(57)【要約】  本発明は、騒音性難聴の治療方法を提供し、該方法は、騒音性難聴の治療を必要とする患者にA1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む。特に好ましい実施態様において、A1アデノシン受容体アゴニストは、選択的A1アデノシン受容体アゴニストである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
A1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む、騒音性難聴の治療方法。
【請求項２】
A1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む、騒音曝露後の蝸牛の組織傷害の治療方法。
【請求項３】
A1アデノシン受容体アゴニストが選択的A1アデノシン受容体アゴニストである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストが、N6-シクロペンチルアデノシン（CPA）、2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシン（CCPA）、S-N6-(2-endo-ノルボルニル)アデノシン[S(-)-ENBA]、アデノシンアミン同種物（ADAC）、（[1S-[1a,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-クロロ-2-チエニル)-1-メチルプロピル]アミノ]-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジル-3-イル]シクロペンタンカルボキサミド)（AMP579）、N-[R-(2-ベンゾチアゾリル)チオ-2-プロピル]-2-クロロアデノシン（NNC-21-0136）、N-[(1S, trans)-2-ヒドロキシシクロペンチル]アデノシン（GR79236）、N-(3(R)-テトラヒドロフラニル)-6-アミノプリンリボシド（CVT-510、テカデノソン（Tecadeonson））、N6-シクロヘキシル-2-O-メチルアデノシン（SDZ WAG 994）、およびN6-シクロペンチル-N5’-エチルアデノシン-5’-ウロンアミド（セロデノソン）を含む群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストがADACである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストがCCPAである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
A1アデノシン受容体アゴニストが非選択的A1アデノシン受容体アゴニストである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
非選択的A1アデノシン受容体アゴニストがアデノシンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
A1アデノシン受容体アゴニストが全身的に投与される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
A1アデノシン受容体アゴニストが蝸牛の正円窓膜上に局所的に投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
A1アデノシン受容体アゴニストが急性の騒音またはインパルス騒音に曝露された患者に投与される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
A1アデノシン受容体アゴニストが長期間の過度の騒音に曝露された患者に投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
A1アデノシン受容体アゴニストが過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
A1アデノシン受容体アゴニストが過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
A1アデノシン受容体アゴニストが、過度の騒音への曝露の後、A1アデノシン受容体アゴニストを1回よりも多く投与することを含む投与計画に従って投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
A1アデノシン受容体アゴニストが、最初の投与が過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与される投与計画に従って投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
A1アデノシン受容体アゴニストが、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与される投与計画に従って投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
A1アデノシン受容体アゴニストが、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与され、かつ残りの投与が最初の投与時から24時間間隔で単回投与として投与される投与計画に従って投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
A1アデノシン受容体アゴニストが、A1アデノシン受容体アゴニストを少なくとも5回投与することを含む投与計画に従って投与される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
過度の騒音への曝露が、24時間の110 dBの音圧レベルという騒音レベルの騒音を超えないものである、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
騒音性難聴の治療のための医薬の製造におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用。
【請求項２２】
騒音曝露後の蝸牛におけるフリーラジカルによる障害を減少させるための医薬の製造におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用。
【請求項２３】
A1アデノシン受容体アゴニストが選択的A1アデノシン受容体アゴニストである、請求項２１または請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストが、N6-シクロペンチルアデノシン（CPA）、2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシン（CCPA）、S-N6-(2-endo-ノルボルニル)アデノシン[S(-)-ENBA]、アデノシンアミン同種物（ADAC）、（[1S-[1a,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-クロロ-2-チエニル)-1-メチルプロピル]アミノ]-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジル-3-イル]シクロペンタンカルボキサミド)（AMP579）、N-[R-(2-ベンゾチアゾリル)チオ-2-プロピル]-2-クロロアデノシン（NNC-21-0136）、N-[(1S, trans)-2-ヒドロキシシクロペンチル]アデノシン（GR79236）、N-(3(R)-テトラヒドロフラニル)-6-アミノプリンリボシド（CVT-510、テカデノソン（Tecadeonson））、N6-シクロヘキシル-2-O-メチルアデノシン（SDZ WAG 994）、およびN6-シクロペンチル-N5’-エチルアデノシン-5’-ウロンアミド（セロデノソン）を含む群から選択される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストがADACである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストがCCPAである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
A1アデノシン受容体アゴニストが非選択的A1アデノシン受容体アゴニストである、請求項２１または請求項２２に記載の使用。
【請求項２８】
非選択的A1アデノシン受容体アゴニストがアデノシンである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
医薬が急性の騒音またはインパルス騒音に曝露された患者に投与するために製剤化されている、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
医薬が長期間の過度の騒音に曝露された患者に投与するために製剤化されている、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
医薬が過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与するために製剤化されている、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
医薬が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与するために製剤化されている、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
医薬がA1アデノシン受容体アゴニストを1回よりも多く投与することを含む投与計画に従った投与のために製剤化されている、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
医薬が、最初の投与が過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与される投与計画に従った投与のために製剤化されている、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
医薬が、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与される投与計画に従った投与のために製剤化されている、請求項３３に記載の使用。
【請求項３６】
医薬が、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与され、かつ残りの投与が最初の投与時から24時間間隔で単回投与として投与される投与計画に従った投与のために製剤化されている、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
医薬がA1アデノシン受容体アゴニストを少なくとも5回投与することを含む投与計画に従った投与のために製剤化されている、請求項３３〜３６のいずれか1項に記載の使用。
【請求項３８】
過度の騒音への曝露が、24時間の110 dBの音圧レベルという騒音レベルの騒音を超えないものである、請求項２１〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３９】
医薬が全身的に投与されるように製造されている、請求項２１〜３８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
医薬が蝸牛の正円窓膜上に局所的に投与されるように製造されている、請求項２１〜３８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
医薬が騒音曝露後の蝸牛におけるグルタミン酸興奮毒性を減少させるものである、請求項２１〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
医薬が蝸牛への血流量および酸素供給を増大させるものである、請求項２１〜４１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４３】
ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体を含むADACの、騒音性難聴の治療のための医薬の製造における使用。
【請求項４４】
ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体を含むADACの、騒音曝露後の蝸牛におけるフリーラジカルによる障害を減少させるための医薬の製造における使用。
【請求項４５】
ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体を含むADACを哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の騒音性難聴の治療方法。
【請求項４６】
ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体を含むADACを哺乳動物に投与する工程を含む、騒音曝露後の哺乳動物における蝸牛の組織傷害の治療方法。
【請求項４７】
実施例および図面に対する特段の参照と共に本明細書中に実質的に記載した、A1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む騒音性難聴の治療方法。
【請求項４８】
実施例および図面に対する特段の参照と共に本明細書中に実質的に記載した、騒音性難聴の治療のための医薬の製造におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用。
【請求項４９】
実施例および図面に対する特段の参照と共に本明細書中に実質的に記載した、騒音曝露後の蝸牛におけるフリーラジカルによる障害を減少させるための医薬の製造におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用。
【請求項５０】
実施例および図面に対する特段の参照と共に本明細書中に実質的に記載した、A1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む騒音曝露後の蝸牛の組織傷害の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概括的に言えば、騒音性難聴の治療の必要がある患者にA1アデノシン受容体アゴニストを投与することによる騒音性難聴の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
聴覚障害は、重大な健康問題および社会問題である。難聴の最も一般的な原因の1つは、騒音への過度の曝露である。この問題は特に、通常の聴覚保護計画が機能しにくい軍事環境および産業環境（建築労働者、鉱業、林業、および航空産業）においてよく見られる。いくつかのレジャー活動（射撃、音の大きい音楽を聴くこと）もまた、偶発性の難聴をもたらし得る。米国の保健統計は、難聴が毎年500億ドルのコストで2500万人を超えるアメリカ人を冒していることを示しており、該コストは多発性硬化症、脳卒中、てんかん、脊髄損傷、ハンチントン病、およびパーキンソン病の総合財務効果を上回る[1]。ニュージーランドの人口の推計10〜13%がかなりの難聴に冒されており、約3分の1は過度の騒音によって生じた障害をその難聴の原因としている。
【０００３】
騒音性難聴は、大きな音への一度の曝露、および長期間にわたる騒音への曝露の繰り返しによって、引き起こされ得る。ニュージーランドの職業安全保健局（Occupational Safety and Health）（OSH）によって定められた基準は、85 dBを超える騒音への継続的な曝露は、いずれは聴覚を害することになることを示している。
【０００４】
インパルス騒音または継続的な騒音への曝露は、持続性の難聴または一時的な難聴を引き起こし得る。用語「一過性閾値変動（temporary threshold shift）」（TTS）は、大きな騒音への曝露の後、通常約1週間以内に消失する、騒音外傷による聴覚機能の一過性の障害を指すのに使用される。曝露後の聴覚閾値が減少したレベルで安定化した場合、「永続性閾値変動（permanent threshold shift）」（PTS）が起こる。
【０００５】
大部分の難聴は、内耳の感覚系の損傷に起因している。中耳の容態については治療法が存在するが、内耳の病態の障害を寛解させることができ、感音性難聴の影響を減少させることができる治療法は実質的には存在しない。酸化ストレスおよび活性酸素種（reactive oxygen species）（ROS）の生成が、例えば騒音曝露、細胞障害性薬物および老化による、多数の形態の蝸牛損傷の発病のキー要因であるという証拠が増加している。酸化ストレスは、グルタミン酸の神経毒性とともに、大抵の蝸牛損傷および難聴の根底にある統一的機構であるとほぼ考えられている[2、3]。したがって酸化ストレスの根底にある機構を標的とする化合物は、難聴の治療法としての考慮すべき可能性を示す。アデノシン受容体アゴニストは、虚血性脳障害および心外傷の治療における使用が成功しており、非凡な細胞保護機能を有することがわかっている。アデノシン受容体は蝸牛において同定されており、騒音曝露によって蝸牛の体液（cochlear fluids）中でアデノシン濃度が上昇することが知られている[4、5]。
