(57)【要約】本発明は、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒノックイン非ヒト動物乳癌モデルの開発、および紡錘細胞腫瘍形成に関与する自然機能喪失型ＴＰ５３変異体の特定のためのその使用に関する。本発明は、さらに、本モデルを使用する乳房腫瘍における付加的体細胞変異およびコピー数異常の特定、ならびに乳癌の診断および治療のための方法および手段に関する。【選択図】図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｃ、図１Ｄ、図１Ｅ、図１Ｆ、図１Ｇ、図１Ｈ、図１Ｉ
2014529298.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾された内因性ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、前記修飾された内因性ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子座が、野生型エクソン２０に隣接したＨ１０４７Ｒをコードする休眠変異体ＰＩＫ３ＣＡエクソン２０を含み、前記非ヒトトランスジェニック動物が、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ（ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ）変異対立遺伝子の条件付き発現が可能である、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
前記変異対立遺伝子の条件付き発現が、ＰＩＫ３ＣＡ内因性プロモーターの制御下にある、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記条件付き発現が、Ｃｒｅ媒介組み換えによる前記変異対立遺伝子の活性化によって引き起こされる、請求項３に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４】
前記条件付き発現が、組織特異的である、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記条件付き発現が、乳腺特異的である、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項６】
前記条件付き発現が、変異体ＰＩＫ３ＣＡＨ１０４７Ｒの発現および腫瘍形成をもたらす、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
齧歯類である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項８】
マウスまたはラットである、請求項７に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
ＰＩＫ３ＣＡ内因性プロモーターの制御下で、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ（ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ）変異対立遺伝子を条件付きで発現する、担腫瘍非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１０】
前記ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異対立遺伝子を組織特異的に発現する、請求項９に記載の担腫瘍非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１１】
前記ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異対立遺伝子が、前記動物の乳腺内で発現し、前記腫瘍が乳腺腫瘍である、請求項１０に記載の担腫瘍非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１２】
前記ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異対立遺伝子についてヘテロ接合体である、請求項１１に記載の担腫瘍非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１３】
前記ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異対立遺伝子についてホモ接合体である、請求項１１に記載の担腫瘍非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１４】
前記乳腺腫瘍が、線維腺腫、腺癌、および紡錘細胞腫瘍からなる群から選択される、請求項１１に記載の担腫瘍非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１５】
齧歯類である、請求項９に記載の担腫瘍非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１６】
マウスまたはラットである、請求項１５に記載の担腫瘍非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１７】
Ｈ１０４７Ｒ変異をコードするエクソン２０のコピーを、野生型ＰＩＫ３ＣＡ対立遺伝子をコードするエクソン２０に隣接して配置することを含む、請求項１に記載のトランスジェニック動物を作製するための方法。
【請求項１８】
前記野生型ＰＩＫ３ＣＡ対立遺伝子をコードする前記エクソン２０の横には、ｌｅｘＰ部位、続いて転写停止カセットおよび前記Ｈ１０４７Ｒ変異をコードするＰＩＫ３ＣＡエクソン２０のコピーが並ぶ、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍の存在について対象をスクリーニングする方法であって、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子または対応する遺伝子産物の存在について、前記対象から得られた生物試料を試験することを含む、方法。
【請求項２０】
前記腫瘍が、線維腺腫、腺癌、および紡錘細胞新生物からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍が、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、白血病、および中枢神経系の悪性腫瘍からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍が乳癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
二次体細胞変異またはコピー数変化の存在について、前記試料を試験することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記二次体細胞変異が、ＴＰ５３遺伝子内にある、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記二次体細胞変異が、Ｒ２４８Ｈ、Ａ１３５Ｖ、またはＩ１９５Ｎ  ＴＰ５３変異である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記二次体細胞変異が、Ｒ２４８Ｈ  ＴＰ５３変異である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記二次体細胞変異が、前記Ｐｌｋ１、Ｔｓｓｋ２、またはＳＭＧ１遺伝子内にある、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
（ａ）請求項９に記載の前記担腫瘍非ヒト動物に薬剤候補を投与することと、（ｂ）前記治療に対する前記腫瘍の反応を測定することと、を含む、腫瘍の治療のための薬剤候補をスクリーニングする方法。
【請求項２９】
工程（ｂ）が、前記薬剤候補が、腫瘍細胞数の減少、腫瘍の大きさまたは腫瘍量の減少、末梢器官への腫瘍細胞浸潤の阻害、腫瘍転移の阻害、および腫瘍増殖の阻害からなる群から選択される少なくとも１つの反応を惹起する能力を評価することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記腫瘍が、線維腺腫、腺癌、および紡錘細胞新生物からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記腫瘍が、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、白血病、および中枢神経系の悪性腫瘍からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記腫瘍が、乳癌である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記薬剤候補が、小分子、ペプチド、ポリペプチド、または抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記薬剤候補が、抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
薬剤耐性癌の治療のための抗癌剤を特定するための方法であって、（ａ）請求項９に記載の前記担腫瘍非ヒト動物に薬剤候補を投与することと、（ｂ）前記治療に対する腫瘍の反応を測定することと、（ｃ）前記腫瘍が前記治療に対して陽性反応を呈する場合、前記薬剤耐性癌の治療のための抗癌剤として前記薬剤候補を特定することと、を含む、方法。
【請求項３６】
前記陽性反応が、腫瘍細胞数の減少、腫瘍の大きさまたは腫瘍量の減少、末梢器官への腫瘍細胞浸潤の阻害、腫瘍転移の阻害、および腫瘍増殖の阻害からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＰＩ３Ｋ阻害剤を特定するための方法であって、（ａ）請求項９に記載の前記担腫瘍非ヒト動物にＰＩ１３Ｋ阻害剤候補を投与することと、（ｂ）前記治療に対する前記腫瘍の反応を測定することと、（ｃ）前記腫瘍が前記治療に対して陽性反応を呈する場合、ＰＩ１３Ｋ阻害剤として前記候補を特定することと、を含む、方法。
【請求項３８】
前記癌が乳癌である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
（ａ）請求項９に記載の前記担腫瘍非ヒト動物に薬剤候補を投与することと、（ｂ）前記治療に対する前記腫瘍の反応を測定することと、を含む、前記腫瘍の治療のための薬剤候補をスクリーニングする方法における、請求項９に記載の前記担腫瘍非ヒト動物の使用。
【請求項４０】
（ａ）請求項９に記載の前記担腫瘍非ヒト動物に薬剤候補を投与することと、（ｂ）前記治療に対する前記腫瘍の反応を測定することと、（ｃ）前記腫瘍が前記治療に対して陽性反応を呈する場合、薬剤耐性癌の治療のための抗癌剤として前記薬剤候補を特定することと、を含む、前記薬剤耐性癌の治療のための抗癌剤を特定するための方法における、請求項９に記載の前記担腫瘍非ヒト動物の使用。
【請求項４１】
（ａ）前記担腫瘍動物にＰＩ１３Ｋ阻害剤候補を投与することと、（ｂ）前記治療に対する前記腫瘍の反応を測定することと、（ｃ）前記腫瘍が前記治療に対して陽性反応を呈する場合、ＰＩ１３Ｋ阻害剤として前記候補を特定することと、を含む、ＰＩ３Ｋ阻害剤を特定するための方法における、請求項９に記載の前記担腫瘍非ヒト動物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非ヒト動物乳癌モデルにおけるＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒノックイン非ヒト動物乳癌モデルの開発、および紡錘細胞腫瘍形成に関与する自然機能喪失型ＴＰ５３変異体の特定のためのその使用に関する。本発明は、さらに、本モデルを使用する乳房腫瘍における付加的体細胞変異およびコピー数異常の特定、ならびに乳癌の診断および治療のための方法および手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラスＩＡ  ＰＩ３Ｋ触媒サブユニット、ｐ１１０α、ｐ１１０β、およびｐ１１０δは、偏性二量体としてｐ８５α、ｐ５５α、ｐ５０α、ｐ８５β、またはｐ５５γ調節サブユニットとの複合で生じる。正常細胞において、ＰＩ３Ｋは、基本的に不活性状態で維持され、成長因子の刺激および細胞表面受容体の連結に続いて活性状態になる。活性化されたＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトール４，５二リン酸（ＰＩＰ２）をリン酸化、および変換して、ホスファチジルイノシトール３，４，５三リン酸（ＰＩＰ３）をもたらす。細胞ＲＩＰ３レベルの上昇により、細胞成長、増殖、および生存を含む多数の細胞過程を順に調節するＰＩ３Ｋエフェクタの活性化が促進される（Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１６５５−７（２００２）、Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｐ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３４，６４７−６２（２００６）、およびＶａｎｈａｅｓｅｂｒｏｅｃｋ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ３０，１９４−２０４（２００５）を参照されたい）。
【０００３】
ｐ１１０αをコードする遺伝子である、ＰＩＫ３ＣＡにおける頻繁な体細胞変異が、結腸直腸癌、乳癌、および肝臓癌において報告されている（Ｓａｍｕｅｌｓ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４，５５４（２００４）、Ｂａｃｈｍａｎ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ３，７７２−５（２００４）、Ｌｅｅ，Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４，１４７７−１４８０（２００４））。報告されているｐ１１０α変異の大部分は、３つのホットスポット（２つ（Ｅ５４２ＫおよびＥ５４５Ｋ）はらせんドメイン、１つ（Ｈ１０４７Ｒ）はキナーゼドメイン）において発生する（Ｂａｄｅｒ，Ａ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５，９２１−９（２００５）、Ｚｈａｏ，Ｌ．＆  Ｖｏｇｔ，Ｐ．Ｋ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５，２６５２−７（２００８））。これらのホットスポット変異は、下流シグナル伝達を構造的に活性化することができる発癌性ｐ１１０αを生じさせる（Ｚｈａｏ，Ｌ．＆  Ｖｏｇｔ、上記）。さらに、ｐ１１０α変異体は、細胞内で発現されると、異種移植モデルにおいて細胞形質転換をもたらし、腫瘍形成を支持することができる（Ｓａｍｕｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．、上記、Ｚｈａｏ，Ｌ．＆  Ｖｏｇｔ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２７，５４８６−５４９６（２００８）、Ｉｓａｋｏｆｆ，Ｓ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，１０９９２−１１０００（２００５）、Ｂａｄｅｒ，Ａ．Ｇ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０３，１４７５−１４７９（２００６）、Ｈｏｒｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２７，４０９６−４１０６（２００８））。
【０００４】
