(57)【要約】ＨＩＶの標的細胞への侵入を阻害する、二機能性分子が本明細書中で開示される。非Ｂおよび多剤耐性株を含むＨＩＶに感染した患者の治療のための、新規抗ＨＩＶ治療薬も開示される。１つの実施態様において、柔軟なリンカーに連結した、ポケット結合ドメインおよび７アミノ酸繰り返し（ＨＲ）結合ドメインを含む最初のＣ末端７アミノ酸繰り返し（ＣＨＲ）ペプチドを含み、次にＨＲ結合ドメインおよびトリプトファンリッチドメインを含む２番目のＣＨＲペプチドに連結する、二機能性分子が本明細書中で開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二機能性分子であって、柔軟なリンカーに連結した、ポケット結合ドメインおよび７アミノ酸繰り返し（ＨＲ）結合ドメインを含む最初のＣ末端７アミノ酸繰り返し（ＣＨＲ）ペプチドを含み、次にＨＲ結合ドメインおよびトリプトファンリッチドメインを含む２番目のＣＨＲペプチドに連結する、二機能性分子。
【請求項２】
前記最初のＣＨＲペプチドは、Ｃ３４（配列番号１１）、Ｃ３６（配列番号１２）、Ｃ３８（配列番号３）、Ｃ４６（配列番号１３）、Ｔ１１４４（配列番号４）、Ｔ１１４４−Ｃ１０（配列番号５）、シフビルチド（配列番号１４）、Ｃ３５−ＥＫ（配列番号１５）、ＣＰ６２１−６５２（配列番号１６）、ＣＰ３２Ｍ（配列番号１７）、Ｔ１２４９（配列番号１８）、ＰＢＤ−４ＨＲ（配列番号１９）、およびＣ３６Ｂ（配列番号２０）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二機能性分子。
【請求項３】
前記２番目のＣＨＲペプチドは、Ｔ２０（配列番号２）、Ｔ２０−Ａ（配列番号２２）、および４ＨＲ−ＬＢＤ（配列番号２３）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二機能性分子。
【請求項４】
前記柔軟なリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎは２および８の間の整数である、請求項１に記載の二機能性分子。
【請求項５】
前記二機能性分子の前記Ｃ末端において、アミノ酸配列ＹＳＳＧＲＩＶＴＤ（配列番号５３）またはＮＳＳＧＲＩＶＴＤ（配列番号４２）をさらに含む、請求項１に記載の二機能性分子。
【請求項６】
前記二機能性分子は、
【化４】
2011521648.tif 000011
のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二機能性分子。
【請求項７】
前記二機能性分子は、
【化５】
2011521648.tif 000012
のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二機能性分子。
【請求項８】
前記二機能性分子は、
【化６】
2011521648.tif 000013
のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の二機能性分子。
【請求項９】
前記二機能性分子は、組換えＤＮＡ技術によって産生される、請求項１に記載の二機能性分子。
【請求項１０】
前記二機能性分子は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞から成る群から選択される発現システムにおいて産生される、請求項１に記載の二機能性分子。
【請求項１１】
前記二機能性分子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて産生される、請求項９に記載の二機能性分子。
【請求項１２】
前記二機能性分子は、固体において、または溶液において合成される、請求項１に記載の二機能性分子。
【請求項１３】
前記二機能性分子は、数個の別々のセグメントとして合成され、そして次いで共に結合される、請求項１に記載の二機能性分子。
【請求項１４】
ヒト免疫不全ウイルス感染の治療における請求項１に記載の二機能性分子の使用であって、
該二機能性分子を、ヒト免疫不全ウイルスに感染した個体に投与する工程；
該ウイルスの標的細胞への侵入を阻害する工程；および
該標的細胞の該ウイルスによる感染を阻害する工程
を含む、使用。
【請求項１５】
ヒト免疫不全ウイルスによる感染の予防における請求項１に記載の二機能性分子の使用であって、
該二機能性分子を、該ヒト免疫不全ウイルスに感染するリスクのある個体に投与する工程；
該ウイルスの標的細胞への侵入を阻害する工程；および
該標的細胞の該ウイルスによる感染を阻害する工程
を含む、使用。
【請求項１６】
ヒト免疫不全ウイルス感染を治療する方法であって、
請求項１に記載の二機能性分子を、該ヒト免疫不全ウイルスに感染した個体に投与する工程；
該ウイルスの標的細胞への侵入を阻害する工程；および
該標的細胞の該ウイルスによる感染を阻害する工程
を含む、方法。
【請求項１７】
ヒト免疫不全ウイルスによる感染を予防する方法であって、
請求項１に記載の二機能性分子を、該ヒト免疫不全ウイルスに感染するリスクのある個体に投与する工程；
該ウイルスの標的細胞への侵入を阻害する工程；および
該標的細胞の該ウイルスによる感染を阻害する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本発明は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００８年５月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／０５６，５８０号の利益を主張し、この出願の全内容は、本明細書中において参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、抗ウイルス薬の分野に関連する。特に、本開示は、ヒト免疫不全ウイルスの標的細胞への侵入を阻害する、二機能性分子を含む抗ウイルス薬に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
２００７年の終わりまでに、世界中で約３３２０万人の人々が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染して生きており、そして２５００万人を超える人々が、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）のために死亡した。従って、ＨＩＶ感染に対する新しい治療戦略を発見および開発することが、緊急に必要である。今までのところ、１５個の逆転写酵素阻害剤（ＲＴＩ）、１０個のプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、１つのインテグラーゼ阻害剤（ＩＩ）、および２つの侵入阻害剤（ＥＩ）を含む、ＨＩＶに感染した人々を治療するための２８個の抗ＨＩＶ薬が米国食品医薬品局によって認可された。ＲＴＩ、ＰＩ、およびＩＩは全て、ウイルスが宿主細胞へ入った後にＨＩＶの複製を阻害するが、２つのＥＩは、宿主細胞へのＨＩＶの侵入を阻害し得る。
【０００４】
ＨＩＶの侵入は、外被糖タンパク質（Ｅｎｖ）表面サブユニットｇｐ１２０の、標的細胞上の一次受容体ＣＤ４への結合、および次いでケモカイン受容体（ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４）への結合によって開始される。これらの相互作用は、ｇｐ４１の構造的再編成を引き起こし、安定なｇｐ４１の６ヘリックス束（６−ＨＢ）コア構造の形成を引き起こし、それはウイルスおよび標的細胞膜の両方を融合のために近接させる。６−ＨＢにおいて、３つのＮ末端７アミノ酸繰り返し（ＮＨＲまたはＨＲ１）が会合して中央の三量体コイルドコイルを形成し、一方３つのＣ末端７アミノ酸繰り返し（ＣＨＲまたはＨＲ２）が、ＮＨＲ三量体の表面の高度に保存された疎水性の溝に、逆平行の様式で斜めに包まれる。各溝において、ＮＨＲ領域に、ポケット形成配列（残基５６５−５８１）によって形成される、高度に保存された疎水性の深いポケットが存在する。このポケットが、ウイルスの融合、および６−ＨＢの安定性の維持に決定的な役割を果たす。
【０００５】
ＦＤＡに認可されたＥＩの１つは、Ｔ２０（一般名：エンフビルチド、商標名：Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）［Ｔｒｉｍｅｒｉｓ］）と命名された、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１ＣＨＲ配列（ａａ６３８−６７３）に基づいてデザインされた合成ペプチドである。Ｔ２０は、ＨＲ（７アミノ酸繰り返し）結合ドメイン（ＨＢＤ）およびトリプトファン−リッチドメイン（ＴＲＤ）を含み（図１）、それを通してＴ２０はＨＲ配列、特にＮＨＲのＧＩＶモチーフ、および標的細胞膜にそれぞれ結合して、ＨＩＶの標的細胞との融合およびそれへの侵入を阻害し得る。
【０００６】