【０００６】
アデノシンシグナル伝達系の使用は、聴覚と関連していることが知られている。動物試験により、アデノシンアゴニストが後天性難聴を防ぐのに予防的に有用であり得ることが実証されている[6〜9]。非選択的A1アデノシン受容体アゴニストであるR-N6-フェニルイソプロピルアデノシン（R-N6-phenylisopropyladenosine）（R-PIA）による前処置によって、騒音に曝露された蝸牛の可聴閾値がより良好に維持されること、および予防的使用の結果として外有毛細胞の生存が増加すること、が示された[6]。しかしながら、R-PIAは、騒音曝露後には適用されておらず、騒音曝露からの蝸牛の回復に対するその効果は知られていない。さらに、R-PIAは選択的アデノシン受容体アゴニストではなく、R-PIAは蝸牛の機能に対して逆効果を有し得るアデノシン受容体、例えばA1受容体およびA2A受容体を活性化する。
【０００７】
過度の騒音に曝露される場合が必ずしも予測され得るわけではなく、したがって予防のための選択肢は使用が制限されているということは明らかである。過度の騒音への曝露が予測可能である場合は、例えば耳栓の使用などの予防的選択肢を取ることができる。したがって、内耳の繊細な構造の損傷を寛解させることができ、過度の騒音への曝露から生じる難聴を減少させることができる騒音性難聴の治療法を開発することが不可欠である。騒音性難聴の治療については、現在薬理療法は利用できず、補聴器および蝸牛インプラントがこの容態を患う患者に提供される唯一の可能なものである。
【０００８】
予防のためのR-PIAによる動物試験では、全身性（心血管系）副作用のために、蝸牛の正円窓膜（round window membrane）（RWM）への局所送達が利用されている。化合物のRWMへの局所送達は、一般に臨床診療で使用されているが、それは外科的手技であり、他の不利な点をいくつか有する。RWMは、内耳への薬物送達の、最も外科的に接近できる経路であるが、RWM上に置かれた物質は蝸牛全体に均一に分布しない[10]。全身的薬物投与（経口、非経口）は、RWM上に薬物を送達するのに必要とされる外科的手技の危険性を解消するため、該投与は臨床診療において好ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
（本発明の目的）
先行技術の不利な点の少なくとも1つを克服する難聴の治療法を提供すること、または少なくとも公衆に有用な選択肢を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
第一態様の本発明は、騒音性難聴の治療方法を提供し、該方法はA1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む。
【００１１】
第二態様の本発明は、騒音曝露後の蝸牛の組織傷害の治療方法を提供し、該方法はA1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む。
【００１２】
A1アデノシン受容体アゴニストは、選択的A1アデノシン受容体アゴニストであることが好ましい。
【００１３】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストは、N6-シクロペンチルアデノシン（N6-cyclopentyl adenosine）（CPA）、2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシン（2-Chloro-N6-cyclopentyl adenosine）（CCPA）、S-N6-(2-endo-ノルボルニル)アデノシン（S-N6-(2-endo-norbornyl)adenosine）[S(-)-ENBA]、アデノシンアミン同種物（adenosine amine congener）（ADAC）、（[1S-[1a,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-クロロ-2-チエニル)-1-メチルプロピル]アミノ]-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジル-3-イル]シクロペンタンカルボキサミド)（AMP579）、N-[R-(2-ベンゾチアゾリル)チオ-2-プロピル]-2-クロロアデノシン（NNC-21-0136）、N-[(1S, trans)-2-ヒドロキシシクロペンチル]アデノシン（GR79236）、N-(3(R)-テトラヒドロフラニル)-6-アミノプリンリボシド（CVT-510、テカデノソン（Tecadeonson））、N6-シクロヘキシル-2-O-メチルアデノシン（SDZ WAG 994）、およびN6-シクロペンチル-N5’-エチルアデノシン-5’-ウロンアミド（セロデノソン）を含む群から選択されることが好ましい。
【００１４】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストは、ADACであることが好ましい。
【００１５】
あるいは、選択的A1アデノシン受容体アゴニストは、CCPAである。
【００１６】
あるいは、A1アデノシン受容体アゴニストは、非選択的A1アデノシン受容体アゴニストである。
【００１７】
非選択的A1アデノシン受容体アゴニストは、アデノシンであることが好ましい。
【００１８】
A1アデノシン受容体アゴニストは、全身的に投与されることが好ましい。
【００１９】
あるいは、A1アデノシン受容体アゴニストは、蝸牛の正円窓膜上に局所的に投与される。
【００２０】
A1アデノシン受容体アゴニストは、急性の（acute）騒音またはインパルス騒音に曝露された患者に投与されることが好ましい。
【００２１】
あるいは、A1アデノシン受容体アゴニストは、長期間の過度の騒音に曝露された患者に投与される。
【００２２】
A1アデノシン受容体アゴニストは、過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与されることが好ましい。
【００２３】
A1アデノシン受容体アゴニストは、過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与されることがより好ましい。
【００２４】
A1アデノシン受容体アゴニストは、過度の騒音への曝露の後、A1アデノシン受容体アゴニストを1回よりも多く投与することを含む投与計画に従って投与されることが好ましい。
【００２５】
A1アデノシン受容体アゴニストは、最初の投与が過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与される投与計画に従って投与されることが好ましい。
【００２６】
A1アデノシン受容体アゴニストは、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与される投与計画に従って投与されることがより好ましい。
【００２７】
A1アデノシン受容体アゴニストは、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与され、かつ残りの投与が最初の投与時から24時間間隔で単回投与として投与される投与計画に従って投与されることが好ましい。
【００２８】
A1アデノシン受容体アゴニストは、A1アデノシン受容体アゴニストを少なくとも5回投与することを含む投与計画に従って投与されることが好ましい。
【００２９】
過度の騒音への曝露は、24時間の110 dBの音圧レベルという騒音レベルの騒音を超えないものであることが好ましい。
【００３０】
第三態様の本発明は、騒音性難聴の治療のための医薬の製造におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用を提供する。
【００３１】
第四態様の本発明は、騒音曝露後の蝸牛におけるフリーラジカルによる障害を減少させるための医薬の製造におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用を提供する。
【００３２】
A1アデノシン受容体アゴニストは、選択的A1アデノシン受容体アゴニストであることが好ましい。
【００３３】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストは、N6-シクロペンチルアデノシン（CPA）、2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシン（CCPA）、S-N6-(2-endo-ノルボルニル)アデノシン[S(-)-ENBA]、アデノシンアミン同種物（ADAC）、（[1S-[1a,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-クロロ-2-チエニル)-1-メチルプロピル]アミノ]-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジル-3-イル]シクロペンタンカルボキサミド)（AMP579）、N-[R-(2-ベンゾチアゾリル)チオ-2-プロピル]-2-クロロアデノシン（NNC-21-0136）、N-[(1S, trans)-2-ヒドロキシシクロペンチル]アデノシン（GR79236）、N-(3(R)-テトラヒドロフラニル)-6-アミノプリンリボシド（CVT-510、テカデノソン（Tecadeonson））、N6-シクロヘキシル-2-O-メチルアデノシン（SDZ WAG 994）、およびN6-シクロペンチル-N5’-エチルアデノシン-5’-ウロンアミド（セロデノソン）を含む群から選択されることが好ましい。
【００３４】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストは、ADACであることが好ましい。
【００３５】
あるいは、選択的A1アデノシン受容体アゴニストは、CCPAである。
【００３６】
あるいは、A1アデノシン受容体アゴニストは、非選択的A1アデノシン受容体アゴニストである。
【００３７】
非選択的A1アデノシン受容体アゴニストは、アデノシンであることが好ましい。
【００３８】
医薬は、急性の（acute）騒音またはインパルス騒音に曝露された患者に投与するために製剤化されていることが好ましい。
【００３９】
あるいは、医薬は、長期間の過度の騒音に曝露された患者に投与するために製剤化される。
【００４０】
医薬は、過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与するために製剤化されていることが好ましい。
【００４１】
医薬は、過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与するために製剤化されていることがより好ましい。
【００４２】
医薬は、A1アデノシン受容体アゴニストを1回よりも多く投与することを含む投与計画に従った投与のために製剤化されていることが好ましい。
【００４３】
医薬は、最初の投与が過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与される投与計画に従った投与のために製剤化されていることが好ましい。
【００４４】
医薬は、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与される投与計画に従った投与のために製剤化されていることが好ましい。
【００４５】
医薬は、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与され、かつ残りの投与が最初の投与時から24時間間隔で単回投与として投与される投与計画に従った投与のために製剤化されていることが好ましい。
【００４６】
医薬は、A1アデノシン受容体アゴニストを少なくとも5回投与することを含む投与計画に従った投与のために製剤化されていることが好ましい。
【００４７】
過度の騒音への曝露は、24時間の110 dBの音圧レベルという騒音レベルの騒音を超えないものであることが好ましい。
【００４８】
医薬は、全身的に投与されるように製造されていることが好ましい。
【００４９】
あるいは、医薬は、蝸牛の正円窓膜上に局所的に投与されるように製造される。
【００５０】
医薬は、騒音曝露後の蝸牛におけるグルタミン酸興奮毒性を減少させることが好ましい。
【００５１】
医薬は、蝸牛への血流量および酸素供給を増大させることが好ましい。
【００５２】
第五態様の本発明は、ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体（chemical variants）を含むADACの、騒音性難聴の治療のための医薬の製造における使用を提供する。
【００５３】
第六態様の本発明は、ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体（chemical variants）を含むADACの、騒音曝露後の蝸牛におけるフリーラジカルによる障害を減少させるための医薬の製造における使用を提供する。
【００５４】
第七態様の本発明は、ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体（chemical variants）を含むADACを哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の騒音性難聴の治療方法を提供する。
【００５５】
第八態様の本発明は、ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体（chemical variants）を含むADACを哺乳動物に投与する工程を含む、騒音曝露後の哺乳動物における蝸牛の組織傷害の治療方法を提供する。
【００５６】
本発明のさらなる態様は、単に例として示すに過ぎない以下の図面および実施例から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１（ａ）（ｂ）】図１は、110 dBの音圧レベル（SPL）で8〜12 kHz帯の騒音に24時間曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を示す。ABRを純音（4〜24 kHz）および可聴クリック音（auditory clicks）に対する反応として測定した。騒音曝露の6時間後もしくは24時間後に単回注射として、または騒音の6時間後に始める24時間ごとに投与する5回の注射として（長期間の処置）、ADAC（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、薬物媒体の注射剤をADACと同じ間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群についてn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；***はp<0.001；対応のないt検定。
【図１（ｃ）（ｄ）】図１は、110 dBの音圧レベル（SPL）で8〜12 kHz帯の騒音に24時間曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を示す。ABRを純音（4〜24 kHz）および可聴クリック音（auditory clicks）に対する反応として測定した。騒音曝露の6時間後もしくは24時間後に単回注射として、または騒音の6時間後に始める24時間ごとに投与する5回の注射として（長期間の処置）、ADAC（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、薬物媒体の注射剤をADACと同じ間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群についてn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；***はp<0.001；対応のないt検定。
【図１（ｅ）（ｆ）】図１は、110 dBの音圧レベル（SPL）で8〜12 kHz帯の騒音に24時間曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を示す。ABRを純音（4〜24 kHz）および可聴クリック音（auditory clicks）に対する反応として測定した。騒音曝露の6時間後もしくは24時間後に単回注射として、または騒音の6時間後に始める24時間ごとに投与する5回の注射として（長期間の処置）、ADAC（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、薬物媒体の注射剤をADACと同じ間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群についてn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；***はp<0.001；対応のないt検定。
