(57)【要約】  本発明は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）のＡ１ドメインに対する特異的結合因子に関する新規な使用、とりわけ、待機的な経皮的冠動脈インターベンションを受ける安定狭心症の患者における使用を提供する。さらに、特定疾患の状況における投薬計画、並びにＲＩＰＡ及びＲＩＣＯ等の好適なアッセイの使用が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
待機的ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者において血栓を防止し及び／又は血栓形成の危険性を低減する方法であって、例えばヘパリン、アスピリン及び／又はＰｌａｖｉｘ等の併用薬の使用の有無にかかわらず、該患者に有効量の特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子を投与することを含む、方法。
【請求項２】
待機的ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者において血栓を防止し及び／又は血栓形成の危険性を低減させる薬剤の調製における、例えばヘパリン、アスピリン及び／又はＰｌａｖｉｘ等の併用薬の使用の有無にかかわらない特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子の使用。
【請求項３】
特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子が、配列番号：１〜配列番号：１８の配列のいずれかの配列を有するポリペプチドから成る群から選択される化合物、又は配列番号：１〜配列番号：１８の配列のいずれかの配列と少なくとも８０％の同一性を有する化合物である、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子が、配列番号：１〜配列番号：１８の配列のいずれかの配列を有するポリペプチドから成る群から選択される化合物、又は配列番号：１〜配列番号：１８の配列のいずれかの配列と少なくとも８０％の同一性を有する化合物であり、及び該化合物のいずれかの解離定数が、１ｎＭ以下、好ましくは１００ｐＭ以下である、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の使用。
【請求項５】
特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子がＡＬＸ−００８１（配列番号：１）である、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の使用。
【請求項６】
ＡＬＸ−００８１（配列番号：１）をＰＣＩ中及びＰＣＩ後２４時間まで６時間毎に与える、請求項５に記載の方法又は使用。
【請求項７】
ＡＬＸ−００８１の投与前の％血小板凝集と比較して、次の６時間に評価されるＲＩＰＡで測定される％血小板凝集が最大で１０％であるか、又は次の６時間に評価されるＲＩＣＯで測定される％凝集が最大で２０％である場合にのみ、好適な用量のＡＬＸ−００８１（配列番号：１）を与える、請求項５又は６に記載の方法又は使用。
【請求項８】
用量が、２ｍｇ〜１２ｍｇ、好ましくは４ｍｇ又は８ｍｇである、請求項６又は７に記載の方法又は使用。
【請求項９】
或る用量の該特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子を、ＰＣＩ中及びＰＣＩ後２４時間まで６時間毎に与える、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１０】
Ａ１  ｖＷＦ結合因子の投与前の％血小板凝集と比較して、次の６時間に評価されるＲＩＰＡで測定される％凝集が最大で１０％であるか、又は次の６時間で評価されるＲＩＣＯで測定される％凝集が最大で２０％である場合にのみ、該用量の該特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子を与える、請求項９に記載の方法又は使用。
【請求項１１】
用量が、２ｍｇ〜１２ｍｇ、好ましくは２ｍｇ〜９ｍｇである、請求項９又は１０に記載の方法又は使用。
【請求項１２】
特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子が、１２ａ２ｈ１（配列番号：１９）、又は配列番号：１９と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む、請求項１又は２に記載の方法又は使用。
【請求項１３】
特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子が、ＡＬＸ−００８１（配列番号：１）結合の少なくとも５０％を交差遮断し、及び／又はＡＬＸ−００８１（配列番号：１）により少なくとも５０％交差遮断される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１４】
ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者においてＡ１  ｖＷＦ結合因子を用いた療法の有効性を評価する方法であって、
該患者の例えばＲＩＰＡ及び／又はＲＩＣＯで測定された血小板凝集のレベルを、所定値と比較する工程、及び
該血小板凝集のレベルが該所定レベル以下を示すかどうかにより、該療法が有効かどうかを判定する工程、
を含む、方法。
【請求項１５】
Ａ１  ｖＷＦ結合因子の投与前のＲＩＰＡアッセイ又はＲＩＣＯアッセイそれぞれによる％血小板凝集と比較して、該所定値が、該ＲＩＰＡアッセイによって測定する場合には１０％血小板凝集であり、該ＲＩＣＯアッセイによって測定する場合には２０％血小板凝集である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者の治療をモニタリングする方法であって、
（例えばヘパリン、アスピリン及び／又はＰｌａｖｉｘ等の併用薬の使用の有無にかかわらず）待機的ＰＣＩを受ける被験者をＡ１  ｖＷＦ結合因子を用いて治療する工程、
該被験者から血液サンプルを得る工程、及び
治療後の％血小板凝集が治療前の％血小板凝集未満である場合には、該被験者が該療法に対してレスポンダーである可能性が高いことが示される、該サンプル中の％血小板凝集を求める工程、
を含む、方法。
【請求項１７】
治療後の％血小板凝集が、該血小板凝集をＲＩＰＡアッセイによって測定する場合には、治療前の血小板凝集の１０％以下であり、又は該血小板凝集をＲＩＣＯアッセイによって測定する場合には、治療前の血小板凝集の２０％以下である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト被験者における療法の過程を決定する方法であって、
（ｉ）％血小板凝集を例えばＲＩＰＡアッセイ及びＲＩＣＯアッセイから成る群から選択されるアッセイによって測定する、血栓形成を防止し及び／又は血栓形成の危険性を低減させる療法を受けるヒト被験者における血小板凝集のレベルを得る工程、
（ｉｉ）（ｉ）で得られる該血小板凝集のレベルを、対照群（例えばプラセボ群）における血小板凝集のレベルに相当する所定値と比較する工程、
（ｉｉｉ）（ｉ）で得られる該血小板凝集のレベルが該所定レベル以下であるかを判定する工程、及び
（ｉｖ）このような判定に基づき該療法の過程を決定する工程、
を含む、方法。
【請求項１９】
所定値が、該ＲＩＰＡアッセイによって測定する場合には１０％血小板凝集であり、該ＲＩＣＯアッセイによって測定する場合には２０％血小板凝集である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
例えばヘパリン、アスピリン及び／又はＰｌａｖｉｘ等の併用薬の使用の有無にかかわらず、待機的ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者において血栓形成を防止し及び／又は血栓形成の危険性を低減する方法であって、
患者の血小板凝集のレベルを所定値未満に下げる、かかる治療が必要な患者に有効量のＡＬＸ−００８１を投与する工程、
を含む、方法。
【請求項２１】
例えばヘパリン、アスピリン及び／又はＰｌａｖｉｘ等の併用薬の使用の有無にかかわらず、待機的ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者において血栓形成を防止し及び／又は血栓形成の危険性を低減する方法であって、
かかる防止が必要な被験者に有効量のＡＬＸ−００８１を投与する工程、
療法を受ける該患者において血小板凝集のレベルを検出する工程、
該血小板凝集のレベルを所定値と比較する工程、及び
任意で、該血小板凝集のレベルに基づき、第２の及び／又はさらなる有効量のＡＬＸ−００８１を患者に投与する工程、
を含む、方法。
【請求項２２】
ＡＬＸ−００８１に対して有効に応答する傾向にある患者を特定する方法であって、
該患者からの血液サンプル中の％血小板凝集を検出する工程、及び
該患者を有効量のＡＬＸ−００８１を用いて治療する工程、
を含み、ここで、該患者からの該血液サンプル中の％血小板凝集が、ＲＩＰＡアッセイで測定する場合には１０％であり、またＲＩＣＯアッセイで測定する場合には２０％である、方法。
【請求項２３】
