(57)【要約】ＭｙＤ８８の発現を下方調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物、組成物および方法が提供される。組成物は、ＭｙＤ８８をコードする核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。組成物はまた、ＭｙＤ８８をコードする核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、他の治療用および／または予防用化合物および／または組成物と組み合わせて含んでもよい。ＭｙＤ８８の発現を下方調節するため、およびＭｙＤ８８の発現の調節が有益であるであろう疾患の予防または処置のために、これらの化合物および組成物を用いる方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭｙＤ８８のｍＲＮＡ（配列番号１５３）に対して相補的な、長さ２０〜５０ヌクレオチドの合成アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号４、１０、２１、２９、３１、３９、４６、４８、６３、６６、７０、７１、７２、７６、８５、１１６または１４２を含む配列を有し、ヒトＭｙＤ８８に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、前記合成アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
アルキルホスホネート類、ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類およびメチルホスホネート類からなる群より選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオチド間結合である、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも１つの２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含む、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドと生理学的に受容可能なキャリアとを含む組成物。
【請求項７】
ＭｙＤ８８の発現を阻害するための方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
ＭｙＤ８８の発現を阻害するための方法であって、請求項６に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項９】
哺乳動物においてＭｙＤ８８の発現を阻害するための方法であって、前記哺乳動物に請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与することを含む、前記方法。
【請求項１０】
哺乳動物においてＭｙＤ８８の発現を阻害するための方法であって、哺乳動物に請求項６に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項１１】
哺乳動物においてＭｙＤ８８媒介性免疫応答を阻害するための方法であって、前記哺乳動物に請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的有効量において投与することを含む、前記方法。
【請求項１２】
哺乳動物においてＭｙＤ８８媒介性免疫応答を阻害するための方法であって、前記哺乳動物に請求項６に記載の組成物を薬学的有効量において投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
ＭｙＤ８８により媒介される疾患を有する哺乳動物を治療的に処置するための方法であって、前記哺乳動物に請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的有効量において投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
ＭｙＤ８８により媒介される疾患を有する哺乳動物を治療的に処置するための方法であって、前記哺乳動物に請求項６に記載の組成物を薬学的有効量において投与することを含む、前記方法。
【請求項１５】
ＭｙＤ８８により媒介される疾患または障害を有する哺乳動物において疾患または障害を予防するための方法であって、前記哺乳動物に請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを予防有効量において投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
ＭｙＤ８８により媒介される疾患または障害を有する哺乳動物において疾患または障害を予防するための方法であって、前記哺乳動物に請求項６に記載の組成物を予防有効量において投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
ＭｙＤ８８の発現を下方調節することによりＭｙＤ８８を活性化する化合物による望ましくないＭｙＤ８８媒介性免疫刺激を予防するための方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが存在しなければＭｙＤ８８媒介性免疫応答を活性化するであろう免疫刺激モチーフを含む１または２以上の化合物と組み合わせて投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
ＭｙＤ８８の発現を下方調節することによりＭｙＤ８８を活性化する化合物による望ましくないＭｙＤ８８媒介性免疫刺激を予防するための方法であって、請求項６に記載の組成物を、該組成物が存在しなければＭｙＤ８８媒介性免疫応答を活性化するであろう免疫刺激モチーフを含む１または２以上の化合物と組み合わせて投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
哺乳動物がヒトである、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
疾患が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、マラリア、ライム病、眼感染症、結膜炎、皮膚の障害、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労性症候群、サルコイドーシス、移植拒絶、アレルギー、喘息または病原体により引き起こされる疾患から選択される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
自己免疫障害が、エリテマトーデス、多発性硬化症、Ｉ型真性糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血症性ショック、汎発性脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、モルフェア、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
炎症性障害が、気道炎症、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性腸疾患、再灌流傷害、関節リウマチ、移植拒絶、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、結膜炎および血管炎から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
化合物が、１または２以上の、ＭｙＤ８８媒介性免疫刺激を活性化するであろう免疫刺激モチーフを含む非ＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２４】
投与の経路が、非経口、筋肉内、皮下、腹腔内、静脈内、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、経皮貼付剤、点眼剤または洗口剤から選択される、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
１または２以上のワクチン、抗原、抗体、細胞傷害剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激分子またはこれらの組み合わせをさらに投与することを含む、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
哺乳動物においてＭｙＤ８８の発現および活性を阻害するための方法であって、前記哺乳動物にＭｙＤ８８のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＭｙＤ８８タンパク質のアンタゴニストを投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
ＭｙＤ８８アンタゴニストが、抗ＭｙＤ８８抗体またはその結合フラグメントもしくはペプチド模倣物、ＲＮＡベースの化合物、オリゴヌクレオチドベースの化合物、およびＭｙＤ８８活性の低分子阻害剤からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物においてＭｙＤ８８の発現および活性を阻害するための方法であって、前記哺乳動物にＭｙＤ８８のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＴＬＲ２、４、５、６、７、８または９タンパク質のアンタゴニストを投与することを含む、前記方法。
【請求項２９】
ＴＬＲアンタゴニストが、ＴＬＲ抗体またはその結合フラグメントもしくはペプチド模倣物、ＲＮＡベースの化合物、オリゴヌクレオチドベースの化合物、およびＴＬＲ活性の低分子阻害剤からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物においてＭｙＤ８８の発現および細胞シグナル伝達活性を阻害するための方法であって、前記哺乳動物に、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび細胞シグナル伝達の阻害剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項３１】
細胞シグナル伝達のアンタゴニストが、キナーゼ阻害剤およびＳＴＡＴタンパク質阻害剤から選択される、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
出願の背景
関連出願
本願は、２００８年８月８日に出願された先の米国仮出願第61/087,243号の利益を主張し、該出願の内容はその全体において参考として組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、骨髄細胞分化初期応答遺伝子８８（ＭｙＤ８８）に関する。特に、本発明は、ＭｙＤ８８をコードする核酸に特異的にハイブリダイズしてＭｙＤ８８の発現および活性を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびにＭｙＤ８８に関連するかまたはＭｙＤ８８の発現の調節が有益であるであろう疾患を処置または予防することにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連分野の要約
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、免疫系の多くの細胞に存在し、自然免疫応答に関与することが示されてきている（Hornung, V. et al., (2002) J. Immunol. 168:4531-4537）。ＴＬＲは、哺乳動物が外来分子を認識してこれに対する免疫応答を開始する重要な手段であり、また、自然免疫応答と獲得免疫応答とが連結する手段を提供する（Akira, S. et al. (2001) Nature Immunol. 2:675-680; Medzhitov, R. (2001) Nature Rev. Immunol. 1:135-145）。脊椎動物において、このファミリーは、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１１と称される少なくとも１１のタンパク質からなり、これらは、細菌、真菌、寄生虫およびウイルス由来の病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、多数の転写因子により媒介される免疫応答を誘導することが知られている。
【０００４】
一部のＴＬＲは細胞表面に位置して、細胞外病原体を検出してこれに対する応答を開始し、他のＴＬＲは細胞の内部に位置して、細胞内病原体を検出してこれに対する応答を開始する。表１は、ＴＬＲの説明、それらに対する既知のアゴニスト、およびＴＬＲを含むことが知られている細胞型を提供する（Diebold, S.S. et al. (2004) Science 303:1529-1531; Liew, F. et al. (2005) Nature 5:446-458; Hemmi H et al. (2002) Nat Immunol 3:196-200; Jurk M et al., (2002) Nat Immunol 3:499; Lee J et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6646-6651）；（Alexopoulou, L. (2001) Nature 413:732-738）。
