(57)【要約】本発明は、配列番号：3の配列の少なくとも8個の連続するアミノ酸残基を含有するか、もしくは該アミノ酸残基から成るが、配列番号：3の配列から成るものではないことを条件とするペプチド、またはそれに対応するペプチド様物質に関し、ここで、該ペプチドまたはペプチド様物質は患者由来のサンプル中に含有される抗KIR4.1抗体に結合し、該患者は多発性硬化症またはその素因を有し、好ましくは、（i）該少なくとも8個の連続するアミノ酸残基はKIR4.1の細胞外ドメインの部分配列であり、該細胞外ドメインは配列番号：1もしくは2の配列から成るか、または（ii）該ペプチドは配列番号：1もしくは2の配列を含有するか、もしくは該配列から成る。更に本発明は、被験体における多発性硬化症または多発性硬化症の素因を診断するための方法に関し、方法は、該被験体から得たサンプル中の抗KIR4.1抗体の存在を測定することを含み、該サンプル中の抗KIR4.1抗体の存在は多発性硬化症または多発性硬化症の素因を示す。また、多発性硬化症の治療のための新規の手段および方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：3の配列の少なくとも8個の連続するアミノ酸残基を含有するかもしくは該アミノ酸残基から成るが、ただし、配列番号：3の配列から成るものではないことを条件とするペプチド、またはそれに対応するペプチド様物質であって、
ここで、該ペプチドまたはペプチド様物質が、患者由来のサンプル中に含有される抗KIR4.1抗体に結合し、該患者が多発性硬化症またはその素因を有し、
ここで、好ましくは、
（i）該少なくとも8個の連続するアミノ酸残基がKIR4.1の細胞外ドメインの部分配列であり、該細胞外ドメインが配列番号：1もしくは2の配列から成る；または
（ii）該ペプチドが配列番号：1もしくは2の配列を含有するか、もしくは該配列から成る、
ペプチドまたはペプチド様物質。
【請求項２】
被験体における多発性硬化症または多発性硬化症の素因を診断する方法であって、該方法が、該被験体から得たサンプル中の抗KIR4.1抗体の存在を測定することを含み、
ここで、該サンプル中の抗KIR4.1抗体の存在が、多発性硬化症または多発性硬化症の素因を示す、
方法。
【請求項３】
抗KIR4.1抗体が該サンプル中に存在する場合、
（i）該被験体における少なくとも１つの多発性硬化症の臨床症状の存在が、多発性硬化症を示し；および、
（ii）多発性硬化症の臨床症状の不存在が、該多発性硬化症の素因を示す、
請求項２記載の方法。
【請求項４】
（ａ）該被験体が多発性硬化症の初回臨床症状（clinically isolated syndrome；CIS）を有する、請求項２記載の方法；または
（ｂ）少なくとも１つの臨床症状がCISである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
抗KIR4.1抗体がKIR4.1（配列番号：3）またはその細胞外ドメインに結合し、該細胞外ドメインが配列番号：1、2、4、または5のいずれかの配列から成る、請求項２から５のいずれかに記載される方法。
【請求項６】
該抗KIR4.1抗体の存在が
（ａ）該サンプルを、該抗KIR4.1抗体に結合する受容体と接触させる；および
（ｂ）受容体-抗KIR4.1抗体複合体の形成を検出する
ことによって測定され、
ここで、該受容体が、好ましくは請求項１記載のペプチドまたはペプチド様物質、KIR4.1タンパク質、および該抗KIR4.1抗体に結合する抗体から成る群から選択される、
請求項２から５のいずれかに記載される方法。
【請求項７】
多発性硬化症の治療または多発性硬化症もしくはその素因の診断に使用するための、請求項６記載の受容体。
【請求項８】
多発性硬化症の治療に使用するためのKIR4.1（配列番号：3）またはその細胞外ドメインに結合する抗体であって、
該ドメインが配列番号1または2の配列から成り、および該抗体が患者由来のサンプル中に含有される抗KIR4.1抗体のKIR4.1への結合に干渉し、該患者が多発性硬化症もしくはその素因を有する、
抗体。
【請求項９】
（i）請求項１記載のペプチドもしくはペプチド様物質、
（ii）請求項１から５のいずれかに記載される抗KIR4.1抗体に結合する抗体、および／または、
（iii）請求項８記載の抗体
を含有する組成物。
【請求項１０】
患者における多発性硬化症の治療に使用するためのリツキシマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、およびFc結合物質から選択される物質であって、
該患者は、血液、血清、血漿、リンパ節、脳脊髄液（CSF）、涙液、尿、痰、および脳生検のいずれかに抗KIR4.1抗体が存在することを特徴とする、
物質。
【請求項１１】
薬物またはリード化合物をスクリーニングする方法であって、該方法が
（i）請求項１から５のいずれかに記載する抗KIR4.1抗体；および
（ii）KIR4.1タンパク質または請求項１記載のペプチドもしくはペプチド様物質
を含有するか、またはそれらから成る複合体を試験化合物と接触させることを含み、
ここで、該複合体の量の低下が、該試験化合物が薬物またはリード化合物であることを示す、
方法。
【請求項１２】
請求項６記載の受容体の使用であって、
血液もしくは血清から抗KIR4.1抗体を除去するかまたはその量を低減させるための、エクスビボで行われる、
使用。
【請求項１３】
血液もしくは血清から抗KIR4.1抗体を除去するかまたはその量を低減させるための、エクスビボ方法であって、該方法が
（ａ）被験体から除去した血液を請求項６記載の受容体および／またはFc結合物質と接触させ；および／または、
（ｂ）プラスマフェレシスを実施する
ことを含む、
方法。
【請求項１４】
請求項６記載の受容体が固定化されている担体。
【請求項１５】
請求項１４記載の担体を含有する、血液から抗KIR4.1抗体を除去する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号：3の配列の少なくとも8個の連続するアミノ酸残基を含有するか、もしくは該アミノ酸残基から成るペプチド（ただし該ペプチドは配列番号：3の配列から成るものではない）またはそれに対応するペプチド様物質に関し、ここで、該ペプチドまたはペプチド様物質は患者由来のサンプル中に含有される抗KIR4.1抗体に結合し、該患者は多発性硬化症またはその素因を有し、好ましくは（i）該少なくとも8個の連続するアミノ酸残基はKIR4.1の細胞外ドメインの部分配列である（該細胞外ドメインは配列番号：1または2の配列から成る）；または、（ii）該ペプチドは配列番号：1もしくは2の配列を含有するか、もしくは該配列から成る。本発明は更に、被験体における多発性硬化症または多発性硬化症の素因を診断する方法に関し、該方法は、該被験体から得たサンプル中の抗KIR4.1抗体の存在を測定することを含み、ここで、該サンプル中の抗KIR4.1抗体の存在は多発性硬化症または多発性硬化症の素因を示す。
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造者の取扱説明書を含む多くの文献を引用する。それらの文献の開示は、本発明の特許性に関連すると見なされるものではなく、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。より具体的には、全ての引用文献は、個々の文献が具体的かつ個別に参照によって組み込まれることが示されるのと同じ程度まで、参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
多発性硬化症（MS）は、最もよく見られる中枢神経系（CNS）の慢性炎症性疾患であり、罹患患者の大部分で身体障害が起こる（1）。MSの病因は明らかになっていないが、疫学的証拠から、遺伝要因および環境要因の複雑な相互作用が示唆されている（2-4）。発症機序が不明確であること、臨床的に不均一であること、そして個々の患者の転帰が予測不能であることが、この疾患の複雑性を増している（5）。
【０００４】
MS発症機序に関する現在の作業仮説は、自己反応性Ｔ細胞が中心的役割を果たしていることを示唆している（6）。しかしながら、組織病理学的研究から、MS患者の一部は急性脱随性病変における顕著な免疫グロブリン沈着および補体活性化を示すことが明らかになっている（7、8）。それらの患者は、血漿交換療法に特に良好に反応する（9）。更に、モノクローナル抗体療法によるＢ細胞の枯渇は、MSの炎症活性に多大な影響を与える（10）。これらの知見は全て、少なくとも一部のMS患者においてはＢ細胞および抗体が疾患の発症および進行に実質的に関与しているという主張を裏付けている（11、12）。このような状況証拠にもかかわらず、MSにおける体液性応答の特定の分子標的が未だ発見されていないという事実により、MSに臨床的に関連する抗体の直接的な証拠は立証されていない。
【発明の概要】
【０００５】
多発性硬化症の診断および／または治療のための改変または改善された手段および方法の提供には、技術的問題がある。
【０００６】
本発明の第１の観点では、配列番号：3の配列の少なくとも8個の連続するアミノ酸残基を含有するか、もしくは該アミノ酸残基から成るペプチド（ただし該ペプチドは配列番号：3の配列から成るものではない）またはそれに対応するペプチド様物質を提供し、ここで、該ペプチドまたはペプチド様物質は患者由来のサンプル中に含有される抗KIR4.1抗体に結合し、該患者は多発性硬化症またはその素因を有し、好ましくは（i）該少なくとも8個の連続するアミノ酸残基はKIR4.1の細胞外ドメインの部分配列である（該細胞外ドメインは配列番号：1または2の配列から成る）；または、（ii）該ペプチドは配列番号：1もしくは2の配列を含有するか、もしくは該配列から成る。従って、選択肢（i）および（ii）のペプチドに対応するペプチド様物質も好ましい。また、該ペプチドが配列番号：3の配列を含有しないことも好ましい。
【０００７】
「KIR4.1」は、特定の内向き整流性カリウムチャネルの省略名である。好ましくは、該KIR4.1はヒト由来である。ヒトKIR4.1の配列を配列番号：3に示す。本明細書で使用する「ヒトKIR4.1タンパク質の配列」および「配列番号：3の配列」という用語は同じ実体を表す。
【０００８】
記載する抗KIR4.1抗体を本明細書では「自己抗体」とも称する。自己抗体は天然に存在する抗体であり、好ましくはIgG抗体である。特に、自己抗体はMS患者およびMS発症の素因を有する被験体中に存在する抗KIR4.1抗体であり、該患者または被験体中に存在しない他の抗KIR4.1抗体並びに下記に開示するような治療目的で使用できる更なる抗体とは異なるものである。この後者のタイプの抗KIR4.1抗体は天然に存在せず、疾患を示すものではない。好ましくは、自己抗体はKIR4.1の細胞外ドメインに結合し、該細胞外ドメインは配列番号：1または2の配列から成る。好ましくは、該自己抗体は配列番号：1の配列から成る細胞外ドメインに結合する。
【０００９】
好ましい配列番号：1および2の配列の部分配列は、それぞれ配列番号：4および5の配列である。配列番号：4および5の配列は、その全体が細胞外に存在すると考えられる。従って、該ペプチドが配列番号：4または5の配列を含有するか、または該配列から成ることも好ましい。また、後者のペプチドに対応するペプチド様物質も企図される。
【００１０】
配列番号：1、2、4、または5のいずれかの配列を含有する、または該配列から成る配列を有するペプチドは好ましいが、更なるペプチド配列も企図され、該ペプチド配列は、配列番号：1、2、4、および5のいずれかの配列と部分的にしか、または全く重複していなくてもよい。更に説明すれば、また、当該分野で知られるように、Ｔ細胞およびＢ細胞は所定の抗原中で異なるエピトープ選好性を有しうる。
【００１１】
