(57)【要約】  動電、誘電泳動、電気泳動および流体の力を多次元的に組み合わせて、高導電率（イオン）強度の生物学的サンプルおよび緩衝液中で細胞、ナノベシクル、ナノ微粒子およびバイオマーカー（ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、タンパク質）を分離する装置および技法について記載する。開示される実施形態では、連続および／またはパルス誘電泳動（ＤＥＰ）力、連続および／またはパルスフィールドＤＣ電気泳動力、微小電気泳動および制御された流体現象の組み合わせを、電極のアレイと共に利用する。特に、チャンバーＤＥＰ装置と、流体、電気泳動およびＤＥＰの力を組み合わせて適切な規模に設計された比較的大型の電極アレイ装置とを使用すれば、比較的大量および／または臨床的意義がある量の血液、血清、血漿または他のサンプルを、より迅速かつ効率的に直接解析することができる。本発明により「シームレスな」サンプルの応答診断システムおよび装置の作製が可能になる。記載した装置および技法を用いれば、分子、ポリマー、ナノ要素およびメソスケール物質の三次元高次構造体へのアシスト型自己組織化（ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）を行うことができる。
2011516867.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル流体中の生物材料を分離するためのサンプル処理装置であって、
前記サンプル流体を供給し、前記サンプル流体を電極アレイに導く少なくとも１つの入口と、
前記電極アレイから前記サンプル流体を受け取る少なくとも１つの出口
とを含み、
前記電極アレイは、電極の少なくとも１つの小区画部が、電極の残りの小区画部と異なるように帯電することができることにより、異なるように帯電した前記電極によって、前記電極においての異なるように帯電した誘電泳動（ＤＥＰ）力領域（ｆｏｒｃｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を構成し、前記異なるように帯電したＤＥＰ力領域によって、前記生物材料の分離を開始できるように形成された複数の電極を含む、サンプル処理装置。
【請求項２】
前記電極アレイは、
前記装置の前記入口と前記出口との間の平面領域に配列される複数の交流（ＡＣ）電極と、
前記ＡＣ電極に隣接して配列される複数の直流（ＤＣ）電極
とを含む、請求項１に記載のサンプル処理装置。
【請求項３】
前記ＤＣ電極は、前記ＡＣ電極の前記平面領域の外側に延在する、請求項２に記載のサンプル処理装置。
【請求項４】
前記ＡＣ電極の少なくとも１つの小区画部は、前記残りのＡＣ電極の小区画部と、電流の周波数が異なるＡＣ電流が流される、請求項２に記載のサンプル処理装置。
【請求項５】
前記電極は、電解作用による腐食に対して抵抗性がある強固な材料で構成される、請求項１に記載のサンプル処理装置。
【請求項６】
多孔性材料が電解作用による腐食に対して抵抗性を示すように、前記多孔性材料の積層が前記電極に形成されている、請求項１に記載のサンプル処理装置。
【請求項７】
前記装置から分析物の流れを排出する少なくとも１つの分析物の出口をさらに含む、請求項１に記載のサンプル処理装置。
【請求項８】
生物材料を分離するためのシステムであって、
請求項１に記載のサンプル処理装置と、
前記サンプル処理装置の前記電極に選択的に電圧を加え、前記生物材料の分離を開始させるように形成されるコントローラ
とを含む、システム。
【請求項９】
前記生物材料から分離される生物学的成分の前記分離工程および解析のモニタリングに関連する検出システムをさらに含む、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
生物材料を分離する方法であって、
前記生物材料を、電極の少なくとも１つの小区画部が、電極の残りの小区画部と異なるように帯電できることにより、異なるように帯電した前記電極によって、前記電極において異なるように帯電した誘電泳動（ＤＥＰ）力領域を構成できるように形成された、複数の前記電極を有する電極アレイを備えたサンプル処理装置に供給すること、
前記電極を選択的に電圧を加え、前記異なるように帯電した電極によって、前記電極において異なるように帯電したＤＥＰ力領域を構成すること、
前記異なるように帯電したＤＥＰ力領域によって、前記生物材料を、前記サンプル処理装置の分析物の出口に供給される少なくとも１種の分離された分析物成分と前記生物材料の残りの成分とに分離すること
を含む、方法。
【請求項１１】
分離される生物学的成分の分離工程および解析のモニタリングをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離することは、前記電極の小区画部の１つに少なくとも１種の生物材料が保持されることを含む、請求項１０に記載の方法であって、
前記サンプル処理装置に試薬を導入すること、
前記サンプル処理装置において前記導入した試薬を前記保持された生物材料種と反応させること
を含む、方法。
【請求項１３】
前記試薬は蛍光色素を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬は抗体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応させることは、前記保持された生物材料種についてＰＣＲ操作を行うことを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
生物材料を分離するためのシステムであって、
電界が外側の電極チャンバーから通過できる孔（ポータル、穴）を持つ内側のチャンバー構造体により区切られ、かつ各々が電極を有する２つ以上の異なる電極チャンバー構造体と、前記生物材料を供給する前記内側のチャンバーへの入口と、前記生物材料の分離された成分を前記内側のチャンバーから受け取る少なくとも１つの分析物の出口と、前記生物材料の残りの成分を受け取る別の出口と、
前記電極に選択的に電圧を加え、前記生物材料の分離を開始させるように形成されたコントローラと、
分離された生物学的成分の分離工程および解析のモニタリングに関連する検出システムと
を含む、システム。
【請求項１７】
生物材料を分離する方法であって、
前記生物材料を、外側の電極チャンバー構造体を有する内側のチャンバー構造体、前記生物材料を供給する入口、前記生物材料の分離された成分を前記内側のチャンバーから受け取る少なくとも１つの分析物の出口、前記生物材料の残りの成分を受け取る出口、および分離された生物学的成分の分離工程および解析のモニタリングに関連する検出システムに、前記電極を選択的に電圧を加えることにより供給すること、
前記生物材料を、前記内側のチャンバー構造体の分析物の出口に供給される少なくとも１種の分離された分析物成分と、前記生物材料の残りの成分とに分離すること
を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１１〜１５のいずれかに記載のシステムが、分子、ポリマー、ＤＮＡおよびタンパク質誘導体化ナノ粒子、量子ドット、ナノチューブおよび同種のものなどのナノ要素、ならびにメソスケールの成分の三次元高次構造体、材料および装置へのアシスト型自己組織化（ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ）を行うのに使用される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年４月３日に出願された、「細胞、小胞、ナノ粒子およびバイオマーカーを分離および単離するためのエキソビボの多次元システム（Ｅｘ−Ｖｉｖｏ  Ｍｕｌｔｉ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ，Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ）」を発明の名称とする米国仮特許出願第６１／０４２，２２８号明細書の利益を主張するものであり、その開示内容全体を参照によって本明細書に援用する。
【０００２】
連邦政府により資金提供を受けた研究および開発に基づきなされた発明の権利に関する記載
本研究は、ＮＩＨ  Ｇｒａｎｔ／Ｃｏｎｔｒａｃｔ  ＣＡ１１９３３５の支援を受けて実施した。米国政府はこの発明に一定の権利を有する場合がある。
【背景技術】
【０００３】
生体分子の研究および臨床診断では、血液、血漿、血清、唾液および尿のような複雑な体液サンプル中から希少な細胞、細菌、ウイルスおよびバイオマーカー（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、他のタンパク質など）を分離すること、および同定することはどちらも重要であると同時に課題にもなっている。また、バイオナノテクノロジーの登場によって、数多のナノベシクルおよびナノ粒子内に薬剤および造影剤を封入する薬物送達法がもたらされた。こうした方法により、現在では血流中にとどまる残存ナノベシクルおよびナノ粒子を同定および分離することも重要になっている。血液のような複雑なサンプルから特定の細胞、ナノベシクルおよび生体分子のサンプルを調製および単離するには、種々の物理的、電気的および生物学的技法および機構を使用することができる。こうした技法および機構として、遠心分離、ゲル濾過、親和結合、ＤＣ電気泳動、ならびにラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｔｉｐ）、マイクロ流体デバイスおよびサンプルの応答（ｓａｍｐｌｅ−ｔｏ−ａｎｓｗｅｒ）システムに組み込まれた様々な組み合わせが挙げられる。
【０００４】
こうした従来の技法（または組み合わせ）の多くは工程に比較的時間がかかり、問題および限界がないわけでない。特に、希少な細胞（癌細胞、胎児細胞および幹細胞）、少数の細菌およびウイルス、または非常に少数の特定の抗体、タンパク質、酵素、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の単離については、依然として困難なままである。臨床診断の場合も、希少な細胞およびバイオマーカーの検出がサンプルサイズによって、すなわち、重症患者、高齢者および乳児から採取される血液が比較的少量にとどまる場合があることによって制限される場合がある。このため、非効率なものになるか、または原サンプルの高度な希釈が必要とされるサンプル調製工程は失敗するか、あるいは比較的低濃度の範囲での細胞および他の疾患関連マーカーの単離となり信頼できない場合が多い。これは、特に癌、残存病変、母体血中の胎児細胞／ＤＮＡ／ＲＮＡ、血液中の細菌およびウイルス（敗血症性感染）の早期検出、ならびに大量の空気中、水中または食料品の中の少数の病原体（たとえば細菌、ウイルスなど）およびバイオテロ病原体の検出の際に問題となる。
【０００５】
ＡＣ電場を使用して細胞およびナノ粒子の操作を行う交流動電技術は、細胞［参考文献２〜５を参照］、バイオマーカー（ＤＮＡ［参考文献５〜８］、タンパク質［参考文献９］など）、さらには薬物送達ナノベシクル［参考文献１０］の分離の際に特に注目されるいくつかの仕組みを提供する。こうした技術は、３つの現象：（１）電極上の界面の電荷により界面の液体が流動するＡＣ電気浸透；（２）電界により発生する熱勾配により溶液が全体的に流れる電熱による流動（ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ｆｌｏｗ）；および（３）ＡＣ電界中の粒子と媒体との間の誘電率の差により粒子の運動が誘起される誘電泳動（ＤＥＰ）［参考文献１０］に明確に分類される。残念ながら、従来のＤＥＰおよび関連する動電効果の形態には、臨床的意義があるサンプル調製および診断のためのこうした科学技術の有用性を損なう問題がある。
【０００６】
第１に、選択性の速度および制御の点からＤＥＰによる分離を効率的に行うには通常、＜１０〜１００ｍＳ／ｍ程度の比較的低い導電率で行う必要がある［参考文献１１］。加えて、溶液のイオン強度が増加し、導電率が１０ｍＳ／ｍを超えると、正またはＤＥＰの高電場領域（通常電極の周囲または電極上）ではナノ粒子またはＤＮＡバイオマーカーなどの所望の物質／分析物が単離できにくくなる。このため、イオン強度が１００〜２００ｍＭ（導電率は約５００〜１０００ｍＳ／ｍ）の範囲にある血液または血漿などの生物学的サンプルを大幅に希釈する、および／または処理した後でないと、ＤＥＰによる分離を行うことができない［参考文献１３、１４］。このことだけで、希少な細胞または少数のバイオマーカーの検出を必要とする臨床診断におけるＤＥＰの有用性が損なわれる場合が多い。サンプル（１ｍｌの血液）を１００〜１０００倍希釈する場合、それは非常に大きなサンプル量を処理しなければならず、著しく時間がかかる場合がある。最初に遠心分離または濾過などの物理的手段により細胞を濃縮してから、低い導電率の緩衝液に希釈する場合、こうした工程は時間がかかるだけでなく、費用がかさむうえ、サンプルが大きく変質する原因ともなる。ＤＥＰを幹細胞の分離に用いる得る場合、イオン強度が低く生理的とは言い難い緩衝液に希釈するため、感受性の高い幹細胞が変質する可能性があり、その後の細胞の分化に影響する恐れもある。また、血液由来のＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質バイオマーカーの単離は、その後の臨床診断、特に癌化学療法［参考文献１５］、残存病変［参考文献１６］および癌の早期検出［参考文献１７］のモニタリングも重要である。
【０００７】
ＤＥＰはＤＮＡおよびタンパク質の単離に使用されてきたが、ＤＥＰを用いてＤＮＡの検出を行うには、やはり問題点と限界がある。第１の問題は、この場合もＤＥＰ解析の前に血液サンプルを希釈する、および／または処理する必要があることである。血中を循環する臨床的意義がある無細胞ＤＮＡおよびＲＮＡバイオマーカーの場合、ＤＮＡ／ＲＮＡの量、そのサイズおよび塩基組成（突然変異および多型）の発見および測定が重要である［参考文献１７〜１９］。遠心分離、濾過および洗浄の手順を含む、または必要とするサンプル処理では、その工程で破損または溶解された正常細胞からＤＮＡ分子が遊離するばかりでなく、臨床的意義があるＤＮＡがより小さなフラグメントに剪断される恐れがある。異質のＤＮＡフラグメントの遊離、および処理に伴う臨床的意義があるＤＮＡの破壊は、こうした手順を用いた診断的価値を大きく低下させ、かつ失わせる。さらに、こうしたサンプル処理は極めて非効率的であり、こうした手順において血液中のＤＮＡの最大６０％およびＲＮＡの９０％超が失われる可能性がある［１７］。
