(57)【要約】本発明は、ＰＡＲ−２レセプターが炎症性応答を増幅し、ＰＡＲ−２活性化のエフェクターが、それ故炎症性応答の調節に使用でき、それにより患者に治療効果を与えることができるという認識に関連する。本発明は特に、炎症の処置、ならびに、炎症、癌および損傷に起因する痛覚（疼痛）の処置におけるＰＡＲ−２エフェクターの使用に向けられる。本発明は、特に、ＰＡＲ−２活性化のネガティブエフェクターに向けられ、とりわけ、ＰＡＲ−２活性化のネガティブエフェクターである抗ＰＡＲ−２抗体に向けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼレセプター−２（ＰＡＲ−２）の領域と結合できるドメインを含むＰＡＲ−２エフェクター分子であって、該結合がＰＡＲ−２の活性化または活性を調節する分子。
【請求項２】
前記分子がＰＡＲ−２の活性化または活性のネガティブエフェクターである、請求項１記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項３】
前記分子が抗体である、請求項２記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項４】
前記抗体が改変抗体である、請求項３記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項５】
前記改変抗体が約０．０３nM〜約０．２nMのＫｄを示す、請求項４記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項６】
前記改変抗体が約０．２nM〜約０．４nMのＥＣ５０で、ヒトＰＡＲ−２をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞に濃度依存的結合を示す、請求項４記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項７】
前記改変抗体が、約２．０nM〜約０．５nMのＩＣ５０で、ヒト、マウス、ラットの上皮細胞系の細胞において、トリプシン誘導性カルシウム放出を阻害する、請求項４記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項８】
前記ＩＣ５０が約１．０nM〜約０．５nMである請求項７記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項９】
前記改変抗体が、ヒトＰＡＲ−１と比較して、ヒトＰＡＲ−２に少なくとも１００倍高い結合親和性を示す、請求項４記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項１０】
前記改変抗体が、配列番号１１〜１５または１７のいずれかの配列を有する重鎖ＣＤＲを含む、請求項４記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項１１】
前記改変抗体が、配列番号１９〜２０のどちらかの配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む、請求項４記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項１２】
前記改変抗体が、配列番号２１〜２６または３０〜３６のいずれかの配列を有する重鎖を含む、請求項４記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項１３】
前記改変抗体が、配列番号２７〜２８のどちらかの配列を有する軽鎖を含む、請求項４記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項１４】
前記改変抗体が、Ｐａｒ−Ｂ、Ｐａｒ−ＣまたはＰａｒ−Ｄである、請求項４記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項１５】
アミノ酸配列が配列番号３７または配列番号４０のＤＮＡ配列から選択される発現ＤＮＡ配列によってコードされる抗体軽鎖を有する、請求項４記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項１６】
アミノ酸配列が配列番号３８、配列番号３９または配列番号４１のＤＮＡ配列から選択される発現ＤＮＡ配列によってコードされる重鎖を有する、請求項４記載のＰＡＲ−２エフェクター分子。
【請求項１７】
請求項１〜１６記載のＰＡＲ−２エフェクター分子および薬理学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１８】
前記組成物が追加として付加的な抗炎症薬を含む、請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
レシピエント哺乳類における炎症を処置する方法であって、請求項１〜１６記載のいずれかのＰＡＲ−２エフェクター分子および薬理学的に許容しうる賦形剤を含む請求項１７の医薬組成物を、該哺乳類にそのような処理を提供するのに十分な量で投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記組成物が追加として付加的な抗炎症薬を含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記炎症が、乾癬、接触性皮膚炎、炎症性腸疾患、ｔｒａｎｓ  ｖｉｖｏ遅延型過敏症、ＰＡＲ−２仲介大動脈輪弛緩および疼痛からなるグループから選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
レシピエント哺乳類における炎症を予防または阻止する方法であって、該哺乳動物に、該炎症に前もって、請求項１〜１６記載のいずれかのＰＡＲ−２エフェクター分子および薬理学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物を、そのような予防または阻止を提供するのに十分な量で投与することを含む方法。
【請求項２３】
前記組成物が追加として付加的な抗炎症薬を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記炎症が乾癬、接触性皮膚炎、炎症性腸疾患、ｔｒａｎｓ  ｖｉｖｏ遅延型過敏症、ＰＡＲ−２仲介大動脈輪弛緩および疼痛からなるグループから選択される、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年８月５日に出願され、本明細書にその全体を参考として組み込まれる、米国仮特許出願番号第６１／０８６，２８２号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
本発明は、ＰＡＲ−２レセプターが炎症性応答を増幅し、ＰＡＲ−２活性化のエフェクターが、それ故炎症性応答を調節するために使用でき、それにより患者に治療効果を与えられるという認識に関する。本発明は特に、炎症の処置、ならびに、炎症、癌および損傷に起因する痛覚（疼痛）の処置におけるＰＡＲ−２エフェクターの使用に向けられる。
【０００３】
Ｉ．ＰＡＲ−２およびＧタンパク質共役レセプター
Ｇタンパク質共役レセプター（「ＧＰＣＲ」）は、細胞外アミノ末端および細胞内カルボキシル末端により結合される７回疎水性膜貫通（「ＴＭ」）セグメントの共通の構造モチーフを共有する膜タンパク質の巨大なファミリーを含む(Kobilka, B.K. (epub 2006) Biochim. Biophys. Acta. 1768(4):794-807)。ＧＰＣＲは、ホルモン、神経伝達物質および知覚活性化（例えば、視覚、嗅覚および味覚）に応答する膜貫通シグナリングの主なメディエーターである。ＧＰＣＲの多数のサブファミリー（例えば、ロドプシンサブファミリー、Ａｄｈｅｓｉｏｎサブファミリー、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ／Ｔａｓｔｅサブファミリー、グルタミン酸サブファミリー、セクレチンサブファミリー、およびプロテアーゼ活性化レセプター（「ＰＡＲ」）サブファミリー）が、配列分析を通して同定された（Attwood, T.K. et al. (1994) Protein Eng. 7(2):195-203; Kolakowski, L.F., Jr. (1994) Receptors Channels 2(1):1-7; Fredriksson, R. et al. (2003) Mol. Pharmacol. 63(6):1256-1272; Macfarlane, S.R. et al. (2001) Pharmacol. Rev. 53(2):245-282）。ＧＰＣＲの構造の類似性にも関わらず、異なるＧＰＣＲは異なる機能を示し、構造的に多様な天然のリガンドに結合する（Kobilka, supra; Ji, T.H. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(28):17299-17302）。
【０００４】
Ｇタンパク質共役レセプターのＰＡＲサブファミリーの４つのメンバーが記載された：ＰＡＲ−１、ＰＡＲ−２、ＰＡＲ−３およびＰＡＲ−４である（Hollenberg, M.D. et al. (2004) Br. J. Pharmacol. 143(4):443-454; Hansen, K.K. et al. (2004) Immunol. 112(2):183-190; Hollenberg, M.D. (2003) Life Sci. 74(2-3):237-246; Hollenberg, M.D. (2000) Mol. Pharmacol. 58(6):1175-1177; Hollenberg, M.D. et al. (2000) Can. J. Physiol. Pharmacol. 78(1):81-85; Hollenberg, M.D. (1999) Trends Pharmacol Sci. 20(7):271-273; Hollenberg, M.D. et al. (1999) Can. J. Physiol. Pharmacol. 77(6):458-464）。
【０００５】
ＰＡＲサブファミリーメンバーは、独特な活性化方法により特徴付けられる。他のＧＰＣＲの場合のようにレセプターリガンドの結合により刺激されるというよりはむしろ、ＰＡＲサブファミリーメンバーは、そのＮ−末端領域の部分のタンパク質分解的切断を通して酵素的に活性化される。この切断はセリンプロテアーゼにより仲介されるが、レセプターのＮ−末端ドメインの残った部分がＰＡＲ分子の第二番目の細胞外ループ内の残基に結合することを許容する構造をとることを可能にする。このような結合は、レセプターの活性化を仲介する。Ｎ−末端ドメインのタンパク質分解後の部分は、レセプター分子の一部分であるので、「テザーリガンド」と称される（Macfarlane et al.,上記、を参照されたい）。ＰＡＲ−２の切断の原因と知られている主なプロテアーゼは、トリプターゼおよびトリプシンである。
【０００６】
