(57)【要約】本発明は、免疫学および免疫学的診断法の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、治療用抗体による処置が行われる被験体における抗体形成の検出に関する。提供するものは、被験体における治療用抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を判定する診断方法であって、以下のステップ：ａ）ＩｇＧ抗体の定常領域に結合できる固体担体を得るステップ；ｂ）治療用抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を検査しようとする被験体からサンプルを単離するステップ；ｃ）前記固体担体にＩｇＧ抗体を固定化するのに好適な条件下で前記担体を前記サンプルとインキュベートするステップ；ｄ）前記固定化された抗体を前記治療用抗体の定常領域を欠損させ検出可能な標識にコンジュゲートした抗原性フラグメントと、前記固定化された抗体の少なくとも一部と前記抗原性フラグメントとの間で複合体形成が可能な条件下でインキュベートするステップを含み、前記インキュベーションは定常領域を欠損した非治療用抗体の非標識の抗原性フラグメントの存在下で行われる、診断方法である。さらに、そうした方法に使用するキットも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における治療用抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を判定する診断方法であって、以下のステップ：
ａ）ＩｇＧ抗体の定常領域（Ｆｃ）に結合できる固体担体を得るステップ、
ｂ）治療用抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を検査しようとする被験体からサンプルを単離するステップ、
ｃ）前記固体担体にＩｇＧ抗体を固定化するのに好適な条件下で前記担体を前記サンプルとインキュベートするステップ；
ｄ）前記固定化された抗体を、前記治療用抗体の定常領域を欠損させ検出可能な標識にコンジュゲートした抗原性フラグメントと、前記固定化された抗体の少なくとも一部と前記抗原性フラグメントとの間で複合体形成が可能な条件下でインキュベートするステップであって；
前記インキュベーションは定常領域を欠損した非治療用抗体の非標識の抗原性フラグメントの存在下で行われる、ステップおよび
ｅ）前記複合体内の検出可能な標識の量を検出して前記サンプル中の治療用抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を明らかにするステップ
を含む方法。
【請求項２】
治療用抗体に対する前記ＩｇＧ抗体はＩｇＧ４および／またはＩｇＧ１抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固体担体はセファロースビーズまたは磁性ビーズなどのビーズ、ペーパーまたはプラスチック面である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記固体担体はプロテインＡ、プロテインＧ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびＩｇＧに対する一本鎖組換え抗体からなる群から選択される少なくとも１つのＩｇＧ結合成分を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原性フラグメントはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原性フラグメントは好ましくはエラスターゼ、トリプシン、ペプシンおよびパパイン、一層好ましくはペプシンから選択されるプロテアーゼによる治療用抗体の処理により作製される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能な標識は放射性標識、フルオロフォアまたは酵素である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
非治療用抗体の前記非標識の抗原性フラグメントは、任意にＩｇＧを含む組成物（ＩＶＩｇまたはＩｇＧ含有血清）のプロテアーゼ処理により得られるモノクローナル由来のＦ（ａｂ）２フラグメントまたはポリクローナル由来のＦ（ａｂ）２フラグメントである、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記プロテアーゼはエラスターゼ、トリプシン、ペプシンおよびパパインから選択され、好ましくは非標識の抗原性フラグメントを得るのに使用される前記プロテアーゼは前記治療用抗体の前記標識抗原性フラグメントの作製に使用された同じプロテアーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療用抗体は抗癌抗体または抗炎症性抗体であり、好ましくは前記治療用抗体は抗ＴＮＦα抗体である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体は治療用抗体による処置を受けているか、または受けたことがあるヒト被験者、好ましくは癌または関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病、川崎症候群などの（自己）免疫疾患またはアレルギー性障害に罹患しているヒト被験者である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法に使用される診断キットであって、前記キットは治療用抗体の標識抗原性フラグメントおよび非治療用抗体の非標識の抗原性フラグメントを含み、前記抗原性フラグメントは定常領域（Ｆｃ）を欠損している、キット。
【請求項１３】
