(57)【要約】  本発明は、Ｒ２  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ糖タンパク質由来の、膜に結合せず、切断されていないｇｐ１６０ポリペプチドに融合した三量体ドメインからなる融合ポリペプチド及び該融合ポリペプチドを含む組成物に関する。本発明は、さらに、前記融合ポリペプチドのオリゴマーに関する。また、本発明は、前記融合ポリペプチドをコードする核酸に関する。また、本発明は、前記融合ポリペプチドを用いる診断及び治療方法に関する。さらに、本発明は、ＨＩＶ−１に対する交差反応性中和抗体の誘導並びにＨＩＶ−１による感染の予防及び治療のための免疫原性の組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含むＨＩＶ−１多数の株に対する交差反応性の中和抗血清の生産を誘導することが可能な融合ポリペプチドであって、第１のポリペプチドが、配列番号２と少なくとも９２％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが三量体ドメインを含む、融合ポリペプチド。
【請求項２】
第１のポリペプチドが、配列番号２を含む、請求項１記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
第１のポリペプチドが、配列番号２を含み、第２のポリペプチドが配列番号６を含む、請求項１記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
融合ポリペプチドが三量体を形成することが可能である、請求項１記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
三量体ドメインが配列番号６を含む、請求項１記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
請求項１記載の融合ポリペプチドを含む、オリゴマーポリペプチド。
【請求項７】
オリゴマーが三量体である、請求項６記載のオリゴマーポリペプチド。
【請求項８】
オリゴマーポリペプチドが相同ポリペプチドを含む、請求項６記載のオリゴマーポリペプチド。
【請求項９】
融合ポリペプチドがさらに第３のポリペプチドを含む、請求項１記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
第３のポリペプチドがポリペプチド切断部位を含む、請求項９記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
融合ポリペプチドが少なくとも１つのリンカー配列を含む、請求項１記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１記載の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１３】
ヌクレオチド配列が配列番号３を含む、請求項１２記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項１記載の融合ポリペプチドと薬剤として受容可能な担体とを含む、免疫原性の組成物。
【請求項１５】
さらにアジュバントを含む、請求項１４記載の免疫原性の組成物。
【請求項１６】
請求項１４記載の組成物を、有効量投与することを含む、ヒト対象においてＨＩＶ−１に対する交差反応を有する免疫反応を誘導する方法。
【請求項１７】
請求項１記載の融合ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府の支援の承認）
本発明は、以下の連邦政府の助成金：ＡＩ３７４３８及びＡＩ６４０７０を得た研究から一部生じたものである。米国政府は本発明の特定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、ｇｐ１２０及びｇｐ４１サブユニットにタンパク分解により切断することができず、かつ膜の固着を避けるように先端が切り取られた、中和基準ヒト血清（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｈｕｍａｎ  血清）（２）（Ｒ２）のドナー由来の改変したｇｐ１６０  ＨＩＶ−１外被タンパク質である第１のポリペプチドと三量体ドメインである第２のポリペプチドとでなる融合ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）感染を防御する免疫化は、世界的な優先事項である。しかしながら、有効なワクチンを開発する取り組みは、ヒトが感染を受けるのを防止するという点から見て、はるかに成功していない。大部分のウイルスのワクチンが感染を予防するメカニズムは、ワクチン接種した個体の細胞へのウイルスの侵入が発生しないように、ウイルスの感染力を中和化する抗体を誘導することによるものである（Ｑｕｉｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｖｉｒａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  ｅｄ．  Ｇａｌａｓｓｏ，  Ｗｈｉｔｌｅｙ，  ａｎｄ  Ｍｅｒｉｇａｎ，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．  ７９１−８３４）。
【０００４】
ＨＩＶ−１に対するワクチンを開発する取り組みの主な目標は、広く交差反応を有する中和抗体の誘導である（Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５：２３３−２３６）。伝染性株に対する幅広い交差反応を有し、非常に効力があり、かつＨＩＶ−１の中和化を仲介する抗体の誘導は未だ達成されていない。
【０００５】
ＨＩＶ−１外被糖タンパク質複合体（Ｅｎｖ）は、ウイルスの表面上に示されており、中和抗体のターゲットである。２つの異なるタンパク質は、Ｅｎｖ複合体：ｇｐ１２０、表面成分、及び膜貫通型の成分であるｇｐ４１を含む。各々のＥｎｖ複合体は、ヘテロ二量体の三量体におけるこれらの２つのタンパク質の各々の３つのコピーから構成されていると考えられる。Ｔ糖タンパク質が、ｇｐ１６０と名付けられたポリタンパク質としてウイルス感染の間に最初に生産される。細胞のプロテアーゼが、ｇｐ１６０を、Ｅｎｖ複合体においてお互いに非共有結合したままである２つのサブユニットｇｐ１２０及びｇｐ４１に切断する。
【０００６】
交差反応を有する中和抗体のターゲットであるエピトープが、三価複合体の表面上に示されており、それらは、この複合体の第四級構造に依存する。
【０００７】
立体構造的に独立した中和化エピトープは、Ｅｎｖの成分である表面のｇｐ１２０と膜貫通型のｇｐ４１の両方上に位置する（Ｓｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６，  ７３０６−７３２１；  Ｚｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５，  １０８９２−１０９０５；  Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９３，  ７０５−７１１）。また、ヘテロ三量体の複合体と結合した立体構造のエピトープもあり、そのいくつかが、受容体又は共受容体の結合部位を重複する（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７，  １０５５７−１０５６５）。
【０００８】
大部分のＨＩＶ−１に感染した患者の間で、発達する中和抗体の交差反応の程度は、制限されるが、広範囲にわたり交差反応を有する抗体反応を発達させる患者が時折生ずる（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３，  ５２２５−５２３０）。  Ｒ２と名付けられ、ＨＩＶ−１に感染した個体に由来する、ある特定Ｅｎｖは、多様なウイルスサブタイプのＨＩＶ−１多くの初代株に対する広範囲の中和交差反応を示した血清抗体を生成した（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７，  ３１１９−３１３０；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６，  ６４４−６５５）。ＣＤ４と独立した感染を仲介することが可能であるという点において、Ｒ２も、天然に存在するＨＩＶ−１  Ｅｎｖとしては非常に異常である（米国特許第７，０９０，８４８号明細書；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６，  ６４４−６５５）。小さい動物及び人間以外の霊長類で行われた免疫原性の研究は、Ｒ２が、多数のＨＩＶ−１株に対する中和抗体を誘導することを示した（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７，  ３１１９−３１３０；  Ｑｕｉｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７９，  ３３５８−３３６９）。それらの研究で見られた中和化交差反応は、他の外被の免疫原の研究において以前に報告されたものより素晴らしいものであった（Ｌａｂｒｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７，  １０５５７−  １０５６５）。
【０００９】
これらの結果は、そのような反応が可能であることを最初に示したものであったことから大きな進展であった。しかしながら、反応の有効性は穏やかであり、高い比率のワクチン接種した個体において耐久力のある免疫を結果としてもたらすのに充分なものではない。従って、中和化反応の有効性を増大させる方法を特定する研究が大変必要とされている。
【００１０】
ウイルス又は細胞の表面からのタンパク質の抽出が、その第四級構造を実質的に変化させる可能性が高いことから、ウイルスの表面上の天然の三量体の複合体と同じ第四級構造を示すワクチンを投与できる可溶タンパク質の調製は困難である。
【００１１】
ｇｐ１４０としてのＥｎｖの生産が、既に用いられている１つのアプローチである  （Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  １０４：１０１９３−１０１９８；  Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：３１１９−３１３０；  Ｑｕｉｎｎａｎ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：３３５８−３３６９；  Ｅａｒｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：６４５−６５３）。このアプローチの下で、ｇｐ１４０が、組み換えタンパク質として細胞培養において生産される。ｇｐ１４０は、生産されるタンパク質が、プロテアーゼによる切断に必要なアミノ酸を欠如し、さらに、ウイルスの膜（膜貫通型の又はＴＭ断片）に、又はウイルスもしくは細胞の内部に通常埋め込まれているｇｐ４１の断片（細胞質尾部、ＣＴ）を欠如するように、ｇｐ１６０コード配列を変化させることによって改変したｇｐ１６０である。ｇｐ１４０タンパク質が、ＴＭ及びＣＴ断片を欠如しているように先端を切り取られていることから、生産する細胞によって分泌される、非変性条件を用いて組織培養培地から精製できる。それ故に、精製したタンパク質は、無傷のウイルス上の天然のタンパク質のものに似ている第四級構造を示す少なくとも部分的に三量体の形態である。
【００１２】
各々のグループが異なる免疫原を受けているウサギの３つのグループにおいて抗体生産を評価する先行の研究が行われた（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  １０４：１０１９３−  １０１９８）。第１のグループは、アジュバントＡＳ０２ＡにおいてＨＩＶ−１外被糖タンパク質Ｒ２ｇｐ１２０を受け取ったものであり、第２のグループは、アジュバントＡＳ０２ＡにおいてＨＩＶ−１外被糖タンパク質Ｒ２ｇｐ１４０を受け取ったものであり、及び第３のグループは、アジュバントＡＳ０２Ａを受け取ったものである。
【００１３】
図１に示すように、Ｒ２ｇｐ１２０の免疫化を受け取ったウサギは、非常に制限された交差反応を有する、合理的に、迅速かつ効力のある中和抗体反応を発達させた一方で、Ｒ２ｇｐ１４０を受け取ったウサギは、よりゆっくりと発達した広く交差反応を有する中和化を発達させ、有効性がより低かった。このように見られた違いについての一つの説明は、限定された交差反応を有するＲ２ｇｐ１２０によって誘導された中和抗体が、高い親和性を有し、免疫優性であり、株に特異的なエピトープに対して向けられている一方で、幅広い交差反応を有するＲ２ｇｐ１４０によって誘導された中和抗体が、より低い親和性を有し、交差反応を有するエピトープに対して向けられていることである。
【００１４】
