(57)【要約】   本発明は、カフェインおよび／またはその類似体、および／またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）サブタイプ３（ＩＰ３Ｒ３）を阻害するための薬剤が提供される。受容体を通じたＣａ２＋放出と関連する疾病の予防用および／または治療用の組成物も提供される。
2011510976.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カフェイン、７−イソプロピルテオフィリン、７−（β−ヒドロキシエチル）テオフィリン、キサンチン、テオフィリン、１，７−ジメチル−３−イソブチルキサンチンおよびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択される１種以上を有効成分として含む、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体サブタイプ３（ＩＰ３Ｒ３）の阻害用の組成物。
【請求項２】
カフェイン、７−イソプロピルテオフィリン、７−（β−ヒドロキシエチル）テオフィリン、キサンチン、テオフィリン、１，７−ジメチル−３−イソブチルキサンチンおよびこれらの薬学的に許容可能な塩からなる群より選択される１種以上を有効成分として含む、Ｃａ２＋過剰放出と関連する疾病の予防用または治療用の組成物。
【請求項３】
前記Ｃａ２＋過剰放出と関連する疾病は、脳卒中、不安症、過敏性膀胱炎、炎症性腸疾患、過敏性大腸症候群、てんかん性大膓炎、頭部外傷、偏頭痛、慢性、神経病症性または急性痛症、薬品またはアルコール中毒、神経病性障害、精神病、睡眠障害、恐怖症、強迫観念、外傷後ストレス障害、憂鬱症、てんかん、糖尿病、癌、男性不妊、高血圧、肺高血圧、心臓性不整脈、鬱血性心不全症、狭心症、多嚢胞性腎疾患、デュシェンヌ型筋ジストロフィーからなる群より選択される１種以上の疾病である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のうちのいずれか１項に記載の組成物を含む、Ｃａ２＋過剰放出と関連する疾病の改善用の食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年１月３１日付で出願された韓国特許出願第１０−２００８−００１０１５６号の優先権利益を主張し、前記韓国特許出願の明細書は、本明細書に参照として含まれる。
【０００２】
本発明は、カフェインおよび／またはその類似体、および／またはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有するイノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）のサブタイプ３（ＩＰ３Ｒ３）の活性を阻害する薬剤が提供される。ＩＰ３Ｒ３受容体を通じたＣａ２＋放出と関連した疾病の予防および／または治療用の、ＩＰ３Ｒ３阻害剤を含む組成物も提供される。
【背景技術】
【０００３】
イノシトール１，４，５−三リン酸受容体サブタイプ３は、生細胞の多様な機能に広範囲に関連している細胞内Ｃａ２＋チャンネルのうちの一つである。したがって、ＩＰ３Ｒ３受容体を調節することによってＣａ２＋放出を調節することができ、これによって、多様な細胞機能の調節、及び細胞の機能亢進または機能不全により誘発される各種疾病の予防および／または治療にも非常に有用な利益を提供することが可能であると期待される。しかし、現在までＩＰ３Ｒ３の効果的な調節機序および調節物質は知られてないため、これに対するさらなる研究と開発が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ＩＰ３Ｒ３（イノシトール１，４，５−三リン酸受容体サブタイプ３）の調節機序および調節物質の所見に基づき、ＩＰ３Ｒ３を通じたカルシウムイオン放出と関連した疾病を効果的に予防および／または治療する技術を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１ａ〜１ｅは、多様なＧＰＣＲ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）およびＲＴＫ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ）アゴニストによるＣａ２＋応答を示すものであって、  図１ａは、代表的な疑似カラー蛍光強度イメージ（ｐｓｅｕｄｏ  ｃｏｌｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｉｍａｇｅｓ）（３８０ｎｍまたは３４０ｎｍ励起、５１０ｎｍ発光）（上段）、下段は、Ｆｕｒａ−２  ＡＭ（５μＭ）を添加した膠芽腫細胞でのＥＧＦ刺激前後の比率イメージ（ｒａｔｉｏ  ｉｍａｇｅ）を示し、  図１ｂは、４個の膠芽細胞腫細胞株で行われたＣａ２＋イメージ記録から得られたトレース（ｔｒａｃｅ）であり、  図１ｃは、Ｆｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞上での多様なアゴニストによるＦｕｒａ−２  ＡＭ  強度比率の変化を示し、  図１ｄは、ヒト膠芽腫細胞の低倍率での写真（Ｌｏｗ  ｐｏｗｅｒ  ｖｉｅｗ）であって、左上段は２００倍率写真であり、  図１ｅは、多様なＧＰＣＲおよびＲＴＫアゴニストが、ヒト膠芽腫細胞において細胞内Ｃａ２＋増加を誘導することを示す、カルシウムイオン放出の減衰動態（ｄｅｃａｙ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示す。
【図２】図２ａ〜図２ｆは、Ｃａ２＋シグナル伝達と関連した結果を示すものであって、  図２ａは、Ｆｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞でのカルシウムイオン放出の減衰動態であって、Ｆｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞は２ｍＭ  Ｃａ２＋  ＨＥＰＥＳバッファー、Ｃａ２＋−無添加ＨＥＰＥＳバッファー、およびＳＫＦ  ９６３６５の存在下でブラジキニンによって刺激されたものをそれぞれ示し、  図２ｂおよび図２ｃは、各サンプルの減衰動態の代表的な平均トレースおよび半幅値（ｈａｌｆ  ｗｉｄｔｈ）を示し、  図２ｄは、Ｕ７３３４３の前処理によりレスキューされた、Ｕ７３１２２前処理によりあらかじめ遮断された、ブラジキニンまたはＥＧＦ誘導性Ｃａ２＋放出の減衰動態の変化を示し、  図２ｅは、タプシガルギンによる小胞体でのＣａ２＋枯渇後のＧＰＣＲアゴニストの適用の結果を示し、  図２ｆは、リアノジン受容体拮抗剤の存在下における、ブラジキニンによるＵ１７８ＭＧ上でのＩＰ３Ｒ介在性Ｃａ２＋放出の減衰動態を示す。
【図３】図３ａ〜３ｃは、カフェインの膠芽腫細胞の転移および浸潤に対する阻害活性を示すものであって、  図３ａは、損傷部位および創傷閉鎖（ｗｏｕｎｄ  ｃｌｏｓｕｒｅ）率を示し、  図３ｂは、カフェイン濃度の変化によってマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を通じて浸潤する細胞の代表的な写真（上段）、及び浸潤細胞の比率（下段）を示し、  図３ｃは、カフェイン濃度の変化によるコロニーの代表的な写真（上段）、及びコロニー数の比率（下段）を示す。
【図４】図４ａ〜４ｈは、カフェインのＣａ２＋放出阻害活性を示すものであって、  図４ａおよび図４ｂは、それぞれＥＧＦまたはブラジキニンで刺激されたＵ１７８ＭＧでの、カフェインによる細胞内Ｃａ２＋放出の遮断を示し、  図４ｃは、Ｕ１７８ＭＧでカフェイン存在下での、多様なアゴニストにより誘導されたＣａ２＋放出に対する％遮断を示し、  図４ｄは、多様な濃度のカフェイン存在下での、ＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋応答の阻害レベルを示し、  図４ｅは、ＴＦＬＬＲにより誘発されるＣａ２＋放出の用量応答曲線であり、  図４ｆおよび図４ｇは、ＧＰＣＲアゴニストで刺激されたＨＥＫ２９３およびヒト膠芽細胞腫の、カフェインによる細胞内Ｃａ２＋放出に対する遮断をそれぞれ示し、  図４ｈは、それぞれの細胞でのカフェイン存在下でのＧＰＣＲ誘導Ｃａ２＋放出の％遮断を示す。
【図５】図５ａ〜５ｄはＩＰ３ＲｓサブタイプのｍＲＮＡ発現率を示すものであって、  図５ａは、ヒト神経膠腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ１７８ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｍ０５９Ｋ）、ヒト神経芽細胞腫細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞株でのＩＰ３ＲｓおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現を示す電気泳動の画像であり、  図５ｂは、それぞれの細胞でのＩＰ３Ｒサブタイプ３の発現とカフェイン遮断間の相関関係を示し、  図５ｃは、正常ヒト脳細胞とヒト膠芽細胞腫でのＩＰ３ＲサブタイプｍＲＮＡ発現を確認した電気泳動画像であり、  図５ｄは、ヒト試料中でのＩＰ３Ｒ  ｍＲＮＡの濃度測定ヒストグラム（Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｒｉｃ  ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）の結果を示す。