遺伝子操作されたヒト癌マウスモデル（ＧＥＭＭ）は、腫瘍の発生および進行を理解するために重要なリソースとして役立つ（Ｗａｌｒａｔｈ，Ｊ．Ｃ．，Ｈａｗｅｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｖａｎ  Ｄｙｋｅ，Ｔ．＆  Ｒｅｉｌｌｙ，Ｋ．Ｍ．Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １０６，１１３−６４（２０１０））。ＧＥＭＭは、治療薬を試験し、治療法を開発するためにも使用されている（Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｋｒａｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８，５８５−９３（２０１０））。変異体ＰＩＫ３ＣＡによる発癌性形質転換に関する理解を目的とする研究は、主に細胞系、異種移植モデル、およびトランスジェニックモデルを使用して行われている（Ｓａｍｕｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．上記、Ｉｓａｋｏｆｆ、上記、Ｂａｄｅｒ，Ａ．Ｇ．、上記、Ｈｏｒｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、上記、Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４，１３５１−６（２００８）、Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１，２７０６−２７１７（２０１１）′Ｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１））。ＰＩＫ３ＣＡ変異は高頻度に発生し、そして小分子阻害剤を開発するための努力が継続されていることを踏まえると、その天然プロモーターおよびゲノムアーキテクチャから内因性レベルで変異体ＰＩＫ３ＣＡを発現することができるノックインマウスモデルは、腫瘍の発生、進行、および治療を研究するための価値あるツールとなる。またそのようなモデルは、腫瘍増殖中に変異体ＰＩＫ３ＣＡと協働する病変の特定に役立つ。
【０００５】
これを念頭において、我々は、野生型をコードするエクソン２０に隣接したＨ１０４７Ｒをコードする発癌性変異体ＰＩＫ３ＣＡエクソン２０の休眠コピーを配置することによって内因性ＰＩＫ３ＣＡ対立遺伝子を修飾した遺伝子操作マウスモデルを作製した。休眠変異対立遺伝子の活性化に先行して、遺伝子操作されたマウスは、修飾された野生型ＰＩＫ３ＣＡ（ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔ）を発現する。しかしながら、Ｃｒｅ媒介組み換え時に、変異ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒは活性化し、発現する。我々は、マウス乳腺上皮におけるＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子の条件付き活性化が、変異体ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒの発現および腫瘍形成をもたらすことを示す。
【０００６】
次世代シークエンシングが進化および発展するにつれて、ヒト腫瘍を塩基対レベルで特性化するこが可能になったが、（Ｓｈａｈ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６１，８０９−８１３（２００９）、Ｄｉｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６４，９９９−１００５（２０１０））、癌のマウスモデルは、腫瘍を進行させながら腫瘍の全身性試料採取および特性化を可能にする、確立された実験的に追跡可能なシステムを提供する。
【０００７】
腫瘍をシーケンスレベルで特性化する試みにおいて、腫瘍の全エクソームキャプチャおよびシークエンシングを行い、紡錘細胞腫瘍形成に関与する潜在的な協働事象として、自然機能喪失ＴＰ５３変異の出現を特定した。本発明は、さらに、このモデルから得た乳房腫瘍における付加的体細胞変異およびコピー数異常の特定に関する。分子特性化に加えて、ＰＩ３Ｋ小分子阻害剤の能力について有効性を検証し、腫瘍が阻害剤処置に反応性である結果を示す。
【発明の概要】
【０００８】
一態様において、本発明は、修飾された内因性ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子座含む非ヒトトランスジェニック動物であって、該修飾された内因性ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子座が、野生型エクソン２０に隣接したＨ１０４７Ｒをコードする休眠変異体ＰＩＫ３ＣＡエクソン２０を含み、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ（ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ）変異対立遺伝子の条件付き発現が可能である、非ヒトトランスジェニック動物に関する。
【０００９】
一実施形態において、変異対立遺伝子は、ＰＩＫ３ＣＡ内因性プロモーターの制御下にある。
【００１０】
別の実施形態において、条件付き発現は、Ｃｒｅ媒介組み換えによる該変異対立遺伝子の活性化によって引き起こされる。
【００１１】
さらに別の実施形態において、条件付き活性は、組織特異的である。
【００１２】
さらなる実施形態において、条件付き活性は、変異体ＰＩＫ３ＣＡＨ１０４７Ｒの発現および腫瘍形成をもたらす。
【００１３】
すべての実施形態において、非ヒトトランスジェニック動物は、例えば、マウスまたはラット等の齧歯類であってよい。
【００１４】
別の態様において、本発明は、ＰＩＫ３ＣＡ内因性プロモーターの制御下で、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ（ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ）変異対立遺伝子を条件付きで発現する、担腫瘍非ヒトトランスジェニック動物に関する。
【００１５】
一実施形態において、動物は、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異対立遺伝子を組織特異的に発現する。
【００１６】
別の実施形態において、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異対立遺伝子は、動物の乳腺内で発現し、腫瘍は乳腺腫瘍である。
【００１７】
さらに別の実施形態において、担腫瘍非ヒトトランスジェニック動物は、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異対立遺伝子のヘテロ接合体である。
【００１８】
別の実施形態において、担腫瘍非ヒトトランスジェニック動物は、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異対立遺伝子のホモ接合体である。
【００１９】
さらなる実施形態において、乳腺腫瘍は、線維腺腫、腺癌、および紡錘細胞新生物からなる群から選択される。
【００２０】
なおもさらなる実施形態において、担腫瘍非ヒトトランスジェニック動物は、マウスまたはラット等の齧歯類である。
【００２１】
さらなる態様において、本発明は、Ｈ１０４７Ｒ変異体をコードするエクソン２０のコピーを、野生型ＰＩＫ３ＣＡ対立遺伝子をコードするエクソン２０に隣接して配置することを含む、上記のトランスジェニック動物を作製するための方法に関する。
【００２２】
一実施形態において、野生型ＰＩＫ３ＣＡ対立遺伝子をコードするエクソン２０の横には、ｌｅｘＰ部位、続いて転写停止カセットおよびＨ１０４７Ｒ変異体をコードするＰＩＫ３ＣＡエクソン２０のコピーが並ぶ。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、腫瘍の存在について対象をスクリーニングする方法であって、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子または対応する遺伝子産物の存在について、対象から得られた生物試料を試験することを含む、方法に関する。
【００２４】
一実施形態において、腫瘍は、線維腺腫、腺癌、および紡錘細胞新生物からなる群から選択される。
【００２５】
別の実施形態において、腫瘍は、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、白血病、および中枢神経系の悪性腫瘍からなる群から選択される。
【００２６】
さらに別の実施形態において、腫瘍は乳癌である。
【００２７】
さらなる実施形態において、本方法は、二次体細胞変異またはコピー数変化の存在について、該試料を試験することをさらに含み、二次体細胞変異は、例えば、ＴＰ５３遺伝子内にあってよく、例えば、Ｒ２４８Ｈ  ＴＰ５３変異であり得る。他の実施形態において、二次体細胞変異は、Ｐｌｋ１、Ｔｓｓｋ２、および／またはＳＭＧ１遺伝子内にあってもよい。
【００２８】
別の態様において、本発明は、（ａ）請求項１に記載の担腫瘍非ヒト動物に薬剤候補を投与することと、（ｂ）該治療に対する腫瘍の反応を測定することと、を含む、腫瘍の治療のための薬剤候補をスクリーニングする方法に関する。
【００２９】
一実施形態において、工程（ｂ）は、薬剤候補が、腫瘍細胞数の減少、腫瘍の大きさまたは腫瘍量の減少、末梢器官への腫瘍細胞浸潤の阻害、腫瘍転移の阻害、および腫瘍増殖の阻害からなる群から選択される少なくとも１つの反応を引き起こす能力を評価することを含む。
【００３０】
別の実施形態において、腫瘍は、線維腺腫、腺癌、および紡錘細胞新生物からなる群から選択される。
【００３１】
さらに別の実施形態において、腫瘍は、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、白血病、および中枢神経系の悪性腫瘍からなる群から選択される。
【００３２】
さらなる実施形態において、腫瘍は乳癌である。
【００３３】
異なる態様において、本発明は、薬剤耐性癌の治療のための抗癌剤を特定するための方法に関し、（ａ）請求項１に記載の該担腫瘍非ヒト動物に薬剤候補を投与することと、（ｂ）該治療の腫瘍の反応を測定することと、（ｃ）該腫瘍が該治療に対して陽性反応を呈する場合、該薬剤耐性癌の治療のための抗癌剤として該薬剤候補を特定することと、を含む。
【００３４】
一実施形態において、陽性反応は、腫瘍細胞数の減少、腫瘍の大きさまたは腫瘍量の減少、末梢器官への腫瘍細胞浸潤の阻害、腫瘍転移の阻害、および腫瘍増殖の阻害からなる群から選択される。
【００３５】
別の実施形態において、腫瘍は、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、白血病、および中枢神経系の悪性腫瘍からなる群から選択される。
【００３６】
特定の実施形態において、腫瘍は乳癌である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ条件付き活性化可能なノックイン対立遺伝子の生成。ａ〜ｄ。（ａ）ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子座をコードするゲノム遺伝子座、（ｂ）標的構成、（ｃ）標的対立遺伝子、（ｄ）ネオマイシンカセットの除去後のＥＳ内の標的遺伝子座、および（ｅ）Ｃｒｅ媒介活性化後のＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子が示される。ｆ〜ｇ。５′プローブ（ｆ）および３′プローブ（ｇ）によるサザンブロット法を使用して、適切に標的されたノックイン（ｋｉ）および野生型（ｗｔ）対立遺伝子を特定した。ｈ〜ｉ。Ｃｒｅ媒介活性化後のＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ／＋乳腺（ｈ）および腎臓（ｉ）から得られたｃＤＮＡのサンガーシークエンシングは、乳腺における変異対立遺伝子の発現を確認する。
【図２】ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒマウスは、乳腺癌を発症する。ａ〜ｂ．腹部乳腺（ａ）および胸部乳腺（ｂ）において腫瘍を担持するマウス。白色矢印の頭部は腫瘍の位置を指す。ｃ．カプラン−マイヤープロットは、潜在的なＰＩＫ３ＣＡｅ２０mwt対立遺伝子のＭＭＴＶ−Ｃｒｅ媒介活性化後の２つの独立したＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ系統の無腫瘍生存を描く。終点において乳腺腫瘍を担持する動物のみをプロットに示す（約２５００ｍｍ３；研究において観察されたＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ／＋雌マウスの系統１の８６．４％および系統２の８４．２％が腫瘍を発症した）。２つの対照群ＭＭＴＶ−ＣｒｅマウスおよびＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔは、研究の期間中に腫瘍を担持しなかった。ｄ〜ｇ．ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ乳腺腫瘍の組織学。Ｈ＆Ｅ染色された腫瘍切片の分析は、線維腺腫（ｄ）、腺扁平上皮癌（ｅ）、腺癌（ｆ）、および紡錘細胞腫瘍（ｇ）を含む、複数の組織型の存在を示す。ｈ．代表的な組織型であるＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ乳腺腫瘍のウェスタンブロットは、対照の乳腺（レーン１〜２）と比較して、すべての腫瘍型において上昇したｐＡＫＴレベル（レーン３〜１０）およびｐＳ６を示す。腫瘍９、１０は、ＳＣＩＤマウス乳腺脂肪体内の初代紡錘腫瘍の継代に由来した。
【図３】ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ乳腺腫瘍の免疫蛍光染色。ａ〜ｐ。Ｈ＆Ｅ（ａ、ｅ、ｌ、およびｍ）、抗ＣＫ１８および抗ＣＫ５（ｂ、ｆ、およびｊ）、抗ＥＲα（ｃ、ｇ、およびｋ）、抗Ｅｒα、および抗ＰＲ（ｏ）、抗ＰＲ（ｄ、ｈ、およびｌ）、ならびに抗ＣＫ１８および抗ビメンチン（ｎ、ｐ）抗体で染色された線維腺腫（ａ〜ｄ）、腺癌（ｅ〜ｈおよびｉ〜ｌ）、および紡錘細胞腫瘍（ｍ〜ｐ）の連続切片。（ｐ）の切片は、第３継代の紡錘細胞腫瘍外植片から得られた。
【図４】ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒが駆動された乳腺における発現プロファイルおよびゲノム異常。ａ．示される遺伝子セットの発現レベルを使用する、組織学的に明確な乳腺腫瘍型の階層的クラスタリングから得られるヒートマップ。異なる組織型の乳腺腫瘍は、明確な発現プロファイルを示す。各試料は、紡錘細胞腫瘍（１〜４；２〜４は１から派生する連続継代である）、対照乳腺（Ｍｇ）（５〜１０）、線維腺腫（１１〜１５）、および腺癌（１６〜２０）となっている。腫瘍試料１７および１８は、腫瘍１６の連続継代から得られる。同様に、腫瘍試料１８は、継代腫瘍１１に由来した。対照乳腺試料６、９、および１０は、それぞれ腫瘍を担持する動物１２、１３、および１４から得た試料に一致した。ｂ．全体エクソームシークエンシングにより、紡錘細胞腫瘍における自然ＴＰ５３変異を特定する。ゲノム領域、ＴＰ５３エクソン（赤色で示される変異）、対象領域からの読み取り（赤色の点として示される変異位置とともに実線で描かれる）、およびＴＰ５３のドメインアーキテクチャ上の変異が示される。ＰＲはプロリンに富む領域、Ｒｅｇはカルボキシ末端調節領域、ＴＡはトランス活性化ドメイン、Ｔｅｔは四量体化領域。ｃ．ＣＧＨ分析は、紡錘細胞腫瘍中のＮＦ−１の喪失を明らかにする。
【図５】ＰＩ３Ｋ阻害剤のインビボ抗腫瘍活性。ａ．異種移植片として増殖したＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ乳腺腫瘍外植片は、ＧＤＣ−０９４１による治療に反応する。治療用量（すべての用量に対し、ｎ＝９）のそれぞれについて、対象（ｎ＝９）に対する腫瘍増殖阻害率をグラフに示す。ｂ．ＧＤＣ−０９４１によって治療された動物から得た腫瘍は、ＰＩ３Ｋ経路阻害の証拠を示す。
【図６】ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ／＋を発現する乳腺は、過剰な側鎖分岐および腫瘍小結節の存在を示す。１２週（ａ、ｂ）および５０週（ｃ、ｄ、ｅ、およびｆ）齢のＭＭＴＶ−Ｃｒｅ（ａ、ｃ、およびｅ）またはＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ／＋（ｂ、ｄ、およびｆ）マウスから得た腹部乳腺のカルミンアルミニウム染色された全組織標本（ａ〜ｄ）またはＨ＆Ｅ染色された断片（ｅ、ｆ）。
