(57)【要約】  本発明は、ｍａｘ遺伝子含有クローニングベクターの構築に関する。具体的には、本発明は、輸送ベクターを用いたｍａｘ遺伝子含有クローニングベクターの細胞内への導入に関する。また、細胞内にｍａｘ遺伝子含有クローニングベクターが存在すると、同じ細胞中で異なるｍａｘ遺伝子の発現が可能となる。さらに、本発明は、異なるｍａｘ遺伝子の発現が、細胞保護、特に神経保護を有する遺伝子治療、並びに医学および獣医学の神経変性状態の治療への適用に関する。
2011516047.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍａｘ遺伝子を含有する生物学的ベクターであって、
（ａ）クローニングベクター、この際、前記クローニングベクターは
（ａ１）ｍａｘ遺伝子またはそのフラグメントを発現できるヌクレオチド配列；
（ａ２）適切なプロモータ；
を含む：
（ｂ）ウイルス輸送ベクター、非ウイルス輸送ベクター、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される輸送ベクター：
を含むことを特徴とする、生物学的ベクター。
【請求項２】
前記（ａ）のクローニングベクターが、プラスミド、ウイルス、コスミドおよび／またはＹＡＣの群のベクターを含むことを特徴とする、請求項１に記載の生物学的ベクター。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、２、３、４、５およびこれらの組み合わせを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の生物学的ベクター。
【請求項４】
前記プロモータが、プロモータＣＢＡ、ＣＭＶおよび／またはＣＢＡ／ＣＭＶを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の生物学的ベクター。
【請求項５】
前記非ウイルス輸送ベクターが、ＤＮＡ−リン酸カルシウム、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン、ＤＮＡ−脂質、ＤＮＡ−タンパク質、ＤＮＡ−脂質−タンパク質、人工染色体、ナノ粒子、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、プラスミドの投与、ＤＮＡのバリスティックインジェクション、およびこれらの組み合わせなどの、プラスミド、リポソーム、カチオン性脂質、タンパク質、およびアミドタンパク質化合物を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の生物学的ベクター。
【請求項６】
前記ウイルス輸送ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、泡沫状、ＨＩＶ、ワクシニアおよびこれらの組み合わせを含む群から選択されること特徴とする、請求項１に記載の生物学的ベクター。
【請求項７】
（ａ）クローニングベクターを準備する工程、この際、前記クローニングベクターは
（ａ１）ｍａｘ遺伝子またはそのフラグメントを発現できるヌクレオチド配列；
（ａ２）適切なプロモータ；
を含む：
（ｂ）ウイルス輸送ベクター、非ウイルス輸送ベクター、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される生物学的ベクターを準備する工程：
（ｃ）生物学的ベクター（ｂ）をクローニングベクター（ａ）と接触させる工程：
を含むことを特徴とする、ｍａｘ遺伝子含有生物学的ベクターを産生する方法。
【請求項８】
前記（ａ）のクローニングベクターが、プラスミド、ウイルス、コスミドおよび／またはＹＡＣの群のベクターを含むことを特徴とする、請求項７に記載の生物学的ベクターを産生する方法。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、２、３、４、５およびこれらの組み合わせを含む群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の生物学的ベクターを産生する方法。
【請求項１０】
前記プロモータが、プロモータＣＢＡ、ＣＭＶおよび／またはＣＢＡ／ＣＭＶ、および／または、代わりに、例えばニューロンのような特定の細胞タイプに特異的なプロモータを含む群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の生物学的ベクターを産生する方法。
【請求項１１】
前記非ウイルス輸送ベクターが、ＤＮＡ−リン酸カルシウム、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン、ＤＮＡ−脂質、ＤＮＡ−タンパク質、ＤＮＡ−脂質−タンパク質、人工染色体、ナノ粒子、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、プラスミドの投与、ＤＮＡのバリスティックインジェクション、およびこれらの組み合わせなどの、プラスミド、リポソーム、カチオン性脂質、タンパク質、およびのアミドタンパク質化合物を含む群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の生物学的ベクターを産生する方法。
【請求項１２】
前記ウイルス輸送ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、泡沫状、ＨＩＶ、ワクシニアおよびこれらの組み合わせを含む群から選択されること特徴とする、請求項７に記載の生物学的ベクターを産生する方法。
【請求項１３】
生物学的ベクターを適切な細胞と接触させる工程を含み、この際、前記生物学的ベクターが、
（ａ）クローニングベクター、この際、前記クローニングベクターは
（ａ１）ｍａｘ遺伝子またはそのフラグメントを発現できるヌクレオチド配列；
（ａ２）適切なプロモータ；
を含む：
（ｂ）ウイルス輸送ベクター、非ウイルス輸送ベクター、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される輸送ベクター；
を含むことを特徴とする、細胞内にｍａｘ遺伝子を発現させる方法。
【請求項１４】
標的細胞が、高等動物のいずれかの細胞であることを特徴とする、請求項１３に記載の発現方法。
【請求項１５】
前記高等動物がヒトである、請求項１４に記載の発現方法。
【請求項１６】
前記標的細胞がニューロンである、請求項１４に記載の発現方法。
【請求項１７】
前記（ａ）のクローニングベクターが、プラスミド、ウイルス、コスミドおよび／またはＹＡＣの群のベクターを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の発現方法。
【請求項１８】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、２、３、４、５およびこれらの組み合わせを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の発現方法。
【請求項１９】
前記プロモータが、プロモータＣＢＡ、ＣＭＶおよび／またはＣＢＡ／ＣＭＶ、および／または、代わりに、例えばニューロンのような特定の細胞タイプに特異的なプロモータを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の発現方法。
【請求項２０】
前記非ウイルス輸送ベクターが、ＤＮＡ−リン酸カルシウム、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン、ＤＮＡ−脂質、ＤＮＡ−タンパク質、ＤＮＡ−脂質−タンパク質、人工染色体、ナノ粒子、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、プラスミドの投与、ＤＮＡのバリスティックインジェクション、およびこれらの組み合わせなどの、プラスミド、リポソーム、カチオン性脂質、タンパク質、およびアミドタンパク質化合物を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の発現方法。
【請求項２１】
前記ウイルス輸送ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、泡沫状、ＨＩＶ、ワクシニアおよびこれらの組み合わせを含む群から選択されること特徴とする、請求項１３に記載の発現方法。
【請求項２２】
前記生物学的ベクターが、薬学的に許容されるビヒクルを伴うことを特徴とする、請求項１３に記載の発現方法。
【請求項２３】
前記薬学的に許容されるビヒクルが、薬学的に許容される賦形剤および担体を含む群から選択され、経口、非経口、静脈内、筋肉内、脳内、脳室内および眼内を含む一連の治療計画で表されうる特定の組成物の使用について、適当な投与量および治療が選択されることを特徴とする、請求項２２に記載の発現方法。
【請求項２４】
ｍａｘ遺伝子含有生物学的ベクターを、高等動物の少なくとも１つの標的細胞に導入し、前記標的細胞の細胞活性を調節する段階を含むことを特徴とする、遺伝子治療方法。
【請求項２５】
前記高等動物が、ヒトであることを特徴とする、請求項２４に記載の遺伝子治療方法。
【請求項２６】
前記細胞がニューロンであることを特徴とする、請求項２４に記載の遺伝子治療方法。
【請求項２７】
選択的な細胞保護機能を有する標的細胞の活性を調節することを特徴とする、請求項２４に記載の遺伝子治療方法。
【請求項２８】
