(57)【要約】ＣＣＲ３レセプター、ならびにＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニットに対するオリゴヌクレオチドを提供する。このオリゴヌクレオチドは、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、嚢胞性線維症（ＣＦ）、過好酸球増大症、および新生細胞増殖、例えば癌と関連する炎症を含む炎症を抑制するために有用である。
2011519579.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドが（ｉ）配列番号１から６９８のうちのいずれか１つに対応する塩基配列を有し、かつ（ｉｉ）配列番号１から６９８のいずれか１つの修飾オリゴヌクレオチド、のうちの１つである、ＣＣＲ３ケモカインレセプターならびにＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニットからなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸配列に対するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１から６９８のいずれか１つに対応する塩基配列を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドが、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン（ＤＡＰ）またはその類縁体で置換されている請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドがアラビノース修飾オリゴヌクレオチドである請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記アラビノース修飾ヌクレオチドが、フッ素、ヒドロキシル、アミノ、アジド、アルキル、アルコキシ、およびアルコキシアルキル基からなる群より選択される２’置換基を有する請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記アルキル基が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、および官能性アルキル基からなる群より選択され、該アルコキシ基が、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよび官能性アルコキシ基からなる群より選択され、かつ該アルコキシアルキル基がメトキシエチル、およびエトキシエチルからなる群より選択される請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記官能性アルキル基が、エチルアミノ、プロピルアミノおよびブチルアミノ基からなる群より選択され、かつ前記官能性アルコキシ基が、−Ｏ（ＣＨ）ｑ−Ｒからなる群より選択され、ここでｑ＝２〜４であって、かつ−Ｒが−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３基である請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記少なくとも１つのアラビノース修飾ヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）である請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記少なくとも１つのアラビノース修飾ヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの５’末端である請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのアラビノース修飾ヌクレオチドが前記オリゴヌクレオチドの３’末端である請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端の両方に少なくとも２つのアラビノース修飾ヌクレオチドを有する請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端に独立して１から７個のアラビノース修飾ヌクレオチドを有する請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端に独立して１から６個のアラビノース修飾ヌクレオチドを有する請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端に独立して１から５個のアラビノース修飾ヌクレオチドを有する請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端に独立して１から４個のアラビノース修飾ヌクレオチドを有する請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端に独立して１から３個のアラビノース修飾ヌクレオチドを有する請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボラノホスホネートおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含む請求項１から請求項１６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１から６９８のうちの１つである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号８、１３、１５、２４、６８３、６８４、１５８２、１５８３、１５８７、１５８８、１５９９、１６００、１６０５および１６１０のうちの１つである請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項１から１９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも２つを含む薬学的組成物。
【請求項２２】
前記２つのオリゴヌクレオチドが配列番号８、１３、１５、２４、６８３、６８４、１５８２、１５８３、１５８７、１５８８、１５９９、１６００、１６０５および１６１０からなる群より選択される請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記２つのオリゴヌクレオチドが、配列番号１５８８および１６００である請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
患者に対して請求項２０から２３のいずれかに記載の薬学的組成物を投与する工程を包む、患者における喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防する方法。
【請求項２５】
喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための、請求項２０から２３のいずれかに記載の薬学的組成物の用途。
【請求項２６】
喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための薬剤の調製における、請求項２０から２３のいずれかに記載の薬学的組成物の用途。
【請求項２７】
喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための、請求項２０から２３のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
患者に対して請求項１から１９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する、患者におけるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための方法。
【請求項２９】
ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する請求項１から１９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの用途。
【請求項３０】
ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させる薬剤の調製における、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する請求項１から１９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの用途。
【請求項３１】
ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する請求項１から１９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３２】
オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する請求項１から１９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを患者に対して投与する工程を含む、患者におけるＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるための方法。
【請求項３３】
ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する請求項１から１９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの用途。
【請求項３４】
ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させる薬剤の調製における、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する請求項１から１９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの用途。
【請求項３５】
ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する請求項１から１９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための、請求項２０から２３のいずれかに記載の薬学的組成物をその使用方法の説明書と一緒に備える商業的パッケージ。
【請求項３７】
患者におけるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する請求項２０から２３のいずれかに記載の薬学的組成物をその使用方法の説明書と一緒に備える商業的パッケージ。
【請求項３８】
患者におけるＣＣＲケモカインレセプター発現を低下させるための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する請求項２０から２３のいずれかに記載の薬学的組成物をその使用方法の説明書と一緒に備える商業的パッケージ。
【請求項３９】
２本の鎖が、配列番号６９９および７００；７０１および７０２；７０３および７０４；７０５および７０６；７０７および７０８；７０９および７１０；７１１および７１２；７１３および７１４；７１５および７１６；７１７および７１８；７１９および７２０；７２１および７２２；７２３および７２４；７２５および７２６；７２７および７２８；７２９および７３０；７３１および７３２；７３３および７３４；７３５および７３６；７３７および７３８；７３９および７４０；７４１および７４２；７４３および７４４；７４５および７４６；７４７および７４８；７４９および７５０；７５２および７５２；７５３および７５４；７５５および７５６；７５７および７５８；７５９および７６０；７６１および７６２；７６３および７６４；７６５および７６６；７６７および７６８；７６９および７７０；７７１および７７２；７７３および７７４；７７５および７７６；７７７および７７８；７７９および７８０；７８１および７８２；７８３および７８４；７８５および７８６；７８７および７８８；７８９および７９０；７９１および７９２；７９３および７９４；７９５および７９６；７９７および７９８；７９９および８００；８０１および８０２；８０３および８０４；８０５および８０６；８０７および８０８；８０９および８１０；８１１および８１２；８１３および８１４；８１５および８１６；８１７および８１８；８１９および８２０；８２１および８２２；８２３および８２４；８２５および８２６；８２７および８２８；８２９および８３０；８３１および８３２；８３３および８３４；８３５および８３６；８３７および８３８；８３９および８４０；８４１および８４２；８４３および８４４；８４５および８４６；８４７および８４８；８４９および８５０；８５１および８５２；８５３および８５４；８５５および８５６；８５７および８５８；８５９および８６０；８６１および８６２；８６３および８６４；８６５および８６６；８６７および８６８；８６９および８７０；８７１および８７２；８７３および８７４；８７５および８７６；８７７および８７８；８７９および８８０；８８１および８８２；８８３および８８４；８８５および８８６；８８７および８８８；８８９および８９０；８９１および８９２；８９３および８９４；８９５および８９６；８９７および８９８；８９９および９００；９０１および９０２；９０３および９０４；９０５および９０６；９０７および９０８；９０９および９１０；９１１および９１２；９１３および９１４；９１５および９１６；９１７および９１８；９１９および９２０；９２１および９２２；９２３および９２４；９２５および９２６；９２７および９２８；９２９および９３０；９３１および９３２；９３３および９３４；９３５および９３６；９３７および９３８；９３９および９４０；９４１および９４２；９４３および９４４；９４５および９４６；９４７および９４８；９４９および９５０；９５１および９５２；９５３および９５４；９５５および９５６；９５７および９５８；９５９および９６０；９６１および９６２；９６３および９６４；９６５および９６６；９６７および９６８；９６９および９７０；９７１および９７２；９７３および９７４；９７５および９７６；９７７および９７８；９７９および９８０；９８１および９８２；９８３および９８４；９８５および９８６；９８７および９８８；９８９および９９０；９９１および９９２；９９３および９９４；９９５および９９６；９９７および９９８；９９９および１０００；１００１および１００２；１００３および１００４；１００５および１００６；１００７および１００８；１００９および１０１０；１０１１および１０１２；１０１３および１０１４；１０１５および１０１６；１０１７および１０１８；１０１９および１０２０；１０２１および１０２２；１０２３および１０２４；１０２５および１０２６；１０２７および１０２８；１０２９および１０３０；１０３１および１０３２；１０３３および１０３４；１０３５および１０３６；１０３７および１０３８；１０３９および１０４０；１０４１および１０４２；１０４３および１０４４；１０４５および１０４６；１０４７および１０４８；１０４９および１０５０；１０５１および１０５２；１０５３および１０５４；１０５５および１０５６；１０５７および１０５８；１０５９および１０６０；１０６１および１０６２；１０６３および１０６４；１０６５および１０６６；１０６７および１０６８；１０６９および１０７０；１０７１および１０７２；１０７３および１０７４；１０７５および１０７６；１０７７および１０７８；１０７９および１０８０；１０８１および１０８２；１０８３および１０８４；１０８５および１０８６；１０８７および１０８８；１０８９および１０９０；１０９１および１０９２；１０９３および１０９４；１０９５および１０９６；１０９７および１０９８；１０９９および１１００；１１０１および１１０２；１１０３および１１０４；１１０５および１１０６；１１０７および１１０８；１１０９および１１１０；１１１１および１１１２；１１１３および１１１４；１１１５および１１１６；１１１７および１１１８；１１１９および１１２０；１１２１および１１２２；１１２３および１１２４；１１２５および１１２６；１１２７および１１２８；１１２９および１１３０；１１３１および１１３２；１１３３および１１３４；１１３５および１１３６；１１３７および１１３８；１１３９および１１４０；１１４１および１１４２；１１４３および１１４４；１１４５および１１４６；１１４７および１１４８；１１４９および１１５０；１１５１および１１５２；１１５３および１１５４；１１５５および１１５６；１１５７および１１５８；１１５９および１１６０；１１６１および１１６２；１１６３および１１６４；１１６５および１１６６；１１６７および１１６８；１１６９および１１７０；１１７１および１１７２；１１７３および１１７４；１１７５および１１７６；１１７７および１１７８；１１７９および１１８０；１１８１および１１８２；１１８３および１１８４；１１８５および１１８６；１１８７および１１８８；１１８９および１１９０；１１９１および１１９２；１１９３および１１９４；１１９５および１１９６；１１９７および１１９８；１１９９および１２００；１２０１および１２０２；１２０３および１２０４；１２０５および１２０６；１２０７および１２０８；１２０９および１２１０；１２１１および１２１２；１２１３および１２１４；１２１５および１２１６；１２１７および１２１８；１２１９および１２２０；１２２１および１２２２；１２２３および１２２４；１２２５および１２２６；１２２７および１２２８；１２２９および１２３０；１２３１および１２３２；１２３３および１２３４；１２３５および１２３６；１２３７および１２３８；１２３９および１２４０；１２４１および１２４２；１２４３および１２４４；１２４５および１２４６；１２４７および１２４８；１２４９および１２５０；１２５１および１２５２；１２５３および１２５４；１２５５および１２５６；１２５７および１２５８；１２５９および１２６０；１２６１および１２６２；１２６３および１２６４；１２６５および１２６６；１２６７および１２６８；１２６９および１２７０；１２７１および１２７２；１２７３および１２７４；１２７５および１２７６；１２７７および１２７８；１２７９および１２８０；１２８１および１２８２；１２８３および１２８４；１２８５および１２８６；１２８７および１２８８；１２８９および１２９０；１２９１および１２９２；１２９３および１２９４；１２９５および１２９６；１２９７および１２９８；１２９９および１３００；１３０１および１３０２；１３０３および１３０４；１３０５および１３０６；１３０７および１３０８；１３０９および１３１０；１３１１および１３１２；１３１３および１３１４；１３１５および１３１６；１３１７および１３１８；１３１９および１３２０；１３２１および１３２２；１３２３および１３２４；１３２５および１３２６；１３２７および１３２８；１３２９および１３３０；１３３１および１３３２；１３３３および１３３４；１３３５および１３３６；１３３７および１３３８；１３３９および１３４０；１３４１および１３４２；１３４３および１３４４；１３４５および１３４６；１３４７および１３４８；１３４９および１３５０；１３５１および１３５２；１３５３および１３５４；１３５５および１３５６；１３５７および１３５８；１３５９および１３６０；１３６１および１３６２；１３６３および１３６４；１３６５および１３６６；１３６７および１３６８；１３６９および１３７０；１３７１および１３７２；１３７３および１３７４；１３７５および１３７６；１３７７および１３７８；１３７９および１３８０；１３８１および１３８２；１３８３および１３８４；１３８５および１３８６；１３８７および１３８８；１３８９および１３９０；１３９１および１３９２；１３９３および１３９４；１３９５および１３９６；１３９７および１３９８；１３９９および１４００；１４０１および１４０２；１４０３および１４０４；１４０５および１４０６；１４０７および１４０８；１４０９および１４１０；１４１１および１４１２；１４１３および１４１４；１４１５および１４１６；１４１７および１４１８；１４１９および１４２０；１４２１および１４２２；１４２３および１４２４；１４２５および１４２６；１４２７および１４２８；１４２９および１４３０；１４３１および１４３２；１４３３および１４３４；１４３５および１４３６；１４３７および１４３８；１４３９および１４４０；１４４１および１４４２；１４４３および１４４４；１４４５および１４４６；１４４７および１４４８；１４４９および１４５０；１４５１および１４５２；１４５３および１４５４；１４５５および１４５６；１４５７および１４５８；１４５９および１４６０；１４６１および１４６２；１４６３および１４６４；１４６５および１４６６；１４６７および１４６８；１４６９および１４７０；１４７１および１４７２；１４７３および１４７４；１４７５および１４７６；１４７７および１４７８；１４７９および１４８０；１４８１および１４８２；１４８３および１４８４；１４８５および１４８６；１４８７および１４８８；１４８９および１４９０；１４９１および１４９２
；１４９３および１４９４；１４９５および１４９６；１４９７および１４９８；１４９９および１５００ ；１５０１および１５０２；１５０３および１５０４；１５０５および１５０６；１５０７および１５０８
；１５０９および１５１０；１５１１および１５１２；１５１３および１５１４；１５１５および１５１６ ；１５１７および１５１８；１５１９および１５２０；１５２１および１５２２；１５２３および１５２４
；１５２５および１５２６；１５２７および１５２８；１５２９および１５３０；１５３１および１５３２ ；１５３３および１５３４；１５３５および１５３６；１５３７および１５３８；１５３９および１５４０
；１５４１および１５４２；１５４３および１５４４；１５４５および１５４６；１５４７および１５４８ ；１５４９および１５５０；１５５１および１５５２；１５５３および１５５４；１５５５および１５５６
；１５５７および１５５８；１５５９および１５６０；１５６１および１５６２；１５６３および１５６４ ；１５６５および１５６６；１５６７および１５６８；１５６９および１５７０；ならびに１５７１および１５７２のうちの１対を含む、二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項４０】
前記ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドがＦＡＮＡである請求項３９に記載のｓｉＲＮＡ．
【請求項４１】
前記ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドがＤＡＰまたはその類縁体で置換されている請求項３９または４０に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４２】
ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下するための請求項３９から４１のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４３】
２本の鎖が、配列番号１５７３および１５７４；１５７５および１５７６；ならびに１５７７および１５７８のうちの１対を含む二本鎖ｓｉＲＮＡ。
【請求項４４】
少なくとも１つのヌクレオチドがＦＡＮＡである請求項４３に記載のｓｉＲＮＡ．
【請求項４５】
前記ｓｉＲＮＡのうちの少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドがＤＡＰまたはその類縁体で置換されている、請求項４３または４４に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４６】
ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるための請求項４３から４５のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４７】
喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための、請求項３９から４６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４８】
請求項３９から４１のいずれかに記載のｓｉＲＮＡを投与する工程を含む、患者におけるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための方法。
【請求項４９】
請求項４３から４５のいずれかに記載のｓｉＲＮＡを投与する工程を含む、患者におけるＣＲ３ケモカンレセプター発現を低下させるための方法。
【請求項５０】
請求項３９から４６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡを投与する工程を含む、患者における喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための方法。
【請求項５１】
ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための請求項３９から４１のいずれかに記載のｓｉＲＮＡの用途。
【請求項５２】
ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるための請求項４３から４５のいずれかに記載のｓｉＲＮＡの用途。
【請求項５３】
喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための、請求項３９から４６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡの用途。
【請求項５４】
ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための薬剤の調製における、請求項３９から４１のいずれかに記載のｓｉＲＮＡの用途。
【請求項５５】
ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるための薬剤の調製における、請求項４３から４５のいずれかに記載のｓｉＲＮＡの用途。