Ｔ２０治療患者における、Ｔ２０耐性ウイルスの急速な出現のために、Ｔ２０の臨床的な適用は制限される。インビトロおよびインビボの両方の研究は、Ｔ２０耐性が、ｇｐ４１ＮＨＲドメインのＧＩＶおよび隣接する領域（ａａ３６−４５）における、単一のまたは二重の変異と関連する（例えばＧ３６Ｄ、Ｉ３７Ｖ、Ｖ３８Ａ、Ｖ３８Ｅ、Ｖ３８Ｍ、Ｎ４２Ｄ、Ｎ４２Ｓ、およびＮ４３Ｄ）ことを示した。なぜなら、この領域はｇｐ４１の主な結合部位であり、そしてこれらの変異はＴ２０のウイルスｇｐ４１ＮＨＲ領域への結合に影響を与えるからである。Ｔ２０の、ＮＨＲドメインのＨＲ配列への結合は、ウイルスｇｐ４１ＣＨＲとＮＨＲ領域との間の相互作用と競合するほど十分には強力ではないので、Ｔ２０は、ウイルスｇｐ４１ＮＨＲ領域との相互作用を安定化するために、そのＣ末端ＴＲＤを、標的細胞膜と相互作用するために使用しなければならない。抗ＨＩＶ薬としてのＴ２０ペプチドの別の弱点は、高い投与量（９０ｍｇ／投薬）で１日２回注射によって投与しなければならず、ほとんどの患者において有痛性の注射部位反応を引き起こすことである。さらに、ペプチド合成の高い生産コストのために、Ｔ２０は、特に発展途上国において、使用するためには非常に高価である。
【０００７】
Ｃ３８は、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  ＣＨＲ領域のａａ６２６−６７３由来の３８マーのペプチドである。それは、ポケット結合ドメイン（ＰＢＤ）およびＨＢＤを含み（図１）、それによってＣ３８は、ウイルスｇｐ４１  ＮＨＲ領域のポケット形成配列およびＨＲ配列に結合して、安定な異種の６−ＨＢを形成し、そして融合活性ｇｐ４１コア形成を阻害する。これは、ＨＩＶの宿主細胞との融合、およびそれへの侵入の阻害を引き起こす。Ｃ３８の主な結合部位は、ａａ３６−４５領域ではなくポケット形成配列であるので、ｇｐ４１ＮＨＲドメインＴ１１４４におけるＧＩＶモチーフおよび隣接する領域の変異は、Ｃ３８の結合に重大な影響を与えない。従って、ａａ３６−４５に変異を有するウイルスは、Ｔ２０に対して耐性であるが、Ｃ３８に対して感受性である。
【０００８】
Ｔ１１４４も、ＰＢＤおよびＨＢＤを含む３８マーのペプチドである（図１）。αヘリックス性および６−ＨＢの安定性を増加させるために、および薬物動態学的性質を改善するために、Ｃ３８のアミノ酸配列を改変することによって、それをデザインした。Ｃ３８と同様、Ｔ１１４４は、Ｔ２０に対して耐性であるものを含めて、ＨＩＶ−１のＲ５およびＸ４株の両方に対して、Ｔ２０よりもはるかに有効である。
【０００９】
１つの最近の研究が、ＰＢＤｎを含むＣＨＲペプチド（例えばＣ３４、Ｃ３８、Ｔ１１４４）およびＰＢＤを欠くＣＨＲペプチド（例えばＴ２０）の組み合わせが、Ｔ２０感受性および耐性ウイルスの両方に対して、強力な相乗効果を示すことを示した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
標的細胞へのＨＩＶの侵入を阻害する二機能性分子が、本明細書中で開示される。現在の抗ＨＩＶ薬と異なる作用メカニズムによって、これらの分子を、非Ｂおよび多剤耐性株を含む、ＨＩＶに感染した患者の治療のための治療薬として使用し得る。
【００１１】
Ｔ２０および他の抗レトロウイルス薬に耐性のものを含む、ＨＩＶ−１株による感染を治療および予防するための、組換えＨＩＶ侵入阻害剤として、二機能性分子をデザインし、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいて発現した。二機能性分子はそれぞれ、ポケット結合ドメインおよびＨＲ結合ドメインを含むＣＨＲペプチド、リンカー、およびＨＲ結合配列およびトリプトファンリッチドメインから成るＣＨＲペプチドを含む。合成ＣＨＲペプチドと比較して、ＴＬＴ−１に基づく二機能性分子は、以下の利点を有する：ｉ）それらは、より強力な抗ＨＩＶ活性を有する；ｉｉ）それらは、Ｔ２０耐性ウイルスに対してより有効である；ｉｉｉ）それらを、大量にＥ．ｃｏｌｉ発現システムにおいて発現し得、従ってはるかに低い生産コストを有する；ｉｖ）それらは、タンパク質分解酵素に対してより感受性が低い；ｖ）それらは、生物学的溶液中でより安定である；およびｖｉ）それらはより強力にＮＨＲペプチドに結合して、高度に安定な６−ＨＢを形成する。
【００１２】
１つの実施態様において、柔軟なリンカーに連結した、ポケット結合ドメインおよび７アミノ酸繰り返し（ＨＲ）結合ドメインを含む最初のＣ末端７アミノ酸繰り返し（ＣＨＲ）ペプチドを含み、次にＨＲ結合ドメインおよびトリプトファンリッチドメインを含む２番目のＣＨＲペプチドに連結する、二機能性分子が本明細書中で開示される。
【００１３】
別の実施態様において、最初のＣＨＲペプチドは、Ｃ３４（配列番号１１）、Ｃ３６（配列番号１２）、Ｃ３８（配列番号３）、Ｃ４６（配列番号１３）、Ｔ１１４４（配列番号４）、Ｔ１１４４−Ｃ１０（配列番号５）、シフビルチド（配列番号１４）、Ｃ３５−ＥＫ（配列番号１５）、ＣＰ６２１−６５２（配列番号１６）、ＣＰ３２Ｍ（配列番号１７）、Ｔ１２４９（配列番号１８）、ＰＢＤ−４ＨＲ（配列番号１９）、およびＣ３６Ｂ（配列番号２０）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
別の実施態様において、２番目のＣＨＲペプチドは、Ｔ２０（配列番号２）、Ｔ２０−Ａ（配列番号２２）、および４ＨＲ−ＬＢＤ（配列番号２３）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
別の実施態様において、柔軟なリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎは２および８の間の整数である。
【００１６】
さらに別の実施態様において、その二機能性分子はさらに、二機能性分子のＣ末端において、アミノ酸配列ＹＳＳＧＲＩＶＴＤ（配列番号５３）またはＮＳＳＧＲＩＶＴＤ（配列番号４２）を含む。
【００１７】
さらに別の実施態様において、その二機能性分子は、
【００１８】
【化１】
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のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
さらに別の実施態様において、その二機能性分子は、
【００２０】
【化２】
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のアミノ酸配列を含む。
【００２１】
さらに別の実施態様において、その二機能性分子は、
【００２２】
【化３】
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のアミノ酸配列を含む。
【００２３】
別の実施態様において、その二機能性分子を、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳類細胞から成る群から選択される発現システムにおいて、組換えＤＮＡ技術によって産生する。１つの実施態様において、その二機能性分子を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて産生する。
【００２４】
別の実施態様において、その二機能性分子を、固体において、または溶液において合成する。さらに別の実施態様において、その二機能性分子を、数個の別々のセグメントとして合成し、そして次いで共に結合する。
【００２５】
本明細書中で開示された二機能性分子を、ヒト免疫不全ウイルスに感染した個体に投与する工程；ウイルスの標的細胞への侵入を阻害する工程、および標的細胞のウイルスによる感染を阻害する工程を含む、ヒト免疫不全ウイルス感染を治療する方法も、本明細書中で提供される。
【００２６】
本明細書中で開示された二機能性分子を、ヒト免疫不全ウイルスに感染するリスクのある個体に投与する工程；ウイルスの標的細胞への侵入を阻害する工程；および標的細胞のウイルスによる感染を阻害する工程を含む、ヒト免疫不全ウイルスによる感染を予防する方法も、本明細書中で提供される。
【００２７】
別の実施態様において、柔軟なリンカーに連結した、ポケット結合ドメインおよび７アミノ酸繰り返し（ＨＲ）結合ドメインを含む最初のＣ末端７アミノ酸繰り返し（ＣＨＲ）ペプチドを含み、次にＨＲ結合ドメインおよびトリプトファンリッチドメインを含む２番目のＣＨＲペプチドに連結する二機能性分子を含む、医薬組成物が提供される。別の実施態様において、その医薬組成物は、二機能性分子に加えて、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む。
【００２８】
さらに別の実施態様において、その医薬組成物は、複数の本明細書中で開示された二機能性分子を含む。別の実施態様において、その医薬組成物はさらに、少なくとも１つのさらなる抗ウイルス薬を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、二機能性ＨＩＶ侵入阻害剤のデザイン、ＨＩＶ−１ＨＸＢ２ｇｐ４１分子の概略図および代表的なＨＩＶ侵入阻害剤の配列を示す。ＦＰ、融合ペプチド；ＮＨＲ、Ｎ末端７アミノ酸繰り返し；ＣＨＲ、Ｃ末端７アミノ酸繰り返し；ＴＲ、トリプトファンリッチドメイン；ＴＭ、膜貫通ドメイン；ＣＰ、細胞質ドメイン。ＣＨＲペプチドのＰＢＤ（ポケット結合ドメイン）、ＨＢＤ（７アミノ酸繰り返し結合ドメイン）、およびＴＲＤ（トリプトファンリッチドメイン）を、それぞれ太字、イタリック体、および下線で強調する。ＮＨＲの７アミノ酸繰り返し（ＨＲ）配列、ＧＩＶモチーフ（Ｔ２０耐性の決定因子）およびポケット形成配列を、それぞれ下線、太字、およびイタリック体で強調する。