実施例を特に参照して実質的に上記に記載される、全ての新規な化合物、プロセス、方法及び使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）のＡ１ドメインに対する特異的結合因子に関する新規な使用、とりわけ、待機的な経皮的冠動脈インターベンションを受ける安定狭心症の患者における使用を提供する。さらに、特定疾患の状況における投薬計画、並びにリストセチン誘導血小板凝集（ＲＩＰＡ）及びリストセチンコファクター活性（ＲＩＣＯ）等の好適なアッセイの使用が提供される。
【背景技術】
【０００２】
血小板凝集は血餅の形成において不可欠な事象である。正常状態下で、血餅は、血球が血管系から流出することを防止する役割を果たす。しかしながら、或る特定の疾患状態では、血塊（clots）が血流を制限又は完全に遮断し、細胞の壊死をもたらすおそれがある。例えば、アテローム性動脈硬化プラーク位置における血小板凝集及び続く血栓形成は、狭心症、急性心筋梗塞症、並びに血栓溶解及び血管形成が成功した後の再狭窄等の症状の発生の重大な原因要素である。血管形成中及び血管形成後の血栓形成を防止する現行の方策は、血小板糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の阻害剤（アブシキシマブ、ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））及び血小板Ｐ２Ｙ１２受容体の阻害剤（クロピドグレル、Ｐｌａｖｉｘ（登録商標））の使用を含む。現在使用されている抗血栓剤の最も顕著な危険性は、出血傾向の増大又は明らかな出血である。このため、優れた臨床安全性プロファイルを有する改良された抗血栓剤、とりわけ、出血危険性が低減された抗血栓剤に対する明確な医学的必要性が存在している。さらに、アスピリン（登録商標）（アセチルサリチル酸）及びクロピドグレルが、心臓血管疾患の治療における重要な療法として浮上してきた。それらは効力を有するものの、これらの薬物療法を受けている患者は合併症を罹患し続けている。アスピリン（登録商標）（アセチルサリチル酸）及びクロピドグレル耐性は、再発性心筋梗塞、卒中又は死亡等の重症化するおそれのある結果を伴う新たに現れる臨床所見である（非特許文献１）。したがって、アスピリン（登録商標）及びクロピドグレルから構成される現行の抗血小板措置に対する耐性を有する次第に増大する患者が、交差耐性（cross-resistance）を有さず、且つ急性冠動脈疾患を患っている患者における治療効果を維持及び補助する作用の新規な機構を有する新規な療法を必要としている。
【０００３】
早期血小板活性化カスケードにおける近年の検査で、ｖＷＦが、冠動脈における血管壁に対する血小板接着の初期段階及び続く血栓形成（thrombus formation）における重要な役割を担うものとして特定された（非特許文献２）。血管壁において損傷が生じると（経皮的冠動脈インターベンション術中のプラーク崩壊又はステント留置）、内皮下コラーゲンが露出し、血小板を引き付け血栓を形成する。高剪断速度（shear rates：ずり速度）を有する血管（例えば冠動脈）中では、ｖＷＦが内皮下コラーゲンとＡ３ドメインを介して結合し、その後、Ａ１ドメインが、静止状態から、血小板受容体ＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖと相互作用することができる立体配座へと構造変化を起こす。ＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖと、コラーゲンに結合したｖＷＦとの可逆結合によって、血小板が損傷領域上を転がることが可能となり、その後、血小板コラーゲン受容体（ＧＰＩａ／ＩＩａ及びＧＰＶＩ）を介した強固な接着が起こって、血小板の活性化がもたらされる。これは、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体のコンフォメーション活性化（conformational activation）、フィブリノーゲン結合、血小板凝集を導き、最終的に血栓の形成をもたらす。
【０００４】
さらに、ナノボディ（登録商標）ＡＬＸ−００８１（配列番号：１）が、ｖＷＦと血小板との結合を妨害し、即ち、ｖＷＦのＡ１ドメインと、血小板の糖タンパク質Ｉｂ受容体（またＧＰＩｂ）との結合を妨害すること、及び上記ナノボディ（登録商標）を用いた治療がヒヒＦＯＬＴＳモデルにおける血栓形成を妨げること（例えば、特許文献１の実施例（experiment）１８を参照）が示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００６／１２２８２５号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Wang TH, Bhatt DL, Topol EJ. Aspirin and clopidogrel resistance, anemerging clinical entity, European Heart Journal 2006:27, 647-54
【非特許文献２】Conway DSG. Prognostic Value of Plasma von Willebrand Factor andSoluble P-Selectin as Indices of Endothelial Damage and Platelet Activation in994 Patients With Nonvalvular Atrial Fibrillation. Circulation 2003; 107;3141-5
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ここで驚くべきことに、ヒトにおける特定の投薬措置においてＡＬＸ−００８１（配列番号：１）である上述のポリペプチドを投与することができることが見出された。例えば、ＡＬＸ−００８１は、投薬の終了後直ちに作用の迅速な発現を伴う薬力学的効果をもたらし、且つ最大約１２時間その効力を維持することが見出された。加えて、ＡＬＸ−００８１（配列番号：１）は、健常男性ボランティアにおいて十分に耐容性であり且つ安全であることが見出された。これらの結果から、ＡＬＸ−００８１（配列番号：１）、及び可能性としては類似の特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子が、待機的な経皮的冠動脈インターベンション（また以後「ＰＣＩ」）を受ける安定狭心症の患者における急性期治療に好適であり得ることが示される。ＰＣＩはまた、冠動脈形成術又は単に血管形成術として一般的に知られている。ＰＣＩは、冠動脈性心疾患で見られる心臓の狭窄した（狭くなった）冠動脈を治療する治療法である。これらの狭窄部分は、アテローム性動脈硬化症に起因して形成するコレステロール含有プラーク（cholesterol-laden plaques）の蓄積によるものである。ＰＣＩは通常、侵襲的心臓専門医によって行われる。
【０００８】
したがって、本発明は、待機的な経皮的冠動脈インターベンションを受ける安定狭心症を患っている好ましくはヒトである患者における血小板凝集及び血栓形成を防止する方法を提供し、上記防止は、患者に有効量の特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子、例えばＡＬＸ−００８１（配列番号：１）を投与することを含む。
【０００９】
さらに、本発明は、待機的な経皮的冠動脈インターベンションを受ける安定狭心症を患っている好ましくはヒトである患者における血小板凝集及び血栓形成を防止する薬剤の調製における、特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子、例えばＡＬＸ−００８１（配列番号：１）の使用を提供する。
【００１０】
またさらに、本発明は、待機的な経皮的冠動脈インターベンションを受ける安定狭心症を患っている好ましくはヒトである患者における血小板凝集及び血栓形成を防止するような、特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子、例えばＡＬＸ−００８１（配列番号：１）の使用を提供し、上記患者は他の疾患又は病状を伴う。
【００１１】
本発明は、患者における血小板凝集及び血栓形成の安全な防止に特に適用可能である。つまり換言すると、Ｐｌａｖｉｘ（登録商標）（クロピドグレル）、アスピリン（登録商標）（アセチルサリチル酸）、ヘパリン（登録商標）（ヘパリン）及びＲｅｏＰｒｏ（登録商標）（アブシキシマブ）等の現在使用されている非ｖＷＦ特異的抗血栓剤の最も顕著な危険性は、出血傾向の増大又は明らかな出血である。
【００１２】
第Ｉ相の二重盲検のプラセボ対照ランダム化並行群間比較ｉ．ｖ．単回用量漸増試験（single ascending i.v. dose study）（試験ＡＬＸ−００８１−０１／０６）（以下の実験パートを参照）を健常男性被験者において行った。この試験では、ＡＬＸ−００８１の用量が増大するにつれて出血時間の増大が観測されたが、出血時間が注入の開始後１時間と長い全症例で、出血は、圧迫包帯及び圧迫テープを用いて止まり、遅くとも１２時間の時点で１０分未満にまで回復し、（既存の抗凝固剤又は抗血栓薬よりも）優れた安全性プロファイルを示唆すると述べることができる。
【００１３】