【請求項５６】
喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための薬剤の調製における、請求項３９から４６のいずれかに記載のｓｉＲＮＡの用途。
【請求項５７】
好ましくはＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるために、配列番号：１６３４および１６３５；１６３６および１６３７；１６３８および１６３９；１６４０および１６４１；１６４２および１６４３；１６４４および１６４５；１６４６および１６４７；１６４８；１６４９および１６５０；１６５１および１６５２；１６５３および１６５４；１６５５および１６５６；１６５７および１６５８；１６５９；１６６０；１６６１；１６６２；１６６３；１６６４；１６６５；１６６６および１６６７；１６６８および１６６９；１６７０および１６７１；１６７２および１６７３；１６７４および１６７５；１６７６および１６７７；１６７８；１６７９および１６８０；１６８１および１６８２；１６８３および１６８４；１６８５および１６８６；１６８７および１６８８；１６８９および１６９０；１６９１および１６９２；１６９３；１６９４；１６９５および１６９６；１６９７；１６９８；１６９９および１７００；１７０１；１７０２および１７０３；１７０４；１７０５；１７０６；１７０７；１７０８；１７０９；１７１０；１７１１；１７１２および１７１３；１７１４および１７１５；１７１６；１７１７および１７１８；１７１９；１７２０および１７２１；１７２２および１７２３；１７２４；１７２５および１７２６；１７２７；１７２８；１７２９および１７３０；１７３１および１７３２；１７３３および１７３４；１７３５；１７３６；１７３７；１７３８および１７３９；１７４０および１７４１；１７４２；１７４３および１７４４；１７４５；１７４６および１７４７；１７４８および１７４９；１７５０および１７５１；１７５２；１７５３；１７５４；１７５５；１７５６；１７５７；１７５８；１７５９；１７６０；１７６１および１７６２；１７６３；１７６４および１７６５；１７６６；１７６７および１７６８；１７６９；１７７０；１７７１；１７７２；１７７３；１７７４および１７７５；１７７６；１７７７；および１７７８からなる群より選択される１対のオリゴヌクレオチドまたは１つのオリゴヌクレオチドを含む二本鎖または一本鎖のｍｉＲＮＡ。
【請求項５８】
前記ｍｉＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドがＦＡＮＡである請求項５７に記載のｍｉＲＮＡ。
【請求項５９】
前記ｍｉＲＮＡの少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドがＤＡＰまたはその類縁体で置換されている請求項５７または５８に記載のｍｉＲＮＡ。
【請求項６０】
ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現の発現を低下させるための、請求項５７から５９のいずれかに記載の二本鎖または一本鎖のｍｉＲＮＡ。
【請求項６１】
喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための、請求項５７から５９のいずれかに記載の二本鎖または一本鎖のｍｉＲＮＡ。
【請求項６２】
請求項５７から５９のいずれかに記載の二本鎖または一本鎖のｍｉＲＮＡを投与する工程を含む、患者におけるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための方法。
【請求項６３】
請求項５７から５９のいずれかに記載の二本鎖または一本鎖のｍｉＲＮＡを投与する工程を含む、患者における喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための方法。
【請求項６４】
ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための、請求項５７から５９のいずれかに記載の二本鎖または一本鎖のｍｉＲＮＡの用途。
【請求項６５】
喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための、請求項５７から５９のいずれかに記載の二本鎖または一本鎖のｍｉＲＮＡの用途。
【請求項６６】
ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための薬剤の調製における、請求項５７から５９のいずれかに記載の二本鎖または一本鎖のｍｉＲＮＡの用途。
【請求項６７】
喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための薬剤の調製における、請求項５７から５９のいずれかに記載の二本鎖または一本鎖のｍｉＲＮＡの用途。
【請求項６８】
オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つのヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）であり、高度にストリンジェントな条件下でＣＣＲ３ケモカインレセプターならびにＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のサブユニットからなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズし得るアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６９】
オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドが２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン（ＤＡＰ）で置換されている、高度にストリンジェントな条件下でＣＣＲ３ケモカインレセプターならびにＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のサブユニットからなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズし得るアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７０】
（ａ）肺および低い毒性が求められる部位に対する投与用のオリゴヌクレオチドを特定する工程と；（ｂ）少なくとも１つの非ＦＡＮＡヌクレオチドを対応するＦＡＮＡヌクレオチドで置き換える工程、および／または少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドを２−アミノ−２’−デオキシアデノシン（ＤＡＰ）で置換する工程とを含む、哺乳動物に対して投与されるオリゴヌクレオチドの治療有効性対毒性比を改善するための方法。
【請求項７１】
オリゴヌクレオチドの投与が肺で肺胞マクロファージを減少させる請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合がリン酸ジエステル結合およびホスホロチオエート結合の両方を含み、高度にストリンジェントな条件下でＣＣＲ３ケモカインレセプター、ならびにＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニットからなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズし得るアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の細胞レセプターに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの用途であって、単独で、または組み合わせて、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、嚢胞性線維症（ＣＦ）、および過好酸球増大症に関連する炎症を含む炎症を抑制するための用途に関する。本発明はまた、癌のような新生細胞増殖を抑制するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、標的遺伝子のある領域に対して相補的であって、かつ標的遺伝子配列にハイブリダイズして、遺伝子発現を阻害し得る。遺伝子発現は、アデノシンとチミジン（ｍＲＮＡ中ではウラシル）が、またはグアノシンとシチジンが、水素結合を通じて相互作用するワトソン−クリックの塩基対によって特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のセンス標的に対するＡＯＮのハイブリダイゼーションを通じて阻害される。一般に、２種類の機序がこれらの作用に関与していると考えられ、その第一は標的ｍＲＮＡの翻訳の障害を伴うハイブリダイゼーション、そして第二はＲＮａｓｅ  Ｈまたは標的ｍＲＮＡの分解を伴う同様の酵素による誘導である。この方法の主な利点は、特に作用部位に対して直接適用される場合に（局所治療）、低い副作用および低い毒性の可能性しか伴わないという、作用の特異性である。この治療方法は、１個またはいくつかの遺伝子の過剰発現が疾患の存在または残留の原因であると考えられているような疾患に対して適用することができる可能性がある。結果的に、癌およびウィルス疾患に対する治療剤として、ＡＯＮの用途を検討する多数の研究が行われている。
【０００３】
肺胞および気道上皮は、酸化的ストレス、敗血症、内毒血症および肺における他の重病に対する炎症性および代謝性の応答を調節するのに重要な役割を果たす動的な障壁として認識される。この気道上皮は特に、上皮−血液の境界で炎症性の状態／感染の主な標的であり、それ自体が、炎症性細胞を補充することおよび炎症性メディエーターを産生することによって、炎症性シグナルを増幅し得る。
【０００４】
喘息は、過去２５年の間に有病率が２倍に増大した、人口の５〜１０％に影響を及ぼす疾患である。この増大は特に、気道のウィルス感染（細気管支炎）後の幼児において、小児において、そして職業によって引き起こされる喘息において、顕著であった。喘息と関連する再発性の呼吸の問題は、しばしばアレルゲンにより引き起こされるが、しかし喘息の正確な原因は未だ分かっていない。しかしながら、ウィルスなどの物質が、喘息を有する患者の気道において見いだされる異常な炎症の永続化に関与し、従ってその疾患の持続に関与すると考えられている。
【０００５】
この理由のため、喘息の一次治療についての現在の推奨は、コルチコステロイド類および抗ロイコトリエン類を含有する薬剤などの強力な抗炎症性薬剤である。このアプローチは多くの患者において有効であるが、現在の抗炎症性の薬剤が効かない患者もいる。コルチコステロイド類はまた、長期の副作用を伴う強力な免疫抑制剤でもあり、そしてアレルギーまたは喘息の予防に有効であることは示されていない。抗ロイコトリエン類は、アレルギーおよび喘息においていくらか効用があるが、しかしコルチコステロイド類ほどは効果的ではない。
【０００６】
いくつかの炎症性メディエータ類は、喘息を有する患者の気道における炎症の発生および永続化においてある役割を果たす。いくつかのメディエータ類は、好酸球の走化性を通じて（ＣＣＲ３と呼ばれるレセプターを通じて喘息性炎症において最も作用するケモカイン類：ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン１、２、３、ＭＣＰ−３、４）、または内皮細胞活性化を通じて（ＩＬ−４、ＩＬ−１３）、気道へと炎症性細胞を誘引する。その他のメディエータ類は、気道における炎症性細胞の刺激および生存の増大を引き起こす（ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ）。従って、これらのメディエータ類は、好酸球のための特異的ケモカイン類またはＴヘルパーリンパ球２型表現型のサイトカイン（Ｔｈ２：ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＧＭ−ＣＳＦ）のいずれかから構成されている（非特許文献１；非特許文献２）。喘息および一般的な呼吸器炎症において、気道におけるこれらの炎症性メディエータ類が減少する場合、改善が示されている。
【０００７】
アレルギーは、望ましくない免疫応答を引き起こす、アレルゲンに対する過敏性である。アレルギーは、例えば、人口の３０％程度がかかっているアトピー性の鼻炎、皮膚炎およびアレルギー性結膜炎など、非常に一般的な疾患である。アレルギーは、異常なＩｇＥの生成およびアレルゲンに対する炎症により特徴づけられる。ＩｇＥおよびアレルゲンの存在下において、マスト細胞などのエフェクター細胞が脱顆粒して炎症性メディエータ類を放出し、これが喘息において見いだされる同一の炎症性細胞の補充を引き起こす。アレルギー性鼻炎（すなわち、花粉症）、アレルギー性結膜炎、鼻茸、慢性副鼻腔炎、鼻炎およびアトピー性皮膚炎において、喘息において見られるのと同様に、炎症性メディエータ類の過剰が見いだされる。ＩＬ−４およびＩＬ−１３は、ＩｇＥの生成およびＴｈ２表現型を有する細胞の誘導に必要とされる（非特許文献３；非特許文献４）。アトピー性疾患は、特に、アレルゲンに対して容易に感作される遺伝的傾向を有する個体における、アレルゲンに対する曝露により発症するアレルギー性疾患の一般名称である。これらの素因因子を有する個体は、食餌性抗原および吸入抗原に対する異常な免疫応答を容易に発症する。アレルギー性疾患のいくつかの具体的な事例は、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎およびアレルギー性胃腸炎である。
【０００８】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、炎症の持続性上方制御が役割を果たすと考えられる、炎症性気道および肺胞疾患の別の例である。ＣＯＰＤにおける炎症は、好中球、ＣＤ８陽性リンパ球、およびマクロファージの気道内への浸潤増大によって特徴づけられる。好中球およびマクロファージは、組織炎症および損傷を促進するエラスターゼ、メタロプロテアーゼ、および酸素ラジカルを含めて多数のメディエータを放出するそれらの能力が原因となり、ＣＯＰＤにおける気道炎症の病因において重要な役割を果たす。ＣＯＰＤがある患者の気道における炎症細胞の蓄積は、炎症細胞を気道に誘引してそれらを活性化し、それらの存在を維持する、炎症促進性サイトカインおよびケモカインの放出増大によって引き起こされることが示唆されている。存在する細胞はまた、組織に対して悪影響を与えて疾患を永続化させる酵素（メタロプロテアーゼなど）および酸素ラジカルを放出する。ＣＯＰＤがある患者の肺において、ありとあらゆる炎症促進性サイトカインおよびケモカインが増大することが示されている。中でも重要な役割を果たすのが、ＣＯＰＤがある患者の気道においてそのレベルが増大する、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびインターロイキン８（ＩＬ−８）である。
【０００９】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は気道炎症性疾患のさらに別の例である。ＣＦ膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）Ｃｌ−チャネル機能の欠失によって進行性の肺の障害がもたらされ、そして最終的には死にいたる。気道上皮細胞における機能的なＣＦＴＲの喪失は、気道表面の液体の枯渇および酸化の増大を促進する。気道に存在する活性化された好中球によって、大量のプロテアーゼおよび活性酸素種（ＲＯＳ）が生じる。これらの変化をまとめると、細菌の粘膜毛様体クリアランスの低下、複数の経路を通じた上皮細胞シグナル伝達の活性化、およびＣＦ気道におけるその後の高炎症性反応に関連している。気道上皮細胞においてＮＦ−κＢ経路およびＣａ２＋動員の両方が、好中球の補充および活性化、アポトーシスの調節、ならびに上皮性関門の一体性の制御に関与するＩＬ−８のようなメディエータの調節性の産生を介して肺炎症の制御における要因と考えられる。細菌感染および気道の好中球の進行中の蓄積によって維持される過剰でかつ持続的な炎症は、ＣＦの患者における肺の破壊の重要な要因であり、抗炎症性治療の検討が必要となっている。
【００１０】
炎症が役割を果たすようにみえる呼吸器疾患の他の例としては、好酸球性咳、気管支炎、肺同種移植片の急性および慢性の拒絶、サルコイドーシス、肺線維症、鼻炎および副鼻腔炎などが挙げられる。
【００１１】
好酸球性咳は、気道閉塞または応答性亢進の非存在下において、慢性の咳、および患者の気道内の、ほとんどが好酸球である炎症細胞の存在によって特徴づけられる。この疾患ではいくつかのサイトカインおよびケモカインが増大するが、それらはほとんどが好酸球指向性である。好酸球は、気道内で補充され活性化されて、炎症および咳の永続化において役割を果たす酵素および酸素ラジカルを放出する可能性がある。
【００１２】
急性気管支炎は、下気道の感染または刺激的事象（例えば汚染、粉塵、ガスまたは化学物質による）の間に生じる急性疾患である。慢性気管支炎とは、２年間にわたり年に少なくとも３ヶ月間、ほぼ毎日咳の存在および痰の発生があることで定義される。急性または慢性気管支炎の場合は、気道内に広範囲のケモカインおよびサイトカインと共に、ほとんどが好中球である炎症細胞も見られる。これらのメディエータは、これらの疾患の間に起こる炎症、症状、および粘液産生においてある役割を果たすと考えられる。
【００１３】
肺移植術は、末期の肺疾患がある患者において行われる。我々の身体の炎症細胞であるリンパ球が、ドナーの臓器を「自己」と認識しない場合に、急性、およびさらに重要なことには慢性同種移植片拒絶が起きる。炎症細胞はケモカインとサイトカインとによって補充されて、ありとあらゆる酵素類を放出し、この酵素が組織破壊をもたらし、慢性拒絶の場合は閉塞性細気管支炎と呼ばれる疾患をもたらす。
【００１４】
サルコイドーシスは、慢性非乾酪性肉芽腫が組織内で生じる原因不明の疾患である。肺は最も一般に影響を受ける臓器である。肺気管支肺胞の洗浄液は、ほとんどがリンパ球、マクロファージ、時には好中球および好酸球の増大を示す。これらの細胞はまた、サイトカインおよびケモカインによって動員および活性化され、疾患の病因に関与すると考えられる。
【００１５】
肺線維症は、慢性呼吸不全をもたらす進行性および慢性の線維症（瘢痕）によって特徴づけられる肺組織の疾患である。異なるタイプや原因の肺線維症が存在するが、全て肺組織へのコラーゲン沈着と共に、炎症細胞の流入および持続、線維芽細胞の活性化および増殖によって特徴づけられる。これらの事象は、肺組織内のサイトカインおよびケモカインの放出に関連するようである。
【００１６】
急性鼻炎は、鼻または上気道での感染または刺激的事象（例えば汚染、粉塵、ガスまたは化学物質による）の間に起こる急性疾患である。慢性鼻炎は、絶え間ない慢性の鼻水、鼻閉、くしゃみ、および掻痒症の存在によって定義される。急性または慢性の鼻炎の間、上気道内に、広範囲のケモカインおよびサイトカインと共に、炎症細胞も見ることができる。これらのメディエータは、これらの疾患の間に起こる炎症、症状、および粘液産生においてある役割を果たすと考えられる。
【００１７】
急性副鼻腔炎は、発熱の有無、鼻閉、粘性の低い化膿性痰、頭痛または副鼻腔痛によって特徴づけられる、急性で通常は感染性の副鼻腔の疾病である。慢性副鼻腔炎は、急性副鼻腔炎症状の６ヶ月を超える持続によって定義される。急性または慢性副鼻腔炎においては、上気道および副鼻腔内に、広範囲のケモカインおよびサイトカインと共に、炎症細胞も見ることができる。これらのメディエータは、これらの疾患の間に起こる炎症、症状、および痰の産生においてある役割を果たすと考えられる。
【００１８】
新生物は、調節不能でかつ進行性である異常な組織増殖である。悪性新生物はしばしば、癌として特徴づけられる。癌は、ヒトの死因の第二位であり、そして不死化細胞の異常増殖により特徴づけられる１００種類を超える疾患についての一般的用語である。これらの細胞の永続性および増殖の増大に関与する機序の一つは、同族のレセプターを通じて作用する成長因子の放出である。これらの成長因子の中でも、ＧＭ−ＣＳＦは、いくつかの腫瘍細胞にとって重要な成長因子であることが示されている。ケモカインレセプターＣＣＲ３は、最近、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）やヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）を有する患者から回収された悪性Ｂリンパ球中で特徴づけられた（非特許文献５）。実際、ＣＣＲ−３ケモカインレセプターを通じた上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）のトランス活性化が、気管上皮細胞におけるＭＡＰキナーゼ活性化およびサイトカイン生成を引き起こす重要な経路であることが見いだされた（非特許文献６）。成長因子についてのレセプターおよび／またはケモカイン類についてのレセプターの遮断を介する癌細胞増殖の抑制は、特定の癌の治療において重要である場合がある。
【００１９】
好酸球は、白血球細胞のうち一つの型である。それらは、顆粒性白血球であって、これは細長い糸状のクロマチンにより連結された通常は２葉を有する核と、均一なサイズでありエオジンで染色可能である、素早く動く（ｃｏｕｒｓｅ）球状の顆粒を含有する細胞質とを有する。過好酸球増大症は、好酸球数の増大により特徴づけられ、しばしばアレルギー、喘息、および感染と関連している。
【００２０】
炎症反応を抑制するための、レセプターをコードする特異的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの用途は公知である。共有に係る非特許文献７および非特許文献８には、喘息、アレルギー、過好酸球増大症、炎症、および癌を治療および／または予防するために用いられるＡＯＮが記載されている。
【００２１】
潜在的な臨床的用途のため、ＡＯＮは、血清および細胞ヌクレアーゼによる分解に対して安定性を示さなければならず、血清タンパク質および細胞タンパク質に対する低い非特異的結合を示さなければならず、標的ｍＲＮＡ配列への高い認識を示さなければならず、相補的ｍＲＮＡと複合体化された場合、細胞膜透過性、および細胞ヌクレアーゼの誘導を示さなければならない。天然の糖（Ｄ−リボースおよびＤ−２−デオキシリボース）およびリン酸ジエステル（ＰＯ）結合を含有するオリゴヌクレオチドは、血清および細胞内ヌクレアーゼにより迅速に分解され、それが効果的な治療剤としてのそれらの有用性を限定していることは、よく知られている。治療剤としてのそれらの安定性および効率性を向上するための、オリゴヌクレオチドに関する化学的な戦略的修飾が報告されている。主要な化学的変化としては、糖部分の修飾、塩基部分の修飾、および／またはヌクレオチド間リン酸ジエステル結合の修飾もしくは置換が挙げられる。現在までのところ、もっとも広く研究されているアナログは、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴデオキシヌクレオチドであり、これは、リン酸ジエステル骨格中の非架橋性酸素原子の一つが、硫黄原子により置換されたものである（非特許文献９）。いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド合成が、インビトロおよびインビボの研究のために開発され、用いられている（非特許文献１０；非特許文献１１）。
【００２２】
炎症促進性のレセプターを阻害するために、これらのレセプターをコードする核酸配列に対する改良されたＡＯＮが求められている。このようなＡＯＮは、喘息、アレルギー、過好酸球増大症、炎症および癌の治療および／または予防において有用であると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】ジョン・エー・イー（Ｊｏｈｎ  ＡＥ．）およびルカーチ・エヌ・ダブリュ（Ｌｕｋａｃｓ  ＮＷ．），サルコイドーシス・バスキュリティス・アンド・ディフューズ・ラング・ディジーズ（Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ  Ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｕｓｅ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ），２００３年２０：１８０〜１８９
【非特許文献２】ブリーズ（Ｂｌｅａｓｅ）ら，エキスパート・オピニオン・オン・エマージング・ドラッグス（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ．）２００３年，８：７１〜８１
【非特許文献３】バーンズ・ピー・ジェイ（Ｂａｒｎｅｓ  ＰＪ．），サイトカイン・アンド・グロース・ファクター・レビューズ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）．２００３年，１４：５１１〜５２２
【非特許文献４】シュー（Ｓｃｈｕｈ）ら，サイトカイン・アンド・グロース・ファクター・レビューズ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）．２００３年，１４：５０３〜５１０
【非特許文献５】トレンチン（Ｔｒｅｎｔｉｎ）ら，ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），２００４年，１０４，５０２〜５０８
【非特許文献６】アダチ（Ａｄａｃｈｉ）ら，バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、２００４年，３２０，２９２〜３９６
【非特許文献７】国際公開第ＷＯ９９／６６０３７号パンフレット
【非特許文献８】国際公開第ＷＯ０６／０４５２０２号パンフレット
【非特許文献９】エクステイン・エフ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｆ．），アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９８５年，５４：３６７〜４０２