治療用抗体の前記標識抗原性フラグメントおよび非治療用抗体の前記非標識の抗原性フラグメントは単一容器に入っている、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ＩｇＧ抗体の前記定常領域に結合できる固体担体をさらに含む、請求項１２または１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記固体担体はセファロースビーズまたは磁性ビーズなどのビーズ、ペーパーまたはプラスチック面である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記抗原性フラグメントは好ましくはエラスターゼ、トリプシン、ペプシンおよびパパイン、一層好ましくはペプシンから選択されるプロテアーゼによる治療用抗体の処理により作製される、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
前記検出可能な標識は放射性標識、フルオロフォアまたは酵素である、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８】
非治療用抗体の前記非標識の抗原性フラグメントは、任意にＩｇＧを含む組成物（ＩＶＩｇまたはＩｇＧ含有血清）のプロテアーゼ処理により得られるモノクローナル由来のＦ（ａｂ）２フラグメントまたはポリクローナル由来のＦ（ａｂ）２フラグメントである、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９】
前記プロテアーゼはエラスターゼ、トリプシン、ペプシンおよびパパインから選択され、好ましくは非標識の抗原性フラグメントを得るのに使用される前記プロテアーゼは前記治療用抗体の前記標識抗原性フラグメントの作製に使用された同じプロテアーゼである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記治療用抗体は抗癌抗体または抗炎症性抗体であり、好ましくは前記治療用抗体は抗ＴＮＦα抗体である、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
治療用抗体による被験体の処置を最適化するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法または請求項１２〜２０のいずれか１項に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学および免疫学的診断法の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、治療用抗体により処置される被験体における抗体形成の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床使用が承認された治療用抗体の数は多く、増加しているが、さらに多くの治療用抗体についてヒトの前臨床試験および臨床試験が行われている。その大半はモノクローナル抗体（ｍＡｂ：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、キメラもしくは「ヒト化」抗体またはこれらのフラグメントである。少なくとも約２０種の治療用抗体が市販されており、現在臨床試験が行われているものは１５０種を超えている（非特許文献１、非特許文献２）。こうした治療剤の適応は多岐にわたり、たとえば、臓器移植（ＯＫＴ３（登録商標）、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ（登録商標）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）、Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、腫瘍（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｐａｎｏｒｅｘ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、ＨｕＭａｘ−ＣＤ４（登録商標））、感染症（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標））、炎症および自己免疫疾患（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、多発性硬化症（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））およびアレルギー性喘息（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）））が挙げられる。こうした薬剤の治療活性には、たとえば、標的細胞におけるシグナル伝達イベントの阻害、アポトーシスの直接誘導のほか、間接的な免疫機構など様々な作用機序が関与する場合がある。
【０００３】
関節リウマチ（ＲＡ：ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）の臨床試験により、サイトカイン腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α：ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  α）に対する抗体（アダリムマブ［Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）］、インフリキシマブ［Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）］）が、疾患修飾性抗リウマチ薬、メトトレキサートまたはステロイド治療薬による古典的な処置で効果が得られない大部分の患者に非常に有益であることが明らかになっている。インフリキシマブにはこうした抗炎症作用があるため、クローン病および強直性脊椎炎（ＡＳ：ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）など他の炎症性疾患にも使用され、ＲＡの場合と同様の有効性が認められている。
【０００４】
