(57)【要約】癌、特に膵臓癌を発症する素因を検出または診断するための客観的な方法を本明細書において説明する。１つの態様において、診断法は、抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体を用いてＣ２ｏｒｆ１８の発現レベルを測定する段階を含む。本発明はさらに、癌、例えば膵臓癌などのＣ２ｏｒｆ１８関連疾患の治療において有用な治療物質をスクリーニングする方法、細胞増殖を阻害する方法、およびそれらの症状を治療または軽減する方法も提供する。本発明はまた、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびベクター、二本鎖分子、抗体、ベクター、ならびにそれらから構成される組成物等の産物も特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象由来の生物学的試料におけるＣ２ｏｒｆ１８の試験発現レベルを決定する段階を含む、対象において癌を検出または診断する方法であって、
該レベルがＣ２ｏｒｆ１８の正常対照レベルと比べて上昇していることによって、該対象が癌に罹患しているかまたは発症リスクを有することが示され、
Ｃ２ｏｒｆ１８の試験発現レベルが
（ａ）Ｃ２ｏｒｆ１８のｍＲＮＡの検出、
（ｂ）Ｃ２ｏｒｆ１８にコードされるタンパク質の検出、および
（ｃ）Ｃ２ｏｒｆ１８にコードされるタンパク質の生物学的活性の検出
からなる群より選択されるいずれか１つの方法によって決定される、方法。
【請求項２】
上記上昇が、上記正常対照レベルを少なくとも１０％上回る試験Ｃ２ｏｒｆ１８発現レベルに相当する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記癌が膵臓癌である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記Ｃ２ｏｒｆ１８発現レベルが、上記対象由来の生物学的試料の遺伝子転写物に対するＣ２ｏｒｆ１８プローブのハイブリダイゼーションを検出することによって決定される、請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記Ｃ２ｏｒｆ１８発現レベルが、上記Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子にコードされるタンパク質に対する抗体の結合を検出することによって決定される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
上記抗体が、アミノ酸配列ＣＲＡＡＧＱＳＤＳＳＶＤＰＱＱＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）および／またはＡＥＥＳＥＱＥＲＬＬＧＧＴＲＴＰＩＮＤＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）からなるＣ２ｏｒｆ１８エピトープを認識する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
上記対象由来の生物学的試料が生検材料である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
癌を治療もしくは予防するための候補薬剤、または、癌細胞増殖を阻害できるＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドのアゴニスト候補もしくはアンタゴニスト候補をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）試験薬剤を、Ｃ２ｏｒｆ１８にコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験薬剤との結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドに結合する試験薬剤を選択する段階。
【請求項９】
癌を治療もしくは予防するため、または癌細胞増殖を阻害するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）試験薬剤を、Ｃ２ｏｒｆ１８を発現する細胞と接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）の細胞におけるＣ２ｏｒｆ１８の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験薬剤の非存在下で検出されるＣ２ｏｒｆ１８の発現レベルと比べて、段階（ａ）の細胞におけるＣ２ｏｒｆ１８の発現レベルを低下させる該試験薬剤を選択する段階。
【請求項１０】
上記細胞が膵臓癌細胞を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
癌を治療もしくは予防するため、または癌細胞増殖を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）試験薬剤を、Ｃ２ｏｒｆ１８にコードされるポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
（ｃ）試験薬剤の非存在下で検出される生物学的活性と比べて、段階（ａ）のポリペプチドの生物学的活性を抑制する該試験薬剤を選択する段階。
【請求項１２】
上記生物学的活性が細胞増殖活性である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
癌を治療もしくは予防するため、または癌細胞増殖を阻害するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）試験薬剤を、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階、
（ｂ）段階（ａ）の細胞における該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験薬剤の非存在下でのレベルと比べて、段階（ａ）の細胞における該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる該試験薬剤を選択する段階。
【請求項１４】
上記癌が膵臓癌である、請求項８、９、１０、または１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
Ｃ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の間の結合を阻害する薬剤を同定する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの結合活性と同等の結合活性をＡＮＴ２に対して有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が付加、置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの結合活性と同等の結合活性をＡＮＴ２に対して有するという条件で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して少なくとも約８０％相同であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；および
（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２のアミノ酸配列からなるポリペプチドの結合活性と同等の結合活性をＡＮＴ２に対して有するという条件で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされる、ポリペプチド
からなる群より選択される第１のポリペプチドと、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６のアミノ酸配列からなるポリペプチドの結合活性と同等の結合活性をＣ２ｏｒｆ１８に対して有するという条件で、１つまたは複数のアミノ酸が付加、置換、欠失、または挿入されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６のアミノ酸配列からなるポリペプチドの結合活性と同等の結合活性をＣ２ｏｒｆ１８に対して有するという条件で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対して少なくとも約８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド；および
（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２６のアミノ酸配列からなるポリペプチドの結合活性と同等の結合活性をＣ２ｏｒｆ１８に対して有するという条件で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされる、ポリペプチド
からなる群より選択される第２のポリペプチドとを、薬剤の存在下で接触させる段階；
（ｂ）該第１のポリペプチドと該第２のポリペプチドとの間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）該第１のポリペプチドと該第２のポリペプチドとの結合レベルを、該薬剤の非存在下で検出される結合レベルと比較する段階；ならびに
（ｄ）該第１のポリペプチドと該第２のポリペプチドとの間の結合レベルを低下させる薬剤を選択する段階。
【請求項１６】
二本鎖分子を対象に投与する段階を含む、対象において癌細胞増殖を阻害する方法であって、該二本鎖分子がＣ２ｏｒｆ１８の発現レベルを低下させる、方法。
【請求項１７】
上記二本鎖分子が、Ｃ２ｏｒｆ１８のセンス核酸およびアンチセンス核酸を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
上記二本鎖分子が、標的配列としてのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８からなる配列に対応するヌクレオチド配列を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
上記二本鎖分子が一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有する、請求項１８記載の方法：
式中、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８のヌクレオチドからなる配列に対応するヌクレオチド配列であり、［Ｂ］は約３個〜約２３個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、［Ａ’］は［Ａ］の相補的配列からなるヌクレオチド配列である。
【請求項２０】
上記二本鎖分子が、トランスフェクション促進物質と共に対象に投与される、請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
上記癌が膵臓癌である、請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
有効成分としての、Ｃ２ｏｒｆ１８に対する二本鎖分子の薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、癌を治療または予防するための組成物。
【請求項２３】
上記二本鎖分子が、標的配列としてのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８からなるヌクレオチド配列を含む、請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
上記二本鎖分子が一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有する、請求項２２記載の組成物：
式中、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８のヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列であり、［Ｂ］は３〜２３個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、［Ａ’］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である。
【請求項２５】
有効成分としての、Ｃ２ｏｒｆ１８に対する二本鎖分子をコードするベクターの薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む、癌を治療または予防するための組成物。
【請求項２６】
上記癌が膵臓癌である、請求項２２または２５記載の組成物。
【請求項２７】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、該センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８からなる標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、かつ該アンチセンス鎖が、該センス鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該二本鎖分子が、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する細胞中に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。
【請求項２８】
上記センス鎖が約１９〜約２５ヌクレオチド長である、請求項２７記載の二本鎖分子。
【請求項２９】
一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結された上記センス鎖および上記アンチセンス鎖を含む単一のヌクレオチド転写物である、請求項２８記載の二本鎖分子。
【請求項３０】
一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有する、請求項２９記載の二本鎖分子：
式中、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８からなるヌクレオチド配列であり、［Ｂ］は約３〜約２３個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、［Ａ’］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である。
【請求項３１】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組合せの一方または両方を含むベクターであって、該センス鎖核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸は該センス鎖に相補的な配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該ベクターが、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する細胞中に導入された場合に細胞増殖を阻害する、ベクター。
【請求項３２】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組合せのそれぞれを含むベクターであって、該センス鎖核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ該ベクターが、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する細胞中に導入された場合に細胞増殖を阻害する、ベクター。
【請求項３３】
上記転写物がさらに該センス鎖と該アンチセンス鎖を連結する一本鎖ヌクレオチド配列を含む、請求項３１記載のベクター。
【請求項３４】
上記ポリヌクレオチドが一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有する、請求項３３記載のベクター：
式中、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８からなるヌクレオチド配列であり、［Ｂ］は約３〜約２３個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり、［Ａ’］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列である。
【請求項３５】
Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質に結合する、抗体。
【請求項３６】
アミノ酸配列ＣＲＡＡＧＱＳＤＳＳＶＤＰＱＱＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）および／またはＡＥＥＳＥＱＥＲＬＬＧＧＴＲＴＰＩＮＤＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）からなるＣ２ｏｒｆ１８エピトープを認識する、請求項３５記載の抗体。
【請求項３７】
請求項３５記載の抗体を含む、対象において癌を検出するための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる２００８年３月１２日に出願された米国特許仮出願第６１／０３６，０３５号の恩典を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、癌、特に膵臓癌の存在または発症素因を検出および診断する方法に関する。本発明はまた、癌、特に膵臓癌を治療および予防する方法に関する。特に、本発明は、癌において特異的にアップレギュレートされている遺伝子であるＣ２ｏｒｆ１８、ならびに癌に対する治療標的および診断マーカーとしてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌は死亡の主要原因であり、世界では毎年数百万人の人々が癌で死亡している。特に、膵臓癌は全ての悪性腫瘍のなかで死亡率が最も高い癌のうちの１つであり、患者の５年生存率は４％である。毎年約２８，０００名の患者が膵臓癌と診断され、患者のほぼ全員がこの疾患で死亡する（Greenlee, R. T., et al., (2001) CA Cancer J Clin, 51: 15-36（非特許文献１））。この悪性腫瘍の不良予後は、早期診断が困難であることおよび現行の治療法に対する応答が不良であることの結果である（Greenlee, R. T., et al. (2001) CA Cancer J Clin, Ji: 15-36（非特許文献１）, Klinkenbijl, J. H., et al. (1999) Ann Surg, 230: 776-82; discussion 782-4.（非特許文献２））。
【０００４】
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、欧米における癌死の主要原因の４番目であり、一般的な悪性腫瘍のなかで死亡率が最も高い癌のうちの１つであり、患者の５年生存率はわずか５％しかない（DiMagno EP, et al. Gastroenterology. 1999 Dec;117(6):1464-84.1（非特許文献３）, Wray CJ, et al. Gastroenterology. 2005 May;128(6):1626-41.2（非特許文献４））。米国において、２００７年には約３７，１７０例の新規患者が膵臓癌と診断されることが予想され、３３，３７０例近くがこの疾患で死亡すると考えられる（Jemal A, et al. CA Cancer J Clin. 2007 Jan-Feb;57(1):43-66.3（非特許文献５））。現在、ＰＤＡＣの唯一の治療的処置は外科的切除である。しかしながら、ＰＤＡＣ患者の大多数はかなり進行した段階で診断されるため、診断時点で外科的切除の候補となる患者はわずか１５％〜２０％である。治癒の可能性がある手術を受ける患者のうち大部分の患者は最終的に再発し、この疾患で死亡する（Wray CJ, et al. Gastroenterology. 2005 May;128(6):1626-41.2（非特許文献４））。外科手術とゲムシタビンまたは５−ＦＵを含む化学療法との組合せを含みかつ放射線療法を併用するまたは併用しないいくつかのアプローチは、患者の生活の質を改善し得る（DiMagno EP, et al. Gastroenterology. 1999 Dec;117(6):1464-84.1（非特許文献３）, Wray CJ, et al. Gastroenterology. 2005 May;128(6):1626-41.2（非特許文献４））。しかしながら、侵襲性および化学療法抵抗性が極めて高いという性質のために、このような治療がＰＤＡＣ患者の長期生存率に与える効果は非常に限定されている。
【０００５】
この悲観的な状況を克服するために、分子標的の同定を通してＰＤＡＣに対する新規な分子療法を開発することが、現在急を要する問題である。以前に、試験用の癌細胞の純粋な集団を得るためにレーザーマイクロダイセクションと組み合わせたゲノム全域ｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、ＰＤＡＣ細胞の正確な発現プロファイルが作製されている（参照により組み入れられるNakamura T, et al. Oncogene. 2004 Mar 25;23(13):2385-400（非特許文献６）を参照されたい）。
【０００６】
ミトコンドリアは、細胞の生体エネルギー論にとって極めて重要であり、アポトーシスプロセスを決定する際に中心的役割を果たす（Taniuchi K, et al. Cancer Res. 2005 Jan 1;65(1):105-12.（非特許文献７））。癌に関連した細胞代謝変化は、ミトコンドリア機能に影響し（ワールブルク効果、Galluzzi L, et al. Oncogene. 2006 Aug 7;25(34):4812-30.（非特許文献８））、特に毒性減弱状態において、癌細胞生存能に関わる可能性がある。さらに、アポトーシスの無効化は、ミトコンドリア外膜透過性亢進（ＭＯＭＰ）の阻害に関係があるとされている。理論的根拠に基づき、ミトコンドリアタンパク質を標的とする特異的な治療的介入を開発することが魅力的である（Taniuchi K, et al. Cancer Res. 2005 Jan 1;65(1):105-12.（非特許文献７））。様々な実験上の治療剤がミトコンドリアを直接標的とし、それによってアポトーシスを誘導することができる。このような薬剤の例には、Ｂｃｌ−２様タンパク質のＢｃｌ−２相同ドメイン３（Walensky LD, et al. Science. 2004 Sep 3;305(5689):1466-70.（非特許文献９））、末梢型ベンゾジアゼピン受容体リガンド（Decaudin D, et al. Cancer Res. 2002 Mar 1;62(5):1388-93.（非特許文献１０））、および両性カチオン（Ellerby HM, et al. Nat Med. 1999 Sep;5(9):1032-8.（非特許文献１１））を模倣するように設計されたものが含まれる。このようなＭＯＭＰの誘導物質または促進物質は、それ自体がアポトーシスを誘導できるか、または併用療法においてアポトーシス誘導を促進でき、それによって、ＤＮＡ損傷物質に対する任意の化学療法抵抗性を無効にする（Taniuchi K, et al. Cancer Res. 2005 Jan 1;65(1):105-12.（非特許文献７））。
【０００７】
本発明は、新しい遺伝子標的、すなわち膵臓癌細胞において特異的にアップレギュレートされているＣ２ｏｒｆ１８（第二染色体オープンリーディングフレーム１８（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ２  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  １８））の発見を通じて、改善された膵臓癌の診断および治療法に対する当技術分野における必要性に対処するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Greenlee, R. T., et al., (2001) CA Cancer J Clin, 51: 15-36
【非特許文献２】Klinkenbijl, J. H., et al. (1999) Ann Surg, 230: 776-82; discussion 782-4.
【非特許文献３】DiMagno EP, et al. Gastroenterology. 1999 Dec;117(6):1464-84.1
【非特許文献４】Wray CJ, et al. Gastroenterology. 2005 May;128(6):1626-41.2
【非特許文献５】Jemal A, et al. CA Cancer J Clin. 2007 Jan-Feb;57(1):43-66.3
【非特許文献６】Nakamura T, et al. Oncogene. 2004 Mar 25;23(13):2385-400
【非特許文献７】Taniuchi K, et al. Cancer Res. 2005 Jan 1;65(1):105-12.
【非特許文献８】Galluzzi L, et al. Oncogene. 2006 Aug 7;25(34):4812-30.
【非特許文献９】Walensky LD, et al. Science. 2004 Sep 3;305(5689):1466-70.
【非特許文献１０】Decaudin D, et al. Cancer Res. 2002 Mar 1;62(5):1388-93.
【非特許文献１１】Ellerby HM, et al. Nat Med. 1999 Sep;5(9):1032-8.
【発明の概要】
【０００９】
発明の開示
発明の概要
前述の内容に鑑みて、癌、特に膵臓癌を検出、診断、予後観察（ｐｒｏｇｎｏｓｉｎｇ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）、および／または治療するための新規な方法を提供することが本発明の目的である。本発明の過程において、１つの新規な遺伝子Ｃ２ｏｒｆ１８が、膵臓癌細胞（具体的にはＰＤＡＣ細胞）において特異的に過剰発現されているものとしてマイクロアレイ解析によって同定され、癌細胞におけるその過剰発現がＲＴ−ＰＣＲおよび免疫組織化学的解析によって確認された。Ｃ２ｏｒｆ１８は成人の正常な器官では限定的に発現するため、有害作用が最小限である新規な治療的アプローチのための適切かつ有望な分子標的でありうる。機能的には、膵臓癌細胞株においてｓｉＲＮＡによって内因性Ｃ２ｏｒｆ１８をノックダウンすることによって、膵臓癌細胞増殖の大幅な抑制がもたらされることから、膵臓癌細胞の生存能を維持する上でのその不可欠な役割が示唆されている。免疫細胞化学的解析および細胞分画とそれに続くウェスタンブロット解析の結果から、Ｃ２ｏｒｆ１８がミトコンドリア中に局在することが示唆され、これによってＣ２ｏｒｆ１８が癌細胞におけるアポトーシスまたはエネルギー恒常性に関与している可能性があることが示される。
【００１０】
したがって、生検材料のような対象由来の生物学的試料におけるＣ２ｏｒｆ１８の発現レベルを測定することによって、対象において、癌を検出もしくは診断する方法、癌を発症する素因を決定する方法、および／または癌、特に膵臓癌の治療経過をモニターする方法を提供することが本発明の目的である。Ｃ２ｏｒｆ１８の発現レベルが正常対照レベルと比べて上昇している場合、対象は癌、特にＰＤＡＣに罹患しているか、またはその発症リスクを有することが示唆される。本発明の方法において、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を適切なプローブを用いて検出することができ、またはＣ２ｏｒｆ１８タンパク質を抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体を用いて検出することができる。
【００１１】
本発明はさらに、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性の阻害剤を同定する方法も提供する。本明細書においてより詳細に考察するように、本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の相互作用、ならびにミトコンドリア膜電位の維持およびアポトーシスへのその関与の発見に関する。したがって、本発明の目的は、Ｃ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の相互作用の阻害剤を同定する方法を提供することである。本発明のさらに別の目的は、Ｃ２ｏｒｆ１８関連疾患、例えば癌、例えば膵臓癌、より具体的にはＰＤＡＣを治療もしくは予防するための候補薬剤、またはこれらの罹病状態下で細胞増殖を阻害するための候補薬剤を同定する方法を提供することである。本発明の方法はインビトロまたはインビボのいずれかで実施することができる。試験薬剤の非存在下と比べて、試験薬剤の存在下でＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルおよび／またはその遺伝子産物の生物学的活性が低下している場合、該試験薬剤はＣ２ｏｒｆ１８の阻害物質であり、かつ、Ｃ２ｏｒｆ１８を過剰発現する細胞、例えば癌細胞、例えば膵臓癌細胞、より具体的にはＰＤＡＣの増殖を阻害するのに使用され得ることが示唆される。候補薬剤は、膵臓癌、特にＰＤＡＣの症状を、それらの増殖を阻害することによって低減するために使用され得る。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現およびその遺伝子産物であるＣ２ｏｒｆ１８タンパク質の機能の阻害剤を投与することによって、Ｃ２ｏｒｆ１８を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害するための方法を提供することである。好ましくは、薬剤は阻害性核酸（例えば、アンチセンス、リボザイム、二本鎖分子）である。薬剤は、二本鎖分子を提供するための核酸分子またはベクターでもよい。遺伝子の発現は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現を阻害するのに十分な量の二本鎖分子を標的細胞に導入することによって阻害することができる。本発明はまた、対象においてＣ２ｏｒｆ１８を過剰発現する癌細胞の増殖を阻害するための方法、ならびに癌、特に膵臓癌に罹患している対象のための治療法または予防方法も提供する。別の局面において、本発明は、薬学的に許容される適切な担体と組み合わせて、二本鎖分子またはそれをコードするベクターを有効成分として含む、癌、特に膵臓癌を治療または予防するための薬学的組成物に関する。本発明の二本鎖分子は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現を阻害し、かつ、Ｃ２ｏｒｆ１８を過剰発現する癌細胞中に導入された場合にそれらの増殖を阻害する。例えば、このような分子は、ヌクレオチド残基１９６番〜２１４番の間またはヌクレオチド残基５７４番〜５９２番の間に及ぶ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の一部に対応する配列を標的とするように設計することができる。本発明の二本鎖分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、標的配列を含む配列を含み、かつアンチセンス鎖はセンス鎖に相補的な配列を含む。この分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして、本発明の二本鎖分子を形成する。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、Ｃ２ｏｒｆ１８に対する抗体を提供することである。この抗体は、ＣＲＡＡＧＱＳＤＳＳＶＤＰＱＱＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）および／またはＡＥＥＳＥＱＥＲＬＬＧＧＴＲＴＰＩＮＤＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）のアミノ酸配列を有するポリペプチドを抗原として用いて産生させる。これらの抗体は、癌、特に膵臓癌を診断するための免疫学的染色アッセイ法の状況において有用である。別の局面において、本発明は、抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体を含む、癌、特に膵臓癌を検出、診断、または予後判定するための検出試薬またはキットを提供する。本発明において、ＣＲＡＡＧＱＳＤＳＳＶＤＰＱＱＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）および／またはＡＥＥＳＥＱＥＲＬＬＧＧＴＲＴＰＩＮＤＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）のアミノ酸配列を有するペプチドが、抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体を調製するために特に有用である。したがって、本発明の目的は、これらのペプチドならびに抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体を調製する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の１つまたは複数の局面はいくつかの目的を達成できるが、他の１つまたは複数の局面は他のいくつかの目的を達成できることが当業者に理解されると考えられる。各目的が、本発明のすべての局面にすべての点で同等に当てはまるとは限らない。したがって、前述の目的は、本発明の任意の１つの局面に関する代替手段において見出すことができる。
【００１５】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、添付図面および実施例と共に以下の詳細な説明を読むと、さらに十分に明らかになるであろう。しかしながら、前述の発明の概要と以下の詳細な説明の両方ともが、単に好ましい態様を説明しているにすぎず、本発明や本発明の他の代替態様を限定するものではないことを理解すべきである。特に、いくつかの特定の態様を参照して本明細書において本発明を説明するが、説明は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものとしてみなされるべきではないことが理解されよう。添付の特許請求の範囲によって説明されるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者は様々な修正および応用を思い付き得る。同様に、本発明の他の目的、特徴、恩典、および利点は、この概要および後述するいくつかの態様から明らかになり得、当業者には容易に明らかになり得る。このような目的、特徴、恩典、および利点は、添付の実施例、データ、図面、およびそれらから導かれるすべての妥当な推論と組み合わせて、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、前述の内容から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の様々な局面および応用は、以下の図面の簡単な説明ならびに本発明およびその好ましい態様の詳細な説明を考慮することにより、当業者に明らかにになるであろう。
【図１】「ＰＤＡＣ細胞におけるＣ２ｏｒｆ１８過剰発現」  パート（Ａ）は、マイクロダイセクションされたＰＤＡＣ細胞（１〜９）におけるＣ２ｏｒｆ１８およびＴＵＢＡのｍＲＮＡ発現に関するＲＴ−ＰＣＲの結果を、同様にマイクロダイセクションされた正常膵管上皮細胞（ＮＰＤ）および成人の重要器官と比較して示す。Ｐａｎｃ：正常な膵臓、ＢＭ：骨髄。  パート（Ｂ）は、ノーザンブロット解析の結果を示し、これにより、Ｃ２ｏｒｆ１８が前立腺組織、甲状腺組織、副腎組織ではかすかに発現し、ほぼ全ての膵臓癌細胞株で高発現するが、重要器官では極めてわずかな発現であることが明らかになった。  パート（Ｃ）は、ウサギ２匹の血清から精製された抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体（ロット番号１９２およびロット番号１９３）を用いてＰＤＡＣ細胞株中の内因性Ｃ２ｏｒｆ１８を検出した、ウェスタンブロット解析の結果を示す。ＰＤＡＣ細胞株におけるＰＡＰＭ発現は、正常細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ−２９３、およびＣＯＳ７）での発現よりも高かった。β−アクチンはローディングコントロールとしての機能を果たした。  パート（Ｄ）は、抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体を用いた免疫組織化学的研究の結果を示し、ＰＤＡＣ細胞において強い染色が観察された（Ｃ１：×２００、Ｃ２：×４００、Ｃ３：×４００）。Ｃ２ｏｒｆ１８の強い陽性染色がＰＤＡＣ細胞の細胞質において観察された。正常な膵臓組織では、腺房細胞および正常な管上皮細胞は染色を示さなかった（Ｎ、×４００）。
【図２】「ＰＤＡＣ細胞の増殖に対するＣ２ｏｒｆ１８−ｓｉＲＮＡの影響」  パート（Ａ）は、ＰＤＡＣ細胞株であるＭＩＡ−ＰａＣａ２（左）およびＰａｎｃ−１（右）における、Ｃ２ｏｒｆ１８に対するｓｉＲＮＡのノックダウン効果を示す。Ｃ２ｏｒｆ１８に対する各ｓｉＲＮＡ発現ベクター（１９６番、５７４番、および３２５４番）ならびに陰性対照ベクターｓｉＥＧＦＰをトランスフェクトした細胞を用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施し、１９６番および５７４番によるノックダウン効果を確認したが、ｓｉＥＧＦＰおよび３２５４番によるノックダウン効果は確認されなかった。ＲＮＡを定量するためにβ２−ＭＧを使用した。  パート（Ｂ）は、図に示したＣ２ｏｒｆ１８に対する各ｓｉＲＮＡ発現ベクター（１９６番、５７４番、および３２５４番）ならびに陰性対照ベクター（ｓｉＥＧＦＰ）をトランスフェクトしたＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞（左）およびＰａｎｃ−１細胞（右）のコロニー形成アッセイ法の結果を示す。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎと１４日間インキュベートした後に０．１％クリスタルバイオレット染色によって細胞を可視化した。  パート（Ｃ）は、図に示したＣ２ｏｒｆ１８に対するｓｉＲＮＡ発現ベクター（１９６番、５７４番、および３２５４番）ならびに陰性対照ベクター（ｓｉＥＧＦＰ）をトランスフェクトしたＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞（左）およびＰａｎｃ−１細胞（右）のそれぞれを用いたＭＴＴアッセイ法の結果を示す。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎと１４日間インキュベートした後の各平均値を、ＳＤ（標準偏差）を示すエラーバーと共にプロットしている。Ｙ軸のＡＢＳとは、マイクロプレートリーダーを用いて測定した４９０ｎｍでの吸光度および参照としての６３０ｎｍでの吸光度を意味する。これらの実験は３回実施した。＊＊は０．０１未満のＰ値を意味する（スチューデントのｔ検定）。
【図３】「ＰＤＡＣ細胞におけるＣ２ｏｒｆ１８の位置確認」  パート（Ａ）は、抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体を用いた免疫細胞化学的解析の結果を示し、ここでＰＤＡＣ細胞の細胞質中の小胞性パターン（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）として陽性シグナル（緑色）を検出した（左上のパネル）。抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体に対するこれらのシグナル（緑色）をＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒシグナル（赤色：右上のパネル）と部分的に合体させた。抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体に対するこれらのシグナルは、ｓｉＲＮＡによってＣ２ｏｒｆ１８をノックダウンした際には消失したのに対し（右下のパネル）、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＰ）で処理した際には、細胞質中の小胞性パターンとして保持された（左下のパネル）。  パート（Ｂ）は、抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を示し、Ｃ２ｏｒｆ１８が細胞質中、およびミトコンドリア画分にのみ局在することが実証された。抗ミトフィリン抗体を用いてミトコンドリア画分を検出した。  パート（Ｃ）は、免疫沈降アッセイ法とそれに続く質量分析法の結果を示し、Ｃ２ｏｒｆ１８と相互作用するタンパク質の候補としてＡＮＴ２が同定された。Ｃ２ｏｒｆ１８−ＨＡ発現ベクターおよび／またはＡＮＴ２−Ｆｌａｇ発現ベクターをＣＯＳ７細胞に同時トランスフェクトした。Ｃ２ｏｒｆ１８−ＨＡまたはＡＮＴ２−Ｆｌａｇを含むタンパク質複合体を、それぞれ抗ＨＡ抗体（左のパネル）または抗Ｆｌａｇ抗体（右のパネル）によって、細胞抽出物から免疫沈降させた。抗Ｆｌａｇ抗体を用いたウェスタンブロットにより、両方の発現ベクターを同時トランスフェクトした場合、ＡＮＴ２−ＦｌａｇがＣ２ｏｒｆ１８−ＨＡと同時に免疫沈降することが示された（左のパネルの矢印）。抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロットにより、両方の発現ベクターを同時発現させた場合、Ｃ２ｏｒｆ１８−ＨＡがＡＮＴ２−Ｆｌａｇと同時に免疫沈降することが示された（右のパネルの矢印）。
