(57)【要約】本発明は、自身に連結した転写ユニットにおける多様化の活性化に必要かつ十分である、シス作用性多様化活性化因子（ＤＩＶＡＣ）の同定に関連する。本発明は、多様化活性化因子を含む遺伝的構築物を、レシピエント細胞へ導入することを含む、標的核酸の多様化の方法を提供し、ここでその多様化活性化因子は、標的核酸に連結している。本発明は、本発明の多様化活性化因子を含む遺伝的構築物を、レシピエント細胞へ導入して、組換えレシピエント細胞を産生することを含む、標的核酸の多様化の方法を提供し、ここで当該多様化活性化因子は、その標的核酸に連結している。
2011516071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多様化活性化因子（ＤＩＶＡＣ）を含む遺伝的構築物を、レシピエント細胞へ導入して、組換えレシピエント細胞を産生する工程を含む、標的核酸の多様化のための方法であって、
該多様化活性化因子は、該組換えレシピエント細胞内の該標的核酸に連結され、
該多様化活性化因子は、配列番号第１番の配列を有する核酸、該核酸の断片、ならびに該核酸および該断片に相同的な核酸からなる群より選択され、そして
該多様化活性化因子は、該多様化活性化因子に連結した転写ユニットにおける遺伝的多様化を活性化する機能を有する、方法。
【請求項２】
前記多様化は、体細胞高頻度変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸は、該標的核酸に対する遺伝子変換ドナーとして作用し得る少なくとも１つの核酸にさらに連結され、そして前記多様化は、体細胞高頻度変異および遺伝子変換の組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多様化活性化因子は、免疫グロブリンエンハンサー配列を含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記多様化活性化因子は、配列番号第１番の位置２８２５〜３６２５、５１１４〜６１０６、５２８８〜５４８５、６１０７〜７０９９、６１０７〜９７８４、３０９８〜７０９９、９０００〜９７８４、または９５０９〜９８０２の間の配列を有する核酸を含む、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項６】
前記多様化活性化因子の長さは、少なくとも１００ヌクレオチドである、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
前記多様化活性化因子は、配列番号第１番またはその断片と、少なくとも５０％の配列同一性を共有する、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記多様化活性化因子の一つより多いコピー、または一つより多い多様化活性化因子が、前記組換えレシピエント細胞内に存在する、請求項１〜７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的核酸は、外来性核酸である、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的核酸は、免疫グロブリン鎖、選択マーカー、ＤＮＡ結合タンパク質、酵素、受容体タンパク質、またはそれらの一部をコードする、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的核酸と前記多様化活性化因子との間の距離は、１５０ｋｂ以下である、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記多様化活性化因子の存在下における前記標的核酸の前記多様化は、該多様化活性化因子の非存在下よりも、少なくとも５倍高い、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記レシピエント細胞は、活性化誘導性デアミナーゼ（ＡＩＤ）またはその機能的等価物を発現する真核細胞である、請求項１〜１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記レシピエント細胞は、Ｂリンパ球またはそれ由来の細胞株、好ましくはニワトリＢ細胞株ＤＴ４０またはその誘導体である、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
望ましい活性を有する標的核酸を調製するための方法であって、該方法は、
（ａ）レシピエント細胞に、多様化活性化因子および任意で該標的核酸を含む１つ以上の核酸構築物を導入して、組換えレシピエント細胞を得る工程、
（ｂ）組換えレシピエント細胞を同定する工程であって、ここで該多様化活性化因子が、該標的核酸に連結している、工程、
（ｃ）（ｂ）由来の細胞を、該標的核酸の発現および多様化に適当な条件下で、増殖および増加させる工程、ならびに
（ｄ）（ｃ）由来の細胞の集団内で、望ましい活性を有する変異標的核酸を含む個々の細胞または細胞集団を選択する工程：
を含み、
ここで、該多様化活性化因子は、配列番号第１番の配列を有する核酸、該核酸の断片、ならびに該核酸および該断片に相同的な核酸からなる群より選択され、そして
該多様化活性化因子は、該多様化活性化因子に連結した転写ユニットにおける遺伝的多様化を活性化する機能を有する、方法。
【請求項１６】
工程（ｃ）および工程（ｄ）が、反復的に繰り返される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ｄ）において選択した細胞由来の前記標的核酸の変異配列を決定する工程（ｅ）をさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記多様化を終了させる工程（ｆ）をさらに含む、請求項１５〜１７に記載の方法。
【請求項１９】
多様化活性化因子を含む組換え核酸構築物であって、
該多様化活性化因子は、配列番号第１番の配列を有する核酸、該核酸の断片、ならびに該核酸および該断片に相同的な核酸からなる群より選択され、そして
該多様化活性化因子は、該多様化活性化因子に連結した転写ユニットにおける遺伝的多様化を活性化する機能を有する、組換え核酸構築物。
【請求項２０】
外来性核酸として多様化活性化因子を含む組換え細胞であって、
該多様化活性化因子は、配列番号第１番の配列を有する核酸、該核酸の断片、ならびに該核酸および該断片に相同的な核酸からなる群より選択され、そして
該多様化活性化因子は、該多様化活性化因子に連結した転写ユニットにおける遺伝的多様化を活性化する機能を有する、組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、連結した転写ユニットにおける遺伝的多様化を活性化する、免疫グロブリン遺伝子座由来の調節性配列を採用することによる、組換えレシピエント細胞における標的核酸配列の選択的多様化の方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（序論）
変異遺伝子および配列が最適化された遺伝子ならびにそれらの遺伝子産物は、医学、化学、および技術的領域において、広範な適用を有する。遺伝子および遺伝子産物の多様化のための今日の戦略は、主に、インビトロにおける多数の変異配列の産生、人工的発現および続く望ましい性質に関する選択に頼る。これらの方法は、変異遺伝子は生理学的状況において発現するのが困難であり、そしてその変異レパートリーは、それらが発現するときまでに固定されるという欠点を有する。他方、ゲノム全体での変異生成が生きた細胞で誘導される場合、これは偶発的な致死的変異による高い毒性を伴い、かつ、個々の遺伝子における変異率は低い、すなわち、その変異生成は選択性を欠く。
【０００３】
よって、生きた細胞内で遺伝子座特異的核酸多様化を可能にする遺伝的システムを提供することが試みられた。天然において、指向的かつ選択的な多様化は、主に免疫グロブリン遺伝子内の多様性を産生するために使用される。従って、脊椎動物Ｂ細胞は、高頻度変異、遺伝子転換、およびクラススイッチ組換えによって、再編成された免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子を多様化し得る。３つの現象は全て、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ、ＮＣ＿００６０８８）［Ｍｉｒａｍａｔｓｕら、２０００；Ａｒａｋａｗａら、２００２；Ｈａｒｒｉｓら、２００２］の発現を必要とし、これはおそらく、変異導入する配列内および組換える配列内でシチジンを脱アミノ化することによって、Ｉｇ遺伝子の多様化を開始する［Ｄｉ  ＮｏｉａおよびＮｅｕｂｅｒｇｅｒ、２００２；Ｒａｄａら、２００４］。高頻度変異およびスイッチ組換えのさらなる必要条件は、Ｉｇ遺伝子およびスイッチ領域それぞれの転写である［ＰｅｔｅｒｓおよびＳｔｏｒｂ、１９９６；Ｓｈｉｎｋｕｒａら、２００３］。
【０００４】
例えば、Ｅ２Ａ転写因子遺伝子の不活性化が、表面ＩｇまたはＡＩＤ発現のレベルに影響を与えずにＩｇＬ鎖の変異率を抑制することも観察され、このことは、Ｅ２Ａコード化タンパク質は、ＡＩＤをＩｇ遺伝子座へリクルートすることによって、Ｉｇ高頻度変異を増強することを示唆する［Ｓｃｈｏｅｔｚら、２００６］。
【０００５】
ＡＩＤを発現するＢ細胞由来の転写された非Ｉｇ遺伝子の配列分析は、Ｉｇ遺伝子と比較して、変異が全く無いかまたは非常に少数の変異しかないことを明らかにした［Ｓｈｅｎら、１９９８］。Ｂ細胞における多数の発現遺伝子の最近の研究は、野生型マウスにおける変異の数は、ＡＩＤノックアウトマウスにおける変異の数よりも有意に多いことを示した［Ｌｉｕら、２００８］。しかし、ＡＩＤ発現Ｂ細胞における非Ｉｇ遺伝子の変異率は、依然としてＩｇ遺伝子のものより数桁低かった。このＩｇ遺伝子と非Ｉｇ遺伝子との間の差を説明するために、Ｉｇ遺伝子座のシス作用性配列が、おそらくＡＩＤをリクルートすることによって、高頻度変異を活性化していると示唆された。しかし、マウスおよびヒトＩｇ遺伝子座について、これらの配列を明確に定義するための努力は成功しなかった［ＯｄｅｇａｒｄおよびＳｃｈａｔｚ、２００６］。トランスジェニックマウスにおけるキメラリポーター遺伝子を用いた研究は、あるＩｇエンハンサーおよびその周囲の配列が、高頻度変異活性を与えることを示した［Ｂｅｔｚら、１９９４；ＫｌｏｔｚおよびＳｔｏｒｂ、１９９６；Ｋｌｉｘら、１９９８］。しかし、ノックアウトマウスにおけるＩｇｋエンハンサーの欠失は、Ｉｇｋ遺伝子（ＣＡＡ３６０３２）の高頻度変異を防がなかった［ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｏｅｐら、１９９８；Ｉｎｌａｙ、２００６］。少なくとも、１つのマウスＢ細胞株［Ｗａｎｇら、２００４］およびＡＩＤ発現線維芽細胞［Ｙｏｓｈｉｋａｗａら、２００２］は、付近にＩｇ遺伝子座配列が存在しないときに、転写される導入遺伝子を変異させ、このことは、シス作用性調節性配列が高頻度変異のために必要かどうかという問題をさらに混乱させた。
【０００６】