「ペプチド」という用語は、アミノ酸の重縮合物（polycondensate）をいう。好ましくは、該アミノ酸は20種の天然アミノ酸から選択される。本発明のペプチドは少なくとも8アミノ酸長である。好ましくは、該ペプチドの長さの上限は100、50、40、30、25、20、15、14、13、12、11、10、または9アミノ酸残基であり、その最も広範な形態では長さの上限はなく、従って全ての長さのポリペプチドが含まれる。好ましくは、該ペプチドの長さは、それが独自性を持つように選択される。以下に詳述するように、好ましくは、ペプチドがMHC分子に結合できるように長さを選択する。特に、MHC I分子では、一般にペプチドがそれに結合できるためには一定のサイズ制限があることが知られている。従って、好ましい長さおよび長さの範囲は8から12、8から10、そして最も好ましくは9アミノ酸である。これに対してMHC II分子は、一般により長いペプチドも結合することができ、従って、本発明にかかるペプチドの長さに対する制限はない。
【００１２】
「ペプチド様物質」という用語は、当該分野で十分知られている。これはペプチドの誘導体をいい、該誘導体の構造に関しては以下で更に定義する。「対応するペプチド様物質」は、記載する抗体に結合するペプチド様物質である。それらの結合は、由来元であるペプチドの各構成アミノ酸の構造的特徴を保持することによって達成されてもよく、それらの親ペプチドも同様に、記載する抗体に結合する。好ましい態様では、該少なくとも8個の連続するアミノ酸の各側鎖は、該対応するペプチド様物質中で改変された形態または未改変の形態で保持されている。側鎖の改変には、1つまたはそれ以上の水素原子のハロゲン原子（好ましくはF原子）での置換がある。更なる好ましい側鎖改変には環化がある。それとは別に、主鎖ペプチド結合の1つまたはそれ以上が、独立してイソステリック（isosteric）な官能基で置換されていてもよい、すなわちペプチド結合を模倣していてもよい。好ましくは、ペプチド結合-CO-NH-は、-NH-CO-、-CH-(OH)-CH2-、-CO-CH2-、-CH2-NH-、-CH2-O-、-CH2-CH2-、-CH=CH-、-CO-N(CH3)-、およびPO2-X-のいずれかで置換されてもよく、好ましくはXはNH、O、およびCH2から選択される。例えば、対応するペプチド様物質では、親ペプチドの全てのペプチド結合がレトロインベルソ結合（-NH-CO-）で置換されていてもよい。
【００１３】
理解されるように、本発明のペプチド様物質には、親ペプチドの機能特性が実質的に変更されずに備わっている。特に、対応するペプチド様物質は、多発性硬化症患者のサンプル中に含有される抗KIR4.1抗体に結合する。それらの結合は、本明細書に記載する手段および方法を用いて容易に測定することができる。
【００１４】
理解されるように、本発明の第１の観点は、一方ではペプチド、他方ではペプチド様物質に関する。ただし配列番号：3の配列から成るアミノ酸配列は、ペプチドの定義から除外する。すなわち、第１の観点は、（a）配列番号：3の配列の少なくとも8個の連続するアミノ酸残基を含有するか、もしくは該アミノ酸残基から成るペプチド（ただし該ペプチドは配列番号：3の配列から成るものではない）、または、（b）それに対応するペプチド様物質に関し、ここで、該ペプチドまたはペプチド様物質は患者由来のサンプル中に含有される抗KIR4.1抗体に結合し、該患者は多発性硬化症またはその素因を有し、好ましくは（i）該少なくとも8個の連続するアミノ酸残基はKIR4.1の細胞外ドメインの部分配列である（該細胞外ドメインは配列番号：1または2の配列から成る）；または、（ii）該ペプチドは配列番号：1もしくは2の配列を含有するか、もしくは該配列から成る。
【００１５】
本発明のペプチドまたはペプチド様物質は抗KIR4.1抗体に結合し、ここで、該抗KIR4.1抗体は多発性硬化症（MS）患者またはMS発症の素因を有する被験体のサンプル中に含有される。以下で更に詳述するように、本発明は、MS患者が抗KIR4.1自己抗体を保有するか否かの測定、並びにそれらの抗体をMS患者から単離するための種々の手段および方法を提供する。該手段は、本明細書で一般に「受容体」と称する物質を含む。本発明の自己抗体の単離法は、該受容体を被験体から得たサンプルと接触させる段階を含み、該サンプルは抗KIR4.1抗体を含有する疑いがあるものである。当業者は、MS患者から得たそれらの抗KIR4.1抗体を用いて、KIR4.1の少なくとも8個の連続するアミノ酸残基を含有する、もしくは該残基から成るペプチドまたは対応するペプチド様物質が該抗体に結合できるか否かを容易に測定することができる。当業者が使用できる好ましい手段はELISAアッセイである。それらのアッセイでは、主たる態様の該ペプチドまたはペプチド様物質は担体に固定されており、MS患者またはMSの素因を有する被験体由来の自己抗体はペプチドまたはペプチド様物質に結合することができ、該結合は酵素に結合した二次抗体によって検出される。該二次抗体は、例えばFcフラグメントに結合できる抗体であり、従って自己抗体のFc部分に結合するものであってもよい。
【００１６】
上記に関連して、本発明は更に、多発性硬化症患者またはMS発症の素因を有する被験体から得られる抗KIR4.1抗体を提供する。これは上記の自己抗体である。
【００１７】
本明細書に開示する実施例において詳述するように、KIR4.1には少なくとも２つの細胞外ドメインが存在する。２つの細胞外ドメインを大型および小型細胞外ドメインとも称する。多発性硬化症を示す抗KIR4.1抗体は、好ましくは大型細胞外ドメイン、小型細胞外ドメイン、または両方の細胞外ドメインに結合する。KIR4.1の大型および小型細胞外ドメインの配列を、それぞれ配列番号：1および2に示す。それらの厳密な細胞外部分は、それぞれ配列番号：4および5である。
【００１８】
「多発性硬化症」という用語は神経系を侵す炎症性疾患をさす；上記の発明の背景の項で引用した文献も参照されたい。被験体または患者が多発性硬化症を有するか否かは本発明の診断法を用いて確認することができ、その方法は本発明の第２の観点の対象であり、以下に更に記載する。あるいは、またはそれに加えて、多発性硬化症の診断は、発現した臨床症状に基づいて行ってもよく、該臨床症状は当業者に公知である。多発性硬化症の臨床症状には、視覚障害、浮動性めまい、回転性めまい、感覚機能不全、脱力感、協調障害、平衡感覚障害、倦怠感、疼痛、神経認知障害、精神障害、膀胱機能不全、腸管機能不全、性機能不全、熱過敏がある。
【００１９】
患者または被験体から採取したサンプル中の抗KIR4.1自己抗体の検出は多発性硬化症またはその素因を示すが、理解すべきことに、多発性硬化症またはその素因が必ずしも該被験体もしくは患者または彼らから採取したサンプル中に該自己抗体が存在することを特徴とする訳ではない。
【００２０】
従って、抗KIR4.1自己抗体の存在はMS発症の素因を有する個体の亜群を示すものであり、該亜群は該自己抗体を有することを特徴とする。同様に、MS患者の亜群を本明細書に開示するが、該亜群は患者が該自己抗体を有することを特徴とする。すなわち、自己抗体の存在は多発性硬化症の兆候のうちの部分兆候である。このMSの部分兆候を示す患者は、該自己抗体を有さないMS患者と比較した場合、治療に対して異なる反応をすることが予想される。同様に、該自己抗体を有する被験体のリスクプロファイルは、該自己抗体を有さない被験体のリスクプロファイルとは異なることが予想される。従って、MS患者が自己抗体を有するか否か、またはMS発症のリスクを有する被験体が該自己抗体を有するか否かによって、異なる治療処置並びに異なる予防処置が選択されうる。
【００２１】
「部分配列」という用語は、より長い配列から取られた一連の連続するアミノ酸残基をいう。すなわち、該より長い配列がｎ個の残基から成る場合、部分配列の最大長は（n-1）残基である。
【００２２】
本発明は更に、上記の本発明のペプチドをコードする核酸を提供する。核酸はDNA（例えばcDNAまたはゲノムDNA）またはRNAであってもよい。また、該核酸を含有するベクターも提供する。更に本発明は、本発明の核酸および／またはベクターを含有するホスト細胞に関する。ホスト細胞の供与源は任意のものであってもよく、好ましくは、インビトロ（例えば単離されたもの）であるか、または培養細胞であってもよい。留意すべきことに、当業者はヒト胚幹細胞株を任意に使用できるが、ホスト細胞はヒト胚を使用または損傷することによって得たものでないのが好ましい。また、ホスト細胞は、胚細胞または胚幹細胞である限りにおいては、非ヒトであることが好ましい。
【００２３】
第２の観点では、本発明は被験体における多発性硬化症または多発性硬化症の素因を診断する方法を提供し、該方法は該被験体から得たサンプル中の抗KIR4.1抗体の存在を測定することを含み、ここで、該サンプル中の抗KIR4.1抗体の存在は、多発性硬化症または多発性硬化症の素因を示す。
【００２４】
この方法により、多発性硬化症の診断、または、該被験体において多発性硬化症が明らかでない場合はその素因の診断を行うことが可能となる。「素因」という用語は当該分野で確立された意味を有し、疾患を発症する可能性を示す。特に、該可能性は健常対照被験体より高い。健常対照被験体における該可能性は、集団からの無作為抽出サンプルにおけるMS発症の可能性の平均値として表してもよい。
【００２５】
該抗KIR4.1抗体の存在を測定するために好適な物質は、以下で（特に、開示する診断組成物および診断への使用に関する活性物質として）更に詳述する。
【００２６】
該素因を試験するために好ましい個体群は、MSの家族歴を有する個体である。
【００２７】
出願人は、これまで疑われていたMSにおける自己免疫反応の分子標的を初めて同定した。注目すべきことに、MSにおける自己抗体を明らかにするための従来の戦略は、血清の免疫グロブリンに関するスクリーニングを行い、ミエリン生物学および動物モデルにおける脳炎誘発性との機能的関連に基づいて候補となる標的分子を予備選択することに重点が置かれてきた（13）。また、E. coli発現、ファージディスプレー、およびペプチドライブラリーのスクリーニングによるMS特異的自己抗体の一次標的（linear target）の同定も行われた（14-17）。いずれの戦略からも、MSに特異的な、またはMSの兆候となる有望な標的は得られなかった（18、19）。
【００２８】
出願人は、２つの独立した群の50.8％の患者血清で、高力価の抗KIR4.1抗体を検出した。従って、本発明に記載する手段および方法により、MS症例または該疾患の発症リスクを有する被験体の約半数で、それぞれMSまたはその素因の診断を行うことが可能となる。特に、本発明の方法により、MSもしくはその素因の早期診断、または不明確な診断の確認を行うことができる。抗体試験により、侵襲的処置（例えば脳脊髄液の分析）を行わずにCISまたはMSを診断し、当該分野で知られる診断法より早期にMS、CIS、またはMSの素因を診断することが可能となり得る。「CIS」とは「MSの初回臨床症状（clinically isolated syndrome）」をいい、以下で更に記載する。公知のように、MS療法は疾患経過のできるだけ早期に開始した場合に最も高い効果を示す。従って、早期診断により、CIS、MS、またはそれらの疾患の発症リスクを有する患者の早期治療を行うことが可能となる。リスクを有する個体の一部では、疾患の（更なる）進行も予防しうる。
【００２９】
以下で開示する実施例に示すように、自己抗体は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ADCC）または補体の活性化を介してKIR4.1発現グリア細胞を枯渇させうる（図６）。更に、抗体はカリウムチャネルの機能に干渉し、イオン緩衝および神経伝達物質のホメオスタシスに機能的影響を与えうる（20、21、22）。これにより、組織傷害または再ミエリン化障害が起こりうる。
【００３０】
本発明の方法の好ましい態様において、また、抗KIR4.1抗体が該サンプル中に存在する場合においては、（i）該被験体における少なくとも１つの多発性硬化症の臨床症状の存在は、多発性硬化症を示す；そして、多発性硬化症の臨床症状の不在は、該多発性硬化症の素因を示す。
【００３１】