好ましくは、本発明は、Ｐｌａｖｉｘ（登録商標）（クロピドグレル）、アスピリン（登録商標）（アセチルサリチル酸）、ヘパリン（登録商標）（ヘパリン）及びＲｅｏＰｒｏ（登録商標）（アブシキシマブ）等の既存の抗凝固剤又は抗血栓薬を用いて血小板凝集を阻害することができない疾患及び病状を伴う患者における血栓形成を防止する急性期治療に用いられる。例えば、本発明は、例えば上述のような、血小板凝集を阻害することを必要とするが、現行の抗血小板措置に耐性のある患者における血栓形成を防止する急性期治療に用いてもよい。抗血小板措置を必要とするこのような患者の例としては、ＰＣＩを受ける急性冠動脈症候群を患っている患者が挙げられる。
【００１４】
さらに、特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子、例えばＡＬＸ−００８１を、ＰＣＩ前、ＰＣＩ中及び／又はＰＣＩ後の補助療法として、個体（例えば、ヒト等の哺乳動物）に投与し、血栓形成を防止することができる。
【００１５】
より詳細には、特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子、例えばＡＬＸ−００８１を、待機的ＰＣＩ前、待機的ＰＣＩ中及び／又は待機的ＰＣＩ後の補助療法として、個体（例えば、ヒト等の哺乳動物）に投与し、血栓形成を防止することができる。
【００１６】
より詳細には、特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子、例えばＡＬＸ−００８１を、狭心症患者における待機的ＰＣＩ前、待機的ＰＣＩ中及び／又は待機的ＰＣＩ後の補助療法として、個体（例えば、ヒト等の哺乳動物）に投与し、血栓形成を防止することができる。
【００１７】
より詳細には、特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子、例えばＡＬＸ−００８１を、安定狭心症患者における待機的ＰＣＩ前、待機的ＰＣＩ中及び／又は待機的ＰＣＩ後の補助療法として、個体（例えば、ヒト等の哺乳動物）に投与し、血栓形成を防止することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の使用及び方法は、特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子を用いて血小板凝集又は血栓形成を防止又は阻害する冠動脈疾患の既存の療法に対する改善を示す。
【００１９】
このため、本明細書中、「治療（treatment）」又は「治療する（treat）」という用語は、高剪断条件下における不適切な血栓形成の予防的治療又は防止的治療、及び治癒療法又は対症療法の両方を指し、例えば、それらは、狭窄した冠動脈での高剪断条件下における不適切な血栓形成を制限又は完全に低減させるための、狭窄した冠動脈の補助治療、又は予防的治療若しくは防止的治療を指すが、「治療」又は「治療する」という用語は、特に、待機的ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者における急性期治療の状況において言う。
【００２０】
このため、本明細書中、「防止（"prevent", "preventing", and "prevention"）」等という用語は、完全な防止に加えて、高剪断条件下における不適切な血栓形成の「低減（"reduce", "reducing", "reduction"）」、「阻害（"inhibit", "inhibiting", and "inhibition"）」を含む。
【００２１】
このため、特定の実施形態において、本発明は、
患者に有効量の特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子を投与することを含む、待機的ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者における高剪断条件下での血栓形成を防止する方法、
待機的ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者における高剪断条件下での血栓形成を防止する薬剤の調製における特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子の使用、又は
待機的ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者における高剪断条件下での血栓形成を防止する作用物質としての特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子の使用、
を提供する。
【００２２】
本発明で用いられる特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子は典型的に、高剪断条件下での血栓形成を防止するもの、とりわけ、待機的ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者、例えば、現在利用可能な抗凝固剤又は抗血栓薬が禁忌であるか、又は該抗凝固剤又は抗血栓薬には臨床的に意義のある事象を完全に防止する有効性及び安全性が十分にない、患者において安全に適用することが示されるものである。
【００２３】
このため、例えば、本発明で用いられる特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子の好適な作用物質としては、表１中の化合物、又は表１中の化合物と８０％以上、より好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する化合物が挙げられ得る（「配列同一性」に関する定義セクションを参照）。
【００２４】
別の好ましい選択において、本発明で用いられる特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子の好適な作用物質としては、例えば表１の化合物を交差遮断するか又はそれらによって交差遮断される抗体等の作用物質が挙げられ得る（「交差遮断される（cross-blocked）」及び「交差遮断する（cross-block）」に関する定義セクションを参照）。別の好ましい選択では、本発明により用いられる特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子の好適な作用物質が、ＡＬＸ−００８１（配列番号：１）結合の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくはＡＬＸ−００８１結合の少なくとも８０％を交差遮断する抗体、好ましくは単一可変ドメインである。別の好ましい選択では、本発明により用いられる特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子の好適な作用物質が、ＡＬＸ−００８１（配列番号：１）によって少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくはＡＬＸ−００８１によって少なくとも８０％交差遮断される抗体、好ましくは単一可変ドメインである。上記交差遮断測定又は被交差遮断測定は、例えばＢｉａＣｏｒｅ測定によって行われる。
【００２５】
表１：特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子の例
【表１】
2011518772.tif 000002
2011518772.tif 000003
2011518772.tif 000004
2011518772.tif 000005
【００２６】
好ましくは、本発明に用いられる特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子は１２ａ２ｈ１様化合物である。本明細書上、１２ａ２ｈ１様化合物は、１２ａ２ｈ１（即ち、配列番号：１９）を含む化合物、又は１２ａ２ｈ１（配列番号：１９）と８０％以上、より好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する化合物である。
【００２７】
【表２】
2011518772.tif 000006
【００２８】
特に好ましい特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子はＡＬＸ−００８１（配列番号：１）である。
【００２９】
上述の全ての特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子は、文献から既知のものである。こういった文献にはそれらの製造も含まれる（とりわけ、例えば特許文献１、また国際公開第２００４／０６２５５１号パンフレットを参照）。例えば、ＡＬＸ−００８１は例えば特許文献１に記載されているように調製される。
【００３０】
