(57)【要約】本発明は、ヒトフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント、ｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するための方法を含む、それらの製造方法及び使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される重鎖可変領域配列と、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示される軽鎖可変領域配列と、を含む、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７で示される重鎖配列と、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８で示される軽鎖配列と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３】
（ａ）マウス抗体ＮＭＣ−４の重鎖及び軽鎖可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及び２）に存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する重鎖及び軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）ヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する重鎖フレームワーク領域及び／又はヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する軽鎖フレームワーク領域と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４】
ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）からなる群から選択される１以上の重鎖ＣＤＲと、ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）からなる群から選択される１以上の軽鎖ＣＤＲと、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項５】
重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及び／又は軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項６】
請求項４又は５において、ヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域からの重鎖フレームワーク領域及び／又はヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からの軽鎖フレームワーク領域をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項７】
請求項６において、前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項８】
請求項６において、前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項９】
請求項６において、前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１０】
請求項６において、前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１１】
請求項４又は５において、Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、Ｈ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１２】
請求項４又は５において、Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１３】
請求項４又は５において、Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、Ｈ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）からなる群から選択される重鎖可変領域と、Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）からなる群から選択される軽鎖可変領域と、を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１４】
請求項５において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のフレームワーク領域と少なくとも８０％同一であるフレームワーク領域を含む重鎖可変領域配列及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のフレームワーク領域と少なくとも８０％同一であるフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域配列を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１５】
請求項５において、ヒト抗体ファミリーＶＨ４のフレームワーク領域に対応する重鎖フレームワーク領域と、ヒト抗体ファミリーＶＫ１のフレームワーク領域に対応する軽鎖フレームワーク領域と、をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１６】
請求項５において、ヒト抗体重鎖生殖系列配列４−５９に存在する重鎖フレームワーク領域に対応し、ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１）である重鎖フレームワーク領域１、ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２）である重鎖フレームワーク領域２及びＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３）である重鎖フレームワーク領域３と、ヒト抗体軽鎖生殖系列配列０１８に存在するフレームワーク領域に対応し、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６）である軽鎖フレームワーク領域１、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７）である軽鎖フレームワーク領域２及びＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８）である軽鎖フレームワーク領域３と、をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１７】
請求項５において、ヒト抗体重鎖生殖系列配列４−３４に存在する重鎖フレームワーク領域に対応し、ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５）である重鎖フレームワーク領域１、ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６）である重鎖フレームワーク領域２及びＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７）である重鎖フレームワーク領域３と、ヒト抗体軽鎖生殖系列配列０１８に存在するフレームワーク領域に対応し、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６）である軽鎖フレームワーク領域１、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７）である軽鎖フレームワーク領域２及びＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８）である軽鎖フレームワーク領域３と、をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項において、１０ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でｖＷＦに結合する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項において、１００ｎＭ以下の親和性（Ｋｉ）でｖＷＦへの結合に競合する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２０】
請求項１〜１７のいずれか１項において、１０ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でｖＷＦのＡ１ドメインに結合する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２１】
請求項１〜１７のいずれか１項において、１００ｎＭ以下の親和性（Ｋｉ）でｖＷＦのＡ１ドメインへの結合に競合する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか１項において、６５℃以上のＦＡＢフラグメント耐熱温度を有する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか１項において、原型の非ヒト化抗体よりも高いＦＡＢフラグメント耐熱温度を有する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２４】
重鎖ＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、重鎖ＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、重鎖ＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１がＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）ではない及び／又は前記軽鎖ＣＤＲ２がＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）ではない、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２５】
請求項２４において、ヒト抗体重鎖フレームワーク領域及び／又はヒト抗体軽鎖フレームワーク領域をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２６】
請求項２５において、前記重鎖フレームワーク領域が、４−５９由来ヒト抗体に存在する重鎖フレームワーク領域に対応する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２７】
請求項２６において、４−５９由来ヒト抗体に存在する前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２８】
請求項２６において、４−５９由来ヒト抗体に存在する前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２９】
請求項２５において、前記軽鎖フレームワーク領域が、０１８由来ヒト抗体に存在する軽鎖フレームワーク領域に対応する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３０】
請求項２９において、０１８由来ヒト抗体に存在する前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３１】
請求項２９において、０１８由来ヒト抗体に存在する前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３２】
請求項２６において、前記４−５９由来ヒト抗体がＡＡＣ１８１６５．１である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３３】
請求項２９において、前記０１８由来ヒト抗体がＡＡＫ９４８０８である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３４】
請求項２４において、ＬＣＤＲ１及び／又はＬＣＤＲ２がヒト抗体からのＣＤＲである、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３５】
請求項３４において、ＬＣＤＲ２がＤＡＳＮＬＥＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３６】
請求項１から１７及び２４のいずれか１項において、ＨＣＤＲ１が、Ｆ２７Ｇ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ及びＶ３４Ｗからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３７】
請求項１から１７及び２４のいずれか１項において、ＨＣＤＲ２が、Ｓ６１Ｐ及びＡ６２Ｓからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３８】
請求項１から１７及び２４のいずれか１項において、ＬＣＤＲ１が、Ｓ２４Ｑ、Ｎ３０Ｓ及びＫ３１Ｎからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３９】
請求項１から１７及び２４のいずれか１項において、ＨＣＤＲ１が、Ｆ２７Ｇ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ及びＶ３４Ｗからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含み、ＨＣＤＲ２が、Ｓ６１Ｐ及びＡ６２Ｓからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含み、ＬＣＤＲ１が、Ｓ２４Ｑ、Ｎ３０Ｓ及びＫ３１Ｎからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４０】
請求項４又は５において、ヒト抗体からの重鎖フレームワーク領域をさらに含み、前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４１】
請求項４又は５において、ヒト抗体からの軽鎖フレームワーク領域をさらに含み、前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４２】
請求項１５〜１７のいずれか１項において、前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４３】
請求項１５〜１７のいずれか１項において、前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか１項において、原型の非ヒト化抗体又は原型の非ヒト化抗体からの可変領域とヒトＦｃ領域を含むキメラ抗体と同じ活性を保持している、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４５】
請求項４４において、前記活性がリストセチン誘発血小板凝集活性として測定される、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４６】
請求項１〜４３のいずれか１項において、エフェクター機能を有していない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４７】
請求項１〜４３のいずれか１項において、ＩｇＧ４に由来するＦｃ領域を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４８】
請求項１〜４３のいずれか１項において、ヒトｖＷＦのＡ１ドメインに特異的である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４９】
請求項１〜４３のいずれか１項において、完全抗体である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項５０】
請求項１〜４３のいずれか１項において、前記結合性フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２及び二重特異性抗体からなる群から選択される抗体フラグメントである、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項５１】
請求項５０において、前記抗体フラグメントがＦａｂではない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項５２】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸。
【請求項５３】
微生物としてＤＳＭＺに寄託番号：ＤＳＭ２１０５９として寄託されたベクターＧＳ２６４の核酸配列をコードする軽鎖を含む単離核酸。
【請求項５４】
微生物としてＤＳＭＺに寄託番号：ＤＳＭ２１０６０として寄託されたベクターＧＳ２６５の核酸配列をコードする重鎖を含む単離核酸。
【請求項５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される重鎖可変領域配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示される軽鎖可変領域配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸。
【請求項５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７で示される重鎖配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８で示される軽鎖配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸。
【請求項５７】
請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項５８】
請求項５２〜５６のいずれか１項に記載の単離核酸又は請求項５７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５９】
請求項５８に記載の宿主細胞を培養して核酸を発現させ、抗体を製造することを含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントの製造方法。
【請求項６０】
請求項５９において、宿主細胞培養物から前記抗体を回収することをさらに含む方法。
【請求項６１】
請求項５９において、宿主細胞培地から前記抗体を回収する方法。
【請求項６２】
請求項５９において、前記宿主細胞を培養する前に、重鎖可変領域をコードする核酸を含むベクター及び軽鎖可変領域をコードする核酸を含むベクターによる前記宿主細胞に対する共トランスフェクションを行う方法。
【請求項６３】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、製薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物。
【請求項６４】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載の第１のヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、ｖＷＦのＡ１ドメインに結合する第２の抗体と、を含む組成物。
【請求項６５】
請求項６４において、前記第２の抗体がＡＪＷ−２００である組成物。
【請求項６６】
被投与者におけるｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するための方法であって、治療有効量の、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを前記被投与者に投与することを含む方法。
【請求項６７】
請求項６６において、前記被投与者がヒトである方法。
【請求項６８】
請求項６６において、前記ｖＷＦ媒介性障害が血栓症又は血栓疾患である方法。
【請求項６９】
請求項６８において、前記血栓症又は血栓疾患が、心臓血管疾患又は虚血性脳卒中等の脳血管疾患である方法。
【請求項７０】
請求項６９において、前記心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化、再狭窄、口峡炎、急性心筋梗塞、急性冠症候群又は糖尿病に伴う心臓血管疾患である方法。
【請求項７１】
請求項６８において、前記血栓症又は血栓疾患が、血管炎症、静脈血栓症、鎌状赤血球病、異種移植拒絶反応、末梢血管疾患、血栓性血小板減少性紫斑症、嚢胞性繊維症、血管性認知症、レイノー病、関節リウマチ又は糖尿病である方法。
【請求項７２】
請求項６９において、前記脳血管疾患が、血管性認知症、虚血性脳卒中又は再発性脳卒中の予防である方法。
【請求項７３】
請求項６６〜７２のいずれか１項において、前記治療有効量が約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇである方法。
【請求項７４】
請求項７３において、前記治療有効量が約０．００２〜約２０ｍｇ／ｋｇである方法。
【請求項７５】
請求項７３において、前記治療有効量が約０．００２〜約１０ｍｇ／ｋｇである方法。
【請求項７６】
請求項６６〜７５のいずれか１項において、１回又は複数回の投与によって前記治療有効量のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを前記被投与者に投与する方法。
【請求項７７】
請求項６６〜７５のいずれか１項において、前記治療有効量が、血小板凝集を抑制するために十分な量であり、出血の有意な臨床的徴候を引き起こすには不十分な量である方法。
【請求項７８】
請求項６６〜７２のいずれか１項において、前記治療有効量が、出血の有意な臨床的徴候を引き起こすことなく、ＥＤ１００の約１〜約２５０倍である方法。
【請求項７９】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントの薬剤としての使用であって、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを治療有効量で投与することを含む使用。
【請求項８０】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントの、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを治療有効量で投与することを含むｖＷＦ媒介疾患又は障害の治療のための薬剤の調製における使用。
【請求項８１】
請求項７９において、前記薬剤がｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するために使用される使用。
【請求項８２】
請求項８０又は８１において、前記ｖＷＦ媒介性障害が血栓症又は血栓疾患である使用。
【請求項８３】
請求項８２において、前記血栓疾患が、心臓血管疾患又は虚血性脳卒中等の脳血管疾患である使用。
【請求項８４】
請求項８３において、前記心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化、再狭窄、口峡炎、急性心筋梗塞、急性冠症候群又は糖尿病に伴う心臓血管疾患である使用。
【請求項８５】
請求項８２において、前記血栓血栓疾患が、血管炎症、静脈血栓症、鎌状赤血球病、異種移植拒絶反応、末梢血管疾患、血栓性血小板減少性紫斑症、嚢胞性繊維症、血管性認知症、レイノー病、関節リウマチ又は糖尿病を含む使用。
【請求項８６】
請求項８３において、前記脳血管疾患が、血管性認知症、虚血性脳卒中又は再発性脳卒中の予防である使用。
【請求項８７】
請求項７９〜８６のいずれか１項において、前記治療有効量が約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇである使用。
【請求項８８】
請求項８７において、前記治療有効量が約０．００２〜約２０ｍｇ／ｋｇである使用。
【請求項８９】
請求項８７において、前記治療有効量が約０．００２〜約１０ｍｇ／ｋｇである使用。
【請求項９０】
請求項７９〜８９のいずれか１項において、１回又は複数回の投与によって前記治療有効量のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを前記被投与者に投与する使用。
【請求項９１】
請求項７９〜８９のいずれか１項において、前記治療有効量が、血小板凝集を抑制するために十分な量であり、出血の有意な臨床的徴候を引き起こすには不十分な量である使用。
【請求項９２】
請求項７９〜８６のいずれか１項において、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを、出血の有意な臨床的徴候を引き起こすことなく、ＥＤ１００の約１〜約２５０倍の治療有効量で投与する使用。
【請求項９３】
請求項１〜４３のいずれか１項において、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを治療有効量で投与することを含む薬剤としての使用のための、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項９４】
請求項１〜４３のいずれか１項において、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを治療有効量で投与することを含む、ｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するための方法における使用のための、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項９５】
請求項９３において、前記薬剤がｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するために使用される、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項９６】
請求項９４又は９５において、前記ｖＷＦ媒介性障害が血栓症又は血栓疾患である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項９７】
請求項９６において、前記血栓疾患が、心臓血管疾患又は虚血性脳卒中等の脳血管疾患である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項９８】
請求９７において、前記心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化、再狭窄、口峡炎、急性心筋梗塞、急性冠症候群又は糖尿病に伴う心臓血管疾患である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項９９】
請求項９６において、前記血栓血栓疾患が、血管炎症、静脈血栓症、鎌状赤血球病、異種移植拒絶反応、末梢血管疾患、血栓性血小板減少性紫斑症、嚢胞性繊維症、血管性認知症、レイノー病、関節リウマチ又は糖尿病を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１００】
請求項９７において、前記脳血管疾患が、血管性認知症、虚血性脳卒中又は再発性脳卒中の予防である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１０１】
請求項９３〜１００のいずれか１項において、前記治療有効量が約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇである、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１０２】
請求項１０１において、前記治療有効量が約０．００２〜約２０ｍｇ／ｋｇである、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１０３】
請求項１０１において、前記治療有効量が約０．００２〜約１０ｍｇ／ｋｇである、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１０４】
請求項９３〜１０３のいずれか１項において、１回又は複数回の投与によって前記治療有効量のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを前記被投与者に投与する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１０５】
請求項９３〜１０３のいずれか１項において、前記治療有効量が、血小板凝集を抑制するために十分な量であり、出血の有意な臨床的徴候を引き起こすには不十分な量である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１０６】
請求項９３〜１００のいずれか１項において、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを、出血の臨床的徴候を引き起こすことなく、ＥＤ１００の約１〜約２５０倍の治療有効量で投与する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１０７】
出血の臨床的徴候を引き起こすことなく、ＥＤ１００の１〜約２５０倍の治療有効量で投与することができる、ヒトフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１０８】
請求項１０７において、ヒトｖＷＦのＡ１ドメインに特異的である、ヒト抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１０９】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを、投与を必要とする被投与者に投与するための方法であって、有意な出血の臨床的徴候を引き起こすことなく、血小板凝集を抑制するために十分な治療有効量の前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを投与することを含む方法。
【請求項１１０】
請求項６６〜１０９のいずれか１項において、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを皮下投与する方法。
【請求項１１１】
請求項６６〜１０９のいずれか１項において、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを静脈内投与する方法。
【請求項１１２】
請求項６６〜１０９のいずれか１項において、射線治療と組み合わせて、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを静脈内投与する方法。
【請求項１１３】
請求項６６〜１０９のいずれか１項において、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントの前記治療有効量が、ＥＤ１００の約１〜約２５０倍である方法。
【請求項１１４】
請求項７９において、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを、ＥＤ１００の約１〜約２５０倍の量で投与する方法。
【請求項１１５】
ｖＷＦ媒介疾患又は障害の治療のための、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の第１のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを含む製品。
【請求項１１６】
ｖＷＦ媒介疾患又は障害の治療のための、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の第１のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを含むキット。
【請求項１１７】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントの非治療用途における使用。
【請求項１１８】
請求項１１７において、前記非治療用途が診断検定である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、フォンウィルブランド因子に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントに関する。より詳細には、本発明は、全体として、マウス抗体ＮＭＣ−４に存在するＣＤＲに対応するＣＤＲを含むフォンウィルブランド因子に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント等の、フォンウィルブランド因子に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管障害部位への血小板付着の制御は複数のタンパク質の十分に調整された相互作用を含み、止血及び血栓症の両方において重要な役割を果たす。血小板付着を生じさせるタンパク質の１つはフォンウィルブランド因子（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ））である。ｖＷＦは血漿に存在する大きな多量体糖タンパク質である。ｖＷＦは、Ａ１ドメインを介して血小板受容体ＧＰＩｂαと相互作用し、血小板の回転及び付着を促進するとされている（Ｍｏａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７８：１４５６−６１）。血小板の回転及び付着に続いて血小板／フィブリン栓子が形成され、出血が止まる。しかしながら、過度の血小板及び／又は凝集応答によって病理学的な血栓症状が生じ得る。
【０００３】
血小板活性化（例えば、ＧＰＩＩｂＩＩＩａ、ＡＤＰ受容体、シクロオキシゲナーゼ又はホスホジエステラーゼアンタゴニスト）又は凝集（例えば、トロンビン及び第Ｘａ因子阻害剤）を抑制する現在の療法が出血性合併症をもたらすとすれば、止血を有意に損なうことなく、血栓症を実質的に抑制することができる物質の開発が求められる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、全体として、ヒトフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント、ｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するための方法を含む、それらの製造方法及び使用に関する。ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、非ヒト抗体（例えば、マウスＣＤＲ）からの相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒトフレームワーク領域を含むことができる。
【０００５】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される重鎖可変領域配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示される軽鎖可変領域配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【０００６】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７で示される重鎖配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８で示される軽鎖配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【０００７】
本発明は、（ａ）マウス抗体ＮＭＣ−４の重鎖及び軽鎖可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及び２）に存在するＣＤＲに対応する重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、（ｂ）抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）等のＶＨ４−５９由来ヒト抗体の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する重鎖フレームワーク領域及び／又はヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＶＬ０１８）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する軽鎖フレームワーク領域と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【０００８】
本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及び／又はＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の１以上を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【０００９】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、ヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域からの重鎖フレームワーク領域をさらに含むことができる。
【００１０】
また、本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及び／又はＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の１以上を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００１１】
本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、ヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からの軽鎖フレームワーク領域をさらに含むことができる。
【００１２】
また、本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）と、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、ヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からの軽鎖フレームワーク領域及び／又はヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域からの重鎖フレームワーク領域をさらに含むことができる。
【００１３】
本発明は、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、Ｈ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）の１以上を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００１４】
本発明は、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）の１以上を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００１５】
また、本発明は、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、Ｈ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）の１以上と、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）の１以上と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００１６】
例えば、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）；Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）；Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）；Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）；Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）及びＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）及びＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）及びＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）及びＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）及びＨ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）；Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）及びＨ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）；Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）及びＨ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）；Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；又はＬ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）及びＨ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を含むことができる。
【００１７】
また、本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及び／又はＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の１以上と、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及び／又はＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の１以上と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、ヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からの軽鎖フレームワーク領域及び／又はヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域からの重鎖フレームワーク領域をさらに含むことができる。
【００１８】
また、本発明は、１０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下、最も好ましくは少なくとも約０．２ｎＭ〜約０．４ｎＭの親和性（Ｋｄ）でｖＷＦに結合する、本願明細書に記載するヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。また、本発明は、１００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは少なくとも約０．２ｎＭ〜約５．０ｎＭの親和性（Ｋｉ）でｖＷＦへの結合に競合する、本願明細書に記載するヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００１９】
また、本発明は、１０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下、最も好ましくは少なくとも約０．２ｎＭ〜約０．４ｎＭの親和性（Ｋｄ）でｖＷＦのＡ１ドメインに結合する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。また、本発明は、１００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは少なくとも約０．２ｎＭ〜約５．０ｎＭの親和性（Ｋｉ）でｖＷＦのＡ１ドメインへの結合に競合する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００２０】
また、本発明は、６５℃を超えるＦＡＢフラグメント耐熱温度を有する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００２１】
本発明は、ＨＣＤＲ１（ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２（ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３（ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を含み、ＬＣＤＲ１及び／又はＬＣＤＲ２の少なくとも１つがそれぞれＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）又はＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）ではない、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００２２】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１（ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２（ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３（ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＬＣＤＲ１（ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２（ＹＴＳＳＬＨＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３（ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）と、ヒト抗体生殖細胞ファミリーＶＨ４の重鎖フレームワーク領域１、２、３に対応するフレームワーク領域１、２、３と、ヒト抗体生殖細胞ファミリーＶＫ１の軽鎖フレームワーク領域１、２、３に対応するフレームワーク領域１、２、３と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００２３】
また、本発明は、全体として、本願明細書に開示するヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体をコードする単離核酸（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）に関する。いくつかの実施形態では、ベクターは本願明細書に開示する核酸を含むことができる。別の実施形態では、宿主細胞は本願明細書に開示する核酸を含むことができる。
【００２４】
また、本発明は、全体として、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体の製造方法であって、本願明細書に開示する宿主細胞を培養して核酸を発現させ、前記抗体を製造することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、前記方法は、宿主細胞培養物から抗体を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞培地から抗体を回収する。いくつかの実施形態では、宿主細胞を培養する前に、重鎖可変領域をコードする核酸を含むベクター及び軽鎖可変領域をコードする核酸を含むベクターによる宿主細胞に対する共トランスフェクションを行う。
【００２５】