上記のように、本発明の方法は多発性硬化症の診断並びにその素因の診断を提供する。本発明の好ましい態様では、該被験体に関して得るべき更なる情報を提供し、該更なる情報は疾患の診断とその素因の診断とを区別する助けとなる。特に、該更なる情報は、少なくとも１つの多発性硬化症の臨床症状から成るか、またはそれを含む。多発性硬化症は臨床症状が確立された、公知の疾患である。多発性硬化症の特徴である、またはそれを示す臨床症状は当業者に十分知られており（下記も参照されたい）、その存在または不在は容易に判定できる。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、多発性硬化症の臨床症状が存在せずに抗KIR4.1抗体が存在する場合、これは多発性硬化症の素因を示す。すなわち、確立された診断法または予後診断法が役立たない場合でも、本発明によって、将来のある時点で多発性硬化症を発症するリスクが高い被験体を同定することができる。
【００３３】
これに対して、多発性硬化症の臨床症状が少なくとも１つ存在する被験体では、抗KIR4.1抗体の測定は多発性硬化症診断の更なる裏付けとなる。臨床パラメータだけでは明らかな診断が下せない場合、本発明は該診断の実施および裏付けの助けとなる。これは、特に早期の多発性硬化症に適用される。当業界で知られるように、多発性硬化症は、一般に早期段階がより治療可能性が高いことを考慮すると、早期診断が強く望まれる。
【００３４】
更なる好ましい態様では、該臨床症状は少なくとも１つの以下から選択されるものである：視覚障害、浮動性めまい、回転性めまい、感覚機能不全、脱力感、協調障害、平衡感覚障害、倦怠感、疼痛、神経認知障害、精神障害、膀胱機能不全、腸管機能不全、性機能不全、熱過敏、脳脊髄液（CSF）中の炎症マーカー（単数または複数）の存在、脳および／または脊髄病変の存在。それらの病変はMRTイメージで検出してもよい。一般に、それらの病変は脳の室周囲、皮質近傍、および／またはテント下部位に起こる。MSを示す炎症マーカーは当該分野で十分知られており、好ましくは髄液細胞増加（CSF中の細胞数の異常増加であり、一般的な増加細胞数は5から50細胞／μlまたはそれ以上である）、髄腔内IgG合成、およびCSF中のオリゴクローナルIgGバンドの存在から選択される。
【００３５】
更なる好ましい態様では、該被験体は多発性硬化症の初回臨床症状（CIS）を有するか、または該少なくとも１つの臨床症状がCISである。CISは当該分野において、一般的に、MSに特徴的な臨床パラメータが完全に発現する前のMSの早期段階のことであると理解されている。CISに関する考察については、例えばThrower, Neurology 68, S12-S15 (2007)を参照されたい。本発明の手段および方法は、CISを有する患者に関する更なる証拠の収集が可能となるという利点を有する。
【００３６】
更なる好ましい態様では、該抗KIR4.1抗体、すなわちMS患者およびMS発症リスクを有する被験体に存在しうる抗KIR4.1抗体は、KIR4.1（配列番号：3）または配列番号：1、2、4、もしくは5のいずれかの配列から成るKIR4.1の細胞外ドメインに結合する。KIR4.1の構造については、本明細書に開示する実施例において更に記載する。具体的には、（少なくとも）２つの細胞外ドメインを含有し、それらは１つの膜貫通セグメントで分離されていると推定される；図４ｃ参照。本明細書では、２つの細胞外ドメインを大型細胞外ドメインおよび小型細胞外ドメインとも記載し、それらを配列番号：1および2で表す。図４ｃに示す残基部分は、それぞれ配列番号：4および5である。
【００３７】
更なる好ましい態様では、該サンプル中の抗KIR4.1抗体の検出は、ELISA、免疫沈降、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光、免疫組織化学、フローサイトメトリー、メタロイムノアッセイ（例えばGLORIA）、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）アッセイ、および質量分析から成る群から選択される方法によって行われる。これらの方法は十分確立されており、当業者は任意に使用できる。例えばELISAアッセイでは、該抗KIR4.1抗体に結合する抗体を使用してもよい。免疫沈降、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光、および免疫組織化学も同様である。上記のように、当業者は、本発明の教示があれば、抗KIR4.1抗体の単離およびキャラクタリゼーションを容易に行うことができる。それらのキャラクタリゼーションは、好ましくは質量分析を用いる。キャラクタリゼーションが行われれば、質量分析を用いて任意の所定のサンプル中の抗KIR4.1抗体の存在または不在を測定してもよい。FRETアッセイを、例えば結合アッセイとの関連で使用してもよく、該結合アッセイは好ましくは受容体を利用するものであり、該受容体については以下で更に記載する。それらのFRETアッセイを、FRETペアのドナーおよびアクセプター間の検出可能なエネルギー移動が受容体と抗KIR4.1抗体が特定の近接位置にある場合にのみ起こり、該特定の近接位置が抗KIR4.1抗体の存在を示すように設計してもよい。
【００３８】
更なる好ましい態様では、該抗KIR4.1抗体の存在の測定は、（a）サンプルを該抗KIR4.1抗体に結合する受容体と接触させ；そして（b）受容体−抗KIR4.1抗体複合体の形成を検出すること、によって行い、ここで、該受容体は、好ましくは本発明のペプチドまたはペプチド様物質、KIR4.1タンパク質（配列番号：3）、および該抗KIR4.1抗体に結合する抗体から成る群から選択される。以下に更に記載するように、所定の抗原（抗体を含む）に対する抗体を調製する手段および方法については、当業者はこれを任意に使用できる。
【００３９】
前述の好ましい態様によって種々の読み出し法を提供したが、本発明の好ましい態様は、抗KIR4.1抗体を効果的に検出するための特異的手段を提供し、該特異的手段は構造的な特徴を有する。従って、これらの好ましい態様、並びに本明細書に開示する他のいずれの態様も、特に記載しない限り、組み合わせることが可能であり、該組み合わせはいずれも、本発明の更なる好ましい態様の対象である。好ましいアッセイでは、KIR4.1タンパク質が細胞内で発現され、該細胞を血清と共にインキュベートし、フローサイトメトリーまたは組織化学法によって、二次抗体を用いてKIR4.1タンパク質への自己抗体の結合を測定する。上記のように、該二次抗体は、好ましくは該自己抗体に（例えばそのFc部分への結合によって）結合する。更なる好ましいアッセイは、本明細書に開示する実施例に記載する。
【００４０】
記載する受容体の好ましい態様は、本発明のペプチドまたはペプチド様物質、および該抗KIR4.1抗体に結合する抗体である。いずれの場合も、該受容体が該抗KIR4.1抗体に特異的であるのが更に好ましい。特異性は比較アッセイまたは競合アッセイによって測定してもよく、それらのアッセイでは、受容体の、該抗KIR4.1抗体への結合、並びに他のタンパク質、結合タンパク質、または抗体への結合を測定する。好ましくは、受容体の自己抗体に対する結合定数（Kd）は、試験を行う他のタンパク質に比較して少なくとも１桁、好ましくは２、３、４、５、または６桁低い。「桁」は10の指数である。
【００４１】
本明細書に開示する治療用または診断用抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。更に、そして特に本明細書に開示する診断用および治療用抗体に関しては、「抗体」という用語は、1本鎖抗体またはそのフラグメントでそれらの各標的に特異的に結合するもの、並びに二重特異性抗体、合成抗体、抗体フラグメント（例えばFab、F(ab2)’、Fv、およびscFvフラグメントなど）、並びにそれらを化学的に修飾した誘導体を更に包含する。
【００４２】
モノクローナル抗体の調製は、例えば最初に報告されたKohlerおよびMilstein, Nature 256 (1975), 495、およびGalfre, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3の方法によって行うことができ、それらの方法は、当該分野で開発された改変を行った、マウス骨髄腫細胞と免疫化された哺乳動物由来の脾臓細胞との融合を使用する。更に、上記のペプチドに対する抗体またはそのフラグメントは、例えばHarlowおよびLane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988に記載される方法を用いて得ることができる。ファージディスプレイ法によって該抗体の誘導体を得る場合、BIAcoreシステムで使用されるような表面プラズモン共鳴を用いて、本発明のペプチドまたはポリペプチドのエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105；Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13）。キメラ抗体の生成は、例えばWO89/09622に報告されている。本発明に従って使用される抗体の更なる供与源として、いわゆる異種抗体がある。異種抗体（例えばマウスで産生させたヒト抗体）の生成の原理は、例えばWO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096、およびWO 96/33735に報告されている。本発明に従って使用される抗体またはそれに対応する免疫グロブリン鎖（単数または複数）の更なる改変を、当該分野で公知の慣例的な方法、例えばアミノ酸の欠失（単数または複数）、挿入（単数または複数）、置換（単数または複数）、付加（単数または複数）、および／もしくは組換え（単数または複数）、および／または当該分野で公知の任意の他の改変（単数または複数）を、単独で、または組み合わせて使用して行うことができる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の基礎となるDNA配列にそれらの改変を導入する方法は、当業者に十分知られている；例えばSambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照されたい。
【００４３】
「モノクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体」という用語（HarlowおよびLane, (1988)（同上）参照）は、該抗体の誘導体で、その結合特異性を保持する、または本質的に保持するものにも関する。該誘導体の特に好ましい態様の詳細については後述するが、それら抗体の他の好ましい誘導体は、例えばマウスまたはラット可変領域とヒト定常領域を含有する、キメラ抗体である。
【００４４】
「scFvフラグメント」（１本鎖Fvフラグメント）という用語は当該分野で十分理解されており、そのサイズが小さいこと、およびそれらのフラグメントの組換えによる作製が可能であるため、好適である。
【００４５】
本発明の方法の特に好ましい態様では、該抗体または抗体結合部分は、ヒト抗体またはヒト化抗体であるか、またはそれらから誘導されたものである。本発明にかかる「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト由来の抗体であって、可変領域中の相補性決定領域（CDR）の少なくとも１つ（例えばCDR3）、好ましくは6つのCDR全てが、所望の特異性を有するヒト由来抗体のCDRで置換されたものを意味する。必要により、抗体の非ヒト定常領域（単数または複数）がヒト抗体の定常領域（単数または複数）で置換されていてもよい。ヒト化抗体の生成法は、例えばEP-A1 0 239 400およびWO90/07861に報告されている。
【００４６】
更なる好ましい態様では、該サンプルは血液、血清、血漿、リンパ節、CSF、涙液、尿、痰、および脳生検から選択される。
【００４７】
第３の観点では、本発明は多発性硬化症の治療または多発性硬化症もしくはその素因の診断に使用するための上記の受容体を提供する。上記の受容体並びにKIR4.1タンパク質全体（すなわち配列番号：3の配列から成るタンパク質）は、これらの医学的用途が企図される。これらの物質の投与により、循環抗KIR4.1抗体の数が減少する。以下に更に詳述するが、これらの物質はMS罹患患者またはその素因を有する、もしくは有することが疑われる被験体に投与できるだけでなく、エクスビボ法で使用してもよく、該エクスビボ法により、MS患者から、または、より具体的には該患者もしくはMS発症リスクを有する被験体の体液から、自己抗体が除去される。
