(57)【要約】  【課題】本発明は、虚血および／または再灌流から生じる組織損傷の治療または低減を提供することを目的とする。  【解決手段】本発明は、δプロテインキナーゼＣ（δＰＫＣ）が虚血性条件下でピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）をリン酸化する能力を特異的に阻害するペプチド組成物を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５アミノ酸残基の連続したコア配列を含むδＰＫＣ選択的調節ペプチドであって、前記連続したコア配列は、配列番号：１と少なくとも６０％同一である、調節ペプチド。
【請求項２】
５〜２０アミノ酸残基からなる、請求項１に記載の調節ペプチド。
【請求項３】
完全長のＰＤＫ（配列番号：１２）に由来する連続した配列と少なくとも６０％同一である、請求項２に記載の調節ペプチド。
【請求項４】
δ−プロテインキナーゼＣ（δＰＫＣ）によるピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（PDK）のリン酸化を阻害する、請求項１に記載の調節ペプチド。
【請求項５】
調節ペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に位置する第１のシステイン残基をさらに含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の調節ペプチド。
【請求項６】
前記第１のシステイン残基が担体ペプチドに連結され、前記担体ペプチドは、該担体ペプチドのＮ−末端またはＣ−末端に第２のシステイン残基を含む、請求項５に記載の調節ペプチド。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載のペプチドを含むδＰＫＣ選択的調節組成物。
【請求項８】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
心臓組織の虚血性傷害を低減するための方法であって、それを必要とする対象にδＰＫＣ選択的調節ペプチドを投与する工程を含む、方法。
【請求項１０】
前記対象が、心血管疾患、心虚血、心虚血／再灌流傷害、心筋梗塞、慢性安定狭心症、または急性冠状動脈症候群を罹患している、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[001]  本願は、その内容が、その全体で参照により本明細書に組み込まれている、２０１１年８月１２日に出願した米国仮出願第６１／５２３，１６７号の優先権を主張するものである。
【０００２】
連邦政府支援の研究に関する陳述
[002]  本発明は、国立衛生研究所が授与した契約ＨＬ５２１４１の下での政府支援で行われた。政府は、本発明におけるある特定の権利を有する。
【０００３】
配列表の相互参照
[003]  配列表は、２０１２年８月１０日に作成し、５８６００８２７１ＷＯ００ｓｅｑｌｉｓｔ．ｔｘｔ（２９３０９バイト）と名付けたテキストファイルの形式でＥＦＳを介して電子的に提出されており、その内容は、その全体で参照により本明細書に組み込まれている。
【０００４】
技術分野
[004]  本開示は一般に、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（PDK）のδＰＫＣリン酸化のペプチドモジュレーター、ならびに心虚血および再灌流傷害を治療するためのこれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
[005]  タンパク質間相互作用は、生物学的プロセスの中核をなし、すべての細胞シグナル伝達事象の特異性を決定し、したがって、薬剤標的の重要なクラスを代表する。しかし、タンパク質間相互作用部位は、より「薬剤を作用させることが可能な」小さな疎水性ポケットではなく、各タンパク質それぞれにおいて大きく平らな界面（７５０〜１５００Å）を構成する。したがって、タンパク質間相互作用の小分子阻害物質を見つけることは、難題であることが証明されている（Arkinら、2004、Nat. Rev. Drug Discov.、3:301-317）。
【０００６】
[006]  ＰＫＣアイソザイムのファミリーのメンバーは、コンホメーション変化を誘導し、酵素を不活性状態から活性状態に変換する脂質由来二次メッセンジャー（およびいくつかのアイソザイムについてはカルシウム）に依存する。ＰＫＣ活性化は、活性酵素の、これらのパートナータンパク質ＲＡＣＫ（活性化Ｃ−キナーゼの受容体（receptor for activated C-Kinase）を表す）へのトランスロケーションとも関係があり、ＲＡＣＫは、様々な細胞内部位（Mochly-Rosen、1995、Science、268:247-251）への酵素トランスロケーション（Ronら、1999. J. Biol. Chem.、274:27039-27046）を促進する。ＰＫＣのレギュラトリー領域内にあるＣ２ドメインがこれらのＲＡＣＫへの結合の少なくとも一部を媒介し（Smithら、1992、Biochem. Biophys. Res. Commun.、188:1235-1240: Johnsonら、1996、J. Biol. Chem.、271:24962-24966）、各ＰＫＣアイソザイムで高度に保存されているＣ２ドメインの中にあるユニークな配列（例えば、βC2-4、δV1-1、およびεV1-2）（Ronら、1995、J. Biol. Chem.、270:24180-24187; Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、98; 11114-11119; Grayら、1997、J. Biol. Chem.、272:30945-30951）がこれらの相互作用部位の一部であることが見つけ出された。これらのユニークな配列に相当するペプチド（例えば、δV1-1）は、競合性阻害物質として働き、対応するアイソザイムがそのＲＡＣＫに会合するのを阻害し、したがって、所与のアイソザイムのすべての機能を阻害する。一方、阻害性分子内タンパク質間相互作用は、不活性状態に酵素を保つ。少なくとも１つのこのような分子内相互作用は、ＰＫＣ中のＲＡＣＫ結合部位と、疑似ＲＡＣＫ（ΨRACK）と呼ばれるそのＲＡＣＫと相同である酵素内の配列との間で起こることが示されている（Dornら、1999、Proc. Natl.、Acad. Sci.、96:12798-12803）。このΨＲＡＣＫ部位に対応するペプチドは、分子内阻害性相互作用と競合し、したがって、対応するアイソザイムの選択的活性化因子として働く。
【０００７】
[007]  δＰＫＣレギュレーティングペプチドは、心虚血および再灌流傷害（すなわち、心発作で誘導される傷害）において重要な役割を果たすことが知られている。マウスおよびラット（Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、98:11114-11119）、ブタ（Inagakiら、2003、Circulation、108:2304-2307）、ならびに場合によりヒト（Batesら、2008、Circulation、117:886-896）を含めた、心筋梗塞の様々な動物モデルにおいて、ΨδＲＡＣＫ、δＰＫＣ特異的活性化因子を用いて虚血事象後に治療すると、δＰＫＣ媒介心外傷が増大し、一方、δＶ１−１、δＰＫＣ特異的阻害物質を用いて治療すると、この傷害が阻止されたことが以前に示されている（Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、98:11114-11119）。
【０００８】
[008]  δＰＫＣの多数の基質が様々な細胞型において同定されており、これらは、異なる細胞内の位置で見つかる。さらに、虚血および再灌流は、活性化δＰＫＣのいくつかのミトコンドリア内へのトランスロケーションを誘導し（Churchillら、2005、Cir. Res.、97:78-85）、ミトコンドリア内酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（PDK）のリン酸化を増大させることが実証されている。ＰＤＫによってピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）がリン酸化されると、ＰＤＨの活性が減少し、それによってＴＣＡサイクルおよびＡＴＰ再生が阻害される。諸研究により、虚血後心臓における心臓効率、および収縮機能の回復は、ＰＤＨの薬理学的刺激によって改善され得ることが示唆されている（Lewandowskiら、1995、Circulation、91:2017-2079: Schoderら、1998、Biochim Biophys. Acta.、1406:62-72）。しかし、δＰＫＣによるＰＤＫ単独のリン酸化が、虚血および再灌流（I/R）後に生じる心外傷の原因となるか否かは明らかでなかった。他のδＰＫＣ基質のいずれかが、単独で、またはＰＤＫと一緒に、この傷害の一因となり、またはこの傷害に決定的となり得る可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
[009]  Ｉ／Ｒによる心外傷に対するδＰＫＣ媒介ＰＤＫリン酸化の重要性を判定するために、このアイソザイムの他の基質のリン酸化に影響することなく、δＰＫＣによるＰＤＫリン酸化を選択的に阻害するペプチド阻害物質を設計した。ＰＤＫ自体の選択的阻害剤および活性化因子は入手できないので、δＰＫＣのこのような機能分離（separation-of-function）阻害物質は、上記疑問に対処するための重要なツール、ならびに虚血および再灌流による組織傷害を少なくとも治療するための治療用組成物の基礎の両方をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
[010]  第１の態様では、コアアミノ酸配列を含む調節ペプチドであって、コア配列が、５アミノ酸残基の長さであり、配列ＡＬＳＴＥ（配列番号：１）と少なくとも６０％同一である調節ペプチドが提供される。
【００１１】
[011]  一実施形態では、コア配列が、６アミノ酸残基の長さであり、配列ＡＬＳＴＥＲ（配列番号：２）と少なくとも６０％同一である。
【００１２】
[012]  一実施形態では、調節ペプチドは、５〜２０個のアミノ酸残基を含む。別の実施形態では、調節ペプチドは、５〜１５個のアミノ酸、５〜１０個のアミノ酸、６〜１５個のアミノ酸、６〜１０個のアミノ酸、または６〜８個のアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、調節ペプチドは、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、または１５個のアミノ酸を含む。
【００１３】
[013]  一実施形態では、調節ペプチドは、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（PDK）に由来する等しい長さの連続した配列と少なくとも約６０％同一である。別の実施形態では、調節ペプチドは、ＰＤＫに由来する等しい長さの連続した配列と少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。
【００１４】
[014]  一実施形態では、調節ペプチドは、ＡＬＳＴＥＲＧＫＴＬＶ（配列番号：４３）、ＡＬＳＴＤＲＧＫＴＬＶ（配列番号：：４４）、ＡＬＴＴＤＲＧＫＴＬＶ（配列番号：：４５）、ＡＬＴＴＤＲＧＲＴＬＶ（配列番号：：４６）、ＡＬＴＴＤＲＧＫＳＬＶ（配列番号：４７）、ＡＬＴＳＤＲＧＫＴＬＶ（配列番号：４８）、ＡＬＴＴＤＲＰＫＴＬＶ（配列番号：４９）、ＡＬＴＴＤＫＧＫＴＬ（配列番号：５０）、および／またはＡＬＴＴＤＲＧＫＬＶ（配列番号：５１）でない。
【００１５】
[015]  一実施形態では、調節ペプチドは、δ−プロテインキナーゼＣ（δPKC）によるＰＤＫのリン酸化を阻害する。別の実施形態では、調節ペプチドは、δＰＫＣによるＰＤＫのリン酸化を特異的に阻害する。
【００１６】
[016]  一実施形態では、調節ペプチドは、硫黄含有残基をさらに含む。別の実施形態では、硫黄含有残基はシステインである。さらに別の実施形態では、硫黄含有残基はシステイン類似体である。
【００１７】
[017]  一実施形態では、硫黄含有残基は、調節ペプチドのＮ−末端および／またはＣ−末端に位置する。別の実施形態では、硫黄含有残基は内部残基である。
【００１８】