しかしながら、治療用抗体（ＴＡ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）による処置では、投与した治療用抗体に対する抗体（ＡＴＡ：ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）が形成される場合がある。これが望ましくない副作用を起こし、処置の有効性を低下させる恐れもある。たとえば、インフリキシマブの場合、注入反応に関連しているこうした抗体が患者の７〜１９％で認められており、インフリキシマブを反復投与すると、その作用持続時間が抗体により短縮される恐れがある。ベアート（Ｂａｅｒｔ）ら（非特許文献３）はクローン病の患者を対象にインフリキシマブに対する抗体と注入後のインフリキシマブ濃度との関係、インフリキシマブの臨床効果、および注入に関係した副作用を調査した。本発明者らは、インフリキシマブによる処置を受けたＲＡ患者のほぼ半数で処置から１年以内に抗インフリキシマブ抗体が産生され、抗インフリキシマブ抗体の産生が処置に対する応答の低下に関連していることを報告した（非特許文献４）。
【０００５】
治療用抗体の抗原性は様々な種類の治療用抗体に観察されており、ヒト化の程度に左右されないことが明らかになった。抗原性は、マウスのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体のほか、ＩｇＧ１キメラ抗体およびヒト化ＩｇＧ１抗体でも観察される場合がある。治療用抗体に対する自己抗体の出現率は個々の治療薬によって大きく異なり、マウスのＩｇＧ１抗体ＯＫＴ３（登録商標）の約８０％およびＩｇＧ１キメラ抗体Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）の１０〜５７％から、ＩｇＧ１キメラ抗体Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）またはヒト化ＩｇＧ１抗体Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）の２％未満など多岐にわたる（非特許文献５）。
【０００６】
治療用抗体を含むほぼすべての治療用タンパク質はある程度の抗体反応を惹起し、場合によっては、重篤な副作用および治療反応性の低下を来す恐れがある。後者については、用量を調製することで少なくともある程度対処することができる。たとえば、処置に対して不十分な反応を示す、抗インフリキシマブ抗体を持つ患者の一部では、インフリキシマブの投与量を増やして処置を継続すると、治療用抗体に対する抗体のレベルが低下することが明らかになった（非特許文献４）。
【０００７】
このため、治療用抗体は広く使用されているとはいえ、この分野における主な問題の１つは、治療の有効性を阻害することを主に疾患の兆候および症状の再発を観察することで判定し、その結果用量を増量したり、または処置を終了したりしなければならない抗治療用抗体の発現の可能性である。
【０００８】
治療用抗体の免疫原性の可能性は臨床医の関心事であり、確立された療法による処置および臨床試験の際に、治療用抗体に対して発現する抗体を適切に検出および定量化する必要がある。
【０００９】
治療用抗体の処置を受けている患者において抗治療用抗体（ＡＴＡ）の存在をモニターする現在の方法は通常、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）（セントコア（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）標準操作手順）を用いた手法である。しかしながら、特にこのフォーマットによる抗体に対する抗体の試験では非特異的結合が起こりやすい。そのため、こうしたＥＬＩＳＡの主な問題は、バックグラウンドシグナルが比較的高い可能性があることである。さらに、固定化したＴＡを用いてＡＴＡを捕捉する場合、患者の血清中でＦｃ−Ｆｃ相互作用によりＴＡに対する非ＡＴＡの望ましくない結合が起こることがある。特に、ＩｇＧ４抗体および「リウマ因子」（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ）は、バックグラウンド値が高い。こうした問題は、ＡＴＡの捕捉に治療用モノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントしか使用しないＥＬＩＳＡフォーマットでは認められない。一方、このアッセイの欠点は、健常対照の血清かＴＡ処置を受けている患者の血清かに関わらず、任意の血清に、固定化したＦ（ａｂ’）２の性質に関係なくＦ（ａｂ’）２に結合するＩｇＧ抗体が含まれている可能性があるため、やはりバックグラウンドシグナルが高くなる点である。
【００１０】
上記の観点から、本発明の目的は、ＡＴＡ産生の、信頼性が高く高感度な検出を可能にする改良された診断検査を提供することにある。特に、本発明はＡＴＡ診断アッセイにおける偽陽性結果を防ぐ、または最小限に抑えることを目的とする。
【００１１】
こうした目的は、抗原特異的ＩｇＧ抗体の有無を判定する診断法として応用できるラジオイムノアッセイを用いることで達成できることが明らかになった。「抗原結合試験」（非特許文献６）と呼ばれるこの種の試験は、ＩｇＧ抗体の定常領域に結合できる固体担体の使用をもとに、以下のステップ：
ａ）ＩｇＧ抗体の定常領域に結合できる固体担体を得るステップ、
ｂ）治療用抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を検査しようとする被験体からサンプルを単離するステップ、
ｃ）前記固体担体にＩｇＧ抗体を固定化するのに好適な条件下で前記担体を前記サンプル（たとえば、患者の血清サンプル）とインキュベートし、通常続いて非結合血清成分を除去するため１回または複数回の洗浄ステップを行うステップ、
ｄ）前記固定化された抗体の少なくとも一部と抗原性フラグメントとの間で複合体形成が可能な条件下で、前記固定化された抗体を前記治療用抗体の定常領域を欠損させ検出可能な標識にコンジュゲートした前記抗原性フラグメントと接触させ；前記接触は非治療用抗体の非標識の抗原性フラグメントの存在下で）行い、洗浄ステップの後、非結合標識フラグメントを除去するステップ、および
ｅ）サンプル中の複合体内の検出可能な標識の量を検出して治療用抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を明らかにするステップ