選択的な神経保護機能を有する標的細胞の活性を調節することを特徴とする、請求項２４に記載の遺伝子治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｍａｘ遺伝子含有クローニングベクターの構築に関する。具体的には、本発明は、輸送ベクターを用いたｍａｘ遺伝子含有クローニングベクターの細胞内への導入に関する。また、細胞内におけるｍａｘ遺伝子含有クローニングベクターの存在は、細胞中でｍａｘ遺伝子の差次的発現を可能にする。さらに、本発明は、前記ｍａｘ遺伝子が、神経変性状態に対する医学および獣医学治療に適用されうる細胞保護活性、特に神経保護活性を有する、差次的発現の遺伝子治療の方法を参照する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療
ＤＮＡ組換え技術およびヒトゲノムのシークエンシングの著しい発展により、遺伝子治療技術を通じて、遺伝性疾患および遺伝特性の後天性疾患だけでなく、変性疾患および感染性疾患を含む病気に対して、新たな視点が切り開かれた。
【０００３】
一定の疾患の遺伝的基礎の同定、そのいくつかは単一遺伝子の突然変異によるものだけでなく、発症機序または疾患に対する防御力のメカニズムのいずれかに関連する、または関与するリスクファクターの同定が、治療目的で遺伝子発現に直接介入する機会を示した。
【０００４】
遺伝子治療は、治療目的で挿入技術および細胞内における外因性遺伝子物質の発現のセットである。遺伝子物質の輸送はｉｎ  ｖｉｖｏ（標的微生物に直接輸送）または細胞の形質導入によるｅｘ  ｖｉｖｏで行われ、次いで標的微生物に挿入されうる。すなわち、遺伝子治療は、幹細胞を含めた細胞療法と組み合わされうる。
【０００５】
遺伝子治療は１９６０年代に着想され、１９８０年代の終わりに最初の臨床試験に至った。２００９年１月までに、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅに総数約１，５００の進行中の臨床試験が記録されている。この中で、中南米全域においては、１例がメキシコで記録されているのみであり、南アメリカでは記録がない。ブラジルにおける遺伝子治療の研究は、ブラジル科学技術省および米国学術研究会議の遺伝子治療ネットワークによって促進された。
【０００６】
生物学的ベクター
細胞は通常、外因性ＤＮＡの進入に対して抵抗性がある。この障害を乗り越えるために、遺伝子（「輸送ベクター」として知られている）の挿入にビヒクルが用いられ、ＤＮＡ進入の可能性が高くなる。当該技術分野の現状において最も頻繁に用いられているベクターは、微生物が通常、生細胞に感染することから、ウイルスから誘導される。しかしながら、外因性細胞にＤＮＡを導入したＤＮＡプラスミドのような「非ウイルス」ベクターも用いられうる。細胞内へのクローニングベクターの導入を目的とした一定の物理的および生物学的技術が存在する。非ウイルスベクターのうち、ＤＮＡ−リン酸カルシウム、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン、ＤＮＡ−脂質、ＤＮＡ−脂質−タンパク質、および人工染色体などの、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、プラスミドの投与、バリスティックＤＮＡインジェクション、プラスミド、リポソーム、カチオン性脂質化合物、タンパク質、または天然アミドタンパク質の１つが遺伝子治療に利用しうる。ウイルス輸送ベクターのうち、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、単純ヘルペス、レンチウイルス、泡沫状、ＨＩＶおよびワクシニアの１つを利用しうる。
【０００７】
遺伝子治療を目的としたウイルスベクターを用いるため、前記ウイルスは、ウイルスの複製がなく、および有害作用をもたない、細胞感染能がある最小構造を得るため、ウイルス病原に関連したすべての遺伝子を除去するＤＮＡ組換え技術によって修飾される。関連遺伝子が前記構造に加えられ、生じた構造は、処理される微生物の細胞に関連遺伝子を挿入するために用いられうる。
【０００８】
しかし、挿入および微生物への遺伝子の発現は、侵襲的な工程である。導入された遺伝子およびウイルスベクターは、遺伝子発現のアンバランス、または非自己抗原の存在に関連した悪影響を引き起こしうる。標的微生物は、炎症の活性化および免疫応答によって存在するウイルスと反応し、遺伝子治療の標的が損傷されうる。遺伝子治療に適用されるバイオテクノロジーの最も競争的な領域の１つは、より安全であると同時に、標的細胞に増殖感染能および関連遺伝子の長期間の発現を維持しうるベクターの探索である。
【０００９】
特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の構造は、ヒト臨床試験において遺伝子輸送の潜在的なベクターとしてターゲットにされている。最も好ましい性質には、（Ｉ）ヒト疾患を有するアデノ随伴ウイルスと関連がない；（ＩＩ）異なる組織由来の細胞株に感染能がある；（ＩＩＩ）エピソームの形態においてＡＡＶ由来ベクターが持続性であり、このため挿入突然変異が回避される；（ＩＶ）非分裂細胞に感染能がある。
【００１０】
組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を有する形質導入の能力は、分化した細胞を含む、多様な細胞タイプで実証されており、筋肉、肝臓、中枢神経系および肺のような臓器へのｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子導入に対して、このベクターシステムの大きな可能性を示唆している。前記ｒＡＡＶベクターは、外因性関連遺伝子を配置する逆方向末端配列（ＩＴＲｓ）を輸送するプラスミドに由来する。前記逆方向末端配列は、各１４５塩基対の対称配列であり、ＡＡＶ  ＤＮＡの複製を必要とする。従来から、ｒＡＡＶベクターは、２つのプラスミドを有するＨＥＫ２９３細胞のコトランスフェクションによって以前は産生されており、前記２つのプラスミドは、ヘルパーウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）とともに、第１のプラスミドのＩＴＲｓによって配置された関連遺伝子、および第２のプラスミドのパッケージング遺伝子ｒｅｑおよびｃａｐを含み、その役割は、ＡＡＶの複製に補助的な要因を提供することである。しかしながら、現代の技術では、関連遺伝子を含むメインＡＡＶプラスミドのコトランスフェクション、ＩＴＲｓによって配置されたその調節配列、さらにパッケージングに必要なすべての最小配列を含むヘルパープラスミドのみを利用する。この方法は、生産収率の増加に加えて、病原性のアデノウイルスによって調製されたｒＡＡＶの汚染の回避を目的とし、このため、最小ヘルパープラスミドで置換される。前記ｒＡＡＶプラスミドは細胞溶解後に回収され、前記ヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株のＤＮＡとともに除去される。そのため、現在は、以下３つの要素がＡＡＶのパッケージングに必要とされる：（Ｉ）培養液中の真核細胞；（ＩＩ）関連遺伝子および複製配列を有するメインプラスミド；（ＩＩＩ）ウイルス複製配列を有するヘルパープラスミド。
【００１１】
組換えＡＡＶベクターは、一般的に非病原性であり、近年用いられているベクターの中では最も安全である。そのため、ｒＡＡＶに基づく発現プラットホームは、臨床用途に大きな潜在性を有している。
【００１２】
特許分野では、様々な文献で遺伝子治療用の輸送ベクターの構造が記載されている。以下にいくつかの例を記載する。
【００１３】
米国特許第６，５２１，２２５号明細書には、新規なアデノ随伴ウイルスベクターの構築、特に、肝臓への治療用分子の輸送するものであることが記載されている。前記ベクターは、２つの逆方向末端反復（ＩＴＲｓ）を含み、それぞれ５−１５ヌクレオチドの特定配列を含み、１または２以上の欠失または置換を許容する。
【００１４】
他の文献の米国特許第３，４８２，６３４号明細書には、組換えＡＡＶの産生に有用なベクターの構築が記載されている。前記記載された方法は、５’−３’核酸の１分子、パルボウイルス由来のＰ５プロモータ、１つのスペーサー、１つのＡＡＶ  ｒｅｐ配列、１つのＡＡＶ  ｃａｐ配列を含有する宿主細胞を含む。前記スペーサーは、遺伝子産物であるｒｅｐ７８およびｒｅｐ６８の発現を減少させる。前記第２の核酸分子は、１つのミニ遺伝子およびＩＴＲｓによって配置されたトランス遺伝子を交互に含み、宿主細胞における発現、並びに複製およびｒＡＡＶパッケージのための本質的な機能について規定する配列を制御している。
【００１５】
国際公開第０１８２９７２３号パンフレットには、適合骨マトリックスをもたない患者に対して、トランス遺伝子を含む輸送ビヒクルの局所投与により、骨病変の処置に対するトランス遺伝子の輸送するためのビヒクルとして、ウイルスおよび非ウイルスベクターの両方が記載されている。本文献は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、標的細胞に対して、骨病変部の骨誘導因子を生産するようにする、治療的骨誘導因子と関連する遺伝子情報を含む輸送ウイルスベクターまたは輸送非ウイルスベクターが記載されている。
【００１６】
これらの文献は、問題となる生物学的ベクターが、ｍａｘ遺伝子含有クローニングベクターを含まず、およびその用途として神経保護治療の記載がないため、本発明とは重複しない。
【００１７】
神経変性疾患
最近、本願の神経変性疾患の分野において、遺伝子治療の適用に関する文献におけるいくつかの最近のレビューがある。１つの具体的な例では、中枢神経系の一部である網膜が、近年遺伝子治療のターゲットとなっている、変性網膜症または網膜ジストロフィとして知られる神経変性疾患の対象となったものである。
