(57)【要約】  ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）を発現する白血病性幹細胞の阻害方法は、その細胞と、増強されたＦｃエフェクター機能を有するＦｃ領域または改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子と接触させることを含み、この抗原結合分子は、ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に選択的に結合する。本発明は、有効量の抗原結合分子を患者に投与することによる患者の血液学的癌病態の治療を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）を発現する白血病性幹細胞を阻害する方法であって、前記細胞と、Ｆｃ領域または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子とを接触させることを含み、前記抗原結合分子がＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に選択的に結合する、前記方法。
【請求項２】
Ｆｃ領域または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む有効量の抗原結合分子を前記患者に投与することを含む患者における血液学的癌病態を治療する方法であって、前記抗原結合分子がＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に選択的に結合する、前記方法。
【請求項３】
患者がヒトである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
抗原結合分子が、モノクローナル抗体またはＦｃ領域を含む抗体断片である請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
抗原結合分子が、増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体または抗体断片である請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
抗体または抗体断片のＦｃ領域の改変が、前記Ｆｃ領域において、Ｆｃ領域と、関連するＦｃ受容体ならびに補体との相互作用を増強させるために、少なくとも１つのアミノ酸の置換、好ましくは２つまたは３つのアミノ酸の置換を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
改変Ｆｃ領域を含む抗体または抗体断片が、脱フコシル化抗体または抗体断片である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前抗体または抗体断片のＦｃ領域における改変が、前記Ｆｃ領域における保存Ａｓｎ297に結合したオリゴ糖の改変を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
抗原結合分子が、キメラ、ヒト化もしくはヒトのモノクローナル抗体または抗体断片である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項１０】
抗原結合分子が、ヒト定常領域に移植されたマウス抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体の軽可変領域および重可変領域を含むキメラ抗体または抗体断片である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗原結合分子が、ヒトのフレームワーク領域上に移植されたマウス抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体の複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むヒト化抗体または抗体断片である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記血液学的癌病態が、白血病または悪性リンパ球増殖障害である、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記白血病が、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ急性白血病、慢性リンパ急性白血病、および脊髄形成異常性症候群からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記悪性リンパ球増殖障害がリンパ腫である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
リンパ腫が、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および小細胞リンパ腫ならびに大細胞濾胞性リンパ腫からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
患者に化学療法剤を投与することをさらに含む請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
化学療法剤の投与が、抗原結合分子の投与前、投与と同時に、または投与後である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記化学療法剤が、
（ａ）マスタードガス誘導体：メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、およびイホスファミド
（ｂ）エチレンイミン類：チオテパおよびヘキサメチルメラミン
（ｃ）アルキルスルホネート類：ブスルファン
（ｄ）ヒドラジン類およびトリアジン類：アルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジンおよびテモゾロミド
（ｅ）ニトロソ尿素類：カルムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン
（ｆ）金属塩類：カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン
（ｇ）ビンカアルカロイド類：ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビノレルビン
（ｈ）タキサン類：パクリタキセルおよびドセタキセル
（ｉ）ポドフィロトキシン類：エトポシドおよびテニポシド
（ｊ）カンプトテシン類縁体：イリノテカンおよびトポテカン
（ｋ）アントラサイクリン類：ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロンおよびイダルビシン
（ｌ）クロモマイシン類：ダクチノマイシンおよびプリカマイシン
（ｍ）その他の抗癌抗生物質：マイトマイシンおよびブレオマイシン
（ｎ）葉酸アンタゴニスト：メトトレキサート
（ｏ）ピリミジンアンタゴニスト：５−フルオロウラシル、フォクスリジン、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン
（ｐ）プリンアンタゴニスト：６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニン
（ｑ）アデノシンデアミナーゼ阻害剤：クラドリビン、フルダラビン、ネララビンおよびペントスタチン
（ｒ）トポイソメラーゼＩ阻害剤：イロノテカンおよびトポテカン
（ｓ）トポイソメラーゼＩＩ阻害剤：アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩およびテニポシド
（ｔ）リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤：ヒドロキシ尿素
（ｕ）副腎皮質ステロイド阻害剤：ミトタン
（ｖ）酵素類：アスパラギナーゼおよびペガスパルガーゼ
（ｗ）微小管阻害剤：エストラムスチン
（ｘ）レチノイド類：ベキサロテン、イソトレチノインおよびトレチノイン（ＡＴＲＡ）
からなる群から選択される細胞毒性剤である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞毒性剤がシタラビンである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）を発現する白血病性幹細胞の阻害、または阻害用医薬品の製造における、Ｆｃ領域または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子の使用であって、前記抗原結合分子がＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に選択的に結合する使用。
【請求項２１】
患者における血液学的癌病態の治療、またはその治療用医薬品の製造において、Ｆｃ領域または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子の使用であって、前記抗原結合分子がＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に選択的に結合する使用。
【請求項２２】
ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）を発現する白血病性幹細胞を阻害する薬剤であって、Ｆｃ領域または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子を含み、前記抗原結合分子がＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に選択的に結合する阻害剤。
【請求項２３】
患者における血液学的癌病態を治療する薬剤であって、Ｆｃ領域または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子を含み、前記抗原結合分子がＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に選択的に結合する治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液学的癌病態に対する有効な療法として、白血病性幹細胞、特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および他の血液学的癌病態に関連した白血病性幹細胞を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液学的癌病態は、血液、骨髄、およびリンパ系に影響を及ぼす白血病および悪性リンパ球増殖病態などの癌の類型である。
【０００３】
白血病は、急性白血病と慢性白血病に分類できる。急性白血病はさらに、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）に分類できる。慢性白血病としては、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が挙げられる。他の関連病態としては、骨髄性血液細胞の無効性産生（または異形成）およびＡＭＬへの悪性転換の危険性に結びついた、血液学的病態の多様な集合である脊髄形成異常性症候群（以前「前白血病」として知られていたＭＤＳ）が挙げられる。
【０００４】
白血病性幹細胞（ＬＳＣｓ）は、正常な幹細胞に関連した特徴、すなわち、自己再生特性および多系列に発展する能力を有する癌細胞である。このような細胞は、異なる集団としてＡＭＬなどの血液学的癌に永続すると提案されている1。
【０００５】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、異質な未分化の骨髄芽の増殖増大として臨床的に提示されるクローン障害である。白血病ヒエラルキーは、自己再生の明確な能力を有し、白血病性前駆体へと分化することのできるＬＳＣｓの小集団によって維持される1。これらの前駆体は、診断時および再発時に患者において容易に検出可能な多数の白血病性芽細胞を生じさせ、究極的に死に至らしめる2~4。ＡＭＬ−ＬＳＣは、速やかに分裂するクローン原性前駆体とは対照的に、一般に静止細胞として報告されている3,5,6。ＬＳＣｓのこの性質が、増殖細胞を標的にする従来の化学療法剤の有効性を減じ、高比率のＡＭＬ患者が完全な寛解に入るがほぼ例外なく再発し、４年を超えて生存するのは成人の＜３０％である現在の経験の理由を説明する可能性を示すものとなっている7。また、最小残留疾病発生率および生存率の低さは、ＡＭＬ患者における診断時の高いＬＳＣ頻度に帰するものであった8。したがって、新規治療が開発されるＡＭＬ（ならびに類似の他の上記血液学的癌病態）の長期管理のためには、特にＬＳＣｓを除去することが不可避である9~14。
【０００６】
ＡＭＬ−ＬＳＣと正常な造血幹細胞（ＨＳＣｓ）とは、緩徐な分裂、自己複製能力、およびＣＤ３４+ＣＤ３８-表現型などの表面マーカーという共通な性質を有している。しかしながら、ＬＳＣｓは、他の細胞表面マーカーの発現変化に加えて、自己複製活性の増強を有することが報告されており、これらは双方とも治療法開発の現在の標的となっている。インターロイキン−３（ＩＬ−３）は、２つのサブユニット、αサブユニット（ＣＤ１２３）とベータ共通（βc）鎖（ＣＤ１３１）からなる細胞表面受容体との相互作用を介してその作用を媒介する。α鎖とβ鎖との相互作用はＩＬ−３に対する高親和性の受容体を形成し、βc鎖は、引き続くシグナル伝達を媒介する15,16。正常な造血細胞と相対的に、ＡＭＬ芽細胞上のＣＤ１２３、ＣＤ３４+白血病性前駆体およびＬＳＣｓの過剰発現は広範に報告されており17~23、いくつかの研究では、ＬＳＣｓのマーカーとして提案されている24、25。ＣＤ１３１はまた、ＡＭＬ細胞上に発現することも報告されているが21、25、ＡＭＬ−ＬＳＣｓ上のＣＤ１３１発現については相反する報告がある23、25。
【０００７】
ＡＭＬ細胞上のＣＤ１２３の過剰発現によって、正常な造血細胞よりも色々な増殖上の利点が与えられ、ＩＬ−３に応答して、高比率のＡＭＬ芽細胞が増殖するという報告がある26~31。さらに、ＡＭＬ細胞上の高レベルのＣＤ１２３発現は、ＩＬ−３に刺激されたＳＴＡＴ−５活性化のレベル；サイクリング細胞の割合；より原始的な細胞表面表現型；アポトーシスに対する抵抗性に関連していた。臨床的に、ＡＭＬにおけるＣＤ１２３の高発現は、生存時間の短縮、完全寛解率の低下および診断時の多数の芽細胞に関連している19、21、32。
【０００８】
ＨＳＣｓに比較したＬＳＣｓ上のＣＤ１２３の発現増加により、ＡＭＬ−ＬＳＣｓの治療標的化に対する機会が提供される。ＣＤ１２３に対して増加させたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）７Ｇ３は、ＩＬ−３媒介増殖および白血病性細胞株と一次細胞双方の活性化を阻害することが以前示されている33。しかし、標的ＣＤ１２３が機能的にＡＭＬ−ＬＳＣｓを害することができるかどうか、および標的ＣＤ１２３がＡＭＬ−ＬＳＣｓの骨髄ニッチェにおいて、それらのホーミング、滞留および増殖を阻害することができるかどうかは不明瞭なままである。さらに、ＡＭＬ−ＬＳＣｓを標的にする７Ｇ３の能力におけるＩＬ−３媒介シグナル伝達の直接的阻害対抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）の相対的寄与は解明されていない。
【０００９】
米国特許第６，１７７，０７８号明細書（Ｌｏｐｅｚ）は、抗ＩＬ−３受容体アルファ鎖（ＩＬ−３Ｒα）モノクローナル抗体７Ｇ３、ならびにＩＬ−３ＲαのＮ末端ドメイン、特にアミノ酸残基１９〜４９に結合する７Ｇ３の能力を開示している。したがってこの特許は、ＩＬ−３の機能をアンタゴナイズすることによる、患者（骨髄性白血病、リンパ腫およびアレルギーなど）におけるＩＬ−３の過剰産生に起因する病態の治療において、ＩＬ−３Ｒαのアミノ酸残基１９〜４９に対して結合特異性を有する７Ｇ３などのモノクローナル抗体またはその抗体断片の使用を開示している。
【００１０】
米国特許第６，７３３，７４３号明細書（Ｊｏｒｄａｎ）は、細胞を、抗体と細胞毒性剤（化学療法剤、毒素またはアルファ線を放射する放射性同位体から選択）との組成物に接触させ、そのことにより、前記組成物が、細胞死を引き起こす上で有効な量でＣＤ１２３に選択的に結合する、ＣＤ１２３を発現するがＣＤ１３１は有意に発現しない血液学的癌前駆体細胞を損傷させる方法を開示している。血液学的癌は、白血病またはリンパ腫などの悪性リンパ球増殖性障害であり得る。
【００１１】
本発明に至る研究において、本発明者らは、ＭＡｂ  ７Ｇ３の能力を試験し、ＡＭＬ−ＬＳＣｓとＨＳＣｓとの間のＣＤ１２３発現および機能における明白な違いを利用した。ＭＡｂ  ７Ｇ３は、ＩＬ−３シグナル伝達経路および一次ＡＭＬ細胞の増殖を阻害した。さらに、非肥満性糖尿病／重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）異種移植モデルにおけるＡＭＬ芽細胞のホーミングおよび移植は、ＭＡｂ  ７Ｇ３によって大きく減少し、ＬＳＣ機能は阻害された。
【発明の概要】
【００１２】
一態様において、本発明は、ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）を発現する白血病性幹細胞を阻害する方法を提供し、この方法は、ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）を発現する白血病性幹細胞と、Ｆｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子とを接触させることを含み、前記抗原結合分子は選択的にＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に結合する。
【００１３】
本発明はまた、患者における血液学的癌病態を治療する方法を提供し、この方法は、Ｆｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む有効量の抗原結合分子を患者に投与することを含み、前記抗原結合分子は選択的にＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に結合する。
【００１４】
他の態様において、本発明はまた、ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）を発現する白血病性幹細胞の阻害、または阻害用医薬品の製造における、Ｆｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子の使用を提供し、前記抗原結合分子は選択的にＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に結合する。
【００１５】
この態様において、本発明はまた、患者における血液学的癌病態の治療、または治療用医薬品の製造において、Ｆｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子の使用を提供し、前記抗原結合分子は選択的にＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に結合する。
【００１６】
本発明はまた、ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）を発現する白血病性幹細胞を阻害する薬剤を提供し、この薬剤はＦｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子を含み、前記抗原結合分子は選択的にＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に結合する。
【００１７】
この態様において、本発明はまた、患者における血液学的癌病態を治療する薬剤を提供し、この薬剤はＦｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子を含み、前記抗原結合分子は選択的にＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に結合する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＭＡｂ７Ｇ３が、ＩＬ−３に刺激されたＣＤ１３１のリン酸化、および一次ＡＭＬ細胞の増殖を阻害することを示す図である。（ａ）２人の個々の患者からの一次ＡＭＬ細胞を、図に示された濃度の抗体と共に、氷上で３０分間インキュベートした。洗浄せずに、細胞をＩＬ−３（１ｎＭ、３７℃で１０分間）で刺激した。刺激後、直ちに細胞を溶解させた。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で操作し、ＭＡｂ  ４Ｇ１０により免疫ブロットしてから、ブロットをストリップし、充填対照としてのＭＡｂ  １Ｃ１により再探査した。（ｂ〜ｅ）ＴＣＡ不溶性物質への3Ｈ−チミジンにより評価した一次ＡＭＬ細胞の増殖。（ｂ〜ｄ）３人の個々のＡＭＬ患者から新鮮単離した単核細胞を、サイトカインの非存在下（Δ、破線）または存在下で、ＭＡｂ７Ｇ３を４８時間滴定しながらインキュベートした：１ｎｇ／ｍＬでのＩＬ−３（◇、点線）または０．１ｎｇ／ｍＬでのＧＭ−ＣＳＦ（■、実線）。データの点は、３つの点の平均±標準誤差を示す。（ｅ）３５人のＡＭＬ患者からの解凍細胞を、ＩＬ−３（１ｎｇ／ｍＬ）の非存在下または存在下で、ＭＡｂ  ７Ｇ３（１μｇ／ｍＬ）により、増殖の阻害に関して分析した。阻害は、試験した３５人の患者のうち３２人に示された。これらの患者の９人では、増殖レベルはＩＬ−３の非存在下での増殖レベルよりも下に落ちた（構成的増殖）。増殖は、3Ｈ−チミジンの取り込みおよび液体シンチレーションカウンターを用いて定量化した。
【図２】ＣＤ１２３中和により、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける一次ＡＭＬ細胞のホーミングおよび移植が阻害されることを示す図である。７Ｇ３（灰色の棒）またはＩｇＧ２ａ（黒色の棒）（１０μｇ／ｍＬ、２時間）へのエキソビボ暴露後、１０人の患者からの一次ＡＭＬ細胞の移植（ａ）、または５個体からの正常な骨髄（ＮＢＭ）もしくは臍帯血（ＣＢ）（ｂ）。抗体処置細胞を致死量以下の放射線照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植後、４〜８週間目（ａ）または４〜１１週間目（ｂ）で淘汰し、大腿骨髄中のヒトＣＤ４５+細胞の比率をフローサイトメトリーにより推定した。各サンプルに関し、１処置群当たり３匹から１０匹のマウスを用いた。ＡＭＬ−８およびＡＭＬ−８−ｒｅｌは、それぞれ、診断時と再発時における同一患者から採取した白血病性細胞に相当する。ＮＢＭ−４およびＣＢ−１は、プールしたサンプル起源であった。（ｃ）ＩｇＧ２ａ（ｎ＝１０、実線）または７Ｇ３（ｎ＝１０、点線）エキソビボ処置ＡＭＬ−９細胞を移植したマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ無事象生存曲線。（ｄ）移植２４時間後に評価した骨髄および脾臓へのＩｇＧ２ａ（黒色の棒）、７Ｇ３（灰色の棒）エキソビボ処置ＡＭＬ−８−ｒｅｌまたはＡＭＬ−９細胞のホーミング効率。（ｅ）静脈内注入（ＩＶ）または大腿内注射（ＩＦ）後、ＩｇＧ２ａ（白色の棒）または７Ｇ３（黒色の棒）エキソビボ処置細胞を移植したマウスにおけるＡＭＬ−８−ｒｅｌ細胞の移植レベル。ＩＦ移植マウスでは、ＡＭＬ細胞が移植された右大腿（ＲＦ）における移植レベル、および非移植骨（ＷＢＭ）における移植レベルが示されている。（ｄ）および（ｅ）では、１処置群当たり、４〜５匹のマウスが用いられた。マウスは、移植５週後に殺処置した。値は、平均値±標準誤差を表す。対照ＩｇＧ２ａマウスと処置マウスとの間の有意差が示されている：*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．０１；***、Ｐ≦０．０００１。（ｆ）エキソビボ７Ｇ３処置白血病性細胞を注射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄および脾臓にホーミングしたＣＤ３４+３８-ＡＭＬ細胞の絶対数。ＡＭＬ−８に関しては、１群当たりｎ＝２〜３のマウスであり、ＡＭＬ−９に関しては、１群当たりｎ＝５のマウスであった。値は、平均値±標準誤差を表す。（ｇ）マウスの骨髄および脾臓双方へのエキソビボ処置後、選別したＣＤ３４+３８-ＡＭＬ−９細胞のホーミング効率。１処置群当たり、ｎ＝３のマウス。