を含む。
【００１２】
全サブクラスに結合する固定化した抗ＩｇＧ試薬を用いて、ＴＡに対する総ＩｇＧの応答を検査する場合、ステップｃ）およびｄ）をまとめてもよい
【００１３】
このアッセイフォーマットでは、「真の」ＡＴＡだけでなく、フラグメントの特異性に関係なく抗原性フラグメントに反応性を示すもの、たとえば、「偽の」ＡＴＡとして現れるＦ（ａｂ’）２フラグメントなど、関連するＩｇＧ型の抗体も捕捉され、固定化される。しかしながら、本アッセイでは、非標識の競合フラグメントが存在することでその後の「偽の」ＡＴＡに対する標識抗原性フラグメントの結合が大きく減少する。
【００１４】
このため、本発明の方法は、様々なＩｇＧ型ＡＴＡの存在のモニタリングおよび定量化に使用することができる。一般的に言えば、治療用抗体に対するＩｇＧ抗体の大部分はＩｇＧ４および／またはＩｇＧ１型抗体である。原則として、この検査フォーマットを用いれば、固相上に固定化した抗体捕捉成分の種類に応じて全免疫グロブリンクラスの特異的抗体を検査できる点に留意されたい。
【００１５】
本方法のステップａ）は、ＩｇＧ抗体の定常領域に結合できる固体担体の使用を含む。固体担体としては、たとえば、アガロース、セルロース、デキストラン、セファデックス、セファロース、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、濾紙、イオン交換樹脂、プラスチック、ガラス、ナイロン、絹などが挙げられる。担体は、たとえば、シート、チューブ、試験板、ビーズ、ディスク、球および同種のものの形であってもよい。
【００１６】
ＩｇＧ抗体の定常領域（Ｆｃ）に結合できる材料は当該技術分野において公知である。こうした材料として、プロテインＡ、プロテインＧ、ならびにモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および一本鎖組換え抗体などのＩｇＧに対する抗体が挙げられる。ＩｇＧ結合材料は、たとえば、化学的カップリングまたは酵素カップリングなど任意の好適な手段により固体担体に結合することができる。
【００１７】
典型的な一実施形態では、固体担体はセファロース結合プロテインＡまたはプロテインＧを含む担体であり、どちらの担体もプロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースとして市販されている。採取するサンプルは一般に、標準的な技法により被験体の血液サンプルから調製できる血清サンプルなどの抗体（その一部はＡＴＡであってもよい）を含む生物学的液体である。
【００１８】
一部の血清サンプルにはＦ（ａｂ’）２抗体に非特異的に（したがって標識抗原フラグメントにも）結合するＩｇＧ抗体が含まれるため、偽陽性の検査結果が出ることが観察されている。
【００１９】
ステップｂ）では、検査対象の被験体、通常はＴＡ治療を受けている患者またはＴＡの臨床試験に参加している被験者から単離したサンプルの調製を行う。採取するサンプルは一般に、標準的な技法により被験体の血液サンプルから調製できる血清サンプルなどの抗体（その一部はＡＴＡであってもよい）を含む生物学的液体である。
【００２０】
ステップｃ）では、ステップａ）で調製したＩｇＧ結合担体をステップｂ）で調製したサンプルの少なくとも一部と、前記固体担体上にＩｇＧ抗体を固定化できる条件下でインキュベートする。当業者であれば、好適な条件、さらには回避すべき条件も分かるであろう。たとえば、塩濃度が高い、および／またはｐＨ値が極端な場合、抗体とＩｇＧ結合固体担体との間の相互作用を妨害する恐れがある。インキュベーションは、たとえば、７．２〜７．６のｐＨ範囲で１種または複数種の塩を含む緩衝液、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ；０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、ＮａＮ３（０．０５％（ｗ／ｖ）；０．３％ＢＳＡ；（ＰＢＳ−ＡＴ）などの緩衝液中で行うのが好ましい。インキュベーションは様々な温度および様々な時間で行ってもよい。好適な温度範囲は、たとえば、約４℃から室温前後である。インキュベーションは一般に、ＩｇＧ抗体が固体担体上に固定化できるように数時間、たとえば、２〜４８時間かけて行う。この反応混合物については、たとえば、固体担体とサンプルとの混合が十分行われるようにローテーターを用いて撹拌しながらインキュベートしてもよい。
【００２１】
当業者であれば理解するように、適切な検査結果を得るには固相の結合能が十分であることが重要である。インキュベートしようとする担体および検査用サンプルの相対量は、たとえば、サンプルの種類および／または使用する担体に応じて異なってもよい。一実施形態では、１／５０希釈の血清サンプル５０μｌを総容量７５０μｌに溶かしたアガロース固定化プロテインＡ１ｍｇと接触させる。別の実施形態では、１／５０希釈の血清サンプルサンプル５０μｌを１ｍｇ／ｍｌの担体、たとえば、ＩｇＧ４に対するセファロース結合抗体の懸濁液０．５ｍｌと接触させる。
【００２２】
本発明によるアッセイのステップｄ）では、一部がＡＴＡであってもよいＩｇＧ抗体を固体担体上に固定化した後、固定化した抗体を目的の治療用抗体の抗原性フラグメントとインキュベートする。前記フラグメントは定常領域を欠損させ検出可能な標識にコンジュゲートしてある。言い換えれば、ＡＴＡの産生を引き起こした可能性がある治療用抗体の標識抗原性フラグメントであって、容易に検出できるが、ステップａ）で調製した固体担体にまだ結合できないフラグメントを使用する。標識抗原性フラグメントは固定化したＡＴＡにより認識され、これに結合することができる。この場合も、前記固定化された抗体の少なくとも一部と前記標識抗原性フラグメントとの複合体形成が可能な条件を用いる。
【００２３】