【非特許文献１０】グッドチャイルド・ジェイ（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ．），カレント・オピニオン・モレキュラー・セラピューティクス（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）２００４年，６：１２０〜１２８
【非特許文献１１】アーバン・イー（Ｕｒｂａｎ  Ｅ．）およびアール・ノエ・シーアール（Ｒ．Ｎｏｅ  ＣＲ．），ファルマコ（Ｆａｒｍａｃｏ．），２００３年，５８：２４３〜２５８
【発明の概要】
【００２４】
発明の要旨
本発明の一態様は、オリゴヌクレオチドが（ｉ）配列番号１から６９８のうちのいずれか１つに対応する塩基配列を有し、かつ（ｉｉ）配列番号１から６９８のいずれか１つの修飾オリゴヌクレオチド、のうちの１つである、ＣＣＲ３ケモカインレセプターならびにＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニットからなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸配列に対するオリゴヌクレオチドである。
【００２５】
好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは配列番号１〜６９８のいずれか１つに対応する塩基配列を有する。
【００２６】
好ましくは、上記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのアデノシンは、修飾されたヌクレオチド、好ましくは、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン（ＤＡＰ）で置換される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドはアラビノース修飾オリゴヌクレオチド、好ましくは、２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボラノホスホネートおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含む。好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートもしくはリン酸ジエステルオリゴヌクレオチド、またはホスホロチオエートおよびリン酸ジエステル結合の組み合わせを有するオリゴヌクレオチドである。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの少なくとも１つおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、患者に対して本明細書に記載の薬学的組成物を投与する工程を包む、患者における喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防する方法である。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための、本明細書に記載の薬学的組成物の用途である。
【００３２】
本発明のさらなる態様は、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための、薬剤の調製における本明細書に記載の薬学的組成物の用途である。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、患者に対して本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を含み、該オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する、患者におけるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための方法である。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの用途である。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させる薬剤の調製における、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの用途である。
【００３６】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドである。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを患者に対して投与する工程を含む、患者におけるＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるための方法である。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの用途である。
【００３９】
本発明のさらなる態様は、ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させる薬剤の調製における、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの用途である。
【００４０】
本発明のさらなる態様は、ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドである。
【００４１】
本発明のさらなる態様は、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための；患者におけるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための（オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する）；患者におけるＣＣＲケモカインレセプター発現を低下させるための（オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する）、本明細書に記載の薬学的組成物をその使用方法の説明書と一緒に備える商業的パッケージである。
【００４２】
本発明のさらなる態様は、２本の鎖が配列番号６９９および７００；７０１および７０２；７０３および７０４；７０５および７０６；７０７および７０８；７０９および７１０；７１１および７１２；７１３および７１４；７１５および７１６；７１７および７１８；７１９および７２０；７２１および７２２；７２３および７２４；７２５および７２６；７２７および７２８；７２９および７３０；７３１および７３２；７３３および７３４；７３５および７３６；７３７および７３８；７３９および７４０；７４１および７４２；７４３および７４４；７４５および７４６；７４７および７４８；７４９および７５０；７５２および７５２；７５３および７５４；７５５および７５６；７５７および７５８；７５９および７６０；７６１および７６２；７６３および７６４；７６５および７６６；７６７および７６８；７６９および７７０；７７１および７７２；７７３および７７４；７７５および７７６；７７７および７７８；７７９および７８０；７８１および７８２；７８３および７８４；７８５および７８６；７８７および７８８；７８９および７９０；７９１および７９２；７９３および７９４；７９５および７９６；７９７および７９８；７９９および８００；８０１および８０２；８０３および８０４；８０５および８０６；８０７および８０８；８０９および８１０；８１１および８１２；８１３および８１４；８１５および８１６；８１７および８１８；８１９および８２０；８２１および８２２；８２３および８２４；８２５および８２６；８２７および８２８；８２９および８３０；８３１および８３２；８３３および８３４；８３５および８３６；８３７および８３８；８３９および８４０；８４１および８４２；８４３および８４４；８４５および８４６；８４７および８４８；８４９および８５０；８５１および８５２；８５３および８５４；８５５および８５６；８５７および８５８；８５９および８６０；８６１および８６２；８６３および８６４；８６５および８６６；８６７および８６８；８６９および８７０；８７１および８７２；８７３および８７４；８７５および８７６；８７７および８７８；８７９および８８０；８８１および８８２；８８３および８８４；８８５および８８６；８８７および８８８；８８９および８９０；８９１および８９２；８９３および８９４；８９５および８９６；８９７および８９８；８９９および９００；９０１および９０２；９０３および９０４；９０５および９０６；９０７および９０８；９０９および９１０；９１１および９１２；９１３および９１４；９１５および９１６；９１７および９１８；９１９および９２０；９２１および９２２；９２３および９２４；９２５および９２６；９２７および９２８；９２９および９３０；９３１および９３２；９３３および９３４；９３５および９３６；９３７および９３８；９３９および９４０；９４１および９４２；９４３および９４４；９４５および９４６；９４７および９４８；９４９および９５０；９５１および９５２；９５３および９５４；９５５および９５６；９５７および９５８；９５９および９６０；９６１および９６２；９６３および９６４；９６５および９６６；９６７および９６８；９６９および９７０；９７１および９７２；９７３および９７４；９７５および９７６；９７７および９７８；９７９および９８０；９８１および９８２；９８３および９８４；９８５および９８６；９８７および９８８；９８９および９９０；９９１および９９２；９９３および９９４；９９５および９９６；９９７および９９８；９９９および１０００；１００１および１００２；１００３および１００４；１００５および１００６；１００７および１００８；１００９および１０１０；１０１１および１０１２；１０１３および１０１４；１０１５および１０１６；１０１７および１０１８；１０１９および１０２０；１０２１および１０２２；１０２３および１０２４；１０２５および１０２６；１０２７および１０２８；１０２９および１０３０；１０３１および１０３２；１０３３および１０３４；１０３５および１０３６；１０３７および１０３８；１０３９および１０４０；１０４１および１０４２；１０４３および１０４４；１０４５および１０４６；１０４７および１０４８；１０４９および１０５０；１０５１および１０５２；１０５３および１０５４；１０５５および１０５６；１０５７および１０５８；１０５９および１０６０；１０６１および１０６２；１０６３および１０６４；１０６５および１０６６；１０６７および１０６８；１０６９および１０７０；１０７１および１０７２；１０７３および１０７４；１０７５および１０７６；１０７７および１０７８；１０７９および１０８０；１０８１および１０８２；１０８３および１０８４；１０８５および１０８６；１０８７および１０８８；１０８９および１０９０；１０９１および１０９２；１０９３および１０９４；１０９５および１０９６；１０９７および１０９８；１０９９および１１００；１１０１および１１０２；１１０３および１１０４；１１０５および１１０６；１１０７および１１０８；１１０９および１１１０；１１１１および１１１２；１１１３および１１１４；１１１５および１１１６；１１１７および１１１８；１１１９および１１２０；１１２１および１１２２；１１２３および１１２４；１１２５および１１２６；１１２７および１１２８；１１２９および１１３０；１１３１および１１３２；１１３３および１１３４；１１３５および１１３６；１１３７および１１３８；１１３９および１１４０；１１４１および１１４２；１１４３および１１４４；１１４５および１１４６；１１４７および１１４８；１１４９および１１５０；１１５１および１１５２；１１５３および１１５４；１１５５および１１５６；１１５７および１１５８；１１５９および１１６０；１１６１および１１６２；１１６３および１１６４；１１６５および１１６６；１１６７および１１６８；１１６９および１１７０；１１７１および１１７２；１１７３および１１７４；１１７５および１１７６；１１７７および１１７８；１１７９および１１８０；１１８１および１１８２；１１８３および１１８４；１１８５および１１８６；１１８７および１１８８；１１８９および１１９０；１１９１および１１９２；１１９３および１１９４；１１９５および１１９６；１１９７および１１９８；１１９９および１２００；１２０１および１２０２；１２０３および１２０４；１２０５および１２０６；１２０７および１２０８；１２０９および１２１０；１２１１および１２１２；１２１３および１２１４；１２１５および１２１６；１２１７および１２１８；１２１９および１２２０；１２２１および１２２２；１２２３および１２２４；１２２５および１２２６；１２２７および１２２８；１２２９および１２３０；１２３１および１２３２；１２３３および１２３４；１２３５および１２３６；１２３７および１２３８；１２３９および１２４０；１２４１および１２４２；１２４３および１２４４；１２４５および１２４６；１２４７および１２４８；１２４９および１２５０；１２５１および１２５２；１２５３および１２５４；１２５５および１２５６；１２５７および１２５８；１２５９および１２６０；１２６１および１２６２；１２６３および１２６４；１２６５および１２６６；１２６７および１２６８；１２６９および１２７０；１２７１および１２７２；１２７３および１２７４；１２７５および１２７６；１２７７および１２７８；１２７９および１２８０；１２８１および１２８２；１２８３および１２８４；１２８５および１２８６；１２８７および１２８８；１２８９および１２９０；１２９１および１２９２；１２９３および１２９４；１２９５および１２９６；１２９７および１２９８；１２９９および１３００；１３０１および１３０２；１３０３および１３０４；１３０５および１３０６；１３０７および１３０８；１３０９および１３１０；１３１１および１３１２；１３１３および１３１４；１３１５および１３１６；１３１７および１３１８；１３１９および１３２０；１３２１および１３２２；１３２３および１３２４；１３２５および１３２６；１３２７および１３２８；１３２９および１３３０；１３３１および１３３２；１３３３および１３３４；１３３５および１３３６；１３３７および１３３８；１３３９および１３４０；１３４１および１３４２；１３４３および１３４４；１３４５および１３４６；１３４７および１３４８；１３４９および１３５０；１３５１および１３５２；１３５３および１３５４；１３５５および１３５６；１３５７および１３５８；１３５９および１３６０；１３６１および１３６２；１３６３および１３６４；１３６５および１３６６；１３６７および１３６８；１３６９および１３７０；１３７１および１３７２；１３７３および１３７４；１３７５および１３７６；１３７７および１３７８；１３７９および１３８０；１３８１および１３８２；１３８３および１３８４；１３８５および１３８６；１３８７および１３８８；１３８９および１３９０；１３９１および１３９２；１３９３および１３９４；１３９５および１３９６；１３９７および１３９８；１３９９および１４００；１４０１および１４０２；１４０３および１４０４；１４０５および１４０６；１４０７および１４０８；１４０９および１４１０；１４１１および１４１２；１４１３および１４１４；１４１５および１４１６；１４１７および１４１８；１４１９および１４２０；１４２１および１４２２；１４２３および１４２４；１４２５および１４２６；１４２７および１４２８；１４２９および１４３０；１４３１および１４３２；１４３３および１４３４；１４３５および１４３６；１４３７および１４３８；１４３９および１４４０；１４４１および１４４２；１４４３および１４４４；１４４５および１４４６；１４４７および１４４８；１４４９および１４５０；１４５１および１４５２；１４５３および１４５４；１４５５および１４５６；１４５７および１４５８；１４５９および１４６０；１４６１および１４６２；１４６３および１４６４；１４６５および１４６６；１４６７および１４６８；１４６９および１４７０；１４７１および１４７２；１４７３および１４７４；１４７５および１４７６；１４７７および１４７８；１４７９および１４８０；１４８１および１４８２；１４８３および１４８４；１４８５および１４８６；１４８７および１４８８；１４８９および１４９０；１４９１および１４９２
；１４９３および１４９４；１４９５および１４９６；１４９７および１４９８；１４９９および１５００ ；１５０１および１５０２；１５０３および１５０４；１５０５および１５０６；１５０７および１５０８
；１５０９および１５１０；１５１１および１５１２；１５１３および１５１４；１５１５および１５１６ ；１５１７および１５１８；１５１９および１５２０；１５２１および１５２２；１５２３および１５２４
；１５２５および１５２６；１５２７および１５２８；１５２９および１５３０；１５３１および１５３２ ；１５３３および１５３４；１５３５および１５３６；１５３７および１５３８；１５３９および１５４０
；１５４１および１５４２；１５４３および１５４４；１５４５および１５４６；１５４７および１５４８ ；１５４９および１５５０；１５５１および１５５２；１５５３および１５５４；１５５５および１５５６
；１５５７および１５５８；１５５９および１５６０；１５６１および１５６２；１５６３および１５６４ ；１５６５および１５６６；１５６７および１５６８；１５６９および１５７０；ならびに１５７１および１５７２のうちの１対を含み、好ましくはＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための、二本鎖ｓｉＲＮＡである。
【００４３】
本発明のさらなる態様は、２本の鎖が、配列番号１５７３および１５７４；１５７５および１５７６；ならびに１５７７および１５７８のうちの１対を含む二本鎖ｓｉＲＮＡである。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための本明細書に記載のｓｉＲＮＡである。
【００４５】
本発明のさらなる態様は、上記ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドがＦＡＮＡである、本明細書に記載のｓｉＲＮＡである。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、上記ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドがＤＡＰまたはその類縁体で置換されている本明細書に記載のｓｉＲＮＡである。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のｓｉＲＮＡを投与する工程を含む、患者におけるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための方法である。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のｓｉＲＮＡを投与する工程を包む、患者におけるＣＣＲ３ケモカンレセプター発現を低下させるための方法である。
【００４９】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のｓｉＲＮＡを投与する工程を包む、患者における喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための方法である。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現もしくはＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるため、または喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／もしくは予防するための本明細書に記載のｓｉＲＮＡの用途である。
【００５１】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるため；またはＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるため；または喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／もしくは予防するための薬剤の調製における本明細書に記載のｓｉＲＮＡの用途である。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、配列番号：１６３４および１６３５；１６３６および１６３７；１６３８および１６３９；１６４０および１６４１；１６４２および１６４３；１６４４および１６４５；１６４６および１６４７；１６４８；１６４９および１６５０；１６５１および１６５２；１６５３および１６５４；１６５５および１６５６；１６５７および１６５８；１６５９；１６６０；１６６１；１６６２；１６６３；１６６４；１６６５；１６６６および１６６７；１６６８および１６６９；１６７０および１６７１；１６７２および１６７３；１６７４および１６７５；１６７６および１６７７；１６７８；１６７９および１６８０；１６８１および１６８２；１６８３および１６８４；１６８５および１６８６；１６８７および１６８８；１６８９および１６９０；１６９１および１６９２；１６９３；１６９４；１６９５および１６９６；１６９７；１６９８；１６９９および１７００；１７０１；１７０２および１７０３；１７０４；１７０５；１７０６；１７０７；１７０８；１７０９；１７１０；１７１１；１７１２および１７１３；１７１４および１７１５；１７１６；１７１７および１７１８；１７１９；１７２０および１７２１；１７２２および１７２３；１７２４；１７２５および１７２６；１７２７；１７２８；１７２９および１７３０；１７３１および１７３２；１７３３および１７３４；１７３５；１７３６；１７３７；１７３８および１７３９；１７４０および１７４１；１７４２；１７４３および１７４４；１７４５；１７４６および１７４７；１７４８および１７４９；１７５０および１７５１；１７５２；１７５３；１７５４；１７５５；１７５６；１７５７；１７５８；１７５９；１７６０；１７６１および１７６２；１７６３；１７６４および１７６５；１７６６；１７６７および１７６８；１７６９；１７７０；１７７１；１７７２；１７７３；１７７４および１７７５；１７７６；１７７７；および１７７８からなる群より選択される１対のオリゴヌクレオチドまたは単一のオリゴヌクレオチドを含み、好ましくはＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下するための、ｍｉＲＮＡである。
【００５３】
本発明のさらなる態様は、上記ｍｉＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドがＦＡＮＡである、本明細書に記載のｍｉＲＮＡである。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、上記ｍｉＲＮＡの少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドがＤＡＰまたはその類縁体で置換されている、本明細書に記載のｍｉＲＮＡである。
【００５５】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のｍｉＲＮＡを投与する工程を包む、患者におけるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための方法である。
【００５６】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のｍｉＲＮＡを投与する工程を包む、患者における喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための方法である。
【００５７】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるため、あるいは喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための、本明細書に記載のｍｉＲＮＡの用途である。
【００５８】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための；あるいは喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための薬剤の調製における、本明細書に記載のｍｉＲＮＡの用途である。
【００５９】
本発明のさらなる態様は、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つのヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）であり、高度にストリンジェントな条件下でＣＣＲ３ケモカインレセプターならびにＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のサブユニットからなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズし得るＡＯＮである。
【００６０】
本発明のさらなる態様は、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つのアデノシンが２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン（ＤＡＰ）で置換されていて、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のサブユニットをコードする核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＡＯＮである。
【００６１】
