(57)【要約】本開示は、概して、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）において1種または複数種の関心対象の遺伝子産物（例えば、ポリペプチド、RNA）の高レベルの発現を促進する、天然に存在しないポリヌクレオチド配列を提供する。そのような配列の使用、例えばワクチン産生における使用の方法も提供する。2014529407.tif 000035
2014529407.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ATGGTTを含む、天然N.メニンジティディス（N. meningitidis）porAプロモーターの5'部分と、
スペーサー部分と、
配列TATAATを含む、天然N.メニンジティディスporAプロモーターの3'部分と
を含むプロモーターであって、
スペーサーが式N1-TTTCA-N2の配列を含み、
式中、N1は
2014529407.tif 000027
であり、かつN2はXcXdXeであり、
式中、
Xaは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはTまたはAであり；
Xbは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはAまたはCであり；
Xcは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはTまたはGであり；
Xdは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはAまたはGであり；かつ
Xeは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはGであって、
5'部分、スペーサー、および3'部分が機能的に連結されて、N.メニンジティディスにおける転写を提供する、プロモーター。
【請求項２】
スペーサーが、配列
2014529407.tif 000028
を含む、請求項1記載のプロモーター。
【請求項３】
スペーサーが、配列
2014529407.tif 000029
を含む、請求項1記載のプロモーター。
【請求項４】
スペーサーが、配列
2014529407.tif 000030
を含む、請求項1記載のプロモーター。
【請求項５】
スペーサーが、配列
2014529407.tif 000031
を含む、請求項1記載のプロモーター。
【請求項６】
スペーサーが、配列
2014529407.tif 000032
を含む、請求項1記載のプロモーター。
【請求項７】
スペーサーが、配列
2014529407.tif 000033
を含む、請求項1記載のプロモーター。
【請求項８】
スペーサーが、配列
2014529407.tif 000034
を含む、請求項1記載のプロモーター。
【請求項９】
5'から3'に式：
TFB-X-E-ATG
を含むプロモーターであって、
式中、
TFBは天然nmb1523プロモーターの転写因子結合配列を指し；
Eは天然nmb1523プロモーターの66塩基対伸長配列を指し；かつ
Xは、TFBとEとの間に配置される天然nmb1523プロモーターのスペーサー配列を指し、
ここで、Eが存在している場合にはTFBは存在しておらず、TFBが存在している場合にはEは存在していないという条件で、TFB、X、およびE部分が機能的に連結されて、N.メニンジティディスにおける転写を提供する、プロモーター。
【請求項１０】
TFBおよびEの両方が存在していない、請求項9記載のプロモーター。
【請求項１１】
関心対象の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結された請求項1〜10のいずれか一項記載のプロモーターを含む、核酸構築物。
【請求項１２】
請求項1〜10のいずれか一項記載のプロモーターまたは請求項11記載の核酸構築物を含む、単離されたナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）細菌。
【請求項１３】
内在性ポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドの発現を促進するために、プロモーターが細菌のゲノム内に機能的に配置されている、請求項12記載の単離されたナイセリア・メニンジティディス細菌。
【請求項１４】
内在性ポリヌクレオチドがナイセリア・メニンジティディス表面抗原をコードする、請求項13記載の単離されたナイセリア・メニンジティディス細菌。
【請求項１５】
請求項12記載の単離されたナイセリア・メニンジティディス細菌を培養する工程を含む、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原を発現させる方法であって、
該培養する工程が表面抗原の発現を促進する、方法。
【請求項１６】
請求項1〜10のいずれか一項記載のプロモーター配列を、天然表面抗原遺伝子の上流でナイセリア・メニンジティディス宿主のゲノム内に機能的に挿入する工程；および
該ナイセリア・メニンジティディス宿主を培養する工程
を含む、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原を発現させる方法であって、
該培養する工程が表面抗原の発現を促進する、方法。
【請求項１７】
表面抗原をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された請求項1〜10のいずれか一項記載のプロモーター配列を含む核酸構築物を、ナイセリア・メニンジティディス宿主のゲノム内に挿入する工程；および
該ナイセリア・メニンジティディス宿主を培養する工程
を含む、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原を発現させる方法であって、
該培養する工程が表面抗原の発現を促進する、方法。
【請求項１８】
請求項1〜10のいずれか一項記載の第一のプロモーター配列を、天然表面抗原遺伝子の上流でナイセリア・メニンジティディス宿主のゲノム内に機能的に挿入する工程；
表面抗原をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された請求項1〜10のいずれか一項記載の第二のプロモーター配列を含む核酸構築物を、ナイセリア・メニンジティディス宿主のゲノム内に挿入する工程；および
該ナイセリア・メニンジティディス宿主を培養する工程
を含む、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原を発現させる方法であって、
該培養する工程が表面抗原の発現を促進する、方法。
【請求項１９】
第一および第二のプロモーターが同じである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
第一および第二のプロモーターが異なる、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
プロモーターが、関心対象の遺伝子産物をコードする第一のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、かつ該第一のポリヌクレオチドが、関心対象の遺伝子産物をコードする第二のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、それによって、該プロモーターが第一および第二のポリヌクレオチドの発現を推進する、請求項11記載の核酸構築物。
【請求項２２】
第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドがそれぞれ、同じ関心対象の遺伝子産物をコードする、請求項21記載の核酸構築物。
【請求項２３】
第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドがそれぞれ、異なる関心対象の遺伝子産物をコードする、請求項21記載の核酸構築物。
【請求項２４】
関心対象の遺伝子産物がナイセリア・メニンジティディス表面抗原である、請求項22記載の核酸構築物。
【請求項２５】
異なる関心対象の遺伝子産物のそれぞれがナイセリア・メニンジティディス表面抗原である、請求項23記載の核酸構築物。
【請求項２６】
第二のポリヌクレオチド配列の3'末端に機能的に連結されている転写ターミネーターをさらに含む、請求項21記載の核酸構築物。
【請求項２７】
プロモーターが、関心対象の遺伝子産物をコードする第一のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、かつ該第一のポリヌクレオチドが、関心対象の遺伝子産物をコードする第二のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、かつ該第二のポリヌクレオチドが、関心対象の遺伝子産物をコードする第三のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、それによって、該プロモーターが第一、第二、および第三のポリヌクレオチドの発現を推進する、請求項11記載の核酸構築物。
【請求項２８】
第一、第二、および第三のポリヌクレオチドがそれぞれ、同じ関心対象の遺伝子産物をコードする、請求項27記載の核酸構築物。
【請求項２９】
関心対象の遺伝子産物がナイセリア・メニンジティディス表面抗原である、請求項28記載の核酸構築物。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドのうちの2つが、第一の関心対象の遺伝子産物をコードし、かつ前記ポリヌクレオチドのうちの1つが、該第一の関心対象の遺伝子産物とは異なる第二の関心対象の遺伝子産物をコードする、請求項27記載の核酸構築物。
【請求項３１】
第一の関心対象の遺伝子産物がナイセリア・メニンジティディス表面抗原である、請求項30記載の核酸構築物。
【請求項３２】
第二の関心対象の遺伝子産物がナイセリア・メニンジティディス表面抗原である、請求項30記載の核酸構築物。
【請求項３３】
第一、第二、および第三のポリヌクレオチドがそれぞれ、異なる関心対象の遺伝子産物をコードする、請求項27記載の核酸構築物。
【請求項３４】
異なる関心対象の遺伝子産物のそれぞれがナイセリア・メニンジティディス表面抗原である、請求項33記載の核酸構築物。
【請求項３５】
第三のポリヌクレオチドの3'末端に機能的に連結されている転写ターミネーターをさらに含む、請求項27記載の核酸構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2011年8月31日に提出された米国仮特許出願第61/529,776号の優先権の恩典を主張するものであって、その出願は参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって付与された、助成金第AI 046464およびAI 082263の下での政府支援でなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
序論
有効なコロニー形成および伝播を確実にするために、メニンゴコッカス（meningococcus）細菌は、病原性に関与する遺伝子の差異的発現により、様々な微小環境に適応しかつ応答する。ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）において、病原性決定因子の有無は転写レベルで調節され、そして決定因子レベルのより緻密な調整は、転写および翻訳レベルの両方でなされ得る。遺伝子活性化は、典型的には、プロモーター配列領域、コード配列領域、および／または転写ターミネーター配列領域に位置する単純なDNA配列域内（ある場合には反復内）での可逆的変化に関連する。反復の数は、スリップによる鎖の誤対合等のメカニズムを通して複製の間に改変され得、かつその結果として、フレームシフト変異を導入するまたは重大なプロモーター間隔を変化させることによって、転写または翻訳に影響を及ぼし得る。反復単位の減少または増加は、表面抗原に典型的に関連する遺伝子の発現の、高頻度のオン・オフ切り替え（フレームシフト／翻訳制御の場合）または発現のレベルの変調（プロモーター制御の場合）をもたらす。
【０００４】
PorAは、そのプロモーター強度が、転写開始部位に対して−35塩基〜−10塩基の間に位置するポリG域における変化によって少なくとも部分的に調節される表面抗原の一例である。NadAは、そのプロモーター強度が、相変換（phase variation）によって部分的に調節される表面抗原の一例である。nadAプロモーターの上流に位置する反復TAAA配列の区域は、3つの異なるオペレーター要素へのnadR転写リプレッサーの結合とともに、nadAの相変換の頻度を決定する。これらのメカニズムは表面抗原の一貫性のない発現をもたらし得るため、それゆえに、ナイセリア・メニンジティディス宿主において強力な天然プロモーターから表面抗原を過剰発現させることは、ワクチンを産生する際に困難を示す。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本開示は、概して、ナイセリア・メニンジティディスにおいて1種または複数種の関心対象の遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）の高レベルの発現を促進する、操作されたポリヌクレオチド配列を提供する。そのような配列の使用、例えばワクチン産生における使用の方法も提供する。
【０００６】
いくつかの態様において、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列ATGGTTを含む天然N.メニンジティディスporAプロモーターの5'部分と、スペーサー部分と、配列TATAATを含む天然N.メニンジティディスporAプロモーターの3'部分とを含むプロモーターであって、スペーサーは式N1-TTTCA-N2の配列を含み、式中、N1は
2014529407.tif 000003
であり、かつN2はXcXdXeであり、式中：Xaは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはTまたはAであり、Xbは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはAまたはCであり、Xcは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはTまたはGであり、Xdは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはAまたはGであり、かつXeは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはGであって、5'部分、スペーサー、および3'部分は機能的に連結されて、N.メニンジティディスにおける転写を提供する。
【０００７】
いくつかの態様において、スペーサーは、
2014529407.tif 000004
配列を含む。いくつかの態様において、スペーサーは、
2014529407.tif 000005
配列を含む。いくつかの態様において、スペーサーは、
2014529407.tif 000006
配列を含む。いくつかの態様において、スペーサーは、
2014529407.tif 000007
配列を含む。いくつかの態様において、スペーサーは、
2014529407.tif 000008
配列を含む。いくつかの態様において、スペーサーは、
2014529407.tif 000009
配列を含む。いくつかの態様において、スペーサーは、
2014529407.tif 000010
配列を含む。
【０００８】
いくつかの態様において、操作されたポリヌクレオチド配列は、5'から3'に式：TFB-X-E-ATGを含むプロモーターであって、式中、TFBは天然nmb1523プロモーターの転写因子結合配列を指し；Eは天然nmb1523プロモーターの66塩基対伸長配列を指し；かつXは、TFBとEとの間に配置される天然nmb1523プロモーターのスペーサー配列を指し、ここで、Eが存在している場合にはTFBは存在しておらず、TFBが存在している場合にはEは存在していないという条件で、TFB、X、およびE部分は機能的に連結されて、N.メニンジティディスにおける転写を提供する。ある特定の態様において、TFBおよびEの両方が存在していない。
【０００９】
いくつかの態様において、操作されたポリヌクレオチド配列は、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された上記に記載されるプロモーターを含む核酸構築物である。
【００１０】
いくつかの態様において、単離されたナイセリア・メニンジティディス細菌は、上記に記載されるプロモーターまたは上記に記載される核酸構築物を含む。いくつかの態様において、単離されたナイセリア・メニンジティディス細菌は、内在性ポリヌクレオチドの発現を促進するために細菌のゲノム内に機能的に配置されたプロモーターを含む。いくつかの態様において、内在性ポリヌクレオチドは、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原をコードする。
【００１１】
いくつかの態様は、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原を発現させる方法に関するものであり、該方法は、上記に記載される単離されたナイセリア・メニンジティディス細菌を培養する工程を含み、該培養する工程は表面抗原の発現を促進する。
【００１２】
いくつかの態様は、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原を発現させる方法に関するものであり、該方法は、上記に記載されるプロモーター配列を、天然表面抗原遺伝子の上流でナイセリア・メニンジティディス宿主のゲノム内に機能的に挿入する工程、および該ナイセリア・メニンジティディス宿主を培養する工程を含み、該培養する工程は表面抗原の発現を促進する。
【００１３】
いくつかの態様は、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原を発現させる方法に関するものであり、該方法は、表面抗原をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された上記に記載されるプロモーター配列を含む核酸構築物を、ナイセリア・メニンジティディス宿主のゲノム内に挿入する工程；および該ナイセリア・メニンジティディス宿主を培養する工程を含み、該培養する工程は表面抗原の発現を促進する。
【００１４】