【図１（ｇ）（ｈ）】図１は、110 dBの音圧レベル（SPL）で8〜12 kHz帯の騒音に24時間曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を示す。ABRを純音（4〜24 kHz）および可聴クリック音（auditory clicks）に対する反応として測定した。騒音曝露の6時間後もしくは24時間後に単回注射として、または騒音の6時間後に始める24時間ごとに投与する5回の注射として（長期間の処置）、ADAC（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、薬物媒体の注射剤をADACと同じ間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群についてn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；***はp<0.001；対応のないt検定。
【図２】図２は、騒音曝露の6時間後にADACまたは対照溶液の単回注射で処置したラットの閾値の回復（聴性脳幹反応、ABR）を示す。（a）は純音、（b）は可聴クリック音。*はp<0.05；**はp<0.01。動物数：1つの群につきn=8。
【図３】図３は、騒音曝露の24時間後にADACまたは対照溶液の単回注射を受けたラットにおける閾値の回復（ABR）を示す。（a）は純音、（b）は可聴クリック音。*はp<0.05；**はp<0.01。動物数：1つの群につきn=8。
【図４】図４は、（a）ADACまたは対照溶液の5回の注射により処置した群における閾値の回復（ABR）を示す。（a）は純音、（b）は可聴クリック音。***はp<0.001。動物数：1つの群につきn=8。
【図５】図５は、ABR閾値の回復についての異なるADAC処置の比較を示す。（a）は純音のオーディオグラム、（b）は可聴クリック音。動物数：1つの群につきn=8。
【図６】図６は、（a）ADACおよび（b）媒体溶液で処置した後のラットのコルチ器官（ファロイジン染色）を示す。内有毛細胞（IHC）；外有毛細胞の横列1、2、3（OHC1、OHC2、OHC3）。
【図７】図７は、（A）対照および（B）ADACで処理した蝸牛のコルチ器官におけるニトロチロシン免疫染色を示す。クラウディウス細胞（Claudius cells）（cc）；内有毛細胞（inner hair cells）（ihc）；外側溝細胞（outer sulcus cells）（osc）；血管条（stria vascularis）（sv）；らせん神経節細胞（spiral ganglion neurones）（sgn）。
【図８】図８は、ADAC（100 μg/kg）で処置した動物の体重および体温を示す。A．体重は騒音曝露の直前および騒音曝露の14日後に測定した。B．直腸温度（℃）を、ADACの投与前ならびに注射の30分後および60分後に測定した。動物数：1つの群につきn=8。
【図９】図９は、110 dBの音圧レベル（SPL）で2時間8〜12 kHz帯の騒音に曝露（急性の騒音への曝露）させた後のラットのABR閾値の変化を示す。騒音曝露の前に、および騒音曝露後に時間間隔をおいて（30分および14日）、可聴クリック音および純音（4〜28 kHz）に対する反応として、ABRを測定した。騒音の6時間後に開始する24時間間隔で、5回のADAC注射（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、媒体溶液の注射剤をADACと同じ時間間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群につきn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；対応のないt検定。
【図１０】図１０は、2時間騒音に曝露させた蝸牛の有毛細胞の損失率を示す。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群につきn=8。*はp<0.05、***はp<0.001；対応のないt検定。
【図１１】図１１は、11O dBの音圧レベル（SPL）で24時間、広帯域の騒音に曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（ABR）を示す。ABRは、騒音曝露の前（ベースライン）、騒音曝露の30分後（処置前）、およびアデノシン受容体アゴニストの投与の48時間後（処置後）に、可聴クリック音（a）および純音（b〜e）に対する反応として、測定した。すべての薬物は、蝸牛の正円窓膜上に送達した（f）。閾値の回復を、処置後のABRから処置前のABRを引いたものと定めた。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している（n=8）。*はp<0.05；**はp<0.01；***はp<0.001；テューキーの（Tukey's）多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ANOVA）。APは人工の外リンパ（artificial perilymph）（対照）；非選択的アデノシン受容体アゴニストであるアデノシン（1O mM）；選択的A1アデノシン受容体アゴニストであるCCPA（1 mM）；選択的A2A受容体アゴニストであるCGS-21680（0.2 mM）。
【図１２】図１２は、周囲騒音レベル（約6O dBの音圧レベル（SPL））に置かれたラットにおける、アデノシン受容体アゴニストおよびアデノシン受容体アンタゴニストの加重電位（summating potentials）（SP）に対する影響を示す。人工の外リンパを灌流する前（AP；ベースライン）、APを灌流した後、ならびにアデノシン受容体アゴニストのアデノシンおよびCCPAと共に灌流した後に、4〜26 kHzにわたる周波数で、内有毛細胞受容体の電位を表すSPの閾値を測定した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として示している（n=8）。*はp<0.05、**はp<0.01；テューキーの（Tukey's）多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ANOVA）。APは人工の外リンパ（対照）；非選択的アデノシン受容体アゴニストであるアデノシン（1O mM）；選択的A1アデノシン受容体アゴニストであるCCPA（1 mM）；選択的A2A受容体アゴニストであるCGS-21680（0.2 mM）；選択的A2A受容体アンタゴニストであるSCH-58261。
【図１３】図１３は、（A）アデノシン受容体アゴニスト（アデノシン、CCPA）または媒体溶液（AP）で処置した、騒音に曝露させた蝸牛における、ニトロチロシンの免疫染色を示す。ニトロチロシン抗体を含めなかった場合、免疫染色は認められなかった。（B）ニトロチロシンの免疫反応性についての半定量分析。略語：ccはクラウディウス細胞（Claudius cells）；dcはダイテルス細胞（Deiters' cells）；hcはヘンゼン細胞（Hensen's cells）；idcは歯間細胞（interdental cells）；isは内側溝細胞（inner sulcus cells）；ihcは内有毛細胞（inner hair cells）；ohcは外有毛細胞（outer hair cells）；opeは外柱細胞（outer pillar cells）。スケールバー：50 μm。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している（1つの群につきn=4匹の動物）。**はp<0.01；***はp<0.001；テューキーの（Tukey's）多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ANOVA）。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
（詳細な説明）
本発明は、概して、難聴の治療におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用に関する。
【００５９】
特に好ましい実施態様において、本発明は、騒音性難聴の治療のための医薬の製造におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用に関する。
【００６０】
アデノシン受容体は、内耳の蝸牛を含めたほとんどの身体組織に存在している。アデノシンは、組織の保護およびストレスからの回復における役割を有している。本発明者らは、騒音によって誘発された蝸牛損傷を治療するためにA1アデノシン受容体アゴニストを使用すると、聴覚感度が効果的に回復することを見出した。これまではA1アデノシン受容体アゴニストは、予防的用途を有するに過ぎないと考えられていた。そうした考えの結果として、A1アデノシン受容体アゴニストは、実際の用途が限られていると考えられている。
【００６１】
好ましい態様において、A1アデノシン受容体アゴニストの使用は、騒音への曝露後の聴覚の約5〜12 dBの回復を提供することができ、より好ましくは約25〜3O dBの回復を提供することができ、または聴覚損失の約30〜60%の回復を提供することができる。実際的な観点から、診療所においては、5 dBの改善でさえも顕著である。そのため本発明によって達成される改善は、非常に顕著である。
【００６２】
したがって、本発明は、騒音性難聴の治療方法を提供し、該方法はA1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む。
【００６３】
A1アデノシン受容体アゴニストは、A1受容体に対して選択的であるか、または広くすべてのアデノシン受容体（A1、A2A、A2B、A3）に対して選択的であるかのいずれかであってもよい。したがって、本明細書を通じて、言及したA1アデノシン受容体アゴニストは、アデノシンなどの非選択的A1アデノシン受容体アゴニスト、ならびにアデノシンアミン同種物（ADAC）および2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシン（CCPA）などの選択的A1アデノシン受容体アゴニストを含むものと解釈するべきである。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様によるA1アデノシン受容体アゴニストは、選択的A1アデノシン受容体アゴニストとなる。適切な選択的A1アデノシン受容体は、N6-シクロペンチルアデノシン（CPA）、2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシン（CCPA）、S-N6-(2-endo-ノルボルニル)アデノシン[S(-)-ENBA]、アデノシンアミン同種物（ADAC）、（[1S-[1a,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-クロロ-2-チエニル)-1-メチルプロピル]アミノ]-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジル-3-イル]シクロペンタンカルボキサミド)（AMP579）、N-[R-(2-ベンゾチアゾリル)チオ-2-プロピル]-2-クロロアデノシン（NNC-21-0136）、N-[(1S, trans)-2-ヒドロキシシクロペンチル]アデノシン（GR79236）、N-(3(R)-テトラヒドロフラニル)-6-アミノプリンリボシド（CVT-510、テカデノソン（Tecadeonson））、N6-シクロヘキシル-2-O-メチルアデノシン（SDZ WAG 994）、およびN6-シクロペンチル-N5’-エチルアデノシン-5’-ウロンアミド（セロデノソン）を含む群から選択することができる。特に好ましい実施態様において、選択的A1アデノシン受容体アゴニストはCCPAとなる。より特に好ましい実施態様において、選択的A1アデノシン受容体アゴニストはADACとなる。
【００６５】
本発明の別の実施態様によれば、A1アデノシン受容体アゴニストは非選択的A1アデノシン受容体アゴニストであってもよい。本発明における使用のための好ましい非選択的A1アデノシン受容体アゴニストは、アデノシンである。本発明によれば、非選択的A1アデノシン受容体アゴニストが用いられる場合、選択的A1アデノシン受容体アゴニストの濃度と比較して、より高い濃度が必要となる。
【００６６】
本明細書を通じて、A1アデノシン受容体アゴニスト（例えばアデノシン、ADACまたはCCPA）に言及する場合、これはA1アデノシン受容体アゴニストの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される溶媒和物、および／または化学的変異体（chemical variants）などの使用を包含するものと解釈するべきである。当業者に明らかとなるように、言及した種々の形態および／または変異体は、本発明におけるA1アデノシン受容体アゴニストの有益性に有害な影響を及ぼすことになる種類のものであってはならない。本明細書中に開示された本発明をいったん把握した当業者は、このようなことを十分に判断し得る。
【００６７】
以下の表１に示したように、選択的A1アデノシン受容体アゴニスト、特にADACの化学構造は、アデノシンと比較して、広範囲にわたって修飾されている。
【００６８】
【化１】
2011530585.tif 000002
【００６９】
[24]
1つの実施態様において、A1アデノシン受容体アゴニストは、全身的に投与することができ、したがって中耳または内耳の中に治療薬を直接的に投与する（診療所の処置が必要）必要がない。A1アデノシン受容体アゴニストを、腹腔内投与、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、または皮下投与して、この全身的効果を達成することができる。全身的な送達のための最も適切な経路は、少なくとも部分的には、選択されるA1アデノシン受容体アゴニストの薬理学的性質に依存することになる。腹腔内投与は、実験のセクションに例示している。
【００７０】
あるいは、所望される場合、A1アデノシン受容体アゴニストは、鼓室内注射によって、内耳に、特に蝸牛の正円窓膜上に局所投与するために製剤化することができる。局所製剤の鼓室内投与は、実験のセクションで例示している。この処置の利点は、どのような生じ得る薬物の全身性副作用でも回避し得ることである。
【００７１】
過度の騒音は、2つの部分、すなわち曝露時間および騒音の音の大きさから構成される。85デシベル（dB）を超える騒音への持続的な曝露は、過度の騒音であると考えられる。本発明は、経時的な過度の騒音への曝露との関連で使用することができ、ここでそうした曝露は急性である（例えば2時間の持続的な過度の騒音への曝露）か、または長時間のものである（例えば24時間の持続的な曝露）か、あるいは該曝露は突然の音の大きな騒音（例えば爆発など；インパルス騒音として公知）へのものである。過度の騒音への曝露は、24時間の110 dBの音圧レベルという騒音レベルの騒音を超えないものであることが好ましい。
【００７２】
A1アデノシン受容体アゴニストは、好ましくは過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与されるべきである。より好ましくは、この投与は、過度の騒音への曝露から約6時間以内のものであるべきである。
【００７３】
A1アデノシン受容体アゴニストは、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与され、かつ残りの投与が最初の投与時から24時間ごとに単回投与として投与される投与計画に従って投与されることが好ましい。
【００７４】
A1アデノシン受容体アゴニストは、A1アデノシン受容体アゴニストを少なくとも5回投与することを含む投与計画に従って投与されることがさらに好ましい。
【００７５】
ADACは、これまで脳虚血およびハンチントン病の実験モデルにおいて、組織の保護を与えるために使用されている[12〜14]。ADACはアデノシンA1受容体に作用する他の薬物と比較して低減された末梢性（peripheral）副作用を有するため、それは薬物として特に有利であることが見出されている[12]。アデノシンA1受容体に作用する他の薬物は、徐脈ならびに低血圧および低体温などの心血管系副作用を有し得る[15]。ADACによって引き起こされる副作用がないこと、および脳中でのA1受容体に対するADACの高い親和性は、少なくとも一部はその修飾された化学構造、および血液脳関門または血液外リンパ関門（blood-perilymph barrier）を横切る増大した能力によるものであると考えられている[16]。そのためADACは、本発明における使用のための特に好ましいA1受容体アゴニストである。本発明者らはまた、アデノシンおよびCCPAまたは他の選択的A1アデノシン受容体アゴニストは、鼓室内注射（診療所の処置）によって正円窓膜上に局所投与するのに適していることも見出している。これは、どのような全身性副作用の危険性でも回避するものである。
【００７６】
ADACなどのA1アデノシン受容体アゴニストの非経口投与に適した製剤は、これまでに記述されている[17]。こうした公知の製剤としては、溶解補助剤、増粘剤、安定剤および保存剤を含み得る、水性および非水性の、等張性の無菌注射液および無菌懸濁液が挙げられる。A1アデノシン受容体アゴニストのアデノシンは、生理食塩水、デキストロース水溶液および関連する糖溶液、アルコール、例えばエタノール、イソプロパノール、グリコールなどに溶解し得る。非経口投与用のADAC製剤の例は、実験のセクションの方法および材料において示す。