以前に、発明者らは、ニワトリＢ細胞株ＤＴ４０が、付近に偽Ｖ（ψＶ）遺伝子が存在するときは遺伝子変換によって［Ａｒａｋａｗａら、２００２］、またはψＶ遺伝子が欠失している場合は高頻度変異によって［Ａｒａｋａｗａら、２００４；特許文献１］、その再編成されたＩｇ軽鎖（ＩｇＬ）遺伝子を多様化することを示した。両方の活性は、ＡＩＤの発現に厳密に依存する。続いて、発明者らは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＡＡＢ０８０５８）導入遺伝子が、再編成されたＩｇＬ遺伝子座に挿入された場合、変異によって迅速に多様化されることを示し［Ａｒａｋａｗａら、２００８］、このことは、相同的遺伝子変換ドナーの欠失は、ＩｇＬ遺伝子の高頻度変異を引き起こすという最初の発見［Ａｒａｋａｗａら、２００４］と一致していた。同時に、高度に転写された伸長因子１アルファ遺伝子（ＮＰ＿９８９４８８）において変異は見出されず［Ａｒａｋａｗａら、２００４］、このことは、高頻度変異は、ＩｇＬ遺伝子座内でのみ起こることを示した。それぞれＩｇＬ遺伝子座の上流および下流の近傍である、ＶｐｒｅＢ３（ＮＣ＿００６１０２）遺伝子または炭酸脱水酵素（ＸＰ＿４１５２１８）遺伝子も、ＤＴ４０において配列不均一性を示さなかった［ＧｏｐａｌおよびＦｕｇｍａｎｎ、２００８］。エンハンサー領域の下流の、再編成されたＩｇＬ遺伝子座の４．１ｋｂの欠失が、ψＶ陽性ＤＴ４０におけるＩｇＬ遺伝子の変換を停止させることが観察され［Ｋｏｔｈａｐａｌｌｉら、２００８］、このことは、ＩｇＬ遺伝子座の一部が遺伝子変換のために必要であることを示した。しかし、この研究において使用された技術を、小さな特異的多様化活性配列の正確な同定のために使用することはできなかった。さらに、推定多様化配列が、多様化の活性化のために十分であるかどうかという問いも解決できなかった。
【０００７】
このように、ヒト、マウス、またはＤＴ４０細胞のいずれかにおける公知の研究は、ＡＩＤ依存性遺伝的多様化のＩｇ遺伝子座特異性のために必要かつ十分であるシス作用性調節性配列を明らかにしなかった。そのような配列は、ＡＩＤ発現細胞において、Ｉｇ遺伝子座の外で、核酸標的配列の多様性が生じることを可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００５／０８０５５２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、自身に連結した核酸において多様化を活性化する調節性配列、および標的核酸の特異的多様化を達成するための方法に関するニーズが存在する。本発明はそのニーズを満たし、そしてさらなる利点も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、調節性核酸分子、シス作用性多様化活性化因子（cis-acting diversification activator（ＤＩＶＡＣ））を利用可能にし、ＤＩＶＡＣはそれに連結した転写ユニットにおける多様化を活性化する機能を有する。本発明の多様化活性化因子は、ニワトリＢ細胞の免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座由来であり、そして配列番号第１番の配列を有する核酸、当該核酸の断片、または配列番号第１番もしくはその断片に相同的な核酸を含み、それによって当該断片および当該ホモログはＤＩＶＡＣ機能を保持する。
【００１１】
よって、本発明は、本発明の多様化活性化因子を含む遺伝的構築物を、レシピエント細胞へ導入して、組換えレシピエント細胞を産生することを含む、標的核酸の多様化の方法を提供し、ここで当該多様化活性化因子は、その標的核酸に連結している。
【００１２】
標的核酸を導入遺伝子として外部からレシピエント細胞へ供給し得、または、標的核酸はレシピエント細胞ゲノムの一部であり得る。それぞれの場合において、標的核酸はＤＩＶＡＣに連結していることが確保され、すなわちＤＩＶＡＣは、標的核酸の多様化を活性化および指示する。
【００１３】
本発明はさらに、（ａ）レシピエント細胞に、１回以上、多様化活性化因子、および任意で標的核酸を含む１つ以上の遺伝的構築物をトランスフェクトまたは感染させて組換えレシピエント細胞を得る工程、（ｂ）当該多様化活性化因子が当該標的核酸に連結している、組換えレシピエント細胞を同定する工程、（ｃ）標的核酸の発現および多様化に適当な条件下で、（ｂ）由来の細胞を増殖および増加させる工程、ならびに（ｄ）（ｃ）由来の細胞集団内で、望ましい活性を有する変異標的核酸を含む個々の細胞または細胞集団を選択する工程を含む、望ましい活性を有する標的核酸を産生する方法を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、単独で、または標的遺伝子に連結してのいずれかで、本発明の１つ以上の多様化活性化因子を含む組換え核酸構築物を提供する。
【００１５】
免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座とは異なる位置で、細胞染色体に組み込まれた、本発明の多様化活性化因子を含む組換え細胞がさらに提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】図１は、再編成されたＩｇＬ遺伝子座から様々な距離にあるＧＦＰ２レポーターの高頻度変異を示す。（Ａ）再編成されたＩｇＬ遺伝子座、ＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、およびＧＦＰ２レポーターの標的化挿入後のＩｇＬ遺伝子座の物理地図。（Ｂ）第１５染色体におけるＩｇＬ遺伝子座と比較したＧＦＰ２挿入の位置。参照ポイントは、ＩｇＬＧＦＰ２トランスフェクタントにおけるＧＦＰ２の挿入部位である。（Ｃ）標的化されたトランスフェクト構築物が組み込まれた一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｄ）サブクローンの変動分析。各点は、単一のサブクローンの分析を表し、そして同じ一次トランスフェクタント由来の全てのサブクローンの中央値を、線で示す。（Ｅ）第１５染色体への、ＩｇＬ遺伝子座から様々な距離における、ＧＦＰ２を含む構築物の標的化組み込み［２２］。（Ｆ）Ａ−ＭＹＢ、ＲＡＤ５２、ＢＡＣＨ２およびＢｃ１６遺伝子座における、ＧＦＰ２を含む構築物の標的化組み込み。
【図１−２】図１は、再編成されたＩｇＬ遺伝子座から様々な距離にあるＧＦＰ２レポーターの高頻度変異を示す。（Ａ）再編成されたＩｇＬ遺伝子座、ＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、およびＧＦＰ２レポーターの標的化挿入後のＩｇＬ遺伝子座の物理地図。（Ｂ）第１５染色体におけるＩｇＬ遺伝子座と比較したＧＦＰ２挿入の位置。参照ポイントは、ＩｇＬＧＦＰ２トランスフェクタントにおけるＧＦＰ２の挿入部位である。（Ｃ）標的化されたトランスフェクト構築物が組み込まれた一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｄ）サブクローンの変動分析。各点は、単一のサブクローンの分析を表し、そして同じ一次トランスフェクタント由来の全てのサブクローンの中央値を、線で示す。（Ｅ）第１５染色体への、ＩｇＬ遺伝子座から様々な距離における、ＧＦＰ２を含む構築物の標的化組み込み［２２］。（Ｆ）Ａ−ＭＹＢ、ＲＡＤ５２、ＢＡＣＨ２およびＢｃ１６遺伝子座における、ＧＦＰ２を含む構築物の標的化組み込み。
【図１−３】図１は、再編成されたＩｇＬ遺伝子座から様々な距離にあるＧＦＰ２レポーターの高頻度変異を示す。（Ａ）再編成されたＩｇＬ遺伝子座、ＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、およびＧＦＰ２レポーターの標的化挿入後のＩｇＬ遺伝子座の物理地図。（Ｂ）第１５染色体におけるＩｇＬ遺伝子座と比較したＧＦＰ２挿入の位置。参照ポイントは、ＩｇＬＧＦＰ２トランスフェクタントにおけるＧＦＰ２の挿入部位である。（Ｃ）標的化されたトランスフェクト構築物が組み込まれた一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｄ）サブクローンの変動分析。各点は、単一のサブクローンの分析を表し、そして同じ一次トランスフェクタント由来の全てのサブクローンの中央値を、線で示す。（Ｅ）第１５染色体への、ＩｇＬ遺伝子座から様々な距離における、ＧＦＰ２を含む構築物の標的化組み込み［２２］。（Ｆ）Ａ−ＭＹＢ、ＲＡＤ５２、ＢＡＣＨ２およびＢｃ１６遺伝子座における、ＧＦＰ２を含む構築物の標的化組み込み。
【図１−４】図１は、再編成されたＩｇＬ遺伝子座から様々な距離にあるＧＦＰ２レポーターの高頻度変異を示す。（Ａ）再編成されたＩｇＬ遺伝子座、ＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、およびＧＦＰ２レポーターの標的化挿入後のＩｇＬ遺伝子座の物理地図。（Ｂ）第１５染色体におけるＩｇＬ遺伝子座と比較したＧＦＰ２挿入の位置。参照ポイントは、ＩｇＬＧＦＰ２トランスフェクタントにおけるＧＦＰ２の挿入部位である。（Ｃ）標的化されたトランスフェクト構築物が組み込まれた一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｄ）サブクローンの変動分析。各点は、単一のサブクローンの分析を表し、そして同じ一次トランスフェクタント由来の全てのサブクローンの中央値を、線で示す。（Ｅ）第１５染色体への、ＩｇＬ遺伝子座から様々な距離における、ＧＦＰ２を含む構築物の標的化組み込み［２２］。（Ｆ）Ａ−ＭＹＢ、ＲＡＤ５２、ＢＡＣＨ２およびＢｃ１６遺伝子座における、ＧＦＰ２を含む構築物の標的化組み込み。
【図２−１】図２は、再編成されたＩｇＬ遺伝子座の欠失および再構築後のＧＦＰ２高頻度変異を示す。（Ａ）ＧＦＰ２標的化構築物を用いた、再編成ＩｇＬ遺伝子座における欠失および挿入のデザイン。（上の部分）ψＶ遺伝子座の欠失後の再編成ＩｇＬ遺伝子座、ＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、および標的化組み込み後の遺伝子座の物理地図。（中央の部分）欠失した再編成ＩｇＬ遺伝子座、ＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、および標的化組み込み後のＧＦＰ２挿入部位の物理地図。（下の部分）欠失した再編成ＩｇＬ遺伝子座、「Ｗ」断片と共にＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、および再構成されたＩｇＬ遺伝子座におけるＧＦＰ２挿入部位の物理地図。（Ｂ）一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）サブクローンの変動分析。（Ｄ）ＧＦＰ２のＧＦＰオープンリーディングフレーム内の、特定のヌクレオチド置換の頻度。
【図２−２】図２は、再編成されたＩｇＬ遺伝子座の欠失および再構築後のＧＦＰ２高頻度変異を示す。（Ａ）ＧＦＰ２標的化構築物を用いた、再編成ＩｇＬ遺伝子座における欠失および挿入のデザイン。（上の部分）ψＶ遺伝子座の欠失後の再編成ＩｇＬ遺伝子座、ＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、および標的化組み込み後の遺伝子座の物理地図。（中央の部分）欠失した再編成ＩｇＬ遺伝子座、ＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、および標的化組み込み後のＧＦＰ２挿入部位の物理地図。（下の部分）欠失した再編成ＩｇＬ遺伝子座、「Ｗ」断片と共にＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、および再構成されたＩｇＬ遺伝子座におけるＧＦＰ２挿入部位の物理地図。（Ｂ）一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）サブクローンの変動分析。（Ｄ）ＧＦＰ２のＧＦＰオープンリーディングフレーム内の、特定のヌクレオチド置換の頻度。
