(57)【要約】本開示は、リソソームの活性化に関する技術を提供する。本開示は、リソソーム酵素のレベルおよび/または活性を増加させる戦略を提供し、したがって、ある種のプロテイノパチーの処置および/または予防におけるこのような戦略の驚くべき適用性を実証する。とりわけ、本発明は、リソソームの活性化によって、リソソーム蓄積疾患以外のプロテイノパチーを処置および/または予防するための方法および組成物を提供する。特に、本開示は、神経変性プロテイノパチー、特にα-シヌクレインの蓄積を伴う神経変性プロテイノパチーを処置および/または予防するための方法および組成物を提供する。本開示は、具体的には、パーキンソン病を処置および/または予防するための方法および組成物を提供する。2014523881.tif 000063
2014523881.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に、
リソソーム活性化剤;および
薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物を投与する段階を含む方法であって、
該リソソーム活性化剤が、所定の投与レジメンに従って投与された場合に所定の治療効果と相関する投与レジメンに従って、かつ一定量で投与される、方法。
【請求項２】
神経変性プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態が、以下からなる群より選択される、請求項1記載の方法:
副腎白質ジストロフィー、AIDSおよびAIDS関連認知症、嗜銀顆粒性疾患、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(グアム-パーキンソニズム認知症複合またはリティコ・ボディグ(Lytico-Bodig)病)、大動脈中膜アミロイド、感情鈍麻、アテローム性動脈硬化症、注意欠陥障害(ADD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、自閉症、自己免疫性血管炎、B12欠乏症、双極性障害、ウシ海綿状脳症、脳腫瘍、脳病変、心不整脈、脳血管疾患、脳アミロイドアンギオパチー(およびアイスランド型)、電気痙攣ショック療法による認知機能障害、化学療法による認知機能障害、薬物乱用歴による認知機能障害、睡眠時無呼吸による覚醒時認知機能障害、無酸素症後合併症、脳内出血による合併症、大脳皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、ボクサー認知症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、鬱病、真性糖尿病2型、透析関連アミロイドーシス、びまん性レビー小体病、ダウン症候群、失読症、癲癇、家族性アミロイド多発ニューロパチー、フィンランド型アミロイドーシス、葉酸欠乏症、脆弱X症候群、脆弱X関連振戦/運動失調症候群、脆弱XE精神遅滞、前頭葉症候群、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、フリードライヒ運動失調症、神経節膠腫、ハレルフォルデン・シュパッツ病、肝病態、遺伝性非ニューロパチー性全身性アミロイドーシス、ハンチントン病、低血糖症、高カルシウム血症、甲状腺機能低下症、水頭症、封入体筋炎、感染性血管炎、クッフス病、Kufor-Rakeb病、孤立性心房性アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、鉛脳症、レビー小体病、アルツハイマー病のレビー小体変異型(Lewy body mutant)、リポフスチン症、ライム病、栄養失調症、メープルシロップ尿症、甲状腺髄様癌、髄膜血管腫症、代謝疾患、軽度認知機能障害、多発脳梗塞性認知症、多発性硬化症、多系統萎縮症、重症筋無力症、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、神経梅毒、I型脳内鉄蓄積を伴う神経変性、ナイアシン欠乏症、パーキンソン病およびパーキンソン病認知症、ピック病、フェニルケトン尿症、リウマチ性多発筋痛症、心的外傷後ストレス障害、プリオン病(クロイツフェルト・ヤコブ病)、プロラクチノーマ、冠動脈バイパス移植術後、進行性核上性麻痺、正常な老化によるタンパク質および脂質蓄積、レット症候群、関節リウマチ、統合失調症、全身性エリテマトーデス、脊髄小脳失調症(1〜8型、10〜14型、16〜29型)、球脊髄性筋萎縮症(ケネディ病)、孤発性封入体筋炎、蓄積疾患、脳卒中、亜急性硬化性全脳炎、梅毒、全身性ALアミロイドーシス、チアミン欠乏症、外傷性脳損傷、トゥレット症候群、伝達性海綿状脳症、結節性硬化症、ならびに血管性認知症。
【請求項３】
神経変性プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態がシヌクレイノパチーである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
シヌクレイノパチー疾患、障害、および/または状態がパーキンソン病である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
シヌクレイノパチー疾患、障害、および/または状態が多系統萎縮症である、請求項3記載の方法。
【請求項６】
シヌクレイノパチー疾患、障害、および/または状態がびまん性レビー小体病である、請求項3記載の方法。
【請求項７】
シヌクレイノパチー疾患、障害、および/または状態がレビー小体型認知症である、請求項3記載の方法。
【請求項８】
シヌクレイノパチー疾患、障害、および/または状態がI型脳内鉄蓄積を伴う神経変性である、請求項3記載の方法。
【請求項９】
シヌクレイノパチー疾患、障害、および/または状態がグアム-パーキンソニズム認知症複合である、請求項3記載の方法。
【請求項１０】
神経変性プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態がアミロイドパチーである、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
アミロイドパチー疾患、障害、および/または状態が、以下からなる群より選択される、請求項10記載の方法:
副腎白質ジストロフィー、AIDSおよびAIDS関連認知症、嗜銀顆粒性疾患、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(グアム-パーキンソニズム認知症複合またはリティコ・ボディグ病)、大動脈中膜アミロイド、感情鈍麻、アテローム性動脈硬化症、注意欠陥障害(ADD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、自閉症、自己免疫性血管炎、B12欠乏症、双極性障害、ウシ海綿状脳症、脳腫瘍、脳病変、心不整脈、脳血管疾患、脳アミロイドアンギオパチー(およびアイスランド型)、電気痙攣ショック療法による認知機能障害、化学療法による認知機能障害、薬物乱用歴による認知機能障害、睡眠時無呼吸による覚醒時認知機能障害、無酸素症後合併症、脳内出血による合併症、大脳皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、ボクサー認知症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、鬱病、真性糖尿病2型、透析関連アミロイドーシス、びまん性レビー小体病、ダウン症候群、失読症、癲癇、家族性アミロイド多発ニューロパチー、フィンランド型アミロイドーシス、葉酸欠乏症、脆弱X症候群、脆弱X関連振戦/運動失調症候群、脆弱XE精神遅滞、前頭葉症候群、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、フリードライヒ運動失調症、神経節膠腫、ハレルフォルデン・シュパッツ病、肝病態、遺伝性非ニューロパチー性全身性アミロイドーシス、ハンチントン病、低血糖症、高カルシウム血症、甲状腺機能低下症、水頭症、封入体筋炎、感染性血管炎、クッフス病、Kufor-Rakeb病、孤立性心房性アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、鉛脳症、レビー小体病、アルツハイマー病のレビー小体変異型、リポフスチン症、ライム病、栄養失調症、メープルシロップ尿症、甲状腺髄様癌、髄膜血管腫症、代謝疾患、軽度認知機能障害、多発脳梗塞性認知症、多発性硬化症、多系統萎縮症、重症筋無力症、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、神経梅毒、I型脳内鉄蓄積を伴う神経変性、ナイアシン欠乏症、パーキンソン病およびパーキンソン病認知症、ピック病、フェニルケトン尿症、リウマチ性多発筋痛症、心的外傷後ストレス障害、プリオン病(クロイツフェルト・ヤコブ病)、プロラクチノーマ、冠動脈バイパス移植術後、進行性核上性麻痺、正常な老化によるタンパク質および脂質蓄積、レット症候群、関節リウマチ、統合失調症、全身性エリテマトーデス、脊髄小脳失調症(1〜8型、10〜14型、16〜29型)、球脊髄性筋萎縮症(ケネディ病)、孤発性封入体筋炎、蓄積疾患、脳卒中、亜急性硬化性全脳炎、梅毒、全身性ALアミロイドーシス、チアミン欠乏症、外傷性脳損傷、トゥレット症候群、伝達性海綿状脳症、結節性硬化症、ならびに血管性認知症。
【請求項１２】
アミロイドパチー疾患、障害、および/または状態がアルツハイマー病である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
アミロイドパチー疾患、障害、および/または状態が血管性認知症である、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
アミロイドパチー疾患、障害、および/または状態が認知機能障害である、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
神経変性プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態がタウオパチーである、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
タウオパチー疾患、障害、および/または状態が、以下からなる群より選択される、請求項15記載の方法:
副腎白質ジストロフィー、AIDSおよびAIDS関連認知症、嗜銀顆粒性疾患、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(グアム-パーキンソニズム認知症複合またはリティコ・ボディグ病)、大動脈中膜アミロイド、感情鈍麻、アテローム性動脈硬化症、注意欠陥障害(ADD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、自閉症、自己免疫性血管炎、B12欠乏症、双極性障害、ウシ海綿状脳症、脳腫瘍、脳病変、心不整脈、脳血管疾患、脳アミロイドアンギオパチー(およびアイスランド型)、電気痙攣ショック療法による認知機能障害、化学療法による認知機能障害、薬物乱用歴による認知機能障害、睡眠時無呼吸による覚醒時認知機能障害、無酸素症後合併症、脳内出血による合併症、大脳皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、ボクサー認知症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、鬱病、真性糖尿病2型、透析関連アミロイドーシス、びまん性レビー小体病、ダウン症候群、失読症、癲癇、家族性アミロイド多発ニューロパチー、フィンランド型アミロイドーシス、葉酸欠乏症、脆弱X症候群、脆弱X関連振戦/運動失調症候群、脆弱XE精神遅滞、前頭葉症候群、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、フリードライヒ運動失調症、神経節膠腫、ハレルフォルデン・シュパッツ病、肝病態、遺伝性非ニューロパチー性全身性アミロイドーシス、ハンチントン病、低血糖症、高カルシウム血症、甲状腺機能低下症、水頭症、封入体筋炎、感染性血管炎、クッフス病、Kufor-Rakeb病、孤立性心房性アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、鉛脳症、レビー小体病、アルツハイマー病のレビー小体変異型、リポフスチン症、ライム病、栄養失調症、メープルシロップ尿症、甲状腺髄様癌、髄膜血管腫症、代謝疾患、軽度認知機能障害、多発脳梗塞性認知症、多発性硬化症、多系統萎縮症、重症筋無力症、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、神経梅毒、I型脳内鉄蓄積を伴う神経変性、ナイアシン欠乏症、パーキンソン病およびパーキンソン病認知症、ピック病、フェニルケトン尿症、リウマチ性多発筋痛症、心的外傷後ストレス障害、プリオン病(クロイツフェルト・ヤコブ病)、プロラクチノーマ、冠動脈バイパス移植術後、進行性核上性麻痺、正常な老化によるタンパク質および脂質蓄積、レット症候群、関節リウマチ、統合失調症、全身性エリテマトーデス、脊髄小脳失調症(1〜8型、10〜14型、16〜29型)、球脊髄性筋萎縮症(ケネディ病)、孤発性封入体筋炎、蓄積疾患、脳卒中、亜急性硬化性全脳炎、梅毒、全身性ALアミロイドーシス、チアミン欠乏症、外傷性脳損傷、トゥレット症候群、伝達性海綿状脳症、結節性硬化症、ならびに血管性認知症。
【請求項１７】
タウオパチー疾患、障害、および/または状態がアルツハイマー病である、請求項15記載の方法。
【請求項１８】
リソソーム活性化剤;および
薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象におけるα-シヌクレインレベルを減少させる方法であって、
該リソソーム活性化剤が、所定の投与レジメンに従って投与された場合に所定の治療効果と相関する投与レジメンに従って、かつ一定量で投与される、方法。
【請求項１９】
投与する段階の前に、個体におけるα-シヌクレインレベルを決定する段階をさらに含む方法であって、該α-シヌクレインレベルが参照値と比較して上昇している場合に、リソソーム活性化剤および薬学的に許容される担体を対象に投与する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
リソソーム活性化剤が、少なくとも1つのリソソーム酵素の輸送を増加させる、請求項1、18、または19記載の方法。
【請求項２１】
リソソーム活性化剤が、少なくとも1つのリソソーム酵素の安定性を増加させる、請求項1、18、または19記載の方法。
【請求項２２】
リソソーム活性化剤が、リソソーム中のリソソーム酵素のレベルを増加させる、請求項20または21記載の方法。
【請求項２３】
リソソーム活性化剤が、リソソーム中のリソソーム酵素の活性を増加させる、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
リソソーム活性化剤が、リソソーム酵素のその基質への結合を増加させる、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
リソソーム活性化剤がリソソーム酵素に直接結合する、請求項1、18、19、20、または21記載の方法。
【請求項２６】
リソソーム活性化剤がリソソーム酵素に直接結合しない、請求項1、18、19、20、または21記載の方法。
【請求項２７】
リソソーム活性化剤が、リソソーム酵素の触媒部位または活性部位から離れた部位に結合する、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
リソソーム活性化剤が、リソソーム酵素の基質と競合せずに結合する、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
リソソーム酵素がβ-グルコセレブロシダーゼである、請求項20または21記載の方法。
【請求項３０】
β-グルコセレブロシダーゼが野生型である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
β-グルコセレブロシダーゼが変異体である、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
リソソーム活性化剤がβ-グルコセレブロシダーゼを活性化させる、請求項1、18、19、20、または21記載の方法。
【請求項３３】
リソソーム酵素がβ-ヘキソサミニダーゼA/Bである、請求項20または21記載の方法。
【請求項３４】
β-ヘキソサミニダーゼA/Bが野生型である、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
β-ヘキソサミニダーゼA/Bが変異体である、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
リソソーム活性化剤がβ-ヘキソサミニダーゼA/Bを活性化させる、請求項1、18、19、20、または21記載の方法。
【請求項３７】
リソソーム酵素がβ-ガラクトシダーゼアイソフォーム1である、請求項20または21記載の方法。
【請求項３８】
β-ガラクトシダーゼアイソフォーム1が野生型である、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
β-ガラクトシダーゼアイソフォーム1が変異体である、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
リソソーム活性化剤がβ-ガラクトシダーゼアイソフォーム1を活性化させる、請求項1、18、19、20、または21記載の方法。
【請求項４１】
リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドであるか、またはRab1aポリペプチドを含む、請求項20記載の方法。
【請求項４２】
リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドをコードする核酸であるか、またはRab1aポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項20記載の方法。
【請求項４３】
リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドを活性化させる、請求項20記載の方法。
【請求項４４】
リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチド阻害因子を阻害する、請求項20記載の方法。
【請求項４５】
リソソーム活性化剤がサポシンポリペプチドであるか、またはサポシンポリペプチドを含む、請求項21記載の方法。
【請求項４６】
リソソーム活性化剤がサポシンポリペプチドを活性化させる、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
リソソーム活性化剤がサポシンポリペプチド阻害因子を阻害する、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
サポシンポリペプチドがサポシンCであるか、またはサポシンCを含む、請求項45記載の方法。
【請求項４９】
リソソーム活性化剤が小分子である、請求項1、18、19、20、または21記載の方法。
【請求項５０】
小分子が標的リソソーム酵素に直接結合する、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
小分子が、標的リソソーム酵素の基質と競合せずに該酵素に結合する、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
小分子が、標的リソソーム酵素の活性を阻害しない、請求項49記載の方法。
【請求項５３】
リソソーム酵素がβ-グルコセレブロシダーゼである、請求項50、51、または52記載の方法。
【請求項５４】
リソソーム酵素がβ-ヘキソサミニダーゼA/Bである、請求項50、51、または52記載の方法。
【請求項５５】
リソソーム酵素がβ-ガラクトシダーゼアイソフォーム1である、請求項50、51、または52記載の方法。
【請求項５６】
リソソーム活性化剤が下記式を有する化合物またはその薬学的に許容される塩である、請求項49記載の方法:
2014523881.tif 000059
式中、環
2014523881.tif 000060
は、R5が置換されていてもよいビニル基でありかつR6およびR7が下記定義を有する式
2014523881.tif 000061
(i)、またはR5、R6、およびR7が下記定義を有する式
2014523881.tif 000062
(ii)の環系であり、
R1は、(単環式または二環式の炭素環)C0-C4アルキルまたは(単環式または二環式の複素環)C0-C4アルキルであり、これらはそれぞれ非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、-CHO、-COOH、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C2-C6アルカノイル、モノ-またはジ-C1-C6アルキルアミノ、モノ-またはジ-C1-C6アルキルカルボキサミド、C1-C6アルキルエステル、C1-C6アルキルチオ、C1-C6アルキルスルホニル、C1-C2ハロアルキル、およびC1-C2ハロアルコキシから独立して選択される1個または複数個の置換基、ならびにY-Z-から選択される0個もしくは1個の置換基で置換されており、ここでZは、共有結合、C1-C4アルキレン、C2-C4アルケニレン、C2-C4アルキニレン、-S-、-O-、-NR-、-C(O)-、-NHC(O)-、または-C(O)NH-であり、ここでRは、水素またはC1-C4アルキルであり、かつYは、フェニル、ピリミジニル、5員もしくは6員ヘテロシクロアルキル、またはピリジルであり、これらはそれぞれ、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、モノ-またはジ-C1-C4アルキルアミノ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、およびフェニルから独立して選択される0個〜3個の置換基で置換されており;かつR2は、水素、C1-C6アルキル、C3-C7シクロアルキル、(フェニル)C0-C2アルキルであり;またはR1およびR2は一緒になって、N、O、およびSから選択される0個または1個のさらなるヘテロ原子を有する5員〜7員ヘテロシクロアルキル環を形成し、この5員〜7員ヘテロシクロアルキル環は、フェニルまたはピリジルと縮合していてもよく;この5員〜7員ヘテロシクロアルキル環は非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、C1-C2アルキル、およびC1-C2アルコキシから独立して選択される1個または複数個の置換基で置換されており;R3は、水素またはC1-C2アルキルであり;R5は、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、またはフェニルであり;R6は、ハロゲン、ヒドロキシル、C1-C4アルキル、またはC1-C4アルコキシであり;かつR7は、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチルであるか、またはR7は、フェニルであるか、またはN、O、およびSから選択される1個もしくは2個のヘテロ原子を有する5員〜7員ヘテロシクロアルキル環であり、これらのR7はそれぞれ共有結合を介して直接結合しているか、またはC1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、またはC1-C4アルキルアミノを介して結合しており、これらのR7はそれぞれ非置換であるか、またはC1-C4アルキル、(モノ-またはジ-C1-C2アルキルアミノ)C0-C4アルキルから独立して選択される1個〜3個の置換基で置換されており;またはR6およびR7は一緒になって、さらなる不飽和点を有しない5員または6員炭素環式環を形成し、この環は非置換であるか、またはC1-C2アルキルおよびC1-C2アルコキシから独立して選択される1個〜3個の置換基で置換されており;ここで、R6が水素であり、R5およびR7が両方ともメチルである場合、またはR6が水素であり、R5およびR7の一方がメチルであり、他方がフェニルである場合、R1は、非置換のフェニル、ジヒドロインデニル、ベンゾ[b][1,4]ジオキソリル、ベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル、シクロヘキシ���、ピリジルでもなく、クロロ、フルオロ、C1-C4アルキル、C1-C2アルコキシ、アセチル、トリフルオロメチルから独立して選択される1個または2個の置換基で置換されたフェニルでもなく;かつR6が水素であり、R5およびR7の一方がメチルであり、他方がフェニルである場合、R1は1-(4-フルオロベンジル)-1H-ピラゾール-4-イルではない。
【請求項５７】
リソソーム活性化剤が薬理学的シャペロンである、請求項1、18、19、20、または21記載の方法。
【請求項５８】
薬理学的シャペロンが標的リソソーム酵素に直接結合する、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
薬理学的シャペロンが、標的リソソーム酵素の基質と競合せずに該酵素に結合する、請求項57記載の方法。
【請求項６０】
薬理学的シャペロンが、標的リソソーム酵素の活性を阻害しない、請求項57記載の方法。
【請求項６１】
リソソーム酵素がβ-グルコセレブロシダーゼである、請求項58、59、または60記載の方法。
【請求項６２】
リソソーム酵素がβ-ヘキソサミニダーゼA/Bである、請求項58、59、または60記載の方法。
【請求項６３】
リソソーム酵素がβ-ガラクトシダーゼアイソフォーム1である、請求項58、59、または60記載の方法。
【請求項６４】
薬理学的シャペロンがイソファゴミンである、請求項57記載の方法。
【請求項６５】
リソソーム活性化剤がタンパク質恒常性調節因子である、請求項1、18、19、20、または21記載の方法。
【請求項６６】
タンパク質恒常性調節因子が標的リソソーム酵素に直接結合しない、請求項65記載の方法。
【請求項６７】
タンパク質恒常性調節因子がCa2＋チャンネル遮断剤である、請求項65記載の方法。
【請求項６８】
タンパク質恒常性調節因子がRyR阻害剤である、請求項65記載の方法。
【請求項６９】
Ca2＋チャンネル遮断剤が小分子である、請求項67記載の方法。
【請求項７０】
小分子がジルチアゼムである、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
小分子がベラパミルである、請求項69記載の方法。
【請求項７２】
RyR阻害剤が小分子である、請求項68記載の方法。
【請求項７３】
小分子がダントロレンである、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
リソソーム活性化剤が、経口送達用に製剤化された薬学的組成物の状態で投与される、請求項1、18、または19記載の方法。
【請求項７５】
プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に、
リソソーム活性化剤;および
少なくとも1つの第2の治療剤
の組み合わせを投与する段階を含む方法であって、
該リソソーム活性化剤および少なくとも1つの第2の治療剤が、所定の治療効果と相関する治療レジメンに従って、かつ単位用量で投与される、方法。
【請求項７６】
リソソーム活性化剤が請求項56記載の化合物であり、かつ第2の治療剤がパーキンソン病の処置において使用される、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドであり、かつ第2の治療剤がパーキンソン病の処置において使用される、請求項75記載の方法。
【請求項７８】
リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドをコードする核酸であり、かつ第2の治療剤がパーキンソン病の処置において使用される、請求項75記載の方法。
【請求項７９】
リソソーム活性化剤がサポシンCポリペプチドであり、かつ第2の治療剤がパーキンソン病の処置において使用される、請求項75記載の方法。
【請求項８０】
パーキンソン病の処置において使用される第2の治療剤が、レボドパ、カルビドパ、アマンチジン(amantidine)、抗コリン作用薬、カテコール-O-メチルトランスフェラーゼ、モノアミン酸化酵素阻害剤、末梢デカルボキシラーゼ阻害剤、ブロモクリプチジン(bromocriptidine)、ペルゴリド、ロピニロール、プラミペキソール、およびエルゴリドからなる群より選択される、請求項76、77、78、または79記載の方法。
【請求項８１】
リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドであり、かつ第2の治療剤がリソソーム蓄積疾患の処置において使用される、請求項75記載の方法。
【請求項８２】
リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドをコードする核酸であり、かつ第2の治療剤がリソソーム蓄積疾患の処置において使用される、請求項75記載の方法。
【請求項８３】
リソソーム蓄積疾患の処置において使用される第2の治療剤が、アロプレグナノロン、スタチン、フェノフィブラート、ナイアシン、エゼチミブ、およびコレスチラミンからなる群より選択される、請求項81または82記載の方法。
【請求項８４】
第2の治療剤がリソソーム活性化剤である、請求項75記載の方法。
【請求項８５】
リソソーム活性化剤が小分子であり、かつ第2の治療剤がポリペプチドリソソーム活性化剤である、請求項75または84記載の方法。
【請求項８６】
リソソーム活性化剤が小分子であり、かつ第2の治療剤が抗酸化リソソーム活性化剤である、請求項75または84記載の方法。
【請求項８７】
リソソーム活性化剤が抗酸化剤であり、かつ第2の治療剤がポリペプチドリソソーム活性化剤である、請求項75または84記載の方法。
【請求項８８】
小分子が請求項56記載の化合物である、請求項85または86記載の方法。
【請求項８９】
小分子が請求項64記載の薬理学的シャペロンである、請求項85または86記載の方法。
【請求項９０】
小分子がグルコシルセラミド合成酵素ポリペプチドの阻害剤である、請求項85または86記載の方法。
【請求項９１】
グルコシルセラミド合成酵素ポリペプチドの阻害剤が、N-ブチル-デオキシノジリマイシン、AMP-DMP、N-((1R,2R)-1-(2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ダイオキシン-6-イル)-1-ヒドロキシ-3-(ピロリジン-1イル)プロパン-2-イル)オクタンアミド(Genz-112638)、2-(2,3-ジヒドロ-1-H-インデン-2-イル)-1-ヒドロキシ-3-(ピロリジン-1-イル)プロパン-2-イル)アセトアミド(CCG-203586)、およびEXEL-0346からなる群より選択される、請求項90記載の方法。
【請求項９２】
小分子がCa2＋チャンネル遮断剤である、請求項85または86記載の方法。
【請求項９３】
Ca2＋チャンネル遮断剤が、ジヒドロピリジンカルシウムチャンネル遮断剤群、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニグルジピン、ニルジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニバルジピン、リヨシジン(ryosidine)、アニパミル、ジルチアゼム、フェンジリン、フルナリジン、ガロパミル、ミベフラジル、プレニラミン、チアパミル、ベラパミル、マレイン酸ペルヘキシリン、フェンジリン、プレニラミン、塩、エステル、アミド、およびプロドラッグからなる群より選択される、請求項92記載の方法。
【請求項９４】
小分子がRyR阻害剤である、請求項85または86記載の方法。
【請求項９５】
RyR阻害剤が、ダントロレン、リアノジン、アズモレン、カルケストリン(calquestrin)、およびプロカインからなる群より選択される、請求項94記載の方法。
【請求項９６】
ポリペプチドがRab1aポリペプチドである、請求項85または86記載の方法。
【請求項９７】
ポリペプチドがサポシンCポリペプチドである、請求項85または86記載の方法。
【請求項９８】
少なくとも1つの第3のリソソーム活性化剤をさらに含む、請求項75または84記載の方法。
【請求項９９】
第3のリソソーム活性化剤が、請求項58記載の化合物、イソファゴミン、Rab1aポリペプチド、Rab1aポリペプチドをコードする核酸、サポシンCポリペプチド、抗酸化剤、請求項93記載の化合物、請求項95記載の化合物、および請求項97記載の化合物からなる群より選択される、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
抗酸化剤がn-アセチル-システインである、請求項86、87、または99記載の方法。
【請求項１０１】
単位用量の少なくとも1つが、単独で投与される場合の同じ剤の参照単位用量よりも少ない、請求項75、84、または98記載の方法。
【請求項１０２】
治療レジメンが、同じ剤を単独で投与する参照治療レジメンの投与回数よりも少ない投与回数を含む、請求項75、84、または98記載の方法。
【請求項１０３】
治療有効量のリソソーム活性化剤を細胞に投与する段階を含む、細胞におけるタンパク質の凝集または蓄積の毒性を減少させる方法。
【請求項１０４】
リソソーム活性化剤が請求項56記載の化合物である、請求項103記載の方法。
【請求項１０５】
リソソーム活性化剤が請求項64記載の薬理学的シャペロンである、請求項103記載の方法。
【請求項１０６】
リソソーム活性化剤が請求項91記載のグルコシルセラミド合成酵素ポリペプチドの阻害剤である、請求項103記載の方法。
【請求項１０７】
リソソーム活性化剤が請求項93記載のCa2＋チャンネル遮断剤である、請求項103記載の方法。
【請求項１０８】
リソソーム活性化剤が請求項95記載のRyR阻害剤である、請求項103記載の方法。
【請求項１０９】
リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドであるか、またはRab1aポリペプチドを含む、請求項103記載の方法。
【請求項１１０】
リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドをコードする核酸である、請求項103記載の方法。
【請求項１１１】
リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドのアクチベーターである、請求項103記載の方法。
【請求項１１２】
リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチド阻害因子の阻害剤である、請求項103記載の方法。
【請求項１１３】
リソソーム活性化剤がサポシンCポリペプチドであるか、またはサポシンCポリペプチドを含む、請求項103記載の方法。
【請求項１１４】
リソソーム活性化剤がサポシンCポリペプチドのアクチベーターである、請求項103記載の方法。
【請求項１１５】
リソソーム活性化剤がサポシンCポリペプチド阻害因子の阻害剤である、請求項103記載の方法。
【請求項１１６】
リソソーム活性化剤が抗酸化剤である、請求項103記載の方法。
【請求項１１７】
抗酸化剤がn-アセチル-システインである、請求項116記載の方法。
【請求項１１８】
投与する段階が、システム中の細胞に投与することを含む、請求項103記載の方法。
【請求項１１９】
システムがインビトロシステムである、請求項118記載の方法。
【請求項１２０】
システムが生物を含む、請求項118記載の方法。
【請求項１２１】
細胞が神経細胞である、請求項103記載の方法。
【請求項１２２】
細胞が非神経細胞である、請求項103記載の方法。
【請求項１２３】
細胞がα-シヌクレインを発現している、請求項103記載の方法。
【請求項１２４】
細胞がアミロイドを発現している、請求項103記載の方法。
【請求項１２５】
細胞がタウを発現している、請求項103記載の方法。
【請求項１２６】
非リソソーム蓄積疾患プロテイノパチーに罹患しているかまたは罹患しやすい対象に、
リソソーム活性化剤;および
薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物を投与する段階を含む方法であって、
該リソソーム活性化剤が、所定の投与レジメンに従って投与された場合に所定の治療効果と相関する投与レジメンに従って、かつ一定量で投与される、方法。
【請求項１２７】
プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態が増殖性疾患である、請求項126記載の方法。
【請求項１２８】
プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態が炎症性疾患である、請求項126記載の方法。
【請求項１２９】
プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態が心臓血管疾患である、請求項126記載の方法。
【請求項１３０】
リソソーム蓄積疾患、障害、および/または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に、
リソソーム活性化剤;および
薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物を投与する段階を含む方法であって、
該リソソーム活性化剤が、所定の投与レジメンに従って投与された場合に所定の治療効果と相関する投与レジメンに従って、かつ一定量で投与される、方法。
【請求項１３１】
リソソーム活性化剤が、Rab1aポリペプチドのレベルおよび/または活性を増加させる、請求項130記載の方法。
【請求項１３２】
リソソーム活性化剤が抗酸化剤である、請求項130記載の方法。
【請求項１３３】
抗酸化剤がn-アセチル-システインである、請求項130記載の方法。
【請求項１３４】
リソソーム活性化剤が請求項56記載の化合物である、請求項130記載の方法。
【請求項１３５】
リソソーム活性化剤が請求項64記載の薬理学的シャペロンである、請求項130記載の方法。
【請求項１３６】
リソソーム蓄積疾患、障害、および/または状態が、以下からなる群より選択される、請求項130記載の方法:
α-マンノシドーシスI/II型、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、バッテン病(後期乳児性)、β-マンノシドーシス、心不整脈、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシスI/II/III型、GM2ガングリオシドーシスI/II型、ガラクトシアリドーシスI/II型、ハンター症候群、ハーラー症候群、クラッベ病、クッフス病、I細胞病、ムコリピドーシスIV型、モルキオ症候群、ムコ多糖症IX型、多種スルファターゼ欠損症、マロトー・ラミー症候群、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、ポンペ病、偽性ハーラーポリジストロフィー、濃化異骨症、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群A型、サンフィリッポ症候群B型、サンフィリッポ症候群C型、サンフィリッポ症候群D型、シンドラー病、シャイエ症候群、シアル酸尿症、サラ病、シアリドーシスI/II型、スライ症候群、テイ・サックス病、フォークト・シュピールマイアー病、およびウォルマン病。
【請求項１３７】
リソソーム蓄積疾患、障害、および/または状態がゴーシェ病である、請求項130記載の方法。
【請求項１３８】
少なくとも1つのリソソーム酵素を含むシステムを提供する段階;
該システムを試験リソソーム活性化剤と接触させる段階;
該試験リソソーム活性化剤が存在する場合の、該リソソーム酵素のレベルまたは活性を決定する段階;
参照と比べて該試験リソソーム活性化剤が同定されるまたは特徴付けされるように、該決定されたレベルまたは活性を参照レベルまたは活性と比較する段階
を含む、リソソーム活性化剤を同定するおよび/または特徴付ける方法。
【請求項１３９】
システムがリソソームを含む、請求項138記載の方法。
【請求項１４０】
システムが細胞を含む、請求項138記載の方法。
【請求項１４１】
システムが生物を含む、請求項138記載の方法。
【請求項１４２】
システムが神経細胞を含む、請求項138記載の方法。
【請求項１４３】
参照が、参照リソソーム活性化剤が存在する場合の、それ以外は同等の条件下で観察されるレベルまたは活性を含む、請求項138記載の方法。
【請求項１４４】
決定されたレベルまたは活性を、参照リソソーム活性化剤が存在しない場合の、それ以外は同等の条件下で観察されるレベルまたは活性と比較する段階をさらに含む、請求項138記載の方法。
【請求項１４５】
レベルまたは活性を決定する段階が、輸送の程度を決定することを含む、請求項144記載の方法。
【請求項１４６】
レベルまたは活性を決定する段階が、凝集の様式の程度を決定することを含む、請求項144記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条(e)項に基づいて、2011年6月22日に出願された米国仮出願第61/499,930号の恩典を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
背景
プロテイノパチーは、タンパク質の産生、フォールディング、凝集、代謝または分解の異常を伴う疾患、障害、および/または状態である。典型的には、プロテイノパチーは、1つまたは複数の特定のタンパク質が蓄積して凝集体になることを伴い、および/またはこれを特徴とする。タンパク質の凝集体は、認知機能障害、増殖性疾患、炎症性疾患、心臓血管疾患、免疫疾患、眼疾患、ミトコンドリア性疾患、神経変性疾患およびリソソーム蓄積疾患を含む様々な異なる種類の疾患、障害、および/または状態で観察される。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本発明は、リソソーム酵素のレベルを増加させ、かつ/または活性を増加させてリソソーム酵素を活性化させることにより、ある種のプロテイノパチーについての有効な処置、そしてさらには予防を提供できるという知見を包含する。例えば、本発明は、リソソーム活性およびタンパク質凝集に対するその効果についての新規な洞察を提供し、リソソーム機能に関連する生化学的経路が、具体的には、種々の細胞培養物(神経培養物および非神経培養物の両方を含む)、哺乳類生物(例えば、マウス)およびヒトの脳を含む種々の状況においてタンパク質凝集レベルを調節することを実証する。本発明は、具体的には、リソソーム酵素の輸送を増加させることにより、一部の場合では、ある種のプロテイノパチーについての有効な処置(および/または予防)を提供できるという洞察を包含する。
【０００４】
本発明は、いくつかの態様では、リソソーム酵素のレベルおよび/または活性を増加させることにより、リソソーム蓄積疾患以外のプロテイノパチーについての有効な処置、そしていくつかの態様では予防を提供できるという具体的かつ驚くべき知見を提供する。本発明は、リソソーム酵素のレベルおよび/または活性を増加させることにより、ある種の神経変性疾患、障害、および/または状態についての有効な処置、そしていくつかの態様では予防を提供できることを特に教示する。いくつかの特定の態様では、本発明は、リソソーム酵素のレベルおよび/または活性を増加させることにより、パーキンソン病についての有効な処置、そしていくつかの態様では予防を提供できることを実証する。
【０００５】
本発明は、リソソーム酵素グルコセレブロシダーゼ(GCase)のレベルおよび/または活性を増加させることにより、ある種のプロテイノパチーについての有効な処置、そしてさらには予防を提供できるという特定の知見を包含する。
【０００６】
本発明は、リソソーム分解能力を増加させることにより、ある種のプロテイノパチーについての有効な処置、そしてさらには予防を提供できるという特定の知見を包含する。
【０００７】
本発明は、脳細胞におけるGCase活性の活性化が、それらの細胞におけるα-シヌクレインレベルを減少させるという具体的な知見を提供する。本発明によれば、グルコシルセラミド(GlcCer)基質レベルを減少させるレベルでGCaseを活性化させることにより、既に形成された凝集体(例えば、α-シヌクレイン凝集体)を枯渇させるかまたは元に戻し、さらにはそれらが細胞から細胞へと広がる能力を抑制し得る。本発明は、具体的には、例えば、グルコセレブロシダーゼ(GCase)ポリペプチドのレベルおよび/または活性を増加させること、および/またはグルコシルセラミド合成酵素の阻害によってGCase基質レベルを減少させることを含む、グルコシルセラミドレベルを低下させるための様々な手法をさらに提供する。
【０００８】
いくつかの態様では、GCaseポリペプチドのレベルおよび/または活性は、小分子によって増加される。いくつかの態様では、小分子は、GCaseポリペプチドに直接結合する。いくつかの態様では、小分子は、GCaseポリペプチドの触媒部位または活性部位から離れた部位に結合する。
【０００９】
いくつかの態様では、GCaseポリペプチドは、野生型である。いくつかの態様では、GCaseポリペプチドは、変異体である。
【００１０】
本発明は、ガングリオシドがα-シヌクレイン凝集体の安定化および増強に影響を及ぼすという具体的な知見を提供する。本発明によれば、スフィンゴ脂質基質レベルを減少させるレベルでスフィンゴ脂質代謝酵素(例えば、β-ヘキソサミニダーゼまたはβ-ガラクトシダーゼアイソフォーム1)を活性化させることにより、既に形成された凝集体(例えば、α-シヌクレイン凝集体)を枯渇させるかまたは元に戻し、さらにはそれらが細胞から細胞へと広がる能力を抑制し得る。
【００１１】
いくつかの特定の態様では、サポシンポリペプチドは、プロテイノパチーの処置において有用である。
【００１２】
本発明は、少なくともいくつかの態様では、プロテイノパチーにおけるタンパク質凝集体蓄積の存在および/または度合が、Ca2＋シグナル伝達経路の活性によって影響され得るという知見をさらに包含する。いくつかの特定の態様では、タンパク質凝集体蓄積の存在および/または度合は、Ca2＋チャンネル媒介性シグナル伝達によって影響を受ける。したがって、いくつかの態様では、本発明は、Ca2＋チャンネルを遮断する剤を用いて機能獲得型プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態を処置するための方法および試薬を提供し;いくつかの態様では、このような剤は、1つまたは複数のリソソーム酵素のタンパク質フォールディングに影響を与えるので、リソソームにおけるこのような酵素のレベルおよび/または活性に影響を与える。
【００１３】
本発明は、少なくともいくつかの態様では、凝集体蓄積の存在または程度が酸化ストレスによって影響を受け得ること、および/または少なくとも特定のリソソーム酵素(例えば、GCase)のレベルおよび/または活性によって影響を受け得ないことの実証をさらに包含する。したがって、いくつかの態様では、本発明は、(例えば、リソソームにおける)1つまたは複数のリソソーム酵素のレベルおよび/または活性に影響を与える剤の代わりに、または前記剤に加えて、酸化ストレスに影響を与える剤を用いて、リソソーム蓄積疾患を処置するための方法および試薬を提供する。
【００１４】
またさらに、本発明は、少なくともいくつかの態様では、プロテイノパチーにおけるタンパク質凝集体蓄積の存在および/または度合が、タンパク質輸送経路の活性によって影響され得るという実証を包含する。いくつかの特定の態様では、タンパク質凝集体蓄積の存在および/または度合は、1つまたは複数のリソソーム酵素の輸送によって影響を受ける。したがって、いくつかの態様では、本発明は、タンパク質輸送に影響を与える剤を用いてリソソーム蓄積疾患を処置するための方法および試薬を提供し;いくつかの態様では、このような剤は、1つまたは複数のリソソーム酵素のタンパク質輸送に影響を与えるので、リソソームにおけるこのような酵素のレベルおよび/または活性に影響を与える。
【００１５】
本発明は、リソソーム酵素が小胞体からゴルジ体に、そして最終的にはエンドソーム-リソソームシステムに輸送されるのを、Rab機能の増強および/またはGCaseの活性化により改善して、リソソーム機能を改善することにより、リソソームタンパク質分解の増強がもたらされるという具体的な知見を提供する。いくつかの態様では、リソソームタンパク質分解は、酸性加水分解酵素(一般的にはリソソーム中に存在し、酸性pHで最適な酵素活性を有する酵素、例えばヌクレアーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼ、ホスホリパーゼおよびすべてのリソソーム酵素)のタンパク質分解活性の増強によって増強される。いくつかの態様では、リソソームタンパク質分解は、リソソーム小胞の絶対数の増強によって増強される。いくつかの態様では、リソソームタンパク質分解は、リソソーム区画あたりの酸性加水分解酵素量の増強によって増強される。いくつかの態様では、リソソームタンパク質分解は、細胞貯蔵物質のエキソサイトーシスの増強によって増強される。本発明は、リソソーム酵素の輸送を増加させることにより、ある種の神経変性疾患、障害、および/または状態についての有効な処置、そしていくつかの態様では予防を提供できることを特に教示する。
【００１６】
いくつかの特定の態様では、Rab1aポリペプチドは、リソソーム蓄積疾患および他の種類のプロテイノパチーの処置において有用である。
【００１７】
いくつかの特定の態様では、抗酸化剤は、リソソーム蓄積疾患および他の種類のプロテイノパチーの処置において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面の図は、限定ではなく単なる例示目的のためのものである。
【００１９】
【図１】図1A〜図1Gは、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)がリソソーム分解の障害をもたらし、α-シヌクレインの蓄積を引き起こすことを示す。(図1A)GCaseポリペプチドshRNAによる皮質ニューロンにおけるGCaseポリペプチドのノックダウン(KD)をウエスタンブロットによって示す。ローディング対照として神経特異的エノラーゼ(NSE)を使用した。4回のレプリケートを示す。Scrb、スクランブルshRNA。(図1B)左側:GCaseポリペプチドレベル(n＝6、＊p＜0.01)。中央:GCaseポリペプチドの酵素活性(n＝6、＊p＜0.01)。右側:MSによる細胞内GlcCerの定量(Pi、リン酸塩)(n＝3、＊p＜0.05)。(図1C)GlcCer免疫蛍光(上側)および神経脂質をBODIPY 493蛍光によって可視化した(下側)。DAPIを用いて核を可視化した。矢印は、染色の拡散が増加している細胞を示すのに対して、矢頭は、斑点状の脂質蓄積を有する細胞を示す。(図1D)(図1C)に示されている蛍光強度を定量し、DAPIに対して標準化した(n＝3、＊p＜0.05)。(図1E)ニューロンにおける長命タンパク質のタンパク質分解を8時間の時点で評価した。リソソーム阻害剤であるロイペプチン(leu)および塩化アンモニウム(NH4Cl)を使用した(n＝4、＊p＜0.05)。(図1F)内因性α-シヌクレイン(モノクローナル抗体(mAb)syn202)およびタウのウエスタンブロット。4回のレプリケートを示す。タンパク質およびmRNAのレベルをブロットで示す(n＝4、＊p＜0.05)。ローディング対照としてα-チューブリンを使用した。(図1G)誘導H4細胞におけるα-シヌクレインの分析。ドキシサイクリン(DOX)によって発現をオフにして、モノクローナル抗体(mAb)syn211を用いてウエスタンブロットによって、タンパク質クリアランスを測定した。定量を以下に示す(n＝6、＊p＜0.05)。ウエスタンブロットによってGCaseポリペプチドのノックダウン(KD)を示し、ローディング対照としてα-チューブリンを使用した。分子量(MW)はkDaで示す。すべての分析について、値は平均±平均の標準誤差(SEM)である。
【図２】図2A〜図2Gは、shRNA GCaseポリペプチドレンチウイルス感染システムの特異性、およびGCaseポリペプチドをノックダウンした際のリソソームタンパク質レベルの変化を実証する。(図2A)エンドグリコシダーゼH(endo H)またはPNGaseを用いて、形質導入した初代ニューロンの溶解物を消化した。非特異的なバンド(N.S.)が認められる。N.T.、非形質導入。(図2B)図1Eに記載されているように、放射性パルスチェイスをN2a細胞で実施した。ロイペプチン(leu)、塩化アンモニウム(NH4Cl)(n＝3、値は平均±SEMである。＊p＜0.05)。(図2C)scrbまたはGCaseポリペプチドshRNA構築物を初代ニューロンに感染させ、ウエスタンブロットによってリソソームタンパク質のレベルを決定した。右側:デンシトメトリーによってウエスタンブロットを定量した(n＝3、値は平均±SEMである。＊p＜0.05)。M、分子量(MW)マーカー。3回の別個の実験を示す。タンパク質の分子量(MW)はキロダルトン(kDa)で示す。(図2D)GCaseポリペプチドをノックダウンした際のニューロンにおけるスフィンゴ脂質についてのLC/MS/MS分析による測定。Cer、セラミド;Sph 1-P、スフィンゴシン-1-ホスフェート;Sph、スフィンゴシン;dh Sph 1-P、ジヒドロスフィンゴシン-1-ホスフェート;dh Sph、ジヒドロスフィンゴシン;dhC16-Cer、ジヒドロセラミド(n＝3、値は平均±SEMである)。(図2E)形質導入したニューロンにおけるβ-ヘキソサミニダーゼ(Hex)活性の測定(n＝3、値は平均±SEMである)。(図2F)Alexa Fluro 488標識コレラ毒素サブユニットBによって、ガングリオシドGM1レベルおよび染色パターンを評価した。DAPIによって核を可視化した。下方のグラフにおいて、斑点の数および領域を定量した(n＝3、値は平均±SEMである)。N.T.、非形質導入。スケールバー＝10μm。(図2G)scrbまたはGCaseポリペプチドshRNA構築物をニューロンに感染させ、免疫細胞化学によって、LAMP1の細胞分布パターンを評価した。LAMP1斑点サイズの定量をグラフに示す(n＝3、値は平均±SEMである。＊p＜0.05)。スケールバー(上側および中央)＝10μm、下側＝2μm。
【図３】図3A〜図3Bは、ゴーシェ病患者の線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞の作製を示す。(図3A)多分化能マーカーであるOct4、Tra-1-60、SSEA-4およびnanogについて、免疫蛍光分析によって誘導多能性幹(iPS)細胞を分析した。DAPIによって核を可視化した。スケールバー＝30μm。(図3B)正常な染色体の数、サイズおよびゲノム構造を示すゴーシェ病(GD)iPS細胞のGバンド核型分析。
【図４】図4A〜図4Fは、長命タンパク質のタンパク質分解の障害、およびヒトゴーシェ病(GD)ドーパミン作動性ニューロンにおける内因性α-シヌクレインの特異的な蓄積を示す。(図4A)iPS細胞から作製した野生型およびゴーシェ病(GD)ニューロンについての、神経マーカーであるβIIIチューブリンおよびカテコールアミン作動マーカーであるチロシン水酸化酵素(TH)を用いた免疫蛍光分析。DAPIによって核を可視化した。スケールバー＝10μm。(図4B)GCaseポリペプチドのウエスタンブロット分析。ローディング対照としてNSEを使用した。下側、GCaseポリペプチド活性の定量(n＝3、＊p＜0.05)。(図4C)長命タンパク質の分解を評価した(n＝4、＊p＜0.05)。挿入図、短命タンパク質のタンパク質分解(チェイス後15分)。(図4D)モノクローナル抗体(mAb)LB509、βIIIチューブリンを使用した、α-シヌクレインの免疫蛍光分析。スケールバー＝30μm。(図4E)iPSニューロンからのTriton X-100可溶性(T-可溶性)溶解物のウエスタンブロット。Htt、ハンチンチン;CBB、クマシーブリリアントブルー。(図4F)デンシトメトリーによって、図4Eのウエスタンブロットを定量した。
【図５】図5A〜図5Iは、初代皮質ニューロンにおけるヒトα-シヌクレインの発現、およびロイペプチン処理またはGCaseポリペプチドのノックダウンによるリソソーム阻害効果を示す。野生型α-シヌクレインを発現するレンチウイルスベクターを感染多重度3(moi3)でニューロンに感染させ、感染7日後(dp)に分析した。(図5A)ヒトα-シヌクレインに特異的なモノクローナル抗体(mAb)であるsyn211およびLB509を使用した免疫染色分析は、神経突起におけるシナプス集積の典型的な予想斑点パターンを示している。細胞の約60％〜70％が形質導入された。(図5B)初代ニューロンにおいて、野生型、A53TおよびΔ71-82α-シヌクレインを感染多重度3(moi3)で発現させ、ウエスタンブロットによって分析した。ローディング対照としてα-チューブリンを使用した。下側:マウスおよびヒトα-シヌクレインの両方を検出するモノクローナル抗体(mAb)syn202を使用してデンシトメトリーによって、α-シヌクレインタンパク質レベルを測定した。値は、α-シヌクレインの過剰発現を内因性マウスタンパク質と比べたレベルを表す(n＝3、値は平均±SEMである。＊p＜0.05)。(図5C)感染多重度3(moi3)で感染させたニューロンにおいて、感染10日後(10dpi)に、神経フィラメント免疫染色(上側)または神経容積分析(下側)によって、神経毒性を評価した(n＝4、値は平均±SEMである。＊p＜0.05(vect＋scrb shRNA条件との比較)、＊＊p＜0.05(試験したすべての条件との比較))。(図5D)上側:ロイペプチン処理の有無の下で空ベクター(vect)または野生型α-シヌクレインを感染させた細胞における神経フィラメント免疫染色による神経毒性評価(n＝8)。下側:細胞容積分析による毒性評価(n＝4、値は平均±SEMである。N.S.、非有意)。(図5E)GCaseポリペプチドのノックダウンまたはロイペプチン処理の際のLC3-IIのウエスタンブロット。ローディング対照としてNSEを使用した。分子量(MW)はkDaで示す。(図5F)感染7日後(7dpi)に、モノクローナル抗体(mAb)syn211およびポリクローナル抗体(pAb)LC3を用いてα-シヌクレインを免疫染色することによって、ニューロンを分析し、全α-シヌクレイン(可溶性および不溶性)を表す写真の蛍光強度を定量した(n＝3、＊p＜0.05)。(図5G)Triton X-100(T-可溶性)、次いで2％SDS(T-不溶性)中に連続抽出することによって、scrb shRNA(1)、GCaseポリペプチドのノックダウン(2)、またはscrb shRNA＋ロイペプチン処理(3)の際の全タンパク質の溶解性を評価した。SDS-PAGE、続いてクマシーブリリアントブルー(CBB)染色を行って全タンパク質を可視化することによって、画分を分析した。分子量(MW)はkDaで示す。右側:デンシトメトリーによって、不溶性タンパク質レベルを定量した(n＝3、＊p＜0.05)。(図5H)α-シヌクレインおよびLAMP1の免疫染色分析。各写真において、スケールバー＝10μm。右上:凝縮核を有する細胞の割合を定量した。α-シヌクレイン陽性ニューロンのみをカウントした(n＝3)。右中央:α-シヌクレイン/LAMP1が共局在した斑点を有するニューロンの割合を定量した(n＝3、＊p＜0.05(scrb shRNAとの比較)、＊p＜0.05(scrbおよびGC shRNAとの比較))。右下:α-シヌクレイン/LAMP1が共局在した斑点を有し、凝縮核も含有していたニューロンの割合を定量した。(図5I)ヒト野生型α-シヌクレインを発現するニューロン溶解物の細胞成分分画、続いて、Triton X-100可溶性(左側)およびTriton X-100不溶性(T-不溶性)(右側)抽出物のウエスタンブロット分析。LAMP2を使用して、P2画分におけるリソソーム濃縮を確認したところ、予想通り、細胞質タンパク質NSEは、上清画分(S)に濃縮されたことが見出された。ローディング対照としてCBBを使用した。右側:各画分におけるα-シヌクレインレベルのデンシトメトリー定量(n＝3)。各定量について、値は平均±SEMである。テューキー事後検定による一元配置ANOVAを使用した。N.S.＝非有意。実施例4の考察を参照のこと。
【図６】図6A〜図6Hは、GCaseポリペプチドの枯渇が、凝集依存性機序を介してα-シヌクレイン媒介性神経毒性を増強することを実証する。感染7日後(7dpi)に、ヒトα-シヌクレインタンパク質およびGCaseポリペプチドshRNAを発現するニューロンを分析した。(図6A)神経フィラメント免疫染色を使用して、神経突起の分解をモニタリングした。野生型α-シヌクレインを発現するニューロンの代表的な神経フィラメント免疫蛍光染色を示す(下)。DAPIによって核を可視化した。スケールバー＝10μm。(図6B)神経容積分析によって、神経毒性を評価した。(図6Aおよび図6Bでは、n＝8、＊p＜0.001.)。(図6C)ウエスタンブロットによるヒト野生型、A53TおよびΔ71-82α-シヌクレイン(Triton X-100可溶性(T-可溶性))のタンパク質レベル。ローディング対照としてα-チューブリンを使用した。定量を示す(下)(n＝6、＊p＜0.01)。(図6D)Triton X-100可溶性(T-可溶性)画分についてのα-シヌクレインのウエスタンブロット(leu、ロイペプチン;NT、非形質導入)。ローディング対照としてNSEを使用した。(図6E)Triton X-100不溶性(T-不溶性)α-シヌクレインのウエスタンブロット。定量を示す(下)。括弧は、定量に使用したシグナルを示す(n＝3、＊p＜0.05、＊＊p＜0.01(scrb対照との比較))。(図6F〜図6H)Triton X-100可溶性(T-可溶性)溶解物のネイティブSEC/ウエスタンブロット分析(Å、半径(オングストローム単位))。ローディング対照としてNSEを使用した。オリゴマーα-シヌクレイン(ボイド→64Å)を定量した(変化倍率:scrb shRNA＝1±0.5;GC shRNA＝19.5±6.0)(n＝3、値は平均±SEMである。＊p＜0.05)。各ブロットについて、分子量(MW)はkDaで示す。すべての定量について、値は平均±SEMである。
【図７】図7A〜図7Iは、GlcCerが、組換えα-シヌクレインのインビボ線維形成に直接的に影響を及ぼし、可溶性オリゴマー種を安定化させることを示す。(図7A)pH5.0、37℃でPCとGlcCerとの混合物と一緒に、精製α-シヌクレインをインキュベーションし、チオフラビンT蛍光によってアミロイド形成を評価した(相対蛍光単位［RFU］、n＝4、＊p＜0.01)。(図7B)1時間および5時間の時点における100,000xg可溶性α-シヌクレインのSEC(115〜38Åおよび36〜27Å画分)、続いてSDS-PAGE/ウエスタンブロット(syn211)による分析。分子量(MW)はkDaで示す。(図7C)デンシトメトリーによって、可溶性オリゴマーを定量した(n＝3、"p＜0.05)。(図7D)1時間後に形成されたα-シヌクレイン種のANS蛍光(n＝4、＊p＜0.01)。(図7E)28時間の時点の遠心沈降分析(s、上清;p、ペレット)。クマシーブリリアントブルー染色を用いて、α-シヌクレインを検出した。下方のグラフにおいて、ペレット状のα-シヌクレインを定量した(n＝3)。チオフラビンTによって、同じ反応物からアミロイドを測定した(n＝4,＊p＜0.01)。(図7F)24時間の時点におけるフィブリル構造(i〜ii)および不定構造(iv〜v)を示すα-シヌクレイン凝集体のEM分析。パネルii〜vは、モノクローナル抗体(mAb)syn505を使用した免疫EM分析を示す。スケールバー:100nm(i〜iii);500nm(ivおよびv)。(図7G)15時間の時点におけるα-シヌクレイン＋PC25/GlcCer75反応物を、syn505を用いて免疫EM分析したもの。GlcCer脂質管は、幅約50nmである。スケールバー:100nm(iおよびiii);500nm(ii)。(図7H)24時間の時点におけるα-シヌクレイン＋PC25/GlcCer75反応物を、syn505を用いて免疫EM分析したものであり、幅10〜14nmのフィブリル構造であって、GlcCer管から伸びているように見える、捻れた(i)または真直ぐ(ii)の形態を有するフィブリル構造を示している。スケールバー:100nm。(図7I)GlcCer脂質分散液単独の免疫EM分析。スケールバー:100nm。(図7A)および(図7C)〜(図7E)の各グラフについて、値は平均±SEMである。
【図８】図8A〜図8Fは、GlcCerが、pH依存的に、α-シヌクレイン線維および可溶性オリゴマーのインビトロ形成に特異的に影響を与えることを実証する。図7A〜図7Iに記載されているように、脂質分散液と一緒に、精製α-シヌクレインをインキュベーションした。(図8A)36時間の時点において、pH5.0、37℃(0.1M酢酸ナトリウム緩衝液中、2mg/ml)またはpH7.4、37℃(0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液中、2mg/ml)で、アミロイド形成を評価した。値は、各pH条件の対照反応物に対する変化倍率として表す。pH5.0条件では、対照としてPC50％/ポリエチレングリコール(PEG)50％を使用した。(n＝6、＊p＜0.05)。(図8B)脂質分散液を含有するGlcCerの存在下、pH7.4、37℃における線維形成の動態分析。(n＝6)。(図8C)ネイティブゲル電気泳動/ウエスタンブロットによって、pH5.0における100,000xg可溶性α-シヌクレイン/脂質反応物を分析した。マーカーは、球状タンパク質標準(native mark, Invitrogen)による見掛けの分子量(MW)(キロダルトン単位)を示す。(図8D)ネイティブゲル/ウエスタンブロット分析によって検出されたオリゴマー:モノマー比のデンシトメトリー定量。モノマー形態として、約50kDaに泳動するバンドを定量した(精製α-シヌクレインは、その非球状突起構造により、ネイティブゲルにおいて予想分子量(MW)よりも高い位置に泳動する)(n＝3、＊p＜0.01)。(図8E)PC25/ラクトシルセラミド75(LacCer)、PC25/ガラクトシルセラミド75(GalCer)、PC25/グルコシルスフィンゴシン75(GluSph)の存在下、pH5.0でインキュベーションした3時間および15時間後に、SDS-PAGEによって100,000xgα-シヌクレイン可溶性オリゴマーのレベルを決定した。対照としてGlcCerを使用した(n＝3、＊p＜0.05)。(図8F)pH5.0でインキュベーションした3時間および15時間後のα-シヌクレイン/脂質反応物の沈降分析、S、上清;P、ペレット。可溶性α-シヌクレイン(オリゴマーまたはモノマー)は、ペレット状画分(P)に完全に変換されたので、15時間の時点では検出されなかった。すべての定量について、値は平均±SEMである。
