(57)【要約】  式（Ｉ）の構造単位および式（ＩＩ）の構造単位を有するポリグリコールで修飾されたキトサンオリゴ糖脂肪酸グラフト体、ならびにその調製方法が提供され、ここで、該キトサンオリゴ糖の分子量は、２００，０００未満であり、脱アセチル化度は７０％〜１００％であり、キトサンオリゴ糖鎖上の遊離アミノの一部は脂肪酸またはポリグリコールで置換され、ｎはポリグリコールの重合度であり、Ｒは１１〜２１個の炭素原子を有するアルキルであり、脂肪酸のグラフト化率は１％〜５０％であり、かつポリグリコールのグラフト化率は０．０５％〜５０％である。さらに、担体としてポリグリコールで修飾されたキトサンオリゴ糖脂肪酸グラフト体を含む医薬組成物、および医薬組成物の製造におけるポリグリコールで修飾されたキトサンオリゴ糖脂肪酸グラフト体の使用が提供される。2011524446.tif 000014【選択図】なし
2011524446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）で表される構造単位および次式（ＩＩ）で表される構造単位
【化１】
2011524446.tif 000013
を含むＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖であって、
キトサンオリゴ糖鎖の遊離アミノ基の一部は、１２〜２２個の炭素原子を有する脂肪酸、または１，０００〜１０，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧで置換され、ｎはＰＥＧの重合度を指し、Ｒは１１〜２１個の炭素原子を有するアルキル基であり、脂肪酸のグラフト化率は１％〜５０％であり、かつＰＥＧのグラフト化率は０．０５％〜５０％であるＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖。
【請求項２】
ＰＥＧのグラフト化率が０．５％〜５０％である、請求項１に記載のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖。
【請求項３】
脂肪酸のグラフト化率が５％〜５０％である、請求項１または２に記載のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖。
【請求項４】
ＰＥＧが２，０００〜１０，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１から３までのいずれか一項に記載のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖。
【請求項５】
脂肪酸が、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、およびドコサン酸からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１から４までのいずれか一項に記載のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖。
【請求項６】
次のステップ：
（ａ）キトサンを酵素の存在下で分解して、２００，０００Ｄａ未満の分子量を有するキトサンオリゴ糖を得るステップ；
（ｂ）キトサンオリゴ糖を１２〜２２個の炭素原子を有する脂肪酸と、架橋用カップリング剤の存在下でカップリングして、脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖を得るステップ；および
（ｃ）末端で置換された、分子量が１，０００〜１０，０００ＤａであるＰＥＧを、脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖とカップリングして、ＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖を得るステップ；
を含む、請求項１に記載のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖の調製方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）において、末端で置換されたＰＥＧの、脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比が１：２０〜８０：１である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
末端で置換されたＰＥＧが、末端でアルデヒド化されたＰＥＧ、末端でカルボキシル化されたＰＥＧ、末端でスクシンイミド化されたＰＥＧ、および末端で無水マレイン酸化されたＰＥＧからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
薬学的に活性な成分、および請求項１に記載のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖を含む医薬組成物。
【請求項１０】
薬学的に活性な成分が抗腫瘍薬であり、好ましくは該抗腫瘍薬が、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、パクリタキセル、およびヒドロキシカンプトテシンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
腫瘍細胞の薬物耐性を逆転させる能力のある、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
薬学的に活性な成分が遺伝子治療薬であり、好ましくは該遺伝子治療薬が、プラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
薬学的に活性な成分が抗ウイルス薬であり、好ましくは該抗ウイルス薬が、抗Ｂ型肝炎ウイルス薬である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
抗Ｂ型肝炎ウイルス薬が、アデホビル、アシクロビル、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、およびガンシクロビルからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
医薬組成物の調製における請求項１に記載のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖の使用。
【請求項１６】
医薬組成物が抗腫瘍薬、遺伝子治療薬、または抗ウイルス薬を含む、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾された脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖、該ＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖の合成方法、それからなる医薬製剤、および医薬組成物の調製におけるＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖の応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物自体のｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的輸送能力に拘束されて、薬物は、その物理化学的特性に応じて、体循環を介して病巣組織、病巣細胞、およびその細胞内オルガネラ中のその標的に輸送されて、その有効性を発揮するはずである。しかし、現存薬物の生物薬剤学的および薬物動力学的特徴により、明らかに、それらの薬物は、病理組織および健常組織に対する特異性に欠けている。満足な治療効果を達成するには、より多くの薬物投与量が要求され、そのような投与量は、薬物毒性／副作用の発生をもたらし、それによって該薬物の臨床的応用を制限する。
【０００３】
標的療法は、上記の諸問題を解決するのに最も有効な手段の１つである。薬物の分子標的は、病巣組織の細胞中に主として集中され、酵素が５０％を占め、受容体が３５％を占め、イオンチャネルが１５％を占める。薬物の治療効果は、分子標的に対する占拠効果を介して主として提供される。例えば、細胞障害性抗癌薬の分子標的の大部分は、腫瘍細胞の核中に主として存在するＤＮＡ（マイトマイシンＣ，ドキソルビシン、カンプトテシンなど）、または細胞質中に存在する微小管タンパク質（パクリタキセル、ビンブラスチンなど）である。遺伝子治療薬の分子標的は、また、核中のプラスミドＤＮＡおよび細胞質中のｓｉＲＮＡのように、標的細胞の細胞質または核中に存在する。抗ウイルス薬の分子標的は、また、標的細胞の核または細胞質中に存在する。適切な担体技術を介して薬物を病理学的組織（器官）および細胞に直接的に標的化することは、低有効性および毒性／副作用の問題を解決する重要な手段の１つである。最近、国内および国外で、抗腫瘍薬を組織（器官）および細胞に標的化することに関するいくつかの進歩が、担体技術によってなされてきたが、治療効果の飛躍的進歩は得られていない。問題の本質は、抗癌薬のための分子標的の大部分が細胞内部に存在することである。したがって、腫瘍細胞内の分子標的箇所（細胞内オルガネラ）に標的化する薬物担体の材料に関する研究および開発は、癌化学療法のボトルネックを打破するための鍵である。
【０００４】
標的担体の設計は、薬物の分子標的に対する細胞内オルガネラへの標的化効果を達成するために、病巣器官への担体の標的化効果、およびそれに基づいた病巣器官全域での病巣細胞の標的化効果に主として関連付けられる。薬物の組織または器官への初期の標的化では、小さい粒子サイズの微粒子を使用して、肝臓などの器官に受動的に導き、腫瘍組織への集中は、高められた浸透性および保持効果を介して達成される。最近、腫瘍細胞表面の特定の受容体（葉酸受容体など）の過剰発現特性に基づいて、リガンドで修飾された担体材料が、癌標的療法に首尾よく適用されて、腫瘍細胞への標的化を達成し、抗癌薬の細胞内集中を向上させ、かつ抗癌薬自体の有効性を増強している。
【０００５】
最近、ポリマーミセルが、薬剤学および生物医学の分野で広範な注目を引いている。ポリマーミセルは、両親媒性ブロックコポリマーまたはグラフトコポリマーから水性媒体中で自己集合により形成され、コア−シェル構造を有する。ポリマーミセルでは、疎水性部分および親水性部分が、それぞれ、ミセルのコアおよびシェルを形成する。疎水性のコアは、貧水溶性薬物として役立つことができる。外側の親水性膜は、水性環境中でミセルの安定性を維持し、かつ物理および化学的特性を修飾してミセルの活性な標的化効果などの特定の目的を達成できる。
【０００６】
ポリマーミセルは、薬物送達系として多くの利点を有する。それは、溶解度、ｐＨ値、ゼータ電位などの材料特性を調節することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物放出を制御することができる。ミセルの粒子サイズはかなり小さいので、それは、血液脳関門および細網内皮系を通って浸透できるだけでなく、胃腸粘膜などでの吸収を促進することができ、その結果、サイズの大きな粒子が通過できない場所に到達し、それによって、受動的標的化の目的を達成する。ポリマーミセル骨格の保護および遮蔽効果は、薬物が分解されることをある程度まで防止し、薬物の安定性を維持し、かつ薬物の毒性を低減することができる。リポソームに比較して、ポリマーミセルの薬物装填量は、相対的により多い。ポリマー材料の多様性は、ポリマーを担体として使用し、それによって各種の応用分野の要求を満たす多様な医薬製剤の製造に好都合である。
【０００７】
薬物担体の親水性ＰＥＧ化は、担体上への血漿タンパク質の吸着および薬物担体のマクロファージによる貧食作用の双方を低下させ、それによって、循環系中での担体の半減期を延長させることができると報告されている。この基本原理により、ポリマーミセルの親水性シェルのＰＥＧ化は、ポリマーミセルの血漿タンパク質のオプソニン化を低減し、それによって、マクロファージによるポリマーミセルの取込みを低減し、かつ血漿からのポリマーミセルの排除を遅らせることができる。腫瘍組織中でのポリマーミセルの受動的標的化は、高められた浸透性および保持効果を介してさらに改善できる。一方、他の器官および組織への活性な標的化は、リガンド−または抗体−修飾によって実行できる。
【０００８】
