(57)【要約】  本発明は、試料流体又は検体における分子の濃度を測定する方法を提供する。この方法は、流体とカートリッジ内の標識粒子とを混合するステップを有し、標識粒子は、その分子を捕捉しカートリッジのセンサ表面に結合するように適合させられている。そして、標識粒子は、センサ表面に向かって沈降させられ、センサ表面近くの標識粒子の量が測定される。その後、当該表面に結合していない標識粒子は、「洗浄」ステップにおいて除去され、最終的に、センサ表面近くの標識粒子の量は、再度測定される。
2011505572.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料流体における所定分子の濃度を測定する方法であって、
ａ）標識粒子を入れたカートリッジに試料流体を加え、前記標識粒子が当該流体と反応することができるようにし、前記標識粒子は、前記所定の分子を捕捉し前記カートリッジのセンサ表面に結合するよう適合させられているものとするステップと、
ｂ）前記標識粒子が前記センサ表面と相互作用することができるようにするステップと、
ｃ）前記センサ表面に近い標識粒子の量を測定するステップと、
ｄ）前記センサ表面に結合しない標識粒子を除去するステップと、
ｅ）前記センサ表面に近い標識粒子の量を測定するステップと、
を有する方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ステップｃ）及びｅ）の結果を処理し、前記試料流体における前記所定分子の濃度を計算するステップをさらに有する方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、結合標識粒子及び未結合標識粒子の量を計算するステップをさらに有する方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記センサ表面近くの標識粒子の量は、ＦＴＩＲによって測定される、方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記標識粒子は、超常磁性である、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、前記ステップｂ）は、前記センサ表面に向かう標識粒子の磁気的作動により加速させられる、方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法であって、前記センサ表面近くの標識粒子の量は、磁気抵抗センサにより前記標識粒子の浮遊磁場を測定することによって測定される、方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法であって、前記表面に結合していない標識粒子は、磁界により除去される、方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記ステップｃ）は、前記センサ表面の幾つかの特定の結合スポットにおいて行われ、その後に前記ステップｅ）は、前記センサ表面の幾つかの特定の結合スポットにおいて行われる、方法。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記ステップｃ）及びｅ）は、それぞれ、前記センサ表面の幾つかの特定結合スポットにおいて同時に行われる、方法。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の方法であって、結合スポット毎に結合標識粒子及び未結合標識粒子の量を計算するステップをさらに有する、方法。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記標識粒子は、当該分子が捕捉されている場合にのみ、前記センサ表面に結合する、方法。
【請求項１３】
請求項１又は２に記載の方法であって、前記標識粒子は、分子が捕捉されていない場合にのみ前記センサ表面に結合する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識粒子を用いて流体内の分子の濃度を測定する改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンシング、すなわち検体内の特定の分子の量の判定は、益々注目されてきている。大抵、検体、特に関心の分子の量は、極端に少ない。したがって、標識粒子は、これら分子を視覚化するために用いられる。例えば、国際特許出願に係る文献のＷＯ２００５／０１０５４３Ａ１及びＷＯ２００５／０１０５４２Ａ２は、センサ表面にある超常磁性ビーズの磁気的検出に基づいたバイオセンサを記載している。専ら、関心の特定分子が存在する場合に、これら標識ビーズは当該センサ表面に結合する。したがって、結合した標識ビーズの量は、当該検体の特定分子の量につながる。
