(57)【要約】  本発明は、種々の治療的に有用な化合物をインスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦ−１Ｒ）に結合する抗体と併用できる併用療法を用いる治療方法に関する。ＩＧＦ−１Ｒ仲介生存促進及び腫瘍増殖経路を阻害する特定のヒト及びマウスモノクローナル抗体、並びにこれらの変異体、断片、及び誘導体を提供する。また、リガンドであるインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）及びインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）のＩＧＦ−１Ｒに結合する能力をブロックする特定のヒト及びマウスモノクローナル抗体、並びにかかる抗体の断片、変異体、及び誘導体も提供する。本発明はまた、上記抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体をコードしているポリヌクレオチド、並びにかかるポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞を含む。本発明は特にＩＧＦ−１Ｒ抗体による併用療法を用いる癌の治療方法を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の過剰増殖性障害を治療する方法であって、
ａ）単離ＩＧＦ−１Ｒ（インスリン様成長因子−１受容体）抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片がＩＧＦ−１Ｒ仲介性シグナル伝達を阻害する第１の剤と、
ｂ）過剰増殖性障害の治療にとって治療的に有用である第２の剤と、
を含む１種以上の組成物を、治療を必要としている動物に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記第２の剤が、
ａ）細胞成長、
ｂ）細胞増殖、及び
ｃ）細胞生存
から成る群から選択される１種以上の生物学的過程を阻害する、又は
前記第２の剤が、
d ）細胞成長、
e ）細胞増殖、及び
f ）細胞生存
から成る群から選択される１種以上の生物学的過程を制御する１つ以上のシグナル伝達経路を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２の剤が単離抗体又はその断片である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の剤が小分子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の剤が、
ａ）タンパク質、
ｂ）ポリヌクレオチド、
ｃ）脂質、及び
ｄ）炭水化物
から成る群から選択される巨大分子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記動物が哺乳類である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳類がヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記過剰増殖性障害が、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、又はこれらの転移から成る群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記過剰増殖性障害が、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎腺、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭部、頸部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、又は泌尿生殖器管に位置する新生物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記過剰増殖性障害が癌であり、前記癌が、扁平上皮細胞癌、黒色腫、白血病、骨髄腫、胃癌、脳癌、骨癌、肺癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、頭頸部癌、非小細胞肺癌、肉腫、及び骨肉腫から成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の剤が、
ａ）Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ、
ｂ）Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ、
ｃ）Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ、
ｄ）Ｍ１４−Ｂ０１．Ｇ４．Ｐ、
ｅ）Ｍ１２−Ｅ０１．Ｇ４．Ｐ、
ｆ）Ｍ１２−Ｇ０４．Ｇ４．Ｐ、
ｇ）Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、
ｈ）Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、
ｉ）Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、
ｊ）Ｍ１４−Ｂ０１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、
ｋ）Ｍ１２−Ｅ０１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、及び
ｌ）Ｍ１２−Ｇ０４．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、
から成る群から選択される単離抗体又はその断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の剤が、
ａ）Ｍ１３−Ｃ０６、
ｂ）Ｍ１４−Ｇ１１、
ｃ）Ｍ１４−Ｃ０３、
ｄ）Ｍ１４−Ｂ０１、
ｅ）Ｍ１２−Ｅ０１、及び
ｆ）Ｍ１２−Ｇ０４、
から成る群から選択される単離Ｆａｂ抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の剤が、
ａ）Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、
ｂ）２０Ｃ８．３Ｂ８、
ｃ）Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、
ｄ）２０Ｄ８．２４Ｂ１１、
ｅ）Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及び
ｆ）Ｐ１Ｇ１０．２Ｂ８
から成る群から選択されるハイブリドーマ細胞株により産生される単離抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の剤が、
ａ）米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）寄託番号ＰＴＡ−７４４４として寄託されているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、
ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４５として寄託されているＣＨＯ細胞株、
ｃ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５として寄託されているＣＨＯ細胞株、
ｄ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４８５として寄託されているハイブリドーマ細胞株、
ｅ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３２として寄託されているハイブリドーマ細胞株、
ｆ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５７として寄託されているハイブリドーマ細胞株、
ｇ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５６として寄託されているハイブリドーマ細胞株、
ｈ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３０として寄託されているハイブリドーマ細胞株、
ｉ）ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７７３１として寄託されているハイブリドーマ細胞株、
から成る群から選択される細胞株により産生される単離抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の剤が請求項１４に記載の細胞株により産生される単離抗体であり、前記細胞株が、
ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）：Ｃ０６−４０Ｂ５、ＣＨＯ  ＤＧ４４Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  ＥＡ０３．１４．０６、
ｂ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）：Ｃ０３−２  ＣＨＯ  ＤＧ４４Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ  ＤＡ  ０３．１４．０６、
ｃ）チャイニーズハムスター卵巣細胞株：Ｇ１１  ７０  ８ｅ６細胞０８．０９．２００６、
ｄ）ハイブリドーマ８．Ｐ２Ａ７．３Ｄ１１、
ｅ）ハイブリドーマ細胞株：７．２０Ｃ８．３Ｂ８、
ｆ）ハイブリドーマ：５．Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、
ｇ）ハイブリドーマ：７．２０Ｄ８．２４．Ｂ１１、
ｈ）ハイブリドーマ細胞株：９．Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及び
ｉ）ハイブリドーマ細胞株：５Ｐ１Ｇ１０．２Ｂ８、
から成る群から選択されるＡＴＣＣ寄託記載により指定されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の剤が、インスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン−１（ＦＮＩＩＩ−１）から成るポリペプチドドメインに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の剤が、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）及びインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）のＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害する単離抗体又はその抗原結合断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記阻害がアロステリックである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１の剤が、ＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチ領域（ＣＲＲ）から成るポリペプチドドメインに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体がＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２リガンドのＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記阻害が競合的である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の剤が、ＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチ領域（ＣＲＲ）及び第２のロイシンリッチ反復ドメイン（Ｌ２）から成るポリペプチドドメインに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体が、ＩＧＦ−１のＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害するが、ＩＧＦ−２のＩＧＦ−１Ｒへの結合は阻害しない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記阻害剤がアロステリックである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の剤が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生される参照モノクローナル抗体と同じインスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦ−１Ｒ）エピトープに特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の剤が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生される参照モノクローナル抗体のＩＧＦ−１Ｒへの結合を競合的に阻害する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１の剤が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と同一の抗原結合ドメインを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体の重鎖及び軽鎖可変領域が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片に由来する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体の重鎖及び軽鎖可変領域がマウス由来である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体の重鎖及び軽鎖可変領域が、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に由来する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記１種以上の組成物が、第１の剤及び第２の剤に加えて複数の剤を含み、前記複数の更なる剤が過剰増殖性障害の治療に対して治療的に有用である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
例えば生物製剤及び小分子等の治療化合物を併用することは、癌治療において非常に魅力のあるアプローチとなってきている。例えば、
Bianco, R., et al., “Combination of biological therapies in non-small cell lung cancer,” Ann Oncol., 17, Suppl2:ii52-54 (2006);
Rodriguez, J., et al., “Combining chemotherapy and targeted therapies in metastatic colorectal cancer,” World J Gastroenterol., 13 (44):5867-76 (2007);
Gligorov, J., et al., “Novel therapeutic strategies combining antihormonal and biological targeted therapies in breast cancer: focus on clinical trials and perspectives,” Crit Rev Oncol Hematol., 64 (2):115-28 (2007);
Bracci, L., et al., “IFN-alpha and novel strategies of combination therapy for cancer,” Ann NY Acad Sci., 1112:256-268 (2007);
Ho, C., et al., “Dual inhibition: combining epidermal growth factor-targeted therapies in non-small-cell lung cancer,” Clin Lung Cancer, 8 (7):420-4 (2007);
Leonetti, C., et al., ‘Targeting different signaling pathways with antisense oligonucleotides combination for cancer therapy,” Curr Pharm Des., 13 (5):463-70 (2007);及び
Cascone, T., et al., “Combined targeted therapies in non-small cell lung cancer: a winner strategy?,” Curr Opin Oncol., 19 (2):98-102 (2007)
を参照。
【０００２】
本発明は、過剰増殖性障害（癌等）の治療、特にインスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）が仲介するシグナル伝達経路、並びに更なる細胞成長、細胞増殖、及び細胞生存シグナル伝達経路のターゲティングにおける併用治療アプローチに関する。
【背景技術】
【０００３】
多数の疫学的研究により、正常血中濃度よりも高い濃度のＩＧＦ−１が、幾つかの一般的な癌、例えば乳癌(Hankinson et al, Lancet 1998. 351:1393-6)、前立腺癌(Chan et al, Science. 1998. 279:563-6)、肺癌(Yu et al, J. Natl. Cancer Inst.1999.91:151-6)及び結腸直腸癌(Ma et al, J.Natl.Cancer Inst.1999. 91:620-5)のリスク増大と関連があることが示されている。ＩＧＦ−２の血中濃度の上昇も、子宮体癌のリスク増大と関連があることが示されている(Jonathan et al, Cancer Biomarker & Prevention. 2004. 13:748-52）。対照的に、ＩＧＦ結合タンパク質の１種であるＩＧＦ−ＢＰ３の濃度上昇と癌のリスクについては、逆相関が観察された。更に、ＩＧＦの濃度上昇はまた癌患者で認められている(Peyrat et al, Eur. J. Cancer. 1993. 351:1393-6; Jonathan et al, Cancer Biomarker & Prevention. 2004. 13:748-52)。
【０００４】
ＩＧＦ系は、細胞増殖、分化、アポトーシス及び形質転換の制御において重要な役割を果たしている（Jones et al, Endocrinology Rev. 1995. 16:3-34)。ＩＧＦ系は、２種類の無関係な受容体、すなわちインスリン様成長因子受容体１（ＩＧＦ−１Ｒ；ＣＤ２２１）及びインスリン様成長因子受容体２（ＩＧＦ−２Ｒ；ＣＤ２２２）；２種のリガンド、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２）；数種のＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ−１〜ＩＧＦＢＰ−６）を含む。更に、ＩＧＦＢＰプロテアーゼ（例えばカスパーゼ、メタロプロテイナーゼ、前立腺特異抗原）の大きな群は、ＩＧＦが結合したＩＧＦＢＰを加水分解して遊離ＩＧＦを放出し、次いで遊離ＩＧＦはＩＧＦ−１Ｒ及びＩＧＦ−２Ｒと相互作用する。ＩＧＦ系はまた、インスリン及びインスリン受容体（ＩｎｓＲ）と密接に関連している(Moschos et al, Oncology 2002. 63:317-32; Baserga et al, Int J. Cancer. 2003. 107:873-77; Pollak et al, Nature Reviews Cancer. 2004. 4:505-516)。
【０００５】
癌細胞において、受容体チロシンキナーゼ（ＴＫ）は、例えば、細胞分裂周期、生存、アポトーシス、遺伝子発現、細胞骨格構造、細胞接着、及び細胞遊走等の多様な細胞機能を制御する細胞内シグナル伝達経路を細胞外腫瘍微小環境に結び付けることにおいて重要な役割を果たしている。細胞シグナル伝達を制御するメカニズムはよく理解されているため、リガンド結合、受容体の発現／リサイクリング、受容体活性化のレベル及びシグナル伝達事象に関与するタンパク質を標的とすることによって、これら細胞機能の１種以上を崩壊させる治療ストラテジを開発できた（Ｈａｎａｈａｎ及びＷｅｉｎｂｅｒｇ、Ｃｅｌｌ  ２０００．１００：５７−７０）。
【０００６】
Ｉ型インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２２１）は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーに属する(Ullrich et al, Cell. 1990., 61:203-12)。ＩＧＦ−１Ｒは広く発現し、そのリガンドであるＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−２は、生前及び生後発育、成長ホルモン応答、細胞形質転換、生存において重要な役割を果たしており、また浸潤性及び転移性腫瘍表現型の獲得に関与している(Baserga、Cell. 1994. 79:927-30; Baserga et al, Exp. Cell Res. 1999. 253:1-6、Baserga et al, Int J. Cancer. 2003. 107:873-77)。免疫組織化学研究により、多数のヒト腫瘍がより高い濃度のＩＧＦ−１Ｒを発現していることが示されている。
【０００７】
ＩＧＦ−１Ｒの分子構造は、２つの細胞外αサブユニット（１３０〜１３５ＫＤ）と、細胞質触媒キナーゼドメインを含む２つの膜貫通βサブユニット（９５ＫＤ）とを含む。ＩＧＦ−１Ｒは、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）と同様に、共有結合二量体（α２β２）構造を有する点で他のＲＴＫファミリーのメンバーと異なる。構造的に、ＩＧＦ−１Ｒは、ＩｎｓＲと深い関連がある(Pierre De Meyts and Whittaker, Nature Reviews Drug Discovery. 2002, 1:769-83)。ＩＧＦ−１Ｒは、キナーゼドメインにおいてＩｎｓＲに対して８４％の配列同一性を有し、一方膜近傍領域及びＮ末端領域は、それぞれ６１％及び４４％の配列同一性を共有する(Ulrich et al, EMBO J., 1986, 5:2503-12; Blakesley et al, Cytokine Growth Factor Rev., 1996. 7:153-56)。
【０００８】
ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２は、ＩＧＦ−１Ｒの２種の活性化リガンドである。α鎖に対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の結合は、特定のチロシン残基でそれぞれのβ鎖の自己リン酸化をもたらし、受容体を非リン酸化状態から活性状態に変換させる立体構造の変化を誘導する。キナーゼドメインの活性化ループ中の３個のチロシン残基（１１３１、１１３５及び１１３６のＴｙｒ残基）の活性化は、ＩＲＳ−１及びＳｈｃアダプタータンパク質等の基質のドッキング及びリン酸化を誘発する触媒活性の増大を導く。これら基質の活性化は、生存（ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＴＯＲ、Ｓ６）及び／又は増殖（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、ｐ４２／ｐ４４）のシグナル伝達カスケードに関与する更なるタンパク質のリン酸化を招く(Pollak et al, Nature Reviews Cancer. 2004. 4:505-516; Baserga et al, Biochem Biophys Act. 1997. 1332:F105-F126; Baserga et al, Int. J. Cancer. 2003. 107:873-77)。
【０００９】
ＩＧＦ−１ＲとＩｎｓＲとの間の高い相同性にもかかわらず、証拠は、上記２つの受容体が異なる生物学的役割を有すること、すなわちＩｎｓＲは、グルコース輸送並びにグリコーゲン及び脂肪の生合成等の生理学的機能の重要な制御因子であり、一方ＩＧＦ−１Ｒは、細胞の成長及び分化の強力な制御因子であることを示唆している。ＩｎｓＲとは対照的に、ＩＧＦ−１Ｒは、組織成長において役割を果たす組織において、ＩＧＦ−１を調節する成長ホルモン（ＧＨ）の制御下で遍在的に発現している。ＩＧＦ−１Ｒの活性化は、正常な細胞成長を促進することが示されているが、実験的証拠はＩＧＦ−１Ｒが絶対要件ではないことを示唆している(Baserga et al, Exp Cell Res. 1999. 253:1-6; Baserga et al, Int. J. Cancer. 2003. 107:873-77)。
【００１０】
ＩＧＦは、細胞の増殖、分化及びアポトーシスの制御において重要な役割を果たしている。ＩＧＦ−１Ｒ仲介性シグナル伝達の阻害が、腫瘍の増殖速度を低下させ、アポトーシスを増加させ、化学療法及びその他の分子標的療法による腫瘍の殺傷性を増加させることが示されている(Pollak et al, Nature Reviews Cancer. 2004. 4:505-516; Zhang et al, Breast Cancer Res. 2000. 2:170-75; Chakravarti et al, Cancer Res. 2002. 62:200-07に概説されている）。
【００１１】
腫瘍においてＩＧＦ−１Ｒ機能を阻害するために試みられた実験的アプローチは、有望であるが限られた成果しか提供しておらず、その癌治療における有効性は未だ臨床で決定されていない。実験的アプローチとしては、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体(Kull et al, J. Biol. Chem. 1983, 258:6561-66; Kalebic et al, Cancer Res. 1994. 54:5531-4)、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２に対する中和抗体(Fang et al, Mol. Cancer Therapy. 2006. 5:114-20; Miyamoto et al, Clin. Cancer Res. 2005, 11:3494-502)、小分子チロシンキナーゼ阻害剤(Garcia-Escheverria et al, Cancer Cell. 2004. 5:231-9; Scotlandi et al, Cancer Res. 2005. 65:3868-76)、アンチセンスオリゴヌクレオチド(Shapiro et al, J. Clin. Invest. 1994. 94:1235-42; Wraight et al, Nature Biotech. 2000. 18:521-26; Scotlandi et al, Cancer Gene Therapy. 2002. 9:296-07)、ＩＧＦ−１Ｒのドミナントネガティブ突然変異体(Prager et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 1994, 91:2181-85; Kalebic et al, Int. J. Cancer 1998. 76:223-7; Scotlandi et al, Int. J. Cancer. 2002:101:11-6)、ＩＧＦリガンドの類似体(Pietrzkowski et al, Mol. Cell. Biol. 1992. 12:3883-89)、組換えＩＧＦ結合タンパク質(Yee et al, Cell growth Differ. 1994. 5:73-77; Van Den Berg et al, Eur. J. Cancer. 1997, 33:1108-1113; Jerome et al, AACR 2004, Abstract#5334)、ＧＨ−放出ホルモンであるＧＨＲＨの拮抗剤(Szereday et al, Cancer Res. 2003. 63:7913-19; Letsh et al, Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2003. 100:1250-55)及びＧＨ(Kopchick et al, 2002. Endocr. Rev. 23, 623-46)が挙げられる。
【００１２】
抗体がＩＧＦ−１Ｒ機能を阻害する能力は、ＩＧＦ−１Ｒのαサブユニットの未知エピトープを標的とするマウスモノクローナル抗体（αＩＲ３）を用いて初めて実証された(Kull et al, J. Biol. Chem. 1983, 258:6561-66)。その後、ＩＧＦ−１Ｒのαサブユニットに対して作製した他の抗体が、ＩＧＦ−１Ｒ機能を様々な実験癌モデルで様々な程度に阻害することが示された(Maloney et al, Cancer Res. 2003. 63:5073-83; Burtrum et al, Cancer Res. 2003. 63:8912-21; Sachdev D et al, Cancer Res. 2003. 63, 627-35; Cohen et al, Clin. Cancer Res. 2005. 11:3065-74; Goetsch et al, Intl. J. Cancer. 2005. 113:316-28. Lu et al, J. Biol. Chem. 2004. 280:19665-72)。
【００１３】
癌細胞において、生存促進（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）及び増殖シグナル伝達に加えて、ＩＧＦ−１Ｒの活性化が運動性及び浸潤に関与することも示されている(Ress et al, Oncogene 2001. 20:490-00, Nolan et al, Int. J. Cancer. 1997. 72:828-34, Stracke et al, J. Biol. Chem. 1989. 264:21544-49; Jackson et al, Oncogene, 2001. 20:7318-25)。
【００１４】
腫瘍細胞は、ＩＧＦ系の成分（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−２Ｒ及びＩＧＦ−ＢＰ）の１種以上を産生することが示されている。インビトロにおける研究により、腫瘍がＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２を産生できることが示されているが、翻訳研究（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｙ）は、ＩＧＦ−２が腫瘍に対してより関連があり、且つ腫瘍において一般的に発現しているＩＧＦであることを示す。これは、エピジェネティックな変化による腫瘍における発現抑制ＩＧＦ−２アレルの刷り込み消失（ＬＯＩ）によるものであり、これによりＩＧＦ−２遺伝子の両アレルが発現する(Fienberg et al., Nat. Rev. Cancer 2004. 4:143-53; Giovannucci et al, Horm. Metab. Res. 2003. 35:694-04; De Souza et al, FASEB J. et al, 1997. 11:60-7)。これは、次いで、癌細胞への及び腫瘍増殖を支持する微小環境へのＩＧＦ−２供給を増加させる。
【００１５】
ＩＧＦ−１Ｒ感受性腫瘍は、循環（肝臓で生成）からＩＧＦ−１の受容体活性化シグナルを、腫瘍からＩＧＦ−２の受容体活性化シグナルを受け取るため、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方が仲介する生物活性を崩壊させることを目的としたアプローチは、より優れた抗腫瘍反応を提供するはずである。したがって、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方が仲介する生物学的機能を効果的に妨害する抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体法は、腫瘍微小環境においてＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方が仲介するＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達の生物学的機能をそれ程効果的に妨害しない他のアプローチよりも高い効果を提供し得る。
【００１６】
安全性に関しては、ＩＧＦ−１Ｒは遍在的に発現するため、ＩＧＦ−１Ｒを標的とする抗体は、正常組織においてＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性に起因する毒性を避けるために最小限のエフェクター機能しか有するべきではない又は全く有するべきではない。このような抗体を生じさせる１つの可能性は、ＡＤＣＣ機能又はＣＤＣ機能を仲介しないヒトγ４Ｆｃ領域の非グリコシル化型を有することである。
【００１７】
更に、以下の特徴も注目に値する：ＩＧＦ−１Ｒは、癌遺伝子仲介性細胞形質転換に関与する。ＩＧＦ／ＩＧＦ−１Ｒの活性化は、癌細胞におけるマイトジェン及び生存促進シグナル伝達を仲介する。ＩＧＦ−１Ｒ活性化はまた、細胞運動性及び転移を促進する。ＩＧＦ−１Ｒは、多数の癌において過剰発現している。正常な血中ＩＧＦ濃度よりも高い血中ＩＧＦ濃度を有する個体は、癌を発現するリスクが高い。ＩＧＦ１及び２の血漿濃度の上昇が、多数の癌患者で見られる。ヒト腫瘍は、自己分泌成長因子としてＩＧＦ−２を産生する。腫瘍増殖の阻害は、単一薬剤として並びに化学療法剤及び生物剤との併用で実証されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
癌及びその転移を含む種々の新生物疾患の治療のための様々な又は改善された結合特性、有効性及び安全性を有するＩＧＦ−１Ｒ抗体が当技術分野において依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、併用療法、特に２種以上の治療剤の併用による増殖性障害（例えば癌）の治療に関する。具体的には、本発明は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を他の抗癌治療剤と併用して、細胞成長及び増殖、発癌、腫瘍発生、及び／若しくは転移を低減する並びに／又は排除することに関する。本発明の併用療法は、単一剤による治療効果と比較したとき、癌の治療、並びに細胞増殖、発癌、腫瘍発生、及び／又は転移の低減において相乗効果を有し得る。
【００２０】
本発明は、細胞増殖、分化、アポトーシス、及び形質転換の制御におけるＩＧＦ系の重要な役割に部分的に基づいている。具体的には、Ｉ型インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）及びそのリガンドであるＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２は、生前及び生後発育、成長ホルモン応答、細胞形質転換、生存において重要な役割を果たしており、また浸潤性及び転移性腫瘍表現型の獲得に関与している。本発明は一般的に、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、その抗原結合断片、又は誘導体に関する。特定のＩＧＦ−１Ｒ抗体及び抗原結合断片は、ＩＧＦ−１Ｒの機能を阻害する、又はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２仲介性ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達の生物学的機能をブロックする。したがって、本発明は一般的に、癌及び転移を含む種々の新生物性疾患、並びにＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達に関連している種々の過剰増殖性疾患、障害、又は傷害を治療する方法に関する。
【００２１】
幾つかの実施形態では、本発明は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片を包含する。
【００２２】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１ＲＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又は断片がＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生される参照モノクローナル抗体のＩＧＦ−１Ｒへの結合を競合的に阻害する抗体又は断片を包含する。
【００２３】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又は断片がＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体と同一の抗原結合ドメインを含む抗体又は断片を包含する。
【００２４】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片の重鎖可変領域（ＶＨ）が、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８、及び配列番号６３から成る群から選択される参照アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００２５】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）が、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３、及び配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００２６】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８、及び配列番号６３から成る群から選択される参照アミノ酸配列に対し、２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて同一であるアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００２７】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３、及び配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列に対し、２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて同一であるアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００２８】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８、及び配列番号６３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００２９】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３、及び配列番号１１８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００３０】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨ及びＶＬが、それぞれ、配列番号４及び配列番号６８；配列番号８及び配列番号７３；配列番号１４及び配列番号７８；配列番号２０及び配列番号８３；配列番号２６及び配列番号８８；配列番号３２及び配列番号９３；配列番号３８及び配列番号９８；配列番号４３及び配列番号１０３；配列番号４８及び配列番号１０８；配列番号５３及び配列番号１０３；配列番号５８及び配列番号１１３；並びに配列番号６３及び１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００３１】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨ及びＶＬがそれぞれ、配列番号４及び配列番号６８；配列番号８及び配列番号７３；配列番号１４及び配列番号７８；配列番号２０及び配列番号８３；配列番号２６及び配列番号８８；配列番号３２及び配列番号９３；配列番号３８及び配列番号９８；配列番号４３及び配列番号１０３；配列番号４８及び配列番号１０８；配列番号５３及び配列番号１０３；配列番号５８及び配列番号１１３；並びに配列番号６３及び１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列に対し、それぞれ２０個以下の保存アミノ酸置換を除いて同一であるアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００３２】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨ及びＶＬがそれぞれ、配列番号４及び配列番号６８；配列番号８及び配列番号７３；配列番号１４及び配列番号７８；配列番号２０及び配列番号８３；配列番号２６及び配列番号８８；配列番号３２及び配列番号９３；配列番号３８及び配列番号９８；配列番号４３及び配列番号１０３；配列番号４８及び配列番号１０８；配列番号５３及び配列番号１０３；配列番号５８及び配列番号１１３；並びに配列番号６３及び１１８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００３３】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９、及び配列番号６４から成る群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列に対し、２個以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＫａｂａｔ重鎖相補性決定領域−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。更なる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９、及び配列番号６４から成る群から選択される。
【００３４】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０、及び配列番号６５から成る群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列に対し、４個以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＫａｂａｔ重鎖相補性決定領域−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。更なる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０、及び配列番号６５から成る群から選択される。
【００３５】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、及び配列番号６６から成る群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に対し、４個以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＫａｂａｔ重鎖相補性決定領域−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。更なる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、及び配列番号６６から成る群から選択される。
【００３６】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４、及び配列番号１１９から成る群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列に対し、４個以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＫａｂａｔ軽鎖相補性決定領域−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。更なる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４、及び配列番号１１９から成る群から選択される。
【００３７】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５、及び配列番号１２０から成る群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列に対し、２個以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＫａｂａｔ軽鎖相補性決定領域−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。更なる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５、及び配列番号１２０から成る群から選択される。
【００３８】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６、及び配列番号１２１から成る群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に対し、４個以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＫａｂａｔ軽鎖相補性決定領域−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。更なる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６、及び配列番号１２１から成る群から選択される。
【００３９】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、前記ＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つにおける１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて、配列番号５、６、及び７；配列番号１０、１１、及び１２；配列番号１５、１６、及び１７；配列番号２１、２２、及び２３；配列番号２７、２８、及び２９；配列番号３３、３４、及び３５；配列番号３９、４０、及び４１；配列番号４４、４５、及び４６；配列番号４９、５０、及び５１；配列番号５４、５５、及び５６；配列番号５９、６０、及び６１；並びに配列番号６４、６５、及び６６から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００４０】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、配列番号５、６、及び７；配列番号１０、１１、及び１２；配列番号１５、１６、及び１７；配列番号２１、２２、及び２３；配列番号２７、２８、及び２９；配列番号３３、３４、及び３５；配列番号３９、４０、及び４１；配列番号４４、４５、及び４６；配列番号４９、５０、及び５１；配列番号５４、５５、及び５６；配列番号５９、６０、及び６１；並びに配列番号６４、６５、及び６６から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００４１】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、前記ＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つにおける１、２、３、又は４個のアミノ酸置換を除いて、配列番号６９、７０、及び７１；配列番号７４、７５、及び７６；配列番号７９、８０、及び８１；配列番号８４、８５、及び８６；配列番号８９、９０、及び９１；配列番号９４、９５、及び９６；配列番号９９、１００、及び１０１；配列番号１０４、１０５、及び１０６；配列番号１０９、１１０、及び１１１；配列番号１１４、１１５、及び１１６；並びに配列番号１１９、１２０、及び１２１から成る群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００４２】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、配列番号６９、７０、及び７１；配列番号７４、７５、及び７６；配列番号７９、８０、及び８１；配列番号８４、８５、及び８６；配列番号８９、９０、及び９１；配列番号９４、９５、及び９６；配列番号９９、１００、及び１０１；配列番号１０４、１０５、及び１０６；配列番号１０９、１１０、及び１１１；配列番号１１４、１１５、及び１１６；並びに配列番号１１９、１２０、及び１２１から成る群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む抗体又はその断片を包含する。
【００４３】
上記抗体又はその断片の種々の実施形態では、ＶＨフレームワーク領域及び／又はＶＬフレームワーク領域は、５個以下のアミノ酸置換を除いてヒト由来である。
【００４４】
幾つかの実施形態では、上記抗体又はその断片は、直線状エピトープ又は非直線状立体構造エピトープに結合する。
【００４５】
幾つかの実施形態では、上記抗体又はその断片は多価であり、少なくとも２本の重鎖及び少なくとも２本の軽鎖を含む。
【００４６】
幾つかの実施形態では、上記抗体又はその断片は多特異的である。更なる実施形態では、上記抗体又はその断片は二重特異性を有する。
【００４７】
上記抗体又はその断片の種々の実施形態では、重鎖及び軽鎖可変ドメインは完全にヒト由来である。更なる実施形態では、重鎖及び軽鎖可変ドメインは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片に由来する。
【００４８】
上記抗体又はその断片の種々の実施形態では、重鎖及び軽鎖可変ドメインはマウス由来である。更なる実施形態では、重鎖及び軽鎖可変ドメインＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体に由来する。
【００４９】
種々の実施形態では、上記抗体又はその断片はヒト化されている、キメラである、霊長類化されている、又は完全にヒト由来である。特定の実施形態では、上記抗体又はその断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、又はＦｖ断片である。特定の実施形態では、上記抗体は単鎖抗体である。
【００５０】
特定の実施形態では、上記抗体又はその断片は、ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域から成る群から選択される軽鎖定常領域を含む。
【００５１】
特定の実施形態では、上記抗体又はその断片は、重鎖定常領域又はその断片を含む。更なる実施形態では、重鎖定常領域又はその断片はヒトＩｇＧ４である。特定の他の実施形態では、ＩｇＧ４に突然変異を誘発して、グリコシル化部位が除去されている。更なる実施形態では、ＩｇＧ４の突然変異は、Ｋａｂａｔの付番方式を用いてＳ２４１Ｐ及びＴ３１８Ａを含む。
【００５２】
幾つかの実施形態では、上記抗体又はその断片は、前記参照モノクローナル抗体のＫＤより小さい解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片、又はＩＧＦ−１Ｒ変異体ポリペプチドに特異的に結合する。更なる実施形態では、解離定数（ＫＤ）は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下である。
【００５３】
幾つかの実施形態では、上記抗体又はその断片は、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片、又は非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片に比べて、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片に優先的に結合する。
【００５４】
特定の他の実施形態では、上記抗体又はその断片は、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片に結合し、また非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片にも結合する。
【００５５】
幾つかの実施形態では、上記抗体又はその断片は、細胞の表面上で発現しているＩＧＦ−１Ｒに結合する。更なる実施形態では、細胞は悪性細胞、新生物性細胞、腫瘍細胞、又は転移細胞である。
【００５６】
幾つかの実施形態では、上記抗体又はその断片は、インスリン成長因子がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。更なる実施形態では、インスリン成長因子はインスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）又はインスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）である。特定の実施形態では、上記抗体又はその断片は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。
【００５７】
幾つかの実施形態では、上記抗体又はその断片は、ＩＧＦ−１Ｒ仲介性細胞増殖、ＩＧＦ−１、又はＩＧＦ−２の仲介するＩＧＦ−１Ｒのリン酸化、腫瘍細胞の増殖、又はＩＧＦ−１Ｒの内在化を阻害する。
【００５８】
更なる実施形態では、上記抗体又はその断片は、それに融合している異種ポリペプチドを更に含む。
【００５９】
幾つかの実施形態では、上記抗体又はその断片は、細胞傷害性剤、治療剤、細胞分裂抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答調節物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び任意の前記剤の２種以上の組み合わせから成る群から選択される剤に複合体化する、又は前記剤と併用される。更なる実施形態では、細胞傷害性剤（ＩＧＦ−１Ｒ抗体との複合体として用いられる、又は併用される）は、放射性核種、生物毒素、酵素活性毒素、細胞分裂抑制若しくは細胞傷害性治療剤、プロドラッグ、免疫活性リガンド、生体応答調節物質、又は任意の前記細胞傷害性剤の２種以上の組み合わせから成る群から選択される。更なる実施形態では、検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射活性標識、又は任意の前記検出可能な標識の２種以上の組み合わせから成る群から選択される。
【００６０】
更なる実施形態では、本発明は、上記抗体又はその断片と、担体とを含む組成物を包含する。
【００６１】
本発明の特定の実施形態は、抗体のＶＨポリペプチドをコードしている核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８、及び配列番号６３から成る群から選択される参照アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離ポリヌクレオチドを包含する。更なる実施形態では、ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８、及び配列番号６３から成る群から選択される。
【００６２】
特定の実施形態では、ＶＨポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなしに発現を増加させるよう最適化される。更なる実施形態では、最適化は、ポリヌクレオチドを発現している細胞に対する、スプライス供与部位及びスプライス受容部位の同定および除去、並びに／又はコドン使用頻度の最適化を含む。更なる実施形態では、核酸は、配列番号３、配列番号８、配列番号１３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５２、配列番号５７、及び配列番号６２から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６３】
幾つかの実施形態では、本発明は、抗体のＶＬポリペプチドをコードしている核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３、及び配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離ポリヌクレオチドを包含する。更なる実施形態では、ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３、及び配列番号１１８から成る群から選択される。
【００６４】
特定の実施形態では、ＶＬポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなしに発現を増加させるよう最適化される。更なる実施形態では、最適化は、ポリヌクレオチドを発現している細胞に対する、スプライス供与部位及びスプライス受容部位の同定および除去、並びに／又はコドン使用頻度の最適化を含む。更なる実施形態では、核酸は、配列番号６７、配列番号７２、配列番号７７、配列番号８２、配列番号８７、配列番号９２、配列番号９７、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１１２、及び配列番号１１７から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００６５】
特定の他の実施形態では、本発明は、抗体のＶＨポリペプチドをコードしている核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８、及び配列番号６３から成る群から選択される参照アミノ酸配列に対し、２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて同一であり、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離ポリヌクレオチドを包含する。
【００６６】
幾つかの実施形態では、本発明は、抗体のＶＬポリペプチドをコードしている核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３、及び配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列に対し、２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて同一であり、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離ポリヌクレオチドを包含する。
【００６７】
幾つかの実施形態では、本発明は、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９、及び配列番号６４から成る群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列に対し、２個以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列をコードしている核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨ−ＣＤＲ１を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを包含する。更なる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９、及び配列番号６４から成る群から選択される。
【００６８】
幾つかの実施形態では、本発明は、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０、及び配列番号６５から成る群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列に対し、４個以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列をコードしている核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨ−ＣＤＲ２を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを包含する。更なる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５、配列番号６０、及び配列番号６５から成る群から選択される。
【００６９】
幾つかの実施形態では、本発明は、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、及び配列番号６６から成る群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に対し、４個以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードしている核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを包含する。更なる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、及び配列番号６６から成る群から選択される。
【００７０】
幾つかの実施形態では、本発明は、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４、及び配列番号１１９から成る群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列に対し、４個以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列をコードしている核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬ−ＣＤＲ１を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを包含する。更なる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列は、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４、及び配列番号１１９から成る群から選択される。
【００７１】
幾つかの実施形態では、本発明は、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５、及び配列番号１２０から成る群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列に対し、２個以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列をコードしている核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬ−ＣＤＲ２を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを包含する。更なる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列は、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５、及び配列番号１２０から成る群から選択される。
【００７２】
幾つかの実施形態では、本発明は、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６、及び配列番号１２１から成る群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列に対し、４個以下のアミノ酸置換を除いて同一であるＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードしている核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを包含する。更なる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列は、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６、及び配列番号１２１から成る群から選択される。
【００７３】
幾つかの実施形態では、本発明は、抗体のＶＨポリペプチドをコードしている核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドが、配列番号５、６、及び７；配列番号１０、１１、及び１２；配列番号１５、１６、及び１７；配列番号２１、２２、及び２３；配列番号２７、２８、及び２９；配列番号３３、３４、及び３５；配列番号３９、４０、及び４１；配列番号４４、４５、及び４６；配列番号４９、５０、及び５１；配列番号５４、５５、及び５６；配列番号５９、６０、及び６１；並びに配列番号６４、６５、及び６６から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを包含する。
【００７４】
幾つかの実施形態では、本発明は、抗体のＶＬポリペプチドをコードしている核酸を含む単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドが、配列番号６９、７０、及び７１；配列番号７４、７５、及び７６；配列番号７９、８０、及び８１；配列番号８４、８５、及び８６；配列番号８９、９０、及び９１；配列番号９４、９５、及び９６；配列番号９９、１００、及び１０１；配列番号１０４、１０５、及び１０６；配列番号１０９、１１０、及び１１１；配列番号１１４、１１５、及び１１６；並びに配列番号１１９、１２０、及び１２１から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、前記ＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離ポリヌクレオチドを包含する。
【００７５】
幾つかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、抗体のＶＨポリペプチド又は抗体のＶＬポリペプチドに融合しているシグナルペプチドをコードしている核酸を更に含む。
【００７６】
特定の他の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、ＶＨポリペプチドに融合している重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをコードしている核酸、ＶＨポリペプチドに融合している重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをコードしている核酸、ＶＨポリペプチドに融合している重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをコードしている核酸、又はＶＨポリペプチドに融合している重鎖ヒンジ領域をコードしている核酸を更に含む。更なる実施形態では、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４である。特定の他の実施形態では、ＩｇＧ４に突然変異を誘発して、グリコシル化部位が除去される。更なる実施形態では、ＩｇＧ４の突然変異は、Ｋａｂａｔの付番方式を用いてＳ２４１Ｐ及びＴ３１８Ａを含む。
【００７７】
幾つかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、前記ＶＬポリペプチドに融合している軽鎖定常領域ドメインをコードしている核酸を含む。更なる実施形態では、軽鎖定常領域はヒトκである。
【００７８】
上記ポリヌクレオチドの種々の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する。
【００７９】
上記ポリヌクレオチドの種々の他の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生される参照モノクローナル抗体を競合的に阻害する。
【００８０】
上記ポリヌクレオチドの種々の実施形態では、ＶＨポリペプチド、又はＶＬポリペプチドのフレームワーク領域は、５個以下のアミノ酸置換を除いてヒト由来である。
【００８１】
上記ポリヌクレオチドの種々の実施形態では、本発明は、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片であって、直線状エピトープ又は非直線状立体構造エピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片を包含する。
【００８２】
上記ポリヌクレオチドの種々の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は多価であり、少なくとも２本の重鎖及び少なくとも２本の軽鎖を含む。
【００８３】
上記ポリヌクレオチドの特定の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は多特異的である。更なる実施形態では、核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は二重特異性を有する。
【００８４】
上記ポリヌクレオチドの種々の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、完全にヒト由来である重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む。更なる実施形態では、重鎖及び軽鎖可変ドメインは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片の重鎖及び軽鎖可変ドメインと同一である。
【００８５】
上記ポリヌクレオチドの特定の他の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、マウス由来である重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む。更なる実施形態では、重鎖及び軽鎖可変ドメインは、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインと同一である。
【００８６】
上記ポリヌクレオチドの種々の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片はヒト化されている。
【００８７】
上記ポリヌクレオチドの種々の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は霊長類化されている。
【００８８】
上記ポリヌクレオチドの種々の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片はキメラである。
【００８９】
上記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は完全にヒト由来である。
【００９０】
上記ポリヌクレオチドの種々の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、又はＦｖ断片である。上記ポリヌクレオチドの特定の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は単鎖抗体である。
【００９１】
上記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片、又はＩＧＦ−１Ｒ変異体ポリペプチドに特異的に結合する。
【００９２】
上記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片、又は非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片に比べて、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片に優先的に結合する。
【００９３】
上記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片に結合し、また非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片にも結合する。