【０００８】
第２の問題点は、ＤＮＡ、タンパク質およびナノ粒子の分離に使用されてきたＤＥＰによる分離装置のほとんどで、粒子捕集部として機能する電極間の距離を非常に小さくして（６μｍまたはそれ以下）作製された金の多点微小電極を使用するか、あるいはアレイ間の距離が６〜８ミクロンまたはそれ以下の、凹凸を有するバンドを配列させた（ｃａｓｔｅｌｌａｔｅｄ）金の微小電極アレイを使用していることである［参考文献１８〜１９］。こうした金の微小電極アレイ装置は、ガラス基板材料に金をスパッタリングして製造されるのが一般的である。さらに、ナノ電極を使用するＤＥＰ法もいくつかある［参考文献２０］。こうした方法の問題は、ＤＮＡまたは他の生体分子を捕捉する実際のスペースが比較的小さく、ナノ電極からの距離が増大すると（たとえば＞１０ｎｍ）、電界効果が大きく低下するため、元来アレイの処理量が少ないことである。この種の装置をサンプル調製（たとえば、１〜１０ｍｌの血液の処理）に対応させる規模にすると、ＤＥＰ電界により調べられる実際のサンプル面積が電極近傍に限られ、大部分のＤＮＡが見逃されたり、あるいは極めて長いサンプル処理時間が必要になったりすると考えられる。数十ナノメートルのナノ電極内を通るよう液体の流れを抑制するように装置を設計する場合、やはり処理時間が非常に長くなるか、あるいは、かなり大型（ｘ−ｙ次元）の装置が必要とされるであろう。他の動電効果および浸透力（ｏｓｍｏｔｉｃ  ｆｏｒｃｅ）による流体の制御されない渦電流など、種々の他の問題も存在する。他のＤＥＰ用途では、血液由来の細菌、および癌細胞のＤＥＰによる分離を行うのに、間隔を約２００μｍとして多孔性ヒドロゲルで被覆した円形の白金微小電極（直径５０μｍ〜８０μｍ）を用いたアレイも使用されきた［参考文献１３、１４］。こうしたＤＥＰによる分離の場合、やはり血液サンプルを遠心し、小さな細胞画分をイオン強度が低い緩衝液に再懸濁していた［参考文献１３、１４、２４〜２６］。
【０００９】
ＡＣ動電技法の第３の一般的な問題は、重要な、または臨床的意義がある分離を行うには、多くの場合、得られる感度と特異性の比が十分に高くないことである。誘電泳動（ＤＥＰ）を用いて、１００万に１つの割合で、効率的に希少な細胞の分離を行う細胞分離は、行いにくい。疾患の早期診断の多くでは希少な細胞または低レベルのバイオマーカーの検出が必須であるため、感度と特異性の比をできる限り向上できることが重要である。一般に、大半のＤＥＰ装置は、単純な統計上の理由から、１〜１０ｍｌの比較的大量の血液サンプルが必要とされる場合があり、かつ希少な細胞または低レベルのバイオマーカーを単離および検出するという臨床の実体に即して適切な規模に設計できない。ＤＥＰ装置を大型サンプル用に設計する場合、装置は非効率となるうえ、高導電率条件で作動することができず、したがってサンプルの希釈がさらに必要になる。
【００１０】
ＡＣ動電技法の第４の問題は、複雑な生物学的サンプル（たとえば血液、血漿、血清など）において希少な細胞、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質などの分析物およびバイオマーカーについて、効率的（損失が少なく）かつ高度に選択的な分離工程を行うことである。こうした物質はどれもサイズ範囲が２〜３桁異なる場合があるが、一方でサイズおよび組成がより類似した物質間で効率的な分離を実現する必要もある。重要な例として、ＤＮＡナノ微粒子（２０〜５０ｋｂ）、高分子量ＤＮＡ（５〜２０ｋｂ）、中分子量ＤＮＡ（１〜５ｋｂ）および低分子量ＤＮＡ（０．１〜１ｋｂ）の分離が挙げられる。
【００１１】
最後にＡＣ動電（ＤＥＰ）装置および技法の最も重大な問題は、溶液の導電率が上がり（＞１００ｍＳ／ｍ）、ＡＣ周波数が下がり（＜２０ｋＨｚ）、電圧が高くなる（＞２０ボルト  ｐｔ−ｐｔ）とより顕著になる電気化学反応が生じることである。本文書の詳細な説明のセクションで示すように、こうした電気化学は、泡立ち、加熱、流体の乱流、電極の劣化および不安定な分析物の破壊など、いくつかの悪影響を引き起こす恐れがある。こうした悪影響はＤＥＰ装置全体の性能を大きく限定し、ＤＥＰの高電場領域における特定の物質（細胞、ナノ粒子、ＤＮＡおよびタンパク質）の蓄積、単離および検出の妨げとなるほか、細胞および分析物をＤＥＰの低電場領域に単離するのを妨害する。
【００１２】
細胞およびナノ粒子の分離には、他の種類のＡＣ動電装置も使用されているが、高導電率溶液中で有効であることは証明されていない。ＡＣ動電およびＤＥＰ装置の非有効性に対する最も説得力のある論拠の１つは、ＤＥＰが、生物学的研究および臨床診断で繁用されているＤＣ電気泳動と異なり、実用的用途でまったく使用されていないことである。高導電率の生物学的サンプルおよび緩衝液中で分離が可能な高い性能特性を持つ誘電泳動が行われることが望ましいと考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の実施形態は、血液もしくは他の生物学的サンプルまたは緩衝液中の希少な細胞、細菌、ウイルス、薬物送達ナノベシクルおよびナノ粒子、細胞オルガネラおよび構造体（核、ミトコンドリア、液胞、葉緑体、カイロミクロン（ｃｙｌｏｍｉｃｒｏｎ）など）、循環血中の無細胞ＤＮＡ／ＲＮＡバイオマーカーおよび他の疾患関連の細胞ナノ微粒子（たとえば癌細胞、疾患細胞または損傷細胞が血液、リンパ液または器官に放出する部分的に分解された細胞成分）、抗体、抗体複合体、タンパク質、酵素ならびに薬剤および治療剤を直接分離および同定するため、ＡＣ動電および誘電泳動（ＤＥＰ）、ＤＣ電気泳動、装置上の微小電気泳動、および流体技術を独自に多次元的に組み合わせることを含む新規のサンプル調製、サンプルの応答およびポイントオブケアのシステム、装置、方法および技法に関する。開示された実施形態では、複雑なサンプル調製、生体分子の分離および診断解析の実施に使用する、新規のチャンバー装置および多孔性の構造体で積層された強固な電極（ミクロおよび／またはマクロサイズ）のアレイを組み込んだ他の装置により、連続および／またはパルス動電／誘電泳動（ＤＥＰ）力と、連続および／またはパルスフィールドＤＣ電気泳動力と、装置上の微小電気泳動によるサイズ分離と、流体の制御（外部からのポンピングおよび／またはＤＣ／ＡＣ動電による）とを組み合わせて使用する。
【００１４】
本明細書はまず、電極が別々のチャンバーに配置され、内側のチャンバー内に孔または穴構造体を介してＡＣ  ＤＥＰ電界を通過させることにより正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）のＤＥＰ領域および負（ｎｅｇａｔｉｖｅ）のＤＥＰ領域が形成される新規の動電学的ＤＥＰ装置およびシステムを開示する。細胞、ナノ粒子およびバイオマーカーを移動させるため、様々な幾何形状を用いて所望の正のＤＥＰ（高電界）領域および負のＤＥＰ（低電界）領域を形成してもよい。こうした孔または穴構造体は、多孔性材料（ヒドロゲル）を含んでいても（すなわち充填されていても）よいし、または多孔性の膜状構造で被覆されていてもよい。電極を別々のチャンバーに分離することで、こうした孔／穴構造を持つＤＥＰ装置では、ＤＥＰ工程において内部の分離チャンバー内でどのような電気化学作用、加熱または無秩序な流体の移動も基本的に起こらない（図１および図２を参照）。
【００１５】
本明細書はさらに、ＤＥＰ、電気泳動および流体の力を組み合わせて臨床的に意義がある量の血液、血清、血漿または他のサンプルを比較的高イオン強度／導電率条件下でより直接的に解析できるように一定の規模で区切られた（ｘ−ｙ次元の）強固な電極アレイ、および戦略的に配置された（ｘ−ｙ−ｚ次元の）補助電極構成体の使用を開示する。本明細書は、強固な電極構造体（たとえば白金、パラジウム、金など）を１種または複数種の多孔性材料（天然または合成の多孔性ヒドロゲル、膜、制御されたナノポア材料および薄層誘電体材料）の層で積層することで、電極上または電極近傍で起こる任意の電気化学（電界）反応、加熱および無秩序な流体の移動の作用を抑制しつつも、細胞、細菌、ウイルス、ナノ粒子、ＤＮＡおよび他の生体分子の効率的な分離が可能になることを開示する（図３〜８）。より高分離能の分離を達成するには、ＡＣ周波数の交差点のほか、第２の分離の際に装置上（アレイ上）のＤＣ微小電気泳動を使用することもできる。たとえば、ＤＮＡナノ微粒子（２０〜５０ｋｂ）、高分子量ＤＮＡ（５〜２０ｋｂ）、中分子量ＤＮＡ（１〜５ｋｂ）およびより低分子量のＤＮＡ（０．１〜１ｋｂ）フラグメントの分離である（図９〜１２）。装置を小さく区切れるということは、こうした装置上で様々な血液細胞、細菌およびウイルスならびにＤＮＡを並行して同時に分離できることを意味する（図１３〜１６）。
【００１６】
本発明の実施形態はさらに、より選択的かつ効率的に細胞（たとえば癌および幹細胞）を分離する温度制御の使用に関する。したがって、一態様では、本発明の実施形態は、癌細胞、細菌、ウイルス、ナノベシクル（薬物送達）、ナノ粒子、高分子量ＤＮＡナノ微粒子、細胞オルガネラ、タンパク質、抗体および抗体複合体、ならびに疾患および代謝状態の他の様々な臨床的意義があるバイオマーカーについて、血液をモニターおよび／または解析するのに使用できるエキソビボでのサンプル調製、シームレスなサンプルの応答、ラボオンチップおよびポイントオブケア（ＰＯＣ）の診断システムに関する。こうしたエキソビボのシステムおよび装置は、ＡＣ電界を用いた分析物および臨床的意義がある物質の分離、単離、高度な濃縮および検出を行うことで、血液のモニターまたはスキャンが可能である。このシステムを用いれば、以下に限定されるものではないが、免疫化学；ＤＮＡ／ＲＮＡプローブハイブリダイゼーション；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およびジェノタイピング、配列解析、遺伝子発現のための他の技法など、さらに複雑な解析を目的としてこうした物質をすべて同一のサンプルチャンバー（シームレスなサンプルの応答）内で、あるいは関連する分析装置および／または収集システムにより選択的に収集することができる。本発明により構成された新規の装置は、迅速な分子診断を無希釈の血液サンプルを用いてすばやく行うことができる、ポイントオブケア（ＰＯＣ）のシームレスなサンプルの応答システムであってもよい。本発明による別の新規の装置は、患者の血液をシャントに循環させ、迅速に解析（バイオマーカーＤＮＡ、薬剤または薬物送達ナノベシクルのレベルの測定および癌細胞の単離）を行い、希釈による、または物理的／化学的なサンプルの変質を最小限にとどめて（閉ループにより）患者に戻すことが可能なエキソビボの癌化学療法モニタリングシステムであってもよい。さらに、こうしたエキソビボのシステムは、特に救命医療場面での他の治療剤、疾患および患者の傾向のモニタリングに使用してもよい。
【００１７】
本発明を利用する本開示のシステム、装置、方法および技法は今回、従来のＤＥＰによる分離の大部分が使用していたよりも高導電率（＞１００ｍＳ／ｍ）のイオン強度条件下、低ＡＣ（ＤＥＰ）周波数（＜２０ｋＨｚ）および高電界強度（＞２０電圧  最大振幅（ｐｋ−ｐｋ））で細胞、ナノ粒子およびバイオマーカー物質の分離を可能にする。さらに具体的に言えば、より高イオン強度条件下だけでなく、血液、血漿、血清および無希釈の緩衝液などの複雑な生物学的サンプル中で直接ＤＥＰによる分離を行うこともでき、今やＤＥＰの高電場領域でナノスケール（５００ｎｍ〜５ｎｍ）の分析物および物質の単離が可能であると同時に、電極間のＤＥＰの低電場領域でより大きな物質（細胞、ミクロン粒子など）を単離することもできる。
【００１８】
新規の装置を用いれば、現在ナノ粒子および生体分子の分離に好ましい方法である、凹凸を有するバンドを配列させた（ｃａｓｔｅｌｌａｔｅｄ）ＤＥＰ電極アレイの使用に伴って起こる電気化学、加熱および無秩序な流体による作用が抑制される。別の態様では、装置および方法において、区切られたアレイ内に強固な複数の電極がより巨視的な規模の構成を使用してもよい。この電極構成により、これまでより大きなサンプル量をより迅速および効率的に調べられるばかりでなく、基本的に非常に少量の癌細胞、細菌、ウイルス、ナノ粒子およびナノ微粒子、および非常に低濃度のＤＮＡ、ＲＮＡバイオマーカーおよび抗体複合体を、非常に多くの正常な細胞を含む複雑なサンプル、すなわち血液から単離することができる。基本的に、「適切な規模に設計された」巨視的な電極システムを使用すると、百万個の細胞からある特定の細胞（または他の物質）を発見する工程が、千個の細胞からある特定の細胞を発見することに切り替わる。すなわち、サンプルが多くの小さな電極群に分散され、階層的な並列選別機構が形成される。この分離工程を血液の処理に応用すると、比較的小さいサイズのＤＮＡ、ＲＮＡおよび比較的高分子量のＤＮＡをタンパク質および細胞から取り出すことができる。電極のサイズ（直径１０〜１００ミクロン、距離２０〜１００ミクロン）および希釈を抑えたサンプルが使用可能であることにより、今回の分離工程は、各部が個々に１００〜１０００枚の電極を含んでもよい２〜１００個のアレイ部を備えた規模のアレイ装置上で迅速かつハイスループットで実施できる。さらに、この装置には、ｘ−ｙ−ｚ次元に戦略的に配置された補助電極を組み込むことも考えられる。
【００１９】
