(57)【要約】  本発明は、がんを予防及び又は治療するためのＧＰＶＩ阻害剤、そしてまた、がんを予防及び／又は治療する薬剤の製造におけるこのようなＧＰＶＩ阻害剤の使用を提供する。本発明のさらなる側面は、ＧＰＶＩ阻害剤を含む薬学的製剤であり、これはがん、好ましくは皮膚がん、より好ましくは黒色腫、そして最も好ましくは悪性皮膚黒色腫の治療に適している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを予防及び／又は治療する薬剤を製造するためのＧＰＶＩ阻害剤の使用。
【請求項２】
がんを予防及び／又は治療するためのＧＰＶＩ阻害剤。
【請求項３】
ＧＰＶＩがヒトＧＰＶＩである、請求項１に記載の使用又は請求項２に記載のがんを予防及び／又は治療するための阻害剤。
【請求項４】
がんタイプが皮膚がんである、請求項１又は３に記載の使用又は請求項２又は３に記載のがんを予防及び／又は治療するための阻害剤。
【請求項５】
がんタイプが黒色腫である、請求項１、３及び４のいずれか１項に記載の使用又は請求項２〜４のいずれか１項に記載のがんを予防及び／又は治療するための阻害剤
【請求項６】
がんタイプが悪性皮膚黒色腫である、請求項１及び３〜５のいずれか１項に記載の使用又は請求項２〜５のいずれか１項に記載のがんを予防及び／又は治療するための阻害剤。
【請求項７】
ＧＰＶＩ阻害剤が抗体である、請求項１及び３〜６のいずれか１項に記載の使用又は請求項２〜６のいずれか１項に記載のがんを予防及び／又は治療するための阻害剤。
【請求項８】
ＧＰＶＩ阻害剤がモノクローナル抗体ＪＡＱ１である、請求項１及び３〜７のいずれか１項に記載の使用又は請求項２〜７のいずれか１項に記載のがんを予防及び／又は治療するための阻害剤。
【請求項９】
ＧＰＶＩ阻害剤が小分子である、請求項１及び３〜６のいずれか１項に記載の使用又は請求項２〜６のいずれか１項に記載のがんを予防及び／又は処置するための阻害剤。
【請求項１０】
がんの治療において、同時に、別々に、又は逐次的に使用する薬学的製剤を製造するための１つ又はそれ以上の単離されたＧＰＶＩ阻害剤を含む組成物の使用
【請求項１１】
皮膚がんの治療において、同時に、別々に、又は逐次的に使用する配合薬学的製剤を製造するための１つ又はそれ以上の単離されたＧＰＶＩ阻害剤を含む組成物の使用。
【請求項１２】
がんの治療において、同時に、別々に、又は逐次的に使用するための１つ又はそれ以上の単離されたＧＰＶＩ阻害剤、及びＧＰＶＩの阻害剤ではない少なくとも１つのさらなる治療化合物を含む、組成物。
【請求項１３】
皮膚がんの治療において、同時に、別々に、又は逐次的に使用するための１つ又はそれ以上の単離されたＧＰＶＩ阻害剤、及びＧＰＶＩの阻害剤ではない少なくとも１つのさらなる治療化合物を含む、配合組成物。
【請求項１４】
ａ）潜在的ＧＰＶＩ阻害剤の適切な量を哺乳動物の多血小板血漿に添加する工程、
ｂ）場合により、工程（ａ）の多血小板血漿を潜在的ＧＰＶＩ阻害剤と共にインキュベートする工程、
ｃ）コラーゲン関連ペプチド又はコンブルキシン又はコラーゲンを添加してＧＰＶＩ仲介シグナル伝達によって血小板凝集を誘導することによって血小板の凝集を開始させる工程、
ｄ）工程（ｃ）で測定されるような凝集を、工程（ａ）の潜在的ＧＰＶＩ阻害剤を添加することなくコラーゲン関連ペプチド又はコンブルキシン又はコラーゲンを多血小板血漿に加えたときに得た凝集と比較する工程：
を含むＧＰＶＩの阻害剤の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
がんは、依然として医学にとって代表的な主要課題の１つである。
【背景技術】
【０００２】
近年にかけて、多くの研究により特異的なタイプのがんについて特異的療法の選択肢が得られた。特異的療法で治療される特異的な悪性腫瘍の例は、ヘルセプチン(R)によって治療される乳がん、そして他の変種については、例えば、アバスチン(R)で治療される進行した直腸又は肺がん、エルビタックス(R)による進行した直腸がん若しくは頭頚部がん、マブキャンパス(R)（MabCampath）による慢性リンパ性白血病又はゼバリン(R)で治療される濾胞性非ホジキンリンパ腫である。しかし、これらの特異的療法は、いずれも従来の化学療法又は外科的介入と完全に置き換えることはできなかった。実際、ほとんどの新しい治療は、それ自体では効果が不十分であるため、共投薬（co-medication）として化学療法が必要である。一方、化学療法は、重度の、そしておそらく深刻な副作用の負担をもたらすことが不可避である。要するに、がんの治療選択肢は、なお制限されており、たとえ入手可能であっても、心臓血管疾患のような他の生命にかかわる疾患の標準的治療と比較して実質的にあまり許容されていない。
【０００３】
