(57)【要約】本発明は、１つの実施形態において、患者における緑内障または高ＩＯＰを処置するための方法に関し、その方法は、ＰＡＩ−１発現またはＰＡＩ−１活性を阻害する薬剤を含む有効量の組成物を患者に投与する工程を包含する。本発明の別の実施形態は、ＰＡＩ−１関連の眼球障害を処置する必要のある被験体においてそれを処置する方法であり、その方法は、ＰＡＩ−１の活性または発現を阻害する薬剤を含む有効量の組成物を患者に投与する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における緑内障または高ＩＯＰを処置するための方法であって：
ＰＡＩ−１の発現または活性を阻害する薬剤を含む有効量の組成物を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記薬剤が：
チプラクスチニン、ジアプラシニン、アレプラシニン、フェンドサール、ＺＫ４０４４、ＷＡＹ−１４０３１２、Ｔ−６８６、Ｔ−２６３９、Ｓ−３５２２５、ＳＫ−２１６、ＳＫ−１１６、ＳＢ２０２１９０、Ｕ０１２６、ＨＰ−１２９、ＳＰ６００１２５、ＸＲ５９６７、ＸＲ３３４、ＸＲ３３０、ＸＲ５１１８、化合物３９、ビスインドリルマレイミドＩ、ロットレリン、ＳＢ４３１５４２、ＳＩＳ３、スタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ＰＡＩ−１抗体、ＰＡＩ−１タンパク質インヒビター、パイオニン−４およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤が：
アレプラシニン、フェンドサール、Ｔ−２６３９、Ｓ−３５２２５、ＳＫ−２１６、ＳＫ−１１６、ＳＢ２０２１９０、Ｕ０１２６、ＳＰ６００１２５、化合物３９、ビスインドリルマレイミドＩ、ロットレリン、ＳＢ４３１５４２、ＳＩＳ３、スタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ＰＡＩ−１抗体、ＰＡＩ−１タンパク質インヒビター、パイオニン−４およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤が：
チプラクスチニン、ジアプラシニン、ビスインドリルマレイミドＩ、Ｔ−２６３９、化合物３９およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記阻害が、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）の活性のＰＡＩ−１阻害を妨害する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が：
眼科学的に許容可能な保存剤、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、ゲル化剤、疎水性基剤、ビヒクル、緩衝剤、塩化ナトリウム、水およびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
β−遮断薬、プロスタグランジンアナログ、炭酸脱水酵素インヒビター、α２アゴニスト、縮瞳薬、神経保護薬、ｒｈｏキナーゼインヒビターおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を、前記組成物の一部としてか、または別個の投与のいずれかとして投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、約０．０１重量／体積パーセントから約５重量／体積パーセントの前記薬剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、約０．２５重量／体積パーセントから約２重量／体積パーセントの前記薬剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＡＩ−１関連眼球障害を処置する必要のある被験体においてＰＡＩ−１関連眼球障害を処置する方法であって：
ＰＡＩ−１の活性または発現を阻害する薬剤を含む有効量の組成物を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
前記障害が、高眼圧症または緑内障である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記薬剤が：
チプラクスチニン、ジアプラシニン、アレプラシニン、フェンドサール、ＺＫ４０４４、ＷＡＹ−１４０３１２、Ｔ−６８６、Ｔ−２６３９、Ｓ−３５２２５、ＳＫ−２１６、ＳＫ−１１６、ＳＢ２０２１９０、Ｕ０１２６、ＨＰ−１２９、ＳＰ６００１２５、ＸＲ５９６７、ＸＲ３３４、ＸＲ３３０、ＸＲ５１１８、化合物３９、ビスインドリルマレイミドＩ、ロットレリン、ＳＢ４３１５４２、ＳＩＳ３、スタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ＰＡＩ−１抗体、ＰＡＩ−１タンパク質インヒビター、パイオニン−４およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記薬剤が：
アレプラシニン、フェンドサール、Ｔ−２６３９、Ｓ−３５２２５、ＳＫ−２１６、ＳＫ−１１６、ＳＢ２０２１９０、Ｕ０１２６、ＳＰ６００１２５、化合物３９、ビスインドリルマレイミドＩ、ロットレリン、ＳＢ４３１５４２、ＳＩＳ３、スタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ＰＡＩ−１抗体、ＰＡＩ−１タンパク質インヒビター、パイオニン−４およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が：
チプラクスチニン、ジアプラシニン、ビスインドリルマレイミドＩ、Ｔ−２６３９、化合物３９およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記阻害が、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）の活性のＰＡＩ−１阻害を妨げる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が：
