(57)【要約】本発明は、セルロース、ヘミセルロース、デンプン、非デンプン多糖、これらの任意の混合物またはこれらの分解産物を含有する有機原料から、脂質または脂質混合物を生産する方法に関する。本発明方法によると、該有機原料は、水、酸の水溶液またはアルカリの水溶液を用いて１回または複数回処理され、沈殿物と濾液が分離される。上述の処理により得られる沈殿物を機械的または熱機械的に粉砕しもよく、または該沈殿物を強酸で処理してもよく、あるいは該沈殿物は酸性化した後、機械的または熱機械的に粉砕してもよい。該処理の後、沈殿物と濾過物を分離する。培地中で、脂質を生産する微生物と、該有機原料または得られた濾液とを接触させることにより、微生物細胞に脂質の生産を開始させ、次いで該脂質を回収する。
2011502526.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース、ヘミセルロース、デンプン、これら全ての混合物もしくは、これらの任意の混合物またはこれらの分解産物および非デンプン多糖を含有する群から選択される多糖を含有する有機原料から、脂質または脂質混合物を生産する方法であって、
以下工程のａ）〜ｃ）を含むことを特徴とする該方法：
ａ）該有機原料を、
i)  水、
ii)  酸および
iii)アルカリ
から選択される物質で処理し、
該処理の後、沈殿物と濾液とを分離し、
次いで、該処理から得られた該沈殿物を、そのままの状態、または水、酸もしくはアルカリの存在下で機械的または熱機械的に粉砕した後、沈殿物と濾液とを分離するか、あるいは、該沈殿物をi）水、ii）酸またはiii）アルカリのいずれかの物質を用いる処理および／または該物質の存在下での粉砕処理に１回または複数回付し、
ｂ）培地中で、脂質生産性微生物を、上記工程で得られた１種の濾液もしくは複数種の濾液、該沈殿物、またはこれらの任意の混合物および所望による該有機原料と接触させることにより、該微生物の細胞に脂質の生産を開始させ、次いで
ｃ）脂質を回収する。
【請求項２】
沈殿物の処理を、必要に応じて、１または複数の以下に記載の工程ｄ）〜ｇ）を含む方法も使用しておこなうことを特徴とする請求項１に記載の方法：
ｄ）工程ａ）から得られた沈殿物を強酸で処理した後、沈殿物と濾液を分離し、あるいは、
ｅ）工程ａ）またはｄ）から得られた沈殿物を酸性化し、該酸性化物を機械的または熱機械的に粉砕した後、沈殿物と濾液を分離し、または必要に応じて、
工程ａ）、ｄ）またはｅ）のいずれかから得られた沈殿物の処理を、工程ａ）、ｄ）またはｅ）のいずれかによる方法を任意の順番で使用して、１回または複数回おこない、
ｆ）培地中で、脂質生産性微生物を、工程ａ）、ｄ）またはｅ）から得られた濾液もしくは沈殿物、またはこれらの工程から得られた濾液および沈殿物の任意の混合物、および必要に応じた有機原料と接触させることにより、該微生物の細胞に脂質の生産を開始させ、次いで
ｇ）脂質を回収する。
【請求項３】
原料が、木材を機械的または熱機械的に処理したものまたは栽培植物を起源とすることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
原料が水または酸で処理されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
原料が、再生繊維、テンサイパルプ、籾殻、わら、ふすま、穀物粒、全ての栽培可能な作物、栽培植物、ＴＭＰパルプおよびＭＤＦパルプを含む群から選択される原材を起源とすることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
原料が酸で処理されることを特徴とする請求項１、２または５に記載の方法。
【請求項７】
原料が、おがくず、精砕機械パルプ、籾殻、わら、ＴＭＰパルプ、ＭＤＦパルプ、テンサイパルプおよびデンプンを実質上含まない栽培植物を含む群から選択される原材を起源とすることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
原料がアルカリで処理されることを特徴とする請求項１、２または７に記載の方法。
【請求項９】
原料が、微生物マス、沼地または水中のバイオマス、セルロース工場の集水域からのバイオマス、都市の廃棄物からのバイオマスおよび都市の下水からのバイオマスを含む群から選択される原料を起源とすることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
濾液が、脂質の生産において利用可能な糖を少なくとも０.５〜１重量％、２０〜３０重量％まで、好ましくは４〜５重量％含有することを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
工程ａ）、ｄ）またはｅ）のいずれかの処理が１回または複数回おこなわれることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
原料が、工程ａ）のアルカリiii）で処理される場合、得られた沈殿物が酸で再処理され、次いで、沈殿物と濾液が分離されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
繊維質を含有する沈殿物が強酸で処理される場合、得られた沈殿物が機械的または熱機械的に再度粉砕されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
１種または複数種の酵素が、バイオマテリアルの処理溶液に添加されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
いずれかの工程から得られた濾液が、該濾液を微生物の増殖により適した状態に導く方法、例えば、脱色法、ｐＨ調整法および／または水の除去法もしくは添加法などを使用して、さらに処理されることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
原料が、機械的処理、熱機械的処理、物理的処理、化学的処理、生物学的処理またはこれらの任意の併用処理によって、予め処理されることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を使用して生産される脂質または脂質混合物の生物燃料の製造原料としての使用。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を使用して生産される脂質を使用して生産されることを特徴とする生物燃料。
【請求項１９】
都市の下水が、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を使用して処理されることを特徴とする都市の下水の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１の前文に記載の有機原料から脂質または脂質混合物を生産する方法に関する。また、本発明は、該方法により生産される脂質または脂質混合物を、請求項１８に記載の生物燃料と共に請求項１７に記載の生物燃料として使用することに関する。さらに、本発明は、請求項１９に記載の都市の下水を浄化する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
化石原料から製造される輸送燃料の使用は極めて多岐にわたり、該燃料の消費量が継続的に増加していることは一般に知られている。従って、化石エネルギー資源に関する妥当性と、環境効果と、環境に優しい持続可能な開発の局面は、欠くことのできない地球規模の難題として極めて当然のごとく浮上している。この視点において、輸送燃料の再生可能な代替原料が高まる関心の一対象として注目されている。
【０００３】
再生可能な天然資源に依存して燃料を生産することの第一歩は、少なくとも部分的に化石原料を有機原料に置き換えることを試みることである。しかし、このやり方でも、解決するにはかなり困難な問題が生じることを想像できる。例え化石原料のごく一部が置き換えられたとしても、現在の化石原料の消費量に比例して、必要となる有機原料の量は極めて多量になる。これに関する幾つかの点に関連して言えば、この目的のための有機天然資源の一面だけからの大規模な消費または耕作地の開拓が、天然の生物の多様性と食料の一次生産のバランスに影響をもたらすことがすでに観察されており、このような問題を解決することは困難となるであろう。また、有機物質をエネルギー効率のよい方法で輸送燃料の製造に使用できる形態に変換することも、技術的な困難を伴う。
【０００４】
輸送燃料のための特に好ましい原料源は有機脂肪、特にトリアシルグリセロールである。この理由は、有機脂肪のエネルギー含量は、例えば、対応する炭水化物またはアルコールのエネルギー含量に比べて著しく高いからである。さらに、有機脂肪を、比較的効率的な化学的方法によって輸送燃料、例えばディーゼル燃料、バイオディーゼル燃料または再生可能なディーゼル燃料などの成分に変換できることがよく知られている。しかしながら、天然脂肪原料の貯蔵量の不足は、この方法の限定要因となる。現在の脂肪性資源に基づけば、不十分ながらも生物燃料を工業的に生産することはある程度可能である。したがって、脂肪の貯蔵量を増加させるためには、脂肪分の多い植物の栽培量を大幅に増加させる必要がある。脂肪分の多い植物の栽培に関する生産部門におけるこのような大きな変化は、世界市場における食料経済のバランスに強い影響をもたらす。この必要性は、推測の範囲に過ぎないが、食料および飼料原料の価格の大暴騰となって、すでに現れている。
【０００５】
天然における再生可能な有機マスの総量は極めて大きく、該総量は、炭素の量として算出される場合、輸送燃料としての化石炭素の年間使用量よりもかなり大きい。しかしながら、これらの再生可能なマスの大部分（約６０％）は相当な量の酸素を含む化合物で構成されるので、これらのマスの燃料としての価値はきわめて低い。
【０００６】
既知の従来技術に基づくと、比較的エネルギー含有量の低い炭水化物を利用して、より短い炭化水素鎖を有する高エネルギー化合物を、特に化学的な方法（例えば、極めて多量のエネルギーを消費する方法である気化技術など）によって得ることが理論的に知られているが、この場合の供給と収率の間の全効率は低い（Ｒ．アグラワル、Ｎ．Ｒ．シング、Ｆ．Ｈ．リベイロおよびＷ．Ｎ．デラガス著、２００７年、「輸送部門のための持続的に利用可能な燃料」、ＰＮＡＳ、第１０４巻：第４８２８頁〜第４８３３頁、および国際特許出願公開２００６／１１７３１７号明細書）。
対応するする根本的な問題は、炭水化物に含まれているヘキソース糖を高エネルギー化合物に変換させる際に使用する既知の技術による生物工学プロセスにも関連する。この例としては、アルコールの生成、特にエタノールの生成が挙げられ、このような例は、米国特許出願公開２００２／０１８５４４７号明細書、米国特許第５６３７５０２号明細書および国際特許出願公開０３／０３８０６７号明細書などに記載されている。
【０００７】