【００７７】
A1アデノシン受容体アゴニストの局所投与に適した製剤としては同様に、溶解補助剤、増粘剤、安定剤および保存剤を含み得る、水性および非水性の、等張性の無菌注射液および無菌懸濁液が挙げられる。A1アデノシン受容体アゴニストは、生理食塩水、デキストロース水溶液および関連する糖溶液、アルコール、例えばエタノール、イソプロパノール、グリコールなどに溶解し得る。A1アデノシン受容体アゴニストのアデノシンの正円窓膜への局所投与用製剤の例もまた、実験のセクションに示している。
【００７８】
抗酸化剤などの難聴の治療に関して現在使用されている医薬は、予防的に有用であるに過ぎない[8]。こうした公知の医薬は、聴覚の回復を助ける効果がほとんどない。現在利用できる聴覚を回復させる唯一の手段は、補聴器である。補聴器は音を増強することができるが、それは語音弁別能を完全には回復させることができない。補聴器はまた使用者にとって実用上不便でもある。
【００７９】
過度の騒音への曝露は、蝸牛の酸化ストレスを引き起こし、難聴を生じさせる。蝸牛の酸化ストレスは、騒音曝露が停止した後、最大で10日間続き、組織障害の最終レベルを定める。本発明者らは、A1アデノシン受容体アゴニストのアデノシンを騒音曝露後に投与することで、抗酸化物質の産生を増大させ、フリーラジカルおよびグルタミン酸の毒性効果に対抗し（騒音曝露後の蝸牛におけるグルタミン酸興奮毒性を減少させる）、蝸牛の血流量および酸素供給を向上させることによって、騒音曝露後に聴覚機能を維持することを増大させることができると考える。これは、A1アデノシン受容体アゴニストのアデノシンに騒音性難聴に対する治療効果を持たせ、聴覚閾値を回復させ、したがって語音弁別能を向上させる可能性が高い。したがって、本発明の他の態様は、騒音曝露後に蝸牛におけるフリーラジカルによる障害を減少させ、かつ／または蝸牛の組織傷害を治療し、こうして騒音性難聴の治療を必要とする患者の騒音性難聴を治療するためのA1アデノシン受容体アゴニストのアデノシンの使用を提供する。適切な医薬の製造および治療計画は、先に述べている。
【実施例】
【００８０】
実験
実験1および実験2において、ウィスター（Wistar）ラットを騒音（8〜12 kHz、110 dBの音圧レベル（SPL）、2〜24時間）に曝露させた。次いでADACをウィスターラットに100 μg/kg/日で投与した。ADACは、騒音曝露の6時間後の単回注射として、もしくは騒音曝露の24時間後の単回注射として、または複数回注射の最初の注射剤を騒音曝露の6時間後に投与する複数回注射として、のいずれかで投与した。
【００８１】
聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を用いて聴覚閾値を評価し、定量的組織学的検査（quantitative histology）（有毛細胞の損失）によって細胞障害を評価した。ABRは、音（クリック音または純音）に反応した聴神経および中枢聴覚伝導路（脳幹/中脳の部位）の活性を表す。フリーラジカルによる障害の免疫組織化学的評価のためにニトロチロシンマーカーを使用した。
【００８２】
この実験研究は、ADACがABR閾値を劇的に向上させることを示した。騒音曝露の停止の6時間後に開始するADACの複数回注射が最も効果的な治療計画であることがわかった。ADACで処置した蝸牛は、脱毛の減少および活性窒素種（RNS）免疫反応性の減少を示した。
【００８３】
実験1：ADACの長時間の騒音曝露に対する効果（全身的な送達）
材料および方法
動物
この研究では8〜10週齢の雄性ウィスターラットを使用した。
【００８４】
実験群
【００８５】
【表１】
2011530585.tif 000003
【００８６】
各ADAC群（n=8）は、媒体溶液で処置した対応する対照群（n=8）を有するものであった。
【００８７】
アデノシンアミン同種物
Ken Jacobson博士（米国ベセスダ（Bethesda）の国立衛生研究所（NIH））からアデノシンアミン同種物（ADAC）を得た。ADAC（2.5 μg）を最初に100 μLの1 NのHClに溶解し、次いで50 mlの0.1 Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH 7.4）に溶解し、50 μg/mLのストック溶液を調製した。この溶液をエッペンドルフチューブ（eppendorf tubes）で1 mLに分注し、後に使用するために-20℃で保管した。必要とする時にADACのアリコートを37℃の水浴中で30分間加熱してから投与した。ADACの注入量は腹腔内で与えた100 μg/kg/日、200 μl/100 g体重であった。
【００８８】
媒体
100 μLの1 NのHCLを50 mlの0.1 Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH 7.4）に溶解させることによって対照の媒体溶液を調製し、エッペンドルフチューブ（eppendorf tubes）を用いて分注し、同様に水浴中で30分間37℃に加熱してから注射した。同一の容積の媒体溶液（200 μl/100 g体重、腹腔内）を対照群に与えた。
【００８９】
騒音曝露
110 dBの音圧レベル（SPL）で24時間与えた8〜12 kHz帯の騒音にラットを曝露させた。これは、内蔵スピーカーおよび外部制御装置（音波発生装置および周波数選択器）を備えた特別注文の音響チャンバー（オーストラリアのシドニーのShelburg Acoustics）中で行った。校正したRion NL-40騒音計（sound level meter）を用いて該チャンバー内部の音の強さを調べ、最小の偏差の音の強さ（110±1 dBの音圧レベル（SPL））を確保した。標準的なラットケージ中の該チャンバーの中に4匹までのラットを入れた。ラットを音響チャンバーに1時間おきに導入し、その結果引き続いて生じるABRのタイミングをすべてのラットについて一致させておくことができた。
【００９０】
聴性脳幹反応
ABRは、音（クリック音または純音）に反応した聴神経および中枢聴覚伝導路（脳幹/中脳の部位）の活性を表す。微細な白金の電極を、対象とする耳の乳様突起部（関電極）、頭頂（不関電極（reference））、および反対側の耳の乳様突起部（接地電極）の皮下に配置することによって、ABRを得た。種々の強さおよび閾値で与える一連の可聴（auditory）クリック音または純音（4〜28 kHz）は、さまざまなレベルの聴覚処理を反映した電気的活性を生じさせる。波形を観察することができなくなるまで音の強さを連続的に減衰させることによって、ABR複合物（I波〜IV波）の音の閾値を測定した。ABRのための音声刺激を生じさせ、反応をTucker-Davis Technologiesの聴覚生理機能のワークステーション（auditory physiology workstation）（米国フロリダ州のAlachua）を用いて記録した。
【００９１】
すべてのABRの測定は、音減衰器チャンバー（sound attenuator chamber）（オーストラリアのシドニーのShelburg Acoustics）中で行った。ラットをケタミン（75 mg/kg）およびキシラジン（10 mg/kg）の混合物を用いて腹腔内で麻酔し、次いで加温パッド上に載せ、体温を37℃に維持した。音程（steps）が2分の1オクターブの、4〜28 kHzの諸周波数の、デジタル方式で生じさせた5 msのトーンピップ音（tone pips）（0.5 msの立ち上がり・立ち下がり時間）を用いてABR電位を誘起した。閾値レベルよりも10 dB下から開始して90 dBの音圧レベル（SPL）まで5 dBのステップ（steps）で音圧レベル（sound pressure level）（SPL）を上昇させた。各騒音レベルで反応を平均化し（刺激の方向性（polarity）を交互に替えた1024回の反復)、ピーク間の振幅が15 μVを超える場合は反応波形を捨てた。ABR閾値を、反応をノイズフロアよりも上に視覚で認めることができる最低の強さ（最も近い5 dBに対する）と定めた。
【００９２】
騒音曝露の前および後ならびにADAC/媒体による処置の後に、ABR閾値を測定した。騒音の後のABRの記録を得て1時間してからラットにその最初のADACまたは媒体の注射を受けさせた。この記録を得たのは、群1、群2、群5および群6については騒音曝露の5時間後であり、群3および群4については騒音曝露の23時間後であった（表２）。最終のABRの測定値は、最後のADAC/媒体の注射の18時間後に得た。
【００９３】
蝸牛の抽出
最後のABRの測定の後、組織学的解析のために、ペントバルビトンを過剰投与することによってラットを殺し、蝸牛を取り出した。分離した蝸牛を4%のパラホルムアルデヒド中で、さらなる処理（被膜剥離または脱灰）まで一晩保存した。
【００９４】
有毛細胞の計数
一晩固定した後、0.1 Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で蝸牛の被膜を剥離し、コルチ器官を分離した。細いピンセットを用いてコルチ器官を取り出し、先端部のターン（turns）、中間部のターン、および基底部のターンに分離した。コルチ器官の全載した（wholemount）組織を24ウェルプレートの中に入れ、次いで1%のトリチオンX（Trition-X）を含む0.1 Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1時間透過処理した。0.1 Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解した1%のAlexa Fluor 488ファロイジン（Invitrogen）を用いて、有毛細胞およびその不動毛を染色した。組織をファロイジンに覆われた状態で40分間インキュベートし、0.1 Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3×10分間洗浄し、CitiFlourを用いてスライドグラス上に載せた。暗視野フィルターならびに100×、20O×および40O×の倍率を用いて、Zeiss落射蛍光顕微鏡を用いてスライドを可視化し、Axiovisionバージョン3.1ソフトウェアで処理した。蝸牛の全長について重複しない画像を撮影し、各ターンについて欠損した外有毛細胞の数を数え、有毛細胞の総数に占める割合として示した。
【００９５】
ニトロチロシン（nitrotyrosine）（NT）免疫組織化学
ラットの蝸牛を4%のパラホルムアルデヒド（PFA）中で一晩固定した後、5%のEDTA溶液中で7日間脱灰し、30%のスクロース（0.1 Mのリン酸緩衝（PB））溶液中で一晩凍結保護した。この蝸牛をN-ペンタン中で急速に凍結させ（snap-frozen）、さらに処理するまで-80℃で保管した。凍結した蝸牛組織を30 μmに凍結切断し（cryosectioned）、無菌の0.1 Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む24ウェルプレート（米国ネーパービル（Naperville）のNalge Nunc Int.）に移し、1%のトリトンX-100で1時間透過処理した。非特異的結合部位を10%の普通のヤギ血清（カリフォルニア州バーリンゲーム（Burlingame）のVector Laboratories）を用いて遮断した。ニトロチロシン抗体（米国ペンシルバニア州プリマス（Plymouth）のBIOMOL Research Laboratories Inc.）を、1.5%の普通のヤギ血清および0.1%のトリトンX-100を含む0.1 Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1：750に希釈した。組織切片を一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。対照のウェルにおいては一次抗体を含めなかった。二次抗体のAlexa 488ヤギ抗マウスIgG結合体（Invitrogen）を、1.5%の普通のヤギ血清および0.1%のトリトンX-100を含む0.1 Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液で1：400に希釈した。組織切片を二次抗体とともに2時間暗所でインキュベートし、次いでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で数回すすぎ、蛍光培地（米国カリフォルニア州カーピンテリア（Carpinteria）のDAKO Corporation）中にマウントし、共焦点顕微鏡（TCS SP2、ドイツのハイデルベルク（Heidelberg）のLeica Leisertechnik GmbH）を用いてNTに特異的な免疫蛍光についてスクリーニングした。画像取得は、ソフトウェアScanware（Leica）によって制御した。一連の6〜10個の光学的断面を試料ごとに収集し、スタック（stack）の中央からの光学的断面で画像解析を行った。対照で処理した蝸牛とADACで処理した蝸牛との間の相対的な染色密度の比較を可能にするために、検出の設定は変えなかった。
【００９６】
統計解析
すべてのデータをMicrosoft ExcelおよびSPSSバージョン15に入力し、これらによって解析した。結果を平均値±平均値の標準誤差（S.E.M.）として示している。不等分散を仮定し、スチューデントの対応のないt検定を用いてABR閾値および有毛細胞の損失についての比較を行った。αの水準はP=0.05とした。
【００９７】
結果
長時間（24時間）の騒音曝露後の可聴閾値
騒音曝露前（ベースライン）、曝露後、およびADACによる処置の後に、ABR閾値を測定した。ベースラインのABR閾値は、すべての群において同程度であった（図１）。騒音曝露後24時間以内の閾値の変化は、可聴クリック音（auditory clicks）および純音について45 dB〜60 dBの範囲に及んだ（図１）。ADACの単回注射で処置した動物は、かなりのABR閾値の回復、すなわち動物が早期の治療（騒音の6時間後）を受けた場合は17〜26 dB、および騒音曝露の24時間後に処置した動物では5〜12 dB、を示した。ADACによる長期間の処置（5日間）は、すべての純音の周波数（22〜28 dB）でABR閾値の均一な回復を示した。同様の効果が、図１に別個の棒グラフとしてプロットした可聴クリック音について認められた。ABR閾値の最も高い回復は、ADACの複数回注射を受けた群において認められ（29 dB±3 dB)（図４および図５）、最も低い回復は騒音曝露の24時間後に単回のADAC注射を受けた群において認められた（8±2 dB)（図３および図５）。媒体溶液で処置した対照群においては、ABR反応は曝露後の閾値と統計的に異なっていなかった（図１）。
【００９８】
閾値の回復
閾値の回復は、曝露後の閾値と処置後の閾値との差である。ADACで処置した群および対照群の比較を図２〜５に示す。
【００９９】
図２は、騒音曝露の6時間後にADACの単回注射により処置したラットの閾値の回復を示す。純音および可聴クリック音について、回復のレベルの点で、これらの群の間に統計的に有意な差があったが（*はp<0.05；**はp<0.01）、回復のレベルは調べた周波数全体にわたって均一ではなく、12 kHzおよび24 kHzで最も低かった。対照動物において観察される聴覚閾値のわずかな回復は、一過性閾値変動（TTS）によるものである。
【０１００】
図３は、ADACの投与の閾値の回復に対する効果が騒音曝露の24時間後ではあまり顕著でないことを示している。
【０１０１】
図４に示したように、聴覚閾値の最大の回復（<25 dB）は、長時間のADACによる処置（5回の注射）に対して認められた。
【０１０２】
ADACの注射はすべての周波数で安定な回復を与えるが、単回のADAC注射は12 kHzおよび24 kHzの純音および可聴クリック音で効果が少ない。図５に示されるように、ADACによる処置を遅く開始すること（曝露の24時間後）は、最も効果の少ない治療計画である。
【０１０３】
有毛細胞の損失
騒音（8〜12 kHz、110 dBのSPL、24時間）に曝露させたコルチ器官の組織学的解析は、基底部上部のターン（turn）および中間部下部のターンは損傷しているが、先端部のターンは影響を受けていないことを示した。コルチ器官の基底部のターンの代表的な例を図６に示す。媒体溶液で処置した対照である騒音に曝露させた蝸牛のコルチ器官は、特に第一の横列における広範囲にわたる外有毛細胞の損失、およびいくらかの内有毛細胞の損失を示した（図６（a））。対照的に、ADACで処置したラットの蝸牛に由来するコルチ器官の表面の標本（図６（b））は、十分に維持された有毛細胞の形態を示した。
【０１０４】
ニトロチロシン（NT）免疫染色
媒体で処理したラットは、コルチ器官および外側溝細胞（outer sulcus cells）においてNT免疫反応性を示した（図７Ａ）。対照的に、ADACで処理した蝸牛の対応する組織においてはNT免疫染色はほとんど観察されなかった（図７Ｂ）。ADACで処理した蝸牛におけるNT免疫反応性の減少は、低いフリーラジカル活性を示すものであった。
【０１０５】
実験2：ADACの急性の騒音曝露に対する効果（全身的な送達）
材料および方法
実験群
【０１０６】
【表２】
2011530585.tif 000004
【０１０７】
動物