眼科学的に許容可能な保存剤、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、ゲル化剤、疎水性基剤、ビヒクル、緩衝剤、塩化ナトリウム、水およびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
β−遮断薬、プロスタグランジンアナログ、炭酸脱水酵素インヒビター、α２アゴニスト、縮瞳薬、神経保護薬、ｒｈｏキナーゼインヒビターおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物を、前記組成物の一部としてか、または別個の投与のいずれかとして投与する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、約０．０１重量／体積パーセントから約５重量／体積パーセントの前記薬剤を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、約０．２５重量／体積パーセントから約２重量／体積パーセントの前記薬剤を含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願との相互参照）
本出願は、２００７年１０月３１日に出願された、米国特許出願第１１／９３１，３９３号の同時継続出願の一部継続出願であり、米国特許法§１２０に基づき、その優先権を主張する。この米国特許出願の内容は参照により本明細書中に援用される。本出願はまた、２００８年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０４８，１７６号に対する優先権を米国特許法§１１９に基づき主張し、この仮特許出願の内容は、参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、概して、眼球障害に対する処置、より詳細には、ＰＡＩ−１の発現または活性のダウンレギュレーションを介してＩＯＰを低下させる薬剤および／または緑内障を処置するかもしくは予防する薬剤の使用（それによって、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）および／またはウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）の活性のＰＡＩ媒介性阻害が改善される）に関する。
【背景技術】
【０００３】
(発明の背景)
原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）は、処置されずに放置されると進行性の視野喪失を引き起こす、罹患頻度が高く被害の大きい眼疾患である。緑内障患者の大部分は、高い眼内圧（ＩＯＰ）を示し、現在の多くの処置は、ＩＯＰ上昇を低下させることまたは正常なＩＯＰを維持することに向けられている。
【０００４】
高レベルのプラスミノゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）は、癌、肥満症および糖尿病をはじめとした種々の疾患状態に関与するとみられる。高レベルのＰＡＩ−１は、緑内障患者の房水中で検出されている（Ｄａｎら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２３：２２０−２２４，２００５）。ＰＡＩ−１レベルは、他の内因性刺激の中でもサイトカインＴＧＦβ（Ｂｉｎｄｅｒら、Ｎｅｗｓ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１７：５６−６１，２００２）によって上昇する。ＰＡＩ−１は、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）およびウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）の両方の活性を阻害する。ｔ−ＰＡとｕ−ＰＡの両方は、プラスミノゲンを線維素溶解カスケードにおける重要な中間体であるプラスミンに変換することを触媒する（Ｗｕら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，Ｖｏｌ．２：２７−４２，２００２）。プラスミンは、ある特定のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）を、それらの活性な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分解型に変換することを促進すると知られている（Ｈｅら、ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．８６：２６３２−２６３６，１９８９）。ＰＡＩ−１は、接着レセプターとして作用する細胞表面インテグリンと、ＥＣＭの構成要素であるビトロネクチンとの会合も調節する（Ｚｈｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１０（７）：５４１−５４４，２００３）。したがって、ＰＡＩ−１は、非眼球組織における接着の低下と細胞の剥離の増加の両方に関連している。ヒト眼球組織も、ｔ−ＰＡおよび／またはｕ−ＰＡを様々な程度で発現する；しかしながら、線維柱帯（ＴＭ）が主にｔ−ＰＡを発現すると報告されている（非特許文献１；非特許文献２）。また、ｔ−ＰＡは、ヒト房水（ＡＨ）中に存在する優勢な形態であるとみられる。
【０００５】
ＩＯＰの低下および／またはＰＯＡＧの処置に有効であると証明された薬物治療としては、房水生成を減少させる薬剤と房水流出率を増加させる薬剤の両方が挙げられる。そのような治療は、通常、可能性のある２つの経路；局所的（眼への直接的な適用）または経口的のうちの１つによって投与される。しかしながら、薬学的な眼圧低下アプローチは、様々な望ましくない副作用を示す。例えば、ピロカルピンなどの縮瞳薬は、視界のぼやけ、頭痛および他の負の視覚的副作用を引き起こし得る。全身投与される炭酸脱水酵素インヒビターは、悪心、消化不良、疲労および代謝性アシドーシスも引き起こし得る。ある特定のプロスタグランジンは、充血、眼のかゆみ、ならびに睫毛および眼周囲皮膚の黒ずみを引き起こす。そのような負の副作用は、患者の服薬遵守の低下または治療の終了に導くことがあり、視力が悪化し続ける。さらに、既存のある特定の緑内障治療法で処置されても全く十分に反応しない個体が存在する。ゆえに、緑内障および高眼圧症などの眼球障害を処置するための他の治療薬が必要とされている。
