(57)【要約】本発明は、その表面にコア−１抗原を発現しているＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物に関する。これらの微生物はコア−１陽性疾患の予防および処置のために特に有用であり、具体的には、安定で均一な高いコア−１発現を特徴とする。それぞれのコア−１陽性微生物またはその画分を含む薬学的組成物も提供される。例えば、少なくとも１つのコア−１特異的抗体によって認識される、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分が提供される。
2014529403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのコア−１特異的抗体によって認識される、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分。
【請求項２】
Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ（ＤＳＭ２５００４）、それに由来する微生物またはＣｏｒｅｏｔｉｃｓホモログである、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓに由来する微生物または該Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓホモログが、以下の特性：
ａ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓの種に属すること；
ｂ）ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓおよび／またはＤＳＭ１８８３６として寄託されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓに対して少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％のＤＮＡ間の関連性を示すこと；
ｃ）ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓおよび／またはＤＳＭ１８８３６として寄託されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓに対して少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％もしくは少なくとも９９．５％、より好ましくは１００％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性のレベルを示すこと；ならびに／または
ｄ）以下の特性：
ｉ）ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１発現の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の平均コア−１抗原発現を有すること；
ｉｉ）実施例２に記載のＥＬＩＳＡアッセイにおいて平均で少なくとも０．３、好ましくは少なくとも０．３５の吸光度値を実現すること；
ｉｉｉ）細胞表面に、図４の構造＃１、構造＃２、構造＃３、構造＃４および構造＃５、その類似構造、および／もしくはその反復単位からなる群から選択される少なくとも１つの炭水化物構造を発現していること；
ｉｖ）該微生物の細胞培養物中で、該微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、より好ましくは約１００％が、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１抗原発現の少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％のコア−１抗原発現レベルを有すること；および／もしくは
ｖ）該微生物の細胞培養物中で、該微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、より好ましくは約１００％が、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１抗原発現の７０％から１５０％まで、好ましくは７５％から１２５％までの範囲内のコア−１抗原発現レベルを有すること
の１つもしくは複数を有するコア−１抗原発現を示すこと
の２つ以上を有する、請求項２に記載の微生物。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の微生物であって、
以下の特性：
ａ）実施例２に記載のＥＬＩＳＡアッセイにおいて平均で少なくとも０．３、より好ましくは少なくとも０．３５の吸光度値を有すること；
ｂ）ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１発現の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の平均コア−１抗原発現を有すること；
ｃ）図４の構造＃１、構造＃２、構造＃３、構造＃４および構造＃５、その類似構造、および／もしくはその反復単位からなる群から選択される少なくとも１つの炭水化物構造を含むこと；
ｄ）短鎖脂肪酸を産生することができること；ならびに／または
ｅ）細胞培養物中で、該微生物が以下の特性：
ｉ）該細胞培養物中の該微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、より好ましくは約１００％が、
ａａ）該細胞培養物中の該微生物の平均コア−１抗原発現レベルの少なくとも７５％であり、かつ／もしくは
ｂｂ）ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１抗原発現の少なくとも７５％である
コア−１抗原発現レベルを有すること；
ｉｉ）該細胞培養物中の該微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、より好ましくは約１００％が、
ａａ）該細胞培養物中の該微生物の平均コア−１抗原発現レベルの７０％から１５０％まで、好ましくは７５％から１２５％までの範囲内であり、かつ／もしくは
ｂｂ）ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１抗原発現の７０％から１５０％まで、好ましくは７５％から１２５％までの範囲内である
コア−１抗原発現レベルを有すること
の少なくとも１つを有すること
の１つまたは複数を有するコア−１抗原発現を有する、微生物。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の微生物であって、
少なくとも１つのコア−１特異的抗体を適切な結合条件下で該微生物またはその溶解物もしくは画分と接触させると、該コア−１特異的抗体が該微生物またはその溶解物もしくは画分を認識し、したがって該微生物またはその溶解物もしくは画分に結合し、該コア−１特異的抗体と該微生物または該その溶解物もしくは画分との該結合が、以下の特性：
ａ）該コア−１特異的抗体が以下の抗体：
ｉ）ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号１によるアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号２によるアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｈ３として配列番号３によるアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号４によるアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号５によるアミノ酸配列およびＣＤＲ−Ｌ３として配列番号６によるアミノ酸配列からなるＣＤＲのセットを有する抗体；
ｉｉ）ＣＤＲ−Ｈ１として配列番号７によるアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｈ２として配列番号８によるアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｈ３として配列番号９によるアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｌ１として配列番号１０によるアミノ酸配列、ＣＤＲ−Ｌ２として配列番号１１によるアミノ酸配列およびＣＤＲ−Ｌ３として配列番号１２によるアミノ酸配列からなるＣＤＲのセットを有する抗体；
ｉｉｉ）抗体Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ１および
ｉｖ）抗体Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ２
の群から選択されること；
ｂ）該微生物または該その溶解物もしくは画分に少なくとも２つのコア−１特異的抗体が結合し、該少なくとも２つの異なる抗体が異なるエピトープを認識し、請求項５ａ）において定義される抗体、特に抗体ｉ）およびｉｉ）または抗体ｉｉｉ）およびｉｖ）の群から好ましくは選択されること；
ｃ）該少なくとも１つのコア−１特異的抗体と該微生物または該その溶解物もしくは画分との結合が、過ヨウ素酸処理後に該結合が低下しもしくは存在しないという点で過ヨウ素酸感受性であること；ならびに／または
ｄ）該微生物または該その溶解物が、該コア−１抗原を露出した形態で含み、該露出したコア−１抗原が他の構造によって、特に他の炭水化物構造によってマスクされていないこと
の１つまたは複数を満たす、微生物。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか一項に記載のコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を含む組成物。
【請求項７】
前記組成物中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の前記コア−１陽性微生物が、請求項４および／または５で定義されるコア−１抗原発現を特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物中の前記コア−１陽性微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％、より好ましくは約１００％が、
ａ）該組成物中の全てのコア−１陽性微生物の平均コア−１抗原発現レベルの少なくとも７５％、および／もしくはＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１抗原発現の少なくとも７５％、ならびに／または
ｂ）該培養物中の全てのコア−１陽性微生物の平均コア−１抗原発現レベルの７０％から１５０％まで、好ましくは７５％から１２５％までの範囲内、および／もしくはＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１抗原発現の７０％から１５０％まで、好ましくは７５％から１２５％までの範囲内
であるコア−１抗原発現レベルを有する、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項６から８までのいずれか一項に記載の組成物であって、
以下の特性：
ａ）該組成物が細胞培養物であること、および／または
ｂ）該組成物中の１つもしくは複数の前記コア−１陽性微生物が、生育可能な形態、非生殖形態、生育不能な形態または溶解された形態で存在すること
の１つまたは複数を有する、組成物。
【請求項１０】
ｉ）請求項１から５までのいずれか一項に記載のコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分
および／または
ｉｉ）請求項６から９までのいずれか一項に記載の組成物
を含む薬学的組成物。
【請求項１１】
前記コア−１抗原に対する免疫応答を誘導および／または増強するための、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
好ましくはコア−１陽性腫瘍、がん、胃腸障害および／またはコア−１陽性疾患を処置または予防するための医薬において使用するための、請求項１から５までのいずれか一項に記載のコア−１陽性微生物またはその溶解物もしくは画分、請求項６から９までのいずれか一項に記載の組成物、または請求項１０もしくは１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
コア−１陽性生成物を製造するための方法であって、
ａ）請求項１から５までのいずれか一項に記載のコア−１陽性微生物を提供するステップと、
ｂ）必要に応じて、該コア−１陽性微生物を加工して、そのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を得るステップと、
ｃ）該コア−１陽性微生物および／または該そのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を該コア−１陽性生成物の製造において使用するステップと
を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、
前記コア−１陽性生成物が抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞であり、ステップｃ）が、該抗原提示細胞に前記コア−１陽性微生物および／または前記そのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性断片を負荷するステップを含む、方法。
【請求項１５】
コア−１特異的免疫応答を誘導もしくは増強するため、ならびに／またはコア−１に対する抗体力価を誘導するため、ならびに／または機能的な抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞、および／もしくは活性化Ｔ細胞、Ｔ細胞系もしくはＴ細胞クローンまたはコア−１に対する抗体を生成するための、請求項１から５までのいずれか一項に記載のコア−１陽性微生物および／またはそのコア−１陽性溶解物および／またはそのコア−１陽性画分のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原提示微生物に関する。具体的には、表面にコア−１抗原を保有するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物が提供される。さらに、本発明は、医学におけるこれらの微生物の使用ならびに前記微生物を含有する生成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
異常なグリコシル化はがん細胞の典型的な特徴である。したがって、糖タンパク質および糖脂質上の炭水化物腫瘍抗原は能動免疫療法および受動免疫療法の標的である。これらの極めて豊富な抗原は、腫瘍細胞の複雑なグリコシル化器官における変化に起因して新規に発現される、または上方制御される。種々の脂質またはタンパク質と結合した炭水化物腫瘍抗原、例えば、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、フコシル化ＧＭ１、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、Ｌｅｙおよびムチンコア構造Ｔｎ、シアリル−Ｔｎおよびトムソン−フリーデンライヒ（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ）抗原が記載されている。
【０００３】
トムソン−フリーデンライヒ抗原（ＴＦ）は、一連の報告において腫瘍抗原として記載されている公知の炭水化物構造である。ＴＦは、ＴＦアルファおよびＴＦベータの２つの形態で存在し、タンパク質または糖脂質と結合することができる。
【０００４】
コア−１は二糖Ｇａｌ−β１，３−ＧａｌＮＡｃであり、具体的には癌細胞におけるタンパク質のヒドロキシアミノ酸であるセリンまたはトレオニンとアルファ−アノマー立体配置でＯ−グリコシド結合している。コア−１はトムソン−フリーデンライヒのＴＦ−アルファ構造に対応し、腫瘍上のタンパク質とのみ結合する。したがって、コア−１およびトムソン−フリーデンライヒという用語は、必ずしも同一の構造を指すのではない。
【０００５】
コア−１は、健康な組織および良性の疾患組織では他の炭水化物構成成分によってマスクされているが、大多数の癌およびいくつかの非上皮性悪性腫瘍では覆われていない。したがって、コア−１は、特異的な汎癌（ｐａｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ）抗原である。
【０００６】
コア−１は重要な腫瘍抗原である。コア−１は、主要な結腸癌の６０％超および結腸がんからの肝転移の９０％超において、ならびに、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、および他の消化器がんを含めた他の主要な適応の癌の大多数、例えば、胃癌（gastric  carcinoma）および膵癌（pancreatic  carcinoma）などにおいて発現される。コア−１は結腸癌を有する患者についての独立した予後マーカーであり、コア−１発現の強さが増すにしたがって、死亡率が増加し、生存期間中央値（ｍｅｄｉｕｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）が低下する。肝転移の発生はコア−１の発現と相関する。コア−１陽性原発癌を有する患者では、症例のほぼ６０％で肝転移が発生するが、コア−１陰性腫瘍の肝転移の危険性は有意に低い（２０％未満）。肝臓への転移を媒介することに加えて、コア−１は、内皮を介した転移においても役割を果たし得る。
【０００７】
例外的に高い汎癌（ｐａｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍｉｃ）特異性、予後の関連性および肝転移における直接関与により、トムソン−フリーデンライヒ、特にコア−１ががん免疫療法の第一の標的となる。
【０００８】
コア−１が広く分布していることの結果として、例えば、がんの予防および処置において、特にワクチン接種のための医薬品として使用することができる、コア−１に対応する細胞表面構造を有するコア−１陽性微生物を提供することが有利である。
【０００９】
トムソン−フリーデンライヒに基づく治療的アプローチを提供するための試みが行われた。例えば、Shigoekaら（１９９９年）は、マウスモデルにおける、抗トムソン−フリーデンライヒ特異的モノクローナル抗体による、ノイラミニダーゼ（neuramidase）処理した結腸２６細胞からの肝転移の阻害について記載している。しかし、高度に特異的な抗ＴＦ抗体を生成することが難しいことに起因して、また、単一の結合ドメインの内因性の親和性が比較的低いＩｇＭアイソタイプとしてのそれらの特質が原因で、これまでＴＦ特異的抗体のさらなる開発はなされていない。さらに、いくつかの抗ＴＦ抗原抗体は、腫瘍細胞の望ましくない増殖を引き起こすので、臨床的に有用ではない。特許文献１（国際公開第２００６／０１２６２６号）にも抗ＴＦ抗原抗体の治療的な使用が記載されている。ＴＦ特異的抗体の結合により、腫瘍細胞の増殖が阻害されることが示されている（Jeschkeら（２００６年））。
【００１０】
さらに、トムソン−フリーデンライヒに基づくワクチンを開発するための試みも行われた。それらの大部分では、抗体応答を誘導することに焦点がおかれた。例えば、LivingstonおよびLloyd（２０００年）は、合成ＴＦをＫＬＨと無作為にカップリングした非天然ＴＦコンジュゲートを使用した。このコンジュゲートにより、合成ＴＦに対しては体液性免疫応答が生じたが、天然リガンド上のＴＦに対しては生じなかった（Adluriら（１９９５年））。したがって、これらは腫瘍構造物上のＴＦを認識しなかったので、ＴＦ特異的ではなかった。
【００１１】
ＳｐｒｉｎｇｅｒおよびＤｅｓａｉは、Ｏ型赤血球由来糖タンパク質およびＭＮ型赤血球由来糖タンパク質で構成されるＴ／Ｔｎワクチンを使用したワクチン接種を用い、その結果、少量のＩｇＭが作られただけであったが、乳がん患者の生存率が改善された。しかし、ＩｇＭが示す成熟した免疫応答は小さく、また、ＴＦ−Ａｇに対する抗体に関する多くの以前の試験はＩｇＭ抗体を伴い、したがって、より著しい高度にＴＦ特異的な免疫応答、好ましくはＩｇＧ応答が必要とされる。
【００１２】
推定上ＴＦ陽性である微生物について記載されたわずかな報告が公知である。例えば、Springerら（Brit  J  Haematol  ４７巻（１９８１年）、４５３〜４６０頁；Transfusion  １９巻（１９７９年）、２３３〜２４９頁）では、ニワトリおよびヒトにおいて、ヒト赤血球上のＴＦも認識することができるポリクローナル抗体応答を生じることができる好気性微生物（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ８６）について報告されている。Ｓｐｒｉｎｇｅｒは、免疫応答の特異性を大まかに決定するために、シアリダーゼ処理したＴ赤血球を用いた抗Ｔの吸着および赤血球凝集アッセイを用いた。しかし、ヒト赤血球をシアリダーゼ処理することにより、ＴＦ、特にコア−１だけに限らないが、炭水化物エピトープのうちのいくつかの炭水化物エピトープが脱マスキングされる。したがって、Ｓｐｒｉｎｇｅｒが試験した反応では、交差反応性に起因して、ＴＦ、特にコア−１に対する特異性は示されない。それぞれの非特異的な微生物は、ＴＦに対して特異的に指向とする強力な免疫応答を生じないが、類似したＴＦ様構造物に対して指向し、したがって、潜在的に、体の非腫瘍組織または細胞に対してもますます指向するので、その非特異性に起因してワクチンとして限られた適合性しか有さない。さらに、試験により、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ８６にはコア−１特異的抗体が結合しないので、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ８６はコア−１発現について陽性ではないことが示された。
