(57)【要約】  合成オキシステロールを作製することができ、骨障害、肥満、心血管障害、及び神経学的障害の治療に使用することができる。
2011505357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物活性組成物であって、
薬学的に許容される担体と、
式Ｉを有する化合物とを含み、
【化１】
2011505357.tif 000038
（式Ｉ）
式中、ｑが単結合又は二重結合であり、
ｔが単結合又は二重結合であり、
ｑ及びｔの少なくとも１つが単結合であり、
Ｍが、水素（−Ｈ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、ホルムオキシ（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｈ）、アセトキシ（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）、アシルオキシ（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−アルキル）、酸素（＝Ｏ）、アルコキシ（−Ｏ−アルキル）、スルフヒドリル（−ＳＨ）、アルキルチオ（−Ｓ−アルキル）、アミノ（−ＮＨ２）、メチルアミノ（−ＮＨＣＨ３）、アルキルアミノ（−ＮＨ−アルキル）、ホルムアミド（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｈ）、アセトアミド（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）、及びアルキルアミド（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−アルキル）からなる群から選択され、アルキルが１〜６個の炭素を有し、
Ｍが酸素である場合、ｔが二重結合であり、かつｑが単結合であり、
Ｍが、水素、ヒドロキシ、又はアセトキシである場合、ｔが単結合であり、
Ｅが、炭素数１〜６のアルキルであり、
Ｒ２が、炭素数１〜６のアルカン、炭素数２〜６のアルケン、炭素数２〜６アルキン、炭素数４〜１２のアラルキル、炭素数５〜１２のアラルケン、炭素数５〜１２のアラルキン、炭素数４〜１２のハロゲン置換アラルキル、炭素数５〜１２のハロゲン置換アラルケン、炭素数５〜１２のハロゲン置換アラルキン、炭素数５〜１８のアルキル置換アラルキル、炭素数６〜１８のアルキル置換アラルケン、炭素数６〜１８のアルキル置換アラルキン、炭素数１〜６のヒドロキシ置換アルキル、炭素数２〜６のヒドロキシ置換アルケン、及び炭素数２〜６のヒドロキシ置換アルキンからなる群から選択され、
ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、エチル、ｎ−プロピル、４−メチルペンチル、４−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、又は１−ヒドロキシ−４−メチルペンチルではなく、
ｑが二重結合であり、かつＭが水素である場合、Ｒ２がメチルベンジルではなく、
前記組成物が、哺乳動物細胞に投与された際に生物学的応答を誘導し、前記応答が、骨芽細胞分化の刺激、脂肪細胞分化の阻害、軟骨形成の刺激、発毛の刺激、及び／又は血管新生の刺激と関連している
生物活性組成物。
【請求項２】
ｑが単結合であり、Ｍが水素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、４−メチルペンチル、ビニル、１−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、３−ヒドロキシ−３−メチルブチル、４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、１，４−ジヒドロキシ−４−メチルペンチル、１，５−ジヒドロキシ−４−メチルペンチル、又は２−フェニルエテニルではなく、
ｑが単結合であり、Ｍがヒドロキシであり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、４−メチルペンチル又は４−メチル−３−ペンテニルではなく、
ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｔ−ブチル、１−メチルプロピル、３−メチルブチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、ビニル、アリル、１−プロペニル、４−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、３−ヒドロキシ−３−メチルブチル、４−ヒドロキシ−３−メチルブチル、１−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、４−ヒドロキシ−４−メチル−１−ペンテニル、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−ペンテニル、１，４−ジヒドロキシ−４−メチルペンチル、又は１−（２−ピリジニル）エチルではなく、
ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＥが４−メチルペンチルである場合、Ｒ２がヒドロキシメチルではなく、
ｑが二重結合であり、かつＭが水素である場合、Ｒ２がメチルベンジルではなく、
ｔが二重結合であり、Ｍが酸素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、４−メチル−ペンチル又は１−ヒドロキシ−４−メチルペンチルではない、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項３】
化合物が、
【化２】
2011505357.tif 000039
[Oxy50]                                      ,
2011505357.tif 000040
[Oxy51]                                      ,
2011505357.tif 000041
[Oxy52]                                      ,
2011505357.tif 000042
[Oxy53]                                      ,
2011505357.tif 000043
[Oxy20]                                      ,
2011505357.tif 000044
[Oxy22]                                      ,
2011505357.tif 000045
[Oxy26]                                      ,
2011505357.tif 000046
[Oxy27]                                      ,
2011505357.tif 000047
[Oxy39]                                      ,
2011505357.tif 000048
[Oxy40]                                      ,
2011505357.tif 000049
[Oxy42]                                      ,
2011505357.tif 000050
[Oxy28]                                      ,
2011505357.tif 000051
[Oxy41]                                      ,
2011505357.tif 000052
[Oxy48]                                      ,及び
2011505357.tif 000053
[Oxy49]
からなる群から選択される、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項４】
化合物が、
【化３】
2011505357.tif 000054
[Oxy34]                                      ,
2011505357.tif 000055
[Oxy36]                                      ,及び
2011505357.tif 000056
[Oxy38]
からなる群から選択される、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項５】
化合物が、
【化４】
2011505357.tif 000057
[Oxy34]                                      ,
2011505357.tif 000058
[Oxy49]                                      ,及び
2011505357.tif 000059
[Oxy50]
からなる群から選択される、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項６】
副甲状腺ホルモン、フッ化ナトリウム、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＬＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子II（ＩＬＧＦ−II）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、シトクロムＰ４５０阻害剤、骨形成プロスタノイド、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、及びＢＭＰ１４からなる群から選択される少なくとも１つの追加的な薬剤をさらに含む、請求項１に記載の生物活性組成物。
【請求項７】
骨障害、骨粗しょう症、オステオポリティス、骨関節炎、骨折、肥満、及び／又は黄色腫形成を罹患している対象体を治療するための方法であって、前記対象体に、有効量の請求項１に記載の生物活性組成物を投与することを含む方法。
【請求項８】
対象体に、有効な剤形の生物活性組成物を治療上有効な用量で、選択された間隔で投与して骨量を増加させることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
対象体に、有効な剤形の生物活性組成物を治療上有効な用量で、選択された間隔で投与して骨粗しょう症の症状を改善させることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
心血管障害、動脈硬化症、心筋梗塞、末梢血管疾患、及び／又は脳卒中を罹患している対象体を治療するための方法であって、前記対象体に、有効量の請求項１に記載の生物活性組成物を投与することを含む方法。
【請求項１１】
脱毛症を罹患している対象体を治療する方法であって、前記対象体に、有効量の請求項１に記載の生物活性組成物を投与することを含む方法。
【請求項１２】
骨形成を誘導するよう対象体を治療するための方法であって、
哺乳動物間葉幹細胞を収集することと、
前記哺乳動物間葉細胞を請求項１に記載の生物活性組成物で処理して、前記細胞の骨芽細胞分化を誘導することと、
前記分化した細胞を前記対象体に投与することとを含む方法。
【請求項１３】
ヒト又は動物体内で使用するための、表面を有する基材を含むインプラントであって、前記インプラントの前記表面が、周囲の骨組織で骨形成を誘導するのに十分な量の請求項１に記載の生物活性組成物を含むインプラント。
【請求項１４】
細胞又は組織における、ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性応答、Ｗｎｔ阻害因子−１（Ｗｉｆ−１）経路媒介性応答、及び／又はＷｎｔ経路媒介性応答を調整するための方法であって、前記細胞又は組織を、有効量の請求項１に記載の生物活性組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１５】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性応答が誘導される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ｗｎｔ阻害因子−１遺伝子が誘導される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ｗｎｔ経路関連シグナル伝達が活性化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性応答が、骨芽細胞分化、骨形態形成及び骨増殖の刺激、並びに／又は脂肪細胞分化、脂肪細胞形態形成、及び／若しくは脂肪細胞増殖の阻害である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性応答が、発毛及び／又は軟骨形成の促進である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性応答が、血管新生の刺激である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
式Ｉを有する化合物であって、
【化５】
2011505357.tif 000060
（式Ｉ）
式中、ｑが単結合又は二重結合であり、
ｔが単結合又は二重結合であり、
ｑ及びｔの少なくとも１つが単結合であり、
Ｍが、水素（−Ｈ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、ホルムオキシ（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｈ）、アセトキシ（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）、アシルオキシ（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−アルキル）、酸素（＝Ｏ）、アルコキシ（−Ｏ−アルキル）、スルフヒドリル（−ＳＨ）、アルキルチオ（−Ｓ−アルキル）、アミノ（−ＮＨ２）、メチルアミノ（−ＮＨＣＨ３）、アルキルアミノ（−ＮＨ−アルキル）、ホルムアミド（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｈ）、アセトアミド（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）、及びアルキルアミド（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−アルキル）からなる群から選択され、アルキルが１〜６個の炭素を有し、
Ｍが酸素である場合、ｔが二重結合であり、ｑが単結合であり、
Ｍが、水素、ヒドロキシ、又はアセトキシである場合、ｔが単結合であり、
Ｅが、炭素数１〜６のアルキルであり、
Ｒ２が、炭素数１〜６のアルカン、炭素数２〜６のアルケン、炭素数４〜１２のアラルキル、炭素数５〜１２のアラルケン、炭素数５〜１２のアラルキン、炭素数４〜１２のハロゲン置換アラルキル、炭素数５〜１２のハロゲン置換アラルケン、炭素数５〜１２のハロゲン置換アラルキン、炭素数５〜１８のアルキル置換アラルキル、炭素数６〜１８のアルキル置換アラルケン、炭素数６〜１８のアルキル置換アラルキン、炭素数１〜６のヒドロキシ置換アルキル、及び炭素数２〜６のヒドロキシ置換アルケンからなる群から選択され、
ｑが単結合であり、Ｍが水素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、４−メチルペンチル、ビニル、１−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、３−ヒドロキシ−３−メチルブチル、４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、１，４−ジヒドロキシ−４−メチルペンチル、１，５−ジヒドロキシ−４−メチルペンチル、又は２−フェニルエテニルではなく、
ｑが単結合であり、Ｍがヒドロキシであり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、４−メチルペンチル又は４−メチル−３−ペンテニルではなく、
ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｔ−ブチル、１−メチルプロピル、３−メチルブチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、ビニル、アリル、１−プロペニル、４−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、３−ヒドロキシ−３−メチルブチル、４−ヒドロキシ−３−メチルブチル、１−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、４−ヒドロキシ−４−メチル−１−ペンテニル、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−ペンテニル、１，４−ジヒドロキシ−４−メチルペンチル、又は１−（２−ピリジニル）エチルではなく、
ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＥが４−メチルペンチルである場合、Ｒ２が、ヒドロキシメチルではなく、
ｑが二重結合であり、かつＭが水素である場合、Ｒ２はメチルベンジルではなく、
ｔが二重結合であり、Ｍが酸素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、４−メチルペンチル又は１−ヒドロキシ−４−メチルペンチルではなく、
前記化合物が、ヒト又は動物細胞と接触した際に生物学的応答を誘導し、前記応答が、骨芽細胞分化の刺激、脂肪細胞分化の阻害、軟骨形成の刺激、発毛の刺激、及び／又は血管新生の刺激と関連している
化合物。
【請求項２２】
ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、４−メチル−１−ペンテニルではない、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｍが、水素（Ｈ）、ヒドロキシ（ＯＨ）、アセトキシ（Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）、及び酸素（Ｏ）からなる群から選択され、
Ｅがメチルであり、
Ｒ２が、炭素数１〜６のアルカン、炭素数２〜６のアルケン、炭素数７〜１２のフェンアルカン、炭素数７〜１２のハロゲン置換フェンアルカン、炭素数８〜１２のフェニル置換アルケン、炭素数８〜１２のフェニル置換アルキン、炭素数５〜１１のチオフェン置換アルキル、炭素数６〜１１のチオフェン置換アルケン、炭素数６〜１１のチオフェン置換アルキンからなる群から選択され、
ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＲ２がアルカン又はアルケンである場合、Ｒ２が、
【化６】
2011505357.tif 000061
である、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２４】
式II
【化７】
2011505357.tif 000062
（式II）
を有する、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｍがヒドロキシであり、
Ｒ２が、
【化８】
2011505357.tif 000063
を含む、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２６】
ｑが単結合であり、かつｔが単結合であり、
Ｍがヒドロキシであり、
Ｅがメチルであり、
Ｒ２が、Ｒ３〜Ｒ４であり、Ｒ３が、５炭素環に結合している２つの順次結合された炭素に結合しており、
Ｒ３が、炭素数１〜６のアルカン、炭素数２〜６のアルケン、及び炭素数２〜６のアルキンからなる群から選択され、
Ｒ４が、フェニル及びチオフェンからなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２７】
【化９】
2011505357.tif 000064
[Oxy50]                                      ,
2011505357.tif 000065
[Oxy51]                                      ,
2011505357.tif 000066
[Oxy52]                                      ,及び
2011505357.tif 000067
[Oxy53]
からなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２８】
ｑが二重結合であり、
Ｍが水素であり、
Ｅがメチルであり、
Ｒ２がＲ５〜Ｒ６であり、
Ｒ５が、炭素数１〜６のアルカン、炭素数２〜６のアルケン、及び炭素数２〜６のアルキンからなる群から選択され、
Ｒ６が、水素、フェニル、ハロゲン置換フェニル、チオフェン、及びヒドロキシからなる群から選択され、
Ｒ６が水素であり、かつＲ５が、炭素数１〜６のアルカン又は炭素数２〜６のアルケンである場合、Ｒ２が、
【化１０】
2011505357.tif 000068
であり、
式中、Ｒ６が水素又はヒドロキシである場合、Ｒ５がアルキンではない、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２９】
【化１１】
2011505357.tif 000069
[Oxy20]                                      ,
2011505357.tif 000070
[Oxy22]                                      ,
2011505357.tif 000071
[Oxy26]                                      ,
2011505357.tif 000072
[Oxy27]                                      ,
2011505357.tif 000073
[Oxy39]                                      ,
2011505357.tif 000074
[Oxy40]
2011505357.tif 000075
[Oxy42]
から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３０】
ｑが単結合であり、かつｔが単結合であり、
Ｍがアセトキシ（Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）であり、
Ｅがメチルであり、
Ｒ２が、炭素数２〜６のアルカン又は炭素数２〜６のアルケンである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３１】
【化１２】
2011505357.tif 000076
[Oxy28]                                  ,及び
2011505357.tif 000077
[Oxy41]
からなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３２】
ｑが単結合であり、かつｔが単結合であり、
Ｍがヒドロキシ（ＯＨ）であり、
Ｅがメチルであり、
Ｒ２が、炭素数２〜６のアルカン、炭素数２〜６のアルケン、炭素数２〜６のヒドロキシ置換アルカン、及び炭素数２〜６のヒドロキシ置換アルケンからなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３３】
【化１３】
2011505357.tif 000078
[Oxy48]                                  ,及び
2011505357.tif 000079
[Oxy49]
からなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３４】
ヒト又は動物細胞と接触した際に骨シラルイルタンパク質を誘導する、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｍが、水素（Ｈ）、ヒドロキシ（ＯＨ）、及びアセトキシ（Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）からなる群から選択され、
Ｍがヒドロキシ又はアセトキシである場合、ｑが単結合であり、
Ｍが水素である場合、ｑが二重結合であり、
Ｒ２が、Ｒ７〜Ｒ８であり、Ｒ７が、５炭素環に結合している２つの順次結合された炭素に結合しており、
Ｒ７が、炭素数１〜４のアルカン、炭素数２〜４のアルケン、及び炭素数２〜４のアルキンからなる群から選択され、
Ｒ８が、炭素数３〜４のアルカン、炭素数３〜４のヒドロキシ置換アルカン、炭素数３〜４のアルケン、及びチオフェンからなる群から選択され、
Ｒ７がアルキンである場合、Ｒ８が、アルカン又はヒドロキシ置換アルカンではない、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ７が、２個の単結合炭素、２個の二重結合炭素、及び２個の３重結合炭素からなる群から選択され、
Ｒ８が、イソプロピル、イソプロペニル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヒドロキシ置換イソプロピル、ヒドロキシ置換イソプロペニル、ヒドロキシ置換ｔｅｒｔ−ブチル、及びチオフェンからなる群から選択される、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
【化１４】
2011505357.tif 000080
[Oxy26]                                  ,
2011505357.tif 000081
[Oxy28]                                  ,
2011505357.tif 000082
[Oxy42]                                  ,
2011505357.tif 000083
[Oxy48]                                  ,
2011505357.tif 000084
[Oxy49]                                  ,及び
2011505357.tif 000085
[Oxy50]
からなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３８】
【化１５】
2011505357.tif 000086
[Oxy49]                                  及び
2011505357.tif 000087
[Oxy50]
からなる群から選択される、請求項２１に記載の化合物。
【請求項３９】
プレグネノロンをジメチルホルムアミド及び塩化ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルと反応させて、保護プレグネノロンを生成することと、
前記保護プレグネノロンを有機金属試薬、グリニャール試薬、及び／又はランタニドハロゲン試薬と反応させて、シリルエーテル産物を生成することと、
前記シリルエーテル産物を脱シリル化して、オキシステロール誘導体を生成することとを含む方法。
【請求項４０】
保護プレグネノロンを有機金属反応剤及び／又はランタニドハロゲン試薬と反応させて、シリルエーテル産物を生成することを含む、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年１２月３日に出願された、米国仮出願第６０／９９６，７２９号明細書の出願日の利益を請求するものであり、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）により授与されたＮＩＨ／ＮＩＡＭＳ助成金ＲＯ１ＡＲ０５０４２６による政府支援でなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
オキシステロールは、循環中並びにヒト及び動物組織中に存在するコレステロールの酸化誘導体の大きなファミリーを形成している。現在までヒト血漿中で同定されたオキシステロールには、７α−ヒドロキシコレステロール、２４Ｓ−ヒドロキシコレステロール、並びに４α−及び４β−ヒドロキシコレステロールが含まれており、それらは５〜５００ｎｇ／ｍｌに及ぶ濃度で存在する。これらのオキシステロールは、０．５〜６０時間に及ぶ様々な循環半減期を有しており、それらのレベルは、老化、薬物介入、及び疾患経過によって変化する場合がある。オキシステロールは、自動酸化によって脂質過酸化の二次副産物として、又はほとんどがシトクロムＰ４５０ファミリー酵素のメンバーである特異的モノオキシゲナーゼの作用によってのいずれかで生成されてもよい。これらの酵素の例は、７α−ヒドロキシコレステロールを形成するコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ１、cholesterol 7α-hydroxylase）、２５−ヒドロキシコレステロールを形成するコレステロール２５−ヒドロキシラーゼ、及び２４Ｓ−ヒドロキシコレステロールを形成するコレステロール２４Ｓ−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ４６、cholesterol 24S-hydroxylase）などである。加えて、オキシステロールは食事に由来する場合がある。シトクロムＰ４５０酵素は、オキシステロールをさらに酸化すること、及びそれらを活性又は不活性代謝産物に代謝することにも関与しており、それらを系から最終的に除去することに結びつく。特定のオキシステロールは、コレステロール代謝に強力な効果を与えることができる。オキシステロールは、アテローム性動脈硬化病変に存在することが見出されている。オキシステロールは、細胞分化、炎症、アポトーシス、及びステロイド産生などの種々の生理学的過程に役割を果たすことができる。
【０００４】
骨粗しょう症及びその合併症は、高齢者集団において病的状態及び死亡を引き起こし、骨芽細胞による骨形成の減少と同時に起こる破骨細胞による骨吸収の増加に起因する場合がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明による実施形態では、化合物は以下の式を有する。
【０００６】
【化１】
2011505357.tif 000003
（式Ｉ）
【０００７】
ｑは、単結合であってもよく又は二重結合であってもよく、ｔは、単結合であってもよく又は二重結合であってもよい。ｑ及びｔの少なくとも１つは、単結合であってもよい。Ｍは、水素（−Ｈ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、ホルムオキシ（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｈ）、アセトキシ（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）、アシルオキシ（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−アルキル）、酸素（＝Ｏ）、アルコキシ（−Ｏ−アルキル）、スルフヒドリル（−ＳＨ）、アルキルチオ（−Ｓ−アルキル）、アミノ（−ＮＨ２）、メチルアミノ（−ＮＨＣＨ３）、アルキルアミノ（−ＮＨ−アルキル）、ホルムアミド（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｈ）、アセトアミド（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）、及びアルキルアミド（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−アルキル）であってもよく、アルキルは１〜６個の炭素を有する。Ｍが酸素である場合、ｔは二重結合であってもよく、かつｑは単結合であってもよい。Ｍが、水素、ヒドロキシ、又はアセトキシである場合、ｔは単結合であってもよい。Ｅは、炭素数１〜６のアルキル、例えばメチルであってもよい。Ｒ２は、炭素数１〜６のアルカン、炭素数２〜６のアルケン、炭素数２〜６アルキン、炭素数４〜１２のアラルキル、炭素数５〜１２のアラルケン、炭素数５〜１２のアラルキン、炭素数４〜１２のハロゲン置換アラルキル、炭素数５〜１２のハロゲン置換アラルケン、炭素数５〜１２のハロゲン置換アラルキン、炭素数５〜１８のアルキル置換アラルキル、炭素数６〜１８のアルキル置換アラルケン、炭素数６〜１８のアルキル置換アラルキン、炭素数１〜６のヒドロキシ置換アルキル、炭素数２〜６のヒドロキシ置換アルケン、又は炭素数２〜６のヒドロキシ置換アルキンであってもよい。例えば、Ｒ２は、炭素数７〜１２のフェンアルカン（phenalkane）、炭素数７〜１２のハロゲン置換フェンアルカン、炭素数８〜１２のフェニル置換アルケン、炭素数８〜１２のフェニル置換アルキン、炭素数５〜１１のチオフェン置換アルキル、炭素数６〜１１のチオフェン置換アルケン、又は炭素数６〜１１のチオフェン置換アルキンであってもよい。
【０００８】
