(57)【要約】  本発明は、負の免疫調節因子の抑制により抗原提示が増強されるアジュバント、ワクチンおよび療法を提供する。本組成物および方法は、細胞内の負の免疫調節因子を抑制し、炎症誘発性刺激を提供することにより、微生物病原体および腫瘍関連抗原を含む抗原に対する免疫反応を引き起こすのに有用である。特に、治療または予防反応を誘導するために、負の免疫調節因子インヒビター、抗原および共刺激分子をコードするヌクレオチドと免疫細胞とが接触される。【選択図】図１
2011505144.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)サイトカインシグナル抑制因子(SOCS)またはA20のsiRNAインヒビター;および
(b)フラジェリンポリペプチド;
をコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ポリヌクレオチドが同一または異なる発現ベクターにおいて提供される前記組成物。
【請求項２】
前記siRNAインヒビターがSOCS1インヒビターである、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記siRNAインヒビターがA20インヒビターである、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも1つのエピトープを有する1つ以上の抗原をさらに含み、前記エピトープが哺乳動物において免疫反応を誘導することができる、請求項1に記載の組成物。
【請求項５】
前記1つ以上の抗原が腫瘍関連抗原である、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
前記1つ以上の腫瘍関連抗原が、ドミナントネガティブサバイビン変異体とドミナントT細胞エピトープを含むMUC1フラグメントとの融合体としてコードされる、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
ドミナントネガティブサバイビン変異体およびMUC1フラグメントをコードするポリヌクレオチドが配列番号2の配列を有する、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
前記1つ以上の抗原が病原体と関連する、請求項4に記載の組成物。
【請求項９】
前記1つ以上の病原体関連抗原が、ドミナントT細胞エピトープおよびB細胞エピトープを含む、HCVのE1タンパク質とE2タンパク質との融合体としてコードされる、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
前記フラジェリンポリペプチドが、分泌シグナル配列に作動可能に連結された、請求項1に記載の組成物。
【請求項１１】
分泌シグナル配列に作動可能に連結されたフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、配列番号3の配列を有する、請求項10に記載の組成物。
【請求項１２】
(a)サイトカインシグナル抑制因子(SOCS)またはA20のsiRNAインヒビター;および
(b)プロタミンポリペプチドに共有結合されたフラジェリンポリペプチド
を含む組成物であって、前記プロタミンポリペプチドがsiRNAインヒビターに結合することができる前記組成物。
【請求項１３】
前記siRNAインヒビターがSOCS1インヒビターである、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
前記siRNAインヒビターがA20インヒビターである、請求項12に記載の組成物。
【請求項１５】
少なくとも1つのエピトープを有する1つ以上の抗原をさらに含み、前記エピトープが哺乳動物において免疫反応を誘導することができる、請求項12に記載の組成物。
【請求項１６】
前記1つ以上の抗原が病原体と関連する、請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
前記1つ以上の病原体関連抗原が、ドミナントT細胞エピトープおよびB細胞エピトープを含む、HCVのE1タンパク質とE2タンパク質との融合体としてコードされる、請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
前記プロタミンポリペプチドに共有結合されたフラジェリンポリペプチドが、配列番号174の配列を有する、請求項12に記載の組成物。
【請求項１９】
(a)SOCS1またはA20のsiRNAインヒビター;および
(b)フラジェリンポリペプチド
をコードする1つ以上の発現ベクターを含む細胞。
【請求項２０】
サイレンシングしパルスした細胞を作成する方法であって、
(a)サイトカインシグナル抑制因子(SOCS)またはA20のsiRNAインヒビター;および
(b)フラジェリンポリペプチド
をコードする1つ以上の発現ベクターと細胞を接触させることを含む前記方法。
【請求項２１】
前記細胞が樹状細胞である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記接触させる工程が、ウイルスベクターでの形質導入、プラスミドDNAのエレクトロポレーションもしくはヌクレオフェクション(nucleofection)または融合タンパク質のトランスフェクションを含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物において免疫反応を誘導する方法であって、
抗原並びに
(A)(i)サイトカインシグナル抑制因子(SOCS)もしくはA20のsiRNAインヒビターおよび(ii)フラジェリンポリペプチド、をコードする1つ以上の発現ベクター;
(B)SOCS1もしくはA20のsiRNAインヒビターおよびフラジェリンポリペプチド、をコードする1つ以上の発現ベクターでトランスフェクトされた抗原提示細胞;または
(C)SOCS1もしくはA20のsiRNAインヒビターとプロタミンポリペプチドに共有結合されたフラジェリンポリペプチドとを含む組成物であって、前記プロタミンポリペプチドが前記siRNAインヒビターに結合することができる前記組成物、
のいずれかを哺乳動物に投与することを含み、前記哺乳動物において前記抗原に対する免疫反応が誘導される前記方法。
【請求項２４】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
哺乳動物において癌を治療する方法であって、発現ベクターを含む抗原提示細胞を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含み、前記発現ベクターが、
(a)SOCS1またはA20のsiRNAインヒビター;
(b)ドミナントネガティブサバイビン変異体および、ドミナントT細胞エピトープを含むMUC1フラグメント;並びに
(c)分泌シグナル配列に作動可能に連結されたフラジェリンポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが前記抗原提示細胞により発現され、それによって前記哺乳動物において癌細胞に対する免疫反応を生じる前記方法。
【請求項２６】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項25に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国仮特許出願第60/991,478号(出願日:2007年11月30日)に基づく優先権を主張する(参照によりその全体が本願に組み込まれる)。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、NIH機関が交付した連邦政府による資金提供(CA90427、CA116677)を受けて行った。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
本技術は、一般に、疾患の治療および/または予防に有用なワクチン組成物に関する。特に、本技術は、炎症誘発性分子および負の免疫調節因子インヒビターを含むワクチン組成物およびアジュバントに関する。
【背景技術】
【０００４】
以下の説明は、読者の理解を助けるために提供される。提供された情報または引用文献のいずれも、本発明の先行技術であると認めるものではない。
【０００５】
抗原を認識するT細胞の能力は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)IまたはMHC IIタンパク質のいずれかと抗原との結合に依存する。例えば、細胞傷害性T細胞は、MHC-Iタンパク質に提示された抗原に反応する。従って、ウイルス感染細胞を殺すはずの細胞傷害性T細胞は、その細胞が適切なMHC-Iタンパク質を発現しない場合もその細胞を殺さない。ヘルパーT細胞は、MHC-IIタンパク質を認識する。ヘルパーT細胞活性は、一般に、抗原提示細胞上での抗原の認識および“自己”MHC-IIタンパク質のこれらの細胞上での存在の両方に依存する。自己MHCタンパク質に提示された抗原という認識の必要条件は、MHC拘束と呼ばれる。MHC-Iタンパク質は、事実上すべての有核細胞表面に見られる。MHC-IIタンパク質は、マクロファージ、B細胞ならびに脾臓および皮膚のランゲルハンス細胞の樹状細胞を含む特定の細胞表面に見られる。
【０００６】
哺乳動物において免疫反応を開始させる段階の1つは、MHC-II拘束性外因性抗原を認識するCD4+ヘルパーT細胞の活性化である。これらの抗原は、樹状細胞(DC)などの抗原提示細胞の細胞エンドソーム経路において捕捉され、プロセシングされる。エンドソームおよびリソソームにおいて、抗原はプロセシングされて小さな抗原ペプチドになり、それがゴルジコンパートメントにおけるMHC-IIに複合体化されて、抗原-MHC-II複合体が形成される。この複合体が細胞表面に発現され、それがCD4+T細胞の活性化を誘導する。
【０００７】
哺乳動物における有効な免疫反応の誘導における他の事象には、CD8+T細胞およびB細胞の活性化が含まれる。CD8+細胞は、所望のタンパクがプロセシングされたタンパク質として細胞表面に提示されるように細胞内を運ばれ、MHC-I抗原と複合体化されたときに活性化される。B細胞は、MHCタンパク質を必要とせずに、その表面免疫グロブリン(IgMおよびIgD)を介して抗原と相互作用することができる。しかしながら、CD4+T細胞の活性化により、免疫系のすべてのアームが刺激される。活性化と同時に、CD4+T細胞(ヘルパーT細胞)はインターロイキンを産生する。これらのインターロイキンは、他の免疫系のアームの活性化を促進する。例えば、ヘルパーT細胞は、B細胞の抗体産生を促進するインターロイキン-4(IL-4)およびインターロイキン-5(IL-5)を産生し、CD4+およびCD8+T細胞を活性化するインターロイキン-2(IL-2)を産生し;マクロファージを活性化するγインターフェロンを産生する。MHC-II拘束性抗原を認識するヘルパーT細胞は細胞傷害性T細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞およびB細胞の活性化およびクローン増殖に中心的役割を果たすので、抗原に応答してヘルパーT細胞を活性化する初期事象は、抗原に対する効果的な免疫反応の誘導にとって重要である。
【０００８】
T細胞が免疫反応において果たす役割に加えて、DCもまた等しく重要である。DCは、自己抗原に対する寛容の維持ならびに自然免疫および獲得免疫の活性化に重要な調節的役割を有する専門の抗原提示細胞である(Banchereau et al., 1998, Nature 392:245-52; Steinman et al., 2003, Annu. Rev. Immunol. 21:685-711)。DCが微生物産物などの炎症促進性刺激に遭遇するとき、細胞表面に発現された抗原ペプチド負荷MHC分子および共刺激分子がアップレギュレートされることにより、この細胞の成熟過程が開始される。成熟し、局所リンパ節に戻った後、DCは、T細胞受容体(TCR)および共刺激分子が接着分子により囲まれた中心部に集まっている免疫シナプスを形成することによりT細胞との接触を確立する(Dustin et al., 2000, Nat. Immunol. 1:23-9)。CD8+T細胞は、ひとたび活性化されれば、さらなる抗原刺激なしに数世代にわたって自律的に増殖し、細胞傷害性機能を獲得することができる(Kaech et al., 2001, Nat. Immunol. 2:415-22; van Stipdonk et al., 2001, Nat. Immunol. 2:423-9)。従って、DCにより与えられるペプチド-MHC複合体(シグナル1)および共刺激分子(シグナル2)のレベルおよび持続時間は、抗原特異的T細胞応答の強度および運命を決定するのに必須であることが提案されている(Lanzavecchia et al., 2001, Nat. Immunol. 2:487-92; Gett et al., 2003, Nat. Immunol. 4:355-60)。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、哺乳動物において免疫反応を刺激する組成物および方法に関する。実施例に示した結果から明らかなように、これらのアジュバントは、相乗的に免疫反応を増強することができる。従って、本発明は、特定の抗原に対する細胞の免疫刺激能を増強することによる治療上の利点を提供する。一側面において、本発明は、(a)細胞における負の免疫調節因子インヒビターであって、負の免疫調節因子がサイトカインシグナル抑制因子(SOCS)、分子安定性に関与するタンパク質およびNF-κBインヒビターの発現を誘導する転写因子またはNF-κB標的遺伝子の転写を抑制する転写因子からなる群から選択される前記インヒビター;ならびに(b)フラジェリンポリペプチドであって、同一または異なる発現ベクターによりポリヌクレオチドが提供されるフラジェリンポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドを含むアジュバント組成物を提供する。一実施形態において、フラジェリンポリペプチドは分泌シグナル配列に作動可能に連結される。
【００１０】
一実施形態において、負の免疫調節因子は、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7およびサイトカイン誘導性SH2ドメイン含有タンパク質(CIS)からなる群から選択されるSOCSである。他の実施形態において、負の免疫調節因子はA20タンパク質である。いくつかの実施形態において、負の免疫調節因子インヒビターはアンチセンスRNAまたはリボザイムであり得る。特定の実施形態において、細胞における負の免疫調節因子インヒビターはsiRNAである。
【００１１】
発現ベクターは、プラスミドDNA、ウイルスベクター(例えばアデノウイルスベクター)、細菌ベクターおよび哺乳動物ベクターからなる群から選択され得る。一実施形態において、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへの単離されたポリヌクレオチドの組み込みを促進する組み込みシグナル配列をさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、組成物は、1つ以上の抗原をコードする1つ以上の抗原またはポリヌクレオチドをさらに含む。一実施形態において、抗原は、限定するものではないが、ウイルス、細菌、真菌および原生動物によって引き起こされる感染症を含む感染症と関連する。特定の実施形態において、抗原は、ウイルス、例えばB型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パピローマウイルスまたはヘルペスウイルスからのものであり得る。ウイルス抗原の具体例は、限定するものではないが、B型肝炎ウイルスe抗原遺伝子、B型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子、B型肝炎ウイルスコア抗原遺伝子、ヒト免疫不全ウイルスEnv gp160遺伝子、Gag遺伝子、Pol遺伝子、Rev遺伝子、Tat遺伝子、Vif遺伝子、Nef遺伝子およびそれらの組み合わせを含む。
【００１３】
一実施形態において、ポリヌクレオチドによりコードされる抗原は腫瘍関連抗原である。例えば、腫瘍関連抗原は、過剰発現された腫瘍関連抗原、精巣腫瘍抗原、変異した腫瘍関連抗原、分化腫瘍関連抗原チロシナーゼ、MART、trp、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、gp100、HER-2、Ras、PSA BCR-ABL、CASP、CDK、Ras、p53、HER-2/neu、CEA、MUC、TW1、PAP、サバイビン（survivin）、テロメラーゼ、EGFR、PSMA、PSA、PSCA、チロシナーゼ、MART、TRP、gp100、MART、MAGE、BAGE、GAGE、LAGE/NY-ESO、RAGE、SSX-2、CD19、CD20およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。特定の実施形態において、腫瘍関連抗原はサバイビンおよび/またはMUC1である。腫瘍関連抗原がサバイビンである場合、ポリヌクレオチドは、サバイビンバリアント、例えばドミナントネガティブサバイビン変異体をコードし得る。腫瘍関連抗原がMUC1である場合、ポリヌクレオチドは、MUC1のフラグメント、例えばドミナントT細胞エピトープを含むフラグメントをコードし得る。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、(a)SOCS1またはA20のインヒビター;(b)少なくとも1つの抗原であって、各抗原が哺乳動物における免疫反応を誘導することができる少なくとも1つのエピトープを有する前記抗原および(c)分泌シグナル配列に作動可能に連結されたフラジェリンポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含むワクチン組成物を提供する。SOCS1またはA20のインヒビターは、それぞれ、SOCS1またはA20の発現に特異的に干渉することができるsiRNAであり得る。特定の実施形態において、siRNAをコードするポリヌクレオチドは、配列番号5の配列を有する。
【００１５】
一実施形態において、組成物は、腫瘍関連抗原サバイビンおよびMUC1に対応する抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、抗原は、融合タンパク質、例えば配列番号2のポリヌクレオチドによりコードされる融合タンパク質として発現される。一実施形態において、1つ以上の抗原は病原体と関連する。例えば、抗原は、ドミナントT細胞エピトープおよびB細胞エピトープを含む、HCVのE1タンパク質とE2タンパク質との融合体としてコードされ得る。
【００１６】
一実施形態において、組成物は、分泌シグナル配列に作動可能に連結されたフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、フラジェリンポリペプチドは配列番号3の配列を有し得る。
【００１７】
他の側面において、本発明は、(a)SOCS1またはA20のsiRNAインヒビター;(b)分泌シグナル配列に作動可能に連結されたフラジェリンポリペプチドおよび場合により(c)1つ以上の抗原、をコードするポリヌクレオチドを有する1つ以上の発現ベクターを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は免疫細胞である。特定の実施形態において、免疫細胞は抗原提示細胞、例えば樹状細胞である。
【００１８】
他の側面において、本発明は、(a)細胞における負の免疫調節因子インヒビターであって、負の免疫調節因子がサイトカインシグナル抑制因子(SOCS)、分子安定性に関与するタンパク質およびNF-κBインヒビターの発現を誘導する転写因子またはNF-κB標的遺伝子の転写を抑制する転写因子からなる群から選択される前記インヒビターならびに(b)プロタミンポリペプチドに共有結合されたフラジェリンポリペプチドであって、プロタミンポリペプチドがsiRNAインヒビターに結合できるフラジェリンポリペプチド、を含む組成物を提供する。特定の実施形態において、負の免疫調節因子インヒビターはSOCS1またはA20のsiRNAインヒビターである。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも1つのエピトープであって、哺乳動物において免疫反応を誘導することができる前記エピトープを有する1つ以上の抗原をさらに含む。特定の実施形態において、プロタミンポリペプチドに共有結合されたフラジェリンポリペプチドは配列番号174の配列を有する。
【００１９】
他の側面において、本発明は、サイレンシングしパルスした細胞を作成する方法であって、(a)細胞における負の免疫調節因子インヒビターであって、負の免疫調節因子が、サイトカインシグナル抑制因子(SOCS)、分子安定性に関与するタンパク質およびNF-κBインヒビターの発現を誘導する転写因子またはNF-κB標的遺伝子の転写を抑制する転写因子(例えばSOCS1またはA20)からなる群から選択される前記インヒビター;(b)少なくとも1つの抗原であって、各抗原が、哺乳動物における免疫反応を誘導することができる少なくとも1つのエピトープを有する前記抗原ならびに(c)分泌シグナル配列に作動可能に連結されたフラジェリンポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと細胞とを接触させることを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、細胞は免疫細胞である。特定の実施形態において、免疫細胞は抗原提示細胞、例えば樹状細胞である。
【００２０】
他の側面において、本発明は、哺乳動物において免疫反応を誘導する方法であって、(a)SOCS1またはA20のインヒビター;(b)少なくとも1つの抗原であって、各抗原が哺乳動物において免疫反応を誘導することができる少なくとも1つのエピトープを有する前記抗原ならびに(c)分泌シグナル配列に作動可能に連結されたフラジェリンポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを哺乳動物に投与することを含む前記方法を提供する。哺乳動物へのAPCの投与の前に、ex vivoで発現ベクター(単数または複数)とAPCを接触させ得る。組成物を哺乳動物に投与することにより免疫反応を誘導する方法であって、(a)細胞における負の免疫調節因子インヒビターであって、負の免疫調節因子がサイトカインシグナル抑制因子(SOCS)、分子安定性に関与するタンパク質およびNF-κBインヒビターの発現を誘導する転写因子またはNF-κB標的遺伝子の転写を抑制する転写因子からなる群から選択される前記インヒビターならびに(b)プロタミンポリペプチドに共有結合されたフラジェリンポリペプチドであって、プロタミンポリペプチドがsiRNAインヒビターに結合できる前記フラジェリンポリペプチド、を含む前記方法もまた提供される。
【００２１】
他の側面において、本発明は、哺乳動物において癌を治療する方法において、それを必要とする哺乳動物に発現ベクターを含む抗原提示細胞を投与することを含む方法であって、発現ベクターが、(a)SOCS1またはA20のsiRNAインヒビター;(b)ドミナントネガティブサバイビン変異体および、ドミナントT細胞エピトープを含むMUC1フラグメント;ならびに(c)分泌シグナル配列に作動可能に連結されたフラジェリンポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドが抗原提示細胞により発現され、それによって、哺乳動物において癌細胞に対する免疫反応が生じる前記方法を提供する。発現ベクターを、哺乳動物に直接に投与することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】組換えアデノウイルス構築物Ad-siSSF、Ad-GFPおよびAd-SMの概略図である。
【図２】トランスフェクトされた293T細胞におけるSOCS1 siRNAの効果のウェスタンブロット分析を示す図である。図2Aはデンシトメトリーによる図2Bにおけるウェスタンブロットの定量分析である。各細胞溶解物におけるhSOCS1およびアクチンの相対レベルが示されている。
【図３Ａ】種々の感染多重度(MOI)(10、100、1000、および10000ウイルス粒子(vp)、それぞれレーン1〜4)のAd-siSSFでトランスフェクトされた293T細胞におけるドミナントネガティブ(DN)サバイビン-MUC1融合タンパク質およびフラジェリンのウェスタンブロットの図である。
【図３Ｂ】ヒトSOCS1発現ベクターDNAでトランスフェクトされ、種々のMOI(0、10、100、1,000、10,000および20,000vp;それぞれ図3Bのレーン1〜6)のAd-siSSFまたは対照Ad-GFP(10、100、1,000、10,000および20,000vpのMOI;それぞれ図3Bのレーン7〜11)に感染した293T細胞におけるヒトSOCS1のダウンレギュレーションのウェスタンブロット分析の図である。
【図３Ｃ】デンシトメトリーによる図3Bのウェスタンブロットの定量分析を示す図である。アクチン対ヒトSOCS1バンドの相対密度がヒストグラムで示されている。
【図４】種々のMOIのAd-GFPでトランスフェクトされたヒトDCの蛍光顕微鏡写真(パネルの上列)およびフローサイトメトリーデータ(パネルの下列)を示す図である。
【図５】3回の繰り返し実験の内の1つからの、トランスフェクションの48時間および96時間後におけるアネキシン-VI（Annexin-VI）(BD Bioscience社)染色により明らかにされるAd-siSSFトランスフェクトPBMC-DCの生存率を示すフローサイトメトリーデータのグラフを示す図である。
【図６】Ad-siSSFトランスフェクトヒトDCの成熟の進行を示すフローサイトメトリーデータの一連のグラフを示す図である。3回の繰り返し実験の1つからの、Ad-siSSFおよび対照Ad-GFPウイルス(MOI=25,000vp)でのトランスフェクションの48時間後におけるヒトPBMC-DC上の表面マーカーのパネルの発現レベルが示されている
【図７】Ad-siSSFトランスフェクトヒトDCのエンドサイトーシス活性を示すフローサイトメトリーデータの一連のグラフを示す図である。3回の繰り返し実験の1つからの、4℃または37℃での90分間のインキュベーション後におけるデキストラン-テキサス-レッド（Dextran-Texas-Red）(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバート)を内在化させた、トランスフェクトされたヒトPBMC-DCの百分率をFACSで評価した。
【図８】Ad-siSSFトランスフェクトヒトDCにより産生された炎症性サイトカインおよびケモカインのELISAによる定量を示す一連のグラフを示す図である。
【図９】Ad-siSSFトランスフェクトヒトDCにより産生される炎症性サイトカインおよびケモカインの、RayBio(登録商標)Human Cytokine Antibody Array3(42のサイトカインを検出する)(Ray Biotech社、ジョージア州ノークロス)による定量を示すグラフを示す図である。
【図１０】Ad-siSSFトランスフェクトDCの、上昇した遊走活性を示すグラフを示す図である。組換えCCL21(Genetex社、テキサス州サン・アントニオ)(100ng/mL)に応答してトランスフェクトされたヒトPBMC-DCの遊走率は、3回の繰り返しアッセイの1つから示されている。P<0.05、Ad-siSSF対Ad-SM DC。
【図１１】Ad-siSSF-DCによるTAA特異的T細胞の増強されたプライミングを示すELISPOTアッセイからの一連のグラフを示す図である。ヒト自己T細胞をAdトランスフェクトDC(20:1)と2週間共培養した。次いで、共培養したCD4+およびCD8+T細胞を細胞内IFN-γに対して染色した。
【図１２】図11におけるデータを要約するチャートを示す図である。5名のHLA-A2+ドナーの内の1名のHLA-A2+ドナーからの代表的データを示す。P<0.05、Ad-siSSF対Ad-SM。
【図１３Ａ】ヒト腫瘍細胞に対する増強したTAA特異的CTL細胞障害活性を示すフローサイトメトリーデータのグラフを示す図である。フローサイトメトリーアッセイによりヒト腫瘍細胞株上のHLA-A2およびMUC1の表面発現を試験した。
【図１３Ｂ】定量的RT-PCRにより定量される、これらのヒト腫瘍細胞株における細胞内サバイビンの発現を示すアガロースゲルを臭化エチジウム染色した写真を示す図である。
【図１４】種々のAdトランスフェクト自己DCによる2週間のin vitro感作後の種々のヒト腫瘍細胞株に対するHLA-A2+T細胞の細胞障害活性を示す、標準51Cr放出アッセイの結果を表す一連のグラフを示す図である。3回の繰り返し実験の1つからの細胞障害性百分率が示されている。*P<0.05、Ad-siSSF対Ad-SM。
【図１５Ａ】CD4+CD25high Treg媒介性抑制を克服するAd-siSSF-DCの能力を示す一連のチャートおよびグラフを示す図である。0.5μg/ml抗ヒトCD3の存在下でAdトランスフェクトDCと共培養したCD4+CD25high Tregの存在下でのCFSE標識または非標識CD4+CD25- Teff細胞の増殖率を、3Hチミジン取り込みにより試験した。
【図１５Ｂ】CD4+CD25high Treg媒介性抑制を克服するAd-siSSF-DCの能力を示す一連のチャートおよびグラフを示す図である。0.5μg/ml抗ヒトCD3の存在下でAdトランスフェクトDCと共培養したCD4+CD25high Tregの存在下でのCFSE標識または非標識CD4+CD25- Teff細胞の増殖率を、CFSE希釈アッセイにより試験した。
【図１６】組換えAdベクターの概略図である。
【図１７】抗FliC抗体で染色した、250ifuのMOIでの、示されたAdベクターで形質導入されたマウスBM-DCにおけるFliC発現のウェスタンブロットを示す図である(Miravista Diagnostics社、インディアナ州インディアナポリス)。
【図１８】250ifuのMOIでの、示されたAdベクターで形質導入されたマウスBM-DCにおけるSOCS1 mRNAレベルの定量的RT-PCR分析を示すグラフを示す図である。
【図１９】D2SC1、J77.4およびBM-DC細胞(IMG-663D、IMGENEX)における抗TLR5-PEでの表面TLR5のフローサイトメトリー分析を示す一連のグラフを示す図である。
【図２０Ａ】マウスおよびヒトDCの持続的な刺激におけるAd-shS1/FliCの優れた効力を示す一連のチャートを示す図である。マウスBM-DCが、250ifuのMOIでのAdベクターで形質導入されるかまたは一般的に用いられるTLRアゴニスト(ポリI:C(1(g/ml)、CpG(1(M)、イミキモド(10(g/ml)またはLPS(100ng/ml))で刺激された。24時間後の、代表的なサイトカインに関するアッセイのフローサイトメトリー結果のチャートを示す。データは、3回の繰り返し実験の代表を示す。
【図２０Ｂ】マウスおよびヒトDCの持続的な刺激におけるAd-shS1/FliCの優れた効力を示す一連のチャートを示す図である。マウスBM-DCが、250ifuのMOIでのAdベクターで形質導入されるかまたは一般的に用いられるTLRアゴニスト(ポリI:C(1(g/ml)、CpG(1(M)、イミキモド(10(g/ml)またはLPS(100ng/ml))で刺激された。24時間後の、代表的なサイトカインに関するアッセイのフローサイトメトリー結果のチャートを示す。データは、3回の繰り返し実験の代表を示す。
【図２０Ｃ】マウスおよびヒトDCの持続的な刺激におけるAd-shS1/FliCの優れた効力を示す一連のチャートを示す図である。マウスBM-DCが、250ifuのMOIでのAdベクターで形質導入されるかまたは一般的に用いられるTLRアゴニスト(ポリI:C(1(g/ml)、CpG(1(M)、イミキモド(10(g/ml)またはLPS(100ng/ml))で刺激された。24時間後の、代表的なサイトカインに関するアッセイのフローサイトメトリー結果のチャートを示す。データは、3回の繰り返し実験の代表を示す。
【図２０Ｄ】マウスおよびヒトDCの持続的な刺激におけるAd-shS1/FliCの優れた効力を示す一連のチャートを示す図である。マウスBM-DCが、250ifuのMOIでのAdベクターで形質導入されるかまたは一般的に用いられるTLRアゴニスト(ポリI:C(1(g/ml)、CpG(1(M)、イミキモド(10(g/ml)またはLPS(100ng/ml))で刺激された。培養物を洗浄し、刺激物を含まない新鮮培地で24時間置換した後、代表的サイトカインに関するアッセイのフローサイトメトリー結果のチャートを示す。データは、3回の繰り返し実験の代表を示す。
