(57)【要約】  本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期前駆体細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む培養体を同定し、得る方法に関する。そのような細胞を分類するだけでなく、そのような細胞数を増やす方法もまた検討される。幾つかの態様では、本発明は内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌、及び／又は完全分化内分泌フェノタイプを伴う細胞のユニークなサブセットの選択を可能にする、選択的な細胞表面マーカーであるＤＮＥＲに更に関する。幾つかの態様では、選択的な細胞表面マーカーは、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８からなる群から選択される。更に、本発明はそのような細胞とそれらの組成物から選択される単離細胞に関する。
2011518547.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞を同定する方法において、膵臓細胞を含む細胞個体群をＤＮＥＲ結合試薬に接触させることを含む方法。
【請求項２】
内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞の培養体を得る方法において、膵臓細胞を含む細胞個体群をＤＮＥＲ結合試薬に接触させ、ＤＮＥＲ陽性細胞の画分中のＤＮＥＲ結合試薬に結合する細胞を、ＤＮＥＲ結合試薬に結合しない細胞から分離することを含む方法。
【請求項３】
内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞の培養体を得る方法において、請求項２の方法に従って精製された細胞を得、次いで、得た細胞を、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞への細胞分化を容易にする条件下で培養することを含む方法。
【請求項４】
内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞の数を増加する方法において、請求項２に従って精製された細胞を得、次いで、得た型の細胞増殖を容易にする条件で、得た細胞を培養することを含む方法。
【請求項５】
内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞の数を増加する方法において、請求項４に従って精製し、増殖した細胞を得、次いで、得た細胞を、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞への細胞分化を容易にする条件下で培養することを含む方法。
【請求項６】
細胞が請求項１から５の何れか一項に記載の方法によって得られる、少なくとも一の膵臓ホルモンの産生欠損の哺乳類に、膵臓の内分泌機能を与える方法において、哺乳類の少なくとも一の膵臓ホルモンの測定可能な量を産生するために十分な量の得られた細胞を哺乳類に移植する工程を更に含む方法。
【請求項７】
ａ）細胞にＤＮＥＲ結合試薬を接触させ、ｂ）細胞表面マーカー（ＤＮＥＲ陽性細胞）としてＤＮＥＲを発現する細胞の量を決定することにより、膵臓細胞を含むＤＮＥＲ陽性細胞を定量する方法。
【請求項８】
ＤＮＥＲ発現細胞（ＤＮＥＲ陽性細胞）数が定期的に監視される、インビトロプロトコルにおける最適化のための方法。
【請求項９】
一又は複数の付加的な結合試薬をＤＮＥＲ結合試薬と、同時に又は連続的に組み合わせて使用する、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
付加的な結合試薬が、ＤＤＲ１、プロミニン１（ＣＤ１３３としても知られる）、ＣＤ４９ｆ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＥＲ陽性細胞が、更にインスリン産生細胞に分化し、グルコガン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及び／又はグレリン産生細胞からなる群から選択される細胞に更に分化される細胞を伴ってもよい、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１の何れか一項に記載の方法によって得られる、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞及び及び完全分化内分泌細胞からなる群から選択される単離細胞。
【請求項１３】
請求項１から１１の何れか一項に記載の方法によって得られる、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞及び及び完全分化内分泌細胞からなる群から選択される一又は複数の細胞から選択される単離細胞を含む組成物。
【請求項１４】
細胞表面マーカーとしてのＤＮＥＲタンパク質を発現する細胞を同定又は選択するためのＤＮＥＲ結合試薬の使用。
【請求項１５】
膵臓内分泌細胞の培養体を得るための細胞表面マーカーとしてのＤＮＥＲタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
幾つかの態様では、本発明は、膵臓内分泌プレ前駆体表現型とその子孫を有する細胞独特のサブセットの同定、選択及び／又は定量を可能にする、選択的細胞表面マーカーＤＮＥＲに関する。幾つかの態様では、選択的細胞表面マーカーは、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８からなる群から選択される。
【０００２】
内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞を含む組成物、細胞培養体及び細胞個体群、並びに完全に分化した内分泌細胞を生成させ、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞を検出する方法が考慮される。
【背景技術】
【０００３】
ベータ細胞移植には、１型糖尿病の処置が改善されるとの大きな期待が寄せられているが、まずは多くの障害を克服する必要がある。これらのなかには、ドナー島の不足がある。ベータ細胞から誘導される胚性幹(ＥＳ)細胞は、原則的には、無制限の数の移植用ベータ細胞を供給可能であるが、完全に機能するベータ細胞を作製するための信頼のおけるプロトコルは、未だ開発されていない。胚性幹細胞からの確定的内胚葉(ＤＥ)細胞の形成が、例えば、  国際公開第２００５／１１６０７３、国際公開第２００５／０６３９７１及び米国特許第２００６／０１４８０８１において、マウス及びヒトＥＳ細胞の双方で報告されている。例えば、ＤＥ細胞からの膵臓内胚葉(ＰＥ)細胞の効率的生成は、糖尿病を処置するためのインスリン生成ベータ細胞の作製にとっては有利である。
【０００４】
成人の膵島細胞を培養する試みにおいて、目的は、膵臓ベータ細胞又は島に分化可能な、膵臓及び膵臓内分泌前駆体細胞を単離することが切望されている。外分泌系からの膵臓内分泌系の単離における重要な段階の一つは、膵臓内分泌プレ前駆体細胞及び／又はその前駆体に対して特異的な、認識可能な細胞マーカーを同定することである。細胞内及び細胞外マーカーの双方が、この目的のために調査される。細胞内マーカー、特に完全に分化した島細胞に成長する胚性膵臓細胞からのものは、前駆体マーカーとして、広範囲にわたって研究されている。幾つかの実施態様では、これらの細胞内マーカーは、成熟島細胞に成長する胚性膵臓細胞において検出される転写因子である。転写因子、例えばＰｄｘ１、Ｎｇｎ３、Ｐａｘ６、及びＩｓｌ-１が研究されている。それらは、胚発育中に、膵臓内分泌細胞になるようにプログラムされた細胞において発現している。しかしながら、これらの細胞内マーカーは細胞外マーカーよりも実用的価値が低く、これは、それらのマーカーの発現の分析には、細胞内でのレポーター遺伝子を遺伝的に設計することによる、細胞の永続的修飾又は細胞を殺すことが必要であるからである。
【０００５】
特に、初期の膵臓つぼみ構造（マウス胎児発生の９．５から１０．５日に観察される）を含む最も初期の多能性幹細胞又は前駆体細胞は、３つの転写因子：Ｐｄｘ１、Ｎｋｘ６．１及びＰｔｆｌａを共発現する。Ｐｔｆｌａ及びＮｋｘ６．１の発現は次いで、それぞれ、末梢腺房関連ドメイン及び中枢管／内分泌関連ドメインに区分される。Hald等, J Histochem Cytochem (2008);56(6):587-95を参照されたい。したがって、内分泌系を選択することに既に関与している初期「管／内分泌」前駆対細胞の特定の亜集団のような、膵臓組織サブセットにおいて選択的に発現する有用な表面マーカーを同定することは優先度が高い。我々は、これらの細胞の命名のために、「内分泌プレ前駆対細胞」を使用した。この段階において、ＤＮＥＲは、内分泌プレ前駆体細胞の表面に選択的に発現する。このような細胞は、後に、Ｎｇｎ３を発現し、内分泌成熟に進行する。
【０００６】
同定されると、細胞外マーカーは、マーカーを発現する細胞が滅菌条件下で選別可能で、生存し続けるという利点を提供する。上皮細胞付着分子、例えばＥｐ-ＣＡＭ及びインテグリンは、膵臓島前駆体マーカーとして研究されている。例えば、Cirulliら, J. Cell Biol. 140: 1519-1534 (1998);及び Cirulliら, J. Cell Biol. 150: 1445-1460 (2000)を参照のこと。
【発明の概要】
【０００７】
幾つかの態様では、本発明は特定の膵臓細胞の同定と選択のための細胞外マーカーＤＮＥＲの使用を開示する。幾つかの態様では、本発明は、特定の膵臓細胞の同定と選択のためのＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８からなる群から選択される細胞外マーカ−の使用を開示する。
【０００８】
幾つかの態様では、本発明は内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の同定方法において、膵臓細胞を含む細胞個体群をＤＮＥＲ結合試薬に接触させることを含む方法に関する。幾つかの態様では、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の同定方法において、膵臓細胞を含む細胞個体群をＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８からなる群から選択される結合試薬に接触させることを含む方法に関する。
【０００９】
幾つかの態様では、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の培養体を得る方法において、膵臓細胞を含む細胞個体群をＤＮＥＲ結合試薬に接触させ、ＤＮＥＲ結合試薬に結合しない細胞からＤＮＥＲ陽性細胞の画分におけるＤＮＥＲ結合試薬に結合する細胞を分離することを含む方法に関する。
【００１０】
幾つかの態様では、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の培養体を得る方法において、上又はここに記載の方法に従って精製した細胞を得、次いで得た細胞を、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞へと細胞分化することを容易にする条件下で培養することを含む方法に関する。
【００１１】
幾つかの態様では、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞数を増やす方法において、上又はここに記載の方法に従って精製した細胞を得、次いで得た細胞を、得た細胞の型を増やすことを容易にする条件下で培養することを含む方法に関する。
【００１２】
幾つかの態様では、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の数を増加する方法において、上又はここに記載の方法に従って精製した細胞を得、次いで得た細胞を、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞へと細胞分化することを容易にする条件下で培養することを含む方法に関する。
【００１３】
幾つかの態様では、本発明は、細胞が上又はここに記載の任意の方法によって得られる、少なくとも一の膵臓ホルモンの産生欠損の哺乳類に、膵臓の内分泌機能を与える方法において、哺乳類の少なくとも一の膵臓ホルモンの測定可能な量を産生するために十分な量の得られた細胞を哺乳類に移植する工程を更に含む方法。
【００１４】
幾つかの態様では、本発明は、ａ）細胞にＤＮＥＲ結合試薬を接触させ、ｂ）細胞表面マーカー（ＤＮＥＲ陽性細胞）としてＤＮＥＲを発現する細胞の量を決定することにより、膵臓細胞を含むＤＮＥＲ陽性細胞を定量する方法に関する。
【００１５】
幾つかの態様では、本発明は、ＤＮＥＲ発現細胞（ＤＮＥＲ陽性細胞）数が定期的に監視される、インビトロプロトコルにおける最適化のための方法に関する。
【００１６】
幾つかの態様では、本発明は、ここで定義される任意の方法によって得られた、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞及び及び完全分化内分泌細胞からなる群から選択される単離細胞に関する。
【００１７】
幾つかの態様では、本発明は、ここで定義される任意の方法によって定義される方法によって得られる、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞及び及び完全分化内分泌細胞からなる群から選択される一又は複数の細胞から選択される単離細胞を含む組成物に関する。
【００１８】
幾つかの態様では、本発明は、細胞表面マーカーとしてのＤＮＥＲタンパク質を発現する細胞を同定又は選択するためのＤＮＥＲ結合試薬の使用に関する。
【００１９】
幾つかの態様では、本発明は、膵臓内分泌細胞の培養体を得るための細胞表面マーカーとしてのＤＮＥＲタンパク質の使用に関する。
【００２０】
本発明の方法において同定、増加、及び／又は単離されるＤＮＥＲ陽性細胞は、膵臓系の種々の細胞型に分化するための可能性を有する。幾つかの態様では、ＤＮＥＲ陽性細胞は、インスリン産生細胞に更に分化するが、これは、インスリン産生細胞だけを得るためか、又は、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及び／又はグレリン産生細胞も含む細胞の培養体を産生するためになされ得る。本発明の方法において同定、増加、及び／又は単離される、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺＬ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞は、膵臓系の種々の細胞型へと分化する可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１Ａは、略図として、典型的な８μｍのマウスｅ１５．５膵臓組織切片を示す。マウスの膵臓において、細胞は同時に分化しない。よって、発達段階の異なる細胞が、付与された時間で観察可能である。ｅ１５．５での２つの主要なドメイン、中心及び末梢が観察される。中心ドメインには、初期の内分泌細胞、内分泌前駆体、及び管／内分泌前駆体に発育する細胞が含まれる。この中心ドメインは、外分泌系列の細胞を含まない。腺房系列の細胞は末梢ドメインに見出される。末梢ドメインにおける細胞はＰｔｆ１ａ＋及びＰｄｘ１＋であるが、Ｎｋ６．１−、Ｄｄｒ１−ではない。中心ドメインおいて、細胞はＰｄｘ１＋である。ベータ-細胞系列の細胞はＤｎｅｒｌｏｗであり、このような細胞の幾つかは、インスリンに対して陽性である。Ｄｎｅｒ＋細胞数と比較して、中枢ドメインにおける細胞の殆どは、Ｄｄｒ１＋である。匹敵する細胞及びその局在性がヒト膵臓で見出されると仮定される。  図１Ｂは、細胞が通過する種々の段階の略図を示す。膵臓において、細胞は、多分化能性の膵臓前駆体プール、すなわちＰｄｘ１＋／Ｎｋｘ６．１＋／Ｐｔｆ１ａ＋の一部となり始める。細胞によりなされる運命の最初の選択は、外分泌(Ｐｔｆ１ａ＋)又は管／内分泌系列(Ｐｄｘ１＋及びＮｋｘ６．１＋、又はＰｄｘ１＋、Ｎｋｘ６．１＋、及びＤｄｒ１＋並びにＰｔｆ１ａ−)のいずれに進むかである。これらの細胞の幾つかは、管系列の運命をとるであろう。膵臓細胞がＤｄｒ１＋である場合、内分泌運命又は管運命を選択する可能性があり、よって、後にＮｇｎ３を活性化させる可能性がある。細胞がＮｇｎ３を活性化させたら、それは内分泌前駆体細胞である。また、Ｎｇｎ３＋細胞はＰｄｘ１＋でもある。Ｎｇｎ３発現は、内分泌前駆体細胞内でのみ一時的に生じ、特定の段階を介して内分泌分化プログラムを誘発し、そこではＮｅｕｒｏＤ、Ｐａｘ６、Ａｒｘ(アルファ細胞内）、及びＰａｘ４(ベータ細胞内)を含む他の転写因子が活性化される。これらの転写因子は、一部、ホルモン遺伝子活性化の原因であり、初期の内分泌細胞がホルモンに対して陽性になった場合、それらのほとんどは、Ｎｇｎ３に対して既に陰性であるが、一方でＰａｘ６＋ではない。この時点から、細胞は、以前及び未来の運命決定インプットに応じて、十分に分化した内分泌細胞型(アルファ-、ベータ-、デルタ-、ｐｐ-、及びグレリン-細胞)の一つに発育していく。
【図２】マウスとヒトＤｎｅｒのＣｌｕｓｔａｌＷ。アラインメント同一性は９０％である。透過膜ドメインは下線を引いてある：アミノ酸６３９−６６１。細胞外部位はアミノ酸１−６３８。これは、切断され得るＮ末端シグナル配列（つまり、最初の３０−３５アミノ酸）を含む。アラインメントは、デフォルトで各列において観察される保存の程度を示す下のシンボルを示す：「＊」は、その列における残基又はヌクレオチドがアラインメントの全ての配列において同一であることを示す。「：」は、保存置換が観察されたことを示す。「・」は、半保存置換が観察されることを示す。
【図３】マウス（Ａ）とヒト（Ｂ）ＤｎｅｒのＧｌｃＮＡｃ Ｏ−グリコシル化。ＧｌｃＮＡｃ Ｏ−グリコシル化は、マウスとヒトＤｎｅｒの細胞外側面上に存在すると予測され、「Ｇ」で示される。
【図４】マウス（Ａ）とヒト（Ｂ）Ｄｎｅｒのリシンのイプシロンアミノ基のグリコシル化。グリコシル化は、マウスとヒトＤｎｅｒの細胞外側面上に存在すると予測され、「Ｇ」で示される。
【図５】マウス（Ａ）とヒト（Ｂ）ＤｎｅｒのアスパラギンにおけるＮ−グリコシル化。Ｎ−グリコシル化は、マウスとヒトＤｎｅｒの細胞外側面上に存在すると予測され、「Ｎ」で示される。
【図６】マウス（Ａ）とヒト（Ｂ）Ｄｎｅｒのムチン型ＧａｌＮＡｃ Ｏ−グリコシル化。グリコシル化は、マウスとヒトＤｎｅｒの細胞外側面上に存在すると予測され、「Ｔ」で示される。下線、即ち、「＿」は、切断されるシグナルペプチドを示す。
【図７】Ｄｎｅｒ抗体を用いたアルファＴＣのＦＡＣＳ。一次ヤギ抗Ｄｎｅｒ抗体及び二次サル抗ヤギＣｙ２抗体のいずれともインキュベートしないアルファＴＣのＦＡＣＳを実施し、Ｃｙ２蛍光における非常に弱い細胞個体群の結果となる（即ち、バックグラウンド）。二次サル抗ヤギＣｙ２抗体を添加し、蛍光の注目に値する増加の結果となり、これは、二次抗体の細胞への非特異的な結合が原因である（即ち、バックグラウンド）。一次ヤギＩｇＧアイソタイプコントロールを添加し、二次抗体だけの場合と殆どおなじ蛍光の結果となる（即ち、バックグラウンド）。しかし、ヤギ抗Ｄｎｅｒを添加すると、蛍光の注目に値する増加の結果となり、Ｄｎｅｒタンパク質がＦＡＣＳにおけるタグとして使用され得ることを示す。
【図８】Ｄｎｅｒ抗体（Ａ）及びアイソタイプコントロール（Ｂ）を用いたｅ１５．５マウス膵臓細胞のＦＡＣＳ。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ＤＮＥＲは、内分泌プレ前駆体細胞から完全に分化した膵臓細胞に分化する段階から膵臓細胞において存在する。比較として、ＤＤＲ１は、管／内分泌前駆体細胞から初期内分泌細胞に分化する段階から膵臓細胞に存在する。このように、ＤＮＥＲは、ＤＤＲ１と比較して膵臓細胞の発生におけるより後の段階に出現し、以後の段階においても発現する。したがって、ＤＮＥＲは、細胞が内分泌系に関与する分化の段階における膵臓細胞の細胞外マーカーを提供する。膵臓細胞の同定、増幅、及び／又は単離のための細胞外マーカーであるＤＮＥＲの使用は、完全に分化した内分泌細胞となる可能性がある細胞を提供するが、管又は腺房細胞になる可能性を失った。
【００２３】
ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８は、Ｎｇｎ３発現が起きる周辺又は後の分化段階から存在し、依然としてベータ細胞を含む完全に成熟した内分泌細胞である内分泌系の細胞外マーカーである。したがって、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８は、細胞が内分泌系に関連し、管又は腺房細胞になる可能性を失った分化の段階における膵臓細胞の付加的な細胞外マーカーを提供する。
【００２４】
膵臓内分泌細胞−及びそれらの前駆体
膵臓においては、幾つかの異なった種類の膵臓細胞が見出され得る。これらの細胞は、例えば、多能性の膵臓前駆体細胞、管／内分泌前駆体細胞、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞が含まれる。これらの細胞型の概略は、図１に見出すことができる。
【００２５】
ここで交換可能に使用される場合、「膵臓内分泌細胞」、「膵臓ホルモン発現細胞」とは、次のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及びグレリンの少なくとも一を発現可能な細胞を称する。
【００２６】
ここで使用される場合、「膵臓ホルモン分泌細胞」とは、次のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及びグレリンの少なくとも一を分泌可能な細胞を称する。
【００２７】
ここで使用される場合、「膵臓内分泌プレ前駆体細胞」(「膵臓内分泌プレ前駆体」及び「内分泌プレ前駆体」とも称される)とは、膵臓管及び腺房細胞に成長する可能性を失ったが、依然Ｎｇｎ３タンパク質を発現せず、ホルモン発現をしないが、膵臓内分泌細胞又は膵臓ホルモン分泌細胞に分化する可能性を有し、通常、これらの細胞の表現型特徴の少なくとも一部を共有する細胞のことである。幾つかの態様では、内分泌プレ前駆体細胞は、Ｐｄｘ１＋、Ｎｋｘ６．１＋、Ｄｄｒ１＋及びＤｎｅｒ＋である。
【００２８】
ここで使用される場合、「膵臓内分泌前駆体細胞」(「膵臓内分泌前駆体」及び「内分泌前駆体」とも称される)とは、Ｎｇｎ３タンパク質発現細胞であり、ホルモン発現をしないが、膵臓内分泌細胞又は膵臓ホルモン分泌細胞に分化する可能性を有し、通常、これらの細胞の表現型特徴の少なくとも一部を共有する細胞のことである。幾つかの態様では、内分泌前駆体細胞は、Ｐｄｘ１＋、Ｎｋｘ６．１＋、Ｎｇｎ３＋、Ｄｄｒ１＋及びＤｎｅｒ＋／−である。幾つかの態様では、内分泌前駆体細胞は、Ｐｄｘ１＋、Ｎｋｘ６．１＋、Ｄｄｒ１＋、Ｎｇｎ３＋／ｌｏｗ／−及びＤｎｅｒ＋／ｌｏｗ／−である幾つかの態様では、内分泌前駆体細胞は、Ｐｄｘ１＋、Ｎｋｘ６．１＋、Ｄｄｒ１＋／ｌｏｗ／−及びＮｇｎ３＋である。
【００２９】
ここで使用される場合、「初期の内分泌細胞」(「膵臓の初期の内分泌細胞」とも称される)とは、Ｎｇｎ３を不活性化するが、成人膵臓のランゲルハンス島に見出される、完全に分化した膵臓内分泌細胞の特徴全て、例えばグルコースに対する反応性を共有していない内分泌細胞のことである。初期内分泌細胞は、一又は複数の膵臓内分泌ホルモン(インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及びグレリン)に対して陰性又は陽性であり得る初期内分泌細胞のことである。幾つかの態様では、初期内分泌細胞は、Ｐｄｘ１＋／−、Ｎｋｘ６．１＋／−、ホルモン＋、Ｄｄｒ１＋／−及びＤｎｅｒ＋／−である。幾つかの態様では、初期内分泌細胞は、Ｐｄｘ１ｈｉｇｈ／＋、Ｎｋｘ６．１＋、ホルモン＋／−、Ｄｄｒ１＋／ｌｏｗ／−及びＤｎｅｒ＋／ｌｏｗ／−である。
【００３０】
ここで使用される場合、「完全に分化した内分泌細胞」(「膵臓の成熟した内分泌細胞」とも称される)とは、成人膵臓のランゲルハンス島に見出される、完全に分化した膵臓内分泌細胞の全ての特徴を共有する細胞のことである。「膵臓ホルモン発現細胞」及び「膵臓ホルモン分泌細胞」は、初期から完全に分化した表現型までの範囲で、「膵臓内分泌細胞」とみなされる。幾つかの態様では、完全に分化した内分泌細胞は、Ｐｄｘ１＋／−、Ｎｋｘ６．１＋／−、ホルモン＋、Ｄｄｒ１−及びＤｎｅｒｌｏｗである。幾つかの態様では、完全に分化した内分泌細胞は、Ｐｄｘ１＋、Ｎｋｘ６．１＋／−、ホルモン＋及びＤｎｅｒｌｏｗ／−である。
【００３１】
ここで使用される場合、「ベータ細胞系列」とは、転写因子ＰＤＸ１、及び次の転写因子：Ｎｇｎ-３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、ＩｓＩ-１、Ｈｎｆ-３ ベータ、ＭａｆＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の少なくとも一に対して、陽性な遺伝子発現を有する細胞を称する。ベータ細胞系列に特徴的な細胞発現マーカーにはベータ細胞が含まれる。
【００３２】
ここで使用される場合、「管／内分泌前駆体細胞」は、初期の膵臓の発生において中枢部位に存在し、成熟管細胞又は完全に分化した内分泌細胞になる二つの可能性を保持する細胞のことである。更に、これらの細胞は、転写因子であるＰｄｘ１及びＮｋｘ６．１を発現し、Ｐｔｆ１ａを発現しない。管／内分泌前駆体細胞の例は、マウスのｅ１２．０の周辺の発生段階で見出すことができる。幾つかの態様では、管／内分泌前駆体細胞内分泌プレ前駆体細胞は、Ｐｄｘ１＋、Ｎｋｘ６．１＋、Ｄｄｒ１＋／−である。
【００３３】
ここで使用される場合、「多能性膵臓前駆体細胞」は、膵臓の最も初期の細胞を示す細胞である。これらの細胞は、３つの鍵転写因子：Ｐｄｘ１＋／Ｎｋｘ６．１＋／Ｐｔｆｌａ＋について三重陽性細胞として一意的に特徴付けられる。
【００３４】
ここで使用される場合、「マーカー」は、関心ある細胞内で、差異的に発現する核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的発現とは、陽性マーカーに対してはレベルの上昇、陰性マーカーに対してはレベルの低下を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、関心ある細胞が、当該技術で知られる種々の任意の方法を使用し、同定及び他の細胞と区別できるように、他の細胞と比較して、関心ある細胞内で十分に高い又は低いことである。
【００３５】