米国特許出願公開２００４／０２３１６６１号明細書は、リグノセルロースを含有する物質を水抽出および酸抽出し、その後加水分解をおこなうことで、エタノールの調製に使用可能なキシロースとグルコースが生成される処理法を開示する。米国特許第５２２１３５７号明細書は、ヘミセルロースおよびセルロースを含有する物質を酸加水分解し、固形層を機械的に処理して酸加水分解をおこない、エタノールの調製に使用可能な単糖、例えばペントースおよびヘキソース糖を生成する処理法を開示する。米国特許第４７５２５７９号明細書は、トウモロコシの種外皮を、酸および／またはアルカリ、および酵素加水分解によって単糖を分離する処理法を開示する。
【０００８】
幾つかの明細書では、種々の有機物質から微生物発酵法を用いて、脂質を生産する方法を開示する。米国特許第４３６８０５６号明細書は、ブタノール発酵における産業廃棄物中に低含有量で存在する炭水化物の使用およびバイオディーゼル燃料の生産中に、発酵により生じる微生物によるグリセリドの使用を提案する。ダイらによる刊行物（ダイ，Ｃ、タオ，Ｊ.、シェ，Ｆ.、ダイ，Ｙおよびツァオ，Ｍ著「キシロース同化能を有する油性酵母ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis)からのバイオディーゼル燃料の生成」Ａｆｒ.Ｊ.バイオテクノロジ、第６巻（第１８号）、第２１３０頁〜第２１３４頁、２００７年９月１９日）は、ロドトルラ酵母により脂質を生産するための原料として、植物性素材のわら（例えば、トウモロコシの茎、木の葉および稲）に含まれる炭水化物を、粉砕および酸処理によって抽出する方法、および該処理によって得られた濾液と洗浄水を、ロドトルラ酵母を用いて脂質を製造するときの原料として使用することを開示する。微生物から得られる脂質は、バイオディーゼル燃料の生産に使用される。アンガーバウアーらは、リポマイセス酵母による脂質の生産に廃水汚泥を利用することと共に、アルカリおよび酸によって廃水汚泥を処理し、該汚泥をバイオディーゼル燃料用の原料に変換することを開示する（アンガーバウアー，Ｃ．、サーベンホファー，Ｍ、ミッテルバッハ，Ｍ、グービッツ，Ｇ．Ｍ著「バイオディーゼル燃料を生産するための、リポマイセス・スターケイ（Lipomyces starkeyi)による汚泥の脂質への変換」、バイオリソーステクノロジー、第９９巻（２００８年）第３０５１頁〜第３０５６頁参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許出願公開２００６／１１７３１７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開２００２／０１８５４４７号明細書
【特許文献３】米国特許第５６３７５０２号明細書
【特許文献４】国際特許出願公開０３／０３８０６７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開２００４／０２３１６６１号明細書
【特許文献６】米国特許第５２２１３５７号明細書
【特許文献７】米国特許第４７５２５７９号明細書
【特許文献８】米国特許第４３６８０５６号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｒ．アグラワル、Ｎ．Ｒ．シング、Ｆ．Ｈ．リベイロおよびＷ．Ｎ．デラガス著、２００７年、「輸送部門のための持続的に利用可能な燃料」、ＰＮＡＳ、第１０４巻：第４８２８頁〜第４８３３頁
【非特許文献２】ダイ，Ｃ、タオ，Ｊ.、シェ，Ｆ.、ダイ，Ｙおよびツァオ，Ｍ著「キシロース同化能を有する油性酵母ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis)からのバイオディーゼル燃料の生成」Ａｆｒ.Ｊ.バイオテクノロジ、第６巻（第１８号）、第２１３０頁〜第２１３４頁、２００７年９月１９日
【非特許文献３】アンガーバウアー，Ｃ．、サーベンホファー，Ｍ、ミッテルバッハ，Ｍ、グービッツ，Ｇ．Ｍ著「バイオディーゼル燃料を生成するための、リポマイセス・スターケイ（Lipomyces starkeyi)による汚泥の脂質への変換」、バイオリソーステクノロジー、第９９巻（２００８年）第３０５１頁〜第３０５６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述の方法において生じる問題には、微生物が利用することができる糖の収率が低いという事実、およびこれらの方法は大規模生産の需要に対してあまり重要ではない原料としてバイオマテリアルの使用に適用されるということが含まれる。生物燃料の製造に関する量的目標が、上述した方法および該方法において使用される原料を用いることによって達成できないことは明らかである。
【００１２】
従って、地球に埋蔵される再生可能な有機炭水化物を、その化学的または構造的な組成に関係なく、より高いエネルギー含量を有する化合物へ変換することに使用できる新規の技術的な解決策、特に、以前と比べてより広範囲に適用できる解決策が依然として強く要求されている。様々な有機物質中に存在する炭水化物を、より高いエネルギー含量を有する化合物、例えば、輸送燃料としての使用または該使用のための原料に対してより適合性のある脂肪などへどのようにすれば効率的に変換できるか、という問題を解決することは、特に重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
要旨
本発明の目的は、有機バイオマテリアルを、より高いエネルギー含量を有する化合物へどのようにすれば変換できるか、という問題に対する新規の解決策を提供することである。
【００１４】
特に、本発明の目的は、有機バイオマテリアルから得ることができる炭水化物成分を、バイオディーゼル燃料の生産に適する脂質へどのようにすれば変換できるか、という問題に対する解決策を提供することである。
【００１５】
より正確には、本発明による方法は、請求項１の特徴部分に記載される事項によって特徴づけられる。
【００１６】
同様に、本発明による使用は、請求項１７において記載される事項によって特徴づけられ、また、本発明による生物燃料は、請求項１８において記載される事項によって特徴づけられる
【００１７】
本発明による都市の下水をの浄化方法は、請求項１９において記載される事項によって特徴づけられる。
【００１８】
本発明は、セルロースおよびヘミセルロースフラクションを回収するための種々の方法においてバイオマスを処理した際、該フラクション中において、微生物集団がより急速に出現すると、セルロースおよびヘミセルロースフラクションが更に分解されたという観察に基づく。驚くべきことに、上述した炭水化物フラクション中において、ＡＴＰクエン酸リアーゼ酵素（ＥＣ２.３.３.８；以前のＥＣ４.１.３.８）を有する微生物も増殖し、該微生物が該酵素を利用して脂質、特にトリアシルグリセロールを細胞内に捕集することが発見された。これらの観察に基づいて、本発明によれば、バイオマテリアルを処理してその中に含有されるセルロースおよびヘミセルロースをバイオマテリアルの残余成分から分離した後、加水分解処理に付すことによって、加水分解生成物が、脂質を捕集する微生物の増殖と脂質の生産にとって適合した加水分解生成物を得るバイオマテリアルの処理方法、およびバイオディーゼル燃料の製造における原料としての上記のようにして形成される脂質の使用を開発した。
【００１９】
本発明の説明によると、脂質合成性微生物に利用されるのに適している炭水化物は、種々の材料源を起源とする有機原料より生成されることができ、および／または微生物により脂質が生産され得る炭水化物フラクションを生成させることができる。本発明によると、このような炭水化物は、特に、ヘミセルロース、セルロース、デンプンまたは非デンプン多糖を含有するバイオマテリアルから生産することができる。微生物による利用に適する炭水化物は、特に、ヘキソース糖とペントース糖を共に含有する単糖およびオリゴ糖である。炭水化物ポリマーを利用できる脂質生産性微生物が選択される場合、炭水化物は重合型にすることができる。
【００２０】
様々な形態の木材は、現在回収できる再生可能なバイオマスを最も多く保有する。木材の使用、特に木材の機械的または熱機械的処理または木材からの機械的マスの製造もしくは生産は大規模に行われ、その過程で多量の炭水化物含有副流が生産される。ごく僅かな経済的付加価値が、木材精製産業で生じる裁断片(side cut)に関して見出されている。多くの場合、この種の裁断片は付加的コストをもたらす。何故ならば、該裁断片により引き起される環境負荷は軽減されなければならないからである。技術的な難題として、特に、この種の裁断片のような副流には問題がある。該副流は多量に発生するが、炭水化物の含有量は一般的に少ない。希薄な水性炭水化物溶液は、化学的手段により溶液中の炭水化物を使用することを目的とする工程にとって、あまり適当ではない。
【００２１】
したがって、本発明の目的は、費用のかかる精製手段を目下必要とするかあるいは現在の方法では完全には利用されていないが、エネルギー源としての潜在的な可能性を有するバイオマテリアルを含有する大規模に発生する産業副流を、どのように利用するかという問題の解決策も提供する。
【００２２】
本発明による方法においては、セルロース、ヘミセルロース、デンプン、これら全ての混合物、これらの一部の混合物、またはこれらの分解産物、あるいは、デンプンまたは非デンプン炭水化物自体、またはセルロース若しくはヘミセルロースと結合した該炭水化物を含有する有機原料が処理される。該原料は、機械的、熱機械的、物理的、化学的もしくは生物学的な前処理、またはこれらの併用処理に付すことができ、あるいは該原料をそのまま使用することが適当な場合もある。重合型の炭水化物を含有する原料の場合、水、酸またはアルカリ、またはこれらの混合物を用いて処理することが好ましい。本明細書に記載の方法によるこれらの予備処理の後、混合物は濾液と固形物に分離される。すなわち、沈殿物（図１）および濾液または両フラクションが回収される。水、酸またはアルカリ、またはこれらの混合物を用いる原料の処理を繰り返して行い、沈殿物を分離した後に濾液を混合することが好ましい。アルカリを含む処理において得られる濾液は、そのままの状態または上述の反復処理に付した後の状態の該濾液中において、可溶性単糖の量を増加させるために原料の酸処理をおこなって混合物にすることが好ましい。これらの処理において生成されるいずれかの濾液または沈殿物、原料自体、原料と該濾液若しくは沈殿物との混合物、あるいは複数の濾液または沈殿物は、適切な前処理、例えば中和、脱色および濾過などに付した後に、単細胞脂質の生産に使用される。濾液は、単細胞脂質を生産する微生物にとって適当な単糖の含量と組成を得るために、混合処理、希釈処理または濃縮処理に付すことができる。
【００２３】