【０００６】
２００６年１２月１５日に出願され、特許文献１として公開された米国特許出願番号第１１／９３１，３９３号は、線維柱帯細胞の喪失を予防する手段、究極的には、眼内圧を低下させる手段として、ビトロネクチンに対するＰＡＩ−１の結合を制御する薬剤の潜在的な使用が開示している。本発明は、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）および／またはウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）に対するＰＡＩ−１の効果の阻害に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許公開第２００８／０１０７６４４号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｈｕｍａｎら、ＩＯＶＳ，Ｖｏｌ．２９：４０１−４０５，１９８８
【非特許文献２】Ｔｒｉｐａｔｈｉら、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．５１：５４５−５５２，１９９０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の簡単な要旨）
本発明の実施形態は、ＰＡＩ−１の発現または活性を阻害することにより、眼球疾患を処置することおよび／またはＩＯＰを低下させることに関する。１つの実施形態は、患者における緑内障または高ＩＯＰを処置するための方法を提供し、その方法は、ＰＡＩ−１発現を阻害する薬剤またはＰＡＩ−１が組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）もしくはウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ｕ−ＰＡ）の活性を阻害することを妨げる薬剤を含む有効量の組成物を患者に投与する工程を包含する。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、ＰＡＩ−１関連の眼球障害を処置する方法であり、その方法は、ＰＡＩ−１発現および／またはｔ−ＰＡもしくはｕ−ＰＡの活性に対するＰＡＩ−１の効果を阻害する薬剤を含む有効量の組成物を投与する工程を包含する。
【００１１】
ある特定のこれらの実施形態において、その薬剤は、チプラクスチニン（ｔｉｐｌａｘｔｉｎｉｎ）（ＰＡＩ−０３９）、ジアプラシニン（ｄｉａｐｌａｓｉｎｉｎ）（ＰＡＩ−７４９）、ＺＫ−４０４４、ＷＡＹ−１４０３１２、ＨＰ−１２９、Ｔ−６８６、ＸＲ５９６７、ＸＲ３３４、ＸＲ３３０、ＸＲ５１１８、アレプラシニン（ａｌｅｐｌａｓｉｎｉｎ）（ＰＡＺ−４１７）、Ｔ−２６３９、Ｓ３５２２５、ＳＫ２１６、ＳＫ１１６、２−［２−メトキシ−６−［［［３−（トリフルオロメチル）−４−［４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−１−ピペラジニル］フェニル］アミノ］メチル］フェノキシ］−５−ニトロ安息香酸（本明細書中で「化合物３９」とも呼ばれる；Ｙｅら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４（３）：７６１−７６５，２００４）およびそれらの組み合わせである。他の実施形態は、ＳＢ２０２１９０、Ｕ０１２６、ＳＰ６００１２５、ビスインドリルマレイミドＩ、ロットレリン（ｒｏｔｔｌｅｒｉｎ）、ＳＢ４３１５４２およびＳＩＳ３などの薬剤を使用し得る。なおも他の実施形態では、スタチン剤（例えば、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン）が薬剤として使用され得る。ＰＡＩ−１抗体およびペプチド模倣物もまた、ある特定の実施形態において使用され得る。そのような薬剤の組み合わせもまた企図される。
【００１２】
なおも別の実施形態は、緑内障または高ＩＯＰに対する処置として使用される化合物を製造する方法であり、その方法は、ＰＡＩ−１の発現または活性を阻害するとみられる候補物質を提供する工程、緑内障または高ＰＡＩ−１に苦しんでいる被験体の線維柱帯において、その候補物質がＰＡＩ−１の量を、その候補物質の活性なコンフォメーションで減少させる能力を評価することによって化合物を選択する工程、および選択された化合物を製造する工程を包含する。
【００１３】
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、眼科学的に許容可能な保存剤、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、ゲル化剤、疎水性基剤、ビヒクル、緩衝剤、塩化ナトリウム、水およびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物をさらに含む。
【００１４】
なおも他の実施形態において、β−遮断薬、プロスタグランジンアナログ、炭酸脱水酵素インヒビター、α２アゴニスト、縮瞳薬、神経保護薬、ｒｈｏキナーゼインヒビターおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される化合物が、組成物の一部として、または別個の投与として、投与され得る。
【００１５】
前述の簡単な要約は、本発明のある特定の実施形態の特徴および技術的優位性を大まかに記載している。追加の特徴および技術的優位性は、以下の発明の詳細な説明に記載される。本発明に特有であると考えられる新規特徴は、任意の添付の図面と関連して考えると、発明の詳細な説明からより十分に理解されるだろう。しかしながら、本明細書中に提供される図面は、本発明の説明を助けるか、または本発明の理解を発展させることを補助するために意図されるものであり、本発明の範囲の定義であると意図されるものではない。
【００１６】
添付の図面とともに以下の説明を参照することによって、本発明およびその利点のより完全な理解が得られることがある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ヒト線維柱帯（ＧＴＭ−３）細胞上清中のＰＡＩ−１レベルに対するＴＧＦβ２の濃度依存的効果（２４ｈ）を示している実験結果のグラフである。データは、平均およびＳＥＭ，ｎ＝３として表されている。＊１元配置分散分析の後のダネット検定による対応するビヒクル群に対してｐ＜０．０５。