【図２−３】図２は、再編成されたＩｇＬ遺伝子座の欠失および再構築後のＧＦＰ２高頻度変異を示す。（Ａ）ＧＦＰ２標的化構築物を用いた、再編成ＩｇＬ遺伝子座における欠失および挿入のデザイン。（上の部分）ψＶ遺伝子座の欠失後の再編成ＩｇＬ遺伝子座、ＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、および標的化組み込み後の遺伝子座の物理地図。（中央の部分）欠失した再編成ＩｇＬ遺伝子座、ＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、および標的化組み込み後のＧＦＰ２挿入部位の物理地図。（下の部分）欠失した再編成ＩｇＬ遺伝子座、「Ｗ」断片と共にＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、および再構成されたＩｇＬ遺伝子座におけるＧＦＰ２挿入部位の物理地図。（Ｂ）一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）サブクローンの変動分析。（Ｄ）ＧＦＰ２のＧＦＰオープンリーディングフレーム内の、特定のヌクレオチド置換の頻度。
【図３−１】図３は、「Ｗ」断片欠失シリーズの分析である。（Ａ）欠失したＩｇＬ遺伝子座および「Ｗ」断片の一部と共にＧＦＰ２レポーターの挿入を引き起こす、整列した標的化構築物の物理地図。（Ｂ）代表的な一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）サブクローンの変動分析。再構成された断片の文字のみを示し、そしてトランスフェクタントの完全な名前は示さない。
【図３−２】図３は、「Ｗ」断片欠失シリーズの分析である。（Ａ）欠失したＩｇＬ遺伝子座および「Ｗ」断片の一部と共にＧＦＰ２レポーターの挿入を引き起こす、整列した標的化構築物の物理地図。（Ｂ）代表的な一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）サブクローンの変動分析。再構成された断片の文字のみを示し、そしてトランスフェクタントの完全な名前は示さない。
【図３−３】図３は、「Ｗ」断片欠失シリーズの分析である。（Ａ）欠失したＩｇＬ遺伝子座および「Ｗ」断片の一部と共にＧＦＰ２レポーターの挿入を引き起こす、整列した標的化構築物の物理地図。（Ｂ）代表的な一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）サブクローンの変動分析。再構成された断片の文字のみを示し、そしてトランスフェクタントの完全な名前は示さない。
【図４−１】図４は、非Ｉｇ遺伝子座へのＧＦＰ２レポーターの挿入を示す。（Ａ）ＧＦＰ２挿入の染色体位置。（Ｂ）一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）サブクローンの変動分析。
【図４−２】図４は、非Ｉｇ遺伝子座へのＧＦＰ２レポーターの挿入を示す。（Ａ）ＧＦＰ２挿入の染色体位置。（Ｂ）一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）サブクローンの変動分析。
【図４−３】図４は、非Ｉｇ遺伝子座へのＧＦＰ２レポーターの挿入を示す。（Ａ）ＧＦＰ２挿入の染色体位置。（Ｂ）一次トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）サブクローンの変動分析。
【図５−１】図５は、「Ｗ」断片の存在下における非Ｉｇ遺伝子座におけるＧＦＰ２レポーターの高頻度変異を示す。（Ａ）非Ｉｇ遺伝子座、「Ｗ」断片と共にＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、およびＧＦＰ２レポーターの標的化挿入後の遺伝子座の物理地図。（Ｂ）一次ＡＩＤ陽性トランスフェクタントおよび一次ＡＩＤ陰性トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）サブクローンの変動分析。
【図５−２】図５は、「Ｗ」断片の存在下における非Ｉｇ遺伝子座におけるＧＦＰ２レポーターの高頻度変異を示す。（Ａ）非Ｉｇ遺伝子座、「Ｗ」断片と共にＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、およびＧＦＰ２レポーターの標的化挿入後の遺伝子座の物理地図。（Ｂ）一次ＡＩＤ陽性トランスフェクタントおよび一次ＡＩＤ陰性トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）サブクローンの変動分析。
【図５−３】図５は、「Ｗ」断片の存在下における非Ｉｇ遺伝子座におけるＧＦＰ２レポーターの高頻度変異を示す。（Ａ）非Ｉｇ遺伝子座、「Ｗ」断片と共にＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、およびＧＦＰ２レポーターの標的化挿入後の遺伝子座の物理地図。（Ｂ）一次ＡＩＤ陽性トランスフェクタントおよび一次ＡＩＤ陰性トランスフェクタントのＦＡＣＳ分析。（Ｃ）サブクローンの変動分析。
【図６】図６は、１ｋｂずつ徐々に増加する欠失シリーズの「Ｓ」（または「０−４」）断片の分析である。その欠失シリーズは、配列の５’末端および３’末端から始まる、１ｋｂずつ徐々に増加する欠失から成る。（Ａ）欠失したＩｇＬ遺伝子座および「Ｓ」断片の一部と共にＧＦＰ２レポーターの挿入を引き起こす、整列した標的化構築物の物理地図。（Ｂ）サブクローンの変動分析。
【図７】図７は、「０−４」断片２００ｂｐ欠失シリーズの分析である。その欠失シリーズは、配列の５’末端から始まる連続的な２００ｂｐの欠失から成る。（Ａ）推定エンハンサー部位と比較した、２００ｂｐの欠失の位置を示す、「０−４」断片の物理地図。（Ｂ）サブクローンの変動分析。
【図８】図８は、「２−３」断片５０ｂｐ欠失シリーズの分析である。その欠失シリーズは、配列の５’末端から始まる連続的な５０ｂｐの欠失から成る。（Ａ）推定エンハンサー部位と比較した、５０ｂｐの欠失の位置を示す、「２−３」断片の物理地図。（Ｂ）サブクローンの変動分析。
【図９】図９は、「２−３」断片の５０ｂｐずつ徐々に増加する５’欠失シリーズの分析である。その欠失シリーズは、配列の５’末端から始まる、５０ｂｐずつ徐々に増加する欠失から成る。（Ａ）推定エンハンサー部位と比較した、徐々に増加する５０ｂｐの欠失の位置を示す、「２−３」断片の物理地図。（Ｂ）サブクローンの変動分析。
【図１０】図１０は、「２−３」断片の５０ｂｐずつ徐々に増加する３’欠失シリーズの分析である。その欠失シリーズは、配列の３’末端から始まる、５０ｂｐずつ徐々に増加する欠失から成る。（Ａ）推定エンハンサー部位と比較した、徐々に増加する５０ｂｐの欠失の位置を示す、「２−３」断片の物理地図。（Ｂ）サブクローンの変動分析。
【図１１】図１１は、「２．２−２．４」断片の再構成および多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）である。（Ａ）多様化活性化因子として使用される、「２．２−２．４」単量体および多量体を示す物理地図。（Ｂ）サブクローンの変動分析。
【図１２】図１２は、ＢＡＣＨ２遺伝子座における「２．２−２．４」断片の挿入を示す。（ａ）ＢＡＣＨ２遺伝子座、「２．２−２．４」断片と共にＧＦＰ２レポーターを含む標的化構築物、およびＧＦＰ２レポーターの標的化挿入後の遺伝子座の物理地図。ＧＦＰを矢印で示し、そして「２．２−２．４」断片を灰色の四角で記す。（ｂ）サブクローンの変動分析。再構成断片の文字および位置のみを示し、そしてトランスフェクタントの完全な名前は示さない。各クローンに関するＧＦＰ減少の中央値を、線の上に示す。
【図１３】図１３は、七面鳥およびアヒルにおける「２．２−２．４」ホモログの分析である。（Ａ）ニワトリにおける「２．２−２．４」断片、ならびに七面鳥およびアヒルにおけるその相同的対応物の物理地図。白い部分は、種間で保存された配列を示す。黒い線は、種間の配列の差異を示す。灰色の線は、アヒルおよび七面鳥で保存されているが、ニワトリとは異なる配列である。（Ｂ）１つの一次クローンのサブクローン（ｎ＝２４）の変動分析。各クローンの減少した緑色蛍光の中央値を線の上に書く。
【図１４】図１４は、９．８ｋｂ（「Ｗ」）断片と比較した結合モチーフの位置を示す。Ｅ２Ａ転写因子、ＮＦ−κＢ因子およびＩＳＲＥの結合モチーフを示す。モチーフにはその名前およびその正確なヌクレオチド位置の注釈をつける。「Ｗ」内の重要な欠失断片の位置を、「０−４」（緑色の四角）、「２−３」（赤色の四角）、「２．２−２．４」（橙色の四角）、「３−４」（淡青色の四角）、および「Ｎ」（濃青色の四角）と記載する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、生きた細胞内における標的核酸の遺伝的多様化のための改善された方法を利用可能にする。この方法は、調節性核酸分子、シス作用性多様化活性化因子（ＤＩＶＡＣ）の発見に基づき、それは自身に連結した核酸の遺伝的多様化の活性化に必須かつ十分である。
【００１８】
本発明の目的のために、以下の定義を適用する。
【００１９】
「遺伝的多様化」は、標的核酸における個々のヌクレオチドまたはヌクレオチドの範囲の変化である。本発明による遺伝的多様化は、好ましくは高頻度変異によって起こる。本発明の方法において、標的核酸の相同的ドナーが提供される場合、遺伝的多様化は、遺伝子変換または高頻度変異および遺伝子変換の組み合わせによって起こり得る。
【００２０】
「高頻度変異」は、主に単一のヌクレオチドの置換によって、標的核酸を多様化する。好ましくは、高頻度変異は、１世代あたり１０−５ｂｐ−１と１０−３ｂｐ−１との間の変異率を指し、それは同じ細胞内の非高頻度変異遺伝子のバックグラウンド変異率より少なくとも１００倍高い。
【００２１】
「遺伝子変換」は、配列情報が、一方向性の様式で、相同的遺伝子変換ドナーから遺伝子変換標的配列へ移動する現象である。遺伝子変換は、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型を切り換えて、そして相同的配列から複製することの結果、またはヘテロ二本鎖の形成後のミスマッチ修復（ヌクレオチドが１本の鎖から除去され、そして他の鎖を用いた修復合成によって置換される）の結果であり得る。天然の遺伝子変換の例は、ある種における、付近の偽Ｖ遺伝子変換ドナーによる再編成ＶＪ  ＩｇＬセグメントの多様化である。
【００２２】
多くの脊椎動物において、高頻度変異および遺伝子変換は、Ｂ細胞の免疫グロブリンＶ（Ｄ）Ｊセグメント内に多様性を生じる。高頻度変異は、抗原刺激後に、マウスおよびヒトのような種の胚中心において起こる。遺伝子変換は、抗原刺激とは独立に、ニワトリ、ウシ、ウサギ、ヒツジ、およびブタのような種において、主にファブリキウス嚢または消化管関連リンパ系組織のような一次リンパ系器官において起こる。
【００２３】
「多様化活性化因子」は、標的核酸としてふるまう近傍の転写ユニットの遺伝的多様化を活性化する、シス作用性調節性配列である。