[018]  一実施形態では、調節ペプチドは、担体ペプチドに連結されている。一実施形態では、調節ペプチドは、ジスルフィド結合によって担体ペプチドに連結されている。別の実施形態では、調節ペプチドは、ペプチド結合によって担体ペプチドに連結されており、調節ペプチドおよび担体は、単一の調節融合ペプチドを形成する。
【００１９】
[019]  一実施形態では、担体ペプチドはＴＡＴペプチドである。別の実施形態では、担体ペプチドはＴＡＴ４７〜５７（配列番号：３３）である。さらに別の実施形態では、担体ペプチドは、硫黄含有残基をさらに含む。さらに別の実施形態では、硫黄含有残基はシステインである。別の実施形態では、硫黄含有残基はシステイン類似体である。さらに別の実施形態では、担体ペプチドは、そのＣ−末端（配列番号：５２）またはＮ−末端（配列番号：５３）にペプチド結合を介して結合したシステイン残基をさらに含む。さらに別の実施形態では、システイン残基は、任意の位置で存在し、代替案は、配列番号：３３内の任意の位置におけるシステイン残基の存在である。
【００２０】
[020]  第２の態様では、ＰＤＫの活性を調節するための方法が提供される。
【００２１】
[021]  第３の態様では、対象を治療するための方法であって、選択的δＰＫＣ調節組成物を投与する工程を含む、方法が提供される。
【００２２】
[022]  一実施形態では、本方法は、それを必要とする対象にΨＰＤＫ調節ペプチドを投与する工程を含む。
【００２３】
[023]  一実施形態では、対象は、心血管疾患、心虚血、心虚血／再灌流傷害、心筋梗塞、慢性安定狭心症、または急性冠状動脈症候群を罹患している。別の実施形態では、対象は、心臓移植中であり、またはそれを受けたことがある。
【００２４】
[024]  本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、以下の詳細な説明と併せて読むとより完全に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】[025]二次メッセンジャーまたはモジュレーターペプチドの存在下または非存在下でのＰＫＣのトランスロケーションおよび活性のレギュレーションを伴う機構を示す概略図である。
【図１Ｂ】[026]ヒトＰＤＫ２に由来する部分配列と、様々な種に由来するヒトδＰＫＣの部分配列とのアミノ酸配列アライメントを例示する図である。
【図１Ｃ】[027]ＰＤＫ２の３Ｄ構造を例示する図である。
【図１Ｄ】[028]様々な種に由来するδＰＫＣの部分配列のアミノ酸配列アライメントを例示する図である。
【図１Ｅ】[029]様々な種に由来するＰＤＫ２の部分配列のアミノ酸配列アライメントを例示する図である。
【図１Ｆ】[030]ε−、δ−、およびθ−ＰＫＣ  Ｃ２ドメインのアミノ酸配列アライメントを示し、各アイソザイムのアイソザイム特異的阻害物質（上）および活性化因子（下）も例示する図である。
【図１Ｇ】[031]θ−、δ−、およびε−ＰＫＣタンパク質の二次構造を例示する図である。
【図２Ａ】[032]ジスルフィド結合を介してＴＡＴペプチド（配列番号：３３;YGRKKRRQRRR）に連結したΨＰＤＫペプチド（配列番号：２;ALSTER）の化学構造を例示する図である。システイン残基は、配列番号：３３のＣ−末端および配列番号：２のＣ−末端に存在する（ペプチド結合を介して）。
【図２Ｂ】[033]ペプチド結合およびＧＳＧスペーサー（配列番号：４２;YGRKKRRQRRRGSGALSTER）を介してＴＡＴペプチドに連結したΨＰＤＫペプチドの化学構造を例示する図である。
【図２Ｃ】[034]野生型線維芽細胞内に由来する線維芽細胞内のＭＡＲＣＫＳリン酸化に対する様々なペプチドの効果を示すウエスタンブロットを示す図である。
【図２Ｄ】[034]δＰＫＣノックアウトマウスに由来する線維芽細胞内のＭＡＲＣＫＳリン酸化に対する様々なペプチドの効果を示すウエスタンブロットを示す図である。
【図３Ａ】[035]δＰＫＣによるＰＤＫ２のリン酸化に対するΨＰＤＫペプチドの効果を実証する図である。
【図３Ｂ】[035]δＰＫＣによるＤｒｐ１のリン酸化に対するΨＰＤＫペプチドの効果を実証する図である。
【図３Ｃ】[036]プロテイナーゼＫ（PK）によるタンパク質分解に対するδＰＫＣの感度に対するΨＰＤＫペプチドの効果を実証する図である。
【図３Ｄ】[036]プロテイナーゼＫ（PK）によるタンパク質分解に対するβＩ−ＰＫＣまたはεＰＫＣの感度に対するΨＰＤＫペプチドの効果を実証する図である。
【図４Ａ】[037]ペプチドの存在下（＋）または非存在下（−）で心筋梗塞を模倣するための虚血および再灌流を伴うプロトコールの時間枠を示す概略図である。
【図４Ｂ】[038]δＰＫＣのＩ／Ｒ誘導トランスロケーションに対するΨＰＤＫペプチドの効果を例示する図である。
【図４Ｂ】[039]ΨＰＤＫペプチドで処置した後のミトコンドリア内へのδＰＫＣの侵入を実証するための、プロテイナーゼＫを使用するアッセイの結果を例示する図である。
【図４Ｃ】[039]ΨＰＤＫペプチドで処置した後のミトコンドリア内へのδＰＫＣの侵入を実証するための、プロテイナーゼＫを使用するアッセイの結果を例示する図である。
【図５Ａ】[040]Ｉ／ＲによるδＰＫＣ活性化後の事象のカスケードを要約する概略図である。
【図５Ｂ】[041]ＰＤＫ２のリン酸化を測定するための２−Ｄ  ＩＥＦゲルアッセイの結果を示す図である。
【図５Ｃ】[041]ＰＤＨのリン酸化を測定するための２−Ｄ  ＩＥＦゲルアッセイの結果を示す図である。
【図５Ｄ】[041]ＡＬＤＨ２のリン酸化を測定するための２−Ｄ  ＩＥＦゲルアッセイの結果を示す図である。
【図５Ｅ】[042]ΨＰＤＫペプチドを用いて、または用いないでＩ／Ｒを受けた心臓におけるＭＡＲＣＫＳ（左パネル）およびＤｒｐ１（右パネル）のリン酸化を測定するためのリン酸化アッセイの結果を示す図である。
【図６Ａ】[043]心臓組織内の梗塞サイズに対するΨＰＤＫペプチドを用いた処置の効果を示す図である。
【図６Ｂ】[044]再灌流の最初の３０分の間に、灌流液内にＩ／Ｒ傷害を受けた心臓によって放出されるＣＰＫのレベルを示すグラフである。
【図６Ｃ】[045]Ｉ／Ｒ傷害を受け、その後再灌流が続いた心臓におけるリン酸化ＪＮＫおよび総ＪＮＫのウエスタンブロット分析の結果を示す図である。結果の定量化は、図６Ｄに示されている。
【図６Ｄ】[045]Ｉ／Ｒ傷害を受け、その後再灌流が続いた心臓におけるリン酸化ＪＮＫおよび総ＪＮＫのウエスタンブロット分析の結果の定量化を示す図である。
【図６Ｅ】[046]ミトコンドリアへのδＰＫＣのトランスロケーションに対する対照ペプチドおよび実験ペプチドの効果、ならびにＩ／Ｒのｅｘ  ｖｉｖｏモデルにおける心保護に対する効果の概要を示す図である。
【図７】[047]ジスルフィド結合を介して（レーン３〜４）、またはペプチド結合およびスペーサー（レーン５〜６）を介して担体ペプチドに結合したΨＰＤＫペプチドによるＭＡＲＣＫＳのリン酸化を示すためのアッセイの結果を示す図である。
【図８】[048]δＰＫＣのトランスロケーションおよび活性に対するΨＰＤＫペプチドの効果を要約する概略図である。Ｓ１は、ＭＡＲＣＫＳを示す。Ｓ２は、ＰＤＫを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
[049]  次に、様々な態様を以下でより完全に記載する。しかし、このような態様は、多くの異なる形式で具現化することができ、本明細書に示した実施形態に限定されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が、徹底的かつ完全となり、当業者にその範囲を完全に伝えることになるように提供されている。
【００２７】
[050]  本開示の実施には、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内の化学、生化学、および薬理の従来法が使用されることになる。このような技法は、文献で完全に説明されている。例えば、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Worth Publishers, Inc.、現行版）；ＭｏｒｒｉｓｏｎおよびＢｏｙｄ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Allyn and Bacon, Inc.、現行版）；Ｊ．Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（McGraw Hill、現行版）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、２０版；Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｊ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｈａｒｄｍａｎ、Ｌ．Ｌ．Ｌｉｍｂｉｒｄ、Ａ．Ｇｉｌｍａｎ、１０版を参照。
【００２８】
[051]  値の範囲が提供されている場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値、およびその明言した範囲内の任意の他の明言した値または介在値は、本開示の範囲内に包含されることが意図されている。例えば、１％〜８％の範囲が明言されている場合、２％、３％、４％、５％、６％、および７％も、明示的に開示されており、１％以上の値の範囲および８％以下の値の範囲も明示的に開示されていることが意図されている。
【００２９】
１．定義
[052]  本明細書において、かつ添付の特許請求の範囲では、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、脈絡で別段に明らかに要求されていない限り、複数形の言及を含むことに留意されなければならない。
【００３０】
[053]  別段に定義されていない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと同様または等価な任意の方法および材料を、本発明を実施または試験するのに使用することができるが、好適な方法、デバイス、および材料を次に記載する。本明細書で述べるすべての刊行物は、本発明と共に使用され得る、刊行物に報告されている方法論を記載および開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれている。
【００３１】
[054]  用語「実質的に精製された」は、本明細書において、核酸配列またはアミノ酸配列であって、これらの自然環境から取り出され、単離または分離され、これらが天然に伴い、または精製方法によって伴う他の成分を少なくとも６０％含まない、好ましくは７５％含まない、より好ましくは９０％含まない、最も好ましくは９５％含まない、核酸配列またはアミノ酸配列を指す。
【００３２】
[055]  「ペプチド」および「ポリペプチド」は、本明細書で互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の鎖で構成される化合物を指す。別段の指定のない限り、ペプチドの配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の順序で与えられる。「置換」は、本明細書において、それぞれ、１つまたは複数のアミノ酸の異なるアミノ酸による交換を指す。「保存的アミノ酸置換」は、選択されたポリペプチドの活性または三次構造の有意な変化をもたらさない置換である。保存的アミノ酸置換をアミノ酸配列内で行うことによって、本発明で有利に利用され得るペプチドの誘導体を得ることができる。保存的アミノ酸置換は、当技術分野で公知であるように、かつ本明細書で参照する場合、タンパク質中のアミノ酸を、例えば、構造、サイズ、および／または化学的性質に関して同様の側鎖を有するアミノ酸で置換することを伴う。例えば、以下の群のそれぞれの中のアミノ酸を、以下と同じ群内の他のアミノ酸と交換することができる：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを含めた脂肪族側鎖を有するアミノ酸；セリンおよびトレオニンなどの非芳香族、ヒドロキシル含有側鎖を有するアミノ酸；アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖を有するアミノ酸；グルタミンおよびアスパラギンを含めたアミド側鎖を有するアミノ酸：リシン、アルギニン、およびヒスチジンを含めた塩基性アミノ酸；フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを含めた芳香族環側鎖を有するアミノ酸；ならびにシステインおよびメチオニンを含めた硫黄含有側鎖を有するアミノ酸。さらに、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびこれらのアミドも、本明細書で互換性であるとみなされる。
