(57)【要約】  本発明は、抗癌剤を同定するために、ＥＭＴ過程のモデルとして使用するための腫瘍細胞調製物であって、受容体リガンドにより刺激されてＥＭＴを誘導するか、または、ＥＭＴを促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株ＩＩ３５８の細胞を含む腫瘍細胞調製物を提供する。また、本発明は、このような腫瘍細胞調製物を用いて、ＥＭＴを抑制する作用剤、ＭＥＴを促進する作用剤、または間葉系様細胞の増殖を抑制する作用剤を同定することにより抗癌剤候補を同定する方法も提供する。このような作用剤は、ＥＭＴを起こした腫瘍細胞を抑制するのにはあまり有効ではないと考えられている他の抗癌薬、例えば、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−ＩＲキナーゼ阻害剤と併用すると特に有用なはずである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞が上皮から間葉系へ転換することを阻害する作用剤を同定する方法であって、
上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、
該試料を、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させること、
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていないＨ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、試料内の腫瘍細胞が上皮から間葉系へ転換することを阻害するか否かを判定すること、
およびその結果、該被験作用剤が、腫瘍細胞が上皮から間葉系へ転換することを阻害する作用剤であるか否かを判定すること
を含む方法。
【請求項２】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ受容体、ＴＧＦβ受容体ＩＩ、ＴＮＦ受容体、またはＩＬ−４受容体に結合し活性化するタンパク質リガンドのいずれかから選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−４、ＴＧＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピレグリン、エピジェン、ＴＮＦβ、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２、ＴＧＦβ−３、ＴＧＦβヘテロ二量体、またはＩＬ−１３から選択される、請求項２の方法。
【請求項４】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、またはＩＬ−４から選択される、請求項３の方法。
【請求項５】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭのこの受容体への結合によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する受容体に結合するタンパク質リガンド、それに加えて、チロシンキナーゼ受容体に結合して、ＨＧＦがこの受容体に結合することによって活性化される同じシグナル伝達経路を活性化する一つのリガンドである、請求項１の方法。
【請求項６】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭに結合して、これを活性化する一つのリガンド、それに加えて、ＩＧＦ１−Ｒ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦ受容体のヘテロ二量体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−４、ＨＥＲ受容体のヘテロ二量体、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲαα、ＰＤＧＦＲββ、またはＰＤＧＦＲαβに結合して、これを活性化する一つのリガンドである、請求項５の方法。
【請求項７】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭと、それに加えて、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＭＳＰ、ＴＧＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピレグリン、エピジェン、ヘレグリン、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、またはＰＤＧＦ−ＤＤである、請求項６の方法。
【請求項８】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである、請求項７の方法。
【請求項９】
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーが、上皮細胞バイオマーカーである、請求項１の方法。
【請求項１０】
上皮細胞バイオマーカーが、Ｅ−カドヘリン、ＣＤＨ１プロモーター活性、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、Ｐ−カドヘリン、またはｅｒｂ３である、請求項９の方法。
【請求項１１】
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーが、間葉系細胞バイオマーカーである、請求項１の方法。
【請求項１２】
間葉系細胞バイオマーカーが、ビメンチン、フィブロネクチン、Ｎ−カドヘリン、ＣＤＨ１メチル化、ｚｅｂ１、ｔｗｉｓｔ、ＦＯＸＣ２、またはｓｎａｉｌである、請求項１１の方法。
【請求項１３】
上皮から間葉系へ転換を起こした腫瘍細胞を阻害する作用剤を同定する方法であって、
上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を誘導すること、
該細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、
被験作用剤が、間葉系様Ｈ３５８細胞の増殖を阻害するか否かを判定すること、
およびその結果、該被験作用剤が、上皮から間葉系へ転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤であるか否かを判定すること
を含む方法。
【請求項１４】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ受容体、ＴＧＦβ受容体ＩＩ、ＴＮＦ受容体、またはＩＬ−４受容体に結合し活性化するタンパク質リガンドのいずれかから選択される、請求項１の方法。
【請求項１５】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦα、ＩＬ−４、ＴＧＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピレグリン、エピジェン、ＴＮＦβ、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２、ＴＧＦβ−３、ＴＧＦβヘテロ二量体、またはＩＬ−１３から選択される、請求項１４の方法。
【請求項１６】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、またはＩＬ−４から選択される、請求項１５の方法。
【請求項１７】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭのこの受容体への結合によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する受容体に結合するタンパク質リガンド、それに加えて、チロシンキナーゼ受容体に結合して、ＨＧＦがこの受容体に結合することによって活性化される同じシグナル伝達経路を活性化する一つのリガンドである、請求項１３の方法。
【請求項１８】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭに結合して、これを活性化する一つのリガンド、それに加えて、ＩＧＦ１−Ｒ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦ受容体のヘテロ二量体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−４、ＨＥＲ受容体のヘテロ二量体、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲαα、ＰＤＧＦＲββ、またはＰＤＧＦＲαβに結合して、これを活性化する一つのリガンドである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭと、それに加えて、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＭＳＰ、ＴＧＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピレグリン、エピジェン、ヘレグリン、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、またはＰＤＧＦ−ＤＤである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである、請求項１９の方法。
【請求項２１】
被験作用剤が、上皮から間葉系へ転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害するか否かを判定する工程の後に、さらに、
間葉系様Ｈ３５８腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤が、上皮様Ｈ３５８腫瘍細胞の増殖も阻害するか否かを判定する工程、
およびその結果、該被験作用剤が、上皮から間葉系へ転換を起こした腫瘍細胞の増殖を特異的に阻害する作用剤であるか否かを判定する工程
を含む、請求項１３の方法。
【請求項２２】
被験作用剤が、間葉系様Ｈ３５８腫瘍細胞の増殖を阻害するか否かを判定する工程において、被験作用剤が、該腫瘍細胞のアポトーシスを促進することによって、このような阻害をすると判定される、請求項１３の方法。
【請求項２３】
被験作用剤が、間葉系様Ｈ３５８腫瘍細胞の増殖を阻害するか否かを判定する工程において、被験作用剤が、該腫瘍細胞の増殖を阻害することによって、このような阻害をすると判定される、請求項１３の方法。
【請求項２４】
間葉系様腫瘍細胞が間葉から上皮への転換を起こすのを促進する作用剤を同定する方法であって、
上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞において、上皮−間葉転換を誘導すること、
該細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていない間葉系様Ｈ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう試料内の間葉系様Ｈ３５８細胞を刺激するか否かを判定すること、
およびその結果、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう間葉系様腫瘍細胞を刺激する作用剤であるか否かを判定すること
を含む方法。
【請求項２５】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ受容体、ＴＧＦβ受容体ＩＩ、ＴＮＦ受容体、またはＩＬ−４受容体に結合し、これを活性化するタンパク質リガンドのいずれかから選択される、請求項２４の方法。
【請求項２６】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−４、ＴＧＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピレグリン、エピジェン、ＴＮＦβ、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２、ＴＧＦβ−３、ＴＧＦβヘテロ二量体、またはＩＬ−１３から選択される、請求項２５の方法。
【請求項２７】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、またはＩＬ−４から選択される、請求項２６の方法。
【請求項２８】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭのこの受容体への結合によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化させる受容体に結合するタンパク質リガンド、それに加えて、チロシンキナーゼ受容体に結合して、ＨＧＦがこの受容体に結合することによって活性化される同じシグナル伝達経路を活性化する一つのリガンドである、請求項２４の方法。
【請求項２９】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭに結合して、これを活性化する一つのリガンド、それに加えて、ＩＧＦ１−Ｒ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦ受容体のヘテロ二量体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−４、ＨＥＲ受容体のヘテロ二量体、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲαα、ＰＤＧＦＲββ、またはＰＤＧＦＲαβに結合して、これを活性化する一つのリガンドである、請求項２８の方法。
【請求項３０】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭと、それに加えて、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＭＳＰ、ＴＧＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピレグリン、エピジェン、ヘレグリン、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、またはＰＤＧＦ−ＤＤである、請求項２９の方法。
【請求項３１】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである、請求項３０の方法。
【請求項３２】
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーが、上皮細胞バイオマーカーである、請求項２４の方法。
【請求項３３】
上皮細胞バイオマーカーが、Ｅ−カドヘリン、ＣＤＨ１プロモーター活性、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、Ｐ−カドヘリン、またはｅｒｂ３である、請求項３２の方法。
【請求項３４】
この量が前記試料腫瘍細胞の前記ＥＭＴ状態を示すものである前記バイオマーカーが、間葉系細胞バイオマーカーである、請求項２４の方法。
【請求項３５】
間葉系細胞バイオマーカーが、ビメンチン、フィブロネクチン、Ｎ−カドヘリン、ＣＤＨ１メチル化、ｚｅｂ１、ｔｗｉｓｔ、ＦＯＸＣ２、またはｓｎａｉｌである、請求項３４の方法。
【請求項３６】
上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する化合物を含む組成物を調製する方法であって、
上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料をスクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、
該試料を、該試料を、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させること、
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていないＨ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、試料内の腫瘍細胞が上皮から間葉系への転換を起こすことを阻害するか否かを判定すること、
およびその結果、該被験作用剤が、腫瘍細胞が上皮から間葉への転換を起こすのを阻害する作用剤であるか否かを判定すること、
および同定された被験作用剤を担体と混合して、前記組成物を調製すること
を含む方法。
【請求項３７】
上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する化合物を含む組成物を調製する方法であって、
上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を誘導すること、
該試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、
該被験作用剤が、間葉系様Ｈ３５８細胞の増殖を阻害するか否かを判定すること、
その結果、該被験作用剤が、上皮から間葉への転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤であるか否かを判定すること、
およびこうして同定された被験作用剤を担体と混合して、前記組成物を調製すること
を含む方法。
【請求項３８】
上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する化合物を含む組成物を調製する方法であって、
皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を誘導すること、
該試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていない間葉系様Ｈ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう試料内の間葉系様Ｈ３５８細胞を刺激するか否かを判定すること、
およびその結果、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう間葉系様腫瘍細胞を刺激する作用剤であるか否かを判定すること、
およびこうして同定された被験作用剤を担体と混合して、前記組成物を調製すること
を含む方法。
【請求項３９】
抗癌剤の同定に使用するための間葉系様腫瘍細胞調製物であって、前記腫瘍細胞調製物は
上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一もしくは二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を誘導することを含む方法によって調製され、
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ受容体；ＴＧＦβ受容体ＩＩ；ＴＮＦα受容体；またはＩＬ−４受容体に結合し、これを活性化するタンパク質リガンドのいずれかから選択され、ならびに
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭのこの受容体への結合によって活性化されるシグナル伝達経路を活性化させる受容体に結合するタンパク質リガンド、それに加えて、チロシンキナーゼ受容体に結合して、ＨＧＦがこの受容体に結合することによって活性化される同じシグナル伝達経路を活性化する一つのリガンドである
細胞調製物。
【請求項４０】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ−４、ＴＧＦα、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピレグリン、エピジェン、ＴＮＦβ、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２、ＴＧＦβ−３、ＴＧＦβヘテロ二量体、またはＩＬ−１３から選択される、請求項３９の細胞調製物。
【請求項４１】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＮＦα、またはＩＬ−４から選択される、請求項４０の細胞調製物。
【請求項４２】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭに結合して、これを活性化する一つのリガンド、それに加えて、ＩＧＦ１−Ｒ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦ受容体のヘテロ二量体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−４、ＨＥＲ受容体のヘテロ二量体、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＰＤＧＦＲαα、ＰＤＧＦＲββ、またはＰＤＧＦＲαβに結合して、これを活性化する一つのリガンドである、請求項３９の細胞調製物。
【請求項４３】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭと、それに加えて、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＭＳＰ、ＴＧＦ−α、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピレグリン、エピジェン、ヘレグリン、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、またはＰＤＧＦ−ＤＤである、請求項４２の細胞調製物。
【請求項４４】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである、請求項４３の細胞調製物。
【請求項４５】
腫瘍細胞が上皮から間葉系へ転換することを阻害する作用剤を同定する方法であって、
Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、
該試料を、改変されたＨ３５８細胞において上皮から間葉系への転換を促進する該タンパク質の発現を誘導する化合物と接触させること、
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていない改変されたＨ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、試料内の腫瘍細胞が上皮から間葉系へ転換することを阻害するか否かを判定すること、
およびその結果、該被験作用剤が、腫瘍細胞が上皮から間葉系へ転換することを阻害する作用剤であるか否かを判定すること
を含む方法。
【請求項４６】
誘導的に発現されて、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質が、Ｚｅｂ−１；Ｓｎａｉｌ；恒常活性型ＴＧＦβ；同時発現されるＨＧＦおよびＯＳＭ；ＴＮＦα；恒常活性型ｃＭＥＴ受容体；活性化Ｓｒｃキナーゼ；ｖ−Ｓｒｃ；Ｓｒｃ  Ｙ５３０Ｆ変異体；ＩＬ−４；ＩＬ−１３；ＥＧＦ；ＴＧＦ−α；ＨＢ−ＥＧＦ；アンフィレグリン；ベタセルリン；エピレグリン；エピジェン；またはＴＮＦβである、請求項４５の方法。
【請求項４７】
誘導的に発現されて、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質が、Ｚｅｂ−１、Ｓｎａｉｌ、または恒常活性型ＴＧＦβである、請求項４６の方法。
【請求項４８】
Ｔｅｔ−制御プロモーターを用いて、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質を誘導的に発現させる、請求項４５の方法。
【請求項４９】
Ｔｅｔ−制御プロモーターがＴｅｔ−ｏｎ系である、請求項４８の方法。
【請求項５０】
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーが、上皮細胞バイオマーカーである、請求項４５の方法。
【請求項５１】
上皮細胞バイオマーカーが、Ｅ−カドヘリン、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、Ｐ−カドヘリン、またはｅｒｂＢ３である、請求項５０の方法。
【請求項５２】
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものである上皮細胞バイオマーカーが、上皮細胞バイオマーカー遺伝子プロモーターである、請求項４５の方法。
【請求項５３】
上皮細胞バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物を改変Ｈ３５８細胞の中に含ませて、該プロモーターレポーター活性を、レポーター遺伝子の量または活性で観察することができるようにすることによって、上皮細胞バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性を評価する、請求項５２の方法。
【請求項５４】
上皮バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物が、Ｅ−カドヘリンプロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物である、請求項５３の方法。
【請求項５５】
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーが、間葉系細胞バイオマーカーである、請求項４５の方法。
【請求項５６】
間葉系細胞バイオマーカーが、ビメンチン、フィブロネクチン、Ｎ−カドヘリン、ＣＤＨ１メチル化、ｚｅｂ１、ｔｗｉｓｔ、ＦＯＸＣ２、またはｓｎａｉｌである、請求項５５の方法。
【請求項５７】
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものである間葉系細胞バイオマーカーが、間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性である、請求項４５の方法。
【請求項５８】
間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物を改変Ｈ３５８細胞の中に含ませて、該プロモーター活性を、レポーター遺伝子の量または活性で観察することができるようにすることによって、間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性を評価する、請求項５７の方法。
【請求項５９】
間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物が、ビメンチンプロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物である、請求項５８の方法。
【請求項６０】
Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料が、動物の体内で増殖する異種移植片である、請求項４５の方法。
【請求項６１】
上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞を阻害する作用剤を同定する方法であって、
Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、該タンパク質発現を誘導して細胞内で上皮−間葉転換を誘導する化合物と接触させること、
該細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、
該被験作用剤が、間葉系様Ｈ３５８細胞の増殖を阻害するか否かを判定すること、
およびその結果、該被験作用剤が、上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤であるか否かを判定すること
を含む方法。
【請求項６２】
誘導的に発現されて、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質が、Ｚｅｂ−１；Ｓｎａｉｌ；恒常活性型ＴＧＦβ；同時発現されるＨＧＦおよびＯＳＭ；ＴＮＦα；恒常活性型ｃＭＥＴ受容体；活性化Ｓｒｃキナーゼ；ｖ−Ｓｒｃ；Ｓｒｃ  Ｙ５３０Ｆ変異体；ＩＬ−４；ＩＬ−１３；ＥＧＦ；ＴＧＦ−α；ＨＢ−ＥＧＦ；アンフィレグリン；ベタセルリン；エピレグリン；エピジェン；またはＴＮＦβである、請求項６１の方法。
【請求項６３】
誘導的に発現されて、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質が、Ｚｅｂ−１；Ｓｎａｉｌ；恒常活性型ＴＧＦβである、請求項６１の方法。
【請求項６４】
Ｔｅｔ−制御プロモーターを用いて、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質を誘導的に発現させる、請求項６１の方法。
【請求項６５】
Ｔｅｔ−制御プロモーターがＴｅｔ−ｏｎ系である、請求項６４の方法。
【請求項６６】
間葉系様腫瘍細胞が間葉から上皮への転換を起こすのを促進する作用剤を同定する方法であって、
Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、該タンパク質発現を誘導して細胞内で上皮−間葉転換を誘導する化合物と接触させること、
該細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていない間葉系様Ｈ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう試料内の間葉系様Ｈ３５８細胞を刺激するか否かを判定すること、
およびその結果、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう間葉系様腫瘍細胞を刺激する作用剤であるか否かを決定すること
を含む方法。
【請求項６７】
誘導的に発現されて、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質が、Ｚｅｂ−１；Ｓｎａｉｌ；恒常活性型ＴＧＦβ；同時発現されるＨＧＦおよびＯＳＭ；ＴＮＦα；恒常活性型ｃＭＥＴ受容体；活性化Ｓｒｃキナーゼ；ｖ−Ｓｒｃ；Ｓｒｃ  Ｙ５３０Ｆ変異体；ＩＬ−４；ＩＬ−１３；ＥＧＦ；ＴＧＦ−α；ＨＢ−ＥＧＦ；アンフィレグリン；ベタセルリン；エピレグリン；エピジェン；またはＴＮＦβである、請求項６６の方法。
【請求項６８】
誘導的に発現されて、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質が、Ｚｅｂ−１；Ｓｎａｉｌ；恒常活性型ＴＧＦβである、請求項６６の方法。
【請求項７０】
Ｔｅｔ−制御プロモーターを用いて、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質を誘導的に発現させる、請求項６６の方法。
【請求項７１】
Ｔｅｔ−制御プロモーターがＴｅｔ−ｏｎ系である、請求項７０の方法。
【請求項７２】
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーが、上皮細胞バイオマーカー遺伝子プロモーターである、請求項６６の方法。
【請求項７３】
上皮細胞バイオマーカーが、Ｅ−カドヘリン、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、Ｐ−カドヘリン、またはｅｒｂＢ３である、請求項７２の方法。
【請求項７４】
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものである上皮細胞バイオマーカーが、上皮細胞バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性である、請求項６６の方法。
【請求項７５】
上皮バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物を改変Ｈ３５８細胞の中に含ませて、該プロモーターレポーター活性を、レポーター遺伝子の量または活性で観察することができるようにすることによって、上皮バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性を評価する、請求項７４の方法。
【請求項７６】
上皮バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物が、Ｅ−カドヘリンプロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物である、請求項７５の方法。
【請求項７７】
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーが、間葉系細胞バイオマーカーである、請求項６６の方法。
【請求項７８】
間葉系細胞バイオマーカーが、ビメンチン、フィブロネクチン、Ｎ−カドヘリン、ＣＤＨ１メチル化、ｚｅｂ１、ｔｗｉｓｔ、ＦＯＸＣ２、またはｓｎａｉｌである、請求項７７の方法。
【請求項７９】
この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものである間葉系細胞バイオマーカーが、間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性である、請求項７８の方法。
【請求項８０】
間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物を改変Ｈ３５８細胞の中に含ませて、該プロモーターレポーター活性を、レポーター遺伝子の量または活性で観察することができるようにすることによって、間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性を評価する、請求項７９の方法。
【請求項８１】
間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物が、ビメンチンプロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物である、請求項８０の方法。
【請求項８２】
Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料が、動物の体内で増殖する異種移植片である、請求項６６の方法。
【請求項８３】
抗癌剤の同定に使用するための腫瘍細胞調製物であって、
Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料
を含む腫瘍細胞調製物。
【請求項８４】
誘導的に発現されて、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質が、Ｚｅｂ−１；Ｓｎａｉｌ；恒常活性型ＴＧＦβ；同時発現されるＨＧＦおよびＯＳＭ；ＴＮＦα；恒常活性型ｃＭＥＴ受容体；活性化Ｓｒｃキナーゼ；ｖ−Ｓｒｃ；Ｓｒｃ  Ｙ５３０Ｆ変異体；ＩＬ−４；ＩＬ−１３；ＥＧＦ；ＴＧＦ−α；ＨＢ−ＥＧＦ；アンフィレグリン；ベタセルリン；エピレグリン；エピジェン；またはＴＮＦβである、請求項８３の腫瘍細胞調製物。
【請求項８５】
誘導的に発現されて、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質が、Ｚｅｂ−１；Ｓｎａｉｌ；恒常活性型ＴＧＦβである、請求項８３の腫瘍細胞調製物。
【請求項８６】
Ｔｅｔ−制御プロモーターを用いて、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質を誘導的に発現させる、請求項８５の腫瘍細胞調製物。
【請求項８７】
Ｔｅｔ−制御プロモーターがＴｅｔ−ｏｎ系である、請求項８６の腫瘍細胞調製物。
【請求項８８】
プロモーターレポーター活性をレポーター遺伝子の量または活性で観察することができるように、改変Ｈ３５８細胞の中に安定して取り込まれている上皮および／または間葉系のバイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物をさらに含む、請求項８３の腫瘍細胞調製物。
【請求項８９】
レポーター遺伝子の量または活性を利用してＥＭＴ誘導を観察するために、レポーター遺伝子を誘導的に発現するよう、Ｈ３５８細胞がさらに改変されている、請求項８３の腫瘍細胞調製物。
【請求項９０】
Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料が、動物の体内で増殖する異種移植片である、請求項８３の腫瘍細胞調製物。
【請求項９１】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、任意にＯＳＭまたはＨＧＦを加えられたＴＧＦβである、請求項４の方法。
【請求項９２】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、任意にＯＳＭまたはＨＧＦを加えられたＴＧＦβである、請求項１６の方法。
【請求項９３】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、任意にＯＳＭまたはＨＧＦを加えられたＴＧＦβである、請求項２７の方法。
【請求項９４】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、任意にＯＳＭまたはＨＧＦを加えられたＴＧＦβである、請求項４１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、上皮−間葉転換細胞モデル、および、これらを使用して、特に、上皮−間葉転換を起こしてしまった腫瘍細胞を阻害する点では効力が劣る可能性のある、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−ＩＲキナーゼ阻害剤など他の作用剤と併用して、癌患者を治療するための新規な抗癌剤の同定に使用する方法を目的とする。癌とは、無秩序な増殖、分化の欠如、および局所的な組織に浸潤して転移する能力を特徴とする多様な細胞性悪性腫瘍の総称である。これらの新生物腫瘍は、さまざまな罹患率で、身体のあらゆる組織および器官を侵す。
【背景技術】
【０００２】
抗悪性腫瘍薬は、理想的には、非悪性細胞に対する毒性と比較して高い治療指数をもって、癌細胞を選択的に死滅させるものである。また、この抗悪性腫瘍薬に長期間曝露した後も、なお悪性細胞に対する有効性を維持するものである。残念ながら、現行の化学療法剤には、このような理想的な特徴を有するものはない。それどころか、ほとんどのものの治療指数は極めて低い。そのうえ、致死濃度よりも僅かに低い濃度の化学療法剤に曝露された癌細胞は、高い頻度で、この薬剤に対する耐性を生じ、高い頻度で、他の幾つかの抗悪性腫瘍剤に対しても交差耐性を生じる。
【０００３】
過去数十年間にわたり、数多くの治療薬が、さまざまなタイプの癌を治療するために開発されてきた。最も一般的に使用されている抗癌剤には以下のものが含まれる：ＤＮＡ−アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド）、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、葉酸拮抗剤、およびピリミジン拮抗剤である５−フルオロウラシル）、微小管破壊剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル）、ＤＮＡ挿入剤（例えば、ドキソルビシン、ダウノマイシン、シスプラチン）、およびホルモン療法（例えば、タモキシフェン、フルタミド）。最近になって、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤などの遺伝子標的療法が次第に癌治療に利用されるようになってきた（ｄｅ  Ｂｏｎｏ  Ｊ．Ｓ．およびＲｏｗｉｎｓｋｙ，Ｅ．Ｋ．（２００２）Ｔｏｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：Ｓ１９−Ｓ２６；Ｄａｎｃｅｙ，Ｊ．およびＳａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．Ａ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：９２−３１３）。このような手法、例えば、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤であるエルロチニブなどは、一般に、従来の細胞毒性薬と比較して毒性が低い。従って、これらは、併用療法で使用するのに特に適している。膵臓癌においては、第ＩＩＩ相試験により、エルロチニブを第一選択薬とし、ゲムシタビンと併用による治療が生存期間を延ばすことが示されている。
【０００４】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーは、分化および増殖などの細胞応答に関与する４種類の近縁の受容体（ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）を含む。ＥＧＦＲキナーゼ、またはこのリガンドであるＴＧＦαの過剰発現は、しばしば、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、腎細胞癌、膀胱癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、および星状細胞腫など数多くの癌を伴うため、これらの腫瘍の悪性増殖の一因であると考えられている。ＥＧＦＲ遺伝子（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）の特異的欠失変異も、細胞の腫瘍原性を高めることが見出されている。ＥＧＦＲによって刺激されるシグナル経路を活性化させると、癌を促進させる可能性がある複数のプロセス、例えば、増殖、血管形成、細胞の運動性および浸潤、アポトーシス低下、ならびに薬剤耐性誘導などを促進する。ＨＥＲ１／ＥＧＦＲの発現増加は、しばしば、進行疾患、転移、および予後不良と連関している。例えば、ＮＳＣＬＣおよび胃癌では、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲの発現増加が、転移率の上昇、低腫瘍分化度、および腫瘍増殖の増大と相関することが示されている。
【０００５】
受容体の内在性タンパク質チロシンキナーゼ活性を活性化し、および／または下流シグナル伝達を増大させる突然変異が、ＮＳＣＬＣおよび神経膠芽腫において観察されている。しかし、ＥＧＦ受容体阻害剤、例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））またはゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標））に対する感受性を付与する際の主要機構として突然変異が果たす役割については、未だ意見が一致していない。最近、完全長ＥＧＦ受容体の変異型が、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブに対する反応性を予測するために報告されている（Ｐａｅｚ，Ｊ．Ｇ．ら、（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ３０４：１４９７−１５００；Ｌｙｎｃｈ，Ｔ．Ｊ．ら、（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：２１２９−２１３９）。ＥＧＦ受容体の変異型を発現する細胞株（即ち、Ｈ３２５５）が、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤であるゲフィチニブによる増殖阻害に対して感受性がより強かったこと、および野生型ＥＧＦ受容体を発現する腫瘍細胞株を阻害するには、ずっと高濃度のゲフィチニブが必要であったことが、細胞培養試験によって示されている。これらの観察結果は、ＥＧＦ受容体の特異な変異型が、ＥＧＦ受容体の阻害剤に対する、より高度な感受性を反映する可能性があることを示唆しているが、完全に非応答性の表現型は同定されていない。
【０００６】
エルロチニブ（例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）もしくはＯＳＩ−７７４としても知られているエルロチニブ塩酸塩）は、ＥＧＦＲキナーゼの経口利用可能な阻害剤である。インビトロでは、エルロチニブが、数多くのヒト腫瘍細胞株において、ＥＧＦＲキナーゼに対して実質的な阻害活性を有することが実証されている。第ＩＩＩ相試験において、エルロチニブ単剤療法は、進行性で難治性のＮＳＣＬＣ患者において、生存期間を有意に延ばし、疾患進行を遅らせ、また肺癌関連症状の悪化を遅らせた（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｆ．ら、（２００５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３（２）：１２３−１３２）。２００４年１１月に、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が、少なくとも一種類の化学療法が不成功に終わった後の局所進行性または転移性の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者を治療するため、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）を認可した。
【０００７】
ＩＧＦ−１Ｒの活性化を阻害してＩＧＦ−１Ｒキナーゼ活性を低下させる抗体、またはＩＧＦ−１Ｒの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドと同様、ＩＧＦ−１Ｒのキナーゼ活性を抑制する化合物を抗腫瘍剤として利用するために開発することも、懸命な研究努力が払われている領域となっている（例えば、Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｏ．ら、（２００５）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ９２：２０９７−２１０１；Ｉｂｒａｈｉｍ，Ｙ．Ｈ．およびＹｅｅ，Ｄ．（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：９４４ｓ−９５０ｓ；Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｃ．Ｓ．ら、（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２２１−２３０；Ｃａｍｉｒａｎｄ，Ａ．ら（２００５）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：Ｒ５７０−Ｒ５７９（ＤＯＩ  １０．１１８６／ｂｃｒ１０２８）；Ｃａｍｉｒａｎｄ，Ａ．およびＰｏｌｌａｋ，Ｍ．（２００４）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９０：１８２５−１８２９；Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，Ｃ．ら、（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２３１−２３９参照）。
【０００８】
ＩＧＦ−１Ｒは、主にＩＧＦ−１に結合するが、より低い親和性でＩＧＦ−ＩＩおよびインスリンにも結合する膜貫通ＲＴＫである。ＩＧＦ−１がこの受容体に結合すると、受容体のオリゴマー化、チロシンキナーゼの活性化、分子間における受容体の自己リン酸化、および細胞内基質（主要な基質はＩＲＳ１およびＳｈｃ）のリン酸化が起こる。リガンドによって活性化されたＩＧＦ−１Ｒは、正常細胞においてマイトジェン活性を誘導し、異常増殖において重要な役割を果たしている。ＩＧＦ−１系の主な生理的役割は、正常な増殖および再生を促進することである。過剰発現されたＩＧＦ−１Ｒ（１型インスリン様増殖因子受容体）は、有糸分裂誘発を開始させて、リガンドに依存した悪性腫瘍形質転換を促進することができる。さらに、ＩＧＦ−１Ｒは、悪性の表現型の確立および維持に重要な役割を果たしている。上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体とは異なり、ＩＧＦ−１Ｒの突然変異による発癌型は同定されていない。しかし、幾つかの癌遺伝子が、ＩＧＦ−１１およびＩＧＦ−１Ｒの発現に影響することが実証されている。ＩＧＦ−１Ｒ発現の減少と形質転換に対する耐性との間には相関関係が見られている。ＩＧＦ−１ＲのＲＮＡに対してアンチセンスなｍＲＮＡに細胞を暴露すると、幾つかのヒト腫瘍細胞株は軟寒天内で増殖しなくなる。ＩＧＦ−１Ｒは、インビボにおいてもインビトロにおいても、アポトーシスを進行させなくする。ＴＧＦ−１Ｒの量が野生型の量より少なくなると、インビボで腫瘍細胞のアポトーシスが生じる。ＩＧＦ−１Ｒ破壊がアポトーシスを引き起こす能力は、正常な非発癌性細胞内では低下するようである。
【０００９】
ヒト腫瘍成長におけるＩＧＦ−１経路には重要な役割がある。ＩＧＦ−１Ｒの過剰発現は、さまざまな腫瘍（乳癌、結腸腫瘍、肺腫瘍、肉腫）でよく見られ、しばしば悪性表現型に関連している。高ＩＧＦ−１血中濃度は、前立腺癌、肺癌、および乳癌のリスクと強い相関関係がある。さらに、ＩＧＦ−１Ｒは、インビトロおよびインビボにおける形質転換表現型の確立および維持にとって必要である（Ｂａｓｅｒｇａ  Ｒ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，１９９９，２５３，１−６）。ＩＧＦ−１Ｒのキナーゼ活性は、以下の幾つかの癌遺伝子の形質転換活性に必須である：ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＳＶ４０  Ｔ抗原、活性型Ｒａｓ、Ｒａｆ、およびｖ−Ｓｒｃ。正常線維芽細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの発現は、腫瘍表現型を誘導し、その後インビボで腫瘍を形成する可能性がある。ＩＧＦ−１Ｒ発現は、足場非依存性増殖において重要な役割を果たしている。また、ＩＧＦ−１Ｒは、化学療法、放射線、およびサイトカインによって誘導されるアポトーシスから細胞を保護することが分かっている。反対に、ドミナントネガティブ型ＩＧＦ−１Ｒ、三重らせん形成、またはアンチセンス発現ベクターによって内在性ＩＧＦ−１Ｒを阻害すると、インビトロにおける形質転換活性および動物モデルにおける腫瘍増殖が抑制されることが分かっている。
【００１０】
