(57)【要約】  本発明は、ダンコウバイ抽出物を含む、心血管系疾患の治療用および予防用の組成物に関するものである。具体的には、ダンコウバイ抽出物は、血管疾患の主要原因であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを強力に阻害すると同時に、血管平滑筋の収縮と弛緩を調節して強力な血管弛緩効果を示すことで血圧調節および血管内皮細胞機能障害を改善させる。従って、これを有効成分として含有する組成物は、心血管系疾患の予防および治療のための医薬品または健康機能食品として有用に利用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダンコウバイ抽出物を有効成分として含有する、心血管系疾患の予防用および治療用組成物。
【請求項２】
ダンコウバイが、枝、葉およびその混合物からなる群から選択されるものである、請求項１記載の心血管系疾患の予防用および治療用組成物。
【請求項３】
ダンコウバイ抽出物が、水、Ｃ１〜Ｃ５の低級アルコールおよびその混合物からなる群から選択された溶媒で抽出されたものである、請求項１記載の心血管系疾患の予防用および治療用組成物。
【請求項４】
ダンコウバイ抽出物が、３０〜９５重量％のエタノール水溶液で抽出されたものである、請求項３記載の心血管系疾患の予防用および治療用組成物。
【請求項５】
ダンコウバイ抽出物が、水、Ｃ１〜Ｃ３の低級アルコールおよびその混合物からなる群から選択された溶媒で抽出されたものがブタノールで再抽出されたものである、請求項３記載の心血管系疾患の予防用および治療用組成物。
【請求項６】
ダンコウバイ抽出物がＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害活性を有する、請求項１記載の心血管系疾患の予防用および治療用組成物。
【請求項７】
ダンコウバイ抽出物が血管弛緩効果を有する、請求項１記載の心血管系疾患の予防用および治療用組成物。
【請求項８】
ダンコウバイ抽出物が内皮型一酸化窒素合成酵素の活性の増加効果を有する、請求項１記載の心血管系疾患の予防用および治療用組成物。
【請求項９】
心血管系疾患が、鬱血性心臓病、冠動脈疾患（心臓発作）、虚血性心臓病（心筋虚血）、高脂血症、動脈硬化、高血圧、低血圧、不整脈、心不全症、血管再狭窄、脳血管疾患（脳卒中、認知症）、末梢血管疾患および代謝性疾患からなる群から選択される、請求項１〜８いずれか１項記載の心血管系疾患の予防用および治療用組成物。
【請求項１０】
ダンコウバイ抽出物を有効成分として含有する、心血管系疾患予防用健康機能食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダンコウバイ（Lindera obtusiloba）抽出物を含む心血管疾患の予防および治療用の組成物および健康機能食品に関するものである。詳しくは、本発明は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを直接的に阻害して酸化ストレスを抑制し、同時に内皮型一酸化窒素合成酵素を活性化させて血管平滑筋細胞の収縮および弛緩を調節することによって心血管系疾患を治療および予防する効果を有するダンコウバイ抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関（ＷＨＯ）の統計によると、１９９９年の心血管疾患による世界の死亡率が３０％以上であり、心血管疾患は２０１０年には先進国の死亡率１位の疾患になるとされ 、特に日本、韓国などアジアの国々での増加率が高いと報告されている。これは高齢化社会の到来、食事習慣の変化などによる冠動脈疾患危険因子の増加によるものと推定される。
【０００３】
内皮細胞機能障害は、１９９０年の高血圧患者の血管の異常弛緩の発見（非特許文献１）以来、高血圧、動脈硬化、高脂血症、糖尿、肥満など広範囲にわたる心血管系疾患を誘発する主なメカニズムである（非特許文献２）。内皮細胞は血管およびリンパ管の空洞に沿って並ぶ上皮細胞であって、その主な機能は血管拡張因子および血管拡張因子メディエーターを生産して血管緊張度および構造を調節する。
【０００４】
心血管系疾患は、初期内皮細胞機能障害に始まり最終的に心臓および血管系に異常をきたす疾患である。この名称は、動脈硬化、高血圧、高脂血症、冠動脈疾患（心臓発作）、脳血管系疾患（脳卒中、認知症）、末梢血管疾患、不整脈、心不全、鬱血性心臓病、心筋疾患などを含むがそれらに限定されるものではない心臓および血管の一群の異常の総称である。
【０００５】