幾つかの態様では、本発明に記載の方法によって得られた膵臓内分泌細胞は、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及び／又はグレリン生成細胞の方向に分化した細胞と一緒でもよい、インスリン生成細胞である。ここで使用される場合、「インスリン生成細胞」とは、検出可能な量のインスリンを生成又は分泌する細胞を称する。「インスリン生成細胞」は、個々の細胞又は細胞の収集物であってよい。
【００３６】
幾つかの態様では、本発明に記載の方法により得られた膵臓ＤＮＥＲ＋細胞は、初期内分泌細胞を含む。幾つかの態様では、本発明の方法により得られた膵臓ＤＮＥＲ＋細胞は、内分泌前駆体細胞を含む。幾つかの態様では、本発明の記載の方法によって得られた膵臓ＤＮＥＲ＋細胞は、１）内分泌細胞へと成熟可能な非分裂細胞、２）成熟前に、制限された回数増殖可能な分裂細胞、３）細胞分割を受け、一つの培養容器から他の容器に徐々に継代可能な分裂細胞であってよい。幾つかの態様では、細胞表面マーカーとしてＤＮＥＲを示す膵臓細胞の培養は、検出可能なＤＮＥＲ細胞表面発現に加え、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む、完全に分化した膵臓内分泌細胞に分化可能な、インスリン産生膵臓ベータ細胞を含む、膵臓細胞で増加した培養体と称される。
【００３７】
幾つかの態様では、本発明に記載の方法によって得られた膵臓ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞は、初期の内分泌細胞を含む。幾つかの態様では、本発明に記載の方法によって得られた膵臓ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞は、内分泌前駆体細胞を含む。幾つかの態様では、本発明に記載の方法によって得られた膵臓ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞は、１）内分泌細胞へと成熟可能な非分裂細胞、２）成熟前に、制限された回数増殖可能な分裂細胞、３）細胞分割を受け、一つの培養容器から他の容器に徐々に継代可能な分裂細胞であってよい。幾つかの態様では、細胞表面マーカーとしてＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８を示す膵臓細胞の培養は、検出可能なＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８細胞表面発現に加え、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む、完全に分化した膵臓内分泌細胞に分化可能な、インスリン産生膵臓ベータ細胞を含む、膵臓細胞で増加した培養体と称される。
【００３８】
通常、細胞の「継代」は、部分的コンフルエント状態から、コンフルエント状態までの、播種した培養容器の転移状態を称し、それらが培養容器から取り出された時点で、低密度にて、培養容器に再播種される。しかしながら、細胞はコンフルエンスに達する前に継代されてもよい。典型的には、継代により、コンフルエンスに達するまで成長するため、細胞個体群が増殖する結果となる。細胞個体群の増殖は、当初の播種密度に依存するが、典型的には、１〜１０、１〜５、１〜３、又は１〜２回の増殖である。よって、一般的に継代では、培養中に、複数回細胞分裂可能である細胞が必要である。
【００３９】
膵臓細胞を含む細胞個体群
ここで使用される場合、「膵臓細胞を含む細胞個体群」とは、腺房及び管細胞、多能性膵臓前駆体細胞、管／内分泌前駆体細胞、膵臓内分泌プレ前駆体細胞、膵臓内分泌前駆体細胞、初期の膵臓内分泌細胞、膵臓内分泌細胞、膵臓ホルモン分泌細胞、胎児膵臓細胞、成人膵臓内分泌細胞、及び他の非膵臓細胞からなる群から選択される、一又は複数の細胞型を含む細胞個体群を称する。細胞の「個体群」とは、出発細胞に特定の単離及び培養手順により得られる、複数の細胞を称する。細胞個体群の特性は、一般的に、特定の特性を有する個々の細胞のパーセンテージ(例えば、特定のマーカーで陽性染色される細胞のパーセンテージ)、又は全個体群で測定した場合の特性のバルク平均値(例えば、細胞個体群から作製された溶菌液中のｍＲＮＡ量、又はＮｇｎ３、Ｐａｘ６、インスリン又はグルカゴン等、組織化学的マーカーに対して陽性な細胞のパーセント年齢)により定められる。
【００４０】
幾つかの態様では、膵臓細胞を含む細胞個体群は、胎児膵臓を含む、膵臓から得られる。幾つかの態様では、膵臓細胞を含む細胞個体群は、胎児膵臓又は成人膵臓を含む、膵臓から得られる。幾つかの態様では、膵臓は哺乳動物、例えばヒトからのものである。
【００４１】
幾つかの態様では、膵臓細胞を含む細胞個体群は、体細胞個体群から得られる。本発明の幾つかの態様では、体細胞個体群は、胚様幹(ＥＳ、例えば多能性)細胞への脱分化を誘発する。このような脱分化細胞は、人工多能性幹細胞(ＩＰＳ)とも称される。
【００４２】
幾つかの態様では、膵臓細胞を含む細胞個体群は胚性幹(ＥＳ、例えば多能性)細胞である。幾つかの態様では、膵臓細胞を含む細胞個体群は多能性細胞、例えばＥＳ様細胞である。
【００４３】
幾つかの態様では、膵臓細胞を含む細胞個体群は、分化した胚幹(ＥＳ又は多能性)細胞である。分化は、胚様体及び／又は単層細胞培養、又はその組合せで生じる。
【００４４】
幾つかの態様では、膵臓細胞を含む細胞個体群は哺乳動物由来のものである。本発明の一態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群はヒト由来のものである。幾つかの態様では、細胞個体群は、膵臓内分泌系列に向かって分化している。
【００４５】
幾つかの態様では、膵臓細胞を含む細胞個体群は、一又は複数の提供膵臓から得られる。ここに記載された方法は、提供膵臓の年齢に依存しない。従って、胎児から成人の年齢範囲のドナーから単離された膵臓物質を使用することができる。
【００４６】
膵臓がドナーから収集されると、典型的にはプロセシングされて、種々の方法を使用して培養される、個々の細胞又は細胞の小グループが生じる。このような方法では、収集した膵臓組織を、酵素消化用に浄化し、調製することが必要である。収集された組織の実質が膵臓細胞物質のより小さな単位に解離されるように、酵素的プロセシングが使用されて、結合組織が消化される。収集された膵臓組織は一又は複数の酵素で処理され、収集された器官の全体的構造から、膵臓細胞物質、部分構造、及び個々の膵臓細胞が分離される。コラゲナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、リベラーゼ(Liberase)調製物(米国特許第５８３０７４１号及び同５７５３４８５号を参照)、及び他の酵素が、ここに記載の方法に使用されると考えられる。
【００４７】
さらに、単離された原物質は、一又は複数の所望の細胞個体群に富むようにプロセシングすることができる。幾つかの態様では、培養用に解離した未分画の膵臓組織は、さらなる分離をすることなく、本発明の培養方法に直接使用することもできる。しかしながら、培養用に解離した未分画の膵臓組織は、さらなる分離をすることなく、本発明の培養方法に直接使用することができ、中間細胞個体群が生じるであろう。一実施態様において、単離された膵臓細胞物質は、密度勾配を介した遠心分離により精製される(例えば、Nycodenz、Ficoll、又はPercoll）。例えば、米国特許第５７３９０３３号に記載された勾配法は、島において、プロセシングされた膵臓物質を富ませるための手段として使用可能である。ドナー源から収集された細胞混合物は、典型的には異種性であり、よってアルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、管細胞、腺房細胞、通性前駆体細胞、及び他の膵臓細胞型を含有する。
【００４８】
典型的な精製手順により、多くの層又は界面において、単離された細胞物質の分離に至る。典型的には、２つの界面が形成される。上部界面は島に富み、典型的には、懸濁液に１０〜１００％の島細胞を含有する。第２の界面は、典型的には、島、腺房、及び管細胞を含む細胞の混合個体群である。低層はペレットであり、傾斜の底部に形成される。この層は、典型的には、主として腺房細胞、いくつかの捕捉された島、及びいくつかの管細胞を含有している。管状樹状成分(ductal tree components)を、さらなるマニピュレ−ション用に、別に収集することもできる。  さらなるマニピュレーション用に選択された画分の細胞支持層は、選択される勾配画分、及び各単離の最終結果に応じて変化するであろう。
【００４９】
島細胞が所望の細胞型である場合、単離された画分内で島細胞に適切に富む個体群は、少なくとも１０％〜１００％の島細胞を含有する。他の膵臓細胞型及び濃度も、富化後に収集可能である。例えば、ここに記載の培養方法は、使用される精製勾配に応じて、第２の界面、ペレット、又は他の画分から単離された細胞を用いて、使用することができる。
【００５０】
幾つかの態様では、中間膵臓細胞培養体は、島に富む(上部)画分から作製される。しかしながら、さらに、典型的には、島、腺房、及び管細胞、又は管状樹木成分、腺房細胞、及びいくつかの捕捉された島細胞の混合細胞個体群を含有する、より異種性の第２の界面及び底層画分は、それぞれ、培養に使用することができる。幾つかの態様では、双方の層は、ここに記載のＤＮＥＲ及び／又はＤＤＲ１陽性個体群を生じさせることのできる細胞を含有しており、各層は、開示された方法を用いた使用に対し、特定の利点を有する。幾つかの態様では、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及び／又はＤＤＲ１陽性個体群を生じさせることのできる細胞を含有しており、各層は、開示された方法を用いた使用に対し、特定の利点を有する。
【００５１】
幾つかの態様では、細胞個体群は幹細胞の個体群である。幾つかの態様では、細胞個体群は、膵臓内分泌系列に向かって分化した幹細胞の個体群である。
【００５２】
幹細胞は、単細胞レベルで、自己再生前駆体、非再生前駆体、及び末端で分化する細胞を含む子孫細胞を生成するために、自己再生し分化するといった、それらの能力により定められる未分化細胞である。また幹細胞は、複数の胚葉(内胚葉、中胚葉及び外胚葉)から、種々の細胞系列の機能的細胞においてインビトロで分化する、並びに、移植後、複数の胚様組織を生じせしめ、胚胎盤への注射後、全てではないならば、ほとんどの組織に対してかなり寄与する能力により特徴付けられる。
【００５３】
幹細胞は、それらの発育可能性により：(１)全ての胚及び胚外細胞型を生成可能であることを意味する全能性；(２)全ての胚細胞型を生成可能であることを意味する多能性；(３)全てではないが、特定の組織、器官、又は生理学的システムにおける細胞系列のサブセットを生成可能(例えば、造血幹細胞(ＨＳＣ)は、ＨＳＣ(自己再生)、血液細胞制限少能性(oligopotent)前駆体、及び血液の通常の成分である全ての細胞型及び成分(例えば、血小板)を含む子孫を生成可能)であることを意味する多分化能性；(４)多分化能性幹細胞よりもさらに制限された細胞系列のサブセットを生成可能であることを意味する少能性；及び(５)単一の細胞系列(例えば、精子形成幹細胞)のみを生成可能であることを意味する単能性に分類される。
【００５４】
幹細胞から膵臓細胞を得るためのプロトコルは、限定されるものではないが、D'Amour, K. Aら. (2006), Nat Biotechnol 24, 1392-401; Jiang, Jら. (2007), Stem Cells  25, 1940-53;及びKroon, Eら. (2008), Nat Biotechnol 26, 443 - 452により記載されたプロトコルに例証される。
【００５５】
体細胞、又はＥＳ様細胞等、多能性細胞への脱分化が誘発される体細胞から、膵臓細胞を得るためのプロトコルは、限定されるものではないが、Aoi, Tら. (2008), Science, 2008年2月14日, [Epub印刷準備中]; D'Amour, K. Aら. (2006), Nat Biotechnol 24, 1392-401; Jiang, Jら. (2007), Stem Cells 25, 1940-53; Kroon, Eら. (2008), Nat Biotechnol, 2008年2月20日, [Epub印刷準備中]; Takahashi, Kら. (2007), Cell 131, 861-72; Takahashi, K., 及びYamanaka, S. (2006), Cell 126, 663-76; 及びWernig, Mら. (2007), Nature 448, 318-24により記載されたプロトコルに例証される。
【００５６】
分化とは、特定化していない(「非コミット」)、又はあまり特定化していない細胞が、特定化細胞、例えば神経細胞又は筋肉細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した又は分化誘発性細胞は、細胞の系列内のより特定化された(「コミットされた」)位置をとるものである。分化のプロセスに適用される場合、「コミットされる」なる用語は、正常な環境下で、特定の細胞型又は細胞型のサブセットに分化し続け、正常な環境下で、異なる細胞型への分化が不可能であるか、あまり分化していない細胞型への復帰が不可能な分化経路における点まで進行した細胞を意味する。脱分化とは、細胞が、細胞系列内であまり特定化されていない(又は、コミットされていない)位置に復帰するプロセスを称する。ここで使用される場合、細胞の系列は、細胞の遺伝、すなわち細胞がどこから来て、細胞が何を生成するのかを定める。細胞系列を、発育及び分化の遺伝概略図の細胞に配する。系列特異的マーカーは、関心ある細胞系列の表現型に特異的に関連した特徴を称し、関心ある系列の非コミット細胞の分化を評価するのに使用することができる。
【００５７】
ここで使用される場合、「分化する」又は「分化」とは、未分化状態から分化状態、未熟な状態から、あまり未熟でない状態、又は未熟な状態から成熟した状態へと、細胞が発育していくプロセスを称する。例えば、初期の未分化胚膵臓細胞は増殖し、Ｐｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、及びＰｔｆ１ａ等の特徴的マーカーを発現可能である。成熟又は分化した膵臓細胞は増殖せず、高レベルの膵臓内分泌ホルモンを分泌しない。幾つかの態様では、成熟又は分化した膵臓細胞は増殖せず、高レベルの膵臓内分泌ホルモン又は消化酵素を分泌しない。例えば完全に分化したベータ細胞は、グルコースに反応して、高レベルでインスリンを分泌する。細胞の相互作用及び成熟における変化は、細胞が未分化細胞のマーカーを失うか、又は分化した細胞のマーカーを獲得するために生じる。単一のマーカーの損失又は獲得は、細胞が「成熟又は分化した」ことを示す。単一のマーカーの損失又は獲得は、細胞が「成熟又は十分に分化した」ことを示す。「分化因子」なる用語は、インスリン生成ベータ細胞をも含む、成熟した内分泌細胞へのそれらの分化を高めるために、膵臓細胞に添加される化合物を称する。例示的な分化因子には、肝細胞増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、エキセンディン-４、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、神経成長因子、上皮増殖因子、血小板由来増殖因子、及びグルカゴン様ペプチド１が含まれる。幾つかの態様では、細胞分化は、一又は複数の分化因子を含有する培地において、細胞を培養することを含む。
【００５８】
膵臓内分泌系列に特徴的なマーカーは、Ｎｇｎ-３、ＮｅｕｒｏＤ、島-１、Ｐｄｘ１、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ２．２、ＭａｆＡ、ＭａｆＢ、Ａｒｘ、Ｂｒｎ４、Ｐａｘ-４及びＰａｘ-６、Ｇｌｕｔ２、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド(ＰＰ)及びグレリンからなる群から選択される。幾つかの態様では、膵臓内分泌細胞は、次のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、ＰＰ及びグレリンの少なくとも一を発現可能である。本発明での使用に適しているのは、膵臓内分泌系列に特徴的なマーカーの少なくとも一を発現可能な細胞である。本発明の幾つかの態様では、膵臓内分泌系列に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。また、膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。
【００５９】
本発明の幾つかの態様では、膵臓内分泌細胞はベータ細胞系列に特徴的なマーカーを発現する細胞である。ベータ細胞系列に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Ｐｄｘ１、及び次の転写因子：Ｎｇｎ-３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、ＩｓＩ-１、Ｈｎｆ-３ベータ、ＭａｆＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の少なくとも一を発現する。本発明の幾つかの態様では、ベータ細胞系列に特徴的なマーカーを発現する細胞はベータ細胞である。幾つかの態様では、膵臓内分泌細胞は、マーカーＮｋｘ６．１を発現する細胞である。幾つかの態様では、膵臓内分泌細胞はマーカーＰｄｘ１を発現する細胞である。本発明の幾つかの態様では、膵臓内分泌細胞はマーカーＮｋｘ６．１及びＰｄｘ１を発現する細胞である。
【００６０】
ここで使用される場合、「Ｐｄｘ１」とは、膵臓発育に係るホメオドメイン転写因子を称する。幾つかの態様では、ここで使用される場合、「Ｐａｘ-４」はベータ細胞に特異的な因子であり、ここで使用される場合、「Ｐａｘ-６」は膵島細胞(に特異的な)転写因子であり；双方とも、島発育に関連している。「Ｈｎｆ-ベータ」は、転写因子の肝臓の核内因子に属し、高度に保存されたＤＮＡ結合ドメインと２つの短いカルボキシ末端ドメインにより特徴付けられる。また、「Ｈｎｆ-３ベータ」は「ＦｏｘＡ２」としても公知である。ここで使用される場合、「ＮｅｕｒｏＤ」は、神経発生に係る塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス(ｂＨＬＨ)転写因子である。ここで使用される場合、「Ｎｇｎ-３」は、塩基ループ-ヘリックス-ループ転写因子のニューロゲンファミリーのメンバーである。ここで使用される場合、「Ｎｋｘ-２．２」及び「Ｎｋｘ-６．１」は、Ｎｋｘ転写因子ファミリーのメンバーである。ここで使用される場合、「島-１」又は「ＩｓＩ-１」は、転写因子のＬＩＭ／ホメオドメインファミリーのメンバーであり、発育している膵臓において発現する。ここで使用される場合、「ＭａｆＡ」は、膵臓で発現する転写因子であり、インスリンの生合成及び分泌に係る遺伝子の発現をコントロールする。
【００６１】
Ｎｋｘ６．１及びＰｄｘ１は、成人膵臓で見出される全ての細胞型(例えば、腺房、管、及び内分泌細胞)で発育可能な初期の膵臓多分化能性細胞において、Ｐｔｆ１ａと共に同時発現する。この細胞個体群において、Ｎｇｎ３を一時的に発現する細胞個体群が見出された。細胞がＮｇｎ３を発現又は発現していると、それは、後にランゲルハンス島を形成する、内分泌細胞(一つのタイプはインスリン生成ベータ細胞である)を生成する、内分泌系列の一部である。Ｎｇｎ３が存在しないと、膵臓発育中に、内分泌細胞は形成されない。発育進行時、Ｎｋｘ６．１及びＰｄｘ１は、今はＰｔｆ１ａ発現を欠く、膵臓のさらに中央のドメインにおいて同時発現し、Ｎｋｘ６．１及びＰｄｘ１陽性細胞は、もはや腺房細胞を生成できない。このＮｋｘ６．１及びＰｄｘ１陽性細胞個体群において、有意な数の細胞が、一過性にＮｇｎ３を同時発現し、発生の初期におけるように内分泌系列に対してそれらをマークする。
【００６２】
ＤＮＥＲ
ここで使用される場合、「ＤＮＥＲ」、「Ｄｎｅｒ」、「ＤＮＥＲタンパク質」又は「Ｄｄｒタンパク質」とは、ヒト及びマウスを含む、全ての哺乳類の形態のＤＮＥＲを意味する。幾つかの態様では、「ＤＮＥＲ」、「Ｄｎｅｒ」、「ＤＮＥＲタンパク質」又は「Ｄｄｒタンパク質」は、ＤＮＥＲの全ての脊椎動物の形態を意味する。ここで使用される場合、該用語は、全てが大文字で書かれている「ＤＮＥＲ」、又は最初の文字のみが大文字である「Ｄｎｅｒ」があってよく、ヒト及びマウスを含む任意の哺乳動物からの、ＤＮＥＲを意味する。ヒト形態は、「デルタ／ノッチ様ＥＧＦ繰り返し含有」として、例えば、「ベット」及び「ＵＮＱ２６」としても知られている。マウス形態は、「デルタ／ノッチ様ＥＧＦ関連レセプター」として、例えば、「ＢＥＴ」、「Ｂｒｅｔ」、「ＭＧＣ３９０５９」、及び「Ａ９３００２６Ｄ１９Ｒｉｋ」としても知られている。ＤＮＥＲはＣ末端に単一の膜透過膜ドメインを含み、推定細胞表面タンパク質と推定されている。それはその細胞外ドメインに幾つかのＥＧＦ様繰り返しを含み、その細胞質カルボキシ末端ドメインは、チロシンベースの選別モチーフを含む。ヒトとマウスの両者において、それは７３７アミノ酸長であり、マウスとヒトの類似性は９０％である。一のファミリーメンバーがマウスにおいて同定されている。ＤＮＥＲはマウス小脳におけるバーグマングリアの細胞形態形成におけるノッチリガンドとして機能する。ＤＮＥＲはノッチ１に細胞−細胞接触部位に結合し、インビトロにおけるノッチシグナルを活性化する。
【００６３】
ヒト及びマウスＤＮＥＲのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号：１及び配列番号：２に示す。ＤＮＥＲのアミノ酸配列は、マウス及びヒトの両者において、７３７アミノ酸である。幾つかの態様では、本発明に記載のＤＮＥＲは配列番号：１である。幾つかの態様では、本発明に記載のＤＮＥＲは配列番号：２である。
【００６４】
幾つかの態様では、「ＤＮＥＲタンパク質」なる用語は、８０、８５、９０、９２、９４パーセント同一性のような、７０のタンパク質を含む。幾つかの態様では、用語ＤＮＥＲタンパク質は、９５、例えば９６、９７、９８又は９９パーセント同一のタンパク質を含む。幾つかの態様では、タンパク質のヒト又はマウス形態に関連して決定され得る。パーセント同一性は、２つの配列を整列させ、整列した同一残基の数から異なる残基の数を引き、さらに長い配列の全残基数で割り、１００を掛けることで決定される。
【００６５】
ここで使用される場合、「ヒトＤＮＥＲタンパク質」は、位置２ｑ３６．３又は２２９．９３−２３０．２９Ｍｂの染色体２において、自然に生じる。ヒトＤＮＥＲタンパク質は、ＧｅｎＰｅｐｔ受託番号ＮＰ＿６２０７１１．２を有する。
【００６６】
ここで使用される「マウスＤｎｅｒタンパク質」は、位置１Ｃ５又は８４．２５−８４．５８Ｍｂの染色体１において自然に生じる。マウスＤｎｅｒタンパク質は、ＧｅｎＰｅｐｔ受託番号ＮＰ＿６９０８７９．１を有する。
【００６７】
ここで使用される用語「ＤＤＲ１結合試薬」とは、ＤＮＥＲタンパク質、又は前記タンパク質に共有結合する分子に特異的に結合する化合物、例えば抗体、その抗体フラグメント、分子から誘導された合成抗体、特定のタンパク質に結合する抗体(例えば、合成分子は、ｓｃＦＶ、多重特異性抗体等であってよい)からのＣＤＲを含むもの、レクチン、デルタノッチファミリーの相互作用パートナー及び小分子又はそのフラグメントを称する。
【００６８】
幾つかの態様では、結合試薬はＤＮＥＲタンパク質に特異的に結合する抗体である。幾つかの態様では、結合試薬は、ＤＮＥＲタンパク質に転写後結合する、天然の炭水化物に特異的に結合する抗体である。ここで実施例１に示すように、炭水化物は、ＤＮＥＲアミノ酸配列の幾つかの特定部位に出現しやすいようである。幾つかの態様では、結合試薬は、ＤＮＥＲタンパク質に結合する天然の炭水化物構造体に特異的に結合するレクチンである。幾つかの態様では、結合試薬は、ＤＮＥＲタンパク質のリガンドである。幾つかの実施態様では、ＤＮＥＲのリガンドは、ノッチ−１、−２、−３、及び／又は−４の細胞外ドメインからなる群から選択される。幾つかの態様では、結合試薬は、細胞膜の細胞外又は細胞内側において、ＤＮＥＲタンパク質と相互作用する、無毒の蛍光標識された分子である。「ＤＮＥＲに結合するオリゴ糖」は、ＤＮＥＲタンパク質に共有結合する多糖類分子である。幾つかの実施態様では、オリゴ糖はグリシン（Ｇ）残基を介して結合している。幾つかの実施態様では、オリゴ糖はアスパラギン（Ｎ）残基を介して結合している。幾つかの実施態様では、オリゴ糖はスレオニン（Ｔ）残基を介して結合している。用語「レクチン」は、特定の炭水化物分子を認識するタンパク質を称する。幾つかの態様では、炭水化物は、ＤＮＥＲタンパク質分子に結合するオリゴ糖の全て又は一部である。「リガンド」は、タンパク質により特異的に結合する分子である。また、該用語は、タンパク質に結合する分子、例えばタンパク質に特異的に結合する抗体も含む。幾つかのの態様において、リガンドは、タンパク質に共有結合する分子、例えば炭水化物又はオリゴ糖に結合する。
【００６９】
幾つかの態様では、結合試薬は、ＤＮＥＲタンパク質に特異的に結合する抗体である。また、用語「ＤＮＥＲ結合試薬」は、ＤＮＥＲタンパク質により特異的に結合する化合物、例えばノッチ−１、−２、及び／又は−４の細胞外ドメインが特異的に結合する化合物を含む。用語「結合試薬」は、自然に発生する抗体及びそのフラグメント、並びにいくつかの種の成分からなるキメラ抗体、さらには完全に合成された抗体様分子、例えばｓｃＦＶ、及び抗体との結合特異性を有する他の合成分子を含む(自然に生じるＣＤＲ配列を含む結果として)。
【００７０】
結合試薬は、細胞表面マーカーとして特定のタンパク質を発現する細胞を同定又は選択するために使用される。例えば、ＤＮＥＲ結合試薬は、細胞表面マーカーとしてＤＮＥＲタンパク質を発現する細胞を同定又は選択するために使用される。
【００７１】
「細胞表面マーカーとして」ＤＮＥＲタンパク質を「示す」細胞は、ここに記載の特定のタンパク質に特異的に結合する試薬、及び方法、例えばＦＡＣＳ、免疫細胞化学、免疫吸着、及びパニングを使用し、細胞個体群から細胞を選択又は取り出し可能な、細胞表面に十分な量の特定のタンパク質を示す細胞である。幾つかの態様では、本方法はＭＡＣＳである。幾つかの態様では、ＤＮＥＲ抗体は、「細胞表面マーカーとしてＤＮＥＲを示す」細胞を選択するのに使用される。
【００７２】
一態様において、ＤＮＥＲ結合試薬は、蛍光染料、例えばＰＥ、ｃｙ２、ｃｙ３、ｃｙ５、又はＡｌｅｘａ４８８から選択されるもので標識される。幾つかの態様では、ＤＮＥＲ結合試薬は、ハプテン、例えばＤＩＧ、ビオチン、エピトープ、例えばＦＬＡＧ、ＨＡ、又はＭｙｃで標識される。
【００７３】