ほとんどの癌転移の過程で、上皮−間葉転換（ＥＭＴ）として知られる重大な変化が、腫瘍細胞内で生じる（Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：４４２−４５４；Ｓａｖａｇｎｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２３：９１２−９２３；Ｋａｎｇ  Ｙ．およびＭａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（２００４）Ｃｅｌｌ  １１８：２７７−２７９；Ｊｕｌｉｅｎ−Ｇｒｉｌｌｅ，Ｓ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：２１７２−２１７８；Ｂａｔｅｓ，Ｒ．Ｃ．ら、（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１３：１７２１−１７２７；Ｌｕ  Ｚ．，ら、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．４（６）：４９９−５１５））。ＥＭＴは、胚形成の過程以外、正常細胞においては起こらない。互いに強固に結合して極性を示す上皮細胞が、互いにより緩く結合し、極性の消失を示し、および移動能力を有する間葉細胞を生じさせる。これらの間葉系細胞は、原発腫瘍の周辺の組織に拡散して行くことができるばかりでなく、該腫瘍から分離して血管やリンパ管に浸潤し、新たな場所に移動して、そこで分裂してさらなる腫瘍を形成することができる。最近の研究では、上皮細胞は、ＥＧＦＲおよびＩＧＦ−１Ｒのキナーゼ阻害剤によく応答するが、ＥＭＴの後、生じた間葉系細胞は、このような阻害剤に対してずっと低い感受性しか示さないことが明らかにされている（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．ら、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（２０）：９４５５−９４６２；米国特許出願６０／９９７，５１４）。このように、腫瘍細胞のＥＭＴの生起を予防または逆転させる（例えば、間葉−上皮転換（ＭＥＴ）を刺激する。）か、またはＥＭＴによって生じた間葉様腫瘍細胞の増殖を阻害することができる抗癌剤に対する差し迫った必要が存在する。このような作用剤は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤など、他の抗癌剤と併用されると特に有用なはずである。
【００１１】
ヒト癌が進行してより浸襲的な転移状態になると、細胞および組織の環境によっては、細胞生存を制御するシグナル伝達プログラムおよび遊走プログラムが見られる（Ｇｕｐｔａ，Ｇ．Ｐ．およびＭａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２７，６７９−６９５）。最近のデータは、上皮癌細胞が、上皮−間葉転換に似たプロセスである、より間葉系に似た状態へと分化転換し（ＥＭＴ；（Ｏｆｔ，Ｍ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０，２４６２−２４７７；Ｐｅｒｌ，Ａ．Ｋ．ら、（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ  ３９２，１９０−１９３）、細胞の浸潤および転移が容易になること（Ｂｒａｂｌｅｔｚ，Ｔ．ら、（２００５）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５，７４４−７４９；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ，Ｇ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，４４４−４５０）を強調している。ＥＭＴ様転換によって、間葉系様腫瘍細胞は、増殖能を犠牲にして遊走能を獲得すると考えられている。間葉上皮転換（ＭＥＴ）は、より増殖的な状態を再生させて、原発腫瘍に似たマクロ転移を遠隔部位で形成すると考えられてきた（Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２，４４２−４５４）。腫瘍細胞におけるＥＭＴ様転換は、ジンクフィンガードメイン、フォークヘッドドメイン、ｂＨＬＨドメイン、およびＨＭＧ−ボックスドメインを有する転写因子を介した、相当な期間（数週間〜数ヶ月）にわたる転写の再プログラミングによって生じる（Ｍａｎｉ，Ｓ．Ａ．ら、（２００７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０４，１００６９−１００７４；Ｐｅｉｎａｄｏ，Ｈ．ら、（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ７，４１５−４２８）。Ｅ−カドヘリンの消失およびより間葉系的な状態への転換は、癌の進行において主要な役割を果たしている可能性が高く（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｔ．ら、（２００１）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７，５９４−５９９；Ｙｏｓｈｉｕｒａ，Ｋ．ら、（１９９５）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９２，７４１６−７４１９）、間葉系表現型の獲得は、予後不良と相関している（Ｂａｕｍｇａｒｔ，Ｅ．ら、（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３，１６８５−１６９４；Ｋｏｋｋｉｎｏｓ，Ｍ．Ｉ．ら、（２００７）Ｃｅｌｌｓ，ｔｉｓｓｕｅｓ，ｏｒｇａｎｓ  １８５，１９１−２０３；Ｗｉｌｌｉｐｉｎｓｋｉ−Ｓｔａｐｅｌｆｅｌｄｔ，Ｂ．ら、（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，８００６−８０１４）。腫瘍由来および／または腫瘍関連の間質細胞を標的とすることによって、ＥＭＴ様の転換を阻止して浸潤細胞の生存を阻害するためのユニークな機構が提供される。
【００１２】
ＥＭＴ様の転換に関連した細胞変化によって、生存のためのＥＧＦ受容体シグナル伝達ネットワークへの癌細胞の依存性が変化する。一つには、ＰＩ３’キナーゼ経路とＭｅｋ−Ｅｒｋ経路の一方または両方のＥＧＦＲ非依存性活性化から（Ｂｕｃｋ，Ｅ．ら、（２００７）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，５３２−５４１）、ＥＭＴ様転換は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩエルロチニブに対する細胞不感受性と関連していること（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．ら、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，９４５５−９４６２；Ｗｉｔｔａ，Ｓ．Ｅ．ら、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６，９４４−９５０；Ｙａｕｃｈ，Ｒ．Ｌ．ら、（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，８６８６−８６９８）が観察されている。ＥＭＴの状態とＥＧＦＲ  ＴＫＩに対する感受性とを関連付ける同様のデータが、膵臓細胞株、ＣＲＣ細胞株（Ｂｕｃｋ，Ｅ．ら、（２００７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，５３２−５４１）、膀胱細胞株（Ｓｈｒａｄｅｒ，Ｍ．ら、（２００７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，２７７−２８５）、およびＨＮＳＣＣ細胞株（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋら、（２００７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，１６８３−１６９１）、異種移植片、ならびに患者（Ｙａｕｃｈ，Ｒ．Ｌ．ら、（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，８６８６−８６９８）において報告されている。ＥＧＦ受容体インヒビターに対する細胞感受性を回避することができる、ＰＩ３’キナーゼ経路およびＥｒｋ経路の活性化代替経路の分子的決定因子が活発に調べられている（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ，Ａ．ら、（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２，２００−２０７；Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ら、（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：１０３９−１０４３）。
【００１３】
ＥＭＴ様転換および間葉系様細胞の生存を阻害すると、腫瘍の転移および進行が低下すすると予測されよう。最新のデータでは、転移のある患者は、上皮様表現型および間葉様表現型の細胞を含む可能性のある不均一な腫瘍を有することが示唆されている。腫瘍が、新たなシグナル伝達経路、例えば、ＰＤＧＦＲおよびＦＧＦＲによる自己分泌シグナル伝達を獲得できるという観察結果は、特定の腫瘍細胞集団を標的とする新しい治療法があることを示唆している。これらのデータは、腫瘍細胞の増殖抑制またはアポトーシスを直接的に生じさせるだけでなく、癌の再発を促進する間葉細胞集団にも影響を与える、合理的な薬物の組み合わせがあることを示唆している（Ｍｏｏｄｙ，Ｓ．Ｅ．ら、（２００５）．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ８，１９７−２０９）。このような薬物の組み合わせを発見および開発する上で重要なのは、これらの有用性を容易に評価できる優れた細胞モデルまたは動物モデルである。本明細書に記載の本発明は、このようなモデルを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許出願第６０／９９７，５１４号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ｄｅ  Ｂｏｎｏ  Ｊ．Ｓ．およびＲｏｗｉｎｓｋｙ，Ｅ．Ｋ．（２００２）Ｔｏｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：Ｓ１９−Ｓ２６
【非特許文献２】Ｄａｎｃｅｙ，Ｊ．およびＳａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．Ａ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：９２−３１３
【非特許文献３】Ｐａｅｚ，Ｊ．Ｇ．ら、（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ３０４：１４９７−１５００
【非特許文献４】Ｌｙｎｃｈ，Ｔ．Ｊ．ら、（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：２１２９−２１３９
【非特許文献５】Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｆ．ら、（２００５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３（２）：１２３−１３２
【非特許文献６】Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｏ．ら、（２００５）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ９２：２０９７−２１０１
【非特許文献７】Ｉｂｒａｈｉｍ，Ｙ．Ｈ．およびＹｅｅ，Ｄ．（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：９４４ｓ−９５０ｓ
【非特許文献８】Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｃ．Ｓ．ら、（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２２１−２３０
【非特許文献９】Ｃａｍｉｒａｎｄ，Ａ．ら（２００５）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：Ｒ５７０−Ｒ５７９（ＤＯＩ  １０．１１８６／ｂｃｒ１０２８）
【非特許文献１０】Ｃａｍｉｒａｎｄ，Ａ．およびＰｏｌｌａｋ，Ｍ．（２００４）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９０：１８２５−１８２９
【非特許文献１１】Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，Ｃ．ら、（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２３１−２３９
【非特許文献１２】Ｂａｓｅｒｇａ  Ｒ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，１９９９，２５３，１−６
【非特許文献１３】Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：４４２−４５４；
【非特許文献１４】Ｓａｖａｇｎｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２３：９１２−９２３
【非特許文献１５】Ｋａｎｇ  Ｙ．およびＭａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（２００４）Ｃｅｌｌ  １１８：２７７−２７９
【非特許文献１６】Ｊｕｌｉｅｎ−Ｇｒｉｌｌｅ，Ｓ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：２１７２−２１７８
【非特許文献１７】Ｂａｔｅｓ，Ｒ．Ｃ．ら、（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１３：１７２１−１７２７
【非特許文献１８】Ｌｕ  Ｚ．，ら、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．４（６）：４９９−５１５
【非特許文献１９】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．ら、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（２０）：９４５５−９４６２
【非特許文献２０】Ｇｕｐｔａ，Ｇ．Ｐ．およびＭａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（２００６）Ｃｅｌｌ  １２７，６７９−６９５
【非特許文献２１】Ｏｆｔ，Ｍ．ら（１９９６）Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １０，２４６２−２４７７
【非特許文献２２】Ｐｅｒｌ，Ａ．Ｋ．ら、（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ  ３９２，１９０−１９３
【非特許文献２３】Ｂｒａｂｌｅｔｚ，Ｔ．ら、（２００５）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ５，７４４−７４９
【非特許文献２４】Ｃｈｒｉｓｔｏｆｏｒｉ，Ｇ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４１，４４４−４５０
【非特許文献２５】Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．（２００２）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２，４４２−４５４
【非特許文献２６】Ｍａｎｉ，Ｓ．Ａ．ら、（２００７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０４，１００６９−１００７４
【非特許文献２７】Ｐｅｉｎａｄｏ，Ｈ．ら、（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ７，４１５−４２８
【非特許文献２８】Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｔ．ら、（２００１）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７，５９４−５９９
【非特許文献２９】Ｙｏｓｈｉｕｒａ，Ｋ．ら、（１９９５）．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９２，７４１６−７４１９
【非特許文献３０】Ｂａｕｍｇａｒｔ，Ｅ．ら、（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３，１６８５−１６９４
【非特許文献３１】Ｋｏｋｋｉｎｏｓ，Ｍ．Ｉ．ら、（２００７）Ｃｅｌｌｓ，ｔｉｓｓｕｅｓ，ｏｒｇａｎｓ  １８５，１９１−２０３
【非特許文献３２】Ｗｉｌｌｉｐｉｎｓｋｉ−Ｓｔａｐｅｌｆｅｌｄｔ，Ｂ．ら、（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，８００６−８０１４
【非特許文献３３】Ｂｕｃｋ，Ｅ．ら、（２００７）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６，５３２−５４１
【非特許文献３４】Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．ら、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６５，９４５５−９４６２
【非特許文献３５】Ｗｉｔｔａ，Ｓ．Ｅ．ら、（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６，９４４−９５０
【非特許文献３６】Ｙａｕｃｈ，Ｒ．Ｌ．ら、（２００５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，８６８６−８６９８
【非特許文献３７】Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｉ，Ａ．ら、（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２，２００−２０７
【非特許文献３８】Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ら、（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：１０３９−１０４３
【非特許文献３９】Ｍｏｏｄｙ，Ｓ．Ｅ．ら、（２００５）．Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ８，１９７−２０９
【発明の概要】
【００１６】
（発明の要旨）
本発明は、腫瘍細胞が上皮から間葉への転換を起こすのを阻害する作用剤を同定する方法であって、上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、該試料を、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させること、この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていないＨ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、被験作用剤が、試料内の腫瘍細胞が上皮から間葉系への転換を起こすことを阻害するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、腫瘍細胞が上皮−間葉転換を起こすのを阻害する作用剤であるか否かを判定することを含む方法を提供する。一つの実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドは、ＥＧＦ；ＴＧＦβ；ＴＮＦα；およびＩＬ−４から選択される。別の実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである。
【００１７】
また、本発明は、上皮から間葉への転換を起こした腫瘍細胞を阻害する作用剤を同定する方法であって、上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導すること、該細胞試料をスクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、該作用剤が、間葉様Ｈ３５８細胞の増殖を抑制するか否かを判定すること、および、それによって、該作用剤が、上皮から間葉への転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤であるか否かを判定することを含む方法も提供する。一つの実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドは、ＥＧＦ；ＴＧＦβ；ＴＮＦα；およびＩＬ−４から選択される。別の実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである。
【００１８】
また、本発明は、間葉系様腫瘍細胞を刺激して間葉から上皮への転換を起こさせる作用剤を同定する方法であって、上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導すること、該細胞試料をスクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていない間葉系様Ｈ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、被験作用剤が、試料内の間葉系様Ｈ３５８細胞を刺激して間葉から上皮への転換を起こすか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、間葉系様腫瘍細胞を刺激して間葉−上皮転換を起こさせる作用剤であるか否かを判定することを含む方法も提供する。一つの実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドは、ＥＧＦ；ＴＧＦβ；ＴＮＦα；およびＩＬ−４から選択される。別の実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである。
【００１９】
また、本発明は、抗癌剤の同定に使用するための間葉系様腫瘍細胞調製物であって、前記腫瘍細胞調製物は上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導することを含む方法によって調製される調製物も提供する。ここで、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドは、ＥＧＦ；ＴＧＦβ；ＴＮＦα；およびＩＬ−４から選択され、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである。
【００２０】
また、本発明は、抗癌剤の同定に使用するための腫瘍細胞調製物であって、Ｈ３５８細胞内で上皮から間葉への転換を促進するタンパク質を誘導的に発現すべく改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８細胞の細胞試料を含む調製物も提供する。Ｈ３５８細胞内で誘導的に発現されて上皮から間葉への転換を促進するタンパク質は、Ｓｎａｉｌ、Ｚｅｂ−１、または恒常活性型ＴＧＦβである。本発明は、このような腫瘍細胞調製物を用いて、ＥＭＴを抑制したり、ＭＥＴを促進したり、または間葉系様細胞の増殖を阻害したりする作用剤を同定することによって、抗癌剤候補を同定する方法も提供する。
【００２１】
また、本発明は、本明細書に記載されたいずれかの方法によって同定された作用剤を含む、腫瘍または腫瘍転移の治療に使用される組成物を調製する方法も提供する。
【００２２】
また、本願書には、少なくとも一枚のカラーで作成された図面を含む。カラー図面を伴う本特許のコピーは、請求に応じ、必要な費用を支払うことによって特許庁から入手することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ｈ３５８細胞における、増殖因子およびサイトカインによるＥＭＴの誘導。Ｈ３５８細胞を増殖因子およびサイトカインで７日間処理し（材料および方法の項参照）、細胞抽出物を免疫ブロッティングして、ＥＭＴのタンパク質バイオマーカーであるＥ−カドヘリン、ビメンチン、Ｎ−カドヘリン（Ｎｃａｄ）、およびｅｒｂＢ３を測定した。増殖因子は、アンジオポエチン−１（Ａｎｇ１）、エンドスタチン（Ｅｎｄｏ）、インターロイキン−１、インターロイキン−４、−６、−８、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ＴＧＦα）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ１）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、マトリックスメタロプロテアーゼ−２、−７、−９などであった。免疫ブロットによって検出されたタンパク質のバンド濃度を、模倣処理された対照（Ｃｏｎ）と比較した。
【図２】Ｈ３５８細胞における、複数の増殖因子およびサイトカインによるＥＭＴの誘導。図に示したリガンドで処理されたＨ３５８細胞溶解物における、ＥＭＴのタンパク質バイオマーカーであるＥ−カドヘリン、ビメンチン、ＥｒｂＢ３、およびＺｅｂ１の免疫ブロッティング解析。
【図３】原発腫瘍増殖および転移増殖のインビボ造影に適したｔｅｔ−誘導性ＥＭＴモデルの開発に用いられた概要図。ＥＭＴ誘導遺伝子（Ｓｎａｉｌ、Ｚｅｂ、ＴＧＦβ、Ｓｒｃ、肝細胞増殖因子［ＨＧＦ］、オンコスタチン−Ｍ［ＯＳＭ］、および肝細胞増殖因子受容体［ｃＭＥＴ］）を、テトラサイクリン（例：ドキシサイクリン）による調節下で発現されるべく設計されているプロモーター配列を有するプラスミドの中にクローニングした。これによって、腫瘍細胞が、免疫不全マウスのインビボで異種移植片として増殖した際にＥＭＴを誘導する発現を調節することが可能になる。
【図４】Ｈ３５８細胞におけるＳｎａｉｌおよびＺｅｂの発現によって誘導されたドキシサイクリン依存性ＥＭＴ様転換は、ＥＭＴと一致する形態学的変化（左図）およびバイオマーカーの変化（右図）を示した。タンパク質バイオマーカーは、Ｈ３５８細胞の溶解物中のＥｒｂＢ３およびビメンチンの免疫ブロッティング分析により解析した。
【図５】Ｈ３５８細胞における、ＳｎａｉｌおよびＺｅｂの発現によって誘導されたＥＭＴマーカー発現および表現型における変化は、７日間の処理期間中、ドキシサイクリン依存性であることが分かった。転写抑制因子であるｓｎａｉｌおよびＺｅｂ−１の量は、免疫ブロッティング分析によって決定した。ＥＭＴのタンパク質バイオマーカーは、Ｈ３５８細胞の溶解物中で、上皮バイオマーカーであるＥ−カドヘリン、ｅｒｂＢ３、およびγ−カテニン、ならびに間葉バイオマーカーであるビメンチン、Ｎ−カドヘリン、およびフィブロネクチンを分析することによって解析した。ドキシサイクリン濃度は、図に示すとおり、０〜１．０μｇ／ｍｌである。
【図６】Ｈ３５８細胞において、ＴＧＦβのｄｏｘ誘導性自己分泌により誘導されたＥＭＴ。ＥＭＴドライバーであるＴＧＦβ（恒常的活性型）の量を、免疫ブロッティングによって測定した。ＥＭＴのタンパク質バイオマーカーは、上皮（Ｅｐｉ）バイオマーカーであるＥ−カドヘリンおよび間葉系（Ｍｅｓ）バイオマーカーであるビメンチンを、Ｈ３５８細胞溶解物において免疫ブロッティング分析することにより解析した。ドキシサイクリン濃度は、図に示すとおり、０〜１．０μｇ／ｍｌである。
【図７Ａ】ドキシサイクリンによってＳｎａｉｌを誘導した後に、間葉特異的プロモーター（ビメンチン）を用いたＥＭＴの画像化。（Ａ）間葉特異的プロモーター細胞は、原発腫瘍部位と転移部位のどちらにおいても、ＥＭＴをインビボで可視化する上で有用であり、また、ＥＭＴ過程を標的とする薬物のインビボにおける活性を測定する上でも重要である。（Ｂ）Ｓｎａｉｌ（Ｓ４）、Ｚｅｂ１（Ｚ１７およびＺ２５）の発現によってＥＭＴを起こすべく誘導された細胞を、ビメンチンプロモーター−ルシフェラーゼプラスミドによって形質転換して、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＥＭＴを起こすべく誘導された細胞は、ベクター対照用細胞（Ｖ３）よりも高いビメンチンプロモーター活性を示した。形質転換およびルシフェラーゼ測定は、市販の試薬を用い、標準的なプロトコールを用いて行った。
【図７Ｂ】ドキシサイクリンによってＳｎａｉｌを誘導した後に、間葉特異的プロモーター（ビメンチン）を用いたＥＭＴの画像化。（Ａ）間葉特異的プロモーター細胞は、原発腫瘍部位と転移部位のどちらにおいても、ＥＭＴをインビボで可視化する上で有用であり、また、ＥＭＴ過程を標的とする薬物のインビボにおける活性を測定する上でも重要である。（Ｂ）Ｓｎａｉｌ（Ｓ４）、Ｚｅｂ１（Ｚ１７およびＺ２５）の発現によってＥＭＴを起こすべく誘導された細胞を、ビメンチンプロモーター−ルシフェラーゼプラスミドによって形質転換して、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＥＭＴを起こすべく誘導された細胞は、ベクター対照用細胞（Ｖ３）よりも高いビメンチンプロモーター活性を示した。形質転換およびルシフェラーゼ測定は、市販の試薬を用い、標準的なプロトコールを用いて行った。
【図８】インビボにおけるＨ３５８ルシフェラーゼ発現細胞の画像化。同所性肺モデル（図示）においても、より通常の側腹部注入モデル（図示せず）においても、ルシフェラーゼを発現するＨ３５８細胞を、リアルタイムでＣＣＤカメラを用いて画像化することができる。画像化は、標準的なプロトコール、およびＸｅｎｏＧｅｎ（登録商標）ＣＣＤ画像化装置（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ  ０１７４８）を用いて行った。
【図９Ａ】３Ｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）培養中のＨ３５８における、ＴＧＦβによるＥＭＴの誘導は、低分子ＴＧＦβ阻害剤（ＳＢ４３１５４２）によって阻止することができる。［Ａ］Ｈ３５８  ＮＳＣＬＣを、ＴＧＦβおよびＳＢ４３１５４２の存在下または不在下でＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）内にて１４〜２１日間プレート培養したもの。
【図９Ｂ】３Ｄ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）培養中のＨ３５８における、ＴＧＦβによるＥＭＴの誘導は、低分子ＴＧＦβ阻害剤（ＳＢ４３１５４２）によって阻止することができる。［Ｂ］ＳＢ４３１５４２存在下で上皮表現型が回復されたことを示す、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）におけるＴＧＦβ処理Ｈ３５８の共焦点顕微鏡画像（染色：Ｅ−カドヘリン、緑；ビメンチン、赤；ＤＮＡ核染色、青）。
【図１０】ＥＭＴリガンドは、Ｅ−カドヘリンおよびビメンチンに対する変化を誘導する。細胞を７日間処理し、記載されているとおりにマーカーを染色した。ＨＧＦおよびＯＳＭが、部分的ＥＭＴが起きたことと矛盾しない変化を示す一方、ＴＧＦβおよびすべての二重リガンド処理は、より完全なＥＭＴをもたらす（染色：Ｅ−カドヘリン、緑；ビメンチン、赤；ＤＮＡ、青）。
【図１１Ａ】ＯＳＭによって誘導されるＥＭＴは、ＪＡＫおよびＰＩ３Ｋシグナル伝達を必要とする。細胞を、阻害剤およびリガンドで７日間処理した。培養物をタンパク質について回収し、記載されているとおりにウェスタンブロットを行った（Ａ）。７日目に回収する前に細胞を画像化した（Ｂ）。ＪＡＫｉ（ＪＡＫ阻害剤）は、単独処理または併用処理で、形態的にもマーカーを見ても、ＯＳＭによるＥＭＴを阻止する。ＰＩ３Ｋｉ（ＰＩ３Ｋ阻害剤）は、ＨＧＦ＋ＯＳＭによって誘導された形態学的変化、およびすべてのＯＳＭリガンド処理によって誘導されたマーカーの変化を阻止する。
【図１１Ｂ−１】ＯＳＭによって誘導されるＥＭＴは、ＪＡＫおよびＰＩ３Ｋシグナル伝達を必要とする。細胞を、阻害剤およびリガンドで７日間処理した。培養物をタンパク質について回収し、記載されているとおりにウェスタンブロットを行った（Ａ）。７日目に回収する前に細胞を画像化した（Ｂ）。ＪＡＫｉ（ＪＡＫ阻害剤）は、単独処理または併用処理で、形態的にもマーカーを見ても、ＯＳＭによるＥＭＴを阻止する。ＰＩ３Ｋｉ（ＰＩ３Ｋ阻害剤）は、ＨＧＦ＋ＯＳＭによって誘導された形態学的変化、およびすべてのＯＳＭリガンド処理によって誘導されたマーカーの変化を阻止する。
【図１１Ｂ−２】ＯＳＭによって誘導されるＥＭＴは、ＪＡＫおよびＰＩ３Ｋシグナル伝達を必要とする。細胞を、阻害剤およびリガンドで７日間処理した。培養物をタンパク質について回収し、記載されているとおりにウェスタンブロットを行った（Ａ）。７日目に回収する前に細胞を画像化した（Ｂ）。ＪＡＫｉ（ＪＡＫ阻害剤）は、単独処理または併用処理で、形態的にもマーカーを見ても、ＯＳＭによるＥＭＴを阻止する。ＰＩ３Ｋｉ（ＰＩ３Ｋ阻害剤）は、ＨＧＦ＋ＯＳＭによって誘導された形態学的変化、およびすべてのＯＳＭリガンド処理によって誘導されたマーカーの変化を阻止する。
【図１２Ａ】ＥＭＴは、遊走および浸潤の増加と相関する。細胞を７日間リガンドで処理し、説明されているとおりの改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバー内で遊走および浸潤を測定した。（＊）は、Ｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。細胞の転換が部分的ＥＭＴから完全なＥＭＴになるにつれて、遊走および浸潤は次第に増加する。
【図１２Ｂ】ＥＭＴは、遊走および浸潤の増加と相関する。細胞を７日間リガンドで処理し、説明されているとおりの改変Ｂｏｙｄｅｎチャンバー内で遊走および浸潤を測定した。（＊）は、Ｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。細胞の転換が部分的ＥＭＴから完全なＥＭＴになるにつれて、遊走および浸潤は次第に増加する。
【図１３Ａ】Ｈ３５８のリガンドによって誘導されたＥＭＴは可逆的である。細胞を７日間リガンドで処理した後、リガンドを除去して１４日間復帰させた。１４日間の復帰期間中、マーカー（ａ）および形態（ｂ）を観察した。１４日間復帰させた後、遊走および浸潤を評価した（ｃ）。（＊）は、Ｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。上皮表現型への復帰は、３つの基準すべてでほぼ完全であったが、特に二重リガンドモデルでは、細胞は、完全な復帰を行わない。（記号解説：Ｕｎｔｘ、非処理；ＨＧＦ、肝細胞増殖因子；ＯＳＭ、オンコスタチンＭ；Ｈ＋Ｏ、ＨＧＦ＋ＯＳＭ；Ｅｃａｄ、Ｅ−カドヘリン；Ｖｉｍ、ビメンチン）。
【図１３Ｂ】Ｈ３５８のリガンドによって誘導されたＥＭＴは可逆的である。細胞を７日間リガンドで処理した後、リガンドを除去して１４日間復帰させた。１４日間の復帰期間中、マーカー（ａ）および形態（ｂ）を観察した。１４日間復帰させた後、遊走および浸潤を評価した（ｃ）。（＊）は、Ｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。上皮表現型への復帰は、３つの基準すべてでほぼ完全であったが、特に二重リガンドモデルでは、細胞は、完全な復帰を行わない。（記号解説：Ｕｎｔｘ、非処理；ＨＧＦ、肝細胞増殖因子；ＯＳＭ、オンコスタチンＭ；Ｈ＋Ｏ、ＨＧＦ＋ＯＳＭ；Ｅｃａｄ、Ｅ−カドヘリン；Ｖｉｍ、ビメンチン）。
【図１３Ｃ】Ｈ３５８のリガンドによって誘導されたＥＭＴは可逆的である。細胞を７日間リガンドで処理した後、リガンドを除去して１４日間復帰させた。１４日間の復帰期間中、マーカー（ａ）および形態（ｂ）を観察した。１４日間復帰させた後、遊走および浸潤を評価した（ｃ）。（＊）は、Ｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。上皮表現型への復帰は、３つの基準すべてでほぼ完全であったが、特に二重リガンドモデルでは、細胞は、完全な復帰を行わない。（記号解説：Ｕｎｔｘ、非処理；ＨＧＦ、肝細胞増殖因子；ＯＳＭ、オンコスタチンＭ；Ｈ＋Ｏ、ＨＧＦ＋ＯＳＭ；Ｅｃａｄ、Ｅ−カドヘリン；Ｖｉｍ、ビメンチン）。
【図１４】Ｈ３５８細胞における７日間のＥＭＴリガンド処理による細胞機能の変化。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ法およびプロテオーム解析の両方で、リガンド処理によって変化した６０種類の遺伝子のリストを、ＩＰＡソフトウェア（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ）を用いて解析した。細胞機能に関連する遺伝子における変化を上に示す（黒＝ＨＧＦ；暗灰色＝ＯＳＭ；明灰色＝ＨＧＦ＋ＯＳＭ）。
【図１５】インビボにおけるＨ３５８ルシフェラーゼ発現細胞の画像化。ひとまとめにした細胞集団を、蛍ルシフェラーゼ遺伝子を含むレンチウイルスによって形質導入して、生物発光性Ｈ３５８誘導性細胞を作製した。次いで、これらの細胞を、ヌードマウスに、皮下（Ａ）または同所性（Ｂ）に肺の中に移植し、そこで、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳスペクトル装置を用いて細胞を直ちに画像化した。
【図１６Ａ】インビボにおける遺伝子誘導とＥＭＴマーカーの変化。（Ａ）ドキシサイクリン（ｄｏｘ）で処理した場合、または処理しなかった場合における、恒常活性型ＴＧＦβの誘導、ならびにＥ−カドヘリン、ビメンチン、およびＢ−アクチンの発現について、腫瘍溶解物を探索する。
【図１６Ｂ】インビボにおける遺伝子誘導とＥＭＴマーカーの変化。（Ｂ）ドキシサイクリン（ｄｏｘ）で処理した場合、または処理しなかった場合における、Ｓｎａｉｌの誘導、ならびにＥ−カドヘリン、ビメンチン、およびＢ−アクチンの発現について、腫瘍溶解物を探索する。
【図１６Ｃ】インビボにおける遺伝子誘導とＥＭＴマーカーの変化。（Ｃ）ドキシサイクリン（ｄｏｘ）で処理した場合、または処理しなかった場合における、Ｚｅｂ−１の誘導、ならびにＥ−カドヘリン、ビメンチン、およびβ−アクチンの発現について、腫瘍溶解物を探索する。
【図１７Ａ】インビボにおけるＥＭＴ表現型のＩＨＣによる解析。（Ａ）Ｈ３５８ｔｅｔＯ−ａＴＧＦβ異種移植片に由来するＦＦＰＥ腫瘍を、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）処理を行った場合、または行わなかった場合における、Ｅ−カドヘリンおよびビメンチンの発現について評価する。（Ｂ）Ｈ３５８ｔｅｔＯ−Ｓｎａｉｌ異種移植片に由来するＦＦＰＥ腫瘍を、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）処理を行った場合、または行わなかった場合における、Ｓｎａｉｌの誘導、ならびにＥ−カドヘリンおよびビメンチンの発現について評価する。（Ｃ）Ｈ３５８ｔｅｔＯ−Ｚｅｂ−１異種移植片に由来するＦＦＰＥ腫瘍を、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）処理を行った場合、または行わなかった場合における、Ｓｎａｉｌの誘導、ならびにＥ−カドヘリンおよびビメンチンの発現について評価する。（Ａ）ドキシサイクリン水を投与されていない動物における同一の腫瘍と比較すると、ＴＧＦβ発現が、Ｅ−カドヘリンの下方制御をもたらしたことは明らかである。対照用腫瘍内の細胞は、小型で境界が明確な形態のものからなっている。それに対し、ａＴＧＦβが誘導されている腫瘍（下側の図）は、間質の有意な増加、バラバラな腫瘍構造、および頻出する紡錘型細胞を示している。予想通り、自己分泌ＴＧＦβは、ビメンチンの上方制御をもたらしたが、これは、上皮細胞の核周辺領域の染色強度の上昇によって特徴付けられた。それに対し、非誘導腫瘍では、間質細胞だけがビメンチン染色を示した。（Ｂ）動物にドキシサイクリン水を投与すると、Ｓｎａｉｌが、Ｈ３５８ｔｅｔ−ｏｎ  Ｓｎａｉｌ腫瘍内で誘導される（下側の図）。ドキシサイクリンを投与された動物に由来する腫瘍内のすべての細胞でＳｎａｉｌ染色が見られる。上記したように、Ｓｎａｉｌ発現は、Ｅ−カドヘリンの明らかな下方制御、およびビメンチンの上方制御をもたらした。（Ｃ）動物にドキシサイクリン水を投与すると、Ｚｅｂ１が、Ｈ３５８ｔｅｔ−ｏｎ  Ｚｅｂ１腫瘍内で誘導される。ほとんどの細胞が、ドキシサイクリン投与によって、Ｚｅｂ１を発現したが、すべての細胞において検出可能であったわけではない（下側の図）。他のモデル同様、ドキシサイクリン水を投与されていない動物における同種の腫瘍に較べて、Ｅ−カドヘリンが下方制御され、ビメンチンが上方制御された。Ｅ−カドヘリンおよびビメンチンの発現パターンは、腫瘍全般にわたって一致していたわけではなく、Ｚｅｂ１を発現するか、発現しない細胞の塊と相関している可能性がある。
【図１７Ｂ】インビボにおけるＥＭＴ表現型のＩＨＣによる解析。（Ａ）Ｈ３５８ｔｅｔＯ−ａＴＧＦβ異種移植片に由来するＦＦＰＥ腫瘍を、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）処理を行った場合、または行わなかった場合における、Ｅ−カドヘリンおよびビメンチンの発現について評価する。（Ｂ）Ｈ３５８ｔｅｔＯ−Ｓｎａｉｌ異種移植片に由来するＦＦＰＥ腫瘍を、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）処理を行った場合、または行わなかった場合における、Ｓｎａｉｌの誘導、ならびにＥ−カドヘリンおよびビメンチンの発現について評価する。（Ｃ）Ｈ３５８ｔｅｔＯ−Ｚｅｂ−１異種移植片に由来するＦＦＰＥ腫瘍を、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）処理を行った場合、または行わなかった場合における、Ｓｎａｉｌの誘導、ならびにＥ−カドヘリンおよびビメンチンの発現について評価する。（Ａ）ドキシサイクリン水を投与されていない動物における同一の腫瘍と比較すると、ＴＧＦβ発現が、Ｅ−カドヘリンの下方制御をもたらしたことは明らかである。対照用腫瘍内の細胞は、小型で境界が明確な形態のものからなっている。それに対し、ａＴＧＦβが誘導されている腫瘍（下側の図）は、間質の有意な増加、バラバラな腫瘍構造、および頻出する紡錘型細胞を示している。予想通り、自己分泌ＴＧＦβは、ビメンチンの上方制御をもたらしたが、これは、上皮細胞の核周辺領域の染色強度の上昇によって特徴付けられた。それに対し、非誘導腫瘍では、間質細胞だけがビメンチン染色を示した。（Ｂ）動物にドキシサイクリン水を投与すると、Ｓｎａｉｌが、Ｈ３５８ｔｅｔ−ｏｎ  Ｓｎａｉｌ腫瘍内で誘導される（下側の図）。ドキシサイクリンを投与された動物に由来する腫瘍内のすべての細胞でＳｎａｉｌ染色が見られる。上記したように、Ｓｎａｉｌ発現は、Ｅ−カドヘリンの明らかな下方制御、およびビメンチンの上方制御をもたらした。（Ｃ）動物にドキシサイクリン水を投与すると、Ｚｅｂ１が、Ｈ３５８ｔｅｔ−ｏｎ  Ｚｅｂ１腫瘍内で誘導される。ほとんどの細胞が、ドキシサイクリン投与によって、Ｚｅｂ１を発現したが、すべての細胞において検出可能であったわけではない（下側の図）。他のモデル同様、ドキシサイクリン水を投与されていない動物における同種の腫瘍に較べて、Ｅ−カドヘリンが下方制御され、ビメンチンが上方制御された。Ｅ−カドヘリンおよびビメンチンの発現パターンは、腫瘍全般にわたって一致していたわけではなく、Ｚｅｂ１を発現するか、発現しない細胞の塊と相関している可能性がある。
【図１７Ｃ】インビボにおけるＥＭＴ表現型のＩＨＣによる解析。（Ａ）Ｈ３５８ｔｅｔＯ−ａＴＧＦβ異種移植片に由来するＦＦＰＥ腫瘍を、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）処理を行った場合、または行わなかった場合における、Ｅ−カドヘリンおよびビメンチンの発現について評価する。（Ｂ）Ｈ３５８ｔｅｔＯ−Ｓｎａｉｌ異種移植片に由来するＦＦＰＥ腫瘍を、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）処理を行った場合、または行わなかった場合における、Ｓｎａｉｌの誘導、ならびにＥ−カドヘリンおよびビメンチンの発現について評価する。（Ｃ）Ｈ３５８ｔｅｔＯ−Ｚｅｂ−１異種移植片に由来するＦＦＰＥ腫瘍を、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）処理を行った場合、または行わなかった場合における、Ｓｎａｉｌの誘導、ならびにＥ−カドヘリンおよびビメンチンの発現について評価する。（Ａ）ドキシサイクリン水を投与されていない動物における同一の腫瘍と比較すると、ＴＧＦβ発現が、Ｅ−カドヘリンの下方制御をもたらしたことは明らかである。対照用腫瘍内の細胞は、小型で境界が明確な形態のものからなっている。それに対し、ａＴＧＦβが誘導されている腫瘍（下側の図）は、間質の有意な増加、バラバラな腫瘍構造、および頻出する紡錘型細胞を示している。予想通り、自己分泌ＴＧＦβは、ビメンチンの上方制御をもたらしたが、これは、上皮細胞の核周辺領域の染色強度の上昇によって特徴付けられた。それに対し、非誘導腫瘍では、間質細胞だけがビメンチン染色を示した。（Ｂ）動物にドキシサイクリン水を投与すると、Ｓｎａｉｌが、Ｈ３５８ｔｅｔ−ｏｎ  Ｓｎａｉｌ腫瘍内で誘導される（下側の図）。ドキシサイクリンを投与された動物に由来する腫瘍内のすべての細胞でＳｎａｉｌ染色が見られる。上記したように、Ｓｎａｉｌ発現は、Ｅ−カドヘリンの明らかな下方制御、およびビメンチンの上方制御をもたらした。（Ｃ）動物にドキシサイクリン水を投与すると、Ｚｅｂ１が、Ｈ３５８ｔｅｔ−ｏｎ  Ｚｅｂ１腫瘍内で誘導される。ほとんどの細胞が、ドキシサイクリン投与によって、Ｚｅｂ１を発現したが、すべての細胞において検出可能であったわけではない（下側の図）。他のモデル同様、ドキシサイクリン水を投与されていない動物における同種の腫瘍に較べて、Ｅ−カドヘリンが下方制御され、ビメンチンが上方制御された。Ｅ−カドヘリンおよびビメンチンの発現パターンは、腫瘍全般にわたって一致していたわけではなく、Ｚｅｂ１を発現するか、発現しない細胞の塊と相関している可能性がある。
【図１８Ａ】インビボにおけるＥＭＴ遺伝子誘導の増殖への効果。Ｈ３５８細胞におけるａＴＧＦβ、Ｓｎａｉｌ、およびＺｅｂの発現によって誘導されるドキシサイクリン依存性ＥＭＴ様転換は、皮下異種移植片における腫瘍細胞の増殖をさまざまな程度に遅延させる。（Ａ）ドキシサイクリン（ｄｏｘ）で処理した場合、または処理しなかった場合における、増殖１週目（黒棒）；２週目（暗灰色棒）；３週目（明灰色棒）のＨ３５８ｔｅｔ  ｏｎ−ａＴＧＦβ異種移植片の平均腫瘍体積。
【図１８Ｂ】インビボにおけるＥＭＴ遺伝子誘導の増殖への効果。Ｈ３５８細胞におけるａＴＧＦβ、Ｓｎａｉｌ、およびＺｅｂの発現によって誘導されるドキシサイクリン依存性ＥＭＴ様転換は、皮下異種移植片における腫瘍細胞の増殖をさまざまな程度に遅延させる。（Ｂ）ドキシサイクリン（ｄｏｘ）で処理した場合、または処理しなかった場合における、増殖１週目（黒棒）；２週目（暗灰色棒）；３週目（明灰色棒）のＨ３５８ｔｅｔ  ｏｎ−Ｓｎａｉｌ異種移植片の平均腫瘍体積。
【図１８Ｃ】インビボにおけるＥＭＴ遺伝子誘導の増殖への効果。Ｈ３５８細胞におけるａＴＧＦβ、Ｓｎａｉｌ、およびＺｅｂの発現によって誘導されるドキシサイクリン依存性ＥＭＴ様転換は、皮下異種移植片における腫瘍細胞の増殖をさまざまな程度に遅延させる。（Ｃ）ドキシサイクリン（ｄｏｘ）で処理した場合、または処理しなかった場合における、増殖１週目（黒棒）；２週目（暗灰色棒）；３週目（明灰色棒）のＨ３５８ｔｅｔ  ｏｎ−Ｚｅｂ１異種移植片の平均腫瘍体積。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（発明の詳細な記述）
動物の「癌」という用語は、癌を引き起こす細胞に特有の特徴、例えば、無秩序な増殖、不死性、転移能、急速な成長および増殖、ならびに一定の独特な形態学的特徴を有する細胞が存在することを意味する。しばしば、癌細胞は腫瘍の形をしているが、このような細胞は、動物の体内に単独で存在することもあるし、白血病細胞のように、独立した細胞として血流中を循環することもある。
【００２５】
本明細書において、「細胞増殖」は、例えば、「腫瘍細胞増殖」に関して用いられる場合、別段の記載がない限り、腫瘍学において一般的に使用されているように用いられる。腫瘍学において、この用語は、細胞の再生産（即ち、増殖）速度が、（アポトーシスまたは壊死などによる）細胞死の速度よりも大きい場合に細胞の再生産によって生じ、細胞集団の規模の増大をもたらす細胞数の増加に対して主に使用される。ただし、この増殖の一部は、一定の環境においては、各細胞個体の細胞の大きさ、または細胞質の体積の増加に起因することもある。従って、細胞増殖を阻害する作用剤は、増殖を阻害するか、細胞死を促進するか、またはこの両方によって、これら二つの相反する過程の間の均衡を変えるべく細胞増殖を阻害することができる。
【００２６】
本明細書において、「腫瘍増殖」または「腫瘍転移増殖」は、別段の記載がない限り、腫瘍学における一般的な用法通りに使用される。腫瘍学において、この用語は、腫瘍または腫瘍転移の質量または体積の増加対して主に使用される。
【００２７】
本明細書において、「細胞増殖の異常」は、別段の記載がない限り、正常な調節機構とは別の細胞増殖（例えば、接触阻止の消失）を意味する。これには、（１）変異型チロシンキナーゼを発現するか、受容体型チロシンキナーゼを過剰発現することによって増殖する腫瘍細胞（腫瘍）；（２）チロシンキナーゼの異常な活性化が起こる別の増殖性疾患の良性細胞および悪性細胞；（４）受容体型チロシンキナーゼによって増殖する任意の腫瘍；（５）セリン／スレオニンキナーゼの異常な活性化によって増殖する任意の腫瘍；および（６）セリン／スレオニンキナーゼの異常な活性化が起こる別の増殖性疾患の良性細胞または悪性細胞などが含まれる。
【００２８】
本明細書において、「治療する」という用語は、別段の記載がない限り、癌患者における腫瘍増殖、腫瘍転移、または発癌性細胞もしくは腫瘍細胞の増殖の進行を、部分的にまたは完全に逆転、緩和、抑制、または予防することを意味する。本明細書において、「治療」という用語は、別段の記載がない限り、治療行為を意味する。