【図３】ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの７Ｇ３の投与が、ＡＭＬ移植を減少させることを示す図である。（ａ）移植６時間前に、ＩｇＧ２ａ対照または７Ｇ３（３００μｇ）の単回投与を受けた放射線照射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの大腿骨髄中のＡＭＬ−１細胞の移植レベル。マウスは、移植５週後に淘汰された。（ｂ）ＩｇＧ２ａ（黒色の棒）または７Ｇ３（灰色の棒）で処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＡＭＬ−１、ＡＭＬ−２、およびＡＭＬ−３の移植。処置は、移植２４時間後に開始し、１投与当たり３００μｇ、１日おきに４回投与した。マウスは、移植５週目に淘汰した。（ｃ）骨髄由来細胞上のＣＤ１２３発現、および（ｄ）マウスに接種され、次いで、移植４日後にＩｇＧ２ａ処置または７Ｇ３処置を開始し、合計１２回の注射を３回／週投与したＡＭＬ−１細胞の末梢血および脾臓における移植レベル。マウスは移植５週目に淘汰した。（ｅ）移植２８日後にＩｇＧ２ａ処置（点線）または７Ｇ３処置（実線）を開始し、殺処置時まで、３回／週を続けた場合の骨髄中のＡＭＬ−２細胞の移植レベル。１処置群当たり、３匹〜１０匹の間のマウスを用いた。値は、平均値±標準誤差を表す。（ｆ）移植後２８日目に週３回投与を開始した３００μｇ／投与での７Ｇ３またはＩｇＧ２ａ対照４回投与後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス骨髄中のヒトＡＭＬ−１細胞のパーセンテージ。個々の記号は各々、単一のマウスから得られた値を表す。ＩｇＧ２ａ対照処置マウスと７Ｇ３処置マウスとの間の有意差が示されている：*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．００５。
【図４】パート１は、ＡＭＬ疾患が確立されたマウスへの７Ｇ３およびＡｒａ−Ｃの投与が、二次レシピエントマウスのＬＳＣの再増殖をブロックすることを示す図である。（ａ）略図に示されるように、ＩｇＧ２ａまたは７Ｇ３のいずれかと組み合わせたＡｒａ−Ｃによって処置した一次マウスの骨髄および脾臓におけるＡＭＬ−１０細胞の移植レベル。（ｂ）骨髄および脾臓へのホーミング効率。（ｃ）移植レベル。（ｄ）（ａ）で処置し、二次レシピエントマウスに移植したマウスの骨髄から採取した白血病性細胞の二次移植片中のＣＤ３４+３８-細胞の比率。水平の棒は平均値を示す。ＩｇＧ２ａプラスＡｒａ−Ｃで処置した対照群と７Ｇ３プラスＡｒａ−Ｃで処置した群との間の有意差が示されている：*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．０１。パート２は、（Ａ）７Ｇ３処置または対照ＩｇＧ２ａ処置の１０週間後の骨髄および脾臓におけるＡＭＬ−１０細胞の移植レベルを示す図である。略図に示されるように、抗体処置は、移植後２８日目に、週３回、マウス１匹当たり３００μｇで開始した。（Ｂ〜Ｄ）二次レシピエントマウスのホーミング効率（Ｂ）、骨髄および脾臓における移植レベル（Ｃ）、および骨髄中のＣＤ３４+３８-細胞のパーセンテージ（Ｄ）。ＣおよびＤにおけるマウスは、移植後１２週目に分析した。各記号は単一のマウスを表し、水平の棒は平均値を示す。対照ＩｇＧ２ａ群と７Ｇ３群との間で、*、Ｐ＜０．０５；**、Ｐ＜０．０１。パート３は、（Ａ）７Ｇ３処置または対照ＩｇＧ２ａ処置の１０週間後の骨髄および脾臓におけるＡＭＬ−９細胞の移植レベルを示す図である。略図に示されるように、抗体処置は、移植後２８日目に、週３回、マウス１匹当たり３００μｇで開始した。（Ｂ）二次レシピエントマウスの骨髄中の移植のレベルを示す図である。二次マウスは、移植後８週目に分析した。各記号は単一のマウスを表し、水平の棒は平均値を示す。対照ＩｇＧ２ａ群と７Ｇ３群との間で、**、Ｐ＜０．０１。
【図５】ナチュラルキラー（ＮＫ）リンパ球性細胞が、ＡＭＬ移植の７Ｇ３媒介阻害に寄与することを示す図である。（ａ）移植のレベルおよび（ｂ）ＩｇＧ２ａ（白色の棒）または７Ｇ３（黒色の棒）（１０μｇ／ｍＬ、２時間）でエキソビボ処置し、先にＣＤ１２２+ＮＫ細胞を枯渇させない（−）またはＣＤ１２２+ＮＫ細胞を枯渇させた（＋）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへ移植したＡＭＬ−８−ｒｅｌ細胞のホーミング効率。各処置群に４匹のマウスを用いた。値は、平均値±標準誤差を表す。有意差が示されている：*、Ｐ＜０．０５および**、Ｐ＜０．０１。
【図６】ＩＬ−３依存細胞株およびＡＭＬ細胞において、ＩＬ−３に刺激されたＣＤ１３１（βc）のリン酸化、ＳＴＡＴ−５およびＡｋｔを、ＭＡｂ  ７Ｇ３は阻害するが、６Ｈ６も９Ｆ５も阻害しないことを示す図である。（ａ）ＴＦ−１細胞は、種々の濃度の７Ｇ３、９Ｆ５または６Ｈ６と共に、氷上で３０分間インキュベートした。洗浄せずに、細胞をＩＬ−３（１ｎＭ、３７℃で１０分間）により刺激した。刺激後直ちに細胞を溶解させ、方法に記載されている通りＣＤ１３１免疫沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、リン酸化チロシン残基（４Ｇ１０）、リン酸化ＳＴＡＴ−５またはリン酸化Ａｋｔに対する抗体により免疫ブロットした。ブロットをストリップし、充填対照としてのβｃ（１Ｃ１）に対する抗体により再探索した。（ｂ）ＳＴＡＴ−５のＩＬ−３に誘導された活性化の７Ｇ３阻害は、ＴＦ−１細胞株およびＭ０７ｅ細胞株ならびに一次ＡＭＬ−９細胞の細胞内ＦＡＣＳ染色によっても確認された。偽処置（点線）、ＩＬ−３単独（１０ｎｇ／ｍＬ、２時間、実線）、ＩＬ−３プラス７Ｇ３（１０ｎｇ／ｍＬ、破線）。
【図７】ＣＤ３４+／ＣＤ３８-細胞上のＣＤ１２３発現の強度が、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける移植を阻害する７Ｇ３の能力と逆相関していることを示す図である。Ｙ軸は、各患者またはドナー検体に関するＣＤ３４+／ＣＤ３８-画分についてのＣＤ１２３発現のＲＦＩ対数を表す。Ｘ軸は、各患者個体またはドナーサンプルに関するＩｇＧ２ａ対照を１００％とした％に正規化した７Ｇ３エキソビボ処置群の移植レベル対数をプロットしている。各点は、１処置群当たり３〜１０匹のマウスからの平均値を反映する個別の実験を表し、各実験は、種々のＡＭＬ患者（黒塗り記号）または正常な骨髄サンプル（白抜き記号）を用いて実施された。マウスは全て、移植４〜６週間後に分析した。各移植データポイントは、図２ａに示された３〜１０匹のマウスの測定に基づいた。
【図８】ＡＭＬ細胞を標的細胞としてＮＫ細胞におけるＣＤ１０７ａ発現を示す図である。正常な健常ドナーからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、一次ヒトＡＭＬ細胞（ＲＭＨ００３）と１：１の比率（Ａ＆Ｂ）で、ＩｇＧ１対照（１０μｇ／ｍＬ）（Ａ＆Ｃ）またはＣＳＬ３６０（１０μｇ／ｍＬ）（Ｂ＆Ｄ）のいずれかと共に、３７℃で３時間インキュベートした。ＣＤ１０７ａの非特異的発現を評価するために、ＰＢＭＣを、標的細胞なしに（１：０）抗体と共に（Ｃ＆Ｄ）インキュベートした。
【図９】図８で示した実験で得られたデータの棒グラフを示す図であり、示されているように、抗体を添加していないサンプルも含んでいる。
【図１０】ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの接種前に、１０μｇ／ｍＬのＩｇＧ２ａ、完全７Ｇ３、６Ｈ６または９Ｆ５の抗体ならびに７Ｇ３のＦ（ａｂ’）２断片（７Ｇ３  Ｆａｂ）および６Ｈ６のＦ（ａｂ’）２断片（６Ｈ６  Ｆａｂ）と共にエキソビボ処置したＡＭＬ−８−ｒｅｌサンプルのホーミング効率を示す図である。骨髄内へのヒト単核細胞のホーミング効率は、１６時間後に測定した。各サンプルに関して、１処置群当たり３匹のマウスを用いた。
【図１１】１０μｇ／ｍＬのＩｇＧ２ａ、完全７Ｇ３または９Ｆ５の抗体ならびに７Ｇ３のＦ（ａｂ’）２断片（７Ｇ３  Ｆａｂ）および９Ｆ５のＦ（ａｂ’）２断片（９Ｆ５  Ｆａｂ）と共にエキソビボ暴露した後、致死量以下で放射線照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの、２人の患者（ＡＭＬ−９およびＡＭＬ−１０）からの一次ＡＭＬ細胞の移植を示す図である。ＡＭＬ移植は、大腿骨髄中のヒトＣＤ４５＋細胞の比率として、接種４週後に、フローサイトメトリーによって評価した。各サンプルに関し、１処置群当たり５匹のマウスを用いた。
【図１２】キメラＣＳＬ３６０、ヒトＣＳＬ３６０およびそのＦｃ変種のＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。種々の抗体ならびに正常なヒトドナーからの新鮮単離ＰＢＭＣと共に、カルセインＡＭ標識したＣＴＬＥＮ細胞をインキュベートした。ＣＴＬＥＮ細胞に対するＰＢＭＣの比率は１００：１であった。細胞は、５％のＣＯ2を有する３７℃のインキュベーター内で４時間インキュベートした。インキュベート時間後、細胞を遠心分離し、１００μＬの上澄み液を新鮮なプレートに移した。この上澄み液における蛍光を、Ｗａｌｌａｃマイクロプレートリーダー（励起フィルター４８５ｎｍ、発光フィルター５３５ｎｍ）を用いて測定した。用いた抗体は、キメラＣＳＬ３６０（白抜きの棒）、ヒト化ＣＳＬ３６０（黒塗りの棒）、２つのアミノ酸を変化させたヒト化ＣＳＬ３６０（斜線）または３つのアミノ酸を変化させたヒト化ＣＳＬ３６０（点状）のいずれかであった。対照として、ヒトＩｇＧ１（水平線）および抗体なしのウェル（垂直線）を含めた。
【図１３】（ａ）ｈＣＳＬ３６０ならびにＦｃＲに結合したその３つの変種のＢｉａｃｏｒｅ分析を示す図である。ｈｕＣＳＬ３６０ならびにその３つの変種は、ＣＤ１２３に結合させたＢＩＡｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ上に個々に捕捉した。０．４ｎＭから８００ｎＭの範囲の濃度におけるｈｕＦｃγＲＩ、ｈｕＦｃγＲＩＩｂ／ｃおよびｈｕＦｃγＲＩＩＩａをそれぞれの表面にフローさせ、それらの応答を用いてＫＡを判定した。親和性は、相対値を１と定めたｈＣＳＬ３６０を上回る増加倍数として報告した。（ｂ）ＫＡ値は、４つの抗体各々に関して、ｈｕＦｃγＲＩＩｂ／ｃに対するｈｕＦｃγＲＩＩＩａのＡ／Ｉ比として表した。
【図１４】エフェクター細胞として正常なＰＢＭＣを用いたカルセイン放出アッセイにおいて調べたラージ−ＣＤ１２３陽性細胞のＡＤＣＣ媒介細胞溶解を示す図である。ラージ−ＣＤ１２３低および高エクスプレッサー上で発現したＣＤ１２３分子の概数は、それぞれ４，８１５と２４，４３２であった。（ａ）Ｅ：Ｔ＝２５：１におけるラージ−ＣＤ１２３低のＡＤＣＣ媒介細胞溶解（ｂ）Ｅ：Ｔ＝５０：１におけるラージ−ＣＤ１２３低のＡＤＣＣ媒介細胞溶解（ｃ）Ｅ：Ｔ＝２５：１におけるラージ−ＣＤ１２３高のＡＤＣＣ媒介細胞溶解（ｄ）Ｅ：Ｔ＝５０：１におけるラージ−ＣＤ１２３高のＡＤＣＣ媒介細胞溶解。黒三角形はｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３、円形はｈＣＳＬ３６０ｋｉｆ、黒円形はＣＳＬ３６０、四角形はｈＣＳＬ３６０、星形は抗体無しを表す。
【図１５】ＴＦ−１細胞を標的細胞としたＣＳＬ３６０とその変種のＡＤＣＣ活性の増強を示す図である。抗体のＡＤＣＣ活性はＬＤＨアッセイを用いて調べた。（ａ）黒三角形はｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３、黒四角形はｈＣＳＬ３６０Ｆｃ２、白円形はｈＣＳＬ３６０ｋｉｆ、黒円形はＣＳＬ３６０、星形は抗体無しを表す。（ｂ）黒三角形は１６８−２６Ｆｃ３、黒四角形は１６８−２６Ｆｃ２、黒円形は１６８−２６、星形は抗体無しを表す。
【図１６】一次ヒト白血病性細胞を標的細胞としたＣＳＬ３６０とその変種のＡＤＣＣ活性の増強を示す図である。（ａ）ＲＭＨ００３  ＡＭＬ、（ｂ）ＲＭＨ０１１  ＡＭＬ、（ｃ）ＲＭＨ０１０  ＡＭＬ、（ｄ）ＲＭＨ００８  ＡＭＬ、（ｅ）ＷＭＨ００７  ＡＭＬ、（ｆ）ＲＭＨ００９  Ｂ−ＡＬＬ、（ｇ）ＲＭＨ００７  Ｂ−ＡＬＬ。ＡＤＣＣ活性はＬＤＨアッセイを用いて判定した。
【図１７】白血病移植日からの無事象生存率（ＥＦＳ）に関するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線として表された、対照ＭＡｂ（マウスＩｇＧ２ａ）、７Ｇ３、１６８−２６および１６８−２６Ｆｃ３に対する、ＡＬＬを前移植したマウスのインビボ感受性を示す図である。事象は、末梢血中の２５％ｈＣＤ４５＋負荷として定義する。各群の動物数はそれぞれ、７、６、６、７であった。白血病性増殖遅延（ＬＧＤ）は、中央値ＥＦＳの比較に基づき、対照ＭＡｂ群よりも長く生存した処置群の日数として定義し、７Ｇ３、１６８−２６および１６８−２６Ｆｃ３に関して、それぞれ、２．９（Ｐ＝０．５４）、６．４（Ｐ＝０．１３）、１２．２（Ｐ＝０．０４４）日であった。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
一態様において、本発明は、ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）を発現する白血病性幹細胞を阻害する方法を提供し、この方法は、ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）を発現する白血病性幹細胞と、Ｆｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子とを接触させることを含み、前記抗原結合分子は選択的にＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に結合する。
【００２０】
一態様において、本発明はまた、患者における血液学的癌病態を治療する方法を提供し、この方法は、Ｆｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む有効量の抗原結合分子を患者に投与することを含み、前記抗原結合分子は選択的にＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に結合する。
【００２１】
前記患者はヒトであることが好ましい。
【００２２】
前記抗原結合分子は、Ｆｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含むモノクローナル抗体または抗体断片であることが好ましい。
【００２３】
抗体は、体液性免疫と細胞性免疫との間の連係を提供し、ＩｇＧは最も多量に存在する血清免疫グロブリンである。抗体のＦａｂ領域は抗原を認識するが、Ｆｃ部分は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、単核食細胞または樹状細胞などの全ての免疫補助細胞によって異なって発現されるＦｃγ受容体（Ｆｃγ  Ｒｓ）に結合する。このような結合はこれらの細胞上のＦｃＲと架橋し、その結果それらは活性化する。これらの細胞の活性化は、いくつかの結果をもたらす。例えば、ＮＫ細胞は癌細胞を死滅させ、また細胞増殖および腫瘍関連血管新生を抑制することのできるサイトカイン類やケモカイン類を放出し、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）抗原の細胞表面発現の増加を介して腫瘍免疫原性を増大させる。多価抗原／抗体複合体により受容体が架橋すると、エフェクター細胞の脱顆粒およびサイトカインコード遺伝子の転写活性化が引き起こされ、引き続き標的細胞の細胞溶解または食作用が生じる。
【００２４】
抗体Ｆｃ領域により媒介されるエフェクター機能は次の２つのカテゴリーに分けることができる。（１）抗原に対する抗体の結合後に働くエフェクター機能（これらの機能には、例えば、補体カスケードまたはＦｃ受容体（ＦｃＲ）担持細胞の寄与が含まれる）；（２）抗原結合とは独立して働くエフェクター機能（これらの機能は、例えば循環における持続性および経細胞輸送による細胞バリアを超えて移動される能力を与える）。例えば、抗体に対する補体のＣ１要素の結合は、複合体系を活性化する。補体の活性化は、オプソニン化および細胞病原体の細胞溶解において重要である。補体の活性化はまた、炎症性応答を刺激し、自己免疫過感受性に関与し得る。さらに、抗体はＦｃ領域を介して細胞に結合し、抗体のＦｃ領域上のＦｃ受容体結合部位が、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。細胞表面上のＦｃ受容体に対する抗体の結合は、抗体で被覆された粒子の飲み込みと破壊、免疫複合体のクリアランス、抗体で被覆された標的細胞のキラー細胞による細胞溶解（抗体依存性細胞媒介細胞毒性、またはＡＤＣＣとして知られる）、炎症伝達物質の放出、胎盤輸送および免疫グロブリン産生の制御などの重要で広範な多数の生物学的応答を引き起こす。
【００２５】
抗原結合分子におけるＦｃ領域または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域の存在が、ＣＤ１２３を発現する白血病性幹細胞の阻害にとって重要であり、したがって、白血病性幹細胞に関連した血液学的癌病態の治療において重要であることを、本発明者らは示した。
【００２６】
本発明に従って治療し得る白血病性幹細胞（ＬＳＣｓ）に関連した血液学的癌病態としては、白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ様白血病、慢性リンパ様白血病および骨髄異形成症候群など）ならびにリンパ腫（多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ならびに小細胞および大細胞濾胞性リンパ腫など）を含む悪性リンパ球増殖性病態が挙げられる。
【００２７】
本明細書に用いられる用語「抗原結合分子」とは、キメラ、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体を含む完全免疫グロブリン、または免疫グロブリンの結合相手、例えば宿主細胞タンパク質に対する特異的結合に関して完全免疫グロブリンと競合する免疫グロブリンの抗原結合性および／または可変ドメイン含有性の断片のことである。構造に関わりなく、抗原結合性断片は、完全免疫グロブリンによって認識されるものと同じ抗原に結合する。抗原結合性断片は、合成的に、または完全免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的開裂により作製できるか、または組換えＤＮＡ技法により遺伝子操作できる。抗原結合分子およびそれらの断片の作製方法は、当業界によく知られており、例えば、参照として本明細書に援用されている、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（１９８８）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００２８】
白血病性幹細胞に関して本明細書に用いられる用語「阻害」には、ＬＳＣｓの機能性または活性（成長または増殖および生存活性など）における何らかの低下、特に生存、増殖および／または白血病の前駆体もしくは他の悪性過増殖血液学的癌細胞へ分化するＬＳＣの能力における低下または制限が含まれる。
【００２９】
結合分子、例えば抗体とその結合相手、例えば抗原との相互作用に関して本明細書に用いられる用語「結合選択性」は、相互作用が特定の構造、例えば、結合相手上の抗原決定因子またはエピトープの存在に依存することを意味する。言い換えると、結合相手がたとえ他の分子または生物の混合物中に存在する場合でも、抗体はその結合相手に優先的に結合または認識する。
【００３０】
用語「有効量」とは、血液学的癌病態の治療に有効な本明細書に定義された結合分子の量のことである。
【００３１】
用語「治療」とは、治療処置のこと、ならびに病態を治癒もしくは停止させるか、または少なくともその進行を遅らせるための予防的または防止的な手段のことである。治療を必要としている者には、すでに血液学的癌病態に罹っている者、ならびにこのような病態を予防しようとする者が含まれる。前記病態から部分的にまたは完全に回復した対象もまた治療が必要である場合もある。予防には、血液学的癌病態に関連した症状の１つまたは複数の発症、発現または進行の抑制または減少が包含される。
【００３２】
本発明の方法において、患者への化学療法剤の投与は、抗原結合分子の投与と組み合わせることができ、化学療法剤は、抗原結合分子の投与の前、同時、または後のいずれかに投与される。
【００３３】
化学療法剤は、細胞毒性剤、例えば以下からなる群から選択される細胞毒性剤であることが好ましい：
（ａ）マスタードガス誘導体：メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、およびイホスファミド
（ｂ）エチレンイミン類：チオテパおよびヘキサメチルメラミン
（ｃ）アルキルスルホネート類：ブスルファン
（ｄ）ヒドラジン類およびトリアジン類：アルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジンおよびテモゾロミド
（ｅ）ニトロソ尿素類：カルムスチン、ロムスチンおよびストレプトゾシン
（ｆ）金属塩類：カルボプラチン、シスプラチン、およびオキサリプラチン
（ｇ）ビンカアルカロイド類：ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビノレルビン
（ｈ）タキサン類：パクリタキセルおよびドセタキセル
（ｉ）ポドフィロトキシン類：エトポシドおよびテニポシド
（ｊ）カンプトテシン類縁体：イリノテカンおよびトポテカン
（ｋ）アントラサイクリン類：ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロンおよびイダルビシン
（ｌ）クロモマイシン類：ダクチノマイシンおよびプリカマイシン
（ｍ）その他の抗癌抗生物質：マイトマイシンおよびブレオマイシン
（ｎ）葉酸アンタゴニスト：メトトレキサート
（ｏ）ピリミジンアンタゴニスト：５−フルオロウラシル、フォクスリジン（Ｆｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン
（ｐ）プリンアンタゴニスト：６−メルカプトプリンおよび６−チオグアニン
（ｑ）アデノシンデアミナーゼ阻害剤：クラドリビン、フルダラビン、ネララビンおよびペントスタチン
（ｒ）トポイソメラーゼＩ阻害剤：イロノテカンおよびトポテカン
（ｓ）トポイソメラーゼＩＩ阻害剤：アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩およびテニポシド
（ｔ）リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤：ヒドロキシ尿素
（ｕ）副腎皮質ステロイド阻害剤：ミトタン
（ｖ）酵素類：アスパラギナーゼおよびペガスパルガーゼ
（ｗ）微小管阻害剤：エストラムスチン