【００２４】
「標的核酸」は、遺伝的多様化を受ける核酸分子である。標的核酸は、好ましくは導入遺伝子であり、そして遺伝子産物をコードする１つ以上の転写ユニットを含み得る。その標的核酸はまた、非コード転写ユニットまたは内因性遺伝子であり得、その多様化は多様化活性化因子が近くに挿入されることによって活性化される。ＤＩＶＡＣ関連多様化の結果として変化した標的核酸はまた、変異核酸と呼ばれる。
【００２５】
「導入遺伝子」は、トランスフェクション、形質導入、または感染などによって、レシピエント細胞へ挿入された外来性核酸分子である。例えば、導入遺伝子は、異種の転写ユニットを含み得、それはゲノムへ無作為に、または標的化組み込みによって規定された位置に挿入され得る。本発明の目的のために、その導入遺伝子は、好ましくは多様化活性化因子の隣に位置し、それによって標的核酸となる。
【００２６】
「標的化組み込み」は、内因性遺伝子座への、相同的組換えによる、トランスフェクトされた核酸構築物（これは、内因性核酸配列に相同的な核酸配列を含む）の組み込みである。標的化組み込みは、規定された染色体位置に、あらゆる核酸を直接挿入することを可能にする。
【００２７】
「組換えレシピエント細胞」は、標的核酸の遺伝的多様化のために操作された細胞を指す。好ましくは、そのレシピエント細胞はＡＩＤを発現し、そして多様化活性化因子に連結した導入遺伝子のレシピエントである。
【００２８】
「選択」は、標的核酸によってコードされる遺伝子産物の望ましい活性または標的核酸の調節性機能の望ましい活性を引き起こす、標的核酸における配列変化の存在を決定することを指す。
【００２９】
（標的核酸の多様化の方法）
１つの局面において、多様化活性化因子を含む遺伝的構築物を、レシピエント細胞へ導入して、組換えレシピエント細胞を産生することを含む、標的核酸の多様化の方法を提供し、
ここで当該多様化活性化因子は、標的核酸に連結しており、
ここで当該多様化活性化因子は、配列番号第１番の配列を有する核酸、当該核酸の断片、および当該核酸または当該断片に相同的な核酸から成るグループから選択され、ならびに、
ここで当該多様化活性化因子は、自身に連結した核酸において遺伝的多様化を活性化する機能を有する。
【００３０】
１つの実施態様において、その多様化は、体細胞高頻度変異の過程によって起こる。好ましい体細胞高頻度変異の率は、世代あたり１０−５ｂｐ−１と１０−３ｂｐ−１との間である。
【００３１】
別の実施態様において、その標的核酸は、標的核酸の遺伝子変換ドナーとして作用し得る少なくとも１つの核酸にさらに連結しており、そしてその多様化は、体細胞高頻度変異および遺伝子変換の両方を含む過程によって起こる。
【００３２】
（多様化活性化因子）
本発明の多様化活性化因子（ＤＩＶＡＣ）は、ニワトリＢ細胞の免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座由来である。１つの実施態様において、ＤＩＶＡＣは、ＩｇＬ転写開始部位から炭酸脱水酵素遺伝子の３’末端まで伸びる、再編成ＩｇＬ遺伝子座の９．８ｋｂの断片（「Ｗ」断片とも呼ばれる）である。その９．８ｋｂの断片は、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ染色体ｃｈｒ１５：８１６５０７０−８１７６６９９に位置する。
【００３３】
ニワトリＢ細胞株ＤＴ４０から単離された９．８ｋｂの断片は、配列番号第１番のヌクレオチド配列を有する。別の実施態様において、本発明のＤＩＶＡＣは、自身に連結した核酸の多様化を活性化するＤＩＶＡＣ機能を保持する、９．８ｋｂ断片の断片である。ＤＩＶＡＣ断片は、５０ヌクレオチド程度の短さであり得、および５０００ヌクレオチド程度の長さであり得る。例えば、ＤＩＶＡＣの長さは、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチド、少なくとも１０００ヌクレオチド、少なくとも１２５０ヌクレオチド、少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１７５０ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２５０ヌクレオチド、少なくとも２５００ヌクレオチド、少なくとも２７５０ヌクレオチド、少なくとも３０００ヌクレオチド、少なくとも３２５０ヌクレオチド、少なくとも３５００ヌクレオチド、少なくとも３７５０ヌクレオチド、少なくとも４０００ヌクレオチド、少なくとも４２５０ヌクレオチド、少なくとも４５００ヌクレオチド、少なくとも４７５０ヌクレオチド、少なくとも５０００ヌクレオチド、少なくとも５２５０ヌクレオチド、少なくとも５５００ヌクレオチド、少なくとも５７５０ヌクレオチド、少なくとも６０００ヌクレオチド、少なくとも６２５０ヌクレオチド、少なくとも６５００ヌクレオチド、または少なくとも６７５０ヌクレオチドであり得る。ＤＩＶＡＣの長さは、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５２５０、５５００、６０００、６２５０、６５００、６７５０、または７０００ヌクレオチドであり得る。
【００３４】
特定のＤＩＶＡＣ断片を、個々の断片のＰＣＲ増幅のために使用し得る、表２に列挙したオリゴヌクレオチドに基づいて規定し得る。ＤＩＶＡＣ断片をまた、９．８ｋｂ断片（配列番号第１番）内のヌクレオチド位置に基づいて規定し得る。
【００３５】
従って、ＤＩＶＡＣは、配列番号第１番の位置１−７０９９、１−７７９９、２１８４−９７８４、３０９８−９７８４、４１０２−９７８４、５１１４−９７８４、６１０７−９７８４、または３０９８−７０９９の間のヌクレオチド配列を有し得る。これらの配列は、図３Ａにおいて、それぞれＦ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＮおよびＳと命名された断片に対応する。ＤＩＶＡＣは、配列番号第１番の位置１０００−３０００、２８２５−６０８２、２０００−３０００、２０００−４０００、４０００−９７８４、４０００−７０００、４０００−６０００、５０００−９７８４、５０００−８０００、５０００−７０００、６０００−９７８４、６０００−８０００、８０００−９７８４、８５００−９７８４の間のヌクレオチド配列を有する、５ｋｂと１ｋｂとの間の長さの断片であり得る。ＤＩＶＡＣは、位置２８２５−３６２５、５０００−６０００、６０００−７０００、９０００−９７８４、５１１４−６１０６（「２−３」）、６１０７−７０９９（「３−４」）、９５０９−９８０２（「９．６−９．８」）、または５２８８−５４８５（「２．２−２．４」）の間のヌクレオチド配列を有する、１ｋｂと２００ｂｐとの間の長さのより短い断片であり得る。ＤＩＶＡＣが、配列番号第１番の位置６１０７−９７８４（「Ｎ」）、３０９８−７０９９（「Ｓ」）、５２８８−５４８５（「２．２−２．４」）、または９５０９−９８０２（「９．６−９．８」）の間の断片を含むか、またはそれから成ることが好ましい。ＤＩＶＡＣが、９．８ｋｂ（配列番号第１番）スケール上で約５０００と６０００との間の位置に位置する、Ｉｇエンハンサーを含むことも好ましい。
【００３６】
ＤＩＶＡＣはまた、ニワトリＩｇ重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座由来かまたは他の鳥類もしくは哺乳類種の免疫グロブリン遺伝子座由来の、配列番号第１番の機能性ホモログかまたはその断片であり得る。ＤＩＶＡＣホモログは、ニワトリＩｇ遺伝子座と同様に組織化された免疫グロブリン遺伝子座を有する生物由来であることが好ましい。従って、ＤＩＶＡＣは、様々なトリ由来の、配列番号第１番に対応する配列、またはその断片であり得る。例えば、ＤＩＶＡＣは、七面鳥ＩｇＬ由来であり得、そして配列番号第１１７番（９．８ｋｂ断片のホモログ）、または配列番号第１１５番（「２．２−２．４」断片のホモログ）の配列を有し得る。あるいは、ＤＩＶＡＣは、アヒルＩｇＬ由来であり得、そして配列番号第１１８番（９．８ｋｂ断片のホモログ）、または配列番号第１１６または１１９番（「２．２−２．４」断片のホモログ）の配列を有し得る。ＤＩＶＡＣが、他の生物において配列番号第１番に対応する、位置６１０７−９７８４（「Ｎ」）、３０９８−７０９９（「Ｓ」）、５２８８−５４８５（「２．２−２．４」）、または９５０９−９８０２（「９．６−９．８」）の間の配列を有することが好ましい。
【００３７】
ＤＩＶＡＣはまた、遺伝子変換によってその免疫グロブリン遺伝子を多様化することが公知である、ブタ、ヒツジ、ウシ、またはウサギのような生物のＩｇ遺伝子座由来であり得る。しかし、ＤＩＶＡＣはまた、高頻度変異によってその免疫グロブリン遺伝子を多様化する、マウスまたはヒトのような他の哺乳類由来の、配列番号第１番の機能的ホモログまたはその断片であり得る。
【００３８】
本発明によって、連結した標的核酸の多様化を活性化するＤＩＶＡＣ機能は、ＤＩＶＡＣ非存在下のものと比較して、ＤＩＶＡＣ存在下における標的核酸の多様化率の少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、または１００倍の増加によって定義される。
【００３９】
ＤＩＶＡＣ機能的ホモログをさらに、上記で定義したような９．８ｋｂ断片（配列番号第１番）またはその断片に対する構造的相同性によって特徴付け得、そのホモログは、自身に連結した核酸の多様化を活性化するＤＩＶＡＣ機能を保持する。例えば、本発明のＤＩＶＡＣは、配列番号第１番またはその断片と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を共有する。例えば、アヒル「２．２−２．４」断片とニワトリ「２．２−２．４」断片との間の配列相同性は、約８５％である。
【００４０】
多様化の率を増加させるために、本発明のＤＩＶＡＣを組み合わせ得る。この目的のために、１つより多くのＤＩＶＡＣのコピーを、タンデムリピートの形式でレシピエント細胞へ提供し得る。そのような配列が、相加効果を示すことが好ましい。例えば、リピートは「２．２−２．４」断片（配列番号第１１４、１１５、１１６、または１１９番）の２つ以上のコピーを含み得る。あるいは、異なるＤＩＶＡＣ配列を組み合わせ得る。そのような配列が、累積的効果を示すことが好ましい。例えば、「Ｓ」と「Ｎ」とを、「２．２−２．４」と「３−４」とを、「３−４」と位置８０００−９０００の間の断片とを、「２．２−２．４」と位置８０００−９０００の間の断片とを、「２．２−２．４」と「９．６−９．８」とを；「３−４」と位置８０００−９０００の間の断片と「９．６−９．８」とを、位置２８２５−３６２５の間の断片と「０−４」とを、または位置２８２５−３６２６の間の断片と「０−４」とを、多様化活性を増加させるために組み合わせ得る。
【００４１】
（標的核酸）
本発明の標的核酸は、多様化が望まれる任意の核酸である。本発明の方法において、その標的核酸は、好ましくは転写される。１つの実施態様において、その標的核酸はタンパク質をコードする。例えば、標的核酸は、免疫グロブリン鎖、選択マーカー、ＤＮＡ結合タンパク質、酵素、受容体タンパク質、またはその一部をコードする。その標的核酸はヒト免疫グロブリン遺伝子であることが好ましい。従って本発明の方法は、抗原に対する高い特異性および／または高い親和性のような、特定の結合活性を有する免疫グロブリンをコードする免疫グロブリン遺伝子を産生することを可能にする。その標的核酸が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のような、蛍光タンパク質であることも好ましい。この実施態様において、本発明の方法は、新しく、かつ、異なる吸収／発光波長を有する蛍光タンパク質の産生を可能にする。