【００９４】
上記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、細胞の表面上で発現しているＩＧＦ−１Ｒに結合する。更なる実施形態では、細胞は悪性細胞、新生物性細胞、腫瘍細胞、又は転移細胞である。
【００９５】
上記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む前記抗体又はその抗原結合断片は、インスリン成長因子がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。更なる実施形態では、インスリン成長因子は、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）又はインスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）である。上記ポリヌクレオチドの特定の他の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。
【００９６】
上記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む前記抗体又はその抗原結合断片は、ＩＧＦ−１Ｒ仲介性細胞増殖を阻害し、ＩＧＦ−１若しくはＩＧＦ−２の仲介するＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害し、腫瘍細胞の増殖を阻害し、又はＩＧＦ−１Ｒの内在化を阻害する。
【００９７】
幾つかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドをコードしている核酸を更に含む。
【００９８】
上記ポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、細胞傷害性剤、治療剤、細胞分裂抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答調節物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び任意の前記剤の２種以上の組み合わせから成る群から選択される剤に複合体化する、又は前記剤と併用される。更なる実施形態では、細胞傷害性剤（ＩＧＦ−１Ｒ抗体との複合体として用いられる、又は併用される）は、放射性核種、生物毒素、酵素活性毒素、細胞分裂抑制若しくは細胞傷害性治療剤、プロドラッグ、免疫活性リガンド、生体応答調節物質、又は任意の前記細胞傷害性剤の２種以上の組み合わせから成る群から選択される。特定の他の実施形態では、検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射活性標識、又は任意の前記検出可能な標識の２種以上の組み合わせから成る群から選択される。
【００９９】
幾つかの実施形態では、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含む組成物を包含する。
【０１００】
特定の他の実施形態では、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを包含する。更なる実施形態では、ポリヌクレオチドはプロモータに機能的に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結している。更なる実施形態では、本発明はかかるベクターを含む宿主細胞を提供する。更なる実施形態では、本発明は、前記ポリヌクレオチドがプロモータに機能的に連結しているベクターを提供する。
【０１０１】
更なる実施形態では、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片を産生する方法であって、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを含有している宿主細胞を培養することと、前記抗体又はその断片を回収することを含む方法を包含する。更なる実施形態では、本発明は、上記方法により産生される単離ポリペプチドを提供する。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、本発明は、上記ポリヌクレオチドにコードされている単離ポリペプチドを包含する。
【０１０３】
上記ポリペプチドの更なる実施形態では、前記ポリペプチドを含む抗体又はその断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。他の実施形態は、上記ポリペプチドを含む単離抗体又はその断片を含む。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、本発明は、単離されたＶＨをコードしているポリヌクレオチド及び単離されたＶＬをコードしているポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨをコードしているポリヌクレオチド及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号４及び配列番号６８；配列番号８及び配列番号７３；配列番号１４及び配列番号７８；配列番号２０及び配列番号８３；配列番号２６及び配列番号８８；配列番号３２及び配列番号９３；配列番号３８及び配列番号９８；配列番号４３及び配列番号１０３；配列番号４８及び配列番号１０８；配列番号５３及び配列番号１０３；配列番号５８及び配列番号１１３；並びに配列番号６３及び１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードしている核酸を含み、ＶＨ及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドによりコードされている抗体又はその断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する組成物を包含する。更なる実施形態では、前記ＶＨをコードしているポリヌクレオチド及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４及び配列番号６８；配列番号８及び配列番号７３；配列番号１４及び配列番号７８；配列番号２０及び配列番号８３；配列番号２６及び配列番号８８；配列番号３２及び配列番号９３；配列番号３８及び配列番号９８；配列番号４３及び配列番号１０３；配列番号４８及び配列番号１０８；配列番号５３及び配列番号１０３；配列番号５８及び配列番号１１３；並びに配列番号６３及び１１８から成る群から選択されるアミノ酸配列をコードしている核酸を含む。
【０１０５】
特定の他の実施形態では、包含物は、単離されたＶＨをコードしているポリヌクレオチド及び単離されたＶＬをコードしているポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨをコードしているポリヌクレオチド及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号４及び配列番号６８；配列番号８及び配列番号７３；配列番号１４及び配列番号７８；配列番号２０及び配列番号８３；配列番号２６及び配列番号８８；配列番号３２及び配列番号９３；配列番号３８及び配列番号９８；配列番号４３及び配列番号１０３；配列番号４８及び配列番号１０８；配列番号５３及び配列番号１０３；配列番号５８及び配列番号１１３；並びに配列番号６３及び１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列に対し、２０個未満の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるアミノ酸配列をコードしている核酸を含み、前記ＶＨ及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドにコードされている抗体又はその断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する組成物を提供する。更なる実施形態では、前記ＶＨをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号５、６、及び７；配列番号１０、１１、及び１２；配列番号１５、１６、及び１７；配列番号２１、２２、及び２３；配列番号２７、２８、及び２９；配列番号３３、３４、及び３５；配列番号３９、４０、及び４１；配列番号４４、４５、及び４６；配列番号４９、５０、及び５１；配列番号５４、５５、及び５６；配列番号５９、６０、及び６１；並びに配列番号６４、６５、及び６６から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＨポリペプチドをコードし、前記ＶＬをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号６９、７０、及び７１；配列番号７４、７５、及び７６；配列番号７９、８０、及び８１；配列番号８４、８５、及び８６；配列番号８９、９０、及び９１；配列番号９４、９５、及び９６；配列番号９９、１００、及び１０１；配列番号１０４、１０５、及び１０６；配列番号１０９、１１０、及び１１１；配列番号１１４、１１５、及び１１６；並びに配列番号１１９、１２０、及び１２１から成る群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＬポリペプチドをコードし、前記ＶＨ及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドにコードされている抗体又はその断片はＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
【０１０６】
上記組成物の種々の実施形態では、ＶＨをコードしているポリヌクレオチドは、抗体のＶＨポリペプチドに融合しているシグナルペプチドをコードしている核酸を更に含む。
【０１０７】
上記組成物の種々の実施形態では、ＶＬをコードしているポリヌクレオチドは、抗体のＶＬポリペプチドに融合しているシグナルペプチドをコードしている核酸を更に含む。
【０１０８】
上記組成物の幾つかの実施形態では、ＶＨをコードしているポリヌクレオチドは、ＶＨポリペプチドに融合している重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをコードしている核酸を更に含み、ＶＨポリペプチドに融合している重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをコードしている核酸を更に含み、ＶＨポリペプチドに融合している重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをコードしている核酸を更に含み、又はＶＨポリペプチドに融合している重鎖ヒンジ領域をコードしている核酸を更に含む。更なる実施形態では、重鎖定常領域はヒトＩｇＧ４である。特定の他の実施形態では、ＩｇＧ４に突然変異を誘発して、グリコシル化部位が除去される。更なる実施形態では、ＩｇＧ４の突然変異は、Ｋａｂａｔの付番方式を用いてＳ２４１Ｐ及びＴ３１８Ａを含む。
【０１０９】
上記組成物の幾つかの実施形態では、ＶＬをコードしているポリヌクレオチドは、ＶＬポリペプチドに融合している軽鎖定常領域ドメインをコードしている核酸を更に含む。更なる実施形態では、軽鎖定常領域はヒトκである。
【０１１０】
上記組成物の幾つかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドによりコードされている抗体又はその断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する。
【０１１１】
上記組成物の幾つかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドによりコードされている抗体又はその断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生される参照モノクローナル抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
【０１１２】
上記組成物の幾つかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬポリペプチドのフレームワーク領域は、５個以下のアミノ酸置換を除いてヒト由来である。
【０１１３】
上記組成物の幾つかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドによりコードされている抗体又はその断片は、直線状エピトープ又は非直線状立体構造エピトープに結合する。
【０１１４】
上記組成物の幾つかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドによりコードされている抗体又はその断片は多価であり、少なくとも２本の重鎖及び少なくとも２本の軽鎖を含む。
【０１１５】
上記組成物の幾つかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドによりコードされている抗体又はその断片は多特異的である。更なる実施形態では、ＶＨ及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドによりコードされている抗体又はその断片は二重特異性を有する。
【０１１６】
上記組成物の幾つかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドによりコードされている抗体又はその断片は、完全にヒト由来である重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む。更なる実施形態では、重鎖及び軽鎖可変ドメインは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片の重鎖及び軽鎖可変ドメインと同一である。
【０１１７】
上記組成物の幾つかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドによりコードされている抗体又はその断片は、マウス由来である重鎖及び軽鎖可変ドメインを含む。更なる実施形態では、重鎖及び軽鎖可変ドメインは、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインと同一である。
【０１１８】
上記組成物の種々の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片はヒト化されている。
【０１１９】
上記組成物の種々の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は霊長類化されている。
【０１２０】
上記組成物の種々の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片はキメラである。
【０１２１】
上記組成物の幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は完全にヒト由来である。
【０１２２】
上記組成物の種々の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、又はＦｖ断片である。上記組成物の特定の実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は単鎖抗体である。
【０１２３】
上記組成物の幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片、又はＩＧＦ−１Ｒ変異体ポリペプチドに特異的に結合する。
【０１２４】
上記組成物の幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片、又は非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片に比べて、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片に優先的に結合する。
【０１２５】
上記組成物の幾つかの実施形態では、核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片に結合し、また非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片にも結合する。
【０１２６】
上記組成物の幾つかの実施形態では、核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、細胞の表面上で発現しているＩＧＦ−１Ｒに結合する。更なる実施形態では、細胞は悪性細胞、新生物性細胞、腫瘍細胞、又は転移細胞である。
【０１２７】
上記組成物の幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片は、インスリン成長因子がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。更なる実施形態では、インスリン成長因子は、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）又はインスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）である。上記組成物の特定の他の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのをブロックする。
【０１２８】
上記組成物の幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片は、ＩＧＦ−１Ｒ仲介性細胞増殖を阻害する、ＩＧＦ−１若しくはＩＧＦ−２の仲介するＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する、腫瘍細胞の増殖を阻害する、又はＩＧＦ−１Ｒの内在化を阻害する。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、上記組成物、ＶＨをコードしているポリヌクレオチド、ＶＬをコードしているポリヌクレオチド、又はＶＨ及びＶＬの両方をコードしているポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドをコードしている核酸を更に含む。
【０１３０】
上記組成物の幾つかの実施形態では、前記核酸にコードされているポリペプチドを含む抗体又は抗原結合断片は、細胞傷害性剤、治療剤、細胞分裂抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答調節物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体又はその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び任意の前記剤の２種以上の組み合わせから成る群から選択される剤に複合体化する、又は前記剤と併用される。更なる実施形態では、細胞傷害性剤（ＩＧＦ−１Ｒ抗体との複合体として用いられる、又は併用される）は、放射性核種、生物毒素、酵素活性毒素、細胞分裂抑制若しくは細胞傷害性治療剤、プロドラッグ、免疫活性リガンド、生体応答調節物質、又は任意の前記細胞傷害性剤の２種以上の組み合わせから成る群から選択される。特定の他の実施形態では、検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射活性標識、又は任意の前記検出可能な標識の２種以上の組み合わせから成る群から選択される。
【０１３１】
上記組成物の幾つかの実施形態では、ＶＨをコードしているポリヌクレオチドは第１のベクターに含まれ、ＶＬをコードしているポリヌクレオチドは第２のベクターに含まれる。更なる実施形態では、ＶＨをコードしているポリヌクレオチドは、第１のプロモータに機能的に連結しており、ＶＬをコードしているポリヌクレオチドは第２のプロモータに機能的に連結している。特定の他の実施形態では、第１及び第２のプロモータは同一プロモータのコピーである。更なる実施形態では、第１及び第２のプロモータは同一ではない。
【０１３２】
上記組成物の種々の実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターは単一宿主細胞に含まれる。
【０１３３】
上記組成物の特定の他の実施形態では、第１のベクター及び第２のベクターは別々の宿主細胞に含まれる。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、本発明は、上記宿主細胞を培養することと、抗体又はその断片を回収することとを含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片を産生する方法を包含する。
【０１３５】
他の実施形態では、本発明は、別個の宿主細胞を共培養することと、抗体又はその断片を回収することとを含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片を産生する方法を包含する。上記方法の更なる実施形態では、本発明は、ＶＨをコードしているポリヌクレオチドとＶＬをコードしているポリヌクレオチドとを組み合わせることと、抗体又はその断片を回収することとを提供する。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、本発明は、上記方法により産生される、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片を包含する。
【０１３７】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＶＨをコードしているポリヌクレオチド及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドが同じベクター上に存在する組成物、並びに該組成物中のベクターを包含する。
【０１３８】
上記ベクターの種々の実施形態では、ＶＨをコードしているポリヌクレオチド及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドはそれぞれプロモータに機能的に連結している。
【０１３９】
上記ベクターの種々の実施形態では、ＶＨをコードしているポリヌクレオチド及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドはインフレームで融合し、それらと機能的に連結している単一プロモータから同時転写され、単鎖抗体又はその抗原結合断片に同時翻訳される。
【０１４０】
上記ベクターの種々の実施形態では、ＶＨをコードしているポリヌクレオチド及び前記ＶＬをコードしているポリヌクレオチドは、それらと機能的に連結している単一プロモータから同時転写されるが、別々に翻訳される。更なる実施形態では、ベクターはＶＨをコードしているポリヌクレオチドとＶＬをコードしているポリヌクレオチドとの間に配置されたＩＲＥＳ配列を更に含む。特定の他の実施形態では、ＶＨをコードしているポリヌクレオチド及びＶＬをコードしているポリヌクレオチドは、それぞれ別個のプロモータに機能的に連結しており、別々に転写される。更なる実施形態では、別個のプロモータは同一プロモータのコピーである、又は別個のプロモータは非同一である。
【０１４１】
幾つかの実施形態では、本発明は上記ベクターを含む宿主細胞を包含する。
【０１４２】
他の実施形態では、本発明は、上記宿主細胞を培養することと、抗体又はその断片を回収することとを含む、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片を産生する方法を包含する。
【０１４３】
幾つかの実施形態では、本発明は、上記方法により産生される、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片を包含する。
【０１４４】
幾つかの実施形態では、本発明は、動物における過剰増殖性障害を治療する方法であって、ａ）上記単離抗体又はその断片と、ｂ）薬学的に許容できる担体とを含む組成物を、治療を必要としている動物に投与することを含む方法を包含する。更なる実施形態では、本発明は、動物における過剰増殖性障害を治療する方法であって、ａ）上記単離抗体又はその断片と、ｂ）過剰増殖性障害の治療に有用な１種以上の更なる剤と、ｃ）薬学的に許容できる担体とを含む組成物を、治療を必要としている動物に投与することを含む方法を包含する。更なる実施形態では、本発明は、動物における過剰増殖性障害を治療する方法であって、ａ）上記単離抗体又はその断片と、薬学的に許容できる担体とを含む組成物、及びｂ）過剰増殖性障害の治療に有用な１種以上の更なる剤と、薬学的に許容できる担体とを含む１種以上の別個の組成物（前記別個の組成物は、同時に又は順次、任意の順序で、任意の期間投与される）を、治療を必要としている動物に投与することを含む方法を包含する。更なる実施形態では、過剰増殖性障害は、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、又はこれらの転移から成る群から選択される。
【０１４５】
上記方法の種々の実施形態では、抗体又はその断片は悪性細胞の表面上で発現しているＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。更なる実施形態では、抗体又はその断片が悪性細胞に結合することにより、悪性細胞の増殖が阻害される。
【０１４６】
上記方法の種々の実施形態では、抗体又はその断片はＩＧＦが悪性細胞に結合するのを阻害する。更なる実施形態では、ＩＧＦはＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２である。
【０１４７】
上記方法の種々の実施形態では、抗体又はその断片は、ＩＧＦ−１が前記悪性細胞に結合するのを阻害するが、ＩＧＦ−２は阻害しない。特定の他の実施形態では、抗体又はその断片は、ＩＧＦ−２が前記悪性細胞に結合するのを阻害するが、ＩＧＦ−１は阻害しない。
【０１４８】
上記方法の種々の実施形態では、抗体又はその断片は、ＩＧＦ−１Ｒの悪性細胞への内在化を促進する。
【０１４９】
上記方法の種々の実施形態では、抗体又はその断片は、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する、又は腫瘍細胞の増殖を阻害する。更なる実施形態では、腫瘍細胞の増殖は、転移増殖の阻止又は遅延を通して阻害される。
【０１５０】
上記方法の種々の実施形態では、抗体又はその断片は腫瘍細胞の遊走を阻害する。更なる実施形態では、腫瘍細胞の増殖は、隣接組織への腫瘍の広がり阻止又は遅延を通して阻害される。
【０１５１】
上記方法の種々の実施形態では、過剰増殖性疾患又は障害は、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎腺、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭部、頸部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、又は泌尿生殖器管に位置する新生物である。
【０１５２】
上記方法の種々の実施形態では、過剰増殖性疾患又は障害は癌であり、前記癌は、扁平上皮細胞癌、黒色腫、白血病、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、及び頭頸部癌から成る群から選択される。更なる実施形態では、癌は、胃癌、腎臓癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵癌、卵巣癌、及び前立腺癌から成る群から選択される。
【０１５３】
上記方法の種々の実施形態では、動物は哺乳類である。更なる実施形態では、哺乳類はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】ＩＧＦ−１Ｒ特異的Ｆａｂの結合活性。（Ａ）ＥＬＩＳＡによる、組み換えＩＧＦ−１Ｒ−ｈｉｓ及びＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃタンパク質に対する精製抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ抗体の結合。（Ｂ）フローサイトメトリーによる、３Ｔ３上で発現しているヒトＩＧＦ−１Ｒに対する精製抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ抗体の結合。
【図２】ＭＣＦ−７上で発現しているＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂの結合活性。
【図３】抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂは、ＭＣＦ７細胞における（Ａ）ＩＧＦ−１及び（ｂ）ＩＧＦ−２誘導性リン酸化を阻害した。
【図４】ＥＬＩＳＡによる、可溶性ＩＧＦ−１Ｒ（Ａ）及びＩＮＳＲ（Ｂ）に対するＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ断片抗体の結合。
【図５】完全ヒトＭ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３抗体のＧ４．Ｐ．ａｇｌｙバージョンの非還元及び還元ＳＤＡ  ＰＡＧＥ分析。
【図６】ＥＬＩＳＡにより測定した、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の完全ヒトＧ４．Ｐ（Ａ）及びＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｂ）バージョンの結合活性。
【図７】ＭＣＦ−７（Ａ）、ＩＧＦ−１Ｒ／３Ｔ３（Ｂ）細胞上で発現しているＩＧＦ−１Ｒに対する完全ヒト抗体の結合をフローサイトメトリーにより測定した。ＭＣＦ−７に対する結合ＥＣ５０は、２．７−１２×１０−１０ｎＭの範囲であった。
【図８】ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１（Ａ）及びＩＧＦ−２（Ｂ）の結合をブロックする完全ヒト抗体のＧ４バージョンの能力を、ＲＩＡにより測定した。
【図９】（Ａ）完全ヒト抗体のＧ４バージョンによる、ＩＧＦ−１に応答するＨ−２３腫瘍細胞増殖の阻害；（Ｂ）完全ヒト抗体のＧ４バージョンによる、ＩＧＦ−２に応答するＨ−２３腫瘍細胞増殖の阻害；（Ｃ）完全ヒト抗体のＧ４バージョンによる、ＩＧＦ−１に応答するＣａｌｕ−６腫瘍細胞増殖の阻害。
【図１０】Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ及びＭ１４．Ｇ１１．Ｐ抗体によるＩＧＦ−１（Ａ）及びＩＧＦ−２（Ｂ）により駆動されるリン酸化の阻害。
【図１１】Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙによる下流シグナル伝達の阻害。（Ａ）Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ａｋｔ（Ｔｈｒ３０８）及び全Ａｋｔを、それぞれ上段及び下段に示す。（Ｂ）Ｔｏｐ  Ｐｈｏｓｐｈｏ  ｐ４４／４２ＭＡＰＫ及び全ｐ４４／４２ＭＡＰＫを、それぞれ上段及び下段に示す。
【図１２】選択されたＩＧＦ−１ＲｍＡｂによるＩＧＦ−１仲介性腫瘍細胞成長の阻害。（Ａ）Ｈ２３；（Ｂ）Ｃａｌｕ−６；（Ｃ）Ｐａｎｃ−１；（Ｄ）ＢｘＰＣ３；（Ｅ）ＭａＰａＣａ；及び（Ｆ）Ｃｏｌｏ２０５。バーは、平均及びＳＤを表す。
【図１３】抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体による、Ｈ−２３細胞のＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２に駆動される増殖の阻害。
【図１４】Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体による、ＢｘＰＣ３細胞増殖（組換えヒトＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２により駆動される）の阻害。
【図１５】Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体による、ＮＣＩ−Ｈ２３細胞増殖（組換えヒトＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２により駆動される）の阻害。
【図１６】Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体による、Ａ５４９細胞増殖（組換えヒトＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２により駆動される）の阻害。
【図１７】完全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体による、アミノ酸残基Ｓｅｒ４７３におけるＡｋｔのＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２誘導性リン酸化の阻害。
【図１８】完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、膵癌モデルにおいて腫瘍成長のインビボ用量依存性阻害を示す。
【図１９】完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、肺癌モデルにおいて腫瘍成長のインビボ用量依存性阻害を示す。
【図２０】ゲムシタビンと併せて投与された完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、腫瘍成長の阻害効率の上昇を示す。
【図２１】完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、確立されたカニクイザル線維芽細胞株で発現しているＩＧＦ−１Ｒに結合する。
【図２２】ＩＧＦ−１Ｒ抗体結合エピトープの交差競合結合分析。
【図２３】ＩＲＳ−１及びｐ８５（ＰＩ３Ｋの制御サブユニット）の同時免疫沈降は、ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達のＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ仲介性阻害を示す。
【図２４】哺乳動物細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲの免疫沈降により、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体はＩＧＦ−１Ｒに結合するがインスリン受容体には結合しないことが示される。ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲタンパク質は、マウス抗−ヒトＩＲ（Ａ）又はマウス抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒ（Ｂ）を用いた免疫ブロット（ウェスタンブロット）によって検出された。
【図２５】（Ａ）ｈＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃ及び（Ｂ）ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＭ１３−Ｃ０６Ｆａｂの相対結合親和性測定。ｘ軸及びｙ軸の目盛りは、（Ａ）及び（Ｂ）について同じである。結合フィットの残差を各パネルの下部に示し、各受容体に対するＭ１３−Ｃ０６の相対親和性の測定における１：１結合モデルの適用性を示す。
【図２６】ＩＧＦ−１Ｒ突然変異体タンパク質ＳＤ００６（結合陽性）及びＳＤ０１５（結合陰性）に結合する抗体と比較した、ＳＰＲアッセイにおけるｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ及びｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ対照に結合するＭ１３．Ｃ０６抗体の例。
【図２７】ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲの構造を表す。Ａ）ＩＧＦ−１Ｒの構造の概略図。ＦｎＩＩＩ−２は、図に示すようにインビボでタンパク質分解処理されるループ構造を含む。膜貫通領域は、リン脂質二重層の概略図を横断するヘリカルループとして示す。ＩＧＦ−１Ｒ内のＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合部位の位置を星印で示す。１個のＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２分子のみが各ＩＧＦ−１Ｒヘテロ二量体分子に結合することが示されている。Ｂ及びＣ）相同ＩＮＳＲの構造の表面にマッピングされたＭ１３−Ｃ０６  ＩＧＦ−１Ｒ結合エピトープ。Ｍ１３−Ｃ０６  ＩＧＦ−１Ｒ結合エピトープを、高相同性ＩＮＳＲ結晶構造に基づいてモデル化した。Ｂ）ＩＧＦ−１ＲのＶ４６２−Ｈ４６４の相同的位置に対応するアミノ酸残基位置（すなわち、ＩＮＳＲのＬ４７２−Ｋ４７４）を有するＩＮＳＲの構造の表面に、黒色の陰影を付す。ＩＧＦ−１Ｒ（例えば、本明細書に記載される切頭型ＩＧＦ−１Ｒ（１−４６２）−Ｆｃコンストラクトに含まれる）に対応する最初の３つのドメイン（すなわち、Ｌ１−ＣＲ−Ｌ２）に、灰色の陰影を付す。Ｃ）溶媒に表面領域を露出し且つＩＧＦ−１Ｒの４６２−４６４に対応する残基（すなわち、ＩＮＳＲの４７２−４７４）の半径１４Å（オングストローム）（又は直径２８Å）内にある残基を有するＩＮＳＲの表面に、黒色の陰影を付す。提案されたエピトープの実験的に確認された表面領域を示すために、ＩＧＦ−１Ｒアミノ酸４６２−４６４に対応する残基に灰色の陰影を付す。
【図２８】Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体で処理されたマウス腫瘍におけるインビボＩＧＦ−１Ｒ発現の免疫ブロット（ウェスタンブロット）分析。
【図２９】原発性ヒト結腸腫瘍から生じた腫瘍におけるＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙのインビボ抗腫瘍活性。
【図３０】乳癌（ＭＣＦ−７）細胞から生じた腫瘍におけるＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙのインビボ抗腫瘍活性。
【図３１】Ｍ１３−Ｃ０６抗体は、インビトロＡＤＣＣ活性を示さない。
【図３２】抗体Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、及びαＩＲ３による、ビオチン化ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓの結合阻害。
【図３３】抗体Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、及びαＩＲ３による、ビオチン化ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するヒトＩＧＦ−２  Ｈｉｓの結合阻害。
【図３４】ビオチン化ｈＩＧＦ−１Ｒに対するヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓの結合を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ。ヒトＩＧＦ−１  ＨｉｓをＰＢＳＴ（円形）、および２μＭのＭ１３−Ｃ０６を含有するＰＢＳＴ（四角形）で段階希釈した。
【図３５】突然変異がＭ１３−Ｃ０６のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する結合に影響を及ぼした残基を、相同ＩＲ外部ドメイン構造にマッピングした。ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基４１５、４２７、４６８、４７８及び５３２の突然変異は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体結合に対して検出可能な効果をもたらさなかった。ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基４６６、４６７、５３３、５６４及び５６５の突然変異は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体結合に対して弱い負の効果を示した。ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基４５９、４６０、４６１、４６２、４６４、４８２、４８３、４９０、５７０及び５７１の突然変異は、Ｍ１３−Ｃ０６抗体結合に対して強い負の効果を示した。突然変異分析結果の集計については表２０を参照。
【図３６】突然変異がＭ１４−Ｇ１１のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する結合に影響を及ぼした残基を、ヒトＩＧＦ−１Ｒの最初の３つの外部ドメイン構造にマッピングした。ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基２８、２２７、２３７、２８５、２８６、３０１、３２７及び４１２の突然変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体結合に対して検出可能な効果はもたらさなかった。ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基２５７、２５９、２６０、２６３及び２６５の突然変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体結合に対して弱い負の効果を示した。ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基２５４の突然変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体結合に対して中程度の負の効果を示した。ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基２４８及び２５０の突然変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体結合に対して強い負の効果を示した。突然変異分析結果の集計については表２０を参照。
【図３７】突然変異がαＩＲ３及びＰ１Ｅ２のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する結合に影響を及ぼす残基を、ヒトＩＧＦ−１Ｒの最初の３つの外部ドメイン構造にマッピングした。ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基２８、２２７、２３７、２５０、２５９、２６０、２６４、２８５、２８６、３０６及び４１２の突然変異は、抗体結合に対して検出可能な効果をもたらさなかった。ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基２５７、２６３、３０１、３０３、３０８、３２７及び３８９の突然変異は、抗体結合に対して弱い負の効果を示した。ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基２４８及び２５４の突然変異は、Ｍ１４−Ｇ１１抗体結合に対して中程度の負の効果を示した。ＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基２６５の突然変異は、抗体結合に対して強い負の効果を示した。突然変異分析結果の集計については表２０を参照。
【図３８】別個のＩＧＦ−１Ｒエピトープの組み合わせ抗体ターゲティングを通して、無血清条件下でＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２により刺激されるＢＸＰＣ３（膵癌細胞株）細胞成長の阻害増強を示す。
【図３９】５００ｎＭ〜５ｎＭの濃度の等モル量のＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｃ０６）及びＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｇ１１）抗体を併用すると、対応する同抗体濃度においていずれかの抗体のみで観察される結果と比べて、ＢＸＰＣ３細胞成長の阻害が著しく増強されることを示す。
【図４０】１０％ウシ胎児血清の存在下にて、標準的な細胞培養条件下で成長したＨ３２２Ｍで観察された効果の例を示し、この場合いずれかの抗体のみと比べて、Ｃ０６／Ｇ１１抗体を併用すると細胞成長がより著しく阻害される。
【図４１Ａ】ＮＳＣＬＣ細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びエルロチニブ単独並びに併用の効果を示す。
【図４１Ｂ】ＮＳＣＬＣ細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びエルロチニブ単独並びに併用の効果を示す。
【図４２】膵癌細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びエルロチニブ単独並びに併用の効果を示す。
【図４３】結腸癌細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びエルロチニブ単独並びに併用の効果を示す。
【図４４】ＮＳＣＬＣ細胞におけるＡＫＴ及びＭＡＰＫシグナル伝達に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びエルロチニブ単独並びに併用の効果を示す。
【図４５Ａ】Ｍ１３−Ｃ０６は、播種性Ａ５４９肺腫瘍モデルにおいて、単一剤として抗腫瘍活性を仲介し（Ａ）、Ｔａｒｃｅｖａの抗腫瘍活性を高める（Ｂ）ことを示す。
【図４５Ｂ】Ｍ１３−Ｃ０６は、播種性Ａ５４９肺腫瘍モデルにおいて、単一剤として抗腫瘍活性を仲介し（Ａ）、Ｔａｒｃｅｖａの抗腫瘍活性を高める（Ｂ）ことを示す。
【図４６Ａ】ＮＳＣＬＣ細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びラパマイシン単独並びに併用の効果を示す。
【図４６Ｂ】ＮＳＣＬＣ細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びラパマイシン単独並びに併用の効果を示す。
【図４７】膵癌細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びラパマイシン単独並びに併用の効果を示す。
【図４８】結腸癌細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びラパマイシン単独並びに併用の効果を示す。
【図４９】肉腫細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びラパマイシン単独並びに併用の効果を示す。
【図５０】ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＡＫＴ及びＳ６Ｋシグナル伝達に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びラパマイシン単独並びに併用の効果を示す。
【図５１】肉腫株におけるＡＫＴ及びＳ６Ｋシグナル伝達に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びラパマイシン単独並びに併用の効果を示す。
【図５２】Ｍ１３−Ｃ０６は、ＳＫ−ＥＳ−１肉腫モデルにおいて、単一剤として腫瘍成長を阻害することを示す。
【図５３Ａ】ＮＳＣＬＣ細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びＰＤ０３２５９０１単独並びに併用の効果を示す。
【図５３Ｂ】ＮＳＣＬＣ細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びＰＤ０３２５９０１単独並びに併用の効果を示す。
【図５４】膵癌細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びＰＤ０３２５９０１単独並びに併用の効果を示す。
【図５５】結腸癌細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びＰＤ０３２５９０１単独並びに併用の効果を示す。
【図５６Ａ】ＮＳＣＬＣ細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びＰＩ−１０３単独並びに併用の効果を示す。
【図５６Ｂ】ＮＳＣＬＣ細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びＰＩ−１０３単独並びに併用の効果を示す。
【図５７】膵癌細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びＰＩ−１０３単独並びに併用の効果を示す。
【図５８】結腸癌細胞の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びＰＩ−１０３単独並びに併用の効果を示す。
【図５９】２つの肝細胞癌細胞株の成長に対する、Ｍ１３−Ｃ０６及びソラフェニブ単独並びに併用の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５５】
本出願は、以下の文献の全文を参照することにより本明細書に組み込む：米国仮特許出願第６０／７８６，３４７号（２００６年３月２８日出願）；米国仮特許出願第６０／８７６，５５４号（２００６年１２月２２日出願）；米国特許出願第１１／７２７，８８７号（２００７年３月２８日出願）；米国仮特許出願第６０／９６８，５４０号（２００７年８月２８日出願）；米国特許出願第１２／２００，７６６号（２００８年８月２８日出願）；米国仮特許出願第６１／０７１，０８７号（２００８年４月１１日出願）；国際公開第２００７／１２６８７６号（ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００７６６４；２００７年３月２８日出願；２００７年１１月８日公開）；及び国際公開第２００９／０３２１４５号（ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０１７６；２００８年８月２８日出願；２００９年３月１２日公開）。
【０１５６】
本発明は、併用療法、特に２種以上の治療剤の併用による過剰増殖性障害（例えば癌）の治療に関する。具体的には、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒに結合する抗体を他の治療剤と併用して、細胞成長及び増殖、発癌、腫瘍発生、及び／若しくは転移を低減する並びに／又は排除することに関する。本発明の併用療法は、単一剤による治療効果と比較したとき、癌の治療、並びに細胞の過剰増殖、発癌、腫瘍発生、及び／又は転移の低減において相乗効果を有し得る。本発明の併用には、ＩＧＦ−１Ｒに結合する抗体（又はその断片）と、過剰増殖性疾患又は障害の治療に対して治療的に有用である任意の更なる剤との併用（前記更なる剤が抗過剰増殖活性を有していようといまいと）が含まれる。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体と併用される更なる剤は、更なる剤が抗癌活性を全く有することなしに、症状を低減又は軽減するという理由で癌治療に対して有用であり得る。したがって、本発明の併用は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と更なる剤（１又は複数）との提供であって、前記更なる剤（１又は複数）が治療される対象にとって有益な活性を介して（たとえかかる活性が抗過剰増殖性でなかろうとも）癌の治療を補助する提供を含む。例は、抗過剰増殖活性を有するＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と、赤血球細胞の増殖を刺激するが抗貧血活性を有することにより癌治療において有益であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）との併用である。
【０１５７】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と更なる剤との併用はまた、本明細書で具体的に又は一般的に特定される特定の薬剤、化合物、化学物質、又は分子のいずれにも限定されない。実際、過剰増殖性疾患又は障害の治療において治療的に有用であり得る更なる薬剤、化合物、化学物質、又は分子はいずれも、ＩＧＦ−１Ｒ（又はその断片）と併用されて、前記疾患又は障害の治療に効果を及ぼし得る。したがって、本明細書で具体的に又は一般的に特定される全ての薬剤、化合物、化学物質、又は分子は、単に例を提供する手段として特定され、いかなる方法においても本発明の併用を限定することを意図するものではない。更に、本発明の実施形態は、過剰増殖性疾患又は障害の治療において有用であり得る第２の、第３の、第４の、第５の、第６の、第７の、第８の、第９の、第１０の、及び任意のこれより多い数の更なる剤（例えば１０〜２０、２０〜１００、１００〜１０００、１０００〜１００００００の範囲、又は１，０００，０００超の任意の数の更なる剤）との併用を含む。
【０１５８】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と併用され得る化学療法化合物の幾つかの具体例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
１３−シス−レチノイン酸              ＡＣＣＵＴＡＮＥ（登録商標）
２−ＣＤＡ                            アクチノマイシン−Ｄ
２−クロロデオキシアデノシン          ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）
５−アザシチジン                      ＡＤＲＵＣＩＬ（登録商標）
５−フルオロウラシル                  ＡＧＲＹＬＩＮ（登録商標）
５−ＦＵ                              ＡＬＡ−ＣＯＲＴ（登録商標）
６−メルカプトプリン                  アルデスロイキン
６−ＭＰ                              アレムツズマブ
６−ＴＧ                              ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）
６−チオグアニン                      アリトレチノイン
ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）          ＡＬＫＡＢＡＮ−ＡＱ（登録商標）
ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標）            ブスルファン
オールトランスレチノイン酸            ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標）
αインターフェロン                    Ｃ２２５  ＣＡＬＣＩＵＭ  ＬＥＵＣＯＶＯＲ
ＩＮ（登録商標）
アルトレタミン                        ＣＡＭＰＡＴＨ（登録商標）
アメトプテリン                        ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）
アミホスチン                          カンプトセシン−１１
アミノグルテチミド                    カペシタビン
アナグレリド                          ＣＡＲＡＣ（登録商標）
ＡＮＡＮＤＲＯＮ（登録商標）          カルボプラチン
アナストロゾール                      カルムスチン
アラビノシルシトシン                  カルムスチンウエハ
ＡＲＡ−Ｃ                            ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標）
ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）            ＣＣ−５０１３
ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）              ＣＣＩ−７７９
ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）          ＣＣＮＵ（１−（２−クロロエチル）−３−
ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）            シクロへキシル−１−ニトロソ尿素）
ＡＲＲＡＮＯＮ（登録商標）            ＣＤＤＰ（シス−
三酸化ヒ素                              ジアンミンジクロロ白金）
アスパラギナーゼ                      ＣＥＥＮＵ（登録商標）
ＡＴＲＡＧＥＮ（登録商標）            ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標）
ＡＴＲＡ−ＩＶ                        セツキシマブ
ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）            クロラムブシル
アザシチジン                          シスプラチン
ＡＺＤ６２４４
（ＡＲＲＹ−１４２８８６）            シトロボラム因子
ＢＣＧ（カルメット−ゲラン菌）        クラドリビン
ＢＣＮＵ（１，３−ビス（２−          コルチゾン
クロロエチル）−１−ニトロソ尿素）  ＣＯＳＭＥＧＥＮ（登録商標）
ベバシズマブ                          ＣＰＴ−１１
ベキサロテン                          シクロホスファミド
ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）              ＣＹＴＡＤＲＥＮ（登録商標）
ビカルタミド                          シタラビン
ＢＩＣＮＵ（登録商標）                リポソームシタラビン
ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標）        ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標）
ブレオマイシン                        ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）
ボルテゾミブ                          ダカルバジン
ＤＡＣＯＧＥＮ（登録商標）            ＥＬＬＥＮＣＥ（登録商標）
ダクチノマイシン                      ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）
ダルベポエチンα                      ＥＬＳＰＡＲ（登録商標）
ダサチニブ                            ＥＭＣＹＴ（登録商標）
ダウノマイシン                        エピルビシン
ダウノルビシン                        エポエチンα
塩酸ダウノルビシン                    ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）
リポソームダウノルビシン              エルロチニブ
ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標）        エルウィニア属Ｌ−アスパラギナーゼ
ＤＥＣＡＤＲＯＮ（登録商標）          エストラムスチン
デシタビン                            エチヨル
デホロリムス（ＡＰ２３５７３）        ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ（登録商標）
ＤＥＬＴＡ−ＣＯＲＴＥＦ（登録商標）  エトポシド
ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（登録商標）        リン酸エトポシド
デニロイキンジフチトクス              ＥＵＬＥＸＩＮ（登録商標）
ＤＥＰＯＣＹＴ（登録商標）            ＥＶＩＳＴＡ（登録商標）
デキサメタゾン                        エキセメスタン
酢酸デキサメタゾン                    ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）
デキサメタゾンリン酸ナトリウム        ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）
ＤＥＸＡＳＯＮＥ（登録商標）          ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）
デクスラゾキサン                      フィルグラスチム
ＤＨＡＤ                              フロクスウリジン
（ジヒドロキシアントラセンジオン）  ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標）
ＤＩＣ（ダカルバジン）                フルダラビン
ＤＩＯＤＥＸ（登録商標）              ＦＬＵＯＲＯＰＬＥＸ（登録商標）
ドセタキセル                          フルオロウラシル
ＤＯＸＩＬ（登録商標）                フルオロウラシル（クリーム）
ドキソルビシン                        フルオキシメステロン
リポソームドキソルビシン              フルタミド
ＤＲＯＸＩＡ（登録商標）              フォリン酸
ＤＴＩＣ（ダカルバジン）              ＦＵＤＲ（登録商標）
ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標）        フルベストラント
ＤＵＲＡＬＯＮＥ（登録商標）          Ｇ−ＣＳＦ
ＥＦＵＤＥＸ（登録商標）              ゲフィチニブ
ＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標）            ゲムシタビン
ゲムツズマブオゾガマイシン            インターフェロンα
ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）              インターフェロンα−２Ｂ（ＰＥＧ
ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）              複合体）  
ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標）ウエハ      インターロイキン−２
ＧＭ−ＣＳＦ                          インターロイキン−１１
ゴセレリン                            ＩＮＴＲＯＮ  Ａ（登録商標）
（インターフェロンα−２Ｂ）
顆粒球コロニー刺激                    ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）
因子                                イリノテカン
顆粒球マクロファージコロニー          イソトレチノイン
刺激因子                            ＫＩＤＲＯＬＡＳＥ（登録商標）
ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮ（登録商標）      ＬＡＮＡＣＯＲＴ（登録商標）
ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）        ラパチニブ
ＨＥＸＡＤＲＯＬ（登録商標）          Ｌ−アスパラギナーゼ
ＨＥＸＡＬＥＮ（登録商標）            ＬＣＲ
ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）        レナリドミド
ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）          レトロゾール
ＨＹＤＲＥＡ（登録商標）              ロイコボリン
ＨＹＤＲＯＣＯＲＴ                    ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標）
ＡＣＥＴＡＴＥ（登録商標）        ＬＥＵＫＩＮＥ（登録商標）
ヒドロコルチゾン                      ロイプロリド
リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム      リューロクリスチン
コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム    ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（登録商標）
リン酸ハイドロコートン                リポソームＡＲＡ−Ｃ
ヒドロキシウレア                      ＬＩＱＵＩＤ  ＰＲＥＤ（登録商標）
イブリツモマブ                        ロムスチン
イブリツモマブチウキセタン            Ｌ−ＰＡＭ
ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標）          Ｌ−サルコリシン
イダルビシン                          ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）
ＩＦＥＸ（登録商標）                  ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）
ＩＦＮ−α                            ＭＡＴＵＬＡＮＥ（登録商標）
イホスファミド                        ＭＡＸＩＤＥＸ（登録商標）
ＩＬ−１１                            メクロレタミン
ＩＬ−２                              塩酸メクロレタミン
メシル酸イマチニブ                    ＭＥＤＲＡＬＯＮＥ（登録商標）
イミダゾールカルボキサミド            ＭＥＤＲＯＬ（登録商標）
ＭＥＧＡＣＥ（登録商標）              ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標）
メゲストロール                        オクトレオチド
酢酸メゲストロール                    酢酸オクトレオチド
メルファラン                          ＯＮＣＯＳＰＡＲ（登録商標）
メルカプトプリン                      ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標）
メスナ                                ＯＮＴＡＫ（登録商標）
ＭＥＳＮＥＸ（登録商標）              ＯＮＸＡＬ（商標）
メトトレキサート                      オプレルベキン
メトトレキサートナトリウム            ＯＲＡＰＲＥＤ（登録商標）
メチルプレドニゾロン                  ＯＲＡＳＯＮＥ（登録商標）
ＭＥＴＩＣＯＲＴＥＮ（登録商標）      オキサリプラチン
マイトマイシン                        パクリタキセル
マイトマイシン−Ｃ                    タンパク質結合パクリタキセル
ミトキサントロン                      パミドロネート
Ｍ−ＰＲＥＤＮＩＳＯＬ（登録商標）    パニツムマブ
ＭＴＣ（マイトマイシン−Ｃ）          ＰＡＮＲＥＴＩＮ（登録商標）
ＭＴＸ（メトトレキサート）            ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標）
ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標）        ＰＥＤＩＡＰＲＥＤ（登録商標）
ムスチン                              ＰＥＧインターフェロン
ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標）        ペグアスパルガーゼ
ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標）            ペグフィルグラスチム
ＭＹＬＯＣＥＬ（商標）                ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）
ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）          ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ
ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）        ペメトレキセド
ネララビン                            ペントスタチン
ＮＥＯＳＡＲ（登録商標）              フェニルアラニンマスタード
ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標）          ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標）
ＮＥＵＭＥＧＡ（登録商標）            ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ（登録商標）
ＮＥＵＰＯＧＥＮ（登録商標）          プレドニゾロン
ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）            プレドニゾン
ＮＩＬＡＮＤＲＯＮ（登録商標）        ＰＲＥＬＯＮＥ（登録商標）
ニルタミド                            プロカルバジン
ＮＩＰＥＮＴ（登録商標）              ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標）
ナイトロジェンマスタード              ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）
ＮＯＶＡＬＤＥＸ（登録商標）          プロライフプロスパン２０
ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（登録商標）      ＴＨＩＯＧＵＡＮＩＮＥ  ＴＡＢＬＯＩＤ
（登録商標）
ラロキシフェン                        チオホスホアミド
ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標）          ＴＨＩＯＰＬＥＸ（登録商標）
ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（登録商標）      ＴＨＩＯＴＥＰＡ（商標）
ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）            ＴＩＣＥ（登録商標）
リツキシマブ                          ＴＯＰＯＳＡＲ（登録商標）
ＲＯＦＥＲＯＮ−Ａ（登録商標）        トポテカン
（ＩＮＴＥＲＦＥＲＯＮ  ＡＬＰＨＡ−２Ａ）
ＲＵＢＥＸ（登録商標）                トレミフェン
