(57)【要約】  置換１，３−シクロペンタジオン化合物を用いて、心血管系の危険を軽減するための組成物及び方法を開示する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
療法的有効量の置換１，３−シクロペンタジオン化合物で対象を処置することを含む、それを必要とする対象における心血管系危険因子の改善方法であって、前記量が心血管系危険因子関連マーカーの遺伝子発現の発現を調節する方法。
【請求項２】
該置換１，３−シクロペンタジオン化合物が、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（２−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン及び（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−ペンタノイルシクロペンタ−２−エン−１−オンを含む群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
心血管系危険関連マーカー遺伝子が、ＴＮＦα、ＭＣＰ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＭＰ−３、ＩＣＡＭ１及びＳＤＦ１から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
生活様式の改変又は医薬的処置をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該生活様式の改変又は医薬的処置が血圧低下、コレステロールレベル調節、糖尿病治療、運動増強、炎症、肥満及び体重の減少、血栓形成促進因子の処置、血清ホモシステイン及びリポタンパク質（ａ）の低下、血清トリグリセリド低下、禁煙及びストレス低下から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
それを必要とする対象における血管弾力を助長するための方法であって、血管の弾力又は拡張を高める量である療法的有効量の置換１，３−シクロペンタジオン化合物で該対象を処置する方法。
【請求項７】
該置換１，３−シクロペンタジオン化合物が、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（２−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン及び（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−ペンタノイルシクロペンタ−２−エン−１−オンを含む群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
それを必要とする対象における心血管系の健康を助長する組成物であって、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の療法的有効量を含み、該療法的有効量が（ａ）心血管系危険関連マーカー遺伝子発現の発現を調節する；又は（ｂ）血管の弾力又は拡張を高める量である組成物。
【請求項９】
該置換１，３−シクロペンタジオン化合物が、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（２−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン及び（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−ペンタノイルシクロペンタ−２−エン−１−オンを含む群から選択される、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
該組成物がさらに、製薬的に受容される賦形剤を含む、請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
該製薬的に受容される賦形剤が、コーティング剤、等張性及び吸収遅延剤、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、フレーバー剤、甘味剤、吸収剤、界面活性剤及び乳化剤から成る群から選択される、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
該組成物がさらに、酸化防止剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂肪、及び炭水化物から成る群から選択される１つ以上のメンバーを含む、請求項８記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
[001]本特許出願は、米国仮出願No.61/041,631（2008年4月2日出願）に対する優先権を主張するものであり、該優先権出願の内容は、その全体で本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
[002]発明の分野
[003]本発明は、一般に、（１）内皮細胞（ＨＡＥＣ）におけるＴＮＦα仲介ＶＣＡＭ−１、Ｅセレクチン及びＭＣＰ−１(TNFα mediated VCAM-1, E-selectin and MCP-1)及び（２）ＴＮＦα仲介単球−内皮相互作用(TNFα mediated Monocyte-Endothelial interaction)を包含する、内皮機能及び心血管系併発症に関連した炎症経路をプロテインキナーゼ調節を介して調節するために用いることができる方法及び組成物に関する。より具体的には、本発明は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物を用いる方法及び組成物に関する。
【０００３】
[004]関連技術の説明
[005]単球の活性化と単球の内皮への接着は、炎症性及び心血管系疾患に重要な役割を果たしている。このプロセスは、高血糖によってさらに複雑になり、糖尿病における併発症を招来する。ＴＮＦαと高血糖の両方は、炎症反応に関与する、多くの遺伝子を活性化する(Shanmugam N, Gae Gonzalo IT, Natarajan R.著：単球における高グルコース誘導シクロオキシゲナーゼ−２発現の分子機構，Diabetes. 53(3):795-802, 2004)。
【０００４】
[006]ＭＣＰ−１は、単球の強力な走化性因子であり、内皮への単球浸潤と接着を促進することによって早期アテローム発生に極めて重要な役割を果たし、アテローム斑(atherosclerotic plaque)の形成を招来する(Charo IF, Taubman MB.著：血管性疾患の病因におけるケモカイン，Circ Res. 29;95(9):858-66, 2004)。
【０００５】
[007]マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）は、細胞外空間における主要なタンパク質分解酵素であり、それらは細胞外マトリックスを切断することができるので、該斑キャップの弱化に寄与する(Nagase H, Visse R, Murphy G.著：マトリックスメタロプロテイナーゼ及びＴＩＭＰｓの構造及び機能，Cardiovasc Res 2006;69:562-73)。急性冠動脈症候群の大部分と原因的に関連したアテローム斑破裂は、一般に、連続的炎症及びコラーゲン分解の部位において生じる(Virmani R, Kolodgie FD, Burke AP, Farb A, Schwartz SM.著：冠動脈突然死からの教訓：動脈硬化性病変の包括的形態学的分類表，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20:1262-75)。
【０００６】
[008]臨床的及び実験的研究は、ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）をアテローム斑安定性の重要な決定因子として関係付けている(Gough PJ, Gomez IG, Wille PT, Raines EW.著：活性ＭＭＰ−９のマクロファージ発現は、ａｐｏＥ欠乏マウスにおける急性プラーク破壊を誘導する，J Clin Invest 2006;116:59-69.; Fukuda D, Shimada K, Tanaka A, Kusuyama T, Yamashita H, Ehara S, et al.著：急性心筋梗塞患者対不安定な狭心症患者対安定な狭心症患者における血清マトリックスメタロプロテイナーゼ−９のレベルの比較，Am J Cardiol 2006;97:175-80.; Blankenberg S, Rupprecht HJ, Poirier O, Bickel C, Smieja M, Hafner G, et al.著： 心血管系患者のマトリックスプロテイナーゼ−９の血漿濃度及び遺伝的変異と予後，Circulation 2003;107:1579-85)。ＭＭＰ−９は原則として単球／マクロファージに由来する(Chase AJ, Bond M, Crook MF, Newby AC.著： in vitroでのヒト・マクロファージ及びin vivoで産生されるウサギ泡沫細胞によるメタロプロテイナーゼ−１、−３及び−９分泌における核因子κＢ活性化の役割，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;22:765-71; Stawowy P, Meyborg H, Stibenz D, Borges Pereira Stawowy N, Roser M, Thanabalasingam U, et al. Furin-like proprotein convertases are central regulators of the membrane type matrix metalloproteinase-promatrix metalloproteinase-2 proteolytic cascade in atherosclerosis. Circulation 2005;111:2820-7)、この単球／マクロファージは、アテローム硬化症の初期、進行及び併発症に関与する主要な細胞種類である。ＭＮＣｓにおいて、ＭＭＰ−９は、ＴＮＦ−αを含めた、多くの炎症メディエーターによって強く誘導可能である(Stawowy P, Meyborg H, Stibenz D, Borges Pereira Stawowy N, Roser M, Thanabalasingam U, et al.著：フリン様プロタンパク質転換酵素は、アテローム硬化症における膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ−プロマトリックスメタロプロテイナーゼ−２タンパク質分解カスケードの重要な調節剤である，Circulation 2005;111:2820-7)。
【０００７】
[009]例えばアスピリン、グルココルチコイド及びクルクミンのような抗炎症性化合物が、ＮＦ−κＢシグナリング経路の阻害を介してそれらの効果を発揮することが、以前に判明している(Kopp E and Ghosh S.著：サリチル酸ナトリウム及びアスピリンによるＮＦκＢの阻害，Science. 22: 270 (5244): 2017-9,1994; De Bosscher K, Schmitz ML, Vanden Berghe W, Plaisance S, Fiers W, Haegeman G. 著；核因子κＢ依存性転写のグルココルチコイド仲介抑制はトランス活性化による直接の介在を必要とする，Proc Natl Acad Sci U S A. 9;94(25):13504-9, 1997; Pan MH,  Lin-Shiau SY, Ho CT, Lin JH, Lin JK.著：紅茶からのテアフラビン−３，３’−ジガレート及び他のポリフェノールによる、マクロファージにおけるＩκＢキナーゼ活性のダウンレギュレーションを介してのリポ多糖誘導核因子κＢ活性の抑制，Biochem Pharmacol. 15;59(4):357-67, 2000)。
【０００８】
[0010]例えばＴＮＦαのような炎症メディエーターはＮＦκＢを活性化して、例えば炎症誘発性サイトカイン、接着分子、ケモカイン（単球走化性プロテイン−１（ＭＣＰ−１）を包含する）のような、炎症反応に関与する、多くの遺伝子の発現を制御する(Ueda A, Ishigatsubo Y,  Okubo T, Yoshimura T.著： ヒト単球化学誘引物質プロテイン−１遺伝子の転写制御。２つのＮＦ−κＢ部位の協同作用とＮＦ−κＢ／Ｒｅｌサブユニット特異性，J Biol Chem. 5;272(49):31092-9, 1997)。高血糖が単球におけるＰＫＣ及びＮＦ−κＢシグナリング経路の活性化を介して炎症を活性化することが判明している(Devaraj S, Venugopal SK, Singh U, Jialal I.著：高血糖は、プロテインキナーゼｃ−α及び−βの誘導を介してインターロイキン−６の単球放出を誘導する，Diabetes.;54(1):85-91, 2005; Shanmugam N, Gae Gonzalo IT, Natarajan R.著：単球における高グルコース誘導シクロオキシゲナーゼ−２発現の分子機構，Diabetes. 53(3):795-802, 2004)。 