【図２】図２は、ＮＨＲおよびＣＨＲペプチドの間の相互作用を示す。ＮＨＲドメインおよびＣＨＲドメイン間の線は、それぞれＮＨＲおよびＣＨＲのｅ、ｇおよびａ、ｄ位置に位置する残基間の相互作用を示す。ＰＢＤおよびポケット形成配列の間の相互作用が、６ヘリックス束（６−ＨＢ）の安定化に決定的である。
【図３】図３は、精製したＨＩＶ侵入阻害剤のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図４】図４は、色素転移アッセイによって決定した、ＨＩＶ−１媒介の細胞−細胞融合の、ＨＩＶ侵入阻害剤による阻害を示す。
【図５】図５は、ｐ２４アッセイによって決定された、ＭＴ−２細胞における研究室適応ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ株（サブタイプＢ、Ｘ４）による感染の、ＨＩＶ侵入阻害剤による阻害を示す。
【図６】図６は、一次ＨＩＶ−１分離株（ｉｓｏｌａｔｅ）による感染の、ＨＩＶ侵入阻害剤による阻害を示す。図６Ａ−ｐ２４アッセイによって決定された、ＰＢＭＣにおける一次ＨＩＶ−１  ９２ＵＳ６５７（サブタイプＢ、Ｒ５）による感染の阻害。図６Ｂ−ｐ２４アッセイによって決定された、ＰＢＭＣにおける一次ＨＩＶ−１分離株９３ＩＮ１０１（サブタイプＣ、Ｒ５）による感染の阻害。
【図７】図７は、Ｔ２０耐性ＨＩＶ−１株、ＮＬ４−３Ｖ３８Ａ／Ｎ４２Ｇによる感染の、ＨＩＶ侵入阻害剤による阻害を示す。
【図８】図８は、ヒト血清（図８Ａ）およびＰＢＭＣ培養物（図８Ｂ）における、ＴＬＴ−１の安定性を示す。
【図９】図９は、タンパク質分解酵素プロテイナーゼＫ（図９Ａ）およびトリプシン（図９Ｂ）に対するＴＬＴ−１の感受性を示す。各サンプルを３組試験した。各実験を少なくとも１回繰り返し、そして代表的なデータのセットを、平均値±ＳＤで示す。
【図１０】図１０は、円二色性（ＣＤ）によって決定された、ＴＬＴ−１の２次構造、およびそのＮＨＲペプチドと６−ＨＢを形成する能力を示す。図１０Ａ−Ｔ１１４４、Ｔ２０、およびＴＬＴ−１のＣＤスペクトル。図１０Ｂ−Ｎ４６、Ｎ４６＋Ｔ１１４４、Ｎ４６＋Ｔ２０、Ｎ４６＋ＴＬＴ−１のＣＤスペクトル。
【図１１】図１１は、Ｎ３６との６−ＨＢの形成に関する、ＴＬＴ−１のｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ（Ｎ−ＰＡＧＥ）分析を示す。
【図１２】図１２は、ＦＮ−ＰＡＧＥ分析による、６−ＨＢ形成に対するＴＬＴ−１の阻害効果（図１２Ａ）およびＦＮ−ＰＡＧＥゲルのクーマシーブルー染色（図１２Ｂ）を示す。
【図１３】図１３Ａは、ＴＬＴ−１が、動物において高い力価の抗ＴＬＴ−１抗体を誘導しなかったことを示す。図１３Ｂは、ＴＬＴ−１の抗ＨＩＶ−１活性が、ＴＬＴ−１を投与したマウスにおいて誘導される抗体によって阻害され得なかったことを示す。
【図１４】図１４は、ＨＩＶ侵入阻害剤の推定相互作用モデルを示す。Ｔ２０成分およびＴ１１４４成分は、別々のおよび相補的な機能ドメインを含む。Ｔ１１４４は、そのＨＢＤおよびＰＢＤによって、ＮＨＲドメイン中のＨＲ配列およびポケット形成配列にそれぞれ結合して、安定な異種の６−ＨＢを形成する。Ｔ２０は、そのＨＢＤおよびＴＲＤによって、ＮＨＲのＨＲ配列および脂質膜または融合脂質とそれぞれ相互作用する。ＴＬＴ二機能性ＨＩＶ侵入阻害剤は、以下のものを含むがこれに限らない、ｇｐ４１ＮＨＲおよび脂質膜による４つの可能性のある相互作用モデルを有する：ＴＬＴは、Ｔ２０成分およびＴ１１４４成分の両方で三量体の２つの溝を占めることによって、１つのＮＨＲ三量体と相互作用し得る（モデルＩ）；ＴＬＴは、Ｔ２０成分およびＴ１１４４成分の両方で、各三量体の１つの溝を占めることによって、２つのＮＨＲ三量体と相互作用し得る（モデルＩＩ）；ＴＬＴは、Ｔ１１４４成分（モデルＩＩＩ）またはＴ２０成分（モデルＩＶ）のいずれかで、１つの溝を占めることによって、１つのＮＨＲ三量体と相互作用し得る。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（発明の詳細な説明）
（ｉ）それぞれウイルスｇｐ４１ＮＨＲ領域のポケット形成配列およびＨＲ配列に結合する、ポケット結合ドメイン（ＰＢＤ）および７アミノ酸繰り返し（ＨＲ）結合ドメイン（ＨＢＤ）を含むＣ末端７アミノ酸繰り返し（ＣＨＲ）ペプチド；（ｉｉ）それぞれウイルスｇｐ４１ＮＨＲ領域のＨＲ配列および標的細胞の脂質膜に結合する、ＨＢＤおよびトリプトファンリッチドメイン（ＴＲＤ）を含むＣＨＲペプチド；および（ｉｉｉ）これら２つの機能的ドメインが自由に動いて、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはＨＩＶ感染細胞上の対応する標的タンパク質に結合し得るように、２つのＣＨＲペプチドを連結する、１０から４０アミノ酸から成る柔軟なリンカーから成る、二機能性（キメラ）分子が、本明細書中で提示される。その二機能性分子を、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞において発現し、クロマトグラフィーによって精製し、そしてＨＩＶによる細胞−細胞融合およびＨＩＶ複製に対するその阻害活性に関して試験する。
【００３１】
【表１】
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異なる機能的ドメインを含む２つのＣＨＲペプチドを連結することによって、様々な二機能性タンパク質をデザインした。その二機能性侵入阻害剤は、１００を超えるアミノ酸残基を含み、そして従って組換えタンパク質としての産生に適当であり、そして従ってペプチド合成の高いコストを回避する。
【００３２】
代表的な二機能性ＨＩＶ侵入阻害剤ＴＬＴ−１（配列番号６）は、２つのＣＨＲペプチド、Ｔ１１４４（配列番号４）およびＴ２０（配列番号２）から成る。どちらもｇｐ４１ＮＨＲを標的とするが、異なる、および相補的な機能的ドメインを有する：Ｔ１１４４はＰＢＤおよびＨＢＤを含み、それによってＴ１１４４はウイルスｇｐ４１ＮＨＲ領域のポケット形成配列およびＨＲ配列にそれぞれ結合し、一方Ｔ２０はＨＢＤおよびＴＲＤを含み、それによってＴ２０はウイルスｇｐ４１ＮＨＲ領域のＨＲ配列および標的細胞の脂質膜とそれぞれ相互作用する。この方法において、ＴＬＴ−１はｇｐ４１ＮＨＲの溝、深いポケット、および脂質膜と同時に相互作用して、融合コアの形成を防止する。
【００３３】
３５マーのリンカーは、図１４で示した複数のモデルの少なくとも１つによって、ＴＬＴ−１のＮＨＲおよび脂質膜との相互作用のためのスペースを提供する。これらのモデルは、（ｉ）Ｔ２０成分およびＴ１１４４成分の両方で三量体の２つの溝を占めることによる、１つのＮＨＲ三量体との相互作用（モデルＩ）；（ｉｉ）Ｔ２０成分およびＴ１１４４成分の両方で、各三量体の１つの溝を占めることによる、２つのＮＨＲ三量体との相互作用；（ｉｉｉ）Ｔ１１４４成分（モデルＩＩＩ）またはＴ２０成分（モデルＩＶ）のいずれかで、１つの溝を占めることによる、１つのＮＨＲ三量体との相互作用を含むがこれに限らない。ＴＬＴ−１の２つの成分は、機能的に同等でなくてよい。例えば、Ｔ１１４４は、ＮＨＲに対してＴ２０より強力に結合する。従って、これらの相互作用モデルの１つが、他を支配し得る。
【００３４】
ＴＬＴ−１を、高い収率で、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてうまく発現し、そして高いαヘリックス含有量で安定な構造へフォールディングした。ＴＬＴ−１はＮ４６ペプチドと緊密に結合し、そして高度に熱安定性の複合体を形成する。よって、ＴＬＴ−１は６−ＨＢの形成を強力に阻害し、そしてＨＩＶ−１  ｇｐ４１による細胞−細胞融合に対して高度に活性である。
【００３５】
ＴＬＴ−１はまた、様々なＨＩＶ−１株、特にＴ−２０耐性ＨＩＶ−１株による感染に対して、低いｎＭの活性を実証した。
【００３６】
ＴＬＴ−１は、ヒト血清において、および末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の存在下で安定であり、そしてＴ２０またはＴ１１４４いずれか単独よりも、タンパク質分解に対して耐性である。高い安定性は、より長い半減期を示唆し、そして従ってこの二機能性分子は、より低い投与量において、およびより少ない投与頻度で有用であることが予測される。組換えタンパク質の産生は、合成ペプチドよりもスケールアップが容易であり、ＴＬＴ−１の生産コストはＴ２０およびＴ１１４４よりも非常に低いものであり得ることが示唆される。Ｔ２０耐性株を含む様々なＨＩＶ−１株に対する低ｎＭ活性は、ＴＬＴ−１は、Ｔ２０治療が有効でなかった患者に対する臨床試験に適当であることを示唆する。ＴＬＴ−１の投与はまた、薬剤耐性株の出現を遅らせ得る。高い抗レトロウイルスプロファイルは、ＴＬＴ−１が新世代のＨＩＶ侵入阻害剤への開発に有望なものであることを示唆する。