【図６】図６ａ〜６ｇは、カフェインがＩＰ３Ｒ３に特異的に作用することを示すものであって、  図６ａおよび図６ｂは、ＩＰ３Ｒ１（ウシ）およびＩＰ３Ｒ３（ウシ）でそれぞれ形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのカフェインによるＴＦＬＬＲ誘導Ｃａ２＋放出の遮断をそれぞれ示し、  図６ｃは、ＩＰ３Ｒ１（ウシ）、ＩＰ３Ｒ３（ウシ）、およびＩＰ３Ｒ３（マウス）でそれぞれ形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔでのカフェインによる％遮断を示し、  図６ｄは、Ｕ１７８ＭＧ細胞でＧＦＰのみが発現した場合と、ＩＰ３Ｒ３−ｓｈＲＮＡ＋ＧＦＰが発現した場合とのカフェイン処理後のカルシウムイメージング結果を示し、  図６ｅは、対照群とｓｈＲＮＡ発現群での、カフェイン添加によるＣａ２＋応答を示すグラフであり、  図６ｆおよび図６ｇは、カフェインを処理していないＵ１７８ＭＧ細胞と、カフェインを処理したＵ１７８ＭＧ細胞との細胞遊走を、ライブイメージングした結果を示す。
【図７】図７ａ〜図７ｄは、カフェインの浸潤阻害および生存率改善の活性を示すものであって、  図７ａは、カフェインの存在下または非存在下で、６日目（６ｄａｙ  ａｇｅｄ）の器官型海馬切片培養物（Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｌｉｃｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ；ＯＨＳＣｓ）上に乗せたＵ１７８ＭＧ細胞を示す写真であり、  図７ｂは、カフェインにより、腫瘍細胞のＯＨＳＣｓへの浸潤および遊走が阻害されることを示すグラフであり、  図７ｃは、カフェイン処理による腫瘍の大きさの相対的な減少を示すグラフであり、  図７ｄは、脳腫瘍動物モデルにおける、カフェイン摂取による生存率の増加を示すグラフである。
【図８】各細胞株での様々なカフェイン濃度による細胞生存率を示すＭＴＴアッセイの結果である。
【図９】図９ａ〜９ｄは、カフェイン作用がストア感受性チャンネル（ｓｔｏｒｅ  ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）またはストア枯渇に依存的であることを示すものであって、  図９ａは、Ｃａ２＋無添加ＨＥＰＥＳバッファーでタプシガルギンを２分間添加した後のカルシウムイオン濃度の変化の挙動を示し、ここで無添加群（上）、カフェイン（中央）またはＳＫＦ９６３６５（下）であり、  図９ｂおよび図９ｃは、カフェイン処理なしでＦｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞（対照群）、およびカフェイン処理されたＦｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞での、細胞内Ｃａ２＋濃度のシクロピアゾン酸（Ｃｙｃｌｏｐｉａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）−誘導性またはタプシガルジン−誘導性増加をそれぞれ示し、  図９ｄは、カフェイン存在下でシクロピアゾン酸およびタプシガルジンによる調節率（％）を示す。
【図１０】図１０ａ〜図１０ｃは、カフェイン類似体の脳腫瘍細胞内のカルシウムイオンの放出の阻害活性を示すものであって、  図１０ａおよび図１０ｂは、ＴＦＬＬＲ誘導Ｃａ２＋放出のカフェイン（ａ）およびテオフィリン（ｂ）に対する遮断の代表的なトレースをそれぞれ示し、  図１０ｃは、カフェイン類似体による％遮断を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明のより完全な評価、及びこれらの多様な利点は、以下の詳細な説明により十分に理解されるだろう。
【０００７】
本発明者らは、カフェインおよびその類似体が、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体（ＩＰ３Ｒ）、特にイノシトール１，４，５−三リン酸受容体サブタイプ３（ＩＰ３Ｒ３）の作用を選択的に遮断することで、前記受容体を通じて放出されるＣａ２＋の放出を阻害するため、Ｃａ２＋放出と関連した疾病を予防、治療および／または改善させることができることを発見して、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の一態様は、カフェインおよび／またはその類似体、および／またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、ＩＰ３Ｒ、特にＩＰ３Ｒ３の阻害剤、並びにこれを含むＣａ２＋放出と関連した疾病の予防および／または治療用の組成物を提供する。また、本発明の他の態様は、カフェインおよび／またはその類似体、および／またはそれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、Ｃａ２＋放出と関連した疾病の予防および／または改善用の機能性食品組成物を提供する。
【０００９】
カフェインは高等植物で発見されるプリン塩基の一種であって、下記の化学式Ｉ（Ｃ８Ｈ１０Ｏ２Ｎ４）として表される、３個のメチル基を有するキサンチン構造である。
【化１】
2011510976.tif 000003
【００１０】
カフェインは、白色の軟らかい結晶性物質であり、興奮性成分としての特性を有し、そしてブラジルのコーヒー豆に１乃至５％、熱帯アフリカのコーラの実に約３％、パラグアイのマテ茶に１乃至２％、ブラジルのガラナ種子に３乃至５％存在する。
【００１１】
カフェインは、緑茶などを熱い水で滲出させた後、タンニンなどの物質を除去して単離することができる。または、カフェインはジメチル尿素及びマロン酸を出発物質として化学的に合成することもできる。植物において、カフェインの合成は、その他のプリン塩基と同様に、グリシン、ギ酸、二酸化炭素などの物質を材料として合成される。また、カフェイン中に存在する３個のメチル基は、メチオニンに由来する。カフェインの重要性はその薬理作用にある。カフェインは主に、ＣＮＳ（中枢神経）興奮剤、呼吸興奮剤、強心剤、利尿剤としての活性を有する。少量を投与した場合、カフェインは疲労回復の効力があり、偏頭痛や心臓病も軽減する。しかし、カフェインの脳腫瘍、特に神経膠腫に対する治療活性は、本発明で最初に明らかにされた。
【００１２】
つまり、本発明によれば、カフェインは、ＩＰ３Ｒ３の作用を選択的に遮断することによって、ＩＰ３Ｒ介在性のＣａ２＋増加を阻害する。本発明の一態様では、ヒト膠芽細胞腫（ＧＢＭ）細胞をヌードマウスの脳に注入した動物ＧＢＭモデルでは、飲用水を通じてカフェインを摂取した場合、生存率が増加し、注入された細胞の浸潤程度が減少することを示した。この結果は、カフェインはＩＰ３Ｒ３を選択的に標的化するため、ＧＢＭ浸潤および転移を阻害する治療用物質として有用であることを示唆している。
【００１３】
本発明でＩＰ３Ｒ３に対する選択的な阻害効果を有するカフェイン類似体としては、７−イソプロピルテオフィリン、７−（β−ヒドロキシエチル）テオフィリン、キサンチン、テオフィリン、１，７−ジメチル−３−イソブチルキサンチンなどが挙げられる。前記カフェイン誘導体のＩＰ３Ｒ３阻害活性は、図１０に示したとおりである。
【００１４】
本発明の一態様による組成物により治療することができる疾患は、カルシウムイオンの過剰放出によって引き起こされるすべての疾患を含み、例えば、脳卒中、不安症、過敏性膀胱炎、炎症性腸疾患、過敏性大腸症候群、てんかん性大膓炎、頭部外傷、偏頭痛、慢性痛、神経因性通または急性痛、薬品またはアルコール中毒、神経病性障害、精神病、睡眠障害、恐怖症、強迫観念、外傷後ストレス障害（ＰＴＳＤ）、鬱病、てんかん、糖尿病、癌、男性不妊、高血圧、肺高血圧、心不整脈、鬱血性心不全、狭心症、多発性嚢胞腎疾患（ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ）；デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、ＤＭＤ）などであっても良い。また、本発明の組成物は、カルシウムイオンの放出を抑制することによって神経弛緩剤としても使用することができる。また、本発明の組成物は哺乳動物、好ましくはヒトに適用することができる。
【００１５】
本発明の組成物に有効成分として含有されるカフェイン、その類似体またはその薬学的に許容可能な塩の量に関して、望ましい量は、０．３乃至３０ｍＭ、好ましくは０．５乃至２０ｍＭ、より好ましくは２．５乃至１２ｍＭである。有効成分の含量を前記範囲内に設定することにより、前記組成物は高濃度による細胞毒性を引き起こすことなく、十分な効果を発揮することができる。また、前記組成物の１日投与量は、適用しようとする疾病の症状、程度、患者の状態などに応じて適切に調節される。１日投与量は、好ましくは１乃至５ｍｇ／ｋｇ（体重）に設定することが好ましく、前記量を１回または数回に分量して服用することができる。
【００１６】
本発明の組成物において、カフェイン、その類似体またはその薬学的に許容可能な塩は、組成物内に単独で、または他の薬理学的に許容可能な薬剤、担体または賦形剤と共に含むことができる。組成物に含有されたカフェイン、その類似体またはその薬学的に許容可能な塩の含有量の範囲は、組成物の使用目的に応じて、当業者が適切に設定することができる。本発明の組成物に使用可能な担体または賦形剤は、剤形に応じて適切な物質を使用することができ、通常の希釈剤、充填剤、増量剤、湿潤剤、崩壊剤および／または界面活性剤を使用することができる。代表的な希釈剤または賦形剤としては、水、デキストリン、炭酸カルシウム、ラクトース、プロピレングリコール、流動パラフィン、タルク、異性化糖、メタ重亜硫酸ナトリウム、メチルパラフィン、プロピルパラベン、ステアリン酸マグネシウム、乳糖、生理食塩水、色素および香料がある。
【００１７】
本発明の組成物は、所望の使用方法に応じた多様な剤形で、経口または非経口で投与される。剤形の例としては、硬膏剤、顆粒剤、ローション剤、散剤、シロップ剤、液剤、エアロゾル剤、軟膏剤、流エキス剤、乳剤、懸濁剤、浸剤、錠剤、注射剤、カプセル剤または丸剤を含むことができるが、これらに限定されない。
