(57)【要約】  種々の物質に対する部位特異的コンジュゲーションに有用なシステイン操作抗体を提供する。そのような抗体の設計、製造、スクリーニング、選択および使用のための方法も提供する。【選択図】図１Ａ
2011509675.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
システイン遺伝子操作抗体であって、該システイン遺伝子操作抗体がEUインデックスナンバリングシステムにより定義される、抗体重鎖における131-139領域において１以上のアミノ酸のシステイン残基への置換を有し、少なくとも１つの遊離チオール基を有する、該システイン遺伝子操作抗体。
【請求項２】
前記抗体が２以上の遊離チオール基を有する、請求項１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項３】
前記抗体が４以上の遊離チオール基を有する、請求項１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項４】
前記抗体が６以上の遊離チオール基を有する、請求項１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項５】
前記抗体が８以上の遊離チオール基を有する、請求項１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項６】
前記抗体が１０以上の遊離チオール基を有する、請求項１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項７】
前記抗体が１２以上の遊離チオール基を有する、請求項１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項８】
前記抗体が１４以上の遊離チオール基を有する、請求項１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項９】
前記抗体が１６以上の遊離チオール基を有する、請求項１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項１０】
置換されたアミノ酸が、EUインデックスナンバリングシステムに従い、抗体重鎖の131、132、134、135、136、および139からなる群より選択される、請求項１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項１１】
前記抗体がFabまたはFab2の形態の抗体フラグメントである、請求項１〜１０のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項１２】
前記システイン遺伝子操作抗体が少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合の形成を有する、請求項１〜１１のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項１３】
前記遺伝子操作抗体が、特定の標的について、システイン遺伝子操作前の抗体と同じまたはそれより高い結合親和性を示す、請求項１〜１２のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項１４】
前記遺伝子操作抗体が、特定の標的について、システイン遺伝子操作前の抗体と同じまたはそれよりも低い親和性を示す、請求項１〜１３のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項１５】
前記遺伝子操作抗体が、１以上のFc受容体に対する抗体として、システイン遺伝子操作前の抗体と同じまたはそれよりも高い結合親和性を示す、請求項１〜１４のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項１６】
前記遺伝子操作抗体が、システイン遺伝子操作前の抗体と同じまたはそれよりも高いレベルの抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を誘導する、請求項１〜１５のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項１７】
前記遺伝子操作抗体が、システイン遺伝子操作前の抗体よりも低いレベルの抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を誘発する、請求項１〜１５のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項１８】
前記遺伝子操作抗体が、システイン遺伝子操作前の抗体と同じまたはそれよりも高いレベルの抗体依存性補体依存性細胞傷害(CDC)を誘発する、請求項１〜１７のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項１９】
前記遺伝子操作抗体が、システイン遺伝子操作前の抗体よりも低いレベルの抗体依存性補体依存性細胞傷害(CDC)を誘発する、請求項１〜１７のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項２０】
前記遺伝子操作抗体が、フラグメント化および／または凝集特性により測定すると、システイン遺伝子操作前の抗体と同じまたはそれよりも高いレベルの安定性を示す、請求項１〜１９のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項２１】
前記遺伝子操作抗体が、フラグメント化および／または凝集特性により測定すると、システイン遺伝子操作前の抗体よりも低いレベルの安定性を示す、請求項１〜２０のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項２２】
前記遺伝子操作抗体がシステイン遺伝子操作前の抗体と比較して低減された半減期を示す、請求項１〜２１のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項２３】
前記遊離チオール基が、細胞傷害性物質、化学療法剤、毒素、放射性核種、DNA、RNA、siRNA、マイクロRNA、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、またはビオチンに化学的にコンジュゲートすることができる、請求項１〜２２のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項２４】
前記細胞傷害性物質が、抗チューブリン物質、DNAマイナーグルーブ結合物質、抗ミトメイタンサノイド、およびオーリスタチンからなる群より選択される、請求項２３記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項２５】
前記化学療法剤がタキソール、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキセート、ドラスタチン、ビンカアルカロイド、メトトレキセート、およびデュオカルマイシンからなる群より選択される、請求項２３記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項２６】
前記毒素がアブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、コレラ毒素、ファルカリノール、α毒素、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロタウストラリン、リシン、ストリキニーネ、およびテトロドトキシンからなる群より選択される、請求項２３記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項２７】
放射性核種がクロミウム(51Cr)、コバルト(57Co)、フッ素(18F)、ガドリニウム(153Gd、159Gd)、ゲルマニウム(68Ge)、ホルミウム(166Ho)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、ランタニウム(140La)、ルテチウム(177Lu)、マンガン(54Mn)、モリブデン(99Mo)、パラジウム(103Pd)、リン(32P)、プラセオジミウム(142Pr)、プロメチウム(149Pm)、レニウム(186Re、188Re)、ロジウム(105Rh)、ルテニウム(97Ru)、サマリウム(153Sm)、スカンジウム(47Sc)、セレニウム(75Se)、ストロンチウム(85Sr)、硫黄(35S)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、スズ(113Sn、117Sn)、トリチウム(3H)、キセノン(113Xe)、イッテルビウム(169Yb、175Yb)、イットリウム(90Y)、および亜鉛(65Zn)からなる群より選択される、請求項２３記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項２８】
前記抗体が内在化抗体である、請求項２３記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項２９】
前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異的抗体または多重特異的抗体である、請求項１〜２８のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項３１】
請求項３０記載の核酸を含むベクター。
【請求項３２】
請求項３１記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
請求項１〜２９のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体の抗体コンジュゲート。
【請求項３４】
請求項３３記載の抗体コンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項３５】
被験者に請求項３４記載の組成物を投与することを含む、癌、自己免疫性、炎症性または感染性の疾患もしくは障害を、それを必要とする被験者において検出する方法。
【請求項３６】
疾患または障害が、前記抗体コンジュゲートにより結合される細胞表面抗原を過剰発現する細胞を含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
細胞を有効量の請求項３３記載の抗体コンジュゲートと接触させることを含む、標的細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項３８】
有効量の請求項３４記載の組成物を投与することを含む、被験者における標的細胞の増殖の抑制方法。
【請求項３９】
前記標的細胞が前記抗体コンジュゲートにより結合される細胞表面抗原を過剰発現する、請求項３７または３８記載の方法。
【請求項４０】
治療上有効な量の請求項３４記載の組成物を被験者に投与することを含む、癌、自己免疫性、炎症性、または感染性の疾患もしくは障害を、それを必要とする被験者において治療する方法。
【請求項４１】
疾患または障害が、前記抗体コンジュゲートにより結合される細胞表面抗原を過剰発現する細胞を含むものである、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記方法が前記疾患と関連する細胞を殺すまたは該細胞の増殖速度を低減することを含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が、B細胞またはT細胞を枯渇することを含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４４】
追加の療法を施すことを含み、該追加の療法が、化学療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、および外科手術からなる群より選択される、請求項４０記載の方法。
【請求項４５】
請求項１〜２９のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体に異種分子を効率的にコンジュゲートする方法。
【請求項４６】
異種分子を抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、および139からなる群より選択される少なくとも１つの位置にコンジュゲートすることを含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
異種分子が、細胞傷害性物質、化学療法剤、毒素、放射性核種、DNA、RNA、siRNA、マイクロRNA、ペプチド核酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、またはビオチンからなる群より選択される、請求項４５または４６記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞傷害性物質が、抗チューブリン物質、DNAマイナーグルーブ結合物質、抗ミトメイタンサノイド、およびオーリスタチンからなる群より選択される、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
前記化学療法剤がタキソール、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキセート、ドラスタチン、ビンカアルカロイド、およびメトトレキセートからなる群より選択される、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
前記毒素がアブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、コレラ毒素、ファルカリノール、α毒素、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロタウストラリン、リシン、ストリキニーネ、およびテトロドトキシンからなる群より選択される、請求項４７記載の方法。
【請求項５１】
放射性核種がクロミウム(51Cr)、コバルト(57Co)、フッ素(18F)、ガドリニウム(153Gd、159Gd)、ゲルマニウム(68Ge)、ホルミウム(166Ho)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、ランタニウム(140La)、ルテチウム(177Lu)、マンガン(54Mn)、モリブデン(99Mo)、パラジウム(103Pd)、リン(32P)、プラセオジミウム(142Pr)、プロメチウム(149Pm)、レニウム(186Re、188Re)、ロジウム(105Rh)、ルテニウム(97Ru)、サマリウム(153Sm)、スカンジウム(47Sc)、セレニウム(75Se)、ストロンチウム(85Sr)、硫黄(35S)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、スズ(113Sn、117Sn)、トリチウム(3H)、キセノン(113Xe)、イッテルビウム(169Yb、175Yb)、イットリウム(90Y)、および亜鉛(65Zn)からなる群より選択される、請求項４７記載の方法。
【請求項５２】
前記効率が、コンジュゲーション反応の後に残留する遊離チオール基により測定すると、少なくとも５％以上である、請求項４５〜５１のいずれか１項記載の方法。
【請求項５３】
前記効率が、コンジュゲーション反応の後に残留する遊離チオール基により測定すると、少なくとも２５％以上である、請求項４５〜５２のいずれか１項記載の方法。
【請求項５４】
前記効率が、コンジュゲーション反応の後に残留する遊離チオール基により測定すると、少なくとも７５％以上である、請求項４５〜５３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体が、位置132および／または138におけるシステインへの置換を有しない、請求項１〜２９のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項５６】
前記抗体が位置132および／または138における置換を有し、該置換がシステインではない、請求項１〜２９および５５のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項５７】
前記抗体が131-139ループ領域の少なくとも１つの拡張を有する、請求項１〜２９および５５〜５６のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項５８】
前記抗体が、131-139ループ領域の拡張を有し、該拡張が、少なくとも１〜少なくとも１５のアミノ酸の挿入を含む、請求項１〜２９および５５〜５７のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項５９】
前記抗体が131-139ループ領域の拡張を有し、該拡張が、残基131、132、133、134、135、136、137、138および139からなる群より選択される位置の後に生じる、請求項１〜２９および５５〜５８のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項６０】
前記抗体が131-139ループ領域の拡張を有し、該拡張が、残基131、132、133、134、135、136、137、138および139からなる群より選択される位置の後に生じる、請求項１〜２９および５５〜５９のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【請求項６１】
前記抗体が131-139ループ領域の少なくとも第１および第２の拡張を有し、第１拡張が残基131、132、133、134、135、136、137、138および139からなる群より選択される位置の後に生じ、第２拡張が第１拡張の後に生じ、かつ第２拡張が残基131、132、133、134、135、136、137、138および139からなる群より選択される位置の後に生じる、請求項１〜２９および５５〜６９のいずれか１項記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1．関連出願に対する相互参照
本出願は、2008年1月18日付け出願の米国仮出願第61/022,073号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
【０００２】
2．発明の分野
本発明は、コンジュゲーション反応のための遊離チオール基を生成するシステイン操作CH1ドメインを含む抗体に関する。また、そのような抗体の設計、修飾、製造および使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
3．発明の背景
3.1  癌および癌治療
毎年120万人を超える米国人が癌を発症する。癌は米国における第2位の死亡原因であり、現在の傾向が続けば、癌は2010年までに第1位の死亡原因になると予想される。肺癌および前立腺癌は米国の男性における最上位の癌死亡原因である。肺癌および乳癌は米国の女性における最上位の癌死亡原因である。米国の2人に1人の男性が生涯のうちのある時点で癌と診断される。米国の3人に1人の女性が生涯のうちのある時点で癌と診断される。手術、化学療法および放射線療法のような現在の治療選択肢、しばしば、効果がないか、重大な副作用を示す。
【０００４】
抗転移物質の開発の1つの障害は、これらの薬物を設計し評価するために使用されるアッセイ系にある。ほとんどの通常の癌療法は、迅速に成長する細胞を標的化する。しかし、癌細胞は、必ずしも、より迅速に成長するわけではなく、むしろ、正常細胞にとって非許容性である条件下で生存し成長する（LawrenceおよびSteeg, 1996, World J. Urol. 14:124-130）。正常細胞の挙動と悪性細胞の挙動との間のこれらの基本的相違は治療標的化のための機会を提供する。微小転移性腫瘍が既に全身に散在しているという状況は、外来および三次元微小環境において潜在的化学療法薬を評価する必要性を強調している。多数の標準的な抗癌剤アッセイは、典型的な細胞培養条件下（すなわち、単層成長）での、腫瘍細胞の成長または生存を測定する。しかし、二次元アッセイにおける細胞挙動は、しばしば、腫瘍細胞挙動を、in vivoで、信頼性を伴って予測するものではない。
【０００５】
現在、癌治療は、患者における腫瘍細胞を根絶させるための手術、化学療法、ホルモン療法および／または放射線療法を含みうる（例えば、Stockdale, 1998, “Principles of Cancer Patient Management”, in Scientific American: Medicine, vol. 3, RubensteinおよびFederman編, Chapter 12, Section IVを参照されたい）。これらのアプローチの全ては有意な欠点を患者に与える。手術は、例えば、患者の健康によっては禁忌となることがあり、あるいは患者に受け入れられないことがある。また、手術は腫瘍組織を完全には除去できない可能性がある。放射線療法は、腫瘍組織が正常組織より高い感受性を示す場合に有効となるに過ぎず、放射線療法も、しばしば、重大な副作用を惹起しうる。ホルモン療法は単一物質として投与されることはほどんどなく、有効でありうるものの、他の治療が癌細胞の大部分を除去した後の癌の再発を予防する又は遅延させるために使用されることが多い。
【０００６】
化学療法に関しては、癌の治療に利用可能な種々の化学療法剤が存在する。癌化学療法剤の大多数は、DNA合成を抑制することにより作用する（例えば、Gilmanら, Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Ed. (Pergamon Press, New York, 1990)を参照されたい）。したがって、化学療法剤は本質的に非特異的である。また、ほとんど全ての化学療法剤は毒性であり、化学療法は、重篤な悪心、骨髄抑制、免疫抑制などを含む、有意な、そしてしばしば危険な副作用を引き起こす（例えば、Stockdale, 1998, “Principles Of Cancer Patient Management” in Scientific American Medicine, vol. 3, RubensteinおよびFederman編, ch. 12, sect. 10を参照されたい）。さらに、化学療法剤の組合せの投与の場合であっても、多数の腫瘍細胞は該化学療法剤に対して抵抗性であるか、または抵抗性を獲得する。
【０００７】
癌療法は現在、生物学的療法または免疫療法をも含みうる。生物学的療法／免疫療法は数において限られており、化学療法剤より特異的であるものの、多数は尚も健常細胞および癌細胞の両方を標的化する。また、そのような療法は、副作用、例えば発疹または腫脹、インフルエンザ様症状、例えば発熱、悪寒および疲労、消化管障害またはアレルギー反応を引き起こしうる。
【０００８】
3.2  癌治療用抗体
抗体は、特異的抗原に結合する免疫タンパク質である。ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物においては、抗体は1対の重および軽ポリペプチド鎖から構成される。各鎖は、可変（Fv）および定常（Fc）領域と称される2つの異なる領域から構成される。軽および重鎖Fv領域は該分子の抗原結合決定基を含有し、標的抗原への結合に与る。Fc領域は抗体（例えば、IgG）のクラス（またはアイソタイプ）を定め、いくつかの天然タンパク質への結合に与り重要な生化学的事象を惹起する。
【０００９】
抗体のFc領域は、Fc受容体および他のリガンドを含む多数のリガンドと相互作用して、エフェクター機能と称される一連の重要な機能をもたらす。IgGクラスに対するFc受容体の重要なファミリーはFcガンマ受容体（FcγRs）である。これらの受容体は抗体と免疫系の細胞成分との連絡を媒介する（Raghavanら, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetchら, 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290）。ヒトにおいては、このタンパク質ファミリーは、アイソフォームFcγRIA、FcγRIBおよびFcγRICを含むFcγRI（CID64）；アイソフォームFcγRIIA、FcγRIIBおよびFcγRIICを含むFcγRII（CD32）；ならびにアイソフォームFcγRIIIAおよびFcγRIIBを含むFcγRIII（CD16）を含む（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65）。これらの受容体は、典型的には、Fcへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜伸長領域、および細胞内の何らかのシグナリング事象を媒介しうる細胞内ドメインを有する。これらの異なるFcγRサブタイプは、異なる細胞型上で発現される（Ravetchら, 1991, Annu Rev Immunol 9:457-492）。例えば、ヒトにおいては、FcγRIIIBは好中球上でのみ見出され、FcγRIIIAは、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー（NK）細胞、およびT細胞の小集団上で見出される。
【００１０】
Fc/Fcγ複合体の形成はエフェクター細胞を結合抗原の部位へリクルートして、典型的には、該細胞内でのシグナル事象、ならびに重要な後続免疫応答、例えば炎症伝達物質の遊離、細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用および細胞傷害性攻撃を引き起こす。細胞傷害性および食作用エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的化細胞を破壊する潜在的メカニズムである。FcγRsを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、ついで標的細胞の細胞溶解を引き起こす細胞性反応は、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）と称される（Raghavanら, 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetieら, 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetchら, 2001, Annu Rev Immunol 19.275-290）。注目すべきことに、ADCCを媒介するための一次細胞であるNK細胞はFcγRIIIAを発現するに過ぎないが、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する（Ravetchら. 1991, 前掲）。
【００１１】
もう1つの重要なFcリガンドは補体タンパク質C1qである。C1qへのFc結合は、補体依存性細胞傷害（CDC）と称される過程を引き起こす（Wardら, 1995, Ther Immunol 2-77-94において概説されている）。補体カスケードを活性化するためには2つのIgGへの結合で十分であるが、C1qは6つの抗体に結合しうる。C1qはC1rおよびC1sセリンプロテアーゼとの複合体を形成して、補体経路のC1複合体を形成する。
【００１２】
標的に対する特異性、免疫エフェクターメカニズムを媒介する能力および血清中の長い半減期（これらに限定されるものではない）を含む抗体の中心的特徴の幾つかは抗体および関連免疫グロブリン分子を強力な治療用物質にする。多数のモノクローナル抗体が現在開発中であり、あるいは癌を含む種々の症状の治療のために治療用に使用されている。これらの具体例には、Vitaxin（登録商標）（MedImmune）、ヒト化インテグリンαvβ3抗体（例えば、PCT公開WO 2003/075957）、Herceptin（登録商標）（Genentech）、乳癌の治療のために承認されているヒト化抗Her2/neu抗体（例えば、U.S. 5,677,171）、CNTO 95（Centocor）、ヒトインテグリンαv抗体（PCT公開WO 02/12501）、Rituxan（登録商標）（IDEC/Genentech/Roche）、非ホジキンリンパ腫の治療のために承認されているキメラ抗CD20抗体（例えば、U.S. 5,736,137）およびErbitux（登録商標）（ImClone）、キメラ抗EGFR抗体（例えば、U.S. 4,943,533）が含まれる。
【００１３】
必要な増殖経路の遮断による抗増殖、アポトーシスを招く細胞内シグナリング、受容体のダウンレギュレーションおよび／またはターンオーバーの増強、ADCC、CDC、ならびに適応免疫応答の促進を含む、抗体が腫瘍細胞を破壊する幾つかの考えられうるメカニズムが存在する（Craggら, 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547; Glennieら, 2000, Immunol Today 21 :403-410）。しかし、広範な使用にもかかわらず、抗体は臨床用途に未だ最適化されておらず、多数は最適未満の抗癌効力を有するに過ぎない。したがって、標的化癌細胞を抗体が破壊する能力を増強することが大いに必要とされている。
【００１４】
3.3  抗体コンジュゲート
細胞毒性または静細胞因子、すなわち、癌の治療において腫瘍細胞を殺す又は抑制する薬物（Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549; Wuら (2005) Nature Biotechnology 23(9): 1137-1146: Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; SyrigosおよびEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-DuvazおよびSpringer (1997) Adv. Drag Del. Rev. 26:151 -172; 米国特許第4,975,278号）の局所送達のための、抗体コンジュゲート、すなわち、免疫コンジュゲートの使用は、理論的には、腫瘍への薬物部分の標的化送達およびそこにおける細胞内蓄積を可能にし、これらの未コンジュゲート薬剤の全身投与は、排除されるべき腫瘍細胞だけでなく正常細胞に対しても、許容されないレベルの毒性を引き起こしうる（Baldwinら (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら (編), pp. 475-506）。それにより、最小の毒性と共に最大の効力が追求される。抗体コンジュゲートを設計し精密化するための努力はモノクローナル抗体（mAb）の選択性ならびに薬物連結および薬物放出特性に焦点が合わされている（Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は共に、これらの方法において有用であると報告されている（Rowlandら, (1986) Cancer Immunol. Irnmursoraer., 21 :183-87）。これらの方法において使用される薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキセートおよびビンデシンが含まれる（Rowlandら (1986)）。抗体-毒素コンジュゲートにおいて使用される毒素には、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、植物毒素、例えばリシンおよびゲロニン、小分子毒素、例えばゲルダナマシン（Mandlerら (200O) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19}:1573-1581; Mandlerら (2000) Bioorganic & Med. Chan. Letters 10:1025-1028; Mandlerら (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791）、メイタンシノイド（maytansinoid）（EP 1391213; Liuら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623）、ならびにカリケアマイシン（calicheamicin）（Lodeら (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342）が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、DNA結合またはトポイソメラーゼ抑制を含むメカニズムにより、それらの細胞毒性および静細胞効果をもたらしうる。幾つかの細胞毒性薬は、大きな抗体またはタンパク質受容体リガンドにコンジュゲートされている場合には不活性である又はそれほど活性でない傾向にある。
【００１５】
幾つかの抗体コンジュゲートがFDAにより承認されており、または臨床治験中である。例えば、ZEVALIN（登録商標）（イブリツモマブ・チウキセタン（ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec）は、正常および悪性Bリンパ球の表面上に見出されるCD20抗原に対するマウスIgG1カッパモノクローナル抗体と、チオ尿素リンカー-キレーターに結合した111Inまたは90Y放射性同位体とから構成される（Wisemanら (2000) Eur. J. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wisemanら (2002) Blood 99(l2):4336-42; Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69）。ZEVALIN（登録商標）はB細胞非ホジキンリンパ腫（NHL）に対する活性を有するが、投与はほとんどの患者において重篤かつ持続的な血球減少症を引き起こす。また、カリケアマイシン（calicheamicin）に連結されたヒトCD33抗体から構成される抗体-薬物コンジュゲートであるMYLOTARG（登録商標）（ゲンツズマブ・オゾガミシン（gemtuzumab ozogamicin）, Wyeth Pharmaceuticals）は注射による急性骨髄球様白血病の治療のために2000年に承認された（Drugs of the Future (2000) 25(7):686; 米国特許第4,970,198号、第5,079,233号、第5,585,089号、第5,606,040号、第5,693,762号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,773,001号）。ジスルフィドリンカーSPPを介してメイタンシノイド（maytansinoid）薬物部分DM1に連結されたヒトC242抗体から構成される抗体-薬物コンジュゲートであるカンツズマブ・メルタンシン（Cantuzumab mertansine）（Immunogen, Inc.）（Xieら (2004) J. of Pharm. and Exp. Ther. 308(3): 1073-1082）は、CanAgを発現する癌（例えば、結腸癌、膵臓癌、胃癌など）の治療のための臨床治験が進行中である。メイタンシノイド（maytansinoid）薬物部分DM1に連結された抗前立腺特異的膜抗原（PSMA）モノクローナル抗体から構成される抗体-薬物コンジュゲートであるMLN-2704（Millennium Pharm,, BZL Biologies, fmmtmogen Inc.）は前立腺腫瘍の潜在的治療のために開発中である。
【００１６】
オーリスタチン（auristatin）ペプチド、オーリスタチンE（AE）およびモノメチルオーリスタチン（MMAE）、ドラスタチン（dolastatin）の合成類似体（WO 02/088172）は、（i）キメラモノクローナル抗体cBR96（癌上のルイス（Lewis）Yに特異的）、（ii）血液悪性疾患上のCD30に特異的であるcAC10（Klussmanら, (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773; Doroninaら (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; Franciscoら (2003) Blood 102(4):1458-1465; US 2004/0018194）、（iii）抗CD20抗体、例えば、CD20を発現する癌および免疫障害の治療のためのRITUXAN（登録商標）(WO 04/032828)、（iv）結腸直腸癌の治療のための抗EphB2R抗体2H9および抗IL-8（Maoら (2004) Cancer Research 64(3):781-788）、（v）E-セレクチン抗体（Bhaskarら (2003) Cancer Res. 63:6387-6394）、ならびに（vi）他の抗CD30抗体（WO 03/043583）にコンジュゲートされている。オーリスタチンEの変異体は米国特許第5,767,237号および米国特許第6,124,431号に開示されている。モノクローナル抗体にコンジュゲートされたモノメチルオーリスタチンEは2004年3月28日付けのSenterら, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623に開示されている。オーリスタチン類似体MMAEおよびMMAFは種々の抗体にコンジュゲートされている（WO 2005/081711）。
【００１７】
薬物部分を抗体に共有結合により結合、すなわち、連結させるための通常の手段は、一般に、抗体上の多数の部位において薬物部分が結合した、分子の不均一混合物を与える。例えば、細胞毒性薬は、典型的には、抗体のしばしば多数のリシンまたはシステイン残基を介して抗体にコンジュゲートされて、不均一な抗体-薬物コンジュゲート混合物を与える。反応条件に応じて、該不均一混合物は、典型的には、0〜約8またはそれ以上の結合薬物部分を伴う抗体の分布を含有する。また、抗体に対する薬物部分の特定の整数比を伴う、コンジュゲートの各亜群は、該抗体上の種々の部位において該薬物部分が結合した潜在的に不均一な混合物である。分析的および分取的方法は、コンジュゲーション反応から生じた不均一混合物中の抗体-薬物コンジュゲート種分子を分離し特徴づけるには不適切である。抗体は大きく複雑であり構造的に多様な生体分子であり、しばしば、多数の反応性官能基を伴う。リンカー試薬および薬物-リンカー中間体とのそれらの反応性は、pH、濃度、塩濃度および共存溶媒のような要因に左右される。さらに、多工程コンジュゲーション法は、反応条件の制御ならびに反応物および中間体の特徴づけが困難なため、再現不能となりうる。
【００１８】
プロトン化された及びpH7付近でそれほど求核性ではないほとんどのアミンとは異なり、システインチオールは中性pHで反応性である。遊離チオール（R-SH、スルフヒドリル）基は比較的反応性であるため、システイン残基を有するタンパク質は、しばしば、ジスルフィド結合オリゴマーとしてそれらの酸化形態で存在するか、または内部架橋ジスルフィド基を有する。細胞外タンパク質は、一般に、遊離チオールを有さない（Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach. Academic Press, London, p. 55）。タンパク質中の遊離チオールの量は標準的なエルマンアッセイにより評価されうる。IgMはジスルフィド結合五量体の一例であり、IgGは、サブユニットを互いに結合させる内部ジスルフィド架橋を有するタンパク質の一例である。このようなタンパク質においては、ジチオトレイトール（DTT）またはセレノール（Singhら (2002) Anal. Biochem. 304:147-156）のような試薬でのジスルフィド結合の還元が、反応性遊離チオールを生成させるのに必要である。このアプローチは抗体三次構造および抗原結合特異性の喪失を引き起こしうる。
【００１９】