ＰＡＲレセプターの活性化は、多数の細胞性、組織性および全身性の効果を引き起こす。ＰＡＲ−２は特に本発明に関し、米国特許番号第７，２５６，１７２号、第７，１４８，０１８号、第６，８６４，２２９号および第６，３２３，２１９号、米国特許公開番号第２００７０２３７７５９号；第２００６０１４２２０３号；第２００６００６３９３０号；第２００４００８２７７３号；第２００４０２６６６８７号；第２００２００４５５８１号；欧州特許番号第１５１１７６５号および第１２３８２８３号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ０７／０９２６４０；ＷＯ０７／０７６０５５；ＷＯ０６／１２７３９６；ＷＯ０６／１２７３７９；ＷＯ０６／１０４１９０；ＷＯ０６／０７０７８０；ＷＯ０６／０３５９３６；ＷＯ０６／０２３８４４；ＷＯ０４／００３２０２；ＷＯ０４／００２４１８；およびＷＯ０１／５２８８３；ならびに、Hansen et al., 前記; Hollenberg (2003),前記; Hollenberg et al. (2000),前記; and Macfarlane et al.,前記）に論じられている。ＰＡＲ−２の活性化が血管新生した組織および高度に血管新生した器官において応答を誘導することが見い出されてきた（Nystedt, S. et al. (1995) Eur. J. Biochem. 232(1):84-89; Nystedt, S. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 91:9208-9212）。研究により、それが気管支弛緩（ｂｒｏｎｃｈｅｏｒｅｌａｘａｔｉｏｎ）、骨芽細胞によるカルシウムの取り込み、唾液分泌、有糸分裂誘発に影響を与えること、ならびに、胆嚢、腸、腎臓、膵臓、神経系、免疫系、胃および尿管に影響を与えることが示された。ＰＡＲ−２活性化は、ケラチノサイトへの多数の作用を仲介する；カルシウムの取り込み上昇、増殖阻害および分化阻害、ＩＬ−６およびＧＭ−ＣＳＦの産生誘導、色素沈着の増加、メラニンの取り込み上昇、ならびに貪食の上昇である（Derian, C.K. et al. (1997) Cell Growth Differen. 8:743-749; Santulli, R.J. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:9151-9155; Seiberg, M. et al. (2000) Exp. Cell Res. 254:25-32; Seiberg, M. et al. (2000) J. Invest. Dermatol. 115:162-167; Sharlow, E.R. et al. (2000) J. Cell. Sci. 113:3093-3101）。Macfarlaneら、前記、は、ＰＡＲ活性化の多数の作用を概説している。
【０００７】
ＩＩ．炎症
用語「炎症」は、有害な刺激を取り除き、修復／治癒の過程を開始するために、感染、毒物暴露または細胞障害の部位で、白血球および血漿タンパク質の集積および活性化の達成を目的とした免疫系の複雑な応答を表現するために使用される（Abbas, A.K. et al. (2000) Cellular and Molecular Immunology, 4th Ed., W.B. Saunders, Philadelphia, PA）。炎症性応答が、それ故、しばしば望ましい一方、免疫応答の異常制御は、処置しなければ痛みや組織損傷を引き起こしうる不適切な炎症性応答の開始の原因となりうる（例えば、Hickey, Psychoneuroimmunology II (Academic Press 1990)を参照されたい）。
【０００８】
ステロイド性抗炎症薬（グルココルチコイド：ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾン、デキサメタゾン、ベタメタゾンおよびフルドロコルチゾンなど）は、最も強力で即効性があり信頼できる入手可能な抗炎症薬の一員である。これらの薬剤は、炎症における２つの主要な産物：プロスタグランジンおよびロイコトリエンを抑制するように作用する。不運なことに、既存のステロイド性抗炎症薬の使用は、一般的な免疫抑制、高血糖、皮膚脆弱性の上昇、骨密度の低下（骨粗鬆症、高い骨折のリスク、より遅い骨折の修復）、体重増加、筋肉分解（タンパク質分解）、脱力、筋肉量の低下、成長不全、思春期の遅れおよび中枢神経系の興奮を含む著しく有害な副作用を伴いうる（例えば、米国特許公開番号第２００７０２７５９３８号；van Staa, T.P. (2006) Calcif. Tissue Int. 79(3):129-137; Goodman, S.B. et al. (2007) J. Am. Acad. Orthop. Surg. 15(8):450-460; Irving, P.M. et al. (2007) Aliment Pharmacol Ther. 26(3):313-329; Devogelaer, J.P. (2006) Rheum. Dis. Clin. North Am. 32(4):733-757; Allen, D.B. (2006) Adv. Pediatr. 53:101-110; El Desoky, E.S. (2001) Curr. Therap. Res. 62(2):92-112を参照されたい）。
【０００９】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、最も広く使用される分類の治療薬を含む（例えば，Antman, E.M. et al. (Epub Feb 26, 2007) Circulation 115(12):1634-1642; Adachi, M. et al. (2007) Histol. Histopathol. 22(4):437-442; Fortun, P.J. et al. (2007) Curr. Opin. Gastroenterol. 23(2):134-141; Gaffo, A. et al. (2006) Amer. J. Health Syst. Pharm. 63(24):2451-2465; Rosen, J. et al. (2005) Endocr. Rev. 26(3):452-464を参照されたい）。これらの薬剤すべては、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）のアイソフォームの発現を阻害することにより、鎮痛性の、抗炎症性の、および解熱性の特性を示すが（Grosser, T. (2006) Thromb. Haemost. 96(4):393-400; Hawkey, C.J. et al. (2005) Curr. Opin. Gastroenterol. 21(6):660-664; Curry, S.L. et al. (2005) J. Amer. Anim. Hosp. Assoc. 41(5):298-309）、それらには、サリチル酸（アスピリン）、ナプロキセン、イブプロフェン、ビオックス（登録商標）、セレブレックス（登録商標）、ジクロフェナク−ナトリウム、メロキシカムおよびニメスリドを含む構造的に多様な薬剤のセットが含まれる。不運なことに、ＮＳＡＩＤの使用もまた、著しいリスクを伴う（米国特許公開番号第２００７０２３７７４０号および第２００７０１８４１３３号）。ＣＯＸ−２選択的ではないＮＳＡＩＤが、それらを服薬したすべての個体の２０％〜４０％において、胃腸部の副作用を起こしたことが報告されている（Steinmeyer, J. (2000) Arthritis Res. 2(5):379-385）。ＣＯＸ−２選択的なＮＳＡＩＤにさえも、しかしながら、重大な副作用の可能性がある。患者の１〜２％において、重大な胃腸部の出血が見られる。連続的な治療をうける患者の１５〜２０％において、消化性潰瘍が発生するであろう（Singh, G. et al. (1996) Arch. Intern. Med. 156:1530-1536; Brooks, P.M. et al. (1991) N. Engl. J. Med. 324:1716-1725）。
【００１０】
それ故、従来の進歩すべてにも関わらず、炎症、ならびに、炎症、癌、および他の障害による痛覚（疼痛）のための治療的または予防的処置を提供するために使用できる化合物の必要性が残っている。本発明は、この必要性および関連した必要性に関する。
【００１１】
発明の要約
本発明は、ＰＡＲ−２レセプターが炎症性応答を増幅し、ＰＡＲ−２活性化のエフェクターが、それ故、炎症性応答の調節に使用でき、それにより患者に治療効果を与えられるという認識に関する。本発明は、特に、炎症の処置、ならびに、炎症、癌および損傷による痛覚（疼痛）の処置におけるＰＡＲ−２エフェクターの使用に向けられる。本発明は、特に、ＰＡＲ−２活性化のネガティブエフェクターに向けられ、とりわけ、ＰＡＲ−２活性化のネガティブエフェクターである抗ＰＡＲ−２抗体に向けられる。
【００１２】
詳細には、本発明は、プロテアーゼレセプター−２（ＰＡＲ−２）の１つの領域に結合できるドメインを含む（ここで、その結合がＰＡＲ−２の活性化または活性を調節する）ＰＡＲ−２エフェクター分子を含む組成物を提供する。本発明は、特に、その分子がＰＡＲ−２活性化のネガティブエフェクターまたは活性のネガティブエフェクターである、このようなＰＡＲ−２エフェクター分子の態様に関する。
【００１３】
本発明は、特に、そのようなＰＡＲ−２エフェクター分子の態様に関し、ここで、分子は抗体（および特に改変抗体）である。本発明は、特に、そのような改変抗体の態様に関し、ここで、改変抗体は、性質（Ａ）、（Ｂ）もしくは（Ｃ）を示すか、または、性質（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のいずれかの組み合わせを示す。
（Ａ）約０．０３nM〜０．２nMのＫｄを示す；
（Ｂ）ＥＣ５０が約０．２nM〜約０．４nMで、ヒトＰＡＲ−２をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞に対する濃度依存的結合を示す；および／または
（Ｃ）ＩＣ５０が約２．０nM〜約０．５nM、さらに好ましくはＩＣ５０が約１．０nM〜約０．５nMで、上皮細胞中（および、特に、ヒト、ラット、または、マウス上皮細胞系の上皮細胞中）のトリプシン誘導性のカルシウム放出を阻害する。
【００１４】
本発明は、特に、そのようなＰＡＲ−２エフェクター分子の態様に関し、ここで、そのエフェクター分子は、ヒトＰＡＲ−１と比較してヒトＰＡＲ−２に対し少なくとも１００倍強い結合親和性を示す改変抗体である。
【００１５】
本発明は、特に、そのようなＰＡＲ−２エフェクター分子の態様に関し、ここで、エフェクター分子は、配列番号１１〜１５または１７のいずれかの配列を有する重鎖ＣＤＲ、または配列番号１９〜２０のどちらかの配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む改変抗体である。本発明は、特に、そのようなＰＡＲ−２エフェクター分子の態様に関し、ここで、エフェクター分子は、配列番号１１〜１５または１７のいずれかの配列を有する重鎖ＣＤＲおよび配列番号１９の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む改変抗体である。本発明は、特に、そのようなＰＡＲ−２エフェクター分子の態様に関し、ここで、エフェクター分子は、配列番号１１〜１５または１７のいずれかの配列を有する重鎖ＣＤＲおよび配列番号２０の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む改変抗体である。
【００１６】
本発明は、特に、そのようなＰＡＲ−２エフェクター分子の態様に関し、ここで、エフェクター分子は、配列番号２１〜２６または配列番号３０〜３６のいずれかの配列を有する重鎖ＣＤＲ、または配列番号２７〜２８のどちらかの配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む改変抗体である。本発明は、特に、そのようなＰＡＲ−２エフェクター分子の態様に関し、ここで、エフェクター分子は、配列番号２１〜２６または配列番号３０〜３６のいずれかの配列を有する重鎖ＣＤＲおよび配列番号２７の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む改変抗体である。本発明は、特に、そのようなＰＡＲ−２エフェクター分子の態様に関し、ここで、エフェクター分子は、配列番号２１〜２６または配列番号３０〜３６のいずれかの配列を有する重鎖ＣＤＲおよび配列番号２８の配列を有する軽鎖ＣＤＲを含む改変抗体である。
【００１７】
本発明は、特に、そのようなＰＡＲ−２エフェクター分子の態様に関し、ここで、エフェクター分子は、改変抗体Ｐａｒ−Ｂ、Ｐａｒ−ＣまたはＰａｒ−Ｄである。本発明は、特に、そのようなＰＡＲ−２エフェクター分子の態様に関し、ここで、エフェクター分子は、アミノ酸配列が、配列番号３７または配列番号４０のＤＮＡ配列から選択された発現ＤＮＡ配列によってコードされる抗体軽鎖を有する、および／または、アミノ酸配列が、配列番号３８、配列番号３９、または配列番号４１のＤＮＡ配列から選択された発現ＤＮＡ配列によってコードされる重鎖を有する改変抗体である。
【００１８】
本発明は、また、上記のＰＡＲ−２エフェクター分子のいずれかおよび薬理学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物に関する。本発明は、さらに、追加として付加的な抗炎症薬を含むそのような医薬組成物のすべてに関する。
