(57)【要約】  免疫系を抑制している免疫標的を処置し、免疫系を回復する方法であって、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、血液中のＢ及びＴ細胞の数を修正し、リンパ節を局所的に活性化し、免疫標的に隣接する領域にヘルパーＴ及びＢ細胞を浸潤させ、免疫標的にキラーＴ細胞及びマクロファージを浸潤させ、免疫標的を処置し、免疫系を回復させる、ステップを有する方法。患者に免疫を誘発させる方法。腫瘍を破壊する方法。癌治療に有利な治療結果を予測する方法。免疫予防の方法。免疫回復の方法。腫瘍を処置する方法。腫瘍エスケープを防止する方法。【選択図】図１
2011521967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系を抑制している免疫標的を処置し、免疫系を回復する方法であって、
初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、
血液中のＢ及びＴ細胞の数を修正し、
リンパ節を局所的に活性化し、
免疫標的に隣接する領域にヘルパーＴ及びＢ細胞を浸潤させ、
免疫標的にキラーＴ細胞及びマクロファージを浸潤させ、
免疫標的を処置して、免疫系を回復させる、ステップを有する方法。
【請求項２】
前記修正するステップが、血液中のＢ及びＴ細胞の数を上方制御又は下方制御することとして更に定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記修正するステップが、ナイーブＴ細胞及び早期メモリーＴ細胞の数を修正することとして更に定義される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記修正するステップが、ＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＣＲ７＋ナイーブＴ細胞の数を修正することとして更に定義される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記修正するステップが、ナイーブＴ細胞をメモリー及びエフェクターＴ細胞に分化させることとして更に定義される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
セントラルメモリーＴ細胞を血流から流出させ、排液性リンパ節に移動させるステップを更に有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記修正するステップが、Ｂ細胞をリンパ節に補充し、Ｂ細胞を抗原に暴露し、Ｂ細胞を免疫標的に移動させ、免疫標的を攻撃させることとして更に定義される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記攻撃するステップが、免疫標的を攻撃する抗体の作製及び抗体依存細胞性細胞毒性の支持からなる群から選択される作用として更に定義される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記活性化するステップが、リンパ節を局所的に肥大させ、リンパ球を補充し、洞組織球増殖症を回復に向けさせることとして更に定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫標的に隣接する領域に浸潤させるステップが、免疫標的に隣接する領域にＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋及びＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ２０＋Ｂリンパ球を浸潤させることとして更に定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫標的に浸潤させるステップが、免疫標的にＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球及びＣＤ６８＋マクロファージを浸潤させることとして更に定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫標的に隣接する領域に浸潤させるステップ及び前記免疫標的に浸潤させるステップが、体液性及び細胞性免疫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記初代細胞由来生物製剤が、ＩＲＸ−２として更に定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与ステップが、更にＩＲＸ−２の投与前に低用量のシクロホスファミドを投与することを有し、更にレギュラトリーＴ細胞リンパ球により抑制を回復に向かわせるステップを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与ステップが、更にインドメタシン及び亜鉛を毎日投与することを有することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与ステップが、更にＩＲＸ−２を毎日又は断続的に週に３日、７日の内５日、５〜２０日間皮下に投与することとして更に定義される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与ステップが、更に１日当たり３０〜７００ユニットのＩＲＸ−２を投与することとして更に定義される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
外因性抗原を投与するステップを更に有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
外科手術、放射線療法、化学療法又はそれらの組み合わせを行うステップを更に有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫標的が、遺伝子異常、癌、感染、栄養不良、火傷、ＡＩＤＳ、ＨＩＶ、化学療法及び放射線療法からなる群に起因する生物学的状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
患者に免疫を誘発させることを有する方法であって、
初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、
Ｔ及びＢ細胞の変化を検出し、
患者に免疫を誘発させる、ステップを有する方法。
【請求項２２】
腫瘍を破壊する方法であって、
初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、
未成熟樹状細胞を成熟させ、
ナイーブＴ細胞を活性化させ、
得られた成熟樹状細胞がナイーブＴ細胞を刺激し、
ナイーブＴ細胞をキラーＴ細胞に分化させ、
キラーＴ細胞を腫瘍に移動させ、
腫瘍を破壊する、ステップを有する方法。
【請求項２３】
初代細胞由来生物製剤がＩＲＸ−２として更に定義される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
癌治療に有利な治療結果を予測する方法であって、
初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、
腫瘍周囲におけるヘルパーＴ及びＢ細胞及び腫瘍内におけるキラーＴ細胞及びマクロファージの増加を検出し、
癌治療に有利な治療結果を予測する、ステップを有する方法。
【請求項２５】
前記検出するステップが、腫瘍周辺のＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋及びＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ２０＋Ｂリンパ球の増加、及び腫瘍内のＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球及びＣＤ６８＋マクロファージの増加を検出することとして更に定義される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
初代細胞由来生物製剤が、ＩＲＸ−２として更に定義される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
免疫予防の方法であって、
初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、
免疫抑制を防止する、ステップを有する方法。
【請求項２８】
前記防止するステップが、未成熟樹状細胞を成熟させ、ナイーブＴ細胞を活性化させ、得られた成熟樹状細胞がナイーブＴ細胞を活性化させ、活性化されたナイーブＴ細胞をアポトーシスから保護し、ナイーブＴ細胞をメモリー及びエフェクターＴ細胞に分化させ、免疫系が抑制されないようにリンパ節を局所的に活性化させることとして更に定義される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
初代細胞由来生物製剤が、ＩＲＸ−２として更に定義される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
免疫回復の方法であって、
初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、
患者の免疫系を回復させる、ステップを有する方法。
【請求項３１】