【００４２】
別の実施態様において、その標的核酸は、調節性の活性を有する。例えば、その標的核酸は、プロモーターまたはエンハンサーのような転写調節性エレメントであり得、またはＲＮＡ干渉による特異的遺伝子抑制において使用するための干渉ＲＮＡ分子をコードし得る。この実施態様において、関心のある標的核酸を有する組換えレシピエント細胞を同定するために、標的核酸によって影響されるレポーターが必要である。
【００４３】
１つの実施態様において、その標的核酸は、外来性の核酸である。外来性の核酸を、同じ遺伝的構築物において、または代替的に、異なる遺伝的構築物において、ＤＩＶＡＣと共にレシピエント細胞へ提供し得る。この実施態様において、その遺伝的構築物は、好ましくは導入遺伝子および／またはＤＩＶＡＣを含む細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。その選択可能なマーカー遺伝子を、続いて例えばｃｒｅ−リコンビナーゼシステムを用いて組換えによって除去し得るか、または他の手段によって不活性化し得る。その標的核酸およびＤＩＶＡＣが、細胞染色体に安定に組み込まれることが好ましい。あるいは、その標的核酸およびＤＩＶＡＣは、例えばＥＢＶ由来ベクターのような自己複製ウイルスベクターにおいて、レシピエント細胞の染色体外に留まり得る。
【００４４】
別の実施態様において、その標的核酸は、先天的に細胞染色体の一部、すなわち内因性核酸である。内因性核酸は、免疫グロブリン遺伝子またはその一部ではないことが好ましい。この実施態様において、ＤＩＶＡＣのみが細胞へ提供され、そしてＤＩＶＡＣが標的核酸の近傍において細胞染色体へ組み込まれることを確実にする。
【００４５】
本発明によって、その標的核酸はＤＩＶＡＣに連結する。これは、ＤＩＶＡＣが標的核酸の多様化を活性化および指示することを確実にするようなお互いに対する位置で、上記２つの核酸が同じ染色体上にあることを意味する。一般的にＤＩＶＡＣの多様化活性は、多様化される核酸までの距離の増加に伴って減少することが理解される。従って、ＤＩＶＡＣと標的核酸との間の距離は、１５０ｋｂ以下、好ましくは１２５ｋｂ以下、好ましくは１２０ｋｂ未満、１００ｋｂ未満、７０ｋｂ未満、５０ｋｂ未満、３０ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、５ｋｂ未満、または３ｋｂ未満であることが好ましい。
【００４６】
本発明によって、その標的核酸および／またはＤＩＶＡＣは、規定された位置か、または無作為な位置においてレシピエント細胞の染色体へ組み込まれ得る。１つの実施態様において、外来性標的核酸およびＤＩＶＡＣを含む遺伝的構築物が、無作為な位置において細胞染色体へ組み込まれる。
【００４７】
別の実施態様において、外来性標的核酸、すなわち導入遺伝子を含む１番目の遺伝的構築物が、規定された染色体位置に組み込まれ、そしてＤＩＶＡＣを含む２番目の遺伝的構築物が、ＤＩＶＡＣが導入遺伝子の多様化を活性化および指示することを確実にする染色体位置において組み込まれる。ＤＩＶＡＣが導入遺伝子の近傍へ、好ましくはそこから１５０ｋｂまたは１２５ｋｂまたは１００ｋｂより近いところへ、好ましくは１２０ｋｂ未満、１００ｋｂ未満、７０ｋｂ未満、５０ｋｂ未満、３０ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、５ｋｂ未満、または３ｋｂ未満のところへ組み込まれることが好ましい。
【００４８】
さらなる実施態様において、その標的核酸は、内因性であり、そしてＤＩＶＡＣを含む構築物が、ＤＩＶＡＣが標的核酸の多様化を活性化および指示することを確実にする染色体位置において組み込まれる。ＤＩＶＡＣが、標的核酸の近傍に、好ましくはそこから１５０ｋｂまたは１２５ｋｂまたは１００ｋｂより近くに、好ましくは１２０ｋｂ未満、１００ｋｂ未満、７０ｋｂ未満、５０ｋｂ未満、３０ｋｂ未満、１０ｋｂ未満、５ｋｂ未満、または３ｋｂ未満に組み込まれることが好ましい。
【００４９】
規定された染色体位置における組み込み（標的化組み込み）は、それぞれの遺伝的構築物に、配列が組み込み部位の核酸配列と同一または相同的である核酸断片を含めることによって達成される。標的化組み込みによって、細胞が遺伝的構築物を組み込む能力は、細胞の固有の性質である。異なる種および起源の細胞は、様々な程度でこの性質を有する。例えば、マウス細胞において標的化組み込みはまれな出来事である。対照的に、ＡＬＶ形質導入ニワトリＢ細胞株ＤＴ４０は、好ましくは、規定された染色体位置における標的化組み込みによって、遺伝的構築物を組み込む。
【００５０】
（レシピエント細胞）
本発明のレシピエント細胞は、活性化誘導性デアミナーゼ（ＡＩＤ）またはその機能的等価物を発現する真核細胞である。レシピエント細胞は、脊椎動物種由来のＢリンパ球、特に鳥類または哺乳類Ｂ細胞であることが好ましい。例えば、それはニワトリ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、マウス、またはラット由来のＢ細胞である。レシピエント細胞がニワトリＢリンパ球またはそれ由来であること、特にＡＬＶ形質導入ニワトリＢ細胞株ＤＴ４０またはその誘導体であることがさらに好ましい。
【００５１】
本発明の組換えレシピエント細胞は、トランスジェニック（すなわち外来性）核酸としての本発明の多様化活性化因子、および標的核酸を含むレシピエント細胞である。
【００５２】
１つの実施態様において、その組換えレシピエント細胞は、標的核酸の変異体（これは、望ましい活性を有する）を含む細胞の選択を促進する様式で、標的核酸を発現する。その選択は、細胞表面または細胞の外側での、細胞内の標的核酸によってコードされる活性かまたはそうでなければ細胞内の標的核酸によって決定される活性についての、直接的選択であり得る。あるいは、その選択は、レポーター核酸によってコードされる活性かまたはそうでなければレポーターによって決定される活性に関する間接的選択である。
【００５３】
（トランス作用性調節因子）
本発明によって、標的核酸の多様化を、トランス作用性調節因子によって調節し得る。例えば、そのトランス作用性調節因子は、ＤＮＡ修復または組換え因子、ＤＮＡポリメラーゼ、転写因子、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、染色体組織化に関与する因子であり得る。その多様化過程はまた、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）のような、トランス作用性調節因子によって開始および終了し得る。例えば、ＡＩＤは条件的に発現され得、そして一旦望ましい性質を有する標的核酸が得られたら、その発現はスイッチオフされ得る。これは、最適な性質の喪失を引き起こし得る、さらなる変異を防ぐ。同様に、他の調節因子を、レシピエント細胞へ加え得、またはそこで発現させ得る。
【００５４】
トランス作用性因子は、ＤＩＶＡＣのようなシス調節性多様化活性化配列内のそれぞれのモチーフに結合し得、または標的遺伝子の周囲に形成される多様化複合体内の他のタンパク質に結合することによって上記モチーフに結合し得る。例えば、本発明のＤＩＶＡＣは、Ｅ−Ｂｏｘ、ＮＦ−κＢおよびＩＳＲＥモチーフを含む。あるいは、トランス調節性因子は、自身に融合した係留分子（これは、関心のある遺伝子の近傍にまたは関心のある遺伝子座内に組み込まれたそれぞれの結合モチーフに結合する）によって関心のある遺伝子または遺伝子座へ標的化し得る。
【００５５】
（望ましい活性を有する核酸およびタンパク質を調製する方法）
別の局面において、本発明は、以下の工程を含む、望ましい活性を有する標的核酸を調製する方法を提供する：
（ａ）レシピエント細胞に、本発明の多様化活性化因子および任意で標的核酸を含む１つ以上の核酸構築物を導入して、組換えレシピエント細胞を得る工程、
（ｂ）当該多様化活性化因子が、当該標的核酸に連結している組換えレシピエント細胞を同定する工程、
（ｃ）（ｂ）由来の細胞を、標的核酸の発現および多様化に適当な条件下で、増殖および増加させる工程、ならびに
（ｄ）（ｃ）由来の細胞の集団内で、望ましい活性を有する変異標的核酸を含む個々の細胞または細胞集団を選択する工程。
【００５６】
１つの実施態様において、本方法の工程（ｃ）および（ｄ）を反復する。
【００５７】
別の実施態様において、その方法は、（ｄ）において選択した細胞由来の変異標的核酸の配列を決定することを含む、さらなる工程（ｅ）を含み得る。
【００５８】
さらなる実施態様において、その方法は、多様化を終了させることを含む工程（ｆ）をさらに含む。例えば、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）のようなトランス作用性調節因子の発現をダウンレギュレートすることによって、または多様化活性化因子の除去によって、多様化をスイッチオフし得る。この目的のために、ｔｅｔのようなスイッチ可能なプロモーターを使用し得る。
【００５９】
工程（ａ）において、本発明の核酸構築物を、レシピエント細胞にトランスフェクトし得る。あるいは、レシピエント細胞は、構築物で形質導入され得るかまたは構築物を感染させられ得る。
【００６０】
工程（ｄ）において、望ましい性質を有する変異体の単離のために、様々な選択手順を適用し得る。例えば、改善した結合特異性または新規の結合特異性を有する免疫グロブリン分子を発現する細胞を、蛍光標示式細胞分取(Fluorescence Activated Cell Sorting（ＦＡＣＳ）)、磁気ビーズを用いた細胞分離、抗原クロマトグラフィー法、または他の公知の細胞分離技術によって選択し得る。
【００６１】
１つの実施態様において、その標的核酸およびＤＩＶＡＣは、同じ核酸構築物上にある。あるいは、その標的核酸およびＤＩＶＡＣは、異なる構築物上にある。この実施態様において、多様化されるべき標的核酸を含む遺伝子座を、１回より多くのトランスフェクションによって構築し得る。さらなる実施態様において、その標的核酸は細胞染色体の一部であり、そして構築物は１つ以上のＤＩＶＡＣを含む。
【００６２】
（組換え核酸構築物）
３番目の局面において、本発明は、本発明の多様化活性化因子を含む組換え核酸構築物を提供する。その構築物は、プラスミド、ウイルス、組み込み型ベクターまたは自己複製ベクターのようなウイルス由来ベクターであり得る。その構築物は、ＤＩＶＡＣまたは異なるＤＩＶＡＣの組み合わせの１つ以上のコピーを含み得る。
【００６３】
（組換え細胞）
４番目の局面において、本発明は、トランスジェニック（外来性）配列として本発明の多様化活性化因子を含む、組換え細胞を提供する。１つの実施態様において、その細胞はＢリンパ球である。Ｂ細胞は、トリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス、またはヒトのような、脊椎動物種由来であり得る。Ｂ細胞はニワトリ由来であることが好ましい。本発明の組換え細胞が、ＤＴ４０細胞株の細胞であることが極めて好ましい。
【００６４】