【００３７】
【表２】
2011521648.tif 000007
【００３８】
【表３】
2011521648.tif 000008
開示された分子のアミノ酸残基は、保存的な天然アミノ酸の置換を含む。例えば、タンパク質またはペプチドの一次配列は変化するが、通常その機能は変化しない、保存的アミノ酸置換がなされ得る。保存的アミノ酸置換は、典型的には以下のグループ内の置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシンおよびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびスレオニン；リシンおよびアルギニン；およびフェニルアラニンおよびチロシン。
【００３９】
さらに、非天然アミノ酸の置換が、開示された二機能性ペプチドの範囲内である。非天然アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸、６−アミノヘキサン酸、Ｈ−３−ニトロ−Ｔｙｒ−ＯＨ、１−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−シクロペンタンカルボン酸、４−アミノ−ピペリジン−４−カルボン酸、１１−（Ｂｏｃ−アミノ）−ウンデカン酸、７−アミノ−４−メチルクマリン、１−Ｂｏｃ−４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−ピペリジン−４−カルボン酸、１−Ｆｍｏｃ−４−（Ｆｍｏｃ−アミノ）−ピペリジン−４−カルボン酸、（ＲＳ）−３−アミノ−３−（３−ピリジル）−プロピオン酸、Ｂｐｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ｈｏｍｏａｒｇ−ＯＨ、３−マレイミド−プロピオン酸、Ｆｍｏｃ−４−（ネオペンチルオキシスルホニル）−Ａｂｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−α−アミノ−ＤＬ−Ｇｌｙ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−α−アリル−ＤＬ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｏｍｏｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｈｏｍｏｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｏｍｏｐｈｅ−ＯＨ、Ｈ−Ｈｏｍｏｐｈｅ−ＯＨ、Ｈ−ＤＬ−Ｉｓｏｓｅｒ−ＯＨ、４−アミノ−３−（２，２−ジメトキシ−エチル）−フェノール、Ｆｍｏｃ−α−アミノ−Ｄ−Ｇｌｙ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｈ−Ｄ−Ｐｒａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、スタチンＢｏｃ−フェニルスタチン、Ｈ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｈ−Ｃｙｓ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−Ｖａｌ−ＯＨを含むが、これに限らない。
【００４０】
本明細書中で開示される１つの実施態様において、ポケット結合ドメインは、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ−２のｇｐ４１のＣＨＲ領域のアミノ酸６２８−６３５（ＷＭＥＷＤＲＥＩ；配列番号９）を含む。他の実施態様において、ＰＢＤは、任意のＨＩＶ−１株、任意のＨＩＶ−２株、または任意のサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）株のＧＰ４１のＣＨＲ領域の対応するアミノ酸を含む。別の実施態様において、ＰＢＤの１から３つの残基が、他の天然アミノ酸で置換される。さらに別の実施態様において、ＰＢＤの１から３つの残基が、非天然アミノ酸で置換される。
【００４１】
本明細書中で開示される１つの実施態様において、ＨＲ結合ドメインは、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ−２のｇｐ４１のＣＨＲ領域のアミノ酸６３６−６６５（ＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫ；配列番号１０）を含む。他の実施態様において、ＨＢＤは、任意のＨＩＶ−１株、任意のＨＩＶ−２株、または任意のＳＩＶ株のＧＰ４１のＣＨＲ領域の対応するアミノ酸を含む。別の実施態様において、ＨＢＤの１から１０個の残基が、他の天然アミノ酸で置換される。さらに別の実施態様において、ＨＢＤの１から１０個の残基が、非天然アミノ酸で置換される。
【００４２】
本明細書中で開示される１つの実施態様において、トリプトファンリッチドメインは、ＨＩＶ−１株ＨＸＢ−２のｇｐ４１のＣＨＲ領域のアミノ酸６６６−６７３（ＷＡＳＬＷＮＷＦ；配列番号２１）を含む。他の実施態様において、ＴＲＤは、任意のＨＩＶ−１株、任意のＨＩＶ−２株、または任意のＳＩＶ株のＧＰ４１のＣＨＲ領域の対応するアミノ酸を含む。別の実施態様において、ＴＲＤの１から３つの残基が、他の天然アミノ酸で置換される。さらに別の実施態様において、ＴＲＤの１から３つの残基が、非天然アミノ酸で置換される。
【００４３】
本開示はまた、薬学的に許容可能な担体中に、ＨＩＶの標的細胞への侵入を阻害し得る、上記で記載した二機能性ペプチドを含む医薬組成物に向けられる。
【００４４】
開示された医薬組成物の投与量および望ましい薬剤濃度は、想定される特定の使用に依存して変動し得る。適当な投与量または投与経路の決定は、通常の医師の技術の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効な用量の決定に信頼できる指針を提供する。有効な投与量の種間スケーリングを、Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｙａｃｏｂｉら編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９、４２−９６頁の、Ｍａｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．およびＣｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ  「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」によって策定された原理に従って行い得る。本明細書中で使用される「治療的に有効な」量という用語は、例えば感染性疾患などの疾患の特定の治療を行うために必要な量を指す。「治療」は、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指し、ここでその目的は、標的となる病理学的状況または疾患を予防または遅らせる（軽減する）ことである。治療の必要がある者は、既に疾患を有する者、および疾患を有しやすい者または疾患を予防すべき者を含む。１つの実施態様において、その疾患は存在する。別の実施態様において、細胞または個体の寿命は、本明細書中で記載された方法のために延長される。
【００４５】
上記で記載した化合物を、特定の適用に適するように、ヒトを含む哺乳類への投与のために、過度の実験無しに調合し得る。さらに、組成物の適当な投与量を、標準的な用量−反応プロトコールを用いて、過度の実験無しに決定し得る。
【００４６】
よって、経口、鼻腔内、舌、舌下、頬側、および口腔内投与のためにデザインされた組成物を、当該分野で周知の手段によって、例えば不活性な希釈剤と共に、または薬学的に許容可能な担体と共に、過度の実験無しに作製し得る。その組成物は、ゼラチンカプセルに封入される、または錠剤に圧縮される。経口治療的投与の目的のために、その医薬組成物を、賦形剤と共に組み込んで、そして錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハ、チューインガム等の形態で使用し得る。「薬学的に許容可能な担体」は、任意の標準的な薬学的担体を意味する。適当な担体の例は、当該分野で周知であり、そしてリン酸緩衝生理的食塩水、Ｐｏｌｙｓｏｒｂ８０を含むリン酸緩衝生理的食塩水、水、水中油型エマルションなどのエマルション、および様々な型の湿潤剤などの、任意の標準的な薬学的担体を含み得るがこれに限らない。他の担体はまた、滅菌溶液、錠剤、コーティングした錠剤、およびカプセルを含み得る。典型的には、そのような担体は、デンプン、乳、糖、ある型の粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、タルク、植物脂肪または植物油、ゴム、グリコール、または他の公知の賦形剤などの賦形剤を含む。そのような担体はまた、香味用添加物または着色用添加物または他の成分を含み得る。そのような担体を含む組成物を、周知の従来の方法によって調合する。