【００２９】
「治療法」という語句、またはこれと同等の語句は、例えば、癌について使用する場合、動物体内の癌細胞の数量を減少または除去するよう、または癌の症状を緩和するよう設計されているとする処置および一連の行為を意味する。癌または別の増殖性疾患を「治療する方法」は、癌細胞または他の病気が実際になくなることや、細胞数または病気が実際に低下することや、癌またはその他の病気の症状が実際に緩和されることを必ずしも意味するものではない。しばしば、癌を治療する方法は、成功の見込みが低かったとしても行われるが、それでも、動物の病歴および推定余命を考えれば、なお、総合的に有益な一連の行為と見なされる。
【００３０】
「治療上有効な作用剤」という用語は、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的な応答を引き出す組成物であって、研究者、獣医、医学者、または他の臨床医が探し求めているものを意味する。
【００３１】
「治療有効量」または「有効量」という用語は、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的な応答を引き出す対象化合物または併用物であって、研究者、獣医、医学者、または他の臨床医が探し求めているものの量を意味する。
【００３２】
本発明は、腫瘍細胞が上皮から間葉系への転換（“ＥＭＴ”；Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：４４２−４５４；Ｓａｖａｇｎｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２３：９１２−９２３；Ｋａｎｇ  Ｙ．およびＭａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（２００４）Ｃｅｌｌ  １１８：２７７−２７９；Ｊｕｌｉｅｎ−Ｇｒｉｌｌｅ，Ｓ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：２１７２−２１７８；Ｂａｔｅｓ，Ｒ．Ｃ．ｅｔａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：１７２１−１７２７；Ｌｕ  Ｚ．，ら、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．４（６）：４９９−５１５）を起こしているか否かに基づいて、どの腫瘍が、タンパク質−チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．ら、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（２０）：９４５５−９４６２；米国特許出願６０／９９７，５１４）に最も効果的に応答するかを決定する方法を提供した研究に由来するものである。この研究によって、上皮細胞は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤およびＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤にはよく応答するが、ＥＭＴ後には、生じた間葉系様細胞は、上記阻害剤に対して感受性がずっと弱くなることが実証された。バイオマーカーを利用して、腫瘍細胞がＥＭＴを起こしているか否かを判定することができる（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．ら、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（２０）：９４５５−９４６２）。このような研究の結果、腫瘍の浸潤特性および転移性の重要な要素と考えられているこのような間葉系様細胞の発生、増殖、および／または機能を阻害できる作用剤を発見するための新規の治療学的方法が必要であることが明らかになった。
【００３３】
腫瘍のＥＭＴ事象の制御に関与する生化学経路を詳細に説明することから始まって、生じた間葉系様腫瘍細胞の特徴を調べることまで、かなりの数の研究が新たに行われている。例えば、間葉系様腫瘍細胞によって産生されたさまざまなタンパク質産物の発現の特異的ｓｉＲＮＡ阻害剤を用いた実験によって、ある種の遺伝子産物の発現を減少させると、間葉系様腫瘍細胞の増殖を特異的に阻害できることが実証されている。従って、これらの遺伝子にコードされているタンパク質産物の発現を特異的に阻害するか、発現されたタンパク質の生物活性（例えば、ホスホトランスフェラーゼ活性）を特異的に阻害する薬学的作用剤、例えば、細胞外ドメインを有する発現タンパク質に対する特異的抗体、アンチセンス分子、リボザイム、または低分子酵素阻害剤（例えば、タンパク質キナーゼ阻害剤）なども、同様に、間葉系様腫瘍細胞の増殖を特異的に阻害する作用剤であると期待される。このような作用剤とＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を組み合わせたものの抗腫瘍作用は、これらのキナーゼ阻害剤単独の抗腫瘍作用よりも優れているはずである。なぜなら、このような併用剤は、上皮腫瘍細胞および間葉系様腫瘍細胞の両方を効果的に阻害するので、このような作用剤をＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤と同時投与すれば、ＮＳＣＬ、膵臓癌、結腸癌、または乳癌などの進行癌を患っている患者の治療に効果があるはずだからである。
【００３４】
間葉系様腫瘍細胞の増殖、またはＥＭＴ過程を阻害する作用剤の発見および開発の中心的な標的が同定されたことに鑑み、（例えば、タンパク質キナーゼアッセイ法を用いた）インビトロ・スクリーニング法により同定された作用剤を評価して、これらが、細胞レベルと、インビボの両方において、間葉系様腫瘍細胞の増殖および／または遊走を阻害する予測通りの作用を有するか否かを判定するためのモデルおよび方法が早急に必要とされている。本明細書の実施例に示したデータは、上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８は、一種類以上の細胞受容体リガンドと接触させるか、ＥＭＴ過程を調節することができる一種類以上のタンパク質産物の発現を誘導することによって刺激を受けると、ＥＭＴを起こすことができることを実証している。すべての上皮腫瘍細胞株が、刺激されるとＥＭＴを起こすことができるわけではなく、ＥＭＴを誘導する最適の方法は細胞株によって異なる。従って、さまざまな方法でＥＭＴを誘導するよう処理されたＨ３５８腫瘍細胞を、間葉系様腫瘍細胞を阻害し、この形成を阻止し、またはＥＭＴ過程を逆転させることができる作用剤を同定するための方法において、インビトロおよびインビボにおけるモデルとして利用することができる。また、これらの方法は、腎線維症、肝線維症、肺線維症、および中皮腫など、ＥＭＴ転換に一部起因する線維性疾患を治療するための作用剤を同定する上でも有用である。即ち、腫瘍細胞に適用できると本明細書に記載されている発明はいずれも、ＥＭＴを起こす線維性疾患に関与する他の細胞型にも適用可能である。同様に、抗癌剤の同定に有用であると本明細書に記載されている発明はいずれも、線維症を含む病気を治療するための抗線維症剤の同定にも有用である。
【００３５】
本明細書において、「Ｈ３５８細胞」は、ＣＲＬ−５８０７としてｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８（商標）［Ｈ−３５８；Ｈ３５８としても知られている］の細胞を意味する。
【００３６】
従って、本発明は、腫瘍細胞が上皮から間葉への転換を起こすのを阻害する作用剤を同定する方法であって、上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、該試料を、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させること、この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていないＨ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、試料内の腫瘍細胞が上皮から間葉系への転換を起こすことを阻害するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、腫瘍細胞が上皮から間葉への転換を起こすのを抑制する作用剤であるか否かを判定することを含む方法を提供する。一つの実施態様において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドは、ＥＧＦ；ＴＧＦβ；ＴＮＦα；およびＩＬ−４から選択される。別の実施態様において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである。
【００３７】
本明細書において、「単一タンパク質リガンド調製物」は、細胞受容体に対するタンパク質リガンドを含む調製物を意味する。ただし、該リガンドは、例えば、上皮バイオマーカーであるＥ−カドヘリンの有意の発現低下、および／または間葉系バイオマーカーであるビメンチンの有意の発現上昇によって評価すると、単独で、Ｈ３５８細胞におけるＥＭＴを実質的に誘導することが可能である。本明細書において、「二重タンパク質リガンド調製物」は、異なる細胞受容体に対する２種類のタンパク質リガンドを含む調製物を意味する。ただし、該リガンドはＨ３５８細胞におけるＥＭＴを誘導することが可能であり、ＥＭＴ誘導には、両方のリガンドが必要である（即ち、一方のリガンドは単独では実質的にＥＭＴを誘導しない。）。いずれの調製物も、付加的な化合物またはタンパク質、例えば、細胞栄養物、他の増殖因子、タンパク質リガンドを安定化させる薬剤などを含むことができる。例えば、単一タンパク質リガンド調製物に、ＥＭＴを誘導する一種類以上の別のリガンド、または通常はそれだけではＥＭＴを誘導しないリガンドを添加して、僅かながらより完全に近いＥＭＴをもたらすことも可能である。例えば、ＨＧＦまたはＯＳＭを、ＥＭＴ誘導剤であるＴＧＦβに添加して、Ｅ−カドヘリン発現による評価によると、僅かながらより完全に近いＥＭＴを生じさせることができる。本明細書において、「ＴＧＦβ」は、哺乳動物の活性型ＴＧＦβタンパク質であればよく、例えば、ヒトＴＧＦβ−１（ＴＧＦＢ１；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：７０４０）、ヒトＴＧＦβ−２（ＴＧＦＢ２；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：７０４２）、もしくはヒトＴＧＦβ−３（ＴＧＦＢ３；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：７０４３）、またはこれらのヘテロ二量体などであってもよい（Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ，ら、（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖ．１２：８１−１０３参照）。
【００３８】
本明細書に記載された発明の方法または細胞調製物のいずれにおいても、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドは、既知のものであると、まだ発見も合成もなされていないものであるとを問わず、ＥＧＦ受容体（即ち、ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：１９５６、または他のＨＥＲファミリー受容体を有するヘテロ二量体）；ＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：７０４８）；ＴＮＦα受容体（ＴＮＦＲＳＦｌＡ，ＣＤ１２０ａもしくはＴＮＦ−Ｒｌとしても知られている；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：７１３２）；またはＩＬ−４受容体（インターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：３５６６）に結合して、これを活性化するタンパク質リガンドから選択することができる。例えば、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドは、ＥＧＦ（ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：１９５０）；ＴＧＦβ；ＴＮＦα（腫瘍壊死因子α；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：７１２４）；およびＩＬ−４（インターロイキン４；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：３５６５）から選択してもよい。その他の例には、ＥＧＦ受容体リガンド、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：７０３９）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：１８３９）、アンフィレグリン（ＡＲＥＧ；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：３７４）、ベタセルリン（ＢＴＣ；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：６８５）、エピレグリン（ＥＲＥＧ；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：２０６９）、およびエピジェン（ＥＰＧＮ；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：２５５３２４）；ＴＮＦ受容体リガンド、ＴＮＦβ；ＴＧＦβ受容体ＩＩリガンド、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２、およびＴＧＦβ−３、またはこのヘテロ二量体；ならびにＩＬ−４受容体リガンド、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：３５９６）などがある。上記リガンドタンパク質のヒト型が好ましいが、Ｈ３５８細胞上でヒト受容体を刺激する活性をもち、ＥＭＴを誘導する別の動物型（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サル、ブタなどに由来するもの）がある場合には、これも使用することができる。
【００３９】
本明細書に記載された本発明の方法または細胞調製物のいずれにおいても、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、オンコスタチン−Ｍ受容体（ＯＳＭＲ；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：９１８０）に結合して、これを活性化する一つのリガンドに加え、ＨＧＦ受容体（ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：４２３３；ｍｅｔプロトオンコジン、Ｍｅｔ受容体チロシンキナーゼ、または肝細胞増殖因子受容体としても知られている。）に結合して、これを活性化する一つのリガンドを含むことができる。例えば、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、オンコスタチン−Ｍ（ＯＳＭ；ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：５００８）およびＨＧＦ（ＮＣＩＢ  ＧｅｎｅＩＤ：３０８２）である。別の実施形態では、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、オンコスタチン−Ｍがこの受容体に結合することによって活性化されるシグナル伝達経路を活性化する受容体に結合する一つのタンパク質リガンド（例えば、オンコスタチン−Ｍ受容体に結合して、これを活性化するリガンド（例えば、オンコスタチンＭ））、またはオンコスタチンＭがこの受容体に結合することによって活性化されるシグナル伝達経路と同じシグナル伝達経路（即ち、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路）を活性化する別の受容体に結合するタンパク質リガンド；これに加え、細胞チロシンキナーゼ受容体に結合して、ＨＧＦがこの受容体に結合することによって活性化されるシグナル伝達経路と同一の経路（即ち、ＰＩ３Ｋ経路およびＭＡＰＫ経路；ＨＧＦがＭｅｔ受容体型チロシンキナーゼに結合して活性化されるもの）を活性化する一つのリガンドを含むことができる。ＰＩ３Ｋ経路およびＭＡＰＫ経路を活性化する受容体型チロシンキナーゼは、例えば、ＩＧＦ１−Ｒ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦ受容体１−４のヘテロ二量体、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−４、ＨＥＲ受容体１−４のヘテロ二量体、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）、およびＰＤＧＦＲ（αおよびβ受容体ホモ二量体およびヘテロ二量体）などである。従って、二重リガンド調製物中でオンコスタチンＭと併用することができる更なるリガンドの例には、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ；ＲＯＮ受容体リガンド）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン（ＡＲ）、ベタセルリン（ＢＴＣ）、エピレグリン（ＥＰＲ）、エピジェン（ＥＰＩ）、ニューレグリン（ＮＲＧ−１（ヘレグリン）、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３、ＮＲＧ−４）、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、およびＰＤＧＦ−ＤＤなどがある。上記のリガンドタンパク質のヒト型が好ましいがＨ３５８細胞上でヒト受容体を刺激する活性をもち、ＥＭＴを誘導する別の動物型（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、サ��、ブタなどに由来するもの）がある場合には、これも使用することができる。
【００４０】
本明細書に開示された特異的リガンドによるＨ３５８細胞におけるＥＭＴ誘導により、ＥＭＴを誘導する特異的経路を標的とすることが可能となり、そのため、さまざまな作用機序を有することで、一緒になると相乗的に作用することができる抗癌剤を同定することが可能となる。本明細書に開示された、二重リガンドに誘導されるＥＭＴモデルおよびこれに依存する方法は、ＥＭＴ誘導用の両リガンドに絶対的に依存する。このような二重リガンド調製物によるＥＭＴ誘導はこれまで記載されたことがなく、これらを新規の抗癌剤の同定に用いれば、単一リガンドＥＭＴ誘導系によって同定された作用剤、または他の二重リガンド系よって同定された作用とは異なった作用機序を有する作用剤を同定する結果ももたらされ得る。
【００４１】
本明細書に挙げられているＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ番号は、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  遺伝子データベース記録のヒト遺伝子に対する一意識別子である（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８６００  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｐｉｋｅ，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ３８Ａ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ａｄｄｒｅｓｓ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。本明細書において、これらは、本出願の他の箇所で名称および／または頭字語で言及されている遺伝子産物を明確に識別するために用いられる。このようにして同定された遺伝子によって発現されるタンパク質は、本発明の方法で使用できるタンパク質、および、ＮＣＢＩデータベース（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標））の記録に開示されているように、さまざまなイソ型を含む、これらのタンパク質の配列を代表するものであり、ＮＣＢＩデータベース（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標））の記録は、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００４２】
本発明の方法または調製物のいずれかにおける上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料は、例えば、単層培養中の細胞（例えば、９６穴皿のような、組織培養用のプレートまたは皿の中の細胞）；例えば、マトリゲル（商標）３Ｄ培養、スフェロイド培養、または軟寒天培養などの三次元培養中の細胞（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂ．，（２００５）Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：３６５−３７７；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｍ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７７−１８４；Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｇ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１３１：２９−３４）；または、例えば、腫瘍異種移植片など、インビボの細胞であってもよい。「細胞の同一試料」を必要とする本明細書記載の方法において、この語句は、同一条件下で増殖する、本質的に同数の細胞を有する細胞試料を意味する。例えば、ほぼ同数の細胞が入った同一組織培養皿、または同一サイズもしくは類似したサイズの腫瘍異種移植片。
【００４３】
この発現量または活性量が腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示す数多くのバイオマーカーが知られている（例えば、米国特許出願公開２００７／０２１２７３８；米国特許出願６０／９２３，４６３；米国特許出願６０／９９７，５１４参照）。このようなマーカーは、ＥＭＴの特定の段階に特徴的に関係するため、上皮マーカーまたは間葉系マーカーとして分類される傾向にある。特徴的なバイオマーカーは、例えば、タンパク質、コードｍＲＮＡ、遺伝子プロモーターの活性、転写抑制因子の量、またはプロモーターのメチル化などであり得る。本明細書に記載された方法のいずれにおいても、この発現量が、試料である腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーは、上皮細胞バイオマーカーであってもよい。上皮細胞バイオマーカーは、例えば、Ｅ−カドヘリン、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、Ｐ−カドヘリン、またはｅｒｂＢ３などである。さらに別の上皮細胞バイオマーカーは、Ｂｒｋ、γ−カテニン、α１−カテニン、α２−カテニン、α３−カテニン、コネキシン３１、プラコフィリン３、ストラチフィン１、ラミニンα−５、およびＳＴ１４などである。また、本明細書に記載された方法のいずれにおいても、この発現量が、試料である腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーは、間葉系細胞バイオマーカーであってもよい。間葉系細胞バイオマーカーは、例えば、ビメンチン、フィブロネクチン、Ｎ−カドヘリン、ｚｅｂ１、ｔｗｉｓｔ、ＦＯＸＣ２、またはｓｎａｉｌなどである。さらに別の間葉系様細胞バイオマーカーは、フィブリリン１、フィブリリン２、コラーゲンα２（ＩＶ）、コラーゲンα２（Ｖ）、ＬＯＸＬｌ、ニドジェン、Ｃ１１ｏｒｆ９、テネイシン、チューブリンα３、およびエピモルフィンなどである。さらに、その他、当分野において公知であっても、本明細書に記載されているものでも、または未記載のものであっても、任意の上皮細胞または間葉系細胞のバイオマーカーを、本明細書記載の本発明の方法において用いることができる。本明細書に記載された方法のいずれにおいても、複数のバイオマーカー量測定法を用いてＥＭＴ状態を評価することもでき、それによって、おそらく、より信頼性の高い評価がもたらされる。例えば、ある上皮および間葉系バイオマーカーの量を評価することもでき、それぞれの相互変化によって、ＥＭＴが起こっていることを内部的に確認できる（例えば、適切なバイオマーカーペアは、例えば、Ｅ−カドヘリン／ビメンチンである。）。別の実施形態において、上皮バイオマーカーは、上皮ケラチン１−２８および７１−８０から選択される一つ以上のケラチンを含み、間葉系バイオマーカーはビメンチンであり、上皮バイオマーカーおよび間葉系バイオマーカーが同一量で同時発現すると、間葉系様腫瘍細胞であることが示される（米国特許出願６０／９２３，４６３参照）。本明細書に記載の本発明の方法のいずれにおいて用いられる場合でも、上皮ケラチン１−２８および７１−８０は、本明細書の表２に挙げられているケラチン全部を含む。後者の方法の一つの実施形態において、腫瘍細胞によって発現されるケラチンバイオマーカーの全部または大部分（即ち、５０％以上）を検出する方法を用いて（例えば��多特異性抗体または汎特異性（ｐａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を用いることによって）、上皮ケラチンを評価する。上記の方法の別の実施形態において、上皮ケラチンバイオマーカーの量を測定する場合には、バイオマーカーはケラチン８および／またはケラチン１８を含む。
【００４４】
上皮ケラチンおよび間葉系バイオマーカーであるビメンチンの同時発現の測定に関して本明細書において使用されるとき、「同一量での上皮バイオマーカーおよび間葉系バイオマーカーの同時発現」という用語は、（各バイオマーカーを、同程度の条件で、例えば、親和性が全く同じ抗体、長さが全く同じ核酸プローブ、同一の検出法などを用いて測定すると仮定すれば、）間葉系バイオマーカー量の上皮バイオマーカー量に対する比が約１０：１〜約１：１０の範囲にあることを意味する。
【００４５】
この量が試料である腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を測定する工程を含む本明細書記載の方法のいずれかの別の実施形態において、該バイオマーカーは、腫瘍細胞がＥＭＴを起こすと、遺伝子プロモーターの活性が変化するものであってもよい。このようなプロモーター活性は、プロモーター−レポーター構築物を腫瘍細胞に組み込んでレポーター活性を測定することによって容易に評価できる。一つの実施形態において、上皮バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性は、上皮バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物をＨ３５８細胞に包含させて、該プロモーターレポーター活性をレポーター遺伝子の発現量または活性によって観察できるようにすることによって評価される。例えば、上皮バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物は、Ｅ−カドヘリンプロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物であってもよい。別の実施形態において、間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性は、間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物をＨ３５８細胞に包含させて、該プロモーターレポーター活性をレポーター遺伝子の発現量または活性によって観察できるようにすることによって評価される。例えば、間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター構築物は、ビメンチンプロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物であってもよい。プロモーター−レポーター構築物は、核酸構築物を細胞に移入するための標準的な技術（例えば、形質移入法、電気穿孔法）を用いて、安定した改変細胞株として、Ｈ３５８細胞に恒久的に組み込むか、または一過性的に発現させることができる。また、幾つかのバイオマーカーを同時に観察するために、複数のプロモーター−レポーター遺伝子構築物を用いることができる。例えば、Ｅ−カドヘリン−蛍ルシフェラーゼ構築物およびビメンチンプロモーター−ウミシイタケルシフェラーゼ構築物を、例えば、腫瘍細胞がＥＭＴを起こすにつれて、Ｅ−カドヘリン遺伝子が抑制されることと、ビメンチン遺伝子が誘導されることを同時に観察するために用いることができる。
【００４６】
本発明は、上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞を阻害する作用剤を同定する方法であって、上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞内で上皮−間葉転換を誘導すること、該細胞試料をスクリーニングすべき被験作用剤と接触させること、該被験作用剤が間葉系様Ｈ３５８の細胞増殖を阻害するか否かを判定すること、このようにして、これが上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤であるか否かを決定することからなる方法も提供する。一つの実施形態において、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドは、ＥＧＦ；ＴＧＦβ；ＴＮＦα；およびＩＬ−４から選択される。別の実施形態において、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである。この方法の別の実施形態は、被験作用剤が、上皮―間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害するか否かを判定する工程の後に、間葉系Ｈ３５８腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤が、上皮Ｈ３５８腫瘍細胞の増殖も阻害するか否かを判定すること、および、その結果、これが上皮から間葉系への転換を起こした腫瘍細胞の増殖を特異的に阻害する作用剤であるか否かを決定する工程という更なる工程を含む。上記方法の一実施形態において、上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤は、該腫瘍細胞のアポトーシスを促進することによって増殖を阻害するものと判定される。上記の方法の別の実施形態において、上皮から間葉系への転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤は、該腫瘍細胞の増殖を阻害することによって増殖を抑制するものと判定される。
【００４７】
また、本発明は、間葉系様腫瘍細胞が間葉から上皮への転換を起こすのを促進する作用剤を同定する方法であって、上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞において、上皮−間葉転換を誘導すること、該細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていない間葉系様Ｈ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう試料内の間葉系様Ｈ３５８細胞を刺激するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう間葉系様腫瘍細胞を刺激する作用剤であるか否かを判定することを含む方法も提供する。一つの実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドは、ＥＧＦ；ＴＧＦβ；ＴＮＦα；およびＩＬ−４から選択される。別の実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、ＨＧＦ＋オンコスタチンＭである。
【００４８】
また、本発明は、上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する化合物を含む組成物を調製する方法であって、上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料をスクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、該試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を誘導すること、この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていないＨ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、試料内の腫瘍細胞が上皮から間葉系への転換を起こすことを阻害するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、腫瘍細胞が上皮から間葉への転換を起こすのを抑制する作用剤であるか否かを判定すること、およびこうして同定された被験作用剤を担体と混合して、前記組成物を調製することを含む方法も提供する。
【００４９】
また、本発明は、上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する化合物を含む組成物を調製する方法であって、上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を誘導すること、該試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、該被験作用剤が、間葉系様Ｈ３５８細胞の増殖を阻害するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、上皮から間葉への転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤であるか否かを判定すること、およびこうして同定された被験作用剤を担体と混合して、前記組成物を調製することを含む方法も提供する。
【００５０】
また、本発明は、上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する化合物を含む組成物を調製する方法であって、上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を誘導すること、該試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていない間葉系様Ｈ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう試料内の間葉系様Ｈ３５８細胞を刺激するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう間葉系様腫瘍細胞を刺激する作用剤であるか否かを判定すること、およびこうして同定された被験作用剤を担体と混合して、前記組成物を調製することを含む方法も提供する。
【００５１】
また、本発明は、抗癌剤の同定に使用される間葉系様腫瘍細胞調製物であって、前記腫瘍細胞調製物は上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一もしくは二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を誘導することを含み、ここでＨ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドが、ＥＧＦ；ＴＧＦβ；ＴＮＦα；およびＩＬ−４から選択され、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドが、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである方法によって調製される調製物を提供する。
【００５２】
本明細書に記載された方法のいずれに関しても、被験作用剤は、低分子（分子量約５０００ダルトン未満）および高分子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質、核酸、糖タンパク質、複合糖質、合成または天然のポリマーなど）を含む、任意の化合物であればよい。従って、被験作用剤は、例えば、コンビナトリアルライブラリー、規定された化学物質、ペプチドおよびペプチド模倣体、オリゴヌクレオチドおよび天然物ライブラリー、アプタマー、ならびにディスプレイ産物（例えば、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー）および抗体産物などの他の物質から選択することができる。
【００５３】
また、本発明は、腫瘍細胞が上皮から間葉への転換を起こすのを阻害する作用剤を同定する方法であって、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を刺激するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、該試料を、改変されたＨ３５８細胞における上皮−間葉転換を刺激する該タンパク質の発現を誘導する化合物と接触させること、この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていない改変Ｈ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、試料内の腫瘍細胞が上皮から間葉系へ転換することを阻害するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、腫瘍細胞が上皮から間葉への転換を起こすのを阻害する作用剤であるか否かを判定することを含む方法も提供する。
【００５４】
本明細書において、「誘導的に発現する」は、例えば、タンパク質を「誘導的に発現する」よう改変されている細胞をいう場合、このタンパク質発現が、タンパク質をコードする遺伝子の転写を調節する誘導剤の存在（もしくは欠如）によってのみ開始されることを意味するが、このような誘導剤は、コードタンパク質に対する遺伝子を、誘導剤に応答するプロモーターの調節下に含む構築物による安定的な形質転換によって細胞の中に好適に組み込まれる（即ち、該タンパク質をコードする遺伝子が、遺伝子発現を調節するヌクレオチド配列に機能的に連結されており、該ヌクレオチド配列は、誘導剤の存在によって、この活性を調節することができるプロモーター配列を含んでいる。）。このような誘導プロモーターの一例は、テトラサイクリン（ｔｅｔ）応答性プロモーターである（例えば、Ｔｅｔ−オン系；例えば、Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−１７６９参照）。このような、目的とする特定遺伝子の発現量を調節するための誘導性遺伝子発現システムは、当分野においてよく知られている（例えば、Ｂｌａｕ，Ｈ．Ｍ．およびＲｏｓｓｉ，Ｆ．Ｍ．Ｖ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：７９７−７９９；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ａ．ら、（２００１）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ８：９２３−９３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１２０−１２５参照）。
【００５５】
Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を刺激するタンパク質を誘導的に発現するよう改変された上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８を含む、本明細書記載の方法または細胞調製物のいずれについても、一つの実施形態において、該細胞は、同じように誘導的に発現させることができるプロモーター−レポーター遺伝子構築物も含み、それによって、該プロモーター−レポーター活性を、レポーター遺伝子の発現量もしくは活性によって観察することができようにして、上皮−間葉転換を促進するタンパク質の誘導に成功したか否かを容易に評価するために用いることもできるようにする。このような実施形態の一例では、レポーター遺伝子は蛍ルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼの遺伝子である。レポーターの量の評価は、例えば、Ｈ３５８細胞のＥＭＴ誘導範囲およびＥＭＴを起こした細胞の位置を直ちに観察するために利用することができる。従って、例えば、原発腫瘍から遊走した、即ち転移した、インビボ細胞は、このようなレポーター遺伝子を観察することにより容易に追跡することができる。このように、本発明は、腫瘍細胞が上皮から間葉への転換（および転移）を起こすのを阻害する作用剤を同定する方法であって、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を促進するタンパク質、およびレポーター遺伝子産物（例えば、蛍ルシフェラーゼ）を誘導的に発現するよう改変され、および免疫低下した動物において腫瘍異種移植片を形成させることが可能になっている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤とインビボで接触させること、該試料を、改変Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進する該タンパク質の発現を誘導する化合物およびレポーター遺伝子産物と接触させること、試料である腫瘍細胞が、原発腫瘍からどの範囲遊走したかを（例えば、レポーター遺伝子産物の画像解析によって）、被験作用剤に接触させていない改変Ｈ３５８細胞の同一試料の遊走範囲と比較することにより、該被験作用剤が、試料内の腫瘍細胞が上皮から間葉系へ転換（および転移）することを阻害するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、腫瘍細胞が上皮から間葉へ転換（および転移）することを阻害する作用剤であるか否かを決定することを含む方法を提供する。また、インビボでＥＭＴ転換から生じた細胞も、外科的単離および免疫組織化学法、または、例えば、本明細書または米国特許出願公開２００７／０２１２７３８、米国特許出願６０／９２３，４６３、もしくは米国特許出願６０／９９７，５１４に記載されているようなバイオマーカーを用いたインサイツ・ハイブリッド形成法によって検出することができる。
【００５６】
上記の方法の一つの実施形態において、誘導的に発現されてＨ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質はＳｎａｉｌである。この方法の別の実施形態において、誘導的に発現されてＨ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質はＺｅｂ−１である。この方法の別の実施形態において、誘導的に発現されてＨ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質は、恒常活性型ＴＧＦβである。別の実施形態では、誘導的に発現されてＨ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質は、ＥＭＴを促進する別の一つ以上のタンパク質と同時発現させることができる。改変されたＨ３５８細胞内で誘導的に発現してＥＭＴを促進することができるタンパク質をコードする、さらに別のＥＭＴ原因遺伝子には、同時発現されるＨＧＦおよびＯＳＭ；腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）；恒常活性型ｃＭＥＴ受容体；活性化Ｓｒｃキナーゼ（例えば、ｖ−ＳｒｃまたはＳｒｃのＹ５３０Ｆ変異体）；ＩＬ−４；ＩＬ−１３；ＥＧＦ、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ−α）、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、アンフィレグリン（ＡＲ）、ベタセルリン（ＢＴＣ）、エピレグリン（ＥＰＲ）、エピジェン（ＥＰＩ）；およびＴＮＦβなどがあるが、これらに限定されない。同様に、Ｈ３５８細胞内で誘導的に発現されて上皮−間葉転換を促進するタンパク質を伴う、本明細書記載の他の方法または細胞調製物のいずれにおいても、該タンパク質は、上記の例のいずれであってもよい。
【００５７】
これらの方法の一つの実施形態において、Ｔｅｔ調節プロモーターを用いて、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現させる（例えば、Ｔｅｔ−ｏｎ系）。この方法の一つの実施形態において、改変されたＨ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質の発現を誘導する化合物は、ドキシサイクリンである。使用可能な他の誘導剤には、テトラサイクリンおよびアンヒドロテトラサイクリンが含まれるが、これらに限定されない。同様に、Ｈ３５８細胞内で誘導的に発現されて上皮−間葉転換を促進するタンパク質を伴う、本明細書記載の他の方法または細胞調製物のいずれにおいても、該タンパク質を誘導的に発現させるために使用されるプロモーターおよび誘導因子は、上記の例のいずれであってもよい。誘導系は、テトラサイクリン制御型プラスミド、例えば、Ｔｅｔ−ｏｎおよびＴｅｔ−ｏｆｆ系などである。
【００５８】
上記の方法において、この量が、試料である腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーは、例えば、上皮細胞バイオマーカー、例えば、Ｅ−カドヘリン、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、Ｐ−カドヘリン、もしくはｅｒｂＢ３、または上皮バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性である。一つの実施形態において、上皮バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性は、改変Ｈ３５８細胞にヒト上皮バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物を含ませて、該プロモーター−レポーターの活性をレポーター遺伝子の発現量または活性によって観察できるようにすることにより評価することができる。一つの実施形態において、上皮バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物は、Ｅ−カドヘリンプロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物である。利用可能な上皮プロモーターの更なる例には、以下の遺伝子プロモーターが含まれる：ヒトＥＬＦ３（即ち、Ｅ７４様因子３（ｅｔｓドメイン転写因子、上皮特異的）、ＧｅｎｅＩＤ：１９９９）などがある。別の実施形態において、ヒト上皮細胞に特有であり（Ｓａｖａｇｎｅｒ，Ｐ．ら、（１９９４）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．５（８）：８５１−８６２；Ｏｌｔｅａｎ，Ｓ．ら、（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０３（３８）：１４１１６−１４１２１；Ｇｈｉｇｎａ，Ｃ．ら、（２００５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０（６）：８８１−８９０；Ｂｏｎａｎｏ，Ｖ．Ｉ．ら、（２００７）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２（９）：２１６６−２１８１）、およびＥＭＴ後は機能しないＲＮＡ転写スプライシング機構を、ＥＭＴ状態のマーカーとして利用することができる。例えば、このような上皮特異的スプライシングに必要な配列を、Ｈ３５８細胞に取り込まれたプロモーター−ルシフェラーゼ構築物（例えば、ＣＭＶ−プロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物）の中に包含させて、上皮状態のときにのみ活性型ルシフェラーゼが発現されるようにすれば、ルシフェラーゼの発現または活性の低下によって、ＥＭＴ誘導を容易に観察できる。別の実施形態において、ヒト上皮細胞内で特異的に発現され（例えば、Ｈｕｒｔｅａｕ，Ｇ．Ｊ．ら、（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７：７９７２−７９７６；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ，Ｎ．Ｒ．ら、（２００７）ＲＮＡ  １３：１１７２−１１７８；Ｓｈｅｌｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４（２７）：１１４００−１１４０５参照）、相補的核酸配列含む転写物の翻訳を低下または劣化させるｍｉＲＮＡをＥＭＴ状態のマーカーとして利用することができる。例えば、このようなｍｉＲＮＡに相補的な配列を、Ｈ３５８細胞に取り込まれたプロモーター−ルシフェラーゼ構築物（例えば、ＣＭＶ−プロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物）の中に包含させて、上皮状態では活性型ルシフェラーゼが発現されないようにすれば、ルシフェラーゼの発現もしくは活性の増加によって、ＥＭＴ誘導を容易に観察することができる。同様に、Ｈ３５８細胞内で誘導的に発現されて上皮−間葉転換を促進するタンパク質を伴う、本明細書記載の他の方法のいずれにおいても、この量が試料である腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーは、上記の例のいずれであってもよい。