抗体システインチオール基は、一般に、求電子コンジュゲーション試薬に対して、抗体アミンまたはヒドロキシル基より反応性、すなわち、より求核性である。リガンドに対する共有結合を形成させるため、または新たな分子内ジスルフィド結合を形成させるために、システイン残基が遺伝子操作技術によりタンパク質内に導入されている（Betterら (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhardら (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwoodら (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tuら (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kannoら (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmuraら (2001 ) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(l5):8480-8484; 米国特許第6,248,564号）。しかし、システインアミノ酸へのタンパク質の種々のアミノ酸残基の突然変異によるシステインチオール基を導入する設計は、不対（遊離Cys）残基の場合または反応もしくは酸化を比較的受けやすい場合に特に、問題となる可能性がある。タンパク質の濃縮溶液においては、大腸菌（E. coli.）のペリプラズム、培養上清または部分的もしくは完全に精製されたタンパク質のいずれの場合でも、該タンパク質の表面上の不対Cys残基は対形成し酸化されて、分子間ジスルフィド、ひいてはタンパク質二量体または多量体を形成しうる。ジスルフィド二量体の形成は、新たなCysを、薬物、リガンドまたは他の標識へのコンジュゲーションに対して無反応性にする。さらに、タンパク質が、新たに操作されたCysと既存のCys残基との間で分子内ジスルフィド結合を酸化的に形成すると、どちらのCys基も活性部位への関与および相互作用には利用できない。また、タンパク質は、ミスフォールディングまたは三次構造の喪失により、不活性または非特異的にされうる（Zhangら (2002) Anal. Biochem. 311:1-9）。
【００２０】
コンジュゲーション部位を抗体内に操作することは既に試みられている。米国特許第5,219,916号はSer 156またはThr 173のような「表面ポケット」残基の修飾を記載している（Kabatら. Sequences of Immunological Interest, 4thed., US Dept. of Health and Human Services, 1987による）。関連研究において、研究者らは、「表面ポケット」上の残基のみが、コンジュゲーション部位を操作する試みにおけるシステインの置換を支持しうることを確認した（Lyonsら. (1990) Protein Eng. 3:8 pg 703-708）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】国際公開第2003/075957パンフレット
【特許文献２】米国特許第5,677,171号明細書
【特許文献３】国際公開第02/12501パンフレット
【特許文献４】米国特許第5,736,137号明細書
【特許文献５】米国特許第4,943,533号明細書
【特許文献６】米国特許第4,975,278号明細書
【特許文献７】欧州特許第1391213号明細書
【特許文献８】米国特許第4,970,198号明細書
【特許文献９】米国特許第5,079,233号明細書
【特許文献１０】米国特許第5,585,089号明細書
【特許文献１１】米国特許第5,606,040号明細書
【特許文献１２】米国特許第5,693,762号明細書
【特許文献１３】米国特許第5,739,116号明細書
【特許文献１４】米国特許第5,767,285号明細書
【特許文献１５】米国特許第5,773,001号明細書
【特許文献１６】国際公開第02/088172パンフレット
【特許文献１７】米国特許第2004/0018194号明細書
【特許文献１８】国際公開第04/032828パンフレット
【特許文献１９】国際公開第03/043583パンフレット
【特許文献２０】米国特許第5,767,237号明細書
【特許文献２１】米国特許第6,124,431号明細書
【特許文献２２】国際公開第2005/081711パンフレット
【特許文献２３】米国特許第6,248,564号明細書
【特許文献２４】米国特許第5,219,916号明細書
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Lawrence and Steeg, 1996, World J. Urol. 14:124-130
【非特許文献２】Stock dale, 1998, "Principles of Cancer Patient Management", in Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., Chapter 12, Section IV
【非特許文献３】Gilman et al., Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Ed. (Pergamon Press, New York, 1990)
【非特許文献４】Stockdale, 1998, "Principles Of Cancer Patient Management" in Scientific American Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., ch. 12, sect. 10
【非特許文献５】Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220
【非特許文献６】Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290
【非特許文献７】Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65
【非特許文献８】Ravetch et al., 1991, Annu Rev Immunol 9:457-492
【非特許文献９】Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220
【非特許文献１０】Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766
【非特許文献１１】Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290
【非特許文献１２】Ward et al., 1995, Ther Immunol 2:77-94
【非特許文献１３】Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547
【非特許文献１４】Glennie et al., 2000, Immunol Today 21 :403-410
【非特許文献１５】Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549
【非特許文献１６】Wu et a1.(2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146
【非特許文献１７】Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212
【非特許文献１８】Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614
【非特許文献１９】Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172
【非特許文献２０】Baldwin et al (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05
【非特許文献２１】Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al (ed.s), pp. 475-506
【非特許文献２２】Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549
【非特許文献２３】Rowland et al (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87
【非特許文献２４】Mandler et al (200O) J. of the Nat. Cancer Inst. 92(19}:1573-1581
【非特許文献２５】Mandler et al (2000) Bioorganic & Med. Chan. Letters 10:1025-1028
【非特許文献２６】Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791
【非特許文献２７】Liu et al (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623
【非特許文献２８】Lode et al (1998) Cancer Res. 58:2928
【非特許文献２９】Hinman et al (1993) Cancer Res. 53:3336-3342
【非特許文献３０】Wiseman et al (2000) Eur. j. Nucl. Med. 27(7):766-77
【非特許文献３１】Wiseman et al (2002) Blood 99(l2):4336-42
【非特許文献３２】Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63
【非特許文献３３】Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69
【非特許文献３４】Drugs of the Future (2000) 25(7):686
【非特許文献３５】Xie et al (2004) J. of Pharm and Exp. Ther. 308(3): 1073-1082
【非特許文献３６】Klussman, et al (2004), Bioconjugate Chemistry 15(4):765-773
【非特許文献３７】Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784
【非特許文献３８】Francisco et al (2003) Blood 102(4):1458-1465
【非特許文献３９】Mao et al (2004) Cancer Research 64(3):781-788
【非特許文献４０】Bhaskar et al (2003) Cancer Res. 63:6387-6394
【非特許文献４１】Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented Mar. 28, 2004
【非特許文献４２】Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling: A Practical Approach. Academic Press, London, at page 55
【非特許文献４３】Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-156
【非特許文献４４】Better et al (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650
【非特許文献４５】Bernhard et al (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132
【非特許文献４６】Greenwood et al (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255
【非特許文献４７】Tu et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867
【非特許文献４８】Kanno et al (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214
【非特許文献４９】Chmura et al (2001 ) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(l5):8480-8484
【非特許文献５０】Zhang el al (2002) Anal. Biochem. 311:1-9
【非特許文献５１】Kabat et al,. Sequences of Immunological Interest, 4th ed., US Dept. of Health and Human Services, 1987
【非特許文献５２】Lyons et al. (1990) Protein Eng. 3:8 pg 703-708
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
したがって、種々の物質へのコンジュゲーションが可能な遊離チオール基を提供する安定なシステイン操作抗体を開発することが必要とされている。
【００２４】
本明細書における参考文献の引用または考察は、それが本発明の先行技術であると自認するものと解釈してはならない。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
4．発明の概括
本発明は、種々の物質へのコンジュゲーションが可能な遊離システイン残基を含有するよう修飾されたCH1ドメインを含む抗体を提供する。本発明のシステイン操作抗体（システイン遺伝子操作抗体）は、1以上の非天然システインアミノ酸で置換された抗体重鎖の131-139領域からの1以上のアミノ酸を含み、それにより、該置換システインアミノ酸は、コンジュゲーションが可能な遊離チオール基を提供する。1つの実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は1、2、3、4、5、6、7、8個またはより多数の置換されたシステインアミノ酸を含む。もう1つの実施形態においては、抗体のCH1ドメインの131-139領域はセリンまたはトレオニン残基からシステインへの置換を含む。
【００２６】
本発明のシステイン操作抗体は、修飾CH1ドメインを別の抗体鎖と連結する非天然ジスルフィド結合を含みうる。1つの実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、修飾CH1ドメインを別の抗体鎖と連結する非天然ジスルフィド結合の結果として形成された1以上の遊離チオール基を含む。
【００２７】
本発明のもう1つの態様は、システイン操作抗体の作製のための核酸、ベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００２８】
本発明のもう1つの態様は、細胞毒性物質、化学療法剤、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質スカフォールド、酵素、毒素、放射性核種、DNA、RNA、siRNA、マイクロRNA、ペプチド核酸、蛍光タグまたはビオチンでありうる薬物に結合された本発明のシステイン操作抗体を含む抗体コンジュゲート、およびそのようなコンジュゲートの製造方法を提供する。
【００２９】
本発明のもう1つの態様は、細胞表面受容体に結合するとインターナリゼーション（内在化）されうる抗体を提供する。そのような態様においては、本発明の抗体は被運搬体分子および／または物質の細胞質運搬に有用である。
【００３０】
本発明のもう1つの態様は、癌、自己免疫、炎症または感染症を本発明の抗体コンジュゲートで治療、検出および診断するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
5．図面の簡潔な説明
【図１Ａ】図1AはIgG構造の概要図である。突然変異誘発された、CH1ドメインの残基131-残基139の領域が、濃い黒色で示されている。拡大部分はCH1ドメインの残基131-残基139の拡大図である。
【図１Ｂ】図1Bは、コンジュゲーションが可能な、抗体内の遊離チオールを作製するために用いられた、131位に対するシステイン操作法を示す。具体的には、EphB4特異的抗体1C6のカッパ軽鎖および重鎖が示されており、システイン残基は太字で示されている。また、IgG1抗体形態において天然に存在する比較用ジスルフィド結合が実線で示されている。セリンからシステインへの131位の特異的操作（図中、下線付き太字で示されている）は、軽鎖カルボキシ末端システインを重鎖のシステイン220に連結する、カノニカル（canonical）鎖間ジスルフィド結合に取って代わって形成する潜在的鎖間ジスルフィド結合を表す。131Cysの含有により形成される潜在的ジスルフィド結合が示されている（点線）。ここに示されているジスルフィド結合は実験結果により証明された。
【図１Ｃ】図1Cは、システイン操作のための候補セリンまたはトレオニン残基を含有する対応領域の概要を示す、種々の抗体形態からのCH1ドメインのアライメントである。枠で囲まれた領域は、その他の抗体形態におけるIgG1のCH1ドメインの対応領域を表す。
【図２Ａ】図2Aは、非還元（インセットi）および還元（インセットii）条件下で移動する抗体の発現および精製を実証するクーマシー染色PAGEゲルである。このパネルに示されている抗体としては1C1（レーン1）、および1C1に由来する種々のシステイン操作抗体（レーン2〜15）が挙げられる。抗体は2μg/ウェルの濃度でローディングされた。
【図２Ｂ】図2Bは、IgG1 wtおよびSer131からCysへの突然変異体の非還元性ペプチドマッピングの比較である。1C1はIgG1サブクラスのEphA2特異的抗体である。インセットAは、重鎖ヒンジ領域と軽鎖C末端との通常のジスルフィド結合連結（H11-L15）およびSer131を含有するペプチド（H5）を示した1C1 WT抗体である。インセットBは、軽鎖と重鎖との通常のジスルフィド結合（H11−L15）および1C1 wtペプチドH5の減少、ならびに突然変異システインから軽鎖C末端への（H5m-L15）およびヒンジ領域への（H5m-H11）新たに形成されたジスルフィド結合連結の出現を示した1C1 Ser131Cys突然変異体である。突然変異Cys131に関しては、微量の遊離システインのみが観察された。
【図３】図3は、精製された1C6 WT（A）および1C6 Ser131Cys（B）抗体に対して行ったサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析からの結果を表す。該抗体を発現させ、精製し、SECクロマトグラフィーに付した。点線のトレーシングは、該抗体の見掛け分子量を確定するために使用した1組の所定の分子量マーカーを表す。（A）に示されているとおり、1C6 WT抗体は、単量体抗体に対応する分子量で、SECカラムから溶出している。システイン操作1C6抗体のSEC分析（B）は、この抗体も、野生型抗体と同様に、単量体形態で存在することを示している。
【図４】図4は、精製抗体、すなわち、1Cl WT（A）、1C1 Ser134Cys（B）、1Cl Ser132Cys（C）および1C1 Ser131-132-134-136Cys（D）に対して行ったサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析からの結果を表す。点線のトレーシングは、該抗体の見掛け分子量を確定するために使用した1組の所定の分子量マーカーを表す。（A）に示されているとおり、1C1 WT抗体は、単量体抗体に対応する分子量で、SECカラムから溶出している。システイン操作抗体1C1 Ser134Cys（B）、1Cl Ser132Cys（C）および1C1 Ser131-132-134-136Cys（D）のSEC分析は、これらの抗体も、野生型抗体と同様に、単量体形態で存在することを示した。
【図５】図5は、精製抗体、すなわち、1C6 WTおよび1C6 Ser131Cysに対して行った、ELISAに基づく抗原結合アッセイからの結果を表す。これらの抗体はEphB4受容体を特異的に認識する。この図に示されているとおり、該WT抗体および該システイン操作Ser131Cys抗体のELISA形態において測定された結合親和性（結合アフィニティ）プロファイルは非常に類似している。
【図６】図6は、精製抗体、すなわち、1C1 WTおよび1C1 Ser131Cysに対して行った、ELISAに基づく抗原結合アッセイからの結果を表す。これらの抗体はEphA2受容体を特異的に認識する。この図に示されているとおり、該WT抗体および該システイン操作Ser131Cys抗体のELISA形態において測定された結合親和性（結合アフィニティ）プロファイルは非常に類似している。また、1mM DTTの含有は該結合プロファイルに対して測定可能な影響を及ぼさなかった。
【図７】図7は、1C6 WT抗体（A）および1C6 Ser131Cys抗体（B）の示差走査熱量測定（DSC）サーモグラムを表す。両抗体は、それぞれ、70℃および69℃の、非常に類似した融解温度（Tm）を示している。
【図８−１】図8-1は、1Cl WT（A）、1C1 Ser131Cys（B）抗体の示差走査熱量測定（DSC）サーモグラムを表す。該抗体の全ては非常に類似した融解温度（Tm）を示している。
【図８−２】図8-2は、1Cl Ser134Cys（C）、1C1 Ser(131-132)Cys（D）および1C1 Ser(131-132-134-136)Cys抗体の示差走査熱量測定（DSC）サーモグラムを表す。該抗体の全ては非常に類似した融解温度（Tm）を示している。
【図９】図9は、種々の条件下の1C6(WT)抗体および1C6 Ser131Cys(Mut)抗体のビオチンコンジュゲーション研究からの結果を表す。パネルAにおいては、1C6および1C6 Ser131Cys抗体を種々の温度（4℃、37℃、45℃および55℃）でEZ-Link(登録商標)-ビオチン-HPDP（Pierce）とのコンジュゲーション反応に付した。得られたビオチンコンジュゲーション効率を測定し、プロットした。1C6 Ser131Cys抗体は、1C6抗体より高い部位特異的ビオチンコンジュゲーション効率を示している。パネルBにおいては、1C6および1C6 Ser131Cys抗体を種々の温度（4℃、37℃、45℃および55℃）でEZ-Link(登録商標)ヨードアセチル-PEO2ビオチンとのコンジュゲーション反応に付した。得られた部位特異的ビオチンコンジュゲーション効率を測定し、プロットした。1C6 Ser131Cys抗体は、1C6抗体より高い部位特異的ビオチンコンジュゲーション効率を示している。
【図１０】図10は、種々のFcγ受容体に関する1C1 WTおよび1C1 Ser131Cys抗体に対する相対親和性（相対アフィニティ）を測定するBIACORE（登録商標）アッセイからの結果を表す。調べた種々のFcγ受容体は、FcγRI（A）、FcγRIIIA（B）、FcγRIIA（C）、FcγRIIB（D）、であった。1C1 WTおよび1C1 Ser131Cys抗体は種々のFcγ受容体に関して非常に類似した結合親和性を示している。
【図１１】図11は、pH 6.0およびpH 7.4におけるFcRn受容体に関する1C1 WTおよび1C1 Ser131Cys抗体に対する相対親和性を測定するBIACORE（登録商標）アッセイからの結果を表す。1C1 Ser131Cys抗体は、pH 6.0およびpH 7.4の両方において、1C1 WT抗体と類似した結合プロファイルでFcRn受容体に結合する。
【図１２−１】図12は、PC3細胞について行った抗体インターナリゼーション研究からの結果を表す。1組の対照が第1パネルに示されている。（A）においては、未染色細胞をDAP1で対比染色する。（B）においては、二次抗体のみで染色された細胞をDAPIで対比染色する。（C）においては、対照一次抗体R347を該細胞と共にインキュベートし、DAPIで対比染色する。（D）においては、該細胞を1時間インキュベートし、ついでR347で染色する。該対照（A〜D）はいずれも、抗体特異的細胞染色を何ら示していない。
【図１２−２】図12は、PC3細胞について行った抗体インターナリゼーション研究からの結果を表す。1組の対照が第1パネルに示されている。（E）においては、細胞を1C1 wt抗体と共に時間ゼロから1時間インキュベートする。1時間の時点における2つの代表的なイメージは1C1 WT抗体のインターナリゼーションを示している。（F）においては、細胞を1C1 Ser131Cys抗体と共に時間ゼロから1時間インキュベートする。1時間の時点における2つの代表的なイメージは1C1 Ser131Cys抗体のインターナリゼーションを示している。（G）においては、細胞を1C1 Ser134Cys抗体と共に時間ゼロから1時間インキュベートする。1時間の時点における2つの代表的なイメージは1C1 Ser134Cys抗体のインターナリゼーションを示している。
【図１２−３】図12は、PC3細胞について行った抗体インターナリゼーション研究からの結果を表す。（H）においては、細胞を1C1 Ser(131-132)Cys抗体と共に時間ゼロから1時間インキュベートする。1時間の時点における2つの代表的なイメージは1C1 Ser(131-132)Cys抗体のインターナリゼーションを示している。（I）においては、細胞を1C1 Ser(131-132-134-136)Cys抗体と共に時間ゼロから1時間インキュベートする。1時間の時点における2つの代表的なイメージは1C1 Ser(131-132-134-136)Cys抗体のインターナリゼーションを示している。該システイン操作抗体の全ては、野生型抗体と比較して類似した度合でインターナリゼーションされた。
【図１３】図13は結合特異性実験からの結果を表しており、ここで、該システイン操作抗体は、システイン操作前の野生型1C1と比べて同等の、EphA2に対する結合特異性を示した。2つの無関係な抗体（対照抗体1および2）の使用は、EphA2に対する、このELISA実験の特異性を証明している。また、システイン残基の複数置換は該抗体のそのコグネイト抗原に対する結合特異性を変化させない。これらの結果は、抗体のシステイン操作が、システイン操作前の抗体と比較して結合特異性を変化させないことを示している。
【図１４】図14は、遊離システインでの処理の前（レーン1〜8）または後（レーン9〜16）の、種々のシステイン操作抗体を使用するPEGとのコンジュゲーション反応からの結果を表す。未システイン処理レーンは、10mM 遊離システインでの該システイン操作抗体の処理と比較して、PEG化（PEGylation）（より高い分子量のバンド）のレベルの低下を示している。システイン操作前の抗体を含有する対照ウェルは、いずれの条件においても、検出可能なレベルのPEG化を示していない（レーン1、5、9および13）。該PEG化反応は37℃で120分間行った。サンプルを10％ NuPage MOPゲル上で移動させた。
【図１５】図15は、システイン操作抗体を脱キャップ化（uncapping）反応に付した実験からの結果を表す。該脱キャップ化反応は、全体的な抗体構造を損なうことなく、コンジュゲーションのために該操作システインを遊離させる。抗体1C1（野生型）（レーン2、8）、1C1 Ser134Cys（レーン3、9）、1C1 Thr135Cys（レーン4、10）、1C1 Ser136Cys（レーン5、11）、1C1 Thr139Cys（レーン6、12）を脱キャップ化反応に付し、非還元性PAGEにより分析した。示されたタンパク質プロファイルは、該脱キャップ化反応が、該脱キャップ化反応の前の抗体と比較して（レーン2〜6）、全体的な抗体構造を不安定化しないことを実証している（レーン8〜12）。
【図１６】図16は、種々のシステイン操作抗体がビオチンにコンジュゲートされた実験からの結果を表す。簡潔に説明すると、該システイン操作抗体および対照を脱キャップ化反応に付し、ついで、マレイミド-PEG2-ビオチンを含有するコンジュゲーション反応内に配置した。ついで未反応コンジュゲートを除去した。陽性対照はウエスタンブロット分析により強力なビオチン染色を示している（レーン1）。対照1C1抗体は、検出可能なコンジュゲートビオチンを示さなかった（レーン3）。システイン操作抗体1C1 Ser134Cys（レーン4）、1C1 Thr135Cys（レーン5）、1C1 Ser136Cys（レーン6）および1C1 Thr139Cys（レーン7）はコンジュゲートビオチンに関して強力な染色を示している。また、該システイン操作抗体の軽鎖はビオチンコンジュゲーションを何ら示さないことが、この図から明らかである。該対照抗体（レーン1）の、低いほうのバンドは、高レベルの染色を示しており、一方、該システイン操作抗体の、より低いバンドおよびwt対応物は、低いほう（軽鎖）のバンド上の有意な染色を示していない（レーン3〜7）。
【図１７】図17は、システイン操作抗体が異種物質へのコンジュゲーションの後でそれらのコグネイト抗原に対する結合特異性を保有することを示す実験結果を表す。この実験においては、ビオチンにコンジュゲートされたシステイン操作抗体を、システイン操作前の親抗体と比較して抗原結合特異性の保有に関して分析した。ELISAに基づくアッセイは、コンジュゲートされたシステイン操作抗体1C1 Ser134Cys、1C1 Thr135Cys、1C1 Ser136Cysおよび1C1 Thr139Cysが、システイン操作およびコンジュゲーションの前の親抗体に非常に類似した、コグネイトEphA2抗原に対する結合プロファイルを示すことを実証している。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
6．詳細な説明
本発明は、抗体のCH1ドメインの表面上に存在する残基（図1Aを参照されたい）が、種々の物質へのコンジュゲーションが可能な部位を操作する試みにおけるシステインの置換に適しているという知見に基づく。
【００３３】
本発明の化合物には、システイン操作抗体が含まれ、ここで、CH1ドメインの131-139領域［ここで、該定常領域のナンバリングシステムは、親または野生型抗体の、Kabatら (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)に記載されているEUインデックスのものである］の1、2、3、4、5、6、7、8個またはそれ以上のアミノ酸がシステインアミノ酸で置換されている。システイン残基の単一の置換は、IgG分子のホモ二量体性により、生じた抗体における2つのシステイン残基の出現（提示）をもたらすことに注目すべきである。本発明の、生じたシステイン操作抗体は、薬物または化合物へのコンジュゲーションの目的のための少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18個またはそれ以上の遊離チオールを提示しうる。
【００３４】
いくつかの実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体はセリンからシステインへの置換を含む。他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体はトレオニンからシステインへの置換を含む。いくつかの実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、セリンおよびトレオニンの両方がシステインへと置換された置換を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、138および139［ここで、該定常領域のナンバリングシステムは、Kabatら (前掲)に記載されているEUインデックスのものである］から選択される位置における少なくとも1つの置換を含む。他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、138および139位から選択される少なくとも2つの置換を含む。他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、138および139位から選択される少なくとも3つの置換を含む。他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、138および139位から選択される少なくとも4つの置換を含む。他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、138および139位から選択される少なくとも5つの置換を含む。他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、138および139位から選択される少なくとも6つの置換を含む。他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、138および139位から選択される少なくとも7つの置換を含む。他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、138および139位から選択される少なくとも8つの置換を含む。他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、138および139位の置換を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は132および／または138位の置換を含まない。他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、IgG1分子のCH1ドメインの131-139領域またはその等価体に天然に存在するトレオニンおよび／またはセリンアミノ酸のみにおける置換を含む。
【００３７】
1つの実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、131、132、133、134、135、136、137、138および139からなる群より選択される位置においてセリンおよび／またはトレオニンがシステインで置換されたIgG1を含む。他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体はIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4形態に由来する。さらに他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は非IgG形態、例えばIgA1、IgA2、IgM、IgDまたはIgEに由来する。他の実施形態においては、本発明の抗体は、IgG1のCH1領域の131-139領域に対応する残基のシステイン操作を含む。もう1つの実施形態においては、本発明の抗体は、図1Cに記載されている種々の抗体形態において大まかに示されている残基のシステイン操作を含む。さらに他の実施形態においては、本発明の抗体は、抗体フラグメント、例えばFabおよびFab2分子形態（これらに限定されるものではない）を含む。
【００３８】
該IgG1分子のCH1ドメインの131-139領域は、図1Aに例示されているとおりに溶媒露出される。したがって、131-139ループは、種々の物質の部位特異的コンジュゲーションのための表面を促進するために拡張されうる（言い換えると、追加的なアミノ酸を含有しうる）と予想される。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体のCH1ドメインの131-139ループは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14または少なくとも15アミノ酸、拡張される。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体のCH1ドメインの131-139ループの拡張は131、132、133、134、135、136、137、138または139残基の後に生じる。他の実施形態においては、本発明の抗体のCH1ドメインの131-139ループの拡張は131、132、133、134、135、136、137、138または139残基の後に生じる。
【００３９】
他の実施形態においては、IgG1分子のCH1ドメインの131-139ループの拡張は任意のアミノ酸を含みうる。他の実施形態においては、該拡張は少なくとも1つの非天然システインアミノ酸を含む。他の実施形態においては、該拡張はトレオニンおよび／またはセリン残基を含む。他の実施形態においては、該拡張はまた、天然システイン残基から非システイン残基への置換と共役している。
【００４０】
もう1つの実施形態においては、システイン操作抗体は少なくとも1つの非天然ジスルフィド結合の形成を含む。該非天然ジスルフィド結合は鎖内または鎖間結合でありうる。該非天然ジスルフィド結合は2つの別々の抗体分子を互いに連結しうる。非天然ジスルフィド結合の形成は、別のシステイン残基に予め連結されていた少なくとも1つの遊離チオール基を遊離しうる。
【００４１】
遊離チオール基を提示させるためのシステイン残基の操作は抗体種の混合物をもたらし、ジスルフィド結合の位置の高度の可変性を示しうる。例えば、天然に存在する「カノニカル（canonical）」ジスルフィド結合（図1Bに例示）は、サンプル中に存在する抗体のいくつかにおいて表されうるに過ぎない。他の非天然システインの操作は「カノニカル」ジスルフィド結合以外のジスルフィド結合の形成を招きうると理解される。いくつかの実施形態においては、ジスルフィド結合は、重鎖の131-139領域内に存在するいずれかの非天然システイン残基と軽鎖との間で形成される。他の実施形態においては、ジスルフィド結合は、重鎖の131、132、133、134、135、136、137、138および／または139位に存在するいずれかの非天然システイン残基と軽鎖との間で形成される。
【００４２】
サンプル中の抗体に存在するジスルフィド位置の可変性を制限するために、システイン操作抗体は、ジスルフィド結合を除去するための、天然システイン残基から別の残基への代償性置換を含みうる。特定の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、ジスルフィド結合を除去するための、天然システイン残基（例えば、重鎖の220位に存在するシステイン）から別のアミノ酸への置換を含む。
【００４３】
少なくとも1つの非天然ジスルフィド結合の形成は、修飾前の抗体と比較して、本発明のシステイン操作抗体の安定性に影響を及ぼしうる。いくつかの実施形態においては、該非天然ジスルフィド結合は、システイン操作前の同一抗体と比較して該システイン操作抗体の安定性を増強しうる。他の実施形態においては、該非天然ジスルフィド結合は、システイン操作前の同一抗体と比較してシステイン操作抗体の安定性を低下させうる。
【００４４】
本発明のシステイン操作抗体はその野生型対応物の抗原結合能を保有する。1つの実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、システイン操作前の抗体と比較して実質的に同じアフィニティ（親和性）を示す。もう1つの実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、システイン操作前の抗体と比較して低下したアフィニティを示す。もう1つの実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は、システイン操作前の抗体と比較して増強されたアフィニティを示す。
【００４５】
本発明の抗体は、そのコグネイト抗原の1以上に対する高い結合アフィニティ（結合親和性）を有しうる。例えば、本明細書に記載されている抗体は、少なくとも2×105 M-1s-1、少なくとも5×105 M-1s-1、少なくとも106 M-1s-1、少なくとも5×106 M-1s-1、少なくとも107 M-1s-1、少なくとも5×107 M-1s-1または少なくとも108 M-1s-1の会合速度定数またはkon速度（抗体（Ab）+ 抗原->Ab-Ag）を有する。