【００１８】
また、本発明の一態様は、カフェイン、その類似体またはその薬学的に許容可能な塩を含む、脳腫瘍予防および／または改善用の機能性食品を提供する。本発明の機能性食品に含まれるカフェイン、その類似体またはその薬学的に許容可能な塩の含量は、特に制限はなく、最終製品の目的および特性に応じて適切に調節可能であり、例えば、食品組成物全体に対して０．００００１乃至９９．９重量％、好ましくは０．００１乃至５０重量％の範囲で設定することができる。本発明において、このような機能性食品は、各種食品、健康補助食品および食品添加剤を総称する。上記食品、健康補助食品または食品添加剤は、特に制限はない。例えば、前記食品は、特殊栄養食品（調製乳類、乳幼児食など）、食肉加工品、魚肉製品、豆腐類、カード、麺類（ラーメン類、そば類など）、パン類、機能性食品、調味食品（醤油、味噌、コチュジャン（唐辛子みそ）、混合醤など）、ソース類、クッキー類及びスナック類、乳加工品（醗酵乳、チーズなど）、その他加工食品、キムチ、漬物（醤油に漬けた薄切り大根またはキュウリ）、並びに飲料（果物ジュース、野菜ジュース、豆乳類、発酵飲料類など）を含むことができ、かつこれらは通常の製造方法で製造されたものであっても良い。
【００１９】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００２０】
細胞内ストアからのＣａ２＋の放出を担当するチャンネルとして、ＩＰ３ＲｓおよびＲｙＲｓの２つのチャンネルが知られている。カフェインは、特に筋肉細胞および心筋細胞で、ＲｙＲｓ開放により細胞内ストアからのＣａ２＋放出を誘導することが知られている。したがって、本発明者等は、ＧＢＭの運動性、浸潤性および増殖性に対する様々なアッセイにおいて、Ｃａ２＋放出機序を強化または阻害する他の薬剤と共に、カフェインをテストした。驚くべきことに、１０ｍＭのカフェインが様々なＧＢＭ細胞株（Ｕ１７８ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、およびＴ９８Ｇ細胞）の運動性、浸潤性および増殖性を顕著に阻害する反面（図３ａ、図３ｂおよび図３ｃ）、細胞生存性にはほとんど影響を与えないことが示された（図８）。このようなカフェインの矛盾的効果は、１Ｍのタプシガルジン、１０Ｍの２−ＡＰＢ、２０ＭのＣＰＡ、５０ＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭなどのような細胞内ストアからのＣａ２＋放出を阻害することが知られている多様な製剤を使用することで類似の効果を得ることができるが、この濃度でのＲｙＲｓに対するアゴニストである１０Ｍのリアノジンでは得られなかった（図３ａ）。これは、カフェインの作用機序は細胞内ストアからのＣａ２＋放出の阻害に起因し、おそらくＲｙＲｓでなくＩＰ３Ｒｓを標的化していることを示唆する。
【００２１】
最も悪性でかつ浸潤する脳腫瘍である、多形性膠芽細胞腫（ＧＢＭ）は、診断後の平均生存期間が約１年以下であり、予後が非常に良くない。また、脳細胞と腫瘍細胞間の境界が不明確であるため、ＧＢＭを外科的に完全除去することはほとんど不可能である。この困難性は、これらの細胞が脳の隣接した部位に転移および浸潤する潜在的な傾向を有することに基本的に起因する。高度に浸潤するＧＢＭ細胞は、能動的なニューロンの死滅を通じて、正常の脳に散在的に浸潤して、空間を確保する。様々なシグナリング分子がこれらのＧＢＭ細胞を活性化し、これらの増殖、運動性および浸潤性に影響を与える。これらのシグナリング分子には、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの様々な成長因子、並びにＡＴＰ、ブラジキニン（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、リソフォスファチジン酸 （ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＬＰＡ）、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）、トロンビン、及びプラスミンなどのＧ−蛋白質結合受容体（ＧＰＣＲ）アゴニストなどが含まれる。このようなシグナリング分子は次にこれらの対応部（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｐａｒｔ）上の表面受容体を活性化する。これらの表面受容体は、ＥＧＦＲ、ＰＡＲ１、Ｂ２、Ｐ２Ｙ、ＬＰＡ受容体、Ｓ１Ｐ受容体などと多様であり、これらの活性化は下流のエフェクターの活性を誘発し、より重要なことには、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の増加を誘発する（図１）。
【００２２】
図１は、様々なＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）および受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）アゴニストによるＣａ２＋応答を示す。図１ａは、代表的な疑似カラー蛍光強度イメージ（３８０ｎｍまたは３４０ｎｍ励起、５１０ｎｍ発光）（上段）、及びＦｕｒａ−２  ＡＭ（５μＭ）が添加された膠芽細胞腫細胞でのＥＧＦ刺激前後の比率イメージ（下段）を示す。右側のカラースケール（ｂａｒ）は、蛍光強度による疑似カラーの程度を示すものであって、黒色になるほど蛍光強度が低く、黄色になるほど蛍光強度が高い。図１ｂは、４種の膠芽細胞腫細胞株で行われたＣａ２＋イメージ記録から得られたトレースである。それぞれのトレースは、それぞれの細胞でのＦｕｒａ−２  ＡＭの強度比率の変化を示す（各細胞株当りｎ＝３６乃至８３）。赤色線は平均応答を示す。灰色の棒グラフは、ＥＧＦの適用時間を示す。
【００２３】
図１ｃは、Ｆｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞上での多様なアゴニストによるＦｕｒａ−２  ＡＭ強度比率変化を示す。図１ｄは、ヒトＧＢＭ細胞の低倍率画像（Ｌｏｗ  ｐｏｗｅｒ  ｖｉｅｗ）であって、左上段は２００倍率写真であり、細胞水準のグリア細胞腫瘍は２地点で偽柵状構造（ｐｓｅｕｄｏｐａｌｉｓａｄｉｎｇ）壊死（矢印、Ｈ＆Ｅ、×２００）を示し、右上段は４００倍率写真であり、頻繁に有糸分裂する細胞（矢印）を示し（Ｈ＆Ｅ、×４００）、左下段は多核多形態性核を示し（Ｈ＆Ｅ、×２００）、右下段は大部分の腫瘍細胞がグリア繊維性酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に対して免疫反応性があることを示す（×２００）（ＧＦＡＰ免疫染色）。図１ｅは、ＧＰＣＲおよびＲＴＫアゴニストが、ヒト膠芽腫細胞内において細胞内Ｃａ２＋増加を誘導することを示す。
【００２４】
癌細胞遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）は、主にアクチン重合反応および細胞内組織化に依存し、前記重合反応および細胞内組織化は多様なアクチン結合蛋白質により影響を受ける。アクチン結合蛋白質の活性の調節はホスホイノシチド（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅｓ）およびカルシウムのような二次情報伝達物質（ｓｅｃｏｎｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）により媒介される。したがって、ＧＢＭ細胞内でのＣａ２＋増加の正確なメカニズムが、前記細胞の増殖、運動性および浸潤性を調節するのに非常に重要な要因であると言える。しかし、今まで前記ＧＢＭ細胞でのＣａ２＋シグナル伝達と関連して行なわれた研究は、ごくわずか行われているのみである。
【００２５】
Ｆｕｒａ２−ＡＭが添加された培養ＧＢＭ細胞株、および外科的に除去された組織から急性的に分離して得られたＧＢＭ細胞に対してＣａ２＋イメージ化を行うことによって、これら細胞内での［Ｃａ２＋］ｉ増加が部分的には細胞内放出プール（ｐｏｏｌｓ）からのＣａ２＋放出によるものであり、部分的にはストア感受性チャンネル（ｓｔｏｒｅ  ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）を通じたＣａ２＋流入によるものであることを発見した（図２ａ、図２ｂおよび図２ｃ参照）。このような細胞内ストアからのＣａ２＋放出は、Ｇ−蛋白質結合受容体（ＧＰＣＲｓ）および受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ、ＲＴＫｓ）の活性化に応答してホスホイノシトール−４，５−ビスホスフェート（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ−４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＩＰ２）の代謝によりＩＰ３を生産する、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）に対する特異的な抑制剤であるＵ７３１２２によって完璧に抑制された（図１ｃ参照）。
【００２６】
