(57)【要約】  本発明は、(ａ)ウイルスの外来エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(ｂ)前記エンベロープコーディング配列に作動的に連結された第１プロモーターと、(ｃ)抗原蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(ｄ)前記抗原コーディング配列に作動的に連結された第２プロモーターとを含む組換えバキュロウイルス、及び前記組換えバキュロウイルスを含むワクチン組成物に関する。本発明の組換えバキュロウイルスは、特定抗原(例えば、HPVのL1)に対する体液性免疫誘導能に優れているだけではなく、細胞性免疫誘導能にも優れており、向上したワクチン効能を奏する。
2011509092.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)ウイルスの外来エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(ｂ)前記エンベロープコーディング配列に作動的に連結された第１プロモーターと、(ｃ)抗原蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(ｄ)前記抗原コーディング配列に作動的に連結された第２プロモーターとを含む組換えバキュロウイルス。
【請求項２】
前記抗原は、ウイルス病原体抗原、バクテリア病原体抗原、寄生虫(parasitic)抗原または癌抗原であることを特徴とする、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項３】
前記抗原は、HPV(Human papillomavirus)抗原、HBV(hepatitis B virus)抗原、HCV(hepatitis C virus)抗原、HIV(human immunodeficiency virus)抗原、ロタウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、HSV(herpes simplex virus)抗原、鳥インフルエンザウイルス抗原、豚コレラウイルス抗原、口蹄疫ウイルス抗原及びニューカッスルウイルス抗原からなる群から選択されるウイルス病原体抗原であることを特徴とする、請求項２に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項４】
前記抗原は、HPV抗原であることを特徴とする、請求項３に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項５】
前記抗原は、HPVのL1、L2、E6またはE7蛋白質であることを特徴とする、請求項４に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項６】
前記HPVの抗原蛋白質は、HPVタイプの1、2、3a、4、5、6b、7、8、9、10、11a、12、13、16及び18からなる群から選択されるHPV由来のものであることを特徴とする、請求項４に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項７】
前記ウイルスのエンベロープは、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ミクソウイルス、コロナウイルス、レトロウイルス、フィロウイルスまたはアレナウイルス由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項８】
前記ウイルスのエンベロープは、レトロウイルス由来のものであることを特徴とする、請求項７に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項９】
前記ウイルスのエンベロープは、ヒト内因性レトロウイルス(Human Endogenous Retrovirus: HERV)のエンベロープであることを特徴とする、請求項８に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１０】
前記HERVのエンベロープをコーディングする配列は、配列番号2のアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１１】
前記第1プロモーターは、昆虫細胞で作動するプロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１２】
前記昆虫細胞で作動するプロモーターは、バキュロウイルスIE-1プロモーター、IE-2プロモーター、p35プロモーター、p10プロモーター、gp64プロモーターまたはポリヘドリンプロモーターであることを特徴とする、請求項１１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１３】
前記第2プロモーターは、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターまたは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１４】
前記第2プロモーターは、U6プロモーター、H1プロモーター、CMV(cytomegalo virus)プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス7.5Kプロモーター、SV40プロモーター、HSVのtkプロモーター、RSVプロモーター、ヒト延長因子1α(hEF1α)プロモーター、メタロチオニンプロモーター、β-アクチンプロモーター、ヒトIL-2遺伝子のプロモーター、ヒトIFN遺伝子のプロモーター、ヒトIL-4遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトGM-CSF遺伝子のプロモーター、TERTプロモーター、PSAプロモーター、PSMAプロモーター、CEAプロモーター、E2Fプロモーター、AFPプロモーターまたはアルブミンプロモーターであることを特徴とする、請求項１３に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１５】
請求項１乃至１４のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスを有効成分として含むワクチン組成物。
【請求項１６】
前記組換えバキュロウイルスは、HPV(Human papillomavirus)抗原遺伝子を含み、前記ワクチン組成物は、HPVワクチン組成物であることを特徴とする、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
請求項１５に記載のワクチン組成物の薬剤学的有効量(pharmaceutically effective amount)を対象(subject)に投与する段階を含む、生体内で特定抗原に対する免疫反応を誘導する方法。
【請求項１８】
前記ワクチン組成物に含まれている組換えバキュロウイルスは、HPV(Human papillomavirus)抗原遺伝子を運搬し、前記方法は、HPV感染-誘発癌の予防または治療方法であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト内因性レトロウイルス(Human Endogenous Retrovirus: HERV)のエンベロープ蛋白質をコーディングして、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え(キメラ)バキュロウイルス及びこれを含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
HPV(Human papillomavirus)が発生の主要原因である子宮頸癌は、全世界女性癌の12％を占めており、全世界で２分に一人が死亡に至るほど、発生頻度と死亡率が高い疾病である(Vaccine 24:5235-5244(2006))。HPVは、現在まで約100余種が分離されて、これらの中、高危険(high risk)と区分されているHPVタイプ16とHPVタイプ18は、70%以上が子宮頸癌組織から発見されている(Vaccine 22:3004-3007(2004))。
【０００３】
子宮頸癌を調節するために、HPV感染に対する効果的なワクチン開発がなされており、特に、子宮頸癌の予防のための予防ワクチンの開発が非常に重要である。
【０００４】
HPV L1蛋白質は、ウイルス様粒子(virus like particles: VLPs)に自己組立する固有の特徴を有しており、ウイルス遺伝体は有せず、外部被膜のみを形成する。このようなVLPを注射する場合、これに対する十分な免疫反応が起こって、高いタイターの中和抗体を誘導することができるという結果が報告されている(Journal of Virology 81(24);13927-13931(2007), Virology 321:205-216(2004); Journal of Medical Virology 80:841846(2008))。
【０００５】
遺伝子の効率的な体内伝達のために、様々なウイルスベクターを利用した遺伝子伝達システムが開発されている。レトロウイルス及びアデノウイルスなどを利用したウイルスベクターが、遺伝子治療の目的で、HPV16L1遺伝子を動物宿主に伝達するために利用されている(Science 260(5110):926-932(1993))。しかしながら、このようなウイルスの使用は、複製依存性ウイルスの発生、細胞毒性、初期免疫反応及び望んでいないウイルス遺伝子の発現などの問題点を有している。
【０００６】
一方、バキュロウイルス伝達ベクターは、比較的大きいサイズの外来遺伝子を挿入できるという点と、高等真核細胞である昆虫細胞を利用するため、解毒後変形過程(post-translational processing)が起こって、原核生物の大腸菌から生成された蛋白質とは違って、発現された組換え蛋白質の生物学的及び免疫学的活性が本来の蛋白質と等しい効果を示すという重要な長所を有している。その他にも、バキュロウイルスは、動物細胞内では複製が不可能で、細胞毒性を起こさないため、生物学的に安全なウイルスと知られている(Virology 125:107-117(1983); Hum. Gene Ther. 7:1937-1945(1996); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:127-132(1999); Trends Biotechnol. 20:173-180(2002))。昆虫ウイルス群に属するAcNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)は、多様な種類の動物細胞において複製は不可能であるが、細胞内に入ることができ、遺伝子を伝達することができると知られている(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10099-10103(1995); Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2348-2352(1996))。既にAcMNPV(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus)遺伝体内に特定遺伝子が動物プロモーターにより調節される場合、特定遺伝子が動物細胞内で高い水準で発現できると報告されている(Journal of Virology, 76(11):5729-5736(2002); Vaccine 26(20):2451-2456(2008))。
【０００７】
最近、バキュロウイルス表面に他のウイルスのEnvを導入し、遺伝子伝達効率を高めるための研究が試みられている。例えば、VSV(vesicular stomatitis virus)エンベロープG蛋白質をバキュロウイルス表面に存在するようにするか(Journal of Virology, 78(16):8663-8672(2004); Journal of Urology 250(2): 276-283(2006); Biochemical and Biophysical Research Communications 289(2):444-450(2001); Journal of Virology 75(6):2544-2556(2001))、gp64蛋白質をウイルス表面にさらに添加し、遺伝子伝達効果を高めたという報告があった(Human Gene Therapy, 14(1):67-77(2003))。また、バキュロウイルスベクターでワクチン化し、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン糖蛋白質(hemagglutinin glycoprotein)に対する免疫反応を誘導するという報告があった(Journal of Immunology, 171: 1133-1139(2003))。