【図７】多経産および未経産群の無腫瘍生存。多経産（４６５日）および未経産（４９２日）における無腫瘍生存の中央値のカプラン−マイヤー分析は、統計的に異なる（ログランク試験ｐ値＝０．０００２）。終点において乳腺腫瘍を担持する動物のみがプロットに示される。
【図８】ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔ（ａ、ｃ）またはＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ／＋（ｂ、ｄ）から得た精嚢（ａ、ｂ）および唾液腺（ｃ、ｄ）の組織診。
【図９】初代腫瘍および継代腫瘍の組織学的比較。ａ〜ｆ．（ａ）の線維腺腫は、継代されるとき、（ｂ）に示される紡錘細胞腫瘍を生じた。同様に、（ｃ）の線維腺腫は、継代されるとき、（ｄ）に示される腺癌を生じた。しかしながら、紡錘細胞腫瘍（ｅ）は、継代されるとき、侵襲特性（ｆ）を有するその紡錘細胞組織像を維持した。
【図１０】初代腫瘍および継代腫瘍における腫瘍型別の予測される体細胞変異のヒートマップ表示。ＳＩＦＴ（Ｎｇ，Ｐ．Ｃ．＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １２，４３６−４６（２００２））によって予測される、遺伝子機能に対する変異の作用、有害作用、耐性作用、および採点されない作用（読み出されない作用）が示される。１、２、および３は、３つの異なる線維腺腫であり、４〜６は腺癌である。５および６は、マウス内で継代された２つの独立した腫瘍４外植片に由来する腫瘍である。７〜１０は紡錘細胞腫瘍である。腫瘍７外植片は、マウス内で連続継代され、腫瘍８、９、および１０を生じる。
【図１１】表示される用量でＰＩ３Ｋ阻害剤により治療された担腫瘍マウスの進行にかかる時間のカプラン−マイヤー分析。
【図１２】標的テンプレートベクター。このベクターは、クローニングのための特有の制限酵素部位および標的ベクターを生成するために必要な他の要素を提供するように操作した。
【図１３】ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔ／＋×ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔ／＋交雑から得られる子孫の遺伝子型。
【図１４】ゲノム解析に使用される試料。
【００３８】
表１．腫瘍内で予測される体細胞変異
2014529298.tif 000003
2014529298.tif 000004
【発明を実施するための形態】
【００３９】
Ｉ．定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）。当業者であれば、本発明の実施において使用され得る、本明細書に記載されるものに類似するか、または相当する多くの方法および材料を認識するであろう。実際に、本発明は、記載される方法および材料に決して制限されない。本発明の目的に対し、以下の用語を以下に定義する。
【００４０】
本明細書で使用される「対立遺伝子」、「対立遺伝子多型」、または「対立遺伝子変異」という用語は同義的に使用され、同一の染色体座を占める遺伝子の２つ以上の代替型のいずれかを指す。対立遺伝子変異は、変異を通じて自然に発生し、集団内の表現型多型を生じ得る。遺伝子変異はサイレントであり得るか（コードされたポリペプチドに変化がない）または変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。「対立遺伝子多型」という用語はまた、遺伝子の対立遺伝子多型によってコードされるタンパク質を意味するように本明細書で使用される。典型的には、遺伝子の基準形態は、ある種の集団または単一基準部員からのポリペプチドの野生型形態および／または優位形態をコードする。典型的には、種間および種内に多型を含む対立遺伝子多型は、典型的には、同一種の野生型および／または優位形態と少なくとも８０％、９０％、またはそれ以上のアミノ酸相同性を有し、相同性の程度は遺伝子、および比較が種間であるか、もしくは種内であるかに依存する。一般的に、種内対立遺伝子多型は、ポリペプチドの野生型および／または優位形態と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％以上の相同性（ポリペプチドの野生型および／または優位形態との９６％、９７％、９８％、９９％以上の相同性を含む）を有する。
【００４１】
対象が遺伝子の２つの同一対立遺伝子を有するとき、対象は、その遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合性であると言える。対象が遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有するとき、対象は、その遺伝子についてヘテロ接合性であると言える。特定遺伝子の対立遺伝子は、単一ヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドにおいて互いとは異なり得、ヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含み得る。遺伝子の対立遺伝子は、変異を含む遺伝子の形態であり得る。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「条件付き発現」または「条件付きで発現する」という表現は、条件が満たされるときに遺伝子の転写があり、条件が満たされないときに遺伝子の転写がないことを示すことが意図される。条件付き発現は、細胞によって自然に達成もしくは実行され得るか（すなわち、人工的介入なしに）、または人工的に達成もしくは実行されてよい（すなわち、例えば、これらに限定されないが、化学薬剤の使用等によって調節された領域またはプロモーターの使用等の人工的介入の関与を伴う）。条件付き発現は、例えば、部位特異的リコンビナーゼによって引き起こされる組み換え事象によって開始されてよく、Ｃｒｅ媒介組み換え等によって休眠遺伝子の活性化を生じる。
【００４３】
「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および必要に応じてリボ核酸（ＲＮＡ）等のポリヌクレオチドを指す。この用語は、同等のものとして、ヌクレオチド類似体から作製されたＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの類似体、および必要に応じて、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドも含む。「単離された」核酸分子は、通常は天然源の核酸分子と関連付けられる、少なくとも１つの混在核酸分子から特定および分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、それが自然界で見出される形態または設定以外のものである。単離された核酸分子は、したがって、自然の細胞に存在する核酸分子から区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が自然の細胞とは異なる染色体位置にある、コードされたタンパク質を通常の状態で発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００４４】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それに結合された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。「発現ベクター」という用語は、ベクターによって運ばれるそれぞれの組み換え遺伝子によってコードされる対象タンパク質を合成することができる、プラスミド、コスミド、またはファージを含む。好適なベクターは、それらが結合される核酸の自己複製および発現が可能なものである。本明細書において、プラスミドは最も一般に使用されるベクターの形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」は同義的に使用される。
【００４５】
本明細書で使用される「転写調節要素」および「転写調節配列」という用語は、同義的に使用され、核酸、例えば特定の宿主有機体における操作可能に結合されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に適した対照配列は、プロモーター、任意にオペレータ配列、およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。これらの用語は、転写を促進または調節するすべての要素を包含することが意図され、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼと転写要素との基本的相互作用に必要なコア要素、上流要素、エンハンサー、および応答要素を含む（Ｌｅｗｉｎ，″Ｇｅｎｅｓ  Ｖ″（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）ページ８４７−８７３）。本明細書において、遺伝子または遺伝子群の転写調節要素に関する言及は、天然に存在する転写調節要素のすべてもしくは正常な領域、およびその遺伝子または遺伝子群の転写調節要素の修飾形態の両方を含む。このような修飾形態は、要素の再配置、いくつかの要素または外部シーケンスの欠失、および異種要素の挿入を含む。転写調節要素のモジュール性質およびエンハンサー等のいくつかの調節要素の機能の位置依存の欠如がそのような修飾を可能にする。遺伝子の調節要素を切断して、それらの位置および機能を決定するための多くの技術が使用可能である。このような情報を使用して、希望するときに、要素の修飾を指示することができる。しかしながら、遺伝子の転写調節要素の正常な領域を使用することが好ましい。
【００４６】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、「操作可能に結合される」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前駆タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に結合される。プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に作用する場合、コード配列に操作可能に結合される。リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に操作可能に結合される。一般に、「操作可能に結合される」とは、結合されるＤＮＡ配列が隣接している、および分泌リーダーの場合には、読み取り段階にあって隣接していることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要がない。結合は、便利な制限酵素部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来法に従って使用する。
【００４７】
「トランスフェクション」という用語は、核酸媒介遺伝子導入によるレシピエント細胞への核酸（例えば発現ベクター）の導入を指す。本明細書で使用される「形質転換」は、外因性ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞取り込みの結果として、細胞の遺伝子型が変化するプロセスを指し、形質転換された細胞は、所望の異種タンパク質を発現する。
【００４８】
本明細書で使用される「導入遺伝子」という用語は、それが導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞に対して部分的または全体的に異種、すなわち外来であるか、あるいはそれが導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞の内因性遺伝子に対して同種であるが、それが挿入される細胞を変化させるような方法で、動物のゲノムに挿入されるように設計される、または挿入される（例えば、自然遺伝子とは異なる位置で挿入されるか、またはその挿入がノックアウトを生じる）、核酸配列を指す。導入遺伝子は、選択された核酸の最適発現に必須であり得る、１つ以上の転写調節配列およびイントロン等の任意の他の核酸に操作可能に結合され得る。
【００４９】
したがって、「導入遺伝子構成」という用語は、宿主有機体のゲノムに挿入するための導入遺伝子の一般的操作に有用であり得る、導入遺伝子、および（任意に）転写調節配列、ポリアデニル化部位、複製起源、マーカー遺伝子等の他の核酸配列を含む核酸を指す。
【００５０】
本明細書において、「トランスジェニック」という用語は、例えば、動物の特性、または導入遺伝子を包含する構成を説明する形容詞として使用される。例えば、本明細書で使用される「トランスジェニック有機体」は、任意の動物、好ましくは非人哺乳類、より好ましくは齧歯類であり、動物の細胞の１つ以上が、ヒトの介入（例えば、該技術分野において良く知られているトランスジェニック技術）によって導入された異種核酸を含有する。核酸は、マイクロインジェクション等の意図的な遺伝子操作、または組み換えウイルスによる感染による、細胞前駆体への導入によって、直接または間接的に細胞中に導入される。「遺伝子操作」という用語は、伝統的な交配または体外受精を含まないが、組み換えＤＮＡ分子の導入を指すものである。この分子は、染色体内で統合され得るか、または染色体外で複製するＤＮＡであり得る。
【００５１】
遺伝子の「ノックアウト」は、標的遺伝子の機能の減少を生じる遺伝子配列内の変化を意味し、好ましくは、標的遺伝子の発現は、検出不可能であるか、または影響を与えるものではない。トランスジェニックノックアウト動物は、標的遺伝子の異種ノックアウト、または標的遺伝子の同種ノックアウトを含み得る。本明細書で使用される「ノックアウト」は、条件付きノックアウトも含み、標的遺伝子の変化が、例えば、標的遺伝子の変化、標的遺伝子部位における組み換えを促進する酵素の導入（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系のＣｒｅ）、または生後に標的遺伝子の変化を指示するための他の方法を促進する物質に動物が曝露されると発生し得る。
【００５２】
「ノックイン」は、例えば、標的遺伝子の追加コピーの導入によるか、もしくは標的遺伝子の内因性コピーの発現の強化を提供する調節配列を操作的に挿入することによって、導入遺伝子の発現および／または内因性標的遺伝子の発現変化（例えば、増加（異所性を含む）または発現減少）を生じさせる、宿主細胞ゲノム内の導入遺伝子の標的挿入を指す。「ノックイン」トランスジェニックは、導入遺伝子の異種ノックインまたは導入遺伝子の同種ノックインを含み得る。「ノックイン」は、条件付きノックインも包含し、導入遺伝子の発現および／または内因性標的遺伝子の発現変化は、例えば、そのような発現を促進する物質に動物を曝露することによるか、標的挿入部位において組み換えを促進する酵素を導入することによるか（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘ系のＣｒｅ）、または標的挿入部位を変化させるためのいくつかの他の方法によって発生し得る。
【００５３】
「同種」状態は、同一対立遺伝子が同種染色体上の対応する座に常駐するときに存在する遺伝子状態を意味する。対照的に、「異種」状態は、異なる対立遺伝子が同種染色体上の対応する座に常駐するときに存在する遺伝子状態を意味する。
【００５４】
「部位特異的リコンビナーゼ」は、いくつかのウイルスおよび細菌中に存在し、エンドヌクレアーゼおよびリガーゼ特性の両方を有するように特性化された酵素である。部位特異的リコンビナーゼは、少なくとも以下４つの事象を触媒する。（ａ）「適合性のある部位特異的リコンビナーゼ標的部位」（ＳＳＲＴＳ）で同一方向（例えば、頭尾または尾頭）に挟まれたＤＮＡ断片の欠失、（ｂ）適合性のあるＳＳＲＴＳで反対方向（例えば、頭頭または尾尾）に挟まれたＤＮＡ断片の変換、（ｃ）ＳＳＲＴＳを含有する周期性ＤＮＡ断片の適合性のあるＳＳＲＴＳへの統合、および（ｄ）異なる染色体上に位置する適合性のあるＳＳＲＴＳ間の染色体転座。それらの反応を行うために、部位特異的リコンビナーゼは、典型的には、少なくとも以下の４つの活性を有する。（１）１つまたは２つの特異的ＤＮＡ配列の認識、（２）該ＤＮＡ配列または複数配列の開裂、（３）鎖交換に関与するＤＮＡトポイソメラーゼ活性、および（４）ＤＮＡの開裂された鎖を再封鎖するＤＮＡリガーゼ活性（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：５２１−５２７，１９９４）。