【図４】「Ｃ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰは、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）およびアポトーシスに関与していた」  パート（Ａ）は、ＡＮＴ２  ｓｉＲＮＡ、Ｃ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰ  ｓｉＲＮＡ、またはｓｉＥＧＦＰ（対照として）をＰＤＡＣ細胞であるＫＬＭ−１にトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後に回収した、トランスフェクション試験の結果を示す。抗Ｃ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰ抗体を用いたウェスタンブロット解析により、ＫＬＭ−１細胞に対するＣ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰ  ｓｉＲＮＡのノックダウン効果が確認された。  パート（Ｂ）は、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３およびＰＩと共に細胞をインキュベートし、ＦＡＣＳ解析によって蛍光を測定した、蛍光アッセイ法の結果を示す。Ｘ軸のＲｈｏｄａｍｉｎｅ１２３（Ｒｈ１２３）強度はΔΨｍを反映し、Ｘ軸のＰＩ（ヨウ化プロピジウム）透過性は死細胞における細胞膜破壊を反映する。Ｒｈ１２３強度が低レベルでありＰＩの透過性が陰性である場合、ミトコンドリアのΔΨｍが低下しているがアポトーシスは完全に終わっていない初期アポトーシス細胞を示し、Ｒｈ１２３強度が低レベルでありＰＩの透過性が陽性である場合、死細胞を示す。ΔΨｍが低くかつＰＩ透過性が陰性である細胞の数は、対照（ｓｉＥＧＦＰ、１９％）と比べてＡＮＴＢＰ２（２５％）またはＡＮＴ２（２６％）をノックダウンした場合に増加していた。  パート（Ｃ）は、ＴＵＮＥＬアッセイ法の結果を示し、これは、Ｐａｎｃ−１細胞中のＣ２ｏｒｆ１８のノックダウンにより、ｓｉＥＧＦＰをトランスフェクトした細胞と比べてアポトーシス細胞（緑色で示されるＴＵＮＥＬ陽性細胞）の数が増加したことを実証している。ＤＮａｓｅ  Ｉで処理し透過性にした細胞をＴＵＮＥＬアッセイ法の陽性対照として調製した。  部分（Ｄ）は、フローサイトメトリーによって計数されたＴＵＮＥＬ陽性細胞の数を示す。ヒストグラムプロットにおいて、Ｘ軸はＴＵＮＥＬ陽性細胞の緑色シグナルの強度を示す。ヒストグラムの右方向への移動は、Ｃ２ｏｒｆ１８のノックダウンにより、ｓｉＥＧＦＰをトランスフェクトした細胞と比べてＴＵＮＥＬ陽性細胞の数が増加したことを示す。
【００１７】
発明の開示
本発明の態様の実施または試験においては本明細書に記載されたものと類似のまたは同等の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。しかしながら、本明細書に記載された特定の方法論およびプロトコールは常用の実験および最適化によって変更されうるので、本発明はこれらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書において用いる用語は特定の型または態様を説明する目的のみのために用いられるものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではないことも、理解されたい。
【００１８】
特記する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。しかし、矛盾が生じる場合は、定義を含め本明細書が優先する。したがって、本発明の文脈においては、以下の定義が適用される。さらなる定義は、以降の関連する文章中に点在している。
【００１９】
定義：
本明細書で用いる「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、特に明記しない限り、「少なくとも一つの」を意味する。
【００２０】
本明細書で使用する「生物」という用語は、少なくとも１つの細胞から構成される任意の生きている実体を意味する。生きている生物は、例えば、真核単細胞のような単純なものでもよく、ヒトを含む哺乳動物のような複雑なものでもよい。
【００２１】
本明細書で使用する「生物学的試料」という用語は、生物全体、またはその組織、細胞、もしくは構成部分（例えば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊膜臍帯血、尿、膣液、および精液を含むがこれに限定されない、体液）の部分集団を意味する。「生物学的試料」という用語は、さらに、生物全体またはその細胞、組織、もしくは構成部分の部分集団から調製されたホモジネート、溶解産物、抽出物、細胞培養物、または組織培養物、あるいはその画分または一部を意味する。最後に、「生物学的試料」とは、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの細胞成分を含む、生物が増殖している栄養ブロスまたはゲルなどの培地を意味する。
【００２２】
本発明の文脈において、対象由来の試料とは、試験対象、例えば癌、より具体的には膵臓癌を有することが判明しているかまたはその疑いがある対象から得られる任意の組織であり得る。例えば、組織は上皮細胞を含み得る。より具体的には、組織は膵臓癌またはＰＤＡＣ由来の上皮細胞であり得る。
【００２３】
ある物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチドなど）に関して本明細書において使用する場合、「単離された」および「精製された」という用語は、該物質が、天然供給源においてはさもなくば含まれうる少なくとも１つの物質を、実質的に含まないことを示す。したがって、「単離された」もしくは「精製された」抗体とは、タンパク質（抗体）が由来する細胞または組織源からの糖質、脂質、または他の混入タンパク質などの細胞材料を実質的に含まないか、あるいは、化学合成された場合には、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、抗体を指す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語には、ポリペプチドが単離されるか組換え的に産生される細胞の細胞成分から該ポリペプチドが分離された、該ポリペプチドの調製物が含まれる。したがって、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドには、（乾燥重量あたり）約３０％、２０％、１０％、５％、２％、または１％未満の異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称する）を有するポリペプチドの調製物が含まれる。ポリペプチドが組換え的に産生される場合には、培養培地を実質的に含まないことも好ましく、これには、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、１０％未満、または５％未満の培養培地を有するポリペプチド調製物が含まれる。ポリペプチドが化学合成により産生される場合には、化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まないことが好ましく、これには、タンパク質の合成に伴う化学的前駆体またはその他の化学物質をタンパク質調製物の体積の約３０％、２０％、１０％、５％、２％、または１％（乾燥重量あたり）未満有するポリペプチド調製物が含まれる。例えば、特定のタンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色等を行った後に単一のバンドが出現することによって、該タンパク質調製物が単離または精製されたポリペプチドを含むと示すことができる。好ましい態様において、本発明の抗体は単離または精製されている。
【００２４】
ｃＤＮＡ分子などの「単離された」または「精製された」核酸分子は、組換え技法によって産生された場合には他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まず、または、化学合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。好ましい態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は単離または精製されている。
【００２５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。上記用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基または非天然残基である、例えば対応する天然アミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに、天然アミノ酸ポリマーに該当する。
【００２６】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに、細胞において翻訳後に修飾されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸アナログ」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合した、α炭素）を有するが、修飾Ｒ基または修飾骨格を有する、化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、構造は一般的アミノ酸と異なるが機能は類似である化学物質を指す。
【００２７】
アミノ酸は本明細書では、一般的に知られている３文字表記で表すこともあり、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ推奨の１文字表記で表すこともある。
【００２８】
本発明の文脈において、例えばアミノ酸の付加、欠失、および／または置換に適用される「いくつかの」という用語は、３〜７個、好ましくは３〜５個、より好ましくは３〜４個、さらにより好ましくは３個のアミノ酸残基を意味する。
【００２９】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、特記しない限り互換的に用いられ、アミノ酸と同様、それらの一般に認められている１文字コードで示される。アミノ酸と同様、これらは天然および非天然の核酸ポリマーの両方を包含する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、または核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから構成され得る。
【００３０】
本発明の文脈において、「対照レベル」という語句は、対照試料において検出される遺伝子またはタンパク質の発現レベルを指し、かつこれには、（ａ）正常対照レベルまたは（ｂ）癌特異的対照レベル、より詳細には膵臓癌特異的対照レベルが含まれうる。対照レベルは、単一の参照集団に由来する単一の発現パターンであってもよく、複数の発現パターンで構成されてもよい。「正常対照レベル」という語句は、正常で健康な個体においてまたは癌、例えば膵臓癌、例えばＰＤＡＣに罹患していないことが既知である個体集団において検出された遺伝子発現のレベルを指す。正常な個体とは、癌、例えば膵臓癌、例えばＰＤＡＣの臨床症状を有しない個体である。一方、「膵臓癌（ＰＣ）対照レベル」または「ＰＤＡＣ対照レベル」とは、それぞれ膵臓癌（ＰＣ）および膵管腺癌（ＰＤＡＣ）に罹患している集団において認められる遺伝子発現のレベルを指す。
【００３１】
試験試料とＰＣ対照またはＰＤＡＣ対照との間のＣ２ｏｒｆ１８発現レベルが類似している場合、（該試験試料を入手した）対象が、それぞれＰＣまたはＰＤＡＣに罹患しているかまたはその発症リスクを有することを示す。本発明によれば、特定遺伝子の発現レベルは、該遺伝子の発現が対照レベルと比較して少なくとも１．１倍、好ましくは１．５倍超、好ましくは２．０倍超、好ましくは５．０倍超、好ましくは１０．０倍またはそれ以上を超えた倍率で増加した場合に「増加した」と見なされる。同様に、特定遺伝子の発現レベルは、該遺伝子の発現が対照レベルと比較して少なくとも１．１分の１、好ましくは１．５分の１未満、好ましくは２．０分の１未満、好ましくは５．０分の１未満、好ましくは１０．０分の１未満の倍率で低下した場合に「低下した」と見なされる。例えばＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロット解析により対象由来の組織試料からＣ２ｏｒｆ１８のｍＲＮＡを検出することによって、あるいは、例えば対象由来の組織試料の免疫組織化学的解析によりＣ２ｏｒｆ１８によりコードされるタンパク質を検出することによって、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子発現を測定することができる。
【００３２】
Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子およびＣ２ｏｒｆ１８タンパク質：
本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８をコードする遺伝子が非癌性組織と比べＰＤＡＣにおいて過剰発現しているという発見に、一部基づく。本明細書においてＣ２ｏｒｆ１８は、ＰＡＭＰ（膵臓癌ミトコンドリアタンパク質）とも称される。本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子およびそれにコードされるＣ２ｏｒｆ１８タンパク質、ならびに膵臓癌の診断および治療の状況におけるこれらの使用に関する。
【００３３】
Ｃ２ｏｒｆ１８と同定されたｃＤＮＡは３９１２ヌクレオチド長である。Ｃ２ｏｒｆ１８の核酸配列およびポリペプチド配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２にそれぞれ示す。また、上記配列データは、アクセッション番号Ｃ２ＯＲＦ１８／Ｃ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰ：ＮＭ＿０１７８７７によっても入手可能である。
【００３４】
本発明の文脈において、機能的等価物もまた「Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチド」と見なされる。本明細書において、タンパク質の「機能的等価物」とは、該タンパク質と同等の生物学的活性を有するポリペプチドである。すなわち、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質の生物学的能力を保持している任意のポリペプチドを、本発明におけるそのような機能的等価物として用いてもよい。本発明の文脈において、Ｃ２ｏｒｆ１８機能的等価物が保持している生物学的活性は、天然Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質に関連する細胞増殖促進活性であることが好ましい。生物学的試料の細胞増殖活性は、増殖速度を検出することによって、または細胞サイクルもしくはコロニー形性能を測定することによって、測定可能である。そのような活性は、従来技術および、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）を通して利用可能なＭＴＴ細胞増殖アッセイまたはＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製のＶｉａＬｉｇｈｔ（商標）アッセイなどの標準アッセイ法を用いて、規定通り分析されうる。同じく、天然Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質がＡＮＴ２に結合する能力も関心対象である。
【００３５】
機能的等価物の例には、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質の天然アミノ酸配列に１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されているものが含まれる。あるいは、上記ポリペプチドは、各タンパク質の配列に対して少なくとも約８０％の相同性（配列同一性とも称される）、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％の相同性、さらにより好ましくは９９％の相同性を有するアミノ酸配列から構成されてもよい。他の態様において、ポリペプチドは、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の天然ヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされてもよい。
【００３６】
本発明のポリペプチドは、その生成のために用いる細胞もしくは宿主または用いる精製方法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に関して異なってもよい。いうまでもなく、本発明のヒトＣ２ｏｒｆ１８タンパク質のポリペプチドと同等の機能を有する限り、上記ポリペプチドは本発明の範囲に含まれる。
【００３７】
「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、核酸分子が、典型的には核酸の複合混合物中にあるその標的配列とはハイブリダイズするが、他の配列とのハイブリダイズは検出不可能となる条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、別の環境下では異なると考えられる。配列が長くなればなるほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays"(1993)において見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度ｐＨでの特定の配列に関する熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとで）標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍにおいては、平衡状態でプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成されうる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルとは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションである。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例には、以下が含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％  ＳＤＳ中、４２℃でインキュベートするか、または５×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ中、６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ中、５０℃で洗浄する。
【００３８】
本発明の文脈において、ヒトＣ２ｏｒｆ１８タンパク質と機能的に等価なポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって日常的に選択されうる。例えば、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液」（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ）を用いて６８℃で３０分間またはそれ以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加して、６８℃で１時間またはそれ以上加温することにより、ハイブリダイゼーションを実施することができる。その後の洗浄段階は、例えば低ストリンジェントな条件で行うことができる。低ストリンジェント条件の例には、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳが含まれ得、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳが含まれ得る。高ストリンジェント条件を用いるのが好ましいことが多い。高ストリンジェントな条件の例には、２×ＳＳＣ、０．０１％  ＳＤＳ中、室温で２０分間の洗浄３回、次に１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、３７℃で２０分間の洗浄３回、および、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、５０℃で２０分間の洗浄２回が含まれ得る。しかし、温度および塩濃度などのいくつかの要素がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼすと考えられ、当業者は必要なストリンジェンシーを得るためにこれらの要素を適切に選択することができる。
【００３９】
一般に、タンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸の修飾は該タンパク質の機能には影響を与えないことが知られている。実際、変異タンパク質または修飾タンパク質、すなわち、ある特定のアミノ酸配列のアミノ酸残基の１つもしくは複数の置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によって修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、元の生物学的活性を保持していることが知られている（Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982); Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)）。したがって当業者は、単一アミノ酸または少数のアミノ酸を改変するような、アミノ酸配列に対する個別の付加、欠失、挿入、または置換、あるいはタンパク質の改変によって類似の機能を有するタンパク質がもたらされる「保存的修飾」と見なされているものが、本発明の文脈において許容可能であることを認識するであろう。
【００４０】
タンパク質の活性が維持されている限り、アミノ酸変異の数は特に限定されない。しかし、アミノ酸配列の５％以下を改変することが一般には好ましい。したがって、好ましい態様において、そのような変異体において変異させるアミノ酸の数は概して、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１０アミノ酸以下、より好ましくは６アミノ酸以下、およびさらにより好ましくは３アミノ酸以下である。
【００４１】
変異対象となるアミノ酸残基は、該アミノ酸の側鎖の特性が保存される別のアミノ酸へと変異させる（保存的アミノ酸置換として知られる方法）ことが好ましい。アミノ酸側鎖の特性の例としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖などが挙げられる：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基を含む側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子を含む側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミドを含む側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基を含む側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族基（ａｒｏｍａｔｉｃ）を含む側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。例えば以下の８群はそれぞれ、互いに対して保存的置換となるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９８４を参照されたい）。
【００４２】
このような保存的に改変されたポリペプチドが本発明の文脈に含まれ、天然Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質の生物学的活性を保持する限り、「Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチド」とみなされる。しかしながら、本発明はそれらに限定されず、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドは、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質の少なくとも１種の生物学的活性（細胞増殖の刺激など）が保持されている限り、非保存的な改変も含みうる。さらに、改変タンパク質は、多型性変異体、種間ホモログ、およびこれらのタンパク質の対立遺伝子にコードされるものを排除しない。
【００４３】
さらに、本発明のＣ２ｏｒｆ１８遺伝子は、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質のそのような機能的等価物をコードするポリヌクレオチドを包含する。ハイブリダイゼーションに加え、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質をコードするＤＮＡの配列情報（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１）に基づいて合成したプライマーを用いてＣ２ｏｒｆ１８タンパク質と機能的に等価のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離することができる。ヒトＣ２ｏｒｆ１８遺伝子およびタンパク質それぞれと機能的に等価のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、通常、それらの元となるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列と高い相同性を有する。「高い相同性」とは典型的に、４０％またはそれ以上の相同性、好ましくは６０％またはそれ以上の相同性、より好ましくは８０％またはそれ以上の相同性、さらにより好ましくは９０％〜９５％またはそれ以上の相同性を意味する。特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性は、”Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80:726-30 (1983)”内のアルゴリズムに従って決定することができる。
【００４４】
抗体：
本発明はまた、Ｃ２ｏｒｆ１８に対する抗体、またはそのような抗体の免疫学的に活性な断片も提供する。そのような抗体は、Ｃ２ｏｒｆ１８特異的発現の検出において有用性が認められる。本発明の文脈において、Ｃ２ｏｒｆ１８に特異的なポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学的解析により、これが膵臓癌細胞において過剰発現すること、および、正常な成人の重要器官（心臓、肺、腎臓、肝臓、および脳）において全くまたはほとんど発現しないことが確認された。したがって、本発明の抗体は、対象由来の生検材料においてＣ２ｏｒｆ１８タンパク質を検出するため、Ｃ２ｏｒｆ１８関連疾患、例えば膵臓癌、例えばＰＤＡＣを診断するため、およびこれらの疾患を治療するために有用である。さらに、本発明の抗体は、Ｃ２ｏｒｆ１８の機能的解析を行うための有用なツールとなりうる。ＣＲＡＡＧＱＳＤＳＳＶＤＰＱＱＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）および／またはＡＥＥＳＥＱＥＲＬＬＧＧＴＲＴＰＩＮＤＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）に記載のアミノ酸配列を有するＣ２ｏｒｆ１８断片を用いて、本発明の抗体を調製することができる。したがって、本発明には、アミノ酸配列ＣＲＡＡＧＱＳＤＳＳＶＤＰＱＱＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）および／またはＡＥＥＳＥＱＥＲＬＬＧＧＴＲＴＰＩＮＤＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）からなるエピトープを認識する抗体が含まれる。より具体的には、好ましい態様において、本発明の抗体はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６のアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識するかまたはこれに結合する。
【００４５】
本明細書で用いる用語「抗体」は、天然抗体および非天然抗体を包含し、例えば、単鎖抗体、キメラ抗体、二機能性抗体、およびヒト化抗体、ならびにそれらの抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびｒＩｇＧ）を含む。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995（Pierce Chemical Co., Rockford, IL）も参照されたい。同じく、例えばKuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York (1998)も参照されたい。このような非天然抗体は固相ペプチド合成を用いて構築することもでき、組換え的に産生することもでき、または例えば、参照として本明細書に組み入れられるHuse et al., Science 246:1275-81 (1989) に記載されているように、可変重鎖と可変軽鎖とからなるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって得ることもできる。例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、一本鎖抗体、および二機能性抗体を作製するこれらおよびその他の方法は、当業者に周知である（Winter and Harris, Immunol. Today 14:243-6 (1993); Ward et al., Nature 341:544-6 (1989); Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988; Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach (IRL Press 1992); Borrebaeck, Antibody Engineering, 2d ed. (Oxford University Press 1995); このそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる）。
【００４６】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む。この用語はまた、キメラ抗体（例えばヒト化マウス抗体）およびヘテロ結合抗体（例えば二重特異性抗体）などの遺伝子操作された形態も含む。この用語はまた、組換え単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）も指す。抗体という用語はまた、二価または二重特異性の分子、すなわち二重特異性抗体、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、および四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）を含む。二価および二重特異性の分子は、例えば以下に記載される：Kostelny et al. (1992) J Immunol 148:1547、Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579、Holliger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci U S A. 90:6444、Gruber et al. (1994) J Immunol :5368、Zhu et al. (1997) Protein Sci 6:781、Hu et al. (1997) Cancer Res. 56:3055、Adams et al. (1993) Cancer Res. 53:4026、およびMcCartney, et al. (1995) Protein Eng. 8:301。
【００４７】
典型的には、抗体は重鎖および軽鎖を有する。重鎖および軽鎖はそれぞれ定常領域および可変領域（これらの領域は「ドメイン」としても知られる）を含む。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる、３つの超可変領域によって中断される４つの「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は規定されている。軽鎖または重鎖それぞれのフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成要素である軽鎖と重鎖のフレームワーク領域の組み合わせによって、ＣＤＲは３次元空間内に配置され整列する。
【００４８】
ＣＤＲは主に、抗原のエピトープに対する結合を担う。各鎖のＣＤＲは、典型的にはＮ末端から順に番号がつけられてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれ、また典型的には、その特定のＣＤＲが位置する鎖によって同定される。したがって、ＶＨ  ＣＤＲ３は、それが見出された抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、ＶＬ  ＣＤＲ１は、それが見出された抗体の軽鎖の可変ドメインのＣＤＲ１である。
【００４９】
「ＶＨ」への言及は抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指し、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＦａｂの重鎖を含む。「ＶＬ」への言及は免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指し、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、またはＦａｂの軽鎖を含む。
【００５０】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という表現は、通常の二本鎖抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが連結して一本鎖を形成した抗体を指す。典型的には、リンカーペプチドが二本鎖の間に挿入されており、適正な折り畳みと活性な結合部位の形成とが可能になっている。
【００５１】
「キメラ抗体」は、（ａ）異なるもしくは変更されたクラス、エフェクター機能、および／もしくは種の定常領域に、またはキメラ抗体に新しい特性を付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などに、抗原結合部位（可変領域）が結合するように、定常領域またはその一部分が改変された、置き換えられた、または交換された；あるいは（ｂ）可変領域またはその一部分が、異なるまたは変更された抗原特異性を有する可変領域に改変された、置き換えられた、または交換された、免疫グロブリン分子である。
【００５２】
「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む免疫グロブリン分子である。ヒト化抗体には、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基でレシピエントのＣＤＲ由来の残基が置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。一部の例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体においても、移入されたＣＤＲやフレームワークの配列においても見出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体とは少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインを実質的に全て含み、ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全てまたは実質的に全てのフレームワーク（ＦＲ）領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。最適には、ヒト化抗体とは、典型的にはヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含む（Jones et al., Nature 321:522-5 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-7 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-6 (1992)）。ヒト化は本質的に、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者の方法（Jones et al., Nature 321:522-5 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-7 (1988)；Verhoeyen et al., Science 239:1534-6 (1988)）に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で対応するヒト抗体の配列を置換することによって行うことができる。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的にヒト可変ドメインの全長より短い領域が、非ヒト種由来の対応する配列によって置き換えられたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。
【００５３】
「エピトープ」、「抗原性」、および「決定基」という用語は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続したアミノ酸から、またはタンパク質の三次折り畳みによって隣接された非連続アミノ酸から形成され得る。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは典型的に、変性溶媒に曝露されても保持されるが、三次折り畳みによって形成されたエピトープは典型的に、変性溶媒による処理で失われる。エピトープは典型的に、独特の空間的高次構造中に少なくとも３アミノ酸、より一般的には少なくとも５または８〜１０アミノ酸を含む。エピトープの空間的高次構造を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)を参照されたい。
【００５４】
以下により詳細に考察するように、「非抗体結合タンパク質」または「非抗体リガンド」または「抗原結合タンパク質」という用語は互換的に、非免疫グロブリンタンパク質骨格を用いる抗体模倣体を指し、これは、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、一本鎖ポリペプチド結合分子、および抗体様結合ペプチド模倣体を含む。
【００５５】
抗体と同様の様式で標的を標的化してそれに結合する、その他の化合物が開発されてきた。これらの「抗体模倣体」の一部は、抗体の可変領域のための代替タンパク質フレームワークとして非免疫グロブリンタンパク質骨格を使用する。
【００５６】
例えばＬａｄｎｅｒら（米国特許第５，２６０，２０３号）は、凝集しているが分子的には離れている軽鎖可変領域および重鎖可変領域をもつ抗体と同様の結合特異性を持つ一本鎖ポリペプチド結合分子を記載している。一本鎖結合分子は、抗体の、ペプチドリンカーによって接続されている重鎖可変領域および軽鎖可変領域両方の抗原結合部位を含み、２つのペプチド抗体の構造と同様の構造に折り畳まれる。一本鎖結合分子は、より小さなサイズ、より高い安定性を含む、従来の抗体に勝るいくつかの利点を示し、より容易に修飾される。
【００５７】
Ｋｕら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(14):6552-6556 (1995)）は、チトクロームｂ５６２に基づく抗体の代替物を開示する。Ｋｕら（１９９５）は、チトクロームｂ５６２のループのうち２つがランダム化されたライブラリーを作製し、ウシ血清アルブミンに対する結合について選択した。個々の変異体は、抗ＢＳＡ抗体と同様にＢＳＡと選択的に結合することが見出された。
【００５８】
Ｌｉｐｏｖｓｅｋら（米国特許第６，８１８，４１８号および第７，１１５，３９６号）は、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン様タンパク質骨格および少なくとも１つの可変ループを特徴とする、抗体模倣体を開示している。アドネクチンとして知られるこれらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、任意の標的化リガンドに対する高い親和性および特異性を含む、天然抗体または改変抗体と同じ特徴の多くを示す。新規のまたは改善された結合タンパク質を進化させるための任意の技術を、これらの抗体模倣体と共に用いることができる。