本発明において、本発明者らの以前の研究を基礎にして、急速な細胞内取込みおよびオルガネラへの標的化効果を示す脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルを採用して、ＰＥＧでの表面修飾を実施し、細網内皮系の識別を回避できる、長期循環性の脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖を合成した。このような脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖は、抗癌薬、遺伝子治療薬、抗ウイルス薬等々の調製および応用に適用できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの標的化、および薬学的に活性な成分の吸収を向上させるために、本発明は、ポリマーミセルを形成することによって薬学的に活性な成分のｉｎ  ｖｉｖｏでの放出を制御し、薬物の能動的および受動的標的化を達成し、薬物が分解されるのをある程度まで防止し、薬物の安定性を維持し、かつ薬物の毒性／副作用を低減することができる、ＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖を提供する。ＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖は、抗癌薬、遺伝子治療薬、薬物などの各種薬物の調製で薬物担体として応用できる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖は、次式（Ｉ）で表される構造単位および次式（ＩＩ）で表される構造単位を含むことができ、ここで、キトサンオリゴ糖鎖の遊離アミノ基の一部は、１２〜２２個の炭素原子を有する脂肪酸または１，０００〜１０，０００の分子量を有するＰＥＧで置換されている。式中、ｎはＰＥＧの重合度を表し、Ｒは、１１〜２１個の炭素原子を有するアルキル基である。
【００１１】
【化１】
2011524446.tif 000003
【００１２】
本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖において、脂肪酸のグラフト化率は１％〜５０％、ＰＥＧのグラフト化率は０．０５％〜５０％である、
脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖は、キトサンオリゴ糖鎖中の遊離アミノ基の一部が脂肪酸で置換されているオリゴマーを指す。脂肪酸は、１２〜２２個の炭素原子を有する飽和または不飽和の脂肪酸でよい。他方で、脂肪酸は、また、１２〜２２個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の脂肪酸でよい。加えて、脂肪酸は、好ましくは、１２〜２０個の炭素原子、１２〜１８個の炭素原子、１４〜２２個の炭素原子、１６〜２２個の炭素原子、１４〜２０個の炭素原子、または１６〜１８個の炭素原子を有する。好ましくは、脂肪酸は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、ドコサン酸、またはそれらの任意の混合物から選択できる。
【００１３】
本発明中で使用されるキトサンオリゴ糖は、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはグルコサミンが、β−１，４−グリコシド連結を介して連結されたキトサンを分解することによって得ることができる。例えば、キトサンオリゴ糖は、２００，０００未満の分子量、および７０％〜１００％の脱アセチル化度を有するものでよい。好ましくは、キトサンオリゴ糖の脱アセチル化度は、８０％〜１００％でよく、中でも９０％〜１００％が好ましく、および、７０％〜８０％、または７０％〜９０％でもよい。
【００１４】
本発明中で使用されるキトサンオリゴ糖は、好ましくは、１００，０００未満、より好ましくは５０，０００未満、最も好ましくは５，０００未満の分子量を有する。他方で、本発明中で使用されるキトサンオリゴ糖は、好ましくは、５００を超える、より好ましくは１，０００を超える、最も好ましくは２，０００を超える分子量を有する。例えば、キトサンオリゴ糖の分子量は、５００〜１００，０００、５００〜５０，０００、５００〜５，０００、１，０００〜１００，０００、２，０００〜１００，０００、１，０００〜５０，０００、または２，０００〜５，０００でよい。
【００１５】
本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖において、脂肪酸のグラフト化率は、１％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上、さらにより好ましくは１５％以上、最も好ましくは２０％以上である。他方で、脂肪酸のグラフト化率は、５０％以下、好ましくは４５％以下、より好ましくは４０％以下，さらにより好ましくは３５％以下、最も好ましくは３０％以下である。例えば、脂肪酸のグラフト化率は、１％〜５０％、５％〜５０％、１０％〜５０％、１５％〜５０％、２０％〜５０％、１％〜４５％、１％〜４０％、１％〜３５％、１％〜３０％、５％〜４５％、１０％〜４０％、１５％〜３５％、または２０％〜３０％でよい。
【００１６】
本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖において、ＰＥＧのグラフト化率は０．０５％以上、好ましくは０．１％以上、より好ましくは１．０％以上、さらにより好ましくは５．０％以上、最も好ましくは１０．０％以上である。他方で、ＰＥＧのグラフト化率は、５０％以下、好ましくは４５％以下、より好ましくは４０％以下、さらにより好ましくは３５％以下、最も好ましくは３０％以下である。例えば、ＰＥＧのグラフト化率は、０．０５％〜５０％、０．５％〜５０％、１．０％〜５０％、５．０％〜５０％、１０．０％〜５０％、０．１％〜４５％、０．１％〜４０％、０．１％〜３５％、０．１％〜３０％、０．５％〜４５％、１．０％〜４０％、５．０％〜３５％、または１０．０％〜３０％でよい。
【００１７】
本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖において、ＰＥＧの分子量は、１，０００以上、好ましくは１，５００以上、より好ましくは２，０００以上、さらにより好ましくは２，５００以上、最も好ましくは３，０００以上である。他方で、ＰＥＧの分子量は、１０，０００以下、好ましくは９，５００以下、より好ましくは９，０００以下、さらにより好ましくは８，０００以下、最も好ましくは７，０００以下である。例えば、ＰＥＧの分子量は、１，０００〜１０，０００、１，５００〜１０，０００、２，０００〜１０，０００、２，５００〜１０，０００、３，０００〜１０，０００、１，０００〜９，５００、１，０００〜９，０００、１，０００〜８，０００、１，０００〜７，０００、１，５００〜９，５００、２，０００〜９，０００、２，５００〜８，０００、または３．０００〜７，０００でよい。
【００１８】
本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖は、脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖をＰＥＧで修飾することによって調製できる。典型的な調製方法は、次のステップを含むことができる：
（ａ）キトサンを酵素の存在下で分解して、２００，０００未満の分子量を有するキトサンオリゴ糖を得るステップ；
（ｂ）該キトサンオリゴ糖を、架橋用カップリング剤の存在下で１２〜２２個の炭素原子を有する脂肪酸とカップリングさせて、脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖を得るステップ；
（ｃ）ＰＥＧの分子量が１，０００〜１０，０００である末端置換ＰＥＧを、脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖とカップリングさせて、ＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖を得るステップ。
【００１９】
上記ステップ（ａ）において、キトサンの分解は、当技術分野で周知の方法で実施することができる。例えば、分解中に使用される酵素はセルラーゼでよい。さらに、酵素のキトサンに対する質量比率は、０．０５〜５．０：１００でよい。分解は、５０〜６５℃の温度および４．０〜６．０のｐＨ値で実施できる。分解完了後、分離または精製は、当技術分野で周知の方法で実施することができる。例えば、限外濾過膜を使用して限外濾過を行うことができ、得られる濾液を凍結乾燥して、２００，０００未満の分子量を有するキトサンオリゴ糖を得る。
【００２０】
上記ステップ（ｂ）において、キトサンと脂肪酸とのカップリングは、当技術分野で周知の方法で実施することできる。例えば、該ステップで使用される架橋用カップリング剤は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴと略記）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰと略記）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣと略記）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣと略記）などの当技術分野で周知のもののいずれかでよい。加えて、キトサン、脂肪酸、および架橋用カップリング剤のモル比は、１：１〜５０：１〜５０でよい。キトサンと脂肪酸とのカップリングは、４〜９０℃の温度で実施することができる。カップリングの完了後、分離または精製を、当技術分野で周知の方法で実施することができる。例えば、カップリング反応溶液を、透析で精製し、次いで凍結乾燥して、疎水性の修飾されたキトサンオリゴ糖、すなわち脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖を得る。
【００２１】
上記ステップ（ｃ）において、末端置換ＰＥＧは、末端アルデヒド化基−ＰＥＧ、末端カルボキシル化ＰＥＧ、末端スクシンイミド化ＰＥＧ、末端無水マレイン酸化ＰＥＧなどの、上記ステップ（ｂ）で得られる脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖と適切な反応を介してカップリングすることのできる任意の末端活性化ＰＥＧでよい。ステップ（ｃ）において、末端置換ＰＥＧの上記ステップ（ｂ）で得られる脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比は、１：２０〜８０：１でよい。一態様において、このような比率は、好ましくは１：２０〜１：１、より好ましくは１：５〜５：１、さらにより好ましくは１：５〜１０：１、さらにより好ましくは１：５〜２０：１、最も好ましくは１：５〜５０：１でよい。他方で、該比率は、好ましくは５０：１〜８０：１、より好ましくは２０：１〜８０：１、さらにより好ましくは１０：１〜８０：１、さらにより好ましくは１０：１〜８０：１、最も好ましくは５：１〜８０：１でよい。より好ましくは、該比率は、１：１〜５０：１，５：１〜２０：１、または１０：１〜２０：１でよい。例えば、ステップ（Ｃ）において、末端置換ＰＥＧのキトサンオリゴ糖脂肪酸グラフト体に対するモル比は、１：２０、１：１０、１：５、１：１、５：１、１０：１、２０：１、５０：１、８０：１、または任意のその他の適切な比率でよい。
【００２２】
ステップ（ｃ）において、カップリングは、ＰＥＧの末端活性基と脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖のアミノ基との間のＳｃｈｉｆｆ反応により実施することができる。例えば、末端アルデヒド化ＰＥＧの場合、カップリングは、ＰＥＧの末端アルデヒド基とアミノ基との間のＳｃｈｉｆｆ反応により実施することができる。当技術分野で周知のように、上述のＳｃｈｉｆｆ反応中に、反応物と水との混合物を、超音波にかけて溶解を促進することができ、室温で撹拌することもできる。反応の完結後、当技術分野で周知の方法で分離または精製を実施することができる。例えば、カップリング反応溶液を、透析で精製し、次いで凍結乾燥して、ＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖を得ることができる。
【００２３】