【０００８】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、バキュロウイルスを利用し、多様な病原体に対してより向上した免疫反応を誘導できるワクチンを開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、抗原遺伝子とウイルスの外来エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を組み合わせて(combination)、発現コンストラクト及び組換えバキュロウイルスを製造し、これを利用して免疫化する場合は、免疫反応が大きく向上されるだけではなく、安全且つ経済的なワクチンを提供することができることを確認し、本発明を完成した。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、組換えバキュロウイルスを提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、ワクチン組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、特定抗原に対する免疫反応を誘導する方法を提供することにある。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、ヒト内因性レトロウイルス(Human Endogenous Retrovirus: HERV)のエンベロープ蛋白質をコーディングする核酸分子を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、HERVエンベロープ蛋白質-コーディング核酸分子を含む組換えベクターを提供することにある。
【００１５】
本発明のまた他の目的は、HERVエンベロープ蛋白質-コーディング核酸分子を含むバキュロウイルスに基づいた遺伝子伝達体を提供することにある。
【００１６】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の一様態によると、本発明は、(ａ)ウイルスの外来エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(ｂ)前記エンベロープコーディング配列に作動的に連結された第１プロモーターと、(ｃ)抗原蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(ｄ)前記抗原コーディング配列に作動的に連結された第２プロモーターとを含む組換えバキュロウイルスを提供する。
【００１８】
本発明の他の様態によると、本発明は、前記本発明の組換えバキュロウイルスを有効生物として含むワクチン組成物を提供する。
【００１９】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、前記本発明のワクチン組成物を対象(subject)に投与する段階を含む、生体内で特定抗原に対する免疫反応を誘導する方法を提供する。
【００２０】
本発明者らは、バキュロウイルスを利用し、多様な病原体に対してより向上した免疫反応を誘導できるワクチンを開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、抗原遺伝子とウイルスの外来エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を組み合わせて(combination)、発現コンストラクト及び組換えバキュロウイルスを製造し、これを利用して免疫化する場合は、免疫反応が大きく向上されるだけではなく、安全且つ経済的なワクチンを提供することができることを確認した。
【００２１】
本発明の最も大きい特徴は、抗原遺伝子とウイルス(最も好ましくは、ヒト内因性レトロウイルス(HERV))外来エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列の組み合わせを利用することである。
【００２２】
本発明の組換えバキュロウイルスは、多様な抗原遺伝子の運搬に利用できる。本明細書において用語‘抗原遺伝子’または‘抗原蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列’は、免疫システムにより認識できる抗原性蛋白質(例えば、細胞またはウイルス表面抗原性蛋白質)をコーディングする配列を意味する。
【００２３】
本発明の好ましい具現例によると、前記抗原は、ウイルス病原体抗原、バクテリア病原体抗原、寄生虫(parasitic)抗原または癌抗原であり、より好ましくは、ウイルス病原体抗原または癌抗原であって、最も好ましくはウイルス病原体抗原である。
【００２４】
本発明で利用できるウイルス病原体抗原の例は、インフルエンザウイルスのようなOrthomyxoviruses; RSV(respiratory syncytial virus), SIV(simian immunodeficiency virus)及びHIVのようなレトロウイルス; EBV(Epstein-Barr Virus)のようなHerpesviruses; CMV(cytomegalovirus)またはHSV(herpes simplex virus); Lentiviruses;狂犬病(rabies)のようなRhabdoviruses;ポリオウイルスのようなPicomoviruses;ワクチニアのようなPoxviruses; Rotavirus;及びParvoviruses由来の抗原を含む。より具体的に、ウイルス病原体抗原の例は、HPV抗原の例は、HPVのL1, L2, E6またはE7蛋白質; HIVの抗原の例は、nef, p24, gp120, gp41, tat, rev, pol, env及びgp120のT細胞とB細胞エピトープ(Palker et al, J. Immunol., 142:3612-3619(1989))を含む。HBVの表面抗原の例は、Wu et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:4726-4730(1989)に開示されている。ロタウイルス抗原の例は、VP4(Mackow et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:518-522(1990))及びVP7(Green et al, J. Virol., 62:1819-1823(1988)を含み;インフルエンザウイルス抗原は、ヘマグルチニン(hemagglutinin: HA)及びヌクレオ蛋白質を含み;HSV抗原は、チミジンキナーゼを含み(Whitley et al, In: New Generation Vaccines, pages 825-854);鳥インフルエンザウイルス抗原は、ヘマグルチニンを含み;豚コレラウイルス抗原は、エンベロープ;口蹄疫ウイルス抗原は、エンベロープ;及びニューカッスルウイルス抗原は、HN(Hemagglutinin-neuraminidase), F(Fusion protein)を含む。
【００２５】
本発明に利用できるバクテリア病原体抗原の例は、Mycobacterium spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp., E. coli, Rickettsia spp., Listeria spp., Legionella pneumoniae, Pseudomonas spp., Vibrio spp.及びBorellia burgdorferi由来の抗原を含む。具体的に、本発明に利用できるバクテリア病原体抗原の例は、Shigella sonneiのform-1抗原(Formal et al, Infect. Immun., 34:746-750(1981)); V. choleraeのO-抗原(Forrest et al, J. Infect. Dis. 159:145-146(1989); E. coliの FA/I繊毛抗原(fimbrial antigen)(Yamamoto et al, Infect. Immun., 50:925-928(1985))と熱敏感性毒素の非毒性B-サブユニット(Klipstein et al, Infect. Immun., 40:888-893 (1983)); Bordetella pertussisのパータクチン(pertactin)(Roberts et al, Vacc., 10:43-48(1992)); B. pertussisのアデニレートシクラーゼ-ヘモライシン(Guiso et al, Micro. Path., 11:423431(1991));及びClostridium tetaniのテタナス毒素の断片C(Fairweather et al, Infect. Immun., 58:1323-1326(1990))を含む。
【００２６】
本発明に利用できる寄生虫抗原の例は、Plasmodium spp., Trypanosome spp., Giardia spp., Boophilus spp., Babesia spp., Entamoeba spp., Eimeria spp., Laishmania spp., Schistosome spp., Brugia spp., Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp.,及びOnchocerea spp.由来の抗原を含む。より具体的に、本発明に利用できる寄生虫抗原の例は、Plasmodium bergeriiのcircumsporozoite抗原及びP. falciparumのcircumsporozoite抗原のようなPlasmodium spp.のcircumsporozoite抗原(Sadoff et al, Sci., 240:336-337 (1988)); Plasmodium spp.のmerozoite表面抗原(Spetzler et al, Int. J. Pept. Prot. Res., 43:351-358 (1994)); Entamoeba histolyticaのガラクトース特異レクチン(Mann et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3248-3252 (1991)); Leishmania spp.のgp63(Russell et al, J. Immunol., 140:1274-1278 (1988)); Brugia malayiのパラミオシン(Li et al, Mol. Biochem. Parasitol., 49:315-323 (1991));及びSchistosoma mansoniのトリオス-ホスフェートイソメラーゼ(Shoemaker et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1842-1846 (1992))を含む。
【００２７】
本発明に利用できる癌抗原の例は、前立腺特異抗原(Gattuso et al, Human Pathol., 26:123-126 (1995)), TAG-72及びCEA(carcinoembryonic antigen) (Guadagni et al, Int. J. Biol. Markers, 9:53-60 (1994)), MAGE-1及びチロシナーゼ(Coulie et al, J. Immunothera., 14:104-109 (1993)), p53(WO 94/02167), NY-ESO1(cancer- testis antigen), AFP(α-feto protein)及び癌抗原125(CA-125), EPCA(Early Prostate Cancer Antigen)を含む。
【００２８】
より好ましい具現例によると、本発明で利用される抗原は、ウイルス病原体抗原または癌抗原であり、最も好ましくは、ウイルス病原体抗原である。
【００２９】
本発明で利用される抗原遺伝子がウイルス病原体抗原である場合、前記抗原は、好ましくは、HPV(Human papillomavirus)抗原、HBV(hepatitis B virus)抗原、HCV(hepatitis C virus)抗原、HIV(human immunodeficiency virus)抗原、ロタウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、HSV(herpes simplex virus)抗原、鳥インフルエンザウイルス抗原、豚コレラウイルス抗原、口蹄疫ウイルス抗原またはニューカッスルウイルス抗原である。