いくつかの態様は、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原を発現させる方法に関するものであり、該方法は、上記に記載される第一のプロモーター配列を、天然表面抗原遺伝子の上流でナイセリア・メニンジティディス宿主のゲノム内に機能的に挿入する工程、表面抗原をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された上記に記載される第二のプロモーター配列を含む核酸構築物を、ナイセリア・メニンジティディス宿主のゲノム内に挿入する工程、および該ナイセリア・メニンジティディス宿主を培養する工程を含み、該培養する工程は表面抗原の発現を促進する。いくつかの態様において、第一および第二のプロモーターは同じである。他の態様において、第一および第二のプロモーターは異なる。
【００１５】
いくつかの態様において、核酸構築物は、関心対象の遺伝子産物をコードする第一のポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含み、該第一のポリヌクレオチドは、関心対象の遺伝子産物をコードする第二のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、それによって、該プロモーターは第一および第二のポリヌクレオチドの発現を推進する。いくつかの態様において、核酸構築物は、同じ関心対象の遺伝子産物をコードする第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、核酸構築物は、異なる関心対象の遺伝子産物をコードする第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、関心対象の遺伝子産物の一方または両方は、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原である。いくつかの態様において、核酸構築物は、第二のポリヌクレオチドの3'末端に機能的に連結されている転写ターミネーターを含む。
【００１６】
いくつかの態様において、核酸構築物は、関心対象の遺伝子産物をコードする第一のポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含み、該第一のポリヌクレオチドは、関心対象の遺伝子産物をコードする第二のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、かつ該第二のポリヌクレオチドは、関心対象の遺伝子産物をコードする第三のポリヌクレオチドに機能的に連結されており、それによって、該プロモーターは第一、第二、および第三のポリヌクレオチドの発現を推進する。いくつかの態様において、核酸構築物は、同じ関心対象の遺伝子産物をコードする第一、第二、および第三のポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、関心対象の遺伝子産物は、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原である。いくつかの態様において、前記ポリヌクレオチドのうちの2つは、第一の関心対象の遺伝子産物をコードし、かつ前記ポリヌクレオチドのうちの1つは、該第一の関心対象の遺伝子産物とは異なる第二の関心対象の遺伝子産物をコードする。いくつかの態様において、第一の関心対象の遺伝子産物は、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原である。いくつかの態様において、第二の関心対象の遺伝子産物は、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原である。いくつかの態様において、第一、第二、および第三のポリヌクレオチドはそれぞれ、異なる関心対象の遺伝子産物をコードする。いくつかの態様において、関心対象の遺伝子産物のそれぞれは、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原である。いくつかの態様において、核酸構築物は、第三のポリヌクレオチドの3'末端に機能的に連結されている転写ターミネーターを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1A〜1Bは、2種の相変換可能なナイセリア外膜タンパク質遺伝子の天然プロモーターの概略的表現を示している。図1Aは、天然nadAおよびporAプロモーターの主要な配列特性を示している。下線を引かれた配列は、相変換に関与するセグメントを表す。nadAプロモーターの四角で囲まれた部分は、転写リプレッサーNadR（NMB1843）によって認識される部位を表す。NadRの結合は、nadAプロモーターが機能するのを妨げる。図1Bは、転写開始部位から−35〜−10の間に位置する塩基対の領域に焦点を絞った、nadAおよびporAプロモーター配列のアライメントを示している。
【図２】2種の代表的なナイセリア株：莢膜群B株MC58および莢膜群A株Z2491における、H因子結合タンパク質（fHbp）モデル遺伝子／抗原の上流および下流に位置する遺伝子の概略図を示している。近隣遺伝子から概算される転写活性の方向を破線で印付けしている。
【図３】パネルAは、プロモーターの出力を増大させ、それによりナイセリア細胞によって産生されるモデル遺伝子／抗原（例えば、fHbp）の量を増大させる配列の同定のためのストラテジーを表した略図を示している。相同的組換えによって、天然fHbpプロモーターを、操作されたプロモーター配列で置き換えた。パネルBは、操作されたプロモーター配列のファミリーを示している。
【図４】ナイセリアporAおよびnadAプロモーター領域の配列の組み合わせを含有する、本開示のキメラプロモーター（X1〜X7と呼ばれる）に存在している配列特性を示している。X0は、元の改変されていないporAプロモーター配列である。nadAプロモーター由来のスペーサー配列（X1）を用いた完全な置き換えまたは異なる配列変種として、操作された配列を転写開始部位に対して−35〜−10ヌクレオチドに位置する領域内に挿入した。
【図５】キメラプロモーターに存在している配列特性を記載したアライメントを示している。X0は、対照として用いられた、元の改変されていないporAプロモーター配列である。したがって、X0は、ポリG域を含有しかつ相変換可能である。X1は、nadA遺伝子由来の間隔（spacing）配列（下線を引かれた）を含有する。X2〜X4は、1個の付加的T（X2）、1個の付加的Aおよび第二のTのAへの変異（X3）、ならびに1個のCのAへの変異（X4）を含む、X1の変異体変種である。X5は、天然porA遺伝子由来の5'部分および天然nadA遺伝子由来の3'部分を含むスペーサーを含む。X6およびX7は、天然porA遺伝子由来の5'部分および天然porA遺伝子由来の3'部分を含むスペーサー部分を含む。
【図６】欠失された2つの要素：転写因子結合ドメインおよび66bp伸長ドメインを含有する、天然nmb1523プロモーター（SL）の概略図を示している。S1、66bp伸長を含まないが転写因子結合部位を保持するnmb1523；S2、66bp伸長を含むが転写因子結合部位を含まないnmb1523；S3、66bp伸長を含まずかつ転写因子結合部位を含まないnmb1523。
【図７】パネルAは、定量的ウェスタンブロットによって測定された、操作されたCH21Aナイセリア単離体の間でのfHbp ID 5の発現を示している。パネルBおよびCは、フローサイトメトリーのデータを示している。
【図８】1コピー（X1）または1個を上回る数のコピー（X1-S1およびX1-X1）の操作されたプロモーターを含有する変異体CH21A株におけるfHbp ID 5レベルに関する定量的ウェスタンブロットのデータを示している。
【図９】パネルAは、定量的ウェスタンブロットによって測定された、操作されたCH38Wナイセリア単離体におけるfHbp ID 5の発現を示している。パネルBおよびCは、フローサイトメトリーのデータを示している。
【図１０】変異体CH38W株におけるfHbp ID 9の発現レベルについての定量的ウェスタンブロットのデータを示している。
【図１１】パネルAは、定量的ウェスタンブロットによって測定された、操作されたCH248B（H44/76としても知られる）ナイセリア変異体単離体の間でのfHbpの発現レベルを示している。パネルBおよびCは、フローサイトメトリーのデータを示している。
【図１２】CH253B（NZ98/254としても知られる）誘導体の間でfHbp ID 14発現レベルを測定した定量的ウェスタンブロットのデータを示している。
【図１３】定量的ウェスタンブロットによって測定された、操作されたCH164Xナイセリア単離体の間でのfHbp ID 74の発現レベルを示している。
【図１４】パネルAは、CH36W変異体における発現レベルについての定量的ウェスタンブロットのデータを示している。パネルBおよびCは、フローサイトメトリーのデータを示している。
【図１５】転写ターミネーター配列を含むおよび含まないCH21A株におけるfHbp ID 5の発現レベルを示している。
【図１６】ナイセリア・メニンジティディスFAM18株におけるコドン使用量の頻度を示した表である。
【図１７】ナイセリア・メニンジティディスZ2491株におけるコドン使用量の頻度を示した表である。
【図１８】fHbp ID 9に対する、コドン最適化された配列と元の配列との間の配列比較である。最適化されたコドンは灰色で示されている。
【図１９】fHbp ID 23のコドン最適化された配列である。
【図２０】fHbp ID 4のコドン最適化された配列である。
【図２１】fHbp ID 28のコドン最適化された配列である。
【図２２】fHbp ID 1のコドン最適化された配列である。
【図２３】fHbp ID 14のコドン最適化された配列である。
【図２４】fHbp ID 45のコドン最適化された配列である。
【図２５】fHbp ID 55のコドン最適化された配列である。
【図２６】fHbp ID 19のコドン最適化された配列である。
【図２７】fHbp ID 77のコドン最適化された配列である。
【図２８】NspA（nmb0663）のコドン最適化された配列である。
【図２９】NspA（nmc0612、nma0862）のコドン最適化された配列である。
【図３０】NHbp（nmb2132）のコドン最適化された配列である。
【図３１】TbpB（Tbp2、nmb0461）のコドン最適化された配列である。
【図３２】TbpA（Tbp1、nmb0461）のコドン最適化された配列である。
【図３３】LbpB（nmb1541）のコドン最適化された配列である。
【図３４】LbpA（nmb1540）のコドン最適化された配列である。
【図３５】オパシティタンパク質（クラス5、nmb1053）のコドン最適化された配列である。
【図３６】NadA（nmb1994）のコドン最適化された配列である。
【図３７】PorA（nmb1429）のコドン最適化された配列である。
【図３８】feta（nmb1988）のコドン最適化された配列である。
【図３９】パネルAは、表面抗原をコードする最高3種までの異なるポリヌクレオチド配列の発現を推進する操作されたプロモーターについての、かつ表面抗原コード配列の下流に位置する転写ターミネーター配列を含む概略的図解である。パネルBは、fHbpおよびNspAの発現を推進する操作されたプロモーターについての、かつ表面抗原コード配列の下流に位置する転写ターミネーターを含む概略的図解である。パネルCは、fHbp、TbpB、およびTbpAの発現を推進する操作されたプロモーターについての、かつ表面抗原コード配列の下流に位置する転写ターミネーターを含む概略的図解である。
【図４０】CH38W変異体ナイセリア・メニンジティディス株における、fHbpおよびNspA表面抗原配列の両方の発現レベルについての定量的ウェスタンブロットのデータを示しており、該表面抗原配列の両方の発現が、操作された単一プロモーターによって推進されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明をさらに記載する前に、本発明は、記載される特定の態様に限定されるものではなく、そのため、当然変わり得るということを理解するべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される専門用語は、特定の態様を記載することのみを目的とするものであって、限定することを意図するものではないことも理解するべきである。
【００１９】
値の範囲が提供される場合、そうでないことが文脈においてはっきりと指示されない限りは下限の単位の10分の1までの、間に存在する各値、その範囲の上限と下限との間に存在する各値、およびその明記された範囲における他の任意の明記された値または間に存在する各値が、本発明の範囲内に包含される。明記された範囲において具体的に除外される任意の限界値に依存して、これら狭い範囲の上限および下限は、該狭い範囲に独立して含まれてよく、そしてまた、本発明の範囲内にも包含される。明記された範囲が限界値の一方または両方を含む場合、そうした含まれる限界値のいずれかまたは両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【００２０】
そうでないことが定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践または試験において、本明細書において記載されるものと同様のまたは同等の任意の方法および材料も使用することができるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載されている。本明細書において言及されるすべての刊行物は、それに関連して該刊行物が引用される方法および／または材料を開示しかつ記載するために、参照により本明細書に組み入れられる。
【００２１】
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において使用するとき、「a」、「an」、および「the」という単数形は、そうでないことが文脈においてはっきりと指示されない限り、複数形の指示対象を含むことに留意しなければならない。ゆえに、例えば「プロモーター（the promoter）」への言及は、1つまたは複数のプロモーターなどへの言及を含む。特許請求の範囲は、任意の選択的要素を除外するように起草され得ることがさらに留意される。そのため、この表現は、特許請求の範囲の要素の記述に関連した、「のみ」、「単に」などのような排他的用語の使用、または「消極的」限定の使用のための先行詞としての役割を果たすことを意図する。
【００２２】
本明細書において論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、先行発明が理由で本発明がそのような刊行物に先行する権利を与えられないという承認として解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日時は、個別に確認される必要があり得る実際の刊行日とは異なる場合がある。
【００２３】
定義
そうでないことが示されない限り、以下の用語は以下の意味を有する。定義されていない任意の用語は、それらの技術分野により認識されている意味を有する。
【００２４】
本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、およびそのフラグメントまたは部分を指し、ならびに一本鎖または二本鎖であり得、かつセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得る、ゲノムまたは合成起源のDNAまたはRNAを指す。
【００２５】
「プロモーター」とは、下流（3'方向）配列の転写を始動させ得る配列を有するDNA調節領域を指す。
【００２６】
「転写ターミネーター」とは、上流（5'方向）配列の転写を終結させ得るDNA調節領域を指す。
【００２７】
「コドン」とは、ポリペプチド鎖における特異的アミノ酸残基をコードする、または翻訳の終結をコードする（例えば、「終止」コドン）、一連の3個の連続コドンである。
【００２８】
「翻訳的に最適化された配列」とは、DNA配列のより効率的な発現を促進するために、同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンのうちの1つに対する、該配列を発現する生物の選好性に基づいてコドンが変更されている、非天然DNA配列を指す。
【００２９】
「欠失」とは、天然に存在する参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と比較して、1個または複数個のヌクレオチド塩基が存在していない、ヌクレオチド配列における変化として定義される。
【００３０】
「挿入」または「付加」とは、天然に存在する参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と比較して、1個または複数個のヌクレオチド塩基の付加をもたらしている、ヌクレオチド配列におけるその変化である。
【００３１】
「置換」は、天然に存在する参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列と比較して、異なるヌクレオチドによる1個または複数個のヌクレオチドの置き換えによって生じる。
【００３２】
「構築物」または「ポリヌクレオチド構築物」とは、天然において一緒には見出されない1つまたは複数の機能的単位を含むように構築されている核酸配列を意味する。
【００３３】
「機能的に連結された」とは、適切な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）が調節配列に結合している場合に遺伝子発現を可能にするような方式で、DNA配列と調節配列（例えば、プロモーター）とが接続されていることを意味する。DNA配列の上流に（例えば、5'方向に）調節配列を機能的に挿入することによって、または調節配列の下流に（例えば、3'方向に）DNA配列を機能的に挿入することによって、DNA配列と調節配列との機能的な連結を遂行することができる。
【００３４】
「内在性」という用語は、細胞の天然に存在する任意の成分を指す。
【００３５】
「外因性」という用語は、細胞の外側を起源とする、細胞の天然に存在しない任意の成分を指す。
【００３６】