加えて、カップリングは、ＰＥＧの末端活性基と脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖のアミノ基との間の縮合反応により実施することができる。例えば、末端スクシンイミド化ＰＥＧまたは末端無水マレイン酸化ＰＥＧの場合、カップリングは、ＰＥＧの末端スクシンイミドまたは無水マレイン酸基とアミノ基との間の縮合反応により実施することができる。末端アルデヒド化ＰＥＧの場合、反応は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴと略記）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰと略記）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣと略記）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣと略記）などの適切な縮合剤の存在下で実施することができる。縮合反応の完結後、当技術分野で周知の方法で分離または精製を実施することができる。例えば、カップリング反応溶液を、透析で精製し、次いで凍結乾燥してＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖を得ることができる。
【００２４】
本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖は、水性媒体中で自己集合によりミセルを形成する能力を有する。例えば、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度の本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖は、水中または１〜１２のｐＨ値を有する緩衝液中でミセルを形成することができる。粒子サイズアナライザーで測定すると、前記ミセルの粒子直径は、２０〜５００ｎｍの範囲である。表面電位アナライザーで測定すると、前記ミセルの表面電位は、１０〜５０ｍＶの範囲である。ピレン蛍光法で測定すると、本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖のＰＢＳ中での臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は、５〜３００μｇ／ｍＬの範囲である。
【００２５】
本発明は、また、担体として前述のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖を含む医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、適切な薬学的に活性な成分および本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖を含むことができる。
【００２６】
本発明の医薬組成物において、薬学的に活性な成分は、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、パクリタキセル、ヒドロキシカンプトテシン（ＨＣＰＴ）などの抗腫瘍薬でよい。本発明の抗腫瘍性医薬組成物は、腫瘍細胞の薬物耐性を逆転させることができる。
【００２７】
本発明の医薬組成物において、薬学的に活性な成分は、プラスミドＤＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの遺伝子治療薬でよい。
【００２８】
本発明の医薬組成物において、薬学的に活性な成分は、抗ウイルス薬でよい。抗ウイルス薬の典型例が、アデホビル、アシクロビル、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、ガンシクロビルなどの抗Ｂ型肝炎ウイルス薬である。
【００２９】
また、本発明の医薬組成物において、薬学的に活性な成分は、上記の薬物以外の薬物、例えば、カルシトニン、インターフェロン、インスリンなどのポリペプチドまたはタンパク質；ヘパリン、ヒアルロン酸などの多糖薬物であってもよい。
【００３０】
加えて、本発明は、また、前記医薬組成物の調製におけるＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルのマクロファージＲＡＷ２６４．７中への取込みを量的に示す図である。（◇）：比較例１のステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル；（△）：実施例２のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル；（×）：実施例３のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル；（□）：実施例１のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル。
【図２】ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの肝癌細胞ＨｅｐＧ２中への取込みを量的に示す図である。（◇）：比較例１のステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル；（△）：実施例２のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル；（×）：実施例３のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル；（□）：実施例１のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル。
【図３】ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの不死化正常肝細胞ＢＲＬ−３Ａ中への取込みを量的に示す図である。（◇）：比較例１のステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル；（△）：実施例２のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル；（×）：実施例３のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル；（□）：実施例１のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル。
【図４Ａ】ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を担体として含む本発明の医薬組成物のＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ−ＤＮＡの発現に対する抑制効果（ＨｅｐＧ２．２．１５細胞との同時インキュベーション後）を示す図である。
【図４Ｂ】対照としての薬物溶液のＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ−ＤＮＡの発現に対する抑制効果（ＨｅｐＧ２．２．１５細胞との同時インキュベーション後）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
（１）ＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖の調製
（比較例１〜３）ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の調製
キトサン（６ｇ、平均分子量：４５０，０００Ｄａ）を、塩酸水溶液（２００ｍＬ、１．２５（ｖ／ｖ））中に添加し、撹拌しながら５５〜６０℃で溶解した。得られた溶液のｐＨ値を希アンモニアまたは希塩酸を用い５．０に調整した。セルラーゼを、セルロース：キトサン＝０．５：１００（ｗ／ｗ）の比率で添加した。８時間反応した後、反応生成物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心した。続いて、上清液を、０．４５μｍの微多孔フィルター膜で前処理し、限外濾過膜を使用して分子量の相違に基づいて分画した。限外濾過液を凍結乾燥して特定の分子量を有するキトサンオリゴ糖を得た。ゲル浸透クロマトグラフィーで測定すると、キトサンオリゴ糖の平均分子量は１８，６００Ｄａであった。
【００３３】
上で得られたキトサンオリゴ糖を、秤量し（５．０ｇ）、蒸留水（４０ｍＬ）中に添加し、撹拌しながら溶解した。次いで、カルボジイミド（１．０ｇ）を添加し、撹拌しながら溶解した。比較例１〜３では、ステアリン酸（それぞれ、０．７８ｇ、１．５ｇ、および２．４ｇ）をメタノール溶液（１０ｍＬ）に添加した。超音波で溶解した後、得られた溶液を上記のキトサンオリゴ糖溶液に添加した。温度６０℃、４００ｒｐｍで磁気撹拌しながら、反応を、２４時間を超えて実施した。続いて最終反応混合物を、透析袋に入れ、２回蒸留水で２４時間透析して、反応副生物を除去した。透析液を凍結乾燥して、疎水性の修飾されたキトサンオリゴ糖、すなわち、ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を得た。
【００３４】
当技術分野で周知のゲル浸透クロマトグラフィーで測定すると、比較例１〜３のステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の平均分子量は、それぞれ２０，０００、２１，０００および３３，０００Ｄａであった。
（比較例４）ラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の調製
上記比較例１で説明したのと同様の方法で、１８，６００Ｄａの平均分子量を有するキトサンを調製した。上で得られたキトサンオリゴ糖を、秤量（５．０ｇ）し、蒸留水（４０ｍＬ）に添加し、撹拌しながら溶解した。次いで、カルボジイミド（１．０ｇ）を添加し、撹拌しながら溶解した。ラウリン酸（０．５ｇ）をメタノール溶液（１０ｍＬ）に添加した。超音波で溶解した後、得られた溶液を上記のキトサンオリゴ糖溶液に添加した。温度６０℃、４００ｒｐｍで磁気撹拌しながら、反応を、２４時間を超えて実施した。続いて、最終反応混合物を、透析袋に入れ、２回蒸留水で２４時間透析して、反応副生物を除去した。透析液を凍結乾燥して、疎水性の修飾キトサンオリゴ糖、すなわち、ラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を得た。
【００３５】
当技術分野で周知のゲル浸透クロマトグラフィーで測定すると、比較例４のラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の平均分子量は、２０，０００Ｄａであった。
（比較例５）ドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の調製
上記比較例１で説明したのと同様の方法で、１８，６００Ｄａの平均分子量を有するキトサンを調製した。上で得られたキトサンオリゴ糖を、秤量（５．０ｇ）し、蒸留水（４０ｍＬ）に添加し、撹拌しながら溶解した。次いで、カルボジイミド（１．０ｇ）を添加し、撹拌しながら溶解した。ドコサン酸（１．０ｇ）をメタノール溶液（１０ｍＬ）に添加した。超音波で溶解した後、得られた溶液を上記のキトサンオリゴ糖溶液に添加した。温度６０℃、４００ｒｐｍで磁気撹拌しながら、反応を、２４時間を超えて実施した。続いて、最終反応混合物を、透析袋に入れ、２回蒸留水で２４時間透析して、反応副生物を除去した。透析液を凍結乾燥して、疎水性の修飾されたキトサンオリゴ糖、すなわち、ドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を得た。
【００３６】
当技術分野で周知のゲル浸透クロマトグラフィーで測定すると、比較例５のドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の平均分子量は、２０，５００Ｄａであった。
（比較例６）オレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の調製
上記比較例１で説明したのと同様の方法で、１８，６００Ｄａの平均分子量を有するキトサンを調製した。上で得られたキトサンオリゴ糖を、秤量（５．０ｇ）し、蒸留水（４０ｍＬ）に添加し、撹拌しながら溶解した。次いで、カルボジイミド（１．０ｇ）を添加し、撹拌しながら溶解した。オレイン酸（０．８ｇ）をメタノール溶液（１０ｍＬ）に添加した。超音波で溶解した後、得られた溶液を上記のキトサンオリゴ糖溶液に添加した。４００ｒｐｍで磁気撹拌しながら６０℃の温度で、反応を、２４時間を超えて実施した。続いて、最終反応混合物を、透析袋に入れ、２回蒸留水で２４時間透析して、反応副生物を除去した。透析液を凍結乾燥して、疎水性の修飾されたキトサンオリゴ糖、すなわち、オレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を得た。
【００３７】
当技術分野で周知のゲル浸透イオンクロマトグラフィーで測定すると、比較例６のオレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の平均分子量は、２０，０００Ｄａであった。
（実施例１）