【００１９】
本発明は、また、レシピエント哺乳動物の炎症を処置する方法を提供し、上記のＰＡＲ−２エフェクター分子のいずれかおよび薬理学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物を、そのような処置を提供するのに十分な量で、哺乳動物に投与すること含む。本発明は、さらに、そのような方法のすべてに関し、ここで提供された組成物は追加として付加的な抗炎症薬を含む。本発明は、特に、そのような方法のすべてに関し、ここで、炎症は、乾癬、接触性皮膚炎、炎症性腸疾患、ｔｒａｎｓ  ｖｉｖｏ遅延型過敏症、ＰＡＲ−２仲介大動脈輪弛緩および疼痛からなるグループから選択される。
【００２０】
本発明は、また、レシピエント哺乳動物における炎症を予防または阻害する方法を提供し、哺乳動物に、炎症に前もって、上記のＰＡＲ−２エフェクター分子のいずれかおよび薬理学的に許容しうる賦形剤を含む医薬組成物を、そのような予防または阻害を提供するのに十分な量で投与することを含む。本発明はそのような方法の態様も提供し、ここで、組成物はさらに付加的な抗炎症薬を含む。本発明は、特に、そのような方法の態様に関し、ここで、炎症は乾癬、接触性皮膚炎、炎症性腸疾患、ｔｒａｎｓ  ｖｉｖｏ遅延型過敏症、ＰＡＲ−２仲介大動脈輪弛緩および疼痛からなるグループから選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１、パネルＡ〜Ｃは、細胞膜内のＰＡＲ−２の構造を図示する。図１、パネルＡは、ＰＡＲ−２の一般的な構造を示す。図１、パネルＢは、そのＮ−末端ドメインのタンパク質分解的切断時のＰＡＲ−２の活性化を図示する。ＰＡＲファミリーのレセプターの活性化は、結果として新しいＮ−末端をもたらすタンパク質分解的切断により仲介される。この新しく露出されたリガンドは、その後、これらのＧＰＣＲの第二番目の細胞外ループとの分子内相互作用に関与し、結果として下流のシグナリングイベントをもたらす。テザーリガンドの配列とマッチする短いペプチドもまた、各々のＰＡＲレセプターを活性化でき、それ故ターゲット確認のための重要なツールとして使用できる（図１、パネルＣ）。
【図２】図２は、ＦＲＥＴに基づくペプチド切断アッセイにおいて、抗体Ａｂ３７７７がＰＡＲ−２のトリプシン切断の部分的阻害を示すことを示す。
【図３】図３は、抗体Ａｂ３７７７が、細胞性の切断アッセイにおいて、部分的阻害を示すことを示す。図３のレジェンドを表１に示す。
【図４】図４は、「親和性成熟抗体」ＩｇＧ４＿Ｐｒｏ  Ａｂ４９９６、Ａｂ４９９９、Ａｂ５００５および親ＩｇＧ１Ａｂ３７７７の、ＰＡＲ−２をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞への結合の研究結果を示す。
【図５】図５は、親和性を最適化したＩｇＧを試験するためのＦＬＡＧ−ＰＡＲ−２切断アッセイの代表的なデータを示す。細胞表面でのＦＬＡＧタグの検出は阻害活性と相関する。
【図６】図６は、トリプシン誘導性カルシウム応答アッセイにおいて、抗体Ａｂ３７７７が部分的阻害を示すことを示す。
【図７】図７は、ｅｘ  ｖｉｖｏでのラット大動脈輪のトリプシン誘導性緩和の強力な阻害を示し、本発明の抗ＰＡＲ−２抗体が、ＰＡＲ−２活性化を通して仲介される生物学的応答を機能的に阻害できることを実証する。
【図８Ａ】図８Ａは、抗ＰＡＲ−２抗体Ｐａｒ−Ｂ（図８Ａ）のｔｒａｎｓ  ｖｉｖｏ  ＤＴＨを阻害する能力を示す。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）単独の注入後、またはＰＢＭＣおよびテタヌス毒（ＴＴ）の注入後の、足の厚さにおける変化を示す。マウスは、ＰＢＳ、ヒトＩｇＧ４（２０mg/kg）または抗ＰＡＲ−２抗体で前処理（−３時間に、腹腔内）した。パーセント阻害はバーの上部に示される。＊ｐ＜０．０５（ＰＢＳとの比較）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、抗ＰＡＲ−２抗体Ｐａｒ−Ｄ（図８Ｂ）のｔｒａｎｓ  ｖｉｖｏ  ＤＴＨを阻害する能力を示す。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）単独の注入後、またはＰＢＭＣおよびテタヌス毒（ＴＴ）の注入後の、足の厚さにおける変化を示す。マウスは、ＰＢＳ、ヒトＩｇＧ４（２０mg/kg）または抗ＰＡＲ−２抗体で前処理（−３時間に、腹腔内）した。パーセント阻害はバーの上部に示される。＊ｐ＜０．０５（ＰＢＳとの比較）。
【図９】図９は、抗ＰＡＲ−２抗体Ｐａｒ−ＢおよびＰａｒ−ＤによるＩＬ−８分泌の濃度依存的な阻害を示す。
【００２２】
詳細な説明
炎症性応答におけるＰＡＲ−２の役割は、げっ歯類およびヒトの両方において様々な状況でよく記載されてきた（Cottrell, G. S. et al. (2003) Biochem. Soc. Trans. 31:1191-1197）。ＰＡＲ−２レセプターは広範に低レベルで発現しているが、それらは炎症性刺激に応答して局所的に活性化され、サイトカイン産生および細胞増殖に至る。タンパク質分解活性の上昇およびＰＡＲ−２発現の増加が様々な異なる疾患における炎症部位で示されてきた。結果として肥満細胞の脱顆粒をもたらす初期の炎症性シグナルは、直接的にＰＡＲ−２レセプターに作用するトリプターゼおよびトリプシンの放出を刺激する。ＰＡＲ−２レセプターの刺激は、サイトカイン産生および細胞増殖に至る炎症性応答を増幅する。ＰＡＲ−２はまた、痛覚および神経性炎症（Bunnett, N. W. (2006) Semin. Thromb. Hemost. 32 (Suppl. 1):39-48を参照されたい），ならびに癌の兆候（O'Brien, P.J. et al. (2001) Oncogene 20:1570-1581を参照されたい）に関与することが示されてきた。
【００２３】
上に論じられたように、ＰＡＲ−２（図１、パネルＡ）は、そのＮ−末端のタンパク質分解的切断を通して活性化され、結果として、それによりレセプターを活性化するための、第二番目の膜貫通ループの残基に結合できる「テザー」リガンドの生成をもたらす（図１、パネルＢ）。
【００２４】
本発明は、部分的に、ＰＡＲ−２レセプターが炎症性応答を増幅し、ＰＡＲ−２活性化のエフェクターが、それ故、炎症性応答の調節に使用でき、それにより、患者に対して治療効果を与えられるという認識に由来する。本発明は、特に、炎症の処置、ならびに、炎症、癌および障害による痛覚（疼痛）の処置におけるＰＡＲ−２エフェクターの使用に向けられる。
【００２５】
本明細書において使用される時には、ＰＡＲ−２活性化の「エフェクター」は、ＰＡＲ−２の活性化または活性を調節する分子である。そのようなエフェクター分子は、それらがＰＡＲ−２を活性化する（またはＰＡＲ−２の活性化を促進する）場合には、ＰＡＲ−２活性化の「ポジティブ」エフェクターであろう。あるいは、そのような分子は、それらがＰＡＲ−２の活性化を阻害または抑制する（または、ＰＡＲ−２活性化の速度論を減少させる）なら、ＰＡＲ−２の「ネガティブ」エフェクターであろう。それ故、本発明のＰＡＲ−２のエフェクターは、レシピエントにおける炎症を増加させるためにＰＡＲ−２の活性化を上方制御するエフェクターおよびレシピエントにおける炎症を減少または抑制するためにＰＡＲ−２活性化を下方制御するエフェクターを含む。ＰＡＲ−２のポジティブエフェクターは、非効果的または不十分な免疫応答（例えば、細菌、真菌もしくはウイルスの感染、癌、または老化の場合）を増大するために望ましい（Paludan, S.R. (2000) J. Leukocyte Biol. 67(1):18-25; Garbino, J. et al. (2007) Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 5(1):129-140; Pugin, J. (2007) Novartis Found Symp.280:21-27を参照されたい）。ＰＡＲ−２のネガティブエフェクターは、望ましくない炎症を抑制または阻害するために望ましい。
【００２６】
本発明に限定されることなく、本発明のＰＡＲ−２エフェクターは、様々なメカニズムのいずれかを通して機能してもよい。例えば、本発明のポジティブＰＡＲ−２エフェクターは、テザーリガンドの擬態として作用し、そのようにレセプターの活性化を仲介してもよい（図１、パネルＣ）。あるいは、本発明のＰＡＲ−２エフェクターは、「テザー」リガンドとＰＡＲ−２の第二番目の膜貫通ループの関連残基との間におこる結合を阻害または予防するように作用でき、それにより、ＰＡＲ−２の活性化を阻害または予防する。本発明のＰＡＲ−２エフェクターは、ＰＡＲ−２のＮ−末端の切断を促進するように作用でき、それにより、ＰＡＲ−２活性化の速度論および程度を増大させる。逆に、本発明のＰＡＲ−２エフェクターは、ＰＡＲ−２のＮ−末端の切断を抑制するように作用でき、それにより、ＰＡＲ−２の活性化を減弱または抑制する。本発明のＰＡＲ−２エフェクターの能力は、それ自体、それぞれのターゲットに対するそのようなエフェクターの結合親和性を増加または減少させることによって調節できる。本発明は、特にＰＡＲ−２の活性化のネガティブエフェクターの治療上の使用を意図する。
【００２７】
用語「ＩＣ５０」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて５０％阻害に必要とされる薬物の濃度を意味し、一方、用語「ＥＣ５０」は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて最大効果の５０％をえるために必要とされる血漿濃度を意味する。
【００２８】
本発明は、特に、炎症の処置においてｉｎ  ｖｉｖｏで予防的または治療的使用のできる高い有効性のＰＡＲ−２エフェクターに関する。本明細書において使用される時には、「高い有効性」のＰＡＲ−２エフェクターは、６ｎＭ未満、好ましくは、２ｎＭ未満、さらに好ましくは、１ｎＭ未満、そして、さらにもっと好ましくは、０．５ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満のＥＣ５０を有するＰＡＲ−２エフェクターである。好ましくは、そのような高い有効性のＰＡＲ−２エフェクターは、さらに、６ｎＭ未満、好ましくは、２ｎＭ未満、さらに好ましくは１ｎＭ、そしてさらにもっと好ましくは０．５ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、または０．１ｎＭ未満のＩＣ５０、および、０．５ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、または、さらに好ましくは、０．０５ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を示すであろう。
【００２９】
用語「炎症」は、本明細書において使用される時には、特異的または非特異的防御システムのいずれかの反応に起因する状態および疾患を含むことを意味する。本明細書において使用される時には、用語「特異的防御システム」は、特定の抗原の存在に対して反応する免疫システムのその成分を意味することを意図する。炎症が特定の防御システムの反応に引き起こされる、仲介される、または関連する場合、炎症は特異的な防御システムの応答に起因すると言われる。特定の防御システムの応答に起因する炎症の例には、風疹ウイルスなどの抗原への応答、自己免疫疾患、Ｔ細胞により仲介される遅延型過敏症応答（例えば、マントーテストで、テストの結果が「陽性」である個体において見られるような）などが含まれる。「非特異的防御システム反応」は、免疫記憶の出来ない白血球に仲介される応答である。そのような細胞には、顆粒球およびマクロファージが含まれる。本明細書において使用される時には、炎症が非特異的な防御システムの反応に引き起こされる、仲介される、または関連する場合、炎症は非特異的防御システムの応答に起因すると言われる。少なくとも部分的に非特異的防御システムの反応に起因する炎症の例には、喘息；成人呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、または、敗血症もしくは外傷の二次的な多臓器障害症候群；心筋または他の組織の再灌流障害；急性糸球体腎炎；乾癬、関節リウマチ；反応性関節炎；急性炎症性成分に関する皮膚疾患；接触性皮膚炎；急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性疾患；熱損傷；人工透析；白血球除去；炎症性腸疾患；潰瘍性大腸炎；クローン病；壊死性腸炎；顆粒球輸血に関連する症候群；およびサイトカイン誘導性毒性のような状態に関連した炎症が含まれる。