この研究では雄性ウィスターラット（8〜10週齢）を使用した。
【０１０８】
処置
実験1と同様にADACおよびアリコートならびに媒体溶液を調製した。
【０１０９】
騒音曝露
110 dBのSPLで2時間与えた8〜12 kHz帯の騒音にラットを曝露させた。騒音曝露は、内蔵スピーカーおよび外部制御装置（音波発生装置および周波数選択器）を備えた特別注文の音響チャンバー（オーストラリアのシドニーのShelburg Acoustics）中で行った。校正したRion NL-40騒音計を用いて該チャンバー内部の音の強さを調べ、最小の偏差の音の強さ（110±1 dBのSPL）を確保した。標準的なラットケージ中の該チャンバーの中に4匹までのラットを入れた。
【０１１０】
聴性脳幹反応
微細な白金の電極を、対象とする耳の乳様突起部（関電極）、頭頂（不関電極（reference））、および反対側の耳の乳様突起部（接地電極）の皮下に配置することによって、ABRを得た。種々の強さおよび閾値で与える一連の可聴クリック音または純音（4〜28 kHz）は、さまざまなレベルの聴覚処理を反映した電気的活性を生じさせる。波形を観察することができなくなるまで音の強さを連続的に減衰させることによって、ABR複合物（I波〜IV波）の音の閾値を測定した。ABRのための音声刺激を生じさせ、反応をTucker-Davis Technologiesの聴覚生理機能のワークステーション（auditory physiology workstation）（米国フロリダ州のAlachua）を用いて記録した。
【０１１１】
すべてのABRの測定は、音減衰器チャンバー（オーストラリアのシドニーのShelburg Acoustics）中で行った。ラットをケタミン（75 mg/kg）およびキシラジン（10 mg/kg）の混合物を用いて腹腔内で麻酔し、次いで加温パッド上に載せ、体温を37℃に維持した。音程（steps）が2分の1オクターブの、4〜28 kHzの諸周波数の、デジタル方式で生じさせた5 msのトーンピップ音（0.5 msの立ち上がり・立ち下がり時間）を用いてABR電位を誘起した。閾値レベルよりも10 dB下から開始して90 dBのSPLまで5 dBのステップ（steps）で音圧レベル（SPL）を上昇させた。各騒音レベルで反応を平均化し（刺激の方向性（polarity）を交互に替えた1024回の反復)、ピーク間の振幅が15 μVを超える場合は反応波形を捨てた。ABR閾値を、反応をノイズフロアよりも上に視覚で認めることができる最低の強さ（最も近い5 dBに対する）と定めた。
【０１１２】
ABRを騒音曝露の30分後および14日後に記録するとともに、ADACによる処置を騒音曝露の停止の6時間後に開始した。
【０１１３】
有毛細胞の計数
実験1と同様に有毛細胞の総数のパーセンテージを測定した。
【０１１４】
統計解析
実験1と同様に統計解析を行った。
【０１１５】
結果
体重および体温
ADACによる処置は、明白なラットの行動変化または体重変化を誘発しなかった（図８（a））。また、ADACの投与後に体温は依然として安定していた（図８（b））。
【０１１６】
急性の騒音への曝露の後の可聴閾値
この研究では、110 dBのSPLで2時間与えた8〜12 kHz帯の騒音にラットを曝露させた。実施例1と同じ治療計画、すなわち24時間間隔で与える5回のADAC注射、を使用した。騒音曝露の前および後（30分および14日）にABRの記録を行った。
【０１１７】
すべての騒音に曝露させた動物は、騒音の30分後に可聴クリック音および純音（4〜28 kHz）について同程度の閾値の変化（32〜60 dB）を示した。最も高い閾値の変化（55〜60 dB）は8〜12 kHzの周波数で認められ、最も損傷を受ける領域を表した。研究の終了時点（騒音の14日後）において、ADACで処置した動物では、媒体で処置した対照と比較して、閾値の変化が減少していた（図９）。閾値の回復は、4〜16 kHzの範囲の純音の周波数で最も高かった（最大で30 dB）。ADACは、急性の騒音に曝露されたラットの難聴を効果的に寛解させた。
【０１１８】
急性の騒音への曝露の後の有毛細胞の損失
コルチ器官の基底部のターン（turns）、中間部のターンおよび先端部のターンにおけるAlexa 488ファロイジン標識した表面の標本において外有毛細胞および内有毛細胞を計数し、各ターンについて欠損した有毛細胞の割合を算出した。有毛細胞の損失についての定量分析を図１０に示す。対照の媒体で処置した動物における欠損した有毛細胞の数は23〜34%の間で変化したが、ADACで処置した動物は中間部の蝸牛のターンおよび基底部の蝸牛のターンにおいて平均してそれぞれ7〜9%の有毛細胞の損失を示した。このように、長期間のADACによる処置は、傷害性騒音曝露の後のコルチ器官における細胞傷害を確実に減少させた。
【０１１９】
以下の実験では、選択的アデノシン受容体アゴニストを正円窓膜（RWM）上に送達し、複合活動電位（compound action potentials）（CAP）、加重電位（summating potentials）（SP）、または聴性脳幹反応（ABR）を使用して、騒音曝露の前および後の蝸牛の機能の効力を測定した。
【０１２０】
実験3−アデノシン、CCPAおよびCGS-21680の急性の騒音への曝露に対する効果（局所送達）
材料および方法
薬物
以下のアデノシン受容体アゴニストおよびアデノシン受容体アンタゴニスト：アデノシン；A1アデノシン受容体アゴニストであるCCPA（2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシン）；A2A受容体アゴニストであるCGS-21680（2-p-(2-カルボキシエチル)フェネチルアミノ-5'-N-エチルカルボキサミドアデノシン塩酸塩水和物）；およびA2A受容体アンタゴニストであるSCH-58261（7-(2-フェニルエチル)-5-アミノ-2-(2-フリル)-ピラゾロ-[4,3-e]-1,2,4-トリアゾロ[1,5-c]ピリミジン）をSigma-Aldrichから購入した。これらの化合物のストック溶液を、人工の外リンパ溶液（artificial perilymph solution）（AP；122 mMのNaCl、18 mMのNaHCO3、5 mMのKCl、0.7 mMのCaCl2、0.5 mMのMgCl2、4 mMのD-グルコース、14 mMのマンニトールを含む5 mMのHEPES、pH 7.5）を用いて調製した。化合物を分注し、-80℃で保管した。
【０１２１】
動物
この実験は、普通のプライエルの反射（Preyer's reflex）を伴う雄性ウィスターラット（8〜10週間）で行った。動物は、Vernon Jansen部（Unit）（ニュージーランドのオークランド大学（University of Auckland））から供給された。この研究において記載したすべての実験手順は、オークランド大学動物倫理委員会（University of Auckland Animal Ethics Committee）によって認可された。
【０１２２】
騒音曝露
ラットを、90 dB、100 dBまたは110 dBのSPLで24時間与えた広帯域の騒音に曝露させた。騒音曝露は、内蔵スピーカーおよび外部制御装置（音波発生装置および周波数選択器）を備えた特別注文の音響チャンバー（オーストラリアのシドニーのShelburg Acoustics）中で行った。校正したRion NL-49騒音計を用いてケージの中の騒音レベルを測定し、最小の偏差の音の強さを確保した。曝露中、動物を食物および水に自由にアクセスさせた。
【０１２３】
アデノシン受容体アゴニストによる蝸牛の灌流および聴覚機能の評価
騒音研究の基礎として、また選択的アデノシン受容体アゴニストの蝸牛に対する一般的効果を判定するために、最初に対照動物において、加重電位（SP；内有毛細胞受容体の電位の尺度）および複合活動電位（CAP；求心性神経（neural afferent）の出力の尺度）を用いて、聴覚機能を評価した。これは、騒音に曝露された動物についての研究の基盤として、通常の蝸牛におけるアデノシン受容体活性化のバックグラウンドの影響を特定するために行った。
【０１２４】
動物を麻酔し（ペントバルビタールナトリウム（sodium pentobarbital）；60 mg/kg、腹腔内）、遠隔恒温制御装置に接続した、サーモスタットで制御された毛布（米国マサチューセッツ州ホリストンのHarvard Apparatus）上に載せて、直腸の熱電対プローブ（Harvard Apparatus）を通じて安定した体温（37.5℃）を維持した。加熱ブロック（heat block）温度調節器に接続した、加熱した（38℃の表面温度）定位固定用頭部ホルダー（ニュージーランドのオークランド大学（University of Auckland）の医用生体工学部門（Bio-Medical Engineering Services））に動物の頭部を配置した。動物を人工呼吸し、腹側外側でのアプローチを用いて鼓胞（auditory bulla）を曝露させた。灌流導管を正円窓膜（RWM）付近に挿入した。Harvard ApparatusのPHD 22/2000シリーズのシリンジポンプを用いて、A1アデノシン受容体アゴニストまたはA2Aアデノシン受容体アゴニストを含む試験溶液で、2.5 ml/分でRWMを灌流した。アデノシン受容体アゴニストのアデノシン（10 mM）、CCPA（1 mM）、CGS-21680（200 μM）を単独で、またはアデノシン受容体アンタゴニストのSCH-58261（200 μM）と共に、90分間灌流した。純音の刺激（4〜28 kHz）に対する、音によって誘起された蝸牛の反応（CAPおよびSP）を、蝸牛の正円窓上に配置した銀線電極（silver wire electrode）で記録した。音刺激を与え、Grass P16前置増幅器（Pre-amplifier）を通じて電位を取得するためのTucker-Davis System IIを用いて、これらの反応を測定した。
【０１２５】
聴性脳幹反応（ABR）
聴覚神経および脳幹聴神経核（brainstem auditory nuclei）の音に誘起された電位を表す聴性脳幹反応（ABR）を用いて、騒音に曝露させた動物の可聴閾値を測定した。ABRの測定値を、騒音曝露の少なくとも24時間前に記録し（ベースライン）、次いで騒音曝露の30分後（処置前）に記録した。次いでアデノシン受容体アゴニストまたは媒体対照を蝸牛の正円窓に送達し（騒音の約6時間後）、次いで薬物投与の48時間後（処置後）にABRの測定を繰り返した。ABRの測定は、音減衰器チャンバー（オーストラリアのシドニーのShelburg Acoustics）中で行った。ラットをケタミン（75 mg/kg）およびキシラジン（10 mg/kg）を用いて麻酔し、記載した加温パッドを用いてその体温を38℃に維持した。微細な白金の電極を、対象とする耳の乳様突起部（関電極）、頭頂（不関電極（reference））、および反対側の耳の乳様突起部（接地電極）の皮下に配置することによって、ABRを得た。種々の強さおよび閾値で与えた一連の可聴（auditory）クリック音または純音（4〜28 kHz）は、さまざまなレベルの聴覚処理を反映した電気的活性を生じさせた。波形が観察されなくなるまで音の強さを連続的に減衰させることによって、ABR複合物（I波〜IV波）の音の閾値を測定した。ABRのための音声刺激を生じさせ、コンピュータに基づくデジタル信号処理のパッケージおよびソフトウェア（BioSig、米国フロリダ州のAlachua）によって制御されたTucker-Davis Technologiesの聴覚生理機能のワークステーション（auditory physiology workstation）（米国フロリダ州のAlachua）を用いて反応を記録した。音程（steps）が2分の1オクターブの、4〜28 kHzの諸周波数の、デジタル方式で生じさせた5 msのトーンピップ音（tone pips）（0.5 msの立ち上がり・立ち下がり時間）を用いてABR電位を誘起した。閾値レベルよりも10 dB下から開始して90 dBのSPLまで5 dBのステップ（steps）で音圧レベル（SPL）を上昇させた。各騒音レベルで反応を平均化し（刺激の方向性（polarity）を交互に替えた1024回の反復)、ピーク間の振幅が15 μVを超える場合は反応波形を捨てた（アーチファクトの排除）。ABR閾値を、反応をノイズフロアよりも上に視覚で認めることができる最低の強さ（最も近い5 dBに対する）と定めた。聴覚評価の後、動物を安楽死させ、フリーラジカルによる障害の免疫組織化学的評価のために蝸牛を収集した。
【０１２６】
アデノシン受容体アゴニストの蝸牛中への投与
広帯域の騒音（110 dBのSPL、24時間）への曝露の6時間後、アデノシン受容体アゴニストを左側の蝸牛の正円窓膜（RWM）に送達し、一方、反対側の耳を未処置の対照とした。ラットをケタミン（75 mg/kg、腹腔内）およびキシラジン（10 mg/kg、腹腔内）で麻酔し、背部でのアプローチによって鼓胞（auditory bulla）を開いて中耳への接近方法を得、蝸牛を無菌条件下で曝露させた。手短に言えば、耳介の内側および後側で切開し、鼓胞の基礎をなしている骨から筋肉を分離した。メスの刃を用いて鼓室胞の後方部に小さな開口部をつくって、RWMを曝露させた。RWMを手術用顕微鏡下で可視化し、10 μLの容積の試験薬物（10 mMのアデノシン；1 mMのCCPA；200 μMのCGS-21680）を含む生理食塩水に浸漬したゼラチンスポンジ（Gelfoam；ミシガン州カラマズー（Kalamazoo）のUpjohn）1個をRWMと直接接触させてその溝の中に配置した。対照実験においては、試験薬物のない生理食塩溶液をRWM上に適用した。次いで該胞を骨セメントで密封し、創傷を縫合し、動物を回復させた。手術の48時間後に聴性脳幹反応を測定した。
【０１２７】
ニトロチロシン免疫組織化学による酸化ストレスの評価
免疫組織化学によって、騒音に曝露させた蝸牛におけるニトロチロシンの形成を評価した。騒音に曝露させたラットの蝸牛および対照のラットの蝸牛を4%のPFA中で一晩固定した後、5%のEDTA溶液中で7日間脱灰し、30%のスクロース（0.1 MのPB）溶液中で一晩凍結保護した。次いでこの蝸牛を0.1 Mのリン酸緩衝液（PB）ですすぎ、イソペンタン中で急速に凍結させ（snap-frozen）、-80℃で保管した（at stored）。その凍結切片（20 μm）を無菌の0.1 Mのリン酸緩衝生理食塩水（PBS、pH 7.4）を含む48ウェルプレート（米国ネーパービル（Naperville）のNalge Nunc Int）中に置き、透過処理し（1%のトリトンX（Triton-X）、1時間）、非特異的結合部位を遮断した（5%の普通のヤギ血清および5%のウシ血清アルブミン）。内在性ペルオキシダーゼの活性を0.3%のH2O2とともに短時間インキュベーションすることによってクエンチした。切片をニトロチロシンに対する市販の抗体（SA-468、米国ペンシルバニア州プリマスミーティング（Plymouth Meeting）のBIOMOL）とともに1:500の希釈度で4℃で一晩インキュベートした。対照反応では、一次抗体を含めなかった。二次ビオチン結合ヤギ抗ウサギIgGを用いて免疫ペルオキシダーゼ反応を検出し、続いてアビジン・ビオチン・ペルオキシダーゼ複合体（ABCキット、Vector Laboratories）およびジアミノベンジジン（DABキット、Vector）を用いて反応を可視化した。ノマルスキー微分干渉コントラスト型オプティクス（Nomarski differential interference contrast optics）を備えた顕微鏡（米国ニューヨーク州ソーンウッド（Thornwood）のZeiss Axioskop）を用いて、免疫染色を観察した。デジタルカメラ（Zeiss Axiocam）でデジタル画像を得、ソフトウェアAxioVision 4.7で処理した。同一の取得パラメータを用いて画像を解析し、ソフトウェアImageJ（米国国立衛生研究所（NIH）、バージョン1.38x）を用いて免疫標識を半定量化した。画像をデコンボリューションして（プラグインのカラーデコンボリューション1.3（Colour Deconvolution 1.3））、DABの染色をバックグラウンドと差異化し、8ビットの画像に変換した。関心領域を選択し、その免疫染色強度のヒストグラムを得、グレースケール変換後の平均ピクセル強度として表した[23]。各群（1つの群につきn=4匹の動物）において、中間部の蝸牛のターン（turn）の15〜32個の画像を二重盲検の様式で解析した。
【０１２８】
統計解析
結果を平均値±平均値の標準誤差（S.E.M）として表す。一元配置分散分析（ANOVA）およびテューキーの（Tukey's）多重比較検定を用いて、統計解析（全周波数にわたる聴覚閾値と治療法との比較）を行った。αの水準は、P=0.05とした。
【０１２９】
結果
アデノシンおよび選択的A1アデノシン受容体アゴニストのCCPAは、騒音曝露後に蝸牛に保護を与える