Ｒ２ｇｐ１４０の組み換えの調製物が、単量体の、三量体の、及び多量体のタンパク質の混合物である際、免疫優性であり、混合物中のいくつかのタンパク質種上の高い親和性を有するエピトープが、重要なエピトープに対する免疫反応の発達を無効にする。典型的にはタンパク質によって誘導された抗体反応は、Ｒ２ｇｐ１４０によって誘導された交差反応を有する反応よりもＲ２ｇｐ１２０−誘導された反応により似ている動力学で発達する傾向がある。すなわち、アジュバントでの単一の免疫化の後に得られる効力のある反応及び効力のある追加免疫の効果が、追加免疫化が一か月又はより後で与えられる場合に見られた。この点において、Ｒ２ｇｐ１２０によって誘導された反応が典型的なものである一方で、Ｒ２ｇｐ１４０によって誘導された交差反応を有する中和化反応は異種である。このような違いは、高い交差反応を有する中和化を仲介する抗体を産生するＢ細胞が、制限された交差反応を有する中和化を仲介する抗体を生産するＢ細胞よりも効果的に誘導されていないことを示す。
【００１５】
最近のデータは、Ｒ２ｇｐ１２０およびＲ２ｇｐ１４０の抗原性の構造において重要である可能性がある違いの存在をさらに証明する。これらのデータは、異なる株のＨＩＶ−１Ｅｎｖへ結合する抗体の存在についての同じウサギ由来の血清の試験及び合成ペプチドが中和化活性を阻害する能力の試験を見るものである。異なる株のＥｎｖへ結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）の試験の結果も、以前に報告されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  １０４：１０１９３−１０１９８）。図２に示すように、免疫化に用いられるＲ２Ｅｎｖ株及び２つの他のＥｎｖの株へのＩｇの結合は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定された。ｇｐ１２０の免疫化によって誘導された抗体は、２つの他の株のいずれか由来のｇｐ１４０とよりもＲ２ｇｐ１４０とさらに多く反応した。対照的に、Ｒ２ｇｐ１４０の免疫化によって誘導された抗体は、３つのｇｐ１４０すべてと同様に反応した。ｇｐ１２０を用いる免疫化による株に特異的な抗体の誘導は、公開された文献にてよく確立されている。
【００１６】
そのような抗体を誘導するＲ２ｇｐ１４０の免疫化の失敗は、予期されておらず、たとえ全部のＲ２ｇｐ１２０配列がタンパク質に含まれていても、株に特異的な反応を誘導するエピトープが、Ｒ２ｇｐ１４０によって免疫システムに効果的に示されていないであることを示す。株に特異的な反応は、株の間で保存されている配列よりもむしろ、タンパク質の可変の部分に対して向けられている傾向がある。とりわけ、Ｒ２ｇｐ１２０における免疫優性の可変の領域のエピトープは、可変の領域３（Ｖ３）である。興味深い可能性は、Ｒ２ｇｐ１４０によって仮想される立体構造が、免疫優性の、可変の領域３のエピトープが免疫システムによって見ることができないように遮蔽されるようなものである。この可能性は、抗Ｖ３抗体が、制限された中和化交差反応を示す主な理由が、ウイルス表面上のＥｎｖの立体構造が、Ｖ３ループの重大な領域ヘのアクセスを遮蔽することであることを実証する証拠と一致する。
【００１７】
ＥｎｖのＶｌ、Ｖ２またはＶ３領域に対して向けられている抗体が、Ｒ２ｇｐ１２０またはＲ２ｇｐ１４０によって誘導された中和化反応に寄与しているかどうか決定する先行の研究が行われた。これらの研究のために、これらの領域の配列に対応したペプチドを合成した。以前の研究が、これらの領域に対して向けられている抗体による中和化を可溶性ペプチドの存在によって阻害できることを示したことから、このアプローチが行われた。ＶｌおよびＶ２の領域のペプチドは、Ｒ２ｇｐ１２０またはＲ２ｇｐ１４０のいずれかの免疫性を与えたウサギ由来の血清による中和化に対し効果がない。同様に、ＶｌおよびＶ２領域の欠如変異体は、野生型Ｅｎｖを示すウイルスと同程度のウサギ血清による中和化の影響を受けやすかった。対照的に、図３に示すように、Ｒ２ＥｎｖのＶ領域と相同である合成ペプチドは、ｇｐ１４０ではなくｇｐ１２０により免疫性を与えたウサギ由来の血清による中和化を著しく阻害した。結果は、Ｖ３に対して向けられている中和抗体が、Ｒ２ｇｐ１４０によって誘導された高い交差反応を有する反応ではなく、Ｒ２ｇｐ１２０に対する中和化反応に寄与しているであることを示す。これらの結果は、Ｖ３の遮蔽がＲ２ｇｐ１４０において生じることを示すことと一致する。
【００１８】
Ｂ細胞の反応の誘導における高い親和性のエピトープと低い親和性エピトープとの間の競合は、免疫学の文献においてよく立証されている。実際に、抗原に特異的な反応の成功した誘導は、Ｔヘルパー細胞の補充によるＢ細胞と抗原との高い親和性の相互作用から生じる反応増幅およびアポトーシスによる抗原と弱く相互作用するＢ細胞のサブセットの欠失に依存する。このようにして、他の無関係の抗原と交差反応する可能性が低い高い親和性を有する抗体のみ誘導される。
【００１９】
免疫優性であるエピトープは、Ｂ細胞の反応の誘導の競合的な環境においてより成功したものである。交差反応が限定された中和化を仲介する抗体が、より典型的な反応として発達し、幅広い交差反応を仲介する抗体が、より低い有効性でよりゆっくりと発達することが見られることは、前者を誘導するエピトープが免疫優性であることを示す。確かに、優性の及び非優性のエピトープがＲ２ｇｐ１４０上にあり、Ｒ２ｇｐ１２０上の優性のエピトープを形成する配列がＲ２ｇｐ１４０上にすべて存在する。しかしながら、これらの優性のエピトープが、立体構造上無傷の三量体のＥｎｖによってＢ細胞に効果的に示されていないという仮説を立てる合理的基礎がある。
【００２０】
立体構造上無傷のＥｎｖを結合する抗体が、交差反応を有するように初代ウイルスを中和化する有力な証拠が存在する。対照的に、いずれの特定のウイルスの立体構造上無傷のＥｎｖを結合しない抗体は、該ウイルスを中和化する。反対に、抗体分子によって認識できないＥｎｖは、その表面上に該分子を発現するＢ細胞によって抗体生産を誘導する能力がない。
【００２１】
Ｒ２ｇｐ１２０及びＲ２ｇｐ１４０によって誘導された免疫反応の比較の特徴は、Ｒ２ｇｐ１４０によって誘導された反応が、免疫原性においてＲ２ｇｐ１２０と似ているタンパク質の形態並びにそれらが高い交差反応を有する中和化と関連したエピトープを示すという点においてｇｐ１２０と異なる形態の追加の効果を表すことを示す。さらに、データは、免疫優性のエピトープが、ｇｐ１２０様の種によってのみ効果的に示される可能性がある一方で、幅広い中和交差反応と関連したエピトープが、オリゴマーの種上でのみ示されることを示す。それ故に、高度に交差反応を有する中和化反応を選択的に誘導するために高度に精製したオリゴマーである免疫原が必要である。そのような精製したオリゴマーも、より優性のエピトープからの競合の欠如を可能にするのに役立つ。交差反応を有する反応の高い有効性を有し、迅速な抗体反応への転換を可能にするために、精製したオリゴマーが必要である。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、オリゴマーとして高濃度で結合することが可能であるＲ２ｇｐ１６０誘導体からなる融合ポリペプチドを提供する。本発明は、さらに、内生の切断部位が変異しているようにＲ２由来ｇｐ１６０に対し変異することを含む。また、本発明は、タンパク質が膜貫通に固定されていないようにＲ２由来ｇｐ１６０に対し変異することも含む。本発明は、Ｒ２ｇｐ１４０タンパク質（配列番号２）と名付けられた、切断しておらず、膜に結合していないＲ２ｇｐ１６０の誘導体および対応するヌクレオチド配列（配列番号１）を提供する。
【００２３】
本発明は、三量体ドメインに融合したＲ２ｇｐ１４０からなる融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施態様において、三量体ドメインは、コイルドコイルである。好ましい実施態様において、三量体ドメインは、ＧＣＮ４モチーフのアミノ酸配列（配列番号６）であり、ヌクレオチド配列（配列番号５）が対応する。好ましい実施態様において、Ｒ２ｇｐ１４０は、三量体ドメイン、より好ましくはコイルドコイル、及びより好ましくはＧＣＮ４モチーフ（配列番号４）に融合している。
【００２４】
また、本発明は、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドに融合した切断のための部位及び／又は親和性のタグ及び／又はエピトープのタグなどの追加のポリペプチドも提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、融合ポリペプチドにおける１又は複数のポリペプチドの間に挿入されたリンカー配列を提供する。
【００２５】
また、本発明は、三量体ドメインをコードする核酸に融合したＲ２ｇｐ１４０をコードする核酸からなる核酸も提供する。好ましい実施態様において、核酸分子は、ＧＣＮ４モチーフ（配列番号３）に融合したＲ２ｇｐ１４０をコードする。
【００２６】
また、本発明は、三量体ドメインに融合したＲ２ｇｐ１４０のオリゴマーも提供する。いくつかの実施態様において、オリゴマーは、３つのＲ２ｇｐ１４０−三量体ドメインが融合したポリペプチドの三量体である。好ましい実施態様において、本発明の融合ポリペプチドは、三量体として高濃度で会合する。
【００２７】
また、本発明は、三量体ドメインに融合したＲ２ｇｐ１４０ポリペプチドからなる免疫原性の組成物も提供する。好ましい実施態様において、免疫原性の組成物は、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドを含むオリゴマーからなる。より好ましい実施態様において、オリゴマーは、三量体より好ましくはＲ２ｇｐ１４０−三量体ドメインのポリペプチドの三量体である。
また、本発明は、抗体の生産を誘導するのに充分な量で本発明の１又は複数のタンパク質、ポリペプチド及び核酸を投与することを含む、対象において抗体を生成する方法も提供する。好ましい実施態様において、方法は、高い効力のある、迅速な交差中和抗体反応を生じる。方法は、ＨＩＶ−１による感染の治療または予防に用いてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、Ｒ２ｇｐ１２０（黒三角）、Ｒ２ｇｐ１４０（黒丸）、又はアジュバント単独（白四角）による連続した免疫化の後に得られたウサギ血清によるＨＩＶ−１株の中和化を示す図である。Ｒ２株、ＳＦ１６２株、ＭＡＣＳ４株、ＳＶＰＢ９株、及び１４／００／４株は、２回の投与の後にｇｐ１２０で、及びｇｐ１４０で誘導された反応によって中和化された一方で、ＤＵｌ５１−２株、ＳＶＰＢ４株、及びＳＶＰＢ１２株は、４回の投与の後に初めてｇｐ１４０で誘導された反応によってのみ中和化された。
【図２】図２は、Ｒ２株、１４／００／４株、及びＣＭ２４３株のｇｐ１４０を抗原として用いるＥＬＩＳＡによって測定された、Ｒ２株のｇｐ１２０又はｇｐ１４０での４回の免疫化の後のウサギの血清中のＩｇＧを示す図である。ｇｐ１２０で免疫性を与えた血清又はウサギにおいて測定された相乗平均のＩｇＧ力価は、他方のｇｐ１２０又はＲ２ｇｐ１４０に対するものよりもＲ２ｇｐ１２０に対するものにおいて約１０倍高い；これらの違いは、スチューデントｔ検定によって、すべて統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。ｇｐ１４０によって誘導されたＩｇＧは、ｇｐ１４０の各々に同様に結合し、及び１４／００／４及びＣＭ２４３のｇｐ１４０へのｇｐ１２０及びｇｐ１４０によって誘導されたＩｇＧの結合は、同様であった；これらの結果は、有意に異なる。
【図３】図３は、コントロールペプチド（Ｃ）によってではなく、Ｒ２ＥｎｖのＶ３領域と相同であるアミノ酸配列を有する合成の、環化したペプチド（Ｖ）によって、Ｒ２ｇｐ１２０又はＲ２ｇｐ１４０で免疫性を与えたウサギ由来の血清によるＨＩＶ−１株Ｒ２及びＳＦ１６２の中和化が阻害されたことを示す図である。血清を、５０又は２５μｇ／ｍｌのペプチドで予めインキュベートし、続いて、ウイルスの中和化について試験した。示された結果は、Ｖ又はＣペプチドの存在下での血清とのインキュベーションの後の相対的な感染力の平均である。統計的に有意であるＶペプチド又はｇｐ１４０ではなくｇｐ１２０で免疫性を与えたウサギ由来の血清による中和化の阻害が見られた（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【図４】図４は、Ｒ２ｇｐ１４０及びＲ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ４のブルー・ネイティブゲル電気泳動を示す図である。これらの分析における三量体（Ｔ）、二量体（Ｄ）及び単量体のおよその見かけの分子量半径は、７５０、５００、及び２５０ＫＤａである。