【０００９】
[0011]タンパク質の可逆的リン酸化は、細胞生理学の殆ど全ての面を制御する。特異的なキナーゼ及びホスファターゼの慢性的な制御不全は、細胞内タンパク質の正常なリン酸化状態を変化させることによってそれらの影響を及ぼして、癌及び炎症性疾患を含めた、多くの障害を招来する。このため、プロテインキナーゼは主要な治療標的である。
【００１０】
[0012]特異的キナーゼの過剰活性化は、特に、多くの疾患に関連する、そして予想されるように、ある一定の標的指向キナーゼ阻害剤(certain,targeted kinase inhibitors)は、細胞生理学を正常化して、ほぼ寛解をもたらすことに効果的であると判明している。例えば、イマチニブ（キロシンキナーゼ阻害剤）は白血病の治療に[Savage DG, N Eng J Med 2002]; エルロチニブ(上皮増殖因子受容体阻害剤)は肺癌に(Expert Opin Pharmacother, Gridelli, 2007において考察);そしてルボキシストーリン(ＰＫＣ−βＩＩ阻害剤)は糖尿病患者の微小血管合併症の軽減に(Joy SV, et al.著：糖尿病微小血管併発症の新たな治療薬としてのロボキシスターリン、プロテインキナーゼＣ−β阻害剤，Ann Pharmacother. 39(10): 1693-9, 2005)有効である。
【００１１】
[0013]内皮由来一酸化窒素(endothelial derived Nitric Oxide)（ＮＯ）は、血管内皮反応性を調節し、したがって、全身血圧、血管リモデリング及び血管新生を制御する、心臓血管ホメオスタシスの重要な決定因子である(Moncada S, Higgs A著:Ｌ−アルギニン−一酸化窒素経路，NEJM 1993;329:2002-12)。ＮＯを連続産生させるための重要な刺激は、内皮を横切って血流に関係する粘性抵抗である。内皮型ＮＯシンターゼ（ｅＮＯＳ）はプロテインキナーゼＡｋｔによる直接の制御下にある。剪断応力と高血糖は、一連の仲介キナーゼ(mediating kinases)を介して、Ａｋｔを直接活性化する(Dimmeler S, Fleming I, Fisslthaler B, Hermann C, Busse R, Zeiher AM. Ａｋｔ依存性リン酸化による内皮細胞における一酸化窒素シンターゼの活性化，Nature 1999;399:601-5)。実際にＡｋｔを阻害する、これらのキナーゼの１つはＰＫＣβである。ＰＫＣβは、高血糖によって活性化される。高血糖が、内皮依存性血管拡大を直接阻害することが判明している(Rammos G, Peppes V, Zakopoulos N.著：正常対象における一過性インシュリン耐性：急性高血糖は正常対象における内皮依存性血管拡大を阻害する，Metabolic Syndrome and Related Disorders 2008;6(3):159-170)。ロボキシスターリンはＰＫＣβを阻害する、したがって、流量依存性血管拡張（ＦＭＤ）によって測定されるように、内皮機能を正常化する(Mehta NN, Sheetz M, Price K, Comiskey L, Amrutia S, Iqbal N, Mohler ER, Reilly MP.著：ロボキシスターリンによる選択的ＰＫＣβ阻害と２型糖尿病における内皮機能，Cardiovasc Drugs Ther 2009;23(1):17-24)。ＦＭＤは、低酸素血症誘導後に上腕動脈血流生理学を測定するための非侵襲性の超音波検査法である(Corretti MC et al.著：気管支動脈の内皮依存性流量仲介血管拡張の超音波評価のガイドライン−国際気管支動脈反応性専門調査団のレポート，J Am Coll Cardiol 2002; 39(2): 257-65)。
【００１２】
[0014]以前に、本出願人らは、フムロン、ルプロン、イソフムロン及び還元イソフムロン（フレーバー剤として用いられる修飾ホップ抽出物）を含めたホップコーン由来の数種類の化合物がＲＡＷ２６４．７細胞におけるリポ多糖（ＬＰＳ）刺激ＰＧＥ２形成を強力に阻害することを報告した(Tripp M, Darland G, Lerman R, Lukaczer D, Bland J, Babish J著: ホップ及び修飾ホップ抽出物は強力なin vitro及びin vivo抗炎症特性を有する，Acta Hort (ISHS) 2005, 668:217-228)。ホップ由来の最も活性な置換１，３−シクロペンタジオン化合物のなかには、テトラヒドロイソアルファ酸類（テトラヒドロイソα酸類）（本明細書では、集約的にＭｅｔａ−０６０又はＴＨＩＡＡと呼ぶ）が含まれる。Ｍｅｔａ−０６０は、３種類の関連類似体、テトラヒドロ−イソフムロン、−コフムロン及び−アドフムロンの４９：４２：９の比率での混合物を含む修飾ホップ抽出物である。ＭＥＴＡ−０６０は、ＲＡＷ２６４．７細胞においてＮＦκＢシグナリング経路を阻害することによってＬＰＳ誘導ＰＧＥ２産生及びＣＯＸ−２発現を阻害する(Desai A, Konda VR, Darland G, Austin M, Prabhu KS, Bland JS, et al.著：ＭＥＴＡ０６０は、ＮＦ−κＢ経路における多重キナーゼを阻害し、in vitro及びex vivoにおけるＬＰＳ仲介炎症を抑制する，Inflamm Res 2009)。
【００１３】
[0015]マクロファージ／単球の活性化は、多くの慢性的炎症疾患の病態生理学に極めて重要に関与する。アテローム硬化プロセスのあらゆるステージにおける炎症の役割は、研究の活性な分野になっており、アテローム硬化症を治療するための新規で、革新的な治療学が必要とされている。このようなものとして、本発明者は、ＮＦκＢ活性化に関与する重要なキナーゼに対するキナーゼ阻害を介して作用する、ＮＦκＢ経路に対するＭｅｔａ−０６０の阻害効果を確認している。さらに、特異性を評価するために、８５種類の異なるキナーゼに対するＭＥＴＡ−０６０の効力を評価した。
【００１４】
[0016]さらに、本発明者は、ＮＦκＢの制御下にあり、（１）内皮細胞（ＨＡＥＣ）におけるＴＮＦα仲介ＶＣＡＭ−１、Ｅセレクチン及びＭＣＰ−１及び（２）ＴＮＦα仲介単球−内皮相互作用を包含する、心血管系併発症に関連した、他の炎症マーカーを阻害するＭＥＴＡ−０６０の能力に関して報告する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Shanmugam N, Gae Gonzalo IT, Natarajan R.著： 単球における高グルコース誘導シクロオキシゲナーゼ−２発現の分子機構，Diabetes. 53(3):795-802, 2004；
【非特許文献２】Charo IF, Taubman MB.著： 血管性疾患の病因におけるケモカイン，Circ Res. 29;95(9):858-66, 2004；
【非特許文献３】Nagase H, Visse R, Murphy G.著： マトリックスメタロプロテイナーゼ及びＴＩＭＰｓの構造及び機能，Cardiovasc Res 2006;69:562-73；
【非特許文献４】Virmani R, Kolodgie FD, Burke AP, Farb A, Schwartz SM.著：冠動脈突然死からの教訓：動脈硬化性病変の包括的形態学的分類表，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000;20:1262-75；
【非特許文献５】Gough PJ, Gomez IG, Wille PT, Raines EW.著：活性ＭＭＰ−９のマクロファージ発現は、ａｐｏＥ欠乏マウスにおける急性プラーク破壊を誘導する， J Clin Invest 2006;116:59-69;
【非特許文献６】Fukuda D, Shimada K, Tanaka A, Kusuyama T, Yamashita H, Ehara S, et al.著：急性心筋梗塞患者対不安定な狭心症患者対安定な狭心症患者における血清マトリックスメタロプロテイナーゼ−９のレベルの比較，Am J Cardiol 2006;97:175-80;
【非特許文献７】Blankenberg S, Rupprecht HJ, Poirier O, Bickel C, Smieja M, Hafner G, et al著： 心血管系患者のマトリックスプロテイナーゼ−９の血漿濃度及び遺伝的変異と予後，Circulation 2003;107:1579-85;
【非特許文献８】Chase AJ, Bond M, Crook MF, Newby AC.著： in vitroでのヒト・マクロファージ及びin vivoで産生されるウサギ泡沫細胞によるメタロプロテイナーゼ−１、−３及び−９分泌における核因子κＢの役割，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002;22:765-71;
【非特許文献９】Stawowy P, Meyborg H, Stibenz D, Borges Pereira Stawowy N, Roser M, Thanabalasingam U, et al著：フリン様プロタンパク質転換酵素は、アテローム硬化症における膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ、プロマトリックスメタロプロテイナーゼ−２タンパク質分解カスケードの重要な調節剤である，Circulation 2005;111:2820-7；
【非特許文献１０】Kopp E 及び Ghosh S.著： Science. 22: 270 (5244): 2017-9,1994;
【非特許文献１１】De Bosscher K, Schmitz ML, Vanden Berghe W, Plaisance S, Fiers W, Haegeman G．著；核因子κＢ依存性転写のグルココルチコイド仲介抑制はトランス活性化による直接の介在を必要とする，Proc Natl Acad Sci U S A. 9;94(25):13504-9, 1997;
【非特許文献１２】Pan MH, Lin-Shiau SY, Ho CT, Lin JH, Lin JK.著： 紅茶からのテアフラビン−３，３’−ジガレート及び他のポリフェノールによる、マクロファージにおけるＩκＢキナーゼ活性のダウンレギュレーションを介してのリポ多糖誘導核因子κＢ活性の抑制，Biochem Pharmacol. 15;59(4):357-67, 2000；
【非特許文献１３】Ueda A, Ishigatsubo Y, Okubo T, Yoshimura T.著： ヒト単球化学誘引物質プロテイン−１遺伝子の転写制御。２つのＮＦ−κＢ部位の協同作用とＮＦ−κＢ／Ｒｅｌサブユニット特異性， J Biol Chem. 5;272(49):31092-9, 1997；
【非特許文献１４】Devaraj S, Venugopal SK, Singh U, Jialal I.著：高血糖は、プロテインキナーゼｃ−α及び−βの誘導を介してインターロイキン−６の単球放出を誘導する，Diabetes.;54(1):85-91, 2005;
【非特許文献１５】Shanmugam N, Gae Gonzalo IT, Natarajan R.著：単球における高グルコース誘導シクロオキシゲナーゼ−２発現の分子機構，Diabetes. 53(3):795-802, 2004;
【非特許文献１６】Savage DG, N Eng J Med 2002;
【非特許文献１７】Expert Opin Pharmacother, Gridelli, 2007；
【非特許文献１８】Joy SV, et al著：糖尿病微小血管併発症の新たな治療薬としてのロボキシスターリン、プロテインキナーゼＣ−β阻害剤，Ann Pharmacother. 39(10): 1693-9, 2005；
【非特許文献１９】Moncada S, Higgs A著: Ｌ−アルギニン−一酸化窒素経路，NEJM 1993;329:2002-12；
【非特許文献２０】Dimmeler S, Fleming I, Fisslthaler B, Hermann C, Busse R, Zeiher AM.著： Ａｋｔ依存性リン酸化による内皮細胞における一酸化窒素シンターゼの活性化，Nature 1999;399:601-5；
【非特許文献２１】Rammos G, Peppes V, Zakopoulos N.著： 正常対象における一過性インシュリン耐性：急性高血糖は正常対象における内皮依存性血管拡大を阻害する，Metabolic Syndrome and Related Disorders 2008;6(3):159-170；