【００５５】
「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、部位特異的組み換え（ＳＳＲ）を実行してＤＮＡ構造を変化させる酵素（複数可）を指す。この定義は、トランスポーゼース、ラムダ統合／除去酵素、および部位特異的リコンビナーゼを含む。良く知られたリコンビナーゼの例としては、これらに限定されないが、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、ＦＬＰ／ＦＲＴ、Ｒ／ＲＳ、Ｇｉｎ／ｇｉｘ、ｐＳＲ１系、ｃｅｒ系、およびｆｉｍ系が挙げられる（例えば、Ｎ．Ｌ．Ｃｒａｉｇ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：１７，１９８８、Ｏｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂ．Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｐｌａｎｔｓ，１９９４，ｐｐ．２１９−２７０，Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ，Ｊｅｒｚｙ，ｅｄ．Ｋｌｕｗｅｒ：Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。さらに、ＳＳＲ系は、ファージ、細菌（例えば、大腸菌）、酵母等の微生物中で特定された。これは、統合および除去のための大腸菌ラムダａｔｔ  Ｐ系（Ｚｕｂｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：４４２，２０００）およびストレプトミセスファージＣ３１インテグラーゼ（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：５９９５，２０００）を含む。これらの微生物からのＳＳＲ系が、この系が由来する有機体とは異なる有機体（植物を含む）に導入されるとき、元の有機体内と同様に動作する。
【００５６】
「リコンビナーゼ部位」または「部位特異的組み換え配列」は、リコンビナーゼが組み換え事象を促進する際に認識するＤＮＡ配列を意味する。当然のことながら、機能性が維持され、リコンビナーゼ酵素が依然としてその部位を認識し、ＤＮＡ配列に結合して、２つの隣接したリコンビナーゼ部位の間の組み換えを触媒し得る限り、これは野生型または変異体リコンビナーゼ部位であり得る。
【００５７】
「ｌｏｘＰに挟まれた（ｆｌｏｘｅｄ）」という用語は、遺伝子要素またはその一部とタンダム部位特異的配列の隣接を指す。部位特異的配列は、同一方向、すなわち直接反復（ＤＮＡ要素がＳＳＲ上で除去されるように）または互いから反対方向（ＤＮＡ要素がＳＳＲ上で反転されるように）に配向されてよい。ｌｏｘＰに挟まれた要素は、単一プロモーター、転写「停止」遮断要素、標的配列に操作可能に結合されたプロモーター、またはこれらと他の遺伝子要素の組み合わせであってよい。
【００５８】
「部位特異的組み換え基質」または「ＳＳＲ基質」は、リコンビナーゼ部位上の部位特異的リコンビナーゼの作用から生じるＳＳＲの基質である任意のＤＮＡを指す。この用語は、ｌｏｘＰで挟まれたＤＮＡ要素、すなわち、リコンビナーゼ部位によって挟まれたＤＮＡ要素を含む。
【００５９】
「創始系統」および「創始動物」という用語は、導入遺伝子が添加された胚の成熟生成物である動物、すなわち、ＤＮＡが挿入された胚から成長し、１つ以上の代理宿主に移植された動物を指す。
【００６０】
「子孫」および「トランスジェニック動物の子孫」という用語は、元の形質転換された哺乳類に続くすべての世代の任意およびすべての子孫を指す。
【００６１】
「哺乳類」という用語は、ヒト、高等霊長類、家畜および農場動物（例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ）、ならびに動物園、スポーツ、またはペット動物、ならびにマウスおよびラットなどの齧歯類を含む哺乳類の全構成員を指す。
【００６２】
「非ヒト哺乳類」という用語は、ヒトを除く哺乳類の全構成員を指す。
【００６３】
本明細書で使用される「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」という表現は、同義的に使用され、すべてのそのような指定は子孫を含む。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、転換の数に関係なくそこに由来する一次対象細胞および培養物を含む。すべての子孫は、意図的または不慮の変異に起因して、ＤＮＡ含有量において精密に同一でない場合があることも理解される。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同一の機能または生物活性を有する変異子孫が含まれる。明らかな指定が意図される場合、それは文脈から明らかとなる。
【００６４】
本明細書で使用される「腫瘍」は、悪性または良性に関わらず、すべての腫瘍性細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌および癌の細胞および組織を指す。
【００６５】
「癌」および「癌性」という用語は、無秩序な細胞成長によって典型的に特徴付けられる哺乳類の生理学的状態を説明または指す。癌の例としては、これらに限定されないが、癌種、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患が挙げられる。そのような癌のより詳細な例としては、扁平細胞癌（例えば、上皮扁平細胞癌）、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。
【００６６】
本明細書で使用される「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能を阻害または防止する、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法薬、および毒素（細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素または酵素的に活性な毒素（それらの断片および／または変異型を含む））を含むことが意図される。
【００６７】
「化学療法薬」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法薬の実施例としては、アルキル化薬、例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）；エチレンイミンおよびメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールメラミンを含む）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；δ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成類似トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特定のクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン）；抗生物質（例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアマイシンγ１ＩおよびカリケアマイシンωＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）を参照）））；ダイネミシン（ダイネミシンＡを含む）；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連クロモタンパク質エネジイン抗生物質発色団（アクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｓｉｎ）、アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン（ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシ��（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキシルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、ミトマイシン（例えば、ミトマイシンＣ）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミピリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン；抗副腎薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充薬、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２′，２′′−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作されたナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））、およびドセタキセルのアルブミン操作されたナノ粒子製剤（ＴＡＸＯＴＥＲ��（登録商標））；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；プラチナ剤、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン；ツブリン重合が微小管を形成するのを防止するビンカ（ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む）；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボビン；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロン酸；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸（ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含む；ビスホスホン酸塩、例えば、クロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳＯ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常細胞増殖に関わるシグナル伝達経路における遺伝子（例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ））の発現を阻害するもの；ワクチン、例えば、ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン：トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；Ｂｃｌ−２阻害剤、例えば、オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピキサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照）；チロシンキナーゼ阻害剤（以下の定義を参照）；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体；ならびに上記の２つ以上の組み合わせ、例えば、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキシルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニソロンの複合療法の省略形）、およびＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵおよびロイコボビンと複合されたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）による治療計画の省略形）が挙げられる。
【００６８】
本出願において使用される「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比較して腫瘍細胞に対して細胞毒性が低く、より活性な親形態に酵素的に活性化または変換され得る、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体形態を指す。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，″Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ″Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）およびＳｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，″Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，″Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照されたい。本発明のプロドラッグとしては、これらに限定されないが、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫酸含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾されたプロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよびより活性があり細胞毒性を含まない薬物に変換され得る、他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられる。本発明において使用するためのプロドラッグ形態に誘導体化され得る細胞毒性薬の例としては、上述の化学療法薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
「リポソーム」は、薬物（例えば、本明細書で開示される抗ＥｒｂＢ２抗体、および任意に化学療法薬）の哺乳類への送達に有用な様々な種類の脂質、リン脂質、および／または界面活性剤から構成される小胞である。リポソームの成分は一般に、生体膜の脂質配置と同様に、二層構造で配置される。
【００７０】
「小分子」は、本明細書において、約５００ダルトン以下の分子量を有すると定義される。
【００７１】
本明細書において、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、所望の抗原結合活性を呈する限りにおいて、正常なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの正常な抗体から形成される多特異的抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含む。
【００７２】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る自然発生する可能性のある変異を除いては同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体を混入させずに合成され得るという点において有益である。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体の性質を表すものであり、任意の特定の方法により抗体を産生する必要があるものと解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により記載されたハイブリドーマ法により作製され得るか、あるいは、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）により作製され得る。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００７３】