心血管系疾患発現の主要因子としては遺伝要因、生活習慣、糖尿病の合併症など様々な要因が知られている。現代医学の観点から、ＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性増加に伴う活性酸素種（ＲＯＳ）および血管内酸化ストレスの増加、ならびに内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の活性の減少による一酸化窒素の減少が主要因子として知られている。内皮型一酸化窒素合成酵素により生成される一酸化窒素は、強力な血管弛緩因子であると同時に、血小板凝集、血管筋肉細胞の増殖、単球の血管接着および動脈硬化関連タンパク質の発現を阻害して全体的な心血管系の恒常性調節において非常に重要な役割を果たす（非特許文献３）。しかし、多くの要因によって引き起こされる、血管内活性酸素種の生成を担うＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性増加は、一酸化窒素の生成を減少させ［非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６］、また、このようにして生じた活性酸素種は、接着分子発現の調節［非特許文献７]、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖および移動の刺激［非特許文献８］、酸化力のあるリポタンパク質の調節などをもたらして、心血管系疾患を引き起こす［非特許文献９］。さらにまた、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼによる血管内活性酸素種の生成の増加は、アテローム性動脈硬化および冠動脈疾患の臨床的危険因子を有する患者における内皮細胞由来の一酸化窒素（ＮＯ）の機能障害と関連がある。基本的には、活性酸素種の生成は血管の収縮をもたらす［非特許文献１０］。
【０００６】
一般に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの直接的な阻害による、活性酸素種の減少、活性酸素種の下流発生抑制および内皮型一酸化窒素合成酵素の活性誘導は、心血管疾患の予防および治療において非常に重要なターゲットとして認識されている［非特許文献３；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３]。
【０００７】
現在まで、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを阻害する物質としてはジフェニレンヨードニウム（ＤＰＩ）および４−ヒドロキシ−３−メトキシアセトフェノン（Ａｐｏｃｙｎｉｎ）［Holland  J．ら、特許文献１］が知られている。しかし、これらの物質は毒性および特異性の問題のため商業化および臨床に用いられていない。また、一酸化窒素調節剤としては、ニトロプルシド、ニトログリセリンが入手可能である。しかし、これらの物質も臨床的使用で耐性および毒性の問題があって心臓発作などの応急時にしか使用されない。
【０００８】
一方、ダンコウバイは、クスノキ科の落葉性潅木である。２〜３ｍほどの高さに成長し、開花期は３〜４月であり、結実期は９月である。実を圧搾して得られた油は女性の頭髪油として使用されている。この植物は、葉や枝を摘むとショウガのような匂いがするのでジンジャーツリー（Ｇｉｎｇｅｒ  Ｔｒｅｅ）と呼ばれ、また、Ｆｏｏｌ’ｓ  ＣａｍｅｌｌｉａまたはＪａｐａｎｅｓｅ  ｓｐｉｃｅｂｕｓｈとしても知られている。この植物は、活血、舒筋、消腫などの効能があって、打撲傷ならびに溢血による腫脹および疼痛を治療することが知られており、通常押し潰して創傷部位に付ける。この植物は、主に胃痛に用いられ、解熱剤または鎮咳薬としても使用される。民間では解熱剤または鎮咳薬としてこの植物の葉と芽を茶のように煎じて飲む［非特許文献１４；非特許文献１５］。
【０００９】
ダンコウバイの成分に関する研究としては、Park，Jong-Chulら（非特許文献１６）が葉からクエルシトリンを、枝からヒペロシドを単離し、一方、Kwon，Hak-Cheolら（非特許文献１７）がアクチフォリン（actifolin）、パルビアチロール（pulviatilol）、５，６−ジヒドロマタイレシノール、（＋）−シリンガレシノール、９−Ｏ−トランス−フェルロイル−５，５−ジメトキシラリシレシノールなどを単離した。単離された各成分の効能としては殺癌作用、抗炎症作用などを含むことが報告された（非特許文献１８；非特許文献１７）。
【００１０】
しかしながら、前記文献中には、ダンコウバイの抽出物がＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害による血管内酸化ストレス抑制効果、血管弛緩効果および血圧調節効果を及ぼすという点についてはいかなる開示も教示も行われてない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６０９０５１号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Panza JA et al., New England Journal of Medicine, 323:22-27, 1990
【非特許文献２】Brunner H. et al., J. Hypertens, 2005, 23:233-246
【非特許文献３】Forstermann et al., Circulation, 113:1708-1714, 2006
【非特許文献４】Gryglewski et al., Nature, 320:454-456, 1986
【非特許文献５】Paravicini et al., Circulation Research, 91:54-61, 2002
【非特許文献６】Dusting et al., Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 25:S34-41, 1998