塩酸ルビドマイシン                    ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）
ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（登録商標）    トシツモマブ
ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ  
ＬＡＲ（登録商標）                  トラスツズマブ
サルグラモスチム                      トレチノイン
ＳＯＬＵ−ＣＯＲＴＥＦ（登録商標）    ＴＲＥＸＡＬＬ（登録商標）
ＳＯＬＵ−ＭＥＤＲＯＬ（登録商標）    ＴＲＩＳＥＮＯＸ（登録商標）
ソラフェニブ                          ＴＳＰＡ
ＳＰＲＹＣＥＬ（登録商標）              （トリエチレンチオホスホルアミド）
ＳＴＩ−５７１                        ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）
ストレプトゾシン                      ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）
スニチニブ                            ＶＣＲ（ビンクリスチン）
ＳＵ１１２４８                        ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）
ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）              ＶＥＬＢＡＮ（登録商標）
タモキシフェン                        ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）
ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）            ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標）
ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標）        ＶＥＳＡＮＯＩＤ（登録商標）
ＴＡＸＯＬ（登録商標）                ＶＩＡＤＵＲ（登録商標）
ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）          ＶＩＤＡＺＡ（登録商標）
ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）            ビンブラスチン
テモゾロマイド                        硫酸ビンブラスチン
テムシロリムス                        ＶＩＮＣＡＳＡＲ  ＰＦＳ（登録商標）
テニポシド                            ビンクリスチン
ＴＥＳＰＡ                            ビノレルビン
サリドマイド                          酒石酸ビノレルビン
ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標）          ＶＬＢ
ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標）          ＶＭ−２６（登録商標）
チオグアニン                          ボリノスタット
ＶＰ−１６（商標）
ＶＵＭＯＮ（登録商標）
ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）
ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標）
ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）
ＺＩＮＥＣＡＲＤ（登録商標）
ＺＯＬＡＤＥＸ（登録商標）
ゾレドロン酸
ＺＯＬＩＮＺＡ（登録商標）
ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）
【０１５９】
上に示し、本明細書で論じる例に加えて、更なる化学療法剤（同じ細胞標的と相互作用し、また本明細書に引用した例と比べて新規及び異なる細胞標的とも相互作用する）が開発され続けていることも認識される。したがって、将来開発される更なる化学療法剤を、過剰増殖性障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体と併用し得ることも想到される。
【０１６０】
当業者は、過剰増殖性疾患及び障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と併用し得る化合物について多数の情報源が存在することを認識する。かかる参考文献の幾つかの例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：
・2008 Physicians’Desk Reference(登録商標)(PDR) (ISBN-10 1563636603)；
・Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence Evaluations, （別名“The Orange Book”)28th Edition, U.S.Dept. of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Pharmaceutical Science, Office of Generic Drugs；
・Electronic Orange Book Approved Drug Products with Therapeutic Equivalence Evaluations、ワールドワイドウェブ（インターネット）で入手可能：www.fda.gov/cder/ob/；及び
・Biopharmaceutical Products in the U.S.and European Markets, 6th Edition, by Ronald A. Rader, BioPlan Associates, Inc., 2 volumes, 1602 pages, September 2007 (ISBN:2 vol. set:978-1-934106-04-4 (previous format 1-934106-04-6))。
上に引用した情報源は本明細書に参照することにより組み込まれる。
【０１６１】
「ある１つ（ａ又はａｎ）」の実体（ｅｎｔｉｔｙ）という用語は、１つ以上のその実体を指すことに留意すべきである；例えば、「ある１つのＩＧＦ−１Ｒ抗体」は、１つ以上のＩＧＦ−１Ｒ抗体を表すと理解される。このように、「ある１つ（ａ又はａｎ）」、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において互換的に使用できる。
【０１６２】
本明細書で使用するとき、「剤」という用語（例えば１つ以上のＩＧＦ−１Ｒ抗体と併用される「治療」、「抗過剰増殖性」又は「抗癌」「剤」に言及して用いられるとき）は、任意の治療的に有用な化合物を含み、例えば小分子（例えば小有機分子）、大分子（例えば有機ポリマー）、並びに全てのクラス及び種類の生体巨大分子（例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」という用語は、単数形「ポリペプチド」及び複数形「ポリペプチド」を包含することを意図し、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）で線状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は２個以上のアミノ酸の任意の鎖（１本又は複数）を指し、特定の長さの生成物を指すものではない。従って、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は２個以上のアミノ酸の鎖（１本又は複数）を指すのに使用されるその他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲に含まれ、また「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれの代わりに使用し得る又はこれらの用語と互換的に使用し得る。「ポリペプチド」という用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾産物、例えば限定されないがグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク分解切断、又は非天然アミノ酸による修飾の産物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然生物学的源由来してもよく、組換え技術で作製してもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳されるとは限らない。ポリペプチドは、任意の方法で、例えば化学合成で生成し得る。
【０１６４】
本発明に包含されるポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、又は２，０００個以上の大きさのアミノ酸であり得る。ポリペプチドは、確定した３次元構造を有し得るが、必ずしもこのような構造を有するとは限らない。確定した３次元構造を有するポリペプチドは、折りたたまれていると言われ、また確定した３次元構造を有しないが、多数の種々の立体構造を取ることができるポリペプチドは、折りたたまれていないと言われる。本明細書で使用されるとき、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えばセリン残基又はアスパラギン残基の酸素含有側鎖又は窒素含有側鎖を介してタンパク質に結合される少なくとも１個の糖質部分に連結されたタンパク質を指す。
【０１６５】
「単離」ポリペプチド又はその断片、変異体、若しくは誘導体とは、その自然環境にあるポリペプチドではないポリペプチドを意図する。特定のレベルの精製が必要とされている訳ではない。例えば、単離ポリペプチドは、その本来の環境又は自然環境から取り出すことができる。宿主細胞中で発現する、組換え技術によって産生されるポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な方法で分離され、分画され、又は部分的に若しくは実質的に精製されている天然又は組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されているとみなされる。
【０１６６】
本明細書で使用するとき、指定のタンパク質「に由来する」とは、ポリペプチドの源を指す。１つの実施形態では、特定の出発ポリペプチドに由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、可変領域配列（例えばＶＨ又はＶＬ）又はそれに関連する配列（例えばＣＤＲ又はフレームワーク領域）である。１つの実施形態では、特定の出発ポリペプチドに由来するアミノ酸配列は連続していない。例えば、１つの実施形態では、１、２、３、４、５、又は６個のＣＤＲが出発抗体に由来する。１つの実施形態では、特定の出発ポリペプチド若しくはアミノ酸配列に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列又はその一部と本質的に同一であるアミノ酸配列を有し、前記一部は、少なくとも３〜５アミノ酸、５〜１０アミノ酸、少なくとも１０〜２０アミノ酸、少なくとも２０〜３０アミノ酸、又は少なくとも３０〜５０アミノ酸から成る、又はそうでなければ出発配列中にその源を有することが当業者に同定可能である。
【０１６７】
また、本発明に包含されるポリペプチドとして、前記ポリペプチドの断片、誘導体、類似体、又は変異体、及びこれらの任意の組み合わせも包含される。「断片」、「変異体」、「誘導体」及び「類似体」は、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体又は抗体ポリペプチドを指す場合には、対応する天然抗体又はポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも幾つかを保持する任意のポリペプチドを包含する。本発明に包含されるポリペプチドの断片には、本明細書の他の個所で論じる特異抗体断片の他に、タンパク分解断片、及び欠失断片が含まれる。本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体及び抗体ポリペプチドの変異体には、前記の断片、及びアミノ酸の置換、欠失又は挿入により改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。変異は、天然に生じたものであってもよく、非天然的に生じたものであってもよい。非天然変異は、当技術分野で公知の突然変異誘発技術を使用して産生させ得る。変異ポリペプチドは、保存又は非保存アミノ酸置換、欠失又は付加を含有し得る。本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体及び抗体ポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドには認められない別の特徴を示すように変性されているポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変異ポリペプチドはまた、本明細書において「ポリペプチド類似体」と呼ばれる場合もある。本明細書で使用されるとき、ＩＧＦ−１Ｒ抗体又は抗体ポリペプチドの「誘導体」とは、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１個以上の残基を有する対象ポリペプチドを指す。「誘導体」としては、２０個の標準アミノ酸の１種以上の天然アミノ酸誘導体を含有するペプチドも包含される。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに使用し得；５−ヒドロキシリシンをリシンの代わりに使用し得；３−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに使用し得；ホモセリンをセリンの代わりに使用し得；及びオルニチンをリシンの代わりに使用し得る。  
【０１６８】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数形の核酸及び複数形の核酸を包含することを意図し、単離核酸分子又はコンストラクト、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来のホスホジエステル結合又は非従来の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見出されるようなアミド結合）を含有し得る。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の１個以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。「単離」核酸又はポリヌクレオチドとは、その本来の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含有されるＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードしている組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されているとみなされる。単離ポリヌクレオチドの更なる例としては、異種宿主細胞中に保持された組換えポリヌクレオチド又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが挙げられる。単離ＲＮＡ分子には、本発明に包含されるポリヌクレオチドのインビボ又はインビトロＲＮＡ転写物が含まれる。本発明に包含される単離ポリヌクレオチド又は核酸には、さらに合成的に作製されたこのような分子が含まれる。また、ポリヌクレオチド又は核酸は、調節因子、例えばプロモータ、リボソーム結合部位、又は転写ターミネータであってもよく又はこれらを含有していてもよい。
【０１６９】
本明細書で使用されるとき、「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンを含む核酸の一部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部であるとみなしてよい。しかし、任意のフランキング配列、例えばプロモータ、リボソーム結合部位、転写ターミネータ、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。本発明に包含される２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば１個のベクター上に、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中に、例えば別個の（異なる）ベクター上に存在することができる。また、任意のベクターは、単一のコード領域を含有していてもよいし、又は２つ以上のコード領域を含有していてもよく、例えば、１個のベクターが免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードしていてもよい。また、本発明に包含されるベクター、ポリヌクレオチド、核酸は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体又はその断片、変異体、若しくは誘導体をコードする核酸に融合されているか又は融合されていない異種コード領域をコードし得る。異種コード領域には、限定されないが、特殊なエレメント又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインが挙げられる。
【０１７０】
ある実施形態において、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合は、ポリペプチドをコードする核酸を含有するポリヌクレオチドは、通常プロモータ及び／又は１つ以上のコード領域と機能的に連結されたその他の転写若しくは翻訳制御エレメントを含有し得る。機能的な連結は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、１つ以上の制御配列と、該制御配列（１つ以上）の影響又は制御下で遺伝子産物の発現を行うような方法で連結されることである。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びそれと連結されたプロモータ）は、プロモータ機能の誘導が、所定の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び前記２つのＤＮＡ断片の間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指令する発現制御配列の能力を妨害しないか又は転写されるべきＤＮＡテンプレートの能力を干渉しない場合「機能的に連結される」。従って、プロモータ領域は、プロモータがその核酸の転写を生じさせることができる場合には、ポリペプチドをコードする核酸と機能的に連結されることとなるであろう。プロモータは、所定の細胞内のＤＮＡのみの実質的な転写を指令する細胞特異的プロモータであり得る。プロモータの他に、他の転写制御因子、例えば、エンハンサ、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルは、細胞特異的転写を指令するためにポリヌクレオチドと機能的に連結することができる。適当なプロモータ及び他の転写調節領域が、本明細書に開示される。
【０１７１】
様々な転写制御領域が、当業者に知られている。これらの転写制御領域としては、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、以下に限定されないが、サイトメガロウイルス（即時型プロモータ、イントロン−Ａと併用して）、シミアンウイルス４０（初期プロモータ）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）由来のプロモータ及びエンハンサーセグメントが挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビンに由来する転写制御領域、並びに真核細胞において遺伝子発現を調節できる他の配列が挙げられる。更なる好適な転写制御領域としては、組織特異的プロモータ及びエンハンサ並びにリンホカイン誘導性プロモータ（例えば、インターフェロン又はインターロイキンによって誘導できるプロモータ）が挙げられる。
【０１７２】
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に知られている。それには、以下に限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、並びにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ（ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる））が挙げられる。
【０１７３】
他の実施形態において、本発明に包含されるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えばメッセンジャーンＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。
【０１７４】
本発明に包含されるポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明に包含されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指令する、分泌又はシグナルペプチドをコードしている更なるコード領域と連結し得る。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、いったん粗面小胞体を横切る成長タンパク質鎖の搬出が開始されると成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、一般に、完全又は「完全長」ポリペプチドから切断されて分泌型又は「成熟」型のポリペプチドを産生する、ポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを知っている。ある実施形態において、天然シグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用される、又はそれに機能的に連結されるポリペプチドの分泌を指令する能力を保持するその配列の機能性誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体を使用し得る。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されていてもよい。
【０１７５】
本発明は、特定のＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。特に天然由来抗体などのフルサイズの抗体に言及しない限り、「ＩＧＦ−１Ｒ抗体」という用語は、フルサイズの抗体及びこのような抗体の抗原結合性断片、変異体、類似体、又は誘導体、例えば天然由来抗体又は免疫グロブリン分子、あるいは抗体分子と同様の方法で抗原に結合する改変された抗体分子又は断片を包含する。
【０１７６】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において互換的に使用される。抗体又は免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変領域を含有し、通常少なくとも重鎖及び軽鎖の可変領域を含有する。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Harlow et al., Antibodies:A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)を参照。
【０１７７】
以下でさらに詳しく論じるように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別することができる種々の広範なクラスのポリペプチドを含有する。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロン（γ、μ、α、δ、又はε）として分類され、この中に幾つかのサブクラスを有する（例えば、γ１〜γ４）ことを理解するであろう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、又はＩｇＥと決定するしているのは、この鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などがよく特徴付けされており、機能が特殊化していることが知られている。これらのクラス及びアイソタイプのそれぞれの修飾バージョンは、当業者であればこの開示を考慮して容易に認識でき、従って、本発明の範囲内にある。全ての免疫グロブリンクラスは、明らかに本発明の範囲内にあり、以下の論議は、一般的に免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに関する。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同じ軽鎖ポリペプチドと、分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同じ重鎖ポリペプチドを含む。これらの４本の鎖は、典型的には、「Ｙ」の根元で始まり且つ可変領域を通して続く重鎖を軽鎖が支えている「Ｙ」立体配置でジスルフィド結合によって接合される。  
【０１７８】
軽鎖は、カッパ又はラムダ（κ、λ）に分類される。各重鎖クラスは、κ又はλ軽鎖と結合し得る。一般に、軽鎖と重鎖は、相互に共有結合され、２つの重鎖の「尾」部は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞又は遺伝子操作宿主細胞によって生じる場合には、ジスルフィド結合又は非共有結合によって相互に結合される。重鎖において、アミノ酸配列は、Ｙ立体配置の分岐の末端におけるＮ−末端から、それぞれの鎖の下部のＣ−末端まで続く。
【０１７９】
軽鎖及び重鎖の両方は、構造的及び機能的に相同な領域に分けられる。「定常」及び「可変」という用語は、機能的に使用される。これに関して、軽鎖部分（ＶＬ）及び重鎖部分（ＶＨ）双方の可変領域が、抗原認識及び特異性を決定することが理解されるであろう。反対に、軽鎖の定常領域（ＣＬ）及び重鎖の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３）は、重要な生物学的性質、例えば分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などを与える。慣例により、定常領域ドメインの番号は、抗原結合部位又は抗体のアミノ末端からより遠ざかるにつれて増加する。Ｎ末端部分は、可変領域であり、Ｃ−末端部分に定常領域がある。実際、ＣＨ３及びＣＬドメインは、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含有する。
【０１８０】
上記に示したように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、組み合わされて３次元抗原結合部位を確定する可変領域を形成する。この４次抗体構造は、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、Ｖ重鎖及びＶ軽鎖のそれぞれの３つのＣＤＲによって規定される。ある場合には、例えば、ラクダ科動物種に由来する又はラクダ科動物免疫グロブリンに基づいて改変されたある種の免疫グロブリン分子、完全免疫グロブリン分子は、重鎖のみからなり、軽鎖を有していない。例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)参照。
【０１８１】
天然由来抗体において、各抗原結合性ドメインに存在する６個の「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境においてその３次元立体配置をとる際に、抗原結合性ドメインを形成するために特異的に配置される短い隣接しないアミノ酸である。抗原結合性ドメインのアミノ酸の残部（「フレームワーク」領域と呼ばれる）は、分子間変動が少ない。フレームワーク領域は、主としてβ−シート立体配置をとり、ＣＤＲは、β−シート構造を連結し、場合によってはβ−シート構造の一部を形成するループを形成する。従って、フレームワーク領域は、鎖間非共有相互作用によって正しい配向でＣＤＲを位置付けるための足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を形成するよう作用する。位置付けられたＣＤＲによって形成された抗原結合性ドメインは、免疫活性抗原上のエピトープに相補的な表面を規定する。この相補的表面は、その同種エピトープに対する抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲ及びフレームワーク領域を成すアミノ酸はそれぞれ、これらが正確に定義されていることから、当業者は所定の重鎖又は軽鎖可変領域について容易に特定することができる(“Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Kabat, E. et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983);及びChothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)参照、これらはその全てが参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８２】
当技術分野内で使用される及び／又は許容される用語について２つ以上の定義が存在する場合には、本明細書で使用されるときのその用語の定義は、そうではないと明記しない限り全てのこのような意味を含むことを意図する。具体例は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチド双方の可変領域の中に見られる隣接しない抗原結合部位を説明するための用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ）の使用である。この特定の領域は、Kabat, E. et al., U.S.Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983);及びChothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)に記載されており（これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）、この場合に、その定義は、相互に比較した場合のアミノ酸残基の重複又はサブセットを包含する。それにもかかわらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを指すいずれの定義の適用も、本明細書において定義され且つ使用される用語の範囲内にあることを意図する。上記で引用された参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、以下に比較として表１に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基の番号は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、当業者は、どの残基が特定のＣＤＲを成すかを日常的に決定できる。
【表１】
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【０１８３】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用できる可変領域配列についての付番方式も定義した。当業者は、配列それ自体を超える実験データに依存することなく、任意の可変領域配列に対して「Ｋａｂａｔ付番」のこの体系を明確に割り当てることができる。本明細書で使用されるとき、「Ｋａｂａｔ付番」とは、Kabatet al., U.S.Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983)に示された付番方式を指す。特に明記しない限りは、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体の特定のアミノ酸残基部分の付番に対する言及は、Ｋａｂａｔ付番方式に従う。
【０１８４】
ラクダ科動物種において、重鎖可変領域（ＶＨＨという）は、完全抗原結合性ドメインを形成する。ラクダ科動物ＶＨＨ可変領域と従来の抗体に由来する可変領域（ＶＨ）との主な相違としては、（ａ）ＶＨＨの対応領域と比べてＶＨの軽鎖接触表面のアミノ酸はより疎水性であること、（ｂ）ＶＨＨのＣＤＲ３はより長いこと、及び（ｃ）ＶＨＨのＣＤＲ１とＣＤＲ３の間のジスルフィド結合の高い出現頻度が挙げられる。
【０１８５】
本発明に包含される抗体又はその抗原結合断片、変異体、若しくは誘導体には、限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、又はキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬ又はＶＨドメインのいずれかを含有する断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって生成される断片、及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書に開示のＩＧＦ−１Ｒ抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれる。ＳｃＦｖ分子は、当技術分野において知られており、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明に包含される免疫グロブリン又は抗体分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであり得る。
【０１８６】
抗体断片（単鎖抗体を含む）は、可変領域（１つ以上）を、単独で、又はヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインの全体又は一部と組み合わせて含有し得る。本発明の実施形態は、可変領域（１つ以上）とヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせを含有する抗原結合断片も包含する。本発明に包含される抗体又はその免疫特異的断片は、任意の動物起源、例えば鳥類及び哺乳動物に由来するものであり得る。好ましくは、抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ロバ抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、モルモット抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体、ウマ抗体、又はニワトリ抗体である。別の実施形態において、可変領域は、軟骨魚（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源（例えば、サメ由来）であり得る。本明細書で使用されるとき、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、またヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、又は１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物から単離された抗体であって、以下に記載の及び例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載の内因性免疫グロブリンを発現しない抗体が含まれる。
【０１８７】
本明細書で使用されるとき、「重鎖部分」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を包含する。重鎖部分を含有するポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中間部、及び／又は下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はこれらの変異体若しくは断片の少なくとも１つを含有する。例えば、本発明で使用する結合性ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含有するポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、及びＣＨ２ドメインを含有するポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド鎖、又はＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド鎖を含有し得る。別の実施形態において、本発明に包含されるポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含有するポリペプチド鎖を含有する。また、本発明で使用する結合性ポリペプチドは、少なくともＣＨ２ドメインの一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部又は一部）を欠いていてもよい。上記のように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）が自然に存在する免疫グロブリン分子と、アミノ酸配列において異なるように修飾し得ることは、当業者には理解されるであろう。
【０１８８】
本明細書に記載のある種のＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体において、多量体の１本のポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第２のポリペプチド鎖の重鎖部分と同一である。あるいは、本発明に包含される重鎖部分を含有する単量体同士は同一ではない。例えば、各単量体は、異なる標的結合部位を含有し得、例えば二重特異性抗体を形成する。
【０１８９】
本明細書に開示される診断及び治療方法で使用する結合性ポリペプチドの重鎖部分は、種々の免疫グロブリン分子に由来していてもよい。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメイン及びＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含有し得る。別の例において、重鎖部分は、一部はＩｇＧ１分子から及び一部はＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含有することができる。別の例において、重鎖部分は、一部はＩｇＧ１分子から及び一部はＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含有することができる。
【０１９０】
本明細書で使用されるとき、「軽鎖部分」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を包含する。好ましくは、軽鎖部分は、ＶＬ又はＣＬドメインの少なくとも１つを含有する。
【０１９１】
本明細書に開示されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又は抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、抗原のエピトープ（１つ以上）又は部分（１つ以上）、例えば、それらが認識するか又は特異的に結合する標的ポリペプチド（ＩＧＦ−１Ｒ）に関して記載又は特定され得る。抗体の抗原結合性ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの部分が、「エピトープ」又は「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは、単一のエピトープを含有する場合もあるが、典型的には少なくとも２個のエピトープを含有し、抗原の大きさ、立体構造及び種類に応じて、いかなる数のエピトープをも含有することができる。更に、標的ポリペプチド上の「エピトープ」が非ポリペプチド要素であってもよく又は非ポリペプチド要素を含有していてもよいこと、例えば「エピトープ」が炭水化物側鎖を含有していてもよいことに留意すべきである。
【０１９２】
抗体のペプチド又はポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４個〜５個のアミノ酸であると考えられる。ペプチド又はポリペプチドエピトープは、好ましくは少なくとも７個、さらに好ましくは少なくとも９個、最も好ましくは少なくとも約１５個〜約３０個のアミノ酸を含有する。ＣＤＲが抗原性ペプチド又はポリペプチドをその三元体（ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｆｏｒｍ）で認識できることから、エピトープを含有するアミノ酸は、隣接している必要がなく、場合によっては、同じペプチド鎖上に存在していなくてもよい。本発明に包含される実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒ抗体によって認識されるペプチド又はポリペプチドエピトープは、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、さらに好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、又は約１５個〜約3０個の連続又は不連続アミノ酸を含有する。
【０１９３】
「特異的に結合する」とは、一般に、抗体がその抗原結合性ドメインを介してエピトープに結合すること、及び結合が抗原結合性ドメインとエピトープの間にある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体が、その抗原結合性ドメインを介してそのエピトープに、任意の非関連エピトープに結合するよりも容易に結合する場合には、抗体はエピトープに「特異的に結合する」と言う。「特異性」という用語は、本明細書において、ある抗体があるエピトープに結合する相対的な親和性を評価するのに使用される。例えば、抗体「Ａ」は、所定のエピトープについて抗体「Ｂ」よりも高い特異性を有するとみなしてよく、又は抗体「Ａ」は、関連エピトープ「Ｄ」について有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うことができる。
【０１９４】
「優先的に結合する」とは、抗体が関連エピトープ、同様のエピトープ、同種エピトープ、又は類似エピトープに結合するよりもより容易に１つのエピトープに特異的に結合することを意味する。従って、所定のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、例えこのような抗体が関連エピトープと交差反応し得るとしても、関連エピトープに結合するよりもそのエピトープに結合する可能性が高い。
【０１９５】
非限定的な例として、抗体が、第２のエピトープに対する抗体の解離定数（ＫＤ）よりも小さいＫＤで第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例において、抗体が、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも１桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例において、抗体が、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも２桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。
【０１９６】
別の非限定的な例において、抗体が、第２のエピトープに対する抗体の解離速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）（ｋ（ｏｆｆ））よりも小さいｋ（ｏｆｆ）で第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例において、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも１桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。別の非限定的な例において、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも２桁小さい親和性で第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合するとみなすことができる。
【０１９７】
本明細書に開示の抗体又は抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、本明細書に開示の標的ポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、５×１０−２／秒、１０−２／秒、５×１０−３／秒、又は１０−３／秒以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合すると言い得る。さらに好ましくは、本発明に包含される抗体は、本明細書に開示の標的ポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、５×１０−４／秒、１０−４／秒、５×１０−５／秒、又は１０−５／秒、５×１０−６／秒、１０−６／秒、５×１０−７／秒、又は１０−７／秒以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合すると言い得る。
【０１９８】
本明細書に開示の抗体又は抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、本明細書に開示の標的ポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、１０３／Ｍ／秒、５×１０３／Ｍ／秒、１０４／Ｍ／秒又は５×１０４／Ｍ／秒以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合すると言い得る。さらに好ましくは、本発明に包含される抗体は、本明細書に開示の標的ポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、１０５／Ｍ／秒、５×１０５／Ｍ／秒、１０６／Ｍ／秒又は５×１０６／Ｍ／秒、又は１０７／秒以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合すると言い得る。
【０１９９】
抗体が、エピトープに対する参照抗体の結合をある程度ブロックするという程度までそのエピトープに優先的に結合する場合、所定のエピトープに対する参照抗体の結合を競合的に阻害すると言い得る。競合阻害は、当技術分野において既知の方法、例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイで調べることができる。抗体は、所定のエピトープに対する参照抗体の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、又は少なくとも５０％まで競合的に阻害すると言い得る。
【０２００】
本明細書で使用されるとき、「親和性」という用語は、個々のエピトープの免疫グロブリン分子のＣＤＲとの結合の強さの尺度を指す。例えば、Harlow et al., Antibodies:A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)、第２７−２８頁参照。本明細書で使用されるとき、「結合活性」という用語は、免疫グロブリン集団と抗原の間の複合体の全般的安定性、すなわち免疫グロブリン混合物と抗原の機能的結合強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの第２９−３４頁参照。結合活性は、集団内の個々の免疫グロブリン分子と特異的エピトープとの親和性と、免疫グロブリン及び抗原の結合価との両方に関連する。例えば、二価モノクローナル抗体と、ポリマーのような高反復エピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高結合活性の１つである。
【０２０１】
本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体又はその抗原結合性断片、変異体若しくは誘導体はまた、その交差反応性に関して記載又は特定され得る。本明細書で使用されるとき、「交差反応性」という用語は、ある抗原に特異的な抗体が第２の抗原と反応する能力；２つの異なる抗原性物質の間の関連性の尺度を指す。従って、抗体は、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合する場合には交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、誘導性エピトープと同じ相補的構造特性の多くを有し、場合によっては実際にオリジナルよりも適合し得る。
【０２０２】
例えば、ある抗体は、関連するが同じでないエピトープ、例えば参照エピトープに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、及び少なくとも５０％の同一性（当技術分野で既知の方法及び本明細書に記載の方法を使用して算出される）を有するエピトープに結合するという点である程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、及び５０％未満の同一性（当技術分野で既知の方法及び本明細書に記載の方法を使用して算出される）を有するエピトープに結合しない場合には、交差反応性は、ほとんどない又は全くないと言い得る。抗体は、あるエピトープについて、そのエピトープの他のアナローグ、オルソログ、又はホモローグに結合しない場合、「高特異性」であるとみなすことができる。
【０２０３】
本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体又は抗原結合性断片、変異体若しくは誘導体は、標的ポリペプチドに対するその結合親和性に関して記載又は特定され得る。好ましい結合親和性としては、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ未満の解離定数すなわちＫｄを有する結合親和性が挙げられる。
【０２０４】
本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体又は抗原結合性断片、変異体若しくは誘導体は、「多特異性」、例えば、二重特異性、三重特異性又はそれよりも大きい多特異性であり、これは１つ以上の異なる抗原（例えば、タンパク質）上に存在する２つ以上の異なるエピトープを認識し、同時に結合することを意味する。従って、ＩＧＦ−１Ｒ抗体が「単一特異性」であるか又は「多特異性」、例えば「二重特異性」であるかは、結合性ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数を指す。多特異性抗体は、本明細書に記載の標的ポリペプチド種々のエピトープに特異的であり得るか、又は標的ポリペプチド及び異種エピトープ、例えば異種ポリペプチド又は固体担持材料に特異的であり得る。
【０２０５】
本明細書で使用されるとき、「結合価」という用語は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、結合性ポリペプチド又は抗体中に存在する可能な結合ドメイン、例えば抗原結合ドメインの数を指す。それぞれの結合ドメインは、１つのエピトープに特異的に結合する。ＩＧＦ−１Ｒ抗体、結合性ポリペプチド又は抗体が２つ以上の結合ドメインを含有する場合、それぞれの結合ドメインは、２つの結合ドメインを有する抗体について同じエピトープに特異的に結合し得る（「二価一特異的」と呼ばれる）か又は２つの結合ドメインを有する抗体について異なるエピトープに特異的に結合し得る（「二価二重特異的」と呼ばれる）。抗体はまた、二重特異性であり且つそれぞれの特異性について二価であり得る（「二重特異性四価抗体」と呼ばれる）。別の実施形態において、四価ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）又はドメイン欠失抗体が調製され得る。
【０２０６】
二重特異性二価抗体及びその調製方法は、例えば米国特許第５，７３１，１６８号；第５，８０７，７０６号；第５，８２１，３３３号；及び米国特許出願公開第２００３／０２０７３４号及び第２００２／０１５５５３７号に記載されており、これら全ての開示は、本明細書に参照することにより組み込まれる。二重特異性四価抗体及びその調製方法は、例えば、国際公開第０２／０９６９４８号及び同第００／４４７８８号に記載されている。この両方の開示は、本明細書に参照することにより組み込まれる。一般的には、国際公開第９３／１７７１５号；同第９２／０８８０２号；同第９１／００３６０号；同第９２／０５７９３号；Tutt et al., J. Immunol. 147:60-69 (1991)；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)参照。
【０２０７】
前に示したように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び３次元立体配置は周知である。本明細書で使用されるとき、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変領域を包含し、また「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ末端側）定常領域ドメインを包含する。ＣＨ１ドメインは、ＶＨドメインに隣接しており且つ免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側である。
【０２０８】
本明細書で使用されるとき、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、慣用の付番スキームを使用して例えば、抗体のおよそ残基２４４個から残基３６０個まで延在する重鎖分子の部分を包含する（残基２４４−３６０、Ｋａｂａｔ付番方式；及び残基２３１−３４０、ＥＵ付番方式；Kabat EA et al., op. cit. 参照）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対をなさないという点で独特である。むしろ、２つのＮ−結合分岐炭水化物鎖が、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。ＣＨ３ドメインがＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端まで延在し且つ約１０８個の残基を含有することも十分に文献で示されている。
【０２０９】
本明細書で使用されるとき、「ヒンジ領域」という用語は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する重鎖分子の部分を包含する。このヒンジ領域は、約２５個の残基を含有し、且つ柔軟性があり、従って２個のＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域は、３つの別個のドメイン、すなわち上部ヒンジドメイン、中間ヒンジドメイン、及び下部ヒンジドメインに細分化し得る(Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998))。
【０２１０】
本明細書で使用されるとき、「ジスルフィド結合」という用語は、２個の硫黄原子の間で形成される共有結合を包含する。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成するか又は第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含有する。大部分の天然ＩｇＧ分子において、ＣＨ１領域とＣＬ領域は、スルフィド結合によって連結され、また２つの重鎖は、Ｋａｂａｔ付番方式を使用した２３９及び２４２に対応する位置（位置２２６又は２２９、ＥＵ付番方式）での２つのジスルフィド結合によって連結される。
【０２１１】
本明細書で使用されるとき、「キメラ抗体」という用語は、免疫活性領域又は部位が第１の種から得られるか又は第１の種に由来し、且つ定常領域（これは、インタクトであってもよいし、部分であってもよいし又は本発明に従って修飾されていてもよい）が第２の種から得られる抗体を意味するとする。好ましい実施形態において、標的結合領域又は部位は、非ヒト起源（例えば、マウス又は霊長類）に由来し、定常領域はヒト由来である。
【０２１２】
本明細書で使用されるとき、「改変された抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖又はその両方のいずれかの可変領域が既知の特異性を有する抗体由来の１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的な置換により、また必要に応じて部分的フレームワーク領域の置換及び配列変化により変えられる抗体を指す。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラス又は更には同じサブクラスの抗体に由来し得るが、ＣＤＲは異なるクラスの抗体から、好ましくは異なる種由来の抗体に由来することが意図される。既知の特異性を有する非ヒト抗体由来の１つ以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖又は軽鎖フレームワーク領域にグラフトされている改変された抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」という。１つの可変領域の抗原結合能を別の可変領域に移すために、ＣＤＲの全てをドナー可変領域由来の完全ＣＤＲで置換する必要でない場合もある。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要である残基を移すことのみが必要である場合もある。例えば米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、及び同第６，１８０，３７０号に記載の説明を考慮に入れると、日常実験を行うことによって又は試行錯誤試験によって機能的に改変された又はヒト化された抗体を得ることは、十分当業者の能力の範囲内であろう。
【０２１３】
本明細書で使用されるとき、「適切に折り畳まれたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドを成す機能ドメインの全部が明らかに活性であるポリペプチド（例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体）を包含する。本明細書で使用されるとき、「不適切に折り畳まれたポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの機能ドメインの少なくとも１つが活性ではないポリペプチドを包含する。１つの実施形態において、適切に折り畳まれたポリペプチドは、少なくとも１個のジスルフィド結合によって連結されたポリペプチド鎖を含み、また反対に、不適切に折り畳まれたポリペプチドは、少なくとも１個のジスルフィド結合によって連結されていないポリペプチド鎖を含む。
【０２１４】
本明細書で使用されるとき、「改変された」という用語は、合成手段による（例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成によるか、ペプチドの酵素的又は化学的カップリングによるか、あるいはこれら技術の幾つかの組み合わせによる）核酸又はポリペプチド分子の操作を包含する。
【０２１５】
本明細書で使用されるとき、「連結された」、「融合された」又は「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、化学的複合体化又は組換え手段を含むいずれかの手段による２つ超の要素又は成分の接合を包含する。「インフレーム融合」とは、元のＯＲＦの正確な翻訳読み取り枠を維持する方法で、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が接合して、連続するより長いＯＲＦを形成することを指す。従って、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦ（このセグメントは、通常自然界ではそのように接合されていない）によってコードされたポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である。読み取り枠は、このようにして融合セグメント全体を通じて連続するようになるが、セグメントは、例えばインフレームリンカー配列によって物理的に又は空間的に分離されていてもよい。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合されていてもよいが、「融合」ＣＤＲが連続ポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域又は別のＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離されていてもよい。
【０２１６】
ポリペプチドに関する文脈で、「線状配列」又は「配列」とは、配列内の互いに隣り合っている残基がポリペプチドの一次構造において連続しているアミノ末端からカルボキシル末端方向へのポリペプチド内のアミノ酸の順序である。
【０２１７】
本明細書で使用されるとき「発現」という用語は、遺伝子が生化学物質、例えば、ＲＮＡ又はポリペプチドを産生するプロセスを指す。このプロセスには、細胞内の遺伝子の機能的な存在の発現、例えば、限定されないが、遺伝子ノックダウン並びに一時的な発現及び安定な発現が含まれる。このプロセスとしては、限定されないが、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は他のＲＮＡ産物への転写、及びこのようなｍＲＮＡのポリペプチド（１つ以上）の翻訳が挙げられる。最終的な所望の産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質及び任意の前駆物質の創製を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書で使用されるとき、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、又は転写物から翻訳されるポリペプチドであり得る。本明細書に記載の遺伝子産物は、さらに転写後修飾、例えばポリアデニル化された核酸、又は翻訳後修飾、例えばメチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットと結合、タンパク分解切断されたポリペプチドが挙げられる。
【０２１８】
本明細書で使用されるとき、「治療する」又は「治療」という用語は、その目的が、不所望の生理学的変化又は疾患、例えば癌の進行若しくは拡大を防止又は遅らせる（小さくする）ことである治療的処置及び予防的又は予防措置の両方を指す。有益な又は望ましい臨床結果としては、限定されないが、検出できるようができまいが、症状の緩和、疾患の範囲の縮小、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患の進行の遅延又は減速、疾患の改善又は軽減、及び寛解（部分的又は全体的）が挙げられる。「治療」はまた、治療を受けない場合に予期される生存期間と比べて生存期間を延長させることを意味する場合もある。治療を必要としている対象としては、疾患又は障害に罹患している、疾患又は障害に罹患しやすい、あるいは疾患又は障害が予防されるべき対象が挙げられる。
【０２１９】
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後、又は治療を望む任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象としては、ヒト、家畜、牧畜動物、及び動物園、スポーツ又は愛玩動物、例えばイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが挙げられる。
【０２２０】
本明細書で使用されるとき、「結合分子の投与により利益を受ける対象」及び「治療を必要とする動物」などの語句は、例えば結合分子によって認識される抗原の検出のため（例えば、診断方法のため）に使用される結合分子の投与により及び／又は所定の標的タンパク質に特異的に結合する結合分子を用いた癌などの疾患の治療、すなわち、軽減又は予防により利益を受ける哺乳動物対象等の対象を包含する。本明細書においてさらに詳しく説明するように、結合分子は、複合体化されていない形で使用できる、又は薬剤、プロドラッグ、又は同位体に複合体化させることができる。
【０２２１】
本明細書で使用するとき、「結合分子」という用語は、対象標的分子、例えば抗原に結合する（例えば特異的に結合する、又は優先的に結合する）分子を指す。特定の実施形態では、本発明に包含される結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に又は優先的に結合するポリペプチドである。本発明の範囲内の結合分子はまた、小分子、核酸、ペプチド、ペプチド模倣薬、デンドリマー、非免疫グロブリン分子、及び本明細書に記載されるＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する他の分子を含む。
【０２２２】
非免疫グロブリン結合分子
特定の実施形態では、本発明に包含される結合分子は、非免疫グロブリン結合分子である。本明細書で使用されるとき、「非免疫グロブリン結合分子」という用語は、その結合部位が免疫グロブリン以外のポリペプチドに由来する部分（例えばスカフォールド又はフレームワーク）を含むが、所望の結合特異性を付与するために改変（例えば、突然変異誘発）することができる結合分子である。
【０２２３】
非免疫グロブリン結合分子は、免疫グロブリンではない免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー（例えばＴ細胞受容体又は細胞接着タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ−４、Ｎ−ＣＡＭ、テロキン））に由来する結合部位部分を含んでもよい。かかる結合分子は、免疫グロブリンフォールドの立体構造を保持し、ＩＧＦ１−Ｒエピトープに特異的に結合することができる結合部位部分を含む。他の実施形態では、本発明に包含される非免疫グロブリン結合分子はまた、免疫グロブリンフォールドに基づいてはいないが（例えばアンキリン反復タンパク質又はフィブロネクチン）、それにもかからわず標的（例えばＩＧＦ−１Ｒエピトープ）に特異的に結合することができるタンパク質トポロジーを有する結合部位を含む。
【０２２４】
非免疫グロブリン結合分子は、人工的に多様化させた結合部位を有する結合分子のライブラリから標的結合変異体を選択又は単離することにより同定できる。多様化ライブラリは、完全にランダムなアプローチ（例えばエラープローンＰＣＲ、エキソンシャフリング、又は定向進化）を用いて作製してもよく、当該技術分野で認められている設計ストラテジにより補助されてもよい。例えば、結合部位がそのコグネート標的分子と相互作用するとき通常必要とされるアミノ酸位置は、結合部位をコードしている核酸内の対応する位置に縮重コドン、三塩基、ランダムペプチド、又は完全ループを挿入することによりランダム化することができる（例えば、米国特許出願公開２００４０１３２０２８号参照）。アミノ酸位置の場所は、標的分子との複合体中の結合部位の結晶構造を調べることにより同定できる。ランダム化のための候補位置としては、結合部位のループ、平面、らせん、及び結合溝が挙げられる。特定の実施形態では、多様化のための候補であり得る結合部位内のアミノ酸は、免疫グロブリンフォールドとの相同性により同定できる。例えば、フィブロネクチンのＣＤＲ様ループ内の残基をランダム化して、フィブロネクチン結合分子のライブラリを作製することができる（例えばKoide et al., J. Mol. Biol., 284:1141-1151 (1998)参照）。ランダム化され得る結合部位の他の部分は平面を含む。ランダム化後、多様化ライブラリを選択又はスクリーニング手順に供して、所望の結合特性を有する、例えば上記ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する結合分子を得ることができる。例えば、選択は、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、又はリボソームディスプレイ等の当該技術分野で認められている方法により達成できる。
【０２２５】
１つの実施形態では、本発明に包含される結合分子は、フィブロネクチン結合分子由来の結合部位を含む。フィブロネクチン結合分子（例えばフィブロネクチンＩ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型ドメインを成す分子）は、免疫グロブリンとは対照的に鎖内ジスルフィド結合に依存しないＣＤＲ様ループを示す。ＦｎＩＩＩループは、有用な治療ツールを開発するために、ランダム突然変異、並びに標的結合、選択、及び更なる突然変異の繰り返しの定向進化スキームに供され得る領域を含む。フィブロネクチンに基づく「指定可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）」治療的結合分子（「ＦＡＴＢＩＭ」）は、本明細書に記載されるＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に又は優先的に結合するよう開発することができる。ＦＡＴＢＩＭとしては、例えば、Compound Therapeutics, Inc.によりＡｄｎｅｃｔｉｎｓと命名されたフィブロネクチン系結合分子の種が挙げられる。フィブロネクチン結合ポリペプチドを作製する方法は、例えば国際公開第０１／６４９４２号、並びに米国特許第６，６７３，９０１号、同第６，７０３，１９９号、同第７，０７８，４９０号、及び同第７，１１９，１７１号に記載されており、これらは参照することにより本明細書に援用される。
【０２２６】
別の実施形態では、本発明に包含される結合分子は、Ａｆｆｉｂｏｄｙ由来の結合部位を含む。Ａｆｆｉｂｏｄｙは、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳＰＡ）の免疫グロブリン結合ドメインに由来する（例えばNord et al., Nat. Biotechnol., 15:772-777 (1997)参照）。本発明の実施形態として使用されるＡｆｆｉｂｏｄｙ結合部位は、ＳＰＡのドメイン（例えばドメインＢ）に由来するＳＰＡ関連タンパク質（例えばプロテインＺ）の突然変異を誘発し、ＩＧＦ−１Ｒエピトープに対する結合親和性を有する突然変異ＳＰＡ関連ポリペプチドを選択することにより合成できる。Ａｆｆｉｂｏｄｙ結合部位を作製する他の方法は、米国特許第６，７４０，７３４号、及び同第６，６０２，９７７号、並びに国際公開第００／６３２４３号に記載されており、これらは参照することにより本明細書に援用される。
【０２２７】
別の実施形態では、本発明に包含される結合分子は、アンチカリン由来の結合部位を含む。アンチカリン（リポカリンとしても知られる）は、そのバレル／ループ領域において標的分子と結合する機能を有する多様なβ−バレルタンパク質ファミリーのメンバーである。リポカリン結合部位は、バレルの鎖に接続するループ配列をランダム化することによりＩＧＦ−１Ｒに結合するよう改変することができる（例えばSchlehuber et al., Drug Discov. Today, 10:23-33 (2005); Beste et al., PNAS, 96:1898-1903 (1999)）。本発明に包含される結合部位で使用されるアンチカリン結合部位は、Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａのビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）のアミノ酸位置２８〜４５、５８〜６９、８６〜９９、及び１１４〜１２９を含む線状ポリペプチド配列の配列位置に対応する４つのセグメントが突然変異しているリポカリンファミリーのポリペプチドから出発して得ることができる。アンチカリン結合部位を作製する他の方法は、国際公開第９９／１６８７３号及び同第０５／０１９２５４号に記載されており、これらは参照することにより本明細書に援用される。