本発明は、全体として、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体と、製薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物に関する。
【００２６】
また、本発明は、本願明細書に開示する第１のヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、ｖＷＦのＡ１ドメインに結合する第２の抗体と、を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、第２の抗体はＡＪＷ−２００である。
【００２７】
また、本発明は、全体として、被投与者における（例えば、患者）ｖＷＦ媒介疾患又は障害（例えば、血栓症又は血栓疾患）を治療するための方法であって、治療有効量のｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はそのフラグメントを前記被投与者に投与する方法に関する。いくつかの実施形態では、被投与者はヒトである。いくつかの実施形態では、治療有効量は、血小板凝集を抑制するために十分な量であり、出血の有意な臨床的徴候を引き起こすには不十分な量である。
【００２８】
また、本発明は、本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントの薬剤としての使用を提供する。また、本発明は、本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントの、ｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するための薬剤の調製における使用を提供する。いくつかの実施形態では、治療有効量は、血小板凝集を抑制するために十分な量であり、出血の有意な臨床的徴候を引き起こすには不十分な量である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ｖＷＦ媒介疾患又は障害は、血栓症又は血栓疾患である。いくつかの実施形態では、血栓疾患は、心臓血管疾患又は虚血性脳卒中等の脳血管疾患である。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化、再狭窄、口峡炎、急性心筋梗塞、急性冠症候群又は糖尿病に伴う心臓血管疾患である。いくつかの実施形態では、血栓症又は血栓疾患は、血管炎症、静脈血栓症、鎌状赤血球病、異種移植拒絶反応、末梢血管疾患、血栓性血小板減少性紫斑症、嚢胞性繊維症、血管性認知症、レイノー病、関節リウマチ又は糖尿病である。いくつかの実施形態では、脳血管疾患は、血管性認知症、虚血性脳卒中又は再発性脳卒中の予防である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントは作動因子機能を有していない。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＩｇＧ４に由来するＦｃ領域を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントはフォンウィルブランド因子のＡ１ドメインに結合する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２又は二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ｖＷＦに特異的な結合性フラグメントはＦａｂではない。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体は完全抗体（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＣＤＲ１に１以上の置換、例えば、Ｆ２７Ｇ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ及び／又はＶ３４Ｗ置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＣＤＲ２に１以上の置換、例えば、Ｓ６１Ｐ及び／又はＡ６２Ｓ置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＬＣＤＲ１に１以上の置換、例えば、Ｓ２４Ｑ、Ｎ３０Ｓ及び／又はＫ３１Ｎ置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＬＣＤＲ２に１以上の置換、例えば、Ｙ５０Ｄ、Ｔ５１Ａ、Ｓ５３Ｎ、Ｈ５５Ｅ及び／又はＳ５６Ｔ置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＣＤＲ１に１以上の置換、例えば、Ｆ２７Ｇ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ及び／又はＶ３４Ｗ置換を含み、ＨＣＤＲ２に１以上の置換、例えば、Ｓ６１Ｐ及び／又はＡ６２Ｓ置換を含み、ＬＣＤＲ１に１以上の置換、例えば、Ｓ２４Ｑ、Ｎ３０Ｓ及び／又はＫ３１Ｎ置換を含み、ＬＣＤＲ２に１以上の置換、例えば、Ｙ５０Ｄ、Ｔ５１Ａ、Ｓ５３Ｎ、Ｈ５５Ｅ及び／又はＳ５６Ｔ置換を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】リストセチン誘発ｖＷＦ媒介血小板凝集反応検定における、原型のＮＭＣ−４モノクローナル抗体及び異なる抗ｖＷＦ抗体であるＡＪＷ２００と比較した場合のＮＭＣ−４キメラ抗体の阻害活性を示す。
【図２Ａ】非標識ＮＭＣ−４キメラ抗体（相同競合）並びにＡＪＷ２００単独および結合の、Ｅｕ−標識ＮＭＣ−４との結合における競合を示す。非標識ＮＭＣ−４モノクローナル抗体、アイソタイプ対照ＩｇＧ、ＡＪＷ２００及び可変領域Ｈ９及びＬ９を有するＮＭＣ−４抗体のヒト化誘導体による、Ｅｕ−標識ＮＭＣ−４キメラ抗体との結合における競合を示す。
【図２Ｂ】２０ｎＭ  ＡＪＷ２００の存在下及び非存在下におけるＮＭＣ−４競合のＨｉｌｌプロットを示す。
【図３Ａ】せん断流動条件において内皮ｖＷＦへの血小板付着を妨げるＮＭＣ−４の能力を示す（ＨＵＶＥＣ細胞に付着する血小板の顕微鏡写真を含む）。ＨＵＶＥＣ細胞単層は、ＰＢＳで処理した。抗体は単層からの注入直前に対応する血小板懸濁液に添加した。
【図３Ｂ】せん断流動条件において内皮ｖＷＦへの血小板付着を妨げるＮＭＣ−４の能力を示す（ＨＵＶＥＣ細胞に付着する血小板の顕微鏡写真を含む）。ＨＵＶＥＣ細胞単層は、２５μＭヒスタミンで処理した。抗体は単層からの注入直前に対応する血小板懸濁液に添加した。
【図３Ｃ】せん断流動条件において内皮ｖＷＦへの血小板付着を妨げるＮＭＣ−４の能力を示す（ＨＵＶＥＣ細胞に付着する血小板の顕微鏡写真を含む）。ＨＵＶＥＣ細胞単層は、２５μＭヒスタミンと、１０μｇ／ｍＬの抗ｖＷＦ抗体（ＮＭＣ−４）で処理した。抗体は単層からの注入直前に対応する血小板懸濁液に添加した。
【図３Ｄ】せん断流動条件において内皮ｖＷＦへの血小板付着を妨げるＮＭＣ−４の能力を示す（ＨＵＶＥＣ細胞に付着する血小板の顕微鏡写真を含む）。ＨＵＶＥＣ細胞単層は、２５μＭヒスタミンと、１８μｇ／ｍＬの抗ＧＰＩｂα抗体（ＡＫ２）で処理した。抗体は単層からの注入直前に対応する血小板懸濁液に添加した。
【図３Ｅ】せん断流動条件において内皮ｖＷＦへの血小板付着を妨げるＮＭＣ−４の能力を示す（ＨＵＶＥＣ細胞に付着する血小板の顕微鏡写真を含む）。ＨＵＶＥＣ細胞単層は、２５μＭヒスタミンと、１８μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧで処理した。抗体は単層からの注入直前に対応する血小板懸濁液に添加した。
【図４Ａ】動脈血栓のラット塩化第二鉄モデルにおける、ＡＪＷ２００（図４Ｃ）と比較した場合の、ＮＭＣ−４キメラの活性を示す。抗体は用量反応研究で比較した。
【図４Ｂ】動脈血栓のラット塩化第二鉄モデルにおける、ＡＪＷ２００（図４Ｃ）と比較した場合の、可変領域Ｈ１４及びＬ１０を有するヒト化抗体（図４Ｂ）の活性を示す。抗体は用量反応研究で比較した。
【図４Ｃ】動脈血栓のラット塩化第二鉄モデルにおける、ＡＪＷ２００（図４Ｃ）の活性を示す。抗体は用量反応研究で比較した。
【図５】ヒヒにおける周期的血流減少（ＣＦＲ）に対するＧＢＲ６００の漸増投与量（０．０３〜１０ｍｇ／ｋｇ）の作用を示す。
【図６】ヒヒにおけるＣＦＲに対するＧＢＲ６００の漸増投与量（０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ）の作用を示す。
【図７】ヒヒにおけるＣＦＲに対するＧＢＲ６００の累積投与量（０．００５〜０．０７ｍｇ／ｋｇ）の作用を示す。
【図８】ヒヒにおけるＣＦＲに対するＧＢＲ６００の累積投与量の作用を示す。
【図９】ヒヒにおけるクロピドグレルの漸増投与量（１〜１０ｍｇ／ｋｇ）の作用を示す。
【図１０】切開出血試験におけるＧＢＲ６００及びクロピドグレルの漸増投与量による点滴の作用の比較を示す。投与量は有効投与量の倍数として示す（例えば、ＣＦＲがゼロに減少する累積投与量）。
【図１１】示差走査熱量法によるヒト化ＮＭＣ−４変異体の耐熱性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、ヒトフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント、例えば、マウス抗体ＮＭＣ−４に存在するＣＤＲ又はＣＤＲの一部の１以上に対応するＣＤＲ領域を含むヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。ＮＭＣ−４抗体は、ＶＷＦのＡ１ドメインのＧＰ１Ｂ−α結合部位に結合する（例えば、Ｆｕｊｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，７７：１１３−２０，１９９１；Ｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｎａｒａ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ．，３６：６６２，１９８５を参照）。本発明のヒト化抗体は、修飾又は未修飾ヒトフレームワーク領域、例えば、ヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域のフレームワーク領域に対応する重鎖フレームワーク領域及びヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域のフレームワーク領域に対応する軽鎖フレームワーク領域をさらに含むことができる。マウスＮＭＣ−４の重鎖及び軽鎖領域が属するサブファミリーに高い相同性を示すヒトフレームワーク領域を含む様々なヒトフレームワーク領域は、ＮＭＣ−４  ＣＤＲの潜在的な受容体分子であると考えられていた。予期せぬことに、その他の変更（例えば、ヒトフレームワーク残基をマウス残基に変異させる）を加えることなく、選択された重鎖可変領域ヒトフレームワークの１つ及び選択された軽鎖可変領域ヒトフレームワークの１つにＮＭＣ−４  ＣＤＲを移植することにより、ｖＷＦ媒介血小板応答を阻害する際のヒト化抗体の力価を維持することができることが見出された。
【００３８】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体を含む。
【００３９】
「ヒト化抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含む。ヒトフレームワーク配列及び別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列においてフレームワーク領域がさらに修飾されていてもよい。
【００４０】
「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含む。抗体が定常領域を含む場合には、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、生体外ランダム又は部位特異的突然変異又は生体内体細胞突然変異によって生体内に導入された突然変異）を含むことができる。ただし、本願明細書において使用する「ヒト抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含まない。
【００４１】
本願明細書において、ヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する方法によって得られる場合には、特定の生殖系列配列に由来する重鎖又は軽鎖可変領域を含む。そのような方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有する遺伝子導入マウスを抗原で免疫するか、ファージ提示ヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを抗原でスクリーニングすることを含む。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来するヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列と最も近い（最も高い％相同性を有する）配列を有するヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって同定することができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来するヒト抗体は、例えば、天然の体細胞突然変異又は部位特定的突然変異の意図的な導入による、生殖系列配列とのアミノ酸の相違を含んでいてもよい。ただし、選択するヒト抗体又はそのフラグメントは、通常は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有し、他の種（例えば、マウス生殖系列配列）の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列と比較した場合にヒト抗体をヒトに由来するものとして特定するアミノ酸残基を含む。ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされたアミノ酸配列と少なくとも９０％あるいは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）同一のアミノ酸配列を有していてもよい。
【００４２】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される重鎖可変領域配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示される軽鎖可変領域配列を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆａｂ’−ＳＨ，Ｆｖ，ｓｃＦｖ，Ｆ（ａｂ’）２，二重特異性抗体又は単一鎖抗体）を提供する。また、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７で示される重鎖配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８で示される軽鎖配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００４３】
また、本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及び／又はＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の１以上と、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及び／又はＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の１以上と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００４４】
また、本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及び／又はＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の１以上又は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及び／又はＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の１以上と、を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００４５】
本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）と、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００４６】
本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）又は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは重鎖可変領域フレームワーク領域を含むことができ、フレームワーク領域は、ヒトＶＨ４ファミリーからの抗体に存在する１以上（例えば、１、２、３及び／又は４）の重鎖フレームワーク配列（例えば、フレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）及び／又はフレームワーク４（ＦＷ４））を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体又は結合性フラグメントは軽鎖可変領域フレームワーク領域を含むことができ、フレームワーク領域は、ヒトＶＫ１ファミリーからの抗体に存在する１以上（例えば、１、２、３及び／又は４）の軽鎖フレームワーク配列（例えば、フレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）及び／又はフレームワーク４（ＦＷ４））を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体又は結合性フラグメントはヒトＶＨ４ファミリーからの抗体に存在する１以上（例えば、１、２、３及び／又は４）の重鎖フレームワーク配列（例えば、フレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）及び／又はフレームワーク４（ＦＷ４））と、ヒトＶＫ１ファミリーからの抗体に存在する１以上（例えば、１、２、３及び／又は４）の軽鎖フレームワーク配列（例えば、フレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）及び／又はフレームワーク４（ＦＷ４））と、を含むことができる。
【００５０】
ＶＨ４ファミリーのメンバー及びそれらの重鎖フレームワーク領域１、２、３としては、４−０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７，１４８及び１４９）、４−２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０，１５１及び１５２），４−３０．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３，１５４及び１５５）、４−３０．２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６，１５７及び１５８）、４−３０．４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９，１６０及び１６１）、４−３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２，１６３及び１６４）、４−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５，１６６及び１６７）、４−３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８，１６９及び１７０）、４−５９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１，１７２及び１７３）、４−６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４，１７５及び１７６）及び４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７，１７８及び１７９）が挙げられる。
【００５１】
ＶＫ１ファミリーのメンバー及びそれらの軽鎖フレームワーク領域１、２、３としては、０１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０，１８１及び１８２）、０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８３，１８４及び１８５）、０１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６，１８７及び１８８）、０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９，１９０及び１９１）、Ａ２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２，１９３及び１９４）、Ａ３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９５，１９６及び１９７）、Ｌ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９８，１９９及び２００）、Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０１，２０２及び２０３）、Ｌ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０４，２０５及び２０６）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７，２０８及び２０９）、Ｌ１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０，２１１及び２１２）、Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１３，２１４及び２１５）、Ｌ１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１６，２１７及び２１８）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１９，２２０，及び２２１）、Ｌ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２２，２２３及び２２４）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５，２２６及び２２７）、Ｌ２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２８，２２９及び２３０）、Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３１，２３２及び２３３）及びＬ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３４，２３５及び２３６）が挙げられる。
【００５２】
本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及び／又はＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の１以上を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００５３】
本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及び／又はＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の１以上及びヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）からの重鎖フレームワーク領域を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００５４】
本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及び／又はＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の１以上及びヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）からの重鎖フレームワーク領域を含み、前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００５５】
本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及び／又はＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の１以上及びヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）からの重鎖フレームワーク領域を含み、前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基をさらに含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００５６】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００５７】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及びヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）からの重鎖フレームワーク領域を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００５８】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及びヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）からの重鎖フレームワーク領域を含み、前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００５９】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及びヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）からの重鎖フレームワーク領域を含み、前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基をさらに含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００６０】
また、本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及び／又はＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の１以上を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００６１】
また、本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及び／又はＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の１以上及びヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）からの軽鎖フレームワーク領域を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００６２】
また、本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及び／又はＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の１以上及びヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）からの軽鎖フレームワーク領域を含み、前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００６３】
また、本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及び／又はＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）の１以上及びヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）からの軽鎖フレームワーク領域を含み、前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基をさらに含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００６４】
本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００６５】
また、本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）からの軽鎖フレームワーク領域を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００６６】
本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）からの軽鎖フレームワーク領域を含み、前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００６７】
本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）からの軽鎖フレームワーク領域を含み、前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基をさらに含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００６８】
本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）と、必要に応じて、ヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からの軽鎖フレームワーク領域及び／又はヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域からの重鎖フレームワーク領域と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００６９】
また、本発明は、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントのアミノ酸配列変異体を提供する。通常、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントのアミノ酸配列変異体は、軽鎖又は重鎖、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のような軽鎖又は重鎖領域配列の、原型のヒト化抗体の軽鎖及び／又は重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一の（少なくとも８０％のアミノ酸配列相同性を有する）軽鎖及び／又は重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を有することができる。好ましくは、軽鎖及び／又は重鎖フレームワーク領域配列のアミノ酸配列相同性は、少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは９６％、さらに好ましくは９７％、さらに好ましくは９８％、最も好ましくは９９％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）である。本願明細書においては、上記配列との相同性は、最大の配列相同性を得るために配列を整合させ、必要に応じてギャップを導入した後における、ｖＷＦ残基に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントと同一の侯補配列におけるアミノ酸残基の割合と定義される。従って、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために通常使用される標準的な方法で決定することができる。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡ等のコンピュータプログラムを使用すれば、２つのポリペプチドをアミノ酸が（いずれか又は両方の配列の全長に沿って、あるいはいずれか又は両方の配列の所定の部分に沿って）最適にマッチングされるように整合させることができる。プログラムにより、デフォルトオープニングペナルティーとデフォルトギャップペナルティを決定することができる。ＰＡＭ２５０（標準スコアマトリックス；Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ  ５，ｓｕｐｐ．３（１９７８））等のスコアマトリックスをコンピュータプログラムと共に使用することができる。例えば、相同性（％）は、完全一致の総数に１００を乗算し、一致範囲内のより長い配列の長さと２つの配列を整合させるために配列に導入されたギャップの数で除算することにより算出することができる。
【００７０】
従って、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のフレームワーク領域と少なくとも８０％同一であるフレームワーク領域を含む重鎖可変領域配列及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のフレームワーク領域と少なくとも８０％同一であるフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域配列を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。また、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７のフレームワーク領域と少なくとも８０％同一であるフレームワーク領域を含む重鎖可変領域配列及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８のフレームワーク領域と少なくとも８０％同一であるフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域配列を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００７１】
必要に応じて、ヒト化抗体は、ＨＣＤＲ１に１以上の置換、例えば、Ｆ２７Ｇ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ及び／又はＶ３４Ｗ置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＣＤＲ２に１以上の置換、例えば、Ｓ６１Ｐ及び／又はＡ６２Ｓ置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＬＣＤＲ１に１以上の置換、例えば、Ｓ２４Ｑ、Ｎ３０Ｓ及び／又はＫ３１Ｎ置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＬＣＤＲ２に１以上の置換、例えば、Ｙ５０Ｄ、Ｔ５１Ａ、Ｓ５３Ｎ、Ｈ５５Ｅ及び／又はＳ５６Ｔ置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＣＤＲ１に１以上の置換、例えば、Ｆ２７Ｇ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ及び／又はＶ３４Ｗ置換を含み、ＨＣＤＲ２に１以上の置換、例えば、Ｓ６１Ｐ及び／又はＡ６２Ｓ置換を含み、ＬＣＤＲ１に１以上の置換、例えば、Ｓ２４Ｑ、Ｎ３０Ｓ及び／又はＫ３１Ｎ置換を含み、ＬＣＤＲ２に１以上の置換、例えば、Ｙ５０Ｄ、Ｔ５１Ａ、Ｓ５３Ｎ、Ｈ５５Ｅ及び／又はＳ５６Ｔ置換を含むことができる。
【００７２】
また、本発明は、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、Ｈ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）（前記重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９によってそれぞれ示される）のいずれかを含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００７３】
本発明は、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）のいずれかを含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００７４】
また、本発明は、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、又はＨ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）の１以上と、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、又はＬ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）の１以上と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００７５】
本発明は、Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）；Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）；Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）；Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）；Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）及びＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）及びＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）及びＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）及びＨ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）；Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）及びＨ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）；Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）及びＨ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）；Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）及びＨ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）；Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）及びＨ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）；又はＬ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）及びＨ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００７６】
本発明は、１０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下、最も好ましくは少なくとも約０．２〜約０．４ｎＭ（例えば、約０．２１、０．２８又は０．３４〜約０．２５、０．３２又は０．３８ｎＭ）の親和性（Ｋｄ）でｖＷＦに結合する、本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。また、本発明は、１００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは少なくとも約０．２〜約５．０ｎＭ（例えば、約０．２２、０．２８又は０．３４〜約２．３、３．５又は４．７ｎＭ）の親和性（Ｋｄ）でｖＷＦへの結合に競合する、本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００７７】
また、本発明は、１０ｎＭ以下、好ましくは５ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下、最も好ましくは少なくとも約０．２ｎＭ〜約０．４ｎＭ（例えば、約０．２１、０．２８又は０．３４〜約０．２５、０．３２又は０．３８ｎＭ）の親和性（Ｋｄ）でｖＷＦのＡ１ドメインに結合する、本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。また、本発明は、１００ｎＭ以下、好ましくは５０ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、最も好ましくは少なくとも約０．２ｎＭ〜約５．０ｎＭ（例えば、約０．２２、０．２８又は０．３４〜約２．３、３．５又は４．７ｎＭ）の親和性（Ｋｉ）でｖＷＦのＡ１ドメインへの結合に競合する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００７８】
また、本発明は、６５℃、好ましくは７０℃、より好ましくは７５℃、最も好ましくは８０℃を超えるＦＡＢフラグメント耐熱温度を有する、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。ＦＡＢフラグメント耐熱性の分析では、示差走査熱量測定を使用し、完全ＩｇＧではＦＡＢフラグメントの中間融点を特定する。このような熱量測定は当業者に知られており、例えば、Ｇａｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｒｅｓｔ（２００７），ＢＢＲＣ  ３５５：７５１−７に準拠して行うことができる。予期せぬことに、本発明のヒト化抗体は、原型の非ヒト化抗体よりも高いＦＡＢフラグメント耐熱温度を有することが判明した。原型の非ヒト化抗体は、通常はマウス抗体、特にマウス抗体ＮＭＣ−４である。従って、本発明は、原型の非ヒト化抗体よりも高いＦＡＢフラグメント耐熱温度を有する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００７９】
また、本発明は、超可変領域アミノ酸配列：ＨＣＤＲ１（ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２（ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３（ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を含み、ＬＣＤＲ１及び／又はＬＣＤＲ２の少なくとも１つがそれぞれＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）又はＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）ではない、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。驚くべきことに、ＮＭＣ−４  ＬＣＤＲ１及び／又はＬＣＤＲ２を有していないヒト化ＮＭＣ−４抗体は、ｖＷＦに対するナノモル結合親和性を保持している。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体はヒト抗体重鎖フレームワーク領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、重鎖フレームワーク領域は４−５９由来ヒト抗体に存在する重鎖フレームワーク領域に対応する。いくつかの実施形態では、４−５９由来ヒト抗体に存在する重鎖フレームワーク領域は１以上のマウス残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、４−５９由来ヒト抗体に存在する重鎖フレームワーク領域は１以上のマウス残基を含まない。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体はヒト抗体軽鎖フレームワーク領域を含むことができる。いくつかの実施形態では、軽鎖フレームワーク領域は０１８由来ヒト抗体に存在する軽鎖フレームワーク領域に対応する。いくつかの実施形態では、０１８由来ヒト抗体に存在する軽鎖フレームワーク領域は１以上のマウス残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、０１８由来ヒト抗体に存在する軽鎖フレームワーク領域は１以上のマウス残基を含まない。
【００８２】
ＬＣＤＲ１及び／又はＬＣＤＲ２はヒトから得ることができる。いくつかの実施形態では、ＬＣＤＲ１及び／又はＬＣＤＲ２は同一の抗体（例えば、単一のヒト抗体）から得ることができる。別の実施形態では、ＬＣＤＲ１及び／又はＬＣＤＲ２は異なる抗体（例えば、２つのヒト抗体）から得ることができる。ＬＣＤＲ２をヒトから得る場合には、ＬＣＤＲ２は好ましくはＤＡＳＮＬＥＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）である。