本明細書に記載の実施形態は、開示されたアレイ装置およびシステムを用いると、（他のＡＣ動電現象と共に）直径が約５００ｎｍ以下のナノ粒子全体に固有のクラウジウス‐モソティ（Ｃｌａｕｓｉｕｓ  Ｍｏｓｓｏｔｔｉ）因子効果に基づき、比較的低周波数範囲（１０〜５０ｋＨｚ）でナノ粒子および細胞ナノ微粒子を比較的大きなサイズの物質（細胞およびミクロンサイズの粒子）から分離することができることを示す。本明細書はさらに、ＡＣ動電現象を流体と一緒にする場合、その工程で過剰な熱の発生が緩和されることを開示する。本明細書はさらに、流体およびＤＣ電気泳動をＡＣ動電現象と組み合わせると、細胞とタンパク質とを共に図示した装置の下方のアレイ部の方に効率的に移動させられる一方で、強い負電荷を帯びたＤＮＡナノ微粒子およびＤＮＡ分子を、装置の上方のアレイ部の方に濃縮することができることを開示する。このため、図示した装置の異なるアレイ部を用いれば、装置の下方のアレイ部での赤血球、白血球、癌細胞の分離およびタンパク質の除去；中央のアレイ部での細菌、ウイルス、ナノ粒子およびナノベシクルの分離；および上方のアレイ部でのＤＮＡナノ微粒子およびＤＮＡ分子の分離による多重化など、より選択的な分離工程を行うことができる。
【００２０】
最後に、本明細書はさらに、別々の電極チャンバーおよび孔／穴構造体が単独の分離チャンバーに結び付けられている装置、および同時に、あるいはその後に第２のサイズ分離工程を行う際に使用できる、ナノポーラス材料（厚さ１ナノメートルから１ミリメートル）で積層された強固な電極アレイ装置を開示する。たとえば、図示した装置の上方のアレイ部を用いてＤＮＡ成分の複雑な混合物を濃縮できれば、ＡＣ動電現象およびＤＣ電気泳動力の組み合わせを用いて、高分子量ＤＮＡ（５〜５０ｋｂ）、中分子量ＤＮＡ（１〜５ｋｂ）およびより低分子量のＤＮＡ（０．１〜１ｋｂ）からＤＮＡナノ微粒子を分離する第２の分離を実現することができる。さらに、図示した実施形態では、ナノポーラス層内のＤＣ微小電気泳動を用いて様々なＤＮＡフラグメントのサイズ分離が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】各電極が別々のチャンバーに配置され、ＤＥＰ電界が細孔構造体を通過して内側のチャンバー内で発生する、新規動電学的ＤＥＰ装置を示す。
【図２】図１に示す新規動電学的ＤＥＰ装置の表面の孔／穴形状体を示す。
【図３】例示的な流体およびサンプルを表示した、本発明により構成された電極配置を示す。
【図４】本発明による電極にパルスを印加した図１の電極配置を図示する。
【図５】分離結果を改善するため電極を選択的に活性化した、図１の電極配置を示す。
【図６】パルスＡＣ  ＤＥＰ／ＤＣ電気泳動／制御された流体の流れの組み合わせを印加する前の血液サンプルの分離工程のより詳細な模式図を示す。
【図７】パルスＡＣ  ＤＥＰ／ＤＣ電気泳動／制御された流体の流れを組み合わせた最初の段階の血液サンプルを示す。
【図８】パルスＡＣ  ＤＥＰ／ＤＣ電気泳動／制御された流体の流れを組み合わせた最終段階の血液サンプルを示す
【図９】上方のアレイ部でのパルスＡＣ  ＤＥＰおよびＤＣ電気泳動の組み合わせによる、蛍光染色したＤＮＡナノ微粒子（ｎａｎｏｐａｒｉｃｕｌａｔｅ）、非常に高分子量のＤＮＡおよび中から比較的低分子量のＤＮＡの選択および分離を示す。
【図１０】上方のアレイ部でのパルスＡＣ  ＤＥＰおよびＤＣ電気泳動の最初の組み合わせによる、蛍光染色したＤＮＡナノ微粒子、超高分子量（ｖｈ  ＭＷ）ＤＮＡおよび中〜比較的低分子量（ＭＷ）のＤＮＡの選択および分離を示す。
【図１１】上方のアレイ部でのパルスＡＣ  ＤＥＰおよびＤＣ電気泳動の最終的な組み合わせによる、蛍光染色したＤＮＡナノ微粒子（ｎａｎｏｐａｒｉｃｕｌａｔｅ）、超高分子量ＤＮＡおよび中〜低分子量ＤＮＡの選択および分離を示す
【図１２】ＤＮＡナノ微粒子（ｎａｎｏｐａｒｉｃｕｌａｔｅ）および非常に高分子量のＤＮＡの除去と、アレイ上でのＤＣ電気泳動による中および低分子量のＤＮＡフラグメントのサイズ分離とを示す。
【図１３】装置の下方のアレイ部での赤血球および白血球に対する最初のパルスＡＣ  ＤＥＰの印加を示す。
【図１４】装置の下方のアレイ部での赤血球および白血球に対する最終的なパルスＡＣ  ＤＥＰの印加を示す。
【図１５】装置の中央のアレイ部での細菌、ウイルスおよびナノベシクルを分離するための最初のパルスＡＣ  ＤＥＰを示す。
【図１６】装置の中央のアレイ部での細菌、ウイルスおよびナノベシクルを分離するための最終的なパルスＡＣ  ＤＥＰを示す。
【図１７】中および高導電率条件下での６０ｎｍおよび２００ｎｍのナノ粒子のＤＥＰによる分離を示す。
【図１８】中および高導電率条件下での２００ｎｍのナノ粒子のＤＥＰによる分離を示す。
【図１９Ａ−Ｄ】中および高導電率条件下での６０ｎｍのナノ粒子のＤＥＰによる分離に関する３Ｄ蛍光強度画像を示す。
【図１９Ｅ−Ｈ】中および高導電率条件下での２００ｎｍのナノ粒子のＤＥＰによる分離に関する３Ｄ蛍光強度画像を示す。
【図２０】高導電率条件での６０ｎｍのナノ粒子のＤＥＰによる分離に関する実像を示す。
【図２１】６０ｎｍおよび２００ｎｍのナノ粒子における導電率の上昇に対するナノ粒子の蛍光強度の上昇に関するグラフを示す。
【図２２】６０ｎｍおよび２００ｎｍのナノ粒子に関する実験結果とＤＥＰの理論的交差曲線とを導電率の関数としたグラフを示す。
【図２３】非被覆白金電極およびヒドロゲル被覆白金電極を用いて導電率を上げた（電極が黒ずむ）ときの２００ｎｍのナノ粒子のＤＥＰによる分離に関する実像を示す。
【図２４】ナノ粒子の非存在下での高導電率ＤＥＰ後の電極損傷に関する光学顕微鏡画像を示す。
【図２５】高導電率ＤＥＰ後の電極損傷および２００ｎｍのナノ粒子の融合に関するＳＥＭ画像を示す。
【図２６】高導電率ＤＥＰ後の６０ｎｍのナノ粒子および電極損傷に関する蛍光画像を示す。
【図２７】ステップ１を構成する、血液中の高分子（ｈｍｗ）ＤＮＡに関するシームレスなサンプルの応答工程を示す。
【図２８】ステップ２を構成する、血液中の高分子ＤＮＡに関するシームレスなサンプルの応答工程を示す。
【図２９】ステップ３を構成する、血液中の高分子ＤＮＡに関するシームレスなサンプルの応答工程を示す。
【図３０】ステップ４を構成する、血液中の高分子ＤＮＡに関するシームレスなサンプルの応答工程を示す。
【図３１】ステップ５を構成する、血液中の高分子ＤＮＡに関するシームレスなサンプルの応答工程を示す。
【図３２】複雑なサンプルを用いたシームレスなサンプルの応答工程を示す。
【図３３】ＰＣＲおよびイムノアッセイ解析を用いた、複雑なサンプルに関するシームレスなサンプルの応答工程を示す。
【図３４】ＰＣＲおよびイムノアッセイ解析および検出を用いた、複雑なサンプルに関するシームレスなサンプルの応答工程を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本文書は、以下に限定されるものではないが、血液、血漿、血清、尿、リンパ液、唾液、生検サンプル、細胞培養物（幹細胞）、細菌および発酵培養物など適切な量の高導電率（イオン強度）の生物学的および臨床サンプルならびに緩衝液から細胞、ナノベシクルおよびナノ微粒子、細菌および／またはウイルス、さらには臨床的意義がある一連の他の疾患バイオマーカーを分離および同定することができるように、誘電泳動（ＤＥＰ）などのＡＣ動電学、ＤＣ電気泳動学、微小電気泳動および流体光学を多次元的に独自に組み合わせた新規のサンプル分離およびサンプルの応答システム、装置、方法および技法を教示する。本発明の開示された実施形態により、細胞、ナノ粒子および他の分析物のＤＥＰによる分離を無希釈のサンプル（血液、血漿、生体用緩衝液）中で直接を行うことができるが、一方においてこの実施形態は、ある程度希釈したサンプルまたは緩衝液、あるいは他のサンプル調製手順を経たサンプルに対して、開示された装置および方法を使用することを排除するものではない。
【００２３】
規定の直径および離隔距離を持つ強固な電極を備えた新規のマルチチャンバー装置および電極アレイ装置を用いることにより、高導電率（イオン強度）の溶液中でうまく働くＤＥＰを行うことが可能になる。こうした新規のＤＥＰ装置は、高導電率条件下で起こる電気化学反応の進行に起因する泡立ち、加熱および他の悪影響により効率が低下したり、あるいは複雑な生物学的サンプルおよび高イオン強度の緩衝液から特定の分析物または物質が分離、濃縮および検出されるのを妨げたりしないように設計される。問題のあるＡＣ動電および誘電泳動分離装置の大部分にとって、高導電率条件下でＤＥＰによる分離を行うことは大きな課題となっており、そこには限界があった［参考文献１〜２８］。ヒドロゲルを被覆した電極を備えたマイクロアレイ装置を用いて、ある程度高い導電率でのＤＥＰによる分離を短時間実現できたとしても、こうした装置の場合、サンプルの分離手段および診断装置としてうまく働かなかった［参考文献１３、１４、２４〜２８］。
【００２４】
このＤＥＰにおける導電率の限界を分かりやすくするため、本明細書に記載の第１の例として、まず低伝導度緩衝液中のナノ粒子のＤＥＰによる分離を示す。この例では、ミリＱ水（５．５μＳ／ｍ）中で６０ｎｍのＤＮＡ誘導体化ナノ粒子と１０μｍの粒子との分離を行う。分離は１０ｋＨｚ  ＡＣ、１０ボルト  最大振幅（ｐｅａｋ−ｔｏ−ｐｅａｋ：ｐｋ−ｐｋ）で行った。図１７ａは、微小電極アレイ上にランダムに分布する１０μｍの粒子にＡＣ電界を印加する前に白色光を照射したときの初期状態を示す。赤色蛍光検出における初期状態では、マイクロアレイ全体で６０ｎｍのＤＮＡ誘導体化蛍光ナノ粒子からのものと予想される赤色蛍光がぼやけて見える（図１７ｂを参照）。ＡＣ  ＤＥＰ電界をわずか３０秒間印加しただけで、１０μｍの粒子のほとんどが、負のＤＥＰの低電場領域に非常に整然と配列した状態で濃縮された（図１７ｃを参照）。１分間のＡＣ電場の印加後には、６０ｎｍのＤＮＡ誘導体化ナノ粒子が、微小電極上の正のＤＥＰの高電場領域に濃縮された（図１７ｄを参照）。微小電極上の高い蛍光強度とその周辺領域における蛍光強度の低下から、ほとんどのナノ粒子が高電場領域に濃縮されたことが示唆される。次の例は、０．０１×ＴＢＥ（１．８１ｍＳ／ｍ）中で１０μｍの粒子と混合した２００ｎｍのナノ粒子のＤＥＰによる分離を３ｋＨｚ  ＡＣ、１０ボルト  最大振幅で行ったものを示す。最初の白色光の図は、電場を印加する前のランダムに分布する１０μｍの粒子を示し（図１７ｅ）、緑色蛍光の図は、高電場領域に２００ｎｍのナノ粒子が蓄積されていないことを示す（図１７ｆ）。１０分未満で、１０μｍの粒子は低電場領域に濃縮され（図１７ｇ）、２００ｎｍのナノ粒子は正のＤＥＰの高電場領域に高度に濃縮された（図１７ｈ）。こうした低伝導度でのＤＥＰの結果は全般に、文献に引用された他の低伝導度でのＤＥＰによるナノ粒子の分離と一致しており、古典的なＤＥＰ理論から予想されるものである［参考文献１１〜１４］。
【００２５】
次の一連のＤＥＰの例は、伝導度が１００ｍＳ／ｍより大きい緩衝液溶液における６０ｎｍのＤＮＡ誘導体化ナノ粒子、２００ｎｍのナノ粒子および１０μｍの粒子の分離を示す。１×ＴＢＥ（０．１０９Ｓ／ｍ）において、ＡＣ電場を２０分間印加した後、白色光条件下で２００ｎｍのナノ粒子と１０μｍの粒子との分離を行ったところ、１０μｍの粒子が低電場領域に濃縮されることが示された（図１８ａ）。緑色蛍光を照射したところ、２００ｎｍのナノ粒子は、微小電極の上の正のＤＥＰの高電場領域に濃縮された（図１８ｂ）。１×ＰＢＳ（１．６８Ｓ／ｍ）を用いて行ったＤＥＰ実験では、２０分後、１０μｍの粒子が低電場領域に濃縮される（図１８ｃ）。高導電率の１×ＰＢＳ緩衝液実験における２０分後の緑色蛍光画像を、一部の小さい泡を除去してから増幅して撮影した（図１８ｄ）。この画像は、２００ｎｍのナノ粒子が４枚の微小電極の正のＤＥＰの高電場領域に濃縮したことを示す。しかしながら、微小電極は、このとき著しく黒ずみ、微小電極のうち２枚は泡だっていた。２００ｎｍのナノ粒子が主にこうした４枚の微小電極に濃縮されたという観察結果は、微小電極からやや高い電場が発生することと整合する。
【００２６】
１×ＰＢＳ緩衝液中の高導電率実験を６０ｎｍのＤＮＡ誘導体化ナノ粒子を用いて行っても、同様の結果が得られた。すなわち、６０ｎｍのナノ粒子は、微小電極の３枚でやはり正のＤＥＰの高電場領域に濃縮することが観察された。その後、三次元ピークを与えるＭＡＴＬＡＢを用いて、数学的モデルにより蛍光画像の解析を行ったところ、高電場領域における蛍光ナノ粒子の濃縮がより明らかになった。６０ｎｍのＤＮＡ誘導体化ナノ粒子を用いた１×ＴＢＥの実験では、３Ｄ蛍光データにより０分時点（図１９ａ）から２分時点（図１９ｂ）、８分時点（図１９ｃ）および１６分時点（図１９ｄ）にかけて強度が顕著に高まることが示された。同様に、１×ＰＢＳ中における２００ｎｍのナノ粒子の３Ｄ蛍光データでも、０分時点（図１９ｅ）から８分時点（図１９ｆ）時点、１６分時点（図１９ｇ）および２０分後（図１９ｈ）に強度が顕著に高まることが示された。
【００２７】
１×ＰＢＳ中の６０ｎｍのＤＮＡ誘導体化ナノ粒子でもやはり、蛍光画像（図２０ａ）に見られるように濃縮が認められる。この３Ｄ蛍光画像データはさらに、０分（図２０ｂ）から８分（図２０ｃ）および２０分（図２０ｄ）にかけて同様の蛍光の増加も示される。図２０ａに示す微小電極の１枚（３列目２行目）の内部活性化（ｉｎ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）により、電界パターンが若干変化している。緩衝液１×ＴＢＥ、０．１×ＰＢＳ（０．１７７Ｓ／ｍ）および１×ＰＢＳを用いた実験の０分、０．５分、１分、２分、４分、８分、１６分および２０分時点での蛍光データ全体は、ＭＡＴＬＡＢを用いて編集した。６０ｎｍのＤＮＡ誘導体化ナノ粒子に関する結果をグラフ（図２１ａ）に、２００ｎｍのナノ粒子に関する結果をグラフ（図２１ｂ）に示す。こうした例は、経時的に蛍光ナノ粒子の濃縮が増加することを示す。より重要なのは、こうした例はさらに、緩衝液の伝導度が大きくなるにつれ蛍光ナノ粒子の全体の濃縮が著しく低下する、すなわち、導電率条件が上昇するにつれ物質を濃縮するのに要する時間がかなり長くなることを示すことである。
【００２８】
ここで図２２は、６０ｎｍのＤＮＡ誘導体化ナノ粒子および２００ｎｍのナノ粒子のクラウジウス‐モソティ因子（Ｒｅ（Ｋ（ω）））の実部に関する理論曲線および実験結果の範囲と伝導度とを示す。グラフは、こうした例で使用した伝導度に対するＲｅ（Ｋ（ω））の理論値が負であると考えられ、したがってナノ粒子が低電場領域に蓄積するはずであることを示す。しかしながら、実際の結果は、ナノ粒子の蓄積が高電場領域で続くことを示す。残念ながら、こうした高導電率条件下（＞１００ｍＳ／ｍ）では、泡立ち、電極の黒ずみ、電極の故障が起こり、ＤＥＰに要する時間がかなり長くなるため、分離が相対的に非効率的なものになる。