【００５９】
これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体の構造は、ＩｇＧ重鎖の可変領域の構造と類似している。したがって、これらの模倣体は、天然抗体と性質および親和性の点で類似している抗原結合特性を示す。さらに、これらのフィブロネクチンベースの抗体模倣体は、抗体および抗体断片に勝るある種の利点を示す。例えば、これらの抗体模倣体は、天然の折り畳み安定性のためのジスルフィド結合に依るものではなく、かつしたがって、抗体が通常は壊れるような条件下でも安定である。さらに、これらのフィブロネクチンに基づく抗体模倣体の構造がＩｇＧ重鎖の構造と類似していることから、インビボにおける抗体の親和性成熟プロセスと類似したループランダム化およびシャッフリングのプロセスを、インビトロで用いることができる。
【００６０】
Ｂｅｓｔｅら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(5):1898-1903 (1999)）は、リポカリン骨格に基づく抗体模倣体を開示している（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（商標））。リポカリンは、βバレルとタンパク質末端における４つの超可変ループとで構成される。Ｂｅｓｔｅ（１９９９）は、ループをランダム変異誘発に供し、例えばフルオレセインとの結合について選択した。変種３つがフルオレセインとの特異的結合を示し、そのうち１つの変種が抗フルオレセイン抗体と類似した結合を示した。さらなる解析から、ランダム化位置はすべて可変であることが明らかになり、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（商標）が抗体の代替物として使用するのに適していることが示された。
【００６１】
Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（商標）は、典型的に１６０〜１８０残基の小さな一本鎖ペプチドであり、低い生産コスト、貯蔵時の高い安定性、および低い免疫反応を含む、抗体に勝るいくつかの利点を提供する。
【００６２】
Ｈａｍｉｌｔｏｎら（米国特許第５，７７０，３８０号）は、結合部位として用いられる複数の可変ペプチドループに結合したカリックスアレーンの強固な非ペプチド有機骨格を用いる合成抗体模倣体を開示している。ペプチドループはすべて、互いに対して、カリックスアレーンの幾何学的に同じ側から突出している。この幾何学的高次構造のために、すべてのループを結合に利用することができ、これによりリガンドに対する結合親和性が増大する。しかし、他の抗体模倣体と比較して、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は完全にペプチドだけからなるわけではなく、したがってプロテアーゼ酵素による攻撃に強い。この骨格は純粋にペプチドや、ＤＮＡや、ＲＮＡからなるわけではなく、このことは、この抗体模倣体が極端な環境条件において比較的安定であり、かつ長い寿命を有することを意味している。さらに、カリックスアレーンベースの抗体模倣体は比較的小さいため、免疫原性反応を生じる可能性が低い。
【００６３】
Ｍｕｒａｌｉら（Cell. Mol. Biol. 49(2):209-216 (2003)）は、彼らが「抗体様結合ペプチド模倣体」（ＡＢｉＰ）と呼ぶより小さなペプチド模倣体へと抗体を縮小する方法論を考察しており、これは抗体の代替物としても有用であり得る。
【００６４】
Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら（Nat. Biotechnol. (2005), 23: 1556-1561）は、「アビマー」と呼ばれる複数のドメインを有する一本鎖ポリペプチドである、融合タンパク質を開示している。インビトロエキソンシャッフリングおよびファージディスプレイによってヒト細胞外受容体ドメインから開発されたアビマーは、様々な標的分子に対するそれらの親和性および特異性の点である程度抗体に類似した、ある種の結合タンパク質である。得られるマルチドメインタンパク質は、単一エピトープ結合タンパク質と比較して向上した親和性（場合によってはナノモル以下）および特異性を示しうる、複数の独立した結合ドメインを含むことができる。アビマーの構築法および使用法に関するさらなる詳細は、例えば米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号、同第２００５００４８５１２号、同第２００５００５３９７３号、同第２００５００８９９３２号、および同第２００５０２２１３８４号に開示されている。
【００６５】
非免疫グロブリンタンパク質フレームワークに加え、抗体特性はまた、ＲＮＡ分子および非天然オリゴマー（例えば、プロテアーゼインヒビター、ベンゾジアゼピン、プリン誘導体、およびβターン模倣体）（これら全てが本発明での使用に適している）を含む化合物中でも模倣されている。
【００６６】
二本鎖分子：
本発明はまた、Ｃ２ｏｒｆ１８の発現を阻害することが、膵臓癌に関与するものを含む癌細胞の細胞増殖を阻害するのに有効であるという驚くべき発見にも関する。本出願に記載する発明は、この発見に一部基づくものである。
【００６７】
本明細書で使用する「二本鎖分子」という用語は、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；例えば二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ／ＲＮＡ（ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ；例えばＤＮＡおよびＲＮＡの二本鎖キメラ（ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡおよびＲＮＡの短いヘアピンキメラ（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ））を含む標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指す。本明細書で用いる「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列を有し、かつ該相補配列を介して共にアニーリングされて二本鎖ＲＮＡ分子を形成する、２つのＲＮＡ分子からなる構築物を指す。二本鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡだけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子も含みうる。
【００６８】
本明細書で用いる「ｓｈＲＮＡ」という用語は、互いに相補的な第一領域と第二領域（すなわちセンス鎖とアンチセンス鎖）を有するステムループ構造を有するｓｉＲＮＡを指す。第一および第二の領域の相補性および配向性は、領域間で塩基対形成が起こるのに十分な程度であり、第一領域と第二領域はループ領域で連結され、該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）間の塩基対形成が欠けていることによりもたらされる。ｓｈＲＮＡのループ領域とは、センス鎖とアンチセンス鎖の間に介在する一本鎖領域であり、「介在性一本鎖」とも称される。
【００６９】
本明細書で用いる「ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡとＤＮＡの両方からなり、ＲＮＡとＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、かつ標的ｍＲＮＡの翻訳を妨害する、二本鎖ポリヌクレオチド分子を指す。本明細書において、ハイブリッドとは、ＤＮＡからなるポリヌクレオチドとＲＮＡからなるポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成している分子を指し；キメラとは、二本鎖分子を構成する鎖の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡを含み得ることを示す。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、センス核酸配列（「センス鎖」とも称される）、アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも称される）、またはその両方を含む。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、標的遺伝子に由来するセンス核酸配列および相補的アンチセンス核酸配列の両方を単一の転写物が有するように、構築されてもよい（例えば、ヘアピン）。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのどちらかであってもよい。
【００７０】
本明細書で用いる「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列を有しかつ、該相補配列を介して共にアニーリングして二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成する、２分子の構築物を指す。二本鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ヌクレオチド配列だけでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドも含んでよい。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２分子の一方または両方がＲＮＡおよびＤＮＡの両方で構成されている（キメラ分子）か、または代替的に、分子の一方がＲＮＡで構成され、他方がＤＮＡで構成されている（ハイブリッド二本鎖）。
【００７１】
本明細書で用いる「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、互いに相補的な第一領域と第二領域（すなわちセンス鎖とアンチセンス鎖）を有するステムループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを指す。第一および第二の領域の相補性および配向性は、領域間で塩基対形成が起こるのに十分な程度であり、第一領域と第二領域はループ領域で連結され、かつ該ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチドアナログ）間の塩基対形成が欠けていることによりもたらされる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域とはセンス鎖とアンチセンス鎖の間に介在する一本鎖領域であり、「介在性一本鎖」とも称される。
【００７２】
本発明の二本鎖分子は、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含んでもよい。当技術分野で周知の化学的修飾によって、二本鎖分子の安定性、利用可能性、および／または細胞取り込みを増大させることができる。当業者は、本発明の分子に組み込むことができるその他の種類の化学的修飾を認識しているであろう（国際公開公報第０３／０７０７４４号；同第２００５／０４５０３７号）。一態様において、分解に対する耐性向上または取り込み増加を提供するために、修飾を用いることができる。そのような修飾の例には、ホスホロチオエート結合、（特に二本鎖分子のセンス鎖上での）２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ塩基性残基組み込みが含まれる（ＵＳ２００６０１２２１３７）。
【００７３】
別の態様において、二本鎖分子の安定性を増大させるためまたは標的化効率を増大させるために、修飾を用いることができる。修飾には、二本鎖分子の２本の相補鎖の間での化学的架橋、二本鎖分子の１本の鎖の３’末端または５’末端の化学的修飾、糖修飾、核酸塩基修飾および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチド、ならびに２’−デオキシリボヌクレオチドが含まれる（国際公開公報第２００４／０２９２１２号）。別の態様において、標的ｍＲＮＡにおける、および／または相補的二本鎖分子鎖における相補的ヌクレオチドに対する親和性を増大または低下させるために、修飾を用いることができる（国際公開公報第２００５／０４４９７６号）。例えば、未修飾ピリミジンヌクレオチドを２−チオピリミジン、５−アルキニルピリミジン、５−メチルピリミジン、または５−プロピニルピリミジンに置き換えることができる。さらに、未修飾プリンを７−デザ（ｄｅｚａ）プリン、７−アルキルプリン、または７−アルケニルプリンと置き換えることができる。別の態様において、二本鎖分子が３’突出を有する二本鎖分子である場合、３’末端ヌクレオチドが突出しているヌクレオチドを、デオキシリボヌクレオチドで置換してもよい（Elbashir SM et al., Genes Dev 2001 Jan 15, 15(2): 188-200）。さらなる詳細に関しては、ＵＳ２００６０２３４９７０などの公開公報が入手可能である。本発明はこれらの例に限定されるものではなく、得られる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持している限り、本発明の二本鎖分子に対して任意の既知の化学的修飾を用いることができる。
【００７４】
さらに、本発明の二本鎖分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を、例えばｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡを含んでもよい。特に、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖のハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、安定性の増大を示す。二本鎖分子の安定性を増大させるために、ＤＮＡとＲＮＡの混合、すなわち、ＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）とＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）からなるハイブリッドタイプの二本鎖分子、一方または両方の一本鎖（ポリヌクレオチド）においてＤＮＡとＲＮＡの両方を有するキメラタイプの二本鎖分子などを形成してもよい。ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖のハイブリッドは、標的遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖がＤＮＡでありアンチセンス鎖がＲＮＡであるか、またはその反対のどちらかである、ハイブリッドであってもよい。好ましくは、センス鎖ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドがＲＮＡである。同様に、キメラタイプの二本鎖分子は、標的遺伝子を発現する細胞に導入された場合に、該遺伝子の発現を阻害する活性を有する限り、センス鎖とアンチセンス鎖の両方がＤＮＡおよびＲＮＡで構成されてもよく、または、センス鎖とアンチセンス鎖のどちらか一方がＤＮＡおよびＲＮＡで構成されてもよい。
【００７５】
二本鎖分子の安定性を増大させるためには、分子ができる限り多くのＤＮＡを含むことが好ましく、一方、標的遺伝子発現の阻害を誘発するためには、十分な発現阻害を誘発する範囲内で分子がＲＮＡであることが必要である。キメラタイプの二本鎖分子の好ましい例としては、二本鎖分子の上流部分領域（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖における、標的配列またはその相補配列に隣接する領域）がＲＮＡである。好ましくは、上流部分領域とは、センス鎖の５’側（５’末端）およびアンチセンス鎖の３’側（３’末端）を示す。すなわち、好ましい態様において、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域が、または、センス鎖の５’末端に隣接する領域とアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡからなる。例えば、本発明のキメラタイプまたはハイブリッドタイプの二本鎖分子は、以下の組合せを含む。
５’−［−−−ＤＮＡ−−−］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’：アンチセンス鎖、および
センス鎖：５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（−−−ＲＮＡ−−−）−５’：アンチセンス鎖。
【００７６】
上流部分領域は、二本鎖分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補配列の末端から数えて９〜１３ヌクレオチドからなるドメインであることが好ましい。さらに、そのようなキメラタイプの二本鎖分子の好ましい例には、少なくともポリヌクレオチドの上流側半分の領域（センス鎖の５’側領域およびアンチセンス鎖の３’側領域）がＲＮＡであり残りの半分がＤＮＡである、１９〜２１ヌクレオチド鎖長を有する分子が含まれる。そのようなキメラタイプの二本鎖分子において、アンチセンス鎖全体がＲＮＡである場合に、標的遺伝子の発現を阻害する効果が非常に高い（ＵＳ２００５０００４０６４）。
【００７７】
本発明においては、二本鎖分子はヘアピン、例えば低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）および、ＤＮＡとＲＮＡからなる低分子ヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成してもよい。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡとは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために用いることができる密なヘアピンターンを形成している、ＲＮＡの配列またはＲＮＡとＤＮＡの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、一本鎖上にセンス標的配列およびアンチセンス標的配列を含み、これらの配列はループ配列によって分離されている。通常、ヘアピン構造は細胞機構によって切断されてｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡとなり、これが次に、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列に一致するｍＲＮＡに結合して、これを切断する。
【００７８】
Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子に対する二本鎖分子（例えば「Ｃ２ｏｒｆ１８  ｓｉＲＮＡ」）を用いて、該遺伝子の発現レベルを低下させることができる。本明細書において、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する二本鎖ＲＮＡ分子を指す。本発明の文脈において、二本鎖分子は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子に対するセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列から構成される。二本鎖分子は、標的配列のセンス配列と相補的アンチセンス配列の両方を含むように構築される。二本鎖分子は、ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＤ／ＲＮＡ、またはｓｈＤ／ＲＮＡのいずれかであり得る。
【００７９】
Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子に対する二本鎖分子は、標的配列に対応する領域においてｍＲＮＡの標的領域とハイブリダイズし、すなわち正常な一本鎖ｍＲＮＡ転写物と会合し、かつそれによってｍＲＮＡの翻訳を妨げ、このことが最終的には、該遺伝子にコードされるポリペプチドの産生（発現）を低下させるか阻害する。したがって本発明の二本鎖分子は、ストリンジェントな条件下でＣ２ｏｒｆ１８遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズできる能力によって定義することができる。
【００８０】
本発明の文脈において、二本鎖分子は好ましくは、５００、２００、１００、５０、または２５ヌクレオチド長未満である。より好ましくは、二本鎖分子は１９〜２５ヌクレオチド長である。Ｃ２ｏｒｆ１８二本鎖分子の例示的な標的核酸配列には、Ｃ２ｏｒｆ１８の標的配列に対応するオリゴヌクレオチド配列、例えば５’−ＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）または５’−ＧＣＡＣＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＡＣＡＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）が含まれる。したがって、本発明は例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８からなるオリゴヌクレオチド配列を有する二本鎖分子を提供する。二本鎖分子のＲＮＡ領域において、標的配列中のヌクレオチド「ｔ」は「ｕ」と置き換えられる。二本鎖分子の阻害活性を高めるために、ヌクレオチド「ｕ」をアンチセンス鎖の３’末端に付加することができる。付加される「ｕ」の数は、少なくとも２個、一般に２〜１０個、好ましくは２〜５個である。付加された「ｕ」は、二本鎖分子のアンチセンス鎖の３’末端で一本鎖を形成する。
【００８１】
ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列で構成されるループ配列をセンス配列とアンチセンス配列の間に配置することができる。したがって、本発明はまた、一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有する二本鎖分子も提供し、式中、［Ａ］は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子のｍＲＮＡの標的配列またはｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズする配列に対応するオリゴヌクレオチド配列である。好ましい態様において、［Ａ］はＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の標的配列に対応するオリゴヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドで構成されるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］の相補配列で構成されるオリゴヌクレオチド配列である。領域［Ａ］は［Ａ’］にハイブリダイズし、次いで、領域［Ｂ］で構成されたループが形成される。好ましくはループ配列は、３〜２３ヌクレオチド長であってよい。例えばループ配列は、以下の配列からなる群より選択することができる（http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html）：
ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ：Jacque JM et al., Nature 2002, 418: 435-8。
ＵＵＣＧ：Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20:500-5；Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003, 100(4):1639-44。
ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ：Dykxhoorn DM et al., Nature Reviews Molecular Cell Biology 2003, 4:457-67。
「ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ（ＤＮＡでは「ｔｔｃａａｇａｇａ」）」は、特に適したループ配列である。
【００８２】
さらに、２３ヌクレオチドからなるループ配列もまた、活性ｓｉＲＮＡを提供する（Jacque J-M et al., Nature 2002, 418:435-8）。
【００８３】
本発明の文脈における使用に適したヘアピン二本鎖分子の例には以下が含まれる：
５’−  ＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＵＵＣＣＡＧＣＡＵ−［Ｂ］−ＡＵＧＣＵＧＧＡＡＧＣＵＧＵＧＣＵＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の標的配列に対して）；および  
５’−ＧＣＡＣＧＡＣＡＧＵＣＡＧＣＡＣＡＡＧ−［Ｂ］−ＣＵＵＧＵＧＣＵＧＡＣＵＧＵＣＧＵＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の標的配列に対して）。
【００８４】
具体的には、本発明には以下の二本鎖分子［１］〜［１３］が含まれる：
［１］センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、該センス鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８からなる標的配列に対応するヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖が、該センス鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖が互いにハイブリダイズして該二本鎖分子を形成し、かつ該二本鎖分子が、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する細胞中に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。
［２］上記標的配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１からなるヌクレオチド配列に由来する約１９個から約２５個の連続したヌクレオチドを含む、［１］の二本鎖分子。
［３］一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結された上記センス鎖および上記アンチセンス鎖を含む単一のヌクレオチド転写物である、［２］の二本鎖分子。
［４］一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有する、［３］の二本鎖分子：
式中、  
［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む上記センス鎖であり；
［Ｂ］は約３個〜約２３個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ
［Ａ’］は［Ａ］の配列に相補的な配列に対応するオリゴヌクレオチドを含む上記アンチセンス鎖である。
［５］一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有する、［３］の二本鎖分子：
式中、  
［Ａ］は、上記標的配列としてのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８からなる配列に対応するリボヌクレオチド配列であり；
［Ｂ］は約３個〜約２３個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；
［Ａ’］は、［Ａ］の相補的配列からなるリボヌクレオチド配列である。
［６］ＲＮＡを含む、［１］〜［５］の二本鎖分子。
［７］ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む、［１］〜［５］の二本鎖分子。
［８］ＤＮＡポリヌクレオチドおよびＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、［７］の二本鎖分子。
［９］上記センス鎖および上記アンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡで作製される、［８］の二本鎖分子。
［１０］ＤＮＡとＲＮＡのキメラである、［７］の二本鎖分子。
［１１］上記センス鎖における上記標的配列の５’末端領域および／または上記アンチセンス鎖における上記標的配列の相補的配列の３’末端領域の両方が、ＲＮＡからなる、［１０］の二本鎖分子。
［１２］ＲＮＡ領域が９〜１３個のヌクレオチドからなる、［１１］の二本鎖分子。
［１３］３’突出部を含む、［１］〜［５］の二本鎖分子。
【００８５】
本発明の二本鎖分子を、以下でより詳細に説明する。
【００８６】
適切な二本鎖分子のオリゴヌクレオチド配列は、Ａｍｂｉｏｎ社のウェブサイト（http://www.ambion.com/techlib/ misc/siRNA_finder.html）から入手可能なデザインコンピュータープログラムを用いて設計することができる。このコンピュータープログラムは、以下のプロトコールに基づいて二本鎖分子合成のためのヌクレオチド配列を選択する。
【００８７】
標的部位の選択：
１．対象となる転写物のＡＵＧ開始コドンから始めて、ＡＡジヌクレオチド配列を求めて下流にスキャンする。潜在的な標的部位として、個々のＡＡおよび３’側に隣接する１９ヌクレオチドの出現を記録する。５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）および開始コドン近傍（７５ヌクレオチド以内）の領域は調節タンパク質結合部位においてはずっと豊富でありうることから、Tuschl et al. Genes Cev 1999, 13(24):3191-7では、これらに対して標的配列を設計することが推奨されていない。ＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、エンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る。
【００８８】
２．可能性のある標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列に対して有意な相同性をもつ全ての標的配列を検討対象から除く。相同性検索は、ＮＣＢＩサーバ（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）上で見出されるＢＬＡＳＴ（Altschul SF et al., Nucleic Acids Res 1997, 25:3389-402；J Mol Biol 1990, 215:403-10）を用いて実行することができる。
【００８９】
３．合成用の適格な標的配列を選択する。Ａｍｂｉｏｎでは、好ましくは、遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択して評価することができる。
【００９０】
二本鎖分子を細胞に導入するための標準的技術を使用することができる。例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８の二本鎖分子を、ｍＲＮＡ転写物と結合できる形態で、細胞内に直接導入することができる。これらの態様において、本発明の二本鎖分子は通常、アンチセンス分子に関して上述したように修飾される。その他の修飾も可能であり、例えば、コレステロールと結合した二本鎖分子は、薬理学的特性の向上を示す（Song et al., Nature Med 2003, 9:347-51）。
【００９１】
あるいは、二本鎖分子をコードするＤＮＡをベクター（以下、「ｓｉＲＮＡベクター」とも称する）に含めてもよい。そのようなベクターは、例えば、標的Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の配列を、両方の鎖の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする様式で該配列に隣接している機能的に連結された調節配列（例えば、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＨ１  ＲＮＡプロモーターに由来するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写ユニット）を有する発現ベクター中にクローニングすることによって、作製できる（Lee NS et al., Nature Biotechnology 2002, 20: 500-5）。例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子のｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子を第１のプロモーター（例えば、クローニングされたＤＮＡの３’側にあるプロモーター配列）によって転写させ、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子のｍＲＮＡに対してセンス鎖であるＲＮＡ分子を第２のプロモーター（例えば、クローニングされたＤＮＡの５’側にあるプロモーター配列）によって転写させる。センス鎖およびアンチセンス鎖はインビボでハイブリダイズして、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子をサイレンシングするための二本鎖分子構築物を生じる。または、２つの構築物を利用して、センス鎖およびアンチセンス鎖の一本鎖構築物を作製することもできる。この場合には、標的遺伝子のセンス配列と相補的アンチセンス配列の両方を含む単一の転写物として、二次構造、例えばヘアピンを有する構築物を作製する。
【００９２】
具体的には、本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を有するポリヌクレオチドの組み合わせのどちらかまたは両方を有するベクターを提供し、ここで、該センス鎖核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖は該センス鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写物は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ、該ベクターは、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する。
【００９３】
あるいは、本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を有するポリヌクレオチドの組み合わせのどちらかを有するベクターを提供し、ここで、該センス鎖核酸はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸は該センス鎖に相補的である配列を含み、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写物は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ、該ベクターは、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害する。好ましくは、ポリヌクレオチドは、約１９〜２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１のヌクレオチド配列由来の連続したヌクレオチド）である。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせには、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を有する単一のヌクレオチド転写物が含まれる。より好ましくは、ポリヌクレオチドの組み合わせは一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’
を有し、式中、［Ａ］はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８を有するヌクレオチド配列であり；［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００９４】
二本鎖分子のベクターを細胞内に導入するために、トランスフェクション促進剤を使用することができる。ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光順薬工業）は、トランスフェクション促進剤として有用である。
【００９５】
膵臓癌を検出または診断する方法：
膵臓癌細胞においてトランス活性化された何十個もの遺伝子のうちで、本発明は、複数回膜貫通型タンパク質をコードする１つの新規な遺伝子Ｃ２ｏｒｆ１８（ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿０１７８７７）に焦点を合わせる。これは、本明細書において互換的に「ＡＮＴ２ＢＰ」（ＡＮＴ２結合タンパク質（ＡＮＴ２−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ））およびＰＡＭＰ（膵臓癌ミトコンドリアタンパク質（ｐａｎｃｒｅａｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ））と呼ばれる。ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、およびＣ２ｏｒｆ１８に特異的なポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学的解析により、これが膵臓癌細胞において過剰発現すること、および正常な成人重要器官（心臓、肺、腎臓、肝臓、および脳）においてはほとんどまたは全く発現しないことが確認された。
【００９６】
したがって、本発明は、対象由来の生物学的試料、例えば組織試料におけるＣ２ｏｒｆ１８の発現レベルを測定することにより、対象における癌、例えば膵臓癌の存在またはその発症素因を検出、診断、および／または判定する方法を特徴とする。正常対照レベルと比較したＣ２ｏｒｆ１８発現レベルの増大などの変化によって、対象が癌、例えば膵臓癌に罹患しているかまたはその発症リスクを有することが示される。
【００９７】
本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを判定する（例えば、測定する）段階を含む。公知の配列に関するＧｅｎＢａｎｋ（商標）データベースエントリによって提供される配列情報を使用して、当業者に周知の技術を用いたＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の検出および測定を行うことができる。例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子に対応する配列データベースエントリ内の配列を用いて、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション解析において、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子に対応するＲＮＡ配列を検出するためのプローブを構築することができる。プローブは典型的に、Ｃ２ｏｒｆ１８配列のうち少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、または少なくとも２００個のヌクレオチドを含む。別の例として、上記配列を用いて、例えば増幅に基づく検出法における、例えば逆転写に基づくポリメラーゼ連鎖反応における、Ｃ２ｏｒｆ１８核酸を特異的に増幅するためのプライマーを構築することができる。別の例として、Ｃ２ｏｒｆ１８に対する抗体、例えば抗Ｃ２ｏｒｆ１８ポリクローナル抗体または抗Ｃ２ｏｒｆ１８モノクローナル抗体を、免疫測定法、例えば免疫組織化学的解析、ウエスタンブロット解析、またはＥＬＩＳＡなどのために用いることができる。
【００９８】
さらに、増幅に基づく検出法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）により、プライマーを用いてＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の転写産物を定量することができる。そのようなプライマーは、該遺伝子の入手可能な配列情報に基づいて調製することもできる。例えば実施例において使用したプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３および４）はＲＴ−ＰＣＲによる検出のために使用可能であるが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
【００９９】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出することができる。例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質の量を測定してもよい。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法には、該タンパク質を特異的に認識する抗体または抗体模倣体を使用する免疫測定法が含まれる。抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。さらに、断片がＣ２ｏｒｆ１８タンパク質への結合能を保持している限り、検出のために上記抗体の任意の上記断片または修飾（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）を使用してもよい。タンパク質検出用のこれらの種類の抗体を調製するための方法は当技術分野で周知であり、そのような抗体およびその等価物を調製するために、本発明において任意の方法を使用することができる。