本発明による実施形態では、本化合物は、ヒト又は動物細胞と接触すると、骨芽細胞分化を刺激し、脂肪細胞分化を阻害し、軟骨形成を刺激し、発毛を刺激し、及び／又は血管新生を刺激する活性を有する。
【０００９】
例えば、ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２は、エチル、ｎ−プロピル、４−メチルペンチル、４−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、及び１−ヒドロキシ−４−メチルペンチル以外であってもよい。例えば、ｑが二重結合であり、かつＭが水素である場合、Ｒ２は、メチルベンジル以外であってもよい。
【００１０】
例えば、ｑが単結合であり、Ｍが水素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２は、４−メチルペンチル、ビニル、１−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、３−ヒドロキシ−３−メチルブチル、４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、１，４−ジヒドロキシ−４−メチルペンチル、１，５−ジヒドロキシ−４−メチルペンチル、及び２−フェニルエテニル以外であってもよい。例えば、ｑが単結合であり、Ｍがヒドロキシであり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２は、４−メチル−ペンチル及び４−メチル−３−ペンテニル以外であってもよい。例えば、ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２は、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｔ−ブチル、１−メチルプロピル、３−メチルブチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、ビニル、アリル、１−プロペニル、４−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、３−ヒドロキシ−３−メチルブチル、４−ヒドロキシ−３−メチルブチル、１−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、４−ヒドロキシ−４−メチル−１−ペンテニル、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−ペンテニル、１，４−ジヒドロキシ−４−メチルペンチル、及び１−（２−ピリジニル）エチル以外であってもよい。例えば、ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＥが４−メチルペンチルである場合、Ｒ２は、ヒドロキシメチル以外であってもよい。例えば、ｑが二重結合であり、かつＭが水素である場合、Ｒ２は、メチルベンジル以外であってもよい。例えば、ｔが二重結合であり、Ｍが酸素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２は、４−メチル−ペンチル及び１−ヒドロキシ−４−メチルペンチル以外であってもよい。
【００１１】
例えば、ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＲ２がアルカン又はアルケンである場合、Ｒ２は以下の式であってもよい。
【００１２】
【化２】
2011505357.tif 000004
【００１３】
例えば、Ｍはヒドロキシであってもよく、Ｒ２は以下の式を含んでいてもよい。
【００１４】
【化３】
2011505357.tif 000005
【００１５】
本発明による実施形態では、化合物は以下の式を有する。
【００１６】
【化４】
2011505357.tif 000006
（式II）
【００１７】
本発明による実施形態では、ｑは単結合であり、ｔは単結合である。Ｍはヒドロキシであってもよく、Ｅはメチルであってもよい。Ｒ２は、Ｒ３〜Ｒ４であってもよく、Ｒ３は、５炭素環に結合している２つの順次結合された炭素に結合している。Ｒ３は、炭素数１〜６のアルカン、炭素数２〜６のアルケン、又は炭素数２〜６のアルキンであってもよい。Ｒ４は、フェニル又はチオフェンであってもよい。
【００１８】
本発明による実施形態では、ｑは二重結合である。Ｍは水素であってもよく、Ｅはメチルであってもよい。Ｒ２は、Ｒ５〜Ｒ６であってもよく、Ｒ５は、５炭素環に結合している２つの順次結合された炭素に結合している。Ｒ５は、炭素数１〜６のアルカン、炭素数２〜６のアルケン、又は炭素数２〜６のアルキンであってもよい。Ｒ６は、水素、フェニル、ハロゲン置換フェニル、チオフェン、又はヒドロキシであってもよい。Ｒ６が水素であり、かつＲ５が、炭素数１〜６のアルカン又は炭素数２〜６のアルケンである場合、Ｒ２は、以下の式であってもよい。
【００１９】
【化５】
2011505357.tif 000007
【００２０】
本発明による実施形態では、ｑは単結合であり、ｔは単結合である。Ｍはアセトキシ（Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）であってもよく、Ｅはメチルであってもよい。Ｒ２は、炭素数２〜６のアルカン又は炭素数２〜６のアルケンであってもよい。
【００２１】
本発明による実施形態では、ｑは単結合であり、ｔは単結合である。Ｍはヒドロキシ（ＯＨ）であってもよく、Ｅはメチルであってもよい。Ｒ２は、炭素数２〜６のアルカン、炭素数２〜６のアルケン、炭素数２〜６のヒドロキシ置換アルカン、又は炭素数２〜６のヒドロキシ置換アルケンであってもよい。
【００２２】
本発明による実施形態では、Ｍは、水素（Ｈ）、ヒドロキシ（ＯＨ）、又はアセトキシ（Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）であってもよい。Ｍがヒドロキシ、又はアセトキシである場合、ｑは単結合であってもよい。Ｍが水素である場合、ｑは二重結合であってもよい。Ｒ２は、Ｒ７〜Ｒ８であってもよく、Ｒ７は、５炭素環に結合している２つの順次結合された炭素に結合している。Ｒ７は、炭素数１〜４のアルカン、炭素数２〜４のアルケン、又は炭素数２〜４のアルキンからなる群から選択されてもよい。Ｒ８は、炭素数３〜４のアルカン、炭素数３〜４のヒドロキシ置換アルカン、炭素数３〜４のアルケン、又はチオフェンからなる群から選択されてもよい。例えば、Ｒ７は、２個の単結合炭素、２個の二重結合炭素、又は２個の三重結合炭素であってもよい。例えば、Ｒ８は、イソプロピル、イソプロペニル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヒドロキシ置換イソプロピル、ヒドロキシ置換イソプロペニル、ヒドロキシ置換ｔｅｒｔ−ブチル、又はチオフェンであってもよい。
【００２３】
本発明による実施形態では、化合物は、Ｏｘｙ５０、Ｏｘｙ５１、Ｏｘｙ５２、Ｏｘｙ５３、Ｏｘｙ２０、Ｏｘｙ２２、Ｏｘｙ２６、Ｏｘｙ２７、Ｏｘｙ３９、Ｏｘｙ４０、Ｏｘｙ４２、Ｏｘｙ２８、Ｏｘｙ４１、Ｏｘｙ４８、Ｏｘｙ４９、又はＯｘｙ２８であってもよい。
【００２４】
ある実施形態では、生物活性組成物又は医薬組成物は、本発明によるオキシステロール化合物及び薬学的に許容される担体を含むことができる。ある実施形態では、生物活性組成物又は医薬組成物は、化合物Ｏｘｙ３４、Ｏｘｙ３６、及び／又はＯｘｙ３８、並びに薬学的に許容される担体を含むことができる。生物活性組成物又は医薬組成物は、オキシステロールに加えて、１又は複数の薬剤、例えば、副甲状腺ホルモン、フッ化ナトリウム、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＬＧＦ−Ｉ、insulin-like growth factor I）、インスリン様増殖因子II（ＩＬＧＦ−II、insulin-like growth factor II）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β、transforming growth factor beta）、シトクロムＰ４５０阻害剤、骨形成性プロスタノイド、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、及び／又はＢＭＰ１４を含むことができる。
【００２５】
細胞又は組織におけるヘッジホッグ（Ｈｈ、hedgehog）経路媒介性応答、Ｗｎｔ阻害因子−１（Ｗｉｆ−１、Wnt Inhibitory Factor-1）経路媒介性応答、及び／又はＷｎｔ経路媒介性応答を調整するための本発明による方法は、細胞又は組織を、本発明による有効量のオキシステロール化合物と接触させることを含む。細胞又は組織は、インビトロであってもよく、又はヒト、哺乳動物、若しくは動物などの対象体中にあってもよい。例えば、ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性応答は誘導可能であり、Ｗｎｔ阻害因子−１遺伝子は誘導可能であり、及び／又はＷｎｔ経路関連シグナル伝達は活性化可能である。例えば、ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性応答は、骨芽細胞分化、骨形態形成、骨増殖、及び／若しくは発毛の刺激、並びに／又は脂肪細胞分化、脂肪細胞形態形成、及び／若しくは脂肪細胞増殖の阻害を含むことができる。
【００２６】
骨障害、骨粗しょう症、オステオポリティス（osteoporitis）、骨関節炎、骨折、肥満、黄色腫形成、心血管障害、アテリオスクレロシス（ateriosclerosis）、心筋梗塞、末梢血管疾患、脳卒中、及び／又は脱毛症を罹患している対象体を治療するための本発明による方法は、対象体に、本発明によるオキシステロール化合物を含む有効量の生物活性組成物又は医薬組成物を投与することを含むことができる。対象体に、有効な剤形の生物活性組成物又は医薬組成物を治療上有効な用量で選択された間隔で投与して、骨量を増加させることができる。対象体に、有効な剤形の生物活性組成物又は医薬組成物を治療上有効な用量で、選択された間隔で投与して骨粗しょう症の症状を改善することができる。例えば、哺乳動物間葉幹細胞を収集し、哺乳動物間葉細胞を本発明によるオキシステロール化合物で処理して細胞の骨芽細胞分化を誘導し、分化した細胞を対象体に投与することよって、骨形成を誘導するよう対象体を治療することができる。
【００２７】
神経障害を罹患している対象体を治療するための本発明による方法は、対象体に、本発明によるオキシステロール化合物を含む有効量の生物活性組成物又は医薬組成物を投与することを含むことができる。
【００２８】
本発明による実施形態では、ヒト又は動物体内で使用するためのインプラントは、表面を有する基材を含む。インプラントの表面は、周囲の骨組織の骨形成を誘導するのに十分な量の本発明によるオキシステロール化合物を含む生物活性組成物又は医薬組成物を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】Ｏｘｙ２２、Ｏｘｙ２６、Ｏｘｙ２７、Ｏｘｙ２８、Ｏｘｙ３９、及びＯｘｙ４０と称するオキシステロール化合物の化学構造を示す図である。
【図１Ｂ】Ｏｘｙ４ｌ、Ｏｘｙ４２、Ｏｘｙ４８、Ｏｘｙ４９、Ｏｘｙ２０、及びＯｘｙ３４と称するオキシステロール化合物の化学構造を示す図である。
【図１Ｃ】Ｏｘｙ３６、Ｏｘｙ３８、Ｏｘｙ５０、Ｏｘｙ５１、Ｏｘｙ５２、及びＯｘｙ５３と称するオキシステロール化合物の化学構造を示す図である。
【図２ＡＢ】ＬＲＰ５／６阻害剤、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）が、骨髄間質細胞においてオキシステロール誘導性骨形成分化をどのように阻害するかを示す図である。
【図２ＣＤ】ＬＲＰ５／６阻害剤、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）が、骨髄間質細胞においてオキシステロール誘導性骨形成分化をどのように阻害するかを示す図である。
【図２Ｅ】ＬＲＰ５／６阻害剤、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）が、骨髄間質細胞においてオキシステロール誘導性骨形成分化をどのように阻害するかを示す図である。
【図３】骨髄間質細胞におけるＴＣＦ／Ｌｅｆ転写活性に対する骨形成性オキシステロールの効果を示す図である。
【図４ＡＢ】骨形成性オキシステロールが、骨髄間質細胞においてＷｎｔ標的遺伝子発現をどのように差別的に制御するかを示す図である。
【図４ＣＤ】骨形成性オキシステロールが、骨髄間質細胞においてＷｎｔ標的遺伝子発現をどのように差別的に制御するかを示す図である。
【図４ＥＦ】骨形成性オキシステロールが、骨髄間質細胞においてＷｎｔ標的遺伝子発現をどのように差別的に制御するかを示す図である。
【図５ＡＢ】骨髄間質細胞におけるオキシステロール誘導性Ｎｋｄ２及びＷｉｆ−１発現に対する種々の阻害剤の効果を示す図である。
【図５ＣＤ】骨髄間質細胞におけるオキシステロール誘導性Ｎｋｄ２及びＷｉｆ−１発現に対する種々の阻害剤の効果を示す図である。
【図５Ｅ】骨髄間質細胞におけるオキシステロール誘導性Ｎｋｄ２及びＷｉｆ−１発現に対する種々の阻害剤の効果を示す図である。
【図６】Ｗｎｔ３ａ馴化培地が、骨髄間質細胞におけるオキシステロール誘導性アルカリホスファターゼ活性をどのように阻害するかを示す図である。
【図７ＡＢ】オキシステロール誘導性骨形成が、骨髄間質細胞において、ＰＩ３キナーゼ経路によりどのように媒介されるかを示す図である。
【図７ＣＤ】オキシステロール誘導性骨形成が、骨髄間質細胞において、ＰＩ３キナーゼ経路によりどのように媒介されるかを示す図である。
【図７ＥＦ】オキシステロール誘導性骨形成が、骨髄間質細胞において、ＰＩ３キナーゼ経路によりどのように媒介されるかを示す図である。
【図８】骨形成性オキシステロールが骨髄間質細胞の骨形成分化を誘導する分子機序を示す図である。
【図９】骨髄間質細胞におけるアルカリホスファターゼ活性に対する種々のオキシステロール分子の効果を示す図である。
【図１０】骨髄間質細胞における骨シアロタンパク質（ＢＳＰ、bone sialoprotein）発現に対する種々のオキシステロール分子の効果を示す図である。
【図１１】骨髄間質細胞におけるオステオカルシンｍＲＮＡ発現に対する種々のオキシステロールの効果を示す図である。
【図１２】骨髄間質細胞の脂肪生成に対する種々のオキシステロールの効果を示す図である。
【図１３】骨髄間質細胞の脂肪生成に対する種々のオキシステロールの効果を示す図である。
【図１４】Ｇｌｉ誘導性リポーター活性に対するＯｘｙ４９及びＳｈｈの効果を示す図である。
【図１５】Ｇｌｉ誘導性リポーター活性に対するＯｘｙ３４及びＳｈｈの効果を示す図である。
【図１６】骨髄間質細胞におけるＧｌｉ１及びＰａｔｃｈｅｄ  ｍＲＮＡ発現に対する種々のオキシステロールの効果を示す図である。
【図１７】骨髄間質細胞における骨シアロタンパク質ｍＲＮＡ発現に対する種々のオキシステロールの効果を示す図である。
【図１８】骨髄間質細胞の鉱化作用に対する種々のオキシステロールの効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の実施形態を下記で詳細に考察する。実施形態について記述する際には、特定の専門用語を使用して明確さを期す。しかしながら、本発明は、そのように選択された特定の専門用語に制限されることを意図されていない。当業者であれば、他の等価な部分を使用することができ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに他の方法を開発することができることを認識するだろう。本明細書中に引用された文献は全て、あたかも各々が個々に組み込まれたかのように、参照によりそれらの全体が組み込まれる。国際公開第２００８／１１５４６９号パンフレット、国際公開第２００８／０８２５２０号パンフレット、国際公開第２００７／０９８２８１号パンフレット、国際公開第２００７／０２８１０１号パンフレット、国際公開第２００６／１１０４９０号パンフレット、国際公開第２００５／０２０９２８号パンフレット、及び国際公開第２００４／０１９８８４号パンフレットとして公開された特許協力条約（ＰＣＴ、Patent Cooperation Treaty）国際出願が、本明細書に参照により組み込まれる。
【００３１】
本明細書では、「アラルキル」は、アリール環がアルキル基に結合されている化学的官能基を意味することができる。「アラルケン」は、アリール環がアルケン基に結合されている化学的官能基を意味することができる。「アラルキン」は、アリール環がアルキン基に結合されている化学的官能基を意味することができる。「アリール」基は、少なくとも１つの環が芳香族である１又は複数の環を含む化学的官能基を意味することができる。環（複数可）は、炭素原子で形成されてもよく、又はヘテロ環であってもよい。アリール環の例には、ベンゼン環、ナフタレン、ピリジン、ピロール、チオフェン、フラン、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、インドール、及びキノリンが含まれる。ある実施形態では、アリール環は、例えばハロゲン、アルキル（例えばメチル）、アミン、ヒドロキシ、及び／又はスルフヒドリルによって置換されていてもよい。
【００３２】
オキシステロールは、細胞分化に役割を果たすことができる。特定のオキシステロールは、インビトロでヒトケラチノサイトの分化を誘導するが、単球分化は、オキシステロール７−ケトコレステロールによって誘導することができる。オキシステロールによるケラチノサイトの分化は、核内ホルモン受容体、肝臓Ｘ受容体β（ＬＸＲβ、liver X receptor β）によって媒介される。オーファン核内受容体として初期に同定されたＬＸＲα及びＬＸＲβは、オキシステロールに対する受容体として作用する。しかしながら、オキシステロールの効果の多くは、ＬＸＲ非依存性機序によって媒介される。特定のＬＸＲリガンドによるＬＸＲの活性化は、間葉細胞の骨形成分化を刺激するのではなく阻害したため、それらには間葉細胞に対するオキシステロールの効果が含まれる。さらに、ＬＸＲ欠損マウスに由来するＭＳＣも、それらの野生型等価物と同様に、骨形成性オキシステロールに応答することができた。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ、mitogen-activated protein kinase）などのシグナル伝達分子の活性を制御することができる、さらなるオキシステロール結合タンパク質が報告されている。
【００３３】
ヘッジホッグ分子は、組織パターン形成、有糸分裂誘発、形態形成、細胞分化、及び胚発生を含む様々な過程に役割を果たすことができる。胚発生におけるその役割に加えて、ヘッジホッグシグナル伝達は、組織／器官の保全及び機能の生後発達及び維持に役割を果たすことができる。ヘッジホッグシグナル伝達は、インビトロ及びインビボにおいて、骨芽細胞の発達だけでなく骨格形成中も重要であり得る。ヘッジホッグシグナル伝達は、多能性間葉細胞、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ  １／２に適用されると、脂肪生成を阻害することができる。
【００３４】
ヘッジホッグシグナル伝達には、原形質膜タンパク質、キナーゼ、ホスファターゼ、及びヘッジホッグ分子のシャフリング（shuffling）及び分布を促進する因子を含むシグナル伝達分子の複合ネットワークが含まれる場合がある。生産細胞／シグナル伝達細胞のサブセットに由来するヘッジホッグ分子の産生には、その合成、自己プロセシング、及び脂質修飾が含まれる。その機能性に不可欠であり得るヘッジホッグの脂質修飾には、自己切断ヘッジホッグ分子のＣ末端ドメインにコレステロール分子が付加されること、及びそのＮ末端ドメインのパルミトイル化が含まれる場合がある。さらなる補助因子は、ヘッジホッグ分子をシグナル伝達細胞の原形質膜へと行き来させること、それらを細胞外環境へと放出すること、及びそれらを応答細胞に輸送することを支援することができる。
【００３５】
ヘッジホッグ分子の非存在下では、応答細胞の原形質膜に存在するＰａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ）は、別の原形質膜結合シグナル伝達性分子、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）の活性を阻害することによって、ヘッジホッグシグナル伝達を休止モードにしておくことができる。ヘッジホッグの存在下では、ＰｔｃｈによるＳｍｏの阻害を緩和することができ、Ｓｍｏは、ヘッジホッグ制御遺伝子の転写を制御するためのシグナルを伝達することができる。この転写制御には、Ｇｌｉを制御するアクセサリー分子の複合体のメンバー間で相互作用した後、及び７５ｋｄ転写リプレッサーから１５５ｋｄ転写活性化因子へとそれが変換された後で細胞質から核に進入するＣｉ／Ｇｌｉ転写因子が、部分的に含まれる場合がある（Cohen (2003) Am J Med Gen 123A, 5-28; Mullor et al. (2002) Trends Cell Bio 12, 562-569）。
【００３６】
骨髄間質細胞（ＭＳＣ、bone marrow stromal cell）としても知られている骨髄間質で見出される多能性間葉幹細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、線維芽細胞、及び脂肪細胞を含む幾つかの異なる細胞タイプに分化する可能性を有する（Caplan AI.  1994.  The mesengenic process. Clin. Plast Surg 21:  429-435、Majors AK, Boehm CA, Nitto H, Midura RJ, Muschler GF.  1997.  Characterization of human bone marrow stromal cells with respect to osteoblastic differentiation.  J Orthop Res 15:546-557、Prockop DJ.  1997.  Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.  Science 276:71-74）。幹細胞の運命をこれらの種々の系統へと制御することは、組織発生、恒常性、及び修復にとって重要である（Vaananen HK.  2005.  Mesenchymal stem cells.  Ann Med 37:469-479、Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR.  1999.  Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.  Science 284:143-147）。骨粗しょう症は、一般的に骨ターンオーバー恒常性の変化により生じ、骨がもろいこと及び骨折のし易さが増加していることによって特徴付けられる、骨格の変性疾患である（Riggs BL, Melton LJ.  1992.  The prevention and treatment of osteoporosis.  N Engl J Med 327:620-627）。骨芽細胞形成及び／又は前駆細胞活性の低減による骨合成の減少は、過度の破骨細胞の形成及び／又は活性に由来する骨吸収の増加に加えて、骨芽細胞を犠牲にした脂肪細胞形成の増加と同時に生じ、この変性障害に結びつく機序である（Cummings SR, Melton LJ.  2002.  Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures.  Lancet 359: 1761-1767）。再吸収阻害剤に加えて、ＭＳＣに対して骨形成促進性及び脂肪生成阻害性の効果を有する治療用分子は、細胞分化中の明白な不均衡を骨芽細胞に有利なように変化させることにより骨形成を増強することによって、骨粗しょう症への介入を支援することができる（Rodan GA, Martin TJ.  2000.  Therapeutic approaches to bone diseases.  Science 289:1508-1514、Goltzman D. 2002.  Discoveries, drugs and skeletal disorders.  Nat Rev Drug Discov 1:784-796、Mundy GR.  2002.  Directions of drug discovery in osteoporosis.  Annu Rev Med 53:337-354）。
【００３７】
オキシステロールは、コレステロール酸化の産物であり、インビボでは骨芽細胞を含む様々な細胞タイプにより形成される（Schroepfer GJ.  2000.  Oxysterols:  Modulators of cholesterol metabolism and other processes.  Phyiol Rev 80:361-554、Bjorkhem I, Dicsfalusy U.  2002.  Oxysterols:  Friends, foes, or just fellow passengers?  Arterioscler Thromb Vasc Biol 22:734-742）。２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロール（２０Ｓ）などの特定のオキシステロールは、単独で又は２２（Ｓ）−若しくは２２（Ｒ）−ヒドロキシコレステロールと組み合わせて、Ｍ２−１０Ｂ４（Ｍ２）骨髄間質細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ  １／２胚線維芽細胞などの多能性間葉細胞における骨形成分化の強力な誘発因子であり得る（Kha HT, Basseri B, Shouhed D, Richardson J, Tetradis S, Hahn TJ, Parhami F.  2004.  Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells:  Pro-bone and anti-fat.  J Bone Miner Res 19:830-840）。これらのオキシステロールは、ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化を介してＭＳＣの骨形成分化を誘導し、脂肪生成性分化を阻害することができ、ひいては骨形成分化及び脂肪生成性分化を制御する基本スイッチ、すなわち、それぞれＲｕｎｘ２及びＰＰＡＲγを制御する（Richardson JA, Amantea CM, Kianmahd B, Tetradis S, Lieberman JR, Hahn TJ, Parhami F.  2007.  Oxysterol-induced osteoblastic differentiation of pluripotent mesenchymal cells is mediated through a PKC- and PKA-dependent pathway.  J Cell Biochem 100:1131-1145、Dwyer JR, Sever N, Carlson M, Nelson SF, Beachy PA, Parhami F.  2007.  Oxysterols are novel activators of the hedgehog signaling pathway in pluripotent mesenchymal cells.  J Biol Chem 282:  8959-8968、Kim WK, Meliton V, Amantea CM, Hahn TJ, Parhami F.  2007.  20(S)-hydroxycholesterol inhibits PPARgamma expression and adipogenic differentiation of bone marrow stromal cells through a hedgehog-dependent mechanism.  J Bone Miner Res 22:1711-1719）。オキシステロールは、骨粗しょう症及び他の筋骨格障害に介入するための有望な治療薬としての役目を果たすことができる可能性がある。特定の機序が、ＭＳＣ分化に対する骨形成性オキシステロールの効果の媒介において、ヘッジホッグシグナル伝達と相乗効果的及び／又は協同的な役割を果たす可能性がある。
【００３８】
Ｗｎｔは、細胞パターン形成、増殖、及び幹細胞運命決定などの胎生発育の多数の局面に影響を及ぼす、小型（３９〜４６ｋＤａ）脂質修飾分泌性糖タンパク質である（Gordon MD, Nusse R. 2006.  Wnt signaling:  multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors.  J Biol Chem 281:22429-22433、Clevers H.  2006.  Wnt/β-catenin signaling in development and disease.  Cell 127:469-480、Willert K, Jones KA.  2006.  Wnt signaling:  is the party in the nucleus? Genes Dev 20:1394-1404）。Ｗｎｔタンパク質は、β−カテニン依存性（つまり、標準β−カテニン／ＴＣＦ／Ｌｅｆ経路）、又は非依存性（つまり、非標準Ｗｎｔ／平面内細胞極性及びＷｎｔ／カルシウム経路）機序のいずれかを介してシグナルを伝達する７回膜貫通型受容体のファミリーであるＦｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）分子を介してシグナルを送る。β−カテニン依存性経路の活性化は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ、low-density lipoprotein receptor related protein）５／６の存在を必要とする（Johnson ML, Harnish K, Nusse R, Van Hul W.  2004.  LRP5 and Wnt signaling:  a union made for bone.  J Bone Miner Res 19:1749-1757）。特定のＷｎｔは、Ｒｕｎｘ２遺伝子発現の直接的刺激を介して骨形成を誘導し（Gaur T, Lengner CJ, Hovhannisyan H, Bhat RA, Bodine PVN, Komm BS, Javed A, Van Wijnen AJ, Stein JL, Stein GS, Lian JB.  2005.  Canonical Wnt signaling promotes osteogenesis by directly stimulating Runx2 gene expression.  J Biol Chem 280:33132-33140、Westendorf JJ, Kahler RA, Schroeder TM.  2004.  Wnt signaling in osteoblast and bone diseases.  Gene 341:19-39）、ＰＰＡＲγ及びＣ／ＥＢＰαの阻害により脂肪生成を阻害する（Bennett CN, Ross SE, Longo KA, Bajnok L, Hemati N, Johnson KW, Harrison SD, MacDougald OA.  2002.  Regulation of Wnt signaling during adipogenesis.  J Biol Chem 277:30998-31004、Kennell JA, MacDougald OA.  2005.  Wnt signaling inhibits adipogenesis through β-catenin-dependent and -independent mechanisms.  J Biol Chem 280:24004-24010）。さらに、ＬＲＰ５遺伝子のヒト機能喪失型突然変異により、骨減少性障害骨粗しょう症−偽性神経膠腫症候群（Gong Y, Slee RB, Fukai N, Rawadi G, Roman-Roman S, Reginato AM, Wang H, Cundy T, Glorieux FH, et al.  2001.  LDL receptor-related protein 5 (LRP5) affects bone accrual and eye development.  Cell 107:513-523）を生じるが、この同じ遺伝子の機能獲得型突然変異は、高骨量障害を生じる（Boyden LM, Mao J, Belsky J, Mitzner L, Farhi A, Mitnick MA, Wu D, Insogna K, Lifton RP.  2004.  N Engl J Med 364:  1513-1521）。ＬＲＰ５／６に直接結合し、エンドサイトーシスにもかかわらず、それを細胞表面から取り除き、それによってβ−カテニン依存性Ｗｎｔシグナル伝達が生じることを防止するタンパク質Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）を使用して、β−カテニン依存性Ｗｎｔシグナル伝達経路を特異的に阻害することが可能である（Westendorf JJ, Kahler RA, Schroeder TM.  2004.  Wnt signaling in osteoblast and bone diseases.  Gene 341:19-39、Bafico A, Liu G, Yaniv A, Gazit A, Aaronson SA.  2001.  Novel mechanism of Wnt signalling inhibition mediated by Dickkopf-1 interaction with LRP6/Arrow.  Nature Cell Biol 3:683-686）。従来、β−カテニン依存性Ｗｎｔシグナル伝達の阻害剤として特異的に作用すると考えられているが、幾つかの報告によると、Ｄｋｋ−１の阻害作用は、β−カテニン非依存性であることが示されている（Peng S, Miao C, Li J, Fan X, Cao Y, Duan E.  2006.  Dickkopf-1 induced apoptosis in human placental choriocarcinoma is independent of canonical Wnt signaling.  Biochem Biophysic Res Comm 350:641-647、Lee AY, He B, You L, Xu Z, Mazieres J, Reguart N, Mikami I, Batra S, Jablons DM.  2004.  Dickkopf-1 antagonizes Wnt signaling independent of β-catenin in human mesothelioma.  Biochem Biophysic Res Comm 323:1246-1250）。ヘッジホッグ及びＷｎｔシグナル伝達は、骨芽細胞発生及び毛包形態形成を含む幾つかの生理学的及び病理学的過程の制御に、相乗効果的に及び／又は協同的に作用する（Hu H, Thlton MJ, Tu X, Yu K, Ornitz DM, Long F.  2004.  Sequential roles of Hedgehog and Wnt signaling in osteoblast development.  Development 132:49-60、Silva-Vargas V, Lo Celso C, Giangreco A, Ofstad T, Prowse DM, Braun KM, Watt FM.  2005.  β-catenin and hedgehog signal strength can specify number and location of hair follicles in adult epidermis without recruitment of bulge stem cells.  Develop Cell 9:121-131、Mullor JL, Dahmane N, Sun T, Altaba AR.  2001.  Wnt signals are targets and mediators of Gli function.  Current Biol 11:769-773、Taipale J, Beachy PA.  2001.  The hedgehog and Wnt signalling pathways in cancer.  Nature 411:349-354）。