【図２０Ｅ】マウスおよびヒトDCの持続的な刺激におけるAd-shS1/FliCの優れた効力を示す一連のチャートを示す図である。マウスBM-DCが、250ifuのMOIでのAdベクターで形質導入されるかまたは一般的に用いられるTLRアゴニスト(ポリI:C(1(g/ml)、CpG(1(M)、イミキモド(10(g/ml)またはLPS(100ng/ml))で刺激された。培養物を洗浄し、刺激物を含まない新鮮培地で24時間置換した後、代表的サイトカインに関するアッセイのフローサイトメトリー結果のチャートを示す。データは、3回の繰り返し実験の代表を示す。
【図２０Ｆ】マウスおよびヒトDCの持続的な刺激におけるAd-shS1/FliCの優れた効力を示す一連のチャートを示す図である。ヒトPBMC由来DCが、250ifuのMOIでのAdベクターで形質導入されるかまたは一般的に用いられるTLRアゴニスト(ポリI:C(1(g/ml)、CpG(1(M)、イミキモド(10(g/ml)またはLPS(100ng/ml))で刺激された。24時間後の、代表的なサイトカインに関するアッセイのフローサイトメトリー結果のチャートを示す。データは、3回の繰り返し実験の代表を示す。
【図２０Ｇ】マウスおよびヒトDCの持続的な刺激におけるAd-shS1/FliCの優れた効力を示す一連のチャートを示す図である。ヒトPBMC由来DCが、250ifuのMOIでのAdベクターで形質導入されるかまたは一般的に用いられるTLRアゴニスト(ポリI:C(1(g/ml)、CpG(1(M)、イミキモド(10(g/ml)またはLPS(100ng/ml))で刺激された。24時間後の、代表的なサイトカインに関するアッセイのフローサイトメトリー結果のチャートを示す。データは、3回の繰り返し実験の代表を示す。
【図２０Ｈ】マウスおよびヒトDCの持続的な刺激におけるAd-shS1/FliCの優れた効力を示す一連のチャートを示す図である。ヒトPBMC由来DCが、250ifuのMOIでのAdベクターで形質導入されるかまたは一般的に用いられるTLRアゴニスト(ポリI:C(1(g/ml)、CpG(1(M)、イミキモド(10(g/ml)またはLPS(100ng/ml))で刺激された。培養物を洗浄し、刺激物を含まない新鮮培地で24時間置換した後、代表的サイトカインに関するアッセイのフローサイトメトリー結果のチャートを示す。データは、3回の繰り返し実験の代表を示す。
【図２０Ｉ】マウスおよびヒトDCの持続的な刺激におけるAd-shS1/FliCの優れた効力を示す一連のチャートを示す図である。ヒトPBMC由来DCが、250ifuのMOIでのAdベクターで形質導入されるかまたは一般的に用いられるTLRアゴニスト(ポリI:C(1(g/ml)、CpG(1(M)、イミキモド(10(g/ml)またはLPS(100ng/ml))で刺激された。培養物を洗浄し、刺激物を含まない新鮮培地で24時間置換した後、代表的サイトカインに関するアッセイのフローサイトメトリー結果のチャートを示す。データは、3回の繰り返し実験の代表を示す。
【図２１Ａ】抗HCV E2 T細胞の効力およびAd-shS1/FliC-DCにより誘導される抗体反応を示す一連のチャートを示す図である。表面マーカー染色のためにマウスを犠牲にした。
【図２１Ｂ】抗HCV E2 T細胞の効力およびAd-shS1/FliC-DCにより誘導される抗体反応を示す一連のチャートを示す図である。細胞内サイトカイン染色のためにマウスを犠牲にした。
【図２１Ｃ】抗HCV E2 T細胞の効力およびAd-shS1/FliC-DCにより誘導される抗体反応を示す一連のチャートを示す図である。ELISPOTのためにマウスを犠牲にした。
【図２１Ｄ】抗HCV E2 T細胞の効力およびAd-shS1/FliC-DCにより誘導される抗体反応を示す一連のチャートを示す図である。ELISA(図21D)アッセイのためにマウスを犠牲にした。
【図２１Ｅ】Ad-shS1/FliC-DCで免疫したマウスにおけるHCV-E2特異的抗体力価のチャートである。
【図２１Ｆ】Ad-shS1/FliC-DCおよび対照で免疫したマウスにおけるIgG AFC前駆細胞のレベルを示すチャートを示す図である。
【図２２】組換えAdベクターの概略図である。
【図２３Ａ】DCによる抗原特異的T細胞応答の刺激におけるAd-shA20/FliCの優れた効力を示す一連のチャートである。HBsAgタンパク質(Meridian Life Science社、50μg/ml)でパルスし、足蹠（footpad）を通して250ifuのMOI(1x106細胞/マウス)でのAdベクターで形質導入されたBM-DCでもって、C57BL/6マウス群(1群あたり4ひき)を週に2回免疫した後のIFNγ ELISPOTアッセイの結果を示す。
【図２３Ｂ】DCによる抗原特異的T細胞応答の刺激におけるAd-shA20/FliCの優れた効力を示す一連のチャートである。HBsAgタンパク質(50μg/ml)でパルスし、足蹠を通して、週に2回、250ifuのMOI(1x106細胞/マウス)でのAdベクターで形質導入されるかまたは一般的に用いられるTLRアゴニストで刺激されたBM-DCでもって、C57BL/6マウス群(1群あたり4匹)を免疫した後のIFNγ ELISPOTアッセイの結果を示す。
【図２３Ｃ】DCによる抗原特異的T細胞応答の刺激におけるAd-shA20/FliCの優れた効力を示す一連のチャートである。250ifuのMOIでの(1x106細胞/マウス)Adベクターで形質導入された、HBsAgタンパク質(50μg/ml)でパルスしたBM-DCで免疫したC57BL/6マウス群から得たプールした脾細胞からのHBsAg特異的IgG分泌細胞の量を示す。
【図２３Ｄ】DCによる抗原特異的T細胞応答の刺激におけるAd-shA20/FliCの優れた効力を示す一連のチャートである。250ifuのMOIでの(1x106細胞/マウス)Adベクターで形質導入されるかまたは一般的に用いられるTLRアゴニストで刺激された、HBsAgタンパク質(50μg/ml)でパルスしたBM-DCで免疫したC57BL/6マウス群から得たプールした脾細胞からのHBsAg特異的IgG分泌細胞の量を示す。
【図２４】ワクチンアジュバントとして使用するためのFliC-プロタミン融合タンパク質/siRNA複合体の概略図である。
【図２５】組換えFliC-プロタミン融合タンパク質の発現のためのバキュロウイルス発現ベクターの概略図である。
【図２６】FliC-Pに感染したまたは感染していないSf9細胞の細胞溶解物における組換えFliC-プロタミン(FliC-P)融合タンパク質の発現を示す一連のウェスタンブロットを示す図である。
【図２７Ａ】FliC-P/siA20により産生される炎症性サイトカインレベルの増強を示す一連のチャートを示す図である。TNF-αの産生を示す。
【図２７Ｂ】FliC-P/siA20により産生される炎症性サイトカインレベルの増強を示す一連のチャートを示す図である。IL-6の産生を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
詳細な説明
当然のことながら、一般に、本発明の実質的理解を提供するために、本発明の特定の側面、方式、実施形態、変形物および特徴を種々のレベルの詳細さで以下に示す。
【００２４】
樹状細胞(DC)などの抗原提示細胞(APC)は、炎症誘発性遺伝子カスケードならびに自然および適応免疫反応の活性化のために、保存された病原体の部分構造を検知するTLRを用いるので、ワクチンの有効性を改善するアジュバントとしてToll様受容体(TLR)アゴニストの開発に集中的な努力がはらわれてきた。本明細書においては、高度の免疫力を刺激するワクチン組成物およびアジュバントが提供される。
【００２５】
本発明は、負の免疫調節因子インヒビターおよび炎症誘発性分子を含む組成物により免疫細胞の免疫力を高めるワクチンおよび療法を提供する。実施例に示す結果から明らかなように、これらのアジュバントは免疫反応を相乗的に高めることができる。従って、本発明は、特定の抗原に対する細胞の免疫刺激能を高めることによる治療上の利点を提供する。サイトカイン受容体およびTLRシグナル伝達の負の調節因子、例えばサイトカインシグナル抑制因子(SOCS)1およびA20は、成熟、炎症性サイトカイン産生および、重要な抗原提示アテニュエーターとして機能するDCの免疫刺激力に負の調節を行う。従って、負の免疫調節因子のインヒビターおよびフラジェリンポリペプチドを含む新しいタイプのワクチンアジュバントが記載される。
【００２６】
一側面において、免疫細胞は、本発明の組成物(アジュバント)でトランスフェクトされる。一実施形態において、免疫細胞は樹状細胞(DC)である。理論に拘束されることを望まないが、DCは、専門の抗原提示細胞(APC)の中で最も強力であり、病原体および腫瘍関連抗原(TAA)に対して適応免疫反応をプライミングする特有の能力を有する。DCワクチンは、マウス腫瘍モデルおよび臨床試験において試験されてきた。しかしながら、DCワクチン接種は、腫瘍退縮(臨床奏功)または自己免疫病状をほとんど引き起こさず、このことは、宿主レベルでの自己寛容が、免疫された患者においてもなお維持されていることを示唆している。同様に、C型肝炎ウイルス(HCV)などの慢性感染と関連する病原体は、TLRリガンド自身を含む病原体のワクチン接種または自然感染のいずれかにより誘導される免疫反応に対して難治性である。DCワクチンの一般的な無効性に関しては多くの可能な説明があり、非効率な抗原負荷およびDC成熟、DC集団の異種性、腫瘍媒介免疫抑制、TAAに対する自己反応性・低アビディティT細胞自己寛容および調節性T細胞による抑制が含まれる。
【００２７】
本発明のワクチンアジュバントは、DCワクチンに付随する問題の一部を克服する利点を有する。本アジュバントは、負の免疫調節因子インヒビターを含み得る。一実施形態において、負の免疫調節因子はサイトカインシグナル抑制因子1(SOCS1)である。SOCS1は、自己寛容の維持および抗腫瘍免疫の制限における抗原提示アテニュエーター(APA)である(米国特許出願公開第2006/0292119号および第2006/0269519号(参照により本願に組み込まれる)を参照のこと)。SOCSファミリーの1メンバーであるSOCS1は、T細胞およびAPCにおける、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15などを含む種々の炎症性サイトカインによるシグナル伝達の本質的な負の調節因子である(Kubo et al., Nat Immunol, 4: 1169-1176, 2003; Alexander et al., Annu Rev Immunol, 22: 503-529, 2004)。SOCS1は、炎症誘発性刺激後にフィードバック方式で誘導発現され、JAKとSTATとの結合を遮断する偽基質およびJAKをユビキチン化させてその分解を促進するE3リガーゼとして作用する(Yoshimura et al., Nat Rev Immunol, 7: 454-465, 2007)。さらに、SOCS1は、Malのポリユビキチン化およびそれに続く分解を促進することによりTLRシグナル伝達の負の調節を行う (Mansell et al., Nat Immunol, 7: 148-155, 2006)。
【００２８】
SOCS1の抑制は、自己寛容を破壊するのに役立つが、SOCS1のインヒビター単独ではDCを活性化するのに不十分である。炎症誘発性シグナル伝達カスケードの開始には、フラジェリンポリペプチドなどの炎症誘発性刺激をさらに必要とすることを本発明者らは見出した。フラジェリンはTLR5のリガンドであり、TLR5とのその相互作用により、ヒトDCの成熟およびケモカイン産生を誘導する。従って、一側面において、本発明は、負の免疫調節因子インヒビターおよびフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを有するワクチンアジュバントを提供する。
【００２９】
一実施形態において、アジュバント組成物は、SOCS1インヒビター(例えばSOCS1のsiRNA)をコードする1つ以上のポリヌクレオチドおよびフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。SOCS1インヒビターおよびフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物を、それぞれ表1および3に示す。
【００３０】
いくつかの実施形態において、組成物はさらに抗原を含む。選択された実施形態において、ワクチン組成物はSOCS1インヒビター(例えば、SOCS1のsiRNA)をコードする1種以上のポリヌクレオチド、ドミナントネガティブ(DN)サバイビン変異体ポリペプチドおよびMUC1フラグメントをコードするポリヌクレオチドならびにフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。SOCS1インヒビター、DNサバイビン変異体およびMUC1フラグメントならびにフラジェリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物を、それぞれ表1〜3に示す。いくつかの実施形態において、DNサバイビン変異体およびMUC1フラグメントは、別々にまたは一緒に発現される。一実施形態において、DNサバイビン変異体をコードするヌクレオチドは、配列番号2のヌクレオチド1〜387を含む。一実施形態において、MUC1フラグメントをコードするヌクレオチドは配列番号2のヌクレオチド394〜573を含む。特定の実施形態において、DNサバイビン変異体およびMUC1フラグメントは融合タンパク質として、例えば配列番号2の配列により発現される。
【００３１】
【表１】
2011505144.tif 000003
【００３２】
【表２】
2011505144.tif 000004
【００３３】
【表３】
2011505144.tif 000005
【００３４】
典型的な実施形態において、本発明は、SOCS1 siRNA、DNサバイビン/MUC1融合タンパク質およびフラジェリンポリペプチドが単一の構築物で提供されるワクチン組成物を提供する。この構築物の配列を表4に示す。選択された実施形態において、この構築物はアデノウイルスベクターに挿入されることができる(図1に示す)。
【００３５】
【表４−１】
2011505144.tif 000006
【表４−２】
2011505144.tif 000007
【００３６】
本発明の実施において、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学および組換えDNAにおける多くの慣用法が用いられる。これらの技術は公知であり、例えば、それぞれ、Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I-III, Ausubel, Ed. (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II, Glover, Ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, Eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, Ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Meth. Enzymol., (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987);およびMeth. Enzymol., Vols. 154 and 155, Wu & Grossman, and Wu, Eds.において説明されている。
【００３７】
本明細書に用いられる特定の用語の定義を以下に示す。特記しない限り、本明細書で用いられるすべての学術用語は、一般に、本発明が属する当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるとき、単数形“ある(a)”、“ある(an)”および“その(the)”は、文脈により明確に否定されない限り複数指示対象を含む。例えば、“ある細胞(a cell)”とは、2つ以上の細胞の組み合わせを含むなどである。一般に、以下に記載されている、本明細書で用いられる命名法ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、分析化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験室手順は公知であり、当該技術分野で通常用いられている。本明細書におけるすべての引用文献は、各刊行物、特許または特許出願が個別・具体的にその全体が参照により組み込まれるかのように、その全体が参照により本願に組み込まれる。
【００３８】
本明細書において、被験者または細胞へのワクチン、薬剤または薬物の“投与”は、その意図された機能を果たすための化合物を被験者に導入または送達するいずれの経路をも含む。経口、鼻腔内、非経口(静脈内、筋肉内、腹腔内もしくは皮下)、直腸内または局所を含むいずれかの適切な経路により投与することができる。投与は、自己投与および他人による投与を含む。記載されている病状の治療または予防の種々の様式は、“実質的”を意味し、これは、完全な治療または予防ばかりでなく、ある程度の生物学的または医学的に関連する結果が得られる完全未満の治療または予防をも含むことを意味するものであることも明らかであろう。
【００３９】
本明細書において、用語“抗体”は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合できる免疫グロブリン分子のことを言う。抗体は、自然源または組換え源由来の無傷の免疫グロブリンであることもでき、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であることもできる。抗体は、一般的には、免疫グロブリン分子の四量体である。抗体は、種々の形態、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Fv、FabおよびF(ab)2に加えて一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む形態で存在できる。
【００４０】
本明細書において、用語“抗原”または“Ag”は、免疫反応を引き起こす分子として定義される。この免疫反応は、抗体産生もしくは特定の免疫学的にコンピテントな細胞の活性化のいずれかまたはその両方を含み得る。事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含むいずれの高分子でも抗原としての要求を満たすことができることは、当業者には明らかであろう。さらにまた、抗原は組換えDNA由来であることもできるし、ゲノムDNA由来であることもできる。免疫反応を誘導するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むいずれのDNAも、従って“抗原”をコードすることは、当業者には明らかであろう。さらにまた、抗原は、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってコードされなければならないとは限らないことは、当業者には明らかであろう。限定するものではないが、本発明が2種以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列を含み、所望の免疫反応を誘導するポリペプチドを産生するために、これらのヌクレオチド配列が種々の組み合わせで配置されることは容易に理解される。例えば、一実施形態において、DNサバイビン変異体およびMUC1フラグメントに対応する抗原をコードするポリヌクレオチドが、両方の抗原に対する免疫反応を同時に誘導するために組み合わされる。さらに、抗原は“遺伝子”によりコードされなければならないということはないことは当業者には明らかであろう。抗原は、合成されることもできるし、生体試料由来であることもできることは容易に理解される。
【００４１】
“抗原提示細胞”(APC)は、T細胞を活性化できる細胞であり、限定するものではないが、単球/マクロファージ、B細胞および樹状細胞(DC)を含む。
【００４２】
用語“樹状細胞”または“DC”は、リンパ組織または非リンパ組織に見出される形態学的に類似した細胞型の多様な集団のいずれかのメンバーのことを言う。これらの細胞は、その特有の形態である高濃度の表面MHCクラスII発現を特徴とする。DCは、多くの組織源から単離されることができる。DCは、MHC-拘束性T細胞を感作する高い能力を有し、in situでT細胞に抗原を提示する点で大変に有効である。抗原は、T細胞の発生および免疫寛容中に発現される自己抗原であることもできるし、正常な免疫過程中に存在する異種抗原であることもできる。
【００４３】
本明細書において、“活性化DC”は、抗原でパルスされたDCであって、かつ免疫細胞を活性化できるDCである。
【００４４】
本明細書において、用語“成熟DC”は、高濃度のMHCクラスII、CD80(B7.1)およびCD86(B7.2)分子を発現する樹状細胞として定義される。対照的に、未熟な樹状細胞は、低濃度のMHCクラスII、CD80(B7.1)およびCD86(B7.2)分子を発現するが、抗原を取り込む高い能力を有する。
【００４５】
“抗原負荷（antigen-loaded）APC”または“抗原パルス（antigen-pulsed）APC”は、抗原に暴露され、抗原により活性化されたAPCを含む。例えば、APCは、in vitro、例えば抗原の存在下での培養中、Ag-負荷（Ag-loaded）になり得る。抗原への暴露により、APCはin vivoで負荷され得る。
【００４６】
“抗原負荷APC”は、従来は、以下の2つの方法の1つで調製されている:(1)抗原ペプチドとして知られる小ペプチドフラグメントをAPCの外側に直接に“パルスする”あるいは(2)全タンパク質またはタンパク質粒子をAPCと共にインキュベートし、次いでそれがAPCにより摂取される。他の実施形態において、APCは、抗原または抗原をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。これらのタンパク質は、APCにより小ペプチドフラグメントに消化され、最終的に輸送されてAPC表面上に提示される。加えて、抗原負荷APCは、抗原をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入することにより作成することもできる。
【００４７】
本明細書において、用語“サイレンシングしたAPC”または“サイレンシングしたDC”は、それぞれ、負の免疫調節因子インヒビター(負の免疫調節因子を抑制するとしても知られる)に暴露され、それによって負の免疫調節因子が免疫反応の調節に関連するAPCまたはDCのことを言う。サイレンシングしたAPCは、負の免疫調節因子インヒビターで処理されていないこと以外は同じであるAPCと比較して免疫力が増強されている。
【００４８】
“アンチセンス”は、特に、ポリペプチドをコードする二本鎖DNA分子の非コード鎖の核酸配列または非コード鎖に実質的に相同な配列を言う。本明細書で定義されるアンチセンス配列は、ポリペプチドをコードする二本鎖DNA分子の配列に相補的である。アンチセンス配列が必ずしもDNA分子のコード鎖のコード部分のみに相補的であるとは限らない。アンチセンス配列は、ポリペプチドをコードするDNA分子のコード鎖に特定され、コード配列の発現を調節する調節配列に相補的であることができる。
【００４９】
本明細書において、用語“自己の”は、それが後に個体に再導入される予定の同じ個体由来のいずれかの物質を指すと解される。
【００５０】
本明細書において、用語“癌”は、異常な細胞の急速で無制限な増殖を特徴とする疾患として定義される。癌細胞は、局所的に進展することもでき、身体の他の部分に血流およびリンパ系を介して進展することもできる。種々の癌の例は、限定するものではないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などを含む。
【００５１】
“サイトカインシグナル調節因子”または“サイトカインシグナルの調節因子”または“サイトカインシグナル伝達（transduction）調節因子”は、細胞におけるサイトカインシグナル伝達経路を負に調節できるタンパク質のことを言う。サイトカインシグナル伝達調節因子は、限定するものではないが、サイトカインシグナル伝達抑制因子(SOCS1〜SOCS7、サイトカイン誘導性SH2ドメイン含有タンパク質(CIS))、SH2含有ホスファターゼ(SHP)および活性化STAT抑制タンパク質(PIAS)を含む。
【００５２】
“コードする”とは、ヌクレオチドの所定の配列(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)またはアミノ酸の所定の配列のいずれかおよびそれから得られた生物学的特性を有する、生物過程における他のポリマーおよび高分子の合成の鋳型として役立つポリヌクレオチド、例えば遺伝子、cDNAまたはmRNAにおけるヌクレオチドの特定の配列の固有の性質のことを言う。従って、遺伝子に対応する転写およびmRNAの翻訳により、細胞またはたの生物系内でタンパク質が産生される場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であり、通例配列表に示されるコード鎖および遺伝子またはcDNAの転写の鋳型として用いられる非コード鎖は、共に、その遺伝子またはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると呼ぶことができる。
【００５３】
本明細書において、“内因性”とは、生物、細胞、組織または系に由来する、またはその内部で産生されるいずれかの物質のことをいう。
【００５４】
本明細書において、用語“外因性”とは、生物、細胞、組織または系から導入された、またはその外部で産生されたいずれかの物質のことを言う。
【００５５】
本明細書において、用語“エピトープ”は、Bおよび/またはT細胞応答を含む免疫反応を誘導することができる抗原上の小化学分子と定義される。抗原は1つ以上のエピトープを有することができる。大部分の抗原は多くのエピトープを有している。すなわちそれらは多価である。一般に、エピトープのサイズは、おおよそ5アミノ酸および/または糖類である。一般に、分子の特定の線状配列よりはむしろ全体の3次元構造の方が抗原特異性の主な基準であり、それによってあるエピトープが他のエピトープと区別されるということは当業者に明らかである。
【００５６】
本明細書において、用語“発現”は、そのプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および/または翻訳と定義される。
【００５７】
本明細書において、用語“発現ベクター”は、転写されることができる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターのことを言う。場合によっては、RNA分子は、次にタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。別の場合では、例えばアンチセンス分子、siRNA、リボザイムなどの産生においては、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主生物において、機能的に連結されたコード配列の転写およびおそらくは翻訳に必要な核酸配列を指す種々の調節配列を含むことができる。転写および翻訳を左右する調節配列に加えて、発現ベクターは、他の機能に役立つ核酸配列を含むこともできる。
【００５８】
本明細書において、“融合タンパク質”は、融合タンパク質のドメインが、1つ以上の他のタンパク質または人工的に誘導された配列に由来する天然に存在しないタンパク質産物を意味する。例えば、各ドメインは、所望の性質を有する、天然に存在する異なるタンパク質配列またはその変異体/バリアントに由来することができる。本発明の一実施形態において、複数の抗原に対する免疫反応を誘導することができる融合タンパク質を作成するために、2つ以上の抗原ポリペプチドが、単一のポリヌクレオチドによりコードされる。
【００５９】
本明細書において、用語“ヘルパーT細胞”は、その主な機能が、他のBおよびTリンパ球および/またはマクロファージの活性化および機能を促進することであるエフェクターT細胞と定義される。大部分のヘルパーT細胞はCD4T細胞である。
【００６０】
本明細書において、用語“異種”は、異なる種由来のDNAもしくはRNA配列またはタンパク質と定義される。
【００６１】
本明細書において、“相同の”は、2つのポリマー分子、例えば2つの核酸分子または2つのポリペプチド分子間のサブユニットの配列類似性のことを言う。2つの分子の両方におけるサブユニットの位置が同じモノマーのサブユニットで占められている場合。2つの配列間の相同性は、一致した数または相同位置数の一次関数である。例えば、2つの化合物の配列における位置の半分(例えば、長さ10サブユニットのポリマーにおける5つの位置)が相同である場合、2つの配列は50%相同であり、位置の90%、例えば10のうち9が一致または相同である場合、2つの配列は90%の相同性を共有する。比較のための配列のアラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981 の局所相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970 の相同性アラインメントアルゴリズム、Lipman, PNAS USA 85:2444, 1988 の類似性検索方法、アルゴリズムGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTAのコンピュータインプリメンテーションまたはマニュアルアラインメントおよび視覚的検査によって行うことができる。相同性または同一性を決定するための他のアルゴリズムは、加えて、例えば、BLASTプログラム(国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information )におけるBasic Local Alignment Search Tool)を含む。本明細書において、“相同性”は“同一性”と同義で用いられる。
【００６２】
本明細書において、“免疫原”は、哺乳動物において、体液性抗体および/または細胞性免疫反応を刺激または導入することができる物質のことを言う。
【００６３】
本明細書において、用語“免疫グロブリン”または“Ig”は、抗体として機能するタンパク質のクラスと定義される。タンパク質のこのクラスに含まれる5つのメンバーは、IgA、IgG、IgM、IgDおよびIgEである。IgAは、身体分泌物、例えば唾液、涙、母乳、消化管分泌物ならびに気道および泌尿生殖路の粘液分泌物などの身体分泌物中に存在する一次抗体である。IgGは、最も一般的な循環抗体である。IgMは、大部分の哺乳動物における一次免疫反応において産生される主要な免疫グロブリンである。これは、凝集、補体結合および他の抗体反応における最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御において重要である。IgDは、抗体機能が未知の免疫グロブリンであるが、抗原受容体として働いている可能性がある。IgEは、アレルゲンへの暴露に際してマスト細胞および好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことにより即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
【００６４】
本明細書において、“負の免疫調節因子（nagative immune regulator）”または“負の調節因子”または“免疫反応の負の調節因子”は、細胞において免疫のシグナル伝達経路を負に調節できるタンパク質のことを言う。一般的には、負の免疫調節因子は、炎症誘発性シグナル伝達経路を負に調節する。本明細書に記載の負の免疫調節因子は、限定するものではないが、sTLR、RP105、SIGIRR、ST2、NOD2、MyD88、IRAK(IRAKM、IRAK1、IRAK2)、IRF-4、FLN29、TWEAK、TRIAD3A、CYLD、Cbl、A20、SUMO(SUMO1、SUMO2、SUMO3およびSUMO4)、I-κBタンパク質、MKP、Foxj1、Foxo3a、TWIST(Twist1、Twist2)、Roquin、Dok(Dok-1、Dok-2)、PI3K、プロスタグランジン、TRAIL-R、アレスチン、TOLLIP、SOCS(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7およびCIS)、PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASxおよびPIASy)、SHP(SHP-1およびSHP-2)またはそれらの組み合わせを含む。負の免疫調節因子は、限定するものではないが、シグナル伝達に関与するタンパク質(例えば、可溶性TLRデコイ、TIR抑制ホモログ、シグナル伝達分子抑制アイソフォーム、サイトカイン抑制ホモログなど)、分子安定性に関与するタンパク質、シグナル伝達分子複合体の抑制成分、シグナル伝達分子リン酸化の調節に関与するタンパク質、NF-κB標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、RNAの翻訳および安定性の調節に関与するタンパク質、サイトカインシグナル伝達調節因子などの抑制ホモログを含む種々のタンパク質ファミリーに属することができる。一側面において、免疫細胞における1種以上の負の免疫調節因子の抑制は、細胞の免疫力を高めるのに役立つ。