幾つかの態様では、一又は複数の付加的な結合試薬をＤＮＥＲ結合試薬と組み合わせて同時又は連続的に使用し得る。幾つかの態様では、付加的な結合試薬はＤＮＥＲ結合試薬として分析の同じ工程に使用され得る。幾つかの態様では、付加的な結合試薬は、ＤＤＲ１タンパク質、プロミニン１（ＣＤ１３３としても知られる）、及びＣＤ４９ｆからなる群から選択される。例えば、Sugiyama等(2007), PNAS 140(1): 175-180を参照されたい。幾つかの態様では、付加的な結合試薬はＤＤＲ１である。
【００７４】
ＤＤＲ１
ここで使用される場合、「ＤＤＲ１タンパク質」又は「Ｄｄｒ１タンパク質」とは、ＤＤＲ／ＴＫＴ型タンパク質キナーゼ、ジスコイジンドメインレセプターファミリー、メンバー１を称する。ここで使用される場合、本用語は、全てが大文字で書かれている「ＤＤＲ１」、又は最初の文字のみが大文字である「Ｄｄｒ１」があってよく、ヒト及びマウスを含む任意の哺乳動物からの、ジスコイジンドメインレセプターファミリー、メンバー１を意味する。幾つかの態様では、「ＤＤＲ１タンパク質」、「Ｄｄｒ１タンパク質」、「ＤＤＲ１」又は「Ｄｄｒ１」は、ＤＤＲ１の全ての脊椎動物の形態を意味する。ＤＤＲ１はＩ型からＩＶ型までを含む、色々なタイプのコラーゲンにより活性化される。ＤＤＲ１タンパク質にコラーゲンが結合すると自己リン酸化し、チロシンキナーゼの活性化が遅延化するが、持続的になる。ＤＤＲ１は細胞対細胞の相互作用、又は認識においても機能する。８７６、９１３及び９１９アミノ酸の異なるタンパク質アイソフォームに帰する、少なくとも３つのｍＲＮＡ変異体が、ヒトにおいては報告されている。マウスには２つのアイソフォーム、それぞれ８７４及び９１１アミノ酸が報告されている。ＤＤＲ１タンパク質は、ヒトの乳房、卵巣、食道、及び小児脳腫瘍で過剰発現することが示されている。タンパク質は細胞内レセプターチロシンキナーゼ活性を有し、種々のタイプのコラーゲンにより活性化される。その自己リン酸化は、今までテストされた全てのコラーゲン(Ｉ型からＶＩ及びＸＩ型)でなされている。
【００７５】
マウス及びヒトＤＤＲ１のアミノ酸配列を配列番号：３から配列番号：７にそれぞれ示す。
配列番号  由来      型
３        ヒト      ＤＤＲ１アイソフォーム  ａ
４        ヒト      ＤＤＲ１アイソフォーム  ｂ
５        ヒト      ＤＤＲ１アイソフォーム  ｃ
６        マウス    ＤＤＲ１アイソフォーム  １
７        マウス    ＤＤＲ１アイソフォーム  ２
【００７６】
幾つかの態様では、本発明に記載のＤＤＲ１は、配列番号：３である。幾つかの態様では、本発明に記載のＤＤＲ１は、配列番号：４である。幾つかの態様では、本発明に記載のＤＤＲ１は、配列番号：５である。幾つかの態様では、本発明に記載のＤＤＲ１は、配列番号：６である。幾つかの態様では、本発明に記載のＤＤＲ１は、配列番号：７である。
【００７７】
幾つかの態様では、用語「ＤＤＲ１タンパク質」は、７０、例えば８０、８５、９０、９２、９４パーセント同一のタンパク質を含む。幾つかの態様では、用語  ＤＤＲ１タンパク質は、９５、例えば９６、９７、９８又は９９パーセント同一のタンパク質を含む。パーセント同一性は、２つの配列を整列させ、整列した同一残基の数から異なる残基の数を引き、さらに長い配列の全残基数で割り、１００を掛けることで決定される。
【００７８】
ここで使用される場合、「ヒトＤＤＲ１タンパク質」は、位置３０．９９-３１．０１Ｍｂの染色体ｃ６＿ＣＯＸ＿、又は位置６ｐ２１．３の染色体６において、自然に生じる。ヒトＤＤＲ１タンパク質アイソフォームａは、ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿０５４６９９．２を有する。ヒトＤＤＲ１タンパク質アイソフォームｂは、ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿００１９４５．３を有する。ヒトＤＤＲ１タンパク質アイソフォームｃは、ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿０５４７００．２を有する。
【００７９】
ここで使用される場合、「マウスＤｄｒ１タンパク質」は、位置３５．２９-３５．３１Ｍｂ又は１７Ｃ；１７ ２１．５ｃＭの染色体１７において自然に生じる。マウスＤＤＲ１タンパク質アイソフォーム１は、ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿０３１６１０．２を有する。マウスＤＤＲ１タンパク質アイソフォーム２は、ＧｅｎＰｅｐｔ受入番号ＮＰ＿７６６５５０．１を有する。
【００８０】
用語「アイソフォーム」及び「アイソタイプ」は、ここでは交換可能に使用され、例えば単一のヌクレオチド多型を故に、形成された同じタンパク質の異なる形態を称し、ここで異なる形態のタンパク質は、関連遺伝子から生成されてもよいし、スプライシングにより同じ遺伝子から生じたものであってもよい。
【００８１】
ここで使用される場合、用語「ＤＤＲ１結合試薬」とは、ＤＤＲ１タンパク質、又はＤＤＲ１タンパク質に共有結合する分子に特異的に結合する化合物、例えば抗体、その抗体フラグメント、分子から誘導された合成抗体、ＤＤＲ１結合抗体(例えば、合成分子は、ｓｃＦＶ、多重特異性抗体等であってよい)からのＣＤＲを含むもの、レクチン、及びコラーゲンタイプ又はそのフラグメントを称する。
【００８２】
幾つかの態様では、ＤＤＲ１結合試薬は、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体である。幾つかの態様では、ＤＤＲ１結合試薬は、ＤＤＲ１タンパク質に転写後結合する、天然の炭水化物に特異的に結合する抗体であり；実施例１に示すように、炭水化物は、ＤＤＲ１アミノ酸配列の多くの特定部位に出現しやすいようである。幾つかの態様では、ＤＤＲ１結合試薬は、ＤＤＲ１タンパク質に結合する天然の炭水化物構造体に特異的に結合するレクチンである。幾つかの態様では、ＤＤＲ１結合試薬は、ＤＤＲ１タンパク質のリガンドである。幾つかの実施態様において、リガンドは、コラーゲンＩ-ＸＩ、トランスサイレチン、膜貫通４サブファミリー、メンバー１(ＴＭ４ＳＦ１)からなる群から選択される。幾つかの態様では、ＤＤＲ１結合試薬は、細胞膜の細胞外又は細胞内側において、ＤＤＲ１と相互作用する、無毒の蛍光標識された分子である。「ＤＤＲ１に結合するオリゴ糖」は、ＤＤＲ１タンパク質に共有結合する多糖類分子である。幾つかの態様では、オリゴ糖はアスパラギン残基を介して結合している。用語「レクチン」は、特定の炭水化物分子を認識するタンパク質を称する。幾つかの態様では、炭水化物は、ＤＤＲ１タンパク質分子に結合するオリゴ糖の全て又は一部である。「リガンド」は、タンパク質により特異的に結合する分子である。また、本用語は、タンパク質に結合する分子、例えばタンパク質に特異的に結合する抗体も含む。幾つかの態様では、リガンドは、タンパク質に共有結合する分子、例えば炭水化物又はオリゴ糖に結合する。
【００８３】
幾つかの実施態様において、ＤＤＲ１結合試薬は、ＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体である。また、用語「ＤＤＲ１結合試薬」は、ＤＤＲ１タンパク質により特異的に結合する化合物、例えばコラーゲン及びコラーゲンフラグメントを含む。本用語は、抗体及びそのフラグメント、並びに幾つかの種の成分からなるキメラ抗体、さらには完全に合成された抗体様分子、例えばｓｃＦＶ、及び抗体との結合特異性を有する他の合成分子を含む(自然に生じるＣＤＲ配列を含む結果として)。
【００８４】
ＤＤＲ１結合試薬は、細胞表面マーカーとして、ＤＤＲ１タンパク質を発現する細胞の同定又は選択に使用される。
【００８５】
「細胞表面マーカーとしてＤＤＲ１を示す」細胞は、ここに記載のＤＤＲ１に特異的に結合する試薬、及び方法、例えばＦＡＣＳ、免疫細胞化学、免疫吸着、及びパニングを使用し、細胞個体群から細胞を選択又は取り出し可能な、細胞表面に十分な量のＤＤＲ１を示す細胞である。幾つかの態様では、本方法はＭＡＣＳである。幾つかの実施態様において、ＤＤＲ１抗体は、「細胞表面マーカーとしてＤＤＲ１を示す」細胞を選択するのに使用される。
【００８６】
一態様において、ＤＤＲ１結合試薬は、蛍光染料、例えばＰＥ、ｃｙ２、ｃｙ３、ｃｙ５、又はＡｌｅｘａ４８８から選択されるもので標識される。他の態様において、ＤＤＲ１結合試薬は、ハプテン、例えばＤＩＧ、ビオチン、エピトープ、例えばＦＬＡＧ、ＨＡ、又はＭｙｃで標識される。
【００８７】
ＤＤＲ１とＤＤＲ１結合試薬とその使用に関する更なる態様は、出典明示によりここに取り込まれるＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０６１に記載される。
【００８８】
更なる細胞外マーカー
ここで使用される場合、「ＤＩＳＰ２」、「Ｄｉｓｐ２」、「ＤＩＳＰ２タンパク質」、「Ｄｉｓｐ２タンパク質」は、Ｎｇｎ３発現が起きる後に主として見出される内分泌系の細胞外マーカーであり、ベータ細胞を含む完全に成熟した膵臓内分泌細胞中に残るタンパク質を意味する。しかし、幾つかの細胞はＤＩＳＰ２及びＮｇｎ３を共発現することが見出される。ここで使用される場合、該用語は、全てが大文字で書かれている「ＤＩＳＰ２」、又は最初の文字のみが大文字である「Ｄｉｓｐ２」があってよく、哺乳類、ヒト及びマウスを含む任意の脊椎動物からのＤＩＳＰ２を意味する。Ｄｉｓｐ２は、「ｄｉｓｐａｔｈｃｅｄ Ｂ」又は「ｄｉｓｐａｔｃｈｅｄホモログ２」としても知られている。Ｄｉｓｐ２は、ヒトにおいてＧｅｎＰｅｐｔ参照番号ＮＰ＿２７７０４５及びマウスにおいてＮＰ＿７３３４８１を有する。Ｄｉｓｐ２タンパク質をコードする遺伝子は、ヒトにおいて、ＧｅｎｅＩＤ番号８５４５５及びマウスにおいて２１４２４０を有する。
【００８９】
ここで使用される場合、「ＳＥＺ６Ｌ２」、「Ｓｅｚ６ｌ２」、「ＳＥＺ６Ｌ２タンパク質」、「Ｓｅｚ６ｌ２タンパク質」は、Ｎｇｎ３発現が起きる後に主として見出される内分泌系の細胞外マーカーであり、ベータ細胞を含む完全に成熟した膵臓内分泌細胞中に残るタンパク質を意味する。しかし、幾つかの細胞はＳＥＺ６Ｌ２及びＮｇｎ３を共発現することが見出される。ここで使用される場合、該用語は、全てが大文字で書かれている「ＳＥＺ６Ｌ２」、又は最初の文字のみが大文字である「Ｓｅｚ６ｌ２」があってよく、哺乳類、ヒト及びマウスを含む任意の脊椎動物からのＳＥＺ６Ｌ２を意味する。Ｓｅｚ６ｌ２は、「発作関連６ホモログ様２」又は「発作関連６ホモログ（マウス）様２」としても知られている。ヒトにおいて２個のＳｅｚ６ｌ２のアイソフォームが見出され、Ｓｅｚ６ｌ２のアイソフォーム１は、ＧｅｎＰｅｐｔ参照番号ＮＰ＿０３６５４２を有し、Ｓｅｚ６ｌ２のアイソフォーム２は、ＧｅｎＰｅｐｔ参照番号ＮＰ＿９６３８６９を有する。Ｓｅｚ６ｌ２は、マウスにおいてＧｅｎＰｅｐｔ参照番号ＮＰ＿６５９１７５を有する。Ｓｅｚ６ｌ２は、マウスにおいてＧｅｎＰｅｐｔ参照番号ＮＰ＿６５９１７５を有する。Ｓｅｚ６ｌ２タンパク質をコードする遺伝子は、ヒトにおいて、ＧｅｎｅＩＤ番号２６４７０及びマウスにおいて２３３８７８を有する。
【００９０】
ここで使用される場合、「ＬＲＰ１１」、「Ｌｒｐ１１」、「ＬＲＰ１１タンパク質」又は「Ｌｒｐ１１タンパク質」は、Ｎｇｎ３発現が起きる後に主として見出される内分泌系の細胞外マーカーであり、ベータ細胞を含む完全に成熟した膵臓内分泌細胞中に残るタンパク質を意味する。しかし、幾つかの細胞はＬＲＰ１１及びＮｇｎ３を共発現することが見出される。ここで使用される場合、該用語は、全てが大文字で書かれている「ＬＲＰ１１」、又は最初の文字のみが大文字である「Ｌｒｐ１１」があってよく、哺乳類、ヒト及びマウスを含む任意の脊椎動物からのＬＲＰ１１を意味する。Ｌｒｐ１１は、「低密度リポタンパク質レセプター関連タンパク質１１」としても知られている。Ｌｒｐ１１は、ヒトにおいてＧｅｎＰｅｐｔ参照番号ＮＰ＿１１６２２１を、マウスにおいてＮＰ＿７６６３７２を有する。Ｌｒｐ１１タンパク質をコードする遺伝子は、ヒトにおいて、ＧｅｎｅＩＤ番号８４９１８及びマウスにおいて２３７２５３を有する。
【００９１】
ここで使用される場合、「ＳＬＣ３０Ａ８」、「Ｓｌｃ３０ａ８」、「ＳＬＣ３０Ａ８タンパク質」又は「Ｓｌｃ３０ａ８タンパク質」は、Ｎｇｎ３発現が起きる後に主として見出される内分泌系の細胞外マーカーであり、ベータ細胞を含む完全に成熟した膵臓内分泌細胞中に残るタンパク質を意味する。ここで使用される場合、該用語は、全てが大文字で書かれている「ＳＬＣ３０Ａ８」、又は最初の文字のみが大文字である「Ｓｌｃ３０ａ８」があってよく、哺乳類、ヒト及びマウスを含む任意の脊椎動物からのＳＬＣ３０Ａ８を意味する。Ｓｌｃ３０ａ８は、「溶質輸送ファミリー３０（亜鉛トランスポーター）、メンバー８」又は「溶質輸送ファミリー３０メンバー８」としても知られている。Ｓｌｃ３０ａ８は、ヒトにおいてＧｅｎＰｅｐｔ参照番号ＮＰ＿７７６２５０を、マウスにおいてＮＰ＿７６６４０４を有する。Ｓｌｃ３０ａ８タンパク質をコードする遺伝子は、ヒトにおいて、ＧｅｎｅＩＤ番号１６９０２６及びマウスにおいて２３９４３６を有する。
【００９２】
幾つかの態様では、用語ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８は、７０、例えば８０、８５、９０、９２、９４パーセント同一のタンパク質を含む。幾つかの態様では、用語ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８は、９５、例えば９６、９７、９８又は９９パーセント同一のタンパク質を含む。幾つかの態様では、パーセント同一性は、タンパク質のヒト又はマウスの形態に関連して決定される。パーセント同一性は、２つの配列を整列させ、整列した同一残基の数から異なる残基の数を引き、さらに長い配列の全残基数で割り、１００を掛けることで決定される。
【００９３】
ここで使用される場合、用語「ＤＩＳＰ２結合試薬」、「ＳＥＺ６Ｌ２結合試薬」、「ＬＲＰ１１結合試薬」又は「ＳＬＣ３０Ａ８結合試薬」とは、それぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質に特異的に結合する化合物、又はそれぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質に共有結合する分子、例えば抗体、その抗体フラグメント、分子から誘導された合成抗体、それぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８結合抗体(例えば、合成分子は、ｓｃＦＶ、多重特異性抗体等であってよい)からのＣＤＲを含むもの、レクチン、及び小分子又はそのフラグメントを称する。
【００９４】
幾つかの態様では、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬は、それぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質に特異的に結合する抗体である。幾つかの態様では、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬は、それぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質に転写後結合する、天然の炭水化物に特異的に結合する抗体である。幾つかの態様では、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬は、それぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質に結合する天然の炭水化物構造体に特異的に結合するレクチンである。幾つかの態様では、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬は、それぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質のリガンドである。幾つかの態様では、リガンドは、コラーゲンＩ-ＸＩ、トランスサイレチン、膜貫通４サブファミリー、メンバー１(ＴＭ４ＳＦ１)からなる群から選択される。幾つかの態様では、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬は、細胞膜の細胞外又は細胞内側において、それぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８と相互作用する、無毒の蛍光標識された分子である。「ＤＩＳＰ２に結合するオリゴ糖」、「ＳＥＺ６Ｌ２に結合するオリゴ糖」、「ＬＲＰ１１に結合するオリゴ糖」又は「ＳＬＣ３０Ａ８に結合するオリゴ糖」は、それぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質に共有結合する多糖類分子である。幾つかの態様では、オリゴ糖はアスパラギン残基を介して結合している。用語「レクチン」は、特定の炭水化物分子を認識するタンパク質を称する。幾つかの態様では、炭水化物は、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質分子に結合するオリゴ糖の全て又は一部である。「リガンド」は、タンパク質により特異的に結合する分子である。また、該用語は、タンパク質に結合する分子、例えばタンパク質に特異的に結合する抗体も含む。幾つかの態様では、リガンドは、タンパク質に共有結合する分子、例えば炭水化物又はオリゴ糖に結合する。
【００９５】
幾つかの実施態様において、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬は、それぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質に特異的に結合する抗体である。また、用語「ＤＩＳＰ２結合試薬」、「ＳＥＺ６Ｌ２結合試薬」、「ＬＲＰ１１結合試薬」又は「ＳＬＣ３０Ａ８結合試薬」は、それぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質により特異的に結合する化合物、例えばコラーゲン及びコラーゲンフラグメントを含む。該用語は、抗体及びそのフラグメント、並びに幾つかの種の成分からなるキメラ抗体、さらには完全に合成された抗体様分子、例えばｓｃＦＶ、及び抗体との結合特異性を有する他の合成分子を含む(自然に生じるＣＤＲ配列を含む結果として)。
【００９６】
ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬は、細胞表面マーカーとして、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質を発現する細胞の同定又は選択に使用される。
【００９７】
「細胞表面マーカーとしてＤＩＳＰ２を示す」、「細胞表面マーカーとしてＳＥＺ６Ｌ２を示す」、「細胞表面マーカーとしてＬＲＰ１１を示す」、「細胞表面マーカーとしてＳＬＣ３０Ａ８を示す」細胞は、ここに記載の、それぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８に特異的に結合する試薬、及び方法、例えばＦＡＣＳ、免疫細胞化学、免疫吸着、及びパニングを使用し、細胞個体群から細胞を選択又は取り出し可能な、細胞表面に十分な量のそれぞれ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８を示す細胞である。幾つかの態様では、本方法はＭＡＣＳである。幾つかの実施態様において、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８抗体は、それぞれ、「細胞表面マーカーとしてＤＩＳＰ２を示す」、「細胞表面マーカーとしてＳＥＺ６Ｌ２を示す」、「細胞表面マーカーとしてＬＲＰ１１を示す」、「細胞表面マーカーとしてＳＬＣ３０Ａ８を示す」細胞を選択するのに使用される。
【００９８】
幾つかの態様では、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬は、蛍光染料、例えばＰＥ、ｃｙ２、ｃｙ３、ｃｙ５、又はＡｌｅｘａ４８８から選択されるもので標識される。他の態様において、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬は、ハプテン、例えばＤＩＧ、ビオチン、エピトープ、例えばＦＬＡＧ、ＨＡ、又はＭｙｃで標識される。
【００９９】
幾つかの態様では、一又は複数のＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８からなる群から選択されるマーカーが、ＤＮＥＲと組み合わせて本発明の方法において使用され得る。幾つかの態様では、一又は複数のＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８からなる群から選択される結合試薬が、ＤＮＥＲ結合試薬と組み合わせて本発明の方法において使用され得る。
【０１００】
幾つかの態様では、一又は複数のＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８からなる群から選択されるマーカーが、ＤＮＥＲの代わりに本発明の方法において使用され得る。幾つかの態様では、一又は複数のＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８からなる群から選択される結合試薬が、ＤＮＥＲ結合試薬の代わりに本発明の方法において使用され得る。
【０１０１】
幾つかの態様では、一又は複数のＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８からなる群から選択されるマーカーが、ＤＮＥＲの代わりにＤＤＲ１と組み合わせて本発明の方法において使用され得る。幾つかの態様では、一又は複数のＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８からなる群から選択される結合試薬が、ＤＮＥＲ結合試薬の代わりにＤＤＲ１結合試薬と組み合わせて本発明の方法において使用され得る。  
【０１０２】
同定方法
幾つかの態様では、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞を同定する方法に関し、該方法は、膵臓細胞を含む細胞個体群とＤＮＥＲ結合試薬とを接触させることを含む。幾つかの態様では、ＤＮＥＲ結合試薬に結合する細胞、すなわちＤＮＥＲ陽性細胞の数／比率が測定されてよい。幾つかの態様では、本発明は、内分泌前駆体細胞を同定する方法に関し、該方法は、膵臓細胞を含む細胞個体群とＤＮＥＲ結合試薬とを接触させることを含む。幾つかの態様では、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を同定する方法に関し、該方法は、膵臓細胞を含む細胞個体群とＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬とを接触させることを含む。幾つかの態様では、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬に結合する細胞、すなわちＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞の数／比率が測定されてよい。幾つかの態様では、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞を同定する方法に関し、該方法は、膵臓細胞を含む細胞個体群とＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬とを接触させることを含む。幾つかの態様では、本発明は、内分泌前駆体細胞を同定する方法に関し、該方法は、膵臓細胞を含む細胞個体群とＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬とを接触させることを含む。
【０１０３】
幾つかの態様では、本発明は、ａ）細胞とＤＮＥＲ結合試薬とを接触させ；ｂ）細胞表面マーカーとしてＤＮＥＲを示す細胞(ＤＮＥＲ陽性細胞)の量を測定することによる、膵臓細胞を含むＤＮＥＲ陽性細胞を定量する方法に関する。幾つかの態様では、本発明は、ａ）細胞とＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬とを接触させ；ｂ）細胞表面マーカーとしてＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８を示す細胞(ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞)の量を決定することによる、膵臓細胞を含むＤＮＥＲ陽性細胞を定量する方法に関する。
【０１０４】
当業者であれば、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及び／又はＤＤＲ１タンパク質を検出するための多くの方法があることを認識しているであろう。例えば、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及び／又はＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体を、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及び／又はＤＤＲ１の検出に使用することができる。ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及び／又はＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体は、当業者に公知であり、例えば、R&;D Systems、Research Diagnostics, Inc； Abcam；Ancell Immunology Research Products；eBioscience；アイオワ大学のハイブリドーマバンク；及びZymed Laboratories, Inc.、Abnova Corporation、-Affinity BioReagents BioLegend、GeneTex Lifespan Biosciences、MBL International Novus Biologicals、Proteintech Group, Inc、Santa Cruz Biotechnology, Incから商業的に入手可能である。ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及び／又はＤＤＲ１の細胞外部分を認識する抗体は、細胞を選別するために、本発明で使用されてよい。幾つかの態様では、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及び／又はＤＤＲ１の細胞外部分の種々のエピトープを認識する種々の抗体は、単独で又は組合せて使用されてよい。細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインにおける、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及び／又はＤＤＲ１の任意の部分を認識可能な任意のＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及び／又はＤＤＲ１結合試薬が、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及び／又はＤＤＲ１の発現をモニターするのに使用可能である。幾つかの態様では、当業者であれば、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及び／又はＤＤＲ１タンパク質の検出に関する上述した記載が、本発明のマーカーとして使用されると考えられる他の細胞外タンパク質にも適用されるであろうと、自覚している。