【０２２８】
別の実施形態においては、本発明に包含される結合分子は、システインリッチポリペプチド由来の結合部位を含む。本発明の実践において使用されるシステインリッチドメインは、典型的には、α−へリックス、βシート、又はβ−バレル構造を形成しない。典型的には、ジスルフィド結合は、三次元構造へのドメインの折り畳みを促進する。通常、システインリッチドメインは、少なくとも２つのジスルフィド結合、より典型的には、少なくとも３つのジスルフィド結合を有する。例示的なシステインリッチポリペプチドは、Ａドメインタンパク質である。Ａドメイン（時に、「相補型反復」と称される）は、約３０〜５０又は３０〜６５のアミノ酸を含有する。幾つかの実施形態においては、ドメインは、約３５〜４５のアミノ酸、場合によっては、約４０のアミノ酸を含む。３０〜５０のアミノ酸内に、約６つのシステイン残基がある。６つのシステインのうち、ジスルフィド結合は、典型的には、以下のシステイン間で見られる：Ｃ１とＣ３、Ｃ２とＣ５、Ｃ４とＣ６。Ａドメインは、リガンド結合部分を構成する。ドメインのシステイン残基は、ジスルフィド結合され、小型の安定した機能的に独立した部分を形成する。これらの反復のクラスタは、リガンド結合ドメインを構成し、異なるクラスタリングは、リガンド結合に関して特異性を付与することができる。Ａドメインを含有する例示的なタンパク質としては、例えば、補体成分（例えば、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、及び因子Ｉ）、セリンプロテアーゼ（例えば、エンテロペプチダーゼ、マトリプターゼ、及びコリン）、膜貫通タンパク質（例えば、ＳＴ７、ＬＲＰ３、ＬＲＰ５、及びＬＲＰ６）、及びエンドサイトーシス受容体（例えば、ソルチリン関連受容体、ＬＤＬ−受容体、ＶＬＤＬＲ、ＬＲＰ１、ＬＲＰ２、及びＡｐｏＥＲ２）が挙げられる。所望の結合特異性のＡドメインタンパク質を作製するための方法は、例えば、国際公開第０２／０８８１７１号及び国際公開第０４／０４４０１１号において開示され、それぞれの内容は、参照することにより、本明細書に組み込まれる。
【０２２９】
他の実施形態においては、本発明に包含される結合分子は、反復タンパク質由来の結合部位を含む。反復タンパク質は、互いに積み重なって隣接ドメインを形成する、小さい（例えば、約２０〜約４０のアミノ酸残基）構造単位又は反復の連続コピーを含有するタンパク質である。反復タンパク質は、タンパク質における反復数を調整することによって特定の標的結合部位に適するように修飾することができる。例示的な反復タンパク質としては、設計アンキリン反復タンパク質（すなわち、ＤＡＲＰｉｎ）（例えば、Binz et al., Nat. Biotechnol., 22:575-582 (2004）を参照）又はロイシンリッチ反復タンパク質（すなわち、ＬＲＲＰ）（例えば、Pancer et al., Nature, 430:174-180 (2004)を参照）が挙げられる。これまでに決定されているすべてのアンキリン反復単位の三次構造は、βヘアピン及び後続の２つの逆平行α−へリックスから構成され、反復単位を次の単位と接続するループで終結するという特性を共有する。アンキリン反復単位で構築されるドメインは、反復単位を、拡張及び湾曲構造に積み重ねることによって形成される。ＬＲＲＰ結合部位は、ウミヤツメ及び他の無顎類の魚の適応免疫系の一部を形成し、それらは、リンパ球熟成期の間に、一連のロイシンリッチ反復遺伝子の組み換えによって形成されるという点で、抗体に類似している。ＤＡＲＰｉｎ又はＬＲＲＰ結合部位を作製する方法は、国際公開第０２／２０５６５号及び国際公開第０６／０８３２７５号において記載され、それぞれの内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２３０】
本発明に包含される結合分子において使用することができる他の非免疫グロブリン結合部位としては、Ｓｒｃ相同性ドメイン（例えば、ＳＨ２又はＳＨ３ドメイン）、ＰＤＺドメイン、ベータ−ラクタマーゼ、高親和性プロテアーゼ阻害剤、又はサソリ毒等の小ジスルフィド結合タンパク質スカフォールドに由来する結合部位が挙げられる。これらの分子に由来する結合部位を作製するための方法は、当技術分野において開示されており、例えば、Panni et al, J. Biol. Chem., 277:21666-21674 (2002)、Schneider et al., Nat. Biotechnol., 17:170-175 (1999)、Legendre et al., Protein Sci., 11:1506-1518 (2002)、Stoop et al., Nat. Biotechnol., 21:1063-1068 (2003)、及びVita et al., PNAS, 92:6404-6408 (1995)を参照されたい。さらに他の結合部位は、ＥＧＦ様ドメイン、Ｋｒｉｎｇｌｅドメイン、ＰＡＮドメイン、Ｇｌａドメイン、ＳＲＣＲドメイン、Ｋｕｎｉｔｚ／ウシ膵トリプシン阻害物質ドメイン、Ｋａｚａｌ型セリンプロテアーゼ阻害剤ドメイン、Ｔｒｅｆｏｉｌ（Ｐ型）ドメイン、フォンヴィレブランド因子Ｃ型ドメイン、アナフィラトキシン様ドメイン、ＣＵＢドメイン、チログロブリンＩ型反復、ＬＤＬ−受容体クラスＡドメイン、スシドメイン、リンクドメイン、トロンボスポンジンＩ型ドメイン、免疫グロブリン様ドメイン、Ｃ型レクチンドメイン、ＭＡＭドメイン、フォンヴィレブランド因子Ａ型ドメイン、ソマトメジンＢドメイン、ＷＡＰ型四ジスルフィドコアドメイン、Ｆ５／８Ｃ型ドメイン、ヘモペキシンドメイン、ラミニン型ＥＧＦ様ドメイン、Ｃ２ドメイン、及び当業者に公知の他のそのようなドメイン、並びにこれらの誘導体及び／又は変異体から成る群より選択される結合ドメインに由来することができる。例示的な非免疫グロブリン結合分子、及びその作製方法はまた、Stemmer et al., “Protein scaffolds and uses thereof”、米国特許出願公開第２００６０２３４２９９号（２００６年１０月１９日）、及びHey, et al., Artificial, Non-Antibody Binding Proteins for Pharmaceutical and Industrial Applications, TRENDS in Biotechnology, vol. 23, No.10, Table2 and pp.514-522 (Oct. 2005)；中に見出すことができる；また本明細書に提供される参考文献も参照。
【０２３１】
本明細書で使用するとき、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合分子の結合に関して「ＩＧＦ−１Ｒ仲介性シグナル伝達をより著しくブロックする」という用語は、（ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２のうち少なくとも１種の結合をブロックする）ＩＧＦ−１Ｒの第１のエピトープに結合する第１の結合部分、及び（ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２のうち少なくとも１種の結合をブロックする）ＩＧＦ−１Ｒの第２の異なるエピトープに結合する第２の結合部分の結合が、第１又は第２の部分のみの結合より多くＩＧＦ−１Ｒ仲介性シグナル伝達をブロックする状況を指す。ＩＧＦ−１Ｒが仲介するシグナル伝達の阻害は、多くの異なる方法、例えば腫瘍成長の下方制御（例えば腫瘍成長の遅延）、腫瘍の大きさ又は転移の低減、癌の臨床的障害又は症状の寛解又は最小化、かかる治療の非存在下で予想される対象の生存期間を超える生存期間の延長、及び投与前、すなわち予防的投与前に腫瘍が形成されていない動物における腫瘍成長の予防において測定できる。本明細書で使用するとき、「下方制御」、「下方制御する」、又は「下方制御すること」という用語は、特定のプロセスが生じる速度を低下させる、特定のプロセスを阻害する、特定のプロセスを逆行させる、及び／又は特定のプロセスの開始を予防することを指す。したがって、特定のプロセスが腫瘍成長又は転移である場合、「下方制御」という用語は、限定しないが、腫瘍成長及び／若しくは転移が生じる速度を低下させる、腫瘍成長及び／若しくは転移を阻害する、腫瘍成長及び／若しくは転移を逆行させる（腫瘍縮小及び／又は根絶を含む）、並びに／又は腫瘍成長及び／若しくは転移の開始を予防することが挙げられる。
【０２３２】
１つの実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒが仲介するシグナル伝達がより著しくブロックされるとき、相加効果が観察される。「相加効果」という用語は、本明細書で使用するとき、第１の結合部分と第２の結合部分の結合の効果の合計が、第１又は第２の結合部分のみが結合したときに観察される効果とほぼ等しい状況を指す。相加効果は典型的には、第１又は第２の結合部分（のみ）のＩＧＦ−１Ｒに対するモル比が、第１及び第２の結合部分（共に）のＩＧＦ−１Ｒに対するモル比とほぼ等しい条件下で測定される。
【０２３３】
１つの実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ仲介性シグナル伝達がより著しくブロックされるとき、相乗効果が観察される。「相乗効果」という用語は、本明細書で使用するとき、第１及び第２の結合部分の結合時に生じ、双方が用いられることなしに、第１又は第２の結合部分のいずれかのみの個々の投与から得られるであろう効果を超える、相加効果を超える効果を指す。相乗効果は典型的には、第１又は第２の結合部分（のみ）のＩＧＦ−１Ｒに対するモル比が、第１及び第２の結合部分（共に）のＩＧＦ−１Ｒに対するモル比とほぼ等しい条件下で測定される。本発明に包含される実施形態は、前記第１及び第２のＩＧＦ−１Ｒ結合部分の使用を介したＩＧＦ−１Ｒ仲介性シグナル伝達の下方制御において相乗効果を生じさせ、前記効果が対応する相加効果より少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％高い方法を含む。
【０２３４】
１つの実施形態では、相乗効果は、半数有効原理に基づく、Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙの組み合わせ指数（ＣＩ）（Chang et al., Cancer Res. 45:2434-2439, (1985)参照）を用いて測定される。この方法は、種々のレベルの細胞毒性を有する２種の薬物間の相乗、相加、又は拮抗の程度を算出する。ＣＩ値が１未満である場合、２種の薬物間に相乗作用が存在する。ＣＩ値が１である場合、相加作用が存在するが、相乗作用は存在しない。１を超えるＣＩ値は拮抗作用を示す。ＣＩ値が小さくなるほど、相乗効果は大きくなる。別の実施形態では、相乗効果は、部分阻害濃度（ＦＩＣ）を用いることにより測定される。この部分値は、単独で作用する薬剤のＩＣ５０の関数として、組み合わせで作用する薬剤のＩＣ５０を表すことにより決定される。２種の相互作用薬剤では、各薬剤のＦＩＣ値の合計は相乗的相互作用の尺度を表す。ＦＩＣが１未満である場合、２種の薬剤間に相乗作用が存在する。ＦＩＣ値１は相加効果を示す。ＦＩＣ値が小さくほど、相乗効果は大きくなる。
【０２３５】
特定の代替実施形態では、相乗効果は、各化合物の限界若しくは飽和濃度又は用量を用いるとき可能であるよりも大きな調節が、２種の別個の化合物（例えば別個の結合部分又は他の治療剤）を併用したときに生じるときに観察される。相乗作用のこの形態は、単一結合部分（又は他の治療剤）単独では完全な効果を導き得ない場合に生じることがある（例えば、生物学的効果の１００％下方制御、又は変化（例えば阻害又は増強）が、用いられる薬剤の濃度の程度にかかわらず達成されない）。この状況では、相乗効果はＥＣ５０又はＩＣ５０値の分析によっては適切に得られない。２種の化合物（例えば結合部分又は他の治療剤）の併用が、単一化合物で可能であるよりも大きな生物学的効果の下方制御又は変化（例えば阻害又は増強）を導く場合、これは強力な相乗効果であると認識される。
【０２３６】
過剰増殖性疾患又は障害
「過剰増殖性疾患又は障害」とは、全ての形質転換細胞及び組織、並びに全ての癌性細胞及び組織を含む、全ての新生細胞の成長及び増殖（悪性であろうと良性であろうと）を意味する。過剰増殖性疾患又は障害としては、以下に限定されないが、前癌病変、異常細胞増殖、良性腫瘍、悪性腫瘍、及び「癌」が挙げられる。本発明に包含されるある実施形態において、過剰増殖性疾患又は障害、例えば、前癌病変、異常細胞増殖、良性腫瘍、悪性腫瘍、又は「癌」は、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰発現するか又は異常発現する細胞を含む。
【０２３７】
過剰増殖性疾患、障害及び／又は状態の別の例としては、以下に限定されないが、悪性であろうと良性であろうと、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎腺、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び生殖器系に位置する新生物が挙げられる。このような新生物は、ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰発現するか又は異常発現する。
【０２３８】
別の過剰増殖性疾患としては、以下に限定されないが、高γグロブリン血症、リンパ球増殖性疾患、異常タンパク血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンストローム型マクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、及び任意の、新形成以外の、上に列挙された器官系に位置する他の過剰増殖性疾患が挙げられる。本発明に包含されるある実施形態において、前記疾患は、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰発現するか又は異常発現する細胞が関与する。
【０２３９】
本明細書で使用されるとき、「腫瘍」又は「腫瘍組織」という用語は、過剰細胞分裂に起因する組織、ある場合にはＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰発現するか又は異常発現する細胞を含有する組織の異常塊を指す。腫瘍又は腫瘍組織は、異常成長特性を有し且つ有用な身体機能を有していない新生細胞である「腫瘍細胞」を含有する。腫瘍、腫瘍組織及び腫瘍細胞は、良性であり得、又は悪性であり得る。腫瘍又は腫瘍組織はまた、「腫瘍関連非腫瘍細胞」、例えば腫瘍又は腫瘍組織に提供するために血管を形成する血管細胞も含有し得る。非腫瘍細胞は、腫瘍細胞によって、例えば腫瘍又は腫瘍組織における血管新生の誘導によって複製及び成長するために誘導され得る。  
【０２４０】
本明細書で使用されるとき、「悪性腫瘍」という用語は、非良性腫瘍又は癌を指す。本明細書で使用されるとき、「癌」という用語は、無秩序の細胞増殖又は制御されていない細胞増殖を特徴とする悪性腫瘍を含むある種の過剰増殖性疾患を意味する。癌の例としては、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が挙げられる。このような癌のさらに具体的な例は以下に記載され、例えば、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮性扁平上皮細胞癌）、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及び肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌、例えば消化管癌、膵癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮体癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頸部癌が挙げられる。「癌」という用語は、原発性悪性細胞又は腫瘍（例えば、悪性腫瘍又は腫瘍の元の部位以外の対象の体の部位に移動していない悪性細胞又は腫瘍）及び続発性悪性細胞又は腫瘍（例えば、転移、すなわち元の腫瘍の部位と異なる二次的部位への悪性細胞又は腫瘍細胞の移動により生じる悪性細胞又は腫瘍）を包含する。本発明に包含される治療方法につながる癌は、ＩＧＦ−１Ｒを発現するか、過剰発現するか又は異常発現する細胞を含む。
【０２４１】
癌又は悪性腫瘍の別の例としては、限定されないが、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨肉腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂癌及び尿管癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部及び視覚路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体及びテント上原始外胚葉腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟組織肉腫、小児視覚路及び視床下部神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌、子宮体癌、上衣細胞腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫及び関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、毛髪細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高γグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、島細胞癌、島細胞膵癌、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、口唇及び口腔癌、肝癌、肺癌、リンパ球増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性の乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性原発不明頸部扁平上皮癌、転移性原発性頸部扁平上皮癌、転移性頸部扁平上皮癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫、脊髄形成異常症候群、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、妊娠中非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、原発不明転移性頸部扁平上皮癌、口腔咽頭癌、骨／悪性繊維性肉腫、骨肉腫／悪性繊維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性繊維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵癌、異常タンパク血症、紫斑病、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管癌、網膜細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、頸部扁平上皮癌、胃癌、テント上原始外胚葉及び松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行細胞癌、移行腎盂及び尿管癌、栄養膜腫瘍、尿管及び腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路及び視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンストローム型マクログロブリン血症、ウィルム腫瘍、及び任意の他の過剰増殖性疾患、さらには上記の器官系に位置する新生物が挙げられる。
【０２４２】
本発明に包含される方法を用いて、上記障害が挙げられるが、これらに限定されない、前癌状態を治療し、また新生物又は悪性状態への進行を予防することができる。このような使用は、特に、過形成、化生、又は特に異形成症から成る非新生細胞増殖が生じた場合に、新形成又は癌への先立つ進行について知られるか又は疑われる状態において必要とされる（このような異常増殖状態の概説については、Robbins and Angell, Basic Pathology, 2d Ed., W. B. Saunders Co., Philadelphia, pp.68-79 (1976)参照）。細胞がＩＧＦ−１Ｒを発現し始めるか、過剰発現し始めるか、又は異常発現し始めるこのような状態は、本発明に包含される方法で特に治療できる。
【０２４３】
過形成は、構造又は機能の有意な変化なしに組織又は器官の細胞の数の増大を伴う制御された細胞増殖の１つの形である。本発明に包含される方法で治療することができる過形成疾患としては、限定されないが、脈管濾胞性縦隔リンパ節増殖症、好酸球性増加随伴性血管類リンパ組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底基底細胞過形成、良性巨大リンパ節増殖症、セメント質過形成、先天性副腎過形成、先天性脂腺過形成、嚢胞性過形成、乳房の嚢胞性過形成、義歯性繊維症、導管過形成、子宮内膜増殖症、繊維筋性過形成、局所性上皮肥厚、歯肉増殖症、炎症性繊維性過形成症、炎症性乳頭状過形成症、血管内乳頭状内皮過形成、結節性前立腺過形成、結節性再生性過形成、偽上皮腫性増殖、老人性脂腺増生症、及び疣贅性肥厚が挙げられる。
【０２４４】
化生は、ある種の成熟又は完全分化細胞が別種の成熟細胞に置き換わる制御された細胞増殖の１つの形である。本発明に包含される方法で治療できる化生性疾患としては、以下に限定されないが、原因不明骨髄様化生、アポクリン化生、異型化生、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸上皮化生、化生性貧血、変形骨化、化生性ポリープ、骨髄様化生、原発性骨髄様化生、続発性骨髄様化生、扁平上皮化生、羊膜扁平上皮化生、及び症候性骨髄化生が挙げられる。
【０２４５】
異形成症は、癌の前触れである場合が多く、主として上皮に見られる；異形成症は、非新生細胞増殖の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性及び細胞の構造配向の喪失を含む。異形成細胞は、異常に大きく、濃く染色される核を有する場合が多く、多形性を示す。異形成症は、慢性的な刺激又は炎症が存在する場合に特徴的に生じる。本発明に包含される方法で治療できる異形成疾患としては、以下に限定されないが、無汗性外胚葉性異形成症、前後形成異常症、窒息性胸部形成異常、心房指状異形成症、気管支肺異形成症、脳異形成症、頸部異形成症、軟骨外胚葉性異形成症、鎖骨頭蓋異形成症、先天性外胚葉性異形成症、頭蓋骨幹異形成症、頭蓋手根骨足根骨異形成症、頭蓋骨幹端異形成症、象牙質異形成症、骨幹異形成症、外胚葉異形成、エナメル質異形成症、脳眼異形成症、片肢性骨端異形成症、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、顎の家族性繊維性異形成症、家族性白色屈曲異形成症、繊維筋性異形成症、繊維性骨異形成症、開花性骨異形成症、遺伝性腎網膜形成異常、発汗性外胚葉形成異常、無汗性外胚葉形成異常症、リンパ球減少胸腺形成異常、乳腺異形成症、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ型内耳形成異常、単発性繊維性骨異形成、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、歯牙形成不全、眼下顎四肢形成不全、根尖セメント質異形成症、多発性繊維性骨異形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔視覚異形成症、脊柱骨端異形成症及び心室橈骨形成異常が挙げられる。
【０２４６】
本発明に包含される方法で治療できる別の新生物発生前疾患としては、限定されないが、良性の異常増殖性疾患（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性疾患、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、及び食道異形成症）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、及び日光性角化症が挙げられる。
【０２４７】
好ましい実施形態において、本発明に包含される方法は、癌、特に上に挙げた癌の増殖、進行及び／又は転移を阻止するのに使用できる。
【０２４８】
別の過剰増殖性疾患、障害、及び／又は状態としては、限定されないが、悪性腫瘍及び関連疾患、例えば白血病（例えば、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（例えば、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、及び赤白血病））及び慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病））、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病及び非−ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症、重鎖病、及び固体腫瘍、例えば、限定されないが、肉腫及び癌、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨液肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎生期癌、ウィルム腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴覚経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜細胞腫の進行及び／又は転移が挙げられる
【０２４９】
ＩＩ．ＩＧＦ−１Ｒ
天然に存在するインスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦ−１Ｒ）ＩＧＦ−１Ｒは、ジスルフィド結合によって連結された２つのα−サブユニット（それぞれ１３０ＫＤａ）と２つのβ−サブユニット（それぞれ９０ＫＤａ）を含むヘテロ四量体形質膜糖タンパク質である。Massague, J. and Czech, M. P. J. Biol. Chem. 257:5038-5045 (1992)。ＩＧＦ−１Ｒはまた、当技術分野においてＣＤ２２１及びＪＴＫ１３という名称でも知られている。ヒトＩＧＦ−１Ｒ  ｍＲＮＡの核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００８７５として入手でき、本明細書に配列番号１として示す。  
配列番号１
＞ｇｉ｜１１０６８００２｜ｒｅｆ｜ＮＭ＿０００８７５．２｜ホモサピエンス  インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ），ｍＲＮＡ
【０２５０】
前駆体ポリペプチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００８６６として入手でき、本明細書に配列番号２として示す。
配列番号２
＞ｇｉ｜４５５７６６５｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０００８６６．１｜インスリン様成長因子１受容体前駆体［ホモサピエンス］
【０２５１】
配列番号２のアミノ酸１〜３０は、ＩＧＦ−１Ｒシグナルペプチドをコードすることが報告されており、配列番号２のアミノ酸３１〜７４０は、ＩＧＦ−１Ｒ  α−サブユニットをコードすることが報告されており、及び配列番号２のアミノ酸７４１〜１３６７は、ＩＧＦ−１Ｒ  β−サブユニットをコードすることが報告されている。これらの特徴及びＮＰ＿０００８６６  ＧｅｎＢａｎｋ  ｅｎｔｒｙに報告されているヒトＩＧＦ−１Ｒのその他の特徴を表２に示す。
【表２】
2011516549.tif 000003
【０２５２】
本発明はまた、非ヒトＩＧＦ−１Ｒタンパク質、例えば、げっ歯類又は非ヒト霊長類由来のＩＧＦ−１Ｒに特異的に、優先的に又は競合的に結合するＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。
【０２５３】
ＩＧＦ−１Ｒは、多数の腫瘍細胞、例えば、限定されないが、膀胱腫瘍(Hum. Pathol. 34:803 (2003))；脳腫瘍(Clinical Cancer Res. 8:1822 (2002))；乳房腫瘍（Eur. J. Cancer 30:307 (1994)及びHum Pathol. 36:448-449 (2005))；結腸腫瘍、例えば、腺癌、転移、及び腺腫(Human Pathol. 30:1128 (1999)、Virchows. Arc. 443:139 (2003)、及びClinical Cancer Res. 10:843 (2004))；胃腫瘍(Clin. Exp. Metastasis 21:755 (2004))；腎臓腫瘍、例えば、明細胞、嫌色素性及び乳頭状ＲＣＣ(Am. J. Clin. Pathol. 122:931-937 (2004))；肺腫瘍(Hum. Pathol. 34:803-808 (2003)及びJ. Cancer Res. Clinical Oncol. 119:665-668 (1993))；卵巣腫瘍(Hum. Pathol. 34:803-808 (2003))；膵臓腫瘍、例えば、導管腺癌(Digestive Diseases. Sci. 48:1972-1978 (2003)及びClinical Cancer Res. 11:3233-3242 (2005))；及び前立腺腫瘍(Cancer Res. 62:2942-2950 (2002))において発現する。
【０２５４】
ＩＩＩ．ＩＧＦ−１Ｒ抗体
１つの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。例えば、本発明は、表３及び４に示すある種のモノクローナル抗体、並びにその断片、変異体、及び誘導体の少なくとも抗原結合性ドメインを包含する。表３は、ファージディスプレイライブラリー及び抗体の種々の結合特性から特定されたヒト抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ領域を記載し、それらは実施例でさらに詳しく説明する。表４は、ハイブリドーマ技術、及び抗体の種々の結合特性によって確認されたマウス抗−ヒトＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体を記載し、それらは実施例でさらに詳しく説明する。
【表３】
2011516549.tif 000004
【表４】
2011516549.tif 000005
【０２５５】
Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３の完全長抗体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞株は、米国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)（「ＡＴＣＣ」）に２００６年３月２８日付で寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４４４及びＰＴＡ−７４４５それぞれを得た。Ｆａｂ抗体断片Ｍ１４−Ｇ１１を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞株は、米国培養細胞系統保存機関（「ＡＴＣＣ」）に２００６年８月２９日付で寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７８５５を得た。
【０２５６】
完全長ヒト抗体Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、及びＰ１Ａ２．２Ｂ１１を発現するハイブリドーマ細胞株は、ＡＴＣＣにそれぞれ２００６年３月２８日、２００６年６月１３日及び２００６年３月２８日付けで寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５８、ＰＴＡ−７７３２、及びＰＴＡ−７４５７、それぞれを得た。完全長ヒト抗体２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８を発現するハイブリドーマ細胞株は、それぞれ２００６年３月２８日、２００６年７月１１日及び２００６年７月１１日付けで寄託し、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−７４５６、ＰＴＡ−７７３０、及びＰＴＡ−７７３１それぞれを得た。抗体及び寄託細胞株の相互関係についてはＡＴＣＣ寄託表（以下）を参照。
【０２５７】
ＡＴＣＣは、10801 University Boulevard、Manassas、VA 20110-2209, USAにある。ＡＴＣＣ寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項に従ってなされた。
【０２５８】
本発明のある実施形態は、以下の表（「ＡＴＣＣ寄託表」）に示す米国培養細胞系統保存機関に寄託した。
【表５】
2011516549.tif 000006
【０２５９】
本明細書で使用されるとき、「抗原結合性ドメイン」という用語は、抗原（例えばＩＧＦ−１Ｒのエピトープ）上のエピトープに特異的に結合する部位を包含する。抗体の抗原結合性ドメインは、典型的には免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも一部及び免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも一部を含有する。これらの可変領域によって形成される結合部位は、抗体の特異性を決定する。
【０２６０】
本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体又はその抗原結合性断片、変異体若しくは誘導体であって、ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−ＢＯ１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に結合する、ＩＧＦ−１Ｒ抗体又はその抗原結合性断片、変異体若しくは誘導体を包含する。
【０２６１】
本発明は、さらに、ＩＧＦ−Ｒ１抗体、又はその抗原結合性断片、変異体若しくは誘導体であって、ＩＧＦ−Ｒ１抗体が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体をＩＧＦ−Ｒ１に結合させないように競合的に阻害する、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体若しくは誘導体を包含する。
【０２６２】
本発明はまた、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体若しくは誘導体であって、ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の抗原結合性ドメインと同じ抗原結合性ドメインを含有する、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体若しくは誘導体を包含する。
【０２６３】
Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｂ０１のＶＨ及びＶＬ鎖の元来のヌクレオチド及びアミノ酸配列、又は改変バージョンのヌクレオチド及びアミノ酸配列は配列表に示されている。配列番号１３は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号７７は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６の単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号１４は、重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を示す。配列番号７８は、軽鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を示す。配列番号２５は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号８７は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３の単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号２６は、重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を示す。配列番号８８は、軽鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を示す。配列番号３１は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号９２は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１の単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号３２は、重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を示す。配列番号９３は、軽鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号８２は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１の単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号２０は、重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を示す。配列番号８３は、軽鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を示す。配列番号１８は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６の単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号１４は、配列最適化重鎖Ｍ１３−Ｃ０６のアミノ酸配列を示す。配列番号３０は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３の単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号２６は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｃ０３のアミノ酸配列を示す。配列番号３６は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１の単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号３２は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｇ１１のアミノ酸配列を示す。配列番号２４は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１の単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号２０は、配列最適化重鎖Ｍ１４−Ｂ０１のアミノ酸配列を示す。配列番号１５３は、軽鎖定常ドメインの単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号１５４は、軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列を示す。配列番号１５５は、重鎖ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ定常ドメインの単鎖ＤＮＡ配列を示す。配列番号１５６は、重鎖ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ定常ドメインのアミノ酸配列を示す。
【０２６４】
抗体の調製方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される。一度、種々の断片に対する抗体、又はシグナル配列を有していない完全長ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体が産生されると、抗体又は抗原結合性断片がＩＧＦ−１Ｒのどのアミノ酸又はエピトープに結合するかを調べることは、本明細書に記載のエピトープマッピングプロトコル及び当技術分野で既知の方法で調べることができる（例えば、“Chapter11-Immunology”, Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausube et al., v.2, John Wiley&Sons, Inc. (1996)に記載のような二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）。別のエピトープマッピングプロトコルは、Morris, G. Epitope Mapping Protocols, New Jersey:Humana Press (1996)に見出し得る。上記の両方は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。エピトープマッピングはまた、市販の手段で行うこともできる（すなわち、ProtoPROBE, Inc. (Milwaukee, Wisconsin)）。
【０２６５】
さらに、ＩＧＦ−１Ｒのいかなる部分に結合する産生された抗体も、次いで、ＩＧＦ−１Ｒのアンタゴニストとして作用するその能力、例えば、ＩＧＦ−１Ｒに対するインスリン成長因子、例えばＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、又はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方の結合を阻害する能力、ＩＧＦ−１Ｒの内部化を促進する能力、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する能力、下流のリン酸化、例えば、Ａｋｔ又はｐ４２／４４ＭＡＰＫの下流のリン酸化を阻害する能力、あるいは腫瘍細胞の増殖、運動性又は転移を阻害する能力について選別することができる。抗体は、これらの特性及びその他の特性について実施例に詳しく記載する方法に従って選別することができる。ＩＧＦ−１Ｒ抗体の他の機能は、本明細書に記載の他のアッセイを使用して試験することができる。
【０２６６】
他の実施形態において、本発明は、エピトープが配列番号２の少なくとも約４個〜５個のアミノ酸、配列番号２の少なくとも７個、少なくとも９個、又は少なくとも約１５個〜約３０個のアミノ酸を含むか、該アミノ酸から本質的に成るか又は該アミノ酸からなる、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に又は優先的に結合する抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。前記の配列番号２の所与のエピトープのアミノ酸は、連続しているか又は線状であってもよいが、必ずしも連続しているか又は線状である必要はない。ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面で発現するか又は例えばＩｇＧ  Ｆｃ領域に融合された可溶性断片として発現するようなＩＧＦ−１Ｒの細胞外ドメインによって形成される非線状ドメインを含むか、該非線状ドメインから本質的に成るか又は該非線状ドメインからなる。従って、ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープは、配列番号２の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、約１５個〜約３０個、あるいは少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、又は１００個の連続又は不連続アミノ酸を含むか、該アミノ酸から本質的に成るか、又は該アミノ酸からなり、この場合の不連続アミノ酸は、タンパク質折り畳みによってエピトープを形成する。
【０２６７】
他の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に又は優先的に結合する抗体、あるいはその抗原結合性断片、変異体、誘導体であって、エピトープが、前記の配列番号２の１個、２個、３個、４個、５個、６個以上の連続又は不連続アミノ酸の他に、タンパク質を修飾する別の部分、例えば炭水化物部分は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体が、修飾された標的タンパク質を、該タンパク質の未修飾バージョンに結合するよりも高い親和性で結合するように含まれていてもよい糖質部分を含むか、該糖質部分のみから本質的に成るか、又は糖質部分のみからかる、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に又は優先的に結合する抗体を包含する。あるいは、ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、標的タンパク質の未修飾バージョンに全く結合しない。
【０２６８】
ある態様において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片、又はＩＧＦ−１Ｒ変異体ポリペプチドに、所与の参照モノクローナル抗体についての解離定数（ＫＤ）よりも小さいＫＤによって特徴付けられる親和性で、特異的に結合する抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。
【０２６９】
ある実施形態において、本発明は、前記のＩＧＦ−１Ｒあるいは断片又は変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、すなわちこのようなエピトープに非関連又はランダムエピトープに結合するよりも容易に結合するか；前記のＩＧＦ−１Ｒあるいは断片又は変異体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合する、すなわち、このようなエピトープに、関連の、同様の、同種の、類似のエピトープに結合するよりも容易に結合するか；それ自体が前記のＩＧＦ−１Ｒあるいは断片又は変異体のあるエピトープに特異的に又は優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害するか；あるいは前記のＩＧＦ−１Ｒ若しくは断片又は変異体の少なくとも１つのエピトープに、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍ、又は約１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤによって特徴づけられる親和性で、特異的に結合する抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。具体的な態様において、前記抗体又はその断片は、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片に比べて、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片に優先的に結合する。別の具体的な態様において、前記抗体又はその断片は、１つ以上のＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片、例えば、１つ以上の哺乳動物ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドに優先的に結合するが、インスリン受容体（ＩｎｓＲ）ポリペプチドには結合しない。理論に束縛されるものではないが、インスリン受容体ポリペプチドは、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドと幾つかの配列類似性を有することが知られており、ＩｎｓＲと交差反応する抗体は、インビボで望まれない副作用、例えばグルコース代謝の妨害を生じ得る。
【０２７０】
抗体結合解離定数との関連で使用されるように、「約」という用語は、抗体親和性を測定するのに利用される方法に元来付随する変化の程度を考慮に入れる。例えば、使用する装置の精度の程度、測定される試料の数に基づく標準誤差、及び丸め誤差に依存して、「約１０−２Ｍ」という用語は、例えば０．０５Ｍから０．００５Ｍまでを含み得る。
【０２７１】
特定の実施形態において、本発明は、５×１０−２／秒、１０−２／秒、５×１０−３／秒、又は１０−３／秒以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド、その断片若しくは変異体に結合する抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。あるいは、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、５×１０−４／秒、１０−４／秒、５×１０−５／秒、又は１０−５／秒、５×１０−６／秒、１０−６／秒、５×１０−７／秒、又は１０−７／秒以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合する抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。
【０２７２】
他の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片若しくは変異体に、１０３／Ｍ／秒、５×１０３／Ｍ／秒、１０４／Ｍ／秒又は５×１０４／Ｍ／秒以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で結合する抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。あるいは、本発明は、１０５／Ｍ／秒、５×１０５／Ｍ／秒、１０６／Ｍ／秒又は５×１０６／Ｍ／秒あるいは１０７／Ｍ／秒以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片若しくは変異体に結合する抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。
【０２７３】
種々の実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ活性のアンタゴニストである本明細書に記載のＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。ある実施形態において、例えば、腫瘍細胞上で発現するＩＧＦ−１Ｒに対するアンタゴニストＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合は、ＩＧＦ−１Ｒに対するインスリン成長因子、例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、又はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方の結合を阻害するか、ＩＧＦ−１Ｒの内部化を促進し、それによってそのシグナル伝達能を阻害するか、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害するか、シグナル伝達経路の下流の分子、例えば、Ａｋｔ又はｐ４２／４４  ＭＡＰＫのリン酸化を阻害するか、あるいは腫瘍細胞の増殖、運動性又は転移を阻害する。
【０２７４】
特に特記しない限り、本明細書で使用されるとき、抗体に関連して「その断片」とは、抗原結合性断片、すなわち、抗原に特異的に結合する抗体の部分を指す。１つの実施形態において、本発明は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、例えば、本発明の抗体は、二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体、例えば、二重特異性抗体、ミニボディー、ドメイン欠失抗体、又は２つ以上のエピトープ、例えば、２つ以上の抗原又は同一抗原上の２つ以上のエピトープについて結合特異性を有する融合タンパク質である抗体を包含する。１つの実施形態において、本発明は、本明細書に開示の標的ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ上の少なくとも１つのエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体を包含する。別の実施形態において、本発明は、標的ポリペプチド上のエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメイン及び薬物又は毒素に特異的な少なくとも１つの標的結合ドメインを有する二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体を包含する。さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に開示の標的ポリペプチド上のエピトープに特異的な少なくとも１つの結合ドメイン及びプロドラッグに特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体を包含する。二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、本明細書に開示の標的ポリペプチドのエピトープに特異的な２つの標的結合ドメイン及び第２の標的に特異的な２つの標的結合ドメインを有する４価抗体であり得る。従って、４価二重特異性ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、それぞれの特異性について２価であり得る。
【０２７５】
本発明のＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、当業者には知られているように、１つ以上のエフェクター機能を仲介する定常領域を含有することができる。例えば、抗体定常領域に対するＣ１補体成分の結合は、補体系を活性化し得る。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン作用及び溶解に重要である。補体の活性化はまた、炎症反応を刺激し、自己免疫過敏にも関与し得る。また、抗体は、Ｆｃ領域を介して種々の細胞上の受容体に結合し、抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体結合部位は細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。種々のクラスの抗体、例えばＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（ε受容体）、ＩｇＡ（α受容体）及びＩｇＭ（μ受容体）に特異的な多くのＦｃ受容体が存在する。細胞表面のＦｃ受容体に対する抗体の結合は、多数の重要且つ多様な生物学的反応、例えば抗体被覆粒子の取込及び破壊、免疫複合体の浄化、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞仲介性細胞障害、すなわちＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性メディエータの放出、胎盤通過及び免疫グロブリン産生の制御を誘発する。
【０２７６】
従って、本発明のある実施形態は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体であって、所望の生化学的性質、例えばほぼ同じ免疫原性をもつ完全な改変されていない抗体と比べた場合に、エフェクター機能の低下、非共有的に二量化する能力、腫瘍の部位に局在化する能力の上昇、血清半減期の低下、又は血清半減期の増加を提供するように、１つ以上の定常領域ドメインの少なくとも１つの部分が、欠失しているか、又は改変されている、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。例えば、本明細書に記載の診断及び治療方法で使用されるある抗体は、免疫グロブリン重鎖に類似したポリペプチド鎖を含有するが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠いているドメイン欠失抗体である。例えば、ある抗体においては、修飾された抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失、例えば、ＣＨ２ドメインの全部又は一部が欠失する。他の実施形態において、本明細書に記載の診断及び治療方法で使用されるある抗体は、グリコシル化を除外するために改変した定常領域、例えばＩｇＧ４重鎖定常領域を有し、これは本明細書の他の個所で「ａｇｌｙ」抗体と呼ばれる。理論に束縛されるものではないが、「ａｇｌｙ」抗体は向上したインビボ安全性及び安定性プロファイルを有し得ると考えられる。
【０２７７】
本明細書に記載の、あるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体において、そのＦｃ部分は、当技術分野において既知の方法を使用してエフェクター機能を低下させるために変異させ得る。例えば、定常領域ドメインの欠失又は不活性化（点変異又は他の手段による）は、血中修飾抗体のＦｃ受容体結合を抑制し、それによって腫瘍局在を増加させ得る。別の場合に、それは、本発明の実施形態と一致する定常領域の修飾は、補体結合を緩和し、それにより血清半減期及び複合体化細胞毒の非特異的結合を軽減することであり得る。定常領域のさらに別の修飾は、増大した抗原特異性又は抗体柔軟性により、高められた局在を可能にするジスルフィド結合又はオリゴ糖部分を修飾するのに使用し得る。得られる生理学的プロファイル、生体利用性及び修飾の他の生化学的効果、例えば腫瘍局在化、体内分布及び血清半減期は、過度の実験を行うことなく周知の免疫学的方法を使用して容易に測定及び定量し得る。
【０２７８】
本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体の修飾形態は、全前駆体又は親抗体から、当技術分野で既知の方法を使用して調製できる。典型的な方法は、本明細書でさらに詳しく論じる。
【０２７９】
ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体の可変領域及び定常領域の両方は、完全にヒト由来のものである。完全ヒト抗体は、当技術分野において既知の方法及び本明細書に記載の方法を使用して調製できる。例えば、特異抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原投与に反応してこのような抗体を産生するために修飾されているが、その内在性遺伝子座（ｌｏｃｉ）が機能不能にされているトランスジェニック動物に、前記抗原を投与することによって調製できる。このような抗体を調製するのに使用できる例示的な方法は、米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，４５８，５９２号；同第６，４２０，１４０号に記載されている。他の方法は、当技術分野において知られている。完全ヒト抗体は、同様に、本明細書の他の個所でさらに詳しく説明するように、種々のディスプレイ技術、例えば、ファージディスプレイ又は他のウイルスディスプレイ系で産生させることができる。
【０２８０】
本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、当技術分野において既知の方法を使用して調製又は製造できる。ある実施形態において、抗体分子又はその断片は、「組み換えにより産生される」、すなわち組換えＤＮＡ技術を使用して産生される。抗体分子又はその断片を調製するための例示的な方法は、本明細書の他の個所でさらに詳しく論じる。
【０２８１】
本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体はまた、例えば、共有結合が、抗体がその同種エピトープに特異的に結合するのを妨害しないように、抗体に対する任意の種類の分子の共有結合によって修飾される誘導体を包含する。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質に対する連結などによって修飾されている抗体が含まれる。多数の化学修飾のいずれをも、既知の方法、例えば、限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などによって行い得る。さらに、誘導体は、１個以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
【０２８２】
ある実施形態において、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、治療すべき動物において、例えばヒトにおいて、有害な免疫応答を誘発しない。１つの実施形態において、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、当技術分野で認められている方法を使用してその免疫原性を低下させるために修飾される。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫してもよく、又はキメラ抗体を調製してもよい。これらの種類の抗体は、親抗体の抗原結合特性を保持するか又は実質的に保持するが、ヒトにおいて低免疫原性である非ヒト抗体、典型的にはマウス又は霊長類抗体から誘導される。これは、種々の方法で、例えば（ａ）非ヒト可変領域全体をヒト定常領域にグラフトしてキメラ抗体を生成させることによって；（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上の少なくとも一部をヒトフレームワーク及び定常領域に、フレームワーク残基を保持しながら又は保持することなくグラフトすることによって；又は（ｃ）非ヒト可変領域全体を移植するが、これらを表面残基の置換によってヒト様セクションで「覆い隠す（ｃｌｏａｋｉｎｇ）」ことによって達成し得る。このような方法は、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sd. 81:6851-6855 (1984); Morrison et al., Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 28:489-498 (1991); Padlan、Molec. Immun. 31:169-217 (1994)、並びに米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、及び第６，１９０，３７０号に開示されている。これらは全部、その全てが参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２８３】
脱免疫はまた、抗体の免疫原性を低下させるのに使用できる。本明細書で使用されるとき、「脱免疫」という用語は、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の改変を包含する（例えば、国際公開第９８５２９７６Ａ１号、同第００３４３１７Ａ２号参照）。例えば、出発抗体由来のＶＨ及びＶＬ配列が分析され、それぞれのＶ領域からのヒトＴ細胞エピトープ「マップ」は、配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びその他のキー残基に関連してエピトープの配置を示す。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープは、最終抗体の活性を変化させる危険性の低い、別のアミノ酸置換を特定するために分析される。アミノ酸置換の組み合わせを含有する様々な代替ＶＨ及びＶＬ配列が設計され、これらの配列は、その後に様々な結合性ポリペプチド、例えば本明細書に開示の診断及び治療方法で使用されるＩＧＦ−１Ｒ特異抗体又はその免疫特異的断片に組み込まれ、次いで機能について試験される。典型的には、１２〜２４種の変異体抗体が作製され、試験される。修飾されたＶ領域及びヒトＣ領域を含有する完全な重鎖及び軽鎖遺伝子は、次いで発現ベクターにクローン化され、その結果生じたプラスミドが全抗体の産生のために細胞株に導入される。次いで、抗体は、適切な生化学的及び生物学的アッセイにおいて比較され、最適変異体が特定される。
【０２８４】
本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、当技術分野において既知の適当な方法で生じさせ得る。対象の抗原に対するポリクローナル抗体は、当技術分野において周知の種々の方法で産生させ得る。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、例えば、結合性ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するために、種々の宿主動物、例えば、限定されないが、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ハムスター、ヒツジ、ロバなどに投与することができる。種々のアジュバントが、宿主の種に応じて免疫反応を高めるために使用され、該アジュバントとしては、限定されないが、フロイント（完全及び不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホール・リンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウム・パルヴァム(Corynebacterium parvum)が挙げられる。このようなアジュバントもまた当技術分野において周知である。
【０２８５】
モノクローナル抗体は、当技術分野において既知の様々な方法を使用して、例えばハイブリドーマ、組換え体の使用、及びファージディスプレイ法、又はこれらの組み合わせを使用して調製できる。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えば当技術分野において公知であり、例えば、Harlow et al., Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et al.,: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier, N.Y., 563-681 (1981)に教示されているハイブリドーマ法を使用して産生できる（前記の参考文献は、その全てが参照により組み込まれる）。本明細書で使用されるとき「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ法によって産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、単一クローン、例えば真核生物クローン、原核生物クローン、又はファージクローンから誘導されるクローンを指し、それが産生される方法ではない。従って、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ法によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、エピトープ認識の領域を増加させるためにＩＧＦ−１Ｒノックアウトマウスを使用して調製できる。モノクローナル抗体は、当技術分野において既知の様々な方法、例えば本明細書の他の箇所に記載のようなハイブリドーマ及び組換え体の使用並びにファージディスプレイ法を使用して調製できる。
【０２８６】
当技術分野で認められているプロトコールを使用して、１つの例において、抗体は、哺乳動物中で関連抗原（例えば、精製ＩＧＦ−１ＲあるいはＩＧＦ−１Ｒを含有する細胞又は細胞抽出物）及びアジュバントの頻回皮下又は腹腔内注射によって産生される。この免疫化は、典型的には、活性化脾臓細胞又はリンパ球から抗原反応性抗体の産生を含む免疫応答を誘発する。生じた抗体を動物の血清から採取してポリクローナル調剤を提供し得るが、多くの場合モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均質調剤を提供するために脾臓、リンパ節又は末梢血から個々のリンパ球を単離することが望ましい。好ましくは、リンパ球は脾臓から得られる。
【０２８７】
この周知の方法（Kohler et al., Nature 256:495 (1975))では、抗原を注射されている哺乳動物に由来する比較的短命であるか又は不死化していないリンパ球が不死腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合され、このようにして不死であり且つＢ細胞の遺伝子コード化抗体を産生できるハイブリッド細胞すなわち「ハイブリドーマ」を産生する。得られるハイブリッドは、選別、希釈、及び再増殖によって単一の遺伝子株に分離され、それぞれ個々の株は単一抗体の形成に特異的な遺伝子を含有する。これらは、所望の抗原に対して同質である抗体を産生し、その純粋な遺伝起源に関連して、「モノクローナル」と呼ばれる。
【０２８８】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１つ以上の物質を含有する培地に接種され、増殖される。当業者には、ハイブリドーマの形成、選別及び増殖用の試薬、細胞株及び培地は多数の供給源から商業的に入手でき、標準化されたプロトコールが十分に確立されていることが理解されるであろう。一般に、ハイブリドーマ細胞が増殖する培地が、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、インビトロアッセイ、例えば免疫沈降、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で決定される。ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性及び／又は活性をもつ抗体を産生することが確認された後に、クローンを限界希釈法によってサブクローン化し、標準法で増殖させることができる(Goding, Monoclonlal Antibodies:Principles and Practice, Academic Press, pp59-103 (1986))。また、サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培地、腹水又は血清から、慣用の精製法で、例えばプロテイン−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーで分離し得ることが認められるであろう。
【０２８９】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の方法で生じさせ得る。例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、組換え技術によって産生させ得るか、あるいは酵素、例えばパパイン（Ｆａｂ断片を産生させるため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生させるために）を使用して免疫グロブリン分子のタンパク分解切断によって産生させ得る。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
【０２９０】