【００６５】
“単離された核酸”は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から分離された核酸セグメントまたはフラグメント、すなわち、通常そのフラグメントに隣接する配列、すなわちそれが天然に存在するゲノム中のフラグメントに隣接した配列から除去されたDNAフラグメントのことを言う。この用語はまた、核酸に天然に付随する他の成分、すなわち、細胞内で核酸に天然に付随するRNAまたはDNAまたはタンパク質から実質的に精製された核酸に適用される。従って、この用語は、例えば、ベクター、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスまたは原核生物もしくは真核細胞のゲノムDNAに組み込まれる組換えDNA、または他の配列から独立した離れた分子(すなわち、PCRまたは制限酵素消化により作成されるcDNAまたはゲノムまたはcDNAフラグメント)として存在する組換えDNAを含む。これはまた、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAも含む。
【００６６】
本明細書において、用語“主要組織適合遺伝子複合体”または“MHC”は、その多くが、組織適合性の最も重要な決定要因の1つである抗原提示に関与する進化的に関連した細胞表面タンパク質をコードする特定の遺伝子クラスターと定義される。クラスI MHCすなわちMHC-Iは、主にCD8 Tリンパ球への抗原提示において機能する。クラスII MHCすなわちMHC-IIは、主にCD4Tリンパ球への抗原提示において機能する。
【００６７】
本明細書において、用語“ポリヌクレオチド”は、ヌクレオチドの鎖と定義される。さらにまた、核酸はヌクレオチドのポリマーである。本明細書において、核酸とポリヌクレオチドは交換可能である。
【００６８】
本明細書において、用語“ポリペプチド”は、通例所定の配列を有する、アミノ酸残基の鎖と定義される。本明細書において、用語ポリペプチドは、用語“ペプチド”および“タンパク質”と相互に包括的である。
【００６９】
本明細書において、“増殖”は、同様な形態の実体の再生産または増加、例えば細胞の増殖を指すために用いられる。すなわち、増殖は、より多くの数の細胞の産生を含み、特に、例えば単純に細胞数の計数をするか、細胞への3H-チミジンの取り込みを測定することにより測定することができる。
【００７０】
本明細書において、用語“プロモーター”は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構により認識されるDNA配列と定義される。“構成的”プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドに作動可能に連結されたとき、細胞において、細胞の大部分またはすべての生理的条件下で遺伝子産物の産生を引き起こすヌクレオチド配列である。“誘導性”プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドに作動可能に連結されたとき、細胞において、プロモーターに対応する誘導物質が細胞内に実質的に存在するときにのみ遺伝子産物の産生を引き起こすヌクレオチド配列である。“組織特異的”プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは指定するポリヌクレオチドに作動可能に連結されたとき、細胞において、細胞が、実質的にプロモーターに対応する組織型の細胞であるときにのみ遺伝子産物の産生を引き起こすヌクレオチド配列である。
【００７１】
本明細書において、用語“自己抗原”は、宿主の細胞または組織により発現される抗原と定義される。自己抗原は腫瘍抗原であることができるが、特定の実施形態において、正常細胞および腫瘍細胞の両方において発現される。自己抗原は、細胞内で過剰発現されることができることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【００７２】
本明細書において、“実質的に精製された”細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞である。実質的に精製された細胞はまた、天然に存在する状態においては通常付随する他の細胞型から分離された細胞のことも言う。場合によっては、実質的に精製された細胞集団は、均一な細胞集団のことを言う。他の例において、この用語は、単に、天然状態において天然に付随する細胞から分離された細胞のことを言う。いくつかの実施形態において、細胞はin vitroで培養される。他の実施形態において、細胞はin vitroでは培養されない。
【００７３】
本明細書において、用語“置換”は、当該技術分野で一般に用いられる変異の1つである。置換バリアントは、ポリペプチド分子における、異なる残基によって置換された少なくとも1つのアミノ酸残基を有する。“同類置換”は、一般的には、未修飾ポリペプチド配列と同様な生物活性を与え、それにより、保守的に修飾されたバリアントが誘導された。同類置換は、一般的には、あるアミノ酸と、同様な特徴を有する他のアミノ酸との置換を含む。機能的に同様なアミノ酸を提供する保存的置換表は当該分野で公知である。例えば、以下の6つの群は、それぞれ互いに同類置換であるアミノ酸を含む。脂肪族:グリシン(G)、アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)、イソロイシン(I);芳香族:フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);硫黄含有:メチオニン(M)、システイン(C);塩基性(カチオン性):アルギニン(R)、リジン(K)、ヒスチジン(H);酸性(アニオン性):アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);アミド:アスパラギン(N)、グルタミン(Q)。
【００７４】
本明細書において、用語“T細胞”は、種々の細胞性免疫反応に関与する胸腺由来細胞と定義される。
【００７５】
本明細書において、用語“B細胞”は、骨髄および/または脾臓由来の細胞と定義される。B細胞は、抗体を産生する形質細胞へと分化することができる。
【００７６】
本明細書において、“治療的有効量”は、組成物が投与される哺乳動物に有益な効果を与えるのに十分な治療用組成物の量である。
【００７７】
本明細書において、用語“トランスフェクトされた”または“形質転換された”または“形質導入された（transduced）”は、外因性核酸が宿主細胞に挿入または導入される過程のことを言う。“トランスフェクトされた”または“形質転換された”または“形質導入された”細胞は、外因性核酸でトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入された細胞である。この細胞は、初代対象細胞およびその子孫を含む。
【００７８】
本明細書において、用語“治療”または“処置”または“軽減”は、治療処置および予防または防止措置の両方のことを言い、その目的は、標的の病理学的状態または障害を予防する、または遅らせる(軽減する)ことである。例えば、癌に関しては、癌細胞数の減少または癌細胞の非存在;腫瘍サイズの減少;腫瘍転移の抑制(すなわち、ある程度の遅延および好ましくは停止);腫瘍増殖のある程度の抑制;寛解の長さの増加および/または特定の癌と関連する症状の1つ以上のある程度の軽減;罹患率・死亡率の低下およびクオリティ・オブ・ライフ問題の改善である。
【００７９】
本明細書において、用語“転写調節下”または“作動可能に連結された（operatively linked）”は、RNAポリメラーゼによる転写開始およびポリヌクレオチドの発現を調節するポリヌクレオチドに関してプロモーターが正しい位置および配向にあることを意味する。
【００８０】
本明細書において、用語“ワクチン”は、哺乳動物への物質の投与後に免疫反応を引き起こすために用いられる物質と定義される。
【００８１】
本明細書で用いられる用語としての“バリアント”は、参照核酸配列またはペプチド配列とはそれぞれ配列が異なるが、参照分子の本質的特性を保持している核酸配列またはペプチド配列である。核酸バリアントの配列の変化は、参照核酸によりコードされるペプチドのアミノ酸配列を変えない場合もあり、アミノ酸置換体、付加体、欠失体、融合体および短縮体をもたらす場合もある。ペプチドバリアントの配列の変化は、一般的には、限定されている、または保守的であり、従って参照ペプチドおよびバリアントの配列は全般的に密接に類似しており、多くの領域で同一である。バリアントと参照ペプチドとは、1つ以上の置換、付加、欠失のいずれかの組み合わせでアミノ酸配列が異なっていることができる。核酸またはペプチドのバリアントは、天然に存在するバリアント、例えば対立遺伝子バリアントであることもでき、天然に存在することが知られていないバリアントであることもできる。天然に存在しない核酸およびペプチドのバリアントは、変異誘発技術によっても作成できるし、直接合成によっても作成できる。
【００８２】
“ベクター”は、単離された核酸を含み、細胞内部に単離された核酸を送達するために用いることができる物質の組成物である。多数のベクターは当該技術分野で公知であり、限定するものではないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と関連するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含む。従って、用語“ベクター”は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、細胞内への核酸の挿入を容易にする非プラスミドおよび非ウイルス性化合物、例えばポリリジン化合物、リポソームなどを含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、限定するものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含む。
【００８３】
ワクチンおよびアジュバント組成物
一側面において、本発明は、DCの活性化のためのワクチン組成物であって、ワクチン組成物が負の免疫調節因子インヒビター、炎症促進性分子、例えばフラジェリンおよび場合により抗原である前記ワクチン組成物を提供する。一実施形態において、ワクチンまたはアジュバントの成分はポリヌクレオチド発現ベクターによって産生される。一実施形態において、負の免疫調節因子インヒビターはSOCS1またはA20のsiRNAである。発明の詳細な説明のための本セクションにおいては、ワクチン組成物の一般成分およびこれらの成分の構築方法について説明する。
【００８４】
負の免疫調節因子
一般。負の免疫調節因子は、限定するものではないが、シグナル伝達に関与するタンパク質(例えば、可溶性TLRデコイ、TIR抑制ホモログ、シグナル伝達分子抑制アイソフォーム、サイトカイン抑制ホモログなど)、分子安定性に関与するタンパク質、シグナル伝達分子複合体の抑制成分、シグナル伝達分子リン酸化の調節に関与するタンパク質、NF-κB標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、RNAの翻訳および安定性の調節に関与するタンパク質、サイトカインシグナル調節因子などの抑制ホモログを含む種々のタンパク質ファミリーに属することができる。負の免疫調節因子の例は、限定するものではないがsTLR、RP105、SIGIRR、ST2、NOD2、MyD88、IRAK(IRAKM、IRAK1、IRAK2)、IRF-4、FLN29、TWEAK、TRIAD3A、CYLD、Cbl、A20、SUMO(SUMO1、SUMO2、SUMO3、およびSUMO4)、I-κBタンパク質、MKP、Foxj1、Foxo3a、TWIST(Twist1、Twist2)、Roquin、Dok(Dok-1、Dok-2)、PI3K、プロスタグランジン、TRAIL-R、アレスチン、TOLLIP、SOCS(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7およびCIS)、PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASxおよびPIASy)、SHP(SHP-1およびSHP-2)などを含む。
【００８５】
免疫細胞における負の免疫調節因子は、免疫細胞の制御点を“サイレンシングし”、それによって細胞の免疫力を高めるのに役立つ。一側面において、シグナル伝達に関与するタンパク質(例えば、可溶性TLRデコイ、TIR抑制ホモログ、シグナル伝達分子抑制アイソフォーム、サイトカイン抑制ホモログなど)、分子安定性に関与するタンパク質、シグナル伝達分子複合体の抑制成分、シグナル伝達分子リン酸化の調節に関与するタンパク質、NF-κB標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、RNAの翻訳および安定性の調節に関与するタンパク質、サイトカインシグナル伝達調節因子の抑制ホモログまたはそのいずれかの組み合わせの抑制は、本発明のワクチン組成物に用いるとき、哺乳動物への治療上の利点を提供する。
【００８６】
種々の負の免疫調節因子に関するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、当業者に公知のコンピュータ化データベースにおいて見出すことができる。このようなデータベースの1つに、National Center for Biotechnology InformationのGenbankおよびGenPeptデータベースがある。これらの既知遺伝子の核酸配列は、増幅し、本明細書に開示された配列と結合させ(例えば、連結させ)および/または、本明細書に開示された技術もしくは当業者に公知の技術のいずれ(例えば、Sambrookら(2001))を用いても発現させることができる。核酸は、in vitro発現系において発現させることができるが、いくつかの実施形態において、核酸は、in vivo複製および/または発現のためのベクターを含む。
【００８７】
サイトカインシグナル調節因子。一側面において、負の免疫調節因子は、限定するものではないが、サイトカインシグナル伝達抑制因子(SOCS)、SH2含有ホスファターゼ(SHP)および活性化STATのタンパク質インヒビター(PIAS)を含むサイトカインシグナル調節因子である。
【００８８】
サイトカインシグナルの誘導性インヒビターは、SOCS1〜SOCS7およびサイトカイン誘導性SH2ドメイン含有タンパク質(CIS)の8つのファミリーメンバーが存在するサイトカインシグナル抑制因子(SOCS)タンパク質である。SOCSタンパク質は、サイトカイン受容体または関連JAKを認識し、シグナル伝達への直接干渉およびユビキチン媒介性プロテアソーム分解の受容体複合体のターゲッティングの両方によるシグナル伝達を減弱させる。(SHP-1およびSHP-2)を含むが限定されないSHPタンパク質は構成発現され、ヤヌスキナーゼ(JAK)およびその受容体などのシグナル伝達中間体を脱リン酸化することによってサイトカインシグナル伝達を減弱させることができる。PIAS 1、PIAS3、PIASxおよびPIASyを含むが限定されない活性化STAT抑制タンパク質(PIAS)ファミリーのメンバーであり、同じく構成発現され、STAT活性を抑制することによりシグナル伝達を減弱させる。SUMO化の過程は、STAT活性のPIAS媒介性抑制に関連付けられている。
【００８９】
シグナル伝達に関与するタンパク質の抑制ホモログ。有効な免疫反応は、病原体感染に応答したDCの活性化に起因する。この活性化は、TLRなどの病原体認識受容体を介するシグナル伝達を含む。TLRのメンバーは、共通のシグナル伝達経路、特にNF-κBおよびストレス活性化タンパク質キナーゼの活性化を引き起こすシグナル伝達経路を活性化する、保存されたサイトゾル型Toll/インターロイキン-1受容体(TIR)ドメインの存在により同様にシグナル伝達する。NF-κBの活性化は、TNF、IFN、インターロイキン1(IL-1)、IL-6およびIL-12などの炎症性サイトカインの分泌ならびにCD80、CD86およびCD40などの共刺激分子の発現により免疫反応を引き起こす。
【００９０】
細胞内のTLRシグナル伝達に基づく免疫反応を調節するための頻繁に使用される戦略は、TLRの細胞外部分において刺激活性を有さないその非機能的ホモログまたはアイソフォームによって重要なシグナル伝達分子を競合的に抑制することである。負の免疫調節因子であるこのファミリーのタンパク質は、限定するものではないが、可溶性TLRデコイ(sTLR)を含む。sTLRは、TLRと病原性産物(例えば、微生物産物)との相互作用を抑制する。例えば、可溶性TLR2デコイは、対応する微生物リガンドとの相互作用に関してTLR2と競合する。他の例において、可溶性TLR4デコイはMD2と相互作用し、MD2-TLR4複合体の形成を抑制し、それによってTLR4によるLPS媒介性シグナル伝達を遮断する。
【００９１】
本開示に基づけば、本発明が、負の免疫調節因子を抑制する組成物および方法であって、負の免疫調節因子がシグナル伝達分子の非機能的ホモログである前記組成物および方法を含むことは当業者には明らかであろう。好ましくは、シグナル伝達分子の非機能的ホモログは可溶性TLRデコイである。シグナル伝達分子の非機能的ホモログの抑制(またはsTLRの抑制)は、シグナル伝達分子に対する非機能的ホモログの阻害作用を抑制するのに役立つ。
【００９２】
可溶性TLRデコイの抑制に加えて、TLRシグナル伝達を増強するもう1つの戦略は、TLRの細胞質領域において、非機能性TIRホモログまたはアイソフォームを含むタンパク質を抑制することである。これらのタンパク質は、刺激活性を有さないTIRドメインを含む膜結合型非機能性TIRホモログ(非機能性受容体としても知られる)を共有するタンパク質ファミリーのメンバーである。これらのタンパク質は、限定するものではないが、SIGIRR(単一免疫グロブリンIL-1R関連分子)、ST2およびRP105を含む。
【００９３】
特定の理論に拘束されることを望まないが、これらのタンパク質は、TLRがその対応するシグナル伝達分子と結合するのを阻害または封鎖することによってTLRシグナル伝達を抑制する。例えば、SIGIRRは、TLR4とシグナル伝達分子との相互作用を競合することによってTLR4シグナル伝達を減弱させる。従って、本発明は、負の免疫調節因子を抑制する組成物および方法であって、負の免疫調節因子が免疫細胞におけるTLRシグナル伝達を高めるための膜結合型非機能性TIRホモログである前記組成物および方法を含む。この戦略は、免疫細胞の免疫力を高めるための負の免疫調節因子の抑制という一般概念の裏付けを提供する。
【００９４】
TLRシグナル伝達はまた、NOD2によって制御され得る。NOD2は、細菌産物であるムラミルジペプチド(MDP)を認識することができるヌクレオチド結合オリゴマー化ドメインファミリーのメンバーである。NOD2は、TLR2シグナル伝達の負の調節因子である。本明細書記載の本開示に基づけば、免疫細胞におけるNOD2の抑制は、細胞におけるTLRシグナル伝達に対するNOD2の阻害作用を抑制する。従って、免疫者においてNOD2を抑制することにより、細胞の免疫力が高められる。
【００９５】
TLRシグナル伝達を調節するもう1つの戦略は、MyD88およびIRAKなどの細胞質シグナル伝達タンパク質を調節することである。細胞質シグナル伝達分子を抑制する負の免疫調節因子は、TLRシグナル伝達における重要なシグナル伝達分子の非機能性アイソフォーム(シグナル伝達分子アイソフォームとしても知られる)であると考えられている。非機能性アイソフォームであると考えられている負の免疫調節因子の例には、中間ドメインを欠くMyD88の選択的スプライシングされた短いバリアントがある。MyD88で示されるこのMyD88のスプライスバリアントは、TLRシグナル伝達を抑制することが見出されている。例えば、MyD88は、LPS誘発NF-κB活性化を抑制する。MyD88は、IRAK4に結合し、IRAK1リン酸化を促進することができないことにより、LPS誘発NF-κB活性化を抑制すると考えられる。本明細書の開示に基づけば、細胞内での非機能性アイソフォーム(例えば、MyD88)である負の免疫調節因子の抑制により、細胞内でのTLRシグナル伝達を高める手段が提供され、それによって細胞の免疫力が増強される。
【００９６】
シグナル伝達に関与するタンパク質の抑制ホモログのファミリーに属するタンパク質のもう1つの例はIRAKである。キナーゼのIRAKファミリーは、4つのメンバー、IRAK1、IRAK2、IRAK4およびIRAKMを含む。さらに、IRAKMは、キナーゼ活性を欠き、細胞内のTLRシグナル伝達の全身的な負の免疫調節因子として機能する。従って、負の免疫調節因子がIRAKMなどの非機能性アイソフォームである場合、負の免疫調節因子の抑制により、細胞の免疫力を高めるための免疫細胞内の負の免疫調節因子の抑制という一般概念の裏付けが提供される。
【００９７】
TLRシグナル伝達の他の負の免疫調節因子は、限定するものではないが、転写因子のIFN制御因子(IRF)ファミリーのメンバー、FLN29(新規インターフェロンおよびLPS誘導性遺伝子)ならびにTWEAKを含む。従って、これらの負の免疫調節因子のいずれか1つ以上の抑制により、免疫反応に対するそれぞれの負の免疫調節因子の抑制作用を妨げることができる。従って、これらの負の免疫調節因子のいずれか1つ以上の抑制により、細胞内のTLRシグナル伝達を高める手段が提供され、それによって細胞の免疫力が増強される。
【００９８】
分子安定性の調節因子。負の免疫調節因子のファミリーの1つは、シグナル伝達分子の安定性を調節する戦略を用いる。この戦略は、ユビキチン化/脱ユビキチン化による重要なシグナル伝達分子の安定性の調節とSUMO化および他の機構によるシグナル伝達分子複合体の抑制成分の安定性の増加に関連する。これらの負の免疫調節因子の多く、例えばTRIAD3A、Cyld、Cbl、A20およびSUMOはユビキチン修飾酵素であり、これらは標的TLRおよびシグナル伝達分子を修飾し、それらの分解を促進してTLRシグナル伝達を減弱させる。場合によっては、これらの負の免疫調節因子は、TNFRシグナル伝達を減弱させることもできる。従って、本明細書の開示に基づけば、免疫細胞内のこれらの負の免疫調節因子の1つ以上の抑制により、細胞内のTLRおよび/またはTNFRシグナル伝達が高められることは、当業者には明らかであろう。細胞内のTLRおよび/またはTNFRシグナル伝達の増強の結果は、細胞の免疫力の増加である。
【００９９】
分子安定性の調節に関与する他の負の免疫調節因子は、アレスチンファミリーを含む。本開示に基づけば、免疫細胞におけるアレスチンファミリーメンバーの抑制により、NF-κBの活性化に対するアレスチンファミリーメンバーの抑制作用が抑制されることは、当業者には明らかであろう。従って、アレスチンファミリーメンバーの抑制により細胞の免疫力は高められる。
【０１００】
シグナル伝達分子複合体の抑制成分。シグナル伝達分子複合体の抑制成分のファミリーのメンバーである負の免疫調節因子はI-κBタンパク質を含む。I-κBα、I-κBβおよびI-κBεを含むI-κBタンパク質は、細胞質内のNF-κBタンパク質を封鎖し、それによってその正常な機能からNF-κBを抑制する。I-κBタンパク質は、NF-κBサブユニットに対する核局在化配列(NLS)をマスキングすることによって細胞質内にNF-κBを保持する。
【０１０１】
NF-κBの活性化における重要な事象は、I-κBキナーゼ(IKK)複合体によるI-κBのリン酸化である。IKK複合体は、TLRリガンドおよびTNFを含む種々の刺激によるNF-κBの活性化のための収束点である。IKK複合体は、2つの触媒サブユニットIKKαおよびIKKβを含み、NF-κB転写因子の活性化を調節する。IKKβは、炎症性サイトカインおよび微生物産物に応答してNF-κB活性化を媒介する。NF-κB活性化の調節におけるIKKαの負の調節的役割が観察されている。IKKαは、NF-κBサブユニットRelAおよびc-Relの分解ならびに炎症促進遺伝子プロモーターからのRelAおよびc-Relの除去の両方を促進することによってNF-κB活性の抑制に寄与する。
【０１０２】
本明細書の開示に基づけば、NF-κBに負の調節をする、または他の方法でNF-κBのt活性化を妨げるタンパク質は、細胞の免疫力を高めるための本明細書に開示された方法を用いる標的抑制の候補である。I-κBタンパク質、IKKα、IKKβまたはいずれかの組み合わせの抑制により、NF-κB活性化に対するこれらのタンパク質の抑制作用を抑制できることは当業者には明らかであろう。
【０１０３】
シグナル伝達分子のリン酸化の調節。MAPKシグナル伝達経路は、免疫反応の活性化と関連する。MAPK経路の活性化後にホスファターゼが誘導されるため、MAPK経路は、MAPKホスファターゼ(MKP)によるフィードバック抑制を受ける。本開示に基づけば、MKP(例えば、MKP5およびMKP6)の抑制は、対応するMAPK経路に対するMKPの抑制作用の抑制に役立つ。MKP5およびMKP6は、それぞれのMAPK標的の活性を抑制することによって、T細胞活性化を負に調節することが示されている。
【０１０４】
本明細書の開示に基づけば、MKP(例えば、MKP5およびMKP6)の抑制により、MAPKシグナル伝達経路に対するホスファターゼの抑制作用を抑制できることは当業者には明らかであろう。免疫細胞におけるMKPの抑制により、細胞の免疫力を高めることができる。
【０１０５】
標的遺伝子転写の調節因子。免疫反応を調節するもう1つの戦略には、NF-κB標的遺伝子の転写を抑制することまたはシグナル伝達分子複合体における負の成分の転写を高めることがある。このような戦略は、限定するものではないがTwist-1、Twist-2、Foxj1およびFoxo3aを含む負の免疫調節因子を抑制することを含む。本明細書の開示は、これらのタンパク質の少なくとも1つのレベルを抑制することにより細胞の免疫力を高めることができることを明らかにしている。
【０１０６】
Foxo3aおよびFoxj1はフォークヘッド転写因子ファミリーのメンバーであり、NF-κBの負の調節に能動的に関与している。Twistは、NF-κBのもう1つの負の免疫調節因子である。TwistはサイトカインプロモーターにおけるEボックスに結合し、隣接する-κB部位に結合するNF-κBの活性を抑制する。
【０１０７】
負の免疫調節因子を抑制する方法:
本発明は、細胞の免疫力を高めるために細胞における負の免疫調節因子を抑制することを含む。好ましくは、本発明は、A20、SUMO(SUMO1、SUMO2、SUMO3およびSUMO4)、Foxj1、Foxo3a、TWIST(Twist1、Twist2)、SOCS(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7およびCIS)、PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASxおよびPIASy)、SHP(SHP-1およびSHP-2)などからなる群から選択される1つ以上の負の免疫調節因子を抑制することを含む。
【０１０８】
一実施形態において、負の免疫調節因子のインヒビターを含む組成物は、低分子干渉RNA(siRNA)、microRNA、アンチセンス核酸、リボザイム、トランスドミナントネガティブ変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチドおよび小分子からなる群から選択される。
【０１０９】
本明細書の開示に基づけば、負の免疫調節因子、例えば細胞内のサイトカインシグナル伝達調節因子のmRNAおよび/またはタンパク質レベルを低下させる1つの方法は、調節因子をコードする核酸の発現を低下または抑制することによることは当業者には明らかであろう。従って、細胞内の負の免疫調節因子のタンパク質レベルは、遺伝子発現を抑制または低下させる分子または化合物、例えばアンチセンス分子またはリボザイムを用いて低下させることもできる。
【０１１０】
アンチセンス核酸。一実施形態において、調節配列はベクターによって発現されるアンチセンス核酸配列である。アンチセンス発現ベクターは、哺乳動物細胞または哺乳動物それ自身をトランスフェクトし、それによって所望の負の免疫調節因子の内因性発現の低下を引き起こすために使用される。アンチセンス分子および遺伝子発現の抑制のためのその使用は当該分野で公知である(例えば、Cohen, 1989, Oligodeoxyribonucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press を参照のこと)。アンチセンス核酸は、特定のmRNA分子の少なくとも一部に相補的なDNAまたはRNA分子である(Weintraub, 1990, Scientific American 262:40)。細胞内では、アンチセンス核酸は対応するmRNAにハイブリダイズし、二本鎖分子を形成し、それによって遺伝子の翻訳を抑制する。
【０１１１】
遺伝子の翻訳を抑制するためのアンチセンス法の使用は当該技術分野で公知であり、例えばMarcus-Sakura(1988, Anal. Biochem. 172:289) に記載されている。米国特許第5,190,931号に教示されているように、アンチセンス分子をコードするDNAを用いる遺伝子発現により細胞にこのようなアンチセンス分子を提供し得る。
【０１１２】
あるいは、本発明のアンチセンス分子は、合成的に作成され得、次いで細胞に提供され得る。約10〜約30のアンチセンスオリゴマーが好ましく、より好ましくは約15ヌクレオチドが好ましい。なぜなら、それらは合成および標的細胞への導入が容易だからである。本発明により考えられる合成アンチセンス分子は、未修飾オリゴヌクレオチドと比較して生物活性が改善された、当該技術分野で公知のオリゴヌクレオチド誘導体を含む(米国特許第5,023,243号参照)。
【０１１３】
リボザイム。リボザイムおよび遺伝子発現の抑制のためのその使用もまた当該分野で公知である(例えば、Cech et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:17479-17482; Hampel et al., 1989, Biochemistry 28:4929-4933; Ecksteinら、国際公開番号WO92/07065;Altmanら、米国特許第5,168,053号を参照のこと)。リボザイムは、DNA制限エンドヌクレアーゼと同様に他の一本鎖RNAを特異的に切断する能力を有するRNA分子である。これらのRNAをコードするヌクレオチド配列を修飾することにより、RNA分子内の特定のヌクレオチド配列を認識し、それを切断するように分子を操作することができる(Cech, 1988, J. Amer. Med. Assn. 260:3030)。このアプローチの主な利点は、リボザイムが配列特異的であるという事実である。
【０１１４】
リボザイムには2つの基本型がある。すなわち、テトラヒメナ型(Hasselhoff, 1988, Nature 334:585) およびハンマーヘッド型である。テトラヒメナ型リボザイムは長さ4塩基の配列を認識するのに対し、ハンマーヘッド型リボザイムは長さ11〜18塩基の塩基配列を認識する。配列が長ければ長いほど、その配列が標的mRNA種のみに存在する可能性は高まる。その結果として、特定のmRNA種の不活性化にはテトラヒメナ型リボザイムよりもハンマーヘッド型リボザイムが好ましく、種々の非血縁mRNA分子内に無作為に存在しうるより短い認識配列よりも18塩基認識配列が好ましい。
【０１１５】
負の免疫調節因子の発現を抑制するのに有用なリボザイムは、所望の負の免疫調節因子のmRNA配列に相補的な基本リボザイム構造に標的配列を組み込むことにより設計することができる。所望の負の免疫調節因子を標的とするリボザイムは、市販試薬(Applied Biosystems社、カリフォルニア州フォスターシティ)を用いて合成することもできるし、それをコードするDNAから遺伝的に発現することもできる。
【０１１６】
低分子干渉RNA(siRNA)。"低分子干渉RNA"または"短い干渉RNA"または"siRNA"または"短いヘアピンRNA"または"shRNA"は、目的とする核酸配列を標的にするヌクレオチドの二本鎖RNAである。本明細書において、用語“siRNA”は、限定するものではないが、(i)二本鎖RNAポリヌクレオチド、(ii)一本鎖ポリヌクレオチドおよび(iii)1、2、3、4またはそれ以上のヌクレオチド改変または置換を有する(i)または(ii)いずれかのポリヌクレオチド、を含むすべての形態のsiRNAを含む。
【０１１７】