処理が水を用いておこなわれるかあるいは酸またはアルカリの存在下でおこなわれるかに応じて、原料の選択可能な処理によって、多様な組成を有する沈殿物が生成される。糖の収率を増加させるために、好ましくは、沈殿物は、そのままの状態、あるいは水、酸またはアルカリの存在した状態で機械粉砕処理に付され、該機械粉砕処理から濾液および沈殿物が再度得られる。濾液、沈殿物またはこれらの混合物は、単細胞脂質を生産するために使用され、所望の場合には、好ましくは、沈殿物は強酸で処理される。酸処理の結果として、濾液および沈殿物が再度生成され、該濾液もしくは沈殿物またはこれらの混合物は単細胞脂質の生産に使用することができる。沈殿物は、比較的高い酸濃度条件下での粉砕を伴う処理に付すことができる。この処理の結果として生成された濾液、沈殿物またはこれらの混合物は、単細胞脂質の生産に使用される。沈殿物は、分離して焼却することができ、あるいは別の方法による生物燃料またはその前駆体の生成に使用することができる。濾液フラクション、沈殿物または原料はそれぞれ、単細胞脂質を生産するために単独で使用することができるが、種々の混合物として使用することもできる。前述の工程段階から得られる沈殿物は、本明細書において記載される早期または後期の工程段階で再度処理することができる。したがって、糖の収率を増加させるために、沈殿物を、先行する処理で用いた酸またはアルカリよりも強い酸またはアルカリで処理することが好ましい。
【００２４】
さらに、酵素処理または微生物発酵を異なる工程段階の間でおこなうことができる。
【００２５】
本発明は、使用済みのアルカリおよび酸を上記方法において再循環させる方法にも関する。
【００２６】
本発明は、生産された脂質が回収されている場合、上記方法において使用された単細胞バイオマスを、本発明に係るバイオマテリアルとして再循環させる方法にも関する。
【００２７】
経済的に利用できる成分は、本発明方法によっておこなわれる処理により得られる沈殿物から回収することができる。また、濾液は、脂質の生産以外の他の微生物学的方法にも使用できる。
【００２８】
本明細書に記載の方法は、どのようにすれば、バイオマスの炭水化物内に含有されるヘキソース単糖およびペントース単糖を、脂質合成性微生物が脂質を生産するためにより効率的に利用できるフラクションであって、比較的多量の単量体糖ユニットを含有するより小さなフラクションへと徐々に変化させることができるか、という問題の解決策を提供する。不溶性物質（沈殿物）が可溶性物質から分離されると共に、濾液が得られる任意の工程段階と関連して言えば、該濾液中に含有されるヘキソース糖およびペントース糖は、そのままの状態、あるいは必要な前処理の後に得られる単細胞脂質を生産するための濾液混合物状態で、単細胞脂質を生産するために使用できる。濾液のほかに、沈殿物、または濾液と沈殿物との混合物も、単細胞脂質を生産するために使用できる。
【００２９】
本発明の総合的な利点は、エネルギー含有量の少ない生物学的起源の化合物、例えば、ヘキソース糖およびペントース糖またはこれらによって生成されるオリゴマー、並びにこれらの混合物などから、高エネルギーの化合物（即ち、脂質）を生産するために、エネルギー効率的で環境に配慮した形式で、すでに工業的に使用されている単位操作と単純な方法を適用できることである。
【００３０】
本発明による方法においては、水、あるいは種々の濃度の酸またはアルカリで再度処理できる有機物質の、機械的または熱機械的粉砕によって該有機物質の新しい面が常に露出するようにすることが特に好ましく、これによって、溶液と該溶液中の沈殿物が調製され、該溶液と沈殿物、特に溶液から、微生物の脂質生産に使用可能な糖をより多く得ることができる。
【００３１】
溶液と沈殿物の分離を数回おこなう場合、単相の加水分解法と比べて、大幅に高められたヘキソース糖とペントース糖の収率が、機械的または熱機械的粉砕により得られる。
【００３２】
本発明による方法においては、酸処理およびアルカリ処理から得られる濾液を混合することにより、または濾液と沈殿物を混合することによって、種々の処理から得られる処理流は、相互に中和される。したがって、濾液もしくは沈殿物またはこれらの混合物は、酸性度を調整することなくそのままで使用でき、少なくとも、酸性度の調整の必要性は低い。数種の異なるバイオマスおよび異なる起源に由来するバイオマスを相互に混合することも有効である。
【００３３】
脂質の生産に使用できる糖であって、アルコールなどの他の化合物を生成するために、完全にまたは部分的に微生物学的に利用できる該糖が生産されるような方法を開発することが特に強調されている。
【００３４】
本発明に特有の利点は、木材の機械的処理および熱機械的処理による副流または主流を利用することに加えて、脂質を生産するための炭水化物を放出する別のバイオマテリアルの利用にも適していることである。
【００３５】
さらに、本発明は、本発明方法に従って、熱機械的処理およびアルカリまたは酸による処理において生成される繊維を再度循環させることで生成される混合物から、脂質または脂質混合物を形成させる方法に関する
【００３６】
本発明により、ヘキソース糖とペントース糖、またはこれらによって形成されるオリゴマーに変換処理でき、微生物によってこれらの糖等から脂質へと変換できる別の有機原料であって、大規模な利用が困難である別の有機原料は、例えば、新聞紙、テンサイから得られるビートパルプ、籾殻およびエン麦などのわらの再生利用から得られる再生繊維、栽培植物と類似の、おがくず、精砕機械パルプ、わら、および泥炭（特に若干分解された泥炭）である。現在のところほとんど利用されていない他の有機物質は、沼地または水面下のバイオマス、セルロース工場の集水域からのバイオマス、および都市の廃棄物からの活性汚泥プラントに存在するバイオマス、または堆積地域または焼却に関係するその他の有機廃棄物である。これらの材料中に含有される炭水化物が、単細胞バイオマスと脂質とを生産する微生物にとって有用な状態に変換されるように、本発明方法の様々な態様を変更させることによって、これらの有機物質を処理してもよい。例えば、都市の廃水は本発明方法を用いて処理されてもよく、これによって、特に有害な微生物を処理中に死滅させる利点が得られる。
【００３７】
本発明の重要な点は、単細胞脂質を生産することに適している単量体のヘキソース糖および／またはペントース糖、あるいはこれらのオリゴマーが炭水化物から得られるように、有機原料の起源に関係無く、炭水化物を含有するバイオマテリアルが処理されることである。２種またはそれよりも多くの処理法を組み合わせて該処理をおこなうことが好ましい。
【発明の効果】
【００３８】
生物燃料を大量生産するために必要な規模において適切な本発明による方法を使用して、脂質生産性微生物の細胞マスの生産および脂質の生産において使用できる原料を、様々な異なるバイオマスから同時に生産させることができる。微生物の脂質生産に適当な成分は、バイオマスの組成、入手可能性および構造に関係なく生産できる。また、本発明による方法を用いることでもたらされる本発明の大きな利点は、有効な糖を高い収率で生産でき、酸性度の調整に必要な化学薬品の消費量を低減できることである。
【００３９】
常套の先行技術と比較して、本明細書に記載される本発明は、セルロースとヘミセルロースとを共に含むバイオマテリアルを、使用に適したヘキソース糖とペントース糖とに変換することを組合せる、画期的な技術を提供する。同じ実施態様によると、本発明は、バイオマテリアル中に含有されるデンプンおよび非デンプンの単糖ユニットを、単細胞脂質の生産に有用な糖に変換するために使用することも可能にする。特に本発明は、再生可能な天然資源が起源である材料、または産業施設または自治体などから排出される価値の低い該天然資源の副流が起源である材料に対して、工業規模で適用できるように実行される。本発明による方法は、単細胞脂質の生産において、安全な微生物によって使用され得る単細胞脂質の前駆体が生成されるように制御された方法でセルロースとヘミセルロースを含有する材料を処理することにも利用できる。
【００４０】
以下において、本発明は、添付の図面と詳細な説明を用いてより詳しく説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、本発明による方法の主要な作業工程を示す。
【図２】図２は、細胞マスおよび脂質を生産するために、ヘキソース糖およびペントース糖をそのままで、または混合状態で使用することを示す。
【図３】図３は、アルカリ処理が施された籾殻と、そこから得られた濾液の１０％酸加水分解から生成された混合物が、脂質を生産するための炭素源として、添加された培地における、酵母の増殖と脂質の生産を示すグラフである。
【図４】図４は、炭素源として市販のペントース糖が添加された培地における、酵母の増殖を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
「炭水化物」は、アルデヒド基、酸根またはケト基および複数個のヒドロキシル基を有する有機分子を意味する。従って、炭水化物の範囲は、単糖、オリゴ糖、多糖、糖、セルロース、ヘミセルロース、デンプンおよび非デンプン炭水化物などの用語で記載される化合物を含む。
【００４３】
「セルロース」は、グルコースのβ−１−４結合により形成されるポリマーからなる一次構造を有する長鎖状の多糖である。
【００４４】
「デンプン」は、主にα−１−４およびα−１−６グルコース単位からなる長鎖状の多類である。
【００４５】
「使用できる糖」は、本発明の場合、微生物が増殖する際に使用する糖であって、脂質およびアルコール生産性微生物が、脂質またはアルコールの生産に使用できる糖を意味する。
【００４６】
「ヘミセルロース」は、複数の異なるヘキソース糖とペントース糖、例えばガラクトース、マンノース、グルコース、キシロースおよびアラビノースからなる化合物群を意味する。
【００４７】
「単糖」は、一般的に３〜９個の炭素原子からなり、１個または複数個の炭素原子において立体化学的な相違点を有する、（Ｃ−Ｈ２Ｏ）ｎで表される炭水化物のモノマー単位である。これらは、６個の炭素原子を有するヘキソース、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースなど、および５個の炭素原子を有するペントース、例えばキシロース、リボースおよびアラビノースなどを含む。
【００４８】
「オリゴ糖」は、Ｏ−グリコシド結合によって、２個またはそれよりも多くの単糖から生成される炭水化物を意味する。
【００４９】
「ペントース糖」は、５個の炭素原子を含有する単糖を意味する。
【００５０】
「ヘキソース糖」は、６個の炭素原子を含有する単糖を意味する。
【００５１】
「加水分解」は、炭素−炭素結合、炭素−酸素結合、炭素−窒素結合、または炭素−硫黄結合が、該反応における水の関与とは関係なしに、水、酸またはアルカリの影響を受けて切断されることを意味する。酵素加水分解の場合、対応する切断反応は酵素によって触媒される。加水分解は、例えば、炭水化物の単糖間のＯ−グリコシド結合、またはタンパク質のアミノ酸間のペプチド結合が切断される反応である。
【００５２】