【００２９】
こうしたＤＥＰに関する悪影響は、ナトリウム（Ｎａ＋）およびクロライド（Ｃｌ−）電解質を含むイオン強度が比較的高い緩衝液を用いたときに起こる電気化学活性の増加に起因することが発見されている［参考文献２９〜３０］。こうした作用の理解を深めるには、これまでよりうまく機能し頑強な分子診断用途のＤＥＰ装置を開発する必要があった。高導電率条件下における微小電極／ナノ粒子／電解質の不都合な相互作用を明確に示す別の例を、今回本明細書に記載の実施例に示す。こうした例では、様々な導電率（イオン強度）条件下、ヒドロゲルを含む白金微小電極構造体（図２３Ａ〜Ｆ）およびヒドロゲル層を含まない白金微小電極構造体（図２３Ｇ〜Ｈ）を用いて、２００ｎｍの黄色−緑色蛍光ポリスチレンナノ粒子を、１０ミクロン球から分離して、検出を行った。全緩衝液（０．０１×ＴＢＥ、１×ＴＢＥ、１×ＰＢＳ）の結果から、２００ｎｍの緑色蛍光ナノ粒子が微小電極のＤＥＰの高電場領域に分離および濃縮され、１０μｍの球が微小電極間の低電場領域に濃縮されることが示される。この場合も、０．０１×ＴＢＥにおいて２００ｎｍのナノ粒子の濃縮が最も大きいようであり、緩衝液のイオン強度が１×ＰＢＳまで増すにつれ濃縮は小さくなる（図２３Ｂ、２３Ｄ、２３Ｆおよび２３Ｈを参照）。ナノ粒子の濃縮は、ヒドロゲルを含む微小電極の中心で、非被覆の微小電極の外周囲で起こりやすい（図２３Ａ、２３Ｃ、２３Ｅ、２３Ｇ）。導電率が最も高い緩衝液（１×ＰＢＳ）では、ヒドロゲル被覆微小電極（図２３Ｅ）および非被覆の微小電極（図２３Ｇ）のどちらも電極がかなり黒ずんでいる。
【００３０】
こうした図面には示されていないが、１×ＰＢＳ緩衝液中ではＤＥＰから４分後、ヒドロゲル被覆および非被覆の微小電極のどちらも微細な泡立ちが増加することも観察された。ただし、微細な泡立ちは、非被覆の微小電極の方でより顕著なようであった。さらに、ＡＣ電圧を２０ボルト  最大振幅よりも上げたとき、１×ＰＢＳ緩衝液では、ほとんど全部の電極において無秩序な泡立ちも起きる。ヒドロゲル被覆および非被覆の白金微小電極ではどちらもナノ粒子の濃縮および黒ずみが観察され得たが、非被覆の微小電極では走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して電気化学作用を解析し、ナノ粒子の濃縮および付着を確認する状況となった。
【００３１】
次の一連の例では、高伝導度の１×ＰＢＳ緩衝液中で非被覆の微小電極を用いてナノ粒子の存在しない状態でＤＥＰを行った。微小電極アレイを洗浄し、乾燥させてからＳＥＭを用いて画像化した。最初の図２４Ａは不活性な対照微小電極の光学顕微鏡画像を示し、さらに３０００Ｈｚ、１０ボルト  最大振幅でのＤＥＰから１０分後の活性化微小電極（図２４Ｂ）を示す。活性化微小電極が著しく黒ずんでいるのが、はっきりと観察される。次に図２４Ｃおよび２４Ｄは、同じ不活性な微小電極および活性化微小電極のＳＥＭ画像を示す。ＳＥＭ画像では、活性化微小電極の著しい損傷および劣化がはっきりと観察される。図２４Ｅおよび２４Ｆは微小電極のＳＥＭ画像の拡大図であり、微小電極の周囲付近で起こる白金層の劣化が一層はっきりと示される（図２４Ｆ）。
【００３２】
高導電率の１×ＰＢＳ緩衝液中に２００ｎｍのナノ粒子が存在する状態でＤＥＰの例を同様に行った。最初に、図２５Ａは、高伝導度の１×ＰＢＳ緩衝液において３０００Ｈｚ、１０ボルト  最大振幅でのＤＥＰから２分後の不活性な対照微小電極のＳＥＭ画像を示す。この活性化していない対照微小電極では、この構造体にランダムに分布する２００ｎｍのナノ粒子がほとんどないことが示される。図２５Ｂは、対照微小電極の辺縁のＳＥＭ画像の拡大図を示し、白金微小電極の辺縁の間の領域にいくつかのナノ粒子がランダムに捕集されているように見える。図２５Ｃは、２００ｎｍのナノ粒子が存在する状態で２分間活性化された微小電極のＳＥＭ画像を示す。たくさんのナノ粒子が濃縮され、特に微小電極の辺縁に付着している。拡大画像（図２５Ｄ）では濃縮されたナノ粒子の集合体が非常によく分かり、微小電極の辺縁で白金がやや劣化していることが窺われる。次に図２５Ｅおよび２５Ｆは、２００ｎｍのナノ粒子を用いたＤＥＰから５分後の活性化微小電極の画像を示す。ここでも２００ｎｍのナノ粒子の濃縮および集合体形成がはっきりと観察されるが、この場合、白金微小電極構造がより激しく損傷および劣化しているようである。図２５Ｇは図２５Ｄの微小電極辺縁のＳＥＭ画像の拡大図であり、やはりナノ粒子の集合体形成が示される。最後に、図２５Ｈは劣化した微小電極（図２５Ｆで見られる）の画像の拡大図であり、ナノ粒子の集合体がナノ粒子の融合または溶融集合体と一緒に散在していることが示される。こうしたナノ粒子の融合集合体は、ＤＥＰによる活性化時間が長くなったときの強い電気化学活性（熱、Ｈ＋およびＯＨ−）によるものである。
【００３３】
もう１つの一連の例では、高導電率の１×ＰＢＳ緩衝液中で、ヒドロゲルを含まない微小電極構造体を用いて、４０ｎｍの赤色蛍光ナノ粒子を、１０ミクロン球からＤＥＰにより分離し検出した。図２６ＡはＤＥＰによる活性化前の微小電極の赤色蛍光画像であり、４０ｎｍのナノ粒子の濃縮は示されない。図２６Ｂは、１０，０００Ｈｚ、１０ボルト  最大振幅で４分間ＤＥＰにより活性化された後の微小電極の赤色蛍光画像であり、このときは微小電極の周囲に４０ｎｍのナノ粒子の濃縮がはっきりと示される。図２６ＣはＳＥＭによる高倍率画像であり、微小電極の損傷および４０ｎｍのナノ粒子の集合体形成を示す。
【００３４】
こうした例は、ＤＥＰを高導電率条件下（＞１００ｍＳ／ｍ）で行うと電気化学活性の増加が起こることをはっきりと示す。この非常に強い電気化学反応により微細な泡立ち、および微小電極の黒ずみが起こる。より重要なのは、著しい微小電極の劣化が起きており、最終的に電極の故障を引き起こし、かつＤＥＰによる活性化時間が長くなるにつれ、この微小電極の破損が進むことが見て取れることである。劣化した微小電極構造体でポリスチレンナノ粒子の融合が観察されたことから、ＤＥＰはＡＣ動電工程であるにもかかわらず、かなりの加熱が起きていることが示唆される。こうした結果は、Ｏ２、Ｈ２、Ｈ＋、ＯＨ−、熱および泡を発生させると思われるＤＣ電解反応が原因と考えることができる。１×ＰＢＳ緩衝液中にナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）およびクロリド（Ｃｌ−）電解質が存在すると、ＤＥＰ中に微小電極の表面上に認められる全体的な腐食状態を助長する恐れがある。大部分の生物学的および臨床サンプルならびに緩衝液は、導電率の高いことに加えて、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）およびクロライド（Ｃｌ−）の濃度が比較的高い。こうした結果から、強固とは言い難い金スパッタ電極を使用する古典的なＤＥＰが、低い導電率条件でしか行うことができない（参考文献２９、３０）、すなわち、電極が数秒で破損される恐れがある理由がすぐに明らかになる。
【００３５】
ヒドロゲル被覆白金微小電極を用いれば、高導電率条件でナノ粒子を確かに分離することができるが、それでもヒドロゲル被覆白金微小電極は以下の理由から依然としてどのような実用的な用途にも適していない。第１に無秩序な泡立ちが顕著になり、電極が故障すれば、血液を用いたどの種のサンプルの応答分子診断に対しても装置自体が信頼できないものになる。軟膜および全血からナノ粒子の分離を行う別の実験では、泡立ち、電極の黒ずみおよび電極の故障が観察された。ナノ粒子が高電場領域に単離され得ても、ナノ粒子を流体の洗浄により取り出すことは困難であったことから、不都合な加熱によりナノ粒子がアレイ表面に融合していた可能性があることが示唆される。第２に、生物学的サンプルの分離、およびその後の分子解析（たとえばＰＣＲ、イムノアッセイなど）では、こうした加熱および強い電気化学反応が細胞、ＤＮＡ、タンパク質および他のほとんどの分析物に激しい損傷を与えると考えられる。第３に、分離効率を向上させる（濃縮される分析物の総量を増やす）には、ＤＥＰ時間を長くする必要があり、これがさらに多くの悪影響を引き起こすと考えられる。第４に、高いＡＣ電圧（たとえば２０ボルト、最大振幅）を用いて濃縮速度を上げた場合、これも、さらに強い泡立ちおよび電気化学作用を引き起こすことになるであろう。今回、このような古典的なＤＥＰ装置および導電率の限界の根底にある理由が発見されたことで、これまでよりもうまく働くＤＥＰサンプル調製装置、および新規のシームレスなサンプルの応答診断システムを開発する機会がもたらされた。こうした新規のＤＥＰ装置を用いれば、希少な細胞、ナノ粒子および種々の重要な疾患バイオマーカーを血液、血漿、血清および他のほとんどの生物学的サンプルならびに緩衝液中で直接単離、濃縮および検出することができる。
【００３６】
本記述は次に、複雑なサンプル調製を行うのに使用できる本発明の新規の装置と共に、特定の分析物の分離および濃縮、さらにその後の分子診断解析および検出に結び付く連続および／またはパルス動電／誘電泳動（ＤＥＰ）力、連続および／またはパルスＤＣ電気泳動力、装置上（アレイ上）の微小電気泳動サイズ分離、および流体の制御（外部からのポンピングおよび／またはＤＣ／ＡＣ動電による）の組み合わせを開示する。これには、以下に限定されるものではないが、（１）蛍光抗体、非蛍光抗体、抗体誘導体化ナノ粒子、抗体誘導体化ミクロスフェア、抗体誘導体化表面（ＤＥＰ装置上の特定の場所）、ビオチン／ストレパビジンおよび様々なレクチンを含む免疫化学およびリガンド結合法を用いた標識分析物のＤＥＰによる分離および検出、ならびに／またはＤＥＰによる分離後の非標識分析物のその後の検出；（２）特定の細胞、細菌、ウイルス、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核、膜、細胞オルガネラおよび細胞ナノ微粒子を検出するため、一般的および／または特異的染色物、蛍光色素、蛍光ナノ粒子、量子ドットをＤＥＰ前またはＤＥＰ後に使用すること（ＤＥＰは本質的に「標識を用いない」手法であり、その交差周波数により細胞、ナノ粒子および他の分析物を同定することができることを念頭に置くことが重要である。標識については、検出感度を向上させ、個々の物質を同定し、より詳細な解析を行うために使用される）；および（３）蛍光プローブｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨなど）による細胞、核、ＤＮＡおよびＲＮＡの事後分析（ｐｏｓｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）；および（４）以下に限定されるものではないが、ＰＣＲ、ＲＣＡ、ＳＤＡならびに他のジェノタイピング、シーケンシングおよび遺伝子発現技法（どの技法もＤＥＰによる分離が起こる同一チャンバー区画で行うことができる）など細胞、核、ＤＮＡおよびＲＮＡのよく知られた分子解析方法の使用を含めることができる。
【００３７】
上記の例は、装置の別のもう１つのチャンバーでその後の解析を行ったり、またはサンプルの装置以外での解析、保管または記録保存のため分析物をサンプル収集チューブに移動させたりすることを除外するものではない。さらに、解析のために使用してもよい他の種類の検出法として、以下に限定されるものではないが、放射性同位元素法、比色分析法、化学発光法、電気化学法、または分析物、生体分子および細胞が単離されたならば、これらのバイオセンシングまたはナノセンシングを行うための他の方法が挙げられる。本明細書に記載の装置および工程は、無希釈の血液または他の複雑な臨床または生物学的サンプルと一緒に直接使用してもよい完全に「シームレスな」サンプルの応答診断システムと考えるとができる。本明細書に例示するＤＥＰ装置を用いたシームレスなサンプルの応答法については、以下でさらに詳述する。
【００３８】
図２７は、血液サンプルを装置に直接導入し、この場合は、非常に低濃度の高分子量（ｈｍｗ）ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、ＤＥＰを用いて無希釈の全血サンプルから分離するシームレスなサンプルの応答診断の第１のステップを示す。ただし、以下に限定されるものではないが、希少な細胞、ナノ粒子、細胞ナノ微粒子、抗体、免疫複合体、タンパク質およびＲＮＡなど、ほとんどどのような分析物でも分離、濃縮および検出することができ、サンプルとしては、以下に限定されるものではないが、血漿、血清、尿および唾液を挙げることができる点に留意されたい。
【００３９】
次に図２８は、血液細胞（赤および白）を負の（ＤＥＰ）低電場領域に移動させ、高分子量ＤＮＡ（ＲＮＡ）を正の（ＤＥＰ）高電場領域に濃縮させる適切なＡＣ周波数および電圧でＤＥＰ電界を印加するサンプルの応答診断工程の第２のステップを示す（図では、ドーム構造がＤＥＰの高電界強度領域を表す）。
【００４０】
図２９は、単純な流体の洗浄により血液細胞をＤＥＰアレイ装置から除去し、一方、高分子量ＤＮＡ（ＲＮＡ）はＤＥＰの高電場領域に高度に濃縮された状態のままである第３のステップを示す。より大きなサンプル量を処理するため、さらに高導電率溶液中の比較的低いＡＣ低周波数（＜２０ｋＨｚ）、高電圧（＞２０ボルト  ｐｔ−ｐｔ）で顕著になる加熱を抑える機構として、ＤＥＰ装置全体に連続的、パルスまたは間欠的な流体の流れを使用することは本開示の範囲内である。
【００４１】
図３０は、ＤＮＡ（ＲＮＡ）特異的蛍光色素（たとえばサイバーグリーン、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、エチズイムブロミド、ＴＯＴＯ、ＹＯＹＯ、アクリジンオレンジなど）を加えてＤＮＡ（ＲＮＡ）のｉｎ−ｓｉｔｕ標識を行うこの工程の次のステップを示す。この工程では、ＤＥＰ装置全体に適切な蛍光色素の溶液をフラッシュして、ＤＮＡまたはＲＮＡを染色する。ＤＮＡ／ＲＮＡについては、染色が進行している間、ＤＥＰ電界を維持してそのままの状態に保てばよい。ここで、落射蛍光検出システムを用いて蛍光染色ＤＮＡ／ＲＮＡを検出および定量することができる（図３１）。マイクロアレイ装置の解析を行う蛍光検出システムおよび装置は、分子生物学および臨床診断の技術分野において公知であり、種々のシステムが市販されている。
