(57)【要約】  本発明は、一般に、アジュバント特性を有するペプチド、該アジュバントペプチドを含むワクチン、およびインフルエンザの予防もしくは治療におけるそれらの使用に関する。より特には、本発明は、インフルエンザウイルスの凝集を誘導するアジュバントペプチドに関する。ペプチドは、インフルエンザワクチンに含まれ得て、ワクチンに対する免疫応答を増大させ得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原およびアジュバントペプチドを含むワクチンであって、該アジュバントペプチドが式:
(X1)n-A-A-V-A-L-L-P-A-V-L-L-A-L-L-A-P-(x2)m (配列番号2)
［式中、
X1およびX2は、1個またはそれ以上の荷電アミノ酸残基から選択され、
各X1および各X2は、同じであるか、または異なる荷電アミノ酸残基であってもよく、
nは、0または3-10であり、そして
mは、0または3-10である(ただし、mおよびnの両方が0の場合はない)］
を有し、該免疫原が呼吸器ウイルスに対する免疫応答を誘発することが可能である、ワクチン。
【請求項２】
アジュバントペプチドが配列RRKKAAVALLPAVLLALLAP (配列番号1)を有する、請求項1に記載のワクチン。
【請求項３】
免疫原が抗原である、請求項1に記載のワクチン。
【請求項４】
抗原が、スプリットウイルス抗原、サブユニット抗原、不活化全ウイルス、弱毒化生ウイルスおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項3に記載のワクチン。
【請求項５】
ワクチンが約1μg/mLから約10μg/mLの量での免疫原を含む、請求項1に記載のワクチン。
【請求項６】
さらに薬学的に許容される担体を含む、請求項1に記載のワクチン。
【請求項７】
呼吸器ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項1に記載のワクチン。
【請求項８】
インフルエンザウイルスが、鳥インフルエンザウイルスおよび季節性インフルエンザウイルスからなる群から選択される、請求項7に記載のワクチン。
【請求項９】
鳥インフルエンザウイルスがH5N1型である、請求項8に記載のワクチン。
【請求項１０】
インフルエンザウイルスがA型インフルエンザウイルスである、請求項7に記載のワクチン。
【請求項１１】
ウイルス呼吸器感染に対して哺乳類を免疫化する方法であって、哺乳類に免疫原およびアジュバントペプチドを含むワクチンを投与することを含み、該アジュバントペプチドが式:
(X1)n-A-A-V-A-L-L-P-A-V-L-L-A-L-L-A-P-(x2)m (配列番号2)
［式中、
X1およびX2は、1個またはそれ以上の荷電アミノ酸残基から選択され、
各X1および各X2は、同じであるか、または異なる荷電アミノ酸残基であってもよく、
nは、0または3-10であり、そして
mは、0または3-10である(ただし、mおよびnの両方が0の場合はない)］
を有し、該免疫原が呼吸器ウイルスに対する免疫応答を誘発することが可能である、方法。
【請求項１２】
アジュバントペプチドが配列RRKKAAVALLPAVLLALLAP (配列番号1)を有する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
免疫原が抗原である、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
抗原が、スプリットウイルス抗原、サブユニット抗原、不活化全ウイルス、弱毒化生ウイルスおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
呼吸器ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
インフルエンザウイルスが鳥インフルエンザウイルスである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
呼吸器ウイルスが季節性インフルエンザウイルスである、請求項15に記載の方法。
【請求項１８】
ワクチンが非経口投与を介して投与される、請求項11に記載の方法。
【請求項１９】
ワクチンが鼻腔内に投与される、請求項11に記載の方法。
【請求項２０】
ワクチンが予防的に投与される、請求項11に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表についての参照
本願は、配列表を包含する。配列表の紙コピーおよびコンピューター可読コピーは、本明細書と同時に提出される。配列表に含まれる情報は、その全体を引用により本明細書の一部とする。
【０００２】
発明の背景
本発明は、一般に、アジュバント特性を有するペプチド、該アジュバントペプチドを含むワクチン、およびインフルエンザの予防もしくは治療におけるそれらの使用に関する。より特には、本発明は、インフルエンザウイルスの凝集を誘導するアジュバントペプチドに関する。ペプチドは、インフルエンザワクチンに含まれ得て、ワクチンに対する免疫応答を増大させ得る。
【０００３】
A型インフルエンザウイルスの発生は、世界中で蔓延した罹患率および死亡率を引き起こし続けている。米国単独において、人口の約5%から約20%が毎年A型インフルエンザウイルスに感染し、約200,000人が入院し、36,000人が死亡している。包括的なワクチン接種政策の確立がインフルエンザの罹患率を限定的にする有効な手段であった。しかしながら、ウイルスの頻繁に生じる遺伝的浮動は、毎年のワクチンの再製剤化を必要とし、潜在的にワクチン中に存在するウイルス株と循環しているウイルス株間の不一致を生じる。したがって、インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス治療は、疾患重篤度および伝染を限定的にするための重要なツールである。
【０００４】
インフルエンザウイルスは、直径約125 nmの粒子サイズを有するRNAエンベロープウイルスである。それは、基本的に、内部ヌクレオカプシドまたは核タンパク質に結合したリボ核酸(RNA)のコア、その周囲に存在する脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープおよび外部糖タンパク質からなる。ウイルスエンベロープの内層は、主にマトリクスタンパク質からなり、外層は、主に宿主由来脂質物質からなる。表面糖タンパク質ノイラミニダーゼ(NA)およびヘマグルチニン(HA)は、該粒子の表面に10 nmから12 nm長のスパイクとして出現する。これらの表面タンパク質、とりわけヘマグルチニンは、インフルエンザ亜型の抗原特異性を決定する。
【０００５】
現在利用可能なインフルエンザワクチンは、不活化インフルエンザワクチンまたは弱毒化生インフルエンザワクチンであり、不活化インフルエンザワクチンは、3つの考えられる抗原製剤の形態からなる:不活化全ウイルス、精製化ウイルス粒子が界面活性剤または他の試薬で破壊され、脂質エンベロープが可溶化したサブビリオン(いわゆる「スプリット」ワクチン)、または精製化HAおよびNA (サブユニットワクチン)。これらの不活化ワクチンまたは弱毒化生ワクチンは、一般に、筋肉内(i.m.)または鼻腔内(i.n.)に投与される。
【０００６】
スプリットもしくはサブユニット注射用ワクチンは、一般に有機溶媒または界面活性剤を用いてウイルス粒子を破壊し、ウイルスタンパク質を種々の程度まで分離するか、または精製することにより製造される。スプリットワクチンは、有機溶媒または界面活性剤の可溶化濃度を用いて感染性もしくは不活化全インフルエンザウイルスを断片化し、次いで、可溶化剤およびいくつかのもしくはほとんどのウイルス脂質材料を除去することにより製造される。スプリットワクチンは、一般に、夾雑マトリクスタンパク質および核タンパク質および時折脂質、ならび膜エンベロープタンパク質を含む。スプリットワクチンは、通常、必ずしもそれらが全ウイルス中で生じるのと同じ割合ではないが、多くのもしくはすべてのウイルス構造タンパク質を含み得る。一方で、サブユニットワクチンは、本質的に、高度に精製されたウイルス表面タンパク質であるヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼからなり、それらは、ワクチン接種時において望まれるウイルス中和抗体を誘発することに関与する表面タンパク質である。
【０００７】
すべての種類のインフルエンザワクチンは、通常、三価ワクチンである。それらは、一般に、2個のA型インフルエンザウイルス株および1個のB型インフルエンザウイルス株に由来する抗原を含む。多くの場合において、標準的な0.5 mlの注射用量は、一元放射免疫拡散(SRD)により測定されたとり、各株からの15 μgのヘマグルチニン抗原要素を含む。各時期においてインフルエンザワクチンに組み込まれるインフルエンザウイルス株は、保険機関当局(national health authorities)およびワクチン製造業者と協同して世界保健機関により決定される。
【０００８】
不活化ウイルスを含むインフルエンザワクチンの投与における1つの欠点は、抗体の顕著な増加を生じさせるために、該ワクチンが一般に高濃度で投与されなければならないということである。副作用を生じない便利な市販用量での不活化インフルエンザウイルスもしくは抗原の投与は、経鼻または経口で投与された場合に、必ずしも満足のいく免疫応答を産生しない。そのような場合に、ワクチン組成物中にアジュバントを含むことがしばしば必要である。
【０００９】
最近、線維芽細胞成長因子4 (FGF-4)シグナル配列に由来する20アミノ酸ペプチド(エントリーブロッカー(EB)と名付けられている)が、インビトロおよびインビボにおいてインフルエンザウイルスに対する顕著な広域スペクトル活性を有することが示された。EBペプチドは、Jones、et al.による“Inhibition of Influenza Virus Infection by a Novel Antiviral Peptide That Targets Viral Attachment to Cells”、Journal of Virology、(2006) Vol. 80(24)、p. 11960-11967、ならびにBrandt、et al.による米国特許出願公開番号2005/0130884およびまたBrandt、et al.による米国特許出願公開番号2005/0203024に記載されている。特に、EBは、インビトロにおいて10μMまたはそれ以上の濃度でウイルス複製を阻害することが示されている。BALB/cマウスにおいて、EBは、感染前または感染後に投与されたとき、H5N1型インフルエンザウイルス感染の臨床的兆候を妨害し、生存を増加させた。また、EBは、細胞へのインフルエンザウイルス接着を阻害することが確立されている。
【００１０】
本発明において、EBペプチドがまた、ウイルス凝集を誘導し、抗原提示細胞による増加したウイルス摂取および加工を生じることにより有効なインフルエンザワクチンアジュバントとして作用することが見出された。
【発明の概要】
【００１１】
発明の要約
本発明は、一般に、アジュバント特性を有するペプチド、該アジュバントペプチドを含むワクチン、およびインフルエンザの予防もしくは治療におけるそれらの使用に関する。より特には、本発明は、インフルエンザウイルスの凝集を誘導するアジュバントペプチドに関する。ペプチドは、インフルエンザワクチンに含まれ得て、ワクチンに対する免疫応答を増大させ得る。
【００１２】
1つの局面において、本発明は、免疫原およびアジュバントペプチドを含むワクチンであって、該アジュバントペプチドが式:
(X1)n-A-A-V-A-L-L-P-A-V-L-L-A-L-L-A-P-(x2)m (配列番号2)
［式中、
X1およびX2は、1個またはそれ以上の荷電アミノ酸残基から選択され、
各X1および各X2は、同じであるか、または異なる荷電アミノ酸残基であってもよく、
nは、0または3-10であり、そして
mは、0または3-10である(ただし、mおよびnの両方が0の場合はない)］
