(57)【要約】  本出願は、ＰＣＲ反応に用いられるものなどの標識核酸プローブの結合の検出精度を向上させるための方法を提供する。そのような方法の１つは、高い方の温度と低い方の温度である２つの異なる温度で標識強度、例えば、蛍光を測定し、その後、高い方の温度での標識強度に対する低い方の温度での標識強度の比率を計算することを含む。別の方法は、ＰＣＲ後の少なくとも２時点で標識強度を測定し、時間の関数としての標識強度の傾きを計算することを含む。標的核酸に対するプローブの結合のハイブリダイゼーション速度を測定することによって、比率における傾きを計算することが可能になり、それが、この方法に良好な検出特異性を付与する。
2011530296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識核酸プローブとその標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出するための方法であって、
（ａ）標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料と、前記標的核酸とハイブリダイズする標識核酸プローブとを接触させるステップと、
（ｂ）第１の温度及び第２の温度で標識強度を測定するステップであって、前記第１の温度が前記第２の温度より低いステップと、
（ｃ）（ｉ）前記第１の温度における標識強度の、（ii）前記第２の温度における標識強度に対する比率を計算するステップであって、０．８以上の比率が前記標的核酸の存在を示すステップと
を含む方法。
【請求項２】
０．９以上の比率が標的核酸の存在を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の温度が標識核酸プローブのＴｍより低く、第２の温度が前記標識核酸プローブのＴｍより高い、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第２の温度が、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、又は約９５℃である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１の温度が、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、又は約７２℃である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
第１の温度が約５０℃であり、第２の温度が約９５℃である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
標識核酸プローブが蛍光標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
クエンチャー分子と蛍光標識が近接している場合に、前記蛍光標識の蛍光発光が検出できないか、又はクエンチャー分子と蛍光標識が近接していない場合よりも、前記蛍光標識の蛍光発光が少なくとも低く検出されるように、標識核酸プローブが、前記蛍光標識の前記発光を吸収する前記クエンチャー分子をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標識核酸プローブが分子ビーコン又は直鎖状プローブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）が少なくとも２回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
平均比率が繰り返される測定に基づいて計算される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）が、同じ第１の温度及び第２の温度で繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
測定がＰＣＲ反応後に行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＣＲ反応が、
ｉ）適切なプライマー、酵素、及び基質を含む溶液において、標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料を標識核酸プローブと接触させて反応混合物を形成するステップと、
ii）前記反応混合物を、前記標的核酸の増幅に適した変性温度、アニーリング温度、及び伸長温度のサイクルにかけるステップと
を含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
標識核酸プローブとその標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出するための方法であって、
（ａ）標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料と、前記標的核酸とハイブリダイズする標識核酸プローブとを接触させるステップと、
（ｂ）異なる少なくとも２時点において標識強度を測定するステップと、
（ｃ）時間の関数としての前記標識強度の傾きを計算するステップと
を含む方法。
【請求項１８】
標的核酸に結合しているときの標識核酸プローブによって生じるシグナルの強度が、前記標的核酸に結合していないときの前記標識核酸プローブによって生じるシグナルの強度と比較して大きい場合、正の傾きが前記標的核酸の存在を示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
負又はゼロの傾きが標的核酸の非存在を示す、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
標的核酸がＤＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
標的核酸がＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
標識核酸プローブが、蛍光標識された核酸プローブである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
標識核酸プローブが分子ビーコン又は直鎖状プローブである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
測定ステップが等温条件の間に行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
測定ステップがＰＣＲ反応後に行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
測定ステップが、ＰＣＲ反応の完了後約１分〜約１０分間の時間内に完了する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
測定ステップが、異なる少なくとも５時点で行われる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＣＲ反応が、
（ｉ）適切なプライマー、酵素、基質、及び緩衝剤を含む溶液において、標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料を標識核酸プローブと接触させて反応混合物を形成するステップと、
（ii）前記反応混合物を、前記標的核酸の増幅に適した変性温度、アニーリング温度、及び伸長温度のサイクルにかけるステップと
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
