(57)【要約】  本発明は、液体又は気体媒体中に低濃度で存在する微生物の同定を可能にする、膜上の核酸を抽出及び検出するための方法並びにこの方法の実施を可能とする、塩化グアニジウム及び０．１と１％の間のＮ−ラウロイル−サルコシン（ＮＬＳ）を含む新規溶解組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶解組成物であって、塩化グアニジウム及びＮ−ラウロイル−サルコシン（ＮＬＳ）を含み、ＮＬＳ濃度が、前記組成物の総重量に関して、０．１と１％の間で含まれることを特徴とする、溶解組成物。
【請求項２】
塩化グアニジウム濃度が３と８ｍｏｌ．Ｌ−１の間で含まれることを特徴とする、請求項１に記載の溶解組成物。
【請求項３】
ＥＤＴＡも含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の溶解組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の溶解組成物であって、前記組成物のＥＤＴＡ濃度が０．１と１ｍｍｏｌ．Ｌ−１の間で含まれることを特徴とする、溶解組成物。
【請求項５】
溶液の形態で与えられることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の溶解組成物。
【請求項６】
１つ又はそれ以上の細胞の核酸を抽出するための方法であって、以下の
ａ）細胞を溶解させ及び細胞が含有する核酸を放出させるために、溶液中の塩化グアニジウム及びＮ−ラウロイル−サルコシン（ＮＬＳ）で細胞が処理され；
ｂ）ａ）において得られた細胞可溶化液の膜を横切るろ過によって、前記細胞可溶化液から核酸が分離され；
ｃ）前記膜によって保持される核酸が、水中の溶液又は弱くイオン化された水溶液中に回収される工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項７】
ＮＬＳが０．１と１％の間で含まれる濃度で溶液中において使用されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
塩化グアニジウム及びＮＬＳが請求項５に記載の溶解組成物中において同時に使用されることを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
細胞可溶化液から核酸を分離するために工程ｂ）において使用される膜がセルロース膜であることを特徴とする、請求項６から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）において使用される膜が３，０００と１００，０００ダルトンの間、好ましくは５０，０００と１０００，０００ダルトンの間の分子量名目限界を有することを特徴とする、請求項６から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞可溶化液からの核酸の分離が陰圧又は陽圧の影響下で膜を通して実施されることを特徴とする、請求項６から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞可溶化液からの核酸の分離が遠心の影響下で膜を通して実施されることを特徴とする、請求項６から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
水又は弱くイオン化された水溶液などの洗浄溶液（この洗浄溶液は、膜を通過した後に除去される。）を用いて、膜によって保持された核酸を洗浄する工程を工程ｂ）とｃ）の間にさらに含むことを特徴とする、請求項６から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
好ましくは、陰圧若しくは陽圧又は遠心の影響下で、工程ｂ）において適用された方向とは反対の方向に、水又は弱くイオン化された水溶液を膜に通過させることによって、工程ｃ）において、核酸が回収されることを特徴とする、請求項６から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
液体又は気体媒体中の１つ又はそれ以上の細胞を検出するための方法であって、以下の
ａ）試料中に含有される細胞を膜上に保持するために、膜を通して液体又は気体媒体の試料をろ過し；
ｂ）前記細胞から放出された核酸を含有する細胞可溶化液を得るために、溶液中の塩化グアニジウム及びＮ−ラウロイル−サルコシン（ＮＬＳ）で、工程ａ）において保持された細胞を処理し；
ｃ）前記膜を通した又は別の膜を通した前記可溶化液のろ過によって、工程ｂ）において得られた細胞可溶化液から核酸を分離し；
ｄ）工程ｃ）において膜によって保持された核酸を、水又は弱くイオン化された水溶液中に回収し；
ｅ）工程ｄ）において回収された核酸を検出する工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１６】
工程ｅ）における核酸の検出が、プローブ又は特異的な印が付されたプライマーを用いて、工程ｄ）に回収された核酸の全部又は一部の特異的なハイブリッド形成によって実施されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程ｅ）における核酸の検出が、工程ｄ）において回収された核酸の全部又は一部の増幅の工程を含むことを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記増幅工程は重合化連鎖反応（ＰＣＲ）からなることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記増幅工程がＬＡＭＰ、ＮＡＳＢＡ又はＴＭＡ型の増幅などの等温増幅からなることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程ｅ）における核酸の検出がＤＮＡへのＲＮＡの逆転写の工程を含むことを特徴とする、請求項１５から１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
工程ｃ）において溶解組成物の核酸を分離するために使用される膜が工程ａ）において使用されるものと異なることを特徴とする、請求項１５から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程ｂ）からｄ）が請求項６から１４の何れか一項に記載の方法の工程ａ）からｃ）に従って実施されることを特徴とする、請求項１５から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
工程ａ）とｂ）の間で、微生物が前記膜の表面上で増殖できるように、工程ａ）において使用される前記膜が栄養素培地と接触して配置されることを特徴とする、請求項１５から２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
工程ａ）とｂ）の間で、微生物から抽出されたＡＴＰを生物発光試薬（ルシフェリンとルシフェラーゼを含む試薬など）と反応させることによって、微生物の計数を可能にする検出工程が実施されることを特徴とする、請求項１５から２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
核酸を抽出するためのキットであって、
−ろ過膜；
−請求項１から５の何れか一項に記載の溶解組成物；
を含むことを特徴とする、キット。
【請求項２６】
核酸を抽出するためのキットであって、
−ろ過膜；
−請求項１から５の何れか一項に記載の溶解組成物；
−ハイブリッド形成によって又はＰＣＲによって、抽出された核酸の検出を実施するための１つ又はそれ以上の特異的プライマー；
を含むことを特徴とする、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グアニジウム塩及びＮ−ラウロイル−サルコシン（ＮＬＳ）の組み合わせを含む溶解組成物を用いて、膜上でろ過された微生物の極めて少数に適用することができる核酸を抽出する方法に関する。
【０００２】
この方法によって、ハイブリッド形成又は増幅による特異的な様式で検出するのに適した形態で前記微生物の核酸を収集することが可能となる。
【背景技術】
【０００３】
今日、産業又は医学的活動の分野では、ますます厳しくなる基準を満たすために、水及び空気並びに使用又は拒絶される道具及び材料の微生物学的品質管理が必要とされる。
【０００４】
従って、迅速に且つ低コストで救済措置を講じることができるように、産業従事者及び保健機関は、微生物学のきょう雑を可能な限り素早く、自由に検出することができるツールを有する必要がある。
【０００５】
旧来、微生物学的モニタリングは寒天培地上で行われている。実施が簡単な培養のこの種類は、肉眼で細菌の計数を実施することを可能とする。培養のこの種類は、生きた微生物を保存することを可能とし、必要であれば、存在する様々な細菌の属又は種を確定する目的で、性質決定期間をもたらすことを可能とする。