２０，０００Ｄａの分子量を有するステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（２００ｍｇ）、および２，０００Ｄａの分子量を有する末端アルデヒド化ＰＥＧ（２．６８ｍｇ）を秤量し（末端アルデヒド化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比は１：５であった）、脱イオン水（５０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、超音波プローブで２０回（４００ｗ、間隔３秒間で各回２秒間作動させる）処理し、室温で一夜磁気撹拌（４００ｒｐｍ）した。続いて、反応混合物を、透析袋（カットオフ分子量：７，０００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、カリフォルニア州）に入れ、４８時間透析して、未反応の末端アルデヒド化ＰＥＧを除去した。次いで、透析液を凍結乾燥して、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を固体粉末として得た。
（実施例２）
ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を、末端アルデヒド化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比が１：１であること以外は、上記実施例１に記載したと同様の方法で調製した。
（実施例３）
ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を、末端アルデヒド化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比が５：１であること以外は、上記実施例１に記載したと同様の方法で調製した。
（実施例４）
ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を、末端アルデヒド化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比が１：１０であること以外は、上記実施例１に記載したと同様の方法で調製した。
（実施例５）
ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を、末端アルデヒド化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比が１：２０であること以外は、上記実施例１に記載したと同様の方法で調製した。
（実施例６）
ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を、末端アルデヒド化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比が８０：１であること以外は、上記実施例１に記載したと同様の方法で調製した。
（実施例７）
２１，０００Ｄａの分子量を有するステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（２００ｍｇ）、および２，０００Ｄａの分子量を有する末端アルデヒド化ＰＥＧ（３８０ｍｇ）を秤量し（末端アルデヒド化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比は２０：１であった）、脱イオン水（５０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、超音波プローブで２０回（４００ｗ、間隔３秒間で各回２秒間作動させる）処理し、室温で一夜磁気撹拌（４００ｒｐｍ）した。続いて、反応混合物を、透析袋（カットオフ分子量：７，０００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、カリフォルニア州）に入れ、４８時間透析して、未反応の末端アルデヒド化ＰＥＧを除去した。次いで、透析液を凍結乾燥して、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を固体粉末として得た。
（実施例８）
３３，０００Ｄａの分子量を有するステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（２００ｍｇ）、および２，０００Ｄａの分子量を有する末端アルデヒド化ＰＥＧ（３６３ｍｇ）を秤量し（末端アルデヒド化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比は３０：１であった）、脱イオン水（５０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、超音波プローブで２０回（４００ｗ、間隔３秒間で各回２秒間作動させる）処理し、室温で一夜磁気撹拌（４００ｒｐｍ）した。続いて、反応混合物を、透析袋（カットオフ分子量：７，０００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、カリフォルニア州）に入れ、４８時間透析して、未反応の末端アルデヒド化ＰＥＧを除去した。次いで、透析液を凍結乾燥して、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を固体粉末として得た。
（実施例９）
ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を、末端アルデヒド化ＰＥＧが１，０００Ｄａの分子量を有し、末端アルデヒド化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比が２０：１であることを除けば、上記実施例１に記載したと同様の方法で調製した。
（実施例１０）
ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を、末端アルデヒド化ＰＥＧが１０，０００Ｄａの分子量を有し、末端アルデヒド化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比が２：１であることを除けば、上記実施例１に記載したと同様の方法で調製した。
（実施例１１）
２０，０００Ｄａの分子量を有するステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（１００ｍｇ）、２，０００Ｄａの分子量を有する末端カルボキシル化ＰＥＧ（１００ｍｇ）、およびカルボジイミド（１００ｍｇ）を秤量し（末端カルボキシル化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比は１０：１であった）、脱イオン水（５０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、超音波プローブで２０回（４００ｗ、間隔３秒間で各回２秒間作動させる）処理し、６０℃の温度で４８時間磁気撹拌（４００ｒｐｍ）した。続いて、反応混合物を、透析袋（カットオフ分子量：７，０００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、カリフォルニア州）に入れ、４８時間透析して、未反応の末端カルボキシル化ＰＥＧを除去した。次いで、透析液を凍結乾燥して、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を固体粉末として得た。
（実施例１２）
２０，０００Ｄａの分子量を有するステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（１００ｍｇ）、および２，０００Ｄａの分子量を有する末端スクシンイミド化ＰＥＧ（１００ｍｇ）を秤量し（末端スクシンイミド化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比は１０：１であった）、脱イオン水（５０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、超音波プローブで２０回（４００ｗ、間隔３秒間で各回２秒間作動させる）処理し、室温で４８時間磁気撹拌（４００ｒｐｍ）した。続いて、反応混合物を、透析袋（カットオフ分子量：７，０００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、カリフォルニア州）に入れ、４８時間透析して、未反応の末端スクシンイミド化ＰＥＧを除去した。次いで、透析液を凍結乾燥して、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を固体粉末として得た。
（実施例１３）
２０，０００Ｄａの分子量を有するステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（１００ｍｇ）、および２，０００Ｄａの分子量を有する末端無水マレイン酸化ＰＥＧ（１００ｍｇ）を秤量し（末端無水マレイン酸化ＰＥＧのステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比は１０：１であった）、脱イオン水（５０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、超音波プローブで２０回（４００ｗ、間隔３秒間で各回２秒間作動させる）処理し、室温で４８時間磁気撹拌（４００ｒｐｍ）した。続いて、反応混合物を、透析袋（カットオフ分子量：７，０００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、カリフォルニア州）に入れ、４８時間透析して、未反応の末端無水マレイン酸化ＰＥＧを除去した。次いで、透析液を凍結乾燥して、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を固体粉末として得た。
（実施例１４）
比較例４で得られた２０，０００Ｄａの分子量を有するラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（２００ｍｇ）、および２，０００Ｄａの分子量を有する末端アルデヒド化ＰＥＧ（２００ｍｇ）を秤量し（末端アルデヒド化ＰＥＧのラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比は１０：１であった）、脱イオン水（５０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、超音波プローブで２０回（４００ｗ、間隔３秒間で各回２秒間作動させる）処理し、室温で一夜磁気撹拌（４００ｒｐｍ）した。続いて、反応混合物を、透析袋（カットオフ分子量：７，０００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、カリフォルニア州）に入れ、４８時間透析して、未反応の末端アルデヒド化ＰＥＧを除去した。次いで、透析液を凍結乾燥して、ＰＥＧ化ラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を固体粉末として得た。
（実施例１５）
比較例５で得られた２０，５００Ｄａの分子量を有するドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（２００ｍｇ）、および２，０００Ｄａの分子量を有する末端アルデヒド化ＰＥＧ（１９４ｍｇ）を秤量し（末端アルデヒド化ＰＥＧのドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比は１０：１であった）、脱イオン水（５０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、超音波プローブで２０回（４００ｗ、間隔３秒間で各回２秒間作動させる）処理し、室温で一夜磁気撹拌（４００ｒｐｍ）した。続いて、反応混合物を、透析袋（カットオフ分子量：７，０００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、カリフォルニア州）に入れ、４８時間透析して、未反応の末端アルデヒド化ＰＥＧを除去した。次いで、透析液を凍結乾燥して、ＰＥＧ化ドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を固体粉末として得た。
（実施例１６）