【００４７】
錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等も、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、および香味料を含み得る。結合剤のいくつかの例は、微晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチンを含む。賦形剤の例は、デンプンまたはラクトースを含む。崩壊剤のいくつかの例は、アルギン酸、コーンスターチ等を含む。滑沢剤の例は、ステアリン酸マグネシウム、またはステアリン酸カリウムを含む。流動促進剤の例は、コロイド性二酸化珪素である。甘味料のいくつかの例は、ショ糖、サッカリン等を含む。香味料の例は、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香味料等を含む。これらの様々な組成物の調製に使用した材料は、薬学的に純粋および使用した量で無毒性であるべきである。
【００４８】
その化合物を、例えば静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、または皮下注射によるように、容易に非経口投与し得る。非経口投与を、化合物を溶液または懸濁液へ組み込むことによって達成し得る。そのような溶液または懸濁液はまた、注射用水、生理的塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの、滅菌希釈剤を含み得る。非経口調合物はまた、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、およびＥＤＴＡなどのキレート化剤も含み得る。酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの、張度を調整するための薬剤も加え得る。非経口調製物を、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスまたはプラスチック製の複数回投与バイアルに封入し得る。
【００４９】
直腸投与は、化合物を、医薬組成物において、直腸または大腸へ投与する工程を含む。これを、坐剤、浣腸、ゲル、クリーム、錠剤等を用いて達成し得る。坐剤調合物を、当該分野で公知の方法によって容易に作製し得る。同様に、坐剤、ゲル、圧注、クリーム、錠剤、リング等を含む膣投与形態を処方し得る。その組成物は、例えば直腸内で溶解し、そして薬剤を放出する坐剤の形態で、直腸または膣投与のために意図され得る。直腸または膣投与のための組成物は、適当な非刺激性賦形剤として、油性の基剤を含み得る。そのような基剤は、制限無しに、ラノリン、カカオバター、およびポリエチレングリコールを含む。低融点ワックスが坐剤の調製のために好ましく、ここで脂肪酸グリセリドおよび／またはカカオバターの混合物が適当なワックスである。そのワックスを融解し得、そして撹拌によってシクロヘキシルアミン化合物をそこに均一に分散させる。次いで融解した均一な混合物を、簡便なサイズの型に注ぎ、冷却し、そしてそれによって凝固させる。
【００５０】
局所投与のために意図された、開示された組成物は、溶液、エマルション、軟膏、クリーム、またはゲル基剤を適当に含み得る。例えばその基剤は、１つまたはそれを超える以下のものを含み得る：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、蜜蝋、鉱物油、水およびアルコールなどの希釈剤、および乳化剤および安定剤。局所投与のための医薬組成物に、増粘剤が存在し得る。
【００５１】
経皮投与は、皮膚を通した組成物の経皮的吸収を含む。経皮処方物は、パッチ、イオントフォレシスデバイス、軟膏、クリーム、ゲル、膏薬等を含む。
【００５２】
その組成物は、固体投薬単位または液体投薬単位の物理的形態を改変する、様々な物質を含み得る。例えば、その組成物は、活性成分の周囲にコーティングシェルを形成する物質を含み得る。コーティングシェルを形成する物質は、典型的には不活性であり、そして例えば糖、セラック、および他の腸溶性コーティング剤から選択され得る。あるいは、その活性成分を、ゼラチンカプセルまたはカシェ剤に包み得る。
【００５３】
本開示の二機能性分子組成物を、適当な投薬レジメによって、治療的に有効な量で投与し得る。当業者によって理解されるように、必要な正確な量は、被験体の種、年齢および一般的な状況、感染の重症度、特定の薬剤（単数または複数）および投与の様式に依存して被験体ごとに変動し得る。いくつかの実施態様において、被験体の体重に基づいて、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇの組成物を、１日１回またはそれを超えて投与して、望ましい治療的効果を得る。他の実施態様において、被験体の体重に基づいて、約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの組成物を、１日１回またはそれを超えて投与して、望ましい治療的効果を得る。
【００５４】
組成物の１日投与量全量を、確かな医学的判断の範囲内で、主治医が決定する。任意の特定の患者または被験体に関する、特定の治療的に有効な投与量レベルは、治療する疾患およびその疾患の重症度；採用された特定の化合物の活性；採用された特定の組成物；患者または被験体の年齢、体重、一般的な健康、性別および食事；採用された特定の化合物の投与時間、投与経路、および排泄速度；治療の期間；採用された特定の化合物と組み合わせて、または同時に使用される薬剤；および医学的分野において周知の他の因子を含む、様々な因子に依存する。
【００５５】
開示された組成物をまた、併用療法においても採用し得る。すなわち、現在開示されている組成物を、１つまたはそれを超える他の望ましい組成物、治療薬、処置、または医学的手順と同時に、その前に、またはそれに続いて投与し得る。投与される治療薬の特定の組み合わせは、主治医によって決定され、そして処置の適合性および達成される望ましい治療的効果を考慮する。組み合わせて利用される治療的に活性な薬剤を、単一の組成物、処置、または手順で一緒に投与し得る、またはあるいは、別々に投与し得ることが認識される。
【００５６】
例えば、開示された組成物を、例えば１つまたはそれを超えるヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、融合阻害剤、インテグラーゼ阻害剤、ケモカイン受容体（ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５）阻害剤、および／またはヒドロキシウレアを含むがこれに限らない、１つまたはそれを超える他のＨＩＶ阻害剤と組み合わせて投与し得る。
【００５７】
ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤は、アバカビル（ＡＢＣ；Ｚｉａｇｅｎ（登録商標））、ジダノシン（ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）；Ｖｉｄｅｘ（登録商標））、ラミブジン（３ＴＣ；Ｅｐｉｖｉｒ（登録商標））、スタブジン（ｄ４Ｔ；Ｚｅｒｉｔ（登録商標）、Ｚｅｒｉｔ  ＸＲ（登録商標））、ザルシタビン（ジデオキシシチジン（ｄｄＣ）；Ｈｉｖｉｄ（登録商標））、ジドブジン（ＺＤＶ、以前はアジドチミジン（ＡＺＴ）として公知であった；Ｒｅｔｒｏｖｉｒ（登録商標））、アバカビル、ジドブジン、およびラミブジン（Ｔｒｉｚｉｖｉｒ（登録商標））、ジドブジンおよびラミブジン（Ｃｏｍｂｉｖｉｒ（登録商標））、およびエムトリシタビン（Ｅｍｔｒｉｖａ（登録商標））を含むがこれに限らない。ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤は、テノホビルジソプロキシルフマレート（Ｖｉｒｅａｄ（登録商標））を含む。ＨＩＶに対する非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤は、ネビラピン（Ｖｉｒａｍｕｎｅ（登録商標））、メシル酸デラビルジン（Ｒｅｓｃｒｉｐｔｏｒ（登録商標））およびエファビレンツ（Ｓｕｓｔｉｖａ（登録商標））を含むがこれに限らない。
【００５８】
プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）は、アンプレナビル（Ａｇｅｎｅｒａｓｅ（登録商標））、メシル酸サキナビル（Ｆｏｒｔｏｖａｓｅ（登録商標）、Ｉｎｖｉｒａｓｅ（登録商標））、リトナビル（Ｎｏｒｖｉｒ（登録商標））、硫酸インジナビル（Ｃｒｉｘｉｖａｎ（登録商標））、メシル酸ネルフィナビル（ｎｅｌｆｍａｖｉｒ  ｍｅｓｙｌａｔｅ）（Ｖｉｒａｃｅｐｔ（登録商標））、ロピナビルおよびリトナビル（Ｋａｌｅｔｒａ（登録商標））、アタザナビル（Ｒｅｙａｔａｚ（登録商標））、およびホスアンプレナビル（Ｌｅｘｉｖａ（登録商標））を含む。アタザナビルおよびホスアンプレナビル（Ｌｅｘｉｖａ）は、ＨＩＶ−１感染の治療のために、米国食品医薬品局によって最近認可された、新しいプロテアーゼ阻害剤である（ａｔａｚａｎａｖｉｒ（Ｒｅｙａｔａｚ）  ａｎｄ  ｅｍｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ（Ｅｍｔｒｉｖａ）  ｆｏｒ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒ  ｏｎ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ｗｗｗ．ｍｅｄｌｅｔｔｅｒ．ｃｏｍからオンラインで入手可能；Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（２００３）、Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ａｄｕｌｔｓ  ａｎｄ  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ；ａｉｄｓｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓからオンラインで入手可能、を参照のこと）。
【００５９】
融合／侵入阻害剤は、ＣＤ４＋細胞（白血球の型）の外側またはＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４などの共受容体、またはｇｐ４１およびｇｐ１２０などのウイルス膜タンパク質へ結合する。融合／侵入阻害剤は、ウイルスおよび細胞の間の融合が起こること、またはウイルスの細胞への侵入を予防し、そして従って、ＨＩＶ感染および増殖を予防する。融合／侵入阻害剤は、エンフビルチド（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標））およびマラビロク（Ｓｅｌｚｅｎｔｒｙ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）を含むがこれに限らない。
【００６０】
インテグラーゼ阻害剤は、インテグラーゼの作用を阻害し、ＨＩＶ−１の遺伝物質が、宿主ＤＮＡへ組み込まれるのを防止し、そしてそれによってウイルスの複製を停止する。インテグラーゼ阻害剤は、ラルテグラビル（Ｉｓｅｎｔｒｅｓｓ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）；およびエルビテグラビル（ＧＳ９１３７、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むがこれに限らない。
【００６１】
あるいはまたはさらに、本明細書中で開示された組成物を、１つまたはそれを超える感染症治療薬（例えば抗生物質等）、鎮痛薬、または免疫無防備状態の個体において通常見出されるが、ＨＩＶによって直接引き起こされるのではない、１つまたはそれを超える疾患、障害、または状態の症状に取り組むことを意図した他の薬剤と組み合わせて投与し得る。
【実施例】
【００６２】
開示された二機能性分子の実施態様を実証するために、以下の実施例が含まれる。以下の実施例で開示される技術は、発明者らによって、本開示の実施においてよく機能することが発見された技術を示し、そして従ってその実施のための好ましい様式を構成すると考え得ることが、当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示された特定の実施態様において、多くの変更をなし得、そして依然として本発明の精神および範囲から離れることなく同様のまたは類似の結果を得ることを認識するべきである。
【００６３】
実施例１
二機能性分子ＴＬＴ−１の発現、精製、および特徴付け
典型的な二機能性分子ＴＬＴ−１のための発現プラスミドを創製するために、ｐＴＬＴ−１、Ｔ１１４４をコードするＤＮＡ断片、３５マーのリンカー（ＧＧＧＧＳ）７、およびＴ２０を、３段階のオーバーラップＰＣＲによっていっしょに連結した。まず、Ｔ１１４４、Ｌ３５、およびＴ２０  ＤＮＡ断片を、表４で記載したような対応するプライマーペアを用いたオーバーラップＰＣＲによって産生した。２番目に、Ｌ３５およびＴ２０をコードするＤＮＡ断片を、プライマーＦＬ３５およびプライマーＲＴ２０を用いるオーバーラップＰＣＲによって連結した。３番目に、Ｔ１１４４およびＬ３５−Ｔ２０をコードする２つのＤＮＡ断片を、プライマーＦＴ１１４４およびＲＴ２０を用いるオーバーラップＰＣＲによって連結した。最後に、Ｔ１１４４−Ｌ３５−Ｔ２０をコードする増幅ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩによって消化し、そして発現ベクターｐＧＥＸ−６ｐ−１へ挿入して、ｐＴＬＴ−１プラスミドを産生した。
【００６４】
【表４】
2011521648.tif 000009
ＴＬＴ−１融合ペプチドを発現するために、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、ｐＴＬＴ−１で形質転換し、３７℃でＯＤ６００＝０．４になるまで培養し、次いで４時間誘導した。細胞を回収し、そしてプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ）の存在下で、超音波処理によって溶解した。遠心後、ＴＬＴ−１−ＧＳＴ融合タンパク質を含む上清を回収した。次いで、ＴＬＴ−１−ＧＳＴを、グルタチオン−セファロース４Ｂアフィニティーカラムを用いて精製し、そしてＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎＴＭプロテアーゼ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で切断して、ＧＳＴから二機能性タンパク質を放出した。次いでその二機能性タンパク質を、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によって精製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【００６５】
典型的な二機能性分子であるＴＬＴ−１は、３８マーのＴ１１４４（ＴＴＷＥＡＷＤＲＡＩＡＥＹＡＡＲＩＥＡＬＬＲＡＬＱＥＱＱＥＫＮＥＡＡＬＲＥＬ；配列番号４）、３５マーのリンカー［（ＧＧＧＧＳ）７；配列番号４０］、および３６マーのＴ２０（ＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫＷＡＳＬＷＮＷＦ；配列番号２）から成っていた。できたベクターの配列決定は、３つの異なるベクターが産生されたことを示した。３つは全て、Ｎ末端に５つの付加的アミノ酸残基（ＧＰＬＧＳ）を有していた。２つのプラスミドは、そのタンパク質配列がまた、Ｃ末端に９つの付加的アミノ酸残基（ＹＳＳＧＲＩＶＴＤ［配列番号５３］またはＮＳＳＧＲＩＶＴＤ［配列番号４２］）を有することを示した。１つのプラスミドは、Ｃ末端に付加的な９つの付加的アミノ酸残基を有していなかったが、予測される３５マーのリンカーではなく、３０マーのリンカー（配列番号３９）を含んでいた。これらの３つのプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、異なる発現効率を実証する、すなわち３０マーのリンカーと共にＴＬＴ−１遺伝子を有するベクターは、細菌においてあまり発現せず、一方Ｃ末端に９つのさらなるアミノ酸を有する他の２つは、よりよく発現した。ＹＳＳＧＲＩＶＴＤを有するプラスミドを、さらなる研究のために代表的な二機能性分子として選択した。精製二機能性ペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって約１２ｋＤの分子量を実証した（図３）。
【００６６】
実施例２
ＴＬＴ−１の抗ＨＩＶ活性
ＴＬＴ−１は、実験室適応ＨＩＶ−１株および一次ＨＩＶ−１株によるＨＩＶ−１媒介の細胞−細胞融合および感染の阻害において、高度に活性であった。
【００６７】
ＨＩＶ−１媒介の細胞−細胞融合を、エフェクター細胞としてＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ−標識ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢを慢性的に感染させたＨ９（Ｈ９／ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ）細胞、および標的細胞としてＭＴ−２細胞を使用した、色素移行アッセイ（Ｌｕ  Ｈら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０７：１５５−１６１、２００３）によって決定した。キメラによる細胞−細胞融合の阻害パーセントを計算し、そして５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを用いて計算した。図４および表５において示すように、ＴＬＴ−１は、ＨＩＶ−１媒介の細胞−細胞融合の阻害において、低ｎＭレベルのＩＣ５０で高度に有効であり、Ｔ２０より優れ、そして現在最も強力なＨＩＶ−１融合阻害剤であるＴ１１４４とほとんど同等であった。
【００６８】
ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ感染に対する二機能性分子の阻害活性を、ｐ２４産生に関するＥＬＩＳＡによって決定した（Ｊｉａｎｇ  Ｓら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７４：１５５７−１５６３、１９９１）。簡単には、連続的な２倍希釈の抗原特異的抗血清またはＩｇＧ抗体の存在下または非存在下で、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、ＭＴ−２細胞を、１００ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養物感染量）で、３７℃で一晩ＨＩＶ−１ＩＩＩＢに感染させた。次いで培養上清を除去し、そして新しい培地を加えた。感染後４日目に、培養上清を回収し、そしてｐ２４タンパク質ＥＬＩＳＡにおける検出のために、等容量の５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と混合した。ＴＬＴ−１はまた、ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢの感染の阻害において、１１ｎＭのＩＣ５０で高度に強力であり、Ｔ２０の６倍を超えて優れていた（図５および表５）。
【００６９】
【表５】
2011521648.tif 000010
一次ＨＩＶ−１分離株９２ＵＳ６５７（サブタイプＢ、Ｘ５）および９３ＩＮ１０１（サブタイプＣ、Ｘ５）による感染に対する二機能性分子の阻害活性を決定した（Ｊｉａｎｇ  Ｓら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４８：４３４９−４３５９、２００４）。簡単には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、標準的な密度勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７、Ｓｉｇｍａ）遠心分離を用いて、健康なドナーの血液から単離した。３７℃で２時間インキュベートした後、非接着性細胞を回収し、そして１０％ＦＢＳ、５μｇのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）／ｍｌ、および１００ＵのＩＬ−２／ｍｌを含むＲＰＭＩ  １６４０培地に５×１０５／ｍｌで再懸濁し、続いて３７℃で３日間インキュベートした。ＰＨＡ刺激細胞に、連続２倍希釈の抗血清の非存在下または存在下で、対応する一次ＨＩＶ−１分離株を、０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染７日後に上清を回収し、そして上記で記載したように、ＥＬＩＳＡによってｐ２４抗原に関して試験した。上記で記載したように、ＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアを用いてＩＣ５０を計算した。図６および表５に示すように、ＴＬＴ−１は、一次ＨＩＶ−１分離株９２ＵＳ６５７および９３ＩＮ１０１両方による感染を、低ｎＭレベルのＩＣ５０で、用量依存性の様式（ｍａｎｏｒ）で顕著に阻害した。
【００７０】
ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３Ｖ３８Ｅ／Ｎ４２Ｓ（Ｔ２０耐性変異体）による感染に対する二機能性分子の阻害活性を、ルシフェラーゼ活性によって決定した（Ｎｅｕｒａｔｈ  ＡＲら、ＢＭＣ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２：６、２００２）。簡単には、２×１０５または５×１０５のＣＥＭｘ１７４  ５．２５Ｍ７細胞に、段階的な濃度の抗血清または精製ＩｇＧ抗体の非存在下または存在下で、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中で、１００ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養物感染量）で、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２をそれぞれ一晩感染させた。感染後４日目に、細胞を回収し、そして溶解緩衝剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて溶解した。Ｕｌｔｒａ  ３８４ルミノメーターリーダー（Ｔｅｃａｎ）によってルシフェラーゼ活性を測定し、そして阻害パーセントを計算した。ＴＬＴ−１は、Ｔ２０耐性株による感染の阻害において、５ｎＭのＩＣ５０で高度に有効であり、一方Ｔ２０は２，０００ｎＭまでの濃度で阻害を示さなかった（図７および表５）。
【００７１】
実施例３
ＴＬＴ−１の安定性
インビトロにおける安定性を試験するために、ＴＬＴ−１、Ｔ２０、またはＴ１１４４（最終濃度１６μＭ）を、ＰＢＭＣ（１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０中）またはヒト血清（１００％）とそれぞれ３７℃でインキュベートした。異なる間隔でサンプルを回収し、そして上記で記載したように、細胞−細胞融合阻害アッセイを用いて、活性成分の残存濃度に関して試験した。ＴＬＴ−１は、ヒト血清およびＰＢＭＣの存在下で安定であり、そしてＴ１１４４およびＴ２０よりもタンパク質分解に対してより抵抗性であった。ＴＬＴ−１の安定性を、まずヒト血清およびＰＢＭＣの存在下でアッセイし、そしてＴ２０およびＴ１１４４のそれと比較した。試験した３つのペプチドは全て、ヒト血清において安定であり、そして４日までの間完全に活性であり（図８Ａ）、そしてその後活性を失い始めた；ＴＬＴ−１は６日後に４０％の活性を維持し、それぞれ２０％および５％の残存活性を有するＴ１１４４およびＴ２０よりも安定であった。Ｔ２０はＰＢＭＣ中で２日後に活性を失い始め、そして６日間のインキュベーション後９０％を超える活性を失い、一方Ｔ１１４４およびＴＬＴ−１は、ＰＢＭＣアッセイの間には活性の喪失を示さなかった（図８Ｂ）。
【００７２】
タンパク質分解に対する抵抗性を決定するために、二機能性タンパク質ＴＬＴ−１およびペプチドＴ２０およびＴ１１４４を、ＰＢＳ中に溶解し（最終濃度４μＭ）、そして０．１ユニット／ｍｌのアガロースビーズ固定化プロテイナーゼＫ、または１ユニット／ｍｌのトリプシンと、それぞれ３７℃でインキュベートした。サンプルを様々な間隔で回収し、続いて細胞融合阻害アッセイを用いて、活性タンパク質またはペプチドの残存濃度を測定した。図９に示すように、Ｔ２０はプロテイナーゼＫによる５分の処理後、完全にその活性を失い、そしてＴ１１４４およびＴＬＴ−１は、プロテイナーゼＫの処理で１５分まで安定であり、そしてその後活性を失い始め、そして同様の分解曲線を示した。３つのペプチドは全て、トリプシンにおいて時間依存性の活性の喪失を示したが、ＴＬＴ−１は、トリプシンテストにおいてよりなだらかな分解曲線で、Ｔ２０およびＴ１１４４よりも安定であった。
【００７３】
実施例４
ＴＬＴ−１の２次元構造
ＴＬＴ−１は、高いαヘリックス含有量で、構築されたタンパク質へフォールディングし、そしてＮ−ペプチドと共に高度に熱安定性の複合体を形成する。円二色性（ＣＤ）を用いて、タンパク質およびペプチド２次構造の変化を研究した。２つのペプチドの相互作用誘導２次構造の変化を決定するために、混合物のＣＤおよび同じ濃度における個々のペプチドのものを測定し、そして混合物のＣＤスペクトルと２つの別々のペプチドのスペクトルをあわせたものとを比較した。
【００７４】
二機能性分子、または同じモル濃度のＮ４６を含むその混合物を５０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２に溶解し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。最終的なペプチド濃度は１０μＭであった。個々のペプチドおよびペプチド混合物のＣＤスペクトルを、０．１ｎｍの分解能の５．０ｎｍのバンド、０．１−ｃｍの光路長、４．０−ｓの反応時間、および５０ｎｍ／分のスキャン速度を用いて、室温において、Ｊａｓｃｏ分光偏光計（Ｍｏｄｅｌ  Ｊ−７１５、Ｊａｓｃｏ  Ｉｎｃ．、Ｊａｐａｎ）で得た。そのスペクトルを、溶媒に対応するブランクを引くことによって補正した。２２２ｎｍにおける平均残基楕円率を、１００％のヘリックス形成に関して予測される値（３３，０００  ｄｅｇｒｅｅ・ｃｍ２・ｄｍｏｌ−１）で割ることによって、ＣＤシグナルからαヘリックス含有量を計算した。熱変性を、４−９８℃の範囲で２℃／分の熱勾配を適用することによって、２２２ｎｍでモニターした。可逆性を決定するために、ペプチド混合物を４℃まで冷却し、そして４℃で３０分間ＣＤチャンバーに維持し、続いて上記で記載したように熱変性をモニターした。Ｔ２０は溶液中で不定形であった（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）が、Ｔ１１４４は、溶液中で約８０％の計算された螺旋性を有する、典型的なαヘリックス構造を形成した。ＴＬＴ−１は、Ｔ２０およびＴ１１４４よりもはるかに高いヘリックス含有量を有していた（図１０Ａ）。以前の観察と一致して、Ｔ２０はＮ４６と６−ＨＢを形成できなかったが、Ｔ１１４４はＮ４６と相互作用して安定な６−ＨＢを形成し得た。印象的なことに、二機能性分子ＴＬＴ−１は、Ｎ４６に強く結合し、そしてＰＢＳ中で非常に安定な複合体を形成した（図１０Ｂ）。