【図２】図２は、様々な時間にわたるＴＧＦβ２（５ｎｇ／ｍＬ）による処理ありまたは処理なしのＧＴＭ−３細胞上清中のＰＡＩ−１レベルを示している実験結果のグラフである。データは、平均およびＳＥＭ，ｎ＝３として表されている。＊スチューデントのｔ検定による対応するビヒクル時点群に対してｐ＜０．０５。
【図３】図３は、処理されたＧＴＭ−３細胞培養物の上清中の総ＰＡＩ−１含有量および活性ＰＡＩ−１含有量に対するＴＧＦβ２の効果を示しているグラフである。比較のために、ＴＮＦαおよびデキサメタゾンの効果を含める。データは、試験薬剤に２４時間曝露した後の平均およびＳＥＭである；「０」という値は、このアッセイの検出限界未満の発現レベルを示している。
【図４】図４は、ＧＴＭ−３細胞培養物中の活性ＰＡＩ−１に対するＰＡＩ−１阻害の効果を要約している２つの棒グラフを示している。
【図５】図５は、処理されたＧＴＭ−３細胞培養物の上清中における、ＴＧＦβ２によって媒介される総ＰＡＩ−１タンパク質レベルの増加に対するＰＡＩ−１合成インヒビター（Ｔ−２６３９）の効果を示しているグラフである。
【図６】図６は、Ｉ型ＴＧＦβレセプターインヒビターＳＢ４３１５４２の存在下または非存在下におけるＴＧＦβ２（５ｎｇ／ｍＬ）の効果のグラフを示している。上のパネル：様々なＨＴＭ細胞株におけるＳＢ４３１５４２（１０μＭ）の効果。下のパネル：ＧＴＭ−３細胞に対するＳＢ４３１５４２の用量依存的効果。データは、試験薬剤に２４時間曝露した後の平均およびＳＥＭである。（＊は、ｐ＜０．００１を示しているか、または＊＊は、ｐ＜０．０５を示している（これらは、１元配置分散分析の後のボンフェローニ検定による、各々のＴＧＦβ２処理コントロール群に対するものである））。
【図７】図７は、Ｓｍａｄ３インヒビターＳＩＳ３（Ｊｉｎｎｉｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９：５９７−６０７，２００６）の存在下または非存在下におけるＴＧＦβ２（５ｎｇ／ｍＬ）の効果のグラフを示している。上のパネル：様々なＨＴＭ細胞株におけるＳＩＳ３（１０μＭ）の効果。下のパネル：ＧＴＭ−３細胞に対するＳＩＳ３の用量依存的効果。データは、試験薬剤に２４時間曝露した後の平均およびＳＥＭである（＊は、１元配置分散分析の後のボンフェローニ検定による、各々のＴＧＦβ２処理コントロール群に対するｐ＜０．００１を示している）。
【図８】図８は、ＴＧＦβ２によって刺激されたＧＴＭ−３（上のパネル）およびＳＧＴＭ２６９７（下のパネル）細胞に対する様々な細胞内シグナル伝達経路の酵素インヒビターの効果のグラフを示している。使用したインヒビター：ＳＢ２０２１９０（ｐ３８  ＭＡＰＫインヒビター）、Ｕ０１２６（ＭＥＫ１／２インヒビター）、ＳＰ６００１２５（ＪＮＫインヒビター）、ビスインドリルマレイミドＩ（「Ｂｉｓ  Ｉ」；ＰＫＣα、β、δ、ζインヒビター）およびロットレリン（ＰＫＣδインヒビター）。データは、試験薬剤に２４時間曝露した後の平均およびＳＥＭである。（＊は、１元配置分散分析の後のボンフェローニ検定による、ＴＧＦβ２処理コントロール群に対するｐ＜０．００１を示している）；そして
【図９】図９は、ＴＧＦβ２によって刺激されたＧＴＭ−３細胞に対するスタチンの効果のグラフを示している。上のパネル：様々なスタチン（１０μＭ）の効果。下のパネル：アトルバスタチンの用量依存的効果。データは、試験薬剤に２４時間曝露した後の平均およびＳＥＭである。（＊は、ｐ＜０．００１を示しているか、または＊＊は、ｐ＜０．０１を示している（これらは、１元配置分散分析の後のボンフェローニ検定による、ＴＧＦβ２処理コントロール群に対するものである））。
【図１０】図１０は、細胞外マトリックスのクリアランスの代用アッセイにおける化合物（チプラクスチニン、ジアプラシニンおよび「化合物３９」）の効果を示している一連のグラフである。試験された化合物は、６つの異なるＨＴＭ細胞株の各々からの上清アリコート中において、基礎（無処理）活性に対して明らかな増加を誘発した。
【図１１】図１１は、Ｂａｌｂ／ｃＪマウスにおいてＡｄ．ＴＧＦβ２によって誘導される眼内圧の上昇に対してＰＡＩ−１がｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡの活性を阻害する能力を妨げる２つの化合物（チプラクスチニンおよびジアプラシニン）の効果を示している実験結果の２つのグラフを示している。ＩＯＰの低下は、Ａｄｖ．ＴＧＦβ２注射に対して、ＰＡＩ−１インヒビターの事前投薬と事後投薬の両方によって達成された。
【図１２】図１２は、Ｂａｌｂ／ｃＪマウスにおいてＡｄｖ．ＰＡＩ−１によって誘導される眼内圧の上昇に対するＰＡＩ−１のこれらの同じ２つのインヒビター（チプラクスチニンおよびジアプラシニン）の効果を示している実験結果の２つのグラフを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本発明のある特定の実施形態は、以下のスキームに示されるような、ｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡに対するＰＡＩ−１活性ならびに／またはＰＡＩ−１発現を妨害することによって緑内障などの眼球障害におけるＰＡＩ−１の効果を標的化するための方法であり、
【００１９】
【化１】
2011518828.tif 000002
ここで、ＴＧＦβ２（または他の刺激）は、ＰＡＩ−１遺伝子転写を促進した後、ＰＡＩ−１タンパク質発現を増加させ、活性ＰＡＩ−１のレベルを上昇させる。活性ＰＡＩ−１は、ｔ−ＰＡおよび／またはｕ−ＰＡによる、プラスミノゲンからプラスミンへの変換を阻害する。その後のプラスミンレベルの低下は、線維素溶解能を低下させ、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の蓄積を増加させる。ＥＣＭの蓄積は、流出抵抗を高め、究極的には、ＩＯＰを高める。本発明の実施形態は、ＰＡＩ−１発現の阻害ならびに／またはｔ−ＰＡおよび／もしくはｕ−ＰＡに対するＰＡＩ−１活性の妨害が、有用な緑内障治療であることを認める。
【００２０】