【００３９】
ＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ経路は、細胞の成長、増殖、生存、代謝、侵入、血管新生、及びＤＮＡ修復を含む様々な細胞過程に関与する。ＰＩ３−キナーゼ／Ａｋｔ経路は、未分化の骨芽細胞前駆細胞の生存（Debiais F, Lefevre G, Lemonnier J, Le Mee S, Lasmoles F, Mascarelli F, Marie PJ.  2004.  Fibroblast growth factor-2 induces osteoblast survival through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent, -β-catenin-independent signaling pathway.  Experimental Cell Res 297:  235-246、Almeida M. Han L, Bellido T, Manolagas SC, Kousteni S.  2005.  Wnt proteins prevent apoptosis of both uncommitted osteoblast progenitors and differentiated osteoblasts by β-catenin-dependent and -independent signaling cascades involving Src/ERK and Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt.  J Biol Chem 280:41342-41351）、並びに骨芽細胞分化及び遊走の制御（Fujita T, Azuma Y, Fukuyama R, Hattori Y, Yoshida C, Koida M, Ogita K, Komori T.  2004.  Runx2 induces osteoblast and chondrocyte differentiation and enhances their migration by coupling with PI3K-Akt signaling.  J Cell Biol 166:85-95、Ghosh-Choudhury N, Abboud SL, Nishimura R, Celeste A, Mahimainathan L, Choudhurry GG.  2002.  Requirement of BMP-2-induced phosphatidylinositol 3-kinase and Akt serine/threonine kinase in osteoblast differentiation and Smad-dependent BMP-2 gene transcription.  J Biol Chem 277:33361-33368、Ghosh-Choudhurry N, Mandal CC, Choudhurry GG.  2007.  Statin-induced Ras activation integrates the phosphatidylinositol 3-kinase signal to Akt and MAPK for bone morphogenetic protein-2 expression in osteoblast differentiation.  J Biol Chem 282:4983-4993）に役割を果たすことができる。Ａｋｔ−／−マウスは、骨発達の深刻な遅延を示し（Peng X, Xu P, Chen M, Hahn-Windgassen A, Skeen J, Jacobs J, Sundararajan D, Chen WS, Crawford SE, Coleman KG, Hay N.  2007.  Dwarfism, impaired skin development, skeletal muscle atrophy, delayed bone development, and impeded adipogenesis in mice lacking Akt1 and Akt2.  Genes Dev 17:1352-1365）、骨芽細胞におけるＡｋｔ阻害剤、Ｐｔｅｎホスファターゼの特異的欠失は、マウスの生涯全体にわたる骨密度の増加を招く（Liu X, Bruxvoort KJ, Zylstra CR, Liu J, Cichowski R, Faugere MC, Bouxsein ML, Wan C, Williams BO, Clemens TL.  2007.  Lifelong accumulation of bone in mice lacking Pten in osteoblasts.  Proc Natl Acad Sci 104:  2259-2264）。ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ活性化は、細胞周期進行、ニューロン分化及び軟骨形成分化、並びに内皮細胞による毛細管形態形成を含むヘッジホッグシグナル伝達の生物学的効果を媒介する際に、直接的な又は相乗効果的な役割を果たすことができる（Riobo NA, Lu K, Ai X, Haines GM, Emerson CP.  2006.  Phosphoinositide 3-kinase and Akt are essential for Sonic Hedgehog signaling.  Proc Natl Acad Sci 103:4505-4510、Kenney AM, Widlund HR, Rowitch DH.  2003.  Hedgehog and PI-3 kinase signaling converge on Nmycl to promote cell cycle progression in cerebellar neuronal precursors.  Development 131:217-228、Fu J, Liu W, Zhou J, Sun H, Xu H, Luo L, Zhang H, Zhou Y.  2006.  Sonic hedgehog protein promotes bone marrow-derived endothelial progenitor cell proliferation, migration and VEGF production by PI 3-kinase/Akt signaling pathways.  Acta Pharmacol Sinica 27:685-693、Kanda S. Mochizuki Y, Suematsu T, Miyata Y, Nomata K, Kanetake H.  2003.  Sonic hedgehog induces capillary morphogenesis by endothelial cells through phosphoinositide 3-kinase.  J Biol Chem 278:8244-8249）。
【００４０】
特定のオキシステロールは、Ｄｋｋ−１阻害可能かつＰＩ３キナーゼ依存的な機序（複数可）を介してそれらの骨形成効果を及ぼすことができる。Ｄｋｋ−１は、ＭＳＣのオキシステロール誘導性骨形成分化を阻止することができるが、オキシステロールは、Ｗｎｔシグナル伝達の全てではなく幾つかの標的を制御すると考えられる。
【００４１】
骨健康を増進するために、骨前駆細胞を、骨誘導性／同化因子の使用を介してそれらの骨形成分化及び骨形成特性を刺激するために標的とすることができる。特定の天然オキシステロールは、骨前駆細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達の活性化を介して部分的に媒介される骨誘導特性を有している。ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化と同時に、骨形成性オキシステロールは、Ｄｋｋ−１阻害可能かつβ−カテニン非依存的な様式で、Ｗｎｔ関連シグナル伝達経路を活性化することができる。骨髄間質細胞をオキシステロールで処理することにより、Ｗｎｔ標的遺伝子の選択的発現誘導に加えて、骨形成分化マーカーの発現増加を示し得る。これらのオキシステロール効果は、β−カテニン蓄積又はＴＣＦ／Ｌｅｆ活性化の非存在下で生じる場合があり、ヘッジホッグ経路阻害剤、シクロパミンにより、及び／又はＷｎｔ経路阻害剤、Ｄｋｋ−１により阻害することができる。ＰＩ３キナーゼシグナル伝達の阻害剤、ＬＹ２９４００２及びワートマニン（wortmanin）は、オキシステロール誘導性骨形成分化及びＷｎｔシグナル伝達標的遺伝子の誘導を阻害することができる。骨形成性オキシステロールは、多数の発生過程及び発生後過程を制御する多能性間葉細胞におけるシグナル伝達経路の低分子調節因子である。
【００４２】
ラット頭蓋冠欠損モデルにおけるインビボでの骨形成は、骨形成性オキシステロール２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール＋２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールを含有する担体ＰＬＧＡディスクを用いて欠損が移植されると、増強され得ることが実証されている。この知見により、骨前駆細胞、例えば骨髄間質細胞の骨形成分化をインビトロで誘導する骨形成性オキシステロールは、インビボでも細胞の骨形成活性を刺激し、骨治癒を増強することが実証された（Aghaloo T, Amantea C, Cowan C, Richardson J, Wu B, Parhami F, Tetradis S.  Oxysterols enhance osteoblast differentiation in vitro and bone healing in vivo.  J Orthop Res 25:1488-1497; 2007）。
【００４３】
本明細書中で提示されるオキシステロールは、骨形成の誘導、骨粗しょう症の治療、及び他の適応のための新しい治療用製剤の創薬に有用であり得る。これらのオキシステロールは、骨形成を誘導し骨粗しょう症を治療するために現在使用されている従来の化合物より低いコストでの合成／生産、並びにより良好な安全性及び活性プロファイルを有し得る。そのような適用は、これらのオキシステロールがヘッジホッグシグナル伝達経路を誘導する能力に基づくものであり得る。特定のオキシステロールは、多能性細胞を標的とし、これらの細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達を誘導することにより、それらの系統の特異的分化を種々の細胞タイプ、例えば骨芽細胞へと誘導することができる。これらの化合物で処理された間葉幹細胞は、骨芽細胞分化マーカーの発現誘導を示すことができる。本研究では、オキシステロールを合成し、多能性間葉細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化及び骨形成分化マーカーの誘導をインビトロで試験した。特定のオキシステロールは、類似細胞の脂肪生成性分化を阻害することができ、及び／又はＷｎｔ関連シグナル伝達を誘導することができる。本明細書中で提示されるオキシステロールは、これらに限定されないが、局所的骨形成の誘導、骨粗しょう症の治療、及び抗肥満適用を含む種々の適応のための治療用製剤に使用することができる。これらの分子の特性を活性化するヘッジホッグ経路に基づいて適用可能な他の適応は、１）これらに限定されないが、動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、及び脳卒中を含む心血管疾患、２）発毛／脱毛症、並びに３）軟骨形成である。
【００４４】
本出願で論じるオキシステロールには、Ｏｘｙ２２、Ｏｘｙ２６、Ｏｘｙ２７、Ｏｘｙ２８、Ｏｘｙ３９、Ｏｘｙ４０、Ｏｘｙ４ｌ、Ｏｘｙ４２、Ｏｘｙ４８、Ｏｘｙ４９、Ｏｘｙ２０、Ｏｘｙ３４、Ｏｘｙ３６、Ｏｘｙ３８、Ｏｘｙ５０、Ｏｘｙ５１、Ｏｘｙ５２、及びＯｘｙ５３と称するものが含まれる。これらの分子の化学構造は、図１に示されている（Velgova, H.; Cerny, Vaclav; Sorm, Frantisek; Slama, Karel.   Steroids.  CXXVI. Further compounds with antisclerotization effect on Pyrrhocoris apterus larvae; structure and activity correlations.    Collection of Czechoslovak Chemical Communications  (1969),  34(11),  3354-76、Sheikh, Younus M.; Djerassi, Carl.   Mass spectrometry in structural and stereochemical problems.  CCXXX.  Preparation of 5α,20α and 5α,17α,20α-cholestane-3β,6α-diol.  Electron impact induced fragmentation of steroidal Δ17(20), Δ20(21) andΔ20(22) olefins.    Journal of Organic Chemistry  (1973),  38(20),  3545-53）。少なくとも以下のオキシステロールが骨誘導性として同定されている：Ｏｘｙ２２、Ｏｘｙ２６、Ｏｘｙ２７、Ｏｘｙ２８、Ｏｘｙ３９、Ｏｘｙ４０、Ｏｘｙ４１、Ｏｘｙ４２、Ｏｘｙ４８、Ｏｘｙ４９、Ｏｘｙ５０、Ｏｘｙ５１、Ｏｘｙ５２、及びＯｘｙ５３。これらのオキシステロールの骨誘導特性は、アルカリホスファターゼ活性、オステオカルシンｍＲＮＡ発現、及び鉱化作用を含む種々の骨芽細胞分化マーカーの発現を誘導するそれらの能力によって表される。これらのオキシステロールは、ヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化因子である。これらのオキシステロールは、多能性細胞の脂肪生成も阻害する。
【００４５】
本発明によるオキシステロール化合物は、活性を有することができ、すなわち、ヒト又は動物細胞と接触した際に生体応答を誘導することができる。例えば、細胞は、間葉幹細胞又は骨髄間質細胞であってもよい。この活性又は応答は、骨芽細胞分化の刺激、脂肪細胞分化の阻害、軟骨形成の刺激、発毛の刺激、及び／又は血管新生の刺激と相関する場合がある。生物活性組成物、例えば、薬学的に許容される担体及び本発明によるオキシステロール化合物を含む医薬組成物は、活性を有することができ、すなわち、哺乳動物細胞、例えば、インビトロの細胞、又はヒト若しくは動物中の細胞に投与された際に生体応答を誘導することができる。この活性又は応答は、骨芽細胞分化の刺激、脂肪細胞分化の阻害、軟骨形成の刺激、発毛の刺激、及び／又は血管新生の刺激と相関する場合がある。そのような活性又は応答は、ヘッジホッグ経路の刺激から生じる場合がある。例えば、本発明によるオキシステロール化合物のそのような活性又は応答は、オキシステロール化合物が、細胞、ヒト、哺乳動物、又は動物に投与される場合、以下の１又は複数よって特徴付けることができる：対照で観察されたものより高いオステオカルシン、Ｇｌｉ１、Ｐａｔｃｈｅｄ、骨シアロタンパク質、Ａｘｉｎ２、サイクリンＤ１、Ｎｋｄ２、及び／又はＷＩＦ−１  ｍＲＮＡ発現；対照で観察されたもの未満の脂肪細胞増殖（本発明によるオキシステロール化合物及び任意の対照化合物は、各々がトログリタゾンと共に投与された）；対照で観察されたものより高いＧｌｉ誘導リポーター活性、対照で観察されたものより高いＴＣＦ／Ｌｅｆリポーター活性；並びに／又は対照で観察されたものより高い４５Ｃａ取り込み及び／若しくはアルカリホスファターゼ活性。対照は、例えば、インビトロ又は哺乳動物などのヒト若しくは動物中の未処置の細胞であってもよい。或いは、対照は、対照化合物が投与された細胞であってもよい。例えば、そのような対照化合物は、媒体、薬学的に許容される担体、天然若しくは合成オキシステロール、及び／又は別の化合物であってもよい。生体応答は、種々のタイプのタンパク質発現及び他の活性の測定を含む、本明細書中で論じるアッセイなどの細胞レベルの実験室アッセイによって識別することができる。本発明によると、これらの生体応答は、骨芽細胞分化の刺激、脂肪細胞分化の阻害、軟骨形成の刺激、発毛の刺激、及び／又は血管新生の刺激などの、本明細書中で識別された望ましい組織レベルの医薬効果と「関連している」とみなされる。「観察されたものより高い」及び「観察されたもの未満」とは、例えば、ｐ＜０．０５の統計的有意差を指す。
【００４６】
ＢＳＰ発現の誘導は、本明細書中で論じるＯｘｙ化合物などのオキシステロールの最大効能がＭ２−１０Ｂ４細胞の培養で鉱化作用を誘導するのに重要であり得る。ＢＳＰ発現の誘導は、オキシステロール分子の骨誘導特性にとって重要であり得る。本発明者らが実施した構造活性相関（ＳＡＲ、structure-activity relationship）研究、例えば本明細書中で論じる実験に基づくと、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールの２５位炭素と２７位炭素との間に二重結合が付加される場合に、オキシステロールの骨誘導能が増加し得ると考えられる。例えば、オキシステロールの骨誘導能は、それが２５位炭素と２７位炭素との間の二重結合、及び／又はＯｘｙ４９などのようにＢ環の６位炭素から垂下するヒドロキシ基を有する場合に、増加する場合がある。
【００４７】
したがって、本明細書中で論じるオキシステロールの幾つかの適用には、以下が含まれる。オキシステロールは、ヘッジホッグ経路を活性化して、ヘッジホッグ経路の活性化から利益を得るであろう適応について、ヒト及び／又は動物の任意の細胞、器官、又は組織を標的とするために使用することができる。オキシステロールは、全身性骨形成を誘導して、骨粗しょう症などの障害を治療し、偽関節骨折、及び頭蓋冠骨又は歯科適用／インプラントの顎骨欠損などの任意の種類の骨欠損などの状態を治療するために局所的骨形成を誘導し、脊椎固定を誘導するために使用することができる。オキシステロールは、単独で、又は１若しくは複数の骨形態形成タンパク質並びに他の骨誘導性及び骨伝導性分子と組み合わせて使用することができる。異なるオキシステロールの組合せを使用することができる。オキシステロールは、全身性脂肪形成を阻害して肥満などの状態を治療するために、及び局所的脂肪形成を阻害して黄色腫などの状態を治療するために使用することができる。オキシステロールは、単独で又は軟骨細胞分化の他の誘導因子と組み合わせて使用した場合に、例えばヘッジホッグ経路を活性化することによって、軟骨の形成を誘導するために使用することができる。例えば、軟骨の形成を誘導するためのオキシステロールの使用は、骨関節炎など状態を治療するために、又は関節の正常損耗の修復に使用することができる。オキシステロールは、心血管の状態、例えば、これらに限定されないが、脳卒中、心筋梗塞、動脈硬化症、及び末梢血管疾患などの適応のある、神経性及び血管性を含む全起源の細胞に対する保護効果に帰着するヘッジホッグ経路活性の増加から利益を得る可能性のある状態を治療するために使用することができる。オキシステロールは、例えばヘッジホッグ経路の活性化によって、新しい血管形成及び／又は血管新生を誘導するために使用することができる。オキシステロールは、発毛を誘導して脱毛を治療するために使用することができる。オキシステロールは、ヒト又は動物由来の任意の細胞タイプにおけるＷｉｆ−１（Ｗｎｔ阻害因子−１）を誘導するために使用することができる。オキシステロールは、ヒト又は動物由来の任意の細胞タイプにおけるＷｎｔ経路関連シグナル伝達を活性化するために使用することができる。
【００４８】
オキシステロール誘導性骨形成は、Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）によって阻害される
本発明者らは、Ｄｋｋ−１でＭ２細胞を処理することにより、ＭＳＣ（間葉幹細胞）のオキシステロール誘導性骨形成分化においてＷｎｔシグナル伝達が果たし得る役割を検討した。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ、alkaline phosphatase）活性、オステオカルシン（ＯＣＮ、osteocalcin）ｍＲＮＡ発現、及び鉱化作用を含む骨形成分化の幾つかのマーカーを分析した。Ｄｋｋ−１での前処理は、Ｍ２細胞におけるオキシステロール誘導性ＡＬＰ活性の部分的だが有意な阻害を引き起こし（図２Ａ）、Ｄｋｋ−１単独では、効果は観察されなかった。Ｄｋｋ−１を使用して観察されたＡＬＰ活性の阻害がオキシステロールに特異的であったかどうかを評価するために、本発明者らは、Ｄｋｋ−１前処理が、他の骨誘導性因子、すなわちソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ、sonic hedgehog）及び骨形態形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２、bone morphogenetic protein-2）に対して及ぼした効果を検討した。オキシステロール誘導性ＡＬＰ活性でのように、Ｄｋｋ−１前処理は、Ｓｈｈ誘導性ＡＬＰ活性を部分的に阻害した（図２Ｂ）。しかしながら、ＢＭＰ−２誘導性ＡＬＰ活性は、３つの分子によるＡＬＰ活性誘導が全て同じようなレベルであったにもかかわらず、より高い濃度のＤｋｋ−１を使用することによって、オキシステロール誘導性ＡＬＰ活性及びＳｈｈ誘導性ＡＬＰ活性について達成されたものより少ない程度に、わずかに有意に阻害された（図２Ｃ）。Ｄｋｋ−１で前処理されたＭ２細胞における、完全な、ベースラインレベル未満のオキシステロール誘導性鉱化作用の阻害が観察された（図２Ｄ）。Ｄｋｋ−１は、Ｍ２細胞におけるオキシステロール誘導性ＯＣＮ  ｍＲＮＡ発現を阻害せず（図２Ｅ）、ＥＭＳＡ分析によって評価されたオキシステロール誘導性Ｒｕｎｘ２  ＤＮＡ結合活性を阻害しなかった。
【００４９】
骨形成性オキシステロールは、Ｗｎｔシグナル伝達の標的を選択的に制御する
Ｍ２細胞におけるオキシステロール誘導性生物学的効果におけるＷｎｔシグナル伝達の役割を実証するために、本発明者らは、ＴＣＦ／Ｌｅｆ媒介性転写活性、β−カテニンの細胞質ゾル蓄積、及び幾つかの既知のＷｎｔ標的遺伝子の発現誘導を含む、Ｗｎｔシグナル伝達の幾つかのマーカーに対するオキシステロールの効果を検討した。５μＭのＳＳ、２００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ、又は４０ｍＭの塩化リチウム（ＬｉＣｌ）で処理されたＭ２細胞におけるＴＣＦ／Ｌｅｆの転写活性を、４つの野生型又は突然変異ＴＣＦ／Ｌｅｆ結合部位を含有するルシフェラーゼリポーターを使用して測定した（Smith E, Frenkel B.  2005.  Glucocorticoids inhibit the transcriptional activity of LEF/TCF in differentiating osteoblasts in a glycogen synthase kinase-3β-dependent and -independent manner.  J Biol Chem 280:2388-2394）。２４時間後に未処理の対照細胞と比較して、ＳＳ処理細胞又はＳｈｈ処理細胞では、リポーター活性に有意な変化は観察されなかったが、陽性対照、ＬｉＣｌでは、ＴＣＦ／Ｌｅｆリポーター活性が有意に誘導された（図３Ａ）。リポーター活性は、オキシステロール又はＳｈｈで処理した４８又は７２時間後でも誘導されなかった。本発明者らは、ＴＣＦ／Ｌｅｆ結合部位を有し（Tetsu O, McCormick F.  1999.  β-Catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells.  Nature 398:422-426）、処理の２４時間後にオキシステロールではなくＬｉＣｌによって活性化されたサイクリンＤ１プロモーターエレメントを含有する異なるＴＣＦ／Ｌｅｆリポーター構築体を使用した場合に、同様の結果を得た（図３Ｂ）。ＬｉＣｌは、pGL3basicルシフェラーゼ対照リポーターに対して効果を示さなかった（Tetsu O, McCormick F.  1999.  β-Catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells.  Nature 398:422-426）。５μＭのＳＳで８、２４、及び４８時間処理されたＭ２細胞に由来する細胞質ゾル抽出物は、ウエスタンブロット分析により測定し、β−アクチンレベルに対して標準化したところ、β−カテニンレベルの有意な変化を示さなかった。
【００５０】
上述のＴＣＦ／Ｌｅｆリポーターアッセイ及びβ−カテニンのウエスタンブロットに加えて、本発明者らは、Ｗｎｔシグナル伝達の既知標的である幾つかの遺伝子、すなわちＡｘｉｎ２、サイクリンＤ１、Ｎａｋｅｄ  Ｃｕｔｉｃｌｅ  ２（Ｎｋｄ２）、及びＷｎｔ阻害因子−１（Ｗｉｆ−１）の発現に対する、骨形成性オキシステロールの効果も検討した（Tetsu O, McCormick F.  1999.  β-Catenin regulates expression of cyclin D1 in colon carcinoma cells.  Nature 398:422-426、Jho E, Zhang T, Domon C, Joo C, Freund J, Costantini F.  2002.  Wnt/β-catenin/Tcf signaling induces the transcription of Axin2, a negative regulator of the signaling pathway.  Mol Cell Biol 22:1172-1183、Wharton KA, Zimmermann G, Rousset R, Scott MP.  2001.  Vertebrate proteins related to drosophila Naked Cuticle bind Dishevelled and antagonize Wnt signaling.  Develop Biol 234:  93-106、Van Raay TJ, Coffey RJ, Solnica-Krezel L. 2007.  Zebrafish Naked1 and Naked2 antagonize both canonical and non-canonical Wnt signaling.  Develop Biol 309:151-168、Reguart N, He B, Xu Z, You L, Lee AY, Mazieres J, Mikami I, Batra S, Rosell R, McCormick F, Jablons DM.  2004.  Cloning and characterization of the promoter of human Wnt inhibitory factor-1.  Biochem Biophys Res Comm 323:229-234）。その結果、８及び４８時間後にＭ２細胞を５μＭのＳＳ又は２００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈで処理した際には、Ａｘｉｎ２  ｍＲＮＡ発現に有意な変化は示されなかったが、ＬｉＣｌは、両時点でその発現を誘導した（図４Ａ及び４Ｂ）。オキシステロールは、サイクリンＤ１  ｍＲＮＡ発現を有意には誘導しなかったが、Ｓｈｈは、処理の８時間後には、その発現の少ないが有意な増加を引き起こしたが、４８時間後では引き起こさなかった（図４Ｃ及び４Ｄ）。ＬｉＣｌは、８時間ではＭ２細胞におけるサイクリンＤ１の発現を誘導せず、４８時間後にはそのベースライン発現を阻害した。Ｎｋｄ２及びＷｉｆ−１の両方のｍＲＮＡ発現は、標準Ｗｎｔシグナル伝達をアンタゴナイズするＷｎｔ標的遺伝子であり（Wharton KA, Zimmermann G, Rousset R, Scott MP.  2001.  Vertebrate proteins related to drosophila Naked Cuticle bind Dishevelled and antagonize Wnt signaling.  Develop Biol 234:  93-106、Van Raay TJ, Coffey RJ, Solnica-Krezel L. 2007.  Zebrafish Naked1 and Naked2 antagonize both canonical and non-canonical Wnt signaling.  Develop Biol 309:151-168、Reguart N, He B, Xu Z, You L, Lee AY, Mazieres J, Mikami I, Batra S, Rosell R, McCormick F, Jablons DM.  2004.  Cloning and characterization of the promoter of human Wnt inhibitory factor-1.  Biochem Biophys Res Comm 323:229-234）、４８時間後にはオキシステロールによりそれぞれ６倍及び３０倍に著しく誘導されたが、８時間後では誘導されなかった（図４Ｅ及び４Ｆ）。Ｓｈｈ処理は、Ｗｉｆ−１発現を誘導したが、Ｎｋｄ２発現を誘導しなかった（図４Ｅ及び４Ｆ）。ＳｈｈはＮｋｄ２発現を誘導することができないことから予期されるように、Ｈｈ標的遺伝子、Ｐａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ）の誘導された発現を完全に消失させた濃度のＨｈ経路阻害剤、シルコパミン（cylcopamine）は、オキシステロール誘導性Ｎｋｄ２発現を阻害しなかった（図５Ａ）。対照的に、オキシステロール誘導性Ｗｉｆ１発現は、シクロパミンによって完全に阻止された（図５Ｂ）。オキシステロール誘導性Ｎｋｄ２発現は、Ｄｋｋ−１によりほとんど完全に阻害されたが（図５Ｃ）、オキシステロール誘導性Ｗｉｆ−１の阻害は、最小限に過ぎなかった（図５Ｄ）。Ｗｎｔ経路活性化が、オキシステロ��ル誘導性Ｈｈ経路活性を制御する場合があるかどうか評価するために、本発明者らは、オキシステロール誘導性Ｐｔｃｈ  ｍＲＮＡ発現に対するＤｋｋ−１の効果を試験し、Ｄｋｋ−１がＰｔｃｈ発現を阻害しないことを見い出した（図５Ｅ）。