【００３０】
Ｉ．好ましい組成物
本発明は、特に、ＰＡＲ−２エフェクターとしての抗体分子の使用を意図する。本明細書において使用される時には、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、多選択性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２フラグメント）、ジスルフィド結合Ｆｖなどを含む。そのような抗体は、化学合成を通じて（例えばDawson, P.E. et al. (2000) Ann. Rev Biochem. 69:923-960; Wilken, J. et al. (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9(4):412-426; Kochendoerfer, G.G. et al. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3(6):665-671を参照されたい）、リコンビナントまたはトランスジェニックの手法によって（Wang, M. et al. (2007) IDrugs 10(8):562-565; Aubrey, N. et al. (2006) J. Soc. Biol. 200(4):345-354; Laffly, E., et al. (2006) J. Soc. Biol. 200(4):325-343; Hagemeyer, C.E. et al. (2007) Semin. Thromb. Hemost. 33(2):185-195; Rasmussen, S.K. et al. (2007) Biotechnol. Lett. 29(6):845-852; Gasser, B. et al. (2007) Biotechnol. Lett. 29(2):201-212; Jefferis, R. (2005) Biotechnol. Prog. 21(1):11-16; Smith, K.A. et al. (2004) J. Clin. Pathol. 57(9):912-917; Kipriyanov, S.M. et al. (2004) Mol Biotechnol. 26(1):39-60; Fischer, R. et al. (2003) Vaccine 21(7-8):820-825; Maynard, J. et al. (2000) Ann. Rev. Biomed. Eng. 2:339-376; Young, M.W. et al. (1998) Res. Immunol. 149(6):609-610; Hudson, P.J. (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9(4):395-402を参照されたい）、細胞（例えばハイブリドーマ）培養を介して（Laffly et al., supra; Aldington, S. et al. (2007) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848(1):64-78; Farid, S.S. (2006) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848(1):8-18; Birch, J.R. et al. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58(5-6):671-685; Even, M.S. et al. (2006) Trends Biotechnol. 24(3):105-108; Graumann, K. et al. (2006) Biotechnol. J. 1(2):164-186;米国特許第７，１１２，４３９号；米国特許公開番号第２００７００３７２１６号および第２００４０１９７８６６号）、または他の手法によって産生できる。
【００３１】
最も好ましくは、本発明の抗体ＰＡＲ−２エフェクター分子は、バクテリオファージディスプレイパニング法（例えば米国特許公開番号第２００７０２９２９４７号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０６６３０；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９１／１９８１８；ＷＯ９２／０１０４７およびＷＯ９２／０９６９０；Parmley S. F. et al. (1988) Gene 73:305-318; Bass, S. et al. (1990) Proteins: Structure, Function and Genetics 8:309-314; Greenwood, J. et al. (1991) J. Mol. Biol. 220:821-827; Jespers L.S. et al. (1995) Biotechnology (N.Y.) 13:378-382; Kay, B.K. et al. (1996) In: Phage Display Of Peptides And Proteins: A Laboratory Manual, Winter, J. et al. (Eds.) Academic Press, Inc., San Diego; Dunn, I.S. (1996) Curr. Opin. Biotechnol. 7:547-553; McGregor, D. (1996) Mol. Biotechnol. 6:155-162; Gao, C. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 96:6025-6030を参照されたい）を用いて、（例えば、その結合速度論もしくは特異性を改良するため、または、そのような性質を調節するために）単離および／または精密化されるであろう。
【００３２】
本発明の一つの態様において、そのようなＰＡＲ−２エフェクター抗体は、トリプシン／トリプターゼのプロテアーゼ切断部位をまたがるＮ−末端ＰＡＲ−２ペプチドに結合するその能力で選択されるだろう。そのような結合は、タンパク質分解的切断へのこの領域の到達性を下げ、それ故ＰＡＲ−２の活性化を阻害する。したがって、免疫特異的にこの領域に結合する抗体は、ＰＡＲ−２のネガティブエフェクターである。本明細書において使用される時には、用語「免疫特異的に結合する」とは、抗体とその抗体を誘発する抗原との間の相互作用を特徴付ける特異的な結合を意味する。
【００３３】
ＰＡＲ−２Ｎ−末端ドメイン切断部位（「▼」として示される）はヒトＰＡＲ−２タンパク質（配列番号１）の位置３６〜３７の間に位置する。
【００３４】
配列番号１（ヒトＰＡＲ−２；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ５５０８５）。
【表１】
2011530515.tif 000002
【００３５】
従って、切断部位をまたがる適切な数のアミノ酸残基からなるペプチドフラグメントを調製し、候補抗体のライブラリーをペプチドに対する結合に関してスクリーニングする。さらに具体的には、合成ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤライブラリー（Ostendorp, R. et al. (2004) Antibodies Volume 2: Novel Technologies and Therapeutic Use, pp. 13-52 Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York；米国特許第５，５１４，５４８号；第６，２９４，３５３号；第６，３００，０６４号；第６，６５３，０６８号；第６，６６７，１５０号；第６，６９２，９３５号；第６，６９６，２４８号；第６，７０６，４８４号；第６，７５３，１３６号；第６，８２８，４２２号；第７，０４９，１３５号；第７，２６４，９６３号）をペプチド特異的な結合物の選択に使用した。フラグメントに結合する抗体は、上記のバクテリオファージディスプレイ技術を用いて、その親和性を増加させるために、親和性成熟過程（Brocks, B. et al. (2006) Hum. Antibodies 15(4):115-124; Steidl, S. et al. www.priorartdatabase.com/IPCOM/000159278）を受ける。成熟抗体は、結合の上昇のため、ペプチドおよびＰＡＲ−２発現細胞に対してスクリーニングされる。
【００３６】
最も好ましくは、抗体ＰＡＲ−２エフェクター分子を同定するために使用されるペプチドフラグメントは、様々な哺乳類のＰＡＲ−２分子のＮ−末端切断部位をまたがる配列の比較により導き出されたコンセンサス配列であろう。例えば、ヒトＰＡＲ−２の上記のＮ−末端切断部位をまたがる２１アミノ酸長のペプチドを、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＥ１１９５５）、ラット（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４４６３４９）、およびカニクイザル（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００１１０６２０１）のＰＡＲ−２の相同な配列と比較することにより、好ましいコンセンサス配列（配列番号５）が同定されうる（保存配列を下線で示す）：
【表２】
2011530515.tif 000003
【００３７】
本発明の二番目の態様において、そのような抗体は、ＰＡＲ−２の切断後のＮ−末端の「テザー」リガンドを結合するその能力について選択されるであろう。ＰＡＲ−２の切断後のＮ−末端の「テザー」リガンドの配列は、配列番号１（残基３７〜７５）：ＳＬＩＧＫＶＤＧＴＳ  ＨＶＴＧＫＧＶＴＶＥ  ＴＶＦＳＶＤＥＦＳＡ  ＳＶＬＴＧＫＬＴＴに存在する。「テザー」リガンドに結合する抗体は、「テザー」リガンドがＰＡＲ−２の第二番目の細胞外ループの残基に結合する能力を抑制または阻害し、それ故、ＰＡＲ−２の活性化を阻害する。そのような分子は、ＰＡＲ−２のネガティブエフェクターを含む。
【００３８】
本発明の三番目の態様において、そのような抗体は、ＰＡＲ−２の第二番目の細胞外ループの残基に結合するその能力について選択されるであろう。ＰＡＲ−２の第二番目の細胞外ループの配列は、配列番号１（残基１３１〜１４９）：ＫＩＡＹＨＩＨＧＮＮ  ＷＩＹＧＥＡＬＣＮに見い出される。ＰＡＲ−２のポジティブエフェクターを構成するために、この領域に結合する抗体は、例えば、天然の「テザー」リガンドの擬態物としての役目を果たす事によるか、または、ＰＡＲ−２の第二番目の細胞外ループの残基に対する天然の「テザー」リガンドの結合を促進することによって、ＰＡＲ−２の部分的または完全な活性化を引き起こしうる。あるいは、そのような抗体は、それ自身はＰＡＲ−２の活性化はできず、ＰＡＲ−２活性化を仲介する天然の「テザー」リガンドの能力を阻害するように働きうる（そして、それ故ネガティブＰＡＲ−２エフェクターである。）。それ故、ＰＡＲ−２の第二番目の細胞外ループに結合する抗体は、ループの残基との相互作用の性質に依存して、ＰＡＲ−２のポジティブエフェクターか、ＰＡＲ−２のネガティブエフェクターのいずれかであろう。
【００３９】
最も好ましくは、抗体ＰＡＲ−２エフェクター分子は、「改変抗体」を含むであろう。本明細書において使用される時には、用語「改変抗体」は、抗体が、例えば、天然に生じるＩｇＧ４重鎖および／またはλ軽鎖に導入された非天然に生じるＣＤＲのセット、および／または、非天然に生じる可変および定常鎖領域の融合物（例えば、異なるＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ２）の定常領域への重鎖可変領域の融合物）を含むことを意味する。本発明は、特に、改変前または親抗体と比較して増大した結合を示す改変抗体に関する。本明細書において使用される時には、改変前または親抗体によって示される結合よりも、少なくとも５倍、さらに好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは少なくとも２０倍、さらにもっと好ましくは、少なくとも５０倍、さらにもっと好ましくは、少なくとも１００倍、そして、最も好ましくは、少なくとも１０００倍強いならば、改変抗体の結合が増大されたと言われる。