【００４８】
「治療」という用語は治療的処置を指し、疾患および／またはその症状の改善、並びに完全な寛解を包含する。更に、「治療」という用語は予防にまで及ぶ。
【００４９】
本発明にかかる医学的用途の好ましい態様では、記載する物質の１つまたはそれ以上が、使用される唯一の活性物質である。別の好ましい態様では、該記載する物質の１つまたはそれ以上を、MS患者に有益であることが知られている、またはMSの診断の助けとなることが知られている１つまたはそれ以上の物質と併用してもよい。これまでのところ、以下の物質：インターフェロンβ、グラチラマー酢酸塩、ナタリズマブ、ミトキサントロン、フィンゴリモド、アザチオプリンの１つまたはそれ以上を投与することによって、MSの進行の予防または抑制、および再発の防止が行われている。
【００５０】
好ましい態様では、該受容体を被験体から得た血液、血清、血漿、リンパ節、CSF、涙液、尿、痰、および／または脳生検と接触させる。この態様は、診断に使用するのに好ましいサンプルである。
【００５１】
本発明の第３の観点の更に好ましい態様では、該第３の観点が治療に関連する範囲においては、該受容体は少なくとも２回、患者に投与される。複数回投与により、自己抗体が高度に（好ましくは）完全に除去され、最終的には疾患が改善または寛解する。
【００５２】
更に好ましい態様では、該ペプチドを、治療すべき患者のMHCアレルに結合するように選択してもよい。該MHC分子はMHCクラスIまたはクラスII分子であってもよい。MHCクラスI分子への結合を確実にするために、該ペプチドは8から12個、好ましくは8から10個、そして最も好ましくは9個のアミノ酸から成るのが好ましい。更に、アンカーアミノ酸残基（該アンカーアミノ酸残基はMHC結合に関与することが知られている残基である）が存在するのが好ましい。配列番号：1および2中の好適なペプチド配列の選択は、十分当業者の技術範囲内にある。例えばRammenseeら（Immunogenetics, 41: 178-228, 1995）は、MHC結合ペプチドのアンカーアミノ酸を含む特徴について報告している。MHCとの関連では、MSの治療または予防において、該ペプチドの提示により、更なる、または別の機構を標的にすることが可能となる。より具体的には、KIR4.1に特異的なＴ細胞にアポトーシスを起こさせ、それによって内因性KIR4.1タンパク質への自己免疫反応を低減または抑止することができる。更なる好ましい態様では、多発性硬化症の治療に使用するためのMHC−ペプチド複合体を提供する。MHCマルチマー（例えばMHCテトラマー）の使用は特に好ましく、好ましくは、各MHC分子に本発明のペプチドまたはペプチド様物質が結合している。好ましくは、該ペプチドまたはペプチド様物質は、該マルチマーまたはテトラマーの全てのMHC分子で同一である。当該分野で知られるように、テトラマーの形成は、ビオチン化されたMHC分子を用いて行ってもよい。MHC分子のカルボキシ末端は、ビオチン化の好ましい標的である。ストレプトアビジンと共にインキュベートすると、ストレプトアビジンは４つのビオチン結合部位を有するため、テトラマーが形成される。それらのマルチマーまたはテトラマーは、非常に高い親和性で抗原特異的Ｔ細胞受容体に結合する。従って、MHC分子に結合したペプチドのマルチマー（好ましくはテトラマー）の使用によって、KIR4.1特異的Ｔ細胞の同定、更には不活性化が可能となる。
【００５３】
更に、また、特定の理論に拘束されることなく、本発明にかかるペプチドまたはペプチド様物質の投与により、疾患に反応するＴ細胞およびＢ細胞の脱感作が可能となる。これに関連して、該ペプチドまたはペプチド様物質のＴ細胞受容体相互作用の微調整を行う目的で、該ペプチドまたはペプチド様物質の1つまたはそれ以上の位置（該位置はＴ細胞受容体と相互作用する）を改変してもよい。それらの位置およびその改変の方法は当該分野で公知である；例えばKapposら, Nature Med. 6, 1176-1182 (2000)を参照されたい。
【００５４】
換言すれば、本発明はKIR4.1に対する寛容を誘導する手段および方法を提供する。「寛容」という用語は当該分野で確立されている通りの意味を有し、所定の抗原に対して免疫系が無反応性であることをいう。一般に、自己抗原に関しては寛容である。自己抗原に対する寛容を喪失すると、自己抗体が産生され、自己免疫疾患が起こりうる。本発明の開示から明らかなように、多発性硬化症は自己免疫疾患の特徴を有する。KIR4.1タンパク質に対する自己抗体の産生を低減または抑止するために、寛容または脱感作の誘導は好ましい方法の一つである。企図される効果は、KIR4.1に関する自己寛容の構築である。寛容は抗原依存的作用であるため、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはＢ細胞およびＴ細胞の両方に存在しうる。寛容の現象、並びにＢ細胞およびＴ細胞の寛容の根底をなすメカニズムは、当該分野で公知である。
【００５５】
第４の観点では、本発明は多発性硬化症の治療に使用するためのKIR4.1（配列番号：3）またはKIR4.1の細胞外ドメインに結合する抗体を提供し、該ドメインは配列番号：1または2の配列から成り、該抗体は患者由来のサンプル中に含有される抗KIR4.1抗体のKIR4.1への結合に干渉し、該患者は多発性硬化症またはその素因を有する。
【００５６】
好ましくは、該KIR4.1の細胞外ドメインに結合する抗体は、同ドメインに特異的である。抗体の特異性を測定する手段および方法については、当業者はこれを任意に使用でき、また、本明細書でも前述した。特に好ましくは、治療に使用する上記抗体は、自己抗体によって認識されないエピトープに結合することができる。これに関して、理解されるように、当業者はエピトープマッピングのための手段および方法を任意に使用できる。好適なエピトープを選択することにより、上記の機能性に関する要件、すなわち、自己抗体の結合への干渉が確実となる。更に好ましくは、治療用抗体の結合はKIR4.1の生化学的機能または細胞機能には干渉しない、または有意に干渉しない。KIR4.1は、中枢神経系で水とカリウムイオンのホメオスタシスに関与していることが知られている。従って、KIR4.1の機能の保持または再構築は、ニューロンおよび明細胞に対して保護作用を示すと予想される。
【００５７】
これらの態様は、自己抗体がその同族標的に結合するのに干渉し、それによって疾患を緩和する方法を提供する。
【００５８】
第５の観点では、本発明は（i）本発明のペプチド、（ii）上記の抗KIR4.1抗体に結合する抗体（すなわち自己抗体に結合する抗体）、および／または（iii）上記の態様の抗体（すなわち自己抗体の標的への結合に干渉する抗体）を含有する組成物を提供する。
【００５９】
このように、本開示は３つの異なるタイプの抗体に関する。第１に、KIR4.1の細胞外ループに結合する自己抗体を開示する。これは、MS患者の約半数において、MSの原因である、および／またはMSの指標であると考えられる抗体である。第２に、本発明は自己抗体に結合することができる抗体を提供する。この第２のタイプの抗体は、上で詳述した治療および診断の目的のどちらにも好適である。最後に、本発明は、KIR4.1に結合すると同時に、自己抗体の標的への結合に干渉する抗体を提供する。この後者の抗体は、上記の治療目的に好適である。
【００６０】
本発明にかかる組成物の好ましい態様は、必要によって医薬的に許容されるキャリアおよび／または希釈剤を更に含有する医薬組成物、および、該組成物がペプチドまたは抗KIR4.1抗体に結合する抗体に関する範囲においては、診断用組成物に関する。好適な医薬的に許容されるキャリア、添加剤、および／または希釈剤については、当業者はこれを容易に選択できる。例えば、抗体はバッファー溶液のような溶液中で提供されてもよい。
【００６１】
バッファーは当該分野で十分知られており、当業者はアッセイを行う物質に基づいて好適なバッファーを認識する。一般的なバッファーは以下を含有する（括弧内はpKa値）：H3PO4／NaH2PO4（pKa,1=2.12）、グリシン（pKa,1=2.34）、酢酸（4.75）、クエン酸（4.76）、MES（6.15）、カコジル酸（6.27）、H2CO3／NaHCO3（pKa,1=6.37）、ビス-トリス（6.50）、ADA（6.60）、ビス−トリスプロパン（pKa,1=6.80）、PIPES（6.80）、ACES（6.90）、イミダゾール（7.00）、BES（7.15）、MOPS（7.20）、NaH2PO4／Na2HPO4（pKa,2=7.21）、TES（7.50）、HEPES（7.55）、HEPPSO（7.80）、トリエタノールアミン（7.80）、トリシン（8.10）、トリス（8.10）、グリシンアミド（8.20）、ビシン（8.35）、グリシルグリシン（pKa,2=8.40）、TAPS（8.40）、ビス-トリスプロパン（pKa,2=9.00）、ホウ酸（H3BO3／Na2B4O7)（9.24）、CHES（9.50）、グリシン（pKa,2=9.60）、NaHCO3／Na2CO3（pKa,2=10.25）、CAPS（10.40)、およびNa2HPO4／Na3PO4（pKa,3=12.67)。
【００６２】
更に、該バッファーのイオン強度の調整を、例えば塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムの添加によって行ってもよい。好ましい塩化ナトリウム濃度は0から2M、好ましくは100から200mMである。塩化ナトリウムを含有するバッファーの例として、以下がある：PBS（リン酸バッファー；1.37M NaCl、27mM KCl、43mM Na2HPO4・7H2O、および14mM KH2PO4を含有）の10倍ストック溶液（pH7.3に調整）；SSC（3M NaClおよび0.3Mクエン酸ナトリウムを含有）の20倍ストック溶液（pH7.0に調整）；および、STE（塩化ナトリウム／トリス／EDTA；10mM トリス塩基、10mM NaCl、および1mM EDTA（酸）を含有）。あるいはまた、塩化ナトリウムを使用せずにバッファーを調製してもよい。塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを使用せずに調製する一般的なバッファーの例として、以下がある：TAE（トリス／酢酸／EDTA；2Mトリス酢酸および0.1M EDTAを含有）の50倍ストック溶液（pH8.5）；TBE（トリス／ホウ酸／EDTA；0.89Mトリス塩基、0.89Mホウ酸、および0.02M EDTAを含有）の10倍ストック溶液（pH8.0）；および、TE（トリス／EDTA；10mMトリス塩基および1mM EDTA（酸）を含有）（pH7.5）。
【００６３】
本明細書に記載する医薬組成物は、好適な用量で被験体に投与することができる。好適な組成物の投与は、種々の方法、例えば静脈内、腹腔内、皮下、並びに経皮投与で行ってもよい。
【００６４】
より具体的には、医薬組成物の投与は、経口、非経口、例えば皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、経皮、経粘膜、硬膜下、経鼻、イオンフォレーシスによる局部もしくは局所、舌下、吸入スプレー、エアロゾル、または直腸内投与などで、必要により慣例的な医薬的に許容される添加剤を含有する、単回量製剤で行ってもよい。
【００６５】
投与計画は、主治医および臨床学的因子によって決定される。医学分野で十分知られるように、患者への投与量は多くの因子、例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、総体的な健康状態、および同時に投与される他の薬剤に依存する。
【００６６】