【０１０５】
多くの異なる蛍光分子、例えばフルオレセイン、ｃｙ２、ｃｙ３、ｃｙ５、ＰＥ、Ａｌｅｘａ４８８、又はローダミンが、抗体とのコンジュゲートに利用される。当業者であれば、いくつかの例において、１以上の細胞外マーカーが、蛍光分子にコンジュゲートする種々の抗体を使用することにより検出可能であることを承知している。ＦＡＣＳ分析は、関心ある１以上の胞外マーカーを同定する条件下で、実施することができる。
【０１０６】
「抗体」又は「抗体群」は、抗原に特異的に結合し、認識する、免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントからのフレームワーク領域を有するポリペプチドを意味する。抗体(免疫グロブリンとしても公知)は、脊椎動物の血液又は他の体液に見出され、細菌又はウイルス等の、外来体を同定し、中和する免疫システムに使用されるタンパク質である。全ての抗体の一般的構造はかなり類似しているが、タンパク質の先端の小さな領域は、極めて多様であり、わずかに異なる先端構造を有する数百万の抗体の存在が可能になる。この領域は高頻度可変領域として知られている。これらの各変異体は、抗原として公知の種々の標的に結合可能である。この非常に多様な抗体により、等しく多様な抗原を認識する免疫系が可能となる。抗体により認識される、抗原の唯一の部分は、エピトープと称される。これらのエピトープは、高度に特異的な相互作用において、それらの抗体と結合し、いわゆる誘導適合、抗体は、生物体を構成する数百万の種々の分子の中から、唯一特定の抗原を同定し、結合することができるようになる。
【０１０７】
培養された、又は単離された細胞における、タンパク質及び／又はｍＲＮＡのような核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術で標準的なものであり、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(ＲＴ-ＰＣＲ)、ノーザンブロット法、及びインサイツハイブリダイゼーション(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら編、補足)を参照)、及びイムノアッセイ、例えば切片物質の免疫組織化学分析、ウエスタンブロット法、、及び無傷抗体で使用しやすいマーカーについては、フローサイトメトリー分析(ＦＡＣＳ)(例えば、Harlow及びLane, Using Antibodies : A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)を参照）が含まれる。また、内分泌細胞分化の、従来からの組織化学マーカーを使用してもよい。免疫組織化学により研究される細胞は、顕微鏡検査用のガラスチャンバースライドにおいて培養されてよい。また、従来からの組織培養で増殖した細胞は、培養体から手動で取り出され、切片化用にパラフィンに包埋されてよい。また、従来からの組織培養で増殖した細胞は、手動で、酵素的に、又は酵素を含有しない細胞解離バッファーを使用して、培養体から取り出され、切片化用にパラフィン又はTissueTechに包埋されるか、包埋の前に、媒体において再度インキュベートされてもよい。細胞分化マーカーは多様であり、従来からの免疫組織化学で検出することができる。一般的に適用されるプロトコルは以下の通りである。
【０１０８】
いくつかの態様において、チャンバースライド内の細胞を、ＰＢＳを用いて、非常に優しくすすぎ、４％のパラホルムアルデヒド溶液において、４５分、固定する。ついで、細胞をＰＢＳですすぎ、使用するまで、＋５で保管する。使用する日、細胞を、等級付けされたシリーズのエタノール(７０％から開始して、９６％、ついで９９％、ついで再度９９％、ついで９６％、最後に７０％、各濃度で５分のインキュベートを使用)に浸透させ、ついで室温にて、ＴＮＢ(Perkin ElmerからのＴＳＡ(チラミド(Tyramide)シグナル増幅)キット又は正常な血清を含有するブロックバッファーにおいてインキュベートする。一次抗体を適切な希釈度に調製し、細胞に添加し、保湿チャンバー内で、室温(ＲＴ)にて一晩(Ｏ／Ｎ)インキュベートする。一次抗体のインキュベートに続き、細胞をＰＢＳですすぐ。適切な希釈度に調製された蛍光二次抗体を細胞に添加し、暗所でインキュベートする。細胞核を対比染色するために、二次抗体と共にＤＡＰＩ染料をインキュベートしてもよい。ついで、細胞をすすぎ、過度の流体を除去し、スライドのチャンバー部分を取り除き、スライドにカバーガラスを載せる。スライドを乾燥させ、蛍光顕微鏡、例えば共焦点顕微鏡を使用する研究まで、暗所で保管する。いくつかの態様では、染色方法は、スライドのチャンバー部分を取り除いてから始められる。バッファーを用いて、細胞を非常に優しくすすぎ、パラホルムアルデヒド溶液において固定する。ついで、細胞を、室温にて、正常な血清を含有するブロック溶液においてインキュベートする。ブロック溶液において、非イオン性の洗浄剤を用い、細胞を浸透させる。一次抗体を適切な希釈度に調製し、細胞に添加し、インキュベートする。一次抗体のインキュベートに続き、細胞をバッファーですすぐ。適切な希釈度に調製された二次抗体を細胞に添加し、暗所でインキュベートする。インキュベートの後、細胞をすすぎ、Hoechst染料を使用して、核を対比染色する。過度の流体を除去し、スライドを搭載し、カバースライドで覆う。別法として、過度の流体を除去し、スライドを搭載し、カバーガラスで覆う。スライドを乾燥させ、暗所で保管する。  
【０１０９】
また、ＨＲＰ法を使用し、細胞を、免疫細胞化学用に調製することもできる。簡単には、細胞をパラフィンに包埋し、パラフィン切片とスライドを、３７℃で一晩、乾燥させるものである。細胞を脱パラフィンし、過酸化水素水に浸漬し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害する。０．０１Ｍのクエン酸バッファー(ｐＨ６．０)で１５分、スライドを加熱し、所定のエピトープを回復させる。スライドをバッファーで洗浄し、保湿チャンバー内で、室温にて、正常な血清を使用してブロックする。
【０１１０】
いくつかの態様においては、一次抗体をサンプルに添加し、保湿チャンバー内でインキュベートする。スライドを洗浄し、ビオチン-二次抗体と共にインキュベートする。スライドをバッファーで再度すすぎ、アビジン-ＨＲＰと共にインキュベートする。スライドを再度すすぎ、ＴＳＡ試薬と共にインキュベートし、一次抗体を可視化する。いくつかの態様において、ＴＳＡは、チラミドシグナル増幅の略語である。スライドを表示用に搭載する。
【０１１１】
また、ＨＲＰ(西洋ワサビペルオキシダーゼ)法を使用し、細胞を、免疫細胞化学用に調製することもできる。二次抗体として、ビオチン結合したものを使用する。ついで、スライドをＰＢＳですすぎ、アビジン-ＨＲＰと共にインキュベートする。スライドを再度すすぎ、ＴＳＡ試薬と共にインキュベートし、一次抗体を可視化する。蛍光顕微鏡、例えば共焦点顕微鏡を使用し、スライドを視覚的研究用に搭載する。いくつかの態様において、展開を、色素原試薬、例えばＡＥＣを使用して実施してもよい。いくつかの態様において、展開を、従来からの光学顕微鏡により可視化してもよい。
【０１１２】
組織切片におけるタンパク質を同定するために、組織を４％のＰＦＡ(パラホルムアルデヒド)Ｏ／Ｎで固定し、ついて３０％のスクロースＯ／Ｎで凍結保護し、TissueTechに包埋する。ついで、切片を凍結状態で切断し、ＰＢＳ(リン酸緩衝食塩水)ですすぎ、０．０１Ｍのクエン酸バッファー(ｐＨ６．０)において１５分、マイクロ波処理し、エピトープを回復させる。ついで、このような切片は、上述した方法のいずれかを使用して染色可能であるが、等級付けされたエタノール処理は除く。ＨＲＰベースアッセイを使用するケースにおいては、過酸化水素水を使用し、内因性ペルオキシダーゼ活性を阻害する。いくつかの態様においては、ついで、例えばパラフィン切片を使用する場合は、切片をミクロトームで切断する。
【０１１３】
分析用ＦＡＣＳ選別を、生存している細胞、又はリリー固定液(Lillys fixative)において４５分、固定化された細胞において実施する。上清を除去するために、１０ｍｌのｖ-チューブにおいて、室温で５分、１３００ｒｐｍにより、細胞をペレット化する。ついで、この細胞を、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳにおいて洗浄する。固定された細胞用：細胞を、二次抗体が生じた動物から、１０％血清(最終濃度)に達するまで、血清を添加することにより細胞をブロックし、１時間ブロックしておく。ついで、細胞をペレット状にし、上清を除去する。一次抗体の溶液を添加し、室温、Ｏ／Ｎでインキュベートする。次の日、細胞を１０ｍｌのｖ-チューブにおいて２ｘ５分洗浄する。二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートする。細胞を、１０ｍｌのｖ-チューブにおいて、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳにて、２ｘ５分洗浄する。最後に、細胞をＦＡＣＳでアッセイする。生存細胞：一次抗体の溶液を添加し、４℃で１時間インキュベートする。細胞を１０ｍｌのｖ-チューブにおいて２ｘ５分洗浄する。二次抗体を添加し、４℃で３０分インキュベートする。細胞を、１０ｍｌのｖ-チューブにおいて、０．１％のＢＳＡと共にＰＢＳにて、２ｘ５分洗浄する。最後に、細胞をＦＡＣＳでアッセイする。
【０１１４】
幾つかの態様では、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞の同定は、細胞個体群とＤＮＥＲ結合試薬とを接触させ、染色を評価することにより達成され得る。幾つかの態様において、内分泌プレ前駆体細胞の同定は、細胞個体群とＤＮＥＲ結合試薬とを接触させ、染色を評価することにより達成され得る。幾つかの態様において、内分泌前駆体細胞の同定は、細胞個体群とＤＮＥＲ結合試薬とを接触させ、染色を評価することにより達成され得る。この分析は、蛍光標識細胞分取(ＦＡＣＳ）、免疫組織化学(ＩＨＣ）、ウエスタンブロット法、ＰＣＲ、又はＥＬＩＳＡ等の方法を使用して実施されてよい。いくつかの態様において、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞の同定は、細胞個体群とＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬とを接触させ、染色を評価することにより達成され得る。いくつかの態様において、内分泌プレ前駆体細胞の同定は、細胞個体群とＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬とを接触させ、染色を評価することにより達成され得る。いくつかの態様において、内分泌前駆体細胞の同定は、細胞個体群とＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬とを接触させ、染色を評価することにより達成され得る。
【０１１５】
幾つかの態様では、本発明は、ここに記載の方法によって得られた、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される単離細胞に関する。幾つかの態様では、本発明は、ここに記載の方法によって得られた、単離された内分泌プレ前駆体細胞に関する。幾つかの態様では、本発明は、ここに記載の方法によって得られた、単離された内分泌前駆体細胞に関する。幾つかの態様では、本発明は、ここに記載の方法によって得られた、単離された完全に分化した内分泌細胞に関する。幾つかの態様では、本発明は、ここに記載の方法によって得られた、単離された膵臓ベータ細胞に関する。
【０１１６】
いくつかの態様において、本発明は、細胞表面マーカーとしての、ＤＮＥＲタンパク質を発現する細胞を同定又は選択するための、ＤＮＥＲ結合試薬の使用に関する。いくつかの態様において、本発明は、膵臓内分泌細胞の培養体を得るための、細胞表面マーカーとしての、ＤＮＥＲタンパク質の使用に関する。幾つかの態様では、本発明は、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８タンパク質を細胞表面マーカーとして発現する細胞を同定又は選択するための、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬の使用に関する。幾つかの態様では、本発明は、膵臓内分泌細胞の培養体を得るための、細胞表面マーカーとしてのＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の使用に関する。いくつかの態様において、一又は複数のさらなる細胞表面マーカーは、膵臓内分泌細胞の培養体を得るために、同時に又は逐次使用される。いくつかの態様において、さらなる細胞表面マーカーは、ＤＤＲ１タンパク質、プロミニン(prominin)１(ＣＤ１３３としても知られる)、及びＣＤ４９ｆからなる群から選択される。幾つかの態様では、更なる細胞表面マーカーはＤＤＲ１タンパク質である。
【０１１７】
分離方法
いくつかの態様において、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の培養体を得る方法に関し、該方法は、ＤＮＥＲ結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＮＥＲ結合試薬と結合しない細胞から、ＤＮＥＲ陽性細胞の画分中の、ＤＮＥＲ結合試薬と結合した細胞を分離することを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞を含む培養体を得る方法に関し、該方法は、ＤＮＥＲ結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＮＥＲ結合試薬と結合しない細胞から、ＤＮＥＲ陽性細胞の画分中の、ＤＮＥＲ結合試薬と結合した細胞を分離することを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌前駆体細胞を含む培養体を得る方法に関し、該方法は、ＤＮＥＲ結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＮＥＲ結合試薬と結合しない細胞から、ＤＮＥＲ陽性細胞の画分中の、ＤＮＥＲ結合試薬と結合した細胞を分離することを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む培養体を得る方法に関し、該方法は、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬と結合しない細胞から、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞の画分中の、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬と結合した細胞を分離することを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞を含む培養体を得る方法に関し、該方法は、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＮＥＲ結合試薬とと結合しない細胞から、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞の画分中の、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬と結合した細胞を分離することを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌前駆体細胞を含む培養体を得る方法に関し、該方法は、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬と、膵臓細胞を含む細胞個体群とを接触させ、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬と結合しない細胞から、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞の画分中の、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬と結合した細胞を分離することを含む。
【０１１８】
いくつかの態様において、分離工程は、蛍光標識細胞分取(ＦＡＣＳ)によりなされる。幾つかの態様において、方法はＭＡＣＳである。幾つかの態様では、分離工程は、パニングによりなされる。
【０１１９】
また、ＦＡＣＳは、蛍光を測定することに基づき、細胞個体群を物理的に分離するために使用することもできる。流れる細胞は、その強度及び方向が蛍光シグナルの測定される強度に応じて変化する電磁場により偏向する。標識されたＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞は分離容器において偏向可能で、よって未標識のＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陰性細胞から分離される。 
【０１２０】
ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８に特異的に結合する蛍光標識された分子、最も一般的には、抗体は、ＦＡＣＳと併せて、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞を選択するのに使用される。簡単には、一態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は、蛍光標識された抗体と共にインキュベートされ、抗体結合後に、細胞がＦＡＣＳにより分析される。細胞選別機は、液体に懸濁した単細胞を、蛍光光度計に通過させる。蛍光量を測定し、対照となる未標識の細胞よりも検出的に高い蛍光レベルを有する細胞を、陽性細胞として選択する。
【０１２１】
膵臓細胞を含む細胞個体群が膵臓から単離される幾つかの態様において、細胞は、まず一又は複数の継代用に培養され、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８特異的抗体で標識される。ついで、細胞はＦＡＣＳを使用してスキャニングされ、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陰性細胞から、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞が分離される。この例では、標識された抗体を用いたＦＡＣＳ分析を論議しているが、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８に特異的に結合する他の分子、例えばレクチン及びコラーゲン、及び他のＤＮＥＲ結合パートナー、例えば上述にて列挙したものを、本発明の実施に使用することができる。幾つかの態様では、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陰性細胞から、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞を分離する方法は、固体状支持体に、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞を親和吸着させることによりなされる。
【０１２２】
また、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞は、固体状支持体に結合し、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８に特異的に結合する分子を使用することにより、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陰性細胞から分離することができる。当業者であれば、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８特異的抗体が、抗体結合分子、例えばプロテインＧ又はプロテインＡを介して、固体状支持体に結合可能であり、又は固体状支持体に直接コンジュゲート可能であることを認識しているであろう。ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８抗体が結合した固体状支持体は、例えばStem Cell Technologiesから、磁気ビーズであるStemSep及びEasySepTMを、商業的に入手可能である。幾つかの態様では、分離工程は、磁気活性化細胞分取(ＭＡＣＳ)を使用して、実施されてよい。
【０１２３】
また、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞は、パニング技術を介して、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陰性細胞から分離することもできる。パニングは、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬で固体状支持体を被覆し、適切な条件下、適切な時間、表面で膵臓細胞をインキュベートすることによりなされる。平坦面、例えば培養皿は、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬で被覆される。膵臓細胞は表面に添加され、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬との結合が可能になる。ついで、培養皿が洗浄され、皿からＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陰性細胞が除去される。幾つかの態様において、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８特異的抗体は、膵臓細胞個体群において、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞用の培養皿及び「パン」を被覆するために使用される。
【０１２４】
幾つかの態様において、細胞は、Ｐｔｐｒｎ／ＩＡ２-陽性及びＰｔｐｒｎ／ＩＡ２-陰性細胞に細胞を分離することにより、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８による選択の前後に精製されてもよい。幾つかの態様において、細胞は、Ｐｔｐｒｎ／ＩＡ２-陽性及びＰｔｐｒｎ-陰性細胞に細胞を分離することにより、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８による選択の前後に精製されてもよい。幾つかの態様において、細胞は、Ｓｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８-陽性及びＳｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８-陰性細胞に分離されてもよい。幾つかの態様において、細胞は、ＤＤＲ１のような一又は複数の更なる細胞外マーカーと組み合わせたＤＮＥＲによる選択の前後に精製されてもよい。幾つかの態様において、細胞は、ＤＤＲ１のような一又は複数の更なる細胞外マーカーと組み合わせたＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８による選択の前後に精製されてもよい。
【０１２５】
したがって、本発明は、膵臓細胞を含む細胞個体群が、Ｐｔｐｍ陽性画分、Ａｂｃｃ８陽性画分、及び／又はＳｌｃ３０ａ８陽性画分を含む、ベータ細胞陽性である、態様を含む。また、ここ又は上の任意の実施態様に記載の方法により得られた膵臓内分泌細胞の培養体は、さらにＰｔｐｒｎ-陽性／陰性画分及び／又はＡｂｃｂ９-陽性／陰性画分及び／又はＳｌｃ３０ａ８-陽性／陰性画分に分離を含む、ベータ細胞-陽性／陰性画分に分離されてもよい。
【０１２６】
当業者であれば、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８についてはっきりと提示されてはいるが、分離方法に関して上述した部分の詳細は、他の細胞外タンパク質に適用されてもよいことは理解しているであろう。こような細胞外タンパク質には、ＤＤＲ１、プロミニン１(ＣＤ３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆからなる群から選択されるタンパク質が含まれる。
【０１２７】
ベータ細胞への胚性幹(ＥＳ)細胞の分化中、他の細胞型、例えば神経細胞、及び非膵臓内胚葉が生成されることが予期される。ＥＳ細胞は、アクチビンＡにより内胚葉細胞、ついで膵臓細胞に分化可能である。膵臓の運命が獲得されたならば、望ましい細胞を単離することができる。ＤＮＥＲ及び／又はＤＤＲ１は、細胞の所望するサブセットを単離するためのマーカーとして使用することができる。ＤＮＥＲ結合試薬は、膵臓の内分泌プレ前駆体細胞及びその子孫だけでなく、一般的には神経細胞にも特異的に結合し得る。発明者は、ＤＮＥＲが小腸内分泌前駆体細胞のためのマーカーではないことを示す遺伝子発現プロファイリング実験を実施した。ＤＤＲ１結合試薬は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期内分泌細胞だけでなく、膵臓の管／内分泌前駆体細胞にもまた結合する。更に、ＤＤＲ１結合試薬は、神経細胞には結合し得ないが、膵臓細胞以外の他の内分泌細胞に結合し得る。
【０１２８】