【００５９】
上記の方法において、この量が、試料である腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーは、例えば、間葉系細胞バイオマーカー、例えば、ビメンチン、フィブロネクチン、Ｎ−カドヘリン、ｚｅｂ１、ｔｗｉｓｔ、ＦＯＸＣ２、もしくはｓｎａｉｌ、または間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性である。一つの実施形態において、間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性は、改変Ｈ３５８にヒト間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物を含ませて、該プロモーター−レポーター活性を、レポーター遺伝子の発現量または活性によって観察できるようにして評価することができる。一つの実施形態において、間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物は、ヒトビメンチンプロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物である。使用可能な間葉系プロモーターの更なる例は、以下のヒト遺伝子由来のプロモーターなどである：Ｓ１００Ａ４（即ち、Ｓ１００カルシウム結合性タンパク質Ａ４（ＦＳＰｌとしても知られている。）、ＧｅｎｅＩＤ：６２７５）、ＳＰＡＲＣ（即ち、分泌タンパク質、酸性、システインに富む（オステオネクチン）、ＧｅｎｅＩＤ：６６７８）、ＩＬ−１１（即ち、インターロイキン１１、ＧｅｎｅＩＤ：３５８９）、ＰＣＯＬＣＥ２（即ち、プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼエンハンサー２、ＧｅｎｅＩＤ：２６５７７）、ＣＯＬ６Ａ２（即ち、コラーゲン、ＶＩ型、α２、ＧｅｎｅＩＤ：１２９２）、ＴＦＰＩ２（即ち、組織因子経路阻害因子２）、ＧｅｎｅＩＤ：７９８０）、ＦＢＮｌ（即ち、フィブリリン１、ＧｅｎｅＩＤ：２２００）、Ｚｅｂ１（即ち、ジンクフィンガーＥボックス結合ホメオボックス１、ＧｅｎｅＩＤ：６９３５）、およびＣＨＳＴ２（即ち、糖質（Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｏ）硫酸転移酵素２、ＧｅｎｅＩＤ：９４３５）。別の実施形態において、ヒト間葉系細胞に特有であり（Ｓａｖａｇｎｅｒ，Ｐ．ら、（１９９４）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．５（８）：８５１−８６２；Ｏｌｔｅａｎ，Ｓ．ら、（２００６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０３（３８）：１４１１６−１４１２１；Ｇｈｉｇｎａ，Ｃ．ら、（２００５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０（６）：８８１−８９０；Ｂｏｎａｎｏ，Ｖ．Ｉ．ら、（２００７）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２（９）：２１６６−２１８１）、およびＥＭＴ以前には機能しない、上皮細胞におけるＲＮＡ転写スプライシング機構を、ＥＭＴ状態のマーカーとして利用することができる。例えば、このような間葉系特異的スプライシングに必要な配列を、Ｈ３５８細胞に取り込まれたプロモーター−ルシフェラーゼ構築物（例えば、ＣＭＶ−プロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物）の中に包含させて、間葉系状態のときにのみ活性型ルシフェラーゼが発現されるようにすれば、ルシフェラーゼの発現または活性の上昇によって、ＥＭＴ誘導を容易に観察できる。別の実施形態において、ヒト間葉系細胞内で特異的に発現され（例えば、Ｈｕｒｔｅａｕ，Ｇ．Ｊ．ら、（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６７：７９７２−７９７６；Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ，Ｎ．Ｒ．ら、（２００７）ＲＮＡ  １３：１１７２−１１７８；Ｓｈｅｌｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０４（２７）：１１４００−１１４０５参照）、相補的核酸配列を含む転写物の翻訳を低下または劣化させるｍｉＲＮＡをＥＭＴ状態のマーカーとして利用することができる。例えば、このようなｍｉＲＮＡに相補的な配列を、Ｈ３５８細胞に取り込まれたプロモーター−ルシフェラーゼ構築物（例えば、ＣＭＶ−プロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物）の中に包含させて、間葉系状態では活性型ルシフェラーゼが発現されないようにすれば、ルシフェラーゼの発現もしくは活性の低下によって、ＥＭＴ誘導を容易に観察することができる。同様に、Ｈ３５８細胞内で誘導的に発現されて上皮−間葉転換を促進するタンパク質を伴う、本明細書記載の他の方法のいずれにおいても、この量が試料である腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーは、上記の例のいずれであってもよい。
【００６０】
改変Ｈ３５８細胞内にバイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物を、バイオマーカープロモーター活性を観察するために含む、本明細書記載の方法または細胞調製物のいずれにおいても、ＥＭＴ状態を評価するために複数のバイオマーカーを同時に観察することができるよう、一種類よりも多いバイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物を用いることができる。例えば、一つの実施形態において、上皮バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物および間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物の両方を用いて、上皮バイオマーカー遺伝子プロモーター活性の低下および間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター活性の上昇の両方を、ＥＭＴの過程で観察することができるようにする。例えば、上皮バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物は、Ｅ−カドヘリンプロモーター−蛍ルシフェラーゼ構築物であってもよく、間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物はビメンチンプロモーター−ウミシイタケルシフェラーゼ構築物であってもよい。別個に観察可能な２種類の異なるレポーター遺伝子（例えば、異なった固有波長の光を放出することを含む発光反応に関与する生成物を産生する２種類のルシフェラーゼ；例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｅ．Ｈ．ら、（２００２）Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ｄｕａｌ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ９６−および３８４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ．Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  ８１，２２−６；Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｊｓｅｎ  ＢＷ．ら、（２００４）Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．８，６７６−８４参照）を用いることによって、両方のプロモーターを同時に観察することができる。同様に、別個に観察可能な２種類の異なるレポーター遺伝子を用いることによって、上皮または間葉系に特異的なｍｉＲＮＡまたはスプライシング機構に関連した、本明細書において上記記載のバイオマーカーの２種類以上を同時に観察することができる。
【００６１】
レポーター遺伝子の発現量を評価することによって、バイオマーカープロモーター活性を観察するために、改変Ｈ３５８細胞内にバイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物を含む、本明細書記載の方法または細胞調製物のいずれにおいても、レポーター遺伝子は、発現されたタンパク質または酵素の活性によって、この量を容易に測定できるタンパク質を発現する異種遺伝子であってもよい。適当なレポーター遺伝子は、蛍（フォチナス・フィラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））ルシフェラーゼ、ウミシイタケ（レニラ・レニホルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））ルシフェラーゼ、コペポーダ（ガウシア・プリンケプス（Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ））ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などである（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｅ．Ｈ．ら、（２００２）Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ｄｕａｌ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ９６−および３８４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ．Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  ８１，２２−６；Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｊｓｅｎ  ＢＷ．ら、（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．８，６７６−８４；Ｖｅｒｈａｅｇｅｎ  Ｍ．およびＣｈｒｉｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  Ｔ．Ｋ．（２００２）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７４：４３７８−４３８５；Ｔａｎｎｏｕｓ，Ｂ．Ａ．，ら、（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１１：４３５−４４３；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｒ．Ｍ．（２００４）Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａ  １０６（２）：７７−８７）；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｒ．Ｍ．（２００８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８５：４８５−４９５参照）。コペポーダルシフェラーゼは、これが発現されている細胞から分泌されるタンパク質であるため、本発明のいずれの方法においても、インビボで増殖している細胞（例えば、腫瘍異種移植片）から、培養細胞の増殖培地、または血液、またはその他の生体液の中に分泌されたレポーター活性を観察できるようになる可能性がある。
【００６２】
上記の方法の一つの実施形態において、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料は、インビボ試料、例えば、動物の体内で増殖する異種移植片（例えば、免疫低下マウスまたはラット）などである。同様に、Ｈ３５８細胞内で誘導的に発現されて、上皮−間葉転換を刺激するタンパク質を伴う、本明細書記載の他の方法または細胞調製物のいずれにおいても、上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料は、上記した通り、インビボ試料であってもよい。
【００６３】
また、本発明は、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を含む動物モデルであって、該細胞試料が異種移植片である動物モデルも提供する。この動物モデルの一つの実施形態において、動物は免疫不全動物（例えば、Ｆｏｘｎ１ｎｕマウスとしても知られているヌードマウスなどの免疫不全マウス；またはＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ／ＩＬ−２Ｒγｎｕｌｌ）マウス；ＳＣＩＤマウス；またはＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスなど）である。
【００６４】
また、本発明は、上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞を阻害する作用剤を同定する方法であって、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、該タンパク質発現を誘導して細胞内で上皮−間葉転換を誘導する化合物と接触させること、該細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、該被験作用剤が、間葉系様Ｈ３５８細胞の増殖を阻害するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤であるか否かを決定することを含む方法も提供する。この方法の別の実施形態は、該被験作用剤が、上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を抑制するか否かを判定する工程の後に、間葉系様Ｈ３５８腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤が、上皮Ｈ３５８腫瘍細胞の増殖も阻害するか否かも判定し、次いで、該被験作用剤が、上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を特異的に阻害する作用剤であるか否かを決定する更なる工程を含む。上記の方法の一実施形態において、上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤は、該腫瘍細胞のアポトーシスを促進することによって増殖を阻害することが明らかになっている。上記の方法の別の実施形態において、上皮−間葉転換を起こした腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤は、該腫瘍細胞の増殖を抑制することによって増殖を阻害することが明らかになっている。
【００６５】
また、本発明は、間葉系様腫瘍細胞が間葉から上皮への転換を起こすのを促進する作用剤を同定する方法であって、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、該タンパク質発現を誘導して細胞内で上皮−間葉転換を誘導する化合物と接触させること、該細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていない間葉系様Ｈ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう試料内の間葉系様Ｈ３５８細胞を刺激するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう間葉系様腫瘍細胞を刺激する作用剤であるか否かを決定することを含む方法も提供する。
【００６６】
また、本発明は、抗癌剤の同定に使用される腫瘍細胞調製物であって、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を含む腫瘍細胞調製物も提供する。一つの実施形態において、腫瘍細胞調製物は、間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性をレポーター遺伝子の量または活性を観察することによって評価できるよう、改変Ｈ３５８細胞内に間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物も含む。一つの実施形態において、間葉系バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物はビメンチン−蛍ルシフェラーゼ構築物である。別の実施形態において、腫瘍細胞調製物は、上皮バイオマーカー遺伝子プロモーターの活性をレポーター遺伝子の量または活性を観察することによって評価できるよう、改変Ｈ３５８細胞内に上皮バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物を含む。一つの実施形態において、上皮バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物は、Ｅ−カドヘリン−蛍ルシフェラーゼ構築物である。上記細胞調製物において、誘導的に発現されてＨ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質は、このような細胞調製物を利用する、本明細書上記記載の方法において使用するために同定されたタンパク質のうちのいずれであってもよい（例えば、Ｓｎａｉｌ、Ｚｅｂ１など）。この細胞調製物の一実施形態において、Ｔｅｔ調節プロモーターを用いて、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を（例えば、ドキシサイクリン、またはテトラサイクリンを用いて）誘導的に発現させる。上記実施形態において、バイオマーカー遺伝子プロモーター−レポーター遺伝子構築物は、改変Ｈ３５８細胞によって安定的に発現される。従って、本発明は、抗癌剤の同定に使用するために、上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導する前に、上皮Ｈ３５８腫瘍細胞調製物を、次いで、上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導した後に、間葉系様腫瘍細胞調製物を提供する。本明細書で説明したように、これらの細胞調製物を、被験作用剤のスクリーニングに使用して、どちらかの細胞型を阻害する作用剤を同定するか、ＥＭＴを阻害するか、ＭＥＴを促進する作用剤を発見することができる。
【００６７】
本発明の方法に関して、腫瘍細胞によって発現される上皮バイオマーカーまたは間葉系バイオマーカーには、腫瘍細胞の転換状態を示す分子マーカーおよび細胞マーカーが含まれ得る。好適な実施形態において、バイオマーカーは、腫瘍細胞の特定の転換状態に特徴的な、即ち、上皮特性または間葉系特性を示す腫瘍細胞に特徴的な個別のマーカータンパク質、またはこれをコードするｍＲＮＡである。別の実施形態では、一定の環境において、バイオマーカーは、細胞の高分子によって腫瘍細胞内で産生される、上皮状態または間葉系状態のいずれかに特徴的な形態学的パターンであってもよい。従って、形態学的細胞解析法を用いて、腫瘍細胞の上皮状態または間葉系状態についての情報を提供することができる。更なる実施形態において、腫瘍細胞の転換状態を示すバイオマーカーは、Ｅ−カドヘリン遺伝子（ＣＤＨ１）プロモーターのメチル化である。ＣＤＨ１プロモーターのメチル化は、腫瘍細胞がＥＭＴ転換を起こしたことを示すものである。
【００６８】
【表１】
2011516826.tif 000002
【００６９】
【表２】
2011516826.tif 000003
2011516826.tif 000004
【００７０】
表１には、本明細書に記載されている本発明の方法を実施する際に使用することができる上皮分子バイオマーカーまたは間葉系分子バイオマーカーの例をコードする遺伝子が列挙されている。上皮または間葉系の分子バイオマーカーは、これらの遺伝子によって発現される産物を含み、これらの変異体も含むが、これらは、例えば、発現されたｍＲＮＡもしくはタンパク質、スプライス変異体、翻訳中もしくは翻訳後修飾されたタンパク質、多型変異体などである。一つの実施形態において、バイオマーカーは、フィブロネクチン１遺伝子によって発現されるスプライス変異体である胎児性ＥＤＢ＋フィブロネクチンである（Ｋｉｌｉａｎ，Ｏ．ら、（２００４）Ｂｏｎｅ  ３５（６）：１３３４−１３４５）。この胎児性フィブロネクチンを測定することの考えられる利点は、間葉系様腫瘍を周囲の間質組織から容易に識別できる点である。表２には、本明細書に記載されている本発明の方法の一定の実施形態であって、上皮ケラチンおよび間葉系バイオマーカーであるビメンチンが同じようなレベルでの同時発現することが、間葉系細胞であることを示すものである実施形態を実施する際に使用することができる分子バイオマーカーの例をコードする遺伝子が列挙されている。これらの分子バイオマーカーは、これらの遺伝子によって発現される産物を含み、これらの変異体も含むが、これらは、例えば、発現されたｍＲＮＡもしくはタンパク質、スプライス変異体、翻訳中もしくは翻訳後修飾されたタンパク質、多型変異体などである。
【００７１】
本明細書記載の方法のいずれかの別の実施形態において、該方法において利用される間葉系バイオマーカーは、ヒト転写抑制因子であるＳｎａｉｌ（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：６６１５）、Ｚｅｂ１（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：６９３５）、Ｔｗｉｓｔ（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：７２９１）、Ｓｉｐ１（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：８４８７）、およびＳｌｕｇ（ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：６５９１）から選択される。
【００７２】
本発明の方法の別の実施形態において、間葉系バイオマーカーは、腫瘍細胞におけるＥＭＴの結果として転写が抑制される遺伝子のプロモーターのメチル化である。この方法では、高レベルの腫瘍細胞間葉系バイオマーカーは、該プロモーターのメチル化が容易に検出できること（例えば、プロモーターメチル化部位由来のメチル化特異的なＰＣＲ増幅核酸産物を検出する過程での強いシグナル）を本質的に意味し、一方、低レベルの腫瘍細胞間葉系バイオマーカーは、該プロモーターのメチル化が全く検出されないか低いこと（例えば、プロモーターメチル化部位由来のメチル化特異的なＰＣＲ増幅核酸産物を検出する過程でシグナルが全くないか比較的弱いこと）を本質的に意味する。この方法の一つの実施形態において、腫瘍細胞におけるＥＭＴの結果として転写が抑制される遺伝子は、Ｅ−カドヘリン遺伝子（即ち、ＣＤＨ１；ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：９９９）である。この方法の一つの実施形態において、腫瘍細胞におけるＥＭＴの結果として転写が抑制される遺伝子は、γ−カテニン遺伝子（即ち、ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：３７２８）である。この方法の別の実施形態において、腫瘍細胞におけるＥＭＴの結果として転写が抑制される遺伝子は、α−カテニン遺伝子（即ち、ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：１４９５、１４９６、または２９１１９）である。この方法の別の実施形態において、腫瘍細胞におけるＥＭＴの結果として転写が抑制される遺伝子は、サイトケラチン遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ：３８５６（ケラチン８）または３８７５（ケラチン１８））である。
【００７３】
本発明のいずれかの方法において用いることができる更なる上皮マーカーの例には、ホスホ−１４−３−３ε、１４−３−３γ（ＫＣＩＰ−１）、１４−３−３σ（ストラチフィン）、１４−３−３ζ／δ、ホスホセリン／スレオニンホスファターゼ２Ａ、４Ｆ２ｈｃ（ＣＤ９８抗原）、アデニンヌクレオチド輸送体２、アネキシンＡ３、ＡＴＰ合成酵素β鎖、リン酸化インスリンレセプター基質ｐ５３／ｐ５４、バシジン（ＣＤ１４７抗原）、リン酸化ＣＲＫ関連基質（ｐｌ３０Ｃａｓ）、Ｂｃｌ−Ｘ、リン酸化Ｐ−カドヘリン、リン酸化カルモジュリン（ＣａＭ）、カルパイン−２触媒サブユニット、カテプシンＤ、コフィリン−１、カルパイン小サブユニット１、カテニンβ１、カテニンδ１（ｐ２０カテニン）、シスタチンＢ、リン酸化ＤＡＺ関連タンパク質１、カルボニル還元酵素［ＮＡＤＰＨ］、ダイアファノス（Ｄｉａｐｈａｎｏｕｓ）関連ホルミン１（ＤＲＦｌ）、デスモグレイン−２、伸長因子１−δ、リン酸化ｐ１８５ｅｒｂＢ２、エズリン（ｐ８１）、リン酸化接着斑接着キナーゼ１、リン酸化ｐ９４−ＦＥＲ（ｃ−ＦＥＲ）、フィラミンＢ、リン酸化ＧＲＢ２関連結合タンパク質１、Ｒｈｏ−ＧＤＩα、リン酸化ＧＲＢ２、ＧＲＰ７８、グルタチオンＳ−転移酵素Ｐ、３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素、ＨＳＰ９０α、ＨＳＰ７０．１、ｅＩＦ３ｐ１０、ｅＩＦ−４Ｅ、白血球エラスターゼ阻害因子、インポルチン−４、インテグリンα６、インテグリンβ４、リン酸化サイトケラチン１７、サイトケラチン１９、サイトケラチン７、カゼインキナーゼＩα、タンパク質キナーゼＣ、δ、ピルビン酸キナーゼ、アイソザイムＭ１／Ｍ２、リン酸化エルビン（ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｂｉｎ）、ＬＩＭおよびＳＨ３ドメインタンパク質１（ＬＡＳＰ−１）、４Ｆ２１ｃ（ＣＤ９８軽鎖）、Ｌ−乳酸脱水素酵素Ａ鎖、ガレクチン−３、ガレクチン−３結合タンパク質、リン酸化ＬＩＮ−７（ｐｈｏｓｐｈｏ−ＬＩＮ−７）ホモログＣ、ＭＡＰ（ＡＰＣ結合タンパク質ＥＢ１）、マスピン前駆体（プロテアーゼ阻害因子５）、リン酸化Ｍｅｔチロシンキナーゼ（ＨＧＦ受容体）、混合系統白血病タンパク質２、モノカルボン酸輸送体４、リン酸化Ｃ−Ｍｙｃ結合タンパク質（ＡＭＹ−１）、ミオシン−９、ミオシン軽鎖ポリペプチド６、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニバン様（Ｎｉｂａｎ−ｌｉｋｅ）タンパク質（Ｍｅｇ−３）、オルニチンアミノトランスフェラーゼ、リン酸化オクルジン、ユビキチンチオールエステラーゼ、ＰＡＦアセチルヒドロラーゼＩＢβサブユニット、リン酸化分配欠損３（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ３）（ＰＡＲ−３）、リン酸化プログラム細胞死６−相互作用タンパク質、リン酸化プログラム細胞死タンパク質６、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、リン酸化プラコフィリン−２、リン酸化プラコフィリン−３、タンパク質ホスファターゼ１、ペルオキシレドキシン５、プロテアソーム活性化因子複合体サブユニット１、プロチモシンα、レチノイン酸誘導タンパク質３、リン酸化ＤＮＡ修復タンパク質ＲＥＶ１、リボヌクレアーゼ阻害因子、ＲｕｖＢ様１、Ｓ−１００Ｐ、Ｓ−１００Ｌ、カルサイクリン、Ｓ１００Ｃ、��ン酸化Ｓｅｃ２３Ａ、リン酸化Ｓｅｃ２３Ｂ、リソソーム膜タンパク質ＩＩ（ＬＩＭＰＩＩ）、ｐ６０−Ｓｒｃ、リン酸化アンプラキシン（Ａｍｐｌａｘｉｎ）（ＥＭＳ１）、ＳＬＰ−２、γ−シヌクレイン、腫瘍カルシウムシグナル伝達物質１、腫瘍カルシウムシグナル伝達物質２、トランスゲリン−２、トランスアルドラーゼ、チューブリンβ２鎖、翻訳制御（ＴＣＴＰ）、組織トランスグルタミナーゼ、膜貫通タンパク質Ｔｍｐ２１、ユビキチン結合酵素Ｅ２Ｎ、ＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ１、リン酸化ｐ６１−Ｙｅｓ、リン酸化タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−１、ＡＨＮＡＫ（デスモヨキン）、リン酸化ＡＴＰ合成酵素β鎖、リン酸化ＡＴＰ合成酵素δ、低温ショックドメインタンパク質Ｅ１、デスモプラキンＩＩＩ、プレクチン１、リン酸化ネクチン２（ＣＤｌ１２抗原）、リン酸化ｐｌ８５−Ｒｏｎ、リン酸化ＳＨＣ１、Ｅ−カドヘリン、Ｂｒｋ、γ−カテニン、α１−カテニン、α２−カテニン、α３−カテニン、ケラチン８、ケラチン１８、コネキシン３１、プラコフィリン３、ストラタフィン１（ｓｔｒａｔａｆｉｎ  １）、ラミニンα５、ＳＴ１４、および当分野で知られているその他の上皮バイオマーカーなどがある（例えば、米国特許出願公開２００７／０２１２７３８；米国特許出願６０／９２３，４６３；米国特許出願６０／９９７，５１４参照）。上皮バイオマーカーがリン酸化「タンパク質」である場合、タンパク質自体のリン酸化レベルではなく、タンパク質のリン酸化範囲が、ＥＭＴ後に変化するパラメーターである。これらのタンパク質のリン酸化レベルの変化も、このタンパク質の一つ以上のチロシン残基のリン酸化レベルが変化したせいであると理解されている（米国特許出願公開２００７／０２１２７３８）。
【００７４】
本発明のいずれかの方法において用いることができる更なる間葉系マーカーの例には、ＭＭＰ９（基質メタロプロテイナーゼ９；ＮＣＢＩ  ＧｅｎｅＩＤ番号：４３１８）、ＭＨＣクラスＩ抗原Ａ＊ｌ、アシルＣｏＡ不飽和化酵素、ＬＡＮＰ様タンパク質（ＬＡＮＰ−Ｌ）、アネキシンＡ６、ＡＴＰ合成酵素γ鎖、ＢＡＧファミリー分子シャペロン調節因子２、リン酸化水疱性類天疱瘡抗原、リン酸化タンパク質Ｃｌｏｒｆ７７、ＣＤＫｌ（ｃｄｃ２）、リン酸化クラスリン重鎖１、コンデンシン複合体サブユニット１，３，２−トランス−エノイルＣｏＡイソメラーゼ、ＤＥＡＨボックスタンパク質９、ルディメンタリー相同体（ｒｕｄｉｍｅｎｔａｒｙ  ｈｏｍｏｌｏｇ）のリン酸化エンハンサー、リン酸化フィブリラリン、ＧＡＰＤＨ（筋肉）、ＧＡＰＤＨ（肝臓）、シナプス糖タンパク質ＳＣ２、リン酸化ヒストンＨ１．０、リン酸化ヒストンＨ１．２、リン酸化ヒストンＨｌ．３、リン酸化ヒストンＨ１．４、リン酸化ヒストンＨ１．５、リン酸化ヒストンＨ１ｘ、リン酸化ヒストンＨ２ＡＦＸ、リン酸化ヒストンＨ２Ａ．ｏ、リン酸化ヒストンＨ２Ａ．ｑ、リン酸化ヒストンＨ２Ａ．ｚ、リン酸化ヒストンＨ２Ｂ．ｊ、リン酸化ヒストンＨ２Ｂ．ｒ、リン酸化ヒストンＨ４、リン酸化ＨＭＧ−１７様３、リン酸化ＨＭＧ−１４、リン酸化ＨＭＧ−１７、リン酸化ＨＭＧＩ−Ｃ、リン酸化ＨＭＧ−Ｉ／ＨＭＧ−Ｙ、リン酸化甲状腺受容体相互作用タンパク質７（ＴＲＩＰ７）、リン酸化ｈｎＲＮＰ  Ｈ３、ｈｎＲＮＰ  Ｃ１／Ｃ２、ｈｎＲＮＰ  Ｆ、リン酸化ｈｎＲＮＰ  Ｇ、ｅＩＦ−５Ａ、ＮＦＡＴ  ４５ｋＤａ、インポルチンβ３、ｃＡＭＰ依存性ＰＫ１ａ、ラミンＢ１、ラミンＡ／Ｃ、リン酸化ラミニンα３鎖、Ｌ−乳酸脱水素酵素Ｂ鎖、ガレクチン−１、リン酸化Ｆｅｚｌ、ヒアルロン酸結合タンパク質１、リン酸化微小管アクチン架橋因子１、メラノーマ関連抗原４、マトリン−３、リン酸輸送体タンパク質、ミオシン−１０、リン酸化Ｎ−アシルノイラミン酸シチジルトランスフェラーゼ、リン酸化ＮＨＰ２様タンパク質１、Ｈ／ＡＣＡ  リボ核タンパク質サブユニット１、核小体リンタンパク質ｐ１３０、リン酸化ＲＮＡ結合タンパク質Ｎｏｖａ−２、ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ）、ＮＡＤＨ−ユビキノン酸化還元酵素３９ｋＤａサブユニット、リン酸化ポリアデニル酸結合タンパク質２、プロヒビチン、プロヒビチン２、スプライシング因子Ｐｒｐ８、ポリピリミジントラクト結合タンパク質１、パラチモシン、Ｒａｂ−２Ａ、リン酸化ＲＮＡ結合タンパク質Ｒａｌｙ、推定ＲＮＡ結合タンパク質３、リン酸化６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２３、ｈｎＲＮＰ  Ａ０、ｈｎＲＮＰ  Ａ２／Ｂ１、ｈｎＲＮＰ  Ａ／Ｂ、Ｕ２核内低分子リボ核タンパク質Ｂ、リン酸化リアノジン受容体３、リン酸化スプライシング因子３Ａサブユニット２、ｓｎＲＮＰコアタンパク質Ｄ３、ネスプリン−１、チロシン−ｔＲＮＡリガーゼ、リン酸化タンキラーゼ１−ＢＰ、チューブリンβ３、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、リン酸化ｂＺＩＰ促進因子ＢＥＦ（Ａｌｙ／ＲＥＦ；Ｔｈｏ４）、ユビキチン、ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素５、ユビキノール−チトクロムｃ還元酵素、液胞タンパク質ソーティング１６、リン酸化ジンクフィンガータンパク質６４、リン酸化ＡＨＮＡＫ（デスモヨキン）、ＡＴＰ合成酵素β鎖、ＡＴＰ合成酵素δ鎖、リン酸化低温ショックドメインタンパク質Ｅｌ、リン酸化プレクチン１、ネクチン２（ＣＤｌ１２抗原）、ｐｌ８５−Ｒｏｎ、ＳＨＣｌ、ビメンチン、フィブロネクチン、フィブリリン−１、フィブリリン−２、コラーゲンα２（ＩＶ）、コラーゲンα２（Ｖ）、ＬＯＸＬｌ、ニドゲン、Ｃｌ１ｏｒｆ９，テネイシン、Ｎ−カドヘリン、胎児性ＥＤＢ＋フィブロネクチン、チューブリンα３、エピモルフィン、および当分野で知られているその他の間葉系バイオマーカーなどがある（例えば、米国特許出願公開２００７／０２１２７３８；米国特許出願６０／９２３，４６３；米国特許出願６０／９９７，５１４参照）。間葉系バイオマーカーがリン酸化「タンパク質」である場合、タンパク質自体のリン酸化レベルではなく、タンパク質のリン酸化範囲が、ＥＭＴ後に変化するパラメーターである。これらのタンパク質のリン酸化レベルの変化も、このタンパク質の一つ以上のチロシン残基のリン酸化レベルが変化したせいであると理解されている（米国特許出願公開２００７／０２１２７３８）。
【００７５】
上皮バイオマーカーおよび間葉系バイオマーカーの上記の表中のバイオマーカーは、ＥＭＴ後に発現量（即ち、リン酸化「タンパク質」についてはリン酸化レベル）が変化していると確認されている（例えば、米国特許出願公開２００７／０２１２７３８、この内容は参照されて本明細書に組み込まれる；米国特許出願公開２００６／０２１１０６０（２００６年３月１６日出願）；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．ら、（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（２０）９４５５−９４６２；およびＹａｕｃｈ，Ｒ．Ｌ．ら、（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．１１（２４）８６８６−８６９８参照）。
【００７６】
本発明の方法において、バイオマーカーの発現量は、ＥＭＴの過程を通して、または、分子バイオマーカーによって示される上皮転換状態または間葉系転換状態のいずれかを発現する腫瘍細胞を比較したときに、この発現量が一定のままである対照用分子（例えば、ＧＡＰＤＨ、βアクチン、チューブリンなどの「ハウスキーピング」遺伝子）と比較して評価することができる。また、バイオマーカーの発現量は、他の型の腫瘍細胞のバイオマーカー（即ち、間葉系と比較した場合の上皮）に対して、または同じ組織の非腫瘍細胞、もしくは測定用参照として用いられる別の細胞もしくは組織の由来におけるバイオマーカー量に対して評価することもできる。
【００７７】
本発明の方法において、腫瘍細胞によって発現された上皮バイオマーカーまたは間葉系バイオマーカーの量は、下記でより詳細に説明されているように、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、免疫沈降法、免疫ブロット法、免疫蛍光顕微鏡法、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、ＲＴ−ＰＣＲ法、インサイツ・ハイブリッド形成法、ｃＤＮＡマイクロアレイなど、当分野において知られている、遺伝子の発現量を測定するための標準的なバイオアッセイのいずれかを用いて評価することができる。これらの方法の一つの実施形態において、これらの使用は、特定の細胞集団を単離する方法、例えば、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）法と併用される。更なる実施形態において、ＦＡＣＳ解析を、免疫蛍光バイオマーカー（例えば、Ｅ−カドヘリン）標識化法と併用して、異なった上皮バイオマーカーまたは間葉系バイオマーカーを発現する細胞集団を単離・定量化することができ、その結果、例えば、ＥＭＴを起こした細胞の割合を推定することができる（例えば、Ｘｕ，Ｚ．ら、（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３（５）：３４３−３５０参照）。
【００７８】
本発明の方法において、腫瘍細胞の上皮バイオマーカーまたは間葉系バイオマーカーのインビボにおける発現量は、腫瘍生検を測定することによって、好ましくは評価される。一つの実施形態において、生検は、腫瘍の複数の領域から採取された試料、または腫瘍の異なった領域から試料を採取して、腫瘍が含む細胞型に関して腫瘍が異種の性質を持つ場合には、代表的な生検標本が得られるようにする方法（例えば、コアニードル生検）を含む。別の実施形態において、腫瘍が、これが含む細胞のＥＭＴ状態に関して不均一であり得るとみなされるため、本発明の方法は、好ましくは、異なった細胞型に別々に（例えば、ＩＨＣ法、または、特定の細胞集団を単離する工程と一体となった解析法を用いて）適用される。または、細胞表面の上皮および／または間葉系バイオマーカー抗体（例えば、Ｅ−カドヘリン）を使用することによって、ＦＡＣＳ解析法を用いて、ＥＭＴのさまざまな段階において、腫瘍細胞の数を単離・定量化することができる。
【００７９】
しかし、別の実施形態において、腫瘍細胞バイオマーカーは、腫瘍もしくは腫瘍細胞から発生する、検出可能レベルのバイオマーカーを含む体液または排出物で評価することができる。本発明において有用な体液または排出物は、血液、尿、唾液、糞便、胸膜液、リンパ液、痰、腹水、前立腺液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、またはその他任意の分泌物もしくはこの派生物などである。血液とは、全血、血漿、血清、またはあらゆる血液派生物を包含する意味である。このような体液または排出物における腫瘍上皮バイオマーカーもしくは腫瘍間葉系バイオマーカーの評価は、観血的サンプリング法が不適切であるか不都合である環境下では、時として好適なこともある。
【００８０】
腫瘍細胞の上皮バイオマーカーもしくは間葉系バイオマーカーの発現を評価するために、腫瘍細胞、またはこれらの腫瘍細胞によって産生されるタンパク質もしくは核酸を含む腫瘍試料を、本発明の方法において用いることができる。これらの実施形態において、バイオマーカーの発現量は、腫瘍細胞試料、例えば、動物から採取した腫瘍生検、または腫瘍から得られた材料（例えば、血液、血清、尿、またはその他、上記したような体液もしくは排出物）を含む別の試料中のマーカーの量（例えば、絶対量または濃度）を測定することによって評価することができる。細胞試料には、当然ながら、試料中のマーカー量を評価する前に、さまざまな周知の採取後の調製技術または貯蔵技術（例えば、核酸および／またはタンパク質の抽出法、固定法、貯蔵法、凍結法、限外ろ過法、濃縮法、泳動法、蒸発法、遠心分離法など）を施すことができる。同様に、腫瘍生検も、例えば、固定法など、採取後の調製技術または貯蔵技術を施すことができる。
【００８１】
インビボ試験における上皮バイオマーカーまたは間葉系バイオマーカーの量の測定は、上皮関連バイオマーカー（例えば、Ｅ−カドヘリン）または間葉系関連バイオマーカー（例えば、ビメンチン、Ｚｅｂ１）として分離するタンパク質を直接解析する方法など、幾つかの異なる方法によって評価することができる。この方法の利点は、ＥＭＴマーカーを直接読み取り、上皮または間葉系のバイオマーカーを発現する細胞集団の相対量を、例えば、ＦＡＣＳ解析法によって容易に調べて定量化することができる点にある（例えば、Ｘｕ，Ｚ．ら、（２００３）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３（５）：３４３−３５０参照）。しかし、この方法も、解析（例えば、免疫組織化学法）を行うためには十分な量の細胞または組織を必要とする。十分な量の組織を、ＦＮＡ（細針吸引）など一定の処理手順から得るのは困難であり得る。コア生検はより大量の組織を提供できるが、容易に入手できないこともある。または、これらのＥＭＴバイオマーカーは、定量ＰＣＲに基づいた方法を用いて、これらをコードするＲＮＡ転写物の発現量に基づいて評価することができ得る。この方法の利点は、この測定法には極めて僅かな腫瘍細胞しか必要とされない点であり、十分な材料は、ＦＮＡを介して得ることができる可能性が非常に高い。しかし、ここで、あるバイオマーカーの転写量は、腫瘍細胞からも、腫瘍由来の浸潤間質細胞からも得ることができる。間質細胞も間葉系細胞マーカーを発現することから、このことが、腫瘍細胞のＥＭＴ状態を検出することを困難にしている可能性がある。ここでは、インサイツ・ハイブリッド形成法（例えば、ＦＩＳＨ法）または組織マイクロダイセクション法を用いることが、この潜在的限界を克服するのに有用であり得る。
【００８２】
Ｅ−カドヘリンの発現量が腫瘍細胞のＥＭＴ状態を証明するものであることから、本明細書で説明しているように、Ｅ−カドヘリンプロモーターのメチル化状態に基づいて、ＥＭＴを評価することもできる。メチル化は転写を無効にするため、高レベルのメチル化は間葉系様状態と相関する。この方法が有益と考えられる点は、転写量の測定と同様、ＤＮＡのメチル化状態を測定には極めて少量の材料しか必要としない可能性が高いことである。十分な材料をＦＮＡから得られる可能性が高く、コア生検を必要としないと考えられる。さらに、この方法では、ＲＮＡではなくＤＮＡを評価するため、例えば、試料を培地中で保存したり、長期間保存したりという、長期間でも、より安定した読み取り結果となる可能性が高い。
【００８３】
本発明の方法において、腫瘍細胞の表面に提示される部分を少なくとも一つ有するバイオマーカータンパク質の発現を検出することができる。マーカータンパク質、またはこの一部が細胞表面上に露出しているか否かを判定するのは、当業者にとって簡単なことである。例えば、免疫学的方法を用いて、全細胞上でこのようなタンパク質を検出することもできるし、または周知のコンピュータによる配列解析法を用いて、少なくとも一つの細胞外ドメインの存在（即ち、分泌タンパク質および少なくとも一つの細胞表面ドメインを有するタンパク質など）を予測することもできる。マーカータンパク質を発現する細胞の表面上に、この少なくとも一部分が提示されるマーカータンパク質の発現は、必ずしも腫瘍細胞を溶解することなく検出することができる（例えば、該タンパク質の細胞表面ドメインに特異的に結合する標識抗体を用いる。）。
【００８４】
本発明で説明されているバイオマーカーの発現は、転写された核酸またはタンパク質を検出するためのさまざまな周知の方法によって評価することができる。このような方法の非限定的な例には、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞質タンパク質、または核タンパク質を検出する免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質の機能または活性の測定法、核酸ハイブリッド形成法、核酸逆転写法、および核酸精製法などがある。
【００８５】
一つの実施形態において、バイオマーカーの発現は、腫瘍細胞内（例えば、グリコシル化、リン酸化反応、メチル化など）で通常受ける翻訳後修飾の全部または一部を受けたバイオマーカータンパク質を含む、バイオマーカータンパク質またはこの断片と特異的に結合する抗体（例えば、放射性標識抗体、発色団標識抗体、フルオロフォア標識抗体、または酵素標識抗体）、抗体誘導体（例えば、基質を結合した抗体、またはタンパク質−リガンド対｛例えば、ビオチン−ストレプトアビジン対｝のタンパク質またはリガンドを結合した抗体）、または抗体断片（例えば、一本鎖抗体、単離抗体の超可変領域など）を用いて評価する。
【００８６】
別の実施形態において、バイオマーカーの発現を、腫瘍細胞からｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ（即ち、転写されたポリヌクレオチド）を調製し、および該ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡを、バイオマーカーの相補鎖である参照用ポリヌクレオチド、またはこの断片とハイブリッド形成させることにより評価する。ｃＤＮＡは、必要に応じて、参照用ポリヌクレオチドとハイブリッド形成させる前に、多様なポリメラーゼ連鎖反応法のいずれかを用いて増幅させてもよい。同様に、バイオマーカーの発現量を評価するために定量的ＰＣＲ法を用いて、一つ以上のバイオマーカーの発現を検出することも可能である。または、本発明のバイオマーカーの突然変異体もしくは変異体（例えば、単一ヌクレオチド多型、欠失など）を検出する数多くの既知の方法のいずれかを用いて、腫瘍細胞におけるバイオマーカーの発生を検出することも可能である。
【００８７】
関連する実施形態において、試料から得られた転写ポリヌクレオチドの混合物を、バイオマーカー核酸の少なくとも一部（例えば、少なくとも７個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、１００個、５００個、またはこれ以上のヌクレオチド残基）に相補的または相同であるポリヌクレオチドを固定している基質と接触させる。相補的であるか、または相同なポリヌクレオチドを基質上でそれぞれに検出できれば（例えば、異なる発色団もしくはフルオロフォアを用いて検出できるか、または選択された異なる位置に固定されたもの）、複数のバイオマーカーの発現量を、単一の基質（例えば、選択された位置に固定されたポリヌクレオチドの「遺伝子チップ」マイクロアレイ）を用いて同時に評価することができる。１個の核酸を別の核酸とハイブリッド形成させることを含む、バイオマーカー発現評価法を用いる場合、ハイブリッド形成は厳密なハイブリッド形成条件下で行うことが好ましい。
【００８８】
本発明の複数のバイオマーカーを本発明の方法において利用する場合、単一の反応混合物（即ち、各バイオマーカーについて、異なった蛍光プローブなどの試薬を用いる場合）か、またはバイオマーカーの一つ以上に対応する各別の反応混合物のいずれかにおいて、ＥＭＴを起こすよう誘導された腫瘍細胞の各バイオマーカーの発現量を、同一型の非誘導試料中の複数のバイオマーカーそれぞれの発現量と比較することができる。
【００８９】
生体試料の中のバイオマーカーであるタンパク質または核酸の有無を検出する方法の一例は、被験者から生体試料（例えば、腫瘍関連体液）を得ること、および該生体試料を、該ポリペプチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはｃＤＮＡ）を検出することが可能な化合物または作用剤と接触させることを含む。このようにして、本発明の検出法を用いて、インビトロおよびインビボにおいて、生体試料における、例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出することができる。例えば、ｍＲＮＡを検出するインビトロ技術は、ノーザンハイブリダイゼーション法およびインサイツ・ハイブリダイゼーション法などである。バイオマーカータンパク質を検出するインビトロ技術は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、および免疫蛍光法などである。ゲノムＤＮＡを検出するインビトロ手法は、サザンハイブリダイゼーション法などである。ｍＲＮＡを検出するインビボ技術は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、ノーザンハイブリダイゼーション法およびインサイツ・ハイブリダイゼーション法などである。さらに、バイオマーカータンパク質を検出するインビボ技術は、該タンパク質またはこの断片に対する標識抗体を被験対象の体内に導入することを含む。例えば、抗体を、対象内で存在および位置を標準的な画像法によって検出することが可能な放射性マーカーで標識してもよい。
【００９０】
このような診断アッセイ法および予後アッセイ法の一般原則は、バイオマーカー、およびプローブを含む可能性のある試料または反応混合物を、該バイオマーカーおよびプローブが相互作用して結合し、その結果、反応混合物中で取り出しおよび／または検出可能な複合体を形成するの適した条件下で、これに十分な時間をかけて調製することが含まれる。これらのアッセイ法は、さまざまな方法で行うことができる。
【００９１】
例えば、このようなアッセイ法を行うための一方法は、バイオマーカーもしくはプローブを、基質とも呼ばれる固相支持体に固着させること、および反応の最後に、固相支持体上に固着している標的バイオマーカー／プローブ複合体を検出することが含まれる。このような方法の一つの実施形態において、バイオマーカーの存在および／または濃度を測定しようとする被験対象から採取した試料を、担体または固相支持体上に固着させることができる。別の実施形態においては、逆の状況も可能である。即ち、プローブを固相に固着させ、被験対象から採取した試料を、アッセイにおける非固着成分として反応を行わせることができる。
【００９２】
アッセイ成分を固相に固着させるためには、確立された数多くの方法がある。これらに限定はないが、ビオチンとストレプトアビジンの結合を介して固定化されるバイオマーカー分子またはプローブ分子などがある。このようなビオチン化アッセイ成分は、当分野既知の技術（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１．）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル内に固定化することができる。一定の実施形態では、固定化アッセイ成分を有する表面を、予め調製し、保存することも可能である。