【非特許文献７】Lo et al., Am. J. Physiol., 264:L406-412, 1993
【非特許文献８】Griendling and Ushio-Fukai, J. Lab. Clin. Med., 132:9-15, 1998
【非特許文献９】Lynch and Frei, J. Lipid Res., 34:1745-1753, 1993
【非特許文献１０】Guzik et al., Cir.Res., 86:E85-90, 2000
【非特許文献１１】Boggrell SA et al., Drug News Perspect., 17(9)615-632, 2005
【非特許文献１２】Inoguchi T., Curr.Drug Targets, 6(4):495-501, 2005
【非特許文献１３】Muzaffar S.et al., Trends Cardiovasc Med., 15(8):278-282
【非特許文献１４】Illustrated Book of Korean Plants, by Chang-Bol Lee, 1980
【非特許文献１５】Illustrated Boof of Korean Folk Medicines, by Jong-Hee Park, 2005, Encyclopedia of Local Medicines
【非特許文献１６】Park, Jong-Chul et al., Korean Journal of Food Science and Technology, 25, p.76-79, 1996
【非特許文献１７】Kwon, Hak-Cheol et al., Archives of Pharmacal Research, 22, p.417-422, 1999
【非特許文献１８】Planta Medica, 69, 610-616, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは多数の植物抽出物を対象にしてＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性阻害および血管弛緩効果を検索した結果、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性の強力な阻害効果、血管内酸化ストレスの減少効果、内皮型一酸化窒素合成酵素の活性の直接的な増強効果、血管弛緩効果および血圧調節効果を確認して本発明を完成した。
【００１４】
本発明は前記のような問題点を解決するために案出されたものであって、ダンコウバイ抽出物を有効成分として含有する、心血管系疾患の予防および治療用組成物を提供することをその目的とする。
【００１５】
また、本発明はダンコウバイ抽出物を有効成分として含有する、心血管系疾患予防用の健康機能食品を提供することを別の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係る心血管系疾患の予防および治療用組成物は、上述した目的を達成するために、ダンコウバイ抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１７】
該ダンコウバイ抽出物は、枝、葉、または枝および葉から抽出したものが好ましい。
【００１８】
該ダンコウバイ抽出物は、水、Ｃ１〜Ｃ５の低級アルコールおよびその混合物からなる群から選択された溶媒により抽出したものが好ましい。
【００１９】
該ダンコウバイ抽出物は、３０〜９５重量％のエタノール水溶液により抽出したものが好ましい。
【００２０】
該ダンコウバイ抽出物は、水、Ｃ１〜Ｃ３の低級アルコールおよびその混合物からなる群から選択された溶媒により抽出し、それをブタノールにより再抽出したものが好ましい。
【００２１】
該ダンコウバイ抽出物は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ阻害活性を有することを特徴とする。
【００２２】
該ダンコウバイ抽出物は、血管弛緩効果を有することを特徴とする。
【００２３】
該ダンコウバイ抽出物は、内皮型一酸化窒素合成酵素の活性の増加効果を有することを特徴とする。
【００２４】
該ダンコウバイ抽出物は、血圧降下効果および血管内酸化ストレス減少効果を有することを特徴とする。
【００２５】
心血管系疾患は、鬱血性心臓病、冠動脈疾患（心臓発作）、虚血性心臓病（心筋虚血）、高脂血症、動脈硬化、高血圧、低血圧、不整脈、心不全、血管再狭窄、脳血管疾患（脳卒中、認知症）、末梢血管疾患および代謝性疾患からなる群から選択されたものである。
【００２６】
一方、本発明に係る心血管系疾患の予防用健康機能食品は、ダンコウバイ抽出物を有効成分として含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
上述したように、本発明に係るダンコウバイ抽出物は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性を強力に阻害すると同時に血管弛緩効果を示すので、心血管系疾患の予防および治療のための医薬組成物または健康機能食品として有用に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ブタの冠動脈に対するダンコウバイ抽出物の血管弛緩活性の測定を示す図である。