「水、酸またはアルカリを用いる処理」は、この明細書において、有機物質そのもの、または有機物質から誘導される生成物が、水、酸またはアルカリの存在下において、抽出され、機械的または熱機械的に処理されるか、あるいはこれらの処理を組み合わせて行うことを意味する。ブロンステッド・ローリーの酸アルカリ理論によると、酸は、水素イオン（プロトン）を供与できる化学物質、分子またはイオンを意味し、アルカリは、水素イオン（プロトン）を受容することができる物質、分子またはイオンを意味する。酸は、電子対を受容することができる、いわゆるルイス酸とも称され、アルカリは、塩基対を供与することができる、いわゆるルイスアルカリと称される。これらの定義によると、酸またはアルカリとしての物質の活量は、水溶液に限定されない。本明細書においては、これらの定義による用語「酸」および「アルカリ」は、酸触媒およびアルカリ触媒も意味する。本明細書において、酸は、酸として機能する成分を含む任意の酸性相、例えば気相、固相、または液相（例えば、水溶液）も意味する。これに対応して、アルカリは、アルカリとして機能する成分を含む任意のアルカリ性相、例えば気相、固相、または液相（例えば、水溶液）を意味する。
【００５３】
「有機原料」は、本明細書において、生物によって生産される任意の有機物を意味する。本明細書において、該有機原料はバイオマテリアルとも称される。
【００５４】
特に、有機原料は多糖を含有する有機物質を意味する。「多糖」は、単糖以外の化合物も含有できる単糖から形成される炭水化物ポリマーを意味する。例えば、多糖は、セルロース、ヘミセルロースおよびデンプンである。多糖は、とりわけ、アルギナート、グルカン、イヌリンおよびアラビアゴムも含有する。他の多糖の中から、マンナンが例示される。有機原料は、多糖をそのままで、または混合物として含有していてもよく、あるいはこれらの分解産物を含有していてもよい。
【００５５】
「非デンプン多糖」は、デンプンに特有のα−１−４結合が欠けている分子構造、または該結合が少ない分子構造を有する炭水化物を意味する。非デンプン多糖は、例えばグルカン、アルギネート、イヌリンおよびアラビアゴムである。また、非デンプン多糖は、ヘミセルロースおよびセルロースも含有する。他の非デンプン多糖としては、例えば、藻類に含まれる炭水化物ポリマーが挙げられる。
【００５６】
「栽培植物」は、栽培のために準備される土壌において、有益な目的のために植え付けられるか、播種される植物を意味する。
【００５７】
「脂質」という用語は、一般に、分子の一部として、有機溶媒に溶解するが水にはほとんど溶解しない脂肪族炭化水素鎖を含有する脂肪性物質を意味する。
【００５８】
本発明において、微生物において生成される脂質は、主にトリ−、ジ−のまたはモノ−アシルグリセロール、あるいはステロールエステルであるが、他の脂質、例えばリン脂質、遊離脂肪酸、ステロール、ポリプレノール、スフィンゴ脂質、糖脂質およびジホスファチジルグリセロールなども微生物の細胞内で生成される。
【００５９】
本発明は、バイオディーゼル燃料または再生可能なディーゼル燃料の製造に使用できる。
【００６０】
ＥＵ−指令２００３／３０／ＥＹによると、「バイオディーゼル燃料」は「生物燃料として使用するディーゼル燃料品質を有する植物油または動物油から生産されるメチル−エステル」を意味する。
【００６１】
再生可能なディーゼル燃料は、動物、植物または微生物起源の水素処理された脂質を意味し、微生物脂質は、バクテリア、酵母、カビ類、藻類または他の微生物起源であってもよい。
【００６２】
本発明による方法に用いる原料は、セルロース、ヘミセルロースおよびバイオマスであってもよく、好ましくは、機械的もしくは熱機械的な方法またはその他の物理的方法、または化学的、酵素的もしくは微生物学的な方法、あるいはこれらの方法の組み合わせによって生成されるバインダーを含有することもある木材パルプである。デンプンを含有する植物性の原料、例えば、ジャガイモ、ジャガイモの種々の部位、栽培可能な農作物の種子、トウモロコシ、稲、テンサイ、さらに、同種の植物に含有される非デンプン多糖を含有するテンサイのパルプは、本発明方法を変更することなしに、本発明による方法の原料として使用できる。βグルカンなどの非デンプン多糖を含有する植物の種々の部位も、原料として適当である。また、本発明方法は、単細胞生物が起源であるアルギネートなどの炭水化物を原料として使用するために適している。また、上述した原料組成物は、脂質合成微生物の増殖と脂質生成のための原料としても使用できるタンパク質および脂質を種々の割合で含有する。
【００６３】
また、本発明による方法に用いる原料は、例えば、新聞紙の再利用から得られる再生繊維（古紙パルプ）、テンサイパルプおよびエン麦などの穀類の籾殻、おがくず、精砕機械パルプ、泥炭及びわらであってもよい。本発明による方法において有用である別の原料は、例えば、単細胞バイオマスなどの微生物マス、藻類および肉微小藻類を含む沼地または水中のバイオマス、セルロース工場の集水域からのバイオマス、都市の下水から活性汚泥プラントへ移動するバイオマス、または生物学的成合を含む都市廃棄物であって、該廃棄物中に含有される炭素を二酸化炭素として広範囲に放出する焼却法、堆肥化法または他の方法において現在使用されている該都市廃棄物である。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様による方法は、本発明方法によって１種または複数種の有機物質から得られる濾液、濾液混合物、沈殿物または沈殿物混合物が、脂質の生産が行われる混合物中へ導入される少なくとも１つの工程を含む。本発明方法の別の実施態様は、微生物の増殖と脂質の生成に関して、どのような単糖組成が、濾液、濾液混合物、沈殿物、沈殿物混合物、あるいは濾液と沈殿物の混合物において好ましいかという基準で選択できる。従って、濾液または沈殿物、好ましくは、以下の（ｉ）〜（iii）を含む群から選択される物質でバイオマテリアルを処理し：
（ｉ）水、
（ii）酸、および
（iii）アルカリ、
次いで、繊維を含有する沈殿物と、繊維を含有しない濾液を分離することにより生成される群から選択される。
【００６５】
必要に応じて、沈殿物はさらに１回または複数回、任意の物質（ｉ）、（ii）または（iii）による処理に付され、好ましくは、得られた沈殿物は、機械的または熱機械的粉砕処理に付され、該沈殿物と濾液は分離される。
【００６６】
使用するバイオマテリアルの種類、および所望の単糖に応じて、バイオマテリアルは、水、酸またはアルカリで処理され、好ましくは酸またはアルカリで処理され、一般的に、酸またはアルカリの水溶液により処理される。必要な場合、該処理を複数回おこなってもよい。同じバイオマテリアルは、複数種の異なる溶液により逐次的に処理されてもよく、炭水化物の分離および加水分解を促進する化合物を水に添加してもよい。
【００６７】
以下のグループＩのリストに記載される原料は、第一工程において水で処理することができ、処理効果を向上させる場合には、水と酸の混合物で処理される。
【００６８】
グループIIのバイオマテリアルは、好ましくは、第一工程において酸で処理される。
【００６９】
グループIIIのバイオマテリアルは、好ましくは、第一工程においてアルカリで処理される。沈殿物と濾液がすでに回収されている場合、濾液は酸で再び処理することができる。
【００７０】
グループＩ
木材の機械的、熱機械的、酵素的または微生物学的な処理によって得られるバイオマテリアル、またはこれらの処理法の併用によって得られるバイオマテリアル、あるいは栽培植物から得られるバイオマテリアル。
【００７１】
グループII
再生繊維、ビートパルプ、籾殻、わら、ふすま、穀物の顆粒、全ての栽培植物、栽培植物、ＴＭＰパルプ、ＭＤＦパルプ、あるいはデンプンまたは非デンプン多糖を含有する原料。
【００７２】
グループIII
おがくず、精砕機械パルプ、籾殻、わら、植物の木質部位、ＴＭＰパルプ、ＭＤＦパルプ、ビートパルプ、種々の量のデンプンを含有していてもよい栽培植物。
【００７３】
例えば、該処理は、１種または複数種の酵素を処理溶液、好ましくは、水性処理溶液中に添加することにより促進できる。酵素処理または微生物発酵処理を種々の工程段階の間に介在させることができる。
【００７４】
続く工程において、脂質生産性微生物を、培地中の任意の濾液、沈殿物またはこれらの混合物と接触させ、該微生物の細胞に脂質を生産させ、次いで該脂質が回収される。
【００７５】
また、好ましくは、上述のバイオマテリアル処理工程より得られる繊維を含有する沈殿物は、該繊維を含有する沈殿物が機械的に粉砕されて繊維質を含有する沈殿物と繊維不含濾液が分離される方法を使用して処理される。
【００７６】
さらに、機械的な粉砕から得られる繊維を含有する沈殿物を強酸で処理し、次いで繊維を含有する沈殿物と繊維を含まない濾液を分離することができる。酸処理の後、該沈殿物は再び機械的な粉砕処理に付すことができ、または上述のように、該沈殿物は微生物を使用する脂質の生産に使用することができる。
【００７７】
さらに、バイオマテリアルを酸性化処理に付した後、機械的または熱機械的に粉砕することができ、次いで繊維を含有する沈殿物と繊維を含まない濾液を分離することができる。
【００７８】
上述した任意の処理から得られる濾液または沈殿物、あるいはこれらの混合物は、脂質生産性微生物用の培地に添加できる。
【００７９】
一般的に、濾液中の糖の総量は０．５〜１０重量％である。このうち、バイオマスおよび脂質の生産に使用可能な糖は、一般に少なくとも０．５重量％、好ましくは少なくとも３重量％、より好ましくは４〜５重量％である。例えば、バイオマテリアルを粉砕した後、再抽出することで、より多くの糖をバイオマテリアルから分離でき、このようにして、糖の量をより有効な量へと増加できる。しかしながら、濾液中の糖の量は、好ましくは３０重量％未満、より好ましくは、２０重量％未満である。
【００８０】
脂質を生産できる微生物は、該微生物がまずバイオマスを生産し、次いで脂質を生産するか、またはバイオマスと脂質の両方を同時に生産するように増殖させることができる。
【００８１】
バイオマテリアルの起源と該バイオマテリアルの処理方法（水、酸またはアルカリを用いる処理方法）に応じて、ヘキソース単糖、ペントース単糖または両者の種々の割合の混合物を、図２で示されるように、得ることができる。一部のバイオマテリアルからは、主にヘキソース糖を得ることができ、他のバイオマテリアルからは、主にペントース糖を得ることができる。脂質を生産できる微生物を適当に選択することによって、主にヘキソース糖を含有する濾液、沈殿物またはこれらの混合物を細胞マスの生産に使用し、次いで、主にペントース糖を含有する濾液、沈殿物またはこれらの混合物を、細胞マス内で脂質を生産させることに使用できる。あるいは、脂質は、ヘキソースから細胞マス中で生産させることができる。細胞マスと脂質をヘキソースから生産できる。これに対応して、脂質を生産できる微生物の適当な選択により、主にペントース糖を含有する濾液、沈殿物またはこれらの混合物を、細胞マスの生産に使用でき、次いで、主にヘキソース糖を含有する濾液、沈殿物またはこれらの混合物を、細胞マス内で脂質を生産させることに使用できる。あるいは、脂質は、ペントースから細胞マス内で生産させることができ、または細胞マスと脂質はペントースから生産させることができる。細胞マスと脂質は共に、ペントースとヘキソースの混合物から生産させることができる。