を有し、該免疫原が呼吸器ウイルスに対する免疫応答を誘発することが可能である、ワクチンに関する。
【００１３】
他の局面において、本発明は、ウイルス呼吸器感染に対して哺乳類を免疫化する方法であって、哺乳類に免疫原およびアジュバントペプチドを含むワクチンを投与することを含み、該アジュバントペプチドが式:
(X1)n-A-A-V-A-L-L-P-A-V-L-L-A-L-L-A-P-(x2)m (配列番号2)
［式中、
X1およびX2は、1個またはそれ以上の荷電アミノ酸残基から選択され、
各X1および各X2は、同じであるか、または異なる荷電アミノ酸残基であってもよく、
nは、0または3-10であり、そして
mは、0または3-10である(ただし、mおよびnの両方が0の場合はない)］
を有し、該免疫原が呼吸器ウイルスに対する免疫応答を誘発することが可能である、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図1Aは、密度勾配超遠心分離を介して得られた勾配の密度を示す図式であり、実施例1において示されている。
【図１Ｂ】図1Bは、PBS (0 μM ペプチド)で処理されたウイルスのサンプルについての密度勾配超遠心分離の結果を示す図式であり、実施例1において示されている。イムノブロッティングにより決定されたHA抗原の存在を(○)で示し、赤血球凝集活性を(□)で示す。
【図１Ｃ】図1Cは、10 μMのEBペプチドで処理されたウイルスのサンプルについての密度勾配超遠心分離の結果を示す図式であり、実施例1において示されている。イムノブロッティングにより決定されたHA抗原の存在を(○)で示し、赤血球凝集活性を(□)で示す。
【図１Ｄ】図1Dは、30 μMのEBペプチドで処理されたウイルスのサンプルについての密度勾配超遠心分離の結果を示す図式であり、実施例1において示されている。イムノブロッティングにより決定されたHA抗原の存在を(○)で示し、赤血球凝集活性を(□)で示す。
【図２】図2は、モック(PBS-0μM ペプチド) (図2A)または10 μMのEBペプチド(図2B)で処理されたPR/8ビリオンの電子顕微鏡からの像であり、実施例1において示されている。
【図３Ａ】図3Aは、前方および側方の分散特性に基づいてゲーティングされた22 x 105のモック処理マクロファージの単一細胞集団を示す図式であり、実施例2において示されている。
【図３Ｂ】図3Bは、フローサイトメトリーにより決定された、RAW 264.7マクロファージと0 μM EBペプチドで前処理されたFITC標識化インフルエンザウイルス(太線)の結合を示すヒストグラムであり、実施例2において示されている。図3Bにおける細線は、ウイルスに曝露されていないPBS処理マクロファージによるバックグラウンド蛍光を示す。
【図３Ｃ】図3Cは、フローサイトメトリーにより決定された、RAW 264.7マクロファージと10 μM EBペプチドで前処理されたFITC標識化インフルエンザウイルス(太線)の結合を示すヒストグラムであり、実施例2において示されている。図3Cにおける細線は、ウイルスに曝露されていないPBS処理マクロファージによるバックグラウンド蛍光を示す。
【図３Ｄ】図3Dは、フローサイトメトリーにより決定された、RAW 264.7マクロファージと30 μM EBペプチドで前処理されたFITC標識化インフルエンザウイルス(太線)の結合を示すヒストグラムであり、実施例2において示されている。図3Dにおける細線は、ウイルスに曝露されていないPBS処理マクロファージによるバックグラウンド蛍光を示す。
【図３Ｅ】図3Eは、フローサイトメトリーにより決定された、RAW 264.7マクロファージと50 μM EBペプチドで前処理されたFITC標識化インフルエンザウイルス(太線)の結合を示すヒストグラムであり、実施例2において示されている。図3Eにおける細線は、ウイルスに曝露されていないPBS処理マクロファージによるバックグラウンド蛍光を示す。
【図４】図4は、PBS (モック)、不活化VN/1203ウイルス単独、不活化VN/1203ウイルス＋ミョウバン、10 μM EBペプチドで前処理された不活化VN/1203ウイルス、50 μM EBペプチドで前処理された不活化VN/1203ウイルス、0.5 mM EBペプチドで前処理された不活化VN/1203ウイルス、または1 mM EBペプチドで前処理された不活化VN/1203ウイルスでのワクチン接種の28日後のマウスから得られた血液で行われたインフルエンザ特異的IgG力価の結果を示す図表であり、実施例3において示されている。
【図５】図5は、モックワクチン接種、不活化ウイルス＋PBSでのワクチン接種、不活化ウイルス＋ミョウバンでのワクチン接種、または不活化ウイルス＋EBでのワクチン接種を行ったマウスにおける、チャレンジの0-10日後の感染の臨床的兆候についてのスコアを示す図表であり、実施例3において示されている。
【図６】図6は、モックワクチン接種(PBS)、不活化VN/1203ウイルス単独でのワクチン接種、不活化VN/1203ウイルス＋ミョウバンでのワクチン接種、または10 μM EBペプチド、50 μM EBペプチド、0.5 mM EBペプチドもしくは1 mM EBペプチドで前処理された不活化VN/1203でのワクチン接種が行われたマウスにおける、VN/1203ウイルスでのチャレンジの2から12日後の0日目からの重量変化(%)を示す図表であり、実施例3において示されている。モックワクチン接種およびPBSでのモック処理が行われたマウスのコントロール群がまた試験された。
【図７】図7は、モックワクチン接種(PBS)、不活化VN/1203ウイルス単独でのワクチン接種、不活化VN/1203ウイルス＋ミョウバンでのワクチン接種、または10 μM EBペプチド、50 μM EBペプチド、0.5 mM EBペプチドもしくは1 mM EBペプチドで前処理された不活化VN/1203でのワクチン接種が行われたマウスにおける、VN/1203ウイルスでのチャレンジの7日後の肺ウイルス力価の結果を示す図表であり、実施例3において示されている。モックワクチン接種およびPBSでのモック処理が行われたマウスのコントロール群がまた試験された。(*)は、統計学的な有意差を示す。
【図８】図8は、モックワクチン接種(PBS)、準最適用量の不活化VN/1203ウイルス単独でのワクチン接種、準最適用量の不活化VN/1203ウイルス＋ミョウバンでのワクチン接種、または50 μM EBペプチドで前処理された準最適用量の不活化VN/1203ウイルスでのワクチン接種が行われたマウスにおける、VN/1203ウイルスでのチャレンジの0-10日後の生存率(%)を示す図表であり、実施例4において示されている。
【図９】図9は、モックワクチン接種(PBS)、準最適用量の不活化VN/1203ウイルス単独でのワクチン接種、または200 μMの配列番号4のペプチド、200 μM EBペプチド、または追加免疫を受けない200 μM EBペプチドで前処理された準最適用量の不活化VN/1203ウイルスでのワクチン接種が行われたマウスにおける、VN/1203ウイルスでのチャレンジの0-7日後の体重減少(%)を示す図表であり、実施例4において示されている。
【図１０】図10は、モックワクチン接種(PBS)、準最適用量の不活化VN/1203ウイルス単独でのワクチン接種、または200 μMの配列番号4のペプチド、200 μM EBペプチド、または追加免疫を受けない200 μM EBペプチドで前処理された準最適用量の不活化VN/1203ウイルスでのワクチン接種が行われたマウスにおける、チャレンジの2-7日後の感染の臨床的兆候についてのスコアを示す図表であり、実施例4において示されている。
【図１１】図11は、モックワクチン接種(PBS)、準最適用量の不活化VN/1203ウイルス単独でのワクチン接種、または200 μMの配列番号4のペプチド、200 μM EBペプチド、または追加免疫を受けない200 μM EBペプチドで前処理された準最適用量の不活化VN/1203ウイルスでのワクチン接種が行われたマウスにおける、VN/1203ウイルスでのチャレンジの4および7日後の肺ウイルス力価の結果を示す図表であり、実施例4において示されている。エラーバーは、標準偏差を示す。(*)は、統計学的な有意差を示す。
【図１２】図12は、PBS (モックワクチン接種)、準最適用量の不活化VN/1203ウイルス単独、または200 μM EBペプチドで前処理された準最適用量の不活化VN/1203ウイルスでのワクチン接種の28日後のマウスから得られた血液で行われたインフルエンザ特異的全IgG、IgG1およびIgG2力価を示す図式であり、実施例5において示されている。
【図１３】図13は、ワクチン接種前に、またはワクチン接種の15および28日後に(すなわち、プレチャレンジ血清)、およびVN/1203ウイルスでのチャレンジの7および10日後に、マウスから得られた血液についてのマイクロ中和試験の結果を示す表であり、実施例5において示されている。PBS (モック)、準最適用量の不活化VN/1203ウイルス単独、準最適用量の不活化VN/1203ウイルス＋ミョウバン、または200 μMのEBペプチドで前処理された準最適用量の不活化VN/1203ウイルスで、マウスにワクチン接種した。ヤギ抗-H5N9インフルエンザウイルス血清をポジティブコントロールとして使用した。
【図１４Ａ】図14Aは、モックワクチン接種(PBS)、準最適用量の不活化PR/8ウイルス単独でのワクチン接種、準最適用量の不活化PR/8ウイルス＋ミョウバンでのワクチン接種、または50 μMもしくは200 μMのEBペプチドまたは200 μMのEBXペプチドで前処理された準最適用量の不活化PR/8ウイルスでのワクチン接種が行われたマウスにおける、PR/8ウイルスでのチャレンジの0-6日後の生存率(%)を示す図表であり、実施例6において示されている。
【図１４Ｂ】図14Bは、ワクチン接種前に、またはワクチン接種の15および28日後に(すなわち、プレチャレンジ血清)、マウスから得られた血液についてのマイクロ中和試験の結果を示す表であり、実施例6において示されている。PBS (モック)、準最適用量の不活化PR/8ウイルス単独、準最適用量の不活化PR/8ウイルス＋ミョウバン、または50 μMもしくは200 μMのEBペプチドまたは50 μMもしくは200 μMのEBXペプチドで前処理された準最適用量の不活化PR/8ウイルスで、マウスにワクチン接種した。
【図１５】図15は、モックワクチン接種、不活化VN/1203ウイルス単独でのワクチン接種、または200 μMのEBペプチドで前処理した不活化VN/1203ウイルスでのワクチン接種を行ったマウスにおける、ワクチン接種15日および28日後のIFN-γレベルを示す図表であり、実施例7において示されている。
【図１６】図16は、モックワクチン接種(PBS)、不活化PR/8ウイルス単独でのワクチン接種、50 μMもしくは200 μMのEBペプチドまたは200 μMのEBXペプチドで前処理した不活化PR/8ウイルスでのワクチン接種、または200 μM EBペプチドまたは200 μM EBXペプチドを投与したマウスにおける、ワクチン接種15日後のIFN-γレベルを示す図表であり、実施例8において示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、一般に、アジュバント特性を有するペプチド、該アジュバントペプチドを含むワクチン、およびインフルエンザの予防もしくは治療におけるそれらの使用に関する。より特には、本発明は、インフルエンザウイルスの凝集を誘導するアジュバントペプチドに関する。ペプチドは、インフルエンザワクチンに含まれ得て、ワクチンに対する免疫応答を増大させ得る。
【００１６】
定義
薬学的に許容される担体: ワクチンを哺乳類に投与するために許容可能なビヒクルであって、それに含まれる薬学的に活性な物質(例えば、免疫原、アジュバントペプチドなど)と反応しないか、もしくはその有効性を減少させない1個またはそれ以上の非毒性賦形剤を含む、ビヒクル。
【００１７】