【図２】シロネズミの大動脈に対するダンコウバイ抽出物の血管弛緩活性の測定を示す図である。
【図３】ダンコウバイ抽出物の作用による内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）とＡｋｔタンパク質の活性度の測定を示す図である。
【図４】ダンコウバイ抽出物の心拍数への影響度の測定を示す図である。
【図５】ダンコウバイ抽出物の作用による血管内酸化ストレスの減少度の測定を示す図である。
【図６】ダンコウバイ抽出物の細胞毒性度の測定を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の好ましい実施態様に関して詳細に説明する。また、下記の説明では具体的な構成要素など多数の特定事項が明示されているが、これは本発明のより全般的な理解のためだけに提供されたものであり、このような特定事項がなくても本発明を実施できることは、当該技術分野における当業者であれば自明のことである。そして、本発明の説明において、関連の公知の機能または構成に対する具体的な説明が本発明の要旨を不必要に不明瞭にすると判断される場合にはその詳細な説明を省略する。
【００３０】
本発明に係るダンコウバイ抽出物は下記のように得ることができる。
【００３１】
ダンコウバイの地上部、より詳しくは、葉と枝は、自然から採取したもの、栽培したもの、または、市販のもの等、制限なく使用することができる。そして、抽出のための溶媒は、水、Ｃ１〜Ｃ５の低級アルコールおよびその混合物からなる群から選択される。本発明者らはダンコウバイの枝と葉を水洗して不純物および塩分を除去し、乾燥させた。次いで、ダンコウバイ試料重量の約５〜５０倍、好ましくは１０〜３０倍に達する体積の水またはメタノール、エタノールもしくはブタノールのようなＣ１〜Ｃ５の低級アルコールの如き極性溶媒、またはこれらの約１：０．１〜１：１０の混合比を有する混合溶媒により、好ましくは３０〜９５重量％のエタノール水溶液により５０〜９５℃で１時間〜７日間抽出した。前記抽出過程を２〜５回、好ましくは３回繰り返し行った後、減圧濃縮および／又は凍結乾燥してダンコウバイ粗抽出物を得た。
【００３２】
また、本発明の抽出物中の非極性溶媒可溶性抽出物は、前記粗抽出物を蒸留水に懸濁した後、それを懸濁液の約０．１〜１００倍、好ましくは約１〜５倍の体積のヘキサン、酢酸エチルまたはクロロホルムのような非極性溶媒を加え、１回〜１０回、好ましくは２回〜５回、抽出および分離することで得ることができる。さらにまた、加えて、通常の分画工程を行うこともできる（Harborne. J. B., Phytochemical medthods: A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed., pp.6-7, 1998）。
【００３３】
より好ましくは、前記工程により得られたダンコウバイ粗抽出物、好ましくはエタノール水溶液中のダンコウバイ抽出物にｎ−ブタノール、ヘキサンおよび酢酸エチルなどの有機溶媒を極性の低い溶媒から極性の高い溶媒の順に、好ましくは、ヘキサン、酢酸エチルおよびｎ−ブタノールの順に順次的に溶媒分画し、減圧濃縮してダンコウバイのヘキサン、酢酸エチルおよびｎ−ブタノールの画分を得ることができる。
【００３４】
本発明は前記の製法により得られたダンコウバイ粗抽出物または非極性溶媒可溶性抽出物を有効成分として含有する心血管系疾患の予防および治療用組成物を提供する。
【００３５】
本発明に係る心血管系疾患の予防および治療用組成物は、前記抽出物を、組成物の総重量に対して０．１〜９９重量％含む。
【００３６】
本発明のダンコウバイ抽出物を含む組成物は、組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤および希釈剤をさらに含むことができる。
【００３７】
本発明に係る抽出物の薬学的投与形態は、これらの医薬上許容される塩の形態で用いることも可能であり、また、単独で、または他の医薬活性化合物と一緒にならびに適当なアセンブリーとして使用することができる。
【００３８】
本発明に係る抽出物を含む医薬組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤およびエアゾール剤などの経口製剤、ならびに局所製剤、坐剤および滅菌注射剤に製剤化して使用することができる。
【００３９】
当該抽出物を含む組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、シュークロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油を挙げることができる。
【００４０】
製剤化する場合は、該製剤は、通常使用される希釈剤または賦形剤、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤および界面活性剤を使用して調製される。
【００４１】