【００３０】
より好ましくは、前記抗原は、HPV抗原であり、より好ましくは、HPVのL1、L2、E6またはE7蛋白質であって、最も好ましくは、HPVのL1である。
【００３１】
HPV L1は、体内または体外でウイルス様粒子(virus like particles: VLPs)に自己組立する固有の特徴を有している。L1蛋白質は、HPV蛋白質の中、最も保存された蛋白質である。本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用されるL1配列は、HPVタイプの1、2、3a、4、5、6b、7、8、9、10、11a、12、13、16及び18からなる群から選択されるHPV由来のものであり、より好ましくは、HPVタイプ16または18由来のHPV由来のものである。L1蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列は、例えば、GenBank accession No. EU118173( J. Virol. 67(12):6929-6936(1993)), AY383628及びAY383629(Virology 321(2): 205-216(2004))に記載されている。
【００３２】
本発明で利用されるウイルスの外来エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列は、バキュロウイルスを除いた多様なウイルス由来のものである。好ましくは、エンベロープ蛋白質は、ヒト細胞を宿主細胞とするウイルス由来のものであり、より好ましくは、ヒト細胞の表面に該当受容体があるウイルス由来のものであって、最も好ましくは、ヒト細胞の受容体媒介ファゴサイトーシスを誘導できるものである。
【００３３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用できるウイルスのエンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列は、エンベロープは、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ミクソウイルス、コロナウイルス、レトロウイルス、フィロウイルスまたはアレナウイルス由来のものであり、より好ましくは、レトロウイルス由来のものであって、最も好ましくは、ヒト内因性レトロウイルス(Human Endogenous Retrovirus: HERV)由来のものである。HERVは、実際人間に存在する内因性ウイルスであって、大部分は、不活性化された状態でヒトのゲノム上に存在している。エンベロープ蛋白質は、組換えウイルスの表面に発現されて、これは、ヒト細胞の受容体と相互作用し、ファゴサイトーシスを誘導する。
【００３４】
本発明の好ましい具現例によると、HERVのエンベロープをコーディングする配列は、配列番号2のアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列でり、より好ましくは、配列番号1のヌクレオチド配列である。配列番号1のヌクレオチド配列は、昆虫細胞においてHERV表面蛋白質(Env)がよく発現されるように最適化したものである。
【００３５】
本発明のキメラウイルスは、バキュロウイルスに基づく。バキュロウイルスは、棒状のウイルスであって、ヒト細胞において昆虫特異プロモーターから自分の遺伝子を発現しない。このような理由により、バキュロウイルスは、ウイルス遺伝子発現による免疫反応を誘発しないため、遺伝子治療剤の基本システムとして注目を浴びてきた。しかしながら、哺乳動物プロモーターの調節下にあると、バキュロウイルスベクターにある外来遺伝子の発現が高い水準で起こる。バキュロウイルスによる感染は、内因性ヒトウイルスの複製を触発しない長所もある。他の遺伝子治療剤用ウイルスとは違って、バキュロウイルスは、血清不在培地でよく成長し、大量生産に好適な利点がある。
【００３６】
組換えバキュロウイルスの構築及び昆虫細胞の培養は、Summers and Smith. 1986. A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555, College Station, Tex.; Luckow. 1991. In Prokop et al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells with Baculovirus Vectors' Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152; U.S. Pat. No. 4,745,051;及びEP0340359に詳細に記載されており、前記文献は、本明細書に参照として取り込まれる。
【００３７】
例えば、HERV Env遺伝子及びHPV L1遺伝子を含むキメラバキュロウイルスは、HERV Env遺伝子及びHPV L1遺伝子を運搬する転移ベクターを細胞に形質転換させる。HERV Env遺伝子及びHPV L1遺伝子を含む発現コンストラクトは、トランスポゾン配列、例えば、Tn7でフランキング(flanking)される。このような転移ベクターを、ミニ-attTn7ターゲット位置を有するバクミド(バキュロウイルスシャトルベクター)及びトランスポザーゼ(transposase)遺伝子を有するヘルパープラスミドを含む細胞、例えば、E.coliに形質転換させる。転移ベクターが前記E.coli細胞に形質転換されると、トランスポジションが発生し、組換えバクミドが形成される。次いで、組換えバクミドを分離し、これを適した昆虫細胞に形質転換させて、キメラバキュロウイルスを生成させる。本発明に適した昆虫細胞は特に制限されず、例えば、Sf9(Spodoptera frugiperda), Spodoptera exiaua, Choristoneura fumiferana, Trichoplusia ni及びSpodoptera littoralis及びDrosophilaなどが昆虫細胞として利用できる。
【００３８】
本発明の組換えバキュロウイルスにおいて、ウイルスのエンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列及びHPV L1をコーディングするヌクレオチド配列は、適した発現コンストラクト(expression construct)内に存在することが好ましい。前記発現コンストラクトにおいて、エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列及びHPV L1をコーディングするヌクレオチド配列は、プロモーターに作動的に連結されることが好ましい。本明細書において、用語‘作動的に連結される’とは、核酸発現調節配列(例えば、プロモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ)と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び/または解読を調節するようになる。本発明において、エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列またはHPV L1をコーディングするヌクレオチド配列に連結されたプロモーターは、多様なプロモーターが利用できる。
【００３９】
本発明の好ましい具現例によると、前記エンベロープ-コーディング配列に作動的に連結された第1プロモーターは、昆虫細胞で作動するプロモーターであり、より好ましくは、バキュロウイルスIE-1プロモーター、IE-2プロモーター、p35プロモーター、p10プロモーター、gp64プロモーターまたはポリヘドリンプロモーターであって、最も好ましくは、ポリヘドリンプロモーターである。
【００４０】
本発明の好ましい具現例によると、HPV L1-コーディング配列に作動的に連結された第2プロモーターは、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターまたは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターであって、より好ましくは、第2プロモーターは、U6プロモーター、H1プロモーター、CMV(cytomegalo virus)プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス7.5Kプロモーター、SV40プロモーター、HSVのtkプロモーター、RSVプロモーター、ヒト延長因子1α(hEF1α)プロモーター、メタロチオニンプロモーター、β-アクチンプロモーター、ヒトIL-2遺伝子のプロモーター、ヒトIFN遺伝子のプロモーター、ヒトIL-4遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトGM-CSF遺伝子のプロモーター、TERTプロモーター、PSAプロモーター、PSMAプロモーター、CEAプロモーター、E2Fプロモーター、AFPプロモーターまたはアルブミンプロモーターであり、最も好ましくは、ヒト延長因子1α(hEF1α)プロモーターである。
【００４１】
好ましくは、本発明に利用される発現コンストラクトは、ポリアデニル化配列を含む。例えば、ヒト延長因子1α(hEF1α) polyA, 牛成長ホルモンターミネーター(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40由来ポリアデニル化配列(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-グロビンpolyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985))またはポリオマーウイルスpolyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790(1995))を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
本発明の組換えウイルスにおいて、エンベロープ-コーディング配列及びHPV-L1-コーディング配列は、それぞれ第1プロモーター-エンベロープ-コーディング配列-ポリA配列及び第2プロモーター-HPV L1-コーディング配列-ポリA配列の形態の発現コンストラクトで含まれる。また、第1プロモーター-エンベロープ-コーディング配列-第2プロモーター-HPV L1-コーディング配列-ポリA配列の形態で含まれることもできる。
【００４３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組換えウイルスは、発現しようとする目的遺伝子を追加的に含む。本発明の組換えウイルスにより発現される目的遺伝子は、特に制限されない。本発明において目的遺伝子は、例えば、癌細胞の死滅を誘導し、究極的に腫瘍を退化させる癌治療遺伝子であって、腫瘍抑制遺伝子、免疫調節遺伝子[例えば、サイトカイン遺伝子、ケモカイン遺伝子及び助刺激因子(costimulatory factor: B7.1とB7.2のようなT細胞活性に必要な補助分子)]、自殺遺伝子、細胞毒性遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、親-細胞死滅遺伝子及び抗-新生血管形成遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
自殺遺伝子は、細胞が外部因子により殺傷され易いように誘導する物質を発現するか、細胞に毒性条件を誘発する核酸配列である。このような自殺遺伝子としてよく知られたものは、チミジンキナーゼ(TK)遺伝子である(米国特許第5,631,236号及び第5,601,818号)。TK遺伝子産物を発現する細胞は、ガンシクロビル(gancyclovir)の投与により、選択的な死滅に敏感である。腫瘍抑制遺伝子は、腫瘍の形成を抑制するポリペプチドを暗号化する遺伝子を意味する。腫瘍抑制遺伝子は、哺乳動物において自然発生遺伝子であり、この遺伝子の欠失または不活性化は、腫瘍発生に必須前提と信じられている。腫瘍抑制遺伝子の例としては、APC, DPC4, NF-1, NF-2, MTS1, WT1, BRCA1, BRCA2, VHL, p53, Rb, MMAC-1, MMSC-2,網膜芽細胞腫遺伝子(Lee et al. Nature, 329:642(1987))、大腸腺腫症タンパク質(adenomatous polyposis coli protein;米国特許第5,783,666号)、染色体3p21.3に位置した鼻咽喉腫瘍抑制因子遺伝子(Cheng et al. Proc. Nat .Acad. Sci., 95:3042-3047(1998))、欠損された結腸腫瘍(DCC)遺伝子、MTS1, CDK4, VHL, p110Rb, p16及びp21を含む腫瘍抑制遺伝子のINK4系列の一員及びこれの治療学的に有効な断片(例えば、p56Rb, p94Rbなど)が含まれる。当業者であれば、前記例示した遺伝子の他に知られたあらゆる抗腫瘍遺伝子が本発明に使用できるということを理解するだろう。