がんを治療する治療選択肢の選択は、制限されており、そして有害な副作用と関連しているが、いくつかの非常に攻撃的な悪性腫瘍については、疾患の進行が非常に速いため、多くの場合、診断が遅すぎて、従来の治療をすぐに開始しても妥当な利益を期待することができない。
【０００４】
これらの攻撃的変種の１つは、悪性皮膚黒色腫、皮膚がんである。このような黒色腫の発現については、いくつかの危険因子が同定されている。遺伝的素因に加えて、肌の色合い及び髪の色が役割を果たしている。最も多く影響を受けるのは、色白の、すなわち光に敏感なタイプの皮膚を有する人である。特に危険なのは、赤味がかった髪の色の遺伝子である。これらの素因を有する人々の危険性の比較では、肌の色が黒い人が皮膚がんを発症する危険性は、ちょうど１０％である。このタイプのがんの進行は、速いだけでなく、また、発症した患者数がかなりにのぼることである。ドイツでは、毎年、約１５．０００件の新しい症例があり、その結果、約２．０００人の患者が死亡している。これは、他の皮膚腫瘍によって生じるすべての致死率よりもかなり多く、そして現在、黒色腫による死亡率は、他のすべてのがんのものよりも急激に高まっている。きわめて早期の段階で診断されると、原発腫瘍を外科的に完全に除去することによる長期的治癒の可能性は、なお高い。しかしながら、他の悪性腫瘍と対照的に、黒色腫は、疾患が診断された時点で、典型的には転移によってすでに体中に広範囲に広がっている。その場合、外科的除去はもはや不可能であり、これまでのところまだ不十分であるが有効な唯一の治療戦略として放射線−又は全身性の化学療法が残されている。他の型の皮膚がんとの比較だけでなく一般にがんの他の変種との比較の両方において、この高い侵襲性及び転移のため、悪性黒色腫は極めて有毒である。他の悪性腫瘍が進行した状態での転移は、疾患の将来的な経過にとって同様に壊滅的である。従って、循環血中に黒色腫又は他のがん細胞が検出されたそれらの患者では、予後はより悪い。いったん複数の器官が発症したら、現在の治療介入による成功の機会は、実質的に低下する。がんのタイプ及び時点にかかわりなく、特異的な腫瘍により転移が起こるとき、悪性細胞は、典型的に血管系を介して広がる。
【０００５】
血小板は、止血及び血栓症の過程において重要な役割を果たしている。
血小板は、病変によって露出された内皮下コラーゲンとの相互作用のため、病変部位で停止し、そして活性化される。コラーゲンと血小板との間の相互作用は、本質的に３つの受容体が介在している：１）主な役割がコラーゲンへの血小板の粘着であるα２β１インテグリン受容体、２）フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）を介して間接的にコラーゲン受容体に結合するＧＰＩｂ−Ｖ〜ＩＸ、及び３）コラーゲンに結合して血小板を活性化するシグナル伝達受容体、ＧＰＶＩ。ＧＰＶＩは、免疫受容体ファミリーのメンバーであり、そして血小板においてＦｃ受容体ガンマ鎖（FcRgamma）で同時発現される。ＧＰＶＩへのリガンド−結合により、血小板が活性化され、それによって血小板凝集に至る（非特許文献１）。まとめると、α２β１及びＧＰＩｂ−Ｖ〜ＩＸ受容体と同様にＧＰＶＩは、主に心臓血管又は他の疾患から生じる動脈血栓症の予防のための有望な標的としてみなされている（非特許文献２）。ＧＰＶＩは、単一治療によりＧＰＶＩの長期喪失又は阻害を生じることができるため最も有望な治療標的であった（非特許文献３）。
【０００６】
血小板とコラーゲンとの相互作用は、止血及び血栓症の過程で重要な役割を果たしており、これらの３つのコラーゲン受容体を阻害すると抗血栓効果を生じることは、あまり驚くべきことではなかった。血栓症及び止血のための血小板の機能に加えて、それらは、最近、がん成長及び転移における重要な役割が確認された。コラーゲン−受容体阻害の類似の抗血栓効果のため、がん成長及び転移について前記受容体阻害の類似の結果が期待される。α２β１インテグリン受容体を阻止する抗体の投与は、がん細胞の血管外遊出を支持し、すなわち、がん細胞の数を増加させ、これは血流を放置することがあり、そして結果的に、この阻止は、形成された腫瘍の数を増加させる（非特許文献４）。同様に、肺中のＢ１６黒色腫の転移巣の数は、野生型マウスと比較してＶＷＦ−ノックアウトマウスではより多く、効果は、ＶＷＦを有するマウスと置き換えることによって逆転させることができる（非特許文献５）。従って、ＧＰＶＩの阻害は、がん促進効果を有することも期待される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Varga-Szabo D. et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2008, Vol. 28(3), 403-412