【００８２】
バイオマテリアルの処理
以下においては、本発明の好ましい実施態様によるバイオマテリアルの処理が記載される。一般的に、該処理は２種またはそれよりも多種の処理法の併用によって行われる。
【００８３】
好ましくは、原料は９０〜１００℃の温度で抽出される。酸抽出の有利な実施態様においては、５〜１０％の硫酸などの鉱酸、または有機酸、例えばクエン酸または酢酸を使用し、アルカリ抽出の場合、好ましくは０．５〜２．０ＭのＮａＯＨを使用する。処理時間は幅広く設定でき、好ましくは１〜１０時間、一般的に２〜８時間、最も適当には２〜４時間である。別の処理、例えば酵素、微生物、酸化剤または還元剤を用いる処理、またはこれらの処理の組み合わせは、好ましくは水抽出と組み合わせられる。
【００８４】
該方法によると、抽出において生成される沈殿物は、好ましくは１００〜２１０℃、一般的に１５０〜２００℃の温度で、好ましくは２〜２０分間、一般的には５〜１１分間、機械的に粉砕することができる。好ましくは、圧力は６〜８ｂａｒである。生成されたマスは濾過され、濾液は、単細胞脂質の生産に適当となるように上述の方法を使用して処理される。沈殿物は、強酸で酸処理することができ、好ましくは４０〜７２％の硫酸、適当には６５〜７０％の硫酸で処理される。通常、処理時間は２〜８時間、好ましくは２〜４時間である。該方法は、プロトン触媒的加水分解をもたらす任意の酸で実施することができる。適当な酸は、例えば強鉱酸、リン酸、硫酸、または硫黄、窒素、塩素、臭素およびヨウ素の酸素酸である。
【００８５】
加水分解の生成物は、単細胞脂質の生産に適するように処理される濾液と沈殿物に分離され、該沈殿物は好ましくは５〜１０％の硫酸溶液などの希釈酸性溶液中に導入され、１７０〜２００℃の温度と６〜１０ｂａｒの圧力下で、１０〜２０分間粉砕することができる。混合物は、濾液と沈殿物とに分離され、濾液は単細胞脂質の生産に適するように処理され、沈殿物は取り除くことができる。
【００８６】
前述の方法の実施態様は、原料中に存在する炭水化物を、単細胞脂質の生産のために全体的に使用することを目的とする。しかしながら、原料の抽出方法から開始する場合、該方法は、例えば、沈殿物中の繊維材料を別の目的にも使用する場合のように、処理物の一部のみを選択して実行することができる。本発明による方法は、好ましくは、前述の全ての手順を含有することを特徴とするが、本発明方法の１または複数の工程を実施することから、基本的な方法を逸脱する範囲までは制限されず、または単位操作の順番は制限されない。また、本発明方法は、単細胞脂質の生産におけるこれらの操作により生産される単糖フラクションの使用には限定されない。原料から得られる単糖を含有するフラクションが、脂質の他に、単細胞バイオマスまたはエタノールを生産するために使用される工程段階も本発明による方法に付随させることができる。
【００８７】
以下の説明において、本発明の好ましい実施態様による数種類の方法を開示する。該方法は、説明中に記載される原料以外の原料にも適用できる
【００８８】
Ｉ．
本発明の好ましい実施態様によると、粉砕された木部を含有する木部繊維、ＴＭＰパルプ、おがくずまたは機械パルプは、以下の構成工程により処理される：
Ａ．  １００ｇの木部繊維を、１リットルの水中において９０〜１００℃で２〜４時間（好ましくは２時間）抽出する。沈殿物を濾過によって溶液から分離し、該溶液を回収する。該溶液中における炭水化物の収率は、木部繊維の製造方法に応じて２％〜５％の範囲であり、一般的に高い処理温度（１７０℃以上）のＴＭＰ繊維に対して４〜５％である。
Ｂ．  炭水化物の収率を増加させるために、繊維フラクションを、ｐＨが約１で５〜１０％（好ましくは５％）の酸（例えば鉱酸）の溶液１リットル中において、９０〜１００℃の温度で、２〜４時間（好ましくは２時間）加水分解させる。残存する沈殿物を溶液から分離し、該溶液を回収する。
Ｃ．過剰の酸を、沈殿物からデカントし、該沈殿物を蒸煮解繊機（例えば翼式または円板式精砕機）において再度粉砕する。好ましくは、１分間事前蒸煮することにより沈殿物の温度を上昇させ、混合物中に凝縮物を保つことが好ましい。翼式精砕機を使用する場合、温度を１５０〜２００℃（好ましくは１７０℃）に上昇させ、圧力を６〜８ｂａｒとする。粉砕時間は、木材の種類に応じて２〜１５分の範囲より選択される。沈殿物を濾過によって溶液から分離し、溶液を回収する。
Ｄ．４０〜７２％の強酸（硫酸）を沈殿物フラクションに添加し、室温で２〜４時間（好ましくは２時間）該フラクションに強酸を吸着させる。過剰な酸をデカントして取り除き、沈殿物を蒸煮解繊機（例えば翼式または円板式精砕機）において再度粉砕する。凝縮物が排出されないように１分間事前蒸煮することによって、沈殿物の温度を増加させることが好ましい。翼式精砕機を使用する場合、温度を１５０〜２００℃（好ましくは１７０℃）に上昇させ、圧力を６〜８ｂａｒとする。粉砕時間は、木材の種類に応じて２〜１５分間の範囲より選択される。混合物を濾過し、沈殿物を溶液から分離する。溶液を回収し、沈殿物を燃料として使用する。
【００８９】
任意の構成工程Ａ〜Ｄから得られる溶液フラクションは、脱色法、ｐＨの調製法、および水の除去など微生物の増殖を促進する別の手段を用いて、さらなる処理に付すことができる。得られる溶液を微生物の培地において使用することによって、該微生物に脂質を生産させることができる。構成工程Ａ〜Ｄを組合せることにより、４０〜６５％の木部繊維原料を、原料として使用される繊維から可溶化物に変換できる。溶解炭水化物は、グルコース単位、ガラクトース単位、マンノース単位、キシロース単位およびアラビノース単位を含有し、これらの単位の相互割合は使用される木材の種類に応じて典型的な値である。
【００９０】
II．
本発明の別の好ましい実施態様によると、１００ｇの木部繊維、粉砕された木材、再生繊維、ＴＭＰパルプ、おがくずまたは機械パルプが使用され、これらの原料は４〜８％のアルカリ溶液（好ましくは１ＭのＮａＯＨ溶液）１リットル中において９０〜１００℃の温度で２〜４時間（好ましくは３時間）抽出される。沈殿物を室温で濾過して溶液から分離し、両方のフラクションを回収する。原料繊維の処理に応じて、溶液中の炭水化物の収率は５〜８％の範囲内である。好ましくは、この溶液は、以下に記載の任意の構成工程により処理される：
Ａ．  前述の方法によって、後続の繊維バッチの抽出工程において、バット溶液をそのまま再利用し、その後溶液を回収する。
Ｂ．  バット溶液を、前述の実施態様の任意の工程Ｂ〜Ｄにより酸で加水分解させることによって、溶液中に溶解しているリグニン、オリゴ糖および多糖を処理する。
Ｃ．  工程Ａで再利用されるバット溶液を、実施態様Ｉの工程Ｂに従って使用する。
【００９１】
単糖の収率を増加させるために、好ましくは、アルカリ処理において回収される沈殿物は、任意の以下の方法またはこれらの組み合わせを用いて処理される：
Ｄ．  沈殿物は、前述の実施態様Ｉの任意の工程Ｂ、Ｃ、Ｄを使用して、またはこれらの工程を全て用いて処理される。混合物は濾過され、溶液は中和され、次いで沈殿物と溶液が共に回収される。
Ｅ．  実施態様ＩＩの工程Ａから得られた残存している沈殿物はアルカリで再処理される。この場合、好ましくは、当該混合物は、温度１７０℃、圧力４〜１０ｂａｒ（好ましくは８ｂａｒ）で２〜８分間（好ましくは６分間）粉砕される条件の下で再処理される。濾過が行われ、溶液は中和後に回収される。この追加の粉砕手段によって、溶解物質の量を、原料中の繊維の初期量の２７％まで増加させることができる。
【００９２】
各構成工程Ａ〜Ｅにおいて生成される溶液であって、グルコース単位、ガラクトース単位、マンノース単位、キシロース単位およびアラビノース単位を含有する炭水化物を含む該溶液は、例えば、脱色法、ｐＨの調製法、あるいは溶液から水を除去する方法によって、微生物による脂質生産のために適当な状態に調製される。該溶液を微生物のための培地または培地の一部として使用することによって、微生物に脂質を生産させる。
【００９３】
III．
本発明の第三の好ましい実施態様によると、木部繊維、粉砕された木材、ＴＭＰパルプ、おがくず、機械パルプ、再生繊維（または上述の工程Ｂにおいて調製される中和抽出物）が使用され、これらの原料は５〜１０％（好ましくは５％）の濃度を有する酸で加水分解される。該加水分解は、加水分解される材料１００ｇに対して、前述の酸（例えば鉱酸）の溶液を１リットル添加して、ｐＨ約１で、９０〜１００℃の温度で２〜４時間（好ましくは２時間）おこなわれる。沈殿物は濾過によって溶液から分離される。該溶液は、原料の繊維量から計算される炭水化物の４〜１４％を含有する。沈殿物は、繊維として使用されてもよく、または単糖の収率を増加させるために、前述した第１の実施態様の工程ＣまたはＤ、あるいはこれらの両方を使用して、さらに処理されてもよい。溶液は沈殿物から分離され、中和され、濾過され、その後、そのままの状態または濃縮された状態で微生物の培地またはその一部として使用することによって、微生物に脂質を生産させる。
【００９４】
ＩＶ．
本発明の第４の好ましい実施態様によると、１００ｇの木部繊維、粉砕された木材、ＴＭＰパルプ、おがくず、機械パルプ、あるいは実施態様Ｉの工程Ａ〜Ｃまたは実施例ＩＩの工程Ａから得られた残存沈殿物が使用される。これらの原料にｐＨが約１の５〜１０％の酸（例えば鉱酸）の溶液が添加され、酸を２〜４時間（好ましくは２時間）吸収させる。過剰な酸はデカンテーションにより取り除かれ、沈殿物は、蒸煮解繊機（例えば翼式または円板式精砕機）において再度粉砕される。好ましくは、沈殿物の温度は、１分間事前蒸煮することにより上昇させ、濃縮物が流出しないようにする。翼式精砕機を使用する場合、温度を１５０〜２００℃（好ましくは１７０℃）に上昇させ、圧力を６〜８ｂａｒとする。粉砕時間は、木材の種類に応じて２〜１５分間の範囲より選択される。沈殿物を濾過によって溶液から分離する。残留する沈殿物は、燃料として使用することができ、あるいは溶液中の単糖の収率を増加させるために、上述した手順により再度粉砕することができる。溶液は、中和され、濾過され、その後、そのままの状態または濃縮された状態で使用され、また、実施態様Ｉ〜IIIに記載される方法によって使用される。
【００９５】
Ｖ．
本発明の第５の好ましい実施態様によると、１００ｇの木部繊維、粉砕された木材、ＴＭＰパルプ、おがくず、機械パルプ、あるいは任意の実施態様Ｉ〜ＩＶによって得られた沈殿物が使用される。これらの原料に４０〜７２％の酸（例えば硫酸）の溶液が添加され、酸を室温にて２〜４時間（好ましくは２時間）吸収させる。過剰な酸はデカンテーションにより取り除かれ、沈殿物は、蒸煮解繊機（例えば翼式または円板式精砕機）において再度粉砕される。沈殿物の温度は、１分間事前蒸煮することにより上昇させ、濃縮物が流出しないようにする。翼式精砕機を使用する場合、温度を１５０〜２００℃（好ましくは１７０℃）に上昇させ、圧力を６〜８ｂａｒとする。粉砕時間は、木材の種類に応じて２〜１５分の範囲より選択される。炭水化物混合物は濾過され、沈殿物が溶液から分離される。原料として使用される沈殿物からの溶解物の量は、４０〜６５％の範囲である。残留する沈殿物は燃料として使用することができ、あるいは単糖の収率を増加させるために再度粉砕することができる。溶液は中和され、濾過され、その後、任意の実施態様Ｉ〜ＩＶに従って処理される。
