(57)【要約】本発明は、細胞外ドメイン４または５内のヒトＦＬＴ３に対して高親和性にて特異的に結合する完全ヒト抗体を提供する。本発明は、更に、有効量の抗体を単体にて投与するか、あるいは、抗癌剤またはメトトレキサートを含む治療薬と組み合わせて投与することにより、白血病を処置する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＦＬＴ３（配列番号４３）に特異的に結合する抗体であって、配列ＳＹＹＭＨ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ１、配列ＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ２、配列ＧＶＧＡＨＤＡＦＤＩ（配列番号４）または配列ＶＶＡＡＡＶＡＤＹ（配列番号５）を有するＣＤＲＨ３、配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＮＹＬＤ（配列番号６）または配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号７）を有するＣＤＲＬ１、配列ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号８）を有するＣＤＲＬ２、および配列ＭＱＧＴＨＰＡＩＳ（配列番号９）または配列ＭＱＳＬＱＴＰＦＴ（配列番号１１）を有するＣＤＲＬ３を含むものである、抗体。
【請求項２】
配列ＳＹＹＭＨ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ１、配列ＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ２、配列ＧＶＧＡＨＤＡＦＤＩ（配列番号４）を有するＣＤＲＨ３、配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＮＹＬＤ（配列番号６）を有するＣＤＲＬ１、配列ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号８）を有するＣＤＲＬ２、および配列ＭＱＧＴＨＰＡＩＳ（配列番号９）を有するＣＤＲＬ３を含むものである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
アミノ酸配列：
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＤＴＤＦＴＬＱＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＴＨＰＡＩＳＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ（配列番号２２）
を含むＶＬ、および
アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＧＡＨＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１９）
を含むＶＨ
を含むものである、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものである、請求項１から３のうちのいずれか１つに記載の抗体。
【請求項５】
配列番号２５のアミノ酸配列を各々含む２つの重鎖および配列番号２８のアミノ酸配列を各々含む２つの重鎖を含むものである、請求項１から４のうちのいずれか１つに記載の抗体。
【請求項６】
アミノ酸配列：
ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＳＬＱＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ（配列番号２４）
を含むＶＬ、および
アミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＡＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＶＡＡＡＶＡＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２１）
を含むＶＨ
を含むものである、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１から６のうちのいずれか１つに記載される抗体のうちのいずれかのフラグメントであって、ヒトＦＬＴ３に特異的に結合するものである、フラグメント。
【請求項８】
請求項１から７のうちいずれか１つに記載の抗体またはフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むものである、単離されたポリ核酸。
【請求項９】
コードされた抗体またはフラグメントが発現できるように発現制御エレメントと作動可能に結合された、請求項８に記載のポリ核酸を含む発現ベクター。
【請求項１０】
組み換え細胞が、請求項１から７のうちのいずれか１つに記載の抗体またはフラグメントを産生可能である、請求項９に記載の発現ベクターを含む組み換え細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組み換え細胞を、抗体またはフラグメントが産生されるように培養し、次いで抗体またはフラグメントを培養物から回収することにより産生される、抗体またはフラグメント。
【請求項１２】
薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、または賦形剤と一緒に、請求項１から７または１１のうちのいずれか１つに記載される抗体またはフラグメントを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
医薬として用いるための、請求項１から７または１１のうちのいずれか１つに記載される抗体またはフラグメント。
【請求項１４】
癌の処置における使用のための、請求項１から７または１１のうちのいずれか１つに記載される抗体またはフラグメント。
【請求項１５】
癌が白血病である、請求項１４に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１６】
請求項１から７または１１のうちのいずれか１つに記載の抗体またはフラグメント、ならびに治療において同時に、別々に、または連続的に使用するために組み合わされる更なる抗癌剤または処置を含む、製品。
【請求項１７】
請求項１６に記載された製品において、上記抗癌剤は、メトトレキサートであることを特徴とする、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年５月３０日に出願された、米国仮出願第６１／１３０，３９５号、第６１／１３０，５３９号、および、第６１／１０３，３９４号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ヒトＦｍｓ様チロシンキナーゼ３受容体（ＦＬＴ３）に特異的なフラグメントまたはその部分を含むヒト抗体に関する。抗体は、癌細胞の成長を処置するために使用され、また、白血病の治療のために単体で使用され得るか、または、メトトレキサート（ＭＸＴ）を含む（これに限定されない）抗腫瘍剤と組み合わせて使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
ヒトＦｍｓ様チロシンキナーゼ３受容体（ＦＬＴ３）はまた、胎児肝臓キナーゼ２（ＦＬＫ−２）、幹細胞チロシンキナーゼ１（ＳＴＫ−１）、および、ＣＤ１３５（配列番号４３）としても知られており、クラスＩＩＩ受容体チロシンキナーゼのメンバーである。通常、ＦＬＴ３は、未熟骨髄リンパ球性前駆細胞および樹状細胞前駆細胞上で発現するが、成熟成体細胞上ではめったに発現しない。ＦＬＴ３は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の約９０％、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）の過半数、および、慢性骨髄性白血病（ＢＣ−ＣＭＬ）の急性転化期において、過剰発現する。ＦＬＴ３リガンド（ＦＬ）による刺激は、白血病細胞の増殖および生存を促進する。ＦＬＴ３シグナル伝達の阻害は、樹状細胞におけるアポトーシスおよび免疫反応の阻害を誘発する。
【０００４】
低分子阻害剤は、完全にＦＬＴ３に特異的ではなく、薬剤耐性を生じ得る。したがって、低分子ＦＬＴ３阻害剤は未だ、白血病に対する有効的な標的療法を提供していない。この未だ満たされていない医学的ニーズに対する新規治療が非常に望まれている。抗体アプローチは、低分子ＦＬＴ３阻害剤に関連するいくつかの欠点を克服し得る。第１に、抗体は、所定の抗原に対して特異的であるので、多数のキナーゼの阻害により生じる潜在的な副作用を防ぐ。第２に、ＦＬＴ３中和抗体は、キナーゼドメインに比べ変異しない傾向にあり、薬剤耐性の可能性を軽減する、細胞外ドメインを標的としている。第３に、抗体は、免疫エフェクター機構（例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または補体媒介毒性（ＣＭＣ））を採用し得るので、標的腫瘍細胞を殺し、その結果、治療効果を向上させる。最後に、ＦＬＴ３特異的抗体は、野生型（特に、中和抗体の場合）および変異ＦＬＴ３（免疫エフェクター機構が要因）の両方に対して活性があり得るので、標的患者数を広げている。
【０００５】
ＦＬＴ３阻害剤を含む白血病の治療の開発に関する過去の努力（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）は、概して成功していない。他の開発戦略としては、特許文献１（ハイブリドーマ抗体）、特許文献２（アゴニスト抗体）、特許文献３（リガンドに対する抗体）、特許文献４（低分子）が挙げられる。
【０００６】
非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、および、非特許文献１０は、ＦＬＴ３受容体に対して高い結合親和性を有するヒトのアンタゴニスト抗体を開示する。
【０００７】
ＥＢ１０、ＮＣ７およびＤ４−３を含む幾つかの抗ＦＬＴ３抗体は、リガンド依存性（野生型受容体）およびリガンド非依存性（変異受容体）の両方のＦＬＴ３活性を阻害する（上記非特許文献６参照）。本発明に至るまで、本発明の抗ＦＬＴ３抗体における正確なＣＤＲ配列およびエピトープ結合ドメインは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，７７７，０８４号明細書
【特許文献２】国際公開第９５／２７０６２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９４／２８３９１号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００５／０９４８２３号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌｉ  Ｙ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．８２（２）：１０８−１４（２００５）
【非特許文献２】Ｌｉ  Ｙ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７（６）：４９５−５００（２００６）
【非特許文献３】Ｌｉ  Ｙ．ら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７（３）：３１９−３３０（２００７）
【非特許文献４】Ｚｈｅｎｇ  Ｒ．ら，Ｂｌｏｏｄ  １０３（１）：２６７−２７４（２００４）
【非特許文献５】Ｌｉ  Ｙ．ら，Ｂｌｏｏｄ  １０４（４）：１１３７−４４（２００４）
【非特許文献６】Ｐｉｌｏｔｏ，Ｏ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５（４）：１５１４−２２（２００５）
【非特許文献７】Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｂ．ら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １９（８）：１４３２−８（２００５）
【非特許文献８】Ｐｉｌｏｔｏ  Ｏ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６６（９）：４８４３−５１（２００６）
【非特許文献９】Ｐｉｌｏｔｏ  Ｏ．ら，Ｂｌｏｏｄ  １０９（４）：１６４３−１６５２（２００７）
【非特許文献１０】Ｂｒｅｎｔ  Ｒ．ら，ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ２００７，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
加えて、当該技術分野における公知の阻害剤と比べて、ＦＬＴ３に対する高い結合親和性を有し、かつ、ＦＬＴ３受容体に対するリガンドの結合を遮断することで、ＦＬＴ３の活性化およびそのシグナル伝達経路を阻害する、代替抗ＦＬＴ３阻害剤を提供する必要がある。本発明は、当該技術分野における公知の阻害剤と比べて、ＦＬＴ３に対する改善されたリガンド遮断および結合親和性を有する、代替抗ＦＬＴ３抗体を提供することを目指している。
【００１１】
また、細胞表面ＦＬＴ３における迅速かつ効率的な内在化および抑制的調節を誘導する代替抗ＦＬＴ３阻害剤を提供する必要がある。本発明は、当該技術分野における公知の阻害剤と比べて、細胞表面ＦＬＴ３における迅速かつ効率的な内在化および抑制的調節を誘導するヒト抗ＦＬＴ３阻害剤を提供することを目指している。
【００１２】
また、白血病において、野生型ＦＬＴ３のＦＬ誘導リン酸化、ならびに、ＭＰＫ、ＰＩ３ＫおよびＳＴＡＴ５の経路の下流キナーゼを阻害する代替抗ＦＬＴ３阻害剤を提供する必要がある。本発明は、当該技術分野における公知の阻害剤と比べて、白血病において、野生型ＦＬＴ３のＦＬ誘導リン酸化、ならびに、ＭＰＫ、ＰＩ３ＫおよびＳＴＡＴ５の経路の下流キナーゼを阻害するヒト抗ＦＬＴ３抗体を提供することを目指している。
【００１３】
更に、下流免疫エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を活性化させる改善された能力を有する代替抗ＦＬＴ３阻害剤を提供する必要がある。本発明は、当該技術分野における公知の阻害剤と比べて、ＡＤＣＣを含む下流免疫エフェクター機能を活性化させる改善された能力を有するヒト抗ＦＬＴ３抗体を提供することを目指している。
【００１４】
完全ヒト抗体またはヒト化抗体は、例えば、国際公開第９５／０７３４８号パンフレットおよび国際公開第９８／２５４５７号パンフレットのような、ヒトにおけるマウス抗体またはキメラ抗体と比べより低い免疫原性であるので、ヒトの治療としての最大限の可能性を提供する。本発明の抗体は、これらの上述の特徴を持つので、顕著な効果を提供する。
【００１５】
本発明に至るまで、白血病の治療に対するＦＬＴ３阻害剤とメトトレキサート（ＭＴＸ）との組合せは、何の利点もないことが明らかになっている。この定説は、培地内で白血病細胞株を使用した低分子ＦＬＴ３阻害剤とメトトレキサートとの組合せは、白血病の治療において有効でなかったが、一方で、他の化学療法との組合せは有効であったと報告された発見に由来する（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｙ．ら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ（２００７）２１：１００５−１０１４）。本発明に関する実験結果は、実際に、白血病の動物モデルにおいてＦＬＴ３を標的とする抗体（すなわち、ＥＢ１０）とＭＴＸとを組み合わせると、生存において劇的な改善をもたらすこと実証する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ヒトＦＬＴ３のドメインＤ４またはＤ５内でエピトープと結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００１７】
本発明は、哺乳動物において前癌期状態または癌を治療する方法を提供し、当該方法は、ＦＬＴ３阻害剤と組み合わせてＭＴＸを、前癌期状態または癌の治療に有効な量にて、哺乳動物に投与することを含む。また、本発明は、ＭＴＸと連結したＦＬＴ３阻害剤を含む複合体を提供する。
【００１８】
本発明は、表面プラズモン共鳴により決定された、２５℃において可溶性ＦＬＴ３−Ｆｃ融合タンパク質に対して４．５×１０−１０Ｍと同じくらいの親和性にて、ヒト抗原ＦＬＴ３（配列番号４３）に結合する、ヒト抗体およびそのフラグメントを対象にする。また、本発明は、ヒト抗原ＦＬＴ３に結合するヒトモノクローナルアンタゴニスト抗体およびそのフラグメントを対象にする。
【００１９】
本発明の一態様は、ＦＬＴ３に結合する抗体またはそのフラグメントであって、配列ＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（配列番号１）またはＳＹＹＭＨ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ１、配列ＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ２、配列ＧＶＧＡＨＤＡＦＤＩ（配列番号４）またはＶＶＡＡＡＶＡＤＹ（配列番号５）を有するＣＤＲＨ３、配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＮＹＬＤ（配列番号６）またはＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号７）を有するＣＤＲＬ１、配列ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号８）を有するＣＤＲＬ２、および、配列ＭＱＧＴＨＰＡＩＳ（配列番号９）またはＭＱＳＬＱＴＰＦＴ（配列番号１１）を有するＣＤＲＬ３を含む。