【図９】図9A〜図9Eは、マウスゴーシェ病(GD)モデルにおけるスフィンゴ脂質の蓄積を示す。(図9A)4L/PS-NAマウスの皮質におけるスフィンゴ脂質のLC/MS分析。12週齢4L/PS-NAマウスのラクトシルセラミドおよびセラミドのレベル(値は平均±SEMである。n＝3、＊p＜0.05)(n＝マウス3匹)。(図9B)薄層クロマトグラフィー(TLC)によって、ガングリオシドを分析した。(図9C)D409H GCaseポリペプチドを発現するゴーシェ病(GD)マウスにおけるα-シヌクレインの蓄積。α-シヌクレインの蓄積について、免疫蛍光によって、42週齢D409Hホモ接合性マウスおよび年齢適合野生型マウスの皮質を分析した。DAPIによって核を可視化した。(図9D)42週齢D409Hマウスから得られた皮質組織の連続抽出分析。左側、42週齢D409Hマウスにおいて、syn202、SNL-1およびsyn505を用いて、α-シヌクレインのTriton X-100可溶性(T-可溶性)レベルを測定した。ローディング対照としてNSEを使用した。右側、syn202およびsyn505を用いて、Triton X-100不溶性(T-不溶性)α-シヌクレインを決定した。ローディング対照としてビメンチン(Vim)を使用した。下側のグラフ:デンシトメトリーによってTriton X-100不溶性(T-不溶性)α-シヌクレインレベルを定量し、Vimに対して標準化した。値は、3匹の別個のマウスからの平均±SEMである(n＝3、＊p＜0.05)。分子量(MW)マーカーはkDaで示す。(図9E)線虫(C. elegans)におけるGCaseポリペプチドのノックダウンは、インビボにおけるα-シヌクレインの蓄積を増強する。ヒトα-シヌクレイン::GFP融合タンパク質を発現する蠕虫の体壁筋において、α-シヌクレインの凝集をモニタリングする(上側)(Hamamichi et al., PNAS 105(2): 728-733, 2008)。以前に示されているように、分子シャペロン様タンパク質であるTOR-2(ヒトtorsinAの蠕虫オルソログ)の同時発現は、α-シヌクレイン::GFPの凝集を完全に無効化した(中央)。α-シヌクレイン::GFP＋TOR-2蠕虫における蠕虫GCaseポリペプチドオルソログ(C33C12.8)のノックダウンは、α-シヌクレイン斑点構造の量を増加させた(下側)。
【図１０】図10A〜図10Hは、ゴーシェ病(GD)マウスにおけるα-シヌクレインの蓄積および可溶性オリゴマー形成を示す。12週齢ゴーシェ病(GD)マウス(4L/PS-NA)の分析。(図10A)黒質(SN)および皮質(Ctx)のH&E染色。矢印は、好酸性球状物質を示す。スケールバー＝50μm。(図10B)黒質(SN)および皮質(Ctx)におけるα-シヌクレインの免疫蛍光。DAPIによって核を可視化した。スケールバー＝20μm。(図10C)α-シヌクレインおよび神経マーカーNeuNの同時染色。スケールバー＝20μm。(図10D)左側:ニューロン球状物質の定量。ND、不検出。中央:NeuN免疫染色によるニューロン数の定量。右側:免疫染色によるα-シヌクレイン凝集の定量。(図10E)皮質(Ctx)の連続抽出分析。ポリクローナル抗体(pAb)SNL-1およびモノクローナル抗体(mAb)syn202は、すべての内因性α-シヌクレインを検出するのに対して、syn505は、酸化/ニトロ化されたミスフォールディングα-シヌクレインを検出する。ローディング対照としてNSEおよびα-チューブリンを使用した。(図10F)Triton X-100可溶性(T-可溶性)モノマー(18kDa、左側)、Triton X-100可溶性(T-可溶性)オリゴマー(＞18kDa、中央)およびTriton X-100不溶性(T-不溶性)α-シヌクレイン(全レーン、右側)の定量。(図10G)Triton X-100可溶性(T-可溶性)画分のネイティブSEC/SDS-PAGE/ウエスタンブロット。半径、Å。(図10H)syn202デンシトメトリーによって得られたクロマトグラフィープロファイル。値は、3匹のマウスの独立したSEC分析の代表的なものである。各プロットについて、分子量(MW)はkDaで示す。すべての定量について、値は平均±SEMである。
【図１１】図11A〜図11Lは、Triton X-100可溶性(T-可溶性)α-シヌクレインオリゴマーの蓄積が、ゴーシェ病(GD)脳において起こることを示す。ヒト皮質溶解物(Triton X-100可溶性(T-可溶性))のネイティブSEC、続いてSDS-PAGE/ウエスタンブロット。半径はÅ単位であり(横)、見掛けの分子量(MW)はkDa単位である(縦)。モノマーα-シヌクレインは、34Åで溶出する。(図11A〜図11C)健常対照。(図11Dおよび図11E)I型非神経型ゴーシェ病(GD)。(図11F)非定型パーキンソン病(APD)。(図11G)レビー小体型認知症(DLB)。(図11Hおよび図11I)II型急性神経型ゴーシェ病(GD)を有する乳児から得られた皮質物質の分析。(図11J)神経型III型ゴーシェ病(GD)を有する3歳児の皮質溶解物。(図11K)GBA1のヘテロ接合性変異を有するレビー小体型認知症(DLB)。(図11L)病的オリゴマーα-シヌクレインを選択的に検出するsyn303による45Åサイズの画分の分析。syn303およびsyn211の両方を用いて、18、44および75kDaに泳動するバンドを検出した(矢印)。
【図１２】図12A〜図12Eは、ヒトゴーシェ病(GD)脳におけるGCaseポリペプチド活性、GCaseタンパク質レベルおよびα-シヌクレインオリゴマーレベルの定量を示す。ここで分析した試料は、図11A〜図11Lおよび表15に示されているものと同じである。(図12A)皮質試料の全細胞ホモジネートにおいて、GCaseポリペプチド活性を決定した。GCaseポリペプチド変異の存在、そしてさらには神経病理学的な違いに従って、このデータを分類した(シヌクレイノパチー有りまたは無し)。(図12B)ヘテロ接合性GCaseポリペプチド変異体保因者および野生型脳のP2画分におけるGCaseポリペプチド活性は、活性が全細胞の測定結果と比較して劇的に減少している(50％)ことを示している。(図12C)モノクローナル抗体(mAb)syn211によるSEC/SDS-PAGE/ウエスタンブロット分析のデンシトメトリー分析によって、α-シヌクレインオリゴマーを定量した(図11A〜図11Lに示されている代表例;一部のゴーシェ病(GD)ヘテロ接合体のブロットは図11A〜図11Lに示されていないが、定量してこのグラフに示す)。36Åサイズの粒子からカラムのボイド容量までに対応する画分をオリゴマーα-シヌクレインとして定量し、35〜28Åサイズの画分をモノマー形態としてカウントした。(図12D)モノクローナル抗体(mAb)syn303による45Åサイズの画分の定量。代表例を図11Lに示す。一部の試料は、試料の制限により、syn303によって分析できなかった。(図12E)図11A〜図11Lに示されているのと同じ分析試料におけるGCaseポリペプチドのウエスタンブロット。Triton X-100可溶性(T-可溶性)溶解物をendo Hで処理して、成熟GCaseポリペプチド形態のレベルを明らかにした。ローディング対照としてNSEを使用した。分子量(MW)はkDaで示す。パネルA〜Dの列は、平均値を表す。
【図１３】図13A〜図13Fは、α-シヌクレインレベルの上昇がGCaseポリペプチドの細胞内輸送を阻害し、リソソームGCaseポリペプチド機能を減少させることを実証する。(図13A)小胞体(ER)後および小胞体(ER)GCaseポリペプチドについてのウエスタンブロットによって、ヒト野生型α-シヌクレインを発現する誘導H4細胞を分析した(n＝6、＊p＜0.01)。ローディング対照としてα-チューブリンを使用した。(図13B)ヒト野生型、A53TまたはΔ71-82α-シヌクレインを発現する皮質ニューロンにおける小胞体(ER)後/小胞体(ER)GCaseポリペプチド。syn211(ヒト特異的)およびsyn202(ヒトおよびマウス)によって、α-シヌクレインレベルを決定した。ローディング対照としてNSEを使用した。(図13C)P2およびP3画分の皮質ニューロンにおけるGCaseポリペプチド活性(n＝6、＊p＜0.01(vectとの比較))。(図13D)65〜80歳の対照の皮質におけるGCaseポリペプチドの分析。試料1、試料2、試料4、試料6＝「高α-シヌクレイン」;試料3、試料5＝「低α-シヌクレイン」。α-シヌクレインタンパク質および小胞体(ER)後/小胞体(ER)GCaseポリペプチドレベルの定量をブロットの下にグラフ化する(＊p＜0.01)。(図13E)パーキンソン病(PD)脳溶解物のGCaseポリペプチドのウエスタンブロット。ローディング対照としてα-チューブリンおよびCBBを使用した。GCaseポリペプチドレベルを定量した(下)(n＝3［対照］または6［パーキンソン病(PD)］、＊p＝0.02)。下側:P2およびP3画分におけるGCaseポリペプチド活性(n＝3〜6、＊p＝0.04)。各ブロットの分子量(MW)はkDaで示す。(図13F)リソソームにおけるα-シヌクレインおよびGCaseポリペプチド枯渇による正の病原性フィードバック機序。(1)リソソームGlcCerの蓄積は、可溶性α-シヌクレインオリゴマーを加速および安定化させ(太矢印)、最終的にはこれがアミロイド線維に変わる(細矢印)。(2)α-シヌクレインの蓄積は、GCaseポリペプチドの小胞体(ER)-ゴルジ輸送を遮断する。(3)リソソームにおけるGCaseポリペプチドの減少は、GlcCerの蓄積および可溶性α-シヌクレインオリゴマーの安定化をさらに増幅し、各病原サイクルにより、GCaseポリペプチドの小胞体(ER)-ゴルジ輸送のより強い阻害をもたらす。すべての定量について、値は平均±SEMである。
【図１４】図14A〜図14Hは、初代ニューロンおよびヒト脳におけるα-シヌクレイン発現によって、リソソームGCaseポリペプチドの成熟および活性がモジュレーションされることを実証する。(図14A)細胞内遠心分画によるリソソームまたはミクロソーム細胞小器官の濃縮。空ベクター(vect)、野生型、A53TまたはΔ71-82α-シヌクレインを発現するレンチウイルスを感染多重度3(moi3)で感染させ、感染7日後(dpi7)に回収した神経培養物のウエスタンブロット分析。GRP78およびカルネキシンに対する抗体を使用してミクロソームの濃縮を確認し、LAMP1および2に対する抗体を使用してリソソームの濃縮を確認した。ローディング対照としてクマシーブリリアントブルー(CBB)を使用する。ブロットの左側に沿って分子量(MW)をkDaで示す。(図14B)デンシトメトリー分析によって、ウエスタンブロットを定量した(n＝3、＊p＜0.05)。(図14C)初代培養物においてヒト野生型α-シヌクレインを発現させた際の小胞体(ER)GCaseポリペプチドの蓄積および保持。野生型またはΔ71-82α-シヌクレインを発現するように形質導入したTriton X-100可溶性(T-可溶性)神経溶解物のEndo HおよびPNGase F/GCaseポリペプチドウエスタンブロット。対照として、VectおよびN末端短縮ポリQ伸長ハンチンチンタンパク質(Htt 548-72Q)を使用した。60kDaよりも下に泳動するEndo H感受性GCaseポリペプチド免疫活性スメアは、小胞体(ER)局在GCaseポリペプチドのレベルを示した。PNGase Fを使用して、脱グリコシル化GCaseポリペプチドの泳動を決定した。ローディング対照としてα-チューブリンを使用した。(図14D)感染神経培養物のリアルタイムPCRによるGCaseポリペプチドmRNAレベルの定量。(図14E)β-グルクロニダーゼ(GUSB)、酸性ホスファターゼ、ヘキソサミニダーゼA/B/S(Hex)およびGCaseポリペプチドを含む種々のリソソーム加水分解酵素の活性を、野生型またはA53Tα-シヌクレインを感染させた神経培養物のP2画分において、4-メチルウンベリフェリル基質切断によって決定した(n＝3、＊p＜0.05)。(図14F)様々なレベルのα-シヌクレインを有する健常対照脳のGCaseポリペプチドおよび活性レベルの分析。図13Dの対照ヒト脳の試料5および試料6をendo Hで処理し、GCaseポリペプチドのウエスタンブロットによって分析した。syn211を用いて、α-シヌクレインレベルを示す(下)。(図14G)モノクローナル抗体(mAb)syn303を使用した、45Åに対応するSEC画分のウエスタンブロット分析。ローディング対照としてNSEを使用した。分子量(MW)はkDaで示す。syn303は、18、44kDaに対応するバンドおよび他の高分子量(HMW)種のレベルの上昇を検出した。(図14H)左側:「高」および「低」含有α-シヌクレイン試料の全細胞GCaseポリペプチド活性。C5およびC6のP2(中央)およびP3(右側)画分において、GCaseポリペプチド活性を測定した(値は、3回反復した測定結果の平均±SEMである。＊p＜0.05)。(図14B)、(図14D)および(図14E)の定量については、値は平均±SEMである。
【図１５】図15A〜図15Cは、GCaseポリペプチド活性化がヒトドーパミンニューロンにおけるタンパク質分解を増加させることを示す。100μMのIFGまたはビヒクル対照(veh)でニューロンを5日間処理し、続いて1日ウォッシュアウトしてIFGを除去した。(図15A)GCaseポリペプチドのウエスタンブロット分析。ローディング対照として神経特異的エノラーゼ(NSE)を使用した。(図15B)NSEに対して標準化したGCaseポリペプチドレベルのデンシトメトリー分析(Vehに対する％、n＝3、値は平均±SEMである。＊p＜0.05)。(図15C)放射性パルスチェイスによって、タンパク質分解速度を決定した。追跡の0時間、8時間および20時間後に測定することによって速度を決定し、1時間あたりのタンパク質分解の増加倍率として表した。(n＝4、値は平均±SEMである。＊p＜0.05)。
【図１６】図16A〜図16Bは、パーキンソン病(PD)患者のヒト中脳iPSドーパミンニューロンにおいて、GCaseポリペプチドのアロステリック活性化によって、長命タンパク質分解が増強されることを実証する。GCaseポリペプチドのアロステリックアクチベーターでニューロンを処理し、放射性パルスチェイスによって長命(図16A)または短命(図16B)のタンパク質分解を決定した。
【図１７】図17A〜図17Cは、GCaseポリペプチドの過剰発現が、非神経細胞におけるリソソームタンパク質分解を増加させることを実証する。GFPまたはmyc-GCaseポリペプチド発現構築物をHela細胞にトランスフェクションした。(図17A)抗GCaseポリペプチドまたはmyc抗体を使用してウエスタンブロットによって、過剰発現レベルを決定した。ローディング対照としてGAPDHを使用した。2回のレプリケートを示す。(図17B)36時間後に、トランスフェクションHela細胞において、放射性パルスチェイスによって、長命タンパク質のタンパク質分解を決定した。リソソーム阻害剤であるロイペプチン(Leu)および塩化アンモニウム(NH4Cl)を使用して、各条件におけるリソソームタンパク質分解の量を決定した。(図17C)GFPまたはGCaseポリペプチドをトランスフェクションしたHela生細胞において、切断の際に蛍光を発する人工基質を使用して、カテプシンB活性を決定した。基質をウォッシュアウトした0〜60分後の相対蛍光単位(RFU)を測定することによって、活性を決定した。(図17B)および(図17C)については、n＝4、値は平均±SEMである。＊p＜0.05。
【図１８】図18A〜図18Bは、Rab1aポリペプチドの過剰発現によるα-シヌクレインの減少およびリソソーム機能の増強を示す。(図18A)Rab1aポリペプチドを発現するレンチウイルスを用いて、パーキンソン病(PD)患者のヒトiPSドーパミンニューロンに形質導入した。ウエスタンブロットによって、感染多重度5(moi5)でのRab1aポリペプチドの過剰発現を確認した。モノクローナル抗体(mAb)syn211を使用してウエスタンブロットによって、α-シヌクレインレベルを決定した。ローディング対照としてα-チューブリンを使用した。(図18B)図17A〜図17Cに記載されているように、トランスフェクションhela細胞において、カテプシンB活性を評価した。
【図１９】図19A〜図19Bは、GCaseポリペプチドのアロステリック活性化によって、ヒト中脳ドーパミンニューロンにおいてα-シヌクレインが減少することを実証する。(図19A)非罹患健常対照から作製したiPSニューロンをGCaseポリペプチドのアロステリックアクチベーターで処理することにより、α-シヌクレインレベルが減少する。モノクローナル抗体(mAb)syn211を用いてα-シヌクレインを検出し、ローディング対照としてチューブリンおよびハンチンチン(htt)を使用した。右側、デンシトメトリーによって、α-シヌクレインレベルを定量した。n＝3、値は平均±SEMである。＊p＜0.05。(図19B)(図19A)に記載されているように、パーキンソン病(PD)患者から作製したニューロンを処理および分析した。
【図２０】図20A〜図20Bは、GCaseシャペロンであるIFGおよび抗酸化剤の組み合わせが、パーキンソン病(PD)iPS中脳ドーパミンニューロンにおける小胞体(ER)後GCaseポリペプチドを増強することを示す。(図20A)PBS(veh)、IFG、n-アセチル-システイン(NAC)、またはIFG＋NACの両方を用いて、パーキンソン病(PD)患者からのニューロンを処理し、ウエスタンブロットによって、GCaseポリペプチドの成熟を決定した。ローディング対照としてβiiiチューブリンを使用した。(図20B)デンシトメトリーによって、小胞体(ER)後GCaseポリペプチドの量を定量し、チューブリンに対して標準化した。n＝4、値は平均±SEMである。＊p＜0.05(vehおよびIFGとの比較)、＊＊p＜0.05(veh、IFGおよびNACとの比較)。
【図２１】図21は、GM1ガングリオシドまたは全脳ガングリオシドの存在下、pH5.0におけるα-シヌクレインの沈降分析を示す。試料を0時間または15時間インキュベーションし、100,000gで30分間遠心分離して、α-シヌクレイン凝集体を沈降させ、syn211を使用してSDS-PAGE/ウエスタンブロットによって分析した。モノマー形態は18kDaに泳動し、オリゴマー形態は19kDaよりも上に泳動する。s、上清画分;p、ペレット画分。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本発明がより容易に理解されるために、一部の用語を以下のように最初に定義する;当業者であれば、以下に定義され、および/または本明細書において別途使用されるこれらの用語の使途および範囲を認識および理解するであろう。
【００２１】
活性化剤:本明細書において使用される「活性化剤」という用語は、標的実体のレベルおよび/または活性を、活性化剤が存在しない同等条件下におけるそのレベルおよび/または活性と比較して増加させる剤を指す。例えば、活性化剤は、標的実体のレベルおよび/または活性を、活性化剤が存在しない同等条件下におけるそのレベルおよび/または活性と比較して少なくとも約5％、例えば少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％またはそれ以上増加させることができる。いくつかの態様では、活性化剤は、その標的実体のレベルおよび/または活性を、参照レベルおよび/または活性の所定範囲内のある点へと増加させる。いくつかの態様では、参照レベルおよび/または活性は、それ本来の状況にある野生型種の標的実体で観察されるレベルおよび/または活性である。いくつかの態様では、活性化剤は、その標的に直接結合する。いくつかの態様では、活性化剤は、(すなわち、標的に結合する物理的に異なる実体と結合することによって)間接的に結合する。いくつかの態様では、活性化剤は、その標的と直接的にも間接的にも物理的に相互作用しないが、他の作用(例えば、標的の発現を増加させる核酸の調節部位に結合すること;標的を修飾してその活性を変化させる酵素を活性化または阻害すること)によって標的のレベルおよび/または活性を増加させる。いくつかの態様では、活性化剤は、その標的実体の半減期を安定化および/または増加させる。いくつかの態様では、活性化剤は、その標的実体を特定の三次元コンフォメーションで安定化させる。いくつかの態様では、活性化剤は、その標的実体への結合について阻害因子と競合する。いくつかの態様では、活性化剤は、標的実体の凝集を防止するか、または減少させる。いくつかの態様では、活性化剤は、その標的実体と別の実体(例えば、基質タンパク質、RNAもしくはDNA、小分子、ペプチドまたは炭水化物)との相互作用を安定化させる。いくつかの態様では、活性化剤は標的実体に結合して、その標的実体と別の実体との相互作用を、活性化剤が存在しない同等条件下におけるその相互作用と比較して増加させる。いくつかの態様では、活性化剤によって媒介される標的実体と別の実体との相互作用の増加は、その標的実体のレベルおよび/または活性を、活性化剤が存在しない同等条件下におけるそのレベルおよび/または活性と比較して増加させる。いくつかの態様では、活性化剤は標的実体に結合して、その標的実体と別の実体との相互作用を、活性化剤が存在しない同等条件下におけるその相互作用と比較して減少させる。いくつかの態様では、活性化剤によって媒介される標的実体と別の実体との相互作用の減少は、その標的実体のレベルおよび/または活性を、活性化剤が存在しない同等条件下におけるそのレベルおよび/または活性と比較して増加させる。一般に、活性化剤は、任意の化学的クラスの化合物(例えば、小分子、金属、核酸、ポリペプチド、脂質および/または炭水化物)でもよいし、前記化合物を含んでもよい。いくつかの態様では、活性化剤は抗体または抗体模倣物であるか、またはこれらを含む。いくつかの態様では、活性化剤は、核酸剤(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNAなど)またはその模倣物であるか、またはこれらを含む。いくつかの態様では、活性化剤は小分子であるか、または小分子を含む。いくつかの態様では、活性化剤は、天然に存在する化合物(例えば、小分子)であるか、または前記化合物を含む。いくつかの態様では、活性化剤は、ヒトの手によって作製および/または修飾された化学構造を有する。一般に、活性化剤は、細胞または生物中に存在し、および/またはこれらによって産生される1つまたは複数の標的実体のレベルまたは活性を増加させる。いくつかの態様では、標的実体はポリペプチドであるか、またはポリペプチドを含む。いくつかの態様では、標的実体は、核酸(例えば、ポリペプチドをコードするか、または［例えば、その発現および/または活性を変化させることによって］調節する核酸)であるか、または該核酸を含む。いくつかの態様では、標的実体は炭水化物であるか、または炭水化物を含む。いくつかの態様では、標的実体は脂質であるか、または脂質を含む。いくつかの態様では、標的実体は酵素であるか、または酵素を含む。いくつかの態様では、標的実体はリソソーム酵素であるか、またはリソソーム酵素を含む。いくつかの態様では、標的実体は、細胞輸送に関与するポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む。
【００２２】
アミロイドパチー:本明細書において使用される「アミロイドパチー」または「アミロイドパチーの」という用語は、アミロイドコンフォメーション(すなわち、β-プリーツシート)を示す任意の疾患関連タンパク質の病理学的蓄積を伴うか、または前記病理学的蓄積を特徴とする疾患、障害、および/または状態を指し、アルツハイマー病、血管性認知症および認知機能障害が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
抗酸化剤:本明細書において使用される「抗酸化剤」という用語は、別の実体の酸化、ニトロ化またはニトロシル化を阻害する実体、例えば小分子、ポリペプチド、核酸、糖類、脂質、無機物質(例えば、金属、ミネラルなど)またはそれらの組み合わせを指す。
【００２４】
β-ガラクトシダーゼポリペプチド:本明細書において使用される「β-ガラクトシダーゼポリペプチド」または「β-galポリペプチド」という用語は、β-ガラクトシダーゼ酵素であるポリペプチドを指す。当業者であれば、β-ガラクトシダーゼが、ガラクトースとその有機部分との間に形成されたβ-グリコシド結合の加水分解を触媒する加水分解酵素であることを認識するであろう。β-ガラクトシダーゼ酵素は、異なる細胞内位置を有する。すなわち、β-ガラクトシダーゼアイソフォーム1はリソソーム中に局在しており、β-ガラクトシダーゼアイソフォーム2は特定の細胞質領域に局在している。β-ガラクトシダーゼ酵素の基質には、ガングリオシドGM1、ラクトシルセラミド、ラクトースおよび種々の糖タンパク質が含まれる。代表的な公知のβ-ガラクトシダーゼポリペプチドには、以下の表1に列挙されているものが含まれる。
【００２５】
いくつかの態様では、β-ガラクトシダーゼポリペプチドは、β-ガラクトシダーゼポリペプチド相同体である。「β-ガラクトシダーゼポリペプチド相同体」という用語は、そのアミノ酸配列が、表1のポリペプチドに見られる保存残基を含む少なくとも1つの配列要素を含むポリペプチドを含む;いくつかのこのような態様では、このような配列要素は、その同一性および相対位置が保存されている少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の残基を含む。いくつかの態様では、このような配列要素は、少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の連続する残基を含む。あるいはまたは加えて、いくつかの態様では、「β-ガラクトシダーゼポリペプチド相同体」は、そのアミノ酸配列が表1の1つまたは複数のポリペプチドと少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の全体的な配列同一性を示し、および/または少なくとも1つの特徴的な配列要素を表1の1つまたは複数のポリペプチドと共有するポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、このような特徴的な配列要素は、表1のポリペプチドに見られる1つまたは複数の触媒残基および/または1つまたは複数の保存残基を含む。
【００２６】
カルシウムチャンネル遮断剤:「カルシウムチャンネル遮断剤」という用語は、電位依存性カルシウムチャンネルを遮断する剤を指す。「カルシウムチャンネル遮断剤」という用語の同義語は、カルシウムチャンネルアンタゴニスト、カルシウムチャンネル阻害剤およびカルシウム流入遮断剤であり、これらの用語は本明細書において同義に用いられる。例示的なカルシウムチャンネル遮断剤には、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、ニカルジビン、ニフェジピン、ニグルジピン、ニルジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニバルジピン、リヨシジン(ryosidine)、アニパミル、ジルチアゼム、フェンジリン、フルナリジン、ガロパミル、ミベフラジル、プレニルアミン、チアパミル、ベラパミル、マレイン酸ペルヘキシリン、フェンジリン、プレニラミンおよびそれらのいずれかの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
特徴的な配列要素:「特徴的な配列要素」という用語は、ポリペプチド、小分子または核酸のファミリーのすべてのメンバーに見られるものであり、したがって、当業者が該ファミリーのメンバーを定義するのに使用できる特有のコア配列または構造要素を指す。
【００２８】
併用療法:「併用療法」という用語は、対象がいずれの剤にも同時に曝露されるように、2つまたはそれ以上の異なる薬剤が、重複したレジメンで投与される状況を指す。
【００２９】
同等:「同等」という用語は、得られた結果または観察された現象を比較できるほど十分に互いに類似している2つ(またはそれ以上)の条件または環境のセットを説明するのに本明細書において使用される。いくつかの態様では、条件または環境の同等なセットは、複数の実質的に同一の特質および1つまたは少数の異なる特質を特徴とする。当業者であれば、条件または環境の異なるセットの下で得られた結果または観察された現象の違いは、変化するそれらの特質の変動によって引き起こされるか、または前記変動を示すものであるという合理的な結論を支持するのに十分な数および種類の実質的に同一の特質を特徴とする場合に、条件のセットが互いに同等であることを認識するであろう。
【００３０】
投与レジメン:本明細書において使用される「投与レジメン」または「治療レジメン」は、典型的には一定期間を空けて対象に個別に投与される一連の単位用量(典型的には、2つ以上)を指す。いくつかの態様では、所定の治療剤は、1つまたは複数の投与を含み得る推奨投与レジメンを有する。いくつかの態様では、投与レジメンは、それぞれが同じ長さの一定期間で互いに分けられている複数の投与を含む;いくつかの態様では、投与レジメンは、複数の投与と、個々の投与を分けている少なくとも2つの異なる期間とを含む。いくつかの態様では、投与レジメン内のすべての投与は、同じ単位投与量によるものである。いくつかの態様では、投与レジメン内の異なる投与は、異なる量によるものである。いくつかの態様では、投与レジメンは、第1の投与量での第1の投与、続いて第1の投与量とは異なる第2の投与量での1つまたは複数の追加の投与を含む。いくつかの態様では、投与レジメンは、第1の投与量での第1の投与、続いて第1の投与量と同じ第2の投与量での1つまたは複数の追加の投与を含む。
【００３１】
酵素補充療法:本明細書において使用される「酵素補充療法」という用語は、同じ種(例えば、ヒト)の正常個体集団全体で平均して観察されるレベルと比較して減少した酵素活性レベルを酵素投与前に示す対象に、酵素を投与することを指す。
【００３２】
等価用量:「等価用量」という用語は、同じ生物学的結果をもたらす薬学的に活性な異なる剤の投与量を比較するのに本明細書において使用される。2つの異なる剤の投与量は、同等のレベルまたは程度の生物学的結果を達成する場合、本発明に従って互いに「等価」であると考えられる。いくつかの態様では、本発明に従って使用するための異なる薬剤の等価用量は、本明細書において記載されるように、インビトロおよび/またはインビボアッセイを使用して決定される。いくつかの態様では、本発明に従って使用するための1つまたは複数のリソソーム活性化剤は、参照リソソーム活性化剤の用量と等価の用量で用いられる;いくつかの態様では、このような目的のための参照リソソーム活性化剤は、小分子アロステリックアクチベーター(例えば、ピラゾロピリミジン(pyrazolpyrimidine))、イミノ糖(例えば、イソファゴミン)、抗酸化剤(例えば、n-アセチル-システイン)および細胞輸送の調節因子(例えば、Rab1aポリペプチド)からなる群より選択される。
【００３３】
機能獲得型疾患:「機能獲得型疾患」という用語は、典型的には、凝集関連タンパク質毒性の増加を特徴とする疾患を指す。このような疾患では、細胞内および/または細胞外でのクリアランスより凝集が上回っている。機能獲得型疾患は加齢に関連することが多く、毒性機能獲得型疾患とも称される。機能獲得型疾患には、タンパク質内におけるポリグルタミン反復または他のアミノ酸、例えば、アラニンの反復の凝集に関連する神経変性疾患、レビー小体病およびα-シヌクレイン凝集に関連する他の障害、筋萎縮性側索硬化症、トランスサイレチン関連凝集疾患、アルツハイマー病、加齢性黄斑変性、封入体筋炎、ならびにプリオン病が含まれるが、これらに限定されない。ポリグルタミン凝集に関連する神経変性疾患には、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、いくつかの種類の脊髄小脳失調症、および脊髄球性筋萎縮症が含まれるが、これらに限定されない。アルツハイマー病は、2種類の凝集体:Aβペプチドの細胞内および細胞外凝集体、ならびに微小管関連タンパク質タウの細胞内凝集体の形成を特徴とする。トランスサイレチン関連凝集疾患には、例えば、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドニューロパチーおよび家族性アミロイド心筋症が含まれる。レビー小体病はα-シヌクレインタンパク質の凝集を特徴とし、例えば、パーキンソン病を含む。プリオン病(伝達性海綿状脳症としても公知である)はプリオンタンパク質の凝集を特徴とする。例示的なヒトプリオン病は、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症およびクールーである。
【００３４】
遺伝子治療:本明細書において使用される「遺伝子治療」という用語は、対象(例えば、ヒト対象)に、ポリペプチドをコードする核酸(または例えば逆転写による核酸に由来する核酸)を投与することを指す。多くの態様では、このような投与は、投与後にポリペプチドが対象の細胞で発現するか、または対象の細胞によって発現されるように実施される。核酸は細胞のゲノムに組み込んでもよいし、エピソーム(細胞質中に独立して、または染色体の一部として存在できるある種の細胞の遺伝性粒子)として細胞中に永続的に存在してもよい。遺伝子治療は、送達される細胞中で一体化されないまたは永続的には存在しない核酸の送達も包含する。
【００３５】
グルコセレブロシダーゼポリペプチド:本明細書において使用される「グルコセレブロシダーゼポリペプチド」という用語は、β-グルコセレブロシダーゼ酵素であるポリペプチドを指す。当業者であれば、グルコセレブロシダーゼが本来はリソソーム中に局在しており、そこでグルコシルセラミドのβ-グルコシド結合を加水分解することを認識するであろう。この天然に存在するグルコセレブロシダーゼ酵素は、酸性β-グルコシダーゼ、アルグルセラーゼ、β-グルコセレブロシダーゼ、D-グルコシル-N-アシルスフィンゴシングルコシルヒドロラーゼ、GBA1、Glcm_ヒト、Gluc、グルコセレブロシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルコスフィンゴシングルコシルヒドロラーゼ、グルコシルセラミダーゼ、グルコシルセラミドβ-グルコシダーゼまたはイミグルセラーゼとしても公知である。代表的な公知のグルコセレブロシダーゼポリペプチドには、以下の表2に列挙されているものが含まれる。
【００３６】
いくつかの態様では、グルコセレブロシダーゼポリペプチドは、グルコセレブロシダーゼポリペプチド相同体である。「グルコセレブロシダーゼポリペプチド相同体」という用語は、そのアミノ酸配列が、表2のポリペプチドに見られる保存残基を含む少なくとも1つの配列要素を含むポリペプチドを含む;いくつかのこのような態様では、このような配列要素は、その同一性および相対位置が保存されている少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の残基を含む。いくつかの態様では、このような配列要素は、少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の連続する残基を含む。あるいはまたは加えて、いくつかの態様では、「グルコセレブロシダーゼポリペプチド相同体」は、そのアミノ酸配列が表2の1つまたは複数のポリペプチドと少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の全体的な配列同一性を示し、および/または少なくとも1つの特徴的な配列要素を表2の1つまたは複数のポリペプチドと共有するポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、このような特徴的な配列要素は、表2のポリペプチドに見られる1つまたは複数の触媒残基および/または1つまたは複数の保存残基を含む。
【００３７】
グルコシルセラミド合成酵素ポリペプチド:本明細書において使用される「グルコシルセラミド合成酵素ポリペプチド」という用語は、少なくとも1つの特徴的な配列要素および/または全体的な配列同一性を、グルコシルセラミド系スフィンゴ糖脂質の産生に関与するグルコシルトランスフェラーゼ酵素と共有し、グリコシルトランスフェラーゼ(glycosyltransferase)活性を同様に示すポリペプチドを指す。本来、グルコシルセラミド合成酵素は、セラミドへのグルコシル基転移を介して、ガングリオシド(例えば、GM3)と称されるスフィンゴ糖脂質コンジュゲートの産生を調節する。代表的な公知のグルコシルセラミド合成酵素ポリペプチドには、以下の表3に列挙されているものが含まれる。いくつかの態様では、グルコシルセラミド合成酵素ポリペプチドは、そのアミノ酸配列が、表3のポリペプチドに見られる保存残基を含む少なくとも1つの配列要素を含むポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む。
【００３８】
いくつかの態様では、グルコシルセラミド合成酵素ポリペプチドは、グルコシルセラミド合成酵素ポリペプチド相同体であり得る。「グルコシルセラミド合成酵素ポリペプチド相同体」という用語は、そのアミノ酸配列が、表3のポリペプチドに見られる保存残基を含む少なくとも1つの配列要素を含むポリペプチドを含む;いくつかのこのような態様では、このような配列要素は、その同一性および相対位置が保存されている少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の残基を含む。いくつかの態様では、このような配列要素は、少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の連続する残基を含む。あるいはまたは加えて、いくつかの態様では、「グルコシルセラミド合成酵素ポリペプチド相同体」は、そのアミノ酸配列が表3の1つまたは複数のポリペプチドと少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の全体的な配列同一性を示し、および/または少なくとも1つの特徴的な配列要素を表3の1つまたは複数のポリペプチドと共有するポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、このような特徴的な配列要素は、表3のポリペプチドに見られる1つまたは複数の触媒残基および/または1つまたは複数の保存残基を含む。
【００３９】
ヘキソサミニダーゼポリペプチド:本明細書において使用される「ヘキソサミニダーゼポリペプチド」または「β-ヘキソサミニダーゼポリペプチド」という用語は、β-ヘキソサミニダーゼ酵素であるポリペプチドを指す。当業者であれば、β-ヘキソサミニダーゼ酵素が、N-アセチル-β-D-ヘキソサミニデ(hexosaminides)における末端N-アセチル-D-ヘキソサミン残基の加水分解に関与することを認識するであろう。β-ヘキソサミニダーゼ酵素および補因子GM2アクチベータータンパク質は、GM2ガングリオシド、および末端N-アセチルヘキソサミンを含有する他の分子の分解を触媒する。リソソームβ-ヘキソサミニダーゼ酵素は二量体構造であり、3つの活性二量体アイソザイムが、α-およびβ-サブユニット(それぞれHEXAおよびHEXB遺伝子によってコードされる)の組み合わせによって産生される。ヘキソサミニダーゼアイソザイムAはインビボでGM2ガングリオシドを加水分解し、α/βヘテロ二量体サブユニットの組成を有する。ヘキソサミニダーゼアイソザイムBはβ/βホモ二量体サブユニットの組成を有し、ヘキソサミニダーゼアイソザイムSはα/αホモ二量体サブユニットの組成を有する。代表的な公知のヘキソサミニダーゼポリペプチドには、以下の表4に列挙されているものが含まれる。
【００４０】
いくつかの態様では、ヘキソサミニダーゼポリペプチドは、ヘキソサミニダーゼポリペプチド相同体であり得る。「ヘキソサミニダーゼポリペプチド相同体」という用語は、そのアミノ酸配列が、表4のポリペプチドに見られる保存残基を含む少なくとも1つの配列要素を含むポリペプチドを含む;いくつかのこのような態様では、このような配列要素は、その同一性および相対位置が保存されている少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の残基を含む。いくつかの態様では、このような配列要素は、少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の連続する残基を含む。あるいはまたは加えて、いくつかの態様では、「ヘキソサミニダーゼポリペプチド相同体」は、そのアミノ酸配列が表4の1つまたは複数のポリペプチドと少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の全体的な配列同一性を示し、および/または少なくとも1つの特徴的な配列要素を表4の1つまたは複数のポリペプチドと共有するポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、このような特徴的な配列要素は、表4のポリペプチドに見られる1つまたは複数の触媒残基および/または1つまたは複数の保存残基を含む。
【００４１】
改善、増加または減少:本明細書において使用される「改善する」、「増加させる」もしくは「減少させる」という用語または文法上の等価語は、参照測定結果に対する値を示す。いくつかの態様では、参照測定結果は、同等条件下で行われたものである。いくつかの態様では、参照測定結果は過去の値であるか、または過去の値を含む。いくつかの態様では、参照測定結果は異なる時点(例えば、特定の処置または事象の開始前)における同じ個体の測定結果であるか、または前記測定結果を含む。いくつかの態様では、参照測定結果は対照個体(または複数の対照個体)の測定結果であるか、または前記測定結果を含む;いくつかのこのような態様では、「対照」個体は、a)特定の処置または事象に曝露されておらず、および/またはb)プロテイノパチーに対して(試験個体と比較して)異なる易罹患性または苦痛を示すが、任意で1つまたは複数の特徴、例えば人種、年齢(例えば、おおよそ、例えば一定範囲内)、体重(例えば、おおよそ、例えば一定範囲内)、身長(例えば、おおよそ、例えば一定範囲内)、体質、地理的な住居、食習慣、運動習慣などを試験個体と共有していてもよいものである。いくつかの態様では、参照測定結果は、異なる設定(例えば、このような処置または事象が行われないか、または行われなかった設定)で行われた測定結果である。
【００４２】
機能喪失型疾患:「機能喪失型疾患」という用語は、典型的には、不十分なタンパク質フォールディングによってタンパク質が過剰に分解されることを特徴とする疾患を指す。例示的な機能喪失型疾患には、嚢胞性線維症、リソソーム蓄積疾患およびフォンヒッペル・リンダウ(VHL)病が含まれるが、これらに限定されない。嚢胞性線維症において、変異または欠損のある酵素は嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子(CFTR)である。このタンパク質の最もよく見られる変異の1つは、3つのヌクレオチドの欠失(Δ)であるΔF508であり、これにより、タンパク質の508番目(508)の位置にあるアミノ酸フェニルアラニン(F)が消失する。
【００４３】
リソソーム酵素:本明細書において使用される「リソソーム酵素」という用語は、リソソーム中で機能する酵素を指す。リソソーム酵素のいくつかの例には、α-ガラクトシダーゼA;β-グルコシダーゼ;α-グルコシダーゼ;β-ヘキソサミニダーゼA;β-ヘキソサミニダーゼB;α-L-イズロニダーゼ;β-ガラクトシダーゼ;β-グルクロニダーゼ;α-グルクロニダーゼ;α-フコシダーゼ;スルファターゼ;酸性セラミダーゼ;NPC1;酸性スフィンゴミエリナーゼ;カテプシン(A、D、H、S、Z);H(＋)-ATPase;シアリダーゼ;β-ガラクトセレブロシダーゼ;アリールスルファターゼ;イズロン酸-2-スルファターゼ;ヘパランN-スルファターゼ;α-N-アセチルグルコサミニダーゼ;α-グルコサミニドN-アセチルトランスフェラーゼ;N-アセチルグルコサミン-6-硫酸スルファターゼ;N-アセチルガラクトサミン-6-硫酸スルファターゼ;アリールスルファターゼB;酸性α-マンノシダーゼ;酸性β-マンノシダーゼ;酸性α-L-フコシダーゼ;α-N-アセチルノイラミニダーゼ;β-N-アセチルグルコサミニダーゼ;およびα-N-アセチルガラクトサミニダーゼが含まれるが、これらに限定されない。代表的な公知のリソソーム酵素には、以下の表5に列挙されているものが含まれる。いくつかの態様では、リソソーム酵素は、リソソーム酵素相同体であり得る。「リソソーム酵素相同体」は、そのアミノ酸配列が、表5のポリペプチドに見られる保存残基を含む少なくとも1つの配列要素を含むポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む;いくつかのこのような態様では、このような配列要素は、その同一性および相対位置が保存されている少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の残基を含む。いくつかの態様では、このような配列要素は、少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の連続する残基を含む。あるいはまたは加えて、いくつかの態様では、「リソソーム酵素相同体」は、そのアミノ酸配列が表5の1つまたは複数のポリペプチドと少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の全体的な配列同一性を示し、および/または少なくとも1つの特徴的な配列要素を表5の1つまたは複数のポリペプチドと共有するポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、このような特徴的な配列要素は、表5のポリペプチドに見られる1つまたは複数の触媒残基および/または1つまたは複数の保存残基を含む。
【００４４】
リソソーム蓄積疾患:本明細書において使用される「リソソーム蓄積疾患」という用語は、リソソーム中で高分子を破壊してペプチド、アミノ酸、単糖、核酸および脂肪酸にするのに必要な酵素(例えば、酸性加水分解酵素)の少なくとも1つの欠損に起因する遺伝障害の一群を指す。リソソーム蓄積疾患は、酵素活性を有しても有しなくてもよい非リソソームタンパク質に起因し得る:例えば、酸性加水分解酵素をリソソームに輸送するのに関与するタンパク質、例えばリソソーム内在性膜タンパク質2(LIMP2)の欠損;酸性加水分解酵素の翻訳後修飾に関与する小胞体(ER)タンパク質、例えば多種スルファターゼ欠損症(MSD)において見出されたタンパク質の欠損;ゴルジ体において見出されたタンパク質であって、酸性加水分解酵素および他のリソソームタンパク質をリソソーム区画に輸送するのに関与するタンパク質、例えば封入体細胞病(I細胞病)で欠損しているN-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼの欠損;酸性加水分解酵素補因子、例えばスフィンゴ脂質アクチベータータンパク質(サポシンA、B、C、D)の欠損;膜融合タンパク質、例えば神経セロイドリポフスチン症(NCL)を引き起こすセロイドリポフスチン症神経タンパク質(CLN1-9)の欠損;酸性加水分解酵素の基質または代謝産物をリソソームに輸送し、およびこれらをリソソームから輸送するのに関与するタンパク質、例えばニーマン・ピックC型(NPC)で欠損しているニーマン・ピックC型タンパク質(コレステロール輸送体)の欠損;ならびに酸性加水分解酵素の基質をリソソーム内腔に取り込むリソソーム受容体または輸送タンパク質、例えばダノン病で欠損しているLAMP2Aの欠損。その結果として、リソソーム蓄積疾患に罹患している個体は、リソソーム中に蓄積した物質を有する。代表的なリソソーム蓄積疾患には、以下の表10に列挙されているものが含まれる。
【００４５】
変異体:本明細書において使用される「変異体」という用語は、参照実体と顕著な構造同一性を示すが、参照実体と比較して1つまたは複数の化学的部分の存在またはレベルで参照実体と構造的に異なる実体を指す。多くの態様では、変異体は、その参照実体と機能的にも異なる。一般に、特定の実体が参照実体の「変異体」であると適切に考えられるかは、参照実体との構造同一性の度合に基づく。当業者によって認識されているように、任意の生物学的または化学的な参照実体は、ある種の特徴的な構造要素を有する。定義によれば、変異体は、1つまたは複数のこのような特徴的な構造要素を共有する異なる化学的実体である。少数だが例を挙げれば、小分子は、小分子の変異体が、コア構造要素および特徴的なペンダント部分を共有するが、他のペンダント部分の点でおよび/またはコア内に存在する結合の種類(例えば、単一対二重、E対Zなど)の点で異なるものであるように、特徴的なコア構造要素(例えば、大環状のコア)および/または1つもしくは複数の特徴的なペンダント部分を有してもよく、ポリペプチドは、線形空間または三次元空間で互いに関連した指定位置を有し、および/または特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸から構成される特徴的な配列要素を有してもよく、核酸は、線形空間または三次元空間で互いに関連した指定位置を有する複数のヌクレオチド残基から構成される特徴的な配列要素を有してもよい。例えば、変異体ポリペプチドは、アミノ酸配列の1つまたは複数の違い、および/またはポリペプチド骨格に共有結合している化学的部分(例えば、炭水化物、脂質など)の1つまたは複数の違いの結果として参照ポリペプチドと異なってもよい。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％または99％の全体的な配列同一性を示す。あるいはまたは加えて、いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、少なくとも1つの特徴的な配列要素を参照ポリペプチドと共有しない。いくつかの態様では、参照ポリペプチドは、1つまたは複数の生物学的活性を有する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドの生物学的活性の1つまたは複数を共有する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドの生物学的活性の1つまたは複数を欠く。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して減少したレベルの1つまたは複数の生物学的活性を示す。
【００４６】
薬学的組成物:本明細書において使用される「薬学的組成物」という用語は、1つまたは複数の薬学的に許容される担体と一緒に製剤化される活性剤を指す。いくつかの態様では、活性剤は、関連集団に投与された場合に所定の治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンで投与するのに適切な単位用量で存在する。いくつかの態様では、薬学的組成物は、以下のものに適合された形態を含む固体または液体の形態で投与するために特別に製剤化してもよい:経口投与、例えば水薬(水性もしくは非水性の溶液または懸濁液)、錠剤、例えば口腔吸収、舌下吸収および全身吸収を目的とするもの、巨丸剤、粉末、顆粒、舌適用用のペースト;非経口投与、例えば皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射または硬膜外注射によるもの、例えば滅菌溶液もしくは懸濁液または持続放出製剤;局所適用、例えばクリーム、軟膏もしくは制御放出パッチ、または皮膚、肺または口腔に適用される噴霧剤;膣内的または直腸内的なもの、例えばペッサリー、クリームまたはフォーム;舌下;眼;経皮;または鼻腔、肺および他の粘膜表面。
【００４７】
薬学的に許容される:本明細書において使用される「薬学的に許容される」という語句は、正当な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適切であり、合理的なリスク対効果比に見合っている化合物、物質、組成物および/または剤形を指す。
【００４８】
薬学的に許容される担体:本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、主題化合物を、ある器官または体の一部から別の器官または体の一部に運送または運搬することに関与する薬学的に許容される物質、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤または溶媒カプセル化材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に対して有害ではないという意味において「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として作用できる物質のいくつかの例には、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖;コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン;カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体;粉末トラガカントゴム;麦芽;ゼラチン;タルク;ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤;ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油などの油;プロピレングリコールなどのグリコール;グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール;オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル;寒天;水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤;アルギン酸;発熱物質を含まない水;等張生理食塩水;リンガー液;エチルアルコール;pH緩衝溶液;ポリエステル、ポリカーボネートおよび/またはポリ酸無水物;ならびに薬学的製剤で用いられる他の無毒の適合性物質が含まれる。
【００４９】
薬学的に許容される塩:本明細書において使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、薬学的な状況において使用するのに適切であるような化合物の塩、すなわち、正当な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずにヒトおよびより下等な動物の組織と接触させて使用するのに適切であり、合理的なリスク対効果比に見合っている塩を指す。薬学的に許容される塩は、当技術分野において周知である。例えば、S. M. Bergeらは、J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19(1977)において薬学的に許容される塩を詳細に説明している。いくつかの態様では、薬学的に許容される塩には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸を用いて、または酢酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸などの有機酸を用いて、またはイオン交換などの当技術分野において使用される別の方法を使用することによって形成されたアミノ基の塩である無毒の酸付加塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、薬学的に許容される塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、硫酸水素塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩(pectinate)、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれるが、これらに限定されない。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。いくつかの態様では、薬学的に許容される塩には、適切な場合には、ハロゲン化物イオン、水酸化イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、1個〜6個の炭素原子を有するアルキルスルホン酸イオンおよびアリールスルホン酸イオンなどの対イオンを用いて形成された、無毒のアンモニウム、第四級アンモニウムおよびアミンカチオンが含まれる。
【００５０】
ポリペプチド:一般に、「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結された少なくとも2つの残基(例えば、アミノ酸)の鎖である。いくつかの態様では、ポリペプチドは、このような残基以外の1つまたは複数の部分を含む。例えば、いくつかの態様では、ポリペプチドは、その残基に結合された1つまたは複数のグリカン部分を含む(例えば、糖ペプチドである)。いくつかの態様では、ポリペプチドは、1つまたは複数のポリエチレングリコール部分を含む(すなわち、ペグ化されている)。いくつかの態様では、ポリペプチドは、1つまたは複数のジスルフィド結合によって連結され、または他の手段によって結合された1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドは、アミノ酸残基を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドは、アミノ酸ではない1つまたは複数の残基を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸である1つまたは複数の残基を含む。
【００５１】
薬理学的シャペロン:本明細書において使用される「薬理学的シャペロン」という用語は、タンパク質に特異的に結合し、以下の効果の1つまたは複数を有する小分子、ポリペプチド、核酸、脂質または炭水化物などの分子を指す:タンパク質の安定な分子コンフォメーション形成の増強;小胞体(ER)から別の細胞部位、好ましくは本来の細胞部位へのタンパク質輸送の誘導、すなわち、タンパク質の小胞体(ER)関連分解の防止;ミスフォールディングタンパク質の凝集の防止;および/またはタンパク質の少なくとも部分的な野生型機能および/または活性の回復または増強。例えば、いくつかの態様では、薬理学的シャペロンは、1つまたは複数のリソソーム酵素に対して作用する。いくつかの態様では、薬理学的シャペロンは、その適切なフォールディング、輸送、非凝集および/または活性が、薬理学的シャペロンが存在しない場合に観察されるものと比べて増加するように、リソソーム酵素に結合する実体である。
【００５２】
プロテイノパチー:本明細書において使用される「プロテイノパチー」または「プロテイノパチーの」という用語は、1種または複数種のタンパク質、例えば限定されないが、α-シヌクレイン、β-アミロイドおよび/またはタウタンパク質の病原性凝集および/または蓄積を伴う疾患、障害、および/または状態を指す。いくつかの態様では、プロテイノパチーは、タンパク質の産生、フォールディング、凝集、代謝または分解(例えば、オートファジー)、運搬などの1つまたは複数についての異常を特徴とする。いくつかの態様では、プロテイノパチーは、神経変性疾患である。いくつかの態様では、プロテイノパチーは、炎症性疾患である。いくつかの態様では、プロテイノパチーは、心臓血管疾患である。いくつかの態様では、プロテイノパチーは、増殖性疾患である。シヌクレイノパチー、タウオパチー、アミロイドパチー、TDP-43プロテイノパチーなどの具体的な病状は、プロテイノパチーの例である。プロテイノパチーに関係する例示的なタンパク質には、パーキンソン病、レビー小体病および他のシヌクレイノパチーの症例でのα-シヌクレイン;アルツハイマー病およびある種の他の神経変性疾患の症例でのタウおよびβ-アミロイド;筋萎縮性側索硬化症の症例でのSOD1およびTDP-43;ハンチントン病の症例でのハンチンチン;網膜色素変性症の症例でのロドプシン;ならびにリソソーム蓄積疾患に関与するタンパク質が含まれる。
【００５３】
タンパク質恒常性:「タンパク質恒常性」または「タンパク質ホメオスタシス」という用語は、プロテオームを構成するタンパク質の濃度、コンフォメーション、結合相互作用、例えば四次構造および位置を指す。タンパク質恒常性は、タンパク質フォールディング/ミスフォールディングの化学的特性によって影響を受け、ならびにタンパク質の合成、フォールディング、コンフォメーション、結合相互作用、輸送、脱凝集および分解に影響を及ぼす生物学的経路と相互作用および競合する多数の調節ネットワークによって影響を受ける。いくつかの態様では、タンパク質恒常性は、例えば、1つまたは複数の核酸またはタンパク質のレベルおよび/または活性を変化させることによって制御される。いくつかの態様では、タンパク質恒常性は、転写および/または翻訳の変化によって制御される。
【００５４】
Rabポリペプチド:本明細書において使用される「Rabポリペプチド」という用語は、限定されないが、エンドソーム-リソソームシステムの小胞、ニューロンのシナプス小胞、細胞貯蔵物質のエキソサイトーシス、および新たに合成されたタンパク質の小胞体からゴルジ体およびゴルジ区画内への輸送を含む小胞輸送および膜融合の多段階を調節する小分子グアノシン三リン酸のRabファミリーのメンバー(GTPase)と、特徴的な配列要素および/または配列同一性の全体的な度合を共有するポリペプチドを指す。Rabポリペプチドの例は、Rab1aポリペプチドである。表6は、Rab1aポリペプチドをコードする核酸配列を示す。表6は、Rabポリペプチド配列の代表例を示す。
【００５５】
いくつかの態様では、Rabポリペプチドは、Rabポリペプチド相同体である。「Rabポリペプチド相同体」という用語は、そのアミノ酸配列が、表6のポリペプチドに見られる保存残基を含む少なくとも1つの配列要素を含むポリペプチドを含む;いくつかのこのような態様では、このような配列要素は、その同一性および相対位置が保存されている少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の残基を含む。いくつかの態様では、このような配列要素は、少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の連続する残基を含む。あるいはまたは加えて、いくつかの態様では、「Rabポリペプチド相同体」は、そのアミノ酸配列が表6の1つまたは複数のポリペプチドと少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の全体的な配列同一性を示し、および/または少なくとも1つの特徴的な配列要素を表6の1つまたは複数のポリペプチドと共有するポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、このような特徴的な配列要素は、表6のポリペプチドに見られる1つまたは複数の触媒残基および/または1つまたは複数の保存残基を含む。
【００５６】
試料:本明細書において使用される「試料」という用語は、本明細書において記載される関心対象の供給源から得られたか、または前記供給源に由来する生体試料を指す。いくつかの態様では、関心対象の供給源は、動物またはヒトなどの生物を含む。いくつかの態様では、生体試料は、生体組織または生体液を含む。いくつかの態様では、生体試料は、骨髄;血液;血球;腹水;組織または細針生検試料;細胞を含有する体液;遊離浮遊核酸;喀痰;唾液;尿;脳脊髄液、腹膜液;胸膜液;糞便;リンパ液;婦人科学的な液体;皮膚スワブ;膣スワブ;口腔スワブ;鼻スワブ;洗液または洗浄液、例えば管腔洗浄液または気管支肺胞洗浄液;吸引物;剥離物;骨髄検体;組織生検検体;外科検体;糞便、他の体液、分泌物、および/または排出物;および/またはそれらに由来する細胞などであるか、またはこれらを含む。いくつかの態様では、生体試料は、個体から得られた細胞であるか、または前記細胞を含む。いくつかの態様では、試料は、任意の適切な手段によって関心対象の供給源から直接的に得られた「一次試料」である。例えば、いくつかの態様では、一次生体試料は、生検(例えば、細針吸引または組織生検)、外科手術、体液(例えば、血液、リンパ液、糞便など)の採取などからなる群より選択される方法によって得られる。いくつかの態様では、文脈から明らかであるように、「試料」という用語は、一次試料を処理することによって(例えば、一次試料の1つまたは複数の成分を除去することによって、および/または一次試料に1つまたは複数の剤を添加することによって)得られる調製物を指す。例えば、ろ過には半透膜を使用する。このような「処理試料」は、例えば、試料から抽出された核酸またはタンパク質、またはmRNAの増幅もしくは逆転写、ある種の成分の単離および/もしくは精製などの技術に一次試料を供することによって得られた核酸またはタンパク質を含んでもよい。
【００５７】
サポシンポリペプチド:本明細書において使用される「サポシン」という用語は、少なくとも1つの特徴的な配列要素および/または全体的な配列同一性をサポシンタンパク質ドメインと共有するポリペプチドを指す。サポシンは、周囲の膜から脂質基質を切り離し、それを可溶性分解酵素が利用できるようにすることによって、種々のリソソーム脂質分解酵素のアクチベーターとして機能する熱安定性リソソーム小タンパク質である。サポシンは、4個のサポシン-Bドメイン(SapB1およびSapB2を4個ずつ)を含有する単一の前駆体分子プロサポシンとして合成され、タンパク質分解による切断後に活性サポシン(サポシンA、B、CおよびD)および2個のサポシン-Aドメイン(SapA)(これは、活性化の過程で除去される)が生成される。代表的な公知のサポシンポリペプチドには、以下の表7に列挙されているものが含まれる。
【００５８】
いくつかの態様では、サポシンポリペプチドは、サポシンポリペプチド相同体である。「サポシンポリペプチド相同体」という用語は、そのアミノ酸配列が表7のポリペプチドに見られる保存残基を含む少なくとも1つの配列要素を含むポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む;いくつかのこのような態様では、このような配列要素は、その同一性および相対位置が保存されている少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の残基を含む。いくつかの態様では、このような配列要素は、少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の連続する残基を含む。あるいはまたは加えて、いくつかの態様では、「サポシンポリペプチド相同体」は、そのアミノ酸配列が表7の1つまたは複数のポリペプチドと少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の全体的な配列同一性を示し、および/または少なくとも1つの特徴的な配列要素を表7の1つまたは複数のポリペプチドと共有するポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、このような特徴的な配列要素は、表7のポリペプチドに見られる1つまたは複数の触媒残基および/または1つまたは複数の保存残基を含む。
【００５９】
小分子:本明細書において使用される「小分子」という用語は、その分子量が約5000ダルトン(Da)未満である任意の化学物質または他の部分を含む。いくつかの態様では、小分子は、約2500、約1000または約500ダルトン未満の分子量を有する。いくつかの態様では、小分子は、ポリマーではない。いくつかの態様では、小分子は、ペプチドではない。いくつかの態様では、小分子は、核酸ではない。いくつかの態様では、小分子は、生物学的活性を有し、および/または生物学的過程に影響を与えるように作用する。いくつかの態様では、小分子は、天然産物である。いくつかの態様では、小分子は、天然産物ではない(例えば、化学合成によって最初に調製されたものである)。
【００６０】
スフィンゴ脂質代謝酵素:本明細書において使用される「スフィンゴ脂質代謝酵素」という用語は、スフィンゴ脂質の合成および分解を制御する酵素を指す。これらの酵素は、スフィンゴ脂質代謝産物(例えば、セラミド、スフィンゴシン、ジアシルグリセロール(diacyglycerol)またはスフィンゴシン-1-ホスフェート)の相互変換を調整する。例示的なスフィンゴ脂質代謝酵素には、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ、3-ケトジヒドロスフィンゴシン還元酵素、セラミドガラクトシルトランスフェラーゼ、グルコシルセラミド合成酵素、スフィンゴミエリン合成酵素および/または種々のリソソーム酵素、例えばβ-ヘキソサミニダーゼ、β-ガラクトシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。代表的な公知のスフィンゴ脂質代謝酵素には、以下の表8に列挙されているものが含まれる。いくつかの態様では、スフィンゴ脂質代謝酵素は、スフィンゴ脂質代謝酵素相同体であり得る。「スフィンゴ脂質代謝酵素相同体」は、そのアミノ酸配列が、表8のポリペプチドに見られる保存残基を含む少なくとも1つの配列要素を含むポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む;いくつかのこのような態様では、このような配列要素は、その同一性および相対位置が保存されている少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の残基を含む。いくつかの態様では、このような配列要素は、少なくとも3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれ以上の連続する残基を含む。あるいはまたは加えて、いくつかの態様では、「スフィンゴ脂質代謝酵素相同体」は、そのアミノ酸配列が表8の1つまたは複数のポリペプチドと少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の全体的な配列同一性を示し、および/または少なくとも1つの特徴的な配列要素を表8の1つまたは複数のポリペプチドと共有するポリペプチドであるか、または前記ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、このような特徴的な配列要素は、表8のポリペプチドに見られる1つまたは複数の触媒残基および/または1つまたは複数の保存残基を含む。