【００５１】
Ｗｎｔ３ａは、Ｍ２−１０Ｂ４骨髄間質細胞の骨形成分化を阻害する
Ｍ２細胞の骨形成分化に対するＷｎｔシグナル伝達の効果を検討するために、本発明者らは、ＡＬＰ活性に対するＷｎｔ３ａ馴化培地（ＣＭ、conditioned medium）の効果を、対照ＣＭ（Ｃ  ＣＭ、control CM）と比較して試験した。Ｍ２細胞を、１：２５、１：５０、又は１：１００希釈のＣ  ＣＭ又はＷｎｔ３ａ  ＣＭのいずれかを用いて骨形成用培地中で６日間処理した。Ｍ２細胞が骨形成用培地中で分化すると共に通常見られるＡＬＰ活性の自発的な増加は、Ｃ  ＣＭと比較して、用量依存的な様式でＷｎｔ３ａ  ＣＭによって阻害された（図６Ａ）。Ｗｎｔ３ａが、骨誘導性化合物によって誘導されたＡＬＰ活性に任意の効果を及ぼしたかどうかを試験するために、１．２５μＭのＳＳ、２００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ、又は５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を、単独で又は１：２５希釈のＷｎｔ３ａ  ＣＭと組み合わせて用いて、Ｍ２細胞を処理した。Ｗｎｔ３ａ  ＣＭは、ＳＳ誘導性ＡＬＰ活性及びＳｈｈ誘導性ＡＬＰ活性の両方を有意に阻害した（図６Ｂ）。しかしながら、Ｗｎｔ３ａ  ＣＭは、ＢＭＰ−２誘導性ＡＬＰ活性を有意には阻害しなかった（図６Ｂ）。
【００５２】
オキシステロール誘導性骨形成は、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路を介して媒介される
オキシステロールがＭ２細胞の骨芽細胞分化を制御するシグナル伝達機序（複数可）をさらに解明するために、本発明者らは、骨形成分化のオキシステロール誘導性マーカーに対する、ＰＩ３キナーゼ経路阻害剤、ＬＹ２９４００２（ＬＹ）及びワートマニン（Ｗｍ、wortmannin）の効果を試験した。ＬＹ又はＷｍのいずれかでＭ２細胞を前処理することにより、オキシステロール誘導性ＡＬＰ活性が用量依存的な様式で有意に阻害された（図７Ａ）。同様に、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ解析は、５μＭのＬＹ又はＷｍのいずれかを用いた前処理が、Ｍ２細胞において８日後にＳＳ誘導性ＯＣＮ  ｍＲＮＡ発現を有意に阻害したことを示した（図７Ｂ）。４５Ｃａ取り込みアッセイは、ＬＹ及びＷｍが、処理の１４日後にオキシステロール誘導性鉱化作用を有意に阻害したことを示した（図７Ｃ）。オキシステロール誘導性ＡＬＰ活性に対するそれらの阻害効果と同じように、ＬＹ及びＷｍは、Ｍ２細胞におけるＳｈｈ誘導性ＡＬＰ活性も阻害した（図７Ｄ）。本発明者らは、Ｍ２細胞におけるＮｋｄ２及びＷｉｆ−１  ｍＲＮＡ発現に対するＬＹ及びＷｍの効果を検討し、ＬＹ及びＷｍの両方が、オキシステロール誘導性Ｎｋｄ２及びＷｉｆ−１  ｍＲＮＡ発現の部分的ではあるが有意な阻害を引き起こしたことを見い出した（図７Ｅ及び７Ｆ）。
【００５３】
本発明者らは、ＭＳＣのオキシステロール誘導性骨形成分化におけるＷｎｔ関連シグナル伝達経路の役割を実証した。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、骨形成中の骨芽細胞の増殖及び分化の制御に役割を果たす。ヘッジホッグ及びＷｎｔシグナル伝達は、インビボで骨芽細胞の発生に協同すると考えられる（Johnson ML, Harnish K, Nusse R, Van Hul W.  2004.  LRP5 and Wnt signaling:  a union made for bone.  J Bone Miner Res 19:1749-1757、Gaur T, Lengner CJ, Hovhannisyan H, Bhat RA, Bodine PVN, Komm BS, Javed A, Van Wijnen AJ, Stein JL, Stein GS, Lian JB.  2005.  Canonical Wnt signaling promotes osteogenesis by directly stimulating Runx2 gene expression.  J Biol Chem 280:33132-33140、Westendorf JJ, Kahler RA, Schroeder TM.  2004.  Wnt signaling in osteoblast and bone diseases.  Gene 341:19-39、Hu H, Thlton MJ, Tu X, Yu K, Ornitz DM, Long F.  2004.  Sequential roles of Hedgehog and Wnt signaling in osteoblast development.  Development 132:49-60）。本発明者らの結果は、全てではないが幾つかの骨形成分化マーカーが、Ｄｋｋ−１によって阻止されることを示した。オキシステロール誘導性ＡＬＰ活性及び鉱化作用はＤｋｋ−１によって阻害されるが、ＯＣＮ発現又はＲｕｎｘ２  ＤＮＡ結合活性は阻害されないということは、ＭＳＣのオキシステロール誘導性骨形成分化が、ＭＳＣにおけるこの過程の異なる局面を制御する別の機序によって媒介されるという観察と一致する（Richardson JA, Amantea CM, Kianmahd B, Tetradis S, Lieberman JR, Hahn TJ, Parhami F.  2007.  Oxysterol-induced osteoblastic differentiation of pluripotent mesenchymal cells is mediated through a PKC- and PKA-dependent pathway.  J Cell Biochem 100:1131-1145）。このタンパク質の細胞質ゾルレベルが、オキシステロールを用いたＭＳＣ処理の際に影響を受けず、オキシステロール処理細胞ではＴＣＦ／Ｌｅｆ転写活性の明白な誘導はなかったため、オキシステロールのＤｋｋ−１阻害可能効果は、β−カテニン依存性ではないと考えられる。これらの結果は、種々の生物学的効果に対するＤｋｋ−１のアンタゴニスト効果が、β−カテニン非依存性であることを実証する他の報告と一致する。Leeらは、Ｄｋｋ−１がβ−カテニン欠損ヒト中皮腫細胞においてＷｎｔシグナル伝達をアンタゴナイズすることを報告し（Lee AY, He B, You L, Xu Z, Mazieres J, Reguart N, Mikami I, Batra S, Jablons DM.  2004.  Dickkopf-1 antagonizes Wnt signaling independent of β-catenin in human mesothelioma.  Biochem Biophysic Res Comm 323:1246-1250）、Pengらは、ヒト胎盤性絨毛癌細胞のＤｋｋ−１誘導性アポトーシスが、β−カテニン非依存的に生じたことを示した（Peng S, Miao C, Li J, Fan X, Cao Y, Duan E.  2006.  Dickkopf-1 induced apoptosis in human placental choriocarcinoma is independent of canonical Wnt signaling.  Biochem Biophysic Res Comm 350:641-647）。しかしながら、本発明者らの実験条件下ではＭ２細胞において比較的高いベースライン細胞質ゾル及び核内β−カテニンレベルがあったため、本発明者らの知見は、β−カテニン依存性シグナル伝達とオキシステロール誘導性ヘッジホッグ経路活性との間の潜在的な協同的相互作用を除外しない。Ｗｎｔによるβ−カテニン／ＴＣＦ／Ｌｅｆ依存性及び非依存性シグナル伝達は、古典的にはそれぞれ標準及び非標準Ｗｎｔシグナル伝達と呼ばれるため、ＭＳＣにおけるオキシステロール誘導性骨形成の効果は、その後の現象と最も良好に関連すると思われる。Ｄｋｋ−１は、Ｍ２細胞におけるＳｈｈ誘導性ＡＬＰ活性及びＢＭＰ２誘導性ＡＬＰ活性も部分的に阻害したが、その妨害効果は、オキシステロール又はＳｈｈによって誘導されたものと比べて、ＢＭＰ２誘導性ＡＬＰ活性に対してはそれほど強力ではなかった。この違いは、骨形成分化誘導の際の、ＢＭＰ２によるＷｎｔシグナル伝達のより高度な活性化、及びＷｎｔシグナル伝達に対するＢＭＰ２のより大きな依存性に部分的に起因し（Mbalaviele G, Sheikh S, Stains JP, Salazar VS, Cheng S, Chen D, Civitelli R.  2005.  β-Catenin and BMP-2 synergize to promote osteoblast differentiation and new bone formation.  J Cell Biochem 94:403-418、Rawadi G, Vayssiere B, Dunn F, Baron R, Roman-Roman S.  2003.  BMP-2 controls alkaline phosphatase expression and osteoblast mineralization by a Wnt autocrine loop.  J Bone Miner Res 18:1842-1853）、この過程を阻害するにはより高い濃度のＤｋｋ−１が必要であり得る。対照的に、オキシステロール及びＳｈｈは、ヘッジホッグシグナル伝達並びにＷｎｔシグナル伝達関連機序（複数可）により、骨形成分化を誘導すると考えられる。本発明者らは、ＢＭＰ２に応答したＧｌｉ−１及びＰｔｃｈ発現が存在しないことによって根拠が示されたような、ヘッジホッグシグナル伝達がＭ２細胞においてＢＭＰ２により誘導されるという証拠を見出さなかった。これらの結果は、Ｄｋｋ−１がＳｈｈ及びＢＭＰ２の骨形成効果を両方とも阻害するという以前の報告と一致するが（Hu H, Thlton MJ, Tu X, Yu K, Ornitz DM, Long F.  2004.  Sequential roles of Hedgehog and Wnt signaling in osteoblast development.  Development 132:49-60、Rawadi G, Vayssiere B, Dunn F, Baron R, Roman-Roman S.  2003.  BMP-2 controls alkaline phosphatase expression and osteoblast mineralization by a Wnt autocrine loop.  J Bone Miner Res 18:1842-1853）、そのような既報のＤｋｋ−１阻害効果は、もっぱらβ−カテニン依存性の機序の阻害に起因するか、又はβ−カテニン非依存性事象の妨害にも起因する。
【００５４】
本研究は、Ｗｎｔシグナル伝達標的遺伝子が、オキシステロール及びＳｈｈによって、別の機序を介して選択的に制御されることを実証した。Ａｘｉｎ２は、オキシステロールによっても又はＳｈｈによっても誘導されず、サイクリンＤ１は、８時間では最小限にのみ誘導されたが、４８時間では誘導されなかった。対照的に、Ｎｋｄ２は、オキシステロールによってのみ誘導されたが、Ｓｈｈによっては誘導されず、その一方でＷｉｆ−１は、オキシステロール及びＳｈｈの両方によって誘導された。オキシステロール及びＳｈｈによるＮｋｄ２発現の制御が異なることは、これらの骨形成分子によって誘導される応答間の注目すべき違いである。これらの知見は、オキシステロール誘導性Ｗｉｆ−１を完全に阻止するがＮｋｄ２を阻止しないというシクロパミンの能力、及びオキシステロール誘導性Ｎｋｄ２を完全に阻害しＷｉｆ−１を最小限に阻止するに過ぎないというＤｋｋ−１の能力に加えて、これらのＷｎｔ標的遺伝子に対するオキシステロールの効果が、主に、Ｗｎｔ依存性シグナル伝達又はヘッジホッグ依存性シグナル伝達のいずれかを介してであることを示唆する。これらの知見、及びＤｋｋ−Ｉがオキシステロールによるヘッジホッグ経路活性化に効果を及ぼさなかった事実を考慮すると、ＭＳＣにおけるオキシステロール誘導性生物学的応答は、重複して並びに個別的に効果を及ぼす２つの個別の経路：１）ヘッジホッグシグナル伝達経路、及び２）非標準Ｗｎｔシグナル経路の活性化を介して媒介されている可能性がある（図８）。すなわち、オキシステロールは、２つの別個のシグナル経路：１）ヘッジホッグシグナル伝達経路、及び２）Ｄｋｋ−１阻害可能かつβ−カテニン／ＴＣＦ／Ｌｅｆ非依存的な経路を活性化する。これらの経路の活性化は、ＭＳＣの骨形成分化を媒介し、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性、オステオカルシン（ＯＣＮ）ｍＲＮＡ発現、Ｗｉｆ−１及びＮｋｄ２発現、並びにマトリックス鉱化作用を含む、骨形成分化及びＷｎｔシグナル伝達と関連するマーカー及び遺伝子を、協同的に又は個別的に制御する。
【００５５】
ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＬＹ及びＷｍは、ヘッジホッグシグナル伝達を介して媒介されると考えられるもの、並びにＤｋｋ−１阻害可能なシグナル伝達を介して媒介されるものを含む上記の全ての生物学的応答を、部分的に又は完全に阻害することができた。ＬＹ及びＷｍは、オキシステロール誘導性ヘッジホッグ経路活性化を阻害せず、ＰＩ３キナーゼがこの経路の下流に作用することを示唆した。オキシステロールによるＰＩ３キナーゼ活性化の尺度として、本発明者らは、オキシステロールがＡｋｔのリン酸化を誘導するかどうかをウエスタンブロッティングによって検討した。オキシステロール媒介性応答を阻害するＬＹ及びＷｍの一貫した能力にもかかわらず、オキシステロール処理Ｍ２細胞における総Ａｋｔに対して標準化されたホスホ−Ａｋｔレベルの増加は、処理の１０分、３０分、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間後では、実質的に誘導されなかった。検討された全ての時点で、Ｍ２細胞には有意なベースラインレベルのホスホ−Ａｋｔが存在していた。しかしながら、８つを超える実験のうち２つの実験でのみ、あまり大きくない１．５倍のホスホ−Ａｋｔレベルの増加が、オキシステロールで処理した４８時間後のみで観察された。ＰＩ３キナーゼがオキシステロールによって活性化されるのではなく、ＰＩ３キナーゼの基礎活性が、Ｍ２細胞の骨形成分化の誘導に際してオキシステロール及びＳｈｈと協同的に働くと考えられる。ＰＩ３キナーゼと、ヘッジホッグシグナル伝達及びＷｎｔシグナル伝達の両方との間の協同的及び／又は相乗効果的な相互作用が報告されている。Rioboらは、ＰＩ３キナーゼ及びＡｋｔが、前駆細胞における神経発生分化及び軟骨形成分化並びにＧｌｉ活性化中のＳｈｈシグナル伝達にとって不可欠であり、インスリン様増殖因子Ｉによるそれらの活性化が、Ｓｈｈ誘導性シグナル伝達を有意に増強したことを報告した（Riobo NA, Lu K, Ai X, Haines GM, Emerson CP.  2006.  Phosphoinositide 3-kinase and Akt are essential for Sonic Hedgehog signaling.  Proc Natl Acad Sci 103:4505-4510）。彼らの研究では、Ｓｈｈそれ自身は、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔの活性化をある程度引き起こしたに過ぎなかったが、彼らの実験系ではＬＹがホスホ−Ａｋｔのベースラインレベルを明白に低減したため、活性のベースラインレベルは、ヘッジホッグシグナル伝達にも寄与した可能性がある。同様に、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔシグナル伝達は、ヘッジホッグシグナル伝達に対する内皮細胞の形態学的応答及び遊走応答を媒介することが示されており（Fu J, Liu W, Zhou J, Sun H, Xu H, Luo L, Zhang H, Zhou Y.  2006.  Sonic hedgehog protein promotes bone marrow-derived endothelial progenitor cell proliferation, migration and VEGF production by PI 3-kinase/Akt signaling pathways.  Acta Pharmacol Sinica 27:685-693）、ＰＩ３キナーゼ及びヘッジホッグシグナル伝達は、Ｎｍｙｃ（神経細胞においてヘッジホッグシグナル伝達の標的である遺伝子）に収束して、神経前駆体細胞における細胞周期進行を制御することが見出された（Kenney AM, Widlund HR, Rowitch DH.  2003.  Hedgehog and PI-3 kinase signaling converge on Nmycl to promote cell cycle progression in cerebellar neuronal precursors.  Development 131:217-228）。さらに、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のＷｎｔ３ａ誘導性増殖を媒介したこと（Kim S, Lee W, Choi K.  2007.  The PI3 kinase-Akt pathway mediates Wnt3a-induced proliferation.  Cell Signal 19:511-518）、及びＷｎｔタンパク質によるアポトーシスの防止は、標準Ｗｎｔシグナル伝達を刺激するそれらの能力に関係なく、Ｐ１３キナーゼ／Ａｋｉシグナル伝達を介して部分的に媒介されたこと（Almeida M. Han L, Bellido T, Manolagas SC, Kousteni S.  2005.  Wnt proteins prevent apoptosis of both uncommitted osteoblast progenitors and differentiated osteoblasts by β-catenin-dependent and -independent signaling cascades involving Src/ERK and Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt.  J Biol Chem 280:41342-41351）が報告された。ツメガエル（Xenopus）におけるＷｎｔ５ａ及びその受容体Ｒｏｒ２は、部分的にはＰＩ３キナーゼを介して、β−カテニン／ＴＣＦ／Ｌｅｆ非依存的に遺伝子発現を媒介することが報告された（Kim S, Lee W, Choi K.  2007.  The PI3 kinase-Akt pathway mediates Wnt3a-induced proliferation.  Cell Signal 19:511-518）。Ｒｕｎｘ２媒介性骨形成及び軟骨形成分化におけるＰＩ３キナーゼの役割は、ＬＹ又はドミナントネガティブＡｋｔによる阻害が、Ｒｕｎｘ２依存性転写並びに骨形成及び軟骨形成分化マーカーの発現を阻害した前駆細胞で実証された（Fujita T, Azuma Y, Fukuyama R, Hattori Y, Yoshida C, Koida M, Ogita K, Komori T.  2004.  Runx2 induces osteoblast and chondrocyte differentiation and enhances their migration by coupling with PI3K-Akt signaling.  J Cell Biol 166:85-95）。本発明者らの知見は、例えばＭＳＣのオキシステロール誘導性骨形成分化に関して、ヘッジホッグ、Ｗｎｔ、及びＰＩ３キナーゼシグナル伝達の間の協同的な相互作用という概念を支持する（図８）。
【００５６】
本発明者らは、Ｗｎｔ３ａ  ＣＭ、標準Ｗｎｔシグナル伝達に関連しているＷｎｔファミリータンパク質の古典的メンバーが（Boland GM, Perkins G, Hall DJ, Tuan RS.  2004.  Wnt3a promotes proliferation and suppresses osteogenic differentiation of adult human mesenchymal stem cells.  J Cell Biochem 93:1210-1230）、ＭＳＣにおける自発的なＡＬＰ活性並びにオキシテロール（oxsyterol）誘導性ＡＬＰ活性及びＳｈｈ誘導性ＡＬＰ活性を阻害したことを見出した。これは、Ｗｎｔ３ａが骨形成分化を抑制し、その一方でヒト間葉幹細胞の増殖を促進したというBolandらによる報告と一致する（Boland GM, Perkins G, Hall DJ, Tuan RS.  2004.  Wnt3a promotes proliferation and suppresses osteogenic differentiation of adult human mesenchymal stem cells.  J Cell Biochem 93:1210-1230）。標準Ｗｎｔシグナル伝達は、これらの細胞が、非標準Ｗｎｔシグナル伝達に部分的に依存する機序によって誘導され得る最終骨形成分化を起こすために抑制される必要があり得る前駆細胞の維持及び増殖を制御することが示唆されている（Westendorf JJ, Kahler RA, Schroeder TM.  2004.  Wnt signaling in osteoblast and bone diseases.  Gene 341:19-39）。この仮説を支持して、Ｗｎｔ５ａの過剰発現、並びにＷｎｔ１１の上方制御、非標準Ｗｎｔファミリーの両メンバーは、骨前駆細胞における骨形成分化過程を促進及び増強する（Boland GM, Perkins G, Hall DJ, Tuan RS.  2004.  Wnt3a promotes proliferation and suppresses osteogenic differentiation of adult human mesenchymal stem cells.  J Cell Biochem 93:1210-1230）。予備的研究で、本発明者らは、処理の４８時間後にオキシステロール処理Ｍ２細胞においてＷｎｔ５ａのｍＲＮＡ発現が２倍に増加したが、Ｗｎｔ３ａ又はＷｎｔ１０ｂでは増加しなかったことを見出した。Ｎｋｄ２及びＷｉｆ−１は両方ともＷｎｔシグナル伝達のアンタゴニストであり、骨形成性オキシステロールによりそれらが誘導されるということは、標準Ｗｎｔシグナル伝達及び増殖活性の阻害を介して前駆細胞の最終骨形成分化を促進することにそれらが役割を果たしていることを支持する（Boland GM, Perkins G, Hall DJ, Tuan RS.  2004.  Wnt3a promotes proliferation and suppresses osteogenic differentiation of adult human mesenchymal stem cells.  J Cell Biochem 93:1210-1230）。しかしながら、標準Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、インビトロで様々な骨前駆細胞に適用されると実際に分化促進性の役割を果たすことができることを他の研究者が報告しているため、ＭＳＣの制御におけるＷｎｔシグナル伝達の役割は、より複雑である可能性が高い（Bennett CN, Longo KA, Wright WS, Suva LJ, Lane TF, Hankenson KD, MacDougald OA.  2005.  Regulation of osteoblastogenesis and bone mass by Wnt10b.  Proc Natl Acad Sci 102:  3324-3329、Day TF, Guo X, Garrett-Beal L, Yang Y. 2005.  Wnt/β-catenin signaling in mesenchymal progenitors controls osteoblast and chondrocyte differentiation during vertebrate skeletogenesis.  Develop Cell 8:739-750、Hill TP, Spater D, Taketo MM, Birchmeier W, Hartmann C.  2005.  Canonical Wnt/β-catenin signaling prevents osteoblasts from differentiating into chondrocytes.  Develop Cell 8:  727-738、Clement-Lacroix P, Ai M, Morvan F, Roman-Roman S, Vayssiere B, Belleville C, Estrera K, Warman ML, Baron R, and Rawadi G.  2005.  Lrp5-independent activation of Wnt signaling by lithium chloride increases bone formation and bone mass in mice.  Proc Natl Acad Sci 102:17404-17411）。既報の観察にそのようなばらつきがあるのは、様々な研究者により使用された実験モデルの違い、並びに種々の前駆細胞が骨形成系統に分化決定���る段階の違いに起因する可能性がある。これらの違いにもかかわらず、インビトロデータ及びインビボデータは、骨芽細胞及び骨の発生及び維持にＷｎｔシグナル伝達が、骨前駆体貯留の増殖及び維持の正の制御を介して、及び／又はこれらの細胞に対する骨形成促進性分化効果を介して、正の役割を果たしていることを明白に実証する。Rodda及びMcMahonは、骨芽細胞前駆体の特異化、分化、及び維持にヘッジホッグシグナル伝達及びＷｎｔシグナル伝達が別個の役割を果たしていることを実証した（Rodda SJ, McMahon AP.  2006.  Distinct roles for Hedgehog and canonical Wnt signaling in specification, differentiation, and maintenance of osteoblast progenitors.  Development 133:  3231-3244）。特定のオキシステロールが、部分的には、ヘッジホッグシグナル伝達に加えてＷｎｔシグナル伝達の制御を介してそれらの生物学的効果を媒介することは、骨芽細胞生物学においてそれらが役割を果たしていることを支持する。
［実施例］
【００５７】
物質
Ｍ２−１０Ｂ４細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（ロックビル、米国メリーランド州）から購入した。オキシステロール、β−グリセロリン酸塩（βＧＰ、β-glycerophosphate）、及びアスコルビン酸塩は、Sigma-Aldrich社（セントルイス、米国ミズーリ州）から取得した。ＲＰＭＩ  １６４０は、Irvine Scientific社（サンタアナ、米国カリフォルニア州）から取得し、ウシ胎仔血清（１４１３Ｓ）は、Hyclone社（ローガン、米国ユタ州）から取得し、組替えマウスＳｈｈ  Ｎ末端ペプチド、組換えヒトＢＭＰ２、及び組替えマウスＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（Ｄｋｋ−１）は、R&D Systems社（ミネアポリス、米国ミネソタ州）から取得し、シクロパミン、ＬＹ２９４００２、及びワートマニンは、EMD Biosciences社（ラホーヤ、米国カリフォルニア州）から取得した。Ｗｎｔ３ａ馴化培地（Ｗｎｔ３ａ  ＣＭ）及び空ベクター馴化培地（Ｃ  ＣＭ）は、Peter Tontonoz博士（ＵＣＬＡ、ロサンゼルス、米国カリフォルニア州）からの寛大な贈物であった。
【００５８】
細胞培養
Ｍ２−１０Ｂ４細胞を、以前に記述されているように（Kha HT, Basseri B, Shouhed D, Richardson J, Tetradis S, Hahn TJ, Parhami F.  2004.  Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells:  Pro-bone and anti-fat.  J Bone Miner Res 19:830-840）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンで補完された、１０％加熱不活性化ＦＢＳを有するＲＰＭＩ  １６４０中で維持した。処理は、５％ＦＢＳ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸塩、及び３ｍＭ  βＧＰを含有する骨形成分化培地中で実施した。
【実施例１】
【００５９】
一般的なアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性アッセイ
全細胞抽出液に対する比色アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性アッセイを、文献に記述されているように実施した（Kha HT, Basseri B, Shouhed D, Richardson J, Tetradis S, Hahn TJ, Parhami F.  2004.  Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells:  Pro-bone and anti-fat.  J Bone Miner Res 19:830-840）。
【実施例２】
【００６０】
一般的４５Ｃａ取り込みアッセイ
細胞単層におけるマトリックス鉱化作用の尺度としての４５Ｃａ取り込みアッセイを、文献に記述されているように実施した（Parhami F, Morrow AD, Balucan J, Leitinger N, Watson AD, Tintut Y, Berliner JA, Demer LL.  1997.  Lipid oxidation products have opposite effects on calcifying vascular cell and bone cell differentiation.  Arterioscl Thromb Vasc Biol 17:680-687）。
【実施例３】
【００６１】
一般的な定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ）手順
全ＲＮＡを、Stratagene社製（ラホーヤ、米国カリフォルニア州）のＲＮＡ単離キットを用いて、製造業者の説明書に従って抽出した。ＲＮＡを、Ambion社製（オースティン、米国テキサス州）の無ＤＮＡキットを使用して、ＤＮａｓｅ処理した。３μｇのＲＮＡを、Stratagene社製（ラホーヤ、米国カリフォルニア州）の逆転写酵素を使用して逆転写し、一本鎖ｃＤＮＡを作製した。ｃＤＮＡを、Bio-Rad I-cycler IQ quantitative thermocyclerを使用した定量的ＲＴ−ＰＣＲ用に、Bio-Rad Laboratories社製（ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）のQi SYBR Green Supermixと混合した。ＰＣＲ試料は全て、三通り又は四通りを調製した。各試料を９６ウェルプレートの複製ウェルに添加した。４０サイクルのＰＣＲを行った後、プライマー特異性を確認するために融解曲線を分析し、配列を決定しＰｕｂＭｅｄのＧｅｎＢａｎｋから得られた完全ｍＲＮＡ配列と比較することにより、全ＰＣＲ産物の同一性を検証した。遺伝子発現が何倍変化したかを、ΔΔＣｔ法を使用して算出した（Richardson JA, Amantea CM, Kianmahd B, Tetradis S, Lieberman JR, Hahn TJ, Parhami F.  2007.  Oxysterol-induced osteoblastic differentiation of pluripotent mesenchymal cells is mediated through a PKC- and PKA-dependent pathway.  J Cell Biochem 100:1131-1145）。プライマーは全て、Bio-Rad Laboratories社製（ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）のBeacon Designerソフトウェアを使用して設計した。使用されたプライマーは以下の通りである：ＯＣＮ（５’−ＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣ−３’（配列番号１）及び５’−ＴＡＣＣＴＴＡＴＴＧＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧ−３’（配列番号２））、Ａｘｉｎ２（５’ＧＡＧＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＡＧＡＧＡ−３’（配列番号３）及び５’−ＣＴＧＧＣＣＧＡＣＡＧＴＧＣＡＡＧＡＣ−３’（配列番号４））、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１（５’−ＧＡＣＡＣＣＡＡＴＣＴＣＣＴＣＡＡＣＧＡＣ−３’（配列番号５）及び５’−ＴＣＡＣＡＧＡＣＣＴＣＣＡＧＣＡＴＣＣ−３’（配列番号６））、ＮＫＤ２（５’−ＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＴＧ−３’（配列番号７）及び５’−ＧＧＡＧＧＡＧＴＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＧＧ−３’（配列番号８））、ＷＩＦ−１（５’−ＣＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴＧＣＣＣＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号９）及び５’−ＣＴＧＧＣＴＣＣＡＴＡＣＣＴＣＴＴＡＴＴＧＣ−３’（配列番号１０））、及びＧＡＰＤＨ（５’−ＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＡＴＧＣＡＴＣＣＴＧ−３’（配列番号１１）及び５’−ＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＣＣ−３’（配列番号１２））。