【非特許文献２】Clemetson K.J. et al., 2007, Curr. Pharm. Des., vol. 13(26), 2673-2683
【非特許文献３】Nieswandt B. et al., J. Exp. Med. 2001, Vol. 193(4): 459-469
【非特許文献４】Hangan D. et al., Cancer Res. 1996, Vol. 1,56(13), 3142-3149
【非特許文献５】Terraube V. et al., J. Thromb. Haemost. 2006, Vol. 4(3), 519-526
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
さて、驚くべきことに、ここでまとめたデータは、反対のことを示している：ＧＰＶＩの阻害は、がん細胞の成長を劇的に低下させるだけでなく、個々のがん細胞の転移をも減らす。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の意味における「ＧＰＶＩの阻害」とは、以下：例えばアゴニストの結合を阻止することによる、又はリガンドによってＧＰＶＩ活性化を阻止することによる、又は細胞若しくは細胞フラグメントの表面におけるＧＰＶＩの不活化若しくは可逆性若しくは不可逆性の枯渇（depletion）によるＧＰＶＩの正常な機能のなんらかの阻止を意味する。
【００１０】
本発明の意味における「ＧＰＶＩの阻害剤」とは、以下：哺乳動物に投与したときに上記定義された「ＧＰＶＩの阻害」を生じるあらゆる化合物を意味する。
【００１１】
ＧＰＶＩの阻害は、抗ＧＰＶＩ自己抗体から生じる後天性ＧＰＶＩ欠損若しくはＧＰＶＩを発現しない遺伝的な先天性欠損のような機構の大きな変化から生じることがあり、又は不完全な細胞内シグナル伝達を伴う機能不全形態及び外部ドメイン脱粒を生じる内因性血小板メタロプロテイナーゼの活性化により発現される（Arthur J.F. et al., Br. J. Haematol. 2007, Vol. 139(3), 363-372）。
【００１２】
本発明のＧＰＶＩ阻害剤の有効成分は、小さな化学物質、ペプチド、ポリペプチド又はモノクローナル若しくはポリクローナル抗体であってもよい。ＧＰＶＩの阻害剤の非限定的な例は、以下のように分類することができる：
□ＧＰＶＩに結合したときに細胞表面からのＧＰＶＩの枯渇を生じるＧＰＶＩに対するリガンド、例えば
○抗体及びそのフラグメント、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ又はＧＰＶＩに対する二重特異性抗体結合、例えば
・ＪＡＱ１（ＥＰ２００１０１０１４０６）
・Ｆ１２３２−１０−２、Ｆ−１２３２−２１−１、Ｆ−１２３２−７−１、
Ｆ−１２３２−１９−１、Ｆ−１２３２−３７−２、Ｆ−１２３２−１８、Ｆ−１２３２−１７−１、Ｆ−１２３２−１８−３、Ｆ−１２３２−１４−２、Ｆ−１２３２−２４−１、Ｆ−１２０１−２０、Ｆ−１２３２−４３−３、Ｆ−１２０１−１８、Ｆ１１９９−６、Ｆ１２３２−３７−２、ＹＡ−Ａｂｓ−８８、ＹＡ−Ａｂｓ−０３、Ｆ−１２４９−１８−２、Ｆ−１２４５−７−１、Ｆ−１２４６−１−１、Ｆ−１２４９−５−１、Ｆ−１２４９−２０−１、Ｆ−１２４９−２４−１、Ｆ−１２４９−３０−１、Ｆ−１２４５−５−１、Ｆ−１２４６−６−２、Ｆ−１２４９−３−２、Ｆ−１２４５−４−１、Ｆ−１２４９−２２−１、Ｆ−１２５１−１−１、Ｆ−１２５７−３−１、Ｆ−１２３２−３７−２、Ｆ  １２３９−６−１（ＷＯ／２００６／１１８３５０）
・Ｆ１２３９−１−３、Ｆ１２３９−２−３、Ｆ１２３９−４−２、Ｆ１２３９−５−３、Ｆ１２３９−７−１、Ｆ１２３９−８−１、Ｆ１２３９−８−１、Ｆ１２３９−１０−２、Ｆ１２３９−１１−１、Ｆ１２３９−１５−３、Ｆ１２３９−１６−３、Ｆ１２３９−１７−２、Ｆ１２３９−１８−１、Ｆ１２３９−１９−１、Ｆ１２３９−２２−２、Ｆ１２３９−２２−３、Ｆ１２３９−２３−１（ＷＯ／２００７／１１６７７９）
・ｈＧＰ５Ｃ４（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１３７７９）
・１０Ｂ１２、１６Ｅ１２、１Ｃ３、８Ａ１、４Ｈ９、４Ｄ５（ＷＯ／２００３／０５４０２０）
・８Ｍ１４.３、３Ｆ８.１、９Ｅ１８.３、３Ｊ２４.２、６Ｅ１２.３、１Ｐ１０.２、４Ｌ７.３、７Ｈ４.６、９０１２．２（ＷＯ２００１／０００８１０）
□ＧＰＶＩのタンパク質分解不活化を生じるＧＰＶＩに対するリガンド、例えば
○メタロプロテイナーゼの活性化（Bergmeier W. et al., Thromb. Haemost. 2004. Vol. 91(5): 951-958.
