(57)【要約】  正常な妊娠における全血漿FVIIタンパク質と比較して、妊娠中の雌において、活性化FVII（FVIIa）を含む全血漿FVIIタンパク質が上昇していることは、子癇前症の妊娠合併症のインジケータであることが見出された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠中の雌において子癇前症（P-EC）を診断する方法であって、全FVIIタンパク質（第VII因子および第VIIa因子）が、P-ECなしの同等の年齢の妊娠中の女性に由来する同等のサンプルにおける全FVIIタンパク質のレベルと比較して、前記雌に由来する血液または血漿のサンプルにおいて上昇しているかどうかを決定することを含む方法。
【請求項２】
前記サンプルが妊娠の第三期で得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが血漿サンプルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
組織因子と複合体を形成していてもしていなくても、第VII因子および第VIIa因子の両方を検出するイムノアッセイである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
血圧および尿のタンパク質または尿のクレアチン/タンパク質比の測定が後に続く、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
高血圧および/または蛋白尿の決定により示されるP-ECの診断を確認するために使用される、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、妊娠中の雌における子癇前症（P-EC）の診断マーカーとしての血漿第VII因子（FVII）の使用に関する。より詳細には、本発明は、全血漿FVIIタンパク質（活性化FVII（FVIIa）の検出を含む）が、正常な妊娠で見られるものと比較して上昇しているかどうかを決定することに関する。P-ECの雌に由来する血漿サンプルにおけるかかるFVIIの上昇は、組織因子と複合体を形成していてもしていなくても、FVIIおよびFVIIaを検出する単純なイムノアッセイを用いて見出された。
【発明の背景】
【０００２】
正常な妊娠の過程において、局所的な凝固性亢進状態が胎盤ホメオスタシスに不可欠であることが十分に確立されている。しかし、これは、子癇前症の合併症、未知の病因の複雑なマルチシステム障害の発症を伴って更に深刻になる。小さな胎盤血栓は、P-ECの女性に頻繁に観察され、このことは、胎盤の脈管構造の血栓性の性質に加えて、血栓症に対する素因が、この状況の発症を引き起こしたり、それに寄与したりし得ることを示唆する（Bremme and Blomback (1996) Gynecol. Obstet. Invest. 41, 20-26）。血栓の形成は、胎盤の灌流（prefusion）および胎児の成長発達を低下させ、おそらく子宮内死亡につながり得る。よって、P-ECの特徴の多くを説明する際に、脈管内凝固に対する関心が高まっている(たとえばHowie et al. (1976) Lancet 2, 323-325; Howie, (1977) Clin. Obstet. Gynaecol. 4, 595-611; Schjetlin et al. (1999) Acta Obstet. Gynecol. Scand. 78, 191-197を参照)。それにもかかわらず、P-ECの診断は、現在、一般的に高血圧、蛋白尿および他の関連の症状の臨床的観察に基づいているが、かかる診断は欠陥を有し、生存可能な胎児の最善の機会を保証するために、分娩のタイミングについて信頼できる指針を必ずしも提供していない。
【０００３】