特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子（以後、本発明の作用物質と称する）は、ポリペプチドの濃縮物又は調製済（ready-to-use）溶液（以後、「本発明の医薬組成物」とも称する）の形態で使用することができる。例えば、本発明の作用物質は、バッファ（例えば、クエン酸塩、ヒスチジン、Ｔｒｉｓ、ＰＢＳ、ｄ−ＰＢＳ等）、等張化剤（tonicifier）（例えば、マンニトール、グリシン又は塩化ナトリウム）及び界面活性剤（例えば、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０又はＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０等）を含む医薬組成物形態で使用することができる。加えて、浸透圧調整剤及び保存料を添加してもよい。本発明の作用物質は、小量の高用量溶液の形態で、例えば溶液１ｍｌ当たり作用物質１ｍｇから溶液１ｍｌ当たり作用物質５０ｍｇまでの量で存在し得る。例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０又は４５等の他の濃度も実現可能である。ＡＬＸ−００８１に関する好ましい医薬配合剤は、バッファ、等張化剤及び界面活性剤を含む溶液１ｍｌ当たり１ｍｇ〜２０ｍｇ、例えば５ｍｇ〜１０ｍｇのＡＬＸ−００８１を含む。より好ましい医薬組成物は、バッファ、例えばｄ−ＰＢＳ、等張化剤、例えばグリシン、及び界面活性剤、例えばＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０から構成される溶液１ｍｌ当たり１ｍｇ〜２０ｍｇのＡＬＸ−００８１を含む。さらに好ましい医薬組成物は、５（＋／−１）ｍｇ／ｍｌのＡＬＸ−００８１、好適な量のｄ−ＰＢＳバッファ、好適な量のグリシン、及び好適な量のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（ｐＨ７．１）を含む。最も好ましい医薬組成物は、５（＋／−１）ｍｇ／ｍｌのＡＬＸ−００８１、０．１３７ＭのＮａＣｌ、３．７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、９．８ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、２．７ｍＭのＫＣｌ、０．２Ｍのグリシン、０．０２％（体積％）のＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（ｐＨ７．１）を含む。上記組成物は濃縮物の形態であってもよいため、例えばそれを必要とする患者に適用する用量は、濃縮物を所望の用量（例えば、好適な用量に関する実験パートを参照）に希釈することによって採用され得る。
【００３１】
本発明の作用物質（特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子）は好ましくは、治療上有効な量の活性成分を、任意に、投与に好適な無機又は有機、固体又は液体の医薬的に許容可能な担体と一緒に又は混合して含有する医薬組成物の形態で使用される。
【００３２】
医薬組成物は、例えば、静脈内投与若しくは皮下投与等の非経口投与用の組成物、又は経皮投与（例えば、受動投与若しくはイオントフォレーシス投与）用の組成物であってもよい。
【００３３】
好ましくは、医薬組成物は、非経口（特に、静脈内、動脈内又は経皮）投与に適応する。静脈内投与は、特に重要であると考えられる。好ましくは、特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子は非経口型、最も好ましくは静脈内型の形態である。
【００３４】
投与の特定の様式及び投薬量は、主治医が患者の個別事項（particulars）、特に、年齢、体重、生活様式、活動レベル及び必要であれば全身の病状を考慮することによって選択され得る。より厳密には、ＡＬＸ−００８１を６時間の投薬間隔で静脈内投与する。さらに好ましくは、例えば、リストセチン誘導血小板凝集であるＲＩＰＡ（Favaloro EJ. Clin Haematol 2001; 14: 299-319.）及び／又はリストセチンコファクター血小板凝着アッセイ（Howard MA, Firkin BG. Ristocetin - a new tool in the investigationof platelet aggregation. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica 1971; 26: 362-9）により測定される凝集活性を考慮した上で、ＡＬＸ−００８１を６時間の投薬間隔で静脈内投与する。例えば、凝集活性が、次の６時間の間ＲＩＰＡにより測定され１０％未満を保つか又はＲＩＣＯにより測定され２０％未満を保つ（臨床的に意義のある阻害）と評価される場合には、さらなる用量を投与することはしない。
【００３５】
しかしながら、一般的に、本発明の作用物質の投薬量は、活性成分の作用の効力及び持続時間、温血種及び／又は性別、年齢、体重、並びに温血動物の個々の状態等の様々な要素に依存し得る。
【００３６】
通常、投薬量は、単回用量の特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子が、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ結果に基づき、又は例えばカニクイザルにおける亜慢性毒性を試験する用量漸増試験（dose escalating study）による結果に基づき評価されるものである。このような前臨床データセットに基づき、特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子に関する開始用量及びその後の漸増用量が決定され得る。例えば、用量は、０．５ｍｇ〜５０．０ｍｇ、特に１ｍｇ〜３０．０ｍｇであってもよく、およそ７５（＋／−３０）ｋｇの重量の温血動物に投与される（しかし、この基準と異なっていてもよい）。所望であれば、この用量を、数回の任意に等しい部分用量（「ｍｇ」は、処置される哺乳動物（ヒトを含む）１体当たりの薬物のｍｇを意味する）で摂取させてもよい。本発明の作用物質の目的で、意外なことに、用量を体重に合わせて調節する必要がないことが見出され、それゆえ、このことが本発明の別の利点となる。
【００３７】
上述の用量（単回用量として（一実施形態）又は数回の部分用量で投与される）を上述のように、例えば６時間毎に１回、１２時間毎に１回、又は１日に１回繰り返してもよい。言い換えれば、医薬組成物は、連続的な６時間毎の療法からより長い間隔の投与療法に至る投薬計画（regimens）で投与してもよい。
【００３８】
好ましくは、本明細書中でＡＬＸ−００８１に関して示唆してきたようなＰＣＩを必要とする患者における補助的な治療で用いられるものと同程度の用量で、特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子を投与する。例えば、好ましい１２ａ２ｈ１を含有する特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子、例えばＡＬＸ−００８１及びその機能的変異体としては、約０．５ｍｇ〜約１２ｍｇ、好ましくは約２ｍｇ〜約１２ｍｇ、より好ましくは４ｍｇ〜約８ｍｇの範囲の用量の特異的Ａ１  ｖＷＦ結合因子が、ヒト患者における急性期治療に使用され得る。
【００３９】
単回用量単位形態の配合剤は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの活性成分を含有することが好ましく、単回用量単位形態でない配合剤も約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの活性成分を含有することが好ましい。
【００４０】
非経口投与用の医薬製剤は、例えば、アンプル等の投薬量単位形態のものである。それらはそれ自体が既知の方法で、例えば、従来の混合、溶解又は凍結乾燥プロセスによって調製される。
【００４１】
非経口配合剤は特に、ＰＣＩの位置で、動脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、皮内、皮下又は好ましくは静脈内等の様々な方法で有効な注射可能な液体である。このような液体は好ましくは、例えば、活性成分を単独又は医薬的に許容可能な担体と一緒に含有する凍結乾燥製剤又は濃縮物から使用前に調製することができる、等張性の水溶液又は懸濁液である。医薬製剤は、滅菌されていてもよく、且つ／又は付加物、例えば、保存料、安定化剤、湿潤剤及び／又は乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調整するための塩、及び／若しくはバッファを含有していてもよい。
【００４２】
経皮適用に好適な配合剤は、有効量の活性成分を担体と共に含む。有利な担体としては、宿主の皮膚の通過を助ける薬理学的に許容可能な吸収性溶媒が挙げられる。特徴として、経皮デバイスは、基材と、化合物を任意で担体と共に含有する貯蔵槽と、任意に、長時間にわたって制御される既定の速度で宿主の皮膚へ活性成分を送達するための速度制御バリアと、デバイスを皮膚に固定する手段とを備える包帯の形態である。
【００４３】
定義：
ａ）２つ以上のアミノ酸配列を比較する目的で、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」（本明細書中では「アミノ酸同一性」とも称する）のパーセンテージは、［第２のアミノ酸配列における対応する位置のアミノ酸残基と同一である第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の総数］で除算し、［１００％］を乗算することによって算出することができ、（第１のアミノ酸配列と比較される）第２のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入、置換又は付加はそれぞれ、単一アミノ酸残基（位置）での差異、即ち、本明細書中に規定の「アミノ酸差異」と考えられる。
【００４４】
代替的には、同様に標準的な設定を用い、ヌクレオチド配列に関する配列同一性の程度を求めるのに上述したもの等の既知のコンピュータアルゴリズムを用いて、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を算出してもよい。