ＰＡＩ−１の発現または活性を阻害する様々な化合物が、当該分野で公知である。米国特許出願第１１／６１１，３１２号（Ｆｌｅｅｎｏｒら、２００６年１２月１５日に出願され、米国特許公開第２００８／０１０７６４４号として公開）および米国特許第７，３５１，４０７号（Ｆｌｅｅｎｏｒら、２００８年４月１日発行）は、ＰＡＩ−１の発現または活性を阻害する化合物として有用であり得る化合物を開示しており、それらの全体が本明細書によって参考として援用される。
【００２１】
本発明のＰＡＩ−１インヒビターとしては、ＰＡＩ−０３９（チプラクスチニン）（Ｃｒａｎｄａｌｌら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２６（１０）：２２０９−２２１５，２００６）；ＰＡＩ−７４９（ジアプラシニン）（Ｇａｒｄｅｌｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７２（４）：８９７−９０６，２００７）；ＺＫ４０４４（Ｌｉａｎｇら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１１５（４）：３４１−３５０，２００５）；ＷＡＹ−１４０３１２（Ｃｒａｎｄａｌｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｖｏｌ．２（８）：１４２２−１４２８，２００４）；ＨＰ−１２９（フェンドサール）（Ｇｉｌｓら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｖｏｌ．８８（１）：１３７−１４３，２００２）；Ｔ−６８６（Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７５（３）：２９１−２９４，１９９７）；ＰＡＺ−４１７（アレプラシニン）（Ｚｈａｏら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１８：８０３−８０４，２００８）；Ｔ−２６３９（Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｂｉｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１８：６４１９−６４２２，２００８）；Ｓ−３５２２５（Ｒｕｐｉｎら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１２２：２６５−２７０，２００８；ＳＫ−２１６およびＳＫ−１１６（Ｍｕｔｏｈら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．２９（４）：８２４−８２９，２００８）；ならびに２−［２−メトキシ−６−［［［３−（トリフルオロメチル）−４−［４−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−１−ピペラジニル］フェニル］アミノ］  メチル］フェノキシ］−５−ニトロ安息香酸（「化合物３９」；（Ｙｅら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４（３）：７６１−７６５，２００４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
他の小分子（例えば、ピペラジンおよびメントール誘導体（Ｙｅら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１４（３）：７６１−７６５，２００４；Ｙｅら、Ｂｉｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．１３（１９）：３３６１−３３６５，２００３））、ＰＡＩ−１抗体（Ｖｅｒｂｅｋｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｖｏｌ．２（２）：２８９−２９７，２００４；ｖａｎ  Ｇｉｅｚｅｎら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｖｏｌ．７７（５）：９６４−９６９，１９９７；およびＡｂｒａｈａｍｓｓｏｎら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，Ｖｏｌ．７５（１）：１１８−１２６，１９９６）およびパイオニン（ｐａｉｏｎｉｎ）−４（Ｍａｔｈｉａｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７４（３）：６４１−６５３，２００８）などのタンパク質薬剤もまた、本発明のある特定の実施形態において、ＰＡＩ−１の発現または活性を阻害する化合物として使用され得る。
【００２３】
他の実施形態は、ＳＢ２０２１９０、ＨＰ−１２９、Ｕ０１２６、ＳＰ６００１２５、ビスインドリルマレイミドＩ、ロットレリン、ＳＢ４３１５４２およびＳＩＳ３などの薬剤を使用し得る。なおも他の実施形態では、スタチン剤（例えば、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン）が薬剤として使用され得る。ＰＡＩ−１の発現または活性を阻害する好ましい化合物は、チプラクスチニン、ジアプラシニン、化合物３９およびＴ−２６３９である。
【００２４】
ＰＡＩ−１の発現または活性を阻害する本発明の化合物は、送達するために様々なタイプの眼用処方物に組み込まれ得る。それらの化合物は、当業者に周知の手法を用いて、眼に直接送達され得る（例えば：局所用で眼球用の液滴または軟膏；緩効性デバイス（例えば、盲嚢に埋め込まれるか、または強膜に隣接してもしくは眼内に埋め込まれる、薬学的な薬物送達スポンジ）；眼周囲、結膜、テノン嚢下（ｓｕｂ−ｔｅｎｏｎｓ）、前房内、硝子体内または管内注射）か、または全身的に送達され得る（例えば：経口的、静脈内、皮下または筋肉内注射；非経口、経皮または経鼻送達）。本発明のＰＡＩ−１の発現または活性のインヒビターが、眼内挿入物または埋め込み型デバイスとして製剤化され得ることがさらに企図される。
【００２５】