他の人々が、P-ECの発症と関連して凝固因子を観察したところ、Oian et al.は、１ステージ凝固アッセイを用いて、重篤なP-ECをもつ妊娠の第三期の女性に、正常な妊娠グループと比較して有意に低い第VII因子活性を見出し（Br. J. Obstet. Gynaecol. (1985) 92, 511-517）、重篤なP-ECと第VII因子活性の低下との間のかかる関連は、Sandset al.によっても提案されている（Thrombosis Res. (1989) 55, 665-670）。他の人々は、P-ECをもつ妊娠中の女性における第VII因子レベルは、正常な妊娠コントロールと比較して、より少ない差があるかまたは有意な差がないことを報告した（Djeimis et al. (1997) Coll. Antropol. 1, 127-137; Schjetlein et al. (1999) ibid）。しかし、Schjetlin et al.は、彼らの研究のためにFVII ELISAアッセイを採用したが、これは、本発明者らのFVII/FVIIaアッセイとは異なり；これは、抗原の捕捉および検出の両方のためにポリクローナル抗体を採用した。更に、低いFVIIは、P-ECおよび胎児発育遅延をもつ女性に由来する血漿サンプルでのみ見出された。Djelmis et al.は、Radonja Diagnostics試薬を採用した。しかし、この試薬の感度および正確な特異度は、本発明者らにより知られておらず、また、彼らが採用したFVII ELISA技術と異なっていてもよく、これは、上述のとおり、組織因子と複合体を形成していても形成していなくても、FVIIおよびFVIIa抗原の両方を有意に検出する。
【０００４】
対照的に、Bremme and Blomback (Gynecol. Obstet. Invest. Ibid) は、出産から6〜15ヵ月後にP-ECの早期診断をされ、授乳の終了から少なくとも１ヶ月後に血液サンプリングを実施した女性において、血漿第VII因子レベルが上昇していたことを報告したが、ELISAアッセイによるFVIIの顕著に高いレベルは、P-EC後の本態性高血圧症の発症に対する危険因子を理解することを主に目的とした広範な研究の一部として、重篤なP-ECの早期診断をされた女性に由来するこのアッセイで試験された13個の血漿‘残り（leftover）’サンプルのうち３個でしか見出されず、妊娠の間にFVIIレベルの測定は行わなかった。更に、研究された中程度および重度のP-ECグループの両方について採用された除外基準は、腎臓病、グルコース不耐症、遺伝性高血糖症、遺伝性高血圧症および境界型高血圧症、または喫煙（喫煙と凝固活性化との間に相関があることは知られている）などの症状を含まなかった。更に、止血マーカーは、正常な妊娠中の女性およびP-ECの女性の両方において、分娩後5〜6週で正常化することが知られている。たとえば、フォン・ビルブラント因子は、中程度および重度のP-ECの女性において増大するが、分娩後5週までには正常レベルに戻ることが報告されている（Deng et al. (1994) Obstet. Gynecol. 84, 941-945）。Royal College of Obstetricians and Gynaecologists, UKからの情報によれば、P-ECのほとんどの女性は、分娩後6週以内に正常値に戻る。よって、P-ECの発症に関して臨床上の関連がないことは、分娩から更に長時間後に得られたBremme and BlombackのFVII結果から外挿することができる。
【０００５】
第VII因子は、脈管壁の損傷後に組織因子（TF）に結合し、プロテアーゼ開裂によりFVIIaへ活性化される。Ca2+および脂質の存在下で、TF：FVII：FVIIa複合体は、FIXおよびFXの両方を活性化し、最終的にトロンビンの生成およびフィブリン血塊形成につながる。TFは、組織因子経路インヒビター（TFPI）により阻害される。
【０００６】
FVIIおよびFVIIaの両方を、単独であってもTFと複合体を形成していても捕捉し、検出して、血漿サンプルにおける全FVIIタンパク質を決定するようにFVIIに結合する抗体を用いることにより、本発明者らは、P-ECをもつ妊娠の第三期の女性の血液において、正常な妊娠コントロールおよび健康な妊娠していない同等の年齢の雌における全血漿FVIIタンパク質と比較して、全血漿FVIIタンパク質が有意に上昇していることを見出した。対照的に、FVIIa、TFまたはTFPIにおいて、同等の変化は観察されなかった。よって、正常な妊娠で予測されるものを超える全FVIIタンパク質レベルの上昇は、P-ECの有用なマーカーとしてここで提案される。
【発明の概要】
【０００７】