本発明のさらなる態様は、（ａ）肺および低い毒性が求められる部位に対する投与用のオリゴヌクレオチドを特定する工程と；（ｂ）少なくとも１つの非ＦＡＮＡヌクレオチドを対応するＦＡＮＡヌクレオチドで置き換える工程、および／または少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドを２−アミノ−２’−デオキシアデノシン（ＤＡＰ）で置換する工程とを含む、哺乳動物に対して投与されるオリゴヌクレオチドの治療有効性対毒性比を改善するための方法である。好ましくは、哺乳動物に対するこの得られたオリゴヌクレオチドの投与が、未修飾のオリゴヌクレオチドの投与に比較して力価の増強および／または毒性の低下を生じさせる。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合がリン酸ジエステル結合およびホスホロチオエート結合の両方を含み、高度にストリンジェントな条件下でＣＣＲ３ケモカインレセプター、ならびにＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニットからなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズし得るＡＯＮである。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、β鎖のｍＲＮＡ発現を低下させるＡＯＮ配列の有効性を示す。図１ａは、ＡＯＮの配列、ＴＯＰ０５７（配列番号８）からＴＯＰ０７３（配列番号２４）までの有効性を示す。ＴＦ−１細胞（６６８ｎＭ）または２９３−／βｃ−ＧＦＰ細胞（２６７ｎＭ）を２４時間トランスフェクトして、β鎖のｍＲＮＡ発現レベルをＱｕａｎｔｉｇｅｎｅを用いて定量した。結果は、トランスフェクトされてないコントロール細胞と比較したβ鎖ｍＲＮＡの阻害（β２Ｍに対して正規化）の平均の割合±ＳＥＭ（ＴＦ−１細胞株中での２つの実験および２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞株中での２つの実験を合わせたもの）として表す。ＡＯＮの配列ＴＯＰ０５７（配列番号８）、ＴＯＰ０６２（配列番号１３）およびＴＯＰ０６３（配列番号１４）の比活性を、図１ｂの２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞（２６７ｎＭ）そして；図１ｃのＴＦ−１細胞（５００ｎＭ）において、対応するセンスのコントロール配列（ＴＯＰ０５７ｓ（配列番号１７７９）、ＴＯＰ０６２ｓ（配列番号１７８０）およびＴＯＰ０６３ｓ（配列番号１７８１））と比較した。細胞を２４時間トランスフェクトして、β鎖ｍＲＮＡの発現レベルをＱｕａｎｔｉｇｅｎｅを用いて定量した。結果を正規化した比β鎖／β２Ｍ±ＳＥＭとして表した。対応するセンスのコントロールＡＯＮに対するβ鎖のｍＲＮＡの阻害割合を示す。統計学的分析をＡＮＯＶＡ検定（ダネット事後検定，ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１）を用いて行った。
【図２】図２は、ＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現の低下におけるＡＯＮ配列の有効性を示す。図２ａは、ＡＯＮの配列のＴＯＰ０２０（配列番号６７３）からＴＯＰ０４５（配列番号６９８）までの有効性を示す。ＴＦ−１細胞（６６８ｎＭ）または２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞（２６７ｎＭ）を、示したＡＯＮ類でトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後のＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現レベルをＱｕａｎｔｉｇｅｎｅを用いて定量した。結果を、非トランスフェクトのコントロールの細胞と比較して、ＣＣＲ３  ｍＲＮＡ発現阻害の平均割合±ＳＥＭ（ＴＦ−１での２つの実験、および２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞での４つの実験を合わせたもの）として示す。図２ｂは、２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞（２６７ｎＭ）で、対応するセンスのコントロール配列（ＴＯＰ０３０ｓ（配列番号１７８２）およびＴＯＰ０３１ｓ（配列番号１７８３））に比較したＡＯＮの配列ＴＯＰ０３０（配列番号６８３）およびＴＯＰ０３１（配列番号６８４）の比活性を示す。図２ｃは、ＴＦ−１細胞で得られた同様の結果を示す（６６８ｎＭ）。細胞をトランスフェクトして、トランスフェクション２４時間後のＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現レベルをＱｕａｎｔｉｇｅｎｅを用いて定量した。結果を、平均±ＳＥＭ正規化比ＣＣＲ３／β２Ｍ±ＳＥＭとして表す。対応するセンスのコントロールＡＯＮに対するＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現の阻害割合を示す。統計学的分析をＡＮＯＶＡ検定（ダネット事後検定，ｎ＝３，＊＊ｐ＜０．０１）を用いて行った。
【図３】図３は、β鎖のｍＲＮＡ発現レベル低下におけるｓｉＲＮＡの有効性を示す。図３ａは、０．０４、０．１２および０．２４μＭという用量でトランスフェクション２４時間後の２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞におけるβ鎖のｍＲＮＡ発現の低下でのｓｉＲＮＡ配列の有効性を示す。図３ｂおよび図３ｃは、ＴＦ−１細胞におけるβ鎖のｍＲＮＡ発現レベルの低下に対するβ鎖のＡＯＮ（ＴＯＰ０６２（配列番号１３））およびｓｉＲＮＡ配列の有効性を比較する。用量反応実験では、細胞を、示したＡＯＮまたはｓｉＲＮＡを０．２５μＭ、０．５μＭおよび１μＭの用量で用いてトランスフェクトした（図３ｂ）。経時変化観察のために、細胞を１μＭの示したＡＯＮまたはｓｉＲＮＡでトランスフェクトして、β−鎖のｍＲＮＡ発現定量を、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイを用いてトランスフェクションの２４、４８または７２時間後に行った（図３ｃ）。結果は、β２Ｍコントロール遺伝子ＲＬＵに対して正規化したβ鎖の相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔｓ）（ＲＬＵ）の平均比（±ＳＥＭ）として表す。統計学的分析を、一元ＡＮＯＶＡ、続いてダネット事後検定を用いて、コントロールの参照としてＴＯＰ０６２（配列番号１３）を用いて行った（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，ｎ＝３  条件ごとに繰り返す）。
【図４】図４は、ＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現レベルの低下でのｓｉＲＮＡ配列の有効性を示す。図４ａは、２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞でのトランスフェクション後のＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現レベル低下でのｓｉＲＮＡの有効性を示す。細胞を、０．０４μＭ〜０．２４μＭにおよぶ用量でｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクトして、ＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現をトランスフェクションの２４時間後に決定した。図４ｂは、２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞におけるＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現レベルの低下において、示したＡＯＮおよびｓｉＲＮＡ配列の有効性を比較する。２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞を示したＡＯＮまたはｓｉＲＮＡを用いて３００ｎＭの濃度でトランスフェクトして、ＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現の定量をトランスフェクションの２４、４８または７２時間後に行った。総ＲＮＡをトランスフェクトされた細胞から抽出し、精製して、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイを用いてＣＣＲ３のｍＲＮＡ定量に供した。結果は、β２Ｍコントロール遺伝子ＲＬＵに対して正規化したＣＣＲ３の相対発光量（ＲＬＵ）の平均比（±ＳＥＭ）として表す。統計学的分析を、一元ＡＮＯＶＡ、続いてダネット事後検定を用いて、コントロールの参照としてＴＯＰ０３０（配列番号６８３）を用いて行った（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，ｎ＝３  条件ごとに繰り返す）。
【図５】図５は、β鎖またはＣＣＲ３タンパク質発現の低下での選択されたＡＯＮ配列の有効性を示す。細胞を、示したＡＯＮ類またはそれらのコントロールのセンス配列でトランスフェクトして（２６７ｎＭのＡＯＮを、２９３−βｃ−ＧＦＰおよび２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞へトランスフェクトした；６６７ｎＭのＡＯＮを、ＴＦ−１細胞中にトランスフェクトした）、タンパク質レベルを、トランスフェクションの２４時間後のフローサイトメトリーによって分析した。図５ａおよび図５ｃでは、結果を、それぞれ、βｃ−ＧＦＰおよびＣＣＲ３−ＧＦＰタンパク質の発現について陽性の２９３−βｃ−ＧＦＰおよび２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞の平均の割合±ＳＥＭとして表す。図５ｂおよび５ｄでは、結果を、ＴＦ−１細胞における、それぞれβ鎖およびＣＣＲ３タンパク質発現の平均中央蛍光強度（ａｖｅｒａｇｅ  ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（ＭＦＩ）±ＳＥＭとして表す。対応するセンスコントロールＡＯＮに対する標的タンパク質発現の阻害の割合を示す。統計学的分析は、対応のないｔ検定を用い、ｎ＝３、および＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１を用いて行った。
【図６】図６は、それぞれ、β鎖（２９３−／βｃ−ＧＦＰ細胞）およびＣＣＲ３（ＴＦ−１細胞）のタンパク質レベルの低下でのＦＡＮＡ−含有ＴＯＰ０６２（配列番号１３）およびＴＯＰ０３０（配列番号６８３）のＡＯＮ類の有効性を示す。２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞を２００ｎＭのＡＯＮでトランスフェクトし、一方ＴＦ−１細胞は、６６８ｎＭのＡＯＮでトランスフェクトした。タンパク質発現レベルは、トランスフェクション２４時間後のフローサイトメトリーによって測定した。結果は、β鎖（図６ａ）およびＣＣＲ３（図６ｂ）のタンパク質発現について陽性の細胞の主要な割合±ＳＥＭとして表す。統計学的分析は、ＡＮＯＶＡ検定（ダネット事後検定）を用い、ｎ＝３または４で、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１で行った。
【図７】図７は、ＦＡＮＡ−含有ＴＯＰ０６２（配列番号１３）（図７ａ）およびＴＯＰ０３０（配列番号６８３）（図７ｂ）のＡＯＮ類の血清安定性の増大を示す。ＡＯＮ類を５０％のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ中、３７℃でインキュベートした。サンプルを種々の時点で収集して、陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて分析した。残っているインタクトなＡＯＮの割合を、０時間の時点のピーク面積を１００％に設定した値に対して対応するピーク面積を比較することによって決定した。
【図８】図８は、ＣＣＲ３発現に対するＴＯＰ０６２−Ｆ８（配列番号１５８８）（β鎖  ＡＯＮ）、およびβ鎖発現に対するＴＯＰ０３０−Ｆ２（配列番号１６００）（ＣＣＲ３  ＡＯＮ）の交差標的効果を示す。ＴＦ−１細胞は、１６７ｎＭまたは６６８ｎＭの濃度でいずれかのＡＯＮを単独で用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、ＣＣＲ３（図８ａおよび図８ｂ）およびβ鎖（図８ｃおよび８ｄ）のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルについて分析した。ｍＲＮＡ発現レベルの結果は、正規化比のＣＣＲ３／β２Ｍまたはβ鎖／β２Ｍの平均±ＳＥＭとして示すが、タンパク質発現の結果は、ＣＣＲ３またはβ鎖タンパク質を発現する細胞の平均の割合±ＳＥＭとして示す。
【図９】図９は、ＣＣＲ３（図９ａ）およびβ鎖（図９ｂ）のタンパク質発現に対するＴＯＰ６２−Ｆ８（配列番号１５８８）およびＴＯＰ３０−Ｆ２（配列番号１６００）（ＴＰＩ２２００）のＡＯＮ類の交差標的効果を示す。ＴＦ−１細胞を６６８ｎＭの濃度で示したＡＯＮの配列を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、タンパク質発現レベルをフローサイトメトリーによって測定した。結果を平均蛍光強度として表した（ＭＦＩ±ＳＥＭ）。
【図１０】図１０は、ＣＣＲ３およびβ鎖のｍＲＮＡおよびタンパク質発現の阻害に対する、ＴＯＰ０６２−Ｆ８（配列番号１５８８）およびＴＯＰ０３０−Ｆ２（配列番号１６００）を単独でまたは組み合わせての有効性を示す。ＴＦ−１細胞を、ＡＯＮを単独（３３４ｎＭまたは６６８ｎＭ）でまたは組み合わせて用いて（各々のＡＯＮが３３４ｎＭ）トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＣＣＲ３（図１０ａおよび１０ｂ）およびβ鎖（図１０ｃおよび１０ｄ）のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルを定量した。ｍＲＮＡ発現の結果は、正規化比ＣＣＲ３／β２Ｍまたはβ鎖／β２Ｍの平均±ＳＥＭとして示すが、タンパク質発現の結果は、ＣＣＲ３またはβ鎖タンパク質を発現する細胞の平均の割合±ＳＥＭとして示す。トランスフェクトされてないコントロールの細胞に対する発現阻害の割合を示す。統計学的分析は、対応のないｔ検定を用いて、ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１で行った。
【図１１】図１１は、ラットＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現レベルの低下でのＦＡＮＡ−含有ＴＯＰ００７（配列番号１６２８）ＡＯＮの活性を示す。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、ラットのＣＣＲ３のｃＤＮＡ（ｐＣＭＶｓｃｒｉｐｔラットＣＣＲ３）を含む０．２μｇの発現プラスミド、および０．２μｇの示されたＡＯＮを用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現レベルを定量した。トランスフェクション後のＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現レベルは、コントロールプラスミド（ｐＧＬ２−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の発現レベルに対して正規化した。その結果を、ミスマッチのコントロールのＡＯＮを発現する細胞での対応するｍＲＮＡ発現阻害レベルに対してＣＣＲ３のｍＲＮＡの発現阻害の割合として表す。
【図１２】図１２は、感作されたＢＮラットの肺へのアレルゲン誘導性エオシノフィル流入に対する、同じＡＯＮ（それぞれ、ＴＯＰ００６−Ｆ２（配列番号１６２７）およびＴＯＰ００７−Ｆ８（配列番号１６２９））をＦＡＮＡで修飾したものの組み合わせに対するラットβ鎖（ＴＯＰ００６（配列番号１６２６））およびＣＣＲ３（ＴＯＰ００７（配列番号１６２８））を標的するＡＯＮの組み合わせの効果の比較を示す。ＯＶＡ感作の１４日後、ＯＶＡチャレンジの前に示したとおり、媒体または２５μｇの各々のＡＯＮの組み合わせ（１個体あたり全部で５０μｇ）の単回の気管内投与を用いて非チャレンジにするかまたは処置した。ラットをＯＶＡチャレンジの１５時間後に屠殺し、ＢＡＬ液からの異なる細胞計数を行った。データは３つの別の実験からの平均の総細胞数＋／−ＳＥＭを示す。一元ＡＮＯＶＡに続くダネットの多重比較検定（対ビヒクル処置およびＯＶＡチャレンジ）（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）；１群あたりｎ＝１４〜２３のラット。
【図１３】図１３は、長期間の投薬後のげっ歯類（マウスおよびラット）のおよびサルの肺における泡沫状マクロファージの出現割合に対する、ＦＡＮＡ修飾ＡＯＮ類（ＴＰＩ１１００）対非ＦＡＮＡ修飾ＡＯＮ類（ＴＰＩ  ＡＳＭ８）の効果の比較を示す。
【図１４】図１４は、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅを用いて決定されたβ鎖ｍＲＮＡ発現レベルの低下での同じＡＯＮ（それぞれ、ＴＯＰ０６２−ＤＡＰ（配列番号１６２１）、ＴＯＰ０５７−ＤＡＰ（配列番号１６２２）、ＴＯＰ０７３−ＤＡＰ（配列番号１６２３）およびＴＯＰ０７７−ＤＡＰ（配列番号１６２４））のＤＡＰ修飾バージョンの有効性に対する、β−鎖を標的する選択ＡＯＮ類（ＴＯＰ０６２（配列番号１３）、ＴＯＰ０５７（配列番号８）、ＴＯＰ０７３（配列番号２４）およびＴＯＰ０７７（配列番号２８））の有効性の比較を示す。２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞は、２６７ｎＭのＡＯＮでトランスフェクトして、トランスフェクション２４時間後のＲＮＡを抽出して、β鎖のｍＲＮＡ発現レベルを定量した。ｍＲＮＡ発現レベルは、正規化比β鎖／β２Ｍの平均±ＳＤとして示す。統計的な分析を、負のコントロールであるオリゴヌクレオチドＴＯＰ４００５（配列番号１７８４）に対して１元ＡＮＯＶＡを用いて行った；＊＊ｐ＜０．０１，ｎ＝３。
【図１５】図１５は、β鎖ｍＲＮＡおよびタンパク質発現のレベルの低下での選択されたｍｉＲＮＡミミック配列ＴＯＰ５１２０（配列番号：１６３６および１６３７）、ＴＯＰ５１２１（配列番号：１６３８および１６３９）、ＴＯＰ５１２２（配列番号：１６４０および１６４１）、ＴＯＰ０５１２３（配列番号：１６４２および１６４３）およびＴＯＰ５１２４（配列番号：１６４４および１６４５）の有効性を示す。ＴＦ−１細胞を、０．５または１μＭのｍｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後の発現レベルを決定した。図１５ａおよび図１５ｂは、それぞれβ鎖のｍＲＮＡ発現およびタンパク質発現のレベルの低下でのｍｉＲＮＡ模倣配列の有効性の比較を示す。ｍＲＮＡ発現レベルの結果は、正規化比β鎖／β２Ｍの平均±ＳＤとして示す（図１５ａ）が、タンパク質発現の結果は、β鎖タンパク質を発現する細胞の平均割合±ＳＤとして示される（図１５ｂ）。統計的分析は、未処理の細胞（コントロールＮＴ）に対して１元ＡＮＯＶＡを用いて行った；＊＊  ｐ＜０．０１，ｎ＝３−６。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
表の簡単な説明
表１ａ−１ｒは、本発明によるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット（β鎖）に特異性を有するＡＯＮ配列を示す。
【００６５】
表１ｓは、本発明によるＣＣＲ３ケモカインレセプターに対する特異性を有するＡＯＮ配列を示す。
【００６６】
表２ａ−２ｓは、本発明によるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット（β鎖）に対してデザインされたｓｉＲＮＡ配列を示す。
【００６７】
表２ｔは、本発明によるＣＣ３ケモカインレセプターに対してデザインされたｓｉＲＮＡを示す。
【００６８】
表３ａは、本発明によるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット（β鎖）に対する特異性を有するＦＡＮＡ修飾を含むＡＯＮ配列を示す。
【００６９】
表３ｂは、本発明によるＣＣＲ３ケモカインレセプターに対する特異性を有するＦＡＮＡ修飾を有するＡＯＮ配列を示す。
【００７０】
表３ｃは、本発明によるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット（β鎖）に対する特異性を有するＤＡＰ修飾を含むＡＯＮ配列を示す。
【００７１】
表４は、本発明によるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターのラットの共通のβサブユニット（β鎖）ならびにラットＣＣＲ３ケモカインレセプターに対する特異性を有するＡＯＮ配列を示す。
【００７２】
表５は、２’Ｆ−ＡＮＡ修飾ＡＯＮ類（ＴＰＩ１１００）または非２’Ｆ−ＡＮＡ修飾ＡＯＮ類（ＴＰＩＡＳＭ８）で処置されたサルの肺における主な処置関連の組織病理学的変化を示す。
【００７３】
表６は、ＡＯＮ配列ＴＰＩ１１００およびＴＰＩＡＳＭ８を示す。
【００７４】
表７ａ−７ｄは、本発明によるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット（β鎖）に対する特異性を有するｍｉＲＮＡミミック配列を示す。
【００７５】
表８は、その各々が、実験に依存する方法でコントロールとして用いられる、センスオリゴヌクレオチド配列ＴＯＰ０５７ｓ（配列番号：１７７９）、ＴＯＰ０６２ｓ（配列番号：１７８０）、ＴＯＰ０６３ｓ（配列番号：１７８１）、ＴＯＰ０３０ｓ（配列番号：１７８２）、およびＴＯＰ０３１ｓ（配列番号：１７８３）、ならびに非特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列ＴＯＰ４００５（配列番号：１７８４）を示す。
【００７６】
発明の詳細な説明
いくつかの炎症性メディエータ類は、喘息のある患者の気道において、炎症の出現および永続化にある役割を果たしている。いくつかのメディエータ類は、好酸球の走化性を通じて気道中に炎症性細胞を誘引する。これらのケモカイン類の多くは主として、ＣＣＲ３レセプターを通じて喘息性炎症またはアレルギー性炎症において作用する。ＩＬ−３、ＩＬ−５、およびＧＭ−ＣＳＦなどの他のメディエータ類は、気道または皮膚における炎症性細胞のプライミングをおよび生存の増大を引き起こす。気道中のこれらの炎症性メディエータ類が減少する場合、喘息の改善が示された。
【００７７】
さらに、不死化細胞の異常増殖により特徴づけられる癌は、レセプターを通して作用して細胞増殖を引き起こす、炎症性メディエータ類および／または成長因子の放出により、引き起こされる場合がある。これらの中でも、ＧＭ−ＣＳＦは、いくつかの腫瘍細胞にとっての重要な成長因子であることが示されている。ケモカインレセプターＣＣＲ３は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有し、かつヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）を有する患者から回収された悪性Ｂリンパ球に特徴的であった（Ｔｒｅｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｌｏｏｄ，１０４，５０２〜５０８）。実際、ＣＣＲ３を通じたＥＧＦＲのトランス活性化は、気管上皮細胞におけるＭＡＰキナーゼ活性化およびサイトカイン産生を引き起こす重要な経路であることが見いだされた（Ａｄａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３２０，２９２〜３９６）。成長因子またはケモカインレセプターＣＣＲ３についてのレセプターをブロックすることによる癌性細胞の増殖および転移の抑制は、特定のガンの治療において重要である場合がある。
【００７８】
本発明の一態様は、ｉ）配列番号１から６９８のうちのいずれか１つに対応する塩基配列を有し、かつ（ｉｉ）配列番号１から６９８のいずれか１つの修飾オリゴヌクレオチド、のうちの１つである、ＣＣＲ３ケモカインレセプターならびにＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニットからなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸配列に対するオリゴヌクレオチドである。
【００７９】
好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは配列番号１から６９８のいずれか１つに対応する塩基配列を有し、好ましくは配列番号１から６９８のいずれか１つのオリゴヌクレオチドである。
【００８０】
好ましくは、少なくとも１つのアデノシンは、２−アミノ−２’−デオキシアデノシンおよびアナログからなる群より選択されるヌクレオチド置換基で置換される。好ましくは、２−アミノ−２’−デオキシアデノシン類縁体としては、２，６−ジアミノ−デオキシアデノシンヘミ硫酸塩、２−アミノ−９−（β−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシル）アデノシン、７−デアザ−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６−メチル−２’−デオキシリボフラノシルアデノシン、２−アミノアデノシン／２，６−ジアミノプリンリボシド、塩およびその官能性誘導体が挙げられる。
【００８１】
好ましくは、上記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドは、アラビノース修飾ヌクレオチドであり、好ましくは、フッ素、ヒドロキシル、アミノ、アジド、アルキル、アルコキシ、およびアルコキシアルキル基からなる群より選択される２’置換基を有する。好ましくは、このアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、および官能性アルキル基類からなる群より選択され、このアルコキシ基は、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよび官能性アルコキシ基類からなる群より選択され、このアルコキシアルキル基はメトキシエチル、およびエトキシエチルからなる群より選択される。
【００８２】