【００８３】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１（ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２（ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３（ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＬＣＤＲ１（ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２（ＹＴＳＳＬＨＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３（ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）と、ヒト抗体重鎖生殖系列配列４−５９に存在する重鎖フレームワーク領域に対応し、ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１）である重鎖フレームワーク領域１、ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２）である重鎖フレームワーク領域２及びＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３）である重鎖フレームワーク領域３と、ヒト抗体軽鎖生殖系列配列０１８に存在するフレームワーク領域に対応し、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６）である軽鎖フレームワーク領域１、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７）である軽鎖フレームワーク領域２及びＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８）である軽鎖フレームワーク領域３と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００８４】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１（ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２（ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３（ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＬＣＤＲ１（ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２（ＹＴＳＳＬＨＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３（ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）と、ヒト抗体重鎖生殖系列配列４−５９に存在する重鎖フレームワーク領域に対応し、ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１）である重鎖フレームワーク領域１、ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２）である重鎖フレームワーク領域２及びＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３）である重鎖フレームワーク領域３と、ヒト抗体軽鎖生殖系列配列０１８に存在するフレームワーク領域に対応し、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６）である軽鎖フレームワーク領域１、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７）である軽鎖フレームワーク領域２及びＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８）である軽鎖フレームワーク領域３と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００８５】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１（ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２（ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３（ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＬＣＤＲ１（ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２（ＹＴＳＳＬＨＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３（ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）と、ヒト抗体生殖細胞系列ファミリーＶＨ４の重鎖フレームワーク領域１、２、３に対応するフレームワーク領域１、２、３と、ヒト抗体生殖細胞系列ファミリーＶＫ１の軽鎖フレームワーク領域１、２、３に対応するフレームワーク領域１、２、３と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【００８６】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、重鎖可変生殖系列配列４−０４に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＧＴＬＳＬＴＣＡＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）、ＦＷ２：ＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８）、ＦＷ３：ＲＶＴＩＳＶＤＫＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００８７】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、重鎖可変生殖系列配列４−２８に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＤＴＬＳＬＴＣＡＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０）、ＦＷ２：ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１）、ＦＷ３：ＲＶＴＭＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＶＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００８８】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、重鎖可変生殖系列配列４−３０．１に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３）、ＦＷ２：ＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４）、ＦＷ３：ＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００８９】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、重鎖可変生殖系列配列４−３０．２に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＱＬＱＬＱＥＳＧＳＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６）、ＦＷ２：ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７）、ＦＷ３：ＲＶＴＩＳＶＤＲＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５８）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００９０】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、重鎖可変生殖系列配列４−３０．４に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９）、ＦＷ２：ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０）、ＦＷ３：ＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００９１】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、重鎖可変生殖系列配列４−３１に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２）、ＦＷ２：ＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３）、ＦＷ３：ＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００９２】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、重鎖可変生殖系列配列４−３４に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５）、ＦＷ２：ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６）、ＦＷ３：ＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００９３】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、重鎖可変生殖系列配列４−３９に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８）、ＦＷ２：ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９）、ＦＷ３：ＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７０）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００９４】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、重鎖可変生殖系列配列４−５９に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１）、ＦＷ２：ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２）、ＦＷ３：ＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００９５】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、重鎖可変生殖系列配列４−６１に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＱＬＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４）、ＦＷ２：ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７５）、ＦＷ３：ＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７６）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００９６】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、重鎖可変生殖系列配列４−ｂに存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７）、ＦＷ２：ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７８）、ＦＷ３：ＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７９）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００９７】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列０１２に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８１）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８２）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００９８】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列０２に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８３）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８４）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８５）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【００９９】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列０１８に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１００】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列０８に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１０１】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ａ２０に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９４）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１０２】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ａ３０に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９５）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９６）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９７）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１０３】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ１４に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＮＩＱＭＴＱＳＰＳＡＭＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９８）、ＦＷ２：ＷＦＱＱＫＰＧＫＶＰＫＨＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９９）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２００）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１０４】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ１４に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０１）、ＦＷ２：ＷＦＱＱＫＰＧＫＡＰＫＳＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０２）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０３）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１０５】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ１５に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０４）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＳＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０５）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０６）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１０６】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ４に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０８）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０９）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１０７】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ１８に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１１）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１２）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１０８】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ５に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１３）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１４）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１５）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１０９】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ５に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１６）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１７）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１８）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１１０】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ８に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１９）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２０）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２１）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１１１】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ２３に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＡＩＲＭＴＱＳＰＦＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２２）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＡＫＡＰＫＬＦＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２３）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２４）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１１２】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ９に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＡＩＲＭＴＱＳＰＳＳＦＳＡＳＴＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２６）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＣＬＱＳＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２７）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１１３】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ２４に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＶＩＷＭＴＱＳＰＳＬＬＳＡＳＴＧＤＲＶＴＩＳＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２８）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＥＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２９）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＣＬＱＳＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３０）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１１４】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ１１に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＡＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３１）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３２）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３３）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１１５】
ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、κ鎖可変生殖系列配列Ｌ１１に存在するフレームワーク領域１、２、３（例えば、ＦＷ１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３４）、ＦＷ２：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３５）、ＦＷ３：ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３６）に対応するフレームワーク領域１、２、３を含むことができる。
【０１１６】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１（ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２（ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３（ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＬＣＤＲ１（ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２（ＹＴＳＳＬＨＳ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３（ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）と、ヒト抗体４−０４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７，１４８及び１４９）、４−２８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０，１５１及び１５２），４−３０．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３，１５４及び１５５）、４−３０．２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６，１５７及び１５８）、４−３０．４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５９，１６０及び１６１）、４−３１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２，１６３及び１６４）、４−３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５，１６６及び１６７）、４−３９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８，１６９及び１７０）、４−５９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１，１７２及び１７３）、４−６１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７４，１７５及び１７６）及び４−ｂ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７７，１７８及び１７９）の重鎖フレームワーク領域１、２、３に対応するフレームワーク領域１、２、３と、ヒト抗体０１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８０，１８１及び１８２）、０２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８３，１８４及び１８５）、０１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６，１８７及び１８８）、０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９，１９０及び１９１）、Ａ２０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２，１９３及び１９４）、Ａ３０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９５，１９６及び１９７）、Ｌ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９８，１９９及び２００）、Ｌ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０１，２０２及び２０３）、Ｌ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０４，２０５及び２０６）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０７，２０８及び２０９）、Ｌ１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１０，２１１及び２１２）、Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１３，２１４及び２１５）、Ｌ１９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１６，２１７及び２１８）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１９，２２０，及び２２１）、Ｌ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２２，２２３及び２２４）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５，２２６及び２２７）、Ｌ２４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２８，２２９及び２３０）、Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３１，２３２及び２３３）及びＬ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３４，２３５及び２３６）の軽鎖フレームワーク領域１、２、３に対応するフレームワーク領域１、２、３と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【０１１７】
また、本発明は、原型の非ヒト化抗体又は原型の非ヒト化抗体からの可変領域とヒトＦｃ領域を含むキメラ抗体と同じ活性を保持している、本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。原型の非ヒト化抗体は、通常はマウス抗体、特にマウス抗体ＮＭＣ−４である。原型の非ヒト化抗体からの可変領域を含むキメラ抗体は、通常は、マウス抗体、特にマウス抗体ＮＭＣ−４からの可変領域と、ヒトＦｃ領域と、を含む抗体である。ヒトＦｃ領域としては、本願明細書に開示するヒトＦｃ領域を好ましくは使用する。
【０１１８】
本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメント、原型の非ヒト化抗体及びキメラ抗体の活性は、実施例１に記載するようにＥＣ５０活性を決定することによってリストセチン誘発血小板凝集活性として測定することができる。本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントのＥＣ５０活性が、原型の非ヒト化抗体かキメラ抗体のＥＣ５０活性に対して５０％以下、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下異なる（例えば、高い又は低い）場合に、本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、原型の非ヒト化抗体かキメラ抗体と同じ活性を保持しているとみなされる。
【０１１９】
本発明の好適な実施形態では、本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、ヒト抗体からの重鎖フレームワーク領域をさらに含み、前記重鎖フレームワーク領域は、１以上のマウス残基を含まない。
【０１２０】
本発明の好適な実施形態では、本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、ヒト抗体からの軽鎖フレームワーク領域をさらに含み、前記軽鎖フレームワーク領域は、１以上のマウス残基を含まない。
【０１２１】
「１以上のマウス残基を含まないヒト重鎖フレームワーク領域」又は「１以上のマウス残基を含まないヒト軽鎖フレームワーク領域」とは、マウスのみに存在する１以上のマウス残基を含まない（例えば、マウスのみに存在し、ヒトには存在しない残基への復帰突然変異を含まない）軽鎖又は重鎖フレームワーク領域を意味する。上記定義は、マウスにも存在するヒト残基を含むヒト軽鎖又は重鎖フレームワーク領域を排除するものではない。また、ヒト（例えば、ほとんどのヒトフレームワーク領域に共通の残基）に変異したが、マウスには存在しない残基を有するヒト軽鎖又は重鎖フレームワーク領域は上記定義によって排除されない。
【０１２２】
ヒト抗体からの重鎖又は軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基をさらに含む本発明の実施形態の場合には、重鎖又は軽鎖フレームワーク領域は、１０以下、好ましくは９以下、より好ましくは８以下、さらに好ましくは７以下、最も好ましくは６以下、特に好ましくは５以下、さらに好ましくは４以下、さらに好ましくは３以下、さらに好ましくは２以下、最も好ましくは１個のマウス残基を通常は含む。
【０１２３】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される重鎖可変領域配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示される軽鎖可変領域配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を提供する。
【０１２４】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７で示される重鎖配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８で示される軽鎖配列を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を提供する。
【０１２５】
また、本発明は、マウス抗体ＮＭＣ−４に存在するＣＤＲに対応するＣＤＲ領域と、ヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する重鎖フレームワーク領域と、ヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する軽鎖フレームワーク領域と、を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を提供する。
【０１２６】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及びヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域からの重鎖フレームワーク領域を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を提供する。ヒト重鎖フレームワーク領域のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６に記載する。
【０１２７】
また、本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からの軽鎖フレームワーク領域を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を提供する。ヒト軽鎖フレームワーク領域のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７に記載する。
【０１２８】
また、本発明は、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、又はＨ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）のいずれかを含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を提供する。
【０１２９】
また、本発明は、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、又はＬ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）のいずれかを含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を提供する。
【０１３０】
また、本発明は、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、又はＨ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）の１以上と、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、又はＬ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）の１以上と、を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を提供する。
【０１３１】
また、本発明は、２００８年１月２３日（寄託番号：ＤＳＭ２１０５９）に微生物としてＤＳＭＺに寄託されたベクターＧＳ２６４の核酸配列をコードする軽鎖を含む単離核酸を提供する。
【０１３２】
また、本発明は、２００８年１月２３日（寄託番号：ＤＳＭ２１０６０）に微生物としてＤＳＭＺに寄託されたベクターＧＳ２６５の核酸配列をコードする重鎖を含む単離核酸を提供する。
【０１３３】
従って、本発明は、ベクターＧＳ２６４の核酸配列をコードする軽鎖及びベクターＧＳ２６５の核酸配列をコードする重鎖によってコードされた、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。
【０１３４】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される重鎖可変領域配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示される軽鎖可変領域配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を含むベクターを提供する。
【０１３５】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７で示される重鎖配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８で示される軽鎖配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を含むベクターを提供する。
【０１３６】
また、本発明は、マウス抗体ＮＭＣ−４に存在するＣＤＲに対応するＣＤＲ領域と、ヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する重鎖フレームワーク領域と、ヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する軽鎖フレームワーク領域と、を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を含むベクターを提供する。
【０１３７】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及びヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）からの重鎖フレームワーク領域を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を含むベクターを提供する。
【０１３８】
また、本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からの軽鎖フレームワーク領域を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を含むベクターを提供する。
【０１３９】
また、本発明は、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、又はＨ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）のいずれかを含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を含むベクターを提供する。
【０１４０】
また、本発明は、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、又はＬ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）のいずれかを含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を含むベクターを提供する。
【０１４１】
また、本発明は、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、又はＨ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）の１以上と、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、又はＬ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）の１以上と、を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸を含むベクターを提供する。
【０１４２】
また、本発明は、２００８年１月２３日（寄託番号：ＤＳＭ２１０５９）に微生物としてＤＳＭＺに寄託されたベクターＧＳ２６４の核酸配列をコードする軽鎖を含む単離核酸を含むベクターを提供する。
【０１４３】
また、本発明は、２００８年１月２３日（寄託番号：ＤＳＭ２１０６０）に微生物としてＤＳＭＺに寄託されたベクターＧＳ２６５の核酸配列をコードする重鎖を含む単離核酸を含むベクターを提供する。
【０１４４】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される重鎖可変領域配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示される軽鎖可変領域配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０１４５】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７で示される重鎖配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８で示される軽鎖配列を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０１４６】
また、本発明は、マウス抗体ＮＭＣ−４に存在するＣＤＲに対応するＣＤＲ領域と、ヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する重鎖フレームワーク領域と、ヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する軽鎖フレームワーク領域と、を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０１４７】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及びヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）からの重鎖フレームワーク領域を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０１４８】
また、本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からの軽鎖フレームワーク領域を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０１４９】
また、本発明は、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、又はＨ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）のいずれかを含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０１５０】
また、本発明は、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、又はＬ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）のいずれかを含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０１５１】
また、本発明は、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、又はＨ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）の１以上と、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、又はＬ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）の１以上と、を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０１５２】
また、本発明は、２００８年１月２３日（寄託番号：ＤＳＭ２１０５９）に微生物としてＤＳＭＺに寄託されたベクターＧＳ２６４の核酸配列をコードする軽鎖を含む単離核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０１５３】
また、本発明は、２００８年１月２３日（寄託番号：ＤＳＭ２１０６０）に微生物としてＤＳＭＺに寄託されたベクターＧＳ２６５の核酸配列をコードする軽鎖を含む単離核酸を含む宿主細胞を提供する。
【０１５４】
また、本発明は、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントの製造方法であって、本願明細書に開示する宿主細胞を培養して核酸を発現させ、前記抗体を製造することを含む方法に関する。本発明のヒト化抗体又はその結合性フラグメントの製造方法は、宿主細胞培養物から抗体を回収することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞培地から抗体を回収するすることができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞を培養する前に、重鎖可変領域をコードする核酸を含むベクター及び軽鎖可変領域をコードする核酸を含むベクターによる宿主細胞に対する共トランスフェクションを行うことができる。
【０１５５】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される重鎖可変領域配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示される軽鎖可変領域配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを含む組成物を提供する。
【０１５６】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される重鎖可変領域配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示される軽鎖可変領域配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、製薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物を提供する。
【０１５７】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７で示される重鎖配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８で示される軽鎖配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを含む組成物を提供する。
【０１５８】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７で示される重鎖配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８で示される軽鎖配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、製薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物を提供する。
【０１５９】
また、本発明は、マウス抗体ＮＭＣ−４に存在するＣＤＲに対応するＣＤＲ領域と、ヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する重鎖フレームワーク領域と、ヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する軽鎖フレームワーク領域と、を含む、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、製薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物を提供する。
【０１６０】
また、本発明は、ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及びヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域からの重鎖フレームワーク領域を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、製薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物を提供する。
【０１６１】
また、本発明は、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からの軽鎖フレームワーク領域を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、製薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物を提供する。