傾きが、時間の関数として標識強度の一次導関数をとることによって計算される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３０】
時間の関数としての標識強度が、時間の関数として標識強度測定値をフィッティングする最小二乗法によって計算される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
傾きが、時間の関数として標識強度データを以下の方程式にフィッティングすることによって計算される、請求項１７に記載の方法：
ｙ＝ｍｘ＋ｂ
（式中、ｙは標識強度であり、ｘは時間であり、ｍは傾きである。）
【請求項３２】
線の傾きが以下の式を用いて計算される、請求項１７に記載の方法：
【数１】
2011530296.tif 000010
（式中、ｍは線の傾きであり、（ｘ１，ｙ１）及び（ｘ２，ｙ２）は異なる少なくとも２時点であり、ｘ１≠ｘ２である。）
【請求項３３】
標識強度の傾きに基づいた標識核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション速度を時間の関数として計算するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
それぞれが異なる標的核酸とハイブリダイズする少なくとも２つの標識核酸プローブがあり、各プローブが異なる温度でハイブリダイズする、請求項１７に記載の方法。
【請求項３５】
標識核酸プローブがそれぞれ同じ標識を有する、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年８月８日に出願された米国仮出願第６１／１３６，０４０号の米国特許法第１１９条（ｅ）による優先権を主張し、その仮出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０００２】
本出願は、概して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，polymerase chain reaction）を用いる核酸の検出の分野に関する。本出願は、標識プローブと標的のハイブリダイゼーションに対する温度の効果を計算すること、及び標識強度の関数としての、プローブと標的のハイブリダイゼーション速度を時間の関数として計算することにより、ＰＣＲを用いる標的核酸の検出の特異性を高め、したがって感度を増加させるための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
核酸の増幅は、試料における特定の核酸の検出のための貴重なツールになっている。ＰＣＲは、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載されているように、標的核酸、標的核酸に相補的であるＤＮＡ重合のためのプライマー、並びに必要なヌクレオシド及び緩衝試薬を含む反応物においてＴａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのサーモサイクリングを用いて核酸を増幅するために用いられる。Current Protocols in Molecular Biology (April 2008, Print ISSN: 1934-3639; Online ISSN: 1934-3647)に見いだすことができるような、ＰＣＲの多くのバリエーションが特定のニーズのために開発されている。それは、例えば、生体外での、及び環境試料からの病原体検出、インビトロの診断、遺伝子分析、法医学的検査、食品検査及び農業的検査、並びに親子鑑定を含む様々な目的のためにＤＮＡ及びＲＮＡ標的の存在を検出するための広く用いられている技術である。
【０００４】
ＰＣＲは、制御された実験条件下のみで行われる技術から現場（field）試験に有用な技術へと進化している。この進化は、携帯用ＰＣＲ装置の出現によって可能になっている。そのような装置は、高価で、時間がかかり、且つ面倒な実験処理の必要性なしに、病原体の検出、法医学的試料採取、又は病状の迅速な診断までにも特に適し得る。現場でのＰＣＲの使用は、生物テロに対抗するのに、生物兵器の迅速且つ正確な同定が不可欠であるため、特に重要である。
【０００５】
現場適用はさらに、制御された実験環境の欠如にもかかわらず、ロバスト且つ正確なアッセイを必要とする。現場アッセイは、標的ＤＮＡの検出において実験室アッセイとほとんど同程度であるが、ＰＣＲアッセイと、組織試料から細菌感染を診断する従来の培養技術との比較により、ＰＣＲ方法が７２時間実験室培養より感度が低いことが示された（Emanuel et al. J. Clin. Microbiol. (2002) 41:689-693）。したがって、ＰＣＲ感度の向上は、迅速な検出方法を開発する際の目標である。
【０００６】
シグナル特異性は、依然として、いずれのＰＣＲアッセイについても、特に、反応において反応速度及び増幅された標的の量を測定するために蛍光レポーター分子を用いる場合、感度の主な制限になっている。陰性対照反応におけるバックグラウンド蛍光の減算は、一般的に、非特異的ハイブリダイゼーションを考慮に入れるために用いられるが、この方法は依然として、粗さがあり、標的核酸が検出されるために存在しなければならない閾値をより低くすることを制限している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Current Protocols in Molecular Biology (April 2008, Print ISSN: 1934-3639; Online ISSN: 1934-3647)
【非特許文献２】Emanuel et al. J. Clin. Microbiol. (2002) 41:689-693
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
標識核酸プローブとその相補核酸標的とのハイブリダイゼーションを検出するための方法であって、（ａ）標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料と、標的核酸とハイブリダイズする標識核酸プローブとを接触させるステップと、（ｂ）第１の温度及び第２の温度で標識強度を測定するステップであって、前記第１の温度が前記第２の温度より低いステップと、（ｃ）（ｉ）前記第１の温度における標識強度の、（ｉ）前記第２の温度における標識強度に対する比率を計算するステップであって、０．８以上の比率が標的核酸の存在を示すステップとを含む方法が本明細書で提供されている。さらなる実施形態において、ステップ（ｂ）及び（ｃ）は少なくとも２回繰り返される。さらなる実施形態において、ステップ（ｂ）及び（ｃ）は、同じ第１の温度及び第２の温度で繰り返される。第１の温度の測定は、第２の温度の測定前に起こり得、又は逆も起こり得る。さらなる実施形態において、この方法は、ＰＣＲ後の検出技術として用いられる。さらなる実施形態において、方法は、試料が前記温度になった後の３時点以上、例えば、１５秒目、３０秒目、及び４５秒目に単一の温度において標識強度を測定するステップをさらに含む。さらなる実施形態において、この方法は、１５秒目、３０秒目、及び４５秒目などの３時点以上で異なる温度において標識強度を測定するステップをさらに含む。
【００１０】
一実施形態において、０．９以上の比率は、標的核酸の存在を示す。
【００１１】