【００４６】
もう1つの実施形態においては、抗体は、5×10-1 s-1未満、10-1 s-1未満、5×10-2 s-1未満、10-2 s-1未満、5×10-3 s-1未満、10-3 s-1未満、5×10-4 s-1未満または10-4 s-1未満のkoff速度（Ab-Ag -> Ab + Ag）を有しうる。もう1つの実施形態においては、本発明の抗体は、5×10-5 s-1未満、10-5 s-1未満、5×10-6 s-1未満、10-6 s-1未満、5×10-7 s-1未満、10-7 s-1未満、5×10-8 s-1、10-8 s-1未満、5×10-9 s-1未満、10-9 s-1未満または10-10 s-1未満のkoffを有しうる。
【００４７】
もう1つの実施形態においては、抗体は、少なくとも102 M-1、少なくとも5×102 M-1、少なくともl03 M-1、少なくとも5×103 M-1、少なくとも104 M-1、少なくとも5×104 M-1、少なくとも105 M-1、少なくとも5×105 M-1、少なくとも106 M-1、少なくとも5×106 M-1、少なくとも107 M-1、少なくとも5×107 M-1、少なくとも108 M-1、少なくとも5×108 M-1、少なくともl09 M-1、少なくとも5×l09 M-1、少なくとも1010 M-1、少なくとも5×1010 M-1、少なくとも1011 M-1、少なくとも5×1011 M-1、少なくとも1012 M-1、少なくとも5×1012 M-1、少なくとも1013 M-1、少なくとも5×l013 M-1、少なくとも1014 M-1、少なくとも5×1014 M-1、少なくともl015 M-1または少なくとも5×l015 M-1のアフィニティ定数またはKa (kon/koff)を有しうる。さらにもう1つの実施形態においては、抗体は、5×10-2 M未満、10-2 M未満、5×l0-3 M未満、l0-3 M未満、5×10-4 M未満、10-4 M未満、5×10-5 M未満、10-5 M未満、5×10-6 M未満、10-6 M未満、5×10-7 M未満、10-7 M未満、5×10-8 M未満、10-8 M未満、5×l0-9 M未満、l0-9 M未満、5×10-10 M未満、10-10 M未満、5×10-11 M未満、10-11 M未満、5×10-12 M未満、10-12 M未満、5×10-13 M未満、l0-13 M未満、5×10-14 M未満、10-14 M未満、5×l0-15 M未満またはl0-15 M未満の解離定数またはKd (koff/kon)を有しうる。
【００４８】
本明細書に記載されている方法に従い使用される抗体は、本明細書に記載されている又は当業者に公知の方法（例えば、BIAcoreアッセイ、ELISA）（Biacore International AB, Uppsala, Sweden）を用いた評価で3000 pM未満、2500 pM未満、2000 pM未満、1500 pM未満、1000 pM未満、750 pM未満、500 pM未満、250 pM未満、200 pM未満、150 pM未満、100 pM未満、75 pM未満の解離定数（Kd）を有しうる。
【００４９】
Fc領域のモジュレーション
本発明はまた、改変されたFc領域（本明細書においては「変異Fc領域」とも称される）を含有するシステイン操作抗体を提供する。したがって、1つの実施形態においては、本発明の抗体は変異Fc領域（すなわち、後記のとおりに改変されたFc領域）を含む。変異Fc領域を含む本発明の抗体は本明細書においては「Fc変異タンパク質」とも称される。
【００５０】
変異Fc領域の説明においては、本発明の抗体のFc領域は、Kabatら（1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA）におけるのと同様のEUインデックスに従うナンバリングスキームを含むと理解される。
【００５１】
Fc領域の変異体（例えば、アミノ酸の置換および／または付加および／または欠失）はエフェクター機能を増強または軽減することが公知である（Prestaら, 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; 米国特許第5,624,821号、第5,885,573号およびPCT公開番号WO 00/42072、WO 99/58572およびWO 04/029207を参照されたい）。したがって、1つの実施形態においては、本発明の抗体は変異Fc領域を含む。1つの実施形態においては、抗体の変異Fc領域は、天然Fcに類似したレベルのエフェクター機能の誘導を示す。もう1つの実施形態においては、変異Fc領域は、天然Fcより高いエフェクター機能誘導を示す。もう1つの実施形態においては、変異Fc領域は、天然Fcより低いエフェクター機能誘導を示す。もう1つの実施形態においては、変異Fc領域は、天然Fcより高いADCC誘導を示す。もう1つの実施形態においては、変異Fc領域は、天然Fcより低いADCC誘導を示す。もう1つの実施形態においては、変異Fc領域は、天然Fcより高いCDC誘導を示す。もう1つの実施形態においては、変異Fc領域は、天然Fcより低いCDC誘導を示す。変異Fc領域の特定の実施形態を後記で詳細に示す。
【００５２】
また、エフェクター機能を増加または減少させるために、Fc領域のグリコシル化が改変されうることが当技術分野で公知である（例えば、Umanaら, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Daviesら, 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shieldsら, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawaら, 2003, J Biol Chem 278:3466-3473, 米国特許第6,602,684号; U.S. Ser. No. 10/277,370; U.S. Ser. No. 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent（商標）技術 (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb（商標）グリコシル化操作技術 (GLYCARTバイオテクノロジーAG, Zurich, Switzerland)を参照されたい）。
【００５３】
したがって、1つの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域はアミノ酸残基のグリコシル化の改変を含む。もう1つの実施形態においては、アミノ酸残基のグリコシル化の改変はエフェクター機能の低下をもたらす。もう1つの実施形態においては、アミノ酸残基のグリコシル化の改変はエフェクター機能の増加をもたらす。特定の実施形態においては、Fc領域は、軽減されたフコシル化を有する。もう1つの実施形態においては、Fc領域はフコシル化されていない（例えば、米国特許出願公開番号2005/0226867を参照されたい）。
【００５４】
最近の研究は、IgG分子上のオリゴ糖へのシアル酸の付加がそれらの抗炎症活性を増強し、それらの細胞傷害性を改変することを示唆している（Kenekoら, Science 313, 670-673(2006), Scallonら, Mol. Immuno. 2007 Mar;44(7):1524-34）。したがって、抗体治療剤の効力は、意図される用途に最も適合する糖形態の選択により最適化されうる。2つの抗体CH2ドメインの間に介在する2つのオリゴ糖鎖がFc領域のその受容体への結合に関与する。増加したシアリル化（シアル酸化）を有するIgG分子は抗炎症特性を有し、減少したシアリル化を有するIgG分子は、増強した免疫刺激特性を有することを、前記の研究は示している。したがって、抗体治療剤は、個々の用途のための適当なシアリル化プロファイルを有するよう「特製（tailor-made）」されうる。抗体のシアリル化状態のモジュレーションのための方法がWO2007/005786（題名“Methods And Compositions With Enhanced Therapeutic Activity”）およびWO2007/117505（題名“Polypeptides With Enhanced Anti-Inflammatory And Decreased Cytotoxic Properties And Related Methods”）（それらのそれぞれの全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００５５】
1つの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域は、基準未改変Fc領域と比べて改変されたシアリル化プロファイルを含む。1つの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域は、基準未改変Fc領域と比べて増加したシアリル化プロファイルを含む。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域は、基準未改変Fc領域と比べて約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％、約65％、約70％、約80％、約85％、約90％、約95％、約100％、約125％または約150％またはそれ以上のシアリル化における増加を含む。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域は、基準未改変Fc領域と比べて約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍またはそれ以上のシアリル化における増加を含む。
【００５６】
もう1つの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域は、基準未改変Fc領域と比べて減少したシアリル化プロファイルを含む。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域は、基準未改変Fc領域と比べて約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％、約65％、約70％、約80％、約85％、約90％、約95％、約100％、約125％、約150％またはそれ以上のシアリル化における減少を含む。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域は、基準未改変Fc領域と比べて約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍またはそれ以上のシアリル化における減少を含む。
【００５７】
タンパク質の半減期を増加させるためにFc領域を改変しうることも当技術分野で公知である。半減期の増加は、患者に投与する薬物の量の減少および投与の頻度の減少を可能にする。したがって、半減期の増加を伴う本発明の抗体は、FcとFcRn受容体との間の相互作用に関与するものとして特定されたアミノ酸残基を改変（例えば、置換、欠失または付加）することにより作製されうる（例えば、PCT公開番号97/34631および02/060919（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。また、本発明の抗体の半減期は、当技術分野で広く利用されている技術によるPEGまたはアルブミンへのコンジュゲーションにより増加されうる。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域は、基準未改変Fc領域と比べて約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％、約65％、約70％、約80％、約85％、約90％、約95％、約100％、約125％、約150％またはそれ以上の半減期の増加を含む。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域は、基準未改変Fc領域と比べて約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍またはそれ以上の半減期の増加を含む。
【００５８】
もう1つの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域は半減期の減少を有する。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域は、基準未改変Fc領域と比べて約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約60％、約65％、約70％、約80％、約85％、約90％、約95％、約100％、約125％、約150％またはそれ以上の半減期の減少を有する。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体のFc領域は、基準未改変Fc領域と比べて約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約20倍、約50倍またはそれ以上の半減期の減少を有する。
【００５９】
本発明は、比較されうる分子（例えば、野生型Fc領域を有する以外は同一のアミノ酸配列を有するタンパク質）と比べて改変された、Fcリガンド（例えば、Fc受容体、C1q）に対する結合特性を有するFc変異タンパク質を含む。結合特性の具体例には、結合特異性、平衡解離定数（KD）、解離および会合速度（それぞれkoffおよびkon）、結合アフィニティならびに／またはアビディティが含まれるが、これらに限定されるものではない。低いKDを有する結合性分子（例えば、Fc変異タンパク質、例えば、抗体）は、高いKDを有する結合性分子より好ましいであろうと一般に理解されている。しかし、いくつかの場合には、konまたはkoffの値がKDの値より重要でありうる。当業者は、与えられた抗体用途にとって、どの動力学的パラメーターが最も重要であるかを決定しうる。
【００６０】
Fc領域のそのリガンドに対するアフィニティおよび結合特性は、Fc-FcγR相互作用、すなわち、FcγRへのFc領域の特異的結合を決定するための当技術分野で公知の種々のin vitroアッセイ法（生化学的または免疫学的アッセイ）、例えば平衡法（例えば、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）またはラジオイムノアッセイ（RIA））または動力学（例えば、BIACORE（登録商標）分析）および他の方法、例えば間接結合アッセイ、競合阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）、ゲル電気泳動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）を含む当技術分野で公知の種々のin vitroアッセイ法（これらに限定されるものではない）により決定されうる。これら及び他の方法においては、検査されている1以上の成分上の標識を利用することが可能であり、および／または、色素原標識、蛍光標識、発光標識または同位体標識（これらに限定されるものではない）を含む種々の検出方法を利用することが可能である。結合アフィニティおよび動力学の詳細な説明は、抗体-免疫原相互作用を中心に説明しているPaul, W.E.編, Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)において見出されうる。
【００６１】
1つの実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子と比べて増強された、1以上のFcリガンドへの結合を示す。もう1つの実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子の場合より少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍以上大きい、Fcリガンドに対するアフィニティを有する。特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、Fc受容体への、増強された結合を示す。もう1つの特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、Fc受容体FcγRIIIAへの、増強された結合を示す。もう1つの特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、Fc受容体FcγRIIBへの、増強された結合を示す。さらにもう1つの特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、Fc受容体FcRnへの、増強された結合を示す。さらにもう1つの特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子と比べて増強された、C1qへの結合を示す。
【００６２】
ADCCにより標的細胞の細胞溶解を媒介するいずれかの特定のFc変異タンパク質の能力はアッセイ可能である。ADCC活性を評価するためには、関心のあるFc変異タンパク質を標的細胞に免疫エフェクター細胞と共に加え、これは、抗原抗体複合体により活性化されて、該標的細胞の細胞溶解を引き起こしうる。細胞溶解は、一般に、細胞溶解された細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光色素または天然細胞内タンパク質）の遊離により検出される。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。in vitro ADCCアッセイの具体例はWisecarverら, 1985 79:277-282; Bruggemannら, 1987, J Exp Med 166:1351-1361; Wilkinsonら, 2001, J Immunol Methods 258:183-191; Patelら, 1995 J Immunol Methods 184:29-38に記載されている。関心のあるFc変異タンパク質のADCC活性は、in vivo、例えば動物モデル、例えばClynesら, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:652-656に開示されているものにおいても評価されうる。
【００６３】
1つの実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子と比べて増強されたADCC活性を示す。特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子の場合より少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍大きいADCC活性を有する。もう1つの特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子と比べて、Fc受容体FcγRIIIAへの増強された結合を示し、増強されたADCC活性を示す。他の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子と比べて増強されたADCC活性および増加した血清半減期の両方を示す。
【００６４】
1つの実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子と比べて減少したADCC活性を示す。特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子の場合より少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍低いADCC活性を有する。もう1つの特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子と比べて、Fc受容体FcγRIIIAへの、低減した結合を示し、低減したADCC活性を示す。他の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子と比べて低減したADCC活性および増加した血清半減期の両方を示す。
【００６５】
1つの実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子と比べて増強されたCDC活性を示す。特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子の場合より少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または少なくとも50倍、または少なくとも100倍以上大きいCDC活性を有する。他の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子と比べて増強されたCDC活性および増強された血清半減期の両方を示す。1つの実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子と比べて低減した、1以上のFcリガンドへの結合を示す。もう1つの実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子の場合より少なくとも2倍、または少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも7倍、または少なくとも10倍、または少なくとも20倍、または少なくとも30倍、または少なくとも40倍、または少なくとも50倍、または少なくとも60倍、または少なくとも70倍、または少なくとも80倍、または少なくとも90倍、または少なくとも100倍、または少なくとも200倍低い、Fcリガンドに対するアフィニティを示す。特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、Fc受容体への、低減した結合を示す。もう1つの特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、Fc受容体FcγRIIIAへの、低減した結合を示す。もう1つの特定の実施形態においては、本明細書に記載されているFc変異体は、比較されうる分子の場合より少なくとも約5倍低い、Fc受容体FcγRIIIAに対するアフィニティを示し、ここで、該Fc変異体は、比較されうる分子の場合の約2倍以内である、Fc受容体FcγRIIBに対するアフィニティを示す。さらにもう1つの特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、Fc受容体FcRnへの、低減した結合を示す。さらにもう1つの特定の実施形態においては、Fc変異タンパク質は、比較されうる分子と比べて低減した、C1qへの結合を示す。
【００６６】
1つの実施形態においては、本発明は、Fc変異体を提供し、ここで、該Fc領域は、Kabatに記載されているとおりのEUインデックスにより番号付けされた場合に234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440および443からなる群より選択される1以上の位置における非天然アミノ酸残基を含む。場合によっては、該Fc領域は、当業者に公知の追加的および／または代替的位置の非天然アミノ酸残基を含みうる（例えば、米国特許第5,624,821号; 第6,277,375号; 第6,737,056号; PCT特許公開WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925およびWO 06/020114を参照されたい）。
【００６７】
特定の実施形態においては、本発明はFc変異体を提供し、ここで、該Fc領域は、Kabatに記載されているとおりのEUインデックスにより番号付けされた場合に234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236E, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241L, 241Y, 241E, 241R, 243W, 243L, 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Yおよび434Wからなる群より選択される少なくとも1つの非天然アミノ酸残基を含む。場合によっては、該Fc領域は、当業者に公知の追加的および／または代替的な非天然アミノ酸残基を含みうる（例えば、米国特許第5,624,821号; 第6,277,375号; 第6,737,056号; PCT特許公開WO 01/58957; WO 02/06919; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752およびWO 05/040217を参照されたい）。
【００６８】
抗体の製造方法
本発明のシステイン操作抗体は、抗体の合成のための当技術分野公知のいずれかの方法により、特に、化学合成または好ましくは組換え発現技術により製造されうる。
【００６９】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え及びファージディスプレイ技術またはそれらの組合せの使用を含む当技術分野で公知の多種多様な技術を用いて製造されうる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知であり例えばHarlowら, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerlingら, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, pp. 563-681 (Elsevier, N. Y., 1981)（それらの参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に教示されているものを含むハイブリドーマ技術を用いて製造されうる。本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」なる語は、ハイブリドーマ技術により製造された抗体には限定されない。「モノクローナル抗体」なる語は、任意の真核性、原核性またはファージクローンを含む単クローンに由来する抗体を意味し、それが製造された方法によらない。
【００７０】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を製造しそれに関してスクリーニングするための方法は、常套的なものであり当技術分野において良く知られている。簡潔に説明すると、マウスを標的抗原（完全長タンパク質またはそのドメイン、例えば細胞外ドメインまたはリガンド結合性ドメイン）で免疫化することが可能であり、免疫応答が検出されたら（例えば、該標的抗原に特異的な抗体が該マウス血清中で検出されたら）、該マウス脾臓を集め、脾細胞を単離する。ついで該脾細胞を、周知技術により、任意の適当な骨髄腫細胞（例えば、ATCCから入手可能な細胞系SP20からの細胞）に融合させる。ハイブリドーマを選択し、クローニングする（限界希釈により行う）。ついでハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドに結合しうる抗体を分泌する細胞に関して、当技術分野で公知の方法によりアッセイする。高レベルの抗体を一般に含有する腹水は、陽性ハイブリドーマクローンでマウスを免疫化することにより得られうる。
【００７１】
したがって、モノクローナル抗体は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することにより作製されうる。この場合、好ましくは、該ハイブリドーマは、標的抗原で免疫化されたマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合させ、ついで、特異的標的抗原に結合しうる抗体を分泌するハイブリドーマクローンに関して、該融合から生じたハイブリドーマをスクリーニングすることにより作製される。
【００７２】
特異的標的抗原エピトープを認識する抗体フラグメントは、当業者に公知のいずれかの技術により製造されうる。例えば、本発明のFabおよびF(ab')2フラグメントは、（Fabフラグメントを製造するための）パパインまたは（F(ab')2フラグメントを製造するための）ペプシンのような酵素を使用する免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断により製造されうる。F(ab')2フラグメントは可変領域、軽鎖定常領域および重鎖CH1ドメインを含有する。さらに、本発明の抗体は、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を用いることによっても製造されうる。
【００７３】
ファージディスプレイ法においては、機能的抗体ドメインが、それをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面上に提示される。特に、VHおよびVLドメインをコードするDNA配列を動物cDNAライブラリー（例えば、リンパ組織のヒトまたはマウスcDNAライブラリー）から増幅させる。VHおよびVLドメインをコードするDNAをscFvリンカーと共にPCRにより組換え、ファジミドベクター（例えば、pCANTAB6またはpComb 3 HSS）内にクローニングする。該ベクターを大腸菌（E. coli.）内にエレクトロポレーションし、該大腸菌（E. coli.）にヘルパーファージを感染させる。これらの方法において使用するファージは、典型的には、fdおよびM13を含む繊維状ファージであり、該VHおよびVLドメインを、通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIに組換え的に融合させる。関心のあるエピトープに結合する抗原結合性ドメインを発現するファージは、抗原を使用して、例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して選択または特定されうる。本発明の抗体を製造するために使用されうるファージディスプレイ法の具体例には、Brinkmanら, 1995, J. Immunol. Methods, 182: 41-50; Amesら, 1995, J. Immunol. Methods, 184: 177; Kettleboroughら, 1994, Eur. J. Immunol., 24: 952-958; Persicら, 1997, Gene, 187: 9; Burtonら, 1994, Advances in Immunology, 57: 191-280; 国際出願番号PCT/GB91/01134; 国際公開番号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401およびWO97/13844; ならびに米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号および第5,969,108号（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているものが含まれる。
【００７４】
前記参考文献に記載されているとおり、ファージ選択の後、該ファージからの抗体コード領域を単離し、それを使用して、ヒト抗体を含む全抗体または任意の他の所望の抗原結合性フラグメントを得、例えば後記に記載されている哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主内で発現させることが可能である。Fab、Fab'およびF(ab')2フラグメントを組換え的に製造するための技術も、国際公開番号WO 92/22324; Mullinaxら, 1992, BioTechniques, 12:864; Sawaiら, 1995, AJRI, 34: 26; およびBetterら, 1988, Science, 240: 1041（それらの参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているような当技術分野で公知の方法により用いられうる。
【００７５】
全抗体を製造するためには、VHまたはVLヌクレオチド配列、制限部位および該制限部位を保護するためのフランキング配列を含むPCRプライマーを使用して、scFvクローンにおける該VHまたはVL配列を増幅することが可能である。当業者に公知のクローニング技術を用いて、該PCR増幅VHドメインを、VH定常領域、例えばヒトガンマ4定常領域を発現するベクター内にクローニングすることが可能であり、該PCR増幅VLドメインを、VL定常領域、例えばヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクター内にクローニングすることが可能である。好ましくは、該VHまたはVLドメインを発現させるためのベクターはEF-1αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメイン、定常ドメインのためのクローニング部位、および選択マーカー（例えば、ネオマイシン）を含む。該VHおよびVLドメインを、必要な定常領域を発現する1つのベクター内にクローニングすることも可能である。ついで、当業者に公知の技術を用いて、完全長抗体、例えばIgGを発現する安定または一過性細胞系を作製するために、該重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞系内にコトランスフェクトする。
【００７６】
ヒトにおける抗体のin vivoでの使用およびin vitro検出アッセイを含むいくつかの用途には、ヒトまたはキメラ抗体を使用するのが好ましい場合がある。ヒト患者の治療には完全ヒト抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを使用する前記のファージディスプレイ法を含む当技術分野で公知の種々の方法により製造されうる。米国特許第4,444,887号および第4,716,111号; ならびに国際公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735およびWO 91/10741（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）も参照されたい。
【００７７】
また、ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現し得ないがヒト免疫グロブリン遺伝子を発現しうるトランスジェニックマウスを使用することによっても製造されうる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をランダムに又は相同組換えによりマウス胚幹細胞内に導入することが可能である。あるいは、該ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域および多様性領域をマウス胚幹細胞内に導入することが可能である。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に又は該導入と同時に、非機能性にされうる。特に、JH領域のホモ接合欠失は内因性抗体の産生を妨げる。該修飾胚幹細胞を増殖させ、胚盤胞内にマイクロインジェクションして、キメラマウスを作出する。ついで該キメラマウスを交配させて、ヒト抗体を発現するホモ接合後代を得る。該トランスジェニックマウスを、常法により、選択された抗原（例えば、本発明のポリペプチドの全部または一部）で免疫化する。通常のハイブリドーマ技術を用いて、該免疫化トランスジェニックマウスから該抗原に対するモノクローナル抗体を得ることが可能である。該トランスジェニックマウスにより保有されるヒト免疫グロブリントランスジーンはB細胞分化中に再構成され、ついでクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。したがって、そのような技術を用いて、治療的に有用なIgG、IgA、IgMおよびIgE抗体を製造することが可能である。ヒト抗体を製造するためのこの技術の総説として、LonbergおよびHuszar（1995, Int. Rev. Immunol., 13: 65-93）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を製造するためのこの技術ならびにそのような抗体を製造するためのプロトコールの詳細な考察には、例えば、国際公開WO 98/24893、WO 96/34096およびWO 96/33735ならびに米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号および第5,939,598号（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。また、Medarex（Princeton,NJ）のような企業が、前記と同様の技術を用いて、選択された抗原に対するヒト抗体を提供することに関わり得る。
【００７８】
キメラ抗体は、異なる抗体部分が、異なる免疫グロブリン分子に由来する分子、例えば、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体である。キメラ抗体の製造方法は当技術分野において公知である。例えば、Morrison, 1985, Science, 229: 1202; Oiら, 1986, BioTechniques, 4: 214; Gilliesら, 1989, J. Immunol. Methods, 125: 191-202; ならびに米国特許第6,311,415号、第5,807,715号、第4,816,567号および第4,816,397号（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。非ヒト種由来の1以上のCDRとヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを含むキメラ抗体は、例えば、CDRグラフティング（EP 239,400; 国際公開番号WO 91/09967; ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号および第5,585,089号）、ベニアリング（veneering）またはリサーフェシング（resurfacing）（EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28 (4/5): 489-498; Studnickaら, 1994, Protein Engineering, 7: 805; およびRoguskaら, 1994, PNAS, 91:969）、および鎖シャフリング（chain shuffling）（米国特許第5,565,332号）を含む当技術分野で公知の種々の技術を用いて製造されうる。
【００７９】
しばしば、該フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を改変（好ましくは改善）するためにCDR供与抗体由来の対応残基で置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で良く知られた方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定するための該CDRおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を特定するための配列比較により特定される（例えば、米国特許第5,585,089号およびRiechmannら, 1988, Nature, 332: 323（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。
【００８０】
ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域と非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するCDRとを含む、所定の抗原に結合しうる抗体またはその変異体またはそのフラグメントである。ヒト化抗体は、CDR領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン（すなわち、供与抗体）に対応し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。好ましくは、ヒト化抗体は免疫グロブリン定常領域（Fc）（典型的にはヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部をも含む。通常、該抗体は、軽鎖と、重鎖の少なくとも可変ドメインとの両方を含有するであろう。該抗体は重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3およびCH4領域をも含みうる。該ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgAおよびIgEならびにいずれかのアイソタイプ、例えばIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4を含む免疫グロブリンのいずれかのクラスから選択されうる。通常、定常ドメインは、ヒト化抗体が細胞傷害性活性を示すことが望まれる場合には、補体結合定常ドメインであり、該クラスは典型的にはIgG1である。そのような細胞傷害性活性が望ましくない場合には、定常ドメインはIgG2クラスのものでありうる。該ヒト化抗体は2以上のクラスまたはアイソタイプからの配列を含むことが可能であり、所望のエフェクター機能を最適化するために個々の定常ドメインを選択することは当技術分野における通常の技量の範囲内である。ヒト化抗体のフレームワークおよびCDR領域は親配列、例えば供与CDRに厳密に対応する必要はなく、あるいはコンセンサスフレームワークが少なくとも1つの残基の置換、挿入または欠失により突然変異誘発されて、その部位のCDRまたはフレームワーク残基がコンセンサスまたは移入抗体に対応しないようにされることが可能である。しかし、そのような突然変異は広範なものではないであろう。通常、該ヒト化抗体残基の少なくとも75％、より頻繁には90％、さらには95％以上が親フレームワーク領域（FR）およびCDR配列のものに対応するであろう。
【００８１】
ヒト化抗体は、例えば、CDRグラフティング（欧州特許番号EP 239,400; 国際公開番号WO 91/09967; ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号および第5,585,089号）、ベニアリングまたはリサーフェシング（欧州特許番号EP 592,106およびEP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28 (4/5): 489-498; Studnickaら, 1994, Protein Engineering, 7(6): 805-814; およびRoguskaら, 1994, PNAS, 91:969-973）、鎖シャフリング（米国特許第5,565,332号）、および例えば米国特許第6,407,213号、第5,766,886号、第5,585,089号、国際公開番号WO 9317105、Tanら, 2002, J. Immunol 169:1119-25、Caldasら, 2000, Protein Eng. 13:353-60、Moreaら, 2000, Methods 20:267-79、Bacaら, 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84、Roguskaら, 1996, Protein Eng. 9:895-904、Coutoら, 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s、Coutoら, 1995, Cancer Res. 55:1717-22、Sandhu, 1994, Gene 150:409-10, Pedersenら, 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73、Jonesら, 1986, Nature 321:522-525、Riechmannら, 1988, Nature 332:323、およびPresta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol 2:593-596に開示されている技術（これらに限定されるものではない）を含む当技術分野で公知の種々の技術を用いて製造されうる。しばしば、該フレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を改変（好ましくは改善）するためにCDR供与抗体由来の対応残基で置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定するための該CDRおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリング、ならびに特定の位置における異常なフレームワーク残基を特定するための配列比較により特定される（例えば、Queenら, 米国特許第5,585,089号およびRiechmannら, 1988, Nature, 332: 323（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。
【００８２】
さらに、本発明の抗体は今度は、当業者によく知られた技術を用いて、抗イディオタイプ抗体を作製するために使用されうる（例えば、Greenspan & Bona. 1989, FASEB J. 7:437-444; およびNissinoff, 1991, J. Immunol. 147:2429-2438を参照されたい）。本発明は、本発明の抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの使用を利用する方法を提供する。
【００８３】
他の実施形態においては、本発明は、システイン操作残基を含む単離されたCH1ドメインの発現を含む。そのような単離されたCH1ドメインは、提示目的のスカフォールドとして有用でありうる。他の実施形態においては、そのような単離されたCH1ドメインは、抗体軽鎖からのCカッパまたはCラムダサブユニットと共に使用されうる。
【００８４】
さらに他の実施形態においては、本発明の抗体は、少なくとも1つのシステイン残基を欠くヒンジ領域を含みうる。他の実施形態においては、本発明の抗体は、システイン残基を欠くヒンジ領域を含みうる。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は、全てのシステイン残基がセリンまたはトレオニンで置換されているヒンジ領域を含みうる。そのような抗体はコンジュゲーション効率の増加およびジスルフィド混乱状態の軽減を示しうる。
【００８５】
また、種々の刊行物は、FcRn結合性ポリペプチドを分子内に導入することにより（WO 97/43316、米国特許第5,869,046号、米国特許第5,747,035号、WO 96/32478、WO 91/14438）、またはFcRn結合アフィニティは維持されているが他のFc受容体に対するアフィニティは著しく低下している抗体と分子とを融合させることにより（WO 99/43713）、または抗体のFcRn結合ドメインとの融合により（WO 00/09560; 米国特許第4,703,039号）、半減期が改変された生理的に活性な分子を得るための方法を記載している。生理的に活性な分子の半減期を増加させるための具体的な技術および方法は、2006年8月1日付けで付与された米国特許第7,083,784号（題名“Antibodies with Increased Half-lives”）（それをあらゆる目的で参照により本明細書に組み入れることとする）にも見出されうる。特に、本発明の抗体は、アミノ酸残基突然変異：（KabatにおけるEUインデックスによる番号付けで）M252Y/S2541/T256EまたはH433K/N434F/Y436Hを含むFc領域を含む、と想定される。
【００８６】
抗体をコードするポリヌクレオチド
当技術分野で公知のいずれかの方法により、該ポリヌクレオチドは入手可能であり、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されうる。該抗体のアミノ酸配列は既知であるため、これらの抗体をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で周知の方法を用いて決定されうる。すなわち、本発明の抗体またはそのフラグメントをコードする核酸が得られるよう、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンをアセンブリさせる。該抗体をコードするそのようなポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチドからアセンブリされることが可能であり（例えば、Kutmeierら, 1994, BioTechniques 17:242に記載されているとおり）、簡潔に説明すると、これは、該抗体をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよび連結、ならびにそれに続く、PCRによる連結オリゴヌクレオチドの増幅を含む。
【００８７】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは適当な起源からの核酸から製造されうる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できないが該抗体の配列が既知である場合には、該免疫グロブリンをコードする核酸を化学合成し、または適当な起源（例えば、抗体cDNAライブラリー、または該抗体を発現する任意の組織もしくは細胞から作製されたcDNAライブラリー、またはそのような組織もしくは細胞から単離された核酸、好ましくは、ポリA + RNA）から得ることが可能であり、これは、該配列の3'および5'末端にハイブリダイズしうる合成プライマーを使用するPCR増幅により、または個々の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングにより行うことが可能であり、それにより、例えば、該抗体をコードするcDNAライブラリーからのcDNAクローンを特定することが可能である。ついで、PCRにより得られた増幅された核酸を、当技術分野でよく知られた任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクター内にクローニングすることが可能である。
【００８８】
該抗体のヌクレオチド配列が決定されたら、ヌクレオチド配列の操作のための当技術分野で周知の方法、例えば組換えDNA技術、部位特異的突然変異誘発、PCRなどを用いて［例えば、Sambrookら, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NYおよびAusubelら編, 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY（それらの両方の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている技術を参照されたい］、該抗体のヌクレオチド配列を操作して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を得、そのようにして、例えばアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を行うことが可能である。
【００８９】
特定の実施形態においては、通常の組換えDNA技術を用いて、該CDRの1以上をフレームワーク領域内に挿入することが可能である。該フレームワーク領域は、天然またはコンセンサスフレームワーク領域であることが可能であり、好ましくはヒトフレームワーク領域である（例えば、ヒトフレームワーク領域の一覧は、Chothiaら, 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479を参照されたい）。好ましくは、フレームワーク領域およびCDRの組合せにより作製されたポリヌクレオチドは、EphA2またはEphA4に特異的に結合する抗体をコードしている。好ましくは、前記のとおり、1以上のアミノ酸置換は該フレームワーク領域内に施され、好ましくは、該アミノ酸置換は該抗体のその抗原への結合を改善する。また、そのような方法を用いて、鎖内ジスルフィド結合に関与する1以上の可変領域システイン残基のアミノ酸の置換または欠失を施して、1以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体を得ることが可能である。該ポリヌクレオチドに対する他の改変も本発明に含まれ、通常の技量の範囲内である。
【００９０】
抗体の組換え発現
本発明の抗体、その誘導体、類似体またはフラグメントの組換え発現は、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を要する。本発明の抗体または抗体の重もしくは軽鎖またはそれらの一部をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野で周知の技術を用いる組換えDNA技術により、該抗体の製造のためのベクターを製造することが可能である。したがって、抗体コードヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによるタンパク質の製造方法が本明細書に記載されている。抗体コード配列と適当な転写および翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築するためには、当業者に周知の方法が用いられうる。これらの方法には、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えが含まれる。
【００９１】
したがって、本発明は、プロモーターに機能的に連結された、本発明の抗体、抗体の重または軽鎖、抗体の重または軽鎖可変ドメインまたはその一部、あるいは重または軽鎖CDRをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、該抗体の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことが可能であり（例えば、国際公開番号WO 86/05807およびWO 89/01036ならびに米国特許第5,122,464号を参照されたい）、全重鎖、全軽鎖または全重鎖および軽鎖の両方の発現のために、そのようなベクター内に該抗体の可変ドメインがクローニングされうる。
【００９２】
発現ベクターを通常の技術により宿主細胞内に導入し、ついで該トランスフェクト化細胞を通常の技術により培養して、本発明の抗体を得る。したがって、本発明は、異種プロモーターに機能的に連結された、本発明の抗体またはそのフラグメント、あるいはその重または軽鎖、あるいはそれらの一部、あるいは本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現のための或る実施形態においては、後記で詳しく説明するとおり、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを、免疫グロブリン分子全体の発現のために、宿主細胞内で共発現させることが可能である。
【００９３】
本発明の抗体を発現させるために、種々の宿主-発現ベクター系が使用されうる（例えば、米国特許第5,807,715号を参照されたい）。そのような宿主-発現系は、ビヒクルに相当し、該ビヒクルにより関心のあるコード配列が産生され次いで精製されうるが、それのみならず、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合に本発明の抗体をin situで発現しうる細胞にも相当する。これらは、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、E. coliおよびB. subtilis）、抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Saccharomyces Pichia）のような微生物、抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）で形質転換された又は組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス, CaMV; タバコモザイクウイルス, TMV）に感染した植物細胞系、および哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保持する哺乳類細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、293、NS0および3T3細胞）を包含するが、それらに限定されるものではない。好ましくは、Escherichia coliのような細菌細胞、およびより好ましくは、特に全組換え抗体分子の発現には真核細胞を、組換え抗体の発現に使用する。
【００９４】
例えば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間（major intermediate）初期遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組合されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）のような哺乳類細胞は、抗体のための有効な発現系である（Foeckingら, 1986, Gene, 45: 101およびCockettら, 1990, BioTechnology, 8: 2）。
【００９５】
細菌系においては、発現される抗体に意図される用途に応じて多数の発現ベクターが有利に選択されうる。例えば、抗体の医薬組成物の製造のために大量のそのようなタンパク質を製造したい場合には、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましいかもしれない。そのようなベクターは、大腸菌（E. coli）発現ベクターpUR278（Rutherら, 1983, EMBO, 12: 1791）（この場合、融合タンパク質が産生されるよう、該抗体コード配列は個々に、lacZコード領域とインフレームで該ベクター内に連結されうる）、pINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res., 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem., 24: 5503-5509）などを包含するが、これらに限定されるものではない。グルタチオン 5-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために、PGEXベクターも使用されうる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックス・グルタチオン-アガロース・ビーズへの吸着および結合、ならびにそれに続く、遊離グルタチオンの存在下の溶出により、溶解細胞から容易に精製されうる。クローン化標的遺伝子産物がGST部分から遊離されうるよう、該pGEXベクターは、トロンビンまたは因子Xaプロテアーゼ切断部位を含むよう設計される。
【００９６】
昆虫系においては、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）が使用される。該ウイルスはSpodoptera frugiperda細胞内で増殖する。該抗体コード配列は該ウイルスの非必須領域内に個々にクローニングされ、AcNPVプロモーターの制御下に配置されうる。
【００９７】
哺乳類宿主細胞においては、本発明の抗体分子を発現させるために、ウイルスに基づく多数の発現系が使用されうる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合には、関心のある抗体コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび三成分リーダー配列）に連結することが可能である。ついでこのキメラ遺伝子をin vitroまたはin vivo組換えによりアデノウイルスゲノム内に挿入することが可能である。該ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域E1またはE3）内の挿入は、感染宿主内で該抗体を発現しうる生存可能な組換えウイルスを与える（例えば、Logan & Shenk, 1984, PNAS, 81: 6355-6359を参照されたい）。挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のためには、特異的開始シグナルも要求されうる。これらのシグナルはATG開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、該全インサートの翻訳が保証されるためには、該開始コドンは所望のコード配列のリーディングフレームとフェーズが一致（同調）していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然物および合成物の両方を含む種々の起源に由来しうる。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含有させることにより増強されうる（例えば、Bitterら, 1987, Methods in Enzymol., 153: 516-544を参照されたい）。
【００９８】
また、該挿入配列の発現をモジュレーションし又は所望の特定の様態で該遺伝子産物を修飾しプロセシングする宿主細胞株を選択することが可能である。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は該タンパク質の機能に重要でありうる。種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。発現された外来タンパク質の適切な修飾およびプロセシングが保証されるよう、適当な細胞系または宿主系を選択することが可能である。この目的には、該遺伝子産物の一次転写産物の適当なプロセシング、グリコシル化およびリン酸化のための細胞装置を有する真核宿主細胞を使用することが可能である。そのような哺乳類宿主細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O、NS1およびT47D、NS0（いずれの免疫グロブリン鎖をも内因的に産生しないマウス骨髄腫細胞系）、CRL7O3OおよびHsS78Bst細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
組換えタンパク質の長期的な高収率の製造のためには、安定な発現が好ましい。例えば、該抗体を安定に発現する細胞系を操作することが可能である。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用する代わりに、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるDNAおよび選択マーカーで宿主細胞を形質転換することが可能である。外来DNAの導入の後、操作された細胞を強化培地内で1〜2日間増殖させ、ついで選択培地に移すことが可能である。該組換えプラスミド内の選択マーカーは該選択に対する耐性を付与し、細胞がその染色体内に該プラスミドを安定に組込みフォーカスを形成するまで増殖するのを可能にし、そしてそれをクローニングし、細胞系にまで増殖させることが可能である。この方法は、該抗体を発現する細胞系を操作するために有利に用いられうる。そのような操作された細胞系は、該抗体と直接的または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価において特に有用でありうる。
【０１００】
多数の選択系（限定的なものではないが以下のものが含まれる）が使用されうる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wiglerら, 1977, Cell, 11:223）、グルタミンシンテターゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowyら, 1980, Cell, 22:8-17）遺伝子は、それぞれtk-、gs-、hgprt-またはaprt- 細胞において使用されうる。また、以下の遺伝子に関する選択の基礎として、代謝拮抗物質耐性が用いられうる：dhfr, これはメトトレキセートに対する耐性を付与する（Wiglerら, 1980, PNAS 77:357およびO'Hareら, 1981, PNAS 78:1527）；gpt, これはミコフェノール酸に対する耐性を付与する（Mulligan & Berg, 1981, PNAS 78:2072）；neo, これはアミノグリコシドG418に対する耐性を付与する（WuおよびWu, 1991, Biotherapy, 3:87; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:573; Mulligan, 1993, Science 260:926; ならびにMorganおよびAnderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62:191; May, 1993, TIB TECH, 11:155-）、およびhygro, これはハイグロマイシンに対する耐性を付与する（Santerreら, 1984, Gene, 30:147）。所望の組換えクローンを選択するためには、組換えDNA技術の分野で一般に公知の方法を常套的に適用することが可能であり、そのような方法は、例えば、Ausubelら(編), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); ならびに第12および13章, Dracopoliら(編), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapinら, 1981, J. Mol. Biol., 150:1（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０１０１】
抗体の発現レベルはベクターの増幅により増加されうる（総説としては、BebbingtonおよびHentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987) を参照されたい）。抗体を発現するベクター系内のマーカーが増幅可能な場合には、宿主細胞の培養内に存在するインヒビターのレベルの増加は該マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。該増幅領域は該抗体遺伝子と結合しているため、該抗体の産生も増加することとなる（Crouseら, 1983, Mol. Cell. Biol., 3:257）。
【０１０２】
該宿主細胞は、本発明の2つの発現ベクター（第1ベクターは重鎖由来ポリペプチドをコードし、第2ベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードする）でコトランスフェクトされうる。それらの2つのベクターは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一選択マーカーを含有しうる。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードしておりそれらを発現しうる単一のベクターが使用されうる。そのような場合には、過剰な毒性遊離重鎖を避けるために、軽鎖は重鎖の前に配置されるべきである（Proudfoot, 1986, Nature, 322:52; およびKohler, 1980, PNAS 77:2197）。重鎖および軽鎖のコード配列はcDNAまたはゲノムDNAを含みうる。
【０１０３】
本発明のシステイン操作抗体が組換え発現により産生されたら、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、特に、プロテインA後の特異的抗原に関するアフィニティクロマトグラフィー、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術により、それを精製することが可能である。さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントは、精製を促進する本明細書に記載の又は当技術分野で公知の異種ポリペプチド配列に融合されうる。
【０１０４】
システイン操作抗体の規模改変可能な製造
多量の本発明のシステイン操作抗体を得るために、これを、規模改変可能（scalable）な方法（以下、「本発明の規模改変可能な方法」と称される）により製造することができる。いくつかの実施形態においては、システイン操作抗体は、該タンパク質の機能活性を維持しながら分析規模バイオリアクター（限定的なものではないが例えば、5L、10L、15L、30Lまたは50Lのバイオリアクター）において本発明のタンパク質を製造するために大規模化できる、研究実験室における本発明の規模改変可能な方法により製造することができる。例えば、1つの実施形態においては、本発明の規模改変可能な方法により製造されたタンパク質は、HPSECまたはrCGEにより測定された場合に低レベルないし検出不能レベルの凝集、すなわち、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下もしくは0.5％以下（タンパク質の重量％）の凝集、および／または低レベルないし検出不能レベルの断片化、すなわち、無傷操作抗体に相当するピークにおける全ピーク面積の80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、98％以上もしくは99％以上もしくは99.5％以上を示す。
【０１０５】
他の実施形態においては、該システイン操作抗体は、製造規模バイオリアクター（限定的なものではないが例えば、75L、100L、150L、300Lまたは500L）において本発明のタンパク質を製造するために大規模化されうる、研究実験室における本発明の規模改変可能な方法により製造されうる。いくつかの実施形態においては、本発明の規模改変可能な方法は、研究実験室において行われる製造方法と比べて製造効率をほとんど又は全く減少させない。他の実施形態においては、本発明の規模改変可能な方法は、約10 mg/L、約20 m/L、約30 mg/L、約50 mg/L、約75 mg/L、約100 mg/ L、約125 mg/L、約150 mg/L、約175 mg/L、約200 mg/L、約250 mg/Lまたは約300 mg/Lまたはそれ以上の製造効率でシステイン操作抗体を製造する。
【０１０６】
他の実施形態においては、本発明の規模改変可能な方法は、少なくとも約10 mg/L、少なくとも約20 mg/L、少なくとも約30 mg/L、少なくとも約50 mg/L、少なくとも約75 mg/L、少なくとも約100 mg/L、少なくとも約125 mg/L、少なくとも約150 mg/L、少なくとも約175 mg/L、少なくとも約200 mg/L、少なくとも約250 mg/L、少なくとも約300 mg/Lまたはそれ以上の製造効率でシステイン操作抗体を製造する。
【０１０７】
他の実施形態においては、本発明の規模改変可能な方法は、約10 mg/L〜約300 mg/L、約10 mg/L〜約250 mg/L、約10 mg/L〜約200 mg/L、約10 mg/L〜約175 mg/L、約10 mg/L〜約150 mg/L、約10 mg/L〜約100 mg/L、約20 mg/L〜約300 mg/L、約20 mg/L〜約250 mg/L、約20 mg/L〜約200 mg/L、約20 mg/L〜約175 mg/L、約20 mg/L〜約150 mg/L、約20 mg/L〜約125 mg/L、約20 mg/L〜約100 mg/L、約30 mg/L〜約300 mg/L、約30 mg/L〜約250 mg/L、約30 mg/L〜約200 mg/L、約30 mg/L〜約175 mg/L、約30 mg/L〜約150 mg/L、約30 mg/L〜約125 mg/L、約30 mg/L〜約100 mg/L、約50 mg/L〜約300 mg/L、約50 mg/L〜約250 mg/L、約50 mg/L〜約200 mg/L、約50 mg/L〜約175 mg/L、約50 mg/L〜約150 mg/L、約50 mg/L〜約125 mg/L、または約50 mg/L〜約100 mg/Lの製造効率でシステイン操作抗体を製造する。
【０１０８】
本発明の抗体の安定性を保証するために、適当なアッセイが開発されている。1つの実施形態においては、本発明のタンパク質の安定性は当技術分野における公知技術により特徴づけされる。他の実施形態においては、本発明のタンパク質の安定性は凝集および／または断片化の率（速度）またはプロファイルにより評価されうる。凝集または断片化のレベルを決定するためには、多数の技術が用いられうる。1つの実施形態においては、該凝集および／または断片化プロファイルは、分析用超遠心（AUC）、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）、高速サイズ排除クロマトグラフィー（HPSEC）、融解温度（Tm）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、キャピラリーゲル電気泳動（CGE）、光散乱（SLS）、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）、円偏光二色性（CD）、尿素誘発性タンパク質アンフォールディング技術、内在性トリプトファン蛍光、示差走査熱量測定または1-アニリノ-8-ナフタレンスルホン酸（ANS）タンパク質結合技術の使用により評価されうる。もう1つの実施形態においては、本発明のタンパク質の安定性はポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）分析により特徴づけされる。もう1つの実施形態においては、本発明のタンパク質の安定性はサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）プロファイル分析により特徴づけされる。
【０１０９】
抗体コンジュゲート
本発明は、標的化部分としての融合タンパク質（以下、「抗体コンジュゲート」と称される）を製造するための、異種物質に組換え的に融合された又は化学的にコンジュゲート（共有結合および非共有結合の両方を含む）されたシステイン操作抗体の使用を含む。該異種物質は、ポリペプチド（またはその断片、好ましくは、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90または少なくとも100アミノ酸のポリペプチド）、核酸、小分子（1000ダルトン未満）または無機もしくは有機化合物でありうる。該融合は必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して生じうる。異種物質に融合またはコンジュゲートされた抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて障害の進行を検出、治療、処置またはモニターするためにin vivoで使用されうる。例えば、国際公開WO 93/21232; EP 439,095; Naramuraら, 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; 米国特許第5,474,981号; Gilliesら, 1992, PNAS 89:1428-1432: およびFellら, 1991, J. Immunol 146:2446-2452（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。いくつかの実施形態においては、検出、治療、処置またはモニターされるべき障害は自己免疫疾患、炎症性疾患、感染症または癌関連障害である。ポリペプチドを抗体部分に融合またはコンジュゲートするための方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号および第5,112,946号; EP 307,434; EP 367,166; 国際公開番号WO 96/04388およびWO 91/06570; Ashkenaziら, 1991, PNAS 88: 10535-10539; Zhengら, 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; ならびにVilら, 1992, PNAS 89:11337-11341（それらの参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
【０１１０】
他の融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エキソンシャフリングおよび／またはコドンシャフリング（まとめて「DNAシャフリング」と総称される）の技術により製造されうる。DNAシャフリングは、本発明のシステイン操作抗体の活性を改変するために（例えば、より高いアフィニティおよびより低い解離速度を有する抗体）用いられうる。全般的には、米国特許第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号および第5,837,458号、ならびにPattenら, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16:76; Hanssonら, 1999, J. Mol Biol. 287:265、ならびにLorenzoおよびBlasco, 1998, BioTechniques 24:308（これらの特許および刊行物のそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。組換え前にエラープローンPCRによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入または他の方法に付すことにより、抗体もしくはそのフラグメントまたはコード化抗体もしくはそのフラグメントを改変することが可能である。抗体または抗体フラグメントをコードするポリヌクレオチドの部分の1以上を、1以上の異種分子の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、断片などの1以上と組換えることが可能である。
【０１１１】
1つの実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体またはそのフラグメントもしくは変異体は、マーカー配列、例えば精製を促進するペプチドに融合されうる。ある実施形態においては、該マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、pQEベクター（QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311）において提供されるタグのようなヘキサ-ヒスチジンペプチド（それらの多くは市販されている）である。例えばGentzら, 1989, PNAS 86:821に記載されているとおり、ヘキサ-ヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製をもたらす。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに相当する赤血球凝集素（HA）タグ（Wilsonら, 1984, Cell, 37:767）、およびいわゆる「flag」タグが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１２】