経口投与のための固形製剤の例としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが挙げられ、このような固形製剤は前記抽出物に少なくとも一つの賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、シュークロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤なども用いられる。
【００４２】
経口投与のための液剤の例としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられる。これらの液剤は、よく使用される単純希釈剤である水および流動パラフィンに加えて、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを含むことができる。
【００４３】
非経口投与のための製剤の例としては、滅菌水性液剤、非水性液剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤が挙げられる。非水性液剤または懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール、マクロゴール、ツイーン、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【００４４】
本発明の抽出物の好ましい投与量は、患者の状態および体重、疾患の重篤度、薬物の剤形、投与経路および期間によって相違するが、当業者により適切に選択することができる。しかし、好ましい効果のために本発明の抽出物を１日０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ投与することが好ましい。投与は一日に一回行っても、数回に分けて行ってもよい。該投与量はいかなる場合でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００４５】
本発明は心血管系疾患の予防効果を示す前記抽出物および食品学的に許容される食品添加剤を含む健康機能食品を提供する。
【００４６】
ダンコウバイ抽出物を添加することができる健康機能食品としては、例えば、各種一般食品類、飲料、チューインガム、茶、ビタミン複合剤などがある。
【００４７】
また、前記ダンコウバイ抽出物は、心血管系疾患の予防効果を得ることを目的に食品または飲料に添加することができる。この場合、食品または飲料中の当該抽出物の量は、食品の総重量の０．０１〜１５重量％である。健康飲料組成物中の当該抽出物の量は、飲料の総重量１００ｇに対して０．０２〜５ｇ、好ましくは０．３〜１ｇの割合である。
【００４８】
本発明の健康機能性飲料組成物は、指示された割合で必須成分として当該抽出物を含有する以外は他の成分の含有には特別な制限がなく、通常の飲料と同様に種々の矯味矯臭剤または天然炭水化物などの追加成分を含有することができる。前記の天然炭水化物の例としては、単糖類、例えば、グルコース、フルクトースなど；二糖類、例えば、マルトース、シュークロースなど；および多糖類、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールが挙げられる。前記の剤に加えて矯味矯臭剤としてタウマチン、ステビア抽出物、例えば、レバウディオサイドＡ、グリシルリジンなど；および合成矯味矯臭剤、例えば、サッカリン、アスパルテームなどを有効に使用することができる。天然炭水化物の割合は、一般に、本発明の組成物１００ｇ当たり約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。
【００４９】
これらに加えて、本発明の抽出物は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成および天然矯味矯臭剤、着色剤および増量剤（チーズ、チョコレート等）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有することができる。その他に本発明の抽出物は天然果汁、ならびに果汁飲料および野菜飲料の製造のための果肉を含有することができる。これらの成分は個々にまたは組み合わせて使用することができる。この場合、添加剤の割合は重要ではないが、本発明の抽出物１００重量部当たり０．０１〜約２０重量部の範囲から選択されることが一般的である。
【００５０】
以下、本発明を下記実施例および試験例に基づいてより具体的に説明する。
【実施例】
【００５１】
実施例１：ダンコウバイ粗抽出物の製造
江原道地域（Kangwon-do Province）で採取したダンコウバイの枝と葉を水で洗浄して不純物および塩分を除去した後、乾燥し粉砕した。抽出容器に粉砕されたダンコウバイの枝および葉２５ｇずつおよび７０重量％のエタノール水溶液を総５００ｍＬ加え、還流冷却しながら７０℃で３時間ずつ３回反復して加熱抽出した。これを濾紙で濾過し、濾液を４０℃の水浴中で減圧濃縮し、凍結乾燥した。その結果、ダンコウバイの枝の粗抽出物６．４ｇおよびダンコウバイの葉の粗抽出物７．０ｇを得た。
【００５２】
実施例２：ダンコウバイ粗抽出物の画分製造
実施例１で得たダンコウバイの葉と枝の粗抽出物５ｇずつをそれぞれ５０ｍＬの精製水に懸濁した。これを５０ｍＬのヘキサン、酢酸エチルおよびｎ−ブタノールの順に順次的に各３回溶媒分画して各溶媒画分を得、これを減圧濃縮した。その結果、ダンコウバイのヘキサン画分、酢酸エチル画分およびｎ−ブタノール画分を得た。