別の実施形態において、第１の温度は標識核酸プローブのＴｍより低く、第２の温度は標識核酸プローブのＴｍより高い。さらなる実施形態において、第１の温度は、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、又は約７２℃である。
【００１２】
別の実施形態において、第２の温度は、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、又は約９５℃である。
【００１３】
別の実施形態において、第２の温度は、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、又は約９５℃である。
【００１４】
別の実施形態において、第１の温度は約５０℃であり、第２の温度は約９５℃である。
【００１５】
別の実施形態において、標識核酸プローブは、蛍光標識を含む。さらなる実施形態において、クエンチャー分子と蛍光標識が比較的近接している場合に、前記蛍光標識の蛍光発光が検出できないか、又はクエンチャー分子と蛍光標識が近接していない場合よりも、前記蛍光標識の蛍光発光が少なくとも低く検出されるように、標識核酸プローブは、蛍光標識の発光を吸収するクエンチャー分子をさらに含む。さらなる実施形態において、標識核酸プローブは分子ビーコン又は直鎖状プローブである。
【００１６】
一実施形態において、標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００１７】
一実施形態において、平均比率は、繰り返される測定に基づいて計算される。
【００１８】
さらなる実施形態において、測定ステップはＰＣＲ反応後に行われる。
【００１９】
別の実施形態において、ＰＣＲ反応は、ｉ）適切なプライマー、酵素、及び基質を含む溶液において、標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料を標識核酸プローブと接触させて反応混合物を形成するステップと、ii）前記反応混合物を、前記標的核酸の増幅に適した変性温度、アニーリング温度、及び伸長温度のサイクルにかけるステップとを含む。
【００２０】
本明細書ではさらに、標識核酸プローブとその標的核酸のハイブリダイゼーションを検出するための方法であって、（ａ）標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料と、標的核酸とハイブリダイズする標識核酸プローブとを接触させるステップと、（ｂ）異なる少なくとも２時点において標識強度を測定するステップと、（ｃ）時間の関数としての標識強度の傾きを計算するステップとを含む方法が提供される。ステップ（ｂ）で行われる場合の異なる時点における測定ステップは、等温条件下で、又は異なる温度において行うことができる。
【００２１】
さらなる実施形態において、標的核酸に結合しているときの標識核酸プローブによって生じるシグナルの強度が、標的核酸に結合していないときの標識核酸プローブによって生じるシグナルの強度と比較して時間経過に伴い増加する場合、正の傾きは標的核酸の存在を示す。さらなる実施形態において、負又はゼロの傾きは、標的核酸の非存在を示す。
【００２２】
さらなる実施形態において、標識核酸プローブは分子ビーコン又は直鎖状プローブである。
【００２３】
一実施形態において、標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００２４】
一実施形態において、測定ステップは、等温条件の間に行われる。さらなる実施形態において、測定ステップは、ＰＣＲ反応後に行われる。さらなる実施形態において、測定ステップは、ＰＣＲ反応の完了後、約１分〜約１０分間の時間内に完了する。さらなる実施形態において、測定ステップは、異なる少なくとも５時点で行われる。さらなる実施形態において、測定ステップは、ＰＣＲ完了後、１５秒目、３０秒目、及び４５秒目に行われる。
【００２５】
別の実施形態において、ＰＣＲ反応は、（ｉ）適切なプライマー、酵素、基質、及び緩衝剤を含む溶液において、標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料を標識核酸プローブと接触させて反応混合物を形成するステップと、（ii）前記反応混合物を、前記標的核酸の増幅に適した変性温度、アニーリング温度、及び伸長温度のサイクルにかけるステップとを含む。別の実施形態において、アニーリング温度及び伸長温度は同じである。
【００２６】
一実施形態において、傾きは、時間の関数として標識強度の一次導関数をとることによって計算される。さらなる実施形態において、時間の関数としての標識強度は、時間の関数として標識強度測定値をフィッティングする最小二乗法によって計算される。さらなる実施形態において、傾きは、時間の関数として標識強度データを以下の方程式にフィッティングすることによって計算される：ｙ＝ｍｘ＋ｂ（式中、ｙは標識強度であり、ｘは時間であり、ｍは傾きである。）
【００２７】
さらなる実施形態において、標識強度の傾きに基づいた標識核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション速度は、時間の関数として計算される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ビーコンＴｍより高い蛍光値で割ったビーコンＴｍより低い蛍光値の比率を示すグラフである。正の比率（＋）は、生物兵器を研究するための代理生物体であるバチルス・グロビジ（ＢＧ，bacillus globigii）鋳型を含有する試料についてのみ見出され、負の比率（−）はＢＧ鋳型を欠く対照試料について見いだされた。このように、図１は、比率の値の使用を用いて、偽陽性を最小限にしながら、少量の標的試料でさえも陽性に検出できることを示している。
【図２】６個の試料の、３〜１０分間にわたる蛍光値の傾きを測定した結果を示す。標的配列であるＢＧ鋳型を含有する試料のみが正の傾きを示した。
【図３】２つの温度における異なる２時点での標識強度を用いて、標的核酸、つまり炭疽菌に特異的な核酸の存在を、偽陽性を最小限にしながら正確に検出することができるかどうかを決定するために行われたＰＣＲ反応の結果を示す。結果は、炭疽菌が確実に検出されたことを示している。
【図４】２つの温度における異なる２時点での標識強度を用いて、標的核酸、つまり野兎病に特異的な核酸の存在を、偽陽性を最小限にしながら正確に検出することができるかどうかを決定するために行われたＰＣＲ反応の結果を示す。結果は、野兎病が確実に検出されたことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
「核酸プローブ」とは、標的配列に相補的であり、したがって、標的配列と特異的にハイブリダイズするＲＮＡ又はＤＮＡであるオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは任意の適切な長さでよく、いくつかの実施形態において、プローブは２０〜１０００塩基長である。プローブは、標識されていてもよく、例えば、少なくとも１つの検出可能なレポーター分子に連結されていてもよい。蛍光レポーター分子は、そのレポーター分子として用いることができる。蛍光レポーターがクエンチャーと近接している場合、レポーターからの蛍光発光がクエンチャーによって少なくとも一部、吸収され、それに従って、レポーターの検出可能なシグナルを減少させるように、蛍光レポーターをオリゴヌクレオチドの一方の末端に、蛍光クエンチャー分子をオリゴヌクレオチドの反対側の末端に付着させてもよい。これらの分子は、オリゴヌクレオチドの内部に付着させることもできる。このクエンチングの機構は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ，fluorescent resonance energy transfer）として知られており、プローブが結合していない場合に対して、標的に結合した場合、より高い標識強度を有するプローブを結果として生じる。プローブを標識するための他の方法には、放射性同位元素の連結、単一のフルオロフォア、ＤＮＡにインターカレートする色素（SYBR Greenなど）、化学発光分子、アフィニティータグなどが挙げられる。プローブと標的とのハイブリダイゼーションは、全体として参照により本明細書に組み入れられているTsourkas et al. Nuc. Acids Res. (2003) 31:1319-1330に記載されたものなどの当技術分野において知られた方法及び方程式を用いて計算することができる。