□ＧＰＶＩの機能を阻害するが、以下を阻止することによって細胞表面からＧＰＶＩの枯渇を生じないリガンド
○リガンド受容体認識及び／又は
○細胞外マトリックスとの相互作用及び／又は
○ＧＰＶＩ又はそのフラグメントによって、例えば、コラーゲンのＧＰＶＩ結合部位を遮蔽することによるコラーゲンとの相互作用（ＷＯ／２００１／１６３２１、ＷＯ／２００６／１３１５１２、ＷＯ／２００３／００８４５４、ＷＯ／２００１／０００８１０、ＷＯ／２０００／０６８３７７、ＷＯ／２０００／６８３７７）及び／又は
○血小板細胞相互作用
□例えば活性化されたＧＰＶＩによって誘発されるシグナル伝達カスケードの阻害によって、上記詳述した機構と独立したＧＰＶＩ機能を低下させるリガンド、
○例えばＳｙｋキナーゼ、ｃ−Ｓｒｃ、プロテインキナーゼＣ、ホスホリパーゼＣγ２、Ｆｃ受容体γのような細胞内シグナル伝達経路に含まれるタンパク質のリン酸化を阻止することによって。
【００１３】
本発明のＧＰＶＩの阻害剤は、慣用の化学合成によって又はモノクローナル若しくはポリクローナル抗体若しくは抗体のフラグメントの場合、当分野でよく知られている組換え法によって製造することができる（例えば、Benny K.C. Lo, “Antibody engineering, methods and protocols, Humana press, 2003参照）。また、ポリクローナル抗体は、ＧＰＶＩ又はＧＰＶＩのフラグメントで免疫化することによって動物中で増やし、続いて精製することができる。
【００１４】
本発明のＧＰＶＩの阻害剤は、８０％を超える純度、より好ましくは９５％を超える純度に精製することが好ましく、そして例えばＧＰＶＩ阻害剤が、汚染巨大分子、特に他のタンパク質及び核酸からのペプチド又はポリペプチドである場合、汚染分子に対して９９．９％を超える純度であり、そして感染性因子及び発熱性物質を含まない薬学的に純粋な状態が特に好ましい。好ましくは、本発明のＧＰＶＩの単離又は精製された阻害剤は、他のポリペプチドを実質的に含まない。
【００１５】
本発明は、がんの予防及び又は治療のための本明細書に記載されたＧＰＶＩの阻害剤並びにまたがんを予防及び／又は治療する薬剤の製造におけるこのようなＧＰＶＩ阻害剤の使用を提供する。従って、本発明の別の態様によれば、がん、好ましくは皮膚がん、より好ましくは黒色腫、そして最も好ましくは悪性皮膚黒色腫の治療に適しているこの阻害剤を含む薬学的製剤が提供される。
【００１６】
本発明に記載された阻害剤は、治療上の使用のため薬学的製剤に処方することができる。精製されたタンパク質を慣用の生理学的に適合しうる水性緩衝液中に溶解してもよく、これに、場合により、医薬賦形剤を加えて薬学的製剤を得ることができる。
【００１７】
このような薬剤担体及び賦形剤の他に適切な薬学的製剤は、当分野でよく知られている（例えば、“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins”, Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000)又は“Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)参照）。特に、本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物は、凍結乾燥された又は安定な可溶性の形態で処方してもよい。ポリペプチドは、当分野で知られているさまざまな手法によって凍結乾燥してもよい。凍結乾燥された製剤は、注射用蒸留水又は滅菌生理食塩水のような１つ又はそれ以上の薬学的に許容しうる希釈剤の添加によって使用前に再構成される。
【００１８】
組成物の製剤は、いずれかの薬学的に適切な投与手段によって個体に送達される。種々の送達系が知られており、そしていずれか都合のよい経路によって組成物を投与するために用いることができる。本発明の組成物は、全身的に投与するのが好適である。全身的使用では、本発明の治療タンパク質を慣用の方法に従って非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、大脳内、肺内、鼻腔内又は経皮的）又は経腸的（例えば、経口、膣又は直腸）送達用に処方する。ポリペプチドに基づくＧＰＶＩの阻害剤について、最も好適な投与経路は、静脈内投与である。製剤は、注入によって又はボーラス注射によって連続的に投与することができる。いくつかの製剤は、遅延放出系を包含する。
【００１９】
小分子に基づくＧＰＶＩの阻害剤については、経口投与が最も好ましい投与方式である。経口投与のための錠剤及びカプセル剤としては、慣用の賦形剤、例えば結合剤、増量剤、滑沢剤及び湿潤剤、などが含まれうる。経口液体製剤は、水性若しくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤又は同種のものの形態のあってもよく、又は使用する際、水若しくは他の適切なビヒクルと再構成するための乾燥産物として存在してもよい。このような液体製剤は、慣用の添加剤、例えば懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル及び保存剤を含んでもよい。
【００２０】
局所適用に適した製剤は、水性若しくは油性の懸濁剤、液剤、乳剤、ゲル剤又は、好ましくは乳剤性軟膏の形態であってもよい。スプレー適用に有用な製剤は、噴霧液又は乾燥粉末の形態であってもよい。
【００２１】
本発明のＧＰＶＩの阻害剤は、治療上有効な用量で患者に投与され、耐えられない有害な副作用を生じる用量に達することなく、治療する状態又は適応症の重症度又は拡散を予防する又は弱める所望の効果を生じるのに十分な用量を意味する。正確な用量は、例えば適応症、製剤、及び投与方式のような多数の要因に左右され、そしてそれぞれ個々の適応症について前臨床及び臨床試験で決定しなければならない。