【００９３】
このようなアッセイ法に適したその他の担体または固相支持体には、バイオマーカーまたはプローブが属する分子クラスを結合することができる任意の材料などがある。周知の支持体または担体は、ガラス、ポリスチレン、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、アミラーゼ、天然セルロースおよび変性セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロ、ならびに磁鉄鉱などがある。
【００９４】
上記の方法によって測定を行うためには、非固定化成分を、第二の成分が固着している固相に加える。反応が完了した後、複合体を形成しなかった成分を、形成された複合体が固相上に固定化されたままになるような条件下で、（例えば、洗浄によって）除去することができる。固相に固着したバイオマーカー／プローブ複合体の検出は、本明細書に概説されている幾つかの方法で行うことができる。
【００９５】
一つの実施形態において、プローブが非固定化アッセイ成分である場合には、アッセイ結果を検出し、読み取るために、本明細書において検討されており、当業者に周知である検出可能な標識で直接的または間接的にプローブを標識することができる。
【００９６】
また、例えば、蛍光エネルギー移動法（即ち、ＦＥＴ、例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許番号５，６３１，１６９；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ，ら、米国特許番号４，８６８，１０３参照）を利用して、いずれの成分（バイオマーカーまたはプローブ）もこれ以上操作または標識することなしに、バイオマーカー／プローブ複合体の形成を直接検出することも可能である。第一の「ドナー」分子上のフルオロフォア標識は、適当な波長の入射光により励起こされると、この放出蛍光エネルギーが、第二の「受容体」分子上の蛍光標識によって吸収され、これが、次に吸収したエネルギーによって蛍光を発することができるよう選択される。または、「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の天然蛍光エネルギーを単に利用するだけの可能性がある。「受容体」分子の標識を、「ドナー」の標識と区別することできるよう、異なった波長の光を放出する標識が選択される。標識間のエネルギー移動効率は、分子を隔てる距離に関係するため、分子間の空間関係を評価することができる。分子間で結合が起こる状況では、アッセイ法における「受容体」分子標識の蛍光放出が最大となるはずである。ＦＥＴ結合事象は、当分野において周知の標準的な蛍光検出法により（例えば、蛍光光度計を用いて）簡便に測定することができる。
【００９７】
別の実施形態において、プローブのバイオマーカー認識能力の測定は、リアルタイム生体分子相互作用解析法（ＢＩＡ）（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ，１９９１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏら、１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５参照）を利用することによって、どちらのアッセイ成分（プローブまたはバイオマーカー）を標識しなくても行うことができる。本明細書において、「ＢＩＡ」または「表面プラズモン共鳴」は、どの反応成分（例えば、ＢＩＡコア）も標識することなく、生体特異的相互作用をリアルタイムで調べる技術のことである。結合表面における質量の変化（結合現象が起きたことを示す。）が、表面近くの屈折率の変化（表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）の光学現象）をもたらし、生体分子間におけるリアルタイムの反応を示すものとして使用することができる検出可能なシグナルを生じさせる。
【００９８】
または、別の実施形態において、液相中の溶質であるバイオマーカーおよびプローブを用いて、類似の診断アッセイ法および予後アッセイ法を行うことができる。このようなアッセイ法では、複合体形成したバイオマーカーとプローブを、分画遠心法、クロマトグラフィー、電気泳動、および免疫沈降などを含むが、これらに限定されない、数ある標準的な技術のいずれかによって、複合体形成していないバイオマーカーとプローブから分離する。分画遠心法では、複合体の大きさと密度の違いに基づいて、複合体の沈降平衡が異なるため、一連の遠心分離工程によって、バイオマーカー／プローブ複合体を、複合体形成していないアッセイ成分から分離することができる（例えば、Ｒｉｖａｓ，Ｇ．，およびＭｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．，１９９３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．１８（８）：２８４−７参照）。また、標準的なクロマトグラフィー技術を利用して、複合体形成した分子を複合体形成していない分子から分離することも可能である。例えば、ゲルろ過クロマトグラフィーによって、分子は大きさに基づいて分離されるため、適当なゲルろ過樹脂をカラム方式で用いることによって、例えば、比較的大きな複合体を、比較的小さな非複合体成分から分離することができる。同様に、非複合体成分と較べて、相対的に異なるバイオマーカー／プローブ複合体の荷電特性を利用して、例えば、イオン交換クロマトグラフィー用樹脂を利用することによって、複合体を形成していない成分から複合体を区別することができる。このような樹脂およびクロマトグラフィー技術は、当業者に周知である（例えば、Ｈｅｅｇａａｒｄ，Ｎ．Ｈ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．Ｗｉｎｔｅｒ  １１（ｌ−６）：１４１−８；Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．，およびＴｗｅｅｄ，Ｓ．Ａ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ  １９９７  Ｏｃｔ  １０；６９９（ｌ−２）：４９９−５２５参照）。また、ゲル電気泳動を用いて、複合体形成したアッセイ成分を、非結合成分から分離することも可能である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７−１９９９参照）。この技術では、タンパク質または核酸の複合体を、例えば、大きさまたは電荷に基づいて分離する。電気泳動処理の間、結合相互作用を維持するためには、還元剤を含まない非変性ゲル基質用の材料および条件が一般的には好適である。具体的なアッセイ法およびこの成分に適した条件は、当業者に周知である。
【００９９】
特定の実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡのレベルは、当分野において既知の方法を用いて、生体試料において、インサイツ方式でもインビトロ方式でも決定することができる。「生体試料」という用語は、被験対象から単離された組織、細胞、生体液、およびこれらを単離したもの、および被験対象の体内に存在する組織、細胞、体液を含むものである。多くの発現検出法では、単離されたＲＮＡが用いられる。インビトロ法では、腫瘍細胞からＲＮＡを精製するために、ｍＲＮＡの単離にとって不利になるような選択をしないＲＮＡ単離技術を利用することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７−１９９９参照）。また、多数の組織試料は、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ（１９８９、米国特許番号４，８４３，１５５）の一段階ＲＮＡ単離法など、当業者に周知の技術を用いて容易に処理することができる。
【０１００】
単離されたｍＲＮＡは、サザン分析法またはノーザン分析法、ポリメラーゼ連鎖反応解析法、およびプローブ測定法などが含まれるが、これらに限定されないハイブリッド形成アッセイ法および増幅アッセイ法で使用することができる。ｍＲＮＡレベルを検出するための好適な診断法は、単離ｍＲＮＡを、検出しようとしている遺伝子によってコードされているｍＲＮＡとハイブリッド形成することができる核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡ、または、この一部であって、例えば、長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチドであって、厳密な条件下で、本発明のバイオマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリッド形成するのに十分なオリゴヌクレオチドなどであってもよい。本発明の診断アッセイ法で使用するのに適した別のプローブは、本明細書に記載されている。ｍＲＮＡがプローブとハイブリッド形成することは、問題となっているバイオマーカーが発現されていることを意味する。
【０１０１】
一つの方式において、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で泳動し、このｍＲＮＡを、ゲルからニトロセルロースなどの膜に移すことによって、ｍＲＮＡを固相表面に固定化して、プローブに接触させる。別の方式では、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイにおいて、プローブを固相表面に固定化して、ｍＲＮＡをプローブ接触させる。当業者は、既知のｍＲＮＡ検出法を、本発明のバイオマーカーによってコードされるｍＲＮＡのレベルを検出する際に使用できるよう、容易に適合させることができる。
【０１０２】
試料中のｍＲＮＡバイオマーカーのレベルを測定するための別法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許番号４，６８３，２０２に記載された実験による実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９−１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル型複製（Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許番号５，８５４，０３３）、またはその他任意の核酸増幅法によって、核酸を増幅し、その後、当業者に周知の方法を用いて、増幅された分子を検出するという処理を含む。これらの検出工程は、核酸が非常に少数でしか存在しない場合に特に有用である。本明細書において、増幅用プライマーは、ある遺伝子の５’領域または３’領域（プラス鎖およびマイナス鎖、またはこの逆）にアニールすることができ、この間に短い領域を含む一対の核酸分子であると定義される。通常、増幅用プライマーは、長さ約１０〜３０ヌクレオチドであり、長さ５０〜２００ヌクレオチドの領域に隣接している。適当な条件下で、適当な試薬によって、このようなプライマーは、プライマーに隣接したヌクレオチド配列を含む核酸を増幅させることができる。
【０１０３】
インサイツ法では、ｍＲＮＡを、検出前に腫瘍細胞から単離する必要はない。このような方法では、既知の組織学的方法を用いて、細胞または組織の試料を調製／処理する。次いで、試料を支持体、一般的にはスライドガラスに固定化してから、バイオマーカーをコードするｍＲＮＡとハイブリッド形成することができるプローブに接触させる。
【０１０４】
バイオマーカーの絶対的な発現レベルに基づく測定法を行う代わりに、標準化されたバイオマーカー発現レベルに基づいて、測定を行うことができる。バイオマーカーの発現を、バイオマーカーではない遺伝子、例えば、恒常的に発現されているハウスキーピング遺伝子の発現と比較することによって、バイオマーカーの絶対的な発現レベルを補正して、発現レベルを標準化する。標準化するのに適した遺伝子は、アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子、または上皮細胞特異的遺伝子などである。この標準化によって、例えば、腫瘍細胞試料など一つの試料における発現レベルを、例えば、非腫瘍細胞など別の試料と比較したり、異なった由来の試料同士で比較したり、試料をＥＭＴの誘導の前後で比較すたりすることができるようになる。
【０１０５】
または、発現レベルは、相対的発現レベルとして提示することができる。バイオマーカー（例えば、間葉系バイオマーカー）の相対的発現レベルを決定するためには、このバイオマーカーの発現レベルを、１０以上の正常細胞単離株対癌細胞単離株について、好ましくは、５０以上の試料について、問題となっている試料の発現レベルを決定する前に測定する。数が多い方の試料で測定した遺伝子のそれぞれの平均発現レベルを決定し、これを、このバイオマーカーの基準発現レベルとして用いる。次いで、被験試料について測定されたバイオマーカーの発現レベル（発現の絶対的レベル）を、このバイオマーカーについて得られた平均発現値で除算する。これで、相対的発現レベルが提供される。
【０１０６】
本発明の別の実施形態において、バイオマーカータンパク質を検出する。本発明のバイオマーカータンパク質を検出するのに好適な作用剤は、このようなタンパク質またはこの断片に結合することができる抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルか、より好ましくは、モノクローナルである。完全な抗体、またはこの断片もしくは誘導体（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を用いることができる。プローブまたは抗体に関して、「標識された」という用語は、検出可能な物質を、プローブまたは抗体に結合する（即ち、物理的に連結する。）ことによって、プローブまたは抗体を直接標識すること、および、直接標識されている別の試薬との反応性によって、プローブまたは抗体を間接的に標識することを包含する意である。間接的標識の例は、蛍光標識された二次抗体を用いて一次抗体を検出すること、蛍光標識されたストレプトアビジンによって検出できるよう、ＤＮＡプローブをビオチンで末端標識することなどである。
【０１０７】
腫瘍細胞由来のタンパク質は、当業者に周知の技術を用いて単離することができる。用いられるタンパク質単離法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）に記載されているような方法であってもよい。
【０１０８】
さまざまな方式を用いて、試料が、所定の抗体に結合するタンパク質を含むか否かを判定することができる。このような方式の例には、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット分析法、および酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）があるが、これらに限定されない。当業者は、既知のタンパク質／抗体検出法を、腫瘍細胞が、本発明のバイオマーカーを発現するか否かの判定に使用するよう容易に適合させることができる。
【０１０９】
一つの方式において、抗体、または抗体の断片もしくは誘導体を、ウェスタンブロットまたは免疫蛍光技術などの方法で使用して、発現されたタンパク質を検出することができる。このような用途では、抗体またはタンパク質を固体支持体上に固定することが、通常は好ましい。適当な固相支持体または担体は、抗原または抗体に結合することができる任意の支持体などである。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然型および改変型のセルロース、ポリアクリルアミド、ガブロ、および磁鉄鉱などがある。
【０１１０】
当業者は、他にも数多くの、抗体または抗原を結合させるのに適した担体を知っていて、このような支持体を、本発明での使用に適合させることができるはずである。例えば、腫瘍細胞から単離されたタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で泳動させて、ニトロセルロースなどの固相支持体上に固定することができる。次いで、支持体を適当な緩衝液で洗い、その後、検出可能に標識された抗体を処置することができる。次に、固相支持体を緩衝液で二度洗いして、未結合の抗体を除去することができる。次に、従来からある手段によって、固体支持体上の結合標識の量を検出することができる。
【０１１１】
ＥＬＩＳＡ測定法では、特異的な結合対は、免疫型であっても非免疫型であってもよい。免疫特異的結合対の例は、抗原−抗体系、またはハプテン／抗ハプテン系である。フルオレセイン／抗フルオレセイン、ジニトロフェニル／抗ジニトロフェニル、ビオチン／抗ビオチン、ペプチド／抗ペプチドなどを挙げることもできる。特異的な結合対の抗体要素は、当業者によく知られた慣習的方法によって製造することができる。このような方法は、特異的な結合対の一方である抗原で動物を免疫することを含む。特異的な結合対の一方である抗原が非免疫型、例えば、ハプテンなどである場合、これを担体タンパク質に共有結合させて免疫型にすることができる。非免疫型結合対には、双方が、互いに対する天然の結合親和性を有するが、これらは抗体ではないという系が含まれる。非免疫型の結合対の例は、ビオチン−ストレプトアビジン、内因子−ビタミンＢ１２、葉酸−葉酸結合タンパク質などである。
【０１１２】
特異的結合対の構成分子によって抗体を共有結合的に標識するために、さまざまな方法を利用することができる。方法は、特異的結合対の構成分子の性質、所望の連結型、および、さまざまな共役化学法に対する抗体の耐性に基づいて選択される。市販の活性型誘導体を利用して、ビオチンを抗体に共有結合させることができる。これらの誘導体の中には、タンパク質のアミン基に結合するビオチン−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド；カルボジイミド結合を介して炭水化物成分、アルデヒド、およびにカルボキシル基に結合するビオチンヒドラジド；およびスルフヒドリル基に結合するビオチンマレイミドおよびヨードアセチルビオチンがある。フルオレセインは、フルオレセインイソチオシアナートを用いて、タンパク質のアミン基に結合させることができる。２，４−ジニトロベンゼン硫酸または２，４−ジニトロフルオロベンゼンを用いて、ジニトロフェニル基をタンパク質のアミン基に結合させることができる。ジアルデヒド、カルボジイミド共役、ホモ官能性（ｈｏｍｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）架橋、およびヘテロ二官能性架橋など、その他の標準的な共役法を用いて、モノクローナル抗体を、特異的結合対の構成分子に結合させることができる。カルボジイミド結合は、ある物質上のカルボキシル基を別の物質上のアミン基に結合させるのに有効な方法である。カルボジイミド結合は、市販の試薬１−エチル−３−（ジメチル−アミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いることにより促進される。
【０１１３】
二官能性イミドエステルおよび二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ二官能性架橋剤は市販されており、ある物質上のアミン基を、別のある物質上のアミン基に結合させるために使用される。ヘテロ二官能性架橋剤は、異なった官能基を有する試薬である。最も普通に市販されているヘテロ二官能性架橋剤は、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを一方の官能基としてもち、スルフヒドリル反応基をもう一方の官能基として有する。もっとも一般的なスルフヒドリル反応基は、マレイミド、ピリジルジスルフィド、および活性ハロゲンである。官能基の一方は、照射されるとさまざまな基と反応する光活性アリールナイトレンであってよい。
【０１１４】
検出可能に標識された抗体、または特異的結合対の検出可能に標識された構成分子は、リポーターに結合させることにより調製されるが、このリポーターは、放射性同位元素、酵素、発光性物質、化学発光性物質、または電気化学物質であってもよい。一般的に使用されている２種類の放射性同位元素は１２５Ｉおよび３Ｈである。標準的な放射性同位元素による標識方法は、例えば、１２５Ｉについては、クロラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼ法、およびＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ法、３Ｈについては還元メチル化法などである。「検出可能に標識された」という用語は、標識固有の酵素活性によって、または、別の成分の標識であって、これ自体を容易に検出できる標識に結合することによって容易に検出することができるような方法で標識されている分子を意味する。
【０１１５】
本発明において使用するのに適した酵素には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、蛍やウミシイタケなどのルシフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、ウレアーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、およびリゾチームがあるが、これらに限定されない。酵素標識は、抗体を特異的結合対の構成分子と結合させることについて上記したように、ジアルデヒド、カルボジイミド共役、ホモ二官能性架橋剤、およびヘテロ二官能性架橋剤を用いて容易に行うことができる。
【０１１６】
選択される標識方法は、酵素上、および標識すべき物質上で利用できる官能基と、これら両者の結合条件に対する耐性とに応じて決まる。本発明で使用する標識方法は、ＥｎｇｖａｌｌおよびＰｅａｒｌｍａｎｎ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８，８７１（１９７１），ＡｖｒａｍｅａｓおよびＴｅｒｎｙｎｃｋ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８，１１７５（１９７５），Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ４（３）：２０９−３２７（１９８３）、およびＪａｂｌｏｎｓｋｉ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４８：１９９（１９８５）に記載された方法など、現在一般に使用されている常法のいずれか一つであればよいが、これに限定されるものではない。
【０１１７】
標識は、スペーサー、または特異的結合対のもう一方の構成成分を用いるなど、間接的方法によって実施できる。この一例は、非標識ストレプタビジンおよびビオチン化酵素によるビオチン標識抗体の検出であるが、ここで、ストレプタビジンとビオチン化酵素は、連続的に添加されるか、同時に添加される。このように、本発明では、検出に使用する抗体を、リポーターで検出可能なように直接的に標識することも、特異的結合対の一方の構成分子で検出可能なように間接的に標識することも可能である。抗体を特異的結合対の一方の構成分子に結合する場合は、抗体と特異的結合対の一方の構成分子との複合体を、上記したように標識されているか、または標識されていないもう一方の結合対構成分子と反応させることによって検出を行う。
【０１１８】
さらに、非標識検出用抗体は、この非標識抗体を、この非標識抗体に特異的な標識抗体と反応させることによって検出できる。この場合、上記において、「検出可能に標識された」は、この非標識抗体に特異的な標識抗体が結合できるエピトープを含むことを意味するものと解される。このような抗抗体は、上記した方法のいずれかを用いて直接的または間接的に標識することができる。例えば、この抗抗体は、上記のストレプタビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ系と反応させることにより検出されるビオチンに結合することができる。
【０１１９】
本発明の一つの実施形態では、ビオチンが利用される。ビオチン化抗体は、次に、ストレプタビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体と反応させる。オルトフェニレンジアミン、４−クロロ−ナフトール、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＡＢＴＳ、ＢＴＳ、またはＡＳＡを使用して、発色による検出を行うことができる。
【０１２０】
本発明を実施するための一つの免疫アッセイ方式では、捕捉試薬が、通常の技術を用いて支持体の表面に固定されている順方向（ｆｏｒｗａｒｄ）サンドイッチアッセイ法を用いる。アッセイ法に用いられる適当な支持体には、ポリプロピレン、ポリスチレン、例えば、アミノ化ポリスチレンやカルボキシル化ポリスチレンなどの置換ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ガラスビーズ、アガロース、またはニトロセルロースなどの合成ポリマー支持体などがある。
【０１２１】
本明細書記載の方法によって同定される作用剤、および、腫瘍細胞が上皮から間葉系への転換を起こすのを阻害する作用剤、上皮から間葉系への転換を起こした腫瘍細胞を阻害する作用剤、または間葉系様腫瘍細胞を刺激して、上皮から間葉系への転換を起こさせる作用剤を含む組成物は、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療する方法に利用することができる。
【０１２２】
本明細書において、「患者」という用語は、任意の目的で抗癌剤による治療を必要としているヒトを好ましくは意味し、より好ましくは、癌、または前癌性の状態もしくは病変を治療するためにこのような治療を必要としているヒトを意味する。しかし、「患者」という用語は、ヒト以外の動物、好ましくは、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、および非ヒト霊長類などの哺乳動物であって、特に、抗癌剤による治療を必要としている動物を意味することもある。
【０１２３】
本明細書記載の任意の方法によって同定される抗癌剤（または、これらを含む組成物）を用いて、以下の腫瘍または癌のいずれかを治療することができる：ＮＳＣＬ、乳癌、結腸癌、もしくは膵臓癌、肺癌、細気管支肺胞癌、骨癌、皮膚癌、頭部もしくは頸部の癌、皮膚もしくは眼球内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、軟部組織肉腫、尿道癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、慢性もしくは急性の白血病、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン細胞腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫、上記癌の難治性のもの、または上記癌の一つ以上が併存するものを含む。
【０１２４】
本明細書において、「難治性」という用語は、治療（例えば、化学療法剤、生物剤、および／または放射線治療）が無効であることが分かっている癌を定義するために使用する。難治性癌の腫瘍も収縮することはあるが、この治療が有効だと判定できるところまでは収縮しない。しかし、一般的には、腫瘍は治療前と同じ大きさに留まる（安定性疾患）か、または増殖する（進行性疾患）。
【０１２５】
本明細書記載の任意の方法によって同定される抗癌剤（または、これらを含む組成物）を用いて、異常な細胞増殖を治療することができる。
【０１２６】
治療上有効な量の同定された作用剤を、例えば、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤および該作用剤と併用して該患者に投与する的確な方法は、担当医の裁量に任されていることを、医療技術分野における当業者は理解している。投薬量、別の抗癌剤との組み合わせ、投与の時期および投与回数などを含む投与方法は、例えば、患者が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して示す可能性が高い反応性の診断、および患者の状態および病歴によって影響され得る。従って、例えば、単剤としてのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦＲキナーゼ阻害剤に対して比較的感受性が高いと予想される腫瘍と診断された患者であっても、このような阻害剤と同定された作用剤との併用剤によって、必要に応じて、他の抗癌剤、またはキナーゼ阻害剤に対する感受性を変える可能性がある別の作用剤とを組み合わせた治療によって、なお恩恵を受ける可能性がある。
【０１２７】
本発明に関連して、作用剤または治療の「有効量」は上記で定義した通りである。作用剤または治療の「治療量以下の量」は、この作用剤または治療の有効量よりも少ない量であるが、別の作用剤または治療の有効量または治療量以下の量と組み合わせると、例えば、得られた有効な作用の相乗効果によって、または副作用の軽減によって、医師が所望する結果を生じることもある。
【０１２８】
さらに、本発明は、例えば、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤またはＩＧＦＲキナーゼ阻害剤と同定された作用剤とを併用して医薬上許容される担体に含む医薬組成物を提供する。
【０１２９】
また、本発明は、本明細書に記載された方法のいずれかによって調製される医薬組成物であって、腫瘍細胞が上皮から間葉系への転換を起こすのを阻害する作用剤、上皮から間葉系への転換を起こした腫瘍細胞を阻害する作用剤、または間葉系様腫瘍細胞を刺激して、上皮から間葉系への転換を起こさせる作用剤であって、本明細書記載の方法のいずれかによって同定されたもの（即ち、「同定した作用剤」）を、医薬上許容される担体とともに、および、必要に応じて、一種類以上の他の抗癌剤（例えば、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ−ＩＲ、ＲＯＮ受容体、またはＭＥＴ受容体のチロシンキナーゼ阻害剤）とともに含む医薬組成物も包含する。
【０１３０】
医薬組成物を調整する方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９０）に記載されているように、当分野において公知である。
【０１３１】
好ましくは、組成物は、医薬上許容される担体と、非毒性で治療上有効量の同定された作用剤（これら成分の医薬上許容される塩を含む。）とからなる。
【０１３２】
さらに、この好適な実施形態の範囲内で、本発明は、病気を治療するための医薬組成物であって、この使用が、新生細胞、良性および悪性の腫瘍の増殖、または転移の阻害をもたらし、医薬上許容される担体と、非毒性で治療上有効量の同定された作用剤（これら成分の医薬上許容される塩を含む。）を含む医薬組成物を包含する。
【０１３３】
「医薬上許容される塩］という用語は、医薬上許容される非毒性の塩基または酸から調製される塩を意味する。本発明の化合物が酸性の場合、これに対応する塩は、無機塩基および有機塩基などの医薬上許容される非毒性の塩基から適宜調製することができる。このような無機塩基から得られる塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅（二価または一価）、三価鉄、ニ価鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン（三価またはニ価）、カリウム、ナトリウム、亜鉛などの塩が含まれる。特に好ましいのは、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウムおよびナトリウム塩である。医薬上許容される非毒性の有機塩基から得られる塩には、一級、二級、および三級のアミン類、ならびに環状アミン、および天然型および合成型の置換アミンなどの置換アミン類が含まれる。塩を形成させることができるその他の医薬上許容される非毒性の塩基には、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどのイオン交換樹脂が含まれる。
【０１３４】
本発明の化合物が塩基性の場合、これに対応する塩は、無機酸および有機酸などの医薬上許容される非毒性の酸から適宜調製することができる。このような酸には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、スクシン酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが含まれる。特に好適なのは、クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸、および酒石酸である。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、同定された作用剤（この医薬上許容される塩を含む。）を活性成分として、医薬上許容される担体、および必要に応じて、その他の治療成分またはアジュバントを含む。その他の治療成分には、細胞傷害性剤、化学療法剤、もしくは抗癌剤、または、このような作用剤の効果を高める、上に列挙したような薬剤などがあろう。該組成物は、経口投与、直腸投与、局所投与、および非経口投与（皮下投与、筋内投与、および静脈内投与など）に適した組成物を含む。ただし、いずれの場合にも、最も適した経路は、具体的な被投与者、ならびに活性成分が投与される症状の性質および重度に応じて決定される。医薬組成物は、単位剤形にして適宜提示し、医薬分野で公知の方法のいずれかによって調製することができる。
【０１３６】
実際には、本発明の同定された作用剤（この医薬上許容される塩を含む。）は活性成分として、通常の医薬配合技術による医薬用担体と組み合わせて密な混合剤（ｉｎｔｉｍａｔｅ  ａｄｍｉｘｔｕｒｅ）にすることができる。担体は、例えば、経口投与または非経口投与（静脈内投与など）などの投与に望ましい調製物の形態に応じて、非常に多様な形態を採ることができる。そのため、本発明の医薬組成物は、それぞれが所定量の活性成分を含むカプセル剤、カシェ剤、または錠剤など、経口投与に適した個別単位として提供することができる。さらに、組成物は、粉末剤、顆粒剤、溶液剤、水性液体中の懸濁液、非水性液剤、水中油型乳剤、または油中水型乳剤として提供することもできる。上記の一般的剤形以外にも、同定された作用剤（この医薬上許容される塩を含む。）は、徐放手段および／または送達装置によって投与することも可能である。複合組成物は、任意の薬学的方法によって調製することができる。通常、このような方法は、活性成分を、一つ以上の必須成分を構成する担体と結合させる工程を含む。通常、この組成物は、活性成分を、液状担体または微粉化した担体またはこの両方と均一および念入りに混合して調製する。次いで、生成物を、所望の体裁になるよう適宜成形することができる。
【０１３７】
従って、本発明の医薬組成物は、医薬上許容される担体、および同定された作用剤（この医薬上許容される塩を含む。）の併用剤を含むことができる。また、同定された作用剤（この医薬上許容される塩を含む。）を、一種類以上の別の治療的に活性な化合物と組み合わせて医薬組成物に含ませることもできる。別の治療的に活性な化合物は、細胞傷害性剤、化学療法剤、もしくは抗癌剤、または、このような作用剤の効果を高める、上に列挙したような薬剤などが含まれよう。
【０１３８】
従って、本発明の一実施形態において、医薬組成物は、同定された作用剤を、抗癌剤と組み合わせて含むことができる。ここで、該抗癌剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、ポドフィロトキシン、抗生物質、ニトロソウレア、ホルモン療法剤、キナーゼ阻害剤、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、および血管新生阻害剤からなる群から選択される作用剤である。
【０１３９】
使用される医薬用担体は、例えば、固体、液体、または気体であってもよい。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシアゴム、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸などである。液体担体の例は、砂糖シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、および水である。気体担体の例は、二酸化炭素および窒素などである。
【０１４０】
経口剤形用の組成物を調製する際には、任意の便利な医薬用培地を用いることができる。例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤などを用いて、懸濁液、エリキシル、および溶液などの経口液体調合剤を作成することができ、他方、澱粉、砂糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの担体を用いて、粉末剤、カプセル剤、および錠剤などの固体調合剤を作成することができる。投与するのが容易だという理由で、錠剤およびカプセル剤が好適な経口剤形であり、そのため、固体の医薬用担体が用いられる。必要に応じて、標準的な水性技術または非水性技術によって錠剤を被覆することもできる。
【０１４１】
本発明の組成物を含む錠剤は、必要に応じて一種類上の補助成分またはアジュバントとともに圧縮または成形によって調製することができる。圧縮錠は、適当な機械で、粉末や顆粒などの自由流動形態の活性成分を、必要に応じて、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤、または分散剤と混合したものを圧縮することにより調製することができる。成形錠は、適当な機械で、不活性希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を成形して作成することができる。各錠剤は、活性成分約０．０５ｍｇ〜約５ｇを好ましくは含み、各カシェ剤またはカプセル剤は、活性成分約０．０５ｍｇ〜約５ｇを好ましくは含む。
【０１４２】
例えば、ヒトに経口投与するための処方剤は、全組成物の約５パーセント〜約９５パーセントまで変動し得る適当量および適宜量の担体物質と配合して、活性成分約０．０５ｍｇ〜約５ｇを含むことができる。単位剤形は、活性成分を通常約１ｍｇ〜約２ｇ、一般的には２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、または１０００ｍｇ含んでいる。
【０１４３】
非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、活性化合物の水中の溶液または懸濁液として調製することができる。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなど、適当な界面活性剤を含ませることもできる。また、分散剤も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの油中混合物の中で調製することができる。さらに、保存剤を含ませて、微生物の有害な増殖を抑えることも可能である。
【０１４４】
注射用に適した本発明の医薬組成物は、滅菌水溶液または滅菌分散剤などである。さらに、この組成物は、このような注射用の滅菌水溶液または滅菌分散剤を即時調製するための滅菌粉末剤の形状になっていてもよい。すべての場合、最終注射用剤形は、滅菌されていなければならず、容易に注入できるよう実質的に流動的でなければならない。医薬組成物は、製造および保存の条件下で安定していなければならないため、好ましくは、細菌や菌類などの微生物の混入行為から保護する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、植物油、およびこれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。
【０１４５】
本発明の医薬組成物は、例えば、エアロゾル、クリーム、軟膏、ローション、散布剤など、局所使用に適した形態にすることもできる。さらに、この組成物は、経皮用装置で使用するのに適した形態にすることもできる。これらの処方剤は、本発明の同定された作用剤（この医薬上許容される塩を含む。）を利用して、通常の処理法によって調製することができる。一例として、クリーム剤または軟膏は、化合物約５重量％〜約１０重量％とともに、親水性材料を水と混合して、所望の稠度をもったクリーム剤または軟膏を製造することにより調製される。
【０１４６】
本発明の医薬組成物は、担体が固体である、直腸投与に適した形態にすることができる。この混合物は、単位用量の坐薬であることが好ましい。適当な担体は、ココアバターおよびその他、当分野において一般的に使用される材料などである。坐薬は、まず、組成物を、軟化または融解した担体と混合した後、鋳型に入れて冷却および成形することにより、適宜作成することができる。
【０１４７】
上記担体成分以外にも、上記医薬処方剤は、適当であれば、希釈剤、緩衝剤、香味剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、保存剤（抗酸化剤を含む。）など、一種類以上の更なる担体成分を含むことができる。さらに、別のアジュバントを含ませて、処方剤が、目的とするレシピエントの血液と等張になるようにすることもできる。また、同定された作用剤（この医薬上許容される塩を含む。）を含む組成物は、粉末または液体の濃縮形態で調製することも可能である。
【０１４８】
本発明に関し、他の抗癌剤には、例えば、他の細胞傷害性剤、化学療法剤、もしくは抗癌剤、または、このような作用剤の効果を高める化合物、抗ホルモン剤、血管新生阻害剤、腫瘍細胞のプロアポトーシス剤もしくはアポトーシス促進剤、シグナル伝達阻害剤、抗増殖剤、抗ＨＥＲ２抗体もしくはこの免疫療法活性断片、または抗増殖剤、ＣＯＸ  ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤、および抗腫瘍免疫応答を促進することができる作用剤などが含まれる。
【０１４９】
本発明に関し、他の細胞傷害性剤、化学療法剤、もしくは抗癌剤、または、このような作用剤の効果を高める化合物には、例えば、以下のものがある：アルキル化剤、またはアルキル化作用を有する作用剤、例えば、シクロホスファミド（ＣＴＸ；例えばＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））、クロラムブシル（ＣＨＬ；例えばＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））、シスプラチン（ＣｉｓＰ；例えばＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標））、ブスルファン（例えばＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣなど；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ１６；例えばＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標））、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオグアニン（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（例えば．ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）など；抗生物質、例えば、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；例えばＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンなど；アルカロイド、例えば、ビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチンなどのビンカアルカロイド；およびその他の抗腫瘍剤、例えば、パクリタキセル（例えばＴＡＸＯＬ（登録商標））およびパクリタキセル誘導体、細胞分裂阻害剤、デキサメタゾン（ＤＥＸ；例えばＤＥＣＡＤＲＯＮ（登録商標））などのグルココルチコイド、プレドニゾンなどの副腎皮質ステロイド、ヒドロキシウレアなどのヌクレオシド酵素阻害剤、アスパラギナーゼなどのアミノ酸除去酵素、ロイコボリンおよびその他の葉酸誘導体など、多様な抗腫瘍剤。以下の作用剤も、更なる作用剤として使用することができる：アルニフォスチン（例えばＥＴＨＹＯＬ（登録商標））、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシンリポ（例えばＤＯＸＩＬ（登録商標））、ゲムシタビン（例えばＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ダウノルビシンリポ（例えばＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル（例えばＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ  １１（イリノテカン）、１０−ヒドロキシ７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロキスリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンβ、インターフェロンα、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メラファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロランブシル。
【０１５０】
本明細書において、「抗ホルモン剤」という用語は、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するよう作用する天然型または合成型の有機化合物またはペプチド化合物を含む。抗ホルモン剤には、例えば、以下のものがある：ステロイド受容体アンタゴニスト、抗エストロゲン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、その他のアロマターゼ阻害剤、４２−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびトレミフェン（例えばＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））；抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；ならびに上記のいずれかの医薬上許容される塩、酸、または誘導体；糖タンパク質ホルモンのアゴニストおよび／またはアンタゴニスト、例えば卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ならびに黄体形成ホルモン（ＬＨ）およびＬＨＲＨ（黄体形成ホルモン放出ホルモン）；ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標）（Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）として市販されている、ＬＨＲＨアゴニストである酢酸ゴセレリン；ＬＨＲＨアンタゴニストであるＤ−アラニンアミドＮ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−アラニル−４−クロロ−Ｄ−フェニルアラニル−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−アラニル−Ｌ−セリル−Ｎ６−（３−ピリジニルカルボニル）−Ｌ−リジル−Ｎ６−（３−ピリジニルカルボニル）−Ｄ−リジル−Ｌ−ロイシル−Ｎ６−（１−メチルエチル）−Ｌ−リジル−Ｌ−プロリン（例えばＡＮＴＩＤＥ（登録商標）、Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ）；ＬＨＲＨアンタゴニストである酢酸ガニレリックス；ステロイド性抗アンドロゲン剤である酢酸シプロテロン（ＣＰＡ）および酢酸メゲストロール、これはＭＥＧＡＣＥ（登録商標）として市販されている（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）；非ステロイド性抗アンドロゲン剤であるフルタミド（２−メチル−Ｎ−［４，２０−ニトロ−３−（トリフルオロメチル）フェニルプロパンアミド）、これはＥＵＬＥＸＩＮ（登録商標）として市販されている（Ｓｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）；非ステロイド性抗アンドロゲン剤であるニルタミド、（５，５−ジメチル−３−［４−ニトロ−３−（トリフルオロメチル−４’−ニトロフェニル）−４，４−ジメチル−イミダゾリジン−ジオン）；および、例えばＲＡＲ、ＲＸＲ、ＴＲ、ＶＤＲなど、他の非許容性受容体（ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に対するアンタゴニスト。
【０１５１】