本明細書中に開示されるＰＡＩ−１の発現または活性のインヒビターは、眼に送達するために、好ましくは局所用眼用処方物に組み込まれる。それらの化合物は、眼科学的に許容可能な保存剤、界面活性剤、増粘剤、浸透促進剤、緩衝剤、塩化ナトリウムおよび水と併用することにより、水性で無菌の眼用懸濁剤または液剤が形成され得る。眼用液剤処方物は、生理的に許容可能な等張性の水性緩衝液に化合物を溶解することによって調製され得る。さらに、眼用液剤は、化合物の溶解を助ける眼科学的に許容可能な界面活性剤を含み得る。さらに、眼用液剤は、その結膜嚢における処方物の貯留を改善するために、粘度を増加させる薬剤（例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど）を含み得る。ゲル化剤（ゲラン（ｇｅｌｌａｎ）ゴムおよびキサンタンガムを含むがこれらに限定されない）もまた使用され得る。無菌の眼用軟膏処方物を調製するために、活性成分を、適切なビヒクル（例えば、鉱油、液体ラノリンまたは白色ワセリン）中において保存剤と混合する。無菌の眼用ゲル処方物は、類似の眼用調製物に対して公開されている調合に従って、例えば、ｃａｒｂｏｐｏｌ−９７４などの併用から調製される親水性基剤中で化合物を懸濁することによって、調製され得る；保存剤および等張化剤が、組み込まれ得る。
【００２６】
ＰＡＩ−１の発現または活性のインヒビターは、好ましくは、約４〜８のｐＨを有する局所用の眼用懸濁剤または液剤として製剤化される。それらの化合物は、緑内障患者の中で、高ＩＯＰを起こしている患者および／または正常なＩＯＰレベルを維持している患者においてＩＯＰを低下させるのに十分な量で局所用の懸濁剤または液剤に含められる。そのような量は、「ＩＯＰを制御するのに有効な量」またはより単純に「有効量」と本明細書中で呼ばれる。それらの化合物は、通常、０．０１〜５重量／体積パーセント（「ｗ／ｖ％」）の量でこれらの処方物中に含められるが、好ましくは、０．２５〜２ｗ／ｖ％の量で含められる。したがって、局所的適用（ｔｏｐｉｃａｌ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の場合、熟練の臨床医の裁量に従って、１〜２滴のこれらの処方物が、１日あたり１〜４回、眼の表面に送達され得る。
【００２７】
ＰＡＩ−１の発現または活性のインヒビターは、高ＩＯＰまたは緑内障を処置する他の薬剤（例えば、ｒｈｏキナーゼインヒビター、β−遮断薬、プロスタグランジンアナログ、炭酸脱水酵素インヒビター、α２アゴニスト、縮瞳薬、セロトニン作動性アゴニストおよび神経保護薬であるがこれらに限定されない）と併用しても使用され得る。
【００２８】
本明細書中で使用されるとき、「ＰＡＩ−１の発現または活性のインヒビター」は、そのようなインヒビターならびにそれらの薬学的に許容可能な塩を包含する。ＰＡＩ−１の発現または活性のインヒビターの薬学的に許容可能な塩は、ＰＡＩ−１の発現または活性の阻害活性を保持し、ヒトの身体にとって許容可能である塩である。本明細書中の薬剤が、アミノ置換基またはカルボキシ置換基を有し得るので、塩は、酸性塩または塩基性塩であり得る。塩は、酸（例えば、酢酸、安息香酸、桂皮酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グリコール酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、硝酸、シュウ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸など）を用いて形成され得る。塩は、塩基（例えば、第一級、第二級または第三級アミン、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛など）を用いて形成され得る。
【００２９】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含められる。以下の実施例に開示される手法が、本発明の実施において十分に機能すると本発明者らによって発見された手法であり、ゆえにその実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることは、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができること、および依然として多くの変更が同様または類似の結果をもたらすことができることを認識するべきである。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
ＰＡＩ−１の発現または活性のインヒビターは、その生物学的活性を測定するためにも使用され得る、結合アッセイまたは機能アッセイを用いて選択され得る。そのようなアッセイは、以前に報告された方法を用いて当業者によって開発され得る。ＰＡＩ−１の発現または活性のインヒビターを選択するための他の有用なアッセイを実施例２〜５に示す。
【００３１】
ある特定のＰＡＩ−１の発現または活性のインヒビターがＩＯＰを安全に低下させる能力は、インビボアッセイを用いて評価され得る。カニクイザルを用いる１つのそのようなアッセイでは、０．１％プロパラカインによる軽い角膜麻酔の後にＡｌｃｏｎ空気眼圧計を用いてＩＯＰを測定する（Ｓｈａｒｉｆら、Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１７（４）：３０５−３１７，２００１；Ｍａｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．３０６（１）：３０１−３０９，２００３）。各測定後に１または２滴の食塩水で眼をすすぐ。ベースラインのＩＯＰを測定した後、試験化合物を、１または２つの３０μＬのアリコートとして、選択された眼に滴下注入する。続いて、１、３および６時間後にＩＯＰ測定を行う。すべての動物の右眼にレーザー線維柱帯形成術を行うことにより、高眼圧症を誘導する。すべての左眼は、正常であり、ゆえに正常なＩＯＰを有する。
【００３２】
Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ａｌｂｉｎｏウサギを用いる別のアッセイでは、０．１％プロパラカインによる軽い角膜麻酔の後にＭｅｎｔｏｒ  Ｃｌａｓｓｉｃ  ３０空気眼圧計を用いてＩＯＰを測定する。各測定後に１または２滴の食塩水で眼をすすぐ。ベースラインのＩＯＰを測定した後、試験化合物を、１つの３０μＬのアリコートとして、各動物の片眼もしくは両眼に滴下注入するか、または化合物を片眼に、かつビヒクルを反対側の眼に滴下注入する。続いて、０．５、１、２、３、４および５時間後にＩＯＰ測定を行う。