また、当業者には、抗体又は抗体断片（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡもまた、抗体ライブラリ、例えばファージディスプレイライブラリーから誘導し得ることが理解されるであろう。特に、このようなファージは、レパートリー又は組み合わせ抗体ライブラリー（例えば、ヒト又はマウス）から発現する抗原結合性ドメインを提示するのに利用できる。対象の抗原を結合する抗原結合性ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原を使用するか、あるいは固体表面に又はビーズに固定又は捕捉された抗原を使用して、選択又は特定することができる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、Ｆａｂ、Ｆｖ  ＯＥ  ＤＡＢ（軽鎖又は重鎖由来の個々のＦｖ領域）を有するファージから発現したｆｄ及びＭ１３結合ドメインを含有するか、あるいはファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質に組換えによって融合されたジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを含有する線状ファージである。典型的な方法は、例えば、欧州特許第ＥＰ３６８  ６８４Ｂ１号；米国特許第５，９６９，１０８号、Hoogenboom, H. R. and Chames, Immunol. Today 21:371 (2000); Nagy et al., Nat. Med. 8:801 (2002)；Huie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA98:2682 (2001)； Lui et al., J. Mol. Biol. 315:1063 (2002)に示されている。これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。幾つかかの刊行物（例えば、Marks et al., Bio/Technology10:779-783 (1992)）は、鎖シャフリング、並びに大きなファージライブラリーを構築するためのストラテジとして組み合わせ感染及びインビボ組換えによる高親和性ヒト抗体の産生を記載している。別の実施形態において、リボソームディスプレイ法は、ディスプレイプラットホームとしてバクテリオファージを置換するのに使用できる（例えば、Hanes et al., Nat. Biotechnol. 18:1287 (2000)；Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750 (2001)；又はIrving et al., J. Immunol. Methods 248:31 (2001)参照）。さらに別の実施形態において、細胞表面ライブラリで抗体をスクリーニングできる(Boder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10701 (2000); Daugherty et al., J. Immunol. Methods 243:211 (2000))。このような方法は、モノクローナル抗体の単離及びその後のクローニングのための伝統的なハイブリドーマ法に替わる代替法を提供する。
【０２９１】
ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、これらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面に提示される。例えば、ＶＨ及びＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列が、動物ｃＤＮＡライブラリ（例えば、リンパ組織のヒト又はマウスｃＤＮライブラリ）又は合成ｃＤＮＡライブラリから増幅されるか、あるいは単離される。ある実施形態において、ＶＨ及びＶＬ領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲでｓｃＦＶＬリンカーにより一緒に結合され、ファージミドベクター（例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ６又はｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）にクローン化される。ベクターは、大腸菌において電気穿孔され、この大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で使用されるファージは、典型的にはｆｄ及びＭ１３を含有する線状ファージであり、ＶＨ又はＶＬ領域は、通常はファージ遺伝子ＩＩＩ又は遺伝子ＶＩＩＩいずれかに組換えにより融合される。対象抗原（すなわち、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片）に結合する抗原結合性ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば固体表面又はビーズに固定又は捕捉された標識抗原又は抗原を使用して選択又は特定できる。
【０２９２】
抗体を調製するのに使用できるファージディスプレイ法の別の例としては、Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187:9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology57:191-280 (1994)；国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；国際公開第９０／０２８０９号；同第９１／１０７３７号；同第９２／０１０４７号；同第９２／１８６１９号；同第９３／１１２３６号；同第９５／１５９８２号；同第９５／２０４０１号；並びに米国特許第５，６９８，４２６号；同第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；同第５，５８０，７１７号；同第５，４２７，９０８号；同第５，７５０，７５３号；同第５，８２１，０４７号；同第５，５７１，６９８号；同第５，４２７，９０８号；同第５，５１６，６３７号；同第５，７８０，２２５号；同第５，６５８，７２７号；同第５，７３３，７４３号及び同第５，９６９，１０８号に記載の方法が挙げられる；これらのそれぞれは、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９３】
前記参考文献に記載のように、ファージ選別後に、ファージ由来の抗体コード領域を単離し、完全抗体、例えばヒト抗体、又は任意の他の所望の抗原結合性断片を生成させるのに使用し、任意の所望の宿主、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌において発現させる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片を組換え産生させる方法もまた、当技術分野において既知の方法、例えば国際公開第９２／２２３２４号；Mullinax et al., BioTechniques12 (6):864-869 (1992); Sawai et al., AJRI34:26-34 (1995);及びBetter et al., Science 240:1041-1043 (1988)（前記の参考文献は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法を使用して用いることもできる。
【０２９４】
単鎖Ｆｖｓ及び抗体を産生させるのに使用できる方法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２５８，４９８号；Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993)；及びSkerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)に記載の方法が挙げられる。ヒトでの抗体のインビボ使用及びインビトロ検出アッセイを含む幾つかの用途については、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体は、抗体の種々の部分が種々の動物種に由来する分子、例えばマウスモノクローナル抗体に由来する可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。キメラ抗体を産生させる方法は、当技術分野において公知である。例えば、Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989);米国特許第５，８０７，７１５号；同第４，８１６，５６７号；及び同第４，８１６，３９７号参照。これらは、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。ヒト化抗体は、所望の抗原に結合する、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域とを有する非ヒト種抗体由来の抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合性を変化させるために、好ましくは向上させるためにＣＤＲ供与抗体由来の対応残基で置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を確認するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデル化及び特定の位置での異常なフレームワーク残基を確認するための配列比較によって特定される（例えば、Queen et al.，米国特許第５，５８５，０８９号；Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)参照、これはその全てが参照により本明細書に組み込まれる）。抗体は、当技術分野において既知の様々な方法、例えば、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号；国際公開第９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；及び第５，５８５，０８９号参照）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）又はリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第５９２，１０６号；同第５１９，５９６号；Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7 (6):805-814 (1994); Roguska et al., PNAS 91:969-913 (1994))、及び鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を使用してヒト化することができる。
【０２９５】
完全ヒト抗体が、ヒト患者の治療に特に望ましい。ヒト抗体は、当技術分野において既知の様々な方法、例えばヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを使用する前記のファージディスプレイ法で調製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号及び第４，７１６，１１１号；並びに国際公開第９８／４６６４５号、同第９８／５０４３３号、同第９８／２４８９３号、同第９８／１６６５４号、同第９６／３４０９６号、同第９６／３３７３５号、及び同第９１／１０７４１号も参照；これらのそれぞれは、その全てが参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２９６】
また、ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用して産生させることができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、無作為に又は相同的組換えによってマウス胚幹細胞に導入し得る。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子の他に、マウス胚幹細胞に導入し得る。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別個に又は同時に非機能的にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生を阻止する。修飾された胚幹細胞を増殖させ、未分化胚細胞に微量注入して、キメラマウスを作製する。次いで、キメラマウスを飼育してヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を産生する。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば所望の標的ポリペプチドの全体又は部分を用いて通常の方法で免疫される。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ法を使用して免疫化トランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスによって含有されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞の分化中に再配置され、その後にクラススイッチンング及び体細胞変異を行う。従って、このような方法を使用して、治療に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体を産生させることができる。ヒト抗体を産生させるためのこの方法の概説に関しては、Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)を参照のこと。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生させるためのこの方法及びこのような抗体を産生させるためのプロトコールの詳細な考察については、例えば、国際公開第９８／２４８９３号；同第９６／３４０９６号；同第９６／３３７３５号；米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号；及び同第５，９３９，５９８号を参照のこと。これらは、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。また、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）及びＧｅｎＰｈａｒｍ(San Jose、Calif. )などの会社が、前記の方法と同様の方法を使用して選択された抗原に対するヒト抗体を提供するのに関与し得る。
【０２９７】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイディッド・セレクション（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を使用して生成させることができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を導く(Jesperset al., Bio/technology, 12:899-903 (1988)。米国特許第５，５６５，３３２号も参照）。
【０２９８】
また、本発明の標的ポリペプチドに対する抗体は、次いで、当業者に周知の方法を使用して標的ポリペプチドを「模倣する（ｍｉｍｉｃ）」抗イディオタイプ抗体を作り出すのに利用できる。（例えば、Greenspan & Bona、FASEB J. 7 (5):437-444 (1989)及びNissinoff, J. Immunol. 147 (8):2429-2438 (1991)参照）。例えば、本発明のポリペプチドに結合し、ポリペプチド多量体化及び／又はリガンドに対するポリペプチドの結合を競合的に阻害する抗体を、ポリペプチド多量体化及び／又は結合ドメインを「模倣する」、そして結果としてポリペプチド及び／又はそのリガンドに結合し、これらを中和することができる、抗イディオタイプを作り出すのに使用できる。このような中和抗イディオタイプ又はこのような抗イディオタイプのＦａｂ断片は、治療計画においてポリペプチドリガンドを中和するのに使用できる。例えば、このような抗イディオタイプ抗体は、所望の標的ポリペプチドに結合し及び／又はそのリガンド／受容体に結合し、それによってその生物活性を妨害するのに使用できる。
【０２９９】
別の実施形態において、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離し、配列決定することができる。単離され、サブクローン化されたハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。一度単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター中に配置され、次いで原核生物又は真核宿主細胞、例えば以下に限定されないが、別の方法では免疫グロブリンを産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞に移入され得る。さらに詳しくは、単離ＤＮＡ（これは本明細書に記載のようにして合成し得る）は、１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号（これは、本明細書に参照することにより組み込まれる）に記載のような抗体を産生するためのクローン定常領域及び可変領域配列に使用し得る。本質的に、これは、選択した細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、及びＩｇ特異的プライマーを使用するＰＣＲによる増幅を伴う。この目的に適したプライマーもまた米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。以下でさらに詳しく論じるように、所望の抗体を発現する形質転換細胞は、免疫グロブリの臨床及び商用供給を提供するために比較的多量に増殖させ得る。
【０３００】
１つの実施形態において、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖又は軽鎖ＣＤＲを含有する。別の実施形態において、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも２つのＣＤＲを含有する。別の実施形態において、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも３つのＣＤＲを含有する。別の実施形態において、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも４つのＣＤＲを含有する。別の実施形態において、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも５つのＣＤＲを含有する。別の実施形態において、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、１つ以上の抗体分子由来の少なくとも６つのＣＤＲを含有する。対象ＩＧＦ−１Ｒ抗体に含有され得る少なくとも１つのＣＤＲを含有する典型的な抗体分子は、本明細書に記載される。
【０３０１】
具体的な実施形態において、重鎖及び／又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を特定するために、当技術分野において周知の方法で、例えば他の重鎖及び軽鎖可変領域の既知アミノ酸配列と比較して、配列超可変性の領域を調べることによって詳しく調べ得る。常用の組換えＤＮＡ法を使用して、１つ以上のＣＤＲを、非ヒト抗体をヒト化するためにフレームワーク領域内に、例えばヒトフレームワーク領域内に挿入し得る。フレームワーク領域は、天然又はコンセンサスフレームワーク領域、好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（ヒトフレームワーク領域のリストについては、例えば、Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998)参照）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲの組み合わせによって生じるポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換が、フレームワーク領域内で行われ、好ましくは、アミノ酸置換は、抗体のその抗原に対する結合を向上させる。さらに、このような方法は、１個以上の鎖中ジスルフィド結合を欠く抗体分子を産生するために鎖中ジスルフィド結合に関与する１個以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換又は欠失を行うのに使用し得る。ポリヌクレオチドの他の改変も、本発明によって包含され且つ当技術分野範囲に包含される。
【０３０２】
また、適切な抗原特異性をもつマウス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物活性をもつヒト抗体分子由来の遺伝子とスプライシングすることによって「キメラ抗体」を産生させるために開発された技法(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314:452-454 (1985))が使用できる。本明細書で使用されるとき、キメラ抗体は、種々の部分が種々の動物種に由来する分子、例えばマウスモノクローナル抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子、例えばヒト化抗体である。
【０３０３】
あるいは、単鎖抗体の産生のための記載されている方法（米国特許第４，６９４，７７８号；Bird、Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988);及びWard et al., Nature 354:544-554 (1989))を、単鎖抗体を産生するように適合させることができる。単鎖抗体は、Ｆｖ領域の重鎖及び軽鎖断片をアミノ酸架橋によって連結し、単鎖抗体を得ることによって形成される。大腸菌中で機能的Ｆｖ断片を組立てる方法もまた、使用し得る(Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988))。
【０３０４】
本発明に包含されるさらに別の実施形態は、内因性免疫グロブリンを産生できないトランスジェニック動物（例えば、マウス）においてヒト抗体又は実質的にヒト抗体を産生させることを含む（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、同第５，９３９，５９８号、同第５，５９１，６６９号及び同第５，５８９，３６９号参照、これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。例えば、キメラ及び生殖細胞株変異マウスにおける抗体重鎖結合性領域のホモ接合性欠失が内因性抗体産生の完全阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖細胞株変異マウスに対するヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、抗原投与の際にヒト抗体の産生をもたらす。ＳＣＩＤマウスを使用してヒト抗体を作り出す別の好ましい手段は、米国特許第５，８１１，５２４号（これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質もまた本明細書に記載のようにして単離し、操作し得ることが理解される。
【０３０５】
組換え抗体を生じさせるためのさらに別の高効率手段は、Newman, Biotechnology 10:1455-1460 (1992)に開示されている。具体的には、この方法により、サル可変領域及びヒト定常領域配列を含有する霊長類化抗体が作製される。この参考文献は、その全体を本明細書に参照することにより組み込まれる。さらに、この方法は、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号及び第５，７５６，０９６号（これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０３０６】
別の実施形態において、リンパ球を顕微操作によって選択し、可変領域遺伝子群を単離し得る。例えば、末梢血単核細胞は、免疫哺乳動物から単離し、インビトロで約７日間培養し得る。培養物は、スクリーニング基準を満たす特定のＩｇＧについてスクリーニングできる。陽性ウエルからの細胞を単離できる。個々のＩｇ産生Ｂ細胞は、ＦＡＣＳで単離できる又はこれらを補体仲介溶血プラークアッセイで確認することによって単離できる。Ｉｇ産生Ｂ細胞は、試験管内に顕微操作することができ、ＶＨ及びＶＬ遺伝子は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＶＨ及びＶＬ遺伝子は、抗体発現ベクター中にクローン化し、発現のために細胞（例えば、真核又は原核生物細胞）にトランスフェクトすることができる。
【０３０７】
あるいは、抗体産生細胞株を、選択し、当業者に周知の方法を使用して培養し得る。このような方法は、様々な実験室マニュアル及び一次刊行物に記載されている。この点で、以下に記載のように本発明において使用するのに適当な方法は、Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991)に記載されている（これは、補足を含めその全てが参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０３０８】
本発明に包含される抗体は、抗体の合成について当技術分野において既知の任意の方法で、特に化学合成によって又は好ましくは本明細書に記載のような組換え発現法で産生させることができる。
【０３０９】
１つの実施形態において、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、１つ以上のドメインが部分的に又は完全に欠失している（「ドメイン欠失抗体」である）合成定常領域を含有する。ある実施形態において、適合した修飾抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去されているドメイン欠失コンストラクト又は変異体（ΔＣＨ２コンストラクト）を含有する。別の実施形態では、短い連結ペプチドが、可変領域について柔軟性及び移動の自由を提供するために欠失ドメインの代わりに使用され得る。当業者には、このようなコンストラクトが、抗体の異化速度に対するＣＨ２ドメインの調節特性に起因して特に好ましいことが認められるであろう。ドメイン欠失コンストラクトは、ＩｇＧ１ヒト定常領域をコードするベクターを使用して誘導することができる（例えば、国際公開第０２／０６０９５５Ａ２号及び同第０２／０９６９４８Ａ２号参照）。このベクターを操作してＣＨ２ドメインを欠失させ、ドメイン欠失ＩｇＧ１ヒト定常領域を発現する合成ベクターを提供する。
【０３１０】
ある実施形態において、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、ミニボディーである。ミニボディーは、当技術分野に記載の方法を使用して調製できる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号又は国際公開第９４／０９８１７Ａ１号参照）。
【０３１１】
１つの実施形態において、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、単量体サブユニット同士の間で結合を可能にする限り、数個又は場合によっては１個のアミノ酸の欠失又は置換を有する免疫グロブリン重鎖を含有する。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域の１個のアミノ酸の変異は、実質的にＦｃが結合するのを抑制するのに十分であり、それによって腫瘍の局在を高め得る。同様に、調節されるべきエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインのその部分を簡単に欠失することが望ましい場合がある。定常領域のこのような部分欠失は、対象の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を完全に残したまま、抗体（血清半減期）の選択された特性を向上させ得る。また、上で言及したように、開示の抗体の定常領域は、得られるコンストラクトのプロファイルを高める１個以上のアミノ酸の変異又は置換による合成物質であり得る。この点で、修飾抗体の立体配置及び免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を妨害することが可能であり得る。さらに別の実施形態は、エフェクター機能などの望ましい特性を高めるか又はより多くの細胞毒又は糖質の結合を提供するために１個以上のアミノ酸の付加を含有する。このような実施形態において、選択された定常領域ドメインに由来する特定の配列を挿入又は複製することが望ましい場合がある。
【０３１２】
本発明はまた、本明細書に記載の抗体分子（例えば、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含むか、該変異体から本質的に成るか、又は該変異体からなる抗体を包含し、抗体又はその断片は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片若しくは変異体に免疫特異的に結合する。当業者に既知の標準方法、例えば、限定されないが、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発法及びＰＣＲ介在変異誘発法を、ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするヌクレオチド配列の変異を誘導するのに使用できる。好ましくは、前記変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、又はＶＬ−ＣＤＲ３に対して、５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、又は２個未満のアミノ酸置換をコードする。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の電荷をもつ側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。同様の電荷をもつ側鎖を有するアミノ酸残基の群は、当技術分野で定義されている。これらの群は、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。あるいは、変異は、コード化配列の全体又は部分に沿って、例えば飽和変異誘発によって、無作為に誘導することができ、得られる変異体は、活性（例えば、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドを結合能）を保持する変異体を確認するために生物活性について選別することができる。
【０３１３】
例えば、抗体分子のフレームワーク領域にのみ又はＣＤＲ領域にのみ変異を導入することができる。導入された変異は、サイレント変異又は中立ミスセンス変異であり得る、すなわち、抗体の抗原結合能に全く又はほとんど影響を及ぼさず、実際に、幾つかのこのような変異は、いかなるアミノ酸配列をも変化させない。これらの型の変異は、コドン使用頻度を最適化するか、又はハイブリドーマの抗体産生を向上させるのに有用であり得る。本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするコドン最適化コード領域は、本明細書の他の部分で開示される。あるいは、非中立ミスセンス変異は、抗体の抗原結合能を変化させ得る。大部分のサイレント変異及び中立ミスセンス然変異の位置は、フレームワーク領域内に存在する可能性が高く、これに対して大部分の非中立ミスセンス変異の位置はＣＤＲ内に存在する可能性が高い。しかし、これは絶対条件ではない。当業者は、所望の性質、例えば抗原結合活性の変化しない又は結合活性の変化（例えば、抗原結合活性の向上又は抗体特異性の変化）した変異体分子を設計し、試験することができる。変異誘発後に、コード化タンパク質を日常的に発現させ、コード化タンパク質の機能活性及び／又は生物活性（例えば、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの少なくとも１つのエピトープを免疫特異的に結合する能力）を、本明細書に記載の方法を使用して又は当技術分野において公知の修飾方法で調べることができる。
【０３１４】
ＩＶ．ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体をコードする核酸分子を提供する。
【０３１５】
１つの実施形態において、本発明は、重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ又は重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書に開示のモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体由来の参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、又はＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的に成るか、又は該核酸からなる単離ポリヌクレオチドを包含する。あるいは、前記ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示のモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体由来の参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。従って、この実施形態によれば、本発明に包含される重鎖可変領域は、表５に示すポリペプチド配列に関連したＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、又はＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。  
【表６】
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【０３１６】
当技術分野で知られるように、２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチド同士の間の「配列同一性」は、１つのポリペプチド又はポリヌクレオチドのアミノ酸又は核酸配列を、第２のポリペプチド又はポリヌクレオチドの配列と比較することによって決定される。本明細書で論じる場合に、特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一であるかは、当技術分野で既知の方法及びコンピュータープログラム／ソフトウェア、例えば、以下に限定されないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix（登録商標），Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)を使用して決定できる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics2:482-489 (1981)の局所相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列の相同性の最もよいセグメントを見つけ出す。ＢＥＳＴＦＩＴ又は任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明の参照配列と９５％同一であるかどうかを決定する場合には、そのパラメータは、もちろん、参照ポリペプチド配列の完全長にわたって算出されるように及び参照配列中のアミノ酸の総数の最大５％までの相同性のギャップが許されるように設定される。
【０３１７】
ある実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。ある実施形態において、ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それによってコードされるアミノ酸配列を変化させることなく改変される。例えば、配列は、所定の種においてコドン使用頻度を改善するため、スプライス部位を除去するか、又は制限酵素部位を除去するように改変され得る。これらのような配列最適化は、実施例に記載され、周知であり、当業者によって日常的に行われる。
【０３１８】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、表５に示されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的に成るか、又は該核酸からなる単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３１９】
ある実施形態において、前記のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＨを含むか、該ＶＨから本質的に成るか、又は該ＶＨからなる抗体又はその抗原結合性断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に又は優先的に結合するか、あるいはこのようなモノクローナル抗体又は断片をＩＧＦ−１Ｒに結合させないように競合的に阻害する。
【０３２０】
ある実施形態において、前記のポリヌクレオチドの１つ以上によってコードされるＶＨを含むか、該ＶＨから本質的に成るか、又は該ＶＨからなる抗体又はその抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的又は優先的に結合する。
【０３２１】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的に成るか、又は該核酸からなる単離ポリヌクレオチドであって、軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ又は軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書に開示のモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体由来の参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、又はＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的に成るか、又は該核酸からなる単離ポリヌクレオチドを包含する。あるいは、ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示のモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体由来の参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。従って、この実施形態によれば、本発明に包含される軽鎖可変領域は、表６に示すポリペプチド配列に関連したＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、又はＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。  
【表７】
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【０３２２】
ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３２３】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的に成るか、又は該核酸からなる単離ポリヌクレオチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、表６に示されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同じポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的に成るか、又は該核酸からなる単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３２４】
別の態様において、本発明は、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、表６に示されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３群をコードするヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列によってコードされる、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、該核酸から本質的に成るか、又は該核酸からなる単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３２５】
ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドの１種以上によってコードされるＶＬを含むか、該ＶＬから本質的に成るか、又は該ＶＬからなる抗体又はその抗原結合性断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される基準モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に又は優先的に結合するか、あるいはこのようなモノクローナル抗体又は断片がＩＧＦ−１Ｒに結合しないように競合的に阻害する。
【０３２６】
ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドの１種以上によってコードされるＶＬを含むか、該ＶＬから本質的に成るか、又は該ＶＬからなる抗体又はその抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的又は優先的に結合する。
【０３２７】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８、及び６３から成る群から選択される参照ＶＨポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％又は１００％同一のＶＨをコードする核酸を含むか、該核酸から本質的に成るか、又は該核酸からなる単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３２８】
別の態様において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８、及び６３から成る群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＨをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的に成るか、又は該核酸配列からなる単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３２９】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、配列番号３、８、１３、１８、１９、２４、２５、３０、３１、３６、３７、４２、４７、５２、５７、及び６２から成る群から選択される基準核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％又は１００％同一のＶＨコード核酸を含むか、該核酸から本質的に成るか、又は該核酸からなる単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３３０】
別の態様において、本発明は、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的に成るか、又は該核酸配列から成る単離ポリヌクレオチドであって、前記ＶＨのアミノ酸配列が配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８、及び６３から成る群から選択される、本発明に包含されるＶＨをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的に成るか、又は該核酸配列から成る単離ポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的に成るか、又は該核酸配列から成る単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸の配列が配列番号３、８、１３、１８、１９、２４、２５、３０、３１、３６、３７、４２、４７、５２、５７、及び６２から成る群から選択される、本発明に包含されるＶＨをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的に成るか、又は該核酸配列から成る単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、このようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３３１】
ある実施形態において、前記のポリヌクレオチドの１種以上によってコードされるＶＨを含むか、該ＶＨから本質的に成るか、又は該ＶＨから成る抗体又はその抗原結合性断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に又は優先的に結合するか、あるいはこのようなモノクローナル抗体又は断片がＩＧＦ−１Ｒに結合しないように競合的に阻害するか、あるいは、このようなモノクローナル抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合しないように競合的に阻害する。
【０３３２】
ある実施形態において、前記のポリヌクレオチドの１種以上によってコードされるＶＨを含むか、該ＶＨから本質的に成るか、又は該ＶＨから成る抗体又はその抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的又は優先的に結合する。
【０３３３】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、配列番号６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３、及び１１８から成る群から選択されるアミノ酸を有する参照ＶＬポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％又は１００％同一のＶＬをコードする核酸を含むか、該核酸から本質的に成るか、又は該核酸から成る単離ポリヌクレオチドを包含する。別の実施形態において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、配列番号６７、７２、７７、８２、８７、９２、９７、１０２、１０７、１１２、及び１１７から成る群から選択される参照核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％９５％又は１００％同一のＶＬコード化核酸を含むか、該核酸から本質的に成るか、又は該核酸から成る単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、このようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３３４】
別の態様において、本発明は、単離ポリヌクレオチドであって、配列番号６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３、及び１１８から成る群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＬをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的に成るか、又は該核酸配列から成る単離ポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、本発明のＶＬをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的に成るか、又は該核酸配列から成る単離ポリヌクレオチドであって、前記核酸の配列が配列番号６７、７２、７７、８２、８７、９２、９７、１０２、１０７、１１２、及び１１７から成る群から選択される、本発明に包含されるＶＬをコードする核酸配列を含むか、該核酸配列から本質的に成るか、又は該核酸配列から成る単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、このようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３３５】
ある実施形態において、前記のポリヌクレオチドの１種以上によってコードされるＶＬを含むか、該ＶＬから本質的に成るか、又は該ＶＬから成る抗体又はその抗原結合性断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に又は優先的に結合するか、あるいはこのようなモノクローナル抗体又は断片がＧＦ−１Ｒに結合しないないように競合的に阻害する。
【０３３６】
ある実施形態において、前記のポリヌクレオチドの１種以上によってコードされるＶＬを含むか、該ＶＬから本質的に成るか、又は該ＶＬから成る抗体又はその抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的又は優先的に結合する。
【０３３７】
前記ポリヌクレオチドのいずれも、さらに、別の核酸であって、例えば、コードされているポリペプチドの分泌を指令するシグナルペプチド、本明細書に記載のような抗体定常領域、又は本明細書に記載のような他の異種ポリペプチドをコードする別の核酸を包含する。
【０３３８】
また、本明細書に他の個所でさらに詳しく記載するように、本発明は、前記ポリヌクレオチドの１種以上を含有するポリヌクレオチドを含む組成物を包含する。１つの実施形態において、本発明は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含む組成物であって、前記第１のポリヌクレオチドが本明細書に記載のＶＨポリペプチドをコードし且つ前記第２のポリヌクレオチドが本明細書に記載のＶＬポリペプチドをコードする、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含む組成物を包含する。具体的には、組成物は、ＶＨポリヌクレオチド及びＶＬポリヌクレオチドを含むか、ＶＨポリヌクレオチド及びＶＬポリヌクレオチドから本質的に成るか、又はＶＨポリヌクレオチド及びＶＬポリヌクレオチドからなり、ここで前記ＶＨポリヌクレオチド及び前記ＶＬポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４及び６８、８及び７３、１４及び７８、２０及び８３、２６及び８８、３２及び９３、３８及び９８、４３及び１０３、４８及び１０８、５３及び１０３、５８及び１１３、並びに６３及び１１８から成る群から選択される参照ＶＬ及びＶＬポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一のポリペプチドをコードする。あるいは、組成物は、配列番号３及び６７、８及び７２、１３及び７７、１８及び７７、１９及び８２、２４及び８２、２５及び８７、３０及び８７、３１及び９２、３６及び９２、３７及び９７、４２及び１０２、４７及び１０７、５８及び１０２、５７及び１１２、並びに６２及び１１７から成る群から選択される参照ＶＬ及びＶＬ核酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一のＶＨポリヌクレオチド及びＶＬポリヌクレオチドを含むか、該ＶＨポリヌクレオチド及びＶＬポリヌクレオチから本質的に成るか、又は該ＶＨポリヌクレオチド及びＶＬポリヌクレオチドから成る。ある実施形態において、このような組成物中のポリヌクレオチドによってコードされるＶＨ及びＶＬを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３３９】
本発明はまた、本明細書の他の個所に記載のようなポリヌクレオチドの断片を包含する。本明細書に記載のように、融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂ断片、及び他の誘導体をコードする別のポリヌクレオチドも本発明の一部として意図される。
【０３４０】
前記ポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法で産生又は製造し得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合には、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)に記載されている）から組立ててもよく、これは、手短に言えば、抗体をコードする配列の部分を含有するオーバーラップオリゴヌクレオチドの合成、これらオリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、次いでライゲーションされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。
【０３４１】
あるいは、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、適当な供給源由来の核酸から作り出し得る。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できないが、抗体分子の配列が既知である場合には、該抗体をコードする核酸は、化学的に合成し得るし、あるいは適当な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、又は抗体又は他のＩＧＦ−１Ｒ抗体を発現する任意の組織又は細胞、例えば抗体を発現させるために選択されるハイブリドーマ細胞から単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ、から作り出されるｃＤＮＡライブラリ）から、３’末端及び５’末端にハイブリダイズできる合成プライマーを使用してＰＣＲによって得てもよいし、あるいは例えば、抗体又は他のＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするｃＤＮＡライブラリ由来のｃＤＮＡクローンを同定する特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローニングによって得てもよい。ＰＣＲによって生成された増幅核酸は、次いで当技術分野で周知の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローン化させ得る。
【０３４２】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体のヌクレオチド配列及び対応アミノ酸配列が一度決定されると、そのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作のための当技術分野において周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ法、部位特異的変異誘発法、ＰＣＲ法など（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)及びAusubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, NY (1998)に記載の方法を参照、これらは両方共に本明細書においてその全てが参照することにより組み込まれる）を使用して操作して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作り出し得る、例えば、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を作り出し得る。
【０３４３】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドから構成され、これは未修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混和物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混和物であるＲＮＡ、あるいは一本鎖、より典型的には二本鎖であってもよく、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含有するハイブリッド分子から構成されていてもよい。また、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡを含有するか、あるいはＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含有する三重鎖領域から構成されていてもよい。ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドはまた、１つ以上の修飾された塩基又は安定性の理由から又は他の理由から修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡ主鎖を含有していてもよい。「修飾された」塩基としては、例えば、トリチル化塩基及びイノシンなどの独特な塩基が挙げられる。様々な修飾をＤＮＡ及びＲＮＡに対して行い得る；従って「ポリヌクレオチド」は、化学修飾体、酵素修飾体、又は代謝修飾体を包含する。
【０３４４】
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリン重鎖部分又は軽鎖部分）に由来するポリペプチドの非天然変異体をコードする単離ポリヌクレオチドは、１つ以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失がコードされているタンパク質に導入されるように、１つ以上のヌクレオチドの置換、付加又は欠失を、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することによって作製することができる。変異は、標準方法で、例えば部位特異的変異誘発及びＰＣＲ介在変異誘発によって導入し得る。好ましくは、保存アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行われる。
【０３４５】
Ｖ．ＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチド
本発明はまた、ＩＧＦ−１Ｒ抗体を構成する単離ポリペプチド、及びこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、ポリペプチド、例えば、免疫グロブリン分子から誘導されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗原結合領域をコードするアミノ酸配列を含有する。指定されたタンパク質「に由来する」ポリペプチド又はアミノ酸配列とは、あるアミノ酸配列を有するポリペプチドの起源を指す。ある場合には、特定の出発ポリペプチド又はアミノ酸配列に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列のアミノ酸配列、又はその部分と本質的に同じアミノ酸配列を有し、この場合の前記部分は、少なくとも１０〜２０個のアミノ酸からなるか、少なくとも２０〜３０個のアミノ酸からなるか、少なくとも３０〜５０個のアミノ酸からなるか、又は別の方法で当業者に出発配列中にその起源を有すると識別可能である。
【０３４６】
１つの実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る単離ポリペプチドであって、前記重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つ又は前記重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書に開示のモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、又はＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る単離ポリペプチドを包含する。あるいは、前記ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示のモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、及びＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。従って、この実施形態によれば、本発明に包含される重鎖可変領域は、上記の表５に示す群に関連したＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、又はＶＨ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。表５は、Ｋａｂａｔ体系によって定義されるＶＨ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ体系によって定義されるＶＨ−ＣＤＲも本発明に包含される。ある実施形態において、前記ＶＨを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３４７】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリペプチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、表５に示すＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一のポリペプチド配列を有する免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る単離ポリペプチドを包含する。ある実施形態において、前記ＶＨを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３４８】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリペプチドであって、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３領域が、表５に示すＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３群と同一のポリペプチド配列を有する（但し、任意の１つのＶＨ−ＣＤＲ中の１個、２個、３個、４個、５個、又は６個のアミノ酸置換を除く）、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る単離ポリペプチドを包含する。大きいＣＤＲ、例えば、ＶＨ−ＣＤＲ−３において、ＶＨ−ＣＤＲを含有するＶＨがＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する限り、ＣＤＲにおいてさらなる置換を行ってもよい。ある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。ある実施形態において、前記ＶＨを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３４９】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリペプチドであって、配列番号配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８、及び６３から成る群から選択される参照ＶＨポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一のＶＨポリペプチドを含むか、該ＶＨポリペプチドから本質的に成るか、又は該ＶＨポリペプチドから成る単離ポリペプチドを包含する。ある実施形態において、前記ＶＨポリペプチドを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３５０】
別の態様において、本発明は、単離ポリペプチドであって、配列番号配列番号４、９、１４、２０、２６、３２、３８、４３、４８、５３、５８、及び６３から成る群から選択されるＶＨポリペプチドを含むか、該ＶＨポリペプチドから本質的に成るか、又は該ＶＨポリペプチドから成る単離ポリペプチドを包含する。ある実施形態において、前記ＶＨポリペプチドを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３５１】
ある実施形態において、前記のＶＨポリペプチドの１つ以上を含むか、該ＶＨポリペプチドの１つ以上から本質的に成るか、又は該ＶＨポリペプチドの１つ以上から成る抗体又はその抗原結合性断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に又は優先的に結合するか、あるいはこのようなモノクローナル抗体又は断片がＩＧＦ−１Ｒに結合しないように競合的に阻害する。
【０３５２】
ある実施形態において、前記ＶＨポリペプチドの１つ以上を含むか、該ＶＨポリペプチドの１つ以上から本質的に成るか、又は該ＶＨポリペプチドの１つ以上から成る抗体又はその抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的又は優先的に結合する。
【０３５３】
別の実施形態において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る単離ポリペプチドであって、前記軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つ又は前記重鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書に開示のモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する参照重鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、又はＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る単離ポリペプチドを包含する。あるいは、前記ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書に開示のモノクローナルＩＧＦ−１Ｒ抗体に由来する基準重鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、及びＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。従って、この実施形態によれば、本発明に包含される軽鎖可変領域は、上記の表６に示すポリペチド群に関連したＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、又はＶＬ−ＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。表６は、Ｋａｂａｔ体系によって定義されるＶＬ−ＣＤＲを示すが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ体系によって定義されるＶＬ−ＣＤＲも本発明に包含される。ある実施形態において、前記ＶＬを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３５４】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリペプチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、表６に示すＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一のポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る単離ポリヌクレオチドを包含する。ある実施形態において、前記ＶＬを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３５５】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリペプチドであって、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３領域が、表６に示すＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３群と同一のポリペプチド配列を有する（但し、任意の１個のＶＬ−ＣＤＲの１個、２個、３個、４個、５個又は６個のアミノ酸置換を除く）、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、それから本質的に成るか、又はそれから成る単離ポリペプチドを包含する。大きいＣＤＲにおいて、ＶＬ−ＣＤＲを含有するＶＬがＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する限り、ＶＬ−ＣＤＲにおいてさらなる置換を行ってもよい。ある実施形態において、アミノ酸置換は、保存的である。ある実施形態において、前記ＶＬを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３５６】
別の実施形態において、本発明は、単離ポリペプチドであって、配列番号６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３、及び１１８から成る群から選択される参照ＶＬポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％と同一のＶＬポリペプチドを含むか、該ＶＬポリペプチドから本質的に成るか、又は該ＶＬポリペプチドから成る単離ポリペプチドを包含する。ある実施形態において、前記ＶＬポリペプチドを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３５７】
別の態様において、本発明は、単離ポリペプチドであって、配列番号６８、７３、７８、８３、８８、９３、９８、１０３、１０８、１１３、及び１１８から成る群から選択されるＶＬポリペプチドを含むか、該ＶＬポリペプチドから本質的に成るか、又は該ＶＬポリペプチドから成る単離ポリペプチドを包含する。ある実施形態において、前記ＶＬポリペプチドを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３５８】
ある実施形態において、前記のＶＬポリペプチドの１つ以上を含むか、該ＶＬポリペプチドの１つ以上から本質的に成るか、又は該ＶＬポリペプチドの１つ以上から成る抗体又はその抗原結合性断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体と同じＩＧＦ−Ｒ１エピトープに特異的に又は優先的に結合するか、あるいはこのようなモノクローナル抗体又は断片がＩＧＦ−１Ｒに結合しないように競合的に阻害する。
【０３５９】
ある実施形態において、前記のＶＬポリペプチドの１つ以上を含むか、該ＶＬポリペプチドの１つ以上から本質的に成るか、又は該ＶＬポリペプチドの１つ以上から成る抗体又はその抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片、あるいはＩＧＦ−１Ｒ変異ポリペプチドに、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴づけられる親和性で、特異的又は優先的に結合する。
【０３６０】
他の実施形態において、抗体又はその抗原結合性断片は、ＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドを含むか、ＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドのみから本質的に成るか、又はＶＨポリペプチド及びＶＬポリペプチドからなり、この場合、前記ＶＨポリペプチド及び前記ＶＬポリペプチドは、それぞれ、配列番号４及び６８、８及び７３、１４及び７８、２０及び８３、２６及び８８、３２及び９３、３８及び９８、４３及び１０３、４８及び１０８、５３及び１０３、５８及び１１３、並びに６３及び１１８から成る群から選択される参照ＶＬ及びＶＬポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％同一である。ある実施形態において、これらのＶＨ及びＶＬポリペプチドを含有する抗体又は抗原結合性断片は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する。
【０３６１】
前記のポリペプチドのいずれも、さらに別のポリペプチド、例えばコードされたポリペプチドの分泌を指示するシグナルペプチド、本明細書に記載のような抗体定常領域、又は本明細書に記載のような他の異種ポリペプチドを含むことができる。また、本発明に包含されるポリペプチドは、他の個所に記載のようなポリペプチド断片を含む。さらに、本発明に包含されるポリペプチドは、本明細書に記載のような、融合ポリペプチド、Ｆａｂ断片、及び他の誘導体を含む。
【０３６２】
また、本明細書の他の個所にさらに詳しく記載するように、本発明は、前記のポリペプチドを含む組成物を包含する。
【０３６３】
また、当業者には、本明細書に開示のＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチドは、これらが誘導される天然の結合性ポリペプチドと、アミノ酸配列において変化するように修飾されていてもよいことが理解されるであろう。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列と類似し得、例えば該出発配列とある一定の割合の同一性を有し得、例えば出発配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であり得る。