【０００３】
これら標識粒子は、溶液又は乾燥形態で供給することができる。免疫分析法（immuno-assay）のような実験の成果は、抑制及び／又は結合のような異なる分析ステップに係わる標識粒子又はビーズの数に強く依存している。多かれ少なかれ、例えば抑制ステップの間のビーズは、当該測定の感度（多かれ少なかれ利用可能な抗体）に影響を与える。他の例は、結合ステップにおける大概のビーズの効果であって、増加又は減少させられた数の可能な結合部となるのは勿論なものとなるものである。例えば、端点信号は、良好な結合可能性を有する（抑制分析法の場合、低目標濃度）比較的少ないビーズにより、或いは低結合可能性（抑制分析法の場合、高目標濃度）を持つ比較的多数のビーズにより、得ることができる。このことは、関係するビーズ濃度が未知であるとき、信号は同様の値で測定可能であるが、依然として異なる目標濃度を有することを示している。
【０００４】
しかしながら、結合のために存在している標識粒子の量を適切に制御することは難しい場合がある。例えば、これら粒子は、乾燥形態で供給される場合、それらの全てが当該分析法を開始するまでに再分散するものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明の目的は、この欠点を克服し、検体又は試料流体の中の分子の濃度を測定する改善された方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、試料ボリューム又はカートリッジの中に存在し又は得られる標識粒子の実際の数を測定するという思想に基づいている。このことは、少なくとも２回、センサ表面に近い粒子の量を測定することによって達成される。１つの測定において、結合した粒子のみが検出される（一般的になされているように）。第２の測定においては、全ての粒子が検出される。
【０００７】
したがって、本発明は、試料流体又は検体における所定分子の濃度を測定する方法を提供するものである。この方法は、標識粒子を持つカートリッジに当該試料流体を加えるステップを有し、当該標識粒子がこの所定分子を取り込み当該カートリッジのセンサ表面に結合するように適合されている。そして、標識粒子は、センサ表面と相互作用することが可能とされ、センサ表面に近い標識粒子の量が測定される。その後、当該表面に結合されていない標識粒子は、「洗浄」ステップにおいて除去され、最終的に当該センサ表面に近い標識粒子の量が再び測定される。好ましくは、この方法は、測定ステップの結果を処理し当該試料流体における所定分子の濃度を計算するステップをさらに有するのが良い。
【０００８】
２つの測定の結果を用いて、結合された標識粒子及び結合されていない標識粒子の量（そして標識粒子の総量も）を計算することができる。これにより、当該実験（例えば免疫分析法）のための重要なパラメータ、例えば、検出すべき分子の濃度を正確に計算する必要があるパラメータにアクセスすることができる。
【０００９】
説明する方法は、バイオセンシングを行うよう異なる既知の技術において実現可能である。例えば、センサ表面に近い標識粒子の量を、ＦＴＩＲ（Frustrated total internal reflection）によって測定することができる。或いは、センサ表面に近い標識粒子の量を、磁気抵抗センサにより標識粒子の浮遊磁場を測定することによって測定することができる。しかしながら、本発明による方法は、特定の検知技術又はセンサに限定されない。センサは、粒子の特性に基づいて、センサ表面上の又はその近くの（磁性）粒子の存在を検出する適切なセンサとすることができ、例えば、磁気的方法（例えば磁気抵抗、ホール、コイル）、光学的方法（例えば、イメージング、蛍光、ケミルミネセンス、吸収、散乱、エバネセント場技術、表面プラズモン共鳴、ラマン等）、音響検出（例えば、表面音響波、バルク音波、カンチレバー、水晶振動子など）、電気的検出（例えば、導電、インピーダンス、電流測定、酸化還元サイクル）、そしてこれらの組み合わせなどにより検出可能である。
【００１０】