二本鎖ポリヌクレオチドの形態のsiRNAは、長さ約18塩基対、約19塩基対、約20塩基対、約21塩基対、約22塩基対、約23塩基対、約24塩基対、約25塩基対、約26塩基対、約27塩基対、約28塩基対、約29塩基対または約30塩基対を含む。二本鎖siRNAは、負の免疫調節因子の発現および/または活性に干渉することができる。
【０１１８】
一本鎖siRNAは、目的とする遺伝子またはポリヌクレオチドを標的にするRNAポリヌクレオチド配列の一部を含む。一本鎖siRNAは、約18ヌクレオチド、約19ヌクレオチド、約20ヌクレオチド、約21ヌクレオチド、約22ヌクレオチド、約23ヌクレオチド、約24ヌクレオチド、約25ヌクレオチド、約26ヌクレオチド、約27ヌクレオチド、約28ヌクレオチド、約29ヌクレオチド約30ヌクレオチド長のポリヌクレオチドを含む。一本鎖siRNAは、例えばA20、SUMO(SUMO1、SUMO2、SUMO3およびSUMO4)、Foxj1、Foxo3a、TWIST(Twist1、Twist2)、SOCS(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7およびCIS)、PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASxおよびPIASy)、SHP(SHP-1およびSHP-2)などの標的ポリヌクレオチドの発現および/または活性に干渉することができる。一本鎖siRNAは、相補配列にアニーリングして、負の免疫調節因子の発現および/または活性に干渉することができるdsRNAをもたらすこともできる。
【０１１９】
さらに他の側面において、siRNAは、1、2、3、4またはそれ以上のヌクレオチド改変もしくは置換を有する、二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドのいずれかを含むポリヌクレオチドを含む。
【０１２０】
siRNAポリヌクレオチドは、一般に転写後の遺伝子サイレンシング機構により生じると考えられている、RNA活性に干渉するRNA核酸分子である。siRNAポリヌクレオチドは、好ましくは二本鎖RNA(dsRNA)を含むが、それに限定されるものではなく、一本鎖RNAを含み得る(例えば、Martinez et al., 2002 Cell 110:563-74を参照のこと)。siRNAポリヌクレオチドは、他の天然に存在する、組換えもしくは合成一本鎖もしくは二本鎖ポリマーヌクレオチド(リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたは両方の組み合わせ)および/または本明細書記載のヌクレオチドアナログ(例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドなど、一般的には5'-3'ホスホジエステル結合で)を含むことができる。従って、siRNAポリヌクレオチドの転写を指示することができるDNA配列として本明細書に開示された特定の典型的な配列は、相補的ヌクレオチド塩基対形成の確立された原理を考慮すれば、対応するRNA配列およびその相補鎖を記述するものであることも明らかであろう。
【０１２１】
siRNAは、RNAポリメラーゼプロモーターのプロモーターを含む鋳型としてのDNA(ゲノムDNA、cDNAまたは合成DNA)を用いて転写され得る。例えば、プロモーターはU6プロモーターまたはH1 RNAポリメラーゼIIIプロモーターであり得る。
【０１２２】
あるいは、siRNA合成的に誘導されたRNA分子であり得る。特定の実施形態において、siRNAポリヌクレオチドは平滑末端を有し得る。特定の他の実施形態において、siRNAポリヌクレオチドの少なくとも1つの鎖は、siRNAポリヌクレオチドのいずれかの鎖の3’末端において“オーバーハング”する(すなわち、逆鎖における相補的塩基と塩基対を形成しない)少なくとも1つ、好ましくは2つのヌクレオチドを有する。本発明の好ましい実施形態において、siRNAポリヌクレオチド二本鎖の各鎖は、3’末端において2ヌクレオチドオーバーハングを有する。2ヌクレオチドオーバーハングは、好ましくはチミジンジヌクレオチド(TT)であるが、他の塩基、例えばTCジヌクレオチドもしくはTGジヌクレオチドまたは他のいずれのジヌクレオチドをも含み得る。オーバーハングジヌクレオチドは、干渉の標的であるポリヌクレオチドの配列の5’末端における2ヌクレオチドに相補的でもあり得る。siRNAポリヌクレオチドの3’末端の議論に関しては、例えばWO01/75164を参照のこと。
【０１２３】
好ましいsiRNAポリヌクレオチドは、約18〜30ヌクレオチド塩基対の二本鎖ポリヌクレオチドを含み、好ましくは約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26または約27塩基対の二本鎖ポリヌクレオチドを含み、他の好ましい実施形態において、約19、約20、約21、約22もしくは約23塩基対または約27塩基対の二本鎖ポリヌクレオチドを含み、ここで、“約”の使用は、特定の実施形態および特定の条件において、選択されたポリペプチドの発現に干渉することができる機能的siRNAポリヌクレオチドを生じることができるプロセシングの切断段階が絶対的に有効であるわけではないことを示している。従って、siRNAポリヌクレオチドは、siRNAのプロセシング、生合成または人工の合成の変異性の結果として、長さ1、2、3、またはそれ以上の塩基対が異なる(例えば、ヌクレオチド挿入または欠失によって)可能性の有る1つ以上のsiRNAポリヌクレオチド分子を含んでもよい。本発明のsiRNAポリヌクレオチドは、特定の配列から1、2、3または4ヌクレオチド異なる(例えば、挿入またはトランスバージョンを含むヌクレオチド置換により)変異性を示すポリヌクレオチド配列も含み得る。二本鎖ポリヌクレオチドのセンス鎖またはアンチセンス鎖の位置を問わず、分子の長さに応じて、特定のsiRNAポリヌクレオチド配列のいずれかのヌクレオチド位置で差異が生じうる。ヌクレオチド差異は、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖の1つにおいて見出すことができる。置換ヌクレオチドは一般的には水素結合塩基対形成を形成する相補的ヌクレオチドは、必ずしも対応して置換される必要はない。好ましい実施形態において、siRNAポリヌクレオチドは、特異的ヌクレオチド配列に関して相同である。
【０１２４】
本発明のsiRNAポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、特定の実施形態において、一般的にはスペーサー配列で分離された一本鎖オリゴヌクレオチドフラグメント(例えば、約18〜30ヌクレオチドの)およびその逆相補鎖を含む一本鎖ポリヌクレオチド由来のものであり得る。このような特定の実施形態によれば、スペーサーの切断により一本鎖オリゴヌクレオチドフラグメントおよびその逆相補鎖が生じ、それによりそれらはアニールし、場合により、一方または両方の鎖の3’末端および/またはthe5’末端から1、2、3またはそれ以上のヌクレオチドの添加または除去をもたらすさらなるプロセッシング段階を用いて、本発明の二本鎖siRNAポリヌクレオチドを形成させることができる。特定の実施形態において、スペーサーの切断、および場合によりそれに続く、一方または両方の鎖の3’末端および/またはthe5’末端から1、2、3、4またはそれ以上のヌクレオチドの添加または除去をもたらすプロセッシング段階の前では、スペーサーは、フラグメントおよびその逆相補鎖がアニールして二本鎖構造(例えば、ヘアピンポリヌクレオチドのような)を形成することが可能な長さである。従って、スペーサー配列は、二本鎖核酸にアニーリングさせるときsiRNAポリヌクレオチドを生じる2つの相補的ポリヌクレオチド配列領域間に位置する、本明細書に記載のいずれかのポリヌクレオチド配列であり得る。好ましくは、スペーサー配列は少なくとも4ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、スペーサーは5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21〜25、26〜30、31〜40、41〜50、51〜70、71〜90、91〜110、111〜150、151〜200またはそれ以上のヌクレオチドを含み得る。スペーサーによって分離された2つの相補的ヌクレオチド配列を含む単一ヌクレオチド鎖由来のsiRNAポリヌクレオチドの例は記載されている(例えば、Brummelkamp et al., 2002 Science 296:550; Paddison et al., 2002 Genes Develop. 16:948; Paul et al., 2002 Nat. Biotechnol. 20:505-508; Grabarek et al., 2003 BioTechniques 34:734-44)。
【０１２５】
ポリヌクレオチドバリアントは、siRNAポリヌクレオチドの活性を実質的に低下させない1つ以上の置換、付加、欠失、および/または挿入を含み得る。siRNAポリヌクレオチドの活性に対するヌクレオチドの中身のおけるこのようないずれかの改変の効果は、一般に本明細書の他の部分で記載のように評価され得る。バリアントは、天然のA20、SUMO(SUMO1、SUMO2、SUMO3およびSUMO4)、Foxj1、Foxo3a、TWIST(Twist1、Twist2)、SOCS(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7およびCIS)、PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASxおよびPIASy)、SHP(SHP-1およびSHP-2)などをコードするポリヌクレオチド配列の一部に対し、好ましくは、少なくとも約75%、78%、80%、85%、87%、88%または89%の同一性を示し、より好ましくは、少なくとも約90%、92%、95%、96%または97%の同一性を示す。一致率は、当業者に公知のコンピュータアルゴリズムを用いることを含むいずれかの方法を用いて、ポリヌクレオチドの配列と標的ポリヌクレオチドの対応する部分とを比較することにより容易に決定できる。これらには、AlignまたはBLASTアルゴリズムが含まれる(Altschul, 1991 J. Mol. Biol. 219:555-565; Henikoff and Henikoff, 1992, PNAS 89:10915-10919)。
【０１２６】
特定のsiRNAポリヌクレオチドバリアントは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの一部に対して実質的に相同性を示すことができる。これらのポリヌクレオチドバリアント由来の一本鎖ポリヌクレオチドは、中程度のストリンジェントな条件下で、標的ポリペプチドをコードする天然に存在するDNAまたはRNA配列にハイブリダイズすることができる。中程度のストリンジェントな条件下で、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に検出可能な程度にハイブリダイズするsiRNAポリヌクレオチドは、特定の標的ポリヌクレオチドに相補的な、少なくとも10連続ヌクレオチド、より好ましくは11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を有し得る。特定の好ましい実施形態において、このようなsiRNA配列(またはその相補鎖)は、発現に対する干渉が所望される標的ポリペプチドをコードする単一の特定のポリヌクレオチドに特異的である。特定の他の実施形態において、配列(またはその相補鎖)は、ポリペプチド発現に対する干渉が所望される標的ポリペプチドをコードする2つ以上の関連ポリヌクレオチドによって共有され得る。
【０１２７】
適切な中程度にストリンジェントな条件は、例えば、5×SSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)の溶液中でポリヌクレオチドを予洗し;50℃〜70℃、5×SSCで1〜16時間(すなわち終夜)ポリヌクレオチドをハイブリダイズし;それに続いて、0.05%〜0.1%SDSを含有する1以上の2×、0.5×および0.2×SSCのそれぞれで、22℃〜65℃において20〜40分間、1回かまたは2回ポリヌクレオチドを洗浄すること、を含む。さらなるストリンジェンシーに関しては、ハイブリダイゼーション条件は、50℃〜60℃での15〜40分間の0.1×SSCおよび0.1%SDSでのさらなる洗浄を含み得る。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの変化は、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄段階に用いられる時間、溶液の温度および/または濃度を変えることにより達成できることは、当業者には明らかであろう。適切な条件は、一部分において、用いられるプローブおよびブロットされたプロバンド核酸試料の特定のヌクレオチド配列に依存する場合もある。従って、1以上の特定のプロバンド配列にハイブリダイズし、他の特定のプロバンド配列にハイブリダイズしないその能力に基づいて、ポリヌクレオチドの所望の選択性が同定されている場合、適切にストリンジェントな条件は、過度の実験を要することなく容易に選択できることが明らかであろう。
【０１２８】
本発明の配列特異的siRNAポリヌクレオチドは、いくつかの基準の1つ以上を用いて設計し得る。例えば、目的とするポリペプチドをコードする配列と同じ約21連続ヌクレオチドを有するsiRNAポリヌクレオチドを設計するためには、ポリヌクレオチド配列のオープンリーディングフレームは、以下の特徴の1つ以上を有する約21塩基配列長に関してスキャンすることができる:(1)おおよそ1:1であるが2:1または1:2以下であるA+T/G+C比;(2)5’末端におけるAAジヌクレオチドまたはCAジヌクレオチド;(3)55℃未満の内部ヘアピンループ融解温度;(4)37℃未満のホモ二量体融解温度((3)および(4)に記載されている融解温度の計算値は、当業者に公知のコンピュータソフトウェアを用いて決定できる);(5)他のいずれの既知ポリヌクレオチド配列においても存在しないことが確認されている少なくとも16連続ヌクレオチドの配列。あるいは、siRNAポリヌクレオチド配列は、種々のベンダーから市販されているコンピュータソフトウェア、例えば、OligoEngine(登録商標)(ワシントン州シアトル);Dharmacon社(コロラド州ラファイエット);Ambion社(テキサス州オースティン);およびQIAGEN社(カリフォルニア州バレンシア)を用いて設計および選択し得る。 Elbashir et al., 2000 Genes & Development 15:188-200; Elbashir et al., 2001 Nature 411:494-98 もまた参照のこと。次いで、当該技術分野で公知であり、本明細書の他の部分に記載されている方法に従って、標的ポリペプチドの発現に干渉する能力に関してsiRNAポリヌクレオチドを試験し得る。siRNAポリヌクレオチドの有効性の決定は、標的ポリペプチドの発現に干渉するその能力の考察ばかりでなく、siRNAポリヌクレオチドが宿主細胞に対して毒性を有するかどうかも含む。例えば、望ましいsiRNAは、RNA干渉活性を示すとともに好ましくない生物学的結果を示さないことが考えられる。好ましくない生物学的結果の例は、宿主細胞へのsiRNAの導入の結果としての細胞死が所望されない場合の細胞のアポトーシスである。
【０１２９】
本開示に基づけば、当然のことながら、siRNAは、標的ポリペプチド発現のサイレンシングを種々の程度にもたらし得る。従って、まずsiRNAは、その効果について試験する必要がある。所定のsiRNAが標的ポリペプチドの発現に干渉するか、またはそれを調節する能力に基づいてsiRNAの選択がなされる。従って、所望の標的ポリペプチドの発現に干渉することができる特定のsiRNAポリヌクレオチド配列の同定には、各siRNAの産生および試験を必要とする。各siRNAの試験方法および本発明に使用する適切なsiRNAの選択については、実施例においてさらに詳しく説明する。タンパク質発現に干渉するsiRNAがすべて生理学的に重要であるとは限らないので、本開示は、本発明のsiRNAを用いる標的タンパク質発現の干渉レベルが臨床的な重要性を有するかどうかを決定するための種々の生理学的に重要なアッセイもまた示す。
【０１３０】
遺伝コードの縮重の結果として、多くの異なるヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者には明らかであろう。すなわち、アミノ酸はいくつかの異なるコドンの1つによってコードされ得、ある特定のヌクレオチド配列が他のヌクレオチド配列とは異なるのに、そのポリヌクレオチドは、実際上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることがあることを、当業者は容易に決定できる。コドン使用頻度の差異により異なるポリヌクレオチドは、本発明により、本質的にそのようなものとして考えられる。
【０１３１】
本明細書において、標的ポリペプチド発現に干渉するのに有用な多くの特定のsiRNAポリヌクレオチド配列が提供される。siRNAポリヌクレオチドは、一般に、例えば、固相化学合成を含む当該技術分野で公知のいずれの方法でも調製され得る。標準的な変異誘発技術、例えばオリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発を用いて、ポリヌクレオチド配列における修飾を導入することもできる。さらにまた、siRNAは、その安定性および/または送達特性を改善するために、化学修飾することもでき、他の分子と結合させることもできる。本発明の1側面は、1つ以上のリボース糖が除去された本明細書記載のsiRNAを含む。
【０１３２】
あるいは、siRNAポリヌクレオチド分子は、DNAが適切なRNAポリメラーゼプロモーター(例えば、T7、U6、H1またはSP6など、ただし他のプロモーターも同様に有用であり得る)を有するベクターに組み込まれるとの条件で、適切なDNA配列(例えば、標的ポリペプチドまたはその所望の部分をコードするポリヌクレオチド配列)のin vitroまたはin vivo転写によっても作成し得る。さらに、in vivoで所望のsiRNAを作成するために、siRNAポリヌクレオチドは、転写(および場合により適切なプロセッシング段階)を助けるDNA配列(例えば、本明細書に記載の組換え核酸構築物)として、哺乳動物に投与され得る。
【０１３３】
一実施形態において、siRNAポリヌクレオチドであって、標的ポリペプチドの発現に干渉することができる前記siRNAポリヌクレオチドを、サイレンシングした細胞を作成するために使用できる。細胞内で発現するか、または細胞と接触するとき、標的ポリペプチドの発現の有意な低下をもたらすいずれかのsiRNAポリヌクレオチドを本発明は含む。siRNAの非存在下で検出される標的ポリペプチドの発現レベルに対して、好ましくは、低下は約10%を超え、より好ましくは約20%を超え、より好ましくは約30%を超え、より好ましくは約40%、約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%または約98%を超える。好ましくは、細胞におけるsiRNAポリヌクレオチドの存在は、アポトーシスがRNA干渉の所望の効果ではない場合のアポトーシスまたは細胞死などの望ましくない毒作用を何ら引き起こさず、またその原因にならない。
【０１３４】
他の実施形態において、siRNAポリヌクレオチドは、細胞内で発現するか、または細胞と接触するとき、標的ポリペプチドの発現に有意な低下をもたらす。siRNAの非存在下で検出される標的ポリペプチドの発現レベルに対して、好ましくは低下は約10%〜20%であり、より好ましくは約20%〜30%であり、より好ましくは約30%〜40%であり、より好ましくは約40%〜50%であり、より好ましくは約50%〜60%であり、より好ましくは約60%〜70%であり、より好ましくは約70%〜80%であり、より好ましくは約80%〜90%であり、より好ましくは約90%〜95%であり、より好ましくは約95%〜98%である。好ましくは、細胞におけるsiRNAポリヌクレオチドの存在は、望ましくない毒作用を何ら引き起こさず、またその原因にならない。
【０１３５】
さらに他の実施形態において、siRNAポリヌクレオチドは、細胞内で発現するか、または細胞と接触するとき、標的ポリペプチドの発現に有意な低下をもたらす。siRNAの非存在下で検出される標的ポリペプチドの発現レベルに対して、好ましくは低下は約10%以上であり、より好ましくは約20%以上であり、より好ましくは約30%以上であり、より好ましくは約40%以上であり、より好ましくは約50%以上であり、より好ましくは約60%以上であり、より好ましくは約70%以上であり、より好ましくは約80%以上であり、より好ましくは約90%以上であり、より好ましくは約95%以上であり、より好ましくは約98%以上である。好ましくは、細胞におけるsiRNAポリヌクレオチドの存在は、望ましくない毒作用を何ら引き起こさず、またその原因にならない。
【０１３６】
そのようなものとして、本発明は、siRNAポリヌクレオチド、例えば表6の配列番号5〜160において例示されるsiRNAを含む。配列番号5〜7は、SOCS1のhumsiRNA候補の配列である。配列番号8〜13、14〜19、20〜25、26〜31および32〜37は、PIAS1、PIAS3、PIASx、PIASyおよびSHP-1のhumsiRNA候補配列の配列である。A20、SUMO1、SUMO2、SUMO3、SUMO4、Twist-1、Twist-2、Foxj1およびFoxo3aの標的配列の例は、それぞれ、配列番号38〜59、60〜67、68〜80、81〜87、88〜103、104〜111、112〜124、125〜136および137〜160で例示される。
【０１３７】
【表５−１】
2011505144.tif 000008
【表５−２】
2011505144.tif 000009
【表５−３】
2011505144.tif 000010
【表５−４】
2011505144.tif 000011
【０１３８】
本発明のsiRNAポリヌクレオチドの作成後に、siRNAポリヌクレオチドは、治療化合物としてのsiRNAを改善するために修飾できる特定の特性を有することは、当業者には明らかであろう。従って、siRNAポリヌクレオチドはさらに、ホスホロチオアートまたは他の結合、メチルホスホナート、スルホン、スルファート、ケチル、ホスホロジチオアート、ホスホルアミダート、リン酸エステルなどを含むように修飾することにより、分解に耐えるように設計され得る(例えば、Agrwal et al., 1987 Tetrahedron Lett. 28:3539-3542; Stec et al., 1985 Tetrahedron Lett. 26:2191-2194; Moody et al., 1989 Nucleic Acids Res. 12:4769-4782; Eckstein, 1989 Trends Biol. Sci. 14:97-100; Stein, In: Oligodeoxynucleotides. Antisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, ed., Macmillan Press, London, pp. 97-117 (1989) を参照のこと)。
【０１３９】
本発明のポリヌクレオチドはいずれも、in vivoでのその安定性を高めるために、さらに修飾することができる。可能な修飾は、限定するものではないが、5'および/または3’末端における隣接配列の付加;主鎖におけるホスホジエステル結合よりもホスホロチオアートまたは2'O-メチルの使用;ならびに/またはイノシン、ケオシンおよびウィブトシンなどの非在来塩基の包含に加えて、アデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンのアセチル-メチル-、チオ-および他の修飾体も含む。
【０１４０】
本発明の組成物に有用な抗原
本発明は、限定するものではないが、タンパク質、cDNAまたはmRNAの形態で全抗原をAPCに負荷することを含む、APCをパルスする種々の方法を含む。しかしながら、本発明は、APCのパルスに用いる抗原の特定の形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、本発明は、抗原負荷APCを作成するための当該技術分野で公知の他の方法を含む。APCは、所定の抗原をコードするmRNAでトランスフェクトされ得る。配列が既知の遺伝子産物に対応するmRNAは、適切なプライマーおよび転写反応と組み合わせた逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いてin vitroで迅速に作成することができる。mRNAを用いるAPCのトランスフェクションは、パルスしたAPCの作成に関して、他の抗原負荷技術に比べて利点を提供する。例えば、微小量の組織、すなわち腫瘍組織からのRNAを増幅する能力は、多数の患者へのワクチン接種のためのAPCの使用を広げる。
【０１４１】
抗原は、ウイルス、真菌または細菌に由来し得る。抗原は、自己抗原、又は感染症、癌、自己免疫疾患からなる群から選択される疾患と関連する抗原であり得る。さらにまた、別々か、または融合タンパク質としてかのいずれかで、複数の抗原を同時に提供し得る。
【０１４２】
抗原組成物がワクチンとして有用であるためには、その抗原組成物が細胞、組織または哺乳動物(例えば、ヒト)において抗原に対する免疫反応を誘導しなければならない。特定の実施形態において、抗原組成物は、本明細書に記載のいずれの抗原またはその免疫学的機能的等価物の全部または一部を含むかまたはコードする。特定の実施形態において、抗原組成物は、HLAアンカーモチーフアミノ酸に結合されているかまたはそれを含む。
【０１４３】
一実施形態において、抗原組成物は2種以上の抗原の融合タンパク質であり得る。融合タンパク質は、細胞に導入される発現ベクターによりコードされてもよいし、細胞に直接に接触されてもよい。融合タンパク質が発現ベクターによりコードされる場合、各抗原をコードするポリヌクレオチドセグメントは、mRNAの翻訳により融合タンパク質が産生されるように機能的に連結される。場合により、スペーサーをコードする配列により2つのセグメントが分離される。特定の実施形態において、抗原組成物は、ドミナントネガティブサバイビン変異体およびMUC1フラグメントを融合タンパク質内に一緒にして含む。
【０１４４】
本発明の抗原組成物は、固相合成による化学合成および、化学反応の他の産物からのHPLCによる精製または、in vitro翻訳系もしくは生細胞における、本発明の抗原を含むペプチドもしくはポリペプチドをコードする核酸配列(例えば、DNA配列)の発現による産生を含むが限定されない当該分野で公知の方法によって作成し得ることが理解される。さらに、抗原組成物は、生体試料から単離された細胞成分を含むことができる。好ましくは、抗原組成物は1つ以上の望ましくない低分子量分子を除去するために単離され十分に透析される、および/またはより調法な製剤のために所望のビヒクル中で凍結乾燥される。ワクチン成分において行われるアミノ酸付加、変異、化学修飾などは、たとえあるとしても、好ましくはそのエピトープ配列の抗体認識に実質的に干渉しないことが更に理解される。
【０１４５】
本発明の1つ以上の抗原決定基に対応するペプチドまたはポリペプチドは、一般に少なくとも長さ5または6アミノ酸残基である必要があり、最大約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45または約50残基ほどを含み得る。ペプチド配列は、当業者に公知の方法、例えば自動ペプチド合成機械、例えばApplied Biosystems社(カリフォルニア州フォスターシティー)から入手できるものを用いるペプチド合成によって合成され得る。
【０１４６】
組換え法などによって、より長いペプチドまたはポリペプチドを調製し得る。特定の実施形態において、例えば、本発明の種々の組成物および方法のための抗原組成物をin vitroまたはin vivoで作成するために、本明細書記載の抗原組成物および/または成分をコードする核酸を用いることができる。例えば、特定の実施形態において、抗原をコードする核酸は、例えば、組換え細胞内のベクターに含まれる。この核酸は、発現されて、抗原配列を含むペプチドまたはポリペプチドを産生し得る。このペプチドまたはポリペプチドは、細胞から分泌されてもよいし、細胞内の一部として含まれてもよい。
【０１４７】
特定の実施形態において、抗原をコードする核酸で哺乳動物をトランスフェクトまたは接種することによって、免疫反応を促進し得る。次いで、標的哺乳動物に含まれた1つ以上の細胞が、哺乳動物への核酸の投与後に、核酸によりコードされる配列を発現する。ワクチンは、例えば、抗原のペプチドまたはポリペプチド配列の全部または一部をコードする核酸(例えば、cDNAまたはRNA)の形態であり得る。核酸によるin vivo発現は、例えば、プラスミド型ベクター、ウイルスベクターまたはウイルス/プラスミド構築物ベクターによるものであり得る。
【０１４８】
好ましい側面において、核酸は、適切な抗原またはその免疫学的機能的等価物をコードする配列の全部または一部をコードするコード領域を含む。もちろん、核酸は、1つ以上の免疫調節剤またはアジュバントを含む配列を含むが限定されないさらなる配列を含み得るおよび/またはコードし得る。
【０１４９】
腫瘍関連抗原。本発明に関連して、“腫瘍抗原”または“過剰増殖性疾患抗原”または“過剰増殖性疾患と関連する抗原”は、特定の過剰増殖性疾患に共通な抗原を指す。特定の側面において、本発明の腫瘍関連抗原は、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、胃癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頚癌、膀胱癌、腎癌ならびに、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などの腺癌を含むが限定されない癌由来である。
【０１５０】
一実施形態において、本発明の腫瘍抗原は、哺乳動物の癌腫瘍由来の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)によって免疫学的に認識される1つ以上の抗原性癌エピトープを含む。腫瘍ワクチン接種のために、ますます多くのTAAが同定されている。理想的なTAAは、腫瘍細胞において強く発現されていなければならないが、正常細胞ではそうではなく、かつ腫瘍細胞の生存に必須でなければならない。アポトーシス阻害タンパク質(IAP)遺伝子ファミリーのメンバーであるサバイビンは、肺、結腸、膵臓、前立腺、乳房、胃などの腫瘍を含むヒト癌の大部分において強く発現されているが、大部分の正常組織においては多くは検出されないことが見出されている。ヒト正常および癌組織のヒトトランスクリプトームの分析において、サバイビンは、正常組織と比較して通常のヒト癌組織において4番目に高い示差発現遺伝子として同定されている。さらに、サバイビンにおけるMHC-拘束性エピトープが同定され、いくつかの臨床試験は、マウスおよび癌患者において、抗腫瘍免疫反応を誘導するサバイビンの免疫原性を明らかにしている。
【０１５１】
また、一般に、腫瘍ワクチンに関して、複数のTAAのターゲッティングは、1つのTAAのターゲッティングよりも有効であると考えられている。一実施形態において、MUC1は、サバイビンと組み合わせて使用するための、DCワクチンの第2免疫原として選択できる。MUC1は、通常管上皮の頂面上に発現される、細胞外縦列反復配列ドメイン(TRD)を有する高度にグリコシル化された膜貫通タンパク質である。TRDは、20アミノ酸配列からなる可変数(20〜100)の反復配列で構成される。MUC1は、T細胞エピトープを露出する異常な低グリコシル化体で、肺、前立腺、胃および大腸癌腫を含む種々の上皮性悪性腫瘍において広く過剰発現されている。MUC1は腫瘍細胞の表面に発現され、これは抗体媒介性腫瘍破壊のための抗体によって認識することができる。従って、2つのTAAサバイビンおよびMUC1を標的とする本発明のワクチン組成物は、限定するものではないが、肺、前立腺、胃、膵臓、乳および大腸癌を含む種々のタイプのヒト癌の治療に広く使用することができる。
【０１５２】
本発明の他の実施形態は、他のTAAを使用し得る。悪性腫瘍は、免疫攻撃の標的抗原として役立つことができる多くのタンパク質を発現する。これらの分子は、限定するものではないが黒色腫におけるMART-1、チロシナーゼおよびGP100などの組織特異抗原ならびに前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)および前立腺特異抗原(PSA)を含む。他の標的分子は、癌遺伝子HER-2/Neu/ErbB-2などの形質転換関連分子群に属する。さらに他の標的抗原群は、癌胎児性抗原(CEA)などの癌胎児抗原である。B細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個別の腫瘍に特有な、真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。CD19、CD20およびCD37などのB細胞分化抗原は、B細胞リンパ腫における標的抗原の他の候補である。これらの抗原の一部(CEA、HER-2、CD19、CD20、イディオタイプ)は、モノクローナル抗体を用いる受動免疫療法の標的として用いられてきたが、その成功は限定的だった。