【非特許文献２２】Mehta NN, Sheetz M, Price K, Comiskey L, Amrutia S, Iqbal N, Mohler ER, Reilly MP.著：ロボキシスターリンによる選択的ＰＫＣβ阻害と２型糖尿病における内皮機能，Cardiovasc Drugs Ther 2009;23(1):17-24；
【非特許文献２３】Corretti MC et al著：気管支動脈の内皮依存性流量仲介血管拡張の超音波評価のガイドライン−国際気管支動脈反応性専門調査団のレポート，J Am Coll Cardiol 2002; 39(2): 257-65；
【非特許文献２４】Tripp M, Darland G, Lerman R, Lukaczer D, Bland J, Babish J著: ホップ及び修飾ホップ抽出物は強力なin vitro及びin vivo抗炎症特性を有する，Acta Hort (ISHS) 2005, 668:217-228；
【非特許文献２５】Desai A, Konda VR, Darland G, Austin M, Prabhu KS, Bland JS, et al．著：ＭＥＴＡ０６０は、ＮＦ−κＢ経路における多重キナーゼを阻害し、in vitro及びex vivoにおけるＬＰＳ仲介炎症を抑制する， Inflamm Res 2009．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
[0017]本発明は、一般に、（１）内皮細胞（ＨＡＥＣ）におけるＴＮＦα仲介ＶＣＡＭ−１、Ｅセレクチン及びＭＣＰ−１及び（２）ＴＮＦα仲介単球−内皮相互作用を包含する、内皮機能及び心血管系併発症に関連した炎症経路をプロテインキナーゼ調節を介して調節するために用いることができる方法及び組成物に関する。より具体的には、本発明は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物を用いる方法及び組成物に関する。
【００１７】
[0018]本発明の第１実施態様は、それを必要とする対象における心血管系危険因子を改善するための方法を記載する。該方法は、療法的有効量の置換１，３−シクロペンタジオン化合物で該対象を治療することを含み、この場合、該量は心血管系危険因子関連マーカー遺伝子発現の発現を調節する。
【００１８】
[0019]本発明の第２実施態様は、それを必要とする対象における血管弾力を助長するための方法であって、療法的有効量の置換１，３−シクロペンタジオン化合物で該対象を治療する方法を記載する、この場合、該量は血管弾力又は拡張を高める。
【００１９】
[0020] 本発明の第３実施態様は、対象における心血管系健康を助長するための組成物を記載する。この実施態様では、該組成物は、療法的有効量の置換１，３−シクロペンタジオン化合物を含み、この場合、該量は（ａ）心血管系危険関連マーカー遺伝子発現の発現を調節する、又は（ｂ）血管弾力又は拡張を高める。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】[0021]図１は、炎症を制御するキナーゼのキナーゼ活性に対する置換１，３−シクロペンタジオン化合物の効果をグラフによって示し、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の特異性をジニ係数表現によって示す。
【図２】[0022]図２は、選択された内皮炎症バイオマーカーの阻害に対する置換１，３−シクロペンタジオン化合物の効果をグラフによって示す。
【図３】[0023]図３は、内皮−単球相互作用に対する置換１，３−シクロペンタジオン化合物の阻害効果をグラフによって示す。
【図４】[0024]図４は、ＨＡＥＣ細胞に対するＴＨＰ−１細胞相互作用のＭＥＴＡ−０６０阻害を示す。
【図５】[0025]図５は、ＴＨＰ−１細胞におけるＭＣＰ−１発現のＭＥＴＡ−０６０阻害を示す。
【図６Ａ】[0026]図６は、ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦα及びＬＰＳ仲介ＭＭＰ−９レベルに対するＭＥＴＡ−０６０の阻害効果を示す。パネルＡとＢは、ＭＭＰ−９レベルに対するＴＮＦα及びＬＰＳのそれぞれの効果を示すが、パネルＣはＭＭＰ−９発現に対する効果を示すザイモグラフを与える。
【図６Ｂ】[0026]図６は、ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦα及びＬＰＳ仲介ＭＭＰ−９レベルに対するＭＥＴＡ−０６０の阻害効果を示す。パネルＡとＢは、ＭＭＰ−９レベルに対するＴＮＦα及びＬＰＳのそれぞれの効果を示すが、パネルＣはＭＭＰ−９発現に対する効果を示すザイモグラフを与える。
【図６Ｃ】[0026]図６は、ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦα及びＬＰＳ仲介ＭＭＰ−９レベルに対するＭＥＴＡ−０６０の阻害効果を示す。パネルＡとＢは、ＭＭＰ−９レベルに対するＴＮＦα及びＬＰＳのそれぞれの効果を示すが、パネルＣはＭＭＰ−９発現に対する効果を示すザイモグラフを与える。
【図７】[0027]図７は、ＴＨＰ−１細胞におけるＬＰＳ仲介ＮＦκＢ結合に対するＭＥＴＡ−０６０の阻害効果をグラフによって示す。
【図８】[0028]図８は、ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦα活性化遺伝子に対するＭＥＴＡ−０６０の阻害効果を示す。
【００２１】
発明の詳細な説明
[0029]本発明は、一般に、（１）内皮細胞（ＨＡＥＣ）におけるＴＮＦα仲介ＶＣＡＭ−１、Ｅセレクチン及びＭＣＰ−１及び（２）ＴＮＦα仲介単球−内皮相互作用を包含する、内皮機能及び心血管系併発症に関連した炎症経路をプロテインキナーゼ調節を介して調節するために用いることができる方法及び組成物に関する。より具体的には、本発明は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物を用いる方法及び組成物に関する。
【００２２】
[0030] 当業者の知識を確実なものにするために、本明細書に引用した特許、公開出願及び科学文献は、あたかもそれぞれが具体的かつ個別に援用されることが示唆されるかのように同程度まで、それらの全体で本明細書に援用される。本明細書に引用するあらゆる参考文献と本明細書の具体的な教示との間の如何なるコンフリクトも、後者に有利なように解決されよう。同様に、当該技術分野で理解されている単語又は語句の定義と本明細書で具体的に教示される単語又は語句の定義との間の如何なるコンクリフトも、後者に有利なように解決されよう。
【００２３】
[0031]本明細書に使用する技術及び科学の用語は、他に定義されなければ、本発明が関連する当該技術分野の当業者により通常理解される意味を有する。本明細書では、当業者に知られている様々な方法論及び材料を参照する。組換えＤＮＡ技術の一般原理を説明する標準の参考資料には、Sambrook et al.「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク（1989）；Kaufman et al. 監修「医薬のバイオロジーにおける分子及び細胞の方法の手引き（Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine）」ＣＲＣプレス、ボカラトン（1995）；McPherson 監修「定方向突然変異誘発：実践アプローチ（Directed Mutagenesis: A Practical Approach）」ＩＲＬプレス、オックスフォード（1991）が含まれる。薬理学の一般原理を説明する標準の参考資料には、「グッドマン・アンド・ギルマンの治療薬の薬理学的基礎（Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics）」第１１版、マクグローヒルカンパニーズ社、ニューヨーク（2006）が含まれる。
【００２４】
[0032]本明細書と付帯の特許請求項において、単数形には、前後関係が明らかに別のように指定しないかぎり、複数の指示対象(referents)が含まれる。本明細書で使用するかぎり、単数形の冠詞（「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」）には、特に、前後関係が明らかに別のように指定しなければ、それらが指示する用語の複数形が含まれる。追加的に、本明細書に使用するかぎり、具体的に別のように指定しなければ、単語「又は（ｏｒ）」は、「及び／又は」の「包含的な」意味で使用されて、「どちらか一方」の「排他的な」意味では使用しない。用語「約」は、本明細書において、「おおよそ」又は「ほぼ」の範囲で「概ね」を意味するために使用する。用語「約」を数的範囲と一緒に使用する場合、それは、示した数値の上下の境界を広げることによって、その範囲を修飾する。一般に、用語「約」は、本明細書において、数値を、述べた数値の上下２０％の変動だけ修飾するために使用する。
【００２５】
[0033]本明細書に使用するかぎり、ある変数に対する数的範囲の記載（recitation）は、本発明がその範囲内の数値のいずれにも等しい変数で実施し得ることを伝えるためのものである。このように、本来的に不連続である変数では、変数は、その数的範囲のどの整数値にも等しいことができ、その範囲の末端点も包含する。同様に、本来的に連続である変数では、変数は、その数的範囲のどの実数値にも等しいことができ、その範囲の末端点も包含する。例として、０と２の間の数値を有すると記載される変数は、本来的に不連続である変数では、０、１、又は２であり得て、本来的に連続である変数では、０．０、０．１、０．０１、０．００１、又は任意の他の実数値であることができる。
【００２６】
[0034]以下、本発明の特定の態様について詳細に言及する。これら特定の態様に関連して本発明を記載しても、本発明をそのような特定の態様に限定することが意図されるものではないことは理解されよう。むしろ、付帯の特許請求項により定義されるような、本発明の要旨及び範囲内に含まれうるような代替物、修飾物及び同等物を包含することが意図される。以下の記載では、本発明の完全な理解をもたらすために、数多くの特定の詳細を示す。本発明は、これらの特定の詳細の一部又は全部がなくても、実施することが可能である。他の例では、本発明を不必要にわかりにくくしないように、周知のプロセス操作については詳しく記載していない。
【００２７】
[0035]本発明の実施には、当業者に知られた、任意の好適な物質及び／又は方法を利用することができる。しかし、好ましい材料及び方法について記載する。以下の記載及び実施例において言及する材料、試薬、等は、他に記載しないかぎり、商業的供給源より入手可能である。
【００２８】
[0036]本発明の第１実施態様は、それを必要とする対象における心血管系危険因子を改善するための方法を記載する。該方法は、療法的有効量の置換１，３−シクロペンタジオン化合物で該対象を治療することを含み、この場合、該量は、心血管系危険因子関連マーカー遺伝子発現の発現を調節する。
【００２９】
[0037]この実施態様の幾つかの態様では、置換１，３−シクロペンタジオン化合物は、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（２−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン及び（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−ペンタノイルシクロペンタ−２−エン−１−オンを含む群から選択される。
【００３０】
[0038]他の態様では、調節される心血管系危険関連マーカー遺伝子が、ＴＮＦα、ＭＣＰ−１、ＶＣＡＭ−１、ＭＭＰ−３、ＩＣＡＭ１及びＳＤＦ１から成る群から選択される。
【００３１】
[0039]さらに他の態様では、該方法はさらに、生活様式の改変又は医薬品による処置を含み、この場合、生活様式の改変又は医薬品による処置は、血圧低下、コレステロールレベル調節、糖尿病治療、運動増強、炎症、肥満及び体重の軽減、血栓形成促進因子処置、血清ホモシステイン及びリポタンパク質（ａ）の低下、血清トリグリセリド低下、禁煙及びストレス低下から成る群から選択される。
【００３２】
[0040]本明細書で用いる限り、「心血管系危険因子の改善」とは、同定された心血管系危険因子を安定化し、減少させ又は除去し、それによって心血管系健康の改善を促進することを意味する。心血管系危険因子の代表的な非限定的例は、喫煙、高血圧、高い血清総コレステロール（及びＬＤＬ）、糖尿病、加齢、肥満、身体的不活性、早発性心臓疾患の家族歴、高血清トリグリセリド、小さいＬＤＬ粒子、高血清ホモシステイン又はリポタンパク質（ａ）、血栓形成促進因子（例えば、フィブリノゲン）、及び炎症因子（例えば、Ｃ−反応性タンパク質）を包含する。
【００３３】