本明細書のモノクローナル抗体は、特に、「キメラ」抗体（所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するか、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である一方、鎖（複数可）の残りは、別の種に由来するか、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片の対応する配列と同一または相同である抗体）を含む（米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。本明細書において対象となるキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、猿人等）に由来する可変領域抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む、霊長類化抗体を含む。
【００７４】
「抗体断片」は、正常な抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；線形抗体；一本鎖抗体分子、および抗体断片（複数可）から形成される多特異性抗体が挙げられる。
【００７５】
「正常な」抗体とは、抗原結合可変領域、ならびに軽鎖定常領域（ＣＬ）および重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含むものである。定常領域は、天然配列定常領域（例えば、ヒト天然配列定常領域）またはそのアミノ酸配列変異型であってよい。好ましくは、正常な抗体は、１つ以上のエフェクタ機能を有する。
【００７６】
非ヒト（例えば齧歯類）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、大部分がヒト免疫グロブリン（受容抗体）であり、受容抗体の超可変領域由来の残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類等の非ヒト種（供与抗体）の超可変領域由来の残基により置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒト残基により置換される。更に、ヒト化抗体は、受容抗体にも供与抗体にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾を行い、抗体性能を更に洗練する。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、超可変ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲの全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの一部を含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００７７】
ＩＩ．詳細な説明
癌の条件付きＰＩＫ３ＣＡＨ１０４７Ｒ非ヒト動物モデルの生成
上述されるように、クラスＩＡ  ＰＩ３Ｋ触媒サブユニット、ｐ１１０α、ｐ１１０β、およびｐ１１０oは、ｐ８５α、ｐ５５α、ｐ５０α、ｐ８５β、またはｐ５５γ調節サブユニットとの複合で偏性ヘテロ二量体として発生する。正常な細胞において、ＰＩ３Ｋは基本的に不活性な状態で維持され、成長因子刺激および細胞表面受容体連結に続いて活性状態になる。活性化されたＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトール４，５二リン酸（ＰＩＰ２）をリン酸化、変換し、ホスファチジルイノシトール３，４，５三リン酸（ＲＩＰ３）をもたらす。細胞性ＲＩＰ３レベルの上昇により、細胞成長、増殖、および生存を含む多数の細胞過程を順に調節するＰＩ３Ｋエフェクタの活性化が促進される。
【００７８】
ホスホイノシチジド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）触媒サブユニットｐ１１０αをコードするＰＩＫ３ＣＡにおける発癌性変異は、ヒト乳癌の２５％以上で発生する。ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子おける頻繁な変異は、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、肝細胞癌、甲状腺および子宮内膜癌、急性白血病、および中枢神経系の悪性腫瘍等の他の種類のヒト癌においても報告されている。
【００７９】
本発明は、少なくとも部分的に、乳癌のノックインマウスモデルの開発に基づいており、内因性ＰＩＫ３ＣＡ対立遺伝子を修飾して、頻繁に見出されるＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ（ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ）変異対立遺伝子の組織特異的条件付き発現を可能にした。特に、内因性ＰＩＫ３ＣＡ対立遺伝子は、野生型コーディングエクソンに隣接して、Ｈ１０４７Ｒを含む、発癌性変異ＰＩＫ３ＣＡエクソンの休眠コピーを置くことによって修飾した。休眠変異対立遺伝子の活性化の前に、遺伝子操作マウスは、修飾された野生型ＰＩＫ３ＣＡ（ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔ）を発現した。しかしながら、Ｃｒｅ媒介組み換え時に、変異ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子（ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ）は活性化され、その発現をもたらす。本明細書に提示される結果は、マウス乳腺上皮内のＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子の条件付き活性化が、変異ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒの発現および腫瘍形成をもたらすことを示す。さらに、このモデルからの紡錘細胞腫瘍の全エクソーム分析を行う際に、自然機能喪失ＴＰ５３変異の出現が、腫瘍形成に関与する潜在的な協働事象であるとして特定した。
【００８０】
潜在的なＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子の活性化により、複数の組織型を持つ乳房腫瘍を生じたことがわかった。ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒの発現と一致して、すべての腫瘍はＰＩ３Ｋ経路の活性化を示した。さらに、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒを駆動した乳腺腫瘍の全エクソーム分析により、紡錘細胞型腫瘍の発生中に自然に出現したＴＰ５３ホットスポット変異の十分な特性化を含む複数の変異を識別した。腫瘍形成中の二次変異の出現を研究する際にモデルの実用性を実証するだけでなく、臨床開発におけるＧＤＣ−０９４１、ＰＩ３Ｋ阻害剤の有効性について、このマウスモデルを使用して試験したところ、腫瘍がＰＩ３Ｋ阻害に反応したことを示した。したがって、ここで開発されたトランスジェニック非ヒト動物モデルは、腫瘍の発生、進行、および治療を研究するための価値あるツールであり、腫瘍増殖中に変異ＰＩＫ３ＣＡと協働する病変部位の特定にも役立つ。特に、本発明の非ヒトトランスジェニック動物モデルは、抗癌剤のスクリーニングにおける実用性を見出し、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒおよび二次変異は、単独または任意の組み合わせで、乳癌を含むが、これらに限定されない癌の診断、分類、予後、および治療における実用性が見出される。
【００８１】
本発明のトランスジェニックマウスを生成する際に、Ｃｒｅ−ｌｏｘ組み換え系を使用した。Ｃｒｅタンパク質は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼであり、ＤＮＡ分子における特異的部位の間のＤＮＡ組み換えを触媒することができる。ｌｏｘＰ配列として知られるこれらの部位は、組み換えが発生し得る指向性コア配列を取り囲むＣｒｅの特異的結合部位を含有する。ゲノム内にｌｏｘＰ部位を有する細胞がＣｒｅを発現するとき、組み換え事象がｌｏｘＰ部位の間で発生し得る。二本鎖ＤＮＡは、Ｃｒｅタンパク質によって両方のｌｏｘＰ部位で切断される。次いで鎖をＤＮＡリガーゼで再結合する。組み換えの結果は、ｌｏｘＰ部位の配向に依存する。同一染色体腕上の２つのｌｏｘ部位について、逆ｌｏｘＰ部位は挿入を引き起こす一方で、ｌｏｘＰ部位の直接反復は欠失事象を引き起こす。
【００８２】
Ｃｒｅ−ｌｏｘ組み換え系は当初、哺乳類細胞系およびトランスジェニックマウスにおいて遺伝子発現を活性化する際に使用するために開発されたが、その後、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ組み換えを使用して、トランスジェニック動物の様々な選択細胞型において、ｌｏｘＰによって挟まれた染色体ＤＮＡ配列を高い有効性で欠失することができること、およびＣｒｅ−ｌｏｘ組み換えを使用して、インビボで条件付き遺伝子標的に使用され得ることが示された。さらに、これまでに列挙されたものを含む他の部位特異的組み換え系を使用して、本明細書に具体的に例示されるマウスモデルに類似する非ヒトトランスジェニック動物モデルを生成することができる。
【００８３】
乳癌におけるＰＩＫ３ＣＡ変異の重要性に起因して、乳房腫瘍形成におけるＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子の役割を、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔマウスをＭＭＴＶ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスに交配することによって試験し、乳腺許容ＭＭＴＶ  ＬＴＲプロモーターの制御下で、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現させた。他の種類の腫瘍の場合、他の組織許容または組織特異的プロモーターが使用され得る。肝臓、膵臓、腎臓、肝臓、肺、睾丸等の特定の組織型または器官の発現を生じる調節要素を含む、組織特異的プロモーターは、該技術分野において知られており、例えば、いくつかの機能特徴が知られているヒトプロモーター配列のＴｉＰｒｏＤデータベースから入手可能である。このデータベースは、ユーザが個別のプロモーターおよびそれらが媒介する発現パターンをクエリすること、およびそれらの組織特異的活性に従って一式のプロモーターを検索することを可能にする。ＰＩＫ３ＣＡ変異が機能する他の癌種の非ヒトトランスジェニック動物モデルは、例えば、該技術分野において知られている適切な組織特異的プロモーターの１つを使用することによって生成され得る。
【００８４】
子孫を含む本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、任意の適切な方法によって、導入遺伝子の存在および／または発現についてスクリーニングされ得る。スクリーニングは、多くの場合、導入遺伝子の少なくとも一部に補完的であるプローブを使用して、尾組織から調製されたＤＮＡのサザンブロットまたはＰＣＲにより達成される。導入遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体を使用するウェスタンブロット分析または免疫組織化学は、導入遺伝子産物の存在についてスクリーニングするための代替または追加の方法として用いられてよい。あるいは、最高レベルで導入遺伝子を発現すると考えられる組織または細胞を、ノーザン分析またはＲＴ−ＰＣＲを使用して、導入遺伝子のＲＮＡ発現について試験する。
【００８５】
導入遺伝子の存在を評価するための代替または追加の方法としては、限定されないが、適切な生化学アッセイ、例えば、酵素および／または免疫学的アッセイ、特定のマーカーまたは酵素活性の組織学的染色、フローサイトメトリー分析等が挙げられる。血中の導入遺伝子産物の存在の検出ならびに様々な型の血液細胞および他の血液成分に対する導入遺伝子の有効性を評価するために、血液分析も有用であり得る。
抗癌薬候補のスクリーニング
【００８６】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物モデルは、抗癌活性に対する候補薬剤をスクリーニングすることにおいて実用性を見出される。「抗癌活性」という用語は、最も広義に使用され、宿主に対して有益な効果を提供し得る、腫瘍発生および／または成長を予防、遅延、減速、または阻害する際に、任意の効果を直接または間接的に媒介することにおける活性を含む。したがって、「抗癌活性」は、限定されないが、直接または間接的に、癌細胞の数を低減する能力、腫瘍の大きさまたは腫瘍量を低減する能力、末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害する能力（すなわち、ある程度減速し、好ましくは停止する）、腫瘍転移を阻害する能力（すなわち、ある程度減速し、好ましくは停止する）、腫瘍増殖をある程度阻害する能力、および／または癌に関連付けられた症状の１つ以上をある程度軽減する能力を包含する。
【００８７】
癌の治療における臨床使用を見出す抗癌活性を有する薬剤は、特に興味深い。本開示において、特定の関心対象は、ＰＩＫ３ＣＡにおける発癌性変異によって、および特に変異ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子または二次変異の活性によって特徴付けられる癌を治療することにおいて臨床的利益を提供することができる、抗癌活性を有する薬剤の特定である。
【００８８】
一般に、抗癌活性は、非ヒトトランスジェニック動物モデルにおける癌表現型に対する効果の有無を評価することによって、癌表現型に対するどの効果が候補薬剤の抗癌活性の指標となるかを判断する。したがって、例えば、候補薬剤の投与に続く動物の腫瘍量の減少は、薬剤が抗癌活性を有することを示す。
【００８９】
本発明の非ヒト動物モデルを使用して、抗癌活性についてスクリーニングされ得る候補抗癌薬は、これらに限定されないが、小分子、ペプチド、抗体、および他のポリペプチドを含む、合成、天然に存在する、または組み換えで生成された分子を含む。
【００９０】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーを含む、多種多様な源から得ることができる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生分子のランダムおよび指向性合成のために、多くの手段が使用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリーが、使用可能であるか、または容易に生成される。さらに、天然または合成的に生成されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を通じて容易に修飾され、組み合わせライブラリーを生成するために使用されてもよい。既知の薬学的薬剤は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の指向性またはランダム化学修飾に供され、構造類似体を生成し得る。
【００９１】
候補薬剤は、抗癌活性を審査するために、その薬剤の送達に望ましい、および／または適切な任意の方法で投与され得る。例えば、候補薬剤は、注射（例えば、静脈内、筋肉内、皮下注射等による）、点滴、経口、または任意の他の望ましい手段によって投与され得る。
【００９２】
スクリーニング方法は、可変量の候補薬剤の投与を伴うことができ（薬剤なし〜動物に良好に送達され得る量の上限に近付く量の薬剤、例えば、毒性制限内）、異なる製剤および経路での薬剤の送達を含み得る。薬剤は、単独で投与され得るか、または特に薬剤の複合投与が相乗効果を生じ得る場合、２つ以上の組み合わせで複合され得る。
【００９３】
候補薬剤が既存の癌を治療する能力は、トランスジェニック動物に候補薬剤を投与し、癌表現型の変化を評価することによって判断され得る。癌表現型の変化は、例えば、腫瘍量、腫瘍数、腫瘍の大きさ、腫瘍細胞の代謝活性、無進行生存率（ＰＦＳ）、全体生存率（ＯＦＳ）等に対する効果の有無を評価することによって判断され得る。
【００９４】
候補薬剤が癌の予防を促進する能力は、腫瘍発生をもたらす変異の導入に先行して候補薬剤を投与することによって判断され得る。癌の予防は、介入がない（例えば、抗癌活性を有する薬剤の投与なし）場合に予想される癌の発生および／または重篤度に対して、動物における腫瘍の発生および／または重篤度の低減を指す。