【００３３】
[056]  「挿入」または「付加」は、本明細書において、天然に存在する分子と比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加をもたらすアミノ酸配列の変化を指す。
【００３４】
[057]  「欠失」は、本明細書において、アミノ酸配列の変化を指し、１つまたは複数のアミノ酸残基の不在をもたらす。
【００３５】
[058]  第１のアミノ酸配列の「バリアント」は、第１のアミノ酸配列と比べて、１つまたは複数のアミノ酸の置換または欠失を有する第２のアミノ酸配列を指す。
【００３６】
[059]  アミノ酸配列の「修飾」、または「修飾された」アミノ酸配列は、配列のＮ−末端またはＣ−末端のいずれかへの１つまたは複数のアミノ酸残基の付加から生じるアミノ酸配列を指す。「修飾」は、アミノ酸類似体の取り込みなどの、ペプチド配列内の１つまたは複数のアミノ酸の化学修飾も指す場合がある。アミノ酸類似体は、天然に存在する類似体であっても、合成のものであってもよい。
【００３７】
[060]  用語「調節する」または「レギュレートする」は、本明細書において、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）の活性の変化を指す。例えば、調節またはレギュレーションにより、ＰＤＫのタンパク質活性、結合特性、または任意の他の生物学的、機能的、もしくは免疫学的性質を増減させることができる。
【００３８】
[061]  別の配列と「「ｘ」パーセントの同一性を有するアミノ酸配列」に本明細書で言及することは、配列が、以下に示すように決定される指定されたパーセント同一性、「ｘ」を有し、共通の機能活性を共有することを意図する。２つのアミノ酸配列のパーセント同一性を決定するために、配列は、比較を最適にする目的で整列される（例えば、最適なアライメントのために、第１および第２のアミノ酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非相同配列を比較目的のために無視することができる）。好適な実施形態では、比較目的で整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％である。本明細書に記載の相対的に短いペプチド配列については、パーセント同一性は、第１および第２の配列のうちのより長い配列中の残基の総数と比べた、第１の配列と第２の配列との間の同様の残基の数とされる。２つの配列の間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成することもできる。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで入手可能）内のＧＡＰプログラム中に導入されたＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol.、48:444-453（1970））のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量、および１、２、３、４、５、または６の長さ重量を使用して、決定することができる。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）中に導入されたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（CABIOS、4:11-17（1989））を使用して、ＰＡＭ１２０重量残基表（weight residue table）、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティーを使用して決定することもできる。タンパク質配列は、公共データベースに対して探索を実施するための「クエリー配列」としてさらに使用することができる。例えば、ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照。
【００３９】
[062]  「虚血」は、特定の臓器または組織への血液の不十分な供給として定義される。血液供給の減少の結果は、臓器または組織への酸素および栄養分の不十分な供給である（低酸素）。低酸素が長引くと、患部臓器または組織の傷害がもたらされ得る。
【００４０】
[063]  「無酸素」は、臓器または組織内に酸素が実質的に完全に存在しないことを指し、これは、長引くと、臓器または組織の死がもたらされ得る。
【００４１】
[064]  「低酸素状態」は、特定の臓器または組織が、酸素の不十分な供給を受ける状態として定義される。
【００４２】
[065]  「無酸素状態」は、特定の臓器または組織への酸素の供給が遮断された状態を指す。
【００４３】
[066]  「虚血性傷害」は、虚血の期間の結果としての臓器または組織の細胞および／または分子の損傷を指す。
【００４４】
[067]  「再灌流」は、流れ無しまたは流れの低減の期間の後の組織内への流体の流れの復帰を指す。例えば、心臓の再灌流では、流体供給または血液供給の閉塞を除去した後、ｉｎ  ｖｉｖｏで冠動脈などの供給ラインによって、流体または血液が心臓に戻る。
【００４５】
[068]  用語「ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ」または「ＰＤＫ」は、４つの公知のＰＤＫアイソザイムのうちのいずれか１つを指す。４つの公知のヒトアイソザイムとしては、ＰＤＫ１（GenBank受託番号NP_002601；配列番号：１１）、ＰＤＫ２（GenBank受託番号NP_002602；配列番号：１２）、ＰＤＫ３（GenBank受託番号NP_001135858；配列番号：１３）、およびＰＤＫ４（GenBank受託番号NP_002603；配列番号：１４）がある。ＰＤＫは、それだけに限らないが、ラット、マウス、およびニワトリを含めた他の生物に由来するＰＤＫアイソザイムも指す場合がある。いくつかの実施形態では、ＰＤＫは、ヒトＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ＰＤＫ３、またはＰＤＫ４タンパク質配列と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である配列を有するタンパク質を指す場合がある。
【００４６】
[069]  「特異的な」または「特異性」は、δＰＫＣによるδＰＫＣリン酸化のΨＰＤＫペプチドまたはΨＰＤＫペプチド組成物による選択的調節を指す。ΨＰＤＫペプチドは、ΨＰＤＫペプチドまたはΨＰＤＫペプチド組成物の存在下または非存在下で、δＰＫＣによるＰＤＫのリン酸化の量を、他の公知のδＰＫＣリン酸化基質のリン酸化の量と比較することによって、調節（阻害または活性化）のその特異性について試験することができる。一実施形態では、リン酸化アッセイに特定のΨＰＤＫペプチド阻害物質を添加して、ΨＰＤＫペプチドの存在下および非存在下でδＰＫＣによるＰＤＫのリン酸化を測定すると、δＰＫＣによるＰＤＫのリン酸化が減少する。この実施形態では、δＰＫＣによるＰＤＫのリン酸化の減少は、ＰＤＫでない公知のδＰＫＣリン酸化基質のδＰＫＣによるリン酸化の減少より、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍大きい。
【００４７】
ＩＩ．ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（PDK）モジュレーターペプチドの合理的な設計
[070]  マウスおよびラット（Chenら、2001、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、98:11114-11119）、ブタ（Inagakiら、2003、Circulation、108:2304-2307）、ならびに場合によりヒト（Batesら、2008、Circulation、117:886-896）を含めた、心筋梗塞の様々な動物モデルにおいて、ΨＲＡＣＫ、δＰＫＣ特異的活性化因子を用いて心虚血および再灌流傷害（すなわち、心発作で誘導される傷害）を治療すると、δＰＫＣ媒介心外傷が増大し、一方、δＶ１−１、δＰＫＣ特異的ペプチド性インヒビターを用いて治療すると、この傷害が阻止されたことが以前に示されている（Chenら、2001、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、98:11114-11119）。
【００４８】
[071]  δＰＫＣの多数の基質が様々な細胞型において同定されており、これらは、異なる細胞内の位置で見つかる。これらとして、必ずしもそれだけに限らないが、ミリストイル化アラニンリッチＣ−キナーゼ基質（MARCKS）（Disatnikら、2002、J. Cell. Sci.、115:2151-2163; Myatら、1997、Curr. Biol. 7:611-614）、オクルディン（Qiら、2008、J. Clin. Inv.、118:173-182）、ならびに原形質膜において見つかるいくつかのイオンチャネル（Barmanら、2004、Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol.、186:L1275-L1281）；小胞体上にあるｃ−Ａｂｌ（Qiら、2008、J. Cell Sci.、121:804-813）；ミトコンドリア上のダイナミン関連タンパク質１（Drp-1）（Qiら、2010、Mol. Biol. Cell、22:256-265）；ならびに細胞質ゾル内にあるピルビン酸キナーゼおよび熱ショックタンパク質（HSP27）（Siwkoら、2007、Int. J. Biochem. Cell Biol.、39:978-987）が挙げられる。
【００４９】
[072]  組織に虚血／再灌流を受けさせた後に、δＰＫＣによるＰＤＫのリン酸化を特異的に阻害するペプチドモジュレーターの同定および特徴付けに関係する研究を以下に記載する。この高度に選択的なペプチドは、虚血／再灌流事象後に通常観察される組織損傷の低減に有効であり、それによって、虚血性障害を治療および／または予防するための新規療法をもたらす。
【００５０】
[073]  δＰＫＣの単一のリン酸化機能−−ＰＤＫのリン酸化の特異的阻害物質を同定するのに、合理的な設計手法を使用した。この合理的な手法は、ＰＫＣの結合タンパク質ＲＡＣＫ（εV1-1およびδV1-1など；図１ａ、ｅ）（Johnsonら、1996、J. Biol. Chem.、24962-24966; Dornら、1999、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、96:12798-12803; Brandmanら、2007、J. Biol. Chem.、282:4113-4123）へのＰＫＣアンカリングを妨害することによって、ＰＫＣ活性を選択的に阻害するペプチドを同定するのに以前に使用された（Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、98:11114-11119; Brandmanら、2007、J. Biol. Chem.、282:4113-4123）。さらに、自己阻害相互作用を妨害し、したがって対応するアイソザイム（例えば、ΨεRACKおよびΨδRACK）の活性化因子として作用するペプチドが同定された（Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、98:11114-11119; Ronら、1995、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、92:492-496）。
【００５１】
[074]  次いでこの阻害物質は、ＰＤＫのδＰＫＣ媒介リン酸化が、虚血事象後のδＰＫＣ依存心外傷に要求されることを示すのに使用された。このペプチド阻害物質は、ΨＰＤＫと本明細書で呼び、ＰＤＫのδＰＫＣ媒介リン酸化を阻害したが、ＭＡＲＣＫＳまたはＤｒｐ１などの他のδＰＫＣ基質のリン酸化を阻害しなかった。δＰＫＣに対するその特異性は、δＰＫＣを欠く細胞内でΨＰＤＫの効果がないことによっても明白である。
【００５２】
[075]  ΨＰＤＫペプチドは、ＰＤＫ２（ALSTD；配列番号：５）、δＰＫＣの直接基質と、δＰＫＣ（ALSTE：配列番号：１）との間の類似性の短い配列を代表する。ΨＰＤＫ部位、ＡＬＳＴＥと同様に、これらのペプチドは、すべてＣ２ドメインに由来する。しかし、ΨＰＤＫの作用は異なる。