【０１００】
Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルをその翻訳産物に基づいて検出するための別の方法として、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質に対する抗体または抗体模倣体を用いた免疫組織化学的解析により染色強度を観察してもよい。すなわち、強い染色が観察されれば、該タンパク質の存在量が多いことおよび、同時にＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の高い発現レベルが示される。
【０１０１】
さらに、その生物学的活性に基づき、翻訳産物を検出してもよい。具体的には、本明細書において、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質が癌細胞の増殖に関与することが実証された。したがって、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質の細胞増殖活性を、生物学的試料中に存在するＣ２ｏｒｆ１８タンパク質の指標として用いることができる。
【０１０２】
次いで、試験細胞集団、例えば対象由来の組織試料におけるＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを、参照細胞集団における該遺伝子の発現レベルと比較する。参照細胞集団は、比較されるパラメータが既知である一つまたは複数の細胞、例えば膵臓癌細胞、正常な膵臓細胞、または正常な膵管上皮細胞を含む。
【０１０３】
参照細胞集団と比較して、試験細胞集団における遺伝子の発現レベルが癌、例えば膵臓癌、またはその素因を示すかどうかは、参照細胞集団の構成に左右される。例えば、参照細胞集団が（非癌）正常細胞から構成される場合には、試験細胞集団と参照細胞集団の間で遺伝子発現レベルに類似性があることにより、該試験細胞集団が癌でもなくそのリスクも有さないと示される。反対に、参照細胞集団が癌細胞から構成される場合、試験細胞集団と参照細胞集団の間で遺伝子発現に類似性があることにより、該試験細胞集団が癌細胞を含むことが示される。
【０１０４】
試験細胞集団におけるＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルは、参照細胞集団におけるＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルと、１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超、またはそれ以上の倍率で異なる場合、「変化している」または「異なる」とみなされる。
【０１０５】
試験細胞集団と参照細胞集団との間の差次的な遺伝子発現は、対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子に対して標準化することができる。例えば、対照核酸とは、細胞の癌状態でも非癌状態でも差がないことが知られている核酸である。対照核酸の発現レベルを用いて、試験細胞集団および参照細胞集団におけるシグナルレベルを標準化することができる。対照遺伝子の例には、例えば、β−アクチン、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびリボソームタンパク質Ｐ１が非制限的に含まれる。
【０１０６】
試験細胞集団を、複数の参照細胞集団と比較することができる。複数の参照細胞集団はそれぞれ、公知のパラメータが異なってもよい。したがって、試験細胞集団を、例えば膵臓癌細胞を含むことが判明している第１の参照細胞集団と、および、例えば膵臓癌細胞を含まない正常細胞であることが判明している第２の参照細胞集団と比較することができる。試験細胞集団は、癌細胞を含むことが判明しているかまたは含むことが疑われる対象由来の組織または細胞試料を含んでもよい。
【０１０７】
試験細胞集団は、生検材料、例えば体組織または体液、例えば生物学的液体（例えば血液、痰、唾液）から得ることができる。例えば、癌、例えば膵臓癌に罹患していることが疑われる対象由来の膵臓組織から、試験細胞集団を精製することができる。好ましくは、試験細胞集団は上皮細胞を含む。上皮細胞は、癌、例えば膵臓癌であることが判明しているかまたはそれが疑われる組織に由来することが好ましい。
【０１０８】
参照細胞集団における細胞は、試験細胞集団の組織型と類似した組織型に由来することが好ましい。任意で、参照細胞集団は一つの細胞系、例えば膵臓癌細胞系またはＰＤＡＣ細胞系（すなわち陽性対照）であるか、または正常非癌性細胞系（すなわち陰性対照）である。または、対照細胞集団は、分析されるパラメータまたは条件が公知である細胞からの分子情報のデータベースに由来し得る。
【０１０９】
診断される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、または雌ウシが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１１０】
あるいは、本発明によると、対象の状態を検査するための中間結果を提供してもよい。対象が癌、例えば膵臓癌に罹患していると医師、看護師、または他の実務者が判定するのを援助するために、このような中間結果を付加的な情報と組み合わせることができる。
【０１１１】
あるいは、本発明を用いて、対象由来の組織中の癌細胞を検出し、かつ、対象が癌、例えば膵臓癌に罹患していると判定するのに有用な情報を医師に提供することもできる。したがって、本発明は、膵臓組織試料のような対象由来の試料におけるＣ２ｏｒｆ１８レベルを決定（例えば測定）することを含む。本発明において、癌、例えば膵臓癌を診断するための方法はまた、癌、例えば膵臓癌を試験または検出するための方法も含む。あるいは、本発明において、癌を診断することは、対象における癌の疑い、リスク、または可能性を示すことも意味する。
【０１１２】
癌治療の有効性のモニタリングおよび評価：
Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子は、正常細胞と癌細胞では差次的に発現され、したがって、癌治療の経過をモニタリングすることが可能になり、ここで、癌を診断するための前述の方法を、癌、例えば膵臓癌に対する治療の有効性のモニタリングおよび評価に適応させ応用することができる。具体的には、癌に対する治療の有効性は、治療を受けている対象由来の細胞におけるＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを測定することによって評価することができる。望ましいならば、試験用の細胞集団を、治療前、治療中、および／または治療後の様々な時点で対象から採取する。Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルは、例えば、前述した方法に従って測定することができる。本発明の文脈において、検出された発現レベルの比較対象である対照レベルとして、関心対象の治療を受けていない細胞におけるＣ２ｏｒｆ１８遺伝子発現を使用することが好ましい。
【０１１３】
Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを、正常細胞または非癌細胞、例えば非膵臓癌細胞を含む細胞集団から測定される対照レベルと比較する場合、発現レベルが類似していることによって関心対象の治療が有効であることが示され、発現レベルが異なることによって該治療の臨床転帰または予後があまり好ましくないことが示される。これに対して、癌細胞または、癌細胞、例えば膵臓癌細胞を含む細胞集団から測定される対照レベルに対して比較を実施する場合、発現レベルが異なることによって治療が有効であることが示されるのに対し、発現レベルが類似していることによって臨床転帰または予後があまり好ましくないことが示される。
【０１１４】
さらに、治療前後のＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを、治療の有効性を評価するための本方法によって比較することができる。具体的には、治療後の対象由来生物学的試料において検出された発現レベル（すなわち、治療後レベル）を、同一の対象から治療開始前に得た生物学的試料において検出された発現レベル（すなわち、治療前レベル）と比較する。治療前レベルと比較した治療後レベルが減少したことは、関心対象の治療が有効であることを示し、一方、治療前レベルに対して治療後レベルが増大したか同等である場合、臨床転帰または予後が良好ではないことを示す。
【０１１５】
本明細書で使用する「有効な」という用語は、対象において、病的にアップレギュレートされた遺伝子発現の減少、病的にダウンレギュレートされた遺伝子発現の増大、または癌腫のサイズ、罹患率もしくは転移能の低下が治療によってもたらされることを示している。関心対象の治療が予防的に適用される場合、「有効な」という用語は、治療が腫瘍の形成を遅延させるか予防すること、または疾患の臨床症状の少なくとも１つを遅延させるか予防もしくは軽減することを意味する。対象における腫瘍の状態の評価は、標準的な臨床プロトコールを用いて行われ得る。
【０１１６】
さらに、治療の有効性を、癌を診断するための任意の公知の方法に関連して判定することもできる。例えば、症候性の異常、例えば体重減少、腹痛、背部痛、食欲不振、悪心、嘔吐および全身倦怠感、衰弱、ならびに黄疸を同定することによって、癌を診断することができる。
【０１１７】
膵臓癌を検出、診断、または判定するためのキットおよび試薬：
本発明は、癌を検出、診断、または判定するためのキットを提供する。癌は、好ましくは膵臓癌であり、より好ましくはＰＤＡＣである。具体的には、本キットは、対象由来の生物学的試料においてＣ２ｏｒｆ１８の発現レベルを検出するための少なくとも１種類の試薬を含み、該試薬は以下の群より選択されうる：
（ａ）Ｃ２ｏｒｆ１８のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）Ｃ２ｏｒｆ１８の生物学的活性を検出するための試薬。
【０１１８】
Ｃ２ｏｒｆ１８のｍＲＮＡを検出するための適切な試薬には、Ｃ２ｏｒｆ１８  ｍＲＮＡの一部に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドなどの、Ｃ２ｏｒｆ１８  ｍＲＮＡに特異的に結合するまたはこれを同定する核酸が含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドの例は、Ｃ２ｏｒｆ１８  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブである。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法に基づいて調製されうる。必要ならば、Ｃ２ｏｒｆ１８  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体マトリクス上に固定化してもよい。
【０１１９】
一方、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質を検出するための適切な試薬には、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。さらに、断片がＣ２ｏｒｆ１８タンパク質への結合能を保持している限り、抗体の任意の断片または修飾物（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）を試薬として使用することができる。タンパク質検出用のこれらの種類の抗体を調製するための方法は当技術分野で周知であり、本発明においては任意の方法を使用してそのような抗体およびその等価物を調製することができる。さらに、直接結合または間接的標識技術によって、シグナル産生分子を用いて抗体を標識してもよい。標識ならびに、抗体を標識する方法およびその標的に対する抗体の結合を検出する方法は当技術分野で周知であり、本発明のために任意の標識および方法を使用することができる。
【０１２０】
さらに、例えば生物学的試料中で発現したＣ２ｏｒｆ１８タンパク質による細胞増殖活性を測定することによって、生物学的活性を測定することができる。例えば、対象由来の生物学的試料の存在下で細胞を培養し、次に、増殖速度を検出することによってまたは細胞周期もしくはコロニー形成能を測定することによって、生物学的試料の細胞増殖活性を測定することができる。
【０１２１】
さらに本キットは、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子に対するプローブまたはＣ２ｏｒｆ１８タンパク質に対する抗体を結合させるための固体マトリクスおよび試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性対照試薬および陰性対照試薬、ならびに、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含んでもよい。例えば、予後良好または予後不良である対象から得た組織試料は、有用な対照試薬として役立ちうる。本発明のキットは、使用説明書と共に、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、およびパッケージ挿入物（例えば、書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭなど）を含む、商業的なおよびユーザーの観点から望ましいその他の用具をさらに含みうる。これらの試薬等は、ラベル付けした容器内で保持されてもよい。適切な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。
【０１２２】
本発明の一態様として、試薬がＣ２ｏｒｆ１８  ｍＲＮＡに対するプローブである場合、多孔性ストリップなどの固体マトリクス上に該試薬を固定化して、少なくとも１つの検出部位を形成させてもよい。多孔性ストリップの測定領域または検出領域は、それぞれが１つの核酸（プローブ）を含む複数の部位を含んでもよい。また試験ストリップは、陰性対照および／または陽性対照に対する部位を含んでもよい。あるいは、対照部位を試験ストリップとは分離されたストリップ上に配置してもよい。任意で、様々な検出部位が様々な量の固定化核酸を、すなわち第１の検出部位ではより多い量の、以降の部位ではより少ない量の固定化核酸を含んでもよい。試験試料を加えたら、検出可能なシグナルを示す部位の数によって、試料中に存在するＣ２ｏｒｆ１８  ｍＲＮＡの量の量的指標が提供される。検出部位は、任意の適切に検出可能な形状で構成することができ、典型的には試験ストリップの幅全体にわたる棒状またはドット状の形状である。
【０１２３】
あるいは、本発明は、膵臓癌の存在または発症素因を検出、診断、または判定するための上記の試薬を提供する。
【０１２４】
スクリーニング法：
Ｃ２ｏｒｆ１８を過剰発現する細胞においてｓｉＲＮＡによって内因性Ｃ２ｏｒｆ１８をノックダウンすることによって該細胞の増殖が大きく抑制され、このことはそれらの細胞の生存能を維持する上でのその不可欠な役割を示唆するものである。さらに、免疫細胞化学的解析および細胞分画とそれに続くウェスタンブロット解析により、Ｃ２ｏｒｆ１８がミトコンドリア中に局在することが示唆され、このことは、Ｃ２ｏｒｆ１８がそれらの細胞におけるアポトーシスまたはエネルギー恒常性に関与している可能性があることを示す。Ｃ２ｏｒｆ１８の機能および細胞内局在の関するこれらの知見により、Ｃ２ｏｒｆ１８が膵臓癌治療法のための有望な分子標的であり得ることが示された。
【０１２５】
したがって、本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８を過剰発現する細胞の増殖を阻害するための候補薬剤または候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。これらの細胞は、癌細胞、具体的には膵臓癌細胞、より具体的にはＰＤＡＣ細胞でよい。Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子、該遺伝子もしくはその断片にコードされるポリペプチド、または該遺伝子の転写調節領域を用いて、該遺伝子の発現または該遺伝子にコードされるポリペプチドの生物学的活性を阻害する薬剤または化合物をスクリーニングすることが可能である。本発明の文脈において、生物学的活性とは細胞増殖活性であり得る。このような薬剤または化合物は、癌、例えば膵臓癌のようなＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療または予防するための医薬の候補薬剤または候補化合物であり得る。したがって、本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子、該遺伝子もしくはその断片にコードされるポリペプチド、または該遺伝子の転写調節領域を用いて、癌、具体的には膵臓癌、より具体的にはＰＤＡＣのようなＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療または予防するための候補薬剤または候補化合物を同定する方法もさらに提供する。
【０１２６】
本発明のスクリーニング法によって同定される薬剤または化合物は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現または該遺伝子の転写産物の活性を阻害する薬剤または化合物、および、癌、具体的には膵臓癌、より具体的にはＰＤＡＣのようなＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療するために有効であると予想される薬剤または化合物である。すなわち、本発明の方法によって同定される薬剤または化合物は臨床的な利点を有すると予想され、これらを動物モデルまたは試験対象においてＣ２ｏｒｆ１８を過剰発現する細胞の増殖を防止する能力についてさらに試験することができる。
【０１２７】
本発明の文脈において、本スクリーニング法を通して同定される薬剤または化合物は、いくつかの化合物を含む、任意の生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、任意の化合物または組成物であり得る。さらに、本発明のスクリーニング法により細胞またはタンパク質に曝露される試験薬剤または試験化合物は、単一の化合物または化合物の組み合わせであってもよい。本方法において化合物の組み合わせを使用する場合には、該化合物を連続的または同時に接触させてもよい。
【０１２８】
任意の試験薬剤または試験化合物、例えば細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物の産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質もしくは未精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（アンチセンスＲＮＡ、二本鎖分子、ｓｉＲＮＡ、リボザイム等の核酸構築物を含む）、および天然化合物を、本発明のスクリーニング法に使用することができる。本発明の試験薬剤または試験化合物はまた、以下を非限定的に含む、当技術分野において公知であるコンビナトリアルライブラリー法における多くの手法のいずれかを用いて得ることもできる：  
（１）生物学的ライブラリー、
（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー、
（３）脱重畳積分（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー法、
（４）「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、および
（５）アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法。
【０１２９】
生物学的ライブラリー手法はペプチドライブラリーに限定されるが、残りの４種類の手法は、化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリー、または小分子ライブラリーに適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des 1977, 12: 145-67）。分子ライブラリー合成法の例は、当技術分野において見出すことができる（DeWitt et al., Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90: 6909-13；Erb et al., Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91: 11422-6；Zuckermann et al., J Med Chem 37: 2678-85, 1994；Cho et al., Science 1993, 261: 1303-5；Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2059；Carell et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994, 33: 2061；Gallop et al., J Med Chem 1994, 37: 1233-51）。化合物のライブラリーは、溶液中で（Houghten, Bio/Techniques 1992, 13: 412-21を参照されたい）、または、ビーズ上で（Lam, Nature 1991, 354: 82-4）、チップ上で（Fodor, Nature 1993, 364: 555-6）、細菌上で（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子上で（米国特許第５，５７１，６９８号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，２２３，４０９号）、プラスミド上で（Cull et al., Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 1865-9）、もしくはファージ上で（Scott and Smith, Science 1990, 249: 386-90；Devlin, Science 1990, 249: 404-6；Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82；Felici, J Mol Biol 1991, 222: 301-10；米国特許出願第２００２１０３３６０号）、提示することができる。
【０１３０】
本スクリーニング法のいずれかによって同定された構造の一部が付加、欠失、および／または置換によって変換された化合物は、本発明のスクリーニング法によって得られる薬剤または化合物に含まれる。
【０１３１】
さらに、スクリーニングされた試験薬剤または試験化合物がタンパク質であるかまたは該タンパク質をコードするＤＮＡである場合、該タンパク質の全アミノ酸配列を決定して、該タンパク質をコードする核酸配列を推定してもよく、あるいは、得られたタンパク質の部分的アミノ酸配列を解析して、配列に基づくプローブとしてオリゴＤＮＡを調製し、該プローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、該タンパク質をコードするＤＮＡを得てもよい。得られたＤＮＡは、癌の治療または予防のための候補である試験薬剤または試験化合物の調製において、用途が見出される。
【０１３２】
Ｉ．インシリコスクリーニング法
求められる特性を有すると判明した化合物の分子構造および／または阻害するべき標的分子すなわちＣ２ｏｒｆ１８の分子構造についての知識によって、試験化合物ライブラリーの構築が容易になる。さらなる評価に適した試験化合物の予備スクリーニングに対する１つのアプローチが、試験化合物とその標的の間の相互作用のコンピュータモデリングである。本発明において、試験化合物とＣ２ｏｒｆ１８の間の相互作用をモデリングすることにより、相互作用自体の詳細への洞察が提供され、かつ、相互作用に対する潜在的な分子阻害因子を含む、該相互作用を妨害するために可能な戦略が示唆される。
【０１３３】
コンピュータモデリング技術により、選択した分子の３次元原子構造の視覚化と、該分子と相互作用するであろう新しい化合物の合理的設計とが可能である。３次元構築物は典型的に、選択した分子のＸ線結晶構造解析またはＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子動態は力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムにより、新しい化合物が標的分子に連結する方法の予測が可能になり、かつ、結合特異性を完全にするように該化合物および該標的分子の構造を実験操作することが可能になる。片方または両方に小さな変化を起こしたときに分子−化合物間相互作用がどうなるかを予測するには、通常、分子設計プログラムとユーザーとの間のユーザーフレンドリーなメニュー駆動型インターフェースと連係した、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型コンピュータが必要である。
【０１３４】
上記で概説した分子モデリングシステムの一例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  Ｍａｓｓ）からなる。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化および分子動態機能を行う。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および解析を行う。ＱＵＡＮＴＡによって、互いに対する分子の挙動の相互的な構築、修飾、視覚化、および解析が可能となる。
【０１３５】
特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングは、いくつかの論文において概説されている：例えば、Rotivinen, et al. Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166 (1988)；Ripka, New Scientist 54-57 (Jun. 16, 1988)；McKinlay and Rossmann, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29, 111-122 (1989)；Perry and Davies, Prog Clin Biol Res.291:189-93(1989)；Lewis and Dean, Proc. R. Soc. Lond B Biol Sci. 236, 125-40 and 141-62 (1989)；および、核酸成分に対する受容体モデルに関して、Askew, et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 1082-90 (1989)。
【０１３６】
化学物質をスクリーニングし、画像として描写する他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｐａｓａｄｅｎａ，  Ｃａｌｉｆ．、Ａｌｌｅｌｉｘ，  Ｉｎｃ，  Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ、およびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｏｎｔａｒｉｏなどの企業から利用可能である。例えば、DesJarlais et al. (1988) J. Med. Chem. 31:722-9；Meng et al. (1992) J. Computer Chem. 13:505-24；Meng et al. (1993) Proteins 17:266-78；Shoichet et al. (1993) Science 259:1445-50を参照されたい。
【０１３７】
Ｃ２ｏｒｆ１８の推定阻害因子が同定されたら、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて、同定された推定阻害因子の化学構造に基づいて任意の数の変種を構築することができる。得られた推定阻害因子または「試験薬剤」または「試験化合物」のライブラリーを、本発明の方法を用いてスクリーニングし、Ｃ２ｏｒｆ１８の生物学的活性を阻害する試験薬剤または試験化合物を同定することができる。
【０１３８】
ＩＩ．タンパク質ベースのスクリーニング法
本発明によると、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現は、該遺伝子を過剰発現している細胞、例えば癌細胞、具体的には膵臓癌細胞、より具体的にはＰＤＡＣ細胞の増殖および／または生存にとって、極めて重要であることが示唆された。したがって、上記遺伝子にコードされるポリペプチドの発現または機能を抑制する薬剤または化合物は、上記細胞の増殖および／または生存を阻害すること、ならびに細胞増殖の阻害および癌の治療または予防における使用が見出されることが示唆された。したがって本発明は、細胞増殖を阻害するための候補薬剤または候補化合物を、あるいは、Ｃ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療または予防するための候補薬剤または候補化合物を、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドを用いて同定する方法を提供する。本発明において、増殖を阻害される細胞はＣ２ｏｒｆ１８の過剰発現を特徴とし、例えば癌細胞、例えば膵臓癌細胞、特に膵管腺癌細胞である。Ｃ２ｏｒｆ１８関連疾患はＣ２ｏｒｆ１８の過剰発現を特徴とし、例えば癌、例えば膵臓癌、特にＰＤＡＣである。
【０１３９】
本スクリーニング法の文脈において、天然Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを保持している限り、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに加えて、該ポリペプチドの断片を用いてもよい。
【０１４０】
得られるポリペプチドおよび断片が元のポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを保持している限り、ポリペプチドまたはその断片を他の物質にさらに連結してもよい。使用可能な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマーなどが含まれる。さらなる機能を付与するためまたはポリペプチドおよび断片を安定化するために、これらの種類の修飾を行ってもよい。
【０１４１】
本方法のために使用するポリペプチドまたは断片を、天然タンパク質として従来の精製法によって自然界から入手してもよく、または、選択されたアミノ酸配列に基づく化学合成を通して入手してもよい。例えば、合成のために採用できる従来のペプチド合成法には以下が含まれる：
１）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
２）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
３）ペプチド合成，丸善（株），１９７５；
４）ペプチド合成の基礎と実験，丸善（株），１９８５；
５）医薬品の開発  続第１４巻，ペプチド合成，広川書店，１９９１；
６）国際公開公報第９９／６７２８８号；および
７）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【０１４２】
あるいは、ポリペプチド作製のための任意の公知の遺伝子操作法（例えばMorrison J., J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）を採用して、タンパク質を入手してもよい。例えば、まず、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現可能な形態で（例えばプロモーターを含む調節配列の下流に）含む適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞中に形質転換し、その後、宿主細胞を培養して該タンパク質を産生させる。より具体的には、外来遺伝子を発現させるためのベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、またはｐＣＤ８に、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入することにより、該遺伝子を宿主（例えば動物）細胞などにおいて発現させる。発現のためにプロモーターを用いてもよい。例えば以下を含む、一般的に使用される任意のプロモーターを用いることができる：ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson (ed.), Genetic engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982, 83-141）、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al., Gene 1990, 91:217-23）、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al., Gene 1991, 108:193）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen, Methods in Enzymology 1987, 152:684-704）、ＳＲαプロモーター（Takebe et al., Mol Cell Biol 1988, 8:466）、ＣＭＶ前初期プロモーター（Seed et al., Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84:3365-9）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen et al., J Mol Appl Genet 1982, 1:385-94）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al., Mol Cell Biol 1989, 9:946）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーターなど。Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現させるための宿主細胞へのベクターの導入は、例えば以下の任意の方法に従って行うことができる：エレクトロポレーション法（Chu et al., Nucleic Acids Res 1987, 15:1311-26）、リン酸カルシウム法（Chen et al., Mol Cell Biol 1987, 7:2745-52）、ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al., Nucleic Acids Res 1984, 12:5707-17；Sussman et al., Mol Cell Biol 1984, 4:1641-3）、リポフェクチン法（Derijard B, Cell 1994, 7:1025-37)；Lamb et al., Nature Genetics 1993, 5:22-30；Rabindran et al., Science 1993, 259:230-4）など。
【０１４３】
またＣ２ｏｒｆ１８タンパク質を、インビトロ翻訳システムを採用してインビトロで産生することもできる。
【０１４４】
試験薬剤または試験化合物に接触させるＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドは、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、または、他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であることができる。
【０１４５】
ＩＩ−１．Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに結合する薬剤または化合物の同定
あるタンパク質に結合する薬剤または化合物は、そのタンパク質をコードする遺伝子の発現またはそのタンパク質の生物学的活性を変更する可能性が高い。したがって、１つの局面において、本発明は、以下の段階を含む、細胞増殖を阻害するための、およびＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療または予防するための薬剤または化合物をスクリーニングする方法を提供する：
ａ）試験薬剤または試験化合物を、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；
ｂ）ポリペプチド（または断片）と試験薬剤または試験化合物との結合を検出する段階；および
ｃ）ポリペプチド（または断片）に結合する試験薬剤または試験化合物を選択する段階。
【０１４６】
本発明によると、細胞増殖の阻害およびＣ２ｏｒｆ１８関連疾患の治療または予防に対する試験薬剤または試験化合物の治療的効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、細胞増殖を阻害するための、およびＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療または予防するための薬剤または化合物をスクリーニングする方法も提供する：
ａ）試験薬剤または試験化合物を、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；
ｂ）ポリペプチド（または断片）と試験薬剤または試験化合物との結合を検出する段階；および
ｃ）ｂ）の結合と試験薬剤または試験化合物の治療的効果との相互関係を明らかにする段階。
【０１４７】
本発明において、治療的効果は、試験薬剤または試験化合物の結合特性と相関関係を有し得る。例えば、試験薬剤または試験化合物がポリペプチド（または断片）に結合する場合、該試験薬剤または試験化合物は、治療的効果を有する候補薬剤または候補化合物として同定または選択され得る。あるいは、試験薬剤または試験化合物がポリペプチド（または断片）に結合しない場合、該試験薬剤または試験化合物は、有意な治療的効果を有さない薬剤または化合物として同定され得る。Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドへの試験薬剤または試験化合物の結合は、例えば、該ポリペプチドに対する抗体を使用する免疫沈降法によって検出することができる。したがって、そのような検出を目的として、スクリーニング用に使用されるＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片は、抗体認識部位を含むことが好ましい。スクリーニングのために使用される抗体は、その調製方法が当技術分野において周知である本発明のＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドの抗原性領域（例えばエピトープ）を認識する抗体でよく、かつ、本発明において任意の方法を使用し、このような抗体およびそれらの等価物を調製してよい。
【０１４８】
あるいは、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片は、該ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に対して、その特異性が明らかにされているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）をそのＮ末端またはＣ末端に含む融合タンパク質として発現され得る。市販されているエピトープ−抗体系を使用することができる（Experimental Medicine 1995, 13:85-90）。例えばβ−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合タンパク質を、そのマルチクローニング部位を用いることにより発現できるベクターが市販されており、かつ本発明のために使用することができる。さらに、エピトープに対する抗体を用いた免疫沈降法によって検出されるずっと小さなエピトープを含む融合タンパク質もまた、当技術分野において公知である（Experimental Medicine 1995, 13:85-90）。Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその断片の性質を変えないように数十個のアミノ酸からなるそのようなエピトープもまた、本発明において使用することができる。例には、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−タグ）、インフルエンザ凝集体ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７  ｇｅｎｅ  １０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−タグ）、およびＥ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１４９】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）もまた、免疫沈降法によって検出される融合タンパク質の対応物として周知である。ＧＳＴが、融合タンパク質を形成するためにＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその断片と融合されるタンパク質として使用される場合、該融合タンパク質は、ＧＳＴに対する抗体、またはＧＳＴに特異的に結合する物質、すなわちグルタチオンなど（例えばグルタチオン−セファロース４Ｂ）のいずれかを用いて検出することができる。