【０１５３】
腫瘍抗原およびその抗原癌エピトープは、一次臨床分離株、細胞株などの自然源から精製され単離され得る。癌ペプチドおよびその抗原エピトープは、当該技術分野で公知の化学合成または組換えDNA技術によっても得ることができる。
【０１５４】
微生物抗原。微生物抗原は、ウイルス、細菌または真菌起源であり得る。感染性ウイルスの例は:レトロウイルス科(Retroviridae)(例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えばHIV-1(とも呼ばれるHTLV-III、LAVもしくは-HTLV-III/LAVまたはHIV-III;および他の分離株、例えばHIV-LP;ピコルナウイルス科(Picornaviridae)(例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス;エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス);カリシウイルス科(Calciviridae)(例えば、胃腸炎を引き起こす株);トガウイルス科(Togaviridae)(例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス);フラビウイルス科(Flaviridae)(例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス);コロナウイルス科(Coronaviridae)(例えば、コロナウイルス);ラブドウイルス科(Rhabdoviridae)(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス);フィロウイルス科(Filoviridae)(例えば、エボラウイルス);パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)(例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、RSウイルス);オルトミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)(例えば、インフルエンザウイルス);ブニヤウイルス科(Bungaviridae)(例えば、ハンタウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス);アレナウイルス科(Arena viridae)(出血熱ウイルス);レオウイルス科(Reoviridae)(例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス);ビルナウイルス科(Birnaviridae);ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)(B型肝炎ウイルス);パルボウイルス科(Parvovirida)(パルボウイルス);パポーバウイルス科(Papovaviridae)(乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス);Adenoviridae(mostアデノウイルス);Herpesviridae(単純ヘルペスウイルス(HSV)1および2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス);ポックスウイルス科(Poxviridae)(痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス);およびイリドウイルス科(Iridoviridae)(例えば、アフリカブタコレラウイルス);ならびに未分類ウイルス(例えば、牛海綿状脳症の病原体、デルタ型肝炎の病原体(B型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられている)、非A非B型肝炎の病原体(クラス1=内部感染;クラス2=非経口感染(すなわち、C型肝炎);ノーウォークウイルスおよび関連ウイルスならびにアストロウイルス)を含む。
【０１５５】
感染細菌の例は、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pyloris)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borelia burgdorferi)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella peneumophilia)、マイコバクテリア種(Mycobacteria sps)(例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(M.tuberculosis)、マイコバクテリウム・アビウム(M.avium)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(M.intracellulare)、マイコバクテリウム・カンサシ(M.kansasii)、マイコバクテリウム・ゴルドナエ(M.gordonae))、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ナイセリア・ゴノロエエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)(A群連鎖球菌)、ストレプトコッカスアガラクチエ(Streptococcus agalactiae)(B群連鎖球菌)、緑色連鎖球菌(Streptococcus(viridans group))、ストレプトコッカス・フェーカリス(Streptococcus faecalis)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)((嫌気性種)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、病原性カンピロバクター属(Campylobacter)種、エンテロコッカス属(Enterococcus)種、ヘモフィラス・インフルエンザエ(Haemophilus influenzae)、バシラス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)種、エリシペロスリクス・ルシオパシエ(Erysipelothrix rhusiopathiae)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasturella multocida)、バクテロイデス属(Bacteroides)種、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、ストレプトバシルス・モニリホルミス(Streptobacillus moniliformis)、トレポネーマ属(Treponema)、トレポネーマ・ペルテヌエ(Treponema pertenue)、レプトスピラ属(Leptospira)およびアクチノマイセス・イスラエリ(Actinomyces israelli)を含む。
【０１５６】
感染性真菌の例は:クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラスマカプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)、ブラストミセス・デルマチチディス(Blastomyces dermatitidis)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、カンジダアルビカンス(Candida albicans)を含む。他の感染性生物(すなわち、原生生物)は:プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)およびトキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii)を含む。
【０１５７】
本発明の炎症誘発性分子
本発明のワクチン組成物は、さらに、炎症誘発性分子をコードするポリヌクレオチドを含む。Toll様受容体(TLR)アゴニストまたはサイトカインなどの炎症誘発性分子は、炎症誘発性シグナル伝達カスケードを刺激する。一実施形態において、TLRリガンドまたは炎症性サイトカインをコードするポリヌクレオチドが提供される。理論に拘束されることを望まないが、DCは、リポ多糖(LPS)、フラジェリン、非メチル化細菌DNA(CpG)およびRNAなどの保存された微生物構造を認識するためにTLRなどのパターン認識受容体(PRR)を用いる。TLRシグナル伝達は、NF-κBおよびMAPキナーゼを活性化することによりDCの成熟を促進し、次いでそれが、MHC分子および共刺激分子を含む数百の炎症誘発性遺伝子ならびに多数の炎症性サイトカインのアップレギュレーションを媒介し、自然免疫および獲得免疫の誘導をもたらす。次いで成熟DCは所属リンパ節に遊走し、そこにおいてこの細胞は、T細胞活性化の免疫シナプスの形成によりT細胞との接触を確立する。
【０１５８】
負の免疫調節因子インヒビターとの組み合わせに用いるために利用できる、炎症性サイトカイン、ケモカインおよびTLRアゴニストなどの種々の免疫刺激物質がある。一実施形態において、炎症誘発性分子はフラジェリンなどのTLRアゴニストである。TLR5リガンドであるフラジェリンは、細菌の鞭毛の構造タンパク質サブユニットであり、NF-κBの活性化を引き起こすことによる強力な免疫調節作用を有する。さらに、TLR5シグナル伝達は、フラジェリンとの表面相互作用を必要とするため、その刺激活性を最大化するために、フラジェリン遺伝子は、オートクリンおよびパラクリンの形での分泌およびそれに続くDC上の表面TLR5への結合のためのシグナルリーダー配列に作動可能に連結され得る。他の実施形態において、サイトカインを用い得る。サイトカインは、免疫細胞の活性化、増殖および分化の調節に関与する。
【０１５９】
本発明のワクチン組成物の製造
いくつかの側面において、本発明は、負の免疫調節因子インヒビター、1つ以上の抗原および炎症誘発性分子を含む核酸の発現を提供する。いずれの場合にも、これらは、核酸によりコードされるタンパク質またはRNA分子の発現を核酸が指示できるようにプロモーター/調節配列を含む核酸に作動可能に連結された単離された核酸として提供され得る。従って、本発明は、例えば、 Sambrookら(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)および Ausubelら(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) に記載されているような、細胞へ外因性DNAを導入し、同時に細胞内で外因性DNAを発現させるための発現ベクターおよび方法を含む。
【０１６０】
一実施形態において、本発明はsiRNAポリヌクレオチドを含むベクターを含む。好ましくは、siRNAポリヌクレオチドは、A20、SUMO(SUMO1、SUMO2、SUMO3およびSUMO4)、Foxj1、Foxo3a、TWIST(Twist1、Twist2)、SOCS(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7およびCIS)、PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASxおよびPIASy)、SHP(SHP-1およびSHP-2)またはそれらの組み合わせからなる群から選択される標的ポリペプチドの発現を抑制することができる。所望のポリヌクレオチドのベクターへの組み込みおよびベクターの選択は当該分野で公知であり、例えばSambrookら(前出)およびAusubelら(前出)に記載されている。
【０１６１】
本発明のポリヌクレオチドは、多くのタイプのベクターにクローニングすることができる。しかしながら、本発明は特定のベクターに限定されると解釈されるべきではない。むしろ、本発明は、容易に入手できるおよび/または当該分野で公知の、ありあまるほどのベクターを含むと解釈されるべきである。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、限定するものではないがプラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドを含むベクターにクローニングすることができる。特に興味があるベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ作成ベクターおよび配列決定ベクターを含む。
【０１６２】
特定の実施形態において、発現ベクターはウイルスベクター、細菌ベクターおよび哺乳動物細胞ベクターからなる群から選択される。上記の組成物の少なくとも一部または全部を含む多数の発現ベクター系が存在する。ポリヌクレオチドまたはその同種ポリペプチドを産生するために、本発明での使用に原核生物および/または真核細胞ベクターベースの系を用いることができる。このような系の多くは市販されており、広く利用可能である。
【０１６３】
さらにまた、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に投与することができる。ウイルスベクター技術は当該分野で公知であり、例えばSambrookら(2001)およびAusubelら(1997)ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、限定するものではないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスを含む。一般に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物において機能しうる複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位および1つ以上の選択マーカーを含む(例えば、WO01/96584;WO01/29058;および米国特許第6,326,193号を参照のこと。
【０１６４】
本発明のポリヌクレオチドの発現のために、各プロモーターにおける少なくとも1つのモジュールがRNA合成の開始点を位置づける機能を果たしている。最もよく知られているこの例はTATAボックスであるが、TATAボックスを欠くいくつかのプロモーター、例えば哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびSV40遺伝子のプロモーターにおいては、開始点自体の上に重なる別々の領域は開始位置の固定に役立っている。
【０１６５】
さらなるプロモーター配列、すなわちエンハンサーは、転写開始に頻度を調節する。一般的には、これらは開始点の30〜110bp上流の領域に位置するが、最近、いくつかのプロモーターが開始点の下流に機能領域を含むことが示された。プロモーター配列間のスペースは、しばしば融通がきき、従って領域が逆位であるか、または互いに対して移動している場合もプロモーター機能は失われない。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターにおいては、活性が低下し始めるプロモーター配列間のスペースは、50bp離れるまで増加している。プロモーターに応じて、個別の領域は独立してまたは協力して転写の活性化に機能できると思われる。
【０１６６】
プロモーターは、コードセグメントおよび/またはエクソンの上流に位置する5'非コード配列を分離することにより得ることができる、遺伝子またはポリヌクレオチド配列に天然に関連するものであり得る。このようなプロモーターを“内因性”と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流化または上流のいずれかに位置するポリヌクレオチド配列と天然に関連するものであり得る。あるいは、コードポリヌクレオチドセグメントを、その自然環境において通常はポリヌクレオチド配列と関連しないプロモーターを意味する組換えまたは異種プロモーターの調節下に配置することにより一定の利点が得られる。同様に、組換えまたは異種エンハンサーは、その自然環境において通常ポリヌクレオチド配列と関連しないエンハンサーを意味する。このようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーおよびいずれかの他の原核細胞、ウイルスまたは真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサーおよび“天然に存在する”ものでない、すなわち異なる転写調節領域の異なる領域および/または発現を変化させる変異を含むプロモーターまたはエンハンサーを含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に製造することに加えて、本明細書に開示された組成物に関して、PCRを含む組換えクローニングおよび/または核酸増幅技術を用いて配列を製造し得る(米国特許第4,683,202号、米国特許第5,928,906号)。さらにまた、ミトコンドリア、葉緑体などの非核細胞小器官内の配列の転写および/または発現を指示する調節配列を使用することができることもまた考えられる。
【０１６７】
当然、発現のために選択した細胞型、細胞小器官、および生物において、DNAセグメントの発現を効率的に支持するプロモーターおよび/またはエンハンサーを用いることが重要である。分子生物学の当業者は、一般にタンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせの使用法を知っている。例えば、Sambrookら(2001年)を参照のこと。用いられるプロモーターは、構成的、組織特異的、誘導性であり得、かつ/または組換えタンパク質および/またはペプチドの大規模産生に有利である、導入されたDNAセグメントの高濃度の発現を指示する適切な条件下で有用であり得る。プロモーターは、異種でも内因性でもあり得る。
【０１６８】
本明細書に記載の実験例に例示されたプロモーター配列は前初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能的に連結されたいずれかのポリヌクレオチド配列の高濃度の発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、限定するものではないが、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)長端末反復(LTR)プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、EBウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターに加えてヒト遺伝子プロモーター、例えば限定するものではないがアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよび筋肉クレアチンプロモーターを含む他の構成的プロモーター配列もまた使用し得る。さらにまた、本発明は構成的プロモーターの使用に限定されてはならない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として考えられる。本発明における誘導性プロモーターの使用は、それが機能的に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を、このような発現が所望されている場合オンにし、発現が所望されていない場合オフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例は、限定するものではないが、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターを含む。さらにまた、本発明は、そのプロモーターが所望の組織においてのみ活性である組織特異的プロモーターの使用を含む。組織特異的プロモーターは当該分野で公知であり、限定するものではないが、HER-2プロモーターおよびPSA関連プロモーター配列を含む。
【０１６９】
本発明のポリヌクレオチドの発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含むことにより、ウイルスベクターによりトランスフェクトまたは感染されるように試みた細胞の集団からの発現細胞の同定および選択を容易にすることができる。他の実施形態において、選択マーカーは、DNAの別々の断片に含ませ、同時トランスフェクション手順で用い得る。選択マーカーおよびレポーター遺伝子の両方を適切な調節配列に隣接させ、宿主細胞内での発現を可能にすることができる。有用な選択マーカーは当該技術分野で公知であり、例えばneoなどの抗生物質耐性遺伝子を含む。
【０１７０】
トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定し、調節配列の機能性を評価するためにレポーター遺伝子が用いられる。アッセイの容易なタンパク質をコードするレポーター遺伝子は当該分野で公知である。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織内に存在しないかまたはそこで発現されず、かつその発現が酵素活性などの容易に検出できる性質によって明らかにされるタンパク質をコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、レシピエント細胞にDNAが導入されてから適切な時間後にアッセイされる。
【０１７１】
適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子または緑色蛍光タンパク質遺伝子を含み得る(例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Lett. 479:79-82)。適切な発現系は公知であり、公知の技術を用いて製造することもできるし、商業的に入手することもできる。唯一の内部制限部位を用いて、または唯一でない制限部位の部分消化により内部欠失構築物を製造し得る。次いで、高濃度のsiRNAポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドの発現を示す細胞に構築物をトランスフェクトし得る。一般に、レポーター遺伝子の最高の発現レベルを示す、最小5'隣接領域を有する構築物がプロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に結合させ、プロモーターに駆動される転写を調節する薬剤の能力を評価するために用いることができる。
【０１７２】
ワクチンおよびアジュバント組成物の使用
サイレンシングし活性化した免疫細胞の作成
一実施形態において、本発明は、細胞内へ負の免疫調節因子インヒビター、炎症誘発性分子、および場合により抗原を発現する細胞系を提供する。この細胞系は、細胞ならびに、インヒビター、炎症誘発性分子および抗原を発現するための1つ以上の発現ベクターを含む。インヒビターを含む細胞は、“サイレンシングした”といわれ、インヒビターでそのようにサイレンシングし、それ以外では同一の細胞と比較して高められた免疫力を有する。
【０１７３】
本発明は、負の免疫調節因子インヒビターを含む細胞を含む。一側面において、インヒビターは、以下:A20、SUMO(SUMO1、SUMO2、SUMO3およびSUMO4)、Foxj1、Foxo3a、TWIST(Twist1、Twist2)、SOCS(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7、およびCIS)、PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASxおよびPIASy)、SHP(SHP-1およびSHP-2)などの少なくとも1つを抑制することができる。一側面において、細胞は、インヒビターをコードするポリヌクレオチドを含むベクターでトランスフェクトされることができる。ポリヌクレオチドは、細胞に組み込まれる必要がない。他の側面において、細胞はベクターでトランスフェクトされる必要は全くなく、むしろ、細胞はベクターから発現されなかったインヒビターに暴露される。このようなインヒビターの例は、化学合成したsiRNAである。
【０１７４】
本発明は、さらに、抗原に暴露するかまたは抗原で“パルスし”、抗原で活性化した細胞を含む。例えば、APCはin vitroでAg-負荷になり得、例えば抗原の存在下ex vivoで培養することにより、あるいはin vivoで抗原への暴露によりAg-負荷になり得る。
【０１７５】
APCは、APCの表面への抗原の提示を促進するのに十分な時間APCを抗原に暴露する方法で“パルスする”ことができることも、当業者は容易に理解するであろう。例えばAPCは、抗原を抗原ペプチドとして知られる小ペプチドフラグメントの形態で暴露して、APCの外側に直接に“パルスする”ことができ(Mehta-Damaniら(1994年))、あるいはAPCは、全タンパク質またはタンパク質粒子と共にインキュベートすることができ、次いでそれがAPCで消化される。これらの全タンパク質はAPCによって小ペプチドフラグメントに消化され、最終的にAPC表面に運ばれ、そこで提示される(Cohenら(1994年))。ペプチド形の抗原は、本明細書記載の標準的な“パルシング”技術で細胞に暴露することができる。
【０１７６】
本発明の他の実施形態において、APCは、APCによる特定のタンパク質の発現を可能にするベクターでトランスフェクトされることができる。次いで、APCにより発現されたタンパク質は、プロセシングされ、細胞表面のMHC受容体上に提示される。次いで、トランスフェクトされたAPCを、ベクターによりコードされるタンパク質に対する免疫反応を生じさせる免疫原性組成物として使用し得る。
【０１７７】
特定の理論に拘束されることを望まないが、異種抗原または自己抗原の形態での抗原は、抗原の免疫原生の形態を保持するために、本発明のAPCによってプロセシングされる。抗原の免疫原生の形態は、免疫細胞、例えばT細胞により認識され、それを刺激することができる抗原の形態を作成するための、断片化による抗原の断片化によるプロセシングを意味する。好ましくは、このような異種抗原または自己抗原は、APCによりペプチドにプロセシングされたタンパク質である。APCにより生成される関連性のあるペプチドは、免疫原性組成物として使用するために抽出され精製され得る。APCによりプロセシングされたペプチドは、APCによってプロセシングされたタンパク質に対して寛容を誘導するために使用することもできる。
【０１７８】
自己免疫疾患は、自己抗原、すなわち個体内に存在するまたは内因性である自己抗原としても知られる“自己タンパク質”に対する免疫反応により生じると考えられている。自己免疫反応において、これらの“自己タンパク質”はT細胞に提示され、それによりT細胞が“自己反応性”になる。本発明の方法によれば、APCは抗原でパルスされて関連性のある“自己ペプチド”を生じる。MHC産物は高度に多型性であり、各MHC分子は異なるペプチドフラグメントに結合すると考えられるので、関連性のある自己ペプチドはそれぞれ異なっている。次いで、“自己ペプチド”およびサイトカインシグナルのインヒビターのアゴニストを、競合ペプチドの設計または、治療を必要とする個体における自己タンパク質に対する寛容の誘導のために用いることができる。
【０１７９】
本発明の“パルスしたAPC”としても知られる抗原活性化APCは、in vitroまたはin vivoのいずれかで、抗原へのAPCの暴露により作成される。in vitroでAPCをパルスする場合には、APCを培養皿にプレーティングし、十分な量の抗原に十分な時間暴露して、抗原をAPCに結合させる。APCへの抗原の結合を達成するのに必要な量および時間は、当該技術分野で公知の方法を用いて決定し得るが、さもなければ本明細書に開示されている。当業者に公知の他の方法、例えばイムノアッセイまたは結合アッセイを、抗原への暴露後のAPC上の抗原の存在を検出するために用いることができる。
【０１８０】
発現ベクターに関連しては、当該技術分野のいずれの方法によっても、宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞または昆虫細胞にベクターを容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段で宿主細胞に導入することができる。本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターの導入により、負の免疫調節因子に関してサイレンシングした細胞を与えることは明らかであろう。
【０１８１】
宿主細胞へポリヌクレオチドを導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび/または外因性核酸を含む細胞の作成方法は当該分野で公知である。例えば、Sambrookら(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) およびAusubelら(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) を参照のこと。
【０１８２】
目的とするポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入する生物学的方法は、DNAおよびRNAベクターの使用を含む。ウイルスベクターおよび特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞の遺伝子の挿入に最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第5,350,674および第5,585,362号を参照のこと。
【０１８３】
宿主細胞へポリヌクレオチドを導入する化学的手段は、コロイド分散系(例えば高分子複合体)、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに脂質ベース系、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含む水中油型エマルジョンを含む。in vitroおよびin vivoで送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系は、リポソーム(すなわち、人工の膜小胞)である。このような系の製造および使用は当該分野で公知である。
【０１８４】
宿主細胞へ外因性核酸を導入するために使用する方法あるいは本発明のインヒビターを細胞に暴露するために使用する方法の如何を問わず、宿主細胞内の組換えDNA配列の存在を確認するために種々のアッセイを行うことができる。このようなアッセイは、例えば、当業者に公知の“分子生物学的”アッセイ、例えばサザンブロット法、ノーザンブロット法、RT-PCRおよびPCR;“生化学的”アッセイ、例えば免疫学的手段(ELISAおよびウェスタンブロット)または本発明の範囲内に入る薬剤を同定するために本明細書に記載されたアッセイにより、特定のペプチドの存否を検出するアッセイを含む。
【０１８５】
サイレンシングし活性化した細胞を生じさせるために、in vitroまたはin vivoで免疫細胞に所望のポリヌクレオチドを挿入するためにいずれのDNAベクターまたは送達ビヒクルも用いることができる。非ウイルス性デリバリーシステムがもちいられる場合、好ましい送達ビヒクルはリポソームである。ゆえに、前記のデリバリーシステムおよびプロトコルは、Gene Targeting Protocols, 2ed., pp 1-35 (2002) and Gene Transfer and Expression Protocols, Vol. 7, Murray ed., pp 81-89 (1991) において見出すことができる。
【０１８６】
負の免疫調節因子のインヒビター、炎症誘発性分子、および/または宿主細胞への抗原をコードするポリヌクレオチドの導入(in vitro、ex vivoまたはin vivo)に脂質製剤の使用が考えられる。本発明の特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは脂質と関連され得る。脂質と関連したポリヌクレオチドは、リポソームの水性内部媒体に封入させるか、リポソームの脂質二重層内に散在させるか、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方に結合した連結分子によりリポソームと結合させるか、リポソーム内に閉じ込めるか、リポソームと複合体化させるか、脂質を含む溶液に分散させるか、脂質と混合するか、脂質と組み合わせるか、脂質における懸濁液として含ませるか、ミセルに含ませるかもしくは複合体化させるか、または別なふうに脂質と関連させることができる。本発明の脂質、脂質/ポリヌクレオチドまたは脂質/発現ベクター関連組成物は、溶液の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、二層構造で、ミセルで、または“崩壊”構造で存在し得る。それらはまた、単に溶液内に散在させ得、恐らくはサイズまたは形が均一ではない凝集体を形成させることもできる。