【実施例４】
【００６２】
一般的な一過性形質移入及びリポーターアッセイ
７０％コンフルエンスのＭ２−１０Ｂ４細胞を、FuGENE 6形質移入試薬（Roche Applied Science社製、インディアナポリス、米国インディアナ州）を、製造業者の説明書に従って使用して、２４時間形質移入した。野生型及び突然変異ＴＣＦ／ＬＥＦ結合部駆動ルシフェラーゼ構築体（それぞれ、ＴＢＥ４−ｌｕｃ及びＴＢＥ４−ｌｕｃ−ｍｕｔ）は、Baruch Frenkel博士（南カリフォルニア大学、ロサンゼルス、米国カリフォルニア州）から供給され、サイクリンＤ１プロモーターエレメント駆動ルシフェラーゼ構築体（Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１−ｌｕｃ）は、Fanxin Long博士（ワシントン大学、セントルイス、米国ミズーリ州）から供給された。ホタルルシフェラーゼ値を、ウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ活性に対して標準化し、pEGFP-INを使用して形質移入効率を評価した。その後、Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay System（Promega社製、マディソン、米国ウィスコンシン州）を製造業者の説明書に従って使用し、ルシフェラーゼ活性を測定する前に、細胞を試験薬剤で２４、４８、又は７２時間処理した。
【実施例５】
【００６３】
一般的な細胞質ゾルタンパク質抽出及び全細胞溶解産物の調製
Ｍ２−１０Ｂ４細胞を、ＨＬＢ／Ｐ緩衝液［１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、１：１００プロテアーゼ阻害剤カクテル（EMD Biosciences社製、ラホーヤ、米国カリフォルニア州）、１：１００ホスファターゼ阻害剤カクテルＩ及びII（Sigma社製、セントルイス、米国ミズーリ州）］中で、ダウンス型を用いて２５回ホモジナイズし、その後、２，５００ｐｍで５分間４℃で遠心沈殿させた。上清を収集し、１９，０００ｒｐｍで３０分間４℃で遠心沈殿した。この遠心後の上清を収集し、細胞質ゾルタンパク質抽出物として保存した。全細胞溶解産物の調製の場合、Ｍ２−１０Ｂ４細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．９、０．１％トリトンＸ−１００、及び１：１００プロテアーゼ阻害剤カクテル（EMD Biosciences社製、ラホーヤ、米国カリフォルニア州）中で、１５分間氷上でインキュベートした。リン酸化タンパク質の場合は、０．１ｍＭバナジン酸ナトリウム（Ｎａ３ＶＯ４）も溶解緩衝液に含まれていた。その後、各試料を超音波処理し、１２，０００ｒｐｍで５分間４℃で遠心沈殿した。この遠心後の上清を収集し、全細胞溶解産物として保存した。
【実施例６】
【００６４】
一般的なウエスタンブロット解析
タンパク質濃度を、Bio-Rad protein assay（ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）を使用して決定し、文献に記述されているようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した（Parhami F, Jackson SM, Tintut Y, Le V, Balucan JP, Territo M, Demer LL.  1999.  Atherogenic diet and minimally oxidized low density lipoprotein inhibit osteogenic and promote adipogenic differentiation of marrow stromal cells.  J Bone Miner Res 14:2067-2078）。要約すると、細胞質ゾル抽出物又は全細胞溶解産物（３０μｇ）を、Bio-Rad laboratories社製（ハーキュリーズ、米国カリフォルニア州）の１０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル上で分離し、Amersham Biosciences社製（ピスカタウエイ、米国ニュージャージー州）のニトロセルロース膜上に終夜転写させた。ブロッキングを、５％脂肪粉乳（Becton,Dickinson and Company社製、スパークス、米国メリーランド州）を用いて、０．１％Tween-20（ＴＢＳ−Ｔ）を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中で２時間室温で実施した。その後、ブロットを、製造業者の説明書に従って、ホスホ（Ｓｅｒ４７３）−Ａｋｔに対するモノクローナル抗体、又はＡｋｔ、β−カテニン、若しくはβ−アクチンに対するポリクローナル抗体（Cell Signaling Technology社製、ダンバーズ、米国マサチューセッツ州）と共にインキュベートした。一次抗体の結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Santa Cruz Biotechnology社製、Santa Ruz、米国カリフォルニア州）で標識された二次抗体によって検出した。ブロットを、高感度化学発光検出試薬（Perkin Elmer社製、ボストン、米国マサチューセッツ州）を使用して発色させた。
【００６５】
統計分析
コンピューター支援統計分析は、StatView 4.5プログラムを使用して実施した。ｐ値は全て、ＡＮＯＶＡ、及びフィッシャー投影最小有意差（ＰＬＳＤ、Fisher's projected least significant difference）有意差検定を使用して算出した。ｐ＜０．０５の値を、有意であるとみなした。
【実施例７】
【００６６】
ＬＲＰ５／６阻害剤、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）は、骨髄間質細胞におけるオキシステロール誘導性骨形成分化を阻害する。
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性アッセイ（上記の実施例を参照）を、１又は２μｇ／ｍｌ  Ｄｋｋ−１又は媒体で２時間前処理し、その後対照媒体又は２．５μＭのオキシステロールの組合せ、ＳＳ（Ａ）；２００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｈｈ（Ｂ）；又は５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−２（Ｃ）で３日間処理したＭ２細胞で実施した（図２Ａ〜２Ｃを参照）。代表的な実験からの結果を、四重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、タンパク質濃度に対して標準化する（対照対ＳＳ、Ｓｈｈ及びＢＭＰ−２及びＳＳ及びＳｈｈ対ＳＳ及びＳｈｈ＋両濃度のＤｋｋ−１の場合、ｐ＜０．０１；ＢＭＰ−２対ＢＭＰ−２＋２μｇ／ｍｌ  Ｄｋｋ−１の場合は、ｐ＜０．０２）。
【００６７】
４５Ｃａ取り込みアッセイ（上記の実施例を参照）を使用して、１μｇ／ｍｌ  Ｄｋｋ−１又は媒体で２時間前処理し、その後対照媒体又は２．５μＭ  ＳＳで１２日間処理したＭ２細胞で鉱化作用を測定した（図２Ｄを参照）。代表的な実験からのデータを、四重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、タンパク質濃度に対して標準化する（対照対ＳＳ、及びＳＳ対ＳＳ＋Ｄｋｋ−１の場合、ｐ＜０．０１）。
【００６８】
Ｍ２細胞を、媒体又は１μｇ／ｍｌ  Ｄｋｋ−１で２時間前処理し、その後対照媒体又は５μＭ  ＳＳで６日間処理した。ＲＮＡを単離し、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりＯＣＮ発現を分析した（図２Ｅを参照）。代表的な実験からのデータを、三重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、ＧＡＰＤＨ発現に対して標準化する（対照対Ｄｋｋ−１有又は無しのＳＳの場合、ｐ＜０．００３；対照対Ｄｋｋ−１の場合、ｐ＜０．００１）。
【実施例８】
【００６９】
骨髄間質細胞のＴＣＦ／Ｌｅｆ転写活性に対する骨形成性オキシステロールの効果。
Ｍ２細胞を、４つの野生型又は突然変異ＴＣＦ／Ｌｅｆ  ＤＮＡ結合部位によって駆動されるルシフェラーゼリポーター（それぞれＴＢＥ４−ｌｕｃ及びＴＢＥ４−ｌｕｃ−ｍｕｔ）で形質移入し、５μＭ  ＳＳ、２００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｈｈ、４０ｍＭ  ＬｉＣｌ、又は対照媒体に対するそれらの応答を、処理の２４時間後に分析した（図３Ａを参照）。代表的な実験からのデータを、３通りの試料の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化する（対照対ＴＢＥ４−ｌｕｃ発現ベクターを有するＬｉＣｌの場合、ｐ＜０．００１）。
【００７０】
Ｍ２細胞を、サイクリンＤ１プロモーターエレメントによって駆動されるルシフェラーゼリポーター（Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１−ｌｕｃ）で形質移入し、５μＭ  ＳＳ、４０ｍＭ  ＬｉＣｌ、又は対照媒体に対するそれらの応答を、処理の２４時間後に分析した（図３Ｂを参照）。代表的な実験からのデータを、３通りの試料の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化する（対照対ＬｉＣｌの場合、ｐ＜０．０１）。
【実施例９】
【００７１】
骨形成性オキシステロールは、骨髄間質細胞におけるＷｎｔ標的遺伝子発現を差別的に制御する。
Ｍ２細胞を、５μＭ  ＳＳ、２００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｈｈ、４０ｍＭ  ＬｉＣｌ、又は対照媒体で、８又は４８時間処理した。ＲＮＡを単離し、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりＡｘｉｎ２発現を分析した（図４Ａ及び４Ｂを参照）。代表的な実験からのデータを、三重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、ＧＡＰＤＨ発現に対して標準化する（８時間及び４８時間での対照対ＬｉＣｌの場合、及び４８時間での対照対ＳＳの場合、ｐ＜０．０２）。
【００７２】
Ｍ２細胞を、５μＭ  ＳＳ、２００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｈｈ、又は対照媒体で、８又は４８時間処理した。ＲＮＡを単離し、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりサイクリンＤ１発現を分析した（図４Ｃ及び４Ｄを参照）。代表的な実験からのデータを、三重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、ＧＡＰＤＨ発現に対して標準化する（８時間での対照対Ｓｈｈの場合、ｐ＜０．０５）。
【００７３】
Ｍ２細胞を、５μＭ  ＳＳ、２００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｈｈ、又は対照媒体で、４８時間処理した。ＲＮＡを単離し、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりＮｋｄ２（Ｅ）及びＷＩＦ−１（Ｆ）発現を分析した（図４Ｅ及び４Ｆを参照）。代表的な実験からのデータを、三重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、ＧＡＰＤＨ発現に対して標準化する（Ｎｋｄ２及びＷＩＦ−１発現の両方についての対照対ＳＳの場合、ｐ＜０．０１；ＷＩＦ−１発現についての対照対Ｓｈｈの場合、ｐ＜０．００１）。
【実施例１０】
【００７４】
骨形成性オキシステロールは、骨髄間質細胞におけるＷｎｔ標的遺伝子発現を差別的に制御する。
Ｍ２細胞を、指示濃度の媒体又はシクロパミン（Ｃｙｃ、cyclopamine）で２時間前処理した。次に、細胞を、５μＭ  ＳＳ又は対照媒体で４８時間処理した。ＲＮＡを単離し、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりＮｋｄ２（Ａ）及びＷＩＦ−１（Ｂ）発現を分析した（図５Ａ及び５Ｂを参照）。代表的な実験からのデータを、三重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、ＧＡＰＤＨ発現に対して標準化する（Ｎｋｄ２及びＷＩＦ−１発現の両方についての対照対ＳＳの場合、及びＷｉｆ−１発現についてのＳＳ対ＳＳ＋２及び４μＭの両Ｃｙｃの場合、ｐ＜０．００１）。
【００７５】
Ｍ２細胞を、Ｄｋｋ−１又は媒体で２時間前処理した。次に、細胞を、５μＭ  ＳＳ又は対照媒体で４８時間処理した。ＲＮＡを単離し、Ｎｋｄ２（Ｃ）、Ｗｉｆ−１（Ｄ）、及びＰｔｃｈ（Ｅ）発現について分析した（図５Ｃ〜５Ｅを参照）。代表的な実験からのデータを、三重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、ＧＡＰＤＨ発現に対して標準化する（Ｎｋｄ２、ＷＩＦ−１、及びＰｔｃｈ発現についての対照対ＳＳの場合、ｐ＜０．０１；Ｎｋｄ２発現についてのＳＳ対ＳＳ＋Ｄｋｋ−１の場合、ｐ＜０．００１；Ｗｉｆ−１発現についてのＳＳ対ＳＳ＋Ｄｋｋ−１の場合、ｐ＜０．０３）。
【実施例１１】
【００７６】
Ｗｎｔ３ａ馴化培地は、骨髄間質細胞におけるオキシステロール誘導性アルカリホスファターゼ活性を阻害する。
細胞関連アルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰ）アッセイをスクリーニングとして使用して、潜在的な骨誘導性オキシステロールを同定する。プロトコールは、Sigma社製のアルカリホスファターゼアッセイキットの改変である。細胞を、２４ウェル組織培養プレートで培養する。試験薬剤で処理した後、細胞をＰＢＳで２回すすぎ、２００ｍｌの溶解緩衝液（１ｍＭ  ＭｇＣｌ２中の０．２％ＮＰ−４０）中にスクラップし、１０秒間超音波処理した。次に、１ｍｌの反応混合物を各ウェルに添加する。反応混合物は、２２１アルカリ性緩衝液（Sigma社製）：ストック基質溶液（１：１）である。ストック基質溶液は、１０ｍｌのｄｄＨ２Ｏに４０ｍｇのSigma社製１０４ホスファターゼ基質を溶解することにより調製する。反応混合物を溶解細胞に添加した後、インキュベーションを３０分間３７℃で実施する。黄色は、アルカリホスファターゼ活性を示す。１２ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨを各ウェルに添加することによって反応を停止させ、吸光度を４０５ｎｍで決定する。アルカリホスファターゼ活性を、Sigma社製キットの説明書に従い、ｐ−ニトロフェノールを標準物質として使用して算出する。結果を、Bio-Rad社製タンパク質アッセイ溶液（Bio-Rad Laboratories社製）を使用して決定した各ウェルの総タンパク質に対して標準化する。
【００７７】
ＡＬＰ活性アッセイを、種々に希釈したＷｎｔ３ａ馴化培地（Ｗｎｔ３ａ  ＣＭ）又は対照馴化培地（Ｃ  ＣＭ）を有する骨形成用培地中で６日間処理したＭ２細胞で実施した（図６Ａを参照）。代表的な実験からの結果を、三重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、タンパク質濃度に対して標準化する（全てのＣ  ＣＭ対Ｗｎｔ３ａ  ＣＭ（１：２５）及び（１：５０）の場合、ｐ＜０．０５）。
【００７８】
１：２５希釈のＣ  ＣＭ又はＷｎｔ３ａ  ＣＭのいずれかと組み合わせた１．２５μＭ  ＳＳ、２００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｈｈ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ−２、又は対照媒体を用いて３日間処理したＭ２細胞でＡＬＰ活性アッセイを実施した（図６Ｂを参照）。代表的な実験からの結果を、四重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、タンパク質濃度に対して標準化する（対照対ＳＳ、Ｓｈｈ、及びＢＭＰ−２、並びにＳＳ及びＳｈｈ対ＳＳ及びＳｈｈ＋Ｗｎｔ３ａ  ＣＭの場合、ｐ＜０．０２）。
【実施例１２】
【００７９】
オキシステロール誘導性骨形成は、骨髄間質細胞においてＰＩ３キナーゼ経路により媒介される。
種々の用量のＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＬＹ２９４００２（ＬＹ）、又はワーマニン（Ｗｍ、wormannin）、又は媒体で２時間前処理し、その後２．５μＭ  ＳＳ対照媒体で３日間処理したＭ２細胞でＡＬＰ活性アッセイを実施した（図７Ａを参照）。代表的な実験からの結果を、四重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、タンパク質濃度に対して標準化する（対照対ＳＳ、並びに全ての濃度のＳＳ対ＳＳ＋ＬＹ又はＷｍの場合、ｐ＜０．００１）。
【００８０】
Ｍ２細胞を、５μＭのＬＹ、２．５μＭのＷｍ、又は媒体で２時間前処理し、その後２．５μＭのＳＳ対照媒体で６日間処理した。ＲＮＡを、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりＯＣＮ発現について分析し、ＧＡＰＤＨに対して標準化した（対照対ＳＳ、並びにＳＳ対ＳＳ＋ＬＹ及びＳＳ＋Ｗｍの場合、ｐ＜０．０１）（図７Ｂを参照）。
【００８１】
４５Ｃａ取り込みアッセイを使用して、種々の用量のＬＹ、１μＭ  Ｗｍ、又は媒体で２時間前処理し、その後５μＭ  ＳＳ又は対照媒体で１４日間処理したＭ２細胞で鉱化作用を測定した（図７Ｃを参照）。代表的な実験からのデータを、四重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、タンパク質濃度に対して標準化する（対照対ＳＳ、並びに全ての濃度のＳＳ対ＳＳ＋ＬＹ及びＳＳ＋Ｗｍの場合、ｐ＜０．００１）。
【００８２】
Ｍ２細胞を、５μＭのＬＹ、１μＭのＷｍ、又は媒体で２時間前処理し、その後２００ｎｇ／ｍｌのＳｈｈ又は対照媒体で３日間処理した。ＡＬＰ活性アッセイを実施した。代表的な実験からの結果は、四重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告され、タンパク質濃度に対して標準化されている（対照対Ｓｈｈ、並びにＳｈｈ対Ｓｈｈ＋ＬＹ及びＳｈｈ＋Ｗｍの場合、ｐ＜０．００１）（図７Ｄを参照）。
【００８３】
Ｍ２細胞を、５μＭのＬＹ、２．５μＭのＷｍ、又は媒体で２時間時前処理し、その後５μＭ  ＳＳ又は対照媒体で４８時間処理した。ＲＮＡを単離し、Ｎｋｄ２（図７Ｅ）及びＷｉｆ−１（図７Ｆ）発現について分析した。代表的な実験からのデータを、三重反復測定の平均±Ｓ．Ｄ．として報告し、ＧＡＰＤＨ発現に対して標準化する（Ｎｋｄ２及びＷＩＦ−１発現の両方についての対照対ＳＳ、並びにＳＳ対ＳＳ＋ＬＹ及びＷｍの場合、ｐ＜０．０１）。
【実施例１３】
【００８４】
Ｍ２−１０Ｂ４骨髄間質細胞におけるアルカリホスファターゼ活性に対するオキシステロールの効果。
Ｍ２−１０Ｂ４骨髄間質細胞を種々の用量のオキシステロールで３日間処理し、その後それらを収集し、比色アッセイによってアルカリホスファターゼ活性（骨芽細胞分化のマーカー）を分析した（表１）；上述のアルカリホスファターゼアッセイを使用した。代表的な実験からの結果を、対照未処理細胞と比較したアルカリホスファターゼ活性の誘導の倍率として示す。
【００８５】
【表１】
2011505357.tif 000008
【実施例１４】
【００８６】
Ｍ２−１０Ｂ４骨髄間質細胞におけるアルカリホスファターゼ活性に対するオキシステロールの効果。
Ｍ２−１０Ｂ４骨髄間質細胞を種々の用量のオキシステロールで３日間処理し、その後それらを収集し、比色アッセイによってアルカリホスファターゼ活性（骨芽細胞分化のマーカー）を分析した（表２）；上述のアルカリホスファターゼアッセイを使用した。代表的な実験からの結果を、対照未処理細胞と比較したアルカリホスファターゼ活性の誘導の倍率として示す。
【００８７】
【表２】
2011505357.tif 000009
【実施例１５】
【００８８】
骨髄間質細胞におけるアルカリホスファターゼ活性に対する種々のオキシステロール分子の効果。［ＯＸＹ５０〜ＯＸＹ５４］
Ｍ２−１０Ｂ４骨髄間質細胞を、対照媒体（Ｃ）、又は１．２５μＭ（１）若しくは２．５（２）μＭ濃度のいずれかの種々の表示オキシステロール（Ｏｘｙ）分子を有する培養中で処理した。３日間の処理後に、細胞の初期骨形成分化の尺度としてのアルカリホスファターゼ活性を、全細胞溶解産物中で測定した（図９及び表３を参照）；上述のアルカリホスファターゼアッセイを使用した。結果を、四重反復測定の平均±ＳＤとして報告する（ｐ＞０．０５であり、したがって有意ではないＯｘｙ５１（１）及びＯｘｙ５３（１）を除いたＣ対全Ｏｘｙ条件の場合、ｐ＜０．００１、及びＣ対Ｏｘｙ５２（１）の場合、ｐ＜０．０５）。表３に、対照未処理細胞に対する誘導の倍率として結果を報告する。
【００８９】
【表３】
2011505357.tif 000010
【実施例１６】
【００９０】
骨髄間質細胞におけるオステオカルシンｍＲＮＡ発現に対する種々のオキシステロールの効果。
Ｍ２−１０Ｂ４細胞を、対照媒体（Ｃ）又は種々の用量（μＭ）の表示オキシステロールで処理した。６日間の処理の後、ｍＲＮＡを細胞から抽出し、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりオステオカルシン及びＧＡＰＤＨ発現を分析した（図１１を参照）。代表的な実験からのデータを、三重反復測定の平均±ＳＤとして報告し、ＧＡＰＤＨに対して標準化する。
【実施例１７】
【００９１】
骨髄間質細胞の脂肪生成に対する種々のオキシステロールの効果。
Ｍ２−１０Ｂ４細胞を、対照媒体（Ｃ）、又は単独若しくは種々のオキシステロール（５μＭ）と組み合わせた脂肪生成の誘発因子、トログリタゾン（Ｔｒｏ、Troglitazone、１０μＭ）で処理した。１０日間の処理の後、細胞をオイルレッドＯで染色して脂肪細胞を検出した。脂肪細胞を、１条件当たり三重反復のウェルで、１ウェル当たり５区域において計数した（図１２を参照）。代表的な実験からのデータを、三重反復測定の平均±ＳＤとして報告する。
【００９２】
例えば、Ｍ２−１０Ｂ４細胞を、対照媒体（Ｃ）、又は単独の若しくはＯｘｙ３４（５μＭ）と組み合わせた脂肪生成の誘発因子、トログリタゾン（Ｔｒｏ、１０μＭ）で処理した。１０日間の処理の後、細胞をオイルレッドＯで染色して脂肪細胞を検出した。脂肪細胞を、１条件当たり三重反復のウェルで、１ウェル当たり５区域において計数した。代表的な実験からのデータを、三重反復測定の平均±ＳＤとして報告する（図１３を参照）。
【実施例１８】
【００９３】
Ｏｘｙ４９及びＳｈｈのＧｌｉ誘導リポーター活性に対する効果。
Ｍ２−１０Ｂ４骨髄間質細胞を、８ＸＧｌｉルシフェラーゼリポーター又は空ベクター（pGL3b）で形質移入した。細胞を、陽性対照として、対照媒体、５μＭ  Ｏｘｙ４９、又は４００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）で引き続き処理した。４８時間の処理の後、リポータールシフェラーゼ活性を測定し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した（図１４を参照）。代表的な実験からのデータを、四重反復測定の平均±ＳＤとして報告する。
【実施例１９】
【００９４】
Ｏｘｙ３４及びＳｈｈのＧｌｉ誘導リポーター活性に対する効果。
Ｍ２−１０Ｂ４骨髄間質細胞を、８ＸＧｌｉルシフェラーゼリポーター又は空ベクター（pGL3b）で形質移入した。細胞を、陽性対照として、対照媒体、５μＭ  Ｏｘｙ３４、又は４００ｎｇ／ｍｌ組換えヒトソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）で引き続き処理した。４８時間の処理の後、リポータールシフェラーゼ活性を測定し、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して標準化した（図１５を参照）。代表的な実験からのデータを、四重反復測定の平均±ＳＤとして報告する。
【実施例２０】
【００９５】
骨髄間質細胞におけるＧｌｉ１及びＰａｔｃｈｅｄ  ｍＲＮＡ発現に対する種々のオキシステロールの効果。
Ｍ２−１０Ｂ４細胞を、対照媒体（Ｃ）又は種々の表示オキシステロール（５μＭ）で処理した。４８時間の処理の後、ｍＲＮＡを細胞から抽出し、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりヘッジホッグ標的遺伝子Ｇｌｉ１及びＰａｔｃｈｅｄの発現を分析した（図１６Ａ及び１６Ｂを参照）。代表的な実験からのデータを、三重反復測定の平均±ＳＤとして報告し、ＧＡＰＤＨに対して標準化する。
【実施例２１】
【００９６】
骨髄間質細胞における骨シアロタンパク質ｍＲＮＡ発現に対する種々のオキシステロールの効果。
Ｍ２−１０Ｂ４細胞を、対照媒体（Ｃ）、又は種々の用量（μＭ）の表示オキシステロール（Ｏｘｙ３４又はＯｘｙ４９）で処理した。ＳＳは、陽性対照として使用される各５μＭの２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール＋２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールを指す。６日間の処理の後、ｍＲＮＡを細胞から抽出し、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりＢＳＰ及びＧＡＰＤＨ発現について分析した（図１７を参照）。代表的な実験からのデータは、三重反復測定の平均±ＳＤとして報告され、ＧＡＰＤＨに対して標準化されている。
【実施例２２】
【００９７】
骨髄間質細胞における骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）発現に対する種々のオキシステロール分子の効果。［ＯＸＹ５０〜ＯＸＹ５４］
Ｍ２−１０Ｂ４骨髄間質細胞を、対照媒体（Ｃ）又は２．５μＭ濃度の種々の表示オキシステロール（Ｏｘｙ）分子を有する培養中で処理した。４８時間の処理の後に、ＲＮＡを単離し、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによりＢＳＰ発現を骨形成分化の尺度として分析した（図１０を参照）。結果を、三重反復測定の平均±ＳＤとして報告する（Ｃ対Ｏｘｙ４９及びＯｘｙ５０の場合、ｐ＜０．００１）。
【実施例２３】
【００９８】
骨髄間質細胞の鉱化作用に対する種々のオキシステロールの効果。
Ｍ２−１０Ｂ４細胞を、対照媒体（Ｃ）、又は種々の濃度（μＭ）の表示オキシステロールで１４日間処理した。ＳＳは、２０Ｓ−ヒドロキシコレステロール＋２２Ｓ−ヒドロキシコレステロールの組合せを指す。５日おきに栄養補充した１２日後に４５Ｃａを添加し、１４日目に４５Ｃａ取り込みを測定した（図１８を参照）。代表的な実験からのデータを、四重反復測定の平均±ＳＤとして報告する。データは、オキシステロール化合物Ｏｘｙ３４若しくはＯｘｙ４９又はオキシステロールの組合せＳＳの投与が、鉱化作用を増加させたことを示す。オキシステロールＯｘｙ３４及びＯｘｙ４９はＢＳＰ発現を誘導し、Ｏｘｙ３４及びＯｘｙ４９は、Ｂ環の６位炭素に置換されたヒドロキシル基を有する。Ｂ環の６位炭素に置換されたヒドロキシル基は、Ｏｘｙ分子の骨誘導能の増加に帰着することが観察された。オキシステロール２０Ｓは、Ｂ環の６位炭素に置換されたヒドロキシル基を有していない。
【００９９】
ヘッジホッグシグナル伝達：
図１に示されているオキシステロールは全て、以下の方法の少なくとも１つによって評価されるようにヘッジホッグシグナル伝達経路を活性化した。
１．８Ｘ−Ｇｌｉ結合部位を有するリポーター構築体を使用したルシフェラーゼリポーター活性
２．ヘッジホッグ経路標的遺伝子発現Ｇｌｉ１及びＰａｔｃｈｅｄの誘導のＱ−ＲＴ−ＰＣＲ分析
３．ヘッジホッグ経路阻害剤、シクロパミンによるオキシステロールの骨誘導効果の阻害
【０１００】
骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）の発現：
本発明者らは、Ｍ２−１０Ｂ４骨髄間質細胞においてＢＳＰ発現を誘導するオキシステロールの能力を考慮した。Ｏｘｙ３４及びＯｘｙ４９などの、ＢＳＰ発現を誘導するオキシステロールは、Ｍ２−１０Ｂ４細胞培養中の骨芽細胞分化及び鉱化作用の強力な誘導因子であり得る。１）アルカリホスファターゼ活性、及び２）オステオカルシンｍＲＮＡ発現を含むが、ＢＳＰ発現を含まない骨芽細胞分化の他のマーカーを誘導するオキシステロールは、ＢＳＰ発現も誘導するこれらのオキシステロール、例えばＯｘｙ３４及びＯｘｙ４９より高い用量で鉱化作用を誘導する。１）アルカリホスファターゼ活性、２）オステオカルシンｍＲＮＡ発現、及び３）ＢＳＰ発現を誘導するオキシステロールは、骨成長の誘導に最適であり得る。そのような骨形成又は骨塩形成は、Ｍ２−１０Ｂ４細胞の培養における４５Ｃａ取り込みアッセイによって評価することができる。
【０１０１】
本明細書中で論じる本発明者らの構造活性相関研究に基づき、オキシステロールのＣ３及びＣ２０のＯＨ基が、アルカリホスファターゼ活性及びオステオカルシンｍＲＮＡ発現を含む骨形成分化の種々のマーカーの誘導によって測定されるような骨形成の誘導にとって重要であると考えられる。骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）ｍＲＮＡ発現の誘導は、ナノモルから低マイクロモル濃度で使用された際にＭ２−１０Ｂ４骨髄間質細胞の培養中で鉱化作用を誘導するための、本明細書中で考慮したＯｘｙ分子などのオキシステロールの最大効力の前提条件である可能性がある。したがって、ＢＳＰ発現の誘導は、オキシステロールの骨誘導特性にとって重要である可能性がある。オキシステロールの骨誘導能は、２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールのＣ２５とＣ２７との間に二重結合が付加される場合に増加すると考えられる。したがって、本発明者らは、脂肪酸側鎖の末端、例えばＣ２５とＣ２７との間に付加された二重結合、及びＢ環のＣ６にヒドロキシル基を有する２０（Ｓ）−ヒドロキシコレステロールの基本構造を含有する分子及びそれらの変異形の全てが、骨形成、骨鉱化作用、及び他の生化学的現象を誘導するのに有用であると想定する。一例は、以下に示したＯｘｙ４９である。
【０１０２】
【化６】
2011505357.tif 000011
【０１０３】
合成例１−ＯＸＹ２２
１−（（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−３−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリルオキシ］−１０，１３−ジメチル−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）エタノン（１）：