【００５３】
[076]  用語「ΨＰＤＫ」は、δＰＫＣによるＰＤＫのリン酸化を選択的に阻害するペプチド配列を指す。言い換えれば、ΨＰＤＫペプチドを含む組成物は、δＰＫＣによるＰＤＫのリン酸化を低減するが、δＰＫＣによってリン酸化されることが知られている任意の他の基質（および上記に記載の）のリン酸化に影響しない。ΨＰＤＫは、このような基質（PDKでない）のδＰＫＣリン酸化に対する効果が、等価なアッセイ条件下で、δＰＫＣによるＰＤＫのリン酸化に対するΨＰＤＫペプチドの効果より単に低いペプチドを包含することになることが理解される。「より低い」効果は、δＰＫＣによるリン酸化の５％〜２０％、１０％〜５０％、３０％〜５０％、４０％〜６０％、５０％〜８０％、７０％〜９０％、８０％〜９５％、または９０〜９９％の減少を包含し得る。代わりに、この「より低い」効果は、δＰＫＣによるリン酸化の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の減少を包含する。
【００５４】
[077]  ΨＰＤＫは、本明細書で記載するように同定された選択的モジュレーターペプチドと同様であるコアアミノ酸配列を含む。このコアアミノ酸配列は、ＰＤＫ２配列、ＡＬＳＴＥ（配列番号：１）と少なくとも６０％同一である。しかし、δＰＫＣによるＰＤＫのリン酸化を選択的に阻害することができるペプチドは、５アミノ酸残基のこのコア配列より有意に長い場合がある。例えば、ΨＰＤＫモジュレーターペプチドは、長さが５〜２０アミノ酸、または長さが６〜１５アミノ酸である場合がある。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸は、コア配列のＮ−末端、Ｃ−末端、またはＮ−末端とＣ−末端の両方とすることができ、ＰＤＫ配列に由来する。したがって、ΨＰＤＫモジュレーターペプチドの全長は、ΨＰＤＫモジュレーターペプチドが有効であるＰＤＫタンパク質内の同じ長さの配列と、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一となる。ペプチドは、ホモサピエンスに由来するアミノ酸配列を主に参照して記載されているが、ペプチドは、本明細書に示される特定のアミノ酸配列に限定されないことが理解される。
【００５５】
[078]  ΨＰＤＫペプチドは、以下に記載するものなど、天然型で使用し、または担体へのコンジュゲーションによって修飾することができることが理解されることになる。代わりに、配列から１個または２個のアミノ酸を、置換し、または欠失させることができる。各ペプチドの例示的な修飾、誘導体、および断片を以下に示す。いくつかの実施形態では、ΨＰＤＫペプチドは、ＡＩＳＴＥＲ（配列番号：６）、ＡＶＳＴＥＲ（配列番号：７）、ＡＬＴＴＥＲ（配列番号：８）、ＡＴＳＳＥＲ（配列番号：９）、またはＡＬＳＴＤＲ（配列番号：１０）である。
ＩＩＩ．担体部分を含む調節ΨＰＤＫペプチド組成物
【００５６】
[079]  δＰＫＣ特異的ＰＤＫリン酸化の阻害に有用な調節ΨＰＤＫペプチドは、細胞膜を横断する調節ペプチド組成物の移動を促進するペプチド部分に結合または連結させることができる。このペプチド担体は、Ｔａｔ、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質、ポリアルギニンまたはポリリシンなどのポリカチオン性ペプチド（例えば、（R）7）、ペネトラチン、Ｔａｔ、ＶＴ５、ＭＡＰ、トランスポータン、トランスポータン−１０、ｐＶＥＣ、ｐＩＳＬ、Ｐｅｐ−１、およびマウスＰｒＰＣ（1-28）を含めた、細胞膜を横断する移動を促進するための当技術分野で公知のいくつかのペプチド担体のいずれか１つとすることができる（Lundbergら、2003、J. Mol. Recognit.、16:227-233、米国特許公開第２００３／０１０４６２２号および同第２００３／０１９９６７７号を参照）。好適な実施形態では、担体ペプチドは、Ｔａｔ由来輸送ポリペプチド（米国特許第５，７４７，６４７号および同第５，８０４，６０４号; Vivesら、J. Biol. Chem.、272:16010-16017（1997））、ポリアルギニン（米国特許第４，８４７，２４０号および同第６，５９３，２９２号; Mitchellら、2000; Rolhbardら、2000）、またはアンテナペディアペプチド（米国特許第５，８８８，７６２号）である。これらの参考文献の開示は、その全体が本明細書に組み込まれている。
【００５７】
[080]  調節ペプチドは、ジスルフィド結合によって担体ペプチドに連結することができる。いくつかの実施形態では、ジスルフィド結合は、２つのシステイン、２つのシステイン類似体、またはシステインとシステイン類似体との間で形成される。この実施形態では、調節ペプチドおよび担体ペプチドは共に、少なくとも１つのシステインまたはシステイン類似体を含有する。システイン残基あるいは類似体は、ペプチドのＮ−末端残基もしくはＣ−末端残基として、あるいは調節ペプチドおよび担体ペプチドの内部残基として存在し得る。次いでジスルフィド連結が、システイン残基またはシステイン類似体のそれぞれの硫黄残基同士間で形成される。したがって、ジスルフィド連結は、例えば、調節ペプチドのＮ−末端と担体ペプチドのＮ−末端、調節ペプチドのＣ−末端と担体ペプチドのＣ−末端、調節ペプチドのＮ−末端と担体ペプチドのＣ−末端、調節ペプチドのＣ−末端と担体ペプチドのＮ−末端、または調節ペプチドおよび／もしくは担体ペプチド内の任意の内部位置におけるものを含めた任意の他のこのような組合せの間で形成することができる。
【００５８】
[081]  調節ペプチドは代わりに、融合タンパク質の一部とすることができる。一般に、融合タンパク質を形成するために、ペプチドは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ結合以外の結合によって別のペプチドに結合している。一方のペプチドのＣ−末端から他方のペプチドのＮ−末端へのアミド結合は、融合タンパク質中の結合の例示的なものである。この実施形態は、調節ペプチドおよび担体ペプチドの両方を含む単一線形ペプチド組成物を形成するための調節ペプチドと担体ペプチドとの間の、かつこれらを連結するペプチド結合の存在を包含する。調節ペプチドを担体ペプチドのＮ−末端とすることができ、または担体ペプチドを調節ペプチドのＮ−末端とすることができる。
【００５９】
[082]  短いリンカーペプチドが、単一線形ペプチド組成物内の調節ペプチドと担体ペプチドとの間に存在してもよい。リンカーペプチドは、２〜１５個のアミノ酸を含むことができる。代わりに、リンカーペプチドは、２〜１０個のアミノ酸、３〜１０個のアミノ酸、４〜１０個のアミノ酸、２〜８個のアミノ酸、３〜７個のアミノ酸、または４〜６個のアミノ酸を含む場合がある。リンカーペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、１、２、３、４、または５個のグリシン残基を含む。他の実施形態では、リンカーペプチドは、１、２、３、４、または５個のアラニン残基を含む。さらに他の実施形態では、リンカーペプチドは、少なくとも１個のセリン残基を含む。好適な実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙである。リンカーペプチドは、任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体を含み得ることが理解される。単一線形ペプチド組成物は代わりに、調節ペプチドと担体ペプチドとの間に存在する単一のアミノ酸を有することができる。
【００６０】
ＩＶ．ΨＰＤＫの作用機序
[083]  図８は、ΨＰＤＫの作用機序を要約するスキームを提供する。ΨＰＤＫは、細胞質ゾル内の基質のリン酸化を増大させるが（S1、左側に緑色で囲んである）、これは、ＰＤＫのリン酸化を阻害する（S2、右側に赤色で囲んである）。ΨＰＤＫの阻害効果は、任意の細胞内コンパートメント内のすべての基質のδＰＫＣリン酸化を阻害するδＶ１−１と異なる（図１Ａの中央パネルを参照）。ΨＰＤＫは、すべてのδＰＫＣ基質のリン酸化を増大させるΨδＲＡＣＫとも異なる（図１Ａ、右パネル）。したがって、ΨＰＤＫは、他のδＰＫＣ媒介機能を阻害することなく、ミトコンドリア機能のＰＤＫレギュレーションに関連したδＰＫＣ機能を区別する最初のδＰＫＣ特異的ペプチドモジュレーターである。重要なことに、ΨＰＤＫは、ＰＤＫのδＰＫＣ媒介リン酸化は、虚血事象後のδＰＫＣ依存心外傷に要求される、主要なまたは唯一のリン酸化事象であり得ることを実証する。
【００６１】
[084]  多くのミトコンドリアタンパク質は、そのＮ−末端に２０〜５０アミノ酸から構成されるミトコンドリア標的化シグナル（MTS）を有し、これは、ミトコンドリアインポートシステムによって認識される。δＰＫＣは、このようなミトコンドリア標的化配列を含有しないので、ΨＰＤＫがミトコンドリア内へのδＰＫＣの侵入を実際に誘導したことを確認するための実験を行った。ミトコンドリア分画に付随するδＰＫＣは、プロテイナーゼＫ消化に対して耐性であり（図４Ｃ）、δＰＫＣは、ミトコンドリアに確かに入ることを示す。しかし、ミトコンドリア内へのδＰＫＣインポートの機構は、同定されないままである。
【００６２】
[085]  ミトコンドリア内酵素ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）は、クレブス回路内への侵入のために、解糖に由来するピルビン酸をアセチル−ＣｏＡに変換するので、心臓における好気的呼吸への解糖の寄与の重要なレギュレーターである。酵素活性の一部は、それぞれ、リン酸化依存および脱リン酸化依存阻害および活性化によってレギュレートされる（Patelら、2001. Exp. Mol. Med.、33:191-197）。ＰＤＨのリン酸化を触媒し、その活性を調節する酵素は、ＰＤＫである。ＰＤＨが虚血後の心臓の収縮機能の回復をレギュレートするという証拠がある（Lewandowskiら、1995、Circulation、91:2071-2079; Stanleyら、1996、J. Mol. Cell. Cardiol.、28:905-914）。ここで、Ｉ／Ｒで誘導されるＰＤＫリン酸化の増大は、ＰＤＨリン酸化の増大と関連し、ΨＰＤＫの存在下で阻止されることが示される（図５）。δＰＫＣ特異的阻害物質、δＶ１−１が再灌流時に添加されるとき、同じ結果が得られる（図５）。本試験におけるペプチド担体であるＴＡＴ４７−５７ペプチドは、ミトコンドリア膜を通過することが示されているので（Rayapureddiら、2010、Biochemistry、49:9470-9479; Gaizoら、2003、Mol. Genet. Metab.、80:170-180）、ΨＰＤＫ−ＴＡＴコンジュゲートがミトコンドリア膜を通過し、ミトコンドリア内部のＰＤＫ／δＰＫＣ相互作用を阻止した可能性がある。この効果は、細胞質ゾル画分内のΨＰＤＫとδＰＫＣとの相互作用に加えたものとなり得、これは、δＰＫＣのトランスロケーションをもたらし、ＭＡＲＣＫＳリン酸化を増大させる（図２、図５）。さらに、ΨＰＤＫは、ミトコンドリアにトランスロケーションするとδＰＫＣに結合してミトコンドリアの分裂を媒介する別のδＰＫＣ特異的基質であるＤｒｐ１のリン酸化に影響することなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤＫのリン酸化を減少させることが本明細書で示される（Qiら、2010、Mol. Biol. Cell.、22:256-265）。ΨＰＤＫは、δＰＫＣと、その細胞質ゾル基質Ｄｒｐ１、または原形質膜に位置したＭＡＲＣＫＳとの相互作用を阻止しないことが示された
ので、ΨＰＤＫの効果は、δＰＫＣによるＰＤＫのリン酸化に特異的であると結論づけられる。
【００６３】
[086]  キナーゼモジュレーターは、基礎研究および薬剤にとって非常に重要である。多数のキナーゼモジュレーターが、早期に開発されている。これらのレギュレーターのほとんどは、多くは広い活性を伴い、他のものはより高い選択性を伴った小分子である（Karamanら、2008、Nat. Biotech.、26:127-132）。しかし、本発明者らの知る限りでは、単一シグナル伝達分子に特異的なモジュレーターペプチドが報告されるのは、これが最初である。本発明者らの研究は、このような特異的なレギュレーターを合理的に設計することができ、これらのペプチドは、例えば、所与のＰＫＣアイソザイムのいくつかの細胞機能の１つの役割を求めるのに不足しているツールを提供することを実証する。この手法は、他のシグナル伝達タンパク質におそらく適用可能であり、他のタンパク質間相互作用の機能分離レギュレーターの生成を可能にする。
