(57)【要約】  本発明は、天然物質中のルテインの新規な抽出方法を提供し、この方法は、天然物質中の天然ルテインエステルを、抽出処理を容易にする遊離ルテイン及び／または低分子量ルテインエステルに変性させる工程、前記天然物質を、超臨界流体を用いて最適条件で抽出する工程を含む。前記方法は、抽出に用いられる穏やかな条件のために、高純度で多量の粗製ルテインをもたらす。したがって、所望の生成物に劣化は全く起こらない。粗製ルテインは、高純度ルテインを得るために更にクロマトグラフィーで精製することができる。本発明による方法は、キサントフィル類全体／またはルテイン以外のキサントフィル類の抽出に応用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．天然物質中の天然ルテインエステルを、抽出処理を容易にする遊離ルテイン及び／または低分子量ルテインエステルに変性させることによる、ルテインを含む天然物質の予備処理工程、
ｂ．（ａ）で予備処理を施した前記天然物質を超臨界流体と接触させること、30〜100℃、200〜450バールの範囲で一定期間に亘る最適な条件を選択することにより温度及び／または圧力を調節して、超臨界流体中の遊離ルテイン及び／または低分子量ルテインエステルの溶解度を最高にすることを含む抽出工程、
ｃ．抽出、並びに抽出された物質の流体への溶解度を最小にするための温度及び／または圧力の調節、並びに粗製ルテインである前記抽出された物質の回収の後の、流体からの固形物質の分離工程
を含む、天然物質からのルテインの抽出方法。
【請求項２】
前記天然物質が、マリーゴールドフラワー、ケール、ほうれん草、藻類、細菌、酵母、菌類、及び微細藻類を含む微生物細胞、またはこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記天然物質を低分子量酸で加水分解した後、前記物質を工程（ａ）に処する前に、水で洗うことによって前記酸を除去し、且つ／または乾燥させ、且つ／または粉砕する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）におけるルテインエステルの変性が、ケン化である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）におけるルテインエステルの変性が、エステル化である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）におけるルテインエステルの変性が、トランスエステル化である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記流体が、二酸化炭素、エタノール、またはこれらの組合せから選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
好ましい流体が、二酸化炭素である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
流体と共に共溶媒を使用することを更に含み、前記共溶媒が、非毒性天然油、すなわち、パームオイル、大豆油、オリーブオイル、またはこれらの組合せから選択できる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記最適条件が、４０〜７０℃の温度及び３００〜４００バールの圧力を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
粗製ルテインのクロマトグラフィーによる精製工程（ｄ）を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法から得られる粗製ルテイン。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法から得られる純粋ルテイン。
【請求項１４】
キサントフィル類全体／またはルテイン以外のキサントフィル類の抽出のために使用される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法により得られるキサントフィル類全体／またはルテイン以外のキサントフィル類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ルテイン／キサントフィルの抽出、とりわけ、超臨界流体を用いるマリーゴールドフラワーからのルテインの抽出、並びに、こうした方法から得られる高度精製ルテイン／キサントフィル。
【背景技術】
【０００２】
マリーゴールド（Tagetes erecta：マンジュギク）は、管状の花弁を有する、幅広い色の一年生の顕花植物である。タイ国では、マリーゴールドは、主に、スパンブリー（Suphanburi）、カンチャナブリー（Kanchanaburi）、ランプーン（Lampoon）、及びチェンマイ（Chiang Mai）県において栽培されている。その高いカロチノイド含量のため、マリーゴールドは、一般的に動物の健康上の利益のために、動物の餌に用いられている。さらにまた、マリーゴールドに含まれるカロチノイドの鮮やかな黄色及び赤色は、餌の天然着色料として、すなわち、卵の黄身に鮮やかな赤色をもたらす鶏の餌にも使用される。