無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１８０ｍＬ）中のプレグネノロン（５．０ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）撹拌溶液に、イミダゾール（２．７ｇ、３９．７ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を２０分間撹拌させておき、その後ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（３．６ｇ、２３．９ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。周囲温度で１２時間撹拌した後、反応混合物を氷に注いだ。沈殿物を収集し、ジエチルエーテルに溶解した。有機相を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させて、白色粉末として化合物１を産生し（６．７ｇ、１５．６ｍｍｏｌ、９８％）、それをさらなる精製をせずに使用した。分光分析データは、文献（Drew, J.; Letellier, M.; Morand, P.; Szabo, A.G. J. Org. Chem. 1987, 52, 4047-4052）に報告されているものと同一だった。
【０１０４】
（３Ｓ、８Ｓ、９Ｓ、１０Ｒ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｒ）−１７−（２、３、４、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７−テトラデカヒドロ−１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタ−２−イル）１０，１３−ジメチル−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オール（２、［Ｏｘｙ２２］）：
無水ジエチルエーテル（３．５ｍＬ）中の削り屑状マグネシウム（１０６．７ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）撹拌懸濁液に、（３−ブロモプロピル）ベンゼン（１９９．０ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）を添加した。還流下で２時間撹拌した後、最初に生成されたグリニャール試薬を、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、tetrahydrofuran、２０ｍＬ）中の保護プレグネノロン１（３００ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）溶液にカニューレで添加し、溶液をさらに２時間還流した。混合物を氷浴で冷却し、飽和ＮＨ４Ｃｌで処理した。溶液をセライトでろ過し、沈殿物をジエチルエーテルで３回洗浄した。ろ過液を、ジエチルエーテルで２回抽出した。有機質層を混合し、飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させて残留物を産生し、それをシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけた。ヘキサン−ジエチルエーテル（２：１  ｖ／ｖ）で溶出することにより、アルコールを産生した。その後、シリルエーテルを、ＴＨＦ（１．０ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）中のフッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ、tetrabutylammonium fluoride）１．０Ｍ溶液で処理し、混合物を２０℃で撹拌させておいた。１２時間撹拌した後、反応物を水で処理し、ジエチルエーテルで３回抽出し、有機質層を飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して油状物を産生した。この油状物のフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：２ヘキサン／ジエチルエーテル）により、ジオール２（１７０．０ｍｇ、２ステップで５６％）を白色粉末として産生した。
【０１０５】
【化７】
2011505357.tif 000012
【０１０６】
［Ｏｘｙ２２］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：７．３０〜７．２６（２Ｈ，ｍ）、７．２０〜７．１９（３Ｈ，ｍ）、５．３５（１Ｈ，ｍ）、３．５６〜３．４８（１Ｈ，ｍ）、２．６１〜２．５６（２Ｈ，ｍ）、２．２８〜２．２３（２Ｈ，ｍ）、２．２０〜２．１７（１Ｈ，ｍ）、２．０８〜２．０５（１Ｈ，ｍ）、１．８５〜１．３９（１６Ｈ，ｍ）、１．２６（３Ｈ，ｓ）、１．１８〜１．０７（４Ｈ，ｍ）、１．００（３Ｈ，ｓ）、０．８５（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１４２．５、１４０．８、１２８．４、１２８．３、１２５．８、１２１．６、７５．２、７１．７、５７．６、５６．９、５０．０、４３．６、４２．７、４２．３、４０．１、３７．２、３６．５、３１．８、３１．６、３１．３、２６、４、２６．４１、２３．８、２２．３、２０．９、１９．４、１３．６。
【０１０７】
合成例２−ＯＸＹ２７
（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン−２−イル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シドペンタ［ａ］フェナントレン−３−オール（３、［Ｏｘｙ２７］）：
削り屑状マグネシウム（５００ｍｇ、２０．６ｍｍｏｌ）の存在下で１０．０ｍＬ無水ジエチルエーテル中の（２−ブロモエチル）ベンゼン（９５８ｍｇ、５．１７ｍｍｏｌ）から調製したグリニャール試薬を、２の調製用に記述されたものと同様の条件下でプレグネノロン１（３００ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）に添加した。脱シリル化を、ＴＢＡＦを用いて上記のように実行し、ジオール３（Ｏｘｙ２７）（２００．０ｍｇ、２ステップで６９％）を白色粉末として産生した。
【０１０８】
【化８】
2011505357.tif 000013
【０１０９】
［ＯＸＹ２７］
１Ｈ  ＮＭＲ．（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：７．３０〜７．２６（２Ｈ，ｍ）、７．２０〜７．１９（３Ｈ，ｍ）、５．３５（１Ｈ，ｍ）、３．５６〜３．４８（１Ｈ，ｍ）、２．６１〜２．５６（２Ｈ，ｍ）、２．２８〜２．２３（２Ｈ，ｍ）、１．８５〜１．３９（１６Ｈ，ｍ）、１．２６（３Ｈ，ｓ）、１．１８〜１．０７（４Ｈ，ｍ）、１．００（３Ｈ，ｓ）、０．８５（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１４２．５、１４０．８、１２８．４、１２８．３、１２５．８、１２１．６、７５．２、７１．７、５７．６、５６．９、５０．０、４３．６、４２．７、４２．３、４０．１、３７．２、３６．５、３１．８、３１．３、２６．４、２６．４１、２３．８、２２．３、２０．９、１９．４、１３．６。
【０１１０】
合成例３−ＯＸＹ２６
（２Ｓ）−２−（（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ）−３−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリルオキシ］−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）−ペント−４−イン−２−オール（４）：
無水ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）及び塩化第二水銀（７００ｍｇ、２．６ｍｍｏｌ）中の削り屑状マグネシウム（６．０ｇ、２４６．９ｍｍｏｌ）撹拌懸濁液に、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）中の臭化プロパルギル（７．０ｇ、５８．８ｍｍｏｌ）溶液をゆっくりと添加した。還流下で２０分間撹拌した後、最初に生成されたグリニャール試薬を、無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中の保護プレグネノロン１（４．５ｇ、１４．２ｍｍｏｌ）溶液にカニューレで添加し、混合物をさらに１時間還流した。混合物を、氷浴中で飽和ＮＨ４Ｃｌを用いて３０分間反応停止させ、ジエチルエーテルで３回抽出した。有機質層を飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して粗黄色固形物を産生した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：１０ジエチルエーテル／ヘキサン  ｖ／ｖ）により、プロパギルアルコール４（３．６５ｇ、７２％）を白色粉末として産生した。分光分析データは、文献（Burger, A; Colobert, F.; Hetru, C.; Luu, B. Tetrahedron 1988, 44, 1141-1152）に報告されているものと同一だった。
【０１１１】
【化９】
2011505357.tif 000014
【０１１２】
［４］
【０１１３】
（Ｓ）−２−（（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリルオキシ］−１０，１３−ジメチ１，２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）−５−（チオフェン−２−イル）ペント−４−イン−２−オール（５）：
無水ＴＨＦ（８．０ｍＬ）中のプロパギルアルコール４（５００ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（８．０ｍＬ）、２−ブロモチオフェン（６８０ｍｇ、４．２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（８１ｍｇ、０．０７０ｍｍｏｌ）、及びＣｕＩ（４２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した（De la Rosa, M. A.; Velarde, E.; Guzman, A. Synth. Commun. 1990, 20, 2059-2064）。反応混合物を、窒素雰囲気下で１２時間還流した。その後、溶媒を減圧下で除去して残留物を産生し、それをフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：３ジエチルエーテル／ヘキサン  ｖ／ｖ）により精製して、シリルエーテル５（１６０ｍｇ、２１％）を白色に近い粉末として産生した。
【０１１４】
【化１０】
2011505357.tif 000015
【０１１５】
［５］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：７．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，１．２Ｈｚ）、７．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．６，１．１Ｈｚ）、６．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，３．６Ｈｚ）、５．３３〜５．３１（１Ｈ，ｍ）、３．５２〜３．４４（１Ｈ，ｍ）、２．５８（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝１９．６Ｈｚ）、２．１９〜１．４９（１８Ｈ，ｍ）、１．４７（３Ｈ，ｓ）、１．２６〜１．０３（４Ｈ，ｍ）、１．０１（３Ｈ，ｓ）、０．８９（９Ｈ，ｓ）、０．８７（３Ｈ，ｓ）、０．０６（６Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１４１．６、１３１．３、１２６．８、１２６．３、１２３．７、１２１．１、９０．９、８９．９、７５．２、７４．５、５７．７、５６．９、５０．１、４２．８、４０．０、３７．４、３６．６、３５．２、３２．１、３２．０、３１．５、３１．４、２７．０、２６．０、２３．８、２２．５、２１．２、１９．４、１８．３、１３．５、−４．６。
【０１１６】
（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−５−（チオフェン−２−イル）ペント−４−イン−２−イル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ−［ａ］フェナントレン−３−オール（６、［Ｏｘｙ２６］）：
シリルエーテル５（５０ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解し、ＴＨＦ（２．０ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）中のフッ化テトラブチルアンモニウム１．０Ｍ溶液で処理し、混合物を２０℃で撹拌させておいた。１２時間撹拌した後、反応物を水で処理し、ジエチルエーテルで３回抽出し、有機質層を飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して油状物を産生した。この油状物のフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：３ヘキサン／ジエチルエーテル  ｖ／ｖ）により、ジオール６（Ｏｘｙ２６）（４２．０ｍｇ、９６％）を白色粉末として産生した。
【０１１７】
【化１１】
2011505357.tif 000016
【０１１８】
［Ｏｘｙ２６］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：７．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，１．２Ｈｚ）、７．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．６，１．１Ｈｚ）、６．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，３．６Ｈｚ）、５．３３〜５．３１（１Ｈ，ｍ）、３．５２〜３．４４（１Ｈ，ｍ）、２．５８（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝１９．６Ｈｚ）、２．１９〜１．４９（１８Ｈ，ｍ）、１．４７（３Ｈ，ｓ）、１．２６〜１．０３（４Ｈ，ｍ）、１．０１（３Ｈ，ｓ）、０．８７（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１４１．６、１３１．３、１２６．８、１２６．３、１２３．７、１２１．１、９０．９、８９．９、７５．２、７４．５、５７．７、５６．９、５０．１、４２．８、４０．０、３７．４、３６．６、３５．２、３２．１、３２．０、３１．５、３１．４、２７．０、２３．８、２２．５、２１．２、１９．４、１３．５
【０１１９】
合成例４−ＯＸＹ３９
（Ｒ）−２−（（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリルオキシ］−１０，１３−ジメチ１−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）ブト−３−イン−２−オール（７）：
５．０ｍＬ無水ＴＨＦ中のトリメチルシリルアセチレン（５００ｍｇ、５．０１ｍｍｏｌ）溶液に、ｎ−ブチルリチウム（１．０ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。３０分後、ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のプレグネノロン１（５００ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ）溶液を、ゆっくりと添加した。反応を、１時間後に飽和ＮＨ４Ｃｌで停止させ、ジエチルエーテルで２回抽出した。有機質層を混合し、飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させて粗固形物を産生し、それを、メタノール／ＴＨＦ（５：１  ｖ／ｖ）の６．０ｍＬ混合液中の炭酸カリウム（６００ｍｇ、４．３４ｍｍｏｌ）で処理して、粗脱シリル化プロパギルアルコールを産生した。溶媒を除去し、ジエチルエーテルで抽出した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させて残留物を産生し、それをシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより、ヘキサン−ジエチルエーテル（２：１  ｖ／ｖ）を溶出剤として使用して精製し、シリルエーテル７（３６０ｍｇ、２ステップで７８％）を白色固形物として産生した。
【０１２０】
【化１２】
2011505357.tif 000017
【０１２１】
［７］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：５．３２〜５．３１（１Ｈ，ｍ）、３．５２〜３．４４（１Ｈ，ｍ）、２．５１（１Ｈ，ｓ）、２．２３〜２．１２（５Ｈ，ｍ）、１．９９〜１．９５（２Ｈ，ｍ）、１．８２〜１．５７（９Ｈ，ｍ）、１．４９（３Ｈ，ｓ）、１．２８〜１．０４（５Ｈ，ｍ）、０．９８（３Ｈ，ｓ）、０．９６（３Ｈ，ｓ）、０．８３（９Ｈ，ｓ）、０．０６（６Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１４１．７、１２１．０、８７．５、７３．８、７２．６、７１．３、６０．０、５５．３、５０．１、４３．３、４２．８、４０．３、３７．４、３６．６、３２．８、３２．１、３１．９、３１  ４、２６．０、２５．１、２４．２、２０．８、１９．５、１８．３、１３．４、−４．６。
【０１２２】
（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（（Ｓ）−４−（２−フルオロフェニル）−２−ヒドロキシブタン−２−イル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オール（８、［Ｏｘｙ３９］）：
無水ＴＨＦ（５．０ｍＬ）中のプロパギルアルコール７（３００ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）溶液に、ジイソプロピルアミン（５．０ｍＬ）、２−フルオロ−１−ブロモベンゼン（４０４ｍｇ、２．３ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（４２ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）、及びＣｕＩ（１６ｍｇ、０．０．８４ｍｍｏｌ）を添加した（De la Rosa, M. A.; Velarde, E.; Guzman, A. Synth. Commun. 1990, 20, 2059-2064）。反応混合物を、窒素雰囲気下で１２時間還流した。溶媒を減圧下で除去して残留物を産生し、それをフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：３ジエチルエーテル／ヘキサン  ｖ／ｖ）により精製し、アリールアルキン産物（１３９ｍｇ、３８％）を白色に近い粉末として産生した。酢酸エチル（３．０ｍＬ）中のＰｄ／Ｃ（１０％ｍｏｌ）を用いて水素雰囲気下で１２時間触媒水素化を行うことにより、粗混合物を産生し、それを酢酸エチルを使用してセライトでろ過し、溶媒を減圧下で除去した。この残留物を、ＴＨＦ（２．０ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）中のフッ化テトラブチルアンモニウム１．０Ｍ溶液で処理し、混合物を２０℃で撹拌させておいた。１２時間撹拌した後、反応物を水で処理し、ジエチルエーテルで３回抽出し、有機質層を飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して油状物を産生した。この油状物のフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：３ヘキサン／ジエチルエーテル  ｖ／ｖ）により、ジオール８（Ｏｘｙ３９）を定量的収率で白色粉末として産生した。
【０１２３】
【化１３】
2011505357.tif 000018
【０１２４】
［８］［Ｏｘｙ３９］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：７．２０〜７．１３（２Ｈ，ｍ）、７．０７〜６．９７（２Ｈ，ｍ）、５．３３１〜５．３２（１Ｈ，ｍ）、３．５３〜３．４５（１Ｈ，ｍ）、２．６６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１９．６Ｈｚ）、２．１５〜１．４５（１８Ｈ，ｍ）、１．３９（３Ｈ，ｓ）、１．２６〜１．０４（６Ｈ，ｍ）、１．０１（３Ｈ，ｓ）、０．８８（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１６３．１、１５９．９、１４１．６、１３０．５、１３０．４、１２９．６、１２９．４、１２７．５、１２７．４、１２４．０、１２３．９、１２１．１、１１５．３、１１５．１、７５．１、７２．６、５８．０、５７．０、５０．１、４４．１、４２．８、４２．７、４０．２、３７．４、３６．７、３２．１、３１．８、３１．４、２６．１、２４．０、２３．８、２２．４、２０．９、１９．４、１３．６。１９Ｆ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：−１１９．７
【０１２５】
合成例５−ＯＸＹ４２
（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−５−（チオフェン−２−イル）ペンタン−２−イル）−１０，１３−ジメチ１−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オール（９、［Ｏｘｙ４２］）：
ジクロロメタン／無水エタノール（１：１  ｖ／ｖ）の２．０ｍＬ混合物中のアルキンシリルエーテル５（４０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）溶液に、Ｐｄ／Ｃ（２０％ｍｏｌ）を添加した。反応物を水素雰囲気下で１２時間そのままにしておいた。粗混合物を、ジクロロメタンを使用してセライトでろ過し、溶媒を減圧下で除去した。残留物を、ＴＨＦ（２．０ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）中のフッ化テトラブチルアンモニウム１．０Ｍ溶液で処理し、混合物を２０℃で撹拌させておいた。１２時間撹拌した後、反応物を水で処理し、ジエチルエーテルで３回抽出し、有機質層を飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して油状物を産生した。この油状物のフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：３ヘキサン／ジエチルエーテル  ｖ／ｖ）により、ジオール９（Ｏｘｙ４２）を定量的収率で白色粉末として産生した。
【０１２６】
【化１４】
2011505357.tif 000019
【０１２７】
［９］［Ｏｘｙ４２］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：７．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，１．２Ｈｚ）、７．１４（１Ｈ，ｄｄ．Ｊ＝３．６，１．１Ｈｚ）、６．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，３．６Ｈｚ）、５．３６〜５．３４（１Ｈ，ｍ）、３．５５〜３．５１（１Ｈ，ｍ）、２．８３〜２．８０（２Ｈ，ｍ）、２．２９〜１．４５（２２Ｈ，ｍ）、１．２８（３Ｈ，ｓ）、１．２６〜１．０３（４Ｈ，ｍ）、１．０１（３Ｈ，ｓ）、０．８６（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１４５．４、１４０．８、１２６．７、１２４．１、１２２．９、１２１．６、７５．１、７１．８、５７．８、５６．９、５０．０、４３．３、４２．７、４２．３、３７．２、３６．５、３２．３、３１．８、３１．７、３１．６、３１．３、３０．４、２６．４、２３．８、２２．３、２０．９、１９．４、１３．６。
【０１２８】
合成例６−ＯＸＹ４０
（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テドテラデカヒドロ−３−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリルオキシ］−１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−メチルヘプト−６−エン−２−イル）−１０，１３−ジメチル−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン（１０）：
二ヨウ化サマリウムの存在下での保護プレグネノロン１（５００．０ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）と、５−ブロモ−２−メチル−ｌ−ペンテン（１９９．０ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）とのカップリング反応を、報告されているように実施し（Parhami, F.; Jung, M. E.; Dwyer, J. R.; Nyuyen, K. “Preparation of oxysterol compounds that stimulate the hedgehog pathway for treatment of various disorders,” PCT Int. Appl. 2007, 83 pp.）、２０Ｓ−ヒドロキシステロイド１０（４１９．０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ、７１％）を白色粉末として産生した。分光分析データは、文献（Honda, T.; Katoh, M.; Yamane, S. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1996, 2291-2296）に報告されているものと同一だった。
【０１２９】
【化１５】
2011505357.tif 000020
【０１３０】
［１０］
（Ｓ）−６−（（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリルオキシ］−１０，１３−ジメチル，２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）−２−メチルヘプタン−１，６−ジオール（１１）：
０℃に冷却されたＴＨＦ（１．０ｍＬ）中のジエニルシリルエーテル１０（３０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）溶液に、０．０８ｍＬ  ＢＨ３（ＴＨＦ中１．０Ｍ）を添加した。反応物を３時間にわたって２０℃まで暖めておいた。その後、１．２ｍＬ  ＮａＯＨ（１０％）及び０．３ｍＬ  Ｈ２Ｏ２（３０％）の混合物を、０℃で添加し、混合物を１時間にわたって２０℃まで暖めておいた（Cadot, C.; Poirier, D.; Philip, A. Tetrahedron 2006, 62, 4384-4392.）。反応混合物を、ジエチルエーテルで３回抽出した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させて油状物を産生した。この粗油状物のフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：１ヘキサン／ジエチルエーテル  ｖ／ｖ））により、ジオール１１（１２ｍｇ、４０％）を未決定のジアステレオマー混合物として産生した。
【０１３１】
【化１６】
2011505357.tif 000021
【０１３２】
［１１］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；５００ＭＨｚ）δ：５．３２〜５．３１（１Ｈ，ｍ）、３．８７〜３．８１（２Ｈ，ｍ）、３．５２〜３．４８（１Ｈ，ｍ）、２．３５〜１，４３（２２Ｈ，ｍ）、１．２５〜１．２４（７Ｈ，ｍ）、１．２３（３Ｈ，ｓ）、１．０９（３Ｈ，ｓ）、１．０（３Ｈ，ｓ）、０．９０（３Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．７，２．７Ｈｚ）、０．８８（９Ｈ，ｓ）、０．０５（６Ｈ，ｓ）。
【０１３３】
（６Ｓ）−６−（（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−ヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）−２−メチルヘプ−タン−１，６−ジオール（１２、［Ｏｘｙ４０］）
ジヒドロキシシリルエーテル１１（１２ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解し、ＴＨＦ（０．１０ｍＬ、０．１０ｍｍｏｌ）中のフッ化テトラブチルアンモニウム１．０Ｍ溶液で処理し、混合物を２０℃で撹拌させておいた。１２時間撹拌した後、反応物を水で処理し、ジエチルエーテルで３回抽出し、有機質層を飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して油状物を産生した。この油状物のフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：３ヘキサン／ジエチルエーテル  ｖ／ｖ）により、トリオール１２（Ｏｘｙ４０）（１２．０ｍｇ、９６％）を産生した。
【０１３４】
【化１７】
2011505357.tif 000022
【０１３５】
［１２］［Ｏｘｙ４０］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；５００ＭＨｚ）δ：５．３２〜５．３１（１Ｈ，ｍ）、３．８７〜３．８１（２Ｈ，ｍ）、３．５２〜３．４８（１Ｈ，ｍ）、２．３５〜１．４３（２２Ｈ，ｍ）、１．２５〜１．２４（７Ｈ，ｍ）、１．２３（３Ｈ，ｓ）、１．０９（３Ｈ，ｓ）、１．０（３Ｈ，ｓ）、０．９０（３Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．７，２．７Ｈｚ）。
【０１３６】
合成例７−ＯＸＹ４１
（６Ｓ）−６−（（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−［（１，１−ジメチルエチル）ジメチルシリルオキシ］−６−ヒドロキシ−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）−２−メチルヘプタン−１，６−ジオール（１３）：
０℃のＴＨＦ（３．０ｍＬ）中のジエニルシリルエーテル１０（１００ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）溶液に、ＴＨＦ中１．０ＭのＢＨ３（２．０ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を３時間にわたって２０℃に暖めておいた。その後、５．０ｍＬ  ＮａＯＨ（１０％）及び１．５ｍＬ  Ｈ２Ｏ２（３０％）の混合物を、０℃で添加し、混合物を１時間にわたって２０℃まで暖めておいた。反応混合物を、ジエチルエーテルで３回抽出した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させて油状物を産生した。この粗油状物のフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：４ヘキサン／ジエチルエーテル  ｖ／ｖ））により、トリヒドロキシシリルエーテル１３（７０ｍｇ、５２％）を未決定のジアステレオマー混合物として産生した。
【０１３７】
【化１８】
2011505357.tif 000023
【０１３８】
［１３］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１３；５００ＭＨｚ）δ：３．６２〜３．４８（２Ｈ，ｍ）、３．４３〜３．３７（２Ｈ，ｍ）、１．２０〜０．９４（３１Ｈ，ｍ）、０．９０（３Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．７，２．７Ｈｚ）、０．８８（９Ｈ，ｓ）、０．８６（３Ｈ，ｓ）、０．８２（３Ｈ，ｓ）、０．０８（３Ｈ，ｓ）、０．０５（６Ｈ，ｓ）、１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）δ：７５．０、７１．９、６９．４、６８．２、６８．１、５６．２、５４．２、５３．７、５１．７、４３．０、４２．８、４１．５、４１．０、４０．１、３９．８、３７．３、３６．１、３５．６、３３．５、３２．４、３１．５、２５．８、２３．６、２２．５、２１．２、２０．９、１６．６、１３．６、１３．４、−４．７。
【０１３９】
（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３−ヒドロキシ−１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−メチルヘプト−６−エン−２−イル）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−イルアセテート（１４、Ｏｘｙ４１］）：