他の実施形態においては、本発明の抗体は診断用または検出可能な物質にコンジュゲートされる。そのような抗体は、臨床試験法の一部として障害（限定的なものではないが例えば癌）の発生または進行をモニタリングまたは予後診断する（例えば、特定の療法の有効性を決定する）のに有用でありうる。
【０１１３】
そのような診断および検出は、検出可能な物質に該抗体を結合させることにより達成されうる。検出可能な物質には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：限定的なものではないが例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-カラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼのような種々の酵素；限定的なものではないが例えばストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンのような補欠分子族；限定的なものではないが例えばウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンのような蛍光物質；発光物質、限定的なものではないが例えばルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンのような生物発光物質；限定的なものではないが例えばビスマス（213Bi）、炭素（14C）、クロム（51Cr）、コバルト（57Co）、フッ素（18F）、ガドリニウム（153Gd、159Gd）、ガリウム（68Ga、67Ga）、ゲルマニウム（68Ge）、ホルミウム（166Ho）、インジウム（115In、113In、111In、111In）、ヨウ素（131I、125I、123I、121I）、ランタニウム（140La）、ルテニウム（177Lu）、マンガン（54Mn）、モリブデン（99Mo）、パラジウム（103Pd）、リン（32P）、プラセオジム（142Pr）、プロメチウム（149Pm）、レニウム（186Re、188Re、）、ロジウム（105Rh）、ルテニウム（97Ru）、サマリウム（153Sm）、スカンジウム（47Sc）、セレニウム（75Se）、ストロンチウム（85Sr）、硫黄（35S）、テクネチウム（99Tc）、タリウム（201Ti）、スズ（113Sn、117Sn）、トリチウム（3H）、キセノン（133Xe）、イッテルビウム（169Yb、175Yb）、イットリウム（90Y）、亜鉛（65Zn）のような放射性物質；種々の陽電子放射断層撮影法を使用する陽電子放出性金属、ならびに非放射性常磁性金属イオンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１４】
他の実施形態においては、本発明のシステイン操作抗体は治療用物質、例えば細胞毒素、例えば静細胞または殺細胞物質、治療用物質または放射性金属イオン、例えばアルファ-放射体にコンジュゲートされる。細胞毒または細胞毒性物質には、細胞に有害な任意の物質が含まれる。具体例には以下のものが含まれる：パクリタキセル、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシンおよびシクロホスファミドならびにそれらの類似体またはホモログ。治療用物質には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルデカルバジン）; アルキル化剤（例えば、メクロルエタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（BCNU）およびロムスチン（CCNU）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、およびシスジクロロジアミン白金（II）（DDP）すなわちシスプラチン）; アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧称ダウノマイシン）およびドキソルビシン）; 抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧称アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（AMC））; ならびに抗有糸分裂物質（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）。
【０１１５】
1つの実施形態においては、細胞毒性物質は、エネジイン（enediyne）、レキシトロプシン（lexitropsin）、デュオカルマイシン（duocarmycin）、タキサン、ピューロマイシン、ドラスタチン、メイタンシノイド（maytansinoid）およびビンカアルカロイドからなる群より選択される。他の実施形態においては、細胞毒性物質は、パクリタキセル、ドセタキセル、CC-1065、SN-38、トポテカン、モルホリノ-ドキソルビシン、リゾキシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、ドラスタチン-10、エキノマイシン、コンブレタスタチン、カリケアマイシン（caliecheamicin）、メイタンシン（maytansine）、オーリスタチン（auristatin）または他のドラスタチン誘導体、例えばオーリスタチンEまたはオーリスタチンF、AEB、AEVB、AEFP、MMAE（モノメチルオーリスタチンE）、MMAF（モノメチルオーリスタチンF）、エリューテロビン（eleutherobin）またはネトロプシンである。オーリスタチンE（当技術分野においてはドラスタチン-10としても公知である）およびその誘導体の合成および構造は、米国特許出願公開番号2003/0083263 Alおよび2005/0009751 Al; 国際特許出願番号PCT/US02/13435、米国特許第6,323,315号、第6,239,104号、第6,034,065号、第5,780,588号、第5,665,860号、第5,663,149号、第5,635,483号、第5,599,902号、第5,554,725号、第5,530,097号、第5,521,284号、第5,504,191号、第5,410,024号、第5,138,036号、第5,076,973号、第4,986,988号、第4,978,744号、第4,879,278号、第4,816,444号および第4,486,414号（それらの全ての全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０１１６】
他の実施形態においては、本発明の抗体コンジュゲートの細胞毒性物質は抗チューブリン物質である。抗チューブリン物質は、十分に確立された癌治療用化合物の一群である。抗チューブリン物質の具体例には、タキサン（例えば、タキソール（登録商標）（パクリタキセル）、ドセタキセル）、T67（Tularik）、ビンカス（vincas）およびオーリスタチン（例えば、オーリスタチンE、AEB、AEVB、MMAE、MMAF、AEFP）が含まれるが、これらに限定されるものではない。このクラスに含まれる抗チューブリン物質としては以下のものも挙げられる：ビンカアルカロイド、例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビン; タキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルおよびバクカチン（baccatin）誘導体、エピチロンAおよびB、ノコダゾール、5-フルオロウラシルおよびコルシミド（colcimid）、エストラムスチン（estramustine）、クリプトフィシン（cryptophysins）、セマドチン（cemadotin）、メイタンシノイド（maytansinoid）、コンブレタスタチン（combretastatin）、ドラスタチン、ディスコデルモリド（discodermolide）およびエリューテロビン（eleutherobin）。より特定の実施形態においては、細胞毒性物質は、ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサン、バッカチン誘導体、クリプトフィシン（cryptophysins）、メイタンシノイド（maytansinoid）、コンブレタスタチン（combretastatin）およびドラスタチンからなる群より選択される。より特定の実施形態においては、細胞毒性物質はビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、VP-16、カンプトテシン、パクリタキセル、ドセタキセル、エピチロンA、エピチロンB、ノコダゾール、コルキシン（coichicine）、コルシミド（colcimid）、エストラムスチン（estramustine）、セマドチン（cemadotin）、ディスコデルモリド（discodermolide）、メイタンシン（maytansine）、DM-1、オーリスタチンまたは他のドラスタチン誘導体、例えばオーリスタチンEまたはオーリスタチンF、AEB、AEVB、AEFP、MMAE（モノメチルオーリスタチンE）、MMAF（モノメチルオーリスタチンF）、エリューテロビン（eleutherobin）またはネトロプシンである。
【０１１７】
特定の実施形態においては、該薬物は、抗チューブリン物質の一群であるメイタンシノイド（maytansinoid）である。より特定の実施形態においては、該薬物はメイタンシン（maytansine）である。さらに、特定の実施形態においては、細胞毒性または静細胞物質はDM-1（ImmunoGen, Inc.; Chariら, 1992, Cancer Res 52:127-131も参照されたい）である。天然物であるメイタンシンはチューブリン重合を抑制して有糸分裂の遮断および細胞死を招く。したがって、メイタンシンの作用メカニズムはビンクリスチンおよびビンブラスチンの場合に類似しているらしい。しかし、メイタンシンはin vitroにおいてこれらのビンカアルカロイドより約200〜1,000倍細胞毒性である。もう1つの特定の実施形態においては、該薬物はAEFPである。
【０１１８】
いくつかの実施形態においては、該抗体は、他の小分子またはタンパク質毒素、例えばアブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、バトラコトキシン、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、コレラ毒素、ファルカリノール（falcarinol）、フモニシン（fumonisin）B1、フモニシンB2、アルファ毒素、マウロトキシン（maurotoxin）、アジトキシン（agitoxin）、チャリブドトキシン（charybdotoxin）、マルガトキシン（margatoxin）、スロトキシン（slotoxin）、シルラトキシン（scyllatoxin）、ヘフトキシン（hefutoxin）、カルシセプチン（calciseptine）、タイカトキシン（taicatoxin）カルシクルジン（calcicludine）、ゲルダナマイシン（geldanamycin）、ゲロニン、ロタウストラリン（lotaustralin）、オクラトキシン（ocratoxin）A、パツリン（patulin）、リシン、ストリキニーネ、トリコテセン（trichothecene）、ゼアーレノン（zearlenone）およびテトラドトキシンにコンジュゲートされうるがこれらに限らない。
【０１１９】
毒素、スペーサー、リンカー、ストレッチャー（stretcher）などの他の具体例およびそれらの構造は米国特許出願公開番号2006/0074008 Al、2005/0238649 Al、2005/0123536 Al、2005/0180972 Al、2005/0113308 Al、2004/0157782 Al、米国特許第6,884,869 B2号、米国特許第5,635,483号（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に見出されうる。
【０１２０】
本明細書に記載されているとおり、本発明の抗体コンジュゲートへのコンジュゲーションに使用される化合物には、通常の化学療法剤、例えばドキソルビシン、パクリタキセル、カルボプラチン、メルファラン、ビンカアルカロイド、メトトレキセート、マイトマイシンC、エトポシドなどが含まれうる。また、強力な物質、例えばCC-1065類似体、カリキアマイシン（calichiamicin）、メイタンシン、ドラスタチン10の類似体、リゾキシンおよびパリトキシンを、条件的に安定なリンカーを使用して該抗体に連結して、強力な免疫コンジュゲートを形成させることが可能である。
【０１２１】
ある実施形態においては、細胞毒性または静細胞物質はドラスタチンである。より特定の実施形態においては、該ドラスタチンはオーリスタチンクラスのものである。本発明の特定の実施形態においては、細胞毒性または静細胞物質はMMAEである。本発明のもう1つの特定の実施形態においては、細胞毒性または静細胞物質はAEFPである。本発明のもう1つの特定の実施形態においては、細胞毒性または静細胞物質はMMAFである。
【０１２２】
他の実施形態においては、本発明の抗体は、与えられた生物学的応答を改変する治療用物質または薬物部分にコンジュゲートされる。治療用物質または薬物部分は古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、該薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドでありうる。そのようなタンパク質には例えば以下のものが含まれうる：アブリン、リシンA、シュードモナス外毒素、コレラ毒素またはジフテリア毒素のような毒素；腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アポトーシス剤、例えばTNF-α、TNF-β、AIM I（国際公開番号WO 97/33899を参照されたい）、AIM II（国際公開番号WO 97/34911を参照されたい）、Fasリガンド（Takahashiら, 1994, J. Immunol., 6: 1567）およびVEGf（国際公開番号WO 99/23105を参照されたい）のようなタンパク質；血栓性物質または抗血管新生物質、例えばアンジオスタチンまたはエンドスタチン; あるいは生物応答改変物質、例えばリンホカイン［例えば、インターロイキン1（「IL-1」）、インターロイキン2（「IL-2」）、インターロイキン4（「IL-4」）、インターロイキン6（「IL-6」）、インターロイキン7（「IL-7」）、インターロイキン9（「IL-9」）、インターロイキン15（「IL-15」）、インターロイキン12（「IL-12」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）および顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」））または増殖因子［例えば、成長ホルモン（「GH」）］。
【０１２３】
他の実施形態においては、本発明の抗体は、ポリアルギニンまたはポリ-リシン残基を含むポリペプチドにコンジュゲートされる。いくつかの実施形態においては、該ポリペプチドは5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態においては、該ポリ-アルギニンポリペプチドは少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個またはそれ以上のアルギニン残基を含みうる。他の実施形態においては、該ポリ-リシンポリペプチドは少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個またはそれ以上のリシン残基を含みうる。他の実施形態においては、該ポリペプチドはアルギニンおよびリシン残基の任意の組合せを含みうる。
【０１２４】
他の実施形態においては、本発明の抗体は、放射性金属イオン（放射性物質の具体例は前記を参照されたい）をコンジュゲートするのに有用な放射性物質または大環状キレーターのような治療用物質にコンジュゲートされる。ある実施形態においては、該大環状キレーターは、リンカー分子を介して該抗体に結合されうる1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N''-四酢酸（DOTA）である。本明細書中で後記において更に詳しく説明するそのようなリンカー分子は当技術分野で一般に公知であり、Denardoら, 1998, Clin. Cancer Res. 4:2483-90; Petersonら, 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; およびZimmermanら, 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50（それらの各々の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０１２５】
他の実施形態においては、本発明の抗体は核酸にコンジュゲートされる。該核酸は、DNA、RNA、短い干渉性RNA（siRNA）、マイクロRNA、ヘアピンまたは核酸模倣体、例えばペプチド核酸からなる群より選択されうる。いくつかの実施形態においては、該コンジュゲート核酸は少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも5000またはそれ以上の塩基対を有する。いくつかの実施形態においては、該コンジュゲート核酸は一本鎖である。他の実施形態においては、該コンジュゲート核酸は二本鎖である。
【０１２６】
いくつかの実施形態においては、該コンジュゲート核酸はオープンリーディングフレームをコードしている。いくつかの実施形態においては、該コンジュゲート核酸によりコードされるオープンリーディングフレ−ムはアポトーシス誘導性タンパク質、ウイルスタンパク質、酵素または腫瘍抑制タンパク質に対応する。そのような核酸を細胞へ運搬するための技術は、Songら, Nature Biotechnology, 2005, Vol23:6 p709-717、そしてまた、米国特許第6,333,396号（その全体を参照により本明細書に組み入れる）に見出されうる。
【０１２７】
治療用部分を抗体にコンジュゲートするための技術はよく知られている。そのような部分は、限定的なものではないがアルデヒド／シッフ連結、スルフヒドリル連結、酸不安定性連結、cis-アコニチル連結、ヒドラゾン連結、酵素分解性連結を含む当技術分野で公知の任意の方法により抗体にコンジュゲートされうる（全般的には、Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216を参照されたい）。治療用部分を抗体にコンジュゲートするための追加的技術はよく知られている。例えば、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeldら(編), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)中のArnonら, “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”; Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinsonら(編), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)中のHellstromら,“Antibodies For Drug Delivery”; Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pincheraら(編), pp. 475-506 (1985)中のThorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”;Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinら(編), pp. 303-16 (Academic Press 1985) 中の“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”; およびThorpeら, 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。抗体をポリペプチド部分に融合またはコンジュゲートするための方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号および第5,112,946号; EP 307,434、EP 367,166; 国際公開番号WO 96/04388およびWO 91/06570; Ashkenaziら, 1991, PNAS 88:10535-10539; Zhengら, 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; およびVilら, 1992, PNAS 89:11337-11341を参照されたい。そのような部分への抗体の融合は必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して生じうる。そのようなリンカー分子は当技術分野で一般に公知であり、Denardoら, 1998, Clin Cancer Res. 4:2483-90; Petersonら, 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; Zimmermanら, 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943-50; Garnett, 2002, Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216（それらの各々の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０１２８】
本発明の抗体コンジュゲートにより標的化される細胞の外部における薬物活性を最小にするためには、2つのアプローチが考慮されうる。第1のアプローチにおいては、薬物（プロドラッグ変換酵素の作用により産生された薬物を含む）が活性化リンパ球の細胞表面に集中するよう、細胞膜受容体には結合するが可溶性受容体には結合しない抗体が使用されうる。本発明の抗体に結合した薬物の活性を最小にするためのもう1つのアプローチは、該薬物が加水分解または該抗体から切断されない限りはその活性が低下する様態で該薬物をコンジュゲートすることである。そのような方法は、活性化リンパ球の細胞表面における環境（例えば、活性化リンパ球の細胞表面に存在するプロテアーゼの活性）またはコンジュゲートが活性化リンパ球により取り込まれた場合に該コンジュゲートが遭遇する活性化リンパ球の内部の環境（例えば、エンドソーム内、またはリソソーム環境中、例えばpH感受性もしくはプロテアーゼ感受性により）に対して感受性であるリンカーで該薬物を該抗体に結合させることを用いるものである。本発明において使用されうるリンカーの具体例は米国特許出願公開番号2005/0123536 Al、2005/0180972 Al、2005/0113308 Al、2004/0157782 Alおよび米国特許第6,884,869 B2号（それらの全ての全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０１２９】
1つの実施形態においては、該リンカーは、リソソーム中で加水分解される酸不安定性ヒドラゾンまたはヒドラジド基である（例えば、米国特許第5,622,929号を参照されたい）。他の実施形態においては、薬物は、他の酸不安定性リンカー、例えばcis-アコニット酸アミド、オルトエステル、アセタールおよびケタールを介して抗体に付加されうる（DubowchikおよびWalker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Nevilleら, 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661）。そのようなリンカーは中性pH条件下、例えば血中の条件下では比較的安定であるが、リソソームのおおよそのpHであるpH 5より下では不安定である。
【０１３０】
他の実施形態においては、薬物は、細胞内プロテアーゼにより切断されるペプチドスペーサーを使用して、本発明の抗体に付加される。標的酵素には、カテプシンBおよびDならびにプラスミンが含まれ、これらは全て、ジペプチド薬誘導体を加水分解して、標的細胞の内部で活性薬を遊離することが知られている（DubowchikおよびWalker, 1999, Pharm, Therapeutics 83:67-123）。細胞内タンパク質分解薬物放出を用いる利点は、該薬物が、コンジュゲートされている場合には非常に弱められており、該コンジュゲートの血清安定性が非常に高くなりうることである。
【０１３１】
さらに他の実施形態においては、該リンカーは、マロナートリンカー（Johnsonら, 1995, Anticancer Res. 15:1387-93）、マレイミドベンゾイルリンカー（Lauら, 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304）または3'-N-アミド類似体（Lauら, 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(103 : 1305- 12）である。
【０１３２】
前記のとおり、抗体コンジュゲートは、一般に、リンカーを介して化合物または薬物を抗体にコンジュゲートすることにより製造される。本発明のコンジュゲートにおいては、当技術分野で公知の任意のリンカー、例えば二官能性物質（例えばジアルデヒドまたはイミドエステル）または分枝ヒドラゾンリンカー（例えば、米国特許第5,824,805号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）が使用されうる。
【０１３３】
本発明の或る非限定的な実施形態においては、コンジュゲート部分と抗体部分との間のリンカー領域は或る条件下で切断可能であり、この場合、該リンカーの切断または加水分解により該抗体部分から該薬物部分が遊離する。いくつかの実施形態においては、該リンカーは細胞内条件下で切断または加水分解に感受性である。
【０１３４】
1つの実施形態においては、コンジュゲート部分と抗体部分との間のリンカー領域は、pHが或る値だけ変化し又は或る値を超えた場合に切断可能である。本発明のもう1つの実施形態においては、該リンカーは、リソソームの環境中、例えば酸性条件下（すなわち、約5〜5.5またはそれ未満のpH）で切断可能である。他の実施形態においては、該リンカーは、リソソームプロテアーゼ酵素、膜結合プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼ（これらに限定されるものではない）を含むペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素により切断されるペプチジルリンカーである。典型的には、該リンカーは、少なくとも2アミノ酸長、より典型的には少なくとも3アミノ酸長である。例えば、癌組織において高度に発現されるチオール依存性プロテアーゼであるカテプシンBにより切断可能なペプチジルリンカー（例えば、Gly-Phe-Leu-Glyリンカー）が使用されうる。他のそのようなリンカーは例えば米国特許第6,214,345号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０１３５】
本発明の他の非相互的排他的実施形態においては、本発明の抗体コンジュゲートの抗体および化合物がコンジュゲートされているリンカーは、細胞インターナリゼーションを促進する。ある実施形態においては、該リンカー-薬物部分は細胞インターナリゼーションを促進する。ある実施形態においては、該リンカーは、抗体コンジュゲート全体の構造が細胞インターナリゼーションを促進するよう選択される。1つの実施形態においては、該リンカーはチオエーテルリンカーである（例えば、Willnerら, 米国特許第5,622,929号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。もう1つの実施形態においては、該リンカーはヒドラゾンリンカーである（例えば、Greenfieldら, 米国特許第5,122,368号およびKingら, 米国特許第5,824,805号（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）。
【０１３６】
さらに他の実施形態においては、該リンカーはジスルフィドリンカーである。種々のジスルフィドリンカーが当技術分野で公知であり、それらには、以下のものを使用して形成されうるもの（それらに限定されるものではない）が含まれる：SATA（N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセタート）、SPDP（N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオナート）、SPDB（N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)ブチラート）およびSMPT（N-スクシンイミジル-オキシカルボニル-アルファ-メチル-アルファ-(2-ピリジル-ジチオ)トルエン）。SPDBおよびSMPT（例えば、Thorpeら, 1987, Cancer Res., 47:5924-5931; Wawrzynczakら, 1987, In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer, C. W. Vogel編, Oxford U. Press, pp. 28-55を参照されたい; また、Thorpeら,米国特許第4,880,935号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）も参照されたい）。
【０１３７】
本発明の組成物および方法と共に使用されうる種々のリンカーが米国特許出願公開番号US 2004/0018194 Al（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０１３８】
本発明の更に他の実施形態においては、抗体コンジュゲートのリンカー単位は、細胞毒性または静細胞物質（薬物単位; -D）と抗体単位（-A）とを連結する。ある実施形態においては、該リンカー単位は、一般式：
i．-Ta-Ww-Yy-（ここで、
ii．-T-は伸長単位であり、
iii．aは0または1であり、
iv．各-W-は、独立して、アミノ酸単位であり、
v．wは、独立して、2〜12の範囲の整数であり、
vi．-Y-はスペーサー単位であり、そして
vii．yは0、1または2である。）を有する。
【０１３９】
伸長単位（-T-）は、存在する場合には、該抗体単位をアミノ酸単位（-W-）に連結する。天然で又は化学的操作により抗体上に存在しうる有用な官能基には、スルフヒドリル、アミノ、ヒドロキシル、炭水化物のアノマー性ヒドロキシル基およびカルボキシルが含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明のシステイン操作抗体はコンジュゲーションのために少なくとも1つの遊離スルフヒドリル基を提供する。遊離スルフヒドリル基を導入する他の方法は抗体の分子内ジスルフィド結合の還元を含む。あるいは、スルフヒドリル基は、抗体のリシン部分のアミノ基と、2-イミノチオラン（トラウト試薬）または他のスルフヒドリル生成試薬との反応により生成されうる。
【０１４０】
アミノ酸単位（-W-）は、スペーサー単位が存在する場合には、伸長単位（-T-）をスペーサー単位（-Y-）に連結し、スペーサー単位が存在しない場合には、伸長単位を細胞毒性または静細胞物質（薬物単位; D）に連結する。
【０１４１】
いくつかの実施形態においては、-Ww-はジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドまたはドデカペプチド単位である。該リンカー単位のアミノ酸は、腫瘍関連プロテアーゼ（これに限定されるものではない）を含む酵素により酵素的に切断されて該薬物単位（-D-）を遊離することが可能であり、これは、遊離に際してin vivoでプロトン化されて細胞毒性薬物（D）となる。
【０１４２】
1つの実施形態においては、該アミノ酸単位はフェニルアラニン-リシンジペプチド（phe-lysまたはFKリンカー）である。もう1つの実施形態においては、該アミノ酸単位はバリン-シトルリンジペプチド（val-citすなわちVCリンカー）である。
【０１４３】
スペーサー単位（-Y-）は、存在する場合には、アミノ酸単位を該薬物単位に連結する。スペーサー単位は以下の2つの一般的タイプのものである：自己犠牲および非自己犠牲。非自己犠牲スペーサー単位は、該抗体-リンカー-薬物コンジュゲートまたは該薬物-リンカー化合物からアミノ酸単位の酵素切断の後に該スペーサー単位の一部または全部が該薬物部分に結合したままのものである。非自己犠牲スペーサー単位の具体例には、（グリシン-グリシン）スペーサー単位およびグリシンスペーサー単位が含まれるが、これらに限定されるものではない。グリシン-グリシンスペーサー単位またはグリシンスペーサー単位を含有する本発明の抗体-リンカー-薬物コンジュゲートが腫瘍細胞関連プロテアーゼ、癌細胞関連プロテアーゼまたはリンパ球関連プロテアーゼによる酵素切断を受けると、グリシン-グリシン-薬物部分またはグリシン-薬物部分がA-T-Ww-から切断される。該薬物を遊離させるためには、標的細胞内で、該グリシン-薬物単位結合を切断するための独立した加水分解反応が生じるべきである。
【０１４４】
自己犠牲スペーサーの他の具体例には、PAB基と電子的に等価である芳香族化合物、例えば2-アミノイミダゾール-5-メタノール誘導体（例えば、Hayら, Bioorg, Med. Chem. Lett., 1999, 9, 2237を参照されたい）およびオルトまたはパラ-アミノベンジルアセタールが含まれるが、これらに限定されるものではない。アミド結合の加水分解に際して容易な環化を受けるスペーサー、例えば、置換および非置換4-アミノ酪酸アミド（Rodriguesら, Chemistry, Biology, 1995, 2, 223）、適切に置換された環系（Stormら, J. Amer. Chem. Soc, 1972, 94, 5815）および2-アミノフェニルプロピオン酸アミド（Amsberryら, J. Org. Chem,, 1990, 55, 5867）が使用されうる。グリシンのα位において置換されたアミン含有薬物の除去（Kingsburyら, J. Med. Chem., 1984, 27, 1447）も、本発明の抗体-リンカー-薬物コンジュゲートに適用されうる自己犠牲スペーサー法の具体例である。
【０１４５】
抗体に異種分子をコンジュゲートする方法
本発明の抗体には、該操作システイン残基が提供する遊離チオール基を介して、例えば本明細書に記載されているような異種分子が効率的にコンジュゲートされうる。1つの態様においては、本発明は、異種分子をシステイン操作抗体に効率的にコンジュゲートするための方法を提供する。1つの実施形態においては、異種分子のコンジュゲーションは、抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、138および139位から選択される少なくとも1つの操作システイン残基により提供される遊離チオール基において生じうる。他の実施形態においては、本発明の方法は、抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、138および139位から選択される少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7または少なくとも8個の操作システイン残基により提供される遊離チオール基における異種分子の効率的なコンジュゲーションを含む。
【０１４６】
抗体への非天然システイン残基の操作は重鎖および軽鎖のジスルフィド対形成を変更することが可能であり、その結果、ジスルフィド結合の一部であった天然システイン残基が遊離され、コンジュゲーション可能な遊離チオール基を提供する。もう1つの実施形態においては、本発明の方法は、抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、138および139位から選択される少なくとも1つの操作システイン残基により提供されたものではない遊離チオール基におけるシステイン操作抗体への異種分子の効率的なコンジュゲーションを含む。
【０１４７】
抗体における遊離チオール基の存在は、当技術分野で受け入れられている種々の技術（例えば、実施例1に記載されているもの）により決定されうる。抗体への異種分子のコンジュゲーションの効率は、コンジュゲーション反応の後に残留する遊離チオールの存在を評価することにより決定されうる。1つの実施形態においては、本発明は、システイン操作抗体に異種分子を効率的にコンジュゲートする方法を提供する。1つの実施形態においては、該コンジュゲーション効率は、コンジュゲーション反応の後に残留する遊離チオール基のレベルにより測定した場合、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％またはそれ以上である。
【０１４８】
もう1つの実施形態においては、本発明は、抗体に異種分子をコンジュゲートする方法を提供し、ここで、該抗体は、2以上の遊離チオール基が形成されるよう少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。もう1つの実施形態においては、本発明の方法は、少なくとも2、少なくとも4、少なくとも6、少なくとも8、少なくとも10、少なくとも12、少なくとも14、少なくとも16またはそれ以上の遊離チオール基が形成されるよう少なくとも1つのアミノ酸置換を有する抗体を含む。
【０１４９】
コンジュゲーション可能な本発明の抗体は、遮断またはキャップ化されたスルフヒドリル基を含む遊離システイン残基を含有しうる。そのようなキャップは、スルフヒドリル基と相互作用しコンジュゲート形成を妨げ又は抑制するタンパク質、ペプチド、イオンおよび他の物質含む。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体はコンジュゲーション反応前に脱キャップ化を要しうる。特定の実施形態においては、本発明の抗体は脱キャップ化され、コンジュゲーション可能な遊離スルフヒドリル基を提示する。他の特定の実施形態においては、本発明の抗体は、天然ジスルフィド結合を妨げたり再構成したりしない脱キャップ化反応に付される。他の実施形態においては、本発明の抗体は、実施例9または10に記載されている脱キャップ化反応に付される。
【０１５０】
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は、コンジュゲートされるべき抗体が少なくとも1mg/ml、少なくとも2mg/ml、少なくとも3mg/ml、少なくとも4mg/ml、少なくとも5mg/mlまたはそれ以上の濃度で存在するコンジュゲーション反応に付されうる。
【０１５１】
抗体コンジュゲートの使用方法