【００４０】
異なる宿主細胞での増大した発現のため、抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを適応させるため、そして発現を妨害するＲＮＡモチーフを改変するために、コドン最適化の原則が使用されうる。ヌクレオチド配列に対するこれらの変化は、ペプチド配列における変化を起こさない。
【００４１】
本発明の好ましいＰＡＲ−２エフェクター分子は抗体であるが、本発明は、非抗体ＰＡＲ−２エフェクター分子も含む。ある態様では、そのような分子は、非抗体ポリペプチド、例えば、ＰＡＲ−２活性化に作用するためにＰＡＲ−２エピトープに結合する「抗原結合タンパク質」であろう。あるいは、非ペプチドＰＡＲ−２エフェクター（例えば、ペプチド模倣化合物（例えば米国特許第２００７０２３７７５９号を参照されたい）が使用されうる。一般的にペプチド模倣化合物は、ヒト抗体であるが、当業者に周知の方法で、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなるグループから選択される結合によって場合により置換された一個以上のペプチド結合を有するようなパラダイムポリペプチド（すなわち、所望の生物化学的性質または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似している。コンセンサス配列の一個以上のアミノ酸の、同じタイプのＤ−アミノ酸との体系的な置換（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）も、より安定なペプチドを産生するために使用されうる。加えて、コンセンサス配列または実質的に同一であるコンセンサス配列の変異を含む拘束性ペプチドは、当業者に周知の方法（Rizo, J. et al. (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:387-418）で、例えば、ペプチドを環化する細胞内ジスルフィド架橋の形成を可能にする内部のシステイン残基を付加することによって産生されうる。
【００４２】
本発明者のＰＡＲ−２エフェクターの提供が、さらなるエフェクター分子のスクリーニングにおけるそのようなエフェクター分子の使用を可能にする。例えば、ネガティブＰＡＲ−２エフェクター分子（トリプシン／トリプターゼのプロテアーゼ切断部位にまたがるＮ−末端ＰＡＲ−２ペプチドを免疫特異的に結合するＰＡＲ−２エフェクター抗体のようなもの）は、ネガティブＰＡＲ−２作用を逆転させる、または増大させる分子の単離を可能にするために（それにより、ポジティブＰＡＲ−２エフェクター分子またはさらに強力なネガティブＰＡＲ−２エフェクター分子の単離を可能にする）、以下に論じられるＦＬＩＰＲまたは他のアッセイと共に使用されうる。
【００４３】
ＩＩ．組成物の好ましい用途
ＰＡＲ−２活性化のネガティブエフェクターは、乾癬、関節リウマチ、接触性皮膚炎、炎症性腸疾患、喘息のような炎症の処置に特に有用である。乾癬は、リンパ球浸潤、ケラチノサイト過増殖、ならびに炎症促進性のサイトカインおよびケモカインの産生に特徴付けられる皮膚の炎症性疾患である。乾癬は、異常な活性化Ｔ細胞によるサイトカインの産生を含む望ましくない炎症性応答に起因すると信じられている（Chong, B.F. et al. (2007) Clin. Immunol. 123(2):129-138; Ritchlin, C. (2007) Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 3(12):698-706）。この疾患は、白人人口の１〜３％に発症すると報告され、持続的で、外観を損じ、跡が残るであろう（ｓｔｉｇｍａｔｉｚｉｎｇ）（MacDonald, A. et al. (2007) Postgrad. Med. J. 83(985):690-697; Sabat, R. et al. (2007) Exp. Dermatol. 16(10):779-798）。この疾患のための完全に満足な治療法は未だ同定されていない（Menter, A. et al. (2007) Lancet 370(9583):272-284）。
【００４４】
関節リウマチは、関節炎、滑膜過形成、および骨びらんにより特徴付けられる炎症性疾患である。関節リウマチのアジュバンド関節炎モデルでは、ＰＡＲ−２欠損マウスは、関節腫脹が著しく減少し、関節損傷の組織学的な証拠はなかった（Ferrell, W. R. et al. (2003) J. Clin. Invest. 111:35-41）。他のデータは、ＰＡＲ−２の低分子阻害剤（ＥＮＭＤ−１０６８）の使用が、結果として関節炎のカラゲナン／カオリン誘導モデルにおける臨床スコアの減少をもたらしたことを示唆する（Kelso, E.B. (2006) “Therapeutic Promise of Proteinase-Activated Receptor-2 Antagonism in Joint Inflammation,” J. Pharmacol. Exp. Ther. 316(3):1017-1024）。さらに、ＰＡＲ−２アゴニストの関節内注入は、持続的な関節腫脹および滑膜充血を誘導するに十分である。野生型関節炎マウスにおいて、ＰＡＲ−２の発現は滑膜および関節周囲の外側の組織でアップレギュレーションされていることが見い出された（Kelso, E.B. et al. (2006) J. Pharmacol. Exp. Ther. 316:1017-1024）。しかしながら、別のグループは、ＰＡＲ−２ノックアウトマウスにおいて、これらの発見に疑問を投げかけた。Ｂｕｓｓｏらは、ＰＡＲ−２ノックアウトマウスにおいて、ザイモサン誘導関節炎、Ｋ／ＢｘＮ血清誘導関節炎、および抗原誘導関節炎の阻害を示すことが出来なかった（Busso et al. (2007) Arthritis Rheumat. 56:101-107を参照されたい）。
【００４５】
接触性皮膚炎は、刺激性物質およびアレルゲンのような外部因子との接触に対する皮膚の炎症性応答である（Jacob, S.E. et al. (2007) Expert Opin. Pharmacother. 8(16):2757-2774; Diepgen, T.L. et al. (2007) J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21(Suppl 2):9-13; Brasch, J. et al. (2007) J. Dtsch. Dermatol. Ges. 5(10):943-951; Fyhrquist-Vanni, N. et al. Dermatol. Clin. 25(4):613-623; Amado, A. et al. (2007) Actas Dermosifiliogr. 98(7):452-458; Scalf, L.A. et al. (2007) Geriatrics 62(6):14-9）。
【００４６】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、再発性で重大な消化管の炎症により特徴付けられる慢性疾患である。この疾患には、二つの主なサブフォーム、クローン病および潰瘍性大腸炎がある（Nikolaus, S. et al. (2007) Gastroenterology 133(5):1670-1689; Zhong, W. et al. (2008) Front Biosci. 13:1654-1664; Scaldaferri, F. et al. (2007) J. Dig. Dis. 8(4):171-178; Mitsuyama, K. et al. (2007) Anticancer Res. 27(6A):3749-3756; Yamamoto-Furusho, J.K. et al. (2007) World J. Gastroenterol. 13(42):5577-5580; He, S.H. (2004) World J. Gastroenterol. 10(3):309-318）。
【００４７】
喘息は、気道の慢性炎症性疾患である。喘息は、気道の表面上皮のアレルギー性炎症の頻回な発症により開始および促進される気道リモデリングに起因すると考えられている（Tang, M.L.K. et al. (2006) Pharmacol. Therap. 112(2):474-488; Caramori, G. et al. (2003) Pulmon. Pharmacol. Therap. 16(5):247-277; Kawabata, A. et al. (2005) J. Pharmacol. Sci. 97(1):20-24; Reed, C.E. et al. (2004) J. Allergy Clin. Immunol. 114(5):997-1009; Niu, Q.X. et al. (2003) Sheng Li Ke Xue Jin Zhan. 34(4):373-375; Black, J.L. (2002) Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2(1):47-51; Cocks, T.M. et al. (2001) Pulm. Pharmacol. Ther. 14(3):183-191）。喘息の処置における進歩にも関わらず、この疾患は、罹患率、重症度および死亡率における上昇が続いており、世界中で約１０％の小児および５％の成人が発症すると報告されている（Gupta, R. et al. (2004) Bioorg. Medicin. Chem. 12(24):6331-6342）。
【００４８】
本発明の一つの態様は、ＰＡＲ−２活性化が炎症性カスケードを開始するのに関与するという認識、およびそれ故ＰＡＲ−２活性化の下方調節エフェクターが、そのような炎症の、実際のまたは予測された場合の処置に使用しうるという認識に関する。この点で、炎症性の組織は、炎症性サイトカイン産生（例えばＩＬ−８）および顆粒球の浸潤の上昇を伴うタンパク質分解活性の上昇を示す。ＰＡＲ−２は、初期の炎症性応答と、免疫細胞の初期の動員および活性化との間の重要なリンクを提供する。ＰＡＲ−２の発現およびリンパ球の動員も、マウス接触過敏症モデルにおいて上昇する。例えば乾癬の皮膚の炎症におけるＰＡＲ−２の役割と同様、ＰＡＲ−２欠損マウスは、オキサゾロンおよびピクリルクロライドを用いた接触過敏症のモデルにおいて、強い応答を開始できない（Kawagoe, J. et al. (2002) Jpn. J. Pharmacol. 88:77-84）。ヒトにおいて、正常個体の皮膚へのＰＡＲ−２アゴニストの直接的塗布の後、接着性分子の発現（ＥセクレチンおよびＩＣＡＭ）、肥満細胞の活性化およびトリプターゼ産生の上昇も観察される（Seeliger, S. et al. (2003) FASEB J. 17:1871-1885）。アトピー性皮膚炎の患者において、しかしながら、ＰＡＲ−２アゴニストの注入は、強められた持続的なかゆみを引き起こす（Steinhoff, M. et al. (2003) J. Neurosci. 23:6176-6180）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ヒトケラチノサイトはＰＡＲ−２の活性化に応答してＩＬ−８を分泌する（Hou, L. et al. (1998) Immunology 94:356-362）。総合すれば、これらの結果は、ＰＡＲ−２が炎症性カスケードの開始に関与するという本発明の結論を支持している。
【００４９】