【表１】
2011530293.tif 000002
【０００５】
リガンドとＴＬＲとの間の相互作用により媒介されるシグナル伝達経路は、ＴＬＲファミリーの殆どのメンバーの間で共有され、ｔｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲドメイン）、骨髄細胞分化マーカー８８（ＭｙＤ８８）、ＩＬ−１Ｒ関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）、ＴＧＦβ活性化キナーゼ１、ＩκＢキナーゼ、ＩκＢ、およびＮＦ−κＢに関与する（例えばAkira, S. (2003) J. Biol. Chem. 278:38105 および Geller at al. (2008) Curr. Drug Dev. Tech. 5:29-38を参照）。より具体的には、ＴＬＲ１、２、４、５、６、７、８、９および１１について、このシグナル伝達カスケードは、ＰＡＭＰリガンドが、エンドソーム膜または細胞表面にホモダイマーとして存在する膜結合ＴＬＲと相互作用してこれを活性化することにより開始する。活性化に続き、受容体は、ＴＬＲ３を除く全てのＴＬＲシグナル伝達経路に共通するアダプタータンパク質であるタンパク質ＭｙＤ８８を含むＴＩＲドメインの動員を可能にするための構造変化を経験する。ＭｙＤ８８はＩＲＡＫ４を動員し、これはＩＲＡＫ１をリン酸化して活性化する。活性化されたＩＲＡＫ１はＴＲＡＦ６に結合し、これはＴＲＡＦ６へのポリユビキチンの付加を触媒する。ユビキチンの付加は、ＴＡＫ／ＴＡＢ複合体を活性化し、これは次いでＩＲＦをリン酸化し、ＮＦ−κＢの放出および核への輸送をもたらす。核内のＮＦ−κＢは、炎症誘発性遺伝子の発現を誘導する（例えばTrinchieri and Sher (2007) Nat. Rev. Immunol. 7:179-190を参照）。
【０００６】
ＴＬＲの選択的局在と、それから発生するシグナル伝達は、免疫応答におけるそれらの役割についてのいくらかの洞察を提供する。免疫応答は、応答に関与する細胞のサブセットに基づいて、自然応答と獲得応答との両方を伴う。例えば、遅延型過敏などの古典的な細胞媒介性の機能および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化に関与するヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞は、Ｔｈ１細胞である。この応答は、抗原（例えば、ウイルス感染、細胞内病原体および腫瘍細胞）に対する身体の自然応答であり、ＩＦＮ−γの分泌およびＣＴＬの同時活性化をもたらす。
【０００７】
炎症性応答を調節することにおけるこれらの関与の結果として、ＴＬＲは、自己免疫、感染性疾患および炎症を含む多くの疾患の発病において役割を果たすことが示されてきている（Papadimitraki et al. (2007) J. Autoimmun. 29: 310-318; Sun et al. (2007) Inflam. Allergy Drug Targets 6:223-235; Diebold (2008) Adv. Drug Deliv. Rev. 60:813-823; Cook, D.N. et al. (2004) Nature Immunol. 5:975-979; Tse and Horner (2008) Semin. Immunopathol. 30:53-62; Tobias & Curtiss (2008) Semin. Immunopathol. 30:23-27; Ropert et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:41-51; Lee et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:3-9; Gao et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:29-40; Vijay-Kumar et al. (2008) Semin. Immunopathol. 30:11-21）。ＴＬＲの活性化が免疫応答の開始に関与する一方で、ＴＬＲを介した免疫系の制御されないまたは望ましくない刺激は、免疫力が低下した対象において特定の疾患を増悪するか、または望ましくない免疫刺激を引き起こす場合がある。したがって、ＴＬＲの発現および／または活性を下方調節することで、疾患への介入のための有用な手段を提供し得る。
【０００８】
今日まで、ＴＬＲの活性を阻害することを選択的に目的とする研究戦略は、低分子（WO/2005/007672）、抗体（例えばDuffy, K. et al. (2007) Cell Immunol. 248:103-114を参照）、触媒ＲＮＡｉ技術（例えば低分子阻害性ＲＮＡ）、特定のアンチセンス分子（Caricilli et al. (2008) J. Endocrinology 199:399）および修飾またはメチル化オリゴヌクレオチドによる競合的阻害（例えばKandimalla et al. US2008/0089883; Barrat and Coffman (2008) Immunol. Rev. 223:271-283を参照）に関与してきた。例えば、クロロキンおよびヒドロキシルクロロキンは、エンドソームの成熟を下方調節することによりエンドソームＴＬＲシグナル伝達を遮断することが示されている（Krieg, A. M. (2002) Annu. Rev. Immunol. 20:709）。また、Huangらは、Ｔ細胞増殖およびナチュラルキラー細胞活性の腫瘍媒介性抑制を逆転させるためのＴＬＲ４のｓｉＲＮＡの使用（Huang et al. (2005) Cancer Res. 65:5009-5014）、ならびに、細菌誘導性の眼炎を予防するためのＴＬＲ９のｓｉＲＮＡの使用（Huang et al. (2005) Invest. Opthal. Vis. Sci. 46:4209-4216）を示している。
【０００９】
さらに、いくつかのグループが、特定の細胞内タンパク質と相互作用し、ＴＬＲシグナル伝達の阻害と同時の炎症誘発性サイトカインの産生および放出とをもたらす、近位の「ＣＣＴ」トリプレットおよび遠位の「ＧＧＧ」トリプレットの２つのトリプレット配列、ポリ「Ｇ」（例えば「ＧＧＧＧ」もしくは「ＧＧＧ」）または「ＧＣ」配列を有する合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いている（例えばLenert, P. et al. (2003) DNA Cell Biol. 22(10):621-631; Patole, P. et al. (2005) J. Am. Soc. Nephrol. 16:3273-3280), Gursel, I., et al. (J. Immunol., 171: 1393-1400 (2003), Shirota, H., et al., J. Immunol., 173: 5002-5007 (2004), Chen, Y., et al., Gene Ther. 8: 1024-1032 (2001); Stunz, L.L., Eur. J. Immunol. (2000) 32: 1212-1222; Kandimalla et al. WO2007/7047396を参照）。しかし、グアノシンストリング（guanosine string）を含むオリゴヌクレオチドは、四重体構造を形成し、アプタマーとして作用し、トロンビン活性を阻害することが示されている（Bock LC et al., Nature, 355:564-6, 1992; Padmanabhan, K et al., J Biol Chem., 268(24):17651-4, 1993）。したがって、これらの阻害的なオリゴデオキシヌクレオチド分子の有用性は、患者において達成できない可能性がある。
【００１０】
ＴＬＲ活性の抑制への確実なアプローチは、オリゴヌクレオチドベースのアンタゴニストの使用である（Kandimallaら、WO2007/7047396を参照）。
【００１１】
一部の例においては、１つのみまたは幾つかのＴＬＲを阻害することが望ましい場合があり、他の例においては、殆どのまたは全てのＴＬＲを阻害することが望ましい場合がある。後者のアプローチの場合、ＭｙＤ８８は、ＴＬＲシグナル伝達経路におけるそのユビキタスな役割により、魅力的な標的である。
【００１２】
ＴＬＲの発現を「ノックダウン」する潜在的に有用なアプローチは、アンチセンス技術である。KarrasおよびDobie（US7,033,830）は、ＭｙＤ８８を対象とするあるアンチセンス化合物を報告する。しかし、アンチセンス技術の歴史は、遺伝子発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの発見が比較的単純明快である一方で、臨床的候補としての真の可能性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの最適化はそうではないことを明らかにしてきた。したがって、ＭｙＤ８８を下方調節するためのアンチセンスのアプローチを成功させるのであれば、この結果を最も効率的に達成する最適化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが必要である。かかる最適化アンチセンスオリゴヌクレオチドは、単独で用いることも、またはKandimallaらのアンタゴニストもしくは他の治療的アプローチと組み合わせて用いることもできる。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ＭｙＤ８８をコードする核酸を標的とし、ｍＲＮＡ翻訳の阻害を介しておよび／またはＲＮａｓｅＨ媒介性機構を介してＭｙＤ８８の発現を効率的に阻害する、最適化合成アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【００１４】
第１の側面において、本発明による最適化アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号４、１０、２１、２９、３１、３９、４６、４８、６３、６６、７０、７１、７２、７６、８５、１１６または１４２を有するものを含む。
【００１５】
第２の側面において、本発明は、少なくとも１つの本発明による最適化アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む組成物を提供する。
【００１６】
第３の側面において、本発明は、ＭｙＤ８８の発現を阻害する方法を提供する。この方法において、本発明の１つのオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡとin vitroでまたは細胞において特異的に接触またはハイブリダイズさせられる。
【００１７】
第４の側面において、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおいてＭｙＤ８８の発現を阻害するための方法を提供し、かかる方法は、哺乳動物に本発明による化合物または組成物を投与することを含む。
【００１８】
第５の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＭｙＤ８８媒介性免疫応答を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物に本発明のＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的有効量において投与することを含む。
【００１９】
第６の側面において、本発明は、ＭｙＤ８８により媒介される疾患を有する哺乳動物を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、哺乳動物、特にヒトに、本発明のＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその組成物を薬学的有効量において投与することを含む。
【００２０】
第７の側面において、本発明は、ＭｙＤ８８により媒介される疾患または障害を罹患するまたは発症する危険性がある哺乳動物、特にヒトにおいて、疾患または障害を予防するための方法を提供する。本発明のこの側面による方法は、当該哺乳動物に本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその組成物を予防有効量において投与することを含む。
【００２１】