図２は、Ｃａ２＋シグナル伝達と関連した結果を示すものであって、図２ａは、Ｆｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞が、２ｍＭ  Ｃａ２＋  ＨＥＰＥＳバッファー、Ｃａ２＋−無添加ＨＥＰＥＳバッファー、およびＳＫＦ  ９６３６５の存在下においてブラジキニンで刺激されることをそれぞれ示す。図２ｂおよび図２ｃは、前記各サンプルの代表的な平均挙動および半幅（ｈａｌｆ  ｗｉｄｔｈ）の挙動（Ｄｅｃａｙ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示す。エラーバーはＳＥＭを表す。図２ｄは、Ｕ７３１２２の前処理により抑制されたブラジキニンまたはＥＧＦ誘導性Ｃａ２＋放出がＵ７３３４３前処理によりレスキューされた（ｒｅｓｃｕｅｄ）ことを示す。図２ｅは、タプシガルギンによる小胞体でのＣａ２＋枯渇後のＧＰＣＲアゴニストの適用結果を示す。図２ｆは、リアノジン受容体拮抗剤の存在下での、Ｕ１７８ＭＧ上でブラジキニンによるＩＰ３Ｒ介在性Ｃａ２＋減衰動態を示す。
【００２７】
タプシガルギンによるストアの欠乏によって、後続のブラジキニンによる［Ｃａ２＋］ｉの増加誘導が完璧に抑制されるという事実に照らし合わせて（図２ｅ参照）、ストア感受性チャンネルを通じたＣａ２＋流入は放出と密接に関連していると見られる。このような結果から、ＧＢＭ細胞が、細胞内ストアからのＣａ２＋放出を導く共通のホスホイノシチド経路と、それに続くストア感受性チャンネルを通じたＣａ２＋流入とに共役される、様々な表面受容体を発現していると結論付けた。Ｃａ２＋放出経路にあるこれらの分子が、ＧＢＭの遊走および浸潤を調節する潜在的な分子標的としての役割を果たすと仮定される。
【００２８】
細胞内ストアからのＣａ２＋放出に関与するチャンネルとして、ＩＰ３Ｒｓ（イノシトール１，４，５−三リン酸受容体 ）およびＲｙＲｓ（リアノジン受容体）の２つのチャンネルが知られている。カフェインは、特に筋肉細胞および心筋細胞で、ＲｙＲｓの開放により、細胞内ストアからＣａ２＋放出を誘導することが古典的に知られている。したがって本発明者等は、ＧＢＭ運動性、浸潤および増殖に対する多様なアッセイにおいてＣａ２＋放出機構を強化または阻害する製剤と共に、カフェインを試験した。
【００２９】
しかし、本発明者等の予想とは異なり、１０ｍＭカフェインが多様なＧＢＭ細胞株（Ｕ１７８ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、およびＴ９８Ｇ細胞）の運動性、浸潤性および増殖性を顕著に抑制する反面（図３ａ、図３ｂおよび図３ｃ）、細胞生存性にはほとんど影響を与えないことが見出された（図８参照）。このカフェインの矛盾した効果は、１μＭタプシガルギン、１０μＭ  ２−ＡＰＢ、２０μＭ  ＣＰＡ、５０μＭ  ＢＡＰＴＡ−ＡＭなどのような、細胞内ストアからのＣａ２＋放出を阻害することが知られている多様な製剤により模倣されるが、この濃度でＲｙＲｓに対するアゴニストである１０μＭ  リアノジンによっては模倣されなかった（図３ａ参照）。
【００３０】
上記の事実は、カフェインの作用機序は細胞内ストアからのＣａ２＋放出の阻害に関与し、阻害作用はＲｙＲｓではなく、ＩＰ３Ｒｓを選択的に標的化していることを示唆している。本発明での実験結果は、カフェイン及びその類似体によって示される阻害作用は、ＩＰ３Ｒ３に特異的であり、かつＩＰ３Ｒ３介在性Ｃａ２＋増加を阻害することによって、Ｃａ２＋により引き起こされる各種症状の緩和を示すことを明らかにした。
【００３１】
また、ＩＰ３結合に影響を与えずに、ＩＰ３Ｒｓを阻害するというカフェインの作用については、ほとんど知られていない。したがって、本発明者等は、培養したＵ１７８ＭＧ細胞（神経膠腫細胞）において、カフェインがＧＰＣＲおよびＲＴＫの活性化による［Ｃａ２＋］ｉ増加を阻害する能力があるかどうかを試験した。カフェインがブラジキニン−誘導性、表皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）−誘導性、およびＰＡＲ１アゴニストＴＦＬＬＲ−誘導性の［Ｃａ２＋］ｉ増加を最大濃度半値（ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）２．４５ｍＭで、容量依存的に確実に阻害することが示された（図４ａ、図４ｂ、図４ｃ、図４ｄおよび図４ｅ参照）。この結果は、カフェインの阻害作用は、Ｃａ２＋  ストアの欠乏（図９ｂ、図９ｃおよび図９ｄ参照）、ストア感受性チャンネル（図９ａ参照）の阻害、またはＲｙＲｓ（図２ｆ参照）の活性化に関連していないことを示唆する。むしろこの結果は、このような阻害作用はおそらくＩＰ３Ｒｓのみの阻害に関連していることを示す。
【００３２】
また、本発明者等は、カフェインのＣａ２＋応答に対する阻害活性が他の細胞型でも現れるかどうかを試験した。本発明者等は、多様な細胞型が、１０ｍＭカフェイン処理によるＣａ２＋応答の阻害程度の変化を示し、その中でもＵ１７８ＭＧで最も高い遮断効果と、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で最も低い遮断効果が示された（図４ｆ、図４ｇおよび図４ｈ参照）。カフェインによるＣａ２＋遮断の程度がＩＰ３Ｒ発現と関連があるかを確認するために、本発明者等はそれぞれの細胞型当り３つの亜型のＩＰ３Ｒ  ｍＲＮＡに対して、半定量（ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ＲＴ−ＰＣＲを行った（図５ｂ参照）。ＩＰ３Ｒの３つの亜型中、ＩＰ３Ｒ亜型３（ＩＰ３Ｒ３）がＣａ２＋応答の遮断率と最も高い相関関係を示した（相関関係の係数、ｒ２＝０．８８４、図２ｇ）。また、本発明者等は、ＧＢＭ組織サンプル上の３つの亜型のＩＰ３Ｒの半定量ＲＴ−ＰＣＲを行い、正常組織サンプルと比較した。ＧＢＭ組織は正常組織に比べて平均２倍以上のＩＰ３Ｒ３  ｍＲＮＡの発現増加を見せた反面、ＩＰ３Ｒ２  ｍＲＮＡはほとんど変化がなく、ＩＰ３Ｒ１  ｍＲＮＡは若干減少することが見出された（図２ｌおよび図２ｍ）。このような結果は急性調製された（ａｃｕｔｅｌｙ  ｐｒｅｐａｒｅｄ）ＧＢＭ細胞における高いＣａ２＋応答遮断率と一致する（図２ｆおよび図２ｈ）。これらの結果は、ＩＰ３Ｒ３の発現が、Ｃａ２＋応答に対するカフェインの阻害活性と高い相関関係があることを示唆する。
【００３３】
Ｃａ２＋応答に対するカフェインの阻害活性がＩＰ３Ｒ３に対して特異的であることが本当であれば、通常ＩＰ３Ｒ３を欠損するＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＩＰ３Ｒ３の過発現が、前記細胞がカフェインにより、Ｃａ２＋応答に対して高い遮断度示すと考えられる。ＩＰ３Ｒ３が過発現される場合、ＩＰ３Ｒ３発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はカフェインにより約９０％の遮断が起こったが、ＩＰ３Ｒ１またはＩＰ３Ｒ２が過発現される場合には、このような遮断は起こらないことが分かった（図６ａ、図６ｂおよび図６ｃ）。ＩＰ３Ｒ３を発現するＵ１７８ＭＧ細胞を用いた補足実験で、本発明者らは、Ｕ１７８ＭＧ細胞でのＩＰ３Ｒ３に対するｓｈＲＮＡの発現による遺伝子発現抑制（ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）によって、これら細胞らがカフェインによるＣａ２＋応答に対する遮断が喪失するかどうかを試験した。ＩＰ３Ｒ３発現Ｕ１７８ＭＧ細胞に対するｓｈＲＮＡの場合、たった２０％のカフェインによるＣａ２＋応答の遮断が観察された（図６ｄ参照）。これらの結果は、カフェインの阻害作用が、ＩＰ３Ｒ３に対して選択的であることを示す。
【００３４】
また、カフェインの化学的構造を試験し、一連のカフェイン類似体のＩＰ３Ｒ３介在性Ｃａ２＋応答に対する遮断効果を試験することにより、ＩＰ３Ｒ３に対して優れた阻害活性を有する化合物を選別した（図１０ｃ参照）。本発明者等により、７−イソプロピルテオフィリン、７−（β−ヒドロキシエチル）テオフィリン、キサンチン、テオフィリン、１，７−ジメチル−３−イソブチルキサンチンを含むがこれらに限定されないカフェイン類似体が、優れたＩＰ３Ｒ３選択的遮断効果を示すことが観測された。
【００３５】
本発明は、ＩＰ３Ｒ３を選択的に阻害することによって、カＣａ２＋放出を調節する技術を提供するものである。このようなものとして、本願発明は、Ｃａ２＋放出により引き起こされる多様な病的症状の治療および改善に有益である。
【００３６】
以下、本発明の多様な実施例について詳細に説明する。これらの実施例は、しかしながら、いかなる場合も本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【実施例１】
【００３７】
膠芽細胞腫細胞の準備
膠芽細胞腫細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）およびストレプトマイシン（５０単位／ｍＬ）が補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ変形Ｅａｇｌｅ'ｓ培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）に保持した。ヒト膠芽細胞腫は、２０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（５０単位／ｍＬ）が補充されたＤＭＥＭに保持し、使用時まで保管した。
【実施例２】
【００３８】
カフェインのＧＢＭ細胞に対する運動性、浸潤性および増殖性の阻害試験
カフェインの多様なＧＢＭ細胞株に対する運動性、浸潤性および増殖性の阻害活性を試験した。
【００３９】
２．１．掻爬遊走試験（Ｓｃｒａｐｅ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）