【００１８】
安全なウイルスベクターを用いて、適切な遺伝子を特定の神経変性病変に組み合わせた事例が、すでにパーキンソン病、レーバー先天性黒内障、およびアルツハイマー病の治療いくつかの場合で臨床試験が行われている。
【００１９】
様々な特許文献には、神経病変疾患の対する遺伝子治療が記載されている。１つの例が米国特許第６，６８３，０５８号明細書であり、脳神経性疾患を治療する方法が記載されている。この文献には、標的（損傷、疾患、またはコリン作動性神経の機能障害）へのニューロトロフィンの治療的輸送の形成が記載されている。後者は、哺乳類の脳内でニューロトロフィンをコードする、長期間で組換えニューロトロフィンの集合が規定された輸送を生じる、トランス遺伝子を受け取る。
【００２０】
本発明には、前記ベクターの使用を含むｍａｘ遺伝子の発現のいかなる修飾とも関係なく、ニューロトロフィンが関与する脳疾患に対する治療性能を有する生物学的ベクターが記載されているため、前記文献とは異なる。
【００２１】
プログラム細胞死
一般的な変性疾患、および特定の神経変性疾患の治療は、しばしばプログラム細胞死（ＰＣＤ）への細胞の感受性に影響を及ぼす要因の多様性によって妨げられる。この場合、通常は薬物に対する単一の治療標的の感受性がなく、そのため、通常の治療では、しばしば有意な治療効果がなく、大きく制限される。
【００２２】
最近では、ほとんどの神経変性疾患は、不知または効果的な治療に長期間かかるものがある。この疾患のクラスは、神経系、特にニューロンの細胞間でＰＣＤの確率が増加することを特徴とする。これらの発症メカニズムは、ハンチントン病のような突然変異、脳血管疾患のような酸素および栄養の供給の変化、またはアルツハイマー病のような複合的な遺伝および非遺伝の複雑なバランスを含む。本技術分野における研究は、細胞死および細胞保護のメカニズムの研究、および細胞ストレスおよびＰＣＤの可能性を狙った臓器または組織の回復または機能的保護に対する実験戦略のデザインの研究について、世界中で精力的に、および集中して行われている。
【００２３】
特許分野では、米国特許第７，２５６，１８１号明細書には、ＰＣＤ修飾用ウイルスベクターの使用が説明されている。その中には、ｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子治療を目的とした、輸送ベクターを介したインターフェロン−βの非経口投与からなるガンの治療方法が記載されている。インターフェロン−βは、大規模な細胞障害が生じた場合に、アポトーシスを誘導しうる分子をコードするｐ５３遺伝子の導入経路の一部であることが知られている。
【００２４】
前記文献は、誘導を目的とした遺伝子治療を意味しており、ｍａｘ遺伝子もしくは他の転写要因とは関係なく、様々なウイルスベクターおよびインターフェロンβをコードする遺伝子の使用を意味する、ＰＣＤの阻害剤ではないため、本発明とは重複しない。
【００２５】
他の実施例、このときＰＣＤの経路に作用するウイルスベクターの潜在的使用と関連している、は米国特許第６，９９８，１１８号明細書に記載されている。この文献には、シナプス部周辺に注入され、細胞体に向かい、ニューロンの軸索に沿って輸送されたｒＡＡＶベクターを用いて神経形質導入し、その結果、非特定遺伝子の発現が許容される方法が記載されている。前記記載された方法は、軸索輸送に逆行して輸送されうるアデノ随伴ウイルスベクターが使用され、ニューロンに遺伝子が導入または発現し、並びにベクター中に挿入された遺伝子に依存する、神経細胞成長の刺激または阻害およびアルツハイマー病のような疾患の治療において、神経経路の究明に適用されうる。
【００２６】
前記文献には、いずれの場合にも適用されうる関連遺伝子を特定することなく、ニューロンにおける遺伝子の進入および発現を許容する一般的な遺伝子治療が記載されているため、ｍａｘ遺伝子の発現の制御を介した神経変性を制御する遺伝子治療を目的とした具体的なベクターを記載する、本発明と重複しない。
【００２７】
神経保護治療
最も有望な神経変性疾患の原因を含む多様な要因に直面した場合の代案は、神経保護治療の開発、すなわち、一般的にＰＣＤへの神経系の細胞の感受性を減らすことである。神経栄養素（神経系の作用を有する成長因子のクラス）または他の神経保護分子のいずれかに基づく薬理学的方法は、薬物の継続投与の必要性から有効性がほとんどないことが示されている。これは、薬の一部またはすべてが血液から神経組織へ分布することを阻害する、血液脳関門を通過させるための、神経組織中への直接の注入または脳脊髄液への継続注射もしくは持続的点滴のいずれかを意味する。脳組織の反復的な操作によるリスクを回避するため、前記溶液は、処置の数の減少、理想的には単一の処置に基づく治療開発の段階にある。
【００２８】
前記目的は、ＰＣＤが作用する様々な要因に対抗して神経組織を保護することができる、標的遺伝子の発見に基づく遺伝子治療開発を通して達成されうる。しかしながら、神経変性の遺伝子治療のための標的遺伝子の同定は簡単なことではない。ハンチントン病のような場合であっても、単一遺伝子の直接的なアプローチ（通常、単一遺伝子の疾患）は適さない。今までのところ、わずかな予備的な遺伝子治療アッセイにおいて、それは神経変性の患者の臨床症状の悪化を阻害することが明らかとなり、その手法は、中枢神経系の中で特異的な神経回路の機能的回復を目的とする、特定の神経栄養または特定遺伝子の発現の存在による、神経集団の選択的な感受性に基づいて、その条件に固有のものである。
【００２９】
前記遺伝子治療の標的は、もしかすると、ＰＣＤメカニズムの全体でありうる。ＰＣＤの細胞死のいくつかの形態は同定され、細胞ストレスの多様なタイプの結果として引き起こされる。最も知られた細胞死の形態は、アポトーシスによるＰＣＤである。それにもかかわらず、実験的研究では、ＰＣＤの他の形態とともに、アポトーシスの様々な経路が示されている。また、細胞死の一定の経路の阻害は、細胞が他の経路による細胞死を阻害せず、例えば、アポトーシス自体の阻害が活性化されうることも知られている（Ｇｕｉｍａｒａｅｓ  ＣＡ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｅｎ  Ｒ−Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈｓ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｄｅａｔｈｓｔｙｌｅｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４  Ｍａｙ；２７１（９）：１６３８−５０）。
【００３０】
今までに開発された、ある一定の実験的遺伝子治療療法は、遺伝子の導入または差次的発現（過剰発現）のいずれかに基づくものであり、細胞保護効果を有するが、潜在的にガンを生じる可能性がある。この矛盾は、ガンが本質的には細胞増殖およびＰＣＤの機構の間バランスの喪失の結果として生じるためであり、後者の阻害は発ガンの可能性を有する。よって、神経変性疾患の第２の遺伝子治療の試みは、発ガン性のない、細胞保護遺伝子の発現に基づく神経保護する方法を開発することである。
【００３１】
特許分野では、細胞保護／発ガンバランスを維持することの重要性は、米国特許第７，１８６，６９９号明細書に発見されうる。この際、抗腫瘍活性を有し、化学療法または放射線治療を問わず、ＰＣＤ誘導遺伝子の１または２以上の抗血管新生遺伝子をコードする導入または発現遺伝子に使用される、ＶＥＧＦ−ＴＲＡＰをコードするアデノ随伴ウイルスベクターが記載されている。
【００３２】
この文献は、神経保護要因の発現に言及していないため、本発明と重複しない。本明細書がＰＣＤの阻害に関するものであるのに対し、前記特許はＰＣＤの導入方法と関連するものである。
【００３３】
網膜神経節細胞およびｍａｘ遺伝子
脊椎動物の網膜の細胞の様々な集団の中で、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）は、軸索が視神経を形成するニューロンであり、網膜内で脳内の視覚系の上位で処理された情報伝達に関与する。その変性は失明をもたらす。
【００３４】
一般的に、今までに開発されたＰＣＤに対する治療的介入の方法は、回復または機能維持の観点がない、ＰＣＤによる細胞死のメカニズムが既に不可逆的である場合の相対的に細胞変性の工程の後期に作用する。
【００３５】
したがって、ＰＣＤのメカニズムに基づく介入のための新規な解決方法は、細胞ストレスから細胞死実行メカニズムの誘導に移る、できるだけ早い段階で行われるべきである。
【００３６】
齧歯動物の網膜におけるＰＣＤメカニズムの実験的研究では、網膜ニューロンおよび前駆細胞に転写因子の核排除が存在することが示されている。すなわち、正常細胞の核に通常見られる転写因子は、後者が細胞ストレスまたは細胞障害の異なる形態となっている場合、これらの細胞の細胞質に現れる（Ｌｉｎｄｅｎ  Ｒ，  Ｃｈｉａｒｉｎｉ  ＬＢ．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｔｉｓｓｕｅ．Ｂｒａｚ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ．１９９９  Ｊｕｌ；３２（７）：８１３−２０）。
【００３７】