【０００６】
これらの性質決定検査は、微生物中に含有される核酸を抽出すること及び当業者に公知の多数の連鎖反応技術（ＰＣＲ：重合化連鎖反応又はＬＣＲ：連結連鎖反応）の１つによって、特異的な様式で前記核酸を増幅することから一般になる。
【０００７】
それにも関わらず、核酸の増幅による性質決定検査は信頼性の高い水準を有しているが、微生物を培養し、その核酸を抽出し、及びＰＣＲ技術を実施することからなる工程は実行に長時間を要する。
【０００８】
肉眼で見ることができるようにするために、微生物は少なくとも２４時間培養しなければならず、メチロバクテリウム種（ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）などの成長がより遅い微生物に関しては、又は細菌は環境条件によるストレスを受けるので、時には、さらに長時間培養しなければならない。
【０００９】
さらに、核酸の抽出は直接ゲロース上で実施することができず、これは、核酸を抽出する前に、微生物を取り除かなければならないことを意味する。この場合には、検出は定性的なものとなり、もはや定量的ではない。
【００１０】
固体支持体上に固定された核酸プローブを用いるハイブリッド形成技術を基礎とするラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）装置の最近の開発により、微生物の性質決定工程のための時間の短縮が可能となり得る。しかしながら、これらの技術は、なお高価であり、核酸抽出及び転移工程から完全に免れるわけではない。
【００１１】
これらの条件下で、微生物の計数及び性質決定のためには、なお２４時間以上を要することを考慮しなければならず、これは製品の品質の継続的なモニタリングが必要とされる産業状況においては長すぎる。
【００１２】
液体若しくは気体媒体中に又は表面上に存在する微生物の検出を加速するために、出願人（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（Ｒ）  Ｒａｐｉｄという名称で販売されている、微生物を検出するための汎用的方法を数年間開発してきた。
【００１３】
この方法は、出願ＷＯ９２−００１４５に記載されている。この方法は、液体又は空気を膜に通すことにより、溶液中に又は空気中に含有されている微生物が膜の表面に保持されることに存する。肉眼では見ることができないマイクロコロニーを形成するのに必要な時間、寒天培地と接触している膜の表面で微生物が培養される。次いで、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）含有物を放出させるために、マイクロコロニーを形成している細胞を溶解する。放出されたＡＴＰは、ＡＴＰ−生物発光によって生きた細胞を同定及び定量するためのマーカーとして使用される。ＡＴＰは、それによって光シグナルが得られる化学発光反応を生成する酵素への基質としての役割を果たし、次いで、適切なビデオインターフェース（例えば、ＬＣＤカメラ）を用いて検出される。画像へ形成される得られたシグナルは、寒天培地中、ペトリ皿の上で実施される標準的な計数法と類似の様式で、原位置（細菌が発育している膜上の場所）での視覚化を可能とする。このインターフェースは、分析される液体又は気体試料中に最初に存在する微生物の数を定量することも可能とする。
【００１４】
Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（Ｒ）システム中での微生物の検出は、全ての生きた細胞中に含有される基質であるＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を使用するので、「汎用性」と称される。必要なきょう雑除去措置を短時間内に採ることができるように、関与する微生物がどのようなものであれ、この技術は、例えば、産業上の生産ライン上又はクリーンルーム中において、極めて低い濃度でさえ、迅速にきょう雑物の存在を検出することを可能とする。
【００１５】
しかしながら、現在、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（Ｒ）システムを用いて、検出される微生物の正体に関する信頼できる情報を平行して獲得することはできない。
【００１６】
しかし、この同定は、きょう雑の起源をより詳しく決定し、その解決策を確定するのに有用である。
【００１７】
この同定に対する主な障害は、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（Ｒ）システム中で実施されるＡＴＰ−生物発光による検出が関与する微生物を破壊するという事実に存する。
【００１８】
実際、生物発光による検出のための反応の間、まず、微生物は、ＡＴＰ分子を抽出するためにエタノールを基礎とする溶液を用いて処理され、次いで、生物発光試薬によって処理される。さらに、生物発光反応を実施するために、これら２つの工程の間に膜は乾燥される。これらの処理の結果、微生物が死滅し、これにより、標準的な性質決定試験（抗生物質耐性、代謝マーカー、グラム反応など）を実施するためのその後の培養ができなくなる。
【００１９】
従って、本発明者らは、本発明に従い、ハイブリッド形成による又は増幅による（特に、ＰＣＲによる）特異的検出に進むために、生物発光によって処理された微生物の核酸を回収することによって検出された微生物を性質決定することに着手した。
【００２０】
しかしながら、核酸の増幅又はハイブリッド形成の技術は、所望の検出反応へ確かに進むことができるほど十分に濃縮されたＤＮＡ又はＲＮＡの精製試料を必要とする。
【００２１】
ろ過膜上で検出する特定の場合には、これらの核酸を回収する上での困難さは、特に、以下の事実のために非常に大きい。
−１つ又はそれ以上のマイクロコロニー（マイクロコロニーのそれぞれの１つは、少数の微生物（一般に、１０３未満の細胞）を含む。）の形態で膜の表面に微生物が分散される、及び
−抽出されるべき核酸を含有する細胞は乾燥され、さらに、ハイブリッド形成又はＰＣＲ反応の収率を阻害又は低減し得る因子及び塩で予め処理されている。
【００２２】
これらの制約は、膜上の溶液中に核酸を回収し、精製し、及び濃縮しなければならないことを意味する。
【００２３】
細胞中に含有される核酸を抽出し、精製し、及び濃縮するための多くの技術が従来技術存在し、核酸の性質（ＤＮＡ又はＲＮＡ）に従って異なる。
【００２４】
これらの技術の大半は、溶解緩衝液による最初の処理、次いで、溶液中の核酸を沈降させる工程を必要とする。溶解緩衝液の目的は細胞膜を破裂させ、タンパク質を可溶化することであるのに対して、沈降は、核酸を溶液中の他の細胞構成成分から分離することを可能にする。
【００２５】
ＲＮＡ（ＤＮＡより脆弱）を抽出するための最も通常の方法は、例えば、「フェノール−クロロホルム」法として知られる方法である。
【００２６】
この技術によれば、まず、変性剤−プロテイナーゼＫ混合物を含む溶解緩衝液と接触させて細胞を配置し、その目的は、細胞構成成分を解離させて、核酸を放出させることである。
【００２７】
使用される溶解緩衝液は、変性剤として、細胞溶解剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を、及びサルコシル、Ｔｗｅｅｎ（Ｒ）２０又はＮｏｎｉｄｅｔＰ４０などのプロテイナーゼＫの活性化因子を一般に含む。
【００２８】
次いで、得られた細胞可溶化液中に含有される核酸は、強力な脱タンパク質剤であるフェノール及び有機溶媒であるクロロホルムの混合物を適用することによって、タンパク質から分離される。遠心後、核酸は有機相中に可溶化されるのに対して、タンパク質は水相と有機相の間の中間相に集められる。
【００２９】
水相を別の管の中に移した後、核酸は、クロロホルム−イソアミルアルコール混合物で処理される。この効果は、毒性産物のみならず、ポリメラーゼなどのある種の酵素の阻害剤でもあるという欠点を有する有機化合物であるフェノールの微量を除去することである。
【００３０】
次いで、沈殿剤（典型的には、−２０℃で、溶解緩衝液の２．５倍容量の割合の無水エタノール又は０．７容量の割合のイソプロパノール）の添加によって、核酸を沈殿させる。
【００３１】
７０％エタノール中の沈殿された核酸のその後の洗浄は、塩を除去するために不可欠である。
【００３２】
次いで、低イオン強度を有する緩衝液（一般に、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液（１０／１ｍＭ））中に沈殿を採取する。
【００３３】