【０３６４】
さらにまた、「非必須」アミノ酸領域において保存置換又は変化を導くヌクレオチド若しくはアミノ酸の置換、欠失、又は挿入が行われていてもよい。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、１個以上の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個以上の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を除いて、出発配列と同一であってもよい。指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、１個以上の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個以上の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を除いて、出発配列と同一であってもよい。他の実施形態において、指定されたタンパク質に由来するポリペプチド又はアミノ酸配列は、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１５個以下、２０個以下の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を除いて、出発配列と同一であってもよい。ある実施形態において、指定されたタンパク質から誘導されるポリペプチド又はアミノ酸配列は、出発配列と比べて１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、又は１〜２０個の個々のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有する。
【０３６５】
本発明に包含されるあるＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列から成るか、該アミノ酸配列から本質的に成るか、該アミノ酸配列から成る。しかし、あるＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチドは、別の哺乳動物種に由来する１個以上の連続するアミノ酸を含有する。例えば、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、霊長類重鎖部分、ヒンジ部分、又は抗原結合部分を含有し得る。別の例において、１個以上のマウス由来のアミノ酸が、非マウス抗体ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の抗原結合部位に存在し得る。別の例において、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の抗原結合部位は、完全にマウス由来のものである。ある治療用途において、ＩＧＦ−１Ｒ特異抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは類似体は、抗体が投与される動物において免疫原性であるように設計される。
【０３６６】
ある実施形態において、ＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチドは、通常は抗体に伴なわないアミノ酸配列又は１つ以上の部分を含有する。典型的な修飾を、以下でさらに詳しく説明する。例えば、本発明に包含される単鎖ｆｖ抗体断片は、フレキシブルリンカー配列を含有してもよいし、又は機能性部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、又は標識）を付加するために修飾されていていもよい。
【０３６７】
本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体ポリペプチドは、融合タンパク質からなるか、該融合タンパク質から本質的に成るか、又は該融合タンパク質から成る。融合タンパク質は、キメラ分子であって、例えば、少なくとも１つの標的結合部位と、少なくとも１つの異種部分、すなわち自然界においてはそれと自然に連結されない部分を有する免疫グロブリン抗原結合性ドメインを含有するキメラ分子である。アミノ酸配列は、融合ポリペプチド中に一緒にもたらされる別個のタンパク質中に通常の様態で存在していてもよいし又は該アミノ酸配列は、通常の様態で同じタンパク質中に存在するが融合ポリペプチド中に新たな配置で配置されてもよい。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって作り出し得るか、又はペプチド領域が所望の関係でコードされているポリヌクレオチドを作製し、翻訳することによって作り出し得る。
【０３６８】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドに適用される「異種」という用語は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが比較される実体の残部と異なる実体に由来することを意味する。例えば、本明細書で使用されるとき、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは類似体に融合されるべき「異種ポリペプチド」は、同じ種の非免疫グロブリンポリペプチド、あるいは異なる種の免疫グロブリン又は非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。
【０３６９】
「保存アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているアミノ酸置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基の群、例えば、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）は、当技術分野において定義されている。従って、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖の群に由来する別のアミノ酸残基で置換されることが好ましい。別の実施形態において、一連のアミノ酸は、側鎖群の構成メンバーの順序及び／又は組成において異なる構造上類似の一連のアミノ酸で置換することができる。
【０３７０】
あるいは、別の実施形態において、突然変異は、例えば飽和突然変異誘発によって、免疫グロブリンコード化配列の全体又は部分に沿ってランダムに導入されていてもよく、得られる突然変異体は、本明細書に開示の診断及び治療方法で使用されるＩＧＦ−１Ｒ抗体に組み込まれ、その所望の抗原、例えばＩＧＦ−１Ｒに対する結合能についてスクリーニングできる。
【０３７１】
ＶＩ．融合タンパク質及び抗体複合体  本明細書の他の個所でさらに詳しく論じるように、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、さらに異種ポリペプチドにＮ末端又はＣ末端で組換えにより融合させ得るか、あるいはポリペプチド又は他の組成物に化学的に複合体化（例えば、共有結合又は非共有結合による複合体化）させ得る。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ特異的ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、検出アッセイにおける標識として有用な分子に及びエフェクター分子、例えば異種ポリペプチド、薬物、腫放射性核種、又は毒素に組換えにより融合又は複合体化させ得る。例えば、国際公開第９２／０８４９５号；同第９１／１４４３８号；同第８９／１２６２４号；米国特許第５，３１４，９９５号；及び欧州特許第３９６，３８７号参照。
【０３７２】
本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体には、修飾されている誘導体、すなわち、共有結合が、抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合することを妨害しないように、抗体に対する任意の種類の分子の共有結合による誘導体が挙げられる。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体としては、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、ホスフィレーション（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、公知の保護基／封鎖基による誘導体化、タンパク分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質に対する連結などによって修飾されている抗体が挙げられる。多数の化学修飾のいずれもが、既知の方法によって、例えば、以下に限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などによって実施し得る。さらに、前記誘導体は、１個又はそれ以上の非古典的アミノ酸を含有し得る。
【０３７３】
本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合、すなわちペプチドアイソスターによって相互に結合されたアミノ酸から構成され、また２０個の遺伝子コード化アミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体は、自然のプロセス、例えば翻訳後プロセシングによって、又は当技術分野において周知の化学修飾法によって修飾し得る。このような修飾は、基本的な教科書、より詳細な研究書、並びに多数の研究文献に記載されている。修飾は、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体のどこでも、例えばペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端で、あるいは糖質などの部分でも生じ得る。同じ種類の修飾が所与のＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体の幾つかの部位に同程度で又は異なる程度で存在し得ることが理解される。また、所与のＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体は、多数の種類の修飾を含有し得る。ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体は、ユビキチン化の結果として分岐していてもよいし、分岐を有するか又は有せずに環状であってもよい。環状、分岐、及び分岐環状ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体は、翻訳後自然プロセスの結果として生じ得るか又は合成法によって作り得る。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、タンパク分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレン化、硫酸化、タンパク質に対するアミノ酸の転写ＲＮＡ介在付加、例えばアルギニン化、及びユビキチン化が挙げられる。（例えば、Proteins-Structure And Molecular Properties, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York 2nd Ed., (1993); Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)参照）。
【０３７４】
本発明はまた、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体と、異種ポリペプチドとを含有する融合タンパク質を包含する。抗体が融合する異種ポリペプチドは、機能的に有用であり得る、又はＩＧＦ−１Ｒポリペプチドを発現する細胞を標的とするのに有用である。１つの実施形態において、本発明に包含される融合タンパク質は、本発明に包含される抗体の１つ以上のＶＨ領域のアミノ酸配列又は本発明に包含される抗体又はその断片若しくは変異体の１つ以上のＶＬ領域のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む、該ポリペプチドから本質的に成るか、又は該ポリペプチドから成る。別の実施形態において、本明細書に開示の診断及び治療方法で使用される融合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体、又はその断片、変異体、若しくは誘導体の１個、２個又は３個のＶＨ−ＣＤＲのアミノ酸配列、あるいはＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体、又はその断片、変異体、若しくは誘導体の１個、２個又は３個のＶＬ−ＣＤＲのアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含むか、該ポリペプチドから本質的に成るか、又は該ポリペプチドから成る。１つの実施形態において、融合タンパク質は、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体、又はその断片、誘導体、若しくは変異体のＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含有してなり、該融合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する。別の実施形態において、融合タンパク質は、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列と、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその断片、誘導体若しくは変異体の少なく１つのＶＬ領域のアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。融合タンパク質のＶＨ領域及びＶＬ領域は、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する単一起源の抗体（又はｓｃＦｖ若しくはＦａｂ断片）に対応することが好ましい。さらに別の実施形態において、本明細書に開示の診断及び治療方法で使用される融合タンパク質は、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体の任意の１個、２個又は３個のＶＨ  ＣＤＲのアミノ酸配列と、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体、又はその断片若しくは変異体の任意の１個、２個又は３個のＶＬ  ＣＤＲのアミノ酸配列と、異種ポリペプチド配列とを有するポリペプチドを含む。２個、３個、４個、５個、６個、又はそれ以上のＶＨ−ＣＤＲ又はＶＬ−ＣＤＲは、本発明に包含される単一起源の抗体（又はｓｃＦｖ若しくはＦａｂ断片）に対応することが好ましい。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子もまた、本発明に包含される。
【０３７５】
文献に報告されている典型的な融合タンパク質には、Ｔ細胞受容体(Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337:525-531 (1989); Traunecker et al., Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990);及びByrn et al., Nature 344:667-670 (1990));Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）(Watson et al., J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990);及びWatson et al., Nature 349:164-167 (1991)); ＣＤ４４ (Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990)); ＣＤ２８及びＢ７  (Linsley et al., J. Exp. Med. 173:721-730 (1991)); CTLA-4 (Lisley et al., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); ＣＤ２２ (Stamenkovic et al., Cell 66:1133-1144 (1991)); ＴＮＦ受容体(Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27:2883-2886 (1991);及びPeppel et al., J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991));及びＩｇＥ受容体ａ(Ridgway and Gorman, J. Cell. Biol. Vol. 115, Abstract No. 1448 (1991))の融合体が挙げられる。
【０３７６】
本明細書の他の個所で論じるように、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、ポリペプチドのインビボ半減期を増大させために又は免疫測定法で使用するために、当技術分野において既知の方法を使用して異種ポリペプチドに融合し得る。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧを、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体にそのインビボ半減期を増大させるために複合体化させ得る。Leong、S. R. et al., Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002);又はWeir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002)。
【０３７７】
さらに、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、これらの精製又は検出を促進するためにペプチドなどの標識配列に融合させることができる。好ましい実施形態において、標識アミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥベクター中に提供される標識(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif, 91311)、であり、特に、その多くは商業的に入手できる。Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)で論じられているように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の都合のよい精製を提供する。精製に有用な他のペプチド標識としては、限定されないが、「ＨＡ」標識（これは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質から誘導されるエピトープに対応する）(Wilson et al., Cell 37:767 (1984))及び「ｆｌａｇ」標識が挙げられる。
【０３７８】
融合タンパク質は、当技術分野において周知の方法を使用して調製できる（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号及び同第５，２２５，５３８号参照）。融合が行われる正確な部位は、融合タンパク質の分泌及び結合特性を最適化するために実験的に選択し得る。次いで、融合タンパク質をコードするＤＮＡを、発現するために宿主細胞にトランスフェクトする。
【０３７９】
本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体は、複合体化されていない形で使用してもよく、又は様々な分子の少なくとも１つと複合体化して、例えば、該分子の得る治療特性を向上させる、標的検出を促進する、あるいは患者の画像化又は治療に用いることができる。本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、精製を行う場合には、精製の前又は後に、標識するか又は複合体化し得る。
【０３８０】
特に、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節剤、医薬品、又はＰＥＧに複合体化させ得る。
【０３８１】
当業者には、複合体はまた、複合体化させるべき選択された薬剤に応じて様々な方法を使用して組み立て得る。例えば、ビオチンとの複合体は、例えば結合性ポリペプチドを、ビオチンの活性化エステル、例えばビオチンＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルと反応させることによって調製される。同様に、蛍光標識との複合体は、カップリング剤、例えば本明細書に記載のカップリング剤の存在下で又はイソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン−イソチオシアネートとの反応で調製し得る。本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体の複合体は、同様の方法で調製される。
【０３８２】
本発明はまた、診断若しくは治療剤に複合体化された、又は診断若しくは治療剤と併用される、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を包含する。ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、例えば、所定の治療及び／又は予防計画の有効性を調べるための臨床試験手順の一部として、例えば神経疾患の発生又は進行を監視するのに診断的に使用できる。検出は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を検出可能な物質にカップリングすることによって促進できる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々のポジトロン放出断層撮影法を使用するポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。例えば、本発明の診断法として使用される抗体に複合体化させることができる金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号参照。適当な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適当な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる；適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる；並びに適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ又は９９Ｔｃが挙げられる。上述の例のような化合物はまた、過剰増殖性障害を治療するためのＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）とともに併用療法において追加の剤として用いてもよい。
【０３８３】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体はまた、それを化学発光化合物にカップリングすることによって検出可能に標識できる。この場合に、化学発光標識されたＩＧＦ−１Ｒ抗体の存在は、化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することによって調べられる。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
【０３８４】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を検出可能に標識できる方法の１つは、これらを酵素に連結し、得られた連結生成物を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で使用することによる(Voller, A., “The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)”Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978)); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et al., (eds.)，酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、化学書院、東京（１９８１）。ＩＧＦ−１Ｒ抗体に結合された酵素は、適当な基質、好ましくは色素形成基質と、例えば分光光度手段、蛍光光度手段又は視覚手段で検出できる化学部分を生成するような方法で反応する。抗体を検出可能に標識するのに使用できる酵素としては、限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。さらに、検出は、酵素用の色素形成基質を用いる比色法で達成できる。検出はまた、同様に調製された標準と比較して基質の酵素反応の程度を目視比較することによっても達成し得る。
【０３８５】
検出はまた、他の様々な免疫検定法を使用して達成し得る。例えば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体を放射活性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用により抗体を検出することができる（例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)参照。これらは参照することにより本明細書に組み込まれる）。放射性同位元素は、手段、例えば、限定されないが、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、又はオートラジオグラフィーで検出できる。
【０３８６】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体はまた、蛍光放射金属、例えば１５２Ｅｕ、又はランタニド系列の金属を使用して検出可能に標識できる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使用して、抗体に結合することができる。
【０３８７】
種々の部分を、ＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合性断片、変異体、若しくは誘導体に複合体化させるための方法は、周知である。例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp.623-53 (1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”, in Monoclonal Antibodies’84:Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Andibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp.303-16 (1985)、及びThorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)参照。
【０３８８】
特に、本明細書に開示の診断及び治療方法で使用される結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、細胞毒（例えば、放射性同位元素、細胞障害性薬剤、又は毒素）、治療剤、細胞増殖抑制剤、生体毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物学的反応調節剤、医薬品、免疫活性リガンド（例えば、調節性分子が新生細胞及びエフェクター細胞、例えばＴ細胞の両方に結合するリンホカイン又は他の抗体）、又はＰＥＧに複合体化させてもよく、これらと併用してもよい。別の実施形態において、本明細書に開示の診断及び治療方法で使用する結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、腫瘍の血管新生を減少させる分子に複合体化させてもよく、それと併用してもよい。他の実施形態において、開示の組成物は、薬物若しくはプロドラッグに連結させた又はこれらと併用した結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を含有し得る。本発明のさらに別の実施形態は、特定の生体毒素又はその細胞障害性断片、例えばリシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素若しくはジフテリア毒素に複合体化された又はこれらと併用した結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片の使用を含む。使用すべき複合体化された又は複合体化されていない結合性分子の選択は、癌の種類及び病期、補助的治療（例えば、化学療法又は外部放射）の使用並びに患者の状態に依存する。当業者はこのような選択を本明細書の教示を考慮して容易になし得ることが理解される。
【０３８９】
過去の研究において、同位体で標識された抗腫瘍抗体が、動物モデルにおいて、及びある場合にはヒトにおいて固形腫瘍及びリンパ腫／白血病の細胞を破壊するのに首尾よく使用されてきたことが理解される。典型的な放射性同位元素としては、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅが挙げられる。放射性核種は、核ＤＮＡにおいて多数の鎖切断を引きこし、細胞死を導く電離放射線を生じさせることによって作用する。治療用複合体を製造するのに使用される同位体は、典型的には、短いパス長を有する高エネルギーα又はβ粒子を生成する。このような放射性核種は、これらが極めて接近している細胞、例えば、前記複合体が接着しているか又は入っている新生細胞を殺す。これら放射性核種は、非局在細胞に対してはほとんど又は全く影響を及ぼさない。放射性核種は、本質的に非免疫原性である。上記の例のような放射性各種は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体又はその断片と複合化して、あるいは組み合わせて用いることができる。
【０３９０】
放射性標識複合体、又は本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と併用される放射性標識分子の使用に関して、例えば結合性ポリペプチド又は他の治療剤、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、直接に標識し得てもよいし（例えば、ヨウ素化によって）又はキレート化剤の使用によって間接的に標識してもよい。本明細書で使用されるとき、「直接標識」及び「間接標識アプローチ」という語句は、両方共に、キレート化剤が結合性分子に共有結合される及び少なくとも１つの放射線核種がキレート化剤と結合されることを意味する。このようなキレート化剤は、典型的には、ポリペプチド及び放射性同位元素の両方を結合することから、二価キレート化剤と呼ばれる。特に好ましいキレート化剤は、１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン四酢酸（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）及びシクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体である。他のキレート化剤は、Ｐ−ＤＯＴＡ及びＥＤＴＡ誘導体を含む。間接標識に特に好ましい放射性核種としては、１１１Ｉｎ及び９０Ｙが挙げられる。  
【０３９１】
本明細書で使用されるとき、「直接標識」及び「間接標識アプローチ」という語句は共に、放射線核種がポリペプチドに（典型的にはアミノ酸残基）によって共有結合していることを意味する。さらに詳しくは、これらの連結法には、ランダム標識化及び部位特異的標識化が含まれる。後者の場合には、標識化は、ポリペプチド上の特定部位、例えば抗体結合体のＦｃ部分上にのみ存在するＮ−結合糖残基に対して行われる。また、種々の直接標識法及びプロトコールが本発明に適合する。例えば、テクネチウム−９９標識ポリペプチドは、リガンド交換法によって調製し得るし、スズイオン溶液を用いて過テクネチウム酸（ＴｃＯ４−）を還元し、還元されたテクネチウムをセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラム上でキレート化し、このカラムに結合性ポリペプチドを適用することによって調製し得るし、又はバッチ標識法によって、例えば過テクネチウム酸、ＳｎＣｌ２のような還元剤、フタル酸ナトリウム・カリウム溶液のような緩衝液、及び抗体をインキュベートすることによって調製し得る。いずれにしても、抗体又は他の治療剤を直接標識するのに好ましい放射性核種は、当技術分野において周知であり、直接標識するのに特に好ましい放射性核種は、チロシン残基を介して共有結合された１３１Ｉである。本明細書に開示の診断及び治療方法で使用される結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、例えば、放射性ヨウ化ナトリウム又はカリウム及び化学酸化剤、例えば次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴなど、又は酵素酸化剤、例えばラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、及びグルコースを用いて誘導し得る。
【０３９２】
キレート剤及びキレート剤結合体に関する特許は、当技術分野において既知である。例えば、Ｇａｎｓｏｗの米国特許第４，８３１，１７５号は、多置換ジエチレントリアミン五酢酸キレート及びそれを含有するタンパク質複合体、並びにこれらの製造方法に関する。Ｇａｎｓｏｗの米国特許第５，０９９，０６９号、同第５，２４６，６９２号、同第５，２８６，８５０号、同第５，４３４，２８７号及び同第５，１２４，４７１号もまた、多置換ＤＴＰＡキレートに関する。これらの特許明細書は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。適合する金属キレート剤の別の例は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８、１１−四酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢酸などである。シクロヘキシル−ＤＴＰＡ又はＣＨＸ−ＤＴＰＡが、特に好ましく、以下に広範囲にわたって例を挙げる。さらに別の適合するキレート剤、例えばこれから発見されるべきキレート剤は、当業者には容易に識別し、明らかに本発明の範囲内にある。上述の例のような化合物はまた、過剰増殖性障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）との併用療法において更なる剤として用いてもよい。
【０３９３】
適合するキレート剤、例えば米国特許第６，６８２，１３４号、同第６，３９９，０６１号及び同第５，８４３，４３９号（これらの全体は、参照することにより本明細書に組み込まれる）のキレート化を促進するのに使用される特定の二価キレート剤は、三価金属に対する高親和性を提供するために、腫瘍と非腫瘍との比が高く、骨吸収が少なく、且つ標的部位、すなわちＢ−細胞リンパ腫腫瘍部位での放射線核種のインビボ保持が大きいよう選択されることが好ましい。しかし、これらの特性の全部を有しうる又は有し得ない他の二価キレート剤は、当技術分野において既知であり、及び腫瘍治療にも役立ち得る。上述の例のような化合物はまた、過剰増殖性障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）との併用療法において更なる剤として用いてもよい。
【０３９４】
本明細書の教示に従って、結合性分子が診断及び治療目的に種々の放射性標識に複合体化させ得ることも理解される。この目的のために、前記の米国特許第６，６８２，１３４号、同第６，３９９，０６１号及び同第５，８４３，４３９号は、治療用抗体の投与前の腫瘍の診断「画像化」用の放射性標識治療用複合体を開示している。「Ｉｎ２Ｂ８」複合体は、二価キレート剤、すなわちＭＸ−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）（これは、１−イソチオシアナトベンジル−３−メチル−ＤＴＰＡと１−メチル−３−イソチオシアナトベンジル−ＤＴＰＡとの１：１混合物を含む）によって１１１Ｉｎに結合される、ヒトＣＤ２０抗原に特異的なマウスモノクローナル抗体、２Ｂ８を含む。１１１Ｉｎは、約１〜約１０ｍＣｉを検出可能な毒性なしに安全に投与できることから、診断放射線核種として特に好ましく、画像化データは、一般にその後の９０Ｙ−標識抗体分布を予測する。大部分の画像化研究は、５ｍＣｉの１１１Ｉｎ標識抗体を利用している。その理由は、この用量は安全であり且つより低い用量と比べて画像化効率が高く、最適画像化が抗体投与後３〜６日目に生じるからである。例えば、Murray, J. Nuc. Med. 26:3328 (1985)及びCarraguillo et al., J. Nuc. Med. 26:67 (1985)参照。上述の例のような化合物はまた、過剰増殖性障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）との併用療法において更なる剤として用いてもよい。
【０３９５】
上記で示したように、様々な放射性核種が本発明に適用でき、当業者は、どの放射線核種が種々の環境下で最も適しているかを容易に決定できる。例えば、１３１Ｉは、標的免疫療法に使用される周知の放射線核種である。しかし、１３１Ｉの臨床有用性は、幾つかの因子、例えば８日の物理的半減期、血中及び腫瘍部位の両方でのヨウ素化抗体の脱ハロゲン化、及び腫瘍の局在用量析出に最適以下であり得る放出放射特性（例えば、大きなγ成分）によって制限され得る。優れたキレート化剤の出現により、キレート基をタンパク質に結合するための機会が、他の放射性核種、例えば１１１Ｉｎ及び９０Ｙを利用する機会を増加させた。９０Ｙは、放射免疫治療用途での利用について幾つかの利点を提供する。すなわち９０Ｙの６４時間の半減期は、腫瘍による抗体蓄積を可能にするのに十分に長く、例えば１３１Ｉと異なり、９０Ｙはその崩壊においてγ線を伴わず、１００〜１，０００細胞直径の組織内範囲を有する高エネルギーの純粋なβ放射体である。また、最小量の透過性放射線により、９０Ｙ標識抗体の外来患者投与が可能になる。さらに、標識抗体の内部化は、細胞の殺滅に必要とされず、電離放射線の局部放射は標的分子を欠く隣接腫瘍細胞に死をもたらすであろう。上述の例のような放射性核種はまた、過剰増殖性障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）との併用療法において更なる剤として用いてもよい。
【０３９６】
結合性分子、例えば、結合性ポリペプチド、例えば、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片に対する結合体化用の別の好ましい薬剤は、細胞障害性薬剤、特に癌療法に使用される細胞障害性薬剤である。本明細書で使用されるとき、「細胞毒又は細胞障害性薬剤」は、細胞の成長及び増殖に有害であり、細胞又は悪性腫瘍を抑制、阻害又は破壊するために作用し得る薬剤を意味する。典型的な細胞毒としては、以下に限定されないが、放射性核種、生体毒素、酵素活性毒素、細胞増殖抑制又は細胞障害性治療剤、プロドラッグ、免疫活性リガンド及び生物学的反応調節剤、例えばサイトカインが挙げられる。免疫活性細胞又は悪性細胞の成長を遅らせるか遅くするために作用する細胞毒は、本発明の範囲内にある。上述の例のような細胞毒はまた、過剰増殖性障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）との併用療法において更なる剤として用いてもよい。
【０３９７】
典型的な細胞毒としては、一般的に、細胞増殖抑制剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ホルモン及びホルモン拮抗物質などが挙げられる。本発明に適合する典型的な細胞増殖抑制剤としては、アルキル化物質、例えばメクロレタミン、トリエチレンホスホロアミド、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン又はトリアジクォン、あるいはニトロソ尿素化合物、例えばカルムスチン、ロムスチン、又はセムスチンが挙げられる。別の好ましいクラスの細胞障害性薬剤としては、例えば、メイタンシノイドファミリーの薬剤が挙げられる。別の好ましいクラスの細胞障害性薬剤としては、例えば、アントラサイクリンファミリーの薬剤、ビンカファミリーの薬剤、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞障害性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬剤、ジイネン、及びポドフィロトキシンが挙げられる。これらのクラスの特に有用なメンバーとしては、例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン（ダウノマシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキセート、メトプテリン、ミトラマイシン、ストレプトニギリン、ジクロロメトトレキセート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン−Ｄ、ポルフィロマシン、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、フトラフール、６−メルカプトプリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシン、又はポドフィロトキシン誘導体、例えばエトポシド又はリン酸エトポシド、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン（ｌｅｕｒｏｓｉｄｉｎｅ）、ビンデシン、ロイロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）などが挙げられる。本明細書の教示に適合するさらに別の細胞毒としては、タキソール、タキサン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン並びにこれらの類似化合物又は同族化合物が挙げられる。ホルモン及びホルモン拮抗物質、例えばコルチコステロイド、例えばプレドニゾン、プロゲスチン、例えばヒドロキシプロゲステロン又はメドロプロゲステロン、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール、抗エストロゲン剤、例えばタモキシフェン、アンドロゲン、例えばテストステロン、及びアロマターゼ阻害剤が挙げられ、例えばアミノグルテチミドもまた本明細書の教示と適合する。当業者は、所望の化合物に化学修飾を行い、本発明に包含される結合体を調製するために該化合物の反応をより都合よくし得る。上述の例のような化合物はまた、過剰増殖性障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）との併用療法において更なる剤として用いてもよい。
【０３９８】
特に好ましい細胞毒の１つの例は、エンジインファミリーの抗腫瘍抗生物質のメンバー又は誘導体、例えばカリケアマイシン、エスペラマイシン又はダイネミシンを含む。これらの毒素は、極めて強力であり、核ＤＮＡを切断し、細胞死を導くことによって作用する。インビボで切断されて多数の不活性であるが免疫原性のポリペプチド断片を与えることができるタンパク質毒素と異なり、毒素、例えばカリケアマイシン、エスペラマイシンル及び他のエンジインは、本質的に非免疫原性である小分子である。これらの非ペプチド毒素は、モノクローナル抗体及びその他の分子を標識するのに従来使用されている方法で化学的に２量体又は４量体に連結される。これらの連結方法としては、前記コンストラクトのＦｃ部分にのみ存在するＮ−連結糖残基による部位特異的結合が挙げられる。このような部位特異的連結方法は、コンストラクトの結合特性に対して結合の可能な影響を減少させるという利点を有する。上述の例のような化合物はまた、過剰増殖性障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）との併用療法において更なる剤として用いてもよい。
【０３９９】
先に言及したように、複合体の調製に適合する細胞毒は、プロドラッグ含んでもよい。本明細書で使用されるとき、「プロドラッグ」という用語は、腫瘍細胞に対して親薬物に比べて細胞障害性が低く且つより活性な親型に酵素活性化又は転換することができる医薬活性物質の前駆体又は誘導体を指す。本発明に適合するプロドラッグとしては、限定されないが、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、場合により置換されていてもよフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は場合により置換されていてもよいフェニルアセタミド含有プロドラッグ、より活性な細胞障害性遊離薬物に転化させることができる５−フルオロシトシン及び他の５−フルオロウリジンプロドラッグが挙げられる。本発明で使用するプロドラッグ体に誘導し得る細胞障害性遊離薬物の別の例は、前記の化学療法剤を含む。上述の例のような化合物はまた、過剰増殖性障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）との併用療法において更なる剤として用いてもよい。
【０４００】
他の細胞毒の中で、結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えば本明細書に開示のＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片もまた、生体毒素、例えばリシンサブユニットＡ、アブリン、ジフテリア毒素、ボツリヌス、シアンジノシン、サキシトキシン、シガトキシン、破傷風、テトロドトキシン、トリコテセン、ベルコロゲン又は毒性酵素に結合又は複合体化させることができる。好ましくは、このようなコンストラクトは、抗体−毒素コンストラクトの特異的発現を可能にする遺伝子工学技術を使用して調製される。結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えば本明細書に開示のＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片に結合され得る別の生物学的反応調節剤は、サイトカイン、例えばリンホカイン及びインターフェロンを含む。この開示を考慮して、当業者は従来の方法を使用してこのようなコンストラクトを容易に形成できると言える。上述の例のような化合物はまた、過剰増殖性障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）との併用療法において更なる剤として用いてもよい。
【０４０１】
開示された結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片と共に使用し得るか又はこれらに複合体化させ得る適合細胞毒の別のクラスは、腫瘍又は免疫活性細胞に効果的に指向され得る放射線増感薬である。このような薬剤は、電離放射線に対する感受性を高め、それによって放射線治療の効果を増大する。腫瘍細胞によって取り込まれた抗体複合体は、放射線増感が最大である核のより近くに放射線増感剤を送達する。本発明の結合性分子に連結した非結合放射線増感剤は、血中から急速に除去され、標的腫瘍中に残る放射線増感剤を局部に留め且つ正常組織において最小限の吸収を提供する。血中から迅速に除去された後に、３通りの方法すなわち１．）腫瘍に特異的に向けられる外部照射、２．）腫瘍中に直接に埋め込まれた放射能又は３．）同じ標的化抗体を用いた全身放射免疫治療のうちの１つで補助放射線治療が施される。このアプローチの潜在的に魅力ある変型は、放射線増感免疫結合体に対する治療用放射性同位元素の結合であり、それによって患者に単一の薬物を投与する便宜を提供するであろう。放射線感受性薬剤はまた、過剰増殖性障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）との併用療法において更なる剤として用いてもよい。
【０４０２】
ある実施形態において、結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片の安定性又は効果を高める部分が複合体化され得る。例えば、１つの実施形態において、ＰＥＧは、本発明に包含される結合性分子にそのインビボ半減期を増大させるために複合体化させることができる。Leong、S. R. et al., Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002);又はWeir et al., Biochem. Soc. Transactions 30:512 (2002)。ＰＥＧはまた、ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）との併用療法において更なる剤として用いてもよい。
【０４０３】
本発明は、さらに、診断又は治療剤に結合体化させた結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又は免疫特異的断片の使用を包含する。結合性分子は、例えば、所定の及び／又は予防計画の有効性を調べるために臨床試験手順の部分として、例えば腫瘍の発生又は進行を監視するために診断的に使用できる。検出は、結合性分子、例えば、結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を検出可能な物質に結合することによって促進することができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々のポジトロン放出断層撮影法を使用するポジトロン放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。例えば、本発明の診断法として使用される抗体に複合体化させることができる金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号参照。適当な酵素の例としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適当な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられる。適当な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる。生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられる。また、適当な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ又は９９Ｔｃが挙げられる。上述の例のような化合物はまた、過剰増殖性障害を治療するためにＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）との併用療法において更なる剤として用いてもよい。
【０４０４】
結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片はまた、それを化学発光化合物に連結することによって検出可能に標識できる。この場合に、化学発光標識された結合性分子の存在は、化学反応の経過中に生じる発光の存在を検出することによって調べられる。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
【０４０５】
結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を検出可能に標識できる方法の１つは、これらを酵素に連結し、得られた連結生成物を酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で使用することである(Voller, A., “The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)”Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978)); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et al. (eds.)，酵素免疫測定法、化学書院、東京（１９８１）。結合性分子に結合される酵素は、適当な基質、好ましくは色素形成基質と、例えば分光光度手段、蛍光光度手段又は視覚手段で検出できる化学部分を生成するような方法で反応する。抗体を検出可能に標識するのに使用できる酵素としては、限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。また、検出は、酵素用の色素形成基質を用いる比色法で達成できる。検出はまた、同様に調製された標準と比較して基質の酵素反応の程度を目視比較することによっても達成し得る。
【０４０６】
検出はまた、他の様々な免疫検定法を使用して達成し得る。例えば、結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異抗体、あるいはその免疫特異的断片を放射活性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用により癌抗原を検出することができる（例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)参照、これらは本明細書に参照することにより組み込まれる）。放射性同位元素は、例えば、限定されないが、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、又はオートラジオグラフィーのような手段で検出できる。
【０４０７】
結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異抗体、あるいはその免疫特異的断片はまた、蛍光放射金属、例えば１５２Ｅｕ、又はランタニド系列の金属を使用して検出可能に標識できる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使用して、抗体に結合することができる。
【０４０８】
種々の部分を、結合性分子、例えば結合性ポリペプチド、例えばＩＧＦ−１Ｒ特異抗体、あるいはその免疫特異的断片に複合体化させるための方法は、周知である。例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al. “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp.623-53 (1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”, in Monoclonal Antibodies’84:Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Andibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp.303-16 (1985)、及びThorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)参照。
【０４０９】
ＶＩＩ．抗体ポリペプチドの発現
周知のように、たとえば、グアニジニウムイソチオシアネート抽出及び沈殿、次いで遠心分離又はクロマトグラフィのような常法によって元々のハイブリドーマ細胞又はそのほかの形質転換細胞からＲＮＡを単離することができる。望ましい場合、オリゴｄＴセルロース上のクロマトグラフィのような常法によってｍＲＮＡを全ＲＮＡから単離してもよい。好適な技法は当該技術でよく知られている。
【０４１０】
実施態様の１つでは、周知の方法に従って逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを用いて、抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡと重鎖をコードするｃＤＮＡを同時に又は別々に作製してもよい。共通の定常領域のプライマー又は公表されている重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列に基づいたさらに特定のプライマーによってＰＣＲを開始してもよい。上で論じたように、ＰＣＲを用いて抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離してもよい。この場合、共通のプライマー又は、たとえば、マウスの定常領域のプローブのようなさらに大きな相同性のプローブによってライブラリをスクリーニングしてもよい。
【０４１１】
当該技術で既知の技法、たとえば、組換えＤＮＡ技法に関する前述の参考文献で詳細に示された標準の、周知の技法に従ってマッピングされ、配列決定された制限を用いて、ＤＮＡ、通常プラスミドＤＮＡを細胞から単離することができる。当然、単離工程の間、又はその後の解析の間のどの時点でも本発明に従ってＤＮＡは合成されてもよい。
【０４１２】
本発明のＩＧＦ−Ｒ抗体、又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体を提供する単離された遺伝物質の操作に続いて、ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードするポリヌクレオチドは通常、所望の量のＩＧＦ−１Ｒ抗体を産生するのに使用され得る宿主細胞への導入のために発現ベクターに挿入される。
【０４１３】
本明細書に記載される標的分子、たとえば、ＩＧＦ−１Ｒに結合する抗体、又はその断片、誘導体若しくは類似体、たとえば、抗体の重鎖又は軽鎖の組換え発現には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築が必要とされる。本発明によって包含される抗体分子又は抗体の重鎖若しくは軽鎖、又はその一部（好ましくは重鎖又は軽鎖の可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドをいったん入手したら、当該技術で周知の技法を用いた組換えＤＮＡ技術によって抗体分子の製造のためのベクターを作製することができる。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製する方法が本明細書で記載される。当業者に周知である方法を用いて抗体をコードする配列と適当な転写制御シグナルと翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、たとえば、試験管内の組換えＤＮＡ技法、合成技法、及び生体内の遺伝子組換えが含まれる。従って、本発明は、プロモータに操作可能に連結された、本発明によって包含される抗体分子、又はその重鎖若しくは軽鎖、又は重鎖若しくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを包含する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく（たとえば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６；米国特許第５，１２２，４６４号を参照のこと）、抗体の可変ドメインは重鎖又は軽鎖全体を発現するためにそのようなベクターでクローニングされてもよい。
【０４１４】
宿主細胞は、本発明によって包含される２種の発現ベクターで同時形質移入されてもよく、第１のベクターは重鎖に由来するポリペプチドをコードし、第２のベクターは軽鎖に由来するポリペプチドをコードする。２種のベクターは、重鎖と軽鎖のポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含有してもよい。或いは、重鎖のポリペプチドと軽鎖のポリペプチド双方をコードする単一のベクターを使用してもよい。そのような状況では、重鎖の前に軽鎖を有利に置いて過剰な毒性の遊離の重鎖を回避する（Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)）。重鎖及び軽鎖のコーディング配列はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含んでもよい。
【０４１５】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、所望の遺伝子を宿主細胞に導入し、宿主細胞で発現させるための媒体として本発明に従って使用されるベクターを意味するように本明細書で使用される。当業者に知られているように、そのようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスから成る群から容易に選択することができる。一般に、本発明に適合するベクターは、選抜マーカーと、所望の遺伝子のクローニングを円滑にする適当な制限部位と、真核細胞又は原核細胞に入る能力及び／又はそこで複製する能力を含む。
【０４１６】
本発明の目的で、多数の発現ベクター系が採用され得る。たとえば、１つの部類のベクターは、動物ウイルス、たとえば、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ若しくはＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。他には、内部リボソーム結合部位を持つポリシストロン系の使用が含まれる。さらに、形質移入された宿主細胞の選抜を可能にする１以上のマーカーを導入することによって染色体にＤＮＡを統合した細胞を選抜してもよい。マーカーは、栄養要求性の宿主に対する原栄養性、殺生剤耐性（たとえば、抗生剤）又は銅のような重金属に対する耐性を提供して得る。選抜可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結することができ、又は同時形質転換によって同一の細胞に導入することができる。ｍＲＮＡの任意の合成のために追加のエレメントを必要とし得る。これらのエレメントには、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモータ、エンハンサ及び終止シグナルが含まれ得る。
【０４１７】
特に好ましい実施態様では、上で論じたように、合成された重鎖及び軽鎖の定常領域遺伝子（好ましくは、ヒト）と共に、クローニングされた可変領域の遺伝子が発現ベクターに挿入される。実施態様の１つでは、これは、バイオゲンＩＤＥＣ社のＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号で開示された）と呼ばれる有標発現ベクターを用いて達成される。このベクターは、サイトメガロウイルスのプロモータ／エンハンサ、マウスのβグロビンの主プロモータ、ＳＶ４０の複製開始点、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエクソン１とエクソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びリーダー配列を含有する。このベクターは、可変領域と定常領域の遺伝子を組み込み、ＣＨＯ細胞に形質移入し、その後Ｇ４１８を含有する培地で選抜し、メソトレキセートによる増幅を行った際、非常に高いレベルの抗体の発現が得られることが見出された。当然、真核細胞で発現を誘発することが可能であるどんな発現ベクターも本発明で使用してもよい。好適なベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸ１及びｐＺｅｏＳＶ２(カリフォルニア州、サンディエゴのインビトロゲンから入手可能）並びにｐＣＩ（ウィスコンシン州、マジソンのプロメガから入手可能）のプラスミドが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖が、たとえば、ロボット方式によって実施することができる日常実験であるならば、好適に高いレベルを発現するものについて多数の形質転換した細胞をスクリーニングすること。ベクター系は、その全体が参照することにより本明細書に組み入れられる米国特許第５，７３６,１３７号及び同第５，６５８，５７０号においても教示される。この系は高い発現レベル、たとえば、＞３０ｐｇ／細胞／日を提供する。ほかの例となるベクター系はたとえば、米国特許第６，４１３，７７７号で開示されている。
【０４１８】
ほかの好ましい実施態様では、本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体は、たとえば、その全体が本明細書に組み入れられる、２００２年１１月１８日に出願された米国特許出願公開第２００３−０１５７６４１Ａ１号で開示されたようなポリシストロン構築物を用いて発現させてもよい。これらの新規の発現系では、抗体の重鎖と軽鎖のような複数の当該遺伝子産物が単一のポリシストロン構築物から生成されてもよい。これらの系は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有利に用いて、真核宿主細胞にて相対的に高いレベルのＩＧＦ−１Ｒ抗体、たとえば、結合ポリペプチド、たとえば、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を提供する。適合するＩＲＥＳ配列は、本明細書に組み入れられる米国特許第６，１９３，９８０号で開示されている。当業者は、そのような発現系を用いて、本発明で開示されるＩＧＦ−１Ｒ抗体の全長を効果的に製造してもよいことを十分に理解するであろう。
【０４１９】
さらに一般的には、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の単量体サブユニットをコードするベクター又はＤＮＡ配列がいったん調製されると、発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することができる。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者に周知の種々の技法によって達成することができる。その方法には、形質移入（電気泳動及び電気穿孔を含む）、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、内包ＤＮＡによる細胞融合、微量注入及び未処理のウイルスによる感染が含まれるが、これらに限定されない。Ridgway, A. A. G. ”Mammalian Expression Vectors” Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds., Butterworths, Boston, Mass., Chapter 24.2, pp. 470-472 (1988)を参照のこと。典型的には、プラスミドの宿主への導入は電気穿孔法による。発現構築物を抱えた宿主細胞は軽鎖及び重鎖の産生に適当な条件下で増殖し、重鎖及び／又は軽鎖のタンパク質の合成についてアッセイされる。例となるアッセイ法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、又は蛍光活性化細胞ソーター解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学法などが挙げられる。
【０４２０】
発現ベクターは従来の技法によって宿主細胞に移され、形質移入された細胞は次いで従来の技法によって培養され、本明細書で記載される方法で使用されるための抗体を産生する。従って、本発明は、異種プロモータに操作可能に連結された、本発明によって包含される抗体、又はその重鎖若しくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を包含する。二本鎖抗体の発現について好ましい実施態様では、重鎖及び軽鎖の双方をコードするベクターは、以下で詳説するように、免疫グロブリン分子全体を発現するために宿主細胞で同時発現されてもよい。
【０４２１】
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は組換えＤＮＡ技法で構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを抱く細胞を指す。組換え宿主からの抗体の単離の工程の記載では、用語「細胞」及び「細胞培養」は同義に用いて、それ以外の旨が特に明示されない限り、抗体の供給源を示す。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、細胞全体の遠心分離から、又は培地と浮遊細胞の双方を含有する細胞培養からのいずれかを意味し得る。
【０４２２】
種々の宿主発現ベクター系を利用して本明細書で記載される方法で使用するための抗体分子を発現してもよい。そのような宿主発現系は、それによって対象のコーディング配列が生成され、その後精製されてもよい媒体を表すが、適当なヌクレオチドコーディング配列で形質転換又は形質移入された場合、本発明によって包含される抗体分子をその場で発現する細胞も表す。これらには、たとえば、抗体のコーディング配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換した細菌（たとえば、大腸菌、枯草菌）、抗体のコーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（たとえば、出芽酵母、ピキア）のような微生物、抗体のコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、抗体のコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた又は組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系、又は哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモータ（たとえば、メタロチオネインのプロモータ）若しくは哺乳類ウイルスに由来するプロモータ（たとえば、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を含有する組換え発現構築物を抱く哺乳類細胞系（たとえば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３の細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、大腸菌のような細菌細胞、さらに好ましくは、特に組換え抗体分子全体を発現させるための真核細胞が、組換え抗体分子の発現に使用される。たとえば、ヒトのサイトメガロウイルスに由来する主要前初期遺伝子プロモータエレメントのようなベクターと併せたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳類細胞は抗体の効果的な発現系である（Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)）。
【０４２３】
タンパク質の発現に使用される宿主細胞株は哺乳類起源であることが多く、当業者は、その中で発現される所望の遺伝子産物に最も適する特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力を有することが認められる。例となる宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣細胞株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頚癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原によるＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ハムスター新生児腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）及び２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞株は通常、商業サービス、アメリカン・ティシュ・カルチャー・コレクション又は出版された文献から入手可能である。
【０４２４】