（ｘ）レチノイド類：ベキサロテン、イソトレチノインおよびトレチノイン（ＡＴＲＡ）。
【００３４】
化学療法剤の他の例としては、限定はしないが、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アナストロゾール；アントラサイクリン；アントラマイシン；アスペルリン；アザシチジン（Ｖｉｄａｚａ）；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビスホスホネート類（例えば、パミドロネート（Ａｒｅｄｒｉａ）、ナトリウムクロンドロネート（Ｂｏｎｅｆｏｓ）、ゾレドロン酸（Ｚｏｍｅｔａ）、アレンドロネート（Ｆｏｓａｍａｘ）、エチドロネート、イバンドルネート、シマドロネート、リセドロメート、およびチルドロメート）；ビゼレシン；ビレキナルナトリウム；ブロピリミン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチメル；カルヌスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；シロレマイシン；クリスナトールメシレート；デシタビン（Ｄａｃｏｇｅｎ）；脱メチル化剤；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジクオン；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；ドロモスタノロンプロピオン酸塩；デュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；ＥｐｈＡ２阻害剤；エルサミツルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エタニダゾール；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスリジン；フルロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣ−Ｉｓ）；イルモフォシン；イマチニブメシレート（Ｇｌｅｅｖｅｃ、Ｇｌｉｖｅｃ）；イプロプラチン；ランレオチド酢酸塩；レナリドミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコル；メイタンシン；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸塩；メノガリル；メトプリン；メトウレデパ；メチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトジリン；ミトマルシン；ミトスペル；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロマイシン；プロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフル；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；トレストロン酢酸塩；トリシリビンリン酸塩；トリメトレキサート；トリメトレキサートグルクロン酸塩；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシネート硫酸塩；ビンロイロシン硫酸塩；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩；２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト類；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；アンチアンドロゲン、前立腺癌；アンチエストロゲン；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド類；アフィジコリングリシン酸塩；アポトーシス遺伝子モジュレーター類；アポトーシス調節剤；アプリン酸；アラ−ＣＤＰ−Ｄ  Ｌ−ＰＴＢＡ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト類；ベンゾクロリン類；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベータクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリポックスＩＬ−２；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロルルンス（ｃｈｌｏｒｌｎｓ）；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クロミフェン類縁体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類縁体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタントラキノン類；シクロプラタム；シペマイシン；細胞溶解性因子；シトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデミンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デキスラゾキサン；デキシベラパミル；ジアジクオン；ジデミンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセリン；エコムスチン；エデルフォシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エプリステリド；エス��ラムスチン類縁体；エストロゲンアゴニスト類；エストロゲンアンタゴニスト類；エタニダゾール；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルオロダウノルニシン塩酸塩；フォルフェニメックス；フォルメスタン；フォストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；ガリウム硝酸塩；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；グルタチオン阻害剤；ＨＭＧ  ＣｏＡレダクターゼ阻害剤（例えば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、レスコール、ルピトール、ロバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチン）；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン類；イミキモド；インスリン様成長因子−１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト類；インターフェロン類；インターロイキン類；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール、４−イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトールスタチン；レトロゾール；ロイプロリドおよび、エストロゲン、ならびにプロゲステロン；ロイプロレリン；レバミゾール；ＬＦＡ−３ＴＩＰ（Ｂｉｏｇｅｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ；国際公開第９３／０６８６号パンフレットおよび米国特許第６，１６２，４３２号明細書）；リアロゾール；線状ポリアミン類縁体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド類；メイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコル；マトリリシン阻害剤；マトリックス金属ロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテフォシン；ミリモスチム；ミスマッチド二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；ミトナフィド；ミトトキシン線維芽細胞成長因子−サポリン；モファロテン；モルグラモスチム；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモル；多剤耐性遺伝子阻害剤；多重腫瘍サプレッサー１ベース療法；マスタード抗癌剤；ミカペルオキシドＢ；ミコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ置換ベンズアミド類；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；ニルタミド；ニサマイシン；酸化窒素モジュレーター類；窒素酸化物抗酸化剤；ニトルリン；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド類；オナプリストン；オラシン；経口サイトカインインデューサー；オルマプラチン；オサテロン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセル類縁体；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニルアセテート；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニル；ピロカイン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセシンＢ；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；タンパク質Ａベース免疫モジュレーター；タンパク質キナーゼＣ阻害剤；ミクロアルガル；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン類；ピラゾロアクリジン；ピドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン結合体；ｒａｆアンタゴニスト類；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツカイン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣物；セムスチン；セネセンス誘導阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド類；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達調節剤；ガンマセクレターゼ阻害剤、シゾフィラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテート；ナトリウムフェニルアセテート；ソルベロール；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクワラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スウェインソニン；合成グリコサミノグリカン類；タリムスチン；ロイコボリン；タモキシフェンメチオダイド；タウロムスチン；タゾロテン；テコガランナトリウム；テガフル；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブ
ラスチン；チオコラリン；トロンボポイエチン；トロンボポイエチン模倣物；チマルファシン；チモポイエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；スズエチルエチオプルプリン；チラパザミン；チタノセンビクロリド；トプセンチン；トレミフェン；トチポテント幹細胞因子；翻訳阻害剤；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン類；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメックス；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト類；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクターシステム、エリスロサイト遺伝子療法；サリドマイド；ベラレゾール；ベラミン；ベルジン類；ベルテポルフィン；ビンキサルチン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。
【００３５】
本発明により、Ｆｃ領域または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子は、非経口投与経路によって患者に投与されることが好ましい。非経口投与には、注射、注入などによる投与を含めた、消化管を通さない（すなわち、非経腸）任意の投与経路が含まれる。注射による投与としては、例えば、静脈（静脈内）、動脈（動脈内）、筋肉（筋内）および皮膚下（皮下）が挙げられる。抗原結合分子は、所望の薬理学的効果を得るのに十分な投与量で、デポー剤で、または徐放製剤で経皮投与または筋肉投与することもできる。
【００３６】
本発明の一実施形態において、抗原結合分子は、改変Ｆｃ領域、より具体的には、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の増強、抗体依存性細胞の細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）などのエフェクター機能の増強を提供するために改変されたＦｃ領域を含む。ＩｇＧクラスの抗体では、これらのエフェクター機能は、種々の免疫細胞上に発現するＦｃγ受容体（ＦｃγＲｓ）と称される受容体のファミリーとＦｃ領域との係合によって制御される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成により、これらの細胞が抗原結合部位に動員され、一般にはシグナル伝達および引き続く免疫応答がもたらされる。エフェクター機能を増強させるため、特に、「親」Ｆｃ領域に比較してＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を変化させるために、抗体のＦｃ領域に対するＦｃγＲｓの結合親和性を最適化する方法は、当業者によく知られている。単に例として挙げれば、Ｆｃ領域に対する結合親和性を最適化する手法は、Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．34、Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．35、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．36、およびＤｅｓｊａｒｌａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．37に記載されている。これらの方法は、関連するＦｃ受容体との相互作用を増強させて、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）および抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）を促進させる可能性を高めるための抗体のＦｃ領域の改変を含み得る34。Ｆｃ領域における保存Ａｓｎ297においてＩｇＧ１抗体に共有結合したオリゴ糖の改変によるＡＤＣＣ活性の増強も記載されている35,36。他の方法としては、Ｆｃエフェクター機能を増強させた抗体を固有に産生する細胞株の使用が挙げられる（例えば、ウィルスワクチンの作製に関するアヒル胚由来幹細胞、国際公開第２００８／１２９０５８号パンフレット；鳥類ＥＢＸ（登録商標）細胞における組換えタンパク質産生、国際公開第２００８／１４２１２４号パンフレット）。ＣＤＣ活性を増強させる方法としては、ＩｇＧ３サブクラスの部分が、ＩｇＧ１サブクラスの対応する領域内へ導入されるイソ型キメラ現象を挙げることができる（例えば、組換え抗体組成物、米国特許出願公開第２００７１４８１６５号明細書）。
【００３７】
他の態様において、本発明は、ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）を発現する白血病性幹細胞の阻害、または阻害用医薬品の製造における、Ｆｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子の使用を提供し、前記抗原結合分子は選択的にＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に結合する。
【００３８】
この態様において、本発明はまた、患者における血液学的癌病態の治療、または治療用医薬品の製造において、Ｆｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子の使用を提供し、前記抗原結合分子は選択的にＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に結合する。
【００３９】
さらに他の態様において、本発明は、ＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）を発現する白血病性幹細胞を阻害する薬剤を提供し、この薬剤は、Ｆｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子を含み、前記抗原結合分子は選択的にＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に結合する。
【００４０】
この態様において、本発明はまた、患者における血液学的癌病態を治療する薬剤を提供し、この薬剤は、Ｆｃ領域、または増強されたＦｃエフェクター機能を有する改変Ｆｃ領域を含む抗原結合分子を含み、前記抗原結合分子は選択的にＩＬ−３Ｒα（ＣＤ１２３）に結合する。
【００４１】
本発明のこの態様の薬剤は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤および／または希釈剤と共に抗原結合分子を含む製薬組成物であり得る。
【００４２】
非経口投与に好適な組成物は、好ましくはレシピエントの血液に等張な活性成分の滅菌水性製剤を含むのが便利である。この水性製剤は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いる公知の方法により製剤化できる。この滅菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の滅菌注射用の溶液または懸濁液であり得、例えば、ポリエチレングリコールおよび乳酸中の溶液としてあり得る。使用し得る許容できる媒体および溶媒の中でも、水、リンガー液、好適な炭水化物（例えば、スクロース、マルトース、トレハロース、グルコース）および等張な塩化ナトリウムがある。また、滅菌の不揮発性油は、溶媒として、または懸濁媒体として使用するのが便利である。この目的で、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドなどの任意の無刺激油が使用できる。また、オレイン酸などの脂肪酸が注射用製剤に使用される。
【００４３】
このような治療用組成物の製剤は、当業者によく知られている。好適な薬学的に許容される担体および／または希釈剤としては、いずれかのおよび全ての従来の溶媒、分散剤、媒体、増量剤、固体担体、水性溶液、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが挙げられる。このような薬学的活性物質のための媒体ならびに試剤の使用は、当業界によく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡに記載されている。従来の任意の媒体または試剤が、活性成分に不適合性でない限り、本発明の製薬組成物におけるそれらの使用が考慮される。補助的な活性成分もまたこれらの組成物中に組み込むことができる。
【００４４】
本明細書ならびに以下の特許請求の範囲を通して、文脈により別様に必要とされない限り、「含む」という用語および、または「含んでいる」などの変形は、記述された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含むが、他の任意の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を除外するものでないことは理解されるであろう。
【００４５】
任意の先行刊行物（またはそれに由来する情報）または公知の任意の事項に対する本明細書における記述は、先行刊行物（またはそれに由来する情報）または公知の事項が、本明細書が関連する努力分野における共通の一般的知識の一部を形成するとの認知または承認または何らかの形態の示唆と考えられてはおらず、また考えるべきではない。
【００４６】
本発明はさらに、以下の非限定的である実施例によって説明される。
【実施例１】
【００４７】
実施例１
本実施例では、ＭＡｂ  ７Ｇ３の能力を証明し、ＡＭＬ−ＬＳＣｓとＨＳＣｓとの間のＣＤ１２３発現および機能における明白な違いを利用する。ＭＡｂ  ７Ｇ３はＩＬ−３シグナル伝達経路および一時ＡＭＬ細胞の増殖を阻害する。さらに、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ異種移植モデルにおけるＡＭＬ芽細胞のホーミングおよび移植が、ＭＡｂ  ７Ｇ３によって著しく減少し、ＬＳＣ機能が阻害される。
【００４８】
方法
ＡＭＬ患者サンプル、正常造血細胞、および細胞株
アフェレーシス産物、骨髄または末梢血サンプルは、ＡＭＬに罹っている新たに診断した患者および再発患者から得た。患者サンプルは、施設内ガイドラインによるインフォームドコンセント後に採取し、試験は、Ｒｏｙａｌ  Ａｄｅｌａｉｄｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ、およびｔｈｅ  Ｓｏｕｔｈ  Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｓｙｄｎｅｙ  ＆  Ｉｌｌａｗａｒｒａ  Ａｒｅａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。診断は、細胞形態学、細胞遺伝学、白血球抗原発現を用いて行い、仏国−米国−英国（ＦＡＢ）分類に従って評価した。単核細胞は、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ分離またはＦｉｃｏｌｌ密度勾配分離によって濃縮し、液体窒素中で凍結した。ヒト臍帯血およびＢＭ細胞は、それぞれ、予定日正常分娩または股関節置換手術を受けていて同意を得た患者から得たか、またはＣａｍｂｒｅｘ（米国）から市販品を得、先に記載したとおりに処理した38。
【００４９】
増殖アッセイ
ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦに対するＡＭＬ細胞増殖応答を、先に記載したとおり、［3Ｈ］−チミジンアッセイによって測定した39。簡単に述べると、９６ウェルプレートで１ウェル当たり２×１０4単核細胞を、２００μｌのＩＭＤＭ＋１０％の熱不活化ウシ胎仔血清（ＨＩ−ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｕｔａｈ）中、０．００１ｎＭ〜１０ｎＭの７Ｇ３、またはイソ型マッチド対照ＢＭ４（ＩｇＧ２ａ）の存在下、ＩＬ−３（１ｎＭ）またはＧＭ−ＣＳＦ（０．１ｎＭ）により、３７℃、５％ＣＯ2で４８時間刺激し、培養の最後の６時間は、3Ｈ−チミジン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＮＳＷ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の０．５μＣｉを加えた。Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ細胞ハーベスター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて、細胞をグラスファイバー紙上に沈積させ、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてカウントした。サイトカイン類および抗体は全て、市販品を入手（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）したか、またはＣＳＬ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により供給された。
【００５０】
サイトカインシグナル伝達
シグナル伝達タンパク質のリン酸化を、免疫沈降および免疫ブロットにより検出した。ＴＦ−１細胞およびＡＭＬ  ＭＮＣ細胞を洗浄し、成長因子非存在下で、０．５％のＨＩ−ＦＣＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｕｔａｈ）または０．５％のヒトアルブミン（ＣＳＬ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と共に、ＩＭＤＭ媒体中で、１８時間静止状態にした。１億個の細胞をＩｇＧ２ａ（１００ｎＭ）、９Ｆ５、６Ｈ６（非ブロック抗ＣＤ１２３抗体）、または７Ｇ３（０．０００１〜１００ｎＭ）と共に、氷上３０分間インキュベートし、次いで、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３により、３７℃で１５分間刺激した。細胞を、ＮＰ−４０細胞溶解緩衝液40中で溶解させ、１Ｃ１およびセファロースビーズに結合させた８Ｅ４抗体を用いて、ヒトβc（ＣＤ１３１）を免疫沈降させた。免疫沈降物を、先に記載したとおり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットに供した41。免疫ブロットを探索するために用いた抗体は：４Ｇ１０、抗ホスホチロシンＭＡｂｓ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）、抗ホスホ−Ａｋｔ  Ｓｅｒ４７３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）；ならびに抗リン酸化シグナルトランスデューサーおよび転写５（ＳＴＡＴ−５）Ｍａｂのアクチベーター（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）であった。抗体は全て、製造元の指示に従って使用した。シグナルは、増強化学ルミネセンス（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＰｈａｒｍａｃｉａまたはＰｉｅｃｅからのＷｅｓｔ  Ｄｕｒａ）を用いて発色させた。
【００５１】
ＳＴＡＴ−５活性化はまた、白血病細胞株のＭ０７ｅおよびＴＦ１、ならびに一次ＡＭＬ細胞について細胞内ＦＡＣＳによって検出した。細胞は、ＭＥＤＭプラス１０％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍＬのｈｕＩＬ−３（ＣＳＬ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）中、６０分間インキュベートし、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ（商標）緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により固定し、引き続きメタノール透過処理した。次いで細胞を、抗ホスホＳＴＡＴ−５（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【００５２】
エキソビボ抗体処理
解凍ＡＭＬまたは正常造血細胞を、１５〜２０％のＢＩＴ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ  Ｃａｎａｄａ）を添加したＸ−ＶＩＶＯ  １０（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）中、対照のＩｇＧ２ａまたは７Ｇ３と共に、３７℃で２時間インキュベートしてから、再取り込みアッセイのため（以下を参照）致死量以下で放射線照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス内へ静脈内移植した。移植を、４〜１０週目に２つの異なる時点で測定した。
【００５３】
ＡＭＬのインビボ抗体処理
インビボ試験のため、対照のＩｇＧ２ａまたは７Ｇ３（１回の注射当たり、３００〜５００μｇ）を各図の説明文に記載されたスケジュールで週３回、マウスに腹腔内注射した。シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）による７Ｇ３の相乗効果の可能性を調べるために、移植３５日後、５００μｇの抗体を１日１回、３日間連続して注射し、引き続き、４０ｍｇ／ｋｇ／日でＡｒａ−Ｃを５日間連続腹腔内注射した。さらに４週間、週３回、１回の注射当たり５００μｇでの抗体処置を再開し、その後、最後の抗体注射の３日後に移植を測定した。
【００５４】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへのヒト細胞の異種移植
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ／Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ＣｏｍｍｉｔｔｅｅまたはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓのｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された施設内指針の下で、動物試験を実施した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへのヒト細胞の移植は、先に記載したとおりに行った38。簡単に述べると、全てのマウスが、マウス１匹当たり、５００〜１０００万のヒト細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）移植または大腿内移植前に、致死量以下の放射線照射（２５０〜３５０ｃＧｙ）を受けた。抗ＣＤ１２２抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＴＭ−β１（兵庫健康科学大学のＴ．Ｔａｎａｋａ教授により恵与）42から精製し、先に記載したとおりナチュラルキラー細胞枯渇のための放射線照射の直後に、２００μｇをマウスに腹腔内注射した43。同様に、マウス１匹当たり、８００万の正常骨髄細胞、または１００万の選別ＣＤ３４+正常骨髄細胞または３×１０5の系列枯渇ＣＤ３４+正常臍帯血細胞を静脈内移植した。ヒトＡＭＬの移植レベル、ならびにマウス骨髄中の正常造血細胞、末梢血、肝臓および脾臓を、フローサイトメトリーによるｈＣＤ４５+細胞のパーセンテージに基づいて評価した。ＬＳＣ活性に及ぼす７Ｇ３の効果を測定するために、ＩｇＧ２ａ処置群または７Ｇ３処置群において、先に移植したマウスの骨髄から単離したヒト細胞と同数の（９００万細胞／マウス）の静脈内移植により二次移植も行った。
【００５５】
ホーミングアッセイ
一次患者サンプルからのまたは移植マウスから採取した同数のヒト細胞を、致死量以下に放射線照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへ静脈内注射した。注射の１６〜２４時間後、ヒト細胞に関し、５×１０4〜１×１０5の採集結果を用いて、レシピエントマウスの骨髄、脾臓、および末梢血からの単核細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。マウス組織内へのヒト細胞のホーミング効率を、特定臓器内に見られる注射細胞の％を測定することによって判定し、式：組織内で評価されたｈｕＣＤ４５+細胞の％×特定組織内の細胞総数／注射したヒト細胞の総数×１００44~46によって算出した。
【００５６】
細胞染色およびフローサイトメトリー
処置マウスの骨髄、脾臓、肝臓および末梢血からの細胞を、先に記載したとおり2、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合抗マウス抗体ならびにフィコエリスリン−シアニン５（ＰＣ５、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）抗体またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ、ＢｉｏｌｅｇｅｎｄおよびＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）結合抗ヒト抗体により染色した。ＣＤ１２３発現を、フィコエリスリン（ＰＥ）結合抗ヒトＣＤ１２３抗体（クローン９Ｆ５）により測定した。７Ｇ３処置マウスから回収したヒト細胞上の７Ｇ３結合を、９Ｆ５−ＰＥ、または７Ｇ３−ＰＥにより、二通りのサンプルを染色することにより測定した。これら２種のクローンは、完全に別個のエピトープに結合し、非処置一次細胞における蛍光と同様のレベルを生じるからである（データは示していない）。７Ｇ３結合のレベルは、式：［（９Ｆ５―ＰＥ検出ＣＤ１２３のＲＦＩ）−（７Ｇ３−ＰＥ検出ＣＤ１２３のＲＦＩ）］÷（９Ｆ５―ＰＥ検出ＣＤ１２３のＲＦＩ）×１００により算出した。免疫表現型および幹細胞集団は、一連の抗ヒト抗体：抗ＣＤ１５−ＦＩＴＣ、ＰＥに結合した抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１９−ＰＥ、抗ＣＤ３３−ＰＥ、抗ＣＤ３４−ＦＩＴＣまたはＣＤ３４−ＰＣ５、および抗ＣＤ３８−ＰＥまたはＰＥ−シアニン７（別様に記述しない限り、抗体は全て、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから）を用いて同定した。陰性細胞の９９．９％を排除するために、イソ型対照抗体を用い、細胞は、ＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【００５７】
統計解析
データは、平均値±標準誤差として表している。群間差の有意性は、スチューデントｔ検定を用いて決定した。
【００５８】
結果
モノクローナル抗体７Ｇ３は、ＩＬ−３依存性細胞株および一次ＡＭＬ細胞におけるＩＬ−３媒介シグナル伝達をブロックする。
ＩＬ−３Ｒ受容体αサブユニット（ＩＬ−３Ｒα、ＣＤ１２３）に対して増加させたモノクローナル抗体７Ｇ３は、ＣＤ１２３に対するＩＬ−３結合を阻害すると共に、白血病性細胞株（ＴＦ−１）の増殖、ヒト好塩基球からのヒスタミン放出、および内皮細胞活性化などのインビトロＩＬ−３媒介効果を阻害することが先に示されている33。これらの所見に矛盾せず、ＭＡｂ  ７Ｇ３は、ＴＦ−１細胞および一次ヒトＡＭＬ細胞における細胞内シグナル伝達を阻害することが判明した。ＩＬ−３（１ｎＭ）による成長因子誘導ＴＦ−１細胞の刺激により、受容体βサブユニット（ＣＤ１３１）のチロシンリン酸化、ならびにＳＴＡＴ−５および細胞増殖と生存に役割を果たすＡｋｔ下流シグナル伝達分子の活性化がもたらされる（図６ａ）。ＣＤ１３１チロシンリン酸化、ならびにＳＴＡＴ−５およびＡｋｔの活性化は、１ｎＭの濃度の７Ｇ３と共に細胞をインキュベートすることによって阻害され、１０ｎＭの濃度でさらに減少し、１００ｎＭの濃度では完全にブロックされ、７Ｇ３に関して報告された９００ｐＭのＫｄに矛盾しない33。ＩＬ−３結合をブロックしないＣＤ１２３に対する２つの中和不良の抗体、９Ｆ５および６Ｈ６は、ＩＬ−３媒介シグナル伝達の阻害に無効であった（図６ａ）。ＩＬ−３依存性白血病細胞株ＴＦ−１およびＭＯ７ｅにおける７Ｇ３によるＳＴＡＴ−５のＩＬ−３刺激リン酸化の阻害もまた、フローサイトメトリーアッセイによって実証された（図６ｂ）。一次ＡＭＬ細胞において、細胞生存40の促進に関与するシグナルであるＣＤ１３１のチロシン５７７のＩＬ−３依存性リン酸化を、ＭＡｂ  ７Ｇ３が濃度依存的様式で選択的に阻害したことは重要である（図６ａ）。同様に、７Ｇ３はまた、フローサイトメトリーで測定すると、一次ＡＭＬ細胞におけるＩＬ−３刺激ＳＴＡＴ−５リン酸化も減少させた（図６ｂ）。ＭＡｂ  ７Ｇ３によるＩＬ−３シグナル伝達のこの選択的阻害は、ＩＬ−３結合をブロックするその能力と矛盾せず、以前はＣＤ１３１（β鎖）を発現しないと報告されていた25白血病性幹細胞が、もっぱらＣＤ１２３（α鎖）を介してシグナル伝達し得るかどうかという重要な疑問が生じる。
【００５９】
ＡＭＬ白血病性幹細胞上で、ＣＤ１２３（ＩＬ−３Ｒ受容体α鎖）はＣＤ１３１（受容体β鎖）と共発現する。
ＡＭＬ患者からのＣＤ３４+／ＣＤ３８-細胞上のＣＤ１２３の過剰発現は広範に報告されており17~21、いくつかの研究では、白血病性ＣＤ３４+／ＣＤ３８-幹細胞（ＬＳＣ）のマーカーとして提案されている24、25。現在の研究では、多くのＡＭＬサンプル上のＣＤ１２３発現が、２つの異なる研究室で独立して測定されている。ＣＤ３４+／ＣＤ３８-細胞上のＣＤ１２３発現（ＲＦＩ  ６７．７±２４．２、ｎ＝９）は、正常の造血ＣＤ３４+／ＣＤ３８-細胞上のＣＤ１２３発現（ＲＦＩ  １７．１±８．６、ｎ＝４、Ｐ＝０．２１）よりも有意に高く（データは下表１にまとめてある）、他の報告17~21、24、25と矛盾しなかった。この過剰発現は、フローサイトメトリーで測定すると、ＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖（ＣＤ１１６）がＡＭＬサンプル中の等しい集団において発現しなかった点で、選択的であるようだ。その代わり、ＧＭ−ＣＳＦ受容体α鎖は、ＣＤ３４-芽細胞上に多く発現した（データは示していない）。さらに、フローサイトメトリーおよびＰＣＲ分析は、ＣＤ１２３を発現するＣＤ３４+細胞はＣＤ１３１も発現し（データは示していない）、シグナル変換がＣＤ１２３単独を介して生じるのではなく、古典的なヘテロダイマーＩＬ−３受容体を介して生じることを示唆しており、これもＣＤ１３１リン酸化データによって裏付けられている（図１ａ）。さらに、正常のＣＤ３４+／ＣＤ３８-前駆体細胞と悪性のそれとの間のＣＤ１２３発現レベルの差は、７Ｇ３がＬＳＣを選択的に標的化するが、正常の造血幹細胞は標的にしない根拠を提供している。
【００６０】
７Ｇ３は、インビトロで一次ＡＭＬ細胞の自然な増殖およびＩＬ−３に誘導された増殖を阻害する。
３８人の一次ＡＭＬ患者サンプルを用いて、ＩＬ−３に誘導された増殖を阻害する７Ｇ３の能力を調べた。３つの一次サンプルの代表的なプロットを図１ｂ〜１ｄに示す。７Ｇ３は、３２／３５サンプルにおけるＩＬ−３に誘導された増殖を阻害した（図１ｅ）が、ＧＭ−ＣＳＦに刺激された増殖は阻害しなかった（図１ｂ〜１ｄ）。外来的に添加した成長因子の非存在下で、７Ｇ３はまた、いくつかのＡＭＬサンプルからの細胞の増殖を阻害した。試験したサンプルのうち９つで、７Ｇ３およびＩＬ−３の存在により、外来性レベルのおよそ６０％（５０〜７５％の範囲）に増殖が減少し（図１ｅ）、オートクリン経路が示唆された。ブロック不良の６Ｈ６抗体は、ＩＬ−３誘導増殖を阻害しなかった（データは示していない）。７Ｇ３抗体のＫｄ（約９００ｐＭ）33は、増殖を阻害するのに必要な濃度によく合致した（図１ｂ〜１ｄ）。全体として、７Ｇ３は、大多数の一次ＡＭＬサンプルにおけるＩＬ−３媒介増殖ならびに自然な増殖（ＩＬ−３の添加なし）の阻害に有効であり、いくつかのＡＭＬ細胞が構成的にＩＬ−３を産生するか、または７Ｇ３がこれらの細胞に負のシグナルを引き起こすことが示唆された。
【００６１】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、７Ｇ３による前処置はＡＭＬを阻害するが、正常な造血細胞の移植は阻害しない。
免疫欠損マウスにおいて正常細胞および悪性細胞の再増殖能力に及ぼす７Ｇ３の効果を評価するために、一次ＡＭＬ細胞および正常骨髄（ＮＢＭ）細胞または臍帯血（ＣＢ）細胞を、７Ｇ３または無関連のＩｇＧ２ａ（１０μｇ／ｍＬ、２時間）と共に、エキソビボインキュベートし、致死量以下の放射線照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。対照は接種４〜８週後に骨髄移植の証拠を示したが、エキソビボ７Ｇ３インキュベーションは、ＡＭＬサンプルの９／１０の移植を著しく減少させた（対照に比較して、平均８９．７±１．９％の減少、Ｐ＝０．０１３、図２ａおよび表１）。移植におけるこの減少は、接種８週後と１２週後との間で評価した際、サンプルの６／７で持続していた。対照的に、接種４〜１１週後、７Ｇ３は、３／５の正常サンプルの移植に有意な阻害効果を持たず、また、２つのＮＢＭに対する小さな効果が統計的有意性に達していたが、この阻害は、ＡＭＬ細胞と比較するとはるかに低かった（図２ｂおよび表１）。エキソビボ７Ｇ３処置は、ＩｇＧ２ａ対照に比較して、平均２３．５±８．９％（Ｐ＝０．０７８）、正常の造血細胞移植を減少させた。ＮＢＭの３つに関する多系列移植は、ＣＤ３３、ＣＤ１９、およびＣＤ３の発現をモニターすることにより測定したが、ＩｇＧ２ａ処置群と７Ｇ３処置群との間に有意差は見られなかった（データは示していない）。
【００６２】
エキソビボ７Ｇ３処置は、診断時と再発時双方で採取したＡＭＬ−８の移植を同程度に阻害しており、診断サンプルと再発サンプルの双方が、７Ｇ３処置に対して同等の感受性を有し得ることを示した。ＡＭＬ−５は移植がエキソビボ７Ｇ３処置によって減少しなかった唯一のＡＭＬサンプルであり、これは、評価した全てのＡＭＬサンプルのうちで、このサンプルが高比率のＬＳＣ（ＣＤ３４+／ＣＤ３８-）および最低のＣＤ１２３発現を示すことに起因すると考え得る（表１）。全体として、これらの結果は、ＡＭＬ  ＬＳＣに比較して、７Ｇ３処置に対する正常の造血幹細胞の感受性の減少を実証している。
【００６３】
エキソビボ７Ｇ３処置によって生じるＡＭＬ移植の減少はまた、生存率の改善にも関連していた。ＩｇＧ２ａ処置または７Ｇ３処置のＡＭＬ−９細胞を移植したマウスは、それぞれ、１１．５週間と２４週間の生存率中央値を示した（Ｐ＝０．０１８８、各群に関してｎ＝１０、図２ｃ）。２０週間を超えて生存したマウスがいなかった対照群とは対照的に、７Ｇ３群の４０％は実験の終了を超えて生存した（２５週間）。
【００６４】
ＡＭＬまたは正常な造血細胞の移植に及ぼすエキソビボ７Ｇ３処置の阻害効果は、有意な相関性を持って、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-集団におけるＣＤ１２３発現の強度と逆の関連性があった（図７；Ｒ＝−０．６８、Ｐ＝０．００５１）。２つのパターンは明らかであり、７Ｇ３によって移植が強く阻害されたＡＭＬサンプルでは、ＣＤ１２３の発現が一般に高かった。逆に、７Ｇ３によって移植がそれほど顕著に影響されなかった正常の造血サンプルと単一のＡＭＬサンプル（ＡＭＬ−５）では、一般にＣＤ１２３を発現は低レベルであった。
【００６５】
７Ｇ３は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＡＭＬホーミング能力を阻害する。
静脈内接種されたＡＭＬ細胞が、骨髄および脾臓へホーミングする能力に関する７Ｇ３の効果を判定するために、エキソビボ処置されたＡＭＬ−８−ｒｅｌ細胞およびＡＭＬ−９細胞を移植し、２４時間後にマウスを安楽死させて調べた。イソタイプ処置の対照と比較して、７Ｇ３は、骨髄に対するホーミングが４６〜９３％の間で有意に減少したが（Ｐ＜０．０５）、一方、脾臓へのホーミングは、対照の３５％から９０％減じたが、この差は統計的に有意ではなかった（Ｐ＞０．０５）（図２ｄ）。接種２４時間後の時点で骨髄および脾臓内に残留した白血病性細胞は、主としてＣＤ３４+の始原細胞であり、また７Ｇ３は、骨髄において細胞数が減少し、残留細胞の細胞表面表現型を変化させなかった（データは示していない）。
【００６６】
骨髄へのＡＭＬホーミングに及ぼす７Ｇ３の効果をさらに特性化するために、ＡＭＬ−８−ｒｅｌ細胞を７Ｇ３抗体またはイソタイプ対照抗体に曝露し、引き続き尾静脈（ＩＶ）を経るか、または直接右大腿（ＲＦ）に移植し、その５週後にマウスを安楽死させた。図２ｅは、大腿内接種が、静脈内接種と比較して移植に及ぼす７Ｇ３の阻害効果を減衰させたが、大腿注射および非大腿注射双方において移植の有意な減少における７Ｇ３の有効性は存続した。ＡＭＬ−ＬＳＣの７Ｇ３阻害をより直接的に示すために、ＡＭＬ−ＬＳＣ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいてヒト疾患を再利用する能力により規定された）が、このフラクションにかなり濃いのでＣＤ３４+ＣＤ３８-細胞に及ぼす７Ｇ３の処置効果を本発明者らは調べた2、3。ＢＭへのＡＭＬ−８−ｒｅｌおよびＡＭＬ−９のホーミングからのＣＤ３４+ＣＤ３８-細胞数は、エキソビボ７Ｇ３の処置により対照のそれぞれ８．４±０．０１８％と１２．０±４．３％とに減少した（Ｐ＝０．１６と０．０１３、図２ｆ）。同様に、脾臓に対するＡＭＬ−９ホーミングからのＣＤ３４+ＣＤ３８-細胞数が、対照の３．８±１．５％に減少した（Ｐ＝０．０１９）。この所見をさらに確認するために、ＡＭＬ−９から選別されたＣＤ３４+ＣＤ３８-細胞によりホーミング実験を繰り返し、次いでＩｇＧ２ａまたは７Ｇ３のいずれかによりエキソビボ処置してからＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。７Ｇ３の処置群におけるヒト細胞のホーミング効率は、ＢＭにおいてＩｇＧ２ａ対照の７．８±１．７％に、脾臓においては１１．２±０．８４％に減少した（Ｐ＝０．０９）（図２ｇ）。したがって、ＣＤ１２３は、ＡＭＬのＮＯＤ／ＳＣＩＤ白血病開始細胞（ＳＬ−ＩＣ）の支持微小環境へのホーミング、ならびにＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける疾患の確立および伝播に重要な役割を果たしていると思われる。
【００６７】
７Ｇ３の早期投与は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＡＭＬ移植を減少させる
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの７Ｇ３処置が、ＡＭＬ細胞の移植に影響を与えるかどうかを判定するために、７Ｇ３またはイソタイプの対照抗体（３００μｇ）を腹腔内注射により単回投与し、次いで６時間後にＡＭＬ−１細胞を、静脈内に移植した。７Ｇ３処置により、骨髄における移植が、移植後５週目に対照の１．３±０．９％へとほぼ完全に剥離した（Ｐ＝０．０００６、ｎ＝５、図３ａ）。
【００６８】
移植２４時間後または４日後に処置を開始することにより、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＡＭＬの進行の制御における７Ｇ３の有効性もまた調べ、ＳＬ−ＩＣを、処置開始前の骨髄微小環境にホーミングさせると推定した44~46。移植２４時間後に処置を開始すると、移植はＡＭＬサンプルの２／３に減少した。１日ごとに投与された４回投与のこの処置療法により、ＡＭＬ−２およびＡＭＬ−３の移植は、それぞれ対照の４１．１±２７．１％（Ｐ＝０．０９６）と３９．６±１０．０％（Ｐ＝０．０２６）に減少したが、一方、ＡＭＬ−１の移植では影響されなかった（図３ｂ）。
【００６９】