【００４５】
通常、上記で概説した算出方法に従って２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを求めるために、最も多くのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列とし、他のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列とする。
【００４６】
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を求める際、当業者は、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換を考慮に入れることができ、これは一般的に、アミノ酸残基が類似する化学構造の別のアミノ酸残基に置き換わり、且つポリペプチドの機能、活性又は他の生物学的特性への影響がほとんど、又は本質的に全くないアミノ酸置換と説明することができる。このような保存的なアミノ酸置換は、例えば国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット、英国特許出願公開第３３５７７６８号明細書、国際公開第９８／４９１８５号パンフレット、国際公開第００／４６３８３号パンフレット及び国際公開第０１／０９３００号パンフレットにより当該技術分野で既知であり、このような置換の（好ましい）種類及び／又は組合せは、国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット及び国際公開第９８／４９１８５号パンフレット、並びにそれらの中で言及するさらなる参考文献による関連の教示に基づいて選択することができる。このような保存的置換は好ましくは、以下の（ａ）群〜（ｅ）群内の１つのアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基に置換される置換である：（ａ）低分子脂肪族で非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ、（ｂ）極性で負に荷電した残基及びそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、（ｃ）極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、（ｄ）大きな脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ、並びに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。特に好ましい保存的置換は、ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに、ＡｒｇをＬｙｓに、ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに、ＡｓｐをＧｌｕに、ＣｙｓをＳｅｒに、ＧｌｎをＡｓｎに、ＧｌｕをＡｓｐに、ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに、ＨｉｓをＡｓｎに又はＧｌｎに、ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに、ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに、ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに又はＧｌｕに、ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに又はＩｌｅに、ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに又はＴｙｒに、ＳｅｒをＴｈｒに、ＴｈｒをＳｅｒに、ＴｒｐをＴｙｒに、ＴｙｒをＴｒｐに、及び／又はＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに又はＬｅｕに置換するものである。本明細書中に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag,1978によって開発された異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変異頻度の解析、Chou and Fasman,Biochemistry 13: 211, 1974及びAdv. Enzymol., 47: 45-149,1978によって開発された構造形成能（structure forming potentials）の解析、並びにEisenberg et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984、Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981、及びGoldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986によって開発されたタンパク質における疎水性パターンの解析に基づくものであり得る（これらは全て全体が参照により本明細書中に援用される）。ナノボディ（登録商標）の一次構造、二次構造及び三次構造に関する情報は、本明細書中の記載及び上記で言及した一般的な背景技術に与えられる。またこのために、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造が、例えば、Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996)、Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757、及びDecanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999)によって与えられる。従来のＶＨドメインにおいてこれらの位置にＶＨ／ＶＬ界面及び潜在的なラクダ化置換を形成するアミノ酸残基の幾つかに関するさらなる情報は、上記で言及した従来技術に見ることができる。
【００４７】
ｂ）「交差遮断する（cross-block）」、「交差遮断される（cross-blocked）」及び「交差遮断（cross-blocking）」という用語は、本明細書中で交換可能に用いられ、アミノ酸配列又は他の結合剤（本発明のポリペプチド等）が、本発明の他のアミノ酸配列又は結合剤と所定の標的との結合を妨げる能力を意味する。本発明のアミノ酸配列又は他の結合剤が別のアミノ酸配列又は結合剤とｖＷＦのＡ１ドメインとの結合を妨げることができる程度、ひいては、本発明のアミノ酸配列又は他の結合剤が本発明に従って交差遮断すると言えるかを、競合的結合アッセイを用いて判定することができる。１つの特に好適な定量的アッセイは、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定することができるＢｉａｃｏｒｅ装置を使用する。別の好適な定量的交差遮断アッセイは、標的との結合に関して、アミノ酸配列又は別の結合剤間の競合を測定するＥＬＩＳＡに基づくアプローチを使用する。概して以下で、アミノ酸配列又は他の結合剤が本発明に従って交差遮断するか又は交差遮断することができるかを判定するのに好適なＢｉａｃｏｒｅアッセイを説明する。当然のことながら、このアッセイは、本明細書中に記載されるアミノ酸配列又は他の結合剤のいずれと併せても使用することができる。Ｂｉａｃｏｒｅ装置（例えばＢｉａｃｏｒｅ３０００）は、製造業者の推奨に従って作動させる。こうして、１つの交差遮断アッセイでは、標準的なアミンカップリングの化学作用を用いて標的タンパク質をＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップにカップリングさせると、標的でコーティングされた表面が作り出される。典型的に、２００レゾナンスユニット〜８００レゾナンスユニットの標的をチップにカップリングさせる（容易に測定可能レベルの結合が得られるが、使用する試験試薬の濃度により直ちに飽和することができる量）。互いに交差遮断する能力を評価する２つの試験アミノ酸配列（Ａ＊及びＢ＊と呼ぶ）を、好適なバッファ中、１対１の結合部位のモル比で混合し、試験混合物を作製する。結合部位ベースの濃度を算出する場合、アミノ酸配列の分子量は、アミノ酸配列の全分子量を、そのアミノ酸配列上の標的結合部位の数で除算したものと仮定する。試験混合物中の各アミノ酸配列の濃度は、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に捕捉される標的分子上のアミノ酸配列に対する結合部位を直ちに飽和するのに十分高いものとする。混合物中の２つのアミノ酸配列は、（結合部位ベースで）同じモル濃度で存在し、その濃度は典型的に（結合部位ベースで）１．００マイクロモル〜１．５マイクロモルであると考えられる。Ａ＊及びＢ＊を単独で含有する別個の溶液も調製する。これらの溶液中のＡ＊及びＢ＊は、試験混合物と同じバッファ中に同じ濃度で存在するものとする。試験混合物を、標的でコーティングしたＢｉａｃｏｒｅチップ上に通過させ、総結合量を記録する。その後、チップに結合させた標的を損なうことなく、結合したアミノ酸配列を除去するようにチップを処理する。典型的にこれは、チップを３０ｍＭのＨＣｌで６０秒間処理することによって行う。