可溶性タグ: 荷電アミノ酸を含む短いペプチド配列であって、より長い不可溶性ペプチド配列の末端残基に結合すると、水性培地における可溶性を改善し得る、ペプチド配列。ある態様において、可溶性タグの荷電アミノ酸は、専ら正電荷を有するアミノ酸であり、オルニチン、リシンおよびアルギニンを含むがこれらに限定されない。可溶性タグは、2から24アミノ酸長またはそれ以上であり得て、典型的には、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15もしくは16アミノ酸長であり得る。可溶性タグは、より長い不可溶性ペプチドの片方の末端または両方の末端に結合し得る。
【００１８】
抗原: 抗体または受容体に結合する存在物。
【００１９】
免疫原: 免疫応答を誘発する、すなわち、感染から宿主を保護する先天性もしくは適応性宿主応答を誘発する存在物。本明細書で使用される「免疫原」なる用語は、抗原を含み得る。
【００２０】
ペプチド: 「ポリペプチド」および「ペプチド」なる用語は、本明細書を通して交換可能に使用され、α-アミノ酸と隣接するアミノ酸のカルボキシル基との間でのペプチド結合により順番に結合した一連の直鎖アミノ酸残基を示す。ポリペプチドは、中性(非荷電)形または塩形でのさまざまな長さであり得る。アミノ酸残基配列は、酸性基および塩基性基を含み得て、ペプチドにより示される特定の電離状態は、該ペプチドが溶液である場合には周辺培地のpH値に依存し、該ペプチドが固体形態である場合にはそれが得られる培地のpH値に依存することが当分野において十分に理解される。したがって、「ポリペプチド」またはその同等な用語は、参照される適当なアミノ酸残基配列を含むことが意図される。本明細書において、ペプチドまたはポリペプチドは、必ず、左側から右側へ、アミノ末端(N-末端)からカルボキシ末端(C-末端)の方向で示される。
【００２１】
残基: 「残基」なる用語は、アミノ酸残基なる句と交換可能に使用される。本明細書に記載されたペプチドのアミノ酸は、レボ(「l」)アミノ酸またはデキストロ(「d」)アミノ酸であり得る。本明細書に記載されたすべてのペプチドは、dアミノ酸からなるペプチド骨格を有し得る。アミノ酸についての下記の標準的な一文字略称が以下で使用される: アラニン(A)、リシン(K)、ロイシン(L)、プロリン(P)、アルギニン(R)およびバリン(V)。
【００２２】
有効なアジュバント量: 「有効なアジュバント量」なる用語は、投与された免疫原に対する免疫応答を刺激することが可能な本発明のアジュバントペプチドの量を意味する。これは、投与の28日後における血中のウイルス特異的IgGレベルについて測定したとき、投与された免疫原に対する免疫応答をアジュバントペプチドなしに投与された同じ免疫原と比較して増加させるアジュバントペプチドの量であり得る。あるいは、「有効なアジュバント量」は、ウイルス特異的IgGレベルを増大させないが、T細胞の増加を生じるか、または先天性免疫応答を誘発するアジュバントペプチドの量であり得る。
【００２３】
本発明は、アジュバント特性を有するペプチド、該アジュバントペプチドを含むワクチン、およびインフルエンザの予防もしくは治療におけるそれらの使用を開示する。特に、EBペプチドがインフルエンザワクチンに含まれる有効なワクチンアジュバントであることが見出された。上記したとおり、EBは、線維芽細胞成長因子に由来する20アミノ酸の抗ウイルスペプチドであり、それは、16個の疎水性アミノ酸を含み、N末端に付加された高荷電テトラペプチド(RRKK)が可溶性を高めている。EBは、配列RRKKAAVALLPAVLLALLAP(配列番号1)を有する。EBは、以前に、宿主細胞へのウイルス結合を阻害することにより、インフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を示すことが示されている。Jones, et al., Journal of Virology, (2006) Vol. 80(24), pp. 11960-11967を参照のこと。
【００２４】
本発明において、EBがまたインフルエンザワクチンのための有効なアジュバントであることが見出された。任意の特定の理論に拘束されることなく、EBがアジュバントとして作用し得る1つのメカニズムは、インタクトインフルエンザビリオンの凝集を誘導することによりインフルエンザビリオンの宿主細胞への接着を阻害し、その結果、ウイルスが宿主細胞に感染するのを阻害することによるものであることが考えられる。インフルエンザビリオンを凝集するこの能力は、接種部位において大量のウイルスの濃度を生じる。これらの大量のウイルスは、貪食細胞、例えば、樹状細胞およびマクロファージにシグナルを伝達して凝集化インフルエンザビリオンを摂取し、ワクチンに対する免疫応答を開始すると考えられる。
【００２５】
したがって、1つの局面において、本発明は、アジュバントペプチドおよび呼吸器ウイルスに対する免疫応答を誘発することが可能な免疫原を含むワクチンに関する。
【００２６】
アジュバントペプチドは、インフルエンザビリオンの凝集を誘導するすべてのペプチドであり得る。好ましい態様において、アジュバントペプチドは、EBペプチド(配列番号1)である。
【００２７】
上記したとおり、本発明のアジュバントペプチド、例えば、EBは、疎水性アミノ酸配列と共有的に結合する可溶性タグ(RRKK)を含み得る。所望により、本発明のアジュバントペプチドはまた、それと共有的に結合する他の可溶性タグを含み得る。例えば、1つの態様において、アジュバントペプチドは、下記の配列を有する:
【００２８】
(X1)n-AAVALLPAVLLALLAP-(x2)m (配列番号2)
［式中、
X1およびX2は、1個またはそれ以上の荷電アミノ酸残基(例えば、K、R)から選択され、
各X1および各X2は、同じであるか、または異なる荷電アミノ酸残基であってもよく、
nは、0または3-10であり、そして
mは、0または3-10である(ただし、mおよびnの両方が0の場合はない)］。1つの態様において、m=0またはn=0である。上記したとおり、可溶性タグの1つの例は、R-R-K-K (配列番号3)である。好ましい態様において、可溶性タグの荷電アミノ酸残基のすべては、正に荷電したアミノ酸残基である。
【００２９】
本発明のアジュバントペプチドはまた、それらの末端アミノ酸残基に結合するさまざまな反応性タグを有し得る。そのようなタグは、本発明の合成ペプチドの検出および/または除去において有用であり得る。そのようなタグは、一例として、ビオチン、染料、例えば、Cy3、Cy5もしくはCy3.5、および当分野において既知のすべての他のタグを含み得る。
【００３０】
本発明のアジュバントペプチドの特定の誘導体はまた、アジュバントペプチドとして使用され得る。アジュバントペプチドの誘導体は、1個またはそれ以上のアミノ酸残基が除去されて断片を産生するか、または他のアミノ酸残基で置換されているペプチドである。置換は、保存的であってもよいし、配列再配置であってもよい。保存的置換は、当業者に既知であり、類似のまたは同一の電荷、サイズもしくは疎水性のアミノ酸が互いに置換され得る。例えば、リシンおよびアルギニンは、互いに保存的な置換基であり、アスパラギン酸およびグルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、ならびにトリプトファンなども同様である。再配置された配列は、1個またはそれ以上のアミノ酸が本発明のペプチドの配列内でそれらの元の位置から新たな位置に移動された配列である。
【００３１】
本発明のアジュバントペプチド断片は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはそれ以上のアミノ酸の欠失を有し得て、置換誘導体は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の置換を有し得る。ある態様において、アジュバントペプチドの誘導体は、欠失および置換の両方を有し得る。
【００３２】
置換ペプチドまたはペプチド断片は、本発明の範囲内であるためにアジュバント活性を保持しなければならない。本発明によるアジュバントペプチドまたはその誘導体は、下記の実施例に記載された方法によりアジュバント活性について試験され得る。
【００３３】
本発明のアジュバントペプチドはまた、薬学的に許容される塩として提供され得る。「薬学的に許容される塩」は、無機塩基、有機塩基、無機酸、有機酸、塩基性アミノ酸もしくは酸性アミノ酸を有する塩を含む。無機塩基の塩として、本発明は、例えば、ナトリウムもしくはカリウムのようなアルカリ金属; カルシウムおよびマグネシウムもしくはアルミニウムのようなアルカリ土類金属; ならびにアンモニアを含む。有機塩基の塩として、本発明は、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミンを含む。無機酸の塩として、本発明は、例えば、塩酸、ヒドロホウ酸(hydroboric acid)、硝酸、硫酸およびリン酸を含む。有機酸の塩として、本発明は、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ-トルエンスルホン酸を含む。塩基性アミノ酸の塩として、本発明は、例えば、アルギニン、リシンおよびオルニチンを含む。酸性アミノ酸は、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【００３４】
本発明のアジュバントペプチドは、ペプチド合成において通常使用される方法、例えば、アミノ酸残基および/またはペプチド断片の古典的な溶液カップリング、所望により、固相技術を組み込んだ工程により製造され得る。当分野において既知であるペプチド合成についてのすべての方法が使用され得て、例えば、Schroeder and Lubkeによる“The Peptides”, Vol. 1, Academic Press, New York, N.Y., pp. 2-128 (1965); “The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology”, (E. Gross et al., Eds.), Academic Press, New York, N.Y., Vol. 1-8, (1979-1987); Stewart and Youngによる“Solid Phase Peptide Synthesis”, 2nd Ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984); Wild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10537 (1992); およびRimsky et al.によるJ Virol, 72: 986 (1998); Chan & Whiteによる“Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach”, Oxford University Press, (2000)であり得る。
【００３５】
本発明のアジュバントペプチドは、アジュバント活性を示すこと、すなわち、A型インフルエンザ、B型インフルエンザおよびC型インフルエンザのようなさまざまな型のインフルエンザを含む呼吸器ウイルスに対して、インフルエンザワクチンにより提供されるウイルスに対する保護を改善することが見出された。
【００３６】
本発明のワクチンは、有利には、有効なアジュバント量でのアジュバントペプチドを含み得る。当分野における当業者により明らかなとおり、アジュバントペプチドまたはペプチドの最適な濃度は、必然的に、使用される特定のペプチド、患者の特徴、使用される免疫原、ならびに処置または予防が求められるウイルス感染の性質に依存し得る。これらの要因は、本発明の開示の観点で、医療および医薬の分野における当業者により決定され得る。一般に、アジュバントペプチドは、すべての害になるか、もしくは有害な副作用を引き起こすことなく、一般にアジュバント活性を提供する濃度レベルで投与されるのが最も好ましい。一般に、有効なアジュバント量が望ましい。有効なアジュバント量は、投与された免疫原に対する免疫応答を刺激することが可能なアジュバントペプチドの量を意味する。