比較例６で得られた２０，０００Ｄａの分子量を有するオレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（２００ｍｇ）、および２，０００Ｄａの分子量を有する末端アルデヒド化ＰＥＧ（２００ｍｇ）を秤量し（末端アルデヒド化ＰＥＧのオレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖に対するモル比は１０：１であった）、脱イオン水（５０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を、超音波プローブで２０回（４００ｗ、間隔３秒間で各回２秒間作動させる）処理し、室温で一夜磁気撹拌（４００ｒｐｍ）した。続いて、反応混合物を、透析袋（カットオフ分子量：７，０００Ｄａ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、カリフォルニア州）に入れ、４８時間透析して、未反応の末端アルデヒド化ＰＥＧを除去した。次いで、透析液を凍結乾燥して、ＰＥＧ化オレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を固体粉末として得た。
（２）ＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖の特性
前記比較例１〜６で得られた脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖（１０ｍｇ）および前記実施例１〜１６で得られたＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖（１０ｍｇ）を、それぞれ秤量し、水浴中で超音波を用い、適切な量の２回蒸留水中に１０分間分散させた。次いで、容積を１００ｍＬに調整し、対応するミセル溶液を得た。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ３０００ＨＳアナライザーを使用して、溶液中のミセルの平均粒子直径（Ｄ）および表面電位（Ｚｅｔａ）を測定した。未修飾のまたはＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖のＰＢＳ中での臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を、当技術分野で周知のピレン蛍光法でそれぞれ測定した。ＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖中のＰＥＧおよび脂肪酸のグラフト化率を、当技術分野で周知のトリニトロベンゼン−スルホン酸（ＴＮＢＳ）法で測定し、次いでアミノ基の置換度を得ることができる。実施例１〜１６および比較例１〜６の上記特性を、表１に示した。
【００３８】
【表１】
2011524446.tif 000004
【００３９】
本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖は、水性媒体中で自己集合によってミセルを形成する特性を有することがわかる。さらに、本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖は、一般的な界面活性剤のそれに比べて有意により低いＣＭＣを有する。本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖から形成されるミセルは、薬物送達システムとして多くの利点を有する。それは、ＰＥＧおよび脂肪酸のグラフト化率、溶解度、ｐＨ値、ゼータ電位などの材料特性を調節することによって、薬学的に活性な成分のｉｎ  ｖｉｖｏでの放出を制御することができる。ミセルの粒子サイズはかなり小さいので、それは、血液脳関門および細網内皮系を通って浸透できるだけでなく、胃腸粘膜などでの吸収を促進することができ、その結果、大きな粒子が通過できない場所に到達し、それによって、受動的標的化の目的を達成する。ポリマーミセル骨格の保護および遮蔽効果は、薬物が分解されることをある程度まで防止し、薬物の安定性を維持し、かつ薬物の毒性を低減できる。リポソームに比較して、ポリマーミセルの薬物装填量は、相対的により多い。ＰＥＧで修飾されたキトサンオリゴ糖脂肪酸グラフト体の構造の多様性は、ポリマーを担体として使用し、それによって各種の応用分野の要求を満たす多様な医薬製剤の製造に好都合である。したがって、本発明のＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖は、多くの医薬組成物の調製において担体として応用することができる。
（３）種々の細胞系におけるＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖の取込み
１０ｍｇの比較例１のステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖および実施例１〜３のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を、それぞれ秤量し、２ｍＬの脱イオン水に溶解し、超音波プローブで２０回（４００ｗ、刺激時間２秒、中断時間３秒）処理し、次いで、２．０ｍｇ／ｍＬのイソシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を含む２００μＬのエタノール溶液を添加した後、暗所での磁気撹拌（４００ｒｐｍ）の条件下で２４時間連続的に反応した。続いて、最終反応混合物を、透析袋（７，０００Ｄａのカットオフ分子量、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ、カリフォルニア州）中で脱イオン水を用い２４時間透析して、未反応のＦＩＴＣを除去した。透析液を凍結乾燥した後、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のフルオレセインで標識された生成物を得た。
【００４０】
ＲＡＷ２６４．７細胞（マクロファージ）、ＨｅｐＧ２細胞（肝癌細胞）およびＢＲＬ−３Ａ細胞（不死化正常肝細胞）を、１０％ウシ胎児血清で補足されたＤＭＥＭ中で（ＲＡＷ２６４．７およびＨｅｐＧ２）、および１０％新生ウシ血清で補足された１６４０培地中で（ＢＲＬ−３Ａ）、３７℃の５％ＣＯ２インキュベーター中で、対数増殖期まで連続的に培養した。次いで、トリプシン消化の後、細胞を、培地で希釈し、２４ウェル培養プレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｅ  Ｉｎｔｅｒａｔｉｏｎａｌ、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、イリノイ州、米国）にウェル当たり１×１０５個の接種密度で接種し、インキュベーター中で２４時間培養した。次いで、ＦＩＴＣで標識されたＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液を、ミセルの添加濃度を１００μｇ／ｍＬに調節してインキュベーション用培地に添加した。細胞を、それぞれ１．５、３、６、１２および２４時間培養した後、それらを、ＰＢＳで洗浄し、トリプシンで消化した。細胞消化溶液を、採取し、超音波プローブで２０回（４００ｗ、刺激時間２秒、中断時間３秒）処理して、細胞溶解液を得た。蛍光分光光度計を使用して、細胞溶解液の蛍光強度を測定し、次いでＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の細胞中への取込み率を計算し、タンパク質で補正した。ミセルの細胞中への取込み率を、次式：
Ｐｔ（％）＝Ｆｔ／Ｆ０×１００％
により計算した。ここで、Ｐｔは、ｔ時間中でのミセルの細胞中への取込み率を指し、ＦｔおよびＦ０は、それぞれ時刻ｔおよび時刻０の時点での蛍光吸光度（タンパク質で補正された）を表す。
【００４１】
比較例１のステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖、および実施例１〜３のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のＲＡＷ２６４．７細胞、ＨｅｐＧ２細胞、およびＢＲＬ−３Ａ細胞による取込み結果を図１〜３に示した。加えて、上記ミセルのＲＡＷ２６４．７細胞、ＨｅｐＧ２細胞およびＢＲＬ−３Ａ細胞中への２４時間以内での取込み結果を、表２に列挙した。
【００４２】
【表２】
2011524446.tif 000005
【００４３】
上記の結果から、未修飾のステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（比較例１）のミセルと比較して、マクロファージＲＡＷ２６４．７細胞中への同一時間内でのＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（実施例１〜３）の取込み量が、有意に低下したと結論付けることができた。また、ＰＥＧ修飾比率（ＰＥＧのグラフト化率）の増大に伴って、マクロファージ中へのミセルの取込み量は徐々に減少した。
【００４４】
加えて、腫瘍細胞ＨｅｐＧ２および正常細胞ＢＲＬ−３Ａ中への同一時間内でのＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（実施例１〜３）の取込み量は、未修飾のステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（比較例１）のミセルと比較して、有意な差異はなかった。
【００４５】
したがって、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖は、担体が血中マクロファージによって貧食される可能性を著しく低減し、そのため、生物体中での担体材料の循環時間および標的組織中への担体材料の分布を増大させることができると期待することができる。同時に、ＰＥＧ化は、腫瘍細胞中への担体材料の取込みに影響を及ぼさない。したがって、該担体材料を使用することによって、薬物の腫瘍細胞中への標的化送達を増大させることができる。
（４）抗癌薬組成物におけるＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖ミセルの応用
（４．１）ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の応用
（ａ）マイトマイシンＣ製剤
１０ｍｇの比較例１のステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖、および実施例１〜３のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を、それぞれ秤量し、１．５ｍＬのＰＢＳに溶解した。１ｍｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ／ＰＢＳ溶液０．５ｍＬを添加した後、溶液を超音波プローブで２０回（４００ｗ、刺激時間２秒、中断時間３秒）処理して、マイトマイシンＣを装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液を得た。その材料濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、薬物封入効率は３０％であった。
【００４６】
モデルとして肝癌細胞ＨｅｐＧ２を使用して、マイトマイシンＣを装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの抗癌有効性を、薬物送達システムを細胞と同時インキュベートした後の５０％抑制濃度（ＩＣ５０）によって評価した。細胞生存率をＭＴＴアッセイで測定した。接着細胞を２４ウェルプレート中で２４時間前培養した後、種々の濃度のマイトマイシンＣ溶液（溶媒はＰＢＳ）およびマイトマイシンＣを装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルをそれぞれ添加し、対照ウェルは、各群の３つの繰返しで用意した。４８時間インキュベートした後、各ウェルに６０μＬのＭＴＴを添加し、続いて４時間インキュベートした。その後、上清液を廃棄し、細胞をＰＢＳ溶液で２回洗浄した後、各ウェルに４００μＬのＤＭＳＯを添加して反応を終結させた。培養プレートを水平に１０分間振動させた後、ＥＬＳＡメーターで波長５７０ｎｍでの吸光度を測定し、細胞生存率を次式により計算した：
細胞生存率（％）＝Ａ５７０（検体）／Ａ５７０（対照）×１００％。
ここで、Ａ５７０（検体）は、遊離薬物または薬物装填ミセルを添加した細胞の吸光度、Ａ５７０（対照）は、対照細胞の吸光度である。
【００４７】
加えて、同一方法を使用して、対照例として使用されたマイトマイシンＣ溶液のＩＣ５０値を測定した。
上記試験の結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
2011524446.tif 000006
【００４９】