よって、本発明は、妊娠中の雌においてP-ECを診断する方法であって、全FVIIタンパク質（第VII因子および第VIIa因子）が、P-ECなしの同等の年齢の妊娠中の女性に由来する同等のサンプルにおける全FVIIタンパク質のレベルと比較して、前記雌に由来する血液または血漿のサンプルにおいて上昇しているかどうかを決定することを含む方法を提供する。血漿サンプルを使用すると、妊娠の第三期における全FVIIタンパク質のかかる測定は、高血圧および蛋白尿により診断された重篤なP-ECの個体に対して高い感度および特異度を提供することが見出された。重篤なP-ECは、入院時の拡張期血圧＞110 mmHg、または4時間の間隔を空けた2回以上の連続時の＞90 mmHg；および妊娠の20週後に起こる蛋白尿（１日につき＞300 mgタンパク質または尿のタンパク質/クレアチニン比＞30 mg/mmolの何れか）により規定される。対照的に、コントロールとして採用された正常な妊娠中の女性は、120/80 mmHg未満の収縮期/拡張期血圧を有し、高血圧や蛋白尿の病歴を有していなかった。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】研究されたグループにおける全血漿FVIIレベル（ng/ml）の分布：グループ１：重篤なP-ECを有すると従来法で診断された妊娠中の女性；グループ２：同等の年齢の正常な妊娠中の女性（正常なpreg）およびグループ３：同等の年齢の妊娠していない健康な女性（non-preg）。横線は、各グループの中央値を示す。
【図２】健康な妊娠していない女性に対するP-ECの女性における血漿FVIIレベルの相対動作特性（ROC）曲線の濃度曲線下面積（AUC）。
【図３】正常な妊娠中の女性に対するP-ECの女性における血漿FVIIレベルのROC曲線のAUC。
【詳細な説明】
【０００９】
上述のとおり、本発明は、妊娠中の女性の血漿サンプルにおいて全FVIIタンパク質（FVIIおよびFVIIa）を測定することに依存する。かかる測定は、好ましくは、TFと複合体を形成していても複合体を形成していなくても、FVIIおよびFVIIaの両方が決定されるような、結合抗原のための捕捉抗体および検出システムを採用するイムノアッセイの形態をとり得る。かかるイムノアッセイは、従来法の酵素結合イムノソルベント（ELISA）アッセイの形態をとってもよく、これは、たとえばIMUBIND(登録商標) Factor VII ELISAキット（American Diagnostica Inc., Stamford, Connecticut, USA）を採用し、ここでは、抗FVII/FVIIaポリクローナル抗体が捕捉抗体として使用され、FVIIおよびFVIIaを結合するビオチン化モノクローナル抗体が結合抗原の検出のために採用される。たとえば、同じFVIIエピトープを認識する異なる標識モノクローナル抗体および/または異なる捕捉抗体（モノクローナルまたはポリクローナル)を用いて、等価なイムノアッセイが採用されてもよいことが認識される。実際、全FVII抗原に対して同じ検出特異性を提供するのであれば、任意のイムノアッセイが採用され得る。簡便には、捕捉された抗原は、ビオチン化抗体および酵素標識ビオチン特異的結合パートナー、たとえば上記キットを用いた場合のようなホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンの添加を用いて検出され得る。検出のためにかかる酵素標識抗体を使用した場合、硫酸の停止溶液、たとえば例により例証されるように0.5N 硫酸の使用により、感度を増大させてもよい。しかし、結合抗原のための他の検出システムが、標識二次抗体を含めて採用されてもよい。イムノアッセイの分野で慣用的に採用される任意のタイプの検出可能な標識が使用され得る。例として、蛍光標識および化学発光標識が代わりに採用されてもよい。
【００１０】
P-ECの予備的スクリーニングとして上記FVIIタンパク質の決定を使用し、その後、血圧および尿のタンパク質または尿のタンパク質/クレアチン比の測定を使用することが選択されてもよい。また、血漿FVIIタンパク質の決定は、高血圧および/または蛋白尿の決定により示されるP-ECの診断を確認するために使用されてもよい。
【００１１】
以下の例は、本発明を例証しており、全第VII因子タンパク質のELISA決定のための上述のキットおよびFVIIa、TFおよびTFPIを決定するための他のELISA方法を採用して行われた。
【例】
【００１２】
材料および方法
被検体