【００９６】
あるいは、４０〜７２％の濃硫酸を、室温で１〜３時間（好ましくは１．５時間）、沈殿物中に吸収させる。その後、酸を５％まで希釈し、得られる混合物を大気圧下、１００℃で４時間煮沸する。さらなる処理は上述の通りである。
【００９７】
微生物を使用する脂質の生産
本発明は、上記の種々の構成工程において生成される濾液の組み合わせを介して得られる、原料中に含まれる炭水化物並びにヘキソース単糖およびペントース単糖が、微生物学的手法を用いる脂質および単細胞バイオマスの生産に対して広範囲に使用されることを可能にする。回収される各濾液は、予備処理、例えば、洗浄、中和、脱色など、またはその他の後処理に付された後、単細胞脂質を生産するためにそのまま使用されてもよく、あるいは種々の水性フラクションと組み合わせて使用されてもよい。本発明の一部である原料処理方法に起因して、本発明はエタノールの生産にも適用できる。
【００９８】
濾液、すなわち水性フラクション、または濾液の任意の混合物を、微生物が接種されているまたは接種される微生物培地に添加することによって、微生物に脂質を生産させる。該脂質は微生物マスの形態で回収されるか、または該脂質は前記マスから分離され、脂質および脂質から分離された微生物マスは共に回収される。脂質は、細胞から脂質を取り出すか、または細胞を崩壊させる周知の方法を使用して回収できる。脂質は、有機溶媒を使用して崩壊した細胞から抽出することができる。本発明に適用できる脂質の回収方法は、例えばＺ．ヤコブ著「酵母脂質：抽出、品質分析、および受容性」、Critical Reviews in Biotechnology、第１２巻（５／６）；第４６３頁〜第４９１頁（１９９２年）の刊行物に開示されている。脂質を回収するための好ましい方法は、相分離法である。微生物において生成される脂質を脂肪酸エステルに変換する処理は、微生物細胞を事前に均一化しそれに続く脂肪の分離を施さずにおこなうことができる。
【００９９】
本発明の好ましい実施態様は、単量体状またはオリゴマー状のヘキソース糖およびペントース糖を含有する有機原料の処理において生成される炭水化物混合物から、脂質または脂質混合物を生成する方法に関する。この方法によると、炭水化物を含有する混合物は、脂質生産性微生物が培養される水性の培地に添加され、該培地には微生物の増殖に必要な栄養素が補給され、該培地には微生物が接種される。該微生物を培養させ、該微生物に脂質を生産させ、細胞マスが回収される。脂質または脂質混合物が、細胞または脂肪含有細胞から分離され、あるいは、これらの成分がそのまま利用される。
【０１００】
本発明による方法は、微生物学的な脂質生産にとって際だった融通性をもたらす。ヘキソース糖とペントース糖とを共に含有するフラクションは、様々な脂質生産性微生物に対する天然炭素源である。したがって、該方法も、例えば、脂質生産能力、バイオマスの収率、培養の方法または培養条件などに基づいて、幅広い範囲から選択される微生物を利用できるという利点を有する。微生物が生産する脂質以外の別の成分は、様々な異なる方法において高いエネルギー効率で使用できるので、本発明による方法の全体的な経済的効果を改善する。脂質を含まない微生物マスを使用する好ましい方法は、該マスを加水分解して脂質生産性微生物の培地内で再循環させる方法、あるいは飼料または栄養素として使用する方法である。脂質を含まない微生物マスから、様々な成分、例えば、特定の糖、着色剤、β−グルカン、ステロール、ステロールエステルまたはタンパク質などを分離することも可能である。
【０１０１】
微生物は、天然のまたは遺伝子操作された脂肪蓄積性微生物、好ましくは酵母類、カビ類、バクテリアおよび藻類、より好ましくは酵母類、カビ類、最も好ましくは酵母類から選択される。使用される微生物が、ヘキソース糖またはペントース糖または両方から、脂質を生産できることが必須条件である。したがって、本発明は、ＡＴＰ：クエン酸リアーゼ活性（ＥＣ．２．３．３．８）に基づいて脂質を蓄積する全ての微生物を包含する。
【０１０２】
本発明に適用できる脂質合成性酵母属は以下の属を含む：カンジダ属(Candida)、ヤロウイア属(Yarrowia)、リポマイセス属(Lipomyces)、ロドトルラ(Rhodotorula)属またはクリプトコッカス属（Cryptococcus)。この種の酵母にはペントース糖であるキシロースを合成して脂質に変換する菌株、例えば、カンジタ・クルバタ（Candida curuvata)（Ｄ）(エバンス、Ｃ.Ｔおよびラトレッジ著、１９８３年、「連続的培養とバッチ培養において、異なる炭素源上で増殖させた油性酵母「カンジダ・クルバタ」の比較検討」、Ｌｉｐｉｄｓ、第１８巻、第６２３頁〜第６２９頁参照）、ロドトルラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis)（ヤン,Ｓ.、リム,Ｊ.、チョイ,Ｓ．、リュウ,Ｄ.およびリー,Ｊ.、１９８２年、「ロドトルラ・グラシリスの脂質生産に対する炭素源および窒素源の効果」、Ｊ.Ｆｅｒｍｅｎｔ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.、第６０巻、第２４３頁〜第２４６頁参照）、ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides)、ロドトルラ・グルチニス（Rhodotorula glutinis)、ロドトルラ・グラミニス(Rhodotorula graminis) 、リポマイセス・スターケイ（Lipomyces starkeyi)、リポマイセス・リポファー（Lipomyces lipofer)、カンジダ・リポリティカ（Candida lipolytica)、クリプトコッカス、クリプトコッカス・アルビダス（Cryptococcus albidus)、トリコスポロン・クタネウム(Trichosporon cutaneum)およびトリコスポロン・プルランズ（Trichosporon  pullulans)（フォール,Ｒ.、フェルプス,Ｐ.およびスピンドラー,Ｄ.著、１９８４年、「油脂が豊富な酵母による、キシランからトリグリセリドへの生物変換反応」、Ａｐｐｌ.Ｅｎｖｉｒｏｎ.Ｍｉｒｃｏｂｉｏｌ.、第４７巻、第１１３０頁〜第１１３４頁参照）並びに、ペントース糖であるアラビノースを合成して脂質に変換する菌株、例えば、リポマイセス・スターケイ（Lipomyces starkeyi)（ナガヌマ,Ｔ.、ウズカ,Ｙ.およびタナカ．Ｋ著、１９８５年.「酵母「リポマイセス・スターケイ」の総細胞数および脂質含量に影響をおよぼす生理学的因子、」、Ｊ.Ｇｅｎ.Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.、第３１巻、第２９頁〜第３７頁参照）が包含される。
【０１０３】
同様にして、本発明に適用できる脂肪蓄積性カビ属は、とりわけ以下の属を含む：
−アスペルギルス属（Aspergillus)
−カエトミウム属(Chaetomium)
−クロドスポリジウム属(Clodosporidium)
−クンニングハメラ属（Cunninghamella)
−エメリセラ属（Emericella)
−フサリウム属(Fusarium)
−モルティエラ属（Mortierella)
−ムコール属(Mucor)
−ペニシリウム属（Penicillium)
−ピチウム属（Pythium)
−リゾパス属（Rhizopus)
−トリコデルマ属（Trichoderma)。
【０１０４】
同様にして、本発明に適用できる脂肪蓄積性バクテリア属は、とりわけ以下の属を含む：
−アシネトバクター属（Acinetobacter)
−アクチノバクター属（Actinobacter)
−アナベナ属(Anabaena)
−アルスロバクター属(Arthrobacter)
−バシラス属(Bacillus)
−クロストリジウム属(Clostridium)
−フレキシバクテリウム属（Flexibacterium)
−ミクロコッカス属(Micrococcus)
−マイコバクテリウム属(Mycobacterium)
−ノカルジア属(Nocardia）
−ノストック属(Nostoc)
−オスシラトリア属(Oscillatoria)
−シュードモナス属（Pseudomonas)
−ロドコッカス属(Rhodococcus)
−ロドミクロビウム属(Rhodomicrobium)
−ロドシュードモナス属（Rhodopseudomonas)
−スワネラ属（Shewanella)
−ストレプトマイセス属(Streptomyces)
−ビブリオ属(Vibrio)。
【０１０５】
同様にして、本発明に適用できる脂肪蓄積性肉微小藻類は、とりわけ以下のものを含む：
−ボトリオコッカス属（Botryococcus)
−ブラチオモナス属(Brachiomonas)
−クラミドモナス属(Chlamydomonas)
−クロレラ属(Chlorella)
−クリプトテコディニウム属(Crypthecodinium)
−ドゥナリエラ属(Dunaliella)
−ユーグレナ属(Euglena)
−ナンノクロリス属(Nannochloris)
−ナンノクロプシス属(Nannochloropsis)
−ナビキュラ属(Navicula)
−ニチェチア属(Nitzschia)
−シゾチトリウム属(Schizochytrium)
−セレトネーマ属(Sceletonema)
−セネデスモス属（Scenedesmus）
−テトラセルミス属(Tetraselmis)
−サラウストチトリウム属(Thraustochytrium)
−ウルケニア属(Ulkenia)。
【０１０６】
本発明の好ましい実施態様によると、好ましくは細胞の乾燥重量の１２〜６５重量％の割合で、脂肪酸を含有する脂質を細胞内で合成する微生物が、脂質の合成に使用される。
【０１０７】
本発明の特に好ましい実施態様によると、本発明において微生物にとって適当な方法で処理されて生成される脂質を含まないバイオマスは、培地における栄養素として使用される。これらの成分に加えて、培地へ、使用される微生物にとって好ましい成分を補給することができる。脂質を生産するために、一般に微生物は、とりわけ炭素源（本発明においては原料から入手される）、窒素源、例えば、無機アンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム）または有機窒素源（例えば、アミノ窒素、酵母抽出物または加水分解された細胞マス）および微量栄養素、例えば、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、ビタミンまたはカチオン源（例えば、Ｍｇ、Ｋ、Ｎａ、Ｃａ、ＦｅまたはＣｕイオン源）などを必要とする。したがって、これらの成分は必要に応じて培地に添加できる。本発明の方法が適用される場合、細胞中の脂質濃度は、好ましくは４０重量％、より好ましくは６５重量％である。