[0041]「心血管系危険因子関連マーカー遺伝子発現の発現を調節する」なるフレーズは、該遺伝子の発現又はその関連遺伝子産物の産生若しくは活性のアップ又はダウンレギュレーションを意味する。心血管系危険因子の種々な態様によって同定される又は関連した遺伝子の非限定的な代表例は、AQP1, B3GAT3, BCL3, BTG2, C1ORF106, C1ORF38, C1ORF38, CACNA1A, CCDC75, CCL2, CCL8, CCND1, CD40, CD44, CD86, CLIP2, DDX58, DKFZP434H1419, DSC3, EHD1, EIF2AK2, FAM105A, FGD2, FKBP5, G3BP1, GPR153, HTR4, ICAM1, ICOSLG, IFI44, IFI44L, IFIH1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, IGKC, IGKV1-5, IKBKE, IKZF1, IL10RA, IL18RAP, IL1B, IL7R, IRF7, ISG15, KIAA1731, KRT17, LHX, LIMD2, LTB, MARCKSL1, MCP-1, MMP3, MMP14, MMP9, MX1, MX2, NA, NAB1, NAB2, NOD2, NPTX1, OAS1, OAS2, OAS3, OASL, PDE4B, PIP5K1B, PRKCH, PTGIR, PTPN14, RASA, RASA4, RASSF4, REC8, RIN3, RSAD2, SAFB2, SAMD9, SDF1, SEMA4C, SH3TC1, SH3TC, SIGLEC1, SLAMF8, SLC16A3, SLC1A3, SP110, SPI1, SPIB, SSPO, STAT1, TAP1, TAPBP, THBD, TNFα, TRAC, TRIM22, UBE2B, UBQLN4, UBQLN4P, UST, VCAM1, XAF1, ZFP2, ZMIZ2 及び ZNF710を包含する。
【００３４】
[0042]幾つかの態様では、生活様式の改変又は医薬品による処置は、血圧低下、コレステロールレベル調節、糖尿病治療、運動増強、炎症、肥満及び体重の軽減、血栓形成促進因子処置、血清ホモシステイン及びリポタンパク質（ａ）の低下、血清トリグリセリド低下、禁煙及びストレス軽減から成る群から選択される。
【００３５】
[0043]本明細書で用いる限り、「生活様式の改変」なるフレーズは、個人が心血管系危険因子を改善するために、医薬的処置なしに又は医薬的処置と組み合わせて着手することができるような活動を意味する。生活様式の改変の代表的な例は、非限定的に、体重減少、血圧若しくはコレステロールの制御のための食生活改善；ストレス軽減若しくは体重減少のための運動増強；又は禁煙を包含する。本明細書で用いる「医薬品による処置」は、心血管系危険因子の改善を促進するために生活様式の改変の代わりに又は生活様式の改変と組み合わせて用いることができる、医療介護提供者によって得られた又は処方されたような作用剤(agents)を意味する。
【００３６】
[0044] 本明細書で用いる限り、移行句において又は特許請求項の本体においてのいずれであろうとも、用語「含む(comprise(s))」及び「含んでなる(comprising)」は、制限のない意味(an open-ended meaning)を有するものと解釈するべきである。即ち、この用語は、「少なくとも有する」又は「少なくとも包含する」と同義に解釈すべきである。プロセスに関連して使用する場合、用語「含んでなる」は、該プロセスが列挙した工程を少なくとも含むが、追加の工程を包含することも可能であることを意味する。化合物又は組成物に関連して使用する場合、用語「含んでなる」は、化合物又は組成物が列挙した特徴又は化合物を少なくとも含むが、付加的な特徴又は化合物をも含むことができることを意味する。
【００３７】
[0045]本明細書で用いる限り、用語「誘導体」又は「誘導された」物質は、別の物質に構造的に関連して、理論的にはそれより入手可能な化学物質、即ち、別の物質より作製することができる物質を意味する。誘導体には、化学反応を介して入手される化合物を含めることができる。
【００３８】
[0046]本明細書で用いるかぎり、用語「製薬的に受容される」は、組成物の他の成分と適合性であり、該組成物のレシピエントにとって有害でないという意味で用いられる。
【００３９】
[0047]本明細書で用いるかぎり、「テトラヒドロ−イソフムロン」は、それぞれ（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン及び（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンのシス形及びトランス形を当然意味するであろう。
【００４０】
[0048]本明細書で使用する「テトラヒドロ−イソコフムロン」は、それぞれ（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン及び（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オンのシス形及びトランス形を意味する。
【００４１】
[0049]本明細書で使用する「テトラヒドロ−アドフムロン」は、それぞれ（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（２−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン及び（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−ペンタノイルシクロペンタ−２−エン−１−オンのシス形及びトランス形を意味する。
【００４２】
[0050]本明細書で用いるかぎり、「テトラヒドロ−イソアルファ酸」（表１参照）又は「Ｍｅｔａ０６０」は、テトラヒドロ−アドフムロン、テトラヒドロ−イソコフムロン及びテトラヒドロ−イソフムロンの１つ以上の任意の混合物を意味する。
【００４３】
表１  テトラヒドロイソアルファ酸
【００４４】
【表１】
2011516492.tif 000002
【００４５】
【表２】
2011516492.tif 000003
【００４６】
[0051]本明細書で用いる限り、「化合物」は、それらの化学構造、化学名又は慣用名のいずれかによって同定することができる。化学構造と化学名又は慣用名が矛盾する場合には、化学構造が化合物のアイデンティティの決定詞になる。本明細書に記載する化合物は、１つ以上のキラル中心及び／又は二重結合を含有することができ、それ故、例えば、二重結合異性体（即ち、幾何異性体）、エナンチオマー又はジアステレオマーのような立体異性体として存在することができる。したがって、本明細書に図示した化学構造は、立体異性体的に純粋な形（例えば、幾何異性体的純粋な、エナンチオマー的純粋な若しくはジアステレオマー的純粋な）並びにエナンチオマー混合物及び立体異性体混合物を含めた、図示した又は同定した化合物のあらゆる可能なエナンチオマー及び立体異性体を包含するものである。エナンチオマー混合物及び立体異性体混合物は、当業者に周知の分離方法又はキラル合成方法を用いて、それらの構成要素のエナンチオマー又は立体異性体に分割することができる。該化合物は、エノール形、ケト形及びそれらの混合物を含めた、幾つかの互変異性体形で存在することもできる。したがって、本明細書に図示した化学構造は、図示した又は同定した化合物のあらゆる可能な互変異性体形を包含する。記載する化合物はまた、１つ以上の原子が天然で慣用的に見出される原子量とは異なる原子量を有する同位体標識化合物も包含する。本発明の化合物に組み込むことができる同位体の例には、非限定的に、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、等が含まれる。化合物は、非溶媒和形だけでなく、水和形を包含する溶媒和形において、そしてＮ−オキシドとして存在することができる。一般に、化合物は、水和形、溶媒和形、又はＮ−オキシドであることができる。ある種の化合物は、多重の結晶形又は非結晶形で存在することができる。また、本発明の範囲内には、化合物の同属体（congeners）、類似体、加水分解産物、代謝産物、及び前駆体若しくはプロドラッグも包含される。一般に、他に指定しないかぎり、すべての物理形態は、本明細書において考慮する使用に対して同等であり、本発明の範囲内に含まれるように意図される。
【００４７】
[0052]本発明による化合物は、塩として存在することができる。特に、化合物の医薬的に受容される塩が考慮される。本発明の「医薬的に受容される塩」は、本発明の化合物と、該化合物と塩（例えば、本明細書において「Ｍｇ」又は「Ｍａｇ」として示されるマグネシウム塩）を形成し、治療条件下の対象により耐容される酸又は塩基のいずれかとの組合せである。一般に、本発明の化合物の医薬的に受容される塩は、１以上の治療指数（最低有毒量の最低療法的有効量に対する比）を有するものである。当業者は、最低療法的有効量が対象毎に、そして適応症毎に変動するので、それに応じて調整されるものであることを理解するであろう。
【００４８】
[0053]本発明の第２実施態様は、それを必要とする対象における血管弾力を助長するための方法であって、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の、血管弾力又は拡張を高めるような療法的有効量で該対象を治療することを含む方法を記載する。この実施態様の幾つかの態様では、該置換１，３−シクロペンタジオン化合物は、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（２−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン及び（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−ペンタノイルシクロペンタ−２−エン−１−オンを含む群から選択される。
【００４９】
[0054]別の実施態様は、置換１，３−シクロペンタジオン化合物の療法的有効量を含む、それを必要とする対象における心血管系健康を助長するための組成物であって、該量が（ａ）心血管系危険関連マーカー遺伝子発現の発現を調節する、又は（ｂ）血管弾力又は拡張を高める組成物を記載する。
【００５０】
[0055]幾つかの態様では、該置換１，３−シクロペンタジオン化合物は、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（３−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（−）−（４Ｓ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−（３−メチルプロパノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン、（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（２−メチルブタノイル）−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）シクロペンタ−２−エン−１−オン及び（＋）−（４Ｒ，５Ｓ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（３−メチルブチル）−４−（４−メチルペンタノイル）−２−ペンタノイルシクロペンタ−２−エン−１−オンを含む群から選択される。
【００５１】
[0056]この実施態様のさらに他の態様では、該組成物はさらに製薬的に受容される賦形剤を含み、該賦形剤は、コーティング剤、等張性及び吸収遅延剤(isotonic and absorption delaying agents)、結合剤、接着剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、フレーバー剤(flavoring agents)、甘味剤、吸収剤、界面活性剤及び乳化剤から成る群から選択される。さらに、他の態様では、該組成物は酸化防止剤、ビタミン、ミネラル、タンパク質、脂肪、及び炭水化物から成る群から選択される１つ以上のメンバーをさらに含む。
【００５２】
[0057]この実施態様の他の態様では、該組成物に用いられる置換１，３−シクロペンタジオン化合物は、同定された立体異性体に関して５０％超の純粋、好ましくは７５％超の純粋、より好ましくは９０％超の純粋、最も好ましくは９５％超の純粋である（残りの量は別の異性体形である）。幾つかの態様では、該組成物は、投与量(dosage)あたり約５０ｍｇ〜１０，０００ｍｇ、好ましくは、１００ｍｇ〜８，０００ｍｇ、又は最も好ましくは、１５０ｍｇ〜６，０００ｍｇの置換１，３−シクロペンタジオン化合物を含む。
【００５３】