続く実験的研究では、転写因子Ｍａｘは軸索の横断面上のＲＧＣ初期の核から除かれており、カスパーゼ（アポトーシスによる細胞死に関与するプロテアーゼ）活性が独立していることが示されている（Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ  Ｈ，ｄｅ  Ｆｒｅｉｔａｓ  ＦＧ，Ｌｉｎｄｅｎ  Ｒ，Ｃｈｉａｒｉｎｉ  ＬＢ）。転写因子ｍａｘの早期核排除は、カスパーゼ活性と独立した網膜神経節細胞死と関連している（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００４  Ｆｅｂ；１９８（２）：１７９−８７）。同一グループの他の研究では、Ｍａｘの核排除のメカニズムが研究され、核からのこのタンパク質の喪失は、ユビキチン−プロテアソームシステム内の核、および細胞質中で新たに合成されたＭａｘの保持を原因として低下することを見出した（Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ  Ｈ，Ｃｈｉａｒｉｎｉ  ＬＢ＆Ｌｉｎｄｅｎ  Ｒ−Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００８  Ｓｅｐ；２１３（１）：２０２−９）。これらすべての事象は、細胞死実行メカニズムへのＲＧＣのコミットメント前の早期段階で生じる。
【００３８】
ｍａｘ遺伝子は、ｍａｘタンパク質の２１−２２ｋＤａの２つのアイソフォームをコードする。遺伝子の転写の制御において、Ｍａｘの機能は、ガン遺伝子ｃ−Ｍｙｃによってコードされた転写因子の活性に依存する。転写因子として機能するためには、ｃ−ＭｙｃはＭａｘとヘテロ二量化しなければならない。同様に、Ｍａｘはｃ−Ｍｙｃ、およびＭｎｔおよびＭｘｄ１−４（以前は、Ｍａｄ１、Ｍｘｉｌ、Ｍａｄ３およびＭａｄ４として知られていた）のような転写因子のネットワークを含む他のタンパク質とヘテロ二量化、並びにホモ二量化することができる。Ｍｙｃ−ＭａｘへテロダイマーおよびＭａｘ−Ｍａｘホモダイマーは、ゲノムＤＮＡにおける同一成分に対する親和性を有し、反対の効果を有する。このため、Ｍａｘ−Ｍａｘホモダイマーは、Ｍｙｃ−Ｍａｘへテロダイマーの発ガン性を阻害し、Ｍａｘは、ｍａｘ遺伝子に形質導入された細胞に抗ガン作用を有する。
【００３９】
特許分野において、ある文献には、ウイルスベクターと関連したｍａｘ遺伝子が記載されている。米国特許第５，６９３，４８７号明細書には、ｍａｘ遺伝子をコードするヌクレオチド配列、および結果として生じる、ＭｙｃまたはＭａｄのいずれかと形成した場合に、配列特異的な方法においてＤＮＡと形成できる、ヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質の複合体を形成することが記載されている。当該文献では、一定の条件下でｍａｘ  ｃＤＮＡの核酸配列、またはｍａｄ  ｃＤＡＮの核酸配列とハイブリダイゼーションできる核酸分子を参照する。ＭｙｃポリペプチドまたはＭａｄポリペプチドと関連する場合、Ｍａｘ遺伝子は、ＣＡＣＧＴＧを含む核酸配列と結合できる。
【００４０】
米国特許第５，３０２，５１９号明細書には、Ｍａｄポリペプチドをコードし、Ｍａｘポリペプチドと結合することができ、およびＣＡＣＧＴＧ核酸配列へのＭａｘの結合を阻害できる、核酸配列が記載されている。
【００４１】
上述の文献は、ｍａｘ遺伝子の核酸配列と他の配列との特異的相互作用と関連し、および特異的ＤＮＡ配列と結合する単独のＭａｘポリペプチドの発現と関連するため、本発明と重複しない。
【００４２】
米国特許第５，５１２，４７３号明細書は、Ｍａｘポリペプチドと相互作用する、Ｍｘｉ１ポリペプチドの核酸配列および発現を参照する。当該文献は、Ｍａｘ遺伝子と相互作用するほかのＤＮＡ配列および他のポリペプチドを参照するため、本発明と重複しない。
【００４３】
同様に、米国特許第５，８１１，２９８号明細書および米国特許第６，１４０，４７６号明細書には、Ｍａｘ遺伝子をコードする配列と融合された、Ｍｘｉ遺伝子のリプレッサードメインに対するコード配列からなるキメラ遺伝子を含むプラスミドおよびウイルスベクターが記載されている。前記キメラ遺伝子は、ｃ−Ｍｙｃファミリーの発ガン性タンパク質の活性を促進する腫瘍を特異的に阻害する、Ｒｅｐ−Ｍａｘと呼ばれる融合タンパク質をコードするベクターによって発現させる。当該先行技術文献は、（ａ）ｂＨＬＨ、ＬＺ、およびカルボキシ末端のＭａｘドメインのみを含む、融合Ｍｘｉ−Ｍａｘ構成、すなわち、例えば、Ｍａｘタンパク質のリン酸化部位を含むＮ−末端Ｍａｘドメインをコードするｍａｘ遺伝子の５’ＯＲＦがない、換言すると、本発明において用いられるＭａｘ構造とは根本的に異なる構造を参照している；（ｂ）本発明で記載されたＭａｘポリペプチドの効果の代わりに、Ｍｘｉポリペプチドドメインのリプレッサー効果を参照している；（ｃ）本発明で記載されたＭａｘの神経保護効果とは異なり、ｃ−Ｍｙｃファミリーの発ガンタンパク質の活性を促進する腫瘍におけるＭｘｉドメインのリプレッサーを特に参照している；（ｄ）本発明に記載されたＭａｘポリペプチドの直接的な効果と異なり、融合ポリペプチドのＭｘｉドメインのリプレッサー効果を促進するものとして、単独のＭａｘ遺伝子の効果を参照している；（ｅ）本発明に記載されたＭａｘ含有ベクターの神経保護活性と異なり、ｒｅｐ−ｍａｘキメラ構成を含むベクターの抗腫瘍活性を参照していることから、本発明と重複しない。
【００４４】
上述の文献は、ｍａｘ遺伝子を利用したキメラを参照し、ｍａｘそれ自体を含むベクターを参照しないため、本発明と重複しない。また、前記文献は、神経保護活性を有するｍａｘ遺伝子の発現の調節を目的として、ウイルスベクターにｍａｘ遺伝子の付加については言及していない。
【００４５】
いずれの文献にも、ｍａｘ遺伝子含有クローニングベクター、ｍａｘ遺伝子含有輸送ベクター、および細胞保護、特に神経保護療法へのそれらの使用については記載されていない。
【００４６】
本発明は、ｍａｘ遺伝子含有クローニングベクターの構築に関する。具体的には、本発明は、輸送ベクターを用いたｍａｘ遺伝子含有クローニングベクターの細胞内への導入に関する。また、細胞内におけるｍａｘ遺伝子含有クローニングベクターの存在は、細胞中で細胞保護活性、特に神経保護活性を有するｍａｘ遺伝子の差次的発現を可能にし、神経変性状態に対する医学および獣医学治療に適用されうる。
【発明の概要】
【００４７】
発明の効果
一実施態様において、本発明はｍａｘ遺伝子を含有する生物学的ベクターからなり、
（ａ）クローニングベクター、この際、前記クローニングベクターは
（ａ１）ｍａｘ遺伝子またはそのフラグメントを発現できるヌクレオチド配列；
（ａ２）適切なプロモータ；
を含む：
（ｂ）ウイルス輸送ベクター、非ウイルス輸送ベクター、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される輸送ベクター：
を含む。
【００４８】
ある実施形態において、前記（ａ）のクローニングベクターは、プラスミド、ウイルス、コスミドおよび／またはＹＡＣの群のベクターを含む。
【００４９】
ある実施形態において、前記（ｂ）のプロモータは、細胞内にｍａｘ遺伝子および／またはそのフラグメントを直接発現することができる配列のいずれかを含む。
【００５０】
ある実施形態において、前記プロモータは、ＣＢＡ、ＣＭＶおよび／またはＣＢＡ／ＣＭＶおよび／またはハイブリッドＣＢＡ／ＣＭＶおよび／または様々な細胞タイプのそれぞれ１つに特異的なプロモータを含む群から優先的に選択される。
【００５１】
ある実施形態において、前記プロモータは、ニューロン特異的プロモータの群から選択される。
【００５２】
ある実施形態において、非ウイルス輸送ベクターは、プラスミド、リポソーム、カチオン性脂質化合物、タンパク質、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン、ＤＮＡ−脂質、ＤＮＡ−タンパク質、ＤＮＡ−脂質−タンパク質、人工染色体、ナノ粒子、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、プラスミドの投与、ＤＮＡのバリスティックインジェクションを含む群から選択される。
【００５３】
ある実施形態において、ウイルス輸送ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、泡沫状、ＨＩＶ、ワクシニアを含む群から選択される。
【００５４】
本発明の追加の目的は、
（ａ）クローニングベクターを準備する工程、この際、前記クローニングベクターは
（ａ１）ｍａｘ遺伝子またはそのフラグメントを発現できるヌクレオチド配列；
（ａ２）適切なプロモータ；
を含む：
（ｂ）ウイルス輸送ベクター、非ウイルス輸送ベクター、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される輸送ベクターを準備する工程：
（ｃ）生物学的ベクター（ｂ）をクローニングベクター（ａ）と接触させる工程：
を含む、ｍａｘ遺伝子含有生物学的ベクターを産生する方法からなる。
【００５５】
本発明の追加の目的は、生物学的ベクターを適切な細胞と接触させる工程を含む、細胞内にｍａｘ遺伝子を発現させる方法からなり、この際、前記生物学的ベクターは、
（ａ）クローニングベクター、この際、前記クローニングベクターは
（ａ１）ｍａｘ遺伝子またはそのフラグメントを発現できるヌクレオチド配列；
（ａ２）適切なプロモータ；
を含む：
（ｂ）ウイルス輸送ベクター、非ウイルス輸送ベクター、およびこれらの組み合わせを含む群から選択される輸送ベクター；
を含む。
【００５６】
ある実施形態において、生物学的ベクターは、薬学的に許容されるビヒクル中に存在し、前記薬学的に許容されるビヒクルは、薬学的に許容される賦形剤および担体を含む群から選択され、経口、非経口、静脈内、筋肉内、脳内、脳室内、眼内を含む一連の治療計画で表されうる特定の組成物の使用について、適当な投与量および治療が選択される。
【００５７】
ある実施形態において、前記高等動物、例えばヒトの細胞はニューロンである。