「異種性」または「キメラの」という用語は、異なる供給源に由来する構造体によって定義される2つの成分を指す。例えば、キメラプロモーターの文脈において「異種性」が使用される場合、キメラプロモーターは、異なるポリヌクレオチド参照配列（例えば、α参照ヌクレオチド配列からの第一の成分、およびβ参照ヌクレオチド配列からの第二の成分）に由来し得る機能的に連結されたヌクレオチド配列を含んでよい。そのそれぞれが異なる参照配列由来である2つまたはそれを上回る数の定義されたセグメントを含有するキメラポリヌクレオチドは、天然に存在するまたは人造の（天然に存在しない）ものであってよい。天然に存在しないキメラポリヌクレオチド配列は、「人造のキメラ」を指し、かつ例えば天然において一緒には見出されない異種性成分を含むプロモーターを包含してよい。
【００３７】
他の例示的な「異種性」核酸には、コード配列を含む核酸が、（例えば、プロモーター、コード配列、またはその両方に対して異なる遺伝的起源のものであり得る、関心対象の宿主細胞における発現を提供するために）該コード配列のものとは異なる遺伝的起源を有する調節要素（例えば、プロモーター）に機能的に連結されている発現構築物が含まれる。例えば、fHbpポリペプチドまたはそのドメインをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたキメラプロモーターは、異種性核酸であると言われる。
【００３８】
本明細書において使用される「ドメイン欠失プロモーター」とは、天然のプロモーター配列に由来するが、1つまたは複数のドメイン（例えば、転写因子結合ドメインおよび／または塩基対伸長ドメイン）が欠失している、ポリヌクレオチドプロモーター配列を指す。
【００３９】
本明細書において使用される「組換え」とは、遺伝子産物をコードする核酸、そのような核酸によってコードされる遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）、または人間の手による操作を受けており、ゆえにそれは天然において見出されない状況または形態で提供される細胞（例えば、細菌細胞）を指す。ゆえに、「組換え」は、（機能的に連結されたプロモーターからの遺伝子産物の発現を提供する構築物が、天然において見出されないというような）異種性プロモーターに機能的に連結された遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を包含する。例えば、「組換えfHbp」は、fHbpコード配列に対して異種性のプロモーターからの発現を提供する構築物によってコードされるfHbp、天然に存在するfHbpに対して改変されているfHbpポリペプチド（例えば、融合タンパク質の状態にあるような）などを包含する。組換えfHbpポリペプチドは、そのような組換えfHbpコード構築物が存在しているナイセリア・メニンジティディス株に対して内在性または異種性であってよいことに留意すべきである。外因性DNAを生物内に組み入れて、永続的なまたは一過性の遺伝子変化を達成することによって、組換え生物（例えば、組換え細菌）を創出することができる。宿主細胞のゲノム内への外因性DNAの組み入れによって、またはエピソーム性要素としての外因性DNAの一過性のまたは安定的な維持によって、遺伝子変化を遂行することができる。
【００４０】
標的遺伝子の「ノック・アウト」または「ノックアウト」とは、例えば標的遺伝子発現が検出できないもしくは有意でない、かつ／または遺伝子産物が機能しないもしくは有意に機能的でないというような、標的遺伝子の機能の低下をもたらす、遺伝子の配列の変更を指す。例えば、LPS合成に関与する遺伝子の「ノックアウト」とは、該遺伝子の機能が実質的に低下しており、それによって、該遺伝子の発現が検出できないもしくは有意でないレベルでのみ存在している、かつ／または遺伝子産物の生物学的活性（例えば、酵素活性）が、改変前と比べて有意に低減しているかもしくは検出できないことを意味する。「ノック・アウト」は、例えば所定の一連の条件（例えば、温度、浸透圧、標的遺伝子の変更を促す物質への曝露など）へ曝露すると標的遺伝子の変更が起こり得る、条件付きノック・アウトを包含する。
【００４１】
本明細書において使用するとき、「単離された」という用語は、分子が天然に存在する状態とは異なる環境にある関心対象の分子（例えば、プロモーター）を記載することが企図される。ゆえに、例えば、「単離された」は、その天然の環境から単離され、かつ異種性ポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている天然に存在するプロモーターを包含する。「単離された」は、関心対象の化合物が部分的または実質的に精製されているサンプル内にある化合物、例えば単離された表面抗原タンパク質も含んでよい。
【００４２】
「富化された」とは、サンプル中の関心対象の化合物が実験者または臨床医による操作を受けており、それによって、抗原組成物が獲得された株におけるその抗原の濃度より、総重量で少なくとも3倍高い濃度で、通常は少なくとも5倍高い濃度で、より好ましくは少なくとも10倍高い濃度で、より通常には少なくとも100倍高い濃度でそれが存在していることを意味する。ゆえに、例えば、特定の抗原の濃度が1μg/gの総細菌調製物（または総細菌タンパク質）である場合、富化された調製物は、少なくとも3μg/gの総細菌調製物（または総細菌タンパク質）を含有するであろう。
【００４３】
本明細書において使用するとき、「実質的に精製された」という用語は、その天然の環境から取り出され、かつそれが天然に伴っている他の成分を少なくとも60％含まない、好ましくは75％含まない、および最も好ましくは90％含まない化合物（例えば、表面抗原）を指す。
【００４４】
ポリヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、または表面抗原をコードするポリヌクレオチド配列）の文脈において使用される場合、「天然の」という用語は、それらがナイセリア・メニンジティディス細菌において典型的に見出されるという理由で、天然に存在する配列（例えば、天然に存在するporAもしくはnadAプロモーター配列、または天然に存在するfHbpコード配列）を指す。
【００４５】
「ポリヌクレオチド配列（例えば、天然ナイセリアプロモーターに由来するポリヌクレオチド配列）の文脈における「に由来する」は、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド、例えば天然に存在するポリヌクレオチド配列に対して改変されている配列を有することを示すことが企図されるものであって、ポリヌクレオチドを作製する供給源または方法に関して限定することが企図されるものではない。別のポリヌクレオチド配列に由来するポリヌクレオチド配列は、例えば特異的核酸の多数の付加、欠失、または置換を含んでよい。
【００４６】
「ナイセリア・メニンジティディスによって引き起こされる疾患」という語句は、ナイセリア・メニンジティディス細菌による感染症に存在している任意の臨床症状または臨床症状の組み合わせを包含する。これらの症状には、ナイセリア・メニンジティディスの病原性株による上気道（例えば、鼻咽頭および扁桃腺の粘膜）のコロニー形成、粘膜および粘膜下層の血管床への細菌の侵入、敗血症、敗血症性ショック、炎症、出血性皮膚病変、線維素溶解および血液凝固の活性化、腎不全、肺不全、および心不全等の臓器機能障害、副腎出血および筋梗塞、毛細血管漏出、浮腫、末梢肢虚血、呼吸窮迫症候群、心膜炎、ならびに髄膜炎が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４７】
「対象において免疫応答を誘発する」という語句は、特定の抗原調製物の投与前および投与後に測定される免疫応答指標の間に検出可能な差異が存在することを意味する。免疫応答指標には、酵素結合免疫アッセイ（ELISA）、殺菌能アッセイ、フローサイトメトリー、免疫沈降、Ouchter-Lowny免疫拡散法；例えばスポットブロット、ウェスタンブロット、または抗原アレイの結合検出アッセイ；細胞毒性アッセイ等のアッセイによって検出される抗体の力価または特異性が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４８】
「表面抗原」とは、ナイセリア・メニンジティディスの表面構造（例えば、外膜、内膜、ペリプラズム空間、莢膜、線毛など）に存在している抗原である。
【００４９】
本明細書において使用される「血清群」または「莢膜群」とは、莢膜多糖類の免疫学的に検出可能なばらつきによる、ナイセリア・メニンジティディスの分類を指す。約12個の血清群：A、B、C、X、Y、Z、29-E、W-135、H、I、K、およびLが知られている。いずれの1つの血清群も、多数の血清型および多数の血清亜型を包含し得る。
【００５０】
本明細書において使用される「血清型」とは、モノクローナル抗体によって定義される外膜タンパク質ポリン（Porin）Bの抗原性の差異に基づく、ナイセリア・メニンジティディス株の分類を指す。1つの血清型が、多数の血清群および多数の血清亜型において見出され得る。
【００５１】
本明細書において使用される「血清亜型」とは、ポリンAと称される外膜タンパク質に関する抗体によって定義される抗原性のばらつきに基づく、またはDNAシークエンシングから推測されるアミノ酸配列のVR型判定（Sacchi et al., 2000, J. Infect. Dis. 182:1169；Multi Locus Sequence Typingウェブサイトも参照されたい）による、ナイセリア・メニンジティディス株の分類を指す。PorAタンパク質間のほとんどの変動は、8個の推定上の表面に露出したループのうちの2つ（ループIおよびIV）において生じる。可変ループIおよびIVは、それぞれVR1およびVR2と指定されている。1つの血清亜型が、多数の血清群および多数の血清型において見出され得る。
【００５２】
「一価ワクチン」とは、1種の株から調製された小胞ワクチンを指す。株は、変異株（すなわち、遺伝子改変された）または野生型株（天然に存在する）であってよい。そのようなワクチンを、他の免疫原性または抗原性成分と組み合わせて（例えば、1種または複数種の組換えタンパク質抗原と組み合わせて）、ワクチン組成物を提供し得る。
【００５３】
「二価ワクチン」とは、2種の異なる株から調製された小胞ワクチンを指す。2種の株は、変異株もしくは野生型株、または変異株と野生型株との組み合わせであってよい。そのようなワクチンを、他の免疫原性または抗原性成分と組み合わせて（例えば、1種または複数種の組換えタンパク質抗原と組み合わせて）、ワクチン組成物を提供し得る。
【００５４】
本明細書において使用される「対象」という用語は、ヒトまたはヒト以外の動物、例えばヒト、霊長類、家畜（domestic animal）および畜類（farm animal）、ならびにウマ、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯類などの動物園用、運動競技用、実験室用、またはペット用動物を含む哺乳類を指し得る。
【００５５】
詳細な説明
本開示は、概して、組換え宿主細胞において1種または複数種の関心対象の遺伝子産物（例えば、ポリペプチド、RNA）の一貫性のある高レベルの発現を促進する、操作されたポリヌクレオチド配列を提供する。そのような配列の使用、例えばワクチン産生における使用の方法も提供する。
【００５６】
下記により詳細に記載されるように、本開示のポリヌクレオチド配列のいくつかはプロモーターとして機能し、一方で他は転写ターミネーターとして機能する。本明細書において記載されるポリヌクレオチド配列を、1種または複数種の関心対象の遺伝子産物（例えば、ポリペプチド、RNA）をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド配列に機能的に連結させてよく、結果として生じる構築物を宿主細胞、例えばナイセリア・メニンジティディス細胞内に導入して、該1種または複数種の関心対象の遺伝子産物を高レベルに発現し得る組換え宿主を創出し得る。組換え宿主細胞において関心対象のタンパク質の発現を増大させるために、該関心対象のタンパク質をコードする本開示のポリヌクレオチド配列をコドン最適化してもよい。
【００５７】
操作されたプロモーター
本開示は、概して、宿主細胞、例えばナイセリア細胞、例えばN.メニンジティディス、N.ゴノレア（N. gonorrhoeae）もしくは関連するN.フラヴェセンス（N. flavescens）、N.ラクタミカ（N. lactamica）、N.ポリサッカレア（N. polysaccharea）、N.シネレア（N. cinerea）、N.ムコサ（N. mucosa）、N.サブフラバ（N. subflava）、N.シッカ（N. sicca）、N.エロンガータ（N. elongata）、またはヘモフィルス種（Haemophilus spp.）においてプロモーターとして作用し得る操作されたポリヌクレオチド配列を提供する。開示されるプロモーター配列は、宿主細胞において遺伝子産物（例えば、関心対象のタンパク質、例えば表面抗原）の高レベルの発現を促進する。操作されたプロモーターは、例えば、2種またはそれを上回る種類の異なる天然ナイセリアプロモーター（またはその変種）由来の配列を組み入れたキメラプロモーターであってよい。操作されたプロモーターは、例えば、プロモーターの1つまたは複数の機能的ドメインが欠失している（例えば、転写因子結合ドメインおよび／または塩基対伸長ドメインが欠失している）、天然ナイセリアプロモーターに由来するドメイン欠失プロモーターであってもよい。図3は、ナイセリア宿主株におけるプロモーターの出力の増大の促進に関して続いて試験される配列を同定するために利用されるストラテジーを表した略図を示している。
【００５８】
本開示の操作されたプロモーターは、それが機能的に連結された関心対象の遺伝子産物の発現を、その天然プロモーターからの該遺伝子産物の発現と比べて、約5％、約10％、約25％、約50％、約75％、またはそれを上回る割合で増大し得る。本開示の操作されたプロモーターは、関心対象の遺伝子産物の発現を、その天然プロモーターからの該遺伝子産物の発現と比べて、少なくとも約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約8倍、約10倍、または少なくとも約15倍増大し得る。
【００５９】
本開示の転写ターミネーターと組み合わせた場合、転写ターミネーターを伴う操作されたプロモーターは、関心対象の遺伝子産物の発現を、転写ターミネーターを伴わない操作されたプロモーターによって提供されるものを上回って、例えば転写ターミネーターを伴わない操作されたプロモーターと比べて少なくとも約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、またはそれを上回る割合で、さらに増大し得る。
【００６０】
キメラプロモーター
天然ナイセリアプロモーター配列（またはその変種）の組み合わせを含有する、本開示の操作されたプロモーターを、本明細書においてキメラプロモーターと呼ぶ。
【００６１】
概して、キメラプロモーターは、（1）連続ヌクレオチド配列ATGGTTを有する、天然porAプロモーターの5'部分（転写開始部位に対するその位置により、「−35領域」と呼ばれる）、（2）スペーサー部分、および（3）連続ヌクレオチド配列TATAATを有する、天然PorAプロモーターの3'部分（転写開始部位に対するその位置により、「−10領域」と呼ばれる）を含有する。図1Aおよび1Bは、天然NadAおよびPorAプロモーター配列の概略的表現を、それらの主要な配列特性とともに示している。
【００６２】
スペーサー部分は、概して、天然PorAおよび／またはNadAプロモーターに由来する10〜11個の連続ヌクレオチドの配列を含有する5'部分、TTTCA配列を有する5個の連続ヌクレオチド、ならびに天然PorAまたはNadAプロモーターに由来する1〜3個の連続ヌクレオチドの配列を含有する3'部分を含む。本明細書において使用するとき、「類似」という用語は、参照または供給源のプロモーターの、同じ地理的領域を起源とするキメラプロモーターの異種性部分を記載するために用いられる。例えば、NadAプロモーターの−35領域に隣接して位置する10個の連続ヌクレオチドの配列は、PorAプロモーターの−35領域に隣接して位置する10個の連続ヌクレオチドの配列に対して「類似」であろう。図4は、本開示のキメラプロモーターのうちのいくつかについての配列特性を示している。
【００６３】
本開示のキメラプロモーターのスペーサー部分は、概して、5'から3'に式：
N1-TTTCA-N2
の構造を有し、
式中、N1はTTTCAと連続しており、かつ式：
2014529407.tif 000011
のものであって、
式中、
Xaは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはTまたはAであり；かつ
Xbは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはAまたはCであり；
ならびにN2はTTTCAと連続しており、かつ式：
XcXdXe
のものであって、
式中、
Xcは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはTまたはGであり、
Xdは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはAまたはGであり、かつ
Xeは存在しているかまたは存在しておらず、存在している場合にはGである。
【００６４】
天然ナイセリアプロモーター（例えば、天然PorAプロモーター）の一部を別の天然ナイセリアプロモーター（例えば、天然NadAプロモーター）の類似部分で置き換えることによって、スペーサーの成分を選択した。いくつかの態様において、ヌクレオチドの置換、消失、または付加を含む、類似配列の変種を使用した。図5は、本開示のキメラプロモーターのアライメントを示している。
【００６５】
いくつかの態様において、スペーサー部分は、配列
2014529407.tif 000012
のものである。いくつかの態様において、スペーサー部分は、配列
2014529407.tif 000013
のものである。いくつかの態様において、スペーサー部分は、配列
2014529407.tif 000014
のものである。いくつかの態様において、スペーサー部分は、配列
2014529407.tif 000015
のものである。いくつかの態様において、スペーサー部分は、配列
2014529407.tif 000016
のものである。いくつかの態様において、スペーサー部分は、配列
2014529407.tif 000017
のものである。いくつかの態様において、スペーサー部分は、配列
2014529407.tif 000018
のものである。
【００６６】