本発明の抗体コンジュゲートは、種々の疾患または障害（例えば、腫瘍抗原の過剰発現により特徴づけられるもの）を治療するために使用されうると想定される。典型的な疾患または過剰増殖性障害には、良性または悪性の腫瘍、白血病およびリンパ系悪性疾患が含まれる。その他には、ニューロン、グリア、星状膠、視床下部、腺性、マクロファージ、上皮、内皮および支質悪性疾患が含まれる。他の癌または過剰増殖性障害には、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸部、皮膚、骨、肺、結腸、直腸、結腸直腸、胃、脾臓、腎臓、骨格筋、皮下組織、転移性メラノーマ、子宮内膜、前立腺、乳房、卵巣、精巣、甲状腺、血液、リンパ節、腎臓、肝臓、膵臓、脳または中枢神経系の癌が含まれる。本発明の方法により予防、処置、治療または改善されうる癌の具体例には、頭部、頸部、眼、口、喉、食道、胸部、骨、肺、結腸、直腸、胃、前立腺、乳房、卵巣、腎臓、肝臓、膵臓および脳の癌が含まれるが、これらに限定されるものではない。追加的な癌には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：白血病、限定的なものではないが例えば急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、例えば骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病性白血病および骨髄形成異常症候群、慢性白血病、限定的なものではないが例えば慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ性白血病、へアリー細胞白血病; 真性多血症; リンパ腫、限定的なものではないが例えばホジキン病、非ホジキン病; 多発性骨髄腫、限定的なものではないが例えば、くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性（nonsecretory）骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、単発性形質細胞腫および髄外性形質細胞腫; ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症; 意義不明の単クローン性高ガンマグロブリン異常症; 良性単クローン性γグロブリン異常症; 重鎖病; 骨癌および結合組織肉腫、限定的なものではないが例えば骨肉腫、骨髄腫骨疾患、多発性骨髄腫、真珠腫誘発性骨肉腫、骨パジェット病、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部肉腫、血管肉腫、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経線維鞘腫、横紋筋肉腫および骨膜肉腫; 脳腫瘍、限定的なものではないが例えば神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起神経膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫および原発性脳リンパ腫；乳癌、限定的なものではないが例えば腺癌、小葉（小細胞）癌、管内癌、髄様乳癌、ムチン産生乳癌、細管乳癌、乳頭状乳癌、パジェット病（若年性パジェット病を含む）および炎症性乳癌；副腎癌、限定的なものではないが例えば褐色細胞腫および副腎皮質癌；甲状腺癌、限定的なものではないが例えば乳頭状または小胞性甲状腺癌、髄様甲状腺癌および退形成甲状腺癌；膵臓癌、限定的なものではないが例えばインスリノーマ、ガストリン産生腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、VIP産生腫瘍、ソマトスタチン分泌腫瘍およびカルチノイドまたは島細胞腫；下垂体癌、限定的なものではないが例えばクッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、先端巨大症および尿崩症；眼癌、限定的なものではないが例えば眼メラノ���マ、例えば虹彩メラノーマ、脈絡膜メラノーマおよび毛様体メラノーマおよび網膜芽細胞腫；膣癌、例えば扁平上皮癌、腺癌およびメラノーマ；外陰癌、例えば扁平上皮癌、メラノーマ、腺癌、基底細胞癌、肉腫およびパジェット病；子宮頸癌、限定的なものではないが例えば扁平上皮癌および腺癌；子宮癌、限定的なものではないが例えば子宮内膜癌および子宮肉腫；卵巣癌、限定的なものではないが例えば卵巣上皮癌、境界（borderline）腫瘍、胚細胞腫瘍および間質腫瘍；食道癌、限定的なものではないが例えば扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢包癌、粘表皮癌、腺様扁平上皮癌、肉腫、メラノーマ、プラスマ細胞腫、疣状癌および燕麦細胞（小細胞）癌；胃癌、限定的なものではないが例えば腺癌、菌状発育（fungating）（ポリプ状）、潰瘍性、表在性、びまん性、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫および癌肉腫；結腸癌；直腸癌；肝癌、限定的なものではないが例えば肝細胞癌および肝芽腫、胆嚢癌、例えば腺癌；胆管癌、限定的なものではないが例えば乳頭状、結節性およびびまん性；肺癌、例えば非小細胞肺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌および小細胞肺癌；精巣癌、限定的なものではないが例えば胚芽性腫瘍、セミノーマ、無形成性、古典的（典型的）、精母細胞、非セミノーマ、胎児性癌、テラトーマ癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）、前立腺癌、限定的なものではないが例えば腺癌、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫；ペナル（penal）癌；口内癌、限定的なものではないが例えば扁平上皮癌；基底癌；唾液腺癌、限定的なものではないが例えば腺癌、粘表皮癌および腺様嚢胞癌；咽頭癌、限定的なものではないが例えば鱗状細胞癌および疣状；皮膚癌、限定的なものではないが例えば基底細胞癌、扁平上皮癌およびメラノーマ、表在性メラノーマ、結節性メラノーマ、悪性ほくろ、末端性ほくろ性メラノーマ、；腎臓癌、限定的なものではないが例えば腎細胞癌、腺癌、副腎腫、線維肉腫、移行上皮癌（腎盤および/または尿管）；ウィルムス腫瘍；膀胱癌、限定的なものではないが例えば移行上皮癌、鱗状細胞癌、腺癌、癌肉腫。また、癌には以下のものが含まれる：粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌および乳頭状腺癌（そのような障害の概説としては、Fishmanら, 1985, Medicine, 2d Ed., J. B. Lippincott Co., PhiladelphiaおよびMurphyら, 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., inc., United States of Americaを参照されたい）。また、アポトーシスにおける異常により引き起こされる癌も本発明の方法および組成物により治療されうると想定される。そのような癌には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：濾胞性リンパ腫、p53突然変異を有する癌、乳房、前立腺および卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに前癌性病変、例えば家族性腺腫様ポリプ症、および骨髄形成異常症候群。
【０１５２】
本発明のタンパク質およびそれを含む組成物は、多数の目的に、例えば、限定的なものではないが以下のものを含む広範囲の慢性および急性の疾患および障害に対する治療用物質として有用である：自己免疫および／または炎症障害、例えばシェーグレン症候群、慢性関節リウマチ、狼瘡、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生性緑内障、血管腫、甲状腺過形成（グレーヴス病を含む）、角膜および他の組織移植、および慢性炎症、敗血症、慢性関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再灌流障害、敗血症、内毒素ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、脊髄損傷および同種移植片拒絶。自己免疫および／または炎症障害の他の具体例には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、シェーグレン症候群、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性および他の網膜症、水晶体後線維増殖症、加齢性黄斑変性、血管新生性緑内障、血管腫、甲状腺過形成（グレーヴス病を含む）、角膜および他の組織移植、および慢性炎症、敗血症、慢性関節リウマチ、腹膜炎、クローン病、再灌流障害、敗血症、内毒素ショック、嚢胞性線維症、心内膜炎、乾癬、関節炎（例えば、乾癬性関節炎）、アナフィラキシーショック、臓器虚血、再灌流障害、脊髄損傷および同種移植片拒絶、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能不全症候群（CFIDS）、慢性炎症性脱髄多発性神経障害、チャーグーストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、CREST症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状狼瘡、必須混合クリオグロブリン血症、線維筋肉痛-線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギランバレー、橋本病甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、IgAニューロパチー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、1型または免疫性糖尿病、重症筋無力症、尋常性性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性ガンマグロブリン欠乏血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、脈管炎、例えば疱疹状皮膚炎脈管炎、尋常性白斑およびウェゲナー肉芽腫症。炎症障害の具体例には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー障害、敗血性ショック、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節障害、関節炎、炎症性骨溶解および慢性炎症（慢性ウイルスまたは細菌感染から生じるもの）。本発明の組成物および方法は、前記疾患を予防、処置または治療するために使用され��1以上の通常の療法と共に使用されうる。
【０１５３】
本発明はまた、例えばウイルス、真菌、真核微生物および細菌のような種々の感染因子を不活性化するための、抗体および／または抗体コンジュゲートの使用方法を提供する。いくつかの実施形態においては、本発明の抗体または抗体コンジュゲートは、RSV、hMPV、PIVまたはインフルエンザウイルスを不活性化するために使用されうる。他の実施形態においては、本発明の抗体および／または抗体コンジュゲートは、真菌病原体、例えばネグレリア属（Naegleria）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ブラストマイセス属（Blastomyces）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、カンジダ属（Candida）または白癬（Tinea属）（これらに限定されるものではない）のメンバーを不活性化するために使用されうる。他の実施形態においては、本発明の抗体および／または抗体コンジュゲートは、真核微生物、例えばジアルジア属（Giardia）、トキソプラズマ属（Toxoplasma）、プラスモジウム属（Plasmodium）、トリパノソーマ属（Trypanosoma）およびエントアメーバ属（Entamoeba）（これらに限定されるものではない）のメンバーを不活性化するために使用されうる。他の実施形態においては、本発明の抗体および／または抗体コンジュゲートは、細菌病原体、例えばブドウ球菌（Staphylococcus）、レンサ球菌（Streptococcus）、シュードモナス（Pseudomonas）、クロストリジウム（Clostridium）、ボレリア（Borrelia）、ビブリオ（Vibro）およびネイセリア（Neiserria）属（これらに限定されるものではない）のメンバーを不活性化するために使用されうる。
【０１５４】
本発明の抗体および／または抗体コンジュゲートならびにそれらを含む組成物は多数の目的に有用であり、例えば、ウイルス性、細菌性および真菌性疾患などの感染症（これらに限定されるものではない）を含む多種多様な慢性および急性の疾患および障害に対する治療用物質として有用である。ウイルス病原体の具体例には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：アデノウイルス科（例えば、マストアデノウイルス属およびアビアデノウイルス属）、ヘルペスウイルス科（例えば、単純ヘルペスウイルス1、単純ヘルペスウイルス2、単純ヘルペスウイルス5および単純ヘルペスウイルス6）、レヴィウイルス科（例えば、レヴィウイルス属、腸内細菌ファージMS2、アロレヴィウイルス属）、ポックスウイルス科（例えば、チョルドポックスウイルス亜科、パラポックスウイルス属、アビポックスウイルス属、カプリポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属、スイポックスウイルス属、モルスサイポックスウイルス属およびエントモポックスウイルス亜科）、パポーバウイルス科（例えば、ポリオーマウイルス属およびパピローマウイルス属）、パラミクソウイルス科（例えば、パラミクソウイルス属、パラインフルエンザウイルス1、モルビリウイルス属（例えば、麻疹ウイルス）、ルブラウイルス属（例えば、ムンプスウイルス）、ニューモノウイルス亜科（例えば、ニューモウイルス属、ヒト呼吸器合包体ウイルス(ヒトRSウイルス)）、メタニューモウイルス（例えば、トリニューモウイルスおよびヒトメタニューモウイルス））、ピコルナウイルス科（例えば、エンテロウイルス属、ライノウイルス属、ヘパトウイルス属（例えば、ヒトA型肝炎ウイルス）、カルヂオウイルス属およびアフトウイルス属）、レオウイルス科（例えば、オルソレオウイルス属、オルビウイルス属、ロタウイルス属、シポウイルス属、フィジーウイルス属、フィトレオウイルス属およびオリザウイルス属）、レトロウイルス科（例えば、哺乳類B型レトロウイルス属、哺乳類C型レトロウイルス属、トリC型レトロウイルス属、D型レトロウイルス群、BLV-HTLVレトロウイルス、レンチウイルス属（例えば、ヒト免疫不全ウイルス1およびヒト免疫不全ウイルス2）、スプマウイルス属）、フラビウイルス科（例えば、C型肝炎ウイルス）、ヘパドナウイルス科（例えば、B型肝炎ウイルス）、トガウイルス科（例えば、アルファウイルス属（例えば、シンドビスウイルス）およびルビウイルス属（例えば、風疹ウイルス））、ラブドウイルス科（例えば、ベシクロウイルス属、リッサウイルス属、エフェメロウイルス属、シトラブドウイルス属およびヌクレオラブドウイルス属）、アレナウイルス科（例えば、アレナウイルス属、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、イッピーウイルスおよびラッサウイルス）、およびコロナウイルス科（例えば、コロナウイルス属およびトロウイルス属）。細菌病原体の具体例には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：Aquaspirillum科、Azospirillum科、Azotobacteraceae科、Bacteroidaceae科、Bartonella種、Bdellovibrio科、Campylobacter種、Chlamydia種（例えば、クラミジア肺炎菌（Chlamydia pneumoniae））、クロストリジウム、Enterobacteriaceae科（例えば、Citrobacter種、Edwardsiella、エンテロバクター・エアロゲネス（Enterobacter aerogenes��、Erwinia種、大腸菌（Escherichia coli）、Hafnia種、クレブジエラ（Klebsiella）種、モルガネラ（Morganella）種、変形菌（Proteus vulgaris）、Providencia、サルモネラ（Salmonella）種、セラティア・マルセセンス（Serratia marcescens）およびシゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri））、Gardinella科、インフルエンザエ菌（Haemophilus influenzae）、Halobacteriaceae科、ヘリコバクター（Helicobacter）科、Legionallaceae科、リステリア（Listeria）種、Methylococcaceae科、マイコバクテリア（例えば結核菌（Mycobacterium tuberculosis））、Neisseriaceae科、Oceanospirillum科、Pasteurellaceae科、Pneumococcus種、シュードモナス（Pseudomonas）種、Rhizobiaceae科、Spirillum科、Spirosomaceae科、Staphylococcuss（例えば、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）およびスタフィロコッカス・パイロゲネス（Staphylococcus pyrogenes））、レンサ球菌（Streptococcus）（例えば、ストレプトコッカス・エンテリティディス（Streptococcus enteritidis）、ストレプトコッカス・フェーシエ（Streptococcus fasciae）および肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae））、Vampirovibr Helicobacter科、およびVampirovibrio科。真菌病原体の具体例には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：Absidia種（例えば、アブシディア・コリムビフェラ（Absidia corymbifera）およびアブシディア・ラモサ（Absidia ramosa））、アスペルギルス（Aspergillus）種（例えば、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）、アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、クロコウジカビ（Aspergillus niger）およびアスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus））、バシジオボルス・ラナルム（Basidiobolus ranarum）、ブラストマイセス・デルマティディス（Blastomyces dermatitidis）、Candida種（例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・ガラブラータ（Candida glabrata）、カンジダ・ケル（Candida kerr）、カンジダ・クルーゼイ（Candida krusei）、カンジダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）、カンジダ・シュードトロピカリス（Candida pseudotropicalis）、カンジダ・クイレルモンディイ（Candida quillermondii）、カンジダ・ルゴーザ（Candida rugosa）、カンジダ・ステラトイデア（Candida stellatoidea）およびカンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis））、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、Conidiobolus種、クリプトコッカス・ネオフォルムス（Cryptococcus neoforms）、Cunninghamella種、皮膚糸状菌、ヒストプラズマ・カプスラタム（Histoplasma capsulatum）、マイクロスポルム・ジプセウム（Microsporum gypseum）、ムコル・プシルス（Mucor pusillus）、パラコッキディオイデス・ブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、シューダルエシェリア・ボイディイイ（Pseudallescheria boydii）、リノスポリジウム・シーベリ（Rhinosporidium seeberi）、ニューモシスティス・カリニイ（Pneumocystis carinii）、Rhizopus種（例えば、リゾップス・アルヒザス（Rhizopus arrhizus）、リゾップス・オライザエ（Rhizopus oryzae）およびリゾップス・マイクロスポルス（Rhizopus microsporus））、Saccharomyces種、スポロトリクス・シェネキイイ（Sporothrix schenckii）、接合菌綱、ならびに例えばZygomycetes、Ascomycetes、Basidiomycetes、DeuteromycetesおよびOomycetesのような綱。
【０１５５】
本発明はまた、細胞集団を減少させるための、抗体の使用方法を提供する。1つの実施形態においては、本発明の方法は、以下の細胞型を減少させるのに有用である：好酸球、好塩基球、好中球、T細胞、B細胞、マスト細胞、単球、内皮細胞および腫瘍細胞。
【０１５６】
本発明の抗体およびそのコンジュゲートは疾患またはその症状の診断および検出においても有用でありうる。もう1つの実施形態においては、本発明の組成物は疾患の進行のモニタリングにおいて有用でありうる。もう1つの実施形態においては、本発明の組成物は治療計画のモニタリングにおいて有用でありうる。もう1つの実施形態においては、本発明の組成物は、ex vivo用途、例えば診断キットにおける診断に有用である。
【０１５７】
本発明の組成物は標的抗原の可視化において有用でありうる。いくつかの実施形態においては、該標的抗原は、インターナリゼーションする細胞表面受容体である。他の実施形態においては、該標的抗原は細胞内抗原である。他の実施形態においては、該標的は核内抗原である。
【０１５８】
1つの実施形態においては、本発明の抗体または抗体-薬物コンジュゲートは、結合すると、細胞内にインターナリゼーション（内在化）され、この場合、インターナリゼーションは、本明細書に記載されている対照抗体より少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、または少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約110％、少なくとも約130％、少なくとも約140％、少なくとも約150％、少なくとも約160％、または少なくとも約170％多い。
【０１５９】
もう1つの実施形態においては、本発明の抗体は、結合すると、細胞内にインターナリゼーションされ、この場合、インターナリゼーションは、本明細書に記載されている対照抗体より1〜10％、10〜20％、20〜30％、30〜40％、40〜50％、50〜60％、60〜70％、70〜80％、80〜90％、90〜100％、100〜110％、110〜120％、120〜130％、130〜140％、140〜150％、150〜160％、160〜170％多い。
【０１６０】
もう1つの実施形態においては、本発明の抗体は、結合すると、細胞内にインターナリゼーションされ、この場合、インターナリゼーションは、二次抗体を使用するインターナリゼーションアッセイによる判定で、対照抗体より1〜10％、10〜20％、20〜30％、30〜40％、40〜50％、50〜60％、60〜70％、70〜80％、80〜90％、90〜100％、100〜110％、110〜120％、120〜130％、130〜140％、140〜150％、150〜160％、160〜170％多い。
【０１６１】
医薬組成物
もう1つの態様においては、本発明は、製薬上許容される担体と共に製剤化された本発明の抗体または抗体コンジュゲートの1つ又は組合せを含有する組成物、例えば医薬組成物（これに限定されるものではない）を提供する。そのような組成物は、限定的なものではないが例えば、本発明の2以上の異なる抗体の1つ又は組合せを含みうる。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合する又は相補的活性を有する抗体の組合せを含みうる。
【０１６２】
本発明の医薬組成物は、例えば他の物質と組合された組合せ療法（併用療法）においても投与されうる。例えば、該組合せ療法は、少なくとも1つの他の療法（該療法は手術、免疫療法、化学療法、放射線療法または薬物療法でありうる）と組合された本発明の抗体を含みうる。
【０１６３】
本発明の医薬組成物は、1以上の製薬上許容される塩を含みうる。そのような塩の具体例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、無毒性無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リンなどに由来するもの、および無毒性有機酸、例えば脂肪族モノ-およびジ-カルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族酸および芳香族スルホン酸などに由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどに由来するもの、および無毒性有機アミン、例えばN,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどが含まれる。
【０１６４】
本発明の医薬組成物はまた、製薬上許容される抗酸化剤を含みうる。製薬上許容される抗酸化剤の具体例には、（1）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、（2）油溶性抗酸化剤、例えばアスコルビルパルミタート、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、プロピルガラート、アルファ-トコフェロールなど、および（3）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
【０１６５】
本発明の医薬組成物において使用されうる適当な水性および非水性担体には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適当な混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。適当な流動性は、例えば、コーティング剤、例えばレシチンの使用により、および分散液の場合には要求される粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持されうる。
【０１６６】
これらの組成物は、補助剤、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤をも含有しうる。微生物の存在の予防は、滅菌法、ならびに種々の抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの配合の両方により確保されうる。等張化剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを該組成物に配合することも望ましいことがある。また、注射可能な医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを配合することによりもたらされうる。
【０１６７】
医薬組成物は、典型的には、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。該組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の一定の構造体として製剤化されうる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒でありうる。適当な流動性は、例えば、例えばレシチンの使用によるコーティング剤、分散液の場合には要求される粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持されうる。多くの場合、等張化剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを該組成物に配合するのが適当であろう。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを該組成物に配合することによりもたらされうる。
【０１６８】
無菌注射可能溶液は、前記成分の1つ又は組合せと共に活性化合物の必要量を適当な溶媒に配合し、ついで滅菌精密濾過することにより製造されうる。一般に、分散液は、基礎分散媒および前記のものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに活性化合物を配合することにより製造される。無菌注射可能溶液の製造のための無菌散剤の場合、好ましい製造方法は、有効成分およびその予め滅菌濾過された溶液からの任意の追加的な所望の成分の粉末を与える真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１６９】
1つの実施形態においては、本発明の組成物は、内毒素および／または関連発熱原性物質を実質的に含有しない発熱物質非含有製剤である。内毒素には、微生物の内部に封じ込められた毒素および微生物が破壊または死亡した場合に放出される毒素が含まれる。また、発熱原性物質には、細菌および他の微生物の外膜からの発熱誘発性、熱安定性物質（糖タンパク質）が含まれる。これらの物質は共に、ヒトに投与されると発熱、低血圧およびショックを引き起こしうる。潜在的な有害な作用のため、少量の内毒素であってもそれを静脈内投与医薬溶液から除去するのが有利である。Food & Drug Administration（「FDA」）は、静脈内薬物適用に関して1回の1時間における体重1kg当たり1用量当たり5内毒素単位（EU）の上限を設定している（The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)）。治療用タンパク質を体重1kg当たり数百または数千ミリグラムの量で投与する場合、微量の内毒素であってもそれを除去するのが有利である。1つの実施形態においては、該組成物中の内毒素および発熱物質レベルは10 EU/mg未満、または5 EU/mg未満、または1 EU/mg未満、または0.1 EU/mg未満、または0.01 EU/mg未満、または0.001 EU/mg未満である。もう1つの実施形態においては、該組成物中の内毒素および発熱物質レベルは約10 EU/mg未満、または約5 EU/mg未満、または約1 EU/mg未満、または約0.1 EU/mg未満、または約0.01 EU/mg未満、または約0.001 EU/mg未満である。
【０１７０】
1つの実施形態においては、本発明は、組成物を投与することを含み、該投与は、経口、非経口、筋肉内、鼻腔内、膣、直腸、舌、舌下、頬側、頬内、静脈内、皮膚、皮下または経皮投与である。
【０１７１】
もう1つの実施形態においては、本発明は更に、他の療法、例えば手術、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法または放射線療法と組合せて組成物を投与することを含む。
【０１７２】
用量／投与
本発明の抗体／抗体コンジュゲートを含む医薬組成物または無菌組成物を製造するためには、該抗体／抗体コンジュゲートを製薬上許容される担体または賦形剤と混合する。治療用および診断用物質の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液、ローションまたは懸濁液剤の形態で、生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより製造されうる（例えば、Hardmanら, (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avisら, (編) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Liebermanら, (編) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Liebermanら,(編) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; WeinerおよびKotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.を参照されたい）。
【０１７３】
治療のための投与計画の選択は、該物質の血清または組織ターンオーバー速度、症状のレベル、該物質の免疫原性、および生物学的マトリックスにおける標的細胞の接近性を含む幾つかの要因に左右される。ある実施形態においては、投与計画は、許容される副作用レベルと調和させて、患者に送達される治療用物質の量を最大にする。したがって、送達される生物学的製剤の量は、部分的には、個々の物質および治療される状態の重症度に左右される。抗体、サイトカインおよび小分子の適当な用量を選択する際の指針は入手可能である（例えば、Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (編) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Bach (編) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, N.Y.; Baertら, (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgromら, (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamonら, (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitzら, (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghoshら, (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipskyら, (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602を参照されたい）。
【０１７４】
適当な用量の決定は、例えば、治療に影響を及ぼすこと又は治療に影響を及ぼすと予想されることが当技術分野で公知である又は疑われるパラメータおよび要因を用いて、臨床家によってなされる。一般に、投与は、最適用量より若干少ない量から開始され、ついで、いずれかの負の副作用との対比において所望の又は最適な効果が達成されるまで、少しずつ投与量を増加させる。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度、または産生される炎症サイトカインのレベルが含まれる。
【０１７５】
本発明の医薬組成物におけるの有効成分の実際の投与レベルは、患者にとって毒性となることなく個々の患者、組成物および投与方法に関する所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分量が得られるよう様々なレベルとなりうる。選択される投与レベルは、使用される本発明の個々の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時点、使用される個々の化合物の排泄速度、治療の持続期間、使用される個々の組成物と組合せて使用される他の薬物、化合物および／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、症状、全身健康状態および既往歴ならびに医学分野でよく知られた同様の要因を含む種々の薬物動態学的要因に左右される。
【０１７６】
本発明の抗体または抗体コンジュゲートを含む組成物は、連続的注入により、または例えば1日、1週間または週1〜7回の間隔での投与により投与されうる。投与は、静脈内、皮下、局所、経口的、鼻腔内、直腸、筋肉内、脳内に、または吸入により行われうる。特定の投与プロトコールは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または投与頻度を含むものである。週当たりの合計用量は、少なくとも0.05μg/kg体重、少なくとも0.2μg/kg、少なくとも0.5μg/kg、少なくとも1μg/kg、少なくとも10μg/kg、少なくとも100μg/kg、少なくとも0.2mg/kg、少なくとも1.0mg/kg、少なくとも2.0mg/kg、少なくとも10mg/kg、少なくとも25mg/kg、または少なくとも50mg/kgでありうる（例えば、Yangら, (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Heroldら, (2002) New Engl. J. Med. 346:1692-1698; Liuら, (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portieljiら, (20003) Cancer Immunol. Immunother. 52:133-144を参照されたい）。該用量は、少なくとも15μg、少なくとも20μg、少なくとも25μg、少なくとも30μg、少なくとも35μg、少なくとも40μg、少なくとも45μg、少なくとも50μg、少なくとも55μg、少なくとも60μg、少なくとも65μg、少なくとも70μg、少なくとも75μg、少なくとも80μg、少なくとも85μg、少なくとも90μg、少なくとも95μg、または少なくとも100μgでありうる。対象に投与される投与回数は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11もしくは12またはそれ以上でありうる。
【０１７７】
本発明の抗体または抗体コンジュゲートの場合、患者に投与される投与量は0.0001 mg/kg〜100 mg/kg（患者の体重1kg当たりのmg）でありうる。該投与量は、0.0001 mg/kg〜20 mg/kg、0.0001 mg/kg〜10 mg/kg、0.0001 mg/kg〜5 mg/kg、0.0001〜2 mg/kg、0.0001〜1 mg/kg、0.0001 mg/kg〜0.75 mg/kg、0.0001 mg/kg〜0.5 mg/kg、0.0001 mg/kg〜0.25 mg/kg、0.0001〜0.15 mg/kg、0.0001〜0.10 mg/kg、0.001〜0.5 mg/kg、0.01〜0.25 mg/kg、または0.01〜0.10 mg/kg（患者の体重1kg当たりのmg）でありうる。
【０１７８】
本発明の抗体または抗体コンジュゲートの投与量は、キログラム（kg）単位の患者の体重とmg/kg単位の投与用量とを掛け算することにより算出されうる。本発明の抗体の投与量は、150 μg/kg未満、125 μg/kg未満、100 μg/kg未満、95 μg/kg未満、90 μg/kg未満、85 μg/kg未満、80 μg/kg未満、75 μg/kg未満、70 μg/kg未満、65 μg/kg未満、60 μg/kg未満、55 μg/kg未満、50 μg/kg未満、45 μg/kg未満、40 μg/kg未満、35 μg/kg未満、30 μg/kg未満、25 μg/kg未満、20 μg/kg未満、15 μg/kg未満、10 μg/kg未満、5 μg/kg未満、2.5 μg/kg未満、2 μg/kg未満、1.5 μg/kg未満、1 μg/kg未満、0.5 μg/kg未満、または0.5 μg/kg（患者の体重1kg当たりのμg）でありうる。
【０１７９】