【００４５】
本明細書において、用語‘細胞毒性遺伝子(cytotoxic gene)’は、細胞内で発現されて毒性効果を示すヌクレオチド配列を意味する。このような細胞毒性遺伝子の例には、シュードモナス外毒素(exotoxin)、リシン毒素、ジフテリア毒素などをコーディングするヌクレオチド配列が含まれる。
【００４６】
本明細書において、用語‘細胞増殖抑制遺伝子(cytostatic gene)’は、細胞内で発現されて、細胞周期途中に細胞周期を停止させるヌクレオチド配列を意味する。このような細胞増殖抑制遺伝子の例には、p21、網膜芽細胞腫遺伝子、E2F-Rb融合蛋白質遺伝子、サイクリン-従属性キナーゼ抑制因子をコーディングする遺伝子(例えば、p16, p15, p18及びp19)、増殖抑制特異的ホメオボックス(growth arrest specific homeobox, GAX)遺伝子(WO 97/16459及びWO 96/30385)などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
また、各種疾患を治療するに有用に使用できる多くの治療遺伝子も、本発明のシステムにより運搬される。例えば、サイトカイン(例えば、インターフェロン-アルファ、-ベータ、-デルタ及び-ガンマ)、インターロイキン(例えば、IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-19及びIL-20)及びコロニー刺激因子(例えば、GM-CSF及びG-CSF)を暗号化する遺伝子、ケモカイングループ(単球走化性蛋白質1(MCP-1)、単球走化性蛋白質2(MCP-2)、単球走化性蛋白質3(MCP-3)、単球走化性蛋白質4(MCP-4)、マクロファージ炎症性タンパク質1α(MIP-1α)、マクロファージ炎症性タンパク質1β(MIP-1β)、マクロファージ炎症性タンパク質1γ(MIP-1γ)、マクロファージ炎症性タンパク質3α(MIP-3α)、マクロファージ炎症性タンパク質3β(MIP-3β)、ケモカイン(ELC)、マクロファージ炎症性タンパク質4(MIP-4)、マクロファージ炎症性タンパク質5(MIP-5)、LD78β、RANTES、SIS-エプシロン(p500)、胸腺活性化-調節されるケモカイン(TARC)、エオタキシン、I-309、ヒト蛋白質HCC-1/NCC-2、ヒト蛋白質HCC-3、マウス蛋白質C10など)が含まれる。また、組織プラスミノゲン活性化剤(tPA)またはウロキナーゼを発現する遺伝子、及び持続的な血栓効果を提供してコレステロール過多血症を予防するLAL生成遺伝子が含まれる。また、嚢胞性繊維症、アデノシンデアミナーゼ欠乏症及びAIDSのようなウイルス、悪性及び炎症疾患及び状態を治療するための多くのポリヌクレオチドが知られている。
【００４８】
本明細書において、用語‘親-細胞死滅遺伝子(pro-apoptotic gene)’は、発現されて、プログラムされた細胞消滅を誘導するヌクレオチド配列を意味する。このような親-細胞死滅遺伝子の例には、p53、アデノウイルスE3-11.6K (Ad2及びAd5由来)またはアデノウイルスE3-10.5K (Ad由来)、アデノウイルスE4遺伝子、Fasリガンド、TNF-、TRAIL、p53経路遺伝子及びカスパーゼをコーディングする遺伝子が含まれる。
【００４９】
本発明の明細書において、用語‘抗-新生血管生成伝子(anti-angiogenic gene)は、発現されて、抗-新生血管生成因子を細胞外に放出するヌクレオチド配列を意味する。抗-新生血管生成因子には、アンジオスタチン、Tie 2(PNAS, 1998, 95,8795-800)のような血管内皮成長因子(VEGF)の抑制因子、エンドスタチンなどが含まれる。
【００５０】
上述の目的遺伝子のヌクレオチド配列は、GenBankまたはEMBLのようなDNA配列データバンクから入手できる。
【００５１】
本発明の組換えウイルスは、表面のエンベロープ蛋白質によりヒト細胞の受容体媒介ファゴサイトーシスを誘導することができ、発現される抗原蛋白質により注入される生体内で抗原蛋白質に対する免疫反応を誘発する。さらに、本発明の組換えバキュロウイルスは、体液性免疫だけではなく、細胞性免疫反応も良好に誘発する。つまり、本発明の組換えバキュロウイルスは、このような作用により、多様な疾患に対する予防効能をよく発揮することができる。下記の実施例で立証するように、従来のHPVワクチンのガーダシル(Gardasil)と比較し、本発明の組換えバキュロウイルスは、HPVに対する体液性免疫誘導能がほぼ等しいばかりか、ガーダシルが有していない、HPVに対する細胞性免疫誘導能を有しており、ガーダシルより優れたHPVワクチン効能を発揮することができる。
【００５２】
本発明のワクチン組成物は、(ａ)上述の組換えバキュロウイルスの薬剤学的有効量、及び(ｂ)薬剤学的に許容される担体を含む。
【００５３】
本発明のワクチン組成物に含まれる組換えバキュロウイルスは、多様な抗原に対して免疫誘導能を示す。
【００５４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のワクチン組成物において、組換えバキュロウイルスは、HPV抗原遺伝子を含み、前記ワクチン組成物は、HPVワクチン組成物である。
【００５５】
本発明のHPVワクチン組成物は、HPV感染により誘発される多様な疾患、好ましくは、子宮頸癌、直腸癌、外陰部癌、陰茎癌または頭頸部癌の予防または治療、好ましくは、予防に利用できる。最も好ましくは、本発明は、子宮頸癌の予防または治療、好ましくは、予防に利用できる。本明細書において、用語‘薬剤学的有効量’は、上記の疾患に対する予防または治療、好ましくは、予防効果を達成するに十分な量を意味する。
【００５６】
本発明のワクチンに含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。
【００５７】
本発明のワクチンは、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与または局部投与を利用して投与できる。
【００５８】
本発明のワクチンの適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により様々であり、普通に熟練した医者は、目的する治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。好ましくは、本発明のワクチンは、1×103〜1×1015pfu/mlの組換えウイルスを含む。
【００５９】
本発明のワクチンは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び/または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００６０】
本発明の他の様態によると、本発明は、(ａ)ウイルスの外来エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(ｂ)前記エンベロープコーディング配列に作動的に連結された第１プロモーターと、(ｃ)HPV(human papilloma virus)のL1をコーディングするヌクレオチド配列と、(ｄ)前記L1-コーディング配列に作動的に連結された第２プロモーターとを含む組換えバキュロウイルスを提供する。
【００６１】
本発明の組換えバキュロウイルスは、上述のワクチンに含まれる組換えバキュロウイルスと同一であるため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【００６２】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、ヒト内因性レトロウイルス(Human Endogenous Retrovirus: HERV)のエンベロープ蛋白質をコーディングして、配列番号1のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００６３】
本発明者らは、バキュロウイルスに基づいた、より向上した遺伝子伝達システムを構築するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、遺伝子を運搬しようとする目的細胞に存在し、この細胞に毒性を有しない内因性レトロウイルスの表面蛋白質を遺伝子伝達システムに導入させる場合、遺伝子伝達システムの伝達システムを大きく向上させることができることを確認した。
【００６４】
改善された遺伝子伝達システムを開発するために、本発明者らは、まず遺伝子伝達システムに導入されるHERVのエンベロープ蛋白質をコーディングする核酸分子を変形させ、バキュロウイルスの宿主細胞である昆虫細胞における発現を最適化させた。
【００６５】
本発明で遺伝子伝達体に導入されるエンベロープ遺伝子は、HERV由来のものである。HERVは、人体ゲノム内に挿入されているが、全体的に完璧な遺伝子を有しておらず、発現ができない。本発明は、HERVの非発現遺伝子を、昆虫細胞で高い効率で発現されるように、天然(natural-occurring)のHERVエンベロープ遺伝子を変形させたものである。
【００６６】
本明細書において、用語‘核酸分子’は、好ましくはDNA分子を意味する。
【００６７】
本発明のHERVエンベロープ-コーディング核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性(substantial identity)を示す配列も含むとして解釈される。上記の実質的な同一性は、上記の本発明の配列と任意の他の配列とを、最大限対応するようにアラインして、当業界で通常的に利用されるアルゴリズムを利用し、アラインされた配列を分析した場合、好ましくは、少なくとも80％の相同性、より好ましくは、少なくとも85％の相同性、さらに好ましくは、少なくとも90%の相同性、最も好ましくは、少なくとも95％の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアライメント方法は、当業界に公知されている。アラインメントに対する多様な方法及びアルゴリズムは、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981) Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)に開示されている。NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))は、NBCI (National Center for Biological Information)などで接近可能であり、インターネット上でblastp, blasm, blastx, tblastn and tblastxのような配列分析プログラムと連動して利用することができる。BLSATは、http://wwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で接続可能である。このプログラムを利用した配列相同性の比較方法は、http://wwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.htmlで確認できる。
【００６８】
本発明の他の様態によると、本発明は、HERVのエンベロープ蛋白質をコーディングする上記の核酸分子を含む組換えベクターを提供する。
【００６９】
本発明のベクターは、前記HERVのエンベロープ-コーディング配列を含むため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【００７０】
本発明のベクターシステムは、当業界に公知された多様な方法により構築することができ、これに対する具体的な方法は、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)に開示されており、この文献は、本明細書に参照として取り込まれる。
【００７１】