【００３０】
「分子ビーコン」とは、プローブの中央に標的に相補的な配列を有し、５’末端及び３’末端に異種配列を有し、プローブが標的に結合せず、且つステム構造の実効ＴＭより低い温度にある場合、ステムループ構造を形成するプローブを意味する。分子プローブの相補的配列は、標的に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％相補的であり得る。ステムループは、５’末端及び３’末端を近接させ、レポーター分子とクエンチャー分子が相互作用するのを可能にし、その結果として、標識強度の低下を生じる。標的に結合すると、レポーター分子とクエンチャー分子はより遠く離れることになり、標識強度の増加を可能にする。したがって、遊離分子ビーコンは、ほとんど、又は全くシグナルを生じないが、標的配列に結合している分子ビーコンは、ビーコンと標的のハイブリッドの実効ＴＭの近く、又はそれより下の温度ではるかに大きな標識強度を有する。分子ビーコンプローブは当技術分野において周知であり、例えば、Maras et al., Clinica Chemica Acta (2006) 363:48-60に記載されている。
【００３１】
「直鎖状プローブ」とは、特別な二次構造を有しないプローブを意味する。プローブは、標的に１００％相補的であってもよいし、標的に部分的のみ相補的であってもよい。例えば、プローブは、標的に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％相補的であり得る。
【００３２】
他の規定がない限り、「プローブ」は一般的に、核酸プローブ、分子ビーコン、及び直鎖状プローブを指す。言い換えれば、本明細書で用いられる場合、「プローブ」は、他の規定がない限り、核酸プローブ、分子ビーコン、及び直鎖状プローブを含む。
【００３３】
「標的核酸」とは、相補的ＰＣＲプライマー及びプローブを用いて検出されるべき試料中の核酸を意味する。標的は、ゲノムＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、又は合成ＤＮＡなどのＤＮＡであってもよい。標的は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、又は合成ＲＮＡなどのＲＮＡであってもよい。標的核酸を含有する試料は任意の供給源からであってもよい。そのような試料として、例えば、生体試料、環境試料、臨床試料、インビトロ試料、及び組織試料が挙げられる。試料は、例えば、生物戦用物質が混入しているのではないかと疑われる材料由来であり得る。標的核酸の特定の例として、炭疽菌、野兎病、ペスト、及び汎オルソポックスのゲノムの少なくとも一部をコードする核酸が挙げられるが、それらに限定されない。ＰＣＲ反応に用いるそのような試料から核酸を抽出するための方法は当技術分野においてよく知られており、用いることができる。
【００３４】
プローブ及びプライマーは、単一の反応において１つより多い標的を検出するために多重化してもよい。一般的に、異なるプライマーセットは、異なる標的核酸を増幅し、標的を検出するプローブは、２つの標的を同じ反応において識別可能であるように、異なるフルオロフォアなどの異なる標識を有してもよい。そのような方法は、Belanger et al. J. Clin. Microbiol. (2002) 40:1436-1440に記載されたものなど、当技術分野においてよく知られている。別の実施形態において、異なるプライマーセットは、異なる標的核酸を増幅し、その標的を検出するプローブは、同一のフルオロフォアなどの同じ標識を有することができる。そのプローブは、異なる温度でハイブリダイズすることができ、それが、同じ標識にもかかわらず、同じ反応において各プローブが識別可能であることを可能にする。これは、温度空間における多重化とみなすことができる。
【００３５】
さらに、複数の反応を用いて、試料中の病原性生物体又は疾患遺伝子についてのスクリーニングなど、複数の標的についてスクリーニングすることができる。そのような反応は、複数ウェル型、例えば、９６ウェルプレートで行うことができる。
【００３６】
「標識強度」とは、プローブから検出されるシグナルのアンプリチュード（amplitude）を意味する。検出される特定のシグナルはプローブに依存する。例えば、蛍光は、蛍光プローブで標識されたプローブについて検出される。ＦＲＥＴに基づいたプローブ標識を用いる場合、標識強度は、標的に結合したプローブの量と比例し、それに従って、試料中の標的の量に比例する。同様に、SYBR GreenなどのＤＮＡにインターカレートするレポーター分子が用いられる場合、より多くのレポーターが新しく合成された二本鎖ＤＮＡに組み入れられるにつれて、蛍光は増加する。したがって、標識強度は、標的核酸が試料中に存在するかどうかを、及び任意選択で、試料に存在する標的の量を決定するための手段として用いることができる。例えば、標識強度は、既知量の標的を用いて作成された標準曲線と比較して、その結果を内挿し、試料中の標的の量を決定することができる。そのような方法は当技術分野においてよく知られている。
【００３７】
いくつかの実施形態において、プロキシユニット（proxy unit）を用いて標識強度を記録又は表示する。例えば、装置は、蛍光プローブからの蛍光を特定の電圧として検出又は記録することができる。このプロキシユニット、すなわち、この特定の例における電圧は、標識強度とみなすことができる。
【００３８】
「ハイブリダイズする」とは、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが、二本鎖ポリヌクレオチドの１つの鎖を形成するように結合する場合を意味する。核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ、若しくはＤＮＡ−ＲＮＡの二本鎖ポリヌクレオチド、又は三本鎖ハイブリッドを形成してもよい。ハイブリダイゼーションは配列特異的であり、ハイブリダイゼーションの速度は、例えば、参照により本明細書に組み入れられている、Tsourkas et al. Nuc. Acids Res. (2003) 31:1319-1330によって記載されているように、二次方程式を用いて計算することができる。ハイブリダイゼーションの速度はまた、相同性配列へのそれのハイブリダイゼーションの間、時間経過に伴う分子ビーコンの蛍光増加を測定することによって計算することができる。分子ビーコンは、一方の末端において蛍光分子で標識し、もう一方の末端にはクエンチャー分子で標識されている。分子ビーコンがそれの相補的配列にハイブリダイズすると、レポーター蛍光体は、クエンチャー分子から物理的に離され、蛍光は増加する。その後、ハイブリダイゼーションの速度は、標識強度の傾きを用いて蛍光増加の速度として測定することができる。