前記回復させるステップが、未成熟樹状細胞を成熟させ、ナイーブＴ細胞を活性化させ、得られた成熟樹状細胞がナイーブＴ細胞を活性化させ、活性化されたナイーブＴ細胞をアポトーシスから保護し、血液中のＢ及びＴ細胞の数を修正し、リンパ節を局所的に活性化し、免疫標的に隣接する領域にヘルパーＴ及びＢ細胞を浸潤させ、免疫標的内にキラーＴ細胞及びマクロファージを浸潤させることとして更に定義される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
初代細胞由来生物製剤が、ＩＲＸ−２として更に定義される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
免疫標的が腫瘍である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍を治療する方法であって、
初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、
血液中のＢ及びＴ細胞の数を修正し、
リンパ節を局所的に活性化し、
腫瘍周囲にヘルパーＴ及びＢ細胞を浸潤させ、
腫瘍内にキラーＴ細胞及びマクロファージを浸潤させ、
腫瘍を処置する、ステップを有する方法。
【請求項３５】
初代細胞由来生物製剤が、ＩＲＸ−２として更に定義される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記処置するステップが、腫瘍の軟化、腫瘍に起因する痛みの緩和、腫瘍の縮小、腫瘍の断片化、腫瘍の壊死及び腫瘍の線維化からなる群から選択される少なくとも１つの結果を提供する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
腫瘍エスケープを防止する方法であって、
初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、
血液中のＢ及びＴ細胞の数を修正することによって腫瘍の免疫退化を形成し、
リンパ節を局所的に活性化し、
腫瘍周囲にヘルパーＴ及びＢ細胞を浸潤させ、
腫瘍内にキラーＴ細胞及びマクロファージを浸潤させ、
腫瘍エスケープを防止する、ステップを有する方法。
【請求項３８】
初代細胞由来生物製剤が、ＩＲＸ−２として更に定義される、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫系の治療に関する。特に、本発明は、初代細胞由来生物製剤（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ）の免疫系に対する作用機序に関する。
【背景技術】
【０００２】
二十世紀初頭に、ウィリアム・コーリーが毒素によるヒト癌の腫瘍退縮を行ったため、癌治療者は、臨床反応が比較的まれであるにもかかわらず、何百もの異なる免疫治療を行った。これらの失敗の原因について洞察することがほとんど又は全くなかったため、一貫した作用機序は明らかにされなかった。明確な作用機序を確立するためには、常に反応を引き起こし、分析可能な治療を構築する必要があった。
【０００３】
頭頸部扁平上皮癌（ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ：Ｈ＆ＮＳＣＣ）がその患者に見られる免疫不全についてよく知られているので、よいモデルとなる。数例を挙げれば、（１）腫瘍並びにプロスタグランジン、レギュラトリーＴ細胞、骨髄サプレッサー細胞、抗原抗体複合体、ＩＬ−１０などのサイトカイン等を含む宿主経由機序により誘導されたＴリンパ球アネルギー及び喪失（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，２００１；Ｈａｄｄｅｎ，１９９５）、（２）サプレッサー及び炎症性変化の兆候を有する単球／マクロファージの機能異常（Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，２００２）及び（３）洞組織球増殖症（ｓｉｎｕｓ  ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｓｉｓ：ＳＨ）により特徴付けされる樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ：ＤＣ）の異常（Ｄｕｎｎ，２００５）などがある。
【０００４】
異常を回復するには、効果的な治療努力が必要であった。広範な文献の再調査（Ｈａｄｄｅｎ，１９９５）及び一連の臨床前試験により、初代細胞由来生物製剤（ＩＲＸ−２としても知られている）プロトコルが得られた。ＩＲＸ−２プロトコルは、図１に示すように、静脈内注射による低用量（３００ｍｇ／ｍ２）のシクロホスファミド（ＣＹ）を、レギュラトリーＴ細胞リンパ球或いはその他のサプレッサーによる抑制を回復するため、初期投与として使用する。ＣＹに続いて、ＩＲＸ−２を、癌領域のリンパ節の頸部鎖に供給されるように、頭蓋底に１０〜２０日間毎日投与する。これらのリンパ節部位は、免疫が起こる場所として知られている（Ｍａａｓｓ，１９９５）。
【０００５】
ＩＲＸ−２は、Ｔリンパ球の数と機能を上昇させて作用すると考えられていた。近年、米国特許仮出願第６０／９９０，７５９号（Ｓｉｇｎｏｒｅｌｌｉら）に開示されているように、腫瘍誘導性アポトーシスの反転（ｒｅｖｅｒｓａｌ）が主な機構であることが示された。インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ：ＩＮＤＯ）を約２１日間、毎日投与し、腫瘍及び公知の癌関連抑制機構である単球/マクロファージによるプロスタグランジン産生を阻止した。亜鉛もまた、方法の免疫回復成分の他の態様として投与された（Ｈａｄｄｅｎ，１９９５）。
【０００６】
また、上記プロトコルが開発された時点では、Ｔ細胞への腫瘍抗原の提示者として樹状細胞が重要な役割を果たしていることは知られており、ＳＨがＤＣの異常を反映していることも知られていた。米国特許第６，９７７，０７２号及び第７，１５３，４９９号に開示されている作用機序に関する出願人の研究により、ＩＲＸ−２プロトコルがこのＤＣの異常を回復し、強力な免疫を反映する局所のリンパ節変化を起こすこと（Ｍｅｎｅｓｅｓ，２００３）が明らかになった。より具体的には、上記特許は、ナイーブＴ細胞の産生を誘発し、好ましくはサイトカインＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＮＦ−γ及びＴＮＦ−αを含む、ＩＲＸ−２の投与によるＴ細胞免疫を回復させる方法を開示している。これは分子的治療を通して成人がナイーブＴ細胞を産生することができることを最初に示したものの１つであり、また、回復すべき免疫に抗原を提示できるナイーブＴ細胞の存在を示したものである。
【０００７】
ＩＲＸ−２を支持するメカニズム仮説は、抗原投与の必要はないが、治療用癌ワクチンのメカニズムに類似する。頸部に投与されたＩＲＸ−２は、ＤＣ上で頸部リンパ節鎖に直接作用し、成熟及びそれに続くナイーブＴ細胞への内因性腫瘍抗原の提示能力を促進するものと考えられている。
【０００８】
ＩＲＸ−２の作用機序に関する非臨床データは、ＩＲＸ−２がヒト単球由来ＤＣを効果的に刺激、活性化することを示した（Ｅｇａｎ，２００７）。未成熟ＤＣのＩＲＸ−２処置は、ナイーブＴ細胞への抗原提示に重要である分子の分化に加え、ＣＤ８３及びＣＣＲ７（それぞれ、成熟及びリンパ節遊走のマーカーである）の発現を増大させる。また、ＩＲＸ−２は、ナイーブＴ細胞の活性化に重要な共刺激レセプターである、ＣＤ４８、ＣＤ５４及びＣＤ８６を誘導する。ＩＲＸ−２で処置されたＤＣにおける機能的な変化には、抗原提示及びＴ細胞活性の増強が含まれていた。以上をまとめると、未成熟ＤＣのＩＲＸ−２処置は、ナイーブＴ細胞を効果的に刺激できる、成熟かつ活性化されたＤＣの成長に一致するＴ−形態学的表現型機能変化を引き起こす。
【０００９】
抗原特異的反応性を測定することが可能な、定義済みの抗原に基づく治療用癌ワクチンとは対照的に、拒絶抗原はＨ＆ＮＳＣＣ内に見出されていないので、ＩＲＸ−２治療後の抗原特異的反応の測定能が制限される。
【００１０】
ＩＲＸ−２はＴリンパ球の機能を増強し、新たな未成熟Ｔ細胞の生成及び一旦生成されたこれらＴ細胞のアポトーシスを防止することが示されたが、抗原の提示後のＴ細胞の機能については知られていない。Ｔ細胞による腫瘍処置についての正確な機構は、先行技術には明示的にも本質的にも開示されていない。更に、ＩＲＸ−２は癌治療の間に上述の機構において効果を有することが示されたが、ＩＲＸ−２が癌以外の免疫抑制の他の例において同様な作用機序を提供できるという証拠はない。個々のサイトカインが免疫系の各部位を完全には回復させることができなかっただけでなく、複数のサイトカインを含む他の治療も同様に免疫系を回復させることはできなかった。例えば、マルチカイン（ＭＵＬＴＩＫＩＮＥ：Ｃｅｌ−Ｓｃｉ）は腫瘍自身のみに有効で、腫瘍細胞の細胞周期に影響するが、免疫系に影響を与えるという証拠は示されていない。
【００１１】
本質的に、出願人の初期の研究は、免疫系に影響を与えるいくつかの特定の基準における初代細胞由来生物製剤の作用機序について記載している。ここでは、免疫系に影響する、即ち、リンパ球の生存に影響する初代細胞由来生物製剤の他の基準の証拠を示す。ここでのデータは、初代細胞由来生物製剤は、免疫系の各基準に対して、即ち、免疫系の各部門に対して、補正的な、プラス効果を有することを示している。先行技術の組成は、免疫系の単一の部門に向けられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、免疫系の各部門を効果的な対象として免疫系を回復する、免疫抑制に対する完全な作用機序を提供する組成に対する要望がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、（固形腫瘍、バクテリア感染、ＨＩＶなどの感染症等の）免疫系を抑制している免疫標的を処置し、免疫系を回復する方法を提供する。本発明の方法は、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、血液中のＢ及びＴ細胞の数を修正し、リンパ節を局所的に活性化し、免疫標的に隣接する領域にヘルパーＴ及びＢ細胞を浸潤させ、免疫標的にキラーＴ細胞及びマクロファージを浸潤させ、免疫標的を処置し、免疫系を回復させる、ステップを有する。