血管新生阻害剤には、例えば、以下のものがある：ＶＥＧＦＲ阻害剤、例えばＳＵ−５４１６およびＳＵ−６６６８（Ｓｕｇｅｎ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、または、例えば国際出願番号：ＷＯ９９／２４４４０、ＷＯ９９／６２８９０、ＷＯ９５／２１６１３、ＷＯ９９／６１４２２、ＷＯ９８／５０３５６、ＷＯ９９／１０３４９、ＷＯ９７／３２８５６、ＷＯ９７／２２５９６、ＷＯ９８／５４０９３、ＷＯ９８／０２４３８、ＷＯ９９／１６７５５、およびＷＯ９８／０２４３７、ならびに米国特許番号５，８８３，１１３、５，８８６，０２０、５，７９２，７８３、５，８３４，５０４、および６，２３５，７６４に記載されているもの；ＶＥＧＦ阻害剤、例えばＩＭ８６２（（Ｃｙｔｒａｎ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｋｉｒｋｌａｎｄ，Ｗａｓｈ．，ＵＳＡ）；Ｒｉｂｏｚｙｍｅ社（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏ．）およびＣｈｉｒｏｎ社（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）の合成リボザイムであるアンギオザイム；およびＶＥＧＦに対する抗体、例えば、ＶＥＧＦに対する組換えヒト化抗体であるベバシズマブ（例えばＡＶＡＳＴＩＮ（商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）；インテグリン受容体アンタゴニストおよびインテグリンアンタゴニスト、例えばαｖβ３インテグリン、αｖβ５インテグリン、およびαｖβ６インテグリン、およびこれらのサブタイプに対するアンタゴニスト、例えばシレンギチド（ＥＭＤ１２１９７４）、または抗インテグリン抗体、例えばαｖβ３特異的ヒト化抗体（例えばＶＩＴＡＸＩＮ（登録商標））；ＩＦＮ−αなどの因子（米国特許番号４１５３０，９０１、４，５０３，０３５、および５，２３１，１７６）；アンギオスタチンおよびプラスミノーゲン断片（例えばクリングル１−４、クリングル５、クリングル１−３（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら、（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７９：３１５−３２８；Ｃａｏら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９４６１−２９４６７；Ｃａｏら、（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２２９２４−２２９２８）；エンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら、（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８：２７７；および国際特許公開番号ＷＯ９７／１５６６６）；トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１；Ｆｒａｚｉｅｒ，（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：７９２）；血小板因子４（ＰＦ４）；プラスミノーゲン活性化因子／ウロキナーゼ阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；ヘパリナーゼ；フマギリン類似体、例えばＴＮＰ−４７０１；スラミンおよびスラミン類似体；血管新生抑制ステロイド剤；ｂＦＧＦアンタゴニスト；ｆｌｋ−１アンタゴニストおよびｆｌｔ−１アンタゴニスト；血管新生阻害剤、例えばＭＭＰ−２（マトリックスメタロプロテイナーゼ２）阻害剤およびＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテイナーゼ９）阻害剤。マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤の例は、国際特許公開番号ＷＯ９６／３３１７２、ＷＯ９６／２７５８３、ＷＯ９８／０７６９７、ＷＯ９８／０３５１６、ＷＯ９８／３４９１８、ＷＯ９８／３４９１５、ＷＯ９８／３３７６８、ＷＯ９８／��０５６６、ＷＯ９０／０５７１９、ＷＯ９９／５２９１０、ＷＯ９９／５２８８９、ＷＯ９９／２９６６７、およびＷＯ９９／０７６７５、欧州特許公開番号ＥＰ８１８，４４２、ＥＰ７８０，３８６、ＥＰ１，００４，５７８、ＥＰ６０６，０４６、およびＥＰ９３１，７８８；英国特許公開番号ＧＢ９９１２９６１、ならびに米国特許番号５，８６３，９４９、および５，８６１，５１０に記載されている。好適なＭＭＰ−２阻害剤およびＭＭＰ−９阻害剤は、ＭＭＰ−１を阻害する活性がほとんどないか、全くないものである。より好ましくは、他のマトリックスメタロプロテイナーゼ（即ちＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−５、ＭＭＰ−６、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３）と比較して、ＭＭＰ−２および／またはＭＭＰ−９を選択的に阻害するものである。
【０１５２】
シグナル伝達阻害剤には、例えば、以下のものがある：ｅｒｂＢ２受容体阻害剤、例えばｅｒｂＢ２受容体に結合する有機分子または抗体、例えばトラスツズマブ（例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））；他のタンパク質チロシンキナーゼの阻害剤、例えばイミチニブ（例えばＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））；ｒａｓ阻害剤；ｒａｆ阻害剤；ＭＥＫ阻害剤；ｍＴＯＲ阻害剤；サイクリン依存性キナーゼ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤；およびＰＤＫ−１阻害剤（このような阻害剤の幾つかの例の説明、および癌治療のための臨床治験におけるこれらの使用については、Ｄａｎｃｅｙ，Ｊ．およびＳａｕｓｖｉｌｌｅ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２：９２−３１３を参照）。
【０１５３】
ＥｒｂＢ２受容体阻害剤には、例えば、以下のものがある：ＥｒｂＢ２受容体阻害剤、例えばＧＷ−２８２９７４（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  ｐｌｃ）、ＡＲ−２０９（Ａｒｏｎｅｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘ．，ＵＳＡ）および２Ｂ−１（Ｃｈｉｒｏｎ）などのモノクローナル抗体、ならびにｅｒｂＢ２阻害剤、例えば、国際特許公開番号ＷＯ９８／０２４３４、ＷＯ９９／３５１４６、ＷＯ９９／３５１３２、ＷＯ９８／０２４３７、ＷＯ９７／１３７６０、およびＷＯ９５／１９９７０、ならびに米国特許番号５，５８７，４５８、５，８７７，３０５、６，４６５，４４９、および６，５４１，４８１に記載されたもの。
【０１５４】
抗増殖剤には、例えば、以下のものがある：酵素ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼの阻害剤、および受容体チロシンキナーゼＰＤＧＦＲの阻害剤であって、米国特許番号６，０８０，７６９、６，１９４，４３８、６，２５８，８２４、６，５８６，４４７、６，０７１，９３５、６，４９５，５６４、６，１５０，３７７、６，５９６，７３５、および６，４７９，５１３、ならびに国際特許公開ＷＯ０１／４０２１７に開示されて、特許請求されている化合物などがある。また、抗増殖剤には、受容体チロシンキナーゼであるＩＧＦ−ＩＲおよびＦＧＦＲの阻害剤も含まれる。
【０１５５】
有用なＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の例は、アレコキシブ（例えば、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標））、バルデコキシブ、およびロフェコキシブなどである。抗腫瘍免疫応答を増強することができる作用剤には、例えば、以下のものがある：抗ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４）抗体（例えばＭＤＸ−ＣＴＬＡ４）、およびＣＴＬＡ４を阻止できる他の作用剤。本発明で使用できる具体的なＣＴＬＡ４抗体は、米国特許番号６，６８２，７３６に記載されたものなどである。
【０１５６】
さらに、本発明は、患者における腫瘍または腫瘍転移を治療する方法であって、治療上有効な量の、本明細書上記記載の同定された作用剤、および任意に、一種類以上の別の抗癌剤を、同時または連続的に患者に投与することを含む方法を提供する。
【０１５７】
本発明の同定された作用剤の投与量は、本明細書に記載した通りであるが、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時期、投与経路、排泄率、併用剤、および治療を受けている具体的な病気の重篤度などに応じて決まる。
【０１５８】
上記した細胞傷害性抗癌剤およびその他の抗癌剤を化学療法計画で使用することは、癌治療技術分野において、通常十分に特徴が分かっているため、これらの使用は、本明細書において、耐性および有効性を観察するため、および投与経路および投与量を調節するために、いくらかの調整を行いつつ同じように検討される。例えば、細胞傷害性剤の実際の投与量は、組織培養法を用いて判定された患者の培養細胞の応答によって変動し得る。通常、付加的な別の薬剤を使用しない場合に使用される量に較べて、この投与量は少なくなる。
【０１５９】
有効な細胞傷害性剤の一般的な投与量は、製造業者が推奨する範囲内にあるが、インビトロにおける応答、または動物モデルにおける応答によって示された場合には、約一桁少ない濃度または量まで低減することができる。このように、実際の投与量は、医師の判断、患者の状態、および初代培養悪性細胞または組織培養試料のインビトロにおける応答性、または適当な動物モデルで観察された応答によって決定される。
【０１６０】
本明細書において、「ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤」という用語は、当分野において現在知られているか、または将来同定されるＥＧＦＲキナーゼ阻害剤を意味し、患者に投与すると、患者の体内でＥＧＦ受容体の活性化に関連する生物学的活性の阻害をもたらす任意の化学物質を含む。ここで、生物学的活性は、投与がなければ、天然のリガンドがＥＧＦＲに結合して生じる下流のあらゆる生物学的作用を含む。このようなＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲの活性化を阻止するか、または患者の癌を治療することと関連したＥＧＦＲ活性化の下流にある任意の生物学的作用を阻止することができる任意の作用剤を含む。このような阻害剤は、受容体の細胞内ドメインに直接結合して、このキナーゼ活性を阻害することにより作用することができる。または、このような阻害剤は、ＥＧＦ受容体のリガンド結合部位またはこの一部を占領することによって作用して、受容体の天然リガンドが受容体に接触できないようにし、その結果、正常な生物学的活性を妨害または低下させる。または、このような阻害剤は、ＥＧＦＲポリペプチドの二量体化、またはＥＧＦＲポリペプチドと別のタンパク質との相互作用を調節することによって作用するか、またはＥＧＦＲのユビキチン化およびＥＧＦＲのエンドサイトーシスによる分解を増強する。ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、低分子阻害剤、抗体もしくは抗体断片、ペプチドもしくはＲＮＡアプタマー、アンチセンス構築物、低分子阻害性ＲＮＡ（即ちｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）、およびリボザイムがあるが、これらに限定されない。好適な実施形態において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する有機低分子または抗体である。
【０１６１】
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、例えば、キナゾリンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピリド−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピリミド−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピロロ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、ピラゾロ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、フェニルアミノ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、オキシンドールＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、インドロカルバゾールＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、フタラジンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、イソフラボンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、キナロンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤、およびチロホスチンＥＧＦＲキナーゼ阻害剤などであり、例えば、以下の特許公報に記載されているもの、およびこれらＥＧＦＲキナーゼ阻害剤のすべての医薬上許容される塩と溶媒和物とを含む：国際特許公開番号ＷＯ９６／３３９８０、ＷＯ９６／３０３４７、ＷＯ９７／３００３４、ＷＯ９７／３００４４、ＷＯ９７／３８９９４、ＷＯ９７／４９６８８、ＷＯ９８／０２４３４、ＷＯ９７／３８９８３、ＷＯ９５／１９７７４、ＷＯ９５／１９９７０、ＷＯ９７／１３７７１、ＷＯ９８／０２４３７、ＷＯ９８／０２４３８、ＷＯ９７／３２８８１、ＷＯ９８／３３７９８、ＷＯ９７／３２８８０、ＷＯ９７／３２８８、ＷＯ９７／０２２６６、ＷＯ９７／２７１９９、ＷＯ９８／０７７２６、ＷＯ９７／３４８９５、ＷＯ９６／３１５１０、ＷＯ９８／１４４４９、ＷＯ９８／１４４５０、ＷＯ９８／１４４５１、ＷＯ９５／０９８４７、ＷＯ９７／１９０６５、ＷＯ９８／１７６６２、ＷＯ９９／３５１４６、ＷＯ９９／３５１３２、ＷＯ９９／０７７０１、およびＷＯ９２／２０６４２；欧州特許出願番号ＥＰ５２０７２２、ＥＰ５６６２２６、ＥＰ７８７７７２、ＥＰ８３７０６３、およびＥＰ６８２０２７；米国特許番号５，７４７，４９８、５，７８９，４２７、５，６５０，４１５、および５，６５６，６４３；および独国特許出願番号ＤＥ１９６２９６５２。低分子ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤のさらなる非限定的な例には、Ｔｒａｘｌｅｒ，Ｐ．，１９９８，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ  ８（１２）：１５９９−１６２５に記載されたＥＧＦＲキナーゼ阻害剤がある。
【０１６２】
本発明において使用可能な低分子ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の具体的な好適例は、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（ＯＳＩ−７７４、エルロチニブ、またはＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（塩酸エルロチニブ）としても知られている；ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）（米国特許番号５，７４７，４９８；ＷＯ０１／３４５７４、およびＭｏｙｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４８３８−４８４８）；ＣＩ−１０３３（以前はＰＤ１８３８０５として知られていた；Ｐｆｉｚｅｒ）（Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、１９９９，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４０：７２３）；ＰＤ−１５８７８０（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ−１４７８（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＣＧＰ−５９３２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）；ＧＷ−２０１６（ＧＷ−５７２０１６またはジトシル酸ラパチニブとしても知られている；ＧＳＫ）；およびゲフィチニブ（ＺＤ１８３９またはＩＲＥＳＳＡ（商標）としても知られている；Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）（Ｗｏｏｄｂｕｒｎら、１９９７，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３８：６３３）がある。本発明で使用可能な特に好適な低分子ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（即ちエルロチニブ）、この塩酸塩（即ち塩酸エルロチニブ、タルセバ（ＴＡＲＣＥＶＡ）（登録商標））、または他の形の塩（例えばメシル酸エルロチニブ）などである。
【０１６３】
また、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、例えば、ＥＧＦＲキナーゼに対して活性を有するマルチキナーゼ阻害剤、即ち、ＥＧＦＲキナーゼと、一つ以上の別のキナーゼを阻害する阻害剤も含む。このような化合物の例は、ＥＧＦＲとＨＥＲ２の阻害剤であるＣＩ−１０３３（以前はＰＤｌ  ８３８０５として知られていた；Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＧＦＲとＨＥＲ２の阻害剤であるＧＷ−２０１６（ＧＷ−５７２０１６またはジトシル酸ラパチニブとしても知られている；ＧＳＫ）；ＥＧＦＲとＪＡＫ２／３の阻害剤であるＡＧ４９０（チロホスチン）；ＥＧＦＲとＨＥＲ２の阻害剤であるＡＲＲＹ−３３４５４３（Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ）；可逆性二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２キナーゼ阻害剤であるＢＩＢＷ−２９９２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐ．）；ＥＧＦＲとＨＥＲ２の阻害剤であるＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）；ＶＥＧＦ−Ｒ２とＥＧＦＲの阻害剤であるＺＤ６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡ（商標）；Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、およびＥＧＦＲとＨＥＲ２の阻害剤であるＢＭＳ−５９９６２６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）などである。
【０１６４】
抗体を利用したＥＧＦＲキナーゼ阻害剤には、この天然のリガンドによってＥＧＦＲ活性化を部分的に、または完全に遮断することができる抗ＥＧＦＲ抗体またはＥＧＦＲ抗体断片が含まれる。抗体を利用したＥＧＦＲキナーゼ阻害剤の非限定的な例は、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ，Ｈ．ら、１９９３，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ６７：２４７−２５３；Ｔｅｒａｍｏｔｏ，Ｔ．，ら、１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  ７７：６３９−６４５；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：１３１１−１３１８；Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｍ．，ら、１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：５９（８）；１９３５−４０；およびＹａｎｇ，Ｘ．，ら、１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：２３６−１２４３に記載されたものなどである。即ち、ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、モノクローナル抗体Ｍａｂ  Ｅ７．６．３（Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｄ．ら、（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１２３６−４３）、またはＭａｂ  Ｃ２２５（ＡＴＣＣ受入番号：ＨＢ−８５０８）、またはこれらに対する結合特異性を有する抗体または抗体断片であってもよい。適当なモノクローナル抗体ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤には、ＩＭＣ−Ｃ２２５（セツキシマブまたはＥＲＢＩＴＵＸ（商標）としても知られている；Ｉｍｕｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＥＭＤ７２０００（Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ＲＨ３（Ｙｏｒｋ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）、およびＭＤＸ−４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ／Ｍｅｒｃｋ  ＫｇａＡ）などであるが、これらに限定されない。
【０１６５】
または、本発明で使用するためのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ペプチドまたはＲＮＡアプタマーであってもよい。このようなＲＮＡアプタマーは、例えば、ＥＧＦＲの細胞外ドメインまたは細胞内ドメインと相互作用して、細胞のＥＧＦＲキナーゼ活性を阻害する。細胞外ドメインと相互作用するアプタマーは、標的細胞の細胞膜を通過する必要がないため、このようなアプタマーが好適である。また、アプタマーは、ＥＧＦＲに対するリガンド（例えばＥＧＦ、ＴＧＦ−α）とも相互作用して、リガンドがＥＧＦＲを活性させる能力を阻害することができ得る。適当なアプタマーを選択する方法は、当分野で周知である。このような方法を用いて、ＥＧＦＲファミリーの分子と相互作用して、これを阻害するペプチドまたはＲＮＡアプタマーを選択した（例えば、Ｂｕｅｒｇｅｒ，Ｃ．ら、（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３７６１０−３７６２１；Ｃｈｅｎ，Ｃ−Ｈ．Ｂ．ら、（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：９２２６−９２３１；Ｂｕｅｒｇｅｒ，Ｃ．およびＧｒｏｎｅｒ，Ｂ．（２００３）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２９（１２）：６６９−６７５．Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｓｅｐ  １１参照）。
【０１６６】
また、本発明で使用するためのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づくことができる。アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子などのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲのｍＲＮＡに結合することにより、この翻訳を直接阻止するように作用して、タンパク質の翻訳を阻止し、ｍＲＮＡの分解を高め、その結果、細胞におけるＥＧＦＲキナーゼタンパク質の量、即ち活性を低下させる。例えば、少なくとも約１５塩基で、ＥＧＦＲをコードするｍＲＮＡ転写物配列のユニークな領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば、通常のホスホジエステル法によって合成して、例えば静脈内注射または注入によって投与することができる。この配列が公知である遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンス技術を使用する方法は、当分野においてよく知られている（例えば、米国特許番号６，５６６，１３５；６，５６６，１３１；６，３６５，３５４；６，４１０，３２３；６，１０７，０９１；６，０４６，３２１；および５，９８１，７３２参照）。
【０１６７】
また、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も、本発明で使用するためのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤として機能することができる。ＥＧＦＲ遺伝子の発現は、腫瘍、被験対象者、または細胞を、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、または低分子二本鎖ＲＮＡの産生をもたらすベクターもしくは構築物に接触させることによって低下させることができ、その結果、ＥＧＦＲの発現が特異的に阻害される（即ちＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）。この配列が公知である遺伝子について、適当なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択する方法は当分野において公知である（例えば、Ｔｕｓｃｈｉ，Ｔ．，ら、（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３（２４）：３１９１−３１９７；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８；Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２４４−２５１；ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：７３７−７４７；Ｂｒｅｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ら、（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３；米国特許番号６，５７３，０９９および６，５０６，５５９；および国際特許公開番号ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ９９／３２６１９、およびＷＯ０１／６８８３６参照）。
【０１６８】
また、リボザイムも、本発明で使用するためのＥＧＦＲキナーゼ阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、相補的な標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的なハイブリッド形成と、その後のヌクレオチド鎖切断とを伴う。従って、ＥＧＦＲのｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断を特異的および効率的に触媒する、遺伝子操作されたヘアピンモチーフまたはハンマーヘッドモチーフのリボザイム分子は、本発明の範囲において有用である。リボザイム切断部位について標的分子を精査して、ＲＮＡ標的となる可能性のあるものの内部にある特異的リボザイム切断部位をまず同定する。リボザイム切断部位は、一般的にはＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣという配列を含む。同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する、約１５〜２０個のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、このオリゴヌクレオチド配列を切断に適さないものにする可能性があると予測されている、二次構造などの構造的特徴について評価することができる。また、標的候補の適切性は、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、これらが、相補的オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成できるかを試験することによって評価することもできる。
【０１６９】
ＥＧＦＲキナーゼ阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドとリボザイムの両方を、公知の方法によって調製することができる。これらの方法は、例えば固相ホスホラミダイト化学合成法などの化学合成法が含まれる。または、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子をインビトロまたはインビボで転写することにより、アンチセンスＲＮＡ分子を作成することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７ポリメラーゼまたはＳＰ６ポリメラーゼのプロモーターのような適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを取り込む多様なベクターに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドに対するさまざまな修飾を、細胞内での安定性と半減期を増加させるための手段として導入することができる。可能な修飾には、分子の５’末端および／または３’末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、またはオリゴヌクレオチド骨格内において、ホスホジエステラーゼ結合ではなく、ホスホロチオアートもしくは２’−Ｏ−メチルの使用などである。
【０１７０】
本明細書において、「ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤」という用語は、当分野において現在知られているか、または将来同定されるＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を意味し、患者に投与すると、患者の体内でＩＧＦ−１受容体の活性化に関連する生物学的活性の阻害をもたらす任意の化学物質を含む。ここで、生物学的活性は、投与がなければ、天然のリガンドがＩＧＦ−１Ｒに結合して生じる下流のあらゆる生物学的作用を含む。このようなＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒの活性化を阻止するか、または患者の癌を治療することと関連したＩＧＦ−１Ｒ活性化の下流にある任意の生物学的作用を阻止することができる任意の作用剤を含む。このような阻害剤は、受容体の細胞内ドメインに直接結合して、このキナーゼ活性を阻害することにより作用することができる。または、このような阻害剤は、ＩＧＦ−１受容体のリガンド結合部位またはこの一部を占領することによって作用して、受容体の天然リガンドが受容体に接触できないようにし、その結果、正常な生物学的活性を妨害または低下させる。または、このような阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの二量体化、またはＩＧＦ−１Ｒポリペプチドと別のタンパク質との相互作用を調節することによって作用するか、またはＩＧＦ−１Ｒのユビキチン化およびＩＧＦ−１Ｒのエンドサイトーシスによる分解を増強する。また、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、ＩＧＦ−１Ｒを活性化するために利用できるＩＧＦ−１の量を低下させることによって、例えば、ＩＧＦ−１がこの受容体に結合するのに拮抗することによって、ＩＧＦ−１の量を低下させることによって、またはＩＧＦ−１が、ＩＧＦ結合タンパク質（例えばＩＧＦＢＰ３）など、ＩＧＦ−１Ｒ以外のタンパク質と結合するのを促進することによっても作用することができる。ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤には、低分子阻害剤、抗体もしくは抗体断片、アンチセンス構築物、低分子阻害性ＲＮＡ（即ちｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）、およびリボザイムなどがある。好適な実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、ヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する有機低分子または抗体である。
【０１７１】
ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、例えば、イミダゾピラジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、アザ二環式アミン阻害剤、キナゾリンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ピリド−ピリミジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ピリミド−ピリミジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ピロロ−ピリミジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ピラゾロ−ピリミジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、フェニルアミノ−ピリミジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、オキシンドールＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、インドロカルバゾールＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、フタラジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、イソフラボンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、キナロンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、およびチロホスチンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ならびに、このようなＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤のすべての医薬上許容される塩と溶媒和物とを含む。
【０１７２】
ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の例は、アザ二環式アミン誘導体を記載した国際特許公開番号ＷＯ０５／０９７８００、イミダゾピラジンＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤を記載した国際特許公開番号ＷＯ０５／０３７８３６、ＩＧＦ−１Ｒ関連疾患を治療するためのピリミジンを記載した国際特許公開番号ＷＯ０３／０１８０２１およびＷＯ０３／０１８０２２、シクロリグナンおよびＩＧＦ−１Ｒ阻害剤としてのシクロリグナンについて記載した国際特許公開番号０２／１０２８０４号および０２／１０２８０５、ＩＧＦ−１Ｒチロシンキナーゼの阻害に反応する病気を治療するためのピロロピリミジンを記載した国際特許公開番号ＷＯ０２／０９２５９９、チロシンキナーゼ阻害剤としてのピロロピリミジンを記載した国際特許公開番号ＷＯ０１／７２７５１、およびキナーゼのピロロトリアジン阻害剤を記載した国際特許公開番号ＷＯ００／７１１２９に記載された阻害剤、ならびに、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン、およびこれらをチロシンキナーゼ阻害剤として使用することを記載した国際特許公開番号ＷＯ９７／２８１６１、インビトロおよびインビボでＩＧＦ−１Ｒ阻害活性を有するチロホスチンを記載したＰａｒｒｉｚａｓ，ら、（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３８：１４２７−１４３３（１９９７））、ＩＧＦ−１Ｒ阻害剤としてのヘテロアリール−アリールウレアを記載した国際特許公開番号ＷＯ００／３５４５５、ＩＧＦ−１Ｒの調節剤としてのピリミジン誘導体を記載した国際特許公開番号ＷＯ０３／０４８１３３、キナーゼタンパク質に対する阻害作用を有する化合物を記載した国際特許公開番号ＷＯ０３／０２４９６７、ＷＯ０３／０３５６１４、ＷＯ０３／０３５６１５、ＷＯ０３／０３５６１６、およびＷＯ０３／０３５６１９、過剰増殖症状を治療するための方法および組成物を記載した国際特許公開番号ＷＯ０３／０６８２６５、タンパク質キナーゼ阻害剤としてのピロロピリミジンを記載した国際特許公開番号ＷＯ００／１７２０３、セフェム化合物、この製造法と抗生物質組成物を記載した日本国特許公開番号：ＪＰ−Ａ０７／１３３２８０、プテリジンの研究、および第４位が非置換のプテリジンを記載したＡｌｂｅｒｔ，Ａ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｈ．：１５４０−１５４７（１９７０）、およびピラジンから３−４−ジヒドロプテリジンを介してプテリジン（第４位が非置換のもの）を合成することを記載したＡ．Ａｌｂｅｒｔら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｐｔｅｒｉｄｉｎｅｓ  Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．，４ｔｈ，４：１−５（１９６９）に記載されたものなどである。
【０１７３】
本発明において使用可能なＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤のさらなる具体例は、ＩＧＦ−１アンタゴニストであるｈ７Ｃ１０（Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｐｉｅｒｒｅ  Ｆａｂｒｅ）；ＩＧＦ−１Ｒ調節剤であるＥＭ−１６４（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．）；ＩＧＦ−１アンタゴニストであるＣＰ−７５１８７１（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）；ＩＧＦ−１アンタゴニストであるランレオチド（Ｉｐｓｅｎ）；ＩＧＦ−１Ｒオリゴヌクレオチド（Ｌｙｎｘ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）；ＩＧＦ−１オリゴヌクレオチド（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；Ｎｏｖａｒｔｉｓ社で開発中のＩＧＦ−１Ｒタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１，Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，Ｃ．ら、（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２３１−２３９；またはＮＶＰ−ＡＤＷ７４２，Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，ＣＳ．ら、（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２２１−２３０）；ＩＧＦ−１Ｒタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（Ｏｎｔｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ）；ＯＳＩ−９０６（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＩＧＦ−１アンタゴニストであるＡＧ−１０２４（Ｃａｍｉｒａｎｄ，Ａ．ら、（２００５）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：Ｒ５７０−Ｒ５７９（ＤＯＩ  １０．１１８６／ｂｃｒｌ  ０２８）；Ｃａｍｉｒａｎｄ，Ａ．およびＰｏｌｌａｋ，Ｍ．（２００４）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９０：１８２５−１８２９；Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）；チロホスチンＡＧ−５３８およびＩ−ＯＭｅ−ＡＧ５３８；ＩＧＦ−１Ｒの低分子阻害剤であるＢＭＳ−５３６９２４；ＩＧＦ−１アンタゴニストであるＰＮＵ−１４５１５６Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ  ＳｐＡ）；ＢＭＳ５３６９２４，ＩＧＦ−１ＲおよびＩＲの二重キナーゼ阻害剤（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；ＡＥＷ５４１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＧＳＫ６２１６５９Ａ（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ−Ｋｌｉｎｅ）；ＩＮＳＭ−１８（Ｉｎｓｍｅｄ）；およびＸＬ−２２８（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）などである。
【０１７４】
抗体を利用したＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤には、この天然のリガンドによってＩＧＦ−１Ｒ活性化を部分的にまたは完全に遮断することができる抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体またはＩＧＦ−１Ｒ抗体断片が含まれる。また、抗体を利用したＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤には、ＩＧＦ−１Ｒ活性化を部分的にまたは完全に遮断することができる抗ＩＧＦ−１抗体またはＩＧＦ−１抗体断片も含まれる。抗体を利用したＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤の非限定的な例は、Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９２：２０９７−２１０１およびＩｂｒａｈｉｍ，Ｙ．Ｈ．およびＹｅｅ，Ｄ．（２００５）Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１ｌ：９４４ｓ−９５０ｓに記載されたもの；Ｉｍｃｌｏｎｅによって開発されているもの（例えばＩＭＣ−Ａ１２），または抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＡＭＧ−４７９（Ａｍｇｅｎ）；抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＲ１５０７（Ｇｅｎｍａｂ／Ｒｏｃｈｅ）；抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＡＶＥ−１６４２（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ／Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）；抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＭＫ０６４６またはｈ７Ｃ１０（Ｍｅｒｃｋ）；またはＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって開発されている抗体（例えばＳＣＨ７１７４５４または１９Ｄ１２；または、米国特許出願公開２００５／０１３６０６３Ａｌおよび米国特許出願公開２００４／００１８１９１Ａｌに記載されたもの）などである。ＩＧＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤は、モノクローナル抗体でもよく、またはこれに対する結合特異的を有する抗体もしくは抗体断片であってもよい。
【０１７５】
本明細書において、「ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤」という用語は、当分野において現在知られているか、または将来同定されるＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤を意味し、患者に投与すると、患者の体内でＰＤＧＦ受容体の活性化に関連する生物学的活性の阻害をもたらす任意の化学物質を含む。ここで、生物学的活性は、投与がなければ、天然のリガンドがＰＤＧＦＲに結合して生じる下流のあらゆる生物学的作用を含む。このようなＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ＰＤＧＦＲの活性化を阻止するか、または患者の癌を治療することと関連したＰＤＧＦＲ活性化の下流にある任意の生物学的作用を阻止することができる任意の作用剤を含む。このような阻害剤は、受容体の細胞内ドメインに直接結合して、このキナーゼ活性を阻害することにより作用することができる。または、このような阻害剤は、ＰＤＧＦ受容体のリガンド結合部位またはこの一部を占領することによって作用して、受容体の天然リガンドが受容体に接触できないようにし、その結果、正常な生物学的活性を妨害または低下させる。または、このような阻害剤は、ＰＤＧＦＲポリペプチドの二量体化、またはＰＤＧＦＲポリペプチドと別のタンパク質との相互作用を調節することによって作用するか、またはＰＤＧＦＲのユビキチン化およびＰＤＧＦＲのエンドサイトーシスによる分解を増強する。ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤には、低分子阻害剤、抗体もしくは抗体断片、アンチセンス構築物、低分子阻害性ＲＮＡ（即ちｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）、およびリボザイムなどが含まれる。ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤には、抗ＰＤＧＦアプタマーもしくは抗ＰＤＧＦＲアプタマー、抗ＰＤＧＦ抗体もしくは抗ＰＤＧＦＲ抗体、またはＰＤＧＦが、この同族の受容体に結合するのを阻止する、可溶性のＰＤＧＦ受容体デコイも含まれる。好適な実施形態において、ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ヒトＰＤＧＦＲに特異的に結合する有機低分子または抗体である。ある化合物や物質が、ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤として作用することができるかは、当分野に公知の方法、さらには、例えば、Ｄａｉら、（２００１）Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｙ．１５：１９１３−２５；Ｚｉｐｐｅｌ，ら、（Ｔ９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５０（２）：４２８−３４：およびＺｗｉｌｌｅｒ．ら、（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６：２１９−２１に示されている方法によって判定することができる。
【０１７６】
本発明は、当分野において公知のＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤、ならびに下記の文献に記載されたもの、および通常の技術によって作製できる範囲に含まれるあらゆる均等物を含む。例えば、ＰＤＧＦに対する阻害性抗体、例えば、米国特許番号５，９７６，５３４、５，８３３，９８６、５，８１７，３１０、５，８８２，６４４、５，６６２，９０４、５，６２０，６８７、５，４６８，４６８、および国際公開出願番号ＷＯ２００３／０２５０１９に記載されているものなどが当分野で知られている。これらの文献の内容は、この全体が、参照されて本明細書に組み込まれる。さらに、本発明は、ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤であるＮ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、例えば、米国特許番号５，５２１，１８４、およびＷＯ２００３／０１３５４１、ＷＯ２００３／０７８４０４、ＷＯ２００３／０９９７７１、ＷＯ２００３／０１５２８２、およびＷＯ２００４／０５２８２に記載されたものなどを含む。これらの文献は、この全体が、参照されて本明細書に組み込まれる。
【０１７７】
ＰＤＧＦの作用を阻止する低分子は、例えば、米国特許または出願公開番号６，５２８，５２６（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、６，５２４，３４７（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、６，４８２，８３４（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）、６，４７２，３９１（ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤）６，９４９，５６３、６，６９６，４３４、６，３３１，５５５、６，２５１，９０５、６，２４５，７６０、６，２０７，６６７、５，９９０，１４１、５，７００，８２２、Ｕ．Ｓ．５，６１８，８３７、５，７３１，３２６、および米国特許出願公開２００５／０１５４０１４、ならびに国際公開出願番号ＷＯ２００５／０２１５３１、ＷＯ２００５／０２１５４４、およびＷＯ２００５／０２１５３７に記載されているものなどが当分野で知られている。これらの文献の内容は、この全体が、参照されて本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
ＰＤＧＦの作用を阻止するタンパク質およびポリペプチドは、例えば、米国特許番号６，３５０，７３１（ＰＤＧＦペプチド類似体）、５，９５２，３０４に記載されているものなどが当分野で知られている。これらの文献の内容は、この全体が、参照されて本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