【０１０８】
生物燃料の製造
微生物由来の脂質に含まれる脂肪酸エステルは、任意の既知の方法を用いて、バイオディーゼル燃料として適するように処理することができる。１つの好ましい方法は、短鎖アルコール（好ましくはメタノール）でエステル交換反応をおこなって脂肪酸のアルコールエステルを得る方法である。
【０１０９】
アルコール化合物、例えばグリセロールまたは非エステル化脂肪酸塩を含み、エネルギー効率のよい方法で有効に利用することが困難な不純な副流であって、エステル交換反応によるバイオディーゼル燃料または再生可能なディーゼル燃料の製造において生成される該副流は、そのまま使用されるか、または生物起源の別のグリセロ脂質含有物質中へ再循環される単細胞脂質を生産するために再利用できる。
【０１１０】
本発明の利点
本発明の利点には、本発明方法に必要な装置は簡単なものであり、製造と操作に関連する技術は既知であるということが含まれる。本発明による方法は、特定の生産規模に限定されず、炭水化物の含有量と処理される原料の量に応じて、規模の増減を容易に実施することができる。脂質を生産する本発明方法を実施するためには、エネルギーを消費する加熱と、加圧単位操作と、酸接触、アルカリ触媒または酵素触媒以外の別の化学触媒とを必要としない。該方法は、本発明による方法の内部サイクルまたは前述のようなバイオマテリアルの加工処理に組み込まれる化学薬品の使用のみを必要とする。また、本発明方法においては、微生物培地内でそのまま使用するか、または微生物培地としてそのまま使用するためには炭水化物の希釈溶液が適当であるので、使用可能な糖溶液からのコスト増加をもたらす水分除去処理を必要としない。本発明方法の全体的な経済的効果は、次の事実によって改善される。即ち、該方法において生成される脂質を含まないバイオマスは、内部サイクルにおける用途の他に、多くの異なる用途、例えば、個別の有機成分を生産するための用途、飼料または飼料原料としての用途、あるいは微生物を生産するための補給培地としての用途を有する。また、該方法は、単細胞バイオマスとエタノールの生産にも適する。
【０１１１】
本発明によるバイオマスの段階的な処理法の利点は、従来技術と比較して、有機物質をより包括的に加水分解できること、および単細胞脂質を生産するための有機物質の使用適正がより良好なことである。さらに、酸処理およびアルカリ処理から得られる濾液または沈殿物は相互に中和されるので、中和に必要な化学薬品の使用量を低減する。
【０１１２】
先行技術の解決法は、エタノールを生産するために、炭水化物を含有する物質が原料として、そのままでまたは単糖に変換されて使用される微生物工程を含む方法を開示する。また、特許出願公開ＵＳ２００２／０１８５４４７および米国特許ＵＳ５６３７５０２は、例えば、酸またはアルカリを用いる処理方法のような、炭水化物の処理方法を開示する。これらの処理の後にはアルコール発酵がおこなわれる。微生物学的な処理に関して、前記方法はいずれも、多糖から生成されるヘキソース糖を使用するエタノールの生産に限定される。特許出願公開ＵＳ２００３／００９６３８５においては、微生物を使用してプレニルアルコール（アルコールのグラニル誘導体およびファルネシル誘導体）が生産される方法が開示されている。特許出願公開ＷＯ０３／０３８０６７は、真菌微生物のゲノムを改質することによって、ペントース糖を利用できる微生物を生産する方法を開示する。該公開公報は、エタノールの生産のみを目的とする。
【０１１３】
本発明は、特にパルプおよび製紙産業においておこなわれる熱機械的な木材の加工処理により生じる比較的重要な水性副流を、特に輸送燃料の原料として利用するための、新たな解決法を提供する。本発明は、砕木パルプの製造と関連して生成される炭水化物を含む副流の生物学的負荷および廃水処理のエネルギーコストを減少させる。具体的な態様において、本発明は、例えば、ＴＭＰ工程または対応する木材の機械的な処理において生成される炭水化物含有希釈水性フラクションから、輸送燃料用、バイオディーゼル燃料用または再生可能なディーゼル燃料用の原料を生産するための環境にやさしい解決策を提供する脂質の生産方法に関する。
【０１１４】
該方法は、別の原料を利用するための別の解決策も提供する。該方法によると、再生繊維、例えば印刷紙、包装材料およびセルロースを基材とする類似材料が原料として使用できる。
【０１１５】
従って、従来技術と比較して、本発明は、脂質原料の入手可能性を高めると共に、他の原料から生成される有機脂質に対する総需要量を減少させることによって、持続可能な開発原理に従うことになる。従って、本発明は、再生可能な天然資源に基づく生物燃料用の原料の入手可能性を向上させ、これらの生産コストを最終消費者に受け入れられる程度まで低減させることに貢献する。
【０１１６】
原料の全使用に関しては、本発明は、原料に含有される炭水化物を全て使用することのみに限定されない。本発明方法は、回収される木材原料中の抽出フラクションの脂質成分を回収する工程も含む。原料が水で処理される場合、濾液は、当業者において周知の方法により水溶液から回収することができる脂質成分を分離する。原料を酸処理する結果、抽出フラクション中の脂質は、Ｃａ＋＋塩等の不溶性のアルカリ土類金属塩の形態で濾液から分離される遊離脂肪酸を生産する。沈殿物を分離した後に、遊離脂肪酸はアルコールエステルにエステル交換される。これに対応して、原料のアルカリ抽出によって、抽出フラクションからは、水溶性であるために濾液中に混合される脂肪酸塩が生成される。本発明において、該塩は水に不溶な塩（例えばＣａ＋＋塩等）の形態に変換され、沈殿物は水性相から分離され、脂肪酸アルコールエステルを製造するために使用される。
【０１１７】
以下の実施例は本発明を例示的に説明することを目的とし、本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明は、使用した微生物の菌株に限定されるものではない。本発明は、使用した菌株のみを使用するのではなく、同一の種または属の別の菌株、他の微生物属または種の菌株、あるいは遺伝子操作がされた微生物菌株を用いて実施することができる。脂質生産性微生物は一般に入手可能であり、この種の微生物は複数の菌株寄託機関、例えば、ＡＴＣＣ，ＤＳＭなどから入手できる。脂質生産性微生物と、微生物（藻類も含む）を使用する脂質の生産方法は、例えば、次の刊行物に記載されている：「単細胞オイル」、Ｚ.コーヘンおよびＣ.ラトレッジ編、ＡＯＣＳプレス、２００５年、および「微生物脂質」、Ｃ.ラトレッジおよびＳ.Ｇウィルキンソン編、第１巻および２巻、アカデミックプレス、１９８８年、
【実施例】
【０１１８】
実施例１
各１００ｇの木部繊維と、粉砕木材と、ＴＭＰパルプと、おがくずと、機械パルプとを、１リットルの沸騰水（９０〜１００℃）内で２時間貯蔵した。溶液を繊維質物質（以下、沈殿物という）から濾過して分離した。沈殿物を回収し、実施例４または５において記載される別の方法のうちの一方法に従って処理し、単糖の収率を上昇させた。溶液の炭水化物の収率は、原料に応じて２％〜６％の範囲であった。なお、高温（１７０℃以上で）で粉砕されるトウヒ繊維が原料として使用された場合、一般的に収率は４％である。一部の溶液を次の繊維質バッチを抽出するために、事前蒸発に付すことなく再利用し、一部の溶液を、約２０重量％の乾燥物質含量が得られるまで蒸発させ、濃縮させた。濃縮された濾液を、単細胞脂質を生産するために回収した。溶解した炭水化物は、抽出処理に付した樹木種に特有のものであり、該炭水化物はヘキソースとペントースに分離した。
【０１１９】
実施例２
木部繊維と、粉砕木質と、再生繊維と、ＴＭＰパルプと、おがくずと、機械パルプとを、５％アルカリ溶液（ＮａＯＨ）１リットルにそれぞれ投入し、９０℃〜１００℃で３時間攪拌した。常温で濾過をおこない、沈殿物を、実施例４に従って単糖を生産するために別の処理に付した。抽出溶液の一部を、次の繊維バッチを処理する場合に再利用し、一部の溶液を中和し、また、アルカリ抽出溶液中にリグニンがオリゴ糖と多糖と共に溶解していたので、一部の溶液を実施例４に従って加水分解処理に付した。前述のアルカリ処理によって異なる原料から得られた溶液は、平均５重量％の原料を保有していた。
【０１２０】
また、最初のアルカリ処理において得られた沈殿物を、前述のアルカリ処理を繰り返すことによりアルカリで再度処理し、次いで、圧力８ｂａｒ、温度１７０℃で６分間粉砕した。このさらなる粉砕処理によって、アルカリ溶液中に溶解する物質の量は、原料の初期量の平均２７％まで増加できた。溶液は黒色になり、該溶液を中和処理、加水分解処理および濃縮処理した後、活性炭と脱色用のイオン交換体で処理した。混合物を回収し、該混合物を単細胞脂質の生産に使用した。
【０１２１】
実施例３
各１００ｇの木部繊維と、粉砕木質と、ＴＭＰパルプまたはＭＤＦパルプと、おがくずと、機械パルプと、再生繊維と、実施例２により調製された中和抽出物とを、ｐＨ１の、５％鉱酸溶液１リットル中において９０〜１００℃で３時間、加水分解した。沈殿物を濾過によって溶液から分離した。該溶液は、原料に対して平均１０％の単糖を含有した。一部の溶液を中和し、濾過した後に約２０重量％の単糖が得られるまで蒸発により濃縮し、該濃縮溶液を、単細胞脂質を生産するために回収した。溶液の一部を、この実施例において記載される原料のその後のバッチを加水分解するためにそのまま再利用した。以下の実施例５に従って沈殿物をさらに処理することにより、単糖の収率を増加させた。
【０１２２】
実施例４
各１２５ｇの木部繊維と、粉砕木質と、ＴＭＰパルプと、ＭＤＦパルプと、おがくずと、機械パルプと、わらと、穀物殻および実施例１〜３による沈殿物を、１０％濃度の硫酸溶液に投入し、該酸を２時間吸収させた。過剰な酸をデカンテーションにより取り除き、混合物を翼式精砕機に導入し、濃縮物が流出しないようにして１１分間事前蒸煮することにより、温度を上昇させた。その後、温度を１６０℃、圧力を８ｂａｒにし、翼式精砕機を使用する粉砕処理をおこなった。トウヒ繊維のために、混合物を１１分間の粉砕処理に付した。粉砕処理の後、沈殿物を溶液から分離した。混合物を分割し、一部の沈殿物を灰化に使用し、一部の沈殿物を、以下の実施例５に従い単糖の収率を増加させるために再度粉砕処理に付した。これに対応して、溶液を中和し、濾過した後に単糖の濃度が約２０％に達成するまで蒸発により濃縮した。これらの溶液を、単細胞脂質を生産するために回収した。
【０１２３】
実施例５