【００１４】
本発明はまた、患者に免疫を誘発させる方法であって、上記免疫が、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、Ｔ及びＢ細胞の変化を検出し、患者に免疫を誘発させる、ステップを有する方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、腫瘍を破壊する方法であって、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、未成熟樹状細胞を成熟させ、ナイーブＴ細胞を活性化させ、得られた成熟樹状細胞がナイーブＴ細胞を刺激し、ナイーブＴ細胞をキラーＴ細胞に分化させ、キラーＴ細胞を腫瘍に移動させ、腫瘍を破壊する、ステップを有する方法を提供する。
【００１６】
本発明は、癌治療に有利な治療結果を予測する方法であって、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、腫瘍周囲におけるヘルパーＴ及びＢ細胞及び腫瘍内におけるキラーＴ細胞及びマクロファージの増加を検出し、癌治療に有利な治療結果を予測する、ステップを有する方法を提供する。
【００１７】
本発明は、免疫予防の方法であって、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、免疫抑制を防止する、ステップを有する方法を提供する。
【００１８】
本発明は更に、免疫回復の方法であって、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、患者の免疫系を回復させる、ステップを有する方法を提供する。
【００１９】
本発明は、腫瘍を治療する方法であって、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、血液中のＢ及びＴ細胞の数を修正し、リンパ節を局所的に活性化し、腫瘍周囲にヘルパーＴ及びＢ細胞を浸潤させ、腫瘍内にキラーＴ細胞及びマクロファージを浸潤させ、腫瘍を処置する、ステップを有する方法を提供する。
【００２０】
本発明はまた、腫瘍エスケープを防止する方法であって、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、血液中のＢ及びＴ細胞の数を修正することによって腫瘍の免疫退化を形成し、リンパ節を局所的に活性化し、腫瘍周囲にヘルパーＴ及びＢ細胞を浸潤させ、腫瘍内にキラーＴ細胞及びマクロファージを浸潤させ、腫瘍エスケープを防止する、ステップを有する方法を提供する。
【００２１】
本発明の他の利点は、添付の図面に関連して考慮される以下の詳細な説明を参照することにより一層良好に理解されるにつれて、容易に評価されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＩＲＸ−２プロトコルの表示である。
【００２３】
【図２】ＩＲＸ−２の体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）投与量に対する反応を示すグラフである。
【００２４】
【図３】４つの患者群における生存率を示すグラフである。
【００２５】
【図４】４つの患者群におけるリンパ球浸潤の比率の中央値を示すグラフである。
【００２６】
【図５】リンパ球のＨ＆Ｅ染色の写真である。
【００２７】
【図６】リンパ球浸潤のＨ＆Ｅ染色の写真である。
【００２８】
【図７】Ａは反応者におけるリンパ浸潤濃度（ｄｅｎｓｉｔｙ）を示すグラフ、Ｂは非反応者におけるリンパ浸潤濃度を示すグラフである。
【００２９】
【図８】腫瘍内／腫瘍周囲リンパ球浸潤の部位を示すグラフである。
【００３０】
【図９】ＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＴ細胞のＩＨＣ染色を示す写真である。
【００３１】
【図１０】第０日、第２１日における融合ＦＤＧ−ＰＥＴ／ＣＴスキャン画像である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
全体として、本発明は、腫瘍及び全体的な免疫系の両者に対するＩＲＸ−２の作用機序に向けられるものであり、初代細胞由来生物製剤を投与することによる免疫標的の処置方法を提供する。初代細胞由来生物製剤は、以下に更に詳述するように、免疫標的の免疫拒絶を形成する。
【００３３】
本明細書中では、「免疫標的」とは、免疫系の抑制をもたらす生物学的状態又は免疫抑制をもたらす疾病を意味する。免疫標的は、抑制により免疫系が非反応性である、抗原標的でもある。本発明では、免疫標的は、免疫抑制を転換し、免疫系を正常機能に回復させる初代細胞由来生物製剤の「ターゲット」となる。免疫標的は、免疫系組成の遺伝子異常（内因性又は原発性免疫不全）によって引き起こされる。免疫標的はまた、外因性因子（二次免疫疾患）によっても引き起こされる。例えば、免疫標的は、ＡＩＤＳやＨＩＶなどの疾病、放射線照射（放射線治療）、化学療法、栄養不良、火傷、感染、特に癌（腫瘍）により引き起こされる。
【００３４】
本明細書中では、「アポトーシス」とは、細胞死を意味する。アポトーシス（Ｉ型細胞死）は、ストレス、感染、損傷など、さまざまな理由で起こる、細胞の一種のプログラムされた死である。リンパ球のアポトーシスは、これらに限定されないが、癌関連治療（化学療法、放射線照射）などのさまざまな現象及びアポトーシス誘導因子を産生する腫瘍自体により誘導される。
【００３５】
本明細書中では、「リンパ球」とは、免疫系に存在する白血球を指し、大型顆粒リンパ球（ナチュナルキラー（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）細胞））及び小リンパ球（Ｔ及びＢ細胞）を含む。
【００３６】
「初代細胞由来生物製剤」は、本明細書中では、複数のサイトカイン、好ましくは天然の非組換えサイトカインを意味し、特に天然サイトカイン混合物（ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ：ＮＣＭ）として既に知られている。好ましくは、初代細胞由来生物製剤は、以下に記載のＩＲＸ−２であり、意図した意味から外れることなく、この出願を通して、２つの用語を交換可能に使用することができる。 
【００３７】
「ＩＲＸ−２」は、フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ：ＰＨＡ）及びシプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ：ＣＩＰＲＯ）により刺激された精製ヒト白血球細胞（単核細胞）により産生される、白血球由来天然初代細胞由来生物製剤である。主な活性成分は、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）及びγ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）である。好ましくは、本発明に使用されるＩＲＸ−２は、これら６種の重要なサイトカインを含有する。ＩＲＸ−２はまた、先に「ＮＣＭ］、即ち天然サイトカインとして言及しされており、米国特許第６，９７７，０７２号及び第７，１５３，４９９号に定義、説明されている。
【００３８】
簡潔には、ＩＲＸ−２は、４−アミノキノロン抗生剤を常在下において、好ましい実施形態ではＰＨＡであるマイトジェンを、連続的又はパルス状により供給することにより調製される。しかし、その他のマイトジェンを使用することもできる。患者に投与するＩＲＸ−２は、ＩＬ−１βを６０〜６０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは１５０〜１８００ｐｃｇ／ｍＬの濃度範囲で、ＩＬ−２を６００〜６００００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは３０００〜１２０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度範囲で、ＴＮＦ−αを２００〜２００００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは１０００〜４０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度範囲で含有する。
【００３９】
ＩＲＸ−２はまた、ＩＬ−６を６０〜６０００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは３００〜２０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度範囲で、ＩＬ−８を６０００〜６０００００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは２００００〜１８００００ｐｃｇ／ｍＬの濃度範囲で、ＴＮＦ−αを２００〜２００００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは１０００〜４０００ｐｃｇ／ｍＬの濃度範囲で含有することができる。組換え、天然又はペグ化されたサイトカインを使用することができ、又はＩＲＸ−２が組換え、天然又はペグ化されたサイトカインを含有することができる。本発明のＩＲＸ−２は更に、(１００〜１００００ｐｃｇ／ｍＬ、より好ましくは５００〜２０００ｃｐｇ／ｍＬの濃度範囲で）ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ並びにＧ−ＣＳＦなどのその他の組換え、天然又はペグ化サイトカインを含有することができる。ＩＲＸ−２を作製する方法は、上記特許並びに米国特許仮出願第６１／０４４，６７４号に記載されている。