倫理委員会の承認は、Southampton and South West Hants Local Research Ethics Committeeにより研究のために認められた。インフォームドコンセントを全ての参加者から求め、各被検体に対して関連の臨床上の詳細を記録した。トータル57人の同等の年齢の女性を研究した。これらは、健康な妊娠していない女性（n=22; 平均年齢=29±6.04）、正常な妊娠中の女性（n=15; 平均年齢=30.4±5.04）、および妊娠の第三期にP-ECをもつ女性（n=20; 平均年齢=29.1±5.59）を含んでいた。上述のとおり、重篤なP-ECは、入院時の拡張期血圧＞110 mmHg、または4時間の間隔を空けた2回以上の連続時の＞90 mmHg；および妊娠の20週後に起こる蛋白尿（１日につき＞300 mgタンパク質または尿のタンパク質/クレアチニン比＞30 mg/mmolの何れか）により規定した。健康な妊娠していない女性または正常な妊娠中の女性（コントロールグループ）は、120/80 mmHg未満の収縮期/拡張期血圧を有し、高血圧や蛋白尿の病歴を有していなかった。３つのグループに共通の除外基準は、慢性高血圧、凝固障害または止血異常、心臓血管疾患、癌、糖尿病、腎臓および肝臓病、抗凝固またはコルチコステロイド療法、および喫煙であった。いずれの女性も、生殖年齢で高血圧を有しておらず、以前の妊娠の間にP-ECを有していなかった。
【００１３】
サンプル収集
5 mlの静脈血を、21-ゲージ針を用いて、3.8％クエン酸三ナトリウム抗凝固溶液を含有するバキュテイナーチューブ（Becton-Dickinson）に、9体積の血液と1体積の抗凝固溶液の比率で集めた。各アッセイのための製造メーカーの指示書（American Diagnostica Inc., Stamford, Connecticut, USA）に従って、1.5 mlエッペンドルフチューブで全血を遠心分離した後；血漿サンプルをすぐに単離し、バッチ式の分析のために-70℃で保存した。各アッセイのために、予め解凍されていない一部分を使用した。
【００１４】
TF-依存性因子の測定
商業的に入手可能な酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)キット（IMUBIND(登録商標); American Diagnostica Inc., Stamford, Connecticut, USA）を、製造メーカーの指示書に従って使用して、血漿中のFVII、FVIIa、TFおよびTFPIを測定した。採用したアッセイは、以下で更に説明される。
【００１５】
血漿−TF
TFレベルは、IMUBIND(登録商標) TF ELISAアッセイにより決定した。テストサンプルを、捕捉抗体（マウス抗ヒトTFモノクローナル抗体）で予めコーティングしたマイクロタイタープレートの２つのウェルに添加した。その後、結合したTFを特異的に認識するビオチン化抗体フラグメントを用いてTFを検出する。ストレプトアビジン結合ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）のその後の結合により、抗体酵素検出複合体の形成は完了する。TMB基質の添加およびHRPとのその後の反応は、結合した酵素により青色の溶液を産生する。反応は、硫酸を用いて停止させ、450 nmにおいて吸光度を読む。その後、ブランクウェルからのバックグラウンド値を引き算した後、標準曲線から値を自動計算する。IMUBIND(登録商標) TF ELISAアッセイは、TF-apo、TFおよびTF:FVII複合体を認識する。他の血液凝固因子やプロコアギュラントのインヒビターからの有意な干渉は、アッセイにおいて観察されなかった。下限の検出限界は、約10 pg/mlである。アッセイ内およびアッセイ間の変動係数は、それぞれ4.5％および7.5％であった（American Diagnostica Inc., Stamford, Connecticut, USA）。
【００１６】
血漿−FVII
FVIIレベルは、IMUBIND（登録商標）Factor VII ELISAキットを用いて測定した。要するに、IMUBIND FVII ELISAは、捕捉抗体として抗FVII/FVIIaポリクローナル抗体を採用する。FVII/FVIIaを含有する希釈された血漿サンプルを、抗FVII/FVIIa捕捉抗体で予めコーティングされたマイクロテストウェルでインキュベートする。緩衝液で洗浄した後、免疫捕捉されたFVIIを、ビオチン化抗FVIIモノクローナル抗体を用いて検出する。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（HRP）の添加により、抗体酵素検出複合体の形成は完了する。