第８の側面において、本発明は、ＭｙＤ８８の発現を下方調節し、それにより、ある他のアンチセンス分子またはＭｙＤ８８を活性化する副作用を有する他の化合物もしくは薬物の「オフ・ターゲット（off-target）」な活性を防止するための方法を提供する。例えば、本発明のＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドを、本発明のアンチセンス分子と同じ標的を有さず、かつ本発明によるＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドの存在がなければＭｙＤ８８媒介性免疫応答を活性化するであろう免疫刺激モチーフを含む、１もしくは２以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の核酸を含む化合物または他の薬物と組み合わせて投与してもよい。
【００２２】
第９の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＭｙＤ８８の発現および活性を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物に、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＭｙＤ８８タンパク質のアンタゴニストを投与することを含む。
【００２３】
第１０の側面において、本発明は、哺乳動物におけるＭｙＤ８８の発現および他のシグナル伝達分子の活性を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物に、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＴＬＲ２、４、５、６、７、８もしくは９のアンタゴニスト、キナーゼ阻害剤またはＳＴＡＴタンパク質阻害剤を投与することを含む。
【００２４】
本発明の対象のオリゴヌクレオチドおよび方法はまた、細胞において、または対照哺乳動物において、またはＭｙＤ８８もしくはＭｙＤ８８を介した免疫刺激と関連する疾患を罹患する哺乳動物において、ＭｙＤ８８遺伝子の機能を試験するためにも有用である。細胞または哺乳動物にオリゴヌクレオチドを投与し、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を試験する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドのリニア合成についての合成スキームである。ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル；ＣＥ＝シアノエチル。
【００２６】
【図２】図２は、ヒトＭｙＤ８８を発現するＨＥＫ２９３ＸＬ細胞における、本発明による例示的なヒトＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性のグラフ表示である。データは、例２に従って培養および処置されたＨＥＫ２９３細胞において、本発明による例示的なオリゴヌクレオチドがＭｙＤ８８の発現および活性を阻害する能力を実証する。
【００２７】
【図３】図３は、ヒトＭｙＤ８８を発現するＨＥＫ２９３ＸＬ細胞における、本発明による例示的なヒトＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性のグラフ表示である。データは、例２に従って培養および処置されたＨＥＫ２９３細胞において、本発明による例示的なオリゴヌクレオチドがＭｙＤ８８の発現および活性を阻害する能力を実証する。
【００２８】
【図４】図４は、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す［配列番号１５３］（Genbankアクセッション番号NM 002468）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、最適化されたＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチド、かかるオリゴヌクレオチドを含む組成物、およびＴＬＲ２、４、５、６、７、８または９に媒介される免疫応答を阻害または抑制するためのこれらの使用の方法に関する。
【００３０】
具体的には、本発明は、あるゲノムの領域またはそこから転写されるＲＮＡ分子に対して相補的であるように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。これらのＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドは特有の配列を有し、これは、特定の、特に利用可能なｍＲＮＡ配列を標的として、内因性および／または外因性のＴＬＲリガンドまたはＭｙＤ８８アゴニストに対する応答におけるＭｙＤ８８媒介性シグナル伝達の最大限に有効な阻害または抑制をもたらす。
【００３１】
本発明によるＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多様な細胞型において、ならびに多様なin vitroおよびin vivoの実験モデルにおいて、天然または人工のＴＬＲ２、４、５、６、７、８または９アゴニストにより誘導される免疫応答を阻害する。したがって、本発明によるアンチセンス組成物は、免疫系を研究するための、ならびにヒトおよびマウスなどの多様な動物種の免疫系を比較するためのツールとして有用である。
【００３２】
さらに提供されるのは、ＴＬＲ２、４、５、６、７、８または９の活性化と関連する疾患または状態を有するか、これを有することが疑われるか、またはこれを発症する傾向がある動物、特にヒト、を、本発明のアンチセンス化合物または組成物の１または２以上の治療有効量または予防有効量を投与することにより処置する方法である。これらは、限定されないが、成人および小児のヒトおよび獣医学的適用における、癌、自己免疫障害、喘息、呼吸器アレルギー、食物アレルギー、皮膚アレルギー、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節炎、胸膜炎、慢性感染症、炎症性疾患、炎症性腸症候群、敗血症、マラリア、ならびに細菌、寄生虫およびウイルス感染の処置などの免疫治療適用のために用いることができる。さらに、本発明のＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、多様な疾患の予防および／または処置において、単独で、あるいは他の薬物または予防用もしくは治療用組成物、例えば、ＤＮＡワクチン、抗原、抗体およびアレルゲンとの組み合わせにおいて、あるいはこれらとの共投与において；および化学療法剤（伝統的な化学療法および近代的な標的化療法の両方）、ＴＬＲ２、４、５、６、７、８または９のアンタゴニスト、キナーゼ阻害剤、ＳＴＡＴタンパク質阻害剤および／またはＭｙＤ８８アンタゴニストとの組み合わせにおいて、疾患の予防及び処置のために有用である。本発明のＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、望ましくないＭｙＤ８８媒介性免疫刺激特性を有する化合物または薬物との組合せにおいて有用である。
【００３３】
本明細書において引用される特許および刊行物は、当該分野における知識のレベルを反映し、本明細書によりその全体において参考として組み込まれる。これらの特許および刊行物の教示と本明細書との間のあらゆる不一致は、後者を優先して解決されるべきである。
【００３４】
本発明の前述のおよび他の目的、その多様な特徴、ならびに本発明それ自体は、以下の説明から、付随する図面とともに読まれた場合に、より完全に理解することができ、ここで：
【００３５】
用語「２’−Ｏ−置換」は、ペントース部分の２’位の、１〜６個の飽和または不飽和の炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基（例えば、限定されないが、２’−Ｏ−メチル）による、または２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリールまたはアリル基による置換を意味し、ここで、かかるアルキル、アリールまたはアリル基は、置換されていなくても、置換されていても（例えば、２’−Ｏ−エトキシ−メチル、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルボアルコキシもしくはアミノ基で）；または、ヒドロキシ、アミノもしくはハロ基で置換されているが２’−Ｈでは置換されていないものであってもよい。一部の態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、その５’末端において２’−Ｏ−アルキル化された４または５個のリボヌクレオチド（すなわち、５’  ２−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチド）、および／またはその３’末端において２’−Ｏ−アルキル化された４または５個のリボヌクレオチド（すなわち、３’  ２−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチド）を含む。例示的な態様において、合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合により連結されている。ホスホロチオエート結合は、混合されたＲｐおよびＳｐエナンチオマーであってもよく、またはＲｐもしくはＳｐのいずれかの形態において立体規則性または実質的に立体規則性であってもよい（Iyer et al. (1995) Tetrahedron Asymmetry 6:1051-1054を参照）。
【００３６】
用語「３’」は、方向性に用いる場合、一般に、同一のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの別の領域または位置からポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’（ヌクレオチドの３’末端の方へ）の領域または位置を指す。
【００３７】
用語「５’」は、方向性に用いる場合、一般に、同一のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの他の領域または位置からポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’（ヌクレオチドの５’末端の方へ）の領域または位置を指す。
【００３８】
用語「約」は、一般に、正確な数字が臨界的でないことを意味する。したがって、１つもしくは２つのより少数のヌクレオシド残基または１つから数個の付加的なヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドは、上記の各態様の相当物として考慮される。
【００３９】
用語「アゴニスト」は、一般に、細胞の受容体に結合して応答を誘導する物質を指す。アゴニストは、しばしば、リガンドなどの天然に存在する物質の作用を模倣する。
【００４０】
用語「アンタゴニスト」は、一般に、アゴニストの効果を減弱する物質を指す。
【００４１】
用語「キナーゼ阻害剤」は、一般に、細胞におけるリン酸化依存性の細胞シグナル伝達および／または増殖経路に拮抗またはこれを阻害する分子を指す。キナーゼ阻害剤は、天然に存在するものであっても合成のものであってもよく、経口治療として投与される潜在力を有する低分子を含む。キナーゼ阻害剤は、標的キナーゼ分子の活性化を迅速におよび特異的に阻害する能力を有する。タンパク質キナーゼは、魅力的な薬物標的であり、これは部分的に、これらが広範なシグナル伝達および増殖経路を調節し、多数の異なるタンパク質を含むからである。したがって、これらは、癌、心血管疾患、炎症性障害、糖尿病、黄斑変性症および神経障害を含む、キナーゼシグナル伝達に関与する疾患の処置において多大な可能性を有する。キナーゼ阻害剤の例として、ソラフェニブ（Nexavar（登録商標））、Sutent（登録商標）、ダサチニブ、Dasatinib（商標）、Zactima（商標）、Tykerb（商標）およびSTI571が挙げられる。
【００４２】
用語「気道炎症」は、一般に、限定されず、喘息を含む、アレルゲンによって引き起こされた呼吸管の炎症を含む。
【００４３】
用語「アレルゲン」は、一般に、対象にさらすとアレルギー応答を誘発する分子（通常、タンパク質）の抗原または抗原部分を指す。典型的には、対象は、例えば、ホイール・アンド・フレイア試験（wheal and flare test）または当該分野で知られる任意の方法によって示されるようにアレルゲンに対しアレルギー性である。分子は、分子にさらされた場合に対象の小さな小集団だけがアレルギーの（例えば、ＩｇＥ）免疫反応を示しても、アレルゲンであるといわれる。
【００４４】
用語「アレルギー」は、一般に、限定されないが、食物アレルギー、呼吸器アレルギーおよび皮膚アレルギーを含む。
【００４５】
用語「抗原」は、一般に、抗体によって、または、Ｔ細胞抗原受容体によって、認識され、選択的に結合する物質を指す。抗原は、限定されないが、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの組み合わせを含み得る。抗原は、天然または合成であってよく、一般に、当該抗原に特異的な免疫応答を誘導する。