このセクションの実験では、ラットを11O dBのSPLで24時間広帯域の騒音に曝露させ、騒音曝露の6時間後にRWM上に適用した単一用量のアデノシン受容体アゴニストで処置した。可聴クリック音および純音に対する聴性脳幹反応（ABR）を用いて、処置の48時間後に聴覚閾値の機能評価を行った（図１１）。騒音曝露後（処置前）の、ベースラインからのABR閾値の上昇は、すべての試験した動物において同様であった。RWMへのアデノシンおよび選択的A1アデノシン受容体アゴニストCCPAの投与の48時間後（処置後）、動物は、クリック音および純音について、顕著に向上したABR閾値を示した（図１１の（a）、（c）および（d））。対照的に、CGS-21680または対照である人工の外リンパ（artificial perilymph）（AP）溶液で処置した蝸牛においては、処置後の閾値は不変のままであった（図１１の（b）および（e））。種々の群の閾値の回復を図１１の（f）に示す。アデノシンで処置した動物は、クリック音については18 dB、および純音については最大で19 dBの閾値の回復（16 kHz；p<0.01、一元配置分散分析（ANOVA））を示した。CCPAで処置した動物は、クリック音については20 dB、および純音については最大で20 dBのABR閾値の回復を示した（図１１の（f））。媒体溶液で処置した対照動物においては、わずかな量の閾値の回復（1〜7 dB）があった。選択的A2A受容体アゴニストのCGS-21680の投与は、閾値の回復に影響を及ぼさなかった（図１１の（f））。
【０１３０】
アデノシン受容体アゴニストによる可聴閾値のベースラインの測定
対照研究において、蝸牛の灌流の前（ベースライン）、対照のAPの灌流の後、およびアデノシン受容体アゴニストの灌流の後に、加重電位（SP）および複合活動電位（CAP）の閾値を測定して、種々の選択的アデノシン受容体アゴニストの、ベースラインの蝸牛機能に対する一般的効果を、蝸電図法によって評価した。ベースラインでの閾値およびAPの灌流の後の閾値は、各組の実験において同程度であった（図１２）。アデノシン（10 mM）および選択的A1アデノシン受容体アゴニストのCCPA（1 mM）は、SPの閾値に影響を及ぼさなかったが（図１２の（a）および（b））、選択的A2AアゴニストのCGS-21680は、16 kHzでSPの閾値を5 dB減少させた（図１２の（c））（p<0.01、テューキーの（Tukey's）多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ANOVA））。この減少は、A2A受容体アンタゴニストのSCH-58261によって阻害された（図１２の（d））。CAPの閾値は、アデノシンによっても、またどのような選択的アデノシン受容体アゴニストによっても、変化しなかった（データは示していない）。全体的に見て、選択的アデノシン受容体アゴニストの蝸牛に対する影響は、有毛細胞または神経のレベルで、非常に制限されていた。
【０１３１】
騒音に曝露させた蝸牛におけるニトロチロシン免疫反応性
活性窒素種/活性酸素種による組織障害のマーカーとして、騒音に曝露させた蝸牛におけるニトロチロシン形成を用いた。最も強いニトロチロシン免疫染色は、内側溝細胞（inner sulcus cells）および支持するヘンゼン細胞（Hensen's cells）において見られた（図１３のＡ）。ニトロチロシン免疫反応性はまた、他の上皮細胞裏層の中央階（コルチ器官における、支持するクラウディウス（Claudius）細胞、ダイテルス（Dieters'）細胞、および柱細胞）においても観察された。感覚有毛細胞においては、染色はほとんど観察されなかった。らせん靱帯、血管条およびらせん神経節細胞は、染色されていなかった（データは示していない）。騒音に曝露させていない蝸牛においては、および一次抗体を含めなかった場合には、免疫標識はなかった（図１３のＡ）。
【０１３２】
ニトロチロシン免疫染色の分布は、すべての騒音に曝露させた蝸牛において、同様であった。一般に、媒体で処置した対照と比較して、アデノシンまたはCCPAで処置した蝸牛においては、免疫標識の強度が低かった（図１３のＡ、Ｂ）。アデノシンで処置した蝸牛においては、AP対照と比較して、特にヘンゼン（Hensen's）細胞および内側溝細胞（inner sulcus cells）において、平均ピクセル強度が30〜42%減少した（p<0.01、一元配置分散分析（ANOVA））。同様に、CCPAで処置した蝸牛、特にダイテルス（Dieters'）細胞および内側溝細胞（inner sulcus cells）においては、ニトロチロシン免疫染色の強度が22〜45%減少した（p<0.01、一元配置分散分析（ANOVA）。
【０１３３】
結論
これらの実施例は、A1アデノシン受容体の刺激が、騒音によって誘発された蝸牛損傷を軽減することを示している。
【０１３４】
騒音曝露後のA1アデノシン受容体アゴニストによる処置は、有意な聴覚閾値の回復をもたらす。騒音曝露の6時間後に開始する早期の治療は、騒音曝露の24時間後に開始する遅い治療よりも、大きな回復を提供する。長時間の治療（5回の注射）は、聴覚閾値の最高の回復を提供し、臨床環境における治療上のアプローチとして推奨される。
【０１３５】
これらの実施例はまた、実験1および実験2におけるADACなどのA1アデノシン受容体アゴニストの全身的投与が、有意な聴覚閾値の回復をもたらすことも示している。さらに、これらの実施例は、A1アデノシン受容体アゴニスト（例えばアデノシン（非選択的アデノシン受容体アゴニスト）およびCCPA（選択的A1アデノシン受容体アゴニスト））の正円窓膜上への局所的投与が、可聴閾値を向上させ、コルチ器官における細胞傷害を減少させることを示している。
【０１３６】
感覚有毛細胞の生存は、A1アデノシン受容体アゴニストのADACの投与によって増加する。蝸牛における有毛細胞損失の減少およびニトロチロシン活性の減少は、騒音によって誘発される蝸牛損傷の後のA1アデノシン受容体アゴニストの細胞保護および抗酸化の役割を強く支持している。
【０１３７】
ニトロチロシン免疫化学（nytrotyrosine immunochemistry）（NT）を蝸牛における酸化ストレスの分析に使用した。NTは、蝸牛におけるフリーラジカルによる障害のマーカーとしてしばしば使用される[20、21]。NTの免疫染色の全体的な強度は、ADACで処理した蝸牛において、バックグラウンドレベルにまで減少し、ADACの抗酸化活性が強いことを示唆した。RWM上に適用したアデノシンもまた、NTの免疫染色の強度を減少させた。
【０１３８】
ADACでの処置による、体重の減少、または摂食行動もしくは飲水行動における変化、または低体温などの、全身毒性の徴候は、観察されなかった。
【０１３９】
これまでの研究は、アデノシン受容体に作用した薬物は、騒音または耳毒性薬物によって誘発される蝸牛損傷を予防することができるため、予防的に有用であることを実証している。この研究の実験結果は、アデノシン受容体アゴニストが騒音性難聴の治療効果を有することを示している。A1受容体は、内有毛細胞およびらせん神経節細胞（spiral ganglion neurons）に戦略的に局在化され、これらの細胞の生存は、騒音ストレスからの蝸牛の回復にきわめて重要である。
【０１４０】
提示した実験的証拠は、A1アデノシン受容体の活性化が蝸牛の感覚神経組織の障害を減少させ、聴覚閾値の機能回復をもたらすことを示唆している。提示した実験的証拠はまた、投与は全身的であってもよく、局所的であってもよいことも示唆している。
【０１４１】
これらの実験例は、アデノシン、ADACおよびCCPAなどの、A1アデノシン受容体アゴニストは、少なくとも2〜24時間の11O dBを越えない音圧レベルで、騒音によって誘発されるヒトの内耳の損傷の、価値ある薬理学的治療薬となることを強く示唆している。実験例に基づき、本発明者らは、A1アデノシン受容体アゴニストは、急性の騒音またはインパルス騒音への曝露の場合、および長時間の過度の騒音への曝露の場合にも、使用することができると考えている。治療は、音響性外傷の後、できるだけ早く開始するべきであり、治療は、好ましい投与経路のうちの1つを用いて少なくとも5日間継続するべきである。騒音性難聴の治療を必要とする患者に対する利益は、重要である。こうした治療の利益を、A1アデノシン受容体アゴニストの使用によって、かかる患者に提供することができるということは、そうした利益の重要性を考慮すると、驚くべきことである。
【０１４２】
前記は、本発明の好ましい形態を含む本発明を説明している。当業者に容易に明らかとなる変更形態および修正形態は、開示した本発明の範囲の中に含まれることを意図している。
【０１４３】
本明細書中でのいかなる先行技術への言及も、その先行技術が、任意の特定の国において、一般的な通常の知識の一部を形成することを、承認するもの、または何らかのかたちで示唆するものと解釈されず、また解釈するべきではない。
【０１４４】
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24. Jacobsen K. A.およびZhan-Guo, Adenosine receptors as therapeutic targets, Nature, March 2006, 250
【図１（ａ）（ｂ）】
2011530585.tif 000005
【図１（ｃ）（ｄ）】
2011530585.tif 000006
【図１（ｅ）（ｆ）】
2011530585.tif 000007
【図１（ｇ）（ｈ）】
2011530585.tif 000008
【図２】
2011530585.tif 000009
【図３】
2011530585.tif 000010
【図４】
2011530585.tif 000011
【図５】
2011530585.tif 000012
【図６】
2011530585.tif 000013
【図７】
2011530585.tif 000014
【図８】
2011530585.tif 000015
【図９】
2011530585.tif 000016
【図１０】
2011530585.tif 000017
【図１１】
2011530585.tif 000018
【図１２】
2011530585.tif 000019
【図１３】
2011530585.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月10日(2010.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
（発明の概要）
第一態様の本発明は、騒音曝露後の騒音性難聴の治療方法を提供し、該方法はA1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストは、N6-シクロペンチルアデノシン（N6-cyclopentyl adenosine）（CPA）、2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシン（2-Chloro-N6-cyclopentyl adenosine）（CCPA）、S-N6-(2-endo-ノルボルニル)アデノシン（S-N6-(2-endo-norbornyl)adenosine）[S(-)-ENBA]、アデノシンアミン同種物（adenosine amine congener）（ADAC）、（[1S-[1a,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-クロロ-2-チエニル)-1-メチルプロピル]アミノ]-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジル-3-イル]シクロペンタンカルボキサミド)（AMP 579）、N-[R-(2-ベンゾチアゾリル)チオ-2-プロピル]-2-クロロアデノシン（NNC-21-0136）、N-[(1S, trans)-2-ヒドロキシシクロペンチル]アデノシン（GR79236）、N-(3(R)-テトラヒドロフラニル)-6-アミノプリンリボシド（CVT-510、テカデノソン（Tecadeonson））、N6-シクロヘキシル-2-O-メチルアデノシン（SDZ WAG 994）、およびN6-シクロペンチル-N5’-エチルアデノシン-5’-ウロンアミド（セロデノソン）を含む群から選択されることが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
第三態様の本発明は、騒音曝露後の騒音性難聴の治療のための医薬の製造におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストは、N6-シクロペンチルアデノシン（CPA）、2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシン（CCPA）、S-N6-(2-endo-ノルボルニル)アデノシン[S(-)-ENBA]、アデノシンアミン同種物（ADAC）、（[1S-[1a,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-クロロ-2-チエニル)-1-メチルプロピル]アミノ]-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジル-3-イル]シクロペンタンカルボキサミド)（AMP 579）、N-[R-(2-ベンゾチアゾリル)チオ-2-プロピル]-2-クロロアデノシン（NNC-21-0136）、N-[(1S, trans)-2-ヒドロキシシクロペンチル]アデノシン（GR79236）、N-(3(R)-テトラヒドロフラニル)-6-アミノプリンリボシド（CVT-510、テカデノソン（Tecadeonson））、N6-シクロヘキシル-2-O-メチルアデノシン（SDZ WAG 994）、およびN6-シクロペンチル-N5’-エチルアデノシン-5’-ウロンアミド（セロデノソン）を含む群から選択されることが好ましい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
第五態様の本発明は、ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体（chemical variants）を含むADACの、騒音曝露後の騒音性難聴の治療のための医薬の製造における使用を提供する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
第七態様の本発明は、ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体（chemical variants）を含むADACを哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の騒音曝露後の騒音性難聴の治療方法を提供する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
【図１（ａ）（ｂ）】図１は、110 dBの音圧レベル（SPL）で8〜12 kHz帯の騒音に24時間曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を示す。ABRを純音（4〜24 kHz）および可聴クリック音（auditory clicks）に対する反応として測定した。騒音曝露の6時間後もしくは24時間後に単回注射として、または騒音の6時間後に始める24時間ごとに投与する5回の注射として（長期間の処置）、ADAC（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、薬物媒体の注射剤をADACと同じ間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群についてn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；対応のないt検定。
【図１（ｃ）（ｄ）】図１は、110 dBの音圧レベル（SPL）で8〜12 kHz帯の騒音に24時間曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を示す。ABRを純音（4〜24 kHz）および可聴クリック音（auditory clicks）に対する反応として測定した。騒音曝露の6時間後もしくは24時間後に単回注射として、または騒音の6時間後に始める24時間ごとに投与する5回の注射として（長期間の処置）、ADAC（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、薬物媒体の注射剤をADACと同じ間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群についてn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；対応のないt検定。
【図１（ｅ）（ｆ）】図１は、110 dBの音圧レベル（SPL）で8〜12 kHz帯の騒音に24時間曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を示す。ABRを純音（4〜24 kHz）および可聴クリック音（auditory clicks）に対する反応として測定した。騒音曝露の6時間後もしくは24時間後に単回注射として、または騒音の6時間後に始める24時間ごとに投与する5回の注射として（長期間の処置）、ADAC（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、薬物媒体の注射剤をADACと同じ間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群についてn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；対応のないt検定。