【００６１】
安定性:本明細書において使用される「安定性」という用語は、その野生型または機能的に同一のコンフォメーションのリソソーム酵素を誘導するまたは安定化させることを指す。本明細書において使用される機能的に同一という用語は、ほとんどすべてのタンパク質はそれらの生理状態ではいくらかの構造的柔軟性を示すので、軽微な変異がコンフォメーション中に存在してもよいが、構造的柔軟性によって、タンパク質の凝集、小胞体関連分解経路による排除、タンパク質機能の機能障害および/または不適切な細胞内輸送がもたらされないことを意味する。安定化は、人工基質を使用して細胞溶解物で測定した場合に、酵素の細胞内半減期の増加;リソソーム中の酵素レベルの増加;または加水分解活性の増加のいずれか1つによって決定できる。
【００６２】
対象:本明細書において使用される「対象」、「個体」または「患者」という用語は、例えば、実験的、診断的、予防的および/または治療的な目的のために、本発明の態様を使用または実施することができる任意の生物を指す。典型的な対象には、動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類およびヒトなどの哺乳動物;昆虫;蠕虫;など)が含まれる。ヒトには、出生前後の形態が含まれる。いくつかの態様では、対象は、投与されるリソソーム活性化剤によって標的とされるリソソーム酵素の変異体対立遺伝子を保有する。
【００６３】
実質的に:本明細書において使用される「実質的に」という用語は、関心対象の特徴または特性の完全なまたは完全に近い程度あるいは度合を示す量的条件を指す。生物学的技術分野の当業者は、生物学的および化学的現象が完了し、および/もしくは完結まで進行し、または絶対的な結果を達成もしくは回避することは極めてまれであることを理解するであろう。したがって、本明細書において使用される「実質的に」という用語は、多くの生物学的および化学的現象において固有の完全さの潜在的欠如を捉えるために本明細書において使用される。
【００６４】
罹患している:疾患、障害、および/または状態(例えば、脳卒中)「に罹患している」個体は、その疾患、障害、および/または状態の1つまたは複数の症候を持つ、および/または前記症候を示すと診断されている。
【００６５】
罹患しやすい:疾患、障害、および/または状態(例えば、限定されないが、本明細書において記載される任意の疾患、障害、および/または状態を含む任意の疾患、障害、および/または状態)「に罹患しやすい」個体は、その疾患、障害、および/または状態を発症するリスクがある。いくつかの態様では、疾患、障害、および/または状態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害、および/または状態のいかなる症候も示さない。いくつかの態様では、疾患、障害、および/または状態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害、および/または状態であると診断されていない。いくつかの態様では、疾患、障害、および/または状態に罹患しやすい個体は、その疾患、障害、および/または状態の発症に関連する条件に曝露された個体(例えば、感染病原体に曝露された個体;その疾患、障害、および/または状態を引き起こすと考えられる環境災害に曝露された個体;など)である。いくつかの態様では、疾患、障害、および/または状態を発症するリスクは、集団ベースのリスクである(例えば、個体は、その疾患、障害、および/または状態に関連する遺伝子および/または対立遺伝子を保有する)。
【００６６】
シヌクレイノパチー:本明細書において使用される「シヌクレイノパチー」または「α-シヌクレイノパチー」という用語は、タンパク質α-シヌクレインの病理学的蓄積を伴うか、または前記病理学的蓄積を特徴とする疾患、障害、および/または状態を指し、パーキンソン病、レビー小体病、多系統萎縮症、ハレルフォルデン・シュパッツ病および前頭側頭型認知症が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
タウオパチー:本明細書において使用される「タウオパチー」または「タウオパチーの」という用語は、タウタンパク質の病理学的蓄積を伴うか、または前記病理学的蓄積を特徴とする疾患、障害、および/または状態を指し、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症および進行性核上性麻痺が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
治療剤:本明細書において使用される「治療剤」という語句は、生物に投与された場合に所望の薬理学的効果を発揮する任意の剤を指す。いくつかの態様では、剤は、適切な集団全体にわたって統計的に有意な効果を実証する場合に、治療剤であると考えられる。いくつかの態様では、適切な集団は、モデル生物の集団でもよい。いくつかの態様では、適切な集団は、種々の基準、例えば一定の年齢群、性別、遺伝的背景、既存の臨床状態などによって定義してもよい。いくつかの態様では、治療剤は、疾患、障害、および/または状態の1つまたは複数の症候または特徴を緩和し、改善し、軽減し、阻害し、前記症候または特徴の発症を遅延させ、前記症候または特徴の重症度を減少させ、および/または前記症候または特徴の発生率を減少させるのに使用できる任意の物質である。
【００６９】
治療有効量:本明細書において使用される「治療有効量」という用語は、関連集団で検討した場合に、その投与が特定の治療効果の達成と相関するか、または前記達成と相関すると合理的に予想される治療剤の量を指す。治療効果は客観的(すなわち、いくつかの試験またはマーカーによって測定可能である)でもよいし、主観的(すなわち、対象が効果を示すか、または効果を感知する)でもよい。いくつかの態様では、物質の治療有効量は、疾患、障害、および/または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に投与された場合に、その疾患、障害、および/または状態の1つまたは複数の症候を処置、診断、予防および/または遅延および/または緩和するのに十分な量である。いくつかの態様では、治療有効量は、標的細胞において小胞体(ER)後形態のリソソーム酵素を増加させる量である。いくつかの態様では、治療有効量は、標的細胞におけるリソソームタンパク質分解を増加させる量である。いくつかの態様では、治療有効量は、標的細胞におけるスフィンゴ脂質レベルを減少させる量である。いくつかの態様では、治療有効量は、標的細胞におけるグルコシルセラミドレベルを減少させる量である。いくつかの態様では、治療有効量は、標的細胞におけるα-シヌクレインレベルを減少させる量である。疾患の進行は、当業者に明らかな臨床観察、実験室調査および神経画像調査によってモニタリングできる。治療有効量は、一般的には、複数の単位用量を含んでもよい投与レジメンで投与される。任意の特定の治療剤について、治療有効量(および/または有効な投与レジメン内の適切な単位用量)は、例えば、投与経路、他の薬剤との組み合わせに応じて変化し得る。また、任意の特定の患者のための具体的な治療有効量(および/または単位用量)は、処置される障害および障害の重症度;用いられる具体的な薬剤の活性;用いられる具体的な組成物;患者の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事;投与時間、投与経路、および/または用いられる具体的な融合タンパク質の排出もしくは代謝の速度;処置の継続期間;ならびに医療分野において周知であるような要因を含む様々な要因に依存し得る。さらに、有効量は、処置レジメン内で単回投与または複数回投与によって投与してもよい。いくつかの態様では、個々の投与または組成物は、処置レジメンに照らして用量として有効な量を含有する場合、「治療有効量」を含有すると考えられる。当業者であれば、用量または量は、患者集団に投与された場合に統計的に有意な有効性を示すと実証されるか、または実証された場合、有効であるとみなしてもよいことを認識するであろう;量が、本明細書において記載されるように治療上有効であると考えられるために、特定の個々の患者において特定の結果が達成される必要はない。
【００７０】
輸送:本明細書において使用される「輸送」という用語は、ポリペプチドまたは小胞が、小胞体を通して細胞内の所定の位置、細胞膜または細胞外の環境に移動することを指す。いくつかの具体的な態様では、本明細書において使用されるこの用語は、ポリペプチド(例えば、リソソーム酵素)が、小胞体(ER)を通しておよび/またはリソソームへと移動することを指す。
【００７１】
処置:本明細書において使用される「処置」(さらには「処置する」または「処置している」)という用語は、特定の疾患、障害、および/または状態の少なくとも1つの症候または特徴の重症度を緩和し、改善し、軽減し、抑制し、減少させ、および/または前記症候または特徴の発生率を減少させる薬剤の任意の投与を指す。処置には、疾患状態の悪化を予防すること、すなわち、いくつかの症候に基づいて対象が疾患であると診断された時点から、さらに症候が進行するのを停止させることが含まれる。本出願の文脈における処置はまた、対象におけるα-シヌクレインレベルの減少と定義してもよい。いくつかの態様では、処置は、疾患、障害、および/または状態の少なくとも1つの徴候または症候を示す対象に対して行われるという点で治療的である。
【００７２】
予防:本明細書において使用される「予防」という用語は、関連する疾患、障害、および/または状態の徴候または症候を過去に示していなかった対象において、少なくとも1つの症候が現れ始めるのを遅延させる薬剤の投与を指す。
【００７３】
単位用量:本明細書において使用される「単位用量」という表現は、単回投与として、および/または物理的に別個の単位で投与される薬学的組成物の量を指す。多くの態様では、単位用量は、所定分量の活性剤を含有する。いくつかの態様では、単位用量は、単回投与全体の剤を含有する。いくつかの態様では、すべての単回投与を達成するために、2つ以上の単位用量が投与される。いくつかの態様では、目的の効果を達成するために、複数の単位用量の投与が必要であるか、または前記投与が必要であると予想される。単位用量は、例えば、所定分量の1つまたは複数の治療剤を含有する液体(例えば、許容される担体)、所定量の1つまたは複数の固体形態の治療剤、所定量の1つまたは複数の治療剤を含有する持続放出製剤または薬物送達デバイスなどの容量でもよい。単位用量は、治療剤に加えて様々な成分のいずれかを含む製剤中に存在してもよいと認識される。例えば、許容される担体(例えば、薬学的に許容される担体)、希釈剤、安定剤、緩衝剤、保存剤などが、下記のように含まれてもよい。当業者であれば、多くの態様では、特定の治療剤の適切な1日総投与量は単位用量の一部または大部分を含んでもよく、例えば、正当な医学的判断の範囲内において主治医によって決定されてもよいことを認識するであろう。いくつかの態様では、任意の特定の対象または生物のための具体的な有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度;用いられる具体的な活性化合物の活性;用いられる具体的な組成物;対象の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事;投与時間、および用いられる具体的な活性化合物の排出速度;処置の継続期間;用いられる具体的な化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物および/またはさらなる治療薬、ならびに医療分野において周知であるような要因を含む様々な要因に依存し得る。
【００７４】
野生型:本明細書において使用される「野生型」という用語は、その技術的に理解されている意味を有し、(変異体、病的なもの、変化したものなどと対比して)「正常な」状態または状況で天然に見られる構造および/または活性を有する実体を指す。当業者であれば、野生型の遺伝子およびポリペプチドは、複数の異なる形態で存在することが多い(例えば、対立遺伝子)ことを認識するであろう。
【００７５】
小分子化合物構造の定義
本明細書において、小分子化合物は、標準命名法を使用して記載される。別に定義されていなければ、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
【００７６】
(すなわち、暗示または記述によって)特に指示がない限り、本明細書において表現または記載される任意の特定の小分子化合物は、該化合物を含む任意の利用可能なまたは適切な同位体から構成されてもよいと理解される。当業者によって理解されているように、同位体には、原子番号が同じで質量数の異なる原子が含まれる。一般例として、水素の同位体には三重水素と重水素が含まれ、炭素の同位体には11C、13C、14Cが含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
「置換された」という用語は、指定の原子または基の任意の1個または複数個の水素が、指定原子の通常の価数を超えることなく、示されている群から選択されたもので置換されることを意味する。置換基がオキソ(すなわち、＝O)である場合、原子上の2個の水素が置換される。芳香基がオキソ基で置換される場合、芳香環は、対応する部分不飽和環に置き換わる。例えば、オキソで置換されたピリジル基はピリドンである。特定の態様では、特定の置換基および/または変数は、このような組み合わせが安定な化合物または有用な合成中間体をもたらす場合にのみ許容される。安定な化合物または安定な構造は、本発明を実施する際にそれが曝露される環境に耐えるほど十分に頑強なものである。例えば、いくつかの態様では、化合物または構造は、単離および/または精製されるほど十分に頑強なものである場合には安定である。いくつかの態様では、化合物または構造は、薬学的組成物中に化合されるほど十分に頑強なものである場合には安定である。いくつかの態様では、化合物または構造は、本明細書において記載される機能アッセイにおいて用いられるほど十分に頑強なものである場合には安定である。
【００７８】
「置換されていてもよい」位置に存在し得る適切な基には、例えば、ハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、オキソ、アジド、アルカノイル(例えば、C2-C6アルカノイル基、例えばアシルなど);カルボキサミド;アルキルカルボキサミド;アルキル基、アルコキシ基、アルキルチオ基(1つまたは複数のチオエーテル結合を有するものを含む)、アルキルスルフィニル基(1つまたは複数のスルフィニル結合を有するものを含む)、アルキルスルホニル基(1つまたは複数のスルホニル結合を有するものを含む)、モノおよびジアミノアルキル基(1個または複数個のN原子を有する基を含む)(前述の任意のアルキル置換基はすべて、酸素または-NH-で置換された1つまたは複数のメチレン基を有してもよいし、約1個〜約8個、約1個〜約6個または1個〜約4個の炭素原子を有してもよい);シクロアルキル;フェニル;フェニルアルキル(例示的なフェニルアルキル基は、ベンジルである)、フェニルアルコキシ(例示的なフェニルアルコキシ基は、ベンジルオキシである)が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
2つの文字または記号に挟まれていないダッシュ(「-」)は、置換基の結合位置を示すのに使用される。
【００８０】
「アルキル」は、特定数の炭素原子を有する分枝状および直鎖状両方の飽和脂肪族炭化水素基を含む。C1-C2アルキルという用語は、1個〜約2個の炭素原子を有するアルキル基、例えばそれぞれメチルおよびエチルを意味する。
【００８１】
「アルキレン」は、指示数の炭素原子を有する直鎖状または分枝状の飽和二価炭素鎖である。
【００８２】
「アルキルエステル」は、上に定義したアルキル基であって、エステル結合を介して結合したアルキル基である。エステル結合はいずれの向きでもよく、例えば式-O(C＝O)アルキルの基または式-(C＝O)Oアルキルの基である。
【００８３】
「アルカノイル」は、上に定義したアルキル基であって、ケト(-(C＝O)-)橋を介して結合したアルキル基である。アルカノイル基は指定数の炭素原子を有し、ケト基の炭素は番号付けされた炭素原子に含まれる。例えば、C2アルカノイル基は、式 CH3(C＝O)-を有するアセチル基である。
【００８４】
「アルキルスルホニル」は、式 アルキル-(SO2)-(式中、アルキル基は、規定数の炭素原子を有する、上に定義したアルキルである)の基である。例示的なアルキルスルホニル基は、メチルスルホニルである。
【００８５】
「アルキルチオ」は、上に定義したアルキル基であって、硫黄結合を介して結合したアルキル基、すなわち、式 アルキル-S-の基を示す。例には、エチルチオおよびペンチルチオが含まれる。
【００８６】
「アルコキシ」は、上に定義したアルキル基であって、指示数の炭素原子を有し、酸素橋を介して結合したアルキル基を意味する。
【００８７】
「シクロアルキル」は、特定数の炭素原子、通常は3個〜約7個の炭素原子を有する飽和炭化水素環基である。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルおよび架橋飽和環基またはケージド飽和環基、例えばノルボラン(norborane)またはアダマンタンが含まれる。
【００８８】
「単環式または二環式の炭素環」は、炭素環原子のみを含有する3員〜8員の飽和環、部分不飽和環もしくは芳香環、または炭素環原子のみを含有する6員〜11員の飽和二環式炭素環系、部分不飽和二環式炭素環系もしくは芳香族二環式炭素環系である。特に指示がない限り、炭素環基は、安定な構造をもたらすそのペンダント基と任意の炭素原子で結合してもよい。指示されている場合、本明細書において記載される炭素環は、得られる化合物が安定である場合には、任意の利用可能な環炭素で置換されてもよい。炭素環基には、シクロプロピルおよびシクロヘキシルなどのシクロアルキル基;シクロヘキセニル、架橋シクロアルキル基などのシクロアルケニル基;ならびにフェニルなどのアリール基が含まれる。
【００８９】
「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを意味する。
【００９０】
「ヘテロシクロアルキル」は、N、OおよびSから選択される1個〜約3個のヘテロ原子を含有する指示数の環原子を有する飽和環基であって、残りの環原子が炭素である飽和環基である。ヘテロシクロアルキル基の例には、テトラヒドロフラニル基およびピロリジニル基が含まれる。
【００９１】
「単環式または二環式の複素環」は、5員〜8員の飽和環、部分不飽和環または芳香環であって、N、OおよびSから選択される1個〜約4個のヘテロ原子を含有し、残りの環原子が炭素である環であるか、または7員〜11員で二環式の飽和複素環系、部分不飽和複素環系または芳香族複素環系であって、それぞれが、N、OおよびSから選択される少なくとも1個のヘテロ原子を複数の環系中に含有し、N、OおよびSから独立して選択される最大約4個のヘテロ原子を該複数の環系の各環中に含有する環系である。特に指示がない限り、複素環は、安定な構造をもたらす置換基と任意のヘテロ原子または炭素原子で結合してもよい。指示されている場合、本明細書において記載される複素環は、得られる化合物が安定である場合には、炭素または窒素原子で置換されてもよい。複素環中の窒素原子は、四級化していてもよい。複素環基中のヘテロ原子の総数は4以下であること、ならびに複素環基中のSおよびO原子の総数は2以下、より好ましくは1以下であることが好ましい。複素環基の例には、ピリジル、インドリル、ピリミジニル、ピリジジニル(pyridizinyl)、ピラジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、フラニル、チオフェニル、チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキサゾリル、キノリニル、ピロリル、ピラゾリル、ベンズ[b]チオフェニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、チエニル、イソインドリル、ジヒドロイソインドリル、5,6,7,8-テトラヒドロイソキノリン、ピリジニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、ピロリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、ピペリジニルおよびピロリジニルが含まれる。
【００９２】
「モノおよび/またはジアルキルアミノ」は、第二級または第三級アルキルアミノ基であって、アルキル基が上に定義したとおりであり、指示数の炭素原子を有する第二級または第三級アルキルアミノ基を意味する。アルキルアミノ基の結合点は窒素上にある。アルキル基は独立して選択される。モノおよびジアルキルアミノ基の例には、エチルアミノ、ジメチルアミノ、メチル-プロピル-アミノが含まれる。
【００９３】
「モノまたはジアルキルカルボキサミド」は、式-(C＝O)Nアルキル1アルキル2(式中、アルキル1およびアルキル2基は、独立して選択された本明細書において定義されるアルキル基がカルボキサミド結合を介して結合したもの)の基である。カルボキサミド結合はいずれの向きでもよく、例えば-NH(C＝O)-または-(C＝O)NH-である。
【００９４】
「ハロアルキル」は、特定数の炭素原子を有する分枝状および直鎖状両方のアルキル基であって、1個または複数個のハロゲン原子、一般には最大許容数までのハロゲン原子で置換されたアルキル基を意味する。ハロアルキルの例には、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、2-フルオロエチルおよびペンタフルオロエチルが含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
「ハロアルコキシ」は、上に定義したハロアルキル基であって、酸素橋(アルコールラジカルの酸素)を介して結合したハロアルキル基を示す。
【００９６】
「キラル」という用語は、鏡像パートナーの重ね合わせることのできない特性を有する分子を指す。
【００９７】
「立体異性体」は、同一の化学構造を有するが、空間内での原子または基の配置が異なる化合物である。
【００９８】
「ジアステレオマー」は、2つまたはそれ以上のキラリティ中心を有し、その分子が互いの鏡像ではない立体異性体である。ジアステレオマーは、異なる物理的特性、例えば融点、沸点、スペクトル特性および反応性を有する。ジアステレオマーの混合物は、高分解能分析法、例えば電気泳動、分割剤の存在下での結晶化、または例えばキラルHPLCカラムを使用したクロマトグラフィーで分離することができる。
【００９９】
「エナンチオマー」は、化合物の2つの立体異性体であって、重ね合わせることのできない互いに鏡像であるものを指す。エナンチオマーの50:50混合物は、ラセミ混合物またはラセミ化合物と称され、化学反応またはプロセスにおいて立体選択性または立体特異性がなかった場合に生じ得る。
【０１００】
本明細書において使用される立体化学の定義および慣例は、一般に、S. P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company, New York;およびEliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに従う。多くの有機化合物は、光学活性体で存在する。すなわち、それらは、平面偏光面を回転させる能力を有する。光学活性化合物を説明する際に、DおよびLまたはRおよびSという接頭辞は、そのキラル中心についての分子の絶対配置を示すのに使用される。dおよびlまたは(＋)および(-)という接頭辞は、その化合物による平面偏光の回転の様子を指定するのに用いられ、(-)またはlは、その化合物が左旋性であることを意味する。(＋)またはdが付された化合物は、右旋性である。
【０１０１】
「ラセミ混合物」または「ラセミ化合物」は、2つのエナンチオマー種の等モル(または50:50)混合物であって、光学活性を持たないものである。ラセミ混合物は、化学反応またはプロセスにおいて立体選択性または立体特異性がなかった場合に生じ得る。
【０１０２】
（表１）β-ガラクトシダーゼポリペプチドの代表的なアミノ酸配列
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【０１０３】
（表２）β-グルコセレブロシダーゼポリペプチドの代表的なアミノ酸配列
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【０１０４】
（表３）グルコシルセラミド合成酵素ポリペプチドの代表的なアミノ酸配列
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【０１０５】
（表４）ヘキソサミニダーゼポリペプチドの代表的なアミノ酸配列
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【０１０６】
（表５）リソソーム酵素の代表的なアミノ酸配列
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【０１０７】
（表６）Rabポリペプチドの代表的な配列
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【０１０８】
（表７）サポシンポリペプチドの代表的なアミノ酸配列
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【０１０９】
（表８）スフィンゴ脂質代謝酵素の代表的なアミノ酸配列
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【０１１０】
特定の態様の詳細な説明
本発明は、プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態の(治療的または予防的にかかわらず)処置、および/またはこのような処置に有用な剤の同定および/または特徴付けに関する方法および組成物を提供する。特に、本発明は、プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態であると診断されたか、これらを有するリスクがあるか、またはこれらを有すると疑われる個体におけるリソソーム酵素を活性化させる1つまたは複数の治療剤を投与する方法を提供する。特に、本発明は、ある種のプロテイノパチーの有効な処置および/または予防のために、リソソーム酵素のレベルおよび/または機能的活性を増加させる方法を提供する。具体的には、いくつかの態様では、本発明は、リソソーム酵素の輸送の増加を達成し、それにより、ある種のプロテイノパチーの有効な処置および/または予防を提供する方法を提供する。
【０１１１】
いくつかの態様では、本発明は、プロテイノパチーの有効な処置および/または予防のために、リソソーム活性化剤(例えば、リソソーム酵素の輸送を増加させる剤)および/または抗酸化剤を単独で、または互いに組み合わせて使用するための方法を提供する。特に、いくつかの態様では、本発明は、ある種のプロテイノパチーの有効な処置および/または予防のために、タンパク質輸送経路の活性の増加を達成する方法を提供する。具体的には、とりわけ、本発明は、タンパク質輸送に影響を与え、したがって、リソソーム中のリソソーム酵素のレベルおよび/または活性に影響を与える剤を使用するための方法を提供する。特に、特定の態様では、本発明は、グルコシルセラミドレベルを低下させて、細胞におけるα-シヌクレインの蓄積または凝集の減少をもたらすための方法を提供する。
【０１１２】
提供される方法および組成物は、医薬において有用である。提供される方法および組成物は、プロテイノパチーの処置および/または予防において特に有用である。驚くべきことに、提供される方法および組成物は、リソソーム蓄積疾患以外のプロテイノパチーの処置および/または予防において有用である。驚くべきことに、提供される方法および組成物は、神経変性プロテイノパチーの処置および/または予防において有用である。加えて、提供される方法および組成物は、医薬、プロテイノパチーの処置および/もしくは予防、リソソーム蓄積疾患以外のプロテイノパチーの処置および/もしくは予防、ならびに/または神経変性プロテイノパチーの処置および/もしくは予防において有用な新たな剤、剤の組み合わせ、および/または治療レジメンの同定および/または特徴付けを可能にする。
【０１１３】
プロテイノパチー
プロテイノパチーという用語は、1種または複数種のタンパク質の病原性蓄積および/または凝集を伴う疾患、障害、および/または状態を指す。いくつかの態様では、プロテイノパチーは、タンパク質の産生、フォールディング、代謝、分解(例えば、オートファジー、リソソーム、プロテオソーム)、運搬または輸送、分泌などの1つまたは複数についての病理学的変化が関与し得る。オートファジーには、ミクロオートファジー、マクロオートファジー、シャペロン媒介性オートファジー、マイトファジー、ペキソファジーが含まれ得る。
【０１１４】
いくつかの態様では、プロテイノパチーは、小胞体から離れて細胞内におけるその本来の位置、細胞膜または細胞外の環境へと運搬されるべきタンパク質の運搬効率または能力が関与し得る。例えば、リソソーム酵素の本来の位置は、リソソームである。通常のタンパク質輸送経路は、小胞体→ゴルジ体→エンドソーム→リソソームから構成されるが、そのフォールディングおよび輸送が不完全であり得る変異体タンパク質および/またはある種の野生型タンパク質は、小胞体中では不安定であり、通常の運搬経路に沿ったそれらの輸送は遅くなる。
【０１１５】
いくつかの態様では、プロテイノパチーは、調節性の細胞内シグナル伝達経路が関与し得る。例えば、いくつかの態様では、発生中に絶えず変化するプロテオームが存在するために、新たなタンパク質が存在するために、および加齢によりミスフォールディングされたタンパク質が蓄積するために、細胞タンパク質恒常性の一時的な適応が必要である。プロテオームの忠実度は、発生の間および加齢の間に、ならびに高いタンパク質フォールディングおよび輸送能力を要求する病原体への曝露によって、攻撃を受けるので、細胞は、タンパク質恒常性制御の消失に応答するためにストレスセンサーおよび誘導性経路を利用する。これらには、細胞質タンパク質恒常性を調節する熱ショック応答(HSR)経路、エキソサイトーシス経路タンパク質恒常性の維持を助けるアンフォールディングタンパク質応答(UPR)経路、カルシウムイオン(Ca2＋)シグナル伝達経路、および/または生物の寿命に関連する経路、例えばインスリン/インスリン成長因子受容体シグナル伝達経路、および食事制限に関連する経路、ならびにミトコンドリア電子伝達系過程に関連する過程が含まれる。
【０１１６】
HSR経路は、細胞質ゾル中の熱ショックタンパク質(シャペロン/コシャペロン/フォールディング酵素)の発現増強であって、可溶性内腔酵素として分泌経路内でフォールディングおよび輸送されるタンパク質のタンパク質恒常性に効果を及ぼし得る発現増強を指す。シャペロンを含む細胞質ゾル因子は、フォールディングおよび輸送をより許容するように分泌経路を適応させるのに必須である可能性が高い(Bush et al., J Biol Chem 272: 9086, 1997; Liao et al., J Cell Biochem 99: 1085, 2006; Westerheide et al., J Biol Chem 279: 56053, 2004)。
【０１１７】
UPR経路は、最大3つの統合された細胞内シグナル伝達経路アーム、例えば、UPR関連ストレスセンサー、IRE1、ATF6およびPERKの活性化によって、内腔の中のフォールディングされていないタンパク質の蓄積に小胞体(ER)が応答する、総称してアンフォールディングタンパク質応答とも称される小胞体(ER)の中のストレス感知機構を指し、分泌経路内で機能する非常に多くの遺伝子の発現を調節する(Ron et al., Nat Rev Mol Cell Biol 8: 519, 2007; Schroeder et al., Ann Rev Biochem 74: 739, 2005)。UPR関連シャペロンには、BiP、GRP94およびカルレティキュリンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
Ca2＋イオンは普遍的かつ重要な細胞内シグナル伝達イオンである。Ca2＋シグナル伝達は、多様な経路による非常に多くの細胞機能に影響を及ぼし、小胞体(ER)機能の主な調節因子である(Berridge et al., Nat Rev Mol Cell Biol 4: 517, 2003; Burdakov et al., Cell Calcium 38: 303, 2005; Gorlach et al., Antioxid Redox Signal 8: 1391, 2006)。Ca2＋ホメオスタシスは、小胞体(ER)カルシウム受容体の活性によってもモジュレーションされる。小胞体(ER)カルシウム受容体には、例えば、リアノジン受容体(RyR)、イノシトール3-リン酸受容体(IP3R)および筋形質/内質カルシウム(SERCA)ポンプタンパク質が含まれる。RyRおよびIP3Rは、小胞体(ER)からのカルシウム流出を媒介するのに対して、SERCAポンプタンパク質は、小胞体(ER)へのカルシウム流入を媒介する。3種類のRyRサブタイプ、RyR1、RyR2およびRyR3がある。新たに浮上しつつある証拠は、カルシウムシグナル伝達は、プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態に影響を及ぼす可能性があることを示している(Futerman et al., Nat Rev Mol Cell Biol 5: 554, 2004; LaFerla, Nat Rev Neurosci 3: 862, 2002; Petersen et al., Cell Calcium 38: 161, 2005)。この仮説は、SERCAポンプ阻害剤、例えば、タプシガルジンによってカルシウムホメオスタシスを操作すると、ΔF508嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子(CFTR)およびクルクミンのフォールディングおよび輸送が増強されるという観察によって裏付けられている(Egan et al., Nat Med 8: 485, 2002; Egan et al., Science 304: 600, 2004)。
【０１１９】
いくつかの態様では、本発明は、野生型および変異体リソソーム酵素の両方のレベルおよび/または活性を増加させることができる少なくとも1つのリソソーム活性化剤を投与することによって、プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態に罹患している対象の細胞におけるリソソーム分解を増加させることに関する方法を提供する。
【０１２０】
いくつかの態様では、本発明は、対象の細胞におけるα-シヌクレインレベルのレベルを減少させることに関する方法であって、該対象に、α-シヌクレインレベルを減少させる量のGCase活性を活性化できる剤、例えば、Rab1aポリペプチドまたはGCase活性を活性化できるその相同体を投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様では、GCase活性を活性化できる剤を投与する前に、対象は、増加したレベルのα-シヌクレインを有すると最初に診断される。いくつかの態様では、対象は、増加したα-シヌクレインレベルを有するリスクが増加している。
【０１２１】
いくつかの態様では、プロテイノパチーは、脂質蓄積に関与し得る。例えば、ラクトシルセラミド、グルコシルセラミド(GlcCer)、GM2-ガングリオシドおよびアシアロ-GM2の病理学的蓄積は、リソソームのコレステロール蓄積症であるニーマン・ピックC型疾患(酵素をコードする遺伝子のミスセンス変異による酸性スフィンゴミエリナーゼの欠損と関連しない、リソソームのコレステロール蓄積症である)に見られる(Vanier et al., Brian Pathology 8: 163- 74, 1998)。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、本出願人は、例えば、脂質輸送の欠損を含むこの蓄積を説明するために様々な機序が提案されていることを指摘する。健全なエンドソームの輸送システムは、ニューロン機能に対して重要である(Buckley et al., J Physiol 525: 11, 2000)。GlcCerを含むスフィンゴ糖脂質の代謝障害は、細胞内輸送を害し、コレステロール滞留および蓄積を引き起こす(Pagano et al., Traffic 1(11): 807, 2000; Sillence et al., J Lipid Res 43(11): 1837, 2002; Helms et al., Traffic 5(4): 247-54, 2004)。蓄積された糖脂質は、エンドソームシステムでの通常の輸送を維持するのに重要なタンパクを隔離し得る「脂質ラフト」を形成する。また、ニーマン・ピックC型細胞に由来する線維芽細胞で観察される脂質輸送障害は、スフィンゴ糖脂質生合成の強力な阻害剤による処置により回復できるが(Lachmann et al., Neurobiol Dis.l6(3): 654, 2004)、これは、GlcCerおよび他の脂質がこの疾患の病理に関与していることをさらに強調している。例えば、スフィンゴ糖脂質の生合成における最初の段階を触媒する酵素であるグルコシルセラミド合成酵素の阻害は、以下の潜在的機序を介してプロテイノパチー疾患、障害、および/または状態の発症を遅延させる:基質の減少;タンパク質(例えば、α-シヌクレイン)凝集の程度の減少;抗炎症剤としての作用;または非リソソームGCaseを阻害し、神経スフィンゴ糖脂質レベルの変化をもたらす。
【０１２２】
さらに、α-シヌクレインがその本来の細胞部位に正常に局在化するには脂質ラフトとの結合が必要である(Fortin et al., J Neurosci 24(30): 6715- 23, 2004)。パーキンソン病の病理に関連する変異は、この結合を妨害する。したがって、この結合も妨害する脂質ラフト組成の変化は、α-シヌクレインの正常な局在化および分布を損なわせることによって、パーキンソン病に寄与し得る。
【０１２３】
いくつかの態様では、本発明は、対象に少なくとも1つのリソソーム活性化剤を投与することによって、対象の細胞においてプロテイノパチー疾患、障害、および/または状態によって引き起こされる脂質蓄積を減少させることに関する方法を提供する。本発明は、具体的には、少なくとも1つのリソソーム活性化剤を投与することによって、GlcCerの蓄積を減少させることに関する方法を提供する。
【０１２４】
ある種のプロテイノパチーでその凝集が観察される例示的なタンパク質には、α-シヌクレイン(パーキンソン病(PD)およびレビー小体病などのシヌクレイノパチー)、タウタンパク質(アルツハイマー病などのタウオパチー)、アミロイドβタンパク質(血管性認知症、認知機能障害、およびアルツハイマー病などのアミロイドパチー)、SOD1(筋萎縮性側索硬化症などのSOD1プロテイノパチー)、TDP-43(筋萎縮性側索硬化症などのTDP-43プロテイノパチー)、ハンチンチン(ハンチントン病)、ロドプシン(網膜色素変性症)、および/またはまとめてリソソーム蓄積疾患として公知の疾患の症例における多数のタンパク質(例えば、グルコシルセラミド)が含まれる。当業者であれば、ある種の疾患、障害、および/または状態は、2つ以上の異なるタンパク質のミスフォールディングおよび/または凝集を伴うことを認識するであろう。
【０１２５】
いくつかの態様では、本発明は、少なくとも1つのリソソーム活性化剤を投与することによって、対象の細胞におけるα-シヌクレインレベルを減少させるための方法を提供する。
【０１２６】
タンパク質凝集は、認知機能障害、増殖性疾患、炎症性疾患、心臓血管疾患、免疫疾患、眼疾患、ミトコンドリア性疾患、神経変性疾患およびリソソーム蓄積疾患を含む様々な異なる種類の障害、疾患および/または状態で観察される。本発明のいくつかの態様は、すべてのプロテイノパチーに適用可能である。本発明のいくつかの態様は、リソソーム蓄積疾患以外のプロテイノパチーに適用可能である。
【０１２７】
A.神経変性疾患
本発明は、神経変性疾患に関する方法および組成物を提供する。多くの神経変性疾患は、細胞内および/または細胞外における特定のタンパク質凝集体の蓄積に関連する。多くの症例では、タンパク質凝集体は脳に対する毒性作用を発揮し、疾患病状に寄与していると考えられる。
【０１２８】
神経変性プロテイノパチーは、典型的には、以下の構造の凝集を伴う:細胞質ゾル、例えばPDおよびハンチントン病;核、例えば脊髄小脳失調1型(SCA1);小胞体(ER)、例えばニューロセルピン封入体を伴う家族性脳疾患;細胞外タンパク質、例えばアルツハイマー病(AD)のアミロイドβ。
【０１２９】
ミトコンドリア機能障害および酸化ストレスも、神経変性疾患プロテイノパチーにおける重要な役割を果たし得る(Lin et al, Nature 443: 787, 2006)。
【０１３０】
1.シヌクレイノパチー
本発明は、シヌクレイノパチーに関する方法および組成物を提供する。シヌクレイノパチーは、ある種のニューロンおよびグリア集団におけるタンパク質α-シヌクレインの構造変化および翻訳後修飾による凝集体から構成される一般的な病変を共有する多様な神経変性プロテイノパチー群である。
【０１３１】
PDは、レビー小体封入体の形でシナプス前α-シヌクレインタンパク質の蓄積を特徴とする神経変性運動障害である(Spillantini et al., Nature 388(6645); 839, 1997)。α-シヌクレインの蓄積を特徴とする他の神経変性障害には、多系統萎縮症、レビー小体型認知症およびアルツハイマー病のレビー小体変異型(Lewy body mutant)が含まれる。病的α-シヌクレインは、I型脳内鉄蓄積を伴う神経変性、筋萎縮性側索硬化症/グアム-パーキンソン認知症複合および家族性ADにおいて検出されるタンパク質損傷の一部としても認識されている。
【０１３２】
ある種の証拠は、α-シヌクレインが相互作用して、タウ(別の凝集傾向のある中枢神経系タンパク質であり、孤発性ADを特徴付ける神経原線維濃縮体に見られる)の凝集を加速させることに関連している(Giasson et al., Sci. Aging Knowl. Environ. 18: or6, 2003)。そのすべてがタンパク質凝集を安定化および加速させるいくつかのα-シヌクレイン変異が、稀な家族性型PDにおいて見出されている(Hardy et al., Am. J. Epidmeiol. 164(2): 126, 2006)。いくつかのインビボおよび細胞培養モデルにより、α-シヌクレインの過剰発現および凝集は神経毒性を引き起こすことが実証されている(Dawson et al., Neuron 66: 646, 2010)。
【０１３３】
シヌクレインは小タンパク質(123〜143アミノ酸)であり、一次構造は、通常、3個の異なるドメインに分けられる:コンセンサス配列KTKEGVの負電荷の不完全な反復を特徴とする両親媒性N末端領域。この配列により、すべてのシヌクレインは、共通して、高度に保存されたα-ヘリックス脂質結合モチーフを有することになる;タンパク質凝集に関与するアルツハイマー病アミロイド斑領域の非Aβ成分(NAC)を含む、中間部の疎水性領域;および明確な構造的傾向を有しない強酸性かつプロリンリッチなC末端領域。
【０１３４】
ヒトシヌクレインファミリーメンバーには、α-シヌクレイン、β-シヌクレインおよびγ-シヌクレインが含まれ、すべてのシヌクレイン遺伝子は、種内および種間の両方で比較的よく保存されている(Cookson MR, Molecular Neurodegeneration 4(9): 1750, 2009)。ごく最近クローニングされたシヌクレインタンパク質であるシノレチン(synoretin)は、γ-シヌクレインに近い相同性を有し、網膜で主に発現している。表9は、公知のα-シヌクレイン、β-シヌクレインおよびγ-シヌクレイン配列の代表例を示す。
【０１３５】
（表９）α-、β-およびγ-シヌクレインの代表的なアミノ酸配列
2014523881.tif 000012
【０１３６】
老人斑前駆体タンパク質(NACP)、SYN1またはシネルフィン(synelfin)の非アミロイド成分とも称されるα-シヌクレインは、機能が明確に定義されていない熱安定性の「元来フォールディングされない」タンパク質である。それは、中枢神経系(CNS)ニューロンで主に発現しており、そこではシナプス前終末に局在している。電子顕微鏡による分析は、α-シヌクレインが軸索末端のシナプスの小胞に極めて近位に局在化していることを示唆しており、神経伝達またはシナプス構成におけるα-シヌクレインの役割を示している。さらに、生化学的分析により、α-シヌクレインのごく一部は小胞膜と結合し得るが、ほとんどのα-シヌクレインは細胞質ゾルに存在していることが明らかになった。
【０１３７】
遺伝子的および病理組織学的証拠は、α-シヌクレインが、特定の神経変性疾患に特徴的ないくつかのタンパク質性封入体の主要な成分であるという考えを支持している。病的なシヌクレイン凝集はα-シヌクレインアイソフォームに限定されており、β-およびγ-シヌクレインはこれらの封入体で検出されていない。α-シヌクレイン陽性凝集体の存在は、疾患特異的である。レビー小体、PDおよびDLBDの病理組織学的特徴であるニューロンの線維性細胞質封入体は、α-シヌクレインに対する抗体で強く標識される。PDの病状を伴うジストロフィー性のユビキチン陽性神経突起(これは、レビー神経突起(LN)と称される)およびCA2/CA3ユビキチン神経突起もα-シヌクレイン陽性である。さらに、LB病を有する患者の中脳における、ペールボディ(Pale body)(これは、LBの推定前駆体である)、僅かに膨張したニューロン核周部の糸様構造、およびグリア細胞の銀陽性封入体も、α-シヌクレインに対して免疫反応性である。α-シヌクレインは、MSAにおけるグリア細胞封入体(GCI)およびニューロン細胞質封入体、ならびに1型脳内鉄蓄積(PANK1)の主要成分である可能性が高い。α-シヌクレインの免疫反応性は、アルツハイマー病(AD)では老人斑の一部のジストロフィー神経突起に存在し、ALSでは索および皮質に存在する。α-シヌクレインの免疫反応性は、PD、AD、ALSおよびHDの毒素誘発性トランスジェニックマウスモデルにおいて顕著である。
【０１３８】
さらなる証拠は、α-シヌクレインが、LB、LNおよびGCIの原線維成分の実際の構成要素であるという考えを支持している。免疫電子顕微鏡による研究により、これらの原線維は、インサイチューでα-シヌクレイン抗体により強く標識されることが実証されている。真直ぐのおよび捻れた形態を有するサルコシル不溶性α-シヌクレイン線維もまたDLBDおよびMSAの脳の抽出物において観察できる。また、α-シヌクレインはインビトロで集合して、インサイチューで見られるサルコシル不溶性原線維または線維と同様の幅を有する伸長ホモポリマーになり得る。重合は、ランダムなコイルから逆平行のβ-シート構造への二次構造の同時変化を伴うが、これは、これらの線維のチオフラビン-S反応性と一致している。さらに、組換えA53Tα-シヌクレインは野生型α-シヌクレインよりも重合傾向が大きいことから、PD関連α-シヌクレイン変異であるA53Tはこの過程を加速させ得る。この変異は、ポリマーの超微細構造にも影響を与える;二本の原線維から構築されたように、線維は僅かに幅広く、外観上さらに捻れている。A30P変異も、α-シヌクレインの重合傾向を適度に増加させ得るが、この変異の病理学的作用は、その小胞への結合が減少することに関係し得る。興味深いことに、カルボキシル末端が切断されたα-シヌクレインは、全長のタンパク質よりも線維を形成しやすいものであり得る。
【０１３９】
シヌクレイノパチー疾患のための現時点の処置選択肢には、カルビドパ-レボドパ、抗コリン剤およびモノアミンオキシダーゼ阻害剤などの対症薬物療法が含まれるが、効果は様々である。最良の反応者、すなわち特発性パーキンソン病者の場合でさえ、レボドパに対する良好な初期反応は、典型的には、薬物誘発性合併症、例えば治療の最初の5〜7年のうちに運動変動および消耗性運動障害によって目立たないものになる。残りの障害については、現時点の薬物療法は、対症的なほんの僅かな利益を提供する。これらの障害の重度の消耗性およびその有病率を考慮すると、当技術分野では、シヌクレイノパチーを処置および管理することについての新規アプローチに対する明確な必要性が存在する。
【０１４０】
本発明は、とりわけ、リソソーム活性を活性化させることによって、シヌクレイノパチーを有効に処置できるという驚くべき洞察を提供する。いくつかの態様では、本発明は、リソソーム活性化剤を投与することによって、細胞における可溶性α-シヌクレインおよび不溶性α-シヌクレイン両方の毒性を減少させる方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、細胞におけるα-シヌクレインの蓄積を減少させる方法であって、細胞に、治療有効量の提供されるリソソーム活性化剤を投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、細胞におけるα-シヌクレインの毒性および/または蓄積を減少させる方法であって、細胞に、治療有効量の提供されるリソソーム活性化剤を1つまたは複数の別の治療剤と組み合わせて投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様では、細胞は、神経細胞である。いくつかの態様では、細胞は、非神経細胞である。いくつかの態様では、細胞は、α-シヌクレインを発現している。特定の態様では、シヌクレイノパチーは、パーキンソン病、びまん性レビー小体病および/または多系統萎縮障害である。
【０１４１】
パーキンソン病
いくつかの態様では、本発明は、具体的には、PD、シヌクレイノパチーに関する方法を提供する。PDは、動作緩慢、硬直、振戦および姿勢の不安定性を特徴とする神経変性障害である。PDの病理学的特徴は、黒質緻密部(SNpc)におけるニューロンの喪失、および残りのニューロンにおけるレビー小体の出現である。運動性症候が現れる前に、SNpcにおける約50％超の細胞が喪失される必要があると考えられる。関連症候には、小さい手書き文字(小字症)、脂漏症、起立性低血圧症、排尿困難症、便秘および他の消化器機能不全、睡眠障害、鬱病および他の精神神経性現象、認知症、ならびに臭覚障害(早期に起こる)が含まれることが多い。パーキンソニズムを有する患者は、PDを持たない一般的人口と比較して約2倍高い死亡率を有する。これは、大きい脆弱性または運動性の減少に起因する。
【０１４２】
PDの診断は主として臨床であり、上記に列挙されている臨床知見に基づく。パーキンソニズムは、動作緩慢、硬直および/または振戦のうちの任意の2つの組み合わせを指す。PDは、パーキンソニズムの最も一般的な原因である。パーキンソニズムの他の原因は、薬物、主としてハルドールなどの主要な精神安定剤の副作用、基底核が関与する脳卒中、ならびに他の神経変性疾患、例えばDLBD、進行性核上性麻痺(PSP)、前頭側頭型認知症(FTD)、MSAおよびハンチントン病である。PDの病理学的特徴は、典型的には黒質の罹患ニューロンにおいて、そして程度は様々であるが皮質において見られるレビー小体(細胞質内封入体)である。最近、α-シヌクレインは、孤発性パーキンソニズムにおけるレビー小体の主要成分であることが判明している。
【０１４３】
パーキンソニズムは、少数の個体ではウイルス、脳卒中または毒素が明確な原因であり得るが、多くの症例ではパーキンソン病の病因は知られていない。PDに寄与し得る環境的影響には、井戸水の飲用、重金属(例えば、鉄、亜鉛、銅、水銀、マグネシウムおよびマンガン)、アルキル化リン酸塩およびオルト塩素への農業的および工業的な曝露が含まれ得る。パラコート(除草剤)も、PDを含むパーキンソニズムの有病率増加に関連している。喫煙は、PDの発症の減少に関連する。一般的ではない毒素が高い遺伝的感受性と組み合わさって、または一般的な毒素が比較的低い遺伝的感受性と組み合わさってPDが引き起こされ得るというのが現在のコンセンサスである。
【０１４４】
PDを発症するリスクを有する対象の一部は、例えば遺伝子分析によって同定できる。ある種の遺伝因子がPDに関連していることの十分な証拠がある。常染色体優性遺伝性PDの多数の家系が報告されている。例えば、ある家系ではα-シヌクレインの変異が一因であり、他ではSNCA遺伝子(α-シヌクレインをコードする遺伝子)の三重化がPDに関連している。
【０１４５】
びまん性レビー小体病および急速眼球運動睡眠障害
いくつかの態様では、本発明は、具体的には、DLBD、シヌクレイノパチーに関する方法を提供する。DLBDは、高齢者における神経変性認知症の2番目に多い原因であり、65歳よりも高齢の一般人口の7％、および80歳超の一般人口の30％に影響を及ぼしている。それは、シナプスタンパク質であるα-シヌクレインの正常な凝集に基づく神経症の症状を共有する臨床症状範囲の一部である。DLBDは、PDの過程中に起こる認知症の臨床的および病理的特徴の多くを有する。他の臨床および神経学的診断基準に加えて、「1年則」を使用して、DLBDをPDと分けることができる。この法則によれば、パーキンソニズムから12カ月以内に発症する認知症はDLBDと認定されるのに対して、パーキンソニズムから12カ月を超えて発症する認知症はPDと認定される。DLBDの中心的特徴には、通常の社会的および職業的な機能を妨げるのに十分な程度の進行性認知低下が含まれる。顕著なまたは持続的な記憶障害は早期の段階では必ずしも起こらないが、ほとんどの症例では進行とともに明確になる。注意力試験ならびに前頭皮質的技能および視覚的空間的能力試験における障害が、特に顕著な診断上の基本的特徴であり得るが、ほぼ確実にDLBDであると診断するには、注意力および集中力の顕著な変動を伴う認識力不安定性、再発性幻視(これは通常、十分に形のある詳細なものである)、ならびにパーキンソニズムの自然発生的な特徴のうちの2つが必須であり、DLBDの可能性があると診断するには1つが必須である。加えて、繰返しの転倒、失神、意識の一時的喪失、神経遮断剤感受性、体系妄想、幻覚および他の様相、レム睡眠行動障害ならびに鬱病などのいくつかの補助的な特徴が存在し得る。DLBDを有する患者は、言語記憶試験ではアルツハイマー病を有するものよりも良好であるが、視機能試験では悪い。このプロファイルは疾患の重症度範囲全体にわたって維持され得るが、全般的な障害によって、より後期ではさらに認識困難となり得る。DLBDは、典型的には、進行性悪化の状況では再発性の錯乱発作を示す。DLBDを有する患者は、かなりの注意力欠如を伴う皮質および皮質下の神経心理障害と、顕著な前頭皮質の機能不全および視覚空間の障害との組み合わせを示す。これらは、この障害をアルツハイマー病と区別するのに役立つ。
【０１４６】
急速眼球運動(レム)睡眠行動障害は、鮮明で恐ろしい夢が現れる睡眠時異常行動であり、レム睡眠中に単純なまたは複雑な運動行動を伴う。この障害は、シヌクレイノパチー、DLBD、PDおよびMSAを伴うことが多いが、アミロイドパチーおよびタウオパチーにおいてもまれに起こる。レム睡眠行動障害/認知症における機能障害の神経心理学的パターンは、DLBDにおいて報告されているものに類似しており、アルツハイマー病において報告されているものとは質的に異なる。神経変性疾患を伴うレム睡眠行動障害の神経病理学的研究により、レビー小体病または多系統萎縮症が示されている。過眠症の特徴であるレム睡眠覚醒分離(レム睡眠行動障害、昼間睡眠過剰症、幻覚、脱力発作)により、DLBDおよびPDのいくつかの特徴を説明できる。睡眠障害は、DLBDに典型的な不安定性に寄与し得るが、それらの処置により、不安定性および生活の質を改善できる。DLBDを発症するリスクがある対象を同定できる。転倒の繰り返し、失神、意識の一時的喪失および鬱病は、認知機能障害を有する高齢者に共通であり、可能性のあるDLBD診断(危険信号)として役立つことができる。対照的に、レム睡眠行動障害におけるナルコレプシー感受性により、DLBDを高度に予測できる。それらの検出は、常に疑いを持ち、適切なスクリーニングの質問をする臨床医に依存する。
【０１４７】
LBDに罹患しているか、またはLBDを発症するリスクがあるシヌクレイノパチーの対象の臨床診断は、神経画像検査によって支援できる。DLBDに関連する変化には、磁気共鳴画像法(MRI)における海馬体積および内側側頭葉体積の保存、ならびに単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)における後頭部低潅流が含まれる。全身性萎縮、白質の変化、および全脳委縮の進行速度などの他の特徴は、鑑別診断において有用ではない。黒質線条体分解のマーカーである尾状核および被殻におけるドーパミントランスポーターの喪失は、ドーパミンSPECTによって検出でき、臨床鑑別診断において有用であると証明できる。DLBDの死後診断によるスキャン異常では、感度83％および特異性100％であると報告されている。
【０１４８】
DLBDを診断するためのコンセンサス基準には、レビー小体を同定し、レビー小体の数および分布に応じて3つのカテゴリー、脳幹優勢、縁辺系または新皮質に分類するためのユビキチン免疫組織化学的検査が含まれる。最近開発されたα-シヌクレインの免疫組織化学的検査はより多くのレビー小体を可視化でき、これまでに認識されていた神経病変(レビー神経突起と称される)を示すのにも優れている。α-シヌクレインに対する抗体を使用することにより、多くのDLBD症例の診断評点が、脳幹および縁辺系群から新皮質群に変わっている。
【０１４９】
DLBDを有するほとんどの患者において、α-シヌクレインまたは他のパーキンソン病関連遺伝子の遺伝子変異はない。mRNA発現の増加により正常な野生型α-シヌクレインが病理学的にアップレギュレーションされるというのが考えられる機序であり、またはα-シヌクレインが不溶性になったもしくはより凝集できるようになったためにレビー小体が生じる可能性がある。例えば、機能不全のプロテアソームシステムによってα-シヌクレインが異常にプロセシングされるために、その毒性「前原線維」が生産されるという別の可能性がある。これらの毒性原線維をレビー小体に隔離するのは、ニューロンが単に神経変性の残骸となるのではなく、細胞内の生物学的ストレスと闘おうとする努力を反映している可能性がある。
【０１５０】
DLBDの正確な診断のための標的となる症候には、錐体外路運動の特徴、認知機能障害、神経精神医学的特徴(幻覚、鬱病、睡眠障害および関連行動障害を含む)または自律神経障害が含まれ得る。
【０１５１】
本発明の方法は、DLBDを処置するための1つまたは複数の他の薬物療法と組み合わせて使用できる。例えば、許容される最低用量のレボドパは、DLBDを処置するのに使用できる。D2-受容体アンタゴニスト、特に従来の神経遮断剤は、DLBD対象において重度の過敏症反応を誘発し得、死亡率が2〜3倍増加する。上記コリンエステラーゼ阻害剤もDLBDの処置において使用される。
【０１５２】
多系統萎縮症
本発明は、具体的には、MSAに関する方法を提供する。MSAは、運動、認知、自律神経および他の身体機能に影響を与える症候の組み合わせを特徴とする神経変性疾患であるので、「多系統萎縮症」という表示である。MSAの原因は不明である。MSAの症候は、発症および重症度の分布が個々人によって異なる。このため、当初は、名称には、3つの異なる用語、シャイ・ドレーガー症候群、線条体黒質変性症(SD)およびオリーブ橋小脳萎縮症(OPCA)が含まれていた。
【０１５３】
シャイ・ドレーガー症候群では、最も顕著な症候は、自律神経系が関与するもの;血圧、排尿機能、および意識的制御が関与しない他の機能である。線条体黒質変性症は、緩慢な動作および硬直などのパーキンソニズムの症候を引き起こすが、OPCAは、主として平衡、協調および発話に影響を与える。また、MSAの症候には、起立性高血圧、男性の不能、排尿困難性、便秘、発話および嚥下の困難性、ならびに霞目が含まれ得る。
【０１５４】
MSAの初回診断は、通常、患者を注意深く面接し、身体検査を実施することによって行われる。コンピュータ断層撮影、走査、MRIおよびポジトロン照射型断層撮影(PET)を含む数種類の脳イメージングを実証的研究として使用できる。シネメットなどのドーパミン補充療法に対する不完全応答および比較的不良な応答は、運動緩慢および硬直(パーキンソニズム)の徴候がPDのためではないことの手掛りであり得る。顕著な自立神経性機能障害を伴う特徴的な多発性脳系障害はMSAを決定付ける特徴であり、剖検時に診断を確認するものである。さらに、MSAを有する患者は、ある種の脳細胞中にグリア細胞質封入体を有し得る。プロトタイプのレビー小体は、MSA中に存在しない。しかしながら、免疫組織化学検査によるα-シヌクレインの染色は、顕著である。パーキンソンとの比較では、シネメットに対する応答不良に加えて、緩慢および硬直とは比例せずにMSAが強く示唆される少数の他の所見、例えば姿勢の不安定性、起立時の低血圧(起立時低血圧)および横臥時の高血圧、排尿困難症、不能、便秘、発話および嚥下の困難がある。
【０１５５】
本発明の方法は、MSAを処置するための1つまたは複数の代替的な薬物療法と組み合わせて使用できる。典型的には、MSAの種々の症候を処置するのに使用できる薬物は、疾患の進行に伴って有効ではなくなる。PDを処置するのに使用されるレボドパおよびドーパミンアゴニストは、MSAの緩慢および硬直に有効なこともある。起立性高血圧は、コルチゾン、ミドドリン、または血圧を上げる他の薬物を用いて改善できる。男性の不能は、陰茎インプラントまたは薬物を用いて処置することができる。失禁は、薬物療法またはカテーテル法を用いて処置することができる。便秘は、食物繊維の増加または緩下剤によって改善し得る。
【０１５６】
2.アミロイドパチー
アミロイド前駆体タンパク質(APP)は、シナプス機能のモジュレーション、ニューロンの成長および生存の促進、酸化ストレスからの保護、ならびに神経活性化合物、毒素および病原体の監視を含む様々な生理学的機能を果たす。APPのプロセシングについては、2つの異化経路が説明されている:非アミロイド生成性カスケードおよびアミロイド生成性カスケード。非アミロイド生成性経路は、α-セクレターゼ媒介性切断によって生成されるAPPの細胞外可溶性N末端部分の形成につながる。アミロイド生成性経路は、連続するβ-セクレターゼおよびγ-セクレターゼ切断によるアミロイドβ(Aβ)ペプチドの形成をもたらす。Aβは本来は構造化されないと考えられ、これは、それが固有の三次フォールディングを獲得できず、むしろ一連の構造に定着することを意味する。細胞外型AβはAβ1-40であり、神経内AβはAβ1-42に対応する。ADなどの病的状態におけるγ-セクレターゼ経路の活性化は、Aβの蓄積をもたらす。このAβの蓄積は、アミロイドパチーに分類される疾患をもたらす。
【０１５７】
本発明は、アミロイドパチーに関する方法を提供する。例えば、いくつかの態様では、本発明は、細胞におけるアミロイドβの毒性を減少させる方法であって、細胞に、治療有効量のこのような提供される化合物を投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、細胞におけるアミロイドβタンパク質の蓄積を減少させる方法であって、細胞に、治療有効量のこのような提供される化合物を投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様では、細胞は、神経細胞である。いくつかの態様では、細胞は、非神経細胞である。いくつかの態様では、細胞は、アミロイドβタンパク質を発現している。特定の態様では、アミロイドパチーは、アルツハイマー病、血管性認知症および/または認知機能障害である。
【０１５８】
3.タウオパチー
タウオパチーは、ニューロンおよびグリアにおいて、過リン酸化タウタンパク質からなるフィラメント状の沈着物が存在することを特徴とする神経変性障害である。タウのリン酸化異常ならびにニューロンおよびグリア細胞における沈着は、タウオパチーの主要な特徴の1つである。タウオパチーという用語は、前頭側頭型認知症(FTD)および大量のタウ沈着物を有する家系を説明するのに最初に使用された。現在では、この用語は、タウの蓄積が病因に直接的に関連するように見える広範囲のタウ病状を伴う疾患群を特定するのに使用される。主な神経変性タウオパチーには、脳および脊髄におけるフィラメント状のタウ沈着物を特徴とする孤発性および遺伝性疾患が含まれる。
【０１５９】
タウオパチーの大部分では、グリアおよびニューロンのタウ封入体が唯一のまたは主要なCNS病変である。例示的なこのようなタウオパチーには、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソニズム、嗜銀顆粒性認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、17番染色体に連鎖する前頭側頭型認知症、大脳皮質基底核変性症、ピック病、進行性核上性麻痺、進行性皮質下神経膠症および神経原線維変化型認知症(tangle only dementia)が含まれる。
【０１６０】
加えて、タウオパチーは、タウタンパク質の有意な線維および凝集体が見られる疾患、障害、および状態の大規模な群の特徴である。例示的なこのような疾患、障害、および状態には、孤発性および/または家族性アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症/パーキンソニズム認知症複合(ALS-FTDP)、嗜銀顆粒性認知症、ボクサー認知症、石灰化を伴うびまん性神経原線維変化病、ダウン症候群、前頭側頭型認知症、17番染色体に連鎖するパーキンソニズム(FTDP-17)、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病、ハレルフォルデン・シュパッツ病、封入体筋炎、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、多系統萎縮症、ニーマン・ピック病(NPC)、ピック病、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、進行性核上性麻痺(PSP)、亜急性硬化性全脳炎、神経原線維変化優位型アルツハイマー病(tangle-predominant Alzheimer's disease)、大脳皮質基底核変性症(CBD)、筋緊張性ジストロフィー、神経原線維変化を伴う非グアム型(non-guanamian)運動ニューロン疾患、脳炎後パーキンソニズム、プリオンタンパク質脳アミロイドアンギオパチー、進行性皮質下神経膠症、亜急性硬化性全脳炎および神経原線維変化型認知症が含まれる。
【０１６１】
タウ病状が他の異常なタンパク質病変とともに見られる神経変性疾患は、二次的なタウオパチーと考えてもよい。例には、AD、およびプリオンタンパク質、Briまたはα-シヌクレインが凝集しているある種の疾患が含まれる。タウはおそらくは初期の病因因子ではないが、タウ凝集体は最終的な変性に寄与している。
【０１６２】
タウ沈着物は、タウ病変が他の異常なタンパク質病変タンパク質とともに現れるいくつかの他の神経変性疾患にも見ることができる。凝集した過リン酸化タンパク質タウからなる大量の細胞質封入体は、AD、ピック病、前頭側頭型認知症、大脳皮質基底核変性症および進行性核上性麻痺などのいくつかの神経変性障害において特徴的な病理学的所見である。
【０１６３】