【００３７】
特定の投与量は、疾患の状態、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、対象の食事、投与間隔、投与経路、排出速度および薬剤の組み合わせに依存して調整され得る。有効量を含む本明細書に記載された投与形態のすべては、通常の実験の範囲内であり、したがって、本発明の開示の範囲内である。
【００３８】
アジュバントペプチドに加えて、本発明のワクチンはさらに、呼吸器ウイルス、例えば、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘発することが可能な免疫原を含む。1つの態様において、免疫原は、抗原である。他の態様において、免疫原は、DNA分子の細胞への導入(例えば、トランスフェクションによる)後に細胞内で抗原を産生するDNA分子(ポリヌクレオチド)であり得る。DNAそれ自体は「抗原」ではないが、それは、抗原をコードし得て、したがって、本明細書で使用される免疫原である。
【００３９】
抗原は、弱毒化生ウイルス、非生インフルエンザ抗原またはその組み合わせであり得る。本発明における使用のための非生インフルエンザ抗原は、スプリットウイルス抗原、サブユニット抗原(組み換え的に発現されるか、または全ウイルスから作製されたもの)、および/または例えば、ホルムアルデヒド、ホルマリン、β-プロピオラクトンを用いて処理することを含む任意の適当な手段により化学的に不活化されるか、または例えば、紫外線もしくは熱不活化により不活化され得る不活化全ウイルスからなる群から選択され得る。好ましくは、抗原は、不活化全ウイルスである。
【００４０】
適当な抗原はまた、例えば、病原体由来のタンパク質、組み換えタンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質およびリポ多糖を含み得る。
【００４１】
免疫原は、精製形または非精製形で提供され得る。好ましくは、免疫原は、精製形で提供される。
【００４２】
本発明によるワクチンは、A型およびB型ウイルス株免疫原を含み得て、一般に、2個のA型株および1個のB型株の三価組成物である。しかしながら、二価および一価ワクチンは、除外されない。一価ワクチンは、パンデミック状況下において、例えば、できるだけ迅速に製造され、投与されるワクチンを得ることが重要である場合において有利であり得る。
【００４３】
好ましくは、ワクチンに含まれるためのインフルエンザウイルスの各株についての免疫原の濃度は、顕著な副作用を生じることなく免疫応答を誘発する量である。そのような量は、使用される免疫原の種類、ならびにワクチンに含まれるアジュバントペプチドの型および量に依存して変わり得る。一般に、ワクチンは、SRDアッセイにより測定されたとおり、約1から約1000 μg/ml、より好ましくは、約3から約300 μg/ml、および最も好ましくは、約10から約15 μg/mlの量での免疫原を含み得る。最初のワクチン接種後、ワクチン接種された対象は、十分な間隔の後に1回または数回の追加免疫を受け得る。
【００４４】
有利には、本発明のアジュバントペプチドが相対的に低量の免疫原を含む場合においてさえ、そのワクチン組成物の免疫原性を促進し、抗原節約(antigen sparing)を提供することが見出された。そのようなものとして、1つの態様において、本発明のワクチンは、約10 μg/ml未満、または約1 μgから約10 μg/ml、または約1 μgから約5 μg/mlの量での免疫原を含み得る。1つの態様において、ワクチンは、約1 μg/mlでの免疫原を含む。
【００４５】
インフルエンザウイルス免疫原は、慣用的な孵化卵法に由来するものであるか、またはウイルスを増殖させるか、もしくは組み換えインフルエンザウイルス表面抗原を発現させる組織培養を用いた任意の方法に由来するものであり得る。ウイルスを増殖させるための適当な細胞基質は、例えば、イヌ腎臓細胞、例えば、MDCKもしくはMDCKのクローンに由来する細胞(MDCK様細胞)、サル腎臓細胞(ベロ細胞を含む)、例えば、AGMK細胞、適当なブタ細胞株、またはワクチン目的でのインフルエンザウイルスの製造のために適当なすべての他の哺乳類細胞型を含む。適当な細胞基質はまた、ヒト細胞、例えば、MRC-5細胞を含む。適当な細胞基質は、細胞株に限定されるものではなく、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞のような初代細胞がまた包含される。
【００４６】
1つの態様において、ウイルス抗原は、例えば実施例において記載されたとおり、感染細胞培養物から得られる。無血清および無タンパク質培地で培養されるインフルエンザウイルスに感染したMDCK細胞培養物から得られるインフルエンザウイルス免疫原が、インフルエンザウイルスワクチン作製するための本発明による使用のために特に好ましい。感染細胞培養物から得られるウイルス免疫原は、最初にホルマリンを用いて不活化され、次いで、連続密度勾配遠心分離により精製化濃縮ウイルス免疫原として得られ得る。その後、この製剤は、インフルエンザワクチンを産生するために、本発明のアジュバントペプチドと共に使用され得る。
【００４７】
ワクチンの製造における特別な利点は、ウイルス物質が精製前に不活化され得て、その結果、弱毒化生ワクチンの精製の場合と比較して、かなり高い程度の純度を有する免疫原が達成され得ることである。
【００４８】
インフルエンザウイルスに感染した無血清および無タンパク質細胞培養物から得られるインフルエンザウイル免疫原の使用における特定の利点は、アレルギー反応を引き起こし得る卵に特有のタンパク質が存在しないことである。したがって、本発明による使用は、特に、喘息患者のような高リスク群を構成する集団、アレルギーを有する人々、ならびにまた抑制された免疫系を有する人々および高齢者におけるインフルエンザウイルス感染の予防のために適当である。
【００４９】
インフルエンザウイル免疫原はまた、市販で適用可能な多くの方法のいずれかにより、例えば、スプリットインフルエンザ工程により産生され得る。伝統的なスプリットインフルエンザは、溶媒/界面活性剤処理、例えば、トリ-n-ブチルホスフェート、またはTween(商標)と組み合わせたジエチルエーテル(「Tween-エーテル」スプリッティングとして既知である)を用いて産生される。現在のところ使用される他のスプリット剤は、界面活性剤またはタンパク質分解性酵素または胆汁酸塩、例えば、デオキシコール酸ナトリウムを含む。スプリット剤として使用され得る界面活性剤は、カチオン性界面活性剤、例えば、キサデシルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)、他のイオン性界面活性剤、例えば、ラウリル硫酸、タウロデオキシコール酸、または非イオン性界面活性剤、例えば、Triton X-100およびTriton N-101を含む上記されたもの、または任意の2個またはそれ以上の界面活性剤の組み合わせを含む。
【００５０】
スプリットワクチンの製造法は、多くの異なるろ過および/または他の分離工程、例えば、種々の組み合わせでの超遠心分離、限外ろ過、ゾーン遠心分離およびクロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー)工程、ならびに所望により、例えば熱、ホルムアルデヒドもしくはβ-プロピオラクトンまたは紫外線を用いた不活化工程(スプリットの前もしくは後に行われ得る)を含み得る。スプリット工程は、バッチ法、連続法、または半連続法として行われ得る
【００５１】
本発明による好ましいスプリットインフルエンザワクチン免疫原製剤は、製造工程の間に残存したTween 80および/またはTriton X-100の量を含み得て、これらは、スプリット免疫原の調製後に加えられるか、またはそれらの濃度が調整され得る。好ましくは、Tween 80およびTriton X-100の両方が存在する。ワクチン用量中のこれらの非イオン性界面活性剤の最終濃度について好ましい範囲は、Tween 80: 0.01から1% (v/v)、より好ましくは、約0.1% (v/v); Triton X-100: 0.001から0.1 (% w/v)、より好ましくは、0.005から0.02% (w/v)である。
【００５２】
あるいは、インフルエンザウイルス免疫原は、生インフルエンザウイルス以外の起源に由来し得て、例えば、ヘマグルチニン、マトリクス、ノイラミニダーゼまたは核タンパク質抗原は、組み換え的に産生され得る。
【００５３】
免疫原およびアジュバントペプチドに加えて、本発明のワクチンはさらに、1個またはそれ以上の薬学的に許容される担体を含み得て、その割合は、アジュバントペプチドおよび免疫原の溶解度および化学的性質、選択される投与経路ならびに標準的な生物学的投与により決定され得る。本発明のワクチンについての適当な薬学的に許容される担体は、標準的な医薬の教科書に記載されている。例えば、“Remington's Pharmaceutical Sciences”, 18th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1990)を参照のこと。例えば、適当な薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【００５４】
さらに所望により、ワクチンは、少量の補助物質、例えば、該組成物の抗ウイルス効果を促進する薬剤、安定化剤、保存剤などを含み得る。
【００５５】
1つの態様において、ワクチンはまた、特に塩形での胆汁酸またはその誘導体を含み得る。これらは、コール酸の誘導体およびその塩、特に、コール酸もしくはコール酸誘導体のナトリウム塩を含む。胆汁酸およびその誘導体の例は、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、リトコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸および誘導体、例えば、上記胆汁酸のグリコ誘導体、タウロ誘導体、アミドプロピル-1-プロパンスルホン酸誘導体、アミドプロピル-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸誘導体、またはN,N-ビス(3Dグルコノアミドプロピル)デオキシコラミドを含む。最終ワクチン用量中に存在し得る特に好ましい例は、デオキシコール酸ナトリウム(NaDOC)である。
【００５６】
所望により、ワクチンはさらに、本明細書に記載されたアジュバントペプチドに加えてアジュバントを含み得る。本発明の組成物中に含まれるための適当なアジュバントは、当分野において既知のもの、例えば、ヒトにおいて使用されない完全フロイントアジュバント(CFA)、不完全フロイントアジュバント(IFA)、スクアレン、スクアラン、ミョウバンおよびさまざまな油状物を含み、そのすべては、当分野において既知であり、いくつかの供給源、例えば、Novartis (例えば、NovartisのMF59アジュバント)から市販で利用可能である。
【００５７】
投与経路に依存して、ワクチンは、溶液、懸濁液、エマルジョンなどの形態を取り得る。
【００５８】
本発明のワクチンは、哺乳類、例えば、ヒト、ウマ、他の哺乳類などに、鼻腔内、または非経口投与で、例えば、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、腹腔内注射もしくは皮内注射により投与され得る。一般に、ワクチンは、筋肉内もしくは皮内注射により投与される。1個またはそれ以上のアジュバントペプチドは、本明細書に記載されたワクチン中に含まれ得る。
【００５９】
非経口投与について、本発明のワクチンは、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内もしくは皮内注射により投与され得る。ワクチンは、免疫原およびアジュバントペプチドのみを含むか、またはさらに薬学的に許容される担体を含んでいてもよい。注射による投与について、ワクチンは、滅菌水性ビヒクル中、溶液であることが好ましく、それはまた、他の溶質、例えば、緩衝液もしくは保存剤、ならびに溶液を等張にするために十分な量の薬学的に許容される塩もしくはグルコースを含み得る。本発明のアジュバントペプチドは、当分野において既知の薬学的に許容される塩の形態で取得され得る。