上記の結果から、マイトマイシンＣ溶液（対照例）と比較して、マイトマイシンＣを装填した本発明のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（実施例１〜３）のミセルの薬物有効性は、約１４倍高められた。また、マイトマイシンＣを装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（実施形態１〜３）の薬物有効性は、マイトマイシンＣを装填したステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（比較例１）のミセルのそれに一致した。したがって、ＰＥＧ化は、薬物装填型ミセルの抗腫瘍活性に影響を及ぼさない。
（ｂ）アドリアマイシン製剤
実施例７で調製した５０ｍｇのＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（ＰＥＧの分子量は２，０００Ｄａ；キトサンオリゴ糖の分子量は１８，６００Ｄａ；ＰＥＧのグラフト化率は８．１％；ステアリン酸のグラフト化率は８％であった）を秤量し、５０ｍＬのビーカーに入れ、次いで、４０ｍＬの蒸留水（ｐＨ５．７）を添加し、超音波プローブで２０回（５００ｗ、刺激時間２秒、中断時間３秒）処理した。続いて、溶液をメスフラスコに移し、蒸留水で全容積を５０ｍＬとし、１ｍｇ／ｍＬのミセル溶液を得た。２０ｍＬのＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液を取り、１ｍｇ／ｍＬのアドリアマイシンを含む２ｍＬのジメチルスルホキシド溶液を添加した。室温で３時間撹拌した後、溶液を、分子量が３，５００の透析袋中で蒸留水を用いて２４時間透析した。次いで、透析濃縮溶液を、５０００ｒｐｍで５分間遠心して、透析された疎水性抗癌薬を除去した。上清液を、０．２２μｍの微多孔膜を用いて濾過した後、アドリアマイシンを装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルを得た。
【００５０】
測定すると、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの粒子直径は、５５．８ｎｍ、表面電位は３１．７ｍＶ、薬物封入効率は９７．２％であった。
【００５１】
続いて、抗腫瘍有効性の評価を実施した。具体的には、モデルとして使用される子宮頸癌細胞Ｈｅｌａを、９６ウェル培養プレート中で培養した。５×１０３個のＨｅｌａ細胞を含む１００μＬの細胞培養液を、各ウェルに添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。細胞がプレートに完全に接着した後、種々の濃度のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖、薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液、および塩酸ドキソルビシン溶液を、それぞれウェルに添加し、未処理のブランク細胞を対照として使用した。上記各群の繰返しウェルを準備した。細胞を、通常のＤＭＥＭ培地中で４８時間培養した。２０μＬの５ｍｇ／ｍＬメチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）溶液を各ウェルに添加した後、細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間再培養し、次いで上清液を廃棄した。１５０μＬのジメチルスルホキシドを各ウェルに添加し、多機能マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を測定し、次いで次式により細胞抑制率を計算した：
細胞抑制率（％）＝（対照群の吸光度−実験群の吸光度）／対照群の吸光度×１００％。
【００５２】
計算すると、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のＩＣ５０値は５６３．５μｇ／ｍＬ；アドリアマイシン溶液のＩＣ５０値は１．７μｇ／ｍＬ；薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液のＩＣ５０値は０．２μｇ／ｍＬであった。結果は、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖が低毒性材料であり、かつアドリアマイシンをＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖で封入した後に、子宮頸癌細胞Ｈｅｌａに対するその抗腫瘍有効性を８．５倍増大させることができることを示唆した。
（ｃ）パクリタキセル製剤
実施例８で調製した５０ｍｇのＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（ＰＥＧの分子量は２，０００Ｄａ；キトサンオリゴ糖の分子量は１８，６００Ｄａ；ＰＥＧのグラフト化率は８．１％；ステアリン酸のグラフト化率は４８．３％であった）を秤量し、５０ｍＬのビーカーに入れ、次いで、４０ｍＬの蒸留水（ｐＨ５．７）を添加し、超音波プローブで２０回（５００ｗ、刺激時間２秒、中断時間３秒）処理した。続いて、溶液をメスフラスコに移し、蒸留水で全容積を５０ｍＬとし、１ｍｇ／ｍＬのミセル溶液を得た。２０ｍＬのＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液を取り、１ｍｇ／ｍＬのパクリタキセルを含む２ｍＬのジメチルスルホキシドを添加した。室温で３時間撹拌した後、溶液を、分子量が３，５００の透析袋中で蒸留水を用いて２４時間透析した。次いで、透析濃縮溶液を、５０００ｒｐｍで５分間遠心して、透析された疎水性抗癌薬を除去した。上清液を、０．２２μｍの微多孔膜を用いて濾過した後、パクリタキセルを装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルを得た。
【００５３】
測定すると、薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの粒子直径は、８９．１ｎｍ、表面電位は２８．７ｍＶ、薬物封入効率は９９．６％であった。
【００５４】
続いて、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の抗腫瘍有効性を、腫瘍細胞の抑制率によって評価した。具体的には、モデルとして使用されるヒト肺癌細胞Ａ５４９を、９６ウェル培養プレート中で培養した。５×１０３個のＡ５４９細胞を含む１００μＬの細胞培養液を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。細胞がプレートに完全に接着した後、種々の濃度のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖、薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液、およびタキソール溶液を、それぞれウェルに添加し、未処理のブランク細胞を対照として使用した。上記各群の繰返しウェルを準備した。細胞を、通常のＤＭＥＭ培地中で４８時間培養した。２０μＬの５ｍｇ／ｍＬメチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）溶液を各ウェルに添加した後、細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間再培養し、次いで上清液を廃棄した。１５０μＬのジメチルスルホキシドを各ウェルに添加し、多機能マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を測定し、次いで次式により細胞抑制率を計算した：
細胞抑制率（％）＝（対照群の吸光度−実験群の吸光度）／対照群の吸光度×１００％。
【００５５】
計算すると、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のＩＣ５０値は４８９．６μｇ／ｍＬ；タキソール溶液のＩＣ５０値は３．２μｇ／ｍＬ；薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液のＩＣ５０値は０．１μｇ／ｍＬであった。結果は、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖が低毒性材料であり、かつパクリタキセルをＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖で封入した後に、ヒト肺癌細胞Ａ５４９に対するその抗腫瘍有効性を３２倍増大させることができることを示唆した。
（ｄ）ヒドロキシカンプトテシン製剤
実施例７で調製した５０ｍｇのＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（ＰＥＧの分子量は２，０００Ｄａ；キトサンオリゴ糖の分子量は１８，６００Ｄａ；ＰＥＧのグラフト化率は８．１％；ステアリン酸のグラフト化率は８％であった）を秤量し、５０ｍＬのビーカーに入れ、次いで、４０ｍＬの蒸留水（ｐＨ５．７）を添加し、超音波プローブで２０回（５００ｗ、刺激時間２秒、中断時間３秒）処理した。続いて、溶液をメスフラスコに移し、蒸留水で全容積を５０ｍＬとし、１ｍｇ／ｍＬのミセル溶液を得た。２０ｍＬのＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液を取り、１ｍｇ／ｍＬのヒドロキシカンプトテシンを含む２ｍＬのエタノールを添加した。室温で３時間撹拌した後、溶液を、分子量が３，５００Ｄａの透析袋中で蒸留水を用い２４時間透析した。透析濃縮溶液を、５０００ｒｐｍで５分間遠心して、透析された疎水性抗癌薬を除去した。上清液を、０．２２μｍの微多孔膜を用いて濾過した後、ヒドロキシカンプトテシンを装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルを得た。
【００５６】
測定すると、薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの粒子直径は、７２．９ｎｍ、表面電位は３６．２ｍＶ、薬物封入効率は８９．４％であった。
【００５７】
続いて、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の抗腫瘍有効性を、腫瘍細胞の抑制率によって評価した。具体的には、モデルとして使用されるヒト肺癌細胞Ａ５４９を、９６ウェル培養プレート中で培養した。５×１０３個のＡ５４９細胞を含む１００μＬの細胞培養液を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。細胞がプレートに完全に接着した後、種々の濃度のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖、薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液、およびヒドロキシカンプトテシン注射液を、それぞれウェルに添加し、未処理のブランク細胞を対照として使用した。上記各群の繰返しウェルを準備した。細胞を、通常のＤＭＥＭ培地中で４８時間培養した。２０μＬの５ｍｇ／ｍＬメチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）溶液を各ウェルに添加した後、細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間再培養し、次いで上清液を廃棄した。１５０μＬのジメチルスルホキシドを各ウェルに添加し、多機能マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を測定し、次いで次式により細胞抑制率を計算した：
細胞抑制率（％）＝（対照群の吸光度−実験群の吸光度）／対照群の吸光度×１００％。
【００５８】
計算すると、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のＩＣ５０値は４９６．３μｇ／ｍＬ；ヒドロキシカンプトテシン注射液のＩＣ５０値は８．６μｇ／ｍＬ；薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液のＩＣ５０値は０．４μｇ／ｍＬであった。結果は、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖が低毒性材料であり、かつヒドロキシカンプトテシンをＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖で封入した後に、ヒト肺癌細胞Ａ５４９に対するその抗腫瘍有効性を２１．５倍増大させることができることを示唆した。
（４．２）ＰＥＧ化ラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の応用