無水ジクロロメタン（２．０ｍＬ）中のトリヒドロキシシリルエーテル１３（５０ｍｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）溶液に、ジメチルアミノピリジン（１４．４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、その後ｐ−トルエンスルホニルクロリド（１５ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）を添加した。３時間撹拌した後、反応物を飽和ＮａＨＣＯ３で処理し、ジクロロメタンで３回抽出した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：４ヘキサン／ジエチルエーテル  ｖ／ｖ）により、トシレート中間体（３５．０ｍｇ、７０％）を白色粉末として産生した。この粗物質を５．０ｍＬ無水酢酸及びピリジン混合物（１：１  ｖ／ｖ）で処理し（Kametani, T.; Tsubuki, M.; Higurashi, K.; Honda, T. J. Org. Chem. 1986, 51, 2932-2939.）、その後フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：２ヘキサン／ジエチルエーテル  ｖ／ｖ））により精製し、トシルオキシアセテートを定量的収率で産生した。
【０１４０】
無水アセトニトリル（３．０ｍＬ）中のアセテート中間体（３５ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ）溶液に、ヨウ化リチウム（６０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を３時間還流した。その後、混合物を水で処理し、ジエチルエーテルで３回抽出した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗残留物を、３．０ｍＬアセトニトリルの中の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ、1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene）（１５ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）で処理し、２時間還流した（Poza, J.; Rega, M.; Paz, V.; Alonso, B.; Rodriguez, J.; Salvador, N.; Fernandez, A.; Jimene-z, C. Bioorg. Med Chem. 2007, 15, 4722-4740）。反応物を、飽和ＮＨ４Ｃｌで処理し、ジエチルエーテルで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテルの脱保護を、１２の調製用に記述されたものに類似した条件下で実施し、アルケンアセテート１４（Ｏｘｙ４１）を定量的収率で産生した。
【０１４１】
【化１９】
2011505357.tif 000024
【０１４２】
［１４］［Ｏｘｙ４１］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣ１３；５００ＭＨｚ）δ：４．７０〜４．６５（３Ｈ，Ｍ）、３．５７〜３．５４（１Ｈ，ｍ）、２．０３（３Ｈ，ｓ）、２．０１〜１．７１（６Ｈ，ｍ）、１．６１（３Ｈ，ｓ）、１．５７〜１．３１（１６Ｈ，ｍ）、１．２７（３Ｈ，ｓ）１．２１〜０．９０（７Ｈ，ｍ）、０．８６（３Ｈ，ｓ）、０．８３（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＨＣｌ３，１２５ＭＨｚ）δ：１７０．７、１４５．７、１０９．９、７２．４、７０．９、５７．６、５６．２、５３．５、４８．６、４３．４、４２．９、４０．０、３８．１、３７．４、３７．１、３６．５、３３．４、３２．１、３１．０、２９．６、２６．２、２３．６、２２．３、２２．２、２２．１、２１．２、２０．９、１３．６、１３．３。
【０１４３】
合成例８−ＯＸＹ４８
（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（（２Ｓ）−２，７−ジヒドロキシ−６−メチルヘプタン−２−イル）−１０，１３−ジメチルリエキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３，６−ジオール（１５、［Ｏｘｙ４８］）：
【０１４４】
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル１３の脱保護を、１２の調製用に記述されたものに類似した条件下で実施し、１５（Ｏｘｙ４８）を定量的収率で産生した。
【０１４５】
【化２０】
2011505357.tif 000025
【０１４６】
［１５］［Ｏｘｙ４８］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；５００ＭＨｚ）δ：３．６２〜３．４８（２Ｈ，ｍ）、３．４３〜３．３７（２Ｈ，ｍ）、１．２０〜０．９４（３２Ｈ，ｍ）、０．９０（３Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．７，２．７Ｈｚ）、０．８６（３Ｈ，ｓ）、０．８２（３Ｈ，ｓ）、０．０８（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）δ：７５．０、７１．９、６９．４、６８．２、６８．１、５６．２、５３．７、５１．７、４３．０、４２．８、４１．５、４１．０、４０．１、３９．８、３７．３、３６．１、３５．６、３３．５、３２．４、３１．５、２３．６、２２．５、２１．２、２０．９、１６．６、１３．６、１３．４。
【０１４７】
合成例９−ＯＸＹ４９
（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−６−メチルヘプト−６−エン−２−イル）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３，６−ジオール（１６，［Ｏｘｙ４９］）：
メタノール（１．０ｍＬ）中のアセテート１４（１０ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）溶液に、ＫＯＨ（４ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１時間撹拌した。その後、溶媒を減圧中で除去して粗残留物を産生し、それをフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ジエチルエーテル中５％メタノール）により精製して、アルケントリオール１６（Ｏｘｙ４９）を定量的収率で産生した。
【０１４８】
【化２１】
2011505357.tif 000026
【０１４９】
［１６］［Ｏｘｙ４９］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；５００ＭＨｚ）δ：４．７０〜４．６７（２Ｈ，ｍ０，３．５０〜３．４９（１Ｈ，ｍ）、３．４５〜３．３５（１Ｈ，ｍ）、１．９８〜１．７０（１０Ｈ，ｍ）、１．７１（３Ｈ，ｓ）、１．４５〜１．３１（１０Ｈ，ｍ）、１．２５（３Ｈ，ｓ）、１．１９〜０．８８（１０Ｈ，ｍ）、０．８６（３Ｈ，ｓ）、０．８２（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）δ：１４５．７、１０９．９、７２．４、７０．９、５７．６、５６．２、５３．５、４８．６、４３．４、４２．９、４０．０、３８．１、３７．４、３７．１、３６．５、３３．４、３２．１、３１．０、２９．６、２６．２、２３．６、２２．３、２２．２、２２．１、２１．２、１３．６、１３．３。
【０１５０】
合成例１０−ＯＸＹ２８
【０１５１】
【化２２】
2011505357.tif 000027
2011505357.tif 000028
【０１５２】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中のＢ１（１８．０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（９．１ｍｇ、０．１３４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＴＢＳＣｌ（８．８ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応物を２３℃まで暖めておき、終夜撹拌した。反応を、５０％ＮＨ４Ｃｌ（１０ｍＬ）で停止させ、ジエチルエーテル（１５ｍＬ）で抽出した。混合した有機質層を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中３３％酢酸エチル）により精製して、２１．３ｍｇ（９２％）のＢ２を白色固形物として産出した。１Ｈ  ＮＭＲ  δ  ５．３１（ｍ，１Ｈ）、３．４８（ｍ，１Ｈ）、２．３１〜０．８３（ｍ，２７Ｈ）、１．２７（ｓ，３Ｈ）、１．００（ｓ，３Ｈ）、０．８９（ｓ，９Ｈ）、０．８７（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ）、０．８６（ｓ，３Ｈ）、０．０５（ｓ，６Ｈ）。
【０１５３】
ＴＨＦ（１ｍＬ）中のＢ２（１８．０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）溶液に、ＴＨＦ（０．０９８ｍＬ、０．０９８ｍｍｏｌ）中の１．０Ｍボランを０℃で添加し、反応混合物を２３℃で１４時間撹拌した。１５％水酸化ナトリウム水溶液（０．３ｍＬ）及び３０％過酸化水素（０．１５ｍＬ）を、反応混合物に０℃で添加した。２３℃で４時間撹拌した後に、反応混合物を水で希釈し、粗生成物を酢酸エチル抽出により単離した。濃縮により油状生成物を産生し、それをフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。ヘキサン中の２０％酢酸エチルで溶出して、アルコールＢ３（１１．４ｍｇ、６１％）を無色の油状物として産生した。１Ｈ  ＮＭＲ  δ  ３．５２（ｍ，１Ｈ）、３．４０（ｍ，１Ｈ）、２．１７〜０．５７（ｍ，２８Ｈ）、１．２６（ｓ，３Ｈ）、０．８８（ｓ，９Ｈ）、０．８８（ｓ，３Ｈ）、０．８６（ｓ，３Ｈ）、０．８２（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、０．０５（ｓ，６Ｈ）。
【０１５４】
ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）中のアルコールＢ３（５．０ｍｇ、０．００９ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．０１３ｍＬ、０．０９３ｍｍｏｌ）、及び４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．１ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）溶液に、無水酢酸（０．００５ｍＬ、０．０４７ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＬＣが反応の完了を示すまで、反応物を２３℃で撹拌した。反応物を、ジエチルエーテル（１５ｍＬ）で希釈し、水（１０ｍＬ）で反応停止させた。有機相を分離し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮し、その後カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中２０％酢酸エチル）により精製して、５．０ｍｇ（９３％）の所望のアセテートを産生した。
【０１５５】
このアセテート（３．０ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）を、メタノール（１ｍＬ）に溶解した。その後、触媒量のｐ−トルエンスルホン酸（０．２ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）を添加し、ＴＬＣが反応の完了を示すまで、反応混合物を２３℃で撹拌した。反応物を、酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈し、５％ＮａＨＣＯ３溶液（５ｍＬ）で反応停止させた。有機相を分離し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮し、その後カラムクロマトグラフィー（ヘキサン中５０％酢酸エチル）により精製して、１．７ｍｇ（７２％）の所望のアセテートＢ４（Ｏｘｙ２８）を産生した。１Ｈ  ＮＭＲ  δ  ４．６８（ｍ，１Ｈ）、３．５５（ｍ，１Ｈ）、２．１７〜０．５７（ｍ，２８Ｈ）、２．０３（ｓ，３Ｈ）、１．２６（ｓ，３Ｈ）、０．８７（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）、０．８７（ｓ，３Ｈ）、０．８３（ｓ，３Ｈ）。
【０１５６】
合成例１１−ＯＸＹ５１
（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１０，１３−ジメチル−１７−（２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルアセテート（Ｃ１）：
１６０ｍＬベンゼン中の酢酸プレグネノロン（１１．４ｇ、３２ｍｍｏｌ）溶液に、ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム（１．６１ｇ、６．４ｍｍｏｌ）及びエチレングリコール（５．５ｍＬ、６．１２ｇ、９８．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、ディーン−シュタルク装置で１２時間１１０℃で還流した。反応混合物をジエチルエーテルで希釈し、水及び飽和ＮａＣｌで順次洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。加熱ヘキサン中での再結晶によって粗固形物を精製することにより、アセタールＣ１（１０ｇ、７８％）が無色結晶としてもたらされた。
【０１５７】
【化２３】
2011505357.tif 000029
【０１５８】
［Ｃ１］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：５．３７〜５．３６（１Ｈ，ｍ）、４．６３〜４．５６（１Ｈ，ｍ）、４．０２〜３．８２（４Ｈ，ｍ）、２．３２〜２．２９（１Ｈ，ｍ）、２．０２（３Ｈ，ｓ）、１．８７〜１．４３（１６Ｈ，ｍ）、１．２９（３Ｈ，ｓ）、１．２３〜１．０６（３Ｈ，ｍ）、１．０１（３Ｈ，ｓ）、０．７７（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１７０．５、１３９．７、１２２．５、１１２．０、７４．０、６５．２、６３．２、５８．２、５６．５、５０．０、４１．８、３９．４、３８．１、３７．０、３６．６、３１．８、３１．４、２７．８、２４．６、２３．８、２３．０、２１．４、２０．８、１９．３、１２．９。
【０１５９】
１−（（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３，６−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）エタノン（Ｃ２）：
０℃のＴＨＦ（１５０ｍＬ）中アセタールＣ１（５．０ｇ、１２ｍｍｏｌ）溶液に、ＴＨＦ（４０．０ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）中１．０Ｍ  ＢＨ３を添加した。反応物を５時間にわたって２０℃まで暖めておいた。完了の際に、１５０ｍＬ  ＮａＯＨ（１０％）及び７５ｍＬ  Ｈ２Ｏ２（３３％）の混合物を０℃で添加し、４時間にわたって２０℃まで暖めておいた。反応混合物を、ジエチルエーテルで３回抽出した（１００ｍＬ×３）。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させて油状物を産生した。粗アセタールジオール（５．１ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）を、アセトン（２５０ｍＬ）に溶解し、１Ｍ  ＨＣｌ（５０ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）で処理した。還流して３０分後、その結果生じた混合物を、１Ｍ  ＮａＯＨを用いて０℃で反応停止させ、有機溶媒を蒸発させた。水性層を、ジエチルエーテルで３回抽出した（５０ｍＬ×３）。有機質層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗ケトン（４．３２ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）を、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、dimethylformamide、５０ｍＬ）に溶解し、イミダゾール（１５．０ｇ、２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を２０分間撹拌させておき、その後ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（９．８ｇ、６５ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。周囲温度で１２時間撹拌した後、反応混合物を水で反応停止させ、ジエチルエーテルで３回抽出した（１５０ｍＬ×３）。有機質層を１Ｍ  ＮａＯＨで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させて油状物を産生した。残留物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、５：１ヘキサン／ジエチルエーテル  ｖ／ｖ）によって精製することにより、ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ケトンＣ２（３．５ｇ、３ステップで５２％）を白色粉末として産生した。
【０１６０】
【化２４】
2011505357.tif 000030
【０１６１】
［Ｃ２］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：３．５４〜３．４６（１Ｈ，ｍ）、３．３９〜３．３３（１Ｈ，ｍ）、２．５３（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）、２．２０〜２．１４，（１Ｈ，ｍ）、２．１０（３Ｈ，ｓ）、２．０１〜１．９７（１Ｈ，ｍ）、１．８８〜１．８２（１Ｈ，ｍ）、１．７３〜０．８９（１７Ｈ，ｍ）、０．８８（１８Ｈ，ｓ）、０．７９（３Ｈ，ｓ）、０．５９（３Ｈ，ｓ）、０．０４３（３Ｈ，ｓ）、０．０４０（３Ｈ，ｓ）、０．０３（３Ｈ，ｓ）、０．０２（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：２０９．５、７２．２、７０．１、６３．７、５６．４、５３．７、５１．８、４４．２、４１．９、３８．９、３７．６、３６．３、３４．３、３３．２、３１．７、３１．５、２５．９４、２５．９２、２４．４、２２．７、２１．１、１８．３、１８．１、１３．５、１３．４、−４．０６、−４．６１、−４．６９、−４．７３。
【０１６２】
（Ｓ）−２−（（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３，６−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）ペント−４−イン−２−オール（Ｃ３）：
削り屑状マグネシウム（４．０ｇ、１６４．６ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）中の臭化プロパルギル（４．０ｇ、３３．７ｍｍｏｌ）及び塩化第二水銀（触媒）溶液をゆっくりと添加した。還流下で２０分間撹拌した後、最初に生成されたグリニャール試薬を、無水ＴＨＦ（１５０ｍＬ）中のビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）Ｃ２（２．７４ｇ、４．９ｍｍｏｌ）溶液にカニューレで添加し、さらに１時間還流させたままにしておいた。混合物を、氷浴で飽和ＮＨ４Ｃｌを用いて３０分間反応停止させ、ジエチルエーテルで３回抽出した。有機質層を飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮して粗黄色固形物を産生した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、３：１ヘキサン／ジエチルエーテル  ｖ／ｖ）により、ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）プロパギルアルコールＣ３（２．６１ｇ、８８％）を白色粉末として産生した。
【０１６３】
【化２５】
2011505357.tif 000031
【０１６４】
［Ｃ３］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：３．５３〜３．４４（１Ｈ，ｍ）、３．３８〜３．３２（１Ｈ，ｍ）、２．３８〜２．３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．４，２．４Ｈｚ）、２．２９〜２．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．４，２．８Ｈｚ）、２．０４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ）、１．８５〜１．６３（１１Ｈ，ｍ）、１．３９（３Ｈ，ｓ）、１．２７〜０．８９（１１Ｈ，ｍ）、０．８７（１８Ｈ，ｓ）、０．８１（３Ｈ，ｓ）、０．７９（３Ｈ，ｓ）、０．０３３（３Ｈ，ｓ）、０．０３０（３Ｈ，ｓ）、０．０２（３Ｈ，ｓ）、０．０１（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：８１．２、７３．９、７２．３、７１．２、７０．３、５７．４、５６．３、５３．７、５１．８、４２．９、４１．８、４０．０、３７．６、３６．３、３３．９、３３．７、３３．２、３１．７、２６．７、２５．９、２３．７、２２．３、２１．０、１８．３、１８．１、１３．６、１３．５、−４．０３、−４．６０、−４．６７、−４．７２。
【０１６５】
（Ｓ）−２−（（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−３，６−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル）−５−（チオフェン−２−イル）ペント−４−イン−２−オール（Ｃ４）：
無水テトラヒドロフラン（４．０ｍＬ）中のビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）プロパルギルアルコールＣ３（２００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（４．０ｍＬ）、２−ブロモチオフェン（０．１ｍＬ、１７０ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（６０ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）、及びＣｕＩ（３０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、Ｎ２雰囲気下で４．５時間７０℃で加熱した。完了後、溶媒を減圧下で除去し、その後フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：３ジエチルエーテル／ヘキサン  ｖ／ｖ）により、ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）チオフェンＣ４（１８４ｍｇ、８１％）を白色に近い粉末として産生した。
【０１６６】
【化２６】
2011505357.tif 000032
【０１６７】
［Ｃ４］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：７．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，１．２Ｈｚ）、７．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．６，０．８Ｈｚ）、６．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，３．６Ｈｚ）、３．６０〜３．５２（１Ｈ，ｍ）、３．４４〜３．３８（１Ｈ，ｍ）、２．５６（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ）、２．１１〜１．４９（１０Ｈ，ｍ）、１．４５（３Ｈ，ｓ）、１．２９〜０．９１（１２Ｈ，ｍ）、０．８９（１８Ｈ，ｓ）、０．８４（３Ｈ，ｓ）、０．８１（３Ｈ，ｓ）、０．０５１（３Ｈ，ｓ）、０．４９（３Ｈ，ｓ）、０．０３８（３Ｈ，ｓ）、０．０３３（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１３１．２、１２６．７、１２６．１、１２３．６、９０．７、７６．４、７４．３、７２．２、７０．２、５７．６、５６．２、５３．６、５１．７、４２．９、４１．７、３９．９、３７．５、３６．１、３５．１、３３．６、３３．１、３１．６、２６．９、２５．８、２３．６、２２．３、２０．９、１８．２、１７．９、１３．５、１３．４、−４．２、−４．７３、−４．７９、−４．８４。
【０１６８】
（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−５−（チオフェン−２−イル）ペント−４−イン−２−イル）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３，６−ジオール（Ｃ５、［Ｏｘｙ５１］）：
化合物Ｃ４（８０ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を、６．０ｍＬ  ＴＨＦ／ＣＨ３ＣＮ（１：１  ｖ／ｖ）に溶解し、ＨＦ／ピリジン（０．１ｍＬ）で処理した。２０℃で１時間撹拌した後、反応物を水で処理し、ジエチルエーテルで３回抽出した（１０ｍＬ×３）。混合した有機質層を、飽和ＮａＨＣＯ３で、その後飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して油状物を産生した。残留物のフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、５％メタノール／９５％ジエチルエーテル）により、Ｃ５（Ｏｘｙ５１）（３７．７ｍｇ、６９％）を白色粉末として産生した。
【０１６９】
【化２７】
2011505357.tif 000033
【０１７０】
［Ｃ５］［Ｏｘｙ５１］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：７．１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，１．２Ｈｚ）、７．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝３．６，０．８Ｈｚ）、６．９４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，３．６Ｈｚ）、３．６０〜３．５２（１Ｈ，ｍ）、３．４４〜３．３８（１Ｈ，ｍ）、２．５６（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ）、２．１１〜１．４９（１２Ｈ，ｍ）、１．４５（３Ｈ，ｓ）、１．２９〜０．９１（１２Ｈ，ｍ）、０．８４（３Ｈ，ｓ）、０．８１（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１３１．４、１２６．８、１２６．３、１２３．６、９０．８、７６．５、７４．４、７１．２、６９．４、５７．７、５６．３、５３．７、５１．７、４３．０、４１．４、３９．９、３７．３、３６．３、３３．７、３２．３、３０．９、２９．７、２６．９、２３．７、２２．４、２１．０、１３．６、１３．５。
【０１７１】
合成例１２−ＯＸＹ５０
（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−５−（チオフェン−２−イル）ペンタン−２−イル）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３，６−ジオール（Ｃ６、［Ｏｘｙ５０］）：
ジクロロメタン／９５％エタノール（１：１  ｖ／ｖ）の２．０ｍＬ混合物中の化合物Ｃ４（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）溶液に、５％無水Ｐｄ／Ｃ（３．４ｍｇ）を添加した。反応物をＨ２雰囲気下で８時間そのままにしておいた。完了後、粗混合物をジクロロメタンを使用してセライトでろ過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物（１０ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ／ＣＨ３ＣＮ（０．６ｍｌ、１：１  ｖ／ｖ）に溶解し、ＨＦ／ピリジン（２０μＬ）で処理した。２０℃で１時間撹拌した後、反応物を水で処理し、ジエチルエーテルで３回抽出した（１０ｍＬ×３）。混合した有機質層を、飽和ＮａＨＣＯ３で、その後飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して油状物を産生した。残留物のフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、５％メタノール／９５％ジエチルエーテル）により、Ｃ６（Ｏｘｙ５０）（４２．０ｍｇ、９６％）を白色粉末として産生した。
【０１７２】
【化２８】
2011505357.tif 000034
【０１７３】
［Ｃ６］［Ｏｘｙ５０］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；５００ＭＨｚ）δ：７．１１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．２，１．２Ｈｚ）、６．９１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．１，３．４Ｈｚ）、６．７８〜６．７７（１Ｈ，ｍ）、３．６０〜３．５４（１Ｈ，ｍ）、３．４４〜３．３９（１Ｈ，ｍ）、２．８６〜２．７５（２Ｈ，ｍ）、２．１９〜１．４０（１８Ｈ，ｍ）、１．２６（３Ｈ，ｓ）、１．２２〜０．８３（１０Ｈ，ｓ）、０．８２（３Ｈ，ｓ）、０．８１（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）δ：１４５．２、１２６．６、１２４．０、１２２．８、７４．９、７１．１、６９．３、５７．７、５６．２、５３．６、５１．５、４３．１、４２．８、４１．４、４０．３、３７．１、３６．１、３３．５、３２．１、３０．９、３０．３、２６．５、２６．２、２３．５、２２．２、２０．９、１３．６、１３．３。
【０１７４】
合成例１３−ＯＸＹ５３
（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン−２−イル）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３，６−ジオール（Ｃ７、［Ｏｘｙ５３］）：
削り屑状マグネシウム（１．３ｇ、５３．５ｍｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、無水ジエチルエーテル（１０ｍｌ）中の１−ブロモ−３−フェニルプロパン（２．１ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加した。還流下で３０分間撹拌した後、最初に生成されたグリニャール試薬を、無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）中のビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ケトンＣ２（３００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）溶液にカニューレで添加し、還流したままにしておいた。１２時間後に、混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌを用いて０℃で反応停止させ、ジエチルエーテルで２回抽出した。有機質層を混合し、飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧蒸発させて残留物を産生し、それをシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにかけた。ヘキサン−ジエチルエーテル（５：１  ｖ／ｖ）で溶出することにより、アルコール（２００ｍｇ、５５％）を産生し、その後ＴＨＦ／ＣＨ３ＣＮ（１２ｍＬ、１：１  ｖ／ｖ）中のＨＦ／ピリジン（０．２４ｍＬ）で脱シリル化した。２０℃で１時間撹拌した後、反応物を水で処理し、ジエチルエーテルで３回抽出した（１０ｍＬ×３）。有機質層を混合し、飽和ＮａＨＣＯ３で、その後飽和ＮａＣｌで洗浄した。有機相を収集し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮して油状物を産生した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、５％メタノール／９５％ジエチルエーテル）により、トリオールＣ７（Ｏｘｙ５３）（１００ｍｇ、７６％）を白色粉末として産生した。