【００６０】
本発明のアジュバントペプチドは、呼吸器ウイルスのためのワクチンにおいてアジュバント活性を示したので、該ワクチンはまた、呼吸器系に局所的に、例えば、鼻、副鼻腔、副鼻腔膜もしくは肺に送達され得る。アジュバントペプチドを含むワクチンは、任意の適当な方法で、例えば、口もしくは鼻腔内への吸入により呼吸器系に送達され得る。ワクチンは、粉末もしくは液体の経鼻スプレー、懸濁液、点鼻薬、ゲルもしくは軟膏として調剤され、チューブもしくはカテーテルを介して、シリンジで、パックテール(packtail)で、綿撒糸で、または粘膜下注入によって投与され得る。ワクチンは、便利には、加圧型パック(pressurized pack)またはネブライザーおよび適当なプロペラント(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンもしくは二酸化炭素であるがこれらに限定されない)を用いて、エアロゾルスプレーの形態で送達され得る。加圧型エアロゾルの場合において、用量単位は、バルブを用いてメーター量を送達することにより制御され得る。例えば吸入剤もしくは吸入器における使用のためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、ワクチンおよびラクトースもしくはスターチのような適当な粉末塩基の粉末混合物を含むように製剤化され得る。経鼻製剤および投与方法の例は、PCT国際公開WO 01/41782、WO 00/33813、ならびに米国特許第6,180,603号; 第6,313,093号; および第5,624,898号において見出され得る。後者で引用された米国特許は、あらゆる目的のために引用により本明細書の一部とする。エアロゾル製剤についての推進剤は、圧縮空気、窒素、二酸化炭素または炭化水素に基づく低沸点溶媒を含み得る。本発明のワクチンは、便利には、ネブライザーなどからエアロゾル製剤の形態で送達され得る。ある局面において、有効成分(すなわち、免疫原、アジュバントペプチドなど)は、乾燥粉末製剤の投与時に実質的にすべての有効成分の肺への吸入を可能にするように適当に微粉化され、したがって、有効成分は、100ミクロン未満、好ましくは20ミクロン未満、好ましくは1から10ミクロンの間の粒子サイズを有し得る。1つの態様において、ワクチンがデバイスに封入され、それは、吸入、例えば、経鼻スプレーもしくは吸入器により既定かつ一般的に有効な量のワクチンを送達し得る。
【００６１】
本発明のさらなる局面によると、ウイルス呼吸器感染に対して哺乳類を免疫化する方法であって、哺乳類に呼吸器ウイルスに対する免疫応答を誘発することが可能な免疫原および本発明のアジュバントペプチドを含むワクチンを投与することを含む、方法が提供される。
【００６２】
ワクチンは、好ましくは、予防的に投与される。例えば、ワクチンの投与は、感染前もしくは感染時に、または哺乳類が呼吸器ウイルスに曝露されると同時に開始され、所望により、ウイルスがもはや呼吸器に存在しないか、またはその活性がなくなるまで継続され得る。1つの態様において、ワクチンは、呼吸器ウイルスへの曝露の少なくとも1週間前に投与される。他の態様において、ワクチンは、呼吸器ウイルスへの曝露の少なくとも2週間前、または少なくとも1ヶ月前に投与される。
【００６３】
望まれるワクチン投与量は、単回投与で、または適当な間隔で投与される分割投与として、例えば、1日あたり2回、3回、4回もしくはそれ以上の分割投与で提供され得る。所望により、ワクチン投与量は、1日で投与されて、望まれる間隔の後に1回またはそれ以上の追加免疫が投与され得る(ただし、ワクチンについて追加免疫は、感染から保護するために必須ではない)。1つの態様において、最初のワクチン接種が与えられて、その約1週間から15日後に同じワクチンが追加免疫される。
【００６４】
本発明はさらに、下記の例示的な実施例において記載されている。他に記載がなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の分野における当業者により通常示されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似のもしくは同一のすべての方法および材料が本発明の実施において使用され得るが、好ましい方法および材料が記載されている。他に記載がなければ、本明細書において使用されるか、もしくは意図される技術は、当業者に既知の標準的な方法である。材料、方法および実施例は、例示目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中に引用されたすべての参照は、引用により本明細書の一部とする。
【００６５】
本明細書において詳細に記載されたとおり、修飾および変形は、添付の特許請求の範囲において定義された本発明の範囲から離れることなく可能であることは明らかである。
【実施例】
【００６６】
下記の非限定的な実施例は、本発明をさらに例示するために提供される。
【００６７】
試験方法
細胞培養およびウイルス: A/Vietnam/1203/04 (VN/1203, H5N1型)およびA/PuertoRico/8/34 (PR/8, H1N1)を、37℃で24から48時間、10日齢の特定の無病原体孵化鶏卵(Sunnyside Farms, Beaver Dam, WI)において増殖させた。尿膜腔液を回収し、浄化のために遠心分離し、精製のために必要となるまで-70℃で保存した。動物チャレンジのために、VN/1203をメイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞(MDCK, ATCC, Manassas, VA)において増殖させ、培養物上清を感染の48から72時間後(hpi)に回収し、浄化のために遠心分離し、-70℃で保存した。ウイルス力価をMDCK細胞における50%組織培養感染量(TCID50)解析により決定し、Reed and Muench, Am. J. Hyg., Vol. 27, pp. 493-497 (1938)に記載されたとおりに評価した。MDCK細胞を、2 mM グルタミンおよび10% ウシ胎児血清(FBS, Gemini Bio-Products, West Sacramento, CA)を補充した変法イーグル培地(MEM, CellGro, Herndon, VA)中、37℃、5.5% CO2下で培養した。RAW264.7細胞を、1 mM ピルビン酸ナトリウムおよび10% 熱不活化FBSを補充したRPMI 1640培地(CellGro, Herndon, VA)で培養した。
【００６８】
実験施設: 動物を用いた作業を含むH5N1型を用いたすべての実験は、米国Department of Agriculture and Select Agent Programにより認証されたバイオセーフティレベル3封じ込め実験室(U.S. Department of Agriculture and Select Agent Program-certified biosafety level-3 enhanced containment laboratory)において行われた。研究者は、適当な呼吸装置(RACAL, Health and Safety Inc., Frederick, MD)を装着することが必要とされた。マウスは、HEPA-ろ過、陰圧、半密閉式単離容器(vented isolation containers) (M.I.C.E.(登録商標), Animal Care Systems, Littleton, CO)で飼育された。
【００６９】
ウイルス不活化および精製: VN/1203ウイルスを含む尿膜腔液を、4℃で5日間、0.1% ホルマリン(V/V)で処理した。不活化を検証するために、10日齢の孵化鶏卵またはMDCK細胞にウイルスストックを接種し、それぞれ感染の48および72時間後(hpi)に、死亡および細胞変性効果(CPE)をモニターした。接種されたMDCK細胞を回収し、溶解物を再度細胞に感染させるために用いた。不活化の検証時に、ウイルスを30-60%不連続スクロース勾配にかけ、SW28ローターにより26,000 rpmで90分間遠心分離し、ウイルス層を30-60%インターフェースから抽出することにより精製した。次いで、上記したとり、ウイルスを超遠心分離により沈殿させ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、18 g注射針で均質化した。Jones, et al., Journal of Virology, 2006, Vol. 80(24), p. 11960-11967に記載されたとおり、赤血球凝集(HA)アッセイによりウイルス力価を決定し、50 μL (HAU/50 μL)あたりの赤血球凝集単位として示した。
【００７０】
ウイルス標識化: 上記したとおり精製したPR/8ウイルスを、製造者の指示にしたがって、EZ-Label FITCタンパク質標識化キット(Pierce, Rockford, IL)を用いたフルオレセインイソチオシアネート(FITC-PR/8)により標識した。FITC標識化ウイルスの力価をHAアッセイにより測定した。
【００７１】
ペプチド合成: EBペプチド(配列番号1)の合成および解析を、EZBiolab, Inc. (Westfield, IN)により行った。合成したペプチドを、純度が90%を満たすか、またはそれを超えるようにHPLCにより精製した。
【００７２】
沈降密度プロファイル: PR/8ウイルス(512 HA単位)を、37℃で1時間、0 μM (モック)、10 μMまたは30 μMの濃度のペプチドで処理し、連続した20-60%スクロース勾配に層状化させた。Beckman SW-41を用いて、サンプルを18,000 rpmで90分間の超遠心分離にかけた。サンプル(500 μL)を試験管の底から回収し、7 μLの各画分をニトロセルロースにスポットし、0.1% Tween-20 (TTBS)を含むTris-緩衝生理食塩水中、3%ミルクでブロックし、ヤギ抗ヘマグルチニン血清(TTBS中、1:1000)を用いて室温で1時間、その後のロバ抗ヤギIgG (1:2000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)で探索した。免疫複合体を増強化化学発光(enhanced chemiluminescence) (Pierce, Rockford, IL)により検出した。Bausch and Lomb 334610 Refractometer (Rochester, NY)を用いて屈折率を測定することにより、各スクロース画分の密度を決定した。
【００７３】
電子顕微鏡: 精製化PR/8ウイルス(512 HA単位)を、37℃で1時間、PBS単独(モック)または10 μMの異なるペプチドで処理した。サンプルを、23℃で5分間、ポリ-L-リシン被覆グリッドに吸着させた。該グリッドをPBSで洗浄し、pH 6に調整した水中、2% リンタングステン酸(PTA)で染色し、空気乾燥させた。JEOL JEM-1200EX電子顕微鏡を用いて、グリッドを×15,000および×40,000の倍率で調べた。
【００７４】
脾細胞IFN-γ ELISpotアッセイ: ワクチン接種の15日および28日後に、脾臓を2から3個体のマウス/群から回収した。脾細胞を単離するために、脾臓を0.7 μmの細胞ストレーナー(cell strainer)に通し、単離された脾細胞をR10培地(RPMI 1640、10% 熱不活化ウシ胎児血清、1 mM ピルビン酸ナトリウム、および100 I.U ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン)で洗浄した。赤血球細胞を除去するために、脾細胞を遠心分離し、室温で5分間、AKC赤血球細胞溶解緩衝液(0.15 M NH4Cl、1 mM KHCO3、および0.1 mM EDTA)に懸濁した。脾細胞を遠心分離し、洗浄し、R10培地に再懸濁した。製造者(Mabtech, Cincinnati, OH)の指示にしたがって、IFN-γ ELISpotアッセイを行った。要約すると、単離した脾細胞(1 x 106 細胞/ウェル)を、R10培地中、1 μg ホルマリン不活化PR/8ウイルス、1 μg ホルマリン不活化VN/1203ウイルス、CD3抗血清または1 μg/ml コンカナバリンA (ポジティブコントロール)で24時間刺激し、ELISpotプレートの各ウェルに加えた。ELISpotプレートリーダーを用いて、IFN-γ分泌脾細胞の数を数えた。個々のマウスについて、すべての実験をデュプリケートで行った。