好ましくは、上記官能性アルキル基は、エチルアミノ、プロピルアミノおよびブチルアミノ基からなる群より選択され、この官能性アルコキシ基は−Ｏ（ＣＨ２）ｑ−Ｒからなる群より選択され、ここでｑ＝２〜４であり、かつ−Ｒは−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、または−ＯＣＨ２ＣＨ３基である。
【００８３】
好ましくは、上記アラビノース修飾ヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つのアラビノース修飾ヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端；またはその両方の末端である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端で独立して１〜７個のアラビノース修飾ヌクレオチドを有する。好ましくは、このオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端に独立して１〜６、１〜５、１〜４または１〜３個のアラビノース修飾ヌクレオチドがある。
【００８６】
いくつかの実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロチオエート、メチルホスホネート，ボラノホスホネートおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのヌクレオチド間結合を含む。好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはリン酸ジエステルオリゴヌクレオチド、またはホスホロチオエートおよびホリン酸エステル結合の組み合わせを有するオリゴヌクレオチドである。
【００８７】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。
【００８８】
本発明のさらなる態様は、患者に対して本明細書に記載される薬学的組成物を投与する工程を含み、患者における喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための方法である。
【００８９】
本発明のさらなる態様は、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための本明細書に記載の薬学的組成物の用途である。
【００９０】
本発明のさらなる態様は、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための薬剤の調製における本明細書に記載の薬学的組成物の用途である。
【００９１】
本発明のさらなる態様は、患者に対して本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包み、該オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する、患者におけるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための方法である。
【００９２】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニットの発現を低下するための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの用途である。
【００９３】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニットの発現を低下させる薬剤の調製における、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの用途である。
【００９４】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニットの発現を低下させための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号１から６７２のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドである。
【００９５】
本発明のさらなる態様は、塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを投与する工程を包む、患者におけるＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下するための方法である。
【００９６】
本発明のさらなる態様は、ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下するための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの用途でる。
【００９７】
本発明のさらなる態様は、ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させる薬剤の調製における、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３〜６９８のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの用途である。
【００９８】
本発明のさらなる態様は、ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるための、オリゴヌクレオチドの塩基配列が配列番号６７３から６９８のうちの１つを有する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドである。
【００９９】
本発明のさらなる態様は、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための；患者におけるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための（配列番号１から６７２のうちの１つを有するオリゴヌクレオチドの塩基配列）；患者においてＣＣＲケモカインレセプター発現を低下させための（配列番号６７３から６９８のうちの１つを有するオリゴヌクレオチドの塩基配列）、本明細書に記載の薬学的組成物をその使用方法の説明書と一緒に備える商業的パッケージである。
【０１００】
本発明のさらなる態様は２本の鎖が、好ましくは、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるために、配列番号６９９および７００；７０１および７０２；７０３および７０４；７０５および７０６；７０７および７０８；７０９および７１０；７１１および７１２；７１３および７１４；７１５および７１６；７１７および７１８；７１９および７２０；７２１および７２２；７２３および７２４；７２５および７２６；７２７および７２８；７２９および７３０；７３１および７３２；７３３および７３４；７３５および７３６；７３７および７３８；７３９および７４０；７４１および７４２；７４３および７４４；７４５および７４６；７４７および７４８；７４９および７５０；７５２および７５２；７５３および７５４；７５５および７５６；７５７および７５８；７５９および７６０；７６１および７６２；７６３および７６４；７６５および７６６；７６７および７６８；７６９および７７０；７７１および７７２；７７３および７７４；７７５および７７６；７７７および７７８；７７９および７８０；７８１および７８２；７８３および７８４；７８５および７８６；７８７および７８８；７８９および７９０；７９１および７９２；７９３および７９４；７９５および７９６；７９７および７９８；７９９および８００；８０１および８０２；８０３および８０４；８０５および８０６；８０７および８０８；８０９および８１０；８１１および８１２；８１３および８１４；８１５および８１６；８１７および８１８；８１９および８２０；８２１および８２２；８２３および８２４；８２５および８２６；８２７および８２８；８２９および８３０；８３１および８３２；８３３および８３４；８３５および８３６；８３７および８３８；８３９および８４０；８４１および８４２；８４３および８４４；８４５および８４６；８４７および８４８；８４９および８５０；８５１および８５２；８５３および８５４；８５５および８５６；８５７および８５８；８５９および８６０；８６１および８６２；８６３および８６４；８６５および８６６；８６７および８６８；８６９および８７０；８７１および８７２；８７３および８７４；８７５および８７６；８７７および８７８；８７９および８８０；８８１および８８２；８８３および８８４；８８５および８８６；８８７および８８８；８８９および８９０；８９１および８９２；８９３および８９４；８９５および８９６；８９７および８９８；８９９および９００；９０１および９０２；９０３および９０４；９０５および９０６；９０７および９０８；９０９および９１０；９１１および９１２；９１３および９１４；９１５および９１６；９１７および９１８；９１９および９２０；９２１および９２２；９２３および９２４；９２５および９２６；９２７および９２８；９２９および９３０；９３１および９３２；９３３および９３４；９３５および９３６；９３７および９３８；９３９および９４０；９４１および９４２；９４３および９４４；９４５および９４６；９４７および９４８；９４９および９５０；９５１および９５２；９５３および９５４；９５５および９５６；９５���および９５８；９５９および９６０；９６１および９６２；９６３および９６４；９６５および９６６；９６７および９６８；９６９および９７０；９７１および９７２；９７３および９７４；９７５および９７６；９７７および９７８；９７９および９８０；９８１および９８２；９８３および９８４；９８５および９８６；９８７および９８８；９８９および９９０；９９１および９９２；９９３および９９４；９９５および９９６；９９７および９９８；９９９および１０００；１００１および１００２；１００３および１００４；１００５および１００６；１００７および１００８；１００９および１０１０；１０１１および１０１２；１０１３および１０１４；１０１５および１０１６；１０１７および１０１８；１０１９および１０２０；１０２１および１０２２；１０２３および１０２４；１０２５および１０２６；１０２７および１０２８；１０２９および１０３０；１０３１および１０３２；１０３３および１０３４；１０３５および１０３６；１０３７および１０３８；１０３９および１０４０；１０４１および１０４２；１０４３および１０４４；１０４５および１０４６；１０４７および１０４８；１０４９および１０５０；１０５１および１０５２；１０５３および１０５４；１０５５および１０５６；１０５７および１０５８；１０５９および１０６０；１０６１および１０６２；１０６３および１０６４；１０６５および１０６６；１０６７および１０６８；１０６９および１０７０；１０７１および１０７２；１０７３および１０７４；１０７５および１０７６；１０７７および１０７８；１０７９および１０８０；１０８１および１０８２；１０８３および１０８４；１０８５および１０８６；１０８７および１０８８；１０８９および１０９０；１０９１および１０９２；１０９３および１０９４；１０９５および１０９６；１０９７および１０９８；１０９９および１１００；１１０１および１１０２；１１０３および１１０４；１１０５および１１０６；１１０７および１１０８；１１０９および１１１０；１１１１および１１１２；１１１３および１１１４；１１１５および１１１６；１１１７および１１１８；１１１９および１１２０；１１２１および１１２２；１１２３および１１２４；１１２５および１１２６；１１２７および１１２８；１１２９および１１３０；１１３１および１１３２；１１３３および１１３４；１１３５および１１３６；１１３７および１１３８；１１３９および１１４０；１１４１および１１４２；１１４３および１１４４；１１４５および１１４６；１１４７および１１４８；１１４９および１１５０；１１５１および１１５２；１１５３および１１５４；１１５５および１１５６；１１５７および１１５８；１１５９および１１６０；１１６１および１１６２；１１６３および１１６４；１１６５および１１６６；１１６７および１１６８；１１６９および１１７０；１１７１および１１７２；１１７３および１１７４；１１７５および１１７６；１１７７および１１７８；１１７９および１１８０；１１８１および１１８２；１１８３および１１８４；１１８５および１１８６；１１８７および１１８８；１１８９および１１９０；１１９１およ���１１９２；１１９３および１１９４；１１９５および１１９６；１１９７および１１９８；１１９９および１２００；１２０１および１２０２；１２０３および１２０４；１２０５および１２０６；１２０７および１２０８；１２０９および１２１０；１２１１および１２１２；１２１３および１２１４；１２１５および１２１６；１２１７および１２１８；１２１９および１２２０；１２２１および１２２２；１２２３および１２２４；１２２５および１２２６；１２２７および１２２８；１２２９および１２３０；１２３１および１２３２；１２３３および１２３４；１２３５および１２３６；１２３７および１２３８；１２３９および１２４０；１２４１および１２４２；１２４３および１２４４；１２４５および１２４６；１２４７および１２４８；１２４９および１２５０；１２５１および１２５２；１２５３および１２５４；１２５５および１２５６；１２５７および１２５８；１２５９および１２６０；１２６１および１２６２；１２６３および１２６４；１２６５および１２６６；１２６７および１２６８；１２６９および１２７０；１２７１および１２７２；１２７３および１２７４；１２７５および１２７６；１２７７および１２７８；１２７９および１２８０；１２８１および１２８２；１２８３および１２８４；１２８５および１２８６；１２８７および１２８８；１２８９および１２９０；１２９１および１２９２；１２９３および１２９４；１２９５および１２９６；１２９７および１２９８；１２９９および１３００；１３０１および１３０２；１３０３および１３０４；１３０５および１３０６；１３０７および１３０８；１３０９および１３１０；１３１１および１３１２；１３１３および１３１４；１３１５および１３１６；１３１７および１３１８；１３１９および１３２０；１３２１および１３２２；１３２３および１３２４；１３２５および１３２６；１３２７および１３２８；１３２９および１３３０；１３３１および１３３２；１３３３および１３３４；１３３５および１３３６；１３３７および１３３８；１３３９および１３４０；１３４１および１３４２；１３４３および１３４４；１３４５および１３４６；１３４７および１３４８；１３４９および１３５０；１３５１および１３５２；１３５３および１３５４；１３５５および１３５６；１３５７および１３５８；１３５９および１３６０；１３６１および１３６２；１３６３および１３６４；１３６５および１３６６；１３６７および１３６８；１３６９および１３７０；１３７１および１３７２；１３７３および１３７４；１３７５および１３７６；１３７７および１３７８；１３７９および１３８０；１３８１および１３８２；１３８３および１３８４；１３８５および１３８６；１３８７および１３８８；１３８９および１３９０；１３９１および１３９２；１３９３および１３９４；１３９５および１３９６；１３９７および１３９８；１３９９および１４００；１４０１および１４０２；１４０３および１４０４；１４０５および１４０６；１４０７および１４０８；１４０９および１４１０；１４１１および１４１２；１４１３および１４１４；１４１５および１４１６；１４１７および１４１８；１４１���および１４２０；１４２１および１４２２；１４２３および１４２４；１４２５および１４２６；１４２７および１４２８；１４２９および１４３０；１４３１および１４３２；１４３３および１４３４；１４３５および１４３６；１４３７および１４３８；１４３９および１４４０；１４４１および１４４２；１４４３および１４４４；１４４５および１４４６；１４４７および１４４８；１４４９および１４５０；１４５１および１４５２；１４５３および１４５４；１４５５および１４５６；１４５７および１４５８；１４５９および１４６０；１４６１および１４６２；１４６３および１４６４；１４６５および１４６６；１４６７および１４６８；１４６９および１４７０；１４７１および１４７２；１４７３および１４７４；１４７５および１４７６；１４７７および１４７８；１４７９および１４８０；１４８１および１４８２；１４８３および１４８４；１４８５および１４８６；１４８７および１４８８；１４８９および１４９０；１４９１および１４９２
；１４９３および１４９４；１４９５および１４９６；１４９７および１４９８；１４９９および１５００ ；１５０１および１５０２；１５０３および１５０４；１５０５および１５０６；１５０７および１５０８
；１５０９および１５１０；１５１１および１５１２；１５１３および１５１４；１５１５および１５１６ ；１５１７および１５１８；１５１９および１５２０；１５２１および１５２２；１５２３および１５２４
；１５２５および１５２６；１５２７および１５２８；１５２９および１５３０；１５３１および１５３２ ；１５３３および１５３４；１５３５および１５３６；１５３７および１５３８；１５３９および１５４０
；１５４１および１５４２；１５４３および１５４４；１５４５および１５４６；１５４７および１５４８ ；１５４９および１５５０；１５５１および１５５２；１５５３および１５５４；１５５５および１５５６
；１５５７および１５５８；１５５９および１５６０；１５６１および１５６２；１５６３および１５６４ ；１５６５および１５６６；１５６７および１５６８；１５６９および１５７０；ならびに１５７１および１５７２のうちの１対を含む、二本鎖ｓｉＲＮＡである。
【０１０１】
本発明のさらなる態様は、２本の鎖が、好ましくは、ＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるため、配列番号１５７３および１５７４；１５７５および１５７６；ならびに１５７７および１５７８のうちの１対を含む、二本鎖ｓｉＲＮＡである。
【０１０２】
本発明のさらなる態様は、上記ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドがＦＡＮＡである、本明細書に記載のｓｉＲＮＡである。
【０１０３】
本発明のさらなる態様は、上記ｓｉＲＮＡの少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドがＤＡＰまたはその類縁体で置換されている本明細書に記載のｓｉＲＮＡである。
【０１０４】
本発明のさらなる態様は、喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための本明細書に記載のｓｉＲＮＡである。
【０１０５】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のｓｉＲＮＡを投与する工程を包む、患者におけるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための方法である。
【０１０６】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のｓｉＲＮＡを投与する工程を包む、患者におけるＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるための方法である。
【０１０７】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のｓｉＲＮＡを投与する工程を包む、患者における喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための方法である。
【０１０８】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現もしくはＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下させるため、または喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／もしくは予防するための本明細書に記載のｓｉＲＮＡの用途である。
【０１０９】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるため；またはＣＣＲ３ケモカインレセプター発現を低下するため；または喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／もしくは予防するための薬剤の調製における本明細書に記載のｓｉＲＮＡの用途である。
【０１１０】
本発明のさらなる態様は、好ましくはＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるために、配列番号：１６３４および１６３５；１６３６および１６３７；１６３８および１６３９；１６４０および１６４１；１６４２および１６４３；１６４４および１６４５；１６４６および１６４７；１６４８；１６４９および１６５０；１６５１および１６５２；１６５３および１６５４；１６５５および１６５６；１６５７および１６５８；１６５９；１６６０；１６６１；１６６２；１６６３；１６６４；１６６５；１６６６および１６６７；１６６８および１６６９；１６７０および１６７１；１６７２および１６７３；１６７４および１６７５；１６７６および１６７７；１６７８；１６７９および１６８０；１６８１および１６８２；１６８３および１６８４；１６８５および１６８６；１６８７および１６８８；１６８９および１６９０；１６９１および１６９２；１６９３；１６９４；１６９５および１６９６；１６９７；１６９８；１６９９および１７００；１７０１；１７０２および１７０３；１７０４；１７０５；１７０６；１７０７；１７０８；１７０９；１７１０；１７１１；１７１２および１７１３；１７１４および１７１５；１７１６；１７１７および１７１８；１７１９；１７２０および１７２１；１７２２および１７２３；１７２４；１７２５および１７２６；１７２７；１７２８；１７２９および１７３０；１７３１および１７３２；１７３３および１７３４；１７３５；１７３６；１７３７；１７３８および１７３９；１７４０および１７４１；１７４２；１７４３および１７４４；１７４５；１７４６および１７４７；１７４８および１７４９；１７５０および１７５１；１７５２；１７５３；１７５４；１７５５；１７５６；１７５７；１７５８；１７５９；１７６０；１７６１および１７６２；１７６３；１７６４および１７６５；１７６６；１７６７および１７６８；１７６９；１７７０；１７７１；１７７２；１７７３；１７７４および１７７５；１７７６；１７７７；および１７７８からなる群より選択される１対のオリゴヌクレオチドまたは１つのオリゴヌクレオチドを含む、二本鎖または一本鎖のｍｉＲＮＡである。
【０１１１】
本発明のさらなる態様は、ｍｉＲＮＡの少なくとも１つのヌクレオチドがＦＡＮＡである、本明細書に記載のｍｉＲＮＡである。
【０１１２】
本発明のさらなる態様は、ｍｉＲＮＡの少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドがＤＡＰまたはその類縁体で置換されている、本明細書に記載のｍｉＲＮＡである。
【０１１３】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のｍｉＲＮＡを投与する工程を包む、患者におけるＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための方法である。
【０１１４】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のｍｉＲＮＡを投与する工程を包含む、患者における喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための方法である。
【０１１５】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるため、あるいは喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための、本明細書に記載のｍｉＲＮＡの用途である。
【０１１６】
本発明のさらなる態様は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット発現を低下させるための；あるいは喘息、ＣＯＰＤ、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症および癌のうちの少なくとも１つを治療および／または予防するための薬剤の調製における、本明細書に記載のｍｉＲＮＡの用途である。
【０１１７】
本発明のさらなる態様は、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つのヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロアラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）であり、ＣＣＲケモカインレセプターならびにＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニットからなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＡＯＮである。
【０１１８】
本発明のさらなる態様は、オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドが２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン（ＤＡＰ）で置換されている、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のサブユニットのタンパク質をコードする核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＡＯＮである。
【０１１９】