本開示のキメラプロモーターは、関心対象の遺伝子産物の発現を、その天然プロモーターからの該遺伝子産物の発現レベルと比べて、少なくとも約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約50％、約75％、またはそれを上回る割合で増大し得る。本開示の操作されたプロモーターは、関心対象の遺伝子産物の発現を、その天然プロモーターからの該遺伝子産物の発現レベルと比べて、少なくとも2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約8倍、約10倍、約15倍、またはそれを上回る割合で増大し得る。
【００６７】
本開示の転写ターミネーターと組み合わせた場合、キメラプロモーターおよび転写ターミネーターは、関心対象の遺伝子産物の発現を、転写ターミネーターを含まないキメラプロモーターによって提供されるものを上回って、例えば転写ターミネーターを含まないキメラプロモーターと比べて少なくとも約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、またはそれを上回る割合で、さらに増大し得る。
【００６８】
ドメイン欠失プロモーター
天然プロモーターの1つまたは複数の機能的ドメインが欠失している、天然プロモーター配列に由来する本開示の操作されたプロモーターを、本明細書においてドメイン欠失プロモーターと呼ぶ。概して、本開示のドメイン欠失プロモーターは、天然ナイセリアプロモーターに由来する。いくつかの態様において、ドメイン欠失プロモーターは、天然ナイセリアnmb1523プロモーターに由来する。天然nmb1523プロモーターは、長さがおよそ580ヌクレオチドであり、ヌクレオチド105と369との間に位置する転写因子結合ドメインを有する。天然nmb1523プロモーターは、ヌクレオチド511と577との間に位置する66塩基対伸長ドメインも有する。図6は、本開示のいくつかのドメイン欠失プロモーターの概略的表現を示している。
【００６９】
ドメイン欠失プロモーターは、5'から3'に一般的式：
TFB-X-E-ATG
のものであって、式中、TFBは天然nmb1523プロモーターの転写因子結合配列を指し、Eは天然nmb1523プロモーターの66bp伸長配列を指し、かつXは、TFBが存在している場合にはEは存在しておらず、Eが存在している場合にはTFBは存在していないという条件で、天然nmb1523プロモーターのTFB配列とE配列との間に配置されるスペーサー配列であって、そのため、例えば5'から3'に以下の式：TFB-X-ATG、X-E-ATGのドメイン欠失プロモーターを提供する、スペーサー配列を指す。いくつかの態様において、TFBおよびEの両方が存在せず、そのため、式X-ATGを有するドメイン欠失プロモーターを提供する。
【００７０】
いくつかの態様において、ドメイン欠失プロモーターは、5'から3'に式TFB-X-ATGのものであり、そのため、該プロモーターが、転写因子結合ドメインを含有するが66塩基対伸長ドメインを欠いている、天然nmb1523プロモーター配列を含む。一例において、このドメイン欠失プロモーターの配列は、
2014529407.tif 000019
を含む。
【００７１】
他の態様において、ドメイン欠失プロモーターは、5'から3'に式X-E-ATGのものであり、そのため、該プロモーターが、66塩基対伸長ドメインを含有するが転写因子結合ドメインを欠いている、天然nmb1523プロモーター配列のヌクレオチド配列を含む。一例において、該ドメイン欠失プロモーターの配列は、
2014529407.tif 000020
を含む。
【００７２】
他の態様において、ドメイン欠失プロモーターは、5'から3'に式X-ATGのものであり、そのため、該プロモーターが、天然nmb1523プロモーターのスペーサー要素を含むが、転写因子結合ドメインおよび66塩基対伸長ドメインを欠いている。一例において、該ドメイン欠失プロモーターの配列は、
2014529407.tif 000021
を含む。
【００７３】
本開示のドメイン欠失プロモーターは、関心対象の遺伝子産物の発現を、その天然プロモーターからの該遺伝子産物の発現レベルと比べて、少なくとも約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約50％、約75％、またはそれを上回る割合で増大し得る。本開示のドメイン欠失プロモーターは、遺伝子産物の発現を、その天然プロモーターからの該遺伝子産物の発現レベルと比べて、少なくとも約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約8倍、約10倍、またはそれを上回る割合で増大し得る。
【００７４】
本開示の転写ターミネーターと組み合わせた場合、ドメイン欠失プロモーターおよび転写ターミネーターは、関心対象の遺伝子産物の発現を、転写ターミネーターを含まないドメイン欠失プロモーターによって提供されるものを上回って、例えば転写ターミネーターを含まないドメイン欠失プロモーターと比べて少なくとも約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、またはそれを上回る割合で、さらに増大し得る。
【００７５】
転写ターミネーター
本開示は、概して、宿主細胞、例えばナイセリア細胞において遺伝子産物の効率的な発現をさらに促進し得る、転写ターミネーターとして機能するポリヌクレオチド配列を提供する。理論に固執することなく、転写ターミネーター配列は、一般的に、DNA鋳型配列からRNAポリメラーゼを解離させ、ゆえに転写過程を終結させることによって機能する。
【００７６】
本開示は、概して、表面抗原をコードするポリヌクレオチド配列の3'末端に機能的に連結されて効率的な発現を促進し得る転写ターミネーター配列を提供する。いくつかの態様において、転写ターミネーター配列がプロモーター配列、コード配列、またはその両方に対して異種性である、転写ターミネーター配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する。他の態様において、転写ターミネーター配列は、天然においてコード配列の3'末端に機能的に接着しているのが見出される天然配列であってよい。転写ターミネーター配列は、天然表面抗原コード配列、例えばfHbpコード配列、とりわけ他のfHbpコード配列と比べて発現の増大を天然に呈する天然fHbpコード配列、の天然に存在する転写ターミネーターであってよい。
【００７７】
転写ターミネーターとして機能する本開示のポリヌクレオチド配列は、概して、以下の配列：
2014529407.tif 000022
と少なくとも約85％の配列同一性を有する。
【００７８】
いくつかの態様において、転写ターミネーター配列は、上記に開示される配列と最高約90％まで、最高約95％まで、または最高約98％までの配列同一性を有する。
【００７９】
図15に示されるように、表面抗原をコードするポリヌクレオチド配列の3'末端に機能的に連結された転写ターミネーター配列の存在は、組換え宿主において該表面抗原の発現の増大をもたらした。発現を増大させるための転写ターミネーター配列の使用は、実施例9においてさらに記載されている。
【００８０】
ポリヌクレオチド構築物
本開示のポリヌクレオチド配列を、本明細書において記載される方法における使用のための構築物、例えば発現構築物等の種々の形態で提供することができる。例には、非天然核酸配列を含む、環状、直鎖状、二本鎖、染色体外のDNA分子（プラスミド）、コスミド（λファージ由来のCOS配列を含有するプラスミド）、ウイルスゲノムなどが含まれる。「ベクター」とは、標的細胞に遺伝子配列を移入し得る任意の分子または作用物質である。典型的に、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子移入ベクター」とは、関心対象の遺伝子の発現を導き得、かつ標的細胞に遺伝子配列を移入し得る任意のポリヌクレオチド構築物を意味し、それは、ベクターの全体もしくは一部のゲノム組み込み、または染色体外要素としてのベクターの一過性のもしくは遺伝性の維持によって遂行され得る。ゆえに、該用語には、クローニング媒体および発現媒体、ならびに組み込みベクターが含まれる。
【００８１】
本開示の構築物には、例えば、1種または複数種の関心対象の遺伝子産物（例えば、ポリペプチドまたはmRNA）をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドに機能的に連結された操作されたプロモーターを含む発現構築物が含まれてよい。いくつかの態様において、発現構築物は、関心対象のコード配列の3'末端に機能的に連結された転写ターミネーター配列も含んでよい。「発現カセット」は、発現カセットのプロモーターに機能的に連結されている、1つまたは複数の関心対象のコード配列の発現を導き得る任意の核酸構築物を含む。そのようなカセットを「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、または「遺伝子移入ベクター」内に構築して、標的細胞内に発現カセットを移入することができる。ゆえに、該用語には、クローニング媒体および発現媒体、ならびにウイルスベクターが含まれる。
【００８２】
本開示の核酸構築物は、構築物の間または宿主のゲノム内への核酸配列の移入を促進し得る特異的ヌクレオチド配列（例えば、制限酵素認識配列または相同的組換え配列）も含んでよい。例えば、細胞のゲノムにおける所望の位置での相同的組換えによって、宿主細胞（例えば、ナイセリア細胞）のゲノム内への標的配列のゲノム挿入を促進する相同的組換え配列が、操作されたプロモーター（または操作されたプロモーターを含む発現構築物）に近接している構築物を提供し得る。
【００８３】
本開示は、概して、関心対象の遺伝子産物（例えば、関心対象のタンパク質、例えば、表面抗原（例えば、fHbp）等の関心対象の抗原）をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド配列に機能的に連結された本開示の操作されたプロモーターを含み得る発現構築物を提供する。いくつかの態様において、本開示の発現構築物は、関心対象の遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードするポリヌクレオチド配列の3'末端に機能的に連結されている転写ターミネーター配列も含んでよい。いくつかの態様において、本開示の発現構築物は、1種または複数種の関心対象の遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする複数のポリヌクレオチド配列を含有してよい。そのような態様において、関心対象の遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする（複数の）ポリヌクレオチド配列は、異なる関心対象の遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードしてよく、または同じ関心対象の遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードしてよい。
【００８４】
いくつかの態様において、本開示の発現構築物は、1つの操作されたプロモーター配列が1つの関心対象の遺伝子産物（例えば、タンパク質）の発現を推進するように、関心対象の遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている、操作されたプロモーター配列を含んでよい。
【００８５】
いくつかの態様において、本開示の発現構築物は、1つの操作されたプロモーター配列が1種または複数種の関心対象の遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする複数のポリヌクレオチド配列の発現を推進するように、1種または複数種の関心対象の遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする複数のポリヌクレオチド配列、例えば、関心対象の遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする2つもしくはそれを上回る、または3つもしくはそれを上回るポリヌクレオチド配列に機能的に連結されている、操作されたプロモーター配列を含んでよい。そのような態様において、関心対象の遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする（複数の）ポリヌクレオチド配列は、同じ遺伝子産物をコードしてよく、または異なる遺伝子産物をコードしてよい（例えば、異なる表面抗原をコードしてよい）。上記に記載されるように、いくつかの態様において、本開示の発現構築物は、関心対象の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列のうちの1つの3'末端に機能的に連結されている転写ターミネーター配列を含んでよい。本開示の発現構築物は、構築物の間または適切な宿主内へのポリヌクレオチド配列の移入を促進する制限酵素認識配列および／または相同的組換え配列も含有してよい。
【００８６】
組換え宿主
概して、本開示は、核酸構築物の複製および発現のための組換え宿主の使用に関与する。天然に存在する株および遺伝子改変された株を含むがそれらに限定されない、任意の種々の適切な宿主細胞（例えば、多様な適切なナイセリア株）を本開示の構築物および方法とともに用いてよい。
【００８７】
いくつかの態様において、複製宿主を用いて、本開示の核酸構築物を複製する。任意の適切な技術を用いて構築物を複製宿主内に導入し、次いで、該構築物の複製を促進する適当な条件下で宿主細胞を培養する。宿主細胞を十分な時間培養した後、細胞を溶解し、本開示の方法におけるさらなる使用のために、複製された核酸構築物を単離し精製する。
【００８８】
適切な複製宿主は当技術分野において周知であり、例えばDH5αコンピテント細胞、DH10B細胞、XL-1 Blue細胞、JM109細胞などを含む。
【００８９】
本開示のポリヌクレオチド配列の多様な組み合わせを用いることによって、任意の種々の適切な宿主細胞を発現宿主として用いて、関心対象の抗原を発現させ得る。いくつかの態様において、病原性のまたは片利共生的なヘモフィルス種もしくはナイセリア種、または病原性ナイセリア種に由来する株、とくにヒトに対して病原性の株またはヒトに対して病原性のもしくは片利共生的な株に由来する株を発現宿主として用いる。例示的なナイセリア種には、N.メニンジティディス、N.フラヴェセンス、N.ゴノレア、N.ラクタミカ、N.ポリサッカレア、N.シネレア、N.ムコサ、N.サブフラバ、N.シッカ、N.エロンガータなどが含まれる。細菌株の文脈における「に由来する」は、株が、親株のインビボでの継代を通してもしくはインビトロ培養において獲得されたこと、および／または株が、親株の改変によって獲得された組換え細胞であることを示すことが企図される。
【００９０】
異なる表面抗原と相互作用するポリクローナル抗体（Frasch, C. E. and Chapman, 1973, J. Infect. Dis. 127:149-154）またはモノクローナル抗体との反応に基づき、N.メニンジティディスを血清学的莢膜群（血清群とも称される）のPorB血清型とPorA血清亜型とに分けることができる。血清グループ化は、莢膜多糖類の免疫学的に検出可能なばらつきに基づく。約12個の血清群（A、B、C、X、Y、Z、29-E、およびW-135）が知られている。PorA血清亜型を、2つの可変領域（VR1およびVR2）のDNA配列の差異によって分類することもでき、VR型と呼ぶ（例えば、Russell et al. Emerging Infect Dis 2004 10:674-78；Sacchi CT, et al. Clin Diagn Lab Immunol 1998; 5:845-55；Sacchi et al, J. Infect Dis 2000;182: 1169-76を参照されたい）。
【００９１】
発現宿主として用いられる対象となるナイセリア株を、所望され得るいくつかの異なる特徴に従って選択することができる。例えば、所望の血清群、血清型、血清亜型など；莢膜多糖類産生の低下などに従って、株を選択してよい。
【００９２】
あるいはまたは加えて、適切な発現宿主は莢膜欠損株であってよい。莢膜欠損株を用いて（例えば、宿主細胞表面上のシアル酸と交差反応する抗体の産生により）、ワクチンを投与した対象において重大な自己抗体応答を誘発する危険性の低減を提供する小胞ベースのワクチンを産生することができる。本明細書において使用される「莢膜欠損の」または「莢膜多糖類が欠損した」とは、天然に存在する株よりも低い、または株が遺伝子改変された場合には、その莢膜欠損株が由来する親株よりも低い、細菌表面上の莢膜多糖類のレベルを指す。莢膜欠損株には、少なくとも10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％、またはそれを上回る割合で表面莢膜多糖類産生が低下している株が含まれ、かつ莢膜多糖類が細菌表面上で検出できない株（例えば、抗莢膜多糖類抗体を用いた全細胞ELISAによって）が含まれる。
【００９３】
莢膜欠損株には、天然に存在する莢膜欠損したものまたは組換えによって生成された遺伝子改変により莢膜欠損したものが含まれる。天然に存在する莢膜欠損株（例えば、Dolan-Livengood et al. J. Infect. Dis. (2003) 187(10):1616-28)を参照されたい）、ならびに莢膜欠損株を同定および／または生成する方法（例えば、Fisseha et al. (2005) Infect. Immun. 73(7):4070-4080；Stephens et al. (1991) Infect Immun 59(11):4097-102；Frosch et al. (1990) Mol Microbiol. 1990 4(7):1215-1218)を参照されたい）は、当技術分野において公知である。
【００９４】
莢膜多糖類の産生の低下を提供するナイセリア宿主細胞の改変には、改変によって、例えば改変前の親細胞と比べて莢膜多糖類レベルの低下がもたらされる、莢膜合成に関与する1種または複数種の遺伝子の改変が含まれてよい。そのような遺伝子改変には、株を莢膜欠損の状態にする、1種または複数種の莢膜生合成遺伝子におけるヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の変化（例えば、1種または複数種の莢膜生合成遺伝子における1個または複数個の挿入、欠失、置換などによる）が含まれてよい。莢膜欠損株は、1種または複数種の莢膜遺伝子を欠いていてよいまたはそれらに対して機能的でなくてよい。
【００９５】