【０１７５】
【化２９】
2011505357.tif 000035
【０１７６】
［Ｃ７］［Ｏｘｙ５３］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：７．２９〜７．２５（２Ｈ，ｍ）、７．１９〜７．１６（３Ｈ，ｍ）、３．６１〜３．５３（１Ｈ，ｍ）、３．４４〜３．３８（１Ｈ，ｍ）、２．６４〜２．５２（２Ｈ，ｍ）、２．２１〜１．２９（１９Ｈ，ｍ）、１．２５（３Ｈ，ｓ）、１．３２〜０．８８（９Ｈ，ｍ）、０．８２（３Ｈ，ｓ）、０．８１（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１４２．５、１２８．４、１２８．３、１２５．８、７５．１、７１．２、６９．４、５７．７、５６．３、５３．７、５１．７、４３．６、４２．９、４１．５、４０．２、３７．３、３６．５、３６．３、３３．６、３２．３、３１．０、２６．４、２３．７、２２．３、２１．９、２１．０、１３．７、１３．５。
【０１７７】
合成例１４−ＯＸＹ５２
（３Ｓ，５Ｓ，６Ｓ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−フェニルブタン−２−イル）−１０，１３−ジメチルヘキサデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３，６−ジオール（Ｃ８、［Ｏｘｙ５２］）：
削り屑状マグネシウム（６２０ｍｇ、２５．５ｍｍｏｌ）の存在下の５．０ｍＬ無水ジエチルエーテル中での（２−ブロモエチル）ベンゼン（９４０ｍｇ、５．１ｍｍｏｌ）を用いたビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）ケトンＣ２（３００ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）へのグリニャール付加を、Ｏｘｙ５３の調製用に記述されたのと同様の条件下で実施し、その後上記のようにＨＦ／ｐｙｒで脱シリル化して、Ｃ８（Ｏｘｙ５２）（２００．０ｍｇ、２ステップで８６％）を白色粉末として産生した。
【０１７８】
【化３０】
2011505357.tif 000036
【０１７９】
［Ｃ８］［Ｏｘｙ５２］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：７．２９〜７．２５（２Ｈ，ｍ）、７．２１〜７．１７（３Ｈ，ｍ）、３．６２〜３．５４（１Ｈ，ｍ）、３．４５〜３．３９（１Ｈ，ｍ）、２．６５〜２．５９（２Ｈ，ｍ）、２．２１〜１．２９（１９Ｈ，ｍ）、１．３６（３Ｈ，ｓ）、１．３２〜０．８８（９Ｈ，ｍ）、０．８６（３Ｈ，ｓ）、０．８１（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１４２．６、１２８．４、１２８．３、１２５．７、７５．１、７１．２、６９．５、５８．０、５６．３、５３．７、５１．７、４５．７、４２．９、４１．５、４０．２、３７．３、３６．３、３３．７、３２．３、３１．０、３０．７、２６．３、２３．７、２２．４、２１．０、１３．８、１３．５。
【０１８０】
合成例１５−ＯＸＹ２０
（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ）−１７−（（Ｓ，Ｅ）−２−ヒドロキシ−６−メチルヘプト−３−エン−２−イル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−オール、［Ｏｘｙ２０］
化合物Ｏｘｙ２０の立体選択的合成を、公開されている手順に従って実施した（Watanabe, B.; Nakagawa, Y.; Ogura, T.; Miyagawa, H.  Steroids 2004, 69, 483-493）。シリル化プレグネノロンを、アセチレンとｎ−ブチルリチウムとを反応させることにより形成された４−メチル−１−ペンチンの陰イオンの立体選択的付加にかけて、８４％の収率でプロパギルアルコールを準備した。その結果生じたプロパギルアルコールをリンドラー触媒の存在下で水素化することにより、（Ｚ）−及び（Ｅ）−アリルアルコール（９０：１０）の混合物を産生した。両異性体をクロマトグラフィーで分離し、（Ｚ）−異性体を６８％の収率で、（Ｅ）−異性体を７％での収率で産出した。少ない方の（Ｅ）−異性体（１００ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（０．８ｍＬ、０．８ｍｍｏｌ）中のフッ化テトラブチルアンモニウムの存在下で脱シリル化して、対応するジオールＯｘｙ２０（７０ｍｇ、８９％）を白色粉末として産生した。
【０１８１】
【化３１】
2011505357.tif 000037
【０１８２】
［ＯＸＹ２０］
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３；４００ＭＨｚ）δ：５．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．５Ｈｚ）、５．５１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１５．５，６．５Ｈｚ）、５．３５〜５．３３（１Ｈ，ｍ）、３．５５〜３．４７（１Ｈ，ｍ）、２．２８〜１．８１（６Ｈ，ｍ）、１．６６〜１．３８（１３Ｈ，ｍ）、１．３２（３Ｈ，ｓ）、１．２３〜１．０７（４Ｈ，ｍ）、１．００（３Ｈ，ｓ）、０．９８〜０．９０（２Ｈ，ｍ）、０．８７（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、０．８２（３Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，１００ＭＨｚ）δ：１４０．８、１３９．１、１２５．０、１２１．６、７５．４、７１．８、５９．９、５６．８、５０．１、４２．８、４２．３、４１．７、４０．２、３７．２、３６．５、３１．８、３１．７、３１．３、２９．２、２８．５、２３．９、２３．３、２２．４、２２．３、２０．９、１９．４、１３．８。
【０１８３】
生物活性組成物／医薬組成物の態様
経口投与に好適な製剤又は組成物は、水、生理食塩水、又は果汁などの希釈剤に溶解されている有効量のオキシステロールなどの液体液剤；各々が所定量の活性成分を固形物、果粒、又は凍結乾燥細胞として含有するカプセル剤、サシェ剤、又は錠剤；水性液体中の液剤又は懸濁剤；及び水中油乳剤又は油中水乳剤から構成されていてもよい。錠剤形態は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、微結晶性セルロース、アラビアゴム、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、並びに他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香料、及び薬理学的に適合する担体の１又は複数を含むことができる。経口送達に好適な製剤は、合成及び天然ポリマーミクロスフェア、又は胃腸管内での分解から本発明の薬剤を保護するための他の手段に組み込むこともできる。
【０１８４】
非経口投与（例えば、静脈内）に好適な製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を目的受容個体の血液と等張性にする溶質を含有することができる水性及び非水性の等張性無菌注射液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び保存剤を含むことができる水性及び非水性の無菌懸濁液が含まれる。製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位用量又は多用量の密閉容器で提供することができ、注射剤の場合、使用の直前に無菌の液体担体、例えば水を添加すればよいだけのフリーズドライされた（つまり、凍結乾燥された）状態で保管することができる。即時調合注射溶液及び懸濁液は、以前に記述されている種類の無菌散剤、果粒剤、及び錠剤から調製することができる。
【０１８５】
本開示のオキシステロールは、単独で又は他の治療薬と組み合わせて、吸入により投与されるエアロゾル製剤に作ることができる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、及び窒素などのような加圧が許容される噴霧剤に入れることができる。
【０１８６】
オキシステロールは、単独で又は他の治療薬と組み合わせて、経皮的塗布及び吸収に好適な製剤に作ることもできる。経皮的エレクトロポレーション又はイオン導入を使用して、本発明の薬剤及び／又は医薬組成物の皮膚を介した全身性送達を促進及び／又は制御することもできる（Theiss et al. (1991), Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. 13: 353-359）。
【０１８７】
局所性投与に好適な製剤には、香味料、通常はスクロース及びアラビアゴム又はトラガカントに活性成分を含むトローチ剤；ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアラビアゴムなどの不活性基剤に活性成分を含むパステル剤；好適な液体担体中に活性成分を含む口内洗浄液；又はクリーム剤、乳剤、懸濁剤、液剤、ゲル剤、クリーム剤、ペースト剤、発泡剤、潤滑剤、スプレー剤、若しくは坐剤などが含まれる。
【０１８８】
当業者であれば、目下の特定の適用に基づいて、好適な又は適切な製剤を選択、適合、又は開発することができることを認識するだろう。加えて、本発明の医薬組成物は、全身性、局所的、又はその両方であろうとも、様々な異なる経路による投与用に調製することができる。そのような例には、これらに限定されないが、関節内に、頭蓋内に、皮内に、肝内に、筋肉内に、眼球内に、腹腔内に、髄腔内に、静脈内に、皮下に、経皮的に、或いは直接注射、直接塗布、及び／又は動脈若しくは他の適切な組織部位にデバイスを移植することなどによりアテローム硬化部位に直接的に実施される投与が含まれる。
【０１８９】
オキシステロールは、外科的又は医療用デバイス又はインプラント内部に含有されるように処方することができ、又は外科的若しくは医療用デバイス若しくはインプラントにより放出されように適合させることができる。特定の態様では、インプラントは、オキシステロールで被覆されていてもよく、又はそうでなければ処理されてもよい。例えば、ヒドロゲル、又は生体適合性及び／又は生分解性ポリマーなどの他のポリマーを使用して、本発明の組成物を用いてインプラントを被覆することができる（つまり、ヒドロゲル又は他のポリマーを使用することにより、医療デバイスと共に使用するために組成物を適合させることができる）。医療デバイスを薬剤で被覆するためのポリマー及びコポリマーは、当技術分野で周知である。インプラントの例には、これらに限定されないが、血管形成バルーン、ステント、薬物溶出ステント、縫合糸、人工器官、血管カテーテル、透析カテーテル、血管グラフト、人工心臓弁、心臓ペースメーカー、植え込み型除細動器、又はIV針が含まれる。単なる例示として、ステント又はステントグラフトは、典型的には、細長い繊維管状グラフト部分を含み、血管などの体内通路の弱い所を補強又は強化するために通常使用される。ステントグラフトの挿入は、カテーテルの使用によって実施することができる。設置は、バルーン血管形成術の最中又はその後などのバルーン膨張によって容易にすることができ、又は代替的には、ステントグラフトは自己膨張性であってもよい。
【０１９０】
本発明のオキシステロールの用量は、錠剤又はカプセル剤などの単位剤形であってもよい。「単位剤形」という用語は、本明細書中で使用される場合、動物（例えばヒト）対象体用の単一用量として好適な物理的に個別の単位を指し、各単位は、本発明の薬剤の所定の量を、単独で又は薬学的に許容される希釈剤、担体、若しくは媒体と共に、所望の効果が生じるのに十分な量の計算された他の治療薬と組み合わせて含有している。
【０１９１】
当業者であれば、薬剤の所望の有効量又は有効濃度を個々の患者で達成するために、使用される組成物の的確な製剤の投与に関する適切な用量、スケジュール、及び方法を日常的に決定することができる。当業者であれば、疾患、障害、又は状態に関する適切な臨床症状の分析に加えて、適切な患者試料（例えば、血液及び／又は組織）の直接又は間接分析により、本発明の化合物、例えばオキシステロールの「有効濃度」の適切な指標を容易に決定及び使用することもできる。
【０１９２】
動物又は哺乳動物、特にヒトに投与されるオキシステロール又はその組成物の用量は、本発明の状況では、合理的な時間枠にわたって個体に少なくとも１つの治療応答を生じさせるのに十分であるべきである。用量の正確な量は、対象体の種、年齢、体重、及び全身状態、治療される任意の障害の重症度又は作用機序、使用される特定の薬剤又は媒体、並びに投与方法などに依存して、対象体毎に変動するだろう。インビボで所望の濃度を達成するために使用された用量は、使用された特定のオキシステロールの効力、追加的薬剤を用いた場合又は用いない場合の、宿主中のオキシステロールに関連する薬物動力学、感染した個体の疾患状態の重症度、並びに全身性投与の場合には、個体の体重及び年齢によって決定されるだろう。用量のサイズは、使用される特定の薬剤又はその組成物に伴う場合がある任意の有害副作用の存在によって決定することもできる。有害副作用を最小に維持することは、一般的に、可能な場合はいつでも望ましい。
【０１９３】
例えば、用量は、約５ｎｇ（ナノグラム）〜約１０００ｍｇ（ミリグラム）、又は約１００ｎｇ〜約６００ｍｇ、又は約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、又は約２０ｍｇ〜約４００ｍｇの範囲で投与することができる。例えば、用量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１５００ｍｇ／ｋｇ、又は約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、又は約５ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、又は２０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの用量対体重比率を達成するように選択することができる。例えば、用量単位は、本発明による化合物の約１ｎｇ〜約５０００ｍｇ、又は約５ｎｇ〜約１０００ｍｇ、又は約１００ｎｇ〜約６００ｍｇ、又は約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、又は約２０ｍｇ〜約４００ｍｇ、又は約４０ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲であってもよい。
【０１９４】
所望の治療効果を誘発するために必要とされるような用量は、１日当たり１回、１日当たり２回、１日当たり４回、又は１日当たり４回を超えて投与することができる。例えば、用量投与計画は、約０．０１〜約１０００ｎＭ、又は約０．１〜約７５０ｎＭ、又は約１〜約５００ｎＭ、又は約２０〜約５００ｎＭ、又は約１００〜約５００ｎＭ、又は約２００〜約４００ｎＭの範囲の本発明の化合物の血清濃度を達成するように選択することができる。例えば、用量投与計画は、約１μｇ／Ｌ（１リットル当たりのマイクログラム）〜約２０００μｇ／Ｌ、又は約２μｇ／Ｌ〜約１０００μｇ／Ｌ、又は約５μｇ／Ｌ〜約５００μｇ／Ｌ、又は約１０μｇ／Ｌ〜約４００μｇ／Ｌ、又は約２０μｇ／Ｌ〜約２００μｇ／Ｌ、又は約４０μｇ／Ｌ〜約１００μｇ／Ｌの範囲の本発明の化合物の最大半量用量を有する平均血清濃度を達成するように選択することができる。
【０１９５】
本明細書中に記述されているようなオキシステロールの治療上有効量は、アテローム性動脈硬化又は他の関連心血管疾患若しくは状態を改善する薬剤の能力によって測定されるような、患者に有益な臨床効果を有するものを含むことができる。オキシステロールの治療上有効量は、アテローム性動脈硬化又は他の関連状態の発症リスク低減に有益な臨床効果を有するものを含むこともできる。各薬剤の治療上有効量は、所望の臨床効果を達成し、その一方でマイナスの副作用を最小限にするように調節することができる。薬剤の用量は、投与経路、疾患の重症度、患者の年齢及び体重、患者が摂取している他の薬剤、並びに特定の患者に適切な個々の投薬計画及び用量レベルを決定する際に、主治医によって通常考慮される他の要因に依存して、個々の患者について選択することができる。
【０１９６】
例示として、本発明は、内因性循環オキシステロールレベルを患者の基礎レベルを超えて上昇させることを含むことができる。正常な成体では、レベルは、質量分析法によって測定されるように、年齢及びオキシステロールのタイプに依存して約１０〜４００ｎｇ／ｍｌである。薬理学分野の当業者であれば、用量を選択し、それをモニターして、基礎レベルを超えた循環レベル増加が生じたかどうかを判断することができるだろう。
【０１９７】
併用療法で投与する場合、他の薬剤をオキシステロールと同時に投与することができ、又は用量は所望の通りに調節することができる。２つの（又はより多くの）薬物を、組成物中に混合することもできる。組み合わせて使用される場合、どちらかが単独で使用される場合より、各々の用量はより少ない場合がある。特定の実施形態は、独立して又はオキシステロールと相乗効果的に作用して血管状態を改善する追加的な薬剤を用いた治療も含むことができる。
【０１９８】
オキシステロールは、アテローム性動脈硬化のリスクのある細胞及び組織及び対象体に、アテローム性動脈硬化病変を低減、除去、予防、又は治療するのに有効な用量及び経路によって投与することもできる。本発明の別の実施形態は、インビトロ又はインビボのいずれかにおける、本明細書中に開示されている方法のいずれかに有用なキットである。そのようなキットは、本明細書中で論じるオキシステロール又は医薬組成物の１又は複数を含むことができる。キットは、本方法を実施するための説明書を含んでもよい。本発明のキットに含んでもよい要素には、好適な緩衝液、薬学的に許容される担体など、容器、又は包装材料が含まれる。キットの試薬は、試薬が安定する容器中に、例えば凍結乾燥された形態で又は安定化された液体中に存在していてもよい。また、試薬は、単回使用形態で、例えば単一剤形であってもよい。当業者であれば、本発明の方法のいずれかを実行するのに好適なキットの構成要素を認識するだろう。
【０１９９】
この明細書中で例示及び考察された実施形態は、本発明を作製及び使用するのに本発明者らに知られている最良な方法を当業者に教示することのみを意図している。本明細書中の何ものも、本発明の範囲を限定するとみなされるべきでない。提示された例は全て代表的なものであり、非限定的である。本発明の上述の実施形態は、上記の教示に照らして当業者により理解されるように、本発明から逸脱せずに改変又は変更することができる。したがって、本発明は、特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内で、具体的に記述された通り以外にも実施することができると理解されるべきである。
【０２００】
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【図１Ａ】
2011505357.tif 000088
【図１Ｂ】
2011505357.tif 000089
【図１Ｃ】
2011505357.tif 000090
【図２ＡＢ】
2011505357.tif 000091
【図２ＣＤ】
2011505357.tif 000092
【図２Ｅ】
2011505357.tif 000093
【図３】
2011505357.tif 000094
【図４ＡＢ】
2011505357.tif 000095
【図４ＣＤ】
2011505357.tif 000096
【図４ＥＦ】
2011505357.tif 000097
【図５ＡＢ】
2011505357.tif 000098
【図５ＣＤ】
2011505357.tif 000099
【図５Ｅ】
2011505357.tif 000100
【図６】
2011505357.tif 000101
【図７ＡＢ】
2011505357.tif 000102
【図７ＣＤ】
2011505357.tif 000103
【図７ＥＦ】
2011505357.tif 000104
【図８】
2011505357.tif 000105
【図９】
2011505357.tif 000106
【図１０】
2011505357.tif 000107
【図１１】
2011505357.tif 000108
【図１２】
2011505357.tif 000109
【図１３】
2011505357.tif 000110
【図１４】
2011505357.tif 000111
【図１５】
2011505357.tif 000112
【図１６】
2011505357.tif 000113
【図１７】
2011505357.tif 000114
【図１８】
2011505357.tif 000115
【配列表】
2011505357000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月10日(2010.8.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉを有する化合物。
【化１】
2011505357.tif 000116
（式Ｉ）
式中、ｑが単結合又は二重結合であり、
ｔが単結合又は二重結合であり、
ｑ及びｔの少なくとも１つが単結合であり、
Ｍが、水素（−Ｈ）、ヒドロキシ（−ＯＨ）、ホルムオキシ（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｈ）、アセトキシ（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）、アシルオキシ（−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−アルキル）、酸素（＝Ｏ）、アルコキシ（−Ｏ−アルキル）、スルフヒドリル（−ＳＨ）、アルキルチオ（−Ｓ−アルキル）、アミノ（−ＮＨ２）、メチルアミノ（−ＮＨＣＨ３）、アルキルアミノ（−ＮＨ−アルキル）、ホルムアミド（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）Ｈ）、アセトアミド（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３）、及びアルキルアミド（−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−アルキル）からなる群から選択され、アルキルが１〜６個の炭素を有し、
Ｍが酸素である場合、ｔが二重結合であり、かつｑが単結合であり、
Ｍが、水素、ヒドロキシ、又はアセトキシである場合、ｔが単結合であり、
Ｅが、炭素数１〜６のアルキルであり、
Ｒ２が、炭素数１〜６のアルカン、炭素数２〜６のアルケン、炭素数２〜６アルキン、炭素数４〜１２のアラルキル、炭素数５〜１２のアラルケン、炭素数５〜１２のアラルキン、炭素数４〜１２のハロゲン置換アラルキル、炭素数５〜１２のハロゲン置換アラルケン、炭素数５〜１２のハロゲン置換アラルキン、炭素数５〜１８のアルキル置換アラルキル、炭素数６〜１８のアルキル置換アラルケン、炭素数６〜１８のアルキル置換アラルキン、炭素数１〜６のヒドロキシ置換アルキル、炭素数２〜６のヒドロキシ置換アルケン、及び炭素数２〜６のヒドロキシ置換アルキンからなる群から選択され、
ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、エチル、ｎ−プロピル、４−メチルペンチル、４−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、又は１−ヒドロキシ−４−メチルペンチルではなく、
ｑが二重結合であり、かつＭが水素である場合、Ｒ２がメチルベンジルではない。
【請求項２】
ｑが単結合であり、Ｍが水素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、４−メチルペンチル、ビニル、１−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、３−ヒドロキシ−３−メチルブチル、４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、１，４−ジヒドロキシ−４−メチルペンチル、１，５−ジヒドロキシ−４−メチルペンチル、又は２−フェニルエテニルではなく、
ｑが単結合であり、Ｍがヒドロキシであり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、４−メチルペンチル又は４−メチル−３−ペンテニルではなく、
ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｔ−ブチル、１−メチルプロピル、３−メチルブチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、ビニル、アリル、１−プロペニル、４−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、３−ヒドロキシ−３−メチルブチル、４−ヒドロキシ−３−メチルブチル、１−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、４−ヒドロキシ−４−メチルペンチル、４−ヒドロキシ−４−メチル−１−ペンテニル、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−ペンテニル、１，４−ジヒドロキシ−４−メチルペンチル、又は１−（２−ピリジニル）エチルではなく、
ｑが二重結合であり、Ｍが水素であり、かつＥが４−メチルペンチルである場合、Ｒ２がヒドロキシメチルではなく、
ｑが二重結合であり、かつＭが水素である場合、Ｒ２がメチルベンジルではなく、
ｔが二重結合であり、Ｍが酸素であり、かつＥがメチルである場合、Ｒ２が、４−メチル−ペンチル又は１−ヒドロキシ−４−メチルペンチルではない、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
化合物が、
【化２】
2011505357.tif 000117
[Oxy50]                                      ,
2011505357.tif 000118
[Oxy51]                                      ,
2011505357.tif 000119
[Oxy52]                                      ,
2011505357.tif 000120
[Oxy53]                                      ,
2011505357.tif 000121
[Oxy20]                                      ,
2011505357.tif 000122
[Oxy22]                                      ,
2011505357.tif 000123
[Oxy26]                                      ,
2011505357.tif 000124
[Oxy27]                                      ,
2011505357.tif 000125
[Oxy39]                                      ,
2011505357.tif 000126
[Oxy40]                                      ,
2011505357.tif 000127
[Oxy42]                                      ,
2011505357.tif 000128
[Oxy28]                                      ,
2011505357.tif 000129
[Oxy41]                                      ,
2011505357.tif 000130
[Oxy48]                                      ,及び
2011505357.tif 000131
[Oxy49]
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む生物活性組成物。
【請求項５】
化合物が、
【化３】
2011505357.tif 000132
[Oxy34]                                      ,
2011505357.tif 000133
[Oxy36]                                      ,及び
2011505357.tif 000134
[Oxy38]
からなる群から選択される、請求項４に記載の生物活性組成物。
【請求項６】
副甲状腺ホルモン、フッ化ナトリウム、インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＬＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子II（ＩＬＧＦ−II）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、シトクロムＰ４５０阻害剤、骨形成プロスタノイド、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、及びＢＭＰ１４からなる群から選択される少なくとも１つの追加的な薬剤をさらに含む、請求項４に記載の生物活性組成物。
【請求項７】
ヒト又は動物体内で使用するための、表面を有する基材を含むインプラントであって、前記インプラントの前記表面が、周囲の骨組織で骨形成を誘導するのに十分な量の請求項４に記載の生物活性組成物を含むインプラント。
【請求項８】
治療上有効量の組成物を含み、骨障害、骨粗しょう症、オステオポリティス、骨関節炎、骨折、肥満、及び／又は黄色腫形成を罹患している対象体を治療するために使用される、請求項４に記載の生物活性組成物。
【請求項９】
対象体に、有効な剤形で、選択された間隔で投与するための治療上有効な用量の組成物を含み、骨量を増加させるために使用される、請求項８に記載の生物活性組成物。
【請求項１０】
対象体に、有効な剤形で、選択された間隔で投与するための治療上有効な用量の組成物を含み、骨粗しょう症の症状を寛解させるために使用される、請求項８に記載の生物活性組成物。
【請求項１１】
骨形成を誘導して対象体を治療するための組成物であって、
哺乳動物間葉幹細胞を収集することと、
前記哺乳動物間葉細胞を請求項４に記載の生物活性組成物と接触させて、前記細胞の骨芽細胞分化を誘導することと、
前記分化した細胞を前記対象体に投与するために用いられることを特徴とする請求項４に記載の生物活性組成物。
【請求項１２】
治療上有効量の組成物を含み、細胞又は組織におけるヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性応答、Ｗｎｔ阻害因子−１（Ｗｉｆ−１）経路媒介性応答、及び／又はＷｎｔ経路媒介性応答を調整するために使用される組成物であって、前記細胞又は組織と接触させるために用いられる請求項４に記載の生物活性組成物。
【請求項１３】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性応答が、骨芽細胞分化、骨形態形成及び骨増殖の刺激、並びに／又は脂肪細胞分化、脂肪細胞形態形成、及び／若しくは脂肪細胞増殖の阻害である、請求項１２に記載の生物活性組成物。
【請求項１４】
プレグネノロンをジメチルホルムアミド及びｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリドと反応させて、保護プレグネノロンを生成することと、
前記保護プレグネノロンを有機金属試薬、グリニャール試薬、及び／又はランタニドハロゲン試薬と反応させて、シリルエーテル産物を生成することと、
前記シリルエーテル産物を脱シリル化して、オキシステロール誘導体を生成することとを含む方法。
【請求項１５】
保護プレグネノロンを有機金属試薬及び／又はランタニドハロゲン試薬と反応させて、シリルエーテル産物を生成することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
治療上有効量の組成物を含み、心血管障害、動脈硬化症、心筋梗塞、末梢血管疾患、脳卒中及び／又は脱毛症を罹患している対象体を治療するために使用される、請求項４に記載の生物活性組成物。
【請求項１７】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路媒介性応答が、発毛、軟骨形成及び／又は血管新生の刺激である、請求項１２に記載の生物活性組成物。
【国際調査報告】
2011505357.tif 000135
2011505357.tif 000136
2011505357.tif 000137