本発明は、タウオパチーに関する方法を提供する。例えば、いくつかの態様では、本発明は、細胞におけるタウの毒性を減少させる方法であって、細胞に、治療有効量のこのような提供される化合物を投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様では、本発明は、細胞におけるタウタンパク質の蓄積を減少させる方法であって、細胞に、治療有効量のこのような提供される化合物を投与する段階を含む方法を提供する。いくつかの態様では、細胞は、神経細胞である。いくつかの態様では、細胞は、非神経細胞である。いくつかの態様では、細胞は、タウタンパク質を発現している。特定の態様では、タウオパチーは、アルツハイマー病である。
【０１６４】
アルツハイマー病
ADは、高齢者の認知症および認知機能障害の主要な原因であり、発展途上国では心臓血管疾患、癌および脳卒中に次ぐ主な死因である。認知症の症例の最大70％はADによるものであり、血管性疾患が2番目に多い原因である。60歳のADの発生頻度は、約1％である。ADの発生率は、約5年ごとに2倍になる。Forsyth, Phys. Ther. 78:1325, 1998; Evans et al., JAMA 262: 2551, 1989。米国だけで推定400万人がADに罹患しており、費用は年間1000億ドルである。Schumock, J. Health Syst. Pharm. 55(52): 17, 1998; Hay & Ernst, Am. J. Public Health 77:1169, 1987。
【０１６５】
アルツハイマー病は、知的能力の低下(例えば、記憶障害、錯乱、視覚的/空間的理解力の喪失)を特徴とし、アミロイドパチーおよびタウオパチーの両方に関連する。アルツハイマー病における長い形態のアミロイドβ-ペプチド、特にAβ(1-42)の中心的役割が、様々な組織病理学的、遺伝子学的および生化学的研究によって立証されている。具体的には、脳におけるAβ(1-42)の沈着が、すべての形態のアルツハイマー病の初期における固有の特徴であることが見出されている。これは、アルツハイマー病の診断が可能になる前に、およびより短い一次形態のAβ、Aβ(1-40)が沈着する前に起こる。早期発症家族型アルツハイマー病を伴うプレセニリン(γ-セクレターゼ)遺伝子の変異は、Aβ(1-42)レベルを一律に増加させるという観察結果から、疾患の病因におけるAβ(1-42)のさらなる影響が分かる。APPのさらなる変異は全Aβを増大させ、一部の場合ではAβ(1-42)のみを増大させる。種々のAPP変異が、沈着するAβの種類、分量および位置に影響を及ぼし得るが、脳実質に沈着する初期の主要種は長いAβであることが見出されている。初期のAβ沈着では、ほとんどの沈着したタンパク質が不定形または散在性のプラーク形態である場合、実質的にすべてのAβが長い形態である。次いで、これらの初期のAβ(1-42)沈着は、長い形態および短い形態の両方のさらなるAβ沈着物の種となり得る。Aβを発現するトランスジェニック動物では、沈着はAβ(1-42)レベルの上昇と関連し、沈着パターンは、Aβ(1-42)が初期に沈着し、続いてAβ(1-40)が沈着するというヒト疾患で見られるものと同様である。Aβ発現が上昇して沈着が加速しているダウン症候群患者において、同様の沈着パターンおよびタイミングが見られる。アルツハイマー病のアミロイド斑との関連性は、アルツハイマー病がアミロドパチーであると考えられることを意味している。アルツハイマー病は、タウ凝集体の蓄積にも関連しているのでタウオパチーである。
【０１６６】
認知機能障害または認知症
認知機能障害および認知症は、高度に蔓延している神経学的状態であって、様々な疾患、障害、および/または状態のいずれかに関連する神経学的状態である。認知症は、体の損傷または疾患による進行性の認知機能低下であって、正常な加齢から予想されるものを超える進行性の認知機能低下と一般的には定義される。認知症は、記憶、推論、注意、言語および問題解決の問題を含む精神機能の喪失と説明されている。典型的には、より高レベルの機能が最初に影響を受ける。認知症は、個人が日常生活で機能する能力を妨げる。
【０１６７】
認知機能障害または認知症は、任意の原因から生じ得る。認知機能障害および認知症の例示的な原因には、神経変性疾患、神経性疾患、精神病、遺伝性疾患、感染性疾患、代謝性疾患、心臓血管疾患、血管性疾患、加齢、外傷、栄養失調症、小児期疾患、化学療法、自己免疫疾患、眼疾患および炎症性疾患が含まれる。認知機能障害および認知症に関連する特定の疾患には、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、脳血管疾患、血管性認知症、多発脳梗塞性認知症、パーキンソン病およびパーキンソン病認知症、レビー小体病、ピック病、アルツハイマー病、中度の認知機能障害、ハンチントン病、AIDSおよびAIDS関連認知症、脳腫瘍、脳病変、癲癇、多発性硬化症、ダウン症候群、網膜色素変性症、湿性および乾性の加齢性黄斑変性症、高眼圧症、緑内障、角膜ジストロフィー、レット症候群、進行性核上性麻痺、前頭葉症候群、統合失調症、外傷性脳疾患、冠動脈バイパス移植術後、電気痙攣ショック療法による認知機能障害、化学療法による認知機能障害、薬物乱用歴による認知機能障害、注意欠陥障害(ADD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、自閉症、失読症、鬱病、双極性障害、心的外傷後ストレス障害、感情鈍麻、重症筋無力症、睡眠時無呼吸による覚醒時認知機能障害、トゥレット症候群、自己免疫性血管炎、全身性エリテマトーデス、リウマチ性多発筋痛症、肝病態、代謝性疾患、クッフス病、副腎白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフィー、蓄積疾患、感染性血管炎、梅毒、神経梅毒、ライム病、脳内出血による合併症、甲状腺機能低下症、B12欠乏症、葉酸欠乏症、ナイアシン欠乏症、チアミン欠乏症、水頭症、無酸素症後合併症、プリオン病(クロイツフェルト・ヤコブ病)、脆弱X症候群、フェニルケトン尿症、栄養失調症、神経線維腫症、メープルシロップ尿症、高カルシウム血症、甲状腺機能低下症、高カルシウム血症および低血糖症が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
認知機能障害の程度は、医療専門家によって評価されてもよい。認識力を評価するために様々な標準試験が利用可能であり、ミニメンタルステート検査、認知症症候評価スケールおよびアルツハイマー型認知症評価スケール(ADAS)が含まれるが、これらに限定されない。このような試験は、典型的には、測定可能な認知機能障害スコアを提供する。特定の態様では、処置または予防される認知機能障害は、アルツハイマー病に関連する。特定の態様では、認知機能障害は、精神障害(例えば、統合失調症)に関連する。特定の態様では、処置または予防される認知機能障害は、遺伝性疾患に関連する。特定の態様では、処置または予防される認知機能障害は、感染性疾患(例えば、HIV、梅毒)に関連する。
【０１６９】
B.リソソーム蓄積疾患
リソソーム蓄積疾患は、リソソーム活性の欠損を特徴とする一連の障害、疾患および/または状態の代表的なものである。多くの態様では、リソソーム蓄積疾患は、1つまたは複数のリソソーム酵素のレベルまたは活性の減少に起因する。リソソーム蓄積疾患に関与するリソソーム活性の障害は、例えば、リソソームによる脂質、タンパク質または細胞小器官の分解、リソソーム内外への適切な分子輸送、および/またはリソソーム媒介性シグナル伝達を妨げ得る。多くのリソソーム蓄積疾患は、リソソームにおける1つまたは複数のタンパク質(特に、関連リソソーム酵素の基質である1つまたは複数のタンパク質)の凝集体の蓄積を伴う;このようなリソソーム蓄積疾患は、本発明の特定の態様に従ってプロテイノパチーであると考えてもよい。
【０１７０】
したがって、いくつかの態様では、リソソーム蓄積疾患を理解するために、本発明によって提供される、リソソーム活性とプロテイノパチーとの関連性に関する洞察が適用可能である。したがって、本発明は、このようなリソソーム蓄積疾患の処置および/または予防のための方法および試薬を提供する。
【０１７１】
多くのリソソーム蓄積疾患には神経障害が含まれ、(常にではないが)進行性かつ変性性であり得る;症候には、発育遅延、運動失調、視覚の問題、発作などが含まれ得る。正常な場合、リソソームは、不要な物質を、細胞が利用できる基質にプロセシングする。リソソーム蓄積疾患は、典型的には、このプロセシングに関与する酵素の1つまたは複数が欠損もしくは非存在であるか、または欠損もしくは非存在になった場合の結果である。このような酵素の欠損もしくは非存在は、細胞における不要な物質の蓄積をもたらし、最終的には細胞を損傷する。多くの態様では、リソソーム蓄積疾患は、常染色体劣性遺伝を示す遺伝性疾患であり;いくつか(例えば、ファブリー病およびハンター症候群)は、X連鎖である。
【０１７２】
代表的なリソソーム蓄積疾患には、例えば、アクチベーター欠損症/GM2ガングリオシドーシス、α-マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼA欠乏症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病(例えば、I型、II型、III型)、GM1ガングリオシドーシス(例えば、乳児性、後期乳児性/若年性、成人性/慢性)、I細胞病/ムコリピドーシスII、乳児性遊離シアル酸蓄積症/ISSD、若年性ヘキソサミニダーゼA欠乏症、クラッベ病(例えば、乳児性発症、遅延性発症)、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症疾患、偽性ハーラーポリジストロフィー/ムコリピドーシスIIIA(例えば、MPSIハーラー症候群、MPSIシャイエ症候群、MPS Iハーラー・シャイエ症候群、MPS IIハンター症候群、サンフィリッポ症候群A型/MPS III A、サンフィリッポ症候群B型/MPS III B、サンフィリッポ症候群C型/MPS III C、サンフィリッポ症候群D型/MPS III D、モルキオA型/MPS IVA、モルキオB型/MPS IVB、MPS IXヒアルロニダーゼ欠損症、MPS VIマロトー・ラミー、MPS VIIスライ症候群、ムコリピドーシスI/シアリドーシス、ムコリピドーシスIIIC、ムコリピドーシスIV型)、多種スルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病(例えば、A型、B型、C型)、神経セロイドリポフスチン症(例えば、CLN6病-非定型後期乳児性、遅発変異型、早期若年性、バッテン・シュピールマイアー・フォークト/若年性NCL/CLN3病、後期乳児性CLN5のフィンランド変異型、ヤンスキー・ビールショースキー病/後期乳児性CLN2/TPP1病、クッフス/成人発症NCL/CLN4病、北部型癲癇(Northern Epilepsy)/後期乳児性CLN8の変異型、サンタボーリ・ハルシア(Santavuori-Haltia)/乳児性CLN1/PTT病、β-マンノシドーシス)、ポンペ病/糖原蓄積症II型、濃化異骨症、サンドホフ病/GM2ガングリオシドーシス(例えば、成人性発症、乳児性、若年性)、シンドラー病、サラ病/シアル酸蓄積症、テイ・サックス病/GM2ガングリオシドーシスまたはウォルマン病が含まれる。
【０１７３】
リソソーム蓄積疾患は、例えば、リソソーム酵素活性の一次欠損(例えば、ゴーシェ病またはファブリー病)、またはリソソーム酵素の翻訳後プロセシングの欠損(例えば、ムコスルファチドーシス(Mucosuphatidosis))、またはリソソーム酵素の移動の欠損(例えば、IIIA型ムコリピドーシス)、または酵素ではないリソソームタンパク質の欠損(例えば、ダノン病)、または非リソソームタンパク質の欠損(例えば、後期乳児性神経セロイドリポフスチン症の変異型)を含む多数の欠損に起因し得る。リソソーム蓄積疾患では、ある種の脂質(例えば、グルコシルセラミドまたはコレステロール)、またはある種のタンパク質(例えば、ATP合成酵素のサブユニットc)、またはある種の損傷した細胞小器官もしくは細胞小器官断片(例えば、ミトコンドリア断片)が蓄積することが多い。細胞ファジー反応の薬物誘導刺激は、リソソーム蓄積疾患において治療上有益であり得る;このようなファジー反応には、ミクロオートファジー、マクロオートファジー、シャペロン媒介性オートファジー、マイトファジー、ペキソファジーが含まれ得る。
【０１７４】
リソソーム蓄積疾患をもたらし得るか、またはリソソーム蓄積疾患に寄与し得る例示的なリソソーム酵素の欠損を表10に列挙する。
【０１７５】
（表１０）リソソーム蓄積疾患および関連酵素の欠損
2014523881.tif 000013
2014523881.tif 000014
2014523881.tif 000015
【０１７６】
C.他のプロテイノパチー
他のプロテイノパチーには、例えば、炎症性疾患、障害、および/もしくは状態;増殖性疾患、障害、および/もしくは状態;心臓血管疾患、障害、および/もしくは状態;免疫疾患、障害、および/もしくは状態;眼疾患、障害、および/もしくは状態;ならびに/またはミトコンドリア性疾患、障害、および/もしくは状態が含まれ得る。
【０１７７】
1.炎症性疾患
一般に、炎症性疾患、障害、および/または状態は、発熱、発疹または関節腫脹などの症候をもたらす強い炎症エピソードを特徴とする。哺乳類の免疫系は、非自己病原体を認識および排除するための手段を提供する。免疫系は、通常、非自己病原体に対する防衛線を提供するが、免疫反応それ自体が疾患の進行に関与する多くの事例がある。炎症性疾患、障害、および/または状態は免疫疾患とは異なるが、両群の障害は、自分の体の組織を攻撃する免疫系に起因し、さらには炎症の増加をもたらすという点では共通の特徴も共有する。
【０１７８】
特定の態様では、プロテイノパチー炎症性疾患、障害、および状態には、炎症性骨盤疾患、尿道炎、皮膚の日焼け、副鼻腔炎、間質性肺炎、脳炎、髄膜炎、心筋炎、腎炎、骨髄炎、筋炎、肝炎、胃炎、腸炎、皮膚炎、歯肉炎、虫垂炎、膵炎、胆嚢炎、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、糸球体腎炎、皮膚筋炎、強皮症、血管炎、アレルギー性障害、例えば喘息、例えば気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息および塵埃喘息、特に慢性喘息または難治性喘息(例えば、遅発型喘息性気道反応性亢進)および気管支炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、多発性硬化症、関節リウマチ、胃腸管の障害、例えば限定されないが、セリアック病、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸から離れて影響する食物関連アレルギー、例えば片頭痛、鼻炎および湿疹、鼻粘膜の炎症を特徴とする状態、例えば急性鼻炎、アレルギー性鼻炎、萎縮性鼻炎および慢性鼻炎、例えば乾酪性鼻炎、肥厚性鼻炎、化膿性鼻炎、乾燥性鼻炎および薬物性鼻炎;膜性鼻炎、例えばクループ性鼻炎、繊維素性鼻炎および偽膜性鼻炎、および腺病性鼻炎、季節性鼻炎、例えば神経性鼻炎(枯草熱)、および血管運動神経性鼻炎、サルコイドーシス、農夫肺および関連疾患、肺線維症および特発性間質性肺炎、急性膵炎、慢性膵炎および成人呼吸促迫症候群および/または急性炎症性反応(急性呼吸促迫症候群および虚血/再灌流障害など)のうちの1つまたは複数が含まれ得る。
【０１７９】
2.増殖性疾患および免疫疾患
一般に、細胞増殖性障害、疾患および/または状態は、異常な細胞成長、好ましくは細胞増殖の異常増加を特徴とする様々な状態を包含する。例えば、プロテイノパチー細胞増殖性疾患、障害、および/または状態には、癌、免疫媒介性反応および疾患(例えば、移植片拒絶、移植片対宿主病、遺伝子療法に対する免疫反応、自己免疫疾患、病原体誘導の免疫調節異常など)、ある種の循環疾患およびある種の神経変性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
一般に、癌は、異常細胞の制御されない成長および拡散を特徴とする疾患群である。このような疾患の例は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫などである。
【０１８１】
例えば、癌には、白血病およびリンパ腫、例えば皮膚T細胞リンパ腫(CTCL)、末梢T細胞リンパ腫、ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス(HTLV)に関連するリンパ腫、例えば成人T細胞白血病/リンパ腫(ATLL)、B細胞リンパ腫、急性リンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、中皮腫、成人の一般的な固形腫瘍、例えば頭頸部癌(例えば、口腔、喉頭および食道)、尿生殖器癌(例えば、前立腺、膀胱、腎臓、子宮、卵巣、精巣、直腸および大腸)、肺癌、乳癌、膵臓癌、黒色腫および他の皮膚癌、胃癌、脳腫瘍、肝臓癌および甲状腺癌、および/または小児の固形腫瘍、例えば脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、骨腫瘍および軟組織肉腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８２】
免疫媒介性反応および疾患の例には、組織、例えば心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚、角膜、血管、肺、膵臓、腸、四肢、筋肉、神経組織、十二指腸、小腸、膵臓島細胞などの機能の全部または一部を置き換えるための合成または有機移植材料、細胞、器官または組織の移植(異種移植を含む)後の拒絶が含まれる;移植片対宿主病、自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、I型糖尿病ブドウ膜炎、若年性発症または近年発症の真性糖尿病、ブドウ膜炎、グレーブス病、乾癬、アトピー性皮膚炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、血管炎、自己抗体媒介性疾患、再生不良性貧血、エヴァンス症候群、自己免疫性溶血性貧血などの処置;さらに、異常な免疫反応および/または活性化を引き起こす感染性疾患、例えば外傷性または病原体誘発性の免疫調節異常、例えばB型肝炎感染またはC型肝炎感染、HIV、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)感染によって引き起こされるもの、ウイルス性脳炎、敗血症、寄生虫症、炎症性反応によって損傷が誘導されるもの(例えば、ハンセン病)の処置。他の免疫媒介性反応および疾患は、移植片対宿主病(特に、同種細胞による)、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、アトピー性皮膚炎、クローン病、潰瘍性大腸炎および/または多発性硬化症に関する。
【０１８３】
例には、宿主自体の免疫反応によって引き起こされるか、または悪化する疾患も含まれる。例えば、自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、エリテマトーデス、乾癬、肺線維症および関節リウマチ、ならびに免疫反応が病因に寄与する疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、炎症性疾患、骨髄炎、潰瘍性大腸炎、クローン病および移植片対宿主病(GVHD)(これは、器官移植拒絶をもたらすことが多い)。さらなる例示的な炎症性疾患状態には、線維筋痛症、変形性関節症、サルコイドーシス、全身性硬化症、シェーグレン症候群、皮膚の炎症(例えば、乾癬)、糸球体腎炎、増殖性網膜症、再狭窄および慢性炎症が含まれる。
【０１８４】
3.心臓血管疾患
心臓血管疾患、障害、および/または状態は、世界中で主な死因である。5000万人を超える米国人が心臓および心血管関連の問題を有している。通常、心臓血管性の心臓障害が検出されるまでに、疾患は、通常、数十年の進行によりかなり進行しており、多くの場合には進行し過ぎているので、主要な恒久的能力障害を上手く予防できない。
【０１８５】
一般に、心臓血管疾患は、心臓および/または血管、動脈、ならびに時には静脈が関与する疾患であり得る。いくつかの態様では、疾患は血管性疾患である。これらの問題は、動脈性疾患、アテローム性動脈硬化症、アテロームの結果によるものであることが最も多いが、感染、弁および凝固の問題に関するものでもあり得る。いくつかの態様では、プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態は、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、血管炎、結節性多発動脈炎および/または心筋炎などの循環器疾患に関する。
【０１８６】
例示的な特定のプロテイノパチー心臓血管疾患、障害、および/または状態には、心筋虚血、心筋梗塞、血管過形成、心肥大、鬱血性心不全、巨心症、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、高血圧および/または狭心症のうちの1つまたは複数が含まれ得る。
【０１８７】
特定の態様では、プロテイノパチー心臓血管疾患、障害または状態は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、急性冠動脈性症候、不安定狭心症または急性心筋梗塞、安定狭心症、脳卒中、虚血性脳卒中、炎症、またはアテローム性動脈硬化症もしくは再狭窄を伴う自己免疫疾患である。
【０１８８】
4.ミトコンドリア性疾患
一般に、ミトコンドリア性疾患、障害、および/または状態は、ミトコンドリア成分をコードするミトコンドリアDNAまたは核遺伝子の後天性または遺伝性変異によって引き起こされ得る。それらは、薬物、感染または他の環境要因の有害作用による後天的なミトコンドリア機能障害の結果でもあり得る。
【０１８９】
ミトコンドリアは、化学エネルギー源として使用されるアデノシン三リン酸(ATP)の細胞供給の大部分を生成する。細胞エネルギーを供給することに加えて、ミトコンドリアは、一定範囲の他の過程、例えばシグナル伝達、細胞分化、細胞死、ならびに細胞周期および細胞成長の制御に関与する(McBride et al., Curr. Biol. 16(14): R551, 2006)。細胞代謝におけるそれらの役割全体を考慮すると、ミトコンドリアの損傷およびそれに続く機能障害は、広範囲のヒト疾患の重要な要因であり、老化過程における役割を果たし得る。
【０１９０】
ミトコンドリアDNAの遺伝は、常染色体性および伴性遺伝とは異なる振る舞いをする。ミトコンドリアDNAは、核DNAとは異なり、母親から厳密に遺伝し、各ミトコンドリア細胞小器官は、典型的には、複数のmtDNAのコピーを含有する。細胞分裂において、ミトコンドリアDNAのコピーは、2つの新たなミトコンドリア間でランダムに分離し、次いで、それらの新たなミトコンドリアがより多くのコピーを作る。結果として、母親から遺伝したmtDNAコピーのうちの少数のみが不完全である場合でも、ミトコンドリア分裂により、不完全なコピーのほとんどが、最終的にはただ1つの新たなミトコンドリアとなる。ミトコンドリア性疾患は、罹患ミトコンドリアの数が一定レベルに達すると、臨床的に明らかになり得る;この現象は、「閾値発現」と称される。ミトコンドリアDNAの変異は、核DNAが有するエラーチェック能力の欠如により起こることが多い。これは、ミトコンドリアDNA障害が自然発生的かつ比較的頻繁に起こり得ることを意味する。加えて、ミトコンドリアDNAの複製を制御する酵素の欠損は、ミトコンドリアDNAの変異を引き起こし得る。
【０１９１】
ミトコンドリア性疾患には、酸化的リン酸化の電子伝達系のタンパク質複合体の変異による変異型脳ミトコンドリア性脳症および/または筋ミトコンドリア筋症を特徴とする任意の臨床的に不均一な多系統性疾患が含まれる。いくつかの態様では、プロテイノパチーミトコンドリア性疾患には、レーバー遺伝性視神経萎縮症、MERRF(赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌス癲癇)、MELAS(高乳酸血症および脳卒中様エピソードを伴うミトコンドリア脳症);アルパース症候群、ロウ症候群、ルフト症候群、メンケス縮れ毛症候群、ツェルウェガー症候群、ミトコンドリア筋症および肢根型点状軟骨異形成症のうちの1つまたは複数が含まれ得る。
【０１９２】
核遺伝子の欠損は、ミトコンドリアタンパク質の機能障害につながる。これは、フリードライヒ運動失調症、遺伝性痙性対麻痺およびウィルソン病での場合である(Chinnery et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatr. 74(9): 1188, 2003)。ほとんどの他の遺伝性疾患に当てはまるように、これらの疾患は、優性遺伝である。酸化的リン酸化酵素の核変異によって、補酵素Q10欠損症およびバース症候群などの様々な障害が引き起こされ得る(Zeviani et al., Brian 127(pt 10): 2153, 2004)。環境の影響が遺伝的素因と相互作用してミトコンドリア性疾患を引き起こし得る。例えば、殺虫剤の曝露と遅発型パーキンソン病との間には関連性があり得る(Gomez et al., Front Biosci. 12:1079, 2007)。
【０１９３】
ミトコンドリア機能障害が関与する病因による他の病状には、統合失調症、双極性障害、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、脳卒中、心臓血管疾患、網膜色素変性症が含まれる。これらの一見無関係の状態を関連付けると考えられる共通のテーマは、酸化ストレスを引き起こす細胞損傷である。
【０１９４】
いくつかの態様では、本発明は、ミトコンドリア機能障害および酸化ストレスを特徴とする疾患の処置および/または予防を提供する。
【０１９５】
リソソーム酵素
リソソームは膜で囲まれており、天然物に見られる特定の化学結合をそれぞれが切断できる消化酵素を含有する。ほとんどのリソソーム酵素は、リソソーム周囲の膜に組み込まれているプロトンポンプによって達成される酸性環境で最もよく機能する。リソソームは、外側から細胞に取り込まれた物質を消化し(ヘテロファジーとして公知の過程)、細胞自体の細胞質に由来する他の物質を消化する(オートファジー)。消化されるべき物質は、最終的には、リソソーム酵素と同様に、膜で囲まれた区画に組み込まれる。選択的分解産物は、膜を横断することによってリソソームから出ることができるが、酵素は出ることができない。消化のための酵素および物質の混合は、膜で囲まれた区画の融合によって起こるので、細胞を保護するこの隔離は無くなることがない。
【０１９６】
本明細書において記載されるように、本発明は、リソソーム機能のモジュレーションによるプロテイノパチーの処置に関する洞察および技術を提供する。いくつかの態様では、このようなモジュレーションは、1つまたは複数のリソソーム酵素のレベルおよび/または活性を増加させることによって達成される。代表的なこのようなリソソーム酵素には、例えば、表5に列挙されているように、ヘパラン硫酸スルファミダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-マンノシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、β-グルコセレブロシダーゼなどが含まれる。
【０１９７】
いくつかのリソソーム酵素(例えば、グルコセレブロシダーゼ)は、β-バレルを構成する8本の鎖のうちの6本のC末端部に位置する機能的な保存アミノ酸を有する(α/β)8バレルからなる類似の触媒ドメインまたは活性部位を共有する(Durand P et al. Glycobiology 1997)。酵素の活性部位は酵素の一部であり、そこで基質が結合して化学反応を受ける。活性部位の残基(アミノ酸またはヌクレオチド)は基質の認識に関与し、触媒反応の機序に直接的に関与する。リソソーム酵素媒介性疾患(例えば、リソソーム蓄積疾患)の一因であると報告されたいくつかの変異は、リソソーム酵素触媒ドメインのこれらの保存領域内に位置している。
【０１９８】
1.グルコセレブロシダーゼポリペプチド
GBAまたはGBA1遺伝子によってコードされる天然に存在するグルコセレブロシダーゼ(GCase)は、リソソーム中で活性な酵素であり、リソソーム中で、スフィンゴ脂質グルコシルセラミド(GlcCer)のβ-グリコシド結合を糖(グルコース)およびより単純な脂肪分子(セラミド)に加水分解する。代表的なGCaseポリペプチドを表2に示す。
【０１９９】
非リソソームGCaseポリペプチドは、GBA2およびGBA3遺伝子によってコードされる。細胞質GCaseポリペプチドは、ヒトではGBA3遺伝子によってコードされる。細胞質GCaseは主な肝酵素であり、任意の公知の生理的β-グリコシドではなく、β-D-グルコシドおよびβ-D-ガラクトシドを効率的に加水分解する。GBA3は、顕著な中性グリコシルセラミダーゼ活性も有するが、これは、それが、グルコシルセラミド代謝の非リソソーム異化経路に関与し得ることを示唆している。GBA2遺伝子は、内因性化合物としての胆汁酸3-O-グルコシドの加水分解を触媒するミクロソームGCaseポリペプチドをコードする。肝臓におけるこのタンパク質の細胞内局在性により、この酵素は、小胞体がそれを閉じ込めているように見えるミクロソーム画分で主に豊富であることが示された。この推定膜貫通タンパク質は、炭水化物の運搬および代謝における役割を果たすと考えられる。
【０２００】
いくつかの態様では、本発明は、GBA2および/またはGBA3タンパク質のレベルおよび/または活性を増加させることが、ある種のプロテイノパチーの処置および/または予防においても有用であり得ることを教示する。
【０２０１】
GCaseポリペプチドの欠損は、ゴーシェ病(GD)を引き起こす。臨床的進行速度および神経系障害に基づいて、3種類のGDが記載されている(Grabowski, The Lancet 372(9645): 1263, 2008)。I型GDは、古典的には、非ニューロパチーと定義されており、典型的には、肝脾腫、骨格および造血系の異常を特徴とする。I型GDの表現型変異が観察されており、ごく一部の患者が、疾患の経過全体を通して不定年齢でパーキンソニズムを発症する(Bultron et al., J. Inherit. Metab. Dis. 33: 167, 2010; Tayebi et al., Mol. Genet. Metab. 79: 104, 2003)。II型およびIII型は、急性進行性(II型)または慢性進行性(III型)のいずれかの中枢神経系神経変性によってI型とは区別される;しかしながら、これらの形態は、いくつかの表現型変異を示すこともある。3種類すべての共通の特徴は、罹患組織におけるGlcCerの蓄積である。
【０２０２】
最近の研究により、リソソーム酵素の変異とリソソーム蓄積疾患以外の神経障害との間の関連性が示唆されている。例えば、ゴーシェ病(GD)とパーキンソニズムとの間の臨床的な関連性(Sidransky et al., Mol. Genet. Metab. 84: 302, 2005)により、グルコセレブロシダーゼ(GCase)遺伝子(GBA1)の変異およびスフィンゴ脂質代謝の変化は、シヌクレイノパチーの病因に寄与することが示唆された。GDは稀な常染色体劣性LSDであり、GlcCerのβ-グルコシル結合を切断するGCaseポリペプチドの機能喪失型変異に起因する(Brady et al., J. Biol. Chem. 240: 39, 1965)。
【０２０３】
パーキンソニズムは、一部の成人発症I型GD患者で観察されることが多い(Neudorfer et al., QJM 89: 691, 1996; Sidransky et al., Mol. Genet. Metab. 84: 302, 2005; Tayebi et al., Mol. Genet. Metab., 2003)。これらの患者の神経病理学的分析により、α-シヌクレイン陽性レビー小体の存在が明らかになっている(Wong et al., Mol. Genet. Metab. 82: 192, 2004)。GDおよびパーキンソニズムを有する患者は、多くの場合、GBA1変異についてヘテロ接合性であるパーキンソニズムの親類を有することも認められている(Goker-Alpan et al., J. Med. Genet. 41: 937, 2004)。大規模な患者コホートにおけるいくつかのさらなる遺伝学研究により、パーキンソニズムを有する患者は、GBA1変異の発生率が増加していることが実証され(Lill et al., The PDGene Database, Alzheimer Research Forum, 2008; Sidransky et al., N. Engl. J. Med. 361: 1651, 2009)、今日までに、GBA1がPDについての最も一般的な公知の遺伝的リスク因子になった。GBA1変異は、DLBであると診断された患者においても同定されている(Goker-Alpan et al., Neurology 67: 908, 2006; Neumann et al., Brian 132: 1783, 2009)。また、GCaseポリペプチド機能の阻害剤は、α-シヌクレインレベルをモジュレーションすることが示されている(Manning-Bog et al., Neurotoxicology 30: 1127, 2009)。
【０２０４】
本発明は、とりわけ、GD関連変異の発現またはリソソーム酵素GCaseの枯渇のいずれかが、α-シヌクレインの蓄積を引き起こし、神経変性をもたらすことを実証する(例えば、実施例1および実施例2を参照のこと)。
【０２０５】
加えて、本発明は、GlcCerの蓄積が、可溶性中間体のレベルを安定化させることによってα-シヌクレインのコンフォメーションおよび溶解性に明確に影響を与えることを実証する(例えば、実施例3を参照のこと)。
【０２０６】
本発明は、GlcCerが、原線維成長の誘導期を延長させ、オリゴマー中間体を酸性pHで安定化させる能力を有することも実証する(例えば、実施例4を参照のこと)。誘導期の後、GlcCerはアミロイド形成を加速させ、GlcCer脂質管から伸びたように見える原線維を形成した。
【０２０７】
いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、本発明は、オリゴマー中間体が飽和して原線維が急速に重合し始めると、GlcCer管が、それを形成するための足場またはプラットホームを提供すると提唱する。α-シヌクレインオリゴマーについての証拠資料は、神経培養、マウスモデルおよびヒトニューロパチーGD脳における神経変性と相関しているように見えるので、この能力は病因の重要な段階である可能性がある。
【０２０８】
したがって、本発明は、GCaseポリペプチド機能喪失型変異が、ヒトドーパミンニューロンにおけるリソソームタンパク質分解を減少させることを実証し、したがって、GlcCer代謝は、リソソーム活性の基本的な調節因子であると提案する。
【０２０９】
いくつかの態様では、本発明は、α-シヌクレインの蓄積が、GCaseポリペプチドのリソソーム活性を阻害することを実証し、それにより、自己伝播性疾患の機序を含むα-シヌクレインとGCaseポリペプチドとの間の正の双方向フィードバックループを立証する。本発明によれば、α-シヌクレイン集合体の増大および/または形成は、正常または野生型GCaseポリペプチドのリソソーム成熟および活性をさらに阻害し、さらなるGlcCerの蓄積およびα-シヌクレインオリゴマー形成の増加をもたらす(例えば、実施例7を参照のこと)。したがって、本発明は、リソソームGCaseの枯渇が、GCaseポリペプチドの変異を保有する患者だけではなく、孤発型PDならびに他のシヌクレイノパチーおよび/またはプロテイノパチーを有する患者においても起こることを教示する。
【０２１０】
いくつかの態様では、本発明は、GCaseポリペプチドの機能を増強するか、または基質レベルを減少させることによって、細胞におけるGlcCerレベルを低下させることが、脳におけるα-シヌクレインレベルの減少につながることを教示する。この治療戦略は、病原性フィードバックループを破壊して神経変性を停止させるか、または可能であれば回復させもするはずである。本発明によれば、GCaseポリペプチドの機能の増強は、α-シヌクレインの蓄積を特徴とするすべての神経変性障害において治療効果を提供する。
【０２１１】
いくつかの態様では、本発明は、非神経Hela細胞においてGCaseポリペプチドを過剰発現させることにより、リソソームタンパク質分解が約40％増加したことを実証する(例えば、実施例8を参照のこと)。
【０２１２】
本発明は、とりわけ、アロステリック剤がGCaseポリペプチドの活性化をもたらすことを実証する。本発明は、GCaseポリペプチドのアロステリック活性化剤を用いて、PD患者のドーパミンニューロンを処置することにより、リソソーム分解能力が増加したことを教示する(例えば、実施例8を参照のこと)。
【０２１３】
酵素上のアロステリック部位は、その活性部位と物理的に区別される部位である。アロステリック部位は、細胞環境中の分子(例えば、補酵素と称される酵素、または補因子と称される他の非有機物)と結合して、これらの分子と弱い非共有結合を形成し、酵素のコンフォメーション変化を引き起こす。このコンフォメーション変化が活性部位に伝わり、次いで、酵素の反応速度に影響を与える。アロステリック相互作用は、酵素を阻害することおよび活性化させることができる。
【０２１４】
アロステリック活性化剤はアロステリック部位に結合し、活性部位については基質と競合しない。
【０２１５】
本発明のいくつかの態様では、アロステリック剤は、リソソーム酵素の安定性を増加させる。本発明のいくつかの態様では、アロステリック剤は、リソソーム酵素と基質との間の結合を増加させる。本発明のいくつかの態様では、アロステリック剤は、リソソーム酵素の輸送を増加させる。
【０２１６】
本発明は、GCaseポリペプチドのアロステリック活性化剤を用いて、α-シヌクレインを過剰発現するPDドーパミンニューロンを処置することにより、α-シヌクレインの用量依存的な減少がもたらされることも教示する。加えて、本発明は、GCaseポリペプチドアクチベーターを用いて処置することにより、すべての野生型GCaseおよび小胞体(ER)後形態のレベルが増加したことを実証するが、これは、リソソームへのフラックスの増強を示している(例えば、実施例10を参照のこと)。
【０２１７】
いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、本発明は、GCase酵素活性部位に干渉しないアロステリック活性化剤は、変異体および/または野生型GCaseポリペプチドの両方のレベルおよびリソソーム輸送を増加させることによる、(例えば、α-シヌクレインの蓄積を伴う)プロテイノパチー神経変性障害を処置する方法を提供するものであると提唱する。
【０２１８】
したがって、本発明は、GCaseポリペプチドのレベルおよび/または活性を増加させることによって、および/またはGlcCerなどのGCaseポリペプチド基質のレベルおよび/またはアベイラビリティを減少させることによって、(例えば、α-シヌクレインの蓄積を伴う)プロテイノパチー神経変性障害、ならびに神経および非神経タンパク質の蓄積を特徴とする他の疾患を処置する方法を提供する。
【０２１９】
2.スフィンゴ脂質代謝ポリペプチド
スフィンゴ脂質は、真核生物における普遍的な膜構成成分である脂質の主要クラスの代表的なものである。スフィンゴ脂質は、膜形成における一次構造の役割を果たすと考えられていた。しかしながら、スフィンゴ脂質の代謝および機能についての徹底的な調査により、シグナル伝達経路の調節から、タンパク質選別の指示を経て、細胞間の相互作用および認識の媒介までの役割を果たしている生物活性分子として、セラミド、スフィンゴシン、スフィンゴシン-1-ホスフェートおよびセラミド-1-ホスフェートを含むスフィンゴ脂質ファミリーのメンバーが明らかになった。スフィンゴ脂質はステロールと動的にクラスタ化して、有効なシグナル伝達およびタンパク質選別のためのハブとして機能する脂質マイクロドメインまたはラフトを形成することも報告されている(Bartke et al., Journal of Lipid Research S91-6, 2009)。
【０２２０】
スフィンゴ脂質合成は、小胞体において、L-セリンおよびパルミトイル補酵素A(パルミトイル-CoA)が3-ケトスフィンガニンと縮合し、それがスフィンガニンに還元されて開始する。セリンパルミトイルトランスフェラーゼ(SPT)は、2つの遺伝子産物長鎖塩基(LCB)1およびLCB2からなる膜結合ヘテロ二量体であり、スフィンゴ脂質合成の律速酵素である(Hanada, 2003)。セラミドは、真核細胞において、すべての主要スフィンゴ脂質、すなわちスフィンゴミエリン(SM)、グルコシルセラミドおよびより複合的なスフィンゴ脂質の前駆体として機能する中心的な分子であり、スフィンゴ脂質代謝には、様々な重要な酵素が関与する(Hannun et al., Biochemistry 40: 4893, 2001; Gault et al., Adv Exp Med Biol. 688: 1, 2010)。
【０２２１】
スフィンゴ糖脂質(GSL)として公知の複合脂質群は、それらの頭部に結合している糖残基の順序および種類の両方の点で相違する数十の異なるスフィンゴ脂質種を含有する。
【０２２２】
ガングリオシドは、糖鎖上に連結された1つまたは複数のシアル酸(例えば、n-アセチルノイラミン酸、NeuNAc)を有する複合スフィンゴ糖脂質(セラミドおよびオリゴ糖)である。ガングリオシドの構造多様性は、糖残基の組成および配列の変化に起因する。すべてのガングリオシドにおいて、セラミドは、そのC-1を介してβ-グルコシル残基と連結し、これが次にβ-ガラクトシル残基と結合する。GM1(モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド)は、1個のシアル酸残基(モノシアロ)を含有し、神経可塑性および修復機序に影響を与え、脳におけるニューロトロフィンの放出にも関与する。GM2は、特徴付けされている第2のモノシアロガングリオシドである。
【０２２３】
ガングリオシドは細胞膜の重要な構成成分であり、細胞の認識および接着、シグナル伝達、成長調節および分化を含む多数の生物学的機能に関連する。ガングリオシドは、ほとんどの脊椎動物の細胞および組織中に存在するが、神経細胞およびグリア細胞の原形質膜外葉の成分としてそれらが最も多く発現している神経系において特に豊富である。ガングリオシドの代謝異常は、種々の神経変性疾患を伴う。例えば、ガングリオシドレベルの不均衡は、アポトーシスおよびCa＋2シグナル伝達の混乱をもたらすことがあり、これらは両方ともハンチントン病と関連していた(Desplats et al., Neurobiol Dis. 27(3): 265, 2007)。
【０２２４】
本発明は、とりわけ、ガングリオシドがインビトロでα-シヌクレインの蓄積を引き起こすことを実証する(例えば、実施例12を参照のこと)。
【０２２５】
加えて、本発明は、ガングリオシドが可溶性α-シヌクレインオリゴマーの形成を安定化および増加させることを実証する。
【０２２６】
いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、本発明は、ガングリオシドレベルを低下させることは、ガングリオシド代謝酵素の活性および/またはレベルを増強することによる、(例えば、α-シヌクレインの蓄積を伴う)プロテイノパチー神経変性障害の処置戦略を提供するものであると提唱する。
【０２２７】
したがって、本発明は、β-ヘキソサミニダーゼA/B/Sおよびβ-ガラクトシダーゼアイソフォーム1ポリペプチドなどのリソソームスフィンゴ脂質代謝ポリペプチドのレベルおよび/または活性を増加させることによって、および/または限定されないが、ガングリオシドGM1、GM2、GM3を含むスフィンゴ脂質代謝酵素基質のレベルおよび/またはアベイラビリティを減少させることによって、ある種のプロテイノパチー疾患、障害、および/または状態、特に(例えば、α-シヌクレインの蓄積を伴う)神経変性プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態、ならびに神経および非神経タンパク質の蓄積を特徴とする他の疾患を処置および/または予防するための方法および組成物を提供する。
【０２２８】
膜輸送
本発明は、タンパク質輸送の欠損が、ある種のプロテイノパチーにおけるタンパク質の蓄積に寄与し得ることを実証する。膜輸送は、タンパク質および他の高分子を細胞内外の種々の目的地に運搬するのに不可欠である。膜輸送は、細胞が細胞ホメオスタシスを維持し、シグナルの認識および伝達における具体的な要求を満たすという基本的な必要性を支えるものでもある。
【０２２９】
小胞体(ER)から始まる膜タンパク質輸送の経路は、長くて分岐しており、時には双方向性である。膜輸送システムの設計図は真核生物間で保存されており、ER、ゴルジ体、エンドソームおよび溶解区画(例えば、リソソーム)を含む。研究により、病理学的に多量のタンパク質、または膜結合性およびオリゴマー形成が増強された変異型タンパク質の蓄積は、酸化ストレスの増大、ミトコンドリアの変性、脂質代謝の欠損および膜輸送障害の徴候によるニューロン死をもたらし得ることが示されている(Chua et al., Brain Res Rev. 67(1-2): 268, 2011)。例えば、Rabポリペプチドおよび可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質受容体(SNARE)を含む真核生物膜輸送機構のある種の構成要素は、膜輸送の機能障害における重要な役割を果たすことが示唆されている。
【０２３０】
GTPaseの大きなRabファミリーは、真核細胞の細胞内膜系間の脂質およびタンパク質輸送を調節する。他のGTPaseと同様に、Rabポリペプチドは、コンフォメーション間での、すなわちグアノシン二リン酸(GDP)に結合した不活性型と、グアノシン三リン酸(GTP)に結合した活性型との間での切り替わりがある。GDP/GTP交換因子(GEF)はGDP結合型からGTP結合型への変換を触媒し、GDPへのGTP加水分解は、GTPase活性化タンパク質(GAP)によって触媒される。Rabポリペプチドは、Rabエスコートタンパク質(REP)の助けを受けてRabゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ(RabGGT)によるC末端脂質アンカーの付加によって修飾され、それにより、膜を標的として接着することが可能になる。反対に、Rabグアニンヌクレオチド解離阻害因子(Rab GDI)は、Rab-GDPを膜から分離して、それらを細胞質に留める。活性化Rabポリペプチドは、無数のエフェクタータンパク質を動員して、小胞/運搬体輸送を媒介する。ヒトにおいて同定されたRabポリペプチドは、約70種類ある。
【０２３１】
プロテオミクスにより、Rab1aポリペプチドは、初期および後期両方のエンドサイトーシス小胞に結合していることが判明した(Mukopadhyay et al. J Cell Sci 124: 765, 2011)。Rab1ポリペプチドの2つのアイソフォーム、Rab1aおよびRab1bが存在し、これらはアミノ酸配列相同性を92％共有しており、哺乳類細胞では機能上重複していると考えられる。Rab1ポリペプチドは、分泌経路の小胞体(ER)-ゴルジ段階で特異的に機能することが立証されている(Duvernay et al., Cell Signal 17: 1457, 2005)。具体的には、Rab1ポリペプチドは、コートタンパク質II(COPII)小胞が、GRASP65と複合体を形成しているシス-ゴルジ繋留タンパク質GM130の助けによってゴルジと融合するために小胞体(ER)から出芽するのをプログラムするシス-SNARE複合体に、繋留因子p115を動員する。最近、初期エンドソームからゴルジへの輸送におけるRab1aポリペプチドの役割が報告されており、Rab1aポリペプチドは、トランスサイトーシス小胞の成分であると説明されている。Rab1aポリペプチドは、微小管に沿った初期エンドサイトーシス小胞の運搬に重要であることが示されている。
【０２３２】
本発明は、α-シヌクレインを過剰発現するヒトPDドーパミンニューロンにおけるRab1aポリペプチドの過剰発現が、ニューロンにおけるα-シヌクレインレベルの劇的な減少をもたらすことを実証する(例えば、実施例9を参照のこと)。加えて、本発明は、Rab1aポリペプチドが、カテプシンB活性を増加させることによってリソソーム機能を増強することを実証する。
【０２３３】
いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、本発明は、膜輸送または分泌経路の刺激がリソソーム酵素輸送の活性化を提供すると提唱する。本発明は、リソソーム酵素輸送の刺激がリソソーム機能の増加をもたらし、神経細胞および非神経細胞の両方においてα-シヌクレインレベルの減少につながることも教示する。
【０２３４】
本明細書において実証されたように、本発明は、α-シヌクレインの増大が、GCaseポリペプチドのリソソーム輸送の混乱、GCaseポリペプチド活性の減少、そしてしたがってリソソームタンパク質分解の障害をもたらすことを教示する。本発明によれば、GCaseポリペプチド活性は、GBA1変異を有する患者における毒性に寄与するだけではなく、GBA1遺伝子の変異を有しないより一般的な孤発型PDおよびシヌクレイノパチーの発症にも影響を与える。
【０２３５】
本発明は、対照の健常対象におけるα-シヌクレインの変異が、GCaseポリペプチドの小胞体(ER)-ゴルジフラックス(α-シヌクレインのオリゴマー化によって強化され得る特性)を変化させることもできることも実証する。本発明では、この事実は、凝集が不完全なΔ71-82-α-シヌクレインを発現するニューロンにおけるGCaseポリペプチド活性が正常であること、および小胞体(ER)中により高レベルのGCaseポリペプチドを含有する対照においてsyn303に対する免疫反応性が増加していることによってさらに実証される。
【０２３６】
したがって、本発明は、膜輸送または分泌経路の刺激により正常GCaseポリペプチドの細胞内リソソーム輸送を増加させることによって、野生型GCaseポリペプチドを有する対象における(例えば、α-シヌクレインの蓄積を伴う)プロテイノパチー神経変性障害を処置する方法を提供する。
【０２３７】
酸化ストレス
本発明は、プロテイノパチーをもたらす酸化ストレスまたはニトロ化ストレスに関する方法を提供する。ミトコンドリア機能障害、酸化ストレス、タンパク質凝集体の蓄積およびオートファジーストレスは、限定されないが、神経変性疾患を含む多くのプロテイノパチーにおいて一般的である(Lee et al., Biochem. J. 441: 523, 2012)。
【０２３８】
酸化ストレスはタンパク質の非特異的翻訳後修飾につながり得、タンパク質凝集に寄与する。脳は、吸入酸素の20％および消費酸素の90％を使用して、酸化的リン酸化でエネルギーを生産するので、神経細胞が特に酸化ストレス感受性であることは驚くべきものではない。酸化的リン酸化では、脳のニューロンは代謝活性が高く、抗酸化能力が低く、複製能がないので、酸化的損傷に弱い。脳細胞における非常に大量のミトコンドリアは、活性酸素種(ROS)/活性窒素種(RNS)の主要な生成および作用部位である。ROSおよびRNSの具体的な形態には、過酸化水素(H2O2)、スーパーオキシド(O2・-)、酸化窒素(NO)、ペルオキシ亜硝酸(ONOO-)および活性脂質種(RLS)が含まれる。脂質過酸化反応は神経変性疾患の一貫した特徴であり、HNE(4-ヒドロキシノネナール)などの生物活性RLSは、パーキンソン病またはアルツハイマー病を有する個体の脳に蓄積する。タンパク質修飾の他の機序は、NO依存性である。例えば、NOはO2・-と反応してONOO-を生成し、これは、さらなるタンパク質の酸化およびニトロ化を開始させることができる。NOと酸素との反応またはONOO-の分解から生物学的に形成された二酸化窒素ラジカルは、チロシン残基と反応して、3-ニトロチロシンの形成をもたらす。神経変性疾患では、タンパク質上のチオール基にNOが付加されるS-ニトロソ化(S-ニトロシル化とも称される)も報告されている。この付加体は、ニトロ化α-シヌクレインおよびS-ニトロソ化パーキンの両方を伴うパーキンソン病を含む広範囲の病状において検出されている。同様に、アルツハイマー病を有する個体の脳では、タンパク質のONOO-依存性修飾が広範囲に及んでいる。研究により、酸化α-シヌクレインが、種々のシヌクレイノパチーを有する患者の脳のレビー小体および神経突起内に存在することが証明されている(Giasson et al., J. Neurosci Res. 59(4): 528, 2000)。ミトコンドリアは活性種の生成体および標的の両方であるので、酸化ストレスはミトコンドリア機能障害と密接に関連する。酸化体の増加につながるミトコンドリア機能障害は、PDの病因と関連する(Banerjee et al., Biochem. Biophys. Acta 1792: 651, 2009)。ミトコンドリアの代謝回転はオートファジーに依存しており、年齢とともに減少し、神経変性疾患では多くの場合に機能障害されている。したがって、神経変性疾患では、オートファジー、酸化還元シグナル伝達およびミトコンドリア機能障害の間にクロストークがある。
【０２３９】
本発明は、酸化ストレスが、ある種のプロテイノパチーにおけるタンパク質凝集の存在、性質および/または程度に寄与し得ることを実証する。例えば、とりわけ、本発明は、死後GDおよびPD脳試料では、過去に記録がない36〜45Åサイズの可溶性オリゴマーα-シヌクレイン種のレベルが上昇しており、その存在および/またはレベルが神経学的表現型と相関することを、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析によって示す(例えば、実施例5および実施例6を参照のこと)。
【０２４０】
加えて、本発明は、酸化/ニトロ化α-シヌクレインに対して作製された抗体であって、毒性を示すタンパク質の病的なコンフォメーションを選択的に検出する抗体であるモノクローナル抗体(mAb)syn303(Tsika et al., J. Neurosci. 30: 3409, 2010)と、可溶性α-シヌクレインオリゴマーが顕著に反応したことを実証する (例えば、実施例6を参照のこと)。
【０２４１】
本発明は、病的なα-シヌクレインオリゴマーが、乳児性神経型GD症例、およびIII型GDを有する小児においても検出されたことも実証するが(例えば、実施例6を参照のこと)、これは、GBA1変異、およびGlcCer代謝経路における特定の変化が、必ずしも年齢依存性ではないα-シヌクレインオリゴマー化に影響を及ぼすことを強く示唆している。
【０２４２】
いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、本発明は、オリゴマーα-シヌクレインが、パーキンソニズムを伴わないI型GDに由来する試料中に存在しないことは、GCaseポリペプチドの欠損に加えて他の要因が、神経型GDにおけるα-シヌクレインオリゴマー化に寄与している可能性が高いことを示すものであると提唱する。例えば、α-シヌクレインの酸化およびニトロ化は、インビトロでクリアランスを妨害し、α-シヌクレインオリゴマーを安定化させることが示されており(Hodara et al., J. Biol. Chem. 279: 47746, 2004)、シャペロンは、α-シヌクレインの毒性および凝集を打ち消すことも示されている(Auluck et al., Science 295: 865, 2002)。
【０２４３】
いくつかの態様では、本発明は、酸化α-シヌクレインオリゴマーのレベルが、パーキンソニズムまたは神経型の疾患も示したGD患者の脳においてのみ増加していることを実証する。
【０２４４】
本発明は、GCaseポリペプチドのシャペロンであるイソファゴミン(IFG)と抗酸化剤n-アセチル-システイン(NAC)とを組み合わせて処置したPDニューロンでは、小胞体(ER)後または成熟GCaseポリペプチドの量が、いずれか単独による処置と比較して3倍増加していることを実証する。
【０２４５】
いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、本発明は、PDの処置のために、GCaseポリペプチドの成熟を増加させるための抗酸化剤を使用することを提案する。本発明は、抗酸化剤に加えて、GCaseポリペプチドを安定化および活性化させる小分子を組み合わせることが、α-シヌクレインの蓄積によって開始した病原性フィードバックループを効率的に破壊することも実証する。
【０２４６】
したがって、本発明は、併用療法を使用してGCaseポリペプチドのレベルおよび/または活性を増加させることによって、(例えば、α-シヌクレインの蓄積を伴う)プロテイノパチー神経変性障害を処置する方法を提供する。本発明によれば、プロテイノパチーにつながる2つまたはそれ以上の重要な経路を標的とする併用療法は、単独で各経路を標的とする治療法と比較して大きな利益を提供する。いくつかの態様では、本発明は、プロテイノパチーにつながる2つの重要な経路を標的とする治療薬を教示する。いくつかの態様では、本発明は、プロテイノパチーにつながる3つの重要な経路を標的とする治療薬を教示する。いずれの理論にも縛られるものではないが、本発明は、プロテイノパチーの処置において、以下の3つの重要な経路、リソソーム酵素の活性化(レベルまたは機能の増加);膜輸送経路の増強;および/または抗酸化機能のうちの1つまたは複数を標的とする治療薬を提案する。本発明のいくつかの態様では、リソソーム酵素は、GCaseである。
【０２４７】
カルシウムイオン媒介性シグナル伝達
Ca2＋イオンは、普遍的かつ重要な細胞内シグナル伝達イオンである。Ca2＋シグナル伝達は、多様な経路による多数の細胞機能に影響を与え、小胞体(ER)機能の主な調節因子である(Berridge et al., Nat Rev Mol Cell Biol. 4:517, 2003; Gorlach et al., Antioxid Redox Signal 8: 1391, 2006)。Ca2＋チャンネルの活性化により、細胞外Ca2＋が細胞質ゾルに流入することが可能になり、続いてこれが、RyRおよび/または小胞体(ER)膜内のCa2＋イオンチャンネルを活性化させることによって、小胞体(ER)などの細胞内Ca2＋ストアからさらなるCa2＋イオンの放出を誘導する。このカルシウム誘導性カルシウム放出経路を阻害することにより、小胞体(ER)Ca2＋ストアの枯渇が最小限になるが、この過程は、おそらくは、細胞ストレスを軽減するシグナル伝達経路(例えば、HSR、UPR)の活性化によって、一部の細胞質および小胞体(ER)シャペロンの発現をアップレギュレートするように見える。したがって、Ca2＋チャンネル活性の遮断は、おそらくは、BipおよびHsp40を含む一部の分子シャペロンを適度にアップレギュレートすることによって、ミスフォールディングされやすいタンパク質をフォールディングする小胞体(ER)の能力を増強する。
【０２４８】
小胞体(ER)のCa2＋レベルは、SERCA2b Ca2＋流入ポンプを過剰発現させることによって、またはRyR小胞体(ER)Ca2＋流出チャンネルを阻害することによって増強できる。これは次にシャペロン機能を増加させ、変異、ミスフォールディングおよび分解されやすいリソソーム酵素のフォールディング、輸送および機能を増強できる。例えば、小胞体(ER)カルシウム濃度の上昇によるカルネキシンフォールディング経路の翻訳後調節は、ミスフォールディングされやすい変異体酵素をフォールディングするこのシャペロンシステムの能力を増強し、小胞体(ER)関連分解を代償にして輸送受容体と会合できるフォールディング変異体リソソーム酵素の集団を増加させて、リソソーム酵素の濃度および活性を増加させることができる。
【０２４９】
カルネキシン(およびカルレティキュリン)は、Glc1Man9GlcNAc2に対する特異性を有するレクチン部位を介して、および/またはフォールディング中間体の曝露された疎水性表面を認識するポリペプチド結合部位を介して糖タンパク質に結合することが公知である。生化学的研究およびX線結晶学的研究により、構造的役割を果たし得るカルネキシンのN末端β-サンドイッチ上に、1個の小胞体(ER)内腔低親和性Ca2＋結合部位(Kd約0.15±0.05mM)があることが同定されている。このCa2＋結合部位の占有は、N結合糖タンパク質のオリゴ糖部分構造へのカルネキシンの結合、および非グリコシル化ホタルルシフェラーゼの凝集を抑制するその能力を増強し、小胞体(ER)Ca2＋の増加が、カルネキシンと部分的にフォールディングされたリソソーム酵素変異体との間の相互作用の親和性および特異性を増加させるようである理由を合理的に説明する。カルネキシンのC末端ドメイン内には別の推定上の中親和性Ca2＋結合部位があるが、その細胞質局在は、それがカルネキシン-リソソーム酵素の相互作用に影響を及ぼす可能性が低いことを示唆している。カルレティキュリンの機能は、その小胞体(ER)内腔N末端ドメイン上に推定上のCa2＋結合部位があるので、同様に調節されるようである(Schrag et al., Mol. Cell 8: 633, 2001; Brockmeier et al., Biochemistry 45:12906, 2006; Corbett et al., J Biol. Chem. 275: 27177, 2000)。
【０２５０】
小分子を使用した、機能喪失型疾患、障害、および/または状態、例えばリソソーム蓄積疾患を処置するための細胞内カルシウムホメオスタシスの操作(Tong Ong et al., Nat Chem Biol. 6: 424, 2010; Mu et al., PLoS Biology 6(2): e26, 2008)が、異なるリソソーム蓄積疾患に関連する複数の細胞株において、内因性変異体リソソーム酵素のフォールディング、輸送および機能の増強を示すことが文献に報告されている。これらの小分子はカルネキシンの機能を翻訳後に調節し、アンフォールディングタンパク質応答アクチベーターとは異なり、この部類のタンパク質恒常性調節因子は、ストレス応答遺伝子の転写を誘導しない。したがって、小分子は、損傷した酵素を交換するのではなく、カルシウムホメオスタシスを変化させることにより、損傷した酵素を修復することによって機能を回復させる。
【０２５１】
本発明は、カルシウムチャンネル遮断剤が、ある種のプロテイノパチーの有効な処置および/または予防を提供し得るという洞察を提供する。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、本発明は、カルシウムチャンネル遮断剤が、1つまたは複数のリソソーム酵素、特にGCaseのレベルおよび/または活性を増加させるのに有用であり得ると認識する。前記文献とは対照的に、本発明は、カルシウムチャンネル遮断剤が、機能獲得型プロテイノパチーの有効な処置および/または予防を提供することを特に教示する。また、本発明は、カルシウムチャンネル遮断剤が、特にα-シヌクレインの蓄積または凝集を伴うものを含むプロテイノパチー神経変性疾患、障害または状態の有効な処置および/または予防を提供するという特定の洞察を提供する。
【０２５２】
サポシンポリペプチド
サポシンA、B、CおよびDポリペプチドは、共通の前駆体タンパク質プロサポシンに由来する小さな熱安定性糖タンパク質である。これらの成熟サポシンポリペプチドおよびプロサポシンポリペプチドは、種々のスフィンゴ脂質の代謝に関与するいくつかのリソソーム加水分解酵素を活性化させる(Morimoto et al PNAS 87(9): 3493, 1990; Kishimoto et al The Journal Lipid Research 33: 1255, 1992)。
【０２５３】
4種類のサポシンポリペプチドはすべて、システイン6個、グリコシル化部位および保存プロリンの配置が同じ位置であることを含めて互いに構造的に類似している。構造類似性にもかかわらず、スフィンゴ脂質加水分解酵素の活性化についての特異性および様式は、個々のサポシンポリペプチドの間で異なる。サポシンポリペプチドはリソソームタンパク質であるように見え、リソソーム加水分解酵素に対する作用を発揮する。
【０２５４】
プロサポシンは、タンデムに配置された4個のドメイン(各サポシンにつき1個)を含有する70kDaの糖タンパク質である。プロサポシンは、おそらくはリソソーム内でタンパク質分解処理されて、サポシンA、B、CおよびDになる。しかしながら、プロサポシンは、リソソームに入ることはない内在性膜タンパク質としても存在し、多くの生体液、例えば精漿、ヒトの乳および脳脊髄液では切断されていない状態で存在し、それらの場所では異なる機能を有するように見える。
【０２５５】
サポシンがリソソーム蓄積疾患患者の組織内に蓄積していること、およびプロサポシン遺伝子の変異によりスフィンゴリピドーシスが発生することが、サポシンの生理学的重要性を強調している。
【０２５６】
本発明は、サポシンポリペプチドが、ある種のプロテイノパチーの有効な処置および/または予防を提供し得るという洞察を提供する。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、本発明は、サポシンポリペプチドが、1つまたは複数のリソソーム酵素、特にGCaseの活性を増加させるのに有用であり得ると認識する。また、本発明は、サポシンポリペプチドが、特にα-シヌクレインの蓄積または凝集を伴うものを含むプロテイノパチー神経変性疾患、障害または状態の有効な処置および/または予防を提供するという特定の洞察を提供する。
【０２５７】
リソソーム活性化剤
本明細書において記載されるように、本発明は、リソソーム活性を活性化させることによって、プロテイノパチーを処置するための方法および試薬を提供する。いくつかのこのような態様では、活性化は、1つまたは複数のリソソーム活性化剤の投与によって達成される。いくつかの態様では、このようなリソソーム活性化剤は、1つまたは複数のリソソーム成分(例えば、リソソーム酵素またはそのアクチベーター)のレベルおよび/または活性を増加させる。いくつかの態様では、このようなリソソーム活性化剤は、1つまたは複数のリソソーム成分(例えば、リソソーム酵素の阻害因子または基質)のレベルおよび/または活性を減少させる。
【０２５８】
基質減少または枯渇療法とも称される基質阻害療法は、ある種のプロテイノパチー疾患の処置の代替療法として使用できる。この戦略は、疾患を誘導する基質の合成を触媒する酵素の阻害によって、基質の蓄積を減少させようとするものである。いくつかの態様では、本発明は、プロテイノパチーを誘導する基質の蓄積を阻止し、全体的なその基質レベルの減少を可能にするリソソーム活性化剤を提供する。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、スフィンゴ糖脂質生合成経路を減少させる。例えば、GlcCer合成は、スフィンゴ糖脂質生合成経路における最初の段階であり、GlcCer基質合成を減少させることによって、種々のプロテイノパチー疾患、障害、および/または状態に関連したより複合的なスフィンゴ糖脂質のレベルに対して効果があり得る。
【０２５９】
本開示を閲覧する当業者であれば、様々な化学実体および剤のいずれかが、本発明によるリソソーム活性化剤として有用であることを直ちに認識するであろう。少数だが例を挙げれば、いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、小分子剤であるか、または小分子剤を含む。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、ポリペプチド剤(例えば、酵素ポリペプチド、調節ポリペプチド、抗体など)であるか、または前記ポリペプチド剤を含む。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、核酸剤であるか、または核酸剤を含む。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、炭水化物剤であるか、または炭水化物剤を含む。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、脂質剤であるか、または脂質剤を含む。