非経口投与のための製剤には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルションがある。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えばオリーブ油）、および注入可能な有機エステル（例えばオレイン酸エチル）がある。水性キャリアには、水、アルコール性／水性の溶液、エマルション、または懸濁液（例えば食塩水およびバッファー）がある。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油がある。静脈内賦形剤には、体液および栄養補給剤、電解質補給剤（例えばリンゲル・デキストロースに基づくもの）などがある。また、保存剤および他の添加剤を含有してもよく、それらには例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどがある。更に、本明細書に開示する医薬組成物は、その医薬組成物の使用目的に基づいて、更なる物質を含有してもよい。
【００６７】
製剤に使用してもよい医薬的に有用な添加剤は、以下を含有してもよい：キャリア、賦形剤、希釈剤、溶媒、例えば一価アルコール、例えばエタノール、イソプロパノール、多価アルコール、例えばグリコール、食用油、例えば大豆油、ココナツ油、オリーブ油、ヒマワリ油、綿実油、油性エステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル；結合剤、アジュバント、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、崩壊剤、流動促進剤、滑沢剤、緩衝剤、乳化剤、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、着色剤、着香剤、コーティング剤、保存剤、抗酸化剤、プロセシング剤（processing agent）、薬物送達改変剤およびエンハンサー、例えばリン酸カルシウム、magnesium state、タルク、単糖、二糖、デンプン、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストロース、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ポリビニルピロリドン、低融点ワックス、および／またはイオン交換樹脂。
【００６８】
他の好適な医薬的に許容される添加剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第15版, Mack Publishing社（米国ニュージャージー州）(1991)に記載されている。
【００６９】
経口投与のための剤形には、錠剤、カプセル、ロゼンジ、ピル、ウエハー、顆粒、経口液体、例えばシロップ、懸濁剤、溶液、エマルション、再構成用の粉末がある。
【００７０】
局部／局所投与のための剤形には、インサフレーション、エアロゾル、定量エアロゾル、経皮治療システム、薬用パッチ、肛門座薬、および／またはOvulaがある。
【００７１】
本発明の目的では、記載する物質の治療的有効量は一般に約2.5から100mg／日、好ましくは約5から約50mg／日、そして最も好ましくは約10から約30mg／日であり、これを単回または複数回投与してもよい。
【００７２】
しかしながら、認識されるように、個々の患者に対する本発明の化合物の特定の投与レベルは種々の因子、例えば年齢、性別、体重、総体的な健康状態、食事、治療すべき患者の個人反応、投与時期、治療すべき疾患の重篤度、適用する特定の化合物の活性、剤形、適用方法、および併用薬に依存する。所定の状況における治療的有効量は慣例的な試験によって容易に決定され、通常の臨床医または医師の技術および判断の範囲内にある。
【００７３】
第６の観点では、本発明は、患者における多発性硬化症の治療に使用するためのリツキシマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、およびFc結合物質から選択される物質を提供し、ここで、該患者は血液、血清、血漿、リンパ節、脳脊髄液（CSF）、涙液、尿、痰、および脳生検のいずれかの中に抗KIR4.1抗体が存在することを特徴とする。上記のように、自己抗体を保有するMS患者および自己抗体を保有しない患者では、これらの物質に異なる反応を示すことが予期される。
【００７４】
Fc結合物質は、抗体の除去に好適な物質であることが知られている。それらの物質は抗体のFc部分に結合し、抗体の除去または不活性化に好適である。それらの除去工程は免疫吸着とも呼ばれる。
【００７５】
第７の観点では、本発明は更に、薬物またはリード化合物のスクリーニング法も提供し、該方法は：（i）上記の抗KIR4.1抗体（すなわち自己抗体）；および（ii）KIR4.1タンパク質または上記のペプチドもしくはペプチド様物質を含有する、またはそれらから成る複合体を試験化合物と接触させることを含み、ここで、該複合体の量の低下は、試験化合物が薬物またはリード化合物であることを示す。
【００７６】
抗KIR4.1抗体が多発性硬化症に関与するという驚くべき発見から、本発明は更に、薬物およびリード化合物を同定する手段および方法を提供し、該薬物およびリード化合物は多発性硬化症の治療に好適であるか、または多発性硬化症の治療に好適な薬物の開発に好適である。理解されるように、上記の接触は、該複合体が保持される条件下で行う。それらの好適な条件（例えば試験化合物、抗KIR4.1抗体、およびKIR4.1タンパク質または本発明のペプチドもしくはペプチド様物質を含有するバッファー溶液）は当業者に認識される。
【００７７】
好ましくは、該方法はハイスループット・フォーマットで行われる。ハイスループット・アッセイは、生化学アッセイであるか、細胞アッセイであるか、または他のアッセイ
であるかに関わらず、一般にマイクロタイタープレートのウェル中で行われ、各プレートは96、384、または1536ウェルを有してもよい。プレートの取り扱い（室温以外の温度でのインキュベーションなど）および試験化合物とアッセイ混合物との接触は、好ましくは、ピペッティング装置を含む１つまたはそれ以上のコンピュータ制御ロボットシステムによって行う。大規模な試験化合物ライブラリーをスクリーニングする場合、および／またはスクリーニングを短時間で行う場合には、例えば10、20、30、40、50、または100個の試験化合物の混合物を各ウェルに添加する。ウェルが生物学的活性を示す場合、該試験化合物混合物のデコンボルーションを行い、該活性を上昇させる該混合物中の１つまたはそれ以上の試験化合物を同定してもよい。
【００７８】
試験化合物、リード化合物、および／または薬物は、好ましくは小分子、より好ましくは有機小分子である。分子量は、好ましくは2000ダルトン未満、より好ましくは1500、1000、900、800、700、600、500、または400ダルトン未満である。スクリーニングで同定されたヒット化合物の薬理学的特性（吸収、分布、代謝、および排泄など）の最適化を行うことによって、リード化合物から薬物へと展開してもよい。
【００７９】
スクリーニングで同定された化合物（一般に、リード化合物と称する）の薬理学的特性を最適化する方法は当業界で公知であり、リード化合物として同定された化合物を（i）作用部位、活性スペクトラム、器官特異性の改変、および／または（ii）効力の向上、および／または（iii）毒性の低下（治療指数の向上）、および／または（iv）副作用の低減、および／または（v）治療効果の発現、作用の持続時間の改変、および／または（vi）薬物動態パラメータ（再吸収、分布、代謝、および排泄）の改変、および／または（vii）物理化学的パラメータ（溶解性、吸湿性、色、味、臭い、安定性、状態）の改変、および／または（viii）一般的な特異性、器官／組織特異性の改善、および／または（ix）投与形態および経路の最適化のために改変する方法を含み、それらの改変は（i）カルボキシル基のエステル化、または（ii）カルボン酸による水酸基のエステル化、または（iii）水酸基の、例えばリン酸エステル、ピロリン酸エステル、硫酸エステル、もしくはヘミコハク酸エステルへのエステル化、または（iv）医薬的に許容される塩の形成、または（v）医薬的に許容される複合体の形成、または（vi）薬理学的に活性なポリマーの合成、または（vii）親水性部分の導入、または（viii）芳香族基（aromate）もしくは側鎖上の置換基の導入／交換、置換基パターンの変更、または（ix）イソステリックもしくはバイオイソステリック部分の導入による改変、または（x）ホモログ化合物の合成、または（xi）分枝型側鎖の導入、または（xii）アルキル基の環状アナログへの変換、または（xiii）水酸基のケタール、アセタールへの誘導体化、または（xiv）アミド、フェニルカルバメートへのN-アセチル化、または（xv）マンニッヒ塩基、イミンの合成、または（xvi）ケトンもしくはアルデヒドのシッフ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チアゾリジンへの変換、またはそれらの組み合わせによって行われる。
【００８０】
上記の種々の段階は、当該分野で一般的に知られている。それらは、定量的構造活性相関（QSAR）解析（Kubinyi, "Hausch-Analysis and Related Approaches", VCH Verlag, Weinheim, 1992）、コンビナトリアル生化学、古典的化学などを含むか、またはそれらに基づく（例えばHolzgrabeおよびBechtold, Deutsche Apotheker Zeitung 140(8), 813-823, 2000参照）。
【００８１】
第８の観点では、本発明は、血液もしくは血清から抗KIR4.1抗体を除去するか、またはその量を低減させるための上記受容体の使用法を提供し、ここで、該使用法はエクソビボで行われる。
【００８２】
それに関連して、本発明は体液（例えば血液または血清）から抗KIR4.1抗体を除去するか、またはその量を低減させるためのエクスビボ法を提供し、該方法は、
（a）被験体から除去した血液を上記の受容体および／もしくはFc結合物質と接触させること；および／または
（b）プラスマフェレシスを行うこと
を含む。
【００８３】
これらの観点はエクスビボ法に関し、該エクスビボ法は、自己抗体の数の低減またはその完全な枯渇を目的とする。好ましくは、MS患者またはMS発症の素因を有する被験体の血液または血清のエクスビボ処理を行う。理解されるように、該接触は、自己抗体（もし存在すれば）が該受容体に結合できる条件下で行う。ある態様では、該条件は、血液または血清を本発明の担体または装置と接触させることによって行ってもよい。該担体または装置については更に後述する。プラスマフェレシスについては当該分野で公知の通りであり、これを使用して本発明に従って循環自己抗体数を低減させてもよい。
【００８４】
本発明のエクスビボ法の好ましい態様では、該接触後、血液または血清を同じ被験体に戻す。
【００８５】
本発明のエクスビボ使用法またはエクスビボ法の更なる好ましい態様では、該タンパク質、ペプチド、および／または抗体は担体に結合している。固相担体を含む任意の担体が企図される。当該分野で一般的に使用され、ガラス、プラスチック、金、およびシリコンを含む支持材または担体が、本発明の目的に企図される。担体または支持体がコーティングされている場合、好ましいコーティングにはポリ-L-リジンコーティング、アミノ-シランコーティング、エポキシ活性化表面、およびアルデヒド活性化表面がある。好ましい態様では、該担体はカラムの基材である。好適な基材は当該分野で公知であり、該受容体を結合させて誘導してもよい。
【００８６】
本発明は更に、上記の受容体を固定化させた担体に関する。
【００８７】
それに関連して、血液から抗KIR4.1抗体を除去するための装置も提供し、該装置は上記の担体を含む。
【００８８】
装置の好ましい態様では、該装置は、被験体の血液もしくは血清をフィルターに流過させ、そして／または血液もしくは血清を同じ被験体に戻すための流入口および／または流出口を更に含む。
【００８９】
本明細書、特に特許請求の範囲において特徴とされる態様に関しては、従属請求項において記載される各態様は、該従属請求項が従属する各請求項（独立または従属）の各態様と組み合わせられることが意図される。例えば、独立請求項１に３つの選択肢、A、B、およびCが記載され、従属請求項２に３つの選択肢D、E、およびFが記載され、そして請求項３が請求項１および２に従属し、３つの選択肢G、H、およびIが記載されている場合、理解されるように、この明細書は、特に記載しない限り、A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、Iの組み合わせに相当する態様を一義的に開示している。