実施例１４で調製した５０ｍｇのＰＥＧ化ラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を取り、上記（４．１）（ｃ）と同様の方法を使用して、薬物を装填したＰＥＧ化ラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルを調製した。
【００５９】
測定すると、ＰＥＧ化ラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの粒子直径は、１２３．７ｎｍ、表面電位は３１．４ｍＶ、薬物封入効率は９９．３％であった。
【００６０】
続いて、ＰＥＧ化ラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の抗腫瘍有効性を、上記（４．１）（ｃ）と同様の方法を使用して評価した。評価結果は、ＰＥＧ化ラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のＩＣ５０値が４５６．１μｇ／ｍＬ；タキソール溶液のＩＣ５０値が３．２μｇ／ｍＬ；薬物を装填したＰＥＧ化ラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液のＩＣ５０値が０．１μｇ／ｍＬであったことを示す。結果は、ＰＥＧ化ラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖が低毒性材料であり、かつパクリタキセルをＰＥＧ化ラウリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖で封入した後に、ヒト肺癌細胞Ａ５４９に対するその抗腫瘍有効性を３２倍増大させることができることを示唆した。
（４．３）ＰＥＧ化ドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の応用
実施例１５で調製した５０ｍｇのＰＥＧ化ドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を取り、前記（４．１）（ｃ）と同様の方法を使用して、薬物を装填したＰＥＧ化ドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルを調製した。
【００６１】
測定すると、ＰＥＧ化ドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの粒子直径は、８６．４ｎｍ、表面電位は３３．１ｍＶ、薬物封入効率は９９．８％であった。
【００６２】
続いて、薬物を装填したＰＥＧ化ドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の抗腫瘍有効性を、前記（４．１）（ｃ）と同様の方法を使用して評価した。評価結果は、ＰＥＧ化ドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のＩＣ５０値が４３８．８μｇ／ｍＬ；タキソール溶液のＩＣ５０値が３．２μｇ／ｍＬ；薬物を装填したＰＥＧ化ドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液のＩＣ５０値が０．２μｇ／ｍＬであったことを示す。結果は、ＰＥＧ化ドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖が低毒性材料であり、かつパクリタキセルをＰＥＧ化ドコサン酸グラフト化キトサンオリゴ糖で封入した後に、ヒト肺癌細胞Ａ５４９に対するその抗腫瘍有効性を１６倍増大させることができることを示唆した。
（４．４）ＰＥＧ化オレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の応用
実施例１６で調製した５０ｍｇのＰＥＧ化オレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を取り、前記（４．１）（ｃ）と同様の方法を使用して、薬物を装填したＰＥＧ化オレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルを調製した。
【００６３】
測定すると、薬物を装填したＰＥＧ化オレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの粒子直径は、１０９．２ｎｍ、表面電位は３５．２ｍＶ、薬物封入効率は９９．４％であった。
【００６４】
続いて、薬物を装填したＰＥＧ化オレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の抗腫瘍有効性を、前記（４．１）（ｃ）と同様の方法を使用して評価した。評価結果は、ＰＥＧ化オレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のＩＣ５０値が４１３．７μｇ／ｍＬ；タキソール溶液のＩＣ５０値が３．２μｇ／ｍＬ；薬物を装填したＰＥＧ化オレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液のＩＣ５０値が０．１μｇ／ｍＬであったことを示す。結果は、ＰＥＧ化オレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖が低毒性材料であり、かつパクリタキセルをＰＥＧ化オレイン酸グラフト化キトサンオリゴ糖で封入した後に、ヒト肺癌細胞Ａ５４９に対するその抗腫瘍有効性を３２倍増大させることができることを示唆した。
（５）腫瘍の薬物耐性を逆転させるためのＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖の応用
（ａ）アドリアマイシン製剤
前記（４．１）（ｂ）と同様の方法を使用して、アドリアマイシンを装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルを調製した。
【００６５】
測定すると、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの粒子直径は、６７．２ｎｍ、表面電位は３８．３ｍＶ、薬物封入効率は９６．４％であった。
【００６６】
続いて、腫瘍細胞の抑制率を使用して、薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の抗腫瘍有効性、および薬物耐性腫瘍細胞の薬物耐性の逆転効率を評価した。
【００６７】
具体的には、モデル細胞として使用される乳癌細胞（ＭＣＦ−７）およびその薬物耐性細胞（ＭＣＦ−７−ａｄｒ）を、９６ウェル培養プレート中で培養した。５×１０３個のＭＣＦ−７またはＭＣＦ−７−ａｄｒ細胞を含む１００μＬの培養液を、各ウェルに添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。細胞がプレートに完全に接着した後、種々の濃度のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖、薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液、およびドキソルビシンを、それぞれウェルに添加し、未処理のブランク細胞を対照として使用した。上記各群の繰返しウェルを準備した。細胞を、通常のＤＭＥＭ培地中で４８時間培養した。２０μＬの５ｍｇ／ｍＬメチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）溶液を各ウェルに添加した後、細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間再培養し、次いで上清液を廃棄した。１５０μＬのジメチルスルホキシドを各ウェルに添加し、多機能マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を測定し、次いで次式により細胞抑制率を計算した：
細胞抑制率（％）＝（対照群の吸光度−実験群の吸光度）／対照群の吸光度×１００％。
【００６８】
計算すると、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖、ドキソルビシン溶液、および薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液の、ＭＣＦ−７およびその薬物耐性細胞ＭＣＦ−７−ａｄｒに対するＩＣ５０値を表４に要約した。
【００６９】
【表４】
2011524446.tif 000007
【００７０】
上記の結果は、本発明のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖が低毒性材料であり、かつアドリアマイシンをＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルで封入した後に、感受性ＭＣＦ−７細胞に対する抗腫瘍有効性が、１倍増加することがあり、かつその薬物耐性細胞の薬物耐性を、完全に逆転させることができることを示唆した。
（ｂ）パクリタキセル製剤
前記（４．１）（ｃ）と同様の方法を使用して、パクリタキセルを装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルを調製した。
【００７１】
測定すると、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの粒子直径は、８５．６ｎｍ、表面電位は３２．５ｍＶ、薬物封入効率は９８．５％であった。
【００７２】
続いて、腫瘍細胞の抑制率を使用して、薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の抗腫瘍有効性、および薬物耐性腫瘍細胞の薬物耐性の逆転効率を評価した。
【００７３】
具体的には、モデル細胞として使用される卵巣癌細胞ＳＫＯＶ−３およびその薬物耐性細胞ＳＫＯＶ−３／ＳＴ３０を、９６ウェル培養プレート中で培養した。５×１０３個のＳＫＯＶ−３またはＳＫＯＶ−３／ＳＴ３０細胞を含む１００μＬの培養液を、各ウェルに添加し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で２４時間培養した。細胞がプレートに完全に接着した後、種々の濃度の薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液、およびタキソール溶液を、それぞれウェルに添加し、未処理のブランク細胞を対照として使用した。上記各群の繰返しウェルを準備した。細胞を、通常のＤＭＥＭ培地中で４８時間培養した。２０μＬの５ｍｇ／ｍＬメチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）溶液を各ウェルに添加した後、細胞を、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で４時間再培養し、次いで上清液を廃棄した。１５０μＬのジメチルスルホキシドを各ウェルに添加し、多機能マイクロプレートリーダーを使用して吸光度を測定し、次いで次式により細胞抑制率を計算した：
細胞抑制率（％）＝（対照群の吸光度−実験群の吸光度）／対照群の吸光度×１００％。
【００７４】
計算すると、タキソール溶液、および薬を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液のＳＫＯＶ−３およびその薬物耐性細胞に対するＩＣ５０値を表５に要約した。
【００７５】
【表５】
2011524446.tif 000008
【００７６】
これらの結果は、パクリタキセルを、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルで封入した後に、卵巣癌細胞の感受性細胞ＳＫＯＶ−３に対する抗腫瘍有効性を３．５倍高めることができ、かつ卵巣癌の薬物耐性細胞の薬物耐性を完全に逆転させることができることを示唆した。
（６）遺伝子治療用医薬組成物におけるＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖の応用
（ａ）プラスミドＤＮＡ製剤
プラスミドＤＮＡを装填したＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの調製