【図５】図５は、Ｒ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ４の概略を示す図である。図５Ａは、切断部位を除去するためのアルギニンのセリン残基への変異を示すＲ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ４の略絵を示す図である。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、天然の及び変性の条件におけるＧＣＮ４を有する、および有さない精製したＲ２ｇｐ１４０のＰＡＧＥの分析を示す図である。ＧＣＮ４有する、および有さない０．５、１、２μｌの精製したＲ２ｇｐ１４０及びを還元条件での４−１２％ビス−Ｔｒｉｓ  Ｎｕｐａｇｅｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図６Ａ及び６Ｃ）及び３−１２％ネイティブＰＡＧＥ  ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（図６Ｂ及び６Ｄ）で分析した。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、２９３Ｔから精製したＧＣＮ４がないＲ２ｇｐ１４０のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す図である。１．５ｍｇのタンパク質をキャリブレーションした  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ上に流した。４００μｌの画分を回収した；分子量キャリブレーションした曲線からを推定した（図７Ａ）。１μｌの各画分を、ＢＮＰＡＧＥに続いてウエスタンブロッティングによって分析した。ウサギ抗ｇｐ１４０、Ｒ２１４３抗体に続いてＨＲＰ抱合抗−ウサギ抗体を免疫検出に用いた（図７Ｂ）。５μｌの各画分をクーマシーで染色したＢＮＰＡＧＥによって分析した（図７Ｃ）。
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、２９３Ｔから精製したＲ２ｇｐ１４０のサイズ排除クロマトグラフィー分析を示す図である。１．５ｍｇのタンパク質をキャリブレーションしたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ上に流した。４００μｌの画分を回収した；分子量キャリブレーションした曲線からを推定した（図８Ａ）。１μｌの各画分ＢＮＰＡＧＥに続いてウエスタンブロッティングによってを分析した。ウサギ抗ｇｐ１４０、Ｒ２１４３抗体に続いてＨＲＰ抱合抗−ウサギ抗体を免疫検出に用いた（図８Ｂ）。５μｌの各画分をクーマシーブルーで染色したＢＮＰＡＧＥによって分析した（図８Ｃ）。
【図９】図９は、ゲルろ過から回収した画分から単離した二量体及び三量体のＲ２ｇｐ１４０＋及び−ＧＣＮ４のネイティブＰＡＧＥの分析を示す図である。２０μｌのタンパク質を−８００℃で４日間凍結させ、分析するために凍結融解した。１０μｌのタンパク質を４０℃に維持し、凍結融解したものを３−１２％ネイティブＰＡＧＥゲルで分離した。
【図１０】図１０は、個々の画分を最終的に精製し、貯めた後の野生型（ＷＴ）Ｒ２ｇｌ４０、Ｒ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ（三量体）及びＲ２ｇｐ１４０−リンカー−ＧＣＮ（三量体可動性リンカー）の分析を示す図である。パネルＡは、ＳＤＳ−還元条件の下での各々のタンパク質サンプルを示す図であり、パネルＢは、ブルー・ネイティブＰＡＧＥによって分析した同一の量の材料を示す図である。Ｒ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ及びＲ２ｇｐ１４０−リンカー−ＧＣＮの両方が、三量体としてＭＷ〜７２０ｋＤａで移動する一方で、野生型Ｒ２ｇｐ１４０は、主に二量体であり、＞９０％純粋な二量体として精製でき、二量体としてＭＷ〜５２０ｋＤａで移動する。
【図１１】図１１は、精製したＲ２ｇｐ１４０二量体（Ａ）、Ｒ２ｇｐ１４０＋ＧＣＮ三量体（Ｂ）、及びＲ２ｇｐ１４０＋リンカー＋ＧＣＮ三量体（Ｃ）のモノクローナル抗体結合分析（右パネル）及びＣＤ４ｉ及びＣＤ４−ｇｐ１４０複合体に特異的なｍＡｂｓに対する反応性（左パネル）を示す図である。右パネルについて、１μｇの異なるバージョンの精製したＲ２ｇｐ１４０を、７００μｌの反応バッファー（ＰＢＳ含有０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）中の過剰量の（３μｇ）ｓＣＤ４で、又はなしで４°Ｃで一晩に続いて、２μｇの示したｍＡｂをさらに４時間インキュベートした。左パネルについて、１μｇの異なるバージョンの精製したＲ２ｇｐ１４０を、７００μｌの反応バッファー中の示されたｍＡｂｓで４°Ｃで４時間インキュベートした。両方のケースにおいて、次に、複合体を５０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  （２０％  溶液）で、さらに２時間、４°Ｃで沈殿させた。サンプルを、溶解バッファー（０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）で３回洗浄した。沈殿させた複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに再懸濁し、５分間煮沸し、４−１２％ビス−ＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いてウエスタンブロッティングで分離した。続いて、ブロットをポリクローナルウサギ抗−ｇｐ１４０抗血清で探索した。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
ＨＩＶ−１ウイルスへの研究は、主に、ウイルスと戦うメカニズムを発見することに向けられていた。より有効な手段の一つは、免疫化によるものである。にもかかわらず、ＨＩＶ−１ウイルスは容易に変異し、生じたいずれの抗体も多くの場合、効果的に役に立たない。しかしながら、いくつかの抗体がウイルスの多くの株に作用することが可能である。これらの交差反応性の抗体のそのような源の一つは、Ｒ２バージョンのＥｎｖ糖タンパク質である。
【００３０】
Ｒ２Ｅｎｖ由来のｇｐ１６０糖タンパク質の分子の分析によって、タンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする核酸配列が明らかとなった。５１７及び５２０の位置のアルギニン残基をセリン残基に変異することによって、ｇｐ１２０及びｇｐ４１サブユニットへの内生の切断部位を除去する。さらに、膜貫通型のドメインにおけるヌクレオチド配列を切り詰めることによって、膜に結合していない、切断していないバージョンのｇｐ１６０がもたらされる。このような改変した形態のＲ２Ｅｎｖ由来のｇｐ１６０をＲ２ｇｐ１４０と称す。
【００３１】
組み換えＲ２ｇｐ１４０は、ウサギにおける免疫化研究のためのワクシニアウイルスを用いることによって生じ、三量体の化合物として約４０％会合し、大部分のｇｐ１４０が二量体の化合物として会合している（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：３１１９−３１３０）。三量体としてのＲ２ｇｐ１４０の会合の増加は、交差反応を有する中和抗体のより集中した生産を可能にする。高度に精製したＲ２ｇｐ１４０オリゴマーは、二量体上にて露出したより免疫優性のエピトープの競合の欠如を可能にするのに役立ち、それによって、高い効力のある、迅速な抗体反応への交差反応を有する反応の転換を可能にする。
【００３２】
本発明は、オリゴマーとして高濃度で会合する融合ポリペプチドを提供する。本発明は、三量体ドメインへのＲ２ｇｐ１４０の融合物を提供する。本発明は、三量体ドメインに融合した膜に結合していないＲ２ｇｐ１４０の高度に濃縮したオリゴマーを提供する。本発明は、三量体ドメインに融合した高い三量体の濃度の膜に結合していないＲ２ｇｐ１４０を提供する。本発明は、膜結合Ｅｎｖタンパク質と厳密に似ている融合ポリペプチドを提供する。本発明は、高い有効性を有する、交差反応を有する中和抗体を選択的に誘導できる免疫原性の組成物を提供する。本発明は、さらに、立体構造上無傷のＥｎｖを結合する抗体を誘導する免疫原性の組成物を提供する。また、本発明は、ＨＩＶ−１による感染を治療し、かつ／又は予防する方法も提供する。本発明は、免疫反応として高い効力のある迅速な交差反応を有する抗体を誘導する方法を提供する。用いることが可能な方法の例としては、本明細書における実施例に記載されているアッセイが挙げられるが、これらに制限されない。
【００３３】
本明細書で用いられる「抗体」という用語は特定の抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリン分子または又は免疫グロブリン分子の断片を意味する。抗体は、免疫学の科学技術における当業者に周知である。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、全長の抗体分子のみならず抗原結合能力を保持する抗体分子の断片も意味する。そのような断片も、本技術分野において周知であり、及び生体外生体内の両方で定期的に用いられる。特に、本明細書で用いられる「抗体」という用語は全長の免疫グロブリン分子のみならず、周知の活性のある断片Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、及びＦｄなどの抗原結合活性のある断片も意味する。
【００３４】
本明細書で用いられるタンパク質及びポリペプチドについて、「組み換え」という用語は遺伝子工学によって、例えば非天然の核酸の細胞における翻訳によって、生産されるか、もしくは得られ、又は人工の手段もしくはメカニズムによって構築されるタンパク質及び／又はポリペプチド及び／又はペプチドを含んでもよい。
【００３５】
本明細書で用いられるポリペプチド及びタンパク質について、「単離した」という用語は、ヒトの手によって、天然の環境と離れて存在し、及び従って天然の生産物ではないポリペプチドまたは核酸を含んでもよい。例えば、単離したポリペプチドは、精製した形態で存在するか、又は例えば、組み換え宿主細胞などの非天然の環境で存在してもよい。
【００３６】
本明細書で用いられる「アナログ」という用語は、１又は複数の残基が機能的に同様の残基と保存的に置換され、及びさらに、本明細書に記載されている実質的に同一の機能的な態様のポリペプチドを示す本発明のポリペプチドまたはペプチドと実質的に同一のアミノ酸配列を有するいずれのポリペプチドを含んでもよい。保存的な置換の例としては、１つの非極性（疎水性）残基の別のもの（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニン）への置換、１つの極性（親水性）残基の別のもの（例えばアルギニン及びリジンの間に、グルタミン及びアスパラギンの間に、グリシン及びセリンの間に）、１つの塩基性残基の別のもの（例えばリジン、アルギニンもしくはヒスチジン）への置換、または１つの酸性残基の別のもの（例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸）への置換が挙げられる。
【００３７】
本明細書で用いられる「ホモログ」としては、本明細書に記載されているポリペプチドの機能的な性質も示す本発明のポリペプチドと実質的に同一の第３級の構造を有するいずれのポリペプチドが挙げられる。
【００３８】
本明細書で用いられる「三量体ドメイン」は、発現したタンパク質の重合を助ける構造的なモチーフを指す。三量体ドメインは、タンパク質が、それらが膜に結合しているかのように形成するのを助ける。三量体ドメインは、例えば、コイルドコイルモチーフを重合するのに使用してもよい。三量体ドメインの例は、塩基性のロイシンジッパーで見られる。塩基性のロイシンジッパーは、典型的には、ヘリックスにおけるロイシンまたは他の疎水性アミノ酸の位置決めが、又は疎水性コアを形成するように相互作用するαヘリックスのコイルドコイルと相関する。塩基性のロイシンジッパーの例としてはＧＣＮ４がある。
【００３９】
本明細書で用いられる「薬剤として受容可能な担体」としては、活性成分と併用した際に、成分が、生物活性を保持し、免疫システムと反応しないことを可能にするいずれの材料が挙げられる。例としては、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液、水、エマルジョン、及び種々のタイプの湿潤剤などの標準的な薬剤担体が挙げられるが、これらに制限されない。
【００４０】
本明細書で用いられる「融合」とは、本発明に従って配置されている順番で又は状況で互いと結合した天然に見られない配列を含む核酸及びポリペプチドを指す。融合の核酸又はポリペプチドは、必ずしもその全体において核酸又はポリペプチドの天然の配列を含まない。融合タンパク質は、正常なペプチド結合を介して共に結合した２又は３以上の断片を有する。融合核酸は、正常なホスホジエステル結合を介して共に結合した２又は３以上の断片を有する。
【００４１】