まず、運動性に対する効果を試験するために、神経膠腫細胞株としてＵ１７８ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、ｗｔＥＧＦＲ、およびΔＥＧＲＦ細胞を使用した。前記細胞株は、それぞれＥｍｏｒｙ  Ｕｎｉ（Ｕ１７８ＭＧ）、及びＡＴＣＣ（Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、およびＭ５９Ｋ）から入手した。すべての細胞株を、１２−ウェル培養プレート内の血清含有培地（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉ製）で単層増殖させた。１０μＬピペットチップで掻爬（ｓｃｒａｐｅ）を作り、１０ｍＭカフェイン、１μＭタプシガルギン、または１０μＭリアノジンをそれぞれ添加後、プレートをインキュベータに戻して培養した（各細胞株当りｎ＝３乃至４、３７℃）。増殖を防止するために、フルオロデオキシウリジン （ＦｄＵ／Ｕ；Ｓｉｇｍａ社製）を添加した。２４時間培養後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。損傷領域内の３個の１０×フィールドの再増殖の広さを測定し、損傷領域の傷の縫合の平均パーセントを測定した。カフェイン処理していない細胞株を対照群として使用した。
【００４０】
得られた結果を図３ａに示す。図３ａの左側写真のボックスで表示された部分は大略の傷部位の境界を示す。右側のグラフに示されたデータは、細胞遊走による傷の縫合（ｗｏｕｎｄ  ｃｌｏｓｕｒｅ）比率を示す。上記の結果から分かるように、カフェインは、細胞内Ｃａ２＋濃度を減少させるタプシガルギン処理と同様に、細胞内Ｃａ２＋ストアの枯渇を誘導して、傷部位への細胞遊走を非常に効果的に阻害することが明らかになった。しかしながら、細胞内Ｃａ２＋濃度に関与する受容体の一つであるＲｙＲｓ（リアノジン受容体）に対するアゴニストであるリアノジンで処理した場合、このような細胞遊走はほとんど観察されなかった。エラーバー：±ＳＥＭを示す。
**ｐ＜０．０１、事後のニューマン−クールズ分散分析（ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ．）
【００４１】
２．２．マトリゲル浸潤試験（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）
浸潤の阻害効果を試験するために、膠芽腫細胞として、Ｕ１７８ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、およびＴ９８Ｇを使用した。前記細胞株らはそれぞれＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関）から得た。前記細胞らにカフェインをそれぞれ１、２、５、および１０ｍＭを添加した（ｎ＝４）。２４−ウェルプレートで、８μｍ孔径（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ＮＹ、米国）を含むトランスウェルインサートを使用して細胞浸潤を検定した。浸潤試験用に、インサートを２ｍｇ／ｍｌ基底膜マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）でコーティングした。無血清培地（ＦＢＳ、ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ社より、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）内の１×１０５細胞をインサート上段面にプレーティングし、完全培地をチャンバー下部に入れて化学誘引物質として作用するようにした。３７℃で２４時間培養後、インサート上段面上の細胞を綿棒で拭いて除去し、メンブレンの下段面へ遊走した細胞をＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）で染色し、倍率４０倍で、顕微鏡で無作為撮影した。カフェイン未処理細胞（対照群）の平均数を１００％浸潤と見なした。
【００４２】
上記で得られた浸潤の結果を図３ｂに示す。上段は様々なカフェイン濃度におけるマトリゲルを通じて浸潤する細胞の代表的な写真であり、下段は対照群に対する浸潤細胞の比率を示すグラフである。浸潤細胞数は、×２００倍率顕微鏡下でカウンティングした。試験は２回行い、５つ箇所の場を無作為に選択し、アッセイ毎にカウンティングした。結果から分かるように、カフェインは、２４時間の処理後、用量依存的に（処理したカフェイン量に比例して減少が増加する）神経膠腫細胞の浸潤率を減少させた。
【００４３】
２．３．コロニー形成についてのカフェイン阻害効果の軟寒天試験（Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ａｓｓａｙ）
カフェインの増殖能における阻害効果を試験するために、軟寒天試験を行った。１×１０４個の細胞を、６−ウェルプレート中の、０．６％ベース寒天を覆った軟寒天（０．３％、Ｄｉｆｃｏ社）に接種した。凝固した細胞層を、０．５、１、２、５、および１０ｍＭのカフェインを含有する培地で覆い、前記培地は４日毎に交換した。コロニーが発生するように、前記細胞を３７℃で１４乃至１７日間培養した。その後、コロニーを０．０５％クレシルバイオレットで染色して撮影した。対照群として、カフェイン処理していないものを使用した。各試験はｎ＝３で行った。
【００４４】
図３ｃは前記で得られた結果を示す。上段は様々なカフェイン濃度において形成されたコロニーを示す写真であり、下段は対照群に対するカフェイン処理群のコロニー数比率を示すグラフである。図３で示すように、カフェインは試験管内で神経膠腫の接着非依存性増殖（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ）を濃度依存的に減少させた。
【実施例３】
【００４５】
カフェインのカルシウムイオン放出遮断活性試験
Ｕ１７８ＭＧ細胞を１０ｍＭカフェインで処理した。１００秒の処理後、細胞を２つの群に分けた後、ＧＰＣＲ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）アゴニスト、すなわち１００ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦまたは１０μＭブラジキニンでそれぞれ処理した。細胞内電流を測定して、ＥＧＦまたはブラジキニンで刺激されたＵ１７８ＭＧでのカフェインによる細胞内Ｃａ２＋放出の遮断を試験した。細胞内電流測定を通じたカルシウムイオン濃度測定は「Ｃ．Ｊｕｓｔｉｎ  Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，２００７」（前記文献は参照として本明細書に含まれる）の記載通りに行った。カフェインを処理していない群を対照として使用した。前記で得られた結果を図４ａ（ＥＧＦ）および図４ｂ（ブラジキニン）にそれぞれ示した。前記図４ａおよび図４ｂに示したように、カフェインを処理した群では、アゴニストを処理しても、［Ｃａ２＋］ｉが大きく増加していないことが分かる。
【００４６】
Ｕ１７８ＭＧ細胞を１０ｍＭカフェインで１００秒処理後、Ｕ１７８ＭＧは多様なアゴニスト（１０μＭブラジキニン（ＢＫ）、１００ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、３０μＭ  ＴＦＬＬＲ）で刺激した。図４ｃは、Ｕ１７８ＭＧにおけるアゴニスト誘導性Ｃａ２＋放出に対するカフェインによる％遮断率を示す。エラーバーは、平均±ＳＥＭである。  図４ｃに示したように、カフェインは多様なＣａ２＋放出アゴニストに対して、細胞内Ｃａ２＋放出の遮断効果を示す。
【００４７】
Ｕ１７８ＭＧ細胞を０．３ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、および３０ｍＭカフェインでそれぞれ処理した。１００秒後、細胞を３０μＭ  ＴＦＬＬＲで処理した。図４ｄは、Ｕ１７８ＭＧにおけるＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出に対する遮断効果を示す。図４ｄに示したように、カフェインは、ＴＦＬＬＲによるＣａ２＋濃度の増加を、カフェイン濃度依存的に抑制することが分かる。
【００４８】
図４ｅは、カフェイン濃度によるＴＦＬＬＲ（３０μＭ）およびＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）により誘発されるＣａ２＋放出の用量応答曲線を示す。測定されたＩＣ５０値は、ＴＦＬＬＲに対しては２．４５ｍＭであり、ＥＧＦに対しては１．８７ｍＭであった。
【００４９】
図４ｆおよび図４ｇは、ヒト膠芽細胞腫細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＡＴＣＣ）およびＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ）の細胞内Ｃａ２＋放出の挙動を示し、細胞は１０ｍＭカフェインで処理後、１０μＭブラジキニン（ヒト膠芽細胞腫）または３０μＭ  ＴＦＬＬＲ（ＨＥＫ２９３）で刺激した。図４ｆおよび図４ｇから分かるように、両方の細胞株において、カフェインにより細胞内Ｃａ２＋放出が遮断されることを示す。
【００５０】
図４ｈは、ＧＢＭ、Ｕ１７８ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧおよびＨＥＫ２９３細胞でのカフェイン（１０ｍＭ）によるＧＰＣＲ誘導性細胞内Ｃａ２＋放出の％遮断を示す。細胞株は、：ソウル大学校病院神経外科（ＧＢＭ）、Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉ（Ｕ１７８ＭＧ）、ＡＴＣＣ（Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧおよびＨＥＫ２９３）より入手した。大部分の細胞で、細胞内Ｃａ２＋放出がカフェインにより阻害されることが見出された。エラーバーは±ＳＥＭを示す。
【実施例４】
【００５１】
ＩＰ３Ｒ亜型３（ＩＰ３Ｒ３）に対する選択的遮断の評価試験