TMB基質の添加およびHRPとのその後の反応は、青色の溶液を産生する。反応を停止させ、0.5 M硫酸の停止溶液の添加により感度を増大させ、黄色になる。希釈されたサンプル溶液の吸光度を450 nmで測定し、既知量のFVIIを用いて作成した標準曲線のものと比較することにより、FVIIレベルを決定する。このアッセイは、天然のFVIIおよびFVIIa、並びに組換えヒトFVIIa（NovoSeven(登録商標)）を測定する。また、ELISAは、TFと複合体を形成したFVIIおよびFVIIa（TF/FVII、TF/FVIIa）を測定する。アッセイの動作範囲は、1〜50 ng/ml FVIIの間である（American Diagnostica Inc., Stamford, Connecticut, USA）。
【００１７】
血漿−FVIIa
FVIIaレベルは、IMUBIND(登録商標) Factor VIIa ELISAアッセイにより定量した。アッセイは、FVIIaのビオチン化酵素インヒビターおよび捕捉抗体としての抗FVII/FVIIaモノクローナル抗体を採用する。FVIIaを含有するサンプルを、FVIIaと共有結合するがFVIIと共有結合しないビオチン化インヒビターとインキュベートする。その後、FVIIa捕捉抗体で予めコーティングされたマイクロテストウェルにサンプルを添加する。FVIIaは、ストレプトアビジン結合ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）結合体の免疫捕捉FVIIa/ビオチン化インヒビター複合体への結合により検出する。TMB基質の添加およびHRPとのその後の反応により、結合したFVIIaの存在下で青色を呈する。0.5 N硫酸の停止溶液の添加により感度を増大させ、黄色になる。サンプル溶液の吸光度を450 nmで測定し、既知量のFVIIaを用いて作成した標準曲線と比較することにより、FVIIaレベルを決定する。アッセイは、天然および組換えのヒトFVIIaおよびFVIIa/TF複合体を認識する。アッセイで、有意な量のFVIIは検出されない。FVIIは、このアッセイの実施の間に、FVIIaに自動的に活性化されない。下限の検出限界は、FVII欠損血漿に関する平均光学密度の値（n = 15）に2つの標準偏差を加え、標準曲線から対応する濃度を計算することにより決定した。正常なプール血漿におけるFVIIaのレベルは、5＋2 ng/mlであることが見出された（American Diagnostica Inc., Stamford, Connecticut, USA）。
【００１８】
全血漿−TFPI
全TFPIレベルは、IMUBIND(登録商標)Total TFPI ELISAを用いて評価した。要するに、テストサンプルを、捕捉抗体で予めコーティングしたマイクロタイタープレートの２つのウェルに添加する。その後、TFPI Kunitzドメイン1に特異的なビオチン化モノクローナル抗体を用いてTFPIを検出する。ストレプトアビジン結合ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼのその後の結合により、抗体酵素検出複合体の形成は完了する。TMB基質の添加およびHRPとのその後の反応は、結合したTFPIにより青色を呈する。反応は、硫酸を用いて停止させ、450 nmにおいて吸光度を読む。その後、ブランクウェルからのバックグラウンド値を引き算した後、標準曲線から値を自動計算する。Imubind(登録商標)Total TFPI ELISAアッセイは、天然および組換えのヒトTFPIを、複合体およびトランケーション（truncated）形態で認識する。他の凝固因子に由来する有意な交差反応も干渉も、アッセイにおいて観察されなかった（American Diagnostica Inc., Stamford, Connecticut, USA）。アッセイについての下限の検出限界は、0.18 ng/mlであった。5 ng/ml TFPIにおいてアッセイ内およびアッセイ間の変動係数は、それぞれ6.5％および5.5％であった（American Diagnostica Inc., Stamford, Connecticut, USA)。
【００１９】
統計的分析