【００３３】
（実施例２）
以前に報告されているように、ヒトＴＭ細胞を死後のヒトドナー組織から単離し、特徴づけ、そして培養した。形質転換された（ＧＴＭ−３）細胞株の作製および特徴付けは、Ｐａｎｇらによって以前に報告されたとおりであった（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１３（１）：５１−６３，１９９４）。ＴＭ細胞培養物の２４ウェルプレートを２４時間にわたって血清欠乏にした後、さらに２４時間（または記載されるとおり）無血清培地中でＴＧＦβ２とともにインキュベートした。処理された培養物からの上清のアリコートを、ヒトＰＡＩ−１  ＥＬＩＳＡキット（Ｉｍｕｂｉｎｄ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）を用いて、分泌されたＰＡＩ−１含有量について定量化した。このＥＬＩＳＡは、不顕性と活性の両方のＰＡＩ−１、ならびにＰＡＩ−１複合体を検出する（最小検出限界は５０ｐｇ／ｍＬである）。
【００３４】
図１は、ＴＧＦβ２が線維柱帯細胞培養物（ＧＴＭ−３）においてＰＡＩ−１含有量を増加させることを示しているグラフである。ＰＡＩ−１によって媒介される効果は、ＴＭ組織を含む様々な組織において、以前に観察された細胞外マトリックス材料のＴＧＦβ２媒介性の蓄積の一因となり得る。図２は、そのようなＴＧＦβ２媒介性のＰＡＩ−１の増加が、ＴＧＦβ２で処理された細胞培養物において持続していることを実証している。したがって、ＴＧＦβ２処理は、ＴＭ細胞上清においてＰＡＩ−１の濃度依存的かつ時間依存的な蓄積をもたらすとみられる。ＰＡＩ−１レベルは、ＴＧＦβ２に応答して徐々に上昇し、処理の約２４時間後に一定レベルに達する。
【００３５】
（実施例３）
トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦβ）は、多岐にわたる遺伝子およびタンパク質産物の生成、ひいては複数の細胞プロセスを制御する。ヒト線維柱帯（ＨＴＭ）細胞をＴＧＦβ２アイソフォームでエキソビボ処理することにより、おそらく眼球の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）蓄積の一因である重要なメディエーターであるプラスミノゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）の発現が変化することを研究が示している。ＴＭ領域におけるＥＣＭの過度の癒着（ｄｉｓｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｔｅ  ａｃｃｒｅｔｉｏｎ）は、房水（ＡＨ）流出に対するより高い抵抗を与え、その結果として、原発開放隅角緑内障において見られるような高い眼内圧をもたらし得る。さらに、ヒトＰＯＡＧ眼から回収されるＡＨにおけるＴＧＦβ２とＰＡＩ−１の両方のレベルは、緑内障でない眼と比べて高い。さらに、エキソビボヒト前方セグメントは、ＴＧＦβ２で灌流されたときに房水流出率の低下に応答する。
【００３６】
本研究では、以前に報告されたように（Ｐａｎｇら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１３（１）：５１−６３，１９９４）ヒトＴＭ細胞を単離し、特徴付け、そして培養した。これらのアッセイのために、プレーティングされた細胞を２４時間にわたって血清欠乏にした後、無血清培地中で試験薬剤とともにさらに２４時間インキュベートした。次いで、ヒトＰＡＩ−１  ＥＬＩＳＡキット（Ｉｍｕｂｉｎｄ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）を用いる総ＰＡＩ−１含有量の定量化のために、処理された培養物からの上清のアリコートを取り出した。このＥＬＩＳＡは、不顕性と活性の両方のＰＡＩ−１、ならびにＰＡＩ−１複合体を検出する（最小検出限界は５０ｐｇ／ｍＬである）。ウロキナーゼに対する活性ＰＡＩ−１の結合を定量化するＥＬＩＳＡキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ，Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ，ＭＩ）を用いて、細胞上清中の活性ＰＡＩ−１含有量を評価した。不顕性および複合型のＰＡＩ−１は、ウロキナーゼに結合しないので、それらはこのアッセイによって検出されない。このアッセイの予想される検出限界は、約０．０４５Ｕ／ｍＬである（ここで、１単位は、約１．３４ｎｇの活性ＰＡＩ−１と等しい）。
【００３７】
図３〜９は、上記プロトコルを用いて行われたインビトロ実験の結果を示している。本研究におけるＧＴＭ−３細胞による平均基礎ＰＡＩ−１分泌は、３３．９±１．５ｎｇ／ｍＬ／２４ｈ（ｎ＝２３３）だった。ＴＧＦβ２は、ＧＴＭ−３細胞上清のＰＡＩ−１含有量を時間および用量依存的様式で増加させた。５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ２で２４時間処理することにより、ＰＡＩ−１レベルが１２．０２±０．０３倍上昇した。
【００３８】
ＨＴＭ細胞のＰＡＩ−１総タンパク質レベルは、眼内圧上昇に関連する因子（ＴＧＦβ２、ＴＮＦα、デキサメタゾン）によってインビトロにおいてアップレギュレートされる。活性ＰＡＩ−１レベルもまた、ＴＧＦβ２によって上昇する（図３）。図４は、チプラクスチニンが、ＴＧＦβ２で処理されたＧＴＭ−３培養物において活性ＰＡＩ−１レベルを低下させることを示している。ＴＧＦβ２によって刺激されたＰＡＩ−１レベルは、基準（Ｓｍａｄ媒介性）と非基準（Ｓｍａｄ非依存性）の両方のシグナル伝達経路のインヒビターによって有意に（ｐ＜０．０５）ダウンレギュレートされた。図５は、処理されたＧＴＭ−３細胞培養物の上清中の総ＰＡＩ−１タンパク質レベルのＴＧＦβ２媒介性の増加に対するＰＡＩ−１合成インヒビター（Ｔ−２６３９）の効果を示しているグラフである。ＴＧＦβ２媒介性の基準（Ｓｍａｄ）シグナル伝達経路のインヒビター（ＳＢ４３１５４２およびＳＩＳ３）は、ヒト線維柱帯（ＨＴＭ）細胞培養物において総ＰＡＩ−１のインビトロ発現を阻止する（図６および７）。ＴＧＦβ２媒介性の非基準（Ｓｍａｄ非依存性）シグナル伝達経路のインヒビター（ＳＢ２０２１９０、Ｕ０１２６、ＳＰ６００１２５、ビスインドリルマレイミドＩおよびロットレリン）もまた、ＨＴＭ細胞培養物において総ＰＡＩ−１のインビトロ発現を妨げる。現在までに同定されているそのようなシグナル伝達経路としては、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＭＥＫ１／２、ＪＮＫおよびＰＫＣδが挙げられる（図８）。