【００７５】
ELISAによる抗体応答の解析: 血清をすべての時間点から回収し、製造者の指示どおりに受容体破壊酵素(RDE, Denka Seiken, Tokoyo, Japan)で処理し、Lu, et al., “Immunity to influenza A H9N2 viruses induced by infection and vaccination,” J. Virol., 2001, Vol. 75(10), p. 4896-901, and Katz, et al., “Adjuvant activity of the heat-labile enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli for oral administration of inactivated influenza virus vaccine,” J. Infect. Dis., 1997, Vol. 175(2), p. 352-63に記載されたとおり(わずかな修飾を有する)、ELISAによりvsIgGを試験した。要約すると、マイクロタイターウェルを、4℃で一晩、VN/1203を増殖させた50 HAUのMDCKを含む100 μLのPBSで被覆した。0.05% Tween-20を含むPBS(PBST)で洗浄後、非特異的結合部位を、室温で1時間、PBST中、4% BSAでブロックした。RDE処理血清を、PBST中、1% ウシ血清アルブミン(BSA)で1:100に希釈し、100 μLを、室温で1時間、ウェルに加えた。結合したIgGを、室温で1時間、1% BSA/PBSTで希釈した抗-マウスI全IgG、IgG1またはIgG2a特異的結合ストレプトアビジン(1:2000 Jackson Labs, Bar Harbor, ME)により検出し、その後、テトラメチルベンジジン(R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて定量化した。SpectraMax 250分光光度計(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて、インキュベーションの15分後に、A405 nmでの吸光度を測定し、A605 nmで補正した。
【００７６】
マイクロ中和試験による中和抗体応答の解析: Rowe, et al., “Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays,” J. Clin. Microbiol., 1999, Vol. 37(4), p. 937-43に記載されたとおり(いくらかの修飾を有する)、血清中和抗体の検出を行った。2倍希釈物(50 μl量)のRDE処理血清を、96ウェルプレートでアッセイ希釈物(ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むPBS中、1% ウシ血清アルブミン)の1:50-1:400の濃度範囲において調製し、37℃で2時間、VN/1203ウイルス(100 TCID50)と共にインキュベートした。MDCK細胞(3 x 104)を加えて、37℃、5% CO2で18時間、インキュベートした。細胞を80%アセトンで固定し、1% Tween-20を含むアッセイ希釈物でブロックし、マウス抗-インフルエンザ抗体(1:1 MAB8258およびMAB8257の1:4000最終濃度, Millipore, Billerica, MA)を用いて核タンパク質(NP)について探索した。結合したIgGを、室温で1時間、1% BSA/PBSTで希釈した抗-マウスI全IgG、IgG1またはIgG2a特異的結合ストレプトアビジン(1:2000 Jackson Labs, Bar Harbor, ME)により検出し、その後、テトラメチルベンジジン(R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて定量化した。十分な洗浄の後、室温で1時間、ヤギ抗-マウスIgG HRP (1:2000, Jackson Labs, West Grove, PA)を加えて、その後、テトラメチルベンジジン(R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて発色させ、定量化した。ヤギ抗-H5N9血清(BEI Resources, Manassas, VA)を中和のためのポジティブコントロールとして使用した。<50の力価は、ネガティブであると考えられる。
【００７７】
統計学的解析: すべてのデータは、トリプリケートで行われ、少なくとも3回の別々の実験を代表するものである。結果は、トリプリケート実験の平均 ± 標準偏差を示す。分散分析(ANOVA)またはスチューデントt-検定を用いて、およびGraphPad統計学的解析プログラムを用いて、データの統計学的な有意性を決定した。
【００７８】
実施例1
本実施例において、インフルエンザビリオンのEB仲介凝集を介してインフルエンザウイルスの宿主細胞への接着を阻害するEBペプチドの能力を評価した。
【００７９】
潜在的なペプチド誘導ウイルス凝集を単離するために、密度勾配超遠心分離を使用した。上記したとおり、PR/8ウイルスを、37℃で1時間、0 μM、10 μMまたは30 μMのEB (配列番号1)で処理し、連続した20-60%スクロース勾配に層状化させた。18,000 rpmで90分間の遠心分離後、0.5 mLの画分を回収し、ニトロセルロースにスポットし、イムノブロットによりHAを探索し、密度測定法によりHAレベルを定量した。さらに、各画分のHA活性を決定した。結果を図1に示す。図1Bおよび1Cについて、イムノブロットにより決定された各画分中のHA抗原の存在を第1Y軸上の(○)で示し、各画分のHA活性を第2Y軸上の(□)で示す。
【００８０】
図1Aは、各勾配の密度を示す。PR/8ウイルス単独は、1.14 g/cm3の密度を有する約30%スクロースを含む画分に存在した。これらの画分はまた、HA活性を含んでおり、これは、PBS (0 μMペプチド)で処理されたウイルスについての結果を示す図1Bから明らかなとおり、精製化ウイルスが活性であることを示す。対照的に、10 μM EBペプチドでの前処理は、図1Cから明らかなとおり、20%から45%スクロース画分までのHA抗原の位置の遷移を生じた。30 μM EBペプチドでの前処理(図1Dを参照のこと)は、より劇的なHA抗原の遷移を生じ、41-53%スクロースに局在し、ウイルス抗原の多くは1.20 g/cm3の密度で検出された。より重要なことは、HA活性が、ウイルス単独の場合と比較してEBペプチド処理サンプルにおいてかなり低く、これは、凝集体がcRBCに結合するそれらの能力を減少させたことを示す。
【００８１】
EBペプチド誘導ウイルス凝集を確認するために、上記したとおり、精製化PR/8ウイルス(512 HA単位)を、37℃で1時間、PBS(モック)または10 μMのEBで処理し、電子顕微鏡により解析した。結果を図2に示す。
【００８２】
モック処理(図2A)において、個々のビリオンは、散発的な凝集体は観察されたが(約2から4ビリオン)、視野にわたって均一に散らばっていた。対照的に、EBペプチドで処理されたほぼすべてのビリオンは、25から100個の個々のウイルス粒子の巨大なクラスターで見出され、これは、EBペプチドがインフルエンザウイルスを凝集化していることを確認している(図2B)。
【００８３】
実施例2
本実施例において、インフルエンザウイルスとマクロファージの結合に影響を与えるEBの能力を評価した。
【００８４】
フルオレセインイソチオシアネート(FITC-PR/8)で標識した精製化PR/8ウイルス(512全HAU)を、37℃で1時間、0 μM、10 μM、30 μMまたは50 μMのEB (配列番号1)で処理した。次いで、ウイルスを、37℃で1時間、軽く揺らしながら、1% BSAを含む全量1 mLのRPMI 1640中で2 x 105 RAW 264.7 マクロファージと共にインキュベートした。マクロファージをPBSで2回洗浄し、1%パラホルムアルデヒドで固定した。ウイルス-細胞結合をLSR-II Benchtopフローサイトメーター(BD Biosciences, Franklin Labs, NJ)で測定した。モック感染マクロファージ(PBSのみ)の単一細胞集団を、前方および側方(forward and side)の散乱特性に基づいてゲーティングし(gated)、各実験群からの5,000イベントを記録した。すべてのサンプルについての実験をトリプリケートで行った。結果を図3に示す。
【００８５】
図3Aは、前方および側方の分散特性に基づいてゲーティングされた2 x 105のモック処理RAW 264.7マクロファージの単一細胞集団を示す図式である。図3B-3Eは、マクロファージと0 μM EB (図3B)、10 μM EB (図3C)、30 μM EB (図3D)または50 μM EB (図3E)で前処理されたFITC-PR/8の結合を示すヒストグラムである。PBS処理マクロファージによるバックグラウンド蛍光は、図3B-3Eにおいて細線により示され、< 102のFITCシグナルを提供する。図3B-3Eにおける太線は、FITC-PR/8とマクロファージの結合を示す。図3Bは、モック処理(0 μM) FITC-PR/8とマクロファージのバックグラウンド結合を示し、< 103のFITCシグナルを提供する。ウイルスを10 μM EB (図3C)で処理した場合には、図3Bと比較して結合ピークの最小の遷移が存在し、これは、この濃度のEBがマクロファージとの結合を増加させなかったことを示す。対照的に、ウイルスをEBの30 μM (図3D)または50 μM (図3E)で処理した場合には、結合ピークの顕著な遷移により示されたとおり、マクロファージ結合ウイルスの増加が観察された。これらの場合において、103から104以上のFITCシグナルが観察された。結合したウイルスを有する全体的な細胞数は、図3Bと比較して図3Dおよび3Eにおいてより低く、これは、ピークの大きさの減少により示される。しかしながら、これらのマクロファージからのFITCシグナルはかなり高く、これは、これらのマクロファージがより大きなウイルス凝集体を有し得ることを示す。概して、このデータは、30 μMまたはそれ以上の濃度のEBで処理されたウイルスがマクロファージとの結合を増加させることを示し、これは、該ペプチドにより誘導されるウイルス凝集が食細胞によるそれらの摂取を増加させ得ることを示唆する。
【００８６】
実施例3
本実施例において、インビボで鳥インフルエンザワクチン組成物の免疫原性を高めるEBペプチドの能力を評価した。
【００８７】
最初に、ワクチン組成物を製造した。ホルマリン不活化スクロース精製化VN/1203ウイルス(BCAアッセイにより決定された1-10 μgの全タンパク質(Pierce Biotechnologyから市販で入手可能である))を、37℃で1時間、単独で、0.5 mg/ml 硫酸アンモニウムアルミニウム(ミョウバン)と共に、または0.5 mM、1 mM、10 μMもしくは50 μMのEBペプチド(配列番号1)と共にインキュベートした。すべてのワクチンを滅菌PBSで調製した。
【００８８】