さらに、挿入された配列の発現を調節する又は特定の所望の方式で遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。タンパク質産物のそのような修飾（たとえば、グリコシル化）及びプロセシング（たとえば、切断）はタンパク質の機能にとって重要でありうる。異なった宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾について特徴的な且つ特異的なメカニズムを有する。適当な細胞株又は宿主系を選択して発現される外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングを確保することができる。この目的で、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞装置を持つ真核宿主細胞を使用してもよい。
【０４２５】
組換えタンパク質の長期間の高収率の産生のためには、安定な発現が好まれる。たとえば、抗体分子を安定に発現する細胞株を操作してもよい。ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現制御エレメント（たとえば、プロモータ、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）と選抜可能なマーカーによって制御されるＤＮＡにより宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、操作した細胞を豊かな培地で１〜２日間増殖させてもよく、次いで選抜培地に交換する。組換えプラスミドにおける選抜可能なマーカーは選抜に対して耐性を付与し、細胞がプラスミドを安定的に染色体に統合し、増殖して、次にはクローニングされ、細胞株に増殖させることができる増殖巣を形成するのを可能にする。この方法を有利に使用して抗体分子を安定に発現する細胞株を操作してもよい。
【０４２６】
単純性ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell 11:223 (1977)）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., Cell 22:817 1980）を含むが、これらに限定されない多数の選抜系を使用してもよく、これらの遺伝子はそれぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｔ又はａｐｒｔ−細胞で用いることができる。また、以下の遺伝子についての選抜の基礎として抗代謝産物耐性を使用することもできる：メソトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)）、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993) and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993);, TIB TECH 11(5):155-215 (May, 1993）、及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerre et al., Gene 30:147 (1984)）。使用することができる組換えＤＮＡ技術の当該技術で一般に知られた方法は、その全体が参照することにより本明細書に組み入れられるAusubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)に記載されている。
【０４２７】
抗体分子の発現レベルはベクターの増幅によって高めることができる（概説については、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987)を参照のこと）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養に存在する阻害剤のレベルの上昇がマーカー遺伝子のコピー数を増やす。増幅された領域は抗体遺伝子と関係するので、抗体の産生も増える（Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)）。
【０４２８】
試験管内の製造は規模を拡大して大量の所望のポリペプチドを提供するのを可能にする。組織培養条件下での哺乳類細胞の培養の技法は当該技術で既知であり、たとえば、エアリフト反応器若しくは連続撹拌反応器における均質浮遊培養、又はたとえば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースビーズ若しくはセラミックカートリッジにおける固相培養若しくは捕捉培養が挙げられる。必要に応じて及び／又は所望に応じて、たとえば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成の後、又は本明細書に記載されるＨＩＣクロマトグラフィ工程の前、又はそれに続いて、慣例のクロマトグラフィ法、たとえば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥセルロース上でのクロマトグラフィ又は（免疫）親和性クロマトグラフィによってポリペプチドの溶液を精製することができる。
【０４２９】
本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体、又はその抗原結合断片、変異体若しくは誘導体をコードする遺伝子は、非哺乳類細胞、たとえば、細菌又は昆虫又は酵母又は植物の細胞で発現することができる。核酸を容易に処理する細菌には、腸内細菌科のメンバー、たとえば、大腸菌又はサルモネラ；バシラス科、たとえば、枯草菌；肺炎球菌；連鎖球菌及びインフルエンザ菌が挙げられる。細菌で発現されると、異種ポリペプチドは通常、封入体の一部になることがさらに十分に理解されるであろう。異種ポリペプチドは単離され、精製され、次いで機能的分子に組み立てられなければならない。抗体の四価の形態が所望であれば、そのとき、サブユニットは四価の抗体に自己組織化する（ＷＯ０２／０９６９４８Ａ２）。
【０４３０】
細菌系では、発現される抗体分子の用途に応じて多数の発現ベクター系を選択することができる。たとえば、大量のそのようなタンパク質が製造されるべきである場合、抗体分子の医薬組成物の生成については、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指向するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターには、融合タンパク質が産生されるようにインフレームのベクターで抗体のコーディング配列が個々にｌａｃＺコーディング領域に連結され得る大腸菌の発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)）などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターを用いて、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質としての外来ポリペプチドを発現させてもよい。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリクスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着及び結合、それに続く遊離のグルタチオンの存在下での溶出によって、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から解放されるようにトロンビン又は因子Ｘａプロテアーゼの切断部位を含むように設計される。
【０４３１】
原核生物に加えて、真核微生物も使用してもよい。出芽酵母又は一般のパン屋の酵母は、多数のほかの株、たとえば、 メタノール資化酵母が一般に利用可能ではあるが、真核微生物の中で最も一般的に使用される。
【０４３２】
酵母での発現については、たとえば、プラスミドＹＲｐ７（Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980)）が一般に使用される。このプラスミドは、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異株、たとえば、ＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４−１（Jones, Genetics 85:12 (1977)）に選抜マーカーを提供するＴＲＰ１遺伝子をすでに含有する。酵母宿主細胞のゲノムの特徴としてのｔｒｐ１の病変の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖によって形質転換を検出する有効な環境を提供する。
【０４３３】
昆虫系では、オートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を通常、外来遺伝子を発現させるベクターとして使用する。このウイルスは、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）細胞の中で増殖する。ウイルスの非必須領域（たとえば、ポリヘドリン遺伝子）に抗体のコーディング配列を個々にクローニングし、ＡｃＮＰＶのプロモータ（たとえば、ポリヘドリンのプロモータ）の制御下に置いてもよい。
【０４３４】
本発明によって包含される抗体分子がいったん組換えとして発現されると、免疫グロブリン分子の精製についての当該技術で既知の方法、たとえば、クロマトグラフィ（たとえば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡの後の特異抗原に対する親和性、及びサイズ処理カラムクロマトグラフィ）、遠心分離、差次的溶解性によって、又はタンパク質の精製についてのそのほかの標準的な技法によってそれを精製してもよい。或いは、本発明によって包含される抗体の親和性を高める好ましい方法は米国特許２００２／０１２３０５７Ａ１に開示されている。
ＶＩＩＩ．治療用のＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を用いた治療方法
【０４３５】
本発明の実施態様の１つは、過剰増殖性の疾患又は障害、たとえば、癌、悪性腫瘍、腫瘍、又はその転移を、そのような疾患に罹っている動物又はそのような疾患に罹る素因がある動物において治療する方法を提供し、その方法は、ＩＧＦ−１Ｒ又はＩＧＦ−１Ｒの変異体に結合する抗体又はその免疫特異的断片の有効量を動物に投与することを含む、又はそれから本質的に成る、又はそれから成る。
【０４３６】
本発明の別の実施態様は、過剰増殖性の疾患又は障害、たとえば、癌、悪性腫瘍、腫瘍、又はその転移を、そのような疾患に罹っている動物又はそのような疾患にか罹る素因がある動物において治療する方法を提供し、その方法は、第１の薬剤としてＩＧＦ−１Ｒ又はＩＧＦ−１Ｒの変異体に結合する抗体又はその免疫特異的断片の有効量を動物に投与することと、前記第１の薬剤との併用で、過剰増殖性の疾患又は障害を治療するのに治療上有用である１以上の追加の剤を投与すること（前記１以上の追加の剤は前記第１の薬剤に関して同時に、一緒に、又は別々にであるが順次（任意の順、任意の時間枠で）投与される）を含む、又はそれから本質的に成る、又はそれから成る。
【０４３７】
本発明の併用には、追加の剤が過剰増殖抑制活性を有しても有さなくても、過剰増殖性の疾患又は障害の治療に治療上有用である１以上の追加の剤とＩＧＦ−１Ｒに結合する抗体（又はその断片）を併用することが含まれる。たとえば、ＩＧＦ−１Ｒ抗体と併用される追加の剤は、追加の剤が抗癌活性を有さずに症状を軽減する又は緩和する効力によって癌の治療に有用であり得る。従って、本発明の併用は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と追加の剤（単数）若しくは剤（複数）を提供することを含み、その際、追加の剤（単数又は複数）は、そのような活性が過剰増殖抑制ではなくてもよいにもかかわらず、治療される対象に有益である活性を介して癌の治療を支援する。例は、過剰増殖抑制活性を有するＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と、赤血球の産生を刺激するが、貧血抑制活性によって癌の治療に有益であるエリスロポイエチン（ＥＰＯ）との併用である。
【０４３８】
ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）の追加の剤との併用は、本明細書で具体的に又は一般的に特定される特定の薬剤、化合物、化学物質又は分子に限定されない。実際、いかなる過剰増殖性の疾患又は障害の治療に治療上有用である追加の薬剤、化合物、化学物質又は分子もＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と併用して前記疾患又は障害の治療を達成し得る。従って、本明細書で具体的に又は一般的に特定される薬剤、化合物、化学物質又は分子はすべて例を提供する手段として特定され、どのような方法でも、本発明の併用を限定することを意図するものではない。さらに、本発明の実施態様は、過剰増殖性の疾患又は障害を治療するのに有用であってもよい第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０及びそれ以上多くの薬剤（たとえば、１０〜２０、２０〜１００、１００〜１０００、１０００〜１０００００、又は１，０００，０００を超える範囲の追加の薬剤の任意の数）との併用を含む。
【０４３９】
好適なＩＧＦ−１Ｒ抗体には、本明細書で記載されるすべてのＩＧＦ−１Ｒ抗体とその抗原特異的断片が挙げられる。例には、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、若しくはＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される抗体と同一のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、若しくはＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する抗体又はその断片、又はＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片、若しくはＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体と同一の抗原結合ドメインを含む抗体又はその断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４０】
特定の実施態様では、ＩＧＦ−１Ｒ又はその変異体に特異的に結合する、本発明によって包含される抗体は、１以上のインスリン成長因子、たとえば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、又はＩＧＦ−１とＩＧＦ−１の双方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻害する。ほかの実施態様では、ＩＧＦ−１Ｒ又はその変異体に特異的に結合する、本発明によって包含される抗体は、１以上のインスリン成長因子と結合する際、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する。さらなる実施態様では、細胞、特に腫瘍細胞上に発現されたＩＧＦ−１Ｒ又はその変異体に特異的に結合する、本発明によって包含される抗体は、細胞の増殖、運動性及び／又は転移に関与する下流のシグナル伝達分子のリン酸化を阻害する。そのような分子には、Ａｋｔ及びｐ４２／４４ＭＡＰＫが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施態様では、細胞上に発現されたＩＧＦ−１Ｒ又はその変異体に特異的に結合する本発明によって包含される抗体は、表面に発現されたＩＧＦ−１Ｒの内部移行を促進し、ＩＧＦとの相互作用するその利用性を限定する。その上さらなる実施態様では、細胞、特に腫瘍細胞上に発現されたＩＧＦ−１Ｒ又はその変異体に特異的に結合する、本発明によって包含される抗体は、細胞の増殖、運動性及び／又は転移を阻害する。
【０４４１】
本明細書で開示される治療方法で使用される、ＩＧＦ−１Ｒ又はその変異体に特異的に結合する、本発明によって包含される抗体は、細胞の過剰増殖に関与する細胞の活性、たとえば、過剰増殖性の疾患又は障害と関連することが多い血管新生の代替パターン又は異常パターンを誘導する細胞の活性を止める、低減する、防ぐ又は阻害する治療剤として調製し、使用することができる。
【０４４２】
本発明によって包含される抗体又はその免疫特異的断片には、たとえば、ＩＧＦ−１Ｒのような腫瘍関連タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体、及び抗体の断片が含まれるが、これらに限定されない。抗体は、一価、二価、多価、又は二官能性の抗体であってもよく、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖを含む。
【０４４３】
本発明によって包含される治療用抗体は、非標識若しくは非複合体化の形態で使用することができ、又はたとえば、放射性標識及び生化学的細胞毒素のような細胞傷害性部分と結合、又は連結させて治療効果を発揮する剤を製造することができる。
【０４４４】
特定の実施態様では、本発明によって包含される抗体又はその免疫特異的断片は、抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、抗体ごとに異なる抗体の可変領域によって形成される。天然に存在する抗体は少なくとも２つの抗原結合ドメインを含み、すなわち、それらの抗体は少なくとも二価である。本明細書で使用されるとき、用語「抗原結合ドメイン」は、抗原（たとえば、細胞表面又は可溶性抗原）上のエピトープを特異的に結合する部位を含む。抗体の抗原結合ドメインは通常、少なくとも免疫グロブリン重鎖可変領域の一部と少なくとも免疫グロブリン軽鎖可変領域の一部を含む。これらの可変領域によって形成される結合部位が抗体の特異性を決定する。
【０４４５】
本発明は、たとえば、ＩＧＦ−１Ｒ、たとえばヒトのＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する抗体又はその抗原結合断片の有効量を哺乳類に投与することを含む、それらから本質的に成る、又はそれから成る、哺乳類において腫瘍増殖を阻害することによって種々の過剰増殖性疾患を治療する方法を包含する。
【０４４６】
本発明はさらに、１以上の追加の治療剤との併用で、たとえば、ＩＧＦ−１Ｒ、たとえばヒトのＩＧＦ−１Ｒに特異的に又は優先的に結合する抗体又はその抗原結合断片の有効量を哺乳類に投与することを含む、それらから本質的に成る、又はそれから成る、哺乳類において腫瘍増殖を阻害することによって種々の過剰増殖性疾患を治療する方法を包含する。
【０４４７】
本発明はさらに具体的には、ＩＧＦ−１Ｒの１以上のエピトープに特異的に又は優先的に結合する抗体又はその抗原結合断片の有効量を、それを必要とする動物に投与することを含む、それらから本質的に成る、又はそれから成る、動物、たとえば、哺乳類、たとえば、ヒトにおける過剰増殖性疾患を治療する、たとえば、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍侵襲及び／又は転移形成を阻害する又は予防する方法に向けられる。
【０４４８】
本発明は一層さらに具体的には、有効量の１つ以上の追加の治療剤との併用で、ＩＧＦ−１Ｒの１つ以上のエピトープに特異的に又は優先的に結合する抗体又はその抗原結合断片の有効量を、それを必要とする動物に投与することを含む、それらから本質的に成る、又はそれから成る、動物、たとえば、哺乳類、たとえば、ヒトにおける過剰増殖性疾患を治療する、たとえば、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍侵襲及び／又は転移形成を阻害する又は予防する方法に向けられる。
【０４４９】
ほかの実施態様では、本発明は、動物、たとえば、哺乳類、たとえば、ヒトにおける過剰増殖性疾患を治療する、たとえば、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍侵襲及び／又は転移形成を阻害する又は予防する方法を包含し、その際、その方法は、そのような治療を必要とする動物に、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体又はその免疫特異的断片を、薬学上許容可能な担体に加えて含む、それらから本質的に成る、又はそれから成る組成物の有効量を投与することを含み、その際、そのエピトープは、配列番号２の少なくとも約４〜５のアミノ酸、配列番号２の少なくとも７、少なくとも９、又は少なくとも約１５〜約３０の間のアミノ酸を含む、それらから本質的に成る、又はそれから成る。記載された配列番号２の所与のエピトープのアミノ酸は隣接してもよいし、隣接しなくてもよい。特定の実施態様では、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面に発現されるＩＧＲ−１Ｒの細胞外ドメインによって形成される非線形エピトープを含む、それらから本質的に成る、又はそれから成る。従って、特定の実施態様では、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープは、配列番号２の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、約１５〜約３０の間、又は少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００の隣接した又は非隣接のアミノ酸を含み、それらから本質的に成り、又はそれから成り、その際、非隣接のアミノ酸は、タンパク質折り畳みを介してエピトープを形成する。本発明はさらに、前記方法が、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する前記抗体又はその免疫特異的断片との併用で、１以上の追加の治療剤の投与をさらに含む上記方法をさらに含む。
【０４５０】
ほかの実施態様では、本発明は、動物、たとえば、ヒト患者において過剰増殖性疾患を治療する、たとえば、腫瘍形成、腫瘍増殖、腫瘍侵襲及び／又は転移形成を阻害する又は予防する方法を包含し、その際、その方法は、そのような治療を必要とする動物に、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体又はその免疫特異的断片を、薬学上許容可能な担体に加えて含む、それらから本質的に成る、又はそれから成る組成物の有効量を投与することを含み、その際、そのエピトープは、上述のような配列番号２の１、２、３、４、５、６以上の隣接する又は非隣接のアミノ酸に加えて、タンパク質を修飾する追加の部分を含み、それらから本質的に成り、又はそれから成り、たとえば、結合分子がタンパク質の修飾されていないものよりも高い親和性で修飾された標的タンパク質に結合するように糖質部分を含んでもよい。或いは、結合分子は、標的タンパク質の修飾されていないものには全く結合しない。本発明はさらに、前記方法がさらに、ＩＧＦ−１Ｒの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する前記抗体又はその免疫特異的断片との併用で、１以上の追加の治療剤の投与をさらに含む上記方法をさらに含む。
【０４５１】
さらに具体的には、本発明は、治療を必要とするヒトに、有効量のＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片と薬学上許容可能な担体を投与することを含む、ヒトにおいて癌を治療する方法を包含する。本発明はさらに、治療を必要とするヒトに、有効量のＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片及び薬学上許容可能な担体を含む第１の剤と、１以上の追加の治療上有用な剤と、薬学上許容可能な担体とを投与する（その際、前記第１の剤と１以上の治療上有用な剤を一緒に（すなわち、同時に併用）、又は任意の順で任意の時間枠で別々な併用で投与することができる）ことを含むヒトにおいて癌を治療する方法を包含する。治療される癌の種類には、胃癌、腎臓癌、脳腫瘍、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌及び前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５２】
特定の実施態様では、抗体又はその断片は、上述のＩＧＦ−１Ｒ又は断片又は変異体の少なくとも１つのエピトープに結合し、すなわち、無関係な又は無作為なエピトープに結合するよりさらに容易にそのようなエピトープに結合し；上述のＩＧＦ−１Ｒ又は断片又は変異体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合し、すなわち、関係する、類似の、相同の又は類縁のエピトープに結合するよりさらに容易にそのようなエピトープに結合し；それ自体上述のＩＧＦ−１Ｒ又は断片又は変異体の特定のエピトープに特異的に又は優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害し；或いは約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍ又は約１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤを特徴とする親和性で上述のＩＧＦ−１Ｒ又は断片又は変異体の少なくとも１つのエピトープに結合する。抗体結合の解離定数の背景で使用されるとき、用語「約」は、抗体の親和性を測定するのに利用される方法に元来伴なう変動の程度を考慮に入れる。たとえば、使用した機器の精度、使用した試料の数に基づく標準誤差、丸めによる誤差によって、用語「約１０−２Ｍ」は、たとえば、０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを含み得る。特定の実施態様では、本発明によって包含される抗体及びその断片は、それを産生したほかの種のＩＧＦ−１Ｒタンパク質と交差反応し、たとえば、ヒトのＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片は霊長類のＩＧＦ−１Ｒ及び／又はマウスのＩＧＦ−１Ｒとも結合する。本発明によって包含されるほかの好適な抗体又はその断片には、種特異性が高いものが含まれる。
【０４５３】
特定の実施態様では、本明細書で開示される抗体又はその免疫特異的断片は、５×１０−２／秒、１０−２／秒、５×１０−３／秒、又は１０−３／秒以下の解離速度（ｋ（オフ））でＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片又は変異体に結合する。本明細書で開示される他の抗体又はその免疫特異的断片は、５×１０−４／秒、１０−４／秒、５×１０−５／秒、１０−５／秒、５×１０−６／秒、１０−６／秒、５×１０−７／秒又は１０−７／秒以下の解離速度（ｋ（オフ））でＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片又は変異体に結合する。
【０４５４】
ほかの実施態様では、本明細書で開示される抗体又はその免疫特異的断片は、１０−３Ｍ／秒、５×１０−３Ｍ／秒、１０−４Ｍ／秒、５×１０−４Ｍ／秒以上の会合速度（ｋ（オン））でＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片又は変異体をに結合する。本明細書で開示される診断方法及び治療方法で使用するための他の抗体又はその免疫特異的断片は、１０−５Ｍ／秒、５×１０−５Ｍ／秒、１０−６Ｍ／秒、５×１０−６Ｍ／秒、１０−７Ｍ／秒以上の会合速度（ｋ（オン））でＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片又は変異体に結合する。
【０４５５】
種々の実施態様では、上述のような１以上の結合分子は、ＩＧＦ−１Ｒ活性の拮抗物質であり、たとえば、腫瘍細胞に発現されているＩＧＦ−１Ｒへの拮抗物質ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合はインスリン成長因子、たとえば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２又はＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の双方のＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害し、ＩＧＦ−１Ｒの内部移行を促進し、それによってシグナル伝達能を阻害し、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害し、シグナル伝達経路の下流の分子、たとえば、Ａｋｔ又はｐ４２／４４ＭＡＰＫのリン酸化を阻害し、腫瘍細胞の増殖、運動性又は転移を阻害する。
ＩＸ．ＩＧＦ−１Ｒ特異的結合分子と核酸増幅アッセイを用いた診断法及び予後診断法
【０４５６】
ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその断片、誘導体若しくは類似体を診断目的で用いて、ＩＧＦ−１Ｒの異常な発現及び／又は活性に伴う疾患、障害及び／又は症状を検出し、診断し、又はモニターすることができる。ＩＧＦ−１Ｒの発現は腫瘍組織及びそのほかの腫瘍状態では高められる。
【０４５７】
ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその断片は、哺乳類、好ましくはヒトにおける過剰増殖性障害の診断、治療、予防及び／又は予後診断に有用である。そのような障害には、癌、新生物、腫瘍及び／又は本明細書のほかで記載されるもの、特にＩＧＦ−１Ｒに関連する癌、たとえば、胃癌、腎臓癌、脳腫瘍、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌及び前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５８】
たとえば、本明細書で開示されるように、ＩＧＦ−１Ｒの発現は、胃、腎臓、脳、膀胱、結腸、肺、乳腺、膵臓、卵巣及び前立腺の腫瘍組織と関連がある。従って、ＩＧＦ−１Ｒに向けられた抗体（及び抗体断片）を用いて高いレベルのＩＧＦ−１Ｒを発現する特定の組織を検出することができる。生体内で又は試験管内で、たとえば、血液試料で、生検組織で又は剖検組織でこれらの診断アッセイを行うことができる。
【０４５９】
従って、本発明は、癌及びそのほかの過剰増殖性障害の診断中に有用な診断法を提供し、それには、個体からの組織又はそのほかの細胞又は体液におけるＩＧＦ−１Ｒタンパク質又は転写物の発現レベルを測定することと、測定したレベルを正常な組織又は体液における標準的なＩＧＦ−１Ｒの発現レベルと比較することが含まれ、それによって標準と比べて高い発現レベルが障害を示す。
【０４６０】
実施態様の１つは、個体の組織試料又は体液試料におけるＩＧＦ−１Ｒの発現を測定することと、該試料におけるＩＧＦ−１Ｒ発現の存在又はレベルを標準の組織試料又は体液試料のパネルのＩＧＦ−１Ｒ発現の存在又はレベルと比較することを含み、その際、ＩＧＦ−１Ｒ発現の存在又はＩＧＦ−１Ｒ発現の標準を超えた上昇の検出が異常な過剰増殖性細胞の増殖を示す、液体試料又は組織試料における異常な過剰増殖性細胞、たとえば、前癌状態の細胞又は癌性の細胞の存在を検出する方法を提供する。
【０４６１】
さらに具体的には、本発明は、（ａ）本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を用いて個体の組織試料又は体液試料におけるＩＧＦ−１Ｒの発現を測定することと、（ｂ）該試料におけるＩＧＦ−１Ｒ発現の存在又はレベルを標準の組織試料又は体液試料のパネルのＩＧＦ−１Ｒ発現の存在又はレベルと比較することを含み、それによって、ＩＧＦ−１Ｒ発現の存在又はＩＧＦ−１Ｒ発現の標準を超えた上昇の検出が異常な過剰増殖性細胞の増殖を示す、体液試料又は組織試料における異常な過剰増殖性細胞の存在を検出する方法を包含する。
【０４６２】
癌に関しては、個体から生検した組織における相対的に高い量のＩＧＦ−１Ｒタンパク質の存在が、腫瘍又はそのほかの悪性の増殖の存在を示し得、そのような悪性度又は腫瘍の発症に対する素因を示し得て、或いは急性の臨床症状の出現に先立って疾患を検出する手段を提供し得る。この種のさらに決定的な診断は、保健専門家に予防対策又は積極的な治療を採用させ、それによって癌の発症又はさらなる進行を防ぐことができる。
【０４６３】
本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体を用いて、当業者に既知の従来の免疫組織学的な方法を用いて生体試料でタンパク質のレベルを測定することができる（たとえば、Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)を参照のこと）。タンパク質の発現を検出するのに有用なその他の抗体に基づいた方法には、免疫アッセイ、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。好適な抗体アッセイの標識は当該技術で既知であり、酵素標識、たとえば、グルコースオキシダーゼ；放射性標識、たとえば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）、発光標識、たとえば、ルミノール、並びに蛍光標識、たとえば、フルオレセイン及びローダミン、並びにビオチンが挙げられる。好適なアッセイは本明細書のほかでさらに詳細に記載される。
【０４６４】
本発明の態様の１つは、動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトにおけるＩＧＦ−１Ｒの異常な発現に伴う過剰増殖性の疾患又は障害の生体内の検出又は診断のための方法である。実施態様の１つでは、診断は、ａ）ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する本発明の標識抗体又はその断片の有効量を対象に投与すること（たとえば、非経口で、皮下に又は腹腔内に）と、ｂ）ＩＧＦ−１Ｒが発現される対象の部位で標識した結合分子が優先的に濃縮できるように（及び結合しなかった標識分子がバックグラウンドレベルに除かれるように）投与に続く時間間隔を待つことと、ｃ）バックグラウンドレベルを決定することと、ｄ）バックグラウンドレベルを超える標識分子の検出が、対象がＩＧＦ−１Ｒの異常な発現に伴う特定の疾患又は障害を有することを示すように対象における標識分子を検出することを含む。特定の系で以前決定された標準の値と検出された標識分子の量を比べることを含む種々の方法によってバックグラウンドレベルを決定することができる。
【０４６５】
対象の大きさと使用される画像化システムが診断画像を生成するのに必要とされる画像化部分の量を決定することは当該技術で理解されるであろう。放射性同位元素の場合、ヒト対象については、注射される放射活性の量は普通、たとえば、９９Ｔｃで約５〜２０ミリキュリーに及ぶ。標識された結合分子、たとえば、抗体又は抗体断片は次いで特定のタンパク質を含有する細胞の位置で蓄積する。生体内の腫瘍の画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌらの「放射性標識した抗体及びその断片の免疫体内動態」（S. W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)の腫瘍の画像化：癌の放射性化学物質による検出の第１３章）に記載されている。
【０４６６】
使用する標識の種類及び投与の方式を含む幾つかの変数にもよるが、対象の部位で標識した結合分子が優先的に濃縮できるための及び結合しなかった標識分子がバックグラウンドレベルに除かれるための投与に続く時間間隔は、６〜４８時間、又は６〜２４時間、又は６〜１２時間である。別の実施態様では、投与に続く時間間隔は、５〜２０日間又は７〜１０日間である。
【０４６７】
生体内の走査に関する既知の方法を用いて、標識された分子の存在を患者にて検出することができる。これらの方法は、使用した標識の種類に左右される。熟練者は特定の標識を検出する適当な方法を決定することができる。本発明の診断法で使用され得る方法及び装置には、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、たとえば、ポジション放射断層撮影（ＰＥＴ）のような全身走査、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）及び超音波検査法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４６８】
特定の実施態様では、結合分子を放射性同位元素で標識し、放射線応答性外科装置を用いて患者にて検出する（Thurston et al., 米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施態様では、結合分子を蛍光化合物で標識し、蛍光応答性走査機器を用いて患者にて検出する。別の実施態様では、結合分子をポジトロン放射金属で標識し、ポジトロン放射断層撮影を用いて患者にて検出する。さらに別の実施態様では、結合分子を常磁性標識で標識し、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）を用いて患者にて検出する。
【０４６９】
ＩＧＦ−１Ｒ発現の生体内の画像化のための抗体標識又はマーカーには、Ｘ線撮影法、核磁気共鳴画像診断（ＮＭＲ）、ＭＲＩ、ＣＳＴ−走査又は電子スピン共鳴画像診断（ＥＳＲ）によって検出可能なものが挙げられる。Ｘ線撮影法については、好適な標識にはバリウム又はセシウムのような放射性同位元素が挙げられ、それらは検出可能な放射線を放出するが、対象に対して明白に有害ではない。ＮＭＲ及びＥＳＲに好適なマーカーには、重水素のような検出可能な特徴的なスピンが挙げられ、それは関連するハイブリドーマに対する栄養標識によって抗体に取り込むことができる。上昇したＩＧＦ−１Ｒの発現レベルを検出するために生体内の画像化がヒトにおける診断に使用される場合、本明細書のどこか他に記載されるようなヒト抗体又は「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。
【０４７０】
上述のことに関連した実施態様では、たとえば、最初の診断の１ヵ月後、最初の診断の６ヵ月後、最初の診断の１年後などに疾患又は障害を診断する方法のいずれか１つを繰り返すことによってすでに診断された疾患又は障害のモニタリングを実施する。
【０４７１】
腫瘍の診断を含む障害の診断が従来の方法によってすでに行われている場合、本明細書で開示される検出方法は予後の指標として有用であり、それによって高いＩＧＦ−１Ｒの発現を呈し続けている患者が、標準レベル近くに発現レベルが低下している患者に比べて悪い臨床転帰を経験することになる。
【０４７２】
「腫瘍に関連するＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの発現レベルを測定すること」は、直接的に（たとえば、タンパク質の絶対的なレベルを決定する又は推定することによって）又は相対的に（たとえば、第２の生体試料における癌に関連するポリペプチドのレベルと比較することによって）、第１の生体試料におけるＩＧＦ−１Ｒポリペプチドのレベルを定性的に又は定量的に測定する又は推定することを意図する。好ましくは、第１の生体試料におけるＩＧＦ−１Ｒポリペプチドの発現レベルを測定し又は推定し、標準のＩＧＦ−１Ｒポリペプチドのレベルと比較するが、標準は、障害を有さない個体から得られた第２の生体試料から選ばれるか、又は障害を有さない個体の集団からレベルを平均することによって決定される。当該技術で十分に理解されるように、いったん「標準」のＩＧＦ−１Ｒポリペプチドのレベルが分かれば、比較のための標準としてそれを繰り返し使用することができる。
【０４７３】
「生体試料」は、ＩＧＦ−１Ｒを発現している可能性がある個体、細胞株、組織培養又は細胞のそのほかの供給源から得られる任意の生体試料を意図する。示されるように、生体試料には、ＩＧＦ−１Ｒを発現している可能性がある細胞を含有する体液（たとえば、血清、血漿、尿、滑液及び髄液）、及びそのほかの組織供給源が含まれる。哺乳類から組織生検及び体液を得る方法は当該技術で周知である。
【０４７４】
追加の実施態様では、ＩＧＦ−１Ｒの立体構造エピトープに向けられた抗体又は抗体の免疫特異的断片を用いて、ＩＧＦ−１Ｒの遺伝子産物又はその保存的変異体又はそのペプチド断片の存在を定量的に又は定性的に検出することができる。たとえば、光学顕微鏡、フローサイトメータ又は蛍光検出と合わせて蛍光で標識した抗体を用いる免疫蛍光法によってこれを達成することができる。
【０４７５】
上述の方法を用いて診断され得る又は予後診断され得る癌には、胃癌、腎臓癌、脳腫瘍、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌及び前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７６】
Ｘ．免疫アッセイ
本明細書で開示されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、当該技術で既知の方法によって免疫特異的結合についてアッセイされ得る。使用することができる免疫アッセイには、たとえば、ほんの数例を挙げると、ウェスタンブロット、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射性アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイのような技法を用いた競合アッセイ系及び非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなアッセイは日常的であり、当該技術で周知である（その全体が参照することにより本明細書に組み入れられる、たとえば、 Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Vol. 1 (1994)を参照のこと）。例となる免疫アッセイを以下に手短に記載する（が、限定目的では意図されない）。
【０４７７】
免疫沈降のプロトコールは一般に、タンパク質ホスファターゼ及び／又はプロテアーゼ阻害剤（たとえば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）で補完したＲＩＰＡ緩衝液（１％のＮＰ−４０又はトリトンＸ−１００、１%のデオキシコール酸ナトリウム、０．１%ＳＤＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１％のトラシロール）のような溶解緩衝液で細胞集団を溶解すること、細胞溶解物に対象の抗体を加えることと、４℃にてある時間（たとえば、１〜４時間）インキュベートすることと、細胞溶解物にプロテインＡ及び／又はプロテインＧセファロースビーズを加えることと、４℃にて約１時間以上インキュベートすることと、溶解緩衝液中でビーズを洗浄することと、ＳＤＳ／試料緩衝液にビーズを再懸濁させることを含む。対象の抗体の特定抗原を免疫沈降させる能力は、たとえば、ウェスタンブロット解析によって評価することができる。当業者は、抗原への抗体の結合を高め、バックグラウンドを減らすように変更することができるパラメータについての見識を持つ（たとえば、セファロースビーズで細胞溶解物を事前にきれいにすること）。免疫沈降のプロトコールに関するさらなる考察については、たとえば、Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Vol. 1 (1994) at 10.16.1を参照のこと。
【０４７８】
ウェスタンブロット解析は一般に、タンパク質試料を調製することと、ポリアクリルアミドゲル（抗原の分子量によって８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上でのタンパク質試料の電気泳動と、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルから、たとえば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ又はナイロンのような膜に移すことと、ブロッキング溶液（たとえば、３％のＢＳＡ又は脱脂乳を伴ったＰＢＳ）で膜をブロックすることと、洗浄緩衝液（たとえば、ＰＢＳ−ツイーン２０）で膜を洗浄することと、ブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体（当該抗体）で膜をブロックすることと、洗浄緩衝液で膜を洗浄することと、ブロッキング緩衝液で希釈した酵素基質（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）又は放射性分子（たとえば、３２Ｐ又は１２５−Ｉ）に複合体化させた二次抗体（一次抗体、たとえば、抗ヒト抗体を認識する）で膜をブロックすることと、洗浄緩衝液で膜を洗浄することと、抗体の存在を検出することを含む。当業者は、検出されるシグナルを高め、バックグラウンドのノイズを減らすように変更することができるパラメータについての見識を持つ。ウェスタンブロットのプロトコールに関するさらなる考察については、たとえば、 Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York Vol. 1 (1994) at 10.8.1を参照のこと。
【０４７９】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製することと、９６穴マイクロタイタープレートのウェルを抗原で被覆することと、酵素基質（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）のような検出可能な化合物に複合体化させた対象の抗体をウェルに加えることと、ある時間インキュベートすることと、抗原の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡでは、対象の抗体は、検出可能な化合物に複合体化させる必要はなく、その代わりに検出可能な化合物に複合体化させた二次抗体（当該抗体を認識する）をウェルに加える。さらに、抗原でウェルを被覆する代わりに抗体をウェルに被覆してもよい。この場合、被覆されたウェルへの当該抗原の添加に続いて検出可能な化合物に複合体化させた二次抗体を加えてもよい。当業者は、当該技術で既知のＥＬＩＳＡのそのほかの変異と同様に検出されるシグナルを高めるように変更することができるパラメータに関しての見識がある。ＥＬＩＳＡに関するさらなる考察については、たとえば、Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, Vol. 1 (1994) at 11.2.1を参照のこと。
【０４８０】
抗体の抗原への結合親和性及び抗体−抗原の相互作用の解離速度は競合結合アッセイによって決定することができる。競合結合アッセイの一例は、上昇していく量の非標識抗原の存在下で対象の抗体と共に標識抗原（たとえば、３Ｈ又は１２５Ｉ）をインキュベートすることと、標識した抗原に結合した抗体を検出することを含む放射性免疫アッセイである。特定の抗原に対する対象の抗体の親和性及び結合の解離速度は、スキャチャードプロット解析によるデータから決定することができる。放射性免疫アッセイを用いて二次抗体の競合も決定することができる。この場合、上昇する量の非標識の二次抗体の存在下で標識化合物（たとえば、３Ｈ又は１２５Ｉ）に複合体化させた当該抗体と共に抗原をインキュベートする。
【０４８１】
ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体はさらに、癌抗原遺伝子産物又はその保存された変異体又はそのペプチド断片のその場での検出のための、免疫蛍光アッセイ、免疫電子顕微鏡アッセイ又は非免疫アッセイにおけるように組織学的に用いてもよい。その場での検出は、患者から組織学検体を取り出し、好ましくは、生体試料への標識抗体（又は断片）の重層によって塗布される、標識されたＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその断片をそれに塗布することによって達成されてもよい。そのような手順の使用を介して、ＩＧＦ−１Ｒタンパク質又は保存された変異体又はペプチド断片の存在だけでなく、調べた組織におけるその分布も決定することが可能である。本発明を用いて、多種多様な組織学的方法（たとえば、染色法）のいずれかを、そのようなその場での検出を達成するために改変することができることを当業者は容易に理解するであろう。
【０４８２】
ＩＧＦ−１Ｒ遺伝子産物又はその保存された変異体又はそのペプチド断片についての免疫アッセイ及び非免疫アッセイは通常、ＩＧＦ−１Ｒ又はその保存された変異体又はそのペプチド断片に結合することが可能である検出可能に標識された抗体の存在下で、たとえば、体液、組織抽出物、新鮮に回収された細胞又は細胞培養でインキュベートされた細胞の溶解物のような試料をインキュベートすることと、当該技術で周知の多数の技法のいずれかによって結合した抗体を検出することを含む。
【０４８３】
生体試料を、たとえば、固相の支持体若しくは担体、又は細胞、細胞粒子又は可溶性タンパク質を不動化することが可能であるそのほかの固体支持体に接触させ、不動化することができる。次いで支持体を好適な緩衝液で洗浄し、その後検出可能に標識されたＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体によって処理することができる。次いで固相支持体を２回目に洗浄し、未結合の抗体を除くことができる。任意で、抗体をその後標識する。次いで従来の方法によって固体支持体上での結合した標識の量を検出することができる。
【０４８４】
「固相の支持体又は担体」は、抗原又は抗体を結合することが可能である支持体のいずれかをも意図する。周知の支持体又は担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然の及び修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩及び磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のため、ある程度可溶性又は不溶性のいずれかである。支持体材料は、結合した分子が抗原又は抗体に結合することが可能である限り、事実上ほぼいかなる可能な構造上の構成を有してもよい。従って、支持体の構成は、ビーズにおけるような球状、又は試験管の内部表面若しくは竿の外部表面におけるような円筒状であってもよい。或いは、表面は、たとえば、シートや試験片などのように平坦であってもよい。好ましい支持体にはポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体又は抗原を結合するのに好適な多数のそのほかの担体を知っており、日常の実験の使用によってそれを確かめることができる。
【０４８５】
ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体の所与のロットの結合活性は、周知の方法によって決定することができる。当業者は、日常の実験を用いることによって各測定に操作可能な且つ最適なアッセイ条件を決定することができる。
【０４８６】
抗体−抗原の相互作用の親和性を測定するのに利用可能な種々の方法があるが、速度定数を決定する方法は相対的に少ない。ほとんどの方法は抗体又あるいは抗原を標識することに依存し、それは必然的に日常的な測定を複雑にし、測定された量に不確実性を導入する。
【０４８７】
ＢＩＡｃｏｒｅで実施されるような表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）は、抗体−抗原の相互作用の親和性を測定する従来の方法を超えて多数の利点を提供する：（ｉ）抗体又は抗原のいずれかを標識する必要がない、（ｉｉ）あらかじめ抗体を精製する必要がなく、細胞培養上清をそのまま使用することができる、（ｉｉｉ）リアルタイムの測定によって異なったモノクローナル抗体の迅速な半定量的な比較が可能になり、リアルタイムの測定が多数の評価目的で可能であり、十分である、（ｉｖ）一連の異なったモノクローナル抗体を同一条件下で容易に比較できるように生体特異的な表面を再生することができる、（ｖ）分析手順は完全に自動化され、ユーザーの介入なしで広範な測定を行うことができる。ＢＩＡ応用ハンドブック、ＡＢ版（１９９８年増刷）、ＢＩＡＣＯＲＥコード番号ＢＲ−１００１−８６；ＢＩＡ技術ハンドブック、ＡＢ版（１９９８年増刷）、ＢＩＡＣＯＲＥコード番号ＢＲ−１００１−８４。
【０４８８】
ＳＰＲに基づく結合試験は、結合対の一方のメンバーがセンサー表面に不動化されることを必要とする。不動化された結合相手をリガンドと呼ぶ。溶液中の結合相手を検体と呼ぶ。場合によっては、リガンドは、捕捉分子と呼ばれる別の不動化分子を介して表面に間接的に連結される。ＳＰＲの応答は、検体が結合する又は解離するときの検出器表面における質量濃度の変化を反映する。
【０４８９】
ＳＰＲに基づいて、リアルタイムのＢＩＡコア測定が、相互作用を、それらが発生する時に直接モニターする。その技法は、動態パラメータの決定に上手く適合する。比較親和性のランク付けは実行が極めて容易であり、動態定数と親和性定数の双方をセンサーグラムのデータから得ることができる。
【０４９０】
リガンドの表面を横切る不連続のパルスに検体を注入すると、得られるセンサーグラムを３つの根本的な相に分割することができる：（ｉ）試料注入中の検体のリガンドとの会合、（ｉｉ）検体の結合速度が複合体の解離によって均衡する試料注入中の平衡又は定常状態、（ｉｉｉ）緩衝液流動中の検体の表面からの解離。
【０４９１】
会合相と解離相は検体−リガンドの相互作用の動態の情報を提供する（Ｋａ及びＫｄ、複合体の形成と解離の速度、Ｋｄ／Ｋａ＝ＫＤ）。平衡相は検体−リガンドの相互作用（ＫＤ）の親和性の情報を提供する。
【０４９２】
ＢＩＡ評価ソフトウェアは、数値積分法と広範なフィッティングアルゴリズムの双方を用いて、曲線フィッティングのための包括的な機能を提供する。データの好適な解析によって、単純なＢＩＡコアの検討から、相互作用についての分離速度と親和性定数を得ることができる。この技法によって測定可能な親和性の範囲は、ｍＭ〜ｐＭに及び非常に広い。
【０４９３】
エピトープ特異性は、モノクローナル抗体の重要な特性である。ＢＩＡコアによるエピトープのマッピングは、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ又はそのほかの表面吸着法を用いた従来の技法とは対照的に、抗体の標識や精製を必要とせず、数種のモノクローナル抗体を順に用いることによって複数部位の特異性試験を可能にする。さらに、多数の検体を自動的に処理することができる。
【０４９４】
ペアワイズ結合実験は、同一抗原に同時に結合する２つのＭａｂの能力を調べる。別々のエピトープに対して向けられたＭａｂは独立してに結合するが、同一又は密接に関係するエピトープに向けられたＭａｂはそれぞれ他方の結合に干渉する。ＢＩＡコアによるこれらの結合実験は実施するのに容易である。
【０４９５】
たとえば、捕捉分子を用いて第１のＭａｂに結合させ、次いで抗原と第２のＭａｂを順に加えることができる。センサーグラムは、１．どれだけの抗原が第１の抗体に結合するか、２．表面に連結された抗原にどの程度第２の抗体が結合するか、３．第２の抗体が結合しないならば、ペアワイズ試験の順番を反転させることが結果を変えるか、を示すであろう。
【０４９６】
ペプチド阻害は、エピトープのマッピングに使用される別の技法である。この方法は、ペアワイズ抗体結合試験を補完し、抗原の一次配列が分かっている場合、機能的エピトープを構造的特徴に関連付けることができる。不動化された抗原への異なったＭａｂの結合の阻害についてペプチド又は抗原断片を調べる。所与のＭａｂの結合を妨害するペプチドがそのＭａｂによって規定されるエピトープに構造的に関係するとみなされる。
ＸＩ．医薬組成物及び投与方法
【０４９７】
ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片及び追加の治療剤を調製し、それを必要とする対象に投与する方法は当業者に周知であり、又は当業者によって容易に決定される。治療剤、たとえば、結合分子、たとえば、結合ポリペプチド、たとえば、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片の投与の経路は、たとえば、経口、非経口、吸入、又は局所であり得る。用語「非経口」は、本明細書で使用されるとき、たとえば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸又は膣への投与を含む。投与のこれらの形態がすべて本発明の範囲内にあると明瞭に熟考されるが、投与の形態は、注射液、特に静脈内又は動脈内の注射又は点滴である。通常、注射のための好適な医薬組成物は、緩衝液（たとえば、酢酸、リン酸又はクエン酸の緩衝液）、界面活性剤（たとえば、ポリソルベート）、任意で安定剤（たとえば、ヒトのアルブミン）などを含み得る。しかしながら、本明細書の教示に適合するほかの方法では、治療剤及び結合分子、たとえば、結合ポリペプチド、たとえば、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片の投与は、有害細胞集団の部位に直接送達され、それによって治療剤への疾患部位の暴露を増やすことができる。
【０４９８】
非経口投与のための製剤には、無菌の水溶液又は非水性溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコールポリエチレングリコール、植物油、たとえば、オリーブ油、注射可能な有機エステル、たとえば、オレイン酸エチルである。水性担体には、水、生理食塩水及び緩衝化培地を含むアルコール性の／水溶液、水性エマルション又は水性懸濁液が挙げられる。本発明では、薬学上許容可能な担体は、０．０１〜０．１Ｍの、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液又は０．８％の生理食塩水を含むが、これらに限定されない。ほかの一般的な非経口媒体には、リン酸ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液、又は不揮発性油が挙げられる。静脈内媒体には、流体と栄養の補液、電解質補液、たとえば、リンガーのデキストロースなどに基づくものが挙げられる。保存剤及びそのほかの添加剤、たとえば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性気体なども存在してもよい。
【０４９９】
さらに詳しくは、注射用に好適な医薬組成物には、無菌の水溶液（水可溶性）又は水分散液、及び無菌の注射用の溶液又は分散液の即席調製用の無菌の粉末が挙げられる。そのような場合、組成物は無菌でなければならず、容易な注入性が存在する程度に流体であるべきである。それは、製造及び保存の条件下で安定であるべきであり、細菌や真菌のような微生物の混入作用に対して好ましくは保護される。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び好適なその混合物を含有する溶媒又は分散液の媒体であることができる。たとえば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合、必要とされる粒度の維持によって、及び界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。本明細書で開示される治療方法における使用のために好適な処方は、レミングトンの薬学科学（マック出版社、第１６版、１９８０年）に記載されている。
【０５００】
種々の抗菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって微生物の活動の予防を達成することができる。多くの場合、等張剤、たとえば、糖、ポリアルコール、たとえば、マンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。組成物に吸収を遅らせる剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによって注射用組成物の長期にわたる吸収をもたらすことができる。
【０５０１】
どのような場合でも、必要に応じて本明細書に列挙された成分の１つ又は組み合わせと共に適当な溶媒に必要とされる量で有効な化合物（単数）又は化合物（複数）（すなわち、１以上の治療剤、たとえば、結合分子、たとえば、結合ポリペプチド、たとえば、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片、それ自体、又はほかの活性剤との組み合わせで）を組み入れ、その後フィルターによる滅菌を行うことによって無菌の注射用溶液を調製することができる。一般に、塩基性の分散媒体と上記で列挙されたものからの必要とされるほかの成分を含有する無菌の媒体に有効化合物を組み入れることによって分散液を調製する。無菌の注射用溶液の調製のための無菌の粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、それによって有効成分の粉末と、予め無菌濾過したその溶液からの追加の所望の成分が得られる。注射用製剤は、加工され、アンプル、袋、ビン、注射器又はバイアルのような容器に詰められ、当該技術で既知の方法に従って無菌条件下で密封される。さらに、製剤は包装され、その全体が参照することにより本明細書に組み入れられる、同時係属Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２５９，３３７（ＵＳ−２００２−０１０２２０８Ａ１）に記載されているもののようなキットの形態で販売される。そのような製造物品は好ましくは、自己免疫疾患又は腫瘍性疾患に罹っている又はその素因を持つ対象を治療するのに関連する組成物が有用であることを示すラベル又は添付文書を有する。
【０５０２】
本明細書で記載される過剰増殖性障害の治療のための本発明の組成物の有用な投与量は、利用される具体的な併用と治療剤の用量、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトか動物か、投与されるほかの薬剤、及び治療が予防的か又は治療的かを含む、多数の異なった因子によって変化する。普通、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含む非ヒト哺乳類も治療することができる。当業者に既知の日常的な方法を用いて治療の投与量を滴定し、安全性と有効性を最適化することができる。
【０５０３】
抗体又はその断片による過剰増殖性障害の治療のためには、投与量は、たとえば、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに普通には宿主の体重あたり０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（たとえば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、など）に及ぶことができる。たとえば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであることができる。上記の範囲内の中間にある用量も本発明の範囲内であることが意図される。対象に、そのような用量を毎日、代替日、毎週、または経験的分析によって決定された他のスケジュールに従って、投与することができる。例となる治療は、長い期間、たとえば、少なくとも６ヵ月間にわたって複数の投与量での投与を必要とする。追加の例となる治療計画は、２週間ごとに１回又は１ヵ月ごとに１回又は３〜６ヵ月ごとに１回の投与を必要とする。例となる投与量スケジュールには、連続した日での１〜１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ、交互の日での３０ｍｇ／ｋｇ又は毎週６０ｍｇ／ｋｇが挙げられる。方法によっては、異なった結合特性を持つ２以上のモノクローナル抗体又は治療剤を同時に投与し、その場合、投与される各抗体又は治療剤の投与量は示された範囲内に入る。
【０５０４】
本明細書で開示されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は複数にわたって投与することができる。単一投与量の間の間隔は、週に１回、月に１回又は年に１回であることができる。患者における標的ポリペプチド又は標的分子の血中レベルを測定することによって示されるように、間隔は不規則であることもできる。方法によっては、１〜１０００μｇ／ｍＬの血漿ポリペプチドの濃度を達成するため、他の方法によっては、２５〜３００μｇ／ｍＬを達成するために投与量を調整する。或いは、結合分子を徐放性の剤形として投与することができ、その場合、より頻度が少ない投与しか必要とされない。投与量及び投与回数は患者における抗体の半減期によって変化する。結合分子の半減期は、安定なポリペプチド又は部分、たとえば、アルブミン又はＰＥＧへの融合を介して延長することができる。一般に、ヒト化抗体は最長の半減期を示し、キメラ抗体及び非ヒト抗体がそれに続く。実施態様の１つでは、本発明に包含される結合分子は未複合体化の形態で投与することができる。別の実施態様では、本明細書で開示される方法で使用するための結合分子、たとえば、結合ポリペプチド、たとえば、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、複合体の形態で複数回投与することができる。さらに別の実施態様では、本発明に包含される結合分子を未複合体化の形態で、次いで複合体の形態で投与することができ、その逆も行うことができる。
【０５０５】
投与量及び投与回数は、治療が予防的か又は治療的かによって変化しうる。予防的応用では、抗体又はそのカクテルを含む組成物をすでに病気状態ではない患者又は前病気状態の患者に投与して患者の抵抗力を高める。そのような量は、「予防的有効量」と定義する。この使用では、正確な量は再び患者の健康状態と一般的な免疫に左右されるが、一般に１投与当たり０．１〜２５ｍｇ、特に１投与当たり０．５〜２．５ｍｇである。相対的に低い投与量が相対的に頻度が少ない間隔で長い時間にわたって投与される。一部の患者は、その残った生涯について治療を受け続ける。
【０５０６】
治療応用では、相対的に高い投与量（たとえば、１投与当たり約１〜４００ｍｇ／ｋｇの結合分子、たとえば、抗体、５〜２５ｍｇの投与量が放射性免疫抱合にさらに一般的に使用され、細胞傷害性薬剤と複合化した分子についてはさらに高い用量）を相対的に短い間隔で、疾患の進行が低減する又は止まるまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的な又は完全な改善を示すまで必要とされる。その後、患者には予防的計画が投与される。
【０５０７】
実施態様の１つでは、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片をコードする核酸（たとえば、ベクター）を含む組成物で患者を治療することができる。ポリペプチドをコードする核酸の用量は、患者当たり１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、又は３０〜３００μｇのＤＮＡに及ぶ。感染性ウイルスベクターについての用量は、１回当たり１０〜１００以上のビリオンと変化する。
【０５０８】
非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻内、又は筋肉内の手段で予防的及び／又は治療的な治療について治療剤を投与することができる。方法によっては、ＩＧＦ−１Ｒを発現する細胞が蓄積している特定の組織に直接、剤を注射する、たとえば、頭蓋内注射である。抗体の投与には筋肉内注射又は静脈内注射が好ましい。方法によっては、特定の治療用抗体を直接頭蓋内に注射する。方法によっては、徐放性組成物又は徐放性手段、たとえば、Ｍｅｄｉｐａｄ（商標）手段として抗体を投与する。
【０５０９】
疾患を治療するのに有効である又は治療（たとえば、予防的又は治療的）の必要な状態に有効であるほかの剤との併用で、本発明に包含されるＩＧＦ−１Ｒ抗体又はその断片を投与することができる。
【０５１０】
９０Ｙで標識した結合ポリペプチドの有効な単回治療の投与量（すなわち、治療上の有効量）は、約５〜約７５ｍＣｉの間、さらに好ましくは約１０〜約４０ｍＣｉの間に及ぶ。１３１Ｉ標識した抗体の単回治療の非骨髄性の外科的な有効投与量は、約５〜約７０ｍＣｉの間、さらに好ましくは約５〜約４０ｍＣｉの間に及ぶ。１３１Ｉ標識した抗体の単回治療の外科的な有効投与量（すなわち、自己骨髄移植を必要としてもよい）は、３０〜約６００ｍＣｉの間、さらに好ましくは約５０〜約５００ｍＣｉの間に及ぶ。キメラ抗体と併せて、マウスの抗体に相対してして循環半減期が長いために、ヨウ素１３１で標識したキメラ抗体の単回治療の非骨髄性の外科的な有効投与量は、約５〜約４０ｍＣｉの間、さらに好ましくは約３０ｍＣｉ未満である。たとえば、１１１Ｉｎ標識についての画像化基準は通常、約５ｍＣｉ未満である。
【０５１１】
多大な臨床経験は１３１Ｉと９０Ｙによって得られてきたが、ほかの放射性標識が当該技術で既知であり、同様の目的で使用されている。さらにそのほかの放射性同位元素が画像化で使用されている。たとえば、本発明の範囲に適合する追加の放射性同位元素には、１２３Ｉ、１２５Ｉ、３２Ｐ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１Ｋｒ、８７Ｓｒ、１１３Ｉｎ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ及び２１３Ｂｉが挙げられるが、これらに限定されない。この点で、α線、γ線及びβ線はすべて本発明に適合する。さらに、本開示の観点では、当業者が過度の実験を行わずにどの放射性核種が治療の選択された経過に適合するかを容易に決定できるであろうことを提示する。この目的で、臨床診断にすでに使用されている追加の放射性核種には、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、及び１１１Ｉｎが挙げられる。標的とされる免疫療法での使用の可能性のために種々の放射性核種で抗体も標識されている（Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987)）。これらの放射性核種には、それほどではないが、１９９Ａｕ及び６７Ｃｕと同様に１８８Ｒｅ及び１８６Ｒｅが挙げられる。米国特許第５，４６０，７８５号は、そのような放射性核種に関する追加のデータを提供しており、参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０５１２】
本明細書で開示されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を複合体の形態で使用するにしろ又は複合体化されていない形態で使用するにしろ、本発明の主な利点が骨髄抑制された患者、特に放射線療法又は化学療法のような補助療法を受けている又は受けた患者において抗ＩＧＦ−１Ｒ分子を使用する能力であることが十分に理解されるであろう。すなわち、分子の有益な送達特性（すなわち、相対的に短い血清滞在時間、高い結合親和性及び高い局在化）によって、赤色骨髄の保存が低下し、骨髄毒性に感受性である患者を治療するのにそれが有用となる。この点で、分子の独特の送達特性によって、放射性標識した複合体の骨髄抑制された癌患者への投与についてそれが非常に有効になっている。従って、本明細書で開示されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、複合体の形態又は複合体化されていない形態で、外部ビーム照射又は化学療法のような補助療法を以前受けたことがある患者にて有用である。ほかの好ましい実施態様では、結合分子、たとえば、結合ポリペプチド、たとえば、ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片（再び抱合形態又は非抱合形態で）は、化学療法剤との併用治療計画で使用されてもよい。当業者は、そのような治療計画が、開示された抗体又はそのほかの結合分子と１以上の化学療法剤又は治療剤との順次の、同時の、同時の又は同時存在の投与を含んでもよいことを十分に理解するであろう。本発明のこの態様の特に好ましい実施態様は、放射性標識した結合ポリペプチドの投与を含む。
【０５１３】
ＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を直前に記載したように投与してもよいが、他の実施態様では、複合体化された又は複合化されていない結合分子が第１選択の治療剤としてさもなければ健康な患者に投与されてもよい。そのような実施態様では、結合分子は正常な又は平均の赤色骨髄予備能を有する患者及び／又は外部ビーム照射又は化学療法のような補助療法を受けたことがない及び受けていない患者に投与されてもよい。
【０５１４】