フェノール／クロロホルム法は核酸抽出に関する標準法であるが、後者は、多数の工程を含み並びに注意して取り扱わなければならない揮発性且つ毒性の産物であるフェノール及びクロロホルムを使用するという欠点を有している。ＲＮＡ分子より脆弱性が低いゲノムＤＮＡを抽出したい場合、従って、４Ｍと６Ｍの間のチオシアン酸グアニジウム、１０ｍＭＥＤＴＡ、２％と６％の間のＮＬＳ並びに５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（中性ｐＨ）（いわゆる、改変クルード・スーザン法）を典型的に含む溶解緩衝液を使用する傾向がある［Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８：５２９４−５２９９］。この種類の溶解緩衝液は、フェノール−クロロホルムを使用せずに、細胞可溶化液中へ直接核酸の沈殿を実施できるようにする［Ｊｅａｎｐｉｅｒｒｅ，Ｍ．（１９８７）Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５（２２）：９６１１］。
【００３４】
それにも関わらず、特に、水相のより大きな容量及び微生物の性質に応じて変動し得る細胞構成成分の負荷のために、これらの条件下で得られた核酸の品質及び反応の収率は一定しない。次いで、優れた品質のＤＮＡを得るために、核酸の第二の沈殿を実施することが必要となり得る［Ｄｅ  Ｎｅｄｊｍａ，Ａ．（２００５）Ｐｒｉｎｃｉｐｅ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｃｌｉｎｉｑｕｅ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ＆  Ｍａｓｓｏｎ］。
【００３５】
洗浄及び核酸の回収の工程を促進するために、ある種の技術は、シリカビーズを含有するミクロカラム又は同様の固体吸着相を使用する。しかしながら、吸着相上への核酸の沈殿の工程が同じく必要とされるので、原理は同じである。
【００３６】
上記技術は、核酸の少量の調製及び検出には適していない。実際、上述されているように、核酸が希釈されすぎている場合、核酸の沈殿はより無作為になり、精製法の間に核酸が失われる増大したリスクが存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３７】
【特許文献１】国際公開第９２／００１４５号
【非特許文献】
【００３８】
【非特許文献１】Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．他、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８、１９７９年、ｐｐ．５２９４−５２９９
【非特許文献２】Ｊｅａｎｐｉｅｒｒｅ，Ｍ．Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｂｌｏｏｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１５（２２）、１９８７年、ｐｐ．９６１１
【非特許文献３】Ｄｅ  Ｎｅｄｊｍａ，Ａ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｅ  ｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  Ｃｌｉｎｉｑｕｅ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ＆  Ｍａｓｓｏｎ、２００５年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３９】
従って、本発明の目的は、その後、微生物の性質決定を実施するために、微生物の少数から核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡの両方）を調製するための単純で、迅速及び効果的な方法を達成することである。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
従って、本願は、細胞が塩化グアニジウム及びＮＬＳの限定量を用いて溶液中で処理される、例えば、膜上でろ過された細胞に適用することが可能なゲノムＤＮＡの抽出及び精製法を開示する。この方法によれば、沈殿工程へ継続することなく、核酸は膜上で精製され、膜によって保持されたＤＮＡは、ハイブリッド形成による又はＰＣＲによる検出に適した形態で純粋な又は緩衝化された水の一定容量中に回収される。
【００４１】
驚くべきことに、溶解組成物中に通常見出される濃度よりずっと低い、組成物中のＮＬＳの低濃度を用いて最良の検出結果が本発明者らによって得られた。特に、この低い濃度では、ＮＬＳは精製工程の間の膜の目詰まりに伴う問題を回避することを可能にし、方法の最後での核酸の回収も容易にすることが特に注目された。
【００４２】
本発明は、より具体的には、最大Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（Ｒ）Ｒａｐｉｄシステムの１ＣＦＵまでを検出閾値として、膜上にろ過された微生物の極めて少数をＰＣＲによって性質決定することを目的として実施された。しかしながら、本発明は、特に、関与する細胞の種類が何であれ、ハイブリッド形成又は増幅反応を実施する目的で、核酸を調製するための膜微生物の状況外で適用することが可能である。得られた核酸調製物は、例えば、ＰＣＲ反応又はＬＡＭＰタイプの等温増幅反応を実施するために、又はＮＡＳＢＡ若しくはＴＭＡタイプの増幅などのＲＮＡ分子を含む反応を実施するために（ＲＮＡ配列は、逆転写工程により、ＤＮＡへ転写され得ることが理解される。）使用することが可能である。
【００４３】
以下の図面は、本願に記載されている本発明の実施例の結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ＰＣＲによる微生物の検出のために使用された溶解組成物１から７の有効性の比較。全ての事例で、ＤＮＡは、（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｒ））遠心管中に含有されるセルロース膜上で精製された後、対応する溶解組成物によって細胞を処理した。実験は、培養物上に試料として採取された新鮮な細胞（懸濁物中の細胞）、ＰＶＤＦろ過膜上に試料として採取された新鮮な細胞又は（Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（Ｒ）Ｒａｐｉｄ法に従う）ＡＴＰ−生物発光での処理後にＰＶＤＦ膜上に試料として採取された細胞に対して行った。ＰＣＲ阻害対照のために、純粋なＤＮＡを溶解組成物中に導入し、次いで、他の調製物の場合と同様に、膜上で精製した。組成物は、実験当り少なくとも２回検査した。検出された細胞は、イー・コリ細菌である。ＰＣＲの結果は、増幅の再現性と強度を示す写真の形態で与えられている。＋：正の増幅；−負の増幅、１／２：再現性なし；ＮＤ；実施せず；ＮＡ：膜上で負の結果。
【図２】シー・アルビカンス及びエス・セレビシアエ酵母に関する、本発明の核酸抽出及び検出法の検査結果。アガロースゲルは、ＰＣＲによる増幅の優れた再現性を示す。ウェルには、左から右に番号が付されている。１：陽性ＰＣＲ対照（シー・アルビカンスの純粋なＤＮＡ）、２から６（上のゲル）又は２から５（下のゲル）：異なる試料を検査した；７（第一のゲル）又は６（第二のゲル）；１０００塩基対プラスラダー。ＰＣＲ反応は汎用プライマーを用いて実施され、単細胞性真菌を検出することを可能にする。中央には、ＰＣＲ検査された各試料に対して実施されたＡＴＰ−生物発光による汎用検出から得られた膜の合成画像が示されている。
【図３】（Ａ）グラム陽性細菌エス・オーレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、エス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ビー・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、（Ｂ）グラム陰性細菌ピー・アエルギノサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エス・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）のゲノムＤＮＡに関する、本発明の核酸抽出及び検出法の検査結果。アガロースゲルのウェルには、左から右に番号が付されている。１：陽性ＰＣＲ対照、２から４：グラム陽性又はグラム陰性細菌に対して共通のプライマーを用いて、３つの独立した試料に対して実施されたＰＣＲ；５：１００塩基対プラスラダー。中央には、ＰＣＲ検査された各試料に対して実施されたＡＴＰ−生物発光による汎用検出から得られた膜の合成画像が示されている。