その後、Ａ＊単独の溶液を標的でコーティングした表面上に通過させ、結合量を記録する。チップに結合させた標的を損なうことなく、結合したアミノ酸配列を��て除去するようにチップを再度処理する。その後、Ｂ＊単独の溶液を、標的でコーティングした表面上に通過させ、結合量を記録する。次にＡ＊とＢ＊との混合物の最大理論結合を算出する。これは標的表面上を単独で通過させたときの各アミノ酸配列の結合の合計である。実際に記録された混合物の結合がこの理論最大値未満であれば、２つのアミノ酸配列が互いに交差遮断していることになる。それゆえ概して、本発明による交差遮断するアミノ酸配列又は他の結合剤は、アッセイ中及び本発明の第２のアミノ酸配列又は他の結合剤の存在下で記録される結合が、組み合わされた２つのアミノ酸配列又は結合剤の最大理論結合（上記に規定）の８０％〜０．１％（例えば８０％〜４％）、厳密には最大理論結合の７５％〜０．１％（例えば７５％〜４％）、より厳密には７０％〜０．１％（例えば７０％〜４％）をとるように、上記のＢｉａｃｏｒｅ交差遮断アッセイで標的と結合するものである。上記のＢｉａｃｏｒｅアッセイは、アミノ酸配列又は他の結合剤が本発明に従って互いに交差遮断するかを判定するのに用いられる主なアッセイである。まれに、特定のアミノ酸配列又は他の結合剤が、アミンの化学作用を介してＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップにカップリングした標的と結合しないことがある（通常、標的上の関連する結合部位が、チップにカップリングすることによってマスクされるか又は破壊される場合にこれが起こる）。このような場合には、例えばｖＷＦ又は少なくともＡ１ドメインを含有するその断片のタグ付き型、例えばＮ末端Ｈｉｓタグ付き型（R & D Systems, Minneapolis, MN, USA：２００５  ｃａｔ＃  １４０６−ＳＴ−０２５）を用いて交差遮断を判定することができる。この特定のフォーマットでは、抗Ｈｉｓアミノ酸配列をＢｉａｃｏｒｅチップにカップリングさせた後に、Ｈｉｓタグ付き標的をチップの表面上に通過させて、抗Ｈｉｓアミノ酸配列によって捕捉させると考えられる。各チップ再生サイクル後に、抗Ｈｉｓアミノ酸配列でコーティングした表面上に、新たなＨｉｓタグ付き標的を充填し直す以外は、本質的に上記に記載したように交差遮断解析を実行すると考えられる。Ｎ末端Ｈｉｓタグ付きｖＷＦ又は少なくともＡ１ドメインを含有するその断片を用いてもたらされる例に加えて、Ｃ末端Ｈｉｓタグ付き標的を代替的に用いることもできた。さらに、当該技術分野において既知の様々な他のタグとタグ結合タンパク質との組合せをこのような交差遮断解析に用いることができた（例えば、ＨＡタグと抗ＨＡ抗体、ＦＬＡＧタグと抗ＦＬＡＧ抗体、ビオチンタグとストレプトアビジンとの組合せ）。概して以下で、標的に指向性を有するアミノ酸配列又は他の結合剤が、本明細書中に規定したように交差遮断するか又は交差遮断することができるかを判定するＥＬＩＳＡアッセイを説明している。当然のことながら、このアッセイは、本明細書中に記載のアミノ酸配列（又は、本発明のポリペプチド等の他の結合剤）のいずれと併せても使用することができる。このアッセイの基本原理は、標的に指向性を有するアミノ酸配列又は結合剤をＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングさせることである。過剰量の第２の、場合によっては交差遮断する抗標的アミノ酸配列を溶液中に添加する（即ち、ＥＬＩＳＡプレートと結合していない）。その後、限定量の標的をウェルに添加する。コーティングしたアミノ酸配列及び溶液中のアミノ酸配列は、限定数の標的分子の結合に関して競合する。プレートを洗浄して、コーティングしたアミノ酸配列と結合しなかった過剰な標的を除去し、また第２の溶液相のアミノ酸配列、及び第２の溶液相のアミノ酸配列と標的との間で形成された任意の複合体を除去する。その後、標的を検出するのに適切な試薬を用いて結合標的の量を測定する。コーティングしたアミノ酸配列を交差遮断することができる溶液中のアミノ酸配列によって、コーティングしたアミノ酸配列が第２の溶液相のアミノ酸配列の非存在下で結合することができる標的分子の数に比べて、コーティングしたアミノ酸配列が結合することができる標的分子の数を低減させることができる。第１のアミノ酸配列、例えばＡｂ−Ｘを固定化されるアミノ酸配列に選択する場合、第１のアミノ酸配列をＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングし、その後、プレートを好適な遮断溶液で遮断して、その後に添加される試薬の非特異的な結合を最小限に抑える。その後、ウェル１つ当たりのＡｂ−Ｙ[標的]結合部位のモル数が、ＥＬＩＳＡプレートのコーティング時にウェル１つ当たりに用いたＡｂ−Ｘ[標的]結合部位のモル数の少なくとも１０倍になるように、過剰量の第２のアミノ酸配列、即ちＡｂ−ＹをＥＬＩＳＡプレートに添加する。その後、ウェル１つ当たりに添加した[標的]のモル数が、各ウェルをコーティングするのに用いたＡｂ−Ｘ[標的]結合部位のモル数より少なくとも２５倍少なくなるように、[標的]を添加する。好適なインキュベート期間の後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、標的を検出するための試薬を添加し、コーティングした抗[標的]アミノ酸配列（本事例ではＡｂ−Ｘ）と特異的に結合した標的の量を測定する。アッセイに関するバックグラウンドシグナルは、コーティングしたアミノ酸配列（本事例ではＡｂ−Ｘ）、第２の溶液相のアミノ酸配列（本事例ではＡｂ−Ｙ）、[標的]バッファのみ（即ち標的を添加しない）及び標的検出試薬を用いてウェル中で得られたシグナルと定義する。アッセイに関する陽性対照シグナルは、コーティングしたアミノ酸配列（本事例ではＡｂ−Ｘ）、第２の溶液相のアミノ酸配列バッファのみ（即ち第２の溶液相のアミノ酸配列を添加しない）、標的及び標的検出試薬を用いてウェル中で得られたシグナルと定義する。陽性対照シグナルがバックグラウンドシグナルの少なくとも６倍になるように、ＥＬＩＳＡアッセイを行い得る。どのアミノ酸配列をコーティングアミノ酸配列として使用し、どのアミノ酸配列を第２の（競合）アミノ酸配列として使用するかという選択に起因するいかなるアーチファクト（artefact：人為的影響）（例えば有意に異なる、[標的]に対するＡｂ−Ｘ及びＡｂ−Ｙ間の親和性）も回避するために、交差遮断アッセイを２つのフォーマットで行うのがよい：１）フォーマット１は、Ａｂ−Ｘが、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされるアミノ酸配列であり、且つＡｂ−Ｙが、溶液中に存在する競合アミノ酸配列である場合であり、また２）フォーマット２は、Ａｂ−Ｙが、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングされるアミノ酸配列であり、且つＡｂ−Ｘが、溶液中に存在する競合アミノ酸配列である場合である。フォーマット１又はフォーマット２のいずれかにおいて、溶液相の抗標的アミノ酸配列の非存在下（即ち陽性対照ウェル）で得られる標的検出シグナルに比べ、溶液相の抗標的アミノ酸配列が、標的検出シグナル（即ちコーティングしたアミノ酸配列によって結合した標的の量）の６０％〜１００％、厳密には７０％〜１００％、より厳密には８０％〜１００％の低減を引き起こすことができる場合に、Ａｂ−Ｘ及びＡｂ−Ｙは交差遮断すると定義する。
【００４８】
ｃ）「特異的（specific）」という用語は、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチド）分子が結合することができる、様々な種類の抗原又は抗原決定基の数を表す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性及び／又は結合活性に基づき決定することができる。親和性は、抗原と抗原結合タンパク質との解離に関する平衡定数（ＫＤ）により表され、抗原決定基と抗原結合タンパク質上の抗原結合部位との間の結合力に関する評価基準であり、ＫＤの値が小さいほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合力は大きい（代替的に、親和性は、１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）としても表すことができる）。（例えば本明細書中のさらなる開示に基づき）当業者には明らかであると思われるが、対象となる特異的な抗原に応じて、それ自体が既知の方法で親和性を決定することができる。結合活性は、抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチド）と関連抗原との間の結合力の測定基準である。結合活性は、抗原決定基と抗原結合分子上の抗原結合部位との間の親和性、及び抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関係する。典型的に、抗原結合タンパク質（例えば本発明のアミノ酸配列、ナノボディ（登録商標）及び／又はポリペプチド）は、１０−５モル／リットル〜１０−１２モル／リットル以下、好ましくは１０−７モル／リットル〜１０−１２モル／リットル以下、より好ましくは１０−８モル／リットル〜１０−１２モル／リットルの解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５リットル／モル〜１０１２リットル／モル以上、好ましくは１０７リットル／モル〜１０１２リットル／モル以上、より好ましくは１０８リットル／モル〜１０１２リットル／モルの会合定数（ＫＡ）で）それらの抗原と結合するであろう。