【００２０】
本発明の一態様は、ＦＬＴ３に結合する抗体またはそのフラグメントであって、配列ＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（配列番号１）またはＳＹＹＭＨ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ１、配列ＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ２、配列ＧＶＧＡＨＤＡＦＤＩ（配列番号４）を有するＣＤＲＨ３、配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＮＹＬＤ（配列番号６）を有するＣＤＲＬ１、配列ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号８）を有するＣＤＲＬ２、および、配列ＭＱＧＴＨＰＡＩＳ（配列番号９）を有するＣＤＲＬ３を含む。更に別の態様において、上述のＣＤＲを有する抗体は、表面プラズモン共鳴により決定された、２５℃において４．５×１０−１０Ｍと同じくらいの親和性にて、ヒトＦＬＴ３に特異的に結合する。
【００２１】
本発明の別の態様において、ＦＬＴ３に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、配列ＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨ（配列番号１）またはＳＹＹＭＨ（配列番号２）を有するＣＤＲＨ１、配列ＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号３）を有するＣＤＲＨ２、配列ＶＶＡＡＡＶＡＤＹ（配列番号５）を有するＣＤＲＨ３、配列ＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤ（配列番号７）を有するＣＤＲＬ１、配列ＬＧＳＮＲＡＳ（配列番号８）を有するＣＤＲＬ２、および、配列ＭＱＳＬＱＴＰＦＴ（配列番号１１）を有するＣＤＲＬ３を含む。
【００２２】
本発明の別の態様において、ＦＬＴ３に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、配列ＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳ（配列番号１２）またはＳＹＡＩＳ（配列番号１３）を有するＣＤＲＨ１、配列ＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１４）を有するＣＤＲＨ２、配列ＦＡＬＦＧＦＲＥＱＡＦＤＩ（配列番号１５）を有するＣＤＲＨ３、配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号１６）を有するＣＤＲＬ１、配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号１７）を有するＣＤＲＬ２、および、配列ＱＱＳＹＳＴＰＦＴ（配列番号１８）を有するＣＤＲＬ３を含む。
【００２３】
本発明の別の態様は、ＦＬＴ３に結合する抗体またはそのフラグメントであり、配列ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＮＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＤＴＤＦＴＬＱＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＧＴＨＰＡＩＳＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ（配列番号２２）を有するＶＬ、および、ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＶＧＡＨＤＡＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１９）のＶＨ配列を含む。
【００２４】
本発明の別の態様は、ＦＬＴ３に結合する抗体またはそのフラグメントであり、配列ＤＶＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＮＹＬＤＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＬＧＳＮＲＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＭＱＳＬＱＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ（配列番号２４）を有するＶＬ、および、ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＡＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＶＶＡＡＡＶＡＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２１）のＶＨ配列を含む。
【００２５】
本発明の別の態様は、ＦＬＴ３に結合する抗体またはそのフラグメントであり、配列ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＬＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰＦＴＦＧＰＧＴＫＶＤＩＫ（配列番号２３）を有するＶＬ、および、ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＴＦＡＬＦＧＦＲＥＱＡＦＤＩＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２０）のＶＨ配列を含む。
【００２６】
本発明の別の態様は、配列番号２８の軽鎖および配列番号２５の重鎖；または配列番号２９の軽鎖および配列番号２６の重鎖；または配列番号３０の軽鎖および配列番号２７の重鎖を含む、モノクローナル抗体である。本発明の別の態様において、抗体は、配列番号２８の２本の軽鎖および配列番号２５の２本の重鎖を含むか、または、配列番号２９の２本の軽鎖および配列番号２６の２本の重鎖を含むか、または、配列番号３０の２本の軽鎖および配列番号２７の２本の重鎖を含む。このような抗体のＦＬＴ３結合フラグメントは、本発明の一部である。
【００２７】
また、本発明は、このような抗体およびその部分をコードする単離されたＤＮＡを対象にする。本発明の他の態様としては、抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリ核酸；発現配列に結合されたヌクレオチド配列を含む発現ベクター、または、発現ベクターを含む組み換え宿主細胞、または、組み換え宿主細胞もしくはその子孫が挙げられ、ここで、細胞は、抗体またはそのフラグメントを発現する。本発明の更に別の態様は、抗体またはそのフラグメントを生成または精製する方法であって、抗体またはそのフラグメントの発現を許容する条件下で細胞を培養することを含む。
【００２８】
加えて、本発明は、有効量の抗体を投与することにより、全哺乳動物において、癌細胞の成長を阻害する方法、および、白血病を治療する方法を対象にする。本発明の抗体は、固体および非固体の腫瘍を含む腫瘍性疾患を治療するために、かつ、白血病の治療のために、使用され得る。本発明の一態様は、上述の抗体またはそのフラグメントを薬剤として使用することである。更に別の態様において、上述の抗体またはそのフラグメントは、白血病を含むがこれに限定されない癌の治療において使用される。また、本発明は、癌治療用の薬剤の製造において本発明の抗体を使用することを提供する。好ましい実施形態において、癌は、白血病である。
【００２９】
本発明の抗体は、単体で使用され得るか、または、抗腫瘍剤もしくは治療と組み合わせて使用され得る。本発明の一態様は、上述の抗体を、追加の抗癌剤または治療と組み合わせて使用することである。更に別の態様において、抗癌剤は、メトトレキサートである。
【００３０】
天然の抗体は、一般的に、２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖を有し、各軽鎖は、鎖間ジスフィルド結合により重鎖と共有結合している。多数のジスフィルド結合は更に、２本の重鎖を互いに結合させる。改変抗体は、天然の抗体の構造および／またはフォーマットに対する種々の変更を包含し得る。本願明細書において用いられるように、用語「抗体」は、４本のポリペプチド鎖（ジスフィルド結合により鎖間結合された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖）を含む免疫グロブリン分子を含む。個々の鎖は、同じようなサイズ（１１０〜１２５アミノ酸）および構造を有するが異なる機能を持つドメイン内に折り畳まれ得る。
【００３１】
軽鎖は、１つの可変ドメイン（本願明細書においてＶＬとして略記）および／または１つの定常ドメイン（本願明細書においてＣＬとして略記）を含み得る。抗体の軽鎖（免疫グロブリン）は、カッパ（Ｋ）軽鎖またはラムダ（λ）軽鎖のいずれかである。本願明細書において用いられるように、語句ＶＬは、カッパ型軽鎖（ＶＫ）およびラムダ型軽鎖（Ｖλ）からの可変領域の両方を含むことを意図する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。
【００３２】
また、重鎖は、１つの可変ドメイン（本願明細書においてＶＨとして略記）を含み得、かつ／または、抗体のクラスまたはアイソタイプ、３つまたは４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）（本願明細書においてＣＨとして略記）に依存する。ヒトにおいて、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭは、ＩｇＡおよびＩｇＧとともに、更に、サブクラスまたはサブタイプ（ＩｇＡ１−２およびＩｇＧ１−４）へ細分される。本発明は、任意の前述のクラスまたはサブクラスを含む。ヒトＩｇＧ１は、本発明の抗体について好ましいアイソタイプである。
【００３３】
一般的に、可変ドメインは、１つの抗体から次の抗体までにおいて、特に、抗原結合部位の位置において、考慮すべきアミノ酸配列変動性を示す。超可変領域または相補性決定領域（本願明細書においてＣＤＲとして略記）と呼ばれる３つの領域は、フレームワーク（本願明細書においてＦＲとして略記）と呼ばれるあまり変化しない可変領域によって支持された、各ＶＬおよびＶＨにおいて見出される。アミノ酸は、特定のＣＤＲ領域またはドメインに、Ｋａｂａｔの規則（Ｋａｂａｔら，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）．；Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）．）、または、Ｃｈｏｔｈｉａの規則（Ｃ．Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（４）：９０１−９１７（１９８７）．）（Ａ．Ｍａｒｔｉｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ｃｈｏｔｈｉａ．ｈｔｍｌ）に従って、割り当てられる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順（ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４）で配列された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。
【００３４】
ＶＬおよびＶＨドメインからなる抗体の部分は、Ｆｖ（可変フラグメント）で示され、抗原結合部位を構成する。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、１つのポリペプチド鎖上においてＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む抗体フラグメントであり、ここで、１つのドメインのＮ末端および他のドメインのＣ末端は、可溶性組み換え遺伝子ディスプレイパッケージ（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐａｃｋａｇｅｓ）（例えば、バクテリオファージ）の表面上でｓｃＦｖフラグメントのディスプレイを表す、可動性リンカー（例えば、米国特許番号第４，９４６，７７８号明細書（Ｌａｄｎｅｒら）、国際出願公開第８８／０９３４４号パンフレット（Ｈｕｓｔｏｎら）、国際出願公開第９２／０１０４７号パンフレット（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら）を参照）により結合される。
【００３５】
単鎖抗体を生成するために使用されたペプチドリンカーは、ＶＬおよびＶＨドメインにおける適切な３次元折畳みおよび会合の発生を保証するよう選択された可動性ペプチドであり得る。リンカーは、一般的に、１０〜５０のアミノ酸残基である。好ましくは、リンカーは、１０〜３０のアミノ酸残基である。より好ましくは、リンカーは、１２〜３０のアミノ酸残基である。最も好ましくは、リンカーは、１５〜２５のアミノ酸残基である。このようなリンカーペプチドの非制限的な例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３である。
【００３６】
「単離された抗体」は、（１）部分的、実質的に、または、完全に構成要素の混合物から精製され；（２）その天然環境の構成要素から同定および分離および／または回収され；（３）モノクローナルであり；（４）同種由来の他のタンパク質がなく；（５）異種由来の細胞により発現され；または（６）天然に発生しない、抗体である。その天然環境における混入物質の構成要素は、抗体の診断的または治療的使用を妨げ、酵素、ホルモン、および他のタンパク性または非タンパク性溶質を含み得る物質である。単離された抗体の例としては、親和性精製された抗体、インビトロでハイブリドーマまたは他の細胞株によって作製された抗体、および、遺伝子導入マウス由来のヒト抗体が挙げられる。
【００３７】
本願明細書において用いられる、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に同質の抗体（例えば、個々の抗体）の集団から得られた抗体を呼び、当該集団は、起こり得る天然の変異または存在し得る小規模な（ｍｉｎｏｒ）翻訳後の変異を除く実質的に同一であることを含む。モノクローナル抗体は、１つの抗原部位（決定基またはエピトープとしても知られる）に対して高度に特異的である。更に、異なる決定基に対する異なる抗体を一般的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の一つの決定基に対するものである。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に同質な集団から得られ、かつ、任意の特定方法により抗体の生産が要求されるように構築されていない、抗体の特徴を示す。
【００３８】
本願明細書において用いられる、用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列に対応する可変領域および定常領域を有する抗体を含む（上記Ｋａｂａｔらおよび上記Ｃｈｏｔｈｉａらの記載を参照）。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲにおいて、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列（例えば、インビトロにおけるランダムもしくは部位特異的な突然変異またはインビボにおける体細胞変異により導入された変異）によってコードされていないアミノ酸残基を含み得る。ヒト抗体は、アミノ酸残基（例えば、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列によってコードされない活性を促進するアミノ酸残基）と置換された少なくとも１つの位置を有し得る。しかしながら、本願明細書において用いられる、用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖細胞由来のＣＤＲ配列を含み、ヒトフレームワーク配列上で接合された（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体を含むことを意図していない。
【００３９】
語句「組み換えヒト抗体」は、組み換え手法により調製され、発現され、作製され、または、単離されたヒト抗体を含み、例えば、宿主細胞内へトランスフェクトされた組み換え発現ベクターを用いて発現された抗体、組み換えられたヒト抗体の組合せライブラリーから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子導入動物から単離された抗体、または、他のＤＮＡ配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段により調製され、発現され、作製され、または、単離された抗体である。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞免疫グロブリン配列由来の可変領域および定常領域を有する（上記Ｋａｂａｔらおよび上記Ｃｈｏｔｈｉａらの記載を参照）。
【００４０】