４．１．ｍＲＮＡ発現の測定
ヒト神経膠腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ１７８ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｍ０５９Ｋ）、ヒト膠芽細胞腫細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞株での、ＩＰ３Ｒｓおよびグリセルアルデヒド‐３‐ホスファターゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ発現を測定した。ｍＲＮＡの発現はＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）で測定した。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と共に上記の調製サンプルから全ＲＮＡを分離し、１μｇの分離されたＲＮＡを増幅させた。各サイクルは、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で６０秒間の伸張で構成された。使用されたプライマー配列は次の通りである：
ＩＰ３Ｒ１センス：５'−ＣＴＣＴＧＡＴＣＧＴＴＴＡＣＣＴＧ−３'（配列番号１）、
ＩＴＰＲ１アンチセンス：５'−ＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣ−３'（配列番号２）；
ＩＰ３Ｒ２センス：５'−ＡＧＡＡＧＧＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＣ−３'（配列番号３）、
ＩＰ３Ｒ２アンチセンス：５'−ＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＡＣＴＴＧＡＣＴ−３'（配列番号４）；
ＩＰ３Ｒ３センス：５'−ＣＴＧＴＴＣＡＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧ−３'（配列番号５）、
ＩＰ３Ｒ３アンチセンス：５'−ＣＡＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＧ−３'（配列番号６）；
ＧＡＰＤＨセンス：５'−ＡＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴ−３'（配列番号７）、
ＧＡＰＤＨアンチセンス：５'−ＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＣＧＴＴＧ−３'（配列番号８）。
【００５２】
図５ａは、上記で得られたＰＣＲ産物を電気泳動して得られたｍＲＮＡ発現の結果である。３種の亜型のＩＰ３Ｒ  ｍＲＮＡの発現率は、それぞれの細胞株で相異していた。
【００５３】
図５ｂは、それぞれの細胞でのＩＰ３Ｒ３の発現度と、カフェインによるＣａ２＋遮断の相関関係を示す。Ｃａ２＋レベルは、実施例２および３の記載に従って測定した。図５ｂに示すように、ＩＰ３Ｒ３の発現レベルとＣａ２＋遮断との間に、統計的に有意味な相関関係が見出された。これは、カフェインの阻害活性がＩＰ３Ｒ３と関連することを示唆する。
【００５４】
図５ｃは、正常ヒト脳細胞（ｎ＝８、ソウル大学校病院神経外科）とヒト膠芽細胞腫（ｎ＝１０）との間のＩＰ３ＲサブタイプのｍＲＮＡ発現を、電気泳動上での比較を示す。図５ｄは、上記のヒトサンプルにおける、ＩＰ３ＲサブタイプｍＲＮＡ発現の濃度測定ヒストグラム（Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｒｉｃ  ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ）を示す。図５ｃおよび図５ｄで確認できるように、ＩＰ３Ｒの他の亜型と比較してＩＰ３Ｒ３が膠芽細胞腫細胞で顕著に多く発現することが示された。
【００５５】
４．２．ＩＰ３Ｒ３に特異的なカフェインの活性
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＩＰ３Ｒ１（ウシ）およびＩＰ３Ｒ３（ウシ）でそれぞれ形質転換した（ＧＦＰとＩＰ３Ｒ遺伝子を同時に形質転換させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣから入手し、かつＧＦＰが入った細胞らのみをＣａ２＋イメージングし、Ｃａ２＋イメージングは形質転換させてから２日後に行った）。細胞はその後１０ｍＭカフェインで処理した。カフェイン処理した細胞に対して、ＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出（３０μＭ  ＴＦＬＬＲで処理）に対する遮断度を評価した。結果を図６ａおよび図６ｂに示す。図６ａにおいて、ＩＰ３Ｒ１が発現する場合には、ＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出に対するカフェインによる遮断は顕著でなかった。しかしながら、図６ｂに示されているように、ＩＰ３Ｒ３を発現する場合には、ＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出に対するカフェインによる遮断が観測された。
【００５６】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＩＰ３Ｒ１（ウシ）、ＩＰ３Ｒ３（ウシ）、およびＩＰ３Ｒ３（ウシ）でそれぞれ形質転換した（ＧＦＰとＩＰ３Ｒ遺伝子を同時に形質転換させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣから入手し、かつＧＦＰが入った細胞らのみをカルシウムイメージングし、Ｃａ２＋イメージングは形質転換させてから２日後に行った。）。細胞はその後１０ｍＭカフェインで処理した。カフェイン処理した細胞に対して、ＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出（３０μＭ  ＴＦＬＬＲで処理）に対する％遮断を評価した。結果を図６ｃに示す。図６ｃに示すように、ウシ由来のみならず、マウス由来の遺伝子の場合にも、ＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出に対するカフェインによる遮断がＩＰ３Ｒ３に対して特異的であった。エラーバーは平均±ＳＥＭである。
【００５７】
図６ｄおよび図６ｅは、ＩＰ３Ｒ３に対するＧＦＰを付けたｓｈＲＮＡを、電気穿孔を通じて形質させたＵ１７８ＭＧ細胞のＣａ２＋イメージングの結果である。ｓｈＲＮＡが発現している細胞ではＣａ２＋放出がほとんどない反面、ＧＦＰのみを形質転換させた細胞では正常なＣａ２＋放出が観測された。これは、カフェイン添加が有意にカルシウム放出を遮断することを示す。したがって、この実験から、ＩＰ３Ｒ３が神経膠腫細胞でのＣａ２＋放出に非常に重要な役割を果たすことと、カフェインがＩＰ３Ｒ３に特異的なＣａ２＋放出の阻害活性を示すことが証明される。
【００５８】
また、図６ｆおよび図６ｇは、カフェイン処理していないＵ１７８ＭＧ細胞と、カフェイン処理したＵ１７８ＭＧ細胞との細胞遊走をライブイメージングした結果を示し、９時間の間、１０分間隔で顕微鏡観察（２００倍率）して得られた細胞遊走経路を赤線で表示した。図６ｆおよび図６ｇで明らかなように、カフェインで処理した場合、Ｕ１７８ＭＧ細胞の動きが顕著に鈍化することが分かる。
【実施例５】
【００５９】
カフェインによる腫瘍増殖の阻害
海馬の器官型切片培養（Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｌｉｃｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＯＨＳＣｓ）において、カフェインがＵ１７８ＭＧ神経膠腫細胞の浸潤を減少させるかどうかについて試験した。前記ＯＨＳＣｓは「Ｓｉｍｏｎｉ  ＡＤ  ａｎｄ  ＹｕＬＭ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｌｉｃｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（３）：１４３９〜４５」の記載に従って調製した。器官型神経膠腫浸潤を若干変更した（Ｅｙｕｐｏｇｌｕ  ＩＹ、Ｈａｈｎｅｎ  Ｅ、Ｂｕｓｌｅｉ  Ｒ、Ｓｉｅｂｚｅｈｎｒｕｂｌ  ＦＡ、Ｓａｖａｓｋａｎ  ＮＥ、Ｌｕｄｅｒｓ  Ｍ、Ｔｒａｎｋｌｅ  Ｃ、Ｗｉｃｋ  Ｗ、Ｗｅｌｌｅｒ  Ｍ、Ｆａｈｌｂｕｓｃｈ  Ｒ、Ｂｌｕｍｃｋｅ  Ｉ．Ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＳＡＨＡ）ｈａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉ−ｇｌｉｏｍａ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００５  Ｍａｙ；９３（４）：９９２〜９）。簡略に説明すれば、０、１、２、５、および１０ｍＭのカフェインの存在下で、ＤｉＩ株化（ＤｉＩ−ｓｔｒａｉｎｅｄ）Ｕ１７８ＭＧ細胞（５０００細胞／２０ｎｌ）を６日目の海馬器官型切片上に乗せた。１時間および１２０時間経過後、前記神経膠腫細胞の挙動を、倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ）を使用して観察した。得られた結果を図７ａに示す。図７ａは、６日目の切片表面に乗せたＵ１７８ＭＧ細胞を示す写真で、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ７  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して１時間後のイメージ（緑色）と１２０時間後のイメージ（赤色）を重ねておいた併合イメージである。スケールバー：５００μｍ。