１０４モル／リットルより大きい任意のＫＤ値（即ち１０４Ｍ−１（リットル／モル）よりも小さい任意のＫＡ値）は一般的に非特異的な結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価の免疫グロブリン配列は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性で所望の抗原と結合すると考えられる。抗原結合タンパク質と抗原又は抗原決定基との特異的な結合は、それ自体が既知の任意の好適な方法（例えばスキャッチャード解析及び／又は競合的結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイを含む）及び当該技術分野でそれ自体が既知の様々なその変法、並びに本明細書中で言及する他の技法で求めることができる。当業者には明らかであると思われるが、解離定数は実際又は見掛けの解離定数であってもよい。解離定数を決定する方法は、当業者にとって明らかであり、例えば本明細書中で言及する技法が挙げられる。これに関して、１０−４モル／リットル又は１０−３モル／リットルより大きい（例えば１０−２モル／リットルの）解離定数を測定することが不可能であり得ることも明らかであろう。適宜、これも当業者には明らかであると思われるが、（ＫＤ＝１／ＫＡ）という関係性を用いて、（実際又は見掛けの）解離定数を（実際又は見掛けの）会合���数（ＫＡ）に基づいて算出してもよい。
【００４９】
親和性は、分子相互作用の強さ又は安定性を示す。一般的に親和性はＫＤ即ち解離定数によるものとして与えられ、その単位はモル／リットル（又はＭ）である。親和性は、１／ＫＤに等しい会合定数ＫＡとしても表すことができ、その単位は（モル／リットル）−１（又はＭ−１）である。本明細書中、２つの分子（例えば、本発明のアミノ酸配列、ナノボディ又はポリペプチドと、その目的標的との）間の相互作用の安定性は主に、それらの相互作用のＫＤ値で表され、ＫＡ＝１／ＫＤの関係性を鑑み、ＫＤ値による分子相互作用の強さの特定を、対応するＫＡ値を算出するのに使用することも可能であることは、当業者にとって明らかであろう。ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（等しくはＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））（式中、Ｒは気体定数に等しく、Ｔは絶対温度に等しく、ｌｎは自然対数を示す）という既知の関係性から、結合の自由エネルギー（ＤＧ）に関連するため、ＫＤ値は熱力学的な意味でも分子相互作用の強さを特徴付ける。有意（例えば特異的）と見なされる、生物学的相互作用に関するＫＤは典型的に、１０−１０Ｍ（０．１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲内である。相互作用が強くなるほど、ＫＤは小さくなる。ＫＤは、（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ及びＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆのように）複合体の解離速度定数（ｋｏｆｆと示される）と、その会合速度（ｋｏｎと示される）との比としても表すことができる。解離速度（off-rate）ｋｏｆｆの単位は、ｓ−１（ｓは秒のＳＩ単位表記である）である。会合速度（on-rate）ｋｏｎの単位は、Ｍ−１ｓ−１である。会合速度は、１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変化し、二分子相互作用に関する拡散律速会合速度定数に近似し得る。解離速度は、ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆの関係性から所定の分子相互作用の半減期に関連する。解離速度は、１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変化し得る。
【００５０】
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体が既知の様々な技法、例えば、既知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサ技法（例えば、Ober et al., Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001を参照）で測定することができる（該技法では、１つの分子をバイオセンサーチップ上に固定化し、フロー条件下で他の分子を固定化分子上に通過させて、ｋｏｎ、ｋｏｆｆ測定値、したがってＫＤ（又はＫＡ）値を得る）。例えば、既知のＢＩＡＣＯＲＥ機器を用いてこれを実施することができる。
【００５１】
測定プロセスが、例えば１つの分子のバイオセンサ上でのコーティングに関係するアーチファクトによって、示唆される分子の固有の結合親和性に何らかの影響が与えられる場合、測定されるＫＤが見掛けのＫＤに相当し得ることも、当業者にとって明らかであろう。また、１つの分子が、他の分子に対して２つ以上の認識部位を含有する場合にも、見掛けのＫＤを測定することができる。このような状況下では、測定される親和性が、２つの分子による相互作用の結合活性による影響を受ける場合がある。
【００５２】
親和性を評価するのに用いられ得る別のアプローチは、Friguet et al.（J. Immunol. Methods,77,305-19, 1985）の２段階ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）法である。この方法によって、溶液相の結合平衡測定が確立され、プラスチック等の支持体上での分子のうちの１つの吸着に関係する考えられ得るアーチファクトが回避される。
【００５３】
しかしながら、ＫＤの正確な測定は極めて多大な労力を要する場合があり、結果として２つの分子の結合力を評価するのに、見掛けのＫＤ値を求めることが多い。全ての測定が一貫して（例えばアッセイ条件を一定にして）行われていれば、見掛けのＫＤ測定値は真のＫＤの近似値として使用することができ、したがって本明細書中、ＫＤ及び見掛けのＫＤには等しい重要性又は関連性があるとして処理されることに留意されたい。
【００５４】
最後に、多くの状況下で経験豊富な科学者は、幾つかの参照分子と比較して結合親和性を決定するのが好都合であると判断することができることに留意されたい。例えば、分子Ａと分子Ｂとの間の結合力を評価するために、例えばＢと結合することが知られており、且つＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）での検出を容易にするためのフルオロフォア若しくはクロモフォア群、又は他の化学部分（例えばビオチン）、又は他のフォーマット（蛍光検出用フルオロフォア、吸光検出用クロモフォア、ストレプトアビジン媒介性ＥＬＩＳＡ検出用ビオチン）で好適に標識される参照分子Ｃを使用することができる。典型的に、参照分子Ｃを固定濃度に維持し、Ａの濃度を、Ｂの所定の濃度又は量に対して変える。結果として、Ａの非存在下でＣについて測定されたシグナルが半分となるＡの濃度に対応して、ＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤ  ｒｅｆ及び参照分子の総濃度ｃｒｅｆが既知であれば、下記式：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤ  ｒｅｆ）からＡ−Ｂ相互作用に関する見掛けのＫＤを得ることができる。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤ  ｒｅｆであれば、ＫＤ≒ＩＣ５０であることに留意されたい。ＩＣ５０の測定が、比較用の結合因子に関して一貫して（例えばｃｒｅｆを一定にして）実施されるのであれば、ＩＣ５０によって分子相互作用の強さ又は安定性を評価することができ、またこの測定値は、本明細書を通じてＫＤ又は見掛けのＫＤと同等であると判断される。
【００５５】
以下の実験パートは、上記に記載の発明を例示するものである。
【実施例】
【００５６】
実験パート：
実施例１：二重盲検のプラセボ対照ランダム化並行群間比較ｉ．ｖ．単回用量漸増試験を健常男性被験者において行った。
第Ｉ相の二重盲検のプラセボ対照ランダム化並行群間比較ｉ．ｖ．単回用量漸増試験を健常男性被験者において行った。この試験は、ＡＬＸ−００８１（配列番号：１）の安全性、耐容性、ＰＫ及びＰＤを評価するように設計した。治験薬の開始用量は、ｉ．ｖ．５００μｇのＡＬＸ−００８１又はプラセボ（用量レベル１）とし、続いて、用量レベル２〜６でそれぞれ開始用量の２倍、４倍、８倍、１６倍及び２４倍とした。対応量（用量レベル１〜６）のＡＬＸ−００８１薬物製品（表Ｅ−１を参照）を水に添加して注射用とすることによって所望用量のＡＬＸ−００８１を供給する。総量１００ｍＬの注入用溶液を調製したが、注入用溶液はｉ．ｖ．注入１回につき５０ｍＬだけ輸液ポンプを介して６０分間投与した。
【００５７】
表Ｅ−１：ＡＬＸ−００８１薬物製品
５ｍｇ／ｍｌ  ＡＬＸ−００８１
０．１３７Ｍ  ＮａＣｌ