【００４０】
化学的阻害剤、非ステロイド性抗炎症薬（ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ：ＮＳＡＩＤＳ）、これらの組み合わせなど、その他の化合物もＩＲＸ−２とともに投与することができる。化学的阻害剤としては、免疫抑制性ではなく（好ましくは低用量での使用）、かつ、例えば、体内の免疫抑制又は抑制機構を制御することにより、免疫及び／又は免疫応答を増強するような免疫調節効果を有する化学療法剤を使用することができる。好ましい実施形態によれば、化学的阻害剤は、これらに限定されるわけではないが、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質などの抗新生物薬である。化学的阻害剤はまた、サリドマイドなどの免疫調節剤であってもよい。化学的阻害剤はまた、塩又は他の複合体であってもよい。好ましくは、化学的阻害剤は、アルキル化剤であるシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ：ＣＹ）である。ＮＳＡＩＤは好ましくは、ＣｏｘＩ及びＣｏｘＩＩ両者の阻害剤である、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ：ＩＮＤＯ）である。ＮＳＡＩＤはまた、イブプロフェン又はセレコキシブやロフェコキシブなどのＣｏｘＩＩ阻害剤、又はそれらの組み合わせであってよい。また、内因性抗原（即ち、既に体内に存在する抗原）及び外因性抗原をＩＲＸ−２と共に投与することもできる。
【００４１】
本明細書中では、「有効量」とは、本発明の所望の結果を達成するために必要とされるＩＲＸ−２の量、即ち、免疫標的の処置、更に後述される機能を遂行するＩＲＸ−２の量を意味する。当業者であれば、上述のように、さまざまな濃度の成分とともに、特定の患者に投与されるべきＩＲＸ−２の有効量を決定することができる。
【００４２】
本発明は、免疫系を抑制している免疫標的を処置し、免疫系を回復させる方法を対象としている。本方法は、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、血液中のＢ及びＴ細胞の数を修正し、リンパ節を局所的に活性化し、免疫標的に隣接する領域にヘルパーＴ及びＢ細胞を浸潤させ、免疫標的にキラーＴ細胞及びマクロファージを浸潤させ、免疫標的を処置し、免疫系を回復させる、ステップを有する。これらのステップはともに、免疫標的の免疫拒絶の証拠を作製する。言い換えれば、これらのステップのそれぞれが、免疫標的は破壊されているはずであることを免疫系が認識したことの証拠であるとともに、免疫系が正常に機能するように回復した（又は、疾病又は免疫抑制された状態での機能レベルよりも高くなっている）ことの証拠でもある。
【００４３】
初代細胞由来生物製剤、即ちＩＲＸ−２を上述のように投与することが好ましい。化学的阻害剤である低用量シクロホスファミドは、ＩＲＸ−２の投与によりレギュラトリーＴ細胞リンパ球による抑制が転換される前に投与することが好ましい。ＮＳＡＩＤ（好ましくは、インドメタシン）及び亜鉛は、ＩＲＸ−２投薬の間、毎日投与することもできる。ＩＲＸ−２の投与量は、更に後述する。
【００４４】
Ｂ及びＴ細胞の数は、ＩＲＸ−２の投与により、上方制御又は下方制御することができる。変更される血液中のＢ及びＴ細胞の数は、より具体的には、ナイーブＴ細胞及び早期メモリーＴ細胞の数である。数が変更されるナイーブＴ細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＣＲ７＋である。これは、時間依存性の工程である、ナイーブＴ細胞のメモリー及びエフェクターＴ細胞への分化により達成される。セントラルメモリーＴ細胞も、血流から抜け、排液性リンパ節に移動する。言い換えれば、ナイーブＴ細胞の修飾レベルは、ナイーブＴ細胞が免疫標的を効果的に攻撃できるＴ細胞のより進展した形へと分化した結果である。血液中のＢ細胞の数も、Ｂ細胞がリンパ節に補充されることにより変化し、抗原に暴露され、免疫標的へ移動し、免疫標的を攻撃する。より具体的には、Ｂ細胞は、抗体の作製及び／又は抗体依存性細胞性細胞障害の支援により免疫標的を攻撃する。
【００４５】
リンパ節は、局所的なリンパ節を増大させることによって局所的に活性化され、リンパ球を補充し、洞組織球増殖症を回復に向けさせる。免疫標的への抗原の免疫付与が局所的リンパ節に起こる。
【００４６】
免疫標的に隣接する領域へのＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋及びＣＤ４＋Ｔリンパ球並びにＣＤ２０＋Ｂリンパ球の浸潤が起こる。免疫標的に隣接する領域は、免疫標的自身の表面から、その表面から離れた部位まで広がることができる。免疫標的自身への浸潤、即ち、免疫標的内への直接の浸潤は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋及びＣＤ８＋リンパ球（即ち、キラーＴ細胞）及びＣＤ６８＋マクロファージで起こる。これら浸潤工程のそれぞれは、（細胞により媒介される）細胞性免疫と同様、（抗体により媒介される）体液性免疫の形成に貢献する。
【００４７】
本発明の方法のそれぞれにおいて、これらに限定されるわけではないが、例えば、外科手術、放射線療法、化学療法又はそれらの組み合わせなどの治療を更に向上させるために、ＩＲＸ−２の投与と組み合わせて、その他のさまざまな方法を行うことができる。例えば、放射線療法又は化学療法（細胞破壊的工程）の前にＩＲＸ−２を投与することにより、ＩＲＸ−２はアポトーシスからＴリンパ球を保護し、細胞保護剤として作用するので、これらの工程の結果が改善される。
【００４８】
より具体的には、Ｔ細胞がアポトーシスから保護される方法はいくつか存在する。抗アポトーシスシグナル分子（即ち、ＪＡＫ−３及び蛍光体−Ａｋｔ）の発現が上方制御され、アポトーシス促進性分子（即ち、ＳＯＣＳ−２）の発現が下方制御される。全体として、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるカスパーゼ活性化が低減し、ｃＦＬＩＰ発現が増加する。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ生存経路の抑制に対して、ＩＲＸ−２が対抗する。Ｔ細胞は、外因性アポトーシス（ＭＶ−誘導性及びＣＨ−１１Ａｂ−誘導性アポトーシス）及び内因性ミトコンドリアアポトーシスの両者により保護されている。これらの保護ステップのそれぞれについては、更に米国特許仮出願第６０／９９０，７５９号（Ｓｉｇｎｏｒｅｌｌｉら）に記載されている。
【００４９】
本発明はまた、患者に免疫を誘導する方法を提供する。本方法は、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、Ｔ及びＢ細胞の変化を検出し、患者に免疫を誘発させる、ステップを有する。初代細胞由来生物製剤の投与については上述したが、更に後述する。Ｔ及びＢ細胞の変化については上述されているように、Ｔ及びＢ細胞の分化又は他所への移動により、血液中のＴ細胞及びＢ細胞の濃度が変化する。このＴ及びＢ細胞の移動は、免疫が患者に誘導されたことの証拠である。
【００５０】
初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、未成熟樹状細胞を成熟させ、ナイーブＴ細胞を活性化させ、得られた成熟樹状細胞がナイーブＴ細胞を刺激し、ナイーブＴ細胞をキラーＴ細胞に分化させ、キラーＴ細胞を腫瘍に移動させ、腫瘍を破壊する、ステップを有する、腫瘍を破壊する方法が提供される。初代細胞由来生物製剤は、米国特許第６，９７７，０７２号及び７，１５３，４９９号に記載のナイーブＴ細胞の産生を誘導するとともに、樹状細胞の熟成を引き起こす。成熟樹状細胞は、次いでナイーブＴ細胞が活性化されるように、ナイーブＴ細胞に抗原を提示する。本明細書において証明されているように、ナイーブＴ細胞は、直ちにキラーＴ細胞に分化でき、腫瘍に向かって移動し、腫瘍を破壊する。
【００５１】
本発明はまた、癌治療に有利な治療結果を予測する方法を提供する。本方法は、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、腫瘍周囲におけるヘルパーＴ及びＢ細胞及び腫瘍内におけるキラーＴ細胞及びマクロファージの増加を検出し、癌治療に有利な治療結果を予測する、ステップを有する。更に具体的には、上述した、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋及びＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ２０＋Ｂリンパ球の腫瘍周囲における増加、又はＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋及びＣＤ８＋リンパ球及びＣＤ６８＋マクロファージの腫瘍内における増加を検出する。言い換えれば、これらの種類の細胞が増加している場合、初代細胞由来生物製剤での治療が効果的であることを示すバイオマーカーとなる。この方法は、初代細胞由来生物製剤での治療が有効でなく、他の治療方法を探す必要のある患者のスクリーニングに使用することができる。この方法は、これらに限定されないが、例えば、さまざまなアッセイやイムノアッセイ（エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ）、ハイスループット法などの自動化手段による治療結果の予測に使用することができる。