【００２２】
本発明の薬学的組成物は、単独で又は他の治療剤と共に投与してもよい。これらの薬剤は、同じ薬剤の一部として組み込んでもよい。
【００２３】
本発明の別の態様は、がんの治療、好適には皮膚がんの治療、さらにより好適には黒色腫の治療において同時に、別々に又は逐次的に使用する薬学的製剤を製造するための１つ又はそれ以上の単離されたＧＰＶＩ阻害剤を含む組成物の使用である。
【００２４】
また、本発明のさらに別の態様は、ＧＰＶＩのシグナル伝達カスケード下流の成分を阻害するための実施例３に記載された方法によって同定可能な阻害剤の使用である。
【００２５】
本発明の別の実施態様は、ＧＰＶＩの阻害剤を同定する方法は、以下の工程を含む：
ａ）潜在的ＧＰＶＩ阻害剤の適切な量を哺乳動物、好ましくは、ヒト又はマウスのような標準実験室動物種から得た多血小板血漿に添加する工程、
ｂ）場合により、工程（ａ）の多血小板血漿を潜在的ＧＰＶＩ阻害剤と共にインキュベートする工程、
ｃ）コラーゲン関連ペプチド又はコンブルキシン又はあまり特異的でないコラーゲンを添加してＧＰＶＩ仲介シグナル伝達によって血小板凝集を誘導することによって血小板の凝集を開始させる工程、
ｄ）工程（ｃ）で測定されるような凝集を、工程（ａ）の潜在的阻害剤を添加することなくコラーゲン関連ペプチド又はコンブルキシン又はあまり特異的でないコラーゲンを多血小板血漿に加えた時に得られた凝集と比較する工程。
【００２６】
工程（ａ）に記載された潜在的ＧＰＶＩ阻害剤を加えたときに血小板の凝集が損なわれた場合、この化合物は、本発明によるＧＰＶＩの阻害剤である。ＧＰＶＩのこの阻害剤の特異性は、ＧＰＶＩ阻害剤を、好ましくは第一工程と同じ生体からであるが、ＧＰＶＩが欠損している多血小板血漿に適用する対照実験においてさらに試験することができる。このような欠損は、ＧＰＶＩノックアウトマウスのようなＧＰＶＩの遺伝的欠損によって（Kato K, Kanaji T, Russell S, et al., Blood. 2003；102: 1701-1707）又は実質的にＧＰＶＩ活性低下を導く他のアプローチ、例えば遺伝子サイレンシング若しくはｓｉＲＮＡのような技術によって達成することができる。このような欠損は、必ずしも完全である必要はない。ＧＰＶＩ、例えばＡＤＰ、トロンビン又はアラキドン酸又は類似のものよりも他の受容体を介して血小板を活性化することによってコラーゲン関連ペプチド、コンブルキシン又はあまり特異的でないコラーゲンよりも代替アゴニストによって凝集が誘発されるときに、加えた化合物が、依然としてこのような調製物の凝集を損なう場合、化合物は、（それがＧＰＶＩを阻害するにもかかわらず）ＧＰＶＩについて特異的でない。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、がんの治療、好適には皮膚がんの治療、さらにより好適には黒色腫の治療において同時に、別々に又は逐次的に使用する配合薬学的製剤を製造するための１つ又はそれ以上の単離されたＧＰＶＩ阻害剤を含む組成物の使用である。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、がんの治療、好適には皮膚がんの治療、さらにより好適には黒色腫の治療において同時に、別々に又は逐次的に使用するための１つ又はそれ以上の単離されたＧＰＶＩ阻害剤及びＧＰＶＩの阻害剤ではない少なくとも１つのさらなる治療化合物を含む組成物である。
【００２９】
本発明のなおさらなる態様は、がんの治療、好適には皮膚がんの治療、さらにより好適には黒色腫の治療において同時に、別々に又は逐次的に使用するための１つ又はそれ以上の単離されたＧＰＶＩ阻害剤及びＧＰＶＩの阻害剤ではない少なくとも１つのさらなる治療化合物を含む複合的な組成物である。
【００３０】
ＧＰＶＩ阻害は、立証された抗血栓効果を有し、そして出血リスクを生じないことがわかっているため、慣用の外科的介入を受けるがん患者のような出血性合併症のリスク増加にさらされてはならない患者にとってＧＰＶＩ阻害剤による治療上の介入は、特に有益であると考えられる。
【００３１】
特にがん患者では、ＧＰＶＩ阻害は、両方の抗血栓効果と同様に抗がん効果の両方から相乗効果を有しうる。従って、血栓症の増大したリスクを罹患するがん患者ではなおさらそうである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】５×１０4Ｂ１６細胞ｉ.ｖ.の約２週間後の陰性（ビヒクル処置した）対照マウスと比較したマウスにおけるＧＰＶＩ阻害によるがん発生率の低下を示すグラフである。
【図２】１×１０6Ｂ１６細胞ｉ.ｖ.の２週間後のビヒクル処置したマウスの肺の画像を示す図である。
【図３】１×１０6Ｂ１６細胞ｉ.ｖ.の２週間後のＧＰＶＩ阻害を有するマウスの肺の画像を示す図である。
【図４】１．５×１０6Ｂ１６細胞ｉ.ｖ.の２週間後の肺コロニー数（ｎ＝５〜１０／群、個々の結果、線によって結ばれた群中央値）を示すグラフである。
【図５】ビヒクルで処置（陰性対照）するか又は一定期間ＧＰＶＩ阻害し、その前若しくは後にＢ１６注射（pre- or post- B16 injection）を開始したＢ１６注入マウスの生存率（ｎ＝９〜１０／群）を示すグラフである。
【図６】ビヒクル処置（陰性対照）するか又は一定期間ＧＰＶＩ阻害し、その前若しくは後にＢ１６注射を開始したＢ１６注入マウスの経時的な体重（平均、ｎ＝９〜１０／群）を示す図である。
【実施例】
【００３３】
実施例１：
実験の第１セットの目標は、ＧＰＶＩに結合するモノクローナル抗体ＪＡＱ１を用いたＣ５７Ｂｌ６マウスの処置において、３種の異なる細胞数でＢ１６細胞の静脈内注射した後に肺中Ｂ１６黒色腫コロニーの増殖を妨げることができるかどうかを評価することであった。