【００４６】
用語「自己免疫障害」は、一般に、「自己」の抗原が免疫系によって攻撃を受ける障害を指す。かかる用語は、限定することなく、エリテマトーデス、多発性硬化症、Ｉ型真性糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血症性ショック、汎発性脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、モルフェア、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症、自己免疫性喘息、敗血症性ショックおよび乾癬を含む。
【００４７】
用語「癌」は、一般に、限定することなく、異常なまたは制御されない細胞の増殖および／または分裂により引き起こされる任意の悪性の増殖または腫瘍を指す。癌は、ヒトおよび／または動物において起こり得、任意のおよびすべての組織において生じ得る。癌を有する患者を処置することは、異常なまたは制御されない細胞の増殖および／または分裂あるいは転移が影響を及ぼされるような、本発明による化合物、医薬処方物またはワクチンの投与を含み得る。
【００４８】
用語「キャリア」は、一般に、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝化剤、安定化剤、可溶化剤、オイル、脂質、脂質含有ベシクル、ミクロスフェア、リポソームカプセルまたは医薬処方物において用いるための当該分野でよく知られた他の材料を包含する。キャリア、賦形剤または希釈剤の特性が特定の適用のための投与経路に依存するであろうことは理解されるであろう。これらの材料を含む薬学的に許容し得る処方物の調製は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed. A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に記載されている。
【００４９】
用語「共投与（co-administration）」または「共投与される（co-administered）」は、一般に、免疫応答を調節するために十分に時間的に近接した少なくとも２つの異なる物質の投与を指す。共投与は、少なくとも２つの異なる物質の、任意の順序における、単一の用量または別々の用量における、同時投与および数日間間隔まで時間的に間隔をあけた順序を指す。
【００５０】
用語「組み合わせて」は、一般に、本発明による化合物と、患者を処置する過程において該化合物のＭｙＤ８８アンチセンス活性を無効化しない疾患または状態を処置するために有用な別の剤とを投与することを意味する。かかる投与は、同時投与、ならびに数秒から数日間までの間隔で時間的に間隔をあけた順序を含む、任意の順序で行ってよい。かかる組み合わせ処置はまた、本発明による化合物および／または独立して他方の剤の、一回より多くの投与を含んでもよい。本発明の化合物および他方の剤の投与は、同一または異なる経路によってもよい。
【００５１】
用語「個体」または「対象」または「脊椎動物」は、一般に、ヒトなどの哺乳動物を指す。
【００５２】
用語「リニア合成」は、一般に、オリゴヌクレオチドの一端において開始し、他端まで直線的に進行する合成を指す。リニア合成は、同一または同一でない（長さ、塩基組成および／または組み込まれた化学修飾に関して）のモノマー単位のオリゴヌクレオチドへの組み込みを許容する。
【００５３】
用語「哺乳動物」は、温血の脊椎動物を含むことを明示的に意図し、限定することなく、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、雌ウシ、ブタ、ヒツジおよびウサギを含む。
【００５４】
用語「ヌクレオシド」は、一般に、糖（通常はリボースまたはデオキシリボース）とプリンまたはピリミジン塩基とからなる化合物を指す。
【００５５】
用語「ヌクレオチド」とは、一般に、糖に結合したリン含有基(phosphorous-containing group)を含むヌクレオシドを指す。
【００５６】
用語「修飾ヌクレオシド」は、一般に、修飾された複素環式塩基、修飾された糖部分、またはこれらの任意の組み合わせを含むヌクレオシドである。一部の態様において、修飾ヌクレオシドは、本明細書において記載されるように、非天然のピリミジンまたはプリンヌクレオシドである。本発明の目的のために、修飾ヌクレオシド、ピリミジンもしくはプリンの類似体、または天然に存在しないピリミジンもしくはプリンは、交換可能に用いることができ、天然に存在しない塩基および／または天然に存在しない糖部分を含むヌクレオシドを指す。本発明の目的のために、塩基は、それがグアニン、シトシン、アデニン、チミンまたはウラシルでない場合は、非天然のものであると考えられ、糖は、それがβ−リボフラノシドまたは２’−デオキシリボフラノシドでない場合は、非天然のものであると考えられる。
【００５７】
用語「修飾オリゴヌクレオチド」は、本明細書において用いられる場合、そのヌクレオチドのうちの少なくとも２つが、一方のヌクレオチドの５’末端と、５’ヌクレオチドリン酸がいくつかの化学基で置換されている別のヌクレオチドの３’末端との間で、合成の結合、すなわちホスホジエステル結合以外の結合を介して共有結合しているオリゴヌクレオチドを記載する。用語「修飾オリゴヌクレオチド」はまた、２’−Ｏ−置換、５’−Ｏ−置換および／または３’−Ｏ−置換リボヌクレオチドなどの修飾された塩基および／または糖を有する少なくとも１つのヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを包含する。
【００５８】
用語「核酸」は、あるゲノムの領域またはそれから転写されるＲＮＡ分子を包含する。一部の態様において、核酸はｍＲＮＡである。
【００５９】
用語「ヌクレオチドの結合」は、一般に、２つのヌクレオシドをそれらの糖を介して（例えば、３’−３’、２’−３’、２’−５’、３’−５’）連結する化学結合であって、隣接するヌクレオシド間のリン原子および荷電されているかまたは中性の基（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはメチルホスホネート）からなるものを指す。
【００６０】
用語「オリゴヌクレオチド」は、複数の結合したヌクレオシド単位から形成されるポリヌクレオシドを指す。ヌクレオシド単位は、ウイルス、細菌、細胞片またはオリゴヌクレオチドベースの組成物（例えば、ｓｉＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ）の一部であってよい。かかるオリゴヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む現存する核酸のソースから得ることもできるが、好ましくは合成方法により生成される。特定の態様において、各ヌクレオシド単位は、複素環式塩基、およびペントフラノシル、トレハロース、アラビノース、２’−デオキシ−２’−置換ヌクレオシド、２’−デオキシ−２’−置換アラビノース、２’−Ｏ−置換アラビノースまたはヘキソース糖基を含む。ヌクレオシド残基は、多数の公知のヌクレオシド間結合のいずれかにより互いに共役させることができる。かかるヌクレオシド間結合として、限定することなく、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボアルコキシ、アセトアミデート、カルバメート、モルホリノ、ボラノ、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートおよびスルホンヌクレオシド間結合を含む。用語「オリゴヌクレオチドベースの化合物」はまた、１または２以上の立体特異性のヌクレオシド間結合（例えば（ＲＰ）−または（ＳＰ）−ホスホロチオエート、アルキルホスホネート、またはホスホトリエステル結合）を有するポリヌクレオシドを包含する。本明細書において用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ジヌクレオチド」は、当該結合がリン酸基を含むか否かに拘わらず、あらゆるかかるヌクレオシド間結合を有するポリヌクレオシドおよびジヌクレオシドを含むことを明示的に意図される。ある例示的な態様において、これらのヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル、ホスホロチオエートもしくはホスホロジチオエート結合、またはこれらの組み合わせであってよい。
【００６１】
用語「あるゲノム領域またはそれから転写されるＲＮＡ分子に対して相補的である」とは、生理学的条件下において、例えば、ワトソン−クリック塩基対形成（オリゴヌクレオチドと一本鎖核酸との間の相互作用）により、またはフーグスティーン塩基対形成（オリゴヌクレオチドと二本鎖核酸との間の相互作用）により、または、オリゴヌクレオチドの場合はＲＮＡへ結合することおよびシュードノット（pseudoknot）形成を引き起こすことを含む任意の他の手段により、核酸配列に結合するオリゴヌクレオチドを意味することを意図される。ワトソン−クリックまたはフーグスティーン塩基対形成による生理学的条件下における結合は、核酸配列の機能に対する干渉を観察することにより実際に測定される。
【００６２】
用語「ペプチド」は、一般に、当該ペプチドがハプテンであってもなくても、生物学的応答、例えば抗体産生またはサイトカイン活性に影響を与えるために十分な長さおよび組成のポリペプチドを指す。用語「ぺプチド」は、修飾アミノ酸（天然に存在するものまたはまたは天然に存在しないもののいずれであっても）を含んでもよく、かかる修飾として、限定されないが、リン酸化、糖鎖付加、ペグ化、脂質化およびメチル化が挙げられる。
【００６３】
用語「薬学的に受容可能な」は、本発明による化合物の有効性または本発明による化合物の生物学的活性に干渉しない、非毒性の材料を意味する。
【００６４】
用語「生理学的に受容可能な」は、細胞、細胞培養、組織または生体などの生物学的システムと適合性である、非毒性の材料を意味する。好ましくは、生物学的システムは、哺乳動物、特にヒトを含む、脊椎動物などの生体である。
【００６５】
用語「予防有効量」は、一般に、望ましくない生物学的効果の発生を予防または低減するために十分な量を指す。
【００６６】
用語「治療有効量」または「薬学的有効量」は、一般に、限定することなく疾患または障害の徴候または症状の予防、減少、寛解または消失を含む有益な結果などの所望の生物学的効果に作用するために十分な量を指す。したがって、医薬組成物または方法の各活性成分の合計量は、有意義な患者の利益、例えば、限定することなく、免疫刺激により特徴づけられる慢性状態の治癒、を示すために十分である。したがって、「薬学的有効量」は、それが投与される状況に依存する。薬学的有効量は、１または２以上の予防的または治療的投与において投与することができる。個々の活性成分に対して適用され、単独で投与される場合、当該用語はその成分単独について言及する。組み合わせに対して適用される場合、当該用語は、組み合わせにおいて投与されるか、連続してまたは同時に投与されるかに拘わらず、治療効果をもたらす活性成分の組み合わせ量について言及する。
【００６７】
用語「処置」は、一般に、症状の緩和または疾患の進行を遅らせることまたは寛解することを含み得る、有益または所望の結果を得ることを意図するアプローチを指す。
【００６８】
第１の側面において、本発明は、ヒトＭｙＤ８８（配列番号１５３）に対して特異的である核酸に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡのコード配列または５’もしくは３’非翻訳領域の標的領域、および／あるいはそれらの化学修飾の両方に関して最適化されている。この側面の一部の態様において、化合物は、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡ（配列番号１５３）のコード領域の核酸塩基１８８〜１０７８、または５’非翻訳領域の１〜１８７、または３’非翻訳領域の１０７９〜２８２６内のある領域に対して相補的である。
【００６９】