本発明の範囲から除外されるのは、極めてありそうにない実施態様であり、ここで、多様化活性化因子は細胞の染色体に組み込まれ、そして多様化活性化因子と同一の染色体の一部を置換し、その結果として、できた細胞を天然細胞と区別できない。
【００６５】
本発明を以下の実施例によって説明する。
【実施例】
【００６６】
（実施例）
（実施例１：ＧＦＰ発現に基づく高頻度変異レポーター）
発明者らは以前に、ＤＴ４０中のＧＦＰ導入遺伝子は、再編成ＩｇＬのプロモーターの位置に組み込まれた場合、急速に変異を蓄積することを示した［Ａｒａｋａｗａら、２００８］。その高頻度変異活性は、ＡＩＤの発現に依存し、そして有害なＧＦＰ変異のために減少した緑色蛍光を示す細胞の出現によって可視化し得た。
【００６７】
この現象を利用するために、強力なＲＳＶプロモーターに続くＧＦＰコーディング領域、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ブラストサイジン耐性遺伝子（Ｐ１９９９７）およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルから成る、ＧＦＰ２と名付けた新しい発現カセットをデザインした。ＧＦＰ２を、ＧＦＰ２導入遺伝子の転写および転写後調節とＩｇＬ遺伝子の転写および転写後調節との間の干渉を最小限にするために、ＩｇＬ遺伝子の転写方向とは逆に、標的化構築物ｐＩｇＬＧＦＰ２に組み込んだ（図１Ａ）。
【００６８】
条件的にＡＩＤを発現するクローンＡＩＤＲ２へのｐＩｇＬＧＦＰ２のトランスフェクションは、標的化組み込みがＩｇＬプロモーターをＧＦＰ２導入遺伝子で置換した、ＩｇＬＧＦＰ２という名前の多くのトランスフェクタントを生じた。２つの独立した一次トランスフェクタント由来のサブクローンの蛍光標示式細胞分取（ＦＡＳＣ）分析は、１２．８％および１４．５％減少した緑色蛍光の中央値を明らかにした（図１Ｃおよび１Ｄ）。この結果は、発明者らの以前の研究の結果を確認し、上記以前の研究の結果は、ＧＦＰ２導入遺伝子が、再編成ＩｇＬ遺伝子座内で高い率で変異していること、ならびに、減少した緑色蛍光を有する細胞集団を、この高頻度変異活性を定量するために使用し得ることを示している。
【００６９】
（実施例２：ＩｇＬ遺伝子座の近傍における高頻度変異）
第１５染色体のＩｇＬ遺伝子座から様々な距離においてＧＦＰ２レポーターを挿入するために、標的化組み込みを用いた［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、２００４］（図１Ｂおよび１Ｅ）。一次トランスフェクタントおよびそのサブクローンのＦＡＣＳ分析は、減少した緑色蛍光の中央値が、＋２６ｋｂおよび−１５ｋｂ位置において約３％、＋５２ｋｂ位置において０．５％、および−１３５ｋｂ位置において約０．０５％まで低減したことを明らかにした（図１Ｃおよび１Ｄ）。再編成染色体または非再編成染色体のいずれが標的となったか、ＩｇＬ遺伝子座の外側のＧＦＰ２挿入に関しては決定できなかったが、サブクローンの結果も、多数の独立した一次トランスフェクタントを示していた（表１Ａ）。従って、ＧＦＰ２レポーターの高頻度変異は、ＩｇＬ遺伝子座から５２ｋｂ離れるまでの挿入において検出可能であったが、変異の発生は、距離の増加と共に低減し、そして−１３５ｋｂ位置においてはかろうじて検出可能であった。
【００７０】
周囲の配列は転写後プロセシングおよびＧＦＰ２転写物の翻訳に影響を与えるはずはないので、ＧＦＰ２の転写は、導入遺伝子挿入部位と独立に、細胞の緑色蛍光によって反映される。変異する導入遺伝子に関しても、ＧＦＰ２転写レベルを、おそらく非変異ＧＦＰ配列を発現していた主要な細胞集団の平均緑色蛍光から推定し得る。ＦＡＣＳ分析によって見られるように、主要な細胞集団の平均緑色蛍光は、おそらく染色体位置の効果を反映して、一次トランスフェクタントの間でわずかに異なっていた（図１Ｃ）。しかし、トランスフェクタント＋５２ＩｇＬＧＦＰ２とＩｇＬＧＦＰ２とは、それらの主要な細胞集団の類似した緑色蛍光にも関わらず、それらの蛍光減少の中央値において、２０倍を越えて異なっていた。これは、トランスフェクタント間の高頻度変異の差は、ＩｇＬ遺伝子座までのＧＦＰ２挿入部位の距離を反映し、そしてＧＦＰ２転写の変動ではないことを強く示唆した。
【００７１】
（実施例３：多様化活性化因子の同定）
実施例１および２において観察された効果を、距離依存性の様式で高頻度変異を活性化する、シス作用性配列の存在によって説明し得る。この推定調節配列を、多様化活性化因子（ＤＩＶＡＣ）と命名した。ＤＩＶＡＧのマッピングを、ＧＦＰ２レポーターの挿入とＩｇＬ遺伝子座の欠失とを組み合わせることによって行った。
【００７２】
ψＶ遺伝子座の役割に焦点をあてるために、ＧＦＰ２構築物（図２Ａ、上部）を、クローンψＶ−ＡＩＤＲ１にトランスフェクトし［Ａｒａｋａｗａら、２００８］、ここでψＶ遺伝子座の２０ｋｂ全体を欠失させた。そのトランスフェクタントψＶ−ＩｇＬＧＦＰ２は、ψＶ遺伝子座の非存在下で、ＩｇＬプロモーターの位置においてＧＦＰ２レポーターを発現した（図２Ｂ）。ψＶ−ＩｇＬＧＦＰ２サブクローンのＦＡＣＳ分析は、５．２％および７．５％の緑色蛍光減少の中央値を明らかにし（図２Ｃ）、これは、ψＶ陽性ＩｇＬＧＦＰ２サブクローンの中央値よりわずかに１倍低かった。ＩｇＬＧＦＰ２サブクローンとψＶ−ＩｇＬＧＦＰ２サブクローンとの間の差は、変動効果またはＡＩＤＲ２およびψＶ−ＡＩＤＲ１前駆体における異なるＡＩＤ発現レベルにより得るので、ψＶ遺伝子座は、ＧＦＰ２レポーターの高頻度変異活性に対して、もしあるとしてもわずかな刺激しか発揮しないようである。
【００７３】
ψＶ−ＩｇＬＧＦＰ２は、ＩｇＬ転写開始部位から炭酸脱水酵素遺伝子の３’末端まで伸長する、再編成ＩｇＬ遺伝子座の９．８ｋｂ断片（以下において断片「Ｗ」と呼ばれる）を依然として含んでいた。この断片の関連を試験するために、ＧＦＰ２構築物を、クローンψＶ−ＩｇＬ−（再編成ＩｇＬ遺伝子座全体が、ピューロマイシン耐性遺伝子（Ｐ４２６７０）によって置換されている）へトランスフェクトした。できたトランスフェクタントψＶ−ＩｇＬ−，ＧＦＰ２は、欠失したＩｇＬ遺伝子座の位置にＧＦＰ２レポーターを挿入していた（図２Ａ、中央部および図２Ｂ）。ψＶ−ＩｇＬ−，ＧＦＰ２のサブクローンは、０．０１％および０．０２％の緑色蛍光減少の中央値を示し（図２Ｃ）、これは、ψＶ−ＩｇＬＧＦＰ２サブクローンの中央値より１００倍を超えて低かった。これは、「Ｗ」断片（ψＶ−ＩｇＬ−，ＧＦＰ２において存在しないが、ψＶ−ＩｇＬＧＦＰ２において存在している）が、ＧＦＰ２導入遺伝子の高頻度変異に必要であることを示した。ψＶ−ＩｇＬ−細胞を、次いでＧＦＰ２導入遺伝子および「Ｗ」断片を含む構築物でトランスフェクトした（図２Ａ、下部）。トランスフェクタントψＶ−ＩｇＬＷ、ＧＦＰ２のサブクローンは、ψＶ−ＩｇＬＧＦＰ２サブクローンの中央値と同様の緑色蛍光減少の中央値を示した（図２Ｃ）。従って、「Ｗ」断片は、真のＤＩＶＡＣ配列に関して予期されるように、ＩｇＬ遺伝子座への再挿入後に、高頻度変異を効率的に活性化する。
【００７４】
コントロールは、減少した緑色蛍光を有する細胞の出現は、ＧＦＰ２遺伝子における高頻度変異を反映することを確認した。予期されるように、ＡＩＤ陰性トランスフェクタントψＶ−ＩｇＬＧＦＰ２ＡＩＤ−／−のサブクローンは、非常に低い０．００１％の緑色蛍光の減少の中央値しか示さなかったので、ψＶ−ＩｇＬＧＦＰ２培養の緑色蛍光の減少は、ＡＩＤに依存した（図２Ｃ）。さらに、サブクローニングの６週後にψＶ−ＩｇＬＧＦＰ２細胞から増幅されたＧＦＰオープンリーディングフレームは、平均で０．９ヌクレオチドの置換を示した（図２Ｄ）。最も一般的な変異は、ψＶ欠失クローン由来のＩｇＬ  ＶＪセグメントの高頻度変異に関して以前に観察されたように、ＣからＧ、およびＧからＣへのトランスバージョンであった［Ａｒａｋａｗａら、２００４］。対照的に、ψＶ−ＩｇＬ−，ＧＦＰ２細胞のＧＦＰ遺伝子において、非常に少数のヌクレオチド置換しか見出されなかった（図２Ｄ）。
【００７５】
（実施例４：ＤＩＶＡＣのマッピング）
（「Ｗ」断片のマッピング）
標的化構築物の新しいシリーズを、ψＶ−ＩｇＬ−へトランスフェクトして、段階的な欠失によって「Ｗ」断片を特徴付けた（図３Ａ）。異なるトランスフェクタント由来のサブクローンのＦＡＣＳ分析は、「Ｗ」断片がいずれかの末端から短くなった場合に、変動するが進行性の高頻度変異活性の喪失を示した（図３Ｃ）。以前に同定したＩｇＬエンハンサー［Ｂｕｌｆｏｎｅ＿Ｐａｕｓら、１９９５］を含む、「Ｗ」断片の中央にある４ｋｂの「Ｓ」断片は、依然として２．７％および１．７％の緑色蛍光の減少の中央値を生じた。対照的に、上流の「Ｂ」断片および下流の「Ｐ」断片は、それによってそれぞれ約０．１３％および０．０５％の緑色蛍光の減少の中央値を生じ、それは絶対項において低いが、ψＶ−ＩｇＬ−，ＧＦＰ２の中央値より明らかに上であった。これらの断片のうちのいずれか１つを、それぞれ「Ｆ」および「Ｋ」断片中の「Ｓ」断片と組み合わせた場合、緑色蛍光の減少中央値は、約３倍増加した。これは、ニワトリＩｇＬ遺伝子座のＤＩＶＡＣは、全体の活性に寄与する中央のコア領域および部分的に重複する隣接領域から成ることを示唆した。
【００７６】
ψＶ−ＩｇＬＷ，ＧＦＰ２の主要な集団における平均緑色蛍光は、おそらく「Ｗ」断片のＩｇＬエンハンサーによる、ＧＦＰ２におけるＲＳＶプロモーターのさらなる刺激のために、ψＶ−ＩｇＬ−，ＧＦＰ２と比較して増加した（図２Ｂ）。しかし、ψＶ−ＩｇＬ−，ＧＦＰ２において見られる、ＧＦＰ２転写の比較的小さい減少は、おそらく高頻度変異の３００倍を超える低減の原因ではない。図３に示した全ての断片の一次トランスフェクタントは、同様のＧＦＰ転写レベルを示したので、「Ｗ」断片欠失の分析はまた、高頻度変異における差はＧＦＰ２転写の変化によって引き起こされたという可能性に対して強力に反対した。
【００７７】
（「Ｓ」断片のマッピング）
前述したように、再編成されたＤＴ４０  ＩｇＬ遺伝子座の約４ｋｂの部分（「Ｓ」断片）は、ＡＩＤによる高頻度変異に必須であった。そのＤＮＡ断片は、既に同定されたエンハンサーの上流２ｋｂの配列および下流１．６ｋｂの配列にまたがる。推定高頻度変異機構のアセンブリーのプラットフォームとなり得、ならびにＡＩＤをＩｇ遺伝子座に置く、「Ｓ」断片の活性コアを突き止めるために、４ｋｂ領域の詳細な欠失分析を行った。「Ｓ」断片（さらに「０−４」断片と呼ばれる）の５’開始点をゼロ点として規定し、そして配列を４つの１ｋｂ領域に分割した（図６）。配列の５’末端および３’末端から始まる、一連の１ｋｂの段階的欠失を行った。
【００７８】
「０−４」断片それ自身は、２．７％および１．７％の緑色蛍光の減少中央値を生じた。欠失構築物の緑色蛍光減少中央値を、「０−４」コントロールと比較し、そしてマンホイットニーのＵ検定を用いて、ｐ値を計算した。ｐ＜０．００１の値のみを、有意として受け入れた。
【００７９】
「０−３」断片の緑色蛍光減少中央値が依然として３．７％および１．７％であったので、３’末端から始まる欠失は、最後の１ｋｂ領域（「３−４」）は、ＡＩＤのリクルートに有意な関連を有さないことを示した。３’末端からさらに１ｋｂ欠失すること（「０−２」）は、０．１％および０．３％へ明らかに変異を抑制し、このことは、完全なエンハンサー配列を含む「２−３」が、高頻度変異過程において役割を果たしていることを示唆した。５’末端から始まる欠失が、この理論を支持した。断片「２−４」は１．５％および１．３％の範囲であり「０−４」と同じレベルであったが、「２−３」を除去すると、「３−４」のＧＦＰ変異レベルの中央値は、０．４％および０．１％の有意に減少した値に低下した。よって、「０−４」断片の両方の末端からの欠失が、ＡＩＤリクルートのための「２−３」の役割を支持した。