【０１８７】
脂質は、脂肪質の物質であり、天然に存在する脂質または合成脂質であり得る。例えば、脂質は、細胞質内に天然に存在する脂肪質の液滴ばかりでなく、長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドを含む、当業者に公知の化合物のクラスも含む。
【０１８８】
本発明記載のリポソームを製造するために、リン脂質を用いることができ、これは正、負または中性の実効電荷を有し得る。リポソームに負電荷を付与するためにジアセチルホスファートを使用することができ、リポソームに正電荷を付与するためにステアリルアミンを使用することができる。リポソームは1つ以上のリン脂質で作られ得る。
【０１８９】
中性荷電脂質は、電荷をもたない脂質、実質的に非電荷の脂質または等しい数の正電荷および負電荷を有する脂質混合物を含むことができる。適切なリン脂質は、当業者に公知のホスファチジルコリンなどを含む。
【０１９０】
本発明記載の使用に適した脂質は、商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン(“DMPC”)は、Sigma社(ミズーリ州セントルイス)から入手することができ、ジアセチルホスファート(“DCP”)はK&K Laboratories社(ニューヨーク州プレインビュー)から入手することができ;コレステロール(“Chol”)はCalbiochem-Behring社から入手することができ;ジミリスチルホスファチジルグリセロール(“DMPG”)および他の脂質は、Avanti Polar Lipids社(アラバマ州バーミンガム)から入手することができる。脂質のクロロホルムまたはクロロホルム/メタノールにおける原液は約-20℃で保存することができる。好ましくは、クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するので、クロロホルムは唯一の溶媒として用いられる。
【０１９１】
細胞ワクチン
一実施形態において、細胞は培養物、組織、器官または生物から単離され、トランスフェクトされ、細胞ワクチンとして哺乳動物に投与され得る。従って、本発明は“細胞ワクチン”を考える。もちろん、細胞は、免疫調節剤またはアジュバントなどの1つ以上のさらなるワクチン成分を発現することもできる。ワクチンは、細胞の全部または一部を含み得る。適切な実施形態において、本発明の細胞ワクチンはヒトAPCを含み、より好ましい実施形態において、APCはDCである。
【０１９２】
細胞ワクチンは、その免疫力を高めるために、本発明によりサイレンシングしたAPCを含むことができる。炎症誘発性分子をコードするポリヌクレオチド(例えば、TLRアゴニスト)で細胞をトランスフェクトすることにより免疫力をさらに高め得る。次いで、抗原負荷細胞を作成するために、抗原をコードする核酸でサイレンシングしたAPCをトランスフェクトすることができる。本開示に基づけば、抗原を負荷するために、いずれかの抗原型を用いるいずれの方法によってもサイレンシングしたAPCをパルスすることができる。さらに、APCのサイレンシングの前、同時または後にいずれの方法によってもAPCをパルスすることができる。
【０１９３】
本明細書の他の部分で開示されているように、種々の方法を用いて抗原で細胞をパルスすることができる。本発明の抗原は、少なくとも1つのエピトープであって、哺乳動物において免疫反応を誘導することができる前記エピトープを含む。一実施形態において、抗原は発現ベクターで発現される。他の実施形態において、抗原は単離されたポリペプチドである。好ましくは、抗原は感染症、癌および自己免疫疾患からなる群から選択される疾患と関連する。本発明の細胞をパルスするのに有用な多くの好ましい抗原は、本明細書の他の部分で開示されている。抗原は、腫瘍溶解物、タンパク質、ペプチド、mRNA、a DNA、ベクターから発現されたもの、リポソームなどの少なくとも1以上の形態であり得る。
【０１９４】
負の免疫調節因子インヒビターでサイレンシングしたAPCは、高められた免疫力を有し、従って、増強された免疫反応、すなわち抗原を提示し、それに対する免疫反応を活性化する増強された能力を誘導する。本発明記載のサイレンシングしパルスしたAPCは、エフェクターT細胞を刺激し、サイレンシングしなかった以外は同じAPCと比較して、抗原に対する改善された免疫反応を誘導することができる。
【０１９５】
治療用組成物および治療方法
【０１９６】
本発明は、免疫細胞、例えばAPCの免疫力を増強するのに有用な組成物を含む。APCにより提示された抗原に対する反応は、当該分野で公知の方法を用いて、抗原に対する細胞障害性T細胞応答、ヘルパーT細胞応答、および/または抗体反応の誘導をモニタリングすることにより測定し得る。
【０１９７】
本発明は、1つ以上の細胞と抗原組成物とを接触させる段階を含む、哺乳動物における免疫反応の増強方法を含む。本開示に基づけば、負の免疫調節因子インヒビターへの暴露により細胞をサイレンシングすることができ、炎症誘発性分子をコードするポリヌクレオチドの発現により細胞を活性化することができ、それによって、インヒビターおよび炎症誘発性分子への暴露は細胞の免疫力を高める。細胞を抗原組成物で暴露して別なふうに細胞をパルスする前に、またはそれと同時にまたはその後に、本明細書に開示された方法を用いて細胞をサイレンシングすることができる。
【０１９８】
増強される免疫反応は、能動または受動免疫反応であり得る。応答は、APC、例えば樹状細胞、B細胞または単球/マクロファージを哺乳動物(例えば、患者)から採取し、次いで抗原組成物を含む組成物でパルスし(細胞を負の免疫調節因子インヒビターに暴露して別なふうに免疫細胞をサイレンシングする前に、またはそれと同時にまたはその後に)、次いでそれを必要とする哺乳動物にAPCを投与する養子免疫療法アプローチの一部であり得る。
【０１９９】
組成物は、負の免疫調節因子インヒビター、炎症誘発性分子、抗原、サイレンシングした免疫細胞、パルスした細胞および、抗原でパルスもしたサイレンシングした免疫細胞の少なくとも1つ以上の組み合わせを含む。組成物は、哺乳動物におけるex vivo免疫および/またはin vivo療法のためのワクチンであり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０２００】
ex vivo免疫に関しては、哺乳動物に細胞を投与する前に以下の少なくとも1つをin vitroで行う:i)細胞のサイレンシング、ii)細胞のパルシング、iii)炎症誘発性分子による細胞の活性化、および/またはiv)細胞のサイレンシング、パルシングおよび活性化。当然のことながら、本発明の免疫細胞(すなわち、APC)は、抗原でAPCを処理して免疫細胞をパルスする前、またはそれと同時に、またはその後に、本明細書の他の部分で開示した方法を用いてサイレンシングすることができる。
【０２０１】
ex vivo手順は当該分野で公知であり、以下でさらに詳しく説明する。簡潔に言えば、細胞を哺乳動物(好ましくはヒト)から単離し、負の免疫調節因子インヒビターまたは本明細書に開示された負の免疫調節因子のいずれかの他の形態(すなわち、化学合成したsiRNA)でサイレンシングする(すなわち、in vitroで形質導入またはトランスフェクトする)。サイレンシングした細胞は、炎症誘発性分子(例えばフラジェリンなどのTLRアゴニスト)を用いてさらに活性化し得る。サイレンシングした細胞は抗原組成物でさらにパルスし得る。サイレンシングしパルスした細胞は、治療上の利点を提供するために、哺乳動物レシピエントに投与することができる。哺乳動物レシピエントはヒトであり得、このようにサイレンシングした細胞はレシピエントに対して自己由来であり得る。あるいは、この細胞は、レシピエントに対して同種、同系または異種であり得る。
【０２０２】
造血幹細胞および前駆細胞のex vivo増殖手順は米国特許第5,199,942号に記載されており、本発明の細胞に適用できる。他の適切な方法は当該技術分野で公知であり、従って本発明は特定のex vivo細胞増殖方法に限定されない。簡潔に言えば、DCのex vivo培養および増殖は:(1)哺乳動物の末梢血採取物または骨髄外植片からCD34+造血幹細胞および前駆細胞を採取し;(2)前記細胞をex vivoで増殖させる、ことを含む。米国特許第5,199,942号に記載の細胞増殖因子に加えて、flt3-L、IL-1、IL-3およびc-kitリガンドなどの他の因子を、細胞の培養および増殖に使用することができる。
【０２０３】
細胞集団からCD34+造血幹細胞または前駆細胞を同定・分離する種々の細胞選択技術が知られている。例えば、幹細胞または前駆細胞上に見られるマーカータンパク質または表面抗原タンパク質に結合するモノクローナル抗体(または他の特異的細胞結合タンパク質)を使用することができる。造血幹細胞のいくつかのこのようなマーカーまたは細胞表面抗原(すなわち、flt-3、CD34、My-10およびThy-1)は当該技術分野で公知である。
【０２０４】
採取したCD34+細胞を適切なサイトカインと共に培養する。次いでCD34+細胞を樹状系列細胞に分化誘導する。次いで、樹状細胞の特徴であるマーカー、例えばCD1a、HLA DR、CD80および/またはCD86を用いて、フローサイトメトリーまたは類似の手段でこれらの細胞をさらに精製する。DC培養物の単離後に、本発明の方法に従って細胞を修飾できる。あるいは、DC様細胞に分化する前に、前駆細胞を修飾することができる。
【０２０５】
ex vivo免疫に関する細胞ワクチンの使用に加えて、本発明はまた、患者において抗原に対する免疫反応を誘導するin vivo免疫のための組成物および方法を提供する。
【０２０６】
in vivo免疫に関しては、本発明は、APCの重要制御点を無能にすることによりワクチン効力を高める一般的手段として負の免疫調節因子インヒビターの使用を提供する。そのようなものとして、in vivo免疫に有用なワクチンは、少なくとも、負の免疫調節因子を抑制することができるインヒビター成分を含む。他の側面において、ワクチンは、インヒビター成分、炎症誘発性成分および抗原成分を含み、ここで抗原成分は哺乳動物において免疫反応を誘導することができる。
【０２０７】
in vivo免疫に関しては、患者から得られた細胞を、別にサイレンシングした細胞を作成するために、in vivoでトランスフェクトまたは形質導入する。細胞は、ベクターを用いてin vivoでサイレンシングされ、サイトカイン調節因子のインヒビターを発現する。あるいは、ベクターによって発現されない、本明細書に開示された、他のいずれの形態の負の免疫調節因子のインヒビター(すなわち、化学合成したsiRNA)を用いても細胞がサイレンシングされる。in vivoでサイレンシングした細胞を作成する方法は、本明細書に記載されている。
【０２０８】
ワクチンの他の側面は、in vivoで細胞をパルスするのに有用な抗原成分を含む。本発明の負の免疫調節因子インヒビターと組み合わせて、いずれの抗原も投与し得る。本明細書の他の部分で先に述べたいずれの方法を用いても、インヒビターを含むワクチンで細胞をサイレンシングする前に、それと同時に、またはその後に細胞をパルスすることができる。細胞を、同時にパルスしサイレンシングするためには、インヒビターおよび抗原の両方を含む単一のワクチンで哺乳動物を免疫することができることは明らかであろう。あるいは、2つの別々のワクチン(1つにはインヒビターを含み、もう1つには抗原を含むワクチン)で哺乳動物を免疫することができる。
【０２０９】
本発明は、癌および感染症のin vivo免疫を含む。一実施形態において、障害または疾患は、患者において抗原に対する免疫反応を引き起こす抗原と組み合わせた負の免疫調節因子インヒビターおよび炎症誘発性分子のin vivo投与によって治療できる。本開示に基づけば、抗原製剤と組み合わせた負の免疫調節因子インヒビター(例えば、A20、SUMO(SUMO1、SUMO2、SUMO3およびSUMO4)、Foxj1、Foxo3a、TWIST(Twist1、Twist2)、SOCS(SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS6、SOCS7およびCIS)、PIAS(PIAS1、PIAS3、PIASxおよびPIASy)、SHP(SHP-1およびSHP-2)またはそれらの組み合わせに対するsiRNA)の投与は、負の免疫調節因子インヒビターを用いない、他の点では同じワクチン接種プロトコルの効力を高める。特定の理論に拘束されることを望まないが、患者における抗原に対する免疫反応は、(1)投与される負の免疫調節因子インヒビターおよび/または炎症誘発性分子、(2)期間、投与量および投与頻度、(3)患者の体調および、必要に応じて、(4)投与される抗原組成物、によって決まると考えられる。
【０２１０】
一実施形態において、哺乳動物は、ある種の腫瘍特異抗原を発現する癌を有する。本発明によれば、腫瘍特異的抗原配列成分を含む免疫刺激タンパク質を製造できる。このような場合には、それを必要とする患者に、炎症誘発性分子(例えば、TLRアゴニスト)と組み合わせて負の免疫調節因子インヒビターが投与され、例えば、腫瘍特異抗原を発現する癌細胞または固形腫瘍の増殖の低下もしくは減少または癌細胞の総数もしくは総腫瘍量の減少によって証明される患者の治療成績の改善がもたらされる。
【０２１１】
関連する実施形態において、患者は、特定の抗原、例えばウイルス抗原の発現と関連する、ウイルス、細菌、真菌または他のタイプの感染を有すると診断されている。本発明によれば、抗原、例えばHIV特異抗原からなる配列成分を含むタンパク質を製造できる。このような場合には、それを必要とする患者には、タンパク質抗原と組み合わせて負の免疫調節因子インヒビターおよび炎症誘発性分子が投与され、患者内の原因感染性病原体の増殖の低下および/または、一般的には特定の感染症と関連する検出可能な症状の低下もしくは除去によって証明される患者の治療成績の改善がもたらされる。
【０２１２】
いずれの場合においても、それを必要とする患者に、抗原と組み合わせて負の免疫調節因子インヒビターを投与することにより、障害または疾患を治療することができる。本発明は、患者において、抗原に対するDC誘導防御免疫反応を引き起こす手段を提供する。
【０２１３】
医薬組成物の投薬および製剤
本発明は、本発明のワクチンおよびアジュバント組成物投与による、哺乳動物における疾患、例えばHCV感染、癌などの治療を構想する。本発明のワクチンの投与は、例えばレシピエントの生理状態、投与の目的が治療か予防かということおよび当業者に既知の他の因子に応じて、連続投与または間欠投与であり得る。ワクチンの投与は、本質的には、あらかじめ選択した期間にわたって連続的であってもよいし、一連の一定の間隔をあけた投与であってもよい。局所投与および全身投与の両方が考えられる。投与量は、限定するものではないが、選択された組成物、特定の疾患、体重、身体状態および哺乳動物の年齢ならびに予防または治療のどちらが達成されるべきかを含む種々の因子に応じて変化する。臨床医は、当業界に公知の動物モデルまたは他の試験系を用いて、このような因子を容易に決定することができる。
【０２１４】
本発明のワクチン組成物は核酸を含み得る。核酸の医薬製剤、投与量および投与経路は一般に開示されており、例えばFelgner et al., 1987, PNAS 84: 7413-7417に開示されている。一実施形態において、核酸は、例えば患者の腫瘍部位に、あるいは核酸を標的とする1種以上の標的剤の組み合わせを用いて免疫細胞に直接に投与される。他の実施形態において、被験者から単離された免疫細胞と核酸とが接触され、トランスフェクトされた細胞が患者に導入される。
【０２１５】
本発明のワクチンが投与のために製剤化される場合、それらは好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わされて医薬製剤または単位剤形が製造される。このような製剤における全活性成分は、製剤は0.1〜99.9重量%を含む。“薬学的に許容される”物質は、製剤の他の成分と適合し、レシピエント自身に有害でない担体、希釈剤、賦形剤および/または塩である。投与のための活性成分は、粉末または顆粒として存在し得るし、溶液、懸濁液またはエマルジョンとして存在し得る。
【０２１６】
本発明の治療剤を含む医薬製剤は、公知の容易に入手できる成分を用いて、当該技術分野で公知の手順で製造することができる。本発明の治療剤は、非経口投与、例えば筋肉内、皮下または静脈内経路による投与に適切な溶液として製剤化することもできる。本発明の治療剤の医薬製剤は、水性もしくは無水溶液または分散剤という形態をとることもできるし、あるいはエマルジョンまたは懸濁液という形態をとることもできる。
【０２１７】
本発明の発現ベクター、形質導入された細胞、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド(活性成分)は、生物の体内で活性成分と薬剤の作用部位との接触を引き起こすいずれかの手段で種々の疾病状態を治療するために製剤化し投与することができる。それらは、個別の治療活性成分または治療活性成分の組み合わせのいずれかの医薬品と組み合わせて使用するための利用可能ないずれかの慣用法により投与し得る。それらは単独で投与できるが、一般に、選択された投与経路および標準的製薬技法に基づいて選択される医薬担体と共に投与され得る。
【０２１８】
一般に、水、適切なオイル、生理食塩水、水性デキストロース(グルコース)および関連糖溶液ならびにグリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールは、非経口溶液の適切な担体である。非経口投与のための溶液は、活性成分、適切な安定化剤および必要に応じて緩衝物質を含む。抗酸化剤、例えば単独または組み合わせでの硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸は、適切な安定化剤である。クエン酸およびその塩ならびにエチレンジアミン四酢酸ナトリウム(EDTA)もまた使用される。さらに、非経口溶液は、塩化ベンザルコニウム、メチルまたはプロピルパラベンおよびクロロブタノールなどの防腐薬を含み得る。適切な医薬担体は、この分野の標準的な参考書であるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。
【０２１９】
さらに、作用の持続時間を調節するために、標準的な製薬法を使用することができる。これらは当該分野で公知であり、徐放性製剤を含み、適切な高分子、例えばポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセタート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミンを含み得る。放出を調節するために、高分子の濃度および取り込みの方法を調節することができる。さらに、薬剤はポリマー材料、例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ(乳酸)またはエチレンビニルアセタートコポリマーの粒子に取り込まれ得る。取り込まれるのに加えて、これらの薬剤はマイクロカプセルに化合物を捕捉するのにも使用し得る。
【０２２０】
免疫細胞への核酸投与。細胞にベクターを投与するために、種々の送達方法を使用できることは、当業者には明らかである。例には:(1)物理的手段を用いる方法、例えばエレクトロポレーション(電気)、遺伝子銃(物理力)または大量の液体の適用(圧力);および(2)前記ベクターが他の実体、例えばリポソーム、凝集タンパク質または輸送体分子に複合体化されている方法、を含む。
【０２２１】
さらにまた、実際の投与量およびスケジュールは、組成物が他の医薬組成物と組み合わせて投与されるかどうかに応じて変更することもできるし、薬物動態学、薬物素因および代謝における個人間の差異に応じて変更することもできる。同様に、用いられる特定の細胞株に応じて、in vitro適用における量を変更することができる(例えば、細胞表面上に存在するベクター受容体の数または遺伝子導入に用いられる特定のベクターのその細胞株において増殖する能力に基づいて)。さらにまた、1細胞あたり加えられるベクターの量は、ベクターに挿入された遺伝子(単数または複数)の長さおよび安定性ばかりでなく、配列の性質によっても変わると考えられ、特に経験的に決定することを必要とするパラメータであり、本発明の方法に固有でない因子(例えば、合成と関連する費用)によっても変更することができる。特定の状況の緊急性に従って、当業者は容易に必要な調整を行うことができる。
【０２２２】
実験動物モデル
本発明の方法および組成物は、例えば、癌または病原体感染の治療において、免疫反応の誘導への有益な効果を有する。適切な投与量または、本発明の方法の実施または組成物の使用のための投与プロトコルの選択に使用できる多くの癌の動物モデルが既知である。
【０２２３】
ヒト結腸癌へのその形態学的類似性、高い再現性および比較的短い潜伏期間により、前発癌物質1,2-ジメチルヒドラジンおよびその代謝物アゾキシメタン(AOM)によって誘導されるげっ歯動物における結腸腺癌は、よく特徴づけられた発癌物質誘導腫瘍である(Shamsuddin, (1986) Human Path. 17:451-453)。このげっ歯類腫瘍モデルは、その形態学におけるばかりでなく(Shamsuddin & Trump, (1981) J. Natl. Cancer Inst. 66:389-401)、腫瘍形成に関与する遺伝子においても(Shivapurkar et al., (1995) Cancer Lett. 96:63-70; Takahashi et al., (2000) Carcinogenesis 21:1117-1120) ヒト結腸腺癌に類似している。
【０２２４】
げっ歯動物における結腸癌の化学発癌物質誘導モデルに加えて、ホスホイノシチド-3-OHキナーゼの触媒サブユニット(PI3-Kγ)(Sasaki et al., (2000) Nature 406:897-902)またはグアノシン結合タンパク質 Gαi2 (Rudolph et al., (1995) Nat. Genet. 10: 143-50)の遺伝子破壊は、げっ歯動物において自然発生結腸癌を引き起こす。これらの研究は、原型的な腫瘍抑制遺伝子および癌遺伝子における改変以外の潜在的原因がヒト結腸癌の病因に関与しうることを示している。
【０２２５】
ラット、マウスおよびハムスターモデルを含む、口腔扁平上皮癌の多くの動物モデルが開発されている。発癌物質7,12-ジメチルベンズアントラセンによって誘導されるハムスター頬嚢誘発腫瘍モデルは、相変わらず最も一般的なモデルの1つであるが(Baker (1986) Malignant neoplasms of the oral cavity. In: OtolaryngologyHead and Neck Surgery, Cummings et al. (eds.) pp. 12811343. St. Louis, Mo.: CV Mosby)、ヒト口腔腫瘍形成とは多くの差異を示す。ヒト口腔および食道発癌の多くの側面をより密接に真似する発癌物質4-ニトロキノリン-1-オキシド(4-NQO)を用いる新しいマウスモデルが開発されている (Tang et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10: 301-313)。
【０２２６】
マウスに注入したとき、ヒト骨髄腫の特徴を示す病変を引き起こすマウス骨髄腫細胞株5TGM1を用いる多発性骨髄腫の動物モデルが記載されている(Garrett et al.(1997)Bone20:515-520)。このような病変は、重篤な骨溶解ならびに肝臓および腎臓を含む非骨器官の転移を含む。培養した5TGM1細胞で播種したマウスは、予測可能で再現性よく疾患を発症する。その症状は、単クローン性免疫グロブリン血症および放射線骨病変の形成を含む。
【０２２７】
脳内ラット神経膠腫モデル(Sandstrom et al. (2004) Br. J. Cancer, 91: 1174-1180)およびイヌ由来J3T1神経膠腫細胞の注入を用いるマウスモデル(米国特許第6,677,155号)を含む、神経膠腫の研究のための多くの動物モデルが存在する。
【０２２８】
例えば、LC-6ヒト非小細胞肺癌のヒト腫瘍をBALB/C-nu/nuマウスへの皮下移植により異種移植する、非小細胞肺癌の研究のための動物モデルが以前に記載されている (Tashiro et al. (1989) Cancer Chemother. Pharmacol. 24, 187)。
【０２２９】
ヌードマウスにおけるAZ-521ヒト胃癌異種植皮を用いる、胃癌の研究のための動物モデルが記載されている(Fukushima et. al. (2000) Biochem. Pharmacol. 59, 1227-1236)。
【０２３０】
ラット (Blatt, J et al. (1991) Leuk. Res. 15:391-394)および SCID マウス (Vey, N. et al. (2000) Clin. Cancer Res., 6:731-736)におけるAMLを含む、AMLの多数の動物モデルが以前に記載されている。
【０２３１】
HCCの研究に用いられる多くの動物モデルが記載されている(Chisari et al., (1985) Science 230: 1157-1160; Babinet et al. (1985) Science 230: 1160-11; 米国公開第2004/0016011号)。これらの文献は、ゲノムへのHBVウイルスの組み込みによるHCCのトランスジェニックマウスモデルの作成を開示している。
【０２３２】
2つのエストロゲンおよびプロゲステロン受容体(MA-11およびMT-1)陰性ヒト乳癌細胞株を用いる実験的転移パターンを有する動物モデルは、ヒト患者においてしばしば観察される転移と類似している(Engebraaten & Fodstad, (1999) Int. J. Cancer. 82:219-25)。乳癌の他のモデルは、米国公開第2003/0215861号(参照により本願に組み込まれる)を含む。あるいは、単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせてのいずれかで抗乳癌薬剤として機能する本発明の化合物の能力は、野生型スプラーグ・ドーリー・ラットにおける発癌物質誘導乳腺腫瘍において証明することができる(Thompson H. J et al, Carcinogenesis, (1992) 13:1535- 1539)。
【０２３３】
卵巣癌の多くの動物モデルが当該技術分野で公知である。例えば、Connolly et al. ((2003) Cancer Research, 63, 1389-1397)は、MISIIRプロモーターの調節下にあるSV40タグのキメラ発現によってマウスにおいて卵巣上皮癌を発症する方法を開示している。他の例において、Liuら(Cancer Research 64, 1655-1663 (2004))は、不死化したヒト卵巣表面上皮細胞にヒトHRASまたはKRAS癌遺伝子を導入したが、これは免疫不全マウスに注入後に皮下腫瘤を形成する。
【０２３４】
前立腺癌の研究のための多数の動物モデルが入手可能である。SCIDマウスに導入した前立腺癌異種植皮を用いるマウスモデルの1つが米国特許第6,756,036号に開示されている。あるいは、米国公開第2004/0009508号に開示されているように、転移性前立腺癌の同所性マウスモデルを用い得る。
【実施例】
【０２３５】
本発明は、以下の実施例を用いてさらに例示されるが、決してこれらを本発明を限定するものと解釈すべきではない。実施例1は、実施例2〜7において本発明の種々の実施形態を製造し試験するために用いられる材料および方法を説明する。
【０２３６】
実施例１−材料および方法
細胞培養。10%熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバート)、100U/mLペニシリン、100μg/mL抗真菌薬および100μg/mLストレプトマイシンを添加したDMEM培地中、37℃、5%CO2雰囲気下でヒト胎児腎臓細胞株293を培養した。ヒト乳癌細胞株MCF-7およびMDA-MD-231、ヒト腎癌細胞株A498ならびにヒト卵巣癌細胞株SK-OV-3(ATCC)を、10%FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mL抗真菌薬および100μg/mLストレプトマイシンを含む培地中、37℃で維持した。
【０２３７】
SOCS1のダウンレギュレーションおよびウェスタンブロット分析。siRNAによるヒトSOCS1のダウンレギュレーションを評価するために、コンピュータプログラム(www.dharmacon.com)を用いて、ヒトSOCS1を標的とするsiRNA配列を選択した。siRNA1(配列番号5)、siRNA2(配列番号6)およびsiRNA3(配列番号7)の3つのオリゴヌクレオチドを合成した。製造業者のプロトコル(Genlantis社、カリフォルニア州サンディエゴ)に従って、GenePorter(登録商標)試薬を用いて、合成二本鎖siRNAオリゴヌクレオチドまたは関連性のないスクランブルした二本鎖オリゴおよびflagタグ付きヒトSOCS1発現ベクター(pCMVhSOCS1)で293T細胞を同時トランスフェクトした(Shen et al., Nat Biotechnol, 22: 1546-1553, 2004)。簡潔に言えば、GenePorter試薬3μLおよび無血清RPMI1650 94μLに20μMオリゴヌクレオチド溶液3μLを加えた。この混合物を25℃で30分間インキュベートし、その後、PBMC-DCの各ウェルにGenePorter/オリゴヌクレオチド混合物100μLを加え、37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション後、PBMC-DCに、20%FBSを添加したRPMI 1640を500μL/ウェルで加えた。
【０２３８】
ウェスタンブロット分析のために、トランスフェクションの48時間後に細胞を採取し、SDS-PAGEにかけ、次いでHybond-P膜(Amersham社、ニュージャージー州ピスカタウェイ)に転写した。サバイビン、MUC1およびフラジェリンの発現レベルをそれぞれ検出するために、一次抗体ヤギ抗ヒトサバイビン(R&D Systems社、ミネソタ州ミネアポリス)、マウス抗ヒトMUC1(SeroTec、Oxford、UK)およびウサギ抗サルモネラH:I抗体(Santens Serum Institute)を用いた。Flag-SOCS1発現を検出するために、マウスモノクローナル抗体抗Flag(Sigma社、ミズーリ州セントルイス)を用いた(Shen et al., Nat Biotechnol, 22: 1546-1553, 2004)。結合した一次抗体は、適切なHRP標識抗ヤギ、抗マウスまたは抗ウサギIgGで各ブロットをプロービングし、次いでECL-Plus試薬(Amersham社、ニュージャージー州ピスカタウェイ)で検出することにより検出した。デンシトメーターSIでフィルムをスキャンし、バンドをImageQuantソフトウェア(Molecular Dynamics社、カリフォルニア州サニーヴェール)で定量した。バンドの強度を、β-アクチンバンドの強度で正規化した。
【０２３９】
定量的RT-PCR分析。定量的リアルタイムRT-PCRを用いて、ヒトDCにおけるヒトSOCS1の相対的発現を評価した。簡潔に言えば、Trizol試薬(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバート)を用いて、3.5〜5x105BM-DCから全RNAを抽出した。ランダムヘキサマープライマーおよびSuperScript First-Strand合成キット(Invitrogen社)で、各試料に関して全RNA 1マイクログラム(1.0μg)を逆転写した。鋳型として1反応当たり5ng相当の出発RNA材料を用いて、20μlの4連反応で、ABI 7900HT配列検出システム(Applied Biosystems社)によりリアルタイム5′-ヌクレアーゼ蛍光PCR分析を行った。マウスSOCS1用事前開発プライマー/プローブセット(6FAM)および18Sリボソーム対照(VIC)はApplied Biosystems社から購入した(SOCS1用プライマー、5'-ACCTTCTTGGTGCGCGAC-3'(配列番号161)および5'-AAGCCATCTTCACGCTGAGC-3'(配列番号162)ならびにハイブリダイゼーションプローブ、5-6FAM-TCGCCAACGGAACTGCTTCTTCG-TAMRA-3′(配列番号163)。PCRパラメータは、TaqMan Universal PCR Master Mixキット(Applied Biosystems社)に関して推奨されたものを用い、SOCS1および18S反応は別々のチューブで行った。SOCS1レベルは18S rRNAおよび偽トランスフェクトされた対照に対するSOCS1発現で正規化し、刺激されたDCをComparative Ct法で算出した(Shen et al., Nat Biotechnol, 22: 1546-1553, 2004)。