本発明のさらなる態様は、（ａ）肺および低い毒性が求められている部位に対する投与用のオリゴヌクレオチドを特定する工程と；（ｂ）少なくとも１つの非ＦＡＮＡヌクレオチドを対応するＦＡＮＡヌクレオチドで置き換える工程、および／または少なくとも１つのアデノシンヌクレオチドを２−アミノ−２’−デオキシアデノシン（ＤＡＰ）で置換する工程とを包む、哺乳動物に対して投与されるオリゴヌクレオチドの治療有効性対毒性比を改善するための方法である。好ましくは、哺乳動物に対するこの得られたオリゴヌクレオチドの投与は、未修飾のオリゴヌクレオチドの投与に比較してオリゴヌクレオチドの力価の増強および／または毒性の低下を生じる。
【０１２０】
本発明のさらなる態様は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合がリン酸ジエステル結合およびホスホロチオエート結合の両方を含み、ＣＣＲ３ケモカインレセプター、ならびにＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニットからなる群より選択されるタンパク質をコードする核酸配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＡＯＮである。
【０１２１】
従って、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通βサブユニット、ならびにＣＣＲ３レセプターに対するＡＯＮ、ならびにそれらをコードする核酸に対するＡＯＮが提供される。オリゴヌクレオチドを薬学的に許容される担体とともに含む薬学的組成物もまた、提供される。オリゴヌクレオチドの用途、ならびに喘息、アレルギー、ＣＦ、過好酸球増大症、炎症、および癌の少なくとも１つを治療および／または予防するためにオリゴヌクレオチドを投与する工程を包む方法が、記載される。
【０１２２】
「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書中では交換可能に使用され、ヌクレオチドからなる分子、すなわちリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその両方のことを指す。この用語には、ポリマーの場合には、５’から３’への結合を通じて互いに連結されている、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドとのモノマーおよびポリマーが包含される。しかしながら、結合には、例えば、５’から２’への結合を含む核酸を含む、核酸合成技術において公知の任意の結合が含まれ得る。核酸分子中で用いられるヌクレオチドは、天然に存在するものであってもよいし、または天然に存在する塩基対と塩基対合関係を形成し得る合成的に生成された類縁体であってもよい。
【０１２３】
「塩基」としては、天然に存在するプリンおよびピリミジン塩基、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）のうちのいずれか１つが挙げられるが、またその任意の修飾型または類縁型も挙げられる。塩基対を形成することができる天然には存在しない塩基の例としては、限定するものではないが、アザおよびデアザピリミジンのアナログ、アザおよびデアザプリンの類縁体、ならびに他の複素環式塩基アナログであって、プリン環およびピリミジン環の１つ以上の原子および／または官能基がヘテロ原子、例えば、炭素、フッ素、窒素、酸素、硫黄などによって置換されているものが挙げられる。好ましくは、このような塩基としては、イノシン、５−メチルシトシン、２−チオチミン、４−チオチミン、７−デアザアデニン、９−デアザアデニン、３−デアザアデニン、７−デアザグアニン、９−デアザグアニン、６−チオグアニン、イソグアニン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、および６−チオヒポキサンチンが挙げられるが、これらに限定されない。塩基としてはまた、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、イソシトシン、Ｎ４−メチルシトシン、５−ヨードウラシル、５−フルオロウラシル、４−チオウラシル、２−チオウラシル、（Ｅ）−５−（２−ブロモビニル）ウラシル、Ｎ６−メチルアデニン、２−クロロアデニン、２−フルオロアデニン、２−クロロアデニン、Ｎ６−シクロプロピル−２，６−ジアミノプリン、ニコチンアミド、２−アミノプリン、１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミドを挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１２４】
本明細書中で用いる場合、「核酸骨格」という用語は、分子中のヌクレオチドを連結する化学的部分の構造のことをいう。この構造としては、化学的に結合したヌクレオチドの任意のかつ全ての手段から形成された構造を挙げることができる。本明細書中で用いる場合、修飾骨格としては、ヌクレオチド間の化学的結合に対する修飾、ならびに安定性および親和性を向上させるために用いられ得る他の修飾、例えば、糖構造に対する修飾が挙げられる。例えば、天然のβ−アノマーに関して塩基が反転している、デオキシリボースのα−アノマーを用いてもよい。好ましい実施形態において、糖の２’−ＯＨを、親和性を含むことなく分解に対する抵抗性を提供する、２’−Ｏ−アルキル、Ｒ−およびＳ−固定の２’−Ｏ−メチル（Ｒ−ｃＭＯＥおよびＳ−ｃＭＯＥ）または２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）に変更してもよい。
【０１２５】
本明細書中で用いる場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、約１から約１００ヌクレオチド、より好ましくは１から８０ヌクレオチド、そしてさらにより好ましくは約４から約３５ヌクレオチドを含む核酸分子のことをいう。この核酸分子は、センス鎖、または標的核酸配列の非コード鎖のいずれかに対して対応する可変長の核酸分子を含み得る。
【０１２６】
本発明におけるオリゴヌクレオチド化合物には、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、およびＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）アプローチの結果として生じる、ｓｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ（ＲＮＡ−誘導性サイレンシング複合体）もまた、含まれる。ＲＮＡｉアプローチは、最近記述されたものであるが、標的遺伝子の発現を阻害するための新たなツールと考えられている。数年前にすでに知られているように、ＲＮＡｉは、下等真核生物における古くから知られている抗ウィルス防御機構に基づくものである。二本鎖ＲＮＡおよびそのプロセッシングにより典型的には２１から２３残基のｓｉＲＮＡが誘導されて、それがＲＩＳＣ複合体の補助を伴う一本鎖で標的ｍＲＮＡにハイブリダイズした後、相同な内在性ｍＲＮＡの分解を引き起こす。ＲＮＡｉが標的遺伝子発現を阻害する方法は、完全に解明された訳ではないが、すでにＲＮＡｉは線虫、ハエ、植物、真菌、および哺乳動物などの幅広く多様な真核生物種にまたがって機能欠損表現型を生成するために、最初に選択されるアプローチとして役立っている。
【０１２７】
本発明におけるオリゴヌクレオチド化合物としてはまた、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）も挙げられる。マイクロＲＮＡは、典型的には約２１から２３ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡ分子であり、ハイブリダイゼーションに依存した形で遺伝子発現を調節する。典型的には、ｍｉＲＮＡはＤＮＡから転写されるが、タンパク質には翻訳されない遺伝子（非コードＲＮＡ）によってコードされ；代わりにｍｉＲＮＡはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして公知の一次転写物から、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステム−ループ構造に、最終的には機能的なｍｉＲＮＡに処理される。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１つ以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子に対して、代表的にはそのｍＲＮＡの３’末端で部分的に相補的であり、それらの主な機能は遺伝子発現を下方制御することである。
【０１２８】
本発明におけるオリゴヌクレオチド化合物としてはまた、遺伝子転写および／または遺伝子翻訳をインビトロおよび／またはインビボで阻害することができる、上述した化学的修飾を組み込み得る、リボザイムおよび短いヌクレオチド配列、一本鎖または二本鎖の、ＲＮＡまたはＤＮＡが挙げられる。
【０１２９】
「修飾オリゴヌクレオチド」および「修飾核酸分子」という用語には、例えば、１つ以上の塩基の挿入、置換または欠失によって、それらの活性に対して有意な悪影響を与えることなく修飾されているオリゴヌクレオチド化合物が包含される。特に、オリゴヌクレオチドが対する遺伝子に対して１００％の相補性を示すオリゴヌクレオチドの末端で塩基を付加または欠失させることは一般に、阻害活性を有意に喪失することなく、行うことができる。このような修飾は、活性を増強するため、またはオリゴヌクレオチドの安定性の向上を得るためになされる場合がある。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド化合物における１つ以上の塩基の置換は、活性に有害な影響を与えることなく、例えば、プリンを別のプリン（アデニン、グアニン）で置換すること、およびピリミジンをピリミジン（シトシン、チミン、ウラシル）で置換することで行うことができる。本明細書中で用いる場合、修飾オリゴヌクレオチドおよび修飾核酸分子としてはまた、核酸、例としては、核酸塩基、糖部分、ヌクレオシド間リン酸結合のすべてまたはいずれかの天然の分子構造の分子レベルで、１つ以上の化学的修飾を有するオリゴヌクレオチド、ならびに、追加的な置換基、例えば、ジアミン、コレステリル、もしくは他の親油性の基またはこれらの部位で修飾の組み合わせを有する分子が挙げられる。修飾されたヌクレオチドとしては、２−アミノ−２’−デオキシアデノシンおよびアナログからなる群より選択されるヌクレオチド置換を挙げることができる。好ましいアデノシンアナログとしては、２，６−ジアミノアデノシンヘミ硫酸塩、２−アミノ−９−（β−Ｄ−２’−デオキシリボフラノシル）アデノシン、７−デアザ−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６−メチル−２’−デオキシリボフラノシルアデノシン、２−アミノアデノシン／２，６−ジアミノプリンリボシド、塩およびその官能性誘導体が挙げられる。ヌクレオシド間リン酸結合は、リン酸ジエステル、リン酸トリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホラニデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｄａｔｅ）、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエートおよび／またはスルホンヌクレオチド間結合、または３’−３’結合、２’−５’結合、または５’−５’結合、およびそのような類似の結合の組み合わせ（混合骨格修飾オリゴヌクレオチドを生成するためのもの）であってもよい。修飾は、内部に（単一または繰り返し）、またはオリゴヌクレオチド分子の末端（単数または複数）であってもよく、そしてアミノ基と末端リボース、デオキシリボースおよびリン酸修飾（反対側の鎖または関連する酵素もしくは他のタンパク質を切断するかまたは架橋する）との間に様々な数の炭素残基を有するコレステリル、ジアミン化合物などの、ヌクレオシド間リン酸結合の分子への付加を含んでもよい。リボース−ジアルデヒドなどの親電子基は、そのようなタンパク質のリシル残基のイプシロンアミノ基と共有結合することができる。オリゴマーに対して連結されたｎ−エチルマレイミドなど���求核性基は、ｍＲＮＡの５’末端に対して、または別の求電子性部位に対して共有結合し得る。修飾オリゴヌクレオチドという用語はまた、いずれも５’−３’結合を介して互いに連結されている、２置換したリボヌクレオチド、またはデオキシリボヌクレオチドモノマーなどの糖部分に対する修飾を含むオリゴヌクレオチドを包含する。修飾オリゴヌクレオチドはまた、配列の標的特異性を維持しているＰＮＡまたはモルホリノ修飾骨格から構成されてもよい。修飾オリゴヌクレオチドという用語はまた、標的タンパク質の活性を低下させる活性にも、またはその発現を阻害する活性にも有意に悪影響を与えないが、この活性を向上し得るという形態の本明細書に規定されるようなオリゴヌクレオチド化合物を包含する。
【０１３０】
修飾オリゴヌクレオチドとしてはまた、、アラビノヌクレオチドまたは修飾アラビノヌクレオチド残基に基づくかまたはそれから構築されるオリゴヌクレオチドが挙げられ、β−アラビノフラノースおよびその類縁体に基づくＡＯＮ構築物を含むがこれらに限定されない。リボヌクレオチドは、糖環の２’位置における構造のみが異なるリボヌクレオシドの立体異性体である。国際公開第９９／６７３７８号パンフレットは、相補的メッセンジャーＲＮＡへの結合を介して、遺伝子発現の配列特異性阻害を改善するための、アラビノ核酸（ＡＮＡ）オリゴマーおよびそのアナログを開示する。国際公開第９９／６７３７８号パンフレットはさらに、その標的ＲＮＡ配列と二重鎖を形成し、その結果ＲＮａｓｅ  Ｈのための基質を生じる、糖修飾したオリゴヌクレオチドを教示する。具体的には、β−Ｄ−アラビノヌクレオチドおよび２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオシド（ＦＡＮＡまたは２’Ｆ−ＡＮＡ）を含むオリゴマーが開示されている。国際公開第０２／２０７７３号パンフレットは、配列特異的様式で遺伝子転写および発現を阻害するために用いられるオリゴヌクレオチドキメラを開示する。具体的には、国際公開第０２／２０７７３号パンフレットは、様々な長さの一連のデオキシリボースヌクレオチド残基に隣接するアラビノヌクレオチドから構築されたＡＯＮ類を教示する。その様に構築されたＡＯＮ類を用いて、相補性ＲＮＡにハイブリダイズさせてその切断を誘導する。国際公開第０３／０３７９０９号パンフレットは、内部非環状リンカー残基を有するオリゴヌクレオチドを開示する。非環状リンカーを用いて調製されたＡＯＮ類を用いて、ＲＮＡなどの目的の標的核酸の機能を妨げるかまたは消費させる。国際公開第０３／０６４４４１号パンフレットは、糖修飾されたヌクレオシドのセグメントと２’デオキシヌクレオチドのセグメントとを交互に有するオリゴヌクレオチドを開示し、そしてまた糖修飾されたヌクレオチドのセグメントと２’デオキシヌクレオチドのセグメントとを交互に有するオリゴヌクレオチドも開示する。これらの交互に存在するセグメントを有するＡＯＮ類は、ＲＮＡなどの目的とする標的核酸の機能を妨げるかまたは消費させるために用いられることが開示されている。
【０１３１】
さらに、当業者は、本発明に包含される実質的に類似の核酸配列がまた、中程度にストリンジェントな条件（例えば、０．５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６０℃）下で、本明細書に例示される配列と、または本明細書に開示され、かつ本明細書に開示される任意の核酸配列に対して機能的に等価であるヌクレオチド配列の任意の部分に対してハイブリダイズするその核酸配列の能力によって規定されることを理解する。ストリンジェンシー条件は、関連が遠い生物由来の相同な配列などの中度に類似のフラグメントから密接に関連する生物体由来の機能的な酵素を複製する遺伝子などの高度に類似のフラグメントまで、スクリーニングするために調節されてもよい。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件のセットには、一連の洗浄を含み、これは６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを用いて室温で１５分間で開始し、次いで２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを用いて４５℃で３０分間繰り返し、次いで０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを用いて５０℃で３０分間を２回繰り返す。さらに好ましいセットの高度にストリンジェントな条件は、さらに高温での使用を包含し、ここでは洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での最後の２回の３０分洗浄の温度が６０℃に上昇されたことを除いて上記の洗浄と同じである。極めて高度にストリンジェントな条件の別の好ましいセットは、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で６５℃での２回の最終洗浄の使用を包含する。
【０１３２】
「実質的にヌクレアーゼ抵抗性」という用語は、天然に存在する核酸または未修飾核酸と比較した場合、ヌクレアーゼ分解に抵抗性を有する核酸のことをいう。本発明の修飾核酸は、それらの未修飾対応物と比較して、ヌクレアーゼ分解に対して少なくとも１．２５倍抵抗性が高く、より好ましくは少なくとも２倍抵抗性が高く、さらに好ましくは少なくとも５倍抵抗性が高く、最も好ましくは、それらの未修飾対応物と比較して、少なくとも１０倍抵抗性が高い。その様な実質的にヌクレアーゼ抵抗性の核酸としては、修飾骨格、例えばホスホロチオエート、メチルホスホネート、エチルホスホトリエステル、２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル−ｐ−エトキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）、３’−Ｏ−アルキル、３’−Ｏ−アルキル−ｎ（Ｏ−アルキル）、２’−フルオロ、２’−デオキシ−エリスロペントフラノシル、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド、Ｒ−およびＳ−固定２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド（Ｒ−ｃＭＯＥおよびＳ−ｃＭＯＥ）、メチルカルバメート、およびメチルカーボネート；逆位塩基（例えば、逆向きＴ）などの修飾塩基を有する核酸；または任意の上記のキメラを有する核酸が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３３】
本明細書において用いる場合、「ＣＣＲ３およびＩＬ−３／ＩＬ−５／ＧＭ−ＣＳＦレセプターについて共通のβ鎖のＡＯＮ」という用語は、ＣＣＲ３ケモカインレセプターに特異的な配列およびＩＬ−３／ＩＬ−５／ＧＭ−ＣＳＦ−レセプターの共通β鎖を標的とし、かつＣＣＲ３ならびにＩＬ−３／ＩＬ−５／ＧＭ−ＣＳＦ−レセプターの共通β鎖の発現および／または活性を阻害するオリゴヌクレオチドを指す。これらとしては、限定するものではないが、ＣＣＲ３ケモカインレセプターおよびＩＬ−３／ＩＬ−５／ＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通β鎖、ＤＮＡコード配列、ＤＮＡプロモータ配列、ＤＮＡエンハンサ配列、イントロン−エキソン接合部、５’および３’ＵＴＲ、ｍＲＮＡコード配列などが挙げられる。
【０１３４】
上で考察したように、本発明の一実施形態は、ＣＣＲ３ケモカインレセプターおよびＩＬ−３／ＩＬ−５／ＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通β鎖の発現および／または活性に影響を与える配列を標的とするＡＯＮを提供する。一実施形態において、このＡＯＮは、当業者によって理解されるように、オリゴヌクレオチドの構成および／または長さを変化させることができるが、オリゴヌクレオチドが遺伝子発現を下方制御する活性を維持しまたは増強させる、これらの配列のフラグメントまたは改変体を含んでもよい。別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される配列由来の少なくとも２つのＡＯＮの組合せを提供する。
【０１３５】
「治療、処置」、「治療、処置すること」、「療法」などの用語は、本明細書においては一般的に所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを意味するために用いられる。この効果は、疾患もしくはその症候を完全にまたは部分的に予防すると言う観点では予防的であってもよく、ならびに／または疾患について部分的もしくは完全に治癒させることおよび／もしくは疾患に起因する悪影響を改善すると言う観点では治療的であってもよい。本明細書において用いる場合、「治療」とは、既に定義した被験体、特に人における疾患のいずれの治療をもカバーし、これは以下が挙げられる：
（ａ）疾患に対する素因を有する可能性があるが、それを有するとは未だ診断されていない被験体において、疾患が生じないように予防すること；
（ｂ）疾患を抑制すること、すなわち、その発症を阻むこと；または
（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち疾患の退行を引き起こすこと。
【０１３６】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書において担体、サーファクタント、および組成物に関して用いられる場合、毒性ではない、またはそうでなければ本明細書において記載するいずれの経路によっても投与することが許容されない、被験患者の治療において使用するために許容される基質を意味する。
【０１３７】
本発明は一般的に、ｓｉＲＮＡ；ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡミミック；リボザイム；短いヌクレオチド配列（標的核酸に対して相補的であってもよいし、または上述したように必要に応じて修飾されていてもよいＲＮＡおよび／またはＤＮＡを含めて一本鎖または二本鎖）；ＲＮＡとハイブリダイズして、オリゴヌクレオチド−ＲＮＡ二重鎖を形成することができる、上記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を有するＲＮＡオリゴヌクレオチド；またはインビボで内在性遺伝子の発現を下方制御するかまたは阻害するキメラオリゴヌクレオチド、を含む、治療上有効量の本発明によるＡＯＮ化合物を投与することによる、被験体の治療に関する。
【０１３８】
「治療上有効な」量とは、非毒性であるが、所望の治療効果を得るために十分であるアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物の量を意味する。本発明の場合、ＡＯＮ化合物のその用量は、治療している状態または疾患、例えば、アレルギー、喘息、炎症性疾患、例えば炎症性呼吸器疾患の症状を救済するか、寛解するか、または予防するための量である。
【０１３９】
本明細書において用いる場合、「アレルギー」という用語は、過敏になっている物質に対する、身体による任意の望ましくない免疫応答を示す。
【０１４０】
本発明の製剤は、作用部位に対して直接的に投与することが好ましく、従って、限定するものではないが経口、頬内、肺内、直腸、子宮内、腫瘍内、鼻内、くも膜下（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、吸入、経皮、皮内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、イオントフォレーシス、眼、膣、関節内、耳内（ｏｔｉｃａｌ）、経粘膜、直腸、徐放性コーディング製剤、または腸溶性コーディング製剤を含めて、局所的であることが好ましい。上記は何ら制限するものではなく、本発明の製剤は頭蓋内、筋肉内、皮下、血管内、腺内、器官内、リンパ内、腹腔内、静脈内、および移植可能なものであってもよい。製剤中で用いられる担体は、例えば、固体担体および／または液体担体であってもよい。
【０１４１】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物と組み合わせて、呼吸器疾患を治療するために投与するのに適する組成物／製剤となるのに適切である他の担体については、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，第１７版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５を参照するのがよいであろう。
【０１４２】
必要に応じて、現在記載されるオリゴヌクレオチドを、様々な生理学的担体分子と共に製剤化してもよい。現在記載されるオリゴヌクレオチドはまた、標的細胞に進入する能力を向上させる分子と複合体化されてもよい。その様な分子の例としては、限定するものではないが、炭水化物類、ポリアミン類、アミノ酸類、ペプチド類、脂質類、および細胞増殖に重要な分子類が挙げられる。例えば、オリゴヌクレオチドは、脂質と組み合わされてもよく、得られたオリゴヌクレオチド／脂質エマルジョン、またはリポソーム懸濁液は、とりわけ、オリゴヌクレオチドのインビボ半減期を効果的に増大し得る。
【０１４３】