各１２５ｇの木部繊維と、粉砕木質と、ＴＭＰパルプと、おがくずと、機械パルプと、わらと、穀物繊維および実施例１〜４による残留沈殿物を、４０％硫酸溶液に投入し、該酸を室温で２時間吸収させた。過剰な酸をデカンテーションにより取り除き、濃縮物が流出しないようにして１１分間事前蒸煮して沈殿物の温度が上昇するように、沈殿物を翼式蒸煮解繊機で粉砕した。その後、温度を１７０℃に上昇させ、圧力を８ｂａｒとした。わらおよび穀物繊維の最も適当な粉砕時間は１１分間であった。沈殿物を溶液から分離した。溶解物質の割合は、平均して原料の５０％より大きかった。溶液を中和し、濾過した後に蒸発により濃縮し、単細胞脂質を生産するために回収した。沈殿物（すなわち、残存繊維）の一部を灰化し、一部を本実施例に従い再度粉砕することによって、単糖の収率を増加させた。
【０１２４】
また、高濃度の硫酸（７２％）を、上述した原料内に単独で吸収させた（室温での処理時間：２時間）。続いて、該酸を５％まで希釈し、常圧および１００℃で４時間煮沸した。別の処理および生成したフラクションの使用は、上記と同様にしておこなった。
【０１２５】
実施例６
単細胞脂質の生産に適当な単糖は、籾殻、わらおよび穀物殻を、５％の酸を使用して直接的に加水分解して生産してもよく、またはより強い酸に含浸させて５％の溶液中で加水分解して生産してもよく、あるいは予めアルカリで処理し、５％の溶液中で加水分解して生産してもよく、ヘミセルロースおよびセルロースを、上記実施例と同様にしてそれぞれ加水分解してもよい。これらの処理は酸またはアルカリの含浸処理を組み合わせておこなってもよく、次いで、翼式または円板式精砕機により繰り返し粉砕し、熱機械パルプを生産してもよい。しかしながら、本実施例においては、籾殻、わらおよび穀物殻（各１２５ｇ）を、８ｂａｒの圧力で１１分間事前蒸煮し、翼式精砕機を使用して、１７０℃の温度で処理して熱機械パルプとした。生成した熱機械パルプを、５％の酸（硫酸）溶液１リットル中で加水分解した（９０〜１００℃、常圧で４時間）。溶液フラクションを濾過によって分離して、中和した。続いて、溶液を濃縮し、単細胞脂質を生産するために回収した。単糖の収率は、平均して原料の５０％であった。炭水化物の収率を増加させるために、濾過後に残存する沈殿物を実施例５に従い熱機械的に再処理し、一部を灰化に付した。
【０１２６】
実施例７
籾殻、わらおよび穀物殻（各１６ｋｇ）を、それぞれ１００リットルのアルカリ溶液（１．２Ｍ  ＮａＯＨ）中において、９０〜１００℃で４時間処理した。混合物を沈殿物と溶液に分離した。平均して４９〜５７％の供給原料の乾燥物質が溶液中に残存した。アルカリ溶液を、硫酸を使用して５％の酸性溶液とした後、実施例６と同様にして加水分解した。少量のグルコースとガラクトースも含有するキシロースおよびアラビノースの混合物が主に生成した。溶液の単糖含有量は、供給原料の２３〜３３％であった。溶液の色は、単細胞脂質を生産するために溶液を回収する前に施される活性炭処理によって、薄くなった。
【０１２７】
濾過により得られた沈殿物を５％の酸（硫酸）溶液中に含浸し、圧力６ｂａｒ、温度１５０℃で１１分間、翼式精砕機内で粉砕した。中和および濾過した後に、単細胞脂質を生産するために回収される沈殿物を、水溶性の炭水化物（主に、グルコースとガラクトース）に分解した。酸加水分解の後におこなわれた濾過の後に残留する沈殿物の一部を、再度粉砕し、次いで実施例４に従い１０％酸溶液で加水分解した。これらの処理の後、原料に対して合計５５〜６５％の単糖類を含有する溶液を得た。該溶液を、単細胞脂質を生産するために回収した。
【０１２８】
実施例８
蒸気乾燥したビートパルプをタブに投入し、ビートパルプを覆うために充分な量の沸騰水をタブの上部に注いだ。デカンテーションにより固形物から水を分離する前に、溶液を冷却させた。３.６ｍｇ／ｍｏｌの乾燥物質が水中に溶解していた。水性フラクションの一部を新たなバッチ処理に使用し、一部の水性フラクションを濃縮した後に、単細胞脂質を生産するために回収した。得られた固体フラクション（沈殿物）は７４８グラムであり、１６．７％の乾燥物質を含有した。該乾燥物質として対応する１２５ｇの乾燥ビートパルプを、室温で１８時間、０.４Ｍのリン酸溶液（Ｈ３ＰＯ４、５００ｍｌ）に含浸させた。過剰な酸溶液をデカンテーションにより取り除き、熱機械的な粉砕を開始する前に１１分間事前蒸煮に付した。混合物を、翼式精砕機を使用して１１分間粉砕した。粉砕の間、圧力を８ｂａｒに保ち、初期温度を１７２℃とし、粉砕時間が１０分を経過したとき温度を１６２℃にした。混合物を叩解機から取りだし、次いで濾過した。溶液フラクションは２.２６リットルであり、２．７５％の乾燥物質を含有した。粉砕処理に付された５０％の乾燥物質が、濾過後の溶液中に存在した。該溶液は主に、単糖と、グルコースと、ガラクトースとアラビノースとキシロースとを含有した。さらに、５００〜３０００の範囲の分子量であるオリゴ糖と、より高い分子量の化合物が少量観察された。溶液フラクションを中和し濃縮して、単細胞脂質を生産するために回収した。
【０１２９】
ビートパルプの上記処理より得られた固体の繊維質パルプ［沈殿物（１２５ｇの乾燥物質）］を室温で４時間、１５％塩酸中に含浸させた。過剰な酸溶液をデカンテーションにより取り除き、パルプを同一条件下で再度粉砕した。濾過工程の後、さらに２８％の単糖が溶液層に取り込まれたことが観察された。沈殿物を廃棄した。
【０１３０】
実施例９
原料は、熱機械的に処理され４６．８ｇの重量（約１リットルの体積）を備えたトウヒ繊維であり、原料上部に０.２ＮのＮａＯＨを添加し、そこへさらに５.６ｇのＮａ２ＣＯ３と、１.３ｇのＭｇＳＯ４６Ｈ２Ｏ（５００ｍｌ）とを添加した。該混合物を５０℃まで加熱し、溶液中に少量のグルコースと、キシロースと、ガラクトースと、アラビノースと、マンノース、さらにオリゴマーとを生成させた。溶液のｐＨは約１１であり、該溶液を濾過し水で洗浄した。洗浄液と濾液とを混合し、溶液を３２０ｍｌまで蒸発させた。溶解した物質の量は、原料の４.５％（乾燥物質）であった。単糖の量を増加させるために、酸を溶液に添加し沈殿物を生じさせた。該沈殿物を溶液から分離し、後者を回収し、単細胞脂質を生産するために使用した。該沈殿物を、実施例３において記載された５％酸により、単糖へと加水分解した。加水分解を用いることで、１％の単糖が沈殿物マスからから生成され、該単糖類を溶液に導入し、脱色処理の後、単細胞脂質を生産するために回収した。
【０１３１】
実施例１０
熱機械的に処理されたトウヒ繊維の４５ｇバッチ（約１リットル）を計量し、該繊維の上部に０.２ＮのＮａＯＨ溶液を添加し、そこへさらに５.６ｇのＮａ２ＣＯ３と、１.３ｇのＭｇＳＯ４６Ｈ２Ｏ（５００ｍｌ）とを添加した。該混合物を５０℃まで加熱し、濾過した後、沈殿物を水で洗浄した。洗浄液と濾過溶液とを混合した。単糖の量を増加させるために、混合した濾液に酸を添加して、実施例３に従い加水分解をおこなった。中和した後、加水分解生成物を、単細胞脂質を生産するために回収した。洗浄した沈殿物を３００ｍｌまで濃縮し、１リットルのクエン酸緩衝液（ｐＨ４.８）を添加し、セルラーゼ酵素を添加した。混合物内でオリゴマーとグルコースを生成させた。酵素処理された混合物を、そのままおよび分離された濾液（溶液）として回収し、単細胞脂質の生産に使用した。
【０１３２】
実施例１１
１２５ｇのエン麦の籾殻バッチを準備し、該バッチを、１７０℃、圧力８ｂａｒで２時間、熱機械的に粉砕した。該処理の後、沈殿物を濾過により溶液から分離した。溶液を、単細胞脂質を生産に使用するために回収した。７ｇの沈殿物（繊維質）バッチを使用し、該バッチを１９％の濃度の硫酸に添加して４時間還流した。処理物を分析した結果、単糖が溶液中に原料の５６％の割合で存在し、大部分はキシロース、マンノース、グルコース、ガラクトースおよびアラビノースであった。該溶液を単細胞脂質の生産で使用するために回収した。
【０１３３】
実施例１２
エン麦の籾殻４００ｇを計量し、３リットルの水と、２００ｇのＮａＯＨとを添加した。混合物を、９０〜９６℃の温度で２時間攪拌しながら維持した。該混合物を、布を介して濾過し、繊維質を分離した。該濾液フラクション（５０ｍｌ）を中和し、クエン酸緩衝液（４０ｍｌ）でｐＨを４.８に調整した。その後マルチフェクト(multifect)キシラナーゼ（１０ｍｌ）を添加し、該混合物を５０℃の恒温条件下で維持した。糖が溶液中に放出され、その中でも２５．２％がキシロースであり、１１．８％がアラビノースであった。また、反応時間が５０時間を経過した後、溶液中にオリゴマーも存在した。単細胞脂質の生産で使用するために、混合物を全て回収した。
【０１３４】
実施例１３
１２５ｇのビートパルプを０.４Ｍの硫酸に含浸させ、１２時間後、過剰な酸をデカンテーションにより取り除いた。該パルプを翼式精砕機に投入し、該翼式精砕機内で４分間事前蒸煮し、１５０℃、圧力６ｂａｒで１１分間粉砕した。混合物を中和し、ｐＨ値が４になるまでクエン酸を添加した。１０ｍｌのペクチナーゼ４４５０Ｕ（すなわち、１７８ｍｇ／ｍｌのタンパク質（Ｓｉｇｍａ社製））を添加し、反応を２５℃で２４時間継続させた。反応後、混合物の一部を単細胞脂質の生産用に回収し、混合物の一部を濾過した。濾過により得られた沈殿物を粉砕段階に戻し、この処理よりもたらされる溶液フラクションを活性炭（２ｇ／リットル）で処理し、次いで、陰イオン交換カラムへ導入した。カラムから得られる単糖溶液を、乾燥物質の割合が２０％の濃度になるまで蒸発させ、単細胞脂質を生産するために回収した。
【０１３５】
実施例１４
エン麦の籾殻を実施例７に従って処理し、２３．８ｇ／Ｌのグルコースと、９３．３ｇ／Ｌのキシロースと、３７．１ｇ／Ｌのアラビノースと、９．０ｇ／Ｌのガラクトースとを、含有する混合物を生産した。この混合物を脂質合成酵母用の培地として添加した。なお、脂質合成酵母である、ヤロワイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)ＡＴＣＣ２０３７３とロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis)ＴＫＫ３０３１をそのまま１：１に希釈し、対応する希釈物に１１ｇ／Ｌのグルコースを補充した。培養時間を６８時間とし、温度２８℃、２５０ｒｐｍで振盪し、培養液量を５０ｍｌとした。図３で示されるように、該酵母は、他の栄養素を必要とすることなく、増殖し脂質を合成できることが判明した。
【０１３６】
実施例１５
３種類の酵母、ロドトルラ・グルチニスと、ヤロワイア・リポリティカと、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus)(アナム．カンジダ・ケフィール(Anam.Candida kefyl))ＡＴＣＣ４２２６５とを、もっぱら、炭素源としてのキシロースで培養した。培地は、２０ｇ／Ｌのキシロースと、１０ｇ／Ｌの酵母エキスと、２０ｇ／Ｌのペプトンとを含有する。培養を、５０ｍｌの培養液量、温度２５℃、２００ｒｐｍで振盪させておこなった。図４は、全３種の菌株が炭素源としてペントースを使用できることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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