本明細書で用いられる「対象」としては、本発明に従って実施される処置のレシピエントが挙げられる。対象は、脊椎動物を含むいずれの動物であってもよい。対象は、大部分のケースにおいて、好ましくはヒトであるが、家畜、実験対象又はペット動物であってもよい。
【００４２】
本明細書で用いられる「切断」とはアミノ酸又はヌクレオチド配列を切断することを指す。一例として、切断は、トリプシン及びキモトリプシンなどの酵素の使用によって発生する。更なる例として、ヌクレオチド配列は、制限酵素の使用によって切断することができる。
【００４３】
本発明は、ＨＩＶ−１のＲ２Ｅｎｖ由来のｇｐ１４０（Ｒ２ｇｐ１４０）及び三量体ドメインを含む融合ポリペプチドを提供する。本明細書で用いられるｇｐ１４０は、改変したｇｐ１６０である内生の切断部位が変異し、アミノ酸配列が、すべての又は一部の膜貫通型のドメインを除去するように先端を切り取られている。
【００４４】
融合ポリペプチドＲ２ｇｐ１４０及び三量体ドメイン
本発明は、切断していない、膜に結合していない、カルボキシル末端の先端を切り取ったＨＩＶ−１のＲ２Ｅｎｖ由来のｇｐ１６０（すなわちＲ２ｇｐ１４０）の三量体ドメインへの融合を含む融合ポリペプチド（すなわちＲ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチド）を提供する。いくつかの実施態様において、三量体ドメインは、Ｒ２ｇｐ１４０のカルボキシル末端に融合している。他の実施態様において、三量体ドメインは、アミノ末端に融合している。
【００４５】
一実施態様において、Ｒ２ｇｐ１４０アミノ酸配列は、さらに、ポリペプチドの活性、機能又は形状へのわずかな影響から全く影響がないアミノ酸の挿入、置換及び／又は欠失を含む。そのような置換の例としては、１つの非極性残基の別のものへの置換、１つの極性残基の別のものへの置換、１つの塩基性残基の別のものへの置換、又は１つの酸性残基の別のものへの置換が挙げられる。Ｒ２ｇｐ１４０は、さらに、ポリペプチドの活性、機能及び／又は構造へのわずかな影響をもたらす天然のＲ２ｇｐ１４０のアミノ酸配列と比較してアミノ酸の挿入、置換及び／又は欠失を含む。当業者であれば、非天然のアミノ酸も用いてもよいことを認識するだろう。非天然のアミノ酸としては、例えば、β−アラニン（β−Ａｌａ）、もしくは３−アミノプロピオン、２，３−ジアミノプロピオン（２，３−ｄｉａＰ）、４−アミノ酪酸及びその他のものなどの他のω−アミノ酸，α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａｔ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、及びシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ），ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；並びにメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）が挙げられる。
【００４６】
他の実施態様において、スペーサーアミノ酸又はスペーサーアミノ酸配列が三量体ドメインとＲ２ｇｐ１４０を分離してもよい。スペーサーアミノ酸は、本発明の融合したポリペプチドを分離するアミノ酸である。スペーサーアミノ酸配列は、一連のスペーサーアミノ酸である。スペーサーアミノ酸配列は、１００アミノ酸残基と同じくらい非常に長いものであってもよい。スペーサーアミノ酸は、例えば、ＰＣＲ部位に向けられた変異原性からの、及び／又はフレームシフトを避ける、及び／又は特定の制限酵素を使用する分子のクローニング技術の副産物として生じる。スペーサーアミノ酸も、融合したポリペプチドの第３級の構造の最適化を可能にするように導入してもよい。
【００４７】
いくつかの実施態様において、三量体ドメインは、コイルドコイルモチーフである。好ましい実施態様において、三量体ドメインは、塩基性のロイシンジッパーモチーフであり、より好ましくはＧＣＮ４モチーフである。他のコイルドコイルモチーフは、本技術分野において用いられ、既知である。一例として、バクテリオファージＴ４フィブリチンモチーフがある。当業者であれば、他の既知のコイルドコイルモチーフを用いてもよいことを理解するだろう。また、当業者であれば、コイルドコイルを、７アミノ酸の繰り返しにおける戦略的な疎水性アミノ酸残基の配置によって、といった、新規合成をしてもよいことも理解するだろう。
【００４８】
いくつかの実施態様において、本発明は、追加のポリペプチドに融合したＲ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施態様において、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合タンパク質に融合した１、２、３、４又は５以上の追加のポリペプチドがある。いくつかの実施態様において、追加のポリペプチドは、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドのアミノ末端と融合している。他の実施態様において、追加のポリペプチドは、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドのカルボキシル末端と融合している。更なる実施態様において、追加のポリペプチドは、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドに隣接する。
【００４９】
いくつかの実施態様において、追加のポリペプチドは、Ｔヘルパー細胞反応を刺激するエピトープなどの１又は複数のエピトープを含んでもよい。Ｔヘルパーのエピトープは、Ｔヘルパー細胞によって認識されることが可能なエピトープである。他の実施態様において、追加のポリペプチドは、親和性タグを含んでもよい。一例として、エピトープ及び／又は親和性タグを含むポリペプチドのＲ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドへの融合は、タンパク質の精製及び／又は同定を助ける可能性がある。一例として、追加のポリペプチドは、Ｈｉｓ−タグ、ｍｙｃ−タグ、−ペプチドタグ、ＭＢＰタグ（マルトース結合タンパク質）、ＧＳＴタグ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ＦＬＡＧタグ、チオレドキシン・タグ、ＧＦＰタグ（緑色蛍光タンパク質）、ＢＣＣＰ（ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質）、カルモジュリン・タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＳＶ−エピトープタグ、Ｖ５−エピトープタグ及びＣＢＰタグであってもよい。そのようなエピトープ及び親和性タグの使用は、当業者に知られている。
【００５０】
更なる実施態様において、追加のポリペプチドは、タンパク質の切断のための部位をもたらしてもよい。例として、ポリペプチドは、ペプチド結合の加水分解によって切断してもよい。いくつかの実施態様において、切断は、プロテアーゼ酵素によって行われる。いくつかの実施態様において、切断は、細胞において生じる。他の実施態様において、切断は、切断する酵素の人工の操作及び／又は人工の導入によって生じる。一例として、プロテアーゼ酵素としては、アスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼが挙げられる。
【００５１】
本発明のポリペプチドを、いずれの既知の技術によって調製してもよい。例えば、ポリペプチドを、遺伝子工学によって発現させてもよい。一例として、組み換えＤＮＡの翻訳がある。また、ポリペプチドを、合成により調製してもよい。一例として、ポリペプチドを、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  （Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−２１５４．）によって最初に説明されている固相合成の技術を用いて合成してもよく、該文献を参照により本明細書に組み込むものとする。例えば、  Ｋｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ    Ｂｉｏｌｏｇｙ  及び  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ｅｄｓ．  Ａｌｉｔａｌｏ，  Ｐａｒｔａｎｅｎ，  ａｎｄ  Ｖａｋｅｒｉ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  ｐｐ．  ２９５−３５８の他のポリペプチド合成技術を見出してもよい。
【００５２】
本発明の融合ポリペプチドを実質的に純粋な形態で単離するか、又は得てもよい。実質的に純粋とは、タンパク質及び／又はポリペプチド及び／又はペプチドにおいて、天然又は生体内のシステムにおいて意図された用途に実用的かつ適切な範囲で見られる可能性がある他の物質が本質的にないことを意味する。特に、例えば、抗体の生成、配列決定、又は薬剤の調製物の製造に有用であるように、融合タンパク質は、充分に純粋であり、及び該融合タンパク質において、充分に宿主細胞の他の生体成分がない。本技術分野において周知である技術によって、実質的に純粋なポリペプチドを本明細書に開示される核酸及びアミノ酸配列に照らして製造してもよい。本発明の実質的に精製したポリペプチドは、薬剤の調製において、薬剤として受容可能な担体と混合してもよいことから、ポリペプチドは、ある重量パーセンテージの調製物のみ含んでもよい。それにもかかわらず、ポリペプチドは、生物系において結合している可能性がある物質から実質的に分離されるという点において、実質的に純粋である。
【００５３】
本発明のタンパク質及びペプチドは、真核生物の又は原核生物の宿主細胞における望ましいタンパク質又はペプチドの組み換えによる発現を含む、いずれの利用可能な手段によって調製してもよい、（米国特許第５，６９６，２３８号明細書を参照）。精製のために本発明のタンパク質又はポリペプチドを製造する方法は、本技術分野の通常の技術レベル内の従来の分子生物学、微生物学、及び組み換えＤＮＡ技術を使用可能である。そのような技術は、文献において充分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｇｌｏｖｅｒ，  （１９８５）  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｖｏｌｓ．  １−４，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｇａｉｔ，  （１９８４）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：    Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  （１９８５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：    Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  （１９９２）  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：    Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｐｅｒｂａｌ，  （１９８４）    Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ    Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｗｉｌｅｙを参照されたい。
【００５４】
ｇｐ１４０−三量体化融合ポリペプチドのオリゴマー
本発明は、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドを含むオリゴマーを提供する。オリゴマーは、２又は３以上のサブユニットで構成されているタンパク質複合体である。オリゴマーは、をタンパク質−タンパク質相互作用によって会合するサブユニットからなる。オリゴマーの各々のサブユニットは、独立して生じたポリペプチドである。オリゴマーは、各々のサブユニットが同じポリペプチドであるサブユニットからなっていてもよい。オリゴマーは、各々のサブユニットが異なるポリペプチドであるサブユニットからなっていてもよい。オリゴマーは、すべてではない、いくつかのサブユニットが、同じポリペプチドであるサブユニットからなっていてもよい。
【００５５】