【００９５】
本発明のさらなる詳細は、以下の非限定例によって示される。
実施例
【００９６】
条件付きで活性化可能なＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒマウスモデル
材料および方法
条件付きで活性化可能なＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒマウスの生成
標的ベクターテンプレート（図１）を使用して、最終標的ベクターを組み立てた。Ｃ５７Ｂ／６Ｎ  ＥＳ細胞からのマウスゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＰＩＫ３ＣＡエクソン１８〜１９を包含する２．０４５ｋｂ断片（左腕）、ＰＩＫ３ＣＡ野生型エクソン２０を含有する５８８ｂｐ領域（中央腕）、およびこれもエクソン２０および追加の３′イントロン配列を含む３．１３７ｋｂゲノムＤＮＡ（左腕）をＰＣＲ増幅させ、ベクターの構築に使用した。テンプレート標的ベクターにクローン化する前に、標準変異生成技術を使用して、左腕のエクソン２０によってコードされるコドン１０４７をヒスチジン（Ｒ１０４７Ｈ）のコードに変異させた。中央腕を標的テンプレートベクターにクローン化する際に、野生型エクソン２０領域は、ベクター内に存在する高ポリＡシグナルの付加によって修飾した。ネオマイシン発現カセット、４ｘ転写停止カセット（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５，３２４３−８（２００１））もベクターによって提供された。最終構成において、ネオマイシンカセットは、ＥＳ細胞の修飾に続いてその切除を促進するように「ｆｒｔ」部位によって挟まれた。また修飾された野生型エクソンは、その除去を促進するように「ｌｏｘＰ」部位によって挟まれ、その時点で変異エクソン２０が活性化され得る（図１）。標的ベクターの精度は、サンガーシークエンシングによって検証した。標的構成物をＣ５７Ｂ／６Ｎ  ＥＳ細胞中にエレクトロポレーションし、ネオマイシン耐性に対して選択した。適切に標的化されたＥＳクローンは、５′および３′サザンブロット法によって特定した。ＡｆｌＩＩ消化およびサザンブロット法に続いて適切な標的ゲノムＤＮＡを試験したときに、５′プローブは、６．６ｋｂ野生型断片および９．１ｋｂ断片を認識した。同様に、３′プローブは、ＳａｃＩ消化に続いて、適切に修飾されたゲノム領域内で６．９ｋｂ野生型断片および４．８ｋｂ断片を認識した（図１ｃ）。ネオマイシンカセットの除去、ならびにＰＣＲおよびシークエンシングを使用してのＰＩＫ３ＣＡをコードする修飾されたゲノム領域のアーキテクチャの確認に続いて、ＥＳクローンを胚盤胞に注射し、キメラマウスを生成した。野生型マウスにおける２０１ｂｐ断片に対向する２９０ｂｐのＰＣＲ生成物が、プライマー２０Ｆ（ＡＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＡＡＴＡＡＴＴＣＴＴＡＧＣＡＣＡ）（配列番号１）およびを２０Ｒ（ＣＡＧＴＧＣＴＴＧＡＡＣＡＴＴＧＧＡＧＧＴＣＡＧＴ）（配列番号２）を使用して生成され、生殖細胞系列伝達および遺伝子型修飾されたＰＩＫ３ＣＡ対立遺伝子を担持するマウスを追跡した。乳腺内の潜在的なＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異対立遺伝子を活性化するために、ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ  ＃００３５５１）系のこのマウスを生育した。エンドポイント研究のために、触知可能な腫瘍を持つマウスを、腫瘍が約２５００ｍｍ３になるまで追跡し、次いで安楽死させた。また、２未満の任意の身体条件スコア（Ｕｌｌｍａｎ−Ｃｕｌｌｅｒｅ，Ｍ．Ｈ．＆  Ｆｏｌｔｚ，Ｃ．Ｊ．Ｂ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  ４９，３１９−２３（１９９９））、円背姿勢、および２０％超の体重減少を���したマウスも安楽死させた。すべてのマウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従って、動物施設内で維持した。
【００９７】
ＤＮＡ／ＲＮＡの調製
Ｑｉａｇｅｎ  ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して、腫瘍／組織からのＤＮＡを調製した。ＲＮＡ試料は、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して調製した。
【００９８】
発現の分析
総ＲＮＡ試料の量および質を、それぞれＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＤＥ）およびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を使用して決定した。Ｃｙ染料標識ｃＲＮＡおよびアレイハイブリダイゼーションは、製造者（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）の指示に従って調製した。つまり、ＡｇｉｌｅｎｔのＱｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキットを使用して、総ＲＮＡ試料を二本鎖ｃＤＮＡ、次いでＣｙ染料標識ｃＲＮＡに変換した。標識ｃＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して精製した。ｃＲＮＡ収率およびＣｙ染料の統合は、ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を使用して決定した。７５０ｎｇの標識ｃＲＮＡを断片化し、Ａｇｉｌｅｎｔの全マウスゲノム４ｘ４４Ｋアレイにハイブリダイズした。すべての試料をＣｙ５染料で標識し、Ｃｙ３染料標識普遍マウス基準（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）に対してハイブリダイズした。試料を１７時間、６５℃で一定攪拌しながらＰｒｏ  ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎステーションＨＳ４８００（Ｔｅｃａｎ  ＵＳ，ＮＣ）上でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションに続いて、アレイを洗浄、乾燥、およびＡｇｉｌｅｎｔスキャナー上でスキャンした。ＡｇｉｌｅｎｔのＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア１０．７を使用して、得られたアレイ画像を分析した。
【００９９】
遺伝子発現データを、共通の基準設計実験において使用される２色Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイから得た。共通の基準試料をＣｙ３チャネル内で測定し、対象の試料をＣｙ５チャネル内で測定した。ｌｉｍｍａのＲパッケージにおいて実装される方法を使用して、データを処理した（Ｓｍｙｔｈ，Ｇ．Ｋ．Ｓｔａｔ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３，Ａｒｔｉｃｌｅ３（２００４））。最初にデータをバックグラウンド修正し、その後アレイ内レス適合正規化、およびアレイ間四分位正規化を適用した（Ｓｍｙｔｈ，Ｇ．Ｋ．＆  Ｓｐｅｅｄ，Ｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３１，２６５−７３（２００３））。ｌｉｍｍａの線形モデル適合およびＦＤＲを有するプローブを使用して、０．０５以下のＰ値に調整された差次的発現の遺伝子特性を得て、少なくとも２のログ２変化が、差次的に発現したと見なされた。ユークリッド距離メトリックおよび完全な連結クラスタ化を使用して、平均中心化遺伝子発現プロファイル上の試料およびＥＭＴ関連遺伝子の階層クラスタ化を演算した。
【０１００】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）アレイ
ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒマウスからの乳腺腫瘍試料を、製造者のプロトコル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）に従ってＡｇｉｌｅｎｔ  ＣＧＨアレイに関してプロファイル化した。つまり、腫瘍および基準試料両方（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭＥ）の５００ｎｇＤＮＡを、Ａｌｕ  ＩおよびＲｓａ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を用いて消化し、次にＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した。Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  Ｐｌｕｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を使用して、消化された試料をＣｙ５−ｄＵＴＰ（試験試料）またはＣｙ３−ｄＵＴＰ（基準試料）で標識した。試験試料を基準試料とともにプールし、次に、ＭｉｃｒｏＣｏｎ  ＹＭ−３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して精製した。標識プローブをＣｏｔ−１  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、１０ｘ遮断薬および２ｘ  Ｈｉ−ＲＰＭハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）と混合し、Ａｇｉｌｅｎｔの２４４Ｋ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＣＧＨマイクロアレイにハイブリダイズした。試料を２４時間、６７℃で一定攪拌しながらＰｒｏ  ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎステーションＨＳ４８００（Ｔｅｃａｎ  ＵＳ，ＮＣ）上でハイブリダイズした。アレイを洗浄、乾燥し、製造者のプロトコル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）に従って、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナー上でスキャンした。個別のｌｏｇ２比のバックグラウンドを控除したシグナル強度をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアバージョン１０．７から得た。ｌｏｇ２比を中央値ゼロに中心化させ、各プローブについて得られたｌｏｇ２比の値を、ＧＬＡＤを用いてセグメント化した（Ｈｕｐｅ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０，３４１３−２２（２００４））。指定のＧＬＡＤ由来のセグメントのゲノム結合内にあるすべての遺伝子は、そのセグメント内のプローブの平均コピー数値を示した。０．４  ｌｏｇ２比単位以上のコピー数値は獲得を表し、−０．４  ｌｏｇ２比単位以下は喪失を表した。
【０１０１】
エクソームのキャプチャおよびシークエンシング
製造者のプロトコル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）に従って、３μｇのゲノムＤＮＡおよびＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＸＴ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎキットを使用して標的シーケンスキャプチャを行った。Ｍｏｕｓｅ  Ａｌｌ  Ｅｘｏｎキットは、４９．６Ｍｂの標的領域をキャプチャするように設計し、２４，３０６遺伝子内の２２１，７８４エクソンを網羅する。４つのＰＣＲサイクルを使用して、キャプチャ前ライブラリーを増幅させる一方で、１２ＰＣＲサイクルをキャプチャ後増幅に使用した。ＤＮＡ高感度チップ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を使用して、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００上でキャプチャ後増幅されたライブラリーの断片サイズ分布を決定した。ライブラリーの濃度は、Ｋａｐａライブラリー定量キット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＡ）によって測定した。各ライブラリーをＨｉＳｅｑ２０００上でシーケンス化して、製造者（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，ＣＡ）の指示により２ｘ７５ｂｐ読み取りを生成した。デフォルトパラメータに設定されたＢＷＡソフトウェア（Ｌｉ，Ｈ．＆  Ｄｕｒｂｉｎ，Ｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５，１７５４−６０（２００９））を使用して、シークエンシング読み取りをＵＣＳＣマウスゲノム（ＮＣＢＩ３７／ｍｍ９）にマップした。以前に説明されたように、ローカル再配置、複製作製、および原変異型読み出しを行った（ＤｅＰｒｉｓｔｏ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４３，４９１−４９８（２０１１））。ｄｂＳＮＰ  Ｂｕｉｌｄ１３１（Ｓｈｅｒｒｙ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９，３０８−１１（２００１））において表されるＳＮＰを使用して、既知の生殖細胞系列変異型を除去した。さらに、腫瘍および正常試料の両方に存在した変異型は、生殖細胞系列変異型として除去した。腫瘍試料に存在するが、適合する正常試料には存在しない残りの変異型が、体細胞になると予測された。予測された体細胞変異型を、腫瘍および適合正常試料の両方において、最小の１０ｘ被覆の位置のみを含み、適合正常試料において１％未満で観察された変異型対立遺伝子頻度を含むようにさらに選別した。ＳＩＦＴ（Ｎｇ，Ｐ．Ｃ．＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １２，４３６−４６（２００２））およびＰｏｌｙＰｈｅｎ（Ｒａｍｅｎｓｋｙ，Ｖ．，Ｂｏｒｋ，Ｐ．＆  Ｓｕｎｙａｅｖ，Ｓ．Ｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３０，３８９４−９００（２００２））を使用して、遺伝子機能に対するタンパク質体細胞変異の効果を予測した（表１）。
【０１０２】
組織学的、免疫組織化学的全組織分析
５ミクロンのホルマリン固定、パラフィン包埋標本を用いて、ルーチンなヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および組織学評価を行った。
【０１０３】
全組織分析のために、乳腺を切除して広げ、Ｃａｒｎｏｙ固定剤で２〜４時間固定した。組織を水和し、カルミンアルミニウム中で一晩染色した。
【０１０４】
１０ミクロン小片Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ，ＣＡ）包埋凍結試料を使用して免疫蛍光染色を行った。切断された試料を４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、次いで３０分間、１％  ＢＳＡを含有するＰＢＴ（０．１％  トリトンを含むＰＢＳ）中でブロッキングした。次いでブロッキングされた切片を、加湿されたチャンバ内で４℃で一晩、０．１％  ＢＳＡを含むＰＢＴ中で希釈された適切な一次抗体で染色した。スライドをＰＢＴ中で３回洗浄し、次いで加湿されたチャンバ内で室温で６０分間適切な二次抗体で培養した。ＰＢＴで洗浄することによって、未結合の二次抗体を除去した。Ｐｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）をスライド上に載せて使用した。研究に使用される一次抗体は、サイトケラチン５（Ａｂｃａｍ，ａｂ５３１２１）、サイトケラチン１８（Ａｂｃａｍ，ａｂ６６８）、ＥＲα（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｂ−２１）、ＰＲ（Ａｂｃａｍ，ａｂ２７６４）、およびＶｉｍｅｎｔｉｎ（Ａｂｃａｍ，ａｂ４５９３９）である。Ａｌｅｘａ４８８または６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）と共役された適切な二次抗体を、結合された一次抗体を検出するために使用した。