ＰＡＲ−２活性化のネガティブエフェクターは、癌（特に、血液細胞癌、脳腫瘍、乳癌、大腸癌、頭頸部癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、および胃癌）の処置に特に有用でもある。ＰＡＲ−２は、増殖、浸潤、および転移を促進するオートクリンループに関与しているので、ＰＡＲ−２活性化のネガティブエフェクターは、癌に対する治療法を提供する（Soreide, K. et al. (2006) J. Pathol. 209(2):147-156; Versteeg, H.H. et al. (2006) Semin. Thromb. Hemost. 32(1):24-32; MacNaughton, W.K. (2005) Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 100(Suppl 1):211-215; Nishibori, M. et al. (2005) J. Pharmacol. Sci. 97(1):25-30; Yamamoto, H. et al. (2003) Nippon Rinsho. 61(Suppl 7):220-224; Riewald, M. et al. (2002) Trends Cardiovasc. Med. 12(4):149-154; Leadley, R.J., Jr. et al. (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 1(2):169-175; Macfarlane et al., supra）。
【００５０】
本発明は、さらに、疼痛（痛覚）の管理におけるＰＡＲ−２活性化のネガティブエフェクターの使用を意図する。痛みは、侵害刺激が侵害受容器と呼ばれる特殊化した一次求心性ニューロンの末梢端を興奮させる時、開始される（Hwang, S.W. et al. (2007) Curr. Opin. Anaesthesiol. 20(5):427-434; Ma, W. et al. (2007) Expert Opin. Ther. Targets 11(3):307-320; Tominaga, M. (2007) Handbook Exp. Pharmacol. 179:489-505; Haddad, J.J. (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 353(2):217-224を参照されたい）。ＰＡＲ−２を含む多数の分子は、痛覚の増幅および伝播に関与する（Itoh, Y. et al. (2005) J. Pharmacol. Sci. 97(1):14-19; Coelho, A.M. et al. (2003) Curr. Med. Chem. Cardiovasc. Hematol. Agents 1(1):61-72; Vergnolle, N. et al. (2001) Trends Pharmacol. Sci. 22(3):146-152）。
【００５１】
（ＡＩＤＳのような）免疫不全症、癌、および感染のような疾患の臨床上の深刻さは、適切な炎症性応答を示し損なうことにより悪化しうる。そのような場合には、ＰＡＲ−２活性化のポジティブエフェクターは、治療上有効である。例えば、ある病原体（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、ＰＡＲ−２のＮ−末端細胞外ドメインを異常な部位で切断するプロテアーゼを発現することが示され、それ故、結果として生じる「テザー」リガンドの細胞外ループの残基に結合する能力に影響を与え、宿主の炎症性応答を減弱させる（例えば、Chignard, M. et al. (2006) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 34(4):394-398を参照されたい）。他の病原体（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、蠕虫、ウイルスなど）も、抗炎症性環境を誘導することにより、感染した患者におけるそれらの生存を促進する（Magez, S. et al. (2006) J. Infect. Dis. 193(11):1575-158; Maizels, R.M. et al. (2004) Immunol. Rev. 201:89-116; Albee, L. (2006) Inflamm. Res. 55(1):2-9; Woodruff, J.F. (1979) J. Immunol. 123(1):31-36）。同様に、自然免疫システムは、炎症誘発性および抗菌性の応答（例えば、デフェンシンの発現）を導くＴＯＬＬ様レセプター（ＴＬＲ）を、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識および結合するために使用する。ＰＡＲ−２の活性化もデフェンシンの発現を誘導するため、ポジティブＰＡＲ−２エフェクター分子は、ＰＡＭＰによる認識を避ける病原体に起因する感染において所望の抗菌性の応答を増大させる（Froy, O. (2005) Cell. Microbiol. 7(10):1387-1397）。ターゲティングされた炎症も、癌の処置において有益であることが示されてきた（Breitbach, C.J. et al. (Epub Jun 19, 2007) Mol. Ther. 15(9):1686-1693）。
【００５２】
ＩＩＩＩ．組成物の投与
本発明は、上記ＰＡＲ−２エフェクターを哺乳類レシピエントおよび特にヒトレシピエントに投与することを意図する。本発明の組成物は、そのようなレシピエントに、炎症をモデュレーションするために治療上効果的な量、提供されるであろう。本明細書において使用される時には、「治療上効果的な量」は、レシピエント患者における炎症の所望のモデュレーションを提供するに十分な本発明の化合物の量を意味する。本発明の組成物は、そのようなレシピエントにおいて進行中の炎症を処置（ＰＡＲ−２のポジティブエフェクターの場合には増強、またはＰＡＲ−２のネガティブエフェクターの場合には抑制）するために治療上効果的な量、レシピエントに提供されるであろう。本明細書において使用される時には、「治療上効果的な量」は、そのような患者の炎症の処置または管理に治療効果を与えるに十分な本発明の組成物の量を意味する。あるいは、望まない炎症を予防するために（ＰＡＲ−２のネガティブエフェクター）、またはそうでなければ不十分な炎症性応答を仲介する可能性のある患者に炎症を誘導するために（ＰＡＲ−２のポジティブエフェクター）、本発明の組成物をレシピエントに予防に効果的な量、提供してもよい。本明細書において使用される時には、「予防に効果的な量」は、患者に投与する際、そのような結果を達成するに十分な本発明の組成物の量を意味する。
【００５３】
本発明の組成物の治療製剤は、所望の純度を有する一個以上のＰＡＲ−２エフェクターの調製物を、任意の生理学的に許容しうる担体、賦形剤、または安定剤と混合することにより（例えば、Gennaro, A.R. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkinsを参照されたい）、例えば、凍結乾燥した製剤または水溶液の形体に、保管のために調製されうる。許容しうる担体、賦形剤、または安定化剤は、レシピエントに対して使用される投与量および濃度で非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールのような）保存料；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールのような糖；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎタンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤といった緩衝剤を含む。
【００５４】
処方には、一種類以上のＰＡＲ−２エフェクター分子が、特定の適応症の処置を提供するのに必要または望ましいように、単独または一個以上の非ＰＡＲ−２炎症モデュレーターと混合して（集団的に「活性な化合物」）含まれうる。好ましくは、そのような活性な化合物は、互いに悪影響を及ぼすことのない相補的な活性を示すであろう。そのような活性化合物は、意図する目的に効果的な量、組み合わせて、適切に存在する。所望なら、そのような化合物は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって調製されるマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリメタクリル酸メチルマイクロカプセル）中に、コロイドのドラッグデリバリーシステム中に（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョン中に封入してもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ前記に開示されている。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通した濾過または当業者に周知の他の方法で容易に達成される。
【００５５】
徐放性製剤を調製してもよい。適切な徐放性製剤の例には、ポリペプチド変異体を含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリックス（そのマトリックスは、成形された物体、例えば、フイルムまたはマイクロカプセルの形体である）を含む。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日間を超える分子の放出を可能にする一方で、あるヒドロゲルは、より短期間タンパク質を徐放する。封入された抗体が長時間体内に残るとき、３７℃での水分への暴露の結果としてそれらは変性または凝集し得、結果として、生物学的活性を失う可能性および免疫原性の変化の可能性を生じる。使用されるメカニズムに合わせて、安定化のために論理的な戦略を考案してもよい。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換を介した分子内ジスルフィド結合形成であると見い出されるなら、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、適当な添加剤の使用および特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって、安定化が達成されうる。
【００５６】
そのような本発明の薬理学的組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内、ならびに局所的な免疫抑制処置が所望ならば病巣内投与を含むいずれかの適した手段により投与してもよい。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が含まれる。好ましくは、注射によって、最も好ましくは静脈内または皮下注射によって、投与が短期になりそうか長期になりそうかにある程度依存して投薬される。そのような薬理学的組成物の適切な投与量は、炎症の調節の目標、処置される疾患または状態の重症度および経過、薬理学的組成物が予防目的で投与されるかまたは治療目的で投与されるか、以前の治療、患者の病歴および以前の薬理学的組成物への応答、ならびに担当医師の裁量によるであろう。本発明の薬理学的組成物は、一度にまたは一連の処置で、患者に適切に投与される。
【００５７】
疾患のタイプまたは重症度に依存して、活性化合物約１μg/kg〜15mg/kg（例えば０．１〜２０mg/kg）が、例えば一回以上の分割投与か持続点滴による患者への投与の最初の候補投与量である。典型的な投与量（例えば一ヶ月に一度または二度投与される）は、上記の要素に依存して、約１μg/kg〜１００mg/kg以上の範囲であろう。数日以上の繰り返し投与に関して、状態に依存して、疾患の症状の所望の抑制が起こるまで処置は持続される。しかしながら、他の投薬計画も有用であろう。この治療の経過は、容易に従来技術およびアッセイによってモニターできる。
【００５８】
今まで一般的に本発明を記載したが、実例によって提供され、特定されない限りは本発明を限定することを意図しない以下の実施例の参照を通して、同様の事がさらに容易に理解できるであろう。
【００５９】
実施例Ｉ
ＰＡＲ−２特異的抗体の単離および特性