シアル酸生合成を欠損している株を発現宿主として用いてもよい。そのような株は、ヒトシアル酸抗原と交差反応する抗シアル酸抗体を誘発する危険性の低減を有する小胞の産生を提供し得、かつ製造安全性の改善をさらに提供し得る。（天然に存在する改変または操作された改変により）シアル酸生合成の欠陥を有する株は、シアル酸生合成経路におけるいくつかの異なる遺伝子のうちのいずれかに欠陥があり得る。とくに関心対象となるのは、N-アセチルグルコサミン-6-ホスフェート2-エピメラーゼ遺伝子（synX AAF40537.1またはsiaA AAA20475として知られる）によってコードされる遺伝子産物に欠陥がある株、ならびに特別な関心対象である不活性化されたこの遺伝子を有する株である。例えば、一態様において、機能的なsynX遺伝子産物の産生を妨害することによって、莢膜欠損株を生成する（例えば、Swartley et al. (1994) J Bacteriol. 176(5):1530-4を参照されたい）。
【００９６】
非組換え技術を用いて、例えば、莢膜多糖類が低減している株を選択するための殺菌性抗莢膜抗体の使用によって、莢膜欠損株を天然に存在する株から生成することもできる。
【００９７】
2種またはそれを上回る種類の発現宿主の使用が伴う場合（例えば、異なる株から小胞の抗原性組成物を産生するために）、1つまたは複数の株の特徴が異なるように宿主を選択することができる。
【００９８】
組換えナイセリア株の増殖および維持に適した方法は、当技術分野において周知である。一般的に、細菌細胞は、適当な増殖培地（例えば、0.25％グルコース（w/v）および0.02mMシチジン 5'-モノホスホ-N-アセチルノイラミン酸（Sigma-Aldrich, St, Louis, MO, US）を添加したまたは添加しないMueller-Hintonブロス（BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, US）、正規のまたは改変したFrantz培地、最少培地、Catling培地など）中でおよそ35〜37℃にて増殖する。
【００９９】
操作されたプロモーターからの発現に適した遺伝子産物
本開示のポリヌクレオチド配列および方法は、概して、組換え宿主において任意の関心対象の遺伝子産物（例えば、関心対象のタンパク質、例えば関心対象の表面抗原）の一貫性のある高レベルの発現を促進する。本開示のプロモーター配列および／または転写ターミネーター配列を、任意の関心対象の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結させて、組換え宿主においてその発現を促進することができる。いくつかの態様において、本開示のポリヌクレオチドコード配列は、宿主生物における効率的な発現を促進するためにコード配列におけるコドンが最適化されている、翻訳的に最適化された配列を含む。この技術は、下記により詳細に記載されている。
【０１００】
以下は、本開示の組成物および方法によって企図される遺伝子産物の例である。以下の遺伝子産物の例は決して限定的なものではなく、当業者であれば、本開示の配列および方法を用いて、任意の関心対象の遺伝子産物を発現させ得ることを容易に理解するであろう。
【０１０１】
発現に適している関心対象の遺伝子産物には、天然に存在するポリペプチド（例えば、内在性ゲノム配列によってコードされるもの）、および組換えポリペプチドが宿主細胞に対して内在性または外因性アミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る組換えポリペプチドが含まれるが、必ずしもそれらに限定されるわけではない。ポリペプチドが外因性ポリペプチドである場合、該ポリペプチドは、宿主細胞に対して内在性でない天然に存在するポリペプチドのアミノ酸配列を有してよく、かつ／または天然に存在しないアミノ酸配列（例えば、天然において存在しないアミノ酸配列を有する人造のポリペプチド）を有してよい。ポリペプチドは、例えば分泌タンパク質、外膜タンパク質（例えば、表面抗原）、および細胞内タンパク質を含むが、それらに限定されない種々のクラスのいずれかであってよい。関心対象の遺伝子産物には、RNAが宿主細胞に対して内在性または外因性のいずれであってもよい、タンパク質コードRNAおよびタンパク質非コードRNAも含まれる。
【０１０２】
本開示のポリヌクレオチドおよび方法は、例えば組換え宿主においてワクチン産生を促進するなど、本明細書において提供されるような遺伝子産物の発現を促進することにおける用途を見出す。下記に実施例においてより詳細に明示されるように、ナイセリア外膜タンパク質、ならびにそれらの変種および亜変種を含むがそれらに限定されない多様な遺伝子産物は、当技術分野において周知であり、かつ本開示の配列および方法に関連した用途を見出す。
【０１０３】
fHbp
文献においてGNA1870、ORF2086、rLP-2086、および「741」としても知られるH因子結合タンパク質（fHbp）は、ナイセリア・メニンジティディス表面抗原である。図2は、2種の異なるナイセリア株におけるfHbp遺伝子の上流および下流に位置する遺伝子の概略図を示している。本明細書において使用される「fHbpポリペプチド」は、天然に存在するfHbpポリペプチドとヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれより高い割合の配列同一性を共有し、かつナイセリア・メニンジティディス細菌上に存在している天然に存在するfHbpポリペプチドに特異的に結合する抗体を誘発し得る、天然に存在するポリペプチドおよび合成の（天然に存在しない）ポリペプチドを包含する。「fHbpポリペプチド」は、融合タンパク質、例えばN末端および／またはC末端において異種性ポリペプチドを有するfHbpポリペプチドも包含する。
【０１０４】
本開示における使用のためのfHbpポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において公知である。適切なfHbpポリペプチドは、例えばWO 2004/048404；Masignani et al. 2003 J Exp Med 197:789-799；Fletcher et al. Infect Immun 2004 2088-2100；Welsch et al. J Immunol 2004 172:5606-5615；およびWO 99/57280に記載されている。fHbpの変種および亜変種に対する核酸（およびアミノ酸配列）は、アクセッション番号：NC_003112、GeneID：904318（NCBI参照番号NP_274866）（N.メニンジティディス株MC58由来）；AY548371（AAT01290.1）（N.メニンジティディス株CU385由来）；AY548370（AAT01289.1）（N.メニンジティディス株H44/76由来）；AY548377（AAS56920.1）（N.メニンジティディス株M4105由来）；AY548376（AAS56919.1）（N.株M1390由来）；AY548375（AAS56918.1）（N.メニンジティディス株N98/254由来）；AY548374（AAS56917.1）（N.メニンジティディス株M6190由来）；AY548373（AAS56916.1）（N.メニンジティディス株4243由来）；およびAY548372（AAS56915.1）（N.メニンジティディス株BZ83由来）としてGenBankにおいても提供されている。
【０１０５】
本開示において有用なfHbpポリペプチドには、天然に存在するfHbpポリペプチドとはアミノ酸配列が異なるが、ナイセリア宿主の膜に存在しており、それによって、該宿主から調製された小胞が、関心対象のエピトープ、好ましくは殺菌性エピトープの提示を提供しかつ抗fHbp抗体応答を提供する形態でfHbpを含有する、天然に存在しない（人工のまたは変異体）fHbpポリペプチドが含まれる。一態様において、fHbpポリペプチドは、変種1（v.1）または変種2（v.2）または変種3（v.3）fHbpポリペプチド、ならびにv.1の亜変種を含む、関心対象であるv.1、v.2、およびv.3の亜変種である（例えば、Welsch et al. J Immunol 2004 172:5606-5615を参照されたい）。亜変種は、ウェブサイト：pubmlst.org/neisseria/fHbp/で指定されたペプチドアレルまたは識別番号（ID）によって定義される。一態様において、fHbpポリペプチドは、ワクチン接種される対象となる集団に固有の株間で最も普及しているfHbpポリペプチドのアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
本開示において有用なfHbpポリペプチドには、融合タンパク質が、そのN末端またはC末端において融合パートナーを有するfHbpポリペプチドを含む、融合タンパク質も含まれる。関心対象の融合パートナーには、例えばグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、Hisタグなど、ならびに他のタンパク質、とくにリポタンパク質由来のリーダーペプチドが含まれる（例えば、N末端のシステインの前のアミノ酸配列は、対象となる別のリーダーペプチドで置き換えられてよい）。
【０１０７】
公知のfHbpポリペプチドとのアミノ酸配列類似性に基づいてfHbpポリペプチドを同定し得る、当技術分野において周知の技術を用いることによって、他のfHbpポリペプチドコード核酸を同定することができる。そのようなfHbpポリペプチドは、一般的に、ヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれより高い割合の配列同一性を共有する。核酸またはアミノ酸配列のアライメントおよび比較のための方法を用いることによって、配列同一性を判定することができ、その方法は当技術分野において周知である。より長い配列の比較は、2つの配列の最適なアライメントを達成する、より洗練された方法を必要とし得る。比較ウィンドウを整列するための配列の最適なアライメントは、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所アライメントアルゴリズムによって、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444の類似性の検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる履行（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）によって、または検査によって実施されてよく、多様な方法によって生成された最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最高のパーセンテージの配列類似性をもたらす）が選択される。
【０１０８】
PorA
PorAは、別のナイセリア・メニンジティディス表面抗原である。本明細書において使用される「PorAポリペプチド」は、天然に存在するPorAポリペプチドとヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれより高い割合の配列同一性を共有し、かつナイセリア・メニンジティディス細菌上に存在している天然に存在するPorAポリペプチドに特異的に結合する抗体を誘発し得る、天然に存在するポリペプチドおよび合成の（天然に存在しない）ポリペプチドを包含する。「PorAポリペプチド」は、融合タンパク質、例えばN末端および／またはC末端において異種性ポリペプチドを有するPorAポリペプチドも包含する。
【０１０９】
本開示における使用のためのPorAポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において公知である。適切なPorAポリペプチドには、P1.7,16；P1.19,15；P1.7,1；P1.5,2；P1.22a,14；P1.14；P1.5,10；P1.7,4；P1.12,13の血清亜型を与えるもの；ならびに血清亜型判定に用いられる従来の血清学的試薬との反応性を保持し得るまたは保持し得ない、そのようなPorAポリペプチドの変種が含まれる。
【０１１０】
PorAの可変領域（VR）型判定に従って特徴付けされたPorAも関心対象となる（例えば、Russell et al. Emerging Infect Dis 2004 10:674-678；Sacchi CT, et al, Clin Diagn Lab Immunol 1998;5:845-55；Sacchi et al, J. Infect Dis 2000;182:1169-1176を参照されたい）。VR1およびVR2ファミリー「プロトタイプ」に分類され得る、相当数の別個のVR型が同定されている。この命名法および以前の型判定スキームとのその関係性を記載したウェブアクセス可能なデータベースは、neisseria.org/nm/typing/porAに見出される。例示的なPorA VR1およびVR2型のアライメントは、Russell et al. Emerging Infect Dis 2004 10:674-678において提供されている。
【０１１１】
PorA血清亜型によって特徴付けされる例示的なPorAポリペプチドには、
2014529407.tif 000023
が含まれる。
【０１１２】
例示的なPorAポリペプチドのアミノ酸配列は、GenBankアクセッション番号
2014529407.tif 000024
で見出される。
【０１１３】
NspA
NspAは、別のナイセリア・メニンジティディス表面抗原である。本明細書において使用される「NspAポリペプチド」は、天然に存在するNspAポリペプチドとヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれより高い割合の配列同一性を共有し、かつナイセリア・メニンジティディス細菌上に存在している天然に存在するNspAポリペプチドに特異的に結合する抗体を誘発し得る、天然に存在するポリペプチドおよび合成の（天然に存在しない）ポリペプチドを包含する。「NspAポリペプチド」は、融合タンパク質、例えばN末端および／またはC末端において異種性ポリペプチドを有するNspAポリペプチドも包含する。
【０１１４】
本開示における使用のためのNspAポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において公知である。適切なNspAポリペプチドは、例えばMartin et al., J Exp Med, Apr. 7, 1997, 185(7)に記載されている。
【０１１５】
NspAの変種および亜変種に対する核酸（およびアミノ酸配列）は、アクセッション番号：U52069、GQ293900.1、AF175678.1、AF175683.1、AF175682.1、AF175681.1、AF175680.1、AF175679.1、AF175677.1、AF175676.1としてGenBankにおいても提供されている。
【０１１６】
TbpB
TbpBは、ナイセリア表面抗原である。本明細書において使用される「TbpBポリペプチド」は、天然に存在するTbpBポリペプチドとヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれより高い割合の配列同一性を共有し、かつナイセリア・メニンジティディス細菌上に存在している天然に存在するTbpBポリペプチドに特異的に結合する抗体を誘発し得る、天然に存在するポリペプチドおよび合成の（天然に存在しない）ポリペプチドを包含する。「TbpBポリペプチド」は、融合タンパク質、例えばN末端および／またはC末端において異種性ポリペプチドを有するTbpBポリペプチドも包含する。
【０１１７】
本開示における使用のためのTbpBポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において公知である。適切なTbpBポリペプチドは、例えばRokbi, B. et al., "Heterogeneity of tbpB, the transferrinbinding protein B gene, among serogroup B Neisseria meningitidis strains of the ET-5 complex," Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 4(5):522-529 (1997)に記載されている。
【０１１８】
TbpBの変種および亜変種に対する核酸（およびアミノ酸配列）は、アクセッション番号：DQ355978.1、AJ704760.1、AJ704759.1、AJ704758.1、AJ704757.1、AJ704756.1、AJ704755.1、AJ704754.1、AJ704753.1、AJ704752.1、AJ704751.1としてGenBankにおいても提供されている。
【０１１９】
TbpA
TbpAは、ナイセリア表面抗原である。本明細書において使用される「TbpAポリペプチド」は、天然に存在するTbpAポリペプチドとヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれより高い割合の配列同一性を共有し、かつナイセリア細菌上に存在している天然に存在するTbpAポリペプチドに特異的に結合する抗体を誘発し得る、天然に存在するポリペプチドおよび合成の（天然に存在しない）ポリペプチドを包含する。「TbpAポリペプチド」は、融合タンパク質、例えばN末端および／またはC末端において異種性ポリペプチドを有するTbpAポリペプチドも包含する。
【０１２０】
本開示における使用のためのTbpAポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において公知である。適切なTbpAポリペプチドは、例えばJ. Med Microbiol. 1998 Sep; 47(9):757-60に記載されている。
【０１２１】
TbpAの変種および亜変種に対する核酸（およびアミノ酸配列）は、アクセッション：EU339282.1 GI:166863281、アクセッション：M96731.1 GI:150360、アクセッション：AF240638.1 GI:9719359、アクセッション：AF241227.1 GI:9719361、アクセッション：AF124338.1 GI:8439550、アクセッション：X94533.1 GI:2764816、アクセッション：X99615.1 GI:2764959、アクセッション：X99614.1 GI:2764957、アクセッション：X99613.1 GI:2764956、アクセッション：X99612.1 GI:2764955、アクセッション：X99611.1 GI:2764954、アクセッション：X99610.1 GI:2764952としてGenBankにおいても提供されている。
【０１２２】