[0058]本発明による化合物は、任意に、周知の製薬的に受容されるキャリヤー（希釈剤及び賦形剤を包含する）のいずれかと共に、製薬的に受容されるビヒクル中で処方される［Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA 1990 and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins, 1995参照］。本発明の組成物の製造に用いられる製薬的に受容されるキャリヤー／ビヒクルの種類は、哺乳動物への該組成物の投与形式に依存して変化するが、一般には、製薬的に受容されるキャリヤーは生理的に不活性であり、非毒性である。本発明による組成物の処方は、１つより多くの本発明の化合物並びに、治療する症状／状態の治療に有用な、任意の他の薬理学的有効成分(pharmacologically active ingredients)を含有することができる。
【００５４】
[0059]本発明の化合物は、当業者に知られた処方方法を用いて、製薬的に受容されるビヒクル中で提供することができる。本発明の組成物は標準的経路で投与することができるが、吸入経路で投与することが好ましい。本発明の組成物は、経口投与、吸入投与、直腸投与、眼投与（硝子体内又は前房内を含む）、鼻腔投与、局所投与（頬側及び舌下を含む）、膣投与、又は非経口投与（皮下、筋肉内、静脈内、皮内及び気管内を含む）に適した組成物を包含する。さらに、所定化合物の持続放出のための当該技術分野での標準方法に従ってポリマーを加えることができる。
【００５５】
[0060]吸入による投与に適した製剤は、当業者に知られた吸入デバイスによって供給することができる製剤を包含する。このような製剤は、例えば粉末及びエアロゾルのようなキャリヤーを包含することができる。本発明は、噴霧及び気管支内用途に適した液体及び粉末組成物、又は計量を分配するエアロゾル装置（「ＭＤＩ」）を介して投与されるエアロゾル組成物を包含する。有効成分を製薬的に受容される水性吸入ビヒクル（例えば、等張性生理食塩水若しくは静菌水）及び当業者に周知である、他の種類のビヒクル中で処方することができる。溶液は、ポンプ若しくはスクイーズ作動噴霧スプレー式ディスペンサーを用いて、又は液体組成物の必要な１回投与量を患者の肺中に吸入させる若しくは肺への吸入を可能にする、任意の他の慣用的手段によって投与する。本発明の抗炎症性化合物を含有する粉末組成物は、実例として、ラクトース又は、気管支内投与のために許容される他の不活性粉末と完全に混合された有効成分の製薬的に受容される粉末製剤を包含する。粉末組成物は、ディスペンサー（非限定的に、エアロゾル・ディスペンサーを包含する）を介して投与する又は破壊可能なカプセルに入れて、患者が該カプセルをデバイス（これはカプセルを穿刺して、粉末を安定な流れで噴出させることができる）に挿入することによって投与することができる。本発明の方法に用いるためのエアロゾル製剤は、典型的に、推進剤(propellants)、界面活性剤及び共溶媒を包含するものであり、適当な絞り弁(metering valve)によって閉鎖される慣用的エアロゾル容器に充填することができる。
【００５６】
[0061]キャリヤーが固体である、鼻腔内投与に適した、本発明の組成物の製剤は、例えば、２０〜５００μの範囲内の粒度を有する粗粒粉末を包含する、該粉末は、スナッフ(snuff)が投与されるやり方で、即ち、鼻に密接して保持された粉末容器から鼻腔を通しての迅速吸入によって投与される。キャリヤーが、例えば、経鼻スプレー(nasal spray)、エアロゾルを介して、又は点鼻薬として投与するための液体である、適当な製剤は、本発明化合物の水溶液又は油溶液を包含する。
【００５７】
[0062]経口投与のためには、本発明の組成物は、各々が有効成分の所定量を粉末若しくは顆粒として含有する、例えば、カプセル剤、カプレット、ジェルキャップ(gelcaps)、カシェー(cachets)、ピル又は錠剤のような個別単位として；水性液体若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液として；又は水中油滴液体エマルジョン若しくは油中水滴エマルジョンとして及びボーラス等として提供することができる。或いは、本発明の全ての態様の組成物の投与は、液体溶液、懸濁液若しくはエリキシル剤、散剤、トローチ剤、微粒子、及び浸透圧デリバリー系によって行なうことができる。
【００５８】
[0063]非経口投与に適した、本発明の態様による組成物の製剤は、酸化防止剤、安定剤、緩衝液、静菌剤及び、該製剤を予定レシピエントの血液と等張性にする溶質を含有しうる、水性及び非水性滅菌注射溶液と；懸濁化剤及び増粘剤を包含しうる水性及び非水性滅菌懸濁液を包含する。該製剤は、単位投与量容器又は複数回投与量容器（例えば、密封アンプル又はバイアル）に入れて提供することができ、そして凍結乾燥(lyophilized)条件下で貯蔵することができ、使用直前に滅菌液体キャリヤー（例えば、注射用水）の添加のみを必要とする。前述した種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から即時(extemporaneous)注射溶液及び懸濁液を調製することができる。
【００５９】
[0064]任意に１種類以上の補助成分と共に圧縮又は成形することによって、錠剤を製造することができる。圧縮錠剤は、適当な装置内で、任意に結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤又は分散剤と混合した、例えば粉末又は顆粒のような自由流動形の有効成分を圧縮することによって製造することができる。成形錠剤は、適当な装置内で、不活性液体希釈剤によって湿らせた粉末状化合物の混合物を成形することによって、製造することができる。該錠剤は任意に被覆することも、刻み目を付けることもでき、その中に含まれる有効成分が遅延放出又は制御放出されるように処方することができる。
【００６０】
[0065]直腸投与のための本発明の組成物の製剤は、例えばカカオ脂を含む、適当な基剤による座薬として製造することができる。
【００６１】
[0066]口腔内の局所投与に適した、本発明の組成物の製剤は、フレーバー入り基剤（通常は、スクロースとアラビアゴム若しくはトラガント）中に成分を含むトローチ剤；不活性基剤（例えば、ゼラチンとグリセリン又はスクロースとアラビアゴム）中に有効成分を含む香錠；及び適当な液体キャリヤー中に投与すべき成分を含むマウスウォッシュを包含する。皮膚への局所投与に適した、本発明の組成物の製剤は、製薬的に受容されるキャリヤー中に投与すべき成分を含む軟膏、クリーム、ゲル、ローション及びペーストとして提供することができる。考慮される局所デリバリー系は、投与すべき成分を含有する経皮パッチである。
【００６２】
[0067]膣投与に適した、本発明の態様による組成物の製剤は、本発明の化合物の他に、当該技術分野において適当であると知られるような、製薬的に受容されるキャリヤーを含有するペッサリー、座薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤として提供することができる。
【００６３】
[0068]用語「調節する」又は「調節」は、本明細書では、遺伝子の発現又は活性が、該遺伝子に関連する化合物、成分等によってアップ又はダウン・レギュレーションすることを意味するように用いられる。
【００６４】
[0069]本明細書で用いる限り、用語「プロテインキナーゼ」は、ドナー分子からのリン酸基をタンパク質のアミノ酸残基に転移させることができるトランスフェラーゼ・クラスの酵素を表す。Kostich, M., et al., Human Members of the Eukaryotic Protein Kinase Family, Genome Biology 3(9):research0043.1-0043.12, 2002 を参照のこと。これは、プロテインキナーゼとファミリー／グループ命名法の詳細な考察に関して、本明細書にその全体で援用される。
【００６５】
[0070]本発明の方法及び組成物は、本発明の方法の利益を享受する可能性がある、如何なる哺乳動物による使用のためにも意図される。そのような哺乳動物の中で最も重要なのはヒトであるが、本発明は、そのように限定されることを意図せず、獣医学の使用に適用可能である。このように、本発明によれば、「哺乳動物」又は「必要としている哺乳動物」には、ヒトだけでなく非ヒト哺乳動物、特に、非限定的に、ネコ、イヌ、及びウマを含めた家畜動物が包含される。
【００６６】
[0071] 本明細書で使用するかぎり、「処置する」とは、本発明の化合物を投与された個人の症状を、本発明によって処置されなかった個人の症状と比較して、緩和する、予防する及び／又は逆転することを意味する。本明細書に記載する化合物、組成物及び方法は、その後の療法を決定するために熟練した開業医（医師又は獣医）によって臨床的評価を続けながら、用いるべきであることを開業医は理解するであろう。そのため、開業医は、処置後に、心血管系危険因子又は関連した異常(associated dyregularities)の軽減に何らかの改善があるか否かを標準的方法論に従って評価するであろう。このような評価は、特定の処置用量、投与形式等を増大する、軽減する又は続けるかどうかの評価を助けて、知識を与えるであろう。
【００６７】
[0072] 本発明の化合物を投与される対象が特定の外傷性状態(traumatic state)に苦しむ必要がないことは、理解されるであろう。実際に、本発明の化合物は、症状が発現する前に、予防的に投与することができる。用語「療法的」、「療法的に」及びこれらの用語の置換は、療法的、緩和的並びに予防的使用を包含するために用いられる。従って、本明細書で使用するかぎり、「症状を処置する又は緩和すること」は、本発明の化合物が投与された個人の症状を、そのような投与を受けていない個人の症状と比較して、軽減する、予防する、及び／又は逆転させることを意味する。
【００６８】
[0073] 用語「療法的有効量」は、求める療法的結果を達成するのに有効な投与量での処置を示すために用いられる。さらに、当業者は、本発明の化合物の療法的有効量は、微調整によって、及び／又は本発明の化合物の１つより多くを投与することによって、又は本発明の化合物を別の化合物とともに投与することによって減少又は増加させてよいことを理解するであろう。例えば、Meiner, C. L.「臨床治験：設計、実施、及び解析（Clinical Trials: Design, Conduct, and Analysis）」疫学及び生物統計学の研究論文（Monographs in Epidemiology and Biostatistics）第８巻、オックスフォード大学出版局、アメリカ（1986）を参照のこと。それ故、本発明は、所与の哺乳動物に固有の、特別な緊急事態(particular exigencies)に合わせて投与／処置を調整するための方法を提供する。以下の実施例に例示するように、療法的有効量は、例えば、比較的少ない量で開始することによって、そして有益な効果を同時に評価しながら、段階的に増加することによって経験的に容易に決定することができる。
【００６９】
[0074]本発明による化合物の投与の回数が、例えば、該哺乳動物の年齢、体重及び状態、並びに選択する投与経路といったような、他の臨床要因を包含する、その時々の該患者の特別な医学的状態に基づいて、患者毎に変動するものであることは、当業者によって理解されよう。
【００７０】
[0075]本明細書で使用するかぎり、「症状」は、患者により体験されて、特別な疾患に関連している、身体機能のあらゆる感覚又は変化、即ち、「Ｘ」に付随して、「Ｘ」の存在の指標とみなされるものを意味する。症状が、疾患毎に、又は状態毎に変化するものであることは認識され、理解される。非限定的な例を挙げれば、自己免疫障害に関連した症状には、疲労、眠気、不定愁訴、臓器若しくは組織の大きさの増加（例えば、グレイブス病における甲状腺肥大）、又は臓器若しくは組織の機能低下をもたらす臓器若しくは組織の破壊（例えば、糖尿病では、膵臓の島細胞が破壊される）が含まれる。
【００７１】
[0076]本明細書に使用する「炎症」又は「炎症状態」は、毛細血管拡張、白血球浸潤、発赤、発熱、疼痛、腫脹、及びしばしば機能喪失を特徴として、有害な作用体や傷害された組織の排除を始動させる機序として役立つ、細胞損傷に対する局所応答を意味する。炎症又は炎症状態の代表的な症状には、関節に限定すれば、発赤、触ると温かい腫脹関節、関節の疼痛及び硬直、及び関節機能喪失が含まれる。全身性の炎症応答は、例えば、発熱、悪寒、疲労／体力喪失、頭痛、食欲喪失、及び筋肉硬直のような、「風邪様の(flu-like)」症状をもたらす可能性がある。
【００７２】
[0077]下記実施例は、本発明のある一定の好ましい実施態様を詳しく説明することを意図するものであり、本質的に非限定的である。当業者は、定型的な実験だけを使用して、本明細書に記載の特定の物質及び手順に対する数多くの同等物を認識するか、又は確認することができるであろう。
【実施例１】
【００７３】
[0078]この実施例の目的は、プロテインキナーゼ活性、特に、選択した心血管系危険関連マーカーの発現に関連したプロテインキナーゼ活性に対する、そしてさらに単球−内皮細胞相互作用に対する置換１，３−シクロペンタジオン化合物の効果を測定することであった。
【００７４】