【００６４】
Ｖ．使用方法
[087]  本明細書に記載の調節ペプチドおよびペプチド組成物は、虚血および生じる低酸素に起因する臓器、組織、および／または細胞の損傷を予防または低減するために、それを必要とする対象に投与することができる。このようなペプチドは、虚血後の心不全の進行の減速もしくは阻害、生存時間の延長、短縮率の低減、左心室重量と体重の比の低減、線維症の低減、対象のＥＫＧ／ＥＣＧを健康な動物のものにより酷似させること、および／またはこれらの組合せに有用である。ペプチドは、移植手順の間の虚血性障害から心臓を保護するのに特に価値のあるものとなり得る。したがって、ここに記載のペプチドおよびペプチド組成物は、例えば、心血管疾患、心虚血、心虚血／再灌流傷害、心筋梗塞、慢性安定狭心症、もしくは急性冠状動脈症候群を罹患している、または心臓移植を受けている、もしくは受けたことがある対象の治療に有用である。
【００６５】
[088]  ある特定の実施形態では、心血管障害に罹るリスクのある、またはそれに罹った個体を治療する方法が提供される。このような方法は、心臓組織の損傷または傷害を低減する薬理学的有効量のΨＰＤＫペプチド組成物を個体に投与する工程を含む。「有効量」または「薬理学的有効量」は、治療される対象に治療効果、例えば、再灌流傷害の低減などを与えるのに要求される化合物の量を指す。有効用量はまた、当業者が認識するように、投与経路、賦形剤の使用量、および他の治療的処置との任意選択の併用に応じて変化することになる。なおさらに別の実施形態では、心血管疾患から心臓を保護する方法が存在する。このような方法は、ΨＰＤＫペプチド組成物を投与する工程を含み、投与により、ΨＰＤＫペプチド組成物の不投与、または対照ペプチド組成物の投与での結果と比較して、心筋梗塞サイズが低減され、心血行動態性能が改善され、心不全症状が改善され、心毒性薬のアポトーシス作用が低減され、またはこれらの組合せがもたらされる。低減することは、それだけに限らないが、梗塞サイズを含めた、虚血および／または再灌流に起因する傷害の量の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％の減少、またはその間の任意の値もしくは範囲を指すことができる。
【００６６】
[089]  ある特定の実施形態では、ΨＰＤＫペプチドおよびペプチド組成物は、第２の治療剤を含む１つの組成物で同時投与することができる。このようにして、当業者は、ΨＰＤＫペプチドを個々に、組合せで、または第２の治療剤と組み合わせて使用することによって、例えば、心血管疾患、もしくは心虚血、心虚血／再灌流、心筋梗塞、慢性安定狭心症、急性冠状動脈症候群からの傷害、または心臓移植から生じる合併症の進行を遅らせ、もしくは阻害するための薬物を調製することができることを認識することになる。
【００６７】
ＶＩ．製剤
[090]  記載した化合物、および少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む医薬組成物が提供される。このような医薬組成物を調製する方法は、一般に、担体部分を含み、または含まない記載した化合物、および任意選択により１種または複数の副成分を会合させる工程を含む。記載した化合物および／またはこれを含む医薬組成物は、当業者に公知の従来法によって製剤化して薬学的に許容される剤形にすることができる。一般に、製剤は、記載した化合物を液体担体、もしくは微粉化した固体担体、または両方と均一かつ密接に会合させ、次いで必要であれば、生成物を成形することによって調製される。非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、砂糖、アルコール、アミノ酸、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、製剤を意図されたレシピエントの血液と等張性にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含有し得る、１種または複数の薬学的に許容される滅菌等張性水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液、またはエマルジョン、または使用直前に再構成して滅菌注射用溶液もしくは分散液にすることができる滅菌粉末と組み合わせて、１種または複数の記載した化合物を含む。
【００６８】
[091]  本発明の医薬組成物中に使用することができる適当な水性担体および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適当な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルがある。例えば、レシチンなどのコーティング材を使用することによって、分散液の場合では要求される粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。
【００６９】
[092]  これらの医薬組成物は、補助剤、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤なども含有することができる。記載した化合物に対する微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによって保証され得る。張性を制御するための作用物質、例えば、砂糖、塩化ナトリウムなどを組成物中に含めることが望ましい場合もある。さらに、注射用医薬品形態の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどを含めることによってもたらすことができる。
【００７０】
[093]  いくつかの場合では、薬剤の効果を延ばすために、皮下注射または筋肉内注射からの薬剤の吸収を遅くすることが望ましい。これは、難水溶性を有する結晶性または非晶質材料の液体懸濁液を使用することによって達成することができる。このとき薬剤の吸収速度は、その溶解速度に依存し、これはひいては結晶サイズおよび結晶形に依存し得る。代わりに、非経口投与される薬剤形態の吸収の遅延は、油ビヒクル中に薬剤を溶解または懸濁させることによって達成される。
【００７１】
[094]  例えば、記載した化合物は、固体形態の薬剤を液体で再構成することによって作製される溶液の形態でヒトに送達することができる。この溶液は、注入液、例えば、注射用水、０．９％塩化ナトリウム注射剤、５％デキストロース注射剤、および乳酸加リンガー注射剤などでさらに希釈することができる。再構成され、希釈された溶液は、最大効力で送達するために４〜６時間以内に使用されることが好適である。代わりに、記載した化合物は、錠剤またはカプセルの形態でヒトに送達してもよい。
【００７２】
[095]  注射可能デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で記載した化合物のマイクロカプセル化したマトリックスを形成することによって作製される。薬剤とポリマーの比、および使用される特定のポリマーの性質に応じて、薬剤放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（アンヒドリド）がある。デポー注射用製剤は、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬剤を封入することによっても調製される。
【００７３】
[096]  記載した化合物がヒトおよび動物に医薬品として投与される場合、これらは、単独で、または例えば、医薬として許容可能な担体と組み合わせて０．１〜９９％（より好ましくは１０〜３０％）の活性成分を含有する医薬組成物として与えることができる。他の実施形態では、医薬組成物は、０．２〜２５％、好ましくは０．５〜５％または０．５〜２％の活性成分を含有することができる。これらの化合物は、例えば、皮下注射、皮下デポー、静脈内注射、静脈内注入または皮下注入を含めた任意の適当な投与経路による療法のために、ヒトおよび他の動物に投与することができる。これらの化合物は、大量瞬時投与として迅速に（１分未満以内）、または長時間にわたって（数分、数時間、または数日にわたって）よりゆっくり投与することができる。これらの化合物は、毎日、または複数日にわたって、連続的もしくは断続的に送達してもよい。一実施形態では、化合物は、経皮投与される場合がある（例えば、パッチ、微細針、マイクロ細孔、軟膏、マイクロジェット、またはナノジェットを使用して）。
【００７４】
[097]  選択される投与経路にかかわらず、適当な水和形態で使用され得る記載した化合物および／または医薬組成物は、当業者に公知の従来法によって製剤化して薬学的に許容される剤形にされる。
【００７５】
[098]  医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に有毒であることなく、特定の患者、組成物、および投与方法に対して所望の治療応答を実現するのに有効な活性成分の量を得るように変更することができる。
【００７６】
[099]  選択される投与量レベルは、使用される特定の記載した化合物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与の時間、使用される特定の化合物の排泄率または代謝率、吸収の速度および程度、治療の継続時間、使用される特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物、および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、および前の病歴、ならびに医術で周知の同様の要因を含めた様々な要因に依存することになる。
【００７７】
[100]  当技術分野における通常の技術を有する医師または獣医は、要求される医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師または獣医は、所望の治療効果を実現するのに要求されるレベルより低いレベルで医薬組成物中に使用される記載した化合物の用量から開始し、所望の効果が実現されるまで投与量を徐々に増やすことができる。
【００７８】
[101]  一般に、記載した化合物の適当な一日量は、治療効果を生じさせるのに有効な最低用量である化合物の量となる。このような有効用量は一般に、上述した要因に依存することになる。一般に、患者に対する記載した化合物の静脈内、筋肉内、経皮、脳室内、および皮下用量は、指定された効果に対して使用される場合、１時間当たり、体重１キログラム当たり約１μｇ〜約５ｍｇの範囲となる。他の実施形態では、用量は、１時間当たり、体重１キログラム当たり約５μｇ〜約２．５ｍｇの範囲となる。さらなる実施形態では、用量は、１時間当たり、体重１キログラム当たり約５μｇ〜約１ｍｇの範囲となる。
【００７９】
[102]  必要に応じて、記載した化合物の有効な一日量は、１日を通して適切な間隔で、任意選択により単位剤形で、別個に投与される２、３、４、５、６、またはそれ以上のサブ用量として投与することができる。一実施形態では、記載した化合物は、１日当たり１回の用量として投与される。さらなる実施形態では、化合物は、静脈内または他の経路を通じて連続的に投与される。他の実施形態では、化合物は、毎日より低い頻度、例えば、透析治療と併せて２〜３日毎、毎週、またはより低い頻度などで投与される。
【００８０】
[103]  この治療を受ける対象は、霊長類、特に、ヒト、ならびに他の哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、およびヒツジなど、ならびに一般的に家禽およびペットを含めた、必要のある任意の動物である。
【００８１】
[104]  記載した化合物は、そのまま投与しても、または医薬として許容可能な担体との混合物で投与してもよく、抗微生物剤、例えば、ペニシリン、セファロスポリン、アミノ−グリコシド、および糖ペプチドなどと併せて投与することもできる。したがって、併用療法（conjunctive therapy）には、最初に投与されるものの治療的効果が、後続のものが投与されるとき完全に消滅しないように、活性化合物を連続して、同時に、および別個に投与することが含まれる。
【００８２】
ＶＩＩ．開示した化合物の投与経路
[105]  これらの化合物は、任意の適当な投与経路による療法に対してヒトおよび他の動物に投与することができる。本明細書において、用語である投与の「経路」は、それだけに限らないが、皮下注射、皮下デポー、静脈内注射、静脈内注入もしくは皮下注入、眼内注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、気管内投与、イントラアディポーザル（intraadiposal）投与、関節内投与、クモ膜下投与、硬膜外投与、吸入、鼻腔内投与、舌下投与、頬側投与、直腸投与、膣内投与、槽内投与、および局所投与、経皮投与、または局所的送達を介した投与（例えば、カテーテルもしくはステントによる）を含むことが意図されている。