【００５２】
本発明は、免疫予防の方法を提供する。本方法は、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、免疫抑制を防止する、ステップを有する。免疫予防とは、免疫系が抑制されることを防止することである。具体的には、未成熟樹状細胞を成熟させ、ナイーブＴ細胞を活性化させ、得られた成熟樹状細胞がナイーブＴ細胞を活性化し、活性化されたナイーブＴ細胞をアポトーシス（特に、化学療法又は放射線照射の前に投与された場合）から保護し、ナイーブＴ細胞をメモリー及びエフェクターＴ細胞に分化させ、リンパ節を局所的に活性化させ、免疫系が抑制されないようにすることにより、初代細胞由来生物製剤は、免疫系の全ての部位を活発に作動させる。これらのステップのそれぞれは上述の通りである。患者が生物学的因子により免疫抑制される傾向にある場合、この患者に予防的にＩＲＸ−２を投与し、その免疫系の低下を防止する。例えば、患者が癌を生じやすい遺伝因子を有する場合、癌などの免疫標的が生じないようにＩＲＸ−２を投与し、免疫系に免疫標的を攻撃する準備をさせることができる。
【００５３】
本発明はまた、免疫回復の方法を提供する。本方法は、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、患者の免疫系を回復させる、ステップを有する。免疫系が抑制されている患者は、ＩＲＸ−２治療により利益を受け、免疫系が正常又はそれ以上の機能を有するように回復される。更に具体的には、未成熟の樹状細胞を成熟させ、ナイーブＴ細胞を活性化させ、得られた成熟樹状細胞がナイーブＴ細胞を活性化し、活性化されたナイーブＴ細胞をアポトーシスから保護し、血液中のＢ及びＴ細胞の数を修正し、リンパ節を局所的に活性化させ、免疫標的に隣接する領域にヘルパーＴ及びＢ細胞を浸潤させ、免疫標的にキラーＴ細胞及びマクロファージを浸潤させることにより、免疫系が回復される。これらのステップのそれぞれは上述の通りである。免疫系の複数の部門がＩＲＸ−２の投与により作動されることにより、免疫系は免疫標的に対応できるようになる。例えば、腫瘍やその他の免疫標的は、免疫標的を攻撃するのに必要なさまざまな免疫成分を下方制御する傾向にある。免疫標的は、自分自身が免疫系により攻撃されないようにする保護作用を有する。更に、免疫抑制状態の患者の樹状細胞は、免疫標的の存在に対して耐性となる。しかし、これらの免疫標的は、一旦免疫系の抑制が回復されると、攻撃に対して感受性となる。ＩＲＸ−２は、免疫標的に対する樹状細胞の耐性を破壊し、免疫標的の保護作用の全てを克服するために、上述の免疫系の各部門を活性化する。初代細胞由来生物製剤の樹状細胞に対する作用は、米国特許第６，９７７，０７２号及び７，１５３，４９９号に記載されている。
【００５４】
本発明はまた、腫瘍を処置する方法を提供する。本方法は、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、血液中のＢ及びＴ細胞の数を修正し、リンパ節を局所的に活性化させ、腫瘍周囲にヘルパーＴ及びＢ細胞を浸潤させ、腫瘍内にキラーＴ細胞及びマクロファージを浸潤させて、腫瘍を処置するステップを有する。これらのステップのそれぞれは上述の通りである。ＩＲＸ−２は、下記の実施例に示されるように、腫瘍の軟化、腫瘍に起因する痛みの緩和、腫瘍の縮小、腫瘍の断片化、腫瘍の壊死、腫瘍の線維化により証明されるように、癌のさまざまな段階における腫瘍を処置することが示されている。本質的に、ＩＲＸ−２は、免疫系の各部門を抑制することはなく、腫瘍は効果的に処置され、癌が患者から除去される。
【００５５】
本発明は更に、腫瘍エスケープを防止する方法を提供する。本方法は、初代細胞由来生物製剤の有効量を投与し、血液中のＢ及びＴ細胞の数を修正することによって腫瘍の免疫退化を形成し、リンパ節を局所的に活性化し、腫瘍周囲にヘルパーＴ及びＢ細胞を浸潤させ、腫瘍内にキラーＴ細胞及びマクロファージを浸潤させ、腫瘍エスケープを防止する、ステップを有する。これらのステップのそれぞれは上述の通りである。多くの腫瘍は、免疫系に対して攻撃的であり、免疫系を抑制するシグナルを送り出す。免疫系はＩＲＸ−２により完全に抑制から回復されるので、腫瘍は免疫系から逃れることなく、転移することがない。重要なことは、下記の実施例において、ＩＲＸ−２治療後に腫瘍を再発した患者がいないことである。従って、ＩＲＸ−２は効果的に腫瘍エスケープを防止する。
【００５６】
全体的に、ＩＲＸ−２は、免疫系のそれぞれの部門を抑制することなく、さまざまな免疫標的を攻撃する。免疫不全疾病状態（癌、ＡＩＤＳ、その他の前述の疾病）は、ＩＲＸ−２を介してその免疫系の抑制状態を転換する。免疫系の複数部分でのＩＲＸ−２と特定のサイトカインの組み合わせにおけるＩＲＸ−２の効果は、単独の「楽器」というよりはむしろ「シンフォニー」として機能する。これは、各成分の組み合わせではあるが、免疫系の単一の部門にのみ作用する、従来の治療法に対立するものである。免疫系の各部分が、ＩＲＸ−２投与により得られる１つの効果のゲートキーパーとなる。免疫系のこれらの部分のそれぞれが、免疫標的を攻撃するために必要となる。言い換えれば、図１７に示されるように、未成熟樹状細胞は、ナイーブＴ細胞を活性化するために成熟する必要がある。ナイーブＴ細胞の作製は、成熟樹状細胞により抗原が提示されることによっても誘導される。樹状細胞がナイーブＴ細胞に抗原を提示するためには、ナイーブＴ細胞と樹状細胞の両者が、局所的なリンパ節に移動する必要がある。一旦活性化されると、ナイーブＴ細胞は、キラーＴ細胞に分化し、免疫標的を攻撃できるように、アポトーシスから保護される必要がある。Ｂ細胞も、免疫標的を攻撃するために、マクロファージになる必要がある。ＩＲＸ−２を投与することにより、これらの機能のそれぞれが遂行され、あらゆる免疫標的をいつでも攻撃できる、健康に機能する免疫系が提供される。
【００５７】
体内への初代細胞由来生物製剤の投与方法は、ＩＲＸ−２に関連する上記特許に開示されている、ワクチンとＩＲＸ−２とによる免疫療法又はＩＲＸ−２単独による免疫療法と同じである。１回当たり１１５ユニット（Ｕｎｉｔ）のＩＲＸ−２を、１０日間、リンパ節周辺に注射することが好ましいが、更に後述されるように他の方法により注射することもできる。あるいは、タンクを使用し、ＩＲＸ−２を断続的に投与することもできる。例えば、１週間に３日間又は１週間の７日の内５日、投与することができる。後述されるように、ＩＲＸ−２は、１：１から１：１０の濃度範囲で希釈されたＩＲＸ−２液（即ち、ＩＲＸ−２を成長させた培地中のＩＲＸ−２を希釈）でアポトーシスを防止した。
【００５８】
好ましくは、ＩＲＸ−２は、処置されている腫瘍やその他の持続性病変などの病変の領域に局所的なリンパ節に流出するリンパ管の周りに注射される。癌などの病変の近くの、局所的なリンパ節に流出するリンパ管内へ投与される、リンパ管の周辺に投与することが重要である。腫瘍周囲への注入は、ほとんど応答も進行も得られないので、そのような注入は行わない。１０日間の注入計画が最適であり、２０日間の注入プロトコルは、臨床的には効果的であるが、ＴＨ１応答が低下する傾向があり、癌へのリンパ球浸潤により測定した限りでは、望ましくないＴＨ２応答に移るようである。両側注入が効果的である。根治的頸部郭清術の部位では、反対側への注入が効果的である。
【００５９】
本発明の（ＩＲＸ−２を含む）化合物は、アポトーシスから保護するだけでなく、外因性又は内因性抗原への最適な免疫を促進するように、個々の患者の臨床状態、投与の部位及び方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別及び体重を考慮して、投与及び投薬される。本明細書において、目的にとって医薬的に「有効な量」は、当業界において公知である検討事項に基づいて決定される。投与量は、Ｔ細胞をアポトーシスから保護するのに有効であることが好ましい。投与量はまた、免疫を促進して、例えば、腫瘍の縮小、腫瘍切除及び白血球浸潤、再発の遅延又は生存率の改善、症状の緩和又は除去に有効であることが好ましい。
【００６０】
本発明の方法では、本発明の化合物をさまざまな経路で投与することができるが、外リンパ注射が好ましい。上記化合物は、化合物自身として投与することも医薬的に許容される誘導体として投与することもでき、単独で投与しても、医薬的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤と組み合わせて有効成分として投与してもよい。上記化合物はまた、皮内又は皮下、リンパ外又はリンパ内、節内、脾臓内、筋肉内、腹腔内又は胸腔内投与することができる。化合物の移植も有用である。治療される患者は、温血動物であり、特にヒトを含む哺乳動物である。示されたデータは、ヒト又はヒト由来細胞に対するＩＲＸ−２の活性を示しており、本明細書におけるデータは全てヒトに直接関連、適用される。医薬的に許容される担体、希釈剤、アジュバント及び賦形剤、更に移植担体は、一般に、本発明の有効成分と反応しない、不活性、非毒性固体又は液体増量剤、希釈剤又は封入剤をいう。
【００６１】
投与は、単回投与でも数日間の複数回投与でもよいが、１０日間の注入法が好ましい。本発明の化合物を投与する場合、通常、単位注入量形態（例えば、溶液、懸濁液、乳液）に製剤される。注入に好適な医薬製剤としては、滅菌溶液又は分散液、及び滅菌注入用液又は分散液に再構成される滅菌粉末が挙げられる。担体は、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール液など）、好適なそれらの混合物、植物油などの溶媒又は分散媒である。