【図４】イー・コリとエス・エピデルミスの混合物を含む細胞の集団のゲノムＤＮＡに関する、本発明の核酸抽出及び検出法の検査結果。Ａ：ＡＴＰ−生物発光に続く、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（Ｒ）法による、３つの集団中の細胞の混合物の計数。Ｂ：アガロースゲル上で可視化された、本発明のＰＣＲ増幅による検出。１：ＰＣＲ陽性対照；２から４：３つの集団の各々に対して実施されたＰＣＲ；５：陰性対照；６：１００塩基対プラスラダー。第一の系列：イー・コリ及びエス・エピデルミスに対して、汎用プライマーを用いて行われたＰＣＲ；第二の系列：イー・コリに対して、特異的プライマーを用いて行われたＰＣＲ；第三の系列：エス・エピデルミスに対して、特異的なプライマーを用いて行われたＰＣＲ；第四の系列：ビー・スブチリスに対して、特異的なプライマーを用いて行われたＰＣＲ。
【図５】本発明に従う、ＡＴＰ−生物発光（Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ  Ｒａｐｉｄ（Ｒ））による、次いで、ＰＣＲ及び微少配列決定による検出。Ａ：エス・エピデルミディスの１３ＣＦＵ及びビー・スブチリスの９ＣＦＵの計数。Ｂ：Ａ．の膜に対して検出されたものと同じエス・エピデルミス及びビー・スブチリスの細胞から精製されたゲノムＤＮＡの抽出物に対して実施されたＰＣＲ増幅の産物のゲル上での可視化。Ｂで可視化された増幅産物に対して実施された微少配列決定の結果。
【図６】本発明の単細胞真菌及び細菌のＰＣＲ検出に関連する感度検査の結果。本発明の方法に従って、まず、生物発光によって１ＣＦＵに対応するゲノムＤＮＡを検出し、抽出し、次いで、ＰＣＲによって検出する。Ａ：細菌に対して特異的な汎用プライマーを用いて、細菌試料（イー・コリ）に対して得られたＰＣＲの陽性結果。Ｂ：単細胞性真菌（エス・セレビシアエ）の３つの異なる試料に対して得られたＰＣＲの陽性結果。
【図７】グラム陽性細菌ピー・アクネスのＡＴＰ生物発光及びＰＣＲによる検出。Ａ：５及び６ＣＦＵで検出された細菌の数の評価を可能にする、３つの試料中でのＡＴＰ生物発光による検出の結果。Ｂ：本発明の抽出法によって、これら３つの試料からそれぞれ抽出された核酸調製物を用いて得られたＰＣＲの陽性結果。
【図８】本発明に従って、シュードモナス・アエルギノサから抽出された２つの核酸調製物中に含有されるＲＮＡのＴＭＡによる増幅から得られたＲＮＡ増幅断片のリアルタイム蓄積特性。調製物は、それぞれ、約３０及び３００ＣＦＵの細菌の数に相当する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
従って、本発明の主題は、液体若しくは気体媒体中に低濃度で存在する又は表面上に存在する微生物の同定を可能にする、膜上の核酸を抽出及び検出するための方法である。
【００４６】
本発明の方法は、より具体的には、膜を通して液体若しくは気体試料をろ過することによる、又は微生物を含有し若しくは含むことができる媒体若しくは表面と前記膜を接触させて配置することによる、膜上に転移された微生物の検出に関する。本発明は、より具体的には、膜の表面に分散された細菌の同定という問題を解決することを目的とする。
【００４７】
本発明の方法は、例えば、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘｓ迅速法において使用されるＡＴＰ生物発光などの非特異的方法を用いて、膜上で予め検出されている微生物の同定に特に適している。
【００４８】
本発明の方法は、生きた又は死んだ細胞の少数の核酸を抽出及び精製することからなる。本発明の方法は、迅速且つ効果的な様式で核酸を抽出することが求められているあらゆる細胞に対して、膜上の微生物の検出という状況外において適用することができる。この方法は、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ核酸の性質決定のために必要なハイブリッド形成又は精製反応を生成するのに適した形態で、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡ核酸を得るために特に有用である。
【００４９】
この方法は、その間に以下の工程を含む。
ａ）細胞を溶解し、及び細胞が含有する核酸を放出するために、溶液中において、塩化グアニジウム及びＮ−ラウロイル−サルコシン（ＮＬＳ）で細胞を処理し；
ｂ）ろ過によって得られた細胞可溶化液の膜を通したろ過によって、得られた細胞可溶化液から核酸を分離し；
ｃ）前記膜によって保持された核酸を、水中の溶液又は弱くイオン化された水溶液中に回収する。
【００５０】
本明細書において、「細胞」は、膜によって区切られた細胞質を含み及び核酸の形態で遺伝物質を含有する小さなサイズの生物学的物体として定義される。
【００５１】
本発明の意味の中で、「微生物」は、微視的サイズ、すなわち、藻類、単細胞真菌、原生生物、ｍｙｃｅｔｅ  細菌又は配偶子などの、代謝及び生殖能力を有する０．５と５ミクロンの間に含まれるサイズを有する細胞を意味する。
【００５２】
求められる微生物は、より具体的には、病原性細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）又はエアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属のグラム陽性又はグラム陰性細菌、ギアルディア（Ｇｉａｒｄｉａ）、エンタモエバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、シクロスポラ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ）属の原生生物；マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）及びウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）属のマイコプラズマ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）又はペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属の真菌である。
【００５３】
塩化グアニジウム及びＮ−ラウロイル−サルコシンによる工程ａ）中の細胞の処理は、これらの化合物の一方及びその後他方によって又は同時にさえ実施することができる。本発明の好ましい態様によれば、処理は、組成物の総重量の０．１と１％の間に含まれるＮＬＳ濃度を含む溶解組成物を用いて実施される。
【００５４】
塩化グアニジウムは、溶解剤として使用されるカオトロピック剤である。塩化グアニジウムは、タンパク質、特に膜タンパク質を変性させ、及び浸透圧ショックを生成するという二重の効果を有する。塩化グアニジウムは、１Ｌ当り３モルと８モルの間、より好ましくは、溶解組成物１Ｌ当り４モルと６モルの間に含まれる濃度で一般に使用される。
【００５５】
Ｎ−ラウロイル−サルコシン（サルコシルＮＬ−９７又はＮＬＳ）は、Ｎ−メチル−Ｎ−（１−オキソドデシル）グリシン（Ｃ１５Ｈ２８ＮＯ３Ｎａ））のナトリウム塩である。この分子は、タンパク質、特に膜タンパク質を可溶化するために、数モル／Ｌの桁の濃度で、プロテイナーゼＫと組み合わせて、溶解緩衝液中でしばしば使用される変性剤である。
【００５６】
本発明によれば、ＮＬＳは、溶解剤として、又は少なくとも主に溶解剤として使用されない。実際、本発明によれば、ＮＬＳは、溶解組成物の最終重量の０．１と１％の間、より好ましくは、０．１と０．５％の間に含まれる濃度で、すなわち、細胞溶解に対する効果が限定される濃度で好ましく使用される。
【００５７】
本特許出願の実施例に示されているように（特に、図１の結果参照）、この濃度でＮＬＳを添加することによって、特に上記方法の工程ｂ）及びｃ）の抽出及び精製収率を改善し、その結果、その後、得られた核酸調製物を用いて実施することができる微生物の性質決定を改善することが可能となる。
【００５８】
ＮＬＳは、タンパク質中のほぼ全ての非共有的相互作用を変性させ、タンパク質を可溶化する傾向を有する陰イオン性変性剤である。陰イオン性界面活性剤である。理論に拘泥するものではないが、本発明者らは、ＮＬＳが膜を通した細胞可溶化液のろ過の間のＤＮＡとタンパク質の分離及びその後のＤＮＡの濯ぎを促進すると考える。
【００５９】
本明細書では、「細胞可溶化液」によって、工程ａ）での処理が完了時に、溶解組成物を加えた溶液中の溶解された細胞を意味する。
【００６０】
好ましくは、本発明の溶解組成物は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の０．１及び１ｍｍｏｌ・Ｌ−１の間も含む。ＥＤＴＡは、数多くの酵素、特に、ＰＣＲ反応中のポリメラーゼの活性を阻害することができる物質として認識されているが、ＥＤＴＡの存在により、グラム陰性微生物のみならず、グラム陽性微生物の溶解を改善することが可能となることが、本発明者らによって実施された実験において発見された。原理的に、ＥＤＴＡは、二価イオンを封鎖することによって、細菌の膜を不安定化させることができる。