【００１３】
特許文献２（国際公開第２００８／０５５７０３号）には、コア−１陽性微生物、特に、細胞表面にコア−１抗原を発現しているＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ種の微生物、例えば、ＡＧ６およびＭＵ１、ならびに医薬品としてのそれらの使用が開示されている。コア−１特異的抗体と前記微生物の結合によってコア−１抗原の発現が確認された。さらに、ＷＯ２００８／０５５７０３には、治療におけるそれぞれの微生物の使用が開示されている。
【００１４】
コア−１陽性微生物を医薬品として使用する場合、コア−１陽性微生物は、コア−１特異的免疫応答を有効に刺激するために、コア−１抗原を発現するだけでなく、高いコア−１抗原発現を示すことが望ましい。さらに、医薬品として使用するために選択されるコア−１陽性微生物は、安定であり、好ましくは均一である高いコア−１抗原発現を有することが望ましい。安定な高いコア−１抗原発現により、コア−１陽性微生物を含有する生成物が、特に医薬品の分野で生成物の品質にとって重要である低い変動性を示すことが確実になる。安定な高いコア−１抗原発現は、規制要件を満たすためにも重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２００６／０１２６２６号
【特許文献２】国際公開第２００８／０５５７０３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、本発明の目的は、代替のコア−１陽性微生物、具体的には、細胞表面に安定な高いコア−１抗原発現を有する微生物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のコア−１陽性微生物を見いだした。微生物は、コア−１特異的抗体が、接触した際に前記微生物に特異的に結合する場合に、コア−１陽性であり、したがって、その表面にコア−１抗原を発現している。
【００１８】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の新規の種であり、Chassardら（「Bacteroides  xylanisolvens  sp.  Nov.,  a  xylan-degrading  bacterium  isolated  from  human  faeces」；International  Journal  of  Systematic  and  Evolutionary  Microbiology（２００８年）；５８巻、１００８〜１０１３頁）により初めて記載された。これは、ヒト糞便から単離することができるキシラン分解細菌であり、したがって、ヒト共生微生物である。これは、一般に病原性が低いグラム陰性桿菌である。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓは、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）にＤＳＭ１８８３６として寄託され、そこから公的に入手可能である。コア−１特異的抗体を用いた実験によって示された通り、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ（ＤＳＭ１８８３６）はコア−１抗原を発現しない。前記コア−１特異的抗体はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ（ＤＳＭ１８８３６）を認識せず、したがって、それに結合しなかった。これにより、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓがコア−１抗原を発現しておらず、したがってコア−１陽性ではないことが証明される。したがって、本発明者らがＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のコア−１陽性微生物を同定することができたことは非常に驚くべきことであった。さらに、本発明者らは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のコア−１陽性微生物が、コア−１抗原が高量で発現されるだけでなく、発現が非常に安定であり、さらに均一でもあるので、有利なコア−１抗原発現プロファイルを示すことを見いだした。緒言において考察されている通り、安定な高いコア−１抗原発現は、特に医薬品の分野においてコア−１陽性微生物を使用する場合に重要な利点である。例えば、安定かつ均一な、高いコア−１発現を有する微生物を用いて製造された生成物は、一定した高いコア−１含有量を有する。したがって、所望のコア−１レベルを有する生成物を作製するために必要になる微生物は少量であり、また、これらの微生物により、一定した生成物の品質および欠陥の少ない生成物が提供される。したがって、コア−１抗原発現に関する特別な特性に起因して、本発明のコア−１陽性微生物は、医薬品の分野において使用するために特に適している。前記微生物のコア−１陽性溶解物および／またはコア−１陽性画分に同じことが当てはまる。
【００１９】
したがって、本発明のコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分は、例えば、コア−１発現に関連する疾患、具体的には、例えば、腫瘍細胞などのがん細胞でコア−１が発現されているがんの予防法および処置において使用することができる。患者に投与されると、本発明のコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分は、コア−１に対する免疫応答を刺激することができ、次いで該疾患のコア−１陽性細胞にも対抗する。コア−１抗原発現プロファイルが高く安定であるので、誘導および／または増強された免疫応答は非常に強力である。本発明による微生物の安定な高いコア−１抗原発現により、同じ量の本発明によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を使用した場合に有意なバッチ間の変動を伴わずに一定のコア−１活性／発現がさらに提供される。本発明の微生物は安定な高いコア−１抗原発現を有し、したがって、むしろ一定の量のコア−１抗原が提供されるので、これにより最終生成物の品質も改善され、それぞれに欠陥の少ない生成物がもたらされる。本発明による微生物によってもたらされる高く均一な量のコア−１抗原により、免疫応答を引き出すために必要な微生物の量を減らすことも可能になる。
【００２０】
さらに、本発明による微生物は病原性を有さず、したがって、特に、ヒトに投与した場合に有害な副作用を引き起こす高い危険性を伴わずに投与することができる。さらに、病原性が低いので、本発明による微生物の製造、流通および市販に関する法的規制による重大な制限はなく、したがって、ほとんど労力をかけずに履行することができる。具体的には、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ２０００／５４／ＥＣおよびＧｅｒｍａｎ「Ｂｉｏｓｔｏｆｆｖｅｒｏｒｄｎｕｎｇ」に従って、リスク群１の生物学的製剤に分類される。リスク群１は４つのリスク群で最も低く、ヒト疾患を引き起こしそうにない生物学的製剤に関する。他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの種の微生物も含めた多くの他の微生物はまたより高いリスク群に分類される（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓは、リスク群２の生物学的製剤である）。さらに、実施例において実証されている通り、特に、本発明による微生物は、最も重要なビルレンス因子であるプラスミドＤＮＡ材料ならびに関連する細胞外酵素および病原性因子の大部分について陰性であり、ヒト結腸の上皮細胞に付着しない。さらに、本発明による微生物は、マウスにおける毒物学的試験で有害作用を示さず、また、３週間にわたって８．５＊１０１１ＣＴＣ１までの日用量を摂取したヒトにおいていかなる特質の有害作用も示さなかった。したがって、本発明による微生物は、非常に高い安全性基準を満たし、望ましくない副作用の危険性を伴わずにヒトが消費することができる。さらに、本発明による微生物は、種々の抗生物質に対して感受性であることが好ましく、したがって、必要であれば容易かつ有効に排除することができる。
【００２１】
さらに、本発明による微生物の安定かつ均一なコア−１発現を生成物の品質についてのマーカーとして使用することができる。天然の微生物、具体的には最終生成物中には望ましくない微生物は、一般にコア−１を発現しないので、コア−１含有量を本発明による所望の微生物についての特異的なマーカーとして使用することができる。特に、コア−１含有量を本発明による微生物を含有する微生物の培養物の均一性についてのマーカーとして使用することができ、かつ／または培養物中の本発明による微生物の量についてのマーカーとして使用することができる。さらに、他のコア−１陽性微生物と比較して、安定かつ均一な、高いコア−１発現を有する本発明による微生物の作製は改善されている。なぜなら、より短い時間およびより少ない培養ステップで十分な量のコア−１陽性微生物が得られるからである。さらに、コア−１陽性微生物を富化するための作製ステップは必要ない。具体的には、本発明によるコア−１陽性微生物の作製は、栄養補給相（ｆｅｅｄｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）を伴わない単純なバッチ培養を用いて、またはただ１つの栄養補給相を用いて実施することができる。
【００２２】
したがって、第１の態様では、本発明は、少なくとも１つのコア−１特異的抗体によって認識される、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を提供する。
【００２３】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を含む組成物を提供する。一実施形態によると、前記組成物は細胞培養物である。
【００２４】
第３の態様では、本発明は、医学において使用するための、本発明の第１の態様による微生物または本発明の第２の態様による組成物を提供する。
【００２５】
第４の態様によると、本発明の第１の態様によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分および／または本発明の第２の態様による組成物を含む薬学的組成物が提供される。
【００２６】
第５の態様によると、本発明は、
ａ）本発明の第１の態様によるコア−１陽性微生物を提供するステップと、
ｂ）必要に応じて、前記コア−１陽性微生物を加工して、そのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を得るステップと、
ｃ）前記コア−１陽性微生物および／または前記そのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分をコア−１陽性生成物の製造において使用するステップと
を含む、コア−１陽性生成物を製造するための方法を提供する。
【００２７】
以下の記載および添付の特許請求の範囲から、本発明の他の目的、特徴、利点および態様が当業者に明らかになる。しかし、適用の好ましい実施形態が示されている以下の記載、添付の特許請求の範囲、および特定の実施例は、単に例示として示されていることが理解されるべきである。以下を読むことにより、開示されている本発明の主旨および範囲に入る種々の変化および改変が当業者には容易に明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のコア−１陽性微生物を見いだした。したがって、第１の態様では、本発明は、少なくとも１つのコア−１特異的抗体によって認識される、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を対象とする。上記の通り、驚いたことに、コア−１抗原を発現するＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物が存在すること、さらに、これらの微生物は、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓなどの他のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ種のコア−１陽性微生物によっては実現されない安定な高いコア−１抗原発現を示すという点で有利なコア−１抗原発現プロファイルを示すことが見いだされた。
【００２９】
本発明によるコア−１陽性微生物はコア−１抗原を保有する。「コア−１抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、特に、コア−１特異的抗体が認識し、したがって特異的に結合する抗原を指す。コア−１特異的抗体による結合は、コア−１特異的抗体を適切な結合条件下でコア−１抗原、それぞれコア−１抗原を保有する微生物および／またはコア−１抗原を保有するその溶解物もしくは画分と接触させることによって試験することができる。適切なコア−１特異的抗体は先行技術において公知であり（例えば、ＷＯ２００８／０５５７０３を参照されたい）、本明細書にも記載されている。本発明による微生物のコア−１抗原に、それぞれがコア−１抗原の別のエピトープを認識する少なくとも２つのコア−１特異的抗体が結合することが好ましい。コア−１抗原は本発明による微生物の表面に、露出した形態で存在することが好ましい。露出したとは、具体的には、コア−１抗原に周囲の媒体が接近することができ、したがって、接触させるとコア−１特異的抗体が結合することができることを意味する。露出したコア−１抗原は、例えば、他の構造、特に他の炭水化物構造に埋もれていない、したがって、それにマスクされていない。本発明によるコア−１陽性微生物に存在するコア−１抗原は、腫瘍上のタンパク質に見いだされる天然のコア−１と必ずしも同一ではない（天然のコア−１に関する記載については上記を参照されたい）。本発明に関して、本発明による微生物のコア−１抗原にはコア−１特異的抗体が結合することにより、前記コア−１抗原は、コア−１構造を模倣することができ、それにより、コア−１特異的免疫応答を刺激することができることが確実になるので、本発明による微生物のコア−１抗原にはコア−１特異的抗体が結合することだけが決定的である。本発明による微生物のコア−１抗原は炭水化物構造である、または炭水化物構造を含むことが好ましい。好ましい実施形態によると、本発明による微生物によって発現されるコア−１抗原は、コア−１二糖構造Ｇａｌ−ベータ１，３−ＧａｌＮＡｃを含む。コア−１抗原は、通常、骨格構造、好ましくは糖類構造、特にオリゴ糖構造または多糖構造と結合している。コア−１二糖構造Ｇａｌ−ベータ１，３−ＧａｌＮＡｃと骨格構造との間の結合はアルファ−アノマー型であることが好ましい。ベータ−アノマー型は別の選択肢である。この結合はグリコシド結合であることが好ましい。（好ましくはアルファ−アノマー型）グリコシド結合は、例えば、コア−１抗原のＧａｌ−ベータ１，３−ＧａｌＮＡｃ構造と骨格構造のＧａｌＮＡｃ分子との間に確立することができる。好ましい実施形態によると、コア−１抗原は本発明による微生物の莢膜多糖の分岐構造内に存在する。
【００３０】
本発明によると、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物とは、具体的には、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に属し、好ましくは以下の特性：
ａ）ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ＤＳＭ１８８３６またはＤＳＭ２５００４として寄託されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓに対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％のＤＮＡ間の関連性を示すこと；
ｂ）ＤＳＭ１８８３６またはＤＳＭ２５００４として寄託されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓに対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性のレベルを示すこと；
ｃ）以下の特性：
ｉ）ＤＳＭ１８８３６として寄託されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓと同様に、デンプンを分解することができないこと；
ｉｉ）マンニトール、特にＤ−マンニトール、メレジトースおよび／もしくはソルビトール、特にＤ−ソルビトールを使用および／もしくは代謝する能力、ならびに／またはグリセロールから酸を産生する能力を有すること；
ｉｉｉ）グルタミルグルタミン酸アリールアミダーゼ活性を発現すること；
ｉｖ）インドールを産生することができないこと；
ｖ）カタラーゼ活性を示さないこと
の１つもしくは複数を有すること；ならびに／または
ｄ）以下の特性：
ｉ）嫌気性微生物であること；
ｉｉ）非胞子形成性であること；
ｉｉｉ）非運動性であること；および／もしくは
ｉｖ）グラム陰性であること
の１つもしくは複数を有すること
の１つまたは複数を有する微生物を指す。
【００３１】
上で定義されている基準ａ）〜ｄ）の少なくとも２つまたは少なくとも３つ、より好ましくは全てが満たされることが好ましい。
【００３２】
「ＤＮＡ間の関連性」という用語は、具体的には、De  Leyら（１９７０年）  Eur.  J.  Biochem.  １２巻、１３３〜１４２頁またはHussら（１９８３年）Syst.  Appl.  Microbiol.  ４巻、１８４〜１９２頁によるＤＮＡ間ハイブリダイゼーション／復元アッセイによって測定される、２つの微生物のゲノムＤＮＡまたはＤＮＡ全体の類似性の百分率を指す。具体的には、ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイをＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅによって実施することが好ましい。一実施形態では、ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイを下の実施例１．３に記載の通り実施する。
【００３３】
「１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性」という用語は、具体的には、第１の微生物の１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の核酸配列の領域と第２の微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列の対応する領域との間の、同一のヌクレオチドの百分率を指す。領域は、少なくとも１００個の連続したヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２００個の連続したヌクレオチド、少なくとも３００個の連続したヌクレオチドまたは少なくとも４００個の連続したヌクレオチド、最も好ましくは約４８０個の連続したヌクレオチドを含むことが好ましい。一実施形態では、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の核酸配列の領域は、それぞれ配列番号２０および配列番号２１またはそれらの相補配列の配列と隣接している。
【００３４】
「コア−１発現レベル」という用語は、本明細書で使用される場合、具体的には、本発明による微生物に存在するコア−１抗原の量を指し、具体的には、前記微生物の表面のコア−１抗原の量を指す。コア−１抗原発現は、例えば、具体的にはＥＬＩＳＡ法、例えば、本明細書の実施例２に記載の方法を用いて、コア−１特異的抗体（例えば、Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ１および／またはＮｅｍｏｄ−ＴＦ２（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ）など；他の適切なコア−１特異的抗体は下に記載されている）を結合させ、結合した抗体の量を測定することによって決定することができる。コア−１特異的抗体が多く結合するほど、コア−１発現が高度である。一般に、コア−１抗原発現レベルは、定義済みの数の細胞／微生物を用いて決定される。具体的には、２つ以上の発現レベルを互いと比較する場合、各発現レベルを決定するために同様の数の細胞／微生物を使用する、または発現レベルを数学的に同じ数の細胞／微生物に調整する。さらに、異なる試料のコア−１発現レベルを比較する場合、これらの試料中の微生物を同様の条件、特に同一の条件下で培養することが好ましい。例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓなどのＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ微生物、具体的には本発明による微生物をＷｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ（ＷＣ）培地（Ｏｘｏｉｄ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）中、嫌気条件下、３７℃で一晩培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｅ）する。