【０２６０】
いくつかの態様では、本発明に従って使用するためのリソソーム活性化剤は、例えば、ミスフォールディング酵素が適切にフォールディングされ、および/または小胞体からリソソームに輸送されるのを助ける薬理学的シャペロンとして作用するものである。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、リソソーム酵素と直接相互作用する。
【０２６１】
いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、そのリソソーム酵素の活性部位または基質結合部位を介して、リソソーム酵素と直接相互作用する。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、そのリソソーム酵素の活性部位または基質結合部位以外の部位を介して、リソソーム酵素と直接相互作用する。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、リソソーム酵素と直接相互作用しない。いくつかの態様では、リソソーム酵素と直接相互作用しないリソソーム活性化剤は、タンパク質のタンパク質恒常性をモジュレーションする。いくつかの態様では、リソソーム酵素と直接相互作用しないリソソーム活性化剤は、カルシウムホメオスタシスをモジュレーションする。いくつかの態様では、リソソーム酵素と直接相互作用しないリソソーム活性化剤は、小胞体(ER)の生物学的なフォールディング能力をモジュレーションする。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、カルシウム遮断剤である。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤、特にリソソーム酵素と直接相互作用するものは、酵素活性を阻害する。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤、特にリソソーム酵素と直接相互作用するものは、酵素活性を阻害しない。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、リソソーム酵素のアロステリックアクチベーターである。
【０２６２】
いくつかの態様では、本発明に従って使用するためのリソソーム活性化剤は、野生型リソソーム酵素のレベルおよび/または活性を増加させる。あるいはまたは加えて、いくつかの態様では、本発明に従って使用するためのリソソーム活性化剤は、変異体リソソーム酵素のレベルおよび/または活性を増加させる。いくつかの態様では、本発明に従って使用するための特定のリソソーム活性化剤は、野生型標的リソソーム酵素およびその標的リソソーム酵素の1つまたは複数の変異体の両方のレベルおよび/または活性を増加させる。
【０２６３】
あるいはまたは加えて、いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、GCase以外のリソソーム酵素の薬理学的シャペロンを含む。例えば、ある種のリソソーム酵素の潜在的シャペロンを表11に列挙する。
【０２６４】
いくつかの態様では、シャペロンは、投与されるシャペロンが対象とするリソソーム酵素のいずれかにおいていかなる変異も有しない個体に投与される。いくつかの態様では、個体は、投与されるシャペロンが対象とするリソソーム酵素のいずれかにおいて変異を有する。
【０２６５】
いくつかの態様では、特定の疾患、障害、および/または状態の処置において使用するためのリソソーム活性化剤は、このような疾患、障害、および/または状態に対して過去に使用されていない剤である。
【０２６６】
（表１１）リソソーム酵素およびそれに対応する薬理学的シャペロン(SEQ ID NOによって参照されるリソソーム酵素の例示的なアミノ酸配列は、配列リストに示す)
2014523881.tif 000016
2014523881.tif 000017
【０２６７】
1.小分子剤
いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、小分子である。いくつかの態様では、小分子リソソーム活性化剤は、リソソーム酵素のレベルおよび/または活性を、剤が存在しない場合に観察されるものと比較して増加させる(輸送の増加によるものを含む)。いくつかの態様では、小分子リソソーム活性化剤は、リソソーム酵素阻害因子のレベルおよび/または活性を、剤が存在しない場合に観察されるものと比較して減少させる(輸送の減少またはそうでなければ輸送の妨害によるものを含む)。酵素を活性化させるか、または正の調節因子を活性化させるか、または負の調節因子を阻害するあらゆるもの(基質を含む。例えば、基質合成を触媒する酵素を阻害する剤)。
【０２６８】
いくつかの態様では、小分子リソソーム活性化剤は、糖、例えばイミノ糖(例えば、イソファゴミン、N-ブチル-デオキシノジリマイシン、N-ノニル-デオキシノジリマイシン、コンズリトール-β-エポキシド)であるか、または前記糖を含む。
【０２６９】
いくつかのこのような態様では、イミノ糖系リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：例えばAshe et al., PLoS ONE 6(6): e21758, 2011に記載されているような化合物AMP-DMPもしくはGenz-529468またはそれらの類似体。
【０２７０】
いくつかの態様では、小分子リソソーム活性化剤は、1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノール(PDMP)であるか、またはPDMPを含む。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：例えばMcEachern et al., Mol. Genetics and Metabolism 91: 259, 2007に記載されているような化合物N-((1R,2R)-1-(2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ダイオキシン-6-イル)-1-ヒドロキシ-3-(ピロリジン-1イル)プロパン-2-イル)オクタンアミド(Genz-112638)またはその類似体。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：例えばLarsen et al., J. Lipid Res. 53: 282, 2012に記載されているような化合物2-(2,3-ジヒドロ-1H-インデン-2-イル)-1-ヒドロキシ-3-(ピロリジン-1-イル)プロパン-2-イル)アセトアミド(CCG-203586)またはその類似体。
【０２７１】
いくつかの態様では、小分子リソソーム活性化剤は、非イミノ糖化合物であるか、または非イミノ糖化合物を含む。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：例えばRichards et al., J. Med. Chem. 55: 4322, 2012に記載されているような化合物EXEL-0346またはその類似体。
【０２７２】
いくつかの態様では、小分子リソソーム活性化剤は、非イミノ糖化合物であるか、または非イミノ糖化合物を含む。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：例えばMarugan et al., Med. Chem Commun. 3: 56, 2011に記載されているような化合物ML156またはその類似体。
【０２７３】
いくつかの態様では、小分子リソソーム活性化剤は、非イミノ糖化合物であるか、または非イミノ糖化合物を含む。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：例えばGoldin et al., PLoS ONE 7(1): e29861, 2012に記載されているような化合物MLS000674724、NCGC00182292、NCGC00159568、NCGC00182186、NCGC00182510、またはそれらの類似体。
【０２７４】
いくつかの態様では、小分子リソソーム活性化剤は、非イミノ糖化合物であるか、または非イミノ糖化合物を含む。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：例えばZheng et al., PNAS 104: 32, 2007に記載されているような化合物N-(4-メチル-2-モルホリノキノリン-6-イル)シクロヘキサンカルボキサミド、N-(5-エチル-1,3,4-チアジアゾール-2-イル)-4-(フェニルスルホンアミド)ベンズアミド、および2-(4-(5-クロロ-2-メトキシフェニルアミノ)-6-(ピロリジン-1-イル)-1,3,5-トリアジン-2-イルアミノ)エタノール、またはそれらの類似体。
【０２７５】
いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：例えばHuang et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 17, 2007に記載されているようなN2-(2-ヒドロキシル)エチル-6-(ピロリジン-1-イル)-1,3,5-トリアジン-2,4-ジアミンのN4-フェニル修飾を有する化合物またはその類似体。
【０２７６】
いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：例えばTropak et al., ChemBioChem 9(16): 2650, 2008に記載されているような化合物5-((4-メチルフェニル)チオ)キナゾリン-2,4-ジアミンおよび5-(3,5-ジクロロフェノキシ)-N-(4-ピリジニル)-2-フラミドもしくはそれらの類似体、ならびに/または例えばMarugan et al., J Med. Chem. 54(4): 1033, 2011に記載されているようなキナゾリンコアを有する化合物。
【０２７７】
いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：例えばTropak et al., ChemBioChem 9(16): 2650, 2008に記載されているような化合物5-((4-メチルフェニル)チオ)キナゾリン-2,4-ジアミンおよび5-(3,5-ジクロロフェノキシ)-N-(4-ピリジニル)-2-フラミドまたはそれらの類似体。
【０２７８】
いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：例えば国際公開第2012/061597号に記載されているような式Iもしくは式IIの化合物またはそれらの類似体。
【０２７９】
いくつかの特定の態様では、小分子リソソーム活性化剤は、例えばPatnaik et al., J Med. Chem., 2012および/またはMarugan et al.、国際公開第2012/078855号(これらは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる)に記載されているような置換ピラゾロピリミジンであるか、または置換ピラゾロピリミジンを含む。
【０２８０】
いくつかの態様では、このような小分子リソソーム活性化剤は、式(I)の構造を有する:
2014523881.tif 000018
式(I)
式中、環
2014523881.tif 000019
は、R5が置換されていてもよいビニル基でありかつR6およびR7が下記定義を有する式
2014523881.tif 000020
(i)、またはR5、R6およびR7が下記定義を有する式
2014523881.tif 000021
(ii)の環系であり、
R1は、(単環式または二環式の炭素環)C0-C4アルキルまたは(単環式または二環式の複素環)C0-C4アルキルであり、これらはそれぞれ非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、-CHO、-COOH、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C2-C6アルカノイル、モノ-またはジ-C1-C6アルキルアミノ、モノ-またはジ-C1-C6アルキルカルボキサミド、C1-C6アルキルエステル、C1-C6アルキルチオ、C1-C6アルキルスルホニル、C1-C2ハロアルキル、およびC1-C2ハロアルコキシから独立して選択される1個または複数個の置換基、ならびにY-Z-から選択される0個もしくは1個の置換基で置換されており、ここでZは、共有結合、C1-C4アルキレン、-S-、-O-、-NR-、-C(O)-、-NHC(O)-、または-C(O)NH-であり、ここでRは、水素またはC1-C4アルキルであり、かつYは、フェニルまたはピリジルであり、これらはそれぞれ非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、およびトリフルオロメトキシから独立して選択される1個〜3個の置換基で置換されており;かつR2は、水素、C1-C6アルキル、C3-C7シクロアルキル、(フェニル)C0-C2アルキルであり;または
R1およびR2は一緒になって、N、O、およびSから選択される0個または1個のさらなるヘテロ原子を有する5員〜7員ヘテロシクロアルキル環を形成し、この5員〜7員ヘテロシクロアルキル環は、フェニルまたはピリジルと縮合していてもよく;この5員〜7員ヘテロシクロアルキル環は非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、C1-C2アルキル、およびC1-C2アルコキシから独立して選択される1個または複数個の置換基で置換されており;R3は、水素またはC1-C2アルキルであり;R5は、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、またはフェニルであり;R6は、ハロゲン、ヒドロキシル、C1-C4アルキル、またはC1-C4アルコキシであり;かつR7は、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、ジフルオロメチルまたはトリフルオロメチル、またはフェニルである。特定の態様では、R6が水素であり、R5およびR7が両方ともメチルである場合、またはR6が水素であり、R5およびR7の一方がメチルであり、他方がフェニルである場合、R1は、非置換のフェニル、ジヒドロインデニル、ベンゾ[b][1,4]ジオキソリル、ベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル、シクロヘキシル、ピリジルでもなく、クロロ、フルオロ、C1-C4アルキル、C1-C2アルコキシ、アセチル、トリフルオロメチルから独立して選択される1個または2個の置換基で置換されたフェニルでもなく;かつR6が水素であり、R5およびR7の一方がメチルであり、他方がフェニルである場合、R1は1-(4-フルオロベンジル)-1H-ピラゾール-4-イルではない。
【０２８１】
いくつかの態様では、本発明に従って使用するための小分子リソソーム活性化剤は、式Iの下位式である式IIまたは式IIIの構造を有し、変数、例えばR1〜R7が以下の定義を有する化合物も開示される。
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【０２８２】
式IIIでは、R5aは、水素、C1-C4アルキル、C3-C7シクロアルキルであるか、またはN、S、およびOから独立して選択される1個または2個のヘテロ原子を有する4員〜7員の炭素が結合したヘテロシクロアルキルである。
【０２８３】
式IIIの特定の態様では、R5aは、水素またはシクロプロピルである。
【０２８４】
式Iおよび式IIの特定の態様では、R2は、水素またはメチルであり;かつR5は、C1-C4アルキル、ジフルオロメチル、またはフェニルであり;R7は、C1-C4アルキル、ジフルオロメチル、またはフェニルであり;かつR5およびR7は、両方ともがフェニルであることはない。
【０２８５】
式Iおよび式IIの特定の態様では、R5およびR7は両方ともメチルであるか;またはR5およびR7の一方はメチルであり、他方はフェニルであるか;またはR5およびR7の一方はメチルであり、他方はジフルオロメチルである。
【０２８６】
式I、式IIおよび式IIIの特定の態様では、R1は、(フェニル)C0-C4アルキル、(ピリジル)C0-C4アルキル、(ピリミジニル)C0-C4アルキル、(C3-C7シクロアルキル)C0-C4アルキル、(ピラゾリル)C0-C2アルキル、(ピロリル)C0-C2アルキル、(イミダゾリル)C0-C2アルキル、(チエニル)C0-C2アルキル、(フラニル)C0-C2アルキル、(オキサゾリル(oxazoll))C0-C2アルキル、(チアゾリル)C0-C2アルキル、ピロリジニル、ナフチル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロナフチル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロフラニル、ピペラジニル、モルホリニル、ピペリジニル、チオモルホリニル、ジヒドロインデニル、ベンゾ[b][1,4]ジオキシニル、またはベンゾ[d][1,3]ジオキソリルであり、これらはそれぞれ非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、-CHO、-COOH、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C2-C6アルカノイル、モノまたはジC1-C6アルキルアミノ、モノまたはジC1-C6アルキルカルボキサミド、C1-C6アルキルエステル、C1-C6アルキルチオ、C1-C6アルキルスルホニル、C1-C2ハロアルキル、およびC1-C2ハロアルコキシから独立して選択される1個または複数の置換基、ならびにY-Z-から選択される0個または1個の置換基で置換されており、ここでZは、共有結合、C1-C4アルキレン、-S-、-O-、-NR-、-C(O)-、-NHC(O)-、または-C(O)NH-であり、ここでRは、水素またはC1-C4アルキルであり、かつYは、フェニルまたはピリジルであり、これらはそれぞれ非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、C1-C4アルキル、およびC1-C4アルコキシから独立して選択される1個〜3個の置換基で置換されている。
【０２８７】
式I、式IIおよび式IIIのいくつかの態様では、R1およびR2は一緒になって、N、O、およびSから選択される0個のまたはさらなるヘテロ原子を有する5員〜7員のヘテロシクロアルキル環を形成し、この5員〜7員のヘテロシクロアルキル環は、フェニルまたはピリジルと縮合していてもよく;この5員〜7員のヘテロシクロアルキル環は非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、C1-C2アルキル、およびC1-C2アルコキシから独立して選択される1個または複数個の置換基で置換されている。
【０２８８】
式I、式IIおよび式IIIのいくつかの態様では、R1は、シアノ、トリフルオロメチル、CH3C(O)NH-から選択される少なくとも1個の置換基で置換された(フェニル)C0-C2アルキルであるか、またはR1は、少なくとも1つのトリフルオロメチル、C3-C6アルキルで置換されたシクロヘキシルであるか;またはR1は、ジヒドロインデニル、キノリニル、またはイソキノリニルであり;これらのR1はそれぞれ、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、-CHO、-COOH、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、C2-C4アルカノイル、モノまたはジC1-C4アルキルアミノ、C1-C2ハロアルキル、およびC1-C2ハロアルコキシから独立して選択される1個または複数個の置換基で置換されていてもよい。
【０２８９】
式I、式IIおよび式IIIのいくつかの態様では、R2は、水素またはメチルであり;かつR7は、C1-C4アルキル、ジフルオロメチル、またはフェニルである。いくつかの態様では、R7は、ジフルオロメチルである。
【０２９０】
式I、式IIおよび式IIIのいくつかの態様では、R2は、水素またはメチルであり;かつR7は、メチルまたはジフルオロメチルであり;かつR1は、(フェニル)C0-C2アルキル、(ピリジル)C0-C2アルキル、(シクロヘキシル)C0-C2アルキル、ピラゾリル、フラニルナフチル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロナフチル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロフラニル、モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、チオモルホリニル、ジヒドロインデニル、ベンゾ[b][1,4]ジオキシニル、またはベンゾ[d][1,3]ジオキソリルであり、これらはそれぞれ非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、-CHO、-COOH、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、C2-C4アルカノイル、モノまたはジC1-C4アルキルアミノ、モノまたはジC1-C4アルキルカルボキサミド、C1-C4アルキルエステル、C1-C2アルキルスルホニル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、およびジフルオロメチルから独立して選択される1個または複数個の置換基、ならびにY-Z-から選択される0個または1個の置換基で置換されており、ここでZは、共有結合、C1-C4アルキレン、-S-、-O-、-NR-、-C(O)-、-NHC(O)-、または-C(O)NH-であり、ここでRは、水素またはC1-C4アルキルであり、かつYは、フェニルまたはピリジルであり、これらはそれぞれ非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、C1-C2アルキル、およびC1-C2アルコキシから独立して選択される1個〜3個の置換基で置換されている。
【０２９１】
式Iの化合物は、以下の互変異性体式を有する。
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【０２９２】
いくつかの態様では、式I、式IIおよび/または式IIIの化合物は、約0.1mg〜約140mg/キログラム体重/日(約0.5mg〜約7g/対象/日)の範囲内の用量で用いてもよい。単一投与量を作るために担体物質と組み合わせ得る化合物の量は、処置される患者および特定の投与様式に応じて変化するであろう。単位剤形は、一般に、約1mg〜約500mgの各活性化合物を含有するであろう。いくつかの態様では、25mg〜500mgまたは25mg〜200mgの式Iの小分子リソソーム活性化剤を毎日患者に提供する。投与回数も、使用される小分子リソソーム活性化剤および処置される特定の疾患に応じて変化し得る。しかしながら、ほとんどの疾患、障害、および/または状態の処置では、1日4回以下の投与レジメンを使用でき、特定の態様では、1日1回または2回の投与レジメンを使用する。いくつかの態様では、置換ピラゾロピリミジン化合物は、10ng/kg体重〜約100mg/kg体重の範囲内の用量、1日1回〜1カ月1回の投与回数で用いられる。
【０２９３】
小分子リソソーム活性化剤は、化合物が様々な立体異性体で存在できるように、立体中心、立体軸などの1つまたは複数の非対称要素、例えば非対称炭素原子を含有してもよい。このような化合物は、ラセミ化合物または光学活性体で用いることができる。いくつかの態様では、このような化合物は、立体異性的に純粋な形態として用いることができる。当業者によって認識されているように、光学活性体は、非対称合成、光学的に純粋な前駆体からの合成、またはラセミ化合物の分割によって得ることができる。ラセミ化合物の分割は、例えば、分割剤の存在下における結晶化、または例えばキラルHPLCカラムを使用したクロマトグラフィーなどの通常の方法によっても達成できる。2つまたはそれ以上の非対称要素を有する化合物については、ジアステレオマーの混合物として使用できる。
【０２９４】
当業者であれば、小分子化合物は、様々な異なる形態(例えば、溶媒和物、光学異性体、エナンチオマー型、多形体、遊離化合物および塩)で調製できることが多いことを認識するであろう。任意の適切な形態を本発明に従って用いてもよい。
【０２９５】
当業者であれば、小分子リソソーム活性化剤は、塩の形態で提供してもよいことをさらに認識するであろう。薬学的に許容される塩の例には、アミンなどの塩基性残基の無機酸塩または有機酸塩;カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、薬学的に許容される塩には通常の無毒の塩が含まれ、具体的には、例えば無毒の無機酸または有機酸から形成された親化合物の第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、通常の無毒の酸性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来するもの;および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、メシル酸、エシル酸、ベシル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、HOOC-(CH2)n-COOH(式中、nは0〜4である)などの有機酸から調製した塩が含まれる。さらなる適切な塩のリストは、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., p. 1418(1985)に見出すことができる。
【０２９６】
いくつかの態様では、小分子リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：カルシウムチャンネル遮断剤、例えばジルチアゼムおよび/もしくはベラパミルまたはそれらの類似体。
【０２９７】
いくつかの態様では、小分子リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：RyR阻害剤、例えばダントロレン。
【０２９８】
いくつかの態様では、小分子リソソーム活性化剤は、以下であるか、または以下を含む：抗酸化剤、例えばn-アセチル-システイン。
【０２９９】
いくつかの態様では、リソソームGCase酵素を活性化させる小分子は、本発明によるリソソーム活性化剤として特に有用である。いくつかのこのような態様では、小分子リソソーム活性化剤はアロステリック部位に結合し、リソソームGCase酵素を活性化させる。
【０３００】
2.ポリペプチド剤
いくつかの態様では、本発明に従って使用するためのリソソーム活性化剤は、ポリペプチドであるか、またはポリペプチドを含む。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、抗体またはその断片であるか、またはこれらを含む。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、酵素(例えば、リソソーム酵素)である。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、1つまたは複数のリソソーム酵素のレベルおよび/または活性を調節する(このようなリソソーム酵素の輸送に影響を与えることによるものを含む)ポリペプチドである。
【０３０１】
いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、リソソーム酵素であるポリペプチドおよび/またはリソソーム酵素をコードする核酸であるか、またはこれらを含む。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、その活性がリソソーム酵素基質のレベルを減少させる酵素であるポリペプチドおよび/または前記酵素をコードする核酸であるか、またはこれらを含み;いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、リソソーム酵素であるポリペプチドおよび/またはリソソーム酵素をコードする核酸であるか、またはこれらを含む。当業者であれば、関連酵素の活性を欠くか、または正常個体集団で平均して観察されるレベルと比較して減少したレベルの関連酵素の活性を示す対象に、酵素であるリソソーム活性化剤を提供することは、いくつかの態様では「酵素補充療法」と称してもよいことを認識するであろう。当業者であれば、ポリペプチドをコードする核酸の投与によって、このような投与後にポリペプチドレベルが増加するように、ポリペプチドであるかまたはポリペプチドを含むポリペプチドリソソーム活性化剤を提供することは、「遺伝子治療」と称してもよいことを認識するであろう。
【０３０２】
いくつかの態様では、ポリペプチドリソソーム活性化剤は、Rabポリペプチドであるか、またはRabポリペプチドを含む。Rabポリペプチドは、Ras GTPaseスーパーファミリーの最大ブランチを構成する(Grosshans et al., PNAS 103(32): 11821, 2006)。Rabポリペプチドは、前述のグアニンヌクレオチド依存性スイッチ機構を使用して、膜輸送における4つの主要段階(すなわち、小胞の出芽、小胞の送達、小胞の繋留および小胞膜と標的区画の膜との融合)のそれぞれを調節する。Rabポリペプチドのこれらの異なる働きは、特定のGTP結合型Rabに結合する多様なエフェクター分子の集まりによって調節される。公知のRabエフェクターのいくつかの非限定的な例を表12および表13に列挙する。
【０３０３】
（表１２）酵母RabポリペプチドGTPaseエフェクター
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【０３０４】
（表１３）哺乳類RabポリペプチドGTPaseエフェクター
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【０３０５】
いくつかの特定の態様では、ポリペプチドリソソーム活性化剤は、グアニンヌクレオチド交換因子を含む。グアニンヌクレオチド交換因子のいくつかの非限定的な例は、GEFおよび/またはGAPである。
【０３０６】
Rabポリペプチドも膜の挿入分離サイクルに入るが、これは、部分的にはヌクレオチドサイクルと共役している。膜挿入には、2つのカルボキシル末端システインがイソプレニル脂質(ゲラニルゲラニル)部分で不可逆的に修飾されることが必要である。GDP解離阻害因子(GDI)と称されるタンパク質は、GDP結合型プレニル化Rabポリペプチドに結合して、それらのイソプレニルアンカーをマスクすることにより、Rabポリペプチドを細胞質ゾルに留める。したがって、Rabポリペプチドの膜結合には、GDI置換因子(GDF)の機能が必要である。GDIから解離すると、Rabポリペプチドは、GEF刺激によるGTP結合に利用可能になる。次いで、活性型膜結合型Rabポリペプチドは、それらの特定のエフェクターに結合することによって、膜輸送におけるそれらの種々の機能を果たすことができる。それらの特定のGAPによって不活性化された後、GDP結合型Rabポリペプチドは、GDIによって膜から分離され、再利用されて細胞質ゾルに戻ることができる。
【０３０７】
いくつかの特定の態様では、ポリペプチドリソソーム活性化剤は、GDIおよび/またはGDFを含む。
【０３０８】
いくつかの態様では、ポリペプチドリソソーム活性化剤は、Rabポリペプチドのエフェクターを含む。
【０３０９】
いくつかの特定の態様では、ポリペプチドリソソーム活性化剤は、Rab1aポリペプチドであるか、またはRab1aポリペプチドを含む。
【０３１０】
いくつかの特定の態様では、ポリペプチドリソソーム活性化剤は、種々のスフィンゴ脂質の代謝に関与するリソソーム加水分解酵素を活性化させる。いくつかのこのような態様では、ポリペプチドリソソーム活性化剤は、サポシンポリペプチドであるか、またはサポシンポリペプチドを含む。いくつかのこのような態様では、サポシンポリペプチドは、サポシンCポリペプチドであるか、またはサポシンCポリペプチドを含む。
【０３１１】
3.核酸剤
いくつかの態様では、本発明に従って使用するためのリソソーム活性化剤は、核酸であるか、または核酸を含む。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、RNAおよび/またはDNAであるか、またはRNAおよび/またはDNAを含む。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、RNAi剤(例えば、miRNA、siRNA、shRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム)および/または遺伝子治療ベクターであるか、またはこれらを含む。
【０３１２】
RNA干渉またはRNAiは、少なくとも部分的に二本鎖のRNAであり標的RNAに実質的に相補的な部分を含むRNAによって媒介される、遺伝子発現の配列特異的阻害および/または標的RNAレベルの減少を指す。典型的には、実質的に相補的な部分の少なくとも一部は、RNAの二本鎖領域内にある。いくつかの態様では、RNAiは、RNAの選択的細胞内分解によって起こってもよい。いくつかの態様では、RNAiは、翻訳の抑制によって起こってもよい。
【０３１３】
RNAi剤は、任意で1つまたは複数のヌクレオチド類似体または修飾物を含むRNAであって、RNAi機構によって遺伝子発現の阻害を媒介できる分子に特有の構造を有するRNAを指す。いくつかの態様では、RNAi剤は、標的転写産物の分解を引き起こすことによって遺伝子発現の阻害を媒介する。いくつかの態様では、RNAi剤は、標的転写産物の翻訳を阻害することによって遺伝子発現の阻害を媒介する。一般に、RNAi剤は、標的RNAに実質的に相補的な部分を含む。いくつかの態様では、RNAi剤は、少なくとも部分的に二本鎖である。いくつかの態様では、RNAi剤は、一本鎖である。いくつかの態様では、例示的なRNAi剤には、siRNA、shRNA、および/またはmiRNAが含まれてもよい。いくつかの態様では、RNAi剤は、天然RNAヌクレオチド(すなわち、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル)から完全に構成されてもよい。いくつかの態様では、RNAi剤は、1つまたは複数の非天然RNAヌクレオチド(例えば、ヌクレオチド類似体、DNAヌクレオチドなど)を含んでもよい。非天然RNA核酸残基の含有を用いて、RNAi剤をRNAよりも耐細胞分解性にしてもよい。いくつかの態様では、「RNAi剤」という用語は、RNAi作用(例えば、標的RNAの分解および/または翻訳の阻害)を誘導する任意のRNA、RNA誘導体、および/またはRNAをコードする核酸を指し得る。いくつかの態様では、RNAi剤は、ダイサーの基質として作用できる平滑末端(すなわち、オーバーハングを有しない)dsRNAを含んでもよい。例えば、このようなRNAi剤は、免疫応答を無効化するように化学的に修飾されていてもよい25塩基長以上の平滑末端dsRNAを含んでもよい。
【０３１４】
マイクロRNAまたはmiRNAという用語は、長さが約21〜23ヌクレオチド(nt)であるRNAi剤を指す。miRNAは、長さが18〜26ヌクレオチドの範囲であり得る。典型的には、miRNAは、一本鎖である。しかしながら、いくつかの態様では、miRNAは、少なくとも部分的に二本鎖でもよい。特定の態様では、miRNAは、RNA二重鎖(本明細書において「二重鎖領域」と称される)を含んでもよいし、任意で1つまた2つの一本鎖オーバーハングをさらに含んでもよい。いくつかの態様では、RNAi剤は、長さが15〜29bpの範囲の二重鎖領域であって、かつ任意で1つまたは2つの一本鎖オーバーハングをさらに含む二重鎖領域を含む。miRNAは、互いにハイブリダイズする2つのRNA分子から形成されてもよいし、または代わりに自己ハイブリダイズ部分を含む単一のRNA分子から生成されてもよい。一般に、miRNA分子の遊離5'末端はリン酸基を有し、遊離3'末端はヒドロキシル基を有する。miRNAの二重鎖部分は、必ずではないが通常は、1つまたは複数の非対合ヌクレオチドからなる1つまたは複数のバルジを含む。miRNAの一方の鎖は、標的RNAとハイブリダイズする部分を含む。本発明の特定の態様では、miRNAの一方の鎖は、標的RNAの一領域に正確に相補的ではないが、これは、そのmiRNAが1つまたは複数のミスマッチを伴って標的RNAにハイブリダイズすることを意味する。本発明の他の態様では、miRNAの一方の鎖は、標的RNAの一領域に正確に相補的であるが、これは、そのmiRNAがミスマッチを伴わずに標的RNAにハイブリダイズすることを意味する。典型的には、miRNAは、標的転写産物の翻訳を阻害することによって遺伝子発現の阻害を媒介すると考えられる。しかしながら、いくつかの態様では、miRNAは、標的転写産物の分解を引き起こすことによって遺伝子発現の阻害を媒介してもよい。
【０３１５】
「短鎖干渉RNA」(または「siRNA」)という用語は、長さが約19塩基対(bp)であるRNA二重鎖(本明細書において「二重鎖領域」と称される)であって、かつ任意で1または2つの一本鎖オーバーハングをさらに含むRNA二重鎖を含むRNAi剤を指す。いくつかの態様では、RNAi剤は、長さが15〜29bpの範囲の二重鎖領域であって、かつ任意で1つまたは2つの一本鎖オーバーハングをさらに含む二重鎖領域を含む。siRNAは、互いにハイブリダイズする2つのRNA分子から形成されてもよいし、あるいは自己ハイブリダイズする部分を含む単一のRNA分子から生成されてもよい。一般に、siRNA分子の遊離5'末端はリン酸基を有し、遊離3'末端はヒドロキシル基を有する。siRNAの二重鎖部分は、1つまたは複数の非対合ヌクレオチドからなる1つまたは複数のバルジを含んでもよいが、典型的には含まない。siRNAの一方の鎖は、標的RNAとハイブリダイズする部分を含む。本発明の特定の態様では、siRNAの一方の鎖は、標的RNAの一領域と正確に相補的であるが、これは、そのsiRNAが1つのミスマッチも伴わずに標的RNAにハイブリダイズすることを意味する。本発明の他の態様では、siRNAと標的RNAの標的部分との間に1つまたは複数のミスマッチが存在してもよい。完全相補性が達成されない本発明のいくつかの態様では、一般に、任意のミスマッチがsiRNA末端にまたはsiRNA末端付近に位置する。いくつかの態様では、siRNAは、標的転写産物の分解を引き起こすことによって遺伝子発現の阻害を媒介する。
【０３１６】
「短ヘアピンRNA」(または「shRNA」)という用語は、RNAiを媒介するのに十分な長さ(典型的には、少なくとも約19bpの長さ)の二本鎖(二重鎖)構造を形成するようにハイブリダイズしているかまたはハイブリダイズできる少なくとも2つの相補部分と、長さが典型的には約1〜10ヌクレオチド(nt)の範囲であり、ループを形成する少なくとも1つの一本鎖部分とを有するRNAを含むRNAi剤を指す。いくつかの態様では、shRNAは、長さが15〜29bpの範囲の二重鎖部分と、長さが典型的には約1〜10ntの範囲であり、ループを形成する少なくとも1つの一本鎖部分とを含む。二重鎖部分は、1つまたは複数の非対合ヌクレオチドからなる1つまたは複数のバルジを含んでもよいが、典型的には含まない。いくつかの態様では、siRNAは、標的転写産物の分解を引き起こすことによって遺伝子発現の阻害を媒介する。shRNAは、保存された細胞内RNAi機構によってsiRNAへとプロセシングされると考えられている。したがって、shRNAは、siRNAの前駆体であり得る。それにもかかわらず、siRNAは、一般に、siRNAと同様に、標的RNAの発現を阻害できる。
【０３１７】
リボザイムまたはデオキシリボザイムと称されるある種の核酸分子は、RNA分子の配列特異的切断を触媒することが示されている。切断部位は、RNA酵素またはDNA酵素のヌクレオチドと標的RNAのヌクレオチドとの相補対によって決定される。したがって、任意のRNA分子を切断し、それによって、その分解速度を増加させるように、RNA酵素およびDNA酵素を設計できる(Cotten et al, EMBO J. 8: 3861, 1989; Usman et al., Nucl. Acids Mol. Biol. 10: 243, 1996; Usman, et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 1: 527, 1996; Sun, et al., Pharmacol. Rev., 52: 325, 2000。例えば、Cotten et al, EMBO J. 8: 3861, 1989も参照のこと)。
【０３１８】
いくつかの態様では、本発明に従って使用するための核酸リソソーム活性化剤は、リソソーム酵素をコードするポリペプチドの一部に対応またはハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。いくつかの態様では、本発明に従って使用するための核酸リソソーム活性化剤は、リソソーム酵素またはその調節因子の発現を制御する遺伝子発現調節因子に対する結合部位を含むヌクレオチド配列を有する。
【０３１９】
薬学的組成物
当業者によって認識されているように、リソソーム活性化剤は、典型的には、適切な経路による送達のために製剤化され、および/または治療レジメンで使用するための単一単位用量のリソソーム活性化剤(例えば、特定の生物学的効果または結果と相関するもの)を含む薬学的組成物の一部として、本発明に従って用いられる。
【０３２０】
本発明に従って使用するための薬学的組成物は、目的とする特定の投与様式および/または治療用途のために製剤化してもよい。このような組成物はまた、所望の製剤に応じて、1つまたは複数の薬学的に許容される無毒の担体または希釈剤を含んでもよく、これらは、動物またはヒトへの投与のために薬学的組成物を製剤化するのに一般的に使用されるビヒクルと定義される。典型的には、希釈剤は、組み合わせた物の生物学的活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理的リン酸緩衝食塩水、リンガー液、ブドウ糖溶液、およびハンクス液である。加えて、薬学的組成物または製剤はまた、他の担体、アジュバント、または無毒で非治療的な非免疫原性の安定剤などを含んでもよい。
【０３２１】
いくつかの態様では、本発明に従って使用するための薬学的組成物は、少なくとも1つのリソソーム活性化剤および少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む。このような薬学的組成物は、任意で、1つまたは複数のさらなる治療活性物質を含んでいてもよく、および/または1つまたは複数のさらなる治療活性物質と組み合わせて投与してもよい。いくつかの態様では、提供される薬学的組成物は、医薬において有用である。いくつかの態様では、提供される薬学的組成物は、プロテイノパチーの処置または予防において予防剤として有用である。いくつかの態様では、提供される薬学的組成物は、例えば、PDに罹患している個体の治療用途において有用である。いくつかの態様では、薬学的組成物は、ヒトに投与するために製剤化される。
【０３２２】
本明細書において記載されるように、本発明の薬学的組成物は、以下のものに適合された形態を含む固体または液体の形態で投与するために特別に製剤化してもよい:経口投与、例えば水薬(水性もしくは非水性の溶液または懸濁液)、錠剤、例えば口腔吸収、舌下吸収、および全身吸収を目的とするもの、巨丸剤、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト;非経口投与、例えば皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、または硬膜外注射によるもの、例えば滅菌した溶液もしくは懸濁液または持続放出製剤;局所適用、例えばクリーム、軟膏、もしくは制御放出パッチ、または皮膚、肺、または口腔に適用される噴霧剤;膣内的または直腸内的なもの、例えばペッサリー、クリーム、またはフォーム;舌下;眼;経皮;または鼻腔、肺、および他の粘膜表面。
【０３２３】
本明細書において記載されるリソソーム活性化剤の薬学的に許容される塩には、例えば無毒の有機酸または無機酸からの、化合物の通常の無毒の塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。例えば、このような通常の無毒の塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来するもの;および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イソチオン酸などの有機酸から調製された塩が含まれる。
【０３２４】
特定の態様では、記載されるリソソーム活性化剤は、1つまたは複数の酸性官能基を含有してもよく、したがって、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成できる。これらの塩は、投与ビヒクルまたは剤形の製造プロセスで、またはその遊離酸形態の精製化合物(例えば、小分子リソソーム活性化剤)を、適切な塩基、例えば薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、または重炭酸塩と、アンモニアと、または薬学的に許容される第一級、第二級、または第三級有機アミンと別個に反応させることによって同様にインサイチューで調製できる。代表的なアルカリ塩およびアルカリ土類塩には、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩およびアルミニウム塩などが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる。
【０３２５】
薬学的組成物の特定の態様では、湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料および芳香剤、保存剤および抗酸化剤も存在できる。
【０３２６】
薬学的に許容される抗酸化剤の例には、以下のものが含まれる:アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤;パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤;およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤など。
【０３２７】
本発明に従って使用するための製剤には、経口投与、鼻腔投与、局所投与(頬側および舌下を含む)、直腸投与、膣投与および/または非経口投与に適切なものが含まれる。製剤は、有利には単位剤形で提示してもよいし、薬学の分野において周知の任意の方法によって調製してもよい。
【０３２８】
単一剤形を製造するために担体物質と混合される有効成分の量は、処置される宿主および特定の投与様式に応じて変化し得る。単一剤形を製造するために担体物質と混合できる有効成分の量は、一般に、適切な治療レジメンに従って投与された場合に治療効果を生じるリソソーム活性化剤の量と考えられる。一般に、この量は、薬学的組成物全体の中のある重量パーセントを構成し、組成物中の有効成分は約1％〜約99％、好ましくは約5％〜約70％、最も好ましくは約10％〜約30％の範囲内である。
【０３２９】
特定の態様では、本明細書において記載される製剤は、シクロデキストリン、リポソーム、ミセル形成剤、例えば胆汁酸、およびポリマー担体、例えばポリエステルおよびポリ酸無水物からなる群より選択される賦形剤;ならびに本発明のリソソーム活性化剤を含む。特定の態様では、前述の製剤は、記載される本発明のリソソーム活性化剤を経口で生物学的に利用可能なものにする。
【０３３０】
薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよく、本明細書において使用されるように、前記賦形剤は、特定の所望剤形に適しているような溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散助剤もしくは懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤および滑沢剤などでもよいし、これらを含んでもよい。Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro,(Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)には、薬学的組成物を製剤化するのに使用される種々の賦形剤およびそれを調製するための公知技術が開示されている。任意の通常の賦形剤媒体が、例えば、任意の望ましくない生物学的効果を生じるか、または薬学的組成物の任意の他の成分と有害な形で相互作用することによって、基質またはその誘導体と非適合性である場合を除いて、その使用が本発明の範囲内であることを意図する。
【０３３１】
記載されるリソソーム活性化剤を含む製剤または組成物を調製する方法は、典型的には、本発明のリソソーム活性化剤を、担体と、および任意で1つまたは複数の補助的成分と一緒にする段階を含む。多くの態様では、製剤は、本発明のリソソーム活性化剤を液体担体もしくは微細な固体担体またはその両方と均質かつ緊密に一緒にし、次いで必要な場合には生成物を成形することによって調製してもよい。
【０３３２】
経口投与に適切な本明細書において記載される製剤は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ(芳香付された基剤、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴムを使用する)、粉末、顆粒、あるいは水性または非水性液体の溶液または懸濁液、あるいは水中油型または油中水型の液体エマルジョン、あるいはエリキシルまたはシロップ、あるいはトローチ(ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤を使用)および/または口内洗浄剤などの形態でもよく、それぞれが所定量の本発明のリソソーム活性化剤を有効成分として含有する。本明細書において記載されるリソソーム活性化剤は、さらに巨丸剤、舐剤またはペーストとしても投与できる。
【０３３３】
経口投与用の固体剤形(カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉末、顆粒など)では、有効成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの1つまたは複数の薬学的に許容される担体、および/または以下のいずれかと混合される:デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および/またはサリチル酸などの充填剤または増量剤;例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および/またはアラビアゴムなどの結合剤;グリセロールなどの湿潤剤;寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤;パラフィンなどの溶解遅延剤;第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤;例えば、セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール、および非イオン性界面活性剤などの保水剤;カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤;タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの潤滑剤;ならびに着色剤。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、薬学的組成物はまた、緩衝剤を含んでもよい。同様の種類の固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟質殻ゼラチンカプセルおよび硬質殻ゼラチンカプセルの充填剤として用いてもよい。
【０３３４】
錠剤は、任意で1つまたは複数の補助的成分と一緒に圧縮または成形することによって製造できる。圧縮錠剤は、結合剤(例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えば、グリコール酸デンプンナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム)、表面活性剤または分散剤を使用して調製してもよい。成形錠剤は、粉末状のリソソーム活性化剤の混合物を不活性の液体希釈剤で湿らせる適切な機械で製造してもよい。
【０３３５】
錠剤および他の固体剤形、例えば糖衣錠、カプセル、丸剤および顆粒は、任意で、割線を入れてもよいし、コーティング剤およびシェル剤、例えば腸溶性コーティング剤、および薬学的製剤化の分野において周知の他のコーティング剤を用いて調製してもよい。あるいはまたは加えて、それらは、例えば、所望の放出プロファイルを提供するための様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび/またはミクロスフィアを使用して、その中の有効成分の持続放出または制御放出を提供するように製剤化してもよい。それらは、急速放出のために製剤化(例えば、冷凍乾燥)してもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルタに通してろ過することによって滅菌してもよいし、滅菌水、またはいくつかの他の滅菌注射媒体中に使用直前に溶解させることができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌してもよい。これらの組成物はまた、任意で不透明剤を含有してもよいし、有効成分を胃腸管の特定部分でのみ、または好ましくは前記特定部分で放出する組成物であって、任意で遅らせて放出する組成物でもよい。使用できる包埋組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。有効成分はまた、適切な場合には上記賦形剤の1つまたは複数を有するマイクロカプセル化形態であり得る。
【０３３６】
本発明のリソソーム活性化剤の経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルを含む。有効成分に加えて、液体剤形は、当技術分野において一般的に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油(特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物を含有してもよい。
【０３３７】
不活性希釈剤の他に、経口組成物はまた、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、香料および保存剤を含むことができる。
【０３３８】
懸濁液は、活性リソソーム活性化剤に加えて、懸濁剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカントゴム、ならびにそれらの混合物を含有してもよい。
【０３３９】
直腸投与または膣投与用の製剤は、1つまたは複数の本発明のリソソーム活性化剤を、例えばココアバター、ポリエチレングリコール、坐剤ワックス、またはサリチル酸塩を含む1つまたは複数の適切な非刺激性賦形剤または担体と混合することによって調製され得る坐剤として提示してもよく、これらは室温では固体であるが、体温では液体であるので、直腸腔または膣腔で溶融して活性リソソーム活性化剤を放出するであろう。
【０３４０】
本発明のリソソーム活性化剤の局所投与または経皮投与用の剤形には、粉末、噴霧剤、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が含まれる。活性リソソーム活性化剤は、滅菌条件下において、薬学的に許容される担体、および必要とされ得る任意の保存剤、緩衝剤、または噴射剤と混合してもよい。
【０３４１】
軟膏、ペースト、クリーム、およびゲル組成物は、本発明の活性リソソーム活性化剤に加えて、賦形剤、例えば動物脂肪および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、サリチル酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物を含有してもよい。
【０３４２】
粉末および噴霧組成物は、本発明のリソソーム活性化剤に加えて、賦形剤、例えばラクトース、タルク、サリチル酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物を含有できる。加えて、噴霧剤は、慣例の噴射剤、例えばクロロフルオロ炭化水素ならびに揮発性非置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパンを含有できる。
【０３４３】
経皮パッチは、本発明のリソソーム活性化剤の体への制御送達を提供するという追加利益を有する。化合物を適切な媒体中に溶解または分散させることにより、このような剤形を製造できる。吸収促進剤を使用して、皮膚を通過する本発明のリソソーム活性化剤のフラックスを増加させることもできる。速度制御膜を提供するか、または本発明のリソソーム活性化剤をポリマーマトリックスまたはゲル中に分散させることにより、このようなフラックスの速度を制御できる。
【０３４４】
本発明の薬学的組成物において用いてもよい適切な水性担体または非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)およびこれらの適切な混合物、植物油、例えばオリーブ油、ならびに注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング物質を使用することによって、分散物の場合には必要な粒径を維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持できる。
【０３４５】
このような組成物はまた、アジュバント、例えば保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤を含有してもよい。特定の態様では、1つまたは複数の抗細菌剤および/またはおよび抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることが望ましいかもしれない。あるいはまたは加えて、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが望ましいかもしれない。加えて、注射用の薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらしてもよい。
【０３４６】
いくつかの場合では、薬物の効果を延長させるために、皮下注射または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましいかもしれない。これは、難水溶性を有する結晶物質または非晶物質の液体懸濁液を使用することによって達成してもよい。その結果、薬物の吸収速度はその溶解速度に依存し、今度はこれが結晶サイズおよび結晶形に依存し得る。あるいは、非経口投与薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクル中に溶解または懸濁させることによって達成される。
【０３４７】
注射用デポー形態は、記載されるリソソーム活性化剤をポリラクチド-ポリグリコリドなどの生体分解性ポリマー中に含むマイクロカプセルマトリックスを形成することによって製造される。薬物とポリマーの比、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物の放出速度を制御できる。他の生体分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)が含まれる。デポー注射用製剤は、体組織適合性のリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬物を封入することによっても調製される。
【０３４８】
特定の態様では、記載されるリソソーム活性化剤または薬学的調製物は、経口投与される。他の態様では、記載されるリソソーム活性化剤または薬学的調製物は、静脈内投与される。代替的な投与経路には、舌下投与、筋肉内投与、および経皮投与が含まれる。
【０３４９】
本明細書において記載されるリソソーム活性化剤が医薬としてヒトまたは動物に投与される場合、それ自体を与えることもできるし、薬学的に許容される担体と組み合わせて、例えば0.1％〜99.5％(より好ましくは、0.5％〜90％)の有効成分を含有する薬学的組成物として与えることもできる。
【０３５０】
本明細書において記載される調製物は、経口的、非経口的、局所的、または直腸的に与えてもよい。当然のことながら、それらは、関連投与経路に適切な形態で与えられる。例えば、それらは、錠剤またはカプセルの形態で、注射、吸入、洗眼液、軟膏、坐剤などによって投与される。投与は注射、注入または吸入により;局所投与はローションまたは軟膏により;および直腸投与は坐剤による。経口投与が好ましい。
【０３５１】
このようなリソソーム活性化剤は、経口、鼻腔(例えば、噴霧剤による)、直腸、膣内、非経口、嚢内および局所(例えば、粉末、軟膏または液滴による)、例えば頬側および舌下を含む任意の適切な投与経路によって、治療のためにヒトまたは他の動物に投与してもよい。
【０３５２】
選択される投与経路にかかわらず、適切な水和形態で使用してもよい本明細書において記載されるリソソーム活性化剤および/または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の通常の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。
【０３５３】
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の投与量のレベルは、患者に対して毒性を伴わずに、特定の患者、組成物および投与様式で所望の治療反応を達成するのに有効である有効成分の量が得られるように変化してもよい。
【０３５４】
選択される投与量のレベルは、用いられる本発明の特定のリソソーム活性化剤またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられている特定のリソソーム活性化剤の排出または代謝の速度、処置の継続期間、用いられる特定のリソソーム活性化剤と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および/または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、および過去の病歴、ならびに医療分野において周知であるような要因を含む様々な要因に依存するであろう。
【０３５５】
当技術分野における通常の技能を有する医師または獣医は、必要な薬学的組成物の有効量を容易に決定および処方できる。例えば、医師または獣医は、薬学的組成物において用いられる記載される化合物の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要なものよりも低いレベルで開始し、次いで、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができる。
【０３５６】
いくつかの態様では、1つまたは複数の記載されるリソソーム活性化剤またはその薬学的組成物は、プロテイノパチーの対象に慢性的に提供される。慢性処置は、長期間にわたる任意の形式の反復投与、例えば1カ月間またはそれ以上の月数、1カ月間〜1年間、1年またはそれ以上の年数、またはそれよりも長い間にわたる反復投与を含む。多くの態様では、慢性処置は、1つまたは複数の記載されるリソソーム活性化剤またはその薬学的組成物を患者の生涯にわたって反復投与することを含む。好ましい慢性処置は、定期投与、例えば1日1回またはそれ以上の回数、週1回またはそれ以上の回数、月1回またはそれ以上の回数を含む。一般に、1つまたは複数の記載されるリソソーム活性化剤またはその薬学的組成物の適切な用量、例えば1日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量である1つまたは複数の記載されるリソソーム活性化剤の量であろう。このような有効量は、一般に、上記要因に依存するであろう。一般に、患者に対する本発明のリソソーム活性化剤の用量は、表示されている効果のために使用される場合、約0.0001〜約100mg/kg体重/日の範囲であろう。好ましくは、1日投与量は、化合物0.001〜50mg/kg体重、さらにより好ましくは化合物0.01〜10mg/kg体重の範囲であろう。しかしながら、より低用量またはより高用量を使用できる。いくつかの態様では、対象の生理機能が年齢、疾患の進行、体重、または他の要因により変化するので、対象に投与される用量を修正してもよい。
【０３５７】
所望により、1つまたは複数の記載されるリソソーム活性化剤の有効1日用量は、1日を通して適切な間隔で別個に投与される2個、3個、4個、5個、6個またはそれ以上の分割用量として投与してもよいし、任意で単位剤形で投与してもよい。
【０３５８】
リソソーム活性化剤を単独で投与することが可能であるが、上記のように、記載される化合物を薬学的製剤(組成物)として投与することが好ましい。
【０３５９】
記載されるリソソーム活性化剤は、ヒトまたは獣医の医薬における使用では、他の医薬と同様に、任意の有利な方法で投与するために製剤化してもよい。
【０３６０】
本発明によれば、神経学的な状態または疾患を処置するための記載されるリソソーム活性化剤は、リソソーム活性化剤が血液脳関門(BBB)を通過するのを助ける方法を使用して、製剤化または投与できる。脊椎動物の脳(およびCNS)は、体の任意の他の器官とは異なる独特の毛管系を有する。独特の毛管系は、血液脳関門(BBB)を構成する形態的特徴を有する。血液脳関門は、脳の間質腔を血液から分離する系全体の細胞膜として作用する。
【０３６１】
BBBを構成する脳毛細血管の独特な形態的特徴は、(a)上皮様高抵抗密着結合部(これは、すべての脳毛細血管内皮を文字通り一緒に接合する)、および(b)乏しいピノサイトーシス、または経内皮チャンネル(これは、末梢器官の内皮中に豊富である)である。血液脳関門の独特な特徴により、体内の他の組織に容易にアクセスする親水性の薬物およびペプチドは、脳に侵入できないか、またはそれらの侵入速度および/または脳内蓄積は非常に低い。
【０３６２】
本発明の一局面では、BBBを通過する記載されるリソソーム活性化剤は、プロテイノパチーを処置するのに特に有用である。一態様では、BBBを通過する記載される化合物は、パーキンソン病(PD)を処置するのに特に有用である。したがって、当業者であれば、本発明のリソソーム活性化剤の一部はBBBを容易に通過し得ることを認識するであろう。あるいは、本発明のリソソーム活性化剤は、例えば、それらの親水性を低下させてそれらがより容易にBBBを通過するのを可能にする種々の置換基を付加することによって改変できる。
【０３６３】
そうでなければ血液脳関門を通過しないであろう薬物を脳に導入するために、種々の戦略が開発されている。広く使用されている戦略は、薬物を脳に直接的に送達する侵襲的手法を含む。1つのこのような手法は、カテーテルを血管系に挿入して血液脳関門をバイパスし、薬物を脳に直接的に送達することである。これらの手法は、髄膜偏向を有する脳疾患、例えば脳の白血病障害の処置において使用されている(米国特許第4,902,505号を参照のこと)。
【０３６４】
薬物を脳室に直接的に送達するための侵襲的手法には成功例もあるが、脳深部構造ではなく脳組織の表面領域に薬物を分配するだけかもしれないという点で、それらは限定的なものである。さらに、侵襲的手法は、患者に対して潜在的に有害である。
【０３６５】