本発明の一実施態様において、オリゴマーは、各々サブユニットが、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドである多数のサブユニットによって含まれる。好ましい実施態様において、オリゴマーは、各々のサブユニットがＲ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドであるサブユニットの三量体である。他の実施態様において、オリゴマーは、少なくとも１つのサブユニットがＲ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドであるサブユニットの三量体である。当業者であれば、三量体ドメインに融合した他のｇｐ１４０変異体が、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドを有するオリゴマーとして会合してもよいことを理解するだろう。
【００５６】
Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドをコードする核酸
また、本発明は、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸も提供する。核酸としては、単一の又は二重鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又はそのポリマーが挙げられる。該核酸は、さらに、匹敵する結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む。当業者であれば、生じるアミノ酸を変化させずにヌクレオチド配列において置換を行うことができることを理解するだろう。核酸は、分子の一次及び二次構造のみを指し、いずれの特定の第３級の形態に制限される。特定の二重鎖ＤＮＡ分子の構造を論じる場合、配列は、転写されないＤＮＡ鎖（例えば、ｍＲＮＡと相同である配列を有する鎖）に沿って５’〜３’方向での配列のみを与える通常の慣習に従って、本明細書に記載されている。転写及び翻訳の制御配列は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、及びそれらと同様のものなどの核酸制御配列である宿主細胞においてコード配列の発現をもたらす。
【００５７】
核酸「コード配列」は、適切な制御配列の制御の下で配置されている場合に生体内でポリペプチドに転写され、翻訳される二重鎖の核酸の配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）終端の開始コドンによって決定される及び３’（カルボキシル）終端の翻訳停止コドンである。ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常、コード配列の３’に位置する。それによって、核酸は、対応するアミノ酸配列を「コードする」。
【００５８】
また、本発明は、Ｒ２ｇｐ１４０をコードする核酸を、三量体ドメインをコードする核酸に融合する中間のヌクレオチド配列も提供する。当業者であれば、中間のヌクレオチドが、適切なコドンの翻訳を確実にするのに必要であることを認識するだろう。さらに、当業者であれば、中間のヌクレオチドが、スペーサーアミノ酸又はスペーサーアミノ酸配列をコードしてもよいことを認識するだろう。
【００５９】
また、本発明は、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターも提供する。ベクターは、望ましい配列が、異なる遺伝子の環境の間の輸送のための又は宿主細胞における発現のための制限及びライゲーションによって挿入されているいずれの多くの核酸であってもよい。ベクターは、典型的には、ＤＮＡから成るが、ＲＮＡベクターも利用可能である。ベクターとしては、プラスミド及びファージミドが挙げられるが、これらに制限されない。クローニングベクターは、宿主細胞においてを複製することが可能であるものであり、さらに、ベクターが決定できる方法で切断可能であり、新しい組み換えベクターが宿主細胞において複製する能力を保持するように望ましいＤＮＡ配列を連結することが可能である１又は複数のエンドヌクレアーゼ制限部位によって特徴づけられるものである。プラスミドの場合、望ましい配列の複製が、プラスミドが宿主細菌内のコピー数を増加させるのに応じて何度でも、又は宿主が有糸分裂によって再生産する前に宿主当たり１回生じる可能性がある。ファージの場合、複製は、溶菌のフェーズの間では活発に、又は溶原性のフェーズの間では消極的に生じる可能性がある。
【００６０】
ベクターは、さらに、プロモーター配列を含む。プロモーターとしては、核酸の転写を開始する部位を含むコード領域の上流に通常位置する非翻訳核酸配列が挙げられる。プロモーター領域は、遺伝子発現の制御因子として作用する他のエレメントも含んでもよい。本発明の更なる実施態様において、発現ベクターは、発現ベクターが組み込まれている細胞の選択を助ける追加の領域を含む。プロモーター配列には、多くの場合、転写開始部位がその３’終端に結合し（包括的に）、該プロモーター配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小の数の塩基又はエレメントを含む上流に（５’方向）広がる。プロモーター配列内に転写開始部位のみならず、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインも見られる。真核生物のプロモーターは、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含むが、必ずしも含むとは限らない。通常用いられるプロモーターは、ポリオーマ、ウシパピローマウイルスウイルス、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス、マウス又はヒトの）、ラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス、及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。他の制御配列（例えば、ターミネーター、ポリＡ、エンハンサー、又は増幅配列）も用いることができる。
【００６１】
ベクターは、さらに、ベクターで形質転換したか、又はトランスフェクトした細胞の同定及び選択への使用に適した１又は複数のマーカー配列を含んでもよい。マーカーとしては、例えば、抗生物質又は他の化合物への抵抗性又は感受性を増加させるか、又は減少させるタンパク質をコードする遺伝子、本技術分野において既知である標準的なアッセイ活性が検出可能である酵素（例えば、Ｄ−ガラクトシダーゼ又はアルカリホルファターゼ）をコードする遺伝子、及び形質転換した又はトランスフェクトした細胞、宿主、コロニー又はプラークの表現型に見かけ上影響を及ぼす遺伝子が挙げられる。好ましいベクターは、動作可能なように結合したＤＮＡ断片に存在する構造的な遺伝子産物の自律複製及び発現が可能なものである。
【００６２】
発現ベクターは、制限及びライゲーションによって、望ましい核酸配列が、制御配列に動作可能なように結合するように挿入され、ＲＮＡ転写物として発現したものである。発現は、細胞における内生の遺伝子、導入遺伝子又はコード領域の転写及び／又は翻訳を指す。発現ベクターは、ポリペプチドコード配列がベクターに位置するように構築され、コード配列の位置決め及び方向について、制御配列は、コード配列が、制御配列の「制御」の下で転写され、翻訳される（すなわち、制御配列におけるＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコード配列を転写する）ものである。制御配列は、上記のクローニングベクターなどのベクターへの挿入の前にコード配列を連結してもよい。別の方法として、コード配列を、制御配列及び適切な制限部位を既に含む発現ベクターに直接クローン化することができる。選択された宿主細胞が哺乳類の細胞である場合、制御配列は、コード配列と非相同又はと相同であってもよく、コード配列は、イントロンを含むゲノムのＤＮＡ又はｃＤＮＡであってもよい。
【００６３】
ＤＮＡコンストラクトの「非相同」領域は、天然においてより大きい分子と関連して見られない、より大きいＤＮＡ分子内のＤＮＡの識別可能な断片である。それ故に、非相同領域が哺乳類の遺伝子をコードする場合、遺伝子の横に、通常、源となる生物のゲノムにおける哺乳類のゲノムのＤＮＡに隣接しないＤＮＡを配置する。もう１つの例としては、非相同コード配列は、コード配列自体が天然において見られないコンストラクト（例えば、ゲノムのコード配列がイントロン又は天然の遺伝子と異なるコドンを有する合成の配列を含むｃＤＮＡ）である。対立遺伝子の変異又は天然に存在する変異の事象は、本明細書で定義されるＤＮＡの非相同領域を生じさせない。
【００６４】
本明細書で用いられるＤＮＡ配列は、少なくとも約８５％（好ましくは少なくとも約９０％及び最も好ましくは少なくとも約９５％）ヌクレオチドが定められた長さのＤＮＡ配列にわたって一致する場合、「実質的に相同」である。実質的に相同である配列は、例えば、特定のシステムについて定められたストリンジェントな条件の下でのサザンハイブリダイゼーションの実験で同定できる。適切なハイブリダイゼーション条件を定めることは、本技術分野の技術の範囲内である。
【００６５】
コード配列及び制御配列は、制御配列の影響又は制御の下でのコード配列の発現又は転写をするように、それらが共有結合している場合、動作可能なように結合している。コード配列が機能的なタンパク質に翻訳されることが望ましい場合、２つのＤＮＡ配列は、５’制御配列におけるプロモーターの誘導が、コード配列の転写をもたらす場合、及び２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらすものではないか、（２）コード配列の転写を方向づけるプロモーター領域の能力を妨げるか、又は（３）対応するＲＮＡ転写物のタンパク質に翻訳される能力を妨げる場合、動作可能なように結合していると言える。それ故に、プロモーター領域は、プロモーター領域が、生じる転写物が望ましいタンパク質又はポリペプチドに翻訳されるように、ＤＮＡ配列の転写をもたらすことが可能である場合、コード配列に動作可能なように結合している。
【００６６】
また、本発明は、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドをコードする核酸及び追加のポリペプチドをコードするもう１つの核酸によって含まれる核酸も提供する。追加のポリペプチドは、切断部位及び／又は親和性もしくはエピトープのタグ、又は他のエピトープであってもよい。当業者であれば、融合したポリペプチドを適切に発現するコドンの読み枠のフレームシフトを避ける必要性を認識するだろう。当業者であれば、フレームシフトを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってなどの余分なヌクレオチドの追加によって避けることができることを認識するだろう。当業者であれば、スペーサーアミノ酸をコードするヌクレオチドが、フレームシフトを避けることを必要とすることを理解するだろう。
【００６７】
いくつかの実施態様において、追加のポリペプチドをコードする核酸は、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドをコードする核酸の５’末端の上流に位置する。他の実施態様において、追加のポリペプチドをコードする核酸は、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドをコードする核酸の３’末端の下流に位置する。更なる実施態様において、追加のポリペプチドをコードする核酸は、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドをコードする核酸に隣接する。更なる実施態様において、追加のポリペプチドをコードする核酸は、Ｒ２ｇｐ１４０をコードする核酸と三量体ドメインをコードする核酸との間に配置されている。
【００６８】
また、本発明は、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドをコードする核酸の形質転換及び／又はトランスフェクションも提供する。形質転換は、原核生物の細胞内部への外来性の又は異種の核酸の導入である。トランスフェクションは、真核生物の細胞の内部への外来性の又は異種の核酸の導入である。形質転換するか又はトランスフェクトする核酸は、又は細胞のゲノムを構成する染色体のＤＮＡに統合される（共有結合する）可能性があるか、又は可能性がない。原核生物において、例えば、形質転換する核酸は、プラスミド又はウイルスのベクターなどのエピソームのエレメント上で維持されてもよい。真核生物の細胞について、安定してトランスフェクトした細胞は、トランスフェクトする核酸が、染色体の複製で娘細胞によって受け継がれるように染色体に統合されるようになったものである。この安定性は、トランスフェクトした核酸を含む娘細胞の集団からなる細胞株又はクローンを確立する真核生物の細胞の能力によって示される。
【００６９】
高等真核生物の細胞培養を、脊椎動物の細胞からでも、昆虫を含む非脊椎動物の細胞からでも、本発明のタンパク質を発現するのに用いてもよく、その増殖の手順は、既知である。例えば、  Ｋｒｕｓｅ  及び  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  （１９７３）  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００７０】