【０１５０】
免疫沈降法では、（Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドもしくはその機能的断片自体、または該ポリペプチドもしくは断片にタグ付けされたエピトープを認識する）抗体を、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドと試験薬剤または試験化合物との反応混合物に添加することにより、免疫複合体が形成される。試験薬剤または試験化合物が該ポリペプチドに結合可能である場合、形成される免疫複合体は、したがって、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチド、試験薬剤または試験化合物、および抗体から構成されると考えられる。これに対して、試験薬剤または試験化合物がこのような能力を欠いている場合は、したがって、形成される免疫複合体は、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドおよび抗体しか含まない。したがって、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに対する試験薬剤または試験化合物の結合能力は、例えば、形成された免疫複合体のサイズを測定することによって検査することができる。クロマトグラフィーおよび電気泳動などを含む、物質のサイズを検出するための任意の方法を使用することができる。例えば、マウスＩｇＧ抗体が検出に使用される場合、プロテインＡまたはプロテインＧセファロースを、形成された免疫複合体を定量するのに使用することができる。
【０１５１】
免疫沈降におけるさらなる詳細に関しては、例えばHarlow et al., Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988, 511-52を参照されたい。
【０１５２】
さらに、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片に結合する薬剤または化合物をスクリーニングするために用いる該Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片を、担体に結合させてもよい。ポリペプチドを結合させるために用いうる担体の例には、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖類；ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれ；上記の材料から作製された市販のビーズおよびプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど）を用いることが好ましい。ビーズを用いる場合、それらをカラムに充填してもよい。あるいは、磁気ビーズの使用も当技術分野において公知であり、これにより、該ビーズに結合させたポリペプチドおよび試験薬剤または試験化合物を磁力により容易に単離することが可能になる。
【０１５３】
担体とポリペプチドの結合は、化学的結合および物理的吸着などの常用の方法によって実施してもよい。または、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して、ポリペプチドを担体に結合させてもよい。さらに、アビジンとビオチンの組み合わせなどの、相互作用する分子を利用して、担体とポリペプチドの結合を実施することもできる。
【０１５４】
そのような担体結合Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片を用いたスクリーニング法は、例えば以下の段階を含む：試験薬剤または試験化合物と担体結合ポリペプチドとを接触させる段階；混合物をインキュベートする段階；担体を洗浄する段階；ならびに、担体に結合した該薬剤または該化合物を検出および／または測定する段階。緩衝液が結合を阻害しない限り、該緩衝液中で、例えば、これらに限定されるわけではないがリン酸緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液中で、結合を行ってもよい。
【０１５５】
そのような担体結合Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその断片を用いる例示的スクリーニング法には、アフィニティークロマトグラフィーが含まれる。例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドをアフィニティーカラムの担体表面に固定化してもよく、少なくとも１つの試験薬剤または試験化合物を含む溶液を該カラムに適用する。試験薬剤または試験化合物をロードした後にカラムを洗浄し、次に、ポリペプチドに結合した試験薬剤または試験化合物を適切な緩衝液を用いて溶出させる。
【０１５６】
結合した薬剤または化合物を検出または定量する手段として、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを本発明において使用してもよい。このようなバイオセンサーを用いる場合、標識を行うことなく、ごく微量のポリペプチドのみを用いて、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドと試験薬剤または試験化合物との間の相互作用を表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサーを用いて、ポリペプチドと試験薬剤または試験化合物との間の結合を評価することが可能である。
【０１５７】
タンパク質だけでなく化学物質も単離するための、合成化学物質の中で特定のタンパク質に結合する分子または天然物バンクもしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリ内の分子を、担体上に固定化された特定のタンパク質を該分子に曝露することによってスクリーニングする方法、およびコンビナトリアルケミストリー技術に基づくハイスループットスクリーニング法（Wrighton et al., Science 1996, 273:458-64；Verdine, Nature 1996, 384:11-3）もまた、当業者に周知である。またこれらの方法は、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質またはその断片に結合する（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）薬剤または化合物をスクリーニングするためにも使用可能である。
【０１５８】
試験薬剤または試験化合物がタンパク質である場合、本方法のために、例えば、ウエスト−ウエスタンブロット分析（Skolnik et al., Cell 1991, 65:83-90）を用いることができる。具体的には、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに結合するタンパク質を、以下の段階によって得ることができる：まず、ファージベクター（例えば、ＺＡＰ）を用いて、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドと結合する少なくとも１つのタンパク質を発現すると予想される細胞、組織、器官、または培養細胞（例えば膵臓癌細胞）由来のｃＤＮＡライブラリーを調製する段階；ｃＤＮＡライブラリーのベクターにコードされるタンパク質をＬＢ−アガロース上で発現させる段階；発現したタンパク質をフィルター上に固定する段階；精製および標識されたＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドを上記のフィルターと反応させる段階；ならびにその後、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドが結合したタンパク質を発現しているプラークを、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドの標識により検出する段階。
【０１５９】
本方法におけるＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドの標識のために、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン）およびビオチン／アビジンなどの標識物質を用いることができる。タンパク質を放射性同位体で標識する場合には、検出または測定を液体シンチレーションによって行うことができる。あるいは、タンパク質が酵素で標識されている場合には、該酵素の基質を添加し、色の発生などの基質の酵素的変化を吸光光度計で検出することによって、該タンパク質を検出または測定することができる。さらに、標識として蛍光物質を使用する場合には、結合状態のタンパク質を蛍光光度計を用いて検出または測定することができる。
【０１６０】
さらに、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに特異的に結合した抗体またはＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに融合したペプチドもしくはポリペプチド（例えばＧＳＴ）を利用することによって、タンパク質に結合したＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドを検出または測定することができる。抗体を本スクリーニングに用いる場合には、抗体を上記の標識物質のいずれかで標識し、標識物質に基づいて検出または測定を行うことが好ましい。または、標識物質で標識された二次抗体によって検出される一次抗体として、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに対する抗体を用いてもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドと結合した抗体は、プロテインＧカラムまたはプロテインＡカラムを用いて検出または測定することができる。
【０１６１】
あるいは、本発明のスクリーニング法の別の態様において、細胞を利用する２−ハイブリッド系を用いることができる（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ２−ハイブリッド系」、「哺乳動物ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ２−ハイブリッドアッセイキット」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  １−ハイブリッド系」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  ２−ハイブリッドベクター系」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献”Dalton et al., Cell 1992, 68:597-612”および”Fields et al., Trends Genet 1994, 10:286-92”）。２−ハイブリッド系では、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその断片をＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域と融合させ、酵母細胞において発現させる。Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに結合する少なくとも１つのタンパク質を発現することが予想される細胞から、発現した場合にライブラリーがＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域と融合するように、ｃＤＮＡライブラリーを調製する。次にｃＤＮＡライブラリーを上記の酵母細胞に導入し、ライブラリー由来のｃＤＮＡを、検出された陽性クローンから単離する（Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに結合するタンパク質を酵母細胞内で発現させると、両者の結合がレポーター遺伝子を活性化させ、陽性クローンが検出可能になる）。ｃＤＮＡにコードされるタンパク質は、上記のように単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入し、該タンパク質を発現させることによっても調製できる。
【０１６２】
レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子のほかに、例えば、Ａｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを用いることができる。
【０１６３】
本スクリーニングによって同定された薬剤または化合物は、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストの候補である。「アゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を活性化させる分子を指す。一方、「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに結合することによってその機能を阻害する分子を指す。さらに、このスクリーニングによってアンタゴニストとして単離された薬剤または化合物は、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドと分子（核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）およびタンパク質を含む）とのインビボ相互作用を阻害する候補となる。
【０１６４】
ＩＩ−２．Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドの生物学的活性を検出することによる、薬剤または化合物の同定
本発明により、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現は、癌細胞、具体的には膵臓癌細胞、より具体的にはＰＤＡＣ細胞のようなＣ２ｏｒｆ１８を過剰発現する細胞の増殖および／または生存にとって非常に重要であることが示された。したがって、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の翻訳産物の発現または生物学的機能を抑制または阻害する薬剤または化合物は、細胞増殖を阻害するための候補薬剤もしくは候補化合物、またはＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは候補化合物として役立つとみなされる。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補薬剤もしくは候補化合物、またはＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは候補化合物をスクリーニングする方法も提供する：
ａ）試験薬剤または試験化合物を、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；および
ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは断片の生物学的活性を検出する段階。
【０１６５】
本発明によると、細胞増殖の阻害に対する試験薬剤もしくは試験化合物の治療的効果、またはＣ２ｏｒｆ１８関連疾患の治療もしくは予防に関する候補薬剤もしくは候補化合物の治療的効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその断片を用いて、細胞増殖を阻害するための候補薬剤もしくは候補化合物、またはＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは候補化合物をスクリーニングする方法も提供する：
ａ）試験薬剤または試験化合物を、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片と接触させる段階；および
ｂ）段階（ａ）のポリペプチドまたは断片の生物学的活性を検出する段階；および
ｃ）ｂ）の生物学的活性と試験薬剤または試験化合物の治療的効果との相互関係を明らかにする段階。
【０１６６】
本発明において、治療的効果は、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性と相関関係があり得る。例えば、試験薬剤または試験化合物が、試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比べて、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制または阻害する場合、その試験薬剤または試験化合物は、治療的効果を有する候補薬剤または候補化合物として同定または選択され得る。あるいは、試験薬剤または試験化合物が、試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比べて、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片の生物学的活性を抑制も阻害もしない場合、該試験薬剤または試験化合物は、有意な治療的効果を有さない薬剤または化合物として同定され得る。
【０１６７】
本発明のスクリーニング法において指標として使用できるＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドの生物学的活性のうち１種を有している限り、任意のポリペプチドをスクリーニングに使用することができる。Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドは、癌細胞の細胞増殖を促進する活性を有しているため、スクリーニングのための指標として使用できるＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドの生物学的活性には、ヒトＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドのそのような細胞増殖活性が含まれる。例えば、ヒトＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドを使用することができ、その機能的断片を含むそれに対して機能的に等価なポリペプチドも使用することができる。このようなポリペプチドは、適切な細胞によって、内因的または外因的に発現され得る。
【０１６８】
本発明の方法において検出される生物学的活性が細胞増殖活性または抗アポトーシス活性である場合、これは、例えばＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的断片を発現する細胞を調製し、試験薬剤または試験化合物の存在下でこれらの細胞を培養し、かつ細胞増殖速度の測定および細胞周期の測定などを実施することにより、ならびに、創傷治癒活性を検出すること、Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤アッセイ法を実施すること、およびコロニー形成活性を測定することにより、検出することができる。
【０１６９】
本発明のある局面によると、スクリーニングは、前述の段階（ｂ）の後に、以下の段階をさらに含む：
ｃ）試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出される生物学的活性と比べて、ポリペプチドの生物学的活性を抑制する試験薬剤または試験化合物を選択する段階。
【０１７０】
さらに、候補薬剤または候補化合物は、Ｃ２ｏｒｆ１８を発現しない細胞に対する効果と比較することによって、Ｃ２ｏｒｆ１８に対する特異性を確認することができる。候補薬剤または候補化合物が、Ｃ２ｏｒｆ１８発現細胞において効果を示し得るがＣ２ｏｒｆ１８を発現しない細胞では効果を示し得ない場合、該候補薬剤または候補化合物はＣ２ｏｒｆ１８に対する特異性を有する。このスクリーニングによって単離される薬剤または化合物は、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドのアンタゴニストの候補薬剤または候補化合物であり、したがってこれは、該ポリペプチドと分子（核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）ならびにタンパク質を含む）とのインビボ相互作用を阻害する候補薬剤または候補化合物である。
【０１７１】
細胞増殖活性または抗アポトーシス活性に加えて、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質はＡＮＴ２タンパク質に対する結合活性も有する。したがって、本発明はまた、Ｃ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の結合を阻害する薬剤または化合物をスクリーニングする方法も提供する。Ｃ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の結合を阻害する薬剤または化合物は、癌細胞の増殖を抑制すると予想され、したがって、癌を治療または予防するために有用である。したがって、本発明はまた、癌細胞の増殖を抑制する候補薬剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、および癌を治療または予防するための候補薬剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
【０１７２】
より具体的には、本方法は、以下の段階を含む：
（ａ）試験薬剤または試験化合物の存在下でＣ２ｏｒｆ１８タンパク質をＡＮＴ２タンパク質と接触させる段階；
（ｂ）Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質とＡＮＴ２タンパク質の間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質とＡＮＴ２タンパク質の結合レベルを、試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出される結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質とＡＮＴ２タンパク質の結合レベルを低下させる試験薬剤または試験化合物を、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質とＡＮＴ２タンパク質の間の結合を阻害する薬剤または化合物として、すなわち、癌細胞の増殖を抑制するためおよび癌を治療または予防するために使用され得る候補薬剤または候補化合物として選択する段階。
【０１７３】
本発明によると、細胞増殖の阻害に対する試験薬剤もしくは試験化合物の治療的効果、またはＣ２ｏｒｆ１８関連疾患の治療もしくは予防に関する候補薬剤もしくは候補化合物の治療的効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、癌細胞の増殖を抑制する候補薬剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、および癌を治療または予防するための候補薬剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
【０１７４】
より具体的には、本方法は、以下の段階を含む：
（ａ）試験薬剤または試験化合物の存在下でＣ２ｏｒｆ１８タンパク質をＡＮＴ２タンパク質と接触させる段階；
（ｂ）Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質とＡＮＴ２タンパク質の間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質とＡＮＴ２タンパク質の結合レベルを、該試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出される結合レベルと比較する段階；
（ｄ）（ｃ）の結合レベルと該試験薬剤または試験化合物の治療的効果との相互関係を明らかにする段階。
【０１７５】
本発明において、治療的効果は、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質とＡＮＴ２タンパク質の結合レベルと相関関係があり得る。例えば、試験薬剤または試験化合物が、該試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比べて、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質とＡＮＴ２タンパク質の結合レベルを低下させる場合、該試験薬剤または試験化合物は、治療的効果を有する候補薬剤または候補化合物として同定または選択され得る。あるいは、試験薬剤または試験化合物が、該試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比べて、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質とＡＮＴ２タンパク質の結合レベルを低下させない場合、該試験薬剤または試験化合物は、有意な治療的効果を有さない薬剤または化合物として同定され得る。
【０１７６】
本発明の文脈において、２つのタンパク質の間の「結合の阻害」とは、該タンパク質間の結合を少なくとも減少させることを指す。従って、ある場合には、試料中の結合対の割合が、適切な（例えば、試験薬剤で治療されていない）対照試料中の結合対の割合と比較して低下すると考えられる。結合したタンパク質の量は、対照試料中の量の、例えば、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、２５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、またはそれ以下（例えば０％）になりうる。
【０１７７】
本明細書において、上述のように、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質およびＡＮＴ２タンパク質はこれらのタンパク質の機能的等価物を含みうる。スクリーニングに用いられるＣ２ｏｒｆ１８タンパク質もしくはＡＮＴ２タンパク質またはこれらの機能的等価物は、当業者に周知の方法によって、組換えタンパク質または天然タンパク質として調製することができる。ポリペプチド作製のための任意の公知の遺伝子操作法（例えばMorrison J., J Bacteriology 1977, 132: 349-51；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）を採用して、タンパク質を入手してもよい。例えば、組換えタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１（Ｃ２ｏｒｆ１８について）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５（ＡＮＴ２について）のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ）を適切な発現ベクターに挿入する段階、該ベクターを適切な宿主細胞に導入する段階、適切な培地中で該宿主細胞をインキュベートする段階、該宿主細胞の抽出物を入手する段階、および、該抽出物をクロマトグラフィー、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、もしくは該タンパク質に対する抗体を固定したカラムを利用するアフィニティークロマトグラフィーに供することによりまたは上記のカラムを複数組み合わせることにより該タンパク質を精製する段階によって、組換えタンパク質を調製することができる。
【０１７８】
また、本発明の文脈において有用なタンパク質を宿主細胞（例えば、動物細胞および大腸菌）内でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質としてまたは多数のヒスチジンが添加された組換えタンパク質として発現させる場合、発現した組換えタンパク質を、グルタチオンカラムまたはニッケルカラムを用いて精製することができる。
【０１７９】
融合タンパク質の精製後に、必要に応じてトロンビンまたは第Ｘａ因子で切断することにより、目的のタンパク質以外の領域を除くこともできる。
【０１８０】
当業者に既知の方法によって、例えば上述のＣ２ｏｒｆ１８タンパク質またはＡＮＴ２タンパク質に結合する抗体を結合させたアフィニティーカラムを、該タンパク質を発現する組織または細胞の抽出物に接触させることによって、天然タンパク質を単離することができる。抗体は、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質またはＡＮＴ２タンパク質に結合する限り、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または任意の改変抗体であることができる。
【０１８１】
またＣ２ｏｒｆ１８タンパク質もしくはＡＮＴ２タンパク質またはこれらの機能的等価物を、インビトロ翻訳システムを採用してインビトロで産生させてもよい。
【０１８２】
さらに、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質およびＡＮＴ２タンパク質の部分ペプチドを、これらが互いに対する結合活性を保持している限り、本発明のために用いてもよい。そのような部分ペプチドは、遺伝子操作により、公知のペプチド合成法により、あるいは天然のＣ２ｏｒｆ１８タンパク質またはＡＮＴ２タンパク質を適切なペプチダーゼで消化することにより、産生可能である。ペプチド合成に関しては、例えば固相合成法または液相合成法を使用することができる。合成のために採用できる従来のペプチド合成法には以下が含まれる：
１）Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966；
２）The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976；
３）ペプチド合成，丸善（株），１９７５；
４）ペプチド合成の基礎と実験，丸善（株），１９８５；
５）医薬品の開発  続第１４巻，ペプチド合成，広川書店，１９９１；
６）国際公開公報第９９／６７２８８号；および
７）Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2,"Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【０１８３】
ポリペプチドおよび断片が互いに対する元の結合能を保持している限り、ポリペプチドまたはその断片を他の物質にさらに連結してもよい。使用可能な物質には、ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマーなどが含まれる。さらなる機能を付与するためまたはポリペプチドおよび断片を安定化するために、これらの種類の修飾を行ってもよい。
【０１８４】
試験薬剤または試験化合物の存在下で接触させるＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドおよびＡＮＴ２ポリペプチドまたはこれらの機能的断片は、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、または、他のポリペプチドと融合した融合タンパク質でありうる。
【０１８５】
本発明のスクリーニング法は、Ｃ２ｏｒｆ１８とその結合パートナーであるＡＮＴ２の会合を妨害する確率が高い試験薬剤または試験化合物の、効率的で迅速な同定を提供する。概して、試験薬剤または試験化合物がそのような会合を妨害する能力を測定する方法は全て、本発明と共に使用するのに適している。例えば、ＥＬＩＳＡ形式の競合的および非競合的な阻害アッセイを利用することができる。システムの最大結合能を測定するために、対照実験を行う必要がある（例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８をＡＮＴ２と接触させて、Ｃ２ｏｒｆ１８に結合したＡＮ２の量を測定する）。
【０１８６】
タンパク質間の結合を阻害する薬剤または化合物を同定するための方法として、当業者に周知の多くの方法を用いることができる。このような同定は、インビトロアッセイ系として、例えば細胞系において行うことができる。より具体的には、まず、Ｃ２ｏｒｆ１８またはそのパートナーであるＡＮＴ２のいずれかを支持体に結合させ、これに対してもう一方のタンパク質を試験薬剤または試験化合物とともに接触させる。次に、混合物をインキュベートし、洗浄して、支持体に結合したもう一方のタンパク質を検出および／または測定する。
【０１８７】
タンパク質を結合させるために用いうる支持体の例には、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖類；ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれ；好ましくは上記の材料から調製した市販のビーズおよびプレート（例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど）が用いられ得る。ビーズを用いる場合、それらをカラムに充填してもよい。あるいは、磁気ビーズの使用も当技術分野において公知であり、これにより、該ビーズに結合させたタンパク質を磁力により容易に単離することが可能になる。
【０１８８】
タンパク質と支持体との結合は、化学的結合や物理的吸着などの常用の方法によって実施することができる。または、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して、該タンパク質を支持体に結合させてもよい。さらに、アビジンとビオチンの組み合わせなどの、相互作用する分子を利用して、支持体とタンパク質との結合を実施することもできる。
【０１８９】
タンパク質間の結合は、緩衝液がタンパク質間の結合を阻害しない限り、該緩衝液中で、例えば、これらに限定されないがリン酸緩衝液およびＴｒｉｓ緩衝液中で行われる。
【０１９０】
本発明において、表面プラズモン共鳴現象を利用するバイオセンサーを、結合したタンパク質の検出または定量のための手段として用いることができる。このようなバイオセンサーを用いる場合、標識を行うことなく、ごく微量のポリペプチドのみを用いて、タンパク質間の相互作用を表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅなどのバイオセンサーを用いることで、Ｃ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の間の結合を評価することができる。
【０１９１】
または、Ｃ２ｏｒｆ１８またはＡＮＴ２のいずれかを標識してもよく、結合したタンパク質の標識を用いて、該結合したタンパク質の検出または測定を行うことができる。具体的には、タンパク質の一方をあらかじめ標識した後に、標識した該タンパク質を試験薬剤または試験化合物の存在下でもう一方のタンパク質と接触させ、次に、洗浄後、結合したタンパク質を標識によって検出または測定する。
【０１９２】
本方法におけるタンパク質の標識のために、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ）、蛍光物質（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセイン、テキサスレッド、緑色蛍光タンパク質、およびローダミン）、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、熱量測定標識（例えば、金コロイドまたは着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズ）、およびビオチン／アビジンなどの標識物質を用いることができる。そのような標識の使用を開示している特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号；および同第４，３６６，２４１号が含まれる。しかしながら、本発明はこれらに限定されるわけではなく、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段により検出可能な任意の標識を使用してもよい。
【０１９３】
タンパク質を放射性同位体で標識する場合には、検出または測定を液体シンチレーションによって行うことができる。あるいは、酵素で標識したタンパク質を、色の発生などの基質の酵素的変化を検出するために酵素の基質を添加することにより、吸光光度計を用いて検出または測定することができる。さらに、標識として蛍光物質を使用する場合は、結合したタンパク質を蛍光光度計を用いて検出または測定することができる。
【０１９４】
さらに、本スクリーニング法における結合は、Ｃ２ｏｒｆ１８またはＡＮＴ２に対する抗体を用いて検出または測定することもできる。例えば、支持体上に固定化したＣ２ｏｒｆ１８と試験薬剤または試験化合物およびＡＮＴ２とを接触させた後に、混合物をインキュベートして洗浄し、ＡＮＴ２に対する抗体を用いて検出または測定を行うことができる。あるいは、ＡＮＴ２を支持体上に固定化してもよく、Ｃ２ｏｒｆ１８に対する抗体を、上記抗体として使用してもよい。
【０１９５】
本スクリーニングにおいて抗体を用いる場合には、抗体を上記の標識物質のいずれかで標識し、該標識物質に基づいて検出または測定することが好ましい。または、標識物質で標識された二次抗体によって検出される一次抗体として、Ｃ２ｏｒｆ１８またはＡＮＴ２に対する抗体を用いてもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質と結合した抗体は、プロテインＧまたはプロテインＡカラムを用いて検出または測定することもできる。
【０１９６】
あるいは、本発明の同定法の別の態様において、細胞を利用する２−ハイブリッド系を用いることもできる（「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ２−ハイブリッド系」、「哺乳動物ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  ２−ハイブリッドアッセイキット」、「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  １−ハイブリッド系」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）；「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  ２−ハイブリッドベクター系」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；参考文献”Dalton and Treisman, Cell 1992, 68:597-612”、”Fields and Sternglanz, Trends Genet 1994, 10:286-92”）。２−ハイブリッド系において、例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８をＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域と融合させて、酵母細胞内で発現させる。ＡＮＴ２を、ＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域と融合させて、同様に、試験薬剤または試験化合物の存在下において酵母細胞内で発現させる。あるいは、ＡＮＴ２をＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域と融合させ、Ｃ２ｏｒｆ１８をＶＰ１６またはＧＡＬ４の転写活性化領域と融合させてもよい。試験薬剤または試験化合物がＣ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の間の結合を阻害しない場合、両者の結合によってレポーター遺伝子が活性化され、陽性クローンが検出可能になる。レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子に加えて、例えばＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを使用することができる。
【０１９７】
本明細書において、Ｃ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の間の結合レベルは、Ｃ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２との結合の後に起きる任意の変化としても測定可能である。具体的には、試験薬剤または試験化合物とＣ２ｏｒｆ１８およびＡＮＴ２を発現する細胞、例えばＪ８２細胞またはＵＭＵＣ細胞との接触によって、そのようなスクリーニングを実施することができる。例えば、試験薬剤または試験化合物がＣ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の結合に与える影響を判定するために、細胞増殖の抑制を検出してもよい。
【０１９８】
１．競合アッセイ形式