4から6週齢の雌Balb/Cマウス(n=6/群)の尾静脈から血液を採取し、その後、50 μLのワクチン製剤で後肢筋肉内注射するか、または50 μLのPBSで後肢筋肉内(im)注射によりモックワクチン接種を行った(0日目)。すべてのマウスから採血し、15日目にワクチンまたはPBS(モックワクチン接種)の追加免疫を与えた。最初のワクチン接種の28日後に、再びマウスから採血した。最初のワクチン接種の29日後に、下記したとおり、マウスにチャレンジした。
【００８９】
ウイルス特異的抗体産生: ウイルス特異的抗体産生を評価するために、上記したとおり、ワクチン接種の0日、15日および28日後に血液を個々のマウスから回収し、製造者の指示にしたがって、血清を受容体破壊酵素(RDE, Denka Seiken, Tokyo, Japan)で処理した。
【００９０】
以前、Lu, et al., J. Virol., 2001, Vol. 75, p. 4896-4901およびKatz, et al., J. Infect. Dis., 1997, Vol. 175, pp. 352-363に記載されたELISA(わずかな修飾を有する)により、血清中のウイルス特異的IgGレベルを決定した。要約すると、マイクロタイターウェルを、組織培養物の100 μLの100 HAU/mL溶液で被覆し、4℃で一晩、VN/1203を増殖させた。0.05% Tween-20を含むPBS(PBST)で洗浄後、非特異的結合部位を、室温で1時間、PBST中、4% BSAでブロックし、その後、何度も洗浄した。RDE処理血清を、PBST中、1% ウシ血清アルブミン(BSA)で1:100に希釈し、室温で1時間、ウェルに加えた。結合したIgGを、室温で1時間、1% BSA PBSTで1:2000に希釈した抗-マウスIgG結合ストレプトアビジン(Jackson Labs, Bar Harbor, ME)により検出し、その後、テトラメチルベンジジン(R&D Systems, Minneapolis, MN)を用いて定量化した。SpectraMax 250分光光度計(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて、インキュベーションの15分後に、A405 nmでの吸光度を測定し、A605 nmで補正した。
【００９１】
ワクチン接種の28日後の力価についての結果を図4に示す。すべての濃度におけるEBペプチドで前処理した不活化ウイルスでのワクチン接種を行ったマウスは、非アジュバントワクチン(すなわち、不活化ウイルス単独)でのワクチン接種を行ったマウス、またはミョウバンを伴う(adjuvanated)ワクチンでのワクチン接種を行ったマウスと比較して、増加したウイルス特異的IgG力価を示した。統計学的な有意差は、モックワクチン接種マウスについてのウイルス特異的IgG力価とすべてのワクチン接種群についてのウイルス特異的IgG力価との間で見出された。不活化ウイルス単独でのワクチン接種を行ったマウス、不活化ウイルス ＋ ミョウバンでのワクチン接種を行ったマウス、および不活化ウイルス ＋10 μM EB、50 μM EB、0.5 mM EBもしくは1 mM EBでのワクチン接種を行ったマウスについてのウイルス特異的IgG力価において、統計学的な有意差は見出されなかった。これらの結果は、VN/1203 ＋10 μM、50 μM、0.5 mMもしくは1 mM EBでのマウスのワクチン接種が、不活化VN/1203単独でのワクチン接種を行ったマウス、または不活化VN/1203 ＋ ミョウバンでのワクチン接種を行ったマウスと比較して増加したウイルス特異的IgG力価を生じたことを示す。
【００９２】
チャレンジ: 最初のワクチン接種の29日後に、マウスに、軽くイソフルラン麻酔をかけ、VN/1203 (1 MLD50)を鼻腔内(i.n.)投与した。上記したとおり、不活化VN/1203 ＋ 200 μM EBでのワクチン接種を行ったマウスの群(n=6)にまた接種した。上記したとおり、モックワクチン接種を行ったマウスのコントロール群(n=6)に、25 μL PBSをモック接種した。
【００９３】
体重減少について12日間、および感染の臨床的兆候について10日間、マウスをモニターした。0 = 感染の兆候なし、1 = ひだ状突起(ruffled coat)、円背、2 = ゆっくりとした動き、振戦(shivering)、3 = 呼吸困難、食欲不振、ほとんど動かない、および4 = 瀕死状態を示す。結果を図8-10に示す。結果を図5および6に示す。
【００９４】
図5から明らかなとおり、モックワクチン接種が行われたマウスは、感染の8日後に全滅寸前であった。不活化VN/1203 ＋ PBSで、または不活化VN/1203 ＋ ミョウバンでのワクチン接種が行われたマウスは、チャレンジの8日後(as late as)に感染の兆候を示した(2のスコア)。対照的に、不活化VN/1203と200 μMのEBでのワクチン接種が行われたマウスは、チャレンジのすべての日数後において0または1のスコアを示し、これは、不活化ウイルスとEBを含むワクチンが、不活化ウイルスとPBSを含むワクチンまたは不活化ウイルスとミョウバンを含むワクチンよりも感染の臨床的兆候を減少させるのに有効であることを示す。
【００９５】
図6から明らかなとおり、モックワクチン接種を行い、VN/1203を感染させたすべてのマウスは、感染の8日後に死亡した。不活化VN/1203 ＋ PBSでのワクチン接種が行われたマウスは、チャレンジの12日後に体重のわずかな減少を示した。対照的に、不活化VN/1203とミョウバンまたは10 μM、50 μM、0.5 mMもしくは1 mMのEBでのワクチン接種が行われたマウスは、チャレンジの0日目と比較してチャレンジの12日後に体重の増加を示した。さらに、ミョウバンまたは10 μM、50 μM、0.5 mMもしくは1 mMのEBで前処理された不活化VN/1203でのワクチン接種が行われたマウスは、試験されたすべての日数において、VN/1203 ＋ PBSでのワクチン接種が行われたマウスと同じであるか、またはそれ以上の体重であった。これらの結果は、10 μMから1 mMのEBペプチドで前処理された不活化VN/1203でのマウスのワクチン接種が顕著な体重減少を生じず、VN/1203 ＋ PBSでワクチン接種が行われた場合と比較して、体重に負の影響をほとんど与えないことを示す。
【００９６】
肺ウイルス力価: チャレンジの7日後に、各群からの3個体のマウスに、十分なイソフルラン麻酔をかけ、頸椎脱臼により安楽死させ、肺を取り出した。この工程を、チャレンジの10日後に残りのすべてのマウスについて繰り返した。上記のとおり、抗体を含む1 mlの氷冷PBSで組織を均質化し、MDCK細胞についてのTCID50解析により肺におけるウイルス力価を決定した。結果を図7に示す。
【００９７】
図7から明らかなとおり、50 μMまたはそれ以上の量のEBで前処理されたVN/1203でのワクチン接種が行われたマウスは、感染の7日後にそれの肺において検出可能な感染ウイルスを有していなかった。対照的に、モックワクチン接種マウス、不活化VN/1203 ＋ PBSでのワクチン接種が行われたマウス、およびVN/1203 ＋ ミョウバンでのワクチン接種が行われたマウスについて、感染ウイルスは、肺において検出され、モックワクチン接種マウスの場合には、ウイルス力価は、肺において104までの感染ウイルス粒子に到達した。これらの結果は、EBペプチドを伴う(adjuvanated with)鳥インフルエンザワクチンが伝統的なインフルエンザワクチンよりも強力な免疫応答を誘導することにより殺菌免疫を生じ得ることを示す。10日後に、不活化VN/1203 ＋ EBでのワクチン接種が行われた群のいずれの肺においても感染ウイルスは検出されなかった(データは、示していない)。
【００９８】
実施例4
本実施例において、準最適用量の抗原を含む鳥インフルエンザワクチン組成物の免疫原性を高めるEBおよびその誘導体の能力をインビボで評価した。
【００９９】
最初に、ワクチン組成物を製造した。ホルマリン不活化VN/1203 H5N1ウイルス(BCAアッセイにより決定された1-10 μgの全タンパク質(Pierce Biotechnologyから市販で入手可能である))を、37℃で1時間、単独で、0.5 mg/ml 硫酸アンモニウムアルミニウム(ミョウバン)と共に、50 μMもしくは200 μMのEBペプチド(配列番号1)と共に、または配列RRKKLPAVLLALLAP (配列番号4)を有する200 μMのEBペプチド誘導体と共にインキュベートした。すべてのワクチンを滅菌PBSで調製した。配列番号4のペプチドは、EBペプチドのN末端においてRRKK (配列番号3)可溶性タグを保持しながら、5個のアミノ酸残基を除去することにより作製された。
【０１００】
4から6週齢の雌Balb/Cマウス(n=10/群)に、後肢筋肉内(i.m.)注射により、50 μLのワクチン製剤を投与するか、または50 μLのPBSでモックワクチン接種を行った(0日目)。15日目に、ワクチンまたはPBS(モック)の追加免疫をすべてのマウスに与えた。
【０１０１】
最初のワクチン接種から29日後(追加免疫の14日後)に、マウスに、軽くイソフルラン麻酔をかけ、VN/1203 (10 MLD50)を鼻腔内(i.n.)投与した。生存について10日間、ならびに体重減少および感染の臨床的兆候について7日間、マウスをモニターした。0 = 感染の兆候なし、1 = わずかなひだ状突起、振戦、2 = ひだ状突起、呼吸困難、3 = ひだ状突起、浅い呼吸、振戦、食欲不振を示す。結果を図8-10に示す。
【０１０２】
図8から明らかなとおり、PBSでのモックワクチン接種が行われたマウスは、チャレンジの10日後にすべて死んでおり、準最適用量の不活化VN/1203ウイルス単独(すなわち、EBまたはミョウバンを含まない)でのワクチン接種が行われたマウスは、20%未満の生存率を示した。対照的に、50 μMのEBで前処理された準最適用量の不活化VN/1203ウイルスでのワクチン接種が行われたマウスは、ウイルスチャレンジの10日後(as late as)に60%より高い生存率を示した。これらの結果は、EBが準最適用量の不活化VN/1203ウイルスを含む鳥インフルエンザワクチンにより提供される保護を増大させることを示す。
【０１０３】
図9から明らかなとおり、PBSでモックワクチン接種を行い、VN/1203ウイルスを感染させたマウスは、チャレンジの7日後に25%以上の体重減少を示した。準最適用量の不活化VN/1203ウイルス単独でのワクチン接種が行われたマウス、および200 μMの配列番号4のペプチドで前処理された準最適用量の不活化VN/1203ウイルスでのワクチン接種が行われたマウスは、モックワクチン接種マウスと比較して、ウイルスチャレンジの7日後により少ない体重減少、すなわち約20%の体重減少を示した。対照的に、200 μMのEBペプチドで前処理された準最適用量の不活化VN/1203でのワクチン接種が行われたマウスは、ワクチンの追加免疫がマウスに投与されなかった場合においてさえも、ウイルスチャレンジの7日後にほとんど体重減少を示さなかった。
【０１０４】
図10から明らかなとおり、モックワクチン接種を行い、VN/1203ウイルスを感染させたマウスは、チャレンジの7日後に顕著な感染の兆候を示した(3のスコア)。準最適用量の不活化VN/1203単独でのワクチン接種が行われたマウスおよび200 μMの配列番号4のペプチドで前処理された準最適用量の不活化VN/1203でのワクチン接種が行われたマウスは、チャレンジの7日後(as late as)に感染の兆候を示した(2のスコア)。対照的に、ワクチンの追加免疫の有無で、200 μMのEBペプチドで前処理された準最適用量の不活化VN/1203でのワクチン接種が行われたマウスは、チャレンジの7日後にほとんど感染の兆候を示さなかった(それぞれ、0および1のスコア)。これらの結果は、ワクチンの追加免疫の有無での200 μMのEBを含む鳥インフルエンザワクチンが、ワクチンが準最適用量の不活化ウイルスを含む場合において、ワクチン単独またはワクチン＋配列番号4のペプチドと比較して感染の臨床的兆候を減少させるのにより有効であることを示す。
【０１０５】