双方の移植後処置療法における７Ｇ３の比較的低い効果にもかかわらず、マウスの骨髄から採取されたＡＭＬ細胞上の７Ｇ３の被覆は、はっきりと明白であった（データは示していない）。さらに、７Ｇ３処置により、試験されたいずれの処置療法もＡＭＬ−１細胞上のＣＤ１２３発現を減少させた。例示として移植４日目後に開始する７Ｇ３の処置により、９Ｆ５抗体を用いて評価されたように、ＢＭから採取されたＡＭＬ−１のＣＤ１２３発現は対照の５１．３±４．０％に減少した（図３ｃ、Ｐ＜０．０００１）。同じ実験において、７Ｇ３はまた、マウスの末梢血および脾臓に対するＡＭＬ−１の伝播をそれぞれ対照の２７．８±７．５％（Ｐ＝０．００２９）と２３．５±５．３％（Ｐ＝０．０００９）とに減少させた（図３ｄ）。
【００７０】
７Ｇ３は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける確立されたＡＭＬ疾患の負荷を減少させることができる。
本試験の主要目的は、ＡＭＬ幹細胞上の標的ＣＤ１２３の効果を試験することであるが、白血病性幹細胞の移植に及ぼす効果を超えた確立された白血病疾患に対する任意の単一薬剤の治療活性を示す７Ｇ３の能力を、確立された疾患モデルにおいて移植２８日後に連続７Ｇ３処置または対照ＩｇＧ２ａ処置を開始し、殺処置時まで処置を継続することによって評価した。患者のサンプルの間でこのモデルにおける７Ｇ３処置への応答にばらつきがあったが、これは臨床的に見られるＡＭＬの異種性を反映している可能性が高い。５つのサンプルのうち２つに、ＡＭＬのＢＭ負荷における有意な減少が見られた（図３ｅおよび３ｆに示す）。ＡＭＬ−２は、移植後９週目と１４週目に、ＢＭ移植において有意な減少を伴って７Ｇ３に応答したが（図３ｅ）、一方、８日間にわたって７Ｇ３の４回のみの投与によるマウスの処置では、ＡＭＬ−１の移植がＩｇＧ２ａ対照の１８．９±４．１％（Ｐ＝０．００１、図３ｆ）に有意に減少した。さらに、多数のＡＭＬサンプルにおいて、移植後４日目または２８日目における７Ｇ３処置の開始によりＢＭにおける白血病負荷に有意な減少はなかったが、末梢造血器官（脾臓、末梢血、および肝臓）における白血病負荷が、７Ｇ３処置群においてより低下した（図３ｄ、データは示していない）。まとめるとこれらのデータは、７Ｇ３が、生物学的にインビボ活性であり、単一薬剤として使用される場合、ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルにおけるＡＭＬの増殖を抑制できることを示唆している。
【００７１】
７Ｇ３は、ＳＬ−ＩＣの自己複製能力を標的にする。
連続的移植実験は、全ての癌幹細胞（ＣＳＣ）特異的療法に関して重要な問題を扱っており、ＣＳＣが実際にインビボで標的にされているという証拠を提供する。ＡＭＬの場合、ＡＭＬ−ＬＳＣを一次ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを再増殖させると、それらは自己複製しなければならないことが知られており3；自己複製は、全ての幹細胞において重要な性質であり、二次移植により最良に評価される。
【００７２】
より迅速に増殖するＡＭＬ芽細胞を標的にする従来の療法に対するアジュバントとして、自己複製能力を有するＬＳＣを標的にするために、７Ｇ３もまた使用できるかどうかを調べる目的で、７Ｇ３またはＩｇＧ２ａを、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）と組み合わせ、ＳＬ−ＩＣおよび白血病負荷に及ぼすそれらの効果を判定した。ＡＭＬ−１０細胞の移植後３５日目に、マウスを３日間毎日７Ｇ３またはＩｇＧ２ａ対照（５００μｇ／日）で処置し、次いで連続５日間Ａｒａ−Ｃ（４０ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した。Ａｒａ−Ｃで処置後、さらに４週間７Ｇ３を投与した。７Ｇ３およびＡｒａ−Ｃで処置されたマウスの骨髄および脾臓内の白血病移植は、ＩｇＧ２ａおよびＡｒａ−Ｃで処置されたマウスと比較して減少しなかった（図４のパートＩａ）。しかしながら、細胞を、処置マウスの骨髄から採取し、同数のヒト細胞を二次レシピエントマウスに移植した場合、７Ｇ３／Ａｒａ−Ｃ処置ドナーマウスから採取された細胞の骨髄および脾臓へのホーミングは、それぞれＩｇＧ２ａ／Ａｒａ−Ｃ処置対照の３３．６±５．０％（Ｐ＝０．０１４）と１０．９±４．６％（Ｐ＝０．１５）まで阻害された（図４のパートＩｂ）。さらに、二次レシピエントマウスの骨髄および脾臓の再増殖もまた、７Ｇ３／Ａｒａ−Ｃにより、それぞれＩｇＧ２ａ／Ａｒａ−Ｃ処置対照の２１．０±１５．２％（Ｐ＝０．０２４）と３５．８±３１．８％（Ｐ＝０．３１）とに減少した（図４のパートＩｃ）。ドナーマウスの骨髄に出現するＣＤ３４+／ＣＤ３８-ＬＳＣの比率は、ＩｇＧ２ａ／Ａｒａ−Ｃ処置に比して、７Ｇ３／Ａｒａ−Ｃにより減少しなかったが（データは示していない）、図４のパートＩｄは、ＩｇＧ２ａ／Ａｒａ−Ｃで処置されたドナーと比較して、７Ｇ３／Ａｒａ−Ｃドナーからの二次レシピエントマウスの骨髄および脾臓における細胞集団の有意な減少を示している。これらのデータは、７Ｇ３のインビボ投与がＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＡＭＬ−ＬＳＣを特異的に標的にし、二次レシピエントマウスにおけるホーミングおよび移植の減少をもたらすことを示している。
【００７３】
７Ｇ３が単一薬剤として作用できるかどうかを確証するために、Ａｒａ−Ｃの非存在下で７Ｇ３のインビボ処置後に連続移植を実施した。図４のパートＩＩＡに示すように、１０週間の７Ｇ３処置は、一次移植マウスのＢＭまたは脾臓におけるＡＭＬ−１０の移植を明白には減少させなかったが、７Ｇ３処置マウスから採取したＡＭＬ細胞は、ＩｇＧ２ａ処置対照と比較して二次レシピエントマウスのＢＭ（２８．２±２．９％、Ｐ＝０．００８３）および脾臓（１８．３±４．８％、Ｐ＝０．００２１）へのホーミング能力は有意に減少した（図４のパートＩＩＢ）。再増殖能力もまた、有意に減少した：未処置の対照細胞を移植した９匹の二次レシピエントマウスのうちの８匹は、移植されたが、一方、７Ｇ３処置マウスからの細胞を接種した８匹のマウスのうちの３匹だけが、移植の証拠を示した（図４のパートＩＩＣ）。７Ｇ３処置マウスにおける平均移植レベルは、ＩｇＧ２ａ処置対照と比較して有意に減少した（ＢＭ、３４．６±１８．６％、Ｐ＝０．０３９；脾臓、３３．７±２０．４％、Ｐ＝０．１９）（図４のパートＩＩＣ）。この患者サンプルは、７Ｇ３処置一次マウスにおいて減少しなかった高レベルのＣＤ３４+ＣＤ３８-始原細胞を有した。しかしながら、ＩｇＧ２ａで処置されたドナーと比較して、７Ｇ３処置ドナーから移植された二次レシピエントマウスのＢＭにおける始原細胞集団が有意に減少した（対照の５６．６±１５．０％、Ｐ＝０．０３１）（図４のパートＩＩＤ）。ＡＭＬ−９細胞を用いる独立した実験において同様の結果が得られ、７Ｇ３は、平均レベルの移植を対照の１９．３％±９．８％に減少させたことを示した（図４のパートＩＩＩ）。
【００７４】
図４に示された３つの独立した実験の全てのデータを組み合わせてまとめると、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ａプラスＡｒａ−Ｃで処置した対照マウスから採取された細胞により、２７匹の二次マウスのうちの１匹（３．７％）だけが移植されなかった。対照的に、７Ｇ３または７Ｇ３プラスＡｒａ−Ｃで処置したマウスから採取された細胞により、２３匹の二次マウスのうちの１１匹（４８％）が移植できなかった。これらの結果は、７Ｇ３のインビボ投与は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＡＭＬ−ＬＳＣを特異的に標的にし、その結果、二次レシピエントにおけるホーミングおよび移植を減少させることを実証している。
【００７５】
ＣＤ１２２+ＮＫ細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＡＭＬ再増殖の７Ｇ３媒介阻害に寄与する
Ｆｃ依存、抗体依存性の細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を促進する免疫系におけるエフェクター細胞の中には、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球および樹状細胞がある。ＡＭＬの移植を阻害する７Ｇ３の能力へのそれらの寄与は、エキソビボの７Ｇ３処置ＡＭＬ細胞の白血病性細胞移植前に、ＣＤ１２２としても知られているＩＬ−２Ｒβ−鎖（ＩＬ−２Ｒβ）に対するモノクローナル抗体を放射線照射されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射することによって評価された。ＩＬ−２Ｒβは、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、およびマクロファージに広く発現し、ｍＡｂによるＩＬ−２Ｒβのブロックによって、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ異種移植系におけるヒト造血細胞の移植を改善することができる。
【００７６】
移植後４週目に、ＩｇＧ２ａ対照によりエキソビボ処置されたＡＭＬ−８−ｒｅｌ細胞を移植したＮＫ細胞欠失マウスにおける白血病移植は、非欠失マウスの１１３．３±２．８％（Ｐ＝０．０２３）に増加し（図５ａ）、ＣＤ１２２+ＮＫ細胞が、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＡＭＬ移植を中等度に減少させることが示唆された。ＣＤ１２２+細胞の欠失はまた、部分的ではあるが有意に、ＡＭＬ細胞の移植を減少させる７Ｇ３の能力を減じたことから、ＣＤ１２２陽性細胞は、７Ｇ３の阻害効果を一部媒介することが示唆された（図５ａ）。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖に及ぼす効果と対照的に、７Ｇ３は依然として、抗ＣＤ１２２処置マウスにおいて、ＩｇＧ対照の８５％を超えて白血病細胞のホーミングを強力に阻害した（図５ｂ）。これらの結果により、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＡＭＬ細胞の移植およびホーミングを阻害する７Ｇ３の能力は、少なくとも２つの協同的経路：ＮＫおよび／または他のＣＤ１２２依存性細胞により生じたＡＤＣＣ；およびＩＬ−３／ＣＤ１２３シグナル経路をブロックする７Ｇ３の特異的阻害効果によって媒介されることを示している。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
考察
ＡＭＬ芽細胞およびＬＳＣ上のＣＤ１２３の一貫した過剰発現は、特に再発または最少残存疾患に関して、ＡＭＬ単独または確立された療法と併用した治療のための将来有望な治療標的を提供する。ＣＤ１２３に基づいた幾つかの療法が考案されており、種々のアッセイにおいて抗ＡＭＬ効果を示している23、47~49。本研究において、７Ｇ３は、インビトロでＩＬ−３媒介シグナル経路、それに続く種々のＡＭＬサンプルの誘導増殖を特異的かつ一貫して阻害することが示された。さらに、７Ｇ３処置により、ＡＭＬ−ＬＳＣ移植は著しく減少し、マウスの生存率が改善された。予め確立された疾患を有するマウスは、ＢＭおよび周辺部のＡＭＬ負荷の減少および処置の際の二次的移植の減損を示し、処置マウスにおいてＡＭＬ−ＬＳＣが直接標的にされていることを確証した。これらの結果により、治療的抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体によるＡＭＬ−ＬＳＣの標的化、および臨床的適用の可能性に向けたインビボ前臨床研究知見の解釈に対して明瞭な確証を提供している。
【実施例２】
【００７９】
実施例２
ＣＳＬ３６０は、マウスモノクローナル抗体７Ｇ３の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を、ヒトＩｇＧ１定常領域上に移植することによって得られたキメラ抗体である。７Ｇ３と同様に、ＣＳＬ３６０は、ＣＤ１２３（ヒトＩＬ−３Ｒα）に高親和性で結合し、受容体への結合に関してＩＬ−３と競合し、その生物活性をブロックする33。したがってヒトキメラ抗体ＣＳＬ３６０の大部分は、ＡＭＬ  ＬＳＣ細胞を標的とし、排除するためにも使用できる可能性がある。ＣＳＬ３６０はまた、ヒト設定のエフェクター活性を開始できると思われるそのヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域があるため、ヒトの治療剤としての潜在的有用性の利点を有する。さらに、ヒトにおけるＣＳＬ３６０は、恐らくマウス７Ｇ３対応物に比してクリアランスの減少を示し、より免疫原性が少ないと考えられる。ＣＤ１２３発現白血病の治療におけるＣＳＬ３６０の作用機序は、１）ＩＬ−３とその受容体との結合をブロックすることによるＩＬ−３シグナル伝達の阻害、２）抗体が標的細胞に結合した後の補体の動員および補体依存性細胞障害活性（ＣＤＣ）を引き起こすこと、または３）抗体が標的細胞に結合した後、エフェクター細胞の動員および抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を引き起こすこと、を含み得る。
【００８０】
抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を試験するために開発された方法が、以下に記載されており、このアッセイにおいて（１）標的細胞集団または（２）エフェクター細胞集団を分析する方法に分類することができる。標的細胞の分析に関与する方法では、ＡＤＣＣによってもたらされた標的細胞溶解または標的細胞の早期アポトーシスを測定する。エフェクター集団を調べる方法では、ＮＫ細胞-誘導細胞溶解に関するマーカーとしてＮＫ細胞などのエフェクター細胞上の膜顆粒の誘導を測定する。
【００８１】
方法
51クロム放出アッセイを用いるＡＤＣＣの測定
Ｊｅｎｋｉｎｓら50により記載されたＣＤ１２３を発現させるために操作されたマウスリンパ細胞株ＣＴＬ−ＥＮまたは新たに解凍された白血病細胞（５×１０6）を、２５０μＣｉの51Crム−クロム酸ナトリウムと共に３７℃で１時間インキュベートした。ＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ媒体により細胞を３回洗浄して遊離の51Crム−クロム酸ナトリウムを除去した。クロム標識された標的細胞を、丸底９６ウェルプレート中に１０，０００個の細胞／ウェルで分配した。ＣＳＬ３６０またはイソタイプ対照抗体、（ＭｏｎｏＲｈｏ、組換え抗アカゲザルＤヒト免疫グロブリンＧ１）を、１０μｇ／ｍＬで加えた。
【００８２】
単離された新鮮ＰＢＭＣを、三通りの異なる比率でエフェクター細胞として添加し、５％ＣＯ2インキュベーター中３７℃で４時間インキュベートした。サンプルの全量は２００μＬ／ウェルであった。インキュベーション時間後、プレートを６００×ｇで５分間遠心分離し、１００μＬの上澄液を取り出し、放出51CrをWallace γ−カウンター中で測定した。
【００８３】
特異的細胞溶解は、式、細胞溶解％＝１００×［（抗体がある場合の平均ｃｐｍ−平均自発ｃｐｍ）／（平均最大ｃｐｍ−平均自発ｃｐｍ）］を用いることにより決定した。自然発生放出は、抗体もエフェクター細胞もない標的細胞を有したサンプルから得られた。最大放出は、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理された標的細胞から決定した。
【００８４】
カルセインＡＭ標識の標的細胞アッセイを用いるＡＤＣＣの測定
ＣＳＬ３６０により誘導されたＡＤＣＣを、Ｎｅｒｉら52によって記載された方法により測定した。この方法は、51クロムの替わりにカルセインＡＭによる標的細胞の標識を含んだ。標的細胞を、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で３０分間１０μＭカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ３０９９）と共にインキュベートした。標識細胞を洗浄して遊離のカルセインＡＭを除去し、次いで丸底プレートに１ウェル当り５０００個の細胞で分配した。エフェクター細胞を異なる比率で添加した。関連する抗体を、１０μｇ／ｍＬの最終濃度に加え、抗体の無い細胞を陰性対照として供した。プレートを、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション時間後、プレートを６００×ｇで５分間遠心分離した。１００μＬの上澄液を取り出し、蛍光を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー（励起フィルター４８５ｎｍ、発光フィルター５３５ｎｍ）で測定した。特異的細胞溶解は、式、細胞溶解％＝１００×［（抗体を有する平均蛍光−平均自然発生蛍光）／（最大平均蛍光−自然発生平均蛍光）］を用いることにより算出した。最大蛍光は、３％Ｅｘｔｒａｎによる細胞溶解により決定し、自然発生細胞溶解は、抗体またはエフェクター細胞の無い標的細胞により得られた蛍光であった。
【００８５】
細胞溶解の代理マーカーとしての膜顆粒タンパク質ＣＤ１０７ａのエフェクター細胞発現としてのＡＤＣＣの測定
ＮＫ細胞による膜結合溶解性顆粒タンパク質であるＣＤ１０７ａの発現レベルが、標的細胞の細胞障害性と関連することを、Ｆｉｓｃｈｅｒら51は示した。この方法を用いてＣＳＬ３６０のＡＤＣＣ活性を評価した。この方法は、標的細胞を有する白血球層から新鮮に単離されたヒトＰＢＭＣのインキュベーションを含んだ。使用された標的細胞は、ＣＤ１２３発現細胞株または一次ヒトＡＭＬ細胞であった。抗体の存在または非存在下、１：１の比率で標的細胞をヒトＰＢＭＣに加えた。ＣＤ１０７ａの非特異的または自然発生発現を、添加された抗体または標的細胞の無いヒトＰＢＭＣで評価した。ＰＥ−Ｃｙ５結合ＣＤ１０７ａモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５８０２）を全てのサンプルに加え、５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション開始１時間後、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を加えた。インキュベーション終了時に、細胞を洗浄し、抗ＣＤ５６−ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号３４７７４７）および抗ＣＤ１６−ＦＴＴＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５５４０６）モノクローナル抗体で染色した。次に細胞を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いてフローサイトメトリーにより分析し、膜結合溶解性顆粒タンパク質を発現したＦｃＲγＩＩＩＡ受容体を発現するＮＫ細胞を表すＣＤ５６ｄｉｍＣＤ１６＋ＣＤ１０７ａ細胞に関して分析した（Ｆｌｏｗ  Ｊｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）。
【００８６】
結果
ＣＳＬ３６０は、51クロム放出アッセイにより評価した際、ＡＭＬサンプルおよびＣＤ１２３発現細胞株においてＡＤＣＣを誘導する。
ＣＴＬＥＮ細胞による51クロムの総取り込みは、界面活性剤の細胞溶解によるクロムの最大放出で判定した際、ＡＭＬ細胞によるわずか約４００〜２００ｃｐｍと比較して２０００〜１５００ｃｐｍの間であった。陰性対照抗体ＭｏｎｏＲｈｏによる１．９％の細胞溶解と比較して、エフェクター対標的細胞の１００：１比率でＡＭＬ（ＳＬ）細胞の１５％の細胞溶解が見られた。陰性対照抗体ＭｏｎｏＲｈｏによる５％の細胞溶解と比較して、エフェクター対標的細胞の１００：１比率でＣＴＬＥＮ細胞の５１％の細胞溶解が見られた（表２）。これらの結果により、たとえＡＭＬ細胞がＣＤ１２３のより高レベルの表面発現があっても、ＣＴＬＥＮ細胞は、ＡＭＬ細胞よりもＣＳＬ３６０媒介ＡＤＣＣ細胞溶解を受けやすいことが示唆された。
【００８７】
ＣＳＬ３６０は、エフェクターＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａ発現により評価した際、ＡＭＬサンプルおよびＣＤ１２３発現細胞株においてＡＤＣＣを誘導する。
図８は、ＣＳＬ３６０またはイソタイプ対照抗体の存在下、ＡＭＬ患者サンプル、ＲＭＨ００３と共にインキュベートした正常なドナーからのＰＢＭＣを混合することにより誘導されたＮＫ細胞上の膜溶解性顆粒、ＣＤ１０７ａの誘導を示すフローサイトメーター分析を示している。この混合集団内のＮＫ細胞は、ＣＤ５６（ＮＫマーカー）およびＣＤ１６（ＦｃＲγＩＩＩＡ）を発現したリンパ球集団から導かれた。イソタイプ対照抗体と共にインキュベートした同じドナーおよび患者サンプルからのＮＫと比較して（図８Ａの約３％のＣＤ１０７ａ陽性細胞）、ＣＳＬ３６０で被覆されたＡＭＬ細胞に曝露されたＮＫは、有意に上昇したＣＤ１０７ａを示したこと（図８Ｂの約３９％のＣＤ１０７ａ陽性細胞）をデータが示している。ＣＳＬ３６０を、標的ＡＭＬ患者細胞の非存在下でエフェクター細胞に添加するとＣＤ１０７ａが検出されなかったことから、ドナーＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａの誘導は標的細胞依存性である（図８Ｄ）。図９は、棒グラフとしてプロットされた同一の実験からのデータを示している。
【００８８】
ヒトＣＤ１２３（ＣＴＬＥＮ、ＥＬ４）を発現するために操作された多数の細胞株または内因性ＣＤ１２３を発現するヒト白血病細胞株（ＴＦ−１）および３つまでの異なるドナーに由来するエフェクター細胞とインキュベートされた標的細胞としての白血病患者の一次サンプルから上記と同様の方法で作出されたデータが表３に含まれる。データは、ＣＳＬ３６０の存在下または添加抗体無しで種々のサンプルとインキュベートされた、ＣＤ１０７ａを発現したＮＫ細胞のパーセンテージとして表されている。ＣＳＬ３６０の存在下、ヒトＣＤ１２３を発現する２つのマウス細胞株は、ＮＫ細胞においてＣＤ１０７ａ発現を誘導した。４／８一次白血病サンプルは、ＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａのＣＳＬ３６０媒介発現を示した。ＲＭＨ００７は、ＣＳＬ３６０の非存在下であってもＮＫ細胞におけるＣＤ１０７ａの発現を誘導した。ＲＢＨ０１３は、１つのドナーからＰＢＭＣにより同様の結果を与えたが、異なるドナーではＣＤ１０７ａ発現は、ＣＳＬ３６０に特異的であり、この場合ＣＳＬ３６０により誘導されたＮＫ媒介ＡＤＣＣに対するドナー特異的感受性を示した。
【００８９】
８つの一次白血病サンプルのうち６つを、エフェクター細胞源として種々のドナーを用いて、ＡＤＣＣ効果に関して調べた。ＡＤＣＣに感受性であったサンプルは、通常ドナーに関わりなくエフェクター細胞においてＣＤ１０７ａを誘導したことは重要な所見であった。同様に、ＡＤＣＣに耐性であったサンプルもまた、一般にドナー細胞に関わりなく陰性のままであった。
【００９０】
ＣＳＬ３６０は、カルセインＡＭ放出アッセイにより評価した際、ＡＭＬサンプルにおいてＡＤＣＣを誘導する。
溶解された細胞により媒体に放出されたカルセインは、ＡＤＣＣ媒介細胞溶解の指標である。患者ＲＭＨ００３およびＲＭＨ００８は、このアッセイにおいてＡＤＣＣに対する感受性を示したが、一方、ＲＭＨ００９、ＲＭＨ０１０およびＲＭＨ０１３は、細胞溶解に耐性であったと思われる（表４）。これら５人の患者全てを、このアッセイに用いられたものと同じエフェクター細胞を用いるＮＫ細胞ＣＤ１０７ａ発現アッセイにおいて、ＣＳＬ３６０媒介ＡＤＣＣに対する感受性について試験し、比較結果を表５に示してある。６人の患者サンプルのうちの３つにおけるＡＤＣＣの状態は、２つの異なるアッセイと一致した。
【００９１】
【表２】
2011505386.tif 000003