【０１０５】
ウェスタンブロット分析
凍結腫瘍を計量し、プロテアーゼ阻害剤（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｌｔｄ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、およびホスファターゼ阻害剤カクテル１および２（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）が補充された細胞抽出緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）中で乳棒ＰＰ（Ｓｃｉｅｎｃｅｗａｒｅ，ＮＪ）を用いて溶解させた。Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、タンパク質濃度を決定した。ＮｕＰａｇｅ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ４〜１２％勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用して電気泳動により等量のタンパク質をウェスタンブロットのために分離し、ｉＢｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を使用して、タンパク質をニトロセルロース孔膜の上に移した。ブロットに使用される一次抗体は、ｐＡｋｔ（Ｓｅｒ４７３）、ｐＡｋｔ（Ｔｈｒ３０８）、総Ａｋｔ、ｐＳ６（Ｓｅｒ２３５／２３６）、ｐＳ６（Ｓｅｒ２４０／２４２）を含み、総Ｓ６抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から取得し、抗アクチン抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。適切な二次西洋ワサビペルオキシダーゼ共役二次ＩｇＧ抗体と連結された化学発光ウェスタンブロット検出（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＰＡ）を用いて、一次抗体結合タンパク質を検出した。
【０１０６】
薬物有効性研究
体重２０〜２５ｇの８〜１０週齢の雌Ｃ．Ｂ−１７  ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）の乳腺脂肪体の付近に乳腺腫瘍小片を皮下移植した。腫瘍が平均腫瘍容積２００〜３００ｍｍ３に到達するまで監視し、投与の開始前に各群９匹の４群にランダムに分類した。ＧＤＣ−０９４１を０．２％  Ｔｗｅｅｎ８０（ＭＣＴ）賦形剤を含む０．５％のメチルセルロースに溶解し、３つの用量群：５０、１００、１５０ｍｇ／ｋｇを強制経口投与によって１３日間毎日投与した。研究の経過全体にわたって、１週間に２回、腫瘍の大きさおよびマウスの体重を記録した。腫瘍容積をキャリパーを用いて二次元で測定し、以下の式：腫瘍の大きさ（ｍｍ３）＝（長い方の測定値×短い方の測定値２）×０．５を用いて計算した。以下の式：群体重変化率＝（最新体重−初期体重）／初期体重）×１００を用いて体重変化率を計算した。平均腫瘍容積（＋／−ＳＥＭ）および体重変化率を計算し、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（バージョン４．０３、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してプロットした。腫瘍容積が２，０００ｍｍ３以上であるか、または初期体重から２０％以上体重が減少したマウスは、ＩＡＣＵＣガイドラインに基づいて即時に安楽死させた。同一動物からの腫瘍容積の反復測定を経時的に分析するために、混合モデリングアプローチを使用した（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ，Ｊ．，Ｂａｔｅｓ，Ｄ．，ＤｅｂＲｏｙ，Ｓ．，Ｓａｒｋａｒ，Ｄ．＆  Ｔｈｅ  Ｒ  Ｃｏｒｅ  ｔｅａｍ．ｎｌｍｅ：Ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｍｉｘｅｄ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｍｏｄｅｌｓ．Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１−８９．（２００８））。このアプローチは、反復測定および研究終了前の動物の任意の非治療関連死に起因するわずかな脱落の両方に対処する。立方回帰スプラインを使用して、非線形プロファイルを各用量レベルにおけるｌｏｇ２腫瘍容積の時間経過に適合させる。次いでこれらの非線形プロファイルを混合モデル内の用量に関連付けた。賦形剤のパーセントとしての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）は、式：％ＴＧＩ＝１００×（１−ＡＵＣｄｏｓｅ／ＡＵＣｖｅｈ）を使用して、賦形剤に関して１日当たりのそれぞれの用量群について、近似曲線下の面積（ＡＵＣ）のパーセントとして計算した。％ＴＧＩの不確実性間隔（ＵＩ）を得るために、近似曲線および近似共分散マトリックスを使用して、％ＴＧＩの分散に対する近似としてランダム試料を生成した。ランダム試料は、近似混合モデルの１０００疑似実現で構成され、％ＴＧＩは、各実現について再計算された。我々が報告したＵＩは、適合モデルを仮定して、時間の９５％の間に％ＴＧＩの再計算値がこの領域内にある値である。疑似分布の２．５および９７．５パーセンタイルは、上方および下方ＵＩとして使用した。プロットは、Ｒ（バージョン２．８．１、Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ  ２００８；Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）、おびＥｘｃｅｌを使用して生成した。Ｒを使用してデータを分析し、ｎｌｍｅパッケージ（Ｐｉｎｈｅｉｒｏら、上記）を使用して、混合モデル��Ｒ内で適合させた。
【０１０７】
結果
条件付きで活性化可能なＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒマウスの作製
腫瘍の発生、成長、および進行におけるＰＩＫ３ＣＡ変異の役割を研究するために、天然プロモーターによって駆動される変異ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子を条件付きで発現することができるマウスを作製した。作製されたマウスＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔは、両側にｌｏｘＰ部位を含むように修飾された野生型ＰＩＫ３ＣＡエクソン２０を有する。修飾された野生型エクソンには、転写停止カセットおよびＨ１０４７Ｒ変異をコードするＰＩＫ３ＣＡエクソン２０のコピーが続く（図１ａ〜ｄ）。標的ベクター（図１ｂ）を使用して、マウス胚幹（ＥＳ）細胞内の内因性ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子座を修飾した。適切な修飾を含有する、サザンブロット法により特定された２つの独立したＥＳ細胞クローン（図１ｆ、ｇ）を使用して、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔ対立遺伝子の生殖細胞系列伝達を示すキメラマウスを生成した。異種ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔ／＋マウスを伴う異形交雑は、予想されるメンデル比で適切な遺伝子型を持つ子孫を生じた（図１３）。ＰＩＫ３ＣＡ−／−ヌルマウス（Ｂｉ，Ｌ．，Ｏｋａｂｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，１０９６３−８（１９９９））において認められた胚死亡率とは異なり、Ｃｒｅ媒介組み換えに先行して、同種ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔ／ｅ２０ｍｗｔ動物が予想されたメンデル頻度で誕生したことを認め、これは修飾されたＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔが野生型ＰＩＫ３ＣＡ対立遺伝子に類似の機能を果たしたことを示す。
【０１０８】
ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子の乳腺特異的発現
ＰＩＫ３ＣＡは、ヒト乳癌の２５％超において変異するため（Ｚｈａｏ  ＆  Ｖｏｉｇｔ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２７，５４８６−５４９６（２００８））、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔマウスをＭＭＴＶ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスに交配することによって乳房腫瘍形成におけるＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒの役割を試験した（Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５，４３２３−３０（１９９７）；Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  １０，５４５−５３（２００１））。  ＭＭＴＶ−Ｃｒｅ株は、乳腺許容ＭＭＴＶ  ＬＴＲプロモーターの制御下でＰ１  Ｃｒｅリコンビナーゼを発現し、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒの組み換えおよび発現を可能にする。ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ／＋マウスの乳腺から抽出されたＰＩＫ３ＣＡ  ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡをシークエンシングすることによって、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ変異対立遺伝子および天然の野生型ＰＩＫ３ＣＡ対立遺伝子の発現を確認した（図１ｈ）。対照的に、腎臓から抽出されたＲＮＡは、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔ対立遺伝子からの野生型ＰＩＫ３ＣＡの発現のみを示し（図１ｉ）、変異ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ対立遺伝子の乳腺特異的発現を確認した。
【０１０９】
ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒの発現は強化された乳腺分岐形態形成をもたらす
以前の研究は、癌遺伝子の発現またはＰＴＥＮ等の腫瘍抑制因子の喪失が、マウス乳腺の分岐および形態形成に作用することを示した（Ｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）、Ｌｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，４１５９−７０（２００２）、Ｆｉｓｈｌｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２９，４００７−１７（２０１０））。したがって、全組織染色を使用して、乳腺の発達に対するＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒの発現の影響を研究した。１２週目に、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ変異乳腺は、対照乳腺における正常な末端終末小体（ＴＥＢ）と比較して、超分岐管状および末端構造を示した（図６ａ、ｂ）。５０週目までに、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ変異乳腺は、対照乳腺と比較して、羽毛状の超分岐形態を示した（図６ｃ、ｄ）。さらに、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ変異乳腺の組織学的切片は、５０週齢で腫瘍小結節の証拠を示した（図６ｅ、ｆ）。これは、ＰＴＥＮ条件付きヌルマウスおよびＰＩ３Ｋ経路の活性化を有する他の乳腺特異的トランスジェニックモデルを伴う以前の研究において報告された乳腺分岐形態形成の欠陥に類似する（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上記、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、上記）。
【０１１０】
ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ発現は乳腺腫瘍形成を促進する
雌ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ／＋、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔ／＋、およびＭＭＴＶ−Ｃｒｅマウスを、８０週の期間にわたって乳腺腫瘍の発生について追跡した。異種ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ／＋動物は、乳腺腫瘍を発生し（図２ａ〜ｃ）、無腫瘍生存の中央値は４７８．５日であった。動物の大半は、胸部乳腺内で腫瘍が発生したが（＃１、２、３、６、７、および８）、鼠径−腹部乳腺内で腫瘍が発生したものもあり（＃４、５、９、および１０）、数匹は胸部乳腺および鼠径−腹部乳腺の両方で腫瘍が発生した。ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ／＋とは対照的に、対照ＰＩＫ３ＣＡｅ２０ｍｗｔ／＋およびＭＭＴＶ−Ｃｒｅ動物は、研究期間の間、無腫瘍のままであった。同様の潜伏期を有する乳腺腫瘍表現型は、第２の独立した標的ＥＳクローンに由来するＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ／＋マウスにおいても認められ（図２ｃ）、ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ発現駆動された腫瘍表現型の特異性をさらに確認する。
【０１１１】
ＭＭＴＶプロモーターは、未泌乳および泌乳乳腺の両方において、その制御下で遺伝子の発現を駆動する（Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５，４３２３−３０（２０１０）。これを前提として、未経産および多経産マウスにおける腫瘍発生を比較したところ、４９２〜４６５日の未経産ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒと比較して、多経産ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒにおいて、潜伏期間が著しく短いことがわかり（ｐ＝０．０００２）、これは妊娠に関連する乳腺の変化が腫瘍形成の加速に寄与することを示唆する。
【０１１２】
ＭＭＴＶプロモーターは、生後６日目に主に乳腺上皮細胞内で開始するＣｒｅの発現を指示するが、唾液腺および雄の精嚢における発現を駆動することも知られている（Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ  １０，５４５−５３（２００１））。乳腺腫瘍を担持するマウスから得た唾液腺および３５〜４１週齢の雄から得た精嚢の組織学的分析を行う際に、腫瘍の証拠は見出されなかった（図８ａ、ｂ）。しかしながら、形態学的に、対照動物と比較して、精嚢はＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ／＋マウスにおいてより大きかった（ｎ＝３）。精嚢断面の組織学的分析は、精嚢液分泌の量の増加を示し、管の膨張および肥大をもたらす（図８ｃ、ｄ）。しかしながら、これはＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ／＋オスマウスの交配および生殖能力に作用しなかった。