【００９０】
同様に、独立請求項および／または従属請求項が選択肢を記載していない場合も、理解されるように、従属請求項が複数の先行する請求項を引用する場合、それらによって網羅される対象の全ての組み合わせが明白に開示されているものと見なされる。例えば、独立請求項１があり、従属請求項２が請求項１を引用し、そして従属請求項３が請求項２および１の両方を引用する場合、請求項３および１の対象の組み合わせは、請求項３、２、および１の対象の組み合わせであるものとして明白かつ一義的に開示されていることになる。更なる従属請求項４が存在し、請求項１から３のいずれか１つを引用している場合、請求項４および１、請求項４、２、および１、請求項４、３、および１、並びに請求項４、３、２、および１の対象の組み合わせが明白かつ一義的に開示されていることになる。
【００９１】
上記の考慮は、添付する全ての請求項に準用される。例えば、請求項６、５、４（ｂ）、３、および２の組み合わせは、請求項の構造上、明白かつ一義的に企図される。同様のことが請求項６、５、４（ａ）、３、および２の組み合わせにも適用され、非制限的な例として、請求項４（ａ）および２の組み合わせ、並びに請求項５、４（ａ）および２の組み合わせがある。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】MS血清IgGのCNS膜抗原との反応性。（ａ）MSまたはOND患者由来の血清IgGを用いたラット小脳（上段）およびヒト脳（下段）切片の免疫蛍光標識の代表的な顕微鏡写真。スケールバーは100μm（上段）および20μm（下段）。（ｂ）ラット脳組織から調製した膜タンパク質画分を用いた捕捉ELISAアッセイ。MSおよびOND患者における血清の反応性を示す（OD：光学密度）。
【図２】MSにおける血清IgGの標的としてのKIR4.1の同定（ａ）ONDまたはMS患者由来のIgGプールで沈降させたヒト脳ライセートの１次元SDSゲル電気泳動（左段）。MS患者から精製した血清IgGプールでの免疫沈降後、ユニークなバンド（レーン３）がIgG重鎖（矢印）の上部および下部に出現したことに注目されたい。MS患者由来血清IgGでの免疫沈降後に得られた脳抗原２次元電気泳動（右段）。MALDI-MS/MS分析で同定されたKIR4.1タンパク質を含有するスポットを囲みで示す。矢印はIgG重鎖のスポットを示す。（ｂ）種々の免疫沈降におけるウェスタンブロット分析によるKIR4.1の検出。ONDまたはMS患者由来の血清IgGを用いて、ラット腎臓およびヒト脳ライセートの膜タンパク質高含有画分の免疫沈降を行った。（ｃ）ONDまたはMS患者由来の血清IgGを用いたインビトロ翻訳KIR4.1タンパク質の免疫沈降物中のKIR4.1のウェスタンブロット分析。
【図３−１】MS患者における血清IgG反応性の標的としてのKIR4.1の検証（ａ）ラット小脳切片におけるMS患者由来血清IgGおよび抗KIR4.1モノクローナル抗体の共局在化を示す２重免疫蛍光標識。OND患者の血清による染色を対照として示す。スケールバーは200μm。（ｂ）MS患者由来精製血清IgGによる野生型（左段）およびKir4.1-/-マウス（右段）の脳切片の免疫蛍光標識。スケールバーは100μm（上段）および50μm（下段）。
【図３−２】（ｃ）マウスアストロサイト初代培養の２重免疫蛍光染色。OND血清IgG（上段）およびMS血清IgG（下段）による染色を緑色チャンネルで検出した。更なるGFAP染色（右段）を赤色チャンネルで検出した。（ｄ）MSおよびOND患者由来血清によるマウスアストロサイト初代培養の染色およびフローサイトメトリー分析。
【図４】一部のMS患者におけるKIR4.1に対する高力価の血清反応性。（ａ）血清の抗KIR4.1反応性に関する、タンパク質に基づくELISAスクリーニング法。HEK293細胞からの精製組換えKIR4.1をELISAプレートの固相に共有結合させた。HD、OND、およびMS患者において、KIR4.1への血清抗体結合を測定した。クラスカル・ワリス検定によって、抗体陽性および陰性血清の頻度をHD（n=14）、OND（n=71）、およびMS（n=122）患者間で比較した。抗KIR4.1抗体陽性の閾値（カットオフOD：0.866。HD被験体のOD中央値プラス5 x SD）を水平破線で示す。（ｂ）２つの独立したMS患者群およびOND患者群における抗KIR4.1抗体ELISA試験の診断能を示すROC曲線。発見群（実線）は（ａ）に示す群に相当する。検証群（破線）は132人のOND患者および147人のMS患者から成る。ROC曲線下面積（AUC）  発見群：0.76（95％ CI：0.69-0.81）、検証群：0.82（95％ CI：0.76-0.87）。（ｃ）uniprotデータベース（http://www.uniprot.org/uniprot/P78508）からの配列アノテーションに基づくKIR4.1タンパク質の２次元図。大型および小型細胞外ループを、それぞれ赤色および黄色で示す。（ｄ）KIR4.1の第1の細胞外ループを含有するペプチドKIR4.183-120を結合させたプレートを用いたELISAアッセイ。発見群のHD、OND患者、およびMS患者（（ａ）参照）において、KIR4.183-120に対する血清の反応性を測定した。クラスカル・ワリス検定によって、抗体陽性および陰性血清をHD、OND、およびMS患者間で比較した。抗KIR4.1陽性の閾値（カットオフOD：0.7558。HD被験体のOD中央値プラス5 x SD）を水平破線で示す。
【図５】KIR4.1特異的MS血清IgG抗体はKIR4.1の細胞外ループ（KIR4.183-120）に特異的である（ａ）KIR4.183-120（第１の細胞外ループ）またはKIR4.1356-375（c-末端ドメイン）によってアフィニティー精製した抗KIR4.1血清IgGの精製完全長組換えHis標識KIR4.1に対する競合結合。抗KIR4.1血清IgGをELISAプレートに固定化し、漸増濃度のペプチド（濃度範囲：0.045-150nM）と共に、一定濃度（150nM）のHis標識した組換えKIR4.1タンパク質の存在下でインキュベートした。KIR4.1タンパク質の結合を、抗His標識検出抗体で測定した。（ｂ）MS患者由来サンプル（n=122）における抗KIR4.1血清反応性を定量するための、KIR4.1タンパク質またはKIR4.183-120ペプチドを結合させたプレートに基づくELISAアッセイの相関関係。（ｃ）セルベース競合結合アッセイ。KIR4.1を発現するHEK293細胞を、競合無し（左段）またはKIR4.183-120（中段）もしくはKIR4.1356-375（右段）の存在下で、MS血清IgGを用いて免疫標識した。代表的な顕微鏡写真。
【図６】（ａ）P10マウス小脳切片で行った免疫蛍光標識。MS血清IgG（左段）および抗GFAP抗体（右段）で染色。スケールバーは50μm。（ｂ）MS血清IgG（左段）および抗GFAP抗体免疫標識（右段）によるヒト皮質切片の血管周囲染色パターン。囲み部分の拡大図を下段に示す。スケールバーは100μm（上段）および20μm（下段）。
【図７】KIR4.1特異的MS血清IgG抗体はインビボにおいてKIR4.1染色の喪失、GFAPフィラメント構造の崩壊、および補体の活性化を誘導する  PBS（１段目）、KIR4.1特異的抗体反応性を枯渇させたMS患者血清IgG（２段目）、または抗KIR4.1反応性を保持する血清IgG（３段目）を、ヒト補体と共にC57BL/6マウスの大槽に注射した。注射の24時間後、マウスを屠殺し、免疫組織化学法によって脳切片をGFAP（左段）、KIR4.1（中段）、およびC9neo（右段）反応性について評価した。スケールバーは50μmおよび20μm（最下段）。
【図８】（ａ）KIR4.1発現コンストラクト［PcDNA3.1(+)/KIR4.1］でトランスフェクトしたHEK293細胞からのHis標識KIR4.1タンパク質の精製。レーン１：HEK293の清澄ライセート；レーン２：フロースルー；レーン３-５：洗浄画分；レーン６-８：溶出画分。（ｂ）MS患者の血清IgGからの抗KIR4.1反応性の枯渇。レーン１：擬似トランスフェクションを行ったHEK293細胞ライセートと混合したビーズ。レーン２：PcDNA3.1 (+)/KIR4.1でトランスフェクトしたHEK293細胞ライセートと混合したビーズ。これらのビーズを用いて、それぞれ擬似前吸着および前吸着カラムを作製した。右側の免疫ブロットは、ビーズに結合させたKIR4.1に基づく前吸着カラムによって捕捉された血清IgGを示す。（ｃ）擬似前吸着および吸着カラムからの濃縮されていないフロースルーを、精製組換えKIR4.1によるELISAでKIR4.1反応性について試験した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００９３】
実施例１：
試料と方法
患者および対照
患者および対照をミュンヘン工科大学レヒツ・デア・イザール病院（Klinikum rechts der Isar of the Technische Universitat in Munich）神経科で募集した。研究には、MS患者および高リスクの臨床的に孤立した症候群を有する患者からなる２つの独立した群を含めた。対照群は、年齢を適合させた健常ドナー（healthy donors；HD）または他の神経疾患に罹患した患者（other neurological diseases；OND）から成る。患者および対照の特徴を表１に示す。この研究は、大学の倫理委員会の承認を受けたものである。
【００９４】
【表１】
2014523869.tif 000002
【００９５】
抗体
抗ヒト／マウス／ラットKIR4.1・ウサギポリクローナル抗体（Millipore社（米国マサチューセッツ州ビレリカ）およびSigma-Aldrich社（米国ミズーリ州セントルイス）より入手）、抗ヒト／ラットKIR4.1マウスモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich社）、抗ラット／マウスGFAPモノクローナル抗体（Invitrogen社）、抗ヒトC9 neo・ウサギ抗体、または精製血清IgGを一次抗体として使用し、ビオチン-、AlexaFluor 488-、またはAlexaFluor 555-標識した抗ヒト、抗ラット（Invitrogen社（米国カリフォルニア州カールスバッド））、または抗マウスIgG（Vector Laboratories社（米国カリフォルニア州バーリンゲーム））ウサギポリクローナル抗体を２次抗体として、全ての免疫標識試験で使用した。
【００９６】
免疫蛍光および免疫組織化学
免疫蛍光染色では、新たに切り出したマウス、ラット、またはヒト由来のCNS組織を急速冷凍し、tissue-tek O.C.T（VWR社（米国ペンシルバニア州ラドナー））に包埋した。-20℃で凍結切片化を行い、10μm切片を得た。100％氷冷メタノールで10分間固定化した後、ブロッキング段階を行うために、ペルオキシダーゼ、アビジン、およびビオチンブロッキング試薬（Vector Laboratories社）でそれぞれ15分間、そしてPBS-T（リン酸バッファー（pH 7.0）に混合した0.05% tween-20）に混合した10％ヤギ、マウス、またはラット血清で30分間処理した。次いで、切片を希釈した精製血清IgG（PBS-T中、10μg/ml）または市販の抗体溶液と共に4℃で一晩インキュベートした。複数回の洗浄段階の後、切片をビオチン標識した２次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。切片をアビジン-ビオチン複合体（Vector社）と共に更に1時間、そして8.8 mM H2O2含有PBSに混合したビオチン化チラミド1μlと共にインキュベートした。全ての洗浄工程はPBS-Tで行った。抗体結合をAlexaFluor 488またはAlexaFluor 555で標識したアビジンで検出した。核染色をDAPI含有Gold antifade（Invitrogen社）を用いて行った。切片をアビジン-ビオチン複合体と共にインキュベートした後、DAB色原体（Dako社）またはAEC色原体（Sigma社）のいずれかを用いて発色させた。ヘマラム溶液を用いて対比染色を行った。DAB色原体の場合は脱水してキシレン相溶性roto-histoキット封入剤で封入し、AEC色原体では水溶性封入剤（Vector社）で封入した。画像を、AxioCam MRmカメラを搭載したZeiss Cell Observer顕微鏡（Carl Zeiss MicroImaging社（ドイツ  ゲッティンゲン））で撮影した。