【００９２】
【表３】
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【００９３】
【表４】
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【００９４】
【表５】
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【００９５】
考察
ＡＤＣＣ活性を測定するために知られた幾つかのアッセイ全ての使用を通して、感受性に変動はあるにしても、ＣＳＬ３６０が、異所性ヒトＣＤ１２３を発現する培養物中に維持されたマウス細胞株におけるＡＤＣＣ応答を誘導できることが示されていた。重要なことに、ＣＳＬ３６０はまた、正常なドナーからの機能性エフェクター細胞の存在下、一次ヒトＡＭＬ患者サンプルに対するＡＤＣＣ応答を誘導することができた。このデータにより、白血病細胞がＬＳＣを含む白血病患者においてＣＤ１２３の十分なレベルを発現すること、特に患者、例えば、寛解期患者または最少の残存疾患を有する患者などが、血行中に幾つかの機能性エフェクターを保持した場合、治療的に投与されたＣＳＬ３６０は、白血病細胞のＡＤＣＣ特異的排除を誘導し得ることが示唆されている。
【実施例３】
【００９６】
実施例３
ＬＳＣを含むＡＭＬ細胞上のＣＤ１２３の遍在的な発現およびＡＭＬの病因において重要な役割を果たすＩＬ−３が関係している証拠により、ＩＬ３Ｒα機能をブロックする能力が、７Ｇ３などのＩＬ−３Ｒαを標的にする抗体の治療的活性にとって重大な意味を持つ出であろうことが示唆された。本実施例において、やや意外なことに、ＡＭＬ患者サンプルによりＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの移植または再増殖を阻害する７Ｇ３の能力は、７Ｇ３のＦｃドメインによって誘導されたエフェクター機能の応答に少なくとも部分的に依存することが示されている。また、ＩＬ−３Ｒα機能を有意に阻害することのない他のＩＬ−３Ｒα抗体もまた、移植をブロックし、それ故、ＡＭＬのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデルにおいて治療活性を示す。
【００９７】
方法
F(ab)’2断片の調製
６Ｈ６、９Ｆ５および７Ｇ３に関するF(ab)’2断片は、抗体と共に３７℃、２時間インキュベートされた固定化ペプシン−アガロース（２２．５Ｕのペプシンアガロース／ｍｇ抗体）を用いるペプシン開裂により誘導された。３Ｍトリスを用いてｐＨを６．５に調整することにより消化をクエンチした。固定化ビーズを、遠心分離により得られたＦ（ａｂ）’２から分離した。
【００９８】
７Ｇ３のF(ab)’2を、直列型クロマトグラフィー法：チオール基吸着クロマトグラフィー（１５カラム容量超で４０ｍＭのＨＥＰＥＳ中２０〜０％の硫酸アンモニウム勾配）およびアニオン交換クロマトグラフィーを用いて残存する免疫グロブリンおよび他の不純物から精製した。９Ｆ５ F(ab)’2および６Ｈ６ F(ab)’2を、イオン交換クロマトグラフィー、次いでアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。エンドトキシン濃度は、ＬＡＬ発色アッセイにより定量した。エンドトキシン濃度が＞１０ＥＵ／ｍＬであった場合、Ｄｅｔｏｘｉｇｅｌを用いてエンドトキシン濃度を減少させた。予想したとおり７Ｇ３  F(ab)’2は、ＩＬ−３依存ＴＦ−１増殖アッセイにより評価した際、ＣＤ１２３中和活性を保持した（データは示していない）。
【００９９】
ＡＭＬ患者サンプル
末梢血細胞は、３人の新たに診断された患者からインフォームドコンセントを得た後に採取した。ＡＭＬ患者を診断し、仏国−米国−英国（ＦＡＢ）診断基準に従って分類した。ＡＭＬ−８−ｒｅｌは最初の診断において当初、Ｍ４として分類され、ＡＭＬ−９はＭ５ａとして分類され、ＡＭＬ−１０は分類されなかった。ＡＭＬ芽細胞は、フィコール密度勾配遠心分離により単離し、液体窒素中、一定分量で凍結させた。
【０１００】
インビトロ抗体処置
ＩＬ−３受容体α鎖（ＣＤ１２３）、７Ｇ３、９Ｆ５、６Ｈ６およびそれらのＦ（ａｂ）’２断片に対するモノクローナル抗体を用いてＡＭＬ患者から採取した細胞を処置した。対照としてＩｇＧ２ａを並行して用いた。解凍ＡＭＬ細胞を、ＸＶＩＶＯ１０プラス１５％ＢＩＴ中に接種し、１０μｇ／ｍＬの濃度で抗体と共に独立してインキュベートした。３７℃で２時間のインキュベーション後、採取した白血病細胞を、再増殖アッセイのために致死量以下の放射線照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに静脈内注入した。
【０１０１】
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへのヒト細胞の異種移植
異種移植は基本的には、実施例１に概説したように実施した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを繁殖させ、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ／Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅで飼育した。ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ／Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの動物保護委員会によって承認された、施設ガイドラインの下で動物試験を実施した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの白血病細胞の移植は、以前に記載されたとおりに実施した3。手短に述べると、同一実験での全てのマウスを、３００ｃＧｙの線量で同時に照射してから、同数のヒト細胞を注射した。静脈内移植に関しては、各群５匹のマウスを用いて、マウス１匹当り５００万〜１０００万の白血病細胞を注射した。ヒトＡＭＬの移植レベルは、マウス骨髄のフローサイトメトリーによりＣＤ４５＋細胞のパーセンテージに基づいて評価した。
【０１０２】
細胞染色およびフローサイトメトリー
処置マウスの骨髄からの細胞を、ＡＰＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）に結合したヒトＣＤ４５（抗ＣＤ４５）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合した抗ＣＤ３４、および抗ＣＤ３８−ＰＣ５（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に特異的なマウス抗体で染色した。偽陽性細胞を回避するためにイソタイプ対照を用いた。抗ＣＤ１２３−ＰＥ（クローン９Ｆ５および７Ｇ３、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、ＡＭＬ細胞上のＩＬ−３受容体α鎖の発現を試験した。染色した細胞は、Ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
【０１０３】
統計解析
データは、平均値±標準誤差として供される。処置群間差の有意性は、スチューデントｔ検定を用いたｐ値により決定した。結果は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であると考えられた。
【０１０４】
結果
抗ＩＬ−３Ｒα抗体Ｆｃドメインは、ＡＭＬホーミング能力の阻害に有意に寄与する。
実施例１におけるデータ、図５ａおよび５ｂにより、ＮＫおよび／または他のＣＤ１２２依存細胞により生じたＡＤＣＣは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄内へのＡＭＬ細胞のホーミングおよび再増殖を阻害する７Ｇ３の能力に寄与し、さらにＩＬ−３／ＣＤ１２３シグナル伝達経路をブロックする７Ｇ３の効果を示している。これを直接調べるために、エキソビボ処置のＡＭＬサンプルのホーミングに対する抗ＩＬ−３Ｒα抗体６Ｈ６および９Ｆ５を、他に不十分に中和する効果を調べた。６Ｈ６および９Ｆ５が双方とも、ＣＤ１２３と特異的に結合するが、７Ｇ３とは異なり、それらはＩＬ−３Ｒα機能をブロックしない33。これはまた、７Ｇ３とは異なり、６Ｈ６および９Ｆ５が双方とも、試験された最高用量でもＣＤ１３１（βｃ）チロシンのリン酸化、ＳＴＡＴ−５のリン酸化およびＡｋｔのリン酸化を含むＩＬ−３誘導シグナル伝達を阻害できなかったことを図６ａに明白に示している。６Ｈ６および９Ｆ５はそれでも、この実験においてＢＭへのＡＭＬ細胞のホーミングを少なくとも７Ｇ３と同様に強力に阻害したことを図１０は示している。
【０１０５】
ホーミングの阻害に関する７Ｇ３の効果に対するＦｃドメインの寄与は、７Ｇ３および６Ｈ６双方のF(ab)’2断片を試験することによって評価された。抗体F(ab)’2断片は、Ｆｃエフェクター免疫グロブリンドメインを欠いており、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ応答を誘発できない。図１０はまた、この実験において７Ｇ３および６Ｈ６双方のF(ab)’2断片が、ＡＭＬ細胞ホーミングを阻害しなかったことを示しており、双方の抗体のＦｃドメインが、骨髄へのＡＭＬ細胞のホーミング阻害にとって重要であることを示している。
【０１０６】
抗ＩＬ−３Ｒα抗体のＦｃドメインは、ＡＭＬ細胞の骨髄移植および再増殖能力の阻害に有意に寄与する。
次にＩＬ−３Ｒαの中和およびレシピエントマウスの骨髄内へのＡＭＬ細胞の移植阻害のためのエフェクター活性の寄与を評価するために、この実験を拡張した。２人のＡＭＬ患者のサンプルを、１０μｇ／ｍＬの濃度で種々の無処置抗体および抗体断片を３７℃で２時間エキソビボ処置をした。インキュベーション後、細胞を遠心分離して未結合の抗体を除去し、致死量以下の放射線照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。ヒトＡＭＬの移植レベルを、移植４週後のマウスの骨髄におけるｈｕＣＤ４５陽性細胞のパーセンテージを評価することによって分析した。図１１ａおよび１１ｂに示されるように、予想したとおり７Ｇ３は、ＡＭＬ患者サンプル双方のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの移植を有意に阻害した。ホーミングに対する効果と一致して、９Ｆ５もまた、患者サンプル双方のＡＭＬ細胞移植を強力に阻害した。興味深いことに、図１１ａは、患者サンプルＡＭＬ−９に関して、７Ｇ３および９Ｆ５双方のF(ab)’2断片は、有意に減少した阻害能力を示したが、移植を対照抗体で見られたレベルに完全に戻すことができなかったことを示している。対照的にサンプルＡＭＬ−１０に関して、双方のF(ab)’2断片の阻害効果は無かった。
【０１０７】
考察
これらの結果をまとめると、７Ｇ３がＩＬ−３Ｒα機能を中和する能力に加えて、７Ｇ３のＦｃドメインもまた、ＡＭＬ細胞のホーミングと移植能力の阻害にとって重要であることが示されている。Ｆｃドメインが無いと、ＣＤ１２３に対する抗体は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＡＭＬ−ＬＳＣのホーミング、滞留、および再増殖を阻害する能力を喪失する。
【実施例４】
【０１０８】
実施例４
抗体のエフェクター機能活性を増加させるための多くの方法が記載されている。これらの方法は、関連するＦｃ受容体との相互作用を増強し、抗体依存細胞媒介細胞障害性（ＡＤＣＣ）および抗体依存細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）を促進させる可能性を増加させるために、抗体のＦｃ領域のアミノ酸改変を含み得る34,35。Ｆｃ領域における保存Ａｓｎ297におけるＩｇＧ１抗体に共有結合したオリゴ糖の改変に続いてＡＤＣＣ活性における増強もまた記載されている34。Ｌｅｅ１３細胞におけるヒトＩｇＧ１抗体発現のさらなる研究において36、他の点では正常なオリゴ糖にフコースを添加させる能力を欠いている変異体のチャイニーズハムスター卵巣細胞株は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに５０倍まで改善された結合性を有しＡＤＣＣ活性の改善されたフコース欠失抗体を生じた。
【０１０９】
脱フコシル化抗体を生成させる代わりのアプローチもまた、一定のグリコシダーゼ阻害剤の存在下、抗体発現細胞の培養を介して記載されている53。この研究において、目的の抗体を発現するＣＨＯ細胞を強力なα−マンノシダーゼＩ阻害剤であるキフネンシン（ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ）の存在下で培養し、フコースを含有していないオリゴマンノースタイプのグリカン類を有するＩｇＧ類の分泌が生じた。これらの抗体は、ＦｃＲに関する親和性の増加およびＡＤＣＣ活性の増強を示した。
【０１１０】
本実施例では、Ｆｃ操作または脱フコシル化を介して増強されたＡＤＣＣ活性を有するＣＳＬ３６０変種の作出および試験を記載している。
【０１１１】
方法
ＣＳＬ３６０の一過性の発現およびＦｃ最適化ＣＳＬ３６０に関する哺乳動物の発現ベクター構築
マウス抗ＣＤ１２３抗体７Ｇ３の軽鎖および重鎖双方の可変領域に関する遺伝子を、総７Ｇ３からクローン化した。１Ｂ８ハイブリドーマＲＮＡは、製造元の取扱説明書に従ってＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて単離した。第一鎖ｃＤＮＡは、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて合成し、可変領域は、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｌａｎｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＡＣＥ−ＰＣＲにより増幅させた。可変重鎖領域に対して用いられたプライマーは、ＵＰＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  ｍｉｘ、ＤＢ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＭＨ２ａ（５’ＡＡＴＡＡＣＣＣＴＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＴＣＣＴＡ３’）であった。同様に、可変軽鎖領域は、ＵＰＭおよびＭＫ（５’ＣＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴＡＡＣＴ３’）を用いて増幅された。標準的な分子生物学的技法を用いて、重鎖可変領域は；ａ）ヒトＩｇＧ１定常領域を含むように改変されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に基づいた哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈＩｇＧ１、またはｂ）ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈＩｇＧ１S239D/A330L/I332E、またはｃ）ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈＩｇＧ１S239D/I332Eにクローン化された。ｂ）およびｃ）に使用されたベクターは、有意に改善されたＡＤＣＣ活性を有する抗体を生じることが報告されているアミノ酸変異を組み入れるタンパク質をコードする35。これらのアミノ酸変異は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異誘発技法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて導入された。軽鎖可変性領域は、ヒトカッパ定常領域を含むように改変されたｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターに基づいた発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ｈκにクローン化された。
【０１１２】
細胞培養
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手した。ペニシリン／ストレプトマイシン／ファンギゾーン剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）発現用培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で細胞を培養した。トランスフェクション前に、細胞を８％ＣＯ2の雰囲気で３７℃に維持した。
【０１１３】
一過性トランスフェクション
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞を用いる発現プラスミドの一過性トランスフェクションは、製造元の取扱説明書に従って２９３フェクチンのトランスフェクション剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。軽鎖および重鎖発現ベクターを合わせて、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞に共トランスフェクトした。細胞（１０００ｍｌ）を、１×１０6個の生存細胞／ｍＬの最終濃度でトランスフェクトし、２／１０Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒシステム２／１０または２０／５０（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で８％ＣＯ2の雰囲気下、３７℃で５日間Ｃｅｌｌｂａｇ  ２Ｌ（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中でインキュベートした。トランスフェクション４時間後にＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、０．１％ｖ／ｖの最終濃度で加えた。トランスフェクション２４時間後に、細胞培養物を、０．５％ｖ／ｖの最終濃度にＴｒｙｐｔｏｎｅ  Ｎ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を添加した。次いで細胞培養上澄液を、精製前にＭｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＰＯＤフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通すろ過により採取した。
【０１１４】
キフネンシン処理
脱フコシル化抗体の産生のために、指示されたキフネンシン（Ｔｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を記載されたとおりに53、０．５μｇ／ｍＬの最終濃度で一過性にトランスフェクトされたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞の培養培地（トランスフェクション２４時間後）に加えた。
【０１１５】
タンパク質発現の分析
５日後、２０μｌの培養物上澄液を、４〜２０％のトリス−グリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル上での電気泳動に供し、クーマシーブルー試剤で染色することにより可視化した。
【０１１６】
抗体精製
実施例２に記載されたキメラＣＳＬ３６０に加えて、本実施例においてはＣＳＬ３６０のヒト化変種（ｈＣＳＬ３６０）の使用もまた記載している。これは、７Ｇ３からのマウスＣＤＲ領域を、好適なヒト可変性フレームワーク領域に移植した標準的なＣＤＲ移植技法により産生した54。得られたヒト化抗体は、完全にヒトフレームワーク配列を含有する。ヒト化過程の結果、ＣＤ１２３に対するＭＡｂ親和性は、中等度に減少したが（ＣＳＬ３６０およびｈＣＳＬ３６０に関して、それぞれ１．０６ｎＭ対１２．８ｎＭのＫＤ値を示す）、結合特異性は変化せず、ＩＬ−３依存ＴＦ−１細胞増殖により測定すると、ｈＣＳＬ３６０は、強力なＣｄ１２３中和活性を保持した（ＣＳＬ３６０およびｈＣＳＬ３６０に関して、それぞれ５ｎＭ対１９ｎＭのＩＣ50値を示す）。標準的なリボソームベースの変異誘発55を用いる親和性の最適化を使用して、親マウスのＭＡｂ７Ｇ３およびキメラＣＳＬ３６０に少なくとも等しいレベルにｈＣＳＬ３６０の結合親和性を回復させた。同等のＣＤ１２３結合親和性および親ＭＡｂに対するＣＤ１２３の中和活性（ＣＤ１２３への結合に関して０．６ｎＭのＫＤおよび６ｎＭのＩＬ−３中和ＩＣ50を示す）を示した、親和性を最適化したＭＡｂクローンを産生した（１６８−２６）。３つのアミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（１６８−２６Ｆｃ３）または２つのアミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（１６８−２６Ｆｃ２）を有するＩｇＧ１Ｆｃドメインを含有するこのクローンのＦｃ操作誘導体はまた、ｈＣＳＬ３６０に関して上記のとおり産生した。
【０１１７】
非改変キメラＣＳＬ３６０、ヒト化変種（ｈＣＳＬ３６０）およびＡＤＣＣ最適化およびヒト化ＣＳＬ３６０S239D/I332E（ｈＣＳＬ３６０Ｆｃ２）とＣＳＬ３６０S239D/A330L/I332E（ｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３）およびキフネンシン処理細胞から誘導された材料を、３０ｍＬのＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ空カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ）内にパックされたＭａｂＳｅｌｅｃｔ樹脂（５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）を有するタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーを用いて４℃で精製した。最初にこの樹脂を、１０カラム容量のパイロジェン無しのＧＩＢＣＯ蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）で洗浄して貯蔵エタノールを除去し、次いで５カラム容量のパイロジェン無しのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＧＩＢＣＯ  ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）で平衡にした。次いでろ過した調整細胞培養培地（１Ｌ）を樹脂上に重力を与えて装填した。次に樹脂を、５カラム容量のパイロジェン無しのＰＢＳで洗浄して非特異的タンパク質を除去した。結合抗体を、２カラム容量の０．１ＭのグリシンｐＨ２．８（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）で溶出させ、低ｐＨを中和するために０．２カラム容量の２Ｍトリス−ＨＣｌｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）を含有するフラクションに入れた。溶出された抗体は、５ＬのＰＢＳに対して１２ｍｌのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット分子量カットオフ３．５ｋＤ（Ｐｉｅｒｃｅ、ＩＬ）中、４℃で１８時間透析した。抗体の濃度は、Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ  ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）分光計を用い、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより決定した。抗体の純度は、還元性サンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）中２μｇのタンパク質をＮｏｖｅｘ１０〜２０％のトリスグリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）上に装填し、１５０Ｖの一定電圧を、トリスグリシンＳＤＳ操作用緩衝液を用いてＸｃｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）内で９０分間印加したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析してから、製造元の取扱説明書に従ってクーマシー染色を用いて可視化した。