【０１６２】
本発明は、重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）と、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）と必要に応じて、ヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からの軽鎖フレームワーク領域及び／又はヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域からの重鎖フレームワーク領域と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、製薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物を提供する。
【０１６３】
また、本発明は、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、Ｈ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）のいずれかを含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを含む組成物を提供する。
【０１６４】
本発明は、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）のいずれかを含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、製薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物を提供する。
【０１６５】
また、本発明は、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、又はＨ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）のいずれかと、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、又はＬ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）のいずれと、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、製薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物を提供する。
【０１６６】
また、本発明は、本願明細書に開示する第１のヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、ｖＷＦのＡ１ドメインに結合する第２の抗体と、を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、第２の抗体はＡＪＷ−２００である。
【０１６７】
また、本発明は、被投与者（例えば、ヒト）におけるｖＷＦ媒介疾患又は障害（例えば、血栓症又は血栓疾患）を治療するための方法であって、治療有効量の、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される重鎖可変領域配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示される軽鎖可変領域配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はそのフラグメントを前記被投与者に投与することを含む方法を提供する。
【０１６８】
また、本発明は、被投与者（例えば、ヒト）におけるｖＷＦ媒介疾患又は障害（例えば、血栓症又は血栓疾患）を治療するための方法であって、治療有効量の、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７で示される重鎖配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８で示される軽鎖配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はそのフラグメントを前記被投与者に投与することを含む方法を提供する。
【０１６９】
また、本発明は、被投与者（例えば、ヒト）におけるｖＷＦ媒介疾患又は障害（例えば、血栓症又は血栓疾患）を治療するための方法であって、治療有効量の、マウス抗体ＮＭＣ−４に存在するＣＤＲに対応するＣＤＲ領域と、ヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する重鎖フレームワーク領域と、ヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する軽鎖フレームワーク領域と、を含む、ヒトｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを前記被投与者に投与することを含む方法を提供する。
【０１７０】
また、本発明は、被投与者（例えば、ヒト）におけるｖＷＦ媒介疾患又は障害（例えば、血栓症又は血栓疾患）を治療するための方法であって、治療有効量の、ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及びヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域からの重鎖フレームワーク領域を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はそのフラグメントを前記被投与者に投与することを含む方法を提供する。
【０１７１】
血栓疾患は、心臓血管疾患又は虚血性脳卒中等の脳血管疾患であってもよい。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化、再狭窄、口峡炎、急性心筋梗塞、急性冠症候群又は糖尿病に伴う心臓血管疾患である。いくつかの実施形態では、血栓症又は血栓疾患は、血管炎症、静脈血栓症、鎌状赤血球病、異種移植拒絶反応、末梢血管疾患、血栓性血小板減少性紫斑症、嚢胞性繊維症、血管性認知症、レイノー病、関節リウマチ又は糖尿病である。いくつかの実施形態では、脳血管障害は、脳動脈梗塞及び腺窩性小梗塞による虚血性脳卒中及び血管性認知症を含んでもよい。また、ヒト化ｖＷＦ抗体は、再発性脳卒中又は脳血管炎症によって引き起こされた脳卒中の予防に使用することができる。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、血栓症又は血栓疾患は癌を含んでもよい。
【０１７３】
本発明は、被投与者（例えば、ヒト）におけるｖＷＦ媒介疾患又は障害（例えば、血栓症又は血栓疾患）を治療するための方法であって、治療有効量の、軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、ＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）及びヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からの軽鎖フレームワーク領域を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はそのフラグメントを前記被投与者に投与することを含む方法を提供する。
【０１７４】
また、本発明は、被投与者（例えば、ヒト）におけるｖＷＦ媒介疾患又は障害（例えば、血栓症又は血栓疾患）を治療するための方法であって、治療有効量の、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）又はＨ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）のいずれかを含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はそのフラグメントを前記被投与者に投与することを含む方法を提供する。
【０１７５】
本発明は、被投与者（例えば、ヒト）におけるｖＷＦ媒介疾患又は障害（例えば、血栓症又は血栓疾患）を治療するための方法であって、治療有効量の、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、又はＬ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）のいずれかを含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はそのフラグメントを前記被投与者に投与することを含む方法を提供する。
【０１７６】
また、本発明は、被投与者における（例えば、ヒト）ｖＷＦ媒介疾患又は障害（例えば、血栓症又は血栓疾患）を治療するための方法であって、治療有効量の、重鎖可変領域：Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、又はＨ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）のいずれかと、軽鎖可変領域：Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、又はＬ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）のいずれかと、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はそのフラグメントを前記被投与者に投与することを含む方法を提供する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は作動因子機能を有していない。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＩｇＧ４に由来するＦｃ領域を含む。
【０１７８】
本発明は、有意な出血の臨床的徴候を引き起こすことなく、ＥＤ１００の１〜約２５０倍の治療有効量で投与することができる、ヒトフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントを提供する。好ましくは、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、ヒトｖＷＦのＡ１ドメインに特異的である。より好ましくは、ｖＷＦに特異的なヒト抗体又はその結合性フラグメントは、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントである。
【０１７９】
また、本発明は、被投与者（好ましくはヒト）におけるｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するための方法であって、本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントを、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．００２〜約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．００２〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．００５〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．０１〜約０．１ｍｇ／ｋｇの治療有効量で前記被投与者に投与する方法を提供する。
【０１８０】
また、本発明は、ｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するための方法であって、本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントを、ＥＤ１００の約１〜約２５０倍、好ましくは約１〜約２００倍、より好ましくは約１〜約１００倍の治療有効量で被投与者に投与する方法を提供する。
【０１８１】
また、本発明は、ｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するための方法であって、治療有効量の本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントを治療を必要とする被投与者に１又は複数の投与によって投与する方法に関する。
【０１８２】
また、本発明は、ｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するための方法であって、治療有効量の本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントを治療を必要とする被投与者に皮下投与する方法に関する。
【０１８３】
また、本発明は、ｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するための方法であって、治療有効量の本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントを治療を必要とする被投与者に静脈内投与する方法に関する。
【０１８４】
また、本発明は、ｖＷＦ媒介疾患又は障害（例えば、血栓症又は血栓疾患）を治療するための方法であって、治療有効量の本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントを、放射線治療（例えば、放射性物質の照射又は導入（例えば、ＵＩＣＣ（Ｅｄ．），Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ  Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８２）を参照））と順次又は組み合わせて、治療を必要とする被投与者に投与する方法に関する。
【０１８５】
本発明の実施又は試験において本願明細書に開示する方法及び材料と同等又は均等な方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法及び材料は本願明細書に開示する方法及び材料である。
【０１８６】
ヒト化フォンウィレブランド因子抗体の製造
本発明は、ヒト化フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）抗体（例えば、マウスＮＭＣ−４）又はその結合性フラグメントの製造方法を提供する。ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、ヒト以外の動物（例えば、マウス）からのＶＨ及び／又はＶＬ領域からの１以上のＣＤＲ又はその一部を、ヒトＶＨ及び／又はＶＬ領域からの１以上のフレームワーク領域に導入することによって製造することができる。必要に応じて、ＶＨ及び／又はＶＬ領域に存在するヒトフレームワーク残基を、結合親和性を維持するために必要又は望ましい対応する非ヒト（例えば、マウス）残基によって置換することができる。必要に応じて、ＣＤＲに存在する非ヒトアミノ酸残基をヒト残基によって置換することができる。
【０１８７】
本願明細書に開示するフレームワーク及びＣＤＲ（ＨＦＲ１及びＨＣＤＲ１は除く）の分類は、Ｋａｂａｔ付番方式に基づくものである。この定義では、重鎖のＣＤＲは残基３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）を含み、軽鎖のＣＤＲは残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、８９〜９７（ＬＣＤＲ３）を含む。ＶＨ（例えば、重鎖フレームワーク領域１（ＨＦＲ１）、重鎖フレームワーク領域２（ＨＦＲ２）、重鎖フレームワーク領域３（ＨＦＲ３）及び／又は重鎖フレームワーク領域４（ＨＦＲ４））のフレームワーク領域は、残基１〜３０（ＨＦＲ１）、３６〜４９（ＨＦＲ２）、６６〜９４（ＨＦＲ３）、１０３〜１１３（ＨＦＲ４）を含み、ＶＬのフレームワーク領域は、残基１〜２３（ＬＦＲ１）、３５〜４９（ＬＦＲ２）、５７〜８８（ＬＦＲ３）、９８〜１０７（ＬＦＲ４）を含む（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，１９７０  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１）。一方、ＣＤＲの構造に基づき、ＣｈｏｔｈｉａはＣＤＲ１−Ｈが残基２６〜３２を含むと定義している（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９）。ＡｂＭ（抗体モデル）定義は、ＣＤＲ１−Ｈが残基２６〜３５を含むとするＯｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデルソフトウェアが使用する折衷案である。ＮＭＣ−４を使用する本願明細書に開示するヒト化方法は、この定義を使用する。
【０１８８】
フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、ＮＭＣ−４からの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域におけるフレームワーク領域に対応する重鎖フレームワーク領域に導入し、ＮＭＣ−４からの軽鎖ＣＤＲを、ヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域におけるフレームワーク領域に対応する軽鎖フレームワーク領域に導入することによって製造することができる。
【０１８９】
また、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体は、マウスＮＭＣ−４からの１以上の重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９））を、ヒトフレームワーク領域（例えば、ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域からのフレームワーク領域）に導入することによって製造することができる。
【０１９０】
また、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体は、１以上の軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２））を、ヒトフレームワーク領域（例えば、ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からのヒトフレームワーク領域）に導入することによって製造することができる。
【０１９１】
また、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体は、マウスＮＭＣ−４からの１以上の重鎖ＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９））を、ヒトフレームワーク領域（例えば、ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域からのフレームワーク領域）に導入し、１以上の軽鎖ＣＤＲ（例えば、ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２））を、ヒトフレームワーク領域（例えば、ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からのヒトフレームワーク領域）に導入することによって製造することができる。
【０１９２】
ｖＷＦに特異的なヒト化抗体は、ＮＭＣ−４に存在するＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域を含む修飾重鎖可変領域（例えば、Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、Ｈ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）をヒト定常領域に導入することによって製造することができる。
【０１９３】
また、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体は、ＮＭＣ−４に存在するＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域を含む修飾軽鎖可変領域（例えば、Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０））をヒト定常領域に導入することによって製造することができる。
【０１９４】
ｖＷＦに特異的なヒト化抗体は、ＮＭＣ−４に存在するＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域を含む修飾重鎖可変領域（例えば、Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、Ｈ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）をヒト定常領域に導入し、ＮＭＣ−４に存在するＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域を含む修飾軽鎖可変領域（例えば、Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０））をヒト定常領域に導入することによって製造することができる。
【０１９５】
ヒト化抗体の免疫原性をさらに減少させるために、ＣＤＲにおける残基（例えば、マウス残基）をヒトアミノ酸残基に変更する（例えば、置換する）ことができる。例えば、ヒト化抗体は、ＨＣＤＲ１にＦ２７Ｇ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ及び／又はＶ３４Ｗ置換の１以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＣＤＲ２にＳ６１Ｐ及び／又はＡ６２Ｓ置換の１以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＬＣＤＲ１にＳ２４Ｑ、Ｎ３０Ｓ及び／又はＫ３１Ｎ置換の１以上を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＬＣＤＲ２に１以上の置換、例えば、Ｙ５０Ｄ、Ｔ５１Ａ、Ｓ５３Ｎ、Ｈ５５Ｅ及び／又はＳ５６Ｔ置換を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、ＨＣＤＲ１にＦ２７Ｇ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ及び／又はＶ３４Ｗ置換の１以上を含み、ＨＣＤＲ２にＳ６１Ｐ及び／又はＡ６２Ｓ置換の１以上を含み、ＬＣＤＲ１にＳ２４Ｑ、Ｎ３０Ｓ及び／又はＫ３１Ｎ置換の１以上を含み、ＬＣＤＲ２にＹ５０Ｄ、Ｔ５１Ａ、Ｓ５３Ｎ、Ｈ５５Ｅ及び／又はＳ５６Ｔ置換の１以上を含むことができる。
【０１９６】
様々な形態のヒト化抗体を使用することができる。例えば、ヒト化抗体は、免疫抱合体を生成するために１以上の細胞毒性薬と任意に結合させるＦａｂ等の抗体フラグメントであってもよい。あるいは、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体（ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｍａｔｕｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、完全ＩｇＧ１抗体等の完全抗体であってもよい。
【０１９７】
ヒト化抗体の抗体フラグメントを製造するために様々な方法が開発されている。従来は、これらのフラグメントは完全抗体のタンパク分解によって得ていた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：１０７−１１７（１９９２）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）。現在は、これらのフラグメントは組換え型宿主細胞によって直接製造することができる。例えば、抗体フラグメントは、上述した抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収し、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２））。別の方法では、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え型宿主細胞培養物から直接単離することができる。その他の抗体フラグメント製造方法は当業者には明らかであろう。別の実施形態では、抗体は一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。国際公開第ＷＯ１９９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。また、抗体フラグメントは、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に開示されているような線状抗体であってもよい。
【０１９８】
別の方法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。融合は、少なくともヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインによって行うことが好ましい。第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）は、融合領域の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含むことが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合領域をコードするＤＮＡ及び必要に応じて免疫グロブリン軽鎖を別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に共トランスフェクションする。これにより、３本のポリペプチド鎖を均等ではない比率で使用することによって最適な収量を得る実施形態において、３つのポリペプチドフラグメントの割合を柔軟に調節することができる。ただし、少なくとも２本のポリペプチド鎖を等比で発現させることによって高収量が得られる場合や、比率が特に重要ではない場合には、２又は３本のポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することも可能である。
【０１９９】
また、本発明は、化学療法薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の小分子毒素又はその酵素的に活性な毒素、そのフラグメント及び／又は変異体）、放射性同位体（すなわち、放射性抱合体（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ））等の細胞毒性薬に結合した抗体を含む免疫抱合体に関する。
【０２００】
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えば、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）等のリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間に形成された免疫抱合体を提供する。
【０２０１】
放射性結合ヒト化ｖＷＦ抗体を製造するために放射性同位体を使用することができる。放射性同位体の例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｌｕの放射性同位体が挙げられる。
【０２０２】
抗体と細胞毒性薬の抱合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシニミジル等）、アルデヒド（グルタルデヒド等）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムべンゾイル）エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリレン２，６−ジイソシアネート等）、ビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）等の様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して製造することができる。例えば、リシン免疫毒素はＶｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に開示されているように調製することができる。放射性ヌクレオチドを抗体に結合するためのキレート化剤の例としては、炭素１４−標識１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が挙げられる。国際公開第ＷＯ１９９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞における細胞毒性薬の放出を容易化する開裂性リンカー（ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー又は二硫化物含有リンカー（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２：１２７−１３１（１９９２））を使用することができる。
【０２０３】
ヒト化ｖＷＦ抗体と細胞毒性薬を含む融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成によって製造することができる。
【０２０４】
さらに別の実施形態では、ヒト化ｖＷＦ抗体は、抗体−受容体抱合体を患者に投与し、洗浄剤を使用して未結合抱合体を循環経路から除去した後、細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド）に結合したリガンド（例えば、アビジン）を投与する腫瘍プレターゲッティングにおいて利用するための受容体（ストレプトアビジン等）に結合させることができる。
【０２０５】
本発明の抗体は、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法薬、国際公開第ＷＯ１９８１／０１１４５号を参照）を活性抗ガン剤（例えば、国際公開第ＷＯ１９８８／０７３７８号及び米国特許第４，９７５，２７８号を参照）に転換するプロドラッグ活性化酵素にヒト化ｖＷＦ抗体を結合することによってＡＤＥＰＴにおいて使用することができる。
【０２０６】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫抱合体の酵素成分は、プロドラッグをより活性の高い細胞毒性形態に転換するようにプロドラッグに作用する酵素を含む。
【０２０７】
有用な酵素の例としては、これらに限定されるものではないが、リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に転換するために有用なアルカリホスファターゼ；硫酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に転換するために有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬の５−フルオロウラシルに転換するために有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に転換するために有用な、例えば、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン（カテプシンＢ及びＬ等）等のプロテアーゼ；β−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを転換するために有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に転換するために有用な糖鎖開裂酵素（β−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼ等）；β−ラクタムで誘導化された薬剤を遊離薬物に転換するために有用なβ−ラクタマーゼ；アミン窒素基をフェノキシアセチル基又はフェニルアセチル基で各々誘導化された薬物を遊離薬物に転換するために有用なペニシリンアミダーゼ（ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼ等）が挙げられる。あるいは、アブザイムとして知られる酵素活性を有する抗体を使用して本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２８：４５７−４５８（１９８７）参照）。抗体−アブザイム抱合体は、腫瘍細胞へのアブザイムを送達するために本願明細書に開示するように調製することができる。
【０２０８】
酵素は、上述したヘテロ二官能性架橋試薬を使用する等の周知の方法によってヒト化ｖＷＦ抗体に共有結合させることができる。あるいは、適当な酵素の少なくとも機能的に活性な部分に結合した抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）参照）。
【０２０９】
抗体のその他の修飾も考えられる。例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー等様々な非タンパク様ポリマーの１つに抗体を結合させることができる。また、抗体は、コアセルベーション法、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル等の界面重合法、コロイド（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル）のドラッグデリバリシステム、マクロ乳化等によってマイクロカプセル化することもできる。このような方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第ｌ６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０２１０】
また、本願明細書に開示するヒト化ｖＷＦ抗体は、免疫リポソームとして製剤化することができる。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号；１９９７年１０月２３日に公開された国際公開第ＷＯ１９９７／３８７３１号に開示されているように公知の方法によって調製する。循環時間が改善されたリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０２１１】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を使用して逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは所定の孔径を有するフィルターから押し出して所望の直径を有するリポソームを得る。抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド相互交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるようにリポソームに結合させることができる。必要に応じて、化学療法薬をリポソーム内に含有させる。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照されたい。
【０２１２】
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
また、本発明は、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体及びその結合性フラグメントをコードする単離核酸、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞、抗体又はその結合性フラグメントを製造するための組換え技術を提供する。
【０２１３】
抗体を組換えによって製造する場合には、抗体をコードする核酸を単離し、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクターに挿入することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは単離し、従来の方法によって（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）配列を決定することができる。多くのベクターを利用することができる。ベクター成分の例として、これらに限定されるものではないが、シグナル配列、複製起点、１以上の標識遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列の１以上が挙げられる。
【０２１４】
（ｉ）シグナル配列成分
本願明細書に開示するヒト化ｖＷＦ抗体は、組換えによって直接製造するだけではなく、好ましくはシグナル配列又は成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ−末端に特異的開裂部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドを含む組換え体として製造することもできる。異種シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞によって認識及びプロセッシングされる（例えば、シグナルペプチダーゼによって開裂する）配列である。ヒト化ｖＷＦ抗体シグナル配列を認識及びプロセッシングしない原核宿主細胞の場合、前記シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ及び耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーからなる群から選択される原核シグナル配列で置換することができる。酵母の分泌の場合には、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス及びクルイベロミセスα因子リーダー等）、酸ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダー又は国際公開第ＷＯ１９９０／１３６４６に開示されたシグナルによって天然型シグナル配列が置換されていてもよい。哺乳動物細胞の発現において、哺乳動物シグナル配列及びウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルを使用することができる。
【０２１５】
そのような前駆体領域のＤＮＡは、読み取りフレーム内においてヒト化ｖＷＦ抗体をコードするＤＮＡに連結することができる。
【０２１６】
（ｉｉ）複製起点成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、１以上の選択された宿主細胞内でベクターの複製を可能とする核酸配列を含む。通常、上記配列は、クローニングベクターにおいて宿主の染色体ＤＮＡとは独立してベクターの複製を可能とし、複製起点又は自己複製配列を含む。そのような配列は、様々な細菌、酵母、ウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点はほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド起点は酵母に好適であり、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに好適である。通常、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターには必要ではない（通常、初期プロモーターを含むためにＳＶ４０起点が使用される）。
【０２１７】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。代表的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラサイクリン等な抗生物質又は他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、（ｃ）複合培地（例えば、杆菌のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）から得られない必要又は所望の栄養分を供給するタンパク質をコードする。
【０２１８】
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を阻害する薬剤を使用する。異種遺伝子によって形質転換された細胞は、薬剤耐性を与えるタンパク質を産生し、選択レジメンを切り抜ける。このような優性選択の例では、ネオマイシン、マイコフェノール酸及びハイグロマイシン等の薬剤を使用する。
【０２１９】
哺乳動物細胞に好適な選択可能マーカーの別の例としては、ヒト化ｖＷＦ抗体をコードする核酸、例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉ及び−ＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等を取り込むことができる細胞の同定を可能とするマーカーが挙げられる。
【０２２０】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的拮抗薬であるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含む培地で形質転換体を培養して同定する。野生型ＤＨＦＲを使用する場合に適当な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞株である。
【０２２１】
あるいは、ヒト化ｖＷＦ抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質及び他の選択可能マーカー（アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）等）をコードするＤＮＡ配列で形質転換又は同時形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８を含む選択可能なマーカーの選択物質を含む培地における細胞増殖によって選択することができる（例えば、米国特許第４，９６５，１９９号を参照）。
【０２２２】
酵母において好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子により、トリプトファンにおける増殖能力がない酵母の突然変異株、例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４−１の選択マーカーが得られる（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７））。酵母宿主細胞ゲノムのｔｒｐ１病変の存在により、トリプトファンの不在下での増殖による形質転換を検出する有効な環境が提供される。同様に、Ｌｅｕ２遺伝子を有するプラスミドにより、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ  ２０，６２２又は３８，６２６）を使用することができる。
【０２２３】
また、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１に由来するベクターをクルイベロミセス酵母の形質転換に使用することができる。あるいは、Ｋ．ｌａｃｔｉｓの組換え型仔ウシキモシンの大規模産生のための発現方法がＶａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）に報告されている。クルイベロミセスの工業用菌株による成熟組換え型ヒト血清アルブミンの分泌のための安定なマルチコピー発現ベクターも開示されている（Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））。
【０２２４】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、宿主生物によって認識され、ヒト化ｖＷＦ抗体をコードする核酸に作動的に結合することができるプロモーターを通常は含む。原核生物宿主との使用に好適なプロモーターの例としては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系及びｔａｃプロモーター等のハイブリッドプロモーターが挙げられる。ただし、他の公知の細菌プロモーターも適している。また、細菌系において使用するプロモーターは、ヒト化ｖＷＦ抗体をコードするＤＮＡに作動的に結合されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含むことができる。
【０２２５】
真核生物についてのプロモーター配列は公知である。真核細胞遺伝子は、転写開始部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始部位から７０〜８０上流にある他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）領域である。ほとんどの真核遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端にポリＡ尾部を付加するためのシグナルであるＡＡＴＡＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）配列である。これらの配列は真核細胞発現ベクターに好適に挿入される。酵母宿主と共に使用するために好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又はエノラーゼ等の他の解糖系酵素、グリセルアルデヒド３‐リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、グルコキナーゼが挙げられる。
【０２２６】
転写が増殖条件によって制御されるという利点をさらに有する誘発性プロモーターである他の酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝関連分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド３‐リン酸デヒドロゲナーゼ、マルトース及びガラクトースの利用に関与する酵素のためのプロモーター領域が挙げられる。酵母の発現に使用するための好適なベクター及びプロモーターは欧州特許第７３，６５７号にさらに記載されている。また、酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に有利に使用することができる。
【０２２７】
哺乳動物宿主細胞のベクターからのヒト化ｖＷＦ抗体の転写は、宿主細胞系と適合性を有する、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られたプロモーター、異種哺乳動物プロモーター（アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター等）から得られたプロモーター及びヒートショックプロモーターによって制御される。
【０２２８】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得ることができる。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして簡便に得られる。ウシ乳頭腫ウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための方法が、例えば米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。上記方法の変形が米国特許第４，６０１，９７８号に開示されている。Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）は、単純疱疹ウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現について記載している。あるいは、ｒｏｕｓ肉腫ウイルスの末端反復配列をプロモーターとして使用することができる。
【０２２９】
（ｖ）エンハンサー要素成分