本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭｙＤ８８媒介性免疫応答を阻害することが有益であるであろう疾患を処置および／または予防する上で有用である。本発明による有用なＭｙＤ８８標的化アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、天然に存在するヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチドおよび／または骨格修飾オリゴヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるがこれらに限定されない。しかし、ｍＲＮＡにコードされるタンパク質の翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、不十分に活性なアンチセンスオリゴヌクレオチド、不適当なバイオアベイラビリティ、最適以下の薬物動態または薬力学および免疫刺激を含む、望ましくない生物学的効果をもたらす場合がある。したがって、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの最適な設計は、単純な相補的配列の設計を超えた多くの配慮を必要とする。したがって、本発明によるＭｙＤ８８標的化アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製は、アンチセンス活性に対する二次構造の干渉を限定し、オリゴヌクレオチドの標的特異性を増大し、結合因子もしくは競合因子（例えばタンパク質）との相互作用を最小化し、細胞による取り込み、安定性、バイオアベイラビリティ、薬物動態および薬力学を最適化し、ならびに／または免疫細胞の活性化を阻害、防止もしくは抑制するために必要な変化を組み込むことを意図される。かかる免疫細胞の活性化の阻害、防止または抑制は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＭｙＤ８８に対するｍＲＮＡ内に含まれるヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力を損なうことなく、多数の方法により達成することができる。かかる方法として、限定することなく、１または２以上の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド結合の組み込み、ここで、かかる修飾ヌクレオチドは、「ＣｐＧ」ジヌクレオチドの「Ｃ」上の２’−Ｏ−メチル、３’−Ｏ−メチル、５−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル−Ｃ、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチル−Ｃおよび／または２’−Ｏ−メチル−５−メチル−Ｃ、ＣｐＧの「Ｇ」上の２’−Ｏ−置換−Ｇ、２’−Ｏ−メチル−Ｇおよび／または２’−Ｏ−メトキシエトキシ−Ｇであり、かかる修飾ヌクレオチド結合は、「ＣｐＧ」ジヌクレオチドのＣとＧとの間の非リン酸または非ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、「ＣｐＧ」ジヌクレオチドのＣとＧとの間のメチルホスホネート結合および／または２’−５’ヌクレオチド間結合である。
【００７０】
ＭｙＤ８８のコード領域は約０．９ｋＢからなることが決定されており、２９６アミノ酸のタンパク質に相当する転写物もまたヒトにおいて同定されている（Bonnert et al. (1997) FEBS Lett. 402:81-84）。ＭｙＤ８８をコードする遺伝子の配列は、マウスにおいて（Hardiman et al. (1997) Genomics 45:332-339）、およびヒトについて（Bonnert et al. (1997) FEBS Lett. 402:81-84）報告されている。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＭｙＤ８８の発現を阻害するための標的として最も有効に作用する、ＭｙＤ８８の核酸配列のうちの最適に利用可能な部分を対象としている。ＭｙＤ８８遺伝子のこれらの標的領域は、既知のエクソンまたは５’非翻訳領域の部分を含む。さらに、イントロン−エクソン境界、３’非翻訳領域およびイントロンは、ＭｙＤ８８の発現のアンチセンス阻害のための潜在的に有用な標的である。いくつかの代表的なヌクレオチド配列、ヒトＭｙＤ８８に特異的な非限定的なオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１５５を有する。本発明による最適化オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号４、１０、２１、２９、３１、３９、４６、４８、６３、６６、７０、７１、７２、７６、８５、１１６または１４２を有するものを含む。
【００７１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたは両方の組み合わせからなり、一方のヌクレオチドの５’末端と別のヌクレオチドの３’（または限定された場合において２’）末端とが共有結合している。これらのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１４ヌクレオチドの長さであるが、好ましくは１５〜６０ヌクレオチド長、好ましくは２０〜５０ヌクレオチドの長さである。一部の態様において、これらのオリゴヌクレオチドは、約１４〜２８個のヌクレオチド、または約１６〜２５個のヌクレオチド、または約１８〜２２個のヌクレオチド、または２０個のヌクレオチドを含む。これらのオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミデートまたはＨ−ホスホネート化学などの当該分野において認められている方法により調製することができ、これはマニュアルで、または自動合成機により行うことができる。本発明の合成ＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、それらがＭｙＤ８８のｍＲＮＡにハイブリダイズする能力を損なうことなく多数の方法で修飾することができる。かかる修飾として、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチド間結合が、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバメート、カーボネート、リン酸トリエステル、アセトアミデートもしくはカルボキシメチルエステル、または、これらと、一方のヌクレオチドの５’末端と５’ヌクレオチドのホスホジエステル結合が幾つかの化学基により置き換えられている別のヌクレオチドの３’末端との間の他のヌクレオチド間結合との組み合わせであることが挙げられる。
【００７２】
例えば、米国特許第5,149,797号は、ホスホロチオエートのコア領域がメチルホスホネートまたはホスホルアミデートのフランキング領域の間に挿入されている、伝統的なキメラオリゴヌクレオチドを記載する。米国特許第5,652,356号は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートの１または２以上の領域により挟まれた１または２以上の非イオン性オリゴヌクレオチド領域（例えば、アルキルホスホネートおよび／またはホスホルアミデートおよび／またはホスホトリエステルヌクレオシド間結合）を含む、「逆転」キメラオリゴヌクレオチドを開示する。修飾ヌクレオチド間結合を有する多様なオリゴヌクレオチドを、標準的な方法に従って調製することができる。ホスホロチオエート結合は、混合されたＲｐおよびＳｐエナンチオマーであってもよく、またはこれらを標準的な手順に従ってＲｐもしくはＳｐのいずれかの形態において立体規則性もしくは実質的に立体規則性にしてもよい。
【００７３】
自己安定化（self-stabilized）オリゴヌクレオチドもまた、本発明の方法において有用な修飾オリゴヌクレオチドであると考えられる（Tang et al. (1993) Nucleic Acids Res. 20:2729-2735）。これらのオリゴヌクレオチドは、２つの領域を含む：標的にハイブリダイズする領域；および自己安定化オリゴヌクレオチド内の核酸配列に対して相補的なオリゴヌクレオチド配列を有する自己相補的領域。
【００７４】
他の修飾として、オリゴヌクレオチド分子の内部または末端におけるものが挙げられ、これは、ヌクレオシド間リン酸結合の分子に対する、コレステロール、コレステリル、またはアミノ基との間に多様な数の炭素残基を有するジアミン化合物などの付加、ならびに、反対の鎖またはゲノムに結合する関連する酵素もしくはタンパク質を切断するかまたはこれと架橋する、末端のリボース、デオキシリボースおよびリン酸の修飾を含む。かかる修飾オリゴヌクレオチドの例として、リボースの替わりにアラビノースなどの修飾塩基および／または糖を有するオリゴヌクレオチド、または、その３’位および５’位の両方においてヒドロキシル基以外（その３’位において）およびリン酸基以外（その５’位において）の化学基と結合している糖を有する３’、５’−置換オリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００７５】
糖への修飾の他の例として、リボース部分の２’位への修飾が挙げられる。これは、限定されないが、１〜６個の飽和または不飽和の炭素原子を含む−Ｏ−アルキル基による、または−Ｏ−アリール、もしくは２〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリル基による２’−Ｏ−置換を含み、ここで、かかる−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アリールまたは−Ｏ−アリル基は、未置換であっても、例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシ、カルボアルコキシまたはアミノ基で置換されていてもよい。これらの置換のいずれも、リボースの場合はネイティブな２’−ヒドロキシル基、デオキシリボースの場合は２’１−Ｈ−を有する他のヌクレオチドの存在を除外することを意図しない。
【００７６】
米国特許第5,652,355号は、ＤＮＡコア領域を挟む２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドの領域を有する、伝統的なハイブリッドオリゴヌクレオチドを開示する。米国特許第5,652,356号は、「逆転」ハイブリッドオリゴヌクレオチドを開示し、これは、２つのオリゴデオキシリボヌクレオチド領域の間に位置する２’−Ｏ−置換（または２’ＯＨ、未置換）ＲＮＡ領域を含むオリゴヌクレオチドを含み、「伝統的な」ハイブリッドオリゴヌクレオチドに対して「逆転」した構造である。特に有用な本発明のオリゴヌクレオチドの非限定的な例は、その３’、５’、または３’および５’末端において、２’−Ｏ−アルキル化リボヌクレオチドを有し、少なくとも４または５個の近接したヌクレオチドがそのように修飾されている。２’−Ｏ−アルキル化基の非限定的な例として、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−ブチルおよび２’−Ｏ−エトキシ−メチルが挙げられる。
【００７７】
他の修飾オリゴヌクレオチドは、その３’および／または５’末端においてヌクレアーゼ耐性を付与する嵩高い置換基でキャップされているか、または、ヌクレオチド毎に１つの非架橋酸素において置換を有する。かかる修飾は、一部のまたは全てのヌクレオシド間結合におけるもの、ならびに、オリゴヌクレオチドの一方または両方の末端におけるもの、および／または分子の内部におけるものであってよい。
【００７８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のアンチセンス分子と同じ標的ではなく、かつ本発明によるＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドが存在しなければＴＬＲ２、４、５、６、７、８または９媒介性免疫応答を活性化するであろう免疫刺激モチーフを含む、１または２以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の核酸を含む化合物と組み合わせて投与してもよい。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、１または２以上のワクチン、抗原、抗体、細胞傷害剤、アレルゲン、抗生物質、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、キナーゼ阻害剤、ＭｙＤ８８阻害剤、ＳＴＡＴタンパク質阻害剤もしくは共刺激分子またはこれらの組み合わせと組み合わせて投与してもよい。
【００７９】
ＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドの非限定的なリストを、配列番号１〜配列番号１５３および以下の表２において示す。本発明による最適化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、配列番号４、１０、２１、２９、３１、３９、４６、４８、６３、６６、７０、７１、７２、７６、８５、１１６または１４２を有するものが挙げられる。表２において、オリゴヌクレオチドベースのＭｙＤ８８アンチセンス化合物は、全てホスホロチオエート（ＰＳ）結合を有する。しかし、当業者は、ホスホジエステル（ＰＯ）結合、またはＰＳとＰＯ結合との混合、ならびに他の修飾結合を用いることができることを理解するであろう。
【表２−１】
2011530293.tif 000003
【表２−２】
2011530293.tif 000004
【表２−３】
2011530293.tif 000005
【表２−４】
2011530293.tif 000006
【００８０】