【０００３】
マリーゴールドに含まれる主要なカロチノイドは、キサントフィル類（最高1％）、特にルテインである。
【０００４】
ルテインは、抗酸化特性を示すキサントフィルであり、目の網膜の構成物である。ルテインを、視覚に関する疾患の治療に有効に使用することができ、且つ、人体の機能維持のためにも使用することができることが報告されている。したがって、天然物質からのルテインの抽出方法は、興味深い。
【０００５】
試みの一つは、マリーゴールドから、有機溶媒、特に、ヘキサンなどの非極性溶媒によってルテインを抽出することである。前記有機溶媒に含まれる物質は、ミセルと呼称される。ルテイン生成物を得るためには、残りの溶媒を蒸発させねばならない。溶媒蒸発の後に得られる粗製抽出物は、含油樹脂と呼称される。この含油樹脂は、キサントフィルを10％（w/w）含有し、ルテインがその主な生成物である。
【０００６】
問題の一つに、抽出溶媒の完全な除去に対する厳しい要求がある。残留溶媒は、国際基準を超えてはならない。これは、残留溶媒が、消費者に深刻な健康上の問題を引き起こしうるためである。
【０００７】
別の溶媒、すなわち、超臨界流体、特に、消費者製品に使用することが安全な、超臨界二酸化炭素を使用してルテインを抽出する試みがなされている。さらにまた、超臨界二酸化炭素は、液体溶媒と比較すると、高い拡散性及び低い粘度を有する。超臨界二酸化炭素は、したがって、その物質移動特性のために、抽出に適切である。さらに、これは、抽出された物質の分解または劣化を回避する、低温（臨界温度は30℃）での抽出に使用することができる。これはまた、減圧または温度降下によって、容易に除去することもできる。  
【０００８】
米国特許第20040267033号には、ルテインをマリーゴールドから超臨界二酸化炭素によって70℃及び475バールにて抽出し、８５〜９０％の収率を得ることが記載されている。この発明の問題点は、栄養補助食品または医薬品における応用のために要求される、高純度のキサントフィルを得るためには、高温を採用しなければならない点である。抽出の間の温度上昇に関連する問題が、キサントフィルの劣化または分解である一方で、圧力の増大もまた、より多くのエネルギーを要してより大きな危険性をはらむ。したがって、超臨界流体は、キサントフィル、特に高度精製ルテインの工業的抽出のためには、実質的に使用できない。上記発明による方法は、液体溶媒の安全性に関する問題を解消できるとしても、依然として厳しい条件に関する問題を伴う。
【０００９】
別の関連文献には、米国特許第44669223号、第5120558号、第5932101号、第6737552号、第6350890号、第7214379号、第5780693号、第6262284号、第7351424号、及び第6689400号が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第20040267033号
【特許文献２】米国特許第44669223号
【特許文献３】米国特許第5120558号
【特許文献４】米国特許第5932101号
【特許文献５】米国特許第6737552号
【特許文献６】米国特許第6350890号
【特許文献７】米国特許第7214379号
【特許文献８】米国特許第5780693号
【特許文献９】米国特許第6262284号
【特許文献１０】米国特許第7351424号
【特許文献１１】米国特許第6689400号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者は、従来技術における問題点及びこの化合物の本来の特性及び自然界に存在する別のキサントフィル類について研究した。自然界におけるルテイン及び別のキサントフィル類が、概ね脂肪酸とのジエステル、すなわち、ルテインジパルミテート、ルテインジミリステート、ゼアキサンチンジパルミテート、及びゼアキサンチンジミリステートの形態であることが判明した。これらのジエステルは高い分子量を有する。すなわち、遊離ルテインが５６９ダルトンの分子量を有するに過ぎないのに対して、ルテインジパルミテートは１０４５ダルトンの分子量を有する。このように、超臨界流体を用いてこの複合体形成分子中の天然ルテイン／キサントフィル類を抽出し、ルテイン／キサントフィル類の溶媒抽出方法と同様の収率を得るためには、高温及び／または高圧が必要となる。
【００１２】
本発明者は、天然物質から、超臨界流体を直接用い、６０℃の低温及び、３００、３５０、及び４００バールの圧力条件にて、それぞれ４時間に亘って、図１に示されるようにルテインの抽出を行った。
【００１３】