ＰＡＲ−２のＮ−末端のプロテアーゼ切断部位にまたがる残基に免疫特異的に結合することのできる抗体（Ｆａｂフラグメント）についてパニングするために、抗体ファージディスプレイ技術を使用した。このスクリーニングにおいて同定された抗体のうち、最初の選択で、抗体Ａｂ３７７７がＰＡＲ−２に対して最も高い親和性（６５nM）を有することが見い出された。親和性成熟において、１０００倍まで改良された親和性および５０pMまで低下した解離定数（Ｋｄ）の抗体が同定された。抗体Ａｂ３７７７の重鎖（ＩｇＧ４）および軽（ラムダ）鎖の可変領域の配列が以下に示される（ＣＤＲ残基には下線が引かれる）：
Ａｂ３７７７  ラムダ３  軽鎖（配列番号６）
【表３】
2011530515.tif 000004
Ａｂ３７７７  ＶＨ３  重鎖（配列番号７）
【表４】
2011530515.tif 000005
Ａｂ４２１３  ラムダ３  軽鎖（配列番号８）
【表５】
2011530515.tif 000006
Ａｂ４２１３  ＶＨ３  重鎖（配列番号９）
【表６】
2011530515.tif 000007
【００６０】
ＰＡＲ−２のＮ−末端のトリプシン仲介切断を阻止する抗体ＡＢ３７７７の能力を評価するために、ＰＡＲ−２のＮ−末端を表す標識したペプチドの切断の際の蛍光の上昇を測定するＦＲＥＴアッセイで抗体をテストした。結果は、Ａｂ３７７７がこのペプチドに結合し、一過性の様式で部分的にこの切断を阻止できたということを示した（図２）。親和性成熟抗体は、ＩＣ５０をこのアッセイのほとんど感度限界である３０nMまで低下させ、完全にペプチド切断を阻害した。抗体のＰＡＲ−２のＮ−末端のトリプシン仲介切断を阻止する能力を細胞で評価するために、ＦＬＡＧタグをつけたＰＡＲ−２過発現ＨＥＫトランスフェクタントをＡｂ３７７７  ｄＨＬＸ二価Ｆａｂの存在下または非存在下、トリプシンで処理した。ＰＡＲ−２の活性化は、フローサイトメトリーアッセイで抗体に検出されるＦＬＡＧエピトープの損失となる、レセプターの切断／内部移行をもたらした（図３）。表１は、図３のレジェンドを提供する。
【表７】
2011530515.tif 000008
【００６１】
図４は、ＰＡＲ−２をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞への親和性成熟抗体ＩｇＧ４＿Ｐｒｏ  Ａｂ４９９６、Ａｂ４９９９、Ａｂ５００５およびその親ＩｇＧ１  Ａｂ３７７７の結合の研究の結果を示す。図５は、親和性が最適化されたＩｇＧを試験するＦＬＡＧ−ＰＡＲ−２切断アッセイの代表的なデータを示す。細胞表面のＦＬＡＧタグの検出は阻害活性と相関する。
【００６２】
二価Ｆａｂ型のＡｂ３７７７は、トリプシン誘導性カルシウム応答アッセイにおいて部分的な阻害を示す。Ａ５４９細胞を用い、トリプシン刺激後のカルシウム応答の検出によって、ＰＡＲ−２の活性化は測定される。Ｆａｂはこの応答を阻害する能力についてこのアッセイで試験された。Ａｂ３７７７（ＰＡＲ−２  Ｐ１ペプチドに対して最高の親和性を有するＦａｂ）は、二価Ｆａｂ型で計測される時、ＦＬＩＰＲの部分的に用量依存的な阻害を示した。このＦａｂは一価型では活性でなかったし、ＩｇＧ１型において活性ではあるがより弱いようである。コントロールの二価Ｆａｂ（Ａｂ３２０７）またはＩｇＧ１（ＬＹ６．３）は、ＰＡＲ−２に結合せず、ネガティブコントロールとして含まれる。抗体濃度はμg/mlで表示される（図６）。
【００６３】
実施例２
抗体Ａｂ３７７７の親和性成熟
抗体Ａｂ３７７７は、機構的アッセイ（ＦＲＥＴに基づくＰＡＲ−２ペプチド切断アッセイ）および機能的アッセイ（細胞に基づくＰＡＲ−２切断アッセイ；細胞に基づくトリプシン刺激カルシウム応答アッセイ）の両方において独特に部分的阻害を示せることが発見された。長期的なアッセイ（例えば、ケラチノサイトによるトリプシン誘導性ＩＬ−８産生）で測定される際にサイトカイン産生を阻害するように、阻害を示す程度を上昇させるため、ＰＡＲ−２のＮ−末端エピトープに対して上昇した親和性を示す、抗体Ａｂ３７７７の誘導体が探索された。そのような抗体は、ＰＡＲ−２切断のより高い阻害および最終的により高い治療効果を提供するであろう。従って、Ａｂ３７７７の親和性成熟に取り掛かった。低いが有意な親和性を示す他のＰＡＲ−２結合抗体（抗体Ａｂ４２１３を含む）のプールの成熟も、さらなる高親和性の結合体の発見可能性を最大化するために、並行して行った。
【００６４】
６３個の親和性成熟Ｆａｂの特徴付けは、親和性、有効性、および多様性の維持に基づく８個の候補物の選択（つまり、親またはプールからの成熟および重鎖または軽鎖におけるそれらの変化を有するもの）につながった（表２）。
【表８】
2011530515.tif 000009
成熟結合体Ａｂ４９９４およびＡｂ４９９６は、溶液中のＰＡＲ−２ペプチドについてのパニングに由来する。他のすべての成熟結合体（Ａｂ４９９７、Ａｂ４９９９、Ａｂ５００３、Ａｂ５００５、Ａｂ５００６、Ａｂ５００７）は、ＰＡＲ−２をトランスフェクションされた細胞についてのパニングに由来する。
【００６５】
親抗体Ａｂ４２１３および成熟抗体（Ａｂ４９９４、Ａｂ４９９６、Ａｂ４９９７、Ａｂ４９９９、Ａｂ５００３、Ａｂ５００５、Ａｂ５００６、およびＡｂ５００７）の重鎖（ＩｇＧ４）および軽（ラムダ）鎖可変領域の配列は以下に記載される（ＣＤＲ残基には下線が引かれる）：
Ａｂ４９９４  ＶＨ３  重鎖（配列番号２１）
【表９】
2011530515.tif 000010
Ａｂ４９９６  ＶＨ３  重鎖（配列番号２２）
【表１０】
2011530515.tif 000011
Ａｂ４９９７  ＶＨ３  重鎖  （配列番号２３）
【表１１】
2011530515.tif 000012
Ａｂ５００３  ＶＨ３  重鎖  （配列番号２４）
【表１２】
2011530515.tif 000013
Ａｂ５００６  ＶＨ３  重鎖  （配列番号２５）
【表１３】
2011530515.tif 000014
Ａｂ５００７  ＶＨ３  重鎖  （配列番号２６）
【表１４】
2011530515.tif 000015
Ａｂ４９９９  ラムダ３  軽鎖  （配列番号２７）
【表１５】
2011530515.tif 000016
Ａｂ５００５  ラムダ３  軽鎖  （配列番号２８）
【表１６】
2011530515.tif 000017
【００６６】
抗体Ａｂ４９９９およびＡｂ５００５の重鎖の配列は、Ａｂ３７７７  ＶＨ３の重鎖の配列（配列番号７）と同じである。抗体Ａｂ４９９４、Ａｂ４９９７、Ａｂ５００３、Ａｂ５００６およびＡｂ５００７の軽鎖の配列は、Ａｂ３７７７  ラムダ３の軽鎖の配列（配列番号６）と同じである。抗体Ａｂ４９９６の軽鎖の配列はＡｂ４２１３  ラムダ３の軽鎖の配列（配列番号８）と同じである。いくつかのクロスクローニングされた（トランスフェクションされた）抗体も作製された：Ａｂ５１４９（Ａｂ４９９７の重鎖と結合したＡｂ４９９９の軽鎖からなる）；Ａｂ５１５０（Ａｂ５００３の重鎖と結合したＡｂ４９９９の軽鎖からなる）およびＡｂ５１５１（Ａｂ５００７の重鎖と結合したＡｂ４９９９の軽鎖からなる）。
【００６７】
上記の抗体のＦａｂフラグメントも作製された。おのおのの場合、上に報告された重鎖可変配列の位置３に現れるグルタミン残基は、グルタミン酸残基と置換された：
ＦａｂのためのＡｂ３７７７  ＶＨ３重鎖（配列番号２９）
【表１７】
2011530515.tif 000018
ＦａｂためのＡｂ４２１３  ＶＨ３重鎖（配列番号３０）
【表１８】
2011530515.tif 000019
ＦａｂためのＡｂ４９９４  ＶＨ３重鎖（配列番号３１）
【表１９】
2011530515.tif 000020
ＦａｂためのＡｂ４９９６  ＶＨ３重鎖（配列番号３２）
【表２０】
2011530515.tif 000021
ＦａｂためのＡｂ４９９７  ＶＨ３重鎖（配列番号３３）
【表２１】
2011530515.tif 000022
ＦａｂためのＡｂ５００３  ＶＨ３重鎖（配列番号３４）
【表２２】
2011530515.tif 000023
ＦａｂためのＡｂ５００６  ＶＨ３重鎖（配列番号３５）
【表２３】
2011530515.tif 000024
ＦａｂためのＡｂ５００７  ＶＨ３重鎖（配列番号３６）
【表２４】
2011530515.tif 000025
【００６８】
抗体Ａｂ４９９９およびＡｂ５００５のＦａｂフラグメントの重鎖配列は、Ａｂ３７７７  ＶＨ３の重鎖の配列（配列番号２９）と同じである。抗体Ａｂ４９９４、Ａｂ４９９７、Ａｂ５００３、Ａｂ５００６およびＡｂ５００７のＦａｂフラグメントの軽鎖の配列は、Ａｂ３７７７  ラムダ３の軽鎖の配列（配列番号６）と同じである。抗体Ａｂ４９９６のＦａｂフラグメントの軽鎖の配列は、Ａｂ４２１３  ラムダ３の軽鎖の配列（配列番号８）と同じである。
【００６９】
これらのＦａｂは、次いで、ＩｇＧ４＿Ｐｒｏ（「ＩｇＧ４ｐ」）型に変換された。ＩｇＧ４＿Ｐｒｏ抗体は、Ｈ鎖のヒンジ領域にＳｅｒ２４１Ｐｒｏの変異を含むヒトＩｇＧ４の定常領域に融合された、対応するＦａｂ由来の可変ＶＨおよびＶＬ領域からなる。ヒンジ領域におけるプロリン置換は、天然のヒトＩｇＧ４分子の半分子の形成を阻止する事が知られている（Angal et al. (1993) Molec. Immunol. 30:105-108）。これらの抗体は、ＨＥＫ細胞に過発現されたＰＡＲ−２に対して改善された結合（ほとんど親和性の影響による）を保有または示した（表３）。親抗体Ａｂ３７７７と比較して、親和性成熟抗体は、親和性において約１０００倍までの改善を示した。このことは、ＧＰＣＲに対する抗体の親和性成熟の効果を示す。
【表２５】
2011530515.tif 000026
【００７０】
ＩｇＧ４＿Ｐｒｏ型の、親和性成熟されクロスクローニングされた抗体は、細胞結合、ＦＬＩＰＲアッセイにおけるトリプシン誘導性カルシウム応答の阻害、ＦＲＥＴアッセイにおけるＰＡＲ−２ペプチド切断の阻害、および細胞に基づくアッセイシステムにおけるＰＡＲ−２切断の阻害に関して評価された。すべての候補物は、ＰＡＲ−２をトランスフェクションされた細胞に対して優れた見かけの親和性（ＥＣ５０）を、そして、すべての短期細胞性アッセイにおいて最大の有効性および効力を示す（表４）。
【表２６】
2011530515.tif 000027
【００７１】
表４に示されるように、親和性におけるこの改善は、ＰＡＲ−２の機能的拮抗作用を測定するアッセイにおいては、効力の上昇に形を変えた。抗体Ａｂ４９９６、Ａｂ４９９９、Ａｂ５１５０およびＡｂ５１５１が、更なる分析のために選択された。
【００７２】
親和性または効力における更なる改善が得られるかどうかを決定するために、８個の親和性成熟抗体由来の最適化された重鎖および軽鎖が組み合わされた。生成された６個の更なる抗体のうち４個が、ＰＡＲ−２をトランスフェクションされた細胞によい結合と機能アッセイにおいて阻害を示した。ＦＬＡＧに基づくアッセイでのＡｂ５００６およびＡｂ５１４７の減少した活性に基づき、これらの抗体はさらなるプロファイリングから除外された。つまり、１４候補抗体の、細胞上のＰＡＲ−２に対する結合親和性、ＦＬＩＰＲにおける機能的阻害、細胞性の切断の阻止、およびペプチド切断の阻止に関する評価後、１０個の候補体（７個は最初の親和性成熟から選択され、３個はクロスクローニングから選択された）が同定された。１０個の候補抗体のうち４個（Ａｂ４９９６、Ａｂ４９９９、Ａｂ５１５０およびＡｂ５１５１）が、発現の最適化に関して選択された。これらの抗体は、ＰＡＲ−２に対するその優れた親和性および特異性、短期細胞性アッセイにおける強い阻害活性の提示、多様性の維持（親の誘導、親和性成熟  対  クロスクローニング）および種の交差反応性の提示に基づいて選択された。
【００７３】
実施例３
抗ＰＡＲ−２抗体の最適化
抗体の可変領域のコドン最適化は、抗体の産生に使用されるハムスター細胞系ＣＨＯ−ＤＧ４４における発現の増大のために使用された。コドンの使用は、ハムスターの傾向に適応させ、ＲＮＡの安定性や発現を妨げるであろうＲＮＡモチーフは取り除いた。３個の候補抗ＰＡＲ−２抗体（Ｐａｒ−Ｂ、Ｐａｒ−ＣおよびＰａｒ−Ｄ）の最適化された可変領域のｃＤＮＡ配列を以下に示す。Ｐａｒ−ＢおよびＰａｒ−Ｃは同じ軽鎖を共有する。
【００７４】
抗体Ｐａｒ−Ｂ
配列番号３７［Ａｂ４９９９軽鎖可変領域の最適化されたｃＤＮＡ配列］
【表２７】
2011530515.tif 000028
配列番号３８［Ａｂ４９９９重鎖可変領域の最適化されたｃＤＮＡ配列］
【表２８】
2011530515.tif 000029
【００７５】
抗体Ｐａｒ−Ｃ
配列番号３７［Ａｂ４９９９軽鎖可変領域の最適化されたｃＤＮＡ配列］
配列番号３９［Ａｂ５００７またはＡｂ５１５１重鎖可変領域の最適化されたｃＤＮＡ配列］