下線のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドであり、他の全ては２’−デオキシリボヌクレオチドである。例示的な本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、「ＣＧ」ジヌクレオチドが配列中に含まれる場合、かかるオリゴヌクレオチドは、当該オリゴヌクレオチドの免疫刺激特性を取り除くかまたは防止するように修飾される。
【００８１】
第２の側面において、本発明は、少なくとも１つの本発明による最適化アンチセンスオリゴヌクレオチドと生理学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。キャリアの特徴は、投与の経路に依存する。かかる組成物は、合成オリゴヌクレオチドおよびキャリアに加えて、希釈剤、充填剤、塩、緩衝化剤、安定化剤、可溶化剤および当該分野において周知の他の材料を含んでもよい。本発明の医薬組成物はまた、ＭｙＤ８８の発現の阻害を増強する他の活性因子および／または剤を含んでもよい。例えば、その各々がＭｙＤ８８のｍＲＮＡの異なる領域を対象とする合成オリゴヌクレオチドの組み合わせを、本発明の医薬組成物において用いてもよい。本発明の医薬組成物は、さらに、アジドチミジン、ジデオキシシチジン、ジデオキシイノシンなどの、ヌクレオチド類似体を含んでもよい。かかるさらなる因子および／または剤は、本発明の合成オリゴヌクレオチドとの相乗的、相加的または増強された効果をもたらすために、または、本発明の合成オリゴヌクレオチドにより引き起こされる副作用を最小化するために、医薬組成物中に含まれてもよい。本発明の医薬組成物は、リポソームの形態であってもよく、その中において、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、他の薬学的に受容可能なキャリアに加えて、ミセル、不溶性単層、液晶または水溶液中のラメラ層として凝集した形態で存在する脂質などの両親媒性の剤と組み合わされる。リポソーム製剤に好適な脂質として、限定することなく、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが挙げられる。特に有用な脂質キャリアの１つはリポフェクチンである。かかるリポソーム製剤の製造は、例えば米国特許第4,235,871号、同第4,501,728号、同第4,837,028号および同第4,737,323号において開示される通り、当該分野における技術のレベルの範囲内である。本発明の医薬組成物は、さらに、細胞内へのオリゴヌクレオチドの送達を増強するかまたはポリマーの放出を遅延させる、シクロデキストリンなどの化合物を含んでもよい。
【００８２】
第３の側面において、本発明は、ＭｙＤ８８の発現を阻害する方法を提供する。この方法において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドは、in vitroで、または細胞において、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡと特異的に接触させられるかまたはハイブリダイズされる。
【００８３】
第４の側面において、本発明は、哺乳動物、特にヒトにおいて、ＭｙＤ８８の発現を阻害するための方法を提供し、かかる方法は、哺乳動物に本発明による化合物または組成物を投与することを含む。
【００８４】
第５の側面において、本発明は、哺乳動物においてＴＬＲ媒介性免疫応答を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物に本発明によるＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的有効量において投与することを含み、ここで、投与の経路として、非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣によるもの、遺伝子銃によるもの、経皮貼付剤によるものまたは点眼剤もしくは洗口剤の形態におけるものが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８５】
第６の局面において、本発明は、ＭｙＤ８８により媒介される疾患を有する哺乳動物を治療的に処置するための方法を提供し、かかる方法は、哺乳動物、特にヒトに、本発明のＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的有効量において投与することを含む。
【００８６】
ある態様において、疾患は、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性疾患、感染性障害、マラリア、ライム病、眼感染症、結膜炎、皮膚の障害、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労性症候群、サルコイドーシス、移植拒絶、アレルギー、喘息または病原体により引き起こされる疾患である。好ましい自己免疫障害として、限定することなく、エリテマトーデス、多発性硬化症、Ｉ型真性糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血症性ショック、汎発性脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、モルフェア、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。ある態様において、炎症性障害として、限定することなく、気道炎症、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性腸疾患、再灌流傷害、関節リウマチ、移植拒絶、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、結膜炎および血管炎が挙げられる。
【００８７】
第７の側面において、本発明は、ＭｙＤ８８により媒介される疾患または障害を罹患するかまたは発症する危険性がある哺乳動物、特にヒトにおいて、疾患または障害を予防するための方法を提供する。この側面による方法は、哺乳動物に、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは組成物の予防有効量を投与することを含む。かかる疾患および障害として、限定することなく、脊椎動物における、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性疾患、感染性障害、マラリア、ライム病、眼感染症、結膜炎、皮膚の障害、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労性症候群、サルコイドーシス、移植片拒絶、アレルギー、喘息または病原体により引き起こされる疾患が挙げられ、かかる方法は、脊椎動物、特にヒトに、本発明のＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的有効量において投与することを含む。自己免疫障害として、限定することなく、エリテマトーデス、多発性硬化症、Ｉ型真性糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血症性ショック、汎発性脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、モルフェア、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。炎症性障害として、限定することなく、気道炎症、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性腸疾患、再灌流傷害、関節リウマチ、移植拒絶、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、結膜炎および血管炎が挙げられる。
【００８８】
第８の側面において、本発明は、ＭｙＤ８８の発現を下方調節し、それにより特定の他のアンチセンス分子またはＭｙＤ８８を活性化する副作用を有する他の化合物もしくは薬物の「オフ・ターゲット」な活性を防止するための方法を提供する。ＭｙＤ８８以外の標的の発現を下方調節するように設計された特定のアンチセンスならびに他のＤＮＡおよび／またはＲＮＡベースの化合物、ならびに他の薬物はまた、ＭｙＤ８８のタンパク質を活性化して免疫応答を誘導する場合がある。この活性は、「オフ・ターゲット」効果として言及することができる。本発明によるＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＭｙＤ８８の発現を下方調節する能力を有し、従って、ＭｙＤ８８を標的としないアンチセンス分子または他の薬物のＭｙＤ８８媒介性オフ・ターゲット活性を防止する。例えば、本発明によるＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のアンチセンス分子と同じ標的を有さず、かつ本発明によるＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドが存在しなければＭｙＤ８８媒介性免疫応答を活性化するであろう免疫刺激モチーフを含む、１または２以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせて投与してもよい。したがって、例えば、ＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと同じ分子を標的としない１または２以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ分子（例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｄＲＮＡおよびｅｉＲＮＡ）と組み合わせて投与してもよい。
【００８９】
第９の側面において、本発明は、哺乳動物においてＭｙＤ８８の発現および活性を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物に、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＭｙＤ８８タンパク質のアンタゴニストを投与することを含む。この側面によれば、ＭｙＤ８８の発現はアンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害され、一方、残留して発現されるＭｙＤ８８タンパク質はアンタゴニストにより阻害される。好ましいアンタゴニストとして、抗ＭｙＤ８８抗体またはその結合フラグメントもしくはペプチド模倣物、ＲＮＡベースの化合物、オリゴヌクレオチドベースの化合物、および／またはＭｙＤ８８活性の低分子阻害剤が挙げられる。
【００９０】
第１０の側面において、本発明は、哺乳動物においてＭｙＤ８８の発現および他のシグナル伝達分子の活性を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物に、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＴＬＲ２、４、５、６、７、８もしくは９のアンタゴニスト、キナーゼ阻害剤またはＳＴＡＴタンパク質阻害剤を投与することを含む。この側面によれば、ＭｙＤ８８の発現はアンチセンスオリゴヌクレオチドに阻害され、一方、他のシグナル伝達カスケードはアンタゴニストにより阻害される。好ましいアンタゴニストとして、抗ＴＬＲ２、４、５、６、７、８および／もしくは９抗体またはそのその結合フラグメントもしくはペプチド模倣物、ＲＮＡベースの化合物、オリゴヌクレオチドベースの化合物、ならびに／あるいはＴＬＲ２、４、５、６、７、８および／もしくは９の活性またはシグナル伝達タンパク質の活性の低分子阻害剤が挙げられる。
【００９１】
本発明による多様な方法において、ＭｙＤ８８の発現を阻害する上で有効な本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療有効量または予防有効量を細胞に投与する。この細胞は、細胞培養、血管新生化組織（neovascularized tissue）培養の一部であっても、またはヒトもしくは他の哺乳動物などの動物の一部または全身であってもよい。投与は任意の好適な経路によるものであってよく、限定することなく、非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣によるもの、遺伝子銃によるもの、経皮貼付剤によるもの、または点眼剤もしくは洗口剤の形態におけるものを含む。ＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療用組成物の投与は、当業者により決定されるとおり条件および応答に依存して、公知の手順を用いて、疾患の症状または代用マーカーを減少させるために有効な投与量でかつそのような期間にわたって行うことができる。本発明の治療用ＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドの１または２以上の治療有効量を、個体に、一回の処置エピソードとして、同時に、または連続して投与することが望ましい場合がある。上で記載される本発明の方法の一部の例示的な態様において、オリゴヌクレオチドは、局所および／または全身で投与される。用語「局所投与される」とは、身体の規定の範囲または領域への送達を指し、一方、用語「全身投与」とは、全生体への送達を包含することを意味する。