【００６０】
また、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ、ＭＤ）を用いて、ＤｉＩ株化細胞の浸潤領域を計算した。
【００６１】
浸潤領域（％）＝（１２０時間後のＤｉＩ株化細胞領域／１時間後のＤｉＩ株化細胞領域）×１００。
【００６２】
このように得られた浸潤領域の計算結果を図７ｂに示した。データは平均±ＳＥＭとして表示している（***ｐ＜０．００１  対照に対するＳｔｕｄｅｎｔｓ  ｔ−検定；による；＋＋＋ｐ＜０．００１  未処理に対するＳｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ−検定による）。図７ｂで示されているように、カフェイン処理していない場合よりは、カフェイン処理した場合に浸潤領域が減少し、カフェイン処理濃度に比例して浸潤領域が減少することが見出された。
【００６３】
また、カフェインによる腫瘍増殖抑制効果を確認するため、異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルを用いた試験を行い、Ｕ７８ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ）を皮膚に注入して腫瘍の進行を検討した。
【００６４】
５週齢の無胸腺マウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ）をＣｅｎｔｒａｌ  Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｃ．（日本）から得た。異種移植腫瘍増殖アッセイのために、Ｕ８７ＭＧ細胞（３×１０６  細胞／１５０μｌ  ＰＢＳ）をマウスの左側横腹に皮下注入し（ｎ＝５乃至１０マウス／グループ）、実験は３回行った。注入後７日目に、カフェイン（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を飲用水に１ｍｇ／ｍｌの濃度で与えた。対照群には蒸溜水を与えた。腫瘍の大きさは一週間に２回ずつ４週間測定し、腫瘍体積は次の式で計算した：
体積＝（長さ×幅２）／２
【００６５】
カフェインの効果は、移植された腫瘍細胞の増殖遅延によって測定した。
【００６６】
図７ａに示すように、カフェイン処理した場合、カフェイン処理していない対照群と比較して、顕著に腫瘍体積の増加が阻害された。図７ｂは、カフェイン処理し始めた日を０日とし、この時の腫瘍体積を１００％として腫瘍の大きさの成長を％値で示す。
【００６７】
試験管内試験の結果をより全身的水準で適用するために、局所的な微小環境がカフェインの効果を損なうことができる急性切片及び生体内動物モデルに対するカフェインの効果を試験した。マウスの脳の急性切片に対して１μｌ  ＤｉＩが添加されたＵ１７８ＭＧ細胞（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉ．）を線条体部位に乗せた後、これらの細胞の隣接部位に対する放射状進行を試験した。図７ｃで示されるように、１０ｍＭカフェインで処理された脳切片において、ＤｉＩが添加されたＵ１７８ＭＧ細胞は、１０ｍＭ  ７−エチルテオフィリン及びカフェインなし（０ｍＭ）で処理した対照群切片と比較して、顕著に低い浸潤を示したことが見出された。
【００６８】
生存率に対するカフェインの効果を試験するために、ヒトＵ８７ＭＧが移植された箇所において同所移植モデルを構築した。同所移植モデルを調製するため、最初にカフェイン溶液（０．１％  ｗｔ／ｖｏｌ）で１週間前処理した。その後、Ｕ８７ＭＧ細胞（２×１０５  細胞／５μｌ  ＰＢＳ）をブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）の側面２ｍｍ、前方０．５ｍｍおよび脳実質（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ）の３．５ｍｍの座標で、左側前頭葉に頭蓋内注入して移植した。Ｕ８７ＭＧ細胞をヌードマウス（５週齢、Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ）の脳に注入したＧＢＭ動物モデルにおいて、１ｍｇ／ｍｌカフェイン含有飲用水を通じてカフェインを摂取したモデル群とカフェインを摂取していないモデル群での生存率を測定した。結果を図７ｄに示す。生存率は図７ｄのグラフに示すように、腫瘍細胞注入日（０日）からマウスが死ぬまでの時間である。対照群（ＣＴＬ）は、カフェイン処理していない群である。図７ｄで示すように、カフェインを摂取したマウスは、カフェインを摂取していない対照マウスと比較して、生存率が顕著に増加した。これはマウスモデルにおけるカフェイン処理は、ＧＢＭ細胞の浸潤および増殖を顕著に減少させることを示す。
【実施例６】
【００６９】
細胞毒性試験
各細胞株（Ｕ１７８ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、およびＴ９８ＭＧ）でのカフェイン濃度に依存する細胞生存率を、比色ＭＴＴ還元アッセイ（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ＭＴＴ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によって評価した。カフェイン処理前に、細胞を９６−ウェルプレートで増殖させた。処理２４時間後、ＭＴＴ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）１０μｌをそれぞれのウェルに入れ、細胞を３７℃で４時間培養した。細胞をＤＭＳＯで可溶化させ、５７０ｎｍにおいて分光光度的に定量化した。データは、対照値に対する生存率で表示した。
【００７０】
得られた結果を図８に示した。図８のデータは対照群（カフェイン処理なし）に対する生存率で表示した。図８から分かるように、Ｔ９８ＭＧ細胞株における１０ｍＭカフェイン処理では生存率が減少することが見出され、他の細胞株では生存率が高かった（７０％以上）。これはカフェインが比較的高濃度でも低い細胞毒性レベルを示すことを示唆する。
【実施例７】
【００７１】
カフェイン作用とＣａ２＋濃度との関係
カフェイン作用はストア感受性チャンネルまたはストア枯渇に依存的であることを示すために、Ｃａ２＋添加およびＣａ２＋無添加浴槽（ｂａｔｈ）でのカフェイン作用を試験した。
【００７２】
まず、Ｃａ２＋無添加ＨＥＰＥＳバッファーで１μＭタプシガルギンを２分間適用した。小胞体でのＣａ２＋枯渇後、追加溶液を２ｍＭ  Ｃａ２＋  ＨＥＰＥＳバッファーに交換した。前記カルシウムイオン含有追加溶液に交換する１００秒前に、１０ｍＭカフェインまたは２０μＭ  ＳＫＦ９６３６５を適用した（Ｕ１７８ＭＧ細胞株、Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉ．）。得られたカルシウムイオン濃度変化を図９ａに示した。上段は無添加群、中段はカフェイン添加群、下段はＳＫＦ９６３６５添加群である。
【００７３】
図９ｂおよび図９ｃは、カフェイン未処理のＦｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞（対照群）および１０ｍＭカフェイン処理のＦｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞での、シクロピアゾン酸（Ｃｙｃｌｏｐｉａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、２０μＭ）誘導性またはタプシガルギン（１μＭ）誘導性の［Ｃａ２＋］ｉ増加を示す。図９ｄは、１０ｍＭカフェイン存在下でのシクロピアゾン酸（２０μＭ）およびタプシガルギン（１μＭ）による％対照を示す。エラーバーは、平均±ＳＥＭである。
【００７４】
図９ａ乃至図９ｄは、カフェインによるＣａ２＋遮断が、ＩＰ３Ｒを通じたＣａ２＋放出の遮断によって起こることを示す。つまり、カフェインによるＣａ２＋遮断は、Ｃａ２＋枯渇または、ＴＲＰＣ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）を通じたカルシウム流入の遮断によらない。むしろ、Ｃａ２＋遮断はＩＰ３Ｒを遮断することによって起こる。
［実施例７］
【００７５】
カフェイン誘導体の作用試験
カフェインのみならず、カフェイン類似体もカフェインと同等程度の活性、つまり、脳腫瘍細胞でのＣａ２＋放出に対する阻害、およびＣａ２＋シグナル伝達による細胞増殖、移動および浸潤阻害活性を有するかどうかを確認するために、いくつかのカフェイン類似体のＣａ２＋放出に対する阻害活性を測定した。
【００７６】
まず、Ｕ１７８ＭＧ細胞（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉ．）を１０ｍＭカフェインまたは１０ｍＭ  ７−エチルテオフィリンでそれぞれ処理した後、３０μＭ  ＴＦＬＬＲで処理した。細胞内Ｃａ２＋放出の挙動動態を測定して、図１０ａ（カフェイン）および図１０ｂ（７−エチルテオフィリン）にそれぞれ示した。図１０ａおよび図１０ｂで示すように、カフェイン処理によりＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出が阻害されるが、その類似体である７−エチルテオフィリン処理によっては、このような阻害が見出されなかった。したがって、すべてのカフェイン類似体がカフェインと類似するＣａ２＋遮断効果を示すのではないことが見出された。
【００７７】