LbpA
LbpAは、ナイセリア表面抗原である。本明細書において使用される「LbpAポリペプチド」は、天然に存在するLbpAポリペプチドとヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれより高い割合の配列同一性を共有し、かつナイセリア細菌上に存在している天然に存在するLbpAポリペプチドに特異的に結合する抗体を誘発し得る、天然に存在するポリペプチドおよび合成の（天然に存在しない）ポリペプチドを包含する。「LbpAポリペプチド」は、融合タンパク質、例えばN末端および／またはC末端において異種性ポリペプチドを有するLbpAポリペプチドも包含する。
【０１２３】
本開示における使用のためのLbpAポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において公知である。適切なLbpAポリペプチドは、例えばVaccine (2006) Vol.24 Issue 17, pp. 3545-57に記載されている。
【０１２４】
LbpAの変種および亜変種に対する核酸（およびアミノ酸配列）は、アクセッション：DQ058017.1 GI:68359439、アクセッション：U16260.1 GI:915277、アクセッション：AF049349.1 GI:3582727、アクセッション：DQ058018.1 GI:68359441、アクセッション：X79838.1 GI:509053としてGenBankにおいても提供されている。
【０１２５】
LbpB
LbpBは、ナイセリア表面抗原である。本明細書において使用される「LbpBポリペプチド」は、天然に存在するLbpBポリペプチドとヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれより高い割合の配列同一性を共有し、かつナイセリア細菌上に存在している天然に存在するLbpBポリペプチドに特異的に結合する抗体を誘発し得る、天然に存在するポリペプチドおよび合成の（天然に存在しない）ポリペプチドを包含する。「LbpBポリペプチド」は、融合タンパク質、例えばN末端および／またはC末端において異種性ポリペプチドを有するLbpBポリペプチドも包含する。
【０１２６】
本開示における使用のためのLbpBポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において公知である。適切なLbpBポリペプチドは、例えばVaccine (2006) Vol.24 Issue 17, pp. 3545-57に記載されている。
【０１２７】
LbpBの変種および亜変種に対する核酸（およびアミノ酸配列）は、アクセッション：AF123382.1 GI:4884690、アクセッション：AF072890.1 GI:4106392、アクセッション：AF031432.1 GI:3213214、アクセッション：AF022781.1 GI:2843172、アクセッション：AF123380.1 GI:4884686、アクセッション：AF123383.1 GI:4884692、アクセッション：AF123381.1 GI:4884688としてGenBankにおいても提供されている。
【０１２８】
GNA2132
GNA2132は、ナイセリア表面抗原である。本明細書において使用される「GNA2132ポリペプチド」は、天然に存在するGNA2132ポリペプチドとヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれより高い割合の配列同一性を共有し、かつナイセリア細菌上に存在している天然に存在するGNA2132ポリペプチドに特異的に結合する抗体を誘発し得る、天然に存在するポリペプチドおよび合成の（天然に存在しない）ポリペプチドを包含する。「GNA2132ポリペプチド」は、融合タンパク質、例えばN末端および／またはC末端において異種性ポリペプチドを有するGNA2132ポリペプチドも包含する。
【０１２９】
本開示における使用のためのGNA2132ポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において公知である。適切なGNA2132ポリペプチドは、例えばProc Natl Acad Sci U.S.A. 2010 Feb. 23;107(8):3770-5に記載されている。
【０１３０】
GNA2132の変種および亜変種に対する核酸（およびアミノ酸配列）は、アクセッション：FJ750981.1 GI:224830211、アクセッション：AY315195.1 GI:32455020、アクセッション：AY315194.1 GI:32455018、アクセッション：AY315193.1 GI:32455016、アクセッション：AY315192.1 GI:32455014、アクセッション：GQ302857.1 GI:254547346、アクセッション：AY315196.1 GI:32455022、アクセッション：AF226448.1 GI:7228725、アクセッション：AF226447.1 GI:7228723、アクセッション：AF226446.1 GI:7228721、アクセッション：AF226445.1 GI:7228719、アクセッション：FN908855.1 GI:308814886、アクセッション：FN908854.1 GI:308814884、アクセッション：FJ615459.1 GI:222107907、アクセッション：FJ615446.1 GI:222107881としてGenBankにおいても提供されている。
【０１３１】
NadA
NadAは、ナイセリア表面抗原である。本明細書において使用される「NadAポリペプチド」は、天然に存在するNadAポリペプチドとヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、またはそれより高い割合の配列同一性を共有し、かつナイセリア細菌上に存在している天然に存在するNadAポリペプチドに特異的に結合する抗体を誘発し得る、天然に存在するポリペプチドおよび合成の（天然に存在しない）ポリペプチドを包含する。「NadAポリペプチド」は、融合タンパク質、例えばN末端および／またはC末端において異種性ポリペプチドを有するNadAポリペプチドも包含する。
【０１３２】
本開示における使用のためのNadAポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において公知である。適切なNadAポリペプチドは、例えばInfection and Immunity, July 2004, Vol. 72, No. 7, pp. 4217-23に記載されている。
【０１３３】
NadAの変種および亜変種に対する核酸（およびアミノ酸配列）は：アクセッション：FJ750979.1 GI:224830207、アクセッション：DQ239933.1 GI:83616362、アクセッション：DQ239932.1 GI:83616360、アクセッション：DQ239931.1 GI:83616359、アクセッション：DQ239930.1 GI:83616357、アクセッション：DQ239929.1 GI:83616355、アクセッション：DQ239928.1 GI:83616354、アクセッション：DQ239927.1 GI:83616353、アクセッション：DQ239926.1 GI:83616351、アクセッション：FJ619647.1 GI:222159590としてGenBankにおいても提供されている。
【０１３４】
関心対象の遺伝子産物のさらなる例
本開示の配列および方法による用途を見出す遺伝子産物の他の例には、以下が含まれる：
オパシティ（Opacity）外膜タンパク質（例えば、Hobbs et al., Microbiology 144: 157-66 (1998)を参照されたい）、Genbankアクセッション番号：U03412.1、U37255.1、U37256.1、U37257.1、AF016292.1、AF016285.1、AF001204.1、AF001203.1；
FetA（例えば、Biegel et al, J. Bacteriology 181(9):2895-901 (1999)を参照されたい）、Genbankアクセッション番号：JN182195.1 GI:343174597、EF157665.1 GI:120971583、EF153764.1 GI:120971579、EF153762.1 GI:120971576；
MafB、MspA、App、Opa、Opc、NhhA、MafA-1、MafA2、NalP、Mip、NMB1483、HmbR（例えば、Echenique-Rivera et al., PLoS Pathog 7(5):1-18 (2011)を参照されたい）。
【０１３５】
前述の遺伝子産物は、本開示の範囲を限定することを意図するものでは決してなく、本明細書において開示されるポリヌクレオチド配列および方法を用いて発現し得る抗原の例としての役割を果たすにすぎない。
【０１３６】
コドン最適化
関心対象の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列は、天然に存在する配列、ならびにコドン最適化された配列を包含する。発現のために選択された宿主生物の公知のコドン選好性に基づき、天然に存在する配列をコドン最適化して、発現レベルの増大をさらに促進し得る。例えば、表面抗原（例えば、fHbp）をコードする公知のポリヌクレオチド配列を変更して、宿主生物に選好されないそれらのコドンを、同じアミノ酸残基をコードするが宿主生物に選好される縮重コドン（redundant codon）で置き換え、それにより宿主生物におけるコード配列のより効率的な発現を促進し得る。
【０１３７】
コドン最適化を促進する種々のコンピューターアルゴリズムは、インターネットを介して公的に入手可能である。例えば、Puigb P., Guzman E., Romeu A., and Garcia- Vallv S., OPTIMIZER: A web server for optimizing the codon usage of DNA sequences. Nucleic Acids Research, 35:W126-W131 (2007)を参照されたい。一般的に、ユーザーはそのようなアルゴリズムに、遺伝子産物をコードする公知のポリヌクレオチド配列を入力する。配列がいったん提供されると、ユーザーは任意の所望のコドン使用量選好性（例えば、選出された発現宿主における各アミノ酸残基に対して最も高頻度に使用されるコドン）を指定してよく、次いでコンピューターアルゴリズムによって、コドン最適化された配列がユーザーに提供される。例えば、図16および17は、それぞれナイセリア・メニンジティディスFAM18およびZ2491株における各アミノ酸残基に対する千分の平均コドン使用量を提供する表を示している。既定の発現宿主に対して平均コドン使用量がいったん判定されると、同じアミノ酸残基をコードするが発現宿主によってより高頻度に利用されるコドン、すなわち、同じアミノ酸残基をコードするがより高い平均使用量値を有するコドンで縮重コドンを置き換えることによって、関心対象の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列を操作することができる。図18は、同じ遺伝子産物に対してコドン最適化された配列と比較した、天然fHbp ID 9のヌクレオチド配列を示した配列比較である。コドン最適化された配列において、より選好されないコドンは、より高頻度に利用される縮重コドンで置き換えられている。コドン最適化は、実施例10においてさらに記載されている。
【０１３８】
作製方法
化学的突然変異誘発、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、1個または複数個の部位特異的突然変異誘発などを含む突然変異誘発技術を含むがそれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の手段によって、本開示のポリヌクレオチド配列を生成してよい。当技術分野において公知の試薬および技術を用いることによって、ポリヌクレオチド配列を化学的に合成してもよい。PCR、クローニングなどを含むがそれらに限定されない、当技術分野において公知の技術を用いることによって、本開示に従った発現構築物を生成してよい。本発明の実践は、当技術分野において周知である従来の分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の技術の使用を伴ってよい。そのような技術は、文献、例えばSambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989)；DNA Cloning, Volumes IおよびII (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed, 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.)；Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)において十分に説明されている。
【０１３９】
概して、本開示のポリヌクレオチド配列を、本開示の方法における使用にとって適切なベクターまたは発現構築物内にクローニングしてよい。いくつかの態様において、操作されたプロモーター配列を、転写ターミネーター配列に機能的に連結されている、表面抗原をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結する。結果として生じた配列（プロモーター配列、表面抗原コード配列、および転写ターミネーター配列を含む）を、次いでPCRによってまたは制限酵素を用いて単離し、適切なベクターまたは構築物内にクローニングしてよい。いくつかの態様において、構築物は、例えば相同的組換えによって宿主のゲノム内に標的配列を導入するために用いられ得るポリヌクレオチド配列を含有してよい。
【０１４０】
使用方法
概して、本開示は、組換え宿主生物において1種または複数種の関心対象の遺伝子産物、例えば1種または複数種の関心対象のタンパク質、例えば1種または複数種の関心対象の表面抗原を高レベルに発現させる方法を提供する。方法は、選択された組換え宿主生物、例えばナイセリア・メニンジティディス細菌において関心対象の遺伝子産物（例えば、タンパク質）の高レベルの発現を促進するような形で、本開示のポリヌクレオチド配列を組み合わせる工程を伴う。本開示の方法は、表面抗原の一貫性のある高レベルの発現が望ましい、例えばワクチンの産生における用途を見出す。
【０１４１】
上記に記載されるように、本開示のポリヌクレオチド配列のうちのいくつかは、宿主生物においてプロモーターとして機能する。いくつかの天然に存在するプロモーター配列とは異なり、本プロモーターは、それらが機能的に連結されている1つまたは複数の遺伝子産物コードポリヌクレオチド配列の可変的な発現を引き起こさず、その代わりに一貫性のある高レベルの発現を提供する。本開示の他のポリヌクレオチド配列は、効率的な転写、およびそれによりそれらが機能的に連結されている遺伝子産物コード配列の発現の増進を促進する転写ターミネーターとして機能する。本開示のポリヌクレオチド配列の多様な組み合わせを用いて、組換え宿主において1種または複数種の関心対象の遺伝子産物（例えば、表面抗原）の高レベルの発現を促進し得る。加えて、本開示は、発現のために選出された組換え生物のコドン選好性に基づき、発現される対象となるタンパク質、例えば表面抗原をコードするポリヌクレオチド配列のコドン最適化を提供する。本開示の方法は、選択された組換え宿主生物において1種または複数種の関心対象の遺伝子産物の一貫性のある高レベルの発現を促進するような多様な形で、これらのポリヌクレオチド配列を組み合わせる工程を伴う。
【０１４２】
内在性宿主配列の上流へのプロモーターの導入
いくつかの態様において、本開示の方法は、天然遺伝子、例えば天然表面抗原遺伝子の上流で（例えば、5'方向に）、適切な宿主生物、例えばナイセリア宿主細胞のゲノム内に、本開示のポリヌクレオチドプロモーター配列を挿入する工程を伴う。次いで、該天然遺伝子の発現を促進する条件下で、組換え宿主細胞を培養する。N.メニンジティディスが宿主生物として選出される態様においては、次いで、宿主細胞によって産生された小胞を単離することができ、そして対象に投与して該対象における免疫応答を誘導し得るワクチン組成物を調製するために用いることができる。
【０１４３】
例えば、いくつかの態様において、天然fHbp遺伝子の上流でナイセリア株のゲノム内にキメラプロモーター（例えば、X1〜X7）またはドメイン欠失プロモーター（例えば、S1〜S3）を挿入する。操作されたプロモーター配列の導入によって、fHbp遺伝子の高レベルの発現が促進される。
【０１４４】
発現構築物の導入
いくつかの態様において、本開示の方法は、関心対象の遺伝子産物、例えば関心対象のタンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド配列に機能的に連結された操作されたプロモーターを含む発現構築物を、宿主生物のゲノム内に挿入する工程を伴う。いくつかの態様において、転写ターミネーター配列を、関心対象の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列の3'末端に機能的に連結させる。例えば、いくつかの態様において、fHbpをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結され、かつ上記に記載される配列を有する転写ターミネーターに機能的に連結された、キメラプロモーター（例えば、X1〜X7）またはドメイン欠失プロモーター（例えば、S1〜S3）を含む発現構築物を、ナイセリア宿主細胞のゲノムの適切な領域（例えば、lpxL1遺伝子座）内に挿入する。
【０１４５】
いくつかの態様において、1種または複数種の宿主遺伝子の発現を妨害する位置で、発現構築物を宿主のゲノム内に挿入してよい。例えば、いくつかの態様において、内毒素（リポ多糖、LPS）の産生を促進する遺伝子の発現を妨害する位置で、発現構築物を宿主のゲノム内に挿入してよい。結果として生じる組換え宿主は、低減した内毒素を有するワクチンの産生に有用であり得る内毒素ノックアウト宿主である。
【０１４６】
いくつかの態様において、第一の操作されたプロモーター配列を、天然遺伝子、例えば天然表面抗原遺伝子の上流で宿主細胞のゲノム内に挿入し、かつ関心対象の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第二の操作されたプロモーター配列を含む発現構築物を、該宿主細胞のゲノム内の適切な位置（例えば、lpxL1遺伝子座）で宿主細胞のゲノム内に挿入する。