図１は、抽出によって得られた粗製ルテインの収率を示す。圧力を増大させることによって粗製ルテインは増量したが、最高収率も４００バールにて７４．４０％に過ぎない。
【００１４】
さらにまた、本発明者は、粗製ルテインをクロマトグラフィーで精製し、図２に示されるように、遊離エステルが非常に多量のルテインエステルと混合していたことを見出した。
【００１５】
今日までに、低温及び低圧で粗製天然ルテインを超臨界流体で抽出し、９０％超の収率を得たという報告はなされていない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、本発明者は、ルテインエステル／キサントフィルエステルを、超臨界流体での抽出前に、遊離ルテイン／キサントフィル及び／または低分子量ルテインエステル／キサントフィルエステルに変性させることを目的とする。ルテイン／キサントフィル類を含む天然物質には、マリーゴールド、ケール、ほうれん草、微生物細胞、すなわち、細菌、酵母、菌類、並びに、微細藻類及び藻類が含まれる。本発明は、天然物質からの超臨界流体での粗製ルテインの抽出を低温及び低圧で行うが、依然として高収率を得ることを可能にするものである。
【００１７】
本発明は、天然物質からルテインを抽出するための新規な方法を提供し、この方法は、従来法よりも高い粗製ルテイン収率及び／または高純度ルテインをもたらす。
【００１８】
本発明の別の目的は、ルテインと同じ化合物群に含まれるキサントフィル類に応用することのできる抽出方法を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、本発明による方法により得られる高度精製ルテイン／キサントフィル類を提供することである。
【００２０】
本発明による方法には、天然物質中の天然ルテインエステルの遊離ルテイン及び／または低分子量ルテインエステルへの変性、前記天然物質の、最適な条件における超臨界流体での抽出が含まれる。本発明による方法は、抽出の効率が向上することから、天然物質からの大量のルテイン抽出を行うことができる。粗製ルテインをクロマトグラフィーで更に精製して、高度精製ルテインを得ることができる。
【００２１】
本発明においては、「粗製ルテイン」とは、最終生成物としてルテインを含む粗製生成物を意味する。
【００２２】
本発明による方法が、キサントフィル類全体／またはルテイン以外のキサントフィル類に適用される場合には、「粗製ルテイン」はキサントフィル類全体／またはルテイン以外のキサントフィル類の粗製生成物を意味する。したがって、「ルテイン」及び「キサントフィル類」なる語は、本願明細書全般において置き換え可能である。
【００２３】
本発明による天然物質からのルテインの抽出方法の詳細について、以下に説明する。
【００２４】
天然ルテインの抽出方法には、
ａ．天然物質中の天然ルテインエステルを、抽出処理を容易にする遊離ルテイン及び／または低分子量ルテインエステルに変性させることによる、ルテインを含む天然物質の予備処理工程、
ｂ．（ａ）で予備処理を施した前記天然物質を超臨界流体と接触させること、30〜100℃、200〜450バールの範囲で一定期間に亘る最適な条件を選択することにより温度及び／または圧力を調節し、超臨界流体中の遊離ルテイン及び／または低分子量ルテインエステルの溶解度を最高にすることを含む抽出工程、
ｃ．抽出、並びに抽出された物質の流体への溶解度を最小にするための温度及び／または圧力の調節、並びに粗製ルテインである前記抽出された物質の回収の後の、流体からの固形物質の分離工程
が含まれる。
【００２５】
前記方法によれば、前記天然物質は、マリーゴールドフラワー、ケール、ほうれん草、藻類、細菌、酵母、菌類、及び微細藻類を含む微生物細胞から選択することができる。
【００２６】
前記方法によれば、前記天然物質を低分子量酸で加水分解した後、前記物質を工程（ａ）に処する前に、水で洗うことによって前記酸を除去し、且つ／または乾燥させ、且つ／または粉砕する。前記酸は、有機酸、すなわち、酢酸、または無機酸、すなわち、塩酸等であってよい。
【００２７】
工程（ａ）におけるルテインエステルの変性は、広く用いられているケン化である。例えば、前記ケン化は、ＫＯＨ及びエタノールを、最適温度にて、使用される天然物質によって異なる時間に亘って使用することにより行うことができる。ルテインエステルの変性は、低分子量酸、すなわち塩酸と、エタノールとを用いるエステル化、あるいはＫＯＨとメタノールとを用いるトランスエステル化によって達成しうる。
【００２８】
本発明による流体は、二酸化炭素、エタノール、またはこれらの組合せから選択することができる。しかしながら、二酸化炭素が好ましい。
【００２９】
原料として使用される天然物質によって、共溶媒、例えば、非毒性天然油、すなわち、パームオイル、大豆油、オリーブオイル、またはこれらの組合せを、前記流体と共に使用して、抽出有効性を改善できる場合がある。
【００３０】