Ｆｃ（フラグメント、結晶化可能領域）は、ペアの重鎖定常ドメインからなる抗体の部分またはフラグメントを示す記号表示である。ＩｇＧ抗体において、例えば、Ｆｃは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体のＦｃは、更に、ＣＨ４ドメインを含む。Ｆｃは、Ｆｃ受容体結合、補体媒介性細胞毒性（ＣＭＣ）およびＡＤＣＣの活性化に関連する。例えばＩｇＡおよびＩｇＭのような抗体は、多数のＩｇＧ様タンパク質の複合体であり、複合体の形成には、Ｆｃ定常ドメインを必要とする。
【００４１】
したがって、本発明の抗体としては、限定されないが、天然の抗体、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、組み換えヒト化抗体、モノクローナル抗体、消化フラグメント、特定された部分およびその変異体が挙げられ、抗体模倣物を含むか、または、抗体または特定されたフラグメントもしくはその部分の構造および機能を模倣した抗体の部分を含み；各々は、少なくとも１つのＣＤＲを含む。機能的フラグメントとしては、ＦＬＴ３抗原に結合する抗原結合フラグメントが挙げられる。例えば、ＦＬＴ３またはその部分に結合可能であり、かつ、本発明に採用された抗体フラグメントとしては、インタクトな鎖間ジスフィルド結合を有する二価フラグメント（例えば、（Ｆａｂ’）２）、ＶＬ−ＣＬ  ＶＬ−ＣＨ１ドメインからなる抗体のフラグメントと呼ばれ、かつ、（例えば、パパイン分解による）重鎖ヒンジ領域を保持しない一価フラグメント（例えば、Ｆａｂ（抗原結合フラグメント）、重鎖ヒンジ領域を保持するｆａｂ、（例えば、プラスミン分解による）ｆａｃｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ジスフィルド結合が欠損したＦａｂ’、（例えば、ペプシンまたはプラスミン分解による）ｐＦｃ’、（例えば、ペプシン分解、部分的還元、および、再凝集による）Ｆｄ、およびＦｖ、または、（例えば、分子生物学的技術による）ｓｃＦｖが挙げられる。また、抗体フラグメントは、例えば、ドメインが削除された抗体、線形の抗体、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、多価単鎖抗体、抗原に対して特異的に結合する抗体フラグメント（例えば、二機能性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、三機能性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）などを含む）から形成された複数特異的抗体を含むことを意図する。
【００４２】
ヒンジ領域は、抗体のＦａｂおよびＦｃ部分に分かれ、互いにかつＦｃに対するＦａｂの移動性を提供し、ならびに、２本の重鎖における共有結合のための多数のジスフィルド結合を含む。
【００４３】
抗体フォーマットは、結合特異性を保持するが、例えば、２つの特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）、多価性（２つ以上の結合部位）、および、小型（例えば、結合ドメインのみ）といった望ましくあり得る他の特徴を有するよう開発された。
【００４４】
本発明の抗体は、ＦＬＴ３に対して特異的である。抗体特異性とは、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識のことを呼ぶ。本発明の抗体は、例えば、単一特異的または二重特異的であり得る。二重特異的抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なる抗原結合特性または部位を有する抗体である。抗体が１つ以上の特異性を有する場合、認識されたエピトープは、単一の抗原または１つ以上の抗原に関連し得る。したがって、本発明は、少なくとも１つのＦＬＴ３に対する特異性を有する、２つの異なる抗原に結合する二重特異的抗体を提供する。上述のように、このような抗体は、その任意のフラグメントを含む。
【００４５】
本抗体またはそのフラグメントのＦＬＴ３に対する特異性は、親和性および／または結合力に基づいて決定され得る。親和性は、抗体に対する抗原の解離に関する平衡定数（ＫＤ）で表され、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合の強さを測定する。
【００４６】
本発明の抗体またはそのフラグメントは、ＦＬＴ３のエピトープに結合し、当該エピトープは、ＦＬＴ３の５つの細胞外ドメインセグメント（以下、単に「ドメイン」または「ＥＣＤ」と呼ぶ）（すなわち、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５）のうちのいずれか１つを含み得る。本発明の抗体またはフラグメントに結合するエピトープは、ドメインＤ４またはＤ５内に存在する。抗体ＥＢ１０およびＤ４−３は、ＦＬＴ３のドメイン４内のエピトープと結合し、一方で、ＮＣ７は、ＦＬＴ３のドメイン５内のエピトープと結合する。本願明細書において用いられる、用語「エピトープ」は、本発明の抗体により認識される抗原上の個々の３次元部位を呼ぶ。エピトープは、複合抗原上の免疫学的に活性な領域であり、当該領域は、実質的にＢ細胞受容体に結合し、Ｂ細胞により生成された結果生じる抗体分子により実質的に結合される。一般的に、抗原は、少なくとも一つのエピトープを含み、通常は、１つ以上のエピトープを含む。タンパク抗原上のエピトープは、線形または非線形であり得る。線形エピトープは、タンパク質のアミノ酸配列において隣接するアミノ酸残基から構成されたエピトープである。線形エピトープが、天然の３次元構造を形成するため、かつ、抗原に対する結合特異性を有する抗体を生成する免疫反応を生じさせるために、立体配座の折り畳みを必要とする場合もあり得、また、必要としない場合もあり得る。非線形エピトープは、隣接しないアミノ酸残基から構成される。したがって、非線形エピトープは、天然の３次元構造を形成するため、かつ、抗原に対する結合特異性を有する抗体を生成する免疫反応を生じさせるために、必要なアミノ酸残基を互いに近接させる程度のタンパク質折り畳みを必要とする。
【００４７】
本発明の抗体またはそのフラグメントは、野生型または変異型のＦＬＴ３に結合する。ＦＬＴ３は、変異型または野生型のいずれかであり、例えば、ＡＭＬおよびＡＬＬ、ならびに、他の白血病において高い頻度にて発現される。急性ＡＭＬ患者のうち約３分の１において、キナーゼドメイン（ＫＤ）に通常関与する、膜近傍ドメインの遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）または点変異のいずれかによる変異が生じる。両タイプの変異は、構造的にＦＬＴ３を活性化する。ＦＬＴ３シグナル伝達を妨げる上に、抗ＦＬＴ３抗体は、更に、細胞毒性を誘発する更なる機構としてＡＤＣＣを誘発し得る。
【００４８】
本発明の抗体またはそのフラグメントは、更に、特異的変異、親和性成熟法、ファージディスプレイ法、または鎖シャッフリング法により改変または改善された結合特徴を持つ抗体またはそのフラグメントを含む。親和性および特異性は、ＣＤＲおよび／またはＦＷ残基を変異させ、かつ、所望の特徴を有する抗原結合部位をスクリーニングすることにより、改変または改善され得る（例えば、Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３（１９９５）を参照）。ＣＤＲは種々の方法において変異される。１つの方法としては、個々の残基または残基の組合せを任意抽出するものであり、これにより、母集団または同一の抗原結合部位中から、２から２０個のアミノ酸のサブセットが特定の位置にて発見される。代わりに、変異は、エラープローンＰＣＲ法により残基の範囲にわたって誘発され得る（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−９６（１９９２）を参照）。別の例としては、重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、大腸菌の突然変異誘発株において繁殖され得る（例えば、Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：３５９−６８（１９９６）を参照）。例えば、重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、大腸菌の突然変異誘発株において繁殖され得る（例えば、Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：３５９−６８（１９９６）を参照）。これらの突然変異生成方法は、当業者に知られる多くの方法の例示である。
【００４９】
置換変異体を生成するのに便利な方法は、ファージディスプレイを用いる親和性変異である。つまり、いくつかのＣＤＲ領域部位は、各部位において全ての可能なアミノ酸置換を生じさせるために変異される。したがって、生成された抗体変異体は、各分子内でパッケージ化されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物に対する融合として、繊維状ファージ分子から一価の様式でディスプレイされる。ファージディスプレイされた変異体は、その後、本願明細書に開示されたように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性、特異性、ＩＣ５０、ＥＣ５０、ＫＤ）についてスクリーニングされる。改変のための候補ＣＤＲ領域部位を同定することを目的として、アラニンスキャニング突然変異生成が、抗原結合に大きく貢献するＣＤＲ領域残基を同定するために行われ得る。代わりにまたは加えて、ランダム変異導入法が、１つ以上の残基位置にて１つ以上のＣＤＲ配列上で行われ得る。ここで、ＣＤＲが可変領域に作動可能に結合している間かまたはＣＤＲが他の可変領域配列から独立している間のいずれかにおいて、変更されたＣＤＲは、組み換えＤＮＡ技術を用いて可変領域に戻される。一旦、このような変異体抗体が生成され発現されると、変異体のパネルは、本願明細書において記載されるようにスクリーニングに供され、そして、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特徴を有する抗体が更なる開発のために選択され得る。
【００５０】
本願明細書に特に記載された抗体に加えて、他の「実質的に同質の」改変抗体は、当業者に周知な種々の組み換えＤＮＡ技術に用いて容易に設計されかつ製造され得る。例えば、フレームワーク領域は、いくつかのアミノ酸置換、末端および中間における付加および欠損などにより、１次構造レベルにおいて天然の配列と異なり得る。更に、種々の異なるヒトフレームワーク領域は、本発明のヒト化免疫グロブリンを基礎として、単体で用いられ得るかまたは組み合わせて用いられ得る。一般的に、遺伝子の改変は、種々の周知技術（例えば、部位特異的突然変異誘発法）により容易に達成され得る。
【００５１】
本発明は、完全長抗ＦＬＴ３抗体の可変領域または超可変領域における記載されたアミノ酸配列と実質的に同様なアミノ酸配列を有するＦＬＴ３結合ポリペプチドを含む。実質的に同様なアミノ酸配列は、本願明細書において、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４−８（１９８８））によるＦＡＳＴＡ検索法により決定される、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも約８０％、および、より好ましくは少なくとも約９０％の別のアミノ酸配列に対する相同性を有する配列として、定義される。加えて、本発明は、上記で開示した抗体の機能的特徴を保存する保存アミノ酸置換を含む。
【００５２】
本発明は、ＶＨ領域のうちのいずれかの１つもしくはその部分、または、本願明細書において開示されるような任意の変異体を含むＶＨ  ＣＤＲのうちのいずれかの１つを含む、抗ＦＬＴ３抗体重鎖をコードする核酸配列を含む。本発明は、更に、ＶＬ領域のうちのいずれかの１つもしくはその部分、または、本願明細書において開示されるような任意の変異体を含むＶＬ  ＣＤＲのうちのいずれかの１つを含む、抗ＦＬＴ３抗体軽鎖をコードする核酸分子を含む。
【００５３】
本発明の抗体の各ドメインは、重鎖または軽鎖の可変ドメインを有する完全な抗体であり得るか、あるいは、機能的相当物または天然のドメインの変異体もしくは誘導体であり得るか、あるいは、例えば国際出願公開９３／１１２３６号パンフレット（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら）において開示されたような技術を用いて例えばインビトロで構築された合成ドメインであり得る。一例として、少なくとも１つのアミノ酸を失った抗体可変ドメインに対応するドメインを一緒に結合することが可能である。また、本発明は、ＣＤＲ配列のうちの１つ内において１つ以上のアミノ酸置換、変異、または欠損を有する抗体を含む。重要な特徴は、相補的なドメインと関連して抗原結合部位を形成するという各ドメインの能力である。したがって、用語「可変重鎖・軽鎖フラグメント」は、特異性における重大な影響を有さないＣＤＲに対する変異体を含む変異体を除外して構築されるべきでない。
【００５４】
本発明の抗体は、当該技術分野において公知の方法により生成され得る。これらの方法としては、以下の文献「ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）ならびにＣａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｏｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｂｕｒｄｏｎら，Ｅｄｓ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８５）」に記載された免疫学的方法、ならびに、以下の文献「Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）」に記載された組み換えＤＮＡ方法が挙げられる。抗体は更に、ｓｃＦｖまたはＦａｂの形態におけるＶＨおよびＶＬドメインの組合せをもたらす、ファージディスプレイライブラリーから取得され得る。ＶＨおよびＶＬドメインは、合成されたか、部分的に合成されたか、または、天然由来のヌクレオチドによりコードされ得る。特定の実施形態において、ヒト抗体フラグメントをもたらすファージディスプレイライブラリーが好ましくあり得る。ヒト抗体の他の供給源は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニックマウス改変体である。
【００５５】
抗体フラグメントは、抗体全体を切断するか、または、そのフラグメントをコードするＤＮＡを発現させることにより、生成され得る。抗体のフラグメントは、以下の文献「Ｌａｍｏｙｉら，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５６：２３５−２４３（１９８３）およびＰａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２８９５−２９０２（１９８３）」に記載された方法により生成され得る。このようなフラグメントは、ＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントの１つまたは両方を含み得る。このようなフラグメントは更に、単鎖フラグメント可変領域抗体（すなわち、ｓｃＦｖ）、二機能性抗体、または、他の抗体フラグメントを含み得る。このような機能的相当物を生成する方法は、ＰＣＴ出願の国際出願公開９３／２１３１９号パンフレット、欧州特許出願第２３９，４００号明細書、ＰＣＴ出願の国際出願公開８９／０９６２２号パンフレット、欧州特許出願第３３８，７４５号明細書、および、欧州特許出願第３３２，４２４号明細書において開示される。本願明細書を通して、本発明における用語「抗体」は、特に指定してもしなくとも、任意のそのフラグメントを含む。
【００５６】
本発明におけるベクターの形質転換および抗体の発現に用いる好ましい宿主細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ＮＳＯ細胞（非分泌（０）マウス骨髄腫細胞）、２９３細胞およびＣＨＯ細胞、ならびに、他のリンパ系起源の細胞株（例えば、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、または、ハイブリドーマ細胞）である。他の真核性宿主としては、例えば、酵母が代わりに用いられ得る。
【００５７】
本発明は、ＦＬＴ３に特異的な単離された抗体またはそのフラグメントを提供する。本発明の抗体は、以下に示す活性を１つ以上行うことが可能である。（１）ＦＬＴ３に対する高親和性結合を示すこと；（２）ＦＬＴ３受容体に対するリガンド結合を遮断することで、ＦＬＴ３およびそのシグナル伝達経路の活性を阻害すること；（３）細胞表面ＦＬＴ３における迅速かつ効率的な内在化および抑制的調節を誘導すること；（４）白血病において野生型ＦＬＴ３のＦＬ誘発リン酸化ならびにＭＰＫ、ＰＩ３ＫおよびＳＴＡＴ５経路の下流キナーゼを阻害すること；（５）ヒトにおいて軽減された免疫原性を示すこと；（６）下流免疫エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ））を活性化する改善された能力を示すこと；（７）ＦＬＴ３受容体内在化を誘導すること；ならびに、（８）インビトロおよびインビボにおいて腫瘍成長を阻害すること。本発明の一態様において、本発明の抗ＦＬＴ３抗体は、１つ以上の以下の特性を示し、更に実施例を含む本願明細書を通して明らかにされるヒト抗体である。
（ｉ）野生型ＦＬＴ３に結合するＦＬＴ３リガンド（ＦＬ）を阻害すること；
（ｉｉ）遺伝子内縦列重複変異ＦＬＴ３（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）に結合するＦＬを阻害すること；