【００５８】
本発明の追加の目的は、ｍａｘ遺伝子含有生物学的ベクターを、少なくとも１つの標的細胞に導入する段階を含む遺伝子治療方法からなり、前記標的細胞におけるｍａｘ遺伝子の差次的発現が細胞活性の調節を促進しうる。
【００５９】
前記細胞活性の調節が細胞保護機能を有する。
【００６０】
前記細胞は、高等動物、例えばヒトの細胞はニューロンである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、輸送ベクターｐＴＲ−ＣＢＡ−ｍａｘの配列を示す。
【図２】図２は、輸送ベクターｐＴＲ−ＳＢｓｍＣＢＡ−ｍａｘの配列を示す。
【図３】図３は、輸送ベクターｐＨｐａ−ｔｒｓ−ＳＫ−ｍａｘの配列を示す。
【図４】図４は，ｒＡＡＶ−Ｍａｘによるｉｎ  ｖｉｖｏにおける神経保護のデータを示す。新生仔ラット（生後１日）の片目にｐＴＲ−ＣＢＡ−ｍａｘを投与し、もう一方の片目にｐＴＲ−ＣＢＡ−ＧＦＰを注射した。１４日後、前記動物を麻酔で安楽死させ、眼を除去し、網膜を解剖した。約１ｍｍ２の網膜組織の組織片を切り取り、５％ウシ胎仔血清の培地に３０時間静置した後、組織を４％パラホルムアルデヒドに固定した。網膜神経節細胞における細胞死率は、サンプル部分における細胞の総数に関連した、アポトーシスによる細胞死の指標となる、濃縮した核の割合（ヒストグラムにおける平均値および標準誤差）によって評価した。ｒＡＡＶ−Ｍａｘと形質導入された網膜の組織片は、コントロールのｒＡＡＶ−ＧＦＰと形質導入された組織片よりも約５０％細胞死率が低かった。Ｍａｘの発現の増加は、免疫組織化学手法によって確認され、ＧＦＰの発現は、コントロールのタンパク質の内在蛍光によって確認された。
【図５】図５は、ｒＡＡＶ−Ｍａｘによる、ｉｎ  ｖｉｖｏの神経保護のデータを示す。スキームに示されるように、ラットを４つの実験群に分類した。２つのグループには、生後１日後または６０日後のいずれかに、ｐＴＲ−ＣＢＡ−ｍａｘを片目に投与した。３つのグループには生後６０日後に（上記注射をした場合、注射した側を）視神経を損傷させ、４つのグループすべてを生後７４日後に麻酔で安楽死させた。４％のパラホルムアルデヒドに固定化させた後、眼を除去し、網膜全体をゼラチン化したガラススライドに水平にマウントして、固定化した組織を接着した。生細胞の核または細胞死の指標となる核濃縮の特性は、緑色蛍光でＤＮＡをラベルするＤＮＡ挿入剤のｓｙｔｏｘ  ｇｒｅｅｎで染色し、レーザー共焦点顕微鏡法で得られた顕微鏡写真で数えることによって、神経節細胞層を定量した。
【００６２】
総数を核（細胞）濃度に変換し、その結果、平均値および標準誤差の形態で示される。水平な破線は、アマクリン細胞（灰色）に置き換えた平均密度を示し、ラットの神経節細胞層に見られた。この際、神経節細胞（黒色）を評価するため、全数から差し引かれている。生後１日でｒＡＡＶ−ｍａｘで形質導入された網膜は、神経節細胞の死から防御された。生後１日で視神経を損傷させた形質導入した網膜は、ｐＴＲ−ＣＢＡ−ｍａｘベクターが介在するトランス遺伝子の発現に必要な時間（約１４日間）のため、有意な防御を示さなかった。
【図６】図６は、ｒＡＡＶ−Ｍａｘによるｉｎ  ｖｉｖｏの神経保護の他の実施例におけるデータを示す。スキームに示されるように、ラットを４つの実験群に分類した。生後１日のすべての動物に、ＲＧＣの細胞体へ軸索に沿って輸送される赤色蛍光マイクロスフェアの懸濁剤を上丘（ＲＧＣ軸索の投射標的）に頻回注射した。この手順は、中枢神経系における神経変性モデルを構成するニューロンのタイプを確実に同定に役立つ。３つのグループには、生後３０日後または６０日後のいずれかに、ｐＴＲ−ＣＢＡ−ｍａｘを片目に注射した。３つのグループには、生後６０日後に（上記注射をした場合、注射した側を）視神経を破砕によって損傷させ、４つのグループすべてを生後７４日後に麻酔で安楽死させた。４％のパラホルムアルデヒドに固定化させた後、眼を除去し、網膜全体を解剖し、固定化した組織を接着するためにゼラチン化したガラススライドに水平にマウントして調製した。ＲＧＣはマイクロスフェアでラベルした赤色によって同定される一方、神経節細胞層における細胞中の核はＤＮＡ挿入剤のｓｙｔｏｘ  ｇｒｅｅｎ（緑色）でラベルされる。共焦点顕微鏡法で得られた顕微鏡写真で数えることによって、ＲＧＣを定量した。総数を核（細胞）濃度に変換し、その結果、平均値および標準誤差の形態で示される。前と同じように、損傷前の３０日間のＲＧＣの形質導入により神経保護が生じた（Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ，未発表の結果）。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
下記に示す実施例は、本発明の技術的範囲を制限するものではなく、本発明を行うための多くの方法を例示するためのものである。
【００６４】
本明細書中において、「クローニングベクター」は、外因性ＤＮＡに挿入されうるＤＮＡフラグメントの遺伝子情報を増幅できるベクターであり、プラスミド、ウイルス、コスミド、および／またはＹＡＣｓを含む群から選択されうる。前記クローニングベクターは、細胞中のＤＮＡ配列の発現を促進できる配列であるプロモータを含む。前記プロモータは、ＣＢＡ、ＣＭＶ、および／またはハイブリッドＣＢＡ／ＣＭＶ、および／または例えば、ニューロン特異的プロモータのような標的細胞に特異的なプロモータを含む群から優先的に選択される。
【００６５】
本明細書中において、「輸送ベクター」は、クローニングベクターを含む標的細胞への遺伝子情報のキャリアであり、ウイルスおよび非ウイルス輸送ベクターを含む群から選択されうる。
【００６６】
本明細書中において、「ウイルス輸送ベクター」は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、泡沫状、ＨＩＶ、ワクシニアを含む群である。
【００６７】
本明細書中において、「非ウイルス輸送ベクター」は、ＤＮＡ−リン酸カルシウム、ＤＮＡ−ＤＥＡＥデキストラン、ＤＮＡ−脂質、ＤＮＡ−タンパク質、ＤＮＡ−脂質−タンパク質、人工染色体、ナノ粒子、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、プラスミドの投与、ＤＮＡのバリスティックインジェクションなどの、プラスミド、リポソーム、カチオン性脂質、タンパク質、およびアミドタンパク質化合物を含むものである。
【００６８】
本明細書中において、「生物学的ベクター」は、少なくとも１つの輸送ベクターが挿入されたクローニングベクターである。
【００６９】
本明細書中において、「薬学的に許容される」とは、当業者に周知の薬学的に許容される賦形剤およびキャリアであり、経口、非経口、静脈内、経鼻内、硝子体内、筋肉内、脳内、脳室内、眼内を含む一連の治療計画で表されうる特定の組成物、その投与および／またはその製剤を使用できる投与量および治療の開発でありうる。
【００７０】
本明細書において、「標的細胞」は、ｍａｘ遺伝子の発現によって利益を受けうる細胞である。このような細胞は、例えばニューロンのような高等動物の細胞を含む。
【００７１】
本明細書中において、「活性の調節」とは、ｍａｘ遺伝子またはサイレンシングのいずれかの過剰発現を目的とした、標的細胞におけるＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質のような要素の発現のいずれの調節、さらに標的細胞におけるｍａｘ遺伝子の発現の間および／または後の細胞の反応における、いずれの変化も含む。特に、調節は、ｍａｘ遺伝子の過剰発現の促進を目的とするものである。
【実施例】
【００７２】
実施例１−プラスミドの構築
ｍａｘ２１およびｍａｘ２２に対するｃＤＮＡｓはＲｏｂｅｒｔ  Ｎ．Ｅｉｓｅｎｍａｎ（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  −Ｓｅａｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）から提供された。
【００７３】
ｒＡＡＶメインプラスミドは、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｌｏｒｉｄａ−Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，Ｆｌｏｒｉｄａ，ＵＳＡ）から提供されたプラスミドｐＴＲ−ＵＦ１１を基に構築された。前記構築において、ＡＡＶ２  ＩＴＲｓ（逆方向末端配列）によって配置されたトランス遺伝子は、ＣＢＡ（チキンβ―アクチン）プロモータによって制御された発現を有し、３８１塩基対を有するＣＭＶ（サイトメガロウイルス）の前初期エンハンサー、および１３５２塩基対を有するチキン−β−アクチン−エクソン  １−イントロン１プロモータのハイブリッドである。この配列すべては、次いで、ＳＶ−４０ポリアデニル化が行われる。
【００７４】
ＣＢＡ−ＣＭＶの組み合わせは、網膜細胞、特に神経節細胞において、効率よく形質導入が生じる。しかしながら、プロモータおよびエンハンサーの組み合わせは、細胞タイプ、特にニューロンタイプにおける使用のために、本発明の技術的範囲内でいつかは改良されうる。
【００７５】