一方、本発明のベクターが発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合は、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター、哺乳動物ウイルス由来のプロモーターまたはバキュロウイルス由来のプロモーター(例えば、ポリヘドリンプロモーター)が利用でき、転写終結配列として、一般にポリアデニル化配列を有する。
【００７２】
本発明のベクターは、選択標識として、当業界で通常的に利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【００７３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のベクターは、添付した図11の遺伝子地図を有する。即ち、図11のベクターは、HERVのエンベロープ遺伝子の発現は、ポリヘドリンプロモーターにより調節されて、目的遺伝子(最も好ましくは、HPVの16L1遺伝子)の発現は、hEF1αプロモーターにより調節され、終結信号として、hEF1αポリA信号を有して、発現カセットの両側にトランスポゾン7の二つのアームが位置している。
【００７４】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、HERVのエンベロープ蛋白質をコーディングする前記核酸分子を含むバキュロウイルスに基づいた遺伝子伝達体(gene carrier)を提供する。
【００７５】
本発明の遺伝子伝達体は、上述の組換えベクターを昆虫細胞に感染させて得られたウイルス由来であるため、前記組換えベクターと共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載の省く。
【００７６】
最近、遺伝子伝達システムとしては、ウイルスを利用した方法が主をなしている。ウイルスを利用した遺伝子伝達システムとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びワクチニアなど、多くのウイルスが使用される。これらのウイルスは、大部分ヒトに新しい感染または危険を与えるウイルスであって、人体使用に制限がある反面、バキュロウイルスは、人体感染能無しに制限された昆虫でのみ複製が可能であるため、生物学的に安全なウイルスと知られている。ウイルスを媒介とした遺伝子伝達システムは、ウイルスの感染を通じてなされるが、この感染は、ウイルスの表面蛋白質と目的細胞及び動物の受容体との相互作用を通じて決定される。
【００７７】
本発明は、このようなバキュロウイルスの利点に着眼し、バキュロウイルス表面に、適用しようとする動物に存在する内因性ウイルスの表面蛋白質を組換えして挿入することにより、より向上した遺伝子伝達システムを提供する。内因性ウイルスは、ヒトを始めとし、豚、ネズミ、猫及び犬などのあらゆる哺乳類に広く分布していると知られている。
【００７８】
本発明の遺伝子伝達体の場合、ヒトの内因性レトロウイルスのエンベロープ蛋白質が表面に結合されているため、ヒト細胞内に所望の遺伝子を高い効率で且つ安全に運搬することができる。したがって、本発明の遺伝子伝達体は、多様な疾患及び疾病に対する遺伝子治療剤の開発に有用に利用できる。
【発明の効果】
【００７９】
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである：
(i)本発明のワクチンは、抗原遺伝子とウイルスの外来エンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列を含む組換えバキュロウイルスを含む。
【００８０】
(ii)本発明の組換えバキュロウイルスは、表面のエンベロープ蛋白質によりヒト細胞の受容体媒介ファゴサイトーシスを誘導することができ、発現される抗原蛋白質(例えば、HPV L1)により注入される生体内で免疫反応を誘発する。
【００８１】
(iii)さらに、本発明の組換えバキュロウイルスは、体液性免疫だけではなく、細胞性免疫反応も良好に誘発する。
【００８２】
(iv)つまり、本発明の組換えウイルスは、このような作用により、特定抗原により誘発される多様な疾患(例えば、子宮頸癌)に対する予防効能をよく発揮することができる。
【００８３】
(v)従来のHPVワクチンのガーダシルと比較し、本発明の組換えバキュロウイルスは、HPVに対する体液性免疫誘導能がほぼ等しいばかりか、ガーダシルが有していない、HPVに対する細胞性免疫誘導能を有しており、ガーダシルより優れたHPVワクチン効能を発揮することができる。
【００８４】
(vi)本発明によると、安全且つ経済的なワクチンを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】本発明で利用された転移ベクターpAc-hEF1α16L1の製作過程を概略的に示した模式図である。図1において、黒い矢印は、ポリヘドリンプロモーター、白い矢印は、hEF1αプロモーター、小さくて黒い四角形は、hEF1αポリAシグナルを示す。
【図２】本発明で利用された転移ベクターpAcHERVenv-hEF1α16L1の製作過程を概略的に示した模式図である。図1bにおいて、黒い矢印は、ポリヘドリンプロモーター、白い矢印は、hEF1αプロモーター、小さくて黒い四角形は、hEF1αポリAシグナルを示す。
【図３】製作されたpAc-hEF1α16L1及びpAcHERVenv-hEF1α16L1を含むキメラバキュロウイルス転移ベクター及びウイルスの予想模式図である。図1cにおいて、黒い矢印は、ポリヘドリンプロモーター、白い矢印は、hEF1αプロモーター、小さくて黒い四角形は、hEF1αポリAシグナルを示す。
【図４】本発明で合成したHERV表面蛋白質の遺伝子配列と既存のHERV表面蛋白質の遺伝子配列との相同性を比較した図面である。NM 014590は、HERV表面蛋白質の遺伝子のGenBank接近番号(accession no.)である。
【図５】本発明で合成したHERV表面蛋白質の遺伝子配列と既存のHERV表面蛋白質の遺伝子配列の相同性を比較した図面である。NM 014590は、HERV表面蛋白質の遺伝子のGenBank接近番号(accession no.)である。
【図６】本発明で合成したHERV表面蛋白質の遺伝子配列と既存のHERV表面蛋白質の遺伝子配列の相同性を比較した図面である。NM 014590は、HERV表面蛋白質の遺伝子のGenBank接近番号(accession no.)である。
【図７】本発明で合成したHERV表面蛋白質の遺伝子配列と既存のHERV表面蛋白質の遺伝子配列の相同性を比較した図面である。NM 014590は、HERV表面蛋白質の遺伝子のGenBank接近番号(accession no.)である。
【図８】Ac-hEF1α16L1及びAcHERVenv-hEF1α16L1を感染させたHuh7細胞において、HPV 16L1遺伝子の発現程度を分析したRT-PCR結果写真である。‘NTC’は、テンプレートを入れなかった対照群を示す。AcHERVenv-hEF1α16L1は、豚内因性レトロウイルスのエンベロープ蛋白質を含むものであって、Huh7ヒト細胞にほとんど感染されていないことを確認することができる。
【図９】Ac-hEF1α16L1及びAcHERVenv-hEF1α16L1を感染させたHuh7細胞と正常Huh7細胞におけるHPV 16L1発現を、免疫細胞化学法を通じて分析した写真である。AcHERVenv-hEF1α16L1は、豚内因性レトロウイルスのエンベロープ蛋白質を含むものであって、Huh7ヒト細胞にほとんど感染されていないことを確認することができる。
【図１０】Ac-hEF1α16L1及びAcHERVenv-hEF1α16L1を感染させたHuh7細胞内におけるHPV 16L1 mRNA発現水準を定量するために、実時間PCRによる定量分析をDelta-Delta CT法で行った結果である。AcHERVenv-hEF1α16L1は、豚内因性レトロウイルスのエンベロープ蛋白質を含むものであって、Huh7ヒト細胞にほとんど感染されていないことを確認することができる。
【図１１】本発明の一実施例で構築したベクターの遺伝子地図である。Polhプロモーター、ポリヘドリンプロモーター; HERVenv, HERVのエンベロープ遺伝子;そして、Tn7R及びTn7Lは、それぞれトランスポゾン7の右側アーム及び左側アーム。AcHERVenv-hEF1α16L1の場合、目的遺伝子の位置にHPVの16L1遺伝子が位置する。
【図１２】本発明のキメラバキュロウイルスで免疫化した血清におけるIgG抗体反応を示すELISA分析結果である。試料は、1:100に希釈、抗-マウスIgGは、1:2,000に希釈して使用した。各グループにおいて、左側棒から右側にそれぞれ1週、3週、5週、9週及び14週に該当する。
【図１３】本発明のキメラバキュロウイルスで免疫化した膣洗浄液におけるIgA抗体反応測定結果を示す。試料は、1:50に希釈、抗-マウスIgAは、1:1,000に希釈して使用した。y軸は、405nmにおける吸光度値である。各グループにおいて、左側棒から右側にそれぞれ1週、3週、5週、9週及び14週に該当する。
【図１４】本発明のキメラバキュロウイルスで免疫化されたマウスの抗血清によるHPV16 PVs(pseudoviruses)に対する中和反応を示す。
【図１５】細胞性免疫反応を測定するためのELISPOT分析結果である。脾臓細胞に対して、ELISPOT分析により、IFN-γを発現するかどうかを調べた。CD8+ T細胞をHPV 16 PVsまたはHPV18 PVsで刺激した。(A)は、ガーダシルで免疫化した実験群、(B)は、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1で免疫化した実験群、(C)は、対照群。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００８７】
〔材料及び方法〕
＜細胞準備＞
昆虫細胞であるSf9(ATCC CRL-1711)は、27℃, 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco BRL)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco BRL)が入っているTC-100培地(Welgene)で培養した。293TT細胞(Schiller Lab, 米国NCI)は、10% FBS及びハイグロマイシンB(400 μg/ml)(Invitrogen Corp.)で補充されたDMEM(Dulbecco's modified minimal essential medium)で培養した。ヒト肝癌細胞株であるHuh7(JCRB0403)は、5% CO2と37℃温度下で10% FBS(Gibco BRL)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco BRL)が入っているDMEM培地で培養した。HeLa細胞(ATCC)は、10% FBS, 100Uペニシリン/ml及び100μgストレプトマイシン/mlが入っているDMEM培地で培養した。
【００８８】
＜HERV表面蛋白質を暗号化する遺伝子合成＞
HERV(human endogenous retrovirus)は、実際人間に存在する内因性ウイルスであって、大部分は、不活性化された状態で人間のゲノム上に存在している。HERVの表面蛋白質を獲得するために、HERV表面蛋白質をコーディングする遺伝子を直接合成し、合成時、遺伝子の塩基配列を昆虫細胞における発現に適合するように最適化した(GeneScript)。自己合成されたHERV表面蛋白質をコーディングする遺伝子をpUC57ベクター(GeneScript)のEcoRV位置に挿入し、pUC57-HERVenvを製作した。
【００８９】
＜転移ベクターのクローニング＞
転移ベクター(transfer vector)のクローニング過程を含む組換えバキュロウイルスの製造は、製造社(Invitrogen)のプロトコールによって、Bac-to-BacTM バキュロウイルス発現システムを利用して行った。組換えウイルスシステムを利用して動物細胞においてHPV 16L1蛋白質を発現させるために、AcMNPV(Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus)転移ベクターに人間延長因子1αプロモーター(hEF1α)とHPV 16L1遺伝子を挿入させた。まず、hEF1αプロモーターの後ろにHPV 16L1遺伝子とhEF1aポリAシグナルが連結された遺伝子部分を、プラスミドDNAのp16L1L2(Schiller Lab, 米国NCI; Christopher B. Buck et al., J. Virol. 82(11):51905197(2008))を鋳型としてPCR増幅させた。使用されたプライマーの配列は、次のようである:センスプライマー5-GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCA-3;アンチセンスプライマー5 -TTAATTAACCCACGTTTCAACATG-3'。