高等真核生物による本発明のヒト化ｖＷＦ抗体をコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって高めることができる。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）からの多くの有用なエンハンサー配列が知られている。ただし、真核細胞ウイルスからのエンハンサ配列も有用である。例えば、複製開始点の後期側（ｂｐ１００−２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側にあるポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）は、真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサー要素について記載している。エンハンサーは、ヒト化ｖＷＦ抗体をコードする配列に対して５’位置又は３’位置でベクターにスプライスされ、好ましくはプロモーターから５’位置に位置する。
【０２３０】
（ｖｉ）転写停止成分
真核生物宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物からの有核細胞）に使用される発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写停止及び安定化に必要な配列を含むことができる。そのような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの非翻訳領域の５’（場合によっては３’）末端から得ることができる。これらの領域は、ヒト化ｖＷＦ抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。有用な転写停止成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域（例えば、国際公開第ＷＯ１９９４／１１０２６号及び国際公開第ＷＯ１９９４／１１０２６号に開示された発現ベクターを参照）である。
【０２３１】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質変換
ベクター内におけるＤＮＡのクローニング又は発現に好適な宿主細胞としては、原核細胞、酵母又は高等真核生物細胞が挙げられる。この目的のために好適な原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性菌等の真正細菌、例えば、エシェリキア属等の腸内細菌（大腸菌エンテロバクター属、エルウイニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属（ネズミチブス菌等）、セラシア属（セラチアマルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ））及び赤痢菌、杆菌（枯草菌及びバシラス・リセニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等）、シュードモナス属（緑膿菌等）、ストレプトミセス属が挙げられる。大腸菌クローニング宿主としては、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）、大腸菌  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）が挙げられる。
【０２３２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の真核性微生物もヒト化ｖＷＦ抗体をコードするベクターの好適なクローニング又は発現宿主である。出芽酵母（通常のパン酵母）が発現に有用である。また、多くの他の属、種及び株、例えば、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ブルガリカス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ウィッケラミ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ウオルティ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）又はＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）等のクルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主；ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）（欧州特許第４０２，２２６号）；フィチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（欧州特許第１８３，０７０号）；カンジダ属；トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（欧州特許第２４４，２３４号）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属（シュワニオマイセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ））；糸状菌（ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ））、アスペルギルス属宿主（Ａ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）等）等も利用可能であり、有用である。
【０２３３】
グリコシル化ヒト化ｖＷＦ抗体の発現に好適な宿主細胞は多細胞生物に由来する。真核細胞の例としては、植物、昆虫及び脊椎動物細胞が挙げられる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（芋虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、ボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）等の宿主から多くのバキュロウイルス株、変異株及び対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、オートグラファ・カリホルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体及びボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）ＮＰＶのＢｍ−５株が入手可能であり、このようなウイルスは、本発明に係るウイルス、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに使用することができる。
【０２３４】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、タバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。
【０２３５】
ただし、脊椎動物細胞に最も注目されており、多様な培養物（組織培養物）における脊椎動物細胞の増殖が通常使用されている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＣｈＫ２細胞（Ｃｈｒｏｍｏｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）；  ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎細胞株（増殖のために浮遊培養物中でサブクローンされた２９３又は２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞（Ｓｉｍｍｏｎｓ，１９９０  Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７５：３０９）；ＳＰ２脾臓骨髄腫融合細胞（Ｈａａｓ  ａｎｄ  Ｗａｂｌ，１９８４，ＰＮＡＳ  ８１：７１８５）；チャイニーズハムスター卵胞細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０）、ＤＧ４４（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．，１２：５５５−５６６（１９８６））及びＤＰ１２細胞株等）；マウスセルトリ（ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝細胞癌細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。宿主細胞は、ヒト化ｖＷＦ抗体を製造するための上述した発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、目的の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修飾された従来の栄養培地内で培養する。
【０２３６】
また、本発明のヒト化抗体を製造するために、高濃度の抗体を発現する安定した細胞株を使用することもできる。例えば、多重部位特異的な再結合受容体部位を含むように設計されたマウス人工染色体発現（ＡＣＥ）プラットホームに基づく高収量哺乳動物タンパク質発現系に、ターゲットシャトルベクターと共に変異ラムダインテグラーゼ（例えば、ＡＣＥインテグラーゼ）を使用して異種遺伝子配列を導入することができる（Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ，（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３２（２１）：ｅ１７２（２００４）；米国特許出願公開第２００３／０１１９１０４  Ａ１号及び米国特許出願公開第２００６／０２４６５８６  Ａ１号）。この発現系は、選択されたヒト化変異体及びＮＭＣ−４キメラの発現のための安定した細胞株を生成するために使用することができる。
【０２３７】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
ヒト化ｖＷＦ抗体を製造するために有用な宿主細胞は様々な培地内で培養することができる。市販の培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）は宿主細胞の培養に適している。また、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；米国特許第４，６５７，８６６号；米国特許第４，９２７，７６２号；米国特許第４，５６０，６５５号；米国特許第５，１２２，４６９号；国際公開第ＷＯ１９９０／０３４３０；国際公開第ＷＯ１９８７／００１９５；又は米国再発行特許第３０，９８５号に記載された任意の培地を宿主細胞の培地として使用することができる。これらの培地には、必要に応じてホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、上皮細胞成長因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシン、チミジン等）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬剤等）、痕跡元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物）、グルコース又は同等のエネルギー源を添加することができる。その他の必要な補充物質も当業者に公知の適切な濃度で添加することができる。温度及びｐＨ等の様々な培養条件は、発現のために選択する宿主細胞に応じて使用することができる。
【０２３８】
（ｉｘ）ヒト化ｖＷＦ抗体の精製
組換え技術を使用する場合には、抗体を細胞内で製造するか、細胞周辺腔内で製造するか、培地に直接分泌させることができる。抗体を細胞内で製造する場合には、第１の工程として、例えば遠心分離又は限外濾過によって粒子状片（宿主細胞又は溶解フラグメント）を除去することができる。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌される抗体を単離するための方法について記載している。簡単に説明すると、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で細胞ペーストを約３０分間にわたって解凍する。細胞片は遠心分離によって除去することができる。抗体を培地に分泌させる場合には、ＡＭＩＣＯＮ（商標）又はＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＰＥＬＬＩＣＯＮ（商標）限外濾過装置等の市販のタンパク質濃縮フィルターを使用して発現系の上清を濃縮する。タンパク質分解を阻害するためにフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）等のプロテアーゼ阻害剤を上述した工程のいずれかにおいて添加してもよく、汚染物質の成長を防止するために抗生物質を添加することもできる。
【０２３９】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製方法である。プロテインＡのアフィニティリガンドとしての適性は、抗体に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧはマウスのアイソタイプ及びヒトγ３に使用することができる（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５１６１５１７（１９８６））。アフィニティリガンドが結合するマトリックスとしてはアガロースを使用することができ、他のマトリックスも使用することができる。孔制御ガラスやポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等の機械的に安定なマトリックスの場合には、アガロースと比較して流量の向上及び処理時間の短縮が可能となる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合には、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ    ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。他のタンパク質精製方法、例えば、イオン交換カラム、エタノール沈殿、シリカを使用する逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）を使用するクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）を使用するクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫安塩析も回収する抗体に応じて使用することができる。
【０２４０】
製剤
本発明は、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体を含む製剤を提供する。ヒト化ｖＷＦ抗体の製剤は、保存を目的として、所望の純度を有する抗体を任意の製薬学的に許容し得る担体、賦形剤又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合して凍結乾燥製剤又は水溶液として調製する。使用することができる担体、賦形剤又は安定化剤は、採用する用量及び濃度において被投与者に無毒であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸やメチオニン等の酸化防止剤；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール、べンジルアルコール；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、べンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、イムノグロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリン等の単糖類、二糖類、その他の糖類；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；蔗糖、マンニトール、トレハロース、ソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（Ｚｎタンパク錯体等）；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン界面活性剤が例として挙げられる。好ましい凍結乾燥ヒト化ｖＷＦ製剤は国際公開第ＷＯ１９９７／０４８０１号に開示されている。国際公開第ＷＯ１９９７／０４８０１号の開示内容は、この参照によって本願明細書に援用する。
【０２４１】
また、抗体製剤は、治療する特定の適応症に必要な２種以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有する化合物を含むことができる。上記化合物の代わりとして、又は上記化合物に加えて、組成物は、化学療法薬、細胞毒性薬、サイトカイン、増殖阻害物質、抗ホルモン剤、ヒト化ｖＷＦ薬剤、抗血管新生剤及び／又は心臓保護剤をさらに含むことができる。そのような分子は、意図した目的に有効な量において組み合わせて使用する。
【０２４２】
また、活性成分は、コアセルベーション法、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル等の界面重合法、コロイド（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル）のドラッグデリバリシステム、マクロ乳化等によってマイクロカプセル化することもできる。このような方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第ｌ６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）に開示されている。
【０２４３】
徐放製剤を調製することもできる。徐放製剤の好適な例としては、抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性基材が挙げられ、半透過性基材はフィルム又はマイクロカプセル等の成形品である。徐放基材の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）等）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能な小球体）等の分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸が挙げられる。
【０２４４】
生体内投与に使用する製剤は無菌状態としなければならない。無菌状態は、無菌濾過膜による濾過によって達成される。
【０２４５】
ヒト化ｖＷＦ抗体による治療
ヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントは、様々なｖＷＦ関連疾患又は障害を治療するために使用することができる。疾患又は障害の例としては、血栓症又は血栓疾患が挙げられる。血栓疾患の例としては、心臓血管疾患又は虚血性脳卒中等の脳血管疾患が挙げられる。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化、再狭窄、口峡炎、急性心筋梗塞、急性冠症候群又は糖尿病に伴う心臓血管疾患であってもよい。いくつかの実施形態では、血栓症又は血栓疾患は、血管炎症、静脈血栓症、鎌状赤血球病、異種移植拒絶反応、末梢血管疾患、血栓性血小板減少性紫斑症、嚢胞性繊維症、血管性認知症、レイノー病、関節リウマチ又は糖尿病であってもよい。いくつかの実施形態では、脳血管障害は、脳動脈梗塞及び腺窩性小梗塞による虚血性脳卒中及び血管性認知症を含む。また、ヒト化ｖＷＦ抗体は、再発性脳卒中又は脳血管炎症によって引き起こされた脳卒中の予防に使用することができる。急性冠状動脈症候群の場合には、ヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントはＳＴ診断患者の治療のために特に適している。ヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントは、血塊の形成を防止するための術後治療にも使用することができる。
【０２４６】
また、例えば、検出対象分子に結合し、検出可能な標識（例えば、放射性同位体）でタグ付けされた分子（抗体等）を投与し、標識の位置を特定するために外部から患者をスキャンすることによって、生体内診断検定を使用してｖＷＦの過剰発現又は増幅を評価することができる。
【０２４７】
ある実施形態では、細胞毒性薬に結合したヒト化ｖＷＦ抗体を含む免疫抱合体を患者に投与する。好ましくは、免疫抱合体及び／又は免疫抱合体が結合したヒト化ｖＷＦ抗体は細胞に取り込まれ、免疫抱合体が結合した癌細胞を殺す際に免疫抱合体の治療効率が向上する。好適な実施形態では、細胞毒性薬（マイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼ、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ等）は、癌細胞内の核酸を標的とするか、阻害する。別の実施形態では、細胞毒性薬（タキサン又はエポチロン等）は、癌細胞内の微小管及び微小管依存有糸分裂を標的とするか、阻害する。
【０２４８】
ヒト化ｖＷＦ抗体又は免疫抱合体は、公知の方法、例えば、静脈内投与（例えば、ボーラス）、連続点滴、筋肉内投与、腹腔内投与、脳脊髄内投与、皮下投与、関節内投与、滑液嚢内投与、くも膜下腔内投与、経口投与、局所投与又は吸入投与によってヒト患者に投与することができる。抗体の静脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与が好ましく、皮下投与又は腹腔内投与が特に好ましい。好ましい投与計画は、治療する哺乳動物、抗体の種類及び医師に周知のその他の要因に応じて、急性障害の場合には１回の投与又は慢性疾患の場合には３〜４週間に約１回の投与とする。ただし、その他の投与計画も採用することができる。
【０２４９】
他の治療計画をヒト化ｖＷＦ抗体の投与と組み合わせることができる。組み合わせ投与としては、別々の製剤又は単一の製剤を使用する併用投与及び任意の順序での連続投与が挙げられ、好ましくは双方（全て）の活性物質が同時に生物学的活性を発揮するように時間をおいてもよい。
【０２５０】
一実施形態では、心筋梗塞、脳梗塞又は他の脳血管障害によって引き起こされた虚血を治療する場合には、治療は、ヒト化抗ｖＷＦ抗体と、アルテプラーゼ、デスモテプラーゼ又はマイクロプラスミン等の線維素溶解薬及び／又はアスピリン、ジピリダモール又はクロピドグレル等の抗血小板薬の組み合わせ投与を含むことができる。
【０２５１】
また、ヒト化ｖＷＦ抗体の投与と別の腫瘍関連抗原に対する抗体の投与を組み合わせることが望ましい場合もある。
【０２５２】
一実施形態では、本発明の治療は、ヒト化抗ｖＷＦ抗体と、１以上の哺乳動物免疫機能調整剤（サイトカイン等）、化学療法薬又はは増殖阻害剤の組み合わせ投与を含むことができ、異なる化学療法薬のカクテルの併用投与を行うこともできる。好ましい化学療法薬としては、タキサン（パクリタクセル、ドセタクセル等）及び／又はアントラサイクリン抗生物質が挙げられる。そのような化学療法薬の調製及び投与計画は、製造者の指示に応じて決定するか、熟練した医師が経験的に決定する。そのような化学療法の調製及び投与計画は、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９２）にも記載されている。
【０２５３】
ヒト化ｖＷＦ抗体は、抗ホルモン化合物、例えば、タモキシフェン等の抗卵胞ホルモン化合物又はアナストロゾール等のアロマターゼ阻害薬；オナプリストン等の抗プロゲステロン（欧州特許第６１６  ８１２号を参照）；又はフルタミド等の抗アンドロゲンと、そのような分子に公知の用量で組み合わせることができる。治療する癌がホルモン非依存性癌である場合には、患者に対して抗ホルモン療法を予め行い、癌がホルモン非依存性になった後に、ヒト化ｖＷＦ抗体（及び本願明細書に記載する任意の他の物質）を患者に投与することができる。
【０２５４】
疾患の予防又は治療のための抗体の適切な投与量は、治療する疾患の種類、疾患の重症度と経過、抗体を投与する目的（予防又は治療）、薬歴、患者の病歴と抗体への反応、主治医の裁量に応じて異なる。抗体は患者に一度に投与するか、一連の治療において投与することができる。疾患の種類と重症度並びに抗体の除去速度に応じて、例えば、１回以上の投与又は連続点滴による抗体の患者への初期侯補投与量は約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）である。通常の１日当たりの投与量は、上述した要因に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲とすることができる。症状に応じて数日以上にわたって繰り返し投与する場合には、症状の所望の抑制が生じるまで治療を持続することができる。
【０２５５】
ヒト化ｖＷＦ抗体の好ましい投与量は約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。約０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はそれらの組み合わせ）の１以上の投与量で患者に投与することができる。そのような投与量の場合には、断続的（例えば、毎週、２週間毎、３週間毎又は４週間毎）に（例えば、ヒト化ｖＷＦ抗体を患者が約２〜約２０回（例えば、約６回）投与されるように）投与することができる。最初に高い負荷投与量で投与を行った後、１以上の低い負荷投与量で投与することができる。投薬計画の一例として、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量で投与を行った後、約２ｍｇ／ｋｇのヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントを毎週維持投薬する。ただし、その他の投与計画も有用である。治療の進展は、通常の方法及び測定によって容易に監視することができる。
【０２５６】
ヒヒにおける本願明細書に開示するヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントの有効性と安全を評価する研究では、予期せぬことに、ヒト化抗体は非常に低い投与量（例えば、低いμｇ／ｋｇの範囲）で生体内において血小板凝集を防止する（例えば、減少又は改善する）ために有効であることが判明した。これは、ｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療する際の予期せぬ前例のない結果である。小さな切り傷からの出血（例えば、切開出血試験で測定したテンプレート出血時間及び／又は出血量）が増加したこと以外は、これらの濃度において出血の臨床的徴候は観察されなかった。さらに驚くべきことに、ＥＤ１００の約１〜約２５０倍の投与量では、小さな切り傷からの出血は観察されるが、有意な出血の臨床的徴候は観察されない。従って、本願明細書に開示するヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントは、ヒトにおけるｖＷＦ関連疾患又は障害を治療するために有効であると思われる。
【０２５７】
本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇの治療有効量で被投与者（好ましくはヒト）に投与することができる。好ましくは、治療有効量は、約０．００２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．００２〜約１０ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは約０．００２〜約０．４ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは約０．００５〜約０．２ｍｇ／ｋｇであり、最も好ましくは約０．０１〜約０．１ｍｇ／ｋｇのヒト化抗体又はその結合性フラグメントを被投与者（好ましくはヒト）に投与する。治療有効量のヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントは、１以上の治療有効投与量で投与することができる。投与される治療有効量のヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントは、有意な出血の臨床的徴候を引き起こすためには通常は不十分だが、血小板凝集を抑制するためには十分である。すなわち、治療有効量のヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントは、有意な出血の臨床的徴候を引き起こすことなく（例えば、小さな切り傷からの出血の増加を除き、出血の臨床的徴候を引き起こすことなく）投与することができる。
【０２５８】
本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、約０．００２〜約０．４ｍｇ／ｋｇ又は約０．００５〜約０．２ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１〜約０．１ｍｇ／ｋｇの治療有効投与量で被投与者（好ましくはヒト）に投与して被投与者における治療効果（例えば、血栓形成の減少）を得ることができる。
【０２５９】
本願明細書に開示するヒト化抗体又はその結合性フラグメントは、ＥＤ１００の約１〜約２５０倍、好ましくはＥＤ１００の約１〜約２００倍、より好ましくはＥＤ１００の約１〜約１００倍の治療有効投与量で、有意な出血の臨床的徴候を引き起こすことなく（例えば、小さな切り傷からの出血の増加を除き、出血の臨床的徴候を引き起こすことなく）投与することができる。治療有効量のヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントは、１回又は複数回の投与によって被投与者に投与することができる。上記有効投与量は静脈内投与の場合に好ましい。皮下投与の場合には、好ましい総投与量は、静脈内投与の投与量の約１〜３倍、好ましくは２倍である。
【０２６０】
出血の臨床的徴候とは、Ｓｅｒｅｂｒｕａｎｙ及びＡｔａｒ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，２００７，Ｖｏｌｕｍｅ  ９９，Ｉｓｓｕｅ  ２，１５  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００７，Ｐａｇｅｓ  ２８８−２９０）に記載され、動物モデルに適用されるＢｌｅｅｄＳｃｏｒｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎを意味する。ＢｌｅｅｄＳｃｏｒｅは、抗血小板療法に特有な出血の種類を採点するために開発された。ＢｌｅｅｄＳｃｏｒｅは、出血の重症度に応じて臨床所見に点数を割り当てることによって得られる。全ての所見の全ての点数を合計することによってスコアを得る。出血症状は、重症度に応じて、１）表面出血（１出血当たり２点）、２）内出血（１出血当たり３点）、３）憂慮すべき出血又はこれらの組み合わせ（１出血当たり６点）に分けられる。この方法は、最も重症の出血合併症を考慮に入れながら、現代の抗血小板及び抗血栓療法に関連する軽度から中度の出血の判定と報告に特に有用である。表面出血の判断基準としては、単純挫傷、小さな切り傷からの出血（例えば、テンプレート出血時間の増加）、点状出血、皮下溢血が含まれる。内出血の判断基準としては、血腫、衂血、口又は膣からの失血、下血、眼内出血、血尿、吐血が含まれる。憂慮すべき出血の判断基準としては、輸血を必要とする出血、脳内出血、致命的出血が含まれる。
【０２６１】
血小板凝集の阻害（血小板凝集を抑制又は血小板凝集を阻害するために十分であること）は、投与した治療有効量のヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントが、動脈障害動物モデルにおいて人工的に傷つけた動脈の閉塞血栓の形成を阻害するために十分であることを示す（動脈内血流量の監視によって測定）。血小板凝集の生体内抑制を定量的に判断するための方法の１つは、動脈障害モデルにおける循環血流減少（ＣＦＲ）を測定することである。従って、例えば、血小板凝集の阻害は、投与した治療有効量ののヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントが、動物におけるＣＦＲ数を減少させるために十分であることを示す。
【０２６２】
治療有効量（有効量）とは、治療する被投与者の症状を改善又は予防又は治療する患者を延命させるために有効な量を意味する。治療有効量は、特に本願明細書に開示した内容に照らして当業者が判断することができる。本願明細書における治療有効量は、被投与者におけるｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するために有効なｖＷＦ抗体の量を含む。ｖＷＦ抗体の治療有効量は、（例えば、大動脈、末梢性動脈、細動脈又は静脈における血栓症における）血小板凝集を治療又は抑制するために必要な量を含む。
【０２６３】
「治療有効投与量（有効投与量）」とは、治療する被投与者の症状を改善又は予防又は治療する患者を延命させるために有効な投与量を意味する。本願明細書における治療有効投与量は、被投与者におけるｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するために有効なｖＷＦ抗体の投与量を含む。本願明細書における治療有効投与量は、（例えば、大動脈、末梢性動脈、細動脈又は静脈における血栓症における）血小板凝集を治療又は抑制する投与量を含む。治療有効投与量は、血栓の形成を１００％抑える（血管内血流量の減少によって測定）ために十分な有効量であるＥＤ１００を含む。本願明細書におけるＥＤ１００は、血流量の減少数を３０分間でゼロに減少させるｖＷＦ抗体の量を含む。治療有効投与量は、血栓形成を減少させる投与量、例えば、血栓形成を少なくとも約１５％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも１００％減少させる（血管内血流量の減少又は血小板凝集の減少を測定する適当な生体外試験によって測定）投与量を含む。
【０２６４】
あるいは、ヒト化ｖＷＦ抗体は、連続的又は放射線治療（例えば、ＵＩＣＣ（Ｅｄ．）、Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ  Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８２）に記載された放射性物質の照射又は導入）と組み合わせて投与することができる。
【０２６５】
従って、本発明は、有意な出血の臨床的徴候を引き起こすことなく、ＥＤ１００の１〜約２５０倍の治療有効量で投与することができる、ヒトフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをさらに提供する。好ましくは、ヒト抗体又はその結合性フラグメントは、ヒトｖＷＦのＡ１ドメインに特異的である。好ましくは、ｖＷＦに特異的なヒト抗体又はその結合性フラグメントは、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントである。
【０２６６】
製品
本発明の別の実施形態は、上述した障害の治療に有用な材料（例えば、ヒト化ｖＷＦ抗体）を含む製品を提供する。製品は、容器と、容器上又は容器内に設けられたラベル又は添付文書を含む。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル又は注射器が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の各種材料で形成することができる。容器は、症状を治療するために有効な組成物を収容し、無菌アクセス口（例えば、容器は静脈注射用溶液バッグ又は皮下注射針を貫通させることができるストッパーを有するバイアル）を有することができる。組成物に含まれる少なくとも１つの活性物質は、本願明細書に開示するヒト化ｖＷＦ抗体であってもよい。ラベル又は添付文書は、組成物を癌等の任意の症状を治療するために使用することを表示することができる。一実施形態では、ラベル又は添付文書は、ヒト化ｖＷＦ抗体を含む組成物をｖＷＦ関連障害を治療するために使用することができることを表示することができる。
【０２６７】
また、製品は、（ａ）ヒト化抗体を含む組成物を収容した第１の容器と、（ｂ）ヒト化抗体以外の治療薬を含む組成物を収容した第２の容器と、を含むことができる。本実施形態の製品は、第１及び第２の組成物をｖＷＦ関連疾患又は障害を治療するために使用することができることを表示する添付文書をさらに含むことができる。そのような治療剤は、上述した節において説明した補助治療剤（例えば、抗血小板剤、化学療法薬、抗血管新生剤、抗ホルモン化合物、心臓保護剤及び／又は哺乳動物免疫機能調整剤（サイトカイン等）のいずれかであってもよい。あるいは又はさらに、製品は、静菌剤注射用蒸留水（ＢＷＦＩ）、燐酸緩衝食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液等の製薬学的に許容し得る緩衝液を含む第２（第３）の容器をさらに含むことができる。製品は、その他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、注射器等の市販又はユーザーの見地から望ましいその他の材料をさらに含むことができる。
【０２６８】
ヒト化ｖＷＦ抗体の非治療的使用
ヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントは、非治療用途にも使用することができる。例えば、抗体はアフィニティ精製剤として使用することができる。この場合、抗体は、周知の方法を使用してＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）樹脂又は濾過紙等の固相に固定する。固定した抗体を精製対象のヒト化ｖＷＦタンパク質（又はそのフラグメント）を含む試料に接触させ、固定された抗体に結合しているヒト化ｖＷＦタンパク質以外のほぼ全ての物質を除去する適当な溶媒で担体を洗浄することができる。最後に、担体をグリシン緩衝液等の適当な溶媒でｐＨ５．０にて洗浄し、ヒト化ｖＷＦタンパク質を抗体から遊離させる。
【０２６９】
また、ヒト化ｖＷＦ抗体は、例えば、特定の細胞、組織又は血清中におけるヒト化ｖＷＦ抗体の発現を検出するヒト化ｖＷＦ抗体の診断検定にも有用である。診断用途では、抗体を検出可能な部位で標識することができる。通常、放射性同位体、蛍光標識、酵素基質標識に分類される多くの標識を使用することができる。
【０２７０】
（ａ）３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ等の放射性同位元素。抗体は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １及び２，Ｃｏｌｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）に記載された方法を使用して放射性同位体で標識することができる。放射能は、例えば、シンチレーションカウントを使用して測定することができる。
【０２７１】
（ｂ）希土類キレート（ユーロピウムキレート）、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリン、テキサスレッド等の蛍光標識。蛍光標識は、例えば、上記Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに開示されている方法を使用して抗体と結合させることができる。蛍光性は蛍光光度計を使用して定量することができる。
【０２７２】
（ｃ）酵素−基質標識も使用することができる（例えば、米国特許第４，２７５，１４９号を参照）。通常、これらの酵素は、様々な方法を使用して測定することができる色原性基質の化学的変化を触媒する。酵素は、例えば、分光光度計で測定することができる基質の色変化を触媒する。あるいは、酵素は基質の蛍光性又は化学発光を変化させる。蛍光性の変化を定量化する方法は上述した通りである。化学発光性基質は化学反応によって電子的に励起され、（例えば、化学発光計を使用して）測定可能な光を放射するか、蛍光受容体にエネルギーを供給する。酵素標識の例としては、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質酸化酵素（例えば、ブドウ糖酸化酵素、ガラクトース酸化酵素、ブドウ糖−６−リン酸脱水素酵素）、複素環酸化酵素（ウリカーゼ、キサンチン酸化酵素等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、類似物が挙げられる。抗体に酵素を結合させる方法は、例えば、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．（Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ  ＆  Ｈ．Ｖａｎ  Ｖｕｎａｋｉｓ（編）），Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，７３：１４７−１６６（１９８１）に記載されている。
【０２７３】
酵素と基質の組み合わせの例を以下に記載する。
【０２７４】
（ｉ）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての水素ペルオキシダーゼ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（水素ペルオキシダーゼは色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
【０２７５】
（ｉｉ）アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と色原性基質としてのｐ−ニトロフェニルホスフェート；
【０２７６】
（ｉｉｉ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）と色原性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）又は蛍光発生基質である４−メチルウンベリフェリル−ｐ−β−ガラクトシダーゼ。
【０２７７】
その他の多くの酵素及び基質の組み合わせも使用することができる（例えば、米国特許第４，２７５，１４９号及び米国特許第４，３１８，９８０号を参照）。
【０２７８】
標識は、間接的に抗体と結合される場合もある。間接的な結合は、様々な方法によって行うことができる。例えば、抗体はビオチンと結合し、上述した３種類の標識のいずれかをアビジンと結合させることができる。ビオチンは選択的にアビジンに結合するため、標識を間接的に抗体と結合させることができる。あるいは、標識を抗体に間接的に結合させるために、抗体を小ハプテン（例えば、ジコキシン）及び上述した標識の１つを抗ハプテン抗体（例えば、抗ジコキシン抗体）に結合させることができる。このようにして、標識を抗体に間接的に結合させることができる。
【０２７９】
本発明の別の実施形態では、ヒト化ｖＷＦ抗体を標識せずに、ヒト化ｖＷＦ抗体に結合する標識化抗体を使用してヒト化ｖＷＦ抗体の存在を検出することができる。
【０２８０】
本発明の抗体は、公知の検定法、例えば競合タンパク結合測定法、直接及び間接サンドイッチ検定、免疫沈降反応検定に使用することができる（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７））。
【０２８１】
免疫組織化学解析の場合には、例えば、新鮮又は凍結腫瘍試料をパラフィンに包埋し、ホルマリン等の保存剤に固定する。
【０２８２】
また、抗体は生体内診断検定に使用することもできる。通常、例えば、免疫シンチオグラフィーを使用して腫瘍の位置を特定することができるように、放射性核種（１１１Ｉｎ，９９Ｔｃ，１４Ｃ，１３１Ｉ，１２５Ｉ，３Ｈ，３２Ｐ又は３５Ｓ）で抗体を標識する。
【０２８３】
本発明の抗体はキット、（所定量の試薬の組み合わせと診断検定を実施するための説明書のパッケージ等）として提供することができる。抗体を酵素で標識する場合は、キットは、酵素に必要な基質と補因子（例えば、検出可能な発色団又は発蛍光団となる基質前駆体）を含むことができる。また、キットは、他の添加剤、例えば、安定化剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液又は溶解緩衝液）等を含むことができる。各種試薬の相対量を大きく異ならせて検定感度を実質的に最適化する試薬溶液濃度とすることができる。特に、試薬は、例えば、溶解した際に試薬溶液を適切な濃度とする賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供することができる。
【０２８４】
ヒト化ｖＷＦ抗体は、宿主（好ましくは血流）に標識化抗体を投与し、宿主内の標識化抗体の存在と位置は測定する生体内撮像にも有用である。生体内撮像は、血管性栓子の位置特定又は腫瘍の病期分類及び治療に好適に使用することができる。抗体は、例えば核磁気共鳴によって検出可能な非放射性指示体又はその他の公知の手段等の、宿主内において検出可能な任意の部位によって好適に標識することができる。好ましくは、標識は、ヨウ素（例えば、１２５Ｉ又は１３１Ｉ）、セレン、二官能性キレート、銅（例えば、６７Ｃｕ）、テクネチウム（例えば、９９ｍＴｃ）、レニウム（例えば、１８６Ｒｅ又は１８８Ｒｅ）等の放射性標識であってもよい。放射性同位体は、任意の手段（例えば、金属キレート化合物又はラクトペルオキシダーゼ又はヨウ素化のためのヨードゲン法）によってタンパク質に結合させることができる。
【０２８５】
材料の寄託
以下の材料はＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託されている。ヒト化ＮＭＣ−４変異体Ｈ９Ｌ９ＩｇＧ４の軽鎖コード核酸配列を含む単離核酸を含むベクターＧＳ２６４を含む微生物（大腸菌）（２００８年１月２３日に寄託、寄託番号：ＤＳＭ  ２１０５９）。ヒト化ＮＭＣ−４変異体Ｈ９Ｌ９ＩｇＧ４の重鎖コード核酸配列を含む単離核酸を含むベクターＧＳ２６５を含む微生物（大腸菌）（２００８年１月２３日に寄託、寄託番号：ＤＳＭ  ２１０６０）。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく規則に基づいてなされた。
【０２８６】
当業者は、上記説明及び以下の実施例に基づいて、本発明の物質を製造・利用し、請求項に記載されたを実施することができると思われる。なお、以下の実施例は本発明の実施を容易にするために記載するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２８７】
実施例１：キメラ抗体の作製
ＮＭＣ−４−ヒトＦｃキメラの生成：マウス抗体ＮＭＣ−４及びヒトＦｃ領域からの可変領域を含むキメラ抗体を以下のようにして作製した。抗ｖＷＦ抗体ＮＭＣ−４（例えば、公表された可変領域アミノ酸配列を有するＩｇＧ１κ）を使用して、ＮＭＣ−４のＶＨ及びＶＬ領域の合成遺伝子配列を生成した（Ｃｅｌｉｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２３：１２３−１３４）。例えば、Ｃｅｌｉｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．に記載されたアミノ酸配列を使用し、ＶＥＣＴＯＲ  ＮＴＩソフトウェアを使用して対応するヌクレオチド配列を生成することによってＮＭＣ−４のＶＨ及びＶＬ領域の合成遺伝子配列を生成した。
【０２８８】
【表１】
2011510622.tif 000002
【０２８９】
ＰＣＲ反応は、Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  ＰＦＸ  ＤＮＡ  ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ  ＫＩＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施することができる。例えば、１ｘＰＦＸ緩衝液、０．２μＭ  ｄＮＴＰ混合物、ＰＦＸポリメラーゼ、１μＭフォワードプライマー、１μＭリバースプライマー及び１００ｎｇのＤＮＡ鋳型を含む５０μＬの反応混合物を調製した。標準ＰＣＲプログラムは、９４℃で１分間の初期変性及び９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１分間、６８℃で１０分間を１サイクルとする３０サイクルとした。ＰＣＲ産物は０．８％ＴＡＥゲルを使用したアガロースゲル電気泳動法によって精製し、所望の大きさの１以上のバンドを切り取り、Ｑｉａｇｅｎ  ＧＥＬ  ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ  ＫＩＴで精製した。ＤＮＡフラグメントは、１ｘＴ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、０．５μＬのＴ４ＤＮＡ  リガーゼ（ＮＥＢ）及び１００ｎｇの欠くＤＮＡを含むｌ０μＬの混合物内において室温で３０分間連結させた。次に、１μＬの連結反応物を使用してＪＭ１０９大腸菌細胞を形質転換し、ＰＣＲ生成挿入部位をＢｅｃｋｍａｎ  ＣＥＱ８０００ＤＮＡ  ＡＮＡＬＹＺＥＲを使用したシークエンシングによって確認した。