使用された手順は、制限されないが、例えば（ａ）ｐＴＲ−ＳＢ−ｓｍＣＢＡ、この際、ネオマイシン、その真核生物のプロモータＨＳＶ−ｔｋ、またはポリオーマウイルスのエンハンサーＰＹＦ４４１への耐菌性、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルの遺伝子配列のコードを含まず、プラスミド由来のベクターがヒト患者における臨床アッセイに使用できる、（ｂ）ＤＮＡ二重鎖を含むｒＡＡＶベクターであり、上述したベクターとは異なるｐＨｐａ−ｔｒｓ−ＳＫ、のような他のプラスミドに適用する。前記ベースベクターｐＨｐａは、Ｄｒ  Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ）からフロリダ大学のＤｒ．  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｈａｕｓｗｉｒｔｈへ授与されたものが、出願人のグループに提供された。そして、その構築は、ＤＮＡ二重鎖を含むベクターの形成、続く相補鎖の合成段階を相対的に遅いスキッピングによって、トランス遺伝子の発現の促進を狙ったものである。この場合、前記プロモータは、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）であるが、必要に応じて、本発明の技術的範囲内で他のプロモータに置き換えられうる。出願人の研究室では、最長７日間、本ベクターが網膜におけるトランス遺伝子を発現させ、前記トランス遺伝子発現の必要とする時間を５０％減少していることを示す実験を行った（Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ，未発表の結果）。
【００７６】
実施例２−ｐＴＲ−ＣＢＡ−ＭＡＸ２１プラスミドおよびＰＴＲ−ＣＢＡ−ＧＦＰプラスミドの構築
１ｐｆｕ（１．５Ｕ／５０μｌ反応）ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）に用いて、ＮｏｔＩ制限酵素で切断するためのコンセンサス配列を配置させたｍａｘクローンを発生させた。用いられたプライマーは、フォワード（５’−ｇｃｇｇｃｃｇｃａｔｇａｇｃｇａｔａａｃｇａｔ−３’）およびリバース（５’−ｇｃｇｇｃｃｇｃｔｔａｇｃｔｇｇｃｃｔｃｃａｔ−３’）である。発生したクローンをＴＯＰＯブリッジプラスミドに挿入し、次いで、前記手順およびＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ社）の試薬に従った。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）の遺伝子は、規定通りに実験コントロールとして使用され、ｐＢＩＩＳＫブリッジプラスミドにおけるＮｏｔＩ切断配列によって配置された。挿入物を含むプラスミドは、１Ｕ／μｇのＤＮＡ濃度を３７℃で１時間、ＮｏｔＩ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で分解させた。生じたフラグメントは、ＤＮＡ  ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、アガロースゲルで精製した。
【００７７】
ＮｏｔＩによって発生された凝集末端を有した時点で、クローンはｐＴＲ−ＵＦプラスミドに結合しており、また、ＮｏｔＩで分解される前に３７℃で３０分間、ＳＡＰ（エビ由来アルカリホスファターゼ−Ｐｒｏｍｅｇａ社，５Ｕ／μｇ  ＤＮＡ）を用いて脱リン酸化し、７５℃で１０分間不活性化させ、フェノール−フロロホルム（Ｓｉｇｍａ社）で精製し、並びに３倍容量の８０％エタノールおよび１０％容量の３Ｍ酢酸ナトリウムで沈殿させた。最終反応容量２０μｌにおいて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌ（２０，０００Ｕ／ｍｌ−Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、氷浴中、反応開始温度を１３℃、反応終了温度を２００℃として、終夜連結反応が行われた。連結生成物４μｌを用いて、エレクトロポレーション（２５μＦＤ，２００Ｏｈｍｓおよび１．２５Ｋｖｏｌｔｓ）によるエレクトロコンピテント細菌ｒｅｃＡ−およびｒｅｃＢ−（ＳＵＲＥ細胞−Ｉｎｂｉｔｒｏｇｅｎ社）５０μｌに形質導入させた。前記細菌を、インキュベータシェイカー中、２００ｒｐｍ、３７℃の条件で、抗生物質を含まないＬＢ培地（１％ＮａＣｌ，１％ペプトン，０．５％酵母エキス）でさらに１時間インキュベートし、次いで、ＬＢ寒天培地（１．５％寒天中，１％ＮａＣｌ，１％ペプトン，０．５％酵母エキス）に移し、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃、１４時間で成長させて、発生したコロニーを単離した。
【００７８】
抗生物質により選択されたコロニーを、インキュベータシェイカー中、２００ｒｐｍ、３７℃の条件で、アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌ中に１４時間成長させ、解析に十分なプラスミドを得た。懸濁液中の細菌は、Ｗｉｚａｒｄ−ｐｌｕｓ  ｍｉｎｉ−ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてプラスミドの精製に用いられた。前記プラスミドは、ｐＴＲ−ＵＦプラスミド：フォワード（５’−ｔｃｔｔｔｔｔｃｃｔａｃａｇｃｔｃｃｔｇｇｇｃａａ−３’）およびリバース（５’−ｇｃａｔｔｃｔａｇｔｔｇｔｇｇｔｔｔｇｔｃｃａａａ−３’）の配列のプライマーを用いて、ＤＮＡ配列を通じた、クローンの存在および方向性について解析された。前記プラスミドはまた、ＤＮＡの濃度が１Ｕ／μｇ、室温、１時間でＳｍａＩ制限酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社）により分解され、クローンの存在、その方向性、および繰り返し配列であるＩＴＲｓが、長期間の培養中に細菌から容易にプラスミドが除かれることが確認された。
【００７９】
実施例３−プラスミドの調製
ウイルスベクターの効率的な調製に必要とされる大規模形質導入には、高度に精製されたメインプラスミドおよびヘルパーｐＤＧプラスミドの両方を大量に必要とする。上述したように、ヘルパープラスミドは、パッケージングおよびパッケージング工程のヘルパーウイルスとしてのアデノウイルスの存在を回避するために必要とされる最小配列のみを含む。
【００８０】
実施例３．１−ＭＡＸＩ−ＰＲＥＰ
関連の構築物を含む細菌のコロニーを、インキュベータシェイカー中、２００ｒｐｍ、３７℃の条件で、アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌの懸濁液中で５時間成長させ、次いで、１０％ＫＨＰＯ緩衝液および０．１％アンピシリンを含むＴＢ培地（１．２％トリプトン，２．４％酵母および０．４％グリセロール）１Ｌに移し、３７℃でプレインキュベートした。ＬＢ培地中のコロニーは、３７℃、シェイカー中でさらに１４時間静置した。前記培地を、ＪＡ−１０  ｒｏｔｏｒを用いて４，０００ｒｐｍで遠心分離して、細菌を沈殿させた。遠心分離した培地のそれぞれ２５０ｍｌに対して、２０ｍｌの再懸濁溶液（５０ｍＭトリス−塩酸，ｐＨ８．０，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，２０μｇ／ｍｌ  ＲＮＡｓｅ）をペレットに添加し、後者をピペットで分離した。次いであらかじめ調製した溶解液２０ｍｌ（０．２Ｎ  ＮａＯＨ，ＳＤＳ  １％（ｗ／ｖ））を添加した。前記混合物を振とうし、室温で５分間インキュベートした。最後に、振とうしながら２０ｍｌの中和溶液（３Ｍ酢酸カリウム，２８．７％酢酸（ｗ／ｖ））を添加した。前記混合物を氷上に１０分間静置し、次いでＪＡ−１０  ｒｏｔｏｒを用いて８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を集め、０．６容量のイソプロパノールを添加、混合して、氷上に少なくとも２０分間インキュベートした。次に、前記混合物を、ＪＡ−１０  ｒｏｔｏｒを用いて、１０，０００ｒｐｍで２０分間スピンさせた。前記上清を捨て、ペレットを１０ｍｌの８０％エタノールで洗浄し、室温で乾燥するまで静置させた。
【００８１】
実施例３．２−塩化セシウム密度勾配による精製
前記乾燥ペレットを、ピペットを用いて１０ｍｌのＴＥ（１００ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．６，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０）に慎重に溶解した。次に、１ｇの塩化セシウムを溶液１ｍｌにそれぞれ添加した。前記混合物を超遠心分離機用チューブ（２５．４×８９．１ｍｍ，Ｑｕｉｃｋ−Ｓｅａｌ−Ｂｅｃｋｍａｎ社）に移し、１００μｌの臭化エチジウム（７４０μｇ／ｍｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した。前記チューブを封じ、Ｖｔｉ−６５  ｒｏｔｏｒを用いて４５，０００ｒｐｍで終夜遠心分離した。遠心分離後、臭化エチジウムで染色したチューブにおける一番下のバンドをシリンジおよび＃１８ニードルで除去した。前記ＤＮＡを、飽和ブタノール水溶液を用いて３度洗浄した。ＤＮＡの最初の容量の２．５倍量の水を添加し、全量の２倍量のエタノールを添加し、混合物を氷上にインキュベートした後、ＪＡ−１０  ｒｏｔｏｒを用いて、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を捨てた後、パレットを８０％エタノールで洗浄して、室温で乾燥させ、水で再懸濁させた。
【００８２】
実施例４−プラスミドの投与量
ＤＮＡ濃度を、分光光度計を用いて、ＵＶ（紫外線光）吸収により測定した。ＤＮＡ５μｌを９９５μｌの水に添加し、２６０ｎｍの励起における光学濃度を読んだ。サンプルの純度を解析するため、２８０ｎｍの励起における第２の測定を行った。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける２つの測定値の比率を決定した。前記比率が２〜１．５の範囲の場合、プラスミドがトランスフェクションに用いられうる。１．５以下の場合には、さらに精製する必要がある。