【００４２】
以下に限定されるものではないが、（１）ＰＣＲ、分子ビーコンを用いたリアルタイムＰＣＲ、ＲＣＡおよびＳＤＡなど、他の分子解析検出方法および技術を使用すること；（２）後で蛍光レポータープローブを用いて解析／検出を行うため、ＤＥＰによる分離工程において、サンプルＤＮＡ／ＲＮＡをハイブリダイズして、ＤＥＰ装置の特定の場所に固定化したプローブ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｐＮＡなど）を捕捉すること；（３）後で蛍光レポータープローブを用いて解析／検出を行うため、ＤＥＰ濃縮場所からＤＮＡ／ＲＮＡを遊離し、これをＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＣＡまたはＳＤＡを用いて増幅し、変性させてから、部位選択的ＤＣ電気泳動を用いてその単位複製配列を再びハイブリダイズしてＤＥＰ装置に固定化したプローブを捕捉すること；（４）配列特異的ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｐＮＡプローブを用いて蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用すること；（５）ＤＮＡ／ＲＮＡを遊離し、ＤＥＰあるいは電気泳動（ＤＣ電場）的に装置上の別の特定の位置に移動させること；および（６）より詳しい解析または保管を目的としてＤＮＡ／ＲＮＡを遊離し、（流体により）装置の別のチャンバーまたはサンプル収集チューブに移動させることは、本開示の範囲内である。
【００４３】
図３２は、サンプルの応答装置を用いて、希少な細胞、細菌、ウイルス、細胞ナノ微粒子またはＣＮＰ（細胞膜、核、高分子量ＤＮＡ、高分子量ＲＮＡ、液胞、小胞体、ミトコンドリアなど）、タンパク質、抗体複合体および他のバイオマーカーを、より高度に多重化されたＤＥＰにより全血からどのように分離できるかを示す。次に図３３は、装置に濃縮されている特定の分析物の同定に使用することができる分子解析方法を示す。こうした方法として、以下に限定されるものではないが、蛍光染色、蛍光イムノアッセイ、ＦＩＳＨおよびＰＣＲ、ＲＣＡおよびＳＤＡ法が挙げられる。最後に、図３４は、よく知られた蛍光法および他の検出法を用いた細胞、細菌、ウイルス、ＣＮＰおよび抗体複合体の最終的な検出を示す。
【００４４】
本開示はさらに、本明細書に記載のサンプルの応答装置およびシステムの分析および診断能力を向上させるために使用できる独自の方法について記載する。ＤＮＡおよびＲＮＡの単離および検出の場合、ＤＥＰを用いて高分子量ＤＮＡ／ＲＮＡは効率的に単離および濃縮できるのに対し、より低分子量のＤＮＡおよびＲＮＡ（＜１０ｋｂ）については、ＤＥＰによる単離が難しくなる。この場合、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ特異的抗体および一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ特異的抗体が利用可能であり、これを用いてより低分子量のＤＮＡおよびＲＮＡを標識し、より大きなナノ構造体（＞５ｎｍ）を作製する。こうしたより大きなＤＮＡ−抗体複合体は、ＤＥＰによってより効率的に単離および濃縮することができる。
【００４５】
また、本明細書に記載の装置を用いれば、種々の新規の抗体検査が可能になる。より具体的には、比較的大きな抗体複合体から単一抗体を分離する能力がＤＥＰにあれば、臨床サンプルから比較的大きな抗体−抗原複合体の形成をＤＥＰにより分離できる多くの１抗体および２抗体アッセイを開発することができるということである。この場合、蛍光抗体および／または二次抗体をサンプルに直接加えてもよく、ＤＥＰを印加すると、蛍光標識した抗体−抗原複合体だけがＤＥＰの高電場領域に濃縮され、その後検出されることになる。こうしたＤＥＰを用いた抗体アッセイは、以下に限定されるものではないが、薬剤、ホルモン、代謝産物およびペプチドなどの小分子抗原；さらには以下に限定されるものではないが、タンパク質、酵素および他の抗体などのより大きな抗原に使用してもよい。また、抗体、ビオチン／ストレプトアビジン、レクチン、タンパク質、酵素、ペプチド、デンドリマー、アパタマー、量子ドット、蛍光ナノ粒子、カーボンナノチューブ、ならびに選択的標識および検出目的で設計された他のナノ物質と結合する選択的リガンドを用いて、以下に限定されるものではないが、細菌、ウイルス、バクテリオファージ、ナノ粒子、ＣＮＰの検出を行うなど、比較的大きな複合体の形成に基づく、他の多くの類似したＤＥＰによるアッセイを可能にすることも本記述の範囲内である。最後に、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｐＮＡ捕捉プローブをＤＥＰ装置に装着または固定化するだけでなく、以下に限定されるものではないが、抗体、ビオチン／ストレプトアビジン、レクチン、タンパク質、酵素、ペプチド、デンドリマーおよびアパタマーなど他の種々の結合物質をＤＥＰ装置に装着させてもよい。こうした固定化リガンドによりＤＥＰ電界を停止した後も分析物はＤＥＰ装置に選択的に結合した状態にある。
【００４６】
本明細書に記載の今回の新規のＤＥＰ装置は、通常であれば、固定化に使用される大部分の生体分子（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、タンパク質など）、さらに検出および解析のためＤＥＰにより装置上の特定の高電場領域に単離および濃縮される分析物およびバイオマーカーを損傷または破損する不都合な泡立ち、加熱および電気化学作用をなくすか、または大幅に抑制することにより上述のすべての方法を可能にすることに注目されたい。
【００４７】
本明細書はまず、電極が別々のチャンバーに配置され、内部のサンプルチャンバー内に孔または穴構造体を介してＡＣ  ＤＥＰ電界を通過させることにより正のＤＥＰ領域および負のＤＥＰ領域が形成される新規の動電学的ＤＥＰ装置およびシステムをより詳細に開示する。サンプルチャンバーで細胞、ナノ粒子およびバイオマーカーを移動させるため、様々な幾何形状を用いて所望の正のＤＥＰ（高電界）領域および負のＤＥＰ（低電界）領域を形成してもよい。こうした孔または穴構造体は、多孔性材料（アガロースまたはポリアクリラミイドヒドロゲル）が充填されていてもよいし、または多孔性の膜状構造（ペーパー、セルロース、ナイロンなど）で被覆されていてもよい。こうした多孔性膜に積層された構造体は厚さが１ミクロンから１ミリメートルであってもよいが、一層好ましくは１０ミクロンから１００ミクロンであり、細孔サイズは１ナノメートルから１００ミクロンであるが、一層好ましくは１０ナノメートルから１ミクロンである。電極を別々のチャンバーに分離することで、こうした独自のＤＥＰ装置では、どのような電気化学作用、加熱または無秩序な流体の移動も、ＤＥＰ工程において内側の分離チャンバー内で起こる分析物の分離に影響を与えることは基本的にない。こうしたチャンバー装置は、非常に高いＡＣ電圧（＞１００ボルト  最大振幅）で作動させもよく、ＤＥＰだけでなく、サンプルチャンバー内でＤＣ電気泳動による移動および電気泳動法を行うのに使用することもできる。一般に、こうした装置およびシステムは、ＡＣ周波数範囲１０００Ｈｚ〜１００ｍＨｚ、１ボルトから２０００ボルト  最大振幅までの幅があってもよい電圧、ＤＣ電圧１ボルト〜１０００ボルト、流量１０マイクロリットル／分から１０ミリリットル／分、温度範囲１℃〜１００℃で作動可能である。図１および図２にチャンバー装置を示す。こうした装置は、種々の孔および／または穴構造（ナノスケール、マイクロスケール、さらにはマクロスケール）を用いて作製してもよく、細胞、ナノ粒子または他の物質が内側のチャンバーに拡散または移動するのを制御、制限または防止できる膜、ゲルまたは濾過材料を含んでも構わない。一方で、ＡＣ／ＤＣ電界、溶質分子、緩衝液および他の小分子はチャンバーを通過することができる。
【００４８】
図１および図２は、本発明により構成することができるチャンバー装置の最も基本的な形態である。本発明による装置では種々の構成が想定される。こうした装置としては、多重電極およびチャンバー装置、再構成可能な電界パターンを作製できる装置、ＤＣ電気泳動法と流体法とを組み合わせた装置；サンプル調製装置、その後の検出および解析を含むサンプル調製および診断装置、ラボオンチップ装置、ポイントオブケアおよび他の臨床診断システムまたは形態があるが、これに限定されるものではない。図１は、本明細書の本教示によるサンプル処理装置の模式図であり、装置１００がハウジング１０６内に複数の電極１０２と電極を含むチャンバー１０４とを含むことを示す。装置のコントローラ１０８は、本明細書に詳述されるように電極１０２を独立に制御する。
【００４９】
図２は、各々が少なくとも１枚の強固な白金電極を備える６つの電極チャンバー１０４と共に図示した装置１００の上面図を示す。図２は、中心に主要な分離チャンバー１１０を１つ形成した装置を示し、分離チャンバー１１０にはヒドロ−ゲルが充填された様々なサイズの１８個の孔／穴構造体１１２が配置される（内側のチャンバーは孔または穴を被覆する多孔性膜を有していてもよい）。孔／穴構造体は、３群の６つの孔／穴構造体で構成される。分離チャンバー１１０の上方部は物理的に隔てられていないのに対し、下方部分は９つの区画（明るい破線（ｌｉｇｈｔ  ｄａｓｈｅｄ  ｌｉｎｅ）で示す）に分けられている。こうした区画は各々、電極チャンバーと流体接触しているが、相互には接触していない。ＡＣ  ＤＥＰ電界を電極に印加すると、電界が孔１１２を通過し、細孔構造体の上に正のＤＥＰの高電場領域が、細孔構造体の間に負のＤＥＰの低電場領域が形成される。サンプルは、入口２２０および出口２２２を介して装置に添加し、装置から取り出すことができる。装置は別の入口２２４および出口２２６を含んでいてもよい。図１および図２に示す装置は、高導電率ＤＥＰチャンバー装置の一形態に過ぎない。多数の孔／穴および様々な幾何形状を持つ多くの異なる種類の装置を作製してもよいことを理解すべきである。
【００５０】
別の装置の実施形態は、電流型動電および誘電泳動分離装置（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅｓ）で問題となる電気化学作用および加熱を抑制できる規定の直径および離隔距離を持つ強固な電極の電極アレイを使用することを含む。強固な電極（たとえば白金、パラジウムおよび金）を適切に組み立てて被覆すれば、分離工程での電気化学反応生成物の悪影響を抑制し、非常に高い電圧を印加できるため、分離時間を大きく改善することが可能である。さらに、電流装置は比較的処理量が小さいが、本明細書に記載のこの実施形態はあるシステムを設けることでこの問題を解決した。このシステムは多重並列部アレイを使用し、装置を１つの大きな分離ゾーンとして用い、次いで個別制御される分離ゾーンに切り換えることで、システム全体の感度および選択性を向上することができる。他の従来のシステムで見られる第３の問題は、サイズおよび組成が比較的類似したサンプル成分を分離できないことである。この問題は、本明細書の記述に従ってＤＥＰアレイ装置自体で微小電気泳動など第２の分離工程を直接行うことができる装置を提供することで解決される。
【００５１】
負の誘電泳動（ＤＥＰ）力は、正のＤＥＰ力よりも比較的弱く、したがって負のＤＥＰを受ける物質は流体により移動し得るのに対し、正のＤＥＰを受ける物質はそのままとどまることになる。ここに記載される実施形態では、流体力とＤＣ電気泳動力とを逆方向に使用することで、血液および他のサンプル中のＤＮＡフラグメントおよび電荷が大きいＤＮＡナノ微粒子を細胞およびタンパク質から分離することができる。このように複数のＡＣ周波数、パルスＤＣ電気泳動および微小電気泳動を用いれば、ＤＮＡナノ微粒子およびＤＮＡフラグメントのより完全なサイズ分離を達成することができる。
【００５２】
このように高導電率条件（血液、血漿、血清など）下でＤＥＰを行えるようになった新規のシステムおよび装置の商業用途には現在、ポイントオブケア診断、治療剤および薬物モニタリング、環境および給水モニタリング、ならびにバイオテロ病原体検出などの多くの研究および臨床診断用途が挙げられよう。こうしたシステムを用いれば、希少な細胞（癌細胞、胎児細胞、造血幹細胞）、細菌、ウイルス、ＤＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡナノ粒子バイオマーカー、薬物送達ナノベシクル、さらには正常または異常タンパク質などの多くの分析物および物質を検出することができる。
【００５３】
実験用ＡＣ  ＤＥＰおよびＤＣ電気泳動分離システム（以下の実施例のセクションで詳述する実験室内卓上型）を構築して、この新規のプロトタイプ装置を改良するための実験を行った。こうした（上述した）装置から得られる結果は、古典的なＤＥＰがなぜ低い導電率溶液に限定されてきたかの重要な発見に結び付く。
【００５４】