[0079]in vitroキナーゼ活性に対するＭＥＴＡ−０６０の阻害：  ２５μｌの最終反応量で、問題のキナーゼ（５〜１０ｍＵ）を特定の緩衝液とペプチド基質、１０ｍＭ酢酸Ｍｇ及び［γ−３３Ｐ−ＡＴＰ］と共にインキュベートした。ＭｇＡＴＰミックスの添加によって反応を開始させた。室温における４０分間のインキュベーション後に、３％リン酸溶液５μｌの添加によって、反応を停止させた。次に、反応１０μｌをＰ３０フィルターマット(filtermat)上にスポットして、５０ｍＭリン酸中で５分間３回、そしてメタノール中で１回洗浄してから、乾燥させ、シンチレーション測定した。
【００７５】
[0080]ＨＡＥＣ細胞中でのＴＮＦα誘導ＶＣＡＭ１、Ｅ−セレクチン及びＭＣＰ−１に対するＭＥＴＡ−０６０の阻害：  ＨＡＥＣ細胞を種々の濃度のＭＥＴＡ−０６０（１０、５及び１ｍｇ／ｍｌ）と共に１時間プレインキュベートして、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で８時間刺激した。ＶＣＡＭ−１／Ｅ−セレクチン・レベルを、細胞に基づくＥＬＩＳＡによってＶＣＡＭ−１及びＥ−セレクチンに対する抗体を用いて測定して、非刺激（対照）細胞と比べて誘導倍率を算出した。ＭＣＰ−１に関しては、ヒトＭＣＰ−１イムノアッセイキット(R&D Systems)を用いて、細胞培地を測定した。データは、８個の個別サンプルの平均値±ＳＤを表す。
【００７６】
[0081]ＴＮＦα誘導単球−内皮細胞相互作用に対するＭＥＴＡ−０６０の阻害：  ＨＡＥＣｓのコンフルエント単層に対する蛍光標識ヒト単層（ＴＨＰ−１）細胞の接着をマイクロプレートに基づくアッセイの使用によって測定した。ＨＡＥＣ又はＴＨＰ−１細胞をＭＥＴＡ−０６０（１０ｍｇ／ｍｌ）及びパルテノライド（１０ｍＭ）と共に１時間プレインキュベートして、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）によって８時間刺激した。ＴＨＰ−１細胞を蛍光染料ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（１μｍＭ最終濃度；Sigma）によってＨＢＳＳ培地中で４℃において３０分間標識した。次に、細胞を（３７℃）ＨＢＳＳ培地で２回洗浄して、ＥＧＭ２培地中に再懸濁させた。１００，０００ＴＨＰ−１細胞を各ウェル（９６ウェルプレート）に加えて、３０分間インキュベートした。プレートを密封して上下逆に置いて遠心分離することによって、非結合ＴＨＰ−１細胞をＰＢＳによって２回洗浄した。ＢＣＥＣＦ−ＡＭ標識ＴＨＰ−１細胞に関する標準曲線を作成した。ＰＢＳ２００μｌを各ウェルに加え、Ｖｅｃｔｏｒ２（Perkin Elmer）蛍光プレートリーダー（励起：４８５ｎｍ；発光：５３５ｎｍ）を用いて、蛍光を測定した。ＴＨＰ−１刺激：（Ａ）ＴＨＰ−１細胞、刺激なし、（Ｂ）ＴＨＰ−１細胞、ＴＮＦαにより刺激、（Ｃ）ＴＨＰ−１細胞、パルテノライド（１０μｇ／ｍｌ）とＴＮＦαにより刺激、（Ｄ）ＴＨＰ−１細胞、ＭＥＴＡ−０６０（１０μｇ／ｍｌ）とＴＮＦαにより刺激。データは、６個の個別サンプルの平均値±ＳＤを表す。
【００７７】
[0082]結果：  結果は図１〜３と以下の表２に示す。
【００７８】
表２：
１０ｉＭ（Ｇ１０）における８５キナーゼに対する４０阻害剤（サポート情報参照）のジニ係数とヒット率（＞５０％阻害）
【００７９】
【表３】
2011516492.tif 000004
【００８０】
【表４】
2011516492.tif 000005
【００８１】
[0083]記載したデータは、Ｍｅｔａ−０６０が（ａ）内皮細胞中でのＴＮＦα仲介のＭＣＰ−１、ＶＣＡＭ−１及びＥ−セレクチン発現を阻害する；（ｂ）ＴＮＦα仲介のＴＨＰ−１−ＨＡＥＣ細胞相互作用を阻害する；（ｃ）炎症シグナリング経路に関与するキナーゼ（例えば、ＰＫＣｂＩＩ、ＮＦ−κＢ、ＰＩ３Ｋ及びＧＳＫ３）を阻害する；そして（ｄ）１３μＭ濃度における０．８１のジニ係数値は、ＭＥＴＡ−０６０がキナーゼ阻害に高い特異性を示すことを提示する。
【００８２】
[0084]キナーゼ阻害剤の開発は、それらが特異性を相対的に有さず[Bain, Biochem J 2003, Graczek 2007]、その結果、オフターゲット副作用を生じることによって複雑化される。レビュー文献では、Ｇｒａｃｚｅｋが、一連のキナーゼに対するキナーゼ阻害剤の特異性を予測するための方法として、ジニ係数（０＝特異性なし、１＝最高の特異性）を提案している。４０種類の商業的に入手可能な阻害剤を、０．１〜０．８の範囲のジニ係数を有する８５種類のキナーゼの阻害に関して試験した。比較のために、本明細書に加える。
【実施例２】
【００８３】
[0085]この研究の目的は、単球−内皮細胞相互作用と、単球細胞、ＴＨＰ−１におけるＭＣＰ−１及びＭＭＰ−９レベルの発現とに対する置換１，３−シクロペンタジオン化合物の効果を評価することであった。さらに、ＴＮＦα活性化ＴＨＰ−１細胞における種々な炎症遺伝子の発現と無細胞酵素アッセイ(cell free enzyme assays)における２５０超のキナーゼのin vitroキナーゼ・スクリーニングを評価した。
【００８４】
[0086]ＴＨＰ−１とＨＡＥＣ細胞相互作用：  （Ａ）ヒト単球細胞系、ＴＨＰ−１を、低（５ｍＭ）グルコース及び高（２５ｍＭ）グルコースと共に８日間インキュベートした。ＴＨＰ−１細胞をＴＨＩＡＡによって８時間処理した。（Ｂ）ＴＨＰ−１細胞を試験化合物の１時間の存在下及び非存在下で、ＴＮＦαによって８時間活性化した。細胞をＢＣＥＣＦで３０分間標識して、ヒト内皮細胞（ＨＡＥＣ）の単層上に３０分間加えた。ウェルに結合したＴＨＰ−１細胞数をＢＣＥＣＦ標識ＴＨＰ−１細胞からの標準曲線を用いて測定して、誘導倍率を８サンプルの平均値から算出した。
【００８５】
[0087]ＭＣＰ−１発現：  ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）及びサイトカイン（ＴＮＦα、Ｉｌ−１ｂ及びＩＦＮｇ、各１０ｎｇ／ｍｌ）誘導ＭＣＰ−１産生に対するＭＥＴＡ−０６０阻害。細胞を種々な濃度のＭＥＴＡ−０６０と共に１時間プレインキュベートして、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）によって２４時間刺激した。ＭＣＰ−１レベルをヒトＭＣＰ−１イムノアッセイ・キット（R&D System）を用いて測定した。データは、８サンプルの平均値±ＳＤを表す。
【００８６】
[0088]ＭＭＰ−９発現：  ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）誘導ＭＭＰ−９産生に対するＭＥＴＡ−０６０阻害。細胞を種々な濃度のＭＥＴＡ−０６０と共に１時間プレインキュベートして、（Ａ）ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）又は（Ｂ）ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）によって２４時間刺激した。培地中のＭＭＰ−９レベルをヒトＭＭＰ−９イムノアッセイ・キット（GE Healthcare）を用いて測定した。データは、代表的な実験の平均値±ＳＤを表す。ＭＭＰ−９活性に関しては、（Ｃ）ＬＰＳ条件培地にＮｏｖｅｘ緩衝液(Invitrogen)を１：１で混合して、これを０．１％ゼラチン含有１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で電気泳動にかけた。ＳＤＳをＴｒｉｔｏｎＸ−１００（２．５％）に交換して、続いて、活性化緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６；５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２；０．２ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ；及び０．０２％Ｂｒｉｊ）中３７℃において２４時間インキュベーションすることによって、ゲルを再生した。続いて、ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色溶液（０．５％Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｒ２５０；３０％ＭｅＯＨ；１０％酢酸）によって２時間染色した後、脱染した（５０％ＭｅＯＨと１０％酢酸）。
【００８７】
[0089]電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）：  ＴＨＰ−１細胞を試験化合物と共に１時間プレインキュベートし、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）によって２時間刺激した。本質的にDignam, et al（Nucl. Acids. Res 11:1475-1489)が記載しているとおりに、核抽出物を調製して、ＤＮＡへのＮＦκＢ結合を電気泳動移動度シフト解析を用いて、標識ＮＦκＢコンセンサスＤＮＡプローブ(5`AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC)によって評価した。
【００８８】
[0090]ＴＨＰ−１細胞におけるタンパク質リン酸化の制御：  ６ウェル・プレートにＴＨＰ−１細胞を接種して、ＭＥＴＡ−０６０（２０μｇ／ｍｌ）の存在下及び不存在下で１時間プレインキュベートし、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）によって１時間刺激した。細胞溶解物(cell lysates)を、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  ＭＡＰテクノロジー(Millipore, Billerica, MA)からのユーザー・マニュアルの指示に従って調製した。Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇキットを用いて、細胞溶解物中のリン酸化Erk/MAPキナーゼ1/2 (Thr185/Tyr187)、STAT3 (Ser727)、 STAT5A/B (Tyr694/699)、JNK (Thr183/Tyr185)、p70 S6 キナーゼ (Thr412) 及びp38 (Thr180/Tyr182)の変化を、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムによって検出する。細胞溶解物（２５μｇ／ウェル）を用いて、該溶解物中のリンタンパク質を指示に従って測定して、対照として無刺激サンプルを用いて、誘導倍率を算出した（表３と４）。
【００８９】
表３：
ＴＨＰ−１細胞中のＴＮＦα仲介タンパク質リン酸化に対するＭｅｔａ０６０の効果
【００９０】
【表５】
2011516492.tif 000006
【００９１】
表４：
ＴＨＰ−１細胞中のＬＰＳ仲介タンパク質リン酸化に対するＭｅｔａ０６０の効果
【００９２】
【表６】
2011516492.tif 000007
【００９３】
[0091]ＴＨＰ−１細胞における転写因子の制御：  ＴＨＰ−１細胞を１００ｍｍディッシュ中に接種し、ＭＥＴＡ−０６０（１０ｍｇ／ｍｌ）と共に１時間プレインキュベートして、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）によって２時間刺激した。核抽出物をユーザー・マニュアル(Panomics, CA)の指示に従って調製した。転写因子をＰｒｏｃａｒｔａ（登録商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐｌｅｘパネル 1 (Panomics, CA)を用いて、製造者の使用説明書に従って、Ｌｕｍｉｎｅｘ２００によって測定した。３回の測定から誘導倍率を測定した。ＴＦＩＩＤを内部標準として用い、無刺激サンプルを用いて、誘導倍率を算出した。データは表５と６に示す。
【００９４】
表５：
ＴＨＰ−１細胞中のＴＮＦα仲介転写因子に対するＭｅｔａ０６０の効果
【００９５】
【表７】
2011516492.tif 000008
【００９６】
【表８】
2011516492.tif 000009
【００９７】
表６：
ＴＨＰ−１細胞中のＬＰＳ仲介転写因子に対するＭｅｔａ０６０の効果
【００９８】
【表９】
2011516492.tif 000010
【００９９】
【表１０】
2011516492.tif 000011
【０１００】
【表１１】
2011516492.tif 000012
【０１０１】
[0092]ヒト遺伝子アレイ分析：  ＴＨＰ−１細胞をＭＥＴＡ０６０（１０ｍｇ／ｍｌ）又はパルテノライド（１０ｍＭ）と共に１時間プレインキュベートして、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）によって４時間刺激した。遺伝子を、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムアレイＵ１３３Ａ２．０を用いて分析して、〜２２，０００転写物(transcripts)を測定した（Expression Analysis Inc, North Carolinaによる)。内皮と単球の相互作用を活性化すると知られている遺伝子を示した。各値は２回の独立した測定の平均値を表す。