【０２９０】
マウス抗体ＮＭＣ−４及びヒトＦｃ領域からのＶＨ及び／又はＶＬを含むキメラ抗体は、公知の標準プロトコルに従ってＰＣＲによって合成した。すなわち、マウス抗体ＮＭＣ−４に特異的なプライマー及びヒトＦｃ領域に特異的なプライマーを使用してＰＣＲを行うことによってマウス抗体ＮＭＣ−４からのＶＨ及び／又はＶＬをヒトＦｃ領域に融合させた。
【０２９１】
必要に応じて、アミノ酸置換（例えば、突然変異）をＩｇＧ１  Ｆｃ領域に導入してＦｃ領域と補体結合部位を除去し、野生型γ１  Ｆｃ定常領域が媒介すると仮定される細胞障害性を排除した（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３を参照）。例えば、プライマーｈＩｇＧ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）及びｈＩｇＧ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）を使用して、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．ｃＤＮＡクローン＃４７６４５７９（ＡＴＣＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）に由来するヒトＩｇＧ１定常領域（例えば、Ｆｃ）を増幅した（表１）。例えば、部位選択的突然変異生成により、アミノ酸置換（例えば、Ｌ２３５Ｅ（ＦｃＲ結合部位）及びＥ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３３２Ａ（Ｃ１ｑ補体結合部位））をＩｇＧ１  Ｆｃ領域に導入した（Ｄｕｎｃａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ；Ｎａｔｕｒｅ．３３２（６１６６）：７３８−４０（１９８８））。例えば、プライマー対であるｈＦｃ−Ｌ２３５Ｅ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）及びｈＦｃ−Ｌ２３５Ｅ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０）を使用して、Ｌ２３５Ｅ突然変異は定常領域に導入し、プライマー対であるＣＨ２−Ｃ１ｑ（−）−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）及びＣＨ２−Ｃ１ｑ（−）−Ｒ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）を使用して補体部位変異を導入した（表１）。２つの外側プライマーｈＩｇＧ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）及びＩｇＧ１−ＢａｍＨＩ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を使用して４つの突然変異を含むＰＣＲ産物を結合し、修飾ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（ＩｇＧ１（ｄｍ））をコードするＰＣＲ産物を得た。
【０２９２】
ＮＭＣ−４の重鎖可変領域を、公知の組換え技術によって修飾ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ１（ｄｍ））に融合した。例えば、ＮＭＣ−ＶＨのＮ末端の上流のＥｃｏＲ１クローニング部位を導入するプライマーＮＭＣ−ＶＨ−ＥｃｏＲＩ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）及びＮＭＣ−ＶＨ−ＩｇＧ１−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５）を使用して、ＮＭＣ−４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を増幅した。簡単に説明すると、２工程の組換え型ＰＣＲにより、最初にプライマー対であるＮＭＣ−ＶＨ−ＥｃｏＲＩ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）及びｈＩｇＧ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）を使用し、次に、プライマー対であるＮＭＣ−ＶＨ−ＥｃｏＲＩ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）及びＩｇＧ１−ＢａｍＨＩ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）を使用してＰＣＲ反応を行ってＰＣＲ産物を重鎖定常領域（例えば、ＩｇＧ１（ｄｍ））に結合させた。最終ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによって消化させ、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローニングされたＩｇκリーダー配列（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０のポリヌクレオチドでコード）を含むように修飾されたｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ−Ｉｇκベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１部位にクローニングした。
【０２９３】
ＮＭＣ−４の軽鎖可変領域を、以下の組換え技術によって修飾ＩｇＧ１  Ｆｃ領域（例えば、ＩｇＧ１（ｄｍ））に融合した。例えば、Ｉｇκ軽鎖定常領域の３’末端にＢａｍＨ１制限部位を導入するプライマーであるＫａｐｐａ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）及びＫａｐｐａ−ＢａｍＨＩ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）を使用して、Ｉｇκ軽鎖定常領域（例えば、κＣ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１））をＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．クローン＃４７０４４９６Ｅ（ＡＴＣＣ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）から作製したＤＮＡから増幅した。同様に、５’末端にＥｃｏＲ１を導入するプライマーＮＭＣ  ＶＬ  ＥｃｏＲＩ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）及びＮＭＣ−ＶＬ−Ｋａｐｐａ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）（表１）を使用して、軽鎖可変領域を合成ＶＬ遺伝子から増幅した。次に、プライマーＮＭＣ  ＶＬ  ＥｃｏＲＩ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５）及びＫａｐｐａ−ＢａｍＨＩ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）を使用して、ＮＭＣ４可変領域とκＣ１フラグメントを組換え型ＰＣＲによって結合させた。最終ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩによって消化させ、同一部位におけるｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ２−Ｉｇκベクターにクローニングした。
【０２９４】
同一のＩｇκリーダー配列を軽鎖と重鎖の両方に使用した場合でも、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクターにおける重鎖の発現レベルは、軽鎖マウスヒトキメラを発現するｐＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄプラスミドと比較して低い場合がある。従って、重鎖の発現レベルを向上させるために、プライマー対である４−５９  ｌｅａｄｅｒ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮＭＣ−４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）及びＩｇＧ１−ＢａｍＨＩ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）並びに鋳型として機能するｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ−ＮＭＣ４−ＩｇＧ（ｍｕｔ）ベクターを使用して、Ｉｇκリーダー配列をヒト生殖細胞系列４−５９  ＶＨ（ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）からのリーダー配列と交換した（表１）。フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩとＰｍｅＩによって消化させ、ｐｃＤＮＡ６−ｃＭｙｃ−Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｍｅＩ部位にサブクローニングした。
【０２９５】
ＡＪＷ２００参考抗体の作製：ＡＪＷ２００はｖＷＦのＡ１ドメインに対する別の抗体であり、ｖＷＦ  Ａ１ドメインのＧＰＩｂαとの相互作用を阻害する能力を有する。ＡＪＷ２００参考抗体は、発現の向上のための機能的Ｋｏｚａｋ配列をさらに含むように米国特許第６，２２８，３６０号に開示されたＶＨとＶＬ配列を操作することによって生成した。例えば、合成ＡＪＷ２００ＶＨ遺伝子をプライマーＨｉｎｄ  ＩＩＩ−Ｋｏ−ＡＪＷ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）及びＨｕＦａｂ−Ｈ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）（表２）を使用して増幅し、ヒトＩｇＧ１（ｄｍ）重鎖定常領域（ＮＭＣ−４  ＶＨを置換）を含むＨｉｎｄＩＩＩ−消化ＡｐａＩ−ｐｃＤＮＡ６−ｃＭｙｃ−ＡベクターのＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａＩ部位にクローニングした。プライマー対であるＸｈｏＩ−Ｋｏ−ＡＪＷ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１）及びＫａｐｐａ−ＢａｍＨＩ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）を使用してＡＪＷ２００  ＶＬを増幅し、ＮＭＣ軽鎖キメラ（ＮＭＣ４のＶＬを置換）を有するｐＩＲＥＳ−ＤｓＲｅｄベクターのＸｈｏＩ及びＢａｍＨ１部位にサブクローニングした。
【０２９６】
【表２】
2011510622.tif 000003
【０２９７】
抗体の製造：キメラ抗体は公知の様々な方法によって製造することができる。本実施例では、振盪フラスコ内において、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を１２０ｒｐｍ、３７℃、８％ＣＯ２でＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で培養した。細胞をペレット化し（１００×ｇ）、３０ｍＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地に再懸濁させ、２０秒間ボルテックスして単一細胞懸濁液を得た。細胞をカウントし、２Ｌの振盪フラスコに３．３×１０８個の細胞を播種した（Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３培地：３３０ｍＬ）。トランスフェクション混合物は、同量のＤＮＡ／ＯｐｔｉＭＥＭ（例えば、１６５μｇのＨＣ発現プラスミド、１６５μｇのＬＣ発現プラスミド及び室温ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（全量：１１ｍＬ））及び２９３ｆｅｃｔｉｎ／ＯｐｔｉＭＥＭ（例えば、４３３μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と室温ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（全量：１１ｍＬ））を含んでいた。ＤＮＡ混合物を２９３ｆｅｃｔｉｎ混合物に添加して混合した後、室温で２０分間培養し、２９３Ｆ細胞を含む培地に添加した。細胞を、３７℃、８％ＣＯ２で１２０ｒｐｍで震盪しながら培養した。トランスフェクションから７２時間後、懸濁液を１００×ｇで５分間遠心分離して細胞をペレット化し、Ｍａｂ−含有上清を０．２μｍのフィルターで濾過し、プロテインＡアフィニティーカラムを使用して精製した。
【０２９８】
トランスフェクションを行ったＨＥＫ−２９３Ｆ細胞からの少量の馴化培地（ＣＭ）を、ＰＢＳで平衡化した０．３ｍＬのプロテインＡセファロースドリップカラムに添加した。カラムを１０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、タンパク質を０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ２．７）で溶離した。１ｍＬのフラクションを０．１ｍＬの１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）に回収し、抗体のほとんどは最初の２つの溶出液フラクションにおいて溶離された。フラクションをプールし、例えばＶｉｖａｓｐｉｎ  ０．５ｍＬ遠心分離装置を使用して最終体積（例えば、０．２〜０．３ｍＬ）に濃縮した。濃縮工程時に、ＰＢＳによって希釈して緩衝液をトリスグリシンからＰＢＳに交換した。例えば、０．２μｍのシリンジフィルターによって濃縮液を濾過することによって殺菌し、抗体を含む試料のタンパク質濃度は、Ｌｏｗｒｙタンパク質分析法（ＢｉｏＲａｄ  ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ）を使用して決定した。
【０２９９】
大量精製の場合には、トランスフェクションを行った接着細胞（例えば、ＨＥＫ−２９３Ｔ）からの馴化培地（ＣＭ）（２Ｌ）を、中空糸カートリッジ（例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３０，０００ＮＭＷＣ／２９０ｃｍ２中空糸カラムＵＦＰ−３０−Ｃ−３Ｘ２ＭＡ）を使用した限外濾過によって体積が２００ｍｌ以下になるまで濃縮した。濃縮材料（より小量のトランスフェクションの場合には濃縮していないＣＭ）を、０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化した１２ｍＬのプロテインＡセファロースカラムにポンプで送った。ＵＶ２８０がベースラインとなるまでカラムを０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄した。抗体を０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．７）で溶離し、３ｍＬのフラクションを回収した。ピークタンパク質含有フラクションのｐＨをトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して調節した（最終濃度：０．１Ｍ）。ピークフラクションはプールし、限外濾過（例えば、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５ｍＬ遠心分離装置）によって７ｍＬ以下に濃縮し、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（２回）を使用してＰＢＳに脱塩した。
【０３００】
培養上清から得られたタンパク質を公知の方法（例えば、Ｌｏｗｒｙタンパク質検定（ＢｉｏＲａｄ  ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ））によって定量化及び分析した。本実施例では、培養上清はＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分析した。簡単に説明すると、タンパク質をニトロセルロース膜に移し、５％乳／ＰＢＳによって室温で１時間ブロックし、ＨＲＰ結合マウス抗ヒトＩｇＧ（例えば、γ鎖特異的、１：１０，０００）及びマウス抗ヒトカッパ（例えば、α鎖特異的、１：１，０００）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃９０４２−０５、及び＃９２２０−０５、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）と共に培養し、ＥＣＬキットによってシグナルを検出した。
【０３０１】
リストセチン誘発血小板凝集反応検定における生体外阻害活性：キメラＮＭＣ−４ヒトＦｃ領域抗体のｖＷＦに対する結合特異性を含む活性に関する試験を行った。例えば、凍結乾燥ヒト血小板（Ｂｉｏ／Ｄａｔａ、Ｈｏｒｓｈａｍ  ＰＡ）を使用し、標準的な血小板凝集計（Ｂｉｏ／Ｄａｔａ、ＰＡＰ−４）によって血小板凝集反応検定を行った。簡単に説明すると、５０μＬのリストセチン（例えば、原料濃度＝１５ｍｇ／ｍＬ）（Ｂｉｏ／Ｄａｔａ）及び４８．５μＬのＴＢＳ又は試験抗体を、１×１０８個の凍結乾燥血小板を含むチューブ（４００μＬ）に添加した。１．５μＬの精製ｖＷＦ（例えば、最終濃度：１．５μｇ／ｍＬ）をチューブに添加して凝集反応を開始させる前に、ベースライン測定値を１０秒間記録した。試験抗体のＥＣ５０は、血小板凝集反応を５０％抑制した濃度として推定した。親モノクローナル抗体との比較では、キメラ抗体は親マウスＮＭＣ４抗体と同等の力価を示した。
【０３０２】
ＥＣ５０値をより正確に決定するために、例えばマイクロプレート法から改変したプレートリーダ法を使用してキメラ抗体の検定を行った。９６ウェルＣＯＳＴＡＲ３６０３プレートを使用して、１ウェル当たり４．５×１０７個のパラホルムアルデヒド固定血小板を１５０μＬのＴＢＳ（ｐＨ７．５）に添加し、精製ヒトｖＷＦ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を１ウェル当たり１．５μｇ／ｍＬの最終濃度となるように添加した。試験抗体を段階的な濃度で添加した後、リストセチンを１ウェル当たり１．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度となるように添加して凝集反応を開始させ、濁度（例えば、４０５ｎｍにおける吸光度）を、測定サイクル間に２０秒間振盪しながら、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ  ＰＬＵＳ  ＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）セットを使用して３７℃で６分間監視した。阻害剤化合物又は参考ＭＡｂ（例えば、ＡＶＷ−３）を添加し（例えば、２０μＬ／ウェル）、混合物を２分間培養・監視した。最後に、リストセチン又はボトロセチンを添加し（２０μＬ／ウェル）、混合物を４０分間培養・監視した。吸光度（例えば、−Δ吸光度）の減少を凝集反応シグナルとして監視した。
【０３０３】
ＮＭＣ−４−ヒトＦｃキメラを、ＮＭＣ−４モノクローナル抗体及びクローニングされたＡＪＷ２００抗体と比較した。図１に示すように、ＮＭＣ−４キメラの活性はＮＭＣ−４  ｍＡｂと同様であり、リストセチン誘発血小板凝集反応検定においてＡＪＷ２００よりも僅かに力価が高く、ＥＣ５０値はそれぞれ０．１ｎＭ、０．１７ｎＭ、０．２７ｎＭだった。
【０３０４】
実施例２：ヒト化抗体の作製
ヒト受容体フレームワークの選択：データベース（例えば、ヒト生殖系列データベース、Ｖ  ｂａｓｅ又はＫａｂａｔデータベース）又は刊行物（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，１９９２）を使用して、マウスの重鎖及び軽鎖可変領域が属するサブファミリーを特定し、受容体分子としての使用に最も適したヒト生殖系列フレームワークを決定することができる。受容体配列として使用することができるこれらのサブファミリー内のＶＨ及びＶＬ配列の選択は、移植後の６つのＣＤＲの適切な相対提示を保存するために配列相同性及び／又はＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域の基準構造のマッチングに基づいて行うことができる。
【０３０５】
例えば、Ｖ  ｂａｓｅを使用する場合には、ＮＭＣ−４  ＶＬフレームワークとκサブファミリー１（ＶＫ１）との間で良好な相同性が特定されれば、ＮＭＣ−４のκ軽鎖はカッパ１サブファミリーのものである。最も高い相同性とＣＤＲループの基準構造の最も良好な保存は、生殖系列配列Ｏ１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）において観察される。生殖系列配列Ｏ１８は、ＣＤＲ３までの配列全体に対する７８％の配列同一性とフレームワーク領域に対する８４％の配列同一性を有する。表３に、ＮＭＣ−４軽鎖及びヒト軽鎖Ｏ１８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）及びＡＡＫ９４８０８（Ｏ１８由来成熟抗体、同じ領域におけるＮＭＣ−４との比較のためにＬＣＤＲ３及びフレームワーク４配列を得るために使用）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の比較を示す。ＮＭＣとヒト抗体の相違を太字で示す（付番はＫａｂａｔ付番方式（Ｋａｂａｔ，１９７８）に基づく）。
【０３０６】
同様に、Ｖ  ｂａｓｅを使用する場合には、フレームワーク３までのＶＨ配列はＶＨサブファミリーＩＶに属する。ヒトＶＨ  ＩＶサブファミリー内において、ＮＭＣ−４  ＶＨは、ＣＤＲ３までのＶＨ全体のについてマウスＶＨと５６％の配列相同性を示し、フレームワーク領域とは６７％の相同性を示す４−５９生殖系列配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）と最も高い配列相同性を示す（表４）。本願明細書に開示する理論に拘束されるものではないが、ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）をＨＣＤＲ３及びフレームワーク４比較配列を得るために選択したのは、ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）が、フレームワーク１〜３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２においてヒト生殖系列４−５９  ＶＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）と同じアミノ酸配列を共有するためである。ＨＣＤＲ３及びフレームワーク４領域はＶ  ｂａｓｅデータベースにおけるＶＨ生殖系列配列に含まれず、ＨＣＤＲ３領域は大きく相違しており、ＦＷ４は別の遺伝子産物（Ｊ）に由来する異なるドメインである。ＮＭＣ−４  ＶＨとＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）配列のアミノ酸の相違を表４に示す（太字で強調し、相違する位置をアスタリスクで示す）。
【０３０７】
【表３】
2011510622.tif 000004
【０３０８】
【表４】
2011510622.tif 000005
【０３０９】
ヒト抗体フレームワークへのマウス抗体からのＣＤＲの直線的な移植によって抗原結合親和性が消失すると仮定されるため（Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７−４９９（１９９２）；Ｘｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２５３：３８５−９０（１９９５）；Ｈｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２９６−３０１（２００１））、フレームワークにおける残基をそれらの位置においてマウス残基に復帰変異させることが望ましい場合がある（復帰突然変異処理）。例えば、表５は、ＣＤＲの立体配座に影響を与え、マウス残基への復帰突然変異の有力な候補であり得る残基を示す（例えば、これらの位置におけるＮＭＣ−４とヒトフレームワークのアミノ酸の相違をイタリック体の太字で強調）。
【０３１０】
【表５】
2011510622.tif 000006
【０３１１】
ＣＤＲのプレゼンテーションを調整するための重鎖及び軽鎖のペアリングに関与し得るアミノ酸残基は特定されており（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２９６−３０１（２００１））、復帰突然変異の侯補であり得る。本願明細書に開示する理論に拘束されるものではないが、ＶＬ領域において、残基４４、９６、９８が重要であると考えられ、残基３４、３６、３８、４６、８７、８９、９１の貢献もある。これらの残基のうち、ＶＬ領域においてＮＭＣ−４と受容体Ｏ１８との間で顕著に異なるのは残基４４（ＮＭＣ−４  Ｖではバリンであり、ヒトＯ１８フレームワークではプロリン）である。本願明細書に開示する理論に拘束されるものではないが、ＶＨ領域において、残基４５及び１０３が重要であると考えられ、残基３５、３７、３９、４７、９１、９３、９５はＶＬとのＶＨのインターフェースパッキングに貢献する。ＮＭＣ−４  ＶＨと受容体４−５９受容体フレームワークとの間で顕著に異なるのは残基９３であり、４−５９におけるアラニンと比較してＮＭＣ−４のバリンには保存的な相違がある（表５）。
【０３１２】
マウスのフレームワーク配列とヒト生殖系列４−５９  ＶＨ配列を比較することにより、ＣＤＲプレゼンテーションとインターフェースパッキングに重要であると仮定される残基の相違の多くがフレームワーク３（残基６７、７１、７３、７８、９３）に見られ、フレームワーク２では残基３７及び４８の相違が見られる。これらの残基は、原型ヒト化配列における復帰突然変異のための推定侯補である。しかしながら、フレームワーク２の２つの残基（３７Ｖ対３７Ｉと４８Ｌ対４８Ｉ）の相違は保存的であり、第１の原型ＶＨ配列はフレームワーク３領域における相違に焦点を合わせ、Ｖ６７Ｌ、Ｖ７１Ｋ、Ｔ７３Ｎ、Ｆ７８Ｖ、Ａ９３Ｖのヒトからマウスへの復帰突然変異を生じさせることができる（表６）。合成遺伝子はＲｅｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）によってカスタム合成され（Ｈ２）、細菌性ベクターｐＲＳＦＤｕｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）のＮｈｅ１及びＸｈｏ１部位にクローニングし、４−５９ｈｕＮＭＣ−Ｆ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）及びｈｕ−ＶＨ−Ｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）プライマーを使用した挿入部位を増幅するために鋳型として使用した（表７及び９）。得られたフラグメントをＡｐａ１で消化させた。実施例１で生成したＮＭＣ−４キメラ重鎖を含むプラスミドｐｃＤＮＡ６−ＮＭＣ−ＨＣをＨｉｎｄＩＩＩ及びＡｐａ１で消化させ、ｐｃＤＮＡ−ＩｇＧ１ｄｍフラグメントを含むＤＮＡフラグメントをＮＴＰの存在下でクレノウフラグメントで平滑末端化した。ＶＨを含むＰＣＲ産物を、平滑末端化したｐｃＤＮＡ−ＩｇＧ１ｄｍフラグメントに連結した。次に、プラスミドＤＮＡを使用して大腸菌宿主株ＪＭ１０９を形質転換した。Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣＥＱ８０００ＤＮＡシーケンサを使用して各クローンの配列を決定し、正しい方向及び正しい配列で挿入部位を発現するクローンを特定した（クローンｐｃＤＮＡ−ｈｕＶＨ−ＩｇＧ１ｄｍ）。このベクターを、各残基をヒト残基に個別に戻す影響を評価するために設計されたＨ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８変異体に鋳型として使用した（表６）。これらの変異体は、表７に示すプライマー対を使用して作製した（対応する配列を表９に示す）。
【０３１３】
【表６】
2011510622.tif 000007
【０３１４】
【表７】
2011510622.tif 000008
【０３１５】
基準構造とインターフェースパッキングに影響を与えると仮定される残基の比較により、ＮＭＣ−４  ＶＬとＯ１８ヒトＶＬ受容体フレームワークの間には３つの相違点（例えば、残基４４、４９、７１）があることが分かった。従って、マウス残基への３つの復帰突然変異を有する原型ヒト化変異体は設計することができる（Ｌ５）（例えば、Ｐ４４Ｖ、Ｙ４９Ｆ、Ｆ７１Ｙ）（表６）。また、この変異体はフェニルアラニンからロイシンに変更された残基７３を有するように設計した。これは、ロイシンがヒト抗体レパートリーにおけるこの位置におけるより一般的な残基であるためである。この変異体を生成するために、フレームワーク変化（例えば、Ｙ４９Ｆ、Ｆ７１Ｙ、Ｆ７３Ｖ）を有する変異体（ＶＬ４）をカスタム合成し（Ｒｅｔｒｏｇｅｎ）、表８に示すプライマー対を使用してｐＥＴＤｕｅｔベクターにクローニングした。得られたＬ４−ｐＥＴＤｕｅｔベクターを鋳型として使用して表８に記載するプライマー対を使用してＬ５のＰ４４Ｖ突然変異を導入した。そして、Ｌ５変異体を、マウスＮＭＣ−４ＶＬの代わりにｐＩＲＥＳ  ＤｓＲｅｄ２ベクターのＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１部位にサブクローニングした。そして、Ｌ５−ｐＩＲＥＳ  ＤｓＲｅｄベクターを鋳型として使用して表８に記載するプライマーを使用してＬ６及びＬ７ベクターを生成した。
【０３１６】
【表８】
2011510622.tif 000009
【０３１７】
【表９】
2011510622.tif 000010
【０３１８】
第１組の変異体のクローニングと並行して、ＨＣＤＲ３までの全配列に対して最も高い配列相同性（８８％）を有し、フレームワーク領域との８９％の配列相同性を有するとしてＢＬＡＳＴ検索で特定された１ＤＮ０．ｐｄｂ構造（例えば、２．３Å）を使用して、４−５９受容体生殖系列配列のコンピュータ生成三次元モデルを作製した。ヒト化ＶＨ配列と８１％の配列相同性を有する鋳型として構造１ＡＯＫ．ｐｄｂを選択した。マウスＮＭＣ−４Ｆｖの２つの結晶構造があり、すなわち、１ＯＡＫ．ｐｄｂ（例えば、２．２Å）（結合抗原を有し（Ｃｅｌｉｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：１８９−１９４（１９９８））、原型ヒト化変異体のＶＨドメインに最適として選択）及び結合変異種抗原を有する１ＦＮＳ．ｐｄｂ（２．０Å）である。１ＯＡＫ．ｐｄｂと１ＦＮＳ．ｐｄｂは実質的に同じＶＨ／ＶＬインターフェース角度を有しているため、１ＯＡＫ．ｐｄｂをヒト受容体及びヒト化ＶＨ及びＶＬ配列のモデルの重ね合わせに使用した。
【０３１９】
ＮＭＣ−４  ＶＨ及び４−５９のバックボーン構造が重ね合わせた時に、３つの相違する領域が観察される。ＨＣＤＲ１の一部を含む残基Ｈ２７〜Ｈ３３に相違が存在する。本願明細書に開示する理論に拘束されるものではないが、これらの残基はＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３に接触し、抗原結合部位の一部を形成する。残基３４（マウスＮＭＣ−４ＶＨではＶａｌ、４−５９配列ではＴｒｐ）は、Ｈ２７−３３ループの立体配座の変更の原因であると予測され、復帰突然変異の侯補である。第２に、ＣＤＲ２ループの一部を含む残基Ｈ５２〜Ｈ５５に相違が存在する。フレームワーク残基７１（マウスではＬｙｓ、４−５９ではＶａｌ）は上記相違において潜在的に役割を果たすと考えられ、復帰突然変異の侯補である。抗原結合性を妨げる可能性を有するとして３つの残基が４−５９構造で特定されている。すなわち、Ｈ３７（保存的変化、４−５９ではＩｌｅ、マウスではＶａｌ）、Ｈ７３（中程度の変化、４−５９ではＴｈｒであり、マウスではＡｓｐ）及びＨ７８（大きな変化、４−５９ではＰｈｅ、マウスではＶａｌ）である。第３に、ＣＤＲ３にも相違が存在し、多様性が予想される。
【０３２０】
生殖系列Ｏ１８と原型ヒト化ＶＬドメインのモデルリングのために、構造１ＩＧＭ．ｐｄｂ（例えば、２．３Ａ解像度）はＯ１８ｔの良好な配列相同性（例えば、９５％）を有する（残基Ｌ３４、Ｌ４５、Ｌ４７、Ｌ９２で相違）。原型ヒト化ＶＬの鋳型として構造Ｏ１ＢＪ１．ｐｄｂ（例えば、２．４Ａ解像度）を選択した（９７／１０７残基で一致（例えば、９１％の配列相同性））。
【０３２１】
ＮＭＣ−４とＯ１８  ＶＬ構造のＶＬ骨格の最適性は配列相同性と一致している。唯一の重要な構造の相違は残基Ｌ３９〜Ｌ４５（ＶＨに接触し、パッキング及び結合ポケットの形状に影響を及ぼす）を含むループである。本願明細書に開示する理論に拘束されるものではないが、残基４４（例えば、マウスではＶａｌ、４−５９ではＰｒｏ）は上記相違の原因である可能性が高く、コンピュータモデリングに基づく復帰突然変異の侯補である。
【０３２２】
リストセチン誘発血小板凝集反応検定における生体外阻害活性：コンピュータモデリング予測が活性に対する影響を正確に予測できたか否かを調べるために、ＶＨ２原型変異体をＶＬ変異体（例えば、Ｌ４、５、６、７）と対にし、原型Ｌ５をＶＨ変異体（例えば、Ｈ２、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８）と組み合わせた。抗体変異体はＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的トランスフェクションによって製造し、実施例１においてＮＭＣ−４キメラ抗体について説明したように濾過培養上清から精製した。
【０３２３】
実施例１で説明したように、凍結乾燥血小板を使用してリストセチン誘発血小板凝集反応検定を行った。Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘプレートリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、抗体希釈液の吸光度（例えば、濁度）の変化を測定し、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析して各精製抗体変異体のＥＣ５０値を決定した（例えば、表９を参照）。
【０３２４】
Ｈ２とＬ５を含む第１のヒト化抗体は、原型キメラ（例えば、ＥＣ５０：０．１８ｎＭ）と同等な活性（例えば、ＥＣ５０：０．１３ｎＭ）を示した（表１０）。次に、ヒトフレームワーク残基への連続点突然変異を有する重鎖変異体について試験を行った（例えば、変異体Ｈ２〜Ｈ６）。Ｌ５−Ｈ８変異体が１．５倍低いＥＣ５０を示した以外は、変異体は非常に似通った活性を示した（表９）。興味深いことに、この変異体の収量は低く（例えば、他の変異体の１／１０）、ヒト化重鎖及び軽鎖間の相互作用がこの突然変異の組み合わせによって悪影響を受けたかもしれないことを示唆している（抗体の安定性は重鎖及び軽鎖の正しい組み合わせに依存する）。同様に、Ｌ５変異体抗体を生成し、試験を行った。ヒト化は活性に影響を与えているようには見られず、予期せぬことに、フレームワーク変化は全く必要ではなかったことを示唆している。これらの結果は、問題を引き起こすと予期された受容体フレームワークとＮＭＣ−４可変領域フレームワーク間の相違（コンピュータモデリングによって観察された構造の相違の基礎となると思われた最も顕著な相違及び最も大きな立体配置的相違を引き起こすと見られた相違を含む（例えば、ＶＨのＶ７１Ｋ及びＴ７３Ｎ並びにＶＬのＰ４４Ｖ））は力価に影響を及ぼさなかった。これらの結果に基づき、。完全なヒトフレームワークを有する重鎖変異体（単純ＣＤＲ移植ＶＨ）を作製した（例えば、Ｈ９）。次に、軽鎖変異体及び完全なヒトフレームワークにおける単純なＣＤＲ移植を表す別の変異体Ｌ９と組み合わせてこの変異体の試験を行った。驚くべきことに、直線的なＣＤＲ移植抗体は完全な活性（ＥＣ５０：０．０８ｎＭ；表１０）を保持していた。これらのデータは、予期せぬことに、公表されている結晶学データは複数のＣＤＲが抗原結合性に貢献することを示しており（Ｃｅｌｉｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ．２３：１２３；  Ｃｅｌｉｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ５：１８９）、６つのＣＤＲの相対プレゼンテーションにおける摂動は親和性に影響を与えると予想されたにもかかわらず、ヒト抗体フレームワークへのマウス抗体からのＣＤＲの直線的な移植はマウス抗体の完全な活性を維持したことを示している。
【０３２５】
【表１０】
2011510622.tif 000011
【０３２６】
ＣＤＲ領域のヒト化：分子モデリングは、軽鎖及び重鎖のＣＤＲ１をヒト化するように設計されたさらなる変化が、ＮＭＣ−４  ＬＣＤＲ１（例えば、残基２４、３０、３１）及びＮＭＣ−４  ＨＣＤＲ１（例えば、残基２７、２９、３０、３４）において許容され得ることを示唆している。また、ＨＣＤＲ２配列における２つの残基（例えば、６１及び６２）が許容可能な変化を表すと考えられる（例えば、残基６１のＳｅｒをＰｒｏに変更し、残基６２のＳｅｒをＡｌａに変更）。そこで、一連の「超ヒト化」変異体（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：１１１９−１１２５）を表１２に示す鋳型及びプライマー対を使用して作製した（例えば、完全なヒトＬＣＤＲ１を有する変異体Ｌ１０；一部ヒト化ＨＣＤＲ１領域を有する変異体Ｈ１２及びＨ１３）（表１１）。
【０３２７】
【表１１】
2011510622.tif 000012
【０３２８】
ヒト化抗体の活性を決定するための１以上の検定を行うことによってコンピュータモデリング予測の試験を行った。例えば、Ｌ１１変異体をＨ９と共トランスフェクションし、リストセチン誘発血小板凝集反応検定によって抗体の試験を行った。表１４に示すように、完全に０１８の残基になるようにＬＣＤＲ１を転換する３つの突然変異の導入は許容され、有意な力価の低下を引き起こすことはなかった。Ｈ１２、１３及び１４変異体をＬ９に結合した場合には、Ｈ１２−Ｌ９変異体抗体は僅かな力価の低下を示したが、Ｖ３４Ｗ突然変異は完全な力価を回復し、Ｓ６１Ｐ及びＡ６２Ｓ突然変異は力価にほとんど影響を与えなかった。これは、活性に影響を与えることなく、これらの残基を４−５９配列に転換することができることを示している。次に、ＶＬ変異体Ｌ１０をコードするプラスミド（鋳型）及び表１１及び１２に示すプライマー対を使用して、ＬＣＤＲ２（ＹＴＳＳＬＨＳ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）全体をヒト生殖系列Ｏ１８  ＬＣＤＲ２（ＤＡＳＮＬＥＴ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）で置換したＬ１０鎖の変異体を作製することにより、ｖＷＦ阻害活性を維持する際のＬＣＤＲ２の重要性について評価した。作製した変異体（Ｌ１１）はＨ１４と対にして抗体変異体Ｌ１１−Ｈ１４を製造した。この変異体はナノモル力価を示したが、血小板凝集反応検定においてキメラと比較して１０倍低い活性を示した（ＥＣ５０：１．６３ｎＭ）。これは、ヒト化抗体の最適活性にはＬＣＤＲ２が必要であるかもしれないことを示唆している。
【０３２９】
【表１２】
2011510622.tif 000013
【０３３０】
【表１３】
2011510622.tif 000014
【０３３１】
次に、変異体Ｈ１４にヒト化ＨＣＤＲ１のマウス残基（例えば、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５）を残す重要性を、これらの残基をＶＨ生殖系列４−５９の対応するヒト残基（例えば、Ｄ３１Ｓ、Ｇ３３Ｙ、Ｄ３５Ｓ）に変更することによって調べた。得られた変異体Ｈ１５は、Ｈ１４のＧＧＳＩＳＤＹＧＷＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１）の部分的にヒト化された配列と比較して、ＨＣＤＲ１についてＧＧＳＩＳＳＹＹＷＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）の配列を有していた。最後に、Ｈ１５のＨＣＤＲ２全体をＶＨ４−５９の対応するヒト残基に変更（ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）からＹＩＹＹＳＧＳＴＮＹＮＰＳＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）；合計７つの残基の相違）して、完全なヒトＨＣＤＲ１及びＨＣＤＲ２を有する別の変異体を作製した。変異体Ｈ１５及びＨ１６は個別に軽鎖変異体Ｌ１０と対にして抗体変異体Ｈ１５−Ｌ１０及びＨ１６−Ｌ１０を製造した。
【０３３２】
これらの変異体を血小板凝集反応検定において評価してそれらの活性を決定した。Ｔａｂｌｅ１４に示すデータは、ＨＣＤＲ１全体をヒト配列で置換することによって抗ｖＷＦ活性が失われることを示唆している。これは、ＨＣＤＲ１に３つの残基を残すことが（例えば、位置Ｈ３１のＤ、位置Ｈ３３のＧ、位置Ｈ３５のＤ）、Ｃｅｌｉｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ５：１８９）によって報告された結晶構造に示されているようにこれらの残基が直接抗原に接触しなくても、活性を維持するために重要であることを示唆している。ＨＣＤＲ２全体をヒト４−５９  ＨＣＤＲ２で置換してもＨ１５の失われた活性は回復せず（Ｃｅｌｉｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．の結晶学的研究と一致）、ＨＣＤＲ２の３つの残基（例えば、Ｈ５３、Ｈ５４、Ｈ５８）がｖＷＦ抗原と直接相互作用することを示唆している。
【０３３３】
【表１４】
2011510622.tif 000015
【０３３４】
実施例３：抗体のアイソタイプの再構成
ＶＨ変異体をＩｇＧ１型からＩｇＧ４型に再構成することが望ましい場合がある。これは、ＩｇＧ１は補体活性化と作動因子応答の惹起に関して活性なアイソタイプであるが、ＩｇＧ４は比較的不活性であるためである。例えば、侯補ＶＨ変異体は変異ＩｇＧ１型からＩｇＧ４１型（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４を参照）に転換して開発用侯補を生成した。また、軽鎖及び重鎖オープンリーディングフレームを再設計して５’（例えば、ＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位）及び３’（例えば、ＢａｍＨＩとＮｏｔＩ部位）末端に制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を導入し、下流細胞株発生及び大量抗体産生のための発現ベクターｐＳＴＯ５１８の多重クローニング部位へのサブクローニングを容易にした。
【０３３５】
例えば、ＩｇＧ１定常領域をＩｇＧ４定常領域で置換し、ＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩ部位を５’末端に導入し、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ部位を重鎖発現カセットの３’末端に導入することによって、ヒト化ＶＨ変異体Ｈ９及びＨ１４をＩｇＧ４型に転換した。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４は、可変領域と定常領域の接合部に自然発生Ａｐａ１部位を含む。この部位を、ＩｇＧ１の代わりにＩｇＧ４にクローニングするために使用した。ＢａｍＨ１及びＮｏｔ１制限部位を配列の３’末端に付加し、ｐＳＴＯ５１８ベクターへのサブクローニングを容易にした。ＡｐａＩ部位から終結コドンまでのイントロン削除ＩｇＧ４定常領域配列（ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ部位を追加）をＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）によってカスタム合成した。また、重鎖可変領域の５’末端にＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を導入し、Ｉｇκシグナル配列を挿入するように設計されたプライマーを使用してオーバーラップＰＣＲを行うことによってｐＳＴＯ５１８ベクターのシグナル配列をＩｇκリーダー配列に変更した。
【０３３６】
Ｈ９及びＨ１４重鎖配列はプライマー領域が同じであるため、同じプライマーとクローニング方法を使用した。ｈｕＮＭＣ４−Ｈ９（そして、ｈｕＮＭＣ４−Ｈ１４）重鎖可変領域で必要な変更の１つをそれぞれ導入した２種類のＰＣＲ産物を製造した。ｐＩＲＥＳｄｓＲｅｄ−ＨＵＬ１０（鋳型）及びＩｇＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）及びＩｇＫＨｎｍｃＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）（プライマー）を使用して、フォワードプライマーのＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を組み込み、Ｉｇκシグナルペプチドを増幅するＰＣＲ反応を実施した（表１５ａ及び１５ｂを参照）。次に、ｐＣＤＮＡ６−Ｈ９  （ｏｒ  ｐＣＤＮＡ６−Ｈ１４）（鋳型）及び１４ＶＨＦ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０２）及び１４ＶＨＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０３）（プライマー）を使用し、第１のＰＣＲ反応と３０個のヌクレオチドが重複する第２反応工程を行った。ＰＣＲ産物は、Ｈ９（又はＨ１４）可変領域と、ＡｐａＩ部位を介したＩｇＧ１定常領域の５つのアミノ酸を含んでいた。定常領域の最初の５つのアミノ酸はＩｇＧ１とＩｇＧ４において同一である。また、反応によってＡｐａＩ部位の次にＮｏｔＩ部位が付加され、ＩｇＧ４定常領域の挿入前の可変領域のクローニングが容易になった。上述した２つの工程の反応生成物（鋳型）、第１の反応のプライマー（ＩｇＫＬＦ）（フォワードプライマー）及び第２の反応のプライマー（１４ＶＨＲ）（リバースプライマー）を使用した第３のＰＣＲ工程によってκリーダーを上流に付加した。この反応の生成物をＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで消化させ、同様に消化させたプラスミド骨格ｐＣＩｎｅｏに挿入した。これにより、Ｉｇκリーダー及びＮＭＣ４−Ｈ９（又はＨ１４）の可変領域を含むクローニング中間体ｐＣＩ−ＮＭＣ４−ＶＨ９ｖａｒ又は（ｐＣＩ−ＮＭＣ４−ＶＨ１４ｖａｒ）を製造した。Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た新たに合成されたＩｇＧ４定常領域を含むプラスミドを、ＡｐａＩ及びＮｏｔＩで消化させ、１ｋｂ−γ４定常領域フラグメントをゲル精製し、ＡｐａＩ／ＮｏｔＩ消化ｐｃｉ−ＮＭＣ４−ＶＨ９ｖａｒ又は（ｐｃｉ−ＮＭＣ４−ＶＨ１４ｖａｒ）に連結した。これにより、プラスミドｐＣＩ−ＮＭＣ４−ＶＨ９及びｐＣＩ−ＮＭＣ４−ＶＨ１４を得た。ＤＨα細胞への形質転換後、各クローンからのプラスミド挿入部位の配列を決定し、それらが正しいことを確認した。
【０３３７】
【表１５ａ】
2011510622.tif 000016
【０３３８】
【表１５ｂ】
2011510622.tif 000017
【０３３９】