同定、富化、及び／又は選択のための種々の方法が、例えば以下の実施例のように利用できる：膵臓内胚葉を含む確定的内胚葉への分化が誘導されたＥＳ細胞に、１）ＤＤＲ１＋細胞を単離するためのマーカーとしてのＤＤＲ１を使用すること：２）ＤＤＲ１＋固体群からＤＮＥＲ＋細胞を単離するためのマーカーとしてのＤＮＥＲを使用することができる。この工程により、膵臓プレ前駆体と命名される細胞のＥＳ-誘導プールの直接単離ができるようになる。さらに、このような細胞のインビトロで媒介される分化において、例えばマーカーとしての、Ｐｔｐｒｎ／ＩＡ２-、Ａｂｃｃ８／Ｓｕｒ１-、又はＳｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８-陽性細胞の二次的使用を、初期及び完全に分化した内分泌細胞を単離させるのに使用することができる。
【０１２９】
ＤＤＲ１陽性細胞の一部は、増殖する能力を有すると期待される。したがって、幾つかの態様では、本発明は、細胞個体群のサブセットを単離するために、ａ）細胞の固体群を単離するためのＤＤＲ１結合試薬の使用、ｂ）所望により増殖及び／又は分化を容易にするための細胞個体群の培養、ｃ）ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬の使用の工程を含む方法に関する。この方法によって単離されるＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞個体群  は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含み得る。
【０１３０】
幾つかの態様では、本発明は、ａ）細胞個体群を単離するためのＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬の使用、ｂ）所望により増殖及び／又は分化を容易にするための細胞個体群の培養、ｃ）細胞個体群のサブセットを単離するためのＤＤＲ１結合試薬の使用、ｄ）所望により増殖及び／又は分化を容易にするための細胞個体群の培養、ｅ）所望によりａ）からｄ）をＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞の必要量が達成するまで繰り返す工程を含む方法に関する。
【０１３１】
いくつかの態様において、マーカーとしてＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８を使用することで、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞を含む細胞個体群を、低比率、例えば２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満の他の細胞型と共に含む、又は他の細胞型、例えば、膵臓細胞及び神経細胞以外の内胚葉細胞を含まない細胞個体群が提供される。ＤＮＥＲとＤＤＲ１結合試薬を用いた二重の分離は、開始個体群が神経細胞がない膵臓又は内胚葉由来だけの場合、必要で無くてもよい。
【０１３２】
いくつかの態様において、マーカーとしてＤＤＲ１とＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８を同時又は連続的に組み合わせて使用することで、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞を含む細胞個体群を、低比率、例えば２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、２％未満の他の細胞型と共に含む、又は他の細胞型、例えば、膵臓細胞及び神経細胞以外の内胚葉細胞を含まない細胞個体群が提供される。ＤＮＥＲとＤＤＲ１結合試薬を用いた二重の分離は、開始個体群が神経細胞がない膵臓又は内胚葉由来だけの場合、必要で無くてもよい。
【０１３３】
いくつかの態様において、開始個体群が膵臓由来だけである場合、本発明は、ＤＤＲ１陽性細胞の細胞個体群が得られる、ＤＤＲ１の第一の分離、及びＤＮＥＲ陽性細胞がＤＤＲ１陽性細胞から除かれる、ＤＮＥＲの第二の逆分離に関し；この方法は、幾つかの管／内分泌前駆体細胞を伴って、ＤＤＲ１を発現しＤＮＥＲを発現しない、前内分泌前前駆体細胞の細胞個体群を与え得る。前内分泌前前駆体細胞は、内分泌前前駆体細胞の直接前駆体として定義される。幾つかの態様では、開始個体群が膵臓由来だけの場合、本発明は、ＤＤＲ１陽性細胞の細胞個体群が得られる、ＤＤＲ１の第一の分離、及びＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞がＤＤＲ１陽性細胞から除かれる、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８の第二の逆分離に関し；この方法は、幾つかの管／内分泌前駆体細胞を伴って、ＤＤＲ１を発現しＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８を発現しない、前内分泌前前駆体細胞の細胞個体群を与え得る。前内分泌前前駆体細胞は、内分泌前前駆体細胞の直接前駆体として定義される。
【０１３４】
幾つかの態様において、実質的には他の細胞型を含まない、膵臓内分泌細胞を含有する組成物が、生成されてよい。いくつかの態様において、実質的には他の細胞型を含まない、膵臓内分泌プレ前駆体細胞、膵臓内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び完全に分化した内分泌細胞を含有する組成物が、生成されてよい。いくつかの態様において、実質的には他の細胞型を含まない、膵臓内分泌プレ前駆体細胞を含有する組成物が、生成されてよい。いくつかの実施態様において、実質的には他の細胞型を含まない、膵臓内分泌前駆体細胞を含有する組成物が、生成されてよい。いくつかの態様において、表現「実質的に含まない」は、細胞培養体又は細胞個体群が、細胞の全数に対して、膵臓内分泌プレ前駆体細胞、膵臓内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び完全に分化した内分泌細胞と比べて、他の細胞型を２０％少なく含有することと理解される。いくつかの態様において、表現「実質的に含まない」は、細胞培養体又は細胞個体群が、細胞の全数に対して、膵臓内分泌プレ前駆体細胞より、他の細胞型を２０％少なく含有することと理解される。いくつかの態様において、表現「実質的に含まない」は、細胞培養体又は細胞個体群が、細胞の全数に対して、膵臓内分泌プレ前駆体細胞より、他の細胞型を２０％少なく含有することと理解される。いくつかの態様において、表現「実質的に含まない」は、細胞培養体又は細胞個体群が、細胞の全数に対して、膵臓内分泌前駆体細胞より、他の細胞型を２０％少なく含有することと理解される。
【０１３５】
いくつかの実施態様において、本発明は、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の内分泌プレ前駆体細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の内分泌前駆体細胞からなる方法に関する。
【０１３６】
いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉由来であり、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉由来であり、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の内分泌プレ前駆体細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉由来であり、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の内分泌前駆体細胞からなる方法に関する。
【０１３７】
いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉及び神経由来の細胞を含み、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉及び／又は神経由来の細胞を含み、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の内分泌プレ前駆体細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉及び／又は神経由来の細胞を含み、得られた細胞個体群が、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の内分泌前駆体細胞からなる群から選択される細胞からなる方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、出発細胞個体群が内胚葉又は神経由来の細胞を含む場合、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬が、一又は複数の付加的な結合試薬と組合せて、同時に又は逐次使用され、ここで出発細胞個体群が内胚葉及び／又は神経由来の細胞を含む方法に関する。本発明のいくつかの実施態様において、付加的な結合試薬は、プロミニン１(ＣＤ１３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆ結合試薬からなる群から選択される。
【０１３８】
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法により得られた、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞及び完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される単離された細胞に関する。
【０１３９】
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法により得られた、単離された内分泌プレ前駆体細胞に関する。いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法により得られた、単離された内分泌前駆体細胞に関する。
【０１４０】
いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法に定められた方法により得られた、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群からの一又は複数の細胞から選択される、単離された細胞を含有する組成物に関する。いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法に定められた方法により得られた、単離された内分泌プレ前駆体細胞を含有する組成物に関する。いくつかの態様において、本発明は、ここに記載の任意の方法に定められた方法により得られた、単離され、十分に分化した内分泌細胞を含有する組成物に関する。
【０１４１】
細胞分化マーカー
いくつかの態様において、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含有する細胞培養体を得る方法に関し、該方法は：ここに記載の方法に従い、精製された細胞を得、ついで、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞において、膵臓細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞を含有する培養体を得る方法に関し、該方法は：上又はここに記載した方法に従い、精製された細胞を得、ついで、内分泌プレ前駆体細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌前駆体細胞を含有する培養体を得る方法に関し、該方法は：ここに記載の方法に従い、精製された細胞を得、ついで、内分泌前駆体細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。
【０１４２】
膵臓細胞個体群を同定するのに使用可能な、多くの細胞マーカーが存在する。単離され、培養されたドナーー細胞は、分化した膵臓細胞の種々の表現型及び遺伝子型の兆候を示し始める。表現型及び遺伝子型の兆候の例には、調節された(例えば、アップレギュレーション又はダウンレギュレーション)通性前駆体細胞個体群に存在する、種々の分子マーカーが含まれる。これらの分子マーカーには、膵臓の通性幹細胞（即ち、多能性膵臓幹細胞）のマーカーであると仮定されている、ＣＫ-１９又はＰｄｘ１／Ｎｋｘ６．１／Ｐｔｆ１ａトリプル陽性細胞が含まれる。
【０１４３】
典型的には、哺乳動物幹細胞は、多くの発育段階を介して進行し、最終的な発育終点になるまで成熟する。発育段階は、発育している細胞に存在していない又は存在しているマーカーを同定することにより決定することができる。ヒト内分泌細胞は同様の方式で発育するため、細胞用表現型から偽性島表現型へとそれらが移行する場合の細胞を同定するために、種々のマーカーを使用することができる。
【０１４４】
本発明の方法により増殖又は分化が誘発された細胞におけるマーカー発現は、正常なヒトの膵臓の発育におけるマーカー発現のシーケンスと、ある程度の類似性を有している。発育のかなりの初期、始原上皮細胞は、ホメオドメイン核内因子である、Ｐｄｘ-１、初期の細胞マーカーを発現する。細胞が発育すると、それらは出芽し、管を形成し始める。これらの細胞はサイトケラチン１９、上皮管細胞のマーカーを発現し、一時的には、発育的に内分泌細胞に至るＮｇｎ３を発現する。これらの細胞は内分泌細胞に向かって発育し続けており、それらは、インスリン、ソマトスタチン、グルカゴン、又は膵臓ポリペプチドを発現する能力を獲得する。最終的に分化した細胞は一つのみを発現でき、アルファ細胞(グルカゴン)、ベータ細胞(インスリン)、デルタ細胞(ソマトスタチン)、及びＰＰ-細胞となる。
【０１４５】
ここで使用されるＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞個体群は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び完全に分化した内分泌細胞の主要なカテゴリーに分割可能であると、考えられている。
【０１４６】
ＤＮＥＲの細胞外発現は、膵臓の種々のドメインで変化し、膵臓内分泌細胞の発育段階中に変化する可能性がある、例えば、図１の略図を参照。
【０１４７】
ＤＮＥＲは、膵臓内胚葉のいくつかの細胞で発現する。ＤＮＥＲは多能性膵臓前駆体細胞では発現しない。ＤＮＥＲは腺房系列では発現しない。ＤＮＥＲは外分泌系列では発現しない。ＤＮＥＲは管系列では発現しない。ＤＮＥＲは内分泌腸系列では発現しない。ＤＮＥＲは、Ｎｇｎ３タンパク質の発現の前の分化の段階における新しい細胞型、即ち、内分泌プレ前駆体細胞において発現するようである。よって、ＤＮＥＲは、内分泌プレ前駆体細胞の同定、富化、及び／又は単離に使用可能である。ＤＮＥＲは、内分泌前駆体細胞において、高、中又は低レベルで発現し得る。よって、ＤＮＥＲは、内分泌前駆体細胞の同定、富化、及び／又は単離に使用可能である。ＤＮＥＲは、初期内分泌細胞において、高、中又は低レベルで発現し得る。更に、ＤＮＥＲは、ホルモン陽性内分泌細胞において及び完全に分化した内分泌細胞のような、成人の膵臓内分泌細胞において発現し得る。よって、ＤＮＥＲは、完全に分化した内分泌細胞の同定、富化、及び／又は単離に使用可能である。従って、ＤＮＥＲは、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞を、同定、富化及び／又は単離するのに使用されてよい。特に、多くのタンパク質、例えばＰｔｐｒｎ／ＩＡ２、Ａｂｃｃ８／Ｓｕｒ１、及びＳｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８は、完全に分化した内分泌細胞の同定、富化及び／又は単離に使用可能であるが、ＤＮＥＲのみが、内分泌前駆体細胞の同定、富化及び／又は単離に使用され得る。
【０１４８】
細胞が実際に発達経路における前駆体の例であるか又は単純にインビトロ操作における結果であるかに関わらず、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞は、また最終的には内分泌ホルモンを発現し、又は膵臓の初期の内分泌細胞からさらに成熟した内分泌細胞型へと成熟し、よって任意のタイプの島細胞における欠点を矯正するために使用される可能性を有している細胞に分化可能な、発育経路における前駆体の具体例であると信じられている。
【０１４９】
さらに、ＤＤＲ１陽性細胞個体群は、発育の十分に分化した段階未満であり、十分に分化した内分泌細胞に分化する可能性、及び増殖する能力を保持していると信じられている。細胞が実際に発達経路における前駆体の例であるか又は単純にインビトロ操作における結果であるかに関わらず、ＤＤＲ１陽性細胞は、増殖し、また最終的には内分泌ホルモンを発現し、又は膵臓の初期の内分泌細胞からさらに成熟した内分泌細胞型へと成熟し、よって任意のタイプの島細胞における欠点を矯正するために使用される可能性を有している細胞に分化可能な、発育経路における前駆体の具体例であると信じられている。
【０１５０】
関心あるマーカーは、膵臓において、時間-及び組織-特異的パターンで発現する分子である(Hollingsworth, Ann N Y Acad Sci 880: 38-49 (1999)を参照)。これらの分子マーカーは、一般的に３つのカテゴリー：転写因子、ノッチ経路マーカー、及び中間径フィラメントマーカーに分けられる。転写因子マーカーの例には、Ｐｄｘ-１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｋｘ-６．１、Ｉｓｌ-１、Ｐａｘ-６、Ｐａｘ-４、Ｎｇｎ-３、及びＨＥＳ-１が含まれる。
【０１５１】
ノッチ経路マーカーの例には、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、Ｎｏｔｃｈ４、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｌｌ１、及びＲＢＰｊｋが含まれる。中間径フィラメントマーカーの例には、ＣＫ１９及びネスチンが含まれる。膵臓ベータ細胞の前駆体のマーカーの例には、Ｐｄｘ-１、Ｐａｘ-４、Ｎｇｎ-３、及びＨｂ９が含まれる。完全に分化した膵臓ベータ細胞のマーカーの例には、インスリン、ｐｔｐｒｎ／ＩＡ２、Ａｂｃｃ８／Ｓｕｒ１、及びＳｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８が含まれる。
【０１５２】
インスリンｍＲＮＡ発現
膵臓細胞の同一性、分化又は成熟度の特徴付けに使用され得る一つのマーカーは、インスリンｍＲＮＡのレベルである。例えば、本発明の中間細胞個体群は、定められた範囲でインスリンｍＲＮＡ発現を示す。インスリンｍＲＮＡを定量する方法には、ノーザンブロット法、ヌクレアーゼプロテクション、及びプライマー伸長法が含まれる。
【０１５３】
幾つかの態様において、ＲＮＡを、培養された細胞の個体群から抽出し、プロインスリンメッセージの量を、定量的逆転写ＰＣＲにより測定する。逆転写の後、インスリンｃＤＮＡを、インスリンｃＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションしたプライマーを使用し、増幅した生成物の量が、サンプル中に存在するｍＲＮＡの量に関連する増幅条件下で、サンプルから、特異的かつ定量的に増幅させる(例えば、 Zhouら, J Biol Chem 272: 25648-51 (1997)を参照)。動力学的定量手順は、出発ｍＲＮＡレベルを正確に測定可能であるため、好ましい。
【０１５４】
インスリンｍＲＮＡの量を、構造的に発現したｍＲＮＡ、例えばアクチンに対して、頻繁に正常化し、アクチンに特異的なプライマーを使用し、同様のＲＮＡサンプルから特異的に増幅させる。よって、インスリンｍＲＮＡの発現レベルは、アクチンｍＲＮＡ増幅生成物に対する、インスリンｍＲＮＡ増幅生成物の比率、又は単純に、インスリン：アクチンのｍＲＮＡ比率として報告される。他の膵臓ホルモン(例えば、ソマトスタチン又はグルカゴン)をコードするｍＲＮＡの発現は、同様の方法で定量される。また、インスリン及びアクチンのｍＲＮＡレベルは、インサイツハイブリダイゼーションにより測定され、ついでインスリン：アクチンのｍＲＮＡ比率の測定に使用することができる。インサイツハイブリダイゼーション法は、当業者に公知である。
【０１５５】
増殖方法
いくつかの態様において、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の数を増やす方法に関し、該方法は：ここ又は上に記載した方法に従い、精製された細胞を得、ついで、得られた細胞型(類)の増殖を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞数を増加させる方法に関し、該方法は：ここ又は上に記載した方法に従い、精製された細胞を得、ついで、内分泌プレ前駆体細胞の増殖を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、本発明は、内分泌前駆体細胞の数を増加させる方法に関し、該方法は：ここ又は上に記載した方法に従い、精製された細胞を得、ついで、内分泌前駆体細胞の増殖を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。
【０１５６】
いくつかの態様において、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の数を増やす方法に関し、該方法は：ここ又は上に記載した方法に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される細胞において、膵臓細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。幾つかの態様において、本発明は、内分泌プレ前駆体細胞の数を増やす方法に関し、該方法は：ここ又は上に記載した方法に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、内分泌プレ前駆体細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。幾つかの態様において、本発明は、内分泌前駆体細胞の数を増やす方法に関し、該方法は：上述した方法に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、内分泌前駆体細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。さらなる他の態様において、本発明は、初期の内分泌細胞の数を増やす方法に関し、該方法は：上述した方法に従い、精製され、増殖した細胞を得、ついで、初期の内分泌細胞の分化を容易にする条件下にて、得られた細胞を培養することを含む。
【０１５７】
胎児／成人組織から誘導された膵臓細胞及び幹細胞を増殖させるプロトコルは、限定されるものではないが、Heimberg, Hら. (2000), Diabetes 49, 571-9; Heremans, Yら. (2002), J Cell Biol 159, 303-12; Miralles, Fら. (1998), Development 125, 1017-24; 及びMiralles, Fら. (1999), Dev Dyn 214, 116-26に記載のプロトコルにより例証される。
【０１５８】
機能アッセイ
ベータ細胞の重要な機能の一つは、グルコースレベルに応じて、そのインスリン分泌を調製することである。典型的には、静的グルコース刺激(ＳＧＳ)アッセイは、種々のグルコースレベルに応じてインスリンを分泌可能であるかどうかを同定するために、増殖する粘着性膵臓細胞において実施される。細胞は、ほぼコンフルエントになるまで、適切な基質において培養される。ＳＧＳテストの３日前、培養培地を、インスリンを欠き、及び、１ｇ／Ｌのグルコースのみを含有する以外は同様の特性の培地に置き換える。３日間、毎日培地を交換し、４日目にＳＧＳテストを実施する。
【０１５９】
テストの前に、培養培地を、グルコース及びインスリン分析用に収集しておいてもよい。テスト用の細胞を調製するために、ダルベッコのリン酸緩衝食塩水(ＤＰＢＳ)＋０．５％ＢＳＡで、細胞を２回洗浄し、各洗浄と共に、５分インキュベートし、ついで、ＤＰＢＳ単独で１回、さらに５分インキュベートする。洗浄後、３７℃のインキュベーターにおいて３０分、６０ｍｇ／ｄｌのグルコース(ＫＲＢ-６０)を含有する、１０ｍｌ(１００ｍｍの皿において)又は５ｍｌ(６０ｍｍの皿において)のクレブスリンゲルＳＧＳ液と共にインキュベートする。ついで、このインキュベートを繰り返す。
【０１６０】
ＳＧＳアッセイを予め作製しておくために、細胞を、３ｍｌ(１００ｍｍの皿)又は４ｍｌ(Ｔ７５フラスコ)又は２ｍｌ(６０ｍｍの皿ｄｉｓｈ)のＫＲＢ-６０において、３７℃で２０分インキュベートする。培地を吸引してスパンさせ、ＬＧ-１(低グルコース刺激工程)としてインスリンアッセイ用に収集する。ついで、ＫＲＢ-４５０＋テオ(４５０ｍｇ／ｄｌのグルコースと１０ｍＭのスレオフィリンを含有するＫＲＢ)を、上述した同じ容量で添加し、上述した同様の条件下で細胞を培養する。ＨＧ(高グルコース刺激)として、インスリンアッセイ用に上清を収集する。ついで、細胞を、ＫＲＢ-６０と共に、再度インキュベートし、ＬＧ-２として、別の時間にはＬＧ-３として培地を収集する。インスリン分析用に培地を収集し、インスリン含有量がラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は他の適切なアッセイにより測定されるまで、−２０℃で保管する。
【０１６１】
ＳＧＳテストの結果は、多くの場合、ＨＧインスリン値をＬＧ-１インスリン値で割ったものと定義される、刺激指標として表される。一般的に、約２以上の刺激指標は、ＳＧＳアッセイにおいて陽性の結果であるとみなされ、他の値(例えば、１．５、２．５、３．０、３．５等)は、特定の細胞個体群を定めるために使用され得る。
【０１６２】
治療方法
いくつかの態様において、本発明は、少なくとも一の膵臓ホルモンの生成に欠損がある哺乳動物に、膵臓内分泌機能を提供する方法に関し、ここで細胞は上述した任意の方法により得られたものであり、該方法は、哺乳動物において、少なくとも一の膵臓ホルモンを測定可能な量生成するのに十分な量の得られた細胞を、哺乳動物にインプラントする工程をさらに含む。
【０１６３】
当業者であれば、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８選択細胞又はさらに培養され分化した細胞が、インプラント用の再生可能な資源であり、哺乳動物における膵臓機能を回復させると認識しているであろう
【０１６４】
ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性膵臓細胞は、哺乳動物において、まずインプラント前に分化する。また、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８選択細胞は前駆体状態でインプラントされ、体内で分化可能である。使用者が望むのであれば、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８細胞は、インプラント前にカプセル化することができる。
【０１６５】
哺乳動物において、インプラント前のＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性膵臓細胞の分化は、グルコース反応性インスリン生成ベータ細胞を含む、十分に分化した内分泌細胞、すなわち単離されたランゲルハンス島のベータ細胞と同等のものからなる群から選択される分化の状態のものであってよい。いわゆるエドモントンプロトコルを使用する単離されたランゲルハンス島のインプラント例は、Shapiro AM (2000), N Engl J Med.; 343(4):230-8に見出すことができる。
【０１６６】
ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８により選択される細胞は、前駆体状態、すなわち未熟な細胞、例えば膵臓プレ内分泌前駆体細胞、膵臓前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞からなる群から選択され、体内で分化可能な細胞を含む細胞個体群でインプラントされてもよい。幾つかの態様において、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８により選択される細胞は、膵臓プレ前駆体細胞の前駆体状態でインプラントされてもよい。いくつかの実施態様において、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８により選択される細胞は、膵臓前駆体細胞の前駆体状態でインプラントされてもよい。従って、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞は、移植に直接使用されてもよい。この状況において、インビボ環境により、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞の治療用ベータ細胞への分化が引き起こされると予測される。移植用に未熟な膵臓細胞を使用する例は、Kroon E ら. (2008), Nat Biotechnol 26, 443 - 452.に記載されている。
【０１６７】
ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞のカプセル化により、カプセル中に、細胞凝集体が形成される結果となる。カプセル化により、１型糖尿病の宿主に膵臓細胞を移植することが可能となり、同時に、宿主動物の免疫反応を最小にすることができる。カプセル化膜の空隙率により、インスリンのような生体材料の、カプセルからの分泌が可能となり、同時に、外来細胞に対する宿主の免疫系へのアクセスが制限される。
【０１６８】
カプセル化の方法は当該技術で公知であり、以下の参照：van Schelfgaarde &; de Vos, J. Mol. Med. 77: 199-205 (1999), Uludagら. Adv. DrugDel Rev. 42: 29-64 (2000)、及び米国特許第５７６２９５９号、同５５５０１７８号、及び同５５７８３１４号に開示されている。
【０１６９】
カプセル化の方法は、参照としてここに導入される、出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／４１６１６に詳細に記載されている。
【０１７０】
哺乳動物へのインプラント又は移植、ついで、内分泌機能のモニタリングは、島移植に一般的に使用される方法に従い実施されてよい；例えば、Ryanら, Diabetes, 50: 710-19(2001); Peckら, Ann Med 33: 186-92 (2001); Shapiroら, NEngl JMed 343 (4): 230-8(2000); Carlssonら, Ups J Med Sci 105 (2): 107-23 (2000)及びKuhtreiber, WM, Cell Encapsulation Technology and Therapeutics, Birkhauser, Boston, 1999を参照。幾つかの態様では、インプラントの好ましい部位には、腹膜腔、肝臓、及び腎臓カプセルが含まれる。
【０１７１】
当業者であれば、未成熟膵臓細胞を含む膵臓細胞を使用して移植を実施する場合、膵臓ホルモン及び血糖値の測定のようなベータ細胞機能の測定は、移植後、少なくとも２週間、例えば、少なくとも４週間、少なくとも６週間、又は少なくとも８週間実施すべきであることを理解するであろう。対照的に、分化した膵臓細胞を使用して移植を行う場合、ベータ細胞機能、例えば、膵臓ホルモン及び血糖値レベルの測定を移植直後、例えば、移植後の１２時間以前、２４時間以前、又は３６時間以前に実施すべきである。
【０１７２】
当業者であれば、意図する受容者用のマイクロカプセルの適切な用量を決定することができるであろう。用量は、受容者が必要とするインスリンに依存する。ベータ細胞又はマイクロカプセルの決まった数から分泌されるインスリンレベルは、免疫学的に、又は生物活性量により決定することができる。用量を決定する場合、受容者の体重を考慮に入れることができる。（カプセル化されてもよい）細胞に対する受容者の反応をモニターしている場合、必要であるならば、１以上のインプラントを実施することもできる。よって、（）カプセル化されてもよい）細胞の用量に対する指針として、インプラントに対する反応性を使用することができる(Ryanら, Diabetes 50: 710-19 (2001))。
【０１７３】
受容者における、（カプセル化されてもよい）細胞の機能は、グルコースに対する受容者の反応をモニターすることにより測定することができる。（カプセル化されてもよい）細胞のインプラントにより、血糖値をコントロールすることができる。さらに、膵臓内分泌ホルモン、インスリン、Ｃ-ペプチド、グルカゴン、及びソマトスタチンのレベルが増加したという証拠により、（カプセル化されてもよい）細胞の機能を示すことができる。
【０１７４】
当業者であれば、血糖のコントロールは、種々の方法でモニター可能であると、認識しているであろう。例えば、血糖は、体重とインスリン必要量から、直接測定することができる。経口グルコース負荷試験を付与することもできる。腎臓機能は、他の代謝パラメーターから測定することもできる(Soon-Shiong, Pら, PNAS USA 90: 5843-5847 (1993); Soon-Shiong, Pら, La71cet 343: 950-951 (1994))。
【０１７５】
ここで使用される場合、用語「インスリン生成内分泌膵臓細胞」は、インスリンを生成し、血糖依存方式でインスリンを分泌する細胞を称する。
【０１７６】
幾つかの態様において、膵臓細胞を含む細胞個体群は、(この発明の)培養源から単離される。ついで、単離された細胞は、例えば、さらなる培養に使用されるか、又は米国特許第５７６２９５９号のマイクロカプセル化法に従いマイクロカプセル化される。
【０１７７】
用語「このような機能を必要とする哺乳動物に膵臓機能を付与する」とは、それ自身、このようなホルモンを生成できない哺乳動物の体内で、膵臓ホルモンを生成する方法を称する。幾つかの態様において、膵臓ホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及びグレリンからなる群から選択される。いくつかの態様において、インスリンは糖尿病の哺乳動物の体内で生成される。膵臓機能は、この開示の方法により生成された、インスリンを生成する膵臓細胞を、哺乳動物にインプラント又は移植することにより提供される。インプラントされた凝集体の数は、哺乳動物に、測定可能な量のインスリンを生成するのに十分な量とされる。インスリンは、Ｅｌｉｓａアッセイ又はラジオイムノアッセイ又はインスリン機能、例えば血糖値の維持度合いのアッセイを含む、当業者に公知の他の検出方法により測定可能である。 
【０１７８】
インスリンは、等モル量のＣ-ペプチドと同時分泌され、よって、インスリン分泌活性は、血中のＣ-ペプチドを検出することにより測定することができる。幾つかの態様において、膵臓機能の提供は、体外で生成されるインスリンへの、哺乳動物の依存性を低減又は除去するのに十分である。
【０１７９】
「カプセル化」とは、細胞が、生体融合性のある無細胞物質、例えばアルギン酸ナトリウム及びポリリジンで取り囲まれるプロセスを称する。好ましくは、糖類及び小分子量のタンパク質のような小分子が、カプセル化された細胞周囲の環境から取り込まれるか、又はそこに分泌可能である。同時に、より大きな分子によりカプセル化された細胞、及び免疫細胞へのアクセスは制限される。
【０１８０】
「インプラント」は、受容者に細胞をグラフトする又は配置することである。それには、カプセル化した細胞又は非カプセル化が含まれる。細胞は、当該技術で公知の方法により、皮下、筋肉内、門脈内、又は腹腔内に配することができる。
【０１８１】
幾つかの態様において、分離工程は蛍光標識細胞分取により実施される。幾つかの態様において、分離工程はパニングにより実施される。幾つかの態様において、分離工程は流動床により実施される。
【０１８２】
幾つかの態様では、本発明はまた、細胞表面マーカーとして、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質を発現する細胞を同定又は選択するためのＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬の使用に関する。いくつかの態様において、本発明は、一又は複数の付加的な結合試薬、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬として、分析の同じ工程(類)にかけられてもよい、と組合せて、細胞表面マーカーとしてのＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺＬ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８を発現する細胞を同定又は選択するためのＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺＬ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及びＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬の同時又は逐次使用に関する。幾つかの態様において、付加的な結合試薬は、ＤＤＲ１、プロミニン(ＣＤ１３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆ結合試薬からなる群から選択される。幾つかの態様では、付加的な結合試薬は、ＤＤＲ１結合試薬である。
【０１８３】
また本発明は、膵臓内分泌前駆体細胞又は膵臓ホルモン分泌細胞又は初期内分泌細胞の培養体を得るための細胞表面マーカーとしての、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の使用に関する。いくつかの態様において、本発明は、一又は複数の付加的な結合試薬と組合せて、膵臓内分泌前駆体細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞、又は初期の内分泌細胞の培養体を得るための、細胞表面マーカーとしての、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の同時又は逐次使用に関する。いくつかの態様において、付加的な結合試薬は、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬として、分析の同じ工程(類)にかけられてもよい。幾つかの態様において、付加的な結合試薬は、ＤＤＲ１、プロミニン(ＣＤ１３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆ結合試薬からなる群から選択される。幾つかの態様では、付加的な結合試薬は、ＤＤＲ１結合試薬である。幾つかの態様において、付加的な結合試薬は、初期の、及び十分に分化した内分泌細胞を単離するのに使用可能な、Ｐｔｐｒｎ／ＩＡ２、Ａｂｃｃ８／Ｓｕｒ１、及びＳｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ-８結合試薬からなる群から選択される。
【０１８４】
幾つかの態様では、本発明は、このような機能を必要とする哺乳動物に、膵臓機能を提供することによる、１型糖尿病を処置する方法に関する。
【０１８５】
インビトロプロトコルの最適化
いくつかの態様において、膵臓細胞を含むインビトロ培養体は、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８の発現について、定期的にモニターされる。いくつかの態様において、一又は複数の付加的なマーカーが、同時又は逐次的に、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８と組合せて使用されてよい。いくつかの態様において、付加的なマーカーは、ＤＤＲ１、プロミニン(ＣＤ１３３としても公知)、及びＣＤ４９ｆからなる群から選択される。幾つかの態様では、付加的なマーカーはＤＤＲ１タンパク質である。ＤＮＥＲの高発現レベルは、内分泌細胞になることに関連するが、Ｎｇｎ３タンパク質の発現の前の発達の段階にある細胞をマークする。
【０１８６】
胚性幹細胞の分化の最適化について、十分に分化した内分泌細胞に向かった膵臓細胞の発育の種々の段階を同定するマーカーを有することが、非常に重要である。ＤＮＥＲ及びＤＤＲ１は、今までは、他のマーカーを使用して検出可能でなかった、細胞分化の重要かつ特定の段階を特定するために、単独で、又は組合せて使用されてよい。ＤＮＥＲ及び／又はＤＤＲ１は、一又は複数の付加的なマーカーと組合せて使用されてよい。ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及びＤＤＲ１は、今までは、他のマーカーを使用して検出できなかった、細胞分化の重要かつ特定の段階を特定するために、単独又は組み合わせて使用され得る。ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１、ＳＬＣ３０Ａ８及びＤＤＲ１は、一又は複数の付加的なマーカーと組合せて使用されてよい。
【０１８７】
ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８を発現する細胞は、上又はここに記載の方法、例えばＦＡＣＳを使用し、同定、富化、及び／又は単離することができる。
【０１８８】
幾つかの態様では、ＤＤＲ１＋及びＤＮＥＲ＋細胞を単離することで、例えばＥＳ細胞-誘導性の限定的内胚葉細胞個体群から、内分泌プレ前駆体細胞の純粋な培養体の生成に、かなりの利点が提供される。幾つかの態様では、ＤＤＲ１陽性細胞とＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞の逐次単離により、例えば、内胚葉細胞個体由来のＥＳ細胞からの、内分泌プレ前駆体細胞の純粋な培養体の生成に、かなりの利点が提供される。よって、より純粋な内分泌細胞個体群に向かっての、さらなる増殖及び／又は分化にかけることのできる培養体が得られる。
【０１８９】
各文献が、出典明示により個々にかつ具体的に援用されるように記載され、その全内容がここに記載されているかと同程度に、ここに引用された、刊行物、特許出願および特許を含む全ての文献は、出典明示によりその全内容がここに援用される（法律により許容される最大範囲）。
【０１９０】
全ての表題および副題は、ここでは便宜的に使用され、決して本発明を限定するものと解すべきではない。
【０１９１】
ここに提供される任意かつ全ての例、または例示的な言語（例えば「例えば、等」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解すべきではない。
【０１９２】
ここでの特許文献の引用および援用は単に便宜上なされているものに過ぎず、そのような特許文献の有効性、特許性、および／または権利行使性についての見解を反映させるものではない。
【０１９３】
この発明は、適用される法律に容認される場合、ここに付加される請求項に列挙された主題事項の全ての修正点および等価物を含む。
【実施例】
【０１９４】
動物由来とここの実施例で使用される抗体の濃度を表１に示す。全ての二次抗体を製造元の指示書に従って希釈し使用した。
2011518547.tif 000003
【０１９５】
実施例１：マウス及びヒトＤｎｅｒの生物情報学的分析
細胞外及び膜貫通ドメインを見出すために、マウス及びヒトのＤｎｅｒを、ＣＢＳ(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)にて、膜貫通プレディクターＴＭＨＭＭサーバーｖ．２．０に通した。結果は、ヒトとマウスのＤｎｅｒの両者がヒト及びマウスの両者の細胞外側に最初の主な６３８アミノ酸を有する単一の透過膜タンパク質（Ｉ型）であると予測され、該透過膜ドメインは６３９−６６１アミノ酸であると予測された。Ｄｎｅｒタンパク質の最初の部位におけるＴＭＨＭＭによって予測される透過膜様領域は、シグナルペプチドであり、シグナルＰに関連する下の結果においてまた考察される。
【０１９６】
Ｄｎｅｒのマウス及びヒトシグナルペプチドは、ＣＢＳ(http://www.cbs.dtu.dk/)にて、シグナルＰ３．０予測サーバーを用いて解析した。マウス：シグナルペプチド可能性：１．０００；シグナルアンカー可能性：０．０００；位置３９及び４０の間で最大切断箇所可能性０．４９４。ヒト：シグナルペプチド可能性：１．０００；シグナルアンカー可能性：０．０００；最大切断箇所可能性：位置３４及び３５の間で０．３７９。結果は、マウス及びヒトＤｎｅｒにおいて観察される透過膜様構造が、透過膜ドメインではなく、１の可能性を有するシグナルペプチドであることを示す。
【０１９７】
マウスとヒトＤｎｅｒの間でのアミノ酸の差異を調べるために、タンパク質のアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ  (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/)を使用して整列させた。図２に結果を示す。配列同一性は、９０％であった。このように、マウス及びヒトのＤｎｅｒのアミノ酸配列は、高度に保存されている。透過膜ドメインは下線を引いている：アミノ酸６３９から６６１。
【０１９８】
Ｄｎｅｒ結合試薬により結合可能な修飾についての情報を得るために、ＣＢＳ(http://www.ebi.ac.uk/)にて、マウス及びヒトＤｎｅｒを、翻訳後予測サーバーに通した。結果を図３から６に示す。ＧａｌＮＡｃ Ｏ-グリコシル化を調べるために、マウス及びヒトＤｎｅｒをＤｉｃｔｙＯＧｌｙｃ１．１サーバー（http://www.ebi.ac.uk/における）を通した。図３はＧｌｃＮＡｃＯ−グリコシル化がマウス及びヒトＤｎｅｒの細胞外側に存在すると予測され、「Ｇ」で示される。リシンのイプシロンアミノ基のグリコシル化を調べるために、マウス及びヒトＤｎｅｒをＮｅｔＧｌｙｃａｔｅ１．０サーバー（http://www.ebi.ac.uk/における）を通した。図４はグリコシル化がマウス及びヒトＤｎｅｒの細胞外側に存在すると予測され、「Ｇ」で示される。アスパラギンのＮ−グリコシル化を調べるために、マウス及びヒトＤｎｅｒをＮｅｔＧｌｙｃａｔｅ１．０サーバー（http://www.ebi.ac.uk/における）を通した。図５はグリコシル化がマウス及びヒトＤｎｅｒの細胞外側に存在すると予測され、「Ｎ」で示される。ムチン型ＧａｌＮａｃＯ−グリコシル化を調べるために、マウス及びヒトＤｎｅｒをＮｅｔＧｌｙｃ３．１ーバー（http://www.ebi.ac.uk/における）を通した。図６はグリコシル化がマウス及びヒトＤｎｅｒの細胞外側に存在すると予測され、「Ｔ」で示される。下線、即ち「＿」は、切断されたシグナルペプチドを示す。
【０１９９】
これらの結果（ＴＭＨＭＭ、シグナルＰ及び図２から６）は、Ｄｎｅｒが細胞外側において翻訳後に修飾される可能性が高いことを示す。Ｄｎｅｒのマウスとヒト形態の両者は従ってこのような修飾を認識する結合試薬が結合する。
【０２００】
マウスとヒトＤＤＲ１の情報学的解析は、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０６１の実施例１に従って実施され得、これに関する結果はその中に示される。マウスＤＤＲ１のアイソタイプの研究は、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０６１の実施例２に従って実施され得、これに関する結果はその中に示される。
【０２０１】
実施例２：膵臓ベータ細胞株におけるＤｎｅｒとＤｄｒ１の発現
全ＲＮＡは、マウス内分泌様細胞株から単離された：Ｉｓｎ１、ベータＨＣ、ベータＴＣｔｅｔ（条件：テトラサイクリンと伴に培養（＋ｔｅｔ）、ベータＴＣｔｅｔ（条件：テトラサイクリンを伴わず培養（−ｔｅｔ）、Ｍｉｎ６及びアルファＴＣ及びｅ１５．５ＮＭＲＩ内臓（胃、十二指腸、脾臓、及び膵臓）組織から単離された。細胞株Ｉｎｓ１はM Asafari等Endocrinology, 130巻, 167-178に記載されている。細胞株ベータＨＣ−９は、Noda M等, Diabetes, 1996 Dec;45(12):1766-73に記載されている。細胞株ベータＴＣ−ｔｅｔは、Fleischer N等, Diabetes, 1998 Sep;47(9):1419-25に記載されている。細胞株Ｍｉｎ６は、J Miyazaki等, Endocrinology,1990 Jul;127(1):126-32に記載されている。細胞株アルファＴＣは、Powers AC等, Diabetes, 1990 Apr;39(4):406-14に記載されている。ＲＮＡをテンプレートとして使用することにより、ランダムプライムのｃＤＮＡを作製した。ＰＣＲの３５サイクルをこれらのｃＤＮＡ上で実施した（９６℃で１８０秒、次いで（９６℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒）を３５回）。ｅ１５．５ｃＤＮＡを陽性コントロールとして使用し、水Ｈ２Ｏを陰性コントロールとして使用した。
【０２０２】
これらの結果は、Ｄｄｒ１が調べた全ての細胞株で発現したこと及びＤｎｅｒがＩｎｓ１を除く全ての細胞株で発現していることを示した。このことは、細胞の培養体中でＤｎｅｒとＤｄｒ１を発現させることが可能であることを示す。類似の結果が膵臓細胞に分化するＥＳ細胞についても得ることができると期待される。
【０２０３】
実施例３：チャンバースライド中のＩＨＣで可視化される内分泌様細胞株、アルファＴＣ中のＤｎｅｒ及びＤｄｒ１の発現
アルファＴＣを１０００ｍｇ／ＬのＤ−グルコース、ピルビン酸ナトリウム（０．５ｍＭ）、Ｐ／Ｓ（ペニシリン（１０ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１０μｇ／ｍｌ）、及び１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。細胞株アルファＴＣは、Powers AC等, Diabetes, 1990 Apr;39(4):406-14に記載されている。細胞をリリー固定液で４５分間固定し、次いでＰＢＳ中で洗浄し、使用まで＋５℃においてＰＢＳ中で保存した。エタノールグラジエント(７０％から出発して、９６％、ついで９９％、ついで再度９９％、ついで９６％、最後に７０％、各濃度で５分のインキュベートを使用)に浸透させ、次いで０．５％のＴＮＢブロッキング試薬（パーキンエルマーから）でブロッキングする。ヤギ抗Ｄｎｅｒ（Ｒ＆Ｄシステム、ＡＦ２２５４、１：１５０）又はマウス抗Ｄｄｒ１（Ｒ＆Ｄシステム、ＭＡＢ２３９６、１：５０）を添加し、室温（ＲＴ）で終夜（Ｏ／Ｎ）インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ビオチニル化抗サル又は抗マウス抗体を添加し、４５分間インキュベートした。ＰＢＳ中で細胞を洗浄後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、１５分間インキュベートし、次いでＰＢＳ中で洗浄した。最後に、染色を展開するために、チラミド−ｃｙ３を添加した。
【０２０４】
結果は、不均質なＤｎｅｒ及びＤｄｒ１の免疫反応性がアルファＴＣ中で検出され得ることを示す。強力で明確な免疫反応性が約１０％の細胞中でＤｎｅｒについて観察された。明確な免疫反応性はまた約１０％の細胞中でＤｄｒ１についても観察された。
【０２０５】
ＥＳ細胞がベータ細胞に分化する際、他の細胞型もまた産生されることが期待される。Ｄｎｅｒ及び／又はＤｄｒ１は、次いで細胞の所望のサブセットを単離するために使用され得る。このことは、ここの実施例４から７において、不均質なＤｎｅｒとＤｄｒ１染色において示される。ＥＳ細胞はアクチビンＡによって内分泌細胞に分化し、次いで膵臓細胞に分化する。膵臓細胞の運命が決定されると、所望の細胞を単離することができる。１）管／内分泌前駆体を単離するために、Ｄｄｒ１結合試薬を使用し得る。２）内分泌プレ前駆体細胞及び内分泌前駆体細胞を単離するために、Ｄｎｅｒ結合試薬を単独で又はＤｄｒ１結合試薬と組み合わせて使用し得る。
【０２０６】
Ｄｎｅｒをマーカーとして使用して単離した細胞を内分泌細胞型を得るために使用することができ、一方でＤｄｒ１をマーカーとして使用して単離した細胞は内分泌及び管細胞型を生じ得る。Ｄｄｒ１＋細胞は従ってＤＮＥＲを発現する可能性を示す細胞の亜集団を含む。
【０２０７】
幾つかの態様では、マウスにおけるＤｄｒ１の発現パターンの研究は、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０６１の実施例３に従って実施され得、これに関する結果はその中に示される。
【０２０８】
実施例４：蛍光染色により可視化されるｅ１５．５、ｅ１８．５及び成体マウス膵臓における、Ｄｎｅｒの局在化