血液脳関門を回避する他の方法では、薬物を潜伏化すること(latentiation)、または親水性薬物を脂溶性薬物に転換することを含む薬理学的手法を用いる。潜伏化の方法の大部分は、薬物のヒドロキシル、カルボキシル、および第一級アミン基をブロックして、それをより脂溶性にし、したがって、それがより容易に血液脳関門を通過できるようにすることを含む。
【０３６６】
BBBの薬物透過性を増加させるための別の方法は、血液脳関門を一時的に開いて、親水性薬物の通過を可能にする高浸透圧物質を動脈内注入することを含む。しかしながら、高浸透圧物質は潜在的に毒性であり、血液脳関門を損傷し得る。
【０３６７】
抗体は、本発明の組成物を送達するための別の方法である。例えば、脳毛細血管内皮細胞上に存在するトランスフェリン受容体と反応する抗体を神経薬剤とコンジュゲートして、抗体-神経薬剤コンジュゲートを生産できる(米国特許第5,004,697号を参照のこと)。このような方法は、脳毛細血管内皮細胞上のトランスフェリン受容体に抗体が結合し、神経薬剤が薬学的に活性な形態で血液脳関門を通過して移動する条件下で行われる。脳への抗体の取り込みまたは運搬は、抗体をカチオン化して、約8.0〜11.0の等電点を有するカチオン化抗体を形成することによっても大きく増加させることができる(米国特許第5,527,527号を参照のこと)。
【０３６８】
リガンド-神経薬剤融合タンパク質は、組成物を宿主に送達するのに有用な別の方法である(米国特許第5,977,307号を参照のこと)。リガンドは、脳毛細血管内皮細胞受容体と反応する。この方法は、脳毛細血管内皮細胞上の受容体にリガンドが結合し、神経薬剤が薬学的に活性な形態で血液脳関門を通過して移動する条件下で行われる。いくつかの態様では、リガンド結合特性および神経薬学的特性の両方を有するリガンド-神経薬剤融合タンパク質は、遺伝子工学技術を使用して連続的なタンパク質として生産できる。血液脳関門を通過して送達されるべきタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするDNAに融合されたリガンドをコードするDNAを含む遺伝子構築物を調製できる。リガンドをコードする配列および前記剤をコードする配列は、所望の融合タンパク質の適切な発現に適切な方法で発現ベクターに挿入する。遺伝子融合物は、リガンド部分および神経薬剤部分の両方を含有する連続的なタンパク質分子として発現される。
【０３６９】
血液脳関門の透過性は、血液脳関門アゴニスト、例えばブラジキニン(米国特許第5,112,596号を参照のこと)、または受容体媒介性透過剤(RMP)と称されるポリペプチドを投与することによって増加させることができる(米国特許第5,268,164号を参照のこと)。皮下注射、静脈内注射、もしくは筋肉内注射によって、または消化管、呼吸器系、もしくは皮膚などの体組織を介した吸収によって、外因性分子を宿主の血流に非経口投与できる。分子が投与される形態(例えば、カプセル、錠剤、溶液、エマルジョン)は、少なくとも部分的にはその投与経路に依存する。宿主の血流への外因性分子の投与および血液脳関門透過性アゴニストの静脈内注射は、同時にまたは時間内に連続して行われ得る。例えば、治療薬は、錠剤の形態で経口投与でき、血液脳関門透過性アゴニストの静脈内投与をその後にする(例えば、30分後〜数時間後)。これにより、アゴニストを与える前に胃腸管内で吸収されて血流に取り込まれる時間が薬物に与えられて、血液脳関門の薬物透過性が増加する。一方、血液脳関門透過性アゴニスト(例えば、ブラジキニン)は、薬物の静脈注射の前にまたはそれと同時に投与できる。したがって、「同時投与」という用語は、血液脳関門の透過性を増加させ、外因性分子が血液から中枢神経系の細胞へと最大限通過するのを可能にするという同時効果を生じるための有意な血中濃度を達成すると考えられる時点で、血液脳関門アゴニストおよび外因性分子が投与されることを意味するのに本明細書において使用される。
【０３７０】
いくつかの態様では、記載されるリソソーム活性化剤は、脂肪酸担体(および任意で別の神経活性薬)を有するプロドラッグとして製剤化できる。プロドラッグは胃および血流の両方の環境において安定であり、摂取によって送達してもよい。プロドラッグは、血液脳関門を容易に通過する。プロドラッグは、好ましくは、薬物単独の脳浸透指数の少なくとも2倍の脳浸透指数を有する。中枢神経系中に入ると、好ましくは不活性であるプロドラッグは、脂肪酸担体および記載される化合物またはその類似体(および任意で別の薬物)へと加水分解される。担体は、好ましくは、中枢神経系の通常成分であり、不活性かつ無害である。リソソーム活性化剤および/または薬物は、脂肪酸担体から離れると、活性である。好ましくは、脂肪酸担体は、約16〜26個の炭素原子、より好ましくは20〜24個の炭素原子を有する部分的に飽和した直鎖分子である。脂肪酸担体の例は、米国特許第4,939,174号;米国特許第4,933,324号;米国特許第5,994,932号;米国特許第6,107,499号;米国特許第6,258,836号;および米国特許第6,407,137号に示されている。
【０３７１】
本発明の剤の投与は、予防目的または治療目的のいずれかであり得る。予防的に提供される場合、リソソーム活性化剤は疾患の症候に先だって提供される。剤の予防的投与は、例えば、パーキンソン病(特発性パーキンソン病(PD)を含む)、レビー小体型認知症(DLB)としても公知のびまん性レビー小体病(DLBD)、アルツハイマー病とパーキンソン病との合併症、および多系統萎縮症(MSA)の症候の発症を予防するか、または前記症候の発症速度を減少させるのに役立つ。治療的に提供される場合、リソソーム活性化剤は、実際の疾患の症候の出現開始時に(または僅かに後に)提供される。いくつかの態様では、リソソーム活性化剤の治療的投与は、疾患の重症度および継続期間を減少させるのに役立つ。
【０３７２】
いくつかの態様では、薬学的組成物は、ゆっくりと代謝される大きな高分子、例えばタンパク質、多糖、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー(例えば、ラテックス官能化Sepharose(商標)、アガロース、セルロースなど)、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマーならびに脂質凝集体(例えば、油滴またはリポソーム)を含むことができる。加えて、これらの担体は、免疫賦活剤(すなわち、アジュバント)として機能できる。
【０３７３】
非経口投与の場合、本発明のリソソーム活性化剤は、生理学的に許容される希釈剤に物質を溶解させた溶液または懸濁液の注射投与物として、無菌の液体、例えば水、油、食塩水、グリセロール、またはエタノールでもよい薬学的担体と一緒に投与できる。加えて、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、pH緩衝物質などが組成物中に存在してもよい。薬学的組成物の他の成分は、石油、動物、植物、または合成に由来するもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油および鉱油である。一般に、グリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールは、特に注射液の好ましい液体担体である。抗体は、デポー注射剤または有効成分を持続放出するように製剤化できるインプラント調製物の形態で投与できる。例示的な組成物は、50mM L-ヒスチジン、150mM NaClからなる水性緩衝液であって、HClでpH6.0に調整された水性緩衝液中で製剤化された5mg/mLのモノクローナル抗体を含む。非経口投与用の組成物は、典型的には、実質的に滅菌されており、実質的に等張性であり、FDAまたは類似団体のGMP条件下で製造される。
【０３７４】
典型的には、組成物は、注射液、すなわち液体溶液または懸濁液として調製される;注射前に液体ビヒクル中に溶解または懸濁するのに適切な固体形態も調製できる。調製物はまた、上記のようにアジュバント効果を増強するために乳化することもできるし、リポソームまたは微粒子、例えばポリラクチド、ポリグリコリドまたはコポリマー中に封入することもできる(Langer, Science 249:1527, 1990)およびHanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97, 1997を参照のこと)。本発明のリソソーム活性化剤は、デポー注射剤または有効成分を持続放出または拍動放出(pulsatile release)するように製剤化できるインプラント調製物の形態で投与できる。
【０３７５】
他の投与様式に適切なさらなる製剤には、経口製剤、鼻腔内製剤および肺製剤、坐剤および経皮適用が含まれる。坐剤の場合、結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含む;このような坐剤は、0.5％〜10％、好ましくは1％〜2％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成できる。経口製剤には、賦形剤、例えば薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムが含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤、または粉末の形態をとり、10％〜95％、好ましくは25％〜70％の有効成分を含有する。
【０３７６】
局所適用によって経皮送達または皮内送達できる。局所投与は、リソソーム活性化剤を、コレラ毒素またはその無毒化した誘導体もしくはサブユニット、または他の類似の細菌毒素と同時投与することによって容易にすることができる(Glenn et al., Nature 391:851, 1998を参照のこと)。同時投与は、混合物として、または化学的架橋によってもしくは融合タンパク質としての発現によって得られた連結分子として成分を使用することによって達成できる。あるいは、経皮送達は、皮膚パッチを使用して、またはトランスフェロソーム(transferosome)を使用して達成できる(Paul et al., Eur. J. Immunol. 25: 3521, 1995; Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201, 1998)。
【０３７７】
いくつかの態様では、薬学的組成物は、冷蔵および/または凍結できる形態で提供される。いくつかの態様では、薬学的組成物は、冷蔵および/または凍結できない形態で提供される。いくつかの態様では、再構成溶液および/または液体剤形は、再構成後に一定期間(例えば、2時間、12時間、24時間、2日間、5日間、7日間、10日間、2週間、1カ月間、2カ月間またはそれ以上)にわたって保管してもよい。
【０３７８】
液体剤形および/または再構成溶液は、投与前に粒子状物質および/または変色剤を含んでもよい。いくつかの態様では、変色もしくは混濁している場合、および/またはろ過後に粒子状物質が残っている場合には、溶液を使用するべきではない。
【０３７９】
いくつかの態様では、本発明の組成物は、定量の組成物を送達するデバイスを使用して投与される。
【０３８０】
本明細書において記載される皮内薬学的組成物の送達で使用するのに適切なデバイスには、短いニードルデバイス、例えば米国特許第4,886,499号、米国特許第5,190,521号、米国特許第5,328,483号、米国特許第5,527,288号、米国特許第4,270,537号、米国特許第5,015,235号、米国特許第5,141,496号、米国特許第5,417,662号に記載されているものが含まれる。皮内組成物はまた、ニードルが皮膚に侵入するのに有効な長さを制限するデバイス、例えば国際公開第99/34850号(これは、参照により本明細書に組み入れられる)に記載されているものおよびその機能的等価物によって投与してもよい。また、液体ジェット注射器を介して、または角質層に穴を開け、真皮に達するジェットを生じるニードルを介して真皮に液体組成物を送達するジェット注射デバイスも適切である。ジェット注射デバイスは、例えば、米国特許第5,480,381号、米国特許第5,599,302号、米国特許第5,334,144号、米国特許第5,993,412号、米国特許第5,649,912号、米国特許第5,569,189号、米国特許第5,704,911号、米国特許第5,383,851号、米国特許第5,893,397号、米国特許第5,466,220号、米国特許第5,339,163号、米国特許第5,312,335号、米国特許第5,503,627号、米国特許第5,064,413号、米国特許第5,520,639号、米国特許第4,596,556号、米国特許第4,790,824号、米国特許第4,941,880号、米国特許第4,940,460号、国際公開第97/37705号および国際公開第97/13537号に記載されている。また、皮膚の外層から真皮まで粉末形態で組成物を加速させる圧縮ガスを使用する弾道粉末/粒子送達デバイスも適切である。加えて、通常のシリンジは、皮内投与の古典的なマントー法(mantoux method)で使用してもよい。
【０３８１】
本発明による薬学的組成物は、関連活性薬剤および/または送達経路にとって適切な製剤化および/または形式で提供される。特定のクラスの剤についての確立された形式および製剤化は、当技術分野において公知である。
【０３８２】
例えば、核酸剤(例えば、遺伝子治療剤、RNAi剤など)は、核酸ベクターシステムおよび/またはカチオン性ポリマー;アルギニンリッチペプチド、ヒスチジンリッチペプチドおよびカチオン性脂質および中性脂質を含む種々のペプチド分子トランスポーター;種々の非カチオン性ポリマー;リポソーム;炭水化物;ならびに界面活性物質中に、またはこれらと一緒に提供してもよい(例えば、米国特許出願公開第2002/0150626号および米国特許出願公開第2004/242518号;ならびに米国特許第5,574,142号、米国特許第5,925,628号、米国特許第6,383,814号、米国特許第6,410,517号、米国特許第7,101,995号および米国特許第7,109,173号を参照のこと)。
【０３８３】
本明細書において使用される「ベクター」は、細胞内への第2の核酸分子の侵入(例えば、導入、運搬など)を媒介できる核酸分子を指す。導入される核酸は、一般に、ベクター核酸分子に連結(例えば、挿入)される。ベクターは、自律複製を指示する配列を含んでもよいし、細胞DNAへの一体化を可能にするのに十分な配列を含んでもよい。有用なベクターには、例えば、プラスミド(典型的には、DNA分子であるが、RNAプラスミドが公知である)、コスミドおよびウイルスベクターが含まれる。当技術分野において周知であるように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には核酸分子の導入もしくは一体化を容易にするウイルス由来の核酸要素を含む核酸分子(例えば、プラスミド)(例には、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターが含まれる)または核酸導入を媒介するウイルスもしくはウイルス粒子(例には、レトロウイルスもしくはレンチウイルスが含まれる)のいずれかを指す。当業者に明らかであるように、ウイルスベクターには、核酸に加えて、種々のウイルス成分が含まれてもよい。
【０３８４】
「RNAi誘導ベクター」は、それが細胞内に存在することにより、自己ハイブリダイズまたは互いにハイブリダイズして、RNAi剤(例えば、siRNA、shRNAおよび/またはmiRNA)を形成する1つまたは複数のRNAの生産がもたらされるベクターを指し、これを使用してRNAiを誘導できる。本発明の種々の態様では、この用語は、それが細胞内に存在することにより、自己ハイブリダイズまたは互いにハイブリダイズして、RNAi剤を形成する1つまたは複数のRNAの生産がもたらされるプラスミド、例えばDNAベクター(この配列は、ウイルスに由来する配列要素を含んでもよい)またはウイルス(人間の手によって修飾されていない天然に存在するウイルスまたはプラスミド以外のもの)を包含する。一般に、ベクターは、ハイブリダイズまたは自己ハイブリダイズして、RNAi剤を形成する1つまたは複数のRNAが、ベクターが細胞内に存在する場合に転写されるように、発現シグナルに機能的に連結された核酸を含む。したがって、ベクターは、1つまたは複数のRNAまたはその前駆体の細胞内合成のための鋳型を提供する。RNAiを誘導する目的では、(例えば、ウイルスエンベロープと細胞膜との融合後に)ウイルスゲノムが細胞内に存在することが、細胞内のウイルスの存在を構成するのに十分であると考えられる。加えて、RNAiを誘導する目的では、ベクターは、細胞に導入されるか、細胞に侵入するか、または親細胞から遺伝される場合、それが細胞内で続いて修飾またはプロセシングされるかにかかわらず、細胞内に存在すると考えられる。RNAi誘導ベクターは、ベクターが細胞内に存在することにより、互いにハイブリダイズまたは自己ハイブリダイズして、転写産物に標的化されるRNAi剤を形成する1つまたは複数のRNAの生産がもたらされる場合、すなわち、ベクターが細胞内に存在することにより、転写産物に標的化される1つまたは複数のRNAi剤の生産がもたらされる場合、転写産物に標的化されると考えられる。
【０３８５】
いくつかの態様では、本発明に従って(例えば、併用療法において)使用するための薬学的組成物は、ワクチン組成物を含んでもよい。ワクチン組成物は、典型的には、1つまたは複数の抗原および1つまたは複数のアジュバントを含む。
【０３８６】
併用療法
いくつかの態様では、併用療法は、2つまたはそれ以上のリソソーム活性化剤の投与を含む。
【０３８７】
いくつかの態様では、本発明は、例えば、プロテイノパチーを処置し、ならびに/または関連プロテイノパチーのおよび/もしくはその1つもしくは複数の処置の1つもしくは複数の副作用を軽減するのに現在使用されている薬物を含む1つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて、少なくとも1つのリソソーム活性化剤を用いる。
【０３８８】
いくつかの態様では、リソソーム活性化剤およびさらなる治療剤は、単一の薬学的組成物の状態で一緒に投与され;いくつかの態様では、リソソーム活性化剤およびさらなる治療剤は、別個の薬学的組成物の状態で投与される。いくつかの態様では、1つまたは複数の個別用量のリソソーム活性化剤および他の治療剤は、一緒に投与され;いくつかの態様では、リソソーム活性化剤および他の治療剤は、異なる治療レジメンに従って投与される。
【０３８９】
いくつかの態様では、1つまたは複数の個別用量のリソソーム活性化剤および/または他の治療剤は、2つの剤が組み合わせて使用される場合に、いくつかの治療効果と相関する参照治療レジメンにおいていずれかが単独で使用される場合よりも量および/または回数が少ない。典型的には、リソソーム活性化剤および/または別の治療剤は、(関連する剤として一つが存在する場合には)このような参照治療レジメンで用いられるものの50〜100％の範囲内の用量および/または曝露で、本発明に従って使用されるであろう。
【０３９０】
本明細書において使用される「組み合わせ」、「組み合わせた」という用語、および関連する用語は、本発明による治療剤の同時投与または連続投与を指す。
【０３９１】
2つまたはそれ以上の剤は、患者または個体が両方の剤に同時に曝露される場合、典型的には「組み合わせて」投与されると考えられる。多くの態様では、患者または個体が、特定の標的組織または試料(例えば、脳、血清など)中に、剤の治療上関連するレベルを同時に示す場合、2つまたはそれ以上の剤は、典型的には「組み合わせて」投与されると考えられる。
【０３９２】
少数だが非限定的な例を挙げれば、関心対象のプロテイノパチーがPDである場合、本発明に従って併用療法において使用するのに適切な剤には、例えば、レボドパ、カルビドパ、アマンチジン(amantidine)(SYMMETREL(登録商標))、抗コリン作用薬(トリヘキシフェニジル、メタンスルホン酸ベンズトロピン、プロシクリジン、アーテン、コゲンチン)、COMT(カテコール-O-メチルトランスフェラーゼ)、MAOI(モノアミン酸化酵素阻害剤)、末梢デカルボキシラーゼ阻害剤、ドーパミン受容体アゴニスト、例えばブロモクリプチジン(bromocriptidine)(パーロデル)、ペルゴリド(ペルマックス)、ロピニロール(レキップ)、プラミペキソール(ミラペックス)、およびエルゴリドが含まれる。
【０３９３】
関心対象のプロテイノパチーがDLBDである場合、本発明に従って併用療法において使用するのに適切な剤には、例えば、レボドパ、D2-受容体アンタゴニスト、コリンエステラーゼ阻害剤が含まれる。
【０３９４】
関心対象のプロテイノパチーがニーマン・ピック病C型である場合、本発明に従って併用療法において使用するのに適切な剤には、例えば、アロプレグナノロン、低コレステロールの食事、またはコレステロール降下薬、例えばスタチン(例えば、LIPITOR;ある種のLDLレベルを減少させ、および/またはある種の集団における脳卒中のリスクを減少させるために承認されており、10〜80mg/日の範囲内の用量で投与されるべきものであり、推奨開始用量は、大幅なLDL-C減少(＞45％)が必要である場合には1日1回10mgもしくは20mgまたは1日1回40mgであるか、または乳児対象の場合には1日1回10mgである)、フィブラート、例えばフェノフィブラート(LIPIDIL)、ナイアシン、エゼチミブ(ZETIA)、および/または結合樹脂、例えばコレスチラミン(QUESTRAN)が含まれる。
【０３９５】
いくつかの態様では、記載される化合物および製剤は、以下のパーキンソン病の1つまたは複数の処置と組み合わせて投与してもよい：例えばACR-343、ロチゴチン(Schwarz)、ロチゴチンパッチ(UCB)、アポモルヒネ(Amarin)、アポモルヒネ(Archimedes)、AZD-3241(Astra Zeneca)、クレアチン(Avicena)、AV-201(Avigen)、リスリド(Axxonis/Biovail)、ネビカポン(BIAL Group)、アポモルヒネ(Mylan)、CERE-120(Ceregene)、メレボドパ＋カルビドパ(Cita Neuropharmaceuticals)、ピクロゾタン(Daiichi)、GM1ガングリオシド(Fidia Farmaceutici)、アルトロパン(Harvard University)、フルオラテック(Fluoratec)(Harvard University)、フィパメゾール(Juvantia Pharma)、イストラデフィリン(Kyowa Hakko Kogyo)、GPI-1485(MGI GP)、Neu-120(Neurim Pharmaceuticals)、NGN-9076(NeuroGeneration Inc)、NLX-P101(Neurologix)、AFQ-056(Novartis)、アルンド酸(Ono/Merck & Co)、COMT阻害剤(Orion)、プロサビン(ProSavin)(Oxford Biomedica)、サフィナミド(Pharmacia & Upjohn)、PYM-50028(Phytopharm)、PTX-200(Phytix)、123I-イオメトパン(Research Triangle Institute)、SYN-115(Roche Holding)、プレラデナント(preladenant)(Schering Plough)、ST-1535(Sigma-Tau Ind. Farm)、ロピニロール(SmithKline Beecham)、パルドプルノックス(pardoprunox)(Solvay)、SPN-803(Supernus Pharmaceuticals)、ニチシノン(Syngenta)、TAK-065(Takeda)、細胞治療(Titan Pharmaceuticals)、PD遺伝子治療(University of Auckland/Weill Medical College)、18F-AV-133(University of Michigan)、ミトキノン/ミトキノールレドックス混合物(mitoquinone/mitoquinol redox mixture)(Antipodean Pharmaceuticals)、99m-Tc-トロパンチオール(99m-Tc-tropantiol)(University of Pennsylvania)、アポモルヒネ(Vectura)、BIIB-014(Vernalis Group)、アプリドア(aplindore)(Wyeth)、およびXP-21279(XenoPort Inc)、ABT-126(Abbott Laboratories)、ポザニクリン(Abbott Laboratories)、MABT-5102A(AC Immune)、Affitope AD-01(AFFiRiS GmbH)、Affitope AD-02(AFFiRiS GmbH)、ダブネチド(davunetide)(Allon Therapeutics Inc)、ニルバジピン誘導体(Archer Pharmaceuticals)、アナプソス(ASAC Pharmaceutical International AIE)、ASP-2535(Astellas Pharma Inc)、ASP-2905(Astellas Pharma Inc)、11C-AZD-2184(AstraZeneca plc)、11C-AZD-2995(AstraZeneca plc)、18F-AZD-4694(AstraZeneca plc)、AV-965(Avera Pharmaceuticals Inc)、AVN-101(Avineuro Pharmaceuticals Inc)、免疫グロブリン静注(Baxter International Inc)、EVP-6124(Bayer AG)、ニモジピン(Bayer AG)、BMS-708163(Bristol-Myers Squibb Co)、CERE-110(Ceregene Inc)、CLL-502(CLL Pharma)、CAD-106(Cytos Biotechnology AG)、ミモペジル(mimopezil)((Debiopharm SA)、DCB-AD1(Development Centre for Biotechnology)、EGb-761((Dr Willmar Schwabe GmbH & Co)、E-2012(Eisai Co Ltd)、ACC-001(Elan Corp plc)、バピネオズマブ(Elan Corp plc)、ELND-006(Elan Pharmaceuticals Inc)、アトモキセチン(Eli Lilly & Co)、LY-2811376(Eli Lilly & Co)、LY-451395(Eli Lilly & Co)、m266(Eli Lilly & Co)、セマガセスタット(Eli Lilly & Co)、ソラネズマブ(Eli Lilly & Co)、AZD-103(Ellipsis Neurotherapeutics Inc)、FGLL(ENKAM Pharmaceuticals A/S)、EHT-0202(ExonHit Therapeutics SA)、セレコキシブ(GD Searle & Co)、GSK-933776A(GlaxoSmithKline)、ロシグリタゾンXR(GlaxoSmithKline plc)、SB-742457(GlaxoSmithKline)、R-1578(Hoffmann-La Roche AG)、HF-0220(Hunter-Fleming Ltd)、オキシラセタム(ISF Societa Per Azioni)、KD-501(Kwang Dong Pharmaceutical Co Ltd)、NGX-267(Life Science Research Israel)、フペルジンA(Mayo Foundation)、ディメボン(Medivation Inc)、MEM-1414(Memory Pharmaceuticals Corp)、MEM-3454(Memory Pharmaceuticals Corp)、MEM-63908(Memory Pharmaceuticals Corp)、MK-0249(Merck & Co Inc)、MK-0752(Merck & Co Inc)、シンバスタチン(Merck & Co Inc)、V-950(Merck & Co Inc)、メマンチン(Merz & Co GmbH)、ネラメキサン(Merz & Co GmbH)、エパデール(Mochida Pharmaceutical Co Ltd)、123I-MNI-330(Molecular Neuroimaging Llc)、ガンテネルマブ(MorphoSys AG)、NIC5-15(Mount Sinai School of Medicine)、フペルジンA(Neuro-Hitech Inc)、OXIGON(New York University)、NP-12(Noscira SA)、NP-61(Noscira SA)、リバスチグミン(Novartis AG)、ECT-AD(NsGene A/S)、アルンド酸(Ono Pharmaceutical Co Ltd)、PF-3084014(Pfizer Inc)、PF-3654746(Pfizer Inc)、RQ-00000009(Pfizer Inc)、PYM-50028(Phytopharm plc)、Gero-46(PN Gerolymatos SA)、PBT-2(Prana Biotechnology Ltd)、PRX-03140(Predix Pharmaceuticals Inc)、エクセブリル-1(Exebryl-1)(ProteoTech Inc)、PF-4360365(Rinat Neuroscience Corp)、HuCAL抗βアミロイドロイドモノクローナル抗体(Roche AG)、EVT-302(Roche Holding AG)、ニルバジピン(Roskamp Institute)、ガランタミン(Sanochemia Pharmazeutika AG)、SAR-110894(sanofi-aventis)、INM-176(Scigenic & Scigen Harvest)、ミモペジル(mimopezil)(Shanghai Institute of Materia Medica of the Chinese Academy of Sciences)、NEBO-178(Stegram Pharmaceuticals)、SUVN-502(Suven Life Sciences)、TAK-065(Takeda Pharmaceutical)、イスプロニクリン(Targacept Inc)、ラサギリン(Teva Pharmaceutical Industries)、T-817MA(Toyama Chemical)、PF-4494700(TransTech Pharma Inc)、CX-717(University of California)、18F-FDDNP(University of California Los Angeles)、GTS-21(University of Florida)、18F-AV-133(University of Michigan)、18F-AV-45(University of Michigan)、テトラチオモリブデート(University of Michigan)、123I-IMPY(University of Pennsylvania)、18F-AV-1/ZK(University of Pennsylvania)、11C-6-Me-BTA-1(University of Pittsburgh)、18F-6-OH-BTA-1(University of Pittsburgh)、MCD-386(University of Toledo)、酢酸リュープロリドインプラント(Voyager Pharmaceutical Corp)、アレプラシニン(aleplasinin)(Wyeth)、ベガセスタット(begacestat)(Wyeth)、GSI-136(Wyeth)、NSA-789(Wyeth)、SAM-531(Wyeth)、CTS-21166(Zapaq)およびZSET-1446(Zenyaku Kogyo)。
【０３９６】
いくつかの態様では、記載される組成物および製剤は、アルツハイマー病の1つまたは複数の処置、例えばARICEPTおよびEXCELONと組み合わせて投与してもよい。
【０３９７】
いくつかの態様では、記載される組成物および製剤は、運動神経障害のための1つまたは複数の処置、例えばAEOL-10150(Aeolus Pharmaceuticals Inc)、リルゾール(Aventis Pharma AG)、ALS-08(Avicena Group Inc)、クレアチン(Avicena Group Inc)、アリモクロモル(Biorex Research and Development Co)、メコバラミン(Eisai Co Ltd)、タランパネル(Eli Lilly & Co)、R-7010(F Hoffmann-La Roche Ltd)、エダラボン(Mitsubishi-Tokyo Pharmaceuticals Inc)、アルンド酸(Ono Pharmaceutical Co Ltd)、PYM-50018(Phytopharm plc)、RPI-MN(ReceptoPharm Inc)、SB-509(Sangamo BioSciences Inc)、オレソキシム(olesoxime)(Trophos SA)、フェニル酪酸ナトリウム(Ucyclyd Pharma Inc)、およびR-プラミペキソール(University of Virginia)と組み合わせて投与してもよい。
【０３９８】
いくつかの態様では、記載される組成物および製剤は、律速剤を含む1つまたは複数のカルシウムチャンネル遮断剤、例えばベラパミルおよびジルチアゼム(dilitiazem)、ならびにジヒドロピリジンカルシウムチャンネル遮断剤群(Meredith et al., J of Hypertension 22: 1641, 2004)と組み合わせて投与してもよい。カルシウムチャンネル遮断剤の他の例は、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニグルジピン、ニルジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニバルジピン、リヨシジン、アニパミル、フェンジリン、フルナリジン、ガロパミル、ミベフラジル、プレニラミン、チアパミル、マレイン酸ペルヘキシリン、フェンジリンおよびプレニラミン、ならびにそれらのいずれかの塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは他の誘導体である。
【０３９９】
いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、1つまたは複数のL型Ca2＋チャンネル遮断剤と組み合わせて、PD、ならびにリソソーム蓄積疾患以外の神経変性疾患、障害、および/または状態を処置するのに本明細書において使用される。
【０４００】
いくつかの態様では、記載される組成物および製剤は、1つまたは複数のRyRの1つまたは複数の阻害剤と組み合わせて投与してもよく、例えば、アンチセンス核酸を投与することによって、またはsiRNAもしくはshRNAを使用することによって、受容体アンタゴニストを投与すること、および受容体の発現を阻害することが含まれる。例示的なRyR受容体アンタゴニストは、ダントロレン、リアノジン、アズモレン、カルケストリン(calquestrin)およびプロカインである。
【０４０１】
いくつかの態様では、リソソーム活性化剤は、特定の疾患、障害、および/または状態を処置するのに過去に使用された1つまたは複数の剤と組み合わせて、特定の疾患、障害、および/または状態を処置するのに本明細書において使用される。いくつかのこのような態様では、リソソーム活性化剤は、特定の疾患、障害、および/または状態を処置するために承認されている1つまたは複数の剤と組み合わせて、特定の疾患、障害、および/または状態を処置するのに本明細書において使用される。
【０４０２】
いくつかの態様では、本発明の方法は、1つまたは複数の外科的治療と組み合わせて用いることができる。例えば、外科的処置は、現在、PDの医療管理に失敗したものに対して推奨されている。片側の視床切開術を、振戦を減少させるのに使用できる。それは、薬物療法に反応しない片側の振戦を有する患者について検討される場合もある。典型的には、両側性の術式は、PDの処置に勧められていない。振戦のための視床の片側の深部脳の刺激も、さらに振戦のために有利である。片側の淡蒼球切開術は、薬物誘導性の対側性運動機能障害を減少させるのに有効な技術である。視床切開または淡蒼球切開術のガンマナイフ手術は、通常の手術に対する放射線医学的な代替法として実施できる。しかしながら、現時点のPDの好ましい神経外科的介入は、両側性の視床下核の刺激である。神経移植戦略は、依然として実験的なものである。手術および薬物療法に加えて、パーキンソニズムにおける理学療法は、筋緊張、柔軟性を維持し、姿勢および歩様を改善する。
【０４０３】
関心対象のプロテイノパチーが炎症性疾患、障害、および/または状態である場合、本発明に従って併用療法において使用するのに適切な剤には、例えば、抗炎症剤、免疫調節薬、免疫抑制剤およびそれらの組み合わせが含まれる。抗炎症剤の非限定的な例には、ステロイド、非ステロイド系抗炎症剤(NSAIDS)(例えば、サリチル酸塩、フェノプロフェン、ナプロキセン、ピロキシカム、トルメチン、インドメタシン、スリンダク、メクロフェナム酸塩など)、および疾患修飾性抗リウマチ薬(DMARDS)(例えば、D-ペニシラミン、金塩、ヒドロキシクロロキン、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミドなど)が含まれる。
【０４０４】
いくつかの態様では、本発明の方法は、GCaseポリペプチドの基質阻害剤と組み合わせて使用できる。例を挙げれば、シヌクレイノパチーの処置については、GCaseポリペプチドのこのような基質阻害剤は、N-ブチル-デオキシノジリマイシン(ZAVESCA)である。
【０４０５】
治療に対する応答の測定
特定のプロテイノパチー疾患、障害、および/または状態を有する対象は、特徴的な症候を示す。例えば、パーキンソン病の患者は、振戦、硬直、運動緩徐、および姿勢のアンバランスを経験する。レビー小体型認知症の患者は、精神的退化、例えば記憶障害および単純作業の実行不能に加えて、強い精神病性症候(幻視)を経験する。リソソーム活性化剤療法による症候の観察可能な改善、または疾患を発症するリスクがある患者におけるある種の症候の開始遅延、または疾患の進行の遅延は、治療に対する有利な応答の証拠と考えられる。
【０４０６】
あるいはまたは加えて、測定可能な代理マーカーも、リソソーム活性化剤療法に対する応答を評価するために有用であり得る。例えば、何人かの研究者は、より高レベルのα-シヌクレインまたはオリゴマー型α-シヌクレインがパーキンソン病者の血漿中で検出されたことを報告したが(Lee et al., J Neural Transm. 113(10): 1435, 2006; El-Agnaf et al., FASEB J. 20: 419, 2006)、何人かは、正常対照と比較してパーキンソン病者において血漿α-シヌクレインが減少したことを報告した(Li et al., Exp Neurol. 204(2):583, 2007)。
【０４０７】
本発明のいくつかの態様では、パーキンソン病者のドーパミンニューロンにおけるα-シヌクレインについてのリソソーム分解能力またはモニタリングレベルは、リソソーム活性化剤治療に対する応答を決定するまたは特徴付けるためのマーカーとして使用してもよい。
【０４０８】
リソソーム活性化剤を同定するおよび/または特徴付けるためのアッセイ
とりわけ、本発明は、リソソーム活性化剤を同定するおよび/または特徴付けるためのシステムを提供する。本明細書において述べるように、いくつかの態様では、本発明に従って使用するのに特に有用なリソソーム活性化剤は、1つまたは複数のリソソーム酵素の安定性および/または輸送を増加させるものである。
【０４０９】
いくつかの態様では、本発明に従って使用するのに特に有用なリソソーム活性化剤は、神経細胞および/または非神経細胞における1つまたは複数のリソソーム酵素の安定性および/または輸送を増加させるものである。
【０４１０】
いくつかの態様では、本発明に従って使用するのに特に有用なリソソーム活性化剤は、標的リソソーム酵素に直接結合するものである。
【０４１１】
いくつかの態様では、本発明に従って使用するのに特に有用なリソソーム活性化剤は、それらの標的リソソーム活性化酵素の活性を顕著に阻害するものではない。
【０４１２】
いくつかの態様では、本発明に従って使用するのに特に有用なリソソーム活性化剤は、野生型リソソーム酵素のレベルおよび/または活性を増加させるものである。
【０４１３】
本発明は、このような剤を同定するおよび/または特徴付けるためのシステムを提供する。いくつかの態様では、本発明は、参照リソソーム活性化剤と比較して、関心対象のリソソーム活性化剤の等価用量を同定するおよび/または特徴付けるためのシステムを提供する。
【０４１４】
リソソーム活性化剤を同定するおよび/または特徴付けるために、および/またはそうでなければリソソーム活性を評価するために、本発明に従って様々なアッセイを用いることができる。例えば、特にリソソーム酵素および/またはタンパク質(例えば、リソソーム酵素)のリソソームへのタンパク質輸送をモニタリングするアッセイを用いてもよい。あるいはまたは加えて、(例えば、プロテイノパチーで観察される)タンパク質の蓄積をモニタリングするアッセイを用いることができる;いくつかの態様では、このようなアッセイは、リソソーム活性の、および/または1つもしくは複数の潜在的なもしくは公知のリソソーム活性化剤の効果の間接的な読取手段として用いられる。
【０４１５】
少数だが特定の例を挙げれば、いくつかの態様では、小胞体(ER)におけるタンパク質の蓄積は、BiPなどの小胞体(ER)タンパク質と共局在する管状小胞プロファイルにおける核周囲の局在を検出する技術を使用して検出および/または可視化できる。これらのタンパク質はまた、それらの本来の細胞内位置では、例えば細胞表面または別の細胞内区画、例えばリソソームでは、減少しているかまたは存在していない。細胞質におけるタンパク質の蓄積は、同様に細胞質タンパク質との共局在化法を使用して検出できる。
【０４１６】
(例えば、リソソーム酵素の)タンパク質輸送を検出および/または分析するための例示的な方法には、例えば、ゴルジ体においてN-およびO-グリコシル化されるタンパク質の(例えば、放射性標識またはそうでなければ検出可能な標識を使用する)パルスチェイス代謝標識を、例えば、グリコシダーゼ処理および免疫沈降と組み合わせて、タンパク質がゴルジにおいて完全なグリコシル化を受けているか、またはさらなるグリコシル化によりそれらがゴルジに輸送されずに小胞体(ER)中に保持されているかを評価することが含まれる。
【０４１７】
タンパク質の細胞内局在を視覚的に検出するための高感度法には、(例えば、蛍光タンパク質および/または蛍光抗体を使用する)蛍光顕微鏡法も含まれる。このような手法において使用するのに適切な蛍光部分には、例えば、(例えば、タンパク質と融合させて検出できる)ポリペプチド部分が含まれ、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および/または赤色蛍光タンパク質の適切な部分が含まれ;小分子または他の検出可能な蛍光マーカー(例えば、色素、量子ドットなど)を用いることもできる。いくつかの態様では、(例えば、リソソームと、リソソームへのそのターゲティングが評価される関心対象タンパク質との両方の)二重標識研究は、共局在研究に特に有用である。タンパク質輸送における蛍光イメージングの使用の概説については、Watson et al., Adv Drug Deliv Rev. 57(1):43, 2005を参照のこと。タンパク質の細胞内共局在のための共焦点顕微鏡法の使用の説明については、Miyashita et al., Methods Mol Biol. 261:399, 2004を参照のこと。
【０４１８】
蛍光相関分光法(FCS)は、単一分子かつ実時間の分解が可能な超高感度非侵襲的検出法である(Vukojevic et al., Cell Mol Life Sci. 62(5): 535, 2005)。単一粒子蛍光イメージング(SPFI)は高感度の蛍光を使用して、小さな蛍光粒子で選択的に標識された個々の分子を可視化する(Cherry et al., Biochem Soc Trans. 31(Pt 5): 1028, 2003)。脂質ラフト内タンパク質の局在については、Latif et al., Endocrinology. 144(11): 4725, 2003)を参照のこと。生細胞イメージングの概説については、Hariguchi, Cell Struct Funct. 27(5):333, 2002)を参照のこと。タンパク質の構造および局在化を生理学的条件下で研究するために、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)顕微鏡法も使用される(Periasamy, J Biomed Opt. 6(3): 287, 2001)。
【０４１９】
いくつかの態様では、例えば、タンパク質の輸送および/または蓄積をモニタリングするために、ELISAおよび/またはウエスタンブロット分析などの技術を用いることができる。
【０４２０】
いくつかの態様では、例えば酵素基質または他の関連実体のレベルを評価することによって、例えばリソソーム酵素活性をモニタリングするために、質量分析および/またはクロマトグラフィー(例えば、薄層クロマトグラフィー)技術を用いることができる。
【０４２１】
いくつかの態様では、例えば、シヌクレイノパチーにおいて蓄積するポリペプチドのオリゴマー形成をモニタリングする技術が用いられる。例えば、α-シヌクレインは、オリゴマー形態で蓄積する。リソソーム活性および/または推定上のもしくは公知のリソソーム活性化剤の効果を評価するために、α-シヌクレインモノマーおよび/もしくは特定のオリゴマー(例えば、ダイマーおよび/もしくはテトラマー)のレベル、ならびに/または任意でそれらの比率を本発明に従ってモニタリングできる。いくつかの態様では、このような技術は、例えば、脳切片アッセイを使用することによって、インビボのオリゴマーレベルをモニタリングする。
【０４２２】
いくつかの態様では、リソソーム活性および/または推定上のもしくは公知のリソソーム活性化剤の効果は、ニューロンにおける形態異常(例えば、形態分析)によって評価できる。少数だが例を挙げれば、一形式では、タウ-GFPをトランスフェクションしたニューロンにおけるニューロン形態の変化には、非対称性、前後方向投影における軸索数の減少、異常な軸索の束状化、軸索の泡状化、および末端樹状分枝の減少が含まれる。あるいはまたは加えて、凝集、細胞サイズ(細胞面積または細胞密度)、多形性(polymegathism:平均細胞面積の変動係数などの細胞サイズの変化)、多形性(pleomorphism:六角細胞比率(％)または細胞形状の変動係数などの細胞形状の変化)、細胞周囲長、平均細胞側辺長、細胞形状などを含む細胞形態の変化を評価できる。例えば、形態は、例えばVentimiglia et al., J Neurosci Methods. 57:63, 1995およびWu et al., Cerebral Cortex. 14: 543, 2004(ハイスループット解析)に記載されている方法による定量的形態分析を、任意でImage Pro-Plusソフトウェアなどの画像解析ソフトウェアと一緒に使用して評価できる。
【０４２３】
細胞内のタンパク質輸送は、pH勾配(すなわち、小胞体(ER)のpH:約7.0、ゴルジ体のpH:約6.2〜7.0、トランスゴルジ網のpH:約6.0、初期および後期エンドソームのpH:約6.5、リソソームのpH:約4.5)に沿って起こる。一部のプロテイノパチーでは、輸送、リソソーム/エンドソーム形態、および内腔pHも混乱し(Ivleva et al., Biomed Sci. 2: 398, 1991; Futerman and van Meer, Nat Rev Mol Cell Biol. 5: 554, 2004)、エンドソーム中のpH上昇は、エンドソームからゴルジ体への小胞輸送の逆転を促進することが示されている。ある範囲のpHに曝露された細胞(例えば、野生型、未処理患者細胞、およびリソソーム活性化剤処理患者細胞)の増殖速度は、蛍光プレートリーダーを使用して測定し、比較できる。アポトーシスおよび細胞死アッセイを用いて、細胞生存性に関するpH感受性を評価できる。あるいはまたは加えて、リソソームpHおよび輸送に対するpH効果は、共焦点顕微鏡を使用して評価できる。細胞によるエンドサイトーシスを受けるpH感受性蛍光プローブを使用して、リソソームおよびエンドソーム中のpH範囲を測定できる(すなわち、フルオレセインはpH5.0で赤色、pH5.5〜6.5で青色から緑色である)。リソソームの形態およびpHは、野生型、ならびにリソソーム活性化剤処理および未処理患者細胞において比較できる。いくつかの態様では、このアッセイは、pH感受性を決定するために、プレートリーダーアッセイと同時に行うことができる。いくつかの態様では、酵素のリソソームへの輸送は、前記の二重標識実験を使用して異なるpHの細胞中で評価できる。種々のpHに曝露された細胞(野生型、シャペロン処理および未処理患者細胞)のエンドサイトーシスの速度は、量子ドットまたはデキストランブルーを使用して測定できる。いくつかの態様では、蛍光脂質類似体(例えば、BODIPY-LacCer、-GM1ガングリオシドなど)の使用について説明しているアッセイが、Pagano, Phil Trans R Soc Lond B. 358-885-91, 2003に記載されている。
【０４２４】
本発明のいくつかの態様では、タンパク質機能を評価し、および/またはタンパク質が機能的であるかを決定するために、ならびに機能を回復する効果、機能を回復または破壊する効果を評価するために、生化学的アッセイを使用できる。いくつかのこのような態様では、このようなアッセイは、輸送の1つまたは複数の異なる時点(例えば、小胞体(ER)からの放出後、リソソームに入った後など)において実施される。
【０４２５】
多くの態様では、タンパク質活性アッセイは、試験剤の存在または非存在下で関心対象のタンパク質の活性を測定するように設計される。このようなアッセイの細部は、その活性が評価される特定のタンパク質に依存するであろう。例えば、タンパク質が酵素である場合、基質を使用する細胞内酵素活性アッセイが当技術分野ではルーチンであり、酵素活性を評価するのに使用できる。酵素活性のエクスビボおよびインビボ評価は、正常な動物および疾患状態の動物モデルを使用して実施できる。
【０４２６】
本開示では、様々なアッセイを使用して、GCaseポリペプチドの内因性変異はそのリソソーム輸送に影響を与え、これが今度はリソソームのタンパク質分解に影響を与えて、α-シヌクレインの選択的な蓄積につながることを実証した。例えば、実施例1を参照すると、エンドグリコシダーゼH(endo H)処理によって、リソソームにおける成熟GCaseポリペプチドレベルをモニタリングすること;全細胞溶解物の分析によって、GCase活性をモニタリングすること;BODIPY 493および免疫染色によって、細胞脂質をモニタリングすること;神経フィラメント(NF)の免疫染色によって、神経毒性をモニタリングすること;および/またはLAMP1の免疫蛍光分析によって、リソソーム媒介性経路におけるGCaseポリペプチド機能喪失の影響をモニタリングすることが記載されている。実施例1には、リソソーム阻害剤である塩化アンモニウムおよびロイペプチンで処理したニューロンを使用して、ならびに放射性パルスチェイス実験を使用して、ニューロンにおける長命タンパク質のタンパク質分解をモニタリングするためのアッセイがさらに記載されている。実施例1には、免疫蛍光およびウエスタンブロット分析を使用することによって、初代およびiPS神経細胞におけるα-シヌクレインの蓄積をモニタリングするための方法も記載した。
【０４２７】
本開示には、α-シヌクレイン媒介性神経毒性の機序を説明するために、様々なアッセイを使用することが記載されている。例えば、実施例3を参照すると、サイズ排除クロマトグラフィー、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、ウエスタンブロット分析、および免疫染色分析を使用することによって、α-シヌクレインの可溶性高分子量オリゴマーをモニタリングすることが記載されている。
【０４２８】
本開示には、リソソーム酵素基質(例えば、GlcCer)媒介性特異的タンパク質(例えば、α-シヌクレイン)凝集を説明するために、様々なアッセイを使用することが記載されている。例えば、実施例4を参照すると、電子顕微鏡法(EM)および免疫EM、遠心沈降分析、ネイティブゲル電気泳動のような生化学的方法を使用して、ならびに凝集傾向のある構造中間体を検出するのに使用される蛍光色素である8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸結合剤(Stryer, J. Mol. Biol. 13: 482, 1965)を使用することによって、酸性条件下におけるGlcCer脂質分散混合物でのα-シヌクレインの線維形成を分析することが記載されている。
【０４２９】
インビボにおけるタンパク質(例えば、α-シヌクレイン)の蓄積をモニタリングするために、様々なシステムが利用可能である。例えば、実施例5を参照すると、神経内および神経外のα-シヌクレインの蓄積を同定するために、組織病理学、免疫蛍光、およびニューロン特異的マーカーによる同時染色を使用してGDマウスモデルの脳組織を分析することが記載されている。実施例5には、インビボにおけるα-シヌクレインのGCase枯渇媒介性蓄積を実証するために、線虫モデルを使用することも記載されている。さらに、実施例6には、可溶性オリゴマーα-シヌクレインの凝集レベルの上昇と神経変性との間の相関関係を分析するために、GDを有する患者から得られたヒト死後脳試料を使用することが記載されている。
【０４３０】
本開示には、プロテイノパチー(例えば、PD)におけるタンパク質(例えば、α-シヌクレイン)の凝集/蓄積の結果として、野生型リソソーム酵素(例えば、GCase)の輸送および活性が減少することを実証するためのアッセイが記載されている。例えば、実施例7を参照すると、SDS-PAGE、ウエスタンブロット、リソソームおよびミクロソーム濃縮画分における酵素活性の測定、ならびにendo H処理を使用して種々のグリコシル化型GCaseポリペプチドを評価することによって、α-シヌクレインを過剰発現するインビトロおよびインビボモデルの野生型GCaseリソソーム酵素の細胞内輸送をモニタリングすることが記載されている。
【０４３１】
リソソーム酵素の輸送を安定化および/または増加させて、酵素のタンパク質分解活性の増強をもたらすリソソーム活性化剤候補を同定するために、様々なアッセイが利用可能である。例えば、実施例8を参照すると、リソソーム活性化剤(すなわち、GCaseの薬理学的シャペロンアクチベーター(例えば、IFG))で神経細胞を処理した後に(活性部位結合物を除去することによってリソソーム酵素を活性化させるために)ウォッシュアウトし、ウエスタンブロットおよびデンシトメトリー分析によって、GCaseポリペプチドレベルの増加をモニタリングすること、ならびに放射性パルスチェイス実験によって、GCaseポリペプチドのタンパク質分解活性の増加をモニタリングすることが記載されている。実施例8には、リソソーム活性化剤を同定するためのアッセイにおいて、非神経細胞におけるGCase過剰発現が、(放射性パルスチェイスによって評価した)リソソームタンパク質分解を対照細胞と比較して増強することも記載されている。リソソーム阻害剤(例えば、ロイペプチンおよび塩化アンモニウム)により、この効果が完全に無効化されたが、これは、GCase過剰発現が主にリソソーム分解経路の増強をもたらしたことを示している(リソソーム活性化剤候補のはずである)。実施例8には、GCase過剰発現がカテプシンB活性に及ぼす効果を測定することによって、リソソーム活性化剤候補を同定するためのアッセイがさらに記載されている。このアッセイでは、GCase過剰発現は、その基質の分解におけるカテプシンB活性の増加をもたらす(リソソーム活性化剤候補のはずである)。
【０４３２】
本開示には、プロテイノパチーの処置のための分泌経路を刺激する潜在的なリソソーム活性化剤を同定するおよび/または特徴付けるアッセイも記載されている。例えば、実施例9を参照すると、リソソーム輸送障害をもたらすα-シヌクレインを過剰発現するヒトPD神経細胞において、Rab1aポリペプチドを過剰発現させる効果が記載されている。Rab1aポリペプチドの過剰発現は、α-シヌクレインの有意な減少をもたらす(リソソーム活性化剤候補のはずである)。同様に、Rab1aポリペプチドをトランスフェクションした非神経細胞では、カテプシンB活性をモニタリングすることによって、リソソーム機能のRab1aポリペプチド媒介性増強が見られる。
【０４３３】
加えて、本開示には、リソソーム酵素のアロステリック部位に結合する潜在的なリソソーム活性化剤を同定するおよび/または特徴付けるアッセイが記載されている。例えば、実施例8および実施例10を参照すると、後者には、α-シヌクレインを過剰発現するヒトPDニューロンにおけるα-シヌクレインが、アロステリックリソソーム活性化剤で処理した後に用量依存的に減少することが記載されている。このような化合物は、リソソーム酵素を活性化させるためのウォッシュアウト段階を必要としない。
【０４３４】
本開示には、ある種のリソソーム活性化剤候補は、一緒に組み合わせた場合に、リソソーム酵素のより大きな安定化および活性化を示す/達成することを実証するアッセイも記載されている。例えば、実施例11を参照すると、PDニューロンにおけるGCaseポリペプチドの成熟は、2つのリソソーム調節剤を組み合わせてニューロンを処理した場合に、いずれかの剤単独で処理した場合よりも有意に増加したことが記載されている。
【０４３５】
本開示には、リソソーム活性化剤がリソソーム酵素と物理的に相互作用するかを試験するためのアッセイ、および/またはインビボ評価のためのリソソーム活性化剤候補を選択するためのアッセイも記載されている。例えば、実施例13を参照のこと。
【０４３６】
当業者であれば、このような提供されるアッセイにおいて様々な剤のいずれかを試験および/または研究して、本発明によるリソソーム活性化剤としてのその特徴および/または適合性を評価してもよいことを認識するであろう。例えば、リソソーム活性化剤として上で述べた化学的分類の剤は、本明細書において記載されるこのようなシステムを使用して、本発明に従って使用するのに適切なリソソーム活性化剤としてスクリーニング、試験および/または確認できる。
【０４３７】
本発明のいくつかの態様は、番号付けした以下の項目のいずれかに定義され得る:
１. 神経変性プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に、
リソソーム活性化剤;および
薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物を投与する段階を含む方法であって、
該リソソーム活性化剤が、所定の投与レジメンに従って投与された場合に所定の治療効果と相関する投与レジメンに従って、かつ一定量で投与される、方法。
２. 神経変性プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態が、以下からなる群より選択される、項目1記載の方法:
副腎白質ジストロフィー、AIDSおよびAIDS関連認知症、嗜銀顆粒性疾患、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(グアム-パーキンソニズム認知症複合またはリティコ・ボディグ(Lytico-Bodig)病)、大動脈中膜アミロイド、感情鈍麻、アテローム性動脈硬化症、注意欠陥障害(ADD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、自閉症、自己免疫性血管炎、B12欠乏症、双極性障害、ウシ海綿状脳症、脳腫瘍、脳病変、心不整脈、脳血管疾患、脳アミロイドアンギオパチー(およびアイスランド型)、電気痙攣ショック療法による認知機能障害、化学療法による認知機能障害、薬物乱用歴による認知機能障害、睡眠時無呼吸による覚醒時認知機能障害、無酸素症後合併症、脳内出血による合併症、大脳皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、ボクサー認知症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、鬱病、真性糖尿病2型、透析関連アミロイドーシス、びまん性レビー小体病、ダウン症候群、失読症、癲癇、家族性アミロイド多発ニューロパチー、フィンランド型アミロイドーシス、葉酸欠乏症、脆弱X症候群、脆弱X関連振戦/運動失調症候群、脆弱XE精神遅滞、前頭葉症候群、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、フリードライヒ運動失調症、神経節膠腫、ハレルフォルデン・シュパッツ病、肝病態、遺伝性非ニューロパチー性全身性アミロイドーシス、ハンチントン病、低血糖症、高カルシウム血症、甲状腺機能低下症、水頭症、封入体筋炎、感染性血管炎、クッフス病、Kufor-Rakeb病、孤立性心房性アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、鉛脳症、レビー小体病、アルツハイマー病のレビー小体変異型(Lewy body mutant)、リポフスチン症、ライム病、栄養失調症、メープルシロップ尿症、甲状腺髄様癌、髄膜血管腫症、代謝疾患、軽度認知機能障害、多発脳梗塞性認知症、多発性硬化症、多系統萎縮症、重症筋無力症、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、神経梅毒、I型脳内鉄蓄積を伴う神経変性、ナイアシン欠乏症、パーキンソン病およびパーキンソン病認知症、ピック病、フェニルケトン尿症、リウマチ性多発筋痛症、心的外傷後ストレス障害、プリオン病(クロイツフェルト・ヤコブ病)、プロラクチノーマ、冠動脈バイパス移植術後、進行性核上性麻痺、正常な老化によるタンパク質および脂質蓄積、レット症候群、関節リウマチ、統合失調症、全身性エリテマトーデス、脊髄小脳失調症(1〜8型、10〜14型、16〜29型)、球脊髄性筋萎縮症(ケネディ病)、孤発性封入体筋炎、蓄積疾患、脳卒中、亜急性硬化性全脳炎、梅毒、全身性ALアミロイドーシス、チアミン欠乏症、外傷性脳損傷、トゥレット症候群、伝達性海綿状脳症、結節性硬化症、ならびに血管性認知症。
３. 神経変性プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態がシヌクレイノパチーである、項目1記載の方法。
４. シヌクレイノパチー疾患、障害、および/または状態がパーキンソン病である、項目3記載の方法。
５. シヌクレイノパチー疾患、障害、および/または状態が多系統萎縮症である、項目3記載の方法。
６. シヌクレイノパチー疾患、障害、および/または状態がびまん性レビー小体病である、項目3記載の方法。
７. シヌクレイノパチー疾患、障害、および/または状態がレビー小体型認知症である、項目3記載の方法。
８. シヌクレイノパチー疾患、障害、および/または状態がI型脳内鉄蓄積を伴う神経変性である、項目3記載の方法。
９. シヌクレイノパチー疾患、障害、および/または状態がグアム-パーキンソニズム認知症複合である、項目3記載の方法。
１０. 神経変性プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態がアミロイドパチーである、項目1記載の方法。
１１. アミロイドパチー疾患、障害、および/または状態が、以下からなる群より選択される、項目10記載の方法:
副腎白質ジストロフィー、AIDSおよびAIDS関連認知症、嗜銀顆粒性疾患、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(グアム-パーキンソニズム認知症複合またはリティコ・ボディグ病)、大動脈中膜アミロイド、感情鈍麻、アテローム性動脈硬化症、注意欠陥障害(ADD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、自閉症、自己免疫性血管炎、B12欠乏症、双極性障害、ウシ海綿状脳症、脳腫瘍、脳病変、心不整脈、脳血管疾患、脳アミロイドアンギオパチー(およびアイスランド型)、電気痙攣ショック療法による認知機能障害、化学療法による認知機能障害、薬物乱用歴による認知機能障害、睡眠時無呼吸による覚醒時認知機能障害、無酸素症後合併症、脳内出血による合併症、大脳皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、ボクサー認知症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、鬱病、真性糖尿病2型、透析関連アミロイドーシス、びまん性レビー小体病、ダウン症候群、失読症、癲癇、家族性アミロイド多発ニューロパチー、フィンランド型アミロイドーシス、葉酸欠乏症、脆弱X症候群、脆弱X関連振戦/運動失調症候群、脆弱XE精神遅滞、前頭葉症候群、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、フリードライヒ運動失調症、神経節膠腫、ハレルフォルデン・シュパッツ病、肝病態、遺伝性非ニューロパチー性全身性アミロイドーシス、ハンチントン病、低血糖症、高カルシウム血症、甲状腺機能低下症、水頭症、封入体筋炎、感染性血管炎、クッフス病、Kufor-Rakeb病、孤立性心房性アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、鉛脳症、レビー小体病、アルツハイマー病のレビー小体変異型、リポフスチン症、ライム病、栄養失調症、メープルシロップ尿症、甲状腺髄様癌、髄膜血管腫症、代謝疾患、軽度認知機能障害、多発脳梗塞性認知症、多発性硬化症、多系統萎縮症、重症筋無力症、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、神経梅毒、I型脳内鉄蓄積を伴う神経変性、ナイアシン欠乏症、パーキンソン病およびパーキンソン病認知症、ピック病、フェニルケトン尿症、リウマチ性多発筋痛症、心的外傷後ストレス障害、プリオン病(クロイツフェルト・ヤコブ病)、プロラクチノーマ、冠動脈バイパス移植術後、進行性核上性麻痺、正常な老化によるタンパク質および脂質蓄積、レット症候群、関節リウマチ、統合失調症、全身性エリテマトーデス、脊髄小脳失調症(1〜8型、10〜14型、16〜29型)、球脊髄性筋萎縮症(ケネディ病)、孤発性封入体筋炎、蓄積疾患、脳卒中、亜急性硬化性全脳炎、梅毒、全身性ALアミロイドーシス、チアミン欠乏症、外傷性脳損傷、トゥレット症候群、伝達性海綿状脳症、結節性硬化症、ならびに血管性認知症。
１２. アミロイドパチー疾患、障害、および/または状態がアルツハイマー病である、項目10記載の方法。
１３. アミロイドパチー疾患、障害、および/または状態が血管性認知症である、項目10記載の方法。
１４. アミロイドパチー疾患、障害、および/または状態が認知機能障害である、項目10記載の方法。
１５. 神経変性プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態がタウオパチーである、項目1記載の方法。
１６. タウオパチー疾患、障害、および/または状態が、以下からなる群より選択される、項目15記載の方法:
副腎白質ジストロフィー、AIDSおよびAIDS関連認知症、嗜銀顆粒性疾患、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(グアム-パーキンソニズム認知症複合またはリティコ・ボディグ病)、大動脈中膜アミロイド、感情鈍麻、アテローム性動脈硬化症、注意欠陥障害(ADD)、注意欠陥多動性障害(ADHD)、自閉症、自己免疫性血管炎、B12欠乏症、双極性障害、ウシ海綿状脳症、脳腫瘍、脳病変、心不整脈、脳血管疾患、脳アミロイドアンギオパチー(およびアイスランド型)、電気痙攣ショック療法による認知機能障害、化学療法による認知機能障害、薬物乱用歴による認知機能障害、睡眠時無呼吸による覚醒時認知機能障害、無酸素症後合併症、脳内出血による合併症、大脳皮質基底核変性症、レビー小体型認知症、ボクサー認知症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、鬱病、真性糖尿病2型、透析関連アミロイドーシス、びまん性レビー小体病、ダウン症候群、失読症、癲癇、家族性アミロイド多発ニューロパチー、フィンランド型アミロイドーシス、葉酸欠乏症、脆弱X症候群、脆弱X関連振戦/運動失調症候群、脆弱XE精神遅滞、前頭葉症候群、17番染色体に連鎖しパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、フリードライヒ運動失調症、神経節膠腫、ハレルフォルデン・シュパッツ病、肝病態、遺伝性非ニューロパチー性全身性アミロイドーシス、ハンチントン病、低血糖症、高カルシウム血症、甲状腺機能低下症、水頭症、封入体筋炎、感染性血管炎、クッフス病、Kufor-Rakeb病、孤立性心房性アミロイドーシス、格子状角膜ジストロフィー、鉛脳症、レビー小体病、アルツハイマー病のレビー小体変異型、リポフスチン症、ライム病、栄養失調症、メープルシロップ尿症、甲状腺髄様癌、髄膜血管腫症、代謝疾患、軽度認知機能障害、多発脳梗塞性認知症、多発性硬化症、多系統萎縮症、重症筋無力症、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、神経梅毒、I型脳内鉄蓄積を伴う神経変性、ナイアシン欠乏症、パーキンソン病およびパーキンソン病認知症、ピック病、フェニルケトン尿症、リウマチ性多発筋痛症、心的外傷後ストレス障害、プリオン病(クロイツフェルト・ヤコブ病)、プロラクチノーマ、冠動脈バイパス移植術後、進行性核上性麻痺、正常な老化によるタンパク質および脂質蓄積、レット症候群、関節リウマチ、統合失調症、全身性エリテマトーデス、脊髄小脳失調症(1〜8型、10〜14型、16〜29型)、球脊髄性筋萎縮症(ケネディ病)、孤発性封入体筋炎、蓄積疾患、脳卒中、亜急性硬化性全脳炎、梅毒、全身性ALアミロイドーシス、チアミン欠乏症、外傷性脳損傷、トゥレット症候群、伝達性海綿状脳症、結節性硬化症、ならびに血管性認知症。
１７. タウオパチー疾患、障害、および/または状態がアルツハイマー病である、項目15記載の方法。
１８. リソソーム活性化剤;および
薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物を対象に投与する段階を含む、対象におけるα-シヌクレインレベルを減少させる方法であって、
該リソソーム活性化剤が、所定の投与レジメンに従って投与された場合に所定の治療効果と相関する投与レジメンに従って、かつ一定量で投与される、方法。
１９. 投与する段階の前に、個体におけるα-シヌクレインレベルを決定する段階をさらに含む方法であって、該α-シヌクレインレベルが参照値と比較して上昇している場合に、リソソーム活性化剤および薬学的に許容される担体を対象に投与する、項目18記載の方法。
２０. リソソーム活性化剤が、少なくとも1つのリソソーム酵素の輸送を増加させる、項目1、18、または19記載の方法。
２１. リソソーム活性化剤が、少なくとも1つのリソソーム酵素の安定性を増加させる、項目1、18、または19記載の方法。
２２. リソソーム活性化剤が、リソソーム中のリソソーム酵素のレベルを増加させる、項目20または21記載の方法。
２３. リソソーム活性化剤が、リソソーム中のリソソーム酵素の活性を増加させる、項目21記載の方法。
２４. リソソーム活性化剤が、リソソーム酵素のその基質への結合を増加させる、項目21記載の方法。
２５. リソソーム活性化剤がリソソーム酵素に直接結合する、項目1、18、19、20、または21記載の方法。
２６. リソソーム活性化剤がリソソーム酵素に直接結合しない、項目1、18、19、20、または21記載の方法。
２７. リソソーム活性化剤が、リソソーム酵素の触媒部位または活性部位から離れた部位に結合する、項目25記載の方法。
２８. リソソーム活性化剤が、リソソーム酵素の基質と競合せずに結合する、項目25記載の方法。
２９. リソソーム酵素がβ-グルコセレブロシダーゼである、項目20または21記載の方法。
３０. β-グルコセレブロシダーゼが野生型である、項目29記載の方法。
３１. β-グルコセレブロシダーゼが変異体である、項目29記載の方法。
３２. リソソーム活性化剤がβ-グルコセレブロシダーゼを活性化させる、項目1、18、19、20、または21記載の方法。
３３. リソソーム酵素がβ-ヘキソサミニダーゼA/Bである、項目20または21記載の方法。
３４. β-ヘキソサミニダーゼA/Bが野生型である、項目33記載の方法。
３５. β-ヘキソサミニダーゼA/Bが変異体である、項目33記載の方法。
３６. リソソーム活性化剤がβ-ヘキソサミニダーゼA/Bを活性化させる、項目1、18、19、20、または21記載の方法。
３７. リソソーム酵素がβ-ガラクトシダーゼアイソフォーム1である、項目20または21記載の方法。
３８. β-ガラクトシダーゼアイソフォーム1が野生型である、項目37記載の方法。
３９. β-ガラクトシダーゼアイソフォーム1が変異体である、項目37記載の方法。
４０. リソソーム活性化剤がβ-ガラクトシダーゼアイソフォーム1を活性化させる、項目1、18、19、20、または21記載の方法。
４１. リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドであるか、またはRab1aポリペプチドを含む、項目20記載の方法。
４２. リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドをコードする核酸であるか、またはRab1aポリペプチドをコードする核酸を含む、項目20記載の方法。
４３. リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドを活性化させる、項目20記載の方法。
４４. リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチド阻害因子を阻害する、項目20記載の方法。
４５. リソソーム活性化剤がサポシンポリペプチドであるか、またはサポシンポリペプチドを含む、項目21記載の方法。
４６. リソソーム活性化剤がサポシンポリペプチドを活性化させる、項目45記載の方法。
４７. リソソーム活性化剤がサポシンポリペプチド阻害因子を阻害する、項目45記載の方法。
４８. サポシンポリペプチドがサポシンCであるか、またはサポシンCを含む、項目45記載の方法。
４９. リソソーム活性化剤が小分子である、項目1、18、19、20、または21記載の方法。
５０. 小分子が標的リソソーム酵素に直接結合する、項目49記載の方法。
５１. 小分子が、標的リソソーム酵素の基質と競合せずに該酵素に結合する、項目49記載の方法。
５２. 小分子が、標的リソソーム酵素の活性を阻害しない、項目49記載の方法。
５３. リソソーム酵素がβ-グルコセレブロシダーゼである、項目50、51、または52記載の方法。
５４. リソソーム酵素がβ-ヘキソサミニダーゼA/Bである、項目50、51、または52記載の方法。
５５. リソソーム酵素がβ-ガラクトシダーゼアイソフォーム1である、項目50、51、または52記載の方法。
５６. リソソーム活性化剤が下記式を有する化合物またはその薬学的に許容される塩である、項目49記載の方法:
2014523881.tif 000029
式中、環
2014523881.tif 000030
は、R5が置換されていてもよいビニル基でありかつR6およびR7が下記定義を有する式
2014523881.tif 000031
(i)、またはR5、R6、およびR7が下記定義を有する式
2014523881.tif 000032
(ii)の環系であり、
R1は、(単環式または二環式の炭素環)C0-C4アルキルまたは(単環式または二環式の複素環)C0-C4アルキルであり、これらはそれぞれ非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、-CHO、-COOH、C1-C6アルキル、C1-C6アルコキシ、C2-C6アルカノイル、モノ-またはジ-C1-C6アルキルアミノ、モノ-またはジ-C1-C6アルキルカルボキサミド、C1-C6アルキルエステル、C1-C6アルキルチオ、C1-C6アルキルスルホニル、C1-C2ハロアルキル、およびC1-C2ハロアルコキシから独立して選択される1個または複数個の置換基、ならびにY-Z-から選択される0個もしくは1個の置換基で置換されており、ここでZは、共有結合、C1-C4アルキレン、C2-C4アルケニレン、C2-C4アルキニレン、-S-、-O-、-NR-、-C(O)-、-NHC(O)-、または-C(O)NH-であり、ここでRは、水素またはC1-C4アルキルであり、かつYは、フェニル、ピリミジニル、5員もしくは6員ヘテロシクロアルキル、またはピリジルであり、これらはそれぞれ、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アミノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、モノ-またはジ-C1-C4アルキルアミノ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、およびフェニルから独立して選択される0個〜3個の置換基で置換されており;かつR2は、水素、C1-C6アルキル、C3-C7シクロアルキル、(フェニル)C0-C2アルキルであり;またはR1およびR2は一緒になって、N、O、およびSから選択される0個または1個のさらなるヘテロ原子を有する5員〜7員ヘテロシクロアルキル環を形成し、この5員〜7員ヘテロシクロアルキル環は、フェニルまたはピリジルと縮合していてもよく;この5員〜7員ヘテロシクロアルキル環は非置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル、C1-C2アルキル、およびC1-C2アルコキシから独立して選択される1個または複数個の置換基で置換されており;R3は、水素またはC1-C2アルキルであり;R5は、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、またはフェニルであり;R6は、ハロゲン、ヒドロキシル、C1-C4アルキル、またはC1-C4アルコキシであり;かつR7は、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、シアノ、C1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、ジフルオロメチル、またはトリフルオロメチルであるか、またはR7は、フェニルであるか、またはN、O、およびSから選択される1個もしくは2個のヘテロ原子を有する5員〜7員ヘテロシクロアルキル環であり、これらのR7はそれぞれ共有結合を介して直接結合しているか、またはC1-C4アルキル、C1-C4アルコキシ、またはC1-C4アルキルアミノを介して結合しており、これらのR7はそれぞれ非置換であるか、またはC1-C4アルキル、(モノ-またはジ-C1-C2アルキルアミノ)C0-C4アルキルから独立して選択される1個〜3個の置換基で置換されており;またはR6およびR7は一緒になって、さらなる不飽和点を有しない5員または6員炭素環式環を形成し、この環は非置換であるか、またはC1-C2アルキルおよびC1-C2アルコキシから独立して選択される1個〜3個の置換基で置換されており;ここで、R6が水素であり、R5およびR7が両方ともメチルである場合、またはR6が水素であり、R5およびR7の一方がメチルであり、他方がフェニルである場合、R1は、非置換のフェニル、ジヒドロインデニル、ベンゾ[b][1,4]ジオキソリル、ベンゾ[d][1,3]ジオキソール-5-イル、シクロヘキシ���、ピリジルでもなく、クロロ、フルオロ、C1-C4アルキル、C1-C2アルコキシ、アセチル、トリフルオロメチルから独立して選択される1個または2個の置換基で置換されたフェニルでもなく;かつR6が水素であり、R5およびR7の一方がメチルであり、他方がフェニルである場合、R1は1-(4-フルオロベンジル)-1H-ピラゾール-4-イルではない。
５７. リソソーム活性化剤が薬理学的シャペロンである、項目1、18、19、20、または21記載の方法。
５８. 薬理学的シャペロンが標的リソソーム酵素に直接結合する、項目57記載の方法。
５９. 薬理学的シャペロンが、標的リソソーム酵素の基質と競合せずに該酵素に結合する、項目57記載の方法。
６０. 薬理学的シャペロンが、標的リソソーム酵素の活性を阻害しない、項目57記載の方法。
６１. リソソーム酵素がβ-グルコセレブロシダーゼである、項目58、59、または60記載の方法。
６２. リソソーム酵素がβ-ヘキソサミニダーゼA/Bである、項目58、59、または60記載の方法。
６３. リソソーム酵素がβ-ガラクトシダーゼアイソフォーム1である、項目58、59、または60記載の方法。
６４. 薬理学的シャペロンがイソファゴミンである、項目57記載の方法。
６５. リソソーム活性化剤がタンパク質恒常性調節因子である、項目1、18、19、20、または21記載の方法。
６６. タンパク質恒常性調節因子が標的リソソーム酵素に直接結合しない、項目65記載の方法。
６７. タンパク質恒常性調節因子がCa2＋チャンネル遮断剤である、項目65記載の方法。
６８. タンパク質恒常性調節因子がRyR阻害剤である、項目65記載の方法。
６９. Ca2＋チャンネル遮断剤が小分子である、項目67記載の方法。
７０. 小分子がジルチアゼムである、項目69記載の方法。
７１. 小分子がベラパミルである、項目69記載の方法。
７２. RyR阻害剤が小分子である、項目68記載の方法。
７３. 小分子がダントロレンである、項目72記載の方法。
７４. リソソーム活性化剤が、経口送達用に製剤化された薬学的組成物の状態で投与される、項目1、18、または19記載の方法。
７５. プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に、
リソソーム活性化剤;および
少なくとも1つの第2の治療剤
の組み合わせを投与する段階を含む方法であって、
該リソソーム活性化剤および少なくとも1つの第2の治療剤が、所定の治療効果と相関する治療レジメンに従って、かつ単位用量で投与される、方法。
７６. リソソーム活性化剤が項目56記載の化合物であり、かつ第2の治療剤がパーキンソン病の処置において使用される、項目75記載の方法。
７７. リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドであり、かつ第2の治療剤がパーキンソン病の処置において使用される、項目75記載の方法。
７８. リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドをコードする核酸であり、かつ第2の治療剤がパーキンソン病の処置において使用される、項目75記載の方法。
７９. リソソーム活性化剤がサポシンCポリペプチドであり、かつ第2の治療剤がパーキンソン病の処置において使用される、項目75記載の方法。
８０. パーキンソン病の処置において使用される第2の治療剤が、レボドパ、カルビドパ、アマンチジン(amantidine)、抗コリン作用薬、カテコール-O-メチルトランスフェラーゼ、モノアミン酸化酵素阻害剤、末梢デカルボキシラーゼ阻害剤、ブロモクリプチジン(bromocriptidine)、ペルゴリド、ロピニロール、プラミペキソール、およびエルゴリドからなる群より選択される、項目76、77、78、または79記載の方法。
８１. リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドであり、かつ第2の治療剤がリソソーム蓄積疾患の処置において使用される、項目75記載の方法。
８２. リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドをコードする核酸であり、かつ第2の治療剤がリソソーム蓄積疾患の処置において使用される、項目75記載の方法。
８３. リソソーム蓄積疾患の処置において使用される第2の治療剤が、アロプレグナノロン、スタチン、フェノフィブラート、ナイアシン、エゼチミブ、およびコレスチラミンからなる群より選択される、項目81または82記載の方法。
８４. 第2の治療剤がリソソーム活性化剤である、項目75記載の方法。
８５. リソソーム活性化剤が小分子であり、かつ第2の治療剤がポリペプチドリソソーム活性化剤である、項目75または84記載の方法。
８６. リソソーム活性化剤が小分子であり、かつ第2の治療剤が抗酸化リソソーム活性化剤である、項目75または84記載の方法。
８７. リソソーム活性化剤が抗酸化剤であり、かつ第2の治療剤がポリペプチドリソソーム活性化剤である、項目75または84記載の方法。
８８. 小分子が項目56記載の化合物である、項目85または86記載の方法。
８９. 小分子が項目64記載の薬理学的シャペロンである、項目85または86記載の方法。
９０. 小分子がグルコシルセラミド合成酵素ポリペプチドの阻害剤である、項目85または86記載の方法。
９１. グルコシルセラミド合成酵素ポリペプチドの阻害剤が、N-ブチル-デオキシノジリマイシン、AMP-DMP、N-((1R,2R)-1-(2,3-ジヒドロベンゾ[b][1,4]ダイオキシン-6-イル)-1-ヒドロキシ-3-(ピロリジン-1イル)プロパン-2-イル)オクタンアミド(Genz-112638)、2-(2,3-ジヒドロ-1-H-インデン-2-イル)-1-ヒドロキシ-3-(ピロリジン-1-イル)プロパン-2-イル)アセトアミド(CCG-203586)、およびEXEL-0346からなる群より選択される、項目90記載の方法。
９２. 小分子がCa2＋チャンネル遮断剤である、項目85または86記載の方法。
９３. Ca2＋チャンネル遮断剤が、ジヒドロピリジンカルシウムチャンネル遮断剤群、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニグルジピン、ニルジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニバルジピン、リヨシジン(ryosidine)、アニパミル、ジルチアゼム、フェンジリン、フルナリジン、ガロパミル、ミベフラジル、プレニラミン、チアパミル、ベラパミル、マレイン酸ペルヘキシリン、フェンジリン、プレニラミン、塩、エステル、アミド、およびプロドラッグからなる群より選択される、項目92記載の方法。
９４. 小分子がRyR阻害剤である、項目85または86記載の方法。
９５. RyR阻害剤が、ダントロレン、リアノジン、アズモレン、カルケストリン(calquestrin)、およびプロカインからなる群より選択される、項目94記載の方法。
９６. ポリペプチドがRab1aポリペプチドである、項目85または86記載の方法。
９７. ポリペプチドがサポシンCポリペプチドである、項目85または86記載の方法。
９８. 少なくとも1つの第3のリソソーム活性化剤をさらに含む、項目75または84記載の方法。
９９. 第3のリソソーム活性化剤が、項目58記載の化合物、イソファゴミン、Rab1aポリペプチド、Rab1aポリペプチドをコードする核酸、サポシンCポリペプチド、抗酸化剤、項目93記載の化合物、項目95記載の化合物、および項目97記載の化合物からなる群より選択される、項目98記載の方法。
１００. 抗酸化剤がn-アセチル-システインである、項目86、87、または99記載の方法。
１０１. 単位用量の少なくとも1つが、単独で投与される場合の同じ剤の参照単位用量よりも少ない、項目75、84、または98記載の方法。
１０２. 治療レジメンが、同じ剤を単独で投与する参照治療レジメンの投与回数よりも少ない投与回数を含む、項目75、84、または98記載の方法。
１０３. 治療有効量のリソソーム活性化剤を細胞に投与する段階を含む、細胞におけるタンパク質の凝集または蓄積の毒性を減少させる方法。
１０４. リソソーム活性化剤が項目56記載の化合物である、項目103記載の方法。
１０５. リソソーム活性化剤が項目64記載の薬理学的シャペロンである、項目103記載の方法。
１０６. リソソーム活性化剤が項目91記載のグルコシルセラミド合成酵素ポリペプチドの阻害剤である、項目103記載の方法。
１０７. リソソーム活性化剤が項目93記載のCa2＋チャンネル遮断剤である、項目103記載の方法。
１０８. リソソーム活性化剤が項目95記載のRyR阻害剤である、項目103記載の方法。
１０９. リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドであるか、またはRab1aポリペプチドを含む、項目103記載の方法。
１１０. リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドをコードする核酸である、項目103記載の方法。
１１１. リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチドのアクチベーターである、項目103記載の方法。
１１２. リソソーム活性化剤がRab1aポリペプチド阻害因子の阻害剤である、項目103記載の方法。
１１３. リソソーム活性化剤がサポシンCポリペプチドであるか、またはサポシンCポリペプチドを含む、項目103記載の方法。
１１４. リソソーム活性化剤がサポシンCポリペプチドのアクチベーターである、項目103記載の方法。
１１５. リソソーム活性化剤がサポシンCポリペプチド阻害因子の阻害剤である、項目103記載の方法。
１１６. リソソーム活性化剤が抗酸化剤である、項目103記載の方法。
１１７. 抗酸化剤がn-アセチル-システインである、項目116記載の方法。
１１８. 投与する段階が、システム中の細胞に投与することを含む、項目103記載の方法。
１１９. システムがインビトロシステムである、項目118記載の方法。
１２０. システムが生物を含む、項目118記載の方法。
１２１. 細胞が神経細胞である、項目103記載の方法。
１２２. 細胞が非神経細胞である、項目103記載の方法。
１２３. 細胞がα-シヌクレインを発現している、項目103記載の方法。
１２４. 細胞がアミロイドを発現している、項目103記載の方法。
１２５. 細胞がタウを発現している、項目103記載の方法。
１２６. 非リソソーム蓄積疾患プロテイノパチーに罹患しているかまたは罹患しやすい対象に、
リソソーム活性化剤;および
薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物を投与する段階を含む方法であって、
該リソソーム活性化剤が、所定の投与レジメンに従って投与された場合に所定の治療効果と相関する投与レジメンに従って、かつ一定量で投与される、方法。
１２７. プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態が増殖性疾患である、項目126記載の方法。
１２８. プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態が炎症性疾患である、項目126記載の方法。
１２９. プロテイノパチー疾患、障害、および/または状態が心臓血管疾患である、項目126記載の方法。
１３０. リソソーム蓄積疾患、障害、および/または状態に罹患しているかまたは罹患しやすい対象に、
リソソーム活性化剤;および
薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物を投与する段階を含む方法であって、
該リソソーム活性化剤が、所定の投与レジメンに従って投与された場合に所定の治療効果と相関する投与レジメンに従って、かつ一定量で投与される、方法。
１３１. リソソーム活性化剤が、Rab1aポリペプチドのレベルおよび/または活性を増加させる、項目130記載の方法。
１３２. リソソーム活性化剤が抗酸化剤である、項目130記載の方法。
１３３. 抗酸化剤がn-アセチル-システインである、項目130記載の方法。
１３４. リソソーム活性化剤が項目56記載の化合物である、項目130記載の方法。
１３５. リソソーム活性化剤が項目64記載の薬理学的シャペロンである、項目130記載の方法。
１３６. リソソーム蓄積疾患、障害、および/または状態が、以下からなる群より選択される、項目130記載の方法:
α-マンノシドーシスI/II型、アスパルチルグルコサミン尿症、バッテン病、バッテン病(後期乳児性)、β-マンノシドーシス、心不整脈、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ゴーシェ病、GM1ガングリオシドーシスI/II/III型、GM2ガングリオシドーシスI/II型、ガラクトシアリドーシスI/II型、ハンター症候群、ハーラー症候群、クラッベ病、クッフス病、I細胞病、ムコリピドーシスIV型、モルキオ症候群、ムコ多糖症IX型、多種スルファターゼ欠損症、マロトー・ラミー症候群、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、ポンペ病、偽性ハーラーポリジストロフィー、濃化異骨症、サンドホフ病、サンフィリッポ症候群A型、サンフィリッポ症候群B型、サンフィリッポ症候群C型、サンフィリッポ症候群D型、シンドラー病、シャイエ症候群、シアル酸尿症、サラ病、シアリドーシスI/II型、スライ症候群、テイ・サックス病、フォークト・シュピールマイアー病、およびウォルマン病。
１３７. リソソーム蓄積疾患、障害、および/または状態がゴーシェ病である、項目130記載の方法。
１３８. 少なくとも1つのリソソーム酵素を含むシステムを提供する段階;
該システムを試験リソソーム活性化剤と接触させる段階;
該試験リソソーム活性化剤が存在する場合の、該リソソーム酵素のレベルまたは活性を決定する段階;
参照と比べて該試験リソソーム活性化剤が同定されるまたは特徴付けされるように、該決定されたレベルまたは活性を参照レベルまたは活性と比較する段階
を含む、リソソーム活性化剤を同定するおよび/または特徴付ける方法。
１３９. システムがリソソームを含む、項目138記載の方法。
１４０. システムが細胞を含む、項目138記載の方法。
１４１. システムが生物を含む、項目138記載の方法。
１４２. システムが神経細胞を含む、項目138記載の方法。
１４３. 参照が、参照リソソーム活性化剤が存在する場合の、それ以外は同等の条件下で観察されるレベルまたは活性を含む、項目138記載の方法。
１４４. 決定されたレベルまたは活性を、参照リソソーム活性化剤が存在しない場合の、それ以外は同等の条件下で観察されるレベルまたは活性と比較する段階をさらに含む、項目138記載の方法。
１４５. レベルまたは活性を決定する段階が、輸送の程度を決定することを含む、項目144記載の方法。
１４６. レベルまたは活性を決定する段階が、凝集の様式の程度を決定することを含む、項目144記載の方法。
【実施例】
【０４３８】
本発明は、以下の実施例とあわせてよりよく理解されるであろう。しかしながら、これらの実施例は単なる例示目的のためのものであり、本発明の範囲を限定することを意味するものではないと理解するべきである。開示される態様に対する種々の変更および修正は当業者に明らかであり、本発明の精神および添付の特許請求の範囲の範囲から逸脱することなく、限定されないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、製剤および/または方法に関するものを含めて、このような変更および修正を行ってもよい。
【０４３９】
実施例1:GCaseポリペプチドの枯渇はタンパク質分解能力を障害し、ニューロンにおけるα-シヌクレインレベルを増加させる
本実施例の実験では、ニューロンにおけるGCaseポリペプチドのノックダウン(KD)は、リソソーム分解能力の低下、そしてその結果としてα-シヌクレインタンパク質レベルの増加につながることを説明する。さらに、本実施例の実験では、GCaseポリペプチドの内因性変異はリソソームタンパク質分解に影響を与え、α-シヌクレインの選択的な蓄積を引き起こしたことも確認した。
【０４４０】
ニューロンにおけるGCaseポリペプチドのノックダウン(KD)の生物学的効果を試験するために、レンチウイルス感染によって、GCaseポリペプチドのshRNA媒介性ノックダウン(KD)を達成した。この結果、GCaseポリペプチドレベルは、非形質導入ニューロンまたは対照スクランブル(scrb)shRNA感染ニューロンと比較して50％減少した(図1Aおよび図1B)。shRNA処理後に、GCaseポリペプチドのレベルおよび活性をモニタリングした。小胞体(ER)タンパク質の高マンノース部分を切断する酵素であるエンドグリコシダーゼH(endo H)処理によって、成熟リソソームGCaseポリペプチドのレベルを分析した。この分析により、GCaseポリペプチドshRNA構築物を感染させると、endo H耐性GCaseポリペプチドのレベルが低下したことが明らかになったが、これは、リソソーム型の枯渇を示唆している(図2A)。全細胞溶解物のさらなる分析によりGCaseポリペプチド活性の減少が示され(図1B)、BODIPY 493を用いると細胞脂質の増加が見られ、免疫蛍光によってGlcCerの増加が観察された(図1Cおよび図1D)。質量分析によってもGlcCerの蓄積を確認したところ、GCaseポリペプチド枯渇ニューロンではGlcCerが4倍増加したのに対して、セラミドおよび他のスフィンゴ脂質のレベルは依然として変化していないことが明らかになった(図1Bおよび図2D)。他のリソソームタンパク質および活性の分析により、この構築物はGCaseポリペプチドを特異的に減少させることが示唆された(図2C〜図2F)。神経フィラメント(NF)免疫染色(これは、より重度の核毒性が現れる前に、細胞培養において神経炎による変性を検出する高感度法である(Zala et al., Neurobiol. Dis. 20:785, 2005))によって、GCaseポリペプチドをノックダウン(KD)した際の神経毒性を評価した。この分析により、感染7日後(dpi)に評価した際に神経毒性には変化がないことが明らかになったが、これは、ニューロンは、この時間枠内においてGlcCer代謝経路の変化を許容する能力を有することを示唆している。
【０４４１】
本実施例では、生存ニューロンにおける長命タンパク質のタンパク質分解も分析したところ、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)は、これらのタンパク質のタンパク質分解速度を有意に40％減少させたことが見出された(図1Eおよび図2B)。本実施例では、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)がリソソーム分解経路に影響を与えるかを決定するために、試験を行った。この試験では、十分に確立されたリソソーム阻害剤である塩化アンモニウム(NH4Cl)およびロイペプチンでニューロンを処理した。これらの化合物は、GCaseポリペプチドshRNA処理細胞におけるタンパク質分解を相加的に阻害しなかったが、これは、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)が、リソソーム媒介性経路に影響を与えることを示している(図1E)。リソソームマーカーであるLAMP1の免疫蛍光分析によってもこれを確認したところ、ニューロンにおけるLAMP1陽性斑点の蓄積および拡大が明らかになった(図2G)。
【０４４２】
本実施例では、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)は、α-シヌクレインの定常状態レベルを対照と比べて1.8倍増加させたのに対して、別の疾患関連凝集傾向のあるタンパク質であるタウのレベルは、この特定の研究では変化しなかったことが実証された(図1F)。α-シヌクレインのmRNAレベルにも変化はなく、これにより、α-シヌクレインタンパク質レベルについて観察された増加は、タンパク質分解の障害に起因していたことが示唆された(図1F)。本実施例では、テトラサイクリン誘導プロモーター(「tet-off」)の制御下で野生型α-シヌクレインを発現するヒト神経膠腫細胞株(H4)において、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)後のα-シヌクレインレベルの分析も実施した。Doxによってα-シヌクレインの発現をオフにして、α-シヌクレインの分解速度を決定したところ、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)は、α-シヌクレインのクリアランスを妨げたことが明らかになった(図1G)。
【０４４３】
本実施例では、上記の初代細胞培養で得られた結果を確認するために、ゴーシェ病(GD)患者の皮膚線維芽細胞に由来する誘導多能性幹(iPS)細胞から、ドーパミン作動性ニューロンを作製した。ゴーシェ病(GD)iPS細胞の分析により、Oct4、Tra-1-60、SSEA-4およびnanogの発現が明らかになったが、これは、ゴーシェ病(GD)iPS細胞が、必須多能性因子、ならびに正常な染色体の数、大きさおよびゲノム構造を含有することを示している(図3Aおよび図3B)。過去に確立されたプロトコール(Seibler et al., J. Neurosci. 31:5970, 2011)によって、iPS細胞からドーパミン作動性ニューロンを誘導したところ、得られた細胞の約80％はニューロン特異的βIIIチューブリンを発現しており、約10％は、ドーパミン作動性マーカーであるチロシン水酸化酵素(TH)を発現していた(図4A)。遺伝子型決定分析により、野生型ではなくゴーシェ病(GD)のiPSニューロンが、GCaseポリペプチドの予想変異(N370S/84GG挿入)、およびより低レベルのGCaseポリペプチドおよび活性を持っていたことが確認された(図4B、表14)。加えて、野生型およびゴーシェ病(GD)細胞は、パーキンソン病(PD)を引き起こすことが過去に示されている他の変異を含有していなかった(表14)。ゴーシェ病(GD)iPSニューロンの放射性パルスチェイス実験により、長命タンパク質のタンパク質分解が野生型細胞と比較して減少しており、リソソーム阻害剤の添加は、タンパク質分解にさらなる影響は与えなかったことが明らかになった(図4C)。短命タンパク質のタンパク質分解の測定により、野生型細胞と比較して変化がないことが明らかになった(図4C、挿入図)。免疫蛍光およびウエスタンブロット分析により、ゴーシェ病(GD)iPSニューロンにおけるα-シヌクレインタンパク質レベルが、野生型細胞と比較して劇的に増加していることが明らかになった(図4Dおよび図4E)。本研究では、ゴーシェ病(GD)iPSニューロンにおいて、ハンチンチンのレベルには変化が観察されず、タウが少し変化したのみであったが、これは、GCaseポリペプチドの変異がα-シヌクレインレベルに主に影響を与えることを示している(図4Eおよび図4F)。
【０４４４】
（表１４）iPS細胞から作製した野生型およびゴーシェ病(GD)ニューロンから単離したゲノムDNAのSequenom MassARRAY遺伝子型決定分析
2014523881.tif 000033
【０４４５】
実施例2:GCaseポリペプチドの枯渇は、凝集依存性機序を介してα-シヌクレイン媒介性神経毒性を増強する
本実施例の実験では、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)は、重合依存性機序を介してα-シヌクレインの蓄積および神経毒性を促進することを実証する。
【０４４６】
本実施例では、レンチウイルスの形質導入によって、ヒトα-シヌクレインを過剰発現させた。ヒト特異的抗α-シヌクレインモノクローナル抗体(mAb)syn211およびLB509による免疫染色により、神経突起における予想斑点染色パターンは、シナプスのα-シヌクレイン集積と一致することが明らかになった(図5A)(Maroteaux et al., J. Neurosci. 8: 2804, 1988)。本実施例では、α-シヌクレインミスフォールディングの神経毒性への寄与を調べるために、パーキンソン病(PD)関連A53Tα-シヌクレイン変異体、および線維形成能がない人工変異体Δ71-82α-シヌクレイン(Giasson et al., J. Biol. Chem. 276: 2380, 2001)を初代ニューロンで発現させたところ、感染7日後(7dpi)において神経毒性を伴わずに(図6および図5B)、3つの変異体すべてのレベルの増加が観察された。対照的に、GCaseポリペプチドをノックダウン(KD)して、ヒト野生型α-シヌクレインを発現させることにより、神経フィラメント(NF)強度による生存率および神経容積の測定結果が、対照と比較して約25％減少した(図6Aおよび図6B)。モノクローナル抗体(mAb)syn211を用いてTriton X-100可溶性(T-可溶性)溶解物をウエスタンブロット分析することにより、毒性の増強と同時にα-シヌクレインタンパク質レベルが1.8倍増加したことが示された(図6C)。重要なことに、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)は、力価を合わせたA53Tα-シヌクレイン感染細胞の毒性を野生型α-シヌクレインと同程度にまで増強したのに対して、Δ71-82α-シヌクレインを発現するニューロンでは毒性は観察されなかった(図6Aおよび図6B)。凝縮核の測定によって、野生型α-シヌクレインの発現/GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)による毒性をさらに確認した(図5H、右側)。本実施例では、感染後しばらく経った時点(感染10日後(10dpi))でニューロンの生存率も決定したところ、野生型α-シヌクレイン/GCaseポリペプチド枯渇細胞では、毒性がさらに増強された(神経フィラメント(NF)強度による評価では約50％の生存率)ことが見出された(図5C)。GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)により、A53TおよびΔ71-82α-シヌクレインタンパク質のレベルが野生型α-シヌクレインと同程度にまで増加したことから(図6C)、毒性は、α-シヌクレインの71位〜82位のアミノ酸(これは、α-シヌクレインの重合に必要なほとんど疎水性の領域である(Giasson et al., J. Biol. Chem. 276: 2380, 2001))に依存しているように見える。
【０４４７】
実施例3:GCaseポリペプチドの枯渇によるα-シヌクレイン媒介性神経毒性の増強は、異なるα-シヌクレイン種の形成に依存する
本実施例の実験では、GCaseポリペプチド媒介性GlcCer代謝経路の変化は、毒性の可溶性および不溶性α-シヌクレイン種の形成に影響を及ぼし、可溶性高分子量(HMW)型α-シヌクレインの安定化を引き起こすことを示す。
【０４４８】
本実施例では、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)が、ニューロンにおけるα-シヌクレインの重合に影響を与えるかを直接的に決定した。溶解物を連続抽出し、Triton X-100可溶性(T-可溶性)およびT-不溶性画分に分離し、続いてモノクローナル抗体(mAb)LB509を用いてウエスタンブロットを行った。これにより、GCaseポリペプチドをノックダウン(KD)すると、Triton X-100可溶性(T-可溶性)モノマーα-シヌクレイン(18kDa)が増加し、Triton X-100不溶性(T-不溶性)α-シヌクレイン種は14〜39kDaサイズの間に泳動することが明らかになった(図6Dおよび図6E)。本実施例では、ネイティブサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、続いて収集画分のSDS-PAGE/ウエスタンブロットを用いて、Triton X-100可溶性(T-可溶性)オリゴマーα-シヌクレイン種の存在を決定した。GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)により、31〜34Åサイズの粒子として溶出する通常のモノマー形態に加えて、分子半径64〜95Åの高分子量(HMW)集合体が形成された(図6F)。興味深いことに、Δ71-82α-シヌクレインを発現するニューロンの分析により、GCaseポリペプチドをノックダウン(KD)した際の溶出プロファイルには変化がないことが明らかになったが(図6G)、これは、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)が、71位〜82位の残基に依存する可溶性高分子量(HMW)オリゴマーα-シヌクレインの形成を誘導することをさらに示している。これらの結果により、α-シヌクレインが可溶性オリゴマーおよび不溶性種を形成する能力は、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)によって誘導される神経毒性の重要な決定要因であることがさらに示唆された。
【０４４９】
上記のように、GCaseポリペプチドの枯渇によって生じるα-シヌクレインのレベルおよび毒性の増加は、一般的なリソソーム阻害に起因する可能性もあるし、GlcCer脂質代謝の変化による可能性もある。これら2つの可能性を見分けるために、本実施例では、野生型α-シヌクレインを発現するニューロンにおいて、ロイペプチンを用いてリソソームタンパク質分解を阻害し、神経毒性を評価した。ロイペプチン処理は、α-シヌクレイン媒介性神経毒性を増強しなかったことが見出された(図5Dおよび図5H)。生化学的分析により、ロイペプチン処理細胞ではTriton X-100不溶性(T-不溶性)α-シヌクレインが増加しているが、可溶性α-シヌクレインの量には変化がないことが明らかになった(図6Dおよび図6E)。免疫染色分析によってこれを確認したところ、ロイペプチン処理における全α-シヌクレイン免疫染色強度は、対照細胞と比較して増加していることが示された(図5F)。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析により、可溶性高分子量(HMW)α-シヌクレインは、ロイペプチン処理したニューロンでは検出不可能であったことも示されたが(図6H)、これは、それらが急速に消費されて不溶性種になることと一致している。さらに、本実施例では、ロイペプチン処理またはGCaseポリペプチドのノックダウン(KD)による全α-シヌクレイン(可溶性および不溶性)の増加を比較すると、両手法は同様の効果を有していたことが見出された(図5F)。ウエスタンブロット分析により、十分に確立されたリソソーム基質であるLC3-IIのレベルは、ロイペプチンまたはGCaseポリペプチドのノックダウン(KD)によって同等に増加していることも示された(図5E)。したがって、ロイペプチンまたはGCaseポリペプチドのノックダウン(KD)による全α-シヌクレインに対する効果は同様であるにもかかわらず、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)のみが、可溶性高分子量(HMW)α-シヌクレインの定常状態レベルを増加させた。本実施例では、連続抽出、続いてSDS-PAGE/クマシーブリリアントブルー(CBB)染色を使用して、ロイペプチン処理が全細胞タンパク質の溶解性に及ぼす効果を決定した。興味深いことに、ロイペプチン処理は、全不溶性タンパク質のレベルを約2倍増加させたのに対して、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)は効果がなかったことが見出された(図5G)。本実施例は、GCaseポリペプチドのノックダウン(KD)が、α-シヌクレインの溶解性に選択的に影響を与えることを示している。
【０４５０】
実施例4:GlcCerは、可溶性オリゴマー中間体を安定化させることによって、インビボにおけるα-シヌクレインの凝集に影響を及ぼす
本実施例の実験では、GlcCerは、アミロイド線維が形成されるオン経路(on-pathway)における可溶性オリゴマー中間体の形成を選択的に安定化させ、これらの可溶性オン経路中間体が蓄積し続けてGlcCer濃度が過度になると、チオフラビンT(thioT)陽性アミロイド線維が急速に形成されることを示す。
【０４５１】
本実施例では、精製GlcCerと脳ホスファチジルコリン(PC)との混合物から作製した脂質分散液を、α-シヌクレインと一緒に生理学的条件(pH7.4、37℃)でインキュベーションした。電子顕微鏡法(EM)分析により、重合GlcCerからなる管が形成されることが示されたが(図7G〜図7I)、これは、患者およびマウスモデルのゴーシェ細胞において過去に観察されたものと類似している(Lee, PNAS 61: 484, 1968)。生理学的条件下におけるα-シヌクレイン凝集の分析により、GlcCerは線維形成に効果を及ぼさなかったことが示されたが(図8)、これは、過去の観察結果と一致している(Martinez et al., Biochemistry 46:1868, 2007)。
【０４５２】
神経培養データにより、GCaseポリペプチドをノックダウン(KD)すると、α-シヌクレインとLAMP1との共局在化が増加することが示されたので、本実施例では次に、インビトロでリソソーム様環境をシミュレーションするために、GlcCerがα-シヌクレイン線維形成に及ぼす効果を酸性条件(pH5.0、37℃)下で評価した(図5Hおよび図5I)。パネルHおよびパネルIのデータにより、GCaseポリペプチドをノックダウンすると、リソソームマーカーであるLAMP1と共局在しているα-シヌクレイン斑点構造が増加することが示された(パネルH)。野生型α-シヌクレイン/GC枯渇細胞における凝縮核の頻度は、野生型α-シヌクレイン/scrb shRNA細胞と比較して増加しており(パネルH)、これは、ニューロンの生存率の減少と一致していた。ロイペプチン処理細胞では、α-シヌクレイン/LAMP1が共局在した斑点を含有する細胞の割合が劇的に増加(約90％)していることが実証されたが、感染7日後(7dpi)に評価した際に、凝縮核を有する細胞の割合は未処理対照細胞と比較して変化しなかった(パネルH)。しかしながら、ロイペプチン処理により、しばらく経った時点(＞感染12日後(12dpi))において神経毒性はもたらされなかった。野生型α-シヌクレインを発現する溶解物の細胞成分分画により、GCaseポリペプチド枯渇ニューロンのリソソーム濃縮画分(P2)は、scrb shRNA対照感染細胞と比較して多くのα-シヌクレインを含有していたことが示され;しかしながら、上清画分における可溶性α-シヌクレインの増加が観察された(パネルI)。P2において検出されたα-シヌクレインは、Triton X-100可溶性(T-可溶性)18kDaモノマー(パネルI、左側)ならびにTriton X-100不溶性(T-不溶性)モノマーおよびマルチマー(パネルI、右側)の形態であった。したがって、このデータにより、GCaseポリペプチドのノックダウンは、リソソーム濃縮P2画分に蓄積したα-シヌクレインとLAMP1との共局在化を増強したことが実証されたが、これにより、α-シヌクレインは、GCaseポリペプチド枯渇ニューロンのリソソーム内に蓄積する可能性があることが示唆された。
【０４５３】
本実施例の実験により、90％PCおよび10％GlcCerから作製した脂質分散液を含有する酸性反応物(PC90/GlcCer10)は、単独でα-シヌクレインを含有する対照反応物と比較して、α-シヌクレインの線維形成に有意に影響を及ぼさなかったことが明らかになった(図7Aおよび図8A)。しかしながら、総脂質量を一定に維持しながらGlcCerの量を75％に増加させると(PC25/GlcCer75)、不溶性チオフラビンT(thioT)陽性α-シヌクレイン線維の形成が遅延し、遅延時間が2時間から16時間に延びて、α-シヌクレイン線維形成の動態プロファイルが変化した(図7A)。
【０４５４】
上記のように、細胞培養実験からの生化学的なデータにより、GlcCerは、可溶性高分子量(HMW)型α-シヌクレインを選択的に増加させたことが示唆された(図6)。したがって、本実施例では、インビトロで観察された線維形成の遅延は、可溶性オリゴマー中間体種の動態安定化に起因していたと仮説した。これを試験するために、生化学的分析方法によって、PC25/GlcCer75を含有する反応物の誘導期(1〜16時間)に形成する種の性質を特徴付けた。100,000xgの遠心分離によって反応混合物の可溶性部分を得て、SEC/SDS-PAGEによって脂質を添加した1時間および5時間後に分析した。これにより、PC25/GlcCer75脂質分散液を含有する試料では、115〜38Åで溶出し、SDS-PAGEによって18kDaに泳動する高分子量(HMW)オリゴマーα-シヌクレインの量が増加していることが明らかになった(図7B)。さらに、PC25/GlcCer75を含有する反応物では、対照と比較して増加した量の可溶性SDSおよび熱安定性ダイマー(36kDa)、トリマー(54kDa)、ならびに36〜27Åサイズの粒子として溶出するより高次のオリゴマー種が検出された(図7B)。GlcCer誘導性可溶性オリゴマー種は1〜5時間の間に増加したように見えるのに対して、対照反応物におけるオリゴマーおよびモノマーは減少したが、これは、それらが消費されて不溶性線維になることと一致している(図7Bおよび図7C)。ネイティブゲル電気泳動により、720〜1048kDaサイズのα-シヌクレイン種の量が増加していることも明らかになった(図8Cおよび図8D)。さらに、本実施例では、他のスフィンゴ脂質は、可溶性オリゴマーの量を有意に変化させなかったことが見出されたが、これは、GlcCerによる特異的な効果を示している(図8Eおよび図8F)。ミスフォールディングα-シヌクレインを選択的に検出するsyn505抗体を用いた免疫電子顕微鏡法(EM)により、直径約25〜50nmの個々の球体構造(これは、合体してより大きな不定構造を形成するように見える場合もあった)が形成されることが実証された(図7G、iii)。syn505は、GlcCer単独の反応物(図7I)ではなくGlcCer管状構造(図7G、iおよびii)上においてもα-シヌクレインを直接的に検出したが、これは、ミスフォールディングα-シヌクレインがGlcCerと会合していることを示している。凝集傾向のある構造中間体を検出するのに使用される蛍光色素である8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(ANS)結合剤(Stryer, 1965)によって、α-シヌクレイン-GlcCer反応物をさらに分析した。PC25/GlcCer75と一緒にインキュベーションした可溶性α-シヌクレイン試料では、対照反応物と比較して増強したANS蛍光が観察されたが、これは、GlcCerの添加が、溶媒に曝露された疎水性領域を増加させる構造変化をもたらすことを示している(図7D)。タンパク質の疎水性変化は凝集傾向と相関することから、この観察結果は、GlcCerが、線維形成反応の誘導期において、集合能力を有する可溶性中間体種の形成を安定化させることを示している。
【０４５５】
さらに、本実施例では、動態プロファイルの調査により、GlcCerは線維形成の開始を2〜16時間遅延させたが、この段階が開始すると線維集合を加速させもしたことが示された(図7A)。集合が2〜24時間の間に起こった対照反応物と比較して、PC25/GlcCer75を含有する反応物の線維集合期は、16〜24時間の間に起こった。さらに、反応の最終段階における最大チオフラビンT(thioT)シグナルは、対照反応物と比較して2〜3倍高かった(図7A)。線維形成反応の最終段階に形成された凝集種を、集合が完了して平衡に達した後に(28時間の時点で)さらに分析した。ペレット状(P)画分におけるアミロイドおよび非アミロイド凝集体の両方を検出する100,000xgの遠心沈降分析により、GlcCerは、ペレット状のα-シヌクレインタンパク質の量に効果を及ぼさなかったことが明らかになった(図7E)。沈降分析に使用した同じ反応混合物では、チオフラビンT(thioT)によるアミロイド生成性α-シヌクレインの測定により、PC25/GlcCer75を含有する反応物において検出されたアミロイドの量が3倍増加していることが明らかになった(図7E、下側)。24時間の時点におけるα-シヌクレイン/GlcCer反応物の免疫電子顕微鏡法(EM)分析により、GlcCer管から伸びているように見えた約14nm幅のフィブリル構造の存在が確認されたのに対して(図7H)、α-シヌクレイン単独の反応物は、フィブリル凝集体(図7F、i〜iii)および不定形凝集体(図7F、ivおよびv)の両方を含有していた。まとめると、このデータは、GlcCerが、アミロイド線維が形成されるオン経路における可溶性オリゴマー中間体の形成を選択的に安定化させることを示している。しかしながら、これらの可溶性オン経路中間体の連続的な蓄積がインビトロでは2〜16時間の間に起こることにより、GlcCer濃度は最終的には過度になる可能性が高く、チオフラビンT(thioT)陽性アミロイド線維が急速に形成される。
【０４５６】
実施例5:ゴーシェ病(GD)マウスでは、可溶性および不溶性α-シヌクレイン種の蓄積が起こる
本実施例の実験では、GCaseポリペプチドの枯渇は、インビボにおける可溶性オリゴマーおよび不溶性α-シヌクレインの形成を促進することを実証するが、これは、上記細胞培養およびインビトロのデータと一致している。
【０４５７】
本実施例では、内因的に発現するα-シヌクレインタンパク質のレベルが上昇したかを決定するために、前述のゴーシェ病(GD)マウスモデル(4L/PS-NA)の脳組織を分析した。このマウスモデルの過去の分析では、低レベルのGCaseポリペプチド活性、GlcCerの神経蓄積、および20週齢までに神経機能の重度の低下が示された(Sun et al., J. Lipid Res. 46: 2102, 2005)。GlcCerに加えて、他のスフィンゴ脂質のレベルも決定したところ、ラクトシルセラミド、GM2およびGD3の蓄積が示されたのに対して、セラミドのレベルは依然として変化していなかった(図9Aおよび図9B)。本実施例における神経病理学的分析により、好酸性球状物質の存在が明らかになったが、これは、正常な神経構造を示した野生型マウスと比較して、黒質(SN)および皮質(Ctx)を含むゴーシェ病(GD)マウスの複数の脳領域では、変性ニューロンが存在することを示唆している(図10Aおよび図10D)。これらの変性変化は、これらの領域におけるα-シヌクレインレベルの増加と同時に起こった(図10B)。免疫蛍光分析により、α-シヌクレインの蓄積は斑点構造(＜直径5μm)の形態で存在しているのに対して、野生型マウスは、α-シヌクレインについて予想される正常な神経網染色パターンを示したことが明らかになった(図10B〜図10D)。小脳、海馬および脳幹を含む他の神経領域においてもα-シヌクレインの蓄積が観察されたように、これらの変化は黒質(SN)および皮質(Ctx)に限定されなかった(Xu et al., Mol. Genet. Metab. 102: 436, 2010)。
【０４５８】
加えて、本実施例では、ニューロン特異的マーカーであるNeuNで同時染色することによって、神経内および神経外両方のα-シヌクレインの蓄積を同定したが(図10C)、定量分析では、有意なニューロン欠損は示されなかった(図10D)。Triton X-100緩衝液、次いで2％SDS緩衝液中に連続抽出することによって、4L/PS-NAにおいてα-シヌクレインの溶解性を分析した。全α-シヌクレインを検出する抗体であるsyn202およびSNL-1の両方により、4L/PS-NAマウスにおけるTriton X-100可溶性(T-可溶性)α-シヌクレインレベルは、野生型マウスと比較して増加していることが明らかになった(図10E、左側および図10F)。syn202およびsyn505の両方で検出したところ、Triton X-100不溶性(T-不溶性)画分は、野生型マウスでは予想された低レベルのα-シヌクレインを示し、4L/PS-NAマウスではより凝集したα-シヌクレインを示した(図10E、右側および図10F)。サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によってTriton X-100可溶性(T-可溶性)レベルを分析することにより、推定上のオリゴマー形態(120〜70Åおよび51〜44Åサイズの種)のレベルは増加しているのに対して、モノマーは対照マウスと同様であったことが示された(図10Gおよび図10H)。可溶性高分子量(HMW)α-シヌクレインの定量により、4L/PS-NAマウスでは対照マウスと比較して4倍増加していることが明らかになった(図10Fおよび図10H)。十分に特徴付けされた前述の別のゴーシェ病(GD)マウスモデル(ゴーシェ病(GD)関連D409H機能喪失型変異を持つGCaseポリペプチド)(Xu et al., Am. J. Pathol. 163:2093, 2003)において、α-シヌクレインの分析を確認した。これにより、D409Hマウスでは、免疫染色分析によって観察したところ、α-シヌクレイン斑点構造が同様に増加しており(図9C)、可溶性オリゴマーおよび不溶性α-シヌクレイン種がより高レベルであった(図9D)ことが明らかになった。最後に、十分に確立された線虫モデルを使用することにより、GCaseポリペプチドの枯渇は、インビボにおけるα-シヌクレインの蓄積を引き起こすことがさらに実証された(図9E)。
【０４５９】
実施例6:ゴーシェ病(GD)脳における可溶性高分子量(HMW)α-シヌクレインレベルの上昇は、神経変性を伴う
本実施例の実験は、GCaseポリペプチドの欠損は、オリゴマーα-シヌクレインの形成を促進することを示唆しており、II型およびIII型ゴーシェ病(GD)脳におけるこれらのオリゴマーの発生は、それらが、年齢依存性乳児性ゴーシェ病(GD)の病因における役割も果たし得ることを示唆している。本実施例のデータは、毒性オリゴマーα-シヌクレインがGBA1変異を持つ患者において上昇しており、ニューロパチー型疾患に選択的に関連することも実証している。
【０４６０】
上記のように、インビトロの細胞培養およびゴーシェ病(GD)動物モデルのデータにより、GlcCerの蓄積は、可溶性α-シヌクレインオリゴマーレベルの上昇につながったことが示唆された。したがって、本実施例では、ゴーシェ病(GD)を有する患者から得られたヒト死後脳試料において、これらの種を同定することを重視した。ネイティブサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)を行い、続いてモノクローナル抗体(mAb)syn211を使用して収集画分のSDS-PAGE/ウエスタンブロットを行うことによって、皮質試料のTriton X-100可溶性(T-可溶性)画分を分析した。GBA1変異を有しない健常対照の分析(表15)により、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって34Åサイズの粒子として主に溶出し、SDS-PAGEによって18kDaに泳動するモノマーヒトα-シヌクレインの典型的に観察される予想溶出プロファイルが明らかになった(図11A〜図11C)。非神経型I型ゴーシェ病(GD)であると病理学的および臨床的に確認された患者2人の皮質のTriton X-100可溶性(T-可溶性)溶解物の分析により、α-シヌクレインの溶出プロファイルは対照と類似していたが(図11Dおよび図11E)、モノマーα-シヌクレインの総レベルは上昇していたことが明らかになった(α-シヌクレインタンパク質レベル、対照に対する％):対照＝100±12.6、I型ゴーシェ病(GD)(パーキンソン病(PD)なし)＝＊243±53、値は平均±平均の標準誤差(SEM)である、＊p＜0.05、n＝3(対照)、n＝2(I型ゴーシェ病(GD))。非定型パーキンソン病(APD)であると過去に記録されているゴーシェ病(GD)患者の脳溶解物を分析したところ(Tayebi et al., Mol. Genet. Metab. 73: 313, 2001)、α-シヌクレインレベルの劇的な増加が観察された(図11F)。α-シヌクレインは、対照と同様に、34Åサイズの粒子として溶出し、SDS-PAGEによって18kDaに泳動したが、相当割合(全Triton X-100可溶性(T-可溶性)の50％)が、42〜45Åのより大きな推定上のオリゴマー種(または110〜140kDaの球状タンパク質)としても溶出した。変性SDS-PAGEによって分析すると、このオリゴマー画分のα-シヌクレインは、22、44および75kDaの熱安定性種として分離した(図11F)。本実施例のデータにより、オリゴマー種型のTriton X-100可溶性(T-可溶性)α-シヌクレインの増大は、ゴーシェ病(GD)/非定型パーキンソン病(APD)の脳に主に存在することが実証された。
【０４６１】
さらに、本実施例では、GCaseポリペプチドの変異がホモ接合性またはヘテロ接合性(表15)の患者であって、レビー小体型認知症(DLB)であると診断された患者において、α-シヌクレインオリゴマーレベルの上昇が検出された(図11Gおよび図11K)。II型ゴーシェ病(GD)であると診断された乳児およびIII型ゴーシェ病(GD)であると診断された3歳児から得られた死後脳溶解物の分析により、36Å超で溶出するオリゴマーα-シヌクレインが増加していることも示されたが(図11H〜図11J)、試料間におけるいくらかの変動が観察された。syn211モノクローナル抗体(mAb)で検出されたオリゴマーα-シヌクレインレベルを定量したところ、ホモ接合体およびヘテロ接合体両方のGBA1変異保因者であって、神経型の表現型を有する保因者は、対照と比較して有意に高レベルのオリゴマーを含有していたことが見出された(図12C)。これらのゴーシェ病(GD)試料は、より少ないGCaseポリペプチドおよび活性レベルを含有していたことも確認された(図12A、図12Bおよび図12E)。
【０４６２】
本実施例では、45Åサイズのオリゴマー画分も分析した。病的なオリゴマーα-シヌクレインを選択的に検出し(Duda et al., Ann. Neurol. 52: 205, 2002)、潜在的な毒性型を無毒α-シヌクレイン種と区別できる(Tsika et al., J. Neurosci. 30: 3409, 2010)抗体であるモノクローナル抗体(mAb)syn303を用いて、これらを分析した。本発明者らは、すべての神経型ゴーシェ病(GD)試料において、syn303の免疫反応性が増加したことを見出した(図11L、図12D)。ほとんどの症例では、syn303は22、44および75kDaの種と反応し、これらはsyn211でも検出された(図11L)。
【０４６３】
（表１５）対照およびゴーシェ病(GD)患者の臨床データ
2014523881.tif 000034
＊各全細胞溶解物について、3回反復の活性測定を実施した(値は平均±SEMである)、NA、該当なし;WC、全細胞ホモジネート;P2、リソソーム濃縮画分、DLB、レビー小体型認知症。
【０４６４】
実施例7:α-シヌクレインの過剰発現は、GCaseポリペプチドの細胞内輸送を阻害し、GCaseポリペプチド活性の減少をもたらす
本実施例の実験では、α-シヌクレインタンパク質レベルの正常変動が、インビボにおけるGCaseポリペプチドのリソソーム成熟および活性をモジュレーションしていることを説明する。本実施例のデータは、パーキンソン病(PD)および他のシヌクレイノパチーで観察されたα-シヌクレインレベルの上昇が、正常なGCaseポリペプチドのリソソーム活性の減少につながり、これが今度は、オリゴマーα-シヌクレインのさらなる増加および安定化に寄与し得ることも示唆している。
【０４６５】
特発性パーキンソン病(PD)を有するほとんどの患者はα-シヌクレインタンパク質レベルが必ず上昇していたが、GBA1遺伝子の変異を持っていないので、GCaseポリペプチドの正常なリソソーム機能を有すると予想される。本実施例では、野生型GCaseポリペプチドを発現するH4細胞および初代皮質ニューロンにおいて、α-シヌクレインを過剰発現させ、小胞体(ER)後形態を測定して、α-シヌクレインがGCaseポリペプチドのリソソーム成熟活性を破壊するかを決定した。SDS-PAGE/ウエスタンブロット、すなわち、タンパク質のグリコシル化から生じる種々のGCaseポリペプチド形態の分子量(MW)分析によって、GCaseポリペプチドの細胞内輸送を評価した。小胞体(ER)形態のGCaseポリペプチドは60kDaに泳動したが、小胞体(ER)後GCaseポリペプチド形態は、60kDaよりも上に泳動した(Erickson et. al, 1985)。誘導H4細胞の全細胞溶解物の分析により、24または32時間にわたってDoxを添加してα-シヌクレインの発現レベルを低下させることにより、60kDaの小胞体(ER)形態が減少するとともに、小胞体(ER)後GCaseポリペプチド形態が同時に増加したことが示された(図13A)。同様に、初代皮質ニューロンにおいて、ヒト野生型およびA53Tα-シヌクレインを過剰発現させることにより、小胞体(ER)形態の蓄積、および60kDaよりも上に泳動する小胞体(ER)後形態の減少が引き起こされて、小胞体(ER)後/小胞体(ER)GCaseポリペプチド比も変化した(図13B)。力価を合わせて野生型およびA53Tα-シヌクレイン含有プラスミドを感染させることにより、A53Tのタンパク質発現はより低いにもかかわらず、小胞体(ER)後/小胞体(ER)GCaseポリペプチド比がほぼ等しく変化したが、これは、A53Tは、GCaseポリペプチド輸送を、野生型タンパク質と比較してより強力に阻害することを示している(図13B)。興味深いことに、Δ71-82α-シヌクレインは、野生型α-シヌクレインよりも僅かに高いレベルで発現していたところ、これは、小胞体(ER)後/小胞体(ER)GCaseポリペプチド比の軽度の変化のみを原因とするものであったが、空ベクターの対照と比較して有意差はなかった(図13B)。ウエスタンブロットによって観察されたGCaseポリペプチドのグリコシル化パターンの変化が、GCaseポリペプチドのより低いリソソーム活性に対応していたことを確認するために、初代ニューロン培養物のリソソーム(P2)およびミクロソーム(P3)濃縮画分(図14Aおよび図14B)において、酵素活性を測定した。P2画分では、野生型およびA53Tα-シヌクレインの両方の発現により、対照と比較して、GCaseポリペプチド活性は有意に減少し、P3の活性は同時に増加した(図13C)。反対に、Δ71-82α-シヌクレインの発現は、GCaseポリペプチドのリソソーム活性に影響を与えなかった(図13C)。溶解物のendo H処理によってこれらの結果を確認したところ、野生型α-シヌクレインを発現する細胞のendo H処理試料では、60kDaよりも下に泳動するendo H感受性GCaseポリペプチドのレベルが、対照条件と比較して高いことが明らかになった(図14C)。加えて、別のアミロイド形成タンパク質であるポリQ伸長ハンチンチン断片548-72QがGCaseポリペプチドの成熟を阻害する能力を試験したところ、本研究では変化が観察されなかった(図14C)。さらに、α-シヌクレインを発現するニューロンのGBA1 mRNAの測定結果は、対照条件と比較して違いがなかったことから、α-シヌクレインによる小胞体(ER)GCaseポリペプチドの蓄積はタンパク質レベルで起こったことが確認された(図14D)。感染ニューロンのP2画分における他のリソソームタンパク質の酵素活性により、α-シヌクレイン発現によるごく僅かな変化が明らかになったが、これは、α-シヌクレインがGCaseポリペプチド活性に選択的に効果を及ぼすことを示唆している(図14E)。
【０４６６】