【図１（ｇ）（ｈ）】図１は、110 dBの音圧レベル（SPL）で8〜12 kHz帯の騒音に24時間曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を示す。ABRを純音（4〜24 kHz）および可聴クリック音（auditory clicks）に対する反応として測定した。騒音曝露の6時間後もしくは24時間後に単回注射として、または騒音の6時間後に始める24時間ごとに投与する5回の注射として（長期間の処置）、ADAC（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、薬物媒体の注射剤をADACと同じ間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群についてn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；対応のないt検定。
【図２】図２は、騒音曝露の6時間後にADACまたは対照溶液の単回注射で処置したラットの閾値の回復（聴性脳幹反応、ABR）を示す。（a）は純音、（b）は可聴クリック音。*はp<0.05；**はp<0.01。動物数：1つの群につきn=8。
【図３】図３は、騒音曝露の24時間後にADACまたは対照溶液の単回注射を受けたラットにおける閾値の回復（ABR）を示す。（a）は純音、（b）は可聴クリック音。*はp<0.05；**はp<0.01。動物数：1つの群につきn=8。
【図４】図４は、（a）ADACまたは対照溶液の5回の注射により処置した群における閾値の回復（ABR）を示す。（a）は純音、（b）は可聴クリック音。***はp<0.001。動物数：1つの群につきn=8。
【図５】図５は、ABR閾値の回復についての異なるADAC処置の比較を示す。（a）は純音のオーディオグラム、（b）は可聴クリック音。動物数：1つの群につきn=8。
【図６】図６は、（a）ADACおよび（b）媒体溶液で処置した後のラットのコルチ器官（ファロイジン染色）を示す。内有毛細胞（IHC）；外有毛細胞の横列1、2、3（OHC1、OHC2、OHC3）。
【図７】図７は、（A）対照および（B）ADACで処理した蝸牛のコルチ器官におけるニトロチロシン免疫染色を示す。クラウディウス細胞（Claudius cells）（cc）；内有毛細胞（inner hair cells）（ihc）；外側溝細胞（outer sulcus cells）（osc）；血管条（stria vascularis）（sv）；らせん神経節細胞（spiral ganglion neurones）（sgn）。
【図８】図８は、ADAC（100 μg/kg）で処置した動物の体重および体温を示す。A．体重は騒音曝露の直前および騒音曝露の14日後に測定した。B．直腸温度（℃）を、ADACの投与前ならびに注射の30分後および60分後に測定した。動物数：1つの群につきn=8。
【図９】図９は、110 dBの音圧レベル（SPL）で2時間8〜12 kHz帯の騒音に曝露（急性の騒音への曝露）させた後のラットのABR閾値の変化を示す。騒音曝露の前に、および騒音曝露後に時間間隔をおいて（30分および14日）、可聴クリック音および純音（4〜28 kHz）に対する反応として、ABRを測定した。騒音の6時間後に開始する24時間間隔で、5回のADAC注射（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、媒体溶液の注射剤をADACと同じ時間間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群につきn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；対応のないt検定。
【図１０】図１０は、2時間騒音に曝露させた蝸牛の有毛細胞の損失率を示す。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群につきn=8。*はp<0.05、***はp<0.001；対応のないt検定。
【図１１】図１１は、11O dBの音圧レベル（SPL）で24時間、広帯域の騒音に曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（ABR）を示す。ABRは、騒音曝露の前（ベースライン）、騒音曝露の30分後（処置前）、およびアデノシン受容体アゴニストの投与の48時間後（処置後）に、可聴クリック音（a）および純音（b〜e）に対する反応として、測定した。すべての薬物は、蝸牛の正円窓膜上に送達した（f）。閾値の回復を、処置後のABRから処置前のABRを引いたものと定めた。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している（n=8）。*はp<0.05；**はp<0.01；***はp<0.001；テューキーの（Tukey's）多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ANOVA）。APは人工の外リンパ（artificial perilymph）（対照）；非選択的アデノシン受容体アゴニストであるアデノシン（1O mM）；選択的A1アデノシン受容体アゴニストであるCCPA（1 mM）；選択的A2A受容体アゴニストであるCGS-21680（0.2 mM）。
【図１２】図１２は、周囲騒音レベル（約6O dBの音圧レベル（SPL））に置かれたラットにおける、アデノシン受容体アゴニストおよびアデノシン受容体アンタゴニストの加重電位（summating potentials）（SP）に対する影響を示す。人工の外リンパを灌流する前（AP；ベースライン）、APを灌流した後、ならびにアデノシン受容体アゴニストのアデノシンおよびCCPAと共に灌流した後に、4〜26 kHzにわたる周波数で、内有毛細胞受容体の電位を表すSPの閾値を測定した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として示している（n=8）。*はp<0.05、**はp<0.01；テューキーの（Tukey's）多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ANOVA）。APは人工の外リンパ（対照）；非選択的アデノシン受容体アゴニストであるアデノシン（1O mM）；選択的A1アデノシン受容体アゴニストであるCCPA（1 mM）；選択的A2A受容体アゴニストであるCGS-21680（0.2 mM）；選択的A2A受容体アンタゴニストであるSCH-58261。
【図１３】図１３は、（A）アデノシン受容体アゴニスト（アデノシン、CCPA）または媒体溶液（AP）で処置した、騒音に曝露させた蝸牛における、ニトロチロシンの免疫染色を示す。ニトロチロシン抗体を含めなかった場合、免疫染色は認められなかった。（B）ニトロチロシンの免疫反応性についての半定量分析。略語：ccはクラウディウス細胞（Claudius cells）；dcはダイテルス細胞（Deiters' cells）；hcはヘンゼン細胞（Hensen's cells）；idcは歯間細胞（interdental cells）；isは内側溝細胞（inner sulcus cells）；ihcは内有毛細胞（inner hair cells）；ohcは外有毛細胞（outer hair cells）；opeは外柱細胞（outer pillar cells）。スケールバー：50 μm。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している（1つの群につきn=4匹の動物）。**はp<0.01；***はp<0.001；テューキーの（Tukey's）多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ANOVA）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
本発明の好ましい実施態様によるA1アデノシン受容体アゴニストは、選択的A1アデノシン受容体アゴニストとなる。適切な選択的A1アデノシン受容体は、N6-シクロペンチルアデノシン（CPA）、2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシン（CCPA）、S-N6-(2-endo-ノルボルニル)アデノシン[S(-)-ENBA]、アデノシンアミン同種物（ADAC）、（[1S-[1a,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-クロロ-2-チエニル)-1-メチルプロピル]アミノ]-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジル-3-イル]シクロペンタンカルボキサミド)（AMP 579）、N-[R-(2-ベンゾチアゾリル)チオ-2-プロピル]-2-クロロアデノシン（NNC-21-0136）、N-[(1S, trans)-2-ヒドロキシシクロペンチル]アデノシン（GR79236）、N-(3(R)-テトラヒドロフラニル)-6-アミノプリンリボシド（CVT-510、テカデノソン（Tecadeonson））、N6-シクロヘキシル-2-O-メチルアデノシン（SDZ WAG 994）、およびN6-シクロペンチル-N5’-エチルアデノシン-5’-ウロンアミド（セロデノソン）を含む群から選択することができる。特に好ましい実施態様において、選択的A1アデノシン受容体アゴニストはCCPAとなる。より特に好ましい実施態様において、選択的A1アデノシン受容体アゴニストはADACとなる。
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月5日(2010.7.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
A1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む、騒音曝露後の騒音性難聴の治療方法。
【請求項２】
A1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む、騒音曝露後の蝸牛の組織傷害の治療方法。
【請求項３】
A1アデノシン受容体アゴニストが選択的A1アデノシン受容体アゴニストである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストが、N6-シクロペンチルアデノシン（CPA）、2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシン（CCPA）、S-N6-(2-endo-ノルボルニル)アデノシン[S(-)-ENBA]、アデノシンアミン同種物（ADAC）、（[1S-[1a,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-クロロ-2-チエニル)-1-メチルプロピル]アミノ]-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジル-3-イル]シクロペンタンカルボキサミド)（AMP 579）、N-[R-(2-ベンゾチアゾリル)チオ-2-プロピル]-2-クロロアデノシン（NNC-21-0136）、N-[(1S, trans)-2-ヒドロキシシクロペンチル]アデノシン（GR79236）、N-(3(R)-テトラヒドロフラニル)-6-アミノプリンリボシド（CVT-510、テカデノソン（Tecadeonson））、N6-シクロヘキシル-2-O-メチルアデノシン（SDZ WAG 994）、およびN6-シクロペンチル-N5’-エチルアデノシン-5’-ウロンアミド（セロデノソン）を含む群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストがADACである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストがCCPAである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
A1アデノシン受容体アゴニストが非選択的A1アデノシン受容体アゴニストである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項８】
非選択的A1アデノシン受容体アゴニストがアデノシンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
A1アデノシン受容体アゴニストが全身的に投与される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
A1アデノシン受容体アゴニストが蝸牛の正円窓膜上に局所的に投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
A1アデノシン受容体アゴニストが急性の騒音またはインパルス騒音に曝露された患者に投与される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
A1アデノシン受容体アゴニストが長期間の過度の騒音に曝露された患者に投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
A1アデノシン受容体アゴニストが過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
A1アデノシン受容体アゴニストが過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
A1アデノシン受容体アゴニストが、過度の騒音への曝露の後、A1アデノシン受容体アゴニストを1回よりも多く投与することを含む投与計画に従って投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
A1アデノシン受容体アゴニストが、最初の投与が過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与される投与計画に従って投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
A1アデノシン受容体アゴニストが、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与される投与計画に従って投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
A1アデノシン受容体アゴニストが、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与され、かつ残りの投与が最初の投与時から24時間間隔で単回投与として投与される投与計画に従って投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
A1アデノシン受容体アゴニストが、A1アデノシン受容体アゴニストを少なくとも5回投与することを含む投与計画に従って投与される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
過度の騒音への曝露が、24時間の110 dBの音圧レベルという騒音レベルの騒音を超えないものである、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
騒音曝露後の騒音性難聴の治療のための医薬の製造におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用。
【請求項２２】
騒音曝露後の蝸牛におけるフリーラジカルによる障害を減少させるための医薬の製造におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用。
【請求項２３】
A1アデノシン受容体アゴニストが選択的A1アデノシン受容体アゴニストである、請求項２１または請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストが、N6-シクロペンチルアデノシン（CPA）、2-クロロ-N6-シクロペンチルアデノシン（CCPA）、S-N6-(2-endo-ノルボルニル)アデノシン[S(-)-ENBA]、アデノシンアミン同種物（ADAC）、（[1S-[1a,2b,3b,4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-クロロ-2-チエニル)-1-メチルプロピル]アミノ]-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジル-3-イル]シクロペンタンカルボキサミド)（AMP 579）、N-[R-(2-ベンゾチアゾリル)チオ-2-プロピル]-2-クロロアデノシン（NNC-21-0136）、N-[(1S, trans)-2-ヒドロキシシクロペンチル]アデノシン（GR79236）、N-(3(R)-テトラヒドロフラニル)-6-アミノプリンリボシド（CVT-510、テカデノソン（Tecadeonson））、N6-シクロヘキシル-2-O-メチルアデノシン（SDZ WAG 994）、およびN6-シクロペンチル-N5’-エチルアデノシン-5’-ウロンアミド（セロデノソン）を含む群から選択される、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストがADACである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