【００３９】
「Ｔｍ」又は「融解温度」とは、プローブ分子の５０％が標的核酸にハイブリダイズし、一方で、プローブ分子の５０％が溶液中に遊離したままである温度を意味する。Ｔｍは、例えば、式Ｔｍ＝２［Ａ＋Ｔ］＋４［Ｇ＋Ｃ］を用いて計算することができ、又は特にこの目的のために開発されたソフトウェアプログラムによって決定することができる。Ｔｍの計算は当技術分野内においてよく知られている。
【００４０】
「時間の関数としての標識強度の傾き」とは、時間の関数としての、標識強度のプロットである線の傾き、又は標識強度における変化を意味する。プローブがその特定の相補性鋳型にハイブリダイズするにつれて、標識強度は増加する。所与の時間にわたって、より多くのプローブが鋳型にハイブリダイズし、その結果として、時間経過に伴い蛍光（標識強度）の増加を生じる。このように、傾きは、時間経過に伴う強度、又は時間経過に伴う強度の変化として測定することができる。そのような傾きは、例えば、時間の関数として標識強度の一次導関数をとることによって、時間の関数として標識強度測定値をフィッティングする最小二乗法を計算することによって、又は時間の関数として標識強度データを以下の方程式：ｙ＝ｍｘ＋ｂ（式中、ｙは標識強度であり、ｘは時間であり、ｍは傾きである）にフィッティングすることによって計算することができる。当技術分野において知られた任意の適切な方法を用いて、傾きを決定することができる。さらに、標識核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション速度は、このようにして、時間の関数としての標識強度の傾きに基づいて計算することができる。
【００４１】
点（ｘ１，ｙ１）及び点（ｘ２，ｙ２）によって定義された線の傾きは、以下の式を用いて決定することができる：
【００４２】
【数１】
2011530296.tif 000003
【００４３】
式中、ｍは線の傾きであり、ｘ１≠ｘ２である。この等式は、当業者によっていくつもの方法で用いることができる。例えば、データに線をフィッティングさせることができ、その後、その等式を適用して、傾きｍを決定することができる。或いは、傾きｍを、いくつかの異なる点について計算し、その値の平均をとって傾きを決定することができる。いくつかの実施形態において、時間において連続するデータ点を用いて繰り返し、傾きを計算する。
【００４４】
「約」とは、示された値にその値の５パーセントを加えた、又は引いた値を意味する。
【００４５】
「ＰＣＲ」とは、試料由来であり得る標的；Ｔａｑポリメラーゼ又は他の熱安定性ポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ；標的に相補的な少なくとも１つのプライマー；標的の増幅部分に相補的なプローブ；デオキシヌクレオシド三リン酸；及び二価陽イオンを含む緩衝溶液を含む反応物の温度の連続的なサイクリングに基づいた反復標的核酸増幅反応を意味する。成分の適切な濃度は当技術分野においてよく知られており、公知の最適化パラメーターに従って調整してもよい。各サイクルは、典型的には、以下の３つのステップを含む：８５〜１００℃での変性、３７〜６０℃でのアニーリング、及び４０〜７５℃の伸長。各ステップは、時間の長さが１０〜３００秒間、好ましくは３０〜１２０秒間であってよい。ステップの正確な温度は、周知のパラメーターに従って標的の配列により変化し得る。例えば、アニーリング温度は、上記のように計算することができるプライマーのＴｍより約５℃低い温度であり得る。ＰＣＲステップの最適温度を計算するのに利用できる多数のソフトウェアプログラムがある。各サイクルは、以下の２つのステップを含むことができる：変性である第１ステップ、及びアニーリングステップと伸長ステップを一緒に組み合わせた第２ステップ。「ホットスタート」ポリメラーゼについて任意選択の最初の変性ステップが含まれていてもよい。さらに、最終の伸長ステップもまた、いかなる残存する一本鎖ＤＮＡ分子も完全に伸長していることを確実にするために含まれていてもよい。ＰＣＲを行うための特定のプロトコールは当技術分野においてよく知られており、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (April 2008, Print ISSN: 1934-3639; Online ISSN: 1934-3647)に見出すことができる。
【００４６】
ＰＣＲ反応サイクルは、初期、後期、及び最終期として特徴づけることができる。初期において、標的配列の倍加がほぼ１００％の効率で起こるので、指数関数的増幅が生じる。試薬が消耗されるにつれて、反応は後期に入り、効率は次第に低くなる。この段階は直線的段階と呼ばれることがあるが、反応は実際、試薬の有効性及びポリメラーゼの性能に依存して、この段階において高度のばらつきがある。最終期は、試薬及び酵素の消耗によってこれ以上標的配列は蓄積しないプラトーである。
【００４７】
定量的ＰＣＲ又はＱ−ＰＣＲとも呼ばれ、５’ヌクレアーゼＰＣＲアッセイとして最初に記載された「リアルタイムＰＣＲ」は、ＰＣＲ反応中、二重標識プローブの酵素的切断によって生じるシグナル（標識強度）を測定することを指す。標的配列に結合しているプローブの切断によって生じるシグナルは、反応物における標的配列の量に比例する。シグナルを既知の標準と比較することによって、試料中に存在する標的の量を決定することができる。
【００４８】
「エンドポイントＰＣＲ」は、典型的には、反応の後期又は最終期に標識強度を測定することを指す。試薬の完全消耗は必要とされない。試料中の標的は、リアルタイムＰＣＲと比較して、この方法を用いてはそれほど正確には定量化することができないが、標的は最大限に増幅されており、ＰＣＲ反応の最終期において、そのより多くの存在量によってその存在のロバストな検出を可能にする。
【００４９】
「非対称ＰＣＲ」は、標的核酸の一方の鎖を他方より多く優先的に増幅するために用いられるＰＣＲ技術を指す。一般的に、標的核酸の優先的増幅は、優先される核酸についての大過剰のプライマーを用いることによって達成される。特に、非対称ＰＣＴプロトコールは当技術分野においてよく知られている。
【００５０】
増幅された標的の特異的検出は、標識強度を測定する型又は時間に関係なく、依然として、全てのＰＣＲ反応についての限定的な特徴をなしている。
【００５１】
ＰＣＲは、任意の適切なサーマルサイクラー及び９６ウェル又は３８４ウェルプレートなどの型式で行うことができる。或いは、ＰＣＲ反応は、Smiths Detection社製のBIOSEEQ（商標）PLUS装置などの現場用装置で行ってもよい。
【００５２】
時間の関数としての標識強度の傾きは、例えば、コンピュータソフトウェア又はハードウェアを用いて自動的に計算することができる。いくつかの実施形態において、標識強度が検出され、この検出の出力がデータ操作のためにプロセッサーへ転送される。プロセッサーは、必要な計算を実行し、数値的、グラフ的、又は他の解釈可能な出力でそのデータをユーザーへ戻す。他の実施形態において、ユーザーは、シグナル強度データを得て、そのデータを手作業で操作する。データは、標準の数学的方法、又は２００７バージョンを含むMicrosoft社製のEXCELプログラムなどのコンピュータプログラムを用いて手作業で操作することができる。
【００５３】