ステップｅ）では、固定化した抗体と抗原性フラグメントとの間で形成された複合体中の検出可能な標識の量を検出し、サンプル中の治療用抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を明らかにする。このため、ステップｅ）で固体担体に特異的に結合する標識抗原性フラグメントの量を検出すれば、最初からサンプル中に存在するＡＴＡの量が示唆される。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、無関係なＦ（ａｂ’）２の存在下でのインキュベーションの特徴は、偽陽性と考えられるアッセイ結果が減少する点にある。非標識の抗原性フラグメントは定常領域が欠損しており、ＩｇＧ結合固体担体に直接結合することができない。非治療用抗体の非標識の抗原性フラグメントは、抗原性フラグメントの特異性と関係なく抗原性フラグメントと非特異的に反応できる固定化したＩｇＧ抗体と標識フラグメントとの結合を最小限にとどめ、あるいは防止まででき、したがってＡＴＡと見なされることはない。好ましい実施形態では、前記標識および／または非標識の抗原性フラグメントは無関係なＦ（ａｂ’）２フラグメントである。
【００２５】
定常領域を欠損した標識抗原性フラグメントについては、確立した手順に従って目的の治療用抗体をプロテアーゼ処理することで好適に作製する。たとえば、エラスターゼ、トリプシン、フィシン、ペプシンまたはパパインを用いれば、定常領域を除去し、抗原結合フラグメントを分離することができる。
【００２６】
抗体からＦ（ａｂ’）２フラグメントを調製する際はペプシンが繁用される。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの作製には、ヒンジ領域に近い重鎖を切断するペプシンでＩｇＧを消化する。ヒンジ領域で重鎖を連結する１つまたは複数のジスルフィド結合は維持されているため、抗体の２つのＦａｂ領域は共に連結されたままであり、（２つの抗体結合部位を含む）二価の分子が生成され、このためＦ（ａｂ’）２と呼ばれる。軽鎖は無傷のままで重鎖に結合している。Ｆｃフラグメントについては、小さいペプチドに消化される。抗体の消化および抗体フラグメントの精製のプロトコルは（非特許文献７）で確認することができる。
【００２７】
抗原結合活性を保持したＦ（ａｂ’）２フラグメントとして抗体を消化するには市販のキットが入手可能である。プロテアーゼのフィシンは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントをマウスのＩｇＧ１から作製するのに特に好適であることが明らかになった（非特許文献８）。
【００２８】
固定化したＡＴＡの検出を可能にするには、ＴＡの抗原性フラグメントに少なくとも１つの検出可能な標識をつける。好適な標識であればどのようなタイプを用いてもよい。一実施形態では、抗原性フラグメントに、放射性標識（たとえば、１２５Ｉ）、蛍光化学物質（たとえば、ユウロピウムクリプテート）、比色標識および酵素標識（たとえば、西洋わさびペルオキシダーゼ）からなる群から選択される標識をつける。
【００２９】
標識は、標準的な手順により抗原性フラグメントにコンジュゲートすることができる。たとえば、クロラミンＴ法によりＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを直接放射性ヨウ素化することができる（非特許文献９）。
【００３０】
上記から明らかなように本発明の方法では、非治療用抗体の非標識の抗原性フラグメントが、固定化した抗体への結合に際してＴＡの標識フラグメントの「競合物質」として働く。競合物質は、たとえば、ＩｇＧ抗体を含む組成物のプロテアーゼ処理により得られるモノクローナル由来のＦ（ａｂ’）２フラグメントでも、またはポリクローナル由来のＦ（ａｂ’）２フラグメントでもよい。競合フラグメントの調製に好適なＩｇＧ含有組成物に静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ（ＩｎｔｒａＶｅｎｏｕｓ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、サンクイン（Ｓａｎｑｕｉｎ）、オランダ）がある。ＩＶＩＧは、ヒト成人血液中に通常存在する抗体を含む、市販の血漿由来のグロブリン溶液である。ＩＶＩＧは多種多様な自己免疫障害に使用されており、大部分のＩＶＩＧは、複数の血液ドナーに由来するプールしたヒト血漿から製造される。ＩＶＩＧは通常、免疫シグナル伝達が正常に機能する未変性ＩｇＧを９５パーセント超含み、微量のＩｇＡおよびＩｇＭ、サイトカイン、可溶性補体およびＨＬＡ分子も含む。
【００３１】
有用なプロテアーゼとしてはやはり、エラスターゼ、トリプシン、ペプシンおよびパパインが挙げられる。ただし、好ましい実施形態では、非標識の抗原「競合物質」フラグメントを得るのに使用するプロテアーゼは、治療用抗体の標識抗原性フラグメントの作製に使用するのと同じプロテアーゼである。プロテアーゼ処理が類似しているため、類似の非標識フラグメントが、抗体による標識フラグメントの非特異的認識（偽陽性シグナルの原因）を効果的に阻止する可能性が高い。
【００３２】
当業者であれば、本発明を、どのような種類の治療用抗体の抗体検出にも応用できることを理解するであろう。そうした抗体の大部分はモノクローナル抗体（ｍＡｂ：ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、キメラもしくは「ヒト化」抗体またはこれらのフラグメントである。治療用抗体は、たとえば、抗癌抗体または抗炎症抗体である。たとえば、治療用抗体は関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病、川崎症候群、アレルギー性障害などの（自己）免疫疾患の処置に使用される。
【００３３】
特定の態様では、被験体における治療用抗ＴＮＦα抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を判定する診断方法であって、以下のステップ；
ａ）ＩｇＧ抗体の定常領域に結合できる固体担体を得るステップ、
ｂ）治療用抗体の抗ＴＮＦα抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を検査しようとする被験体、たとえば、ＲＡに罹患してインフリキシマブまたは類似の治療用抗体を投与されている患者からサンプルを単離するステップ；