今回の新規の装置は、強固な白金の平面並列電極アレイを使用する。この電極は直径がほぼ約１〜１０００ミクロン、離隔距離が１０〜５０００ミクロンで、５〜１００ミクロン厚のヒドロゲル（アガロース、ポリアシルアミド）または多孔性膜層で被覆されている。この新規の装置では、電界線の密度が他の従来の古典的ＤＥＰシステムほど高くなく、さらにここで重要なのはＤＥＰの高電界の蓄積領域が実際の電極表面から実質的にやや距離があるため、加熱および電気化学の問題が抑えられる。従来の電極設計と大きく異なる点の１つは、特に電界強度が比較的高く、溶液導電率が高いときに電気化学反応により劣化および破損しやすい白金または金スパッタ電極を使用しないことである。新規の装置の電極は、ワイヤーまたはロッドを含め純白金または純金材料で構成される。第２の相違は、１つの大きな分離の問題を、非常に制御しやすくなった、いくつにも分かれている分離の問題に切り換えることで、百万に及ぶ比較的類似した物質（細胞、ナノ粒子、バイオマーカー）から１種類の物質だけを単離するように分離効率を高められることである。本明細書に記載の装置はこれを、区切りを設けた多重アレイを使用し、並行して行われる制御された選別工程により達成する。これを実現するには、アレイ装置全体に複雑な生物学的サンプル（血液）を分布させ、その成分をより小さな分離部（領域）に分離して、所望の分析物または物質を分離および単離できる大型アレイ装置内で、１０〜１００またはそれ以上の電極の、個々に制御されるアレイのサブセットを使用する。複雑なサンプルの分離の問題をより小さな部分に分割することは、感度と特異性の問題を解決するのに最も有望である。すなわち、この方法により、サンプル全体の迅速かつ高度なスループットが可能になるだけでなく、サンプル中の固有の細胞または他の物質を単離および同定する調査（分離）時間を相対的に長くすることもできる。最後に、最後の問題は、多次元階層（ｍｕｌｔｉ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ）選別装置を作製することで解決できる。この解決法は、負のＤＥＰは正のＤＥＰよりも力が弱く、負のＤＥＰを受ける細胞または他の物質は流体の制御により移動させることできるのに対し、正のＤＥＰを受ける分析物または物質の方はＤＥＰの高電界領域に濃縮されたままであるということを利用する。流体の制御およびパルスＤＣ電気泳動を逆方向に使用することで、複雑な生物学的サンプル中のＤＮＡ／ＲＮＡおよび荷電したナノ微粒子を細胞およびタンパク質から分離することができる（これは、細胞およびＤＮＡを分離するＤＥＰの本質的な能力に付加したものである）。
【００５５】
流体の制御およびパルスＤＣ電気泳動と、複数のＡＣ周波数、すなわち最初の電極アレイのサブセットにＣＮＰおよび高分子量ＤＮＡ／ＲＮＡナノ微粒子を捕集するための低周波、および他の電極アレイのサブセットに細胞、徐々に大きくなる粒子（細菌およびウイルス）を捕集するためのより高いＡＣ周波数の使用とを組み合わせると、ほとんどの細胞および物質をサイズ別に完全に分離することができる。電極については、必要に応じて、より微細な分離が局所的に行えるように、サイズ分離全体を全体として維持しながら異なる周波数に切り換えてもよい。
【００５６】
強固な白金平面電極アレイ構造体および補助電極を含む装置であって、そこに複雑な生物学的サンプル（血液、血漿、血清）を直接導入すると、１つまたは複数のファンクションジェネレータからの制御されたＡＣ信号により誘電泳動力が発生し、制御されたＤＣ電源により電気泳動力が発生する装置を含む分離システムについて記載する。また、装置の入口および出口はこのシステムを介して、制御された流量で流体（水、緩衝液など）の通過を制御できる。さらにこのシステムは、装置上で起こっている分離工程（目視および蛍光）のモニタリング、検出、定量および記録を行う光学／落射蛍光顕微鏡およびデジタルカメラも含む。この装置は、最終的には動電効果、誘電泳動力、電気泳動力、微小電気泳動および流体を制御することで可能になる多重化並列階層選別システム（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ，ｐａｒａｌｌｅｌ  ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）である。こうした新規の多重サンプルの応答工程は、従来の装置に見られる不都合な泡立ち、加熱および電気化学作用が新規のＤＥＰ装置によりなくなるか、または大幅に抑制されることで可能になることに留意されたい。
【００５７】
図３に示す装置は、サンプル流体が流動できるハウジング３０２を備えた平面白金電極アレイ装置３００の一形態に過ぎない。装置を通る流体パターンは、大きな矢印で示しており、図の上端の入口端部３０４から下部の出口端部３０６および側方の分析物出口３０８への理想的サンプルの流れを表す。装置は複数のＡＣ電極３１０を含む。例図を簡潔にするため、図３に示す電極３１０はごく一部に過ぎないが、図面の小さい白丸はそれぞれ構成が類似した電極を表すことを理解すべきである。拡大した３×３電極アレイ３１２の１つを、装置３００内のサンプル流体を示すため図面の右側に図示する。このサンプルは、ミクロンサイズの物質または細胞３１４（拡大図に示す一番大きな黒塗りの丸）、比較的大きいナノ微粒子３１６（中間サイズの黒塗りの丸）および比較的小さいナノ微粒子または生体分子３１８（一番小さいサイズの丸）の組み合わせからなる。比較的大きいナノ微粒子３１６は、サンプル中に分散する高分子量ＤＮＡ、ヌクレオソームまたはＣＮＰもしくは細胞残屑を表す場合がある。比較的小さいナノ微粒子３１８は、タンパク質、比較的小さいＤＮＡ、ＲＮＡおよび細胞断片を表す場合がある。図の平面電極アレイ装置３００は６０×２０電極アレイであり、３つの２０×２０アレイに区切ることができ、アレイは別々に制御できる一方、同時に作動させることも可能である。電気泳動のため、図の上部にある補助ＤＣ電極３２０は正電荷に切り換えることができ、図の底部にあるＤＣ電極３２２は負電荷に切り換えることができる。制御されたＡＣおよびＤＣシステムは各々、連続および／またはパルスの形で使用することができる（たとえば比較的短い時間間隔でそれぞれパルスをオンオフすることができる）。サンプルの流れの側面に沿った平面電極アレイ３２４は、ナノポーラス材料で積層されている場合、ＤＣ電気泳動力およびＡＣ  ＤＥＰを発生させるのに使用することができる。加えて、アレイおよび／または補助電極の平面電極を用いれば、ナノポア層内においてｘ−ｙ−ｚ次元で微小電気泳動の分離工程を行うこともできる。一般にこうした装置およびシステムは、ＡＣ周波数範囲１０００Ｈｚ〜１００ｍＨｚ、１ボルトから２０００ボルト  ｐｔ−ｐｔまでの幅があってもよい電圧、ＤＣ電圧１ボルト〜１０００ボルト、流量１０マイクロリットル／分から１０ミリリットル／分、温度範囲１℃〜１００℃で作動可能である。コントローラ１０８（図１）は、電極３１０、３２０、３２２、３２４をそれぞれ独立に制御する。コントローラは、ソケットおよびプラグ接続（図示せず）などにより装置１００に外部接続されていてもよいし、または装置ハウジングに組み込んでもよい。電極の導電線は、図を簡潔にするため図面に示していない。
【００５８】
サンプル中の細胞および粒子ならびに他の物質は、拡大した３×３電極部３１２にしか図示されていないが、電極アレイ全体に均一に分布すると考えられる。流体の流量は、比較的大きい粒子が受ける負のＤＥＰより強いが、比較的大きい粒子が受ける正のＤＥＰよりも弱い力を示すような流量である。
【００５９】
図４は、パルスがオンオフ（１秒間隔でオンオフ）される上部ＤＣ電極３２０および底部ＤＣ電極３２２を示す。これらの電極によりＤＮＡ、ＲＮＡおよび小型ナノ微粒子を図面の上部にある正のＤＣ電極３２０へと押しやる電気泳動の短いパルスが与えられる。６０×２０電極アレイは、独立に制御される３種類の部分すなわちサブアレイに分けられるものとして表示してある。上部２０列のＡＣ電極アレイ４０２は、比較的低い周波数の正のＤＥＰおよびＡＣ動電現象により通常電極の方に移動する比較的小さい物質がその電極に捕集され、同時にこうした周波数で比較的大きい細胞および物質が負のＤＥＰを受けることで一定の流体により装置の低部に移動するように比較的低周波のＡＣ電場に調整される。ＡＣ電極の中央２０列４０４は、ミクロンサイズの粒子および細胞を流す一方で、大きなサブミクロン粒子（たとえばウイルス）を保持する。最後に、ＡＣ電極の最後の２０列４０６は、必要に応じて、所望の細胞およびミクロンサイズの粒子の捕捉に使用できる高いＡＣ周波数に調整することができる。
【００６０】
図５は、「百万個の細胞中の１個の細胞」単離する、すなわち希少な細胞を検出するための分離機構を示す。完全な電極アレイを用いることで、分離の問題を多重並列化して簡素化することができる。これは、分離を改善するのに必要なだけの電極アレイを作動させさえすれば実現することができる。全細胞が均一に分布しているならば、光学検出（すなわち落射蛍光）により解析できる特定の分離領域にアレイを効率的に分割することで、正のＤＥＰを受けているある特定の細胞をその周囲の全細胞から分離することが可能になるはずである。図５では、中間サイズの黒塗りの丸５０２がリンパ球、赤血球および同種のものなど、ある特定の１種の１０μｍの細胞を表し、ＡＣ電極の第３の部４０６のＡＣ電極５０６上に１つだけある黒塗りの丸５０４は、サンプル中の他の５０２と異なる種類の唯一の「百万個の細胞中の１個の細胞」を表す。この細胞は、正の誘電泳動を受けるため、他の細胞と区別しやすい唯一の細胞でもある。誘電泳動を使用するだけでも、唯一の「百万個の細胞中の１個の細胞」である５０４細胞型を、区別されていない５０２細胞型から分離できるはずである。これについては、分離の問題を、より分離および解析しやすい小型のまとまりに分散させるのに十分な数のＡＣ電極があれば、さらに実現しやすくなる。細胞型の分離の問題がこうした形で分散されるならば、図５に示す３×３アレイなど特定の電極アレイ部を１回解析するだけで、目的の唯一の粒子５０４の発見が可能になるはずである。また、選択性および効率性を高めた細胞の分離（たとえば癌および幹細胞の分離）を行うには、温度制御が有効である場合がある。
【００６１】
図６は、パルスＡＣ  ＤＥＰ／ＤＣ電気泳動／制御された流体の流れの組み合わせを施す前の血液サンプル分離工程のより詳細な模式図を示す。図６の図は、血液などの複雑なサンプル中で認められるであろうと推定される様々な診断用およびバイオマーカー物質の一部を示す。そうした物質として、赤血球および白血球、細菌、ウイルス、ナノベシクル、ＤＮＡ／ＲＮＡナノ微粒子、ＤＮＡおよびＲＮＡフラグメントの組み合わせ、ならびにタンパク質を挙げることができる。図６図はさらに、中間密度のナノポア層６０４、低密度のナノポア層６０６、およびＡＣ電極３１０の真上にある高密度のナノポア層６０８で覆われた平面白金アレイ電極３１０も示す。
【００６２】
図７は、パルスＡＣ  ＤＥＰ／ＤＣ電気泳動／制御された流体の流れの組み合わせの最初の段階における血液サンプルを示す。図７では、アレイ装置３００全体を利用して、様々なクラスの物質を各電極サブアレイ部４０２、４０４、４０６（それぞれ上方、中央、下部）に濃縮し始める全体的な分離工程が行われる。
【００６３】
次に図８は、パルスＡＣ  ＤＥＰ、ＤＣ電気泳動および制御された流体の流れの組み合わせの最終段階における血液サンプルを示す。図８では、様々な物質がそのしかるべき電極アレイ部４０２、４０４、４０６に濃縮されている。この例では、ＤＮＡナノ微粒子および比較的小さいＤＮＡフラグメントを上方のアレイ部４０２に、細菌、ウイルスおよびナノベシクルを中央のアレイ部４０４に、細胞およびタンパク質を下方のアレイ部４０８に示してある。
【００６４】
図９は、上方のアレイ部４０２においてパルスＡＣ  ＤＥＰおよびＤＣ電気泳動により、蛍光染色したＤＮＡナノ微粒子、非常に高分子量のＤＮＡ、および中〜比較的低分子量のＤＮＡの選択および分離が行われるＡＣ電極アレイの拡大図を示す。このときこれらの物質は上方のアレイ部において濃縮および単離されているため、適当なＤＮＡ蛍光色素試薬による選択的な染色が可能になり、ここで第２の分離工程を行うことができる。
【００６５】
図１０は、上方のアレイ部４０２においてパルスＡＣ  ＤＥＰおよびＤＣ電気泳動の組み合わせにより、蛍光染色したＤＮＡナノ微粒子、非常に高分子量のＤＮＡ、および中〜比較的低分子量のＤＮＡの最初の選択および分離が行われるＡＣ電極アレイの拡大図を示す。この最初の工程では、ＤＮＡナノ微粒子が、この非常に大きなＤＮＡ物質を通さない細孔サイズを持つ中間のナノポア層の上部に濃縮され始める一方、より中分子量および低分子量のＤＮＡフラグメントはより低密度のナノポア層に移動される。
【００６６】
図１１は、上方のアレイ部４０２においてパルスＡＣ  ＤＥＰおよびＤＣ電気泳動の組み合わせにより、蛍光染色したＤＮＡナノ微粒子、非常に高分子量のＤＮＡ、および中から比較的低分子量のＤＮＡの最終的な選択および微小電気泳動による分離が行われるＡＣ電極アレイの拡大図を示す。装置３００の作動のこの時点で、ＤＮＡナノ微粒子および非常に高分子量のＤＮＡは中間密度のナノポア層６０４の上部に十分に濃縮および単離され、より中分子量および低分子量のＤＮＡフラグメントは内部の低密度ナノポア層６０６内に濃縮される。
【００６７】
図１２は、ＤＮＡナノ微粒子および非常に高分子量のＤＮＡの除去後に中および低分子量のＤＮＡフラグメントがアレイ上でＤＣ電気泳動によりサイズ分離されるＡＣ電極アレイ４０２の拡大図を示す。ＤＮＡナノ微粒子および非常に高分子量のＤＮＡは装置３００の別の部分でさらに解析されるのに対し、より中分子量および低分子量のＤＮＡフラグメントは、ナノポア層６０４、６０６、６０８内の微小電気泳動によりサイズ分離することができる。図１２は、ＡＣ電極３１０ａの中に正に荷電しているものもあれば、負に荷電しているＡＣ電極３１０ｂもあることを示す。
【００６８】
図１３は、装置３００の下方のアレイ部４０６上で最初のパルスＡＣ  ＤＥＰが赤血球および白血球に印加されるＡＣ電極アレイの拡大図を示す。この工程では、サンプル中のタンパク質を装置の別の要素上で除去および／または解析しながら、下方のアレイ部４０６上でＡＣ  ＤＥＰにより細胞および他のミクロンサイズの物質をさらに分離し区別することができる。
【００６９】
図１４は、装置３００の下方のアレイ部４０６上で最終のパルスＡＣ  ＤＥＰが赤血球および白血球に印加される電極アレイの拡大図を示す。装置の作動のこの時点で、赤血球および白血球はＤＥＰの高電場および低電場領域に分離されており、その後赤血球は除去し、白血球はさらに区別することができる。すなわち、癌細胞を単離する工程を開始することができる。
【００７０】
図１５は、装置３００の中央のアレイ部４０４上で最初のパルスＡＣ  ＤＥＰにより細菌、ウイルスおよびナノベシクルが分離されるＡＣ電極アレイの拡大図を示す。図１５の図は、独立に制御できるアレイ装置３００の小区画部が重要な追加の分離工程を行うのにどのように使用し得るかを示す例である。
【００７１】