【００３４】
この仮説を検証するために用いたモデルを、以下の方法で行なった。がん細胞を繁殖させるため、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から購入した深温凍結から滅菌条件下でＢ１６細胞を調製した。細胞をゆっくり解凍し、そして培地で再懸濁した。１×１０6 Ｂ１６細胞をトリパンブルー（tryptan blue）で生存性（viability）について調べた。第１の繁殖のため、それをＣ５７Ｂｌ６マウスに皮下注射した。２週間後、生じた皮下腫瘍を取り去り、腫瘍細胞をコラゲナーゼによって分離した。細胞のさらなる繁殖をin vitroで行なった。簡潔に言えば、単離した細胞を、それぞれの培地を充填した培養皿に移した。細胞が視覚的に検出可能な段階に増えたら、トリプシンを用いて付着細胞を流動化した（mobilized）。この段階で、別のin vitro繁殖サイクルを続けるか、又は細胞をＣ５７Ｂｌ６試験マウスの尾静脈に静脈内注射してＧＰＶＩ阻害剤の治療効果を試験した。マウス（Charles River）を標準収容条件下に飼育した。皮膚がんのこの動物モデルの重要なエンドポイントは、以下の通りである：
１）処置群において腫瘍を有すると見出された動物のパーセンテージ（発生率）
２）死亡数（腫瘍で死亡したか又は瀕死であると見られて犠牲にされた動物の数）
３）個々の処置群において動物当たりの肺で見出される腫瘍及び転移の平均数。
【００３５】
腫瘍は皮膚中でも増殖するが、腫瘍の濃褐色〜黒色のコントラストが薄い色の肺組織に対して強いコントラストを表わす状況のため、マウスの肺において最も良好に定量化することができる。色が濃い皮膚のバックグラウンドに対しては、このような分析は、あまり確実ではない。さらに、注射された大部分の細胞は、肺微小血管系中で捕捉され、血管内皮に付着する。
【００３６】
試験マウスの処置スケジュールを、表１に詳述した。ＪＡＱ１又は生理食塩水（陰性対照として）ビヒクルの用量は、すべてのマウスで同一であった。処置は、Ｂ１６細胞の注射４又は１日前のいずれかに開始し、そして表１に詳述したように継続した。マウスに３種の異なる数、５×１０4、１×１０6又は１,５×１０6のいずれかのＢ１６細胞を注射した。約２週間後、動物を犠牲に、そして肺中のＢ１６コロニー数を測定した。ＪＡＱ１による単独治療では、約５日の長期間でＧＰＶＩが枯渇した（Nieswandt B. et al., J. Exp. Med. 2001, Vol. 193(4): 459-469）。選択した短い間隔のスケジュールを繰り返すことによって、実験の経過中にＧＰＶＩ枯渇を完了させたことが保証された。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
注射したＢ１６細胞数が少ない場合（５×１０4Ｂ１６細胞／マウス，セットＡ）、ＪＡＱ１による処置は、Ｂ１６細胞のｉ.ｖ.注入の１日前に開始して、Ｂ１６肺コロニーを発症した動物数を８２％からちょうど１８％まで劇的に減少させた（表２、図１）。同様に、肺中のコロニー数は、処置によって同じく減少した。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
２０ｘ倍で注射したＢ１６細胞数が増加すると（１×１０6Ｂ１６細胞／マウス、セットＢ）、生理食塩水で治療されたすべてのマウスは、コロニーを示したが、その数は非常に高く、確実にカウントすることはできなかった。セットＡに対するさらなる違いは、セットＡよりも３日早く、すなわちＢ１６細胞注入の４日前に処置を開始したことである。また、Ｂ１６注入に関するこのより積極的な状況では、ＪＡＱ１処置は、Ｂ１６肺コロニーの明らかな減少をもたらした。生理食塩水で処置したマウスの肺におけるコロニー数は、非常に高く（＞１００）、確実にカウントすることができず、従って図２及び３は、ビヒクル及びＪＡＱ１で処置した器官の画像を示し（表３）、ＪＡＱ１注射の治療効果を明確に示している。  
【００４１】
【表３】
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【００４２】
モデルの偶発的な変動のバックグラウンドに対するこの所見のロバストネスを確かめるための繰り返し試験では、増殖したＢ１６細胞は、セットＢについてよりもin vitroであまり悪性でないことがわかった。これにより、１．５×１０6細胞／マウス（セットＣ）にさらに上げることができた。処置スケジュールは、セットＢと同じものであった。また、あまり攻撃的でない細胞によるこのより高い細胞負荷では、Ｂ１６細胞注入の４日前に開始したＪＡＱ１処置は、依然として肺コロニーの明らかな減少をもたらした（表４、図４）。
【００４３】
【表４】
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【００４４】
まとめるとこのセットのデータは、ＪＡＱ１処置が黒色腫コロニーの数を減少させることを実証した。
【００４５】
ＧＰＶＩ阻害がこの保護を引き起こす機構を推測することはできる。それは、いくつかの機構が仲介しうる。それは、実験の開始時に注射した悪性細胞の停止を妨げることに由来し得る。しかしながら腫瘍の縮小は、また、実験の開始時の注入、言い換えれば転移によって生じた最初の腫瘍から放出された停止細胞の増殖を妨げることによって引き起こされ得る。しかしながら、循環する細胞の起源が、そのさらなる運命を定めると仮定する理由はなく、すなわち最初の注入は、すでにマウス中で増殖している腫瘍による転移の状態を反映している。また、さらにＧＰＶＩ欠損は腫瘍の増殖を阻害し、その場合転移が始まる時点を遅らせる、又は転移細胞を循環に放出するプロセスがＧＰＶＩ欠損によって阻害されるのは妥当だと考えられる。
【００４６】
実施例２：