【０１４７】
いくつかの態様において、第一および第二のプロモーター配列は同じであり、一方で他の態様において、第一および第二のプロモーター配列は異なる。例えば、いくつかの態様において、キメラプロモーターX1を、天然fHbp遺伝子の上流でナイセリア細胞のゲノム内に挿入し、fHbpをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたキメラプロモーターX1を含む発現構築物を、宿主ナイセリア細胞のlpxL1遺伝子座内に挿入する。他の態様において、キメラプロモーターX1を、天然fHbp遺伝子の上流でナイセリア株のゲノム内に挿入し、fHbpをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたドメイン欠失プロモーターS1を含む発現構築物を、宿主ナイセリア細胞のlpxL1遺伝子座内に挿入する。
【０１４８】
天然遺伝子、例えば天然表面抗原遺伝子の上流への操作されたプロモーターの導入は、該遺伝子の発現の増大をもたらし、一方で宿主ゲノム内の別の位置での、操作されたプロモーターによって推進される該遺伝子の第二のコピーの導入は、発現の増大をなおさらに促進し得る。いくつかの態様において、1種または複数種の関心対象の遺伝子産物（例えば、1種または複数種の関心対象のタンパク質）をコードする1種または複数種のポリヌクレオチド配列を含むさらなる発現構築物を、宿主細胞ゲノム内に同様に挿入してよい。いくつかの態様において、操作されたプロモーターによって推進される関心対象の遺伝子産物（例えば、関心対象の表面抗原）の第三、第四、または第五のコピーの導入は、該関心対象の遺伝子産物の発現をなおさらに増大させる。
【０１４９】
いくつかの態様において、いくつかの異なる関心対象の遺伝子産物を、同じ宿主細胞で発現させてよい。例えば、いくつかの態様において、操作されたプロモーターを、第一の天然表面抗原遺伝子（例えば、fHbp）の上流に挿入し、同じまたは異なる操作されたプロモーター配列によって推進される異なる表面抗原遺伝子（例えば、NspA）を含む1種または複数種の発現構築物も、宿主細胞のゲノム内に挿入する。結果として生じる宿主細胞は、2種またはそれを上回る種類の異なる表面抗原を発現し、ワクチンの産生に有用であり得る。
【０１５０】
ナイセリア宿主細胞内に遺伝物質を導入するためのベクターおよび方法
本開示の核酸構築物による宿主細胞の遺伝子改変を提供するために容易に適応し得る方法および組成物は、当技術分野において公知である。例示的なベクターおよび方法は、例えばWO 02/09746およびO'Dwyer et al. Infect Immun 2004;72:6511-80において提供されている。
【０１５１】
宿主細胞内への遺伝物質の移入のための方法には、例えば接合、形質転換、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法などが含まれる。一般的に、移入のための方法は、導入された構築物の安定的発現を提供しなければならない。構築物は、遺伝性のエピソーム性要素（例えば、プラスミド）として提供されてよく、またはゲノムに組み込まれてよい。
【０１５２】
適切なベクターは、どんな種類の組換え事象が実施される予定であるかに依存して組成が変わる。組み込み型ベクターは、条件付きで複製するものであってよく、あるいは自殺プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、または制限加水分解もしくはPCR増幅によって得られる線状DNAフラグメントであってよい。抗生物質（例えば、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、またはゲンタマイシン）に対する耐性を与える遺伝子、重金属および／もしくは有毒化合物に対する耐性を与える遺伝子、または栄養要求性突然変異を補完する遺伝子（例えば、pur、leu、met、aro）等の選択可能な遺伝子マーカーの使用によって、組換え事象の選択を遂行することができる。
【０１５３】
ワクチン産生
本開示によって企図される抗原性組成物は、概して、表面抗原を発現するナイセリア細胞から調製された小胞を含む。本明細書において言及されるとき、「小胞」は、外膜小胞ならびに微小胞（ブレブとも呼ばれる）を包含することが企図される。
【０１５４】
ワクチンの産生における使用のための抗原性組成物は、表面抗原、例えばfHbpを発現するように遺伝子改変されたナイセリア・メニンジティディス種の培養株の外膜から調製された外膜小胞（OMV）を含有してよい。好ましくは、培養培地から細菌細胞を分離することによって（例えば、濾過によってまたは細胞をペレットにする低速遠心分離によって、など）、細胞を溶解することによって（例えば、界面活性剤の添加、浸透圧ショック、超音波処理、キャビテーション、ホモジナイゼーションなどによって）、および細胞質分子から外膜画分を分離することによって（例えば、濾過によって；または外膜および／もしくは外膜小胞の差異的沈降もしくは凝集によって、または外膜分子を特異的に認識するリガンドを用いたアフィニティー分離法によって；または外膜および／もしくは外膜小胞をペレットにする高速遠心分離によって、など）、ブロスまたは固形培地培養中のナイセリア・メニンジティディスからOMVを獲得してよく；外膜画分を用いてOMVを産生してよい。
【０１５５】
抗原性組成物は、表面抗原を発現するように遺伝子改変されたナイセリア・メニンジティディス株の培養の間に微小胞（MV）またはブレブが放出される、表面抗原を含有するMV（または「ブレブ」）を含有してよい。例えば、ブロス培養培地中でナイセリア・メニンジティディスの株を培養することによって、ブロス培養培地から全細胞を分離することによって（例えば、濾過によって、または細胞のみをペレットにし、より小さなブレブをペレットにしない低速遠心分離によって、など）、および無細胞培養培地中に存在しているMVを次いで回収することによって（例えば、濾過、MVの差異的沈降もしくは凝集によって、またはブレブをペレットにする高速遠心分離によって、など）、MVを獲得してよい。MVの産生における使用のための株を、培養液中に産生されるブレブの量に基づいて一般的に選択することができる（例えば、本明細書において記載される方法における単離および投与に適したブレブの産生を提供するのに妥当な数で細菌を培養してよい）。高レベルのブレブを産生する例示的な株は、PCT公開公報WO 01/34642に記載されている。ブレブ産生に加えて、より高レベルの特異的表面抗原を産生する株がとくに関心対象となり得る場合（例えば、異なるNspA産生レベルを有するN.メニンジティディス株、例えばMoe et al. (1999 Infect. Immun. 67: 5664)を参照されたい）、MV産生における使用のための株を、他の表面抗原の産生に基づいて選択してもよい。ブレブの産生における使用のための他の関心対象の株には、細胞分離、膜構造、および毒性に必要とされるリポタンパク質をコードする、不活性化されたGNA33遺伝子を有する株が含まれる（例えば、Adu-Bobie et al. (2004) Infect Immun 2:1914-1919を参照されたい）。
【０１５６】
本開示の抗原性組成物は、株が互いに同種性または異種性であり得る、通常は異種性であり得る、1種の株由来の、または2種、3種、4種、5種、もしくはそれを上回る種類の株由来の小胞を含有してよい。例えば、株は、porAおよび／またはfHbp等の特定の表面抗原に関して同種性または異種性であってよい。異なる変種（v.1、v.2、またはv.3）または亜変種（例えば、v.1、v.2、またはv.3の亜変種）由来のfHbpアミノ酸配列から構成され得る特異的表面抗原の1種を上回る変種または亜変種（例えば、fHbpの1種、2種、3種、またはそれを上回る種類の変種）を発現する株から、小胞を調製することができる。
【０１５７】
抗原性組成物は、同じまたは異なる表面抗原を提示するOMVおよびMVの混合物であって、該表面抗原は、変種および／または亜変種の異なる組み合わせ由来のエピトープを任意で提示し得、かつ該OMVおよび／またはMVは、同じまたは異なる株由来のものであり得る、混合物を含んでよい。異なる株由来の小胞を、混合物として投与することができ、または連続して投与することができる。
【０１５８】
所望の場合（例えば、小胞を産生するために用いられる株が、内毒素またはとくに高レベルの内毒素を伴う場合）には、小胞を任意で処理して、内毒素を低減させる、例えば投与後の毒性を低減させることができる。潜在的にあまり望ましくはないが、適切な界面活性剤（例えば、0.1〜10％、好ましくは0.5〜2％の濃度の、BRIJ-96、デオキシコール酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、Empigen BB、Triton X-100、TWEEN 20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、TWEEN 80、およびSDS）による抽出によって、内毒素の低減を遂行することができる。界面活性剤抽出を用いる場合、デオキシコレート以外の界面活性剤を用いることが好ましい。
【０１５９】
抗原性組成物の小胞を、界面活性剤なしで、例えばデオキシコレートなしで調製することができる。界面活性剤処理は内毒素活性を除去するのに有用であるが、それは調製中に表面抗原タンパク質にマイナスの影響を及ぼし得る。ゆえに、界面活性剤を必要としない技術を用いて、内毒素活性を低下させることがとくに望ましいかもしれない。一手法において、内毒素（リポ多糖、LPS）の比較的低い産生体である株を用いて、ヒトにおける使用前に最終調製物から内毒素を除去する必要性を回避する。例えば、ワクチンにおいて望ましくない可能性があるリポオリゴ糖または他の抗原（例えば、Rmp）が低減しているかまたは排除されているナイセリア変異体から、小胞を調製することができる。
【０１６０】
リピドAの低下したまたは検出できない毒性活性をもたらす遺伝子改変を含有するN.メニンジティディス株から、小胞を調製することができる。例えば、そのような株は、リピドA生合成において遺伝子改変されていてよい（Steeghs et al. (1999) Infect Immun 67:4988-93；van der Ley et al. (2001) Infect Immun 69:5981-90；Steeghs et al. (2004) J Endotoxin Res 10:113-9；Fissha et al, (2005) Infect Immun 73:4070）。lpxL1またはlpxL2によってそれぞれコードされる酵素の下方調節および／または不活性化等のLPSの改変によって、免疫原性組成物を無毒化し得る。lpxL1変異体においてなされるペンタアシル化リピドAの産生は、lpxL1によってコードされる酵素が、GlcN IIの2'配置においてN結合型3-OH C14にC12を付加することを示す。lpxL2変異体に見出される主要なリピドA種はテトラアシル化されており、lpxL2によってコードされる酵素が、すなわち、GlcN Iの2配置においてN結合型3-OH C14に他のC12を付加することを示す。これらの遺伝子の発現の低下（もしくは発現なし）（またはこれらの遺伝子の産物の活性の低下もしくは活性なし）をもたらす変異は、リピドAの毒性活性の変更をもたらす（van der Ley et al. (2001) Infect Immun 69:5981-90）。テトラアシル化された（lpxL2変異体）およびペンタアシル化された（lpxL1変異体）リピドAは、野生型リピドAよりも毒性が低い。リピドA 4'-キナーゼコード遺伝子（lpxK）における変異も、リピドAの毒性活性を低下させる。小胞（例えば、MVまたはOMV）の産生における使用のためにとくに関心対象となるのは、低下したまたは検出できない機能的lpxL1コードタンパク質を提供するように遺伝子改変されたN.メニンジティディス株であり、例えばナイセリア細菌（例えば、N.メニンジティディス株）が、lpxL1遺伝子の遺伝子産物の活性低下または活性なしを提供するように遺伝子改変されている。例えば、lpxL1遺伝子ノックアウトを有するようにナイセリア細菌を遺伝子改変することができ、例えばそこではlpxL1遺伝子が妨害されている。例えば、米国特許公報第2009/0035328号を参照されたい。lpxL1遺伝子および／またはlpxL2遺伝子の遺伝子産物の活性低下または活性なしを提供するように、ナイセリア細菌を遺伝子改変することができる。そのような小胞は、LPS産生に関して野生型であるN.メニンジティディス株と比較して低減した毒性を提供し、一方で表面抗原、例えばfHbpの免疫原性を保持する。
【０１６１】
ポリミキシンB耐性（そのような耐性は、リピドAの4'ホスフェート上でのアミノアラビノースの付加と相関している）に関与する遺伝子／遺伝子座に変異を導入することによっても、LPS毒性活性を変更することができる。これらの遺伝子／遺伝子座は、UDP-グルコースデヒドロゲナーゼをコードするpmrE、またはアミノアラビノースの合成および移入に関与し得る、多くの腸内細菌科に共通した抗菌性ペプチド耐性遺伝子の領域であり得る。この領域に存在しているpmrF遺伝子は、ドリコール（dolicol）-ホスフェート・マンノシル（manosyl）トランスフェラーゼをコードする（Gunn J. S., Kheng, B. L., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S. I. 1998. Mol. Microbiol. 27:1171-1182）。
【０１６２】
ホスホリレー2成分調節システム（例えば、PhoP構成的表現型、PhoPc）であるPhoP-PhoQ調節システムにおける変異、または（PhoP-PhoQ調節システムを活性化する）低Mg++環境条件もしくは培養条件は、4'ホスフェート上でのアミノアラビノースの付加およびミリステートを置き換えた2-ヒドロキシミリステート（ミリステートのヒドロキシル化）につながる。この改変されたリピドAは、ヒト内皮細胞によるE-セレクチン発現およびヒト単球からのTNF分泌を刺激し得る能力の低減を呈する。
【０１６３】
ポリミキシンB耐性株も、そのような株は低減したLPS毒性を有することが示されているため、使用に適している（例えば、Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conference. The Guildhall, Winchester, Englandにおけるvan der Ley et al. (1994)を参照されたい）。あるいは、ポリミキシンBの結合活性を模倣する合成ペプチドを抗原性組成物に添加して、LPS毒性活性を低減させ得る（例えば、Rustici et al. (1993) Science 259:361-365；Porro et al. (1998) Prog Clin Biol Res.397:315-25を参照されたい）。
【０１６４】
培養条件の選択によっても、内毒素を低減させることができる。例えば、培地1Lあたり0.1mg〜100mgのアミノアラビノースを含有する増殖培地中で株を培養することによって、脂質毒性の低減が提供される（例えば、WO 02/097646を参照されたい）。
【０１６５】
キット
本明細書において開示されるポリヌクレオチド配列を用いて、上記に記載される方法を実践するためのキットも本開示によって提供される。キットは、さらなる発現構築物および／または組換えナイセリア・メニンジティディス株の産生において用いられる対象となるベクターまたは発現構築物の形態で、本開示の1種または複数種のポリヌクレオチド配列を含有してよい。キットは、ベクターまたは発現構築物の形態で、ナイセリア・メニンジティディス宿主株において発現される対象となる抗原をコードする1種または複数種のポリヌクレオチド配列も含有してよい。キットは、本明細書において開示される操作されたプロモーター配列のうちの1種もしくは複数種、ならびに／または抗原および／もしくは転写ターミネーター配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む、1種または複数種の組換えナイセリア・メニンジティディス株をさらに含んでよい。
【０１６６】
上述の成分に加えて、キットは、該キットの成分を用いて対象方法を実践するための指示書をさらに含んでよい。対象方法を実践するための指示書は、一般的に適切な記録媒体に記録されている。例えば、指示書は紙またはプラスチック等の基板上に印刷されていてよい。そのため、指示書は、添付文書（package insert）としてキット中に、キットまたはその成分の容器の表示（すなわち、梱包または従属梱包（subpackaging）に付随した）などに存在してよい。他の態様において、指示書は、コンピューターが読み取り可能な適切な記憶媒体、例えばCD-ROM、ディスケットなどに存在している電子記憶データとして存在している。さらに他の態様において、実際の指示書はキット中に存在していないが、遠隔ソースから、例えばインターネットを介して指示書を得るための手段を提供する。この態様の例は、指示書を閲覧することができる、かつ／またはそこから指示書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。指示書と同様に、指示書を得るためのこの手段は、適切な基板上に記録されている。
【実施例】
【０１６７】
以下の実施例は、本発明の作製法および使用法についての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであって、本発明者らが彼らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではなく、またそれらは、下記の実験がすべてであるまたは実施された唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。用いられた数（例えば、量、温度など）に関する正確性を確保するための努力はなされているが、いくらかの実験上の誤差および偏差は考慮されるべきである。そうでないことが示されない限り、部分は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度におけるものであり、かつ圧力は大気圧下または大気圧付近におけるものである。標準的な略語、例えばbp、塩基対；kb、キロベース；pl、ピコリットル；sまたはsec、秒；min、分；hまたはhr、時間；aa、アミノ酸；nt、ヌクレオチドなどを用いてよい。
【０１６８】
方法および材料
下記の実施例において、以下の方法および材料を用いた。
