレーザー誘起落射蛍光検出装置によって蛍光を測定し、標準曲線を作成する。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明する。しかし、これらの実施例は例示するものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７１】
実施例１：タンパク質−蛍光物質結合体の調製
関心対象の抗原分析物としての糖化ヘモグロビン（ＨｂＡｌｃ）に対するマウスモノクローナル抗体にシグナル発生源としての蛍光物質を以下のように連結した。蛍光物質の結合に使用するタンパク質は、少なくとも９５％の純度まで精製した。最適な結合のために、このタンパク質を少なくとも１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用した。蛍光物質との反応を容易にするために、精製したタンパク質をアンモニアまたはアミンイオンの入っていない緩衝溶液（０．１Ｍ重炭酸ナトリウム、ｐＨ８．５）で４℃の冷蔵室で１２〜２４時間透析した。透析したタンパク質を、使用するまで零下２０℃で冷凍庫で保管した。緩衝溶液で透析したタンパク質を、粉末状のＡｌｅｘａ６４７蛍光物質（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国）へ直接しかしゆっくり添加した後、４℃の冷蔵庫で１〜２時間この混合物を撹拌した。
【００７２】
実施例２：タンパク質−蛍光物質結合体の精製
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を充填した分配カラムを用いて、タンパク質／蛍光物質結合体と反応せずに残っている余分の蛍光物質を除去した。精製緩衝溶液は０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）を使用した。精製したタンパク質／蛍光物質結合体は、使用するまで冷蔵または零下２０℃の冷凍庫に保管した。
【００７３】
実施例３：ニトロセルロース膜へのキャプターの固定
濃度と量を変化させて、Ｂｉｏdｏｔ分注器を用いてキャプターＨｂＡｌｃを細い線の形状でニトロセルロース膜上に固定した。タンパク質が固定化された膜を、２５℃および湿度３５〜５０％に維持される除湿装置内で２時間保管した。次いで、タンパク質を安定化し、かつ試薬間の非特異的反応を防ぐために、膜を安定化液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、１％スクロース、０．１％ＰＶＡ）で処理して５分間平衡化させた。前記安定化液成分として、ＢＳＡはゼラチンで置換してもよく、Ｔｗｅｅｎ２０はトリトンＸ−１００で置換してもよく、スクロースはトレハロースで置換してもよく、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）はＰＥＧまたはＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）で置換してもよい。余分な溶液を除去した後、膜を４０℃で３０分間乾燥した。乾燥した膜を、２５℃、ＲＨ３５〜５０％が維持される適切な容器内で使用まで保管した。
【００７４】
実施例４：サンプルパッドの前処理
ニトロセルロース膜を介しての溶液成分の移動を容易にし、反応の高い感度を維持し、かつタンパク質／蛍光物質結合体と試料との非特異的反応による実験誤差を防ぐために、サンプルパッドを前処理した。
【００７５】
前処理溶液（２０ｍＭトリス−Ｃｌ、０．１％トリトンＸ−１００、０．０５％ ＮａＮ３、ｐＨ８．５）を用い、この溶液１ｍＬを繰り返してかけることで、サンプルパッド（２．５×３０ｃｍ）を十分に濡らして１０分間平衡化した。全血を試料として用いる場合には、他の前処理溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭホスフェート、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％ＮａＮ３、ｐＨ７．４）を用いて赤血球の溶血を防止した。余分な溶液を除去した後、熱によるパッドの変形を防ぐために、サンプルパッドを５０℃〜６０℃の温度で１時間真空乾燥した。タンパク質／蛍光物質結合体の変性を最小化するために、凍結乾燥法を選択した。準備したパッドは前記膜と同一条件下で、適切な容器で保管した。
【００７６】
実施例５：糖化ヘモグロビン用蛍光免疫クロマトグラフィーアッセイストリップの製造