図１６は、装置３００の中央のアレイ部４０４において最終のパルスＡＣ  ＤＥＰにより細菌、ウイルスおよびナノベシクルが分離される電極アレイの拡大図を示す。この場合も、この中央のアレイ部上での分離工程が、アレイの他の小区画部上で行われる、これ以外の分離工程と同時に、かつ独立に実施できる点に注目すべきである。たとえば上方のアレイ部上ではＤＮＡフラグメントの分離を行うことができ、同時に他の（下部）アレイ部上では細胞の分離を行うこともできる。
【００７２】
最後に、並列多重電極アレイは細胞の階層的選別と併用して、電極の列内に規定の領域を作製することができ、サイズは類似しているが、誘電特性が異なる特定の粒子を捕集することができる。種々の診断および治療用途において動電、誘電泳動、電気泳動および流体の力および効果をすべて相互に併用すれば、装置における分離の感度および効率を向上させることができる。最も重要なのは、こうした高性能で臨床的に有用な分離工程が実現されるのは、動電、電気泳動および流体の力および効果が、適切な規模に設計され、制御された電極アレイ装置上で独自に組み合わされる場合に限られることである。損失がなく（ｌｏｓｓｌｅｓｓ）、標識しない場合がある（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｌａｂｅｌ  ｌｅｓｓ）並列分離法である誘電泳動は、この種の分離だけでなく、様々な用途に使用される細胞およびナノ粒子の分離の水準をさらに大きく改善するため、非常に多くのサンプル調製を必要とするだけでなく、サンプルの損失がより大きいフィールドフローフラクション、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）または磁気による細胞分離などの従来型に近い分離法と併用してもよい。
【００７３】
図示した実施形態の他の態様については、標識（光学蛍光、発光、電気化学、磁気など）を分離対象の細胞、ナノ粒子およびバイオマーカーに加えると、標識が物質のサイズ、伝導度および検出性に作用するため、本明細書に記載の多重化は一層効率的になると考えられる点を指摘しておきたい。
【００７４】
現時点では、上述のＤＥＰによる分離機構は初期の実施例データ段階にある。細胞、ナノ粒子および高分子量ＤＮＡなどの生物材料を加えて分離を行う上記のような電極アレイ構造を用いて、プロトタイプシステムを構築した。この場合、アレイ構造内の電極のサブセットは、デスクトップまたはワークステーションコンピューターなどの従来のコンピューター上で実行可能な好適なソフトウェアプログラミングの制御下で作動するファンクションジェネレータにより選択的に電圧が加えられる。この器具を用いれば、個々の電極を制御することができる。このプロトタイプシステムは、分離実験のモニタリングおよび記録に関連する落射蛍光顕微鏡を備える（追加説明のための以下の実施例のセクションを参照）。
【００７５】
種々の分離および単離の用途としては、血液、他の体液または任意の緩衝液から、たとえば造血前駆細胞などの成体幹細胞を単離するための希少な細胞の検出；癌検出および他の診断を目的とした血液、他の体液または他の緩衝液中の細胞と、タンパク質と、ＤＮＡ／ＲＮＡフラグメントとの粗分離（ｇｒｏｓｓ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）；研究、診断および治療を目的とした血液、他の体液または他の緩衝液からの癌細胞の単離が挙げられる。また、環境モニタリングのための、さらに病原体およびバイオテロ病原体の迅速な検出のための使用も想定される。最後に、本発明に記載のシステム、装置および技法は、薬剤ナノ粒子およびナノベシクル以外にも、量子ドット、金属ナノ粒子、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、ナノワイヤー、さらにはミクロンおよびサブミクロンのＣＭＯＳ装置および要素など、種々の非生物学的物質の分離、単離および精製にも使用し得ることが想定される。図示した実施形態においては、基本的に水性または混合溶媒系に懸濁または可溶化できるどのような巨大分子またはナノ要素も、本明細書に記載の技法を用いて処理することができる。また、我々は現在、こうした新規の装置により、ＤＮＡおよび他のバイオ誘導体化（ｂｉｏｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）ナノ粒子、ナノ要素およびメソスケールの物体の誘導自己組織化を行うことができると考える。これは、診断剤、治療剤送達によるインビトロマイクロサージャリーを行うため、すなわち凝結塊およびプラークを除去し、アテローム性動脈を修復するため血流中に導入できる（同名の映画から着想を得た）高度に統合された細胞サイズの「ミクロ決死隊（Ｆａｎｔａｓｔｉｃ  Ｖｏｙａｇｅ）」装置など、新規のＤＮＡジェノタイピングおよびシーケンシング技術（＄１０００ゲノム）およびナノ／マイクロバイオ／ケムセンサーへの応用；およびナノ電子、ナノ光学、光起電、燃料電池、バッテリー、ナノ材料および多くの他の異種材料集積（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）への応用につながる可能性がある。
【００７６】
本明細書に記載の装置および技法を用いれば、分離操作により、少なくとも１種の生物材料を電極の小区画部の１つに保持しながら、サンプル流体の残りを装置から洗浄して、試薬をサンプル処理装置に導入し、続いてサンプル処理装置内に保持された生物材料種と導入した試薬を反応させることで「サンプルの応答」の結果を得ることができる。上述のように、試薬は、蛍光色素、抗体、または同種のものを含んでもよい。このサンプルの応答法を用いれば、上記のようにＰＣＲ操作および同種のものなど種々の作業を行うことができる。
【００７７】
本発明の理解を得られるように、現時点での好ましい実施形態によって本発明について上述してきた。しかしながら、装置、システムおよび分離機構には本明細書に具体的に記載してはいないものの、本発明に該当する多くの構成および配列順序がある。したがって、本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されるものとして見なすべきではなく、本発明がむしろ、生物学的分離システム全般に対して広い適用性を有することを理解すべきである。このため、添付の特許請求の範囲の範囲内にある改変、変更または等価な配列および実装はすべて、本発明の範囲内と見なすものとする。
【実施例】
【００７８】
緩衝液および伝導度の測定
５倍濃縮トリス・ホウ酸・ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝溶液をＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）から入手し、脱イオンミリＱ超純水（５５ｎＳ／ｃｍ）を用いて０．０１×ＴＢＥ、０．１×ＴＢＥおよび１×ＴＢＥの濃度に希釈した。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）溶液をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手し、ミリＱ水を用いて０．１×ＰＢＳに希釈した。適切な伝導率標準液（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ）で調整した２セル（範囲：１０〜２０００μＳ）および４セル（範囲：１〜２００ｍＳ）電極を用いてＡｃｃｕｍｅｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＡＲ−５０  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙメーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）で伝導度の測定を行った。以下の緩衝液伝導度を測定した：０．０１×ＴＢＥ−１８．１μＳ／ｃｍ；０．１×ＴＢＥ−１２５μＳ／ｃｍ；１×ＴＢＥ−１．０９ｍＳ／ｃｍ；０．１×ＰＢＳ−１．７７ｍＳ／ｃｍ；および１×ＰＢＳ−１６．８ｍＳ／ｃｍ。
【００７９】
粒子、ナノ粒子およびＤＮＡの誘導体化
ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎを表面被覆した蛍光ポリスチレンナノ粒子（ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ナノ粒子の直径は０．０４μｍ（４０ｎｍ）および０．２μｍ（２００ｎｍ）であった。４０ｎｍのポリスチレンナノ粒子は赤色蛍光（ｅｘ：５８５／ｅｍ：６０５）であり、２００ｎｍのポリスチレンナノ粒子は黄色−緑色蛍光（ｅｘ：５０５／ｅｍ：５１５）であった。より大きな１０．１４μｍのカルボキシル化ポリスチレン粒子をＢａｎｇｓ  Ｌａｂｓ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｓ、Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）から入手した。ビオチン化ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列をＴｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｒｉｌｉｎｋ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。４０ｎｍのナノ粒子の誘導体化に使用した５１ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは配列が［５］’−ビオチン−ＴＣＡ  ＧＧＧ  ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＣＴＡ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＣＣＡ  ＣＧＴ  ＴＣＡ  ＣＴＣ  ＡＧＧ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＣＣＡ  ＣＣＴ［３］’であった。使用した２３ｍｅｒの第２の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドは配列が［５］’−ビオチン−ＧＴＡ  ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＣＴＴ  ＡＧＡ  ＣＣ［３］’であった。まず４０ｎｍのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎナノ粒子を様々な濃度のトリス・ホウ酸・ＥＤＴＡ（０．０１×、０．１×、１×ＴＢＥ）またはリン酸塩緩衝生理食塩水（０．１×、１×ＰＢＳ）緩衝液に懸濁して、ビオチン化ＤＮＡオリゴヌクレオチドでこのナノ粒子の誘導体化を行った。この混合物に、５１ｍｅｒのｓｓ−ＤＮＡ配列に対して４００：１（ＤＮＡ：４０ｎｍのナノ粒子）の割合の量で、２３ｍｅｒのｓｓ−ＤＮＡ配列に対して６５００：１（ＤＮＡ：４０ｎｍのナノ粒子）の割合の量でｓｓ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドを加えた。ＤＮＡを加えたら、この溶液を高速度で２０秒間ボルテックスし、次いで約２０分間反応させた。４０ｎｍのＤＮＡ誘導体化ナノ粒子の実験では、０．５μＬの原液を２９９μＬの適当な緩衝液に加えてＤＮＡナノ粒子混合物を作製した。２００ｎｍのナノ粒子の実験では、０．５μＬの原液を２９９μＬの適当な緩衝液に加えた。最後に、このサンプルに１０．１４μｍのポリスチレン粒子原液１μＬを加え、次いでサンプルを約１０秒間ゆっくりと混合した。これでサンプルをマイクロアレイカートリッジ装置に充填する準備が整った。
【００８０】
ＤＥＰ微小電極アレイ装置
本試験に使用した微小電極アレイ装置は、Ｎａｎｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ、ＮａｎｏＣｈｉｐ（登録商標）１００Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）から入手した。アレイの円形微小電極は直径が８０μｍで、白金製であった。このマイクロアレイは１０μｍ厚の多孔性ポリアクリルアミドヒドロゲル層で被覆されている。マイクロアレイは、アレイ上にガラス窓で覆われた２０μＬのサンプルチャンバーを形成するマイクロ流体カートリッジに封入される。個々の微小電極の電気的接続部は、カートリッジの底部にピンで留められている（ｐｉｎｎｅｄ  ｏｕｔ  ｔｏ）。９枚の微小電極の３×３サブセットだけを使用してＤＥＰを行った。チェッカーボードアドレッシングパターン（ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ  ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎ）内の９枚の微小電極に交流（ＡＣ）電界を印加した。このチェッカーボードアドレッシングパターンにおいて、各微小電極は最近接電極と反対のバイアスを持つ。このパターンによる形成される非対称な電界分布に対応するコンピューターモデルは、既に考察されている［２７］。このモデルでは、正のＤＥＰ電界の最大値（高電場領域）が微小電極（上）に存在し、負のＤＥＰ電界の最小値（低電場領域）が電極間の領域に存在することが示される。一般に、低い導電率溶液におけるＤＥＰの場合、６０ｎｍのＤＮＡおよび２００ｎｍのナノ粒子は微小電極の正または高電場領域に濃縮されると予想され［２８］、１０ミクロン粒子は微小電極間の負または低電界ＤＥＰ領域に濃縮される［２９］。この以前のモデルの計算は、５×５微小電極セットを対象に行われた［２７］。各実験の前に、マイクロアレイカートリッジを、２００μＬの適当な緩衝液で５分にわたり１０回フラッシュする。カートリッジを５分間静置し、次いで２００μＬの緩衝液でさらに２回洗浄する。次いでナノ粒子混合物を含むサンプル溶液を合計１５０μＬゆっくりとカートリッジに注入し、最終的に約２０μＬのサンプル量がカートリッジに残る。
【００８１】
実験構成、測定、蛍光およびＳＥＭ解析