（ｉｉｉ）ＦＬＴ３のドメイン４および／またはドメイン５内においてエピトープと結合すること；
（ｉｖ）ＦＬＴ３のＦＬ活性化を中和すること；
（ｖ）ＦＬから独立したＦＬＴ３活性を中和すること；
（ｖｉ）ＡＤＣＣを媒介すること；
（ｖｉｉ）ＦＬＴ３を内在化すること；
（ｖｉｉｉ）表面ＦＬＴ３を減少させること；または
（ｉｘ）約４．５×１０−１０Ｍと同じくらいのＫＤにてＦＬＴ３と結合すること。
【００５８】
本発明の抗体は、ＦＬＴ３の外部ドメインと結合し、ＦＬＴ３に対するＦＬの結合を阻害する。阻害は、例えば、精製された受容体または膜結合型の受容体を用いる直接結合アッセイにより決定され得る。１つの実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、ＦＬＴ３の天然のリガンドと同じくらい強力にＦＬＴ３と好ましく結合する。
【００５９】
本発明の抗体は、ＦＬＴ３を中和する。中和は、種々の機構を介して生じる。このような機能のうちの１つは、ベータサブユニットの自己リン酸化およびＦＬＴ３基質（例えば、下流経路である、ＳＴＡＴ５、Ａｋｔ、ＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫ）のリン酸化を刺激する、ＦＬＴ３の細胞外ドメインに対するＦＬの結合である。ＦＬＴ３の中和は、更に、シグナル変換に通常関連する１つ以上のこれらの活性における、阻害、減少、不活性化、および／または途絶を含む。更に、中和は、ＦＬＴ３ヘテロ二量体およびＦＬＴ３ホモ二量体の阻害を含む。したがって、ＦＬＴ３を中和することは、例えば、成長（増殖および分化）、血管形成（血管動因、浸潤、および、転移）、ならびに、細胞運動性および転移（細胞粘着および侵襲性）を、阻害、減少、不活性化、および／または途絶するといった種々の効果を有する。ＦＬＴ３を中和することにより、開示された種々の機構に限定されないが、本発明の抗体は、ＦＬＴ３キナーゼ活性を減少させ、それによって、疾患の進行を阻害する。
【００６０】
ＦＬＴ３中和の１つの尺度は、受容体のチロシンキナーゼ活動の阻害である。チロシンキナーゼ阻害は、例えば、組み換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、および／または、天然もしくは合成の基質のリン酸化を測定するといった、周知の方法を用いて決定され得る。したがって、リン酸化アッセイは、本発明との関連において中和抗体を決定することに有用である。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウェスタンブロットにおいてホスホチロシンに特異的な抗体を用いて検出され得る。チロシンキナーゼ活性に関するアッセイのうちの一部は、以下の文献「Ｐａｎｅｋら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａ．２８３：１４３３−４４（１９９７）およびＢａｔｌｅｙら，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６２：１４３−５０（１９９８）」に開示されている。本発明の抗体は、リガンドに応答する細胞において、ＦＬＴ３のチロシンリン酸化を、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、および、より好ましくは少なくとも約８５〜９０％、顕著に減少させている。
【００６１】
ＦＬＴ３中和の別の尺度は、ＦＬＴ３の下流基質におけるリン酸化の阻害である。したがって、ＳＴＡＴ５、ＰＩ３Ｋ、ＡｋｔまたはＭＡＰＫのリン酸化レベルが測定され得る。
【００６２】
加えて、タンパク発現の検出方法は、ＦＬＴ３中和を決定するために使用され得る。ここで、測定されるタンパク質は、ＦＬＴ３チロシンキナーゼ活性により制御される。これらの方法としては、タンパク発現を検出するための免疫組織化学（ＩＨＣ）、遺伝子増幅を検出するための蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、競合放射性リガンド結合アッセイ、固体マトリックスブロッティング技術（例えば、ノーザンブロットおよびサザンブロット）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、および、ＥＬＩＳＡが挙げられる。例えば、以下の文献を参照のこと。Ｇｒａｎｄｉｓら，Ｃａｎｃｅｒ  ７８：１２８４−９２（１９９６）；Ｓｈｉｍｉｚｕら，Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８５：５６７−７１（１９９４）；Ｓａｕｔｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１４８：１０４７−５３（１９９６）；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｇｌｉａ  １５：２８９−９６（１９９５）；Ｒａｄｉｎｓｋｙら，Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：１９−３１（１９９５）；Ｐｅｔｒｉｄｅｓら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：３９３４−３９（１９９０）；Ｈｏｆｆｍａｎｎら，ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７：４４１９−２６（１９９７）；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：３１４０−４８（１９９５）。
【００６３】
インビボアッセイは、更に、ＦＬＴ３中和を決定するために使用され得る。例えば、受容体チロシンキナーゼ阻害は、阻害剤の存在下および非存在下において受容体リガンドで刺激された細胞株を用いる細胞分裂アッセイにより観察され得る。１つの方法は、ＦＬＴ３発現腫瘍細胞またはＦＬＴ３を発現するよう形質転換された細胞における成長の阻害を試験することに関する。阻害は更に、腫瘍モデル（例えば、マウスに注入されたヒト腫瘍細胞）を用いて観察され得る。
【００６４】
本発明は、ＦＬＴ３中和におけるあらゆる特定の機構によって限定されない。本発明の抗ＦＬＴ３抗体は、（１）ＦＬＴ３細胞表面受容体に対して外部から結合し得、（２）ＦＬに対する結合を遮断し得、その後の受容体関与チロシンキナーゼを介して媒介されたシグナル変換を遮断し得、そして（３）ＦＬＴ３およびシグナル変換カスケードにおける他の下流タンパク質のリン酸化を妨げ得る。
【００６５】
別の実施形態において、本発明の抗体は、ＦＬＴ３を下方調節する。細胞の表面上に存在するＦＬＴ３の量は、受容体タンパク質の生成、内在化、および、分解に依存する。細胞の表面上に存在するＦＬＴ３の量は、受容体の内在化または受容体に結合された分子を検出することにより、間接的に測定され得る。例えば、受容体内在化は、標識化された抗体を有するＦＬＴ３を発現する接触細胞または被覆細胞により測定され得る。その後、膜結合抗体は、剥がされ、収集され、そして、カウントされる。抗体の内在化は、細胞を溶解し、標識化された構成要素を検出することにより決定される。
【００６６】
細胞の表面上に存在するＦＬＴ３の量は、抗ＦＬＴ３抗体または他の物質による治療の後、例えば、ＦＬＴ３の表面発現を染色した細胞における蛍光活性化細胞選別アッセイにより、細胞上に存在する受容体の量を測定することで直接的に測定され得る。染色した細胞は、インキュベートされ、蛍光強度が経時的に測定される。コントロールとして、染色した集団の一部が、受容体内在化を停止させた条件下においてインキュベートされ得る。
【００６７】
以下の実施例に記載されるように、細胞表面ＦＬＴ３は、ＦＬＴ３に対して特異的でありかつ試験される抗体の結合を遮断または競合しない異なる抗体を用いて、検出かつ測定され得る（Ｂｕｒｔｒｕｍら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：８９１２−２１（２００３））。一実施形態において、本発明の抗体を用いるＦＬＴ３発現細胞の治療は、細胞表面ＦＬＴ３の減少をもたらす。
【００６８】
抑制的調節の別の尺度は、細胞に存在する受容体タンパク質の合計の減少であり、これは、内在する受容体の分解を反映する。したがって、本発明の抗体を用いる細胞（特に、癌細胞）の治療は、細胞ＦＬＴ３の合計における顕著な減少をもたらす。
【００６９】
本発明の抗体は、腫瘍成長を阻害する。例えば、皮下異種移植腫瘍は、免疫不全マウスに癌細胞株の細胞を注入することにより構築され得る。その後、マウスは、抗体の腹腔内注入により治療され、腫瘍サイズが一定の間隔で測定される。コントロールの注入と比較したところ、本発明の抗体は腫瘍成長を阻害する。一実施形態において、本発明の抗体は、抗腫瘍剤と組み合わせた場合に腫瘍退縮を促進する。更なる実施形態において、本発明の抗体は、単剤療法において用いられる場合に腫瘍退縮を促進する。腫瘍退縮を促進することは、有効量の抗体、または、有効量の抗体と抗腫瘍剤との組合せを投与することで、腫瘍のサイズ減少または壊死をもたらすことを意味する。腫瘍退縮は、特定の治療計画中の対象群における平均として測定され得るか、または、腫瘍が退縮している治療群中の対象数により測定され得る。
【００７０】
本発明の抗体は、当該技術分野において公知の任意の方法（例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる沈殿、それに続く、生理食塩水に対する透析、イオン交換クロマトグラフィー、親和性または免疫親和性クロマトグラフィー、および、ゲル濾過またはゾーン電気泳動）により単離または精製され得る。本発明の抗体に対する好ましい精製方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーである。
【００７１】
ヒト抗体をコードするＤＮＡは、対応するヒト抗体領域およびヒト由来のＣＤＲをコードするＤＮＡから実質的にまたは排他的に生成された、ＣＤＲ以外のヒトの定常領域および可変領域をコードするＤＮＡを再結合することにより調製され得る。
【００７２】
抗体のフラグメントをコードするＤＮＡの適切な供給源は、例えば、完全長抗体を発現するハイブリドーマおよび脾臓細胞といった任意の細胞を含む。フラグメントは、抗体相当物としてフラグメント自身によって使用され得るか、または、上述したように相当物へ再結合され得る。ＤＮＡ欠失、再組合せ、および、この節において記載された他の技術は、公知の方法により実行され得る。ＤＮＡの別の供給源は、当該技術分野において公知の抗体のファージディスプレイライブラリーである。本発明の例示された抗体は、ファージディスプレイ技術を介して作製された。
【００７３】
加えて、本発明は、発現配列、プロモーター、および、エンハンサー配列に作動可能に結合された上述のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。原核生物（例えば、細菌）系および真核生物系（例えば、これに限定されないが、酵母および哺乳動物の細胞株系）における抗体ポリペプチドの効率的な合成のための種々の発現ベクターが開発されてきた。本発明のベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列、および、合成ＤＮＡ配列のセグメントを含み得る。
【００７４】
任意の適切な発現ベクターが使用され得る。例えば、原核生物クローニングベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭ、およびＲＰ４）が挙げられる。真核生物ベクターは、また、ファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３および他の繊維状の一本鎖ＤＮＡファージ）の派生物を含む。酵母において有用なベクターの例としては、２μプラスミドである。哺乳動物細胞における発現に適切なベクターは、ＳＶ−４０、アデノウイルス、レトロウイルス由来のＤＮＡ配列の周知な派生物、ならびに、機能的な哺乳動物ベクター（例えば、上述のもの、および、機能的なプラスミドおよびファージＤＮＡ）の組合せに由来するシャトルベクターを含む。
【００７５】
更なる真核生物発現ベクターは、当該技術分野において公知である（例えば、Ｐ．Ｊ．ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＰ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−４１（１９８２）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−６４（１９８１）；ＫａｕｆｍａｎｎおよびＳｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−２１（１９８２）；ＫａｕｆｍａｎｎおよびＳｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６４（１９８２）；Ｓｃａｈｉｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：４６５４−５９（１９８３）；ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．７７：４２１６−２０（１９８０））。
【００７６】
本発明において有用な発現ベクターは、発現されるＤＮＡ配列またはフラグメントに作動可能に結合された少なくとも１つの発現制御配列を含む。制御配列は、クローン化されたＤＮＡ配列の発現を制御および調節するために、ベクター内に挿入される。有用な発現制御配列の例としては、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージラムダの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄ被覆タンパク質の制御領域、酵母の解糖系プロモーター（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター）、酵母酸ホスフォターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α交配因子のプロモーター、ならびに、ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、およびシミアンウイルスに由来するプロモーター（例えば、前期プロモーターおよび後期プロモーターまたはＳＶ４０）、ならびに、原核生物細胞または真核生物細胞およびそれらのウイルスまたはその組合せにおける遺伝子発現を制御することが公知の他の配列が挙げられる。
【００７７】
酵母において遺伝子構築物を発現することが所望される場合、酵母において用いられる適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら，Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら，Ｇｅｎｅ  ７：１４１（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンで繁殖する能力を失った酵母の変異株（例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１）に関する選択マーカーを提供する（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２（１９７７））。酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在は、次いで、トリプトファンの非存在下における繁殖により形質転換を検出する有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより企図される。
【００７８】
本発明は、また、上述の発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を提供する。本発明の抗体は、ハイブリドーマ以外の細胞株において発現され得る。本発明に従うポリペプチドをコードする配列を含む核酸は、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換に用いられ得る。
【００７９】
特に好適な細胞株は、高いレベルの発現、所望のタンパク質の構成的発現、および、宿主細胞からの最小限の汚染に基づいて選択される。発現のための宿主細胞として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野において周知であり、多くの不死化細胞株（例えば、これに限定されないが、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ならびに、多くの他のリンパ系起源の細胞株（例えば、リンパ腫細胞、骨髄腫細胞、または、ハイブリドーマ細胞））を含む。適切な更なる真核生物細胞は、酵母および他の菌類を含む。有用な原核生物細胞宿主としては、例えば、大腸菌（例えば大腸菌ＳＧ−９３６、大腸菌ＨＢ  １０１、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌Ｘ１７７６、大腸菌Ｘ２２８２、大腸菌ＤＨＩ、および大腸菌ＭＲＣｌ）、シュードモナス菌、バチルス菌（例えば、枯草菌）、ならびに、放線菌が挙げられる。
【００８０】