本明細書において提供される薬学的組成物は、上述のオリゴヌクレオチド化合物と１つ以上の薬学的に許容されるサーファクタントとを含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドの取り込みを増強するための適切なサーファクタントまたはサーファクタント成分は、米国特許出願公開第２００３／００８７８４５号に以前に記載されており、その内容はサーファクタントに対して本明細書中に援用される。この出願は、適切なサーファクタントは、「・・・サーファクタントタンパク質Ａ、サーファクタントタンパク質Ｂ、サーファクタントタンパク質Ｃ、サーファクタントタンパク質Ｄ、およびサーファクタントタンパク質Ｅ、二飽和ホスファチジルコリン（ジパルミトイル以外）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン；ホスファチジン酸、ユビキノン類、リソホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルコリン、パルミトイルリソホスファチジルコリン、デヒドロエピアンドロステロン、ドリコール類、スルファチジル酸（ｓｕｌｆａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、グリセロール−３−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセロール、グリセロ−３−ホスホコリン、ジヒドロキシアセトン、パルミテート、シチジンジホスフェート（ＣＤＰ）ジアシルグリセロール、ＣＤＰコリン、コリン、コリンリン酸；ならびにサーファクタントの成分についての天然の担体ビヒクルである天然および人工のラメラ構造、ω−３脂肪酸、ポリエニック酸、ポリエノイック酸、レシチン、パルミチン酸、エチレンまたはプロピレンオキシドの非−イオン性ブロックコポリマー、ポリオキシプロピレン、モノマーおよびポリマーのポリオキシエチレン、デキストランおよび／またはアルカノイル側鎖を有するモノマーおよびポリマーのポリ（ビニルアミン）、Ｂｒｉｊ  ３５（商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商標）および合成サーファクタントＡＬＥＣ（商標）、Ｅｘｏｓｕｒｆ（商標）、Ｓｕｒｖａｎ（商標）およびＡｔｏｖａｑｕｏｎｅ（商標）などの、合成および天然型、ならびに全長型および短縮型が挙げられる。これらのサーファクタントを、単一成分サーファクタントとしてまたは複数成分サーファクタントの一部として製剤中で用いてもよいし、あるいはＡＯＮの５’および／または３’末端に対して共有結合付加物として用いてもよい」ということを述べている。
【０１４４】
本発明の組成物のオリゴヌクレオチド成分は、リポソームまたは微結晶などの脂質粒子または小胞内の医薬製剤に含有させてもよい。米国特許第６，０２５，３３９号に記載されるように、脂質粒子は、オリゴヌクレオチドがその内部に含有される限り、単層または多層などの任意の適切な構造のものであってもよい。Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルスルフェート、すなわち「ＤＯＴＡＰ」などの正に荷電した脂質が、そのような粒子および小胞として特に好ましい。そのような脂質粒子の調製は、周知である。例えば、Ｊａｎｏｆｆらに対する米国特許第４，８８０，６３５号；Ｋｕｒｏｎｏらに対する米国特許第４，９０６，４７７号；Ｗａｌｌａｃｈに対する米国特許第４，９１１，９２８号；Ｗａｌｌａｃｈに対する米国特許第４，９１７，９５１号；Ａｌｌｅｎらに対する米国特許第４，９２０，０１６号；Ｗｈｅａｔｌｅｙらに対する米国特許第４，９２１，７５７号；などを参照のこと。
【０１４５】
本発明の組成物は、例えば肺などの、所望の部位に対してオリゴヌクレオチド化合物を輸送する任意の手段により投与することができる。本明細書中に開示されたオリゴヌクレオチド化合物は、任意の適した手段により患者の肺に対して投与してもよいが、オリゴヌクレオチド化合物を含む呼吸用の粒子からなるエアロゾルの吸入により投与することが好ましい。
【０１４６】
このオリゴヌクレオチドは、乾燥粉末吸入器、定量吸入器、ネブライザー、ソフト・ミスト（ｓｏｆｔ  ｍｉｓｔ）吸入器中で、および吸入経路を介して肺へのオリゴヌクレオチド送達の能力を有する任意の他の適切なデバイスによって投与されるように製剤されてもよい。
【０１４７】
本発明の組成物は、呼吸に適したサイズの粒子、例えば吸入に際して鼻、口、および喉頭を通過し、そして気管支および肺の肺胞を通過するために十分小さいサイズの粒子を含む製剤として、呼吸器系に投与することができる。一般的に、呼吸に適した粒子は、約０．５ミクロン〜１０ミクロンのサイズ範囲である。エアロゾル中に含まれる呼吸に適していないサイズの粒子は、咽頭に沈着して嚥下される傾向があり、従って、エアロゾル中の呼吸に適していない粒子の量は、最小限にすることが好ましい。鼻投与のためには、１０〜５００μＭ（マイクロメートル）の範囲の粒子サイズが、鼻腔における残留を確実にするために好ましい。
【０１４８】
オリゴヌクレオチド化合物を含む固体微粒子組成物は必要に応じて、エアロゾルの形成を容易にするように機能する分散剤、および他の治療化合物を含んでもよい。適切な分散剤はラクトースであり、ラクトースは任意の適切な比、例えば、１対１の重量比でアンチセンス化合物と混合されてもよい。
【０１４９】
エアロゾルを作製するための活性化合物（オリゴヌクレオチド化合物（単数または複数））の液体の薬学的組成物を、このオリゴヌクレオチド化合物と、適切なビヒクル（例えば、発熱性物質を含まない滅菌水またはリン酸緩衝化塩類溶液）と組み合わせることにより調製してもよい。
【０１５０】
このオリゴヌクレオチド組成物は、治療されている疾患の程度、被験患者の状態、特定の製剤、投与経路、被験体への投与のタイミングなどに依存する量である、抗気管支収縮、抗アレルギーおよび／または、抗炎症性の有効量で投与してもよい。一般的に、０．０５〜５０μＭのオリゴヌクレオチドの細胞内濃度、またはより具体的には０．２〜５μＭのオリゴヌクレオチドの細胞内濃度が所望される。哺乳動物の患者、例えばヒトの患者に対して投与するため、約０．００１、０．０１、０．１、または１ｍｇ／Ｋｇの用量から、最大で約５０または１００ｍｇ／Ｋｇ以上の用量が、典型的には使用される。しかしながら、他の用量もまた企図される。いずれかの特定の製剤中における活性化合物の溶解度に依存して、１日用量を、１回または数回の単位用量投与の間で分割してもよい。
【０１５１】
オリゴヌクレオチド化合物を含む液体粒子のエアロゾルを、任意の適切な手段、例えばネブライザーを用いて、作製してもよい。ネブライザーは、狭いベンチュリ（ｖｅｎｔｕｒｉ）開口部を通じて圧縮ガス（典型的には空気または酸素）の加速によって、または超音波攪拌によって、活性成分の溶液または懸濁液を、治療用のエアロゾルミスへと変換する市販のデバイスである。ネブライザー中で使用するための適切な製剤は、製剤の最大４０％ｗ／ｗ、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満の量で、液体担体中に活性のオリゴヌクレオチド成分を含む。この担体は、典型的には水または希薄なアルコール水溶液であり、好ましくは例えば、塩化ナトリウムの添加により体液と等張性にしたものである。任意の添加物としては、製剤が無菌で調製されない場合、防腐剤、例えば、メチルヒドロキシ安息香酸、抗酸化剤、抗細菌剤、香味料、揮発性油、緩衝化剤、および乳化剤、およびその他の製剤サーファクタントが挙げられる。
【０１５２】
活性なオリゴヌクレオチド化合物（単数または複数）および薬学的に許容されるサーファクタントを含む固体粒子のエアロゾルは、同様に、任意の固体微粒子医薬エアロゾル生成器を用いて生成してもよい。固体微粒子医薬を被験体に投与するためのエアロゾル生成器は、上で説明したように、呼吸に適した粒子を生成し、そして予め決定した一定用量の薬剤を含有するある容積のエアロゾルを、ヒト投与のために適した速度で生成する。活性なオリゴヌクレオチド成分は、典型的には、製剤の０．１〜１００ｗ／ｗを含む。実例となるエアロゾル生成器の第二の型は、定量吸入器を含む。定量吸入器は、加圧エアロゾルディスペンサーであり、典型的には液化噴霧剤中に活性成分の懸濁製剤または溶液製剤を含有する。使用の間、これらのデバイスは、典型的には１０〜１５０μＬの一定容積を送達するように適合させたバルブを通じて製剤を放出し、活性成分を含有する微粒子スプレーを生成する。適切な噴霧剤としては、特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、またはヒドロフルオロアルカン、およびこれらの混合物が挙げられる。製剤は、１つ以上の共溶媒、例えば、エタノール、乳化剤、およびその他の製剤サーファクタント、例えばオレイン酸またはトリオレイン酸ソルビタン、抗酸化剤、および適切な着香料をさらに含んでもよい。
【０１５３】
固体粒子から形成されるか液体粒子から形成されるかに関わらず、エアロゾルは、１分間当たり約１〜１５０リットルという速度で、エアロゾル生成器により生成することができる。
【０１５４】
本発明のさらなる態様では、アレルギー、喘息、鼻炎および炎症性疾患に関連する状態を治療するために治療上有効な薬学的に許容されるオリゴヌクレオチド組成物をその中に含有するパッケージング材料を含んでいる製品が提供される。一実施形態において、この組成物は、ＣＣＲ３ケモカインレセプターまたはＩＬ−３／ＩＬ−５／ＧＭ−ＣＳＦ−レセプターの共通β−鎖の遺伝子発現を阻害するために有効なオリゴヌクレオチド化合物を含み、このオリゴヌクレオチド化合物は、この遺伝子に少なくとも５０％相補的である。別の態様において、この組成物は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチド化合物を含み、各々のオリゴヌクレオチド化合物は、各々のＣＣＲ３ケモカインレセプター遺伝子およびＩＬ−３／ＩＬ−５／ＧＭ−ＣＳＦ−レセプターの共通β−鎖遺伝子の発現を下方制御することができ、各々のオリゴヌクレオチド化合物は、そのオリゴヌクレオチド化合物が実際にはそのままではそのオリゴヌクレオチド化合物に対する遺伝子を下方制御するために効果的ではない濃度で存在し、そのオリゴヌクレオチド化合物の組合せが、そのオリゴヌクレオチドが対する少なくとも１つ遺伝子を下方制御するために有効である。
【０１５５】
一実施形態では、製品のパッケージング材料は、その組成物を用いて炎症性呼吸器疾患を治療することができることを示すラベルを備え、そしてさらにその疾患がアレルギー、鼻炎、ＣＯＰＤ、ＣＦおよび喘息のうちの一つであるという指示を備えてもよい。
【０１５６】
別の実施形態において、製品のパッケージング材料は、その組成物を用いて炎症性呼吸器疾患を治療することができることを示すラベルを備え、そしてさらに、その疾患がアレルギー、喘息、過好酸球増大症、気管支炎、ＣＯＰＤ、鼻炎、または副鼻腔炎のうちの１つであるという指示を備えてもよい。
【０１５７】
本発明の目的のため、パッケージング材料は、本発明によるヌクレオチド含有組成物をパッケージングするために適切な任意の材料であってもよく、これには、ボトルもしくは他の容器（プラスチックまたはガラスのいずれか）、カートン、チューブ、またはその他の保護用ラッピングが挙げられる。理解されるように、このパッケージングは、オリゴヌクレオチド組成物の性質により変更されてもよく、例えば、液体製剤はエアロゾル製剤とは異なる方法でパッケージングされてもよい。
【０１５８】
本発明は、本発明の範囲を限定することなく以下の発明を説明するために提供される実施例を参照することにより、さらに容易に理解されるであろう。これらの実施例に関して、以下の方法および材料が、用いられた。
【実施例】
【０１５９】
方法
細胞培養
ＴＦ−１細胞は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１．５ｇ／ｌの炭酸水素ナトリウム、４．５ｇ／ｌのＤ−グルコース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０％のウシ胎仔血清、２ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含んでいるＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞および２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞（それぞれ安定にβ鎖−ＧＦＰおよびＣＣＲ３−ＧＦＰ融合のｃＤＮＡを発現する）は、２ｍＭのＬ−グルタミン、４．５ｇ／ｌのグルコース、１０％のウシ胎仔血清、１５μｇ／ｍｌのブラスチシジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）Ｂ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）を含有するＤＭＥＭ中で培養した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、２ｍＭのＬ−グルタミン、４．５ｇ／ｌのグルコース、１０％のウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。
【０１６０】
ＡＯＮ、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡミミック配列の設計および調製
ホスホロチオエート−ＤＮＡのＡＯＮ類（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）、ＤＡＰ−修飾ホスホロチオエート−ＤＮＡのＡＯＮ類（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ）およびホスホロチオエート−２’Ｆ−ＡＮＡのＡＯＮ類（Ｔｏｐｉｇｅｎ，ＭｏｎｔｒｅａｌまたはＵＣＤＮＡ，Ｃａｌｇａｒｙ）を、β鎖およびＣＣＲ３のｍＲＮＡのコード領域を標的するように設計した。ホスホロチオエート−ＤＮＡ  ＡＯＮ類は特に、β鎖のｍＲＮＡの全体的なコード領域にそった領域、ならびに５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ内およびイントロン／エキソン接合部をまたいで延びる領域を標的するように設計した。β鎖およびＣＣＲ３のＡＯＮの設計のために用いられるオンラインの参照配列（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ全体）は以下であった：β鎖については、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＢＣ０７００８５（ＴＯＰ０５０（配列番号１）−ＴＯＰ０７６（配列番号２７）、ＴＯＰ１９５（配列番号１４６）、およびＴＯＰ２５４（配列番号２０５）−ＴＯＰ２５９（配列番号２１０））；ＮＭ＿０００３９５．２（ＴＯＰ０７７（配列番号２８）−ＴＯＰ１９４（配列番号１４５）、ＴＯＰ１９６（配列番号１４７）−２５３（配列番号２０４）、ＴＯＰ２６０（配列番号２１１）−ＴＯＰ３４６（配列番号：２９７）およびＴＯＰ５１７（配列番号４６８）−ＴＯＰ７２１（配列番号：６７２））；ならびにＮＧ＿００８０４０（ＴＯＰ３４７（配列番号：２９８）−ＴＯＰ５１６（配列番号４６７））；そしてＣＣＲ３についてはＮＭ＿００１８３７（ＴＯＰ０２０（配列番号６７３）−ＴＯＰ０４５（配列番号６９８））。ＳｉＲＮＡ配列は、従来のＴｕｓｃｈｌベースのデザイン（Ｑｉａｇｅｎ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｓｉｇｎ  ｔｏｏｌ）、Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  （ＨＰ）  ＯｎＧｕａｒｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗｉｄｅ  ｓｉＲＮＡ，Ｑｉａｇｅｎ），Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  ＲＮＡｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｓｉＤＥＳＩＧＮ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃｕｓｔｏｍ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｏｏｌ（ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏ．ｃｏｍ／ｓｉｄｅｓｉｇｎ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ  ＢＬＯＣＫ−ＩＴ（商標）  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｎａｉｄｅｓｉｇｎｅｒ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）、またはＥＭＢＯＳＳ（ｈｔｔｐｓ：／／ａｎａｂｅｎｃｈ．ｂｃｍ．ｕｍｏｎｔｒｅａｌ  ．ｃａ／ｈｔｍｌ／ＥＭＢＯＳＳ／ｒｕｎｓ／ｆｉｌｅ６ＬＧＦ４ｆ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて設計した。
【０１６１】
ＭｉＲＮＡミミックは、β鎖遺伝子の３’ＵＴＲに対する相同性を有するｍｉＲＮＡを特定するための公的に利用可能なアルゴリズムを用いて選択した。ｍｉＲＮＡの特定のために使用されるアルゴリズムは、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／）、ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．Ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｔａｒｇｅｔｓ／ｖ５／ｓｅａｒｃｈ．ｐｉ）、ｍｉＲＡＮＤＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｇ／ｍｉｃｒｏｒｎａ／ｇｅｔＧｅｎｅＦｏｒｍ．ｄｏ）、ｍｉＲＧＥＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｉａｎａ．ｐｃｂｉ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｉＲＧｅｎ／ｖ３／Ｔａｒｇｅｔｓ．ｃｇｉ）およびＤＩＡＮＡ  ｍｉｃｒｏＴ（ｈｔｔｐ：／／ｄｉａｎａ．ｃｓｌａｂ．ｅｃｅ．ｎｔｕａ．ｇｒ／ｍｉｃｒｏＴ／）であった。
【０１６２】
全てのオリゴヌクレオチドは、滅菌水中に再懸濁して、その濃度は分光光度法によって決定した。
【０１６３】
細胞のトランスフェクション
指数関数的増殖期にあるＴＦ−１細胞（０．６〜０．８×ｌ０６細胞／ｍｌ）を抗生物質なしの完全増殖培地中で１．２５×１０６細胞／ｍｌの密度で成長させた。細胞を、ＡＯＮ−、ｓｉＲＮＡ−またはｍｉＲＮＡミミック−Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００複合体（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中で希釈した）を用いて直ちにトランスフェクトして、１μｇのオリゴヌクレオチド：１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００という比で、室温で２０分間事前にインキュベートした。細胞を、８３．５ｎＭ〜２．６７μＭにおよぶＡＯＮ濃度、０．２５〜１．０μＭにおよぶｓｉＲＮＡ濃度、および０．５μＭ〜１μＭの濃度のｍｉＲＮＡミミックを用いてトランスフェクトし、次いで３７℃で１８〜７２時間インキュベートした。
【０１６４】
２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞および２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞を、抗生物質なしの完全増殖培地中で培養した。細胞を６７ｎＭ〜５３４ｎＭのＡＯＮ濃度または４０ｎＭ〜１．０μＭのｓｉＲＮＡ濃度で上記のようにトランスフェクトした。ＣＣＲ３−ＧＦＰまたはβ鎖ＧＦＰ発現を、回収の前に２時間（ｍＲＮＡ）または１８時間（タンパク質）、１００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンを用いて誘導した。
【０１６５】
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を上記のように０．２μｇのｐＣＭＶｓｃｒｉｐｔラットＣＣＲ３または０．３μｇのｐＧＬ２−ルシフェラーゼ、ならびに０．２μｇのＡＯＮを用いてトランスフェクトした。
【０１６６】
ｍＲＮＡ発現の定量
ＣＣＲ３およびβ鎖のｍＲＮＡ発現レベルの定量は、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０アッセイを用いて行った。要するに、細胞を１×Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ溶解混合物中に再懸濁して、５３〜５５℃で３０分間インキュベートした。唯一の例外は、ＴＦ−１細胞におけるＣＣＲ３  ｍＲＮＡ定量についてであって、これでは総ＲＮＡをまず、ＲＮＡｅａｓｙミニキットを用いて細胞ペレットから抽出し、製造業者のプロトコールに従ってＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイを用いて定量した。次いで、細胞溶解液または精製されたＲＮＡを特異的なプローブセットを用いて５５℃で一晩ハイブリダイズして、シグナル検出はＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ  ２．０アッセイ手順に従って行った。遺伝子発現は、コントロールの遺伝子（β２Ｍ）の発現に対して正規化した。
【０１６７】
フローサイトメトリーによる、２９３細胞におけるβｃ−ＧＦＰおよびＣＣＲ３−ＧＦＰタンパク質の発現の定量
細胞をトランスフェクションの２４時間後にトリプシンで回収して、ＰＢＳで２回洗浄し、１×透過化溶液中に再懸濁して、室温で１０分間インキュベートした。次いで細胞を、０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて２回洗浄し、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−コンジュゲートされた抗−ＧＦＰ抗体を含有する５０μＬのＰＢＳ中に再懸濁して、４℃で１時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、２％のパラホルムアルデヒド中で固定し、その後にＧＵＡＶＡ  ＥａｓｙＣｙｔｅ装置を用いるフローサイトメトリー（４８８ｎＭ）によって分析した。
【０１６８】
ＦＡＣＳによるＴＦ−１中の内因性タンパク質発現の定量
ＴＦ−１細胞は、トランスフェクション後、示した時点で回収して、ＰＢＳを用いて２回洗浄した。染色は、ＣＣＲ３レセプターの定量についてはＥｏｔａｘｉｎ  Ｆｌｕｏｒｏｋｉｎｅキットを用い、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβ−鎖についてはＩＬ−３Ｆｌｕｏｒｏｋｉｎｅキットを用いて５０，０００個の細胞で行った。これらのアッセイでは、ビオチン化エオタキシンまたはビオチン化ＩＬ−３は、特定の細胞表面レセプターに結合し、アビジン−フロオレセインを用いて検出される。細胞を４％のパラホルムアルデヒド溶液中で固定し、緑色蛍光をＧＵＡＶＡ  ＥａｓｙＣｙｔｅ装置を用いてＦＡＣＳ（４８８ｎＭ）によって検出した。
【０１６９】
ＡＯＮ血清安定性アッセイ
ＡＯＮは拭いて乾燥し、１μｇ／ｍｌという最終濃度で５０％のウシ胎仔血清を補充されたＤＭＥＭ中に再懸濁した。ＡＯＮ類は、３７℃でインキュベートして、サンプル（２０μｌ）を０〜９６時間の間の種々の時点で収集し、分析するまで−８０℃で保管した。サンプルを拭いて乾燥し、１００μｌのｄＨ２Ｏ中に再懸濁し、ＨＰＬＣ分析のためにタンパク質−Ｐａｋ（商標）ＤＥＡＥ−５ＰＷ陰イオン交換カラム（７５×７５ｍｍ）にロードした。
【０１７０】
アレルゲン誘導性気道炎症のラットモデルにおけるアンチセンス有効性
動物の研究は、Ｍｉｓｐｒｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，ＱＣで行い、Ｍｉｓｐｒｏの動物倫理委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）によって承認された。Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ（ＢＮ）ラット（６〜８週齢）を、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  Ｉｎｃ．から入手した。能動感作は、１ｍｇの鶏卵アルブミン（ＯＶＡ）および３．５ｍｇの水酸化アルミニウムゲルを含有する１ｍｌの生理食塩水の皮下注射によって行った。感作の１４日後、ラットに、無菌生理食塩水（５０μｌ）、または５０μｇの組み合わせのＴＯＰ００６（配列番号１６２６）およびＴＯＰ００７（配列番号１６２８）（１：１（ｗ／ｗ）比）、もしくは５０μｇの組み合わせのＴＯＰ００６−Ｆ２（配列番号１６２７）およびＴＯＰ００７−Ｆ８（配列番号１６２９）（１：１（ｗ／ｗ）比）が含有される５０μｌの無菌生理食塩水のいずれかを用いて気管内に（ｉ．ｔ．）注射した。ラットは、閉鎖チャンバ中で１５分間ＯＶＡエアロゾル（５％が生理食塩水中に含有される）に対する曝露によって１０分後にチャレンジした。チャレンジは２４時間後に繰り返した。肺に対する細胞流入に対するＡＯＮ処置の効果を決定するために、ラットを第二のＯＶＡチャレンジの１５時間後に屠殺して、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行った。細胞を遠心分離によって回収して、総白血球計数を血球計を用いて行った。Ｈｅｍａ−３染色キットで染色したサイトスピンスライドで種々の細胞計数を行った。少なくとも２００個の細胞を、油浸顕微鏡下で計数した。肺をＢＡＬ後に収集して、ｍＲＮＡ（右の肺）のため、または免疫組織化学（左の肺）のために処理した。
【０１７１】
動物の吸入研究
サルの研究デザイン
全ての研究をＧＬＰの規制に従ってＩＴＲ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃａｎａｄａ（Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ，ＱＣ）で行った。要するに、雄性および雌性のカニクイザル（１．５〜２．５ｋｇの秤量）に、１４の連続用量のビヒクルまたは０．０５、０．２５もしくは２．５ｍｇ／ｋｇのＴＰＩ  ＡＳＭ８（生理食塩水中）を与えるか、またはＴＰＩ  １１００（リン酸塩緩衝化生理食塩水；ＰＢＳ）を、吸入曝露システムを用いてエアロゾルとして毎日投与した。この動物を、食物消費の定量的アセスメントを含めて臨床的症状について毎日１〜２回検査し、体重を毎週測定した。心電図（ＥＣＧ）活動を記録して、眼の検査を動物の事前研究のために、かつ１４日目に行った。