【００９２】
本発明による方法のいずれにおいても、ＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、該ＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドの免疫調節効果を減弱しない、疾患または病状を処置するために有用な任意の他の剤と組み合わせて投与することができる。本発明による方法のいずれにおいても、疾患または病状を処置するために有用な剤として、免疫応答の特異性または大きさを増強するための１または２以上のワクチン、抗原、抗体、細胞傷害剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、キナーゼ阻害剤もしくはＳＴＡＴ阻害剤、またはサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチドおよび修飾アミノ酸を含むペプチドなどの共刺激分子が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、自己免疫疾患の処置において、ＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドを、１または２以上の標的化された治療剤および／またはモノクローナル抗体と組み合わせて投与し得ることが企図される。あるいは、剤は、抗原またはアレルゲンをコードするＤＮＡベクターを含んでもよい。これらの態様において、本発明のＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドは、直接的な免疫調節または抑制効果をもたらすことができる。
【００９３】
本発明による多様な方法において、投与の経路は、限定することなく、非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣によるもの、遺伝子銃によるもの、経皮貼付剤または点眼剤もしくは洗口剤の形態におけるものであってよい。
【００９４】
本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療有効量を経口投与する場合、合成オリゴヌクレオチドは、錠剤、カプセル、散剤、溶液またはエリキシル剤の形態となる。錠剤の形態において投与される場合、本発明の医薬組成物は、さらに、ゼラチンなどの固体のキャリアまたはアジュバントを含んでもよい。錠剤、カプセルおよび散剤は、約５〜９５％の合成オリゴヌクレオチドを含み、好ましくは約２５〜９０％の合成オリゴヌクレオチドを含む。液体の形態において投与される場合、水、石油、ピーナッツ油、鉱油、大豆油、ゴマ油などの動物もしくは植物に由来するオイル、または合成オイルなどの液体のキャリアを添加してもよい。医薬組成物の液体形態は、さらに、生理食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコール類を含んでもよい。液体の形態において投与される場合、医薬組成物は、約０．５〜９０重量％の合成オリゴヌクレオチド、または約１〜５０％の合成オリゴヌクレオチドを含む。
【００９５】
本発明の合成オリゴヌクレオチドの治療有効量を非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣により、遺伝子銃により、経皮貼付剤または点眼剤もしくは洗口剤の形態において投与する場合、合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、パイロジェンフリーの、非経口で受容可能な水溶液の形態となる。ｐＨ、等張性、安定性などに配慮した、かかる非経口で受容可能な溶液の製造は、当該分野における技術の範囲内である。例示的な非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣によるもの、遺伝子銃によるもの、経皮貼付剤によるもの、または点眼剤もしくは洗口剤の形態におけるもののための医薬組成物は、合成オリゴヌクレオチドに加えて、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウムの注射液、乳酸リンガー注射液または当該分野において公知の他のビヒクルなどの等張性ビヒクルを含むべきである。本発明の医薬組成物はまた、安定化剤、保存剤、緩衝化剤、抗酸化剤または当業者に公知の他の添加物を含んでもよい。
【００９６】
非経口、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣により、遺伝子銃により、経皮貼付剤によりまたは点眼剤もしくは洗口剤の形態において投与される場合、０．０１％〜１０％（重量／容積）の範囲の用量を用いることができる。液体の形態において投与される場合、水、石油、ピーナッツ油、鉱油、大豆油、ゴマ油などの動物もしくは植物に由来するオイル、または合成オイルなどの液体のキャリアを添加してもよい。局所投与は、リポソームまたは徐放性(time-release)経皮貼付剤により行うことができる。
【００９７】
本発明の医薬組成物中の合成オリゴヌクレオチドの量は、処置される状態の性質および重篤度、ならびに患者が経験した先行する処置の性質に依存する。本発明の方法を実施するために用いられる多様な医薬組成物は、体重または器官の重量１ｋｇ当たり、約１０マイクログラム〜約２０ｍｇの合成オリゴヌクレオチドを含むべきであることが企図される。
【００９８】
本発明の医薬組成物を用いる静脈内治療の期間は、処置される疾患の重篤度、および各々の個々の患者の状態および潜在的な特異体質応答に依存して変化する。
【００９９】
一部の疾患は急性の処置に向いており、他の疾患はより長期的な治療を必要とする。疾患における急性および長期的介入はいずれも意義のある目的である。ＭｙＤ８８に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの注射は、特定の疾患を急性期の状況において阻害する有効な手段であり得る。しかし、数週間、数か月または数年の期間にわたる長期的治療のためには、食塩水などのキャリア、遅延放出ポリマーまたはリポソームのいずれかを用いる全身送達（腹腔内、筋肉内、皮下、静脈内）が考慮される可能性がある。
【０１００】
一部の慢性疾患において、オリゴヌクレオチドの全身投与が好ましい場合がある。注射の頻度は、持続的注入から、１カ月に１回、１カ月に数回、またはより少ない頻度であり、疾患の経過およびオリゴヌクレオチドの生物学的半減期に基づいて決定される。
【０１０１】
本発明のオリゴヌクレオチドおよび方法はまた、細胞において、あるいは対照哺乳動物において、あるいはＴＬＲ２、４、５、６、７、８もしくは９に関連するかまたはＴＬＲ２、４、５、６、７、８もしくは９を介した免疫刺激に関連する疾患を罹患する哺乳動物において、ＭｙＤ８８遺伝子の機能を試験するために有用である。かかる用途において、細胞または哺乳動物に、オリゴヌクレオチドを投与し、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を試験する。
【０１０２】
いかなる理論または機構にも限定されることなく、一般に、本発明によるオリゴヌクレオチドの活性は、当該オリゴヌクレオチドの標的核酸（例えば、ゲノムの領域、遺伝子またはそのｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部分）へのハイブリダイゼーションにより標的の機能を撹乱することに依存すると考えられる。生理学的条件下におけるかかるハイブリダイゼーションは、核酸配列の機能への干渉を観察することにより、実際に測定される。したがって、本発明により用いられる例示的なオリゴヌクレオチドは、標的核酸と安定な二本鎖（または、フーグスティーンもしくは他の水素結合対形成機構においては、三重鎖）を形成することができ；ＲＮａｓｅＨまたは他のin vivoでの酵素を活性化してそれにより標的ＲＮＡ分子の効果的な破壊を引き起こすことができ；およびin vivoでの核酸分解（例えばエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼ活性）に対して耐性であることができる。上記のオリゴヌクレオチドへの多数の修飾および当該分野において公知の他のものは、これらの例示的な特徴の各々に特異的におよび首尾よく取り組む。
【０１０３】
本発明の多様な処置の方法または使用において、本発明の合成オリゴヌクレオチドの１、２または３以上の治療有効量または予防有効量を、疾患または障害を罹患するかまたは発症する危険性がある対象に投与する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、単独で、あるいは、限定されないが、免疫応答の特異性もしくは強さを増強するための１または２以上のワクチン、抗原、抗体、細胞傷害剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、ＭｙＤ８８アンタゴニスト、アジュバント、キナーゼ阻害剤もしくはＳＴＡＴ阻害剤、またはサイトカイン、ケモカイン、タンパク質リガンド、トランス活性化因子、ペプチドおよび修飾アミノ酸を含むペプチドなどの共刺激分子を含む他の公知の治療と組み合わせて、本発明の方法により投与することができる。１または２以上の他の治療と共投与される場合、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、他の処置と同時に、または連続的に投与することができる。
【０１０４】
以下の例は、本発明を製造し実施する例示的な態様を説明するものであるが、本発明の範囲を限定することは意図されない。なぜならば、同様の結果を得るために代替的な方法を利用することができるからである。
【０１０５】
例１：
ＭｙＤ８８特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製
本発明による化学的実体を、１μｍｏｌ〜０．１ｍＭのスケールにおいて、自動ＤＮＡ合成機（OligoPilot II、AKTA（Amersham）および／またはExpedite 8909（Applied Biosystem））と、その後に図１に要約したリニア合成手順を用いて合成した。
【０１０６】
５’−ＤＭＴ  ｄＡ、ｄＧ、ｄＣおよびＴホスホルアミダイトを、Proligo（Boulder, CO）から購入した。５’−ＤＭＴ７−デアザ−ｄＧおよびａｒａＧホスホルアミダイトを、Chemgenes（Wilmington, MA）から入手した。ＤｉＤＭＴ−グリセロールリンカー固体支持体を、Chemgenesから入手した。１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−オキソ−７−デアザ−８−メチル−プリンアミダイトをGlen Research（Sterling, VA）から入手し、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド アミダイトをPromega（Obispo, CA）から入手した。本発明による全ての化合物は、ホスホロチオエート骨格修飾されたものであった。
【０１０７】
全てのヌクレオシドホスホルアミダイトを、３１Ｐおよび１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにより特徴づけた。修飾ヌクレオシドを、製造者により推奨される正常なカップリングサイクルを用いて特異的部位で組み込んだ。合成の後で、化合物を、濃縮水酸化アンモニウムを用いて脱保護し、逆相ＨＰＬＣ、脱トリチル化、およびその後の透析により精製した。ナトリウム塩形態として精製した化合物を、使用の前に凍結乾燥した。ＣＧＥおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより、純度を試験した。エンドトキシンレベルは、ＬＡＬ試験により決定したところ、１．０ＥＵ／ｍｇ未満であった。
【０１０８】
例２：
細胞培養の条件および試薬
ＭｙＤ８８アンチセンス活性についてのＨＥＫ２９３細胞培養アッセイ
ヒトＴＬＲ９を安定に発現するＨＥＫ２９３ＸＬ細胞（Invivogen, San Diego, CA）を、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて、１０％熱不活化ＦＢＳを添加した２５０μＬ／ウェルのＤＭＥＭ中で、４８ウェルプレートに播種した。８０％コンフルーエンシーにおいて、培養物を４００ｎｇ／ｍＬの分泌型ヒト胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポータープラスミド（pNifty2-Seap（Invivogen））で、４μＬ／ｍＬのリポフェクタミン（Invitrogen, Carlsbad, CA）の存在下において、培養培地中で、一過性にトランスフェクトした。プラスミドのＤＮＡとリポフェクタミンとを、別々に無血清培地中で希釈し、室温で５分間インキュベートした。インキュベーションの後で、希釈されたＤＮＡおよびリポフェクタミンを混合し、混合物をさらに室温で２０分間インキュベートした。１００ｎｇのプラスミドＤＮＡおよび１μＬのリポフェクタミンを含むＤＮＡ／リポフェクタミン混合物の２５μＬのアリコートを、細胞培養プレートの各ウェルへ添加し、細胞を６時間トランスフェクトした。トランスフェクションの後で、培地を新鮮な培養培地（抗生物質を含まない）で交換し、ヒトＭｙＤ８８アンチセンス化合物をウェルに添加し、インキュベーションを１８〜２０時間続けた。細胞を、次いでオリゴヌクレオチドベースのＴＬＲ９アゴニストで６時間刺激した。