【００３９】
スタチン剤による処理もまた、ＨＴＭ細胞培養物において総ＰＡＩ−１のインビトロ発現を減少させる（図９）。全体の応答は、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβ１型レセプターインヒビター；１μＭ）およびロットレリン（ＰＫＣδインヒビター；１０μＭ）などの薬剤による完全な阻害から、ＳＢ２０２１９０（ｐ３８  ＭＡＰＫインヒビター；１００ｎＭ）、ＳＰ６００１２５（ｃ−ＪｕｎＮ末端キナーゼインヒビター；１μＭ）および様々なスタチン剤による部分的な阻害まで様々だった。
【００４０】
（実施例４）
細胞外マトリックスのクリアランスに対する本発明の化合物の効果を評価するために研究を行った。チプラクスチニン、ジアプラシニンおよび化合物３９の存在下または非存在下において、ヒトＴＭ細胞を２４時間処理する。次いで、細胞上清アリコートを、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳで標識されたカゼイン（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに２時間インキュベートした後、蓄積された蛍光分解産物をＯｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出する。図１０は、チプラクスチニン、ジアプラシニンおよび化合物３９が、６つの異なるＨＴＭ細胞株の各々からの上清アリコートにおいて、基礎（無処理）活性に対して明らかな増加を誘発したことを示している。したがって、これらの化合物による処理は、線維柱帯細胞によるマトリックスタンパク質の分解を増大させる。
【００４１】
（実施例５）
本発明の化合物のインビボ効果を評価するために、マウスモデルを用いた。ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの各々の片側の眼の硝子体内にＡｄ５．ＣＭＶ．ｈＰＡＩ−１またはＡｄ．ＣＭＶ．ｈＴＧＦβ２２２６／２２８を注射した。注射されない反対側の眼をコントロールとした。意識のある動物のＩＯＰを、選択された時点において反跳式（ｒｅｂｏｕｎｄ）眼圧計（ＴｏｎｏＬａｂ（登録商標））によって測定した。グラフに記載されている時間枠において毎日の局所的投薬（ｂｉｄ）によって、試験薬剤を投与した。
【００４２】
図１１は、ｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡに対するＰＡＩ−１の阻害活性を阻害する化合物（チプラクスチニンおよびジアプラシニン）の効果を示している実験結果の２つのグラフを示している。これらの化合物は、Ｂａｌｂ／ＣマウスにおいてＡｄ．ＴＧＦβ２によって誘導される眼内圧の上昇をほぼ完全に逆転させる。Ａｄｖ．ＴＧＦβ２注射に対して、ＰＡＩ−１インヒビターの事前投薬と事後投薬の両方によってＩＯＰ低下が達成された。
【００４３】
図１２は、ｔ−ＰＡおよびｕ−ＰＡに対するＰＡＩ−１の阻害活性を妨げる２つの化合物（チプラクスチニンおよびジアプラシニン）の効果を示している実験結果の２つのグラフを示している。両方の薬剤が、Ｂａｌｂ／ｃＪマウスにおいてＡｄ．ＰＡＩ−１によって誘導される眼内圧の上昇を低下させた。
【００４４】
（実施例６）
【表Ａ】
2011518828.tif 000003
【００４５】
（実施例７）
【表Ｂ】
2011518828.tif 000004
【００４６】
本発明およびその実施形態を詳細に記載してきた。しかしながら、本発明の範囲は、本明細書中に記載されるいかなるプロセス、製造、物質の組成、化合物、手段、方法および／または工程の特定の実施形態にも限定されないと意図される。様々な改変、置換およびバリエーションが、本発明の精神および／または本質的な特徴から逸脱することなく、開示される材料に対して行われ得る。したがって、実質的に同じ機能を果たすか、または本明細書中に記載される実施形態と実質的に同じ結果を達成する、より最近の改変、置換および／またはバリエーションが、本発明のそのような関連する実施形態に従って利用され得ることを本開示から当業者は容易に理解するだろう。したがって、以下の特許請求の範囲は、それらの範囲内に、本明細書中に開示されるプロセス、製造、物質の組成、化合物、手段、方法および／または工程に対する改変、置換およびバリエーションを包含すると意図される。
【００４７】
（参考文献）
以下の参考文献は、それらの全体が本明細書によって参考として援用される：
【００４８】
【数１】
2011518828.tif 000005
【００４９】
【数２】
2011518828.tif 000006
【００５０】
【数３】
2011518828.tif 000007
【図１】
2011518828.tif 000008
【図２】
2011518828.tif 000009
【図３】
2011518828.tif 000010
【図４】
2011518828.tif 000011
【図５】
2011518828.tif 000012
【図６】
2011518828.tif 000013
【図７】
2011518828.tif 000014
【図８】
2011518828.tif 000015
【図９】
2011518828.tif 000016
【図１０】
2011518828.tif 000017
【図１１】
2011518828.tif 000018
【図１２】
2011518828.tif 000019
【国際調査報告】
2011518828.tif 000020
2011518828.tif 000021
2011518828.tif 000022
2011518828.tif 000023
2011518828.tif 000024
2011518828.tif 000025
2011518828.tif 000026
2011518828.tif 000027