【００５３】
試験例１：ダンコウバイ抽出物のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ活性阻害効果の測定
前記実施例１および実施例２にて製造されたダンコウバイ粗抽出物および画分の、心血管系疾患発症指標酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性の阻害効果を測定した。そのために、シロネズミの動脈平滑筋細胞（ラット大動脈平滑筋細胞、ＲＡＳＭＣ）および子牛血管内皮細胞（ウシ大動脈内皮細胞、ＢＡＥＣｓ）を使用してＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の変化を比較し、その結果を下記表１に示す。まず、動脈平滑筋細胞および血管内皮細胞をそれぞれＭＥＭ（最小必須培地）とＤＭＥＭ（ダルベッコ最小必須培地）および１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）溶液と混合し、細胞を、５％ＣＯ２／３７℃の条件下、９６ウェルプレートで２４時間の間培養した。次いで、該細胞を、ＦＢＳが除外された培養液で再度２４時間インキュベートした。細胞が安定化された後、該細胞をＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）で洗浄した。これらの細胞を実施例１で得たダンコウバイの葉抽出物および枝抽出物と一緒に振盪させ、該混合物を１５分間反応させた後、ＨＢＳＳで再度洗浄した。次いで、該反応液に１００ｍＭのＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび５μＭのルシゲニンを添加し、発光読み取り装置（Ｖｉｃｔｏｒ  Ｌｉｇｈｔ、PerkinElmer）を利用してＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼの活性を１時間測定した。試験は３回操作し、各操作を２〜７回繰り返した。その後、対照群の活性と試料処理群の活性を比較し、ＩＣ５０値を算出した。ＩＣ５０値は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性の５０％を阻害する試験物質の濃度（μｇ／ｍｌ）である。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
表１から分かるように、本発明のダンコウバイ抽出物は、血管細胞のＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を阻害する程度が非常に優れていることが分かる。また画分の中ではｎ−ブタノール抽出物の効果が優れていることが分かる。
【００５６】
試験例２：ダンコウバイ抽出物の血管弛緩効果の測定（冠動脈および大動脈）
実施例１および実施例２により製造されたダンコウバイ粗抽出物および画分の血管弛緩効果を確認した。そのために、ブタ心臓の冠動脈およびマウスの大動脈の弛緩効果を比較し、その結果を図１、図２、表２（冠動脈）および表３（大動脈）に示す。屠殺場で屠殺直後に購入したブタ心臓から冠動脈摘出した。雄性ＳＤ（スプラーグドーリー）系シロネズミから大動脈を摘出し、１８ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．１ｍＭのＭｇＳＯ４、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．５ｍＭのＣａＣｌ２、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコースが入っているクレブス液（pH7.4）中に浸漬して結合組織と脂肪を除去した後、約３ｍｍの長さの切片に切断した。
【００５７】
作成した冠動脈および大動脈切片を９５％Ｏ２および５％ＣＯ２気体で飽和させた３７℃のクレブス液中にて固定させた。力−変位変換器（Hugo  Sachs、Germany）を装着したＧｒａｓｓ  ｐｈｙｓｉｏｇｒａｐｈ（Hugo  Sachs、Germany）で切片の等尺性張力を測定した。冠動脈の場合、該動脈を、まず、トロンボキサン誘導体であるＵ４６６１９（１〜６０ｎＭ）で血管最大収縮の８０％に収縮させた。それから１０分後、該動脈を３００ｎＭのブラジキニンで弛緩させ、血管内皮細胞の安全性を測定した後、クレブス溶液で３回洗浄して実験を行った。血管弛緩効果の変化測定は、まず、該動脈を薬物Ｕ４６６１９で収縮させ、その後、ダンコウバイ抽出物による弛緩反応を濃度依存的に試験した。
【００５８】
シロネズミの大動脈の場合、該大動脈をフェニレフリンにより血管最大収縮の８０％に収縮させた。それから１５分後、該大動脈を１０μＭのアセチルコリンにより弛緩させ、血管内皮細胞の安全性を測定した後、クレブス溶液で３回洗浄して実験を行った。血管弛緩効果の変化測定は、まず、該大動脈を薬物フェニレフリンで収縮させ、次いで、ダンコウバイ粗抽出物および画分抽出物により引き起こされる弛緩反応を濃度依存的に試験した。この試験は５〜１０個の種々の個体から摘出した血管を利用して繰り返し行った。ＥＤ５０値は収縮された血管が試料処理により５０％の血管弛緩を示す試料の濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。