ＥＧＦおよび／またはＰＤＧＦの受容体チロシンキナーゼを阻害するビスモノ−および二環式のアリール化合物およびヘテロアリール化合物は、例えば、米国特許番号５，４７６，８５１、５，４８０，８８３、５，６５６，６４３、５，７９５，８８９、および６，０５７，３２０に記載されているものなどが当分野で知られている。これらの文献の内容は、この全体が、参照されて本明細書に組み込まれる。
【０１８０】
ＰＤＧＦを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許番号５，８６９，４６２および５，８２１，２３４に記載されているものなどが当分野で知られている。これら各文献の内容は、この全体が、参照されて本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
ＰＤＧＦを阻害するアプタマー（核酸リガンドとしても知られている。）は、例えば、米国特許番号６，５８２，９１８、６，２２９，００２、６，２０７，８１６、５，６６８，２６４、５，６７４，６８５、および５，７２３，５９４に記載されているものなどが当分野で知られている。これら各文献の内容は、この全体が、参照されて本明細書に組み込まれる。
【０１８２】
ＰＤＧＦを阻害するその他の化合物で当分野において知られているものは、米国特許番号５，２３８，９５０、５，４１８，１３５、５，６７４，８９２、５，６９３，６１０、５，７００，８２２、５，７００，８２３、５，７２８，７２６、５，７９５，９１０、５，８１７，３１０、５，８７２，２１８、５，９３２，５８０、５，９３２，６０２、５，９５８，９５９、５，９９０，１４１、６，３５８，９５４、６，５３７，９８８、および６，６７３，７９８に記載されているものなどである。これら各文献の内容は、この全体が、参照されて本明細書に組み込まれる。
【０１８３】
ＰＤＧＦＲなどのチロシンキナーゼ受容体酵素に対して選択的な、幾つかのタイプのチロシンキナーゼ阻害剤が知られている（例えば、ＳｐａｄａおよびＭｙｅｒｓ（（１９９５）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，５：  ８０５）およびＢｒｉｄｇｅｓ（（１９９５）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，５：１２４５参照）。さらに、ＬａｗおよびＬｙｄｏｎが、チロシンキナーゼ阻害剤の抗癌剤候補をまとめている（（１９９６）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔ  Ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．２４１−２６０）。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，５２８，５２６は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦＲ）のチロシンキナーゼ活性を選択的に阻害する置換キノキサリン化合物を記載している。ＰＤＧＦＲチロシンキナーゼ活性の公知の阻害剤には、Ｍａｇｕｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，（（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．．３７：２１２９）によって、およびＤｏｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ，（（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．．３７：２６２７）によって報告された、キノリンをベースにした阻害剤が含まれる。フェニルアミノ−ピリミジンをベースにする一つの分類の阻害剤が、欧州特許出願ＥＰ５６４４０９でＴｒａｘｌｅｒ，ｅｔ  ａｌによって、およびＢｕｃｈｄｕｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ，（（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）．９２：２５５８）によって最近報告された。ＰＤＧＦ受動態チロシンキナーゼの活性を阻害するのに有用なキナゾリン誘導体には、ビスモノ−および二環式のアリール化合物およびヘテロアリール化合物（例えば、ＷＯ９２／２０６４２参照）、キノキサリン誘導体（（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．．５４：６１０６−６１１４参照）、ピリミジン誘導体（日本特許出願公開８７８３４／９４）、およびジメトキシキノリン誘導体（Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １１６ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（Ｋａｎａｚａｗａ）．（１９９６），２，ｐ．２７５，２９（Ｃ２）１５−２参照）などがある。
【０１８４】
本発明において使用可能な低分子ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤の具体的な好適例は、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＳＵ−１２２４８（リンゴ酸スニチブ（ｓｕｎｉｔｉｂ）、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）；Ｐｆｉｚｅｒ）；ダサチニブ（ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）；ＢＭＳ；ＢＭＳ−３５４８２５としても知られている。）；ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）；Ｂａｙｅｒ；Ｂａｙ−４３−９００６としても知られている。）；ＡＧ−１３７３６（アキシチニブ；Ｐｆｉｚｅｒ）；ＲＰＲ１２７９６３（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）；ＣＰ−８６８５９６（Ｐｆｉｚｅｒ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＭＬＮ−５１８（タンデュチニブ（ｔａｎｄｕｔｉｎｉｂ）；Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＡＭＧ−７０６（モテサニブ（Ｍｏｔｅｓａｎｉｂ）；Ａｍｇｅｎ）；ＡＲＡＶＡ（登録商標）（レフルノミド；Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ；ＳＵｌ０ｌとしても知られている。）、およびＯＳＩ−９３０（ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。本発明において使用可能な、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤でもある分子ＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤の更なる好適例は、ＸＬ−９９９（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）；ＳＵ６６６８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＣＨＩＲ−２５８／ＴＫＩ−２５８（Ｃｈｉｒｏｎ）；ＲＯ４３８３５９６（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、およびＢＩＢＦ−１１２０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）などである。
【０１８５】
本明細書において、「ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤」という用語は、当分野において現在知られているか、または将来同定されるＦＧＦＲキナーゼ阻害剤を意味し、患者に投与すると、患者の体内でＦＧＦ受容体の活性化に関連する生物学的活性の阻害をもたらす任意の化学物質を含む。ここで、生物学的活性は、投与がなければ、天然のリガンドがＦＧＦＲに結合して生じる下流のあらゆる生物学的作用を含む。このようなＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ＦＧＦＲの活性化を阻止するか、または患者の癌を治療することと関連したＦＧＦＲ活性化の下流にある任意の生物学的作用を阻止することができる任意の作用剤を含む。このような阻害剤は、受容体の細胞内ドメインに直接結合して、このキナーゼ活性を阻害することにより作用することができる。または、このような阻害剤は、ＦＧＦ受容体のリガンド結合部位またはこの一部を占領することによって作用して、受容体の天然リガンドが受容体に接触できないようにし、その結果、正常な生物学的活性を妨害または低下させる。または、このような阻害剤は、ＦＧＦＲポリペプチドの二量体化、またはＦＧＦＲポリペプチドと別のタンパク質との相互作用を調節することによって作用するか、またはＦＧＦＲのユビキチン化およびＦＧＦＲのエンドサイトーシスによる分解を増強する。ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤には、低分子阻害剤、抗体もしくは抗体断片、アンチセンス構築物、低分子阻害性ＲＮＡ（即ちｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）、およびリボザイムなどが含まれる。ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤には、抗ＦＧＦアプタマーもしくは抗ＦＧＦＲアプタマー、抗ＦＧＦ抗体もしくは抗ＦＧＦＲ抗体、またはＦＧＦＲがこの同族の受容体に結合するのを阻止する、可溶性のＦＧＦＲ受容体デコイも含まれる。好適な実施形態において、ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤は、ヒトＦＧＦＲに特異的に結合する有機低分子または抗体である。抗ＦＧＦＲ抗体は、ＦＲ１−Ｈ７（ＦＧＦＲ−Ｉ）およびＦＲ３−Ｄ１１（ＦＧＦＲ−３）（Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）などである。
【０１８６】
ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤には、ＦＧＦＲ活性を調節するヘパラン硫酸プロテオグリカンの能力に影響を与えることによってＦＧＦＲシグナル伝達を阻害する化合物も含まれる。細胞外基質内のヘパラン硫酸プロテオグリカンは、ＦＧＦの作用、例えば、タンパク質分解からの保護、局在化、保存、および増殖因子の内部移行などを媒介することができ（Ｆａｈａｍ，Ｓ．ら、（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，８：５７８−５８６）、ＦＧＦを同族のＦＧＦＲに提示するよう、および／または受容体のオリゴマー形成を促進するよう作用する低親和性ＦＧＦ受容体として機能することができる（Ｇａｌｚｉｅ，Ｚ．ら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７５：６６９−６８５）。
【０１８７】
本発明には、当分野において公知のＦＧＦＲキナーゼ阻害剤（例えばＰＤｌ  ７３０７４）、ならびに下記で裏付けられているもの、および通常の技術で作出できる範囲内にあるあらゆる均等物も含まれる。
【０１８８】
ＦＧＦの作用に拮抗することができるため、本明細書記載の方法でＦＧＦＲキナーゼ阻害剤として使用できる化学物質は、スラミン、スラミンの構造類似体、ペントサンポリ硫酸、スコポラミン、アンジオスタチン、スプラウティ（ｓｐｒｏｕｔｙ）、エストラジオール、カルボキシメチルベンジルアミンデキストラン（ＣＭＤＢ７）、スラジスタ、インスリン様増殖因子結合タンパク質−３、エタノール、ヘパリン（例えば、６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン）、低分子ヘパリン、硫酸プロタミン、シクロスポリンＡ、またはｂＦＧＦに対するＲＮＡリガンドなどである。
【０１８９】
その他、当分野で公知のＦＧＦＲキナーゼを阻害するための作用剤または化合物には、米国特許番号７，１５１，１７６（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｐｙｒｒｏｌｏｔｒｉａｚｉｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）；７，１０２，００２（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ピロロトリアジン化合物）；５，１３２，４０８（ＳａＩｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ペプチドＦＧＦアンタゴニスト）；５，９４５，４２２（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ；２−アミノ−置換ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン）；米国特許出願公開２００５／０２５６１５４（４−アミノ−チエノ［３，２−ｃ］ピリジン−７−カルボン酸アミド化合物）；および２０００４／０２０４４２７（ピリミジノ化合物）；公開国際特許出願ＷＯ２００７０１９８８４（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；Ｎ−（３−ピラゾリル）−Ｎ’−４−（４−ピリジニルオキシ）フェニル）ウレア化合物）；ＷＯ２００７００９７７３（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ；ピラゾロロ［ｌ，５−ａ］ピリミジン−７−イルアミン誘導体；ＷＯ２００７０１４１２３（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．；ＦＧＦＲ融合タンパク質）；ＷＯ２００６１３４９８９（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．；含窒素複素環化合物）；ＷＯ２００６１１２４７９（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．；アザヘテロ環化合物）；ＷＯ２００６１０８４８２（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；９−（４−ウレイドフェニル）プリン化合物）；ＷＯ２００６１０５８４４（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；Ｎ−（３−ピラゾリル）−Ｎ’−４−（４−ピリジニルオキシ）フェニル）ウレア化合物）；ＷＯ２００６０９４６００（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；テトラヒドロピロロキノリン誘導体）；ＷＯ２００６０５０８００（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；Ｎ，Ｎ’−ジアリールウレア誘導体）；ＷＯ２００６０５０７７９（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；Ｎ，Ｎ’−ジアリールウレア誘導体）；ＷＯ００６０４２５９９（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；フェニルジウレア誘導体）；ＷＯ２００５０６６２１１（Ｆｉｖｅ  Ｐｒｉｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．；抗ＦＧＦＲ抗体）；ＷＯ２００５０５４２４６（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；ヘテロシクリルアミン）；ＷＯ２００５０２８４４８（Ｍｅｒｃｋ  Ｐａｔｅｎｔ  ＧｍｂＨ；２−アミノ−ｌ−ベンジル−置換ベンゾイミダゾール誘導体）；ＷＯ２００５０１１５９７（Ｉｒｍ  Ｌｉｅ；置換複素環誘導体）；ＷＯ２００４０９３８１２（Ｉｒｍ  Ｌｌｃ／Ｓｃｒｉｐｐｓ；６−フェニル−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体）；ＷＯ２００４０４６１５２（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ；ピリミド［４，５−ｅ］オキサジアジン誘導体）；ＷＯ２００４０４１８２２（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ；ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン誘導体）；ＷＯ２００４０１８４７２（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ；ピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン誘導体）；ＷＯ２００４０１３��４５（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ピロロトリアジン誘導体）；ＷＯ２００４００９７８４（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ；ピロロ［２，ｌ−ｆ］［ｌ，２，４］トリアジン−６−イル化合物）；ＷＯ２００４００９６０１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ；アザインドール化合物）；ＷＯ２００４００１０５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｍｐａｎｙ；複素環誘導体）；ＷＯ０２１０２９７２（Ｐｒｏｃｈｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．／Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ；抗ＦＧＦＲ抗体）；ＷＯ０２１０２９７３（Ｐｒｏｃｈｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．；抗ＦＧＦＲ抗体）；ＷＯ００２１２２３８（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ；２−（ピリジン−４−イルアミノ）−６−ジアルコキシフェニル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン誘導体）；ＷＯ００１７０９７７（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．；ＦＧＦＲ−Ｌおよび誘導体）；ＷＯ００１３２６５３（Ｃｅｐｈａｌｏｎ，Ｉｎｃ．；ピアゾロン誘導体）；ＷＯ０００４６３８０（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＦＧＦＲ−Ｉｇ融合タンパク質）；およびＷＯ０００１５７８１（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ；ヒトＳＰＲＯＵＴＹ−１タンパク質に関連したポリペプチド）に記載されたものなどがある。
【０１９０】
本発明において使用可能な低分子ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤の具体的な好適例は、ＲＯ−４３９６６８６（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）；ＣＨＩＲ−２５８（Ｃｈｉｒｏｎ；ＴＫＩ−２５８としても知られる。）；ＰＤ１７３０７４（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＰＤ１６６８６６（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＮＫ−８３４およびＥＮＫ−８３５（どちらもＥｎｋａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ａ／Ｓ）；およびＳＵ５４０２（Ｐｆｉｚｅｒ）などである。本発明に従って使用可能なＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤でもある低分子ＦＧＦＲキナーゼ阻害剤の更なる好適例は、ＸＬ−９９９（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）；ＳＵ６６６８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＣＨＩＲ−２５８／ＴＫＩ−２５８（Ｃｈｉｒｏｎ）；ＲＯ４３８３５９６（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、およびＢＩＢＦ−１１２０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）などである。
【０１９１】
また、本発明は、上皮細胞が上皮−間葉転換を起こすのを阻害する作用剤を同定する方法であって、上皮細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、該試料を、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させること、この量が試料細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていないＨ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、試料内の細胞が上皮から間葉系へ転換することを阻害するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、細胞が上皮から間葉系へ転換することを阻害する作用剤であるか否かを判定することを含む方法も提供する。上皮細胞が上皮−間葉転換を起こすのを阻害する作用剤は、一部にはＥＭＴ転換に起因する線維症疾患の治療に有用である。線維症疾患は、腎線維症、肝線維症、肺線維症、および中皮腫などである。一つの実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドは、ＥＧＦ；ＴＧＦβ；ＴＮＦα；およびＩＬ−４から選択される。別の実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである。
【０１９２】
また、本発明は、上皮から間葉系への転換を起こした細胞を阻害する作用剤を同定する方法であって、上皮細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を誘導すること、該細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、被験作用剤が、間葉系様Ｈ３５８細胞の増殖を阻害するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、上皮から間葉系へ転換を起こした細胞の増殖を阻害する作用剤であるか否かを判定することを含む方法も提供する。間葉系様細胞を阻害する作用剤は、一部にはＥＭＴ転換に起因する線維症疾患の治療に有用である。線維症疾患は、腎線維症、肝線維症、肺線維症、および中皮腫などである。一つの実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドは、ＥＧＦ；ＴＧＦβ；ＴＮＦα；およびＩＬ−４から選択される。別の実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである。本方法の別の実施形態は、該被験作用剤が、上皮―間葉転換を起こした細胞の増殖を阻害するか否かを判定する工程の後に、間葉系様Ｈ３５８腫瘍細胞の増殖を阻害する作用剤が、上皮Ｈ３５８腫瘍細胞の増殖も阻害するか否かを判定すること、および、その結果、これが上皮から間葉系への転換を起こした細胞の増殖を特異的に阻害する作用剤であるか否かを決定することという更なる工程を含む。上記方法の一実施形態において、上皮−間葉転換を起こした細胞の増殖を阻害する作用剤は、該細胞のアポトーシスを促進することによって増殖を阻害するものと判定される。上記の方法の別の実施形態において、上皮から間葉系への転換を起こした細胞の増殖を阻害する作用剤は、該細胞の増殖を阻害することによって増殖を抑制するものと判定される。
【０１９３】
また、本発明は、間葉系様細胞が間葉から上皮への転換を起こすのを促進する作用剤を同定する方法であって、上皮細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、単一または二重のタンパク質リガンド調製物と接触させて、Ｈ３５８細胞において、上皮−間葉転換を誘導すること、該細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、この量が試料細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていない間葉系様Ｈ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう試料内の間葉系様Ｈ３５８細胞を刺激するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう間葉系様細胞を刺激する作用剤であるか否かを判定することを含む方法も提供する。間葉系様細胞が間葉から上皮への転換を起こすのを促進する作用剤は、一部にはＥＭＴ転換に起因する線維症疾患の治療に有用である。線維症疾患は、腎線維症、肝線維症、肺線維症、および中皮腫などである。一つの実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する単一タンパク質リガンドは、ＥＧＦ；ＴＧＦβ；ＴＮＦα；およびＩＬ−４から選択される。別の実施形態において、Ｈ３５８細胞において上皮−間葉転換を誘導する二重タンパク質リガンドは、オンコスタチンＭ＋ＨＧＦである。
【０１９４】
また、本発明は、細胞が上皮から間葉系へ転換することを阻害する作用剤を同定する方法であって、Ｈ３５８細胞における上皮から間葉系への転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、該試料を、改変されたＨ３５８細胞において上皮から間葉系への転換を促進する該タンパク質の発現を誘導する化合物と接触させること、この量が試料細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていないＨ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、試料内の細胞が上皮から間葉系へ転換することを阻害するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、細胞が上皮から間葉系へ転換することを阻害する作用剤であるか否かを判定することを含む方法も提供する。
【０１９５】
また、本発明は、上皮−間葉転換を起こした細胞を阻害する作用剤を同定する方法であって、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、該タンパク質発現を誘導して細胞内で上皮−間葉転換を誘導する化合物と接触させること、該細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、該被験作用剤が、間葉系様Ｈ３５８細胞の増殖を阻害するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、上皮−間葉転換を起こした細胞の増殖を阻害する作用剤であるか否かを判定することを含む方法も提供する。本方法の別の実施形態は、該被験作用剤が、上皮―間葉転換を起こした細胞の増殖を阻害するか否かを判定する工程の後に、間葉系様Ｈ３５８細胞の増殖を阻害する作用剤が、上皮Ｈ３５８細胞の増殖も阻害するか否かを判定し、および、その結果、これが上皮から間葉系への転換を起こした細胞の増殖を特異的に阻害する作用剤であるか否かを決定するという更なる工程を含む。上記方法の一実施形態において、上皮−間葉転換を起こした細胞の増殖を阻害する作用剤は、該細胞のアポトーシスを促進することによって増殖を阻害するものと判定される。上記の方法の別の実施形態において、上皮から間葉系への転換を起こした細胞の増殖を阻害する作用剤は、該細胞の増殖を阻害することによって増殖を抑制するものと判定される。
【０１９６】
また、本発明は、間葉系様腫瘍細胞が間葉から上皮への転換を起こすのを促進する作用剤を同定する方法であって、Ｈ３５８細胞における上皮−間葉転換を促進するタンパク質を誘導的に発現するよう改変されている上皮腫瘍細胞株Ｈ３５８の細胞試料を、該タンパク質発現を誘導して細胞内で上皮−間葉転換を誘導する化合物と接触させること、該細胞試料を、スクリーニング対象である被験作用剤と接触させること、この量が試料腫瘍細胞のＥＭＴ状態を示すものであるバイオマーカーの量を、被験作用剤に接触させていない間葉系様Ｈ３５８細胞の同一試料における同一のバイオマーカーの量と比較することにより、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう試料内の間葉系様Ｈ３５８細胞を刺激するか否かを判定すること、および、その結果、該被験作用剤が、間葉系から上皮への転換を起こすよう間葉系様腫瘍細胞を刺激する作用剤であるか否かを決定することを含む方法も提供する。
【０１９７】
本発明は、以下の実験の詳細の記載からよりよく理解されよう。しかしながら、検討されている具体的な方法および結果は、この後ろに記載されている特許請求の範囲でさらに十分に説明されている発明を例示したものに過ぎず、いかなる意味でも、本発明を限定するものではないことが、当業者には容易に理解できよう。
【０１９８】
実験の詳細：
緒言
目標とする抗癌剤を同定するためのモデルと、抗癌剤同士の具体的な組み合わせを合理的に設計することが、このような抗癌剤を臨床試験に進めるためには明らかに必要とされる。ここで、本発明者らは、上皮腫瘍細胞および間葉系腫瘍細胞の成分に関するモデルシステムを説明する。腫瘍内にある上皮細胞型と間葉系細胞型とを標的にできることが、患者の長期間生存に対する治療効果にとって重要である。説明するモデルは、インビトロにおいて、および動物モデルにおいて、腫瘍細胞型に関して、抗癌性の化合物、抗体、アプタマー、およびその他の治療用核酸を評価することを可能にする。
【０１９９】
材料と方法
細胞培養条件
ヒト細胞株Ｈ３５８を、ＡＴＣＣが推奨する適切な添加培地の中で培養した。増殖因子およびサイトカインによって誘導されるＥＭＴを、７〜１４日間にわたって観察した。増殖因子およびサイトカインは商業的供給業者から入手したが、これらは、以下のものを含んでいた：ＴＧＦβ１０ｎｇ／ｍｌ、エンドセリン１００ｎＭ、ＩＬ−４  ５ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６  ５ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−８  ５ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦ  １０ｎｇ／ｍｌ、ストロマ細胞由来因子、ｌ００ｎｇ／ｍｌ、上皮細胞由来因子ｌ０ｎｇ／ｍｌ、ＭＭＰ２、１００ｎｇ／ｍｌ、ＭＭＰ７、１００ｎｇ／ｍｌ、ＭＭＰ９、ｌ００ｎｇ／ｍｌ、Ｉ型コラーゲン、５μｇ／ｃｍ２、ＩＶ型コラーゲン、５μｇ／ｃｍ２、フィブロネクチン、１μｇ／ｃｍ２、ラミニン−Ｉ、１μｇ／ｃｍ２、ビトロネクチン、０．１μｇ／ｃｍ２、ポリリジン、１００ｍｇ／ｍＬ、ＨＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬ、ＭＳＰ、１００ｎｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−Ｉ、５０ｎｇ／ｍＬ、ＣＳＦ−Ｉ、１００ｎｇ／ｍＬ、ＥＴｌ、１００ｎＭ、ＳＤＦ−Ｉα、１００ｎｇ／ｍｌ、ＰＧＥ２、５００ｎＭ、ＬＰＡ、１０μＭ、ＳｌＰ、１μＭ、ＴＧＦβ、２．５ｎｇ／ｍＬ、ＴＮＦα、２５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬｌβ、２．５ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ６、２ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ８、０．５ｎｇ／ｍＬ、ＷＮＴ−Ｉ、５ｎｇ／ｍＬ、ＣＴＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ、Ｔｒａｎｃｅ、５０ｎｇ／ｍｌ、ＦＧＦ１、１０ｎｇ／ｍｌ、ＦＧＦ２、１０ｎｇ／ｍｌ、ＢＭＰ４、１００ｎｇ／ｍｌ、ＢＭＰ７、１００ｎｇ／ｍｌ、ＩＧＦ２、１００ｎｇ／ｍｌ、オンコスタチンＭ、１００ｎｇ／ｍｌ、ＮＲＧｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、５０ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、３０ｎｇ／ｍｌ、ＷＩＳＰｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、フルベストラント、１μＭ、ＬＩＦ、２０ｎｇ／ｍｌ、ＩＦＮｇ、５０ｎｇ／ｍｌ、ＨＭＧ−Ｂ１、５０ｎｇ／ｍｌ、Ｍ−ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍｌ、ＰＴＨｒＰ、５０ｎｇ／ｍｌ、ＭＣＰｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−１ａ、１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３３、５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−３１、５０ｎｇ／ｍｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、２５ｎｇ／ｍｌ、アンジオポエチン２、４００ｎｇ／ｍｌ、ＰＡＲ１、ｌ００μＭ、ＰＡＲ２、ｌ００μＭ、ＰＡＲ４、ｌ００μＭ、Ｗｎｔ５ａ、２００ｎｇ／ｍｌ、Ｇ−ＣＳＦ、５０ｎｇ／ｍｌ、アンフィレギュリン、１００ｎｇ／ｍｌ、ＣＮＴＦ、２５ｎｇ／ｍＬ、プレイオトロフィン、２５ｎｇ／ｍｌ、プロラクチン、１００ｎｇ／ｍｌ、ＴＲＡＩＬ、１００ｎｇ／ｍｌ。
【０２００】
薬理学的阻害剤
ＭＥＫ阻害剤１（”ＭＥＫｉ”；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃４４４９３７）、ＪＡＫ阻害剤１（”ＪＡＫｉ”；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃４２００９９）、およびＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＰＩ３Ｋｉ）；ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃４４０２０２）を指示された濃度で用いた。細胞を、リガンドで刺激する前に、阻害剤で３０分間処理した。培地、阻害剤、およびリガンドは、実験３〜４日目に新しくした。
【０２０１】
三次元マトリゲル培養：組織培養用ウェルを、深さ１ｍｍ以上のマトリゲル層で被覆した。この上面に、Ｈ３５８細胞を２％マトリゲルに入れて、播種密度２，５００〜５０００細胞／ｃｍ２で平板塗布した。細胞／マトリゲル層が固まったところで、培地を加え、ＣＯ２恒温器内で３７℃にて一晩温置し、その後、１０μＭ  ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；製品番号：＃Ｓ４３１７）を添加したリガンド、および添加しなかったリガンドで細胞を処理した。実験が継続している期間、培養培地を、１０μＭ  ＳＢ４３１５４２を添加したリガンドおよび添加しないリガンドとともに３〜４日おきに補充した。
【０２０２】
細胞株抽出物の免疫ブロット解析
本文および図面の説明に示した通りに細胞株を処理した。プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ８３４０）およびホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ５７２６）を含むＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ、＃Ｒ０２７８）の中で細胞溶解物を調製した。マイクロ−ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、＃２３２２７）によって、タンパク質濃度を測定した。タンパク質の免疫検出法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離したタンパク質を電気泳動によってニトロセルロースに移行させ、抗体とともに温置し、化学発光第２段階検出法（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｓｅｃｏｎｄ  ｓｔｅｐ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（Ｐｉｃｏ  Ｗｅｓｔ；Ｐｉｅｒｃｅ、＃３４０７８）によって行った。使用された抗体は以下のとおりである：Ｅ−カドヘリン（ｓｃ２１７９１）、Ｎ−カドヘリン（＃７９３９）、ＥｒｂＢ３（ｓｃ２８５）、ＧＡＰＤＨ（＃２５７７８）、およびＺｅｂ１（＃２５３８８）（すべてＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）；ビメンチン（ＢＤ５５０５１３）およびフィブロネクチン（ＢＤ６１００７７）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入）；β−アクチン（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ５４４１）。
【０２０３】
ＴＥＴ−反応性細胞株の作出
Ｈ３５８細胞を、９０ｍｍのＴＣ培養皿に、２４時間後の増殖が確実に８０％コンフルエントになる密度で播種した。プラスミドｐｔＴＳおよびｐｒＴＡを、ＦｕｇｅｎｅＨＤ形質転換用試薬（Ｆｕｇｅｎｅ）を用いて、１０：１の比率で細胞の中に形質移入した。４時間後、培地を除去して、通常の増殖用培地に入れ換え、細胞をさらに４８時間増殖させた。次いで、細胞をさまざまな比率（１：２５、１：５０、および１：１００）で１５０ｍｍのＴＣ培養皿に分割し、２４時間増殖させた。次いで、薬剤（ブラストサイジン、１００μｇ／ｍｌ）を培地に加え、３〜４週間にわたって、Ｂｓｄ濃度を次第に１０μｇ／ｍｌに低下させながら、細胞コロニーを選抜した。単一の細胞から生じたコロニーを、細胞コロニーフィルターを用いて培養皿から選び出して増大させた。これらのクローンを、ルシフェラーゼアッセイ法（Ｓｔｅａｄｙ  ＧＩｏ，Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定して、一過性的に導入したＴＥＴ−反応性ルシフェラーゼ発現プラスミドの誘導性発現が厳密に制御されているコロニーを選抜した。ドキシサイクリン発現に応答したルシフェラーゼ発現が１０倍よりも高い誘導性を示したものを、さらに細胞株を構築するのに適しているとみなした。
【０２０４】
ＴＥＴ−誘導性標的遺伝子細胞株の作出
Ｓｎａｉｌ、Ｚｅｂ１、ＴＧＦβ（恒常活性型）の全長ｃＤＮＡ（ＳｎａｉｌのｍＲＮＡ配列、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿００５９８５、発現物：ＧｅｎｅｌＤ：６６１５；Ｚｅｂ１のｍＲＮＡ配列、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿０３０７５１、発現物：ＧｅｎｅｌＤ：６９３５；恒常活性型Ｓｅｒ２２３／Ｓ２２５ヒトＴＧＦ−β−１をコードするＴＧＦβの配列（即ちＧｅｎｂａｎｋ  ＮＰ＿０００６５１（発現物：ＧｅｎｅｌＤ：７０４０）であって、２２３位と２２５位のシステインがセリンに変異したもの）を、Ｔｅｔ制御プロモーター（ｐＴＲＥ２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）調節下に含むプラスミドを、標準的な方法を用いて構築した。ＴＥＴ−ＯＮ細胞株を平板塗布し、上記したｐＴＲＥ２−Ｓｎａｉｌプラスミド、ｐＴＲＥ２−Ｚｅｂ１プラスミド、またはｐＴＲＥ２−ＴＧＦβプラスミドによって形質転換した。１５０ｍｍ培養皿に平板塗布したら、ピューロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて単一細胞を選抜した。３〜４週間にわたって、ピューロマイシン濃度を最終濃度０．１μｇ／ｍｌまで低下させながら、コロニーを選抜した。コロニーフィルターを用いてコロニーを取り出し、ウェスタンブロット分析法によって、標的遺伝子のＴＥＴ依存性発現するものをスクリーニングした。場合によっては、複数種のｃＤＮＡを、所定の細胞株に同時形質移入させた。これらの方法は、上記に列挙したｃＤＮＡによって、テトラサイクリンまたはこの類似化合物に応答してＥＭＴを起こす細胞株の作出を可能にする。
【０２０５】
細胞増殖の測定：Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて細胞増殖を測定した。細胞株を、１ウェル当たり３０００細胞という密度で９６ウェル培養皿に播種した。平板塗布してから２４時間後、細胞に、さまざまな濃度の薬剤を、単独または併用して投与した。投与してから７２時間後に、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏのシグナルを測定した。
【０２０６】
アポトーシスの測定：カスパーゼ３／７活性の上昇によって測定されるアポトーシス誘導を、カスパーゼ３／７Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて測定した。細胞株を、１ウェル当たり３０００細胞という密度で９６ウェル培養皿に播種した。平板塗布してから２４時間後、細胞に、さまざまな濃度の薬剤を、単独または併用して投与した。投与してから２４時間後に、カスパーゼ３／７Ｇｌｏのシグナルを測定した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で処理した平行培養皿を用いて、カスパーゼ３／７活性を標準化した。以下の公式を用いて、各ウェルについてのシグナルを標準化した：カスパーゼ３／７Ｇｌｏ化学発光単位／ＤＭＳＯ対照のＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ画分。グラフはすべて、ＰＲＩＳＭ（登録商標）ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて作成した。
【０２０７】
免疫蛍光共焦点顕微鏡法
実験０日目に細胞をカバーガラスの上に塗布し、１日目にリガンドで刺激し、３〜４日目に培地とリガンドを新鮮なものにした。７日目に、４％パラホルムアルデヒド（ＥＭＳ、＃１５７０１）／ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、＃１４１９０）の中で室温にて１０分間細胞を固定した。細胞を３％ＢＳＡ／ＰＢＳ内でブロックし、ブロッキング用緩衝液で希釈した一次抗体（Ｅ−カドヘリン、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、＃ｓｃ２１７９１、およびビメンチン、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、＃ＡＢ５７３３）とともに、室温にて２時間温置した。細胞を洗浄し、二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ１１０２９およびＣｈｅｍｉｃｏｎ、＃ＡＰ１９４Ｒ）で温置した後、核ＴＯ−ＰＲＯ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ｔ３６０５）による対比染色を行った。Ｐｒｏ−Ｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ蛍光退色防止用試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐ３６９３４）を用いて、カバーガラスをスライドガラスの上に載せた。Ｌｅｉｃａ共焦点用ソフトウェアを用いて、ＳＰ２スキャナー装置によりＬｅｉｃａ  ＤＭＲＸＥ顕微鏡上で画像を捕捉した。
【０２０８】
細胞の遊走および浸潤の測定
リガンドで６日間処理した細胞を、リガンドとともに血清不足の状態に一晩置いた。翌日、改変ボイデンチャンバー（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ  Ｃｕｌｔｒｅｘ  ＃３４５８−０９６−Ｋ）内で、上部チャンバーの無血清培地中の細胞を用いてアッセイを行った。下部チャンバーでは、１０％ＦＢＳ＋／−３倍濃度のリガンドを化学誘引物質として含む血清を用いた。製造業者の指示に従って、２４時間後、非被覆膜を用いて遊走を測定し定量した。４８時間後、浸潤をコラーゲンＩＶ−被覆膜で測定し定量した。
【０２０９】
ＥＭＴの形態および表現型の復帰
細胞をリガンドで７日間処理するか、または処理をしないで、その後、リガンドを含まない新鮮な培養皿に継代した。タンパク質を調べるために、表示された日に細胞を回収し、復帰を観察するためにＥＭＴマーカーで免疫ブロットを行った。遊走および浸潤を測定するためには、細胞を１４日間復帰させ、最後の日に無血清状態に置いた。次いで、上記したようにアッセイを行った。
【０２１０】
Ｈ３５８  ＨＧＦ  ＯＳＭ  ＥＭＴモデルのマイクロアレイおよびプロテオミクスによるプロファイリングを行うための追加的な材料および方法
細胞の培養および処理
Ｈ３５８細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、および０．１ｍＭ  ＨＥＰＥＳを添加したＲＰＭＩ１６５０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＃２１８７０）で増殖させた。細胞は、５％ＣＯ２下３７℃で増殖させた。実験０日目に細胞を播種し、１日目に完全培地内でリガンドによって刺激し、７日間増殖させた。実験３日目と６日目に培地とリガンドを新鮮なものにした。ＨＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃１００−３９）およびＯＳＭ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃２９５−ＯＭ）はともに１００ｎｇ／ｍｌで用いた。
【０２１１】
Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘアレイ：
実験７日目に、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ペレット化し、即座に凍結した。ｍＲＮＡの単離およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １３３  Ｐｌｕｓ  ２．０アレイによる解析を行うため、細胞ペレットをＧｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｓに送付した。
【０２１２】
プロテオミクス：
実験７日目に、タンパク質を調べるために細胞を回収した。全タンパク質を解析するために、ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ（登録商標）試薬（ＥＭＤ  ＃４４４８１０）を用いて、核画分、膜画分、および細胞質ゾル画分を調製した。次いで、トリクロロ酢酸／デオキシコール酸共沈法を用いて、タンパク質を沈殿させた。２％デオキシコール酸を試料に加え、氷上にて３０分間静置した。次いで、１００％ＴＣＡを１：１の割合（容量／容量）で試料に加えた。試料をボルテックス撹拌し、一晩温置した（１０℃）後、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離した（４℃）。沈殿物を５ｍｌ冷アセトンで洗浄し、撹拌し、再沈殿させることを２回行い、風乾した。沈殿した試料を８Ｍ尿素に再懸濁し、５ｍＭトリブチルホスフィン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃Ｔ７５６７；室温にて１時間）で還元し、ヨードアセトアミド（１５ｍＭ、室温にて１．５時間）でアルキル化し、１Ｍ尿素になるまで希釈し、２０μｇトリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃Ｔ６５６７；３７℃、１８時間）でタンパク質分解を行った。ペプチドをトリフルオロ酢酸（ＴＣＡ）で酸性化し、Ｃｌ８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｐｌｕｓカートリッジ（（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．＃ＷＡＴ０２０５１５）を用いて脱塩した。ビシンコニン酸（ＭｉｃｒｏＢＣＡ  Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質濃度を測定した。既述されたところ（Ｔｈｅｌｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ；Ｐｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ）に従って、抗−ホスホチロシン親和性選択法を行った。
【０２１３】
安定同位体標識法および液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化質量分析法によるペプチドの同定および定量