ｃ）前記固体担体にＩｇＧ抗体を固定化するのに好適な条件下で前記担体を前記検査用サンプルとインキュベートするステップ、
ｄ）前記固定化された抗体を、定常領域を欠損させ検出可能な標識にコンジュゲートした抗ＴＮＦα抗体の抗原性フラグメント、たとえば、ペプシン処理した１２５Ｉ標識インフリキシマブとインキュベートし；前記インキュベーションを、定常領域を欠損した非治療用抗体の非標識の抗原性フラグメント（無関係なＦ（ａｂ’）２フラグメント）、たとえば、ペプシン処理したＩＶＩＧの存在下で行うステップ；および
ｃ）複合体内の１２５Ｉの量を検出してサンプル中の治療用抗体の抗ＴＮＦα抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を明らかにするステップ
を含む方法を提供する。
【００３４】
本発明はまた、本発明による方法に使用される診断キットであって、少なくとも治療用抗体の標識抗原性フラグメントおよび非治療用抗体の非標識Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含むことを特徴とする、キットも提供する。
【００３５】
治療用抗体の標識抗原性フラグメントおよび非治療用抗体の前記非標識の抗原性フラグメントは（たとえば、緩衝塩と共に凍結乾燥して）単一容器に入っていてもよい。一実施形態では、キットは、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ；０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、ＮａＮ３（０．０５％（ｗ／ｖ）；０．３％ＢＳＡおよびＩＶＩＧ−Ｆ（ａｂ’）２（１０μｇ／ｍｌ）を含有する緩衝液を含む。
【００３６】
キットは、たとえば、好ましくはプロテインＡ、プロテインＧ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびＩｇＧに対する一本鎖組換え抗体からなる群から選択される少なくとも１つのＩｇＧ結合成分がついたビーズ、ペーパーまたはプラスチック面などＩｇＧ抗体の定常領域に結合できる固体担体をさらに含んでもよい。一実施形態では、キットは、セファロース結合プロテインＡ、プロテインＧまたはＩｇＧ４に対するセファロース結合抗体の懸濁液を含む。
【００３７】
一実施形態では、キット内の非治療用抗体の非標識の抗原性フラグメントは、任意に精製されたＩｇＧ（たとえば、ＩＶＩＧ）をプロテアーゼ処理して得られるモノクローナル由来のＦ（ａｂ’）２フラグメントでも、またはポリクローナル由来のＦ（ａｂ’）２フラグメントでもよい  前述のとおり、抗原性フラグメントは（非）治療用抗体をプロテアーゼ処理することで容易に得ることができる。好適なプロテアーゼとしてはエラスターゼ、トリプシン、ペプシンおよびパパインがあり、一層好ましくはペプシンがある。診断キットに含まれる治療用抗体の標識抗原性フラグメントおよび非治療用抗体の非標識の抗原性フラグメントは同一のプロテアーゼ処理により調製されていると都合がよい場合がある。
【００３８】
キット内の治療用抗体のフラグメントは、対象となる任意の治療用抗体、すなわち、患者において抗体の形成を誘導すると思われるか、またはそれが分かっている治療用抗体のフラグメントであればよい。提供するある診断キットは、被験体における治療用抗体に対するＩｇＧ（４）抗体の有無を判定するキットであって、前記治療用抗体が抗癌抗体または抗炎症抗体である、キットである。
【００３９】
キットの他の構成要素としては、陽性対照サンプル、陰性対照、希釈用緩衝液、使用説明書からなる群から選択される１つまたは複数の構成要素（単数または複数）がある。陽性および陰性対照サンプルは好適に用いて、アッセイが適切に行われていることを確認する。また、対照サンプルは検出シグナルを、たとえば、ＡＵ／ｍｌまたはμｇ  ＡＴＡ／ｍｌ血清など（非）任意単位に変換するのに役立つ場合がある。
【００４０】
さらに、本明細書は、治療用抗体による被験体の処置を最適化するための本発明による方法および／またはキットの使用も提供する。最適化は臨床または実験現場で行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明によるアッセイにより、ＨＡＣＡ（インフリキシマブに対する抗体）陰性であることが分かっている供血者サンプルを用いてＨＡＣＡの有無を検出した際に得られた結果である。白抜きのバーは、競合物質として無関係なＦ（ａｂ’）２を含まない対照インキュベーション緩衝液により得られたデータを表す。黒塗りのバーは、ＩＶＩＧのＦ（ａｂ’）２の存在下でアッセイを行った際のデータを表す。Ｙ軸は１２５Ｉ放射能標識Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの結合量を示し、ＨＡＣＡの存在を示唆する。詳細については実施例１を参照されたい。
【図２】アダリムマブによる処置を受けた患者Ａ〜Ｍの血清サンプルについてＨＡＨＡ（アダリムマブに対する抗体）を検査したものである。患者Ｋ、ＬおよびＭと異なり、患者Ａ〜Ｊでは臨床的異常が示されなかった。白抜きのバーは、競合物質として無関係なＦ（ａｂ’）２を含まない対照インキュベーション緩衝液により得られたデータを表す。黒塗りのバーは、ＩＶＩＧのＦ（ａｂ’）２の存在下でアッセイを行った際のデータを表す。Ｙ軸は１２５Ｉ放射能標識Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの結合量を示し、ＨＡＨＡの存在を示唆する。詳細については実施例１を参照されたい。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例によって本発明を例証する。
【実施例１】
【００４３】
プロトコル
・５０μｌの血清希釈液（ＰＢＳ−ＡＴで１／５０）を５００μｌのプロテインＡセファロース懸濁液（ＰＢＳ−ＡＴ中に２ｍｇ／ｍｌ）とローテーターにより４ｍｌチューブ内で１６時間インキュベートする。
・セハロースを遠沈させて非結合の血清成分を洗い流し、上清を除去する（５回）