【０１０９】
処置の最後に、２０μＬの培養上清を各ウェルから採取し、ＳＥＡＰ活性についてQuanti Blue法により、製造者（Invivogen）のプロトコルに従ってアッセイした。データは、ＰＢＳ対照に対するＮＦ−κＢ活性の増大の倍率として示す。
【０１１０】
例３：
ＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドのin vivoでの活性
in vivoでの活性を決定するために、５〜６週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｎ＝３／群）に、本発明による例示的なマウスのＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドを５ｍｇ／ｋｇで、またはＰＢＳを、皮下で１日１回３日間にわたり注射する。ＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与に続いて、マウスに０．２５ｍｇ／ｋｇのＴＬＲアゴニストを皮下で注射する。ＴＬＲアゴニストの投与の２時間後に血液を採取し、ＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡにより決定し、ＭｙＤ８８のin vivoでの阻害を決定する。
【０１１１】
均等物
当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書において記載される具体的な物質および手順に対する多数の均等物を認識するか、または確定することができる。例えば、オリゴヌクレオチドと重なるアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることができる。かかる均等物は、本発明の範囲内であり、以下の特許請求の範囲により含められる。
【図１】
2011530293.tif 000007
【図２】
2011530293.tif 000008
【図３】
2011530293.tif 000009
【図４】
2011530293.tif 000010
【配列表】
2011530293000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月6日(2011.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭｙＤ８８のｍＲＮＡ（配列番号１５３）に対して相補的な、長さ２０〜５０ヌクレオチドの合成アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、配列番号４、１０、２１、２９、３１、３９、４６、４８、６３、６６、７０、７１、７２、７６、８５、１１６または１４２を含む配列を有し、ヒトＭｙＤ８８に特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する、前記合成アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
アルキルホスホネート類、ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類およびメチルホスホネート類からなる群より選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を有する、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオチド間結合である、請求項２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも１つの２’−Ｏ−置換リボヌクレオチドを含む、請求項４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドと生理学的に受容可能なキャリアとを含む、医薬組成物。
【請求項７】
ＭｙＤ８８の発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、前記医薬組成物。
【請求項８】
ＭｙＤ８８の発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項６に記載の医薬組成物を含む、前記医薬組成物。
【請求項９】
哺乳動物においてＭｙＤ８８の発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、前記医薬組成物。
【請求項１０】
哺乳動物においてＭｙＤ８８の発現を阻害するための医薬組成物であって、請求項６に記載の医薬組成物を含む、前記医薬組成物。
【請求項１１】
哺乳動物においてＭｙＤ８８媒介性免疫応答を阻害するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１２】
哺乳動物においてＭｙＤ８８媒介性免疫応答を阻害するための医薬組成物であって、請求項６に記載の医薬組成物を薬学的有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１３】
ＭｙＤ８８により媒介される疾患を有する哺乳動物を治療的に処置するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１４】
ＭｙＤ８８により媒介される疾患を有する哺乳動物を治療的に処置するための医薬組成物であって、請求項６に記載の組成物を薬学的有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１５】
ＭｙＤ８８により媒介される疾患または障害を有する哺乳動物において疾患または障害を予防するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを予防有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１６】
ＭｙＤ８８により媒介される疾患または障害を有する哺乳動物において疾患または障害を予防するための医薬組成物であって、請求項６に記載の医薬組成物を予防有効量で含む、前記医薬組成物。
【請求項１７】
ＭｙＤ８８の発現を下方調節することによりＭｙＤ８８を活性化する化合物による望ましくないＭｙＤ８８媒介性免疫刺激を予防するための医薬組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが存在しなければＭｙＤ８８媒介性免疫応答を活性化するであろう免疫刺激モチーフを含む１または２以上の化合物と組み合わせて含む、前記医薬組成物。
【請求項１８】
ＭｙＤ８８の発現を下方調節することによりＭｙＤ８８を活性化する化合物による望ましくないＭｙＤ８８媒介性免疫刺激を予防するための医薬組成物であって、請求項６に記載の医薬組成物を、該組成物が存在しなければＭｙＤ８８媒介性免疫応答を活性化するであろう免疫刺激モチーフを含む１または２以上の化合物と組み合わせて含む、前記医薬組成物。
【請求項１９】
哺乳動物がヒトである、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
疾患が、癌、自己免疫障害、気道炎症、炎症性障害、感染性疾患、マラリア、ライム病、眼感染症、結膜炎、皮膚の障害、乾癬、強皮症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、慢性疲労性症候群、サルコイドーシス、移植拒絶、アレルギー、喘息または病原体により引き起こされる疾患から選択される、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
自己免疫障害が、エリテマトーデス、多発性硬化症、Ｉ型真性糖尿病、過敏性腸症候群、クローン病、関節リウマチ、敗血症性ショック、汎発性脱毛症、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、水疱性類天疱瘡、シャーガス病、慢性閉塞性肺疾患、セリアック病、皮膚筋炎、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、ハシモト病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、間質性膀胱炎、モルフェア、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、統合失調症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」）、血管炎、白斑、外陰部痛およびウェゲナー肉芽腫症から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
炎症性障害が、気道炎症、喘息、自己免疫疾患、慢性炎症、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、ベーチェット病、過敏症、炎症性腸疾患、再灌流傷害、関節リウマチ、移植拒絶、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、結膜炎および血管炎から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
化合物が、１または２以上の、ＭｙＤ８８媒介性免疫刺激を活性化するであろう免疫刺激モチーフを含む非ＭｙＤ８８アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
医薬組成物の投与の経路が、非経口、筋肉内、皮下、腹腔内、静脈内、粘膜送達、経口、舌下、経皮、局所、吸入、鼻内、エアロゾル、眼内、気管内、直腸内、膣、遺伝子銃、経皮貼付剤、点眼剤または洗口剤から選択される、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
１または２以上のワクチン、抗原、抗体、細胞傷害剤、アレルゲン、抗生物質、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、タンパク質、遺伝子治療ベクター、ＤＮＡワクチン、アジュバント、共刺激分子またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項７〜１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
哺乳動物においてＭｙＤ８８の発現および活性を阻害するための医薬組成物であって、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＭｙＤ８８タンパク質のアンタゴニストを含む、前記医薬組成物。
【請求項２７】
ＭｙＤ８８アンタゴニストが、抗ＭｙＤ８８抗体またはその結合フラグメントもしくはペプチド模倣物、ＲＮＡベースの化合物、オリゴヌクレオチドベースの化合物、およびＭｙＤ８８活性の低分子阻害剤からなる群より選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
哺乳動物においてＭｙＤ８８の発現および活性を阻害するための医薬組成物であって、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＴＬＲ２、４、５、６、７、８または９タンパク質のアンタゴニストを含む、前記医薬組成物。
【請求項２９】
ＴＬＲアンタゴニストが、ＴＬＲ抗体またはその結合フラグメントもしくはペプチド模倣物、ＲＮＡベースの化合物、オリゴヌクレオチドベースの化合物、およびＴＬＲ活性の低分子阻害剤からなる群より選択される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
哺乳動物においてＭｙＤ８８の発現および細胞シグナル伝達活性を阻害するための医薬組成物であって、ＭｙＤ８８のｍＲＮＡに対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび細胞シグナル伝達の阻害剤を含む、前記医薬組成物。
【請求項３１】
細胞シグナル伝達の阻害剤が、キナーゼ阻害剤およびＳＴＡＴタンパク質阻害剤から選択される、請求項３０に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2011530293.tif 000011
2011530293.tif 000012
2011530293.tif 000013