【００７５】
ＮペプチドおよびＣペプチドの間の６−ＨＢの形成を決定するために、未変性（ｎａｔｉｖｅ）−ＰＡＧＥ（Ｎ−ＰＡＧＥ）を行った。Ｎペプチド（Ｎ３６）を、４０μＭの最終濃度でＣペプチドと混合し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。その混合物を、２５μｌ／ウェルで、等容量のＴｒｉｓｇｌｙｃｉｎｅ未変性サンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、１０×１．０ｃｍの成形済み１８％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にのせた。室温で２時間、１２５Ｖの定電圧で、ゲル電気泳動を行った。次いでゲルをクーマシーブルーで染色し、そしてＦｌｕｏｒＣｈｅｍ８８００イメージングシステム（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）で画像化した。Ｎ−ＰＡＧＥは、Ｔ１１４４と同様、ＴＬＴ−１はＮ３６と６−ＨＢを形成し得ることを示した（図１１）。
【００７６】
実施例５
ＴＬＴ−１は、６−ヘリックス束の形成を阻害する
ＴＬＴ−１の６−ＨＢ形成を防止する能力を、蛍光Ｃ３４−ＦＡＭプローブを用いた蛍光Ｎ−ＰＡＧＥ（ＦＮ−ＰＡＧＥ）によって決定した。図１２に示すように、Ｃ３４−ＦＡＭは、Ｎ３６と安定な６−ＨＢを形成した。Ｔ２０、Ｔ１１４４、およびＴＬＴ−１のＣ３４−ＦＡＭ／Ｎ３６  ６−ＨＢ形成を阻害する能力も試験した。Ｔ２０は、Ｃ３４またはＮ３６と競合して６−ＨＢ形成を防止することはできなかった。Ｔ１１４４は、Ｃ３４−ＦＡＭと競合することによって、Ｃ３４−ＦＡＭ／Ｎ３６  ６−ＨＢ形成を完全に防止して、Ｎ３６と安定な複合体を形成した。ＴＬＴ−１は、Ｃ３４−ＦＡＭ／Ｎ３６  ６−ＨＢ形成を強力に防止し、そしてＮ３６と複合体を形成した。重要なことに、Ｎ３６／ＴＬＴ−１／Ｃ３４−ＦＡＭ混合物において、速い移動速度を有する新しい蛍光バンドが見られた。そのバンドは、Ｎ３６を含まないＣ３４−ＦＡＭおよびＴＬＴの混合物から成る、ＴＬＴ−１／Ｃ３４−ＦＡＭ複合体と確認された（データは示していない）。速い移動速度は、ＴＬＴ−１／Ｃ３４−ＦＡＭがコンパクトな構造にフォールディングされ、そしてゲル中をより自由に移動することを示唆した。
【００７７】
実施例６
ＴＬＴ−１はそれほど免疫原性ではない
ＴＬＴ−１は、分子量１２ｋＤ程度のよくフォールディングされたタンパク質であり、そして従ってその抗原性を評価した。マウスをＴ２０、Ｔ１１４４およびＴＬＴ−１で免疫し、１０日後に２回追加免疫し、そして３０日後に抗体レベルをチェックした。３つのペプチド全てに関して、非常に弱い抗体反応が観察され、そしてＴＬＴ−１はＴ２０およびＴ１１４４よりもさらに低い免疫原性を示した（図１３Ａ）。Ｔ２０、Ｔ１１４４およびＴＬＴ−１で免疫したマウス由来の抗血清は、ＨＩＶ−１媒介の細胞−細胞融合に対していかなる阻害も示さず（図１３Ｂ）、ＴＬＴ−１を投与したマウスにおける弱い抗ＴＬＴ−１抗体反応は、ＴＬＴ−１の抗ＨＩＶ活性を抑制し得ないことを確認した。
【００７８】
他に示されなければ、本明細書および特許請求の範囲で使用される、成分の量、分子量などの性質、反応条件等を表す全ての数字は、「約」という用語によって、全ての場合において改変されることが理解される。よって、反対であることを指示する場合を除いて、本明細書および添付の特許請求の範囲において述べる数字のパラメーターは、本発明によって得ようとする望ましい性質に依存して変動し得る近似である。少なくとも、そして請求の範囲に対する同等物の原則の適用を制限する試みとしてではなく、数字パラメーターはそれぞれ、少なくとも報告された有意な数字の数を考えて、および通常のまるめの技術を適用することによって解釈されるべきである。本発明の広い範囲を述べる数字の範囲およびパラメーターは近似であるにもかかわらず、特定の実施例において述べる数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、任意の数値は、必ずそのそれぞれの試験測定値において見出される標準偏差から生じる、ある誤差を内在的に含む。
【００７９】
本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求範囲の文脈）において使用される、「ａ」、「ａｎ」「ｔｈｅ」という用語、および同様の指示対象は、本明細書中で他に指示する場合を除いて、または明らかに文脈によって否定されなければ、単数および複数形を両方含むと解釈される。本明細書中における値の範囲の引用は、単に、その範囲にはいる別々の値それぞれに個々に言及する、略式の方法となることが意図される。本明細書中で他に指示する場合を除いて、個々の値それぞれは、それが個々に本明細書中で引用されたかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書中で他に示されなければ、または他に明らかに文脈によって否定されなければ、本明細書中で記載された全ての方法を、任意の適当な順序で行い得る。本明細書中で提供される、任意のおよび全ての実施例、または典型的な言語（例えば「〜などの」）の使用は、単に、本発明をより良く明らかにすることが意図され、そして他に請求される本発明の範囲に対して制限を設けない。本明細書中の言語は、本発明の実施に必須の、任意の請求されない要素を示すと解釈されるべきでない。
【００８０】
本明細書中で開示される本発明の代替要素または実施態様のグループ化は、制限として解釈されない。グループのメンバーはそれぞれ、個々に、またはグループの他のメンバーまたは本明細書中で見出される他の要素との任意の組み合わせで言及および請求され得る。グループの１つまたはそれを超えるメンバーを、利便性および／または特許性の理由で、グループへ含み得る、またはそこから消去し得ることが予想される。任意のそのような含有または消去が起こる場合、本明細書は改変されたようにそのグループを含むと考えられ、従って添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュグループの書かれた記載を満たす。
【００８１】
本明細書中で開示された特定の実施態様はさらに、〜から成る、または実質的に〜から成るという言語を用いて、本特許請求の範囲において制限され得る。本特許請求の範囲において使用する場合、出願時かまたは修正によって加えたかに関わらず、「〜から成る」という移行語句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｒｍ）は、本特許請求の範囲において特定されない任意の要素、工程、または成分を除外する。「実質的に〜から成る」という移行語句は、請求の範囲を、特定の物質または工程、および基本的および新規特徴（単数または複数）に物質的に影響を与えないものに制限する。そのように請求された本発明の実施態様は、本明細書中で生得的にまたは明白に記載または可能にされる。
【００８２】
本発明を実施するために発明者らに公知である最良の方法を含む、本発明のある特定の実施態様を、本明細書中で記載する。もちろん、これらの記載された実施態様に対する変形物が、前述の記載を読むときに、当業者に明らかとなる。本発明者は、当業者がそのような変形物を適当なように採用することを予測し、そして本発明者らは本発明が本明細書中で明確に記載されたのとは違う方法で実施されることを意図する。よって、本発明は、適用可能な法律によって許される限り、ここに添付された特許請求の範囲において引用された内容の全ての改変物および同等物を含む。さらに、本明細書中で他に指示する場合を除いて、または他に明らかに文脈によって否定される場合を除いて、その全ての可能な変形物の、上記で記載した要素の任意の組み合わせが、本発明によって含まれる。
【００８３】
さらに、本明細書を通じて、特許および印刷された出版物に対する多数の言及がなされた。上記で述べた参考文献および印刷された出版物はそれぞれ、その全体として個々に本明細書中で参考文献に組み込まれる。
【００８４】
終わりに、本明細書中で開示された本発明の実施態様は、本発明の原則を説明することが理解される。採用し得る他の改変が、本発明の範囲内である。従って、制限としてではなく、例として、本発明の代替の形態を、本明細書中の教示に従って利用し得る。よって、本発明は、示された、および記載されたように正確には制限されない。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年1月11日(2011.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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