・５０μｌの１２５Ｉ放射能標識Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ＰＢＳ−ＡＴ中の放射能標識タンパク質約１ｎｇに相当）を加え、続いて本発明による５００μｌのインキュベーション緩衝液（ＰＢＳ−ＡＴ、１０μｇのＩＶＩＧ  Ｆ（ａｂ’）２／ｍｌ）を加える。このチューブをローテーターにより一晩インキュベートする
・セファロースを遠沈させて非結合の放射能標識を洗い流し、上清を除去する（５回）
・放射能標識の結合をγカウンティングで測定し、段階希釈した標準品を用いて検査結果を定量する
【００４４】
結果
ＨＡＣＡ（インフリキシマブに対する抗体）またはＨＡＨＡ（アダリムマブに対する抗体）を検出するアッセイにより本発明の方法を評価した。
【００４５】
図１は、本発明によるアッセイを用いてＨＡＣＡの有無を検出した際の結果を示す。白抜きのバーは、競合物質として無関係なＦ（ａｂ’）２を含まない対照インキュベーション緩衝液により得られたデータを表す。９つの血清のうち３つは誤ってＨＡＣＡ陽性（＞１％結合）と見なされたと考えられる。黒塗りのバーは、ＩＶＩＧ  Ｆ（ａｂ’）２の存在下でアッセイを行った際にドナーにおける偽陽性結果が減少したことを示す。
【００４６】
アダリムマブによる処置を受けた患者の血清サンプルのＨＡＨＡを検査した際も同様の現象が観察された（図２を参照）。いくつかのサンプルは競合フラグメントの非存在下で明確な陽性結果を示す一方で、こうした患者は臨床的異常を示さない（Ａ、Ｃ、Ｄ）。典型的な患者（Ｋ、Ｌ、Ｍ）は、本発明により検査した際、明確な陽性結果を示す。
【００４７】
結論：
定常領域を欠損した非治療用抗体の非標識の抗原性フラグメントの存在下でのＨＡＣＡおよびＨＡＣＡなどのＡＴＡ．の検査では、免疫原性試験の信頼性が大きく向上する。
【実施例２】
【００４８】
試験用キットの組成
試験用キットは、対象となる治療用モノクローナル抗体由来の標識Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのほか、対象となる治療用抗体と同じ抗体クラス、一般にＩｇＧ由来の無関係な抗体を調製して得られるＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む。キットはこれ以外に、目的の血清抗体を捕獲できる固定化試薬および洗浄緩衝液を含んでいてもよい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００４９】
【非特許文献１】ホリガー（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ）ら著（２００５年）、ネイチャーバイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第２３巻：ｐ．１１２６−１１３６
【非特許文献２】タイルロード（Ｔｈｅｉｌｌａｕｄ）著（２００５年）、エキスパートオピニオンオンバイオロジカルセラピー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、第５巻（補巻１）：Ｓ１５−Ｓ２７
【非特許文献３】ベアートら著（２００３年）ザニューイングランドジャーナルオブメディシン（Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）第３４８巻：ｐ．６０１
【非特許文献４】ウォルビンク（Ｗｏｌｂｉｎｋ）ら著（２００６年）、アースライティス＆リューマティズム（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ）、第５４巻、Ｎｏ．３、ｐ．７１１−７１５
【非特許文献５】カレントファーマシューティカルバイオテクノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第３巻、ｐ．３４９−３６０、２００２年
【非特許文献６】アールバース（Ａａｌｂｅｒｓｅ）ら著（１９８３年）ザジャーナルオブイムノロジー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１９８３年；第１３０巻：ｐ．７２２−６
【非特許文献７】抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｅ．ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびＤ．レーン（Ｌａｎｅ）編、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバー、Ｎ．Ｙ．、１９８８年（Ａ２９２６）
【非特許文献８】マリアニ（Ｍａｒｉａｎｉ），Ｍ．ら著（１９９１年）。モレキュラーイムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第２８巻、ｐ．６９−７７
【非特許文献９】アラノ（Ａｒａｎｏ）ら著（１９９６年）バイオコンジュゲートケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第７巻：ｐ．６２８−６３７
【図１】
2011510291.tif 000002
【図２】
2011510291.tif 000003
【手続補正書】
【提出日】平成23年1月6日(2011.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における治療用抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を判定する診断方法であって、以下のステップ：
ａ）ＩｇＧ抗体の定常領域（Ｆｃ）に結合できる固体担体を得るステップ、
ｂ）治療用抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を検査しようとする被験体からサンプルを単離するステップ、
ｃ）前記固体担体にＩｇＧ抗体を固定化するのに好適な条件下で前記担体を前記サンプルとインキュベートするステップ；
ｄ）前記固定化された抗体を、前記治療用抗体の定常領域(Fc)を欠損させ検出可能な標識にコンジュゲートした抗原性フラグメントと、前記固定化された抗体の少なくとも一部と前記抗原性フラグメントとの間で複合体形成が可能な条件下でインキュベートするステップであって；