【００３５】
平均コア−１抗原発現レベルは、培養物の試料をプレーティングし、インキュベートした後に単一のコロニーを選び取り、選び取ったコロニーのコア−１抗原発現レベルを決定することによって決定することが好ましい。例えば、平均コア−１抗原発現は、プレーティングした培養物のコロニー１０個を無作為に選び取り、各コロニーについてコア−１発現レベルを決定し（上記を参照されたい）、得られた値を足し、足された値を１０で割ることによって決定することができる。平均コア−１発現レベルはまた、前もってのプレーティングや単一コロニーの選び取りをすることなく、１つまたは複数の培養物の１つまたは複数の試料の発現レベルを測定することによって相応して決定することができる。この場合、例えば、ほぼ同じ数の細胞／微生物を含有するべきである、分析される微生物を含む１つの培養物のいくつかの試料、またはいくつかの培養物のそれぞれの１つの試料を分析し、これらの試料のコア−１抗原発現レベルを、例えば、本明細書に記載のＥＬＩＳＡアッセイを用いることによって決定する。得られた個々の値から平均値を決定する。コア−１抗原発現レベルは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いることによって決定することが好ましい。コア−１抗原発現を決定するための適切なＥＬＩＳＡ試験は実施例２に記載されている。一実施形態によると、本発明によるコア−１陽性微生物は、下の実施例２に記載の通りＥＬＩＳＡアッセイを実施した場合、少なくとも１つのコア−１特異的抗体を使用したＥＬＩＳＡアッセイにおいて、平均で少なくとも０．２、少なくとも０．２５、好ましくは少なくとも０．３、より好ましくは少なくとも０．３５の吸光度値を実現することが好ましい。それぞれ高いコア−１抗原発現レベルを有するコア−１陽性微生物は、強力な免疫応答を誘導することができるので有利である。
【００３６】
さらに、本発明による微生物は、同じ条件で培養した場合、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ（ＤＳＭ２５００４）の平均コア−１発現の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の平均コア−１抗原発現をその表面で示すことが好ましい。
【００３７】
上記の通り、本発明による微生物は、特に安定なコア−１抗原発現を特徴とする。以下の安定性の程度が実現されることが好ましい。一実施形態によると、本発明による微生物の培養物中で、本発明による微生物の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、前記細胞培養物中の全ての本発明による微生物の平均コア−１発現レベルの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％のコア−１抗原発現レベルを有する。培養物中の本発明による微生物の少なくとも９５％が、培養物中の全ての本発明による微生物の平均コア−１発現レベルの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％のコア−１発現レベルを有することが好ましい。本質的に、有意なコア−１抗原発現を示さない培養物中の微生物はほんの少数である。一実施形態によると、培養物中の本発明による微生物の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１発現レベルの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％のコア−１抗原発現レベルを有する。培養物中の本発明による微生物の少なくとも９５％が、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１発現レベルの少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％のコア−１発現レベルを有することが好ましい。培養物中の微生物のコア−１発現レベル、コア−１発現の安定性はそれぞれ、例えば、培養物の試料をプレーティングし、インキュベートした後に単一のコロニーを選び取り、選び取ったコロニーのコア−１発現レベルを決定することによって決定することができる。具体的には、例えば、培養物の微生物の少なくとも９０％が、特定の発現レベルを有するものとする場合、上記の通り分析されたコロニー１０個のうち少なくとも９個が特定された発現レベルを有することになる。異なるクローンまたは培養物のコア−１発現レベルは、同様の条件下で、より好ましくは同一の条件下で決定することが好ましい。特に、異なるクローンまたは培養物は、同様または同一の条件下で、例えば、上記の通り培養することが好ましい。
【００３８】
さらに、本発明による微生物は、均一なコア−１抗原の発現も特徴とする。以下の均一性の程度が実現されることが好ましい。細胞培養物中で、前記細胞培養物中の本発明による微生物の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、前記細胞培養物中の全ての本発明による微生物の平均コア−１抗原発現レベルの６０％から１５０％まで、７０％から１４０％まで、好ましくは７０％から１３０％まで、７５％から１２５％まで、８０％から１２０％まで、または８５％から１１５％まで、最も好ましくは９０％から１１０％までの範囲内のコア−１抗原発現レベルを有することが好ましい。具体的には、前記細胞培養物中の本発明による微生物の少なくとも９５％が、培養物中の全ての本発明による微生物の平均コア−１発現レベルの７５％から１２５％まで、好ましくは８０％から１２５％までの範囲内であるコア−１発現レベルを有する。本質的に、培養物中の平均コア−１発現から著しく変動するコア−１抗原発現を示す培養物中の微生物はほんの少数である。一実施形態によると、前記培養物中の本発明による微生物の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１抗原発現の６０％から１５０％まで、７０％から１４０％まで、好ましくは７０％から１３０％まで、７５％から１２５％まで、８０％から１２０％まで、または８５％から１１５％まで、最も好ましくは９０％から１１０％までの範囲内のコア−１抗原発現レベルを有する。前記細胞培養物中の本発明による微生物の少なくとも９５％が、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１発現レベルの７５％から１２５％まで、好ましくは８０％から１２５％までの範囲内であるコア−１発現レベルを有することが好ましい。均一性は、安定なコア−１抗原発現に関して上記の通り決定されることが好ましい。
【００３９】
コア−１抗原発現レベルは、上記の通り決定されることが好ましい。
【００４０】
一実施形態によると、本発明による微生物のコア−１抗原は、図４の構造＃１、構造＃２、構造＃３、構造＃４および構造＃５、その類似構造、および／またはその反復単位からなる群から選択される少なくとも１つの炭水化物構造を含む。前記類似構造は、コア−１炭水化物構造Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃを含み、図４の構造＃１、構造＃２、構造＃３、構造＃４および構造＃５の単糖単位と同じ数、特に同じ種類および／または位置からなることが好ましい。しかし、類似構造は具体的には、単糖単位の結合（アルファ−アノマー型結合またはベータ−アノマー型結合、結合の位置）および修飾（メチル化、アセチル化）が図４の構造＃１、構造＃２、構造＃３、構造＃４および構造＃５と異なってよい。これらの類似構造は、具体的には、Ｇａｌβ１，３−ＧａｌＮＡｃ二糖がアルファ結合もしくはベータ結合を介して残りの糖類構造の単糖単位の３位もしくは４位と結合していること、および／またはフコース単位の１つまたは複数がメチル化されていてよいこと（必ずしも図４に示されている第３のフコース単位ではない）以外は図４の構造と同一の構造を含む。好ましくは、図４の構造の類似構造は次式：
Ｌ−Ｆｕｃα１→（３／４）−Ｌ−Ｆｕｃα１→（３／４）−Ｌ−Ｆｕｃα１→（３／４）−（Ｄ−Ｇａｌβ１→３−Ｄ−ＧａｌＮＡｃ（α／β）１→（３／４））−Ｄ−ＨｅｘＮＡｃβ１→（３／４）−Ｄ−Ｈｅｘ
を有し、式中、ヘキソース単位（ＨｅｘおよびＨｅｘＮＡｃ）は好ましくはガラクトース単位（それぞれＧａｌおよびＧａｌＮＡｃ）であり、また、フコース単位の１つまたは複数はメチル化されていてよい。
【００４１】
一実施形態によると、前記コア−１抗原はコア−１炭水化物構造Ｇａｌベータ１，３−ＧａｌＮＡｃを含み、これは、骨格構造、好ましくは炭水化物構造とアルファ−アノマー立体配置で結合していることが好ましい。しかし、構造Ｇａｌベータ１，３−ＧａｌＮＡｃは、その代わりに骨格構造とベータ−アノマー立体配置で結合していてよい。コア−１炭水化物構造Ｇａｌベータ１，３−ＧａｌＮＡｃはオリゴ糖または多糖の反復単位内の分岐構成成分として存在していることが好ましい。本発明による微生物のコア−１抗原のこの露出した提示には、誘導される免疫応答に対して有利な効果がある。
【００４２】
本発明による微生物はコア−１抗原をその細胞表面で発現するので、したがって、少なくとも１つのコア−１特異的抗体を適切な結合条件下でコア−１陽性微生物と接触させると、前記コア−１特異的抗体によって認識され、したがって、それが結合する。結合は、例えば、ＥＬＩＳＡ試験を用いることによって試験することができる。適切な結合条件は、例えば、実施例２に記載されている。
【００４３】
コア−１特異的抗体は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０５５７０３およびＷＯ２００４／０５０７０７において記載され、定義されている。コア−１特異的抗体は、具体的には、特に癌細胞におけるタンパク質のヒドロキシアミノ酸であるセリンまたはトレオニンとアルファ−アノマー立体配置でＯ−グリコシド結合している二糖Ｇａｌ−β１，３−ＧａｌＮＡｃであるコア−１に特異的に結合する。コア−１特異的抗体という用語は、具体的には、コア−１のみを認識する抗体、または、あまり好ましくないが、コア−１およびコア−２（Ｇａｌベータ１−３（ＧｌｃＮＡｃベータ１−６）ＧａｌＮＡｃアルファ）を認識する抗体を指す。コア−１特異的抗体は、ＷＯ２００４／０５０７０７の実施例７に示されているものなどの前記炭水化物構造の他の誘導体およびアノマーと、そこに記載されている結合条件下で、いかなる交差反応性も示さないことが好ましい。コア−１特異的抗体は、本明細書で使用される場合、具体的には、Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−ポリアクリルアミド（ＴＦα−ＰＡＡ、ＴＦａ−ＰＡＡ、ＴＦアルファ−ＰＡＡ、コア−１−ＰＡＡ）に特異的に結合するが、一覧番号１の物質のいずれにも結合しない：
一覧番号１
−  ＧｌｃＮＡｃβ１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα−ＰＡＡ（ＧｌｃＮＡｃβ１−２’ＴＦ）
−  Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα−ＰＡＡ（Ｈ型３）
−  ＧａｌＮＡｃα１−３Ｇａｌβ−ＰＡＡ（Ａｄｉ）
−  Ｇａｌα１−３−ＧａｌＮＡｃβ−ＰＡＡ（Ｔアルファβ）
これは、例えばＬｅｃｔｉｎｉｔｙ  ｈｏｌｄｉｎｇｓ，Ｉｎｃ．から入手することができる。あるいは、全ての構造を当業者が生成することができ、当業者は、コンジュゲートするための別の適切なポリアクリルアミド、または別の適切なキャリア分子、ならびに一致した炭水化物構造をカップリングするための適切なコンジュゲーション方法および必要な中間体の合成を選択することもできる。
【００４４】
前記コア−１特異的抗体は、以下の特性：
ａ）アシアログリコホリン（コア−１を保有する）には結合するが、グリコホリン（コア−１を保有しない）には結合せず、この結合が好ましくは過ヨウ素酸感受性であること；
ｂ）ＴＦアルファ−ＰＡＡに結合し、ＴＦベータ−ＰＡＡ（Ｇａｌベータ１−３ＧａｌＮＡｃベータ１−ポリアクリルアミド）にはほとんど、もしくは全く結合せず、アシアログリコホリンに結合し、グリコホリンには結合せず、この結合が好ましくは過ヨウ素酸感受性であること；
ｃ）ＴＦアルファ−ＰＡＡに結合し、ＴＦベータ−ＰＡＡにはほとんど、もしくは全く結合せず、アシアログリコホリンに結合し、グリコホリンには結合せず、ＮＭ−Ｄ４［ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０５］、ＮＭ−Ｆ９［ＤＳＭ  ＡＣＣ２６０６］のうちの少なくとも１つのヒト腫瘍細胞系に結合し、結合が好ましくは過ヨウ素酸感受性であること；および／または
ｄ）結合特性ａ）〜ｃ）の１つもしくは複数を有するが、例えば、ＮＥＭＯＤ−ＴＦ１などのＰＡＡとカップリングした三糖コア−２には結合しない、
のうちの１つまたは複数を有することが好ましい。
【００４５】
上で定義されている基準ａ）〜ｄ）の少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは全てが満たされることが好ましい。
【００４６】
前記コア−１特異的抗体は、例えば、これだけに限定されないが、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどの異なる抗体クラスの、任意の動物またはヒト、例えば、マウス、ラット、ヒト、ラクダ由来の全抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、または、コア−１に対する結合特異性を含む限りは、任意の抗体の断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、単鎖Ｆｖ、または単一ドメイン抗体であってよい。これらの抗体は、少なくとも１つの追加的なアミノ酸または変異またはポリペプチド配列、例えば、タグ、リンカーまたは多量体形成ドメインなども含有してよく、また、植物など、および、合成抗体ライブラリーから、例えば、ファージディスプレイまたはリボソームディスプレイを用いて選択されたものまたは組換え構築によるものなどの、動物とは別の供給源が起源であってよい。「抗体」という用語は、重鎖抗体、すなわち、１つまたは複数、特に２つの重鎖のみで構成される抗体、およびナノボディ、すなわち、単一の単量体可変ドメインのみで構成される抗体、ならびに抗体の断片または誘導体などの抗体も包含する。
【００４７】
「特異的な結合」とは、好ましくは、抗体が、特異的なエピトープ（本発明ではコア−１）などの標的に、別の標的との結合と比較してより強力に結合することを意味する。作用剤（ａｇｅｎｔ）は、第１の標的に、第２の標的に対する解離定数（Ｋｄ）よりも低い解離定数で結合する場合、第１の標的に、第２の標的と比較してより強力に結合する。作用剤が特異的に結合する標的に対する解離定数は、作用剤が特異的に結合しない標的に対する解離定数の２倍超、好ましくは５倍超、より好ましくは１０倍超、なおより好ましくは２０倍超、５０倍超、１００倍超、２００倍超、５００倍超または１０００倍超低いことが好ましい。標的、本発明ではコア−１に対する解離定数は、μＭまたはｎＭの範囲であることが好ましい。好ましい実施形態では、抗体とその特異的な標的、本発明ではコア−１との結合の解離定数は、１０μＭ以下、好ましくは５μＭ以下、２μＭ以下、または１μＭ以下、より好ましくは５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、または２０ｎＭ以下、最も好ましくは１０ｎＭ以下である。解離定数は、標準の条件、例えば、２０℃または室温、および生理的緩衝液条件、例えば、食塩水または１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのトリス／ＨＣｌを含有するｐＨ７の水性溶液において決定されることが好ましい。
【００４８】
適切なコア−１結合抗体は、例えば、ＷＯ２００４／０５０７０７およびＷＯ２００８／０５５７０３に記載されている。例はＨＢ−Ｔ１（ＩｇＭ）［DakoCytomation  GmbH、Hamburg；Giuffre  G、Vitarelli  E、Tuccari  G、Ponz  de  Leon  M、Barresi  G：Detection  of  Tn,  sialosyl-Tn  and  T  antigens  in  hereditary  nonpolyposis  colorectal  cancer.  Virchows  Arch  ４２９巻：３４５〜３５２頁（１９９６年）から得られる］、ＨＨ８（ＩｇＭ）［Clausen  H、Stroud  M、Parker  J、Springer  G、Hakomori  S：Monoclonal  antibodies  directed  to  the  blood  group  A  associated  structure,  galactosyl-A：specificity  and  relation  to  the  Thomsen-Friedenreich  antigen.  Mol  Immunol  ２５巻：１９９〜２０４頁（１９８８年）］、Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ１［Glycotope  GmbH、Berlin；Goletz  S、Cao  Y、Danielczyk  A、Ravn  P、Schoeber  U、Karsten  U.  Thomsen-Friedenreich  antigen：the  "hidden"  tumor  antigen.  Adv  Exp  Med  Biol.  ２００３年；５３５巻：１４７〜６２頁］、およびＮｅｍｏｄ−ＴＦ２［Glycotope  GmbH、Berlin；Goletz  S、Cao  Y、Danielczyk  A、Ravn  P、Schoeber  U、Karsten  U：Thomsen-Friedenreich  antigen：the  "hidden"  tumor  antigen.  Adv  Exp  Med  Biol.  ２００３年；５３５巻：１４７〜６２頁］である。
【００４９】
微生物がコア−１陽性であることを決定するため、および／またはコア−１抗原発現のレベルを決定するためには、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００４／０５０７０７の１６〜１８頁の配列表に開示されている抗体ｍＩｇＭ−Ｋａｒｏ２、ｍＩｇＭ−Ｋａｒｏ４、ｃＩｇＧ−Ｋａｒｏ４および／もしくはｃＩｇＭ−Ｋａｒｏ４の使用、または対応する結合特異性および親和性を有する抗体の使用が特に適している。
【００５０】
一実施形態によると、本発明によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分には、以下の相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットのうちの１つを含むコア−１特異的抗体が結合する：
セット１：
重鎖ＣＤＲ：配列番号１（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号２（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号３（ＣＤＲ−Ｈ３）；および
軽鎖ＣＤＲ：配列番号４（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号５（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号６（ＣＤＲ−Ｌ３）
セット２：
重鎖ＣＤＲ：配列番号７（ＣＤＲ−Ｈ１）；配列番号８（ＣＤＲ−Ｈ２）；配列番号９（ＣＤＲ−Ｈ３）；および
軽鎖ＣＤＲ：配列番号１０（ＣＤＲ−Ｌ１）；配列番号１１（ＣＤＲ−Ｌ２）；配列番号１２（ＣＤＲ−Ｌ３）。
【００５１】
上で定義されているＣＤＲのセット１を有する抗体は、配列番号１３によるアミノ酸配列を含む重鎖および／または配列番号１６によるアミノ酸配列を含む軽鎖、または配列番号１４または配列番号１５によるアミノ酸配列を含む重鎖および／または配列番号１７によるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことが好ましい。上で定義されているＣＤＲのセット２を有する抗体は、配列番号１８によるアミノ酸配列を含む重鎖および／または配列番号１９によるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことが好ましい。