選択的A1アデノシン受容体アゴニストがCCPAである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
A1アデノシン受容体アゴニストが非選択的A1アデノシン受容体アゴニストである、請求項２１または請求項２２に記載の使用。
【請求項２８】
非選択的A1アデノシン受容体アゴニストがアデノシンである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
医薬が急性の騒音またはインパルス騒音に曝露された患者に投与するために製剤化されている、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
医薬が長期間の過度の騒音に曝露された患者に投与するために製剤化されている、請求項２１〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
医薬が過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与するために製剤化されている、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
医薬が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与するために製剤化されている、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３３】
医薬がA1アデノシン受容体アゴニストを1回よりも多く投与することを含む投与計画に従った投与のために製剤化されている、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
医薬が、最初の投与が過度の騒音への曝露から約24時間以内に投与される投与計画に従った投与のために製剤化されている、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
医薬が、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与される投与計画に従った投与のために製剤化されている、請求項３３に記載の使用。
【請求項３６】
医薬が、最初の投与が過度の騒音への曝露から約6時間以内に投与され、かつ残りの投与が最初の投与時から24時間間隔で単回投与として投与される投与計画に従った投与のために製剤化されている、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
医薬がA1アデノシン受容体アゴニストを少なくとも5回投与することを含む投与計画に従った投与のために製剤化されている、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
過度の騒音への曝露が、24時間の110 dBの音圧レベルという騒音レベルの騒音を超えないものである、請求項２１〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３９】
医薬が全身的に投与されるように製造されている、請求項２１〜３８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４０】
医薬が蝸牛の正円窓膜上に局所的に投与されるように製造されている、請求項２１〜３８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
医薬が騒音曝露後の蝸牛におけるグルタミン酸興奮毒性を減少させるものである、請求項２１〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
医薬が蝸牛への血流量および酸素供給を増大させるものである、請求項２１〜４１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４３】
ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体を含むADACの、騒音曝露後の騒音性難聴の治療のための医薬の製造における使用。
【請求項４４】
ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体を含むADACの、騒音曝露後の蝸牛におけるフリーラジカルによる障害を減少させるための医薬の製造における使用。
【請求項４５】
ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体を含むADACを哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物の騒音曝露後の騒音性難聴の治療方法。
【請求項４６】
ADACの互変異性型、立体異性体、多形体、薬学的に許容される塩、および／もしくは薬学的に許容される溶媒和物、ならびに／または化学的変異体を含むADACを哺乳動物に投与する工程を含む、騒音曝露後の哺乳動物における蝸牛の組織傷害の治療方法。
【請求項４７】
実施例および図面に対する特段の参照と共に本明細書中に実質的に記載した、A1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む騒音性難聴の治療方法。
【請求項４８】
実施例および図面に対する特段の参照と共に本明細書中に実質的に記載した、騒音性難聴の治療のための医薬の製造におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用。
【請求項４９】
実施例および図面に対する特段の参照と共に本明細書中に実質的に記載した、騒音曝露後の蝸牛におけるフリーラジカルによる障害を減少させるための医薬の製造におけるA1アデノシン受容体アゴニストの使用。
【請求項５０】
実施例および図面に対する特段の参照と共に本明細書中に実質的に記載した、A1アデノシン受容体アゴニストを投与する工程を含む騒音曝露後の蝸牛の組織傷害の治療方法。
【手続補正書】
【提出日】平成23年4月12日(2011.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
【図１（ａ）（ｂ）】図１は、110 dBの音圧レベル（SPL）で8〜12 kHz帯の騒音に24時間曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を示す。ABRを純音（4〜24 kHz）および可聴クリック音（auditory clicks）に対する反応として測定した。騒音曝露の6時間後もしくは24時間後に単回注射として、または騒音の6時間後に始める24時間ごとに投与する5回の注射として（長期間の処置）、ADAC（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、薬物媒体の注射剤をADACと同じ間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群についてn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；***はp<0.001；対応のないt検定。
【図１（ｃ）（ｄ）】図１は、110 dBの音圧レベル（SPL）で8〜12 kHz帯の騒音に24時間曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を示す。ABRを純音（4〜24 kHz）および可聴クリック音（auditory clicks）に対する反応として測定した。騒音曝露の6時間後もしくは24時間後に単回注射として、または騒音の6時間後に始める24時間ごとに投与する5回の注射として（長期間の処置）、ADAC（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、薬物媒体の注射剤をADACと同じ間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群についてn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；***はp<0.001；対応のないt検定。
【図１（ｅ）（ｆ）】図１は、110 dBの音圧レベル（SPL）で8〜12 kHz帯の騒音に24時間曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を示す。ABRを純音（4〜24 kHz）および可聴クリック音（auditory clicks）に対する反応として測定した。騒音曝露の6時間後もしくは24時間後に単回注射として、または騒音の6時間後に始める24時間ごとに投与する5回の注射として（長期間の処置）、ADAC（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、薬物媒体の注射剤をADACと同じ間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群についてn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；***はp<0.001；対応のないt検定。
【図１（ｇ）（ｈ）】図１は、110 dBの音圧レベル（SPL）で8〜12 kHz帯の騒音に24時間曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（auditory brainstem responses）（ABR）を示す。ABRを純音（4〜24 kHz）および可聴クリック音（auditory clicks）に対する反応として測定した。騒音曝露の6時間後もしくは24時間後に単回注射として、または騒音の6時間後に始める24時間ごとに投与する5回の注射として（長期間の処置）、ADAC（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、薬物媒体の注射剤をADACと同じ間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群についてn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；***はp<0.001；対応のないt検定。
【図２】図２は、騒音曝露の6時間後にADACまたは対照溶液の単回注射で処置したラットの閾値の回復（聴性脳幹反応、ABR）を示す。（a）は純音、（b）は可聴クリック音。*はp<0.05；**はp<0.01。動物数：1つの群につきn=8。
【図３】図３は、騒音曝露の24時間後にADACまたは対照溶液の単回注射を受けたラットにおける閾値の回復（ABR）を示す。（a）は純音、（b）は可聴クリック音。*はp<0.05；**はp<0.01。動物数：1つの群につきn=8。
【図４】図４は、（a）ADACまたは対照溶液の5回の注射により処置した群における閾値の回復（ABR）を示す。（a）は純音、（b）は可聴クリック音。***はp<0.001。動物数：1つの群につきn=8。
【図５】図５は、ABR閾値の回復についての異なるADAC処置の比較を示す。（a）は純音のオーディオグラム、（b）は可聴クリック音。動物数：1つの群につきn=8。
【図６】図６は、（a）ADACおよび（b）媒体溶液で処置した後のラットのコルチ器官（ファロイジン染色）を示す。内有毛細胞（IHC）；外有毛細胞の横列1、2、3（OHC1、OHC2、OHC3）。
【図７】図７は、（A）対照および（B）ADACで処理した蝸牛のコルチ器官におけるニトロチロシン免疫染色を示す。クラウディウス細胞（Claudius cells）（cc）；内有毛細胞（inner hair cells）（ihc）；外側溝細胞（outer sulcus cells）（osc）；血管条（stria vascularis）（sv）；らせん神経節細胞（spiral ganglion neurones）（sgn）。
【図８】図８は、ADAC（100 μg/kg）で処置した動物の体重および体温を示す。A．体重は騒音曝露の直前および騒音曝露の14日後に測定した。B．直腸温度（℃）を、ADACの投与前ならびに注射の30分後および60分後に測定した。動物数：1つの群につきn=8。
【図９】図９は、110 dBの音圧レベル（SPL）で2時間8〜12 kHz帯の騒音に曝露（急性の騒音への曝露）させた後のラットのABR閾値の変化を示す。騒音曝露の前に、および騒音曝露後に時間間隔をおいて（30分および14日）、可聴クリック音および純音（4〜28 kHz）に対する反応として、ABRを測定した。騒音の6時間後に開始する24時間間隔で、5回のADAC注射（100 μg/kg、腹腔内）を投与した。対照群においては、媒体溶液の注射剤をADACと同じ時間間隔で投与した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群につきn=8。*はp<0.05；**はp<0.01；対応のないt検定。
【図１０】図１０は、2時間騒音に曝露させた蝸牛の有毛細胞の損失率を示す。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している。動物数：1つの群につきn=8。*はp<0.05、***はp<0.001；対応のないt検定。
【図１１】図１１は、11O dBの音圧レベル（SPL）で24時間、広帯域の騒音に曝露させたラットにおける聴性脳幹反応（ABR）を示す。ABRは、騒音曝露の前（ベースライン）、騒音曝露の30分後（処置前）、およびアデノシン受容体アゴニストの投与の48時間後（処置後）に、可聴クリック音（a）および純音（b〜e）に対する反応として、測定した。すべての薬物は、蝸牛の正円窓膜上に送達した（f）。閾値の回復を、処置後のABRから処置前のABRを引いたものと定めた。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している（n=8）。*はp<0.05；**はp<0.01；***はp<0.001；テューキーの（Tukey's）多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ANOVA）。APは人工の外リンパ（artificial perilymph）（対照）；非選択的アデノシン受容体アゴニストであるアデノシン（1O mM）；選択的A1アデノシン受容体アゴニストであるCCPA（1 mM）；選択的A2A受容体アゴニストであるCGS-21680（0.2 mM）。
【図１２】図１２は、周囲騒音レベル（約6O dBの音圧レベル（SPL））に置かれたラットにおける、アデノシン受容体アゴニストおよびアデノシン受容体アンタゴニストの加重電位（summating potentials）（SP）に対する影響を示す。人工の外リンパを灌流する前（AP；ベースライン）、APを灌流した後、ならびにアデノシン受容体アゴニストのアデノシンおよびCCPAと共に灌流した後に、4〜26 kHzにわたる周波数で、内有毛細胞受容体の電位を表すSPの閾値を測定した。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として示している（n=8）。*はp<0.05、**はp<0.01；テューキーの（Tukey's）多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ANOVA）。APは人工の外リンパ（対照）；非選択的アデノシン受容体アゴニストであるアデノシン（1O mM）；選択的A1アデノシン受容体アゴニストであるCCPA（1 mM）；選択的A2A受容体アゴニストであるCGS-21680（0.2 mM）；選択的A2A受容体アンタゴニストであるSCH-58261。
【図１３】図１３は、（A）アデノシン受容体アゴニスト（アデノシン、CCPA）または媒体溶液（AP）で処置した、騒音に曝露させた蝸牛における、ニトロチロシンの免疫染色を示す。ニトロチロシン抗体を含めなかった場合、免疫染色は認められなかった。（B）ニトロチロシンの免疫反応性についての半定量分析。略語：ccはクラウディウス細胞（Claudius cells）；dcはダイテルス細胞（Deiters' cells）；hcはヘンゼン細胞（Hensen's cells）；idcは歯間細胞（interdental cells）；isは内側溝細胞（inner sulcus cells）；ihcは内有毛細胞（inner hair cells）；ohcは外有毛細胞（outer hair cells）；opeは外柱細胞（outer pillar cells）。スケールバー：50 μm。データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表している（1つの群につきn=4匹の動物）。**はp<0.01；***はp<0.001；テューキーの（Tukey's）多重比較検定を伴う一元配置分散分析（ANOVA）。
【国際調査報告】
2011530585.tif 000021
2011530585.tif 000022
2011530585.tif 000023