【００６２】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被膜を使用し、分散液の場合には所要の粒子サイズを維持し、界面活性剤を使用することにより保持できる。非水性賦形剤、例えば、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、ラッカセイ油及びミリスチン酸イソプロピルなどのエステルを、化合物組成物の溶媒系として使用することもできる。更に、抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、緩衝剤を含む、組成物の安定性、滅菌性、等張性を高めるさまざまな添加剤を加えることができる。微生物の作用は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などのさまざまな抗菌・抗真菌剤により確実に防止することができる。多くの場合、砂糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含有することが望ましい。注入可能な医薬品形態の持続性吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどの使用により達成することができる。しかし、本発明では、使用される賦形剤、希釈剤又は添加剤は上記化合物と混合可能である必要がある。
【００６３】
注入可能な滅菌溶液は、本発明を実施する際に使用される化合物を、必要とされるいくつかの他の成分とともに、必要量の好適な溶媒に組み入れることにより調製できる。
【００６４】
本発明の薬理学的製剤は、さまざまな賦形剤、添加剤、希釈剤などの相溶性の担体を含有する、注入可能な製剤として患者に投与することができる。あるいは、本発明に使用される化合物は、徐放性皮下移植の形で、又はモノクローナル抗体、ベクター性伝達、イオン泳動、ポリマーマトリックス、リポソーム及びミクロスフェアなどの標的送達システムにより、非経口的に患者に投与することができる。本発明に有用な送達システムとしては、例えば、米国特許第５，２２５，１８２号、５，１６９，３８３号、５，１６７，６１６号、４，９５９，２１７号、４，９２５，６７８号、４，４８７，６０３号、４，４８６，１９４号、４，４４７，２３３号、４，４４７，２２４号、４，４３９，１９６号及び４，４７５，１９６号に記載されているものを挙げることができる。その他の多くの移植、送達システム及びモジュールは当業者に周知である。
【００６５】
本発明を、以下の実験的実施例により更に詳細に記載する。これらの実施例は、説明の目的のみに例示されるものであって、他に明記されない限り、本発明を制限するものではない。従って、本発明が以下の実施例に制限されると解釈されることは全くなく、むしろ、本明細書に提供された開示の結果として明らかになったいかなる変更も包含すると解釈される。
【実施例】
【００６６】
原料及び方法
細胞培養に関連する全てのステップは滅菌状態で行われる。本明細書に記載されていない細胞免疫の一般的な方法は、Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８１）などの細胞免疫技術に関する一般的な参考図書に記載され、当業者に周知の方法に従って行われる。
初代細胞由来生物製剤（ＩＲＸ−２）の調製
【００６７】
初代細胞由来生物製剤を製造する方法は、米国特許仮出願第６１／０４４，６７４号に主に記載されている。単核細胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ：ＭＮＣ）は、リンパ球分離媒体（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ：ＬＳＭ）に白血球を供給し、溶媒を自動細胞処理及び洗浄システムで遠心分離して精製ＭＮＣを取得することにより夾雑細胞を除去して精製する。ＭＮＣを、ＦＥＰリンパ球保存バッグ内に一晩保存する。ＭＮＣの誘導混合物を、使い捨て細胞培養装置内で、マイトジェン、好ましくはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）とシプロフロキサシンで刺激し、ＭＮＣから初代細胞由来生物製剤を作製する。誘導混合物から、マイトジェンを濾過及び接線流濾過法により除去し、誘導混合物を培養する。誘導混合物を濾過により浄化し、初代細胞由来生物製剤上清を得る。最後に、初代細胞由来生物製剤上清を陰イオン交換クロマトグラフィー、１５ナノメーター濾過、更に、必要に応じて、紫外線−Ｃ（ＵＶＣ）による非活性化を行い、ＤＮＡ及び外因性薬剤を除去する。更に、最終生成物を薬瓶に入れ、患者に投与するまで保存することができる。
実施例１
【００６８】
実験に使用されるＩＲＸ−２の投与計画のための用量及びスケジュールの選択は、ＩＲＸ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓにより行われた研究に基づいて行った。ＩＲＸ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによる研究は、前立腺特異膜抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＳＭＡ）ペプチド・コンジュゲートで免疫したマウスを用いて行い、足蹠の腫脹の増大を評価した。図２は、これらのデータ及び特徴的な「釣鐘状」曲線を示す。
【００６９】
研究は、４群の患者について、下記表１に示したように行った。図３及び４は、これらの群の生存及び腫瘍リンパ球浸潤のグラフである。
【表１】
2011521967.tif 000003
【００７０】
本研究では、１１５ユニットのＩＬ−２当量／日で１０日間治療した患者に、最大リンパ球浸潤が得られた。生存率は、最低量（投与計画１）の投与を受けた４患者において好ましくなかった。同様に、最大量を投与された６患者においても、生存率は好ましくなかった。投与計画２及び３の生存率は同程度であったが、投与計画２の患者は、リンパ球浸潤により測定された組織学的応答において最も顕著な効果を示した。
【００７１】
続いて、調査した中で最も活性な２つの投与量（投与計画２及び３）の中間値は、腫瘍及びリンパ節の重要な組織学的変化を達成するのに明らかに好適であり、研究を更に進めるためのＩＲＸ−２の投与量として選択した。１０日間の治療に比較して２０日間の治療は不便であること、及びＩＲＸ−２を高用量で投与された患者でリンパ球浸潤が低かったことに基づいて、両側注入による１０日間の注入プロトコル（ＩＲＸ−２の全量：約２３００ユニット）を、後述の研究に選択した。
実施例２
【００７２】
外科手術及び／又は放射線療法及び／又は化学放射線療法を行う前のＨ＆ＮＳＣＣ患者について、図１に記載したようなＩＲＸ−２プロトコルの検討を行った。一部位当たり１１５ユニットのＩＲＸ−２を両側投与した。２７人の患者を処置した。患者の属性を表２にまとめた。
【表２】
2011521967.tif 000004
【００７３】
開始時、外科手術前に放射線検査（ＣＴ又はＭＲＩ）により主に（ｃｅｎｔｒａｌｌｙ）検討を行った（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ)。血液は、さまざまな白血球の数（表３及び４）について開始時、外科手術前に主に（ｃｅｎｔｒａｌｌｙ）測定した（Ｉｍｍｕｎｏｓｉｔｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）。外科検体を中央標準研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｈｅｎｏｐａｔｈ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）に送付し、さまざまな白血球マーカーについて、組織学的変化及び免疫組織学的性能を評価した（表５）。適切な実験室及び臨床測定を行い、完治及び全生存を通してモニターを続け、毒性及び症状の改善を評価した。
臨床結果：
【００７４】
３患者が目的の腫瘍反応を示した（２ＰＲ；１ＭＲ）。４患者が放射線に反応を示した（＞１２．５％縮小）。節部位では腫瘍陽性と判断され、外科標本では陰性が主流であった５患者（Ｎ２Ｃ，Ｎ２Ｃ、Ｎ１、Ｎ１、Ｎ１）では、進行度が低下した。４腫瘍が和らぎ（陽性兆候）、１４患者で、症状改善／痛み・圧痛の緩和、嚥下作用の改善、出血の減少が見られた。治療に関連する副作用は、吐気、嘔吐、口渇、便秘、注射部位の痛み、頭痛、筋肉痛、貧血、挫傷を含み、一般に軽度（グレードＩ又はＩＩ）かつ稀であった。一例だけ、グレードＩＩＩの消化障害が認められた。完治及び全生存を追跡調査した。ほぼ患者全員が１年以上生存し、生存曲線は、以前に本出願人がメキシコ国立癌研究所（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｘｉｃｏ）で行った研究結果と非常に類似しているが、症状が同等であった米国及びメキシコのコントロールよりも優れているようである。
実施例３
【００７５】
ヘパリン化された血液を集め、免疫表現型を検査し、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞及びエフェクターＴ細胞を含む免疫細胞サブセットの数を決定した。細胞表面マーカーに対する蛍光標識モノクローナル抗体（又は、対応する同位体コントロール）を用いて新鮮、非分画全血を染色した。