本発明の試験薬剤または試験化合物をスクリーニングするために競合アッセイを用いることができる。例として、競合ＥＬＩＳＡ形式は、固体支持体に結合したＣ２ｏｒｆ１８（またはＡＮＴ２）を含みうる。結合したＣ２ｏｒｆ１８（またはＡＮＴ２）を、ＡＮＴ２（またはＣ２ｏｒｆ１８）および試験薬剤または試験化合物と共にインキュベートする。試験薬剤もしくは試験化合物および／またはＡＮＴ２（またはＣ２ｏｒｆ１８）をＣ２ｏｒｆ１８（またはＡＮＴ２）に結合させるのに十分な時間の後、基質を洗浄して、結合していない物質を除く。次に、Ｃ２ｏｒｆ１８に結合したＡＮＴ２の量を測定する。これは、当技術分野で公知の様々な方法のいずれかにより、例えば、検出可能な標識でタグ付されたＡＮＴ２（またはＣ２ｏｒｆ１８）種を用いることによって、あるいは洗浄した基質をＡＮＴ２（またはＣ２ｏｒｆ１８）に対する標識抗体と接触させることによって、遂行されうる。Ｃ２ｏｒｆ１８（またはＡＮＴ２）に結合したＡＮＴ２（またはＣ２ｏｒｆ１８）の量は、試験薬剤または試験化合物がＡＮＴ２に対するＣ２ｏｒｆ１８の会合を妨害する能力に反比例するであろう。抗体および標識を含む標準法は、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988)に記載されている。
【０１９９】
ある変法では、Ｃ２ｏｒｆ１８（またはＡＮＴ２）をアフィニティータグで標識する。標識したＣ２ｏｒｆ１８（またはＡＮＴ２）を次に、ＡＮＴ２（またはＣ２ｏｒｆ１８）および試験薬剤または試験化合物と共にインキュベートした後、免疫沈降させる。次に免疫沈降物をＡＮＴ２（またはＣ２ｏｒｆ１８）に対する抗体を用いたウェスタンブロットに供する。前述の競合アッセイ形式と同様、Ｃ２ｏｒｆ１８（またはＡＮＴ２）と会合することが見出されたＡＮＴ２（またはＣ２ｏｒｆ１８）の量は、試験薬剤または試験化合物がＣ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の会合を妨害する能力と反比例する。
【０２００】
２．非競合アッセイ形式
非競合的結合アッセイも、本明細書に記載したものなどの競合アッセイを用いるスクリーニングを容易に適用できない形式で構築された試験薬剤または試験化合物のライブラリーに対する初期スクリーニングとして、有用性が見出されうる。そのようなライブラリーの一例としては、ファージディスプレイライブラリーが挙げられる（例えば、Barrett et al., Anal Biochem 1992, 204: 357-64を参照されたい）。
【０２０１】
ファージライブラリーは、数多くの異なる組換えペプチドの作業量（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｑｕａｎｔｉｔｙ）を迅速に産生できる点において有用性が見出される。ファージライブラリーはそれ自体は本発明の競合アッセイに向いてはいないが、試験薬剤または試験化合物としてどの組換えペプチドがＣ２ｏｒｆ１８またはＡＮＴ２に結合するかを判定するための非競合形式で効率的にスクリーニングすることができる。次に、非競合形式で同定された試験薬剤または試験化合物を、当技術分野で周知の任意の方法によって産生することができ、競合アッセイ形式を用いてさらにスクリーニングすることができる。ファージディスプレイライブラリーおよび細胞ディスプレイライブラリーの産生およびスクリーニングは当技術分野において周知であり、例えば、Ladner et al., 国際公開公報第８８／０６６３０号；Fuchs et al., Biotechnology 1991, 9: 1369-72；Goward et al., TIBS 1993, 18: 136-40；Charbit et al., EMBO J 1986, 5: 3029-37；Cull et al., PNAS USA 1992, 89: 1865-9；Cwirla et al., PNAS USA 1990, 87: 6378-82において考察されている。
【０２０２】
例示的な非競合アッセイは、競合アッセイに関して記載した手順と類似の手順に従うが、ただし、成分の一方（Ｃ２ｏｒｆ１８またはＡＮＴ２）の添加を行わない。しかしながら、非競合形式ではＣ２ｏｒｆ１８またはＡＮＴ２に結合する試験薬剤または試験化合物を決定するので、試験薬剤または試験化合物がＣ２ｏｒｆ１８およびＡＮＴ２の両方に結合できる能力を各候補について測定する必要がある。したがって、例として、結合していない試験薬剤または試験化合物を洗い流し、結合した試験薬剤または試験化合物を支持体から溶出させ、次に、例えば質量分析、タンパク質測定（ＢｒａｄｆｏｒｄもしくはＬｏｗｒｙアッセイ法、または２８０ｎｍの吸光度測定）によって溶出物を解析することによって、固定化されたＣ２ｏｒｆ１８への試験薬剤または試験化合物の結合を測定してもよい。または、溶出段階を省いて、支持体表面での有機層の分光学的特性の変化をモニターすることによって試験薬剤または試験化合物の結合を測定してもよい。表面の分光学的特性をモニターするための方法としては以下のものが含まれるが、これらに限定されない：吸光度、反射率、透過率、複屈折、屈折率、回折、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共鳴ミラー法、回折格子結合導波路（ｇｒａｔｉｎｇ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗａｖｅｇｕｉｄｅ）技術、および多極共鳴分光法（これらは全て当業者に公知である）。溶出段階の必要性を除くために、標識された試験薬剤または試験化合物をアッセイにおいて使用してもよい。この場合、結合していない物質を洗い流した後に支持体に結合している標識の量が、試験薬剤または試験化合物の結合に比例する。
【０２０３】
いくつかの周知のロボットシステムが液相化学用に開発されている。これらのシステムには、武田薬品工業株式会社（大阪、日本）によって開発された自動合成器のような自動ワークステーション、および、ロボットアームを利用する多くのロボットシステム（Ｚｙｍａｔｅ  ＩＩ，  Ｚｙｍａｒｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，  Ｍａｓｓ．；Ｏｒｃａ，  Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆ．）が含まれ、これらは、化学者によって行われる手動の合成操作を模倣している。上記装置はいずれも、本発明と共に使用するのに適している。本明細書において述べられているように操作することができるようなこれらの装置に対する修飾の種類および実施（もしあれば）は、関連技術分野の当業者には明らかであろう。さらに、数多くのコンビナトリアルライブラリーは、それら自体を商業的に入手することが可能である（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．，  Ａｓｉｎｅｘ，  Ｍｏｓｃｏｗ，  Ｒｕ，  Ｔｒｉｐｏｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＣｈｅｍＳｔａｒ，  Ｌｔｄ，  Ｍｏｓｃｏｗ，  ＲＵ，  ３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｅｘｔｏｎ，  ＰＡ，  Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，  ＭＤ等を参照されたい）。
【０２０４】
本発明の一局面によると、本スクリーニング法に必要な構成要素は、Ｃ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の間の結合を阻害する薬剤または化合物をスクリーニングするためのキット、あるいは膵臓癌細胞の増殖を抑制する薬剤または化合物をスクリーニングするためのキット、あるいは膵臓癌を治療または予防するための薬剤または化合物をスクリーニングするためのキットとして提供されうる。上記キットには、例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドもしくはその機能的に等価な断片および／またはＡＮＴ２ポリペプチドもしくはその機能的に等価な断片が含まれうる。さらに上記キットには、対照試薬（陽性および／または陰性）、検出可能な標識、反応緩衝液、細胞培養培地、スクリーニングに必要な容器、上記方法を実施するための説明書（例えば書面、カセットテープ、ＶＣＲ、ＣＤ−ＲＯＭなど）などが含まれうる。成分および試薬は、別々の容器内に包装されていてもよい。
【０２０５】
ＩＩＩ．ヌクレオチドベースのスクリーニング法
ＩＩＩ−１．Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を用いたスクリーニング法
上記に詳細に考察したように、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを制御することによって、細胞増殖またはＣ２ｏｒｆ１８関連疾患の発症および進行を制御することができる。したがって、細胞増殖の阻害またはＣ２ｏｒｆ１８関連疾患の治療もしくは予防において使用され得る候補薬剤または候補化合物は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを指標として使用するスクリーニングによって同定することができる。本発明の文脈において、このようなスクリーニングは、例えば、以下の段階を含み得る：
ａ）試験薬剤または試験化合物を、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
ｂ）Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
ｃ）試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比べて、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを低下させる試験薬剤または試験化合物を選択する段階。
【０２０６】
本発明によると、細胞増殖の阻害における試験薬剤もしくは試験化合物の治療的効果、またはＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療もしくは予防するための候補薬剤もしくは候補化合物の治療的効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、癌細胞の増殖を抑制する候補薬剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、およびＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療または予防するための候補薬剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
【０２０７】
本発明の文脈において、このようなスクリーニングは、例えば、以下の段階を含み得る：
ａ）試験薬剤または試験化合物を、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する細胞と接触させる段階；
ｂ）Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
ｃ）ｂ）の発現レベルと試験薬剤または試験化合物の治療的効果との相互関係を明らかにする段階。
【０２０８】
本発明において、治療的効果は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルと相関関係があり得る。例えば、試験薬剤または試験化合物が、該試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比べて、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを低下させる場合、該試験薬剤または試験化合物は、治療的効果を有する候補薬剤または候補化合物として同定または選択され得る。あるいは、試験薬剤または試験化合物が、該試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比べて、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを低下させない場合、該試験薬剤または試験化合物は、有意な治療的効果を有さない薬剤または化合物として同定され得る。
【０２０９】
より具体的には、前記発現レベルを、以下からなる群より選択される方法によって検出することができる：
（ａ）Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的等価物をコードするｍＲＮＡの量の検出；
（ｂ）Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的等価物の量の検出；および
（ｃ）Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性の検出。
好ましくは、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドを発現する細胞の細胞増殖活性は、前記生物学的活性として検出され得る。
【０２１０】
本発明において、癌細胞、例えば、膵臓癌細胞、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞などの細胞は、Ｃ２ｏｒｆ１８の過剰発現を特徴とする。癌、例えば膵臓癌、具体的には膵管腺癌（ＰＤＡＣ）などのＣ２ｏｒｆ１８関連疾患は、Ｃ２ｏｒｆ１８の過剰発現を特徴とする。Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現を阻害する薬剤または化合物は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する細胞を試験薬剤または試験化合物と接触させ、次いでＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを測定することによって同定することができる。当然、同定は、単一の細胞の代わりに、該遺伝子を発現する細胞集団を用いて実施することもできる。試験薬剤または試験化合物の非存在下での発現レベルと比べて、該試験薬剤または試験化合物の存在下で検出される発現レベルが低下しているならば、該試験薬剤または試験化合物はＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の阻害因子であることが示され、このことは、該試験薬剤または試験化合物が癌を阻害するのに有用であり、したがって癌の治療または予防用に使用される候補薬剤または候補化合物となる可能性を示唆するものである。
【０２１１】
遺伝子の発現レベルは、当業者に周知の方法によって推定することができる。Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルは、例えば、「実施例」で説明する方法で測定することができる。
【０２１２】
このような同定のために使用される細胞または細胞集団は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する限り、任意の細胞または任意の細胞集団でよい。例えば、細胞または細胞集団は、ある組織に由来する上皮細胞でもよく、またはそれを含んでよい。あるいは、細胞または細胞集団は、癌細胞に由来する不死化細胞（膵臓癌、例えば、ＰＤＡＣに由来する不死化細胞を含む）でもよく、またはそれを含んでもよい。Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する細胞には、例えば、癌から樹立された細胞株（例えばＭＩＡ−ＰａＣＡ２）が含まれる。さらに、細胞または細胞集団は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子をトランスフェクトした細胞でもよく、またはそれを含んでもよい。
【０２１３】
本発明の方法は、様々な薬剤または化合物のスクリーニングを可能にし、かつ、アンチセンスＲＮＡおよびｓｉＲＮＡなどを含む機能的核酸分子を同定するのに特に適している。
【０２１４】
ＩＩＩ−２．Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の転写調節領域を用いたスクリーニング法
別の局面によると、本発明は、以下の段階を含む方法を提供する：
ａ）試験薬剤または試験化合物を、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とから構成されるベクターが導入された細胞と接触させる段階；
ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階；および
ｃ）該試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比べて、該レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる試験薬剤または試験化合物を選択する段階。
【０２１５】
本発明によると、細胞増殖の阻害に対する試験薬剤もしくは試験化合物の治療的効果、またはＣ２ｏｒｆ１８関連疾患の治療もしくは予防に関する候補薬剤もしくは候補化合物の治療的効果を評価することができる。したがって、本発明はまた、癌細胞の増殖を抑制する候補薬剤または候補化合物をスクリーニングするための方法、およびＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療または予防するための候補薬剤または候補化合物をスクリーニングするための方法も提供する。
【０２１６】
本発明の文脈において、このようなスクリーニングは、例えば、以下の段階を含み得る：
別の局面によると、本発明は、以下の段階を含む方法を提供する：
ａ）試験薬剤または試験化合物を、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の転写調節領域と該転写調節領域の制御下で発現するレポーター遺伝子とから構成されるベクターが導入された細胞と接触させる段階；
ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を検出する段階；および
ｃ）ｂ）の発現レベルと試験薬剤または試験化合物の治療的効果との相互関係を明らかにする段階。
【０２１７】
本発明において、治療的効果は、前記レポーター遺伝子の発現または活性と相関関係があり得る。例えば、試験薬剤または試験化合物が、該試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比べて、前記レポーター遺伝子の発現または活性を低下させる場合、該試験薬剤または試験化合物は、治療的効果を有する候補薬剤または候補化合物として同定または選択され得る。あるいは、試験薬剤または試験化合物が、試験薬剤または試験化合物の非存在下で検出されるレベルと比べて、前記レポーター遺伝子の発現も活性も低下させない場合、該試験薬剤または試験化合物は、有意な治療的効果を有さない薬剤または化合物として同定され得る。
【０２１８】
適切なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野において周知である。スクリーニングのために必要なレポーター構築物は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいてゲノムライブラリーから転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントとして得ることができる、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の転写調節領域を用いて調製することができる。
【０２１９】
転写調節領域は、例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子のプロモーター配列でよい。スクリーニングのために必要なレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の転写調節領域に連結することによって調製することができる。本明細書におけるＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の転写調節領域は、開始コドンから少なくとも５００ｂｐ上流、好ましくは１０００ｂｐ、より好ましくは５０００または１００００ｂｐ上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離でき、またはＰＣＲによって増やすこともできる。転写調節領域を同定するための方法、およびまたアッセイ法プロトコールは周知である（Molecular Cloning 第３版 １７章 2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press）。前記レポーター構築物を含むベクターを宿主細胞に感染させ、レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を当技術分野において周知の方法によって（例えば、ルミノメーター、吸光光度計、フローサイトメーターなどを用いて）検出する。本明細書において定義する「発現レベルまたは活性を低下させる」とは、化合物の非存在下と比べた、レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性の好ましくは少なくとも１０％の低下、より好ましくは少なくとも２５％、５０％、または７５％の低下、および最も好ましくは少なくとも９５％の低下である。
【０２２０】
Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の調節配列（例えばプロモーター配列）に機能的に連結させたレポーター遺伝子をトランスフェクトした細胞を使用する場合、レポーター遺伝子産物の発現レベルを検出することにより、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現を阻害しているまたは増大させているとして試験薬剤または試験化合物を同定することができる。
レポーター遺伝子としては、例えば、当技術分野で周知であるＡｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびＨＩＳ３遺伝子などを使用することができる。これらの遺伝子の発現を検出するための方法は、当技術分野において周知である。
【０２２１】
ＩＩＩ−３．個々の個体に適した治療的薬剤または治療的化合物の選択
個体の遺伝子構成の差異が原因で、様々な薬物を代謝する相対的な能力が異なる場合がある。対象中で代謝されて抗腫瘍薬剤または抗腫瘍化合物として作用する薬剤または化合物は、癌性状態に特徴的なものから非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへと、対象の細胞における遺伝子発現パターンを変化誘導することによって、その効果を現すことができる。したがって、本明細書において開示される癌細胞および非癌細胞の間で差次的に発現するＣ２ｏｒｆ１８遺伝子によって、癌の推定上の治療的または予防的な阻害因子を、選択された対象由来の試験細胞集団において試験し、該薬剤または化合物が対象において癌の適切な阻害物質であるかどうかを判定することが可能になる。
【０２２２】
特定の対象にとって適切な癌の阻害物質を同定するために、対象由来の試験細胞集団を治療的薬剤または治療的化合物の候補に曝露させ、そしてＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現を測定する。本発明の方法の文脈において、試験細胞集団は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌細胞を含む。好ましくは、試験細胞は上皮細胞である。
【０２２３】
具体的には、試験細胞集団を、治療的薬剤または治療的化合物の候補の存在下でインキュベートしてよく、かつ、試験細胞集団におけるＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルを測定し、１種または複数種の参照プロファイル、例えば、癌性の参照発現プロファイル、非癌性の参照発現プロファイル、または治療的薬剤と治療的化合物の非存在下での参照発現プロファイルと比較することができる。
【０２２４】
治療的薬剤または治療的化合物と接触させた試験細胞集団におけるＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現レベルが、癌細胞を含む参照細胞集団あるいは該薬剤または化合物の非存在下での参照細胞集団と比べて低下している場合、該治療的薬剤または治療的化合物が、該試験細胞集団が由来する対象において治療能力を有することが示唆される。
【０２２５】
細胞増殖を阻害するため、または癌を治療もしくは予防するための組成物：
本発明のスクリーニング法のいずれかによって同定された薬剤である、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子に対する二本鎖分子およびＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに対する抗体は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現またはＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドの生物学的活性を阻害または抑制し、したがって、細胞増殖を阻害する。したがって、本発明は、細胞増殖を阻害するための組成物、またはＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療もしくは予防するための組成物を提供し、該組成物は、本発明のスクリーニング法のいずれかによって同定された薬剤、例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子に対する二本鎖分子、もしくはＣ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに対する抗体、ペプチド模倣体、化合物、またはそれらの組合せを含む。本発明において、癌細胞、例えば、膵臓癌細胞、具体的には膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞のような細胞は、Ｃ２ｏｒｆ１８の過剰発現を特徴とする。癌、例えば膵臓癌、具体的には膵管腺癌（ＰＤＡＣ）のようなＣ２ｏｒｆ１８関連疾患は、Ｃ２ｏｒｆ１８の過剰発現を特徴とする。本発明の組成物は、癌、具体的には膵臓癌、例えばＰＤＡＣのようなＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療または予防するために使用され得る。
【０２２６】
ヒトならびにその他の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーのための薬物として、本組成物を使用してもよい。
【０２２７】
本発明の文脈において、以下で詳述する本発明の有効成分（スクリーニングされた薬剤、アンチセンス核酸、二本鎖分子、抗体などを含む）に適した薬学的製剤には、経口投与、直腸投与、鼻投与、局所（口腔内および舌下を含む）投与、膣投与、もしくは非経口（筋肉内、皮下、および静脈内を含む）投与に適した製剤、または吸入もしくは吹送による投与に適した製剤が含まれる。静脈内投与が好ましい。製剤は任意で、個別の用量単位に包装される。
【０２２８】
経口投与に適した薬学的製剤には、それぞれが規定量の有効成分を含むカプセル、マイクロカプセル、カシェ剤、および錠剤が含まれる。適切な製剤にはまた、散剤、エリキシル剤、顆粒剤、液剤、懸濁剤、および乳剤も含まれる。有効成分は、ボーラスの舐剤またはペーストとして投与されてもよい。あるいは必要に応じて、薬学的組成物を、水もしくは他の任意の薬学的に許容される液体を含む滅菌液もしくは懸濁液である注射剤の形態で、非経口的に投与することができる。例えば、本発明の有効成分を、薬学的に許容される担体または媒体と共に、具体的には滅菌水、生理食塩液、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、着香料、賦形剤、ビヒクル、保存剤、結合剤などと共に、一般的に許容される投薬実施に必要な単位投与剤形で混合することができる。これらの調製物に含まれる有効成分の量によって、指示範囲内の適した用量が取得可能となる。
【０２２９】
混合して錠剤およびカプセルとすることができる添加剤の例には、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、およびアラビアゴムのような結合剤；結晶セルロースのような賦形剤；コーンスターチ、ゼラチンおよびアルギン酸のような膨張剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、乳糖、またはサッカリンのような甘味料；ならびにペパーミント、アカモノ油、およびチェリーのような着香料が含まれるがそれらに限定されない。錠剤は、任意で１つもしくは複数の製剤用（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎａｌ）成分を用いて、圧縮または成形により作製することができる。圧縮錠剤は、粉末または顆粒などの流動形態の有効成分を、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性剤、または分散剤と混合して、適切な装置内で圧縮することにより調製することができる。湿製錠（ｍｏｌｄｅｄ  ｔａｂｌｅｔ）は、不活性希釈液で湿らせた粉末状化合物の混合物を、適切な装置内で成形することにより作製されうる。錠剤は、当技術分野で周知の方法にしたがって被覆することができる。錠剤は、インビボにおける有効成分の遅延放出または制御放出を提供するように製剤化してもよい。錠剤の包装は、毎月１回服用されるべき１個の錠剤を含んでよい。さらに、単位投与剤形がカプセルである場合、上記成分に加えて油などの液体担体をさらに含めることができる。
【０２３０】
経口流体調製物は例えば、水性もしくは油性の懸濁液、液剤、乳剤、シロップ剤、またはエリキシル剤の形態であってよく、あるいは使用前に水または他の適切な溶剤で再構成するための乾燥製品として提供されてもよい。このような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性溶剤（食用油を含みうる）、または保存剤などの従来の添加剤を含んでもよい。
【０２３１】
非経口投与用製剤には以下が含まれる：抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および、該製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性の滅菌注射液；ならびに、懸濁剤および濃化剤を含んでもよい水性および非水性の滅菌懸濁液。製剤を、単位用量または複数回用量の容器中、例えば密封されたアンプルおよびバイアル中に提供してもよく、かつ、使用直前に担体滅菌液、例えば生理食塩水、注射用水を添加すればよいだけの凍結乾燥条件で貯蔵してもよい。または、製剤を持続注入用に提供してもよい。上述した型の滅菌散剤、顆粒剤、および錠剤から即席の注射液および懸濁液を調製してもよい。
【０２３２】
さらに、注射用滅菌複合体を、注射に適した蒸留水などの溶剤を用いて通常の投薬実施に従って製剤化することができる。生理食塩水、グルコース、ならびに、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、および塩化ナトリウムなどの補助剤を含む他の等張液を、注射用水溶液として用いることができる。これらは、例えば、エタノールのようなアルコール；プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような多価アルコール；ならびに、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（商標）およびＨＣＯ−５０のような非イオン性界面活性剤といった適切な溶解剤と共に用いることができる。
【０２３３】
ゴマ油または大豆油を油脂性液体として用いることができ、これは、溶解剤として安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと組み合わせて用いてもよく、かつ、リン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液などの緩衝剤；塩酸プロカインなどの鎮痛剤；ベンジルアルコールおよびフェノールなどの安定化剤；ならびに／または抗酸化剤と共に製剤化してもよい。調製された注射剤を適切なアンプルに充填してもよい。
【０２３４】
直腸投与用の製剤には、カカオバターやポリエチレングリコールなどの標準的な担体を含む坐剤が含まれる。口腔内、例えば頬側（ｂｕｃｃａｌｌｙ）または舌下での局所投与用の製剤には、ショ糖などの香味基剤およびアラビアゴムまたはトラガカントゴム中に有効成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチン、グリセリン、ショ糖、またはアラビアゴムなどの基剤中に有効成分を含む香錠が含まれる。有効成分を鼻内投与するために、液体噴霧剤、または分散性散剤、または液滴形態を用いることができる。液滴は、１種類もしくは複数の分散剤、可溶化剤、または懸濁剤も含む水性または非水性の基剤を用いて製剤化することができる。
【０２３５】
吸入による投与に関しては、組成物は、インサフレーター、ネブライザー、加圧パック、または他の簡便なエアロゾルスプレー送達手段から都合よく送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭酸ガス、または他の適切なガスなどの適切な噴射剤を含んでもよい。加圧エアロゾルの場合、一定量を送達するためのバルブを設けることによって、用量単位を決定してもよい。
【０２３６】
あるいは、吸入または吹送による投与に関して、組成物は、乾燥粉末組成物、例えば有効成分と乳糖またはデンプンなどの適切な粉末基剤との混合粉体の形態であってもよい。粉末組成物は、例えばカプセル、カートリッジ、ゼラチン、またはブリスター包装中に単位投与剤形で提供されてもよく、そこから、吸入器またはインサフレーターを利用して粉末を投与することができる。
【０２３７】
その他の製剤には、治療的薬剤を放出する、移植可能な装置および粘着性パッチなどが含まれる。
【０２３８】
望ましいならば、有効成分を持続的に放出するように適合化された上記の製剤を用いてもよい。薬学的組成物はまた、抗菌剤、免疫抑制剤、または保存剤などのその他の有効成分を含んでもよい。
【０２３９】
上記で特に言及した成分に加えて、本発明の製剤は、当該製剤の種類を考慮すれば当技術分野では一般的である他の薬剤を含んでもよいことが理解されるべきであり、例えば経口投与に適した製剤は、香味剤を含んでもよい。
【０２４０】
好ましい単位用量製剤は、本発明の有効成分それぞれまたはそれらの適切な画分の有効量（「Ｃ２ｏｒｆ１８関連疾患の治療法」の項において後述される）を含むものである。
【０２４１】
Ｉ．二本鎖分子を含む組成物
本発明は、上述されたまたは上述の本発明のスクリーニング法によって選択された二本鎖分子のいずれかを含む、細胞増殖を妨害するためおよび／またはＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療もしくは予防するための組成物を提供する。本発明の二本鎖分子を、細胞増殖を阻害するためおよびＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を予防または治療するための使用に関して適合化させることができる。
【０２４２】
１つの態様において、本発明の１つまたは複数の二本鎖分子から構成される組成物は、対象に投与するために、送達ビヒクル、例えばリポソーム中に、担体および希釈剤ならびにそれらの塩と共に封入されてよく、かつ／または薬学的に許容される製剤中に存在してもよい。核酸分子を送達するための方法は、Akhtar S & Juliano RL. Trends Cell Biol. 1992 May;2(5):139-44.；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar 1995；Maurer N, et al., Mol Membr Biol. 1999 Jan-Mar;16(1):129-40.；Hofland & Huang. Handb Exp Pharmacol. 1999 137:165-192に記載されている。さらに、核酸分子を送達するための一般的方法も説明されている（米国特許第６，３９５，７１３号および国際公開公報第１９９４０２５９５号）。これらのプロトコールは、実質的に任意の二本鎖分子を送達するために使用され得る。二本鎖分子は、当業者に公知の様々な方法によって細胞に投与することができ、これらの方法には、リポソーム中への封入、イオン導入法、または、他のビヒクル、例えば、生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Gonzalez H, et al., Bioconjug Chem. 1999 Nov-Dec;10(6):1068-74.；国際公開公報第０３／４７５１８号、および国際公開公報第０３／４６１８５号を参照されたい）、乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡマイクロスフェア（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号およびＵＳ２００２１３０４３０を参照されたい）、生分解性ナノカプセル、および生体接着性マイクロスフェア中への組込み、または、タンパク質性ベクター（国際公開公報第２０００５３７２２号）によるものが含まれるがそれらに限定されるわけではない。別の態様において、本発明の二本鎖分子はまた、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、例えば、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）誘導体またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−ｔｒｉ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体と共に製剤化されてもよく、またはそれらとの複合体を形成されてもよい。１つの態様において、本発明の二本鎖分子は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるＵＳ２００３００７７８２９において説明されている（すなわち、脂質ベースの製剤）ように製剤化される。
【０２４３】
本発明の二本鎖分子はまた、全体的な治療的効果を高めるために他の治療化合物と組み合わせて対象に投与してもよい。適応症を治療するために複数の化合物を使用することにより、副作用の存在を低減させつつ有益な効果を増大させることができる。
【０２４４】
別の態様において、本発明はまた、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌を治療または予防する際に使用するための薬学的組成物を製造する際の、本発明の二本鎖分子の使用も提供する。例えば、本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌を治療する際に使用するための薬学的組成物を製造するための、細胞においてＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子の使用に関し、この分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８の配列を標的とする。
【０２４５】
別の態様において、本発明はまた、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌を治療または予防する際に使用するための、本発明の二本鎖核酸分子も提供する。あるいは、本発明はさらに、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌を治療するための薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、該方法またはプロセスは、細胞においてＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子と共に薬学的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含み、該分子は有効成分として、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８の配列を標的とする。
【０２４６】
別の態様において、本発明はまた、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌を治療するための薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスも提供し、該方法またはプロセスは、有効成分を薬学的または生理学的に許容される担体と混合する段階を含み、該有効成分は、細胞においてＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子であり、該分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成するセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８の配列を標的とする。
【０２４７】
ＩＩ．アンチセンス核酸を含む組成物
Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアンチセンス核酸は、癌細胞においてアップレギュレートされている遺伝子の発現レベルを低下させるのに使用され得、かつこれらは細胞増殖の阻害および癌の治療のために有用であり、したがって、これらも本発明に包含される。アンチセンス核酸は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子のヌクレオチド配列もしくはそれに対応するｍＲＮＡに結合し、それによって該遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、ｍＲＮＡの分解を促進し、かつ／または該遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害することによって、作用する。したがって、結果として、アンチセンス核酸は、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質が癌細胞において機能するのを阻害する。本明細書において、「アンチセンス核酸」という語句は、標的配列に特異的にハイブリダイズするヌクレオチドを意味し、かつ、標的配列に完全に相補的なヌクレオチドだけでなく、１つまたは複数のヌクレオチドの不一致を含むヌクレオチドも含む。例えば、本発明のアンチセンス核酸には、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子またはその相補的配列のうち連続した少なくとも１５ヌクレオチドの範囲に渡って、少なくとも７０％またはそれ以上、好ましくは少なくとも８０％またはそれ以上、より好ましくは少なくとも９０％またはそれ以上、さらにより好ましくは少なくとも９５％またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドが含まれる。当技術分野において公知のアルゴリズムを使用して、このような相同性を決定することができる。
【０２４８】
本発明のアンチセンス核酸は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子がコードするタンパク質を産生する細胞に対して、該遺伝子のＤＮＡまたはｍＲＮＡと結合し、それらの転写または翻訳を阻害し、ｍＲＮＡの分解を促進し、かつ該タンパク質の発現を阻害することによって作用し、最終的に該タンパク質の機能を阻害する。
【０２４９】
本発明のアンチセンス核酸を、該核酸に対して不活性である適切な基剤物質と混合することによって、リニメント剤または湿布剤などの外用製剤とすることができる。
【０２５０】
同じく、必要に応じて、賦形剤、等張剤、溶解剤、安定化剤、保存剤、鎮痛剤などを添加することにより、本発明のアンチセンス核酸を、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル、リポソームカプセル、注射剤、液剤、点鼻薬、および凍結乾燥製剤として製剤化することもできる。アンチセンスを含む（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−ｍｏｕｎｔｉｎｇ）媒体を使用することで、持続性および膜透過性を高めることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチン、またはこれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。これらは以下の公知の方法によって調製可能である。
【０２５１】
本発明のアンチセンス核酸は、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質の発現を阻害し、かつこれは、該タンパク質の生物学的活性を抑制するために有用である。さらに、本発明のアンチセンス核酸を含む発現阻害因子は、それらがＣ２ｏｒｆ１８タンパク質の生物学的活性を阻害できるという点において有用である。
【０２５２】
本発明のアンチセンス核酸には、修飾オリゴヌクレオチドが含まれる。例えば、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ抵抗性を付与するためにチオエート化オリゴヌクレオチドを用いることもできる。
【０２５３】
別の態様において、本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌の治療において使用するための薬学的組成物の製造における、本発明のアンチセンス核酸の使用も提供する。
【０２５４】
別の態様において、本発明はまた、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌を治療または予防する際に使用するための、本発明のアンチセンス核酸も提供する。
【０２５５】
あるいは、本発明はさらに、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌を治療するための薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、該方法またはプロセスは、有効成分としての本発明のアンチセンス核酸と共に薬学的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む。
【０２５６】
別の態様において、本発明はまた、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌を治療するための薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、該方法またはプロセスは、有効成分を薬学的または生理学的に許容される担体と混合する段階を含み、該有効成分は、本発明のアンチセンス核酸である。
【０２５７】
ＩＩＩ．抗体を含む組成物
あるいは、癌において過剰発現するＣ２ｏｒｆ１８遺伝子の遺伝子産物の機能を、該遺伝子産物に結合するかまたはそれ以外の方法でその機能を阻害する化合物の投与によって、阻害することができる。そのような化合物として、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに対する抗体を挙げることができ、かつこれを、細胞増殖阻害因子の有効成分またはＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療もしくは予防するための薬学的組成物の有効成分として使用することができる。
【０２５８】
本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子にコードされるタンパク質に対する抗体または該抗体の断片の使用に関する。本明細書で使用する「抗体」という用語は、上述の意味を指す。
【０２５９】
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾してもよい。本発明は、そのような修飾抗体を含む。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することにより得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で一般的である。
【０２６０】
あるいは、本発明のために使用する抗体は、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに対する非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とを有するキメラ抗体、または、非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域で構成されるヒト化抗体であってもよい。そのような抗体は、公知の技術を用いて調製することができる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列の代わりに齧歯類のＣＤＲ配列を用いることによって、行うことができる（例えば、Verhoeyen et al., Science 1988, 239:1534-6を参照されたい）。したがって、このようなヒト化抗体は、無傷のヒト可変ドメインの全長より実質的に短い領域が、非ヒト種由来の対応する配列によって置き換えられたキメラ抗体である。
【０２６１】
また、ヒトのフレームワーク領域および定常領域に加えてヒト可変領域を含む完全ヒト抗体も用いることができる。このような抗体は、当技術分野で公知のさまざまな技術を用いて産生することができる。例えば、インビトロ法には、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用が含まれる（例えば、Hoogenboom et al., J Mol Biol 1992, 227:381-8）。同様に、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているトランスジェニック動物、例えばマウスにヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによって、ヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは例えば、米国特許第６，１５０，５８４号；同第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；および同第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０２６２】
得られた抗体をヒトの身体に投与する場合（抗体治療）は、免疫原性を低下させるためにヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。
【０２６３】
上述のように得られた抗体を、均一になるまで精製してもよい。例えば、抗体の分離および精製は、一般的なタンパク質に対して用いられる分離法および精製法に従って実施することができる。例えば、これらに限定されるわけではないが、アフィニティークロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動など（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)）を適切に選択し組み合わせて用いることにより、抗体を分離および単離することができる。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティーカラムとして使用することができる。使用される例示的なプロテインＡカラムには、例えばＨｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０２６４】
クロマトグラフィーの例には、アフィニティークロマトグラフィー以外に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーなどが含まれる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)）。クロマトグラフィーの手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーによって行うことができる。
【０２６５】
別の態様において、本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌の治療において使用するための薬学的組成物の製造における、本発明の抗体の使用も提供する。
【０２６６】
別の態様において、本発明はまた、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌を治療または予防する際に使用するための、本発明の抗体も提供する。あるいは、本発明はさらに、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌を治療するための薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスを提供し、該方法またはプロセスは、有効成分としての本発明の抗体と共に薬学的または生理学的に許容される担体を製剤化するための段階を含む。
【０２６７】
別の態様において、本発明はまた、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を発現する癌を治療するための薬学的組成物を製造するための方法またはプロセスも提供し、該方法またはプロセスは、有効成分を薬学的または生理学的に許容される担体と混合する段階を含み、該有効成分は本発明の抗体である。
【０２６８】
細胞増殖を阻害する方法：
膵臓癌細胞株においてｓｉＲＮＡによって内因性Ｃ２ｏｒｆ１８をノックダウンすることによりＣ２ｏｒｆ１８を過剰発現する細胞の増殖が大きく抑制され、このことは、該細胞の生存能の維持におけるその不可欠な役割を示唆するものである。したがって、本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８の発現および／またはＣ２ｏｒｆ１８タンパク質の活性を阻害することによる細胞増殖の阻害に関する。Ｃ２ｏｒｆ１８  の発現は、例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を特異的に標的とする二本鎖分子によって阻害される。Ｃ２ｏｒｆ１８標的配列には、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８のヌクレオチドが含まれる。本発明において、癌細胞、例えば、膵臓癌細胞、具体的にはＰＤＡＣ細胞のような細胞は、Ｃ２ｏｒｆ１８の過剰発現を特徴とする。
【０２６９】
これらの調節法は、（例えば、細胞を薬剤とともに培養することにより）エクスビボもしくはインビトロで行うことができ、または（例えば、薬剤を対象に投与することにより）インビボで行うこともできる。本方法は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の異常な発現またはその遺伝子産物の異常な活性を相殺するための処置としての、タンパク質またはタンパク質の組み合わせまたは核酸分子または核酸分子の組み合わせを投与する段階を含む。
【０２７０】
したがって、本発明の文脈において利用されうる薬剤は、例えば以下を含む：  
（ｉ）Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子にコードされるポリペプチド、またはそのアナログ、誘導体、断片もしくはホモログ；
（ｉｉ）Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子もしくは遺伝子産物に対する抗体、またはその断片；
（ｉｉｉ）「機能障害性」（すなわち、過剰発現される遺伝子の核酸内への非相同的挿入によって）である、アンチセンス核酸または核酸；
（ｉｖ）二本鎖分子、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；あるいは
（ｖ）修飾物質（すなわち、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、阻害因子、アンタゴニスト）。
【０２７１】
機能障害性アンチセンス分子は、ポリペプチドの内因性機能を相同組換えによって「ノックアウト」するために利用される（例えば、Capecchi, Science 1989, 244: 1288 92を参照されたい）。
【０２７２】
細胞内のペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、ならびに、ＲＮＡまたはペプチドのレベル、発現されたペプチド（または発現が変化した遺伝子のｍＲＮＡ）の構造および／または活性に関してこれをインビトロで分析することによって、レベルの増大を容易に検出することができる。当技術分野において周知である方法には、免疫測定法（例えば、ウェスタンブロット解析、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学等）、ＲＴ−ＰＣＲ、および／または、ｍＲＮＡの発現を検出するハイブリダイゼーション分析（例えば、ノーザン分析、ドットブロット、インサイチューハイブリダイゼーション等）が含まれるがこれらに限定されない。
【０２７３】
本発明の一局面によると、本方法によってスクリーニングされた薬剤を使用することができる。当業者に周知の方法を用いて、薬剤を投与することができる。上記薬剤がＤＮＡによってコード可能である場合、該ＤＮＡを発現させるためのベクターに該ＤＮＡを挿入し、該ベクターを細胞に投与することができる。二本鎖分子のベクターを細胞内に導入するために、トランスフェクション促進剤を使用することができる。ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光順薬工業）は、トランスフェクション促進剤として有用である。
【０２７４】
Ｃ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療する方法：
Ｃ２ｏｒｆ１８関連疾患の治療、寛解、または予防は、次の段階のいずれかを含む：例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８を過剰発現する細胞の外科的除去、癌細胞の増殖の阻害、腫瘍の退縮または退行、寛解の誘導、癌発病の抑制。Ｃ２ｏｒｆ１８関連疾患の効果的治療により、死亡率が低下し、Ｃ２ｏｒｆ１８関連疾患を有する個体の予後が改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルが低下し、Ｃ２ｏｒｆ１８関連疾患に付随する検出可能な症状が軽減される。
【０２７５】
Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を過剰発現する細胞株においてｓｉＲＮＡによって内因性Ｃ２ｏｒｆ１８をノックダウンすると、該細胞の増殖が大きく抑制されたことから、これらの細胞の生存能を維持する上での不可欠な役割が示唆された。したがって、本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８の発現および／またはＣ２ｏｒｆ１８タンパク質の活性を阻害することによってＣ２ｏｒｆ１８関連疾患を治療または予防することに関する。Ｃ２ｏｒｆ１８の発現は、例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子を特異的に標的とする二本鎖分子によって阻害される。Ｃ２ｏｒｆ１８標的配列には、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７または８のヌクレオチドが含まれる。さらに、Ｃ２ｏｒｆ１８の活性は、抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体またはペプチド模倣体によって阻害される。本発明において、癌、例えば膵臓癌、具体的にはＰＤＡＣのようなＣ２ｏｒｆ１８関連疾患は、Ｃ２ｏｒｆ１８の過剰発現を特徴とする。
【０２７６】
本発明において、阻害性核酸は、裸の核酸として、送達試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）と組み合わせて、または、阻害性核酸を発現する組換えプラスミドベクターまたは組換えウイルスベクターとして、対象に投与することができる。
【０２７７】
本発明の阻害性核酸と組み合わせて投与するために適した送達試薬には、Ｍｉｒｕｓ社のＴｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；もしくはポリカチオン（例えばポリリジン）、またはリポソームが含まれる。好ましい送達試薬はリポソームである。
【０２７８】
リポソームは、網膜組織または腫瘍組織など特定の組織への阻害性核酸の送達を助けることができ、また、阻害性核酸の血中半減期を増大させることができる。本発明で使用するのに適したリポソームは、中性または負に帯電したリン脂質およびステロール、例えばコレステロールを一般に含む、標準的な小胞体形成脂質から形成される。一般に、脂質の選択は、所望のリポソームサイズおよび血流中でのリポソームの半減期などの要素を考慮することによって導かれる。リポソームを調製するための様々な方法が公知であり、例えば、全体の開示が参照により本明細書に組み入れられる、Szoka et al., Ann Rev Biophys Bioeng 1980, 9:467；ならびに米国特許第４，２３５，８７１号；同第４，５０１，７２８号；同第４，８３７，０２８号；および同第５，０１９，３６９号に記載されている。
【０２７９】
好ましくは、本発明の阻害性核酸を封入するリポソームは、該リポソームを癌部位に送達できるリガンド分子を含む。腫瘍細胞によく見られる受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍抗原に結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【０２８０】
特に好ましくは、本発明の阻害性核酸を封入するリポソームは、例えば、構造体の表面にオプソニン作用阻害部分を結合させることによって、単核マクロファージおよび細網内皮系によるクリアランスを回避するように修飾される。１つの態様において、本発明のリポソームは、オプソニン作用阻害部分およびリガンドの両方を含んでよい。
【０２８１】
典型的には、本発明のリポソームを調製する際に使用するためのオプソニン作用阻害部分は、リポソーム膜に結合した大型親水性ポリマーである。本明細書において使用される場合、例えば、脂質可溶性アンカーを膜自体に挿入することにより、または膜脂質の活性基に直接結合することにより、リポソーム膜に化学的または物理的に付着している場合、オプソニン作用阻害部分はリポソーム膜に「結合」している。オプソニン作用を阻害するこれらの親水性ポリマーは、例えば、全体の開示が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，９２０，０１６号に記載されているように、マクロファージ−単球系（「ＭＭＳ」）および細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるリポソームの取込みを有意に減少させる保護的な表面層を形成する。したがって、オプソニン作用阻害部分により修飾されたリポソームは、未修飾のリポソームよりはるかに長い間、血液循環中に残存する。こういう訳で、このようなリポソームは「ステルス」リポソームと呼ばれることがある。
【０２８２】
ステルスリポソームは、多孔性のまたは「漏れやすい」微小血管系によって供給され、組織中に蓄積することが知られている。したがって、このような微小血管系の欠陥を特徴とする標的組織、例えば固形腫瘍はこれらのリポソームを効率的に蓄積すると考えられる；Gabizon et al., Proc Natl Acad Sci USA 1988, 18: 6949-53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる取込みの減少は、肝臓および脾臓中での顕著な蓄積を防止することによって、ステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン作用阻害部分によって修飾された本発明のリポソームは、本発明の阻害性核酸を腫瘍細胞に送達することができる。
【０２８３】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン作用阻害部分は、好ましくは、分子量が約５００〜約４０，０００ダルトン、およびより好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの水溶性ポリマーである。このようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体が含まれ；例えば、メトキシＰＥＧまたはメトキシＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンなどの合成ポリマー；直鎖状、分枝状、またはデンドリマー状（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｉｃ）のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール、例えば、カルボキシル基またはアミノ基が化学的に連結しているポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド、例えば、ガングリオシドＧＭ１が含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、もしくはメトキシＰＰＧの共重合体、またはその誘導体もまた、適している。さらに、オプソニン作用阻害ポリマーは、ＰＥＧとポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロック共重合体でもよい。オプソニン作用阻害ポリマーはまた、アミノ酸またはカルボン酸を含む天然多糖類、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；アミノ化された多糖類もしくはオリゴ糖（直鎖状または分枝状）；またはカルボキシル化された多糖類もしくはオリゴ糖、例えば、カルボン酸誘導体と反応した結果としてカルボキシル基の結合を有するものでもよい。
【０２８４】
好ましくは、オプソニン作用阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることがある。
【０２８５】
オプソニン作用阻害部分は、多数の周知の技術のいずれか一つによってリポソーム膜に結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂質可溶性アンカーに結合させ、次いで膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーを、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物（例えば、３０：１２の比率のテトラヒドロフランおよび水）を用いた６０℃での還元的アミノ化によって、ステアリルアミン脂質可溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０２８６】
本発明の阻害性核酸を発現するベクターは、前述した。本発明の少なくとも１種の阻害性核酸を発現するこのようなベクターはまた、直接、または、Ｍｉｒｕｓ社のＴｒａｎｓｉｔ  ＬＴ１親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例えばポリリジン）、もしくはリポソームを含む適切な送達試薬と組み合わせて、投与することもできる。対象における癌の領域に本発明の阻害性核酸を発現する組換えウイルスベクターを送達するための方法は、当業者の技能の範囲内である。
【０２８７】
本発明の阻害性核酸は、癌部位に阻害性核酸を送達するのに適した任意の手段によって対象に投与することができる。例えば、阻害性核酸は、遺伝子銃、エレクトロポレーション、または他の適切な非経口投与経路もしくは経腸投与経路によって投与することができる。
【０２８８】
適切な経腸投与経路には、経口送達、直腸送達、または鼻腔内送達が含まれる。
【０２８９】
適切な非経口投与経路には、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管系へのカテーテル注入）；組織周辺および組織内への注射（例えば、腫瘍周辺および腫瘍内への注射、網膜内注射、または網膜下注射）；皮下注入を含む皮下注射または皮下デポジション（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルまたは他の配置器具（例えば、網膜ペレット剤もしくは坐剤、または多孔質、非多孔質、もしくはゼラチン質の材料を有するインプラント）による、癌部位領域またはその近傍領域への直接適用；ならびに吸入が含まれる。阻害性核酸またはベクターの注射または注入は癌部位またはその近傍で行うことが好ましい。
【０２９０】
本発明の阻害性核酸は、単回投与または複数回投与で投与することができる。本発明の阻害性核酸の投与を注入によって行う場合、注入は１回の持続投与でもよく、または複数回の注入によって送達してもよい。組織への薬剤の直接注入は、癌部位またはその近傍に行うのが好ましい。癌部位またはその近傍の組織への薬剤の複数回注入が、特に好ましい。
【０２９１】
また、当業者は、所与の対象に本発明の阻害性核酸を投与するための適切な投与計画を容易に決定することができる。例えば、阻害性核酸を対象に、例えば、癌部位またはその近傍への単回の注射またはデポジションとして、１回投与することができる。あるいは、阻害性核酸は、約３日〜約２８日の期間、より好ましくは約７日〜約１０日の期間、毎日１回または２回、対象に投与してもよい。好ましい投与計画において、阻害性核酸は７日間にわたって、１日１回、癌部位またはその近傍に注射される。投与計画が複数回の投与を含む場合、対象に投与される阻害性核酸の有効量は、投与計画全体を通して投与される阻害性核酸の合計量を含み得ることが理解される。
【０２９２】
遺伝子および遺伝子産物の発現レベルまたは生物学的活性それぞれが（疾患または障害に罹患していない対象に対して）増大していることを特徴とする疾患および障害は、過剰発現される遺伝子の活性に拮抗する（すなわち、該活性を低下させるまたは阻害する）治療物質によって治療されうる。活性に拮抗する治療物質は、治療的または予防的に投与することができる。
【０２９３】
したがって、本発明の文脈において利用されうる治療物質は、例えば以下を含む：  
（ｉ）Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子にコードされるポリペプチド、またはそのアナログ、誘導体、断片もしくはホモログ；
（ｉｉ）Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子もしくは遺伝子産物に対する抗体、またはその断片；
（ｉｉｉ）「機能障害性」（すなわち、過剰発現される遺伝子の核酸内への非相同的挿入によって）である、アンチセンス核酸または核酸；
（ｉｖ）二本鎖分子、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；あるいは
（ｖ）修飾物質（すなわち、過剰発現するポリペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、阻害因子、アンタゴニスト）。
【０２９４】
機能障害性アンチセンス分子は、ポリペプチドの内因性機能を相同組換えによって「ノックアウト」するために利用される（例えば、Capecchi, Science 1989, 244: 1288 92を参照されたい）。
【０２９５】
ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、（例えば生検組織から）対象の組織試料を入手し、これを、ＲＮＡまたはペプチドレベル、発現されたペプチド（または発現が変化した遺伝子のｍＲＮＡ）の構造および／または活性に関してインビトロで分析することによって、レベルの増大を容易に検出することができる。当技術分野において周知である方法には、免疫測定法（例えば、ウェスタンブロット解析、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学等）、および／または、ｍＲＮＡの発現を検出するハイブリダイゼーション分析（例えば、ノーザン分析、ドットブロット、インサイチューハイブリダイゼーション等）が含まれるがこれらに限定されない。
【０２９６】
予防的投与は、疾患の顕性の臨床症状が発現する前に、疾患または障害が予防されるかあるいはその進行が遅延されるように実施する。本発明の文脈において、予防とは、疾患に起因する死亡率または罹患率の負荷を減少させる任意の活動である。予防は、第一次、第二次、および第三次の予防レベルで存在し得る。一次予防は疾患の発症を回避するのに対し、二次レベルおよび三次レベルの予防は、疾患の進行および症状の発生を防ぐこと、ならびに、機能を修復しかつ疾患関連の合併症を減少させることにより既に確立された疾患の負の影響を減少させることを狙いとした活動を包含する。したがって、本発明は、癌、例えば膵臓癌、具体的にはＰＤＡＣのようなＣ２ｏｒｆ１８関連疾患の重症度を軽減することを狙いとする幅広い予防的療法を包含する。
【０２９７】
本発明の治療法は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子産物の活性の１つまたは複数を調節する薬剤と細胞とを接触させる段階を含んでもよい。タンパク質活性を調節する薬剤の例には、核酸、タンパク質、このようなタンパク質の天然の同族リガンド、ペプチド、ペプチド模倣体およびその他の低分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９８】
したがって本発明は、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を低下させることにより、対象における癌の症状を治療もしくは軽減するためまたは癌を予防するための方法を提供する。本方法は特に、Ｃ２ｏｒｆ１８関連疾患、例えば癌、例えば膵臓癌、特にＰＤＡＣの治療または予防に適している。
【０２９９】
Ｃ２ｏｒｆ１８関連疾患に罹患しているかまたはその発症リスクを有する（または発症しやすい）対象に対して、適切な治療物質を予防的または治療的に投与することができる。標準的な臨床法を用いることにより、または、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子の異常な発現レベル（「アップレギュレート」または「過剰発現」）もしくは遺伝子産物の異常な活性を検出することにより、そのような対象を同定することができる。
【０３００】
本発明の一局面によると、癌を治療または予防するために、本方法によってスクリーニングされた薬剤を使用することができる。当業者に周知の方法を用いて、例えば動脈内注射、静脈内注射、もしくは経皮注射として、または、鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、もしくは経口投与として、上記薬剤を対象に投与することができる。該薬剤がＤＮＡによりコード可能である場合、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに挿入し、次に、治療を行うために該ベクターを対象に投与することができる。二本鎖分子のベクターを細胞内に導入するために、トランスフェクション促進剤を使用することができる。ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（和光順薬）は、トランスフェクション促進剤として有用である。
【０３０１】
投与量および投与法は、治療対象の患者の体重、年齢、性別、症状、状態、ならびに投与法によって異なる；しかしながら当業者は、適切な投与量および投与法を日常的に選択することができる。
【０３０２】
例えば、Ｃ２ｏｒｆ１８ポリペプチドに結合して該ポリペプチドの活性を調節する薬剤の用量は前述の様々な要素に左右されるが、正常な成人（体重６０  ｋｇ）に経口投与する場合、用量は通常、１日あたり約０．１  ｍｇ〜約１００  ｍｇ、好ましくは１日あたり約１．０  ｍｇ〜約５０  ｍｇ、より好ましくは１日あたり約１．０  ｍｇ〜約２０  ｍｇである。
【０３０３】
正常な成人（体重６０  ｋｇ）に薬剤を注射剤形で非経口投与する場合、患者、標的器官、症状、および投与法によって多少の差はあるが、１日あたり約０．０１  ｍｇ〜約３０  ｍｇ、好ましくは１日あたり約０．１〜約２０  ｍｇ、より好ましくは１日あたり約０．１〜約１０  ｍｇの用量を静脈内注射することが好都合である。他の動物の場合、適切な投与量は、体重６０  ｋｇに変換することにより日常的に算出可能である。
【０３０４】
同様に、本発明の薬学的組成物を癌の治療または予防のために使用することができる。当業者に周知の方法を用いて、例えば動脈内注射、静脈内注射、もしくは経皮注射として、または、鼻腔内投与、経気管支投与、筋肉内投与、もしくは経口投与として、本組成物を患者に投与することができる。
【０３０５】
上記の条件のそれぞれに関して、組成物、例えばポリペプチドおよび有機化合物は、約０．１〜約２５０  ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲で経口的にまたは注射によって投与可能である。成人の用量範囲は通常、１日あたり約５  ｍｇ〜約１７．５  ｇであり、好ましくは１日あたり約５  ｍｇ〜約１０  ｇであり、最も好ましくは１日あたり約１００  ｍｇ〜約３  ｇである。個別の単位で提供される錠剤または他の単位投与剤形は、便宜上、その投与量でまたはその複数回投与量として有効である量、例えば約５  ｍｇ〜約５００  ｍｇ、通常は約１００  ｍｇ〜約５００  ｍｇを含む単位量を含む。
【０３０６】
使用される用量は、対象の年齢、体重、および性別、治療される正確な疾患、およびその重篤度を含むいくつかの要素に左右される。投与経路もまた、状態およびその重篤度によって変化しうる。いずれにしても、適切かつ最適な投与量は、上述の要素を考慮した上で、当業者により日常的に算出可能である。
【０３０７】
特に、Ｃ２ｏｒｆ１８遺伝子に対するアンチセンス核酸は、病的状態の部位に直接適用することによって、または病気部位に達するように血管内に注射することによって、患者に投与することができる。
【０３０８】
本発明のアンチセンス核酸誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適切に調節でき、かつ所望の量で使用することができる。例えば０．１〜１００  ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０  ｍｇ／ｋｇの用量範囲で投与することができる。
【０３０９】
発明の様式１
以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、以下の材料、方法、および実施例は、本発明の局面を単に例示するものであって、本発明の範囲を限定する意図は全くない。したがって、本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験において用いることができる。
【０３１０】
一般的方法
１．細胞株および臨床試料
ＰＤＡＣ細胞株であるＭＩＡ−ＰａＣａ２およびＰａｎｃ−１、ならびにＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、およびＣＯＳ７細胞をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入した。ＰＤＡＣ細胞株であるＫＬＭ−１、ＰＫ−５９、ＰＫ−４５Ｐ、ＳＵＩＴ−２、およびＰＫ−１は、医用細胞資源センター、東北大学（仙台、日本）によって提供された。細胞株はすべて、Ｐａｎｃ−１、ＫＬＭ−１、ＰＫ−５９、ＰＫ−４５Ｐ、ＳＵＩＴ−２、およびＰＫ−１については  ＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中で、ＣＯＳ−７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ−２９３、およびＭＩＡ−ＰａＣａ２についてはダルベッコ改変イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させた。細胞株はすべて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１％抗生物質／抗真菌液を添加した適切な培地中で単層に増殖させ、５％ＣＯ２を含む大気中、３７℃で維持した。凍結しパラフィン包埋したＰＤＡＣ組織を、適切なインフォームドコンセントのもとに大阪府立成人病センターで切除された外科的標本から得た。これらの臨床試料を用いたこの研究は、東京大学医科学研究所および大阪府立成人病センターのＩＲＢによって承認された。
【０３１１】
２．半定量ＲＴ−ＰＣＲ
膵臓癌組織からのＰＤＡＣ細胞および正常管上皮細胞の精製は、以前に記載された（Nakamura T, et al. Oncogene. 2004 Mar 25;23(13):2385-400）。精製したＰＤＡＣ細胞および正常膵管上皮細胞に由来するＲＮＡを、Ｔ７に基づくインビトロ転写を用いた２ラウンドのＲＮＡ増幅（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）に供し、一本鎖ｃＤＮＡへと合成した。製造元推奨の手順にしたがってＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ヒト膵臓癌細胞株由来の全ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で処理し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて逆転写して、一本鎖ｃＤＮＡとした。定量用対照としてα−チューブリン（ＴＵＢＡ）をモニターすることにより、その後のＰＣＲ増幅のための各一本鎖ｃＤＮＡの適切な希釈物を調製した。以下のプライマー配列を使用した：  
ＴＵＢＡについては
５’−ＡＡＧＧＡＴＴＡＴＧＡＧＧＡＧＧＴＴＧＧＴＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １）および
５’−ＣＴＴＧＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＡＡＡＧＣＡＴＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２）、
Ｃ２ｏｒｆ１８（ＮＭ＿０１７８７７）については
５’−ＧＧＴＡＧＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＡＡＣＡＣＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）および
５’−ＧＴＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）。
【０３１２】
すべての反応には、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ，  ＣＡ）において、９４℃で２分間の初期変性の後に、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を２３サイクル（ＴＵＢＡの場合）または２８サイクル（Ｃ２ｏｒｆ１８の場合）を含めた。