【０２４０】
組換え複製欠損型アデノウイルスの作成。前述のように、複製欠損型アデノウイルスを構築し作成するために、Ad-Easy系(E1およびE3欠失;Quantum Biotechnology社、カリフォルニア州パロアルト)を用いた(Ren et al., Cancer Res, 64: 6645-6651, 2004)。Thr34-Ala 変異体 hSVNT34A (Mesri et al., . J Clin Invest, 108: 981-990、2001)を鋳型として用い、一組のプライマーP-SF(5'-GAGTCGACATGAAGGACCACCGCATCT-3'、配列番号164)およびP-SR(5'-ACCAAGCTTATCCATGGCAGCCAGCTG-3'、配列番号165)を用いて、PCRにより、DN短縮型ヒトサバイビン変異体遺伝子を作成した。ヒトMUC13反復MUC1配列を含む二本鎖オリゴヌクレオチドをプライマーP-MF(5'-ATTAACAAGCTTGGTGTCACCTCGGC-3'、配列番号166)およびP-MR(5'-TTAATTGCGGCCGCTTAGTGGGCTG-3'、配列番号167)を用いてPCR増幅し、クローニング部位Hind IIIおよびNot Iを付加した。増幅したサバイビンおよびMUC1フラグメントを制限酵素HindIIIで消化し、室温で1時間連結した。次いで、プライマー(P-SFおよびP-MR)を用いるPCRでDNサバイビン変異体-MUC1融合フラグメントを増幅し、5’末端におけるSal I制限部位および3’末端におけるNotI部位を含むDNサバイビン変異体-MUC1フラグメントを作成した。Salmonella enterica血清型Typhimurium(ATCC)を鋳型として用い、一組のプライマー(5′-TAGTCGACCTCGAGATGCTCCTGGCTGTTTTGTACTGCCTGCTGTGGAGTTTCCAGACCTCCGCTGGCCATTTCCCTAGAATGGCACAAGTCATTA-3′(配列番号168)および5′-GGCTCTAGAGCGGCCGCTTAACGCAGTAAAGAGAGG-3′(配列番号169)を用いて、ヒトチロシナーゼからのシグナルリーダー配列を含む修飾フラジェリン(fliC)遺伝子をPCR増幅した。
【０２４１】
プライマー(5′-AATTGCGGCCGCTAAATTCCGCCCCTCT-3′(配列番号170)および5′-GGCCTCGAGTGTGGCCATATTATCATCG-3′(配列番号171))を用いて、Huangら(Cancer Res, 63: 7321-7329, 2003)によって作成されたpShuttle-CMV-HSPIRES-E1Aベクターから脳心筋炎ウイルス(Encephalomyocarditis virus)IRES配列を増幅した。NotI消化サバイビン-ムチンフラグメントおよびIRESフラグメントの連結反応によって、サバイビン-ムチン-IRESフラグメントを構築した。XhoI/Xbal消化pshuttle-hSOCS1ベクターに修飾分泌フラジェリンを挿入することによりあらかじめ構築したSal I/Xho l消化pshuttle-SFベクターにSalI/Xhol消化サバイビン変異体-MUC1-IRESフラグメントを挿入することにより、得られたシャトルベクターpshuttle-siSSFを構築した。ヒトH1 RNAプロモーター、ヒトSOCS1-siRNAおよび、pSuper-hsiS1ベクターからPCR増幅した転写終結配列をAd pshuttleベクターに挿入することによりpshuttle-hSOCS1ベクターを作成した。続いて、H1 RNAプロモーター(pSuperベクターからの)の調節下にあるヒトSOCS1 siRNAを含む組換え複製欠損性Ad-siSSFウイルスおよび、CMVプロモーターの調節下にある脳心筋炎ウイルスIRES配列を有する修飾フラジェリンに結合されているDNヒトサバイビン変異体-MUC融合遺伝子を製造業者の説明書に従って作成した。これらの遺伝子フラグメントの組換えAdウイルスへの挿入はPCRおよびDNA配列決定によって確認した。製造業者の使用説明書に従って、293細胞において組換えアデノウイルスを産生し滴定した(Quantum Biotechnology社、カリフォルニア州パロアルト)。
【０２４２】
末梢血単核細胞(PBMC)からのヒトDCの作成およびAdトランスフェクション。ヒトPBMCからのDCは、Schroersらによって記載されているようにして行った(Schroers et al., Methids Mol Biol, 246: 451-459, 2004; Schorers et al., Clinical Can Res, 9: 4743-4755, 2003)。簡潔に言えば、Gulf Coast Regional Blood Bank of Houstonからの健常ドナーのバフィーコート調製物から得たヘパリン添加血のFicoll-paque(GIBCO-BRL社、ニューヨーク州グランドアイランド)密度勾配遠心分離によってPBMCを単離した。5×106/mLの細胞密度で、150mm細胞培養プレートに培地中の細胞を播種した。37℃で3時間のインキュベーション後に、非付着細胞を除去し、後に使うために1×106/mLで凍結した。ヒト組換え顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(rhGM-CSF、1,000U/mL、R&D Systems社、ミネソタ州ミネアポリス)およびインターロイキン-4(rhIL-4、1,000U/ml、R&D Systems社、ミネソタ州ミネアポリス)を添加したCellGro DC培地(Freiburg im Breisgau、Germany)で付着血液単球を培養した。3日ごとにrhGM-CSFおよびrhIL-4を補充した。5日目に、PBMC由来DCを採取し、1×106/mLの細胞密度で12ウェル培養プレートに再び播種し、次いで無血清RPMI1640培地中の種々のMOIのAdベクターで1.5時間トランスフェクトし、次いでrhIL4および1000U/mL rhGM-CSFを加えたDC培養培地1000U/mLで48時間インキュベーションした。AdトランスフェクトDCを採取し、後の研究のために無血清RPMI1640培地で洗浄した。
【０２４３】
フローサイトメトリー分析。DCおよびT細胞の表現型をフローサイトメトリーアッセイで測定した。ヒトCD40(B-ly6)、CD80(L307.4)、CD86(2331)、HLA-DR(TU39)、HLA-A2(BB7.2)、CD11c(B-ly6)(BD Bioscience社、ニュージャージー州フランクリン・レイク)、OX40リガンド(OX40L)(ANC10G1)、GITRリガンド(GITRL)(109101)およびCCR7受容体(150503)(R&D Systems社)に対するフルオレセインイソチオシアナート(FITC)、フィコエリスリン(PE)および(APC)標識モノクローナル抗体(Mab)ならびに一致したアイソタイプ対照をDCの多色染色に使用した。T細胞を染色するために、ヒトCD4(RPA-T4)、CD8(G42-8)およびIFN-γ(4S.B3)(BD Bioscience社、ニュージャージー州フランクリン・レイク)に対するFITCまたはPE標識Mabを用いた。抗アネキシンV染色(BD Bioscience社、ニュージャージー州フランクリン・レイク)を用いてDC生存率を測定した。ヒト腫瘍細胞株を染色するために、マウス抗ヒトCD227(MUC1、クローンC595、Serotec、Oxford、UK)を用いた。細胞を洗浄し、2%FCSおよび0.02%アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁した。
【０２４４】
直接染色のために、氷上で10分間、200μg/mLポリクローナルヒトIgG(Sigma社、ミズーリ州セントルイス)中で細胞をプレインキュベートした。特異標識Mabまたは適切なアイソタイプ対照を加え、氷上で25分間細胞をさらにインキュベートした。間接染色のために、抗ヒトCD227Abでのインキュベーションの前に、200μg/mLポリクローナルヒトIgGで細胞をプレインキュベートした。FITC(Santa Cruz Biotechnology社、カリフォルニア州サンタクルーズ)で標識したヤギ抗マウスAbで特異Mabを明示した。対照として、別々のチューブで、一次抗体なしのFITCで標識したヤギ抗マウスAbでの染色をいつも行った。次いで、染色した細胞を、FloJoソフトウェアを用いてFACSaria(Becton Dickinson社、ニュージャージー州フランクリンレイクス)で分析した。製造業者の使用説明書 (Evel-Kabler et al., J Clin Invest, 116: 90-100, 2006)に従って、ELISA およびCytokine Antibody Array アッセイを用いて、DC培養物中のサイトカインおよびケモカイン濃度を、BD Bioscience社(IL-6、IL-12、IL-10、TNF-α、IFN-γおよびランテス（Rantes）)からの市販2部位サンドイッチ酵素免疫抗体法(ELISA)により測定した。製造業者の説明書に従って、RayBio(登録商標)Human Cytokine Antibody Array3(Ray Biotech社、ジョージア州ノークロス)を用いて、DCの培地中の42のヒトサイトカインおよびケモカインの相対レベルを検出した。
【０２４５】
走化性アッセイ。トランスウェルシステム(24ウェルプレート;孔径8μM;Costar社、ニューヨーク州コーニング)を用いてDCの遊走を測定した(Giordano et al., Blood, 107: 1537-1545, 2006)。種々のAdベクターで48時間トランスフェクトされたヒトPBMC由来DCを採取し、上部チャンバーの24ウェルトランスウェルプレート(孔径5μM)に播種した(1×105細胞/ウェル100μL)。100ng/ml CCL21(Genetex社、テキサス州サン・アントニオ)または培地のみを含むDC培地500マイクロリットル(500μL)を下部チャンバーにプレーティングした。培地のみを含むウェルは、自発的遊走の対照として用いた。37℃で3時間培養した後、下部ウェルにおける培地500μLを採取し、50秒間のFACS収集を用いて細胞数を算出した。漸増濃度の細胞を試験することにより、得られた対照滴定曲線の直線範囲内に総数が留まった。ケモカインに応答して遊走した細胞の総数から自発的に遊走した細胞の平均数を差し引いた。遊走率(%)=(CCL21培地中の細胞数-DC培地中の細胞数)/(DC培地中の細胞数)×100。
【０２４６】
ヒトDCのエンドサイトーシスアッセイ。以前報告されたように(Sallusto et al., J Exp Med, 182: 389-400, 1995)、デキストラン-テキサスレッドを用いてPBMC由来DCのエンドサイトーシス能力を試験した。種々のAdベクターを用い、25,000vpのMOIで1×106個の細胞のヒトPBMC由来DCをトランスフェクトした。48時間(48h)後、2×105個のトランスフェクトされたDCを1mg/mLの濃度のデキストラン-テキサスレッド(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバート)で4時間パルスした。反応を停止させるために、冷染色緩衝液(1%FBS/PBS)を加えた。細胞を4回洗浄し、PE標識抗CD11c Abで染色し、次いでFACSariaで分析した。DCとデキストラン-テキサスレッドとの4℃でのインキュベーションにより測定したDCに対するデキストランの非特異的結合を示した。培養に用いた培地にはGM-CSFを添加したが、これは、GM-CSFなしでDCが培養された場合、Agを捕捉するDCの能力が失われるからである(Inaba et al., J of Exp Med, 176: 1693-1702, 1992)。
【０２４７】
in vitro T細胞感作。報告されているように(32、36、37)、自己T細胞のin vitro感作を行った。12ウェル培養プレートにおいて、無血清RPMI1640培地1mL中25000vpのMOIで1.5時間、1×106個のヒトPBMC由来DCを偽トランスフェクトするかAdベクターでトランスフェクトし、次いで20%FBSを含むDC培地1mlを添加して48時間置いた。トランスフェクトされたDCを採取し、RPMI1640で洗浄し、次いで5%CO2を含む加湿雰囲気下で7日間、37℃でrhIL-4およびrhGM-CSFなしでDC培地2ml中DC:エフェクター比1:20で自己T細胞と共培養した。3日ごとに、50U/mLの濃度で培養物に組換えヒトIL-2(R&D Systems社、ミネソタ州ミネアポリス)を補充した。用事調製した偽またはAdトランスフェクト自己DCでT細胞を毎週再刺激した。14間の共培養後に、細胞内サイトカイン染色、ELISPOTおよびCTLアッセイのためにT細胞を採取した。
【０２４８】
in vitro T細胞増殖および抑制アッセイ。AdトランスフェクトDCのTreg機能への効果を評価するために、前述のように、ヒトPBMC由来DC(5日目)を種々のAdベクターを用いてMOI 25000vpで48時間トランスフェクトした。仕様書に従って、ヒトCD4+CD25+MACSキット(Miltenyi Biotec社、カリフォルニア州オーバーン)を用いて、種々のドナーからヒトCD4+CD25+Treg細胞およびCD4+CD25- Teff細胞を単離した。12ウェル細胞培養プレートにおいて、AdトランスフェクトDC(5×105個)を、自己CD4+CD25+Treg細胞(1×105個)と5日間共培養した。CD4+CD25+MACSキットを用いてCD4+CD25+Treg細胞(1×105個)を精製し、96ウェルプレートにおいて0.5μg/mL抗ヒトCD3の存在下でさらに60時間、1×105個のCD4+CD25-Teff細胞および5×104個の自己偽DCと共培養した。次いで、1マイクロキュリー(1μCi)の[3H]チミジン(DuPont NEN社、デラウェア州ウィルミントン)を各ウェルに加え、さらに16時間インキュベートした。3連ウェルにおける細胞を、Filter Mate Harvester(Packard社)を用いてファイバーグラスフィルター上に採取し、フィルターを十分に洗浄した。乾燥後、各ウェルに、25μLのMicroScint20(Packard社)を加え、Topcount NXT Microplate Scintillation and Luminesence Counter(Packard社)で放射能を計数した。並行して、1×105同種CD4+CD25- T細胞を20μM CFSE(Invitrogen社、カリフォルニア州カールスバート)を用いて37℃で15分間標識した。増殖をモニターするために、上記の共培養系にCFSE標識T細胞を加えた。
【０２４９】
ELISPOTアッセイ。ELISPOTアッセイを、以前に記載されたもの(Schroers et al., Methods Mol Biol, 246: 451-459, 2004; Schorers et al., Clinical Can Res, 9: 4743-4755, 2003) に従い、少し修飾を加えて行った。簡潔に言えば、MultiScreen-HAプレート(Millipore社、マサチューセッツ州ベッドフォード)を、コーティング緩衝液(炭酸-重炭酸緩衝液(pH9.6))中10μg/mLの抗ヒトIFNγmAb 1-D1K(Mabtech社、スウェーデン・ストックホルム)を用いて、終夜4℃でコーティングした。RPMI 1640および10%ヒト血清(Bethyl社、テキサス州モンゴメリー)を用いて、37℃で少なくとも2時間プレートをブロックした。刺激したT細胞を2×105/ウェルで播種し、20μg/mL HLA-A2-拘束性サバイビンペプチド(ELTLGEFLKL、配列番号172)(Schmidt et al., Blood, 102: 571-576, 2003)および20μg/ml HLA-A2-拘束性MUC1ペプチド(STAPPAHGV、配列番号173)(Brossart et al., Blood, 93: 4309-4317, 1999; Brossart et al., Blood, 96: 3102-3108, 2000) の存在下、37℃、5%CO2、3連で、Adトランスフェクションなしに照射した4×103個の自己DCと共培養した。加湿5%CO2インキュベーター中37℃で16時間プレートをインキュベートし、次いでPBS-0.05%ツイーン20(Sigma社、ミズーリ州セントルイス)を用いて6回洗浄して、細胞を除去した。PBS-0.5%ヒト血清中1μg/mlの濃度のビオチン化抗ヒトIFNγ抗体7-B6-1(Mabtech社、スウェーデン・ストックホルム)を加え、37℃で2時間プレートをインキュベートした。ストレプトアビジン標識アルカリホスファターゼ(Mabtech社、スウェーデン・ストックホルム)を加え、さらに1時間置いた。5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスファートおよびニトロブルーテトラゾリウム(Life Technologies社、メリーランド州ゲーサーズバーグ)を用いた4分間の反応後にサイトカイン産生細胞を検出した。KS ELISPOT4.3ソフトウェアを用い、自動ELISPOT読み取りシステム(Carl Zeiss社、ニューヨーク州ソーンウッド)を用いて、ZellNet Consulting社(ニューヨーク州ニューヨーク)がブラインド方式で結果を評価した。
【０２５０】
CTL アッセイ。Schroers ら(Cancer Res, 62: 2600-2605., 2002)の記載に従って、CTL標準51Cr放出アッセイを行った。20μg/mLのMUC1および20μg/mLのAdトランスフェクションなしのサバイビンペプチドパルス自己DCで2時間DC感作T細胞を再刺激した。37℃で1時間、RPMI 1640中[51Cr]-クロム酸ナトリウムで標的細胞(MCF7、A498、SK-OV3およびMDA-MB-231)を標識した。丸底96ウェルプレートのウェルに標的細胞(104個)を移した。種々の数のDC感作T細胞を加えて16を最終容量200μLにし、37℃で4時間インキュベートした。アッセイの終わりに上清(50μL/ウェル)を採取し、ベータプレートカウンター(beta-plate counter)で計数した。細胞溶解の百分率を以下のように算出した:100×(実験的放出-自発的放出/最大放出-自発的放出)。自発的放出および最大放出は、それぞれ培地または1%SDSのいずれかの存在下で測定した。
【０２５１】
実施例２−組換えAdベクター Ad-siSSFの構築および解析
本発明の一実施形態に従って、負の免疫調節因子インヒビター、炎症誘発性分子および抗原を同時発現する組換え発現構築物を設計した。特に、本実施例は、組換え複製欠損性アデノウイルスベクターの構築が、短いヘアピンヒトSOCS1-siRNA(siSOCS1)、ドミナントネガティブ(DN)サバイビンおよびMUC1融合タンパク質ならびにTLR5リガンドである分泌フラジェリンを同時発現するように設計されたことを記述する(図1)。実施例1に記載されているようにして、個々の遺伝子断片のPCR増幅を用いてこのベクターを構築した。
【０２５２】
短いヘアピンヒトSOCS1-siRNA(siSOCS1)、ドミナントネガティブ(DN)サバイビンおよびMUC1融合タンパク質ならびにTLR5リガンドである分泌フラジェリン(図1)を同時発現するAd-siSSFで表わされる組換え複製欠損性アデノウイルスベクターを構築するために、サバイビン、MUC1およびフラジェリン遺伝子を修飾した。さらにまた、ヒトSOCS1を効果的にサイレンシングできるsiRNAの1例を同定した。ヒトDCのその高いトランスフェクション効率、確立されたAd製造システム、自己免疫毒性の潜在リスクを限定する導入遺伝子発現の一時的な性質および千以上のヒトにおいて証明された安全性のためにアデノウイルスベクター系を選択した(Song et al., J Exp Med, 186: 1247-1256, 1997; van Ginkel et al., J Immunol, 159: 685-693, 1997; Dietz et al., Blood, 91: 392-398, 1998; Barouch et al., Hum Gene Ther, 16: 149-156, 2005; Shiver et al., Annu Rev Med, 55: 355-372, 2004)。
【０２５３】
悪性細胞生存および形質転換を促進する可能性のあるサバイビンの抗アポトーシス生物活性のために、サバイビン遺伝子に2つの変異を導入してDNサバイビン変異体を作成した。前述のように、p34cdc2-サイクリンB1リン酸化部位および抗アポトーシス活性を除去するために、位置34におけるThrとAlaとの置換変異を行った(O’Connor et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 97: 13103-13107, 2000)。さらに、機能的リン酸化部位への生存変異体の復帰変異の可能性を避けるために、さらにサバイビンのN末端における16アミノ酸短縮体を作成した。なぜなら、アポトーシスのその阻害にN末端配列を必要とするからである(Sun et al., Nature, 401: 818-822, 1999)。20アミノ酸縦列反復配列を3つのみ含む短いヒトムチン1(MUC1)フラグメントを用いた。なぜなら、既知のドミナントT細胞エピトープは20アミノ酸反復配列以内にあり(Fontenot et al., J Biomol Struct Dyn, 13: 245-260, 1995)、 完全長または長いMUC1タンパク質は、Th1型CTL反応を抑制することにより免疫抑制活性を有することが見出されているからである(Carlos et al., J Immunol, 175: 1628-1635, 2005)。
【０２５４】
Ad-siSSFベクターのための標的腫瘍関連抗原としてのDNサバイビン-MUC1融合遺伝子(DN SM)を作成するために、MUC1の3つの20アミノ酸反復配列フラグメントにインフレームで二重変異DNサバイビンを遺伝的に連結した。分泌およびそれに続く、トランスフェクトされたDCによるフラジェリンのDC上の表面TLR5との相互作用を容易にするために、ヒトチロシナーゼ由来のシグナルリーダー配列をフラジェリン遺伝子のN末端に遺伝的に連結した。
【０２５５】
実施例1に記載のコンピュータプログラムを用いて、ヒトSOCS1を特異的にダウンレギュレートする能力を有する低分子干渉RNA(siRNA)を同定した(siRNA1、siRNA2、およびsiRNA3)。図2は、ヒトSOCS1 siRNA1がヒトSOCS1発現を効率的にダウンレギュレートしたのに対し、SOCS1 siRNA2およびSOCS1 siRNA3はそうではなかったことを示している。siRNAによるヒトSOCS1 mRNAのダウンレギュレーションの特異性は、スクランブルした二本鎖siRNA1オリゴヌクレオチド(mut)がSOCS1 mRNAをダウンレギュレートできないことにより確認した。従って、Ad-siSSFベクターの構築のためにヒトSOCS1 siRNA1(配列番号5)を選択した。
【０２５６】
図1に概略を示すように、得られたAdベクターAd-siSSFを構築し、これらの遺伝子の組換えアデノウイルスへの挿入はDNA配列決定により確認した。さらに、DN SM融合タンパク質のみを発現するアデノウイルスベクターAd-SMおよびGFPマーカーを発現するアデノウイルスベクターAd-GFPを対照として構築し、産生させた(図1)。
【０２５７】
トランスフェクトされた細胞において、siSOCS1、DN SM融合タンパク質および分泌フラジェリンの3つの成分を効率的に同時発現するAd-siSSFウイルスの能力をウェスタンブロット分析により明らかにした。図3Aは、種々のMOI(10、100、1000および10000vp、レーン1〜4)のAd-siSSFでトランスフェクトされた293T細胞におけるDNサバイビン-MUC1融合タンパク質およびフラジェリンの発現を示す。100vp以上のMOIは、ポリペプチドの良好な発現を示す。図3Bは、ヒトSOCS1発現ベクターDNAでトランスフェクトされ、種々のMOI(0、10、100、1,000、10,000および20,000vp)(レーン1〜6)のAd-siSSFまたは対照Ad-GFP(10、100、1,000、10、000および20,000vpのMOI;レーン7〜11)に感染した293T細胞の溶解物のウェスタンブロットを示す。アクチンに対するヒトSOCS1バンドの相対密度をヒストグラムで示す(図3C)。1,000vp以上のMOIは、292T細胞におけるSOCS1の発現を有意に低下させることができ、同時にフラジェリンおよびDN生存-MUC1融合タンパク質の良好な発現を与える。従って、本実施例における結果は、負の免疫調節因子インヒビター、炎症誘発性分子をコードするポリヌクレオチドが同じ細胞内で同時発現することができることを明らかにしている。
【０２５８】
実施例３−Ad-siSSFによるヒトDCの効率的な成熟
本発明の1側面に従って、負の免疫調節因子インヒビター、炎症誘発性分子および抗原をコードするポリヌクレオチドを含むワクチン組成物を、DCの成熟を誘導するためにDCに投与した。
【０２５９】
実施例2に記載されているように、ポリヌクレオチドをAdベクターで提供した。最初に、ヒトPBMC由来DCの効率的なトランスフェクションを可能にするが、有意の毒性を有さないAdベクターの適切なMOI(感染多重度)を決定した。Ad-GFPトランスフェクションの24時間後にGFP+DCの百分率を試験することにより、ヒトPBMC由来DCのトランスフェクション効率を測定した。25,000または50,000ウイルス粒子(vp)のMOIを用いて、トランスフェクションの24時間後に、DCの約66%または75%がトランスフェクトされた(図4)。Ad-siSSFまたはAd-GFPでのトランスフェクション後の異なる時間に、トリパンブルー、ヨウ化プロピジウム(PI)およびアネキシンV染色でDCの生存率を測定した。25,000vpのMOIを用いた場合、トランスフェクションの48時間および96時間後の染色から明らかなように、Ad-siSSFトランスフェクトDCの大部分はなお生存していた(図5)。しかしながら、より高いMOIでのトランスフェクションは、DCにかなりの毒性を示し、その生存率は低下した。従って、以下の研究に使用するために、ヒトPBMC由来DCのAdトランスフェクションには、25,000vpのMOIを選択した。
【０２６０】
次に、ヒトPBMC由来DCの成熟に対するAd-siSSFトランスフェクションの効果をフローサイトメトリーアッセイで試験した。検出に使用するフローサイトメトリーおよび抗体は実施例1に記載されている。図6は、CD40、CD80およびCD86などの表面共刺激分子のレベルを示し、MHCクラスII分子は、トランスフェクションの48時間後に、Ad-SMトランスフェクトDCと比較してAd-siSSF-トランスフェクトDCで有意にアップレギュレートされた。GITR(糖質コルチコイドで誘導される腫瘍壊死因子受容体)リガンドおよびOX40リガンド(T細胞共刺激シグナルリガンド)などの腫瘍壊死因子受容体(TNFR)ファミリーメンバーの表面レベルもまたAd-siSSF-DCで有意に増強された(図6)。TLR5はヒトPBMC由来DC上に発現されたが、その発現はAd-siSSFトランスフェクションによってアップレギュレートされなかった。さらにまた、Ad-siSSFトランスフェクトDCは、4℃または37℃での90分間のインキュベーション後に、テキサスレッド標識デキストラン(図7)を取り込むエンドサイトーシスの能力を保持していることが示された。
【０２６１】
従って、本発明のワクチンの側面によれば、これらの結果は、表面共刺激分子の発現増加から明らかなように、ヒトDCの成熟を効率的に促進するための負の免疫調節因子インヒビター、炎症誘発性分子および抗原を発現するAd-siSSFベクターの効力を示している。
【０２６２】
実施例４−Ad-siSSFでトランスフェクトされたヒトDCによる炎症性サイトカインの強い（robust）産生
本実施例において、トランスフェクトされたヒトPBMC由来DCによる炎症性サイトカインの産生に対する本発明のワクチン組成物の実施形態の効果を試験した。最近の研究により、サイトカインは、免疫細胞の活性化、増殖および分化の調節に決定的に関与する。DCによって産生されるサイトカインは、TおよびB細胞のプライミングおよび活性化のための第3のシグナルとして機能することが示唆されている(Curtsinger et al., J Exp Med, 197: 1141-1151, 2003; Valenzuela et al., J Immunol, 169: 6842-6849, 2002)。マウスDCの研究は、SOCS1-siRNA形質導入DCによる炎症性サイトカインの産生促進を示している(Shen et al., Nat Biotechnol, 22: 1546-1553, 2004; Evel-Kabler et al., J Clin Invest, 116: 90-100, 2006)。実施例1に記載されているように、ヒトDCをAd-siSSFまたは対照Ad-GFPもしくはAd-SMでトランスフェクトし、トランスフェクション後の異なる時間でサイトカインELISAアッセイのための培地を採取した。図8は、Ad-GFP-DCと比較しての、Ad-siSSF-DCによるIL-12p40、IL-12p70、IFN-γ、IL-6TNF-αなどの代表的炎症性サイトカインの産生促進を示す。
【０２６３】
DCによるサイトカイン産生に対するAd-siSSFトランスフェクションの効果をさらに評価するために、RayBio(登録商標)Human Cytokine Antibody Array(Ray Biotech社、ジョージア州ノークロス)を用いてAd-トランスフェクトDCの培地中の42のサイトカインを検出した。種々の炎症性サイトカインの産生および分泌がAd-siSSFトランスフェクトDCにおいて広くアップレギュレートされていることが見出された(図9)。さらに、ELISAアッセイは、RANTESなどのケモカインがAd-siSSF-DC培養物中で有意に増加していることが見出された(図8)。ELISAデータの支援において、ヒトサイトカインアレイデータは、Ad-siSSFトランスフェクトDCの培地中でMIP3およびRANTESなどのケモカインレベルを上昇させることも示した。総合すれば、これらの結果は、Ad-siSSFのトランスフェクションが、ヒトPBMC由来DCの成熟に加えて、広い炎症性サイトカインおよびケモカインアレイの産生もまた効果的に刺激することを示している。
【０２６４】
実施例５−Ad-siSSF-DCの効率的なトラフィッキング
本実施例において、トランスフェクトされたヒトPBMC由来DCの遊走に対する効果に関して本発明のワクチン組成物の実施形態が試験された。抗原特異的TおよびB細胞をプライミングする所属リンパ節への抗原提示DCの遊走は、免疫した癌患者における抗腫瘍免疫の誘導にとって不可欠である。成熟後のDCは、末梢リンパ管起源のCCR7リガンド、CCL19および/またはCCL21の走化性勾配に応答してリンパ節に遊走するための主なリンパ節ホーミングケモカイン受容体であるCCケモカイン受容体7(CCR7)を発現する(51)。興味深いことに、対照Ad-GFP-DCと比較してAd-siSSFトランスフェクトDC上でケモカイン受容体CCR7レベルが有意にアップレギュレートされていることが観察された(図6)。その結果として、トランスフェクトされた細胞によって発現された、重要なリンパ節ホーミング受容体であるCCR7の有意に高いレベルは、免疫された患者において、所属リンパ節へのAdsiSSF-DCの遊走能をワクチン組成物が高めることができることを示唆している。
【０２６５】
次に、実施例1に記載されているようにして、in vitroでのトランスウェル遊走アッセイを用いてAd-siSSF-DCの遊走能を試験した。ヒトPBMC由来DCをAd-siSSFまたは対照Ad-SMでトランスフェクトし、次いで3連でトランスウェルの上部コンパートメントに加えた。CCR7リガンドである組換えCCL21を下部コンパートメントに加え、次いで3時間のインキュベーション後にAdトランスフェクトDCの遊走率を測定した。図10は、Ad-SM-トランスフェクトDCと比較して、CCL21に応答したAd-siSSF-トランスフェクトDCの有意に(P<0.05)増加した遊走率を示し、これは、恐らくはケモカイン受容体の発現増加の結果としての、免疫された患者の所属リンパ節へのAd-siSSFトランスフェクトDCの増強された遊走能を示唆している。従って、これらの結果は、本発明のワクチン組成物がDCの遊走を効率的に刺激することができ、患者への投与により、DCがリンパ節へ局在化する能力を高めることができることを示唆している