３．７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４
９．８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ
２．７ｍＭ  ＫＣｌ
０．２Ｍ  グリシン
０．０２％（体積％）  Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）（ｐＨ７．１）
【００５８】
コホート１〜コホート５についてはコホート１群当たりｎ＝６人の被験者（ｎ＝３人がＡＬＸ−００８１及びｎ＝３人がプラセボ）であり、コホート６についてはｎ＝１０人の被験者（ｎ＝６人がＡＬＸ−００８１及びｎ＝４人がプラセボ）である６群の投与コホートのデータに基づくこの第Ｉ相試験の最終解析は、以下の結論をもたらす。
ｉ．ｖ．注入として１時間投与される単回固定用量のＡＬＸ−００８１は、安全であり且つ十分に耐容性であった。
ＡＬＸ−００８１は、２コンパートメントモデルに準拠して非線形ＰＫ特性を示した。
約４００ｎｇ／ｍＬのＡＬＸ−００８１濃度で観測される、完全な阻害を伴うＰＤ効果（測定レベルが１０％未満に低下する場合と規定）に関するマーカーとしてＲＩＰＡを解析した。２ｍｇ以上投与された被験者は全員、投与後１時間から最長で１２時間完全なＲＩＰＡ阻害を実現した。
ＲＩＰＡ阻害の程度及び持続時間は、ＡＬＸ−００８１の投与用量と良好な相関関係にあり、ＡＬＸ−００８１の有効性を評価するこのバイオマーカーの適応性を示唆しているのに対し、テンプレート出血時間はＡＬＸ−００８１の他の薬力学的効果又は薬理学的効果と厳格には相関しなかった。
【００５９】
【表３】
2011518772.tif 000007
【００６０】
・ＲＩＰＡに基づき、最小有効用量は２ｍｇであり、１２ｍｇの最大用量で効果の明らかな飽和が達成された。
凝固パラメータの評価から、用量群全体を通じて、２０％〜５０％のＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）及びｖＷＦのレベルの低下が示された。これは、９人の被験者（ｖＷＦの減少について８人、ＦＶＩＩＩの減少について６人）における１４の軽度の副作用（ＣＴＣＡＥ  グレード１）に相当する（表Ｅ−２を参照）。
【００６１】
表Ｅ−２：
・他の有害事象（ＡＥ、例えば頭痛及び注入部位における血腫）は全て、プラセボによるものと同様の発生率で起こったため、ＡＬＸ−００８１に起因するものではなかった。
・ＡＬＸ−００８１の投与に明らかに起因する唯一の薬物有害反応は、凝固パラメータの変化であった。
・治療に関係するＡＬＸ−００８１抗体の発生は観測されなかった。
【００６２】
結論として、この第Ｉ相のヒト初回投与試験は、ＡＬＸ−００８１が静脈内に与えられる場合の高信頼性の安全性プロファイルを立証するのに好適なものであった。ＡＬＸ−００８１処置は十分に耐容性且つ安全であり、出血の徴候は報告されず、また免疫原性応答も検出されなかった。ＦＶＩＩＩ及びｖＷＦの血漿レベルの減少において起こる軽度及び一過性の有害事象（ＡＥ）が観測されるものの、ＡＥは全て完全に可逆的であった。バイオマーカー（ＲＩＰＡ）により測定されるＡＬＸ−００８１の薬力学的活性は、２ｍｇで始まり、１２ｍｇ用量で１２時間の最大持続時間に達し、ｖＷＦ媒介性血小板活性化及び凝集の臨床的に意義のある阻害を誘起した。２コンパートメントモデルに準拠して非線形薬物動態特性が確認された。
【００６３】
実施例２：待機的ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者において漸増用量のＡＬＸ−００８１の安全性及び有効性を評価する二重盲検のプラセボ対照ランダム化用量漸増第Ｉ相試験
待機的ＰＣＩを受ける安定狭心症の患者において漸増用量のＡＬＸ−００８１（配列番号：１）の安全性を評価する二重盲検のプラセボ対照ランダム化用量漸増第１相試験として単施設試験を実施する（ＡＬＸ−００８１配合製品に関しては表Ｅ−１を参照）。
【００６４】
選択／除外基準：
待機的ＰＣＩを受ける安定狭心症（ＣＣＳ≦３）を患っている１８歳以上の患者
アスピリン、ヘパリン及びＰｌａｖｉｘ（登録商標）を併用薬とする
十分な血液機能、肝機能及び腎機能
以前に且つ／又は並行してＲｅｏＰｒｏ（登録商標）による治療をしていないこと
以前に冠動脈バイパス手術をしていない
ＤＩＣ（播種性血管内凝固）、血栓性微小血管障害症又は凝固障害の病歴がない
自己免疫性血球減少症又は症候性ＤＩＣが臨床的に証明及び／又は文書化されていない
３ヶ月以内に輸血を要する重篤な出血がない
３ヶ月以内に卒中、ＴＩＡ（一過性脳虚血発作）又はＭＩ（心筋梗塞）がない
根本原因を問わない慢性心不全がない
【００６５】
試験は二段階で実施する。段階Ａは主として耐容性を評価するのに対し、段階Ｂは、副次エンドポイントに関する付加的な情報を提示するものである。試験される各用量について、４人の患者群又は８人の患者群をランダムに割り当て（３：１）、ＡＬＸ−００８１又はプラセボいずれかの用量を与える。段階Ａにおける開始活性用量は、ＡＬＸ−００８１の２ｍｇの単回用量であった。その後の用量、及び用量レベル当たりの患者数は以下に示す（表Ｅ−３を参照）。試験薬物の静脈内（ｉ．ｖ．）注入の開始はＰＣＩ術前６０分である。試験薬物の注入は６０分かけて施す。
【００６６】
段階Ａの初めの２つの用量レベルの患者の動員及び治療は、時間をずらした投薬計画を採用した。即ち、患者は最短観測間隔２４時間で順次（即ち、前の患者が終わってから次の患者が）治療される。用量レベル３からは、大規模なモニタリングを必要とする任意の臨床的に有意な安全性シグナルを除外すれば、ＡＬＸ−００８１及びプラセボが与えられる患者を並行して（即ち、同時に２人の患者を）動員及び治療することが可能である。
【００６７】
表Ｅ−３：投薬計画  段階Ａ
【表４】
2011518772.tif 000008
【００６８】
第Ｉｂ相  段階Ａ  暫定的な（preliminary）安全性概要：
ｖＷＦレベル及びＦＶＩＩＩレベルは予想通り一時的に低下したが、臨床徴候及び臨床症状（即ち、有害事象）はもたらされなかった。
出血に関する徴候及び症状はなかった。血腫及び挫傷が複数回の採血により報告されたが、ＰＣＩ穿刺部位に関連するものではなかった。
報告された有害事象の大半が軽度な一過性のものであり、ＰＣＩ術が関係していた。
両方ともＡＬＸ−００８１に無関係に、手術に伴う合併症に起因した長期入院を必要とする２つのＳＡＥが生じた。
全ての有害事象及び重篤な有害事象は完全に可逆的であった。
免疫原性応答は検出されなかった。
【００６９】
第Ｉｂ相  段階Ａ  暫定的な薬力学的概要:
完全なＲＩＰＡ阻害は、ベースラインから１０％未満への低下として規定される。完全なＲＩＣＯ阻害は、ベースラインから２０％未満への低下として規定される。全ての用量群の被験者は全員、投与後１時間から最長で１８時間／３６時間完全なＲＩＰＡ／ＲＩＣＯ阻害を実現した。
注入の終了直後に顕著な発現
高い個体差
２ｍｇ〜９ｍｇの相補的なＡＵＣに対して用量依存的ＰＤ効果を示す傾向
【００７０】
第Ｉｂ相  段階Ａ  暫定的な結論:
アスピリン、ヘパリン及びＰｌａｖｉｘ（登録商標）と組み合わせたＡＬＸ−００８１の投与は、広範な用量にわたって十分に耐容性且つ安全であることが示された。
観測された有害事象は軽度な一過性のものであり、完全に可逆的であり、且つ大半がＰＣＩ術に関係するものであった。
ＡＬＸ−００８１に起因する薬物効果は、無症候性で一過性、且つ完全に可逆的なｖＷＦ及びＦＶＩＩＩの減少であった。
ＲＩＰＡ及びＲＩＣＯは、ＡＬＸ−００８１の生物活性を示す等価なバイオマーカーであることが確認された。ＡＬＸ−００８１の活性は、２ｍｇの用量レベルで開始し、９ｍｇで最適な生物学的レベルに達した。
段階Ｂにおける患者の第１のコホートには、６ｍｇの開始用量、続いて６時間毎に４ｍｇの用量が３回与えられた。
【００７１】
第Ｉｂ相  段階Ｂ:
段階Ｂでは、段階Ａにおいて安全及び薬理学的に有効なものとして求められた初回用量（６時間以上のｖＷＦ媒介性血漿凝集の完全な阻害、開始用量は６ｍｇであり、続いて４ｍｇを３回施す）の後、ＡＬＸ−００８１又はプラセボのその後の用量が６時間毎に３回投与される（４回の投与は合計２４時間かけて与えられる）。その後の用量は、試験薬物に関係する事象が起こるまで且つ／又は目的の薬理学的効果（２４時間以上のｖＷＦ媒介性血小板凝集の完全な阻害）が実証されるまで増やされる。当然のことながら、最大４回のさらなる用量レベルが段階Ｂで必要とされる。
【００７２】
実施例３：ＡＬＸ−００８１での毒性試験
【００７３】
表Ｅ−４：
【表５】
2011518772.tif 000009
2011518772.tif 000010
【００７４】
ヒトにおける化合物の安全試験を評価する毒性試験を行った。
【００７５】
使用した用語及び表現は、説明のために用いたものであり、限定するものではない。また、そのような用語及び表現を用いたことは、示し且つ説明した特徴の同等物又はそれらの一部を排除することを意図するものではない。様々な変更形態が本発明の範囲内で可能であることを理解されたい。
【００７６】
本明細書中に記載の参考文献は全て、とりわけ上記で言及される教示については参照により援用される。
【配列表】
2011518772000001.app
【国際調査報告】
2011518772.tif 000011
2011518772.tif 000012
2011518772.tif 000013
2011518772.tif 000014
2011518772.tif 000015