【０３１３】
３．ノーザンブロット分析
抽出した全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて膵臓癌細胞株１４種から抽出したものであり、ノーザンブロット解析を実施した。ＤＮａｓｅ  Ｉ（ニッポンジーン）による処理の後に、製造元のプロトコールに従ってｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を用いて、ｍＲＮＡを精製した。膵臓癌細胞株由来のｍＲＮＡならびに正常ヒト成人の心臓、肺、肝臓、腎臓、骨髄、および膵臓より単離した各ｍＲＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）の１μｇアリコートを、１％変性アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に転写した。この癌の膜およびＨｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｂｌｏｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を、Ｍｅｇａ  Ｌａｂｅｌ  ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて標識した３２Ｐ標識Ｃ２ｏｒｆ１８  ｃＤＮＡと共に１６時間ハイブリダイズさせた。Ｃ２ｏｒｆ１８  ｃＤＮＡの２３２ｂｐのＰＣＲ産物を、プライマー
５’−ＧＧＴＡＧＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＡＡＡＣＡＣＣＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）および
５’−ＧＴＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＴＧＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）
を用いてプローブとして調製した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は製造元の説明書に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーを−８０℃で１０日間行った。
【０３１４】
４．Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質に特異的な抗体の産生および免疫組織化学的染色
Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０６０３４７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２）のコドン７０〜８６およびコドン３５１〜３７１にわたる領域にそれぞれ対応する２種のペプチド（ＣＲＡＡＧＱＳＤＳＳＶＤＰＱＱＰＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）およびＡＥＥＳＥＱＥＲＬＬＧＧＴＲＴＰＩＮＤＡＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６））はシグマアルドリッチジャパン（石狩、日本）によって作製され、これらの混合物でウサギ２匹を免疫化した。基本的な方法論に従って、各ペプチド抗原を結合したＡｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０活性化親和性媒体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を充填したアフィニティーカラムを用いて免疫血清を精製した。ＰＤＡＣに由来する通常の組織切片は、適切なインフォームドコンセントのもとに大阪府立成人病センターで切除された外科的標本から得た。これらの切片を脱パラフィンし、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間、１０８℃でオートクレーブした。Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，  Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，  ＣＡ）中で３０分間インキュベートすることによって、内因性ペルオキシダーゼの活性を停止させた。ブロッキングのためにウシ胎児血清と共にインキュベートした後、これらの切片をウサギ抗Ｃ２ｏｒｆ１８ポリクローナル抗体（希釈率１：１５００）と共に室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ免疫グロブリン（Ｅｎｖｉｓｉｏｎキット、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて免疫検出を実施した。最後に、３，３’−ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いてこれらの反応物を発色させた。対比染色は、ヘマトキシリンを用いて実施した。
【０３１５】
５．Ｃ２ｏｒｆ１８に特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）発現構築物
以前に説明されているように（Taniuchi K, et al. Cancer Res.2005 Jan 1;65(1):105-12.）、ＰＤＡＣ細胞における内因性Ｃ２ｏｒｆ１８発現をダウンレギュレートするために、ｐｓｉＵ６ＢＸ３．０ベクターは、標的遺伝子に対するショートヘアピンＲＮＡを発現させることを目的とした。終結シグナルとしての５個のチミジンおよびＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による選択のためのｎｅｏカセットと共に、遺伝子特異的配列（標的転写物に由来し、短いスペーサーＴＴＣＡＡＧＡＧＡによって同じ配列の逆相補体から隔てられた１９ｎｔの配列）の上流にＵ６プロモーターをクローニングした。Ｃ２ｏｒｆ１８の標的配列は、５’−ＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）（１９６番）、５’−ＧＣＡＣＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＡＣＡＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）（５７４番）、および５’−ＧＴＧＡＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＡＴＧＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９）（３２５４番）であり、陰性対照の標的配列は、５’−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）（ｓｉＥＧＦＰ）であった。ヒトＰＤＡＣ細胞株、ＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞、およびＰａｎｃ−１細胞を１０ｃｍディッシュに播種し、製造業者の取扱い説明書に従ってＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、１９６番、５７４番、３２５４番、またはｓｉＥＧＦＰの各ｓｉＲＮＡ発現ベクターをトランスフェクトした。０．８ｍｇ／ｍｌ（ＭＩＡ−Ｐａｃａ２の場合）または１．０ｍｇ／ｍｌ（Ｐａｎｃ−１の場合）のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって細胞を選択した。トランスフェクションの７日後に細胞を回収して、前述のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって、Ｃ２ｏｒｆ１８に対するノックダウン効果を解析した。Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを含む適切な培地中で９日間培養した後、１００％メタノールで細胞を固定し、コロニー形成アッセイ法のために０．１％クリスタルバイオレット−Ｈ２０で染色した。
【０３１６】
３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ法において、トランスフェクションの１１日後にＣｅｌｌ−ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同仁化学研究所、熊本、日本）を用いて細胞の生存率を測定した。４９０ｎｍおよび参照として６３０ｎｍでの吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  ５５０（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で測定した。ｓｉＲＮＡの配列
【０３１７】
【表１】
2011518541.tif 000002
【０３１８】
６．免疫細胞化学的解析
製造業者の推奨する手順に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００またはＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって、前述のｓｉＣ２ｏｒｆ１８（１９６番、５７４番）またはｓｉＥＧＦＰに対応するＲＮＡ二重鎖でＰａｎｃ−１細胞を処理し、ｓｉＲＮＡ処理の７２時間後に、２００ｎＭ  ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培養培地に３０分間添加し、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、かつ室温で１分間、ＰＢＳ中０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。室温で３０分間、３％ＢＳＡ含有ＰＢＳで処理することによって、非特異的結合をブロックした。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で希釈した（１：１０００）ウサギ抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体と共に室温で６０分間、細胞をインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、室温で６０分間、ＦＩＴＣを結合させた二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）によって細胞を染色した。ＰＢＳで洗浄した後、４’，６’−ジアミジン−２’−フェニルインドレンジヒドロクロリド（ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅｎｄｉｈｙｄｒｏｃｈｒｏｌｉｄｅ）（ＤＡＰＩ）を含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（ＶＥＣＴＯＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）を用いて標本をマウントし、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｅｉｃａ，  Ｂｅｎｓｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて可視化した。
【０３１９】
７．細胞分画およびＣ２ｏｒｆ１８タンパク質の位置確認
癌細胞における内因性Ｃ２ｏｒｆ１８の細胞内局在をさらに調査するために、まず初めに、Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）を用いてＰａｎｃ−１細胞の細胞溶解物を分画して核画分から細胞質画分を分離させた。次に、ホモジネート緩衝液［０．２５Ｍショ糖、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］中でＰａｎｃ−１細胞をホモジナイズし、５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間、細胞溶解物を超遠心分離して核および破片を除去した。１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間、上清を超遠心分離して、ミトコンドリア画分を回収した。１７０００ｒｐｍ、４℃で３０分間、上清を再び超遠心分離して、ミクロソーム画分（上清）を他の細胞質成分（沈殿物）から分離させた。各細胞画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、前述の抗Ｃ２ｏｒｆ１８ポリクローナル抗体によって内因性Ｃ２ｏｒｆ１８を検出し、抗ミトフィリン抗体（Ａｂｃａｍ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）によってミトコンドリア画分を特異的に検出した。
【０３２０】
８．Ｃ２ｏｒｆ１８およびＡＮＴ２の発現構築物
ヒトＣ２ｏｒｆ１８（ＮＭ＿０１７８７７）をコードする完全長ｃＤＮＡを、１組のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した；
フォワードプライマー：
５’−ＡＴＴＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＣＣＡＡＧＴＡＣＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２７）および
リバースプライマー：
５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２８）。
【０３２１】
続いて、ｐＣＡＧＧＳベクターのＮｏｔ１部位およびＸｈｏ１部位にｃＤＮＡをクローニングした（ｐＣＡＧＧＳ−Ｃ２ｏｒｆ１８−ＨＡ）。同様に、ヒトＡＮＴ２（ＳＬＣ２５Ａ５とも呼ばれる、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２５、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１１５２）をコードする完全長ｃＤＮＡ断片を、
フォワードプライマー、５’−ＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＣＡＧＡＴＧＣＣＧＣＴＧＴＧＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２９）および
リバースプライマー、５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＴＧＡＴＴＴＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３０）
を用いてＰＣＲ増幅し、ｐＣＡＧＧＳベクターのＮｏｔ１部位およびＸｈｏ１部位にクローニングした（ｐＣＡＧＧＳ−ＡＮＴ２−Ｆｌａｇ）。これらのプラスミドのＤＮＡ配列は、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０３２２】
９．Ｃ２ｏｒｆ１８と相互作用するタンパク質の免疫沈降法および質量分光分析による解析
Ｃ２ｏｒｆ１８と相互作用し得るタンパク質を同定するために、免疫沈降実験を実施した。ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ｐＣＡＧＧＳ−Ｃ２ｏｒｆ１８−ＨＡまたは空のｐＣＡＧＧＳ−ＨＡモックを膵臓癌細胞株ＰＫ−１にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を回収し、溶解緩衝液［５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．４％  ＮＰ−４０、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｓｅｔ  ＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）］中に溶かした。ラットモノクローナル抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ、クローン３Ｆ１０）１７．５μｇと共に４℃で１５分間、全タンパク質をインキュベートした。プロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ）３００μｌと共に免疫複合体を１５分間インキュベートし、溶解緩衝液で洗浄した。共沈殿させたタンパク質を１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で分離させ、銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって染色した。モッククローンをトランスフェクトした細胞における沈降物中には無かったが、Ｃ２ｏｒｆ１８−ＨＡをトランスフェクトしたＰＫ−１細胞において沈降物中に特異的に現れたバンドを、抗ＨＡ抗体と共に切り出し、次いで、トリプシンを用いてゲル中でそれらを消化し、ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（島津製作所、つくば、日本）を用いてペプチド−質量フィンガープリントを解析した。１０ｐｐｍ質量精度でペプチド質量を検索し、データベースフィッティングプログラムＩｎｔｅｌｌｉＭａｒｑｕｅ（島津製作所）を用いてタンパク質データベース検索を実施した。Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質とＡＮＴ２タンパク質との相互作用を確認するために、Ｃ２ｏｒｆ１８−ＨＡ発現ベクターおよび／またはＡＮＴ２−Ｆｌａｇ発現ベクターをＣＯＳ−７細胞中に同時トランスフェクトした。前述のようにして、トランスフェクトした細胞を溶解し、ラット抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ、クローン３Ｆ１０）またはウサギポリクローナル抗Ｆｌａｇ抗体（Ｒｏｃｈｅ、Ｆ−７４２５）を用いて免疫沈降させた。Ｃ２ｏｒｆ１８−ＨＡタンパク質とＡＮＴ−２−Ｆｌａｇタンパク質の相互作用を試験するために、ウサギ抗ＦＬＡＧ抗体またはウサギ抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロット法によってこれらの免疫複合体を解析した。
【０３２３】
１０．ミトコンドリア膜電位の検出
ＡＮＴ２を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖５’−ＧＣＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３１）、Ｃ２ｏｒｆ１８  ｓｉＲＮＡ二重鎖５’−ＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＡＴ−３’（１９６番／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）、またはｓｉＥＧＦＰ二重鎖５’−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’（対照として／ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）をＫＬＭ−１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を回収し、前述した抗Ｃ２ｏｒｆ１８ポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット解析によって、Ｃ２ｏｒｆ１８を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のノックダウン効果を確認した。回収した細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＰＢＳに溶かした１０μＭ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３（和光順薬工業、大阪、日本）と共に暗所条件、３７℃で１５分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含むＦＡＣＳ緩衝液０．５ｍｌ中に再懸濁した。Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３（Ｒｈ１２３）は、電気化学的勾配に従ってミトコンドリア中に蓄積することが公知である。取り込まれなかったＲｈ１２３が除去されると、取り込まれたＲｈ１２３は、ミトコンドリア膜電位に比例した量でミトコンドリア中に優先的に保持される（Darzynkiewicz Z et al., Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 2383-7）。膜透過性遷移孔チャネルの開口部（ｏｐｅｎｉｎｇ）のミトコンドリア完全性が失われると、このプローブがミトコンドリアから漏出し、結果として生じる蛍光が減少する（Darzynkiewicz Z et al., Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 2383-7、Johnson LV et al., Proc Natl Acad Sci USA 1980; 77: 990-994.）。Ｒｈ１２３（５３０ｎｍ）およびＰＩ（６００ｎｍ）の蛍光強度はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，  ＢＤ）によって測定した。
【０３２４】
１１．ＴＵＮＥＬアッセイ法
１９６番ｓｉＲＮＡ二重鎖５’−ＧＧＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＣＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）および陰性対照としてのｓｉＥＧＦＰ二重鎖５’−ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０）をＰａｎｃ−１細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を回収し、ＰＢＳで再懸濁し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。ＰＢＳで洗浄した後に、細胞を、免疫細胞化学的解析用に、予冷したエタノール＋酢酸（２：１）によって−２０℃で５分間透過処理するか、またはフローサイトメトリー用に、予冷した７０％エタノールで透過処理した。ＴＵＮＥＬアッセイ法によってアポトーシスを検出するために、ＡｐｏｐＴａｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）を製造業者のプロトコールに従って使用し、Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌｅｉｃａ）を用いて可視化するか、またはフローサイトメトリー（Ｃｅｌｌ  Ｌａｂ  Ｑｕａｎｔａ  ＳＣ  ＭＰＬ，  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ）によって蛍光を測定した。ＤＮａｓｅ  Ｉで処理した透過性処理済細胞をＴＵＮＥＬアッセイ法の陽性対照として調製した。
【０３２５】
発明の様式２
ＰＤＡＣ細胞におけるＣ２ｏｒｆ１８の過剰発現
本発明者らのゲノム全域ｃＤＮＡマイクロアレイ解析により（Nakamura T, et al. Oncogene. 2004 Mar 25;23(13):2385-400.4）、ＰＤＡＣ細胞においてトランス活性化されていることが確認された何十個もの遺伝子のうちで、１つの新規な性質不明の遺伝子であるＣ２ｏｒｆ１８をさらなる研究のために選択した。この遺伝子は、本明細書および他の文献においてＡＮＴ２ＢＰ（ＡＮＴ２結合タンパク質）またはＰＡＭＰ（膵臓癌ミトコンドリアタンパク質）と互換的に呼ばれる。ＲＴ−ＰＣＲ解析により、ＰＤＡＣ細胞９個中８個においてＣ２ｏｒｆ１８過剰発現が確認された（図１Ａ）。Ｃ２ｏｒｆ１８  ｃＤＮＡ断片をプローブとして使用するノーザンブロット解析により、約４．４ｋｂの転写物が前立腺および甲状腺で発現すると同定され、肺、心臓、肝臓、および腎臓を含む重要器官においてはかすかにしかＣ２ｏｒｆ１８発現が検出できないことが示された（図１Ｂ、上のパネル）。検査したＰＤＡＣ細胞株の大半において、高レベルの発現が観察された（図１Ｂ、下のパネル）。Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質に特異的なポリクローナル抗体を用いて、ウェスタンブロット解析により、いくつかの  ＰＤＡＣ細胞株および正常細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ−２９３、およびＣＯＳ７）において内因性Ｃ２ｏｒｆ１８が検出され、正常細胞株よりＰＤＡＣ細胞株の方がＣ２ｏｒｆ１８を高発現することが示された（図１Ｃ）。また、臨床ＰＤＡＣ組織切片に対して免疫組織化学的解析も実施して、ＰＤＡＣ細胞における強い染色を認めたが（図１Ｄ）、正常膵臓組織では染色は認められなかった（図１ＤのＮ）。全体として、ＰＤＡＣ組織２２例中１０例（４５％）がＣ２ｏｒｆ１８の陽性染色を示した。
【０３２６】
発明の様式３
ＰＤＡＣ細胞増殖に対するＣ２ｏｒｆ１８−ｓｉＲＮＡの効果
ＰＤＡＣ細胞におけるＣ２ｏｒｆ１８の生物学的機能およびＰＤＡＣ治療用の分子標的としてのその可能性を調査するために、Ｃ２ｏｒｆ１８に特異的ないくつかのｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築し、高レベルのＣ２ｏｒｆ１８を内因的に発現するＰＤＡＣ細胞株であるＭＩＡ−ＰａＣＡ２中にトランスフェクトした。ＲＴ−ＰＣＲにより、１９６番および５７４番のｓｉＲＮＡ発現構築物をトランスフェクトした場合に内因性Ｃ２ｏｒｆ１８の有意なノックダウン効果が示された（図２Ａ）。１９６番および５７４番を用いたコロニー形成アッセイ法（図２Ｂ）およびＭＴＴアッセイ法（図２Ｃ）では、３２５４番およびノックダウン効果が観察されていない陰性対照ｓｉＥＧＦＰと比べて、生細胞の数が大きく減少していることが明らかにされた。別のＣ２ｏｒｆ１８陽性ＰＤＡＣ細胞株Ｐａｎｃ−１において、同一の効果が観察された（図２Ａ、Ｂ、およびＣ）。
【０３２７】
発明の様式４
ミトコンドリアにおけるＣ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の相互作用
インシリコ解析により、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質の３７１アミノ酸の配列においていくつかの膜貫通ドメインが予測された。抗Ｃ２ｏｒｆ１８抗体を用いた免疫細胞化学的解析により、ＰＤＡＣ細胞の細胞質中の陽性シグナルの小胞性パターンが明らかになり、ｓｉＲＮＡ二重鎖を用いた内因性Ｃ２ｏｒｆ１８のノックダウンによってこれらの蛍光シグナルの消失が観察された（図３Ａ）。これらのシグナルをミトコンドリアに特異的なプローブであるＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒのシグナルと部分的に合体させたところ（図３Ａ）、ミトコンドリア内に局在することが示された。Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質の細胞内局在を正確に規定するために、Ｐａｎｃ−１細胞の溶解物をミトコンドリア画分、小胞体（ＥＲ）画分、および他の細胞質画分に分画した。図３Ｂに示すように、ウェスタンブロット解析では、ミトコンドリアに特異的なタンパク質であるミトフィリンと同様に、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質はミトコンドリア画分でのみ検出された。インシリコ解析により、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質はヌクレオチド−糖輸送体に関連したパーミアーゼとして機能する可能性が予測された。癌細胞におけるＣ２ｏｒｆ１８の機能を調査するために、Ｃ２ｏｒｆ１８と相互作用するタンパク質を同定した。具体的には、外因性Ｃ２ｏｒｆ１８−ＨＡを過剰発現する細胞の溶解物から、Ｃ２ｏｒｆ１８を含むタンパク質複合体を免疫沈降させた。Ｃ２ｏｒｆ１８と相互作用する可能性が高いタンパク質を質量分析によって特徴決定し、Ｃ２ｏｒｆ１８タンパク質と相互作用する候補としてＡＮＴ２タンパク質を同定した。Ｃ２ｏｒｆ１８とＡＮＴ２の相互作用を確認するために、Ｃ２ｏｒｆ１８−ＨＡを発現するベクター、ＡＮＴ２−Ｆｌａｇを発現するベクターのいずれかまたは両方を一緒にＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、抗ＨＡ抗体（図３Ｃ左）または抗Ｆｌａｇ抗体（図３Ｃ右）を用いて、細胞抽出物からＣ２ｏｒｆ１８−ＨＡおよび／またはＡＮＴ２−Ｆｌａｇを含むタンパク質複合体を免疫沈降させた。図３Ｃ（左）において、抗Ｆｌａｇ抗体を用いたウェスタンブロットにより、両方の発現ベクターを同時トランスフェクトした場合、ＡＮＴ２−ＦｌａｇがＣ２ｏｒｆ１８−ＨＡと同時に免疫沈降することが示された。さらに、図３Ｃ（右）において、抗ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロットにより、両方の発現ベクターを同時発現させた場合、Ｃ２ｏｒｆ１８−ＨＡがＡＮＴ２−Ｆｌａｇと同時に免疫沈降することが示された。したがって、この性質不明のタンパク質をＡＮＴ２結合タンパク質（ＡＮＴ２ＢＰ）と名付け、ＡＮＴ２と同様にヌクレオチド−糖輸送体としての役割を果たす可能性を推測した。
【０３２８】
発明の様式５
ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）およびアポトーシスに関与するＣ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰ
癌細胞またはミトコンドリアに欠陥がある細胞において、ミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）の生成は、ＡＮＴ２によるＡＴＰ４−／ＡＤＰ３−交換に主に依存していると推測されている（Chevrollier A, et al. J Bioenerg Biomembr 2005; 37: 307-16.、Bonod-Bidaud C, et al. Mitochondria 2001; 1: 217-224.、Loiseau D, et al. Exp Cell Res 2002; 278: 12-18、Chevrollier A, et al. Mol Carcinog 2005; 42: 1-8.）。したがって、ＡＮＴ２サイレンシングは、ミトコンドリア膜電位を改変することによってアポトーシスを促進した（Jang JY, et al. Breast Cancer Res 2008; 10: R11.、Le Bras M, et al. Cancer Res 2006; 66: 9143-52.）。ＡＮＴ２ＢＰがミトコンドリア膜電位ΔΨｍを調節し得るかどうか、およびミトコンドリアアポトーシスに関与しているかどうかを調査するために、ＰＤＡＣ細胞においてＡＮＴ２ＢＰ発現をノックダウンし、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ１２３染色およびＴＵＮＥＬアッセイ法によってそれぞれΔΨｍおよびアポトーシスを調査した。抗Ｃ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰ抗体を用いたウェスタンブロット解析により、ＫＬＭ−１細胞に対するＣ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰ  ｓｉＲＮＡのノックダウン効果が確認された（図４Ａ）。図４Ｂにおいて、Ｘ軸のＲｈｏｄａｍｉｎｅ１２３（Ｒｈ１２３）強度はΔΨｍを反映し、Ｙ軸のＰＩ（ヨウ化プロピジウム）透過性は死細胞における細胞膜破壊を反映する。Ｒｈ１２３強度が低レベルでありＰＩの透過性が陰性であることは、ΔΨｍは低下しているがアポトーシスは完結していない初期アポトーシス細胞を示し、Ｒｈ１２３強度が低レベルでありＰＩの透過性が陽性であることは、死細胞を示す（Shimizu S, et al. Oncogene 1996; 13: 21-9.）。ΔΨｍが低くかつＰＩ透過性が陰性である細胞の数は、ＡＮＴＢＰ２（２５％）またはＡＮＴ２（２６％）をノックダウンした場合、対照（ｓｉＥＧＦＰ、１９％）と比べて増加した。このＦＡＣＳ解析により、ＡＮＴ２ＢＰノックダウンが、ＡＮＴ２ノックダウンと同様にミトコンドリア膜電位ΔΨｍの低下を誘導することが示唆された。さらに、ＴＵＮＥＬ染色（図４Ｃ）およびＦＡＣＳ解析（図４Ｄ）により、ＡＮＴ２ＢＰをノックダウンした場合にアポトーシス細胞の数が顕著に増加することが示された。これらのデータから、ＡＮＴ２ＢＰがミトコンドリア膜電位の維持において決定的に重要な役割を果たし得、かつＡＮＴ２と同様に、おそらくはＡＮＴ２との相互作用を介して、ミトコンドリアアポトーシス経路に関与し得ることが示された。
【０３２９】
考察：
本明細書における証拠から、ＰＤＡＣ細胞のゲノム全域遺伝子発現プロファイル解析により、１つの新規な遺伝子Ｃ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰが、膵臓癌形成に関与する重要な分子の１つであることが実証される。ＰＤＡＣ細胞株においてｓｉＲＮＡを用いてＣ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰをノックダウンすると、癌細胞の生存能が大きく抑制され、ミトコンドリア膜電位の破壊（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）に続いてアポトーシスが誘導されたことから、ＰＤＡＣ細胞の生存能の維持におけるその不可欠な役割が示唆される。
【０３３０】
また、ミトコンドリア膜透過性遷移孔複合体（ＰＴＰＣ）の成分の１つとして、ミトコンドリアＡＤＰと細胞質ＡＴＰとの交換を触媒する機能を有することが示された、ＡＮＴ２とＣ２ｏｒｆ１８の相互作用が証拠によって示されている。ＰＴＰＣは、アポトーシス、ネクローシス、および自食作用の際のミトコンドリア膜透過化の調節において重要な役割を果たし、ＡＮＴファミリーメンバーは、ミトコンドリア膜電位の維持、ならびに呼吸に関連したＡＴＰ交換または代謝において決定的に重要な役割を有する（Crompton M. J Physiol 2000; 529: 11-21.、Verrier F, et al. Oncogene 2004; 23: 8049-64.）。癌細胞において、エネルギー代謝またはＡＴＰ産生は、ワールブルク効果として認識されている解糖作用に主に依存している（Wallace DE. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2005; 70:363-74.）。ＡＮＴファミリーメンバーの内で、この解糖作用依存性のＡＴＰ産生およびその輸送に関与している可能性が高いのはＡＮＴ２だけであり、癌細胞および低酸素下の増殖細胞、ならびにミトコンドリアに欠陥がある細胞においてこれがアップレギュレーションされていることが示された（Chevrollier A, et al. J Bioenerg Biomembr 2005; 37: 307-16.、Bonod-Bidaud C, et al. Mitochondria 2001; 1: 217-224.、Loiseau D, et al. Exp Cell Res 2002; 278: 12-18、Chevrollier A, et al. Mol Carcinog 2005; 42: 1-8.）。Ｃ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰは、ＡＮＴ２と相互作用するため、ＡＮＴ２複合体のメンバーとして解糖作用依存性のＡＴＰ産生および輸送に関与し、膵臓癌細胞を低酸素または化学療法に対して抵抗性にすると推測されている。ただし、ミトコンドリアにおけるまたは癌細胞のエネルギー代謝におけるＣ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰのさらなる機能解析が必要とされている。いくつかの低分子化合物が、ＡＮＴ輸送体を阻害するために抗癌薬として既に確立されている（Galluzzi L, et al. Oncogene 2006; 25: 4812-30.、Don AS, et al. Cancer Cell 2003; 3: 497-509.、Machida K, et al. J Bio Chem 2002; 277: 31243-31248.）。インシリコ解析によって予測され、本明細書のデータによって支持された、Ｃ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰが有する可能性のある輸送体機能を考慮すると、さらなる機能解析によって新規な抗癌薬としてのＣ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰに対する阻害因子の開発がもたらされ得る。要約すれば、本明細書における発現および機能に関する知見から、Ｃ２ｏｒｆ１８／ＡＮＴ２ＢＰがＰＤＡＣ療法および他の癌に対する有望な分子標的であることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【０３３１】
レーザーキャプチャーダイセクションおよびゲノム全域ｃＤＮＡマイクロアレイの組合せによって得られた、本明細書において考察した膵臓癌、特に膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の遺伝子発現解析により、膵臓癌の検出、診断、および治療のための新規な標的としてＣ２ｏｒｆ１８遺伝子が特定された。Ｃ２ｏｒｆ１８の発現に基づいて、本発明は、膵臓癌、特に膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を特定および検出するための分子診断マーカーを提供する。
【０３３２】
本明細書において説明する方法はまた、ＰＤＡＣなどの膵臓癌の検出、診断、治療、および予防用のさらなる分子標的を同定する際にも有用である。本明細書において報告されるデータは、膵臓癌の総合的な理解の一助となり、それによって新規な診断戦略の開発を容易にし、かつ治療用薬物および予防的薬剤のための分子標的を同定するための手がかりを提供する。このような情報は、膵臓腫瘍形成をより深く理解するのに寄与し、かつ、膵臓癌を、検出、診断、治療、および究極には予防するための新規な戦略を開発するための指標を提供する。
【０３３３】
さらに、本明細書において説明する方法は、ＰＤＡＣなどの膵臓癌の診断、ならびにこの疾患に罹患している患者の経過および予後のモニタリングの際にも有用である。さらに、本明細書において報告するデータは、ＰＤＡＣなどの膵臓癌に対する治療アプローチを開発するために可能性が高い候補も提供する。
【０３３４】
本明細書において言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。しかしながら、本明細書における何事も、以前の発明によるそのような開示に本発明が先行する権利を有さないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
【０３３５】
詳細に、かつその特定の態様に関連して本発明を説明したが、前述の説明は本質的に例示的かつ説明的であり、本発明およびその好ましい態様を例示すると意図されることを理解されたい。常用の実験法によって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および修正をその中で実施できることを、当業者は容易に認識すると考えられる。さらなる利点および特徴は、添付の特許請求の範囲から明らかになり、当業者には理解されるように、これらの特許請求の範囲はその妥当な等価物に基づいて決定される。したがって、本発明は、上記の説明によってではなく、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって規定されることを意図するものである。
【図１（Ａ）】
2011518541.tif 000003
【図１（Ｂ）】
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【図１（Ｃ）】
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【図１（Ｄ）】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図２（Ｃ）】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図３（Ｃ）】
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【図４（Ａ）】
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【図４（Ｂ）】
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【図４（Ｃ）】
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【図４（Ｄ）】
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【国際調査報告】
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