染色、固定して得られた検体を、ベックマン・コールターＦＣ５００フローサイトメーター及びＣＸＰ  ＴＭ分析ソフトウェアを使用して、多重パラメーターフローサイトメトリーにより分析した。フローカウントＴＭビーズを使用し、単一のプラットホーム（フローサイトメトリーのみ）でＴリンパ球サブセットの絶対数を数える方法は、２種（血液測定器及びフローサイトメトリー）のプラットーホーム手法（Ｒｅｉｍａｎｎら、２０００）より正確であることが証明されている。下記の表３は、イムノサイト（ＩｍｍｕｎｏＳｉｔｅ）により測定された免疫マーカーのリストとそれらの免疫における役割を示す。
【表３】
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【００７６】
本発明の目的として、免疫が起こったか否かの仮定の評価に直接関連する細胞集団のみを、ここでは検討する。
【００７７】
Ｔリンパ球、特にＣＤ８＋Ｔ細胞の発生経路は効果的な抗腫瘍免疫と非常に関連が深いので、この１０年、ＣＤ８＋Ｔ細胞に特に注目した研究が盛んに行われてきた。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞とＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞はともに、相互交換可能な下位個体群ＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋に細分される。ＣＤ４５ＲＡ＋細胞は、以前は、ナイーブＴ細胞と命名されていたが、最近、血液中のこれらのＴ細胞は、ナイーブＴ細胞のほかに、より完全に分化した、ＴＥＭＲＡと呼ばれるエフェクターを有することが指摘されている（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ、２００５；Ｋａｅｃｈ、２００２）。ＣＤ４５ＲＯ＋（ＣＤ４５ＲＡ−）メモリーＴ細胞は更に、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｍｏｒｙ：ＴＣＭ）とエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ：ＴＥＭ）に細分される。これらの細分類は、ＣＣＲ７を含む付加的なマーカーが表面に発現していること基づく（Ｓａｌｌｕｓｔｏ，１９９９；Ｔｏｍｉｙａｍａ，２００４）。これらさまざまなＴ細胞サブセットの発生経路及びそれらの分化系列関係は複雑である。有意差のあるデータ及び試験を下記の表４に示す。
【表４】
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【００７８】
ＩＲＸ−２がＴ細胞とＤＣの両者に作用して活性化、成熟を促進し、ナイーブＴ細胞に存在する内因性腫瘍抗原を強化するという仮説と一致して、２１日目のＴ細胞数（ＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋）は基準に比較して低下していることが認められた。ナイーブＴ細胞はまず、適切な主要組織適合複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＣＨ）上に存在する抗原をＤＣが認識することによって活性化される。メモリーＴ細胞と完全エフェクター機能を生成する次のステップは完全には明らかにされていないが、いくつかのマーカー、即ち、ＣＤ４５ＲＡ／ＲＯ及びＣＣＲ７により定義されるＴ細胞の異なる亜集団は、独特の機能特性を有する。例えば、ＣＣＲ７発現は、リンパ節にＴ細胞が帰巣できるようにし、最も効果的な抗腫瘍プライミングが起こる。
【００７９】
ナイーブＴ細胞数（ＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＣＲ７＋）の著しい低下、５５．６細胞／ｍＬ３の基準細胞レベルが２１日目では１７．４細胞／ｍＬ３（ｐ＝０．０２）に低下していることが認められた。ナイーブＴ細胞の欠如は、細胞が、それぞれの類似抗原を見出し、それによって刺激され、メモリー又は完全エフェクター集団のいずれかである、別の機能性集団に分化することにより起こる。
【００８０】
更に、ＣＣＲ７＋を有するセントラルメモリーＴ細胞集団（ＣＤ３＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＣＲ７＋）は、リンパ節へ帰巣する傾向を与えられ、５６．９細胞／ｍＬ３の基準細胞レベルが２１日目では３４．１細胞／ｍＬ３（ｐ＝０．０２８）に低下する。これはまた、腫瘍への免疫がＩＲＸ−２処置の応答として起こっていることを示している。研究により、Ｔ細胞のＴＣＭ集団が、再刺激により、優先的にリンパ節に帰巣し、エフェクター、例えば、細胞溶解性機能を更に獲得する、早期の「幹様」性の高いメモリー集団を代表することが示されている。この集団に見られる著しい低下は、これらのＴＣＭ細胞が血流から抜け出し、排液性リンパ節に移動し、そこで更に活性化されることと一致している。
【００８１】
免疫後、抗原運搬犯への攻撃に協力する他の免疫細胞が期待される。免疫仮説に対する支持は更に、Ｂ細胞の著しい低下（ｐ＜０．０１）が観察されたことに認められた。Ｂ細胞は、リンパ節に補充され、そこで抗原に暴露された後、腫瘍へ向かって分泌され、腫瘍を直接攻撃できる抗体又は抗体依存性細胞毒性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）を支えることができる抗体を作製すると推定される。
【００８２】
ここで観察された統計的に有意性を有する変化及び傾向は、ナイーブＴ細胞の免疫はＩＲＸ−２の投与により起こっていることを強く示している。これらの患者には、その他の一次介入は観察されなかったので、これらの変化は無作為に起こったわけではないと思われる。
【００８３】
ＩＲＸ−２処置が、自己腫瘍抗原への免疫を引き起こすという仮定は、非無作為化正常及びＨ＆ＮＳＣＣコントロール患者と比較した、ＩＲＸ−２処置後のＨ＆ＮＳＣＣリンパ節応答についての出願人の公開情報（Ｍｅｎｅｓｅｓ、２００３）によっても支持される。ＩＲＸ−２処置に関連する目立ったリンパ節応答の特徴は、節補充、リンパ球、特に非処置Ｈ＆ＮＳＣＣ患者のリンパ節で激減されることが示された、Ｔリンパ球の膨潤である（Ｖｅｒａｓｔｅｇｕｉ、２００２）。ＩＲＸ−２によると推定される免疫中に起こる節の拡張は、洞組織球増殖症からの回復、明らかな樹状細胞機能異常と関連することも観察されている。これらの変化は、免疫と一致している。以前の研究は、腫瘍抗原への免疫が、腫瘍自身ではなく、局所的なリンパ節で起こることを確認している（Ｍａａｓｓ、１９９５）。
組織学
【００８４】
免疫がリンパ節に起こる場合、新しいメモリーキラーＴ細胞が発達し、その後血管を通ってリンパ節を出て、組織内に流れ込み、抗原標的（即ち、免疫標的）を巡回すると考えられる。抗原標的を確認すると、メモリーキラーＴ細胞は、組織に浸潤し、標的を殺す。細胞性免疫応答が始まると、その他の免疫細胞も借り出され、標的を殺し、浄化する工程に参加する。
【００８５】
Ｔリンパ球の腫瘍への浸潤、特に、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤は、腫瘍抗原への免疫の証拠であり、そのような浸潤が、Ｈ＆ＮＳＣＣ、メラノーマ、大腸及び卵巣癌を含む、さまざまな癌の生存率の改善に関与していることの証拠である（Ｗｏｌｆ、１９８６；Ｐａｇｅｓ、２００５；Ｇａｌｏｎ、２００６）。
【００８６】
ここでは、リンパ節に免疫を引き起こしたＩＲＸ−２は、腫瘍へのリンパ球の浸潤及び腫瘍崩壊をもたらし、腫瘍内の特定の免疫細胞の存在は、抗腫瘍免疫応答の証拠を提供するという仮説が立てられた。また、腫瘍への免疫応答は、腫瘍の周辺領域から腫瘍内領域に広がる、拡散リンパ球の浸潤により証明されるという仮説が立てられた。
【００８７】
原発性腫瘍生検及び切除標本からのホルマリン固定パラフィン包埋ブロック又は非染色スライドを、ヘマトキシリン及びエオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ及びｅｏｓｉｎ:「Ｈ＆Ｅ」）及び免疫組織化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｓｔａｉｎｉｎｇ：「ＩＨＣ」）のために、臨床現場からＰｈｅｎｏＰａｔｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）に提出した。２６のＩＲＸ−２研究被験者のペア検体を提出し、その内、２５の被験者が評価可能であり、１被験者は外科手術を受け、腫瘍の組織学的証拠は有していなかった。外科手術被験者に限定した２つの比較群として、無作為に選択された非処置Ｈ＆ＮＳＣＣ外科手術標本から、Ｈ＆Ｅ比較用にＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎから２５外科手術標本、Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒから１０外科手術標本を、研究の最後に集めた。
【００８８】
免疫組織化学染色は、ＩＲＸ−２処置検体のみに行い、腫瘍中の免疫マーカーの存在を決定した。そのマーカーを表５に列記する。
【表５】
2011521967.tif 000007
【００８９】
ＩＨＣ染色マーカーの存在は、低出力で段階的に予め定義された０〜１００ｍｍ視覚的アナログ尺度（ｖｉｓｕａｌ  ａｎａｌｏｇ  ｓｃａｌｅ：ＶＡＳ）を使用して評価した。０は、マーカーに対して陽性染色細胞が０％、１００は１００％の存在を意味する。マーカーを強調するために使用されたパーオキシダーゼ反応は、Ｈ＆Ｅ染色に比較して、リンパ球浸潤の領域及び濃度を過大評価するので、ＩＨＣに基づく強度決定の信頼性を下げることになるが、細胞種間の相対関係を解明するにはＩＨＣはなお有用である。