これらの組み換え宿主細胞は、抗体またはそのフラグメントの発現を許容する条件下で細胞を培養し、宿主細胞または宿主細胞の周囲の培地から抗体またはそのフラグメントを精製することにより、抗体またはそのフラグメントを生成するために用いられ得る。組み換え宿主細胞における分泌について、発現された抗体またはフラグメントを標的とすることは、シグナルまたは分泌リーダーペプチドをコードする配列（Ｓｈｏｋｒｉら，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：６５４−６４（２００３）；Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６（１９９７）；およびｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４６８３−９０（１９８６）を参照）を、所望の抗体コード遺伝子の５’末端に挿入することにより、容易化され得る。これらの分泌リーダーペプチド要素は、原核生物配列または真核生物配列のいずれに由来し得る。したがって、適切な分泌リーダーペプチドは、宿主細胞の細胞質および分泌物から培地へとポリペプチドを直接移動させるための、ポリペプチドのＮ末端に結合されたアミノ酸として、用いられる。
【００８１】
形質転換された宿主細胞は、炭素（炭水化物、例えば、グルコースまたはラクトース）、窒素（アミノ酸、ペプチド、タンパク質またはそれらの分解産物、例えば、ペプトン、アンモニウム塩など）、ならびに、無機塩（硫酸塩、リン酸塩および／またはナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウムの炭酸塩）の吸収可能な供給源を含む液体培地において、当該技術分野に公知の方法によって培養される。培地は、更に、例えば、成長促進物質（例えば、鉄、亜鉛、マンガンなどの微量元素）を含む。
【００８２】
本発明の抗体は、さらなるアミノ酸残基に融合され得る。そのようなアミノ酸残基は、おそらく単離を容易にするためにペプチドタグであり得る。特定の器官または組織に対する抗体のホーミングのための他のアミノ酸残基もまた、企図される。
【００８３】
本発明における抗体の調製のための別の実施形態は、挿入されるゲノムを生成するヒト抗体の実質的な部分を有し、内因性抗体の産生の欠損を生じさせるトランスジェニック動物において本発明に係る抗体をコードする核酸の発現である。限定されないが、トランスジェニック動物としては、マウス、ヤギおよびウサギが挙げられる。本発明の１つのさらなる実施形態は、例えば、泌乳の間にポリペプチドを分泌するための動物の乳腺における抗体コード遺伝子の発現を含む。
【００８４】
以下の実施例に記載するように、本発明に係る高親和性の抗ＦＬＴ３抗体は、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子から構築されたファージディスプレイライブラリーから単離され得る。例えば、本発明の可変ドメインは、再配列される可変領域遺伝子を含有する末梢血リンパ球から得られ得る。あるいは、ＣＤＲおよびＦＷ領域などの可変ドメイン部分は、異なるヒト配列由来であり得る。３ラウンドの選択後に回収したクローンの９０％以上はＦＬＴ３に特異的である。スクリーニングしたＦａｂのＦＬＴ３についての結合親和性はｎＭの範囲であり得、これは、ハイブリドーマ技術を用いて産生される二価の抗ＦＬＴ３モノクローナル抗体と同じくらい高い。
【００８５】
本発明の抗体は、例えば、天然の抗体、またはＦａｂもしくはｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーから得られ得る。単一のドメイン抗体は、天然の抗体またはハイブリドーマからＶＨまたはＶＬドメインを選択することによって得られ得るか、あるいはＶＨドメインのライブラリーまたはＶＬドメインのライブラリーから選択される。単一のドメイン抗体の結合の主要な決定基であるアミノ酸残基は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａにより規定されたＣＤＲの範囲内であり得るが、例えば、そうでなければＶＨ−ＶＬヘテロ二量体のＶＨ−ＶＬインターフェースに埋められる残基などの他の残基を同様に含んでもよいことは理解される。
【００８６】
本発明の抗体はまた、結合特性が特異的変異、親和性成熟の方法、ファージディスプレイ、または鎖シャフリングによって改良されているものを含む。親和性および特異性は、ＣＤＲを変異させることによって、および所望の特性を有する抗原結合部位をスクリーニングすることによって、変更または改良されてもよい（例えば、Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３（１９９５）を参照のこと）。ＣＤＲは様々な方法で変異される。１つの方法は、個々の残基または残基の組み合わせをランダム化することであり、それによって、他の同一の抗原結合部位の集団において、全ての２０個のアミノ酸が特定の位置に見出される。あるいは、変異は、エラープローンＰＣＲ法により一定の範囲のＣＤＲ残基にわたって誘発される（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）を参照のこと）。例えば、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を含有するファージディスプレイベクターは、大腸菌の変異誘発株において増殖させることができる（例えば、Ｌｏｗら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：３５９−３６８（１９９６）を参照のこと）。これらの変異誘発法は、当業者に公知である多くの方法の例である。
【００８７】
本発明のＦＬＴ３結合抗体を同定するために使用されるタンパク質は、好ましくはＦＬＴ３であり、より好ましくはＦＬＴ３の細胞外ドメインである。ＦＬＴ３の細胞外ドメインは遊離であってもよいか、または別の分子と結合されてもよい。
【００８８】
本発明の抗体は、さらなるアミノ酸残基と融合され得る。そのようなアミノ酸残基は、おそらく単離を容易にするためにペプチドタグであり得る。特定の器官または組織に対する抗体のホーミングのための他のアミノ酸残基もまた、企図される。
【００８９】
本発明の別の態様において、限定されないが、本発明の抗体を含む、抗ＦＬＴ３阻害剤が、抗腫瘍剤または血管新生阻害剤または検出可能なシグナル生成剤と組み合わされて、あるいはそれらと化学的または生合成的に結合されて、投与され得る。以下に例示するように、本発明の抗体は、ＦＬＴ３を保有する細胞に対する結合の際に効果的に内在化する。抗体と組み合わされて、または抗体と抱合もしくは結合されて投与される抗腫瘍剤は、抗体が結合する腫瘍を破壊または損傷させるか、あるいは抗体が結合する細胞の環境において、腫瘍を破壊または損傷させる任意の薬剤を含む。一態様において、本発明の抗体を含む、抗ＦＬＴ３阻害剤は、受容体に特異的に結合し、リガンド−毒素内在化後に毒素を送達する複合体として投与され得る。別の態様において、ＦＬＴ３阻害剤の複合体は、互いに直接結合され得るか、またはリンカー、ペプチドもしくは非ペプチドを介して結合され得る。例えば、抗腫瘍剤は、化学療法剤などの毒性薬剤または放射性同位体である。適切な抗腫瘍剤は当業者に公知であり、アントラサイクリン（例えばダウノマイシンおよびドキソルビシン）、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ビンデシン、ネオカルチノスタチン、シスプラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシンおよびカリケアマイシンが挙げられる。化学療法剤は、従来の方法を用いて阻害剤、抗体または低分子に抱合される（例えば、ＨｅｒｍｅｎｔｉｎおよびＳｅｉｌｅｒ，Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．８２：１９７−２１５（１９８８）を参照のこと）。一態様において、ＭＴＸは好ましい本発明の抗腫瘍剤である。
【００９０】
本発明はさらに、抗腫瘍剤のみの例として、検出可能なシグナル生成剤が抗体に抱合される診断システムにおいて、放射性標識したアイソトープなどの他の抗体またはレポーターを含む、標的またはレポーター部分に結合された抗ＦＬＴ３抗体を意図する。
【００９１】
検出可能なシグナル生成剤は、診断目的のためにインビボおよびインビトロにおいて有用である。シグナル生成剤は、外部手段、通常、電磁放射の測定によって検出可能である測定可能なシグナルを生成する。大部分に関して、シグナル生成剤は酵素または発色団であり、蛍光、リン光または化学発光によって光を放射する。発色団は、紫外線または可視領域において光を吸収する色素を含み、酵素触媒反応の基質または分解産物であり得る。
【００９２】
本発明はさらに、標的またはレポーター部分に結合される抗ＦＬＴ３抗体を意図する。標的部分は結合対の第１の膜である。抗腫瘍剤は、例えば、そのような対の第２の膜に抱合され、それによって、抗ＦＬＴ３抗体が結合される部位に方向付けられる。このような結合対の一般的な例は、アビジンおよびビオチンである。好ましい実施形態において、ビオチンは抗ＦＬＴ３抗体に抱合され、それによって、アビジンまたはストレプトアビジンに抱合される抗腫瘍剤または他の部分についての標的を与える。あるいは、ビオチンまたは別のそのような部分は本発明の抗ＦＬＴ３抗体に結合され、例えば、検出可能なシグナル生成剤がアビジンまたはストレプトアビジンに抱合される診断システムにおいてレポーターとして使用される。
【００９３】
抗腫瘍剤として使用するための適切な放射性同位体もまた、当業者に公知である。例えば、１３１Ｉまたは２１１Ａｔが使用される。これらの同位体は従来技術を用いて抗体に結合される（例えば、Ｐｅｄｌｅｙら，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６８：６９−７３（１９９３）を参照のこと）。あるいは、抗体に結合される抗腫瘍剤は、プロドラッグを活性化させる酵素である。このように、プロドラッグは、それが腫瘍部位に到達するまで、不活性形態のままで投与され、抗体複合体が投与されると、その細胞毒素形態に変換される。実際には、抗体酵素複合体が患者に投与され、治療される組織の領域に局在化され得る。次いで、プロドラッグが患者に投与され、その結果、細胞毒素の薬物への変換が治療される組織の領域において生じる。あるいは、抗体に抱合される抗腫瘍剤は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）などのサイトカインまたは腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）である。抗体は、サイトカインを腫瘍に標的化するので、サイトカインは、他の組織に影響を与えずに、腫瘍の損傷または破壊を媒介する。サイトカインは、従来の組み換えＤＮＡ技術を用いてＤＮＡレベルで抗体に融合される。
【００９４】
以前に記載される有効量の抗体を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における腫瘍増殖を処置する方法もまた、本発明によって提供される。本発明に従って処置される適切な状態は、好ましくはＦＬＴ３を発現する細胞に関与する。いかなる特定の機構にも束縛されることを意図しないが、本発明の方法は、例えば、ＦＬＴ３によって刺激される腫瘍増殖、臓器移植拒否または自己免疫疾患などの免疫障害を含む、癌細胞の増殖の処置を提供する。
【００９５】
本発明の文脈において、「処置」または「処置する」とは、疾患または障害に関連する内在している状態または望まれない生理学的変化の進行を阻害すること、遅延すること、軽減すること、または反転すること、状態の臨床的症状を改善すること、または状態の臨床的症状の出現を予防することを含む、治療的処置を指す。有益または所望の臨床結果は、限定されないが、検出可能であるか、または検出不可能であるかに関わらず、症状の軽減、疾患または症状の程度の減少、疾患または症状の安定化（すなわち、疾患または症状が悪くならない）、疾患または症状の進行の遅延または減速、疾患または症状の改善または緩和、および疾患または症状の寛解（部分的であろうと全体的であろうと）を含む。「処置」はまた、処置を受けない場合の予想される生存と比較して、生存期間の延長を意味してもよい。処置を必要とするのは、すでに疾患状態であるものである。一実施形態において、本発明は医薬として使用されてもよい。
【００９６】
処置される１つの前癌状態は、骨髄異形成症候群である。処置される他の癌としては、限定されないが、白血病、すなわち、数ある中でもＡＭＬ、ＡＬＬおよび急性転化におけるＣＭＬなどの血液学的悪性腫瘍が挙げられる。他の白血病としては表９のものが挙げられ、表９は、選択された白血病細胞株のＥＢ１０染色から得た選択されたヒト白血病細胞株におけるＦＬＴ３の発現を記載している。癌はまた、甲状腺腫瘍または脳腫瘍などの固形腫瘍であってもよい。
【００９７】
本発明の方法において、治療有効量の本発明の抗体が、それを必要とする哺乳動物に投与される。本明細書に記載される障害の処置のための本発明の組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか、または動物であるか、投与される他の医薬、および処置が予防的であるか、または治療的であるかを含む、多くの異なる要因に依存して変わる。本明細書中で使用する場合、用語、投与することは、目的とする結果を達成し得る任意の方法によって本発明の抗体を哺乳動物に送達することを意味する。それらは、例えば、静脈内または筋肉内に投与され得る。本発明のヒト抗体はヒトへの投与に特に有用であるが、それらは、同様に他の哺乳動物に投与されてもよい。本明細書中で使用する場合、用語、哺乳度物は、限定されないが、ヒト、実験動物、家庭内のペットおよび家畜を含むことを意図する。治療有効量とは、哺乳動物に投与される場合、腫瘍増殖を阻害することなどの所望の治療効果を生じるのに有効である、本発明の抗体の量を意味する。治療用量は、安全性および効果を最適化するために当業者に公知の慣例の方法を用いて設定され得る。
【００９８】
本発明の医薬組成物は、「治療有効量」の本発明の抗ＦＬＴ３抗体を含み得る。「治療有効量」とは、所望の治療効果を達成するのに必要な用量および期間で、有効な量を指す。治療有効量の抗体は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の反応を誘発する抗体または抗体部分の能力などの要因に従って変化させてもよい。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が抗体または抗体部分のあらゆる毒性または有害な効果を上回るものである。投薬計画は、最適な所望の反応（例えば治療反応または予防反応）を与えるために調節されてもよい。
【００９９】
本発明の抗ＦＬＴ３抗体は、腫瘍または病的状態の進行を阻害または減少するのに十分な量でそれを必要とする患者に治療的処置のために投与される。進行としては、例えば、腫瘍または病的状態の増殖、侵襲性、転移および／または再発が挙げられる。これを達成するのに適切な量は、治療有効量として定義される。これを使用するのに有効な量は、疾患の重症度および患者自身の免疫系の全身状態に依存する。投薬スケジュールはまた、病状および患者の状態により変化し、典型的には、単一のボーラス投与または持続注入から１日当たり複数の投与（例えば４〜６時間毎）の範囲、あるいは処置する医師および患者の状態によって示される範囲であろう。本発明の抗体の治療有効量についての例示的な非限定的な範囲は、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは３〜３５ｍｇ／ｋｇ、およびより好ましくは５〜２０ｍｇ／ｋｇである。投与量および頻度は患者を処置する医師によって決定され、毎日、週に３回、週に１回、２週間に１回、またはそれより低い頻度で、１ｍｇ／ｋｇ未満〜１００ｍｇ／ｋｇ以上で与えられる用量を含んでもよい。１回の投与当たりの用量は、１〜１００、２〜７５または５〜６０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。しかしながら、本発明はいかなる特定の用量にも限定されないことは留意されるべきである。
【０１００】
代替の実施形態において、本発明はまた、樹枝状細胞活性化または成熟を阻害する方法を含み、その方法は、単独または他の薬剤と組み合わせてのいずれかで樹枝状細胞と本発明の抗体とを接触させることを含む。本発明の別の方法は、臓器移植拒絶を予防すること、または多発性硬化症もしくは脳炎などの自己免疫疾患を処置することを含み、その方法は、本発明の抗体を単独または他の薬剤と組み合わせて投与することを含む。
【０１０１】
本発明の一実施形態において、抗ＦＬＴ３抗体は、１つ以上の他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与されてもよい。併用療法の例については、例えば、米国特許第６，２１７，８６６号（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒら，Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）；国際公開第９９／６００２３号パンフレット（Ｗａｋｓａｌら，Ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）を参照のこと。化学療法剤、放射線またはそれらの組み合わせなどの任意の適切な抗腫瘍剤が使用されてもよい。
【０１０２】