【００８３】
実施例５−細胞培養
ヒト胎児由来腎臓細胞株（ＨＥＫ−２９３）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ−Ｇｉｂｃｏ社）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ（Ｇｉｂｃｏ社）、および１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）を添加した完全ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）（Ｇｉｂｃｏ社）に保持した。前記培養を５％ＣＯ２、および３７℃でインキュベータに保持した。前記細胞を、洗浄用ＰＢＳおよび０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭＥＤＴＡ含有ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ社）を用いて、３日ごとに１〜３の培養フラスコを通過させ、細胞を分離した。１つの大規模トランスフェクションが、調製したそれぞれのベクターに行われた。いずれのトランスフェクションにおいて、１０の棚を有する６，３２０ｃｍ２の細胞工場（ＮＵＮＣ）が用いられた。トランスフェクションの前日に、１〜３の細胞工場を通過させたため、トランスフェクション当日に、添加した合計１×１０９の細胞は７５−８０％が集密的であった。
【００８４】
実施例６−トランスフェクション
トランスフェクションは、リン酸カルシウムを用いた沈殿によって行われた。ヘルパープラスミドｐＤＧ１．８ｍｇ、メインプラスミド０．６ｍｇの混合物を０．２５Ｍ  ＣａＣｌ２の５０ｍｌにおいてＤＮＡのモル比が１：１となるように作製し、さらに２×５０ｍｌＨＢＳ、ｐＨ７．０５（２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ遊離酸、１．４ＭＮａＣｌ、および１４ｍＭ  Ｎａ２ＰＯ４）を添加した。前記２×ＨＢＳ溶液を最後に添加した。前記混合物を室温で１−２分インキュベートし、次いで完全培地１１００ｍｌを添加した。前記細胞培地を除去し、新たな培地を添加した。前記細胞を７２時間インキュベートした。前記時間の最後に、培養培地を捨て、細胞をＰＢＳで洗浄し、５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ中に分離した。次に、前記細胞を１０−１５分間１，０００ｇで遠心分離し、上清を捨て、パレットを溶解緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭトリス−塩酸，ｐＨ８．４）６０ｍｌに再懸濁させ、−２０℃でベクターの精製までストックした。
【００８５】
実施例７−ウイルスベクターの精製
実施例７．１−細胞溶解およびイオジキサノール勾配
細胞を、エタノール／ドライアイスで３サイクル凍結させて溶解させ、３７℃で溶かした。ベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度５０Ｕ／ｍｌで添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。前記溶解物質を、４，０００ｇで２０分間遠心分離して、ウイルスベクターを含む上清をイオジキサノール（５，５’−［（２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジイル）ビス（アセチル−１，３−ベンゼンカルボキサミド）］）（ＯｐｔｉＰｒｅｐ−Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ社）の４つの勾配に分割した。イオジキサノールは、密度勾配を形成するための非イオン性の培地であり、すべてに密度において等浸透圧性を保持し、ウイルスベクターの精製の効率が向上し、塩化セシウムまたはスクロースにおける感染性および毒性の喪失を回避する（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，１９９９）。ｒＡＡＶの密度は約１，２６６ｇ／ｍｌであり、５０％イオジキサノール５０％と等しい。よって、細胞溶解物の最小密度１５ｍｌ、次いでをＰＢＳ−ＭＫ（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２．５ｍＭ  ＫＣｌを含むＰＢＳ）中１５％イオジキサノール（Ｓｉｇｍａ社）１５ｍｌ、２５％イオジキサノール１５ｍｌ、４０％イオジキサノール１５ｍｌ、最後に６５％イオジキサノール１５ｍｌ中に静置することで、非連続勾配がチューブ（２８，８×１０７．７ｍｍ，Ｑｕｉｃｋ−ｓｅａｌ−Ｂｅｃｋｍａｎ社）中で発生する。前記チューブを封じ、７０Ｔｉ  ｒｏｔｏｒを用いて、６９，０００ｒｐｍ（３５０，０００ｇ）、１８℃で１時間遠心分離した。シリンジの＃１８ニードルを用いて、４０％および６０％間の接触面から、約５ｍｌを吸引した。この物質を続くクロマトグラフィのために４℃で保存または凍結させた。
【００８６】
実施例７．２−クロマトグラフィ
イオジキサノール勾配で得られたフラクションを、次にカラムクロマトグラフィで精製および濃縮した。ＦＰＬＣ  ＡＫＴＡシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）において、５ｍｌ／ｍｉｎで５ｍｌヘパリンＨｉＴｒａｐイオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）が用いられ、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含むＰＢＳ−ＭＫで溶出させた。前記カラムは、５ｍｌ／ｍｉｎではじめに２５ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭトリス−塩酸，１５ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．５）、次いで２５ｍｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭトリス−塩酸，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．５）、さらに２５ｍｌの緩衝液Ａで平衡化させた。前記イオジキサノールベクターのフラクションを緩衝液Ａで１：１に希釈し、３−５ｍｌ／ｍｉｎの流速で前記カラムに適用した。サンプルをＨｉＴｒａｐカラムに流した後、５０ｍｌの緩衝液Ａで洗浄した。前記ベクターを緩衝液Ｂで溶出し、１ｍｌのフラクション約５０個に分画させ、ベクターを含む前記フラクションを集めた。次に、ベクターを濃縮し、Ｂｉｏｍａｘ  １００Ｋ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）で脱塩化させて、微小真菌中、最大１４，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離を３サイクルさせた。それぞれのサイクルにおいて、ウイルスを１ｍｌに濃縮し、次いで乳酸リンゲル液を１０ｍｌ添加した。ｒＡＡＶベクターは−８０℃でストックした。
【００８７】
実施例８−ｒＡＡＶタンパク質の解析
実施例８．１−タンパク質の抽出
それぞれストックした１５μｌを、５分間煮沸したサンプル緩衝液（トリス−塩酸０．５Ｍ  ｐＨ６．８およびブロモフェノールブルー中に４５％グリセロール１００％，５％２−β−メルカプト−エタノール，２％ＳＤＳを含む）に混合し、１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に適用した。
【００８８】
実施例８．２−銀染色
ベクターのストックを精製するために、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｋｉｔを用いて、銀染色したポリアクリルアミドゲル中の前タンパク質を解析した。
【００８９】
実施例９−滴定