【００８３】
[106]  体への経皮薬剤送達は、対象への生物学的活性物質の全身送達、特に、タンパク質およびペプチドなどの芳しくない経口生物学的利用能を有する物質の送達にとって望ましく好都合な方法である。経皮経路の送達は、スコポラミンおよびニコチンなどの小さい（例えば、約１，０００ダルトン未満）親油性化合物で特に成功しており、これらは、体内への物質の侵入に対する有効なバリアとして働く、皮膚の角質層外層を貫通することができる。角質層の下は生存表皮であり、これは、血管をまったく含有しないが、いくつかの神経を有する。さらにより深い所は、真皮であり、これは、血管、リンパ管、および神経を含有する。角質層バリアを横切る薬剤は、一般に、真皮内の毛細血管に拡散し、吸収され、全身に分布し得る。
【００８４】
[107]  経皮送達における技術的進歩は、皮膚を横断して、タンパク質およびペプチドなどの親水性高分子量化合物を送達するための当技術分野における必要性に対処することに集中している。一手法では、角質層がもたらすバリアを低減するために、化学的または物理的方法を使用して角質層を破壊する。最小限に侵襲性の技法を使用して、皮膚内にミクロン寸法の輸送経路（マイクロ細孔）（特に、角質層内のマイクロ細孔）を創製する皮膚マイクロポレーション技術は、より最近の手法である。皮膚（角質層）内にマイクロ細孔を創製する技法としては、熱マイクロポレーションまたはアブレーション、微細針アレイ、音波泳動法、レーザーアブレーション、および高周波アブレーションがある（PrausnitzおよびLanger （2008） Nat. Biotechnology 11:1261-68: Aroraら、Int. J. Pharmaceutics、364:227（2008）; Nandaら、Current Drug Delivery、3:233（2006）; Meidanら、American J. Therapeutics、11:312（2004））。
【００８５】
[108]  一実施形態では、モジュレーターペプチドは、マイクロポレーションを介して送達される。マイクロポレーションのいくつかの技法のいずれか１つを企図し、いくつかを簡単に記載する。
【００８６】
[109]  マイクロポレーションは、皮膚の表面を通じて、下にある皮膚層および／または血流中に本明細書に記載のカルシウム様剤を送達するように角質層を破るために、機械的手段および／または外部原動力によって実現することができる。
【００８７】
[110]  第１の実施形態では、マイクロポレーション技法は、下にある表皮を著しく損傷することなく、角質層をアブレートするのに十分な波長、パルス長、パルスエネルギー、パルス数、およびパルス繰り返し率のパルスレーザー光を使用する、皮膚の特定領域内の角質層のアブレーションである。次いでカルシウム様剤が、アブレーションの領域に施される。レーザー誘起応力波（LISW）と呼ばれる別のレーザーアブレーションマイクロポレーション技法は、高出力パルスレーザーによって生成される広帯域、単極、および圧縮性の波を伴う。ＬＩＳＷは、組織と相互作用して角質層内の脂質を破壊し、角質層内に一過性に細胞間チャネルを創製する。角質層内のこれらのチャネルまたはマイクロ細孔により、カルシウム様剤の侵入が可能になる。
【００８８】
[111]  超音波導入または音波泳動法は、超音波エネルギーを使用する別のマイクロポレーション技法である。超音波は、２０ＫＨｚ超の周波数を有する音波である。超音波は、連続的に、またはパルスで印加することができ、様々な周波数および強度の範囲で印加することができる（Nandaら、Current Drug Delivery、3:233（2006））。
【００８９】
[112]  別のマイクロポレーション技法は、微細針アレイを使用する。微細針のアレイは、対象の皮膚領域に適用されるとき、角質層に穴を開け、神経を著しく刺激する、または毛細血管を刺す深さに侵入しない。患者は、調節剤が送達されるマイクロ細孔を生成するために微細針アレイを適用する際に不快感または痛みをまったく感じないか、最小の不快感または痛みを感じる。
【００９０】
[113]  中空または中実の微細針から構成される微細針アレイが企図されており、この場合、調節剤は、針の外面に被覆し、または中空針の内側から投薬することができる。微細針アレイの例は、例えば、Ｎａｎｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、３：２３３（２００６）およびＭｅｉｄａｎら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１１：３１２（２００４）に記載されている。第一世代の微細針アレイは、治療剤で外部から被覆された中実のシリコン微細針から構成されていた。針のマイクロアレイが皮膚に押し付けられ、約１０秒後に取り外されると、体内への針上の作用物質の浸透が容易に実現される。第二世代の微細針アレイは、中実のシリコンもしくは中空のシリコン、ポリカーボネート、チタン、または他の適当なポリマーの微細針で構成され、治療化合物の溶液で被覆され、または満たされていた。より新しい世代の微細針アレイは、生分解性ポリマーから調製されており、この場合、治療剤で被覆された針の先端部は、角質層内に残り、徐々に溶解する。
【００９１】
[114]  微細針は、金属、セラミック、半導体、有機物、ポリマー、および複合材料を含めた様々な材料から構築することができる。構築物の例示的な材料としては、医薬品グレードのステンレス鋼、金、チタン、ニッケル、鉄、スズ、クロム、銅、パラジウム、白金、これらまたは他の金属の合金、シリコン、二酸化ケイ素、およびポリマーがある。代表的な生分解性ポリマーとしては、乳酸およびグリコール酸などのヒドロキシ酸のポリマー、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリラクチド−ｃｏ−グリコリド、ならびにポリ（エチレングリコール）とのコポリマー、ポリアンヒドリド、ポリ（オルト）エステル、ポリウレタン、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ならびにポリ（ラクチド−ｃｏ−カプロラクトン）がある。代表的な非生分解性ポリマーには、ポリカーボネート、ポリエステル、およびポリアクリルアミドが含まれる。
【００９２】
[115]  微細針は、まっすぐな、または先細のシャフトを有することができる。一実施形態では、微細針の直径は、微細針の基端で最大であり、基部の遠位の端で先細になって点になる。微細針は、まっすぐな（先細になっていない）部分および先細の部分の両方を含むシャフトを有するように製作することもできる。針は、先細端部をまったく有さない場合もあり、すなわち、これらは単に、とがっていない、または平らな先端部を有する円柱であってもよい。実質的に均一な直径を有するが、先細になって点になっていない中空微細針は、「マイクロチューブ」と本明細書で呼ばれる。本明細書において、用語「微細針」は、別段の指定のない限り、マイクロチューブおよび先細針の両方を含む。
【００９３】
[116]  電気穿孔は、皮膚内にマイクロ細孔を創製するための別の技法である。この手法では、角質層内に一過性の透過性の孔を創製するために、マイクロ秒またはミリ秒の長さの高電圧電気パルスの印加が使用される。
【００９４】
[117]  他のマイクロポレーション技法には、皮膚内にマイクロチャネルを創製するための電波の使用が含まれる。熱アブレーションは、経皮的に、より大きい分子量の化合物の送達を実現するためのさらに別の手法である。
【００９５】
[118]  本明細書で述べられるすべての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。しかし、特別の定義を含有する特許、特許出願、または刊行物が参照により組み込まれている場合、これらの特別の定義は、これらが見つかる組み込まれた特許、特許出願、または刊行物に適用され、本願の本文、特に、本願の特許請求の範囲に必ずしも適用されないことが理解されるべきであり、この場合では、本明細書に提供される定義が、取って代わるものである。
【００９６】
[119]  以下の実施例は、本発明の実施方法の完全な開示および記述を当業者に提供するように示されており、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定するように意図されていない。数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証する取り組みを行ってきたが、いくらかの誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定のない限り、部は、重量部であり、温度は℃であり、圧力は、大気または大気付近のものである。
【実施例】
【００９７】
実施例１
材料
[120]  細胞培養。線維芽細胞を、以前に記載されたように（Disatnikら、2004、J. Cell Sci.、117:4469-4479）、野生型またはδＰＫＣノックアウトマウス（Robert Messing博士、Gallo Center、UCSFにより提供）から単離し、２０％ウシ胎児血清中で維持した。
【００９８】
[121]  ペプチド合成。Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（CEM Corporation、Matthews、NC、USA）またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（CA、USA）によって、電子レンジを使用してペプチドを合成した。ペプチドを、Ｃｈｅｎら（2001、Chem. Biol.、8:1123-1129）に記載されているように、ジスルフィド結合によってＴＡＴ担体にコンジュゲートし、または１つのポリペプチド：
Ｎ−末端  −  ＴＡＴ  −  スペーサー  −  カーゴ  −  Ｃ−末端
として合成した。
【００９９】
[122]  ペプチドのＣ−末端を、Ｓａｂａｔｉｎｏら（Cur. Opin. in Drug Disc. & Dev.、11:762-770）に記載されているように、Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＡＭ樹脂を使用して修飾してＣ（Ｏ）−ＮＨ２にすることによって安定性を増大させた。ペプチドを、分析用逆相高圧液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）（Shimadzu、MD、USA）およびマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（MALDI）質量分析法（MS）によって分析し、分取ＲＰＨＰＬＣ（Shimadzu、MD、USA）によって精製した。
【０１００】
[123]  線維芽細胞内のＰＫＣ基質リン酸化。ミリストイル化アラニンリッチＣキナーゼ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、ユビキタスＰＫＣ基質のリン酸化を、抗リン酸化ＭＡＲＣＫＳ（Cell Signaling、Danvers、MA）を使用して、総細胞可溶化物のウエスタンブロットによってモニターした。抗ＭＡＲＣＫＳ抗体および抗δＰＫＣ抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Santa Cruz Biotechnology、CA、USA）から得た。
【０１０１】
[124]  虚血／再灌流（I/R）に対するｅｘ  ｖｉｖｏ心保護。急性虚血性心損傷のｅｘ  ｖｉｖｏモデルを使用した。これは、３０分の平衡期間、その後の３０分の広範囲の虚血を伴い、次いでこれに６０分の再灌流が続いた。心臓を１μＭのＴＡＴまたはＴＡＴ−コンジュゲートペプチドで灌流した。正常酸素圧の対照心臓に、虚血にしないで９０分の灌流にかけた。冠流液（coronary effluent）を収集して、再灌流期間の最初の３０分中のクレアチンホスホキナーゼ（CPK）放出を求めた。再灌流期間の最後に、心臓をスライスして厚さ１ｍｍの横断切片にし、塩化トリフェニルテトラゾリウム溶液（TTC、リン酸塩緩衝液中１％、ｐＨ７．４）中で、３７℃で１５分間インキュベートした。梗塞サイズを、危険ゾーン（総LV筋肉量と等価）の百分率として表した（Brandmanら、2007、J. Biol. Chem.、282; 4113-4123; Inagakiら、2003、Circulation、108:869-875に記載された方法）。