本発明の抗体または抗体コンジュゲートの単位用量は0.1 mg〜20 mg、0.1 mg〜15 mg、0.1 mg〜12 mg、0.1 mg〜10 mg、0.1 mg〜8 mg、0.1 mg〜7 mg、0.1 mg〜5 mg、0.1〜2.5 mg、0.25 mg〜20 mg、0.25〜15 mg、0.25〜12 mg、0.25〜10 mg、0.25〜8 mg、0.25 mg〜7 mg、0.25 mg〜5 mg、0.5 mg〜2.5 mg、1 mg〜20 mg、1 mg〜15 mg、1 mg〜12 mg、1 mg〜10 mg、1 mg〜8 mg、1 mg〜7 mg、1 mg〜5 mg、または1 mg〜2.5 mgでありうる。
【０１８０】
本発明の抗体または抗体コンジュゲートの投与量は、対象において少なくとも0.1 μg/ml、少なくとも0.5 μg/ml、少なくとも1 μg/ml、少なくとも2 μg/ml、少なくとも5 μg/ml、少なくとも6 μg/ml、少なくとも10 μg/ml、少なくとも15 μg/ml、少なくとも20 μg/ml、少なくとも25 μg/ml、少なくとも50 μg/ml、少なくとも100 μg/ml、少なくとも125 μg/ml、少なくとも150 μg/ml、少なくとも175 μg/ml、少なくとも200 μg/ml、少なくとも225 μg/ml、少なくとも250 μg/ml、少なくとも275 μg/ml、少なくとも300 μg/ml、少なくとも325 μg/ml、少なくとも350 μg/ml、少なくとも375 μg/mlまたは少なくとも400 μg/mlの血清力価を達成しうる。あるいは、本発明の抗体の投与量は、対象において少なくとも0.1 μg/ml、少なくとも0.5 μg/ml、少なくとも1 μg/ml、少なくとも2 μg/ml、少なくとも5 μg/ml、少なくとも6 μg/ml、少なくとも10 μg/ml、少なくとも15 μg/ml、少なくとも20 μg/ml、少なくとも25 μg/ml、少なくとも50 μg/ml、少なくとも100 μg/ml、少なくとも125 μg/ml、少なくとも150 μg/ml、少なくとも175 μg/ml、少なくとも200 μg/ml、少なくとも225 μg/ml、少なくとも250 μg/ml、少なくとも275 μg/ml、少なくとも300 μg/ml、少なくとも325 μg/ml、少なくとも350 μg/ml、少なくとも375 μg/mlまたは少なくとも400 μg/mlの血清力価を達成しうる。
【０１８１】
本発明の抗体または抗体コンジュゲートの投与は反復可能であり、それらの投与は、少なくとも1日間、2日間、3日間、5日間、10日間、15日間、30日間、45日間、2ヶ月間、75日間、3ヶ月間または少なくとも6ヶ月間、隔てられうる。
【０１８２】
個々の患者に対する有効量は、治療される状態、患者の全身健康状態、投与の方法、経路および用量ならびに副作用の重症度のような要因によって様々となりうる（例えば、Maynardら, (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla.; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UKを参照されたい）。
【０１８３】
投与の経路は、例えば、局所または皮膚適用、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内、病変内への注射または注入、あるいは徐放系またはインプラントによるものでありうる（例えば、Sidmanら (1983) Biopolymers 22:547-556; Langerら, (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277; Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105; Epsteinら, (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwangら, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034; 米国特許第6,350466号および第6,316,024号を参照されたい）。必要に応じて、該組成物は、可溶化剤、および注射部位の疼痛を軽減するための局所麻酔薬、例えばリドカインをも含みうる。また、例えばを吸入器またはネブライザーの使用およびエアゾール化剤の配合により、肺投与も行われうる。例えば、米国特許第6,019,968号、第5,985,320号、第5,985,309号、第5,934,272号、第5,874,064号、第5,855,913号、第5,290,540号および第4,880,078号; ならびにPCT公開番号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346およびWO 99/66903（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。1つの実施形態においては、本発明の抗体、組合せ療法または組成物は、Alkermes AIR（商標）肺薬物送達技術（Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.）を用いて投与される。
【０１８４】
また、本発明の組成物は、当技術分野で公知の種々の方法の1以上を用いて、1以上の投与経路で投与されうる。当業者に理解されるとおり、投与の経路および／または方法は、所望の結果に応じて様々となろう。本発明の多重特異性エピトープ結合性タンパク質に関する選択される投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば注射または注入が含まれる。非経口投与は経腸および局所投与以外の投与方法に相当しうるものであり、通常は注射によるものであり、限定的なものではないが静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を包含する。あるいは、本発明の組成物は、非-非経口経路、例えば局所、表皮または粘膜投与経路、例えば鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所経路により投与されうる。
【０１８５】
本発明の抗体またはそのコンジュゲートが制御放出または徐放系で投与される場合には、制御放出または徐放を達成するためにポンプが使用されうる（例えば、Langer, 前掲; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwaldら, 1980, Surgery 88:507; Saudekら, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照されたい）。本発明の治療用物質の制御放出または徐放を達成するためには、高分子物質が使用されうる（例えば、Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (編), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenおよびBall (編), Wiley, New York (1984); RangerおよびPeppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照されたい; また、Levyら, 1985, Science 228:190; Duringら, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howardら, 1989, J. Neurosurg. 7 1:105; 米国特許第5,679,377号; 米国特許第5,916,597号; 米国特許第5,912,015号; 米国特許第5,989,463号; 米国特許第5,128,326号; PCT公開番号WO 99/15154; およびPCT公開番号WO 99/20253も参照されたい）。徐放製剤において使用される重合体の具体例には、限定的なものではないが以下のものが含まれる：ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリラート)、ポリ(メチルメタクリラート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-コ-ビニルアセタート)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド (PLG)、ポリ無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド (PLA)、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド) (PLGA)、およびポリオルトエステル。1つの実施形態においては、徐放製剤において使用される高分子は不活性であり、浸出性不純物を含有せず、貯蔵時に安定であり、無菌であり、生分解性である。制御放出または徐放系は予防または治療標的に接近して配置され、したがって、全身投与量のごく一部を要するに過ぎない（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照されたい）。
【０１８６】
制御放出系はLanger (1990, Science 249:1527-1533)による総説において考察されている。本発明の1以上の抗体を含む徐放製剤を製造するためには、当業者に公知の任意の技術が用いられうる。例えば、米国特許第4,526,938号, PCT公開WO 91/05548, PCT公開WO 96/20698, Ningら, 1996, “Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Songら, 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleekら, 1997, “Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, およびLamら, 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,” Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
【０１８７】
本発明の抗体または抗体コンジュゲートを局所投与する場合、それは、軟膏剤、クリーム剤、経皮パッチ、ローション剤、ゲル剤、シャンプー、噴霧剤、エアゾール剤、溶液剤、乳剤または当業者によく知られた他の形態で製剤化されうる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)を参照されたい。非噴霧可能局所剤形の場合、局所適用に適しておりときには水より大きな粘性率を有する担体または1以上の賦形剤を含む粘性ないし半固体または固体形態が典型的に使用される。適当な製剤には、溶液剤、懸濁液剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント剤、ロウ剤などが含まれ（これらに限定されるものではない）、これらは、所望により、滅菌され、または例えば浸透圧のような種々の特性に影響を及ぼすための補助物質（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、バッファーまたは塩）と混合される。他の適当な局所剤形には、噴霧可能なエアゾール剤が含まれ、この場合、有効成分は、いくつかの場合には固体または液体不活性担体と組合され、加圧揮発性物質（例えば、気体推進剤、例えばフレオン）との混合物として、またはスクィーズボトル内に充填される。所望により、医薬組成物および剤形に保湿剤または湿潤剤も加えられうる。そのような追加的成分の具体例は当技術分野でよく知られている。
【０１８８】
抗体または抗体コンジュゲートを含む組成物を鼻腔内に投与する場合には、それは、エアゾール形態、噴霧剤、ミストまたは滴剤の形態で製剤化されうる。特に、本発明において使用する予防用または治療用物質は、適当な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体）の使用により、加圧パックまたはネブライザーから、エアゾール噴霧剤の形態で簡便に送達されうる。加圧エアゾールの場合、一定量を送達するための弁を設けることにより投与単位が定められうる。吸入器または通気器において使用されるカプセル剤およびカートリッジ剤（例えばゼラチンから構成されるもの）は、該化合物と適当な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）との粉末混合物を含有するよう製剤化されうる。
【０１８９】
第2の治療用物質、例えばサイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質または放射線による共投与または治療のための方法は当技術分野で公知である（例えば、Hardmanら, (編) (2001) GoodmanおよびGilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10.sup.th ed., McGraw-Hill, New York, N.Y.; PooleおよびPeterson (編) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.; ChabnerおよびLongo (編) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., Pa.を参照されたい）。治療用物質の有効量は、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも約30％、少なくとも40％または少なくとも50％、症状を軽減しうる。
【０１９０】
本発明の抗体またはそのコンジュゲートと組合せて投与されうる追加的な療法（例えば、予防用または治療用因子）は、本発明の抗体から5分未満を隔てて、30分未満を隔てて、1時間未満を隔てて、約1時間を隔てて、約1〜約2時間を隔てて、約2時間〜約3時間を隔てて、約3時間〜約4時間を隔てて、約4時間〜約5時間を隔てて、約5時間〜約6時間を隔てて、約6時間〜約7時間を隔てて、約7時間〜約8時間を隔てて、約8時間〜約9時間を隔てて、約9時間〜約10時間を隔てて、約10時間〜約11時間を隔てて、約11時間〜約12時間を隔てて、約12時間〜18時間を隔てて、18時間〜24時間を隔てて、24時間〜36時間を隔てて、36時間〜48時間を隔てて、48時間〜52時間を隔てて、52時間〜60時間を隔てて、60時間〜72時間を隔てて、72時間〜84時間を隔てて、84時間〜96時間を隔てて、または96時間〜120時間を隔てて投与されうる。それらの2以上の療法は患者の1回の同じ来院時に投与されうる。
【０１９１】
本発明の抗体または抗体コンジュゲートおよびその他の療法は周期的に投与されうる。周期的（cycling）療法は、ある期間にわたる第1療法（例えば、第1の予防用または治療用因子）の投与、およびそれに続く、ある期間にわたる第2療法（例えば、第2の予防用または治療用因子）の投与、および場合によってはそれに続く、ある期間にわたる第3療法（例えば、予防用または治療用因子）などの投与、ならびにこの連続的投与の反復を含み、すなわち、該周期は、それらの療法の1つに対する耐性の発生を軽減するため、および／またはそれらの療法の1つの副作用を回避または軽減するため、および／またはそれらの療法の効力を改善するためのものである。
【０１９２】
ある実施形態においては、本発明の抗体および抗体コンジュゲートは、in vivoにおける適切な分布が確保されるよう製剤化されうる。例えば、血液-脳関門（BBB）は多数の高親水性化合物を排除する。本発明の治療用化合物が（所望により）BBBを通過することを保証するために、それらは例えばリポソーム中に製剤化されうる。リポソームの製造方法に関しては、例えば、米国特許第4,522,811号、第5,374,548号および第5,399,331号を参照されたい。リポソームは、標的化薬物送達を促進するよう特定の細胞または器官へ選択的に輸送される1以上の部分を含みうる（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい）。典型的な標的化部分には、ホラートまたはビオチン（例えば、Lowらの米国特許第5,416,016号を参照されたい）；マンノシド（Umezawaら, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G. Bloemanら, (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owaisら, (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性剤プロテインA受容体（Briscoeら, (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；p120（Schreierら, (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）（K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい）が含まれる。
【０１９３】
本発明は、本発明の抗体または抗体コンジュゲートを含む医薬組成物を、単独で又は他の療法と組合せて、それを要する対象に投与するための方法を提供する。本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防用または治療用因子）は同時または連続的に対象に投与されうる。本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防用または治療用因子）は周期的にも投与されうる。周期的療法は、ある期間にわたる第1療法（例えば、第1の予防用または治療用因子）の投与、およびそれに続く、ある期間にわたる第2療法（例えば、第2の予防用または治療用因子）の投与、ならびにこの連続的投与の反復を含み、すなわち、該周期は、それらの療法（例えば、因子）の1つに対する耐性の発生を軽減するため、および／またはそれらの療法（例えば、因子）の1つの副作用を回避または軽減するため、および／またはそれらの療法の効力を改善するためのものである。
【０１９４】
本発明の組合せ療法の療法（例えば、予防用または治療用因子）は共に対象に投与されうる。「共に」なる語は、厳密に同一時点での療法（例えば、予防用または治療用因子）の投与に限定されるものではなく、本発明の抗体またはそのコンジュゲートがその他の療法と共に作用して、それらがそれ以外の様態で投与された場合に比べて増加した利益をもたらしうるように或る順序および時間間隔で、本発明の抗体または抗体コンジュゲートを含む医薬組成物が対象に投与されることを意味する。例えば、各療法は、同時に、または異なる時点においていずれかの順序で連続的に対象に投与されうるが、それらは、同時に投与されない場合には、所望の治療または予防効果が得られるよう時間的に十分に接近して投与されるべきである。各療法は、任意の適当な形態および任意の適当な経路で、別々に対象に投与されうる。種々の実施形態においては、該療法（例えば、予防用または治療用因子）は、15分未満を隔てて、30分未満を隔てて、1時間未満を隔てて、約1時間を隔てて、約1〜約2時間を隔てて、約2時間〜約3時間を隔てて、約3時間〜約4時間を隔てて、約4時間〜約5時間を隔てて、約5時間〜約6時間を隔てて、約6時間〜約7時間を隔てて、約7時間〜約8時間を隔てて、約8時間〜約9時間を隔てて、約9時間〜約10時間を隔てて、約10時間〜約11時間を隔てて、約11時間〜約12時間を隔てて、24時間を隔てて、48時間を隔てて、72時間を隔てて、または1週間を隔てて、対象に投与されうる。他の実施形態においては、2以上の療法（例えば、予防用または治療用因子）は患者の同一来院時に投与されうる。
【０１９５】
該組合せ療法の予防用または治療用物質は同一医薬組成物中で対象に投与されうる。あるいは、該組合せ療法の予防用または治療用物質は別々の医薬組成物中で共に対象に投与されうる。該予防用または治療用物質は、同じ又は異なる投与経路により対象に投与されうる。
【０１９６】
具体的な実施形態
１．  システイン遺伝子操作抗体であって、該システイン遺伝子操作抗体がEUインデックスナンバリングシステムにより定義される、抗体重鎖における131-139領域において１以上のアミノ酸のシステイン残基への置換を有し、少なくとも１つの遊離チオール基を有する、該システイン遺伝子操作抗体。
【０１９７】
２．  前記抗体が２以上の遊離チオール基を有する、実施形態１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０１９８】
３．  前記抗体が４以上の遊離チオール基を有する、実施形態１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０１９９】
４．  前記抗体が６以上の遊離チオール基を有する、実施形態１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２００】
５．  前記抗体が８以上の遊離チオール基を有する、実施形態１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２０１】
６．  前記抗体が１０以上の遊離チオール基を有する、実施形態１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２０２】
７．  前記抗体が１２以上の遊離チオール基を有する、実施形態１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２０３】
８．  前記抗体が１４以上の遊離チオール基を有する、実施形態１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２０４】
９．  前記抗体が１６以上の遊離チオール基を有する、実施形態１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２０５】
１０．  置換されたアミノ酸が、EUインデックスナンバリングシステムに従い、抗体重鎖の131、132、134、135、136、および139からなる群より選択される、実施形態１記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２０６】
１１．  前記抗体がFabまたはFab2の形態の抗体フラグメントである、実施形態１〜１０のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２０７】
１２．  前記システイン遺伝子操作抗体が少なくとも１つの非天然ジスルフィド結合の形成を有する、実施形態１〜１１のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２０８】
１３．  前記遺伝子操作抗体が、特定の標的について、システイン遺伝子操作前の抗体と同じまたはそれより高い結合親和性を示す、実施形態１〜１２のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２０９】
１４．  前記遺伝子操作抗体が、特定の標的について、システイン遺伝子操作前の抗体と同じまたはそれよりも低い親和性を示す、実施形態１〜１３のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２１０】
１５．  前記遺伝子操作抗体が、１以上のFc受容体に対する抗体として、システイン遺伝子操作前の抗体と同じまたはそれよりも高い結合親和性を示す、実施形態１〜１４のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２１１】
１６．  前記遺伝子操作抗体が、システイン遺伝子操作前の抗体と同じまたはそれよりも高いレベルの抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を誘導する、実施形態１〜１５のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２１２】
１７．  前記遺伝子操作抗体が、システイン遺伝子操作前の抗体よりも低いレベルの抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を誘発する、実施形態１〜１５のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２１３】
１８．  前記遺伝子操作抗体が、システイン遺伝子操作前の抗体と同じまたはそれよりも高いレベルの抗体依存性補体依存性細胞傷害(CDC)を誘発する、実施形態１〜１７のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２１４】
１９．  前記遺伝子操作抗体が、システイン遺伝子操作前の抗体よりも低いレベルの抗体依存性補体依存性細胞傷害(CDC)を誘発する、実施形態１〜１７のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２１５】
２０．  前記遺伝子操作抗体が、フラグメント化および／または凝集特性により測定すると、システイン遺伝子操作前の抗体と同じまたはそれよりも高いレベルの安定性を示す、実施形態１〜１９のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２１６】
２１．  前記遺伝子操作抗体が、フラグメント化および／または凝集特性により測定すると、システイン遺伝子操作前の抗体よりも低いレベルの安定性を示す、実施形態１〜２０のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２１７】
２２．  前記遺伝子操作抗体がシステイン遺伝子操作前の抗体と比較して低減された半減期を示す、実施形態１〜２１のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２１８】
２３．  前記遊離チオール基が、細胞傷害性物質、化学療法剤、毒素、放射性核種、DNA、RNA、siRNA、マイクロRNA、ペプチド核酸、非天然アミノ酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、またはビオチンに化学的にコンジュゲートすることができる、実施形態１〜２２のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２１９】
２４．  前記細胞傷害性物質が、抗チューブリン物質、DNAマイナーグルーブ結合物質、抗ミトメイタンサノイド、およびオーリスタチンからなる群より選択される、実施形態２３記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２２０】
２５．  前記化学療法剤がタキソール、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキセート、ドラスタチン、ビンカアルカロイド、メトトレキセート、およびデュオカルマイシンからなる群より選択される、実施形態２３記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２２１】
２６．  前記毒素がアブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、コレラ毒素、ファルカリノール、α毒素、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロタウストラリン、リシン、ストリキニーネ、およびテトロドトキシンからなる群より選択される、実施形態２３記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２２２】
２７．  放射性核種がクロミウム(51Cr)、コバルト(57Co)、フッ素(18F)、ガドリニウム(153Gd、159Gd)、ゲルマニウム(68Ge)、ホルミウム(166Ho)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、ランタニウム(140La)、ルテチウム(177Lu)、マンガン(54Mn)、モリブデン(99Mo)、パラジウム(103Pd)、リン(32P)、プラセオジミウム(142Pr)、プロメチウム(149Pm)、レニウム(186Re、188Re)、ロジウム(105Rh)、ルテニウム(97Ru)、サマリウム(153Sm)、スカンジウム(47Sc)、セレニウム(75Se)、ストロンチウム(85Sr)、硫黄(35S)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、スズ(113Sn、117Sn)、トリチウム(3H)、キセノン(113Xe)、イッテルビウム(169Yb、175Yb)、イットリウム(90Y)、および亜鉛(65Zn)からなる群より選択される、実施形態２３記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２２３】
２８．  前記抗体が内在化抗体である、実施形態２３記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２２４】
２９．  前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異的抗体または多重特異的抗体である、実施形態１〜２８のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２２５】
３０．  実施形態１〜２９のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【０２２６】
３１．  実施形態３０記載の核酸を含むベクター。
【０２２７】
３２．  実施形態３１記載のベクターを含む宿主細胞。
【０２２８】
３３．  実施形態１〜２９のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体の抗体コンジュゲート。
【０２２９】
３４．  実施形態３３記載の抗体コンジュゲートを含む医薬組成物。
【０２３０】
３５．  被験者に実施形態３４記載の組成物を投与することを含む、癌、自己免疫性、炎症性または感染性の疾患もしくは障害を、それを必要とする被験者において検出する方法。
【０２３１】
３６．  疾患または障害が、前記抗体コンジュゲートにより結合される細胞表面抗原を過剰発現する細胞を含む、実施形態３５記載の方法。
【０２３２】
３７．  細胞を有効量の実施形態３３記載の抗体コンジュゲートと接触させることを含む、標的細胞の増殖を阻害する方法。
【０２３３】
３８．  有効量の実施形態３４記載の組成物を投与することを含む、被験者における標的細胞の増殖の抑制方法。
【０２３４】
３９．  前記標的細胞が前記抗体コンジュゲートにより結合される細胞表面抗原を過剰発現する、実施形態３７または３８記載の方法。
【０２３５】
４０．  治療上有効な量の実施形態３４記載の組成物を被験者に投与することを含む、癌、自己免疫性、炎症性、または感染性の疾患もしくは障害を、それを必要とする被験者において治療する方法。
【０２３６】
４１．  疾患または障害が、前記抗体コンジュゲートにより結合される細胞表面抗原を過剰発現する細胞を含むものである、実施形態４０記載の方法。
【０２３７】
４２．  前記方法が疾患と関連する細胞を殺すまたは該細胞の増殖速度を低減することを含む、実施形態４０記載の方法。
【０２３８】
４３．  前記方法が、B細胞またはT細胞を枯渇することを含む、実施形態４０記載の方法。
【０２３９】
４４．  追加の療法を施すことを含み、該追加の療法が、化学療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、および外科手術からなる群より選択される、実施形態４０記載の方法。
【０２４０】
４５．  実施形態１〜２９のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体に異種分子を効率的にコンジュゲートする方法。
【０２４１】
４６．  異種分子を抗体のCH1ドメインの131、132、133、134、135、136、137、および139からなる群より選択される少なくとも１つの位置にコンジュゲートすることを含む、実施形態４５記載の方法。
【０２４２】
４７．  異種分子が、細胞傷害性物質、化学療法剤、毒素、放射性核種、DNA、RNA、siRNA、マイクロRNA、ペプチド核酸、ペプチド、酵素、蛍光タグ、またはビオチンからなる群より選択される実施形態４５または４６記載の方法。
【０２４３】
４８．  前記細胞傷害性物質が、抗チューブリン物質、DNAマイナーグルーブ結合物質、抗ミトメイタンサノイド、およびオーリスタチンからなる群より選択される、実施形態４７記載の方法。
【０２４４】
４９．  前記化学療法剤がタキソール、パクリタキセル、ドキソルビシン、メトトレキセート、ドラスタチン、ビンカアルカロイド、およびメトトレキセートからなる群より選択される、実施形態４７記載の方法。
【０２４５】
５０．  前記毒素がアブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽毒素、コレラ毒素、ファルカリノール、α毒素、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロタウストラリン、リシン、ストリキニーネ、およびテトロドトキシンからなる群より選択される、実施形態４７記載の方法。
【０２４６】
５１．  放射性核種がクロミウム(51Cr)、コバルト(57Co)、フッ素(18F)、ガドリニウム(153Gd、159Gd)、ゲルマニウム(68Ge)、ホルミウム(166Ho)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、ランタニウム(140La)、ルテチウム(177Lu)、マンガン(54Mn)、モリブデン(99Mo)、パラジウム(103Pd)、リン(32P)、プラセオジミウム(142Pr)、プロメチウム(149Pm)、レニウム(186Re、188Re)、ロジウム(105Rh)、ルテニウム(97Ru)、サマリウム(153Sm)、スカンジウム(47Sc)、セレニウム(75Se)、ストロンチウム(85Sr)、硫黄(35S)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、スズ(113Sn、117Sn)、トリチウム(3H)、キセノン(113Xe)、イッテルビウム(169Yb、175Yb)、イットリウム(90Y)、および亜鉛(65Zn)からなる群より選択される、実施形態４７記載の方法。
【０２４７】
５２．  前記効率が、コンジュゲーション反応の後に残留する遊離チオール基により測定すると、少なくとも５％以上である、実施形態４５〜５１のいずれか１形態記載の方法。
【０２４８】
５３．  前記効率が、コンジュゲーション反応の後に残留する遊離チオール基により測定すると、少なくとも２５％以上である、実施形態４５〜５２のいずれか１形態記載の方法。
【０２４９】
５４．  前記効率が、コンジュゲーション反応の後に残留する遊離チオール基により測定すると、少なくとも７５％以上である、実施形態４５〜５３のいずれか１形態記載の方法。
【０２５０】
５５．  前記抗体が、位置132および／または138におけるシステインへの置換を有しない、実施形態１〜２９のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２５１】
５６．  前記抗体が位置132および／または138における置換を有し、該置換がシステインではない、実施形態１〜２９および５５のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２５２】
５７．  前記抗体が131-139ループ領域の少なくとも１つの拡張を有する、実施形態１〜２９および５５〜５６のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２５３】
５８．  前記抗体が、131-139ループ領域の拡張を有し、該拡張が、少なくとも１つ〜少なくとも１５のアミノ酸の挿入を含む、実施形態１〜２９および５５〜５７のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２５４】
５９．  前記抗体が131-139ループ領域の拡張を有し、該拡張が、残基131、132、133、134、135、136、137、138および139からなる群より選択される位置の後に生じる、実施形態１〜２９および５５〜５８のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２５５】
６０．  前記抗体が131-139ループ領域の拡張を有し、該拡張が、残基131、132、133、134、135、136、137、138および139からなる群より選択される位置の後に生じる、実施形態１〜２９および５５〜５９のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２５６】
６１．  前記抗体が131-139ループ領域の少なくとも第１および第２の拡張を有し、第１拡張が残基131、132、133、134、135、136、137、138および139からなる群より選択される位置の後に生じ、第２拡張が第１拡張の後に生じ、かつ第２拡張が残基131、132、133、134、135、136、137、138および139からなる群より選択される位置の後に生じる、実施形態１〜２９および５５〜６９のいずれか１形態記載のシステイン遺伝子操作抗体。
【０２５７】
均等物
以上の記載は、当業者が本発明を実施しうるのに十分なものであるとみなされる。前記の記載および実施例は本発明の或る好ましい実施形態を詳細に示しており、本発明者らが想定する最良の形態を記載している。しかし、前記の説明がどんなに詳細に本文中に記載されているとしても、本発明は多数の様態で実施可能であり、本発明は添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従い解釈されるべきであると理解されよう。
【０２５８】
特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書中で引用されている全ての参考文献およびそれらにおいて引用されている参考文献の全内容を参照により本明細書に組み入れることとする。
【０２５９】
また、2008年1月18日付け出願の米国仮特許出願第61/022,073号の全体をあらゆる目的で本明細書に組み入れることとする。
【０２６０】
（実施例）
7．実施例
つぎに以下の実施例を参照して本発明を説明する。これらの実施例は専ら例示目的で記載されており、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではないと解釈されるべきであり、本明細書に記載されている教示により明らかとなるあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
【０２６１】
7.1  実施例1．システイン操作抗体の発現および特徴づけ
セリンまたはトレオニンからシステインへの一連の置換をIgG1分子のCH1ドメインの131-139領域に施した。該システイン操作IgG1分子は、生物分野の当業者に公知の標準的なDNA組換え技術を用いて作製した（例えば、Sambrookら, Molecular Cloning- A Laboratory Manual, December 2000, Cold Spring Harbor Lab Pressを参照されたい）。IgG1分子内に存在するCH1ドメインの131-139領域は、溶媒露出される柔軟性領域に相当する（図1Aを参照されたい）。この領域が示す溶媒への露出は特異的残基へのコンジュゲーション試薬の接近を可能にする。IgG1のCH1ドメイン内の131-139の等価位置を表す他の種々の抗体形態の配列アライメントを図1Cに示す。この領域内に含有されるセリンおよび／またはトレオニン残基は、システイン残基で置換されるべき格別の候補アミノ酸である。