データは、データベースに入れ、Sigma Stat software system version 1.0により分析した。データは、正規分布をせず、概要の統計値は、中央値および四分位数間範囲（IQR）として表した。二以上のグループの間の差は、RanksまたはDunnの方法によるMann-Whitney U-TestまたはKruskal-Wallis One-Way Analysisの何れかにより評価した。P＜0.05は、統計的に有意であると考えた。信頼度の指標は、以下の慣用的な式を用いて評価した：
感度 = 真の陽性/真の陽性＋偽陰性
特異度 = 真の陰性/真の陰性＋偽陽性
陽性予測値 = 真の陽性/真の陽性＋偽陽性
陰性予測値 = 真の陰性/真の陰性＋偽陰性
また、感度および特異度は、相対動作特性(ROC)曲線の濃度曲線下面積（AUC）および95％信頼区間（CI）を測定することによっても決定した。
【００２０】
結果
要約すると、全血漿FVIIタンパク質レベルは、健康な妊娠していない女性グループまたは正常な妊娠中の女性グループにおける全血漿FVIIタンパク質レベルと比較して、P-ECの女性において有意に上昇していた。しかし、研究された他の止血因子、すなわちFVIIa、TFおよびTFPIに同等の変化はなかった。
【００２１】
血漿FVII
血漿FVIIレベルは、健康な妊娠していないグループ（n=22; 中央値=182.88; IQR=143.5-270.52）または正常な妊娠中のグループ（n=15; 中央値=160.88; IQR=107.14-333.8）と比較すると、P-ECの女性（n=20; 中央値=482.63; IQR=418.28-563.70）において、より高い中央値およびIQR範囲を示した。これは、健康な妊娠していない女性グループ（P＜0.001）または正常な妊娠中の女性グループ（P＜0.001）に対して統計的に有意であった。結果の分布を図１に示す。
【００２２】
血漿−FVIIa
血漿FVIIaレベルに関する中央値およびIQRは、研究された３つのグループの間で差がなかった；P-ECの女性（n=20; 中央値=4.34; IQR=3.28-7.16）、健康な妊娠していないグループ（n=22; 中央値=4.51; IQR=3.45-6.31）、または正常な妊娠中のグループ（n=15; 中央値=4.72; IQR=3.17-5.31）。
【００２３】
血漿−TF
血漿TFレベルは、３つのグループを試験した際に相互に有意な差を示さなかった。これらのグループの中央値およびIQRは、P-ECの女性（n=20; 中央値=24.85; IQR=4.0-45.71）、健康な妊娠していないグループ（n=22; 中央値=16.5; IQR=11.63-26.71）、および正常な妊娠中の女性グループ（n=15; 中央値=11.54; IQR=6.62-17.04）であった。
【００２４】
血漿−TFPI
P-ECおよび健康な妊娠していない女性グループは、正常な妊娠中の女性グループと比較すると、血漿TFPIレベルについて僅かに高い中央値およびIQR範囲を示した。しかし、３つのグループの間で血漿TFPIレベルに有意な差はなかった。３つのグループの中央値およびIQR範囲は、P-ECの女性（n=20; 中央値=36.17; IQR=28.76-44.61）、健康な妊娠していない女性（n=22; 中央値=36.79; IQR=30.36-45.48）、および正常な妊娠中の女性（n=15; 中央値=30.4; IQR=24）であった。
【００２５】
P-ECの検出におけるFVIIレベルの信頼度
血漿FVIIレベルは、妊娠の第三期において、高い感度（90％）および特異度（80％）で、P-ECの女性を、健康な妊娠していない女性または正常な妊娠中の女性と識別することができる。他の信頼度の指標は、真の陽性（86％）；偽陽性（14％）；真の陰性（86％）；偽陰性（14％）を含む。よって、陽性および陰性の予測値は、86％であった。ROC曲線を用いても、血漿FVIIレベルは、再度、P-ECの検出において感度および特異度を示した。健康な妊娠していない女性または正常な妊娠中の女性グループに対する相対動作特性（ROC）曲線についてのAUCおよび95％信頼区間（CI）は、それぞれ(0.94; 90％ CI = 0.87-1.0; P＜O.001; 図２)および(0.941 ; 90％ CI = 0.88-1.0; P＜0.001; 図３)であった。これらを表１に要約する。
【表１】
2011521254.tif 000002
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2011521254.tif 000007