【００５９】
【表２】
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【００６０】
【表３】
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【００６１】
試験の結果、図１および図２に示すように、本発明のダンコウバイ抽出物は、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度から有意に弛緩を開始し、濃度３０μｇ／ｍｌでは９４±２％弛緩した。表１および表２に示したとおり、ダンコウバイ抽出物は冠動脈および大動脈の血管を弛緩させる程度が非常に優れていることが分かる。また、画分の中ではｎ−ブタノール抽出物の効果が優れていることが分かる。
【００６２】
試験例３：ダンコウバイ抽出物による内皮型一酸化窒素合成酵素活性テスト
前記実施例１および実施例２により製造されたダンコウバイ粗抽出物の内皮型一酸化窒素合成酵素の活性増強に対する効果を観察した。前記効果はウシ大動脈内皮細胞の内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の１１７７番セリン残基とＡｋｔの４７３セリン残基のリン酸化度をもって比較した。その結果は図３に示される。
【００６３】
まず、血管内皮細胞をＤＭＥＭ（ダルベッコ最小必須培地）および１０％のＦＢＳ（ウシ胎仔血清）溶液と混合し、インキュベートした後、ＦＢＳが除外された培養液中にてさらに２４時間インキュベートした。細胞が安定化された後、該細胞を各濃度の試料で処理した後、３０分間反応させた。次いで、タンパク質を抽出し、遠心分離し、上清を回収して細胞の破片を除去した。抽出したタンパク質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動させた後、ニトロセルロース膜でゲルのタンパク質をブロットさせた。３％のＢＳＡで１時間遮断した後、１：１０００の割合でｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳおよびｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ抗体（Cell  Signaling、米国）を一夜４℃でインキュベートした。次いで、１：２０００の割合に希釈した二次抗体を処理し、周囲温度で１時間培養した後、該二次抗体を化学発光法で現像した。
【００６４】
その結果、図３に示したように、ダンコウバイ抽出物は一酸化窒素を生成させる内皮型一酸化窒素合成酵素の活性化（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｅＮＯＳ）の増強効果およびその上流調節因子であるＡｋｔの活性化（ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ）の増強の程度が大きいことが分かる。
【００６５】
試験例４：心血管系疾患動物モデルにおけるダンコウバイ抽出物の効果テスト
実施例２で得たダンコウバイ抽出物が疾患動物における血圧降下効果、血管内酸化ストレス改善効果、内皮細胞機能障害改善効果を発揮することを確認した。そのためにアンギオテンシン２により引き起こされた疾患モデルで効果の程度を比較し、その結果を図４、図５、図６および表４に示す。
【００６６】
雄性ＳＤ（スプラーグドーリー、６週齢）系のシロネズミをOrientbio Inc.から購入し、１２時間の明暗周期に調節された小動物飼育室で固形飼料と水を自由に供給して１週間順化させた。次いで、該ラットを任意的に対照群とアンギオテンシン２処理群とにそれぞれ６匹ずつグループ分けした。アンギオテンシン２で処理する３日前から、実施例２で得たダンコウバイ抽出物を１００ｍｇ／ｋｇの濃度で０．５％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）に懸濁し、該懸濁液を１日２回経口投与した。対照群は０．５％のＣＭＣだけを投与した。アンギオテンシン２を６５ｎｇ／ｍｉｎ／ｋｇの濃度で生理食塩水に溶かし、ミニ浸透性ポンプ（Ａｌｚｅｔ  Ｍｏｄｅｌ  ２００２）に入れた。前記シロネズミに麻酔をかけ、皮膚を切開し、肩甲骨間領域にミニポンプを挿入することによりアンギオテンシン２処理を行った。血圧測定は経口投与開始と同時に実施し、２日に１回、２週間、午前中の経口投与の１時間後に測定した。検体をあらかじめ４５〜５０℃で約１０分間加熱した後、自動血圧記録計を使用して尾部−腱板プレスチモグラフィー法により尾動脈の最高血圧（収縮期血圧）を非観血的に測定した。同時に心拍数も測定した。
【００６７】
試験例２と同様に大動脈を摘出し、ＤＨＥ（ジヒドロエチジウム）による染色の程度およびアセチルコリンによる弛緩の程度を特定して血管内酸化ストレスと血管内皮細胞機能障害の程度を測定した。結果を対照群の結果と比較した。
【００６８】
【表４】
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【００６９】