一般的に、標識粒子が超常磁性である場合が好ましい。その場合、標識粒子は、磁気的作用により当該センサ表面に向かって動かされる。さらに、「洗浄」ステップ、すなわちセンサ表面からの未結合標識粒子の除去は、磁界を用いることによっても達成可能である。
【００１１】
勿論、本発明は、センサ表面の幾つかの特定の結合スポットにおける粒子の量を測定するステップを繰り返すことによって大規模又はアレイ実験に一般化することもできる。これは、幾つかの結合スポットに対し同時に行われるようにしてもよい。これら結合スポットは、同じ分析法における多数の異なる実験を行うために異なる結合又は取込分子を含みうる。
【００１２】
当該分析法に基づいて、標識粒子は、検出すべき分子が取り込まれつつある場合にセンサ表面にのみ結合することができる。逆に、抑制分析法においては、標識粒子は、分子が捕捉されていない場合にセンサ表面にのみ結合することができる。一般に、本発明による方法は、幾つかの生化学分析法のタイプ、例えば結合／非結合分析法、サンドウィッチ分析法、競合アッセイ、置換分析法、酵素的分析法などとともに用ることができる。
【００１３】
本発明のこれらの態様及びその他の態様は、以下に説明する実施例から明瞭となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＦＴＩＲの原理を概略的に示す図。
【図２】本発明による測定の結果を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
図１は、ＦＴＩＲの機能的原理を概略的に示している。標識粒子２は、カートリッジ７の中に具備される。このカートリッジ７は、センサ表面１を有し、これがレーザ又はＬＥＤ３ａと共に示されている。光は、センサ表面１で反射し検出器４ａにより検出され、この検出器は、例えばフォトダイオード又はＣＣＤカメラとすることができる。到来する光の光路３は、全内部反射の条件が満たされるように選ばれる。その場合、１００ｎｍないし１０００ｎｍの代表的なエバネセント減衰距離を持つエバネセント光学場５が生起される。したがって、標識粒子２がセンサ表面１に十分に近い場合にのみ、矢印により示されるようにこれら粒子において光が散乱し、エバネセント場が乱され、当該反射光の強度を減少させる。
【００１６】
（試料）液体がセンサ表面１又は当該センサ表面１に隣接した（カートリッジ）ボリュームに供給されると、事前に乾燥形態で供給された標識粒子２は、溶液中に散乱する。好ましくは超常磁性体とされる粒子２が完全に散乱すると、これらは、磁石６を用いてセンサ表面１へ向かって加速させられ、これらは、検出すべき特定の分子が液体試料に存在する場合に当該表面に結合されうる。この目的のため、特定の結合場所を、センサ表面に設けることができる。結合に十分な時間量の後、結合していない粒子は、「洗浄」ステップにおいてセンサ表面１から除去される。好ましくは、これは、第２の磁石（図示せず）により発生された磁界により達成される。そして、一般のＦＴＩＲ測定において、センサ表面に結合した粒子（又はこれの結合部分）の量が当該洗浄ステップの後に測定される。センサ表面上の粒子が存在するため、到来光３の一部は、センサ表面（より具体的には、結合された粒子）で散乱し、検出器４ａにおいて反射光における減ぜられた強度を導くことになる。したがって、この強度減少を測定することは、結合粒子の量の推定を見込んでいる。
【００１７】
但し、本発明によれば、洗浄前に測定が行われ、この点も図２を参照して説明する。
【００１８】
図２は、本発明によるこのようなＦＴＩＲ測定の結果を示す図を示している。この図においては、反射光の強度が時間に対する任意単位で示されている。３つの曲線は結合無し（１０）、中間的結合（１１）及び高度結合（１２）に対応する。全ての曲線は、ｔ＝０の、すなわち当該分析法の始まりの１００で始まり、その際にセンサ表面には粒子が存在しない。したがって、１００の信号は、粒子によるフラストレーションを伴うことなく全内部反射に対応する。
【００１９】