【００５２】
市販の特に適切なコア−１特異的抗体は、例えば、Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ１およびＮｅｍｏｄ−ＴＦ２である（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎから入手可能）。これらの抗体は、コア−１に対して高度に特異的である。
【００５３】
ＣＤＲセット１を含む抗体およびＣＤＲセット２を含む抗体はどちらもコア−１に特異的であるが、これらの抗体は、２つの異なる角度からコア−１に結合し、したがって、異なるエピトープに結合する。同様に、Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ１およびＮｅｍｏｄ−ＴＦ２も、どちらもコア−１炭水化物構造に特異的に結合するが、異なるエピトープに結合する。本発明によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分に、コア−１炭水化物構造上の異なるエピトープを認識する少なくとも２つの異なるコア−１特異的抗体が結合することにより、コア−１抗原が、細胞表面に、露出して接近できる形態で存在することが確実になる。したがって、一実施形態によると、本発明によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分には、上で定義されているＣＤＲのセット１を有する抗体ならびに上で定義されているＣＤＲのセット２を有する抗体が結合し、かつ／または本発明によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分には、Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ１およびＮｅｍｏｄ−ＴＦ２が結合する。
【００５４】
一実施形態によると、本発明による微生物には、ＴＦベータに結合する抗体Ａ６８−Ｂ／Ａ１１（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ、Ｂｅｒｌｉｎ）は結合しない。
【００５５】
一実施形態によると、少なくとも１つのコア−１特異的抗体と本発明によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分の結合は、過ヨウ素酸処理後にコア−１特異的抗体の結合が低下しまたは存在さえしないという点で過ヨウ素酸感受性である。過ヨウ素酸処理により、表面の炭水化物部分が部分的に分解される。したがって、コア−１抗原を露出して、したがって、隠れていない（それぞれマスクされていない）形態で保有するコア−１陽性微生物を用いると、過ヨウ素酸処理により細胞表面に存在するコア−１抗原の構造が破壊され、その結果、過ヨウ素酸処理後には、コア−１抗原がもはや存在せず、それぞれインタクトではないので、コア−１特異的抗体はもはや結合することができなくなる。他方では、コア−１抗原、特にコア−１炭水化物抗原を保有しないが、単にコア−１様炭水化物抗原を保有し、コア−１抗原が例えばさらなる糖類単位でマスクされており、したがって、前処理なしではコア−１特異的抗体が結合しない微生物では、過ヨウ素酸処理後にコア−１抗原が現れ得る。少なくとも１つのコア−１特異的抗体と本発明による微生物の結合は過ヨウ素酸感受性である、すなわち、過ヨウ素酸で処理することにより、コア−１特異的抗体が過ヨウ素酸処理した微生物にもはや結合しなくなる、または過ヨウ素酸処理後に少なくとも結合の低下を示すことが好ましい。一実施形態によると、本発明による微生物の溶解物もしくは画分は同じ特性を有する。
【００５６】
本発明による過ヨウ素酸処理とは、具体的には、処理される材料を、過ヨウ素酸を糖類単位の少なくとも部分的な酸化に有効な濃度で含有する溶液に曝露させることを指す。例えば、過ヨウ素酸処理は、処理される材料を５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液の溶液中で５分間インキュベートした後、１０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムの溶液中で１時間インキュベートすることによって実施することができる。５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液の溶液で再度洗浄した後、過ヨウ素酸の作用を、暗所において、５０ｍＭの水酸化ホウ素ナトリウムの溶液中で３０分間インキュベートすることによって停止させる。
【００５７】
さらに、本発明による微生物またはその溶解物もしくは画分の表面のコア−１抗原は、周囲の媒体が接近できること、特に、周囲の媒体中のコア−１特異的抗体が接近できること、したがって、細胞表面に露出していることが好ましい。
【００５８】
本発明による微生物は、特に、その天然の環境に存在していないことが好ましい単離された微生物である。特に、微生物はヒトの体内に存在しておらず、ヒトまたは動物の体内に存在していないことが好ましい。一実施形態によると、本発明による微生物は、コア−１陽性ではなく、かつ／またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種に属さない微生物を含む組成物から単離されたものである。一実施形態によると、本発明による微生物は、本発明による微生物の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、９７％、９９％、最も好ましくは約１００％を含む培養物中に存在するまたはそれから得られる。
【００５９】
「ａ（ある）微生物」という用語は、本明細書で使用される場合、ただ１つの単細胞生物ならびに多数の単一の単細胞生物を指す場合がある。例えば、「ａ（ある）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物」という用語は、１つの単一のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ細菌細胞ならびに複数のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の細菌細胞を指す場合がある。「ａ（ある）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の微生物」および「ａ（ある）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物」という用語は本明細書では同義に使用される。「ａ（ある）微生物」という用語は、多数の細菌細胞を指すことが好ましい。具体的には、前記用語は、少なくとも１０３個の細菌細胞、好ましくは少なくとも１０４個の細菌細胞、少なくとも１０５個または少なくとも１０６個の細菌細胞を指す。
【００６０】
本発明によるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物は、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を産生することができることが好ましい。微生物の炭水化物発酵の最終産物として産生される短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）は健康促進性を有する。例として、プロピオン酸は、潜在的なコレステロール低下効果および抗脂質生成効果を有することが報告された。プロピオン酸は、満腹をさらに刺激し得、また、酢酸および酪酸と一緒に抗発がん効果を示す。好ましい実施形態では、本発明による微生物は、プロピオン酸、酢酸、コハク酸、ギ酸および乳酸からなる群から選択される１種または複数種のＳＣＦＡを産生することができる。本発明による微生物はプロピオン酸および／または酢酸を産生することができることが好ましい。好ましい実施形態では、これらのＳＣＦＡは本発明による微生物またはその溶解物もしくは画分を含有する本発明による組成物にも存在する。本発明による微生物を生育可能な形態で患者に投与するある特定の実施形態では、前記微生物は、投与された後に患者の体内で前記ＳＣＦＡをなお産生することができる。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明によるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物は、特に胃を経由する通過の条件で、および好ましくは特に摂取後のヒトの腸の少なくとも一部を経由する通過の条件でも生存することができる。具体的には、ヒトの胃内の条件で生存するとは、胃液中で、微生物を含む組成物における本発明によるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも８５％が少なくとも１８０分にわたって生存することを指す。さらに、ヒトの腸内の条件で生存するとは、腸液中で、微生物を含む組成物における本発明によるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％が少なくとも２４０分にわたって生存することを指す。好ましい実施形態では、本発明による微生物は、前記処置後、なおその表面に少なくとも１つのコア−１抗原を含む。本発明による微生物は、なおその表面に、処置の開始時にその表面にあったコア−１抗原の量の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である量のコア−１抗原を含むことがより好ましい。さらに、本発明による微生物は、具体的には本明細書に記載の通り、上記の処置後に、その表面にコア−１を発現することができる。したがって、本発明による微生物のコア−１発現は、ヒト胃腸管内の条件の影響を受けず、前記微生物は、なおその表面に高く安定なコア−１抗原密度を含み、生育可能な形態で使用する場合、経口投与された後になおコア−１を発現することができる。したがって、本発明による微生物は、経口製剤での治療剤として使用するために特に有利である。
【００６２】
好ましい実施形態では、本発明によるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物は、以下の安全特性：
（ｉ）抗生物質であるメトロニダゾール、メロペネムおよび／もしくはクリンダマイシンに対して感受性であること；
（ｉｉ）プラスミドＲＰ４（ＤＳＭ３８７６）および／もしくはプラスミドｐＳＣ１０１（ＤＳＭ６２０２）を含有しないこと；
（ｉｉｉ）β−ラクタマーゼ遺伝子であるｃｆｉＡおよび／もしくはｃｆｘＡを含有しないこと；
（ｉｖ）ビルレンス因子であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓの多糖Ａおよび／もしくはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓのエンテロトキシンＢｆｔおよび／もしくは遺伝子ｏｍｐＷによりコードされる「Ｔｏｎ  Ｂ−結合外膜タンパク質」を含有しないこと；
（ｖ）細胞外デオキシリボヌクレアーゼ活性、細胞外コンドロイチナーゼ活性、細胞外ヒアルロニダーゼ活性および／もしくは細胞外ノイラミニダーゼ活性のいずれも示さないこと；ならびに／または
（ｖｉ）ヒト結腸の上皮細胞に付着しないこと
の１つまたは複数を有する。
【００６３】
好ましい実施形態では、本発明によるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ微生物は、
ａ）２０１１年７月１２日に、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｅｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０、１３１２５  Ｂｅｒｌｉｎ（ＤＥ）によって、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ（ＤＥ）においてブタペスト条約の必要条件に従って受託番号ＤＳＭ２５００４の下で寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓ（ＤＳＭ２５００４）、
ｂ）Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓに由来する微生物、または
ｃ）Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓホモログ
である。
【００６４】
Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ（ＤＳＭ２５００４）は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種に属する。Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓは、幅０．４〜０．５μｍであり、一般に長さ１〜２μｍであり、特に、Ｗｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ寒天でコロニーが成長し、１８時間後に環状の乳白色の隆起した凸状の表面を有して直径２〜３ｍｍになる、絶対嫌気性、非胞子形成性、非運動性かつグラム陰性の桿状細菌であることが好ましい。Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓは、その細胞表面で高度に安定な均一の強力なコア−１発現を示す。実施例２に示されている通り、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓの１０個の異なるコロニーについて決定されたコア−１抗原発現値は、それらのコア−１抗原発現の変動性がわずかである、ＥＬＩＳＡアッセイのＯＤ値を示す（実施例２を参照されたい）。それにより、例えば、薬学的組成物にＣｏｒｅｏｔｉｃｓを使用した場合、一定の均一かつ高い量のコア−１抗原が提供される。この発現プロファイルは独特であり、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓが、例えばＣｏｒｅｏｔｉｃｓよりも高いコア−１発現の変動性を示す他のコア−１抗原発現微生物、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＡＧ６  ＤＳＭ１８７２６（ＷＯ２００８／０５５７０３に開示されている）などに対してかなりの利点を有することも示す。Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓのコア−１陽性溶解物およびそのコア−１陽性画分も包含される。
【００６５】
Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓに由来する微生物および／またはＣｏｒｅｏｔｉｃｓホモログは以下の特性：
ａ）上で定義されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓの種に属すること；
ｂ）ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓおよび／またはＤＳＭ１８８３６として寄託されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓに対して少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％のＤＮＡ間の関連性を示すこと；
ｃ）ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓおよび／またはＤＳＭ１８８３６として寄託されたＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓに対して少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．５％、最も好ましくは約１００％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性のレベルを示すこと；
ｄ）以下の特性：
ｉ）ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１発現の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の平均コア−１抗原発現を有すること；
ｉｉ）実施例２に記載のＥＬＩＳＡアッセイにおいて平均で少なくとも０．２５、好ましくは少なくとも０．３、より好ましくは少なくとも０．３５の吸光度値を実現すること；
ｉｉｉ）細胞表面に、図４の構造＃１、構造＃２、構造＃３、構造＃４および構造＃５、その類似構造、および／もしくはその反復単位からなる群から選択される少なくとも１つの炭水化物構造を発現していること；
ｉｖ）細胞培養物中で、前記微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、より好ましくは約１００％が、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１抗原発現の少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％のコア−１抗原発現レベルを有すること；および／もしくは
ｖ）細胞培養物中で、前記微生物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％、より好ましくは約１００％が、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１抗原発現の７０％から１５０％まで、７５％から１２５％まで、好ましくは８０％から１１５％まで、最も好ましくは９０％から１１０％までの範囲内のコア−１抗原発現レベルを有すること
の１つ、２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つ、最も好ましくは全てを有するコア−１抗原発現を示すこと；
ｅ）上に開示されている安全特性のうちの１つもしくは複数を有すること；
ｆ）ヒトの胃内および／もしくは腸内の条件で生存し、特に、前記条件で生存後にコア−１を発現することができる；ならびに／または
ｇ）短鎖脂肪酸、特にプロピオン酸を産生することができること
の１つまたは複数を有することが好ましい。
【００６６】
上で定義されている基準ａ）〜ｆ）の少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つ、最も好ましくは全てが満たされることが好ましい。
【００６７】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を含む組成物を提供する。含まれる本発明によるコア−１陽性微生物は同一であっても異なってもよい。本発明の第１の態様によるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のコア−１陽性微生物の特性に関しては、上記の開示を参照されたい。コア−１陽性溶解物、コア−１陽性画分および／またはコア−１陽性断片に関して同じことが当てはまる。
【００６８】
組成物中の微生物の８０％以上、より好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上、最も好ましくは約１００％が本発明の第１の態様によるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のコア−１陽性微生物であることが好ましい。
【００６９】
好ましい実施形態では、本発明による組成物中のコア−１陽性微生物は、安定なコア−１抗原発現を特徴とする。以下の安定性の程度が得られることが好ましい。一実施形態によると、組成物中のコア−１陽性微生物の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、前記組成物中の全てのコア−１陽性微生物の平均コア−１発現レベルの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％のコア−１抗原発現レベルを有する。組成物中のコア−１陽性微生物の少なくとも９５％が、組成物中の全てのコア−１陽性微生物の平均コア−１発現レベルの少なくとも７５％のコア−１発現レベルを有することが好ましい。一実施形態によると、組成物中のコア−１陽性微生物の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１発現レベルの少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％のコア−１抗原発現レベルを有する。組成物中のコア−１陽性微生物の少なくとも９５％が、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１発現レベルの少なくとも７５％のコア−１発現レベルを有することが好ましい。前記コア−１陽性微生物はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のものであることが好ましい。
【００７０】