【０１０２】
[125]  ウエスタンブロット分析および２Ｄ分析。ラットの心臓を、２１０ｍＭマンニトール、７０ｍＭスクロース、５ｍＭ  ＭＯＰＳ、および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液中でホモジナイズし、その後ミトコンドリア分画を単離し（Churchillら、2008、J. Mol. Cell. Cardiol.、46:278-284に記載）、ＶＤＡＣ（MitoSciences、Eugene、OR、USA）の存在によって同定した。リン酸化および未リン酸化ＪＮＫ１／２のレベルを、それぞれの特異的抗体（Cell Signaling、Danvers、MAおよびSanta Cruz Biotechnology、CA、USA）を使用して、総画分中で分析した。
【０１０３】
[126]  ラットの心臓試料を使用する２−Ｄ  ＩＥＦ／ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を、以前に記載されたように実施した（Chenら、2008、Science、321:1493-1495）。１０％  ＳＤＳゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングを、ＰＤＫ２  ｃ−末端ウサギ（Abgent、CA、USA）、ＰＤＨサブユニットＥ１  αモノクローナル（Invitrogen、CA、USA）、およびＡＬＤＨ２ヤギ（Santa Cruz Biotechnology、CA、USA）の抗体を使用して、標準方法によって実施した。
【０１０４】
[127]  ｉｎ  ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイ。ΨＰＤＫの存在下でのＰＤＫおよびＤｒｐ１リン酸化のレベルを求めるために、δＰＫＣ組換えタンパク質（Invitrogen、CA、USA：２００ｎｇ）を、ペプチドと共に、またはこれを伴わないで１０分間インキュベートし、次いで、組換えＰＤＫ２（Abnova、Taiwan）またはＤｒｐ１（Abnova、Taiwan）１００ｎｇを、少量のＰＫＣ活性化因子、ホスファチジルセリン（PS、１．２５μｇ）、および１，２ジオレオイルｓｎ−グリセロール（DG、０．０４μｇ）の存在下で、５μＣｉ［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（４５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ICN）を含有するキナーゼ緩衝液（２０ｍＭ  Tris-HCl、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μＭ  DTT、２５μＭ  ATP、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）４０μｌ中で、３７℃で２０分にわたって添加した。５％  ＳＤＳを含有するＬａｅｍｍｌｉ緩衝液を添加することによって、キナーゼアッセイを終了し、試料を１０％  ＰＡＧＥ−ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに装填し、リン酸化ＰＤＫ２タンパク質のレベルを、ニトロセルロースに曝露してオートラジオグラフィーにかけることによって求めた。ニトロセルロースも、負荷対照のためにそれぞれの抗体を使用して再プローブした。
【０１０５】
[128]  プロテイナーゼＫ消化。δＰＫＣタンパク質が、Ｉ／Ｒ傷害後にミトコンドリアの内膜に位置しているか、外膜に位置しているかを判定するために、本発明者らは、３０分の虚血、その後６０分の再灌流にかけた心臓から、上述したようにミトコンドリアを単離した。それぞれのミトコンドリア抽出物（２００μｇ）を、５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ストック濃度２０ｍｇ／ｍｌ、Invitrogen、CA、USA）で処理した。５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）を添加することによって消化を停止した。等量のタンパク質を、１０％  ＳＤＳゲルに装填し、δＰＫＣならびにＭＦＮ１（ミトコンドリア外マーカー（outer mitochondrial marker））およびＡＬＤＨ２（ミトコンドリアマトリックスマーカー）についてプローブした。δＰＫＣがプロテイナーゼＫ消化に感受性であることを判定するために、ミトコンドリア分画を１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で可溶化し、同じアッセイで対照として使用した。
【０１０６】
[129]  ヒト組換えδＰＫＣ（Invitrogen、CA、USA；５０ｎｇ；０．６２５ｐｍｏｌｅ）を、ΨＰＤＫ（ＴＡＴとコンジュゲートされていない、１ｎｍｏｌ）と共にインキュベートした後、１μＭ  ＤＴＴを含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中のプロテイナーゼＫ（０．０５μｇ／ｍｌ）を添加した。５ｍＭ  ＰＭＳＦを添加することによって指示された通り反応を停止した。
【０１０７】
[130]  統計的方法。データを平均±標準誤差として表す。対応のない検定を使用して、２群間の統計的差異（ｐ＜０．０５）を明確にした。
【０１０８】
実施例２
δＰＫＣとＰＤＫの間の相同性に基づくペプチドの合理的な設計
[131]  対応するＰＫＣ相互作用タンパク質と相同である各ＰＫＣ上の偽基質部位（Houseら、1987、Science、238:1726-1728）および疑似ＲＡＣＫ部位（Dornら、1999、Proc. Natl. Acad. Sci.、96:12798-12803; Ronら、1995、Proc. Natl. Acad. Sci.、92:492-496）と同様に、δＰＫＣ中にＰＤＫ様配列がある可能性があると推論された。Ｌａｌｉｇｎ（Huangら、1991、Adv. appl. Math.、12:337-357）を使用する配列相同性検索により、δＰＫＣ中の配列（ALSTE、アミノ酸35-39；図１Ｂ）とほとんど同一である、ＰＤＫ中の５アミノ酸ストレッチ（ALSTD；アミノ酸391-395）が同定された。興味深いことに、ＰＤＫ構造中のＡＬＳＴＤ配列は、タンパク質間相互作用に利用可能な露出領域内に位置している（図１Ｂ）。タンパク質間相互作用に極めて重要である配列の同定について確立された基準の１つは、これらの進化の保全である（Souroujonら、1998、Nat. Biotechnol.、16:919-924; Qvitら、2010、Drug Disc. Today: Dis. Mech.、7:e87-e93）。δＰＫＣおよびＰＤＫ中のＡＬＥＳＴＥ／Ｄ配列は、δＰＫＣアイソザイム（図１Ｃ、Ｄ）を有するすべての種において保全されている。上記原理によって支持されて、δＰＫＣを欠く種では、配列は、追加の負電荷を含有し（例えば、ショウジョウバエ、図１Ｄ）、または全体で欠損している（例えば、虫および酵母；図１Ｄ、下）。
【０１０９】
[132]  予想外に、ＡＬＳＴＥは、δＰＫＣのＣ２ドメイン内に見つかる。このドメインは、ＰＫＣのタンパク質間相互作用において極めて重要であり（Smithら、1992、Biochem. biophys. Res. Commun、188:1235-1240; Johnsonら、1996、J. Biol. Chem.、271:24962-24966; Brandmanら、2007、J. Biol. Chem.、282:4113-4123）、アイソザイム特異的阻害物質（例えば、εv1-2、δV1-1、およびθV1-2；図１Ｅ）ならびに活性化因子（ΨεRACK、ΨδRACK、およびΨθRACK；図１Ｅ）を含有することが既に判明していた。重要なことに、ＡＬＳＴＥは、εＰＫＣまたはθＰＫＣ（θPKCは、δPKCとほとんど相同のアイソザイムである）中に見つからない（Baierら、1993、J. Biol. Chem.、268:4997-5004、図１Ｅ）。δＰＫＣ中のＡＬＳＴＥは、θＰＫＣ中にも見つかるユニークなβヘアピンの一部であり、εＰＫＣを含めた他のＰＫＣアイソザイムでは欠損している（図１Ｆ、囲まれた範囲）。
【０１１０】
[133]  この配列が、ＰＤＫのδＰＫＣレギュレーションに関与しているか否かを判定するために、対応するペプチドを合成した。タンパク質間相互作用の生物学的に活性なペプチド阻害物質の最小の長さは、６アミノ酸であり得ることが以前に観察されていたので、本発明者らは、１個のアミノ酸、ＲによってＡＬＳＴＥを伸長した（ALSTER、配列番号：２）。このペプチドをΨＰＤＫと本明細書で呼ぶ。δＰＫＣ中のβヘアピン（図１Ｅ〜Ｆ、囲まれた範囲）を完成するδＶ１−５ペプチドを、対照ペプチド（GKTLVQ、配列番号：４）として合成した。細胞内へのペプチドの送達を促進するために、ペプチドを、調節ペプチドまたは対照ペプチドのそれぞれのＣ−末端に位置したシステイン残基と担体ペプチドとの間でジスルフィド結合を介してＴＡＴ由来細胞透過性ペプチド、ＴＡＴ４７−５７（配列番号：３３）にコンジュゲートした（図２Ａ）。
【０１１１】
実施例３
ΨＰＤＫは、δＰＫＣに特異的である：培養線維芽細胞における試験
[134]  ΨＰＤＫ配列は、ＰＤＫ、およびＰＤＫ同族タンパク質、δＰＫＣの両方に見つかる。したがって、ΨＰＤＫは、阻害性分子内相互作用を模倣すると予測された。ΨδＲＡＣＫと同様に、ΨＰＤＫは、ＰＤＫおよびδＰＫＣの阻害性相互作用と競合し、δＰＫＣ媒介機能を増大させるはずである（図１Ａ）。ミリストイル化アラニンリッチＣ−キナーゼ基質（MARCKS）のリン酸化を、ＰＫＣ活性のマーカーとして使用した（Disatnikら、2004、J. Cell. Sci.、117:4469-4479）。２０％血清（活性化のためにＰＫＣを刺激する（Disatnikら、2004、J. Cell. Sci.、117:4469-4479））を含有する培地中で培養した細胞を、ΨＰＤＫ（図２Ａ）またはδＶ１−５（細胞内へのこれらの送達を促進するために、それぞれをＴＡＴ４７−５７とコンジュゲートした）と共にインキュベートすると、対照ペプチドと比べてＭＡＲＣＫＳリン酸化が増大した（図２Ｃ、左）。陽性対照として使用したＰＫＣまたはΨδＲＡＣＫの強力な活性化因子であるホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（PMA）も、ＭＡＲＣＫＳリン酸化を増大させた（図２Ｃ、右）。δＰＫＣに対するペプチドの選択性を判定するために、δＰＫＣノックアウトマウスに由来する線維芽細胞も使用した。δＶ１−５は、これらの細胞内でＭＡＲＣＫＳリン酸化を増大させた一方、ΨＰＤＫは、δＰＫＣを欠く細胞内でＭＡＲＣＫＳリン酸化に影響しなかった（図２Ｄ、２Ｄの挿入図）。これらのデータは、δＰＫＣ誘導ペプチド、ΨＰＤＫおよびδＶ１−５は、ＭＡＲＣＫＳのδＰＫＣリン酸化の活性化因子であるが、ΨＰＤＫのみがδＰＫＣに特異的であり、δＶ１−５はおそらく、複数のＰＫＣアイソザイムに影響することを実証する。
【０１１２】
実施例４
ΨＰＤＫは、ＩＮ  ＶＩＴＲＯで、δＰＫＣによるＰＤＫリン酸化を特異的に阻害する
[135]  ΨＰＤＫは、δＰＫＣ中のＰＤＫ様配列に由来するので（図１Ｂ）、このペプチドは、ＰＤＫのδＰＫＣリン酸化に選択的な競合性阻害物質として作用するはずであることが推論された。この仮説を直接試験するために、δＰＫＣがＰＤＫをリン酸化する能力が判定されるｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイを使用した。ΨＰＤＫは、ＰＤＫのδＰＫＣリン酸化を約３０％阻害した一方、対照ペプチドは阻害しなかった（図３Ａ）。ＰＤＫに対するΨＰＤＫの選択性を、別のδＰＫＣ基質であるＤｒｐ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏリン酸化を検査することによって判定し（Qiら、2010、Mol. Biol. Cell.、22:256-265）、ΨＰＤＫは、Ｄｒｐ１リン酸化に影響しないことが判明した（図３Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ΨＰＤＫは、δＰＫＣによるＰＤＫリン酸化の特異的阻害物質であることを示唆する。図３Ｃは、ΨＰＤＫがδＰＫＣに直接結合することを実証し、その理由は、このペプチドは、タンパク質分解に対するδＰＫＣの感度を変化させたためである。プロテイナーゼＫ（PK）アッセイでは、ヒト組換えタンパク質δＰＫＣは、ペプチド無しまたは対照ペプチド、ΨδＲＡＣＫと比較して、ΨＰＤＫの存在下でＰＫ消化に対してより安定であることが示された。δＰＫＣのＰＫ分解に対するΨＰＤＫ誘導耐性は、特異的であった。ＰＫによるタンパク質分解に対するεＰＫＣまたはβＩＰＫＣの感度は、ΨＰＤＫの存在によって影響されなかった。