一実施形態において、標識核酸プローブとその標的核酸とのハイブリダイゼーションは、少なくとも２つの異なる温度で標識強度を測定することによって検出される。一実施形態において、方法は、標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料と、標的核酸とハイブリダイズする標識核酸プローブとを接触させるステップと、第１の温度及び第２の温度で標識強度を測定するステップであって、第１の温度が第２の温度より低く、又はその逆であるステップとを含む。
【００５４】
比率は、高い方の温度での標識強度で割った低い方の温度での標識強度として計算される。したがって、その結果生じた数が高ければ高いほど、反応物に含有される標的の濃度は高い。比率の数の特定の値は、用いられることになっている計器の標識強度スケールを含むいくつかの因子に依存する。１より大きい比率は、標的の存在を示し得る。いくつかの実施形態において、約０．９、１．０、１．１、１．２、１．５、２、５、１０、２０、又は５０の比率は、標的核酸の存在を示す。比率はまた、存在する標的の量を計算するために用いることができる。そのような決定は、例えば、比率を標準と比較することによって行うことができる。標的核酸の存在を示す比率を決定することにおける別の態様は、アッセイのノイズと呼ぶことができる、標的核酸を含有しない反応物のベースライン比率を決定することである。標的核酸の存在を決定する比率は、例えば、ノイズより高い５以上の標準偏差であり得る。いくつかの実施形態において、標的核酸の存在を示す比率は、ノイズより高い２、４、６、８、１０、若しくは１５、又はそれ以上の標準偏差であり得る。用いられるプローブに依存して、量はまた、標準との比較を必要とすることなく、比率から直接計算することもできる。
【００５５】
標識強度が測定される温度は、特定の適用によって異なり得、適切な温度は、当業者によって容易に計算することができる。温度の選択は、プローブのＴｍ及び配列に依存する。具体的には、高い方の温度は、プローブのＴｍより高く、低い方の温度は、プローブのＴｍより低い。いくつかの実施形態において、高い方の温度は、少なくとも約９０℃であり、低い方の温度は約５０℃以下である。例えば、高い方の温度は、少なくとも９５℃、１００℃、１０５℃、又は１１０℃であり得、低い方の温度は、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、又は４５℃であり得る。
【００５６】
いくつかの実施形態において、強度は、２つより多い温度で測定される。例えば、強度測定を、第１、第２、及び第３の温度でとることができ、第１、第２、及び第３の温度のそれぞれは異なっている。全ての温度における類似した値は、特異的結合を示す。類似した値とは、違いが２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、又は１％以下の値を意味し得る。用いられる温度の数を増加させることによって、結果への信頼は増加し得る。
【００５７】
比率は、１つの時点又はいくつかの時点で計算することができる。例えば、ＰＣＲ反応後、標識強度を測定して、ＰＣＲ反応の対象である標的核酸の存在を決定することができる。標識強度はまた、ＰＣＲ反応を実行する前に測定することもできる。それゆえに、標的核酸の存在を示す比率によって、不必要なＰＣＲを避けることが可能になり得る。
【００５８】
比率は、高い方の温度及び低い方の温度のそれぞれにおける単一の読取りに基づいて計算することができる。別法では、低い方の温度又は高い方の温度において複数回の読取りを行い、その値を平均することができる。そのような平均を用いて、正しくない読取りによって引き起こされる誤差を避けることができる。
【００５９】
一実施形態において、標識核酸プローブとその標的核酸とのハイブリダイゼーションは、時間の関数としての標識強度の傾きを測定することによって検出することができる。標的を含有する試料中の標的の量はＰＣＲによって時間経過に伴い増加するため、時間経過に伴ってより多くのプローブが標的とハイブリダイズする。したがって、時間の関数としての標識強度は、試料における標的の存在を決定するために用いることができる。さらに、時間の関数としての標識強度は、プローブ／標的相互作用のハイブリダイゼーション速度を決定するために用いることができる。
【００６０】
一実施形態において、方法は、標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料と、標的核酸とハイブリダイズする標識核酸プローブとを接触させるステップ、及び異なる時点で標識強度を測定するステップを含む。時間の関数の標識強度の傾きは、標的核酸の存在、及びプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションの速度の両方を示す。具体的には、標的にハイブリダイズしたときにプローブの標識強度が増加する場合、正の傾きは、標的核酸の存在を示し、プローブがハイブリダイズする標的がないときにプローブの標識強度が減少する場合、負又はゼロの傾きは、標的核酸の非存在を示す。同様に、傾きはまた、周知の速度方程式を用いてハイブリダイゼーションの速度を決定するために用いることができる。
【００６１】
時間の関数としての標識強度の傾きは、当業者に容易に知られたいくつもの方法で計算することができる。例えば、標識強度データを、公知の数値的方法を用いて線にフィッティングすることができる。これらの方法として、最小二乗フィッティング（線形及び非線形の両方）、線形回帰（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）、最良フィット指数曲線、二次回帰、三次回帰、及び多項式回帰が挙げられる。標識強度の傾きは、データへの線フィットの一次導関数を見出すことによって、分析的又は数値的に計算することができる。そのような数学的計算は、当業者に周知である。
【００６２】
標識強度は、等温条件下で、又は異なる温度で測定することができる。一実施形態において、全ての標識強度測定は、単一の温度で行われる。別の実施形態において、標識強度測定は、異なる温度で行われる。この状況は、ＰＣＲ反応混合物の冷却中又は加熱中に起こり得る。さらに別の例において、標識強度は、異なる温度での測定であり得る。このデータに基づいて、異なる傾きを計算することができる。例えば、複数のデータ点を第１の温度、Ｔ１で取り、続いて、第２の温度、Ｔ２で複数のデータ点を取ることができる。このデータに基づいて、１つがＴ１データに対応し、１つがＴ２データに対応する、２つの異なる傾きを計算することができる。標識強度が測定される温度を変化させることによって、ハイブリダイゼーションの速度を研究することができる。
【００６３】
強度測定は任意の時間に行うことができる。測定は、ＰＣＲ後に行うことができ、又はＰＣＲ中に行うことができる。いくつかの実施形態において、測定は、ＰＣＲ後１０分以内に行われる。測定はまた、ＰＣＲ後５分以内、４分以内、３分以内、２分以内、又は１分以内に行うことができる。一実施形態において、測定は、約１５秒目、３０秒目、及び４５秒目に行われる。測定と測定の間の時間は変えることができる。例えば、測定は、少なくとも約１０秒間、約１５秒間、又は約２０秒間、離すことができる。測定はまた、いくらかの時間にわたり急速に連続して行うことができる。
【００６４】
強度測定の回数もまた変えることができる。一般的に、データ点の数を増加させることは、線の傾きへの信頼性を増加させることができる。しかし、わずか２つのデータ点を用いて傾きを決定することができる。いくつかの実施形態において、傾きを決定するために２つ、３つ、又は４つのデータ点が用いられる。
［実施例］
【実施例１】
【００６５】