実施例８で調製した１０ｍｇのＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖（ＰＥＧの分子量は２，０００Ｄａ；キトサンオリゴ糖の分子量は１８，６００Ｄａ；ＰＥＧのグラフト化率は８．１％；ステアリン酸のグラフト化率は４８．３％であった）を正確に秤量し、１０ｍＬの水に溶解して、ミセル溶液を調製した。超音波水浴で１５分間処理した後、溶液を、滅菌のため０．２２μｍの微多孔膜で濾過した。ｐＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質プラスミドＤＮＡ）溶液（５００μｇ／ｍＬ）を２５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４溶液で調製した。ミセル溶液と緑色蛍光タンパク質プラスミドＤＮＡ溶液とを３のＮ／Ｐ比率（キトサンオリゴ糖のアミノ基のＤＮＡのリン酸基に対するモル比）で混合し、続いて室温で２５分間静置して、ミセル／プラスミドＤＮＡの複合ナノ粒子の形成をさらに促進した。
【００７７】
適切な量の混合懸濁液を、脱イオン水で適切に希釈し、次いで粒子サイズおよび表面電位を粒子サイズ表面電位アナライザーで測定した。プラスミドＤＮＡを装填したＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖の物理的および化学的特性を表６に示した。
【００７８】
【表６】
2011524446.tif 000009
【００７９】
これらの結果は、グラフト体のミセルとｐＥＧＦＰ  ＤＮＡとの複合ミセルが形成されると、粒子サイズが増加し、ｐＥＧＦＰプラスミドＤＮＡの、複数のグラフト体のミセルとの封入および接着を介して、複合ミセルの形成が達成されることを示した。
ｐＥＧＦＰ遺伝子を装填したグラフト体のミセルの細胞中でのトランスフェクション
Ａ５４９細胞の培養
ヒトＩＩ型肺上皮細胞Ａ５４９を、１０％ウシ胎児血清で補足された培地中で連続的に培養した（５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーター）。続いて、対数増殖期中の細胞を、トリプシン処理し、ＤＭＥＭで希釈した。希釈された細胞を、２４ウェル培養プレートに、ウェル当たり２×１０５個の接種密度で接種し、インキュベーター中で２４時間前培養した。
グラフト体−ｐＥＧＦＰミセルのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション
Ａ５４９細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、２４ウェル細胞培養プレートにウェル当たり２×１０５個の接種密度で接種し、次いで細胞の８０〜９０％が融合されるまで５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で再培養した。トランスフェクションの前に、プレート中の古い培地を除去した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、リポソームリポフェクタミンＴＭ２０００，グラフト体−ｐＥＧＦＰの複合ナノ粒子懸濁液、および適切な血清不含ＤＭＥＭ培地（そのｐＨは、７．４に調製）を細胞に添加して、最終容積を０．５ｍｌとし、６時間培養した後、培地を、完全培地で置き換え、続いて７２時間再培養した。
【００８０】
トランスフェクション効率の測定：培地を除去した後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、消化し、一定量のＰＢＳで懸濁させた。トランスフェクション効率は、フローサイトメトリーで測定した。結果は、グラフト体（Ｎ／Ｐ５８）で媒介された細胞トランスフェクション効率は１４．２％、リポソームリポフェクタミンＴＭ２０００で媒介されたトランスフェクション効率は２５．１％であることを示した。
ｐＥＤＦ遺伝子を装填したグラフト体のミセルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子治療
理論的遺伝子としてＰＥＤＦを取り、薬物を装填したグラフト体のミセルを調製した。動物モデルとしてのＱＧＹ腫瘍を有するヌードマウスに、２．５ｍｇ／ｋｇのプラスミドＤＮＡ（担体容積７．５ｍｇ／ｋｇ）を２回（それぞれ第１日目および５日目に）、２１日後に１回投与し、ＱＧＹ腫瘍を有する動物モデルの腫瘍抑制率は４９．０４％達することがあった（陽性対照として、２ｍｇ／ｋｇのアドリアマイシン１回での連続７日間の投与の治療を実施し、７８．８５％の腫瘍抑制率が最終的に得られた）。
（ｂ）ｓｉＲＮＡ製剤
ｓｉＲＮＡを装填したＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの調製
１０ｍｇのＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖（ＰＥＧの分子量は２，０００Ｄａ；キトサンオリゴ糖の分子量は１８，６００Ｄａ；ＰＥＧのグラフト化率は８．１％；ステアリン酸のグラフト化率は４８．３％であった）を、１０ｍＬの水に溶解し、ミセル溶液を調製した。超音波水浴で１５分間処理した後、溶液を、滅菌のため０．２２μｍの微多孔膜で濾過した。ｓｉＲＮＡ溶液（５００μｇ／ｍＬ）を２５ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４溶液で調製した。ミセル溶液とｓｉＲＮＡ溶液とを、３のＮ／Ｐ比率で混合し、続いて室温で２５分間静置して、ミセル／ｓｉＲＮＡの複合ナノ粒子の形成をさらに促進した。
【００８１】
適切な量の混合懸濁液を、脱イオン水で適切に希釈し、次いで粒子サイズおよび表面電位を粒子サイズおよび表面電位アナライザーで測定した。ｓｉＲＮＡを装填したＰＥＧ化脂肪酸グラフト化キトサンオリゴ糖の物理的および化学的特性を表７に示した。
【００８２】
【表７】
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【００８３】
（７）抗ウイルス薬組成物におけるＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の応用
抗ウイルス薬を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル調製
実施例８で調製した１００ｍｇのＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖（ＰＥＧの分子量は２，０００Ｄａ；キトサンオリゴ糖の分子量は１８，６００Ｄａ；ＰＥＧのグラフト化率は８．１％；ステアリン酸のグラフト化率は４８．３％であった）を、５０ｍＬのビーカーに入れ、次いで９０ｍＬの蒸留水（ｐＨ５．７）を添加し、超音波プローブで２０回（５００ｗ、刺激時間２秒、中断時間３秒）処理した。続いて、溶液をメスフラスコに移し、蒸留水で全容積を１００ｍＬとし、１ｍｇ／ｍＬのミセル溶液を得た。２０ｍＬのＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセル溶液を取り、それぞれ、１ｍｇ／ｍＬのアデホビル、アシクロビル、アデホビルジピボキシル、エンテカビル、およびガンシクロビル溶液を１ｍＬ添加した。室温で３時間撹拌した後、それらを超音波プローブで２０回（５００ｗ、刺激時間２秒、中断時間３秒）で処理し、０．２２μｍの微多孔膜を用いて濾過して、抗ウイルス薬を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルを得た。
【００８４】
薬物を装填したミセルの粒子サイズおよび表面電位を、粒子サイズおよび表面電位アナライザーで測定し、薬物封入効率をＨＰＬＣで測定した。抗ウイルス薬を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖の物理的および化学的特性を表８に示した。
【００８５】
【表８】
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【００８６】
ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルの抗ウイルス活性
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を、約１０％のウシ血清で補足されたＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した（５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーター中で）。細胞を、それらが対数増殖期に入るようにインキュベートした。具体的には、対数増殖期の細胞を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、培地で希釈した。次いで、希釈した細胞を、２４ウェル培養プレートにウェル当たり１×１０４個の接種密度で接種し、続いて細胞がプレートに接着するまでインキュベーター中で２４時間培養した。古い培地を除去した後、細胞を、ｐＨ７．４の緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、種々の濃度のアデホビル溶液、およびアデホビルを装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルを添加した。細胞を２、４、６、８および１０日間再培養した。最後に、培地を集め、それを使用して、酵素免疫アッセイキットで表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）レベルを検出し、リアルタイム定量ＰＣＲ法でＢ型肝炎ウイルスのＤＮＡ（ＨＢＶ  ＤＮＡ）を測定し、ＭＴＴアッセイで細胞生存率を測定した。
【００８７】
アデホビルジピボキシルおよび薬物を装填したＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖のミセルをＨｅｐＧ２．２．１５細胞と共にインキュベートした後、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢＶ−ＤＮＡの発現抑制率に対するそれらの効果を図４Ａおよび４Ｂに示した。
【００８８】
結果は、アデホビルジピボキシルを装填したグラフト体のミセルが、薬物の抗ウイルス効果を有意に高めることができ；特に、Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡの発現に対する抑制効果は、Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡの発現をそのより低い投与量で完全抑制できるほど意味のあるものであることを明らかにした。
【００８９】
治療指数（ＴＩ）は、抗ウイルス薬の臨床的応用の見込みを評価するための指標の１つである。ＴＩ＞２は、有効かつ低毒性であることを意味し、１＜ＴＩ＜２は、低効率かつ有毒性であることを表し、ＴＩ＜１は毒性効果を意味する。ＴＩ＝ＴＣ５０／ＩＣ５０であり、ここで、ＴＣ５０は、ウイルス感染細胞を薬物で処理して１０日目後に５０％の細胞死をもたらす薬物濃度を指し、当技術分野で周知の方法で測定することができ；ＩＣ５０は、ウイルス感染細胞を薬物で処理して１０日目後にＨＢｓＡｇおよびＨｂｅＡｇに対して５０％の抑制率に達する薬物濃度を指す。アデホビルジピボキシルを装填したグラフト化ミセル送達システムのＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇに対する治療指数を表９に示した。
【００９０】
【表９】
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【００９１】
結果は、アデホビルジピボキシルを装填したグラフト体のミセル送達システムのＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇに対する治療指数は、すべて２を超え、担体として本発明のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖を使用する抗ウイルス薬組成物は、効率が高く、かつ毒性が低い抗ウイルス製剤であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明のＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖は、各種医薬組成物において薬物担体として広範に使用することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物活性成分の標的化吸収を改善するだけではなく、薬物が分解するのをある程度まで予防し、それによって薬物の安定性を維持し、薬物の副作用を低減することができる。したがって、ＰＥＧ化ステアリン酸グラフト化キトサンオリゴ糖および本発明のグラフト体を含む医薬組成物は、産業において広範に応用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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