【０２６６】
実施例６−Ad-siSSF-DCのCTLを活性化する活発な免疫刺激力
一側面において、本発明は、種々の抗原を発現している細胞に対するCTL応答を刺激するワクチン組成物を提供する。実施例1に記載されているようにして、in vitroT細胞感作アッセイを用いて、Ad-siSSF-DCの抗原特異的CTLをプライミングする免疫刺激力を試験した。HLA-A2+ヒトPBMC由来DCをAdベクターでトランスフェクトし、次いで自己T細胞と共に2週間共培養した。サバイビンおよびMUC1ペプチドでパルスし、Adでトランスフェクトされなかった自己DCで再刺激後に、IFN-γELISPOTおよび細胞内染色アッセイで共培養物中の抗原特異的T細胞数を測定した。IFN-γ細胞内染色アッセイにより、Ad-SM-DCと比較して、Ad-siSSF-DCとの共培養においてIFN-γ産生CD8+T細胞およびCD4+T細胞の百分率の増加が示された(図11)。これと同様に、Ad-siSSF-DC共培養において、IFN-γELISPOTアッセイによりIFN-γ産生T細胞数の増加が示される(図12)。従って、Ad-siSSFでトランスフェクトされたDCは、抗原特異的CTL応答をプライミングする強力な免疫刺激力を有することをこれらの結果は示している。
【０２６７】
標準51Cr放出アッセイを用いて、ヒト腫瘍細胞に対してプライミングされたT細胞の細胞障害活性をさらに試験した。フローサイトメトリーアッセイにより、ヒト乳腺(MDA-MD-231およびMCF-7)および腎臓(A498)腫瘍細胞はHLA-A2+およびMUC1+である(図13A)のに、ヒト卵巣(SK-OV-3)癌細胞はHLA-A2-およびMUC1+(図13A)であることが示された。これらのすべてのヒト腫瘍細胞株において、RT-PCRにより、細胞内サバイビンの発現が検出された(図13B)。51Cr放出アッセイを行うために、トランスフェクトDCによるin vitro感作の2週間後に、HLA-A2+ドナーからのT細胞を、Adトランスフェクションを行わないMUC1およびサバイビンペプチドパルス自己DCで再刺激し、次いで、種々の割合の標的51Cr標識ヒト腫瘍細胞と共にインキュベートした。Ad-siSSF-DCでプライミングされたHLA-A2+T細胞は、Ad-SM-DCでプライミングされたものよりも、HLA-A2+およびサバイビン/MUC1+ヒト腫瘍細胞(MCF-7、MDA-MB-231およびA498)に対してより強力な細胞障害活性を有していたことを図14は示す。Ad-siSSF-DCでプライミングされたHLA-A2+T細胞がHLA2-サバイビン/MUC1+SK-OV-3細胞を殺すことができないことおよびAd-GFP-DCでプライミングされたHLA-A2+T細胞がこれらのHLA2+、サバイビン/MUC1+MDAMB-231、MCF-7およびA498腫瘍細胞を殺すことができないことにより、細胞障害活性の特異性が示された。総合すれば、ヒト腫瘍細胞を選択的に致死させることができる抗原特異的抗腫瘍CTL応答をプライミングする、本発明のワクチン組成物の強力な免疫刺激力をこれらの結果は示している。
【０２６８】
実施例７−Ad-siSSF-DCによるTreg媒介性抑制の克服
本実施例において、本発明のワクチン組成物の実施形態の、CD4+CD25+Foxp3+調節性T(Treg)細胞による抑制を克服する効果について試験した。Treg細胞は、マウスおよびヒトにおける抗腫瘍免疫を制限する抑制的役割を果たす (Sakaguchi, Nat Immunol, 6: 345-352, 2005)。エフェクターT細胞の増殖および増加は、CD4+CD25+Tregで抑制できる(Sakaguchi, Nat Immunol, 6: 345-352, 2005)。本研究において、Ad-siSSF-DCにおけるGITRLおよびOX40Lレベルは有意に上昇しており(図6)、Ad-siSSF-DCによって高レベルのサイトカイン、例えばIL-6およびTNFαが産生される(図8および9)ことが見出された。これらの炎症誘発性共刺激分子およびサイトカインは、エフェクターT細胞を刺激するばかりでなく、Treg細胞の抑制活性を抑制することも見出された(Pasare et al., Science, 299: 1033-1036, 2003; Peluso et al., J Immunol, 178: 732-739, 2007)。そのようなものとして、実施例1に記載の方法に従って、Ad-siSSFでトランスフェクトされた活性化過剰DCがヒトCD4+CD25high Tregの抑制活性を無効にすることができるかどうかを試験した。自己CD4+CD25high TregをFACSで選別し、次いでAdトランスフェクトDCで5日間共培養した。3Hチミジン取り込みおよびCFSE希釈アッセイは、共に、Ad-siSSF-DCとの共培養後に、CD4+CD25high TregはもはやCD4+CD25-エフェクターT細胞の増殖を抑制できないのに対し、Ad-SM-DCとの共培養後のCD4+CD25high Tregは、なおCD4+CD25-エフェクターT細胞の増殖を効率的に抑制することを示した(図15)。このことは、Treg媒介性免疫抑制を克服するAd-siSSF-DCの特有の能力を示している。
【０２６９】
実施例８−マウスおよびヒトDCにおける炎症性サイトカインおよび共刺激分子のレベルを増強する防御免疫反応のためのアジュバント
本実施例は、TLR5リガンドを含むアジュバントならびにサイトカイン受容体およびTLRシグナル伝達の調節因子のインヒビターであるSOCS1を記述する。マウスおよびヒト樹状細胞の両方による炎症性サイトカイン産生のレベルおよび期間の刺激およびin vivoでの細胞性および体液性免疫反応の両方の活性化において、このアジュバントはTLRアゴニストより激しくより強力かつ持続性である。従って、このアジュバントは、TLRアゴニストまたは自然感染での刺激では達成できない高いレベルまで免疫反応をより強力に追加免疫する特有の能力を有する。その結果として、このアジュバントは、慢性感染と関連する病原体に対する防御免疫反応のための方法に有用である。
【０２７０】
SOCS1-shRNA(shS1)および、Ad-shS1/FliCで表わされるTLR5リガンドである修飾分泌フラジェリン(FliC)を同時発現する組換え複製欠損性アデノウイルスベクターならびに、一団のshS1、shGFPまたは分泌FliC単独を発現する組換えAdベクターを構築した(図16)。FliCは、抗原特異的細胞性および体液性免疫反応を刺激する。複製欠損型アデノウイルスを構築し作成するために、Ad-Easy系(E1およびE3欠失;Quantum Biotechnology社、カリフォルニア州パロアルト)を用いた。実施例1に記載されているように、鋳型としてSalmonella enterica血清型Typhimuriumを用いるPCRによりフラジェリン(FliC)遺伝子を増幅した。マウスshS1CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT(配列番号175)およびヒトshS1CACGCACTTCCGCACATTC(配列番号176)をAdベクターに挿入し、これらの得られたAdベクターのインサートはDNA配列決定によって確認した。
【０２７１】
組換えAdベクターは、DCの高い形質導入（transduction）効率で知られている。Ad-shS1/FliCおよびAd-shS1によるSOCS1をダウンレギュレートする能力は、qRT-PCRおよびウェスタンブロット法によって確認された(図17)。Ad-shS1/FliCおよびAd-FliCで形質導入された骨髄(BM)由来DCによって高濃度のFliCタンパク質が産生された(図18)。
【０２７２】
次に、DCにより発現される炎症性サイトカインおよび共刺激分子のレベルの増強において、Ad-shS1/FliCがAd-shS1およびAd-FliCより強力であるかどうかを試験した。この研究のために、表面TLR5を発現するマウスBM-DC、J774A.1マクロファージおよびD2SC/1 DC(図19)を用いた。Ad-shS1またはAd-FliC-BM-DCと比較して、Ad-shS1/FliCで形質導入されたBM-DCによって、より高いレベルの炎症性サイトカイン、例えばIL-12、IL-6およびTNF-αが産生されることを我々は見出した(図20A)。より高いレベルの表面共刺激分子もまたAd-shS1/FliC-BM-DC上で観察された(図20B)。Adで形質導入されたJ774A.1マクロファージおよびD2SC/1 DCにおいて同様な結果が得られた。このことは、SOCS1サイレンシングおよびTLR刺激の著しい相乗効果を示している。
【０２７３】
アジュバントとして使用するために、イミキモド、ポリI:C（polyI:C）およびCpGなどの多数のTLRアゴニストが開発されている。DCにより産生される炎症性サイトカインおよび共刺激分子の発現レベルの増強において、Ad-shS1/FliCが一般的に用いられるTLRアゴニストより強力であるかどうかを試験した。炎症性サイトカインおよび共刺激分子の発現の刺激において、Ad-shS1/FliCは一般的に用いられるTLRアゴニスト(LPS、ポリI:C、CpGおよびイミキモド)よりも強力であったことを図20Cは示している(データは示さず)。このことは、Ad-shS1/FliCの優れた刺激力を示している。
【０２７４】
抗原提示の時間・強度は、適応免疫反応の強度および記憶の測定に重要なので、種々の刺激で処理されたDCによる炎症性サイトカイン産生時間を比較した。BM-DCを種々のAdベクターで形質導入するかまたはTLRアゴニストで24時間刺激し、次いで刺激物を含まない新鮮な培地で置換した。洗浄の前後に培地におけるサイトカイン濃度を試験した。Ad-shS1/FliC-DCは、洗浄後においてもなお高濃度の炎症性サイトカインを産生したことを図20Dは示している。対照的に、TLRアゴニスト-DCは、洗浄後にサイトカインを活発に産生できなかった。Adで形質導入されたまたはTLRアゴニストで刺激したDCにおける炎症性シグナル伝達のキネティクスを比較することにより、Ad-shS1/FliCがDCにおけるTLRシグナル伝達カスケードを一意的に引き起こし持続させるかどうかもまた試験した。ウェスタンブロット分析により、pIκBαおよびpSTAT4などの重要な細胞内炎症誘発性シグナル伝達分子の長期のリン酸化が示される(データは示さず)。総合的に、Ad-shS1/FliCは、DCによる炎症性サイトカインの長期の産生促進を刺激する特有の能力を有することをこれらのデータは示している。
【０２７５】
このアジュバントの翻訳潜在能力を評価するために、Ad-shS1/FliCがヒトDCの刺激にも効果があるかどうかを試験した。マウスおよびヒトSOCS1配列の不均一性により、我々は、FliCと、ヒトSOCS1 mRNAを効率的にサイレンシングできるヒト(h)shS1-shRNA(>80%低下)を同時発現する組換えベクターAd-shhS1/FliCを作成した。Ad-shhS1/FliCで形質導入されたヒトDCは、Ad-shhS1またはAd-FliCで形質導入されたヒトDCよりも高いレベルの炎症性サイトカインを産生したことを図20Fは示す。Ad-shhS1/FliCで形質導入されたヒトDCは、一般的に用いられるTLRアゴニストで刺激したDCよりも有意に高いレベルのサイトカインを産生することが観察された(図20G)。さらにまた、炎症性サイトカイン産生時間は、Ad-shhS1またはAd-FliCで形質導入されたヒトDCかまたはTLRアゴニストで刺激したヒトDC(図20H&20I)と比較して、Ad-shhS1/FliCで形質導入されたヒトDCにおいて有意に長期であった。SOCS1はヒトDCにおいても重要な役割を果たし、FliC刺激とヒトSOCS1サイレンシングとの組み合わせは、一般的に用いられるTLRアゴニストよりも、より強力に持続的にヒトDCを刺激することをこれらの結果は示している。従って、SOCSのsiRNAインヒビターおよびフラジェリンポリペプチドを含む組成物は、ワクチンアジュバントとして免疫反応の増強に有用である。
【０２７６】
実施例９−in vivoでDCワクチンの効力を高める防御免疫反応のAd-shS1/FliCアジュバント
in vivoでDCワクチンの効力を高めるAd-shS1/FliCの能力を評価した。週に2回、Adベクターで形質導入されるかまたは、最も強力なTLRアゴニストであるLPSで刺激し、モデル抗原オボアルブミン(OVA)または代表的ウイルス抗原(HCV E2)でパルスしたBM-DCで野生型マウス群を免疫した(足蹠)。マウスBM-DCを、250ifuのMOIの組換えAdベクターと同等の量で形質導入するかまたはLPS(100ng/ml)でそれぞれ24時間刺激し、次いでさらに6時間組換えHCV-E2タンパク質(20μg/ml)でパルスした。C57BL/6マウスの複数の群(6マウス/群)を、週に2回、足蹠に、形質導入されるかまたはLPS刺激によるDC(1x106細胞/マウス)で免疫した。
【０２７７】
Ad-shS1/FliC-DCは、OVA特異的(データは示さず)およびHCV E2特異的CD8+CTLおよびCD4+Th応答の誘導において、IFNγ細胞内サイトカイン染色およびELISPOTアッセイで示されるように、Ad-shS10またはAd-FliCで形質導入されるかまたはTLRアゴニストで刺激したDCよりも有意により強力であり、、抗HCV CD8+CTLおよびCD4+Th応答の両方の活性化においてAd-shS1/FliC-DCの優れた効力を示したことを図21A-21Dは示している。
【０２７８】
抗HCV抗体反応を誘導するDCの効力に対するAd-shS1/FliCの刺激作用もまた調べた。Ad-shS1またはAd-FliCで形質導入されるかまたはTLRアゴニストで刺激したDCで免疫したマウスにおける対応するIgGサブクラスと比較して、Ad-shS1/FliC-DCで免疫したマウスにおける全HCV-E2特異的抗体力価の増加を図21Eは示している。HCV E2特異的抗体サブクラスプロフィールは、Ad-shS1/FliC-DCにより誘導されるTh1応答と関連するサブクラスであるIgG2aのより高い力価であるTh1分極IgG応答を示した。
【０２７９】
B細胞を活性化するAd-shS1/FliC-DCの増強された能力を直接に試験するために、B細胞Elispotアッセイを用いて、免疫したマウスにおける抗HCV E2 IgG産生B細胞の頻度を試験した。抗HCV E2 IgG-産生B細胞の頻度は、Ad-shS1またはAd-FliCで形質導入されるかTLRアゴニストで刺激したDCで免疫したマウスよりもAd-shS1/FliC-DCマウスにおいて有意に高かったことを図21Fは示している(P<0.01)。従って、これらの結果は、Ad-shS1/FliC-DCもまた、より効果的にHCV E2特異的B細胞を活性化して、より高い力価の中和抗体を産生することを示している。
【０２８０】
実施例１０−in vivoでDCワクチンの効力を高めるための防御免疫反応用Ad-shA20/FliCアジュバント
複製欠損型アデノウイルスを構築し作成するためにAdEasy系(E1およびE3欠失;Quantum Biotechnology社、カリフォルニア州パロアルト)を用いた。前述のように、PCRにより、ヒトチロシナーゼからのシグナルリーダー配列を有する修飾フラジェリン(fliC)遺伝子を増幅した。マウスshA20配列(CAAAGCACTTATTGACAGA(配列番号177))およびヒト(h)shA20配列(CCATGCACCGATACACACT(配列番号178))を含むpSuperベクターを構築した。pSuper-shA20またはpSuper-shhA20ベクターからのSpeI-消化U6-shA20またはU6-shhA20をSpeI-消化Ad-FliCベクターに挿入することにより、シャトルベクターAd-shA20/FliCおよびAd-shhA20/FliCを構築した。製造業者の使用説明書(Quantum Biotechnology社、カリフォルニア州パロアルト)に従って、U6RNAプロモーターの調節下にあるマウスA20shRNAまたはヒトA20shRNAおよびCMVプロモーターの調節下にあるフラジェリンを同時発現する組換え複製欠損性ウイルスAd-shA20/FliCおよびAd-shhA20/FliCを作成し産生した。これらの組換えアデノウイルスベクターの概略図を図22に示す。分泌FliCタンパク質の発現およびshA20によるA20のダウンレギュレーションは、ウェスタンブロット分析およびqRT-PCRにより、Ad-shA20/FliCおよびAd-shhA20/FliCで形質導入されたBM-DCにおいて明らかにされた。
【０２８１】
最初に、shA20および分泌FliCを同時発現するAd-shA20/FliCが、shA20のみを発現し、Ad-FliCが刺激DCにおいてのみ分泌FliCを発現するAd-shA20よりも優れているかどうかをin vitroで試験した。Ad-shA20/FliCで形質導入されたBM-DCは、Ad-shA20またはAd-FliCで形質導入されたBM-DCよりも高レベルの炎症性サイトカインを産生することが見出された。さらに、shA20/FliCで形質導入されたBM-DCは、ポリI:CおよびCpGなどのTLRアゴニストで刺激したDCよりも高レベルの炎症性サイトカインを産生した。
【０２８２】
次に、shA20および分泌FliCを同時発現するAd-shA20/FliCが、DCワクチンによる抗原特異的TおよびB細胞反応の刺激において、Ad-shA20およびAd-FliCよりも優れているかどうかをin vivoで試験した。HBsAgでパルスし、Ad-shA20/FliCで形質導入したBM-DCは、HBsAgでパルスしAd-shA20またはAd-FliCで形質導入したBM-DCよりも大変強いHbsAg特異的T細胞およびB細胞反応を誘導することが見出された(図23Aおよび図23C)。さらにまたHBsAgでパルスしAd-shA20/FliCで形質導入したBM-DCは、HBsAgでパルスしLPS、ポリI:CおよびCpGなどのTLRアゴニストで刺激したBM-DCよりも大変強いHbsAg特異的T細胞およびB細胞反応を誘導した(図23Bおよび図23D)。
【０２８３】
要約すれば、実施例9および10に示した結果は、TLRおよび下流のサイトカインシグナルの抑制およびTLR刺激の組み合わせは、APCにおける炎症誘発性シグナル伝達カスケード/ループをトリガーし維持する天然の負のフィードバックバリアを破壊することができるという考えを支持する。持続性で増強された炎症性シグナル伝達は、持続的に自然免疫および獲得免疫を活性化する特有の能力をAPCが有するようにしむける。実際、この概念から作成された原型のアジュバントであるAd-siS1/FliCおよびAd-siA20/FliCは、マウスおよびヒトDCにより産生される炎症性サイトカインレベルの刺激において、一般的に用いられるTLRアゴニストよりも強力である。重要なことに、このアジュバントは、DCによる炎症性サイトカインの産生を持続的に一意的に刺激する。我々はさらに、このアジュバントで刺激したDCは、慢性感染と関連する病原体の抗原に対する細胞性および体液性免疫反応の両方の誘導において著しく高められた効力を有することを見出した。この新規アジュバントは、TLRアゴニストまたは自然感染での刺激によっては達成できなかった高いレベルに細胞性および体液性免疫反応の両方の強度および時間を有意に追加免疫し、これは感染症に対する予防用および治療用ワクチンをより効果的に開発するために使用できる。そのようなものとして、負の免疫調節因子のsiRNAインヒビターおよびフラジェリンを含む組成物は、哺乳動物において免疫反応を高める方法に有用である。
【０２８４】
実施例１１−ワクチンアジュバントとしてのFliC-プロタミン融合タンパク質/siRNA複合体
Ad-siRNA/FliCベクターはex vivo治療用DCワクチンのアジュバントとして使用できるが、in vivoアジュバントとしては、Adベクターの免疫原性がその有効性および有用性を限定する恐れがある。個々の患者から調製された自己DCワクチンは、その技術的な難しさおよびこれらの治療と関連する費用の理由から、慢性感染の治療用には使用されない可能性がある。siRNAベース治療剤開発の主な障害は、mRNA分解を仲介する細胞質に細胞膜を介してin vivoでそれを送達することである。従って、本実施例ではワクチンアジュバントとして使用するFliC-プロタミン融合タンパク質/siRNA複合体を記述する(図24)。
【０２８５】
以前の研究においては、核酸の送達のために、組換え二機能性融合タンパク質を作成した。この融合タンパク質は、抗HIV Fab F105抗体(gp120に対する、HIV-1のエンベロープ糖タンパク質)および、標的遺伝子担体として、精子中のDNAを凝集させるDNA結合部分であるプロタミンからなる。Chen et al. Gene Ther 2, 116-23 (1995)を参照のこと。核酸(負電荷)は、共有結合を必要としないで、プロタミンタンパク質(正電荷)と静的に相互作用して可溶性タンパク質-核酸複合体を形成する。これらの複合体は、受容体媒介性エンドサイトーシスにより標的HIV-1感染細胞に特異的に移動させることができる。最近、siRNAオリゴ(負電荷)が、標的HIV-感染細胞への効果的な送達のために抗HIV F105Fab-プロタミン融合タンパク質に効率的に結合できることが見出された(Song et al. Nat Biotech 23、709-717 (2005))。抗ErbB2-プロタミン融合タンパク質もまたsiRNAをErbB2発現乳癌細胞に特異的に効率的に送達することが示された。前の同僚との最近の共同研究において、抗HBsAg一本鎖抗体およびプロタミン融合タンパク質は、HBV遺伝子発現および複製を抑制するために、HBsAg陽性細胞にsiRNA発現プラスミドを効率的に運び入れることが見出された(Wei-Hong et al.,. Hepatology 46、84-94 (2007))。さらに、Peer et al. PNAS 104, 4095-4100 (2007) は、LFA-1を標的とする抗体-プロタミン融合タンパク質はsiRNAを効率的に送達し、初代単球およびDCにおいて特異的にサイレンシングを誘導することを示した。さらに、彼らは、抗インテグリンβナノ粒子中のプロタミン縮合siRNAを用いて全身的に白血球にsiRNAを送達した。総合すれば、これらの研究は、siRNAの標的送達のための担体としてプロタミン融合タンパク質の使用の実現可能性を示している。
【０２８６】
バキュロウイルス発現系(Novagen社)を用いて組換えFliC-プロタミン融合タンパク質を産生した。鋳型としてあらかじめ構築されたプラスミドpCMV-Fab105-プロタミンベクターを用いてオバーラッピングPCRによりPCR増幅したヒトプロタミン遺伝子(aa1〜51)とFliC遺伝子をインフレームで融合した(表6参照)。
【表６】
2011505144.tif 000012
【０２８７】
次いで、バキュロウイルス初期プロモーターの調節下にあるヒスチジンタグ-FliC-プロタミン(P)融合タンパク質の発現のために、FliC-プロタミン融合遺伝子をバキュロウイルストランスファーベクターpBAC(Novagen社)に挿入した(図25)。得られた発現ベクターをDNA配列決定によって確認した。製造業者の説明書に従って、タンパク質発現のための組換えバキュロウイルスを作成するために、昆虫細胞にバキュロウイルストランスファーベクターおよびBacMagic DNAを同時トランスフェクトした。このFliC-P融合タンパク質の推定分子量は約58kdである。融合タンパク質発現を試験するために、3回の凍結融解サイクル後の、FliC-Pバキュロウイルス感染Sf9細胞または対照Sf9細胞の細胞溶解物上清を、抗ヒスチジン抗体および抗ヒトプロタミン抗体を用いてウェスタンブロット分析にかけた。図26は、抗FliC、抗ヒスチジンおよび抗プロタミン抗体による、バキュロウイルス発現系により発現された組換えFliC-P融合タンパク質の特異的認識を示す。
【０２８８】
製造業者の説明書(Novagen社)に従って、3回の凍結融解後のFliC-P-バキュロウイルス感染Sf9細胞溶解物の上清における組換えタンパク質をNi++クロマトグラフィーにより精製した。精製タンパク質をPBSで透析し、次いで濃縮し、-70℃で保存した。前述の研究に記載されているように、融合タンパク質の正電荷プロタミンと負のsiRNAオリゴとの静的相互作用によりFliC-P/siA20オリゴヌクレオチド二本鎖複合体を調剤した。
【０２８９】
二本鎖siRNAオリゴを、融合タンパク質または対照タンパク質(アルブミン)とPBS中モル比6:1で4℃で30分間混合した。インキュベーション後、1mM MgCl2/CaCl2または5mM MgCl2/1mM EDTAの存在下で、タンパク質/siRNA複合体を含む溶液を、RPMI培地1640/10%FCS中で抗原提示細胞(APC)のトランスフェクションに用いた。FliC-P/siYFP-Cy5複合体はマウス骨髄由来DCの約70%をトランスフェクトすることができた。
【０２９０】
次に、マウスAPCにより産生される炎症性サイトカインのレベルの増強において、FliC-P/siA20複合体がFliCおよび他の一般的に用いられるTLRアゴニストよりも強力であるかどうかを試験した。A20-二本鎖siRNAオリゴを組換え(r)FliC-P融合タンパク質、FliCタンパク質またはアルブミン(Sigma社)とモル比6:1で30分間混合した。FliCタンパク質は、Axxora社(cat#ALX-522-058)から購入したサルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella Typhimurium)株14028から単離した。さらなる対照として、GFP-二本鎖siRNAオリゴはFliC-P融合タンパク質とも混合した。マウスBM由来DC(1x106/ml)を、FliC-P/siRNA複合体、FliC-P/siGFP複合体、FliC-P単独またはFliC単独と、それぞれ3連で48〜72時間処理した。代表的サイトカイン(BD)のELISAアッセイのために培地を採取した。BM-DCによる炎症性サイトカインの産生の刺激において、FliC-P/siA20複合体はFliC-P/siGFP複合体、FliC-P単独およびFliC単独よりも強力であったが、これはAPCによる炎症性サイトカインTNF-αおよびIL-6の産生促進のためのFliC-P/siA20複合体を優れた刺激力を示している(それぞれ図27Aおよび27B)。そのようなものとして、負の免疫調節因子siRNAインヒビターおよびプロタミンポリペプチドに結合されているフラジェリンポリペプチドを含む組成物は、それを必要とする哺乳動物において、免疫反応を高める方法に有用である。
【０２９１】
実施例１２−本発明の組成物を用いるDC細胞のex vivo刺激を含む治療的アプローチ
本発明のワクチン組成物は、癌などの特定の疾患の治療に有用である。本実施例において、サバイビンまたはMUC1抗原を発現している癌を有する被験者が細胞ワクチンを用いて治療される。細胞ワクチンは、治療を必要とする患者からDCを単離および/または増殖させることにより作成し、Ad-siSSFでDCをトランスフェクトし、次いで患者にDCが再導入する。特に、患者からDCを増殖または単離し、SOCS1インヒビター、分泌シグナル配列に作動可能に連結されたフラジェリンポリペプチドならびにドミナントネガティブサバイビン変異体およびMUC1を含む抗原融合タンパク質を発現するベクターでトランスフェクトされる(すなわち、in vitroで形質導入またはトランスフェクトされる)。
【０２９２】
実施例１３−本発明の組成物を用いるin vivoワクチン接種を含む治療的アプローチ
ex vivo免疫のための細胞ワクチンの使用に加えて、本発明はまた、患者における抗原に対する免疫反応を誘導するin vivo免疫のための組成物および方法を提供する。本実施例において、サバイビンまたはMUC1抗原を発現している癌を有する被験者が、SOCS1インヒビター、分泌シグナル配列に作動可能に連結されたフラジェリンポリペプチドならびにドミナントネガティブサバイビン変異体およびMUC1を含む抗原融合タンパク質を発現するベクターを患者に投与することにより治療される。
【０２９３】
均等物
本発明は、本願において記載された、本発明の個々の側面の個々の例示として意図した特定の実施形態に限定されるべきではない。当業者に明らかなように、その精神および範囲から逸脱することなく本発明の多くの修飾および変更を行うことができる。本明細書に列挙したものに加えて、本発明の範囲内の、機能的に同等な方法および組成物は、前述の説明から当業者に明らかであろう。このような修飾および変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。本発明は、添付の特許請求の範囲の用語および前記特許請求の範囲の権利が与えられる均等物の全範囲によってのみ限定されるべきである。本発明は、特定の方法、試薬、化合物組成物または生物系に限定されるものではなく、これらはもちろん変更できることが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語法は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであって、限定するものではないこともまた理解されるべきである。
【０２９４】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲において示される。
【図１】
2011505144.tif 000013
【図２】
2011505144.tif 000014
【図３Ａ】
2011505144.tif 000015
【図３Ｂ】
2011505144.tif 000016
【図３Ｃ】
2011505144.tif 000017
【図４】
2011505144.tif 000018
【図５】
2011505144.tif 000019
【図６】
2011505144.tif 000020
【図７】
2011505144.tif 000021
【図８】
2011505144.tif 000022
【図９】
2011505144.tif 000023
【図１０】
2011505144.tif 000024
【図１１】
2011505144.tif 000025
【図１２】
2011505144.tif 000026
【図１３Ａ】
2011505144.tif 000027
【図１３Ｂ】
2011505144.tif 000028
【図１４】
2011505144.tif 000029
【図１５Ａ】
2011505144.tif 000030
【図１５Ｂ】
2011505144.tif 000031
【図１６】
2011505144.tif 000032
【図１７】
2011505144.tif 000033
【図１８】
2011505144.tif 000034
【図１９】
2011505144.tif 000035
【図２０Ａ】
2011505144.tif 000036
【図２０Ｂ】
2011505144.tif 000037
【図２０Ｃ】
2011505144.tif 000038
【図２０Ｄ】
2011505144.tif 000039
【図２０Ｅ】
2011505144.tif 000040
【図２０Ｆ】
2011505144.tif 000041
【図２０Ｇ】
2011505144.tif 000042
【図２０Ｈ】
2011505144.tif 000043
【図２０Ｉ】
2011505144.tif 000044
【図２１Ａ】
2011505144.tif 000045
【図２１Ｂ】
2011505144.tif 000046
【図２１Ｃ】
2011505144.tif 000047
【図２１Ｄ】
2011505144.tif 000048
【図２１Ｅ】
2011505144.tif 000049
【図２１Ｆ】
2011505144.tif 000050
【図２２】
2011505144.tif 000051
【図２３Ａ】
2011505144.tif 000052
【図２３Ｂ】
2011505144.tif 000053
【図２３Ｃ】
2011505144.tif 000054
【図２３Ｄ】
2011505144.tif 000055
【図２４】
2011505144.tif 000056
【図２５】
2011505144.tif 000057
【図２６】
2011505144.tif 000058
【図２７Ａ】
2011505144.tif 000059
【図２７Ｂ】
2011505144.tif 000060
【配列表】
2011505144000001.app
【国際調査報告】
2011505144.tif 000061
2011505144.tif 000062