好ましい実施形態によると、本発明による組成物中のコア−１陽性微生物は、均一なコア−１抗原の発現を特徴とする。以下の均一性の程度が実現されることが好ましい。組成物中のコア−１陽性微生物の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％が、組成物中の全てのコア−１陽性微生物の平均コア−１抗原発現の６０％から１５０％まで、７０％から１４０％まで、好ましくは７０％から１３０％まで、７５％から１２５％まで、８０％から１２０％まで、または８５％から１１５％まで、最も好ましくは９０％から１１０％までの範囲内のコア−１抗原発現レベルを有することが好ましい。特に、組成物中のコア−１陽性微生物の少なくとも９５％が、組成物中の全てのコア−１陽性微生物の平均コア−１発現レベルの７５％から１２５％までの範囲内であるコア−１発現レベルを有する。一実施形態によると、組成物中のコア−１陽性微生物の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％がＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１抗原発現の６０％から１５０％まで、７０％から１４０％まで、好ましくは７０％から１３０％まで、７５％から１２５％まで、８０％から１２０％まで、または８５％から１１５％まで、最も好ましくは９０％から１１０％までの範囲内のコア−１抗原発現レベルを有する。特に、組成物中の本発明によるコア−１陽性微生物の少なくとも９５％が、ＤＳＭ２５００４として寄託されたＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１発現レベルの７５％から１２５％までの範囲内であるコア−１発現レベルを有する。前記コア−１陽性微生物はＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のものであることが好ましい。
【００７１】
コア−１抗原発現レベルならびに安定性および均一性を決定するための手段は上に記載されている。
【００７２】
一実施形態によると、第２の態様による組成物は細胞培養物である。本発明によるコア−１陽性微生物を含む細胞培養物についての好ましい値は、本発明による第１の態様と併せて上に記載されている。
【００７３】
一実施形態によると、組成物中の単数の微生物または複数の微生物は、生育可能な形態、非生殖形態、生育不能な形態または溶解された形態で存在する。一実施形態によると、本発明の第２の態様による前記組成物には前記微生物のコア−１陽性画分のみが使用されている。
【００７４】
組成物は、少なくとも１０３個の本発明による微生物、より好ましくは少なくとも１０４個、少なくとも１０５個または少なくとも１０６個の本発明による微生物、またはこの量の本発明による微生物の、コア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を含むことが好ましい。
【００７５】
第３の態様では、本発明は、医学において使用するための、本発明の第１の態様によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分または本発明の第２の態様による組成物を提供する。本発明によるコア−１陽性微生物、その溶解物もしくは画分および／または組成物を、コア−１に対する免疫応答を誘導および／または増強するために使用することが好ましい。誘導または増強された免疫応答は、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答であってよく、特にコア−１に対する抗体力価の誘導を伴う。それにより、コア−１陽性腫瘍、がん、胃腸障害および／またはコア−１陽性疾患を処置および／または予防することができる。誘導および／または増強されたコア−１特異的免疫応答は、例えば、コア−１陽性がん細胞に対する防御として、具体的には、コア−１陽性腫瘍または転移の予防、低減のためまたは拡散に対して機能する。本発明の第１の態様によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分または本発明の第２の態様による組成物は、がんに対するワクチンとしても使用することができる。コア−１陽性微生物の他の適切な治療的使用は参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０５５７０３にも記載されている。
【００７６】
具体的には、本発明の第１の態様によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分または本発明の第２の態様による組成物を、がんを有するまたはがんを発症する危険性がある患者に投与することができる。一実施形態によると、表面にコア−１抗原を発現している本発明によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分は、患者においてコア−１抗原に対する特異的な免疫応答を引き出すことができる。免疫応答は、体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答であってよく、細胞性免疫応答、特に、好ましくは免疫系の記憶細胞の形成を含めた適応免疫系の応答を含むことが好ましい。
【００７７】
がんは、表面にコア−１炭水化物（ｃａｂｏｈｙｄｒａｔｅ）抗原を保有する腫瘍細胞を含むがん（コア−１陽性がん）であることが好ましい。がんは、結腸癌または結腸癌の転移であることが好ましい。
【００７８】
「患者」という用語は、本明細書で使用される場合、具体的には、ヒト、非ヒト霊長類または別の動物、特に哺乳動物、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはマウスおよびラットなどのげっ歯類を指す。患者はヒトであることが好ましい。
【００７９】
「がん」という用語は、本発明によると、具体的には、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、直腸がん、子宮体がん、腎がん、副腎がん、甲状腺がん、血液がん、皮膚がん、脳がん、子宮頸がん、腸がん（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝がん、結腸がん、胃がん、腸がん（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｃａｎｃｅｒ）、頭頸部がん、消化器がん、リンパ節がん、食道がん、結腸直腸がん、膵がん、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、卵巣がんおよび肺がんならびにその転移を含む。その例は、結腸癌、結腸直腸癌、および上記のがんの種類または腫瘍の転移である。がんという用語は、本発明によると、がん転移も含む。「腫瘍」という用語は、具体的には、誤調節された細胞増殖によって形成された細胞の一群または組織を指す。腫瘍は、構造的な組織化および正常な組織との機能的な協調の部分的なまたは完全な欠乏を示し得、通常、良性か悪性のいずれかであり得る識別可能な組織の塊を形成する。「転移」という用語は、具体的には、がん細胞がその元の部位から体の別の部分に拡散することを指す。転移の形成は、非常に複雑なプロセスであり、通常、がん細胞が原発腫瘍から脱離し、体循環に進入し、体内の他の場所の正常組織内に位置して成長することを伴う。腫瘍細胞が転移した場合、新しい腫瘍は二次腫瘍または転移性腫瘍と称され、その細胞は通常、元の腫瘍における細胞と似ている。これは、例えば、乳がんが肺に転移した場合、二次腫瘍は、異常な肺細胞ではなく、異常な乳房細胞で構成されることを意味する。それで、肺における腫瘍は肺がんではなく転移性乳がんと称される。
【００８０】
本発明によると、「コア−１陽性疾患」という用語は、具体的には、コア−１腫瘍抗原の出現を特徴とする真核細胞、腫瘍細胞、がんまたは他の生物材料に関連する任意の疾患を指す（上記を参照されたい）。
【００８１】
本発明は、第４の態様において、
ｉ）本発明による第１の態様によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分（本発明によるコア−１陽性微生物の詳細は、上に記載されている；上記の開示を参照されたい）
および／または
ｉｉ）本発明の第２の態様による組成物（それぞれの組成物の詳細は、上に記載されている；上記の開示を参照されたい）
を含む薬学的組成物も提供する。
【００８２】
「薬学的組成物」という用語は、具体的には、ヒトまたは動物に投与するために適した組成物、すなわち、薬学的に許容される構成成分を含有する組成物を指す。薬学的組成物は、活性化合物として第１の態様によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分および／またはその第２の態様による組成物を、キャリア、希釈剤または薬学的賦形剤、例えば、緩衝剤、防腐剤および張度修飾物質と一緒に含むことが好ましい。適切な医薬用途は、上に記載されている；上記の開示を参照されたい。薬学的組成物は経口的に投与することができるが、任意の他の適切な投与経路によって投与することもできる。
【００８３】
本発明による薬学的組成物は、患者に微生物約１０４〜約１０１３個の日用量をもたらす量または濃度でコア−１陽性微生物を含むことが好ましい。日用量は、微生物２．８＊１０１２個、好ましくは微生物２．３＊１０１２個を超えないこと、および／または微生物少なくとも１０７個、好ましくは少なくとも微生物１０９個であることが好ましい。具体的には、日用量は、微生物約１０１０〜約１０１２個の範囲である。薬学的組成物は、それぞれが上記のコア−１陽性微生物の日用量を含む単回単位用量の形態であることが好ましい。コア−１陽性微生物のコア−１陽性溶解物もしくはコア−１陽性画分を含む薬学的組成物に関しては、組成物中のコア−１陽性溶解物もしくはコア−１陽性画分の量または濃度は上記の組成物中のコア−１陽性微生物の量または濃度と同等である。具体的には、組成物中のコア−１陽性溶解物もしくはコア−１陽性画分は、上記のコア−１陽性微生物の量または濃度から得られる。
【００８４】
本発明によるコア−１陽性微生物および本発明による組成物中のコア−１陽性微生物は、生育可能な形態、非生殖形態、生育不能な形態または溶解された形態で使用することができる。ある特定の実施形態では、コア−１陽性微生物は生育可能な形態で使用される。具体的には、生育可能な形態で使用される場合、微生物は、患者の体内でなおプロピオン酸などの短鎖脂肪酸を産生することができ、それにより、上記の通りさらなる健康利益がもたらされる。微生物は、非病原性の形態、非生殖形態、生育不能な形態または溶解された形態で使用することが好ましい。さらに、前記微生物のコア−１陽性画分も使用することができる。本発明によると、微生物のコア−１陽性溶解物もしくはコア−１陽性画分は、上記の通りコア−１特異的抗体が接近できるおよび／または上記の通り過ヨウ素酸感受性であることが好ましい少なくとも１つのコア−１抗原を含む。
【００８５】
本発明によるコア−１陽性微生物および薬学的組成物の１つの具体的な利点は、ヒトまたは動物の体内でコア−１に対する抗体力価を誘導することができることである。この抗コア−１抗体力価により、特に、コア−１陽性疾患、特にコア−１陽性腫瘍細胞またはコア−１陽性がん細胞を含むがんからの全身の保護が提供される。したがって、好ましい実施形態では、本発明によるコア−１陽性微生物またはそのコア−１陽性溶解物もしくはコア−１陽性断片もしくはコア−１陽性画分または本発明による薬学的組成物は、投与されると、ヒトまたは動物の体内でコア−１抗原に対する抗体力価を誘導することができる。誘導された抗体力価は、少なくとも一般的な検出方法で検出可能であることが好ましく、コア−１陽性疾患、特にコア−１陽性腫瘍細胞またはコア−１陽性がん細胞を含むがんにかかる危険性を低減するのに十分であることが好ましい。
【００８６】
第５の態様によると、本発明は、
ａ）本発明の第１の態様によるコア−１陽性微生物を提供するステップと、
ｂ）必要に応じて、前記コア−１陽性微生物を加工して、そのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を得るステップと、
ｃ）前記コア−１陽性微生物および／または前記そのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分をコア−１陽性生成物の製造において使用するステップと
を含む、コア−１陽性生成物を製造するための方法を提供する。
【００８７】
生成物は任意の生成物であってよく、これだけに限定されないが、医薬生成物を含む。それぞれの生成物の製造および本発明によるコア−１陽性微生物の詳細に関しては、上記の開示も参照されたい。本発明の第１の態様によるコア−１陽性微生物は、生育可能な形態または生育不能な形態で使用することができる。製造された生成物をさらに加工することもできる。
【００８８】
「コア−１陽性微生物の画分」という用語および同様の用語は、本明細書で使用される場合、具体的には、前記微生物のより小さな部分の調製物または精製物、例えば、本発明による前記コア−１陽性微生物のコア−１陽性構成成分の細胞壁調製物、エンベロープ調製物、溶解物、リポ多糖調製物、莢膜の調製物、または莢膜多糖調製物などを指す。前記画分は、所望の免疫応答を引き出すことができるためには、前記コア−１陽性微生物の少なくとも１つのコア−１陽性構成成分を含むべきである。これらは、少なくとも１つの本発明によるコア−１陽性微生物由来の調製物または精製物から得ることができる。前記調製物および精製物は、単回のもしくは逐次的な細胞分画（複数可）、フェノール−水抽出、エーテル抽出、リゾチームを用いた消化などの酵素消化、またはクロマトグラフィー法などの当業者に公知の方法によって得ることができる。さらに、コア−１陽性微生物の画分という用語は、人工的に作製された、本発明のコア−１陽性微生物にも見出されるコア−１陽性構成成分も含む。
【００８９】
一実施形態によると、第５の態様による方法に従って作製されるコア−１陽性生成物は、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞である。この場合、本発明の第５の態様による方法のステップｃ）は、前記抗原提示細胞に本発明によるコア−１陽性微生物および／またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を負荷するステップを含むことが好ましい。抗原提示細胞はヒトのものであることが好ましい。抗原提示細胞は白血病細胞系ＭＵＴＺ−３（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９５）から得た樹状細胞またはＭＵＴＺ−３に由来する細胞、例えば、ＮＥＭＯＤ−ＤＣ（ＷＯ２００３／０２３０２３を参照されたい）であることが好ましい。
【００９０】
ＷＯ２００８／０５５７０３では、コア−１陽性微生物ならびにその溶解物および／または画分は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて機能的な抗原提示細胞、特に樹状細胞により提示されると、ヒトＴ細胞をコア−１特異的様式で活性化することができ、それにより、新しい治療機会が開かれることが記載されている（参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０５５７０３、特に７７頁、２６行目〜８５頁、２０行目を参照されたい）。
【００９１】
したがって、本発明の第６の態様によると、コア−１に対する機能的な抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を製造する方法であって、
ａ）本発明の第１の態様によるコア−１陽性微生物を提供するステップと、（請求項１から５も参照されたい）
ｂ）必要に応じて、前記コア−１陽性微生物を加工して、そのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分を得るステップと、
ｃ）適量の少なくとも１つの抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を、適量の、
ｉ）前記コア−１陽性微生物および／または
ｉｉ）前記そのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分
と接触させ、それにより、コア−１に対する機能的な抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を得るステップと
を含む方法が提供される。
【００９２】
ステップｃ）の接触は、コア−１に対する少なくとも１つの機能的な抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を生成するために適した時間にわたり、そのために適した条件下で行う。ステップｃ）でコア−１陽性化合物と接触させる抗原提示細胞は、未成熟の抗原提示細胞、例えば、未成熟の樹状細胞であり、それをその後成熟させてコア−１に対する機能的な抗原提示細胞を得ることが好ましい。前記接触させるステップｃ）の詳細は、ＷＯ２００８／０５５７０３にも記載されている；それぞれの開示を参照されたい。
【００９３】
得られた、コア−１に対する機能的な抗原提示細胞は、上記の通りコア−１特異的抗体を使用することによって試験することができる。コア−１に対する機能的な抗原提示細胞に、使用する本発明によるコア−１陽性微生物（またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分、上記を参照されたい）のコア−１抗原を負荷する。したがって、コア−１抗原は、それぞれに負荷された抗原提示細胞上のコア−１特異的抗体によって検出することができる。得られた、コア−１に対する機能的な抗原提示細胞（抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞の混合物であってもよい）は、特異的にコア−１に対するＴ細胞、特にヒト一次Ｔ細胞を活性化することができ、したがって、コア−１に対する特異的な細胞性免疫応答を刺激することができる。Ｔ細胞活性化は、例えば、ＷＯ２００８／０５５７０３に記載の通り細胞性免疫応答試験によって試験することができる。
【００９４】
第７の態様によると、コア−１に対する活性化Ｔ細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞クローンまたはＴ細胞系を作製する方法であって、
ａ）本発明の第６の態様による方法を用いて、コア−１に対する少なくとも１つの機能的な抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞を得るステップと、
ｂ）コア−１に対する適量の機能的な抗原提示細胞を、適量の、少なくとも１つのＴ細胞またはＴ細胞の混合物または少なくとも１つのＴ細胞を含む細胞の混合物と接触させるステップと、
ｃ）前記Ｔ細胞またはＴ細胞の混合物を、コア−１に対する前記負荷された機能的な抗原提示細胞と一緒に培養して、コア−１に対する１つまたは複数のＴ細胞を活性化および／または初回刺激するステップと
を含む方法が提供される。
【００９５】
本発明と併せて使用することもできる対応する作製方法の詳細は、ＷＯ２００８／０５５７０３にも記載されている；それぞれの開示を参照されたい。
【００９６】
本発明による第６の態様または第７の態様による方法によって作製される、コア−１陽性細胞および／または疾患に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を誘導する、コア−１に対する機能的な抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞、コア−１に対する１つまたは複数の活性化Ｔ細胞、コア−１に対するＴ細胞を含む細胞組成物、コア−１に対するＴ細胞系、またはコア−１に対するＴ細胞クローンも提供される。それぞれの細胞は、特にコア−１陽性腫瘍などのコア−１陽性疾患の予防または治療のための薬剤を製造するのに適している。
【００９７】
本発明は、コア−１特異的免疫応答を誘導または増強するため、および／または機能的な抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞、および／または活性化Ｔ細胞、Ｔ細胞系もしくはＴ細胞クローンまたはコア−１に対する抗体を生成するための、本発明の第１の態様によるコア−１陽性微生物および／またはそのコア−１陽性溶解物もしくはそのコア−１陽性画分のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける使用にも関する。
【００９８】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という表現は、本明細書で使用される場合、その文字通りの意味に加えて、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」という表現も包含し、明確にそれを指す。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という表現は、明確に列挙されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」主題が、別の要素を含まない実施形態、ならびに明確に列挙されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」主題が、別の要素を包含する可能性がある、および／または実際に包含する実施形態を指す。同様に、「有する（ｈａｖｅ）」という表現は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という表現と、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」という表現も包含し、明確にそれを指すと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、本発明による微生物Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓおよび種々の参照微生物の制限分析を示す図である。結果により、ＣｏｒｅｏｔｉｃｓがＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種であることが支持される。