タンパク質の還元、アルキル化、トリプシン分解、および安定同位体標識は、さまざまな等圧タグを用いて、刺激後にペプチドを標識し、既述されている通りに行った｛Ｐｅｔｔｉ，２００５  ＃９５；Ｒｏｓｓ，２００４  ＃９４｝。四重ｉＴＲＡＱ法（Ｒｏｓｓ，２００４）および八重ｉＴＲＡＱ法の両方を用いた。標識した後、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびＣ１８脱塩工程によって、ペプチドをさらに精製した。ポリスルフォエチルＡ樹脂で充填された４．６×５ｍｍの陽イオン交換カートリッジ（ＯｐｔｉｍｉｚｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｒｅｇｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＯＲ）を用いて強陽イオン交換（ＳＣＸ）クロマトグラフィーを行った。ペプチドを脱塩した後、０．１％ＴＦＡ、４〜６０％アセトニトリルの中で５分間、勾配Ｃ１８逆相クロマトグラフィー（３×５ｍｍのトラップ、＃１１−０２８７２−ＴＡ；Ｏｐｔｉｍｉｚｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってオンライン−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行い、２１４ｎｍでＵＶ検出した。ｍ／ｚ  １１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２１のＭＳＭＳタグによる八重ｉＴＲＡＱ標識法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）が用いたＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件は、四重試料について上記した条件と同じであった。
【０２１４】
液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）、およびタンパク質データベース検索｛Ｐｅｔｔｉ，２００５＃９５｝によって、ペプチドの質量、ペプチドの配列情報、およびペプチドの定量化結果を得た。逆相（Ｃ１８）ＨＰＬＣによって、四重極−飛行時間型質量分析器の中にペプチドを導入した。Ｃ１８カラムは、ＰｉｃｏＦｒｉｔ（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）溶融シリカチューブ（内径１５μ）に入った自己充填式の７５μ×約１０ｃｍ（３μＭａｇｉｃＣ１８；Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）であり、約２．７ｋｖのスプレー電圧を用い、２００ｎｌ／分で、アセトニトリル、０．１％ギ酸による勾配溶離（０．３９％／分）によって展開した。０．３秒間の走査（ｍ／ｚ４００−１６００）、その後、一般的には、０．５秒間ずつ（ｍ／ｚ６０−１２００）の生成イオン走査を引き続き３秒間行うことによって、直交型四重極ＴＯＦ（Ｑｑ−ＴＯＦ）機器（ＳＣＩＥＸ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）上で質量分析情報依存型のＭＳおよびＭＳ−ＭＳ取得を行った。２＋、３＋、および４＋の荷電状態を有する親イオンを、２分間の除外期間をおいて選択した。イオンは、第２四重極に集められ、飛行時間型（ＴＯＦ）検出装置の中でイオンをパルスするのと同時に放出された。Ａｎａｌｙｓｔ  ＱＳ（Ｖｅｒｓｉｏｎ１．１；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてＭＳデータを集めた。８倍データビニングを用いた。ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０；Ｂｕｉｌｄｓ  ４４６４９ｂｅｔａおよび５０８６１；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ）のＰａｒａｇｏｎアルゴリズムを用いて、ＵｎｉＰｒｏｔタンパク質データベース（１０／０５〜０１／０７に公開されたもの）内のヒト配列を検索して、調査および生成物のイオンスペクトルデータから、９５％超の信頼度でタンパク質を同定した。複数のイソ型を検出した場合には、それぞれ検出された型に特異的なペプチドだけを用い、イオン計数において、タンパク質の割合を計算する際に重み付けをするための要因として考慮した｛Ｓｈｉｌｏｖ，２００７  ＃１０１｝。タンパク質の同定は｛Ｂｒａｄｓｈａｗ，２００６  ＃９９｝の指針に従ったが、そこでは、同定する対象に含まれるには２つ以上のユニークなイソ型特異的ペプチドが必要とされる。タンパク質の結果が節約されていることは、ＰｒｏＧｒｏｕｐアルゴリズムによって厳密なタンパク質推定を行うことで保証された。９５％以上の信頼度で同定されたタンパク質で、分布の上側四分位および下側四分位（７５％超または２５％未満）の間で細胞または細胞状態が比較的豊富で、ｔ検定による（細胞株または生物学的条件における任意の差異についての）ｐ値が０．０５よりも小さなものをさらに検討した。分布の上側四分位および下側四分位（７５％超または２５％未満）の間で細胞または細胞状態が比較的豊富なタンパク質を用いて、既に定義されていた基準としたタンパク質のＥ−カドヘリン、αカテニン、βカテニン、およびビメンチン｛Ｔｈｏｍｓｏｎ，２００５  ���４４｝を正確に、上皮細胞状態および間葉系細胞状態にビン幅を割り当てた。ＤＮＡマイクロアレイ研究と同様、データ圧縮すると、ＥＬＩＳＡ法や免疫ブロット法と比較して、タンパク質の存在量の変化が過小評価されることに留意すべきである。これは、ＤＮＡアレイ研究では、「オンスポット」ハイブリッド形成によるノイズに起因するが、哺乳動物細胞画分実験では、複合的なペプチド混合物に関連したＭＳ／ＭＳノイズに起因する。
【０２１５】
Ｈ３５８インビボ実験のための追加的な材料および方法
癌の進行およびインビボでの薬剤耐性におけるＥＭＴの役割をより理解するために、３種類のドキシサイクリン誘導性細胞株を作出して、上皮様Ｈ３５８  ＮＳＣＬＣ細胞株において活性型のＴＧＦβ（ｔｅｔ−ｏｎ  ＴＧＦβ）、Ｚｅｂ１（ｔｅｔ−ｏｎ  Ｚｅｂ１）、またはＳｎａｉｌ（ｔｅｔ−ｏｎ  Ｓｎａｉｌ）のいずれかを発現させた。また、これらの安定した細胞株は、インビボ研究での使用のためにレンチウイルスを使用してルシフェラーゼ標識された。これらの誘導細胞株は、インビトロにおいてＥＭＴに似た転換を起こす。これらのモデルを、これらの遺伝子が皮下異種移植片においてＥＭＴ様転換を生じさせる能力を評価することによって、インビボで特徴を明らかにした。ｔｅｔ−応答性遺伝子を誘導するために、マウスに０．５ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを含む飲料水を与えて、腫瘍を増殖させた。一定の時点でマウスを殺して腫瘍を切り出した。免疫組織化学的解析用に腫瘍を固定し、ウェスタンブロット解析用に腫瘍溶解物を作製して、顕著なＥＭＴマーカーであるＥ−カドヘリンおよびビメンチンにおける変化を調べた。さらに、腫瘍増殖を観察し、該当する場合には、病理学的変化を注記した。
【０２１６】
インビボにおける上皮−間葉転換の画像化
ルシフェラーゼを発現する腫瘍細胞は、このような細胞を移植したマウスで観察することができる。Ｔｅｔ誘導性株にＣＭＶ−ルシフェラーゼを形質移入し、腹側部および同所性の異種移植腫瘍モデルにおける腫瘍サイズおよび転移を観察した。または、ヒトＥ−カドヘリン遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｃｏｒｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｏｃｕｓ  ＤＱ３３５１３２、ヒトＥ−カドヘリン遺伝子、プロモーター、および５’ＵＴＲ、１１１２ｂｐのＤＮＡ；Ｌｉｕ，Ｙ−Ｎ．ら、（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４：８２７７−８２９０）の上流にある上皮遺伝子プロモーター配列を、ルシフェラーゼ遺伝子の５’側に連結し、Ｔｅｔ−誘導性細胞株に形質移入して、インビボで、上皮細胞状態にある腫瘍細胞を観察した。同様に、ヒトビメンチン遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｃｏｒｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｏｃｕｓ  ＥＦ４４５０４６の２３４７位〜３９５２位の塩基（プロモーター配列）、全部で１５１２３ｂｐのＤＮＡを有するヒトビメンチン遺伝子）をルシフェラーゼ遺伝子の５’側に連結し、Ｔｅｔ−誘導性細胞株に形質移入して、インビボで、間葉系細胞状態にある腫瘍細胞を観察した。複数の上皮プロモーター配列を使用することも可能である。
【０２１７】
非侵襲性の生物発光を利用した画像化によって、同じ動物で何度も繰り返し測定すること（経時的研究）が可能になり、これらの処理が妨害となることなく、動的な生物学的過程を観察し測定することが可能となる。非侵襲性の生物発光を利用した画像化によって、癌の幾つかの要素：１）位置、２）大きさ、３）時期、および４）型、または病状を多重的に解析することが可能になる。これらの要素を総合すると、腫瘍が成長および／または進行する動的過程を合理的に解釈することができるようになる。インビボで癌細胞を可視化および追跡するためには、まず、細胞が、基質存在下で光を発生させる生物発光性レポーター遺伝子、例えば、蛍ルシフェラーゼとして公知である、フォティナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェリン触媒酵素を発現するよう改変する必要がある。この改変を行うためには、改変Ｈ３５８細胞株に、ｈＥＦｌα／ＨＴＬＶプロモーター（ｃａｔ＃  ＬＶｌ９８，Ｌｅｎｔｉｇｅｎ）によって駆動される蛍ルシフェラーゼを含むレンチウイルスを形質導入した。各細胞株についてプールした細胞集団は、１＊１０６細胞に１”１０７個のレンチウイルス粒子を、６ｎｇ／ｍｌポリブレン存在下、通常の増殖培地内で一晩形質導入して作製した。生物発光活性をインビトロで確認した後、これらの細胞株を安定した細胞株として増殖させ、ヌードマウスの適当な部位に皮下または同所的に移植し、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳスペクトル装置を用いて簡単に画像化した（図１５）。ＥＭＴに関する実験では、インビボでＥＭＴを起こすよう改変された細胞を何度も繰り返し追跡して、腫瘍の増殖、存在場所、拡散、および転移能力を決定することができる。さらに、生物発光の観測は、さまざまなインビボアッセイ法を利用する場合に、腫瘍細胞を定量するための標準化要素として役立つ。
【０２１８】
誘導された腫瘍のウェスタンブロッティング
飲料水にドキシサイクリンを加えて、遺伝子誘導すると同時に、ＳＣＩＤマウスにおけるＨ３５８  ｔｅｔ−誘導性ＥＭＴモデルの皮下腫瘍のＥＭＴマーカーを変化させる。ドキシサイクリン投与の７日後に皮下腫瘍を取り出し、液体窒素内で瞬時に凍結させた。ビーズ式破砕機を用いて、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含むＲＩＰＡ緩衝液内で腫瘍を破砕均質化した。溶解物を、標準的なウェスタンブロッティング技術を用いて解析した。ブロットを、一次抗体とともに一晩温置し、ＨＲＰ結合二次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：７０７４，７０７６；Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ、カタログ番号：ＲＰＮ１２３２）存在下で化学発光法を用いて検出した。以下の一次抗体をタンパク質の検出に使用した：Ｅ−カドヘリン−Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：４６０５、１：１０００；ビメンチン−ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号：５５０５１３、１：５０００；ＴＧＦβ−Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：３７０９、１：１０００；Ｓｎａｉｌ−ＡｂＣａｍ、カタログ番号：１７７３２、１：１０００；Ｚｅｂ１−Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号：１０５７０、１：１０００。病理学者がこれらのスライドを検査して、顕著な変化を報告した。これらのスライドは、Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅを用いて走査し、Ａｐｅｒｉｏ  ＩｍａｇｅＳｃａｎソフトウェアを用いて画像化した。
【０２１９】
誘導された腫瘍の免疫組織化学的検査
飲料水にドキシサイクリンを加えて、遺伝子誘導すると同時に、ＳＣＩＤマウスにおけるＨ３５８  ｔｅｔ−誘導性ＥＭＴモデルの腫瘍のＥＭＴマーカーを変化させる。ドキシサイクリン投与の７日後に皮下腫瘍を取り出し、中性緩衝ホルマリン内で固定した。固定化後、組織をパラフィンに包埋し、８μｍの切片に切断した。免疫組織化学用の染色には、クエン酸緩衝液による抗原賦活化で一般的に行われる方法を利用し、その後、一次抗体との温置、３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質を用いたＨＲＰ−結合二次抗体による検出、およびヘマトキシリン対比染色を行った。タンパク質の検出に用いられて一次抗体は以下の通りである。Ｅ−カドヘリン−Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号：４６０５、１：５０；ビメンチン−Ｃｈｅｍｉｃｏｎ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＡＢ５７３３，１：６４００；Ｓｎａｉｌ−Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号：１０４３３，１：４００；Ｚｅｂ１−Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号：１０５７０、１：５０。
【０２２０】
誘導された腫瘍の増殖
ＳＣＩＤマウスに、１＊１０７Ｈ３５８ｔｅｔ−ｏｎ細胞（目的遺伝子を有するもの）とマトリゲル（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１：１に混合したものを移植した。移植時にドキシサイクリン（飲料水中０．５ｍｇ／ｍｌ）を投与し、腫瘍の増殖を２１日間追跡し、キャピラリーでの測定結果を用いて腫瘍体積を記録した。各群（ｎ＝８）別に平均偏差と標準偏差を報告する。
【０２２１】
結果
ＥＭＴリガンド誘導型細胞モデル
さまざまな細胞外リガンドドライバーを用いて、細胞株が上皮から間葉系への転換（ＥＭＴ）を起こす能力を調べた。Ｈ３５８を含む５つのＮＳＣＬＣ細胞株を、各増殖因子およびサイトカインで処理して、ＥＭＴ様転換を誘導する能力を評価した。Ｈ３５８（図１）だけが、完全な転換を起こすことができた（即ち、例えばＥ−カドヘリンまたはＥｒｂＢ３などの上皮マーカーが消失して、例えば、ビメンチン、フィブロネクチン、および／またはＺｅｂ１などの間葉系マーカーが出現した）。これらの増殖因子およびサイトカインは、インビボにおいて腫瘍細胞のＥＭＴを促進すると考えられている炎症刺激を模倣するよう選ばれたものである。
【０２２２】
以下の結論が得られた。ＴＧＦβは、Ｈ３５８細胞において、他のＮＳＣＬＣ株では見られない最も完全なＥＭＴを誘導することができる。部分的なＥＭＴは、ＴＧＦβで処理された他の幾つかの株でも見られた。ＴＮＦαも、Ｈ３５８細胞においてＥＭＴを誘導することができた。ＥＧＦおよびＩＬ−４は、より弱くＥＭＴを誘導した。
【０２２３】
各リガンドが単独または混合して存在する中で細胞を７日間処理して、ＮＳＣＬＣ細胞株のパネルをスクリーニングした。一次スクリーニングで、リガンドが、形態学的変化を引き起こすことができるか、上皮マーカーであるＥ−カドヘリンを下方制御できるか、または、ビメンチンなどの間葉系マーカーを上方制御することができるかを判定した。ＥＭＴ細胞モデルの候補は、間葉系マーカーを上方制御し、形態学的変化を示すはずである。より確実なモデルは、Ｅ−カドヘリン発現の下方制御を示すものである。Ｅ−カドヘリンのタンパク質量が実質的に下方制御されなかったモデルでは、Ｅ−カドヘリンが誤った場所に局在化していると考えられる。
【０２２４】
ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ３５８では、ＥＭＴ過程を起こす能力があることを示唆するマーカーの変化を示すことができることが明らかになっている。ＴＧＦβ単独で、またはＨＧＦおよびＯＳＭという二重リガンドと一緒にＨ３５８を７日間処理したところ（図２）、どちらもＥＭＴが起きたことを証明するマーカーである、Ｅ−カドヘリンの顕著な減少と、ビメンチンの確実な増加が生じた。ＴＧＦβによるＥ−カドヘリン発現の抑制は、非常に強いものであったが、完全ではなかった。しかし、ＴＧＦβにＨＧＦまたはＯＳＭのどちらかを加えると、ＨＧＦおよびＯＳＭはいずれも単独の薬剤としては、有意なＥ−カドヘリン抑制もビメンチン誘導も生じさせることがないにもかかわらず、より完全なＥ−カドヘリン発現の抑制をもたらした。さらに、ＨＧＦおよびＯＳＭと同じシグナル伝達経路によって作用する二重リガンドの別の組み合わせも、同じようにＥＭＴ過程に影響を与え、Ｈ３５８細胞株において作用することが予想される。オンコスタチンＭ経路の活性化は、ＪＡＫ−Ｓｔａｔ経路を介して作用する。ＨＧＦリガンドは、ＰＩ３経路とＭＡＰＫ経路を介してシグナル伝達するチロシンキナーゼ受容体であるｃ−ＭＥＴを通して作用する。従って、ＰＩ３ＫおよびＭＡＰＫを介してシグナル伝達する別のチロシンキナーゼ受容体によってＨ３５８細胞をリガンド刺激すると、オンコスタチンＭとともに二重リガンド系の一部として作用しＥＭＴを活性化させることが予想される。例えば、ＩＧＦ１−Ｒ、ＦＧＦＲ、ＲＯＮ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、およびＰＤＧＦＲのリガンド刺激などである。
【０２２５】
阻害剤を試験するためにインビトロＨ３５８細胞モデルを利用できることが、低分子ＴＧＦβ阻害剤（ＳＢ４３１５４２）の存在下または非在下でＴＧＦβリガンド処理されたＨ３５８細胞との三次元（３Ｄ）マトリゲル培養で実証されている。ＴＧＦβリガンド存在下で、Ｈ３５８細胞は、間葉系バイオマーカーであるビメンチンの出現によって例証される上皮から間葉系への転換を起こすことができた（図９）。低分子ＴＧＦβ阻害剤ＳＢ４３１５４２存在下では、上皮から間葉系への転換はなくなり、これは、間葉系バイオマーカーであるビメンチンの欠如、および上皮バイオマーカーであるＥ−カドヘリンの保持によって例証された。
【０２２６】
インビトロにおけるＥＭＴの画像化
本発明者らは、リガンド処理された細胞におけるＥ−カドヘリンとビメンチンの発現および局在を調べて、単一細胞レベルでのＥＭＴの程度を決定した（図１０）。２つの不完全なＥＭＴモデルである、ＨＧＦまたはＯＳＭで処理されたＨ３５８細胞は、混合した細胞集団をもたらす。機能的で膜に局在するＥ−カドヘリンをもち、ビメンチンを欠如した上皮の外観を呈する細胞もあれば、細胞質ゾルでＥ−カドヘリンおよびビメンチンを同時に発現するする細胞もあり、部分的なＥＭＴが起きていることを示している。ＴＧＦβは、Ｈ３５８細胞において、ほとんどの細胞がビメンチンを発現し、機能的なＥ−カドヘリンをほとんど発現しないという、より完全なＥＭＴを誘導した。二重リガンドモデルまたはＴＧＦβ多重リガンドモデル（即ち、ＴＧＦβをＯＳＭまたはＨＧＦと併用したもの）は、Ｅ−カドヘリンがほとんど完全に消失し、ビメンチンを強力に発現する細胞のより均質な集団を示す。
【０２２７】
リガンドに誘導されたＥＭＴシグナル伝達の解析
Ｈ３５８細胞におけるＥＭＴに必要とされる、ＨＧＦ、ＯＳＭ、およびＴＧＦβの下流におけるシグナル伝達を測定するために、本発明者らは、リガンドに誘導されるＥＭＴの進行に対する薬学的阻害剤の効果を観測した（図１１）。ＭＥＫ／ＥＲＫ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、およびＰＩ３キナーゼ経路は、ＨＧＦ、ＯＳＭ、およびＴＧＦβの特性がよく分かっているエフェクターであるため、これらの経路を、個別におよびまとめて阻害した。図１１Ａは、ＪＡＫ経路を阻害すると、ＯＳＭ誘導モデルにおいてＥＭＴが阻止されることが分かった。ＪＡＫ阻害剤は、ＯＳＭ、ＴＧＦβ、ＨＧＦ＋ＯＳＭ、およびＴＧＦβ＋ＯＳＭによって誘導されるＥ−カドヘリンの下方制御を阻止し、ＯＳＭ、ＨＧＦ＋ＯＳＭ、およびＴＧＦβ＋ＯＳＭによって誘導されるビメンチンの上方制御を減衰させた。形態学的な変化は、マーカーの変化を反映していた（図１１Ｂ）。これに対し、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の阻害は、どのリガンドで誘導しても、マーカーの変化に対しても、形態学的な変化に対しても影響を与えなかった。ＰＩ３キナーゼ経路を阻害すると、ＨＧＦ＋ＯＳＭマーカーと形態学的な変化を部分的に阻止した。さらに、ＯＳＭおよびＯＳＭ＋ＴＧＦβによって誘導された形態学的な変化は、Ｅ−カドヘリンまたはビメンチンに対する対応する変化を伴うことなく、ＰＩ３キナーゼ阻害剤によって阻止された。これらの結果は、ＪＡＫおよびＰＩ３キナーゼのシグナル伝達経路が、Ｈ３５８細胞において、ＯＳＭに誘導されるＥＭＴにとって必要であることを示している。
【０２２８】
ＥＭＴは、細胞の遊走と浸潤を増加させる
Ｈ３５８細胞において、リガンドによって誘導される形態学的変化およびマーカー変化は、改変ボイデンチャンバーアッセイ法によって測定すると、遊走および浸潤する能力の増加と相関していた（図１２Ａおよび１２Ｂ）。完全なＥＭＴを起こした（即ち、ＨＧＦ＋ＯＳＭ、またはＴＧＦβ＋ＯＳＭで処理された）細胞は、部分的に転換しただけの（即ち、ＨＧＦまたはＯＳＭ単独で処理された）細胞よりも運動性が高かったが、このことは、細胞の遊走浸潤能力は、ＥＭＴプログラムにおける細胞の状態に基づいていることを示唆している。
【０２２９】
リガンドに誘導されたＥＭＴは可逆的である
このＥＭＴモデルにおける細胞は準安定的で、刺激を除去すると上皮表現型に復帰する。図１３Ａおよび１３Ｂは、リガンド処理した間葉系細胞を、リガンドを除去してから培養すると、マーカーも形態も上皮状態に復帰することを示している。不完全ＥＭＴモデル（ＨＧＦまたはＯＳＭ）において、復帰は、６日間でほぼ完全に終わるが、より完全な二重リガンドモデルまたはＴＧＦβ多重リガンドモデルでは、同等の上皮表現型に復帰するにはもっと長い時間（１２日間）が必要となる。復帰した細胞は、遊走アッセイおよび浸潤アッセイにおいても上皮細胞に似ている（図１３Ｃ）が、二重リガンドモデルでは、復帰は完全ではない。
【０２３０】
誘導性ＥＭＴモデル
抗癌剤およびこの併用剤をインビボで選択するのに適したＥＭＴモデルを作出するために、特異的なＥＭＴ誘導因子を、テトラサイクリン類似化合物で誘導可能なプロモーターの調節下に置いて、ＥＭＴ様転換を起こすことができることが示されている腫瘍細胞株の中に安定的に形質移入した。この過程は、下記の図３に図示されている。
【０２３１】
ドキシサイクリンが存在すると、Ｈ３５８−Ｓｎａｉｌ安定形質転換体（Ｓ４）は、Ｓｎａｉｌの誘導、上皮マーカー（例えば、ＥｒｂＢ３）の消失、および間葉系マーカー（例えば、ビメンチン）の取得を示す。ＧＡＰＤＨをローディング対照として用いた（図４および５）。ＳｎａｉｌおよびＺＥＢ１の発現は、Ｈ３５８細胞に対して、より散在性で運動性の表現型を誘導した。Ｓｎａｉｌの表現型の方が、ＺＥＢ表現型よりもはっきりしていた。
【０２３２】
ＴＧＦβは、癌細胞におけるＥＭＴの最も強力な誘導因子の一つである（上記参照）。本発明者らは、ＴＥＴ誘導性の恒常活性型ＴＧＦβ１（ａＴＧＦβｌ）遺伝子を含む細胞株を作製した。細胞を７日間ドキシサイクリンで処理してａＴＧＦβｌを誘導すると、ＥＭＴを証明する変化であるＥ−カドヘリンの下方制御、およびビメンチン発現の上方制御がもたらされる。３つの別種の安定細胞クローンを下記の図６に示す。
【０２３３】
インビボにおけるＥＭＴの画像化、およびその他Ｈ３５８のインビボ研究
インビボにおける腫瘍の増殖および浸潤を画像化するために、細胞の数および位置、ならびに上皮細胞状態と間葉系細胞状態を、ルシフェラーゼで読み取る方法を確立した。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子の５’側に融合した間葉ビメンチンプロモーターを用いて、ｔｅｔ誘導性細胞の間葉系状態を測定することができる。ビメンチンプロモーター−ルシフェラーゼプラスミドで形質転換されたＨ３５８  Ｔｅｔ−Ｓｎａｉｌ細胞において、ルシフェラーゼ発現は、本明細書に示されているように（図７）、間葉系状態にあるときにのみ、即ち、細胞をドキシサイクリンに暴露したときにのみ観察された。間葉系特異的プロモーター細胞は、原発腫瘍部位においても転移部位においても、インビボでＥＭＴを可視化するのに役立ち、ＥＭＴ過程を標的とする薬剤のインビボにおける活性を測定する際にも重要である。
【０２３４】
ルシフェラーゼ発現によって、本明細書に示すように、Ｈ３５８ｔｅｔＯ−ＣＭＶ−ｌｕｃｉ細胞の同所性移植片内のインビボ画像化が可能になった。即ち、例えば、図８に示すように、細胞の位置および数を、抗癌剤の評価が可能になる非侵襲的な方法で簡単に測定することができる。ルシフェラーゼを発現するＨ３５８細胞を、同所性肺モデル（図示されている。）およびより通常の側腹部注入モデル（図示せず）の両モデルにおいて、ＣＣＤカメラを用いてリアルタイムで画像化することができる。
【０２３５】
ＥＭＴは、細胞極性の消失、ならびに間葉系細胞にとってより特徴的な一定の表現型の誘導、例えば、変化した、より線維芽細胞様の形態、および細胞運動性の増加などを特徴とする。これらの変化に合致して、Ｅ−カドヘリンが消失して、ビメンチンが出現することが、ＥＭＴの過程を確認するために用いることができる確立した特徴である（Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：４４２−４５４；Ｓａｖａｇｎｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２３：９１２−９２３；Ｋａｎｇ  Ｙ．およびＭａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．（２００４）Ｃｅｌｌ  １１８：２７７−２７９；Ｊｕｌｉｅｎ−Ｇｒｉｌｌｅ，Ｓ．，ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６３：２１７２−２１７８；Ｂａｔｅｓ，Ｒ．Ｃ．ら、（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：１７２１−１７２７；Ｌｕ  Ｚ．，ら、（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．４（６）：４９９−５１５；Ｈｕｇｏ  Ｈ（２００７）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２１３（２）：３７４−８３；Ｌｅｅ  ＪＭ（２００６）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７２（７）：９７３−８１）。そのため、Ｈ３５８誘導性（ａＴＧＦβ、Ｚｅｂ１、またはＳｎａｉｌ）皮下腫瘍を担持するＳＣＩＤマウスに由来する異種移植片において遺伝子を誘導した後、上皮（Ｅｐｉ）バイオマーカーであるＥ−カドヘリンと、間葉系（Ｍｅｓ）バイオマーカーであるビメンチンの発現量を評価した。誘導性遺伝子産物、およびＥＭＴのタンパク質バイオマーカーの発現を、ドキシサイクリン処理７日後の全腫瘍の溶解物を免疫ブロッティング分析して解析した。
【０２３６】
Ｈ３５８ｔｅｔ−ｏｎａＴＧＦβ（恒常活性型）モデルにおいて、分泌タンパク質は、動物にドキシサイクリン水（０．５ｍｇ／ｍｌ）を与えたときに誘導される。ＴＧＦβシグナル伝達に応答して、細胞が、Ｅ−カドヘリンを転写下方制御し、ビメンチンなどの間葉系遺伝子を上方制御し得ることは十分に確認されている（Ｚａｖａｄｉｌ  Ｊ（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４（３７）：５７６４−７４；Ｍｏｕｓｔａｋａｓ  Ａ（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９８（１０）：１５１２−２０；Ｐｅｎｎｉｓｏｎ  Ｍ．（２００７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９（６）：５７９−８５；Ｌｅｉｖｏｎｅｎ  ＳＫ（２００７）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１５；１２１（１０）：２１１９−２４；Ｙａｎｇ  Ｊ．（２００８）Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．（６）：８１８−２９；Ｋｉｍ  ＪＨ（２００７）Ｊ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．：８９８−９０４；Ｒｅｅｓ  Ｊ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：６６（１９）：９５８３−９０）。ドキシサイクリンに暴露された動物由来のＨ３５８  ｔｅｔ−ｏｎａＴＧＦβ腫瘍をウェスタンブロッティング分析したところ、ドキシサイクリン処理されていない動物の同じタイプの対照用腫瘍と比較すると、Ｅ−カドヘリンの減少およびビメンチンの増加と同時にＴＧＦβ遺伝子が誘導されることが明らかになった（図１６Ａ）。ローディング量を標準化するために、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンを用いた。同じようにして、動物にドキシサイクリン水（０．５ｍｇ／ｍｌ）を与えたときに、Ｈ３５８ｔｅｔ−ｏｎＳｎａｉｌ腫瘍においてＳｎａｉｌを誘導した。Ｓｎａｉｌは、Ｅ−カドヘリン遺伝子のプロモーターに結合して転写を阻害することによって、Ｅ−カドヘリンを含む数多くの上皮遺伝子の転写を直接的に下方制御する転写抑制因子である。このＥ−カドヘリン消失によって、Ｂ−カテニンによるシグナル伝達の増加、およびビメンチンなど、幾つかの間葉系関連遺伝子の誘導が可能になる。（Ｐｅｉｎａｄｏ  Ｈ（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．７（６）：４１５−２８；Ｍｏｒｅｎｏ−Ｂｕｅｎｏ  Ｇ．（２００８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ：２４；２７（５５）：６９５８−６９；Ｂｅｃｋｅｒ  ＫＦ（２００７）Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ．８５（ｌ−３）：２０４−１２）。この生物学現象と合致して、Ｈ３５８  ｔｅｔ−ｏｎ  Ｓｎａｉｌ細胞からなる腫瘍におけるＳｎａｉｌの誘導が、ドキシサイクリンを投与されていない動物の同じタイプの対照用腫瘍と比較すると、Ｅ−カドヘリンタンパク質量の顕著な減少、およびビメンチン発現の顕著な増加をもたらした（図１６Ｂ）。前と同じように、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンを用いて、タンパク質のローディング量を標準化した。最後に、同じようにして、動物にドキシサイクリン水（０．５ｍｇ／ｍｌ）を与えたときに、Ｈ３５８ｔｅｔ−ｏｎＺｅｂ１腫瘍においてＺｅｂ１を誘導した。Ｓｎａｉｌ同様、Ｚｅｂ１も、Ｅ−カドヘリン転写の抑制因子であり、また、間葉系遺伝子の誘導因子でもある（Ｐｅｉｎａｄｏ  Ｈ（２００７）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．７（６）：４１５−２８；Ｍｏｒｅｎｏ−Ｂｕｅｎｏ  Ｇ．（２００８）Ｏ��ｃｏｇｅｎｅ：２４；２７（５５）：６９５８−６９；Ｂｅｃｋｅｒ  ＫＦ（２００７）Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ．８５（ｌ−３）：２０４−１２）。Ｓｎａｉｌモデルにおけると同様、Ｚｅｂ１を誘導すると、標準的なＥＭＴを証明する特徴であるＥ−カドヘリンおよびビメンチンに予想された変化がもたらされた（図１６Ｃ）。ローディング量を標準化するために、ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンを再び用いた。３つのモデルすべてで見られたこれらの変化は、ＥＭＴの過程で起こる遺伝子発現の変化と一致している。
【０２３７】
ＥＭＴにおいて、細胞−細胞接触の消失も、形態学的変化による特徴とされている。Ｈ３５８腫瘍のウェスタンブロッティングによって観察されたＥＭＴマーカーの変化を確認するために、誘導性Ｈ３５８腫瘍のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片を作製し、免疫組織化学法（ＩＨＣ）によるＥＭＴマーカー発現を測定した。さらに、この方法では、ドキシサイクリンによって目的遺伝子を誘導したときに、ＥＭＴに関連する腫瘍内の病理学的差異を検討することが可能である。この方法によって、ｔｅｔ−誘導性遺伝子が発現された後、特徴的なＥＭＴマーカーであるＥ−カドヘリンおよびビメンチンを直ちに試験することができる。ウェスタンブロッティングのデータによって示されているように、３つのモデルすべてにおいて、ドキシサイクリン水を投与されていない動物における同一の腫瘍と比較すると、これらのタンパク質の発現が劇的に変化していることは、ＩＨＣ法によって明らかである（図１７）。
【０２３８】
分泌性の可溶性タンパク質であるため、ＴＧＦβの発現を、Ｈ３５８  ｔｅｔ−ｏｎ  ａＴＧＦβ腫瘍内でＩＨＣによって直接試験することは可能とは考えられない。しかし、組織学的な読み取り結果から、ａＴＧＦβ発現によって、Ｅ−カドヘリンの下方制御がもたらされたことは明らかである（図１７Ａ、上図）。非処理腫瘍（上図）は、強い膜Ｅ−カドヘリンを示し、小型で、境界が明確な上皮細胞領域を有する明確な上皮細胞床（ｃｅｌｌ  ｂｅｄｓ）を形成し、腫瘍全体に間隔を置いて配置されている間質細胞のポケットによって支持されている。ビメンチンの発現は、間質細胞に限定されない（図１７Ａ、上図）。これに対し、ａＴＧＦβが誘導されている腫瘍（図１７Ａ、下図）では、腫瘍の組成に顕著な変化が存在する。上皮細胞数が有意の増加し、間質細胞が有意に増加して、異常で破壊された腫瘍構造を作出している。さらに、これらの上皮細胞は、対照用腫瘍のような境界がはっきりした細胞床を形成せず、上皮細胞床内への線維芽細胞の浸潤が有意に増加している。明らかに、紡錘状細胞の存在が増加しており、ＥＭＴに特徴的な形態学的な変化が起きていることを示唆している。上皮細胞は、Ｅ−カドヘリンの細胞表面における発現の全面的な消失を示し、非処理腫瘍と比較して、大部分の細胞が、核周囲におけるビメンチン発現を獲得する。ＥＭＴマーカー変化および細胞形態におけるこのような変化は、上皮細胞に対するＴＧＦβシグナル伝達の効果と一致している。腫瘍構造における全体的な変化は、ＴＧＦβが間質細胞を補充できることに起因しているか、上皮細胞の凝集が低下して、運動性が促進された結果であるか、またはこの両方のせいであり得る。これらの現象はすべて、腫瘍におけるＴＧＦβシグナル伝達によってもたらされる、ＥＭＴによって見られる表現型上の変化と一致している（Ｔｓｅ  ＪＣ（２００７）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｌ０１（４）：８１６−２９；Ｄｅ  Ｗｅｖｅｒ  Ｏ．（２００８）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ：１３０（３）：４８１−９４）。
【０２３９】
Ｈ３５８ｔｅｔ−ｏｎＳｎａｉｌ腫瘍内でＳｎａｉｌを誘導すると、強力な核Ｓｎａｉｌ染色がすべての細胞で見られる（図１７Ｂ、下図）。これと比較すると、対照用腫瘍は、拡散した背景染色を示したが、これは、一次抗体が、無関係の類似したエピトープに非特異的に結合したことによるアーティファクトの可能性が高い（図１７Ｂ、上図）。ａＴＧＦβ同様、Ｓｎａｉｌの発現は、腫瘍細胞において、膜Ｅ−カドヘリンの明らかな下方制御とビメンチンの上方制御とをもたらした。ａＴＧＦβモデルと同様、Ｓｎａｉｌが誘導されている腫瘍では、間質細胞に対する腫瘍の割合が有意に低下するにつれて、主要構造の全体的な破壊がみられた。しかし、細胞が依然として境界が明確な上皮細胞床を形成しており、間質細胞は、補充されているとも、これらの上皮細胞の中に浸潤しているとも思われないため、これは、ａＴＧＦβモデルとは異なっていると考えられる。これらの腫瘍において腫瘍細胞の含有がなくなったのは、Ｓｎａｉｌの抗増殖作用によって、間質細胞が正常な非処理腫瘍よりも高い割合で存在することが可能になったせいであり得る（図１７Ｂ、上図）。
【０２４０】
同様に、Ｈ３５８ｔｅｔ−ｏｎＺｅｂ１腫瘍内でＺｅｂ１を誘導すると、ほとんどの細胞がＺｅｂ１を発現したが、すべての細胞でＺｅｂ１が検出可能であったわけではない（図１７Ｃ、下図）。他のモデル同様、ドキシサイクリンを与えていない動物における同様の腫瘍と比較すると、腫瘍内ではＥ−カドヘリンが下方制御され、ビメンチンが上方制御されていた。Ｅ−カドヘリンおよびビメンチンの発現パターンは、腫瘍すべてで一貫していたわけではない。しばしばＥ−カドヘリンを全く発現しなかった細胞のグループや、誤った場所（細胞質）に局在化しているＥ−カドヘリンを有するグループがあった。ビメンチン染色のパターンも、核周囲ビメンチンを発現したグループもあった点で同様であった。Ｚｅｂ１およびＥ−カドヘリンまたはＺｅｂ１およびビメンチンの二重免疫染色を行ったが、連続切片の配置から、これらの領域が、Ｚｅｂ１を発現しているか、発現していない細胞のポケットに相関していることが示唆された（データ不記載）。これらの観察結果は、Ｚｅｂ１が、Ｅ−カドヘリン転写の抑制因子としての役割を持っている、および、ＥＭＴ過程を制御するマイクロＲＮＡ（ＭｉＲｓ）の直接的な調節因子としての役割を持っていることとも矛盾しない（Ｓｈｉｒａｋｉｈａｒａ  Ｔ（２００７）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ：３５３３−４４；Ｇｒｅｇｏｒｙ  ＰＡ（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ７（２０）：３１１２−８；Ｇｒｅｇｏｒｙ  ＰＡ（２００８）Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０（５）：５９３−６０１；Ｐａｒｋ  ＳＭ（２００８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２２（７）：８９４−９０７；Ｂｕｒｋ  Ｕ（２００８）ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．９（６）：５８２−９）。
【０２４１】
ＴＧＦβは、細胞上にあるＴＧＦβ受容体の構成に依存して、増殖抑制作用または増殖促進作用を有することが知られている。その上、別のＢＭＰファミリーメンバーのタンパク質の発現の変化およびＳＭＡＤシグナル伝達の変化によって、ＴＧＦβが、腫瘍上皮細胞に対して増殖阻害作用を有するか否かが決まる（Ｐａｒｄａｌｉ  Ｋ（２００７）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１７７５（１）：２１−６２；Ｒａｈｉｍｉ  ＲＡ（２００７），Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｌ０２（３）：５９３−６０８）。転写活性の抑制因子であるＳｎａｉｌおよびＺｅｂ１も、上皮細胞に対して増殖抑制作用をもたらすことが知られている（Ｚａｖａｄｉｌ  Ｊ（２００５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２４（３７）：５７６４−７４；Ｍｏｕｓｔａｋａｓ  Ａ（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．９８（１０）：１５１２−２０；Ｐｅｎｎｉｓｏｎ  Ｍ．（２００７）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９（６）：５７９−８５；Ｌｅｉｖｏｎｅｎ  ＳＫ（２００７）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１５；１２１（１０）：２１１９−２４；Ｙａｎｇ  Ｊ．（２００８）Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．（６）：８１８−２９；Ｒｅｅｓ  Ｊ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：６６（１９）：９５８３−９０）。そのため、Ｈ３５８  ｔｅｔ−ｏｎ（ａＴＧＦβ、Ｓｎａｉｌ、Ｚｅｂ１）モデルにおいて、飲料水に０．５ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを入れて動物に投与したときの長期間にわたる皮下腫瘍体積の違いを比較した。この目的で、３つのモデルすべてにおいて、誘導された遺伝子の増殖抑制作用は、さまざまな程度になることが注目された（図１８）。３つの場合すべてにおいて、非処理群と比較すると、ドキシサイクリン処理後７日目に、腫瘍増殖阻害が最低であった。しかし、ａＴＧＦβモデルは、遺伝子誘導した後２１日目まで、緩やかな増殖阻害を示しただけであった（図１２Ａ）。Ｚｅｂ１モデルは、遺伝子誘導後２１日目まで、増殖静止状態を示した（図１８Ｂ）。それに対し、Ｓｎａｉｌモデルにおける腫瘍は、遺伝子誘導すると、２１日目まで退行した（図１８Ｃ）。この結果は予想外であったが、これらの遺伝子の既知の増殖抑制作用と整合している。免疫組織化学的評価で見られたように、これらのモデルにおいて、上皮細胞含有率および異常構造が外見上消失したことは、これらの遺伝子の誘導によって、アポトーシスおよび／または細胞周期停止が生じる可能性を示唆している。未検討ではあるが、この考えは、細胞に対するこれらの遺伝子産物の確認されている作用と符合している。この増殖抑制作用は、腫瘍微小環境という背景に特異的なものであるか、細胞がＥＭＴによる進行を継続するにつれて、時間をかけて克服される可能性がある。このことを解明するには、具体的な病気状態における誘導遺伝子とＥＭＴの役割を検討する一層の研究が必要である。
【０２４２】
結論として、すべてのモデルにおいて、ドキシサイクリンで誘導される遺伝子の発現は、Ｅ−カドヘリンの有意な減少、ビメンチンの獲得、および、腫瘍増殖全体で測定すると、細胞増殖の低下をもたらしたことが認められる。さらに、ＥＭＴを誘導された腫瘍では、腫瘍構造および各細胞の形態に顕著な変化が見られた。転写、タンパク質発現、形態、および増殖において同時に起きたこれらの変化は、ＥＭＴの全体的な過程と合致する。そのため、これらのＨ３５８  ＮＳＣＬＣモデルは、腫瘍病理に対するＥＭＴの効果を評価するのに適したインビボ誘導系を代表するものである。従って、これらのモデルは、癌の進行、薬剤耐性、ならびにＥＭＴに関連した新規の薬剤標的およびこれに作用する薬剤の同定におけるＥＭＴの役割をよりよく評価する上で有用である。
【０２４３】
ＥＭＴモデルのゲノムおよびプロテオーム解析
ＥＭＴは、腫瘍のエルロチニブ感受性を消失させる一因となるとともに、播種性腫瘍細胞の転移効率に寄与し、これらが組合わされると、患者の生存率が顕著に低下する可能性がある。ＥＭＴのインビトロモデルは、この過程を調節する標的を発見することを目的とする薬剤発見を促進する。ＥＭＴモデルにおける転写およびシグナル伝達の変化の特徴を調べることによって、ＥＭＴ過程をよりよく理解することができ、薬剤発見につながる標的を示し得る制御の臨界点を同定できるはずである。
【０２４４】
リガンドによって誘導されるＨ３５８  ＥＭＴモデルの特徴を調べるために、不完全なＥＭＴ（ＨＧＦまたはＯＳＭの単独リガンド）または完全なＥＭＴ（ＨＧＦ＋ＯＳＭ二重リガンド）を誘導する条件下において、ｍＲＮＡおよびタンパク質の全体的な変化を特徴づけた。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒト発現マイクロアレイを用いて、ｍＲＮＡ転写産物の変化を同定し、質量分析プロテオミクスによって、タンパク質の発現およびチロシンリン酸化の変化を同定した。データ解析によって、ＨＧＦとＯＳＭの併用処理による相乗的シグナル伝達を明らかにし、多岐にわたる細胞機能制御の特徴的パターンが得られた。細胞が、不完全なＥＭＴに較べて、完全なＥＭＴを起こすと、ｍＲＮＡ、タンパク質発現、およびチロシンリン酸化における変化の数および程度が有意に増加した。これらの遺伝子の変化によって影響を受ける細胞機能を調べたところ、本発明者らは、複数の制御パターンを発見したが、このうち２つが特に興味深かった（図１４）。まず、不完全なＥＭＴおよび完全なＥＭＴによって幾つかの細胞機能を変化させたが、完全なＥＭＴの方が、より重要な効果を与えた。細胞の形態、細胞増殖、および細胞死が、このパターンの制御を示した。第二に、幾つかの細胞機能は、不完全なＥＭＴをもたらした処理によって影響を受けなかったが、細胞が、完全なＥＭＴを起こしたときには、影響を受けた。アミノ酸代謝、フリーラジカル捕捉、ならびにＲＮＡの損傷および修復は、この制御パターンに含まれる。全体的に見て、Ｈ３５８細胞では、完全なＥＭＴによって誘導される具体的な細胞機能が変化したことは、腫瘍細胞が生存するメカニズムとして可能なもの、およびこれらの機能を調節するシグナル伝達経路を示している。
【０２４５】
略語：
ＥＧＦ、上皮細胞増殖因子；ＥＧＦＲ、上皮細胞増殖因子受容体；ＥＧＦＲ−ＴＫＩ、上皮細胞増殖因子受容体チロシンキナーゼ阻害剤；ＥＭＴ、上皮−間葉系転換；ＭＥＴ、間葉系−上転換；ＮＳＣＬ、非小細胞肺；ＮＳＣＬＣ、非小細胞肺癌；ＨＮＳＣＣ、頭頸部扁平上皮癌；ＣＲＣ、結腸直腸癌；ＭＢＣ、転移性乳癌；Ｂｒｋ、乳癌キナーゼ（タンパク質チロシンキナーゼ６（ＰＴＫ６）としても知られている。）；ＦＣＳ、ウシ胎児血清；ＬＣ、液体クロマトグラフィー；ＭＳ、質量分析法；ＩＧＦ−１、インスリン様増殖因子−１；ＴＧＦα、形質転換増殖因子α；ＨＢ−ＥＧＦ、ヘパリン結合性上皮細胞増殖因子；ＬＰＡ、リゾホスファチジン酸；ＩＣ５０、最大半量阻害濃度；ｐＹ、ホスホチロチン；ｗｔ、野生型；ＰＩ３、ホスファチジル・イノシトール−３キナーゼ；ＧＡＰＤＨ、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素；ＭＡＰＫ、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ；ＰＤＫ−１、３−ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ−１；Ａｋｔ、ウイルス性癌遺伝子ｖ−Ａｋｔの細胞の相同体であって、タンパク質キナーゼＢとしても知られる；ｍＴＯＲ、ラパマイシンの哺乳動物における標的；４ＥＢＰ  １、真核生物翻訳開始因子−４Ｅ（ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質）結合タンパク質−１であって、ＰＨＡＳ−Ｉとしても知られている；ｐ７０Ｓ６Ｋ、７０  ｋＤａリボソームタンパク質−Ｓ６キナーゼ；ｅＩＦ４Ｅ、翻訳開始因子−４Ｅ（ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質）；Ｒａｆ、Ｒａｆ発癌遺伝子のタンパク質キナーゼ産物；ＭＥＫ、ＥＲＫキナーゼであって、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼとしても知られている；ＥＲＫ、細胞外シグナル制御タンパク質キナーゼであって、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼとしても知られている；ＰＴＥＮ、「１０番染色体上で検出されたホスファターゼおよびテンシンの相同体」、ホスファチジルイノシトールリン酸ホスファターゼ；ｐＰＲＯＴＥＩＮ、リンタンパク質、「タンパク質」は、リン酸化され得る任意のタンパク質、例えば、ＥＧＦＲ、ＥＲＫ、Ｓ６など；ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水；ＴＧＩ、腫瘍増殖阻害；ＷＦＩ、注射用蒸留水；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；ＥｒｂＢ２、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス性発癌遺伝子相同体２」であって、ＨＥＲ−２としても知られている；ＥｒｂＢ３、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス性発癌遺伝子相同体３」であって、ＨＥＲ−３としても知られている；ＥｒｂＢ４、「ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス性発癌遺伝子相同体４」であって、ＨＥＲ−４としても知られている；ＦＧＦＲ、線維芽細胞増殖因子受容体；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド。
【０２４６】
参照による組み込み
本明細書に開示されているすべての特許、公開特許出願、およびその他の参考文献は、明示的に、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２４７】
均等物
当業者は、日常的な実験だけを用いて、本明細書に具体的に記載されている発明の具体的実施形態に多くの均等物があることを認識し、確認することができる。このような均等物も、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
2011516826.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ−１】
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【図１１Ｂ−２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
2011516826.tif 000033
【図１８Ｂ】
2011516826.tif 000034
【図１８Ｃ】
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【国際調査報告】
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