【０１６９】
細菌株
以下に続く実施例において用いられた6種のN.メニンジティディス株を表1に一覧にする。
【０１７０】
（表１）以下の実施例において用いられたN.メニンジティディス株
2014529407.tif 000025
【０１７１】
ウェスタンブロットによるfHbp発現の測定
わずかな変化を有して、以前に報告された（Pajon, Vaccine 2010 Feb 25;28(9):2122-9）ように実施される定量的ウェスタンブロットによって、fHbp発現を測定した。変種群1におけるfHbp配列に対して、fHbp配列変種ID 1、4、または9の検出には抗fHbp mAb JAR 3を用い、ID 74にはJAR 5を用いた。変種群2または3におけるfHbpに対して、抗fHbp mAb JAR 31を用いた（Beernink, Infect Immun. 2008 Sep;76(9):4232-40）。それぞれfHbp変種1（ID 1）および2（ID 77）の高発現を有する、対応する参照株H44/76または8047由来の細菌細胞によって発現されたfHbpの量のパーセンテージとして、試験株についての結果を報告した。
【０１７２】
フローサイトメトリー
生きたメニンゴコッカスへのマウス抗fHbp mAbの結合を測定して、対照と比べて増大したまたは低下したfHbpを有するように操作された変異体において、抗体に接近可能な、細菌表面上のfHbpの相対量を査定した。それぞれ10μg/mLの最終濃度で2種のマウス抗fHbp mAbのJAR4およびJAR5の組み合わせを用いて、以前に記載されたようにフローサイトメトリーを実施した（Welsch, J Infect Dis. 2008 Apr 1;197(7):1053-61）。アッセイにおける対照には、群A（JW-A1）または群B（SEAM 12）多糖類に特異的なマウスmAb（Moe, Mol Immunol. 2006 Mar;43(9):1424-31）が含まれた。
【０１７３】
実施例1：fHbp ID 5を発現する血清群A株である同系変異体のCH21Aのシリーズにおける、操作されたプロモーターによって推進された高いfHbpレベル
fHbp ID 5を発現する血清群A株であるナイセリア・メニンジティディス株CH21Aを用いて、本開示の操作されたプロモーターが発現を推進し得る能力を試験した。キメラプロモーターおよびドメイン欠失プロモーターをfHbp遺伝子の上流でCH21A宿主株のゲノム内に機能的に挿入し、それに続くfHbpの発現を定量的ウェスタンブロットによって測定した。結果を図7に示す。パネルAにおける値は、fHbp ID 1（変種群1）の比較的高い発現体である参照群B株H44/76によるfHbpの発現と比較したパーセンテージである。エラーバーは、2つの独立した実験において測定された値の範囲を表す。対照株には、野生型親株、および不活性化されたfHbp遺伝子を有する変異体であり、かついかなるfHbpタンパク質も産生しないfHbp KO；WT、天然に低いfHbp ID 5産生体であるCH21A野生型単離体；X1、X5〜X7、キメラプロモーター；SLおよびS1〜S3、ドメイン欠失プロモーター；pFP12-f、高レベルのfHbpを発現するナイセリア内で複製するが、プラスミド不安定性が理由でワクチン産生に適さないプラスミド構築物、が含まれる。X1プロモーターは、プラスミドベースのシステムpFP12-fから見られるものと同程度のレベルまでfHbp発現を推進し得る。パネルBは、KO（薄い灰色）、WT（破線）、およびX1（実線）株に対するfHbpに特異的なモノクローナル抗体（4μg/mLの総濃度でのJAR4およびJAR5混合物）を用いたフローサイトメトリーのデータを示している。パネルCは、莢膜群A多糖類を認識する抗莢膜モノクローナル抗体JW-A1についてのフローサイトメトリーのデータを示している。データは、fHbp KO変異体がわずかにより高い莢膜含有量を有するように見えるが、試験したすべての株間の莢膜多糖類に対する同程度の発現レベルを示している。
【０１７４】
実施例2：fHbp遺伝子の第二のコピーの挿入は、単一コピー株または野生型株と比較して、CH21AにおいてfHbpレベルを増強させる
ナイセリア・メニンジティディス株CH21Aにおいて、fHbp遺伝子の上流にキメラプロモーターX1を機能的に挿入した。加えて、fHbp遺伝子のコピーに機能的に連結されたキメラプロモーターX1またはドメイン欠失プロモーターS1を含む発現構築物を、宿主株のlpxL1遺伝子座内に挿入して、fHbp遺伝子の第二のコピーを提供した。それに続くfHbpの発現を定量的ウェスタンブロットによって測定した。結果を図8に示す。値は、fHbp ID 1（変種群1）の比較的高い発現体である参照群B株H44/76によるfHbpの発現と比較した平均パーセンテージである。エラーバーは、2つの独立した実験において測定された値の範囲を表す。KO、fHbp遺伝子が不活性化されており、該タンパク質を発現しなかった変異体；WT、天然に低いfHbp ID 5産生体である野生型単離体；X1、キメラプロモーター；X1-S1、fHbp天然遺伝子座においてX1-fHbp、およびlpxL1遺伝子座内に挿入されたS1-fHbp遺伝子カセットの形態でfHbp遺伝子の第二のコピーを含有する変異体；X1-X1、fHbp天然遺伝子座においてX1-fHbp、およびlpxL1遺伝子座内に挿入されたX1-fHbp遺伝子カセットの第二のコピーを含有する変異体。lpxL1遺伝子座内への第二のコピーの挿入は、内毒素活性の減衰ももたらした。これらのデータは、関心対象の操作されたプロモーター−遺伝子の多コピーによって、ゲノム内での位置にかかわらず発現レベルの増大が推進され得ることを示す。
【０１７５】
実施例3：キメラプロモーターによって推進される高いfHbpレベル
fHbp ID 9を発現する血清群W-135株であるナイセリア・メニンジティディス株CH38Wを用いて、本開示のキメラプロモーターが発現を推進し得る能力を試験した。キメラプロモーターX1〜X4をfHbp遺伝子の上流でCH38W宿主株のゲノム内に機能的に挿入し、それに続くfHbpの発現を定量的ウェスタンブロットによって測定した。結果を図9に示す。値は、fHbp ID 1（変種群1）の比較的高い発現体である参照群B株H44/76によるfHbpの発現と比較した平均パーセンテージ（2つの実験からの＋/−範囲）である。KO、抗生物質マーカーの挿入（株を、いかなる検出可能なfHbpタンパク質も産生し得ない状態にする）によってfHbp遺伝子が不活性化された変異体；WT、fHbp ID 9の天然に低い産生体であるCH38W野生型単離体；X1〜X4、キメラプロモーター。これらのプロモーターを用いた発現レベルは、天然porAプロモーター（X0）によって達成されるものと同程度またはそれより高かった。パネルBは、KO（薄い灰色）、WT（破線）、およびX1（実線）株に対するfHbpに特異的なモノクローナル抗体（4ug/mLでのJAR4およびJAR5混合物）を用いて収集されたフローサイトメトリーのデータを示している。パネルCは、莢膜群W135多糖類を認識する抗莢膜モノクローナル抗体JW-W1を用いて収集されたフローサイトメトリーのデータを示している。
【０１７６】
実施例4：天然のfHbp部位における操作されたプロモーターの挿入に加えて、lpxL1遺伝子座内への、操作されたプロモーターによって推進されるfHbp遺伝子の第二のコピーの挿入
ナイセリア・メニンジティディス株CH38Wにおいて、fHbp遺伝子の上流にキメラプロモーターX1を機能的に挿入した。加えて、fHbp遺伝子のコピーに機能的に連結されたキメラプロモーターX1またはドメイン欠失プロモーターS1を含む発現構築物を、宿主株のlpxL1遺伝子座内に挿入して、fHbp遺伝子の第二のコピーを提供した。それに続くfHbpの発現を定量的ウェスタンブロットによって測定した。結果を図10に示す。KO、不活性化されたfHbp遺伝子（およびfHbpタンパク質発現なし）を有する変異体；WT、天然に低いfHbp ID 5産生体である野生型単離体；X1、天然fHbpプロモーターをX1プロモーターで置換することによって構築された同系変異体；X1-lpxL1、不活性化された天然fHbp遺伝子、およびlpxL1遺伝子座内に挿入されたX1-fHbp発現構築物のコピーを有する変異体；X1-S1、fHbp天然遺伝子座においてX1-fHbp、およびlpxL1遺伝子座内に挿入されたS1-fHbp遺伝子カセットの形態でfHbp遺伝子の第二のコピーを含有する変異体；X1-X1、fHbp天然遺伝子座においてX1-fHbp、およびlpxL1遺伝子座内に挿入されたX1-fHbp遺伝子カセットの第二のコピーを含有する変異体。値は、fHbp ID 1（変種群1）の比較的高い発現体である参照群B株H44/76によるfHbpの発現と比較した平均パーセンテージ（反復実験における＋/−範囲）である。
【０１７７】
実施例5：CH248B莢膜群B株によるfHbpモデル抗原の過剰産生
莢膜群B株であるナイセリア・メニンジティディス株CH248Bを用いて、本開示のキメラプロモーターが発現を推進し得る能力を試験した。この株はH44/76とも呼ばれる。キメラプロモーターX1をfHbp遺伝子の上流でCH248B宿主株のゲノム内に機能的に挿入し、それに続くfHbpの発現を定量的ウェスタンブロットによって測定した。結果を図11に示す。これは参照群B株でありかつfHbp ID 1（変種群1）の比較的高い発現体であるため、値は、fHbp単独の発現と比較した平均パーセンテージ（反復実験における＋/−範囲）である。KO、fHbp遺伝子およびタンパク質を欠いている変異体；WT、天然に高いfHbp ID 1産生体である野生型単離体；X1、天然fHbpプロモーターをX1プロモーターで置換することによって構築された同系変異体；pFP12-f、高レベルのfHbp ID 1を発現するナイセリア内で複製するが、プラスミド不安定性が理由でワクチン産生に適さないプラスミド構築物を含有する株。パネルBは、KO（薄い灰色）、WT（破線）、X1（実線）、およびpFP12-f（点線）株に対するfHbpに特異的なモノクローナル抗体（4ug/mLでのJAR4およびJAR5混合物）を用いて収集されたフローサイトメトリーのデータを示している。X1キメラプロモーターは、プラスミドベースのシステムpFP12-fと同程度のレベルまで表面fHbp発現レベルを推進し得た。パネルCは、莢膜群B多糖類を認識する抗莢膜モノクローナル抗体SEAM-12を用いて収集されたフローサイトメトリーのデータを示している。
【０１７８】
実施例6：CH253B莢膜群B株におけるfHbpモデル抗原の過剰産生
fHbp ID 14を発現する莢膜群B株であるナイセリア・メニンジティディス株CH253Bを用いて、キメラプロモーターX1が発現を推進し得る能力を試験した。キメラプロモーターX1をfHbp遺伝子の上流でCH253B宿主株（NZ98/254としても知られる）のゲノム内に機能的に挿入し、それに続くfHbpの発現を定量的ウェスタンブロットによって測定した。結果を図12に示す。値は、fHbp ID 1（変種群1）の比較的高い発現体である参照群B株H44/76によるfHbpの発現と比較した平均パーセンテージ（反復実験における＋/−範囲）である。KO、fHbp遺伝子およびタンパク質を欠いている変異体；WT、天然に低いfHbp ID 14産生体である野生型単離体；X1、天然fHbpプロモーターをX1プロモーターで置換することによって構築された同系変異体。キメラプロモーターX1は、野生型単離体と比較して、fHbpの有意により高い発現を達成した。
【０１７９】
実施例7：CH164X莢膜群X株によるfHbpモデル抗原の過剰産生
fHbp ID 74を発現する莢膜群X株であるナイセリア・メニンジティディス株CH164Xを用いて、キメラプロモーターX1が発現を推進し得る能力を試験した。キメラプロモーターX1をfHbp遺伝子の上流でCH164X宿主株のゲノム内に機能的に挿入し、それに続くfHbpの発現を定量的ウェスタンブロットによって測定した。結果を図13に示す。KO、fHbp遺伝子およびタンパク質を欠いている変異体；WT、天然に低いfHbp ID 74産生体である野生型単離体；X1、天然fHbpプロモーターをX1プロモーターで置換することによって構築された同系変異体。キメラプロモーターX1は、野生型単離体と比較して、fHbpの有意により高い発現を達成した。
【０１８０】
実施例8：CH36W莢膜群W135株によるfHbp変種2モデル抗原の過剰産生
fHbp ID 23（変種2）を発現する莢膜群W135株であるナイセリア・メニンジティディス株CH36Wを用いて、キメラプロモーターX1が発現を推進し得る能力を試験した。キメラプロモーターX1をfHbp ID 23遺伝子の上流でCH36W宿主株のゲノム内に機能的に挿入し、それに続くfHbpの発現を定量的ウェスタンブロットによって測定した。結果を図14に示す。パネルAは、CH36W変異体における発現レベルについての定量的ウェスタンブロットのデータを示している。値は、fHbp ID 77（変種群2）の比較的高い発現体である参照群B株8047によるfHbpの発現と比較した平均パーセンテージ（2回の複写実験における＋/−範囲）である。KO、fHbp遺伝子が不活性化されており、該タンパク質を発現しない変異体；WT、天然に低いfHbp ID 23産生体である野生型単離体；X1、キメラプロモーター。パネルBは、KO（薄い灰色）、WT（破線）、およびX1（実線）株に対するfHbpに特異的なモノクローナル抗体（4ug/mLでのJAR31）を用いて収集されたフローサイトメトリーのデータを示している。パネルCは、莢膜群W135多糖類を認識する抗莢膜モノクローナル抗体JW-W1を用いて収集されたフローサイトメトリーのデータを示している。まとめると、データは、変種群2 fHbpの発現の増大を推進し得る操作されたプロモーターの能力を例証している。
【０１８１】
実施例9：発現を増大させるための転写ターミネーター配列の使用
莢膜群A株であるナイセリア・メニンジティディス株CH21Aを用いて、fHbp ID 5の発現レベルに対する転写ターミネーター配列の影響を評価した。X1プロモーター配列を、fHbp ID 5をコードする配列の上流でCH21A株のゲノム内に機能的に挿入した。第一の組換え宿主において、配列
2014529407.tif 000026
を有する天然転写ターミネーターを、fHbp ID 5コード配列の3'末端に機能的に連結させた。第二の組換え宿主においては、天然転写ターミネーター配列を欠失させた。次いで、両方の組換え宿主を同じ条件下で培養し、fHbp ID 5の発現レベルを2種の宿主間で比較した。結果を図15に示す。fHbp ID 5の発現レベルは、転写ターミネーター配列を含有する宿主においてより高く、該転写ターミネーター配列がより高い発現を促進することを示した。
【０１８２】
実施例10：コドン最適化における使用のためのコドン使用頻度の判定
2種の異なるナイセリア・メニンジティディス株であるFAM18およびZ2491において、コドン使用頻度を判定した。2種の株についてのコドン使用量の平均および標準偏差の結果を図16および17に示す。各アミノ酸残基に対して、最も高い平均使用量値を有するコドンを判定した。次に、コドン使用量の結果に基づき、fHbp ID 9をコードするポリヌクレオチド配列を各株における発現のために操作した。fHbp ID 9コード配列をオンラインのコドン最適化ツールにアップロードし、各株に対するコドン使用量選好性が提供された。オンラインのコドン最適化ツールによって、コード配列における縮重コドンは、各アミノ酸残基に対して選好されるコドンで置き換えられた。元のfHbp配列とコドン最適化された配列との比較を図18に示す。
【０１８３】
fHbp ID 23、ID 4、ID 28、ID 1、ID 14、ID 45、ID 55、ID 19、ID 77、NspA（nmb0663）、NspA（nmc0612、nma0862）、NHbp（nmb2132）、TbpB（Tbp2、nmb0461）、TbpA（tbp1、nmb0461）、LbpB（nmb1541）、LbpA（nmb1540）、オパシティタンパク質（クラス5、nmb1053）、NadA（nmb1994）、PorA（nmb1429）、およびfeta（nmb1988）をコードするポリヌクレオチド配列に対してもコドン最適化を実施した。コドン最適化された配列を図19〜38に示す。
【０１８４】
実施例11：多数の表面抗原の発現を推進するための操作された単一プロモーター配列の使用
操作されたプロモーター配列を用いて、オペロン様の形式で編成されている、表面抗原をコードする多数のポリヌクレオチドの発現を推進した。図39、パネルA。これにより、単一コピーの操作されたプロモーターの制御下で、多数の表面抗原の過剰発現が可能となった。操作されたプロモーターの高い出力により、該システムを用いて、複数のポリヌクレオチドを同時に発現させることができる。試験した表面抗原コードポリヌクレオチド配列の構成の例は、図39、パネルBおよびCに提供されており、NspA（パネルB）と一緒に、ならびにTbpBおよびTbpAの両方（パネルC）と一緒に、fHbpを過剰発現させる。
【０１８５】
この手法をさらに例証するために、fHbp ID 9およびNspAを両方とも低いレベルで発現する莢膜W-135株であるナイセリア・メニンジティディス株CH38Wにおいて、操作されたプロモーターX1をfHbpコードポリヌクレオチド配列の上流に機能的に挿入した。NspAコードポリヌクレオチド配列を、fHbpコード配列のすぐ下流に機能的に挿入した。fHbp由来の転写ターミネーター配列を、NspAコードポリヌクレオチド配列の3'末端に機能的に連結させた。それに続くfHbpおよびNspAの両方の発現を、該抗原のそれぞれに特異的なモノクローナル抗体を用いた定量的ウェスタンブロットによって測定した。図40は、操作されたX1プロモーター（図39、パネルB）の制御下にfHbpコードポリヌクレオチド配列およびNspAコードポリヌクレオチド配列の両方を含有するCH38W変異株における、発現レベルについての定量的ウェスタンブロットのデータを示している。示される値は、野生型（WT）単離体におけるfHbpまたはNspAのいずれかの発現と比較した平均蛍光単位（2回の反復における＋/−範囲）である。変異体におけるfHbpおよびNspAの両方の発現レベルともに、WT株よりも有意に高い。これらのデータは、操作された単一プロモーターによって、多数のポリヌクレオチド配列の発現が高いレベルまで推進され得ることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年5月29日(2014.5.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014529407.tif 000078