【図２】図２は、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ（ＤＳＭ２５００４）およびＡＧ６（ＤＳＭ１８７２６）の、コア−１特異的抗体を使用した抗原ＥＬＩＳＡ結合試験を示すグラフである。種々のＣｏｒｅｏｔｉｃｓまたはＡＧ６のコロニーを、マイクロタイターウェルにプレーティングし、コア−１特異的抗体を結合させた。ペルオキシダーゼとカップリングした二次抗体を使用して結合を可視化した。ＥＬＩＳＡアッセイにより、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓは安定かつ均一なコア−１抗原の発現を有するが、ＡＧ６はそれよりも安定ではなく、したがって、それよりも均一でないコア−１発現を有することが示されている。ＡＧ６の平均コア−１抗原発現もＣｏｒｅｏｔｉｃｓの平均コア−１抗原発現より低かった。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた抗コア−１抗体とＣｏｒｅｏｔｉｃｓ（ＤＳＭ２５００４）の結合を示すグラフである。先行する過ヨウ素酸処理により、抗体結合性が消失した。コア−１陽性対照（ＰＫ）について同じ結果が得られた。参照菌株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６ではいかなる抗コア−１抗体結合も示されなかった。
【図４】図４は、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ微生物の細胞表面に存在し得るコア−１様二糖モチーフを保有する種々の炭水化物構造を示す図である。
【図５】図５は、プラスミドおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子であるｃｆｉＡ、ｃｆｘＡおよびｃｅｐＡの決定を示す図である。（Ａ）プラスミド：単離されたプラスミドＤＮＡそれぞれ２０μｇをローディングした。レーン：１、１ｋｂのＤＮＡラダー；２、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＳＭ３８７６；３、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＳＭ６２０２；４、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４。（Ｂ）ｃｆｉＡ遺伝子：レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＴＡＬ３６３６；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４；４、陰性対照。（Ｃ）ｃｆｘＡ遺伝子：レーン：１および６、１ｋｂのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＭＮ７；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＭＮ２３；４、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４；５、陰性対照。（Ｄ）ｃｅｐＡ遺伝子：レーン：１および６、１００ｂｐのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＭＮ２３；４、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４；レーン５、陰性対照。
【図６】図６は、ビルレンスコード遺伝子であるｂｆｔ、ｗｃｆＲ、ｗｃｆＳ、およびｏｍｐＷの決定を示す図である。（Ａ）ｂｆｔ遺伝子：レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ４３８５８；４、陰性対照。（Ｂ）ｗｃｆＲ遺伝子：レーン：１、１ｋｂのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ４３８５８；４、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ２１５１；５、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４；６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＴＡＬ３６３６；７、陰性対照。（Ｃ）ｗｃｆＳ遺伝子：レーン：レーン：１、１ｋｂのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ４３８５８；４、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ２１５１；５、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４；６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＴＡＬ３６３６；７、陰性対照。（Ｄ）ｏｍｐＷ遺伝子：レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー；２、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４；３、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｃｃａｅ  ＤＳＭ１９０２４；４、陰性対照。
【図７】図７は、菌株ＤＳＭ２５００４とＣａｃｏ−２細胞の結合の分子分析を示す図である。（Ａ）ＧＡＰＤＨおよびスクロースイソマルターゼ。レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Ｂｉｏｌｉｎｅ）；２、１日目；３、３日目；４、６日目；５、８日目；６、１０日目；７、１３日目；８、１４日目、９、陰性対照。（Ｂ）菌株ＤＳＭ２５００４およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６の検出。レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー；２、１回目の洗浄ステップ後の菌株ＤＳＭ２５００４；３、６回目の洗浄ステップ後の菌株ＤＳＭ２５００４；４、菌株ＤＳＭ２５００４＋Ｃａｃｏ−２細胞；５、１回目の洗浄ステップ後のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６；６、６回目の洗浄ステップ後のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６；７、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６＋Ｃａｃｏ−２細胞；８、Ｃａｃｏ−２細胞；９、菌株ＤＳＭ２５００４；１０、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６；１１、陰性対照。（Ｃ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓの検出。レーン：１、１回目の洗浄ステップ後のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９１２６；２、６回目の洗浄ステップ後のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９１２６；３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９１２６＋Ｃａｃｏ−２細胞；４、Ｃａｃｏ−２細胞；５、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ９１２６；６、陰性対照；７、１００ｂｐのＤＮＡラダー。
【図８−１】図８は、９０日間の経口毒性試験中のマウスの体重および摂食量を示すグラフである。（Ａ）雄のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの体重。（Ｂ）雌のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの体重。（Ｃ）雄のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの摂食量。（Ｄ）雌のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの摂食量。群当たりの平均値：１日当たり動物当たり、群１（０）、群２（１×１０６）、群３（１×１０７）、群４（１×１０８）のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４のＣＦＵ、および群５（１×１０１１）の低温殺菌したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４。統計的有意性はＰ≦０．０１によって示された。値はダネット検定によった。
【図８−２】図８は、９０日間の経口毒性試験中のマウスの体重および摂食量を示すグラフである。（Ａ）雄のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの体重。（Ｂ）雌のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの体重。（Ｃ）雄のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの摂食量。（Ｄ）雌のＣｒｌ：ＮＭＲＩマウスの摂食量。群当たりの平均値：１日当たり動物当たり、群１（０）、群２（１×１０６）、群３（１×１０７）、群４（１×１０８）のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４のＣＦＵ、および群５（１×１０１１）の低温殺菌したＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４。統計的有意性はＰ≦０．０１によって示された。値はダネット検定によった。
【図９】図９は、マルチプレックス種特異的ＰＣＲによる、注射溶液中のコンタミネーションの検出を示す図である。レーン：１、陽性対照（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４）；２、溶液２（１ｍｌ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１、１×１０９個）；３、溶液３（１ｍｌ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４、１×１０９個）；４、溶液４（１ｍｌ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１、１．５×１０８個）；５、溶液５（１ｍｌ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４、１．５×１０８個）；６、溶液６（１ｍｌ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１、５×１０６個）；７、溶液７（１ｍｌ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４、５×１０６個）、８、陽性対照（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１）；９、溶液１（対照群）。コンタミネーション対照：レーン１０、９０％のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１と１０％のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４の混合物；レーン１１、１０％のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１と９０％のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４の混合物。レーン１２、１ｋｂのＤＮＡラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。
【図１０】図１０は、穿刺した膿瘍から単離したＤＮＡの種特異的ＰＣＲを示す図である。（Ａ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４を注射した動物の膿瘍におけるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓの検出。レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）；２〜３、群３（体重１ｋｇ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４、４．６×１０９個）；４〜５、群５（体重１ｋｇ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４、６．９×１０８個）；６〜７、群７（体重１ｋｇ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４、２．３×１０７個）；８、陽性対照（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４）；９、陰性対照（水）。（Ｂ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１を注射した動物の膿瘍におけるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓの検出。レーン：１、１００ｂｐのＤＮＡラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）；２〜３、群２（体重１ｋｇ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１、４．６×１０９個）；４〜５、群４（体重１ｋｇ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１、６．９×１０８個）；６〜７、群６（体重１ｋｇ当たりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１、２．３×１０７個）、８、陽性対照（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１）；９、陰性対照（水）；１０、１ｋｂのＤＮＡラダー（ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。
【実施例】
【０１００】
（実施例１）
コア−１陽性微生物は、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種の別個の菌株である
【０１０１】
１．１ヒト糞便試料からの細菌の選択的な富化および単離
【０１０２】
ヒト糞便試料からコア−１陽性細菌を富化するために、コア−１に特異的なモノクローナル抗体でコーティングした磁気ビーズを製造者の推奨に従って調製した（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）。過去３カ月の間に抗生物質を摂取していない健康なヒト被験体由来の糞便試料をこの試験に使用した。糞便試料を還元ＰＢＳ（ＰＢＳｒｅｄ：１Ｌ当たり８．５ｇのＮａＣｌ、０．３ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．６ｇのＮａ２ＨＰＯ４、０．１ｇのペプトンおよび０．２５ｇのシステインＨＣｌ、ｐＨ７．０）に希釈し、ホモジナイズし、遠心分離した（３００×ｇ、１分、２１℃）。上清を１回洗浄し（８０００×ｇ、５分、２１℃）、ＰＢＳｒｅｄに再懸濁させた。体積２０μｌの細菌懸濁液をＰＢＳｒｅｄ  １８０μｌおよび抗体をコーティングした磁気ビーズ５μｌに加え、混合物を室温で３０分間インキュベートした。その後、ビーズをＰＢＳｒｅｄ  １ｍｌに懸濁させ、３回洗浄した。一定分量（１００μｌ）を選択寒天プレートおよび非選択寒天プレート上に広げた。コロニーをマクファーランド濁度標準３〜５（SmibertおよびKrieg  １９９４年）までＰＢＳｒｅｄに懸濁させ、この懸濁液の一定分量２０μｌを、抗コア−１抗体をコーティングしたビーズに再度加えた。コロニーを寒天プレートから無作為に収集し、非選択培地上に数回再画線した。コロニーを、適切なブロス培地において、適切な条件下で培養した。培養物を一部凍結させ、一部固定した。固定培養物を使用して、抗体ＮＭ−ＴＦ１、ＮＭ−ＴＦ２およびＢ／Ａ１１−６８と各菌株の結合性をアッセイした。菌株Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓのみが、ＮＭ−ＴＦ１およびＮＭ−ＴＦ２が強力かつ過ヨウ素酸感受性に結合し、Ｂ／Ａ１１−６８は結合しない、免疫的に接近可能なヒトコア−１構造と同様の抗体結合プロファイルを示した。Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓの細菌種へのほぼ確実な分類学的所属を、生化学的アッセイ（迅速ＩＤ３２ＡおよびＡＰＩ２０Ａ生化学キット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて特徴付けた。結果として、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓを、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓの種の群に属すると分類することができた。さらなる分類学的分析を行うために、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓの培養物を選択培地でプレーティングし、その後、
ステップ１：顕微鏡下で、均一な細胞集団を示すコロニーを選択するステップ、
ステップ２：ステップ１から：適切なコア−１発現（上記のプロファイル）を示すコロニーを選択するステップ、
ステップ３：ステップ２で選択されたコロニーから：一晩培養し、その後、２００〜５００コロニー形成単位（ｃｆｕ）をプレーティングするステップ、
ステップ４：コロニーの均一な集団を示すプレートを選択するするステップ
によってＣｏｒｅｏｔｉｃｓの純粋な培養物を得た。
【０１０３】
選択プロセス（ステップ１〜４）を数回反復した。数回の精製ラウンドの後、純粋なＣｏｒｅｏｔｉｃｓ菌株を分類学的分析にかけた。
【０１０４】
１．２  分類学的分析１：１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列類似性
【０１０５】
菌株Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（４８０塩基）を、ユニバーサルプライマーである２７ｆ（５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号２０））および５１９ｒ（５’−ＧＷＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＫＧＣＴＧ−３’（配列番号２１））を使用したＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を使用することによって精製し、ＤＮＡ濃度および産物のサイズを、Ｌｏｗ  ＤＮＡ  Ｍａｓｓ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）を使用することによって推定した。ＰＣＲ産物について、ＤＹＥｎａｍｉｃＴＭ  ＥＴ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００キャピラリーシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者の仕様に従って使用して配列決定した。ＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７年）およびｍｅｇａＢＬＡＳＴプログラム（Ｚｈａｎｇら、２０００年）によって、有効に（ｖａｌｉｄｌｙ）公開された原核生物の名称を伴う標準菌株のデータベース（Chunら、２００７年）に対して系統発生の近隣（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ）の同定を最初に行った。次いで、ＥｚＴａｘｏｎサーバー（http://www.eztaxon.org/;Chunら、２００７年）で実行するグローバルアラインメントアルゴリズムを使用してペアワイズ配列類似性を算出するために、最高スコアの５０配列を選択した。得られた複数の配列アラインメントを、プログラムＭＥＧＡバージョン５（Tamura、２００７年）を使用することによって手動で補正して、アラインメントギャップおよび不明確な塩基を取り除き、プログラムＭＥＧＡバージョン５（Tamura、２００７年）を用い、近隣結合法（Saitou  &  Nei、１９８７年）に従って系統樹を構築した。