前記精製したベクターのストックをＤＮＡｓｅ  Ｉで処理し、汚染物質を含まないＤＮＡを分解した。精製したベクターのストック１０μｌを、反応混合物（５０ｍＭトリス−塩酸，ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）１００μｌ中１０ＵのＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を用いて、３７℃で１時間インキュベートした。反応の終わりに、プロテインキナーゼＫ緩衝液（１０ｍＭトリス−塩酸，ｐＨ８．０，１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳ）１０μｌ×１０を添加し、次いでプロテインキナーゼＫ（１８．６ｍｇ／ｍｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）１μｌを添加した。前記混合物を４２℃で１時間インキュベートした。ウイルスＤＮＡを、フェノール／クロロホルムを用いた２つの抽出液、次いで、クロロホルムを用いた１つの抽出液、キャリアとして１０μｇのグリコーゲンを用いて、−２０℃で終夜エタノールを用いた沈殿物に精製した。次に、前記混合物を、微小真菌中、最大１４，０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心分離した。沈殿したＤＮＡを１００μｌの水で再懸濁させた。ＰＣＲ用の各反応混合物は、トランス遺伝子含有ベクターとは明らかに異なるが、既知濃度を有するウイルスベクターの産生に用いられるメインプラスミドでありうる、一般的なプラスミドの２連続希釈で希釈されたウイルスＤＮＡを１μｌ有する。前記一般的に最適な速度は１から１００ｐｇの範囲内にあり、他に用いられる希釈は、１、１０、５０および１００ｐｇの発現速度と同等である。用いられたプライマーは、トランス遺伝子挿入の上流および下流にすぐ接した配列を参照する：フォワード（５’−  ａｇｔｔａｔｔａａｔａｇｔａａｔｃａａｔｔａ−３’）およびリバース（５’−ａｔｃｃｔｔｔｃａｇｇｇｔａｔｔｃｃａｇｔａ−３’）。各反応生成物は、０．５μｌ／ｍｌの臭化エチジウムを含む、２％アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）ゲルで解析した。２つのバンドまで行われる電気泳動で分解され、比較が可能となるバンドの画像は、ＩｍａｇｅＳｔｏｒｅ  ７５００  ＵＶＰシステム（ＢｉｏＲａｄ社）を用いて得た。各バンドの密度は、画像解析ソフトウェア（ＺＥＲＯ−Ｄｓｃａｎ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ１．０−Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ社）を用いて測定された。標準ＤＮＡに対する濃度の機能に対して比率がプロットされた。ウイルスベクターストックの濃度は、ウイルスＤＮＡおよび標準ＤＮＡの等しい分子数に対応する。
【００９０】
実施例１０−ベクターｐＴＲ−ＣＢＡ−ｍａｘ（図１）：構築された血清型２ｒＡＡＶベースベクター（ｐＴＲ）は、いずれの細胞タイプにおいて、ｍａｘ遺伝子の発現を促進できる、選択されたネオマイシン耐性遺伝子およびＣＢＡ（チキンベータ−アクチン）ジェネラルプロモータを含む。ＡＡＶ由来のベクターは、発現工程が相対的に遅く、トランスフェクションの後、トランス遺伝子の発現が最大約１４日間に達する。前記ｐＴＲ−ＣＢＡ−ｍａｘベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方において、軸索のトランスフェクション後の網膜神経節細胞の細胞死への感度が減少している。
【００９１】
実施例１０．１−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験における、軸索のトランスフェクション後の網膜神経節細胞の細胞死への感度
神経節細胞におけるＭａｘの形質導入：新生仔ラット（生後１日）の片目にｈｔｅ  ｐＴＲ−ＣＢＡ−ｍａｘを注射した。１４日後、動物を麻酔で安楽死させ、眼を除去してリン酸緩衝液中４％パラホルムアルデヒドに浸して固定した。前記眼を、クライオスタットおよび１０マイクロメートルの切片に切り取り、免疫組織化学用にガラススライドにマウントした。前記Ｍａｘタンパク質は、特異的抗体との反応、続く第２抗体による赤色蛍光の発生により検出された。ＲＧＣでラベルされたクラスＩＩＩのベータ−チューブリンの前記タンパク質は、特異的抗体との反応、続く第２抗体による緑色蛍光の発生により検出された。レーザー共焦点顕微鏡により顕微鏡写真を得た。Ｍａｘタンパク質含量は、ｐＴＲ−ＣＢＡ−ｍａｘベクター（ｍｏｄ．ｆｒｏｍ  Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ，２００５）でトランスフェクトされたＲＧＣ中で明らかに増大した。
【００９２】
ｒＡＡＶ−Ｍａｘによるｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける神経保護：新生仔ラット（生後１日）の片目にｐＴＲ−ＣＢＡ−ｍａｘを、もう一方の片目にｐＴＲ−ＣＢＡ−ＧＦＰ（コントロール）を注射した。１４日後、動物を麻酔で安楽死させ、眼を除去して、網膜を解剖した。約１ｍｍ２の網膜組織の組織片を切り取り、５％ウシ胎仔血清の培地に３０時間保持した後、前記組織を４％パラホルムアルデヒドで固定した。神経節細胞の細胞死率は、サンプル中の全細胞数に対する（ヒストグラムにおける平均値および標準誤差）、アポトーシスの細胞死を示す濃縮核の百分率で評価された。前記ｒＡＡＶ−ｍａｘで形質導入された網膜は、コントロールのｒＡＡＶ−ＧＦＰで形質導入した組織片よりも、約５０％低い細胞死の比率を示した（図４）。Ｍａｘの発現の増加は、免疫組織化学的手法により確認され、一方ＧＦＰの発現は、後者のタンパク質の内在蛍光により確認された（Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ，未公表の結果）。
【００９３】
実施例１０．２−ｉｎ  ｖｉｖｏ実験における、軸索のトランスフェクション後の網膜神経節細胞の細胞死への感度
ｒＡＡＶ−ｍａｘによるｉｎ  ｖｉｖｏの神経保護：図５のスキームに示されるように、ラットを４つの実験グループに分類した。２つのグループには、生後１日または生後６０日に、片目にｐＴＲ−ＣＢＡ−ｍａｘを注射した。３つのグループには、生後６０日に（上記注射をした場合、注射した側を）視神経を損傷させ、４つのグループを生後７４日に麻酔で安楽死させた。次いで、４％パラホルムアルデヒドで固定し、眼を除去し、全網膜を固定化した組織を接着させるために、ゼラチン化させたガラススライドに水平にマウントした。死細胞を示す生細胞の核および濃縮核は、緑色蛍光でＤＮＡをラベルするＤＮＡ挿入剤のｓｙｔｏｘ  ｇｒｅｅｎで染色させ、レーザー共焦点顕微鏡により得た顕微鏡写真の神経節層を数えることによって定量した。数は核（細胞）密度に変換され、その結果は、平均値および標準誤差の形で示される。平行の破線は、ラットの神経節細胞で見られたアマクリン細胞（灰色）に置き換えた密度を示しており、神経節細胞（黒色）の密度を評価するため、総数から差し引かれている。生後１日にｒＡＡＶ−ｍａｘで形質導入された網膜は、神経節細胞の死から保護された。同日に視神経をも損傷させた、形質導入された網膜は、ｐＴＲ−ＣＢＡ−ｍａｘベクターからトランス遺伝子が運ばれたトランス遺伝子の発現に時間（約１４日）が必要とされたため、有意な保護作用を示さなかった（Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ，未公表の結果）。
【００９４】
ｒＡＡＶ−ｍａｘによるｉｎ  ｖｉｔｒｏの神経保護：図６のスキームに示されるように、ラットを４つの実験グループに分類した。生後１日に、すべての動物の上丘（ＲＧＣ軸索の投射標的）に、赤色蛍光性マイクロスフェアを頻回投与し、軸索に沿ってＲＧＣの細胞体に移動した。この手順は、中枢神経系の神経変性のモデルとなる、このタイプのニューロンを確実に同定するのに役立つ。３つのグループには、生後３０日および生後６０日に、片目にｐＲＴ−ＣＢＡ−ｍａｘを注射した。３つのグループには、生後６０日に、圧迫して（上記注射をした場合、注射した側を）視神経を損傷させ、４つすべてのグループを、生後７４日に麻酔で安楽死させた。次いで、４％パラホルムアルデヒドで固定し、眼を除去し、全網膜を固定化した組織を接着させるために、ゼラチン化させたガラススライドに水平にマウントした。前記ＲＧＣはマイクロスフェアを用いて赤色でラベルさせて同定し、一方、神経節細胞層の細胞のすべての核は、ＤＮＡ挿入剤のｓｙｔｏｘ  ｇｒｅｅｎ（緑色）でラベルさせた。前記ＲＧＣは、レーザー共焦点顕微鏡により得た顕微鏡写真を数えることによって定量した。数は核（細胞）密度に変換され、その結果は、平均値および標準誤差の形で示される。再び、損傷前の３０日にＲＧＣの形質導入では、神経保護を生じた（Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ，未公表の結果）。
【００９５】
実施例１１−ベクターｐＴＲ−ＳＢ−ｓｍＣＢＡ−ｍａｘ（図２）：デザイン１で用いられた、ベースベクターと同様の、構築された血清型２ｒＡＡＶベースベクター（ｐＴＲ）。本ベクターは、ネオマイシン耐菌性遺伝子、その真核性ＨＳＶ−ｔｋプロモータ、ＰＹＦ４４１ポリマーウイルスエンハンサ、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをコードする配列の欠失配列を有する。これらの変異では、トランス遺伝子発現の速度は変わらず、神経系のベクターの分布も変化しない。しかしながら、この変化は、前記ベクターをヒト臨床アッセイに適したものにする。
【００９６】
実施例１２−ベクターｐＨｐａ−ｔｒｓ−ＳＫ−ｍａｘ（図３）：上述したベクターとは異なる、構築された血清型２ｓｃ  ＡＡＶベースベクター（ｐＨｐａ）。前記ｐＨｐａベースベクターはフロリダ大学のＷｉｌｌｉａｍ  Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ博士らのグループで修飾されたものであり、二重らせん構造の形成によってトランス遺伝子の発現を促進し、このため相対的に遅い相補鎖の合成段階をスキップする。この場合、プロモータはＣＭＶ（サイトメガロウイルス）である。このベクターのタイプは、トランス遺伝子を最高で７日で発現する、すなわち、トランス遺伝子の発現に必要な時間が５０％まで短くなる。出願人の研究室で行われた試験では、網膜組織でこのベクターを形質導入させたＧＦＰトランス遺伝子の発現の促進が確認された（Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ，未公表の結果）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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