【００９０】
PCR増幅産物をpGEM-Teasyベクター(Promega)にクローニングして、pGEM-Teasy/hEF1α16L1でhEF1α16L1をEcoRIで切断し、pFastBacTM1(Invitrogen)転移ベクターのEcoRI部位に挿入して、pAc-hEF1α16L1ベクターを製造した(参照:図１)。pUC57-HERVenvでSalIで切断し、HERV表面蛋白質遺伝子をpFastBacTM1に挿入させて、hEF1α16L1は、pGEM-Teasy/hEF1α16L1をNotIで切断した後、pFastBacTM1-HERVenv転移ベクターに挿入し、pAcHERVenv-hEF1α16L1ベクターを製造した(参照:図1b)。クローニングした転移ベクターのORF(open reading frame)を確認するために、ABI遺伝子配列分析器(ABI)を利用して遺伝子配列を分析した。
【００９１】
＜組換えバキュロウイルスの製作＞
クローニングした組換え転移ベクターをそれぞれDH10Bac(Invitrogen)に形質転換させて、組換えバクミド(bacmid, baculovirus shuttle vector)を生産した。組換えされたバクミドの区別は、M13プライマー(Invitrogen)を利用し、PCRを通じて確認した。確認された3種類のバクミドは、組換えバキュロウイルスを製作するために、リポフェクチン(Invitrogen)を利用してSf9細胞に形質感染させた。四日後、感染された細胞で生成されたウイルスは、収集し、新しいSf9細胞に反復的に感染させて、高い力価のウイルスを生産した。そして、選抜された組換えウイルスをそれぞれAcHERVenv-hEF1α16L1及びAc-hEF1α16L1と命名した(参照:図1c)。最終的に準備された組換えバキュロウイルスの力価は、Sf9細胞でプラーク確認法を通じて確認した。一方、HPV 18L1遺伝子を運搬する組換えバキュロウイルス(AcHERVenv-hEF1α18L1)は、利用されるHPV 18L1遺伝子(GenBank accession No.AY383629)を除いては、上述のHPV 16L1に対する組換えバキュロウイルス(AcHERVenv-hEF1α16L1)と同一な方法で製造した。
【００９２】
＜組換えバキュロウイルスを利用したHuh7細胞への遺伝子導入＞
Huh7細胞を24-ウェルプレートに1x105 細胞/ウェルに分株して、37℃で培養した。培養12時間後、PBSで洗浄し、100 MOIでAc-hEF1α16L1及びAcHERVenv-hEF1α16L1ウイルスを感染させた。37℃で10時間培養した後、10% FBSと1%ペニシリン/ストレプトマイシンが含有された新しいDMEM培地に入れ換えて、48時間培養した。それぞれのウイルスで発現されるHPV 16L1の発現程度は、以下の実験を通じて調べた。
【００９３】
＜逆転写重合酵素連鎖反応(RT-PCR)の分析＞
遺伝子導入されたHuh7細胞からRNeasy miniキット(Qiagen, Valencia, CA)を利用して総RNAを精製し、ジオキシリボヌクレアーゼI(DNaseI, Promega, Madison, WI)を処理してDNAを除去した。精製されたRNAは、M-MuLV逆転写酵素(Bioneer, USA)を利用して、cDNAを合成した。2.5μlのcDNAを7.5μlの重合酵素連鎖反応の反応混合物(PCR reaction mixture)に添加し、Thermal Cycler PCR(GeneAmp PCR system 9700, Perkin-Elmer Cetus, USA)を利用してPCRを行った。PCR条件は、94℃で3分間ホットスタートを1回行った後、94℃で30秒間変性反応させた後、62℃で20秒間アニリング反応、及び72℃で20秒間延長反応の30サイクルである。反応に利用されたプライマーは、センスプライマー5-CAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGG-3、アンチセンスプライマー5 -GGCTGCAGGCCGAAGTTCCAGTCCTCCA-3であり、約275 bpの増幅産物を期待することができる。試料間のRT-PCR効率を補正するために、ハウスキーピング遺伝子である18S rRNA (ribosomal RNA)遺伝子を利用した。PCR産物を、1.5%アガロースゲルで確認した。
【００９４】
＜実時間PCRによる定量分析(Q-PCR)＞
感染された細胞内における HPV 16L1 mRNA発現水準を定量するために、以前報告(Dhar et al., 2001)された通りに実時間PCRによる定量分析(Q-PCR)を行った。総HPV 16L1 mRNA発現水準は、実時間PCR(Roter Gene 3000, Corbett Research, Australia)機器を利用し、4回反復実験を行って確認した。PCR反応混合液には、5μlのDyNAmoTM HS SYBRTM Green qPCRキット反応液と、5μlのサンプル溶液(プライマーと鋳型)が添加されている。プライマーは、16L1センスプライマー5’-CAGCGAGACCACCTACAAGA-3とアンチセンスプライマー5-GCTGTTCATGCTGTGGATGT-3で構成されて、約138 bpの増幅産物を期待することができる。初期DNA変性過程を95℃で5分間、94℃で変性反応10秒間、62℃でアニリング20秒間、そして72℃で20秒間延長反応を45サイクル行って、PCR増幅産物を得た。PCRを終了した後、標的分子のコピー数とメルティングカーブ分析(melting curve analysis)をして、ソフトウェアRoter-Gene ver. 6.0(Roter Gene 3000, Corbett Research, Australia)プログラムを利用した。
【００９５】
＜免疫細胞化学法(Immunocytochemistry)＞
Huh7細胞をガラススライドに分株して、Ac-hEF1α16L1とAcHERVenv -hEF1α16L1ウイルスをそれぞれ100 MOIで形質感染させた。感染されてから48時間になった細胞を4%ホルムアルデヒドで4℃で12時間固定し、PBS(Phosphate Buffered Saline)で洗浄した後、0.5% Triton X-100が入っているPBSを入れて37℃で10分間培養した。その後、PBSで洗浄した後、5%正常ヤギ血清が入っているPBSで37℃で30分間ブロッキングした。この後、HPV 16L1単一クローン抗体(Camvir-1)と共に、一日間4℃環境で反応させた。反応させた細胞をPBSで30分間洗浄後、マウスIgG-ホースラディッシュペルオキシダーゼ抗体を使用して1時間反応させた後、PBSで洗浄し、共焦点レーザー走査顕微鏡(confocal laser scanning microscope, FV-1000 spectral, Olympus, Japan)機器を利用して、HPV 16L1蛋白質の存在有無を確認した。
【００９６】
＜ガーダシル＞
ガーダシルTM(MERCK & CO, USA, MSD, Korea)は、HPV Quadrivalent(タイプ6, 11, 16及び18)ワクチンであって、本実験では、免疫反応陽性対照群として利用した。
【００９７】
＜マウス＞
雌性の4週齢BALB/cマウスをオリエント-バイオ(大韓民国)から購入し、フィルターチップ条件下で、水と飼料に自由に接近できるようにしながら飼育した。
【００９８】
＜マウスの免疫化＞
組換えバキュロウイルスを滅菌PBSに総容量100μlに希釈した後、107 PFU(plaque forming unit)の量でマウスの下端脚筋肉に注射し、免疫化させた。24匹のBALB/cマウスを八つの群に分けた(表１)。選択されたプライムブーストレジームによってそれぞれの群のマウスに注射した。免疫化は、2週間隔で3回ずつ行って、それぞれの免疫化後、1週目に血液及び膣洗浄液(vaginal washes)を収集した。分析前に、抗-血清を熱変性させた。
【００９９】
【表１】
2011509092.tif 000003
【０１００】
HPV16 L1とマルトース結合蛋白質(MBP)が結合されたMBP-L1(バイオプロジェン、韓国)を、1μg/mlで60μlをELISAプレートのそれぞれのウェルに添加して、4℃で14〜16時間処理した。0.1% Tween-20を含むPBS(ブロッキング緩衝液)内の5%スキムミルクでウェルを37℃で2時間ブロッキングした。0.05% Tween-20及び0.05% NP-40を含むPBSで洗浄した後、ブロッキング緩衝液で1:100希釈された血清試料をウェルに添加し、室温で1時間反応した。IgG検出のために、抗-マウスIgG-HRP(SC-2030, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)をブロッキング緩衝液で1:2,000に希釈し、ウェルに添加した。IgA検出のために、抗-マウスIgA-HRP(SC-3791, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)をブロッキング緩衝液で1:1,000に希釈し、ウェルに添加した。0.1Mシトレート緩衝液(pH 4.7)内のo-フェニレンジアミン基質をウェルに添加し、450nmにおける吸光度を測定した。
【０１０１】
＜シュウドウイルスの製造＞
Schiller(J. Virol. 78(2):751757(2004))が提案した方法によって、293TT細胞の共同形質転換を行い、PVs(pseudoviruses)を製造した。まず、形質転換16時間前に293TT細胞を25Tフラスコにシーディングして、L1/L2-プラスミド及びpfwBプラスミド(強化緑色蛍光蛋白質(GFP)を発現)の混合物としてLipofectin(Invitrogen)を利用して形質転換させた。使用されたプラスミドのヌクレオチドマップは、 http://ccr.cancer.gov/Staff/links.asp?profileid=5637で確認することができる。HPV16 PVsの製造のために、pfwB及びp16L1/L2それぞれ9ugで細胞を形質転換させた。また、HPV18 PVsの製造のために、pfwB及びp18L1/L2それぞれ9 ugで細胞を形質転換させた。4〜6時間後、形質転換細胞の培地を入れ換えた。形質転換48時間後、細胞を収集した。上澄み液を分画し、次の実験前まで-80℃で保管した。
【０１０２】
＜中和反応の分析＞
免疫注射したマウスの希釈血清及びPVsの混合物を室温で１時間インキュベーションした。接種16時間前に1x104個シーディングされたHeLa細胞に混合物を接種し、二日間インキュベーション後、蛍光顕微鏡下でGFP発現を観察した。GFP発現水準を正常マウス血清で処理した試料の1/2まで減少させる血清の最大希釈度の逆数で中和タイターを示した。
【０１０３】
＜IFN-γ酵素-連結免疫スポット分析(enzyme-linked immunospot: ELISPOT)＞
PBS 100μl内の抗-マウスガンマインターフェロン(IFN-γ)捕獲抗体(BD Bioscience)200ngで96ウェルプレートを4℃で一晩中コーティングした。プレートを培地(RPMI 1640 with 10% FBS)100μlで2時間37℃でブロッキングし、脾臓細胞をウェル当たり1 X 106 細胞密度で二個ずつシーディングした。次いで、2x106 IFUでPVsを接種し、37℃で2時間インキュベーションした。PBS0.05% Tween 20で3回洗浄して細胞を除去した。次いで、PBS10% FBS 100μl内の滅菌-フィルタリングされたバイオチン化抗-マウスIFN-γ検出抗体20ngをそれぞれのウェルに添加し、プレートを室温で2時間放置した。PBS0.01% Tween 20でプレートを3回洗浄した後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ1:1,000希釈液100μlを添加した。その後、プレートを室温で1時間インキュベーションし、PBS0.01% Tween 20で3回洗浄して、PBSで3回洗浄した。プレートにAEC基質試薬(BD Biosciences, CA, USA)100μlを添加して10分間反応した。プレートを蒸留水で洗浄し、反応を停止した。スポットをELISPOTリーダー(AID ElispotReader ver.4, Germany)で定量化した。培地だけがあって、脾臓細胞が処理されていないウェルを陰性対照群として利用した。バックグラウンドウェルのカウントを試料から減価した。