試験の結果、表４に示したようにアンギオテンシン２により引き起こされる試験動物の血圧上昇は、ダンコウバイ抽出物の投与によって有意に阻害されたことが分かる。
【００７０】
また、心拍数の増加を測定した結果、図４に示すように、ダンコウバイ抽出物は頻脈など心臓に対して副作用を起こさないことを確認した。
【００７１】
また、図５に示すように、アンギオテンシン２により引き起こされる血管内酸化ストレスの増加がダンコウバイ抽出物の投与により強力に阻害されることが分かる（図５は、背景が黒色であり、対象が赤色に表示された写真を白黒変換したものであって、変換時、対象を明瞭に区分するために背景を白色に処理した）。
【００７２】
また、アンギオテンシン２で処理した動物における０．０１μＭのアセチルコリンにより引き起こされる弛緩を対照群と比較した場合、血管内皮細胞機能障害が起こり、弛緩が円滑に生じなかった（対照群  −  ２７％、アセチルコリン  −  ８％）。このような血管内皮細胞機能障害は、ダンコウバイの枝の抽出物（２０％）および葉の抽出物（１９％）の投与により改善されることが分かる。
【００７３】
試験例５：ダンコウバイ抽出物の細胞毒性試験
実施例１および実施例２により製造されたダンコウバイ粗抽出物の細胞毒性の程度を比較した結果を図６に示す。
【００７４】
動脈平滑筋細胞をＭＥＭ（最小必須培地）および１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）溶液と混合し、５％ＣＯ２／３７℃の条件下で２４時間インキュベートした。細胞が安定化された後、実施例２で得たダンコウバイの抽出物で処理し、振盪し、２４時間反応させた。次いで、ＭＴＳ溶液（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Promega）の存在下で１時間インキュベートした後、４９０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７５】
図６に示すように、本発明に係るダンコウバイ抽出物は、細胞の生存にいかなる影響も与えなかったことが判明し、非常に安全な薬物であることが分かる。
【００７６】
試験例６：統計処理
試験結果の有意性は、実験結果をスチューデントｔ−検定および一元分散分析法を通してｐが０．０５以下である場合に有意な差があると判定した。
【００７７】
以下に本発明の抽出物を含む医薬組成物および健康機能食品の調製例を説明するが、これらは本発明を限定するものでなく具体的に説明しようとするものである。
【００７８】
製剤例１：散剤の製造
ダンコウバイ抽出物粉末  ２０ｍｇ
ラクトース  １００ｍｇ
タルク  １０ｍｇ
これらの成分を混合し、シール・パッケージに充填して散剤を製造した。
【００７９】
製剤例２：錠剤の製造
ダンコウバイ抽出物粉末  １０ｍｇ
コーンスターチ  １００ｍｇ
ラクトース  １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ２ｍｇ
これらの成分を混合した後、通常の錠剤製造方法に従って打錠して錠剤を製造した。
【００８０】
製剤例３：カプセル剤の製造
ダンコウバイ抽出物粉末  １０ｍｇ
結晶性セルロース  ３ｍｇ
ラクトース  １４．８ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ２ｍｇ
通常のカプセル剤製造方法に従って、これらの各成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００８１】
製剤例４：注射剤の製造
ダンコウバイ抽出物粉末  １０ｍｇ
マンニトール  １８０ｍｇ
注射用の滅菌蒸留水  ２７９４ｍｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２６ｍｇ
通常の注射剤製造方法によって、１アンプル（２ｍＬ）当たり前記の成分含量にて注射剤を製造した。
【００８２】
製剤例５：液剤の製造
ダンコウバイ抽出物粉末  １０ｍｇ
異性化糖  １０ｇ
マンニトール  ５ｇ
精製水  適当量
通常の液剤製造方法によって、これらの成分を精製水に加えて溶解させ、レモン香を適量加えた後、成分を混合し、精製水を加えて総量を１００ｍＬに調節した。それを茶色の瓶に充填し、滅菌して液剤を製造した。
【００８３】
製剤例６：健康飲料の製造
ダンコウバイ抽出物粉末  １０ｍｇ
ビタミンＣ  １５ｇ
ビタミンＥ（粉末）  １００ｇ
乳酸鉄  １９．７５ｇ
酸化亜鉛  ３．５ｇ
ニコチン酸アミド  ３．５ｇ
ビタミンＡ  ０．２ｇ
ビタミンＢ１  ０．２５g
ビタミンＢ２  ０．３g
水  適当量
通常の健康飲料製造方法によって、これらの成分を混合し、８５℃で約１時間、撹拌しながら加熱した後、形成された溶液をろ過した。濾液を２リットルの滅菌容器に入れて密封し、滅菌した後、冷蔵保存し、本発明に係る健康飲料組成物の製造に使用した。前記組成比で、嗜好飲料に比較的適した成分を好ましい実施例として混合し、組成したが、消費者階級や消費国、用途など地域的および民族的嗜好に応じてその配合比を適切に変更することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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