マウスｅ１５．５、ｅ１８．５胚、及び成体組織を収集し、ＰＢＳに４％のパラホルムアルデヒド(ＰＦＡ)が入ったものにおいて、一晩(Ｏ／Ｎ)固定した。ＰＢＳに３０％のスクロースが入ったもので組織を平衡にし、TissueTechに包埋した。８μｍ切片に切断し、−８０℃で保管した。切片を室温(ＲＴ)で解凍し、ＰＢＳで洗浄し、０．０１Ｍのクエン酸バッファーでマイクロ波処理し、ＰＢＳに１％のＨ２Ｏ２が入ったものと共に、３０分インキュベートし、ついで、０．５％のＴＮＢブロック試薬(Perkin-Elmerからのもの)を用いてブロックした。ついで、１：７５のヤギ抗Ｄｎｅｒ、１：２００のモルモット抗インスリン（Ｇｐ抗-Ｉｎｓ）、１：７５のマウス抗グルカゴン（マウス抗Ｇｌｕ００１）を添加し、室温で終夜インキュベートした。次の日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ビオチニル化した抗-サル抗体と、抗-マウス-ｃｙ５、及び抗-ｇｐ-ｃｙ２を添加し、４５分インキュベートした。ＰＢＳにおいて細胞を洗浄後、ストレプトアビジン-ＨＲＰを添加し、１５分、インキュベートした。ついで、細胞をＰＢＳで洗浄した。最終的に、チラミド-ｃｙ３を添加して、染色を展開した。
【０２０９】
結果は、Ｄｎｅｒがｅ１５．５及びｅ１８．５の膵臓において強く発現していることを示した。しかし、成体膵臓では、不均質で弱いＤｎｅｒが検出された。ｅ１５．５では、強いＤｎｅｒ免疫反応性が、膵臓の中枢Ｎｋｘ６．１陽性ドメイン中の拡散した細胞中で検出された。膵臓中のＤｎｅｒの局在は、Ｎｇｎ３タンパク質の局在化に非常に類似していた。Ｄｎｅｒシグナルは、インスリン又はグルカゴン陽性ドメイン中でまれに観察された。ｅ１８．５において、インスリン及びグルカゴンを共発現しないＤｎｅｒ個体群は依然存在するが、Ｄｎｅｒを共発現するインスリン及びグルカゴン陽性細胞は劇的に増加した。更に、Ｄｎｅｒ陰性であるインスリンとグルカゴン陽性細胞もまた観察された。場合によっては、Ｄｎｅｒは、管システムと密接に関連するグルカゴン又はインスリン陽性細胞を共発現することが見出された。Ｄｎｅｒ発現はまた周囲の間葉でも観察された。間葉におけるＤｎｅｒシグナルはＨｕＣ／Ｄに陽性の神経細胞の支配から得られる見込みがあった。ｅ１８．５において、Ｄｎｅｒはｅ１５．５に比較して弱いようであった。成体の膵臓では、Ｄｎｅｒ免疫反応性は島に見出された。それはインスリンとグルカゴンの両者に共局在した。成体膵臓では、Ｄｎｅｒはｅ１５．５とｅ１８．５と比較して弱いようであった。しかし、幾つかの細胞はＤｎｅｒを高いレベルで発現した。要約すると、Ｄｎｅｒ免疫反応性はマウス膵臓発生のｅ１５．５日目における膵臓の中枢ドメインに局在化する細胞型において最も高度に発現し、高度に特徴的な「Ｎｇｎ３様」染色様式を伴った（現在内分泌プレ前駆体及び内分泌前駆体（Ｎｇｎ３＋細胞）である細胞を含むことが知られている）。Ｄｎｅｒはより後段階の内分泌細胞及び完全に分化した内分泌細胞においてより低いレベル発現し得る。Ｄｎｅｒは神経において発現する（膵臓及び膵臓間葉の両者を神経支配する）。
【０２１０】
実施例５：蛍光染色で可視化したｅ１５．５ｗｔ及びＮｇｎ３機能喪失突然変異マウス膵臓におけるＤｎｅｒ、Ｐｄｘ１、及びＨｕｃ／ＨｕＤの局在化
Ｄｎｅｒの発現の開始がＮｇｎ３タンパク質の発現の前であるという仮説を試験するために、野生型及びＮｇｎ３-機能欠損突然変異ｅ１５．５マウス膵臓をＤｎｅｒ、Ｐｄｘ１、及び神経マーカーＨｕＣ／ＨｕＤについて染色した。データはＤｎｅｒがｎｇｎ３-発現欠損マウスにおいて発現することを明確に示した。Ｄｎｅｒは従ってＮｇｎ３より前に発現するマーカーである。
【０２１１】
方法の記載についてはここの実施例４を参照されたい。具体的には、マウス抗ＨｕＣ／ＨｕＤ（Molecular Probes、Ａ−２１２７１）を１：１５０で使用し、サル抗マウスｃｙ２で展開した。ウサギ抗Ｐｄｘ１（Ｈｍ-２５３）を１：６００で使用し、サル抗ウサギｃｙ５で展開した。
【０２１２】
結果はｅ１５．５野生型膵臓中でＤｎｅｒ陽性細胞のほとんどがＰｄｘ１を共発現し、Ｐｄｘ１ｈｉｇｈを共発現しないことを示した。Ｐｄｘ１と共局在しないＤｎｅｒ免疫反応性の幾つかは、膵臓中で、神経マーカーであるＨｕＣ／ＨｕＤと共局在する。ＤｎｅｒとＨｕＣ／ＨｕＤの共局在は、膵臓を神経支配する。ＨｕＣ／ＨｕＤ染色は強い。強いＤｎｅｒ染色はまた膵臓中でも観察された。幾つかのＤｎｅｒ陽性細胞はＰｄｘ１とＨｕＣ／ＨｕＤのいずれも共発現しなかった。ｅ１５．５のＮｇｎ３機能欠損突然変異膵臓において、多くのＤｎｅｒ免疫反応性が長い糸で観察された（矢頭）。このようなＤｎｅｒ陽性細胞はＨｕＣ／ＨｕＤ及びＰｄｘ１について陰性であった。わずかにいくつかのＤｎｅｒ陽性細胞Ｄｎｅｒ陽性細胞がＰｄｘ１を共発現することが見出された。Ｐｄｘ１を共発現しなかったＤｎｅｒ陽性細胞は、Ｐｄｘ１陽性内胚葉から葉裂するようであった。そしてＣ’−Ｃ’’’’中で観察されたＤｎｅｒ＋／ＰＤｘ１−細胞の糸は、このような葉裂細胞を示し得る（矢頭）。このことは一度細胞がＤｎｅｒになると、Ｎｇｎ３はＰｄｘ１を維持するために必要であることを示すであろう。
【０２１３】
実施例６：蛍光染色よって可視化したマウスｅ１５．５膵臓中のＤｎｅｒ、Ｐａｘ６、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、及びＰｔｆｌａの局在化
切片の作製は、ここの実施例４を参照されたい。ヤギ抗Ｄｎｅｒは、切片上で１：７５（ＴＳＡ-ｃｙ３で展開した）及び全量で１：２５０（サル抗ヤギｃｙ２で展開した）で使用した。ウサギ抗Ｐａｘ６（Covane、ＰＲＧ-２７８Ｐ）を切片上で１：２００（サル抗ウサギｃｙ５で展開した）、及び全量で１：２０００（ＴＳＡ-ｃｙ３で展開した）で使用した。ウサギ抗Ｐｄｘ１（Ｈｍ-２５３）を切片上で１：５００（サル抗ウサギｃｙ５で展開した）使用した。モルモット抗Ｐｄｘ１を全量で１：１０００（Abcam、ａｂ４７３０８−１００、サル抗ウサギｃｙ５で展開した）で使用した。マウス抗Ｎｇｎ３（AbCore、Ｆ２５Ａ１Ｂ３）を切片上で１：１００（サル抗ウサギｃｙ２で展開した）で使用した。ウサギ抗Ｎｇｎ３（AbCore、２３６９Ｂ）を全量で１：１６０００で使用した（ＴＳＡ-ｃｙ３で展開した）。ウサギ抗Ｐｔｆｌａを全量で１：５０００（サル抗ウサギｃｙ５で展開した）で使用した。全量の方法については、Ahnfelt-Ronne J等., J Histochem Cytochem. 2007 Sep;55(9):925-30を参照されたい。
【０２１４】
全量の結果は、Ｄｎｅｒが中枢内分泌Ｐａｘ６ドメインに局在化していることを示した。しかし、切片上では、Ｄｎｅｒ陽性細胞が、主にＰａｘ６について陰性であるが、Ｐａ６発現細胞に非常に近接して発現していることが観察された。幾つかのＤｎｅｒ陽性細胞は、Ｐａｘ６を共発現した。更なる全量の研究から、ＤｎｅｒがＰｄｘ１ｈｉｇｈ発現細胞が局在化している膵臓の中枢ドメインに局在化していることは明らかであった。切片上では、Ｄｎｅｒが主としてＰｄｘ１ｈｉｇｈ細胞核に対して陰性であるが、Ｐｄｘ１を発現する全てのＤｎｅｒ発現細胞に近いことが観察された。全てのＮｇｎ３を用いたＤｎｅｒ染色は、Ｄｎｅｒが他の細胞型中でＮｇｎ３を発現する内分泌前駆体を含む膵臓の中枢ドメインに局在化していることを示した。切片上で、幾つかのＤｎｅｒ陽性細胞がＮｇｎ３を共発現し、他のＤｎｅｒ陽性細胞がＮｇｎ３に対して陰性であることが観察された。最終的にＤｎｅｒが腺房細胞をマークするＰｔｆｌａを共発現しないことが観察された。これらの結果からｅ１５．５においてＤｎｅｒは膵臓内胚葉（ＤｎｅｒはＰｄｘ１と共局在する）において発現し、Ｄｎｅｒは主に膵臓内胚葉で発現することが観察された。ＤｎｅｒはＮｇｎ３と共発現し、Ｎｇｎ３が細胞中で刺激する前にも発現した（Ｄｎｅｒ陽性細胞の大多数は、Ｐｄｘ６と共局在せず、Ｐｄｘ１陽性Ｄｎｅｒ細胞はＮｇｎ３機能欠損突然変異膵臓で見出されることに注意されたい。（ここの実施例５））。従って、ＤｎｅｒはＮｇｎ３の前の発生段階における新しい細胞型である、内分泌プレ前駆体細胞中で発現するようである。ＤｎｅｒがＰｔｆｌａと共局在しないのでＤｎｅｒは腺房系の一部ではないことが示された。従って、Ｄｎｅｒは内分泌プレ前駆体細胞を精製するために使用され得る。更に、Ｄｎｅｒは、また内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞の幾つか及び完全に分化した内分泌細胞の多くにおいて発現し（ここの実施例４）、従ってこのような細胞を精製するためにまた使用され得る。
【０２１５】
実施例７：蛍光染色により可視化されるｅ１５．５マウス膵臓における、Ｄｎｅｒ及びＤｄｒ１の局在化
ｅ１５．５マウス膵臓及び他の内分泌細胞型において、Ｄｎｅｒ及びＤｄｒ１の局在化を測定するために、蛍光染色を実施した。方法の記載についてはここの実施例４を参照されたい。ヤギ抗Ｄｄｒ１（R&D systems、ＡＦ２３９６）は１：１５０で使用され、ヤギ抗Ｄｎｅｒを１：７５で使用し、両者はＴＳＡ-ｃｙ３で展開した。
【０２１６】
実験は蛍光染色によって可視化されるｅ１５．５マウス胚中のＤｎｅｒ及びＤｄｒ１の局在化を決定するために実施された。結果はこの時間点において近接する内胚葉−腺房又は胃後壁にはない内分泌前駆体を他の細胞型の間に含む膵臓の中枢ドメインで高度に広範囲に発現した（Ｎｋｘ６．１の様に）。膵臓から更に離れてＤｄｒ１は前胃、食堂及び胚の幾つかの部位で発現する。神経管において、幾つかの発現が中枢部位において観察された。Ｄｄｒ１は、一般的に神経管の中枢部位における幾つかの発現から離れた神経組織において発現しなかった。Ｄｎｅｒはまた膵臓の内胚葉において発現した。しかしこれから離れて、胃の前後壁、十二指腸、食道及び胚において観察されるように内胚葉で発現しなかった。しかしＤｎｅｒは神経管の非中枢部位で強く発現した。更にＤｎｅｒは体内の神経で広く発現した。Ｄｎｅｒは胃、十二指腸及び食堂の周囲の神経で観察された。神経管では、Ｄｄｒ１とＤｎｅｒは、相補パターンで発現するようであった。内胚葉におけるＤｄｒ１とＤｎｅｒ発現を比較すると、Ｄｎｅｒは膵臓で発現するだけなのに対しＤｄｒ１はより広く発現した。膵臓では、ＤｎｅｒはＤｄｒ１陽性細胞のサブセットで発現するだけなので、Ｄｄｒ１はまたＤｎｅｒより広く発現した。結果はまた動眼核及び滑車核における脳幹運動ニューロンを除く全ての分化した神経中で発現する、Ｐｈｏｘ２ｂがＤｎｅｒと共発現することを示した。
【０２１７】
結果には、ＤｎｅｒとＤｄｒ１の両者の二重陽性細胞及びＤｎｅｒ又はＤｄｒ１二重陽性細胞が、蛍光染色で可視化されたｅ１５．５膵臓において見出されることがさらに示された。
【０２１８】
結果には、Ｄｎｅｒ又はＤｄｒ１陽性細胞が、蛍光染色で可視化されたｅ１５．５膵臓において、グレリンを共発現しなかったことが示された。
【０２１９】
結果には、約９０％のＮｇｎ３陽性細胞が、蛍光染色で可視化されたｅ１５．５膵臓において、Ｄｄｒ１を同時発現することがさらに示された。
【０２２０】
結果には、蛍光染色で可視化された場合に、細胞増殖のマーカーであるＫｉ-６７について陽性であるため、ｅ１５．５膵臓において、約５−１０％のＤｄｒ１陽性細胞が増殖していることがさらに示された。
【０２２１】
結果には、ｅ１５．５で、Ｄｄｒ１は、管から十二指腸への接合部に近接した主な膵臓管のほとんど全ての細胞で発現したことがさらに示された。特にＤｎｅｒ及びＤｄｒ１の両者は膵臓でのみ発現しており、主な膵臓管のＤｄｒ１陽性細胞と、十二指腸のＤｄｒ１陰性細胞とＤｄｒ１陰性細胞とのはっきりとした境界が、蛍光染色による可視化により観察された。
【０２２２】
幾つかの膵臓細胞を含む内胚葉に主に分化するＥＳ培養体では、Ｄｎｅｒ結合試薬は膵臓の内分泌プレ前駆体細胞だけでなく一般的に神経細胞にも特異的に結合することが観察される。Ｄｄｒ１結合試薬はまた内分泌プレ前駆体細胞にも結合し得るが、加えて膵臓の管／内分泌前駆体細胞にも結合し得る。しかし、Ｄｎｅｒ結合試薬の場合と反対に、Ｄｄｒ１結合試薬は神経細胞には結合せず、膵臓細胞以外の他の内胚葉細胞に反応し得る。従って、最初にＤｄｒ１結合試薬を使用することによって、管／内分泌内胚葉細胞は、他の内胚葉と一緒に精製し得るが、次いで、Ｄｎｅｒ結合試薬を同時に又は連続的に使用することにより、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞を精製し得るが、完全に分化した内分泌細胞は精製し得ない。しかし、Ｄｎｅｒ免疫反応性はｅ１８．５よりｅ１５．５において、成体で強いようであり、このことは内分泌プレ前駆体細胞及び内分泌前駆体だけを選択的に精製するために使用され得る。得られた細胞個体群は、他の内胚葉及び神経細胞型のような他の細胞型の低比率を含み得る。
【０２２３】
幾つかの態様では、蛍光染色によって可視化されるｅ１５．５マウス膵臓におけるＤｄｒ１の局在化は、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０６１の実施例４に従って実施され得、これに関する結果はその中に示される。
【０２２４】
実施例８：蛍光線色によって可視化したＷＧ２１ヒト膵臓中のＤＮＥＲ、インスリン及びグルカゴンの局在化
蛍光染色をヒトＷＧ２１膵臓中のＤｎｅｒ、インスリン及びグルカゴンの局在化を決定するために実施した。切片は最初に脱パラフィン化した。ヤギ抗Ｄｎｅｒ（Ｒ＆Ｄシステム、０．２ｍｇ／ｍｌ）を１：７５で使用し（即ち、２．７μｇ／ｍｌ）、ＴＳＡ-ｃｙ３で展開した。インスリンは、モルモット抗ヒトインスリン１：１００（Ａｂｃａｍ、全血清）で検出し、グルカゴンはウサギ抗ヒトグルカゴン１：１００（ＤＡＫＯ、全血清）で検出した。染色はサル抗モルモット-Ｃｙ２とサル抗ウサギ-Ｃｙ５で展開した。方法の記述は、ここの実施例４を参照されたい。
【０２２５】
結果は、ＤＮＥＲ発現がヒト膵臓で見出されることを示した。幾つかの細胞はＤＮＥＲに対し強い陽性であり、幾つかは弱い陽性であった。ＤＮＥＲの強い陽性細胞は、一般的にインスリン又はグルコガンを共発現しないことが見出されている。しかし、ＤＮＥＲの弱い陽性細胞の幾つかは、インスリン又はグルカゴンに対し陽性である。
【０２２６】
実施例９：Ｄｎｅｒを使用したアルファＴＣ細胞の分離
アルファＴＣのＤｎｅｒ分離は、リリー固定液に４５分固定化した細胞を使用して分析ＦＡＣＳ分離によって実施した。上清を除くため、細胞を１４００ｒｐｍで１０分間室温で２ｍｌのチューブでペレット化した。続いての細胞を０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で洗浄し、動物からの１０％血清（最終濃度）に達するまで血清を添加することによりブロックするが、ここで、二次抗体を起こし、１時間ブロックした。細胞は、次いでペレット化し、上清を除いた。一次抗体溶液を添加し、室温で終夜インキュベートした。翌日細胞を２ｍｌチューブ中で３ｘ５分間洗浄した（１．８ｍｌ使用）。二次抗体を添加し、１時間室温でインキュベートした。細胞を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で３ｘ５分間洗浄した（１．８ｍｌ使用）。二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。最後に、ＦＡＣＳで細胞をアッセイした。具体的には、ヤギ抗Ｄｎｅｒを１：１５０で使用し、サル抗ヤギｃｙ２（１：３００）で展開した。
【０２２７】
結果を図７に示す：Ｄｎｅｒ抗体を用いたアルファＴＣのＦＡＣＳ。結果は一次ヤギ抗Ｄｎｅｒ抗体と二次サル抗ヤギＣｙ２抗体の何れとも一緒にインキュベートしてないアルファＴＣのＦＡＣＳを実施し、非常に弱いＣｙ２蛍光（即ち、バックグラウンド）を有する細胞個体群を得た。二次のサル抗ヤギＣｙ２抗体を添加し、注目に値する蛍光の増加を得た−このことは、二次抗体の細胞への非特異的な結合が原因であった（即ち、バックグラウンド）。一次のヤギＩｇＧアイソタイプコントロールを添加すると、二次抗体単独（即ち、バックグラウンド）の場合と殆ど同様の蛍光が得られた。しかし、ヤギ抗Ｄｎｅｒを添加すると、注目に値する蛍光の増加が得られ、Ｄｎｅｒタンパク質をＦＡＣＳにおけるタグとして使用し得ることが示された。
【０２２８】
主として膵臓細胞を含む内胚葉及び幾らかの神経細胞になるように分化したＥＳ細胞培養体は、ＦＡＣＳによりアルファ細胞と同様の方法で精製し得る。マーカーＤｎｅｒを使用して分離することにより、内分泌プレ前駆体個体群は、幾らかの神経細胞を伴って精製され得る。マーカーＤｄｒ１を使用して分離することにより、管／内分泌前駆体、内分泌プレ前駆体、内分泌前駆体、及び／又は初期の内分泌細胞を他の内胚葉細胞を伴って精製し得る（Ｄｎｅｒ内分泌プレ前駆体細胞もまた含む）。しかし、マーカーＤｄｒ１とＤｎｅｒを組み合わせて使用し二重分離を実施し、純粋な前駆体プレ前駆体、内分泌前駆体、及び／又は初期の内分泌細胞を得るであろう。二重分離は、開始個体群が神経細胞がない膵臓由来の内胚葉のみからなる場合は必要ないであろう。
【０２２９】
幾つかの態様では、ＦＡＣＳを介してＤｄｒ１を使用するベータＴＣ３細胞のような細胞の分離は、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０６１の実施例５に従って実施され得、これに関する結果はその中に示される。
【０２３０】
実施例１０：ＦＡＣＳによるｅ１５．５マウス膵臓からのＤｎｅｒ陽性細胞の分離
実験の目的は、原発性細胞がＤｎｅｒについて分離され得るかどうかを試験することである。
ＮＭＲＩｅ１５．５胚の膵臓を氷冷ＰＢＳ中でミクロ切断することによって単離した。単一の細胞を３０℃で約１時間又は例えば、組織の量に依存して単一の細胞が得られるまで、アクターゼと共にインキュベートすることにより組織から作製した。細胞は５ｍｌの氷冷ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｐ／Ｓを添加することにより、１０ｍｌｖ-チューブで２回洗浄し、４℃で５分間１２００ｒｐｍで細胞をペレットにし、３ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｐ／Ｓ＋１０％ＦＣＳに再懸濁した。細胞を次いで３７℃で２．５時間再インキュベートし、ペレット化し、氷冷ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ中に再懸濁した。一次抗体溶液（ラット抗-ｍＤｎｅｒ、ＩｇＧ１型、１０μｇ／ｍｌ又はアイソタイプ、１０μｇ／ｍｌ）を添加し、４５分間氷上でインキュベートした。細胞を５ｍｌのＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡを用いてｖ-チューブ中で３回洗浄した。二次抗体（サル抗-ラット-ｃｙ２、Jackson ImmunoResearch、ストック濃度 １．５ｍｇ／ｍｌ、１：３００で使用、即ち、５μｇ／ｍｌ）を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を５ｍｌＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡを用いてｖ-チューブ中で３回洗浄した。最後に、細胞はＦＡＣＳで評価した。
【０２３１】
図８に示す結果は、１０μｇ／ｍｌのＤｎｅｒ抗体（Ａ）及び１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ１アイソタイプコントロール（Ｂ）を使用した結果を示す。結果はアイソタイプ抗体と比較して特異的抗体を用いると、ｅ１５．５細胞個体群はより高い蛍光を示すようにシフトすることを示す。
【０２３２】
幾つかの態様では、ＦＡＣＳを介してＤｄｒ１を使用するマウス胚性膵臓細胞は、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０６１の実施例６に従って実施され得、これに関する結果はその中に示される。
【０２３３】
実施例１１：ＦＡＣＳによって分離されるｅ１５．５マウス膵臓からのＤｎｅｒ陽性細胞の特徴付け
実験の目的は胚性膵臓からのＤｎｅｒ陽性細胞がどのような細胞型を生じるか決定し、このような細胞の可能性を試験することである。
【０２３４】
Ｄｎｅｒ陽性及び陰性である細胞はここの実施例１０の通り胚性膵臓から分離される。２個の細胞個体群をKroon, E.等. (2008), Nat Biotechnol 26, 443 - 452に記載の通り腎臓カプセルの下に移植した。移植部位は処理され、ここの実施例４及び６に記載のＩＨＣによって染色した。続くインビボ成熟では、移植した細胞をインビトロで回収し、グルコース調節インスリン分泌の試験のように、機能的に試験した。Ｄｎｅｒ陽性個体群の移植物はインスリン／グルカゴン発現細胞を含み、Ｄｎｅｒ陰性細胞の移植物は外分泌細胞を含み得、従ってアミラーゼとＤＢＡについて陽性に染色されることが期待される。従ってＤｎｅｒ陽性細胞はまた血糖レベルを規格化することもできるであろう。
【０２３５】
幾つかの態様では、胎児膵臓由来細胞又はＦＡＣＳを使用しＤｄｒ１を介して単離されるＥＳ由来細胞中のインスリン産生の検出は、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０６１の実施例７又は８に従って実施され得る。
【０２３６】
実施例１２：膵臓に分化する運命であるヒトＥＳ細胞中でのＤｄｒ及びＤｎｅｒの発現
膵臓に分化する運命であるヒトＥＳ細胞中でのＤｄｒ１及びＤｎｅｒの発現を決定するために、このような細胞を固定化し、ここの実施例４に記載の方法に従って染色し得る。
【０２３７】
実施例１３：ｈＥＳ細胞から分化した膵臓内分泌細胞の精製
実験の目的は、ベータ細胞とその他の内分泌細胞及びその内分泌関連前駆体を精製することである。
【０２３８】
胚幹細胞を単離し、段階４に達するまで、Kroon, Eら(2008), Nat Biotechnol 26, 443 - 452に記載されたプロトコルに従い、分化させてよい。管-内分泌前駆体細胞、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞又は初期内分泌細胞の亜集団を精製するために、ＥＳ由来細胞を単一の細胞とし、Ｄｎｅｒ及びＤｄｒ１を単独又は組み合わせて、下記の修正を伴って、ここの実施例６に記載の通り染色した：マウス抗-Ｄｄｒ１(R&D Systems、ＭＡＢ２３９６)及びマウス抗Ｄｎｅｒ（Ｒ＆Ｄシステム、ＭＡＢ３６４６）抗体を使用した。二次抗体及び洗浄後、細胞を固定せず、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％のＦＣＳ＋Ｐ／Ｓを含有する２つのチューブに、ＦＡＣＳＡｒｉａｎにおいて、生存している状態で選別する。ポジティブ細胞を、最初のチューブに選別する。ネガティブ細胞を他方のチューブに選別する。その後、Kroon, Eら. (2008), Nat Biotechnol, 26, 443 - 452に記載されたようにして、腎臓の下にカプセルをインプラントする。陽性個体群からのインプラントはインスリン／グルカゴン発現細胞を含み、陰性細胞はアミラーゼ陽性細胞を含むことが期待される。
【０２３９】
実施例１４：Ｌｒｐ１１、Ｄｉｓｐ２及びＳｅｚ６ｌ２の局在化
インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を成体マウス膵臓からの凍結切片においてＬｒｐ１１、Ｄｉｓｐ２及びＳｅｚ６ｌ２について実施した。特的なＩＳＨシグナルがランゲルハンスの内分泌島で観察された。ｅ１８．５及びｅ１５．５において、またＩＳＨシグナルが内分泌コンパートメントに局在していた。これはＬｒｐ１１、Ｄｉｓｐ２又はＳｅｚ６ｌ２を認識する抗体の使用によって確認された。成体膵臓におけるＩＨＣは、Ｌｒｐ１１、Ｄｉｓｐ２及びＳｅｚ６ｌ２が全てランゲルハンスの内分泌島でホルモン産生細胞と共局在していることを示した。胚性膵臓では、Ｌｒｐ１１、Ｄｉｓｐ２又はＳｅｚ６ｌ２について陽性の細胞の幾つかは、ホルモンを共発現する一方で、その他はホルモンを共発現しなかった。しかしいつもＬｒｐ１１、Ｄｉｓｐ２又はＳｅｚ６ｌ２ＩＨＣシグナルは胚性膵臓の中枢内分泌ドメインで見出された。
【０２４０】
実施例１５：ＦＡＣＳによるＤｉｓｐ２又はＳｅｚ６ｌ２陽性細胞の分別
実験は成体島形態マウスがＤｉｓｐ２に対するモノクローナル抗体を使用することによりＦＡＣＳで分離し得ることを示した。Ｓｅｚ６ｌ２に特的なウサギ血清は、ベータＴＣ細胞をＦＡＣＳ分離するために使用した。
【０２４１】
実施例１６：ＤＮＥＲ、ＤＤＲ１、及び／又はＮｇｎ３の発現の定量による幹細胞の分化のためのインビトロプロトコルの最適化
ＥＳ分化の効率的な最適化のため、完全に分化した内分泌細胞に成長する膵臓細胞の種々の段階を同定するマーカーを有することは非常に重要である（図１を参照されたい）。Ｄｎｅｒ、Ｄｄｒ１、及びＮｇｎ３は、他のマーカーを使用して検知することが今日まで不可能であった重要で特異的な細胞分化の段階を特定するために組み合わせて使用され得る。Ｄｎｅｒ、Ｄｄｒ１、及びＮｇｎ３は、一又は複数の付加的なマーカーと組み合わせて使用され得る。
【０２４２】
内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞の同定は、細胞個体群をＤｎｅｒ結合試薬、Ｄｄｒ１結合試薬、及び／又は他の内胚葉マーカー（例えば、Ｐｄｘ１又はＥ-カドヘリン結合試薬）の結合試薬と接触させ染色を評価することによってなされ得る。結合試薬の選択は、Ｄｄｒ１は内胚葉をマークするが、膵臓を刺激する神経細胞はマークしないため、細胞培養体中に神経細胞が存在するかに依存してよい。しかし、Ｄｎｅｒの高発現レベルは、内分泌細胞になることになっている内分泌プレ前駆体又は内分泌前駆体である細胞をマークする。三重陽性である、Ｎｇｎ３及びＤｄｒ１細胞に対する同時染色により、内分泌前駆体群のグルーピングが可能となり、高レベルのＤｎｅｒ免疫反応性を有し、Ｎｇｎ３を欠いてＤｄｒ１免疫反応性を有する細胞は内分泌プレ前駆体細胞に属する。この分析は、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、ＩＨＣ、又はパニング等の方法を使用して実施されてよい。
【０２４３】
いくつかの態様において、幹細胞の分化についてのインビトロプロトコルを最適化する方法は、最適な培養条件をスクリーニングする方法である。
【０２４４】
いくつかの態様では、幹細胞の分化についてのインビトロプロトコルを最適化する方法は、以下の工程を含む：
ａ）１)細胞個体群とＤＮＥＲ結合試薬とを接触させ、２)細胞表面マーカーとしてＤＮＥＲを示す細胞(ＤＮＥＲ陽性細胞)の量を測定することによる、ＤＮＥＲ陽性細胞の定量；
ｂ）場合によっては、ＤＮＥＲ結合試薬と結合しない細胞から、ＤＮＥＲ陽性細胞のフラクション中の、ＤＮＥＲ結合試薬と結合した細胞を分離；
ｃ）場合によっては、得られた細胞型(類)の増殖を容易にする条件下にて、ＤＮＥＲ陽性細胞を含む細胞個体群を培養することによる、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞の数を増加；
ｄ）管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び十分に分化した内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞への分化を容易にする条件下にて、ＤＮＥＲ陽性細胞を含む細胞個体群を培養；