【００６１】
本願において、「膜」は、その孔が既知の平均直径を有する２つの表面を有する合成支持体を表す。このような膜は、高い表面／容積比を有する。膜の厚さは、一般に、９０と２００ミクロンの間で一定である。
【００６２】
このような膜は、単一層又は複数層であり得る。このような膜は、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリカーボナート、ポリアミド、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、アセチルセルロース及びニトロセルロースから選択される１つ又はそれ以上の材料から一般に構成される。
【００６３】
本発明のＤＮＡ抽出法の工程ｂ）において指定される膜は、一般に、限外ろ過膜（すなわち、３，０００と１００，０００ダルトンの間、好ましくは、５０，０００と１００，０００ダルトンの間の分子量名目限界値を有する膜）と称されるセルロース製の膜である。膜のこの種類の例は、ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｒ）遠心管（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とともに提供される膜である。
【００６４】
本発明によれば、細胞可溶化液からの核酸の分離は、陰性又は陽性の圧力の影響下で、膜を通じて実施される。例として、可溶化液の通過は、真空ポンプを用いて、膜の表面の１つの上に対する低い圧力によって実施され得る。これは、遠心の影響下において、すなわち、膜の表面における細胞可溶化液へ遠心力を負荷することによって活性化することもできる。遠心効果は、遠心装置中に配置された遠心管などの支持体上に膜を配置することによって一般に得られる。
【００６５】
さらに、本発明は、前記方法の工程ｂ）とｃ）の間で、水又は弱くイオン化された水溶液などの洗浄溶液を用いて、膜によって保持された核酸を洗浄する工程を実施できることを提供する。洗浄溶液は、膜を通過した後に除去される。
【００６６】
工程ｃ）では、核酸は、工程ｂ）で与えられる方向又は上記さらなる洗浄工程の方向と反対方向に、膜を通して水又は弱くイオン化された水溶液を通過させることによって容易に回収することができる。工程ｃ）が陰圧若しくは陽圧の負荷によって又は遠心によって促進される場合には、必要とされるのは、元の方向とは反対の方向に膜がその上に固定されている支持体を配置し、及び膜の表面上に弱くイオン化された溶液の滴を配置することだけである。
【００６７】
圧力又は遠心力によって発揮される力は、膜の孔に水を強制的に通過させ、膜から核酸を放出させる。次いで、遠心管の底に投入された水の滴の中に核酸を集める。
【００６８】
この場合には、弱くイオン化されたとは、リットル当りのその塩中の濃度が１０−２モル／Ｌ、より好ましくは、５．１０−３モル／Ｌ未満である溶液を表す。
【００６９】
より具体的には、本発明は、以下の工程を含むことを特徴とする、液体又は気体媒体中の１つ又はそれ以上の細胞を検出するための方法に関する。
ａ）試料中に含有される細胞を膜上に保持するために、膜を通して液体又は気体媒体の試料をろ過する工程；
ｂ）前記細胞から放出された核酸を含有する細胞可溶化液を得るために、溶液中の塩化グアニジウム及びＮ−ラウロイル−サルコシン（ＮＬＳ）で、工程ａ）において保持された細胞を処理する工程；
ｃ）前記膜を通した又は別の膜を通した前記可溶化液のろ過によって、工程ｂ）において得られた細胞可溶化液の核酸を分離する工程；
ｄ）工程ｃ）において膜によって保持された核酸を、水の中又は弱くイオン化された水溶液中に回収する工程；
ｅ）工程ｄ）において回収された核酸を検出する工程。
【００７０】
好ましくは、前記検出方法の工程ｂ）からｄ）は、本発明に係る核酸の抽出及び精製方法、すなわち、上記方法の工程ａ）からｃ）に従って実施される工程に対応する。
【００７１】
検出方法の目的は、細胞の正体を可能な限り決定しながら（科、属、種など）、細胞、より具体的には、水などの液体媒体又は空気などの気体媒体中に存在する微生物を計数することである。
【００７２】
液体又は気体媒体は、０．１と１．５ミクロンの間、好ましくは０．１５と０．８ミクロンの間、より好ましくは０．２と０．６ミクロンの間に一般に含まれる平均直径の孔を有する膜を横切って圧力差を付与することによってろ過され得るあらゆる流体を表す。このような流体は、無菌製品の製造の一部を形成する純粋な溶液のみならず、複雑な溶液（携帯水、血清、尿、羊水など）又は大気などの気体混合物からもなり得る。
【００７３】
本発明は、動物又は患者を起源とする試料を分析するための診断薬の分野にも適用され得る。
【００７４】
検出法の工程ａ）において、細胞転移は、いわゆるろ過膜（すなわち、液体又は気体媒体に対して透過性であるが、その平均孔径が対象細胞又は微生物の少なくとも８０％、好ましくは９０％を保持することができる膜）上で一般に実施される。好ましくは、この膜は、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド）、セルロース又はポリエチレンスルホンから主として構成される。より好ましくは、膜は、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘの商品名及びＭＸＨＶＷＰ１２４又はＲＭＨＶＭＦＸ２４参照記号でＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社によって販売されている種類のＰＶＤＦ製のフィルター膜である。
【００７５】
本発明の好ましい態様によれば、工程ｃ）において溶解組成物の核酸を分離するために使用される膜は、工程ａ）において使用される膜とは異なる。さらに、工程ａ）において使用される膜は、前記膜によって保持された細胞又は微生物が工程ａ）とｂ）の間でその表面上で増殖できるように、栄養素培地と接触して配置することができる。次いで、栄養素培地は一般にゲロース培地であり、その栄養素は毛細管作用によって細胞に達する。膜の表面上で増殖しながら、マイクロコロニーへの細胞の形成が起こる。
【００７６】
Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ技術のためにも提供されるように、膜上の微生物の計数を可能とする検出工程は、例えば、工程ａ）と工程ｂ）の間に細胞からＡＴＰを抽出することによって、並びにルシフェリン及びルシフェラーゼを含む生物発光試薬とこのＡＴＰを反応させることによって、工程ｂ）における細胞溶解の前に予め実施することができる。
【００７７】
本発明によれば、抽出された核酸はＲＮＡ及びＤＮＡ，特に、メッセンジャー及びリボソームＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡによって構成される。本発明の方法は、本発明の方法によって細胞から抽出されたＲＮＡ及びＤＮＡを使用することができるという利点を有する。
【００７８】
工程ｅ）における核酸の検出は、特異的に印を付すことができるプライマー又はプローブを用いて、工程ｄ）において回収された核酸の全部又は一部の特異的なハイブリッド形成によって好ましく実施される。
【００７９】
本発明によれば、プローブとは、上記核酸のカテゴリーの１つを認識し、これと組み合わされて、核酸のマーク付けを可能とする高分子を意味する。
【００８０】
本発明によれば、プライマーとは、核酸の増幅反応を開始するために、上記核酸のカテゴリーの１つを認識し、これと組み合わされることができる高分子を意味する。
【００８１】
一般に、使用されるプローブ又はプライマーは、特異性のある程度で、抽出された核酸の間に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ配列とハイブリッド形成することができる高分子である。本発明は、例えば、単純なオリゴヌクレオチド、２’Ｏ−メチル−ＲＮＡ型のオリゴヌクレオチド、ＰＮＡ型のプローブ又はプライマー（プリン及びピリミジン塩基によって置換されたポリペプチド鎖によって構成されるプローブ）［Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｐ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５４：１４９７−１５００］又は欧州特許１０１３６６１号に記載されているようなＬＮＡ（２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルの１つ又はそれ以上の単量体を含むオリゴヌクレオチド）など、核酸との特異的なハイブリッド形成を生じることができる当業者に公知のプローブ又はプライマーのあらゆる種類を想定する。