Ｈ＆Ｓ研究：方法及び分析
【００９０】
３つの分析方法により、Ｈ＆Ｅ染色スライドを比較した。分析方法の２つは、ＭＤ  ＡｎｄｅｒｓｏｎからのＩＲＸ−２処置２５標本及び非処置外科手術２５標本を、ブラインド特徴抽出するもので、腫瘍特徴及び免疫応答特徴について分析した。第３の分析は、Ｓｔｏｎｙ  ＢｒｏｏｋからのＨ＆Ｅ染色された１０スライドからの、同一、非混合免疫応答特徴抽出である。それぞれにおいて、特徴は、症例報告形式で、ＶＡＳを用いて抽出、定量した。
【００９１】
免疫応答特徴のそれぞれについて、２つの評価がなされた。第１の評価は、全外科手術標本に全体的に存在するマーカーの存在についてであり、第２の評価は、腫瘍の周辺又は腫瘍内への浸潤の程度についてである。
【００９２】
全体の評価は、リンパ球浸潤、その濃度、腫瘍と浸潤とのバランス及び腫瘍の形態印象を含むその他の特徴を考慮して行った。その他の下位特徴には、線維化及び壊死の広がり、腫瘍はもはや存在しないが腫瘍が存在したことの示唆、及び分化扁平上皮癌において、腫瘍破壊の他の印である、最小量の又は腫瘍を囲んでいないケラチン真珠の濃度が挙げられる。「活性免疫応答」には、免疫系により作り出された損傷の証拠であるリンパ球浸潤、及び腫瘍がもはや生存できず崩壊する程度、即ち、宿主が腫瘍と闘う範囲及び過程が含まれる。「活性免疫応答」のリンパ球浸潤下位特徴の一例を、図５及び６に示す。
【００９３】
活性免疫応答変化の主要な下位特徴の１つが、ＩＲＸ−２処置患者に見られる、リンパ球浸潤（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：ＬＩ）の位置と強さである。ＩＲＸ−２処置患者及び本目的に限定される比較群の両者でこの反応を実証する外科手術標本は、ＬＩ全体の濃度、腫瘍周辺ＬＩ及び腫瘍内ＬＩの顕著な増加を示した。
【００９４】
下記表６に示すように、ＶＡＳの５０ｍｍ以上の事前特定臨界点に基づいた分析の結果、外科手術標本の３つの群の間で活性免疫応答率が異なっていた。
【表６】
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【００９５】
活性免疫応答を示すこれらの患者の頻度は、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＳｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋに集められた標本の２０％から、ＩＲＸ−２処置群では４４％（カイ二乗検定：ｐ＜０．０５）に増加した。
腫瘍周辺対腫瘍内ＬＩの決定
【００９６】
腫瘍内の免疫細胞の位置も評価した。ここでは、活性抗腫瘍免疫応答は、周辺領域から腫瘍内領域を含むように拡大したリンパ球浸潤を有すると仮定した。
【００９７】
ＩＲＸ−処置患者における活性免疫応答のＶＡＳ分析では、１１患者が強い反応（≧５０、反応者と呼ぶ）を示し、１４患者は比較的弱い反応（＜５０、非反応者と呼ぶ）を示した。これら２群の患者のＬＩの比較を図７Ａ、７Ｂに示す。
【００９８】
図に示されるように、非反応者に比較して、反応者では、典型的な部位にＬＩの（領域及び濃度の両者において）顕著な増加が見られた。腫瘍内（INTRA）ＬＩの増加は、腫瘍周辺（PERI）の変化に比べ、比例的にはるかに大きい。
【００９９】
さまざまなマーカーの位置の免疫組織化学は、各位置でどの細胞が支配的であるかを明確にすることを助ける。これらの結果を図８に示す。腫瘍周辺の浸潤は、標本におけるＬＩの約２５％を占め、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ２０＋Ｂリンパ球が支配的であった。一方、腫瘍内の浸潤は、標本におけるＬＩの約７５％を占め、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋リンパ球（即ち、エフェクター「キラー」Ｔ細胞表現型）及びＣＤ６８＋マクロファージが支配的であった。図９は、ＩＲＸ−２処置外科手術標本におけるＣＤ４５ＲＯ＋メモリーＴ細胞をＩＨＣ染色の画像例を示す。
【０１００】
免疫仮説の最も強力な支持は、腫瘍の中及び周囲への浸潤についてのリンパ球浸潤の実験及び壊死、線維化、腫瘍の縮小を示す腫瘍拒絶の実態に由来する。拒絶のパターンは、増加したＢリンパ球と活性化マクロファージがそれぞれ体液性及び細胞性免疫の両者にとって特徴的である。
実施例４
【０１０１】
一患者において、図１０に示すように、融合ＦＤＧ  ＰＥＴ／ＣＴスキャンを第０日目及び第２１日目で比較した。全糖分解活性及び容量を測定し、表７に示す。
【表７】
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【０１０２】
実施例５
予め、腫瘍標本に対する生検の組織病理学の基準（Ｍｅｎｅｓｅｓ）は、腫瘍の全体的な縮小、腫瘍の断片化及びリンパ球浸潤（ＬＩ）の増加である。本発明に従って、コントロール腫瘍に対する処置腫瘍についてここで新たな基準、即ち、壊死及び繊維化による腫瘍の破壊、及び腫瘍周辺よりも腫瘍内でのＬＩが増加していることを定める。Ｈ＆ＮＳＣＣのサイトカイン処置についてのさまざまな発見を下記表８にまとめる。重要なことは、ＩＲＸ−２は免疫系の全ての部門に作用することが示されたことである。これは、他の複数のサイトカイン組成治療ではなされないことである。マルチカイン（ＭＵＬＴＩＫＩＮＥ：Ｃｅｌ−Ｓｃｉ）はその製剤に複数のサイトカインを含むが、その作用は腫瘍自体への単一のものであり、免疫系には作用しない。
【表８】
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結論
【０１０３】
本研究は、扁平上皮頭頸部癌を有する患者に対して、外科手術前に有意な生物学的活性を与えるＩＲＸ−２投与計画の能力に関する、出願人の先行する報告を確認、拡げるものである。本研究により、上記処置は、安全で、副作用は投与計画に起因する僅かなものであることを確認している。実際、リンパ球浸潤の病理組織学的変化の証拠を示した患者は、痛み・圧痛の緩和、呼吸・発声の改善、（崩壊の証明としての）腫瘍の軟化などの症状の改善の大部分を有していた。３患者は臨床応答（２ＰＲ、１ＭＲ）を有すると見なされた。全体的な生存データ及び、未完成ではあるが、再発のない生存者については、出願人の先の研究の程度及び概要に類似しているが、更に助長されている。追跡調査の最初の１２ヶ月では再発に死亡は一例もなかったことは、注目に値する。今までに死亡した症例は、１例を除いて、非応答群である。
【０１０４】
最も説得力のあるデータは、作用機序の研究に関連するものである。Ｂリンパ球及び２つのＴ細胞サブセットの低下は、最初の免疫及びリンパ節ホーミングに関連することが観察された。メモリー／エフェクター細胞の増加は血液中では観察されないが、これは免疫により誘導されるＴ細胞の経路パターンに基づいて説明可能である。レギュラトリーＴ細胞の増加は特に認められなかった。
【０１０５】
出願人の先の研究は、ＩＲＸ−２投与計画に反応する患者には、腫瘍に隣接している非関与リンパ節の増加、劣化したＴリンパ球領域の補充及び抗原により起こる活性化の実態を示している。このように、リンパ球は、血液やリンパ管を介して、局所のリンパ節に輸送され、そこで自己腫瘍抗原に免疫されると推定される。ここに示されるように、その後、リンパ球はリンパ節を離れ、血液により腫瘍に運ばれ、そこでリンパ球は腫瘍内及び周辺に浸潤し、腫瘍破壊の証拠（壊死、線維化及び腫瘍の縮小）に関与する。この反応を示す患者では、リンパ球浸潤の増加は、主に腫瘍の周辺のＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞群及びＣＤ２０＋Ｂリンパ球、及び腫瘍内のＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＰ＋Ｔリンパ球群及びマクロファージに関与する。腫瘍内の変化は、周辺の変化に比較して大きい。この機構は、概して図１７に示される。
【０１０６】
注目すべきは、非処置患者ではそのような反応は時々起こる（２０％）だけであり、ＩＲＸ−２投与計画によって処置された患者に比べて非常にその頻度が低い（２０％に対して４４％）ことである。コントロール群での反応の存在は、好ましい結果が予想される新しいバイオマーカーを意味する。
【０１０７】
実態は、臨床的、放射線学的、病理学的、免疫学的に総合されたものであり、自己腫瘍抗原への免疫の十分な証拠を提供する。ＩＲＸ−２は、免疫系の全ての部門を活性化し、免疫機能の全体的な回復及び免疫標的を攻撃する能力を提供する。
【０１０８】
本出願を通して、米国特許を含め、さまざまな刊行物を著者及び発行年により、また特許はその番号により引用した。刊行物の全引用を下記に列挙した。本発明が属する技術分野における技術水準を的確に理解するために、これら刊行物及び特許の開示の全体が、この参照により本出願に包含される。
【０１０９】
本発明を例示的に説明してきたが、使用された用語は制限的なものではなく、説明の単語の本質を意図して使用したことを理解されたい。
【０１１０】
上述を踏まえると、本発明の多くの変形態様及び変更態様が可能であることは明らかである。従って、添付の特許請求の範囲内で、本発明は具体的な説明とは別の方法で実施できることを理解されたい。
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【図１】
2011521967.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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