その後、粒子は、約２２０秒の間に磁石によってセンサ表面に向かって引き込まれる。したがって、粒子は、センサ表面の近くに来て、反射光の強度を減少させる。粒子は、脈打つようにして当該表面に向かって引き寄せられて、通常は、磁界がオンに切り換えられる時間の間でかつ再びバルク中へ拡散する傾向にあるところの磁界をオフに切り換えることにより、当該表面に向かって引っ張られる。したがって、エバネセント場におけるこれらの平均滞留時間は、非結合粒子については非常に低く、かなり低い信号寄与となる。但し、粒子の幾つかは、これらが当該表面に接触しこれら粒子が当該表面に留まるときに結合することができる。これら結合した粒子は、当該表面において固定され、これにより、これらは継続的に当該エバネセント場と相互作用し、非結合粒子よりも非常に高い信号寄与度となる。
【００２０】
ここで使われるようなエバネセント波検出の場合、結合粒子と非結合粒子との間の信号差は、非常に高い。何故なら、エバネセント場の探査深度が相応に小さい（５０〜１５０ｎｍオーダ）からである。バルクの中へ入る粒子の少しの動きだけが、ＦＴＩＲセンサに対してそれらを不可視にする。他のセンサ原理がより大きい検知深度とともに使われるときには、この効果は不明確となり、非結合粒子の信号寄与は、非常に類似したものとなる。
【００２１】
当該実験の初期の段階において、これまでよりも多くの粒子が当該表面の近くに集められる。このことは、センサ信号１０において明確に確認することができ、結合が行われない。約２分後に、多くの粒子が集まり信号１０が平坦に留まる。他の曲線１１及び１２については、粒子の収集過程は、結合過程と並行して行われる。信号１０と他の曲線との差は、結合された粒子の信号寄与によるものである。これまでよりも多くの粒子が当該実験の初期段階において当該表面近くに集められるので、結合過程の速度は、初めに上昇することになる。約２分後、全ての粒子が当該表面の近くに集められ、結合レートがほぼ一定している。結合された粒子の平均の信号寄与が未結合粒子からの信号寄与よりも相当に高いことが明確に分かる。
【００２２】
センサ表面に結合するのに十分な時間量で当該粒子が与えられた後、第２の磁石は、センサ表面から、結合されていない超常磁性粒子を除去するために用いられる。図２において、このことは、約ｔＡ＝２２０秒後に起こり、反射光強度の信号において急激な増加をもたらす。その理由は、全内部反射のフラストレーションを生じさせる粒子の幾つかは、センサ表面から除去されるからである。全ての未結合粒子が除去されたときに、曲線は時刻ｔＢで飽和する。
【００２３】
結合のない場合、曲線１０により示されるように、信号は、１００の初期値において明らかに飽和する（１０ｂ）。これは、磁界により当該表面に引き寄せられた全ての粒子が再び磁界により除去されるからである。但し、結合が行われると、曲線１１及び１２により示されるように、初期値に再び満たない。これは、この場合、センサ表面に向かって引き寄せられる粒子の幾つかは、それに結合して、これによりそこで留まるからである。結合が多いほど、ｔＢにおいて最終的な信号は小さいものとなる。
【００２４】
時刻ｔＡ及びｔＢにおける反射強度の信号から、それぞれ、センサ表面における粒子の総数ｘ＋ｙ及び結合粒子の数ｙに関する情報を得る。考慮に入れるべきなのは、未結合粒子の信号寄与が結合粒子の信号寄与よりもかなり低いことである。何故なら、センサの感応領域における未結合粒子の平均滞留時間が結合粒子に対するよりも相当に低いからである。したがって、この効果を補償するよう補正ファクタを考慮に入れるべきである。
【００２５】
したがって、或る特定のセンサにおいて結合過程に参加しつつある大抵は未知数の粒子にアクセスする。この数は、一般に、乾燥粒子を溶かす際のばらつき及び溶かす速度に依存する。ばらつきの他の理由は、センサチップに対する作動磁石の不整合及び／又は不均質な傾斜磁場である。
【００２６】
抑制過程の場合、当該抑制過程に参加する数、すなわち、試料ボリュームにおける粒子の総数が関心の高いものとなる。幾つかのセンサｎがあるとき、上述したようにセンサｉ毎にセンサｘｉ＋ｙｉについての粒子の数を計算し、これらの数を加算して、当該試料ボリュームにおける総数Ｘ＋Ｙの粒子を得るようにしている。すなわち、Ｘ＋Ｙ＝ｘ１＋ｙ１＋ｘ２＋ｙ２＋…＋ｘｎ＋ｙｎである。センサｎの数が大きくなるほど、粒子の総数についての推定がより正確になる。
【００２７】
異なるセンサにおける粒子の数のばらつきも、センサ当たりの抑制のための余分な補正ファクタを発生することが可能である。これまでのところ、我々は、小さい目標分子の拡散は、この現象を無視するのに十分高速であると仮定しているが、今後の実験は、この仮定の有効性を示すこととなる。余分な補正ファクタが必要とされないときでも、この空間粒子数のばらつきを、当該試験の或る種の確実性の確認として用いることができる。全ての測定は、当該試験の或る種の確実性の確認として用いることができる。或る特定のセンサにおける粒子の総数が非常に少ない場合、当該試験は非常に不確実なものとなる可能性がある。