【００８０】
「２−３」は、高頻度変異増強効果を有する（０．９％および１．３％）わずか１ｋｂの断片であったけれども、１ｋｂ断片「２−３」の実験は、その結果を確認した。「０−１」、「１−２」および「３−４」のクローンにおける多様化活性は、ＩｇＬ−と比較した場合、依然としてバックグラウンドレベルより上であったが、「０−１」（どちらも０．１％）、「１−２」（０％および０．３％）および「３−４」のいずれもが、高頻度変異を有意な程度まで開始しなかった。この結果は、高頻度変異に対する「０−１」、「１−２」および「３−４」の相加効果（すなわちそれらによる増強効果）に反対した。しかし、それらの断片のうちの１つを「２−３」に加えた場合、高頻度変異レベルがわずかに増加するので、これらの断片にはいくらかの累積的な効果が存在し得る。「２−３」断片は、高頻度変異を標的化する原因となるコアシスエレメントを含むようである。上記結果はまた、高頻度変異活性化過程における、「２−３」内に存在する、エンハンサーの重要な役割を示した。
【００８１】
（「０−４」断片の精密なマッピング）
「０−４」における内部欠失の欠失分析は、より小さい活性断片の規定において有用である。同時に、それは、お互いに離れていたとしても協同的な方法で作用する、単一作用性配列またはエレメントを同定することを助ける。体細胞高頻度変異の頻度の低下は、ＡＩＤによる多様化に関与する重要なエレメントが欠失していることを示す。
【００８２】
「０−４」断片の精密なマッピングを、一連の２００ｂｐの欠失の助けを借りて行った（図７）。欠失クローンを、もとの「０−４」クローンと比較し、そしてマンホイットニーのＵ検定によって有意性を計算した。２０個の欠失クローンのうち３つの体細胞高頻度変異活性が、有意に抑制された。構築物「０．０−１．０／１．２−４．０」および「０．０−３．６／３．８−４．０」は、０．８％のＧＦＰ発現の減少を示し、そして構築物「０．０−２．２／２．４−４．０」は、０．４％のＧＦＰ発現の減少を示した。これらの３つの構築物の実験における人為的影響を除外するために、その結果を、各構築物に関してさらに１つのクローンをスクリーニングすることによって確認した。「０．０−１．０／１．２−４．０」および「０．０−３．６／３．８−４．０」の２番目のクローンのＧＦＰ発現の減少は、それぞれ３．５％および４．９％であった（データは示していない）。トランスフェクトした構築物の無作為な組み込みはコントロールし得ないので、クローンの差は、ＡＩＤｃＤＮＡ発現カセットまたは体細胞高頻度変異に関わる他の遺伝子の喪失または阻害のためであり得る。「０．０−２．２／２．４−４．０」の２番目のクローンは、０．５％の有意に減少したＧＦＰ発現を示し（データは示していない）、従って最初のクローンで得られたデータを確認した。同定された２００ｂｐの領域「２．２−２．４」は、以前に同定された「２−３」断片の一部であり、そしてＩｇＬエンハンサー内に位置する。これらの結果は、高頻度変異遺伝子座へのＡＩＤのリクルートに関するエンハンサーの役割を支持する。
【００８３】
（「２−３」断片のマッピング）
典型的なタンパク質結合部位は、１０−２０ｂｐの範囲であるので、「２−３」断片においてより詳細な欠失分析を行って、特異的タンパク質結合領域を規定した。５０ｂｐの内部欠失および両方の末端からの５０ｂｐの連続的欠失の組み合わせが、重複モチーフまたはモチーフの反復を同定するために有用である。
【００８４】
「２−３」断片のマッピングを、「２−３」断片の５０ｂｐの末端欠失および内部欠失を分析することによって行った（図８、９、および１０）。
【００８５】
５’末端から始まる、５０ｂｐの徐々に増加する欠失シリーズは、「２．２−３．０」の０．６％から、「２．２５−３．０」の０．２％へのＧＦＰ発現の減少を示した（図９）。「２．２−２．２５」の除去は、「２．２−２．４」断片の重要性を確認する。しかし、「２．２−２．２５」の内部欠失は影響を有さなかったので（図８）、「２．２−２．４」領域に重複エレメントが存在することが予期される。３’末端において５０ｂｐの欠失を増加させることは、「２．２５−２．３」における、「２．２−２．４」断片の高頻度変異活性に関連するさらなるエレメントの存在を示した（図１０）。例えば、ＧＦＰ変異レベルは、「２−２．２５」の０．２％から、「２−２．３」の０．５％へ上昇した。従って、「２．２−２．３」領域におけるいくつかの異なる、または反復するモチーフが予期された。しかし、「２．２−２．２５」および「２．２５−２．３」の内部欠失（図８）は、高頻度変異活性の有意な喪失を示さなかったので、「２．２−２．２５」および「２．２５−２．３」において同定されたモチーフは、適当な機能のためにさらなるエレメントを必要とするようである。
【００８６】
３’末端欠失シリーズにおいて、「２−２．７５」および「２−２．８」に関連するＧＦＰ減少の低下が、さらに検出され得る（図１０）。これは、サイレンシングエレメントの影響を反映し得る。しかし、５０ｂｐ内部欠失シリーズにおいてこの領域の欠失は影響を受けなかった（図８）。「２．８−２．８５」の追加が、その影響を補い得る。これらの結果は、高頻度変異活性化因子としての２００ｂｐのエレメント「２．２−２．４」の役割を確認する。
【００８７】
このように、５０ｂｐの内部欠失は、ＧＦＰ発現の有意な減少を示さなかった。無作為な欠失を産生したので、保存された部分は欠失せず、配列モチーフの一部のみが欠失したと推測したくなる。さらに、「２−３」断片は、お互いに置換し得る重複エレメントを含み得る。
【００８８】
（「２．２−２．４」断片の再構築および多量体化）
「０−４」断片における「２．２−２．４」の欠失は、ＧＦＰ発現減少の５倍の低下を引き起こした。「２−３」と同様に、「２．２−２．４」が高頻度変異に必要なだけでなく十分でもあるかどうか調べるために、「２．２−２．４」断片を、ψＶ−ＩｇＬ−に再構築した。０．６％のＧＦＰ発現減少の中央値を検出し得た。この結果は、「２．２−２．４」は、高頻度変異に十分な１つまたはいくつかのエレメントを含むことを確認した。しかし、ＧＦＰ陰性細胞の数は、「２−３」におけるよりも低く（０．９％、１．３％）、そして「０−４」におけるよりも有意に低かった（２．７%、１．７％）。
【００８９】
この効果が、追加のエレメントまたは反復性モチーフのためであるかどうかを調べるために、「２．２−２．４」断片を多量体化した（図１１）。エレメントを２倍にすることは、蛍光の減少中央値を２倍に増強し（１．５５％）、一方エレメントを４倍にすることは、ＧＦＰ陰性細胞の画分が、「０−４」のもの（４％）よりさらに高いレベルに達することを引き起こした。その配列を８倍および１４倍に多量体化しても、高頻度変異率をさらに高くすることはできなかった。「２．２−２．４」断片に関する飽和レベルが存在すること、ならびに、他のモチーフおよび／または内因性因子の欠如がその過程を制限し得ることが考えられる。これらのデータは、「２．２−２．４」断片は、高頻度変異を誘発するために必要かつ十分であることを確認する。
【００９０】
（実施例５：非Ｉｇ遺伝子座における高頻度変異）
（「Ｗ」（９．８ｋｂ）断片）
ＧＦＰ２レポーターが自身によって非Ｉｇ遺伝子座において安定に発現することを確認するために、５つの異なる染色体における６つの遺伝子座［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、２００４］を、ψＶ−ＡＩＤＲ１へのＧＦＰ２構築物のトランスフェクションによって標的化した（図４Ａおよび１Ｆ）。一次トランスフェクタント（図４Ｂ、表１Ｂ）もそのサブクローン（図４Ｃ）も、高いパーセントの緑色蛍光減少を示さなかった。実験および挿入部位に依存して、サブクローンの中央値は０．０２％から０．２２％の範囲であり、このことは、選択した遺伝子座におけるＧＦＰ２レポーターの変異率は、ＩｇＬ遺伝子座におけるよりも５０から５００倍低いことを示した。しかし、これらの中央値は、ＡＩＤ陰性トランスフェクタント由来の様々なサブクローンの中央値よりも約２−１０倍高く（図２Ｃおよび５Ｃ）、このことは、ＡＩＤ発現Ｂ細胞におけるバックグラウンド変異率においてのわずかな増加を確認した［Ｌｉｕら、２００８］。
【００９１】
次いでＧＦＰ２を「Ｗ」断片と共に、ψＶ−ＡＩＤＲ１のＡＩＤ遺伝子座、ＢＡＣＨ２（ＮＣ＿００６０９０）遺伝子座およびＲＤＭ１（ＢＡＣ０２５６１）遺伝子座それぞれに挿入した（図５Ａおよび５Ｂ）。トランスフェクタントψＶ−ＡＩＤＷ，ＧＦＰ２、ψＶ−ＢＡＣＨ２Ｗ，ＧＦＰ２、およびψＶ−ＲＤＭ１Ｗ，ＧＦＰ２のサブクローンは、ψＶ−ＩｇＬＧＦＰ２およびψＶ−ＩｇＬＲ，ＧＦＰ２サブクローンの中央値と同様の、４．０％と９．４％との間の緑色蛍光減少の高い中央値を示した（図５Ｃ）。ＡＩＤ陰性トランスフェクタントψＶ−ＡＩＤＷ，ＧＦＰ２／−、ψＶ−ＢＡＣＨ２Ｗ，ＧＦＰ２／−ＡＩＤ−／−およびψＶ−ＲＤＭ１Ｗ，ＧＦＰ２／−ＡＩＤ−／−のサブクローンは、０．００１％から０．０３％の範囲の、緑色蛍光減少の非常に低い中央値を示したので、ＧＦＰ２高頻度変異はＡＩＤ依存性であった。これらの結果は、「Ｗ」断片は、そうでなければ高頻度変異を支持しない遺伝子座において、ＡＩＤによる高頻度変異を活性化し得ることを示した。
【００９２】
（「２．２−２．４」断片）
ＤＩＶＡＣ配列のマッピングは、「２．２−２．４」が、高頻度変異を開始し得る、真の高頻度変異コアエレメント（「ＨｙＣｏｒＥ」）のように作用することを示した。このエレメントの多量体化は、相加効果を有していた。「２．２−２．４」の、高頻度変異を特定の非Ｉｇ遺伝子座へ標的化する能力について試験した。異なる非Ｉｇ遺伝子座における「Ｗ」断片についてのこの実施例において記載された実験と同様に、「２．２−２．４」断片の高頻度変異活性を、ＢＡＣＨ遺伝子座において試験した（図１２）。「２．２−２．４」と共にＧＦＰ２レポーターを、ＢＡＣＨ２遺伝子座へ標的化した。できたクローンＡＩＤＲ１ＩｇＬ−ＢＡＣＨ２＋／２．２−２．４，ＧＦＰ２をサブクローニングし、そしてＦＡＣＳによって分析した。減少した緑色蛍光の中央値を、クローンＡＩＤＲ１ＩｇＬ２．２−２．４，ＧＦＰ２のものと比較した。
【００９３】
ψＶ−ＡＩＤＲ１のＢＡＣＨ２遺伝子座の位置における、ＧＦＰ２レポーター単独の挿入（ＡＩＤＲ１ＩｇＬ−ＢＡＣＨ２＋／ＧＦＰ２）は、ＧＦＰ導入遺伝子における変異を引き起こさなかった。しかし、「２．２−２．４」断片と組み合わせた場合、ＧＦＰ２は、緑色蛍光の約１％の減少の中央値で変異の標的となった。これは、上記断片が欠失したＩｇＬ遺伝子座の位置に挿入された、「ＩｇＬ２．２−２．４」よりもいくらか高い。同時に、両方の値は、ＩｇＬ遺伝子座全体の欠失のためにＧＦＰ２レポーターが高頻度変異していない細胞株、「ＩｇＬ−」から有意に異なっていた。
【００９４】
これらの結果は、「２．２−２．４」断片は、非Ｉｇ遺伝子座において高頻度変異を引き起こし得ることを示し、このことは、「２．２−２．４」断片は、高頻度変異を活性化するために必要かつ十分であることを示す。
【００９５】
（実施例６：アヒルおよび七面鳥における「２．２−２．４」断片のホモログ）