【０１１８】
結果
野生型ＣＳＬ３６０およびＦｃ操作ＣＳＬ３６０変種のＡＤＣＣ試験
種々の変異抗体のエフェクター活性を試験するために、ＣＤ１２３発現ＣＴＬＥＮ細胞株を、標的細胞株を用い、エフェクター細胞源として正常なＰＢＭＣの存在下、実施例２に概説されたカルセインＡＭ放出アッセイを用いてＡＤＣＣ活性を評価した。図１２は、ＣＴＬＥＮ標的細胞株のＡＤＣＣ特異的細胞溶解を誘導する能力に関して、キメラＣＳＬ３６０とヒト化変異（ｈＣＳＬ３６０）抗体ならびにＦｃ改変変種ｈＣＳＬ３６０Ｆｃ２とｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３の比較を示している。キメラＣＳＬ３６０ならびにＦｃドメインの改変なしのヒト化変種の双方が、ＣＴＬＥＮ細胞株（５〜１０％の標的細胞溶解）に対してＡＤＣＣを誘導する能力は検出可能性を有したが、中等度であり、実施例２に概説された知見と一致していることをデータは示している。改変Ｆｃドメインを有する変種ｈＣＳＬ３６０Ｆｃ２とｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３の双方は、Ｆｃ非改変抗体と同じ濃度で試験した場合に見られる５０〜６０％の標的細胞溶解でＣＴＬＥＮ標的細胞のＡＤＣＣ特異的溶解を誘発する能力が有意に増強されたことを示した。
【０１１９】
Ｆｃ受容体に対する結合に関するＣＳＬ３６０、Ｆｃ操作ＣＳＬ３６０変種および脱フコシル化ＣＳＬ３６０の試験
既述されたように、抗体Ｆｃエフェクター機能は、生来の免疫系の種々のエフェクター細胞上に発現したＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）への結合を介して媒介される37。
【０１２０】
ＦｃγＲへの結合増強に関する抗体の最適化により、エフェクター細胞のより大きな活性化および抗体被覆腫瘍細胞のより多くの死滅を生じる。
ｈＣＳＬ３６０、Ｆｃ操作変種のｈＣＳＬ３６０Ｆｃ２とｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３、キフネシン処理により産生した脱フコシル化ｈＣＳＬ３６０（ｈＣＳＬ３６０ｋｉｆ）に対する種々のヒトＦｃγＲの相対的親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ａ１００バイオセンサーで測定した。種々の抗体は個々に、ＣＤ１２３と結合したＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅチップ上で捕捉された。０．３ｎＭから８００ｎＭの範囲の濃度で可溶性ＦｃγＲ類（ｈｕＦｃγＲＩ、ｈｕＦｃγＲＩＩｂ／ｃおよびｈｕＦｃγＲＩＩＩａ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手））は、それぞれの表面上でフローさせ、親和性の測定は、動態学的モデルおよび／または定常状態モデルにデータを適合させることによって判定した。
【０１２１】
図１３Ａは、ｈｕＦｃγＲＩ、ｈｕＦｃγＲＩＩｂ／ｃおよびｈｕＦｃγＲＩＩＩａに結合に関してｈＣＳＬ３６０に比してｈＣＳＬ３６０Ｆｃ２、ｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３およびｈＣＳＬ３６０ｋｉｆの親和性（ＫＡ）を比較している。その結果は、ｈＣＳＬ３６０Ｆｃ２およびｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３に関して概して同様であり、ｈｕＦｃγＲＩおよびｈｕＦｃγＲＩＩｂ／ｃへの結合に関してｈＣＳＬ３６０に比してＫＡがおよそ１５〜３５倍の増加を有する。結合について最も著しい増加は、親和性が約１００倍増加したｈｕＦｃγＲＩＩＩａに見られた。ｈＣＳＬ３６０ｋｉｆの親和性の絶対的増加倍数は、Ｆｃ操作変種よりも少なかったが、ｈｕＦｃγＲＩ（０．７５倍）およびｈｕＦｃγＲＩＩｂ／ｃ（２．６倍）と比較して、ｈｕＦｃγＲＩＩＩａでは同様のパターンが見られ、やはり最大の改善倍数（約５倍）を示した。
【０１２２】
最近の研究では、絶対的な親和性よりも、ＩｇＧ親和性における高い活性／阻害（Ａ／Ｉ）（ＦｃγＲＩＩＩ：ｈｕＦｃγＲＩＩｂ）比が、最大抗体媒介エフェクター活性にとって重要であることが示されている56。ＦｃγＲＩＩＩ：ｈｕＦｃγＲＩＩに関するｈＣＳＬ３６０変種の親和性の比率として表されるデータを図１３ｂに示してある。全ての変種が、ｈＣＳＬ３６０ｋｉｆ、ｈＣＳＬ３６０Ｆｃ２およびｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３に関して、ｈＣＳＬ３６０に比してそれぞれ約２倍、約４倍、および約３倍の増加でＡ／Ｉ比の増加を示した。
【０１２３】
予想されたとおり、種々のｈＣＳＬ３６０Ｆｃ増強変種は、ＦｃγＲ変種に対して親和性増加を示し、活性対阻害ＦｃγＲ変種に関してはより大きな効果を有することがこれらのデータにより確認される。
【０１２４】
考察
Ｆｃ操作および脱フコシル化ＣＳＬ３６０変種は、ＦｃγＲに対して有意に増加した親和性およびＡ／Ｉ結合比ならびにインビトロでの改善されたＡＤＣＣエフェクター活性を実証することが本実施例で示された。この結果、ＡＭＬのマウスモデルにおける抗ＣＤ１２３抗体の治療効果に対するエフェクター機能活性にとって重要な役割を示す実施例１および３に提供されたデータと共にまとめると、エフェクター機能増強変種の抗ＣＤ１２３抗体療法は、ヒト患者におけるＡＭＬおよび他のＣＤ１２３陽性白血病の治療に関して恐らく改善された治療活性を示し得ることが強く示唆される。
【実施例５】
【０１２５】
実施例５
本実施例において、ＣＤ１２３を発現させるために操作された細胞株ならびに固有のＣＤ１２３を発現するヒト白血病細胞株に対するＡＤＣＣ活性増強に関して、種々のＦｃ増強抗体を試験した。Ｆｃ増強ＭＡｂ類もまた、ＡＭＬおよびＡＬＬ患者からの一次白血病サンプル群に対してエキソビボＡＤＣＣアッセイを用いて試験した。
【０１２６】
方法
乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイを用いるＡＤＣＣの測定
ＡＤＣＣは、記載されたとおり35、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイを用いて測定した。ＬＤＨは、細胞溶解の際に放出される安定なサイトゾル酵素である。ＬＤＨが特定の基質を赤色産物に変換させる比色アッセイを用いて、培養培地に放出されたＬＤＨを測定する。細胞溶解は、放出されたＬＤＨとして測定され、形成された着色度に直接比例する。ＣＤ１２３を発現する標的細胞を、ＡＤＣＣに対するエフェクター細胞として用いられたＮＫ細胞の存在下、抗ＣＤ１２３抗体の量を変えてインキュベートした。ＮＫ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃのＮＫ単離キット（カタログ番号１３０−０９２−６５７）を用いて正常なバフィーパックから精製した。５％ＣＯ2の存在下、３７℃で４時間細胞をインキュベートした。抗体またはＮＫ細胞の無い標的細胞を、自然発生ＬＤＨ放出（バックグラウンド）対照として用い、細胞溶解用緩衝液で溶解された標的細胞を、最大細胞溶解対照として用いた。培養培地に放出されたＬＤＨは、製造元の取扱説明書に従ってＰｒｏｍｅｇａ’ｓ  ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）の非放射性細胞障害性アッセイキットを用いて測定した。
【０１２７】
他の方法は全て、先の実施例に記載されたとおりである。
【０１２８】
結果
図１４は、ＣＤ１２３を発現させるために操作されたヒトリンパ芽球腫ラージ細胞に対するＡＤＣＣ活性に及ぼす種々のＣＳＬ３６０誘導抗体の効果を調べている。低レベルのＣＤ１２３（約４，８００の受容体／細胞）を発現する安定なクローン（ラージ−ＣＤ１２３低）（図１４ａおよび１４ｂ）または高レベルのＣＤ１２３（約２４，４００の受容体／細胞）を発現する独立したクローン（ラージ−ＣＤ１２３高）（図１４ｃおよび１４ｄ）を、これらの実験に用いた。２５：１および５０：１のエフェクター対標的細胞比を用いた。一貫して、ｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３およびｈＣＳＬ３６０ｋｉｆは、親のｈＣＳＬ３６０抗体と比較してラージ−ＣＤ１２３低およびラージ−ＣＤ１２３高双方に対して有意に改善されたＡＤＣＣ活性を示した。５０：１のＥ：Ｔ比でｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３およびｈＣＳＬ３６０ｋｉｆは双方とも、低濃度（約１ｎｇ／ｍＬ）抗体でラージ−ＣＤ１２３高の標的細胞のほぼ完全な溶解を達成した。ラージ−ＣＤ１２３低細胞では等しい効果のために、量がおよそ１桁多い抗体を必要とした。興味深いことに、ｈＣＳＬ３６０と比較して、キメラＣＳＬ３６０誘導ＡＤＣＣは、（Ｆｃ増強変種よりも低レベルにもかかわらず）わずかにより著しかった。このことは、先に考察されたようにヒト化処置から得られたキメラＭＡｂと比較して、ＣＤ１２３結合に関するヒト化変種に対する親和性が約１０倍減少するためと考えられる。
【０１２９】
図１５ａは、標的細胞としてのＣＤ１２３を自然に発現するＴＦ−１ヒト白血病細胞を用いた今回の上記実験の反復したものを示している。ｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３変種は、やはりｈＣＳＬ２６０Ｆｃ３およびｈＣＳＬ３６０ｋｉｆにより効力はより小さいが有意に改善されたＡＤＣＣを示し、Ｆｃ非最適化ｈＣＳＬ３６０と比較して活性増加も示した。
【０１３０】
図１５ｂは、ＴＦ−１細胞において、ヒト化され親和性最適化された抗ＣＤ１２３抗体変種１６８−２６およびそのＦｃ増強誘導体１６９−２６Ｆｃ３および１６９−２６Ｆｃ２の活性を比較している。この図面におけるデータは、Ｆｃ操作が、ヒト化のみの変種（ｈＣＳＬ３６０）で見られたものと同様に、ヒト化され親和性最適化された１６８−２６変種のＡＤＣＣ活性を改善したことを示している。
【０１３１】
次に、種々のＦｃ増強ｈＣＳＬ３６０変種に関する活性を、５人のＡＭＬ患者（図１６ａ〜ｅ）および２人のＡＬＬ患者（図１６ｆ〜ｇ）から一次白血病細胞サンプル群に対して比較した。これら一次患者サンプルにおける結果は、ＡＤＣＣ活性に関する効力のランク順序がｈＣＳＬ３６０Ｆｃ３≧１６８−２６Ｆｃ３＞ｈＣＳＬ３６０Ｆｃ２≧ｈＣＳＬ３６０ｋｉｆ＞＞ＣＳＬ３６０≧１６８−２６≧ｈＣＳＬ３６０である細胞株を用いて得られたものと同様であった。重要なこととして、Ｆｃ最適化変種は、試験した一次患者サンプルの全てにおいて一貫してＡＤＣＣを誘導した。５つのＡＭＬサンプルの全ておよび双方のＡＬＬサンプルが、Ｆｃ最適化変種により有意により高いレベルのＡＤＣＣを示したが、一方、Ｆｃ最適化のない変種では、ＡＭＬサンプルのうちの３つだけが、弱い応答を示した。全てのサンプルはいずれも、Ｆｃ非最適化変種ＭＡｂ類に対しては有意なＡＤＣＣ応答を示さなかった。
【０１３２】
これらのデータは、ＣＳＬ３６０処理が、４／６ＡＭＬサンプルおよび０／２ＡＬＬサンプルにおいて、種々のＡＤＣＣ方法論により評価した際に、低いＡＤＣＣ活性を誘導した実施例２に説明された結果と一致している。
【０１３３】
考察
実施例５におけるデータにより、ＣＤ１２３ＭＡｂのＦｃ最適化は、エキソビボアッセイで試験された一次白血病サンプルの全てに対して有意なエフェクター機能応答がもたらされ、Ｆｃ非最適化抗ＣＤ１２３ＭＡｂと比較して有意な改善を表すことを示している。
【０１３４】
ＣＤ１２３を発現するＡＬＬ腫瘍によるこれらの知見は、ＡＭＬに加えてＣＤ１２３を発現する他の悪性疾患もまた、Ｆｃエフェクター機能を増強させた抗ＣＤ１２３ＭＡｂ療法に対して恐らく感受性であるという考えと一致する57~61。
【実施例６】
【０１３５】
実施例６
実施例４および５に記載された結果により、Ｆｃエフェクター機能を増強させたＣＳＬ３６０変種が、ＣＤ１２３を発現させるために操作された細胞株、ＣＤ１２３を固有に発現するヒト白血病細胞株の群、および重要なこととして、ＡＭＬ患者またはＡＬＬ患者から採取された一次白血病サンプルを用いたエキソビボアッセイにおいてもインビトロでのＡＤＣＣ活性増加を提示することを示している。このエキソビボ設定における試験によりヒト疾患設定において効力の可能性に何らかの予測が可能になるので、ＡＭＬ患者およびＡＬＬ患者双方の一次サンプルに対するエキソビボＡＤＣＣのデータは、特に重要である。
【０１３６】
本実施例では、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのヒトＡＬＬ異種移植モデルにおける治療的効力に関してＣＳＬ３６０のＦｃ操作変種（１６８−２６Ｆｃ３）を試験するために実験を拡張している。これは、ＡＬＬ臨床疾患を正確に反映し、患者成績と有意に相関することが示されている前臨床モデルである62。このモデルの臨床関連性は、十分に認識されており、現在、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ主導：ｔｈｅ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｐｒｏｇｒａｍの不可欠な部分である63。
【０１３７】
方法
以前に記載されたように62、小児ＡＬＬ患者に由来するヒトＡＬＬ白血病細胞（ＡＬＬ−２）を、メスの非肥満糖尿病（ＮＯＤ）／ｓｃｉｄ−／−マウスに静脈内接種することにより伝播させた。この異種移植は、通常のＣＤ１０+Ｂ細胞前駆体ＡＬＬと診断された６５ヶ月齢の女性の３回目の再発に由来した。この患者は疾患のため死亡し、この異種移植は従来の化学療法に耐性である62。マウスを各々６〜７匹の処置群と対照群とに無作為化して、処置開始時に全ての群にほぼ等しい中央値の白血病負荷を与えた。全てのマウスを隔壁条件下で維持し、ｔｈｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓにより承認されたプロトコルと条件を用いて実験を実施した。ヒトＣＤ４５陽性（ｈＣＤ４５＋）細胞のパーセンテージは、以前に記載されたとおりに決定した62。
【０１３８】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４．０ａを用いて実施された正確なログランク検定を用いて、治療群と対照群との間の無事象の生存率分布を比較した。Ｐ値は、両側であり、試験の探索的性質を与えられた多重比較に関して調整しなかった。
【０１３９】
処置は、移植後３４日目に開始し、マウスは、リン酸緩衝生理食塩水に溶解した抗体の１００μＬ当り３００μｇの処置を受けた。腹腔内注射により１週当り３回（２〜３日ごとに）投与の抗体を投与した。白血病負荷は、毎週マウスの尾静脈出血によりモニターした。事象が及ぶまで処置を継続し、末梢血において２５％のｈＣＤ４５＋負荷として規定した。
【０１４０】
結果
図１７は、無関連のＭＡｂ対照（マウスＩｇＧ２ａ）、マウスＭＡｂ７Ｇ３、ヒト化して親和性最適化した変種１６８−２６および後者のＦｃ操作変種１６８−２６Ｆｃ３を含む種々の抗体に関してＡＬＬ移植マウスに及ぼす効果を調べている。この図面は、各々の処置群に関する無事象の生存（ＥＦＳ）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を示しており、各垂直線は事象を表している。対照ＭＡｂで処置されたマウスは、７Ｇ３、１６８−２６および１６８−２６Ｆｃ３に対してそれぞれ５６．３日、５９．９日および６５．７日と比較して、５３．５日の中央値ＥＦＳを示した。この結果では、７Ｇ３および１６８−２６は、それぞれ２．９日および６．４日、白血病増殖の進行を遅らせたが、この効果は、対照Ｍｂと比較して統計的に有意ではなかった（Ｐ＞０．０５）ことを示している。１６８−２６Ｆｃ３は、対照処置マウスと比較して統計的に有意な１２．２日の白血病増殖遅延（Ｐ＝０．０４４）を有し、ＡＬＬの増殖に対して最も著しい効果を示した。重要なこととして、Ｆｃ操作変種１６８−２６Ｆｃ３対１６８−２６（Ｆｃ改変無しの同じＭＡｂ）のＥＦＳ効果の増加は統計的に有意であり（Ｐ＝０．０３７）、５．９日の白血病増殖遅延であった。このことにより、Ｆｃエフェクター機能を増強させた抗ＣＤ１２３抗体が、インビボ治療効力の改善を示すことを示している。
【０１４１】
結論
これらのデータは、予め確立された白血病を有するマウスにおいて増強させたＦｃエフェクター機能を有する抗ＣＤ１２３ＭＡｂ類が、Ｆｃ非改変ＭＡｂ類と比較して治療的効力を改善したことを示している先の実施例に供されたものをかなり拡張している。重要なこととして、ヒト疾患の過程を予測することが示されているＡＬＬの前臨床的に実証されたモデル62の使用により、このようなＦｃ最適化抗ＣＤ１２３ＭＡｂ類もまた、白血病患者における臨床的効力の改善をも示し得ることが強く裏付けられている。
【０１４２】
参考文献
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６．Ｇｕｚｍａｎ，  Ｍ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ  ｉｓ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ９８，  ２３０１−２３０７  （２００１）．
７．Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ，  Ｂ．，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｊ．Ｄ．  ＆  Ｔａｌｌｍａｎ，  Ｍ．Ｓ．  Ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ，  ８２−１０１  （２００３）．
８．ｖａｎ  Ｒｈｅｎｅｎ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｔ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｈｉｇｈ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｐｏｏｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，  ６５２０−６５２７  （２００５）．
９．Ｍｏｒｇａｎ，  Ｍ．Ａ．  ＆  Ｒｅｕｔｅｒ，  Ｃ．Ｗ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｉｎ  ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ．  Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ８５，  １３９−１６３  （２００６）．
１０．Ｔａｌｌｍａｎ，  Ｍ．Ｓ．  Ｎｅｗ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １９，  ３１１−３２０  （２００６）．
１１．Ａｒｉｂｉ，  Ａ．，  Ｒａｖａｎｄｉ，  Ｆ．  ＆  Ｇｉｌｅｓ，  Ｆ．  Ｎｏｖｅｌ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．  １２，  ７７−９１  （２００６）．
１２．Ａｂｕｔａｌｉｂ，  Ｓ．Ａ．  ＆  Ｔａｌｌｍａｎ，  Ｍ．Ｓ．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７，  ３４３−３６９  （２００６）．
１３．Ｓｔｏｎｅ，  Ｒ．Ｍ．  Ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３５，  １６３−１６６  （２００７）．
１４．Ｋｒｕｇ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １７６，  ２４３−２６２  （２００７）．
１５．Ｍｉｙａｊｉｍａ，  Ａ．，  Ｍｕｉ，  Ａ．Ｌ．，  Ｏｇｏｒｏｃｈｉ，  Ｔ．  ＆  Ｓａｋａｍａｋｉ，  Ｋ．  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３，  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−５．  Ｂｌｏｏｄ  ８２，  １９６０−１９７４  （１９９３）．
１６．Ｂａｇｌｅｙ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｗｏｏｄｃｏｃｋ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｓｔｏｍｓｋｉ，  Ｆ．Ｃ．  ＆  Ｌｏｐｅｚ，  Ａ．Ｆ．  Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｂｅｔａ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  （ＩＬ−３），  ａｎｄ  ＩＬ−５  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ８９，  １４７１−１４８２  （１９９７）．
１７．Ｍｕｎｏｚ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｃｈａｉｎ  （ＣＤ１２３）  ｉｓ  ｗｉｄｅｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８６，  １２６１−１２６９  （２００１）．
１８．Ｓｐｅｒｒ，  Ｗ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋａｅｍｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ３４  Ｓｕｐｐｌ  ２，  ３１−４０  （２００４）．
１９．Ｇｒａｆ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  （ＡＭＬ）：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ７２，  ８９−１０６  （２００４）．
２０．Ｆｌｏｒｉａｎ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−−  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４７，  ２０７−２２２  （２００６）．