現在当該分野において公知であるか、または評価されている抗腫瘍剤は、例えば、細胞分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、挿入抗生物質（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、増殖因子抑制剤、細胞周期抑制剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物反応修飾物質、抗ホルモン、および抗血管新生剤を含む、種々のクラスに分類され得る。アルキル化剤の例としては、限定されないが、シスプラチン、シクロホスファミド、メルファランおよびダカルバジンが挙げられる。代謝拮抗剤の例としては、限定されないが、シトシンアラビノシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ゲムシタビン、ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）、およびトポイソメラーゼ阻害剤イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、アミノカンプトテシン、カンプトテシン、ＤＸ−８９５１ｆ、トポテカン（トポイソメラーゼＩ）、エトポシド（ＶＰ−１６）およびテニポシド（ＶＭ−２６）（トポイソメラーゼＩＩ）が挙げられる。抗腫瘍剤が放射線である場合、放射線源は、処置される患者に対して外部（外照射療法−ＥＢＲＴ）または内部（小線源療法−ＢＴ）のいずれであってもよい。投与される抗腫瘍剤の用量は、例えば、薬剤の種類、処置される腫瘍の種類および重症度ならびに薬剤の投与経路を含む、多くの要因に依存する。しかしながら、本発明はいかなる特定の用量にも限定されないことは強調されるべきである。
【０１０３】
本発明の一態様において、ＭＴＸは、本発明の抗体と併せて与えられる好ましい抗腫瘍剤である。本明細書に与えられるデータは、ＭＴＸを併せた抗ＦＬＴ３抗体、ＥＢ１０の相乗効果を実証する。この組み合わせは、特に新規であり、ＭＴＸを除く他の化学療法剤とのＦＬＴ３阻害剤、ＰＫＣ４１２の同時投与はＦＬＴ３白血病に対して臨床的に効果的であると報告している、Ｆｕｒｕｋａｗａら（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２１：１００５−１０１４（２００７））によって公開されたインビトロでの作用を考えると予想されない。
【０１０４】
本発明において、任意の適切な方法または経路が、本発明の抗ＦＬＴ３抗体を投与するために、および必要に応じて、抗腫瘍剤および／または他の受容体のアンタゴニストを同時投与するために使用されてもよい。本発明の併用療法において、抗ＦＬＴ３抗体は、例示のみとしてＭＴＸを含む、別の薬剤での治療を開始する前、間、または後、ならびにそれらの任意の組み合わせ、すなわちその前および最中、前後、最中および後、あるいは抗腫瘍剤治療を開始する前、間、および後に投与されてもよい。例えば、抗ＦＬＴ３抗体は、放射線療法を開始する前に、１〜３０日の間、好ましくは３〜２０日の間、より好ましくは５〜１２日の間で投与されてもよい。本発明の好ましい実施形態において、化学療法剤は、抗体治療剤と同時に、またはより好ましくは抗体治療剤の後に投与される。
【０１０５】
本発明の別の態様において、任意のＦＬＴ３阻害剤が、白血病の処置のためにＭＴＸとともに使用されてもよい。
【０１０６】
本発明の抗ＦＬＴ３抗体は、腫瘍増殖または血管形成に関与する他の受容体を中和する抗体とともに投与され得る。本発明の一実施形態において、抗ＦＬＴ３抗体は、ＥＧＦＲと特異的に結合する受容体アンタゴニストとともに使用される。このような受容体の別の例はＶＥＧＦＲである。本発明の抗ＦＬＴ３抗体は、ＶＥＧＦＲアンタゴニストとともに使用されてもよい。さらなる代替の実施形態において、ＦＬＴ３抗体は、１つ以上の適切な補助剤、例えばサイトカイン（例えばＩＬ−１０およびＩＬ−１３）または他の免疫促進剤、例えば限定されないが、ケモカイン、腫瘍関連抗原、およびペプチドとともに投与されてもよい。さらに、これらの促進剤はＭＴＸとともに投与されてもよい。しかしながら、単剤療法としての抗ＦＬＴ３抗体単独の投与は、治療的に有効な方法で腫瘍の進行を予防、阻害または減少するのに十分であることが理解されるべきである。
【０１０７】
本発明において、任意の適切な方法または経路が、本発明の抗ＦＬＴ３抗体を投与するために、および必要に応じて、ＭＴＸなどの抗腫瘍剤および／または他の受容体のアンタゴニストを同時投与するために、使用されてもよい。本発明に従って利用される抗腫瘍剤の投薬計画は、患者の腫瘍状態の処置に最も適切であると考えられる任意の投薬計画を含む。種々の形態の白血病を含む、異なる悪性腫瘍は、患者間に基づいて決定される、特定の抗腫瘍抗体および特定の抗腫瘍剤の使用を必要とし得る。投与経路としては、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下、髄腔内、または筋肉内投与が挙げられる。投与されるアンタゴニストの用量は、例えば、アンタゴニストの種類、処置される腫瘍の種類および重症度ならびにアンタゴニストの投与経路を含む、多数の要因に依存する。しかしながら、本発明は、投与のいかなる特定の方法または経路にも限定されないことが強調されるべきである。
【０１０８】
予防または処置のために哺乳動物に使用される本発明の抗ＦＬＴ３抗体は、さらに薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物の形態で投与されることが理解される。適切な薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどの１種以上、およびそれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に受容可能なキャリアはさらに、保存期間または結合タンパク質の有効性を向上させる湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤などの少量の補助物質を含む。注射組成物は当該分野において周知であり、哺乳動物への投与後、活性成分の迅速な放出、持続放出または遅延放出を与えるように処方され得る。
【０１０９】
本発明はまた、腫瘍増殖および／または血管新生を阻害するためのキットを含み、そのキットは、治療有効量のヒト抗ＦＬＴ３抗体を含む。本発明の別の実施形態は、腫瘍増殖および／または血管新生を阻害するためのキットを含み、そのキットは、ＭＴＸとともに治療有効量のヒト抗ＦＬＴ３抗体を含む。キットはさらに、腫瘍形成または血管新生に関与する例えば別の増殖因子受容体（例えば、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＰＤＧＦＲ、ＮＧＦＲおよびＦＧＦＲ）の任意の適切なアンタゴニストを含んでもよい。あるいは、またはさらに、本発明のキットはさらに、抗腫瘍剤を含んでもよい。本発明の文脈において適切な抗腫瘍剤の例は、本明細書に記載されている。本発明のキットはさらに、補助剤（その例は上に記載している）を含んでもよい。
【０１１０】
さらに、本発明の範囲に含まれるのは、当該分野において周知である、試験または診断方法のためのインビボおよびインビトロでの本発明の抗体の使用である。診断方法は、本発明の抗体を含有するキットを含む。
【０１１１】
本発明の抗体は、ＦＬＴ３リガンド結合活性のものより強い結合強度、すなわち約２００×１０−１２Ｍ〜５００×１０−１２ＭのＫＤでＦＬＴ３に結合する。ヒトＦＬＴ３−Ｆｃ融合タンパク質に結合する抗体についてのＫＤは、２５℃での測定で０．５×１０−１０Ｍ〜５×１０−１０Ｍであり；好ましい抗体は、全て２５℃での測定で１．０×１０−１０Ｍ〜４．７５×１０−１０Ｍ、１．５×１０−１０Ｍ〜４．５×１０−１０Ｍ、または４．５×１０−１０Ｍと同じくらいのＫＤでヒトＦＬＴ３−Ｆｃ融合タンパク質に結合する。抗体は、全て２５℃で、本明細書に記載される表面プラズモン共鳴によって測定した場合、４．５×１０−５１／ｓ（ｓｅｃ−１、１／秒）〜６×１０−５１／ｓの間、５．０×１０−５１／ｓ〜５．７×１０−５１／ｓの間の解離速度定数（Ｋｄまたはｋｏｆｆ）でＦＬＴ３に結合することが好ましく、より好ましくは、抗体は、５．１×１０−５１／ｓ〜５．６×１０−５１／ｓの間、またはそれらの速度定数の１０％以内のＫｄまたはｋｏｆｆでＦＬＴ３に結合する。抗体は、全て２５℃で、本明細書に記載される表面プラズモン共鳴によって測定した場合、０．５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１（１／Ｍｓ；１／モル濃度  １／秒）〜５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１の間、または１×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１〜４×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１の間の会合速度定数（Ｋａまたはｋｏｎ）でＦＬＴ３に結合することがさらに好ましく、より好ましくは、抗体は、１．２×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１〜３．６×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１の間、またはそれらの速度定数の１０％以内のＫａまたはｋｏｎでＦＬＴ３に結合する。さらなる実施形態において、抗体は、２５℃で表面プラズモン共鳴によって測定される場合、同じ条件の下でＥＢ１０、ＮＣ７またはＤ４−３について測定される解離速度定数の１０％以内である解離速度定数でＦＬＴ３に結合する。
【０１１２】
本発明は、表１および表２におけるＣＤＲからなる群より選択される１つ以上のＣＤＲを含む、ＦＬＴ３に対して特異的なモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む。別の態様において、本発明は、配列：ＭＱＧＴＨＰＡＩＳ（配列番号９）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を有するＦＬＴ３に対して特異的なモノクローナル抗体またはそのフラグメントである。別の態様において、本発明は、配列：ＧＶＧＡＨＤＡＦＤＩ（配列番号４）を含む重鎖ＣＤＲ３を有するＦＬＴ３に対して特異的なモノクローナル抗体またはそのフラグメントである。異なる態様において、本発明は、（ｉ）ＥＢ１０、ＮＣ７およびＤ４−３からなる群より選択される軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）ＥＢ１０、ＮＣ７およびＤ４−３からなる群より選択される重鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。別の態様において、本発明は、（ｉ）ＥＢ１０、ＮＣ７およびＤ４−３の軽鎖可変領域、（ｉｉ）ＥＢ１０、ＮＣ７およびＤ４−３の重鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンＧ１（ｈＩｇＧ１）定常領域を含む、ＦＬＴ３に対して特異的なモノクローナル抗体またはそのフラグメントである。
【０１１３】
本発明の一態様は、ＦＬＴ３のエピトープに結合する抗体またはそのフラグメントであり、そのエピトープは５つまでの細胞外ドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＤ５）を含み、最低でもドメインＤ４またはＤ５のいずれかまたは両方を含む。さらなる態様において、エピトープはＤ４である。なおさらなる態様において、エピトープはＤ５である。
【０１１４】
本発明の一実施形態において、抗体または抗体フラグメントは、ＳＴＡＴ５、Ａｋｔ、ＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫを含むＦＬＴ３の下流経路のリン酸化を阻害する。
【０１１５】
一態様において、本明細書に開示される抗体は、アウリスタチンまたはメトトレキサートを含む抗腫瘍剤に対して免疫抱合される。免疫抱合体は検出可能な標識に結合され得る。別の態様は、標的細胞サンプルと抗体または抗体フラグメントとを接触させて、標識された抗体を検出することによってサンプルがＦＬＴ３を含むかどうかを決定することによって検出する方法である。
【０１１６】
一態様において、治療組成物は、ＦＬＴ３を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害するか、またはＦＬＴ３を発現するヒト腫瘍の退縮を促進するのに有効である。さらなる態様において、治療組成物は、本明細書に開示される抗体および薬学的に受容可能なキャリアである。
【０１１７】
本発明の別の態様は、哺乳動物に有効量の抗体またはその抗体フラグメントを投与することによって哺乳動物内のＦＬＴ３の活性化を中和する方法である。さらに別の態様は、樹枝状細胞の活性化または成熟を阻害する方法であり、その方法は、樹枝状細胞の活性化または成熟を阻害するのに有効な量で樹枝状細胞と本明細書に開示される抗体またはフラグメントとを接触させることを含む。
【０１１８】
本発明の別の態様は、哺乳動物における癌を処置する方法であり、その方法は、哺乳動物に有効量の上記の態様のいずれかの抗体またはそのフラグメントを投与することを含む。本発明はまた、白血病を含む血液学的悪性腫瘍を処置するための方法を提供する。本発明において、白血病としては、限定されないが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病急性転化（急性転化におけるＣＭＬ）および骨髄異形性症候群が挙げられる。本発明によって与えられる別の処置方法は、本発明の抗体またはそのフラグメントを用いて、さらなる抗癌剤または治療を施すことを併せることである。一つの処置方法において、抗癌剤はメトトレキサート（ＭＸＴ）である。
【０１１９】
従って、このように本発明の受容体抗体は、当該分野において周知である、試験、診断、予防または処置の方法のためにインビボおよびインビトロにおいて使用されてもよい。本明細書に開示される本発明の原理の変更が当業者によってなされてもよく、そのような修飾は本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１２０】
本明細書に開示される本発明の原理の変更が当業者によってなされ得ることは理解され、かつ予想され、そのような修飾は本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【０１２１】
以下の実施例は本発明をさらに例示するが、決して本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではなく；それらは本発明の広範な範囲を限定すると決して解釈されるべきではない。ベクターおよびプラスミドの構築、ポリペプチドをコードする遺伝子のそのようなベクターおよびプラスミドへの挿入、宿主細胞へのプラスミドの導入、ならびに遺伝子および遺伝子産物の発現およびその決定に利用されるものなどの従来の方法の詳細な説明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＣｏｌｉｇａｎ，Ｊら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（１９９４）を含む、多くの刊行物から得られ得る。
【実施例】
【０１２２】
ヒト抗ＦＬＴ３抗体の発現および精製
各抗体に関して、ＰＣＲクローニングなどの適切な方法によって、適切な重鎖ヌクレオチド配列、例えば配列番号３７、３８または３９（それぞれＥＢ１０、ＮＣ７およびＤ４−３について）を、適切な発現プラスミド、例えばｐＧＳＨＣへ遺伝子操作し、適切な軽鎖ヌクレオチド配列、例えば配列番号４０、４１または４２（それぞれＥＢ１０、ＮＣ７およびＤ４−３について）を、適切な発現プラスミド、例えばｐＧＳＬＣに遺伝子操作する。安定な細胞株を確立するために、透析したウシ胎仔血清およびグルタミン合成酵素補足物を含むグルタミンを含まないダルベッコ改変イーグル培地などの適切な培地中のエレクトロポレーションおよび培養によって、線形の重鎖および軽鎖プラスミドとともにＮＳＯまたはＣＨＯ細胞などの適切な宿主細胞株中で共トランスフェクトをする。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって抗体発現のためのクローンをスクリーニングし、スピナーフラスコにおいて培養のための最も高い産生株を選択する。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーなどの適切な方法によって抗体を精製する。
【０１２３】
本発明は、組み換えヒトモノクローナル抗体ＥＢ１０、ヒトＦＬＴ３受容体を標的とする完全長ＩｇＧ１κを含む。それは、サブグループＩのヒトγ−１重鎖およびサブグループＩＩのヒトκ軽鎖から構成される。ＥＢ１０  Ｆａｂを、ヒトＦＬＴ３受容体に結合する高親和性および受容体に結合するリガンドを遮断する能力についての選択により、ヒトＦａｂファージディスプレイライブラリーから分離した。ＥＢ１０は、高親和性でヒトＦＬＴ３に選択的に結合し、ＦＬ結合を遮断することを示し、免疫エフェクター機能の活性化に関与する機構によって異種移植片モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を媒介した。
【０１２４】
本発明はまた、組み換えヒトモノクローナル抗体ＮＣ７、ヒトＦＬＴ３受容体を標的とする完全長ＩｇＧ１κを含む。それは、サブグループＩのヒトγ−１重鎖およびサブグループＩＩのヒトκ軽鎖から構成される。ＮＣ７は、高親和性でヒトＦＬＴ３に選択的に結合し、ＦＬ結合を遮断することを示した。
【０１２５】
本発明はまた、組み換えヒトモノクローナル抗体Ｄ４−３、ヒトＦＬＴ３受容体を標的とする完全長ＩｇＧ１κを含む。それは、サブグループＩのヒトγ−１重鎖およびサブグループＩＩのヒトκ軽鎖から構成される。Ｄ４−３は、高親和性でヒトＦＬＴ３に選択的に結合し、ＦＬ結合を遮断することを示した。
【０１２６】
表１および表２は、本発明のアミノ酸配列および種々のＣＤＲの配列番号を提供する。全てのＣＤＲ配列は、Ｃｈｏｔｈｉａの規則の方法を用いて決定した配列番号１および１２を除いて、Ｋａｂａｔの規則の方法を用いて決定する。表３は、本発明に関する種々の配列の配列番号を提供する。以下に開示されるアミノ酸配列をコードするポリ核酸配列もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０１２７】