高等真核生物において本発明のポリペプチドを発現するのに適した宿主細胞としては、２９３（ヒト胎児由来腎臓）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）；２９３Ｆ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）；２９３Ｔ及び誘導体２９３Ｔ／１７（２９３ｔｓＡ１６０９ｎｅｏ及び誘導体ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）（ＳＶ４０  Ｔ抗原によって形質転換したヒト胎児由来腎臓）；ＣＯＳ−７（ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶＩ株）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１Ｏ）；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）；マウスセルトリ細胞；ＣＶＩ（サル腎臓細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；ＶＥＲＯ７６（アフリカミドリザル腎臓細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８７）；ＨｅＬａ（ヒト子宮頚ガン細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；ＭＤＣＫ（イヌ腎臓細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；ＢＲＬ３Ａ（バッファロー・ラット肝細胞（ｂｕｆｆａｌｏ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ））（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；Ｗ１３８  （ヒト肺細胞）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓細胞）（ＨＢ８０６５）；及びＭＭＴ  ０６０６５２（マウス乳ガン）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）が挙げられる。
【００７１】
当然のことながら、哺乳類の組織にて発現させた場合、組み換え融合ポリペプチドの産物は、糖鎖付加などの翻訳後の修飾のために、予期されているものよりも高い分子量を有してもよい。従って、いくらか異なる分子量を有する部分的に又は完全にグリコシル化された形態の本発明の融合ポリペプチドは、本発明の範囲内であることが意図される。
【００７２】
融合遺伝子／タンパク質の構築及びポリペプチドリンカー
本明細書における「融合タンパク質」という用語は、ｇｐ１２０及びｇｐ４１の動作可能なように結合したコード配列の発現から生じるタンパク質を指す。これらの融合タンパク質は、ｇｐ１２０のＣ末端の部分が、介在性のインフレームのリンカー配列を介してｇｐ４１のＮ末端の部分に融合しているコンストラクトを含む。
【００７３】
リンカーは、概して、長さが６〜２８アミノ酸のポリペプチドである。２つの分子を連結するリンカーは、好ましくは、２つの分子が折り畳まれ、互いに独立して作用することが可能なように設計される規則正しい二次構造を発達させる傾向を有さない２つのタンパク質の機能的なサブユニットを妨げることが可能である、機能的なタンパク質のサブユニットと相互作用することが可能である最小の疎水性又は電荷のある特徴を有し、ｇｐ４１からのギャップ１２０の完全な解離を防ぐが、広く交差反応を有するＨＩＶ中和抗体を誘発することが可能な保存されているエピトープの露出をもたらすことができる立体構造の変化が未だ制限される。
【００７４】
典型的には、可動性タンパク質領域における表面アミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒが挙げられる。実質的に、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含むアミノ酸配列のいずれの置換は、リンカー配列における上記の基準を満たすことが期待される。Ｔｈｒ及びＡｌａなどの他の中性アミノ酸も、リンカー配列において用いられる。好ましくは、そのような中性アミノ酸は、相対的に小さい表面領域（１６０Ａ２又はそれ以下）を有する。追加のアミノ酸も、融合の構築を容易にする独自の制限部位の追加のためのリンカーに含まれている。
【００７５】
本発明のリンカー例としては、式：（ＧｌｙＳｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ５Ｓｅｒ）ｎ、（ＧｌｙｎＳｅｒ）ｎ又は（ＡｌａＧｌｙＳｅｒ）ｎ（式中、ｎは３〜１２の値をとることができる）からなる群から選択された配列が挙げられる。好ましいリンカー追加の例は配列番号９〜１３に記載されている。
【００７６】
しかしながら、本発明は、用いられるリンカー配列の形態、サイズ、組成物又は数によって制限されない。リンカーの唯一の必要条件は、融合の個々の分子の折り畳み及び機能を機能的に妨げず、別の面では、キメラ融合分子の発現を可能にすることである。リンカーの機能の１つの試験は、合抱体の形成阻害によるもの及びレポーター遺伝子（β−ｇａｌ及びルシフェラーゼ）アッセイである。本発明のリンカーのコンストラクトは、いずれかのアッセイによって少なくとも５０％阻害（約１００ｎｇ／ｍｌ融合タンパク質での）を示す融合タンパク質を形成する。融合タンパク質は、ｇｐ１２０及びｇｐ４１に対して産生される抗体にも特異的に結合する。
【００７７】
また、本発明は、エンドペプチダーゼ認識配列が含まれるリンカーも含む。そのような切断部位は、融合の個々の成分を分離し、例えば、適切に折り畳まれ、生体外で活性があるかどうか決定するのに有益である。種々のエンドペプチダーゼの例としては、プラスミン、エンテロキナーゼ、カリクレイン、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータ、クロストリパイン、キモシン、コラゲナーゼ、ラッセルクサリヘビ毒液プロテアーゼ、ポストプロリン切断酵素、Ｖ８プロテアーゼ、トロンビン及び第Ｘａ因子が挙げられるが、これらに制限されない。
【００７８】
免疫原性の組成物
また、本発明は、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドを含む免疫原性の組成物も提供する。免疫原性の組成物は、免疫反応を生じることが可能な組成物である。免疫反応は、組成物の特定の免疫優性の領域に向けられていてもよい。いくつかの実施態様において、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドの会合は、抗体結合のための１の新規のエピトープ又は複数の新規のエピトープを示す。本発明の一実施態様において、Ｒ２ｇｐ１４０の免疫優性のＶ３領域が遮蔽されている。
【００７９】
本発明は、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドからなる免疫原性の組成物の対象への投与を提供する。好ましい実施態様において、免疫原性の組成物は、オリゴマーが、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドによって含まれているオリゴマーからなる。より好ましい実施態様において、オリゴマーは、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体化融合ポリペプチドの三量体である。
【００８０】
本発明のいくつかの実施態様において、免疫原性の組成物は、高い効力のある、迅速な抗体反応をもたらす。好ましい実施態様において、本発明の免疫原性の組成物は、交差反応を有する中和抗体をもたらす。
【００８１】
免疫原性の組成物の融合ポリペプチドを、組成物の一部として投与できる。例えば、アジュバントにおけるものである。本明細書で用いられる「アジュバント」は、いずれの特異的な抗原性効果をそれ自体有さない一方で、免疫システムを刺激することが可能であり、ワクチンに対する反応を増加させる物質を指す。いくつかの実施態様において、アジュバントは、サポニンと組み合わせてトール様受容体（ＴＬＲ）４リガンドを含む。トール様受容体（ＴＬＲ）４リガンドは、例えば、リピドＡ誘導体、詳細にはモノホスホリル・リピドＡ又はより詳細には３脱アシル化モノホスホリル・リピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）などのアゴニストであってもよい。３Ｄ-ＭＰＬは、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって商標ＭＰＬ（登録商標）の下で販売され、主に、ＩＦＮ−ｇ（Ｔｈ１）表現型を有するＣＤ４＋Ｔ細胞反応を促進する。該３Ｄ−ＭＰＬは、英国特許第２２２０２１１号公報に開示されている方法に従って製造できる。化学的に、該３Ｄ-ＭＰＬは、３−脱アシル化モノホスホリル・リピドＡの３、４、５又は６のアシル化した鎖との混合物である。一実施態様において、本発明の組成物において、小さい粒子の３Ｄ−ＭＰＬが用いられる。小さい粒子の３Ｄ-ＭＰＬは、０．２２μｍフィルターによって無菌でろ過できるような粒子サイズを有する。そのような調製物は、国際公開第９４／２１２９２号パンフレットに記載されている。
【００８２】
また、アジュバントは、ＴＬＲ４アゴニストとして知られているリピドＡの１又は複数の合成の誘導体も含み、該誘導体としては、国際公開第９５／１４０２６号パンフレットに記載されているＯＭ１７４（２−デオキシ−６−ｏ−［２−デオキシ−２−［（Ｒ）−３−ドデカノイロキシテトラ−デカノイルアミノ］−４−ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノＪ−α−Ｄ−グルコピラノシルジハイドロジェンホスフェート）；国際公開第９９／６４３０１号パンフレット及び国際公開第００／０４６２号パンフレットに記載されているＯＭ２９４ＤＰ（３Ｓ，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイロキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９（Ｒ）−［（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１，１０−ビス（ジハイドロジェンホスフェート）；及びＯＭ１９７ＭＰ−ＡｃＤＰ（３Ｓ−，９Ｒ）−３−［（Ｒ）−ドデカノイロキシテトラデカノイルアミノ］−４−オキソ−５−アザ−９−［（Ｒ）−３-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ］デカン−１，１０−ジオール，１−ジハイドロジェンホスフェート１０−（６−アミノヘキサノエート）（国際公開第０１／４６１２７号パンフレット）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
使用可能である他のＴＬＲ４リガンドとしては、国際公開第９８／５０３９９号パンフレット又は米国特許第６，３０３，３４７号明細書（ＡＧＰの調製プロセスも開示されている）に開示されているものなどのアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）、又は米国特許第６，７６４，８４０号明細書に開示されているＡＧＰの薬剤として受容可能な塩が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかのＡＧＰはＴＬＲ４アゴニストであり、いくつかのものはＴＬＲ４アンタゴニストである。両方とも本発明の組成物に１又は複数のアジュバントとして用いることができる。
【００８４】
本発明における使用のための好ましいサポニンは、Ｑｕｉｌ及びその誘導体である。Ｑｕｉｌ  Ａは、Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｔｒｅｅ  Ｑｕｉｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａから単離したサポニンの調製物であり、アジュバント活性を有するものとして、Ｄａｌｓｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７４）  Ｓａｐｏｎｉｎ  ａｄｊｕｂａｎｔ，  Ａｒｃｈｉｖ．  ｆｕｒ  ｄｉｅ  ｇｅｓａｍｔｅ  Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈｕｎｇ，  Ｖｏｌ．  ４４，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  ｐｐ．  ２４３−２５４によって最初に説明されたものである。Ｑｕｉｌ  Ａの精製した断片は、ＨＰＬＣによって単離され、Ｑｕｉｌ  Ａと関連した毒性なしでアジュバント活性を保持し（欧州特許公開第０  ３６２  ２７８号公報）、例えばＱＳ７及びＱＳ２１（ＱＡ７及びＱＡ２１としても知られている）がある。ＱＳ２１は、ＣＤ８＋細胞障害性のＴ細胞（ＣＴＬｓ）、Ｔｈ１細胞及び支配的なＩｇＧ２ａ抗体反応を誘導する  Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮由来の天然のサポニンであり、本発明の状況において、好ましいサポニンである。