２つの温度において標識強度を測定することによる偽陽性の低減
２つの温度における標識強度を用いて、標的核酸の存在を、偽陽性を最小限にしながら、正確に検出することができるかどうかを決定するためにＰＣＲ反応を行った。それぞれ２５μＬであったＰＣＲ反応物は、下の表１に記載されており、用いられたプライマー配列は表２に記載されている。
【００６６】
【表１】
2011530296.tif 000004
【００６７】
【表２】
2011530296.tif 000005
【００６８】
以下の量の合成バチルス・グロビジ（ＢＧ，bacillus globigii）鋳型を含有する４セットの２連反応物を設定した：０個、６０個、６０００個、又は６００，０００個のゲノムコピー等価物。反応物を、８５℃〜９５℃から５０℃〜７０℃へ５５回のサイクルにかけた。その後、反応物を、ビーコンのＴｍより低い、すなわち、４０℃〜６０℃まで低下させた。蛍光読取りを１５秒間ごとに約５分間、行った。その後、反応物を８０℃〜９５℃まで加熱し、５回の１５秒間ごとの読取りを行った。８０℃〜９５℃での蛍光で割った４０℃〜６０℃での蛍光の比率は、下の表３に示されている。
【００６９】
【表３】
2011530296.tif 000006
【００７０】
上記のように、１より低い蛍光比率は、反応物に標的核酸が含まれてなかったことを示し、１より高い蛍光比率は、標的核酸が含まれていたことを示す。このように、結果は、少なくともわずか６０コピーのペストを、本明細書に記載された比率を用いて確実に検出することができることを実証している。
【実施例２】
【００７１】
時間経過に従って標識強度を測定することによる偽陽性の低減
時間の関数としての標識強度を用いて標的核酸の存在を決定することができるかどうかを決定するためにＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応を、上の実施例１に記載されているように行った。
【００７２】
ビーコンＴｍより高い蛍光値で割った、ビーコンＴｍより低い蛍光値の比率を計算した。図１及び下記の表４は、ＰＣＲ反応物についての計算された比率を示す。正の比率は、鋳型を含有する試料においてのみ見出され、負の比率は陰性対照について見出された。
【００７３】
【表４】
2011530296.tif 000007
【００７４】
標識強度をまた、ＢＧ鋳型を含有する、又は含有しない粉末試料を用いて測定した。具体的には、６個の白色粉末試料を、Training Assay消耗品を用いてSmiths Detection社製のBioseeq PLUS機器で実行した。１個の試料は陰性粉末を受け（図２において−と表示された試料）、残りの５個の試料は陽性ＢＧ粉末を受けた（図２において＋と表示された試料）。試料を、８５℃〜９５℃から５０℃〜７０℃へ５５回のサイクルにかけた。その後、反応温度を、ビーコンのＴｍより低い、すなわち、４０℃〜６０℃まで低下させ、蛍光読取りを１５秒間ごとに約１０分間、行った。３分目から１０分目までに行った蛍光読取りを散布図上にプロットし、線形回帰を用いてデータをフィッティングすることによって傾きを計算した。この傾きの値は図２に示されている。
【００７５】
この実施例は、時間経過に従って標識強度を測定することが、標的配列が存在するかどうかを決定するために効果的に用いることができることを実証している。偽陽性は見られなかった。
【実施例３】
【００７６】
炭疽菌pX01アッセイに関する、時間経過に従い、且つ異なる温度で標識強度を測定することによる偽陽性の低減
２つの温度における異なる２時点での標識強度を用いて、標的核酸の存在を、偽陽性を最小限にしながら正確に検出することができるかどうかを決定するためにＰＣＲ反応を行った。それぞれ２５μＬであったＰＣＲ反応物は、上の表１に記載されており、用いられたプライマー配列は下の表５に記載されている。
【００７７】
【表５】
2011530296.tif 000008
【００７８】
図２は測定の結果を示す。具体的には、標的比率のカラムにおける値は、比率における傾きを示し、正（ＰＯＳ）のコールと負（ＮＥＧ）のコールとの間に見られる差の例である。炭疽菌鋳型（モジュール１、２、及び３）を含有しない３個の試料はＮＥＧコールを示した。約６０，０００個の炭疽菌ゲノムコピー等価物（モジュール４、５、及び６）を含有する３個の試料はＰＯＳコールを示した。ＮＥＧコールは負の傾きを示し、一方ＰＯＳコールは正の傾きを示す。EXCELにおける傾き関数を用い、上記のプロットに示された２番目及び４番目のデータ点を用いて傾きを計算し、その関数はｂ＝Ｓｕｍ（（ｘ−Ａｖｇ（ｘ））＊（ｙ−Ａｖｇ（ｙ）））／Ｓｕｍ（（ｘ−Ａｖｇ（ｘ））＾２）であり、式中ｘは、ｘ座標を含む傾きにおけるフィールドであり、ｙはｙ座標を含む傾きにおけるフィールドである。結果は、２つの温度における異なる２時点での標識強度を用いて、標的核酸の存在を、偽陽性を最小限にしながら正確に検出することができることを実証している。
【実施例４】
【００７９】
野兎病アッセイに関する、時間経過に従い、且つ異なる温度で標識強度を測定することによる偽陽性の低減
２つの温度における異なる２時点での標識強度を用いて、標的核酸の存在を、偽陽性を最小限にしながら正確に検出することができるかどうかを決定するためにＰＣＲ反応を行った。それぞれ２５μＬであったＰＣＲ反応物は、下の表１に記載されており、用いられたプライマー配列は表６に記載されている。
【００８０】
【表６】
2011530296.tif 000009
【００８１】
図３は測定の結果を示す。具体的には、標的比率のカラムにおける値は、比率における傾きを示し、正（ＰＯＳ）のコールと負（ＮＥＧ）のコールとの間に見られる差の例である。野兎病鋳型（モジュール１、２、及び３）を含有しない３個の試料はＮＥＧコールを示した。約６０，０００個の野兎病ゲノムコピー等価物（モジュール４、５、及び６）を含有する３個の試料はＰＯＳコールを示した。３つのＮＥＧコールのうちの２つは、負の傾きを示すが、３つ目のＮＥＧコールは、ＰＯＳコールに用いられる閾値（この場合、０．００２であった）より低い弱い正の傾きを示す。これはアッセイのバックグラウンドノイズの実例である。ＰＯＳコールは正の傾きを示す。EXCELにおける傾き関数を用い、上記のプロットに示された２番目及び４番目のデータ点を用いて傾きを計算し、その関数はｂ＝Ｓｕｍ（（ｘ−Ａｖｇ（ｘ））＊（ｙ−Ａｖｇ（ｙ）））／Ｓｕｍ（（ｘ−Ａｖｇ（ｘ））＾２）であり、式中ｘは、ｘ座標を含む傾きにおけるフィールドであり、ｙはｙ座標を含む傾きにおけるフィールドである。結果は、２つの温度における異なる２時点での標識強度を用いて、標的核酸の存在を、偽陽性を最小限にしながら正確に検出することができることを実証している。
【図１】
2011530296.tif 000011
【図２】
2011530296.tif 000012
【図３】
2011530296.tif 000013
【図４】
2011530296.tif 000014
【配列表】
2011530296000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成23年3月29日(2011.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識核酸プローブとその標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出するための方法であって、
（ａ）標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料と、前記標的核酸とハイブリダイズする標識核酸プローブとを接触させるステップと、