【００８２】
増幅反応とは、標準的な方法によって（例えば、アガロースゲル又はアクリルアミド上でのクロマトグラフィー、微小配列決定又は蛍光によって）、その存在を検出することができる高分子を前記核酸から合成することを可能にする酵素反応を表す。
【００８３】
従って、本発明の方法は、ＰＣＲ（重合化連鎖反応；Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）又は例えば、ＮＡＳＰ型［Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５０：９１−９２］、ＴＭＡ又はＬＡＭＰ型［Ｎｏｔｏｍｉ  Ｔ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００）、２８（１２）：ｅ６３］の増幅など、当業者に周知の技術に従って等温的に実施される増幅反応などの当業者に公知の技術の１つによって、工程ｄ）において回収された核酸の全部又は一部を増幅する工程を工程ｅ）の中に含むことができる。
【００８４】
このような増幅は、検出の目的に利用可能な核酸の量を増加させることにより、微生物の最適な検出に有用であることが判明し得る。増幅のこの工程が高度に特異的であれば、微生物をより高い選択性で同定することがさらに可能になる。
【００８５】
本発明の方法に従って得られた核酸調製物は、増幅によって核酸の検出を実施するのに特に適している。
【００８６】
本発明の主題は、以下を含むことを特徴とする、核酸を抽出するためのキットでもある。
−膜、好ましくは、セルロース又はＰＶＤＦ製の膜
−既述されている溶解組成物。
【００８７】
有利なことに、このキットは、特にハイブリッド形成によって又はＰＣＲによって、抽出された核酸の検出を実施するための１つ又はそれ以上の特異的なプローブ又はプライマーをさらに含む。場合によって、このキットは、液体又は気体媒体をろ過するための第二の膜も含み得る。このキットによって、本発明の方法を実施することが可能となる。
【００８８】
このようなキットは、ＤＮＡを抽出及び精製し、その後、先述されている条件下で細胞又は微生物を同定する方法を実施するのに特に有用である。
【００８９】
以下の実施例は、一切の限定を課することなく、本発明の説明を補完することを意図する。
【実施例】
【００９０】
実施例
材料と方法
検査された微生物
本明細書の以下に記載されている検出試験において使用される微生物は、アメリカの微生物収集所ＡＴＣＣから得られた。株の参照番号は、表１に与えられている。
【００９１】
【表１】
2011509669.tif 000002
【００９２】
これらの株は、適切な培地（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆＣ６０３９）中において、−８０℃に保たれた。次いで、必要とされる密度を得るために、これらの株を培養し、ペプトンを基礎とする培地（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、ｒｅｆ．４２１１１）中に希釈した。
【００９３】
総微生物叢の計数
２つの方法に従って、微生物を計数した。
１−ゲロース培地上での計数法：
希釈された培養物１００μＬが接種されたゲロース培地を含有するペトリ皿を、細菌については３５℃＋／−２．５℃で２４から４８時間、酵母及びカビについては２５℃＋／−２．５℃で４８から７２時間温置する。接種のために使用した希釈された培養物の濃度を測定するために３つの異なる皿の上で、コロニーを視覚的に計数する。
２−ろ過による方法：
セルロース製の膜（ＭＣＥ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｒｅｆ．ＭＸＨＡＷＧ１２４）又はポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｒｅｆ．ＲＭＨＶＷＰ１２４）製の膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｒｅｆ．ＲＭＨＶＷＰ１２４）（その平均孔径は０．４５μｍである。）上で希釈された培養物の同じ１００μＬをろ過するために、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅによって販売されているＭｉｌｌｉｆｌｅｘ（Ｒ）システムを伴った装置及び消耗品を使用した。無菌条件下で、以下の操作に従う。
１．０．９％ＮａＣｌを含む無菌溶液５０ｍＬを漏斗に配置する。
２．次いで、希釈された培養物１００μＬを添加する。
３．均一化のために０．９％ＮａＣｌを含む無菌溶液５０ｍＬをさらに添加する。
４．セルロース膜を通して真空ポンプを用いて、ろ過を実施し、ゲロース媒体カセット上に膜を移す。
５．ＡＴＰ生物発光（迅速な微生物学）によって計数するために数時間又は肉眼で計数するために１若しくは２日間、膜の上で微生物を発育させる。
【００９４】
次いで、ＡＴＰ生物発光技術を用いて、ＰＶＤＦ膜上に発育するマイクロコロニーを検出するために、自動化された迅速検出システム（Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ  Ｒａｐｉｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用する。この技術は、細胞のＡＴＰを放出するための溶解試薬及び反応基質としてＡＴＰを使用するルシフェラーゼ及びルシフェリンを含む生物発光試薬を使用する。適切なスプレー（Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ  Ｒａｐｉｄ  Ａｕｔｏｓｐｒａｙ  Ｓｔａｔｉｏｎ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｒｅｆ．ＭＸＲＰ  ＳＰＲＫＴ）を使用することによって、試薬のそれぞれの３５μＬを噴霧することによって、膜を処理する。ソフトウェアによって管理されるインターフェースに接続されたＣＣＤカメラによって、ＡＴＰと生物発光試薬の間の反応によって生成される光子を暗室で検出し、膜を合成画像として再構築できるようにする（Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ  Ｒａｐｉｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ３．０）。測定される最小ＡＴＰ濃度は２００アットモルである（すなわち、１つの酵母から又は１００個の細菌から抽出されるＡＴＰの量に等しい。）。
【００９５】
Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ膜の表面に含有される核酸の抽出
点１．２での上記生物発光検出工程後にＰＶＤＦ膜上に存在する細胞を溶解緩衝液中に採取する。幾つかの溶解緩衝液を検査した。これらの緩衝液は、ＳＩＧＭＡ社によって販売されている製品の１つ又はそれ以上から調合され、以下から、異なる濃度で選択された。チオシアン酸グアニジウム（Ｒｅｆ．５０９８０）、塩酸グアニジム（Ｒｅｆ．Ｇ９２８４）、ＴｒｉｓＥＤＴＡ緩衝液（Ｒｅｆ．８６３７７）、ＴｒｉｔｏｎＸ１００（Ｒｅｆ．Ｔ８７８７）、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｒｅｆ．Ｐ−７９４９）及びＮ−ラウロイルサルコシン（Ｒｅｆ．Ｌ７４１４）。
【００９６】
溶解プロトコールは、以下のとおりである。
１．注射器を用いて溶解組成物の１から１．５ｍＬがその内部に注入される密封されたユニットを形成するように、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ膜をカセット（ｒｅｆＭｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＭＰＲＢＬＢ１００）の上に配置する。
２．１０から１２ｒｐｍで、穏やかな撹拌下において、５５℃で１時間、溶解組成物と接触させて膜を維持する。
３．注射器を用いて、細胞可溶化液を回収する。
【００９７】
核酸の精製
２つの方法を使用した。イソプロピルアルコール（ＩＰＡ、Ｓｉｇｍａ  ｒｅｆ．Ｉ９０３０）による核酸の沈降、次いで、エタノール（Ｐｒｏｌａｂｏ、ｒｅｆ．２０  ８２４．３６５）での処理を基礎とする標準的な方法（いわゆる、「改変クルード・スーザン」法）。本発明者らが改変したこの方法に従って、プロテイナーゼＫの不存在下において、以下のものを含む溶解組成物で細胞を処理する。
チオシアン酸グアニジウム          ４Ｍ
ＮＬＳ                            ２％
Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝７．６            ５０ｍＭ