【０２６２】
システイン操作抗体法の一例を図1Bに示す。太字で示されているのはこの配列内の天然システイン残基であり、予想ジスルフィド結合対パターン（実線）が一緒に示されている。下線部は131位におけるセリン残基のシステイン置換の位置である。この導入システインを含む潜在的ジスルフィド結合が破線で示されている。
【０２６３】
図2Aにおいては、1C1野生型およびそのシステイン操作誘導体を発現させ、精製し、PAGE分析に付した。1C1野生型（レーン1）抗体およびその種々のシステイン操作誘導体（レーン2〜15）は、非還元性（インセット1）および還元性（インセットii）条件下、非常に類似した分子量プロファイルを示した。
【０２６４】
図2Bには、1C1wtおよび1C1 Ser131Cys突然変異体の非還元性ペプチドマッピングの比較を示す。この実施例においては、限定タンパク質分解および逆相クロマトグラフィー／質量分析（RP-LC/MS）を使用して、野生型ならびにシステイン操作1C1および1C6抗体におけるジスルフィド結合パターンおよび遊離システイン残基を特徴づけした。
【０２６５】
材料および方法：非還元性ペプチドマッピング。MAbを、酸性バッファー中、室温で20分間にわたり5mM N-エチルマレイミド（NEM）でキャップ化し、10mM リン酸バッファー、250mM NaCl、6M グアニジン（pH7.0）中、37℃で30分間にわたり変性させた。ついで該変性MAb溶液を100mM リン酸バッファー、0.1mM EDTA（pH7.0）で6倍希釈した。エンドペプチダーゼLys-Cを1:10の酵素:タンパク質比で加えた。該反応混合物を37℃で16〜24時間インキュベートした。該反応混合物の半分を、5〜10μLの500mM DTTを加えることにより還元し、37℃で15分間インキュベートした。未還元消化物および還元消化物の両方をLC/MSにより分析した。逆相HPLC（Phenomenex Jupiter 5m C18カラム; 250×2 mm）を用いてHPLC分離を行い、UV検出器およびオンラインLTQイオントラップ質量分析計（Thermo Fisher）による検出を行った。RP-HPLC移動相AはH2O中の0.1％ TFAであり、移動相Bはアセトニトリル中の0.1％ TFAであった。流速は0.2mL/分であり、勾配は150分間で0〜60％ Bであった。エレクトロスプレーインターフェースを備えたLTQイオントラップ質量分析計を300〜2000のm/z範囲で正イオンモードで作動させた。該ペプチドマップにおける各ピークをMSフルスキャンおよびズームスキャン分析により同定した。また、ペプチドの配列を確認するために、MS/MSスペクトルを集めた。ジスルフィド結合連結をLC-MS実験からのペプチド質量により決定し、還元消化物と未還元消化物とのペプチドマップを比較することにより確認した。NEM付加体を有するペプチド質量を探すことにより、遊離チオール含有ペプチドを特定した。
【０２６６】
結果：1C1はIgG1サブクラスのEphA特異的抗体である。図2BインセットAは、重鎖ヒンジ領域と軽鎖C末端との間の通常のジスルフィド結合連結（H11-L15）およびSer131を含有するペプチド（H5）を示した1C1 WT抗体である。図2BインセットBは、軽鎖と重鎖との間の通常のジスルフィド結合（H11-L15）およびwtペプチドH5の減少、ならびに突然変異システインから軽鎖C末端への（H5m-L15）およびヒンジ領域への（H5m-H11）新たに形成されたジスルフィド結合連結の出現を示した1C1 Ser131Cys突然変異体である。前記の方法を用いて、本発明者らは、1C1、1C1 Ser131Cysおよびその他の突然変異体のジスルフィド結合連結を決定した。また、1C1 Ser131Cys抗体は軽鎖と重鎖との間に新たな鎖間ジスルフィド架橋を形成しており、重鎖の220位のシステインは部位特異的薬物コンジュゲーションのために遊離していることを、本発明者らは確認した。前記方法を用いて遊離チオールも特定した。他のシステイン操作抗体でも同様の結果が得られた（データは示されていない）。
【０２６７】
図3には、1C6（EphB4特異的抗体）野生型（A）および1C6 Ser131Cys抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析の結果を表すプロットが示されている。サイズ排除クロマトグラフィーは、天然状態の分子（例えば、タンパク質）の見掛け分子量を決定するための当技術分野で周知の方法である。この実施例においては、精製抗体1C6野生型（A）または1C6 Ser131Cys（B）を、100mM 硫酸ナトリウム、100mM リン酸ナトリウム（pH6.8）を含有するバッファー中、SECカラム（TSK-GEL G3000SWXL）上にローディングした。該カラムを流速1ml/分での溶出に付した。見掛け分子量の決定のために加えられた校正標準物には以下のものが含まれた：チログロブリン（670kDa）、ウシガンマ-グロブリン（158kDa）、ニワトリオボアルブミン（44kDa）、ウマミオグロビン（17kDa）およびビタミンB12（1.35kDa）。パネル（AおよびB）に示されている非常に類似した軌線（トレーシング）により示されるとおり、1C6野生型および1C6 1Ser131Cysは単量体状態で存在する。他のシステイン操作抗体でも同様の結果が得られた（データは示されていない）。
【０２６８】
図4には、1C1野生型（A）、1C1 Ser134Cys（B）および1C1 Ser131-132Cys（C）および1C1 Ser131-132-134-136Cys（D）抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析の結果を表すプロットが示されている。サイズ排除クロマトグラフィーは前記のとおりに行った。パネル（A〜D）に示されている非常に類似した軌線（トレーシング）により示されるとおり、1C1野生型およびその種々のシステイン操作突然変異体は単量体状態で存在する。他のシステイン操作抗体でも同様の結果が得られた（データは示されていない）。
【０２６９】
7.2  実施例2．システイン操作抗体のエピトープ結合の特徴づけ
この実施例においては、システイン操作抗体の結合特性を親野生型抗体と比較した。
【０２７０】
材料および方法：結合アッセイを1×PBS中の1％ BSA中で行った。すべてのインキュベーション工程は、6.5の振とう速度でLab-Line Instrumentタイタープレートシェカーを使用して、室温で行った。ビオチン化EphB4またはEphA2およびルテニウム標識（BVタグ）抗ヒトカッパをストレプトアビジンM280ビーズならびにそれぞれ1C6、1C6 Ser131Cysおよび1C1および1C1 Ser131Cysの系列希釈物と共にインキュベートした。受容体および抗ヒトカッパの濃度は1μg/mlであり、該抗体濃度は1μg/ml〜7.8ng/mlであった。Bioveris M-シリーズ分析装置を使用して、特異的結合が示された。該装置はプレートから混合物を吸引し、それを電磁石上で流動させる。M280ビーズはプラットフォームに付着し、ついでビーズ上に洗浄溶液を流して未結合抗体または受容体を除去する。プラットフォームに静電荷を加えた。これはサンドイッチにおけるルテリウム標識まで移動して、それを発光させる。該読取り液は最終電子受容体として作用して、電荷が加えられている限りルテリウムが連続的に発光するのを可能にする。ついで電磁石を取り外し、サンプルを洗い落とした。洗浄および読取りは装置により自動的に行われ、ウェル間で一貫していた。
【０２７１】
結果：この実施例においては、ELISA（溶液形態）に基づく抗原結合アッセイを、精製抗体、すなわち、1C6 WTおよび1C6 Ser131Cysに対して行った。これらの抗体はEphB4受容体を特異的に認識する。図5に示すとおり、WT抗体およびシステイン操作抗体Ser131Cys抗体のELISA形態で測定された結合アフィニティプロファイルは非常に類似していた。同様に、1C1に基づくシステイン操作抗体についても、1C1野生型および1C1 Ser131Cys抗体に関してELISA形態において測定された結合アフィニティプロファイルは非常に類似していた（図6を参照されたい）。1mM DTTのような還元剤の含有は、システイン操作抗体1C1 Ser131Cysにより示される結合プロファイルに影響を及ぼさなかった。他のシステイン操作抗体でも同様の結果が得られた（データは示されていない）。これらの結果は、CH1ドメイン内へのシステイン残基の操作が、親抗体と比較して、生じる抗体のエピトープ結合特性を変化させないことを示している。
【０２７２】
7.3  実施例3．システイン操作抗体の安定性の特徴づけ
この実施例においては、親（野生型）抗体の融解温度（Tm）を該システイン操作抗体と比較する。
【０２７３】
材料および方法：野生型およびシステイン操作抗体の融解温度（Tm）を決定するために、示差走査熱量測定（DSC）を用いた。Tmは抗体の安定性の指標であり、より高いTmは、非常に安定で非凝集性の抗体に関連している。DSC実験は、本発明において研究された抗体（野生型およびシステイン操作抗体）の熱容量を10℃〜110℃の範囲の温度の関数として測定した。DSC測定は、Microcal VP-DSC超高感度走査マイクロ熱量計（ultrasensitive scanning microcalorimeter）を使用して行った。DSC実験は、25mM ヒスチジン-HCl（pH 6）、5mM EDTA中で行った。DSCのために使用される全ての溶液およびサンプルは、0.22ミクロン-フィルターを使用して濾過し、熱量計内へのローディングの直前に脱気した。各組の測定に関して、まず、バッファー対ベースライン実施を行った。この直後に、該バッファー溶液をサンプルセルから除去した。該サンプルセルに0.5〜1mg/mlの範囲の濃度の0.5mlの抗体（野生型およびシステイン操作抗体）溶液を充填した。測定中、参照セルをサンプルバッファーで満たした。各サンプル対バッファー実験から、対応するバッファー対バッファーベースラインを差し引いた。生データを濃度および走査速度に関して正規化した。Microcalにより提供されたOrigin DSCソフトウェアを使用して、データを当てはめた。また、コンジュゲート抗体（EZ-Link(登録商標)ビオチン-HPDP (Pierce) およびZ-Linkヨードアセチル-PEO2 Biotinとのコンジュゲート）を使用してDSC実験を行い、野生型およびシステイン操作抗体に類似したサーモグラムを得た。
【０２７４】
結果：この実施例においては、種々の野生型およびシステイン操作抗体の融解曲線を決定するために、示差走査熱量測定（DSC）を用いた。図7に、1C6 WT抗体（A）および1C6 Ser131Cys抗体（B）の示差走査熱量測定（DSC）サーモグラムを示す。両抗体は、それぞれ70℃および69℃の、非常に類似した融解温度（Tm）を示している。図8に、1C1 WT（A）、1C1 Ser131Cys（B）、1C1 Ser134Cys（C）、1C1 Ser(131-132)Cys（D）および1C1 Ser(131-132-134-136)Cys抗体の示差走査熱量測定（DSC）サーモグラムを示す。これらの抗体は全て、非常に類似した融解温度（Tm）を示している。他のシステイン操作抗体でも同様の結果が得られた（データは示されていない）。これらの結果は、CH1ドメイン内へのシステイン残基の操作が、生じる抗体の安定性を変化させないことを示している。
【０２７５】
7.4  実施例4．システイン操作抗体のビオチンコンジュゲーション
この実施例においては、システイン操作抗体上の遊離コンジュゲーション部位をビオチンの取り込みの増加により示す。
【０２７６】
材料および方法：EZ-Link(登録商標)ビオチン-HPDP（コンジュゲーション試薬1 =- CR1）およびEZ-Link(登録商標)ヨードアセチル-PEO2ビオチン（コンジュゲーション試薬2 = CR2）をPierceから入手した。野生型およびシステイン操作抗体を、100mM リン酸バッファー、100mM NaCl（pH 8.0）、0.02mM DTT、5mM EDTA中、窒素下で37℃で3時間インキュベートした。このインキュベーションの後、1 PBS 1×、1mM EDTA中、窒素下の透析を用いて、抗体サンプルをバッファー交換に付した。CR1を2mg/mlで100％ DMSOに溶解し、CR2を蒸留水に溶解した。7μg/mlのコンジュゲーション試薬ならびに0.5mg/mlの野生型およびser131cysの両抗体を別々に混合し、ボルテックスし、ついで4℃、37℃、45℃および55℃で90分間インキュベートした。SEC（サイズ排除クロマトグラフィー）または脱塩カラム（Pierce社のZEBA, Desalt Spin Columns）を使用して、未結合CR1およびCR2を除去した。ストレプトアビジン結合アッセイを用いて、ビオチンの取り込みを測定した。結合アッセイは、１×PBS中の1％ BSA中で行い、全てのインキュベーション工程は、6.5の速度設定のLab-Line Instrumentタイタープレートシェーカーを使用して室温で行った。ストレプトアビジンM280ビーズおよびルチジウム（BVタグ）標識抗ヒトカッパをそれぞれビオチン化ser131cysおよび野生型の系列希釈物と混合した。抗ヒトカッパの濃度は1μg/mlであり、抗体濃度は1μg/ml〜7.8ng/mlであった。Bioveris Mシリーズ分析装置を使用して、該特異的結合を評価した。
【０２７７】
結果：種々の条件下の1C6（WT）抗体および1C6 Ser131Cys（Mut）抗体のビオチンコンジュゲーション研究からの結果を図9に示す。パネルAにおいては、1C6および1C6 Ser131Cys抗体を種々の温度（4℃、37℃、45℃および55℃）でEZ-Link(登録商標)ビオチン-HPDP（Pierce）とのコンジュゲーション反応に付した。得られたビオチンコンジュゲーション効率を測定し、プロットした。1C6 Ser131Cys抗体は、1C6抗体より高い部位特異的ビオチンコンジュゲーション効率を示した。パネルBにおいては、1C6および1C6 Ser131Cys抗体を種々の温度（4℃、37℃、45℃および55℃）でEZ-Link(登録商標)ヨードアセチル-PEO2ビオチンとのコンジュゲーション反応に付した。得られた潜在的部位特異的ビオチンコンジュゲーション効率を測定し、プロットした。1C6 Ser131Cys抗体は、1C6抗体より高い部位特異的ビオチンコンジュゲーション効率を示した。これらの結果は、1C3 Ser131Cys抗体のようなシステイン操作抗体が、種々の物質へのコンジュゲーション（例えば、ビオチンへのコンジュゲーション）が可能なシステインを提示することを示している。
【０２７８】
7.5  実施例5．システイン操作抗体により示されるFcγ受容体に対する結合アフィニティの特徴づけ
この実施例においては、システイン操作抗体により示されるFcγ受容体に特異的な結合特性を野生型抗体と比較した。
【０２７９】
材料および方法：BIAcore（登録商標）3000装置（Biacore International）および標準的なプロトコールを用いて、BIAcore（登録商標）実験を行った。簡潔に説明すると、標準的なアミンカップリングキットを使用して、1C1-wtの7444RU（Resonance Unit）および1C1 serl31cysの7781RUをCM5センサーチップ（Pharmacia Biosensor）のデキストランマトリックスに結合させた。過剰の反応性エステルを、70μlの1.0M エタノールアミン塩酸塩（pH 8.5）の注射によりクエンチした。FcγRs（I、IIA、IIIA、IIB）を流速5μl/分で500nMで注射した。FcγRsの結合レベルは1C1野生型と1C1 ser131cysとで類似している。オボアルブミンを陰性対照として使用した。結合実験の後、1C1野生型および1C1 ser131cys突然変異体に関するセンサーチップ表面を、1M NaCl/50mM NaOHを使用して再生させた。0.05％ Tween 20を含有する50mM リン酸バッファー（pH 6.0）中または0.05％ Tween 20を含有する50mM リン酸バッファー（pH 7.4）中のヒトFcRnへの結合を測定するために、再生表面チップを使用した。ヒトFcRnを含有する溶液を該センサーチップ上に5μl/分で流動させた。野生型および突然変異体の両方の結合レベルは類似している。陰性対照としてオボアルブミンを使用した。
【０２８０】
結果：種々のFcγ受容体に対する1C1 WTおよび1C1 Ser131Cys抗体の相対アフィニティを測定するBIAcore（登録商標）アッセイからの結果を図10に示す。調べた種々のFcγ受容体はFcγRI（A）、FcγRIIIA（B）、FcγRIIA（C）、FcγRIIB（D）であった。1C1 WTおよび1C1 Ser131Cys抗体は種々のFcγ受容体に対する非常に類似した結合アフィニティを示している。また、pH 6.0およびpH 7.4におけるFcγ受容体に対する1C1 WTおよび1C1 Ser131Cys抗体の相対アフィニティを測定するBIAcore（登録商標）アッセイからの結果を図11に示す。1C1 Ser131Cys抗体は、pH 6.0およびpH 7.4の両方において、1C1 WT抗体に類似した結合プロファイルでFcRn受容体に結合する。試験したその他のシステイン操作抗体でも同様の結果が得られた。これらの結果は、抗体のCH1ドメインへのシステイン残基の操作が、Fcγ受容体に対する結合アフィニティに影響を及ぼさず、したがって、エフェクター機能を制御する能力に影響を及ぼさないことを示している。
【０２８１】
7.6  実施例6．システイン操作抗体のインターナリゼーション
この実施例においては、該システイン操作抗体を、細胞表面抗原への結合に際してインターナリゼーション（内在化）される能力に関して試験した。
【０２８２】
材料および方法：96ウェルU底プレートを使用して、インターナリゼーションアッセイを行った。106細胞/mlの濃度のPC3細胞（高レベルのEphA2を天然で発現するPC3細胞）を対照抗体（R347）、1C1野生型および1C1システイン操作抗体（全て1mg/ml）と共に氷中で30分間インキュベートした。このインキュベーションの後、該細胞を1×PBS中で2回洗浄した。ついで該細胞を、3.7％ パラホルムアルデヒド中、室温で20分間固定し、1×PBS中で2回洗浄した。該細胞を1×PBS中の0.5％ Triton X-100で室温で5分間にわたり透過性亢進させ、1×PBS中で2回洗浄した。1×PBS、2％ FBS中の1μgの二次抗体（Alexa-Fluor 488ヤギ抗ヒトIgG (H+L) Molecular Probes #A 11013）を該細胞に加え、暗所において室温で30分間インキュベートした。このインキュベーションの後、該細胞を1×PBS中で2回洗浄し、顕微鏡処理スライド上に直接的にコートした。ついで、DAPI含有マウント媒体（DAPI含有VcctaShield HardSet Mounting Medium. Vector Laboratories #H-1500）を使用して、該細胞を顕微鏡カバーガラス（Covershps VWR#48382-138）の下にマウントした。ついでスライドを4℃で一晩インキュベートし、ついでKikon Eclipse 55i Fluroscent蛍光顕微鏡を使用して可視化した。
【０２８３】
結果：PC3細胞上で行った抗体インターナリゼーション研究からの結果を図12に示す。1組の対照が第1パネルに示されている。（A）においては、未染色細胞がDAP1で対比染色されている。（B）においては、二次抗体のみで染色された細胞がDAPIで対比染色されている。（C）においては、対照一次抗体R347を該細胞と共にインキュベートし、それがDAPIで対比染色されている。（D）においては、該細胞を1時間インキュベートし、ついでそれがR347で染色されている。該対照（A〜D）はいずれも、抗体特異的細胞染色を何ら示していない。（E）においては、細胞を1C1 wt抗体と共に時間ゼロから1時間インキュベートする。1時間の時点における2つの代表的なイメージは1C1 WT抗体のインターナリゼーションを示している。（F）においては、細胞を1C1 Ser131Cys抗体と共に時間ゼロから1時間インキュベートする。1時間の時点における2つの代表的なイメージは1C1 Ser131Cys抗体のインターナリゼーションを示している。（G）においては、細胞を1C1 Ser134Cys抗体と共に時間ゼロから1時間インキュベートする。1時間の時点における2つの代表的なイメージは1C1 Ser134Cys抗体のインターナリゼーションを示している。（H）においては、細胞を1C1 Ser(131-132)Cys抗体と共に時間ゼロから1時間インキュベートする。1時間の時点における2つの代表的なイメージは1C1 Ser(131-132)Cys抗体のインターナリゼーションを示している。（I）においては、細胞を1C1 Ser(131-132-134-136)Cys抗体と共に時間ゼロから1時間インキュベートする。1時間の時点における2つの代表的なイメージは1C1 Ser(131-132-134-136)Cys抗体のインターナリゼーションを示している。システイン操作抗体の全ては、野生型抗体と比較して類似した度合でインターナリゼーションされた。これらの結果は、抗体のインターナリゼーションがCH1ドメインにおけるシステイン残基の操作により影響されないことを示している。
【０２８４】
7.7  実施例7．システイン操作抗体における遊離チオールの定量
この実施例においては、システイン操作抗体における遊離チオールを測定した。
【０２８５】
材料および方法：エルマン（Ellman）のDNTB試薬（DNTB: 5,5'-ジチオ-ビス-(2-ニトロ安息香酸)）を使用して、抗体遊離スルフヒドリル（-SH）基の定量的測定を行った。DNTBを25mMでDMFに溶解した。この化合物の溶液は測定可能な黄色生成物（TNB: 13600M-1 cm-1の吸光係数）を与え、これは、遊離スルフヒドリルへのDNTBの結合に際して遊離されるとpH 8.0において412nmの可視領域で吸光する。コンジュゲーションに用いたのと同じ方法を用いて、抗体サンプルを調製した。野生型抗体およびシステイン操作抗体におけるスルフヒドリル基を、既知濃度のスルフヒドリル含有化合物（例えば、システイン）から作成された標準曲線との単純比較により評価した。あるいは、TNB（これは遊離チオールへのDNTB結合に際して遊離され、その量は全遊離スルフヒドリル基に直接的に関連づけられる）の吸光係数を用いて、スルフヒドリル基を定量することが可能である。25mMの濃度の20μlのDNTB実施溶液を1mg/mlの濃度の990μlのサンプル中に希釈した。ブランク試験チューブのために及び10μgの標準濃度のシステイン標準体（使用する場合）のために、同容量のDNTBを990μlのサンプル透析バッファー中に希釈した。DNTBおよびサンプルを激しく混合し、37℃の室温で15分間インキュベートした。Agilent 8453 UV-Visible Spectroscopyを使用し50μlの石英キュベットを使用して、412nmおよび280nmにおける吸光度を測定した。抗体内に存在する遊離チオールを計算するために、412nmにおける2つの独立した測定値の平均吸光度を13600 M-1 cm-1（TNBの吸光係数）で割り算して、該アッセイにおけるモル濃度を得、抗体のモル濃度も決定した。TNBのモル濃度を溶液中の抗体モル濃度で割り算することにより、遊離スルフヒドリルを計算した。
【０２８６】
結果：前記の方法を用いて、1C6および1C1野生型抗体ならびに1C6および1C1 Ser131Cys抗体上の遊離チオールの数の決定を行った。エルマン試薬結合に関して示された遊離チオールの数を表す整数へと吸光度測定値を統合して、表1に示すデータを得た。このデータは、得られたシステイン操作抗体が、予想どおり、2つの遊離チオール（抗体二量体における各修飾CH1ドメインにつき1つ）を提示することを示している。他のシステイン操作抗体でも同様の結果が得られた（データは示されていない）。これらの結果は、予想どおり、該システイン操作抗体が遊離チオールを提示することを示している。
【表１】
2011509675.tif 000003
【０２８７】
7.8  実施例8．システイン操作抗体の結合特異性
この実施例においては、種々のシステイン操作抗体の結合特異性をシステイン操作前の抗体との比較において測定した。
【０２８８】
材料および方法：この実施例においては、1C1から誘導された種々のシステイン操作抗体のEphA2に対する相対結合特異性を測定するために、ELISAに基づくアッセイを行った。組換えマウスEphA2-FcをELISAプレート上にコートした。各抗体を2μg/mlで加え、HRPにコンジュゲートされた抗カッパ抗体への結合に関して分析した。データは3つの独立した実験の平均である。
【０２８９】
結果：この実験からの結果を図13に示す。ここで、システイン操作抗体は、システイン操作前の野生型1C1と比べて同等の、EphA2に対する結合特異性を示した。2つの無関係な抗体（対照抗体1および2）の使用はEphA2に対するこのELISA実験の特異性を証明している。また、システイン残基の複数の置換は抗体のそのコグネイト抗原に対する結合特異性を変化させない。これらの結果は、抗体のシステイン操作が、システイン操作前の抗体と比較して結合特異性を変化させないことを示している。
【０２９０】
7.9  実施例9．システイン操作抗体はPEGにコンジュゲートされうる
この実施例においては、種々のシステイン操作抗体をマレイミドリンカーを介してポリエチレングリコール（PEG）にコンジュゲートさせた。抗体上に存在する遊離操作システインは、コンジュゲーションのために該遊離スルフヒドリル基を露出させるための脱キャップ化を要する。
【０２９１】
材料および方法：伝統的な哺乳類一過性発現を用いて、システイン抗体突然変異体（1C1 WT、1C1 Ser134Cys、1C1 Ser136Cysおよび1C1 Ser132Cys-Ser134Cysなど）を製造した。精製中、空気（酸素）によるシステインの酸化を最小限度にするために、該サンプルを絶えず窒素気流下に配置した。全ての抗体精製バッファーは、遊離システインを遮断し又はそれに結合する物質をキレート化するために、少なくとも、25mM EDTAを含有していた。全ての操作は、0.1M リン酸ナトリウム、0.15M NaCl、0.025M EDTA（pH 7.2）を含有するコンジュゲーションバッファー（CB）中で行った。pH 7.2は、マレイミド-システインコンジュゲーションの特異性を最大にするのに最適である。コンジュゲーション部分（マレイミド-PEG2000）は、CB中で毎回新たに調製する。該抗体突然変異体を、一定の回転下、CB中、10mM システイン-HClと共に37℃で30分間インキュベートした。システイン処理後、市販の脱塩カラム（Pierceから購入したZebaカラム）を使用して、CB中のタンパク質脱塩により遊離システインを除去した。脱塩後、該システイン抗体突然変異体を約3モル過剰のコンジュゲーション試薬（この場合は、NOF North America Corporationから購入したマレイミド-PEG2000）と共にインキュベートした。コンジュゲーションを、一定の回転下、37℃で2時間行った。コンジュゲーション後、過剰のマレイミド-PEG20000をタンパク質脱塩により除去した。SDS-PAGEにおいて見られるコンジュゲート化／非コンジュゲート化重鎖バンドの比のデンシトメトリー分析により、サンプルをモニターした。
【０２９２】
結果：システイン操作抗体の脱キャップ化およびマレイミド-PEG2000へのコンジュゲーションのSPS-PAGE分析を図14に示す。コンジュゲーションは、PEGの非存在下の抗体を表すレーン（レーン1〜4、9〜12）において観察された結合プロファイルと比較して、抗体+PEGを表すレーン（レーン5〜8、13〜16）において見られる高いほうの分子量のバンドとして可視化された。脱キャップ化反応前のシステイン操作抗体（1C1 Ser134Cys、1C1 Ser136Cys、1C1 Serl32-l34Cys）は、低いが検出可能なレベルの、PEGとのコンジュゲーションを示す（レーン2〜4、6〜8）。遊離システインで処理した後のシステイン操作抗体は、脱キャップ化反応前のシステイン操作抗体（レーン2〜4、6〜8）と比較して高いレベルのコンジュゲーションを示す（レーン10〜12、14〜16）。非システイン処理レーンは、10mM 遊離システインでのシステイン操作抗体の処理と比較して低下したレベルのPEG化（より高い分子量のバンド）を示している。システイン操作前の抗体を含有する対照ウェルは、いずれの条件においても、検出可能なレベルのPEG化を何ら示していない（レーン1、5、9および13）。これらの結果は、システイン操作抗体（1C1 Ser134Cys、1C1 Ser136Cys、1C1 Serl32-l34Cys）が、部分的にキャップ化された遊離システインを提示することを示唆している。スルフヒドリル基のキャップは脱キャップ化反応により効率的に除去され、スルフヒドリル基を、コンジュゲートに対して反応性となるよう遊離させる。
【０２９３】
7.10  実施例10．システイン操作抗体の脱キャップ化は全体的な抗体構造を損なわない
この実施例においては、抗体構造の全体的な安定性を判定するために、コンジュゲーションのために遊離システイン残基を露出させるために種々のシステイン操作抗体を脱キャップ化させた。
【０２９４】
材料および方法：この実施例のための脱キャップ化法は以下のとおりであった。親および突然変異抗体を、PBS 1×（pH 7.4）、10mM EDTA中、システイン-HCl（システイン-HCl/抗体のモル比は75）と共に、一定の回転および窒素ガス下、37℃でインキュベートした。バッファー交換およびPBS 1×（pH 7.4）、10mM EDTA中の一晩の透析により、過剰のシステイン-HClを除去した。脱キャップ化システインの酸化を最低限度にするために、窒素ガス下、室温で透析を行った。未処理および脱キャップ化抗体をSDS-PAGE電気泳動により分析して、抗体構造の完全性を判定した。
【０２９５】
結果：この実験からの結果を図15に示す。結果は、システイン操作抗体内の不対システインを遊離させるための脱キャップ化プロトコールが鎖間ジスルフィド結合を損なわず、したがって全体的な抗体構造を損なわないことを示している。未処理レーンをコグネイト処理レーンと比較したところ、それらのシステイン操作抗体（1C1 Ser134Cys、1C1 Thr135Cys、1C1 Ser136Cys、1C1 Ser139Cys）はSDS-PAGEプロファイルにおける相違を示しておらず、このことは、それらの抗体がシステイン処理により還元されていないことを示唆している。また、対照としての野生型抗体（レーン2、8）はSDS-PAGEプロファイルにおける変化を示しておらず、このことは、脱キャップ化プロトコールの途中および後に全体的な抗体構造が無傷のままであることを示唆するデータを更に補充するものである。
【０２９６】
7.11  実施例11．システイン操作抗体はPEG-ビオチンにコンジュゲートされうる
この実施例においては、種々のシステイン操作抗体をマレイミドリンカーを介してPEG-ビオチンにコンジュゲートさせた。
【０２９７】
材料および方法：システイン操作抗体および野生型対照抗体を前記のとおりに製造した。マレイミド-PEG2-ビオチンを使用し1:6（マレイミド-PEG2-ビオチン/抗体）のモル比を用いて、PBS 1×（pH 7.4）、10mM EDTA中、一定の回転下、37℃で2時間にわたり、コンジュゲーションを行った。PBS 1×（pH 7.4）、10mM EDTA中で4℃の十分な透析により、未反応マレイミド-PEG2-ビオチンを除去した。抗体をウエスタンブロット分析により分析し、ビオチンに関して可視化した。該抗体は1mg/mlの濃度で存在した。しかし、5mg/mlまでの抗体濃度でも同様の結果が得られた。
【０２９８】
結果：種々のシステイン操作抗体とのビオチンコンジュゲーション反応からの結果を図16に示す。レーン1は、遊離システインにコンジュゲートされたビオチンを含有する予想サイズの抗体を可視化するためにビオチンで標識された対照抗体である。1C1野生型抗体は、遊離システインの欠如のため、ビオチンコンジュゲーションを示さなかった（レーン3）。種々のシステイン操作抗体（1C1 Ser134Cys、1C1 Thr135Cys、1C1 Ser136Cysおよび1C1 Thr139Cys）は予想分子量においてビオチンへの効率的なコンジュゲーションを示した（レーン4〜7）。これらの結果は、システイン操作抗体1C1 Ser134Cys、1C1 Thr135Cys、1C1 Ser136Cysおよび1C1 Thr139Cysが、ビオチンへのコンジュゲーションが可能な露出遊離システインを提示することを示している。
【０２９９】
7.12  実施例12．コンジュゲートされたシステイン操作抗体はコグネイト抗原への結合を維持する
この実施例においては、ビオチンにコンジュゲートされた種々のシステイン操作抗体を、対照未コンジュゲート抗体の場合と比較した結合特異性の維持に関して試験した。
【０３００】
材料および方法：システイン操作抗体を、実施例11に記載されているとおりに製造した。組換え製造されたEphA2-FLAGを2μg/mlでコートして、ELISAプレートを調製した。種々の抗体を該ELISAプレートと共にインキュベートし、洗浄し、HRPにコンジュゲートされた抗ストレプトアビジンで検出した。
【０３０１】
結果：ビオチンにコンジュゲートされた種々のシステイン操作抗体をコグネイト抗原特異性の維持に関して試験したELISAプレート結合実験からの結果を図17に示す。対照抗体は、検出のためのコンジュゲートビオチンを含有していないため、該プレート上で可視化され得なかった。この実験においては、ビオチンコンジュゲートシステイン操作抗体1C1 Ser134Cys、1C1 Thr135Cys、1C1 Ser136Cysおよび1C1 Thr139CysはEphA2への結合を維持していた。これらの結果は、種々のシステイン操作抗体のコンジュゲーションがそれらのコグネイト抗原への結合に悪影響を及ぼさないことを示している。
【０３０２】
7.13  実施例13．システイン操作抗体へのビオチンコンジュゲーションの定量
この実施例においては、ビオチンにコンジュゲートされた種々のシステイン操作抗体を抗体分子当たりのビオチンの比含量に関して分析した。
【０３０３】
材料および方法：システイン操作抗体を、実施例11に記載されているとおりに製造した。それぞれの抗体の見掛け質量を測定するために、標準的な質量分析技術を用いた。未コンジュゲート抗体およびコンジュゲート抗体の無傷質量を測定した。質量分析により未コンジュゲート質量とコンジュゲート質量との差を求めた。2つのビオチン分子の予想質量を約1051.24Daとして用いると、未コンジュゲート質量とコンジュゲート質量との差は、付加されたビオチン分子を表しうる。
【表２】
2011509675.tif 000004
【０３０４】
結果：ビオチンにコンジュゲートされた種々の抗体の質量分析からの結果を表2に示す。1C1野生型抗体は（ビオチンで処理された場合であっても）、コンジュゲート質量と未コンジュゲート質量との有意な差を示しておらず、このことは、その抗体にコンジュゲートされたビオチン分子が存在しないことを示唆している。1C1 Ser134Cys、1C1 Thr135Cys、1C1 Ser136Cysおよび1C1 Thr139Cysは全て、コンジュゲート質量と未コンジュゲート質量との質量差を示している。この差は1051.24Daの2つのビオチン分子の予想質量にほぼ等しい。したがって、抗体重鎖のホモ二量性のため、各抗体の重鎖における単一のシステイン置換。
【０３０５】
7.14  実施例14．システイン操作抗体へのコンジュゲーションは部位特異的かつ高効率的である
この実施例においては、種々のシステイン操作抗体へのビオチンコンジュゲーションの効率および位置を決定した。
【０３０６】
材料および方法：システイン操作抗体を、実施例11に記載されているとおりに製造した。ビオチンコンジュゲーション反応の相対位置および効率を決定するために、標準的なペプチドマッピング技術を用いた。該抗体の一次配列に基づき、理論質量およびペプチド断片化プロファイルを決定した。この理論質量を、該ペプチドにより示された実測質量と比較し、差を求めた。特異的ペプチドにコンジュゲートされたビオチン分子により示される予想質量変化を特定した。また、ビオチン含有ペプチドおよび未コンジュゲートペプチドの相対強度をコンジュゲーションの効率として決定した。該コンジュゲーション効率の結果を以下の表3に示す。
【表３】
2011509675.tif 000005
【０３０７】
結果：ビオチンにコンジュゲートされた種々の抗体のペプチドマッピング分析において、ビオチンがコンジュゲートされた特異的ペプチドを特定した。具体的には、1C1 Ser134Cys、1C1 Thr135Cys、1C1 Ser136Cysおよび1C1 Thr139Cysの各抗体に関して、推定不対システインにビオチンがコンジュゲートされていた。さらに、コンジュゲートビオチン種と未コンジュゲートビオチン種との相対比率を分析して、コンジュゲーション効率を決定した。表3に示す結果は種々のシステイン操作抗体のコンジュゲーション効率である。該野生型抗体は、コンジュゲーションに容易に利用可能な部位を保有しないため、コンジュゲーションを全く示さなかった。該システイン操作抗体は48％〜70％の範囲のビオチンコンジュゲーション効率を示した。これらのデータは、種々のシステイン操作抗体において部位特異的コンジュゲーションが高レベルの効率で生じることを示している。
【０３０８】
前記の発明は明瞭化および理解を目的として相当に詳細に説明されているが、本発明の真の範囲から逸脱することなく形態および詳細において種々の変更が施されうることが、この開示を読むことにより当業者に明らかとなろう。例えば、前記の技術および装置は全て、種々の組合せで使用されうる。本出願において引用されている全ての刊行物、特許、特許出願および他の文書の全体を、それぞれの個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書があらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられると個別に示されているのと同等に、あらゆる目的で参照により本明細書に組み入れることとする。
【０３０９】
本出願は、2008年1月18日付け出願の米国仮特許出願第61/022,073号（参照によりその全体を本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
【図１Ａ】
2011509675.tif 000006
【図１Ｂ】
2011509675.tif 000007
【図１Ｃ】
2011509675.tif 000008
【図２Ａ】
2011509675.tif 000009
【図２Ｂ】
2011509675.tif 000010
【図３】
2011509675.tif 000011
【図４】
2011509675.tif 000012
【図５】
2011509675.tif 000013
【図６】
2011509675.tif 000014
【図７】
2011509675.tif 000015
【図８−１】
2011509675.tif 000016
【図８−２】
2011509675.tif 000017
【図９】
2011509675.tif 000018
【図１０】
2011509675.tif 000019
【図１１】
2011509675.tif 000020
【図１２−１】
2011509675.tif 000021
【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2011509675.tif 000026
【図１６】
2011509675.tif 000027
【図１７】
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【配列表】
2011509675000001.app
【国際調査報告】
2011509675.tif 000029
2011509675.tif 000030