アヒルおよび七面鳥における「２．２−２．４」断片のホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）をクローニングおよび配列決定した。３つの種間の配列相同性は非常に高く、アヒル配列８５％、および七面鳥配列９２％の相同性であった（図１３）。機能的保存を示すために、アヒル（配列番号第１１６番）および七面鳥（配列番号第１１５番）の「２．２−２．４」断片を、ψＶ−ＩｇＬ−細胞株へ挿入した。アヒル配列は、０．９％のＧＦＰ発現の減少を、そして七面鳥配列は１．０％の減少を引き起こした。これは、多様化活性化因子配列が、異なる種を通じて保存されていることを示す。
【００９６】
（実施例７：配列モチーフの分析）
約９．８ｋｂの「Ｗ」断片のバイオインフォマティクス分析を、重要なタンパク質結合モチーフの位置を同定する目的で行った。モチーフＥ−Ｂｏｘ、ＮＦ−κＢおよびＩＳＲＥを考慮した、９．８ｋｂの断片のモチーフ分析を、図１４に示す。これらのモチーフは、それらが「２．２−２．４」断片内で最も興味深い候補であるので、選択した。特に、ＮＥＭＯ（（ＮＫ−κＢ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）ＮＦ−κＢを活性化する因子）は、高頻度変異に影響を与えることが公知であり、そしてインターフェロン調節因子に結合するＩＳＲＥ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）は、ＮＦ−κＢと相互作用することが公知である［Ｊａｉｎら、２００４；Ｓｏｕｔｏ−Ｃａｒｎｅｉｒｏら、２００８；Ｎａｓｃｈｂｅｒｇｅｒら、２００４；Ｗｕら、１９９４；ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ転写因子データベース（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ；Ｑｕａｎｄｔら、１９９５；Ｃａｒｔｈａｒｉｕｓら、２００５）］。
【００９７】
図１４は、上記３つのモチーフの最も緊密なクラスターが、「２．２−２．４」断片において見出されることを示す（図１４、橙色の四角）。「２．２−２．４」断片に存在するモチーフはまた、「９．６−９．８」断片にも含まれる。別のクラスターが、６−７．１ｋｂの間の約１ｋｂの配列内にある（図１４、淡青色の四角）。配列のこの部分は、「０−４」および「Ｎ」に含まれ、すなわち両方の断片は、高頻度変異活性を有する。実際、この１ｋｂの断片が、「Ｎ」断片と「Ｐ」断片との間の唯一の違いであり、そしてそれは高頻度変異を１００倍増強する（図３を参照のこと）。もう１つのクラスターは、８−９ｋｂにあり、そして「Ｎ」の一部である。「３−４」のクラスターが、８ｋｂと９ｋｂとの間のクラスターと相互作用することが可能である。有意な高頻度変異活性を有さない、上記配列の最初の５ｋｂにおいて、３つのモチーフのクラスターは存在しない。
【００９８】
９．８ｋｂスケールにおける欠失断片の座標を、表３に示す。
【００９９】
【表３】
2011516071.tif 000003
従って、「Ｗ」断片は、「２．２−２．４」のものと高い類似性を有する複数の重複モチーフから構成されるようである。多量体化の結果（実施例４；図１１）は、この仮説に有利に作用する。さらに、これらのモチーフは、特に、高頻度変異の誘発に関連することが証明された「Ｗ」配列の部分において、クラスター化する。
【０１００】
この分析は、「高頻度変異モチーフ」は、Ａ−Ｂ−Ｂ−Ａ構造を有するという理論を支持する。９．８ｋｂ断片の最初の８００ｂｐ（２８２５−３６２５）は、モチーフＡに対応する。モチーフＡは、コアモチーフまたはモチーフＢのエンハンサーであるモチーフである。モチーフＢは、例えば「２．２−２．４」断片である。２つのコアエレメント（Ｂ）は、２つの増強エレメント（Ａ）と同様に、明確なモチーフ相同性を有する。ＮＥＭＯにおける欠損は、ＡＩＤが存在するとしても上記過程を停止することが公知である。これは、非常に明確な活性化コアエレメントを示し、シグナル伝達はここで、体細胞高頻度変異、遺伝子変換、およびクラススイッチ組換え活性へと通訳される。上で列挙したエレメントがおそらく主なものであるが、ＳＰ１、ＡＰ１、Ｅ２Ａ／Ｔｈｉｎｇ１、ＰＡＸ２／４／５ファミリーのような、考えられる増強モチーフ因子も、役割を果たし得る。
【０１０１】
（実施例８：材料および方法）
標的化構築物。ＧＦＰ２構築物を、ＲＳＶプロモーター−ｐＨｙｐｅｒｍｕｔ２のＧＦＰオープンリーディングフレーム［２０］を、ＩＲＥＳ［Ａｒａｋａｗａら、２００４］、ブラストサイジン耐性遺伝子およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル［Ａｒａｋａｗａら、２００１］を含むＰＣＲ増幅産物を組み合わせることによって作製した。そのＰＣＲを、補足の表２で記載したプライマーを用いて行った。ＧＦＰ２は、標的化ベクターへの容易なクローニングのために、唯一のＢａｍＨＩ制限部位に隣接していた。
【０１０２】
「Ｗ」断片欠失および再構成のシリーズに属するものを除く全ての標的化構築物を、アームの配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ）にクローニングし、そして次いで図５Ａおよび図１Ｅおよび１Ｆにおいて示したように、ＧＦＰ２を唯一のＢａｍＨＩ部位またはＢｇｌＩＩ部位のいずれかへ挿入することによって作製した。ＡＩＤ［Ａｒａｋａｗａら、２００１］、およびＲＤＭ１［Ｈａｍｉｍｅｓら、２００４］の標的化が、以前に記載された。全ての標的アームのＰＣＲ増幅を、Ｅｘｐａｎｄ  ｌｏｎｇ  ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、鋳型としてＤＴ４０ゲノムＤＮＡ、および、表２において記載したようなプライマーを用いて行った。
【０１０３】
「Ｗ」断片は、単一の配列として増幅することが困難であったので、上流および下流ＰＣＲ増幅産物を、再編成ＩｇＬ標的化構築物「構築物Ｒ」［ＢｕｅｒｓｔｅｄｄｅおよびＴａｋｅｄａ、１９９１］から切除された２．２ｋｂのＡｖｒＩＩ／ＳｐｅＩ制限断片と組み合わせることによって、連続的にクローニングした。そのＡｖｒＩＩ／ＳｐｅＩ制限断片の配列は、Ａ／Ｔリッチであり、そしてＪセグメントとＣ領域との間に位置していた。アセンブルした「Ｗ」断片を配列決定し、そしてアクセッション番号ｂａｎｋｉｔ  ＦＪ４８２２３４でＧｅｎｂａｎｋへ寄託した。「Ｗ」断片欠失シリーズに属する構築物を、標的アームの間のＧＦＰ２をクローニングし、そして次いで「Ｗ」断片またはその一部を、唯一のＮｈｅＩ／ＳｐｅＩ部位へ挿入することによって作製した。ＧＦＰ２および「Ｗ」断片を含むＢａｍＨＩ断片を、ＡＩＤ、ＢＡＣＨ２およびＲＤＭ１標的化ベクターへ組み込み、非Ｉｇ遺伝子座における「Ｗ」断片の活性を試験した。
【０１０４】
細胞培養。細胞を、ニワトリ培地（１０％胎仔ウシ血清、１％ニワトリ血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、０．１μＭのβ−メルカプトエタノールおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０またはＤＭＥＭ／Ｆ−１２）中で、４１℃において、５％ＣＯ２と共に培養した。トランスフェクションを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）によって、２５μＦおよび７００Ｖにおいて、４０μｇの直線化プラスミドＤＮＡを用いて、エレクトロポレーションによって行った。１５μｇ／ｍｌのブラストサイジン中で培養することによって、安定なトランスフェクタントを選択した。標的化組み込みによって、トランスジェニック構築物を組み込まれたトランスフェクタントを、ＧＦＰ２のＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列由来の内側プライマーと、標的アームの外側の配列由来のプライマー（表２）とを共に使用したＰＣＲによって同定した。ＩｇＬ遺伝子座への挿入の場合、再編成アレルへの標的化組み込みを、再編成されていない遺伝子座のＶＪ介在配列を増幅することによって立証した。ＡＩＤ再構築クローンＡＩＤＲ２を、ＡＩＤ  ｃＤＮＡ発現カセットを欠失ＡＩＤ遺伝子座の１つに標的化する構築物のトランスフェクションによって、ＡＩＤ欠失クローンＡＩＤ−／−［Ａｒａｋａｗａら、２００２］から産生した。ＡＩＤ陰性トランスフェクタントを、ψＶ−ＡＩＤ−／−［Ａｒａｋａｗａら、２００４］をトランスフェクトすることによって産生した。
【０１０５】
フローサイトメトリー。各変異の表現型を、少なくとも２つの独立した標的化トランスフェクタントおよび２４個のそれぞれのサブクローンのＦＡＣＳ分析によって決定した。一次トランスフェクタントを、トランスフェクションの約３週間後に、そしてサブクローンを、サブクローニングの２週間後に、ＦＡＣＳによって分析した。主要な集団における緑色蛍光レベルは、トランスフェクタント間でわずかに変動するので、緑色蛍光細胞の主要な集団を、減少または消失した緑色蛍光を示す細胞から分離するためのゲートを、状況に応じて適合させた。生きた細胞のゲートに入る少なくとも５０００のイベントを、各一次トランスフェクタントまたはサブクローンに関して回収した。５０％を超える生きた細胞のイベントが、減少または消失した緑色蛍光についてのゲートに入ったサブクローンは、サブクローニングの時点で既に変異ＧＦＰ２導入遺伝子を発現している前駆細胞の増殖を示しているかもしれないので、分析から除外した。
【０１０６】
ＧＦＰ遺伝子配列決定。ＰＣＲ導入変異を最小限にするために、Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａホットスタートポリメラーゼ（Ｓｔａｒａｔｇｅｎｅ）を、配列決定の前のＧＦＰオープンリーディングフレームの増幅のために使用した。配列決定および配列分析を、以前に記載したように行った［Ａｒａｋａｗａら、２００４］
【０１０７】
【数１】
2011516071.tif 000004
【０１０８】
【数２】
2011516071.tif 000005
【０１０９】
【数３】
2011516071.tif 000006
【０１１０】
【数４】
2011516071.tif 000007
【０１１１】
【数５】
2011516071.tif 000008
【０１１２】
【表１】
2011516071.tif 000009
【０１１３】
【表２−１】
2011516071.tif 000010
【０１１４】
【表２−２】
2011516071.tif 000011
【０１１５】
【表２−３】
2011516071.tif 000012
【０１１６】
【表２−４】
2011516071.tif 000013
【図１−１】
2011516071.tif 000014
【図１−２】
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【図１−３】
2011516071.tif 000016
【図１−４】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
2011516071.tif 000021
【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2011516071000001.app
【国際調査報告】
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