第１の実施例でまとめたデータは、ＧＰＶＩ枯渇が腫瘍の増殖を劇的に弱めるだけでなく、転移も最小限にすることを実証している。しかしながら、受容体枯渇は、悪性細胞の注射前に誘発された。しかしながら、がんの証拠のない予防上のＧＰＶＩ阻害は、可能性のある臨床設定にとってむしろまれな状態を表しうる。従って、第２の実施例で検証する仮説は、悪性細胞の注入後に開始した場合にも、ＧＰＶＩ阻害が有効であるかどうかであり、従ってがんに対する予防的保護だけでなくすでに確定されたがんの後の処置も可能にするかどうかである。この問題を評価するため、ある特定の時点でのみコロニー数を測定する代わりに、臨床的に最も妥当なエンドポイント、すなわち死亡数を用いて有効性を決定した。さらに、短期治療の最悪の症例のシナリオを選択した。この実施例のＣ５７Ｂｌ６マウスは、表５に詳述したように処置した。実施例１の変法として、そして治療時の出発点の潜在的影響を直接比較するため、ＪＡＱ１の効果を２つの処置スケジュールによって評価した。１つは、実施例１と同様に悪性細胞の注入４日前に開始し、２つ目のスケジュールは、自由に循環するがん細胞がもはやなくなった時点、Ｂ１６細胞の注入８時間後に開始した。従って、おそらく全てではないにしてもほとんどの悪性細胞は、停止したか又は内皮に付着したか、又は血管壁を通して血管外遊出した後、周囲組織にすでに浸潤している。これは、処置効果が、肺微小血管系における腫瘍細胞の滞留減少に左右されるかどうか、又は血管外遊出及び達成した転移に関するもののような独立した機構によっても仲介されるかどうかを決定するために重要である。
【００４７】
ＪＡＱ１による処置は、約１週間に制限した。処置スキームは、投与後の顕著なＧＰＶＩ阻害を確実にするように設計した。約３〜４日の期間内に、このような単独処置によって達成される阻害が完了し、そして数が増加した完全に適格な血小板がその前駆細胞から放出され、そして阻害された血小板は取り除かれたら、それは減衰し始め、そのため、循環中のその比率は、それに応じて変化する。最後の処置の約１週間後、ＧＰＶＩ阻害のレベルはむしろ低く、そしておそらく、この設定ではわずかである。従って、この実施例では、ＧＰＶＩ阻害は、死亡まで維持されなかったが、悪性細胞の注入後、少なくともに最初の週に限定された。従って、死亡（死亡までの約２〜３週間、典型的には３〜４週間）までの観察期間の主な部分、両処置群の動物は、実際には処置を受けていなかった。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
治療期間が非常に短かったにもかかわらず、ＧＰＶＩ阻害は、明らかに死亡を遅らせた（表６及び図５）。また、ＧＰＶＩ阻害をＢ１６細胞の注入の前又は後に開始した場合、死亡数は、非常に類似していたようである。体重の時間経過は、最初の重度の（massive）腫瘍増殖、続いて悪化する全身状態に対応している（図６）。
【００５０】
【表６】
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【００５１】
この実施例の処置前効果により、先の実施例１によって得られた証拠が確認され、ＧＰＶＩの阻害は、腫瘍増殖及び／又は転移を弱めることを示している。
【００５２】
また、実施例１のみに基づき、ＧＰＶＩ阻害の抗がん効果は、ＧＰＶＩを阻害する抗血栓効果によって説明することができ、がん細胞繁殖は、がん細胞が凝固を誘発する可能性に左右されると考えられ、これは微小血管系中でがん細胞の滞留（retention）を高め、それによってがん細胞が血管外遊出する機会を増加させる。例えば、抗凝固又はフィブリノーゲン欠損動物について有益効果が報告されている（Amirkhosravi A. et al., J. Thrombosis Haemostasis, 2003, Vol. 1, 1972-1976; Palumbo J. S., Cancer Research, 2002, Vol. 62, 6966-6972）。
【００５３】
対照的に、実施例２は、ＧＰＶＩ阻害が、悪性細胞注入時に存在したかどうか、又はそれがその後誘発されたかどうかで実質的な違いがなかったことを示す。従って、これらのデータは、肺中のがん細胞の捕捉、そしておそらく血管外遊出でさえ、すでに完了した時点で、例えばＧＰＶＩ阻害剤の抗血栓効果があまり重要でないと考えられる時点で治療を開始したとしても、最大の抗がん、抗転移効果が達成されうることを示している。
【００５４】
また、この実施例は、腫瘍の縮小がＧＰＶＩ枯渇マウスの死亡遅延に対応することを実証している。重要なことに、ＧＰＶＩ阻害が非常に短期間のこの最悪の症例シナリオにおいても、処置は、明らかに死亡遅延をもたらした。ＧＰＶＩの連続的な阻害では、治療有効性は、さらにより顕著であると期待される。
【００５５】
実施例３：
第３の実施例は、ＧＰＶＩ阻害の治療効果が阻害剤の性質とは独立していることを例証する。阻害性化合物は、適切な濃度の潜在的阻害剤を、好ましくはヒト、又はマウスのような標準実験室動物種から得た哺乳動物の多血小板血漿に加えることによって同定することができる。適した培養期間後、ＥＰ１２２８７６８に記載されているように、コラーゲン関連ペプチド又はコンブルキシン又はあまり特異的でないコラーゲンを加えることによって血小板の凝集を開始させた。ＧＰＶＩ仲介シグナル伝達によって血小板凝集を誘発させるようにこれらの化合物を用いた（Nieswandt B, Watson SP., Blood. 2003; 15:102: 449-461）。凝集が損なわれた場合、使用した化合物又は方法は、ＧＰＶＩ又はＧＰＶＩによって活性化された下流シグナル伝達カスケードの成分を阻害した。対照実験として第２工程では、潜在的ＧＰＶＩ阻害剤を、好ましくは第一工程と同じ生体であるが、ＧＰＶＩが欠損しているものからの多血小板血漿に適用した。このような欠損は、ＧＰＶＩノックアウトマウスのような、ＧＰＶＩの遺伝的欠損によって（Kato K, Kanaji T, Russell S, et al., Blood. 2003;102: 1701-1707）又はＧＰＶＩ活性を実質的な低下に導く他のアプローチ、例えば遺伝子サイレンシング若しくはｓｉＲＮＡのような技術によって達成することができる。このような欠損は、必ずしも完全である必要はない。凝集が代替アゴニストにより誘発され、ＧＰＶＩよりも他の受容体、例えばＡＤＰ、トロンビン若しくはアラキドン酸又は類似のものを介して血小板を活性化するとき、加えた化合物がこのような調製物の凝集をなお損なう場合、化合物は、（それがＧＰＶＩを阻害するにもかかわらず）ＧＰＶＩについて特異的でない。