【０１０４】
〔実験結果〕
＜HERV表面蛋白質の遺伝子合成＞
転移ベクター製作に利用するHERV表面蛋白質(Env)遺伝子は、自体的に遺伝子合成を通じて製作されて、昆虫細胞内で効果的に発現できるように、昆虫遺伝子暗号に合わせて遺伝子を最適化した。このように合成されたHERV表面蛋白質のアミノ酸配列は、既存報告されたHERV表面蛋白質のアミノ酸配列をそのまま維持しながら、遺伝子配列の一部分のみを一部変更した。配列番号1の配列及び配列番号2の配列は、本実験に使用するために合成した1617 bpのHERV表面蛋白質の遺伝子配列とアミノ酸配列である。また、図4〜7を通じて、既存のHERV表面蛋白質の遺伝子配列と合成させた本発明の遺伝子配列を比較した。図4〜7から分かるように、約73.5%の遺伝子配列が相同性を有していることが分かる。
【０１０５】
＜組換えバキュロウイルスの製作＞
組換えバキュロウイルスを製造するために、pAc-hEF1α16L1及びpAcHERVenv-hEF1α16L1の二種の転移ベクターの製作を計画して、予想されるバキュロウイルスの形態を予想してみた(図3)。バキュロウイルス表面の蛋白質を追加するために、ポリヘドリンプロモーター(polyhedrin promoter)の後ろには、HERV表面蛋白質(Env)の遺伝子を挿入し、HPV 16L1遺伝子は、hEF1αにより発現が調節されるように構成した。HERVのEnvは、ヒト細胞の受容体媒介ファゴサイトーシスを誘導する。図１は、pAc-hEF1α16L1クローニング方法を示し、図２は、pAcHERVenv-hEF1α16L1クローニング方法を簡略に示したものである。同一な方法により、pAcHERVenv-hEF1α18L1クローニングを行った。
【０１０６】
昆虫ウイルスプロモーターの調節を受けるように作られたHERV表面蛋白質の場合、昆虫細胞では非常に高い発現量を示すが、動物細胞では、発現がうまく起こらない特徴を有する。これとは逆に、HPV 16L1蛋白質の場合は、ヒトプロモーターであるヒト延長因子1αプロモーター(hEF1α)を有するため、動物細胞では、効率的に発現が活性化されるが、昆虫細胞では全く発現が起こらないか、非常に微細な発現のみが可能である。クローニングされたそれぞれのプラスミドを利用して組換えバクミドを製造し、Sf9細胞に形質感染させて、高い力価のウイルスを生産した。
【０１０７】
＜Huh7へのHPV 16L1遺伝子の形質導入効率の測定＞
バキュロウイルス表面が変形されることによるHPV 16L1遺伝子の伝達効率を調べるために、Ac-hEF1α16L1及びAcHERVenv-hEF1α16L1ウイルスをHuh7細胞にそれぞれ100MOIで感染させた。HPV 16L1 mRNA発現水準を、まずRT-PCRで確認した。図8のように電気泳動を通じて、Ac-hEF1α16L1及びAcHERVenv-hEF1α16L1を感染させた細胞から約275 bpのHPV 16L1増幅産物を確認することができた。しかしながら、HPV 16L1遺伝子の増幅程度には差があった。バキュロウイルス表面にHERV表面蛋白質を有したAcHERVenv-hEF1α16L1の場合、表面を変形させなかったバキュロウイルスに比べ、HPV 16L1遺伝子増幅産物の量が高かった。
【０１０８】
次は、Ac-hEF1α16L1及びAcHERVenv-hEF1α16L1ウイルスが感染されたHuh7細胞におけるHPV 16L1発現を顕微鏡上で確認するために、免疫細胞化学分析を行った。感染されてから48時間が経った細胞をもって、HPV 16L1単一クローン抗体(Camvir-1)とマウスIgG-ホースラディッシュペルオキシダーゼ抗体で染色し、共焦点レーザ走査顕微鏡を通じてHPV 16L1蛋白質の存在有無を確認した。図9から分かるように、ウイルスを感染させなかったHuh7細胞と比較した時、HERVenv-hEF1α16L1及びAc-hEF1α16L1ウイルスで感染させた細胞では全般的に蛍光を帯びることを確認することができた。しかし、二つの試料において、HPV 16L1の発現による蛍光程度の差を確実に区別することができず、以下のような追加的な実験を行った。
【０１０９】
感染によるHPV 16L1遺伝子の伝達効率を確実に数値化するために、実時間PCRによる定量分析(Q-PCR)を行った。Q-PCR分析の正確性は、標準曲線を指定することにより確認した。実験は、4回繰り返して行われて、図10のように、Roter-Gene ver. 6.0を利用して、Delta-Delta CT法で相対定量を行った。下記表１から分かるように、Ac-hEF1α16L1ウイルスを感染させた細胞のコピー数を1とした時、AcHERVenv-hEF1α16L1ウイルスで感染させた細胞における遺伝子コピー数が4.17倍高いことを確認することができた。
【０１１０】
【表２】
2011509092.tif 000004
【０１１１】
＜マウスにおける免疫反応＞
AcHERVenv, AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1 107 PFUを筋肉内注射して、陽性対照群としてガーダシル投与群、陰性対照群としてAcHERVenv投与群とPBS投与群に分けて、各実験群の免疫反応を比較した。ELISA分析を行って、免疫化マウス血清からHPV16L1-特異IgG抗体またはHPV18L1-特異IgG抗体を測定した。免疫化する前、AcHERVenvのみを注射した群、そしてPBSのみを注射した群の血清では、予想の通り、著しく低い水準のIgG抗体が観察された。図12から分かるように、一回目の免疫化後は、ガーダシル投与群(Group1)のみがIgG抗体反応を示して、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1投与群(Group 2)では、明確なIgG抗体反応を示さなかった。ガーダシルを二回免疫化して得た血清では、IgG抗体反応が、一回目の免疫化の時より約2.7倍(HPV16)または2倍(HPV18)増加して、ガーダシルを3回目免疫化した時は、二回目より1.3倍(HPV16)または1.3倍(HPV18)、一回目より約3.5倍(HPV16)または2.5倍(HPV18)増加した(Group 1)。AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1を二回免疫化して得た血清では、IgG抗体反応が、一回目の免疫化の時より3倍(HPV16)または2倍(HPV18)増加して、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1を三回目免疫化した時は、二回目より1.1倍(HPV16)または1.1倍(HPV18)、一回目より約3.3倍(HPV16)または2.4倍(HPV18)増加した(Group 2)。したがって、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1を注射したマウスの血清におけるIgG抗体反応は、ガーダシルを注射した場合とほぼ等しいことが分かる。また、最初の免疫化後、9週目と14週以後にも、IgG抗体反応が観察されたことから、免疫力が維持されることが分かった。
【０１１２】
分泌性IgA反応は、免疫化マウスの膣洗浄液を利用し、ELISAを行って測定して、ガーダシルを注射した実験群だけではなく、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1を注射した群でもIgA抗体が分泌されることを確認した(図13)。一回目の免疫化に続いて二回目、三回目の免疫化後、IgA抗体分泌が増加することを確認し、最初の免疫化後、9週目と14週以後にも、IgA抗体反応が観察されたことから、免疫力が持続されることが分かった。したがって、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1免疫化が、マウスにおいて粘膜免疫反応を誘導できることが分かる。
【０１１３】
＜マウス抗血清によるHPVタイプ16、18及びBPV PVsの中和＞
抗血清の中和活性は、HeLa細胞において、GFP発現プラスミドを感染性HPV16またはHPV18 PVsの感染を抑制する程度により決定した。中和抗体タイターは、血清を最大希釈して(5倍数血清希釈)、血清処理されなかった試料と比較し、GFP発現水準が50%または90%減少する時の逆数で表現した。各実験群の希釈された血清のHPV16またはHPV18 PVsに対する中和活性は、図14のようである。図14は、50%中和された時の中和タイターであり、一回目の免疫化後、二回目及び三回目の免疫化後の中和抗体タイターが全ての実験群で高く表れた。三回目の免疫化後、Group 1と2における中和抗体タイターは、156,250であり、ガーダシルを投与した群と本発明で開発したAcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1を投与した群におけるB細胞体液性免疫では、有意な差がなく高く表れることが分かった。また、中和活性50%を基準にGroup 3と4において、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1でプライミングした後、ガーダシルでブースティングする場合の中和タイターが234,375から312,500として高く表れることを確認することができる。特に、AcHERVenv-hEF1α16L1でプライミングした後、ガーダシルで2回ブースティングする場合であるGroup4の中和タイターが、312,500と最も高く表れることを確認することができる。この結果として、AcHERVenv-hEF1α16L1のプライミングがガーダシルブースティング効果を向上できることを期待することができる。
【０１１４】
＜細胞性免疫反応分析＞
免疫化マウスでT細胞免疫反応を確認するために、ELISPOT 分析を行った。AcHERVenv-hEFα16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1を3回免疫したGroup 2のマウス脾臓細胞1x106 個において約500個のスポットが生成されることを観察して、ガーダシル免疫したGroup 1または陰性対照群では、IFN-γの分泌によるスポットを観察することができなかった。ガーダシル、AcHERVenv-hEFα16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1、そしてPBSを注射したマウスの中で、AcHERVenv-hEF1α16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1で免疫化したマウスで強いHPV16特異T細胞反応(IFN-γの分泌)が発生することを確認して、ガーダシルで免疫化した実験群は、全く細胞性免疫が起こらなかった(図15)。
【０１１５】
結論的に、AcHERVenv-hEFα16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1キメラバキュロウイルスは、動物生体内に安全にDNAワクチンを効率よく伝達することにより、体液性免疫では、既存ワクチンガーダシルとほぼ等しい効果を示し、AcHERVenv-hEFα16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1キメラバキュロウイルスとガーダシルの併用ワクチン接種をする場合は、ガーダシル単独よりはさらに高い中和抗体価を示した。細胞性免疫では、ガーダシルは、蛋白質を注入するため予想された結果通り細胞性免疫を起こすことができないが、AcHERVenv-hEFα16L1またはAcHERVenv-hEF1α18L1キメラバキュロウイルスは、APC(antigen presentation cell)内でDNAワクチンでL1遺伝子を発現することにより、非常に強い細胞性免疫能を誘導するため、ワクチン効能面では、ガーダシルより優れた、新しい安全且つ経済的なワクチンと言える。
【０１１６】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【０１１７】
−参照文献−
Abe T, Takahashi H, Hamazaki H, Miyano-Kurosaki N, Matsuura Y, Takaku H. (2003) Baculovirus induces an innate immune response and confers protection from lethal influenza virus infection in mice. Journal of Immunology, 171: 1133-1139.