ｅ）場合によっては、得られた細胞型(類)の増殖を容易にする条件下にて、ＤＮＥＲ陽性細胞を含む細胞個体群を培養することによる、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期の内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞の数を増加；
ｆ）１)細胞個体群とＤＮＥＲ結合試薬とを接触させ、２)細胞表面マーカーとしてＤＮＥＲを示す細胞(ＤＮＥＲ陽性細胞)の量を測定することによる、ＤＮＥＲ陽性細胞の定量；
ｇ）工程ｆ）のＤＮＥＲ陽性細胞の量が、工程ａ）のＤＮＥＲ陽性細胞の量より多いかどうかを測定；
ｈ）場合によっては、ＤＮＥＲ結合試薬と結合しない細胞から、ＤＮＥＲ陽性細胞のフラクション中の、ＤＮＥＲ結合試薬と結合した細胞を分離；
ｉ）場合によっては、分化に影響を与える条件を変えることにより、ＤＤＲ１陽性細胞の量を増加させるための培養条件、例えば１）分化因子の濃度又は組合せ、２）成長培地の濃度又は組成、３）成長培地へのサプリメントの濃度又は組成、４）インキュベート時間、及び／又は５）酸素分圧、を調節することを導入；
ｊ）場合によっては、ＤＮＥＲ結合試薬と結合しない細胞から、ＤＮＥＲ陽性細胞のフラクション中の、ＤＮＥＲ結合試薬と結合した細胞を分離；
ｋ）満足のいく量のＤＮＥＲ陽性細胞が得られるまでの、工程ａ）ないしｈ）のシーケンスの繰り返し。
【０２４５】
幾つかの態様では、幹細胞の分化のためのインビトロプロトコルの最適化法は、ＤＤＲ１結合試薬とＤＮＥＲ結合試薬の連続的な使用を含む。幾つかの態様では、ＤＤＲ１結合試薬の使用は、ＤＮＥＲ結合試薬の使用前になされる。ａ）からｋ）の工程によって定義されるＤＮＥＲ結合試薬の使用に関する上記の方法は、工程ａ）の前及び／又は工程ｄ）の前の以下の工程α）からγ）：
α）細胞個体群にＤＤＲ１結合試薬を接触させ２）細胞表面マーカー（ＤＤＲ１陽性細胞）としてＤＤＲ１を発現する細胞の量を決定し；
β）所望によりＤＤＲ１結合試薬に結合しない細胞からＤＤＲ１陽性細胞の画分におけるＤＤＲ１結合試薬に結合する細胞を分離し；
γ）所望により得られた細胞型の増加を容易にする条件下でＤＤＲ１陽性細胞を含む細胞個体群を培養することにより、管／内分泌前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、及び初期内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞の数を増やす；
の使用のような、ＤＤＲ１結合試薬の使用と組み合わせ得る。
【０２４６】
幾つかの態様では、幹細胞の分化のためのインビトロプロトコルの最適化法は、ＤＤＲ１結合試薬とＤＮＥＲ結合試薬及びＬＲＰ１１及び／又はＤＩＳＰ２及び／又はＳＥＺ６Ｌ２及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬の連続的な使用を含み、ＤＮＥＲ結合試薬の使用は上の工程ａ）からｋ）によって定義され得、ＤＤＲ１結合試薬の使用は上の工程α）からγ）によって定義され、工程ａ）の前及び／又は：工程ｄ）の前並びに工程γ）又はｃ）の後に使用され得る。
ｉ）細胞個体群にＬＲＰ１１、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬を接触させ２）細胞表面マーカー（ＬＲＰ１１、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞）としてＬＲＰ１１、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２及び／又はＳＬＣ３０Ａ８を発現する細胞の量を決定し；
ｉｉ）所望によりＬＲＰ１１、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬に結合しない細胞からＬＲＰ１１、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞の画分におけるＬＲＰ１１、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬に結合する細胞を分離する。
【０２４７】
幾つかの態様では、幹細胞の分化のためのインビトロプロトコルの最適化法は、ＤＤＲ１結合試薬とＬＲＰ１１及び／又はＤＩＳＰ２及び／又はＳＥＺ６Ｌ２及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬の連続的な使用を含み、ＤＤＲ１結合試薬の使用は上の工程α）からγ）によって定義され、ＲＰ１１及び／又はＤＩＳＰ２及び／又はＳＥＺ６Ｌ２及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬は、工程γ）の後の工程ｉ）及びｉｉ）によって定義される通り使用される。
【０２４８】
いくつかの態様では、ＤＮＥＲ及び／又はＤＤＲ１陽性細胞の量的測定は、自動化された染色システム、例えば蛍光検出を使用して実施されてよい。
【０２４９】
内分泌前駆体細胞、及び／又は初期の内分泌細胞の同定は、場合によっては、他の内胚葉マーカーについての付加的な結合試薬(例えば、Ｐｄｘ１結合試薬)と組合せて、ＤＤＲ１結合試薬と細胞個体群とを接触させ、染色を評価することにより達成され得る。結合試薬の選択は、例えばＤＤＲ１は内胚葉をマークするが、膵臓を刺激する神経細胞はマークしないため、神経細胞が存在するかどうか等、細胞培養体の組成に依存してよい。二重陽性である、Ｎｇｎ３及びＤＤＲ１細胞に対する同時染色により、内分泌前駆体群のグルーピングが可能となる。この分析は、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、ＩＨＣ、又はパニング等の方法を使用して実施されてよい。
【０２５０】
幾つかの態様では、ＤＤＲ１の定量による幹細胞分化のためのインビトロプロトコルの最適化は、ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６８０６１の実施例９に従って実施され得る。
【０２５１】
ここに記載の本発明は、バンダービルト大学を通し、ＮＩＨ／ＮＩＤＤＫからの付与(＃５Ｕ０１-ＤＫ０７２４７３)により支持されている。
【０２５２】
本発明の実施態様
１．内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞を同定する方法において、膵臓細胞を含む細胞個体群をＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される一又は複数の結合試薬に接触させることを含む方法。
２．内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞を同定する方法において、膵臓細胞を含む細胞個体群をＤＮＥＲ結合試薬に接触させることを含む方法。
３．内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の培養体を得る方法において、膵臓細胞を含む細胞個体群をＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される一又は複数の結合試薬に接触させ、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞の画分中のＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬に結合する細胞を、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬に結合しない細胞から分離することを含む方法。
４．内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の培養体を得る方法において、膵臓細胞を含む細胞個体群をＤＮＥＲ結合試薬に接触させ、ＤＮＥＲ陽性細胞の画分中のＤＮＥＲ結合試薬に結合する細胞を、ＤＮＥＲ結合試薬に結合しない細胞から分離することを含む方法。
５．内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の培養体を得る方法において、実施態様３又は４の方法に従って精製された細胞を得、次いで、得た細胞を、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞への膵臓細胞の分化を容易にする条件下で培養することを含む方法。
６．内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の培養体を得る方法において、実施態様３又は４の方法に従って精製された細胞を得、次いで、得た細胞を、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞への細胞分化を容易にする条件下で培養することを含む方法。
７．内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む膵臓細胞の数を増加する方法において、実施態様３又は４に従って精製された細胞を得、次いで、得た型の細胞増殖を容易にする条件で、得た細胞を培養することを含む方法。
８．内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の数を増加する方法において、実施態様７に従って精製し、増殖した細胞を得、次いで、得た細胞を、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞への膵臓細胞の分化を容易にする条件下で培養することを含む方法。
９．内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される細胞を含む細胞の数を増加する方法において、実施態様７に従って精製し、増殖した細胞を得、次いで、得た細胞を、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期内分泌細胞、及び／又は完全分化内分泌細胞からなる群から選択される膵臓細胞への細胞の分化を容易にする条件下で培養することを含む方法。
１０．細胞が実施態様１から９の何れか一項に記載の方法によって得られる、少なくとも一の膵臓ホルモンの産生欠損の哺乳類に、膵臓の内分泌機能を与える方法において、哺乳類の少なくとも一の膵臓ホルモンの測定可能な量を産生するために十分な量の得られた細胞を哺乳類に移植する工程を更に含む方法。
１１．膵臓ホルモンの量が、移植後の日よりも早くないか又は少なくとも１、２、３又は４週間後のような、インビボ成熟後に決定される、実施態様１０に記載の方法。
１２．前記の少なくとも一の膵臓ホルモンがインスリンである、実施態様１０又は１１に記載の方法。
１３．哺乳類がヒトである、実施態様１０から１２の何れかに記載の方法。
１４．前記の少なくとも一の膵臓ホルモンが、インスリン、グルコガン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及びグレリンからなる群から選択される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
１５．ａ）細胞にＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される一又は複数の結合試薬を接触させ、ｂ）細胞表面マーカー（ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞）としてＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８を発現する細胞の量を決定することにより、膵臓細胞を含むＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞を定量する方法。
１６．ａ）細胞にＤＮＥＲ結合試薬を接触させ、ｂ）細胞表面マーカー（ＤＮＥＲ陽性細胞）としてＤＮＥＲを発現する細胞の量を決定することにより、膵臓細胞を含むＤＮＥＲ陽性細胞を定量する方法。
１７．ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８発現細胞（ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞）数が定期的に監視される、インビトロプロトコルにおける最適化のための方法。
１８．ＤＮＥＲ発現細胞（ＤＮＥＲ陽性細胞）数が定期的に監視される、インビトロプロトコルにおける最適化のための方法。
１９．一又は複数の付加的な結合試薬をＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される一又は複数の結合試薬と、同時に又は連続的に組み合わせて使用する、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
２０．一又は複数の付加的な結合試薬をＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬と、同時に又は連続的に組み合わせて使用する、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
２１．一又は複数の付加的な結合試薬をＤＮＥＲ結合試薬と、同時に又は連続的に組み合わせて使用する、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
２２．付加的な結合試薬が、ＤＤＲ１、プロミニン１（ＣＤ１３３としても知られる）、及びＣＤ４９ｆ結合試薬からなる群から選択される、実施態様２０又は２１の何れかに記載の方法。
２３．付加的な結合試薬が、ＤＤＲ１結合試薬である、実施態様２０又は２１の何れかに記載の方法。
２４．ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８陽性細胞が、更にインスリン産生細胞に分化し、グルコガン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及び／又はグレリン産生細胞からなる群から選択される細胞に更に分化される細胞を伴ってもよい、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
２５．ＤＮＥＲ陽性細胞が、更にインスリン産生細胞に分化し、グルコガン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、及び／又はグレリン産生細胞からなる群から選択される細胞に更に分化される細胞を伴ってもよい、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
２６．膵臓細胞を含む細胞個体群が、膵臓から得られる、実施態様１から２５の何れか一に記載の方法。
２７．膵臓細胞を含む細胞個体群が、体細胞個体群から得られる、実施態様１から２５の何れか一に記載の方法。
２８．体細胞個体群が、ＥＳ様細胞のような多能性細胞に脱分化するために誘導される、実施態様２７に記載の方法。
２９．膵臓細胞を含む細胞個体群がＥＳ細胞のような多能性細胞から得られる、実施態様１から２５の何れか一に記載の方法。
３０．膵臓細胞を含む細胞個体群が脊椎動物由来である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
３１．膵臓細胞を含む細胞個体群が哺乳類由来である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
３２．膵臓細胞を含む細胞個体群がヒト由来である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
３３．膵臓細胞を含む細胞個体群がマウス由来である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
３４．膵臓細胞を含む細胞個体群がラット由来である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
３５．膵臓細胞を含む細胞個体群がニワトリ由来である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
３６．細胞個体群が膵臓内分泌系に分化する、実施態様３０から３５の何れか一に記載の方法。
３７．細胞の分化が一又は複数の分化因子を含む培地中で細胞を培養することを含む、実施態様３６に記載の方法。
３８．膵臓細胞を含む細胞個体群がベータ細胞陽性画分である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
３９．膵臓細胞を含む細胞個体群がｐｔｐｒｎ／ＩＡ２陽性画分である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
４０．膵臓細胞を含む細胞個体群がＡｂｃｃ８／Ｓｕｒ１陽性画分である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
４１．膵臓細胞を含む細胞個体群がＳｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ−８陽性画分である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
４２．上又はここの実施態様の何れか一に記載の方法によって得られる膵臓内分泌細胞の培養体が、ベータ細胞陽性画分において更に分離される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
４３．上又はここの実施態様の何れか一に記載の方法によって得られる膵臓内分泌細胞の培養体が、ｐｔｐｒｎ／ＩＡ２陽性画分において更に分離される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
４４．上又はここの実施態様の何れか一に記載の方法によって得られる膵臓内分泌細胞の培養体が、Ａｂｃｃ８／Ｓｕｒ１陽性画分において更に分離される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
４５．上又はここの実施態様の何れか一に記載の方法によって得られる膵臓内分泌細胞の培養体が、Ｓｌｃ３０ａ８／ＺｎＴ−８陽性画分において更に分離される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
４６．ＤＮＥＲ結合試薬がＤＮＥＲタンパク質に特異的に結合する抗体である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
４７．Ｄｉｓｐ２結合試薬がＤｉｓｐ２タンパク質に特異的に結合する抗体である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
４８．Ｓｅｚ６ｌ２結合試薬がＳｅｚ６ｌ２タンパク質に特異的に結合する抗体である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
４９．Ｌｒｐ１１結合試薬がＬｒｐ１１タンパク質に特異的に結合する抗体である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
５０．Ｓｌｃ３０ａ８結合試薬がＳｌｃ３０ａ８タンパク質に特異的に結合する抗体である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
５１．ＤＤＲ１結合試薬がＤＤＲ１タンパク質に特異的に結合する抗体である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
５２．分離又は監視の工程が蛍光標識細胞分取である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
５３．分離又は監視の工程が磁気標識細胞分取である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
５４．分離の工程がパニングによってなされる、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
５５．細胞が内分泌プレ前駆体細胞である、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
５６．Ｄｉｓｐ２結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりに使用される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
５７．Ｓｅｚ６ｌ２結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりに使用される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
５８．Ｌｒｐ１１結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりに使用される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
５９．Ｓｌｃ３０ａ８結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりに使用される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
６０．Ｄｉｓｐ２結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりにＤＤＲ１結合試薬と組み合わせて使用される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
６１．Ｓｅｚ６ｌ２結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりにＤＤＲ１結合試薬と組み合わせて使用される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
６２．Ｌｒｐ１１結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりにＤＤＲ１結合試薬と組み合わせて使用される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
６３．Ｓｌｃ３０ａ８結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりにＤＤＲ１結合試薬と組み合わせて使用される、上記実施態様の何れか一に記載の方法。
６４．実施態様１から６３の何れかで定義される方法によって得られる、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び／又は完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される単離細胞。
６５．前記単離細胞が内分泌プレ前駆体細胞である、実施態様６４に記載の単離細胞。
６６．前記単離細胞が完全に分化した内分泌細胞である、実施態様６４に記載の単離細胞。
６７．実施態様１から６３の何れか一で定義される方法によって得られる、内分泌プレ前駆体細胞、内分泌前駆体細胞、初期の内分泌細胞、及び完全に分化した内分泌細胞からなる群から選択される１又は複数の単離細胞を含む組成物。
６８．細胞表面マーカーとしてＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質を発現する細胞を同定又は選択するためのＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８結合試薬からなる群から選択される結合試薬の使用。
６９．細胞表面マーカーとしてＤＮＥＲタンパク質を発現する細胞を同定又は選択するためのＤＮＥＲ結合試薬の使用。
７０．膵臓内分泌細胞の培養体を得るための、ＤＮＥＲ、ＤＩＳＰ２、ＳＥＺ６Ｌ２、ＬＲＰ１１及び／又はＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の使用。
７１．膵臓内分泌細胞の培養体を得るための、細胞表面マーカーとしてのＤＮＥＲタンパク質の使用。
７２．膵臓内分泌細胞の培養体を得るために、一又は複数の更なる細胞表面マーカーを同時又は連続的に使用する、実施態様７０又は７１に記載の使用。
７３．更なる細胞表面マーカーがＤＤＲ１タンパク質、プロミン１（ＣＤ１３３としても知られる）、及びＣＤ４９ｆからなる群から選択される、実施態様７２に記載の使用。
７４．更なる細胞表面マーカーがＤＤＲ１タンパク質である、実施態様７２に記載の使用。
７５．Ｄｉｓｐ２結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりに使用される、実施態様６８から７４の何れか一に記載の使用。
７６．Ｓｅｚ６ｌ２結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりに使用される、実施態様６８から７４の何れか一に記載の使用。
７７．Ｌｒｐ１１結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりに使用される、実施態様６８から７４の何れか一に記載の使用。
７８．Ｓｌｃ３０ａ８結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりに使用される、実施態様６８から７４の何れか一に記載の使用。
７９．Ｄｉｓｐ２結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりにＤＤＲ１結合試薬と組み合わせて使用される、実施態様６８から７４の何れか一に記載の使用。
８０．Ｓｅｚ６ｌ２結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりにＤＤＲ１結合試薬と組み合わせて使用される、実施態様６８から７４の何れか一に記載の使用。
８１．Ｌｒｐ１１結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりにＤＤＲ１結合試薬と組み合わせて使用される、実施態様６８から７４の何れか一に記載の使用。
８２．Ｓｌｃ３０ａ８結合試薬がＤＮＥＲ結合試薬の代わりにＤＤＲ１結合試薬と組み合わせて使用される、実施態様６８から７４の何れか一に記載の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年12月7日(2010.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011518547000001.app
【国際調査報告】
2011518547.tif 000042
2011518547.tif 000043