【００８５】
ＱＳ２１の特定の処方を、説明し、該処方が特に好ましく、これらの処方は、さらにステロールを含む（国際公開第９６／３３７３９号パンフレット）。本発明の一部を形成するサポニンは、ミセルの形態、混合したミセル（好ましくは、胆汁塩のものであるが、これに限定されない）の形態で分離されてもよいか、又はコレステロール及び脂質で処方した場合、ＩＳＣＯＭマトリックス（欧州特許第０１０９９４２Ｂｌ号）、リポソーム、又は虫のような形の又は環状の多量体の複合体又は脂質の／層状の構造及びラメラなどの関連したコロイド構造の形態であってもよく、水エマルジョン中の油の形態（例えば国際公開第９５／１７２１０号パンフレットに記載されているもの）であってもよい。サポニンは、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムなどの金属塩と結合してもよい（国際公開第９８／１５２８７号パンフレット）。いくつかの実施態様において、サポニンは、リポソーム、ＩＳＣＯＭ又は水エマルジョン中の油の形態にて示される。
【００８６】
いくつかの実施態様において、アジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１の組み合わせ（欧州特許公開第０６７１９４８号公報）、並びに３Ｄ−ＭＰＬ及びＱＳ２１を含む水エマルジョンの油（国際公開第９５／１７２１０号パンフレット、国際公開第９８／５６４１４号パンフレット）である。
【００８７】
免疫原性の組成物の融合ポリペプチドは、典型的には、単離した及び精製したタンパク質である。タンパク質は、好ましくは少なくとも９５％純度に、より好ましくは、少なくとも９８％純度に、及びさらにより好ましくは少なくとも９９％純度に精製される。タンパク質の立体構造を保持する精製の方法は、本技術分野において既知である。精製したタンパク質は、好ましくは、薬剤として受容可能な担体、希釈剤、賦形剤又は安定化剤がある薬剤の組成物中に存在する。
【００８８】
本発明の免疫原性の組成物の処方は、有効な量のタンパク質又はポリペプチド抗原を用いる。すなわち、アジュバントと組み合わせて、ＨＩＶウイルスへの後の曝露から対象に防御を与えるように、対象に特異的な及び充分な免疫反応を生じさせる抗原の量が含まれる。免疫原性の組成物として用いる場合、処方は、アジュバントと組み合わせて、対象に診断の又は治療の目的に用いられる特異的な抗体を生産させる量の抗原を含む。
【００８９】
本発明の免疫原性の組成物は、ＨＩＶ−１感染の予防又は治療に有用である。ＨＩＶ−１に罹るすべての動物をこのようにして治療できる一方で、本発明は、当然、ヒトにおける本発明のワクチンの予防上の及び治療上の使用に特に向けられている。
【００９０】
免疫原性の組成物は、通常は注射によって動物へ組成物を導入するいずれの従来の方法で投与される。経口投与について、免疫原性の組成物を他のタンパク質性の材料の経口投与に用いられるものと似ている形態で投与できる。予防又は治療に使用する正確な量及び処方は、抗原の固有の純度及び活性、いずれの追加の成分もしくは担体、投与方法並びにそれらと同様のものの状況に応じて変化させることができる。
【００９１】
限定されない例として、投与する投与量は、典型的には、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン抗原について、最小約０．１ｍｇ／投与、より典型的には、最小約１ｍｇ／投与、及び多くの場合最小約１０ｍｇ／投与である。最大の投与量は、通常それほど重大ではない。しかしながら、通常は、投与量は、５００ｍｇ／投与以下、多くの場合２５０ｍｇ／投与以下である。これらの投与量は、投与量を保有するのに充分な容量で、いずれの適切な薬剤の媒体又は担体に懸濁できる。概して、最終の容量は、担体、アジュバント、及びそれらと同様のものを含み、典型的には少なくとも０．１ｍｌ、典型的には少なくとも約０．２ｍｌである。投与する量の実用性よって支配される上限は、概して、約０．５ｍｌ〜約１．０ｍｌ以下である。
【００９２】
別の構成として、免疫原性の組成物を、宿主動物において本発明の融合ポリペプチドを発現するワクチンベクターとして調製する。いずれの利用可能なワクチンベクターを用いてもよく、該ベクターとしては、生きたベネズエラウマ脳炎ウイルス（米国特許第５，６４３，５７６号明細書を参照），ポリオウイルス（米国特許第５，６３９，６４９号明細書を参照）、ポックスウイルス（米国特許第５，７７０，２１１号明細書を参照）及びワクシニア（ｖａｃｃｉｎａ）ウイルス（米国特許第４，６０３，１１２号明細書及び第５，７６２，９３８号明細書を参照）が挙げられる。別の方法として、本発明のタンパク質又はペプチドをコードするネイキッドな核酸を、抗原の発現をもたらすように直接投与してもよい（米国特許第５，７３９，１１８号明細書を参照）。
【００９３】
ＨＩＶ−１に対する交差反応を有する免疫反応を誘導する方法
また、本発明は、ＨＩＶ−１に対する交差反応を有する免疫反応を誘導する方法も提供する。いくつかの実施態様において、交差反応を有する免疫反応を誘導する方法は、対象に、本発明の融合ポリペプチドを投与することを含む。いくつかの実施態様において、交差反応を有する免疫反応を誘導する方法は、対象に、本発明の免疫原性の組成物を投与することを含む。他の実施態様において、交差反応を有する免疫反応を誘導する方法は、対象に、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸を投与することを含む。更なる実施態様において、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸からなるベクターを投与する。他の実施態様において、本発明の融合ポリペプチドをコードするネイキッドな核酸を投与する。対象への投与の経路は、本技術分野において既知である。例えば、そのような経路としては、経口、直腸、経鼻、局所、非経口、皮下、筋肉内、静脈内及び／又は皮内の経路が挙げられる。
【００９４】
対象の血清にて生じ、存在する抗体の量を最大にするように免疫反応を操作できる。１つのそのような方法は、初回刺激と称される、対象に最初の免疫原性の組成物を受けさせ、その後、追加免疫と称される、対象の免疫反応を曝露を繰り返すことによって誘発することによって達成される。使用の一つの方法において、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドからなるオリゴマーを用いて、対象を初回刺激すし、同じオリゴマーを用いて、対象を追加免疫する。他の方法においては、追加免疫が、他のｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドによって含まれるオリゴマーによって達成される他の方法においては、追加免疫が、Ｒ２ｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチド及び他のｇｐ１４０−三量体ドメイン融合ポリペプチドからなるオリゴマーである。投与の投与量スケジュール及び免疫原性の組成物の有効性は、本技術分野において既知である方法によって決定できる。免疫反応を維持し、かつ／又は強化するように、余分な投与量を選択してもよい。投与量の投与計画は、少なくとも部分的には、対象の必要性によって決定され、実行者の判断次第である。
【００９５】
いくつかの実施態様において、該方法は、対象において新規の抗原を示すことによって、ＨＩＶ−１に対する交差反応を有する抗体を誘導する。いくつかの実施態様において、該方法は、天然のｇｐ１２０において免疫優性であるエピトープの遮蔽をもたらす。他の実施態様において、該方法は、天然のｇｐ１２０において無口であるエピトープへ結合する抗体を提供する。いくつかの実施態様において、該方法は、対象において中和抗体を誘導する。好ましい実施態様において、中和抗体は、交差反応を有し、より好ましくは、中和抗体は、高い効力のあるものでもある。いくつかの実施態様において、該方法は、立体構造上無傷のＨＩＶ−１  Ｅｎｖタンパク質を結合する抗体を誘導する。いくつかの実施態様において、該方法は、対象において迅速な抗体反応を誘導する。
【００９６】
交差反応を有する免疫反応を誘導する方法を用いて対象を治療してもよい。該方法は、対象において抗体生産を誘導する予防するものとして用いてもよい。該方法を用いて、対象において後のＨＩＶ−１感染を防いでもよい。該方法を用いて、ＨＩＶ−１への曝露から対象を保護してもよい。交差反応を有する反応を誘導する方法は、ＨＩＶ−１に対する対象のワクチン接種を容易にすることが可能である。
【００９７】
更に説明することなく、当業者であれば、これまでの説明及び以下の実施例を用いることができ、特許請求の範囲に記載した発明を実施し、利用することができる。従って、以下の実施例は、具体的には、本発明の好ましい実施態様を指摘するものであり、本発明を制限するものと解釈されるものではない。すべての論文、発行物、特許文献及び文書は、参照によって、本願に組み込まれるものとする。
【実施例】
【００９８】
（実施例１）
材料及び方法。Ｒ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ４をコードする遺伝子をプロモーター改変哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｈｙｇｒｏ（＋）  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に構築した。トランス遺伝子発現レベルを増加させるために、ｐｈＣＭＶｌベクター（Ｇｅｌａｎｔｉｓ）由来の増大させたＣＭＶプロモーターをｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｈｙｇｒｏ（＋）へ導入した。ハイグロマイシン選択マーカーは、通常用いられるジェネテシン（Ｇ４１８）抗生物質に対し耐性があるトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の選択を可能にする。変異した切断部位を有するヒトコドンに最適化したＲ２ｇｐ１４０を、三量体のコイルコイルドＧＣＮ４モチーフとＣ末端で融合した（図５）。この構築は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）によって、Ｒ２ｇｐ１４０の停止コドンの上流にＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位を生成することによって、プライマー：フォワード  ５’−  ＣＴＧＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＡＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡＧＧＧ（配列番号７）及びリバース  ５  ’  −ＣＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＴＡＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＡＴＧＴＡＣＣＡＣＡＧ  （配列番号８）  （  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位を下線で示す）を用いて行った。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位の横に配置したＧＣＮ４断片を、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  で消化した  Ｒ２ｇｐ１４０に連結した。ＧＣＮ４の正確な方向を、酵素による消化及びＤＮＡ配列決定の両方によって確認した。次に、生じたＲ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ４（配列番号３）を、プロモーター改変ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏ（＋）にクローン化した。このプラスミドを、ｐＬＹ−１と称す。図５は、構築されたＲ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ（配列番号４）の概略を示す。
【００９９】