【０１０６】
菌株Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列解析により、この菌株がＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６（１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列類似性１００％）と共に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＡＴＣＣ８４８３（９７．５％）と共に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＡＴＣＣ２９１４８（９４．２％）と共に、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＤＳＭ１７５６５（９２．２％）と共にクラスターを形成することが示された。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の相違（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）において類似性値が≧９７％であることが種を正確に説明するために有意であることが一般に認識されている（Stackebrandt  &  Goebel、１９９４年）。しかし、Stackebrandt  &  Ebers（２００６年）は、この値は、「種」の説明の質および精度を犠牲にすることなく９８．７〜９９％まで増加させることが可能であること、かつこの値が分類学者の助けとなり得ると推奨した。
【０１０７】
１．３  分類学的分析２：全ゲノムのＤＮＡ間ハイブリダイゼーション
【０１０８】
ＤＮＡ間ハイブリダイゼーションは、分類学におけるゴールドスタンダードであると考えられている。Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ菌株の全ゲノムを、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＤＳＭ２０７９およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＤＳＭ１７５６５の全ゲノムとのハイブリダイゼーションにかけた（これらの分析は、ＤＭＳＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）において、ＤＭＳＺによって実行された。簡単に述べると、比較しようとする各菌株のバイオマテリアル３ｇをＤＮＡ調製のために使用した。単離されたＤＮＡの純度を分析し、ＤＮＡを、フレンチプレスを使用してせん断し、高温で変性させた（１００℃、１０分）。ＤＮＡは、２００ｋＤａから６００ｋＤａの間のサイズを有し、主要な画分が約４５０＋／−１００ｋＤａである断片にせん断することが好ましい。各菌株のＤＮＡならびに両方の菌株のＤＮＡの等濃度の混合物（試料中の最終的なＤＮＡ濃度は基本的に同一であり、好ましくは約２０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの間、特に約３０μｇ／ｍｌである）の復元を、２６０ｎｍにおける吸光度を用いて分光光度的に測定した。溶液をＤＮＡの融解温度を下回る温度２５℃まで直ちに冷却することによって復元を開始し、測定を３０分にわたって実施した。ＤＮＡ関連性を、単一の細菌株および両方の菌株のＤＮＡの混合物のそれぞれのＤＮＡの復元曲線の種々の傾きから算出した。具体的には、復元速度ｖ’を１分当たりの吸光度の減少（ΔＡ／ｔ）として決定し、結合の程度（Ｄ）、すなわちＤＮＡ関連性をＤｅ  Ｌｅｙら（上記を参照されたい）によって示された式に従って算出した：
【数１】
2014529403.tif 000003
式中、Ｄは結合の程度（％）であり、ｖ’ｍは混合物の復元速度であり、ｖ’Ａは第１の菌株のＤＮＡの復元速度であり、ｖ’Ｂは第２の菌株のＤＮＡの復元速度である。
【０１０９】
全ゲノムのハイブリダイゼーションの結果が表１に示されている：
【０１１０】
【表１】
2014529403.tif 000004
【０１１１】
１．４  分類学的分析３：微生物学的な特徴付けおよび生化学的な特徴付け
【０１１２】
菌株ＤＳＭ２５００４は、絶対嫌気性、非胞子形成性、非運動性かつグラム陰性であると同定することができた。短桿状細胞または桿状細胞は幅０．４〜０．５μｍであり、長さは一般に１〜２μｍの範囲で様々であった。１８時間後にＷｉｌｋｉｎｓ−Ｃｈａｌｇｒｅｎ寒天（Ｏｘｏｉｄ）で成長したコロニーは直径２〜３ｍｍであり、環状の乳白色の隆起した凸状の表面を有した。最初の生化学的分析により、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ種（Ｄａｔａｂａｎｋ  ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）に対して９１％の類似性が示された。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓとは対照的に、菌株ＤＳＭ２３９６４はデンプンを利用することや、インドールを産生することができず、また、カタラーゼ活性を示さなかった。単離された細菌およびそれらの構成的な酵素および基質利用プロファイルの生化学的同定を、迅速ＩＤ３２ＡおよびＡＰＩ２０Ａ生化学キット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、Ｍａｒｃｙ  ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を製造者の指示に従って使用することによって実施した。菌株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＤＳＭ１７５６５、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＤＳＭ２０７９およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６の化学分類学的分析の結果が表２に要約されている。菌株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣｏｒｅｏｔｉｃｓおよびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６はどちらも同一の生化学プロファイルを有した。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓは、グリセロール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトールおよびＤ−メレジトースの利用により、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６とは区別し得た。さらに、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６についての結果とは対照的に、グルタミルグルタミン酸アリールアミダーゼ活性を示した。他の部分では、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６はロイシンアリールアミダーゼ活性を発現することができたが、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓはそれができなかった。したがって、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＤＳＭ１７５６５、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＤＳＭ２０７９およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６とは区別し得た（表２）。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＣｏｒｅｏｔｉｃｓおよびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６についての結果とは対照的に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＤＳＭ２０７９は酵素活性についての試験において多数の陽性の結果を示した。
【０１１３】
【表２】
2014529403.tif 000005
【０１１４】
菌株：１：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ；２：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６；３：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ  ＤＳＭ１７５６５；４：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６；５：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ  ＤＳＭ２０７９；６：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＤＳＭ１３９６。特性は、「＋」：陽性反応；「−」：陰性反応としてスコア化されている。
【０１１５】
１．５  無作為に増幅された多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）パターンおよび遺伝子型解析
【０１１６】
ＣｏｒｅｏｔｉｃｓがＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種と別個の菌株であるかどうかを試験するために、ＲＡＰＤアッセイを実施した。鋳型ＤＮＡを増幅するために、４つの異なるランダムプライマーを別々の反応に使用した（各反応ではただ１つのプライマーを使用した）。ＰＣＲ反応混合物（５０μｌ）は、Ｔａｑ緩衝液（１６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６７ｍＭのトリスＨＣｌ）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１μＭのプライマー、２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび２μｌの鋳型ＤＮＡを含有した。ＰＣＲプログラムは、９５℃で５分、９５℃で１分を３５サイクル、５０℃で１分および７２℃で１分、最後に７２℃で６分であった。全てのプライマーについてのバンドパターンを１％アガロースゲルで分析した。したがって、各鋳型ＤＮＡについて、４つの異なるバンドパターン（各プライマーについて１つ）を得た。
【０１１７】
コア−１陽性ＣｏｒｅｏｔｉｃｓをＲＡＰＤ分析に供し、結果を参照細菌であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種（ＤＳＭ１８８３６）、Ｂａｃｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｉｎｅｇｏｌｄｉｉ種（ＤＳＭ１７５６５）およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ種（ＤＳＭ１８９６）の結果と比較した（１つの例示的なプライマーについては図１を参照されたい）。結果は、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓが、公知のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ菌株ＤＳＭ１８８３６と同一ではない別個の菌株であることを実証している。
【０１１８】
１．６  要約
【０１１９】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列類似性、全ゲノムのＤＮＡ間ハイブリダイゼーションおよび生化学的特徴付けの結果により、単離された微生物ＣｏｒｅｏｔｉｃｓがＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ種のものであることが実証された。さらに、ＲＡＰＤ分析により、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓが、公知のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ菌株とは異なる特異的かつ別個のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ菌株であることが示された。
【０１２０】
（実施例２）
安定かつ均一なコア−１抗原の発現
【０１２１】
２．１  ＡＧ６と比較したＣｏｒｅｏｔｉｃｓのコア−１発現
【０１２２】
固定した細菌細胞を、ＰＢＳを用いて１ｍｌ当たり細胞１＊１０７個の細胞濃度に調整した。５０μｌを２連でＰｏｌｙＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のウェルに適用し、３７℃で一晩コーティングした。さらなるインキュベーションステップ全ての前に、プレートを、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水（８．７８ｇのＮａＣｌ、１Ｌ当たり６．０６ｇのトリス、および０．０５％［ｖ／ｖ］のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．６）２００μｌを用いて３回洗浄した。さらなる方法のステップを室温で実施した。ウェルをＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μｌと一緒に２０分間インキュベートすることによって残余の結合部位をブロッキングした。コア−１に特異的なモノクローナル抗体（Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ１）を、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ  ５０μｌ中の一次抗体として適用し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水２００μｌを用いて３回洗浄した後、二次抗体と一緒にインキュベートした。二次抗体（ペルオキシダーゼ−ウサギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ  Ｐ０２６０、ＤＡＫＯ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＰＢＳ中１％ＢＳＡで１／５０００に希釈し、ウェル当たり５０μｌを適用し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、再度、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水２００μｌを用いて３回洗浄し、顕色液（５０μＭ酢酸ナトリウム緩衝液中の１％［ｖ／ｖ］ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌのテトラメチルベンジジン）１００μｌを各ウェルに加えることによって、暗所中で５〜２０分間顕色した。その後、２．５ＭのＨ２ＳＯ４  ５０μｌを加えて、反応を停止させ、ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ、ＵＳＡ）で吸光度（Ｅ４５０／６３０）を測定した。同様にＰＢＳを用いて１ｍｌ当たり細胞１＊１０７個の細胞濃度に調整した、ＷＯ２００８／０５５７０３）に開示されているＡＧ６  ＤＳＭ１８７２６の固定培養物が陽性対照としての機能を果たした。あるいは、アシアログリコホリンおよびグリコホリン（ＰＢＳ中１ウェル当たり１００ｎｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が、それぞれコア−１抗原に対する陽性対照および陰性対照としての機能を果たした。アッセイは、少なくとも２つの別々の場合に対して２連で実施した。
【０１２３】
１０個の異なるＣｏｒｅｏｔｉｃｓ（ＤＳＭ２５００４）コロニーおよび１０個の異なるＡＧ６（ＤＳＭ１８７２６、ＷＯ２００８／０５５７０３に開示されている）コロニーのＥＬＩＳＡアッセイにより、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ）はそれらの細胞表面で非常に安定かつ均一な高いコア−１発現を示すが、ＡＧ６（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ）はそれよりも変動性が高く低い平均コア−１発現を示すことが明らかになった（図２を参照されたい）。
【０１２４】
２．２  Ｂ．ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ参照菌株と比較したＣｏｒｅｏｔｉｃｓのコア−１発現
【０１２５】
コア−１発現を、ＥＬＩＳＡ実験においてコア−１特異的抗体Ｎｅｍｏｄ−ＴＦ１（Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の結合によって分析した。陽性対照（ＰＫ）および菌株Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓについて強力なＴＦ１結合を同定することができた。これにより、その表面にコア−１構造物が存在することが明らかになった。過ヨウ素酸を用いた前処理により、抗コア−１抗体の結合が完全に消失した。参照菌株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ１８８３６では、いかなるコア−１特異的抗体の結合も存在しなかった。結果が図３に示されている。
【０１２６】
（実施例３）
模擬の胃液および加熱処理のコア−１発現に対する影響
【０１２７】
胃腸管の通過を模倣するために、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ細菌に、模擬の胃液および腸液の作用を受けさせた。Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ菌株の生存率は胃液中では１８０分後に９０％超であり、腸液に２４０分間曝露させた後には９６％超であった。興味深いことに、いずれの処理も、菌株Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓの表面のコア−１抗原の露出に対していかなる影響も有さなかった。低温殺菌もコア−１抗原密度に影響を及ぼさず、室温、４℃または−２０℃で保管した場合、１２カ月にわたって安定のままであった。
【０１２８】
（実施例４）
短鎖脂肪酸の産生
【０１２９】
ＨＰＬＣ分析に基づいて、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ菌株ＣＴＣ１が、プロピオン酸および酢酸のような短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）ならびにコハク酸、ギ酸および乳酸のような他の物質を産生することができることが実証された。成長条件および培地組成に応じて、上清において測定された代謝産物の濃度は、それぞれ、コハク酸については２．５ｍＭから４４．７ｍＭまで、プロピオン酸については５．８ｍＭから２９．３ｍＭまで、酢酸については３．４ｍＭから３８．３ｍＭまで、ギ酸については０ｍＭから４５ｍＭまで、および乳酸については０．８８ｍＭから８．６ｍＭまで様々であった。
【０１３０】
（実施例５）
ビルレンス因子の分析
【０１３１】
５．１  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓの抗生物質抵抗性
【０１３２】
いくつかの抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の分析により、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ菌株は、ペニシリンＧ、アンピシリンおよびメズロシリン（meziocillin）のようなβ−ラクタム系薬物に対して抵抗性であることが明らかになった。しかし、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ菌株はメトロニダゾール、メロペネムおよびクリンダマイシンのような通常の抗生剤に対しては感受性であり、また、β−ラクタマーゼ阻害剤を添加することによりβ−ラクタム系薬物に対する感受性が回復した。
【０１３３】
５．２  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓにおけるプラスミドの検出
【０１３４】
Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ菌株におけるプラスミドの潜在的な存在を調査するために、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓから、ならびに対照菌株、それぞれ低コピープラスミドＲＰ４（６０ｋｂ）およびｐＳＣ１０１（９．４ｋｂ）を含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＤＳＭ３８７６、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＳＭ６２０２の両方からプラスミドＤＮＡ材料を単離した。２６０ｎｍにおけるプラスミドＤＮＡ濃度の測定により、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓのプラスミド調製物中にＤＮＡが存在しないことが明らかになった。プラスミド調製物をアガロースゲルで泳動することにより、対照菌株由来の低コピープラスミドの両方が単離されたこと、およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ由来の検出可能なプラスミド材料が存在しないことが確認された（図５Ａ）。
【０１３５】
５．３  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓのゲノムにおけるβ−ラクタマーゼ遺伝子ｃｆｘＡ、ｃｅｐＡおよびｃｆｉＡの同定
【０１３６】
Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ菌株のβ−ラクタマーゼ活性を特徴付けるために、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属に関して公知のβ−ラクタマーゼ遺伝子であるｃｆｉＡ、ｃｆｘＡ、およびｃｅｐＡのそれぞれに対して特異的なＰＣＲアッセイを実行した。結果は、菌株Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓが排他的にｃｅｐＡ遺伝子を含有することを示す（図５Ｂ〜Ｄ）。
【０１３７】
５．４  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属におけるビルレンス因子をコードする遺伝子
【０１３８】
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ多糖Ａ（ＰＳ  Ａ）およびＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓエンテロトキシンＢｆｔはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属の最も重要なビルレンス因子である。エンテロトキシンＢｆｔの存在について調査するために、ｂｆｔ遺伝子に対して特異的なＰＣＲを実施した。ＰＳ  Ａの場合、ＰＳ  Ａの生合成遺伝子の上流に位置する高度に保存されたオープンリーディングフレームであるｕｐａＹ、ｕｐａＺに対して、ならびに、最も重要な遺伝子である、アミノトランスフェラーゼをコードするｗｃｆＲおよびグリコシルトランスフェラーゼをコードするｗｃｆＳに対して特異的なＰＣＲを設計した。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ４３８５８とは対照的に、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ菌株はｂｆｔ遺伝子を保有しない。遺伝子ｗｃｆＲ、ｗｃｆＳおよびオープンリーディングフレームであるｕｐａＹとｕｐａＺの両方も検出することができなかった（図６Ａ〜Ｃ）。
【０１３９】
さらに、ＩＢＤの発生に関与する可能性があるビルレンス因子である「Ｔｏｎ  Ｂ−結合外膜タンパク質」をコードする遺伝子ｏｍｐＷの存在について分析した。Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ菌株ではｏｍｐＷコード遺伝子を検出することはできなかった（図６Ｄ）。
【０１４０】
５．５  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓの細胞外酵素および病原性因子の決定
【０１４１】
ノイラミニダーゼに加えて、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属のいくつかの菌株が、感染プロセスに関与し得るコラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼおよびいくつかのプロテアーゼを含めた望ましくない細胞外酵素を産生することが記載された。最も関連の深い細胞外酵素活性を、ＰＣＲ（ノイラミニダーゼ）または酵素アッセイによって分析した。Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ菌株は、デオキシリボヌクレアーゼ活性、コンドロイチナーゼ活性、ヒアルロニダーゼ活性、およびノイラミニダーゼ活性を示さず、弱いβ−溶血活性およびコラゲナーゼ活性のみを示す。
【０１４２】
５．６  Ｃａｃｏ−２細胞へのＣｏｒｅｏｔｉｃｓの接着
【０１４３】
Ｃａｃｏ−２細胞を培養し、分化を誘導した。結果は、ＧＡＰＤＨの発現レベルは分化の間一定であったが、スクラーゼイソマルターゼのレベルは分化の間に増加したことを実証している。顕微鏡観察により、Ｃａｃｏ−２細胞が１４日後に単層としてよく分化したことが確認された。嫌気条件下で３時間共にインキュベーションした後の、細菌と分化したＣａｃｏ−２細胞の結合を、連続的な洗浄ステップの上清に対して、および最終的にはこすり取ったＣａｃｏ−２細胞に対して実施した種特異的なＰＣＲによって分析した。陽性対照とは対照的に、第１の洗浄ステップの上清において当然検出することができたＣｏｒｅｏｔｉｃｓ細胞は、その後の上清でもこすり取ったＣａｃｏ−２細胞でも検出することができなかった。これは、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ細胞がヒト結腸の上皮細胞に付着しないことを示している（図７）。
【０１４４】
（実施例６）
毒物学的試験
【０１４５】
６．１  生存能力アッセイ
【０１４６】
凍結乾燥および再水化後のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ（ＤＳＭ２５００４）の生存能力をいくつかの独立した実験で分析した。最低の同定生存率により、４×１０９ＣＦＵ／ｇの生育可能な細菌の最小濃度が示された。この濃度は、「利用可能な濃度」として許容された。
【０１４７】
６．２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異原性試験（エイムス試験）
【０１４８】
この試験は、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓまたはそれらの発酵生成物の任意の毒性または変異原性の影響を検出するために実施した。プレート当たり細菌０．２８ｍｇから２８．５ｍｇの範囲の生育可能な細菌の５つの用量またはプレート当たり低温殺菌した細菌５９ｍｇの１つの用量を、それぞれ代謝活性化あり、およびなしで行った２つの独立した実験において使用した。代謝活性化ありおよびなしの５つの試験菌株のいずれの濃度についても、また、それぞれプレート組み込み（ｐｌａｔｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびプレインキュベーション様式のどちらの試験形式においても、対照のカウントと比較して細胞傷害性の徴候も復帰変異体コロニー数の増加も観察されなかった。
【０１４９】
６．３  染色体異常誘発活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける評価（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ染色体異常アッセイ）
【０１５０】
試験に使用したＣｏｒｅｏｔｉｃｓの最高濃度は、最大の妥当な濃度であると考えられる培養培地１ｍｌ当たり生育可能な細菌２．８ｍｇおよび培養培地１ｍｌ当たり低温殺菌した細菌５．９ｍｇであった。代謝活性化の不在下では、陰性対照において観察された染色体異常の平均発生率（ギャップを除いて）は４時間曝露させた後、および２４時間曝露させた後に、それぞれ１．０％または０．５％であった。生育可能なＣｏｒｅｏｔｉｃｓおよび低温殺菌したＣｏｒｅｏｔｉｃｓのいずれの濃度でも、４時間曝露させた後、および２４時間曝露させた後に異常な細胞のいかなる統計的に有意な増加も生じなかった（０．５％〜２．５％）。対照的に、陽性対照は、４時間曝露させた後、および２４時間曝露させた後に、それぞれ１０．５％および１７．５％の異常な細胞の増加を示した。代謝活性化の存在下では、陰性対照において観察された染色体異常の平均発生率（ギャップを除いて）は、４時間曝露させた後に０．５％であった。さらに、生育可能なＣｏｒｅｏｔｉｃｓおよび低温殺菌したＣｏｒｅｏｔｉｃｓのいずれの濃度でも、異常な細胞のいかなる統計的に有意な増加も生じず、２つの独立した実験において、それぞれ０．０％および１．５％であった。陽性対照は、４時間後に、２つの実験においてそれぞれ１３．５％および１６．５％の異常な細胞を示した。代謝活性化ありまたはなしでの実験において、試験したＣｏｒｅｏｔｉｃｓ濃度の全てについて、品目関連の倍数性や核内倍加は認められなかった。さらに、以前の結果を確認して、代謝活性化ありまたはなしでの実験において、試験したＣｏｒｅｏｔｉｃｓの濃度のいずれにおいても細胞傷害性の徴候は認められなかった。
【０１５１】
６．４  マウスにおける９０日経口毒性試験
【０１５２】
この試験の目的は、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓを経口摂取することに何らかの毒物学的影響があるかどうかを決定することであった。Ｃｒｌ：ＮＭＲＩマウス（雄５０匹、雌５０匹）を５つの試験群（群当たり雄１０匹、雌１０匹）に割り当て、日用量の細菌を胃管栄養法によって９０日間にわたって経口投与した。１日当たり動物当たり１×１０６〜１×１０８ＣＦＵまたは１×１０１１個の低温殺菌したＣｏｒｅｏｔｉｃｓの作用を試験した。結果が図８に示されている。９０日の試験の間、対照群の場合と同様に、生育可能なＣｏｒｅｏｔｉｃｓまたは低温殺菌したＣｏｒｅｏｔｉｃｓで処置した群のいずれにおいても死亡は認められなかった。処置したマウスおよび処置していないマウスはいずれも、その挙動または外観にいかなる変化も示さなかった。さらに、機能的な観察では、いかなる試験品目に関連する影響も示されず、運動性、糞便の硬さ、および水分消費量ならびに体重増加および摂食量に、実験期間全体を通して処置群と対照群との間で有意差は示されなかった。血液学的検査では、いずれの試験用量レベルの生育可能なＣｏｒｅｏｔｉｃｓおよび低温殺菌したＣｏｒｅｏｔｉｃｓでも、試験品目に関連する影響は示されず、対照群と処置したマウスの群との間に統計的有意差は観察されなかった。臨床的な生化学的値および眼科学的検査により、生育可能なＣｏｒｅｏｔｉｃｓおよび低温殺菌したＣｏｒｅｏｔｉｃｓの両方について、いずれの群、いずれの用量レベルにおいても試験品目に関連する変化がないことが明らかになった。さらに、肉眼での死後分析により、試験品目に関連する病変や異常がないことが明らかになった。最後に、全ての臓器の広範囲にわたる詳細な病理組織学的分析により、処置群と対照群との間に差異がないことが明らかになった。
【０１５３】
６．５  Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓのｉｎ  ｖｉｖｏにおける病原性（膿瘍形成）
【０１５４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腹腔内膿瘍形成モデルは、日和見細菌株の病理的性質を調査するために広く受け入れられているモデルである（McConvilleら、１９８１年；Onderdonkら、１９８４年；Thadepalliら、２００１年）。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６９７１またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ  ＤＳＭ２５００４（Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓ）の新鮮な一晩細菌培養物を使用した。体重１ｋｇ当たり２．３×１０７〜４．６×１０９ＣＦＵ、５０％（ｗ／ｗ）のオートクレーブしたラット糞便、および１０％（ｗ／ｖ）の硫酸バリウムを含有する混合物をマウスの腹腔内に注射した。注射した後、各品目の生存能力、細菌の濃度および純度を、残りの材料において遡及的に決定した。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓおよび／またはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓの存在を同定するために、Liuら（２００３年）により記載されているマルチプレックス種特異的ＰＣＲを確立した。このマルチプレックスＰＣＲにより、一方の種が非常に低い比率を占めるコンタミネーションの状況にある種の両方を同定することも可能になった。本発明者らは、単一の試験品目のそれぞれが、求められる細菌株を含有し、他の種が混入していないことを確認した（図９参照）。それぞれの試験品目を適切な寒天上にプレーティングし、それを好気性条件下でインキュベートすることにより、さらなる潜在的なコンタミネーションを分析した。４８時間インキュベートした後にいかなる単一のコロニーも検出することはできなかった。２つの別々の実験において、高用量のＣｏｒｅｏｔｉｃｓを注射したマウスでは、陰性対照（硫酸バリウム＋滅菌ラット糞便）よりも多くのまたはより大きな膿瘍の発生は誘導されなかった。対照的に、高濃度のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６９７１では、より多くの、より大きな膿瘍の形成が誘導された。７日後に、滅菌条件下で動物当たり２つの膿瘍を取得し、内容物を穿刺し、ＤＮＡ抽出に供した。本発明者らは、種特異的なＰＣＲによって、膿瘍におけるＣｏｒｅｏｔｉｃｓまたはＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６７９１の存在を評価した（図１０）。それぞれ体重１ｋｇ当たり２．３×１０７〜４．６×１０９個のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓを注射した群２、群４および群６から単離した全ての膿瘍においてＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＲＭＡ６９７１を検出することができた。対照的に、注射した細菌の濃度とは関係なく、分析した膿瘍のいずれにおいてもＣｏｒｅｏｔｉｃｓを検出することはできなかった。Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓを注射したマウスについてのこれらの結果により、この菌株が膿瘍の形成を誘導しないこと、およびこの菌株が実際にはｉ．ｐ．注射後に免疫系によって直ちに完全に根絶されることが明白に示された。
【０１５５】
（実施例７）
マウスモデル
【０１５６】
マウス血清は、炭水化物構造物と交差反応性の抗体を含有し得る。免疫した後、任意のコア−１キャリア分子または細胞において観察される結合の増大も、そのような交差反応性抗体に関連し、偽陽性シグナルがもたらされる可能性がある。コア−１特異的抗体力価を特異的に分析するために、各時点におけるコア−１特異的抗体のレベルを比率：「コア−１R＝キャリア−コア−１におけるシグナル／キャリア−参照におけるシグナル」として表した。参照構造物は、Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓの表面に存在しない任意の炭水化物構造物であってよく、二糖であることが好ましい。Ｃｏｒｅｏｔｉｃｓを投与した後にこの比率が増加することにより、コア−１特異的抗体力価が増加したことが示される。
【０１５７】
７〜９週齢の雄のＣ３Ｈマウスに、４週間にわたって１日に５＊１０９個のＣｏｒｅｏｔｉｃｓを経口投与した。陰性対照として、マウス４匹をＮａＣｌで処置し、マウス４匹をコア−１陰性菌株Ｂ．ｏｖａｔｕｓ  ＤＳＭ１８９６で処置した。免疫を開始する前、ならびに２１日目および２８日目に血清を取得した。血清を１／１００希釈し、コア−１特異的ＩｇＭ抗体におけるそれらの含有量を、複合糖質ＰＡＡ−コア−１およびＰＡＡ−参照（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）に対して以下の通り分析した。
【０１５８】
複合糖質ポリアクリルアミド−Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ（ＰＡＡ−コア−１）およびポリアクリルアミド−Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ（ＰＡＡ−参照）を、コーティング緩衝液（ｃｏａｔｉｎｇ  ｐｕｆｆｅｒ）（４．２ｇのＮａＨＣＯ３、１．７８ｇのＮａ２ＣＯ３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｈ２Ｏを用いて１Ｌ、ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの濃度に調整した。各複合糖質５０μｌをＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のウェルに２連で適用し、４℃で一晩コーティングした。さらなるインキュベーションステップ全ての前に、プレートを、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水（１Ｌ当たり８．７８ｇのＮａＣｌ、６．０６ｇのトリス、および０．０５％［ｖ／ｖ］のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．６）２００μｌを用いて３回洗浄した。残余の結合部位を、ウェルをＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００μｌとともに２０分間インキュベートすることによってブロッキングした。
【０１５９】
動物の血清を、ＰＢＳを含有する１％ＢＳＡを用いて適切に希釈し（１／５０〜１／２００）、５０μｌを、ＰＡＡ−コア−１でコーティングしたウェルおよびＰＡＡ−参照でコーティングしたウェルに２連で適用し、室温で１時間インキュベートした。プレートを、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水２００μｌを用いて３回洗浄した後に、二次抗体（ペルオキシダーゼ−ヤギ抗マウスＩｇＭ  １１５−０３５−０７５、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）のＰＢＳ中１％ＢＳＡ中１／５０００希釈物５０μｌとともに１時間インキュベートした。プレートを、再度、Ｔｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝食塩水２００μｌを用いて３回洗浄し、顕色液（５０μＭ酢酸ナトリウム緩衝液中１％［ｖ／ｖ］ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌのテトラメチルベンジジン）１００μｌを各ウェルに加えることによって暗所中で５〜２０分顕色した。その後、２．５ＭのＨ２ＳＯ４  ５０μｌを加えて反応を停止させ、吸光度（Ｅ４５０／６３０）を測定した。コア−１特異的抗体のレベルを比率：「ＰＡＡ−コア−１におけるＥ４５０／６３０／ＰＡＡ−参照におけるＥ４５０／６３０」として表した。免疫の前後の比率を比較することにより、コア−１特異的抗体力価の変化を特異的に分析することが可能になった。
【０１６０】
結果として、マウスにおいてＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｘｙｌａｎｉｓｏｌｖｅｎｓ菌株ＣＴＣ１によりコア−１特異的抗体力価が誘導されたことを示すことができた。したがって、本発明による微生物がコア−１抗原に対する免疫応答を誘導することができることが実証された。
【図４】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【図５（Ｃ）】
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【図５（Ｄ）】
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【図６（Ａ）】
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【図６（Ｂ）】
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【図６（Ｃ）】
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【図６（Ｄ）】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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