工程（ｂ）の、流体を用いた抽出では、最適条件は40〜70℃及び300〜400バールである。この条件は、従来法に比べて「高過ぎない」温度及び圧力のために最高の粗製ルテイン収率をもたらす。
【００３１】
さらにまた、この抽出法は、クロマトグラフィーによる粗製ルテインの精製工程（ｄ）を更に含んでよい。
【００３２】
本発明はまた、前述の抽出方法で得られるルテインの粗製生成物及び、クロマトグラフィーから得られる精製ルテインにも関する。
【００３３】
本発明が、溶媒除去の際に（部分的）分解を引き起こしうる溶媒を使用しないことは、注記すべき重要な点である。本発明は、天然物質中のルテインエステルの直接変性を利用する。これには、流体での抽出前にルテインを全く無駄にしないという利点がある。その一方で、前記抽出はまた、分子量の低減により、抽出のターゲット化合物の低減された分子量のために、滑らかでより効果的なフローを提供するはずである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、６０℃、３００、３５０、及び４００バールにて、超臨界流体によって天然物質から直接抽出された粗製ルテインの収率を示す。
【図２】図２は、図１で得られる粗製ルテインのクロマトグラムであり、少量の遊離ルテイン及び多量のルテインエステルを示す。
【図３】図３は、本発明による温度及び圧力にて、超臨界流体によって（マリーゴールド中のルテインエステルを変性させた後の天然物質から）抽出された粗製ルテインの収率を示す。
【図４】図４は、図３で得られる粗製ルテインのクロマトグラムであり、多量の遊離ルテインが、高度に精製されてもいることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下に、図面を参照した実施例を挙げるが、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されることを企図するものではない。
【実施例】
【００３６】
＜加水分解＞
マリーゴールドの生の花弁を、セルロースを破壊するために、低分子量の酸、すなわち、酢酸または塩酸で３０分間に亘って加水分解した。加水分解した花弁を水で洗い、乾燥もしくは日干しし、粉砕して粉末とした。
【００３７】
＜変性（天然物質中のルテインエステルの遊離ルテインまたは低分子量のルテインエステルへの変性）＞
マリーゴールドの加水分解粉末１グラムを、２mlの９５%エタノールに７５℃の温度で加えた。２mlの４０％アルカリ溶液を加え、７５℃にて４時間に亘ってインキュベートした。溶液を６５℃に冷却し、２５％塩酸を用いてｐＨを７に調節して、ケン化を終了させた。その後溶液を乾燥させた。
【００３８】
＜超臨界二酸化炭素による抽出＞
この工程では、超臨界二酸化炭素抽出装置１０ml（ISCO社製、SFX-220型）を使用した。ケン化されたマリーゴールド粉末（１g）を、超臨界二酸化炭素が前記粉末に接触する前に前記抽出装置に添加した。４時間に亘って、あるいは超臨界二酸化炭素への遊離ルテイン及び／または低分子量のルテインエステルの溶解度を最大とするために別の期間に亘って、40〜120℃、200〜500バールの最適条件に温度及び／または圧力を選択した。最適条件は、35〜45℃及び300〜400バールとなるはずである。この系では、二酸化炭素の再利用、または任意に周囲への二酸化炭素の放出を行ってよい。
【００３９】
出願人は、以下の条件を選択することにより実験を行った。
１）    温度４０℃、圧力１５０、２００、２５０、３００、３５０、及び３７０バール
２）    温度６０℃、圧力１５０、２００、２５０、３００、及び３２５バール
３）    温度８０℃、圧力１５０、２００、２５０、及び２９０バール
４）    温度１００℃、圧力１５０、２００、２５０、及び２７５バール
５）    温度１２０℃、圧力１５０、２００、及び２５５バール
【００４０】
上記の実験から得られた粗製ルテイン生成物の結果を、図３に示した。図３からは、４０℃の温度及び３７５バールの圧力にて粗製ルテインは９８．５%となり、６０℃の温度及び３３０バールの圧力でも粗製ルテインは９８．５％となることが見て取れる。
【００４１】
結論としては、低温を採用した場合は、ルテインの収率を最大とするためには高圧が必要とされる。対照的に、高温を採用した場合には、低圧を適用してよい。しかしながら、高過ぎる温度及び酸化保護剤の欠如によれば、許容しがたい程度でのルテインの劣化または分解が引き起こされるであろう。
【００４２】
図３における本発明による方法と図１における方法とを比較すると、６０℃の温度にて、本発明による方法では３７５バールの圧力を要するのみで最高９８．５％の粗製ルテインをもたらす一方で、図１の方法での圧力は４００バールでなければならず、粗製ルテインの収率は７４．４０％に過ぎないことが示されている。本発明の方法が、より有効であると結論付けることができる。
【００４３】
前記実験はまた、上述のグラフにより、抽出が、３０℃の温度から実行可能であることを示した。