次に、プラスミドｐＬＹ−１を用いて、２９３Ｔ及び２９３Ｆ細胞をトランスフェクトした。安定した細胞株が、ハイグロマイシンの選択及び希釈の制限によって生じた。次いで、Ｒ２ｇｐ１４０−ＧＣＮを発現する生じた２９３Ｔ及び２９３Ｆの安定した細胞株を増殖させて、タンパク質発現及び精製のスケールを増加させた。比較のために、ＧＣＮ４モチーフがない同じプラスミドのコンストラクトも用いて、安定した２９３Ｔ及び２９３Ｆ細胞を生成した。
【０１００】
表１は、生成した細胞株及びそれぞれの培地にて増殖した各々の細胞株からのおよそのタンパク質収量を示す。Ｒ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ４を発現する安定した２９３Ｔ細胞株は、１０％血清を補充した１７００ｃｍ２ＤＭＥＭ（Ｄ−１０）にて４日間増殖させた。次に、血清を含む培地をＯｐｔｉＭＥＭで置き換え、細胞をさらに４日間成長させた。２９３Ｆ細胞を、最初にＤ−１０中、１５０ｃｍ２フラスコにて増殖させた。２つのコンフルエントなフラスコから細胞を２９３血清がない培地（２９３ＳＦＭ）にて除去し、５００ｍｌ振盪フラスコへ１×１０６／ｍｌの密度で播き、１２５ｒｐｍの速度で振盪しながら懸濁培養した。翌日に密度が１．５×１０６／ｍｌ以上である場合、細胞を、０．５〜０．７×１０６／ｍｌに希釈した。トリパンブルー分析を毎日実施して細胞の成長をモニターした。細胞を、死細胞が見られるまで、さらに３〜４日間培養した。
【０１０１】
【表１】
2011502521.tif 000002
【０１０２】
２９３Ｔ又は２９３Ｆの細胞培養物から培養上清を、遠心し、０．２２μ膜によるろ過により回収した。清澄な上清を、レンチルレクチン親和性精製にアプライし、０．５Ｍメチルマンノピラノシドで溶出した。溶出物を濃縮し、及びＰＢＳでバッファー交換した。精製したタンパク質を４−１２％  ビス−Ｔｒｉｓ  Ｎｕｐａｇｅ  ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いる還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びブルー・ネイティブ（ＢＮ）ゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの３−１２％ネイティブＰＡＧＥゲルで分析した。
【０１０３】
結果。変性条件は、サイズ及びＲ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ４タンパク質の発現がＲ２ｇｐ１４０に匹敵したことを示す（図６Ａ及び６Ｃ）。非変性条件を用いることで、オリゴマー集合ＧＣＮ４モチーフの原因への影響の分析が可能になる。ＧＣＮ４の存在によって、顕著な推定の〜７５０ｋＤａの三量体のバンドが得られた（図６Ｂ）。ＧＣＮ４モチーフの欠如は、〜５００ｋＤａ及び〜２５０ｋＤａの推定上の二量体及び単量体の２つの追加のバンドをそれぞれ示した（図６Ｄ）。これらのデータは、ＧＣＮ４モチーフが三量体として癒合するＲ２ｇｐ１４０の好みを増加させることを示す。
【０１０４】
（実施例２）
材料及び方法。精製したＲ２ｇｐ１４０±ＧＣＮ４（実施例１に記載されているように製造されたもの）のＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  （ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）  ｃｏｌｕｍｎ用いるサイズ排除クロマトグラフィーを行った。約１．５ｍｇのタンパク質を、分子量スタンダードでキャリブレーションした  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ｃｏｌｕｍで分析して、オリゴマーの種を観測し、異なる種のおよその分子量を評価した。４００μｌの画分を回収した。１０μｌ及び１μｌの各画分を、クーマシーブルーにおけるＢＮゲルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  （図７及び８）を用いて、製造業者の説明書に従って分析した。ウエスタンブロッティングにおける免疫検出のために、  ポリクローナルウサギ抗ｇｐ１４０血清Ｒ２１４３を用いた。次に、残存するタンパク質を、ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ  ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎにアプライした。
【０１０５】
結果。ＧＣＮ４モチーフの存在は、溶出プロファイルを、ボイド容量の後のより早いピークへシフトしたことに加えて、後の画分におけるタンパク質の検出におけるよりシャープな減少をもたらした（図７Ａ及び８Ａ）。これらのデータは、ＧＣＮ４が、より重い全体のタンパク質複合体、すなわち三量体をもたらすことを示唆する。クーマシー染色及びウエスタンブロットは、溶出プロファイルを裏付け、ＧＣＮ４が、〜７５０ｋＤａの結合した分子量に基づく推定上の三量体の１つの種を支配的に生産することを示す（図８Ｂ及び８Ｃ）。ＧＣＮ４モチーフ欠如は、推定上の二量体（〜５００ｋＤａ）及び単量体（〜２５０ｋＤａ）のバンドを、推定上の三量体に加えて生じさせた（図７Ｂ及び７Ｃ）。ＧＣＮ４の存在は、推定上の二量体及び単量体の存在を有意に減少させ、ＧＣＮ４が、融合タンパク質が三量体として集合する好みを生じさせることを示す。
【０１０６】
（実施例３）
材料及び方法。推定上の三量体及び二量体の画分（実施例２から得られた）をゲルろ過の後に回収した。サンプルの一部を−８０°Ｃで４日間貯蔵し、次いで凍結融解した。凍結融解したサンプルを、ＢＮ−ＰＡＧＥ上に、比較のために４℃で貯蔵したサンプルと並べて流した（図９）。
【０１０７】
結果。凍結の前後で、画分が移動し、支配的に二量体の及び三量体のタンパク質調製物が予測された。これらのデータは、免疫原として使用するのに充分な量の実質的な量の三量体の及び二量体のＲ２ｇｐ１４０が、本技術によって製造でき、貯蔵できる。
【０１０８】
前記の記述及び例は、単に、特定の好ましい実施態様の詳細な説明を示すことを理解すべきである。従って、種々の改変及び均等物が本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行うことができることは本技術分野における当業者に明らかである。本願において特定されているすべての論文、他の参考文献、特許、及び特許出願は、参照により本願に組み込まれているものとする。
【０１０９】
（実施例４）
材料及び方法。可溶性オリゴマーのＲ２ｇｐ１４０糖タンパク質を、減少した（ｏｐｔｉＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）血清条件の下で安定したＨＥＫ２９３Ｔ細胞株培養における発現によって製造した。タンパク質を、レンチルレクチン親和性クロマトグラフィー、Ｃａｐｔｏ−ＤＥＡＥ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ及びＳｕｐｅｒｄｅｘ−２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ  ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる最終の分離を用いて、順次精製した。３つのバージョンのＲ２ｇｐ１４０オリゴマーを示し（図１０）、すべて変異している切断部位を有する。ＷＴ：野生型の先端を切り取ったｇｐ１４０；＋ＧＣＮ：Ｃ末端にＧＣＮ４三量体ドメインを付加したｇｐ１４０；＋リンカー−ＧＣＮ：ｇｐ１２０及びｇｐ４１外部ドメインの間の切断部位の場所にて１５ａａの可動性リンカーを有し、Ｃ末端にＧＣＮ４三量体ドメインを付加したｇｐ１４０。３μｇの各々の精製したタンパク質を各レーンにロードした。パネルＡ（図１０）：サンプルを還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーで処理し、煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシーで染色した。パネルＢ（図１０）：サンプルを処理し、３−１２％ブルー・ネイティブＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分離した。
【０１１０】
結果。Ｒ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ及びＲ２ｇｐ１４０−リンカー−ＧＣＮの両方が、ＭＷ〜７２ＯｋＤａを有する三量体として移動した一方で、野生型Ｒ２ｇｐ１４０は、主に二量体であり、＞９０％純粋な二量体として精製でき、ＭＷ〜５２０ｋＤａを有する二量体として移動した（図１０）。
【０１１１】
（実施例５）
材料及び方法。各タイプのＲ２ｇｐ１４０タンパク質、（ＷＴ）Ｒ２ｇｌ４０、Ｒ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ（三量体）及びＲ２ｇｐ１４０−リンカー−ＧＣＮ（を有する三量体）を、モノクローナル抗体のパネルに加えてＣＤ４についての結合コンピテンスを用いて分析した。Ｒ２ｇｐ１４０調製物の質を計測するために、精製したＲ２ｇｐ１４０調製物を、ＣＤ４結合コンピテンス及び立体構造依存的な及び独立したｍａｂｓに加えてＲ２ｇｐ１４０と反応することが知られ、特定のプロフィール（ＣＤ４ｉ）ｍａｂｓを示す特定のｍＡｂｓを含むモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）のパネルに対する反応性について調べた。Ｒ２ｇｐ１４０オリゴマーは、ＣＤ４結合を有するおよび有さないＣＤ４ｉ  ｍａｂｓによって認識される独自の能力を示す一方で、他のｇｐ１４０株は、ＣＤ４ｉ  ｍＡｂｓがｇｐ１４０（Ｅｎｖ）に結合するために、ＣＤ４結合を必要とする。
【０１１２】
結果。沈降に続いてウエスタンブロットの検出（ＩＰ−Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイ）によって評価した特異的なｍＡｂ結合を図１１に示す。図１１の左側は、実証するＣＤ４ｉに特異的なヒトｍＡｂｓのパネルに対する、及びＣＤ４−ｇｐ１２０エピトープ複合体に特異的なｍＡｂとの特徴的な結合反応性を示す。Ｒ２ｇｐ１４０へのｍＡｂ結合アッセイを、複合体形成して及び形成しないで、ＣＤ４をＩＰ−Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔでアッセイして行った。ｍＡｂ１２ＣＡ５は、ＨＡエピトープタグに特異的な抗体（コントロール）である。既に見られているように、ＣＤ４の結合は、いずれのこれらの抗体、パネルＡ：Ｒ２ｇｌ４０（野生型）；パネルＢ：Ｒ２ｇｐ１４０−ＧＣＮ（三量体）；及びパネルＣ：Ｒ２ｇｐ１４０−リンカー−ＧＣＮ（可動性リンカーを有する三量体）の効果的な相互作用を必要としないように思われ、ＣＤ４受容体がタンパク質に予め結合するかどうかにかかわらず、これらのエピトープが、Ｒ２ｇｐ１４０オリゴマー上で予め曝されることを示す（図１１）。ＣＧｌＯｍＡｂの反応性は、ＣＤ４のタンパク質への結合に完全に依存している。それ故に、Ｒ２ｇｐ１４０のこのＣＤ４ｉ  ｍＡｂｓのパネルへの結合反応性は、独自の特性であり、その他のＨＩＶ−１外被糖タンパク質が同様の性質を有することは報告されていない。
【０１１３】
いくつかのマウス及びヒトｍＡｂｓの直接的な結合反応性を、図１１の右側に示す。Ｄ１９は、立体構造上独立したＶ３−ループに特異的なマウス抗体である。Ｄ３８．１、Ｄ４０、Ｄ５４及びＤｌＯは、立体構造に依存したｇｐ４１に特異的なマウスｍＡｂｓである。２Ｇ１２は、よく特徴づけられたｇｐ１２０−グリカンに特異的なヒトｍＡｂであり、４Ｅ１０及び２Ｆ５は、よく特徴づけられたｇｐ４１反応性のヒトｍＡｂｓである。二量体及び三量体オリゴマー（９０％二量体）の混合物を含む野生型のＲ２ｇｐ１４０タンパク質は、４Ｅ１０、２Ｆ５及びＤ３８．１によって認識されるエピトープのより弱い結合又は提示を持つ。一方で、重要であることに、安定化した精製Ｒ２ｇｐ１４０三量体の両方（可動性リンカーを有するもの及び有さないものの両方）は、これらのｍＡｂｓの結合の有意の向上を示し、Ｒ２ｇｐ１４０−リンカー−ＧＣＮは、最も向上した結合の特徴を示した。このような向上は、生体内で用いる場合により良いワクチン免疫原になるものであり、４Ｅ１０及び２Ｆ５エピトープに代表される重要なタイプの中和抗体反応を誘発できる。
【図１】
2011502521.tif 000003
【図２】
2011502521.tif 000004
【図３】
2011502521.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2011502521.tif 000009
【図８】
2011502521.tif 000010
【図９】
2011502521.tif 000011
【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2011502521.tif 000015
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