【０１１３】
実施例５
ΨＰＤＫは、虚血および再灌流（I/R）を受けたインタクトな心臓において、δＰＫＣのミトコンドリア内へのトランスロケーションを増大させる
[136]  δＰＫＣによるミトコンドリアＰＤＫのリン酸化は、心筋梗塞後のみで起こる。これらの条件下で、δＰＫＣは、ミトコンドリア内にトランスロケートし（Churchillら、2005、Circ. Res.、97:78-85）、そこでこれは、ＰＤＫへのアクセスを有する。したがって、ΨＰＤＫペプチドがミトコンドリア内へのδＰＫＣのトランスロケーションに影響するか否かを最初に判定した。心筋梗塞を模倣する虚血および再灌流（I/R）条件の後（図４Ａ）、対照ペプチドで処置した心臓と比較して、心臓をΨＰＤＫで処置したとき、ミトコンドリアとのδＰＫＣの会合が２倍増加した（図４Ｂ）。本発明者らは、ΨＰＤＫは、正常酸素圧条件下では、ミトコンドリアへのδＰＫＣのトランスロケーションを誘導しないことも見出した。δＰＫＣが、ΨＰＤＫで処置した後にミトコンドリアに入るか否かを判定するために、上記インタクトな心臓ミトコンドリアをプロテイナーゼＫ処置にかけた。外膜タンパク質、ミトフュージョン１（MFN1）は、完全に分解された（図４Ｃ、下のパネル）。しかし、ミトコンドリアマトリックスタンパク質、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH2）と同様に、δＰＫＣの大部分は、ＰＫによるタンパク質分解に非感受性であった（図４Ｃ；図４Ｄで定量化）。これらのデータは、ΨＰＤＫは、ミトコンドリア内へのＩ／Ｒ誘導δＰＫＣ侵入を増大させたことを示す。
【０１１４】
実施例６
ΨＰＤＫは、Ｉ／Ｒ後のδＰＫＣ基質、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼのリン酸化を選択的に阻害する
[137]  上述したように、心虚血および再灌流後のＰＤＫのδＰＫＣリン酸化により、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（PDH）がリン酸化し、その活性が低下する（Churchillら、2005、Circ. Res.、97:78-85）。したがって、ＰＤＫがＰＤＨをリン酸化すると、ＴＣＡサイクルおよびＡＴＰ産生に要求されるアセチルＣｏＡ産生が低減する（図５Ａ）。ΨＰＤＫは、δＰＫＣ中のＰＤＫ相同配列に由来するので、次に、ＰＤＫリン酸化がΨＰＤＫ処置によって影響されるか否かを判定した。以前に報告されたように（Churchillら、2005、Circ. Res.、97:78-85）、２次元等電点電気泳動法（2-D IEF）を使用して、心臓Ｉ／Ｒにより、ＰＤＫ２のリン酸化が増大し（図５Ｂ：矢印）、引き続いてＰＤＨのＥ１サブユニットがリン酸化する（図５Ｃ；矢印）ことが判明した。しかし、これらの２つの酵素のリン酸化（2-D IEF分析による酸性ｐＨへのシフトによって示される）は、ΨＰＤＫの存在下でも、δＶ１−１、δＰＫＣ特異的阻害物質の存在下でも起こらなかった（図５Ｂ〜Ｃ）（Chenら、2001、Proc. Natl. Acad. Sci.、98:11114-11119）。
【０１１５】
[138]  ΨＰＤＫ阻害が、ミトコンドリア内部の場合のδＰＫＣ媒介リン酸化に選択的であるか否かを判定するために、アルデヒドデヒドロゲナーゼ２（ALDH2）、εＰＫＣ選択的ミトコンドリア基質のリン酸化状態（Chenら、2008、Science、321: 1493-1495）も検査した。アイソザイム特異的ペプチドレギュレーターについて予想されたように、ΨＰＤＫもδＶ１−１もＡＬＤＨ２リン酸化に影響せず（図５Ｄ）、δＰＫＣに対するこのペプチドの選択的効果を実証した。
【０１１６】
[139]  最後に、同じ心臓Ｉ／Ｒ条件下で、ΨＰＤＫは、膜結合基質、ＭＡＲＣＫＳのリン酸化を阻害せず、むしろ、Ｉ／Ｒ誘導ＭＡＲＣＫＳリン酸化の増大が、対照ペプチドと比較して、ΨＰＤＫの存在下で観察された。さらに、ΨＰＤＫは、Ｉ／Ｒを受けたこれらの心臓においてＤｒｐ１リン酸化も増大させた（図５Ｅ）。まとめると、これらのデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイと同様に（図３Ａ）、ΨＰＤＫは、ミトコンドリアにおいてＰＤＫリン酸化の阻害物質として作用したことを示す。重要なことに、ΨＰＤＫは、同じ条件下で他の細胞内コンパートメント内の他のδＰＫＣ基質のリン酸化に影響しなかった（図３Ｂ、５Ｅ）。
【０１１７】
実施例７
ΨＰＤＫペプチド処置により、心発作のｅｘ  ｖｉｖｏモデルにおいて心臓保護が誘導される
[140]  ΨＰＤＫは、ＰＤＫのδＰＫＣ媒介リン酸化を阻害したが、他のδＰＫＣ基質のリン酸化を阻害しなかったので、心虚血および再灌流傷害におけるδＰＫＣ媒介ΨＰＤＫリン酸化の役割を次に判定した。ランゲンドルフ標本（Langendorff、1895、Pfilgers Archiv、61:291-382; Hondeghemら、1978、Amer. J. Physiol.、235:H574-H580）を使用して、δＰＫＣを活性化すると、心筋の虚血性傷害が増大することが以前に判明した（Chenら、2001、Proc. Natl.、Acad.、Sci. 98:11114-11119）。ＰＤＫリン酸化がδＰＫＣ媒介機能に決定的である場合、他のδＰＫＣ基質のリン酸化に影響することなくＰＤＫリン酸化を選択的に阻害するΨＰＤＫは、Ｉ／Ｒ誘導傷害から心筋を保護することが予想される。
【０１１８】
[141]  ３つの基準を使用して、ΨＰＤＫで処置すると、対照ペプチドと比較して、Ｉ／Ｒ後の心保護が誘導されることが確認された（図６）。第１に、ΨＰＤＫまたはδＶ１−１で処置した後のＩ／Ｒ誘導梗塞サイズ（Inagakiら、2003、Circulation、108:869-875）は、対照ペプチド、またはΨδＲＡＣＫ、δＰＫＣ特異的活性化因子、またはδＶ１−５で処置した心臓におけるものより小さかった（図６Ａ）。第２に、心筋梗塞のマーカーとして放出されたクレアチンホスホキナーゼ（CPK）のレベルを求める際、同様のデータが得られた。ΨＰＤＫまたはδＶ１−１で処置した心臓におけるＣＰＫレベルは同様であり、対照ペプチド、ΨδＲＡＣＫ、またはδＶ１−５で処置した後のものより低かった（図６Ｂ）。最後に、細胞ストレスおよびアポトーシスの公知のマーカーである、ＪＮＫタンパク質リン酸化のレベル（Davisら、2000、Cell、103:239-252）を求めた。δＶ１−１およびΨＰＤＫは、他のδＰＫＣ−誘導ペプチド、δＶ１−５およびΨδＲＡＣＫと比較して、Ｉ／Ｒ誘導ＪＮＫリン酸化を低減した（図６Ｃおよび６Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＰＤＫリン酸化の選択的阻害剤であるΨＰＤＫは、Ｉ／Ｒ傷害を阻害するのに十分であったことを示す。
【０１１９】
[142]  ΨＰＤＫは、Ｎ−末端上のＴＡＴとＣ−末端上のカーゴとの間に３アミノ酸（GSG）のスペーサーを含む、アミド結合によってＴＡＴに接続された単一ポリペプチドとしても合成した（ΨPDK-GSG-TATと呼ぶ）。興味深いことに、これらの条件下で、ΨＰＤＫ−ＧＳＧ−ＴＡＴ（配列番号：４１）は、δＰＫＣ活性の指標としてＭＡＲＣＫＳリン酸化を使用する場合、ΨＰＤＫ−Ｃｓ−ｓＣ−ＴＡＴと比較して、より有効なδＰＫＣレギュレーターであることが判明した（図７）。これは、ΨＰＤＫ−Ｃｓ−ｓＣ−ＴＡＴ放出性ペプチドと比べて、細胞内へのΨＰＤＫ−ＧＳＧ−ＴＡＴ（配列番号：４１）の送達が改善されていることに起因し得るが、このことは、まだ決定されていない。さらに、ＴＡＴ−ＧＳＧ−ΨＰＤＫ（線形ポリペプチド、図２Ｂ、配列番号：４２）は、より心保護的であることが示された。これは、４５％の保護（放出性ペプチドによって誘導される）から７３％の保護までＩ／Ｒ傷害からの保護を大いに増大させた（n=6）。
【０１２０】
[143]  δＰＫＣ中のＰＤＫ関連配列は、ＰＤＫ中のものと同一（またはほとんど同一）であることが意外にも判明した（図１Ｂ、Ｄ）。これにより、配列ＡＬＳＴＥ（配列番号：１）のいくつかのアミノ酸またはすべてのアミノ酸の極めて重要な役割が示唆された。このペプチドの効果に対するアミノ酸のそれぞれの寄与の判定を始めるために、アラニンスキャニングを使用した（Brunelら、2006、J. Virol.、80:1680-1687; Chenら、J. Pep. Res.、2000、56:147-156; Bremsら、1992、Prot. Eng.、5:527-533）（個々のアミノ酸をアラニンと置換する）。次いで、得られたΨＰＤＫペプチド類似体を、心外傷のマーカーとしてＣＰＫ放出およびＪＮＫリン酸化を使用して、心筋梗塞の同じモデルで使用した。灌流液中へのＣＰＩ放出および心臓内のｐＪＮＫを、それぞれのペプチドの存在下でＩ／Ｒ後に求め、対照ペプチドの存在下でＩ／Ｒにかけられた心臓内のレベルと比較した。置換を有するペプチドのいずれも、いずれの有意な生物活性も有していなかった（表１）。さらに、ＡＬＳＴＥＲ中のＳおよびＴは、δＰＫＣのコンセンサス配列に相当しないが、合成中にＳ／Ｔをリン酸化Ｓ／Ｔ（それぞれS（p）およびT（p）として表１に表した）と置換すると、ペプチドの生物活性が変化するか否かを次に判定した。リン酸化ペプチド（p197、198、199）のいずれも、ｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｉ／Ｒモデルにおいて心保護に影響しなかった（表１を参照）。したがって、ＡＬＳＴＥＲペプチドのみが、表１に記載の他のペプチド配列と比較して心保護作用を発揮することが観察され、δＰＫＣとの相互作用におけるこれらのアミノ酸の側基のそれぞれの役割と一致した。
【０１２１】
【表１】
2014529592.tif 000002
【図１Ａ】
2014529592.tif 000003
【図１Ｂ】
2014529592.tif 000004
【図１Ｃ】
2014529592.tif 000005
【図１Ｄ】
2014529592.tif 000006
【図１Ｅ】
2014529592.tif 000007
【図１Ｆ】
2014529592.tif 000008
【図１Ｇ】
2014529592.tif 000009
【図２Ａ】
2014529592.tif 000010
【図２Ｂ】
2014529592.tif 000011
【図２Ｃ】
2014529592.tif 000012
【図２Ｄ】
2014529592.tif 000013
【図３Ａ】
2014529592.tif 000014
【図３Ｂ】
2014529592.tif 000015
【図３Ｃ】
2014529592.tif 000016
【図３Ｄ】
2014529592.tif 000017
【図４Ａ】
2014529592.tif 000018
【図４Ｂ】
2014529592.tif 000019
【図４Ｃ】
2014529592.tif 000020
【図４Ｄ】
2014529592.tif 000021
【図５Ａ】
2014529592.tif 000022
【図５Ｂ】
2014529592.tif 000023
【図５Ｃ】
2014529592.tif 000024
【図５Ｄ】
2014529592.tif 000025
【図５Ｅ】
2014529592.tif 000026
【図６Ａ】
2014529592.tif 000027
【図６Ｂ】
2014529592.tif 000028
【図６Ｃ】
2014529592.tif 000029
【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
2014529592.tif 000031
【図７】
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【図８】
2014529592.tif 000033
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014529592.tif 000035
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