【表１】
2011521647.tif 000002
【０１２８】
【表２】
2011521647.tif 000003
【０１２９】
【表３】
2011521647.tif 000004
【０１３０】
【表４】
2011521647.tif 000005
【０１３１】
実験に使用した抗体は、表４に与えるように、シグナルを有さない完全長の重鎖および軽鎖から構成された。
【０１３２】
【表５】
2011521647.tif 000006
【０１３３】
抗ＦＬＴ３抗体の結合エピトープ
Ｃ末端からＦＬＴ３の細胞外Ｉｇドメインを次第に欠失することによって、一連のＦＬＴ３細胞外ドメイン欠失変異体−Ｆｃ融合の構築物は、４つの切断受容体タンパク質：ＦＬＴ３−Ｄ１、ＦＬＴ３−Ｄ１−２、ＦＬＴ３−Ｄ１−３、ＦＬＴ３−Ｄ１−４、および完全長レセプター、ＦＬＴ３−Ｄ１−５を含む、５つの構築物の産生を生じる。ＰＣＲベースのストラテジーを用いてＦＬＴ３  ＥＣＤのＩｇ様ドメインを連続的に欠失することによって、ＦＬＴ３  ＥＣＤ変異体のセットを生成する。４つの欠失変異体：Ｆｄ１（アミノ酸２４−１８３）、Ｆｄ１−２（アミノ酸２４−２７１）、Ｆｄ１−３（アミノ酸２４−３７０）、およびＦｄ１−４（アミノ酸２４−４５１）を生成する。ポジティブコントロールとして、同様の方法でアミノ酸２４−５４１を含む完全長ＦＬＴ３（Ｆｄ１−５）を生成する。ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）タグに対してＣ末端上で融合されるヒトＩｇＧ１のＦｃドメインを有するフレーム内で、全ての構築物がライゲーションするＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を用いて、発現ベクターｐｃＤＮＡ  ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に全ての構築物をクローン化する。ＤＮＡシークエンシングによって構築物の各々の完全性を検証する。ＣＯＳ細胞における構築物を一過性に発現し、各々の発現された構築物の正確なサイズをウェスタンブロット解析により検証する。細胞培養物の上清を濃縮する。抗ヒトＦｃ  ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット解析の両方によって上清における各々の変異体の相対タンパク質濃度を推定することにより、変異受容体に対するＦＬの結合を試験し、次いで、結合アッセイに用いる前におよそ同じレベルに調整する。
【０１３４】
ＥＬＩＳＡによってＦＬおよび抗体に対するＦＬＴ３  ＥＣＤドメイン欠失変異体の結合を解析する。手短に、９６ウェルプレートを抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）でコーティングし、続いて、穏やかに振盪しながら１時間、上記のＦＬＴ３  ＥＣＤ  Ｉｇドメイン欠失変異体とともにインキュベーションする。プレートをＰＢＳＴ（０．１％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、次いで、２％Ｍ  ＰＢＳＴ中の抗ＦＬＴ３  ＩｇＧ抗体の１００μｌ／ウェルの連続希釈物とともにインキュベーションする。３回の洗浄後、１００μｌ／ウェルのＨＲＰ抱合抗ヒトＦａｂ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）を含むプレートをインキュベーションする。リガンド結合アッセイにおいて、プレートを４℃で一晩、ＦＬ（１００ｎｇ／ウェル）でコーティングし、続いて、穏やかに攪拌しながら１時間、ＦＬＴ３  ＥＣＤ  Ｉｇドメイン欠失変体とともにインキュベーションする。３回の洗浄後、１００μ／ウェルのＨＲＰ抱合抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）を含むプレートをインキュベーションする。上記のようにプレートを発達させる。変異受容体に対するＦＬの結合を試験する。
【０１３５】
エピトープマッピング研究により、ＮＣ７  Ｆａｂではなく、ＥＢ１０およびＤ４−３一価Ｆａｂフラグメントの両方が、ＥＢ１０およびＤ４−３が（ＦＬＴ３−Ｄ１−ではなく）ＦＬＴ３−Ｄ１−４および完全長の受容体に結合するという事実によって示されるように、そのリガンドに対する結合からＦＬＴ３を遮断することが明らかになり、従って、ヒトＦＬにも結合するＩｇドメイン４内のそれらの結合エピトープをマッピングする。一方で、ＮＣ７は完全長の受容体に結合するだけでなく、任意の他の変異体にも結合し、従って、その結合部位がＩｇドメイン５内に位置することを示す。従って、本発明の抗体はドメイン４またはドメイン５に結合し、これは、ドメイン１〜３に結合する当該分野において公知のリガンドとは異なる。
【０１３６】
競合酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）および遮断アッセイ
ＦＬＴ３結合アッセイに関して、９６ウェルプレートのコーティングを、４℃で一晩、抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でコーティングした。遮断バッファー（０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標）および５％  ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＰＢＳ）で１時間、ウェルを遮断し、次いで、室温で１時間、ＦＬＴ３−Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ×１００μｌ／ウェル）とともにインキュベーションする。ＰＢＳＴで３回ウェルを洗浄し、次いで、ＥＢ１０およびコントロールＩｇＧを加え、室温で１時間、インキュベーションする。洗浄後、１００μｌの抗ヒトκ鎖抗体ＨＲＰ抱合体を含むプレートを室温で１時間、インキュベーションする。そのプレートを洗浄し、次いで、１００μｌの３，３’，５，５’−テトラ−メチルベンジジンとともにインキュベーションする。４５０ｎｍの吸光度にてマイクロプレートリーダーを使用する。
【０１３７】
受容体−リガンド遮断アッセイに関して、可変量のＥＢ１０またはコントロールＩｇＧと、固定量のビオチン化ＦＬＴ３−Ｆｃ融合タンパク質（４５ｎｇ／ウェル）とを混合し、室温で１時間、インキュベーションする。ＦＬ（２５ｎｇ／ウェル）でプレコーティングした９６ウェルプレートに混合物を移し、次いで、室温でさらに１時間、インキュベーションする。洗浄後、ストレプトアビジンＨＲＰ抱合体を加え、４５０ｎｍで吸光度を読む。ＦＬに対するＦＬＴ３結合の５０％阻害（ＩＣ５０）に必要とされる抗体濃度を算出する。
【０１３８】
受容体に結合するＥＢ１０の能力をＥＬＩＳＡによって試験した。表６に示すように、ＥＢ１０は０．５〜１ｎＭの範囲内のＥＣ５０でＦＬＴ３に結合する。
【０１３９】
受容体−リガンド結合を遮断するＥＢ１０の能力を、ＦＬ結合競合ＥＬＩＳＡにおいて試験した。表７に示すように、ＥＢ１０は０．５〜１ｎＭの範囲内のＩＣ５０でＦＬＴ３に対するＦＬの結合を遮断したが、遮断活性はコントロールＩｇＧについて見られなかった。
【０１４０】
【表６】
2011521647.tif 000007
【０１４１】
【表７】
2011521647.tif 000008
【０１４２】
従って、本発明の抗体は、高いリガンド遮断能力およびＦＬＴ３についての高い結合親和性を有する。
【０１４３】
表面プラズモン共鳴による結合反応速度の解析／Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）解析
表面プラズモン共鳴、例えばＢｉａｃｏｒｅ  ２０００（商標）バイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、２５℃でのＦＬＴ３に対する抗体の結合反応速度を測定する。センサーチップ上に約１０００ＲＵ（参照ユニット）の抗体を固定化し、１．５〜１００ｎＭの範囲の濃度で可溶性ＦＬＴ３−Ｆｃ融合タンパク質を注入する。各濃度でセンサーグラムを得て、機器のプログラム、例えばＢＩＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．０プログラムを用いて評価して、速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆを決定する。ｋｏｆｆとも称されるＫｄもまた、解離反応の速度定数である。ｋｏｎとも称されるＫａもまた、会合反応の速度定数である。親和定数（ＫＤ）は、モル濃度（Ｍ）で測定された速度定数の比  ｋｏｎ：ｋｏｆｆから算出する。本明細書に例示する抗体、ＥＢ１０、ＮＣ７およびＤ４−３についてのＫａ、ＫｄおよびＫＤを表８にまとめる。
【０１４４】
【表８】
2011521647.tif 000009
【０１４５】
従って、本発明の抗体はＦＬＴ３についての高い結合反応速度を有する。
【０１４６】
フローサイトメトリー解析
冷ＰＢＳ中で以下に記載する種々の細胞（０．１ｍｌ中に５×１０５）を２回洗浄し、次いで１００μｌのＰＢＳ中の１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とともに３０分間、インキュベーションして、種々の細胞上でＦｃ受容体を遮断する（表９を参照のこと）。冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、次いで、ＥＢ１０（１０μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳに希釈した対応するヒトＩｇＧアイソタイプコントロールとともに、４５分間、インキュベーションする。冷ＰＢＳで細胞を洗浄し、次いで、氷上で４５分間、１００μｌのＰＥ−抱合抗ヒトＦ（ａｂ’）２二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）（１／２００希釈）中でインキュベーションする。洗浄後、Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）Ｅｐｉｃｓ（登録商標）フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，Ｆｌ）などのフローサイトメトリーによって細胞を解析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）でデータを測定する。
【０１４７】
表９は、選択した白血病細胞株のＥＢ１０染色の結果を示す。フローサイトメトリー解析により、ＥＢ１０が、ＥＯＬ−１細胞で発現された野生型ＦＬＴ３、およびＢａＦ３−ＩＴＤ細胞で発現されたＩＴＤ変異体ＦＬＴ３に対しても結合したことを示した。ＥＢ１０に対する結合は、ＦＬＴ３陰性ＪＭ１またはＢａＦ３コントロール細胞株で観察されなかった。
【０１４８】
【表９】
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【０１４９】
リン酸化アッセイ
無血清ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｅｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地中で一晩、細胞を培養する。無血清培地中の種々の濃度の抗体で６０分間、細胞を処理する。３７℃で１５分間、３０ｎｇ／ｍｌ  ＦＬで細胞を刺激する。溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％  ＮＰ−４０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  フッ化フェニルメチルスルホニル，０．５ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム，１μｇ／ｍｌ  ロイペプチン，１μｇ／ｍｌ  ペプスタチンＡ，および１μｇ／ｍｌ  アプロチニン）中に細胞を溶解する。抗ＦＬＴ３抗体４Ｇ８（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに各サンプルから等量の細胞溶解物を、４℃で一晩、インキュベーションし、次いで、さらに２時間、プロテインＡアガロース（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）とともにインキュベーションする。電気泳動後、ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移し、抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて免疫ブロット法を実施して、リン酸化ＦＬＴ３を評価する。Ｑｅｎｔｉｘ（商標）シグナルエンハンサー（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で処理した膜を剥離し、抗ＦＬＴ３抗体Ｓ−１８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で再プローブして、全ＦＬＴ３タンパク質を検出する。化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いてタンパク質のバンドを視覚化した。活性化ＭＡＰＫ、Ｓｔａｔ５またはＡＫＴを検出するために、５０μｇの細胞タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜に移し、示した抗体：ホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ抗体、ホスホ−Ｓｔａｔ５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）またはホスホ−ＡＫＴ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて免疫ブロットする。全ＭＡＰＫ、Ｓｔａｔ５またはＡＫＴタンパク質を検出するために、膜を剥離し、示した抗体：ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ抗体、Ｓｔａｔ５抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、またはＡＫＴ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて再プローブする。
【０１５０】
ＥＢ１０は、野生型ＦＬＴ３のＦＬにより誘発されるリン酸化およびＩＴＤ変異体ＦＬＴ３のリガンド非依存性構成的リン酸化を阻害する。
ＥＯＬ−１およびＥＭ３細胞において、ＦＬの付加は、ＦＬＴ３受容体リン酸化を非常に増加させた。ＥＢ１０とのインキュベーションにより、０．４〜４ｎＭのＩＣ５０での用量依存的様式においてＦＬにより誘発されるリン酸化が遮断された。これらの結果は、ＥＢ１０が、野生型ＦＬＴ３のリガンドにより誘発される活性化の強力な阻害剤であることを示す。
【０１５１】
ＡＭＬにおいて高頻度で見出されるＩＴＤ変異は、ＦＬ非依存性受容体リン酸化およびキナーゼシグナル伝達経路の活性化を引き起こすことが知られている。ＢａＦ３−ＩＴＤおよびＭＶ４；１１の細胞株を用いる変異体ＦＬＴ３の構成的活性化に対するＥＢ１０の阻害効果を表１０に報告する。ＢａＦ３−ＩＴＤおよびＭＶ４；１１の細胞株の両方における変異体ＦＬＴ３は、構成的にリン酸化した。コントロール抗体と比較して、ＥＢ１０は、ＢａＦ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬ非依存性ＦＬＴ３−ＩＴＤリン酸化を阻害した。より少ない程度に、ＥＢ１０はまた、ＭＶ４；１１の細胞におけるＦＬ非依存性ＦＬＴ３−ＩＴＤリン酸化を著しく阻害した。総合すれば、これらの結果は、ＥＢ１０がまた、ＦＬＴ３−ＩＴＤキナーゼ活性の強力な阻害剤であることを実証する。
【０１５２】
【表１０】
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【０１５３】
本発明の抗体は、野生型ＦＬＴ３のＦＬにより誘発されるリン酸化を阻害する。
【０１５４】
ＥＢ１０は下流のキナーゼのＦＬＴ３により媒介される活性化を阻害する。
ＭＡＰＫ、ＰＩ３ＫおよびＳｔａｔ５経路は、活性化ＦＬＴ３の下流のシグナル伝達に関与することが確認されている（Ｓｔｉｒｅｗａｌｔ  ＤＬおよびＪＰ，Ｒａｄｉｃｈ，ＪＰ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ３：６５０−６６５（２００３））。本発明の抗体は、白血病におけるＭＰＫ、ＰＩ３Ｋ、およびＳＴＡＴ５経路の下流のキナーゼを阻害する。
【０１５５】
ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異体によって誘発されるＦＬ非依存性ＭＡＰＫリン酸化に対するＥＢ１０の効果を、ＢａＦ３−ＩＴＤおよびＭＶ４；１１の細胞を用いて調べた。ＥＢ１０は両方の細胞株においてＭＡＰＫのリン酸化を強力に遮断した。これらの結果は、ＥＢ１０によるＦＬＴ３リガンド−受容体相互作用の遮断が、下流のＭＡＰＫシグナル伝達経路の阻害を生じることを実証する（表１１）。ＥＢ１０でのインキュベーションは、ＥＯＬ−１細胞におけるＡＫＴのＦＬにより誘発されるリン酸化およびＢａＦ３−ＩＴＤ細胞におけるＡＫＴのＦＬ非依存性リン酸化を阻害した（表１２）。ＢａＦ３−ＩＴＤ細胞において、ＦＬ非依存性Ｓｔａｔ５のリン酸化は、ＥＢ１０によって強力に阻害されたが、ＥＯＬ−１においては効果はなかった（表１３）。
【０１５６】
【表１１】