肺ウイルス力価: チャレンジの4日および7日後に、各群からの3個体のマウスに、十分なイソフルラン麻酔をかけ、頸椎脱臼により安楽死させ、肺を取り出した。上記のとおり、抗体を含む1 mlの氷冷PBSで組織を均質化し、MDCK細胞についてのTCID50解析により肺におけるウイルス力価を決定した。試験は、個々のマウスについてトリプリケートで行われた。結果を図11に示す。
【０１０６】
図11から明らかなとおり、ワクチンの追加免疫の投与の有無で、200 μMの配列番号4のペプチドで前処理された準最適用量のVN/1203でのワクチン接種が行われたマウス、および200 μMのEBペプチドで前処理された準最適用量のVN/1203でのワクチン接種が行われたマウスは、モックワクチン接種マウス(PBS)および準最適用量の不活化VN/1203単独でのワクチン接種が行われたマウスと比較して、チャレンジの7日後にウイルス除去を促進した。これらの結果は、準最適用量の不活化VN/1203を含む鳥インフルエンザワクチン中における200 μM EBの包含が、ワクチンの追加免疫を必要とすることなくチャレンジの7日後にウイルス除去を促進することを示す。
【０１０７】
実施例5
本実施例において、全もしくは血清中和抗体を増加させることにより、鳥インフルエンザワクチン組成物の免疫原性を高めるEBの能力を評価した。
【０１０８】
最初に、ワクチン組成物を製造した。ホルマリン不活化スクロース精製化VN/1203 H5N1ウイルス(BCAアッセイにより決定された1 μgの全タンパク質(Pierce Biotechnologyから市販で入手可能である))を、37℃で1時間、単独で、0.5 mg/ml 硫酸アンモニウムアルミニウム(ミョウバン)と共に、または200 μMのEBペプチド(配列番号1)と共にインキュベートした。すべてのワクチンを滅菌PBSで調製した。
【０１０９】
4から6週齢の雌Balb/Cマウス(n=3/群)に、後肢筋肉内(i.m.)注射により、50 μLのワクチン製剤を投与するか、または50 μLのPBSでモックワクチン接種を行った(0日目)。ワクチン接種前に尾静脈から採血し、15日目に、ワクチンまたはPBS(モックワクチン接種)の追加免疫をすべてのマウスに与えた。最初のワクチン接種の28日後に、再びマウスから採血した。実施例4に記載されたとおり、最初のワクチン接種の29日後に、VN/1203ウイルス(10 MLD50)をマウスに鼻腔内チャレンジした。6日間、生存についてマウスをモニターした。結果を図14Aに示す。再びマウスから採血し、チャレンジの7日および10日後に血清を回収した。
【０１１０】
試験方法において記載された手順を用いて、最初のワクチン接種の28日後の血清(すなわち、プレチャレンジ血清)からのELISAにより、インフルエンザ特異的全IgG、IgG1およびIgG2レベルを決定した。試験は、個々のマウスについてトリプリケートで行われ、少なくとも2回の別々の実験を代表するものである。結果を図12に示す。
【０１１１】
図12から明らかなとおり、全IgG、IgG1およびIgG2レベルは、準最適用量のVN/1203ウイルス単独をワクチン接種されたマウス、および200 μM EBペプチドで前処理された準最適用量のVN/1203ウイルスをワクチン接種されたマウスについて同じであり、これは、EBが全抗体を増加させることにより鳥インフルエンザに対する保護を改善していないことを示す。
【０１１２】
ワクチン接種前の血清、ワクチン接種の15日および28日後の血清(すなわち、プレチャレンジ血清)、ならびにチャレンジの7日および10日後の血清を、試験方法において記載されたとおり、マイクロ中和試験を用いて、ウイルス中和抗体の存在について解析した。ヤギ抗-H5N9インフルエンザ血清(BEI Resources, Manassas, VAから入手可能である)をポジティブコントロールとして使用した。試験は、個々のマウスについてトリプリケートで行われ、少なくとも2回の別々の実験を代表するものである。結果を図13に示す。図13から明らかなとおり、すべての血清について力価はネガティブであり、これは、EBが血清中和抗体を増加させることにより鳥インフルエンザに対する保護を改善していないことを示す。
【０１１３】
実施例6
本実施例において、血清中和抗体を増加させることにより、季節性インフルエンザウイルス(H1N1ウイルス)についての季節性インフルエンザワクチン組成物の免疫原性を高めるEBの能力を評価した。
【０１１４】
最初に、ワクチン組成物を製造した。ホルマリン不活化PR/8 H1N1ウイルス(BCAアッセイにより決定された1-10 μgの全タンパク質(Pierce Biotechnologyから市販で入手可能である))を、37℃で1時間、単独で、0.5 mg/ml 硫酸アンモニウムアルミニウム(ミョウバン)と共に、50 μMもしくは200 μMのEBペプチド(配列番号1)と共に、または50 μMもしくは200 μMのEBX(EBペプチドを構成するアミノ酸がスクランブル化された20アミノ酸のコントロールペプチド)と共にインキュベートした。すべてのワクチンを滅菌PBSで調製した。EBXは、下記の配列を有していた: RRKKLAALPLVLAAPLAVLA (配列番号5)。
【０１１５】
4から6週齢の雌Balb/Cマウス(n=3/群)に、後肢筋肉内(i.m.)注射により、50 μLのワクチン製剤を投与するか、または50 μLのPBSでモックワクチン接種を行った(0日目)。尾静脈から採血し、15日目に、ワクチンまたはPBS(モックワクチン接種)の追加免疫をすべてのマウスに与えた。最初のワクチン接種の28日後に、再びマウスから採血した。実施例4に記載されたとおり、最初のワクチン接種の29日後に、PR/8ウイルス(10 MLD50)をマウスに鼻腔内チャレンジした。6日間、生存についてマウスをモニターした。結果を図14Aに示す。
【０１１６】
図14Aから明らかなとおり、PBSモックワクチン接種が行われたマウスは、チャレンジの4日後に40%未満、およびチャレンジの6日後に20%未満の生存率を示した。ミョウバンまたは200 μMのEBXペプチドで前処理された準最適用量の不活化PR/8ウイルスでのワクチン接種が行われたマウスは、チャレンジの5日後に60%未満の生存率を示し、準最適用量の不活化PR/8ウイルス単独(すなわち、EBまたはミョウバンは接種されない)でのワクチン接種が行われたマウスは、チャレンジの6日後に60%をわずかに超える生存率を示した。対照的に、50 μMもしくは200 μMのEBペプチドで前処理された準最適用量の不活化PR/8ウイルスでのワクチン接種が行われたマウスは、チャレンジの6日後に100%の生存率を示した。これらの結果は、EBが準最適用量の不活化PR/8ウイルスを含む季節性インフルエンザワクチンにより提供される保護を増大させることを示す。
【０１１７】
試験方法において記載されたとおり、赤血球凝集阻害アッセイによりインフルエンザ特異的中和抗体を決定した。<40の値は、ネガティブであると考えられる。試験は、プール化血清についてトリプリケートで行われ、少なくとも2回の別々の実験を代表するものである。結果を図14Bに示す。
【０１１８】
図14Bから明らかなとおり、ワクチン接種の15日後におけるすべての処理物について力価はネガティブであり、これは、EBが血清中和抗体を増加させることにより季節性インフルエンザウイルスに対する保護を改善していないことを示す。
【０１１９】
実施例7
本実施例において、不活化鳥インフルエンザウイルスをワクチン接種したマウスにおいてIFN-γレベルを増大させるEBの能力を評価した。
【０１２０】
最初に、ワクチン組成物を製造した。ホルマリン不活化スクロース精製化VN/1203 H5N1ウイルス(BCAアッセイにより決定された1 μgの全タンパク質(Pierce Biotechnologyから市販で入手可能である))を、37℃で1時間、単独で、または200 μMのEBペプチド(配列番号1)と共にインキュベートした。すべてのワクチンを滅菌PBSで調製した。
【０１２１】
4から6週齢の雌Balb/Cマウス(n=2/群)に、後肢筋肉内(im)注射により、50 μLのワクチン製剤を投与するか、または50 μLのPBSでモックワクチン接種を行った(0日目)。15日目に、ワクチンまたはPBS(モックワクチン接種)の追加免疫をすべてのマウスに与えた。上記の手順により、ワクチン接種の15日および28日後のマウスから脾細胞を単離した。単離した脾細胞を、R10培地単独で、または1 μg/mL ホルマリン不活化VN/1203ウイルスを含むR10培地で刺激して、試験方法に記載された方法を用いて、ELISpotアッセイによりIFN-γ分泌脾細胞を決定した。データを、平均値 ± 平均値の標準誤差として示す。結果を図15に示す。CD3抗体をポジティブコントロールとして使用し、>100スポットを作製した(データは、示していない)。
【０１２２】
図15から明らかなとおり、EBペプチドは、不活化VN/1203ウイルスをワクチン接種したマウスにおいてIFN-γレベルを増大させ、これは、T細胞が刺激されたことを示す。細胞性免疫の刺激は、不活化VN/1203ウイルス単独を含むワクチンでは見られない。
【０１２３】
実施例8
本実施例において、不活化季節性インフルエンザウイルスをワクチン接種したマウスにおいてIFN-γレベルを増大させるEBの能力を評価した。
【０１２４】
最初に、ワクチン組成物を製造した。ホルマリン不活化スクロース精製化PR/8 H1N1ウイルス(BCAアッセイにより決定された1 μgの全タンパク質(Pierce Biotechnologyから市販で入手可能である))を、37℃で1時間、単独で、または50 μMもしくは200 μMのEBペプチド(配列番号1)と共に、または200 μMのEBXペプチド(配列番号5)と共にインキュベートした。すべてのワクチンを滅菌PBSで調製した。
【０１２５】
4から6週齢の雌Balb/Cマウス(n=3/群)に、後肢筋肉内(im)注射により、50 μLのワクチン製剤を投与するか、50 μLの200 μM EBもしくは200 μM EBXペプチドを投与するか、または50 μLのPBSでモックワクチン接種を行った(0日目)。15日目に、ワクチンまたはPBS(モックワクチン接種)の追加免疫をすべてのマウスに与えた。上記の手順により、ワクチン接種の15日後のマウスから脾細胞を単離した。単離した脾細胞を、R10培地単独で、またはコンカナバリンA (1 μg/mL)、ホルマリン不活化PR/8ウイルス(1 μg)もしくは不活化VN/1203ウイルス(1 μg)を含むR10培地で刺激した。試験方法に記載された方法を用いて、ELISpotアッセイによりIFN-γ分泌脾細胞を決定した。データを、平均値 ± コンカナバリンA刺激脾細胞と比較した平均値の標準誤差として示す。結果を図16に示す。
【０１２６】
図16から明らかなとおり、EBペプチドは、不活化PR/8ウイルスをワクチン接種したマウスにおいてIFN-γレベルを増大させ、これは、T細胞が刺激されたことを示す。細胞性免疫の刺激は、不活化PR/8ウイルス単独を含むワクチンでは見られない。
【０１２７】
本発明の開示またはその好ましい態様の要素を導入するとき、「1つ」、「1個」、「その」および「該」なる用語は、1個またはそれ以上の要素が存在することを意味することが意図される。「含む」、「包含する」および「有する」なる用語は、包括的であることが意図され、記載された要素以外のさらなる要素が存在し得ることを意味する。
【０１２８】
上記より、本発明の開示のいくつかが達成されることが理解され、他の有利な結果がまた達成される。
【０１２９】
本発明の開示の範囲から逸脱することなく、上記組成物および産物におけるさまざまな変化が為され得るので、上記に含まれるすべての事項は、何らその意味が限定されるものではなく、例示として解釈されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年2月8日(2011.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2011524372000001.app
【国際調査報告】
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