【０１０２】
[0093]結果：  この実施例の結果を図４〜８と表７に示す、この結果は、ＭＥＴＡ０６０が（ａ）高血糖症とＴＮＦα仲介ＴＨＰ−１−ＨＡＥＣ細胞相互作用；（ｂ）サイトカインとＬＰＳ仲介ＭＣＰ−１分泌；（ｃ）ＴＮＦαとＬＰＳ活性化ＭＭＰ−９レベル；（ｄ）ＬＰＳ仲介ＮＦκＢ結合；及び（ｅ）ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦα仲介炎症遺伝子（ＭＣＰ−１、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＭＭＰ−９及びＴＮＦαを包含する）を阻害することを実証する。
【０１０３】
表７
【０１０４】
【表１２】
2011516492.tif 000013
【０１０５】
【表１３】
2011516492.tif 000014
【０１０６】
【表１４】
2011516492.tif 000015
【０１０７】
【表１５】
2011516492.tif 000016
【０１０８】
【表１６】
2011516492.tif 000017
【０１０９】
【表１７】
2011516492.tif 000018
【０１１０】
【表１８】
2011516492.tif 000019
【０１１１】
【表１９】
2011516492.tif 000020
【０１１２】
【表２０】
2011516492.tif 000021
【０１１３】
【表２１】
2011516492.tif 000022
【０１１４】
【表２２】
2011516492.tif 000023
【０１１５】
【表２３】
2011516492.tif 000024
【０１１６】
【表２４】
2011516492.tif 000025
【０１１７】
【表２５】
2011516492.tif 000026
【０１１８】
【表２６】
2011516492.tif 000027
【０１１９】
【表２７】
2011516492.tif 000028
【０１２０】
【表２８】
2011516492.tif 000029
【０１２１】
【表２９】
2011516492.tif 000030
【０１２２】
【表３０】
2011516492.tif 000031
【０１２３】
【表３１】
2011516492.tif 000032
【０１２４】
【表３２】
2011516492.tif 000033
【０１２５】
【表３３】
2011516492.tif 000034
【０１２６】
【表３４】
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【０１２７】
【表３５】
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【０１２８】
【表３６】
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【０１２９】
【表３７】
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【０１３０】
【表３８】
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【０１３１】
【表３９】
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【０１３２】
【表４０】
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【０１３３】
【表４１】
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【０１３４】
【表４２】
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【０１３５】
【表４３】
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【０１３６】
【表４４】
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【０１３７】
【表４５】
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【０１３８】
【表４６】
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【０１３９】
【表４７】
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【０１４０】
【表４８】
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【０１４１】
【表４９】
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【０１４２】
【表５０】
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【０１４３】
【表５１】
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【０１４４】
【表５２】
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【０１４５】
【表５３】
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【０１４６】
【表５４】
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【０１４７】
【表５５】
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【０１４８】
【表５６】
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【０１４９】
【表５７】
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【０１５０】
【表５８】
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【０１５１】
【表５９】
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【０１５２】
【表６０】
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【０１５３】
【表６１】
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【０１５４】
【表６２】
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【０１５５】
【表６３】
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【０１５６】
【表６４】
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【０１５７】
【表６５】
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【０１５８】
【表６６】
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【０１５９】
【表６７】
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【０１６０】
【表６８】
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【０１６１】
【表６９】
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【０１６２】
【表７０】
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【０１６３】
【表７１】
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【０１６４】
【表７２】
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【０１６５】
【表７３】
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【０１６６】
【表７４】
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【０１６７】
【表７５】
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【０１６８】
【表７６】
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【０１６９】
【表７７】
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【０１７０】
【表７８】
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【０１７１】
【表７９】
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【０１７２】
【表８０】
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【０１７３】
【表８１】
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【０１７４】
【表８２】
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【０１７５】
【表８３】
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【０１７６】
【表８４】
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【０１７７】
【表８５】
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【０１７８】
【表８６】
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【０１７９】
【表８７】
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【０１８０】
【表８８】
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【０１８１】
【表８９】
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【０１８２】
【表９０】
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【０１８３】
【表９１】
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【０１８４】
【表９２】
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【０１８５】
【表９３】
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【０１８６】
【表９４】
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【０１８７】
【表９５】
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【０１８８】
【表９６】
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【０１８９】
【表９７】
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【０１９０】
【表９８】
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【０１９１】
【表９９】
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【０１９２】
【表１００】
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【０１９３】
【表１０１】
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【０１９４】
【表１０２】
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【０１９５】
【表１０３】