【表２９】
2011530515.tif 000030
【００７６】
抗体Ｐａｒ−Ｄ
配列番号４０［Ａｂ４９９６軽鎖可変領域の最適化されたｃＤＮＡ配列］
【表３０】
2011530515.tif 000031
配列番号４１［Ａｂ４９９６重鎖可変領域の最適化されたｃＤＮＡ配列］
【表３１】
2011530515.tif 000032
【００７７】
実施例４
第一次ターゲットに対する最適化抗ＰＡＲ−２抗体の結合：ＰＡＲ−２ペプチドおよび細胞結合
抗体ＰＡＲ−２エフェクター分子候補は、トリプシン切断部位を含むＮ−末端ＰＡＲ−２ペプチド配列に免疫特異的に結合するその能力について評価された。このエピトープに対する結合親和性を決定するために、異なる種のＰＡＲ−２配列由来のペプチドが使用された（配列番号１〜４、上記）。溶液中のペプチドへの結合は、Ｋｉｎｅｘａ技術により決定された。表５に示されるように、４個の抗体すべてが、３０〜２００pMの範囲の解離定数（Ｋｄ）で、ヒトＰＡＲ−２ペプチドに高い親和性を示した。抗体Ｐａｒ−ＢおよびＰａｒ−Ｃは、マウスＰＡＲ−２ペプチドに対して同様の親和性を示した一方、抗体Ｐａｒ−Ｄは、幾分、より弱い結合を示し、ヒトペプチドと比較して、約１００倍低い結合を示した。さらに、ラットおよびカニクイザルＰＡＲ−２由来のペプチドに対する抗体Ｐａｒ−ＢおよびＰａｒ−Ｄの親和性が測定され、ヒトＰＡＲ−２ペプチドに対してと同様の範囲の解離定数を示した。
【表３２】
2011530515.tif 000033
【００７８】
非改変抗体Ａｂ４９９６、Ａｂ４９９９およびＡｂ５１５１は、ヒトＰＡＲ−２をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞に対して、０．２nM（抗体Ａｂ４９９６およびＡｂ４９９９）ならびに０．４nM（抗体Ａｂ５１５１）のＥＣ５０値で、濃度依存的な結合を示した。これらのデータと一致して、候補抗体Ｐａｒ−ＢおよびＰａｒ−Ｄは、ヒトＰＡＲ−２をトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞に特異的な飽和結合を示した。抗体Ｐａｒ−ＢおよびＰａｒ−Ｄは共に、それぞれ約０．３nMおよび約０．４nM（ｎ＝２）のＥＣ５０値で、強力な結合活性を示した。最大強度が約３〜５倍低い結合も、内在性ＰＡＲ−２を発現すると報告されている親のＨＥＫ２９３細胞系において検出された。さらに、内在性ＰＡＲ−２発現ヒト肺上皮細胞系Ａ５４９に対する抗体の特異的結合が検出され、ＰＡＲ−２のＮ−末端領域由来のＰＡＲ−２ペプチドの添加により阻害できた。
【００７９】
実施例５
抗ＰＡＲ−２抗体の分子選択性
ＰＡＲ−１およびＰＡＲ−４に対するＰＡＲ−２への抗体の分子選択性を、３種すべてのＰＡＲのＮ−末端領域由来のペプチドを用いて評価した：
【表３３】
2011530515.tif 000034
【００８０】
ＥＬＩＳＡ実験は、Ａｂ４９９６、Ａｂ４９９９およびＡｂ５１５１のＰＡＲ−２ペプチド（担体としてのトランスフェリンに結合された）に対する特異的な結合を示したが、ＰＡＲ−４ペプチドには結合しないことを示した。Ａｂ４９９６は、ＰＡＲ−１ペプチドに対して限られた結合（約１００倍弱い）を示した一方、Ａｂ４９９９およびＡｂ５１５１は、ＰＡＲ−１ペプチドに対して検出できる結合は示さなかった。
【００８１】
Ａ５４９細胞において、トロンビンはＰＡＲ−１を活性化する一方、ＰＡＲ−２はトリプシンによって活性化される。それ故、ＰＡＲ−１ペプチドに対するＡｂ４９９６の観察された反応性の機能的関連性を評価するために、トロンビン誘導カルシウム応答を阻害するＡｂ４９９６の能力をＦＬＩＰＲアッセイを用いて分析した。Ａｂ４９９６およびＡｂ５１５１は、トリプシン仲介カルシウム応答の有意な阻害を示したが、抗体濃度が３００nMまでではトロンビン誘導応答の阻害は示さなかった。これらの研究は、観察されたＡｂ４９９６の低レベルのＰＡＲ−１ペプチドへの結合能力は生理学的には関連がなく、単離された抗体はＰＡＲ−２選択的であり、ＰＡＲ−１の活性化を妨げないことを示す。
【００８２】
実施例６
ＰＡＲ−２抗体の細胞活性
抗体Ｐａｒ−Ｂ、Ｐａｒ−ＣおよびＰａｒ−Ｄのすべては、トリプシンで刺激されたヒト肺上皮細胞系Ａ５４９において、それらの親抗体に示されたように強力なカルシウム放出の阻害を示した。
【００８３】
抗体Ｐａｒ−ＢおよびＰａｒ−Ｄの細胞活性は、ヒト初代ケラチノサイトを用いたＦＬＩＰＲアッセイで評価された。３８４ウェル平底組織培養プレートに、ヒトケラチノサイト（２×１０５細胞）を３７ｏＣ、５％ＣＯ２で、一晩インキュベーションした。培養培地を取り除いた後、コンフルエントの細胞層はＦｌｕｏ−３、ＡＭ細胞透過性色素をロードされた。細胞層を２回洗浄した後、ヒトケラチノサイトを各種濃度の抗体Ｐａｒ−ＢおよびＰａｒ−Ｄと共に３０分間インキュベーションし、その後０．１４μMのトリプシンで刺激した。細胞のカルシウムフラックスを蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）を用いて計測した。両方の抗体は、Ａ５４９細胞に見られる活性に匹敵する低ナノモル範囲のＩＣ５０値で、ヒト初代ケラチノサイトにおけるトリプシン仲介カルシウムフラックスを濃度依存的に阻害した。両方の抗体は、Ａ５４９細胞に見られる活性に匹敵する低ナノモル範囲のＩＣ５０値で、効率的に濃度依存的な阻害を示した。
【００８４】
マウスＰＡＲ−２との機能的な交差反応性をさらに評価するために、抗体は、マウスルイス肺がん（ＬＬＣ）細胞系を用いたＦＬＩＰＲアッセイで試験された。抗体Ｐａｒ−ＢおよびＰａｒ−Ｃは、ＬＬＣ細胞においてトリプシン誘導性カルシウム放出の効率的な阻害を示した一方、抗体Ｐａｒ−Ｄは、有意な効果を示さなかった。ＦＬＩＰＲアッセイの結果を表６に示す。
【表３４】
2011530515.tif 000035
【００８５】
第二の長期の細胞に基づくアッセイにおいて、ＩＬ−８の分泌が、約２０時間トリプシンで刺激されたヒト初代ケラチノサイトにおいて分析された。上記ＦＬＩＰＲアッセイの結果と一致して、ＩＬ−８の分泌の明確な濃度依存的阻害が観察された（図９）。しかしながら、ＦＬＩＰＲアッセイとは対照的に、抗体ＰＡＲ−２エフェクター分子候補の効力は約１００倍低かった。
【００８６】
このアッセイにおけるＩＣ５０は、約１００nMであった。しかしながら、完全な容量反応曲線が得られなかったため、これはただの推計である。ＩＬ−８アッセイにおける（ＦＬＩＰＲアッセイと比較して）より低い効力は、ＰＡＲ−２上の同じ結合部位に対して抗体と競合するトリプシンとの長いインキュベーションによって説明されるかもしれない。
【００８７】
要約すれば、所望の抗ＰＡＲ−２抗体の阻害活性は、二つの異なる細胞性アッセイ（カルシウム放出またはＩＬ−８分泌の測定）において示された。後者のアッセイの結果は、ヒトケラチノサイトは適切なターゲットであり、好中球を引きつけるケモカインＩＬ−８の抗体仲介阻害は乾癬において治療効果を提供しうる。このアッセイの結果の要約は、表７に報告される。
【表３５】
2011530515.tif 000036
【００８８】
実施例７
種交差反応性および大動脈輪アッセイ
非ヒト種との交差反応性の分析は、薬理学的および毒物学的研究において使用できる関連した種の同定を促進するために望ましい。上記ＰＡＲ−２ペプチドの結合および細胞のＦＬＩＰＲアッセイは、抗ヒトＰＡＲ−２抗体のげっ歯類のＰＡＲ−２との交差反応性を評価するために使用された。
【００８９】
抗体Ｐａｒ−Ｄは、マウスペプチドに対して少しより低い結合活性を有するようであったが、上記のように、両抗体Ｐａｒ−ＢおよびＰａｒ−Ｄは、ヒトペプチドに対して観測された親和性に匹敵するナノモル未満の親和性をマウスＰＡＲ−２ペプチドに対して示した。上記のマウスＬＬＣ細胞系を用いたＦＬＩＰＲ研究は、抗体Ｐａｒ−Ｂの強力な阻害活性を示したが、抗体Ｐａｒ−Ｄの効果は示さなかった。
【００９０】
非ヒトＰＡＲ−２に対するこれらの抗体の機能的な交差反応性を評価するために、大動脈輪アッセイを初代げっ歯類組織を用いて実施した（Saifeddine M. et al. (1996) Br. J. Pharmacol 118:521-530; Kamata, K. et al. (1997) Res. Commun. Mol. Pathol. Pharmacol. 96:319-328を参照されたい）。このアッセイは、ラットまたはマウスの大動脈輪組織のトリプシン誘導性弛緩におけるＰＡＲ−２抗体の阻害活性を測定する。トリプシンおよびＰＡＲ−２アゴニストペプチドが、おそらくＰＡＲ−２仲介の亜酸化窒素（ＮＯ）産生および内皮由来過分極因子（ＥＤＨＦ）を通じて、事前に緊張した大動脈輪を弛緩させることが出来るということが見い出された（図７）。抗体Ｐａｒ−ＢおよびＰａｒ−Ｄは各々、ラット大動脈輪のトリプシン誘導性弛緩の強力な阻害を示すことが見い出された一方、マウスの大動脈輪の弛緩は抗体Ｐａｒ−Ｂによってのみ阻害され、抗体Ｐａｒ−Ｄには阻害されなかった。これらのデータは、マウスおよびラット細胞系を用いたＦＬＩＰＲ研究由来の上記データと一致している。結論として、抗体Ｐａｒ−Ｂはマウスおよびラット両方のＰＡＲ−２と機能的な交差反応性を示す一方、抗体Ｐａｒ−ＤはラットＰＡＲ−２のみと機能的活性を示すが、マウスＰＡＲ−２とは示さない。種交差反応性研究は、以下の表８に要約した。
【表３６】
2011530515.tif 000037
【００９１】
実施例８
ｔｒａｎｓ  ｖｉｖｏ  ＤＴＨモデルにおけるＰＡＲ−２抗体の活性
ｔｒａｎｓ  ｖｉｖｏ遅延型過敏症（ＤＴＨ）は、マウスにおけるヒトＴ細胞の仲介する炎症の検証されたモデルである（Warnecke, G. et al. (2007) Transplantation 84(3):392-399; Pelletier, R.P. et al. (March 28, 2007, Epub) Hum. Immunol.  68(6):514-522; Carrodeguas, L. et al. (1999) Hum. Immunol. 60(8):640-651）。このアッセイでは、テタヌスで感作されたドナー由来のヒトＰＢＭＣが単離され、マウスの足蹠にテタヌス毒（ＴＴ）と共に同時注入される。足蹠で発生するこの腫れ応答は２４時間目に計測される。この腫れ応答は、ヒトＴ細胞の抗原特異的活性化およびマウス細胞に仲介される炎症に依存する。
【００９２】
図８Ａおよび図８Ｂに示されるのは、ＰＢＭＣおよびＴＴの注入後２４時間の足蹠の厚みにおける変化である。抗体Ｐａｒ−Ｂ（図８Ａ）およびＰａｒ−Ｄ（図８Ｂ）は、１０mg/kgでのデキサメタゾンの有効性（約８０％阻害）と同様の有効性で容量依存的に応答を阻害した（20mg/kgで７１％阻害）。これらの実験は、抗ＰＡＲ−２抗体のｉｎ  ｖｉｖｏにおける細胞仲介性免疫応答を機能的に阻害する能力を示す。
【００９３】
この明細書で言及されたすべての刊行物および特許は、各々の刊行物または特許出願が、引用によってその全体が具体的および個別に引用されることを示される場合と同じ程度に、引用によって本明細書に援用される。本発明はその具体的態様に関して記載された一方、さらに改変できること、および本出願が一般的に本発明の原理に従う本発明のすべての変化、使用、または適応を含めることを意図し、本発明の関連する技術分野において周知または慣行であって、本明細書において説明された本質的特徴に適用されうる本発明の開示からのそうした逸脱も含まれることは理解されるであろう。
【図１】
2011530515.tif 000038
【図２】
2011530515.tif 000039
【図３】
2011530515.tif 000040
【図４】
2011530515.tif 000041
【図５】
2011530515.tif 000042
【図６】
2011530515.tif 000043
【図７】
2011530515.tif 000044
【図８Ａ】
2011530515.tif 000045
【図８Ｂ】
2011530515.tif 000046
【図９】
2011530515.tif 000047
【配列表】
2011530515000001.app
【国際調査報告】
2011530515.tif 000048
2011530515.tif 000049
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