【００９７】
膜タンパク質高含有CNS組織画分の調製
8検体のラット脳またはヒト脳由来CNS組織（2.4g）を、ガラス製組織ホモジナイザーを用い、氷冷ホモジナイズバッファー（0.32Mショ糖、10mM HEPESpH 7.4、2mM EDTA）およびプロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma-Aldrich社）中でホモジナイズした。懸濁液を1000gで遠心分離し、核画分のペレットを得た。高速遠心分離およびショ糖密度勾配法を用いて、膜画分を濃縮した。膜高含有ペレットをHEPESリシスバッファー（50 mM HEPES pH 7.4、2mM EDTA、およびプロテアーゼインヒビターカクテル）中に再懸濁した。CNS組織からの膜高含有画分を用い、製造者のプロトコルに従って臭化シアン（CNBr）活性化セファロースビーズ濃縮カラム（GE Healthcare Life Sciences社、米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）を調製した。
【００９８】
免疫沈降、2-D電気泳動、およびウェスタンブロッティング
12人のMS患者由来のCNS膜反応性血清IgG抗体を、CNBr活性化セファロース濃縮カラム（上記）を用いて濃縮し、プロテインGビーズ法（GE Healthcare Life Sciences社）を用いて精製した。精製したMS血清IgG抗体をプールし、反応性抗原の免疫沈降を、プロテインG磁気ビーズ（Invitrogen社）に基づく精製カラムを用い、製造者のプロトコルに従って行った。溶出した抗原画分をクロロホルム／メタノールで沈殿させ、2-Dタンパク質可溶化剤（Invitrogen社）で可溶化した。可溶化した画分を等電点電気泳動ストリップ（Invitrogen社）に負荷し、pH 3-10またはpH 4-6で泳動した。免疫沈降したCNS抗原を同定するために、小型の2-D卓上型装置（Invitrogen社）を用いて2-D電気泳動を行った。スポットを切り出し、マトリックス支援レーザー脱離／タンデム質量分析（MALDI-MS/MS；Alphalyse社、米国カリフォルニア州）による同定を行った。対照として、24人のOND患者から精製した血清IgG抗体のプールを含有するサンプルを並行して試験した。
【００９９】
検証のため、ラット腎臓ライセート（RKL）、ヒト脳ライセート（HBL）、およびインビトロ翻訳したKIR4.1タンパク質について、MS患者および対照由来の血清IgGでの免疫沈降を、プロテインGセファロースビーズ（Invitrogen社）を用いて行った。総量4mgの精製血清IgGを5mlのPBSで希釈したものを400μlのビーズ懸濁液に捕捉させ、50mMホウ酸バッファーに混合したピメリミド酸ジメチル（DMP）-2HClを用いて室温（RT）で架橋させた。架橋後、過剰のDMPを50mMホウ酸バッファーでクエンチングし、エタノールアミンバッファー（200mM、pH 8.0）でブロッキングを行った。調製したビーズを用いて、RKL、HBL、およびKIR4.1インビトロ翻訳反応混合液からKIR4.1を免疫沈降させた。全てのウェスタンブロッティング試験は、4-12% SDSゲル（Invitrogen社）上で、ウサギ抗ヒトKIR4.1ポリクローナル抗体によりECL検出システム（GE Healthcare Life Sciences社）を用いて行った。
【０１００】
KIR4.1タンパク質のインビトロ翻訳
ヒト脳総RNAを用いて、KIR4.1をコードする完全長cDNAの合成を行った。プライマー、5' GGA TCC ATG ACG TCA GTT GCC AAG GTG 3'および3' CTC GAG TCA GAC ATT GCT GAT GCG CAC 5'を用い、BamH1およびXho1制限酵素部位をそれぞれ5'および3'末端に付加した。PCR産物をプラスミドpT7CFE1-CHIS（Pierce、Thermo Fisher Scientific社（米国イリノイ州ロックフォード））にクローニングした。インビトロ翻訳は、ヒトタンパク質発現キット（Pierce、Thermo Fisher Scientific社）により、製造者のプロトコルに従って行った。全てのインビトロ翻訳実験において、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするpT7CFE1-CHISコンストラクトを対照として使用した。ウェスタンブロッティングを4-12% SDSゲル（Invitrogen社）上で行い、ウサギ抗ヒトKIR4.1ポリクローナル抗体およびECL検出を用いてKIR4.1の発現を確認した。
【０１０１】
マウス皮質アストロサイト初代培養の調製およびフローサイトメトリー
皮質アストロサイト初代培養を単離するために、マウス胎仔を屠殺し、小脳および視神経を切除し、氷冷バッファー［1.47M NaCl、5mM KCl、0.2mM NaHPO4(2H2O)、0.2mMKH2PO4、5.5mMグルコース、0.058Mショ糖（１リットル、pH6.5）］中に配した。その後、組織を粉砕し、0.5%トリプシンで37℃、10分間処理した。MG培地［MEM培地（Sigma-Aldrich社）に10% FCS（低エンドトキシン）、1% L-グルタミン、および0.5% Pen/Strepを添加したもの］で洗浄した後、先端を溶融したパスツールピペットを用いて組織懸濁液を調製した。アストロサイト培養のために、組織懸濁液をMG培地に播種した。２〜３日毎に培地を交換した。２週間後、得られた混合グリア細胞培養液を37℃で6時間、緩やかに撹拌し、小グリア細胞を除去した。アストロサイト培養液を用い、MSおよびOND患者由来の血清IgG抗体および抗マウスGFAP抗体を一次抗体として用いて、免疫蛍光二重染色試験およびフローサイトメトリー分析（CyAn ADP（Beckmann Coulter社、米国フロリダ州）を行った。
【０１０２】
クローニング、発現、および精製
HEK293細胞において組換えKIR4.1を発現させるために、C-末端にヘキサヒスチジン標識（his-tag）を有する、ヒトKIR4.1をコードする完全長cDNAを、5'-GCG GCC GCA CCA TGA CGT CAG TTG CCA AGG TGT ATT ACA GTC AG-3'および5'-CTC GAG TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG GAC ATT GCT GAT GCG CAC-3'（下線はhis-tagコード配列）をフォーワードおよびリバースプライマーとして使用し、ヒト脳総RNA（BD Biosciences（米国カリフォルニア州サンノゼ））から合成した。NotIおよびXhoI制限部位（それぞれ、フォワードおよびリバースプライマーを介して挿入されたもの）を用いてpcDNA3.1(+)（Invitrogen社）へのクローニングを行い、pcDNA 3.1(+)/KIR4.1発現コンストラクトを得た。リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬（Invitrogen社）を製造者の説明書に従って使用し、HEK293細胞のpcDNA 3.1(+)/KIR4.1での一過性トランスフェクションを行った。トランスフェクションの6時間後、培地に10% FCSおよび300mM塩化バリウムを添加した。トランスフェクションの36時間後、細胞を回収し、氷冷PBSで2回洗浄した。細胞を計数した後、3000万個の細胞を10mLの50mMリン酸ナトリウムバッファー（pH7.4；550mM塩化ナトリウム、5mM Tris-HCl、1.0% Fos-Choline、500ユニットのBenzonase(登録商標）ヌクレアーゼ（Sigma社）、および1X EDTA未含有プロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma社）含有）中で溶解した。Sorvall RC6 plus遠心分離機でSS34ローターを用い、20,000rpmで4℃、30分間、細胞ライセートを遠心分離した。遠心分離後、上清（清澄ライセート）を回収し、総量40mgのタンパク質を、1mlのHisPureTMコバルト樹脂（Pierce社）を含有する精製カラム（5mlの結合バッファー（リシスバッファーと同一）であらかじめ平衡化したもの）に負荷した。6mlの洗浄バッファー（リシスバッファーと同一）で洗浄を行った。3mlの溶出バッファー（50mMリン酸ナトリウム、300mM塩化ナトリウム、150mMイミダゾール；pH 6.0）を用いて、his標識されたタンパク質画分を溶出した。最後に、溶出画分をPBSに対して透析し、ウェスタンブロット法（ウサギ抗ヒト4.1抗体（Millipore社）でプローブ）によって、精製KIR4.1の存在を確認した。
【０１０３】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）
MSおよび対照患者におけるCNS膜タンパク質に対する血清の反応性を検出するために、ラット小脳（400mg。急速冷凍）を用いて、膜および細胞質抗原を高濃度で含有するタンパク質画分を調製した。Sulfo-NHS-SS-Biotin（Pierce社）を用いてタンパク質画分の表面ビオチン化を行い、PBSで希釈して最終濃度80μg/mlとした。コーティングのために、Nunc immobilizerTM ストレプトアビジン・コーティング／ブロッキング済みELISAプレート（Pierce社）の各ウェルに100μlの希釈したタンパク質画分を添加した。プレートをロータリーシェーカー上、4℃で一晩、緩やかに撹拌した。コーティング後、プレートをPBS-Tで2回洗浄した。
【０１０４】
血清サンプルにおける抗KIR4.1反応性をスクリーニングするために、固相結合した精製組換えKIR4.1を使用した。精製KIR4.1タンパク質をPBSで希釈して最終濃度6μg/mlとし、100μlをNunc immobilizerTMアミノプレート（Pierce社）の各ウェルに添加した。プレートをロータリーシェーカー上、4℃で一晩、緩やかに撹拌した。コーティングしたプレートをPBS-Tで2回洗浄し、100mM炭酸ナトリウム中の10mMエタノールアミン（pH9.6）を用いて1時間ブロッキングした。
【０１０５】
血清サンプルの抗KIR4.1細胞外ペプチド反応性をスクリーニングするために、KIR4.1タンパク質の第１および第２の細胞外ループのアミノ酸配列［それぞれ、GVVWYLVAVAHGDLLELDPPANHTPCVVQVHTLTGAFL（大型細胞外ドメイン；KIR4.183-120；配列番号：1；下線配列：KIR490-114；配列番号：4）およびTIGYGFRYISEECPLAIVLLI（小型細胞外ドメイン；KIR4.1128-148；配列番号：2；下線配列：KIR4.1134-142；配列番号：5）］をN-末端をビオチン修飾したものを、JPT peptide Technologies社（ドイツ  ベルリン）から購入した。ペプチドをリン酸ナトリウムバッファー（pH 8.0）で16μg/mlに希釈した。上記のようにNunc immobilizerTMストレプトアビジン・コーティング／ブロッキング済みELISAプレート（Pierce社）をコーティングした。全てのスクリーニング試験において、対照ELISAプレートはウシ血清アルブミン（Sigma社）でコーティングした。血清サンプルを3％スキムミルク（Biorad社）で希釈し、IgG濃度を10μg/mlとした。HRPコンジュゲートした抗ヒトIgG抗体（Dako社）を用いて検出を行った。光学密度（OD）の測定を、Tecanマイクロプレートリーダー（Tecan Group社、スイス）を用いて450nmで行った。