【０１１３】
ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ駆動された腫瘍における組織診およびシグナル伝達活性化
ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ腫瘍の組織学的分析を行い、その病理学的特徴を理解し、腫瘍の大半が線維腺腫（７６．９％［２０／２６］）と一致する特徴を示したが（図２ｄ）、少数は腺癌（１５．４％［４／２６］）（図２ｅ、ｆ）または紡錘細胞新生物（７．７％［２／２６］）（図２ｇ）の病理学的特徴を示した。
【０１１４】
腫瘍をさらに特徴付けるために、組織学的に明らかな腫瘍型のＰＩ３Ｋ経路活性化状態を試験した。すべての腫瘍型において、いずれもＰＩ３Ｋの下流にあるｐＡＫＴおよびｐＳ６−キナーゼの上昇が観察され（図２ｈ）、これらの腫瘍における経路の構造的活性化を示された。
【０１１５】
観察された乳腺腫瘍型をさらに理解するために、組織学的に明らかな乳腺腫瘍型における基礎サイトケラチン５（ＣＫ５）、管腔サイトケラチン１８（ＣＫ１８）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、およびビメンチン、間葉性マーカーの発現を研究した。線維腺腫および腺癌はいずれもＣＫ５、ＣＫ１８、ＥＲ、およびＰＲに対して陽性であることがわかったが、紡錘細胞腫瘍はＥＲ−／ＰＲ−（図３ｎ、ｏ）およびＣＫ５−（データ図示せず）であった。意外なことに、これはＥＲ／ＰＲ陰性でもあるヒト乳腺紡錘細胞腫瘍を連想させる。さらに、紡錘細胞腫瘍は、ＣＫ１８＋／ビメンチン＋（図３ｎ、ｐ）であり、細胞が上皮間葉移行（ＥＭＴ）を経ていることを示す。
【０１１６】
ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ駆動された乳腺腫瘍のゲノム解析
ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ乳腺腫瘍のゲノム解析を行う前に、腫瘍形成の長期潜伏期間を前提として、乳腺腫瘍に由来する腫瘍外植片がＳＣＩＤマウスにおいて異種移植片として成長するか否かを最初に試験した。試験した線維腺腫、腺癌、および紡錘細胞腫瘍の大半は、腫瘍を形成した。意外なことに、線維腺腫外植片に由来する腫瘍の組織診は、腺癌または紡錘細胞新生物の特徴を示し、線維腺腫が良性である可能性があること、および腫瘍形成能力を有する元の外植片内の細胞のサブセットのみが継代時の腫瘍の発生に寄与したことを示す（図９ａ〜ｄ）。しかしながら、紡錘細胞腫瘍の外植片は、継代の間にその組織学的特徴を維持した（図９ｅ、ｆ）。
【０１１７】
異なる乳腺腫瘍サブタイプおよび対照乳腺のマイクロアレイベースの遺伝子発現分析を行い、腫瘍の分子特徴をさらに理解した。上皮細胞、幹細胞、およびＥＭＴのマーカーを使用する発現データの階層クラスタ化（Ｗｅｉｇｅｌｔ，Ｂ．＆  Ｒｅｉｓ−Ｆｉｌｈｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６，７１８−７３０（２００９）、Ｔａｕｂｅ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０７，１５４４９−１５４５４（２０１０））は、初代線維腺腫、腺癌、およびこれらの腫瘍型からの継代外植片に由来する腫瘍が一緒にクラスタ化して共通の起源を示し、一連の遺伝子発現変化を共有することを示した（図４ａ）。対照的に、紡錘細胞型は初代腫瘍および継代腫瘍の両方が一緒にクラスタ化して、ＥＭＴの特徴を示し、明らかな細胞起源を示唆していた（図４ａ）。
【０１１８】
全エクソームのキャプチャおよびシークエンシングは、ゲノムのコード領域における体細胞変異を特定する際に適用されている（Ｖａｒｅｌａ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４６９，５３９−５４２（２０１１））。当モデルにおいて観察された様々な乳腺腫瘍型における二次変異の出現を理解するために、選択した試料群の全エクソームキャプチャおよびシークエンシングを行った（図１４）。遺伝子操作されたＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異の存在に加えて、腫瘍はいくつかの追加の体細胞変化を含んでいた（表１）。線維腺腫の低レベルの体細胞変異（２〜５）に続いて、腺癌（２２変異）、および紡錘細胞腫瘍（６１変異）を有することがわかった。特に、紡錘細胞腫瘍において、ＡｒｇをＨｉｓで置換したコドン２４５で、Ｔｒｐ５３（ＴＰ５３）の変異を特定した（図４ｂ）。この変異は、コドン２４８におけるヒトＴＰ５３ホットスポット変異に相当し（Ｒ２４８Ｈ）、ドミナントネガティブタンパク質として作用させるＴＰ５３のＤＮＡ結合領域内のよく特徴付けられた機能喪失変異である（Ｏｌｉｖｉｅｒ，Ｍ．，Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ，Ｍ．＆  Ｈａｉｎａｕｔ，Ｐ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，ａ００１００８−ａ００１００８（２０１０））。さらにＴＰ５３変異および初代紡錘細胞腫瘍内で特定された変異の大半は、継代後の外植片由来の腫瘍においても見出され、初代紡錘腫瘍は異種性が低い可能性があることを示す（図１０）。紡錘細胞腫瘍内で観察されるように、初代腺癌内に存在する変異の大半は、移植後に派生した腫瘍内に存在した（図１０）。腺癌において、観察された２２変異のうち、Ｐｌｋ１、Ｔｓｓｋ２、およびＳＭＧ１キナーゼを含む１２例は、機能的効果を有することが予測され、したがって駆動体として作用し得る（表１および図１０）。興味深いことに、ヒト乳癌におけるＳＭＧ１変異は、以前に報告されている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３７，５９０−５９２（２００５）。
【０１１９】
全エクソーム変異分析に加えて、ＣＧＨアレイ上で腫瘍をプロファイルして、染色体コピー数の変化を理解した。興味深いことに、線維腺腫および腺癌において観察された低レベルの体細胞変異を反映して、これらの腫瘍型の両方は、コピー数異常の領域はごくわずかであった。線維腺腫および腺癌とは対照的に、紡錘細胞腫瘍において、正常な乳腺と比較したときに、コピー数の変化を伴ういくつかの領域を見出した。約３Ｍｂ領域内の染色体１１において広い増幅を観察し、染色体１および４において  限局性獲得を観察した。さらなる詳細については、発癌遺伝子ウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｏｎｃ）上での論文（Ｙｕａｎ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２０１２），１−９、付随するＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを含む。すべてが参照により本明細書に明示的に組み込まれる）を参照されたい。紡錘細胞腫瘍は、いずれもいくつかのコード遺伝子を含む染色体１１および１２内にある２つの染色体喪失領域によっても特徴付けられる。特に、染色体１１における欠失は、Ｎｆ１の喪失をもたらし（図４Ｃ）、その下方調節された発現と一致し（ｌｏｇ２比−２．０９、ｐ＝８．３３８ｅ−０５、図４Ａ）、Ｒａｓ−ＭＡＰＫ経路もこれらの腫瘍に関与し得ることを示唆する。
【０１２０】
ＰＩＫ３ＣＡｅ２０Ｈ１０４７Ｒ乳腺腫瘍はＰＩ３Ｋ阻害剤に反応する
遺伝子操作されたマウスモデルは、前臨床設定における候補薬物試験のための理想的なプラットホームを提供する（Ｓｉｎｇｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８，５８５−９３（２０１０））。本研究におけるマウスは、長期の潜伏期間後に乳腺腫瘍を発症したため、腫瘍外植片由来の腫瘍モデルを使用して、薬物の有効性評価におけるその実用性を試験した。ＴＰ５３変異を有する紡錘細胞腫瘍に由来する外植片は、乳腺脂肪体付近に皮下的に移植し、腫瘍が少なくとも約２００ｍｍ３に到達した後、ＰＩ３ＫＣＡ阻害剤、ＧＤＣ−０９４１を用いて治療した（Ｅｄｇａｒ，Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７０，１１６４−１１７２（２０１０）、Ｆｏｌｋｅｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＷＯ２００７１２７１７５）。各群９匹の４群に分けられた担腫瘍マウスを、５０、１００、および１５０ｍｇ／ｋｇのＧＤＣ−０９４１または賦形剤で治療した。賦形剤治療と比較して、ＧＤＣ−０９４１で治療した動物が、１５０ｍｇ／ｋｇで８５％の最高腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を示したが、試験した他の用量においても腫瘍増殖阻害が認められ（図５ａ）、これらの腫瘍の成長が依然として変異ＰＩＫ３ＣＡシグナル伝達に依存することを示すことがわかった。さらに、進行までの期間に関するこのデータのｌｏｇランク試験は、賦形剤対照で治療された動物と比較したときに、すべての薬物治療群は試験したすべての用量において、統計的に有意な差異を示すことを示した（１５０ｍｇ／ｋｇにおいてｐ  ＜０．０００１、図１２）。観察されたＴＧＩと一致して、ＧＤＣ−０９４１で治療されたマウスから得た腫瘍は、治療後少なくとも１０時間までにｐＡＫＴおよびｐＳ６の著しい減少を示し（図５ｂ）、腫瘍増殖阻害におけるＰＩ３Ｋ阻害の寄与を確認した。
【０１２１】
考察
遺伝子操作された癌のマウスモデルは、腫瘍の発生、進行、および治療評価を理解するために貴重である（Ｔｕｖｅｓｏｎ，Ｄ．＆  Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ  ４７１，３１６−７（２０１１））。さらに、これらのモデルに対する次世代シークエンシング技術の適用は、腫瘍の進化中に生じる分子異常に関する価値ある情報を提供することができる。ここでは乳癌の条件付きで活性化可能なＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒマウスモデルについて説明し、これらのマウスが線維腺腫、腺癌、および紡錘細胞新生物を含む複数の組織型の乳腺腫瘍を発症することを示す。腺癌はホルモン受容体およびサイトケラチン（ＣＫ５＋／ＣＫ１８＋）に対して陽性であることがわかり、それらの起源が上皮であることを示す。対照的に、紡錘細胞腫瘍は、サイトケラチン１８に対して陽性である一方、ＥＲ／ＰＲ陰性だが、ビメンチン陽性であることにおいて明らかに異なる。これらはヒト乳腺紡錘腫瘍を連想させる（Ｋｈａｎ，Ｈ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２９，６００−６０３（２００３）、Ｃａｒｔｅｒ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  ３０，３００−９（２００６））。当乳癌モデルにおいて観察される複数の組織型は、マウスにおけるＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ駆動された乳癌のトランスジェニックモデルを伴う以前の研究と一致する（Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１，２７０６−２７１７（２０１１）、Ｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１））。しかしながら、当モデルにおける乳房腫瘍発生の潜伏期間は、ＭＭＴ−Ｃｒｅを使用したその発現の活性化の後に、ＲＯＳＡ２６遺伝子座プロモーター（系統Ａにおける生存日数中央値１５０日、系統ＮＬＳＴにおいて５００日超）またはニワトリβ−アクチンプロモーター（平均２１４±２２．６日）の制御下でＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異ｃＤＮＡが発現した２つの研究と比較して長い。これは、当ノックインモデルが、正常なゲノム構成に存在するその内因性プロモーターから変異ＰＩＫ３ＣＡ対立遺伝子を発現するという事実を反映している可能性があり、したがってＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ駆動された腫瘍形成をインビボでより正確に模倣する。
【０１２２】
次世代シークエンシング技術の出現は、配列レベルでの癌の包括的な特徴付けを可能にした（Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５８，７１９−７２４（２００９））。次世代シークエンシング技術を適用する際に、当マウスモデルに由来する腫瘍を特徴付けて、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ変異対立遺伝子の発現後の乳房腫瘍の発生に必要な追加のヒットを理解する。ＰＩＫ３ＣＡＨ１０４７Ｒと協働し得るいくつかの候補二次ヒットの中で、紡錘細胞腫瘍におけるＴＰ５３Ｒ２４５Ｈ変異の発生を報告した。Ｒ２４５Ｈ変異は、ヒト癌において観察されるＲ２４８Ｈホットスポットドミナントネガティブ変異体に相当するものである。機能喪失ＴＰ５３Ｒ２４５Ｈ変異の自然出現、ＴＰ５３変異は乳癌においてＰＩＫ３ＣＡ変異と共発生するという事実（Ｂｏｙａｕｌｔ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（２０１１））、およびＴＰ５３の喪失がトランスジェニックマウスモデルにおいて発癌性ＰＩＫ３ＣＡと協働することが示されたこと（Ａｄａｍｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１，２７０６−２７１７（２０１１））は、これが協働するドライバー変異である可能性があることを示唆する。これは、当モデルがヒト乳腺腫瘍形成に寄与する病変を模倣し、したがって、変異ＰＩＫ３ＣＡ駆動された乳腺腫瘍における治療介入を研究するための理想的なモデルとなることを示す。これと一致して、ＥＭＴ特徴を持つ乳腺腫瘍のサブセットにおいて、ＧＤＣ−０９４１（ＰＩ３Ｋ阻害剤）の有効性試験におけるモデルの実用性を実証する。以前の報告では、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒトランスジェニック肺腫瘍モデルにおけるＮＶＰ−ＢＥＺ２３５、二重汎ＰＩ３Ｋ、およびラパマイシン（ｍＴＯＲ）阻害剤の哺乳類標的の有効性を研究した。しかしながら、ＰＩＫ３ＣＡ変異がヒト乳癌においてより頻繁であることを考慮して、当モデルは、乳癌におけるＰＩ３Ｋ阻害剤の有効性を試験するための遺伝的に定義された系として機能することができ、臨床薬物試験のモデル治療計画を支援できる可能性がある。
【０１２３】
乳腺腫瘍形成の研究におけるその実用性に加えて、このモデルを使用して、適切な組織特異的Ｃｒｅ系統を使用して変異ＰＩＫ３ＣＡ対立遺伝子を活性化することによって、ＰＩＫ３ＣＡ変異が観察された他の癌を研究することができる。さらに次世代シークエンシング技術と共にこのモデルを使用して、追加の腫瘍型において変異ＰＩＫ３ＣＡと協働する他のドライバー遺伝子を発見および理解することができる。ＰＩ３Ｋ経路の活性化が治療に対する抵抗に関与したことを考慮して、ＰＩ３ＫＣＡ  Ｈ１０４７Ｒマウスを使用して、薬物耐性をモデル化し、耐性を克服するための治療方法を研究することもできる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
2014529298.tif 000011
【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図４Ａ−１】
2014529298.tif 000038
【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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