ＥＤＴＡ                          １０ｍＭ
β−メルカプトエタノール          １％
【００９８】
このようにして処理された細胞可溶化液に、等容量の（ｖｏｌｕｍｅ  ｆｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）イソプロピルアルコールを添加する。得られた混合物を、１５℃で、１３２００ｒｐｍで３０分間遠心する。次いで、遠心管から上清を除去し、沈殿によって形成されたペレットを７０％のエタノール４００μＬで濯ぎ、次いで、１５℃で、１３２００ｒｐｍで１０分間、再度遠心した。上清を廃棄し、ペレットを周囲温度で２０分間乾燥させる。最後に、核酸沈殿物を純水５０μＬ中に溶解する。
【００９９】
本発明の他の方法は、遠心管中に装着された限外ろ過膜を使用することからなる。膜のこの種類は、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｒ）フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ｒｅｆ．４２４１３）の商品名で入手することができる。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｒ）フィルターは、再生されたセルロース膜を含有し、その孔は１００，０００Ｄａ（ＭＷＣＯ）未満の名目分子量の分子の通過を可能とする。この消耗品は、５００μＬの収容量を有している。
【０１００】
核酸精製プロトコールは、以下のとおりである。
１．細胞可溶化液５００μＬをフィルター中の膜上に配置し、フィルターを周囲温度で２５から３０分間、５００×ｇでの遠心に供する。
２．膜を通過した細胞可溶化液を廃棄する。
３．５５℃で精製水（ＭｉｌｌｉＱ）４５０μＬの容量をフィルター中の膜上に配置する。
４．周囲温度にて、５００×ｇで２０分間の遠心に、フィルターを再度供する。
５．膜を通過した水を廃棄する。
６．４及び５と同じ操作を繰り返す。
７．膜の表面上に残存する水の容積を５０μＬに調整する。
８．フィルターを数秒間渦巻き撹拌する。
９．フィルターをひっくり返し、新しい１．５ｍＬ遠心管中に配置する。
１０．フィルターを１，０００×ｇで３分間遠心する。
１１．１．５ｍＬの管中に存在する水溶液中に、核酸を回収する。
【０１０１】
膜はこれらの操作の間に乾燥しないことが推奨される。
【０１０２】
ＰＣＲによるＤＮＡの増幅
製造業者の指示書に従って、ＱｉａｇｅｎＰＣＲキット（Ｒｅｆ．２０１２２３）を用いて、ＰＣＲ増幅を行った。使用される試薬の容量は、表２に示されている。Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃによって製造されたプライマーの配列及びそのハイブリッド形成温度が表３に示されている。
【０１０３】
【表２】
2011509669.tif 000003
【０１０４】
【表３】
2011509669.tif 000004
【０１０５】
Ｂａｃｔ−Ｆ及びＢａｃｔ−Ｒに対するＰＣＲ条件は、以下のとおりである。
（細菌に対する汎用性検出）
−９５℃５分間、１サイクル
−３５サイクル
（９４℃３０秒間、５２℃４０秒間、７２℃１分１０秒間）；
−７２℃で２０分間、１サイクル
【０１０６】
ＹＭ−Ｆ及びＹＭ−Ｒに対するＰＣＲ条件は、以下のとおりである。
（酵母に対する汎用性検出）
−９５℃５分間、１サイクル
−３５サイクル
（９４℃１分間、５２℃１分間、７２℃１分間）；
−７２℃で２０分間、１サイクル
【０１０７】
イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ビー・スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びエス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の特異的な共通の検出に対するＰＣＲ条件は、以下のとおりである。
−９５℃５分間、１サイクル
−３５サイクル
（９４℃１分間、それぞれ、６２℃／６０℃／６４℃４０秒間、７２℃１分１０秒間）；
−７２℃で２０分間、１サイクル
特異的な入れ子式ＰＣＲ（ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）検出に対するＰＣＲ条件：
−９５℃５分間、１サイクル
−３５サイクル
（９４℃１分間、６０℃４０秒間、７２℃１分１０秒間）；
−７２℃で２０分間、１サイクル
【０１０８】
既知の大きさのＤＮＡラダー（Ｇｅｌ  Ｐｉｌｏｔ１Ｋｂ又は１００ｂｐ  Ｐｌｕｓｅ  Ｌａｄｄｅｒ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｒｅｆ．２３９０４５）との比較によって、ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で分析する。
【０１０９】
結果
膜上で精製されたＤＮＡの量及び品質に対する溶解組成物の影響
第一のアプローチは、例えば、Ｑｉａｇｅｎ（Ｒ）又はＤｙｎａｌ（Ｒ）から得られるキットなどの市販のキットを使用することからなった。しかしながら、それらの使用は、アガロースゲル上で検出可能なＰＣＲによる増幅を可能とするために、ろ過膜の表面に保持された微生物から核酸の十分な量を精製することを可能にしなかった（Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ  Ｒａｐｉｄシステムによって検出可能なマイクロコロニー中に含有される細胞の数は、１００から１０００の細菌細胞に対応する。）。
【０１１０】
第二のアプローチは、その処方として以下のものを有する溶解組成物を使用することからなった。
−チオシアン酸グアニジン４Ｍ、
−Ｔｒｉｓ５０ｍＭ
−ＥＤＴＡ２５ｍＭ
【０１１１】
微生物の異なる株上でこの組成物を検査し、次いで、２つの方法に従って、ゲノムＤＮＡを精製した。
−改変クルード・スーザン法に従う沈殿、又は
−セルロース膜上でのろ過による
【０１１２】
改変クルード・スーザン法に従って得られた結果は、結果の再現性が低いために、失望するものであることが判明した。ＰＣＲ増幅は、おそらくは沈殿工程の間に遺伝物質が失われるために、調製物ごとに強度が変動した。
【０１１３】
Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（Ｒ）膜上での精製に関しては、明白に高すぎたチオシアン酸グアニジウム濃度（４Ｍ）のために、溶解組成物がセルロース膜に孔を開けたので、これは失敗であった。
【０１１４】
得られた結果のため、チオシアン酸グアニジウムは、これ以降、再び使用しなかった。
【０１１５】
第三のアプローチは、塩化グアニジウム（ＧＨＣｌ）を含む一連の組成物を調製し、検査することからなった。これらの組成物の幾つか及びＥＤＴＡに、変性剤（Ｔｗｅｅｎ、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＬＳ）を添加した。細菌イー・コリ（グラム陰性）の細胞に対して、これらの組成物を独立して２回検査した。ゲノムＤＮＡの抽出は、希釈された培養物を起源とする新鮮な細胞又は膜上のろ過後のマイクロコロニーに起因する新鮮な細胞又は膜上でろ過され、次いで、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ（Ｒ）法に従って、生物発光によって処理されたマイクロコロニー、すなわち死んだ細胞の何れかから開始して実行した。全ての事例で、細胞可溶化液中のゲノムＤＮＡ含有物は、Ｍｉｃｒｏｎｃｏｎ（Ｒ）セルロース膜上で精製し、次いで、いわゆる汎用プライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅した。
【０１１６】
組成物１
塩化グアニジウム                      ６Ｍ
Ｔｒｉｓ                              １０ｍＭ
ＥＤＴＡ                              １ｍＭ
【０１１７】
組成物２
塩化グアニジウム                      ６Ｍ
Ｔｒｉｓ                              １０ｍＭ
ＥＤＴＡ                              １ｍＭ
ＴｒｉｔｏｎＸ１００                  最終１％
【０１１８】
組成物３
塩化グアニジウム                      ６Ｍ
Ｔｒｉｓ                              １０ｍＭ
ＥＤＴＡ                              １ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ２０                        最終１％