【０１０６】
競合結合アッセイ
総血清IgGを、プロテインGセファロースビーズ（GE biosciences社）を用い、製造者のプロトコルに従って精製した。総血清IgGからのKIR4.1反応性IgG画分の単離には、KIR4.1を結合させたCNBr活性化セファロース親和性ビーズ（GE biosciences社）を用いた。精製組換えKIR4.1を用いる直接ELISAによって、単離されたKIR4.1反応性血清IgG画分の結合能を概算した。競合結合アッセイでは、KIR4.1反応性血清IgGをPBSで5μg/mlに希釈し、Nunc immoblizerTMアミノストリップ（Pierce社）の各ウェルに添加した。コーティングおよびブロッキングを上記のように行った。その後、漸増濃度（12nMから144nM）の細胞外KIR4.1ペプチド（KIR4.1128-148）またはKIR4.1細胞内C-末端ペプチド（KIR4.1356-375）をウェルに添加した。1時間のインキュベーション後、プレートをPBS-Tで3回洗浄し、145nMのhis標識された精製組換えKIR4.1タンパク質を各ウェルに1時間添加した。洗浄後（PBS-Tで3回）、HRPがコンジュゲートした抗his-tag抗体を用いて検出を行った。競合結合アッセイを２重複で行い、市販の抗KIR4.1モノクローナル抗体（Millipore社）のC-末端KIR4.1ペプチド（KIR4.1356-375）への結合を用いて、アッセイの性能を検証した。細胞外ペプチド（KIR128-148）および細胞内C-末端ペプチド（KIR356-375）のそれぞれと共にあらかじめインキュベートした、およびインキュベートしていないKIR4.1反応性血清IgGを用いて、KIR4.1でトランスフェクトしたHEK293細胞のセルベース競合結合アッセイを行った。
【０１０７】
マウスにおけるMS血清IgGの髄腔内注射
総MS血清IgG、KIR4.1反応性を枯渇させたMS血清IgG、およびPBS（対照）の注射用アリコートを調製した。MS血清IgG中のKIR4.1の枯渇には、KIR4.1を結合させた Ni-NTAアガロースビーズ（Pierce社）を製造者の説明書に従って使用した。注射用アリコートを調製するために、10kDカットオフの遠心式濃縮機（Pierce社）を用いて、全ての血清IgG標品を30mg/mlまで濃縮した。等量の濃縮血清IgG（またはPBS）およびヒト総補体（30ユニット/ml）を含有する20マイクロリットルの注射用アリコートを調製した。6から8週齢のC57BL/6マウスを3群に分割し（n=3-6検体）、それぞれにKIR4.1反応性を枯渇させた総MS血清IgG、KIR4.1反応性を枯渇させていない総MS血清IgG、またはPBSを投与した。イソフルラン吸入により、マウスに麻酔を施した。皮下嚢内注射のプロトコルは、過去の報告（Klein M, Ann Neurol. 2003, Oct;54(4):451-8）に従った。24時間後、マウスを屠殺し、左心室を通して氷冷PBSおよびパラホルムアルデヒド（4%、pH 7.4）を灌流した。脳幹および小脳を切除し、4℃で一晩、20％ショ糖中に配した。脳幹および小脳の矢状断片をTissue Tek（Sakura社）に包埋し、液体窒素中で凍結し、10μmの凍結切片を調製した（Leica CM3050S）。免疫組織化学法を上記のように実施した。
【０１０８】
統計分析
ODがHDで観察される力価によって測定したカットオフ値（OD中央値プラス標準偏差の5倍）を超えた場合に、血清が抗体陽性であると見なした。クラスカル・ワリス検定を用いて、ONDおよびMS群における抗体陽性および陰性患者の数を比較した。p値が0.05未満の場合を有意と見なした。受信者操作特性（ROC）分析を行い、MedCalc（またはAnalyse-it）ソフトウェアを用いて２つの独立したサンプル群について、ROC曲線下面積（AUC）を算出した。
【０１０９】
実施例２：MS血清IgG抗体はCNS中の膜抗原に特異的に結合する
19人のMS患者および24人の他の神経疾患に罹患した患者（OND）の血清サンプルからIgG抗原を精製し、免疫蛍光法によってラットおよびヒト脳組織切片との反応性を試験した。MS血清IgGでは、ラット小脳の37％（7/19）およびヒト脳切片の58％（11/19）で膜免疫反応性が観察された(図１ａ）。これに対して、いずれのOND患者由来血清IgGでも、この特定の染色パターンは観察されなかった(図１ａ）。特異的膜反応性の確認を行うために、出願人は、膜および細胞質抗原を高濃度に含有するラット小脳タンパク質画分に基づく捕捉ELISAを構築した。膜タンパク質画分との反応性の上昇はMS患者由来血清でのみ観察され（n=56）、OND患者由来血清では観察されなかった（n=29）。このことは、MS患者にはCNS膜タンパク質に対する特異的血清IgG抗体が存在することを示唆している（図１ｂ）。一方、細胞質タンパク質画分に対する反応性は、MSおよびOND患者由来血清のいずれでも同様であった（データ未掲載）。従って、免疫沈降試験の結果として、出願人は膜タンパク質高含有CNS組織画分を用いて、これに続くMSにおける標的抗原の同定を行った。
【０１１０】
実施例３：MSにおける血清IgGの標的としてのKIR4.1の同定
12人のMS患者由来のCNS反応性血清IgGをプールし、ヒト脳組織から調製した膜タンパク質画分でコーティングしたCNBr活性化ビーズを用いて濃縮を行った。濃縮カラムから溶出したMS血清IgGを、これに続く抗原免疫沈降に使用した。その後、沈殿カラムから溶出した抗原-IgG複合体をSDS-PAGEで分析し、2-Dゲル電気泳動で分離した（図２ａ）。７つのタンパク質スポットを切り出し、MALDI-MS/MSで解析した（この場合、“MS”は質量分析を指す）。スポットの１つで、内向整流性カリウムチャンネルKIR4.1が同定された。次いで、KIR4.1がMS血清IgG抗体標的であることを、ラット腎臓ライセート、ヒト脳ライセート（図２ｂ）、およびインビトロ翻訳したKIR4.1の反応混液(図２ｃ）からの抽出物を用いた免疫沈降およびウェスタンブロッティングによって同定した。
【０１１１】
実施例４：KIR4.1のMS血清IgGとの反応性は海馬および小脳アストロサイトに局在する
MS血清由来精製IgG抗体および抗KIR4.1モノクローナル抗体を用いて、ラット脳切片の免疫蛍光２重標識を行った（図３ａ）。対照として、OND患者の血清由来精製IgGで同様の染色を行った。ラット小脳切片上の抗KIR4.1モノクローナル抗体および血清IgG抗体の特異的な局在化は、MS-IgGでは観察されたが、OND-IgGでは観察されなかった（図３ａ）。この観察を更に検証するために、10日齢の野生型マウスおよびKir4.1ヌルマウス（Kir4.1-/-）の小脳切片をMS血清IgGで免疫標識した(図３ｂ）。生後10日目（P10）で、KIR4.1が多量に発現することが知られている（20）。野生型マウスの小脳および海馬切片ではKIR4.1抗体陽性MS血清によってアストロサイトが染色されたが、Kir4.1-/-マウスの切片とは反応しなかった(図３ｂおよび図６）。KIR4.1抗体陰性血清では、野生型マウスまたはKir4.1-/-マウスのいずれから由来するCNS組織も染色されなかった（データ未掲載）。MS血清における抗KIR4.1反応性のアストロサイト局在化を検証するために、マウス混合グリア初代培養を調製した。高度にMS血清特異的な膜染色が、GFAP陽性細胞で観察された（図３ｃ）。同様のグリア細胞のMS血清特異的表面染色が、フローサイトメトリーでも観察された（図３ｄ）。
【０１１２】
実施例５：KIR4.1タンパク質の細胞外ループに対する高力価の血清反応性はMSに限定的である
抗KIR4.1反応性を定量化するために、ヒトPC3細胞株から単離したKIR4.1タンパク質に基づく捕捉ELISAアッセイを使用した。122人のMS/CIS患者、70人のOND患者、および14人の健常ドナー（HD）からの血清を分析した（図４ａ）。有意に高い濃度（＞健常対照の中央値＋5 x SD）のKIR4.1血清自己抗体がOND患者の16.9％（12/71）およびMS患者の50.8％（62/122）で検出された（p<0.0001）。全ての陽性MS血清は、OND群の血清より高い濃度の抗体を含有していた。これらの知見は、130人のOND患者および149人のMS患者を含む第２の症例対照群においても独立して確認された（図４ｄ）。
【０１１３】
より小規模な患者および対照群において、インビトロ翻訳したKIR4.1タンパク質を捕捉基質として用いたELISAアッセイにより、同様の結果が得られた（データ未掲載）。このアッセイにおいて、いずれのOND患者由来血清にも有意に高い抗体価は含まれず、これに対して、MS患者血清の22.5％（10/44）は抗体陽性であった（p=0.0108）。膜トポロジー解析（Uniprotデータベース  バージョン107、エントリー78508（最終更新日：2011年4月5日）；http://www.uniprot.org/uniprot/P78508）により、KIR4.1タンパク質の２つの細胞外ループ；25アミノ酸長の大型ループ（KIR4.190-114；配列番号：4）および9アミノ酸長の小型ループ（KIR4.1134-142；配列番号：5）が予測された；図４ｃ参照。
【０１１４】
KIR4.1の外部ループを模倣するために、KIR4.1の細胞外領域および隣接する膜内ドメインのアミノ酸配列を含有するペプチドにビオチン標識を含有させて合成し、アビジンコーティングしたプレート上に固定化した。MS患者および対照由来の血清を、これらのペプチドに結合する抗体に関して試験した。KIR4.1の小型細胞外ドメイン（KIR4.1128-148；配列番号：2）のペプチドに対する抗体反応性は、MS患者の4％で観察されただけで、HDまたはOND患者では観察されなかった（データ未掲載）。しかしながら、MS血清のKIR4.1の第1の細胞外ループ（KIR4.183-120；配列番号：1）に対する結合能に関するアッセイでは、OND患者（1/70、1.4％）に対して、MS患者では有意に高い抗体濃度が観察された（37/122、30.3％）（p<0.0001）。この知見は、第２の症例対照群でも独立して再現された（データ未掲載）。
【０１１５】
大型細胞外ドメインへのヒトKIR4.1特異的抗体の結合を、競合アッセイで更に検証した；図５参照。
【０１１６】
総体的に、PC3細胞からのKIR4.1タンパク質に基づくELISAおよびKIR4.183-120ペプチド（配列番号：1）に基づくELISAアッセイ間には強い相関関係が見られ、このことは、KIR4.1に対するMS血清抗体がKIR4.1の第1の細胞外ループ中のエピトープを認識していることを示唆している。
【０１１７】
実施例６：KIR4.1特異的血清抗体はインビボにおいてKIR4.1発現の喪失、GFAPフィラメントの崩壊、および補体の活性化を誘導する。
KIR4.1特異的抗体を含有する血清IgGを注射したマウスは、KIR4.1の喪失が観察される部位においてアストロサイト中のGFAPフィラメント構造の崩壊、KIR4.1発現の喪失、および補体の活性化を示した。これらの変化は、PBS、またはKIR4.1特異的抗体を枯渇させた同じ患者からの血清IgGを投与したマウスでは観察されなかった。対応するデータを図７および８に示す。
【０１１８】
さらなる参照文献
【表２−１】
2014523869.tif 000003
【表２−２】
2014523869.tif 000004
【図１】
2014523869.tif 000005
【図２】
2014523869.tif 000006
【図３−１】
2014523869.tif 000007
【図３−２】
2014523869.tif 000008
【図４】
2014523869.tif 000009
【図５】
2014523869.tif 000010
【図６】
2014523869.tif 000011
【図７】
2014523869.tif 000012
【図８】
2014523869.tif 000013
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014523869.tif 000015
2014523869.tif 000016