ニトロセルロース膜（ＮＣ膜）、サンプルパッド、吸収パッドおよび支持台を、４６０ｍｍのサイズを有するストリップを製造するために、使い捨てカセットに組み立てた。キャプターとしてのヒト糖化ヘモグロビン（２ｍｇ／ｍＬ）を、Ｂｉｏ Ｄｏｔ分注器を用いて０．８８μＬ／ｃｍの量で線の幅が０．８ｍｍとなるようにＮＣ膜上に分注した後、ＲＨ３５〜５０％で２時間固定化した。次いで、タンパク質を安定化し、かつ試薬間の非特異的反応を防ぐために、膜を安定化液（１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＰＶＡ）で処理して５分間平衡化させた（前記安定化液成分として、ＢＳＡはゼラチンで置換してもよく、Ｔｗｅｅｎ２０はトリトンＸ−１００で置換してもよく、スクロースはトレハロースで置換してもよく、ＰＶＡはＰＥＧまたはＰＶＰで置換してもよい）。余分な溶液を除去した後、処理した膜を４０℃で３０分間乾燥した。試験に使用する膜は、サンプルパッド、吸収パッドなどと重ね合わせた後、切断器を用いて４ｍｍの幅に切断し、最終的にストリップが４×６０ｍｍの寸法を有するようにした。
【００７７】
Ｂｉｏ Ｄｏｔ分注器（Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、米国）を用いて、ＮＣ膜上に内部標準の対照の線としてストレプトアビジン（３ｇ／Ｌ）を、１μＬ／ｃｍの量で線の幅が１ｍｍとなるように分注した。製造されたストリップは、レーザー蛍光スキャナのホルダーにフィットするように設計された使い捨てカセット（１６×９０ｍｍ）中で組み立て、除湿室で包装した後、使用まで室温で保管した。
【００７８】
実施例６：デテクター緩衝溶液の調製
一般に既知のラテラルフロークロマトグラフィーで使用される、デテクターを結合体放出パッドに固定する方式の代わりに、このデテクターを液体状態で新しいチューブに保管した。採取した血液が５μＬに過ぎないため、展開膜上で移動を誘発するには足りない体積である。したがって、緩衝溶液の添加が必要である。使用した緩衝溶液は、１％ＢＳＡの添加されたＰＢＳである。
【００７９】
実施例７：赤血球溶血溶液の調製
１０ｍＭ Ｋｐｉ溶液１Ｌにフェリシアン化カリウム５０ｇを溶かした後、赤血球の溶血のためにジギトニン１００ｍｇをそこへ添加してｐＨ７．４の溶液を調製した。調製した溶液を０．４５μｍのメンブレインフィルターを用いて滅菌し、使用まで冷暗所に保管した。
【００８０】
実施例８：ＬＥＤ検出システムを用いたヘモグロビンの標準曲線の作成
ヘモグロビン測定のための参照物質としては、既知の生化学試験によって測定し濃度が確認された全血を使用した。準備された溶液を糖化ヘモグロビン測定用ストリップにアプライして、糖化ヘモグロビンとヘモグロビンを同時に測定するように製造された機器でヘモグロビン値を測定し、標準曲線を作成した。シリコンダイオードによって測定されたヘモグロビン濃度は、既知の生化学試験によって測定された濃度と比較したところ、完全に一致することを確認した。濃度依存的な結果を図４に示した。ストリップで測定された濃度と既存の方法で測定された濃度とは相関が高かった（Ｒ２値が０．９８以上）。再現性を示すＣＶ％値は３％未満であり、信頼性が非常に高かった。
【００８１】
実施例９：免疫クロマトグラフィー方法を用いた糖化ヘモグロビン標準曲線の作成
糖化ヘモグロビン検出溶液を調製するために、ＢＳＡ−ビオチン結合体（０．１ｇ／Ｌ）と抗ＨｂＡｌｃ抗体（４μｇ／ｍＬ）を使用した。糖化ヘモグロビン０．２５、０．５、１、および２ｍｇ／ｍＬそれぞれを検出溶液と１：１の比率で混合した。カセットのサンプルホルダーに各混合物７５μＬを添加した。混合溶液をアプライしたカートリッジは、室温で１２分間反応させた後、蛍光検出器を用いて蛍光強度を測定した。検査の線と対照の線で記録された結果を、準備されたプログラムを用いて面積値（検査の線：ＡＴ、対照の線：ＡＣ）に転換した後、面積比（ＡＴ／ＡＣ）を用いて、抗原の濃度を計算し、図５に示した。図５によれば、面積値は糖化ヘモグロビンの濃度に濃度依存的に比例し、この標準曲線を用いてＨｂＡ１ｃ％値を計算した。その結果、ＨｂＡｌｃの濃度とは相関が高かった（Ｒ値：０．９９）。ＣＶ％の値も５％程度と低かった。
【００８２】
実施例１０：既知のＨｂＡｌｃ測定装置を用いた実検体の比較試験
ＨＰＬＢｉｏ−Ｒａｄ ＶａｒｉａｎｔIIを使用して糖化ヘモグロビン値を確認した後、本発明の糖化ヘモグロビン測定システムを用いて実検体を測定した。測定値を違いに比較した。結果の値を比較した資料を図６に示した。本発明で使用した免疫分析法とＨＰＬＣ法は、原理的には互いに異なる方法であるが、Ｒ値は０．９６であって、相関が高かった。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明に係るラテラルフローアッセイストリップ、レーザー誘起落射蛍光検出装置およびＬＥＤ検出装置からなるラテラルフロー定量アッセイシステムは、抗原−抗体反応によって効果的に糖化ヘモグロビンを定量する方法を提供する。その結果、グルコースレベルの管理が必要な患者に非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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