２１．Ｔｅｓｔａ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−３Ｒａｌｐｈａ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｌａｓｔ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ，  ａｎｄ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １００，  ２９８０−２９８８  （２００２）．
２２．Ｒｉｃｃｉｏｎｉ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｃｈａｉｎ．  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４５，  １５１１−１５１７  （２００４）．
２３．Ｙａｌｃｉｎｔｅｐｅ，  Ｌ．，  Ｆｒａｎｋｅｌ，  Ａ．Ｅ．  ＆  Ｈｏｇｇｅ，  Ｄ．Ｅ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｕｎｉｔｓ  ｏｎ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｂｌａｓｔｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｅｎｇｒａｆｔ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｂｌｏｏｄ  １０８，  ３５３０−３５３７  （２００６）．
２４．Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ，  Ａ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ３３  ｉｎ  ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ１２３＋  ＡＭＬ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ３７，  ７３−８２  （２００７）．
２５．Ｊｏｒｄａｎ，  Ｃ．Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｃｈａｉｎ  ｉｓ  ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４，  １７７７−１７８４  （２０００）．
２６．Ｂｕｄｅｌ，  Ｌ．Ｍ．，  Ｔｏｕｗ，  Ｉ．Ｐ．，  Ｄｅｌｗｅｌ，  Ｒ．，  Ｃｌａｒｋ，  Ｓ．Ｃ．  ＆  Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ，  Ｂ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ａｎｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｂｌｏｏｄ  ７４，  ５６５−５７１  （１９８９）．
２７．Ｓａｌｅｍ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｆｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  ７１，  ３６３−３７０  （１９８９）．
２８．Ｄｅｌｗｅｌ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ：  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ａ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｂｌｏｏｄ  ７２，  １９４４−１９４９  （１９８８）．
２９．Ｍｉｙａｕｃｈｉ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ，  ＩＬ−３，  ＧＭ−ＣＳＦ，  ａｎｄ  Ｇ−ＣＳＦ，  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｉｎ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｂｌｏｏｄ  ７０，  ６５７−６６３  （１９８７）．
３０．Ｐｅｂｕｓｑｕｅ，  Ｍ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−３  ａｎｄ  Ｇ−ＣＳＦ  ａｃｔ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ３，  ２００−２０５  （１９８９）．
３１．Ｖｅｌｌｅｎｇａ，  Ｅ．，  Ｏｓｔａｐｏｖｉｃｚ，  Ｄ．，  Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，  Ｂ．  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｊ．Ｄ．  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＩＬ−３，  ＧＭ−ＣＳＦ，  ａｎｄ  Ｇ−ＣＳＦ  ｏｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １，  ５８４−５８９  （１９８７）．
３２．Ｔｅｓｔａ，  Ｕ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １８，  ２１９−２２６  （２００４）．
３３．Ｓｕｎ，  Ｑ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ７Ｇ３  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  （ＩＬ−３）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ−ｃｈａｉｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩＬ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ．  Ｂｌｏｏｄ  ８７，  ８３−９２  （１９９６）．
３４．Ｎｉｗａ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ  ．  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｆｕｃｏｓｅ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｆｒｏｍ  Ａｓｎ297−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．    Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ３０６，  １５１−１６０  （２００５）．
３５．Ｌａｚａｒ，  Ｇ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．    Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．    Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １０３，  ４００５−４０１０  （２００６）．
３６．Ｓｈｉｅｌｄｓ，  Ｒ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．．    Ｌａｃｋ  ｏｆ  ｆｕｃｏｓｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．    Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７７：２６７３３−２６７４０  （２００２）．
３７．Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒ’ｓ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．  ２００７  Ｎｏｖ；  １２（２１−２２）：８９８−９１０）．
３８．Ｍａｚｕｒｉｅｒ，  Ｆ．，  Ｄｏｅｄｅｎｓ，  Ｍ．，  Ｇａｎ，  Ｏ．Ｉ．  ＆  Ｄｉｃｋ，  Ｊ．Ｅ．  Ｒａｐｉｄ  ｍｙｅｌｏｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｆｅｍｏｒａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ｍｉｃｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ９，  ９５９−９６３  （２００３）．
３９．Ｌｏｐｅｚ，  Ａ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ：  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｓｅｒｉｅｓ．  Ｂｌｏｏｄ  ７２，  １７９７−１８０４  （１９８８）．
４０．Ｇｕｔｈｒｉｄｇｅ，  Ｍ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ−５８５−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｃｌ−２．  Ｂｌｏｏｄ  １０３，  ８２０−８２７  （２００４）．
４１．Ｇｕｔｈｒｉｄｇｅ，  Ｍ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＬ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６，  ９９−１０８  （２０００）．
４２．Ｔａｎａｋａ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ａｎ  ａｎｔｉ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｃｈａｉｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  １７８，  １１０３−１１０７  （１９９３）．
４３．ＭｃＫｅｎｚｉｅ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｇａｎ，  Ｏ．Ｉ．，  Ｄｏｅｄｅｎｓ，  Ｍ．  ＆  Ｄｉｃｋ，  Ｊ．Ｅ．  Ｈｕｍａｎ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａｆｅｍｏｒａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｏｆ  ＣＤ１２２＋  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １０６，  １２５９−１２６１  （２００５）．
４４．Ｄｉｃｋ，  Ｊ．Ｅ．  ＆  Ｌａｐｉｄｏｔ，  Ｔ．  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ８２，  ３８９−３９６  （２００５）．
４５．Ｋｏｌｌｅｔ，  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｏｍｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４（＋）ＣＤ３８（−／ｌｏｗ）ＣＸＣＲ４（＋）  ｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  ｓｐｌｅｅｎ  ｏｆ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ  ａｎｄ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２ｍ（ｎｕｌｌ）  ｍｉｃｅ．  Ｂｌｏｏｄ  ９７，  ３２８３−３２９１  （２００１）．
４６．Ｌａｐｉｄｏｔ，  Ｔ．，  Ｄａｒ，  Ａ．  ＆  Ｋｏｌｌｅｔ，  Ｏ．  Ｈｏｗ  ｄｏ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｉｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｗａｙ  ｈｏｍｅ？  Ｂｌｏｏｄ  １０６，  １９０１−１９１０  （２００５）．
４７．Ｈｏｇｇｅ，  Ｄ．Ｅ．，  Ｆｅｕｒｉｎｇ−Ｂｕｓｋｅ，  Ｍ．，  Ｇｅｒｈａｒｄ，  Ｂ．  ＆  Ｆｒａｎｋｅｌ，  Ａ．Ｅ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ−ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ  ｉｎ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ．  ２８，  １２２１−１２２６  （２００４）．
４８．Ｆｅｕｒｉｎｇ−Ｂｕｓｋｅ，  Ｍ．，  Ｆｒａｎｋｅｌ，  Ａ．Ｅ．，  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｇｅｒｈａｒｄ，  Ｂ．  ＆  Ｈｏｇｇｅ，  Ｄ．Ｅ．  Ａ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ−ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ３  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔｏ  ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｂｕｔ  ｓｐａｒｅｓ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６２，  １７３０−１７３６  （２００２）．
４９．Ｄｕ，  Ｘ．，  Ｈｏ，  Ｍ．  ＆  Ｐａｓｔａｎ，  Ｉ．  Ｎｅｗ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＣＤ１２３，  ａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  （１９９７）  ３０，  ６０７−６１３  （２００７）．
５０．Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｐｏｉｎｔ  Ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｍｏｎ  −Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  （ＧＭ−ＣＳＦ），  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  （ＩＬ）−３，  ａｎｄ  ＩＬ−５  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｈｅ  ＧＭ−ＣＳＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  −Ｓｕｂｕｎｉｔ  ｆｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  １９９９  ２７４：１３，  ８６６９−８６７７）
５１．Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ｌａｒｓ，  Ｏｌａｆ  Ｐｅｎａｃｋ，  Ｃｈｉａｒａ  Ｇｅｎｔｉｌｉｎｉ，  Ａｘｅｌ  Ｎｏｇａｉ，  Ａｒｎｅ  Ｍｕｅｓｓｉｇ，  Ｅｃｋｈａｒｄ  Ｔｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｌｕｔｚ  Ｕｈａｒｅｋ．    Ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  （ＮＫ）  ｃｅｌｌｓ．    Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ３４：  ７５３−７５９  （２００６）
５２．Ｎｅｒｉ  Ｓ，  Ｍａｒｉａｎｉ  Ｅ，  Ｍｅｎｅｇｈｅｔｔｉ  Ａ，  Ｃａｔｔｉｎｉ  Ｌ  ａｎｄ  Ｆａｃｃｈｉｎｉ  Ａ．  Ｃａｌｃｅｉｎ−Ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｓｓａｙ：  ｓｔａｎｄａｒｄｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｎ  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ８：１１３１−１１３５  （２００１）
５３．Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｎｏｎ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｍａｎｎｏｓｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００８  ９９（３）：６５２−６５）
５４．Ｔａｎ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ，  “Ｓｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｚｅｄ”  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：    ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：    ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ２８．  ２００２  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．    １６９，  １１１９−１１２５）
５５．Ｋｏｐｓｉｄａｓ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ，  ＲＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｙｉｅｌｄｓ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｍＲＮＡ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．  ２００７  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７，  １８）
５６．Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ＆  Ｒａｖｅｔｃｈ，  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇ  ｓｕｂｃｌａｓｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５  ３１０（５７５３）：１５１０−２）．
５７．Ｆｅｕｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ＣＤ４（＋）ＣＤ５６（＋）  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  Ｂｌｏｏｄ  ２００２  ９９（５）：１５５６−６３
５８．Ｍｕｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｃｈａｉｎ  （ＣＤ１２３）  ｉｓ  ｗｉｄｅｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ２００１  ８６（１２）：１２６１−９
５９．Ｌｈｅｒｍｉｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｓｔ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  Ｔ−ＡＬＬｓ  ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｒａ−ＩＬ３  （ＣＤ１２３）：  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ＤＴ−ＩＬ３  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２００６  ２０（１０）：１９０８−１０
６０．Ａｌｄｉｎｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３  ｉｎ  ｃｌａｓｓｉｃａｌ  Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ２００５  ４６（３）：３０３−１１
６１．Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−３  ａｎｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．  １９９９  ２６；９６（２２）：１２８０４−９）
６２．Ｌｉｅｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０３（１０）：３９０５−１４）
６３．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２００２；  ８：３６４６−３６５７）
【図１ａ】
2011505386.tif 000007
【図１ｂ−ｅ】
2011505386.tif 000008
【図２】
2011505386.tif 000009
【図２ａ】
2011505386.tif 000010
【図２ｂ】
2011505386.tif 000011
【図２ｃ−ｅ】
2011505386.tif 000012
【図３ａ−ｄ】
2011505386.tif 000013
【図３ｅ−ｆ】
2011505386.tif 000014
【図４−１】
2011505386.tif 000015
【図４−２】
2011505386.tif 000016
【図４−３】
2011505386.tif 000017
【図５】
2011505386.tif 000018
【図６ａ】
2011505386.tif 000019
【図６ｂ】
2011505386.tif 000020
【図７】
2011505386.tif 000021
【図８】
2011505386.tif 000022
【図９】
2011505386.tif 000023
【図１０】
2011505386.tif 000024
【図１１ａ−ｂ】
2011505386.tif 000025
【図１２】
2011505386.tif 000026
【図１３ａ】
2011505386.tif 000027
【図１３ｂ】
2011505386.tif 000028
【図１４】
2011505386.tif 000029
【図１５】
2011505386.tif 000030
【図１６】
2011505386.tif 000031
【図１７】
2011505386.tif 000032
【国際調査報告】
2011505386.tif 000033
2011505386.tif 000034
2011505386.tif 000035