【０１７２】
最終投与の１日後（１５日目）、２４匹のサル（３匹／性別／群）を安楽死させた。全ての残りの動物を回復期間の終わりに安楽死させた（ＴＰＩ  ＡＳＭ８研究については最終投与の１４日後、またはＴＰＩ１１００研究については最終投与の２８日後）。最終手順は、約４０の組織の完全な全体的剖検、収集および保存、ならびに全ての主要な臓器の重量の測定を含んだ。全ての動物由来の呼吸器管組織（鼻腔、鼻咽頭、喉頭、咽頭、気管、気管支、気管支分岐部および気管支リンパ節を含めて肺）を、光学顕微鏡によって検査して、全ての収集された組織を全ての高用量およびコントロール群の動物について検査した。さらに、気管支、肺、肝臓および腎臓の一部をＡＯＮ含量の分析のために収集した。
【０１７３】
げっ歯類研究デザイン
ラットでの研究（ＴＰＩ  ＡＳＭ８）およびマウスでの研究（ＴＰＩ  １１００）はサルの研究について記載されたとおり行った。雄性および雌性のＣＤ−１マウスに、１４の連続用量のビヒクルまたは０．０５、０．２５もしくは２．５ｍｇ／ｋｇのＴＰＩ  １１００を、吸入曝露システムを用いてエアロゾルとして毎日投与した。雄性および雌性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、１４の連続用量のビヒクルまたは０．０２、０．０７、０．２  ０．１もしくは５ｍｇ／ｋｇのＴＰＩ  ＡＳＭ８を、吸入曝露システムを用いてエアロゾルとして毎日投与した。
【０１７４】
実施例１：ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニットに対するＡＯＮ配列の有効性
ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦレセプターの共通のβサブユニット（β鎖）に対するＡＯＮ配列の配列および組成を表１ａ−１ｒに示す。全てのＡＯＮ類を精製して、脱塩した。いくつかの選択された配列の力価を図１ａに示しており、この図は、２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞株およびＴＦ−１細胞株において示されたＡＯＮでのトランスフェクション後のインビトロにおける遺伝子発現の低下を示す。表１ａ−１ｒに列挙されるＡＯＮ活性は、トランスフェクトされていないコントロールに対するβ鎖のｍＲＮＡの平均阻害割合として表される。２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞株は、β鎖／緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合物のｍＲＮＡおよびタンパク質を人工的に発現するように操作し、一方ＴＦ−１細胞は、β鎖のｍＲＮＡおよびタンパク質を内因性に発現するように操作した。
【０１７５】
いくつかの選択されたＡＯＮ配列の特異性は、そのＡＯＮ配列の有効性を２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞（図１ｂ）およびＴＦ−１細胞（図１ｃ）において、それらのＡＯＮ配列それぞれのコントロールのセンス配列に比較したβ鎖のｍＲＮＡ発現レベルの低下において比較することによって評価された。各々の細胞株では、β鎖のｍＲＮＡに相補的でないそれぞれのコントロールのセンス配列は不活性であった。さらに、β鎖を標的するＡＯＮの阻害活性はまた、フローサイトメトリーによって分析の際にタンパク質レベルで観察された。図５ａおよび図５ｂによって、２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞およびＴＦ−１細胞が、特定のＡＯＮを用いたトランスフェクションおよび一晩のインキュベーション後にβ鎖タンパク質発現のレベルが低下していたが、コントロール配列では効果がなかったことが示される。
【０１７６】
実施例２：ＣＣＲ３ケモカインレセプターに対するＡＯＮ配列の有効性
ＣＣＲ３を標的するＡＯＮ配列の列挙は、表１ｓに示される。全てのＡＯＮは上記のとおり、調製して精製した。いくつかの選択された配列の力価は、図２ａに示されており、この図は、２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞株およびＴＦ−１細胞株において示されたＡＯＮを用いたトランスフェクション後、インビトロにおける遺伝子発現の低下を示す。２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞株は、ＣＣＲ３／緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合産物を発現するように操作したが、ＴＦ−１細胞は、ＣＣＲ３のｍＲＮＡおよびタンパク質を内因性に発現する。図２ｂおよび図２ｃは、ＣＣＲ３に対するＡＯＮ類でのトランスフェクションの２４時間後、それぞれ２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞およびＴＦ−１細胞におけるＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現レベルの特異的な減少を示すが、それぞれのコントロールのセンス配列は不活性であった。表１ｓに示されるＡＯＮ活性は、トランスフェクトされていないコントロールに対するＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現の平均阻害割合として表される。
【０１７７】
ＣＣＲ３を標的するＡＯＮの阻害性活性はまた、フローサイトメトリーによって分析の際にタンパク質レベルで観察した。図５ｃおよび図５ｄによって、２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞およびＴＦ−１細胞では、示したＡＯＮを用いたトランスフェクションの２４時間後、ＣＣＲ３タンパク質発現のレベルが低下していたが、コントロールの配列では効果はなかったことが示される。
【０１７８】
実施例３：β鎖のｍＲＮＡ発現の低下におけるＡＯＮとｓｉＲＮＡ配列との間の比較
ＡＯＮの配列に加えて、ｓｉＲＮＡ分子を設計して（表２ａ−２ｓ）、それらの有効性についてβ鎖のｍＲＮＡ発現の低下において試験した（図３）。図３ａは、トランスフェクトされていない細胞（Ｃｔ１  ＮＴ）に比べ、および無関係のｓｉＲＮＡ配列（ｓｉＣｔｌ）に比べて２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞でのβ鎖ｍＲＮＡ発現レベルの低下におけるいくつかの選択されたｓｉＲＮＡ配列の有効性を示す。ＴＦ−１細胞におけるβ鎖のｍＲＮＡ発現低下に対するＡＯＮ  ＴＯＰ０６２（配列番号１３）の有効性を、共通のβ鎖を標的するように設計された種々のｓｉＲＮＡ配列に対して比較した。結果として、ＡＯＮ  ＴＯＰ０６２（配列番号１３）（０．５および１μＭ）が、ｓｉＲＮＡ配列（図３ｂ）に比較してβ−鎖のｍＲＮＡ発現の低下において優れた有効性を呈したことが示された。さらに、経時的実験によって、ＡＯＮ  ＴＯＰ０６２（配列番号１３）でトランスフェクトされた細胞におけるβ鎖のｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクション後最大７２時間まで維持されたが、評価した全てのｓｉＲＮＡ配列がこの時点で発現の低下について有効では無かったことが示された（図３ｃ）。
【０１７９】
実施例４：ＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現の低下におけるＡＯＮとｓｉＲＮＡ配列との間の比較
ＡＯＮの配列に加えて、ｓｉＲＮＡ分子を設計し（表２ｔ）、その有効性についてＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現の低下について試験した（図４）。図４ａは、トランスフェクトされていない細胞（Ｃｔ１  ＮＴ）に比べ、および無関係のｓｉＲＮＡ配列（ｓｉＣｔｌ）に比べて２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞でのＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現レベルの低下におけるいくつかの選択されたｓｉＲＮＡ配列の有効性を示す。２９３−ＣＣＲ３−ＧＦＰ細胞におけるＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現低下に対するＡＯＮ  ＴＯＰ０３０（配列番号６８３）の有効性を、ＣＣＲ３を標的するように設計された種々のｓｉＲＮＡ配列に対して比較した（図４ｂ）。経時的実験によって、ＡＯＮ  ＴＯＰ０３０（配列番号６８３）でトランスフェクトされた細胞におけるＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現の阻害は、トランスフェクション後最大７２時間まで維持されたが、ｓｉＲＮＡ配列のうちこの時点で阻害活性を維持していたのは１つだけ（ｓｉＣＣＲ３＿１ＨＰ)であったことが示された（図３ｃ）。
【０１８０】
実施例５：ＦＡＮＡ化学で修飾されたＡＯＮ類は、有効性の増大および血清安定性の延長を示した。
本実施例は、ＡＮＡ修飾がＡＯＮの化学に組み込まれる場合の、β鎖およびＣＣＲ３特異的ＡＯＮ類の有効性の増大および血清安定性の延長に関する。表３ａおよび表３ｂは、ＦＡＮＡ残基で修飾されたＡＯＮの組成を記載する。図６ａでは、β鎖特異的なＡＯＮ類（示したとおり修飾された、ホスホロチオエート骨格またはＦＡＮＡを有する未修飾ＤＮＡ）でトランスフェクトされた２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞中のβ鎖発現について得た結果を示す。ＦＡＮＡ（ＴＯＰ０６２−Ｆ２（配列番号１５８２）およびＴＯＰ０６２−Ｆ３（配列番号１５８３））を用いたＴＯＰ０６２（配列番号１３）の修飾は、標的タンパク質発現の阻害の増大によって示されるとおりＡＯＮの有効性を増強し、このことはＡＯＮ活性についてのこの修飾の利点を明確に示している。同様に、ＦＡＮＡ（ＴＯＰ０３０−Ｆ１２）（配列番号１６１０）を用いたＴＯＰ０３０（配列番号６８３）の修飾は、それがＣＣＲ３タンパク質発現を阻害する有効性を増強し、このこともやはり、ＡＯＮ活性についてのこの修飾の利点を支持している（図６ｂ）。このＦＡＮＡ修飾はまた、それぞれのｍＲＮＡ標的（ＴＱＰ０６２−Ｆ１４（配列番号１５９４）の発現に対してＡＯＮの活性に影響することなく、Ｆ１８およびＴＯＰ０３０−Ｆ１２（配列番号１６１０））に対する、天然のリン酸ジエステル結合の組み込みを可能にした（表３ａおよび３ｂ）。これは、驚くべきことである。なぜなら、リン酸ジエステル含有ＡＯＮ類は通常、ヌクレアーゼ分解に対してさらに感受性であると考えられており、ホスホロチオエート含有ＡＯＮ対応物に比較してアンチセンス阻害性活性の低下を生じるからである。
【０１８１】
ＦＡＮＡ修飾は、ＡＯＮの安定性を向上すると期待され、これはヌクレオシダーゼ消化に対してＡＯＮをさらに耐性にして、さらにＡＯＮ活性の延長を生じる。図５は、５０％のウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭで希釈し、３７℃で示した期間インキュベートされたＴＯＰ０６２（配列番号１３）（β鎖）およびＴＯＰ０３０（配列番号６８３）（ＣＣＲ３）の種々の処方物の比較を示す。アリコートは、種々の時点で収集して、インタクトなＡＯＮの存在をＨＰＬＣを用いて分析した。結果によって、ＴＯＰ０６２（配列番号１３）（図７ａ）およびＴＯＰ０３０（配列番号６８３）（図７ｂ）中のＦＡＮＡ修飾ヌクレオチドの組み込みが血清媒介の変性に対する有意な耐性を付与したことが示された。
【０１８２】
実施例６：１つのレセプターに特異的なＡＯＮの、別のレセプターの発現に対する交差標的効果
本実施例は、種々のレセプターのｍＲＮＡ生成に対する単一のレセプターの阻害の効果に関する。この実験は、ＴＦ−１細胞で行った。ＡＯＮの配列は、それらのそれぞれの標的に対して特異的に設計されたが、図８および図９の結果は、いくつかのＡＯＮがその特異的な標的を阻害することが見出されただけでなく、他のレセプターに対応するｍＲＮＡを下方制御できたことを示す（交差標的効果）。ＣＣＲ３特異的なＡＯＮ  ＴＯＰ０３０−Ｆ２（配列番号１６００）は、その特異的な標的の阻害を提供するだけでなく（図８ａおよび８ｂ）、共通のβ鎖のｍＲＮＡ（図８ｃ）およびタンパク質（図８ｄ）の発現も下方制御した。
【０１８３】
同様に、ＡＯＮ類ＴＯＰ０３１（配列番号６８４）およびＴＯＰ０３７（配列番号６９０）は、ＣＣＲ３（図９ａ）の発現を下方制御し、さらに共通のβ鎖タンパク質発現に向かう阻害活性を下方制御した（図９ｂ）。
【０１８４】
逆に、その特異的な標的の発現を下方制御する以外に、共通のβ鎖（図８ｃおよび８ｄ）、ＴＯＰ０６２−Ｆ８（配列番号１５８８）はまた、ＣＣＲ３のｍＲＮＡ（図８ａ）およびタンパク質（図８ｂ）の発現レベルを低下するのにおいて有効であることが示された。この交差標的阻害効果は、ＴＯＰ０６２−Ｆ８（配列番号１５８８）に限定されず、またβ鎖を標的とする追加のＡＯＮの配列（ＴＯＰ０５７（配列番号８）およびＴＯＰ０７３（配列番号２４））でも観察された（図９ａおよび図９ｂ）。
【０１８５】
実施例７：２つの異なる標的遺伝子のヌクレオチド配列由来の２つのＡＯＮを組み合わせることの複数の遺伝子ノックダウン効果
本実施例は、β鎖およびＣＣＲ３遺伝子発現に対する特異的なＡＯＮ類の組み合わせの効果に関する。両方のレセプターを内因性に発現するＴＦ−１細胞でのβ鎖およびＣＣＲ３のｍＲＮＡ発現に対する、２つの別々のＡＯＮ類を組み合わせることの効果を評価した（図１０）。各々のＡＯＮは、単独でまたは組み合わせて細胞中にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションの２４時間後ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現について分析した。ＴＯＰ０３０−Ｆ２（配列番号１６００）およびＴＯＰ０６２−Ｆ８（配列番号１５８８）の組み合わせは、ＴＯＰ０３０−Ｆ２（配列番号１６００）単独に比較してＣＣＲ３のｍＲＮＡ（図１０ａ）およびタンパク質（図１０ｂ）の発現レベルを低下することに有意に有効であることが示された。同様に、ＴＯＰ０３０−Ｆ２（配列番号１６００）の濃度に対して低い濃度のＴＯＰ０６２−Ｆ８（配列番号１５８８）の組み合わせによって、ＴＯＰ０６２−Ｆ８（配列番号１５８８）単独に比較してβ鎖のｍＲＮＡの発現レベル（図１０ｃ）およびタンパク質の発現レベル（図１０ｄ）に強力な相乗効果が示された。
【０１８６】
実施例８：アレルゲン誘発性気道炎症のラットモデルにおけるアンチセンスの有効性
本実施例は、ＦＡＮＡ修飾がラットのアレルギー性喘息のインビトロおよびインビボのモデルでＡＯＮの化学に組み込まれる場合の、ラットβ−鎖およびラットＣＣＲ３を標的するＡＯＮの有効性の増大に関する。表４は、ラットβ−鎖およびラットＣＣＲ３を標的するＡＯＮの組成物、ならびにＦＡＮＡ残基を有する修飾を記載する。図８では、ラットのＣＣＲ３のｍＲＮＡを一過性に発現するように操作されたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、ラットのＣＣＲ３に特異的なＡＯＮ（未修飾のＤＮＡであって、ホスホロチオエート結合を有する（ＴＯＰ００７（配列番号１６２８））かまたは示されるとおりＦＡＮＡ−修飾ヌクレオチド（ＴＯＰ００７−Ｆ８）（配列番号１６２９）を組み込む）を用いてトランスフェクトして、トランスフェクションの２４時間後に分析した。その結果によって、ＴＯＰ００７（配列番号１６２８）配列をＦＡＮＡモノマーを用いて修飾すれば（ＴＯＰ００７−Ｆ８（配列番号１６２９））、標的のｍＲＮＡ発現の阻害に対してＡＯＮの有効性が増強され、このことは明らかに、ＡＯＮ活性に対するこの修飾の利点を示している（図１１）。
【０１８７】
ラットβ鎖およびラットＣＣＲ３を標的するＦＡＮＡ修飾ＡＯＮ類の活性増強がまた、Ｂｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙ（ＢＮ）ラットでアレルギー性喘息のインビボモデルで示された。このモデルの喘息では、ＢＮラットには、感作の１４日後にオボアルブミン（ＯＶＡ）をチャレンジし、結果としてその動物の肺において好酸球の顕著な流入を生じた（図１２）。好酸球は喘息においてアレルギー性の反応の背景にある重要な細胞である。ＢＮラットを、ラットβ鎖（ＴＯＰ００６（配列番号１６２６））を標的する１つの未修飾のＡＯＮおよびラットＣＣＲ３（ＴＯＰ００７（配列番号１６２８））を標的する１つの未修飾のＡＯＮ（ＴＯＰ００７（配列番号１６２８））の５０μｇの組み合わせ（１：１（ｗ／ｗ）の比）でチャレンジする前に処置した場合、アレルゲン誘発性の好酸球流入の有意な減少は観察されなかった（図１２）。しかし、感作されたＢＮラットをＦＡＮＡ−含有ＡＯＮ類（ＴＯＰ００６−Ｆ２（配列番号１６２７）およびＴＯＰ００７−Ｆ８（配列番号１６２９））の５０μｇの組み合わせ（１：１（ｗ／ｗ）の比）で処置した場合、肺へのアレルゲン誘発性の好酸球流入は６０％まで低下した（図１２）。
【０１８８】
実施例９：２’Ｆ−ＡＮＡ修飾ＡＯＮ類の長期間送達後の肺へのマクロファージ流入
本実施例は、げっ歯類およびサルでの１４日間連続のＦＡＮＡ修飾したＡＯＮ類の長期間投与後の肺胞マクロファージの浸潤の相対的な低下に関する。図１３は、ＦＡＮＡ修飾ＡＯＮ類（ＴＰＩ  １１００）および非−２’Ｆ−ＡＮＡ修飾ＡＯＮ類（ＴＰＩ  ＡＳＭ８（ＴＯＰ００４（配列番号：１６３０）およびＴＯＰ００５（配列番号：１６３１））の長期間投与後のげっ歯類（マウスおよびラット）の肺およびサルの肺における肺胞マクロファージの発生率を示す。肺の組織学的検査は、最終のＡＯＮ曝露の２４時間後に評価した（１５日）。結果として、ＦＡＮＡ修飾ＡＯＮ類（ＴＰＩ  １１００（ＴＯＰ１５７２（配列番号：１６３２）およびＴＯＰ１７３１（配列番号：１６３３）、ＩＣ５０約１ｍｇ／ｋｇ）を投与された動物では、非−２’Ｆ−ＡＮＡ−含有ＡＯＮ類（ＴＰＩ  ＡＳＭ８，ＩＣ５０約０．１ｍｇ／ｋｇ）を投与されている動物に比較して肺胞マクロファージの頻度が低く、種依存性であった（げっ歯類および霊長類）。
【０１８９】
実施例１０：β鎖のｍＲＮＡ発現の低下に対する２−アミノ−２’−デオキシアデノシン−含有ＡＯＮの配列の有効性
本実施例は、ＡＯＮの化学において２−アミノ−２’−デオキシアデノシン（ＤＡＰ）修飾を組み込むβ鎖特異的ＡＯＮ類の有効性に関する。表３ｃは、ＤＡＰ残基で修飾されたＡＯＮの組成を記載する。いくつかの選択された配列の力価は、図１４に示しており、この図では、２９３−βｃ−ＧＦＰ細胞中で示したＡＯＮ類を用いたトランスフェクション後のインビトロでの遺伝子発現の減少が示される。ＡＯＮの配列の特異性は、無関係のＡＯＮ配列（ＴＯＰ４００５（配列番号１７８４））に比較してβ鎖のｍＲＮＡ発現レベル低下についてその配列の有効性を比較することによって評価した。
【０１９０】
実施例１１：β鎖のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を低下するのにおけるｍｉＲＮＡミミック配列の有効性
ＡＯＮの配列およびｓｉＲＮＡに加えて、ｍｉＲＮＡ模倣分子を設計して（表７ａ−７ｄ）、その有効性についてβ鎖のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現を低下するのにおいて試験した（図１５）。図１５ａは、トランスフェクトされていない細胞コントロール（コントロールＮＴ）に比較してＴＦ−１細胞におけるβ鎖のｍＲＮＡレベルの低下に対するいくつかの選択されたｍｉＲＮＡミミック配列の有効性を示す。ｍｉＲＮＡの作用機序と一致して、β鎖のｍＲＮＡレベルに対する効果は測定されなかった。β鎖タンパク質発現に対するｍｉＲＮＡの阻害活性はまた、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）によっても分析された。図１５ｂは、トランスフェクトされてないコントロールの細胞に比較して、特定のｍｉＲＮＡでのトランスフェクションおよび一晩のインキュベーション後、ＴＦ−１細胞がβ鎖タンパク質発現のレベルの用量依存性の低下を有したことを示す。
【０１９１】
引用された全ての参考文献は、本明細書において参照によって援用される。本発明の好ましい実施形態は、本明細書に記載してきたが、本発明の趣旨または特許請求の範囲から逸脱しない範囲において適宜変更することができる。
【表１ａ】
2011519579.tif 000003
【表１ｂ】
2011519579.tif 000004
【表１ｃ】
2011519579.tif 000005
【表１ｄ】
2011519579.tif 000006
【表１ｅ】
2011519579.tif 000007
【表１ｆ】
2011519579.tif 000008
【表１ｇ】
2011519579.tif 000009
【表１ｈ】
2011519579.tif 000010
【表１ｉ】
2011519579.tif 000011
【表１ｊ】
2011519579.tif 000012
【表１ｋ】
2011519579.tif 000013
【表１ｌ】
2011519579.tif 000014
【表１ｍ】
2011519579.tif 000015
【表１ｎ】
2011519579.tif 000016
【表１ｏ】
2011519579.tif 000017
【表１ｐ】
2011519579.tif 000018
【表１ｑ】
2011519579.tif 000019
【表１ｒ】
2011519579.tif 000020
【表１ｓ】
2011519579.tif 000021
【表２ａ】
2011519579.tif 000022
【表２ｂ】
2011519579.tif 000023
【表２ｃ】
2011519579.tif 000024
【表２ｄ】
2011519579.tif 000025
【表２ｅ】
2011519579.tif 000026
【表２ｆ】
2011519579.tif 000027
【表２ｇ】
2011519579.tif 000028
【表２ｈ】
2011519579.tif 000029
【表２ｉ】
2011519579.tif 000030
【表２ｊ】
2011519579.tif 000031
【表２ｋ】
2011519579.tif 000032
【表２ｌ】
2011519579.tif 000033
【表２ｍ】
2011519579.tif 000034
【表２ｎ】
2011519579.tif 000035
【表２ｏ】
2011519579.tif 000036
【表２ｐ】
2011519579.tif 000037
【表２ｑ】
2011519579.tif 000038
【表２ｒ】
2011519579.tif 000039
【表２ｓ】
2011519579.tif 000040
【表２ｔ】
2011519579.tif 000041
【表３ａ】
2011519579.tif 000042
【表３ｂ】
2011519579.tif 000043
【表３ｃ】
2011519579.tif 000044
【表４】
2011519579.tif 000045
【表５】
2011519579.tif 000046
【表６】
2011519579.tif 000047
【表７ａ】
2011519579.tif 000048
【表７ｂ】
2011519579.tif 000049
【表７ｃ】
2011519579.tif 000050
【表７ｄ】
2011519579.tif 000051
【表８】
2011519579.tif 000052
【図１ａ】
2011519579.tif 000053
【図１ｂ】
2011519579.tif 000054
【図１ｃ】
2011519579.tif 000055
【図２ａ】
2011519579.tif 000056
【図２ｂ】
2011519579.tif 000057
【図２ｃ】
2011519579.tif 000058
【図３ａ】
2011519579.tif 000059
【図３ｂ】
2011519579.tif 000060
【図３ｃ】
2011519579.tif 000061
【図４ａ】
2011519579.tif 000062
【図４ｂ】
2011519579.tif 000063
【図５ａ】
2011519579.tif 000064
【図５ｂ】
2011519579.tif 000065
【図５ｃ】
2011519579.tif 000066
【図５ｄ】
2011519579.tif 000067
【図６ａ】
2011519579.tif 000068
【図６ｂ】
2011519579.tif 000069
【図７ａ】
2011519579.tif 000070
【図７ｂ】
2011519579.tif 000071
【図８ａ】
2011519579.tif 000072
【図８ｂ】
2011519579.tif 000073
【図８ｃ】
2011519579.tif 000074
【図８ｄ】
2011519579.tif 000075
【図９ａ】
2011519579.tif 000076
【図９ｂ】
2011519579.tif 000077
【図１０ａ】
2011519579.tif 000078
【図１０ｂ】
2011519579.tif 000079
【図１０ｃ】
2011519579.tif 000080
【図１０ｄ】
2011519579.tif 000081
【図１１】
2011519579.tif 000082
【図１２】
2011519579.tif 000083
【図１３】
2011519579.tif 000084
【図１４】
2011519579.tif 000085
【図１５ａ】
2011519579.tif 000086
【図１５ｂ】
2011519579.tif 000087
【配列表】
2011519579000001.app
【国際調査報告】
2011519579.tif 000088
2011519579.tif 000089
2011519579.tif 000090
2011519579.tif 000091