カフェイン類似体中の有意な遮断効果を有する物質を探索するために、カフェインおよび１０種類の代表的なカフェイン類似体について、Ｃａ２＋放出（％遮断）に対する遮断効果を測定した。結果を図１０ｃに示す。エラーバーはＳＥＭを示す。図１０ｃから観測されるように、カフェイン以外の物質にも、ある程度のＣａ２＋放出に対する遮断効果が見出された。このような物質には、７−イソプロピルテオフィリン、７−（β−ヒドロキシエチル）テオフィリン、キサンチン、テオフィリン、および１，７−ジメチル−３−イソブチルキサンチンが含まれる。これらの物質の中でも、７−（β−ヒドロキシエチル）テオフィリン、キサンチン、テオフィリン、および１，７−ジメチル−３−イソブチルキサンチンは、２０％以上の優れた阻害効果を示し、特に１，７−ジメチル−３−イソブチルキサンチンは、５０％以上の非常に優れた阻害効果を示した。
【実施例８】
【００７８】
Ｃａ２＋シグナル経路に対する遺伝子のマイクロアレイ解析
本実施例で使用されたマイクロアレイ解析は次のような方法で行った。
【００７９】
８．１：全ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡは、１０個の正常ヒト脳組織および２７個の神経膠腫から、使用説明書に従ってＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、英国）を用いて単離し、その後ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で精製した。
【００８０】
８．２．ＲＮＡ量、完全性（Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）および純度の評価
ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、米国）を用いて、ＯＤ２６０／２８０を測定し、全ＲＮＡ量および純度を測定した。Ａ２６０／２８０比率が＞１．８であるものを、マイクロアレイ実験に使用可能なものと見なした。ＲＮＡの長さ分布および完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  ｃｈｉｐ  ａｓｓａｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いる蛍光検出（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００）によるキャピラリー電気泳動で、２８Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡバンドの存在に対して評価した。理論上、２８Ｓバンドの強度は、１８Ｓバンドの強度の２倍にならなければならない。
【００８１】
８．３．マイクロアレイプラットフォーム
遺伝子発現解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  １Ａ（Ｖ２）ｏｌｉｇｏ  ｍｉｃｒｏａｒｒｙ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）を用いて行った。マイクロアレイは各プローブ当り４個の複製配列（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）がアレイを横切って分布するように、つまり、４×２０Ｋ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘスライドフォーマットで設計した。４個の複製配列は、対照スポット（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｐｏｔ）を含む、それぞれ２０，０００個以上の６０塩基長のヒト遺伝子及び転写配列を含む。
【００８２】
８．４．ＲＮＡ標識およびハイブリダイゼーション
オリゴマイクロアレイ解析に使用するための蛍光ラベル化ｃＤＮＡは、アミノアルキル−ＵＴＰ存在下でＡｍｉｎｏ  ａｌｌｙｌ  ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐＴＭ  ａＲＮＡ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｔｅｘａｓ）を使用して全ＲＮＡを増幅させた後、Ｃｙ３またはＣｙ５染料（１色使用の場合はＣｙ３染料）（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を結合させて調製した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ６０ｍｅｒオリゴマイクロアレイプロセシングプロトコルを使用して、回転ハイブリダイゼーション化オーブンで、６５℃で１７時間ハイブリダイゼーションを行った。プロトコルに従ってスライドを洗浄した後、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ  アレイスキャナ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）でスキャンした。
【００８３】
８．４．マイクロアレイデータ解析
スキャンされたイメージは、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて解析して、遺伝子発現比率を得た。変換されたデータはＬＯＷＥＳＳ回帰式［Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００７  Ｆｅｂ；６４（４）：４５８〜７８］を用いて正常化し、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  ７．３ソフトウェアプログラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．米国）を用いて解析した。１色デフォルト正常化（チップあたり：平均または百分位数に正常化させる；遺伝子当たり：平均に正常化させる）と共に、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸは先ずそれぞれの実測強度値をチップの平均値で割った。その後、各値を、サンプルにわたる各遺伝子の平均値でさらに割って、最終正常化値を得た。
【００８４】
カルシウムイオンのシグナル経路に対する遺伝子のマイクロアレイ解析結果を、次の表１に示した。
【表１】
2011510976.tif 000004
【００８５】
表１は、カフェインの標的として見出された、Ｃａ２＋に関与するシグナル伝達系に関連した遺伝子の発現程度（数字で表される）を反映する数値を示したものである。ＩＴＰＲ３、ＴＲＰＣ６、ＥＧＦＲ、Ｆ２Ｒ、ＰＬＣＥ１などの遺伝子発現レベルが、顕著に増加していることが観測された。
【図１ａ】
2011510976.tif 000005
【図１ｂ】
2011510976.tif 000006
【図１ｃ】
2011510976.tif 000007
【図１ｄ】
2011510976.tif 000008
【図１ｅ】
2011510976.tif 000009
【図２ａ】
2011510976.tif 000010
【図２ｂ】
2011510976.tif 000011
【図２ｃ】
2011510976.tif 000012
【図２ｄ】
2011510976.tif 000013
【図２ｅ】
2011510976.tif 000014
【図２ｆ】
2011510976.tif 000015
【図３ａ】
2011510976.tif 000016
【図３ｂ】
2011510976.tif 000017
【図３ｃ】
2011510976.tif 000018
【図４ａ】
2011510976.tif 000019
【図４ｂ】
2011510976.tif 000020
【図４ｃ】
2011510976.tif 000021
【図４ｄ】
2011510976.tif 000022
【図４ｅ】
2011510976.tif 000023
【図４ｆ】
2011510976.tif 000024
【図４ｇ】
2011510976.tif 000025
【図４ｈ】
2011510976.tif 000026
【図５ａ】
2011510976.tif 000027
【図５ｂ】
2011510976.tif 000028
【図５ｃ】
2011510976.tif 000029
【図５ｄ】
2011510976.tif 000030
【図６ａ】
2011510976.tif 000031
【図６ｂ】
2011510976.tif 000032
【図６ｃ】
2011510976.tif 000033
【図６ｄ】
2011510976.tif 000034
【図６ｅ】
2011510976.tif 000035
【図６ｆ】
2011510976.tif 000036
【図６ｇ】
2011510976.tif 000037
【図７ａ】
2011510976.tif 000038
【図７ｂ】
2011510976.tif 000039
【図７ｃ】
2011510976.tif 000040
【図７ｄ】
2011510976.tif 000041
【図８】
2011510976.tif 000042
【図９ａ】
2011510976.tif 000043
【図９ｂ】
2011510976.tif 000044
【図９ｃ】
2011510976.tif 000045
【図９ｄ】
2011510976.tif 000046
【図１０ａ】
2011510976.tif 000047
【図１０ｂ】
2011510976.tif 000048
【図１０ｃ】
2011510976.tif 000049
【配列表】
2011510976000001.app
【国際調査報告】
2011510976.tif 000050
2011510976.tif 000051
2011510976.tif 000052