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【０１９６】
【表１０４】
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【０１９７】
【表１０５】
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【０１９８】
【表１０６】
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【０１９９】
【表１０７】
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【０２００】
【表１０８】
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【０２０１】
【表１０９】
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【０２０２】
【表１１０】
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【０２０３】
【表１１１】
2011516492.tif 000112
【０２０４】
【表１１２】
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【０２０５】
【表１１３】
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【０２０６】
【表１１４】
2011516492.tif 000115
【０２０７】
【表１１５】
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【０２０８】
【表１１６】
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【０２０９】
【表１１７】
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【０２１０】
【表１１８】
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【０２１１】
【表１１９】
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【０２１２】
【表１２０】
2011516492.tif 000121
【０２１３】
【表１２１】
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【０２１４】
【表１２２】
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【０２１５】
【表１２３】
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【０２１６】
【表１２４】
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【０２１７】
【表１２５】
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【０２１８】
【表１２６】
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【０２１９】
【表１２７】
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【０２２０】
【表１２８】
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【０２２１】
【表１２９】
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【０２２２】
【表１３０】
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【０２２３】
【表１３１】
2011516492.tif 000132
【０２２４】
【表１３２】
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【０２２５】
【表１３３】
2011516492.tif 000134
【０２２６】
【表１３４】
2011516492.tif 000135
【０２２７】
【表１３５】
2011516492.tif 000136
【０２２８】
【表１３６】
2011516492.tif 000137
【０２２９】
【表１３７】
2011516492.tif 000138
【０２３０】
【表１３８】
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【０２３１】
【表１３９】
2011516492.tif 000140
【０２３２】
【表１４０】
2011516492.tif 000141
【０２３３】
【表１４１】
2011516492.tif 000142
【０２３４】
【表１４２】
2011516492.tif 000143
【０２３５】
【表１４３】
2011516492.tif 000144
【０２３６】
【表１４４】
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【０２３７】
【表１４５】
2011516492.tif 000146
【０２３８】
【表１４６】
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【０２３９】
【表１４７】
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【０２４０】
【表１４８】
2011516492.tif 000149
【０２４１】
【表１４９】
2011516492.tif 000150
【０２４２】
【表１５０】
2011516492.tif 000151
【０２４３】
【表１５１】
2011516492.tif 000152
【０２４４】
【表１５２】
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【０２４５】
【表１５３】
2011516492.tif 000154
【０２４６】
【表１５４】
2011516492.tif 000155
【０２４７】
【表１５５】
2011516492.tif 000156
【０２４８】
【表１５６】
2011516492.tif 000157
【０２４９】
【表１５７】
2011516492.tif 000158
【０２５０】
【表１５８】
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【０２５１】
【表１５９】
2011516492.tif 000160
【０２５２】
【表１６０】
2011516492.tif 000161
【０２５３】
【表１６１】
2011516492.tif 000162
【０２５４】
【表１６２】
2011516492.tif 000163
【０２５５】
【表１６３】
2011516492.tif 000164
【０２５６】
【表１６４】
2011516492.tif 000165
【０２５７】
【表１６５】
2011516492.tif 000166
【０２５８】
【表１６６】
2011516492.tif 000167
【０２５９】
【表１６７】
2011516492.tif 000168
【０２６０】
【表１６８】
2011516492.tif 000169
【０２６１】
【表１６９】
2011516492.tif 000170
【０２６２】
【表１７０】
2011516492.tif 000171
【０２６３】
【表１７１】
2011516492.tif 000172
【０２６４】
【表１７２】
2011516492.tif 000173
【０２６５】
【表１７３】
2011516492.tif 000174
【０２６６】
【表１７４】
2011516492.tif 000175
【０２６７】
【表１７５】
2011516492.tif 000176
【０２６８】
【表１７６】
2011516492.tif 000177
【０２６９】
【表１７７】
2011516492.tif 000178
【０２７０】
【表１７８】
2011516492.tif 000179
【０２７１】
【表１７９】
2011516492.tif 000180
【０２７２】
【表１８０】
2011516492.tif 000181
【０２７３】
【表１８１】
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【０２７４】
【表１８２】
2011516492.tif 000183
【０２７５】
【表１８３】
2011516492.tif 000184
【０２７６】
【表１８４】
2011516492.tif 000185
【０２７７】
【表１８５】
2011516492.tif 000186
【０２７８】
【表１８６】
2011516492.tif 000187
【０２７９】
【表１８７】
2011516492.tif 000188
【０２８０】
【表１８８】
2011516492.tif 000189
【０２８１】
【表１８９】
2011516492.tif 000190
【０２８２】
【表１９０】
2011516492.tif 000191
【０２８３】
【表１９１】
2011516492.tif 000192
【０２８４】
【表１９２】
2011516492.tif 000193
【０２８５】
【表１９３】
2011516492.tif 000194
【０２８６】
【表１９４】
2011516492.tif 000195
【０２８７】
【表１９５】
2011516492.tif 000196
【０２８８】
【表１９６】
2011516492.tif 000197
【０２８９】
【表１９７】
2011516492.tif 000198
【０２９０】
【表１９８】
2011516492.tif 000199
【０２９１】
【表１９９】
2011516492.tif 000200
【０２９２】
【表２００】
2011516492.tif 000201
【０２９３】
【表２０１】
2011516492.tif 000202
【０２９４】
【表２０２】
2011516492.tif 000203
【０２９５】
【表２０３】
2011516492.tif 000204
【実施例３】
【０２９６】
気管支動脈流量依存性拡張に対するテトラヒドロ−イソアルファ酸の効果
[0094]この研究の目的は、テトラヒドロ−イソアルファ酸（１００ｍｇ）経口投与の、気管支動脈内皮応答性（心血管系危険性の尺度）に対する効果を評価することであった。
【０２９７】
[0095]気管支動脈流量依存性応答性は、Ｓｏｎｏｓｉｔｅ  ＭｉｃｒｏＭａｘｘ超音波装置を用いて、Corretti ,MC.らによる「気管支動脈の内皮依存性流量依存性血管拡張の超音波評価のガイドライン−A Report of the International Brachial Artery Reactive Task Force.」 J. Am. Coll. Cadiol. 2002; 39(2):257-65に紹介されている手段に従って、流量依存性血管拡張を測定することによって評価した。簡単に説明すると、収縮期圧を５０ｍｍＨｇ超えるまでに膨張させた血圧カフを用いて、虚血を気管支動脈内に誘導して、基準と充血後の流量(flow rate)を超音波によって測定した。テトラヒドロ−イソアルファ酸１０５６ｍｇを経口投与した後１〜２時間に試験を繰り返した。
【０２９８】
[0096]結果：  対象は、テトラヒドロ−イソアルファ酸の投与前に基準から観察された流量を超えて流量の４０．２％増加［１００ｘ比率：（充血流量−基準の低流量）／基準流量として計算］を有することが認められた。テトラヒドロ−イソアルファ酸の投与後１〜２時間に、基準から流量の６３．３％増加［１００ｘ比率：（充血流量−基準の低流量）／基準流量として計算］が観察された。これは基準に比べて５７％の流量の上昇である。さらに、テトラヒドロ−イソアルファ酸の投与が、非処置個体のピーク充血後流量に比べて、ピーク充血後流量の２８．２％増加を生じたことが認められた。この流量増加は、このプロトコル中に血圧と心拍数が比較的定常に留まるかぎりにおいて、血管直径の増加に帰することができる。
【図１】
2011516492.tif 000205
【図２】
2011516492.tif 000206
【図３】
2011516492.tif 000207
【図４】
2011516492.tif 000208
【図５】
2011516492.tif 000209
【図６Ａ】
2011516492.tif 000210
【図６Ｂ】
2011516492.tif 000211
【図６Ｃ】
2011516492.tif 000212
【図７】
2011516492.tif 000213
【図８】
2011516492.tif 000214
【国際調査報告】
2011516492.tif 000215