【００２８】
勿論、本発明において説明する方法は、ＦＴＩＲセンサについて説明しているものの、ＦＴＩＲに限定されない。このセンサは、粒子のいずれかの特性に基づいて、センサ表面上又はその近傍における磁性粒子の存在を検出するための適切なセンサとすることができる。例えば、それは、磁気的方法（例えば、磁気抵抗、ホール、コイル）、光学的方法（例えば、イメージング、蛍光、化学ルミネセンス、吸収、散乱、エバネセント場技術、表面プラズモン共鳴、ラマンなど）、音波検出（例えば、表面音響波、バルク音響波、カンチレバー、水晶振動子など）、電気的検出（例えば、導電、インピーダンス、電流測定、酸化還元サイクル）、これらの組み合わせなどにより検出することができるものである。
【００２９】
他のセンサが用いられる場合、或る特定の方策が特定の実現形態のために行われるようにしてもよい。例えば、磁気抵抗センサの場合、大抵は、超常磁性粒子において双極子を誘発させその双極子場が磁気抵抗センサにより測定されうるところの磁界を発生するために、電流線が用いられる。これら電流線は、粒子の横方向の上昇濃度をもたらす。上昇濃度は、未結合粒子に対してのみ発生する。これは、測定される未結合粒子の数が結合粒子に関して多すぎることを意味している。したがって、上昇濃度ファクタＡは、上昇濃度を伴わない１であり、これが当該方法に加えられる。
【００３０】
分子分析法に加えて、より大きな半分のものが検出可能である。例えば、細胞、ウィルス、細胞又はウィルスの断片、組織抽出物などである。この検出は、バイオセンサ表面に対してセンサ要素のスキャンにより又はスキャンに拠らずして行うことができる。測定データは、端点測定として、また動力学的に又は断続的に信号を記録することによって得ることができる。標識粒子は、検知方法により直接検出することができる。また、これら粒子は、検出前にさらなる処理又は過程を経ることができる。他の処理の例は、材料が追加されるもの、又は標識粒子の（生）化学的又は物理的特性が検出を容易にするように変更されるものがある。本発明による方法は、幾つかの生化学的な分析法タイプ、例えば結合／未結合分析法、サンドイッチ分析法、競合アッセイ、置換分析法、酵素的分析法などと共に用いることができる。この発明の方法は、センサ多重化（すなわち、異なるセンサ及びセンサ表面の並行利用）、標識多重化（すなわち、異なるタイプの標識の並行利用）及びチャンバ多重化（すなわち、異なる反応チャンバの並行利用）に適している。本発明において説明した方法は、小さい試料ボリュームのためのポイントオブケア型のバイオセンサを用いるのに、迅速、堅牢及び簡単なものとして用いることができる。反応チャンバは、小型リーダとともに用いるべき使い捨てアイテムであって、１つ又は複数の磁界発生手段及び１つ又は複数の検出手段を含むものとすることができる。また、本発明の方法は、自動化された高スループット試験に用いることができる。この場合、反応チャンバは、例えば、自動化された機器に適合したウェルプレート又はキュベットとされる。
【００３１】
以上、本発明を図面及びこれまでの説明で詳細に図示し説明したが、このような図示及び説明は、例示するもの又は模範的なものとみなされるべきものであり、限定するものではなく、本発明は、開示の実施例に限定されない。開示した実施例に対する他のバリエーションは、図面、開示内容及び添付請求項の検討により、請求項記載の発明を実施する当業者によって理解され実施されることのできるものである。請求項において、「有する」なる文言は、他の要素又はステップを排除するものではなく、単数表現は複数を排除しない。単一のプロセッサ又は他のユニットは、請求項に挙げられている幾つかのアイテムの機能を満たすことができるものである。或る特定の方策が相互に異なる従属請求項に挙げられているに過ぎない点は、これら方策の組み合わせを活用することができないことを示すものではない。請求項における参照符号は、当該範囲を限定するものと解釈してはならない。
【図１】
2011505572.tif 000003
【図２】
2011505572.tif 000004
【国際調査報告】
2011505572.tif 000005
2011505572.tif 000006
2011505572.tif 000007