（ｂ）第１の温度及び第２の温度で標識強度を測定するステップであって、前記第１の温度が前記第２の温度より低いステップと、
（ｃ）（ｉ）前記第１の温度における標識強度の、（ii）前記第２の温度における標識強度に対する比率を計算するステップであって、０．８以上の比率が前記標的核酸の存在を示すステップと
を含む方法。
【請求項２】
０．９以上の比率が標的核酸の存在を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の温度が標識核酸プローブのＴｍより低く、第２の温度が前記標識核酸プローブのＴｍより高い、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第２の温度が、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、又は約９５℃である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
第１の温度が、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、又は約７２℃である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
第１の温度が約５０℃であり、第２の温度が約９５℃である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
標識核酸プローブが蛍光標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
クエンチャー分子と蛍光標識が近接している場合に、前記蛍光標識の蛍光発光が検出できないか、又はクエンチャー分子と蛍光標識が近接していない場合よりも、前記蛍光標識の蛍光発光が少なくとも低く検出されるように、標識核酸プローブが、前記蛍光標識の前記発光を吸収する前記クエンチャー分子をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標識核酸プローブが分子ビーコン又は直鎖状プローブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）及び（ｃ）が少なくとも２回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
平均比率が繰り返される測定に基づいて計算される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
測定がＰＣＲ反応後に行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＣＲ反応が、
ｉ）適切なプライマー、酵素、及び基質を含む溶液において、標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料を標識核酸プローブと接触させて反応混合物を形成するステップと、
ii）前記反応混合物を、前記標的核酸の増幅に適した変性温度、アニーリング温度、及び伸長温度のサイクルにかけるステップと
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
標識核酸プローブとその標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出するための方法であって、
（ａ）標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料と、前記標的核酸とハイブリダイズする標識核酸プローブとを接触させるステップと、
（ｂ）異なる少なくとも２時点において標識強度を測定するステップと、
（ｃ）時間の関数としての前記標識強度の傾きを計算するステップと
を含む方法。
【請求項１７】
標的核酸に結合しているときの標識核酸プローブによって生じるシグナルの強度が、前記標的核酸に結合していないときの前記標識核酸プローブによって生じるシグナルの強度と比較して大きい場合、正の傾きが前記標的核酸の存在を示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
標的核酸がＤＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
標的核酸がＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
標識核酸プローブが、蛍光標識された核酸プローブである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
標識核酸プローブが分子ビーコン又は直鎖状プローブである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
測定ステップが等温条件の間に行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
測定ステップがＰＣＲ反応後に行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
測定ステップが、ＰＣＲ反応の完了後約１分〜約１０分間の時間内に完了する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＰＣＲ反応が、
（ｉ）適切なプライマー、酵素、基質、及び緩衝剤を含む溶液において、標的核酸を含有するのではないかと疑われる試料を標識核酸プローブと接触させて反応混合物を形成するステップと、
（ii）前記反応混合物を、前記標的核酸の増幅に適した変性温度、アニーリング温度、及び伸長温度のサイクルにかけるステップと
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
傾きが、時間の関数として標識強度の一次導関数をとることによって計算される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
時間の関数としての標識強度が、時間の関数として標識強度測定値をフィッティングする最小二乗法によって計算される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
傾きが、時間の関数として標識強度データを以下の方程式にフィッティングすることによって計算される、請求項１６に記載の方法：
ｙ＝ｍｘ＋ｂ
（式中、ｙは標識強度であり、ｘは時間であり、ｍは傾きである。）
【請求項２９】
線の傾きが以下の式を用いて計算される、請求項１６に記載の方法：
【数１】
2011530296.tif 000015
（式中、ｍは線の傾きであり、（ｘ１，ｙ１）及び（ｘ２，ｙ２）は異なる少なくとも２時点であり、ｘ１≠ｘ２である。）
【請求項３０】
標識強度の傾きに基づいた標識核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション速度を時間の関数として計算するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
それぞれが異なる標的核酸とハイブリダイズする少なくとも２つの標識核酸プローブがあり、各プローブが異なる温度でハイブリダイズする、請求項１６に記載の方法。
【国際調査報告】
2011530296.tif 000016
2011530296.tif 000017
2011530296.tif 000018
2011530296.tif 000019