【０１１９】
組成物４
塩化グアニジウム                      ６Ｍ
Ｔｒｉｓ                              １０ｍＭ
ＥＤＴＡ                              １ｍＭ
Ｎ−ラウロイル−サルコシン（ＮＬＳ）  最終１％
【０１２０】
組成物５
塩化グアニジウム                      ６Ｍ
Ｔｒｉｓ                              １０ｍＭ
ＥＤＴＡ                              １ｍＭ
Ｎ−ラウロイル−サルコシン（ＮＬＳ）  最終０．５％
【０１２１】
組成物６
塩化グアニジウム                      ６Ｍ
Ｔｒｉｓ                              １０ｍＭ
ＥＤＴＡ                              ０．５ｍＭ
Ｎ−ラウロイル−サルコシン（ＮＬＳ）  最終１％
【０１２２】
組成物７
塩化グアニジウム                      ６Ｍ
Ｔｒｉｓ                              １０ｍＭ
ＥＤＴＡ                              ０．５ｍＭ
Ｎ−ラウロイル−サルコシン（ＮＬＳ）  最終０．５％
【０１２３】
増幅の結果は、図１中の表に示されている。ＰＣＲに対する溶解組成物の阻害効果を検査するために使用される対照（ＰＣＲ阻害対照）は、膜上での精製前に、純粋な細菌ＤＮＡがその中に導入された試料を起源とする。これらの結果は、組成物７のみが、膜上にろ過された細胞に関して、満足できる及び再現性のある結果を得ることを可能にすることを示している。これは、予め生物発光によって処理された又は処理されていない（すなわち、細胞溶解の時点で生きている又は死んでいる。）、１０と１００の間から構成される多数の細胞に対して確認される。これらの実験は、膜上でのＤＮＡ精製及びＰＣＲによるその増幅の有効性に対する溶解組成物の著しい影響を示す。
【０１２４】
検出の汎用性、特異性及び感度
本発明の方法の特異性及び汎用性を確認するために、上記溶解組成物７番を用いて開発されたゲノムＤＮＡを抽出及び検出するためのプロトコールを、様々な微生物（カビ、酵母、グラム陽性及びグラム細菌）に対して適用した。
【０１２５】
汎用性
得られた検出結果は、図２及び３Ａ及び３Ｂに記されている。
【０１２６】
これらの結果は、汎用ＰＣＲプライマーの使用によって、シグナル増幅の同等のレベルで、全ての検査された微生物の検出を取得できることを示している。
【０１２７】
細菌プロピオニバクテリウム・アクネスＡＴＣＣ６９１９の核酸（３９時間、３２．５℃で、嫌気的にＴＳＡ培地上で温置された５と６ＣＦＵの間）を同じ方法に従って抽出した。核酸のこの調製物中に含有されるＤＮＡは、オリゴヌクレオチドＢａｃｔ−Ｆ及びＢａｃｔ−Ｒを用いて（これによって、細菌の汎用検出が可能となる。）、上に記載されているのと同じ様式で、ＰＣＲによって増幅された。検査された３つの核酸調製物に対する増幅の結果が、図７に示されている。
【０１２８】
特異性
特に、細胞の数個の種類が混合物中に存在する場合に検出の特異性を確認するために、以下の微生物：ビー・スブチリスＡＴＣＣ６６３３、エス・エピデルミディスＡＴＣＣ１４９９０及びイー・コリＡＴＣＣ２５９２２の特異的な内部プライマーを使用するＰＣＲを実施した。
【０１２９】
これらの３つの細菌種を含む細胞の集団をこのようにして調製し、次いで、Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ  Ｒａｐｉｄ（Ｒ）システムの膜上にろ過し、ＡＴＰ生物発光による検出を可能にした。３つの異なる細胞試料に対するＡＴＰ−生物発光による検出の結果が、図４に示されている。次いで、本発明の溶解組成物（組成物７番）で細胞を処理し、細胞のゲノムＤＮＡを先述されているようにセルロース膜上で精製した。汎用プライマー及び特異的なプライマーの各対を用いるＰＣＲによって得られた結果が、図４Ｂに示されている。
【０１３０】
別の実験では、２つの細胞培養物（一方はビー・スブチリスＡＴＣＣ６６３３及び他方はエス・エピデルミディスＡＴＣＣ１４９９０）を、先述されているＭｉｌｌｉｆｌｅｘ  Ｒａｐｉｄ（Ｒ）検出プロトコールに従って処理した（図５Ａの結果）。次いで、前記溶解組成物７番を使用することによって、細菌のＤＮＡを膜の上で抽出及び精製し、次いで、汎用プライマーを使用するＰＣＲによって増幅した（図５Ｂの結果）。
【０１３１】
次いで、増幅産物を微小配列決定に供した。微小配列決定の結果（図５Ｃ）は、増幅産物の１００％が培養中の微生物に対応することを示している。
【０１３２】
検出感度
本発明の方法の検出閾値を測定するために、細菌イー・コリ及び酵母エス・セレビシアエの１ＣＦＵを別々の膜上に配置した。Ｍｉｌｌｉｆｌｅｘ  Ｒａｐｉｄシステムを用いて、ＡＴＰ生物発光によって膜を計数し、次いで、先述されているように、ゲノムＤＮＡを抽出及び増幅した。
【０１３３】
図６に示されている結果は、１ＣＦＵによって表される少ない細胞数が、ＰＣＲに続く本発明のＤＮＡ抽出法によって増幅できることを示している。この感度は、細菌及び酵母の両方に対して達成される。
【０１３４】
核酸調製物中に含有されるＲＮＡの検出
ＨＰＡ法（ハイブリッド形成保護アッセイ）
【０１３５】
前記方法に従って、プロピオニバクテリウム・アクネスの１．６．１０８から開始して調製された核酸調製物中に含有されるＲＮＡを生物発光に続くＨＰＡ法によって検出した。
【０１３６】
この方法は、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ（Ｒ）（１０４５７４Ｒｅｖ．Ｃ）から得たＭＴＣ−ＮＩ  ＲＡＰＩＤ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＳＹＳＴＥＭキットを用いて実施した。このキットにより、細胞溶解後に入手可能なピー・アクネスのリボソームＲＮＡの濃度を定量することが可能になる。ＲＮＡの存在は、ハイブリッド形成期の間に、アクリジンエステルの分子を含む一本鎖ＤＮＡの保護を可能にする。次いで、過酸化物イオンを添加し、読み取りを行う。過酸化物イオンはアクリジンエステル分子と反応し、光子の放出を引き起こす。放出された光子の量は、最初に添加されたＲＮＡの量に比例する。放出された光は照度計を用いて測定され、結果は相対光単位で与えられる。
【０１３７】
表４は、本発明に従って、溶解組成物７番を用いて抽出された調製物に対して得られた結果を比較し、溶解組成物を用いて得られた調製物はＭＴＣ−ＮＩキットとともに供給され、陰性及び陽性対照はＭＴＣ−ＮＩキット中に供給されていた。
【０１３８】
【表４】
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【０１３９】
これらの結果は、本発明の溶解組成物を用いて得られた核酸の調製物によって、ＭＴＣ−ＮＩキット中に供給された溶解組成物を用いて得られたものより優れた検出を得ることが可能となることを示している。
【０１４０】
ＴＭＡ増幅法（転写媒介増幅）：
前記方法に従って、プロピオニバクテリウム・アクネスの３０及び３００ＣＦＵから調製された核酸調製物中に含有されるＲＮＡを、Ｃｒａｉｇ  Ｓ  Ｈｉｌｌ他［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ＴＭＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉｇａｎ．１（４）：４４５−５５］によって記載されたＴＭＡ技術によって、増幅及び検出された。この技術は、第一の工程において、試料中に存在するＲＮＡ分子を逆転写すること、次いで、第二の工程において、第一の工程で産生されたＤＮＡからの転写によって、ＲＮＡ断片を合成する（等温増幅工程）ことからなる。
【０１４１】
ＴＭＡ技術は、Ｍｉｌｌｉｐｒｏｂｅシュードモナス・アエルギノサ検出キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｒｅｆ．ＧＰＰＡＥ０１００）から得られる試薬を用いて実施した。
【０１４２】
図８は、本発明に従う、核酸調製物の各々に対して反応溶媒中に合成された増幅産物のリアルタイム検出を表す（３０及び３００ＣＦＵ）。
【０１４３】
３０ＣＦＵに対応する核酸の調製物は３００ＣＦＵに対応するものとほぼ等しい満足できる増幅を可能にし、溶解組成物番号７によるピー・アエルギノサのＲＮＡの抽出に対する有効性の極めて高いレベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2011509669.tif 000015
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