Ｌ９及びＬ１０軽鎖をＰＣＲによって変化させた。Ｌ９及びＬ１０軽鎖はプライマー領域が同じであるため、同じプライマーとクローニング方法を使用した。各軽鎖について２つのＰＣＲ鋳型を作製した。第１のＰＣＲ工程によって５’末端にＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入した。第２のＰＣＲ工程は第１のＰＣＲ工程と３０個のヌクレオチドが重複し、フラグメントの３’末端にＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩ部位を導入した。第３のＰＣＲ反応では、これらの２つの重複ＰＣＲ生成物を鋳型として使用し、第１のＰＣＲ工程からのフォワードプライマー及び第２のＰＣＲ工程からのリバースプライマーを使用してそれらを増幅することによってこれらの変更を導入した最終オーバーラップＰＣＲ生成物を得た。第３のＰＣＲ反応で得た生成物をＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで消化させ、同様に消化させたプラスミドｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、プラスミドｐＣＩ−ＮＭＣ４−ＶＬ９及びｐＣＩ−ＮＭＣ４−ＶＬ１０（表１６ａ及び１６ｂは、軽鎖作製に使用したプライマー及び方法の例を示す）。
【０３４０】
【表１６ａ】
2011510622.tif 000018
【０３４１】
【表１６ｂ】
2011510622.tif 000019
【０３４２】
Ｈ９−Ｌ９及びＨ１４−Ｌ１０のＩｇＧ４アイソタイプを実施例１に記載したようにＨＥＫ２９３Ｔ細胞から生成し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製した抗体をｖＷＦ媒介血小板凝集反応検定によって試験を行い、相対力価を決定した。表１７に示すように、ＩｇＧ４アイソタイプへの転換は力価に影響を与えなかった。
【０３４３】
【表１７】
2011510622.tif 000020
【０３４４】
実施例４：ｖＷＦ又はＡ１ドメインへの抗体の結合
ＨｉｓタグＡ１ドメイン抗原のクローニング：本願明細書に開示する理論に拘束されるものではないが、ＮＭＣ−４は、通常はｖＷＦが活性であるとき場合（例えば、高せん断条件下）にのみアクセス可能なｖＷＦのＡ１ドメインに結合すると仮定することができる。別のアプローチとして、完全な活性化ｖＷＦと同等な力価でＧＰ１ｂαと結合すると報告されている（Ｃｅｌｉｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）ｖＷＦの孤立（ｉｓｏｌａｔｅｄ）Ａ１ドメインを発現させることが望ましい場合もある。そこで、Ａ１ドメインを、マイクロウェル結合研究のための基質として機能するようにクローニングした。ＡＴＣＣ（Ｃａｔ＃６７１２２）から完全ヒトｖＷＦ  ｃＤＮＡを含むプラスミドクローンを購入した。ｖＷＦ−Ａ１−Ｆｏｒ（５’−ＣＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＧＡＡＣＣＧＣＧＴＴＧＣＡＣ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）及びｖＷＦ−Ａ１−Ｒｅｖ（５’−ＣＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＣＴＣＴＴＧＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）をプライマーとして使用し、クローンからｖＷＦ  Ａ１ドメイン（例えば、残基４９９〜７２９）を増幅した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＥｃｏＲ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉによって消化させ、ｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクターにクローニングした。生成物をＤＨ５α競合細胞に形質転換し、酸化型Ａ１ドメインを得た。
【０３４５】
ラットＡ１ドメインを発現するプラスミドを作製するために、メーカーの実施要綱（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｃａｔ＃  ＤＮ１２７，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ）に従ってＤＮＡｚｏｌ試薬を使用してラットゲノムＤＮＡをラット肝臓から単離した。（Ｒａｔ−ｖＷＦ−Ａ１−Ｆ（５’−ＡＧＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１４）及びＲａｔ−ｖＷＦ−Ａ１−Ｒ（５’−ＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＣＡＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣ−３’）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１５）をプライマーとして使用し、ゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ  Ｉ及びＮｏｔ  Ｉによって消化させ、ｐＥＴＤｕｃｔ−１ベクターの同一部位にクローニングした。生成物をＤＨ５α競合細胞に形質転換した。
【０３４６】
抗生物質（カルベニシリン、カナマイシン、テトラサイクリン）を含む１Ｌの細菌培地（ＬＢ又は２×ＹＴ）に２５ｍＬの細菌培養物（例えば、プラスミドｐ３５［ｐＥＴ−Ｄｕｅｔ−Ｒａｔ−Ａ１］又はｐ３６［ｐＥＴ−Ｄｕｅｔ−ｈｕｍａｎ−Ａ１］を有するＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ）を一晩にわたって植菌した。培養物は、シェーカー内において３７℃で０．６〜０．８のＯＤ６００に増殖させた。ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度に添加することによって組換え型タンパク質の発現を誘起し、培養物を３７℃で４〜５時間にわたって引き続き増殖させた。その後、ＪＡ−１０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）内において６０００ｒｐｍで遠心分離を行って集菌した。細胞ペレットは−８０℃で凍結するか、ペレットを２錠のプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を溶解した２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、氷上において細胞懸濁液に対して２分間の細胞破壊サイクルを２回行うことによって直ちに処理した（例えば、１〜２の一定のデューティサイクル設定及びアウトプットコントロール設定でマイクロチップを備えたＢｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０）。細胞溶解物に対して、ＪＡ−２０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）内において４℃で３０分間遠心分離（１６，０００ｒｐｍ）を行った。上清を０．４５μｍのシリンジフィルターを使用して濾過し、結合緩衝液（５ｍＭイミダゾール、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ：８．０）で平衡化したＨｉｓ−Ｓｅｌｅｃｔ  ＨＦ  Ｎｉｃｋｅｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）を充填した２ｍＬのカラムに添加した。１ｍｌ／分に流量を調整するシリンジポンプを使用してクロマトグラフィーを行った。カラムを２０ｍＬの結合緩衝液で洗浄した後、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾール、０．３Ｍ  ＮａＣｌ及び５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ：８．０）で溶離させ、１ｍＬを回収した。タンパク質のほとんどは最初の４回の溶離操作で溶離した。タンパク質の大きさ（〜２８ｋＤ）と完全性をクマシー染色ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで監視した。ピークフラクションをプールし、必要に応じて２．５ｍＬに濃縮し、ＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＰＢＳに脱塩した。タンパク質濃度は、Ｌｏｗｒｙタンパク質分析法（ＢｉｏＲａｄ  ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ）を使用して測定した。
【０３４７】
結合キネティクス：Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ、Ｋｄ値を評価するために、感受性分析を行ってユウロピウム（Ｎ１キレート）抗体抱合体を合成し、精製した。これらのユウロピウム標識ＮＭＣ−４キメラ及びアイソタイプ対照抗体の固定されたＡ１抗原への結合を、解離増強ランタニド蛍光免疫測定法（ＤＥＬＦＩＡ）を使用して測定した。
【０３４８】
例えば、対照抗体（例えば、アイソタイプ対照ＭＯＰＣ−２１、ヒト骨髄腫血漿からのＩｇＧ１／κ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）及びＮＭＣ−４キメラをユウロピウム標識した。簡単に説明すると、抗体を無菌濾過ナトリウムリン酸緩衝液（９６ｍＭ、ｐＨ：７．４）に添加し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ：７．４、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６７ｍＭ  ＫＣｌ）に透析し、低分子量第一級アミンを除去した。透析した抗体を、ＪＡ−２０ローター内において４℃で２０分間、９５００ＲＰＭ（７０００×ｇ）で洗浄したＭｉｃｒｏＳｅｐ濃縮装置を使用して濃縮した。１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ：９．３）を含むＰＢＳによって抗体濃度を４．０ｍｇ／ｍＬに調節した。ｍＡｂ／重炭酸塩混合物（０．２５０ｍＬ）を穏やかに混和しながらＥｕ３＋（Ｅｕ−Ｎ１−ＩＴＣ；Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ）でキレートした０．２ｍｇのＮ１−（ｐ−イソチオシアナートベンジル）−ジエチレントリアミン−Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−四酢酸を含む試験管に添加した。抗体とアミン活性キレートの混合物を４℃で一晩撹拌せずに反応させた。
【０３４９】
標識された抗体混合物を、ＰＢＳで予備平衡化したＮＡＰ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に添加した。フラクション（例えば、０．５ｍＬ）をカラム緩衝液にＰＢＳを使用して回収した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３８４吸光プレートリーダーを使用して試料の総タンパク量（Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を測定し、ＤＥＬＦＩＡエンハンスメント溶液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）で１：１０．０００に希釈後、Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して時間分解蛍光（ＴＲＦ）法によりユーロピウム（Ｅｕ）を測定した。タンパク質及びＥｕ標識について陽性だったフラクションをプールし、泳動バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ：７．４、１３８ｍＭ  ＮａＣｌ）で予備平衡化したＮＡＰ−１０カラムに添加した。タンパク質及びＥｕ標識について陽性だったフラクションをプールし、泳動バッファーで予備平衡化したＰＤ−１０カラムに添加した。タンパク質及びＥｕ標識について陽性だったフラクションをプールし、総タンパク量及びユーロピウム含有量をユーロピウム標準液（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に対して較正したＴＲＦにより測定した。そして、蛍光：タンパク比（ｆｌｕｏｒ：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒａｔｉｏ）を算出した。
【０３５０】
Ｉｍｍｕｌｏｎ−４プレートのウェルを、一晩にわたって４℃で培養することにより、ヒト（例えば、１００μＬ／ウェルに２５ｎｇ、３０ｍＭトリス、ｐＨ：７．４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ又は２価カチオンを含有しないＰＢＳ）又はラット（例えば、５０ｎｇ／ウェル）からのｖＷＦのＨｉｓ−Ａ１ドメインでコーティングした。使用前に、プレートを洗浄緩衝液（例えば、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ：７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で３回洗浄し、３００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（例えば、３．０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを含有しないＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含む洗浄緩衝液）で室温で１時間ブロックし、洗浄緩衝液で５回洗浄した。
【０３５１】
以下のようにして平衡結合定量法を行った。Ｅｕ標識抗体は結合緩衝液（例えば、１００μｇ／ｍＬのＩｇＧを含有しないＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含む洗浄緩衝液）で希釈し、９６ウェルプレートのウェル（例えば、１０μＬ／ウェル）に添加した。プレートはＳＥＡＬＰＬＡＴＥフィルムで封止した。プレートを震盪し（例えば、Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｓｈａｋｅｒ、１５秒又は６０秒以上で４の速度設定（ＲＴ））、濡らしたペーパータオルを入れたナルゲンボックスに入れ、密閉したボックス内において３７℃で２時間培養した。遊離標識の測定では、上澄試料（４．０μＬ）を、結合混合物を含むウェルからＤＥＬＦＩＡ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （１００μＬ／ウェル）を含む平行なウェルセットに移した。結合した抗体を評価するために、結合混合物が残留したＡ１被覆ウェルを、洗浄緩衝液で５回洗浄し、ペーパータオルで乾燥させ、結合した標識の測定のために空のウェルにＤＥＬＦＩＡ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μＬ／ウェル）を添加した。検定の較正のために、ＤＥＬＦＩＡ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μＬ／ウェル）を未使用のウェルに添加し、ユウロピウム標準（１．０μＬ／ウェル）を添加した。プレートを震盪し（Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｓｈａｋｅｒ、速度設定を５として室温で１０分間）、Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｗａｌｌａｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用して時間分解蛍光（ＴＲＦ）強度を測定した。結合は、各抗体について蛍光：タンパク質比（Ｆ：Ｐ）によってＥｕ−キレート含有量について正規化した。特異的結合は、全結合（例えば、Ｅｕ−ＮＭＣ−４による結合）から非特異的結合（例えば、Ｅｕ標識アイソタイプ対照による平均結合）を差し引くことによって算出した。結合部位の数及びＫｄ値はＳｃａｔｃｈａｒｄ（１９４９）の方法によって算出した。Ｈｉｌｌプロット
【数１】
2011510622.tif 000021
を作成して結合を評価した。
【０３５２】
この分析により、Ｋｄ＝０．３７ｎＭの高親和性部位とＫｄ＝５ｎＭの低親和性部位という２種類の親和性部位があることが明らかになった。同様に、抗Ｈｉｓ  ｍＡｂによって捕捉されたラットｖＷＦからのＨｉｓ−ｒＡ１への結合は、０．１９ｎＭ又は３．４ｎＭのＫｄ値を有する２種類の親和性部位の存在を示している（表１７）。
【０３５３】
同じプロトコルを使用して会合キネティクスを調べた。ただし、異なる時点において洗浄緩衝液の代わりに上記濃度（１００μｌ／ウェル）のユウロピウム標識抗体を使用した。プレートを直ちに封止し、震盪し（Ｔｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｓｈａｋｅｒ、速度設定を４として室温で１５秒間）、３７℃で上述した時間にわたって培養した。結合混合物を含むプレートを洗浄緩衝液で５回洗浄し、ペーパータオルで乾燥させ、各プレートの洗浄時間を記録した。結合した標識の測定のために、未使用のウェルにＤＥＬＦＩＡ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００μＬ／ウェル）を添加した。各抗体濃度の見掛けのオンレート（ｋｏｎ，ａｐｐ）を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して特異結合対時間を以下の式に当てはめることによって測定した。
【０３５４】
【数２】
2011510622.tif 000022
【０３５５】
見掛けの会合速度（ｋｏｎ，ａｐｐ）はＥｕ−ｍＡｂ濃度に対してプロットした。データを一次方程式に適用した。
【０３５６】
【数３】
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式中、オンレート係数ｋｏｎは傾きであり、ｍＡｂはＥｕ−ＮＭＣ−４の濃度であり、解離速度ｋｏｆｆは切片である。
【０３５７】
ヒト又はラットｖＷＦからのＨｉｓ−Ａ１に結合したＮＭＣ−４キメラの解離の半減期は以下の式によって算出する。
【０３５８】
【数４】
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【０３５９】
ヒト及びラットｖＷＦのＨｉｓ−Ａ１へのＥｕ−ＮＭＣ−４の特異的結合は単一の指数関数会合式となり、標識化抗体の各濃度の見掛けの会合速度ｋｏｎ，ａｐｐ（例えば、指数結合曲線からの定数ｋ）が得られる。両方の抗原対する見掛けの会合速度（ｋｏｎ，ａｐｐ）は、ｋｏｎ，ａｐｐとＥｕ−ＮＭＣ−４濃度のプロットに示すように用量依存的である。結果を表１７に示す。これらの結果は、ＮＭＣ−４キメラは、ヒトＡ１ドメインに対して０．３２±０．０７ｎＭのＫｄを有し、ラットＡ１ドメインに対して０．２８±０．０１ｎＭのＫｄを有することを示している。いずれの場合でも、これらの結果は平衡結合によって決定したＫｄ値と厳密に一致している。また、これらの結果は、両方のＡ１種において抗原−抗体複合体は長い寿命を有することを示唆しており、ヒト及びラット抗原の生体外の解離半減期は４４分及び６９分だった。
【０３６０】
【表１８】
2011510622.tif 000025
【０３６１】
競合結合研究を行ってＫｉ値（例えば、抗原に対する相対親和性の基準）を決定することができる。検定は会合キネティックスに関して上述したように行った。ただし、８０μＬ／ウェルの結合緩衝液（例えば、１００μｇ／ｍＬのＩｇＧを含有しないＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含む洗浄緩衝液）を添加し、１０μＬ／ウェルのＥｕ−ＮＭＣ−４又はＥｕ非標識競合物のいずれか及び１０μＬ／ウェルの非標識競合物抗体（１０−１２Ｍ〜１０−７Ｍに希釈）を添加した。Ｅｕ標識抗体は結合緩衝液（例えば、１００μｇ／ｍＬのＩｇＧを含有しないＢＳＡ及び０．１％アジ化ナトリウムを含む洗浄緩衝液）で希釈し、９６ウェルプレートのウェル（例えば、１０μＬ／ウェル）に添加した。プレートはＳＥＡＬＰＬＡＴＥフィルムで封止した。ユウロピウム標識抗体の最終濃度は１００ｐＭである。非特異的バックグラウンド結合レべルはキレート化剤ＤＴＰＡ（１μＭ）の存在下でかなり減少したため、競合タンパク結合測定法に含めた。また、ウェルのコーティングは、タンパク質製剤から還元Ａ１を除去するためにヨードアセチルゲルを使用して精製されたＨｉｓ−Ａ１を使用して最適化した。混合物は反応が完全均衡に達するように３．７５時間培養した後、洗浄し、結合した標識化抗体を上述したようにＴＲＦで測定した。阻害曲線をＰｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｉｎｃ．）を使用して「ｏｎｅ  ｓｉｔｅ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ（一部位競合）」モデルに当てはめてＩＣ５０値を求め、平衡結合実験のＳｃａｔｃｈａｒｄ解析で測定されたＫｄ値を使用し、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆ（１９７３  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ．２２：３０９９）の式によってＫｉを算出した。
【０３６２】
競合タンパク結合測定法の標定は、非標識ＮＭＣ−４キメラによる相同競合で得られたＫｉ値をＥｕ−ＮＭＣ−４の抗原への結合について測定された親和性（Ｋｄ）と比較することによって行った。ヒトＨｉｓ−Ａ１への相同競合の場合には、ＮＭＣ−４キメラは０．２８±０．０６ｎＭのＫｉ（表１９）で結合するＥＵ−ＮＭＣ−４の潜在的な阻害剤である。これは、観察された０．３２±０．０７ｎＭのＫｄと一致している。同様に、ラットＨｉｓ−Ａ１への相同競合の場合には、ＮＭＣ−４キメラは０．２９７±０．１２８ｎＭのＫｉ（表１８）を有し、０．２７６±０．０１１ｎＭのＫｄと一致している。一方、ヒト骨髄腫血漿からの非標識アイソタイプ対照ＩｇＧ１／κは、Ａ１抗原に対するＥｕ−ＮＭＣ−４の結合の阻害効果を有していなかった。
【０３６３】
【表１９】
2011510622.tif 000026
【０３６４】
次に、競合タンパク結合測定法を使用して、ヒト化ＮＭＣ−４変異体Ｈ９Ｌ９  ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の力価を調べた。ＣＤＲ移植Ｈ９Ｌ９変異体の２つのアイソタイプは同じｎＭ活性を示したが、ＮＭＣ−４キメラよりも低かった（表１９）。
【０３６５】
競合タンパク結合測定法によってＡＪＷ−２００抗体の試験を行った。Ｈｉｓ−Ａ１へのＥｕ−ＮＭＣ−４の結合に競合するヒト化ＮＭＣ−４変異体とは対照的に、Ｈｉｓ−Ａ１へのＥｕ−ＮＭＣ−４の結合は２１０ｐＭのＥＣ５０でＡＪＷ２００によって高められた。Ｈｉｓ−Ａ１へのＥｕ−ＮＭＣ−４の結合のＨｉｌｌプロットは、Ｈｉｌｌ傾きがほぼ１（ｎＨ＝０．９８４及び０．９５７）であることを示し、協働性のない単一の結合部位への結合と一致している。一方、１．８ｎＭ又は２０ｎＭのＡＪＷ２００の存在下でのＨｉｓ−Ａ１へのＥｕ−ＮＭＣ−４の結合のＨｉｌｌプロットは、Ｈｉｌｌ傾きが１よりも大きく（ｎＨ＝１．５４８及び１．２０１）であることを示し、積極的な協働性を示した。ＡＪＷ２００による積極的な協働性は、異なる日に行われた２回の独立した実験で観察された。これらの結果は、ＮＭＣ−４が別々の結合部位に結合した後にＡＪＷ２００がｖＷＦのＡ１ドメインに結合することだけではなく、少なくとも孤立Ａ１フラグメントについて、ＡＪＷ２００がＮＭＣ−４のＧＰ１ｂα結合部位への結合を高めることを示している。
【０３６６】
実施例５：血小板付着を妨げる抗体の能力
抗体がｖＷＦのＧＰ１ｂα受容体結合部位をブロックすることは、自然な流量条件下でｖＷＦ−ＧＰ１ｂの相互作用に拮抗することができることを示している。Ｍｏａｋｅら（１９８６，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ７８：１４５６−６１）が開発した方法は、内皮細胞がヒスタミンで活性化されると、非常に大きいｖＷＦ（ＵＬｖＷＦ）を分泌し、Ａ１ドメインは開いた（例えば、活性な）構造を有するという事実を利用する。血漿の導入による急速な崩壊は、ＵＬｖＷＦのＡＤＡＭＳ１３媒介開裂によるものである（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｂｌｏｏｄ  １００：４０３３−９）。
【０３６７】
本実施例では、第１の通過（Ｐ１）ＨＵＶＥＣを分割し、１×１０５細胞／皿の密度で３５ｍｍの培養皿に播種し、７日間培養し、７日目（１００％密集の２〜３日後）に使用した。ＣＦＳＥ−標識ヒト血小板は、１．２ｍＬ／ｍｉｎの流量で容易にＨＵＶＥＣを付着する（図３Ａ）。細胞を２５μＭヒスタミンで室温において１０分間であらかじめ処理した場合には、より多くの血小板がＨＵＶＥＣに付着した（図３Ｂ）。このような血小板の付着は、血小板を１０μｇ／ｍｌの濃度でＮＭＣ−４を含有する緩衝液内で単分子層を透過させた場合には完全に阻害され（図３Ｃ）、血小板を１８μｇ／ｍｌの濃度の抗ＧＰＩｂα抗体（例えば、ＡＫ２）の存在下で透過させた場合には部分的に阻害された（図３Ｄ）。一方、１８ｇ／ｍｌの濃度のマウス対照ＩｇＧはｖＷＦポリマーへの血小板の付着を抑制しなかった（図３Ｅ）。これは、ＨＵＶＥＣへの血小板の付着が内皮由来ｖＷＦと血小板ＧＰＩｂαとの相互作用によって媒介されることを示唆している。撮影された２０枚の像から血小板によってカバーされる面積をＣｏｍｐｉｘソフトウェアを使用して測定及び定量化すると、ごくわずかな影響を及ぼす対照抗体と比較して、ＮＭＣ−４は血小板の付着を９５％を超える割合で抑制した。
【０３６８】
実施例６：血管閉塞を防止する抗体の能力
動脈血栓の塩化第二鉄モデルを使用して、ＡＪＷ２００と比較した場合のＮＭＣ−４キメラ及びヒト化誘導体（例えば、Ｈ１４、Ｌ１０）の抗血栓活性を評価した。唾液線及び付随する脂肪組織の切開の頭蓋側への再配置によって対側頚動脈を分離した。頚動脈を露出した後、頚動脈を包み、塩化第二鉄（７．５％）溶液に頚動脈が浸漬されるように折り曲げた濾紙（４×５ｍｍ）上に置いた。ＦｅＣｌ３溶液に４分間浸漬した後、血流プローブを頚動脈の周囲に配置し、閉塞時（対照ラットでは通常１０分間）まで、又は４５分間、Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．のｆｌｏｗ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ）を使用して血流を測定した。４匹のラットからなる群（生理的食塩水の場合はｎ＝６）に、５〜０．０１ｍｇ／ｋｇのＮＭＣ−４キメラ、Ｖ１４、Ｌ１０、ＡＪＷ２００又は対照ＩｇＧを投与した（ｌμＬ／ｇ）。抗体製剤は無菌濾過し、エンドトキシン含有量が低くなるように、ＬＩＭＵＬＵＳ  ＡＭＯＥＢＯＣＹＴＥ  ＡＳＳＡＹ  ＫＩＴ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を使用してメーカーの説明書に従って試験を行い、動物研究に使用する前にＨＰＬＣ分析によって単分散性について評価した。
【０３６９】
図４Ａないし図４Ｃに示すように、ＮＭＣ−４とＡＪＷ２００は血管閉塞を有意に抑制した。ＮＭＣ−４は、０．０３及び０．１ｍｇ／ｋｇの投与量でＡＪＷ２００と同様なＥＤ５０を示した。ヒト化誘導体、Ｈ１４、Ｌ１０も同様な活性を示し、０．０３及び０．１ｍｇ／ｋｇの投与量でＡＪＷ２００と同様なＥＤ５０を示した（図４Ｂ）。
【０３７０】
実施例７：出血時間及び失血量に対する抗体の作用
失血は、抗血小板剤（例えば、抗ｖＷＦ抗体）に関連する有害な副作用として生じる場合がある。従って、それらの出血合併症の可能性についてヒト化ＮＭＣ−４抗体を評価することが必要である。そのため、標準出血時間検定を行った。尾を切断する３０分前に、抗体対照、ＮＭＣ−４キメラ又はＡＪＷ２００を投与した。尾の先端（例えば、０．５ｍｍ）を切断し、既知の量の温めた生理食塩水に入れ、出血が止まるまでの時間を測定した。また、出血時間の評価時に生理的食塩水に回収された血球のヘモグロビン含有量を測定することによって失血量を測定した。すなわち、赤血球を低速遠心分離によってペレット化し、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含有する生理的食塩水（５ｍＬ）に再懸濁し、４２０ｎｍの吸光度を測定することによって溶液のヘモグロビン濃度を測定した。
【０３７１】
ＮＭＣ−４キメラは、ヒト化Ｈ１４−Ｌ１０と同じ０．０９ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０投与量において、出血時間における有意な増加を示した。動脈血栓のＦｅＣｌ３モデルにおける２種類の抗体の有効性に関連する０．０３ｍｇ／ｋｇの投与量では、出血時間の有意な増加又は失血量の有意な増加は見られなかった。ＮＭＣ−４及びそのヒト化誘導体は、ＡＪＷ２００（ラットにおける出血が増加した場合のＥＤ５０投与量が抗血栓活性の場合のＥＤ５０投与量と近い）よりも僅かに改善されたＥＤ５０投与量応答を示し、ＡＪＷ２００と比較してＮＭＣ−４は向上した治療濃度域を有することを示唆している。
【０３７２】
【表２０】
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【０３７３】
止血におけるこれらの抗体の有害な副作用の別のパラメータは失血量であり、出血時間を測定する際に採取した血液を使用して評価した。０．１ｍｇ／ｋｇよりも多い投与量では、これらの抗体は有意な失血をもたらした。しかしながら、０．３〜３ｍｇ／ｋｇの投与量の場合には、ＡＪＷ２００は同一の投与量においてＮＭＣ−４キメラよりも顕著な失血を引き起こした。ただし、これらの相違は３．０ｍｇ／ｋｇの群の統計的有意性に近づいたのみである（ｎ＝３ではなくｎ＝４）（表２０）。Ｈ１４及びＬ１０抗体変異体は、原型ＮＭＣ−４キメラとの有意差は示さなかった。
【０３７４】
実施例８：循環血小板及び白血球数に対する抗体の作用
ある種の抗血小板剤は血栓症形成を抑制するが、同時に血小板減少症を引き起こし得ると考えられている（Ｈａｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｈａｓａｒ，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２９８：１６５−７１（２００１））。治療された動物における循環白血球（ＷＢＣ）及び血小板の数に対するＮＭＣ−４の影響を調べるために、２３０〜２６０ｇの体重を有する５匹のラットからなる群に１ｍｇ／ｍＬのＮＭＣ−４を（例えば、静脈内）注射し、３匹のラットからなる対照群に賦形剤（例えば、外科グレードＰＢＳ）を注射した。注射前に尾から採血し、例えば、ＨＥＭＡＶＥＴ  ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ  ＡＮＡＬＹＺＥＲ（商標）（Ｄｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してベースライン血球数を測定した。抗体又は生理的食塩水の注射後に、所定の時点（例えば、３０分後及び２、４、２４、４８時間後）に麻酔を行っていないラットの後眼窩部より毛管ピペットを使用して血液試料を採取した。約４０μＬの血液を５μＬのクエン酸−クエン酸塩−ブドウ糖（ＡＣＤ）抗凝血剤溶液を含む試験管に移し、直ちにＨＥＭＡＶＥＴ血球カウンターに採取して血小板数と白血球の数を測定した。各採血において、試料を別々の目から採取した。
【０３７５】
ＮＭＣ−４は、分析時点において血小板数にほとんど影響を与えなかった。注射後３０分の時点で３７．５％（ｐ＝０．０１６）の一時的な白血球数の減少が観察されたが、同様な減少はＰＢＳの注射でも観察された。ＮＭＣ−４群及び対照群において、注射後２〜４時間で白血球レべルはベースラインに戻った。
【０３７６】
実施例９：抗体の発現のための細胞株の確立
多重部位特異的な再結合受容体部位を含むように設計されたマウス人工染色体発現（ＡＣＥ）プラットホームに基づく高収量哺乳動物タンパク質発現系に、ターゲットシャトルベクターと共に変異ラムダインテグラーゼ（例えば、ＡＣＥインテグラーゼ）を使用して異種遺伝子配列を導入することができる（Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ，（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３２（２１）：ｅ１７２（２００４）；米国特許出願公開第２００３／０１１９１０４  Ａ１号及び米国特許出願公開第２００６／０２４６５８６  Ａ１号）。この発現系は、選択されたヒト化変異体及びＮＭＣ−４キメラの発現のための安定した細胞株を生成するために使用することができる。
【０３７７】
プラスミドｐＣＩ−ＮＭＣ４−ＶＬ１０及びｐＣＩ−ＮＭＣ４−ＶＨ１４の挿入部位をＮｏｔ１及びＨｉｎｄＩＩＩ（軽鎖ベクター）又はＸｈｏ１及びＢａｍＨ１（重鎖ベクター）で消化させ、ｐＳＴＯ５１８ベクターのＭＣＳ１（軽鎖）及びＭＣＳ２（重鎖）にクローニングした。重鎖及び軽鎖挿入部位を有するｐＳＴＯ５１８ベクターは、Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．に記載されたターゲットベクターに由来する異なる耐性遺伝子を有するＡＣＥターゲットベクター（ＡＴＶ）への導入のためのシャトルベクターとして機能する（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３２（２１）：ｅ１７２（２００４）；米国特許出願公開第２００３／０１１９１０４  Ａ１号及び米国特許出願公開第２００６／０２４６５８６  Ａ１号）。抗体の重鎖及び軽鎖を含むカセットをＡＴＶに導入するために、前記ｐＳＴＯ５１８−ＶＨ１４及びＶＬ１０ベクターをＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩのホーミング・エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ）によって消化させた。ＶＨ１４及びＶＬ１０フラグメントをゲル精製し、Ｉ−Ｃｅｕ１及びＰＩ−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼで予め消化させたｐＺｅｏ及びｐＨｙｇｒｏ−ＡＴＶの同等な部位にクローニングした。これにより、プラスミドｐＮＨＴ６０５−Ｈ１４Ｌ１０−ＩｇＧ４（ｈｙｇＲ遺伝子）及びｐＮＨＴ６０７−Ｈ１４Ｌ１０−ＩｇＧ４（ｐ  ｚｅｏＲ遺伝子）を得た。
【０３７８】
同様に、ＮＭＣ−４  ＩｇＧ４キメラを有するｐＳＴＯ５１８ターゲットベクターを作成し、タンデム挿入部位をｐＺｅｏとｐＨｙｇｒｏ  ＡＴＶベクターにサブクローニングし、プラスミドｐＮＨＴ６２３（ヒトＩｇＧ４キメラ及びｈｙｇＲ遺伝子）及びｐＮＨＴ６２４（ヒトなＩｇＧ４キメラ及びｚｅｏＲ遺伝子）を得た。
【０３７９】
プラットホームＡＣＥへの標的組み込みのために、宿主ＣｈＫ２ＡＣＥプラットホーム細胞を６ウェル培養プレートのウェル当たり０．４×１０５細胞の密度で播種し、一晩培養した。トランスフェクションの３時間前に培地を無血清培地に取り替え、３時間後に、１μｇのベクター及び製造者の取扱説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合させた１μｇのＡＣＥ  Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ発現ベクターによるトランスフェクションを行った。２４時間後、細胞を１５ｃｍの培養皿に広げた。翌日、３．０μｇ／ｍＬのゼオマイシン又はハイグロマイシン（使用されるベクターに応じて選択）を培地に添加した。１４日間の選別後、薬物抵抗性コロニーをクローニングリングを使用して分離し、各クローンを抗体産生分析のために増幅した。
【０３８０】
実施例１０：ＮＭＣ−４抗体の生体内有効性及び安全性
ヒト化ＮＭＣ−４抗体の有効性と安全性をインビボ動物（例えば、ヒヒ）モデルを使用して調べた。
【０３８１】
ケタミン塩酸塩（Ａｎａｋｅｔ−Ｖ（商標）、Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）によってヒヒに麻酔をかけ（１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ／３０分又は全身麻酔を維持する必要がある場合）、発熱テーブルを使用して体温を３７℃に維持した。次に、４〜５ｃｍの部分を大腿血管の周辺組織からゆっくりと切り取った。大腿動脈及び大腿静脈の周囲の分岐部分は結紮した。次に、大腿動脈を及び大腿静脈を小さく切開し、血管の先端を挿入し、外科用絹糸で固定した。シリコーン管は血管の先端に取り付け、動脈血を大腿静脈に入れた。毛細血管を迂回して動脈から静脈に血液を直接循環させることにより、血流量は約１５０〜３００ｍＬ／分に増加した。チューブ式の超音波血流プローブ（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ，Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をシリコーンチューブに取り付け、血流量を約２０分間安定化させた。前記平均血流及び血流相を実験中絶え間なく測定し、薬物投与と血液採取にシャントを使用した。
【０３８２】
次に、Ｍａｒｔｉｎ持針器（Ｈｅｇａｒ−Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ  ＴＣ  Ｇｏｌｄ  １４ｃｍ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  ｃｏｄｅ  ２０．６３４．１４）を使用して、最大俯角で１０秒間内皮を強く圧迫することによって血管の先端近傍で大腿動脈の内皮を傷付けた。重複する２つの傷を形成し、調節可能なプラスチック製締め付け具を傷部位の上に配置して血流量を基礎値の１０〜２０％に減少させた。血栓形成によって血流量は次第に減少した。血流量が５ｍｌ／分以下に減少したときに、締め付け具を開き、血小板を多く含む血栓を移動させた。次に、外部狭穿を再び行うと、血栓形成が再開した。機械的な回復後に血流を減少させる繰り返しパターンを周期的血流減少（ｃｙｃｌｉｃ  ｆｌｏｗ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ（ＣＦＲ））という。時間の関数としてのＣＦＲ数を測定した。ベースラインＣＦＲを３０分間記録した。生理的食塩水を注入した後、ＣＦＲを３０分間監視した。実施例３に記載したヒト化ＮＭＣ−４変異体Ｈ９Ｌ９  ＩｇＧ４（以下、「ＧＢＲ６００」という）を使用した。
【０３８３】
薬物投与後の出血を評価するために２つの方法を使用することができる。第１の方法では、前腕の表面において皮膚テンプレート出血時間を測定する。血液測定用カフを腕の周りに取り付け、４０ｍｍ  Ｈｇで膨張させる。その後、Ｓｕｒｇｉｃｕｔ装置（ＩＴＣ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）を使用して創傷を形成する。皮膚出血時間は、創傷形成と視覚的な出血の停止との間の時間と定義される。血液は、１５秒毎に濾紙を創傷に触れないように慎重に軽くはたいて取った。皮膚出血時間が９００秒（例えば、１５分）を超え、９００秒であるとみなされる時に測定を終了した。
【０３８４】
第２の方法では、切開部からの失血量をウサギ頚動脈傷害モデルにおける組換え型アネキシンＶによって評価する（例えば、Ｐ．Ｔｈｉａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６（７）：２３３９−４７を参照）。２×０．８ｃｍの切開部を鼠蹊部に形成し、計量したガーゼ綿棒は挿入し、３０分の注入期間の終了時又は血液で飽和状態になった時に取り替えた。ガーゼは調査終了時に計量して失血量を算出した。各投与に対応する値は対照（生理的食塩水）ガーゼとの比率として表される。調査時には１０分間隔で心拍数と血圧を監視した。
【０３８５】
各投与期間の最後に、１ｍｌのＥＤＴＡ血液及び１０ｍｌのクエン酸血を採取し、ＦＢＣ血小板数、プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間、第ＶＩＩＩ因子及びｖＷＦを測定した。必要に応じて、２つの試料（各３００μｌ）を実験室における生体外試験のために−８０℃で凍結した。同様にして、血流量調査の収量から０．５、１、２、８、２４、４８時間後に血液を採取した。最終投与後、試験試料及び対照試料を使用して血小板凝集試験を行った。
【０３８６】
連続投与の終了後（例えば、ＣＦＲの完全な阻害が観察された時）、エピネフリン（ＥＰＩ）（Ｉｎｔｒａｍｅｄ）を２０分間にわたって２．２μｇ／ｋｇ／分の投与量で点滴し、ＣＦＲを再び測定した。エピネフリン（ＥＰＩ）のみではヒヒの血小板凝集を引き起こさないが、他の血小板凝集因子を増強することによって循環血流の変動を回復することができる（例えば、Ｇ．Ａｎｆｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２６：３５３−３７０を参照）。
【０３８７】
ＧＢＲ６００の有効性と安全性調査：ＧＢＲ６００の有効性と安全性を調べるために以下の調査１〜４を行った。
【０３８８】
調査１：パイロット調査を動物（ｎ＝１）に対して行い、ＧＢＲ６００の量の増加に応じた用量反応曲線を作成し、ＣＦＲの最大抑制が観察される有効投与量を特定した。テンプレート出血と切開出血を全ての投与量について測定した。血液試料を４８時間まで採取し、最大投与量における抗体の薬物動態を確認した。
【０３８９】
以下の漸増投与量でＧＢＲ６００を３０分間隔で注射し（投与量１：０．０３ｍｇ／ｋｇ、投与量２：０．１ｍｇ／ｋｇ、投与量３：０．３ｍｇ／ｋｇ、投与量４：１ｍｇ／ｋｇ、投与量５：１０ｍｇ／ｋｇ）、調査期間にわたって血流量を記録した。各投与量の注射後１０分間が経過したときに出血試験を行った。
【０３９０】
図５及び表２１は、ＣＦＲに対するＧＢＲ６００の漸増投与量の影響について示す。ＣＦＲが安定していない場合には、３０分間のベースラインフェーズの終了間際に動脈を再び傷付けた。０．０３ｍｇ／ｋｇのＧＢＲ６００により、ＣＦＲ数は生理的食塩水の場合の８／３０分から５／３０分に減少した。０．１ｍｇ／ｋｇをさらに点滴することによってＣＦＲは完全に抑制された。これは、動脈の再損傷によってＣＦＲの再発が生じなかったことによって確認された。ＣＦＲの抑制は以下の漸増投与量の全てについて観察された。最大投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）のＧＢＲ６００の点滴後、エピネフリン（ＥＰＩ）を２．２μｇ／ｋｇ／分の投与量で点滴し、血小板沈着が抑制されるか否かを確認した。エピネフリン（ＥＰＩ）の点滴により、血圧に対する作用のために血流量が一時的に増加したが、ＣＦＲの抑制は持続した。
【０３９１】
【表２１】
2011510622.tif 000028
【０３９２】
調査２：調査２は調査１と同様にして行ったが、調査１において０．０３ｍｇ／ｋｇの投与量においてＣＦＲの抑制が観察されたため、０．０１ｍｇ／ｋｇの投与量を投与量増加の開始時（０．０３ｍｇ／ｋｇの投与量の前）に追加した。
【０３９３】
調査２（例えば、図６及び表２２を参照）では、０．０１ｍｇ／ｋｇのＧＢＲ６００によるＣＦＲに対する作用（７ＣＦＲ／３０分（生理的食塩水では９ＣＦＲ／３０分））が観察された。ただし、０．０３ｍｇ／ｋｇ（累積投与量＝０．０４ｍｇ／ｋｇ）をさらに点滴することによってＣＦＲは完全に抑制された。従って、ＧＢＲ６００のＥＤ１００は０．０４ｍｇ／ｋｇである。動脈を再び傷付けてもＣＦＲの抑制は持続した。抑制作用は１０ｍｇ／ｋｇの最大投与量まで持続した。エピネフリン（ＥＰＩ）の点滴により、血圧に対する作用のために血流量が一時的に増加したが、ＣＦＲの抑制は持続した。
【０３９４】
【表２２】
2011510622.tif 000029
【０３９５】
調査３：調査３は調査１と同様にして行ったが、開始投与量を０．００５ｍｇ／ｋｇとし、０．００５ｍｇ／ｋｇをさらに投与し（累積投与量＝０．０１ｍｇ／ｋｇ）、０．０１ｍｇ／ｋｇづつ６段階で増加させた。
【０３９６】
調査３（例えば、図７を参照）では、０．００５ｍｇ／ｋｇのＧＢＲ６００によるＣＦＲに対する作用（８ＣＦＲ／３０分が７ＣＦＲ／３０分に減少）が観察された。ＣＦＲはＧＢＲ６００の投与量の増加と共に直線的に減少した。投与期間当たりのＣＦＲ数を表２３及び図８に示す。図８は、ＣＦＲはＧＢＲ６００の投与量の増加に伴うＣＦＲ数の直線的な減少を示している。ＣＦＲ数とＧＢＲ６００の投与量の関係は以下の式によって表される。データのＲ２は０．９９０１だった。
ＣＦＲ数／投与期間＝−１０９×ＧＢＲ６００投与量（ｍｇ／ｋｇ）＋７．４５１７
【０３９７】
調査２では０．０４ｍｇ／ｋｇの累積投与量によって完全な抑制が達成されたが、調査３のＥＤ１００は０．０７ｍｇ／ｋｇだった。調査３では、３０分間隔で投与量を漸増させた。観察されたＥＤ１００の相違は、薬剤の初期クリアランスによる血液中のＧＢＲ６００濃度の減少によるものと思われる。エピネフリン（ＥＰＩ）の点滴により、ＣＦＲは抑制されなくなった。これは、０．０７ｍｇ／ｋｇの累積投与量におけるＣＦＲ曲線の形状に関連すると思われる。０．０７ｍｇ／ｋｇの累積投与量においてＣＦＲの抑制が徐々に消失した（血栓が成長した）。これらの特定の条件下では、エピネフリン（ＥＰＩ）はＣＦＲの抑制を消失させることができるように思われる。
【０３９８】
【表２３】
2011510622.tif 000030
【０３９９】
調査４：調査４は調査１と同様にして行ったが、クロピドグレルを陽性対照として３匹のヒヒに使用し、クロピドグレルと１、１．５、２．５、５、１０ｍｇ／ｋｇで投与したＧＢＲ６００の有効性と出血傾向を比較した。
【０４００】
調査４において、ヒヒ１では１０ｍｇ／ｋｇの累積投与量においてクロピドグレルによってＣＦＲが完全に抑制され、ヒヒ２及び３では５ｍｇ／ｋｇの累積投与量においてＣＦＲが完全に抑制された（表２４及び図９（表２４のヒヒ３の結果を示す）を参照）。エピネフリン（ＥＰＩ）の点滴により、ＣＦＲは抑制されなくなった。
【０４０１】
【表２４】
2011510622.tif 000031
【０４０２】
テンプレート出血時間：調査１及び２では、０．０４ｍｇ／ｋｇを超える投与量ではテンプレート出血時間は１５分を超えた。クロピドグレル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ／Ｓａｎｏｆｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）による陽性対照試験では、２．５ｍｇ／ｋｇを超える累積投与量においてテンプレート出血時間は同程度に増加した。調査３では、テンプレート出血時間は１５分を超えることはなかった。テンプレート出血時間は高いベースライン変動性を示すため（例えば、クロピドグレルを投与したヒヒ１、２、３のベースライン値を参照）、テンプレート出血時間は出血傾向の非常に正確な尺度ではない。従って、術前設定等では、テンプレート出血時間は臨床的に非常に適切な出血の予測であるとはみなされていない（例えば、Ｌｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ４８５−４９３，Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ  ＡＤ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照）。切開出血試験は切開によって失われた実際の出血量を定量化し、より高いダイナミックレンジを有するため、変動は少ない。従って、テンプレート出血試験に加えて切開出血試験も行った。得られたデータを表２５及び表２６に示す。
【０４０３】
【表２５】
2011510622.tif 000032
【０４０４】
【表２６】
2011510622.tif 000033
【０４０５】
表２７及び表２８は、切開出血試験によってクロピドグレル及びＧＢＲ６００について得られた結果を示す。ガーゼに吸収される血液量は、当初は投与量と共に増加し、高い投与量で自己限定的となった。全ての調査において、最大の出血は４番目の投与量で観察され、ガーゼに吸収される血液量はその後減少し、創傷は治癒したものと思われる。調査１及び２において、最大出血はクロピドグレルの場合と同様だった。ただし、クロピドグレルはＥＤ１００の２〜４倍で試験を行ったが、ＧＢＲ６００は最大２５０倍で試験を行った。調査３では、全ての投与量においてごく少量の出血が見られた。
【０４０６】
【表２７】
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【０４０７】
【表２８】
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【０４０８】
ＧＢＲ６００の治療濃度域と出血スコア：図１０では、調査１及び２の切開出血試験及びクロピドグレルの調査の結果をＧＢＲ６００及びクロピドグレルの投与量に対してプロットした（投与量はＥＤ１００の倍数として表し、対数スケールにプロットした）。