【００４４】
＜堆積物の分離及び粗製ルテインの回収＞
抽出が完了した後、堆積物を分離した。残りの溶液を、抽出された物質の二酸化炭素への溶解度が最小になるような温度及び／または圧力に調節した。その後、二酸化炭素を蒸発させ、ルテインである粗製抽出物をアルミホイルで覆ったガラス管中に回収して、暗所に４℃にて保存した。
【００４５】
＜精製＞
遊離キサントフィルエステル及び脂肪酸から得られた遊離キサントフィル類の精製を、３５mm×２４０mmのシリカカラム（シリカ１００ｇ）を用いて順相クロマトグラフィーで行った。移動相を、７０：３０のヘキサン：酢酸エチルであり、蠕動ポンプにより５〜１０ml／分の流速でカラムにポンプ注入した。試料を、１０分毎に回収した。１０ml／分の流速では、図４に示されるように、純度９９．５％のキサントフィル類が４６％の収率で得られる。
【００４６】
図４は、図３に示される粗製ルテインのクロマトグラムを示し、粗製ルテイン生成物中のルテインの量が、図１による方法から得られるものよりも多いことを示す。図１による方法によって得られた粗製ルテイン生成物が、図２のクロマトグラムに示されるように多量のルテインエステルを含む一方で、図４はまた、粗製ルテイン生成物が、ほぼ純粋なルテイン（１００％）であることを示した。
【００４７】
この実施例ではマリーゴールドが天然物質の試料として使用されたが、本発明による方法は、ルテインを含む別の天然物質、すなわち、ケール、ほうれん草、細菌、酵母、菌類、並びに、微細藻類及び藻類を含む微生物細胞にも応用することができる。
【００４８】
しかしながら、当業者が本発明を変更することも可能であり、前記変更もまた本発明の範囲内と見なされる。
【００４９】
当業者は、本発明による抽出方法の原理を、キサントフィル類を含む天然物質からのキサントフィル類の（ルテインの有無によらない）抽出に、前記天然物質及び選択されるキサントフィル類に適したものに条件を調節することによって応用できることも理解する。
【００５０】
本発明の最良の態様は、本明細書に記載の通りである。
【図１】
2014529607.tif 000003
【図２】
2014529607.tif 000004
【図３】
2014529607.tif 000005
【図４】
2014529607.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月28日(2014.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
＜超臨界二酸化炭素による抽出＞
この工程では、超臨界二酸化炭素抽出装置１０ml（ISCO社製、SFX-220型）を使用した。ケン化されたマリーゴールド粉末（１g）を、超臨界二酸化炭素が前記粉末に接触する前に前記抽出装置に添加した。４時間に亘って、あるいは超臨界二酸化炭素への遊離ルテイン及び／または低分子量のルテインエステルの溶解度を最大とするために別の期間に亘って、40〜120℃、200〜500バールの最適条件に温度及び／または圧力を選択した。最適条件は、40〜70℃及び300〜400バールとなるはずである。この系では、二酸化炭素の再利用、または任意に周囲への二酸化炭素の放出を行ってよい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
出願人は、以下の条件を選択することにより実験を行った。
１）   温度４０℃、圧力１５０、２００、２５０、３００、３５０、及び３７５バール
２）   温度６０℃、圧力１５０、２００、２５０、３００、及び３２５バール
３）   温度８０℃、圧力１５０、２００、２５０、及び２９０バール
４）   温度１００℃、圧力１５０、２００、２５０、及び２７５バール
５）   温度１２０℃、圧力１５０、２００、及び２５５バール
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
上記の実験から得られた粗製ルテイン生成物の結果を、図３に示した。図３からは、４０℃の温度及び３７５バールの圧力にて粗製ルテインは９８．５%となり、６０℃の温度及び３２５バールの圧力でも粗製ルテインは９８．５％となることが見て取れる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
図３における本発明による方法と図１における方法とを比較すると、６０℃の温度にて、本発明による方法では３２５バールの圧力を要するのみで最高９８．５％の粗製ルテインをもたらす一方で、図１の方法での圧力は４００バールでなければならず、粗製ルテインの収率は７４．４０％に過ぎないことが示されている。本発明の方法が、より有効であると結論付けることができる。
【国際調査報告】
2014529607.tif 000007
2014529607.tif 000008
2014529607.tif 000009