本マイクロアレイ装置は、１００枚の各微小電極に印加される電圧を個々に制御できる特注の切り換えシステム（我々の実験室において設計および構成された）を用いて制御した。微小電極を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ３３１２０Ａ  Ａｒｂｉｔｒａｒｙ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて適切なＡＣ周波数および電圧に設定した。ＡＣ周波数は、１０ボルト  最大振幅で１０００Ｈｚ〜１０，０００Ｈｚの範囲であった。実験に使用した波形はすべて正弦波であった。実験は、適切な励起および発光フィルター（緑色蛍光Ｅｘ５０５ｎｍ、Ｅｍ５１５ｎｍ；赤色蛍光Ｅｘ５８５ｎｍ、Ｅｍ６０５ｎｍを使用してＪｅｎａＬｕｍａｒ落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の１０×ＰＬ  Ｆｌｕｏｔａｒ対物レンズで可視化した。バックライト画像および蛍光画像はどちらもＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  ２４−ｂｉｔ  ＲＧＢ  ＣＣＤカメラ（Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ、Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて撮像した。画像データは、Ａｄｏｂｅ  Ｐｒｅｍｉｅｒｅ  Ｐｒｏ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）あるいはＷｉｎｄｏｗｓ  Ｍｏｖｉｅ  Ｍａｋｅｒを用いてラップトップコンピューターに接続されたＣａｎｏｐｕｓ  ＡＤＶＣ−５５ビデオキャプチャカード（Ｃａｎｏｐｕｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）により処理した。最終の蛍光データは、０分時点、３０秒時点、１分時点、２分時点、４分時点、８分時点、１６分時点および２０分時点にビデオの個々の蛍光画像フレームをＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ、ＵＳＡ）に入力して解析した。グラフは、微小電極全体の蛍光強度値に関するＭＡＴＬＡＢ解析により得られたデータからＥｘｃｅｌを用いて作成した。ＭＡＴＬＡＢを用いて作成した。グラフの作成には以下のデータを使用した：σｐ（２００ｎｍ）＝１８ｍＳ、σｐ（４０ｎｍ＋ＤＮＡ）＝５０ｍＳ  Ｋｓ＝０．９ｎＳ、εｐ＝２．５５ε０。ｒ＝３０ｎｍおよびｒ＝１００ｎｍ。ｆ＝３ｋＨｚ。ＤＥＰ実験の終了後、ＦＣＯＳマイクロアレイの表面からすべての流体を除去し、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＸＬ３０走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で視覚化した。ＳＥＭを用いてマイクロアレイの表面上の最終的なナノ粒子層を画像化した。
【００８２】
本記述に引用した参考文献は以下の通りである：
１．Ｔｏｎｇ，Ｙ−Ｋ．；Ｌｏ，Ｙ．Ｍ．Ｄ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ．３６３：１８７−９６；２００６
２．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｆ．Ｆ．；Ｗａｎｇ，Ｘ−Ｂ．；Ｈｕａｎｇ，Ｙ．；Ｐｅｔｈｉｇ，Ｒ．；Ｖｙｋｏｕｋａｌｔ，Ｙ．；Ｇａｓｃｏｙｎｅ，Ｐ．Ｒ．Ｃ．Ｔｈｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ．Ｊ  Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２７：２６５９−２６６２；１９９４．
３．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｆ．Ｆ．；Ｗａｎｇ，Ｘ−Ｂ．；Ｈｕａｎｇ，Ｙ．；Ｐｅｔｈｉｇ，Ｒ．；Ｖｙｋｏｕｋａｌｔ，Ｙ．；Ｇａｓｃｏｙｎｅ，Ｐ．Ｒ．Ｃ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｒｏｍ  Ｂｌｏｏｄ  ｂｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９２：８６０−８６４；１９９５．
４．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｍ，Ｔａｌａｒｙ  ＭＳ，Ｐｅｔｈｉｇ  Ｒ，Ｂｕｒｅｔｔ  ＡＫ，Ｍｉｌｓ  Ｋｌ．Ｔｈｅ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ＣＤ３４＋ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｓ．Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１８：７７７−８２．１９９６
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９．Ｈｏｌｚｅｌ，Ｒ．；Ｃａｌａｎｄｅｒ，Ｎ．；Ｃｈｉｒａｇｗａｎｄｉ，Ｚ；Ｗｉｌ  ａｎｄｅｒ，Ｍ．；Ｂｉｅｒ，Ｆ．Ｆ．Ｔｒａｐｐｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｆｔ．９５：１２８１０２（２００５）
１０．Ｒａｍｏｓ，Ａ．；Ｍｏｒｇａｎ，Ｈ．；Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｇ．；Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ，Ａ．Ａｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｆｏｒｃｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｊ  Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．３１：２３３８−２３５３；１９９８．
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１６．Ｇａｕｔｓｃｈｉ  ０，Ｂｉｇｏｓｃｈ  Ｃ，Ｈｕｅｇｌｉ  Ｂ，Ｊｅｒｍａｎ  Ｍ，Ｍａｒ  Ａ，Ｃｈａｓｓｅ  Ｅ，Ｒａｔｓｃｈｉｌｅｒ  Ｄ，Ｗｅｄｅｒ  Ｗ，Ｊｏｅｒｇｅｒ  Ｍ，Ｂｅｔｔｉｃｈｅｒ  ＤＣ，Ｓｔａｈｅｌ  ＲＡ，Ｚｉｅｇｌｅｒ  Ａ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｄｅｏｘｙｒｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｓ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｅｏｌ．２２：４１５７−６４．２００４
１７．Ｓｔｒｏｕｎ  Ｍ，Ａｎｅｒ  Ｐ，Ｌｙａｕｔｅｙ  Ｊ，ｅｔ  ａＬ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｅｏｌ  ２３：７０７−７１２．１９８７．
１８．Ｍｏｒｇａｎ，Ｈ．；Ｈｕｇｈｅｓ，Ｍ．Ｐ．；Ｇｒｅｅｎ，Ｎ．Ｇ．「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｂ  ｍｉｃｒｏｎ  Ｂｉｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｂｙ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ」  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ．７７：５１６−５２５．１９９９
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２０．Ｔｕｕｋａｎｅｎ，Ｓ．；Ｔｏｐｐａｒ，Ｊ．Ｊ．；Ｋｕｚｙｋ，Ａ．；Ｈｉｒｖｉｎｉｅｍｉ，Ｌ；Ｈｙｔｏｎｅｎ，Ｖ．Ｐ．；ｌｌａｌａｉｎｅｎ  Ｔ．；Ｔｏｒｍａ，Ｐ．Ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ  ａｓ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．６：１３３９−１３４３；２００６．
２１．Ｃｈｉｎｇ  １．ｅｔ  ａｌ．，「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｃｅｒｉｖｃａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｉｘｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ａ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｈｉｐ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＶｏＬ．７０，＃１１  ，ｐｐ．２３２１−２３２６，１９９８．
２２．Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆＤＮＡ／Ａ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｏｎ  １５  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｈｉｐｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＶｏＬ．１６，ｐｐ．５４１−５４６，１９９８．
２３．Ｈｕａｎｇ  Ｙ，Ｅｗａｌｔ  ＫＬ，Ｔｉｒａｄｏ  Ｍ，Ｈａｉｇｉｓ  Ｒ，Ｆｏｒｓｔｅｒ  Ａ，Ａｃｋｌｅｙ  Ｄ，Ｈｅｌｌｅｒ  ＭＪ，Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ＪＰ，ａｎｄ  Ｋｒｈａｋ  Ｍ，「Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆＢｉｏｐａｒｉｃ１ｅｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｎ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１，（７３）：１５４９−５９．
２４．Ｈｕａｎｇ  Ｙ，Ｊｏｏ  Ｓ，Ｄｕｈｏｎ  Ｍ，Ｈｅｌｌｅｒ  ＭＪ，Ｗａｌｌａｃｅ  Ｂ  ａｎｄ  Ｘｕ，「Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ２０  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｎ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｈｉｐ  Ａｒｒａｙｓ」，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｒｎ．２００２，７４，３３６２−７１．
２５．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，６３２，９５７，Ｍａｙ  ２７，１９９７，Ｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ．
２６．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，２８９，５９０  Ｂｌ，Ａｕｇｕｓｔ  ２８，２００１  ，Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｎｅｌｌ−Ｌｅｓｓ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ２５  Ｂｉｏｐａｒｉｃｌｅｓ  ｏｎ  ａ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｈｉｐ  ｂｙ  Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．
２７．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ＮＱ．６，４０３，３６７，３６７  Ｂｌ，Ｊｕｎｅ  １１，２００２，Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ．２４．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２３Ｆ】
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【図２３Ｇ】
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【図２３Ｈ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｆ】
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【図２５Ｇ】
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【図２５Ｈ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ−Ｄ】
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【図１９Ｅ−Ｈ】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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