Ault KA, Giuliano AR, Edwards RP, Tamms G, Kim LL, Smith JF, Jansen KU, Allende M, Taddeo FJ, Skulsky D, Barr E.(2004) A phase I study to evaluate a human papillomavirus (HPV) type 18 L1 VLP vaccine. Vccine 22(23-24):3004-7.
Baskin LS, Yucel S, Cunha GR, Glickman SE, Place NJ. (2006) A neuroanatomical comparison of humans and spotted hyena, a natural animal model for common urogenital sinus: clinical reflections on feminizing genitoplasty. J Urol. 175(1):276-83. 
Barsoum, J., Brown, R., McKee, M. and Boyce, F. M. (1997) Efficient transduction of mammalian cells by a recombinant baculovirus having the vesicular stomatitis virus G glycoprotein. Hum Gene Ther 8, 2011-2018.
*196Blissard, G. W. and Wenz, J. R. (1992) Baculovirus gp64 envelope glycoprotein is sufficient to mediate pH-dependent membrane fusion. J Virol 66, 6829-6835.
Boyce, F. M. and Bucher, N. L. (1996) Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 93, 2348-2352.
200Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C. and Kost, T. A. (1999) Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 127-132.
Daftarian P, Mansour M, Benoit AC, Pohajdak B, Hoskin DW, Brown RG, Kast WM.(2006) Eradication of established HPV 16-expressing tumors by a single administration of a vaccine composed of a liposome-encapsulated CTL-T helper fusion peptide in a water-in-oil emulsion.V accine. 24(24):5235-44. 
Dhar, A. K., Roux, M. M. and Klimpel, K. R. (2001) Detection and quantification of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus and white spot virus in shrimp using real-time quantitative PCR and SYBR Green chemistry. J Clin Microbiol 39, 2835-2845.
Facciabene A, Aurisicchio L, La Monica N.(2004) Baculovirus vectors elicit antigen-specific immune responses in mice. Journal of Virology, 78(16):8663-8672.
Gambhira R, Karanam B, Jagu S, Roberts JN, Buck CB, Bossis I, Alphs H, Culp T, Christensen ND, Roden RB. (2007) A protective and broadly cross-neutralizing epitope of human papillomavirus L2.Journal of virology, 81 (24) ;13927-13931.
Hofmann, C., Sandig, V., Jennings, G., Rudolph, M., Schlag, P. and Strauss, M. (1995) Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 10099-10103.
Kondo K, Ochi H, Matsumoto T, Yoshikawa H, Kanda T. (2008) Modification of human papillomavirus-like particle vaccine by insertion of the cross-reactive L2-epitopes.Journal of Medical Virology 80, 841846.
Kost, T. A. and Condreay, J. P. (2002) Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors. Trends Biotechnol 20, 173-180.
Kumar M, Bradow BP, Zimmerberg J. (2003) Large-scale production of pseudotyped lentiviral vectors using baculovirus GP64. Hum Gene Ther.14(1):67-77.
Lin, S. W., Hensley, S. E., Tatsis, N., Lasaro, M. O. and Ertl, H. C. (2007) Recombinant adeno-associated virus vectors induce functionally impaired transgene product-specific CD8 T cells in mice. J Clin Invest 117, 3958-3970.
Lung O, Westenberg M, Vlak JM, Zuidema D, Blissard GW. (2002) Pseudotyping Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV): F proteins from group II NPVs are functionally analogous to AcMNPV GP64.Journal of Virology, 76(11):5729-5736.
Mangor JT, Monsma SA, Johnson MC, Blissard GW. (2001) A GP64-null baculovirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus G protein. Journal of Virology 75(6):2544-2556.
Monahan, P. E., Jooss, K. and Sands, M. S. (2002) Safety of adeno-associated virus gene therapy vectors: a current evaluation. Expert Opin Drug Saf 1, 79-91.
Monsma, S. A., Oomens, A. G. and Blissard, G. W. (1996) The GP64 envelope fusion protein is an essential baculovirus protein required for cell-to-cell transmission of infection. J Virol 70, 4607-4616.
Mulligan RC. (1993) The basic science of gene therapy. Science 260(5110):926-932.
Park SW, Lee HK, Kim TG, Yoon SK, Paik SY. (2001) Hepatocyte-specific gene expression by baculovirus pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein. Biochemical and Biophysical Research Communications 289(2):444-450.
Pastrana DV, Buck CB, Pang YY, Thompson CD, Castle PE, FitzGerald PC, KrKjaer S, Lowy DR, Schiller JT. (2004) Reactivity of human sera in a sensitive, high-throughput pseudovirus-based papillomavirus neutralization assay for HPV16 and HPV18. Virology 321, 205-216.
Ratish Gambhira, Balasubramanyam Karanam, Subhashini Jagu, Jeffrey N. Roberts, Christopher . Buck, Ioannis Bossis, Hannah Alphs, Timothy Culp, Neil D. Christensen,and Richard B. S. Roden (2007) A Protective and Broadly Cross-Neutralizing Epitope of Human Papillomavirus L2. Journal of Virology 81(24) : 13927-13931.
Sandig, V., Hofmann, C., Steinert, S., Jennings, G., Schlag, P. and Strauss, M. (1996) Gene transfer into hepatocytes and human liver tissue by baculovirus vectors. Hum Gene Ther 7, 1937-1945.
Tjia, S. T., zu Altenschildesche, G. M. and Doerfler, W. (1983) Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) DNA does not persist in mass cultures of mammalian cells. Virology 125, 107-117.
Vogt, S., Ueblacker,P., Geis, C., Wagner, B., Wexel, G., Tischer, T., Kruger, A., Plank, C., Anton, M., Martinek, V., Imhoff, A. B. and Gansbacher, B. (2008) Efficient and stable gene transfer of growth factors into chondrogenic cells and primary articular chondrocytes using a VSV.G pseudotyped retroviral vector. Biomaterials 29(9):1242-9.
Wilson S, Baird M, Ward VK. (2008) Delivery of vaccine peptides by rapid conjugation to baculovirus particles. Vaccine 26(20):2451-2456.
V Schirrmacher, C Haas, R Bonifer, T Ahlert, R Gerhards and C Ertel. (1999) Human tumor cell modification by virus infection: an efficient and safe way to produce cancer vaccine with pleiotropic immune stimulatory properties when using Newcastle disease virus. Gene Theraphy 6(1) : 63-73.。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月8日(2010.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)レトロウイルス由来の外来ウイルスエンベロープ蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(ｂ)前記エンベロープコーディング配列に作動的に連結された第１プロモーターと、(ｃ)抗原蛋白質をコーディングするヌクレオチド配列と、(ｄ)前記抗原コーディング配列に作動的に連結された第２プロモーターとを含む組換えバキュロウイルス。
【請求項２】
前記抗原は、ウイルス病原体抗原、バクテリア病原体抗原、寄生虫(parasitic)抗原または癌抗原であることを特徴とする、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項３】
前記抗原は、HPV(Human papillomavirus)抗原、HBV(hepatitis B virus)抗原、HCV(hepatitis C virus)抗原、HIV(human immunodeficiency virus)抗原、ロタウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、HSV(herpes simplex virus)抗原、鳥インフルエンザウイルス抗原、豚コレラウイルス抗原、口蹄疫ウイルス抗原及びニューカッスルウイルス抗原からなる群から選択されるウイルス病原体抗原であることを特徴とする、請求項２に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項４】
前記抗原は、HPV抗原であることを特徴とする、請求項３に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項５】
前記抗原は、HPVのL1、L2、E6またはE7蛋白質であることを特徴とする、請求項４に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項６】
前記HPVの抗原蛋白質は、HPVタイプの1、2、3a、4、5、6b、7、8、9、10、11a、12、13、16及び18からなる群から選択されるHPV由来のものであることを特徴とする、請求項４に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項７】
前記ウイルスのエンベロープは、ヒト内因性レトロウイルス(Human Endogenous Retrovirus: HERV)のエンベロープであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項８】
前記HERVのエンベロープをコーディングする配列は、配列番号2のアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項９】
前記第1プロモーターは、昆虫細胞で作動するプロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１０】
前記昆虫細胞で作動するプロモーターは、バキュロウイルスIE-1プロモーター、IE-2プロモーター、p35プロモーター、p10プロモーター、gp64プロモーターまたはポリヘドリンプロモーターであることを特徴とする、請求項９に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１１】
前記第2プロモーターは、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーターまたは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１２】
前記第2プロモーターは、U6プロモーター、H1プロモーター、CMV(cytomegalo virus)プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス7.5Kプロモーター、SV40プロモーター、HSVのtkプロモーター、RSVプロモーター、ヒト延長因子1α(hEF1α)プロモーター、メタロチオニンプロモーター、β-アクチンプロモーター、ヒトIL-2遺伝子のプロモーター、ヒトIFN遺伝子のプロモーター、ヒトIL-4遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、ヒトGM-CSF遺伝子のプロモーター、TERTプロモーター、PSAプロモーター、PSMAプロモーター、CEAプロモーター、E2Fプロモーター、AFPプロモーターまたはアルブミンプロモーターであることを特徴とする、請求項１１に記載の組換えバキュロウイルス。
【請求項１３】
請求項１乃至１２のいずれかに記載の組換えバキュロウイルスを有効成分として含むワクチン組成物。
【請求項１４】
前記組換えバキュロウイルスは、HPV(Human papillomavirus)抗原遺伝子を含み、前記ワクチン組成物は、HPVワクチン組成物であることを特徴とする、請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
ヒト内因性レトロウイルス(Human Endogenous Retrovirus: HERV)のエンベロープ蛋白質をコーディングして、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１６】
レトロウイルスは、内因性レトロウイルスであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えバキュロウイルス。
【国際調査報告】
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