前記インキュベーションは定常領域(Fc)を欠損した非治療用抗体の非標識の抗原性フラグメントの存在下で行われる、ステップおよび
ｅ）前記複合体内の検出可能な標識の量を検出して前記サンプル中の治療用抗体に対するＩｇＧ抗体の有無を明らかにするステップ
を含む方法。
【請求項２】
治療用抗体に対する前記ＩｇＧ抗体はＩｇＧ４および／またはＩｇＧ１抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記固体担体はセファロースビーズまたは磁性ビーズなどのビーズ、ペーパーまたはプラスチック面である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記固体担体はプロテインＡ、プロテインＧ、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体およびＩｇＧに対する一本鎖組換え抗体からなる群から選択される少なくとも１つのＩｇＧ結合成分を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記抗原性フラグメントはＦ（ａｂ’）２フラグメントである、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗原性フラグメントは好ましくはエラスターゼ、トリプシン、ペプシンおよびパパイン、一層好ましくはペプシンから選択されるプロテアーゼによる治療用抗体の処理により作製される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出可能な標識は放射性標識、フルオロフォアまたは酵素である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
非治療用抗体の前記非標識の抗原性フラグメントは、任意にＩｇＧを含む組成物（ＩＶＩｇまたはＩｇＧ含有血清）のプロテアーゼ処理により得られるモノクローナル由来のＦ（ａｂ）２フラグメントまたはポリクローナル由来のＦ（ａｂ）２フラグメントである、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記プロテアーゼはエラスターゼ、トリプシン、ペプシンおよびパパインから選択され、好ましくは非標識の抗原性フラグメントを得るのに使用される前記プロテアーゼは前記治療用抗体の前記標識抗原性フラグメントの作製に使用された同じプロテアーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療用抗体は抗癌抗体または抗炎症性抗体であり、好ましくは前記治療用抗体は抗ＴＮＦα抗体である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体は治療用抗体による処置を受けているか、または受けたことがあるヒト被験者、好ましくは癌または関節リウマチ（ＲＡ）、クローン病、川崎症候群などの（自己）免疫疾患またはアレルギー性障害に罹患しているヒト被験者である、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
先行する請求項のいずれか１項に記載の方法に使用される診断キットであって、前記キットは治療用抗体の標識抗原性フラグメントおよび非治療用抗体の非標識の抗原性フラグメントを含み、前記抗原性フラグメントは定常領域（Ｆｃ）を欠損している、キット。
【請求項１３】
治療用抗体の前記標識抗原性フラグメントおよび非治療用抗体の前記非標識の抗原性フラグメントは単一容器に入っている、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ＩｇＧ抗体の前記定常領域(Fc)に結合できる固体担体をさらに含む、請求項１２または１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記固体担体はセファロースビーズまたは磁性ビーズなどのビーズ、ペーパーまたはプラスチック面である、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記抗原性フラグメントは好ましくはエラスターゼ、トリプシン、ペプシンおよびパパイン、一層好ましくはペプシンから選択されるプロテアーゼによる治療用抗体の処理により作製される、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
前記検出可能な標識は放射性標識、フルオロフォアまたは酵素である、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８】
非治療用抗体の前記非標識の抗原性フラグメントは、任意にＩｇＧを含む組成物（ＩＶＩｇまたはＩｇＧ含有血清）のプロテアーゼ処理により得られるモノクローナル由来のＦ（ａｂ）２フラグメントまたはポリクローナル由来のＦ（ａｂ）２フラグメントである、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９】
前記プロテアーゼはエラスターゼ、トリプシン、ペプシンおよびパパインから選択され、好ましくは非標識の抗原性フラグメントを得るのに使用される前記プロテアーゼは前記治療用抗体の前記標識抗原性フラグメントの作製に使用された同じプロテアーゼである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記治療用抗体は抗癌抗体または抗炎症性抗体であり、好ましくは前記治療用抗体は抗ＴＮＦα抗体である、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
治療用抗体による被験体の処置を最適化するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法または請求項１２〜２０のいずれか１項に記載のキットの使用。
【国際調査報告】
2011510291.tif 000004
2011510291.tif 000005
2011510291.tif 000006