【０４０９】
ＧＢＲ６００は、ＥＤ１００の１００倍を超える投与量であっても、ＥＤ１００の最大４倍においてクロピドグレルについて観察されたレべルで出血を生じさせた。予期せぬことに、ＧＢＲ６００は、出血の危険性に関してかつてない安全治療濃度域を有していた。
【０４１０】
本調査において観察された唯一の臨床的に重要な出血の増加は、テンプレート出血法及び切開出血法で測定した浅い切り傷からの自己限定的な出血の増加である。外科手術後の４８時間にわたって動物を注意して観察したが、簡単な挫傷、点状出血又は斑状出血等の表面出血の追加的な徴候は観察されなかった。より重要なことに、血腫、衂血、口又は膣からの失血、下血、眼内出血、血尿、吐血等の内出血の兆候は見られなかった。手術創は出血せず、正常に治癒した。
【０４１１】
表２９に示すように、クロピドグレル及びＧＢＲ６００の出血スコア法におけるスコアは１だった。表面創傷における出血の増加以外には、実験期間中又は調査終了後の４８時間の観察期間において動物にその他の症状は観察されなかった。
【０４１２】
【表２９】
2011510622.tif 000036
【０４１３】
有効性及び安全性調査からの知見：表３０〜表３２は、調査１〜３におけるｖＷＦレべル、第ＶＩＩＩ因子レべル、白血球数、ヘモグロビン濃度（Ｈｂ）、血小板数（Ｐｌｔ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）に対するＧＢＲ６００の作用を示す。
【０４１４】
調査１〜３におけるｖＷＦレべルに関しては、調査１ではパターンは観察されなかったが、調査２及び３では、明らかなｖＷＦレべルの減少が観察された。投与量をかなり多くした調査２では、投与量を比較的少なくした調査３よりも作用は顕著だった。ｖＷＦに結合しない対照ヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体を使用した調査では、ｖＷＦレべル対する作用は観察されなかった。ＧＢＲ６００の作用及びその意味は将来の研究で慎重に観察すべきである。全ての調査において、ＧＢＲ６００は第ＶＩＩＩ因子レべルに対して顕著な作用を示さなかった。
【０４１５】
ＷＢＣの増加が観察されたが、これは侵襲的手法の公知の作用であり、ｖＷＦに結合しない対照モノクローナルＩｇＧ４抗体及びこれまでにこのモデルで試験を行った他の全ての薬剤の結果と相関している。ＧＢＲ６００の点滴によるヘモグロビン濃度に対する顕著な作用は観察されなかった。血小板数に対するＧＢＲ６００の点滴の作用としては、血小板沈着はＣＦＲ時に動脈閉塞の原因となるため、血小板は実験中に消費された。従って、ＣＦＲを効果的に抑制することにより、血小板の消費量は減少する。これは、ＣＦＲの抑制が観察されなかった、ｖＷＦに結合しない対照ヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体を使用した場合に観察された血小板の消費量の増加を説明するものである。
【０４１６】
凝固タンパク質の完全性のインジケータであるＰＴ及びａＰＴＴに対するＧＢＲ６００の顕著な作用はないように思われた。ｖＷＦに結合しない対照ヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体にも同様な結果が得られた。
【０４１７】
【表３０】
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【０４１８】
【表３１】
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【０４１９】
【表３２】
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【０４２０】
ＧＢＲ６００は、動脈血栓時の血小板沈着の潜在的な阻害剤であるように思われる。クロピドグレルとは異なり、エピネフリン（ＥＰＩ）によってＣＦＲの抑制が妨げられることはなかった。ＧＢＲ６００の場合には、現在有効と思われる投与量の最大２５０倍の投与量で点滴した場合にも、重度かつ有害な出血は観察されなかった。これらの投与量では、煎じた切開出血モデルで測定した出血は、有効投与量の４〜８倍の投与量で点滴したクロピドグレルと同様の結果が得られた。ＧＢＲ６００は、ＰＴ及びａＰＴＴに結果によって示されるように、凝集タンパク質に対する作用は示さなかった。一方、フォンウィルブランド因子レべルの減少が観察された。しかしながら、第ＶＩＩＩ因子レべルに対する顕著な作用は観察されなかった。ワルファリンは機能的なビタミンＫ依存凝固タンパク質の循環値を減少させることによって血液凝固系を阻害するため、これは問題とはならない。本調査では、全血球数パラメータ（ＷＢＣ、Ｈｂ、Ｐｌｔ）に対する予測せぬ作用は観察されなかった。
【０４２１】
実施例１１：ヒト化ＮＭＣ−４変異体の耐熱性
マウスＮＭＣ−４ＦＡＢフラグメント及びキメラＮＭＣ４−ＩｇＧ１のヒト化ＮＭＣ−４変異体の耐熱性を熱量測定によって比較した。モノクローナル抗体の融解曲線はアイソタイプに特有だが（Ｇａｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｒｅｓｔ（２００７），ＢＢＲＣ  ３５５：７５１−７）、完全ＩｇＧについてもＦＡＢフラグメントの中間融点は容易に特定することができる。ＦＡＢ部分の中間融点を使用してヒト化侯補のモノクローナル安定性について確認した。
【０４２２】
ＶＰ−ＤＳＣ示差走査型マイクロ熱量計（ＭｉｃｒｏＣａｌ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＫ）を使用して熱量測定を行った。細胞量は０．１２８ｍＬ、加熱速度は１℃／分、過剰圧力は６４ｐｓｉに維持した。全てのタンパク質フラグメントは、１〜０．５ｍｇ／ｍＬ（７４μＭ）の濃度でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に添加した状態で使用した。各タンパク質のモル熱容量は、タンパク質を含まない同一の緩衝液を含む試料との比較によって推定した。部分モル熱容量及び融解曲線は、標準的な方法を使用して分析した。示差熱図は、Ｏｒｉｇｉｎ  ｖ７．０ソフトウェアによる非二状態（ｎｏｎ−ｔｗｏ  ｓｔａｔｅ）モデルを使用して分析する前に、ベースライン補正及び濃度正規化を行った。実施例３に記載したようにＨ１４Ｌ１０−ＩｇＧ４について得られたデータの例を図１１に示す。マウスＮＭＣ−４ＦＡＢフラグメントは７４．７℃において単一の遷移を示したが、Ｈ１４Ｌ１０−ＩｇＧ４  ＦＡＢフラグメントの遷移は８１．１℃に現れた。これは、安定性における有意な差（６．４℃）に対応する。ヒトＦＡＢ定常ドメインの影響を調べるために、ヒトＩｇＧ１（最も安定したヒトアイソタイプ；Ｇａｒｂｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｒｅｓｔ  （２００７），ＢＢＲＣ  ３５５：７５１−７）に移植したマウスＮＭＣ−４可変ドメインからなるキメラを調製した。Ｈ１４Ｌ１０−ＩｇＧ４及びキメラＮＭＣ４−ＩｇＧ１（７９．１℃）の見掛けのＦＡＢ  Ｔｍ値は、Ｈ１４−Ｌ１０  ＦＡＢの安定性における有意な上昇を示した（ｄｅｌｔａＴｍ＞１℃）。
【０４２３】
実施例１２：ＧＢＲ６００の重鎖（ＶＨ９）及び軽鎖（ＶＬ９）をコードする遺伝子のクローニング
以下の材料と方法を使用してＧＢＲ６００をコードする遺伝子のクローニングを行った。
ＰｆｕＵｌｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．：６００３８０）
ＳｐｅＩ（ＮＥＢ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．：Ｒ０１３３）
ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．：Ｒ０１０４）
ＣＩＰ（ＮＥＢ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．：Ｍ０２９０）
ｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．：４４−０３０２）
プライマー：Ｏｐｅｒｏｎ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ
ＧＬＮＰＲ１０７：ＴＡＡＣＴＡＧＴＣＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＧＴＣ
ＧＬＮＰＲ１０８：ＡＡＧＣＴＴＡＣＧＧＣＴＡＧＣＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧ
ＧＬＮＰＲ１３９：ＣＣＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＣＡＡＡＧ
ＧＬＮＰＲ  １７６：ＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣ
ＧＬＮＰＲ  １７７：ＴＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧ
ＧＬＮＰＲ  １７８：ＴＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧ
ＢＧＨＲＥＶ：Ｆａｓｔｅｒｉｓ製
ＴＭＣベクターｐＣＩ−ＮＭＣ４−ＶＬ９（ｐ１５６）及びｐＣＩ−ＮＭＣ４−ＶＨ９（ｐ１５８）（Ｃｈｒｏｍｏｓ）
Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．：２８７０６）
１ｋｂ＋ｌａｄｄｅｒ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．：Ｒ０４９１）
ｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．：Ｖ７９５−２０）
ｐＥＦ−Ｄｅｓｔ５１［ＣＤ１９］（ＲＺＰＤ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．：ＲＺＰＤｏ８３９Ｇ０１６７−ｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１）
配列決定：Ｆａｓｔｅｒｉｓ  ＳＡ（Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
Ｇｉｇａｐｒｅｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．：Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ  ＰＣ１００００）
【０４２４】
発現ベクターｐＥＦｃＤＮＡ３．１のクローニング
発現ベクターｐＥＦｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＣＭＶプロモーターをｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１からのＥＦ１−αプロモーターで置換することによって作製した。ＥＦ１−αプロモーターは、ＰｆｕＵｌｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、アニール温度：５５℃、３０サイクル）を使用し、プライマーＧＬＮＰＲ１０７及び１０８を使用して増幅した。プライマーは完全なＥＦ１−αプロモーターを増幅し、増幅したフラグメントの５’末端にＳｐｅＩを付加し、３’末端にＨｉｎｄＩＩＩを付加した。ＰＣＲアンプリコンをｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化物によってクローンを分析した。クローン＃４からのＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを分離し、同じ酵素の組み合わせとＣＩＰｅｄを使用して消化させたｐｃＤＮＡ３．１（−）骨格にクローニングした。ＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用してクローンを分析した。クローン＃２は陽性であるように思われた。骨格を有する第２の消化物及び挿入部位により、プロモーターフラグメントが正しいサイズを有することを確認した。
【０４２５】
ＧＢＲ６００のｐＥＦｃＤＮＡへのクローニング
ＧＢＲ６００  ＶＨ９を、ＰｆｕＵｌｔｒａ（標準状態、アニール温度：５５℃、３０サイクル）及びプライマーＧＬＮＰＲ１７６及び１７７を使用して増幅した。鋳型はＴＭＣベクターｐ１５６であった。ＧＢＲ６００  ＶＬ９は、重鎖について説明したように、プライマーＧＬＮＰＲ１７６及び１７８を使用して増幅した。鋳型はＴＭＣベクターｐ１５８であった。プライマーにより、ＮｈｅＩ制限部位５’及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位３’がアンプリコンに付加された。得られたＰＣＲフラグメントをｐＣＲ−ｂｌｕｎｔにクローニングし、ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用した制限消化物（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｄｉｇｅｓｔ）によって分析した。軽鎖のためのクローン＃１と重鎖のためのクローン＃３を分離し、酵素ＮｈｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ並びにＣＩＰｅｄを使用して消化させたｐＥＦｃＤＮＡクローニングした。制限消化物は、軽鎖のためのクローン＃１と軽鎖のためのクローン＃６が正しいサイズのフラグメントを含むことを示した。これらの２つのクローンを配列決定のために試料ＧＳ２５６及びＧＳ２５７としてＦａｓｔｅｒｉｓに送った。配列決定ファイルを参照配列と比較した。ミニ調製ＤＮＡの品質が悪かったため、重鎖配列ＧＳ２５７は１００％まで確認することができなかった。ＧＢＲ６００重鎖ＶＨ９（ＧＳ２５７）及びＧＢＲ６００軽鎖ＶＬ９（ＧＳ２５６）をコードするプラスミドを使用してＧｉｇａｐｒｅｐｓを調製した。配列確認のためにプラスミドを再びＦａｓｔｅｒｉｓに送った。試料名は、ＧＢＲ６００重鎖ＶＨ９のためのＧＳ２６５及びＧＢＲ６００軽鎖ＶＬ９のためのＧＳ２６４であった。ＤＮＡの品質が良かったため、重鎖及び軽鎖について参照配列との配列相同性を確認することができた。
【０４２６】
様々な特定の材料、方法及び実施例を参照して本発明について説明したが、本発明は、目的のために選択される材料及び方法の特定の組み合わせに限定されるものではない。当業者には、そのような詳細部分に関して多くの変形を行うことを理解されるだろう。明細書及び実施例は単なる例示のみを意図するものであり、本発明の範囲は添付請求項に示されるものである。本願において引用した文献、特許文献及び特許出願の内容は各参照によって本願明細書に援用するものとする。
【図１】
2011510622.tif 000040
【図２Ａ】
2011510622.tif 000041
【図２Ｂ】
2011510622.tif 000042
【図４Ａ】
2011510622.tif 000043
【図４Ｂ】
2011510622.tif 000044
【図４Ｃ】
2011510622.tif 000045
【図５】
2011510622.tif 000046
【図６】
2011510622.tif 000047
【図７】
2011510622.tif 000048
【図８】
2011510622.tif 000049
【図９】
2011510622.tif 000050
【図１０】
2011510622.tif 000051
【図１１】
2011510622.tif 000052
【図３Ａ】
2011510622.tif 000053
【図３Ｂ】
2011510622.tif 000054
【図３Ｃ】
2011510622.tif 000055
【図３Ｄ】
2011510622.tif 000056
【図３Ｅ】
2011510622.tif 000057
【配列表】
2011510622000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年9月27日(2010.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
血栓疾患は、心臓血管疾患又は虚血性脳卒中等の脳血管疾患であってもよい。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化、再狭窄、口峡炎、急性心筋梗塞、急性冠症候群又は糖尿病に伴う心臓血管疾患である。いくつかの実施形態では、血栓症又は血栓疾患は、血管炎症、静脈血栓症、鎌状赤血球病、異種移植拒絶反応、末梢血管疾患、血栓性血小板減少性紫斑症、嚢胞性繊維症、血管性認知症、レイノー病、関節リウマチ又は糖尿病である。いくつかの実施形態では、脳血管障害は、脳動脈梗塞及び／又は腺窩性小梗塞による虚血性脳卒中並びに血管性認知症を含んでもよい。また、ヒト化ｖＷＦ抗体は、再発性脳卒中又は脳血管炎症によって引き起こされた脳卒中の予防に使用することができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４５】
ヒト化ｖＷＦ抗体による治療
ヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントは、様々なｖＷＦ関連疾患又は障害を治療するために使用することができる。疾患又は障害の例としては、血栓症又は血栓疾患が挙げられる。血栓疾患の例としては、心臓血管疾患又は虚血性脳卒中等の脳血管疾患が挙げられる。いくつかの実施形態では、心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化、再狭窄、口峡炎、急性心筋梗塞、急性冠症候群又は糖尿病に伴う心臓血管疾患であってもよい。いくつかの実施形態では、血栓症又は血栓疾患は、血管炎症、静脈血栓症、鎌状赤血球病、異種移植拒絶反応、末梢血管疾患、血栓性血小板減少性紫斑症、嚢胞性繊維症、血管性認知症、レイノー病、関節リウマチ又は糖尿病であってもよい。いくつかの実施形態では、脳血管障害は、脳動脈梗塞及び／又は腺窩性小梗塞による虚血性脳卒中並びに血管性認知症を含む。また、ヒト化ｖＷＦ抗体は、再発性脳卒中又は脳血管炎症によって引き起こされた脳卒中の予防に使用することができる。急性冠状動脈症候群の場合には、ヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントはＳＴ診断患者の治療のために特に適している。ヒト化ｖＷＦ抗体又はその結合性フラグメントは、血塊の形成を防止するための術後治療にも使用することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７４】
（ｉ）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と基質としての水素ペルオキシダーゼ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（水素ペルオキシダーゼは色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される重鎖可変領域配列と、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２８で示される軽鎖可変領域配列と、を含む、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７で示される重鎖配列と、（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８で示される軽鎖配列と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３】
（ａ）マウス抗体ＮＭＣ−４の重鎖及び軽鎖可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及び２）に存在する相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する重鎖及び軽鎖ＣＤＲと、（ｂ）ヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する重鎖フレームワーク領域及び／又はヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域に存在するフレームワーク領域に対応する軽鎖フレームワーク領域と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４】
重鎖ＣＤＲ：ＨＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）及びＨＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）及び／又は軽鎖ＣＤＲ：ＬＣＤＲ１：ＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＬＣＤＲ２：ＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）及びＬＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）と、ヒト抗体ファミリーＶＨ４のフレームワーク領域に対応する重鎖フレームワーク領域と、ヒト抗体ファミリーＶＫ１のフレームワーク領域に対応する軽鎖フレームワーク領域と、を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項５】
請求項４において、ヒト抗体ＡＡＣ１８１６５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の可変領域からの重鎖フレームワーク領域及び／又はヒト抗体ＡＡＫ９４８０８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の可変領域からの軽鎖フレームワーク領域をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項６】
請求項５において、前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項７】
請求項５において、前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項８】
請求項５において、前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項９】
請求項５において、前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１０】
請求項４において、Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  
ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、Ｈ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１１】
請求項４において、Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１２】
請求項４において、Ｈ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、Ｈ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、Ｈ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）、Ｈ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、Ｈ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、Ｈ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、Ｈ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、Ｈ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、Ｈ１３（ＳＥＱ  ＩＤ
ＮＯ：２１）、Ｈ１４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）、Ｈ１５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５）、Ｈ１６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）からなる群から選択される重鎖可変領域と、Ｌ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）、Ｌ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）、Ｌ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）、Ｌ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）、Ｌ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）、Ｌ９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）、Ｌ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）、Ｌ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）からなる群から選択される軽鎖可変領域と、を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１３】
請求項４において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９のフレームワーク領域と少なくとも８０％同一であるフレームワーク領域を含む重鎖可変領域配列及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８のフレームワーク領域と少なくとも８０％同一であるフレームワーク領域を含む軽鎖可変領域配列を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１４】
請求項４において、ヒト抗体重鎖生殖系列配列４−５９に存在する重鎖フレームワーク領域に対応し、ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７１）である重鎖フレームワーク領域１、ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７２）である重鎖フレームワーク領域２及びＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７３）である重鎖フレームワーク領域３と、ヒト抗体軽鎖生殖系列配列０１８に存在するフレームワーク領域に対応し、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６）である軽鎖フレームワーク領域１、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７）である軽鎖フレームワーク領域２及びＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８）である軽鎖フレームワーク領域３と、を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１５】
請求項４において、ヒト抗体重鎖生殖系列配列４−３４に存在する重鎖フレームワーク領域に対応し、ＱＶＱＬＱＱＷＧＡＧＬＬＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＡＶＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５）である重鎖フレームワーク領域１、ＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６）である重鎖フレームワーク領域２及びＲＶＴＩＳＶＤＴＳＫＮ
ＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６７）である重鎖フレームワーク領域３と、ヒト抗体軽鎖生殖系列配列０１８に存在するフレームワーク領域に対応し、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８６）である軽鎖フレームワーク領域１、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８７）である軽鎖フレームワーク領域２及びＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８）である軽鎖フレームワーク領域３と、を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項において、１０ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でｖＷＦに結合する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項において、１００ｎＭ以下の親和性（Ｋｉ）でｖＷＦへの結合に競合する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか１項において、１０ｎＭ以下の親和性（Ｋｄ）でｖＷＦのＡ１ドメインに結合する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか１項において、１００ｎＭ以下の親和性（Ｋｉ）でｖＷＦのＡ１ドメインへの結合に競合する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２０】
請求項１〜１５のいずれか１項において、６５℃以上のＦＡＢフラグメント耐熱温度を有する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか１項において、原型の非ヒト化抗体よりも高いＦＡＢフラグメント耐熱温度を有する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２２】
重鎖ＣＤＲ１：ＧＦＳＬＴＤＹＧＶＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、重鎖ＣＤＲ２：ＭＩＷＧＤＧＳＴＤＹＮＳＡＬＫＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、重鎖ＣＤＲ３：ＤＰＡＤＹＧＮＹＤＹＡＬＤＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２及び軽鎖ＣＤＲ３：ＱＱＹＥＫＬＰＷＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を含み、前記軽鎖ＣＤＲ１がＳＡＳＱＤＩＮＫＹＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）ではない及び／又は前記軽鎖ＣＤＲ２がＹＴＳＳＬＨＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）ではない、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２３】
請求項２２において、ヒト抗体重鎖フレームワーク領域及び／又はヒト抗体軽鎖フレームワーク領域をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２４】
請求項２３において、前記重鎖フレームワーク領域が、４−５９由来ヒト抗体に存在する重鎖フレームワーク領域に対応する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２５】
請求項２４において、４−５９由来ヒト抗体に存在する前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２６】
請求項２４において、４−５９由来ヒト抗体に存在する前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２７】
請求項２３において、前記軽鎖フレームワーク領域が、０１８由来ヒト抗体に存在する軽鎖フレームワーク領域に対応する、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２８】
請求項２７において、０１８由来ヒト抗体に存在する前記軽鎖フレームワーク領域が１
以上のマウス残基をさらに含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項２９】
請求項２７において、０１８由来ヒト抗体に存在する前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３０】
請求項２４において、前記４−５９由来ヒト抗体がＡＡＣ１８１６５．１である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３１】
請求項２７において、前記０１８由来ヒト抗体がＡＡＫ９４８０８である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３２】
請求項２２において、ＬＣＤＲ１及び／又はＬＣＤＲ２がヒト抗体からのＣＤＲである、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３３】
請求項３２において、ＬＣＤＲ２がＤＡＳＮＬＥＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８）である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３４】
請求項１から１５及び２２のいずれか１項において、ＨＣＤＲ１が、Ｆ２７Ｇ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ及びＶ３４Ｗからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３５】
請求項１から１５及び２２のいずれか１項において、ＨＣＤＲ２が、Ｓ６１Ｐ及びＡ６２Ｓからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３６】
請求項１から１５及び２２のいずれか１項において、ＬＣＤＲ１が、Ｓ２４Ｑ、Ｎ３０Ｓ及びＫ３１Ｎからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３７】
請求項１から１５及び２２のいずれか１項において、ＨＣＤＲ１が、Ｆ２７Ｇ、Ｌ２９Ｉ、Ｔ３０Ｓ及びＶ３４Ｗからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含み、ＨＣＤＲ２が、Ｓ６１Ｐ及びＡ６２Ｓからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含み、ＬＣＤＲ１が、Ｓ２４Ｑ、Ｎ３０Ｓ及びＫ３１Ｎからなる群から選択される１以上のアミノ酸置換を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３８】
請求項４において、前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項３９】
請求項４において、前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４０】
請求項１４又は１５において、前記重鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４１】
請求項１４又は１５において、前記軽鎖フレームワーク領域が１以上のマウス残基を含まない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれか１項において、原型の非ヒト化抗体又は原型の非ヒト化抗体
からの可変領域とヒトＦｃ領域を含むキメラ抗体と同じ活性を保持している、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４３】
請求項４２において、前記活性がリストセチン誘発血小板凝集活性として測定される、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４４】
請求項１〜４１のいずれか１項において、エフェクター機能を有していない、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４５】
請求項１〜４１のいずれか１項において、ＩｇＧ４に由来するＦｃ領域を含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４６】
請求項１〜４１のいずれか１項において、ヒトｖＷＦのＡ１ドメインに特異的である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４７】
請求項１〜４１のいずれか１項において、完全抗体である、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４８】
請求項１〜４１のいずれか１項において、前記結合性フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２及び二重特異性抗体からなる群から選択される抗体フラグメントである、ヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項４９】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸。
【請求項５０】
微生物としてＤＳＭＺに寄託番号：ＤＳＭ２１０５９として寄託されたベクターＧＳ２６４の核酸配列をコードする軽鎖を含む単離核酸。
【請求項５１】
微生物としてＤＳＭＺに寄託番号：ＤＳＭ２１０６０として寄託されたベクターＧＳ２６５の核酸配列をコードする重鎖を含む単離核酸。
【請求項５２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で示される重鎖可変領域配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で示される軽鎖可変領域配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸。
【請求項５３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３７で示される重鎖配列及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３８で示される軽鎖配列を含む、ｖＷＦに特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメントをコードする単離核酸。
【請求項５４】
請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項５５】
請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の単離核酸又は請求項５４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５６】
請求項５５に記載の宿主細胞を培養して核酸を発現させ、抗体を製造することを含む、ヒト化抗体又はその結合性フラグメントの製造方法。
【請求項５７】
請求項５６において、宿主細胞培養物から前記抗体を回収することをさらに含む方法。
【請求項５８】
請求項５６において、宿主細胞培地から前記抗体を回収する方法。
【請求項５９】
請求項５６において、前記宿主細胞を培養する前に、重鎖可変領域をコードする核酸を含むベクター及び軽鎖可変領域をコードする核酸を含むベクターによる前記宿主細胞に対する共トランスフェクションを行う方法。
【請求項６０】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、製薬学的に許容し得る担体と、を含む組成物。
【請求項６１】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載の第１のヒト化抗体又はその結合性フラグメントと、ｖＷＦのＡ１ドメインに結合する第２の抗体と、を含む組成物。
【請求項６２】
請求項６１において、前記第２の抗体がＡＪＷ−２００である組成物。
【請求項６３】
被投与者におけるｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するための方法であって、治療有効量の、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを前記被投与者に投与することを含む方法。
【請求項６４】
請求項６３において、前記被投与者がヒトである方法。
【請求項６５】
請求項６３において、前記ｖＷＦ媒介性障害が血栓症又は血栓疾患である方法。
【請求項６６】
請求項６５において、前記血栓症又は血栓疾患が、心臓血管疾患又は虚血性脳卒中等の脳血管疾患である方法。
【請求項６７】
請求項６６において、前記心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化、再狭窄、口峡炎、急性心筋梗塞、急性冠症候群又は糖尿病に伴う心臓血管疾患である方法。
【請求項６８】
請求項６５において、前記血栓症又は血栓疾患が、血管炎症、静脈血栓症、鎌状赤血球病、異種移植拒絶反応、末梢血管疾患、血栓性血小板減少性紫斑症、嚢胞性繊維症、血管性認知症、レイノー病、関節リウマチ又は糖尿病である方法。
【請求項６９】
請求項６６において、前記脳血管疾患が、血管性認知症、虚血性脳卒中又は再発性脳卒中の予防である方法。
【請求項７０】
請求項６３〜６９のいずれか１項において、前記治療有効量が約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇである方法。
【請求項７１】
請求項７０において、前記治療有効量が約０．００２〜約２０ｍｇ／ｋｇである方法。
【請求項７２】
請求項７０において、前記治療有効量が約０．００２〜約１０ｍｇ／ｋｇである方法。
【請求項７３】
請求項６３〜７２のいずれか１項において、１回又は複数回の投与によって前記治療有効量のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを前記被投与者に投与する方法。
【請求項７４】
請求項６３〜７２のいずれか１項において、前記治療有効量が、血小板凝集を抑制するために十分な量であり、出血の有意な臨床的徴候を引き起こすには不十分な量である方法。
【請求項７５】
請求項６３〜６９のいずれか１項において、前記治療有効量が、出血の有意な臨床的徴候を引き起こすことなく、ＥＤ１００の約１〜約２５０倍である方法。
【請求項７６】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントの薬剤としての使用であって、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを治療有効量で投与することを含む使用。
【請求項７７】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントの、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを治療有効量で投与することを含むｖＷＦ媒介疾患又は障害の治療のための薬剤の調製における使用。
【請求項７８】
請求項７６において、前記薬剤がｖＷＦ媒介疾患又は障害を治療するために使用される使用。
【請求項７９】
請求項７７又は７８において、前記ｖＷＦ媒介性障害が血栓症又は血栓疾患である使用。
【請求項８０】
請求項７９において、前記血栓疾患が、心臓血管疾患又は虚血性脳卒中等の脳血管疾患である使用。
【請求項８１】
請求項８０において、前記心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化、再狭窄、口峡炎、急性心筋梗塞、急性冠症候群又は糖尿病に伴う心臓血管疾患である使用。
【請求項８２】
請求項７９において、前記血栓血栓疾患が、血管炎症、静脈血栓症、鎌状赤血球病、異種移植拒絶反応、末梢血管疾患、血栓性血小板減少性紫斑症、嚢胞性繊維症、血管性認知症、レイノー病、関節リウマチ又は糖尿病を含む使用。
【請求項８３】
請求項８０において、前記脳血管疾患が、血管性認知症、虚血性脳卒中又は再発性脳卒中の予防である使用。
【請求項８４】
請求項７６〜８３のいずれか１項において、前記治療有効量が約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇである使用。
【請求項８５】
請求項８４において、前記治療有効量が約０．００２〜約２０ｍｇ／ｋｇである使用。
【請求項８６】
請求項８４において、前記治療有効量が約０．００２〜約１０ｍｇ／ｋｇである使用。
【請求項８７】
請求項７６〜８６のいずれか１項において、１回又は複数回の投与によって前記治療有効量のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを前記被投与者に投与する使用。
【請求項８８】
請求項７６〜８６のいずれか１項において、前記治療有効量が、血小板凝集を抑制するために十分な量であり、出血の有意な臨床的徴候を引き起こすには不十分な量である使用。
【請求項８９】
請求項７６〜８３のいずれか１項において、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを、出血の有意な臨床的徴候を引き起こすことなく、ＥＤ１００の約１〜約２５０倍の治療有効量で投与する使用。
【請求項９０】
出血の臨床的徴候を引き起こすことなく、ＥＤ１００の１〜約２５０倍の治療有効量で
投与することができる、ヒトフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に特異的なヒト化抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項９１】
請求項９０において、ヒトｖＷＦのＡ１ドメインに特異的である、ヒト抗体又はその結合性フラグメント。
【請求項９２】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを、投与を必要とする被投与者に投与するための方法であって、有意な出血の臨床的徴候を引き起こすことなく、血小板凝集を抑制するために十分な治療有効量の前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを投与することを含む方法。
【請求項９３】
請求項６３又は９２において、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを皮下投与する方法。
【請求項９４】
請求項６３又は９２において、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを静脈内投与する方法。
【請求項９５】
請求項６３又は９２において、射線治療と組み合わせて、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントを静脈内投与する方法。
【請求項９６】
請求項６３又は９２において、前記ヒト化抗体又はその結合性フラグメントの前記治療有効量が、ＥＤ１００の約１〜約２５０倍である方法。
【請求項９７】
ｖＷＦ媒介疾患又は障害の治療のための、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の第１のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを含む製品。
【請求項９８】
ｖＷＦ媒介疾患又は障害の治療のための、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の第１のヒト化抗体又はその結合性フラグメントを含むキット。
【請求項９９】
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその結合性フラグメントの非治療用途における使用。
【請求項１００】
請求項９９において、前記非治療用途が診断検定である方法。
【国際調査報告】
2011510622.tif 000058
2011510622.tif 000059
2011510622.tif 000060