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【０１５７】
【表１２】
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【０１５８】
【表１３】
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【０１５９】
細胞増殖アッセイ
ＥＯＬ−１細胞を収集し、無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて３回洗浄する。無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地中で１２時間、細胞を培養する。ＢａＦ３−ＩＴＤ細胞に関して、外因性ＦＬの非存在下で１０％  ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ  １６４０培地中で増殖アッセイを実施する。無血清ＡＩＭ−Ｖ培地中で細胞を再構成し、平底の９６ウェルプレート（１×１０４／１００μｌ／ウェル）中で３連で平板培養し、種々の濃度の抗体（０〜１００ｎＭ）および３０ｎｇ／ｍｌのＦＬとともに３７℃で６８時間、インキュベーションする。バックグラウンドコントロールとして、外因性ＦＬの非存在下で単独の培地を用いて細胞をインキュベーションする。細胞に０．２５μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］−チミジンを４時間適用する。細胞を収集し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃｅ−１２０５  Ｂｅｔａｐｌａｔｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）においてｃｐｍを測定する。ＥＯＬ−１細胞についてのＦＬによって誘発される増殖の阻害率を算出し、全ての実験サンプルのｃｐｍからバックグラウンド増殖（すなわち、ＦＬで刺激していない細胞サンプル）のｃｐｍを推定する。以下の式：［（未処理のサンプルのｃｐｍ−抗体のｃｐｍ−処理したサンプル）／未処理のサンプルのｃｐｍ］×１００％を用いて阻害率を算出する。
【０１６０】
ＥＢ１０は野生型を発現する白血病細胞の増殖を阻害する。
ＦＬは白血病細胞の増殖において重要な役割を果たす。ＦＬとのインキュベーションにより、ＥＯＬ−１細胞の［３Ｈ］−チミジンの取り込みが増加した。ＥＢ１０での処理は、用量依存的様式においてＥＯＬ−１細胞のＦＬにより誘発される増殖を阻害した（表１４）。
【０１６１】
【表１４】
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【０１６２】
ＥＢ１０はＩＴＤ−変異体ＦＬＴ３を発現する白血病細胞の増殖を阻害する。
ＩＴＤ形質転換したＢａＦ３細胞をＦＬ刺激の非存在下で増殖させる。ＦＬ刺激は、ＢａＦ３−ＩＴＤ細胞の増殖を増加させなかった。ＥＢ１０での処理は用量依存的様式においてこれらの細胞のＦＬ非依存性増殖を阻害した（表１５）。
【０１６３】
【表１５】
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【０１６４】
抗体内在化アッセイ
製造業者の指示書に従って、ＩＯＤＯビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて１２５Ｉで放射性ヨウ素標識する。ＥＯＬ−１細胞を、５００ｍｌの冷完全培地中で５×１０５細胞／サンプルにてマイクロチューブに等分する。約１ｍｇのＥＢ１０およびＤ４−３１２５Ｉ標識化抗体を細胞に加え、４℃で１時間インキュベーションする。細胞を冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、５００ｍｌの完全培地に再懸濁し、次いで４℃または３７℃で、０、３０、６０、１２０、２４０または３６０分間、インキュベーションする。各時点で、ＰＢＳ中で細胞を３回洗浄し、次いでガンマカウンタ上で４℃のサンプルを計数して、細胞表面に結合した放射活性の全量を決定する。３７℃のサンプルを５分間、剥離バッファー（１００ｍＭ  グリシン、２Ｍ  尿素、ｐＨ２．５）で剥離する。ガンマカウンタ上で剥離バッファーおよび剥離した細胞ペレットの両方を計数し、内在化した放射性活性の割合を決定する。
【０１６５】
【表１６】
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【０１６６】
ＥＢ１０またはＤ−４３で放射性標識したＥＯＬ−１細胞は腫瘍細胞の表面に容易に結合し、時間依存的に内在化した（表１６）。
【０１６７】
インビトロでのヒト白血病に対する抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）
標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによってＡＤＣＣアッセイを実施する。例えば、ＲｏｓｅｔｔａＳｅｐ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ；ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，カナダまたはＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから供給される正常なドナー血液由来のヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の濃縮物を得る。標的細胞（２×１０６）を２００μＣｉ５１Ｃｒで２時間標識し、次いで洗浄する。多数のＮＫ細胞（以前に１０μｇ／ｍＬ（６７ｎｍｏｌ／Ｌ）コントロールＩｇＧ、Ｃ２２５、ＥＢ１０、ＮＣ７またはＤ４−３ｍＡｂとともに４５分間インキュベーションした）（０〜４００，０００細胞）を、３７℃で６時間、Ｖ底の９６ウェルプレートにおいて３連で約４，０００の５１Ｃｒ標識化標的細胞とともに、または５％  ＳＤＳとともにインキュベーションして、全溶解を測定する。自然放出を測定するために、１００μｌの培地のみを用いて標的細胞（１００μｌ／ウェル中に４，０００細胞）をインキュベーションする。細胞毒性培養物の各ウェルの上清から回収し、ガンマカウンタ（例えば１４７０  Ｗａｌｌａｃ  ＷＩＺＡＲＤ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）上で５１Ｃｒを計数する。１００×（サンプル放出−自然放出）／（全放出−自然放出）として溶解率または細胞毒性率を算出する。
【０１６８】
異なる低分子のＦＬＴ３阻害剤である、ＦＬＴ３に対する抗体は、腫瘍細胞を発現するＦＬＴ３に対する患者の免疫反応を開始できる。特に、抗体は、ＦＬＴ３を発現する細胞がヒトＩｇＧでコーティングされる場合、細胞溶解を誘発できる。この溶解は、白血球、特にＦｃ受容体を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化を生じ得る。本発明の抗体は、ＡＤＣＣなどの下流の免疫エフェクター機能を活性化させる向上した能力を有するヒト抗ＦＬＴ３抗体を提供する。ＥＢ１０は強力なＡＤＣＣ反応を誘発し；ＮＣ７およびＤ４−３は効力の弱いＡＤＣＣ反応を誘発した（表１７）。
【０１６９】
【表１７】
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【０１７０】
ＥＢ１０、ＮＣ７およびＤ４−３は効果的に白血病異種移植片を処置する
ＥＯＬ−１異種移植片ヒトＡＭＬ白血病モデル
１０の群において、５×１０６個の白血病細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射する。腫瘍注射の１日後に処置を開始する。２００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の５００μｇ、２５０μｇまたは１００μｇ／用量のＥＢ１０の示した量の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によりマウスを週に３回処置する。精製したヒトＩｇＧ（５００μｇ／用量）でコントロール群を処置する。生存についてマウスを毎日モニターする。Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ検定によって処置群における生存を比較する。
【０１７１】
コントロール群の全てのマウスは、４０日以内（平均生存時間３６．０±３．１日）で疾患の広範な播種により死んだ。対照的に、生存は、５００μｇ、２５０μｇまたは１００μｇ／用量のＥＢ１０で処置したマウスの群において著しく延びた（０．００１未満、０．００５未満、または０．００１未満のそれぞれのＰ値での平均生存時間６２．３±１８．７、５５．３±１８．９、または５２．８±１８．６）。１０μｇのＥＢ１０で処置した群において効果は観測されず、ＥＢ１０の抗白血病効果が用量依存的であることを示した。
【０１７２】
ヒト白血病細胞の骨髄の生着
２０日で、ＥＢ１０処置したマウス（５００μｇ／用量）およびコントロールＩｇＧ処置した群の大腿骨から骨髄を収集する。骨髄の腫瘍細胞浸潤の程度に関して、白血病細胞注射の６週および１４週後にフローサイトメトリーによってヒトＣＤ４５についての細胞を解析する。蛍光標識した抗ヒトＣＤ４５抗体を用いて免疫組織化学染色を使用して、骨髄の腫瘍細胞浸潤の程度を比較する。骨髄における腫瘍細胞の数は、ＥＢ１０で処置したマウスにおいて著しく減少した。
【０１７３】
ＢａＦ３−ＩＴＤ白血病モデル
１０匹の無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウスの群に５×１０４個のＢａＦ３−ＩＴＤ細胞のｉ．ｖ．注射を開始する。統計的解析のために、ノンパラメトリック片側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定（ＳｉｇｍａＳｔａｔ  ２．０３，ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用する。腫瘍注射の１日後に処置を開始する。２００μＰＢＳ中の５００μｇ／用量または１００μｇ／用量のＥＢ１０のｉ．ｐ．注射により週に３回マウスを処置する。精製したヒトＩｇＧ（５００μｇ／用量）でコントロール群を処置する。生存についてマウスを毎日モニターする。
【０１７４】
コントロールＩｇＧ処置（平均生存時間３２．４±１０．６日）と比較して、ＥＢ１０での処置は、マウスの生存を著しく延ばした（５００μｇ用量に関して６３．４±４４．６日、Ｐ＜０．０５、および１００μｇ用量に関して６６．５±３２．９日、Ｐ＜０．００１）。これらの結果は、ＥＢ１０が野生型ＦＬＴ３およびＩＴＤ−変異体ＦＬＴ３モデルの両方でインビボにおいて治療的に有効であることを示す。
【０１７５】
ＭＯＬＭ１４異種移植片ＡＭＬ白血病モデル
マウスをガンマ線照射器を用いて２００ｒａｄで照射し、次いで１０×１０６個のＭＯＬＭ−１４白血病細胞をｉ．ｖ．注射する。腫瘍注射の１日後に処置を開始する。マウスを週に２回、２００μｌＰＢＳ中の１０ｍｇ／ｋｇおよび０．２ｍｇ／ｋｇ用量のＥＢ１０のｉ．ｐ．注射で処置する。コントロール群を１０μｇ／ｍｌのＵＳＰ生理食塩水で処置する。生存についてマウスを毎日モニターする。Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ検定によって処置群の生存を比較する。
【０１７６】
ＥＢ１０は生存を著しく延ばした。平均生存は、生理食塩水コントロールについての３６日と比較して、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇおよび０．２ｍｇ／ｋｇの用量について、６３日〜３８．５日の範囲であった。この効果は用量依存的であり、各用量は次のより低い用量より、著しくより有効である。
【０１７７】
ＳＥＭ−Ｋ２異種移植片ヒト白血病モデル
１０の群のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに５×１０６個の白血病細胞のｉ．ｖ．注射を開始する。腫瘍注射の１日後に処置を開始する。週に２回マウスを、２００μｌＰＢＳ中の２０ｍｇ／ｋｇのＥＢ１０、ＮＣ７およびＤ４−３のｉ．ｐ．注射で処置する。コントロール群を精製したヒトＩｇＧ（５００μｇ／用量）で処置する。生存についてマウスを毎日モニターする。Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ検定によって処置群の生存を比較する。
【０１７８】
ＥＢ１０、ＮＣ７およびＤ４−３のインビボでの効果を、ＳＥＭ−Ｋ２細胞、野生型ＦＬＴ３を発現するヒトのＡＬＬ細胞株において決定する。ヒトＩｇＧ（平均生存３０．５日）と比較して、ＳＥＭ−Ｋ２白血病モデルにおけるＥＢ１０、ＮＣ７およびＤ４３処置の全ては、生存を著しく延ばした（それぞれ、平均生存１０８．５日、ｐ＜０．０００１；５８．５日、ｐ＜０．０００１および５５．５日、ｐ＝０．０００１）。その効果は、ＮＣ７（ｐ＜０．０００１）およびＤ４３（ｐ＜０．０００１）についてより、ＥＢ１０について著しく、より強力である。ＮＣ７とＤ４３（ｐ＝０．２４４）との間の効果に有意な差は存在しない。
【０１７９】
ＰＫ試験によって決定されるＥＢ１０の効果
反復投与ＰＫ試験において、ＥＢ１０は非常に低い用量で効果的であることを示した。最大効力についての閾値は、２〜１０μｇ／ｍｌの間であることを見出した。ＥＢ１０は、マウスの白血病モデルにおいて４１〜４０１μｇ／ｍｌ  Ｃａｖｇの間、および４９〜４７５μｇ／ｍｌ  Ｃｍａｘの間で最大効力を達成する。Ｃｍａｘについての二次範囲は３７５〜４７５μｇ／ｍｌである。
【０１８０】
ＳＥＭ−Ｋ２白血病モデルにおけるＥＢ１０および化学療法剤メトトレキサート（ＭＴＸ）での併用療法
処置の開始の１日前に、６５匹の７週齢の雄性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、２００μｌの総容量でＰＢＳに懸濁した５×１０５個のＳＥＭ−Ｋ２細胞をｉ．ｖ．注射する。９０％未満の細胞を静脈内に受容しているマウスをこの試験から除外する。次の日、ＳＥＭ−Ｋ２白血病細胞を保有しているＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを、１群当たり１２匹のマウスの４つの処置群に分ける：
１）ＵＳＰ生理食塩水１０μｌ／グラム、ｉ．ｐ．、２回／週；
２）ＥＢ１０  １０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．  ２回／週；
３）ＭＴＸ  １００ｍｇ／ｋｇ、Ｑ７Ｄ；および
４）ＭＴＸ  １００ｍｇ／ｋｇとＥＢ１０  １０ｍｇ／ｋｇとの組み合わせ。
【０１８１】
１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＵＳＰ生理食塩水中にＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，カタログ番号Ｍ９９２９）を調製し、３サイクルについてＱ７Ｄを投与する。ＵＳＰ生理食塩水中にＥＢ１０を調製し、最後の生理食塩水コントロール動物が死ぬ４０日まで、２回／週で投与する。１０ｍｌ／ｋｇ  ｉ．ｐ．で全てのマウスに投与する。組み合わせの群において、１日目にＥＢ１０処置を開始する前に少なくとも１時間、ＭＴＸを投与する。毎日、マウスの生存を記録する。生存についてマウスを追跡し、病的状態／死亡の兆候を示すいずれかのマウスを屠殺する；屠殺の日に死んだと記す。１６８日で試験を終了し、その時点で生存しているいずれかのマウスを屠殺する。処置群の間でＬｏｇ  Ｒｎａｋ検定によって処置群の生存を比較する。
【０１８２】
ＡＬＬのＳＥＭ−Ｋ２モデルにおいてマウスの生存に対するＭＴＸ（その最大耐用量で投与される）およびＥＢ１０の組み合わせの効果を決定した。ＳＥＭ−Ｋ２白血病を、３４日で白血病により死ぬコントロール処置群における全てのマウスで積極的に成長させた。ＥＢ１０およびＭＴＸの両方はこのモデルにおいて効果的であったが、２つの薬剤の組み合わせは、単剤療法としてのいずれかの処置より著しい効果を有した。ＥＢ１０での治療は、コントロール群と比較してマウスの生存（ｐ＜０．０１）を著しく延ばした。より少ない程度で、ＭＴＸでの治療もまた、生存を延ばした。
【０１８３】
ＥＢ１０とＭＴＸの両方での併用療法は、単剤療法と比較して向上した効果（Ｐ＜０．００１）を有した。ＥＢ１０とＭＴＸの組み合わせは、このモデルにおける任意の他の処置より著しく長い平均生存を生じた。さらに、組み合わせの群における４匹のマウスは１６８日のこの試験の終わりまで生存したが、他の処置を受けているマウスはその時点まで生存しなかった。併用療法により、一部のマウスは１５０日の処置を越えて生存することができるが、単剤療法としてＥＢ１０またはＭＴＸのいずれも、この長期間の生存を達成することができないという事実は、ＥＢ１０とＭＴＸの組み合わせは相乗効果があることを示す。ＭＴＸを除く他の化学療法剤とのＦＬＴ３阻害剤、ＰＫＣ４１２の同時投与が、ＦＬＴ３白血病に対して臨床的に効果的であると報告されている、Ｆｒｕｋａｗａら（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２１：１００５−１０１４（２００７））によって公開されたインビトロでの作用を考えると、この結果は、特に予想されないものである。
【配列表】
2011521647000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月26日(2010.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2011521647000001.app
【国際調査報告】
2011521647.tif 000019
2011521647.tif 000020