さらに、本実施例では、GCaseポリペプチドのウエスタンブロットによりヒト皮質物質を分析することによって、GCaseポリペプチドのグリコシル化パターンが、インビボのα-シヌクレインタンパク質レベルに感受性であるかを決定した。健常であると報告されている対照であって、一般的なGBA1変異を有さず、65〜80歳齢の年齢の対照数人(表16および表17)の脳組織を分析すると、α-シヌクレインの発現レベルについての自然変動が対象間で認められた。対照試料1、対照試料2、対照試料4および対照試料6は、非常に低いα-シヌクレインレベルを含有していた試料3および試料5と比べて中〜高レベルのα-シヌクレインを有すると認められた(図13D)。ウエスタンブロットによってGCaseポリペプチドのグリコシル化パターンを分析したところ、小胞体(ER)後/小胞体(ER)GCaseポリペプチド比について劇的な違いが観察され、これはα-シヌクレインレベルと相関していた。すべての試料は、同様の小胞体(ER)後GCaseポリペプチドレベルを有するように見えたが、低α-シヌクレインの試料(試料3および試料5)が含有していた60kDaの小胞体(ER)形態は、かなり少なかった(図13D)。endo H消化により、endo H処理後に60kDaよりも下に泳動した小胞体(ER)含有GCaseポリペプチドは、より高レベルであることも確認された(図14F)。すべての低および高α-シヌクレイン含有試料の全細胞溶解物の皮質組織におけるGCaseポリペプチド活性レベルをさらに分析したところ、活性の違いは観察されなかった(図14H、左側)。しかしながら、P2およびP3のGCaseポリペプチド活性を決定したところ、「高」α-シヌクレイン試料のミクロソーム濃縮P3画分は、有意に高レベルの活性を含有していたことが見出されたのに対して、P2画分では変化が観察されなかった(図14H)。syn303を用いたウエスタンブロット分析により、「高」α-シヌクレイン試料C6におけるオリゴマー酸化α-シヌクレインレベルは、C5と比較して高いことも明らかになった(図14G)。これらの知見により、α-シヌクレインタンパク質レベルの正常変動が、インビボにおけるGCaseポリペプチドのリソソーム成熟および活性をモジュレーションしていることが示唆された。
【０４６７】
α-シヌクレインレベルの上昇は、ニューロンにおけるGCaseポリペプチドの輸送に影響を与えるという上記データの観察結果により、特発性パーキンソン病(PD)脳では、リソソームGCaseポリペプチド機能が低下している可能性があるという仮説が導かれた。本実施例では、パーキンソン病(PD)脳の帯状皮質に由来するTriton X-100可溶性(T-可溶性)溶解物における全GCaseポリペプチドレベルは、年齢および死後時間適合対照と比較して約40％減少していたことがさらに観察された(図13E)。加えて、P2画分におけるGCaseポリペプチド活性は、年齢適合対照と比べて約50％減少していたのに対して、P3画分では変化が観察されなかった(図13E、下側)。遺伝子型決定分析により、ヘテロ接合性変異N370Sを含有していた1個の試料を除いて、これらの患者は、GBA1の変異を持っていなかったことが明らかになった(表18)。1個の試料(PD4)では、GCaseポリペプチド活性が予想された50％よりも低く減少していたが(対照の38％)、これはおそらくは、α-シヌクレインの蓄積によってGCaseポリペプチドがさらに阻害されたことを示している(表18)。表19は、図13に関するものである。
【０４６８】
（表１６）対照の臨床データ
2014523881.tif 000035
C、白人;PMI、死後間隔;NA、該当なし
【０４６９】
（表１７）対照のSequenom MassARRAY遺伝子型決定分析
2014523881.tif 000036
【０４７０】
（表１８）対照およびパーキンソン病(PD)試料のSequenom MassARRAY遺伝子型決定分析
2014523881.tif 000037
O.R.、オッズ比;NC、細胞なし
【０４７１】
（表１９）対照およびパーキンソン病(PD)患者の臨床データ
2014523881.tif 000038
C、白人;m、男性;f、女性;PMI、死後間隔;NA、該当なし
【０４７２】
実施例8:神経および非神経プロテイノパチーの処置としてのGCaseポリペプチド活性化
本実施例の実験では、薬理学的シャペロン処理またはGCaseポリペプチドの過剰発現のいずれかによってGCaseポリペプチド機能を増強することにより、リソソーム分解経路が活性化されたことを実証する。したがって、本実施例のデータは、GCaseポリペプチド機能の活性化が、α-シヌクレインの蓄積を特徴とする疾患だけではなく、神経および非神経タンパク質の蓄積を特徴とする他の疾患においても治療上有益であり得ることも示唆している。
【０４７３】
本実施例では、非罹患対照のiPS細胞から作製したヒトドーパミンニューロンを、GCaseポリペプチドの薬理学的シャペロンアクチベーターであるイソファゴミン(IFG)で処理した。遺伝子型決定分析により、これらの細胞は、N370S、L444P、L84TERおよびE326Kを含む最も一般的に見られるGBA1変異のいずれも持たないことが確認された。野生型ニューロンを100μMのIFGで5日間処理し、続いて1日ウォッシュアウトすることにより、GCaseポリペプチドレベルが増加した(図15Aおよび図15B)。この増加は、野生型GCaseポリペプチドが小胞体(ER)で時にはミスフォールディングされて分解された(小胞体(ER)で製造された全体の約30％)が、IFGが、野生型のミスフォールディング形態をも安定化させるように見えたという事実による可能性が高い。次いで、下記のように、放射性パルスチェイスによってタンパク質分解速度を決定したところ、IFG処理ニューロンでは、対照と比較して3倍増加していることが明らかになった(図15C)。これにより、GCaseポリペプチド活性は、分解能力の増強と相関することが示唆された。
【０４７４】
上記考察により、IFGによるGCaseポリペプチド活性のモジュレーションは、リソソームタンパク質分解を増大させたことが示された。本実施例では、非天然部位に結合する化合物であって、GCaseポリペプチドのアロステリックアクチベーターとして作用できるので、IFGとは異なり、GCaseポリペプチドを活性化させるのにウォッシュアウトを必要としない化合物を用いても、上記効果を再現できるかをさらに決定した。最近同定された一連のアロステリックGCaseポリペプチドアクチベーター(Goldin et. al., PLoS One 7: e29861, 2012)からのこのような化合物を試験したところ、化合物処理後に、リソソーム分解活性能力の有意な増強が観察された(図16A〜図16B)。
【０４７５】
さらに、本実施例では、GCaseポリペプチドの過剰発現が、非神経細胞株におけるリソソームタンパク質分解を直接的に増強する能力を有していたかを評価した。mycタグ化GCaseポリペプチド発現構築物をHela細胞にトランスフェクションし、放射性パルスチェイスによってリソソームタンパク質分解を評価した(図17A)。GCaseポリペプチドの過剰発現により、タンパク質分解は、GFP対照トランスフェクション細胞と比較して約40％増加した(図17B)。この効果は、十分に確立されたリソソーム阻害剤であるロイペプチンおよび塩化アンモニウムを添加することによって完全に無効化された。これにより、GCaseポリペプチドを過剰発現させると、主にリソソーム媒介性分解経路が増強したことが示された。異なるアッセイにより、GCaseポリペプチドの過剰発現がリソソームプロテアーゼカテプシンBの活性に及ぼす効果を測定することによっても、この効果を確認した。細胞透過性蛍光タグ化カテプシンB基質(MAGIC RED cathepsin detection kit, Immunochemistry Technologies, www.immunochemistry.com)をトランスフェクションHela細胞に添加し、基質のウォッシュアウト後に、生細胞においてこの基質の分解を決定した。これにより、GCaseポリペプチドトランスフェクション細胞におけるカテプシンB活性は、GFPを発現するものと比較して増加していることが明らかになった(図17C)。
【０４７６】
実施例9:神経および非神経プロテイノパチーの処置としての分泌経路の刺激
本実施例の実験では、Rab1aポリペプチドの過剰発現による分泌経路の増強はリソソーム機能を増強し、重要なことに、ヒト中脳ドーパミンニューロンにおけるα-シヌクレインレベルを減少させたことを実証する。本実施例のデータにより、Rab1aポリペプチドは、GCaseポリペプチドの過剰発現の効果と同様に、リソソームタンパク質分解を一般的に刺激する能力を有することが例証された。したがって、本実施例のデータは、Rab1aポリペプチド活性の刺激も、タンパク質の蓄積を特徴とする他の疾患において治療効果を提供するであろうことを示唆している。また、Rab1aおよびGCaseポリペプチドは両方とも普遍的に発現しているので、この効果は、神経および非神経組織の両方において明らかなはずである。
【０４７７】
上記のように、タンパク質の蓄積はGCaseポリペプチドのリソソーム輸送を混乱させ、これがGCaseポリペプチド活性の減少につながり、したがってリソソームタンパク質分解の障害をもたらした。本実施例では、分泌経路の刺激によるリソソーム酵素輸送の増強が、リソソーム機能の増加およびα-シヌクレインの減少をもたらすかを調査した。したがって、本実施例では、iPSニューロンにおいてレンチウイルスを感染させることによって、GTPase Rab1aポリペプチドを過剰発現させて、酵素輸送を刺激した。Rab1aポリペプチドは、分泌経路の小胞体(ER)-ゴルジ段階において特異的に機能することが立証されている(Duvernay et al., Cell Signal 17: 1457, 2005)。パーキンソン病(PD)患者の再プログラム化線維芽細胞(Coriell株ND27760)に由来するヒトiPSドーパミンニューロンにおいて、Rab1aポリペプチドの効果を決定した。これらの細胞は、α-シヌクレインをコードするSNCAを含有するゲノム領域に三重変異を持っており、これがタンパク質の過剰発現およびリソソーム輸送の障害につながっている。ヒトパーキンソン病(PD)ドーパミンニューロンにおけるRab1aポリペプチドの過剰発現は、感染多重度5(moi5)で感染させた場合にα-シヌクレインレベルを劇的に減少させた(図18A)。さらに、本実施例では、カテプシンB活性をモニタリングすることによって、Rab1aポリペプチドがリソソーム機能を増強するかを決定した。上記のように、トランスフェクションHela細胞においてカテプシンB活性を決定したところ、カテプシンB活性が増加していることが明らかになったが、これは、Rab1aポリペプチドによってリソソーム機能が増強されることを示唆している(図18B)。
【０４７８】
実施例10:アロステリック結合化合物によるリソソームGCaseポリペプチドの活性化は、パーキンソン病(PD)患者のヒト中脳ニューロンにおけるα-シヌクレインレベルを減少させる
本実施例の実験では、アロステリック結合化合物は、GCaseポリペプチドの活性化およびα-シヌクレインレベルの減少をもたらすことを実証する。したがって、本実施例のデータは、GCase酵素の活性部位に干渉しないアロステリック化合物が、シヌクレイノパチー、およびタンパク質凝集体の蓄積を特徴とする他の神経変性疾患の処置についての新規な治療戦略に相当することを示唆している。
【０４７９】
本実施例では、本発明において述べたように、健常対照、および三重のSNCAゲノム領域を持っているパーキンソン病(PD)患者から、ヒト中脳iPSドーパミンニューロンを作製し、GCaseポリペプチドアロステリックアクチベーターNCGC00188758の存在下で培養した。ウエスタンブロット分析によってα-シヌクレインレベルを決定したところ、健常非罹患対照のニューロンおよびパーキンソン病(PD)患者から作製したニューロンの両方において、α-シヌクレインタンパク質が用量依存的に減少していることが実証された(図19A)。本実施例では、GCaseポリペプチドアクチベーターによる処理は全GCaseタンパク質レベルを増加させ、小胞体(ER)後形態を増加させたことも示されたが、これは、リソソームへのフラックスの増強を示している(図19B)。
【０４８０】
実施例11:GCaseポリペプチドのシャペロンと抗酸化剤との組み合わせでニューロンを処理することにより、小胞体(ER)後形態のGCaseが増強される
本実施例の実験では、GCaseポリペプチドを安定化および活性化させる化合物を抗酸化剤と組み合わせることが、上記α-シヌクレインの蓄積によって開始される病原性フィードバックループのより効率的な破壊につながることを説明する。本実施例のデータは、GCaseポリペプチドの活性化、分泌経路の増強および抗酸化機能を含む3つの重要なニューロン経路を標的とする併用療法が、これらの経路のいずれかを個別に標的とする治療法と比較してより大きな利益を提供するであろうことも示唆している。
【０４８１】
本実施例では、GCaseポリペプチドの薬理学的シャペロンであるIFGを抗酸化剤であるn-アセチル-システイン(NAC)と組み合わせることが、パーキンソン病(PD)のiPSニューロンにおけるGCaseポリペプチドの成熟に及ぼす効果を試験した。IFG、NACのいずれかで、またはIFGおよびNACを合わせてニューロンを処理し、ウエスタンブロットによってGCaseポリペプチドの成熟を分析した。これにより、IFGおよびNACの両方を合わせた処理は、小胞体(ER)後(成熟)GCaseポリペプチドの量を、いずれか単独の処理と比較して3倍増加させたことが示された(図20A〜図20B)。
【０４８２】
実施例12:ガングリオシドは、α-シヌクレインの凝集に影響を及ぼす
本実施例の実験では、スフィンゴ脂質、すなわちガングリオシドは、可溶性α-シヌクレインオリゴマーを安定化させて増強することを実証する。
【０４８３】
10:1の脂質:タンパク質比を使用して、ガングリオシドGM1または全脳ガングリオシドのいずれかと一緒に、α-シヌクレインを15時間インキュベーションすることにより、可溶性α-シヌクレインオリゴマーは、α-シヌクレイン単独の対照と比較して劇的に安定化および増強された(図21)。
【０４８４】
ガングリオシドーシスを有する患者の脳におけるα-シヌクレインの蓄積についての文献(Suzuki et al., Acta Neuropathol 114: 481, 2007)と合わせると、本実施例のデータは、パーキンソン病および他のシヌクレイノパチーでは、ガングリオシド代謝酵素を増強することによってガングリオシドレベルを低下させることに利益があるであろうことを示唆している。これらの酵素には、リソソームβ-ヘキソサミニダーゼA/B/Sおよびβ-ガラクトシダーゼアイソフォーム1が含まれるが、これらに限定されない。
【０４８５】
実施例13:リソソーム活性化剤によるリソソーム酵素活性のモジュレーションをモニタリングするための例示的なアッセイ
高速液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)加水分解アッセイ:このアッセイでは、質量分析計に接続された液体クロマトグラフィーを使用して、試料(例えば、脾臓ホモジネート)中のリソソーム酵素(例えば、GCase)が、蛍光基質前駆体(pro-fluorescent substrates)である4-メチルウンベリフェリル-β-d-グルコピラノシド(4MU-Glc、青色蛍光発生基質)またはC12-BODIPY-GlcCerを切断する能力を評価する。次いで、停止させた酵素反応物に対して、HPLCを使用してクロマトグラフィーを実施する。リソソーム活性化剤の活性は、このアッセイを使用して、基質代謝回転の用量依存的な活性化をモニタリングすることによって分析できる。
【０４８６】
マイクロスケール熱泳動(MST)アッセイ:MSTは最近開発された技術であり、制御された温度勾配下における分子運動を測定する。このアッセイは、リソソーム活性化剤がGCaseポリペプチドと物理的に相互作用するかを決定するのに適用できる。MSTでは、リガンドに結合すると、ポリペプチド分子の運動が温度勾配に沿って変化するのを示すことができる蛍光標識ポリペプチド標的を使用する。そのタンパク質所要量が少ないことおよびその感度の理由により、この技術は結合分析に最適である。
【０４８７】
吸収・分布・代謝・排泄(ADME)アッセイおよび薬物動態(PK):インビボ評価のための考えられるリソソーム活性化剤候補の選択は、これらの剤に対してADME試験を実施することによって行うことができる。代表的なリソソーム活性化剤の安定性は、マウス肝臓ミクロソームで調べることができる。最も強力なリソソーム活性化剤の透過性は、標準的なcaco-2透過性アッセイで分析できる。例えば、0.3の流出比は、caco-2単層で発現しているABCトランスポーターによって化合物が認識されないので、良好な経口吸収性およびおそらくは血液脳関門透過性を有すると予想されることを示唆している。
【０４８８】
ADME試験からのリソソーム活性化剤の効力に基づいて、インビボ原理証明試験のために、マウス薬物動態(PK)試験を開始できる。
【０４８９】
材料および方法:
抗体
以下の抗α-シヌクレイン抗体を使用した:Syn202(モノクローナル抗体(mAb), Covance, http://www.covance.com, # MMS-529R, 1:1000ウエスタンブロット［WB］)、Syn505(モノクローナル抗体(mAb), Invitrogen, http://www.invitrogen.com, # 35-8300, 1:500ウエスタンブロット(WB))、SNL-1(ポリクローナル抗体(pAb), Benoit I. Giasson, University of Pennsylvaniaのギフト, 1:1000ウエスタンブロット(WB))、syn211(モノクローナル抗体(mAb), Sigma- Aldrich, http://www.sigma-aldrich.com, # S_5566, 1:1000ウエスタンブロット(WB), 1:400免疫細胞化学(ICC))、LB509(モノクローナル抗体(mAb), Invitrogen # 18-0215, 1:500ウエスタンブロット(WB), 1:100免疫細胞化学(ICC))、Syn303(モノクローナル抗体(mAb), Harry Ischiropoulos, The Children's Hospital of Philadelphiaから贈与, 1:500ウエスタンブロット(WB))、抗α-シヌクレインC末端(ポリクローナル抗体(pAb), Abcam, http://www.abcam.com, #ab85862, 1:200 IHC, 図10B)、抗α-シヌクレイン(ポリクローナル抗体(pAb), Abcam, #ad52168, 1:250 IHC, 図10C)。
【０４９０】
他の抗体:抗神経特異的エノラーゼ(ポリクローナル抗体(pAb), Polysciences, http://www.polysciences.com, #16625, 1:2000ウエスタンブロット(WB), 47 kDa)、抗ビメンチン(モノクローナル抗体(mAb), BD PharMingen, http://www.bdbiosciences.com, # 550513, 1:500ウエスタンブロット(WB), 57 kDa)、抗グルコセレブロシダーゼ(ポリクローナル抗体(pAb), Sigma- Aldrich, # G4171, 1:1000ウエスタンブロット(WB), 55〜70 kDa(トリスグリシン中), 51〜70 kDa(MOPS/ビス-トリス中))、抗α-チューブリン(モノクローナル抗体(mAb), Sigma-Aldrich, # T-6074, 1:5000ウエスタンブロット(WB), 50 kDa)、抗LC3(ポリクローナル抗体(pAb), Abgent, http://www.abgent.com, # AP 1802a, 1:500ウエスタンブロット(WB), 14〜16 kDa)、抗LC3(ポリクローナル抗体(pAb), Cell Signaling, http://www.cellsignal.com, #2775, 1:50免疫細胞化学(ICC))、抗神経フィラメント(モノクローナル抗体(mAb), Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, http://dshb.biology.uiowa.edu, # 2H3, 1:1000免疫細胞化学(ICC))、抗LAMP2(ポリクローナル抗体(pAb), Invitrogen, #51- 2200(Igp96), 1:500ウエスタンブロット(WB), 90〜100 kDaトリスグリシン, 70〜95 kDa MOPS/ビス-トリス)、抗LAMP1(ラットモノクローナル抗体(mAb), Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa,, #ID4B, 1:50免疫細胞化学(ICC))、抗LAMP1(モノクローナル抗体(mAb), Santa Cruz Biotechnology, http://www.scbt.com, #sc-20011, 1:500ウエスタンブロット(WB), 110 kDa)、抗カテプシンD(ヤギポリクローナル抗体(pAb), Santa Cruz Biotechnology, #sc-6487, 1:500ウエスタンブロット(WB), 50, 44, 28 kDa)、抗酸性セラミダーゼ(ヤギポリクローナル抗体(pAb), Santa Cruz Biotechnology, #sc-28486, 1:500ウエスタンブロット(WB), 60 kDa)、抗-グルコシルセラミド(ポリクローナル抗体(pAb), Glycobiotech, http://www.glycobiotech.com, #RAS_0011, 1:50免疫細胞化学(ICC))、抗Oct4(ポリクローナル抗体(pAb), Abcam, #ab19857, 1:400免疫細胞化学(ICC))、抗Tra-1-60(モノクローナル抗体(mAb), Millipore, http://www.millipore.com, #MAB4360, 1:400免疫細胞化学(ICC))、抗SSEA-4(モノクローナル抗体(mAb), Millipore, #MAB4304, 1:200免疫細胞化学(ICC))、抗Nanog(ポリクローナル抗体(pAb), Abcam, #ab21624, 1:200免疫細胞化学(ICC))、抗神経クラスIIIβ-チューブリン(TUJ1), Covance, http://www.covance.com, #MMS-435P, 1:2000免疫細胞化学(ICC))、抗チロシン水酸化酵素(ポリクローナル抗体(pAb), EMD chemicals, http://www.emdchemicals.com, #657012, 1:1000免疫細胞化学(ICC))、抗NeuN(モノクローナル抗体(mAb), Millipore, #MAB377, 1:100 IHC)、抗GRP78 BiP(4E3)(モノクローナル抗体(mAb), Abcam, #ab96483, 1:500ウエスタンブロット(WB), 66 kDa)、抗カルネキシン(ポリクローナル抗体(pAb), Enzo Life Sciences, http://www.enzolifesciences.com, #ADI-SPA-865, 1:500, ウエスタンブロット(WB), 90 kDa)、抗タウ(ポリクローナル抗体(pAb), Dako, http://www.dako.com, # A0024, 1:1000ウエスタンブロット(WB))、抗ハンチンチン(モノクローナル抗体(mAb), Millipore, #MAB5490, 1:1000ウエスタンブロット(WB))。
【０４９１】
プラスミド
マウスGCaseポリペプチドに対するshRNA、またはスクランブル配列対照を発現するレンチウイルスプラスミドはpLKO.1ベクター骨格であり、Open Biosystems(http://www.openbiosystems.com, 製品# RMM3981-98834484、マウス:5'- cga ctt cca gtt atc caa ctt-3')から入手し、100μg/mlのカルベニシリン(Sigma-Aldrich # C-9231)を用いてDH5-αコンピテント細胞で増殖させた。ヒト野生型および変異体α-シヌクレインを発現するpCDNAプラスミドは、以前に記載されていたものである(Mazzulli et al., J. Biol. Chem. 282: 31621, 2007)。α-シヌクレインコード配列をpENTR1A(Invitrogen # A10462)のKpnl/Xhol部位にサブクローニングし、25μg/mlのカナマイシン(Fisher Scientific, http://www.fisherscientific.com, # BP906-5)を用いてOne Shot TOP10コンピテント細胞(Invitrogen # C4040-10)で増殖させた。ゲートウェイクローニングシステム(Invitrogen, LR recombination reaction, # 11791-020)を使用して、pENTR1A-α-シヌクレイン構築物のα-シヌクレインコード配列を、マウスホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターを含有するSIN-W-PGKレンチウイルスベクター骨格(Deglon et al., Hum. Gen Ther. 11:179, 2000)に組換えによって移し、続いてPsilで消化してpENTR1A骨格を取り除いた。100μg/mlのカルベニシリンを用いて、SIN-W-PGK-α-シヌクレイン構築物をTOP10細胞で増殖させた。
【０４９２】
初代皮質培養、レンチウイルス感染およびロイペプチン処理
初代皮質培養の手順は、以前に詳細に記載されている(Tsika et al., J. Neurosci. 30: 3409, 2010)。GCaseポリペプチドshRNAおよびα-シヌクレインを発現するレンチウイルスの両方について、感染多重度3(moi3)で細胞に感染させた。ロイペプチン処理については、インビトロ培養5日目(DIV)にα-シヌクレインを発現するレンチウイルスを細胞に感染させ、次いでインビトロ培養8日目(DIV8)に50μMのロイペプチン(EMD chemicals, http://www.emdchemicals.com)で処理し、インビトロ培養12日目(DIV12)(または感染7日後(dpi7))に回収した。
【０４９３】
神経毒性評価
皮質細胞を細胞50,000個/ウェルで96ウェルプレートに播種し、インビトロ培養5日目(DIV5)に感染させ、表示時点において4％パラホルムアルデヒド中で固定した。染色および分析の手順は記載されている(Tsika et al., J. Neurosci. 30: 3409, 2010)。
【０４９４】
細胞培養物および組織の連続的な生化学的抽出
細胞をTriton X-100溶解緩衝液中に回収した。抽出物を100,000xgで30分間遠心分離した。ペレットを2％SDS緩衝液中に抽出した。20容量のTriton X-100溶解緩衝液を使用して、マウスおよびヒトの脳組織についても同様の手順を用いた。試料はSDS-PAGEゲルにロードするか、または下記のようにネイティブSEC、続いてウエスタンブロット分析に供した(Mazzulli et al., J. Neurosci. 26:10068, 2006)。
【０４９５】
ネイティブSEC
感染皮質細胞(細胞8,000,000個/10cmプレート)をTriton X-100溶解緩衝液中に回収し、以前に記載されているように(Mazzulli et al., J. Neurosci. 26:10068, 2006)、100,000xgのTriton X-100可溶性溶解物をSuperdex 200 HR 10/300カラム(GE healthcare, http://www. gelifesciences.com)にロードした。α-シヌクレインオリゴマーの定量は、以前に詳細に記載されている(Tsika et al., J. Neurosci. 30: 3409, 2010)。
【０４９６】
α-シヌクレインタンパク質の精製およびアミロイドの測定
以前に記載されているように(Mazzulli et al., J. Biol. Chem. 282: 31621, 2007)、BL21 CodonPlus(DE3)-RILコンピテント大腸菌(E. coli)(Agilent)から、組換えヒトα-シヌクレインを精製した。精製α-シヌクレインを脂質分散液と混合し、下記のようにチオフラビンT結合によってアミロイド形成を決定した。
【０４９７】
細胞成分分画
感染皮質細胞(細胞8,000,000個/10cmプレート)を、10 mM HEPES(pH7.4)および0.1M EDTA(SHB)を含有する0.25Mスクロース緩衝液中に回収し、ホモジナイズし、6,800xg、4℃で5分間遠心分離した。残ったペレットを保管した(P1)。この上清を17,000xg、4℃で10分間遠心分離し、上清を回収し(S)、リソソームが濃縮された残ったペレット(P2)を保管した。画分Sを100,000xgで1時間遠心分離して、P3を得た。上記のように、ペレットを1％ Triton X-100溶解緩衝液中に抽出し、次いで2％SDS緩衝液中に抽出した。下記のように、ウエスタンブロット分析によって、またはGCaseポリペプチド活性を測定することによって画分を分析した。
【０４９８】
統計分析
タンパク質分解、神経毒性、LC3およびα-シヌクレインの免疫染色の定量、P2およびP3のGCaseポリペプチド活性アッセイ、ANS、ならびにチオフラビンTの決定では、テューキー事後検定による一元配置ANOVAを使用した。皮質ニューロンの小胞体(ER)後/小胞体(ER)GCaseポリペプチド比では、ダネット事後検定による一元配置ANOVAを使用した。生化学的分析、α-シヌクレインおよびGCaseタンパク質レベルの定量、BODIPY 493蛍光分析、ならびにリピドミック解析では、両側スチューデントt検定を用いた。0.05未満のp値を有意であるとみなした。統計的計算は、GraphPad Prismソフトウェア、バージョン4.0(http://www.graphpad.com)を用いて実施した。
【０４９９】
ゴーシェ病マウスモデルの組織学的分析
V394L(4L)を発現するホモ接合性点変異gba1マウスと、低形質プロサポシン変異体マウス(PS-NA)との交配は、以前に記載されている(Sun et al, 2005)。組織学的分析では、12週齢4L/PS-NAマウスの脳を灌流し、4％パラホルムアルデヒド中で固定し、ヘマトキシリン(hermatoxylin)・エオシン染色によって、黒質(SN)および皮質(Ctx)の8μm切片を神経変性について分析した。α-シヌクレインの免疫蛍光分析では、0.4％ Triton X-100を含む10％ヤギ血清/PBS中で切片をブロッキングし、抗α-シヌクレイン抗体(1:200, abcam #ab85862)と一緒にインキュベーションし、続いてAlexa610標識抗ヤギ二次抗体と一緒にインキュベーションした。Zeiss Apotome AxioV 200顕微鏡(400x)を用いて、写真を撮った。NeuN/α-シヌクレインの共局在化では、一次抗体を1x PBS(ウサギ抗α-シヌクレイン[Abcam, ad52168], 1:250およびマウス抗NeuN [Millipore, MAB377], 1:100)で希釈し、脳切片に4℃で一晩アプライした。1x PBS-0.2％ Triton X-100(10分間、3回)で洗浄した後、ブロッキング溶液中、それぞれ対応する二次抗体［ビオチン化ヤギ抗ウサギ(Vector Labs, http://www.vectorlabs.com, #BA-1000), 1:1000およびヤギ抗マウス-Alexa488(Invitrogen, #A11001), 1:1000］と一緒に、切片をインキュベーションした。1x PBS-0.2％ Triton X-100で洗浄した後、ストレプトアビジン-Alexa610(1xPBSで1:1500)を添加し、インキュベーションして、α-シヌクレインのシグナルを発生させた。
【０５００】
4L/PS-NAの脳におけるα-シヌクレイン凝集体および好酸性球状物質の定量
黒質(SN)および皮質(Ctx)の切片におけるH&E染色によって、12週齢4L/PS-NAマウスを神経変性について分析した。図10Aの矢印は、軸索腫脹に代表的なものであり、変性ニューロンを示す好酸性球状物質の存在を示している。球状物質の数は、4L/PS-NA(n＝3)および野生型(n＝2)マウスの3つの脳皮質切片でカウントした。切片(4μm)は連続的なものであり、実験では3番目の切片ごとに使用した。黒質(SN)(4領域/切片)および皮質(Ctx)(20領域/切片)の左右の半球から、写真を撮影した。
【０５０１】
マウス脳の連続的な生化学的抽出
症候性4L/PS-NA(12〜14週齢)または42週齢D409Hホモ接合性マウスの皮質を使用した。10容量の1％ Triton X-100緩衝液(1％ Triton X-100、20 mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、10％グリセロール、1mM EDTA、1.5mM MgCl2、1mMフッ化フェニルメタンスルホニル(PMSF)、50mM NaF、2mMオルトバナジウム酸Naおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche diagnostics, http://www.roche.com, # 11-836-170-001)中、テフロン乳棒を用いて、脳試料をホモジナイズし、100,000xg、4℃で30分間遠心分離した。ペレットを別の10容量のTriton X-100緩衝液中に再抽出し、先のように遠心分離し、上清を合わせてTriton可溶性画分とした。Triton可溶性画分を4回の凍結/解凍サイクルに供して潜在的なタンパク質-脂質相互作用を破壊した。10分間煮沸し、プローブ超音波発生装置を用いて50％の出力(4x3sパルス)で超音波処理し、次いでさらに10分間煮沸することによって、残ったペレットを5容量の2％SDS、50mMトリス-Cl(pH7.4)中に抽出した。SDS抽出物を20,000xg、25℃で20分間遠心分離した。BCAマイクロアッセイ(Pierce, www.piercenet.com, # 23235)によって、Triton X-100可溶性画分のタンパク質濃度を決定した。
【０５０２】
線虫実験
標準的な手順(Brenner, 1974)に従って、ネマトーダを給養した。記載されているように(Hamamichi et al, 2008)、UA50[balnl3;Punc-54::α-シヌクレイン::gfp, Punc-54::tor-2, rol-6(sul006)]蠕虫に、GBA(C33C12.8)の蠕虫オルソログを標的とするdsRNA(Geneservice, http://www.geneservice.co.uk)を発現する細菌を与えることによって、RNAiおよび蛍光顕微鏡法を行ったが、以下の修正を加えた。蠕虫をRNAi細菌で数世代にわたって成長させ、次いで、ミスフォールディングについてL4期にスコア化した。α-シヌクレインの蓄積の分析をデュプリケイトで実施し、RNAi処理が斑点を有意に増強した場合に、候補を陽性としてスコア化した(蠕虫の80％が、α-シヌクレイン凝集体の分量およびサイズについて増加を示した)。
【０５０３】
レンチウイルスの作製
これらの手順は、以前に詳細に記載されている(Mazzulli et al, 2006)。10％ウシ胎仔血清を含有するneurobasal培地中で、トランスフェクションHEK-FT細胞からの上清を500倍濃縮した。p24 ELISA kit(Zeptometrix, http://www.zeptometrix.com, # 801111)を使用して、ウイルス力価を決定した。
【０５０４】
誘導多能性幹細胞の作製および神経分化
以前に記載されているように(Seibler et al., J. Neurosci. 31:5970, 2011)、OCT4、SOX2、cMTCおよびKLF4を感染させることによって、ゴーシェ病(GD)患者(GM00852)の皮膚線維芽細胞を再プログラム化した。1〜2カ月後にiPS細胞のコロニーを採取し、MEFフィーダー細胞で増殖させた。OCT4、Tra-1-60、SSEA4およびNanogの発現によって、多分化能を決定した。Gバンドによる核型分析は、Cell Line Genetics(http://www.clgenetics.com)によって実施された。以前に記載されているように(Seibler et al., J. Neurosci. 31:5970, 2011)、神経分化を実施した。脳由来神経栄養因子(BDNF)、アスコルビン酸、ソニックヘッジホッグ(SHH)および線維芽細胞成長因子8(FGF8)を添加することによって、分化を開始させた。10日後、BDNF、アスコルビン酸、グリア由来神経栄養因子(GDNF)、トランスフォーミング成長因子β-3(TGFβ-3)および環状AMPを5週間にわたって添加することによって、細胞を分化させた。iPSニューロンを4％PFA中で固定し、Triton可溶性画分の免疫蛍光およびウエスタンブロットによって、神経およびカテコールアミン作動性マーカーならびにα-シヌクレインレベルについて分析した。
【０５０５】
患者および細胞株の遺伝子型決定
iPSニューロン、対照またはパーキンソン病(PD)脳の遺伝子型決定では、Sequenom MassARRAY法を使用した(表14、表17および表18)。DNeasy kit(QIAGEN, http://www.qiagen.com)を使用して、ゲノム物質を抽出した。MALDI-TOF質量分析を使用したsequenom法を使用して、DNA試料を遺伝子型決定したが、これは、Harvard Partners Center for Genetics and Genomics(http://pcpgm.partners.org/)によって提供されているサービスである。表15に示されている試料のGBA1変異の遺伝子型決定分析は、以前に記載されているように(Stone et al., Hum. Mutat. 15:181, 2000)、遺伝子の配列決定によって実施した。
【０５０６】
神経培養物のmRNA測定
適切なレンチウイルス構築物を感染多重度3(moi3)で感染させた7日後(7dpi)、1mlのトリゾール/クロロホルム(Invitrogen)を使用し、続いてRNeasy mini kit(QIAGEN)を使用して、6.6x105個のニューロンから全RNAを抽出した。Superscript III First-Strand synthesis SuperMix(Invitrogen #11752-050)を使用して、逆転写によってcDNAを作製した。以下のプライマーセット
2014523881.tif 000039
を使用して、リアルタイムPCRによってcDNAの量を定量した。
プライマーは、標準化遺伝子であるアクチン
2014523881.tif 000040
と同じ割合で標的配列を増幅する能力に基づいて選択した。
500nMの各プライマー、cDNA反応液の1:100希釈物、および2X SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems # 4309159)を使用して、リアルタイムPCRを実施した。標的転写産物のサイクル閾値(Ct)をアクチンのCt値に対して標準化し、対照に対する％としてプロットした。
【０５０７】
ウエスタンブロット分析
SDS-PAGE用のほとんどの材料は、Invitrogen(NuPAGE system)から入手した。タンパク質溶解物を試料緩衝液(20mMトリス、1％(v/v)グリセロール、180mM β-メルカプトエタノール、0.003％(w/v)ブロモフェノールブルー、2％(w/v)SDS、pH6.8)中で煮沸し、MOPS-SDSランニング緩衝液中の4％〜12％ビス-トリスポリアクリルアミドプレキャストゲル、または4％〜12％トリス-グリシンゲル上で分離した。一部のGCaseポリペプチドのウエスタンブロットでは、10％トリス-グリシンゲルを用いた(図13B、図13Dおよび図13Eならびに図14Cおよび図14F)。ほとんどの分析では、Triton X-100可溶性画分には50μg/レーンを使用したが、SDS画分は、Triton X-100可溶性画分において見られた量に従ってロードした(10〜20μg/レーン)。20％メタノール(Boston Bioproducts, www.bostonbioproducts.com, #BP-190)を含有する転写緩衝液中、4℃で、ゲルを二フッ化ポリビニリデン膜(0.45mM-poreイモビロンFL; Millipore, http://www. millipore.com, #IPFL 000 10)に12〜16時間転写した。0.05％Tweenを含有するOdysseyブロッキング緩衝液(Li-Cor biosciences, www.licor.com, # 927-40000)、または5％脱脂粉乳TBS-T0.2％溶液中でブロットをブロッキングし、続いて一次抗体(希釈物についての上記を参照のこと)と一緒にインキュベーションし、IRDye 680もしくは800標識抗マウスまたはウサギIgG(1:10,000, Li-Cor biosciences)で検出した。対照については、ブロッキング段階の後にブロットをスキャンして自己蛍光バンドを決定し、二次抗体(Ab)を単独で添加した後にも決定した。デンシトメトリー分析では、検出されたいかなるバンドにも非特異的なものは含まれていなかった。Odysseyソフトウェアv2.1、Li-Cor biosciences)を使用して、デンシトメトリーおよび分子量(MW)分析を実施した。
【０５０８】
グリコシダーゼ処理
10μlの糖タンパク質変性緩衝液中で、30〜50μgのTriton X-100可溶性(T-可溶性)溶解物を変性させ、製造業者の説明書(New England Biolabs, http://www.neb.com, #P0702S [endo H], #P0704S [PNGase F])に従って、500UのEndo HまたはPNGase Fで1時間消化した。平行して、対照反応物をグリコシダーゼなしでインキュベーションした。ビス-トリス緩衝液を含む4％〜12％ MOPS NuPAGEゲル(図2)または10％トリス-グリシンゲル(図14)のいずれかに、30〜50μgの試料をロードした。
【０５０９】
培養細胞の免疫染色分析
12ウェルクラスタのポリ-D-リシンコーティングカバースリップ上で成長させた皮質細胞を温PBSでごく簡単に洗浄し、続いてPBS緩衝4％パラホルムアルデヒド(w/v)中で迅速に15分間で固定した。0.3％(v/v)Triton X-100を含有するPBSと一緒に細胞を4℃で一晩インキュベーションし、次いで、PBS-Triton X-100中、2％(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)(Sigma-Aldrich, # A-7906)および10％正常ヤギ血清(Jackson Immunoresearch Laboratories, http://www.jacksonimmuno.com, #005-000-121)で1時間ブロッキングした。一次抗体をブロッキング緩衝液に希釈し(希釈物についての上記を参照のこと)、4℃で一晩インキュベーションし、PBS-Triton X-100で十分に洗浄した。二次抗体(Alexa488標識抗マウスまたはウサギ(1:400)またはAlexa568[1:200], Invitrogen)をブロッキング緩衝液で希釈し1時間インキュベーションし、続いてPBS-Triton X-100で十分に洗浄した。10μlの4,6-ジアミジノ-2-フェニルインドールジヒドロクロリド(DAPI)含有フルオロマウントG(Southern Biotech, http://www.southernbiotech.com, #0100-20)と一緒にカバースリップをスライドガラスに載せ、蛍光顕微鏡を用いて可視化した。α-シヌクレインおよびLC3免疫染色の定量では、Adobe PhotoshopソフトウェアCS2(Adobe Systems, http://www.adobe.com)を使用して、同時間曝露した写真の画素を定量し、DAPIに対して標準化した。
【０５１０】
ガングリオシドGM1およびLAMP1免疫蛍光斑点の定量
感染神経培養物を固定し、GM1分析用のAlexaFluor 488標識コレラ毒素サブユニットB(Invitrogen #34775)を用いて、または抗LAMP1抗体(1 D4B-c)、続いてAlexaFluor 488標識抗ラットIgGを用いて染色した。20倍および100倍対物レンズの写真を同じ曝露時間で撮影し、Image Jソフトウェア(http://rsbweb.nih.gov/ij/)を使用して、閾値を合わせた写真で粒径および粒子数を決定した。DAPI染色も定量し、総細胞数/領域を決定するのに使用した。各レプリケートについて3〜10個の視野を評価し、1条件あたり3回のレプリケートを実施した。
【０５１１】
蛍光染色による中性脂質の定量
中性脂質を検出する蛍光色素である4,4-ジフルオロ-1,3,5,7,8-ペンタメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン(BODIPY 493/503)色素(Invitrogen # D-3922)を生きた培養菌に取り込ませることによって、細胞内中性脂質を定量した。上記のように、ポリ-D-リシンコーティングカバースリップ上で皮質細胞を成長させ、GCaseポリペプチドに対するshRNAを発現するレンチウイルスを感染させた。感染6.5日後(dpi6.5)、BODIPY 493(1mg/ml原液、エタノール中)を完全neurobasal培地中の生きた培養菌に最終濃度10μg/mlで添加し、37℃、5％CO2で30分間インキュベーションした。次いで、細胞を温PBSで洗浄し、PBS緩衝4％パラホルムアルデヒド(paraformaldyhyde)(w/v)中で固定し、蛍光顕微鏡下で可視化した。Adobe PhotoshopソフトウェアCS2(Adobe Systems)を使用して写真中のBODIPY蛍光の総画素を定量し、核染色に対して標準化した。
【０５１２】
SFC/MS/MS分析によるGlcCerの定量
上記のように、GCaseポリペプチドshRNAを発現するレンチウイルスベクターを、6ウェルクラスタで成長させた皮質細胞に感染させ、感染6.5日後(dpi6.5)にPBS中に回収した。200 x gで5分間遠心分離することによって細胞を回収し、分析まで細胞ペレットを-80℃で迅速に保管した。脂質の定量を実施したが、これは、Medical University of South Carolina(http://hcc.musc.edu/research/sharedresources/lipidomics/lipidomicsanalytics.htm)のリピドミクスコア施設によって提供されているサービスである。超臨界流体クロマトグラフィー/質量分析(SFC/MS/MS)によって、グリコシルセラミドを分析した。全細胞リン酸塩レベル(P)に対して試料(各条件について3個のうちのn個)を標準化し、フェムトモル/ナノモルPiとして表した。
【０５１３】
放射性パルスチェイスによる細胞タンパク質分解の決定
3H-ロイシンを使用して放射性パルスチェイスによって、長命タンパク質のタンパク質分解を決定した。以前に記載されているように(Kaushik et al. Methods Enzymol. 452: 297, 2009)、この手順を実施した。簡潔に言えば、細胞33000個/ウェルで播種した24ウェルクラスタで皮質細胞を成長させ、scrbまたはGCaseポリペプチドshRNAを発現するレンチウイルスベクターを感染多重度3(moi3)で感染させた。感染4日後(dpi4)、B27を含有する標準neurobasal培地中に、3H-ロイシン(PerkinElmer, http://www.perkinelmer.com, # NET460A001 MC, 最終5μCi/ml)を2日間にわたって添加して、標識タンパク質を追跡した。感染6日後(dpi6)、過度の冷ロイシン(最終2.8mM)を含有する調整neurobasal培地で細胞を10分間にわたって2回洗浄し、続いて2時間にわたって1回洗浄して、短命タンパク質から放出された遊離アミノ酸を除去した。細胞を冷培地でインキュベーションし、洗浄が完了した後0時間および8時間の時点で50μlの培地を取り出し、100μlの20％トリクロロ酢酸に入れた。BSAを添加(最終0.5mg/ml)して培地からのタンパク質の沈殿を容易にし、試料を4℃で8〜16時間インキュベーションした。試料を20,000xg、4℃で20分間遠心分離し、Beckman LS 1701液体シンチレーションカウンター(Beckman Instruments, http://www. beckmancoulter.com)を使用して5mlのシンチレーションカクテル中で、放射活性を測定した。沈殿したタンパク質ペレットを200μlのデオキシコール酸Na、0.1M NaOH中に抽出し、放射活性を決定した。他で詳細に記載されているように(Kaushik et al. Methods Enzymol. 452: 297, 2009)、タンパク質分解の割合を計算した。
【０５１４】
ロイペプチン/NH4Cl処理では、上記のように細胞に感染させ、次いで感染2日後(dpi2)に50μMのロイペプチンを添加し、続いて感染4日後(dpi4)に3H-ロイシンを添加した。感染5日後(dpi5)にNH4Cl(最終5mM)を添加し、上記のように冷培地中で細胞を追跡した。成長因子(BAGTC)処理2.5週間後に、上記のように、iPSニューロンのタンパク質分解分析を実施した。
【０５１５】
脂質分散液の製剤化
脳ホスファチジルコリン(phosphotidylcholines)(PC, # 840053P)、グルコシル(β)セラミド(18:1, GlcCer, #860547)、ラクトシルセラミド(＃86057P)、ガラクトシルセラミド(＃860521)およびグルコシルスフィンゴシン(＃860535)を含む精製脂質は、Avanti Polar lipids(http://www.avantilipids.com)から入手した。25mg/mlで1％エタノール安定剤を含有するHPLCグレードのクロロホルム中にPCを溶解させ、窒素ガスオーバーレイを有するガラステフロン蓋付バイアル中に-20℃で保管した。GlcCerおよび他のスフィンゴ脂質をクロロホルム:メタノール:-水(80:20:2、v:v)中に10mg/mlで溶解させ、直ちに使用した。脂質を等分し、ガラス試験管中で十分に混合し(PC:GlcCer混合物のモル比は90:10または25:75のいずれか)、続いて窒素気流下で乾燥させた。PCの混合は、スフィンゴ脂質分散水溶液の溶解性および安定化に必要であることが見出された。脂質フィルムをPBS中で水和させ、ポリプロピレン微小遠心管に移し、超音波洗浄槽(Cole-Parmer Instruments, http://www. coleparmer.com, #EW-08895-04)中、25℃で30分間超音波処理した。次いで、試料を2回の凍結/解凍サイクルに供し、続いて溶液が透明になるまでさらに10〜60分間超音波処理した(不透明な溶液は結果を変動させた)。下記のように、脂質分散液を精製α-シヌクレインに直接的に添加し、インキュベーションした。個々の各実験ごとに、脂質分散液を新たに作製した。
【０５１６】
脂質分散液の存在下におけるα-シヌクレイン凝集のインビトロ評価
α-シヌクレインを大腸菌で発現させ、以前に記載されているように(Mazzulli et al 2007)、煮沸した後にHPLCによって精製した。精製α-シヌクレインを0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)または0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)のいずれかで138μM(2mg/ml)に希釈した。最終濃度が69μM α-シヌクレインおよび690μMリポソーム(10:1の最終脂質:タンパク質比)となるように、1.38mMの脂質を等容量の希釈α-シヌクレインに添加した。次いで、pHを決定したところ、脂質分散液の添加は、試料の最終pHを変化させなかったことが見出された。鉱油オーバーレイで蒸発を制御し、Eppendorf thermomixer compact(http://www.eppendorf.com, # 022670000)を使用して1000rpmで一定に振盪しながら、試料を37℃でインキュベーションした。試料を種々の時間インキュベーションし、チオフラビンTによる動態分析用に一定分量を回収した。100mMグリシン緩衝液(pH8.5)中、10マイクロリットルの試料を190μlの10μMチオフラビンT(Sigma-Aldrich, # T-3516)と混合し、25℃で5分間インキュベーションした。黒色FluorNunc Maxisorp 96ウェルプレート(Nunc, http://www. nuncbrand.com, # 475515)中、Wallac Victor2プレートリーダーで蛍光発光(励起(ex)＝430nm、蛍光(em)＝510、0.1s)を決定した。このアッセイは、3個の別個のリポソーム調製物を用いて反復した(毎回n＝3〜4回の反応)。
【０５１７】
8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸の蛍光発光によるオリゴマーα-シヌクレインの評価
8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(ANS)(Acros # 401220050)によっても、オリゴマーを検出した。1時間インキュベーションした後、水で希釈した100μMのANS(最終容量100μl)と一緒に、2μlのα-シヌクレイン-脂質反応混合物をインキュベーションした。白色FuorNunc Maxicorp 96(Nunc, #437591)で試料を15分間インキュベーションし、Wallace Victor2プレートリーダー(Perkin Elmer)で相対蛍光単位を決定した(励起(ex＝355、蛍光(em)＝460、1.0s)。脂質のみを含有していた対照反応物によって、脂質分散液単独から観察されたANSシグナルの分布を決定し、次いでα-シヌクレイン/脂質反応物から差し引いた。さらなる対照はα-シヌクレインのみおよび緩衝液のみを含んでおり、これらをすべて、実験反応物と同じインキュベーション時間および条件に供した。
【０５１８】
インビトロで形成されたα-シヌクレイン凝集体の沈降分析
28時間インキュベーションした反応物を100,000xgで20分間遠心分離し、上清を回収し、ペレットを同じ容量のPBS中に溶解させた。SDS-PAGEによって5μlの各画分を分析し、CBBで染色した。Odyssey赤外線画像装置でゲルをスキャンし、OdysseyソフトウェアV2.1(Li-Cor)を用いて定量した。n＝3の実験から、ペレット状タンパク質の割合を計算した。
【０５１９】
インビトロで形成された可溶性α-シヌクレイン凝集体のネイティブゲル電気泳動
組換えα-シヌクレイン/脂質混合物を表示時点で回収し、NativePAGE Novexビス-トリスゲルシステム(Invitrogen)を使用してネイティブゲル電気泳動によって、200ngを分析した。ゲルをPVDF膜に転写し、モノクローナル抗体(mAb)syn211と一緒にインキュベーションし、続いてセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体と一緒にインキュベーションした。強化化学発光(Pierce # 32106)によってHRPを検出し、フィルムに曝露した。
【０５２０】
逆染色免疫電子顕微鏡分析
α-シヌクレイン/脂質インキュベーション物を300メッシュ炭素コーティング銅グリッドに吸収させ、PBSで洗浄し、1％BSA/PBSで10分間ブロッキングした。ブロッキング溶液中で、syn505(1:100)をこのグリッドに30分間にわたって添加し、続いてPBSで十分に洗浄した。ブロッキング溶液中で、15nm金標識二次抗体を30分間にわたって添加し、続いてPBSで十分に洗浄した。試料を1％酢酸ウラニルで染色し、Massachusetts General HospitalのProgram in Membrane Biologyに設置されているJEOL 1011透過型電子顕微鏡を用いて可視化した。
【０５２１】
グルコセレブロシダーゼポリペプチドおよび他のリソソーム活性のアッセイ
記載されているように(Marshall et al, 2002)、GCaseポリペプチドのアッセイを実施した。上記のように、scrbまたはGCaseポリペプチドshRNAを12ウェル培養からの皮質細胞に感染させ、感染6.5日後(dpi6.5)に50μlの活性アッセイ緩衝液(0.25％(v/v)Triton X-100(Sigma-Aldrich # T-8787)、0.25％(w/v)タウロコール酸(Sigma-Aldrich, # T9034)、1mM EDTA(クエン酸/リン酸緩衝液中、pH5.4))中に回収し、凍結/解凍を2回行い、氷上で30分間インキュベーションした。試料を20,000xgで20分間遠心分離し、10μlの上清を使用して、1mMの4-メチルウンベリフェリルβ-グルコピラノシド(glucophyranoside)(4-MU, Sigma-Aldrich, # M3633)を含む総容量50μlの1％BSA中で、GCaseポリペプチド活性を決定した。37℃で40分間インキュベーションした後(このアッセイは90分間通して線形であると決定した)、等容量の1Mグリシン(pH12.5)を添加することによって、反応を停止させた。100μlの反応物を蛍光発光用の白色96ウェルプレート(Nunc, #136101)にロードし、蛍光発光(励起(ex)＝355nm、発光(em)＝460、0.1s)をWallac Victor2プレートリーダー(Perkin Elmer)で決定した。神経培養物のP2およびP3画分ならびにヒト脳のGCaseポリペプチド活性の分析は、使用した試料が総反応容量100μl中5μlであったことを除いて同様の方法で行った。ヒトパーキンソン病(PD)の分析では、3個の異なる対照および6個の異なるパーキンソン病(PD)試料からの抽出物を試験した。
【０５２２】
ゴーシェ病(GD)脳(表15)およびレンチウイルス感染初代培養物(図13)におけるGCaseポリペプチド活性の測定では、コンズリトール-b-エポキシド(CBE)によって阻害されなかった活性の量を決定することによって、非リソソームGCaseポリペプチド活性(GBA2)を全活性から差し引いた。
【０５２３】
以下のアッセイは、初代神経培養物のP2画分を使用して、GCaseポリペプチドと同じ方法で行った:以前に記載されているように(Tropak et al., J. Biol. Chem. 279:13478, 2004)、4-MU-N-アセチル-D-グルコサミニド(Sigma # M2133)を使用して、ヘキソサミニダーゼA/B/S活性アッセイを実施した。4-MU-D-グルクロニド(Sigma #M9130)を用いて、β-グルクロニダーゼ(GUSB)活性を決定した。4-MU-リン酸塩(Sigma #M8168)を用いて、リソソーム酸性リン酸活性を決定した。
【０５２４】
LC-MS加水分解アッセイ
クォータナリポンプ、G1315ダイオードアレイ検出器およびG1321蛍光検出器を備えるAgilent 1200 LCを使用できる。流量を1.8mL/分、勾配を85/15(メタノール/0.1％ギ酸水溶液)〜100％メタノール、10分間として、周囲温度の4.6mm x 250mm Agilent Eclipse Plus C18(5μm)を使用できる。4MUでは励起(Ex)＝365nm;蛍光(Em)＝440nm、またはC12-BODIPYでは励起(Ex)＝506nm;蛍光(Em)＝540nmの蛍光検出を使用して、リソソーム活性化剤をモニタリングできる。反応の基質および生成物の予想ピークとマッチさせることによって、蛍光ピークのマスを確認できる。異なる濃度のリソソーム活性化剤を使用できる(例えば、0、20nM〜50μM、50μMからの1:2希釈、9個の濃度)。食品ブレンダを最高速度で5分間使用し、続いてモーター駆動性の50mLガラス-テフロンホモジナイザーに10回通して、ヒト脾臓組織をホモジナイズできる。ホモジネートを1000gで10分間遠心分離できる。次いで、40μmのフィルタを使用して上清をろ過し、一定分量の得られた脾臓ホモジネートを使用するまで-80℃で冷凍保管できる。140μg/ウェルの脾臓ホモジネートをアッセイに使用できる。脾臓ホモジネート用のアッセイ緩衝液は、50mMクエン酸、115mM K2HPO4、110mM KCl、10mM NaCl、1mM MgCl2および0.01％Tween-20(pH5)である。精製酵素用の緩衝液は、50mMクエン酸、KH2PO4(組換え野生型酵素用にpH5.9に滴定し、N370S変異体用にpH7に滴定する)および0.01％Tween-20である。自動化ピンツールステーション(Kalypsys, San Diego, CA)を使用して、23nL/ウェルの化合物をアッセイプレートに移すことができる。室温で5分間インキュベーションした後、2μL/ウェルの基質を添加することによって、酵素反応を開始させる。4-MU-Glcでは最終濃度2mM、およびC12-BODIPY-Cerでは最終濃度25μMを使用できる。酵素および基質を37℃で30〜45分間インキュベーションし、次いで2μL/ウェルの停止液(1M NaOHと1Mグリシンとの混合物、pH10)を添加することによって、反応を終了させることができる。
【０５２５】
ミクロソーム安定性
CD-1マウス肝臓ミクロソームと一緒に、試験リソソーム活性化剤を37℃、デュプリケイトでインキュベーションできる。反応物は、100mMリン酸カリウム、2mM NADPH、3mM MgCl2(pH7.4)中にミクロソームタンパク質を含有するであろう。各試験剤について、NADPHを省いて対照をランして、NADPHを含まない分解物を検出できる。表示時点において、各実験反応物および対照反応物から一定分量を回収し、等容量の氷冷停止液(ハロペリドール、ジクロフェナクまたは他の内部標準を含有する0.3％AcOH MeCN溶液)と混合するべきである。次いで、停止反応物を-20℃で少なくとも10分間インキュベーションし、追加容量の水を添加する。試料を遠心分離して沈殿したタンパク質を除去し、LC/MS/MSによって上清を分析して、残ったタンパク質を定量する。データは、時間0の濃度値で割ることによって％残存物として報告する。
【０５２６】
Caco-2透過性
組織培養フラスコで増殖させたCaCo-2細胞をトリプシン処理し、培地中に懸濁し、懸濁液を24ウェル式コラーゲンコーティングBioCoat Cell Environment(BD Biosciences)のウェルに1ウェルあたり細胞24,500個でアプライする。細胞を成長させ、3週間分化させ、2日間隔でフィードする。CaCo-2細胞の単層が適切に形成されることを確認するために、蛍光発光によって一定分量の細胞緩衝液を分析して、不透過性色素であるLucifer Yellowの運搬を決定できる。透過性については、試験剤を先端(A)または基底(B)部のいずれかに添加し、LC/MS/MSによって他の部位への透過量を決定する。A部位用の緩衝液は、トランスポート緩衝液(10mM HEPES溶液、1xハンクス平衡塩類溶液中、1.98g/Lグルコース)(pH6.5)中に100μMのLucifer yellow色素を含有し、B部位用の緩衝液は、トランスポート緩衝液(pH7.4)である。これらの緩衝液と一緒に、CaCo-2細胞を2時間インキュベーションする。データは、透過性(Papp)(dQ/dtは透過速度である)として表す。双方向透過性研究では、非対称指数(AI)またはフラックス比も計算する:AI＞1は、PGPまたは他の活性輸送の潜在的な基質を示す。
【０５２７】
薬物動態
餌および水を自由に利用可能にして、C57BL/6マウス(18〜26g、雄、N＝36)を使用できる。腹腔内(IP)投与液を20％ PEG 400+80％(20％ HP-β-CD)で調製できる。試料を抽出する前に、3容量のPBS(pH7.4)を用いて、脳、肝臓の試料をホモジナイズできる。1gの浮腫脳が1mLに等しいと仮定して、最終濃度を希釈係数4で調整できる。次いで、Acquity UPLC BEH C18カラム、流量0.6mL/分、溶媒A:H2O-0.2％FA、10mM NH4OAC、溶媒B:MeOH-0.2％FA、10mM NH4OACからなる移動相を用いて、試料のLC-MS/MS分析を行うことができる。
【０５２８】
配列リスト
グルカン1,4-α-グルコシダーゼ
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70kDα-グルコシダーゼ
2014523881.tif 000042
グルコセレブロシダーゼ
2014523881.tif 000043
α-ガラクトシダーゼA前駆体
2014523881.tif 000044
β-ガラクトシダーゼ前駆体
2014523881.tif 000045
ガラクトセレブロシダーゼ
2014523881.tif 000046
リソソーム酸性α-マンノシダーゼ
2014523881.tif 000047
β-マンノシダーゼ
2014523881.tif 000048
α-L-フコシダーゼ前駆体
2014523881.tif 000049
α-N-アセチルグルコサミニダーゼ
2014523881.tif 000050
α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ
2014523881.tif 000051
β-ヘキソサミニダーゼサブユニットαプレプロタンパク質
2014523881.tif 000052
β-ヘキソサミニダーゼサブユニットβプレプロタンパク質
2014523881.tif 000053
α-L-イズロニダーゼ前駆体
2014523881.tif 000054
β-グルクロニダーゼ前駆体
2014523881.tif 000055
リソソームシアリダーゼ
2014523881.tif 000056
イズロン酸2-スルファターゼ
2014523881.tif 000057
酸性スフィンゴミエリナーゼ
2014523881.tif 000058
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2014523881.tif 000065
【図１Ｃ】
2014523881.tif 000066
【図１Ｄ】
2014523881.tif 000067
【図１Ｅ】
2014523881.tif 000068
【図１Ｆ】
2014523881.tif 000069
【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
2014523881.tif 000077
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ−１】
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【図５Ｈ−２】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
2014523881.tif 000100
【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
2014523881.tif 000102
【図６Ｈ】
2014523881.tif 000103
【図７Ａ】
2014523881.tif 000104
【図７Ｂ】
2014523881.tif 000105
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2014523881.tif 000107
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
2014523881.tif 000110
【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
2014523881.tif 000112
【図８Ａ】
2014523881.tif 000113
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
2014523881.tif 000153
【図１４Ｄ】
2014523881.tif 000154
【図１４Ｅ】
2014523881.tif 000155
【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年3月4日(2014.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014523881000001.app
【国際調査報告】
2014523881.tif 000171
2014523881.tif 000172