【００５６】
ＧＰＶＩを阻害する小分子化学物質についての具体例は、アンギオテンシンＩＩ １型受容体アンタゴニストの代謝物、ＥＸＰ３１７９である（Grothusen C, Umbreen S, et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007 May;27(5): 1184-90）。反復投与又は持続注入のような他のアプローチによって、マウスの血漿レベルがＧＰＶＩ阻害の連続的に高いレベルに達するのを保証することができる。高レベルの阻害が達成されるかどうかは、コラーゲン誘発血小板凝集を定量化することによって試験することができる。
【００５７】
ＥＸＰ３１７９のようなＧＰＶＩ阻害剤が同様に黒色腫のようながんを予防するのに有効かどうか評価するため、十分なＧＰＶＩ阻害に達するまで、約１０匹のマウスの一群をＥＸＰ３１７９で前処置した。好ましくは、これは少なくとも２５％又は少なくとも５０％又は少なくとも７５又は少なくとも９０％である。本研究についての適切な収容条件及びマウス系統は、実施例１に詳述した。次に、Ｂ１６細胞を、おそらくまた、同様に異なる細胞数の範囲又は様々な悪性度の細胞を実施例１に詳述したように静脈内に注入した。ＥＸＰ３１７９のようなＧＰＶＩ阻害剤で継続的に処置し、マウスの生存を記録しながら、約１週間又はそれより長い適切な期間、マウスを観察した。観察期間の終わりにマウスを犠牲にし、そして実施例１に掲記したエンドポイントを定量化した。参照したように、マウスの類似の大群を同じ条件下で保持し、そして注入溶液がＢ１６細胞を含まないことを除いて同じように処置した。この対照群との比較は、ＥＸＰ３１７９のような阻害剤によるＧＰＶＩ阻害がＪＡＱ１のような阻害剤の使用と同様に生存性を改善しながら腫瘍及び転移増殖を弱めるのに有効であることを示している。
【００５８】
第２のアプローチでは、がんの診断が為された後に、ＥＸＰ３１７９のようなＧＰＶＩ阻害剤で患者を処置する臨床的により関連した状況を研究しうることを表わす。これは、実施例１に記載した予防上の設定に対して補完的であり、がん細胞を注入した時点で阻害が完全に存在する。実施例２にまとめたこの真に治療的な設定では、がんの誘発（Ｂ１６細胞の注入による）は、適したＧＰＶＩ阻害剤による処置の前に起こる。エンドポイントの定量は、同じままである。この治療状況においても、腫瘍及び転移増殖の縮小が見られ、生存率の改善を伴った。
【００５９】
ＧＰＶＩの阻害によるがんの予防及び処置方法に関するＧＰＶＩ阻害の利益を評価する別のアプローチの可能性としては、ＧＰＶＩノックアウトマウスの使用であろう。しかしながら、このアプローチを、阻害ＧＰＶＩ機能に導くインタクトＧＰＶＩを有するマウスの処置とは異なるものにしているいくつかの基礎的な側面がある。厳密には、ＧＰＶＩノックアウトマウスの使用は、ＧＰＶＩ遺伝子が破壊された患者を反映しているだけで、これはまれな状況である（総説については、Arthur JF, Dunkley S, Andrews RK.. Br J Haematol. 2007 Nov;139(3): 363-72.参照）。このような症例の特徴は、ＧＰＶＩ欠損ががんの発症中にすでに存在することである。そのため、それは、予防的ＧＰＶＩ阻害処置下にあるがそれにもかかわらずがんを発症している患者の状況を反映している。これは、完全ＧＰＶＩ欠損患者の症例でさらにより明らかになる（ＧＰＶＩノックアウトマウスによっても反映される）。このような患者におけるＧＰＶＩ活性の低下を目的とする治療は、意味がない。これに対して、本発明は、最初のうちは阻害されてないＧＰＶＩ活性を有する個体におけるＧＰＶＩの阻害は、がんを予防的に予防するだけでなく、むしろがん診断後にがんを治療的に処置するために可能性を有しうることを示している。また、実施例２に示すようにＧＰＶＩの阻害は、疾患の診断後に処置を開始する場合で、従って治療的アプローチとしても有効である。
【００６０】
従って、まとめると、ＧＰＶＩ阻害は、予防的な処置としてだけでなく、また黒色腫が確定された患者において、そして転移が顕著なプロセスである段階においても、有効であり得ると結論された。血小板が血管再構築の開始における主な役割を担っているため（Massberg et al., J. Exp. Med., 2006, Vol. 203(5): 1221-1233）、ＧＰＶＩ枯渇は、いくつかの機構、例えばがん増殖又は転移に必要な血管新生に関与するもの、すなわちがん細胞の播種、停止又は侵入などに干渉し又は阻害することを通して作用しうる。従って、ＧＰＶＩ除去剤（GPVI-depleting agents）又はＧＰＶＩ阻害剤又は他の手段によってＧＰＶＩの機能を妨げる薬剤は、新規な抗がん／抗転移薬として用いることができる。それらは、出血性合併症のリスク増加にさらされてはならない患者にとって、特に有益でありうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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