しかしながら、上記で論じたように、本発明の選択された実施態様は、骨髄抑制された患者へのＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片の投与又は１以上の放射線療法又は化学療法のような補助療法との併用で、若しくはそれと併せた（すなわち、併用療法計画）投与を含む。本明細書で使用されるとき、補助療法と併せた又はそれとの併用でのＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片の投与は、療法と開示された結合分子の順次の、同時の、同時存在の、共同の、付随する又は同時発生する投与又は適用を意味する。当業者は、併用療法計画の種々の成分の投与又は適用は、時間を選んで治療の全体的な有効性を高めてもよいことを理解する。たとえば、標準的な周知の治療過程で化学療法剤を投与し、その後数週間以内に本明細書で記載される放射性免疫抱合体を投与し得る。逆に、細胞毒素と複合化した結合分子を静脈内に投与し、その後、腫瘍局在化の外部ビーム照射を投与し得る。さらにほかの実施態様では、単回の外来で１以上の選択された化学療法剤と同時に結合分子を投与してもよい。技能のある熟練者（たとえば、経験のある腫瘍学者）は、選択された補助療法と本明細書の教示に基づいて過度な実験なしで有効な併用療法計画を識別することができる。
【０５１５】
この点で、結合分子（細胞毒素と共に又はそれを伴わずに）と化学療法剤の併用は、いかなる順序でも、治療利益を患者に提供するいかなる時間枠ででも投与され得ることが理解される。すなわち、化学療法剤とＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、どんな順序でも又は同時に投与されてもよい。選択された実施態様では、本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、以前化学療法を受けたことがある患者に投与される。さらにほかの実施態様では、本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、化学療法治療と実質的に同時に又は共同して投与される。たとえば、患者は、一連の化学療法を受けると同時に結合分子を与えられる。好ましい実施態様では、化学療法剤又は化学療法治療の１年以内に結合分子が投与される。ほかの好ましい実施態様では、化学療法剤又は化学療法治療の１０、８、６、４、又は２ヵ月以内にポリペプチドが投与される。さらにそのほかの好ましい実施態様では、選択された化学療法剤又は化学療法治療の４、３、２又は１週間以内に結合分子が投与されるであろう。さらにそのほかの実施態様では、選択された化学療法剤又は化学療法治療の５、４、３、２又は１日以内に結合分子が投与される。２つの剤又は治療は、せいぜい時間内又は分内（すなわち、実質的に同時に）患者に投与され得る。
【０５１６】
さらに、本発明によれば、骨髄抑制された患者は、低下した血球数を示す患者を意味するものとする。当業者は、骨髄抑制の臨床的指標として従来使用された幾つかの血球数パラメータがあり、患者において骨髄抑制が生じている程度を容易に測定することができることを十分に理解するであろう。技術が認可した骨髄抑制の測定の例は、絶対好中球数（ＡＮＣ）又は血小板数である。そのような骨髄抑制又は部分的な骨髄機能廃絶は、種々の生化学的な障害若しくは疾患の結果であり得、又は以前の化学療法若しくは放射線療法の結果である可能性が高い。この点で、当業者は、従来の化学療法を受けたことがある患者は通常、赤色骨髄予備能の低下を呈することを十分に理解する。上で論じたように、そのような対象は、死亡率又は罹患率の上昇を招く貧血又は免疫抑制のような受け入れ難い副作用のために最適なレベルの細胞毒素（すなわち、核種）を用いて治療することができないことが多い。
【０５１７】
さらに具体的には、本発明によって包含される複合体化された又は複合体化されていないのＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を用いて、約２０００／ｍｍ３未満のＡＮＣ又は約１５０，０００／ｍｍ３未満の血小板数を有する患者を効果的に治療することができる。さらに好ましくは、本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を用いて、約１５００／ｍｍ３未満の、約１０００／ｍｍ３未満の、さらに好ましくは約５００／ｍｍ３未満のＡＮＣを有する患者を治療することができる。同様に、本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を用いて、約７５，０００／ｍｍ３未満の、約５０，０００／ｍｍ３未満の、さらに約１０，０００／ｍｍ３未満の血小板数を有する患者を治療することができる。さらに一般的な意味では、当業者は政府が実施する指針と手順を用いて患者が骨髄抑制されている場合を容易に判定することができるであろう。
【０５１８】
上記で示したように、骨髄抑制された多数の患者は、化学療法、埋め込み放射線療法又は外部ビーム照射を含む一連の治療を受けたことがある。後者の場合、外部照射源は、悪性腫瘍の局所照射のためである。放射線療法の埋め込み法については、放射性試薬を外科的に悪性腫瘍の中に入れ、それによって患部を選択的に照射する。いずれにしろ、本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を用いて、原因にかかわらず骨髄抑制を呈する患者において障害を治療することができる。
【０５１９】
この点で、生体内で腫瘍細胞の増殖を排除する、減らす、阻害する又は制御するいかなる化学療法剤（単数又は複数）（たとえば、併用治療計画を提供するための）とも併せて、又はそれを併用して本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片を用いてもよいことがさらに十分に理解されるであろう。先に論じたように、そのような剤は結果的に、赤色骨髄予備能の低下を生じることが多い。そのような患者における腫瘍の積極的な治療を有利に可能にする本発明によって包含される化合物の消失した骨髄毒性によって、この低下を全体的に又は部分的に相殺し得る。ほかの実施態様では、核種に対する腫瘍細胞の感受性を高める放射線増感剤とともに、本明細書で開示される放射性標識された免疫複合体を効果的に用いることができる。たとえば、放射性標識された結合分子が血流から大きく除かれたが、腫瘍(単数）又は腫瘍（複数）の部位では治療上有効なレベルで残っている後、放射性増感化合物を投与することができる。
【０５２０】
本発明のこれらの態様に関して、本発明に適合する例となる化学療法剤には、アルキル化剤、ビンカアルカロイド類（たとえば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）、プロカルバジン、メソトレキセート及びプレドニゾンが挙げられる。４剤併用のＭＯＰＰ（メクレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ビンクリスチン（オンコビン）、プロカルバジン及びプレドニゾン）は、種々のリンパ腫を治療するのに非常に有効であり、本発明の好ましい実施態様を構成する。ＭＯＰＰ耐性の患者では、ＡＢＶＤ（たとえば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン及びダカルバジン）、ＣｈＩＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン及びプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン及びストレプトゾトシン）、ＭＯＰＰ及びＡＢＶＤ、ＭＯＰＰ及びＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシン及びビンブラスチン）又はＢＣＶＰＰ（カルムスチン、サイクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジン及びプレドニゾン）の併用を使用することができる。Arnold S. Freedman and Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, in Harrison's Principles of Internal Medicine 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher et al., eds., 13th ed. 1994) and V. T. DeVita et al., (1997)及び標準的な投与とスケジュールに関してそれらの中で引用された文献。本発明によって包含される１つ以上のＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片との併用で、これらの治療法を変更せずに使用してもよいし、又は特定の患者について必要に応じて変更することができる。
【０５２１】
本発明の背景で有用である追加の投薬計画には、サイクロホスファミド若しくはクロラムブシルのようなアルキル化剤単剤の使用、又はたとえば、ＣＶＰ（サイクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰ及びドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（サイクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰプラスプロカルバジン及びブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰプラスメソトレキセート、ブレオマイシン及びリューコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メソトレキセート、ドキソルビシン、サイクロホスファミド、エトポシド及びリューコボリン及び標準のＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、サイクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メソトレキセート及びリューコボリン）、並びにＭＡＣＯＰ−Ｂ（メソトレキセート、ドキソルビシン、サイクロホスファミド、ビンクリスチン、固定用量のプレドニゾン、ブレオマイシン及びリューコボリン）のような併用が挙げられる。当業者は、これらの投薬計画のそれぞれについて標準の投与量及びスケジュール設定を容易に決定することができる。ＣＨＯＰはまた、ブレオマイシン、メソトレキセート、プロカルバジン、ナイトロジェンマスタード、シトシンアラビノシド及びエトポシドとも併用されている。そのほかの適合する化学療法剤には、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）、２’−デオキシフォルミシン及びフルダラビンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５２２】
中程度に悪性及び高度に悪性で、寛解を達成できない、または再発の患者については、サルベージ療法が使用される。サルベージ療法は、たとえば、シトシンアラビノシド、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド及びイホスファミドのような薬剤を単剤で又は併用で使用する。特定の腫瘍疾患の再発型又は悪性型では、以下のプロトコールが使用されることが多い：それぞれ周知の投与速度とスケジュールがあるＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メソトレキセート及びエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ギャグ、イホスファミド、メソトレキセート及びエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量のシタラビン及びシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（サイクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾン及びブレオマイシン）、並びにＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビン及びプレドニゾン）。
【０５２３】
本発明によって包含される１つ以上のＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片との併用で使用される化学療法剤の量は、対象によって異なってもよく、当該技術で既知のものに従って投与されてもよい。たとえば、Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics 1233-1287 (Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed. (1996))を参照のこと。
【０５２４】
別の実施態様では、本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、生物製剤と併せて投与される。癌の治療で有用な生物製剤は当該技術で既知であり、本発明によって包含される結合分子を、たとえば、そのような既知の生物製剤と併せて投与することができる。
【０５２５】
たとえば、ＦＤＡは乳癌の治療について以下の生物製剤を認可している：ヘルセプチン（登録商標）（トラスツズマブ、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのジェネンテック社、ＨＥＲ２陽性の乳癌で抗腫瘍活性を有するヒト化モノクローナル抗体）；ファスロデックス（登録商標）（フルベストラント、デラウェア州、ウィルミントンのアストラゼネカ製薬会社、謬癌を治療するのに使用されるエストロゲン受容体拮抗剤）；アリミデックス（登録商標）（アナストロゾール、アストラゼネカ製薬会社、エストロゲンを作るのに必要な酵素であるアロマターゼを遮断する非ステロイド性のアロマターゼ阻害剤）；アロマシン（登録商標）（エクセメスタン、ニューヨーク州、ニューヨークのファイザー、乳癌の治療に使用される不可逆性のステロイド性アロマターゼ不活化剤）；フェマラ（登録商標）（レトロゾール、ニュージャージー州、イーストハノーバーのノバルティス製薬、乳癌を治療するためにＦＤＡによって認可された非ステロイド性アロマターゼ阻害剤）；及びノルバデックス（登録商標）（タモキシフェン、アストラゼネカ製薬会社、乳癌を治療するためにＦＤＡによって認可された非ステロイド性の抗エストロゲン）。本発明によって包含される結合分子と併用されてもよいそのほかの生物製剤には、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ、ジェネンテック社、血管新生を阻害するように設計された最初にＦＤＡに認可された治療法）及びゼバリン（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、マサチューセッツ州、ケンブリッジのバイオゲン社、Ｂ細胞リンパ腫の治療のために現在認可されている放射性標識のモノクローナル抗体）が挙げられる。これらの例のような化合物は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と併用して追加の剤として過剰増殖性の疾患及び障害の治療に使用されてもよい。
【０５２６】
さらに、ＦＤＡは結腸直腸癌の治療のために以下の生物製剤を認可している：アバスチン（商標）；エルビタックス（商標）（セツニマブ、ニューヨーク州、ニューヨークのイムクローンシステムズ社、ニューヨーク州、ニューヨークのブリストルマイヤーズスクイブ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対して向けられたモノクローナル抗体）；グリーベック（登録商標）（タンパク質キナーゼ阻害剤）；及びエルガミソール（登録商標）（レバミソール、ニュージャージー州、タイタスビルのジャンセン・ファーマシューティカ・プロダクツ社、デュークのステージＣの結腸癌患者で外科切除後５−フルオロウラシルとの併用でアジュバント治療として１９９０年にＦＤＡによって認可された免疫調節剤）。これらの例のような化合物は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と併用して追加の剤として過剰増殖性の疾患及び障害の治療に使用されてもよい。
【０５２７】
非ホジキンリンパ腫の治療での使用について現在認可されている治療法には、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）（トシツモマブとヨウ素１３１トシツモマブ、ノースカロライナ州、リサーチトライアングルパークのグラクソスミスクライン、反応性分子（ヨウ素１３１Ｉ）に連結したマウスモノクローナル抗体（トシツモマブ）を含む複数段階治療）；イントロン−Ａ（登録商標）（インターフェロンα−２ｂ、ニュージャージー州、ケニルワースのシェーリング社、アントラサイクリン含有の併用療法（たとえば、サイクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾン［ＣＨＯＰ］と併せた濾胞性非ホジキンリンパ腫の治療で認可された一種のインターフェロン）；リツキサン（登録商標）（リツキシマブ、カリフォルニア州、サウスサンフランシスコのジェネンテック社及びマサチューセッツ州、ケンブリッジのバイオゲン社、非ホジキンリンパ腫の治療で認可されたモノクローナル抗体）；オンタック（登録商標）（デニリューキンディフチトックス、カリフォルニア州、サンディエゴのリガンド・ファーマシューティカル社、遺伝的にインターロイキン２に融合されたジフテリア毒素の断片から成る融合タンパク質）；及びゼバリン(登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、バイオゲン社、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の治療のためにＦＤＡによって認可された放射性標識されたモノクローナル抗体）が挙げられる。これらの例のような化合物は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と併用して追加の剤として過剰増殖性の疾患及び障害の治療に使用されてもよい。
【０５２８】
白血病の治療については、本発明によって包含される結合分子との併用で使用されてもよい例となる生物製剤には、グリーベック（登録商標）、カムパス−１Ｈ（登録商標）（アレムツズマブ、カリフォルニア州、リッチモンドのベルレックス、慢性リンパ性白血病の治療に使用される一種のモノクローナル抗体）が挙げられる。さらに、ゲナセンス（オブリメルセン、ニュージャージー州、バークレーハイツのゲンタ社）；白血病を治療するために開発中のＢＣＬ−２アンチセンスを使用してもよく（たとえば、単剤で、又はフルダラビン及びサイクロホスファミドのような１以上の化学療法剤との併用で）を請求される結合分子と共に投与してもよい。これらの例のような化合物は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と併用して追加の剤として過剰増殖性の疾患及び障害の治療に使用されてもよい。
【０５２９】
肺癌の治療については、例となる生物製剤には、タルセバ（商標）（エルロチニブＨＣＬ、ニューヨーク州、メルビルのＯＳＩファーマシューティカルズ社、ヒト表皮増殖因子受容体１（ＨＥＲ１）経路を標的とするように設計された小型分子）が挙げられる。このような化合物は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と併用して追加の剤として過剰増殖性の疾患及び障害の治療に使用されてもよい。
【０５３０】
多発性骨髄腫の治療については、例となる生物製剤には、ベルカデ（登録商標）（ボルテゾニブ、マサチューセッツ州、ケンブリッジのミレニアムファーマシューティカルズ、プロテアソーム阻害剤）が挙げられる。追加の生物製剤には、タリドミド（登録商標）（タリドミド、ニュージャージー州、ワレンのクレジーン社、免疫調節剤であり、骨髄腫細胞の増殖及び生き残りを阻害する能力と抗血管新生を含む複数の作用を有すると思われる）が挙げられる。これらの例のような化合物は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と併用して追加の剤として過剰増殖性の疾患及び障害の治療に使用されてもよい。
【０５３１】
ほかの例となる生物製剤には、ニューヨーク州、ニューヨークのイムクローンシステムズ社によって開発されたＭＯＡＢ  ＩＭＣ−Ｃ２２５、及びたとえば、インテグリン（たとえば、ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）（ナタリズマブ））及びＣＤ分子（たとえば、ＣＤ２０（たとえば、リツキサン（登録商標））、ＣＤ２３、ＣＤ５２及びＣＤ８０）のような、しかし、これらに限定されないタンパク質、リガンド及び受容体の生物活性を標的とする又はそれを達成する化学療法剤が挙げられる。これらの例のような化合物は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体（又はその断片）と併用して追加の剤として過剰増殖性の疾患及び障害の治療に使用されてもよい。
【０５３２】
前に論じたように、本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片、又はその組換え体は、哺乳類の過剰増殖性障害の生体内治療のために薬学上有効な量で投与されてもよい。この点で、開示される抗体は、投与を容易にし、活性剤の安定性を助長するように製剤化されることが十分に理解されるであろう。好ましくは、本発明に係る医薬組成物は、薬学上許容可能な非毒性の、無菌の担体、たとえば、生理学的な生理食塩水、非毒性の緩衝液、保存剤などを含む。本応用の目的で、治療剤に複合体化された又は複合体化されない、本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片、又はその組換え体の薬学上有効量は、標的への効果的な結合を達成し、利益を達成する、たとえば、疾患若しくは障害の症状を改善する又は物質若しくは細胞を検出するのに十分な量を意味することとする。腫瘍細胞の場合、結合分子は好ましくは、腫瘍細胞上又は免疫反応性細胞上又は非腫瘍細胞上、たとえば、腫瘍細胞に伴う血管細胞上の選択された免疫反応性の抗原と相互作用することが可能であり、これらの細胞の死の増加を提供する。当然、本発明によって包含される医薬組成物が単回用量又は複数回用量で投与されて薬学上有効な量の結合分子を提供し得る。
【０５３３】
本開示の範囲に従って、本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、治療効果又は予防効果を生じるのに十分な量で前述の治療の方法に従ってヒト又はそのほかの動物に投与されてもよい。本発明によって包含されるＩＧＦ−１Ｒ特異的抗体又はその免疫特異的断片は、本発明によって包含される抗体を既知の技法に従って従来の薬学上許容可能な担体又は希釈剤と組み合わせることによって調製される従来の投与形態でそのようなヒト又はそのほかの動物に投与されてもよい。薬学上許容可能な担体又は希釈剤の形態及び特徴は、組み合わせられるべき有効成分の量、投与経路及びその他の周知の変数によって決定付けられることが当業者によって認識されるであろう。当業者はさらに、本発明に係る１以上の種の結合分子を含むカクテルが特に有効であることが分かってもよいことを十分に理解するであろう。
【０５３４】
本発明の実践は、特に指示されない限り、当該技術の技能の範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技法を採用する。そのような技法は文献で十分に説明されている。たとえば、分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989);分子クローニング：実験室マニュアル, Sambrook et al., ed., Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), ＤＮＡクローニング, D. N. Glover ed., Volumes I and II (1985); オリゴヌクレオチド合成, M. J. Gait ed., (1984); Mullis et al. U.S. Pat. No: 4,683,195; 核酸ハイブリッド形成, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); 転写と翻訳, B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984); 動物細胞の培養, R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., (1987); 不動化細胞と酵素, IRL Press, (1986); B. Perbal, 分子クローニングの実践的ガイド (1984); 学術論文, 酵素学における方法, Academic Press, Inc., N.Y.; 哺乳類細胞のための遺伝子移行ベクター, J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.); 細胞と分子生物学における免疫化学的方法, Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987); 実験免疫学のハンドブック, Volumes I-IV, D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., (1986); マウス胚の操作, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); and in Ausubel et al., 分子生物学における現在のプロトコール, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)を参照のこと。
【０５３５】
抗体の操作の一般的原理は、抗体の操作、第２版、C.A.K. Borrebaeck, Ed., Oxford Univ. Press (1995)に示されている。タンパク質の操作の一般的原理は、タンパク質の操作、実践的アプローチ、Rickwood, D., et al., Eds., IRL Press at Oxford Univ.  Press, Oxford, Eng. (1995)に示されている。抗体と抗体−ハプテンの結合の一般的原理は、Nisonoff, A., 分子免疫学, 2nd ed., Sinauer Associates, Sunderland, MA (1984); and Steward, M.W.,抗体、その構造と機能, Chapman and Hall, New York, NY (1984)に示されている。さらに、当該技術で知られているが、具体的には記載されていない免疫学の常法は、一般に以下免疫学における現在のプロトコール, John Wiley & Sons, New York; Stites et al. (eds) , 基礎と臨床の免疫学 (8th ed.), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) and Mishell 及び Shiigi (eds), 細胞免疫学における精選された方法、W.H. Freeman and Co., New York (1980)のとおりである。
【０５３６】
免疫学の一般的な原理を示す標準的な参考文献には、免疫学における現在のプロトコール、 John Wiley & Sons, New York; Klein, J., Immunology: 自己と非自己の識別の科学、 John Wiley & Sons, New York (1982); Kennett, R., et al., eds., モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的解析における新しい側面、 Plenum Press, New York (1980); Campbell, A., 「モノクローナル抗体技術」 in Burden, R., et al., eds., 生化学と分子生物学における実験室技法、 Vol. 13, Elsevere, Amsterdam (1984), Kuby 免疫学 4th ed. Ed. Richard A. Goldsby, Thomas J. Kindt and Barbara A. Osborne, H. Freemand & Co. (2000); Roitt, I., Brostoff, J. and Male D., Immunology 6th ed. London: Mosby (2001); Abbas A., Abul, A. and Lichtman, A., 細胞性免疫学と分子免疫学、 Ed. 5, Elsevier Health Sciences Division (2005); Kontermann and Dubel, 抗体操作 Springer Verlan (2001); Sambrook and Russell, 分子クローニング：実験室マニュアル、 Cold Spring Harbor Press (2001); Lewin, Genes VIII, Prentice Hall (2003); Harlow and Lane, 抗体：実験室マニュアル、 Cold Spring Harbor Press (1988); Dieffenbach and Dveksler, ＰＣＲプライマー、Cold Spring Harbor Press (2003)が挙げられる。
【０５３７】
本明細書で引用したすべての参考文献と同様に、上記で引用した参考文献もすべてその全体が参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０５３８】
本発明の一部の実施態様（Ｅ＃及びＦ＃）は以下を含む：
Ｅ１．ａ）寄託番号ＰＴＡ−７４４４でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ｂ）寄託番号ＰＴＡ−７４４５でＡＴＣＣに寄託され、指定されたＣＨＯ細胞株、ｃ）寄託番号ＰＴＡ−７８５５でＡＴＣＣに寄託されたＣＨＯ細胞株、ｄ）寄託番号ＰＴＡ−７４８５でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株、ｅ）寄託番号ＰＴＡ−７７３２でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株、ｆ）寄託番号ＰＴＡ−７４５７でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株、ｇ）寄託番号ＰＴＡ−７４５６でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株、ｈ）寄託番号ＰＴＡ−７７３０でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株、及び寄託番号ＰＴＡ−７７３１でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株から成る群から選択される細胞株によって産生される抗体。
Ｅ２．Ｅ１の細胞株によって産生される抗体であって、前記細胞株は、ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｃ０６−４０Ｂ５、ＣＨＯＤＧ４４バイオゲンＩｄｅｃＥＡ０３．１４．０６、ｂ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）：Ｃ０３−２ＣＨＯＤＧ４４バイオゲンＩｄｅｃＤＡ０３．１４．０６、ｃ）チャイニーズハムスター卵巣細胞株：Ｇ１１  ７０  ８ｅ６細胞、０８．０９．２００６、ｄ）ハイブリドーマ、８．Ｐ２Ａ７．３Ｄ１１、ｅ）ハイブリドーマ細胞株：７．２０Ｃ８．３Ｂ８、ｆ）ハイブリドーマ、５．Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、ｇ）ハイブリドーマ、７．２０Ｄ８．２４Ｂ１１、ｈ）ハイブリドーマ細胞株：９．Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びｉ）ハイブリドーマ細胞株：５Ｐ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるＡＴＣＣ寄託記載によって指定される。
Ｅ３．Ｅ１又はＥ２の単離された細胞株。
Ｅ４．インスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン−１（ＦＮＩＩＩ−１）から成るポリペプチドドメインに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片。
Ｅ５．Ｅ４の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体は、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）及びインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）のＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害する。
Ｅ６．Ｅ５の抗体又は抗原結合断片であって、前記阻害はアロステリックである。
Ｅ７．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体結合の親和性は、ａ）Ｇｌｕ−４５９、ｂ）Ｓｅｒ−４６０、ｃ）Ａｓｐ−４６１、ｄ）Ｖａｌ−４６２、ｅ）Ｈｉｓ−４６４、ｆ）Ｔｈｒ−４６６、ｇ）Ｓｅｒ−４６７、ｈ）Ｔｈｒ−４７８、ｉ）Ｈｉｓ−４８０、ｊ）Ｔｙｒ−４８２、ｋ）Ａｒｇ−４８３、ｌ）Ｇｌｕ−５３３、ｍ）Ｉｌｅ−５６４、ｎ）Ａｒｇ−５６５、ｏ）Ｌｙｓ−５６８、ｐ）Ｇｌｕ−５７０、及びｑ）Ｉｌｅ−５７１から成る群から選択される１以上のＩＧＦ−１Ｒ残基の突然変異によって低下する。
Ｅ８．Ｅ７の抗体又は抗原結合断片であって、前記突然変異は、ａ）Ｇｌｕ−４５９からＡｌａへ、ｂ）Ｓｅｒ−４６０からＡｌａへ、ｃ）Ａｓｐ−４６１からＡｌａへ、ｄ）Ｖａｌ−４６２からＴｈｒへ、ｅ）Ｈｉｓ−４６４からＡｌａへ、ｆ）Ｈｉｓ−４６４からＧｌｕへ、ｇ）Ｔｈｒ−４６６からＬｅｕへ、ｈ）Ｓｅｒ−４６７からＴｙｒへ、ｉ）Ｔｈｒ−４７８からＡｒｇへ、ｊ）Ｈｉｓ−４８０からＧｌｕへ、ｋ）Ｔｙｒ−４８２からＡｌａへ、ｌ）Ａｒｇ−４８３からＴｒｐへ、ｍ）Ｇｌｕ−５３３からＨｉｓへ、ｎ）Ｉｌｅ−５６４からＴｈｒへ、ｏ）Ａｒｇ−５６５からＡｌａへ、ｐ）Ｌｙｓ−５６８からＡｌａへ、ｑ）Ｇｌｕ−５７０からＡｌａへ、及びｒ）Ｉｌｅ−５７１からＴｈｒへ、から成る群から選択される置換変異である。
Ｅ９．Ｅ７又はＥ８の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体の結合親和性が約２．５〜約１０倍の間で低下する。
Ｅ１０．Ｅ７又はＥ８の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体の結合親和性が約１０〜約１００倍の間で低下する。
Ｅ１１．Ｅ７又はＥ８の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体の結合親和性が１００倍を超えて低下する。
Ｅ１２．Ｅ７又はＥ８の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体の結合親和性がなくなる。
Ｅ１３．Ｅ７〜Ｅ１２のいずれか１つの抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体又は抗原結合断片はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２リガンドのＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害する。
Ｅ１４．Ｅ１３の抗体又は抗原結合断片であって、前記阻害はアロステリックである。
Ｅ１５．ＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチ領域（ＣＲＲ）から成るポリペプチドドメインに特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合断片。
Ｅ１６．Ｅ１５の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２リガンドのＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害する。
Ｅ１７．Ｅ１６の抗体又は抗原結合断片であって、前記阻害は競合的である。
Ｅ１８．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体結合の親和性は、ａ）Ａｓｐ−２４８、ｂ）Ａｓｐ−２５０、ｃ）Ａｓｎ−２５４、ｄ）Ｓｅｒ−２５７、ｅ）Ｇｌｕ−２５９、ｆ）Ｓｅｒ−２６０、ｇ）Ｓｅｒ−２６３、ｈ）Ｇｌｙ−２６５、及びｉ）Ｇｌｕ−３０３から成る群から選択される１以上のＩＧＦ−１Ｒ残基の突然変異によって低下する。
Ｅ１９．Ｅ１８の抗体又は抗原結合断片であって、前記突然変異は、ａ）Ａｓｐ−２４８からＡｌａへ、ｂ）Ａｓｐ−２５０からＳｅｒへ、ｃ）Ａｓｎ−２５４からＡｌａへ、ｄ）Ｓｅｒ−２５７からＰｈｅへ、ｅ）Ｓｅｒ−２５７からＬｙｓへ、ｆ）Ｇｌｕ−２５９からＬｙｓへ、ｇ）Ｓｅｒ−２６０からＡｓｎへ、ｈ）Ｓｅｒ−２６３からＡｒｇへ、ｉ）Ｇｌｙ−２６５からＴｙｒへ、及びｊ）Ｇｌｕ−３０３からＧｌｙへ、から成る群から選択される置換変異である。
Ｅ２０．Ｅ１８又はＥ１９の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体の結合親和性が約２．５〜約１０倍の間で低下する。
Ｅ２１．Ｅ１８又はＥ１９の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体の結合親和性が約１０〜約１００倍の間で低下する。
Ｅ２２．Ｅ１８又はＥ１９の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体の結合親和性が１００倍を超えて低下する。
Ｅ２３．Ｅ１８又はＥ１９の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体の結合親和性はなくなる。
Ｅ２４．Ｅ１８〜Ｅ２３のいずれか１つの抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体又は抗原結合断片はＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２リガンドのＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害する。
Ｅ２５．Ｅ２４の抗体又は抗原結合断片であって、前記阻害は競合的である。
Ｅ２６．ＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチ領域（ＣＲＲ）及び第２のロイシンリッチリピートドメイン（Ｌ２）から成るポリペプチドドメインに特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合断片。
Ｅ２７．Ｅ２６の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体は、ＩＧＦ−１のＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害するが、ＩＧＦ−２リガンドの結合を阻害しない。
Ｅ２８．Ｅ２７の抗体又は抗原結合断片であって、前記阻害はアロステリックである。
Ｅ２９．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体結合の親和性は、ａ）Ａｓｐ−２４８、ｂ）Ａｓｎ−２５４、ｃ）Ｓｅｒ−２５７、及びｄ）Ｇｌｙ−２６５から成る群から選択される１以上のＩＧＦ−１Ｒ残基の突然変異によって低下する。
Ｅ３０．Ｅ２９の抗体又は抗原結合断片であって、前記突然変異は、ａ）Ａｓｐ−２４８からＡｌａへ、ｂ）Ａｓｎ−２５４からＡｌａへ、ｃ）Ｓｅｒ−２５７からＬｙｓへ、及びｄ）  Ｇｌｙ−２６５からＴｙｒへ、から成る群から選択される置換変異である。
Ｅ３１．Ｅ２９又はＥ３０の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体の結合親和性が約１０〜約１００倍の間で低下する。
Ｅ３２．Ｅ２９又はＥ３０の抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体の結合親和性はなくなる。
Ｅ３３．Ｅ２９〜Ｅ３２のいずれか１つの抗体又は抗原結合断片であって、前記抗体はＩＧＦ−１のＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害するが、ＩＧＦ−２リガンドの結合を阻害しない。
Ｅ３４．Ｅ３３の抗体又は抗原結合断片であって、前記阻害はアロステリックである。
Ｅ３５．Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体と同一のインスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦ−１Ｒ）のエピトープに特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片。
Ｅ３６．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
Ｅ３７．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体と同一の抗原結合ドメインを含む。
Ｅ３８．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片の重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８及び配列番号６３から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
Ｅ３９．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３及び配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
Ｅ４０．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨは、２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８及び配列番号６３から成る群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
Ｅ４１．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬは、２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３及び配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
Ｅ４２．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨは、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８及び配列番号６３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
Ｅ４３．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬは、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３及び配列番号１１８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
Ｅ４４．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨとＶＬはそれぞれ、配列番号４と配列番号６８、配列番号９と配列番号７３、配列番号１４と配列番号７８、配列番号２０と配列番号８３、配列番号２６と配列番号８８、配列番号３２と配列番号９３、配列番号３８と配列番号９８、配列番号４３と配列番号１０３、配列番号４８と配列番号１０８、配列番号５３と配列番号１０３、配列番号５８と配列番号１１３、及び配列番号６３と配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
Ｅ４５．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨ及びＶＬはそれぞれ、２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４と配列番号６８、配列番号９と配列番号７３、配列番号１４と配列番号７８、配列番号２０と配列番号８３、配列番号２６と配列番号８８、配列番号３２と配列番号９３、配列番号３８と配列番号９８、配列番号４３と配列番号１０３、配列番号４８と配列番号１０８、配列番号５３と配列番号１０３、配列番号５８と配列番号１１３、及び配列番号６３と配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
Ｅ４６．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨ及びＶＬはそれぞれ、配列番号４と配列番号６８、配列番号９と配列番号７３、配列番号１４と配列番号７８、配列番号２０と配列番号８３、配列番号２６と配列番号８８、配列番号３２と配列番号９３、配列番号３８と配列番号９８、配列番号４３と配列番号１０３、配列番号４８と配列番号１０８、配列番号５３と配列番号１０３、配列番号５８と配列番号１１３、及び配列番号６３と配列番号１１８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
Ｅ４７．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、２つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９及び配列番号６４から成る群から選択される参照の重鎖相補性決定領域−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のカバットによるＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。
Ｅ４８．Ｅ４７の抗体又はその断片であって、前記ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９及び配列番号６４から成る群から選択される
Ｅ４９．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５配列番号６０及び配列番号６５から成る群から選択される参照の重鎖相補性決定領域−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のカバットによるＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。
Ｅ５０．Ｅ４９の抗体又はその断片であって、前記ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５配列番号６０及び配列番号６５から成る群から選択される。
Ｅ５１．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１及び配列番号６６から成る群から選択される参照の重鎖相補性決定領域−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のカバットによるＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
Ｅ５２．Ｅ５１の抗体又はその断片であって、前記ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１及び配列番号６６から成る群から選択される。
Ｅ５３．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４及び配列番号１１９から成る群から選択される参照の軽鎖相補性決定領域−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のカバットによるＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。
Ｅ５４．Ｅ５３の抗体又はその断片であって、前記ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４及び配列番号１１９から成る群から選択される。
Ｅ５５．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、２つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５及び配列番号１２０から成る群から選択される参照の軽鎖相補性決定領域−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のカバットによるＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。
Ｅ５６．Ｅ５５の抗体又はその断片であって、前記ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列が配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５及び配列番号１２０から成る群から選択される。
Ｅ５７．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６及び配列番号１２１から成る群から選択される参照の軽鎖相補性決定領域−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のカバットによるＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
Ｅ５８．Ｅ５７の抗体又はその断片であって、前記ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列が配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６及び配列番号１２１から成る群から選択される。
Ｅ５９．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、前記ＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つにおける１つ、２つ、３つ又は４つのアミノ酸置換を除いて、配列番号５、６及び７；配列番号１０、１１及び１２；配列番号１５、１６及び１７；配列番号２１、２２及び２３；配列番号２７、２８及び２９；配列番号３３、３４及び３５;配列番号３９、４０及び４１；配列番号４４、４５及び４６；配列番号４９、５０及び５１；配列番号５４、５５及び５６；配列番号５９、６０及び６１；並びに配列番号６４、６５及び６６から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
Ｅ６０．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＨが、配列番号５、６及び７；配列番号１０、１１及び１２；配列番号１５、１６及び１７；配列番号２１、２２及び２３；配列番号２７、２８及び２９；配列番号３３、３４及び３５;配列番号３９、４０及び４１；配列番号４４、４５及び４６；配列番号４９、５０及び５１；配列番号５４、５５及び５６；配列番号５９、６０及び６１；並びに配列番号６４、６５及び６６から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
Ｅ６１．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、前記ＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つにおける１つ、２つ、３つ又は４つのアミノ酸置換を除いて、配列番号６９、７０及び７１；配列番号７４、７５及び７６；配列番号７９、８０及び８１；配列番号８４、８５及び８６；配列番号８９、９０及び９１；配列番号９４、９５及び９６；配列番号９９、１００及び１０１；配列番号１０４、１０５及び１０６：配列番号１０９、１１０及び１１１；配列番号１１４、１１５及び１１６並びに配列番号１１９、１２０及び１２１から成る群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
Ｅ６２．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又はその断片であって、前記抗体又はその断片のＶＬが、配列番号６９、７０及び７１；配列番号７４、７５及び７６；配列番号７９、８０及び８１；配列番号８４、８５及び８６；配列番号８９、９０及び９１；配列番号９４、９５及び９６；配列番号９９、１００及び１０１；配列番号１０４、１０５及び１０６：配列番号１０９、１１０及び１１１；配列番号１１４、１１５及び１１６並びに配列番号１１９、１２０及び１２１から成る群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
Ｅ６３．Ｅ３５〜Ｅ６２のいずれか１つの抗体又はその断片であって、５つ以下のアミノ酸置換を除いてＶＨのフレームワーク領域がヒト型である。
Ｅ６４．Ｅ３５〜Ｅ６３のいずれか１つの抗体又はその断片であって、５つ以下のアミノ酸置換を除いてＶＬのフレームワーク領域がヒト型である。
Ｅ６５．非線形立体構成のエピトープに結合する、Ｅ３５〜Ｅ６４のいずれか１つの抗体又はその断片。
Ｅ６６．アミノ酸残基バリン−４６２を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片。
Ｅ６７．アミノ酸残基、ヒスチジン−４６４を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片。
Ｅ６８．アミノ酸残基、バリン−４６２とヒスチジン−４６４を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片。
Ｅ６９．残基、バリン−４６２から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４オングストロームの溶媒接触可能表面半径を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片。
Ｅ７０．残基、ヒスチジン−４６４から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４オングストロームの溶媒接触可能表面半径を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片。
Ｅ７１．残基、バリン−４６２とヒスチジン−４６４から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４オングストロームの溶媒接触可能表面半径を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片。
Ｅ７２．ヒトＩＧＦ−１Ｒの残基、バリン−４６２とヒスチジン−４６４の中心から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４オングストロームの溶媒接触可能表面半径を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片。
Ｅ７３．線形のエピトープに結合するＥ３５〜Ｅ６４のいずれか１つの抗体又はその断片。
Ｅ７４．多価であり、少なくとも２つの重鎖と少なくとも２つの軽鎖を含むＥ３５〜Ｅ７３のいずれか１つの抗体又はその断片。
Ｅ７５．多重特異性であるＥ３５〜Ｅ７４のいずれか１つの抗体又はその断片。
Ｅ７６．二重特異性であるＥ７５の抗体又はその断片。
Ｅ７７．二重特異性であるＥ３５〜Ｅ７６のいずれか１つの抗体又はその断片。
Ｅ７８．Ｅ３５〜Ｅ７７のいずれか１つの抗体又はその断片であって、重鎖と軽鎖の可変ドメインが完全にヒト型である。
Ｅ７９．Ｅ７８の抗体又はその断片であって、前記重鎖と軽鎖の可変ドメインは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片に由来する。
Ｅ８０．Ｅ３５〜Ｅ７７のいずれか１つの抗体又はその断片であって、重鎖と軽鎖の可変ドメインがマウス型である。
Ｅ８１．Ｅ８０の抗体又はその断片であって、前記重鎖と軽鎖の可変ドメインが、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体に由来する。
Ｅ８２．Ｅ３５〜Ｅ７７及びＥ８１〜Ｅ８２のいずれか１つの抗体又はその断片であって、ヒト化されている。
Ｅ８３．Ｅ３５〜Ｅ７７及びＥ８１〜Ｅ８２のいずれか１つの抗体又はその断片であって、キメラである。
Ｅ８４．Ｅ３５〜Ｅ７７及びＥ８１〜Ｅ８２のいずれか１つの抗体又はその断片であって、霊長類化されている。
Ｅ８５．Ｅ３５〜Ｅ７９のいずれか１つの抗体又はその断片であって、完全にヒト型である。
Ｅ８６．Ｅ３５〜Ｅ８５のいずれか１つの抗体又はその断片であって、Ｆａｂ断片である。
Ｅ８７．Ｅ３５〜Ｅ８５のいずれか１つの抗体又はその断片であって、Ｆａｂ’断片である。
Ｅ８８．Ｅ３５〜Ｅ８５のいずれか１つの抗体又はその断片であって、Ｆ（ａｂ）２断片である。
Ｅ８９．Ｅ３５〜Ｅ８５のいずれか１つの抗体又はその断片であって、Ｆｖ断片である。
Ｅ９０．Ｅ３５〜Ｅ８５のいずれか１つの抗体又はその断片であって、単鎖抗体である。
Ｅ９１．Ｅ３５〜Ｅ８８及びＥ９０のいずれか１つの抗体又はその断片であって、ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域から成る群から選択される軽鎖定常領域を含む。
９２．Ｅ３５〜Ｅ８８及びＥ９０のいずれか１つの抗体又はその断片であって、重鎖定常領域又はその断片を含む。
Ｅ９３．Ｅ９２の抗体又はその断片であって、前記重鎖定常領域又はその断片はヒトＩｇＧ４である。
Ｅ９４．Ｅ９３の抗体又はその断片であって、グリコシル化部位を除くように前記ＩｇＧ４を突然変異されている。
Ｅ９５．Ｅ９４の抗体又はその断片であって、前記突然変異はカバット番号付与方式を用いたＳ２４１ＰとＴ３１８Ａを含む。
Ｅ９６．Ｅ３５〜Ｅ９５のいずれか１つの抗体又はその断片であって、前記参照モノクローナル抗体の解離定数（ＫＤ）より小さいＫＤを特徴とする親和性でＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片又はＩＧＦ−１Ｒ変異体ポリペプチドに特異的に結合する。
Ｅ９７．Ｅ３５〜Ｅ９６のいずれか１つの抗体又はその断片であって、５×１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性でＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片又はＩＧＦ−１Ｒ変異体ポリペプチドに特異的に結合する。
Ｅ９８．Ｅ３５〜Ｅ９７のいずれか１つの抗体又はその断片であって、前記親和性は、約１×１０−１０Ｍ〜約５×１０−９Ｍの範囲内の解離定数（ＫＤ）を特徴とする。
Ｅ９９．Ｅ３５〜Ｅ９８のいずれか１つの抗体又はその断片であって、前記親和性は、（ａ）約１．１×１０−１０Ｍ、（ｂ）約１．３×１０−１０Ｍ、（ｃ）約３．６×１０−１０Ｍ、（ｄ）約１．３×１０−９Ｍ、（ｅ）約４．０×１０−９Ｍ、及び（ｆ）約４．９×１０−９Ｍから成る群から選択される解離定数（ＫＤ）を特徴とする。
Ｅ１００．Ｅ３５〜Ｅ９９のいずれか１つの抗体又はその断片であって、前記親和性は、（ａ）約１．１×１０−１０Ｍ、（ｂ）約１．３×１０−１０Ｍ、（ｃ）約３．６×１０−１０Ｍ、（ｄ）約１．３×１０−９Ｍ、（ｅ）約４．０×１０−９Ｍ、及び（ｆ）約４．９×１０−９Ｍから成る群から選択される解離定数（ＫＤ）を特徴とする。
Ｅ１０１．Ｅ３５〜Ｅ１００のいずれか１つの抗体又はその断片であって、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片又は非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片に比べてヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片に優先的に結合する。
Ｅ１０２．Ｅ３５〜Ｅ１００のいずれか１つの抗体又はその断片であって、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片に結合するが、非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片にも結合する。
Ｅ１０３．Ｅ３５〜Ｅ１０２のいずれか１つの抗体又はその断片であって、細胞の表面に発現されたＩＧＦ−１Ｒに結合する。
Ｅ１０４．Ｅ１０３の抗体又はその断片であって、前記細胞は、悪性腫瘍細胞、新生物細胞、腫瘍細胞又は転移細胞である。
Ｅ１０５．Ｅ３５〜Ｅ１０４のいずれか１つの抗体又はその断片であって、インスリン成長因子がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻止する。
Ｅ１０６．Ｅ１０５の抗体又はその断片であって、前記インスリン成長因子はインスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）である。
Ｅ１０７．Ｅ１０５の抗体又はその断片であって、前記インスリン成長因子はインスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）である。
Ｅ１０８．Ｅ１０５の抗体又はその断片であって、ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の双方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻止する。
Ｅ１０９．Ｅ３５〜Ｅ１０８のいずれか１つの抗体又はその断片であって、ＩＧＦ−１Ｒが介在する細胞増殖を阻害する。
Ｅ１１０．Ｅ３５〜Ｅ１０９のいずれか１つの抗体又はその断片であって、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する。
Ｅ１１１．Ｅ３５〜Ｅ１１０のいずれか１つの抗体又はその断片であって、腫瘍細胞の増殖を阻害する。
Ｅ１１２．Ｅ３５〜Ｅ１１１のいずれか１つの抗体又はその断片であって、ＩＧＦ−１Ｒの内部移行を阻害する。
Ｅ１１３．Ｅ３５〜Ｅ１１２のいずれか１つの抗体又はその断片であって、それに融合された異種ポリペプチドをさらに含む。
Ｅ１１４．Ｅ３５〜Ｅ１１３のいずれか１つの抗体又はその断片であって、前記抗体が、細胞傷害剤、治療剤、細胞静止剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体反応調節剤、医薬剤、リンホカイン、異種抗体若しくはその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び２以上の前記剤の組み合わせから成る群から選択される剤と複合体化されている。
Ｅ１１５．Ｅ１１４の抗体又はその断片であって、細胞傷害剤が、放射性核種、生体毒素、酵素的に活性のある毒素、細胞静止性若しくは細胞傷害性の治療剤、プロドラッグ、免疫的に活性のあるリガンド、生体反応調節剤、又は２以上の前記細胞傷害剤の組み合わせから成る群から選択される。
Ｅ１１６．Ｅ１１４の抗体又はその断片であって、前記検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射活性標識、又は２以上の前記検出可能な標識の組み合わせから成る群から選択される。
Ｅ１１７．Ｅ３５〜Ｅ１１６のいずれか１つの抗体又はその断片と担体を含む組成物。
Ｅ１１８．抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８及び配列番号６３から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１１９．Ｅ１１８のポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列が配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８及び配列番号６３から成る群から選択される。
Ｅ１２０．Ｅ１１８又はＥ１１９のポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく発現を高めるために最適化されている。
Ｅ１２１．Ｅ１２０のポリヌクレオチドであって、前記最適化がスプライス供与部位とスプライス受容部位の特定と除去を含む。
Ｅ１２２．Ｅ１２０又はＥ１２１のポリヌクレオチドであって、前記最適化が前記ポリヌクレオチドを発現する細胞についてのコドン使用頻度の最適化を含む。
Ｅ１２３．Ｅ１１８〜Ｅ１２２のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸が、配列番号３、配列番号８、配列番号１３、配列番号１８、配列番号２４、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５２、配列番号５７及び配列番号６２から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
Ｅ１２４．抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３及び配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１２５．Ｅ１２４のポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３及び配列番号１１８から成る群から選択される。
Ｅ１２６．Ｅ１２４又はＥ１２５のポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなく発現を高めるために最適化されている。
Ｅ１２７．Ｅ１２６のポリヌクレオチドであって、前記最適化がスプライス供与部位とスプライス受容部位の特定と除去を含む。
Ｅ１２８．Ｅ１２６又はＥ１２７のポリヌクレオチドであって、前記最適化が前記ポリヌクレオチドを発現する細胞についてのコドン使用頻度の最適化を含む。
Ｅ１２９．Ｅ１２４〜Ｅ１２８のポリヌクレオチドであって、前記核酸が、配列番号６７、配列番号７２、配列番号７７、配列番号８２、配列番号８７、配列番号９２、配列番号９７、配列番号１０２、配列番号１０７、配列番号１１２及び配列番号１１７から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
Ｅ１３０．抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列が、２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８及び配列番号６３から成る群から選択される参照アミノ酸配列と同一であり、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１３１．抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３及び配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列と同一であり、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１３２．２つ以下のアミノ酸置換を除いて配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９及び配列番号６４から成る群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨ−ＣＤＲ１を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１３３．Ｅ１３２のポリヌクレオチド又はその断片であって、前記ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列が配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９及び配列番号６４から成る群から選択される。
Ｅ１３４．４つ以下のアミノ酸置換を除いて配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５配列番号６０及び配列番号６５から成る群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨ−ＣＤＲ２を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１３５．Ｅ１３４のポリヌクレオチド又はその断片であって、前記ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５配列番号６０及び配列番号６５から成る群から選択される。
Ｅ１３６．４つ以下のアミノ酸置換を除いて配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１及び配列番号６６から成る群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一のＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１３７．Ｅ１３６のポリヌクレオチド又はその断片であって、前記ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１及び配列番号６６から成る群から選択される。
Ｅ１３８．４つ以下のアミノ酸置換を除いて配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４及び配列番号１１９から成る群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＬ−ＣＤＲ１を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１３９．Ｅ１３８のポリヌクレオチド又はその断片であって、前記ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列が、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４及び配列番号１１９から成る群から選択される。
Ｅ１４０．２つ以下のアミノ酸置換を除いて配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５及び配列番号１２０から成る群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＬ−ＣＤＲ２を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１４１．Ｅ１４０のポリヌクレオチド又はその断片であって、前記ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列が、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５及び配列番号１２０から成る群から選択される。
Ｅ１４２．４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６及び配列番号１２１から成る群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列と同一のＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１４３．Ｅ１４２のポリヌクレオチド又はその断片であって、前記ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６及び配列番号１２１から成る群から選択される。
Ｅ１４４．抗体のＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドは、配列番号５、６及び７；配列番号１０、１１及び１２；配列番号１５、１６及び１７；配列番号２１、２２及び２３；配列番号２７、２８及び２９；配列番号３３、３４及び３５;配列番号３９、４０及び４１；配列番号４４、４５及び４６；配列番号４９、５０及び５１；配列番号５４、５５及び５６；配列番号５９、６０及び６１；並びに配列番号６４、６５及び６６から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１４５．抗体のＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドは、配列番号６９、７０及び７１；配列番号７４、７５及び７６；配列番号７９、８０及び８１；配列番号８４、８５及び８６；配列番号８９、９０及び９１；配列番号９４、９５及び９６；配列番号９９、１００及び１０１；配列番号１０４、１０５及び１０６：配列番号１０９、１１０及び１１１；配列番号１１４、１１５及び１１６並びに配列番号１１９、１２０及び１２１から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体又はその抗原結合断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ１４６．Ｅ１１８〜Ｅ１１１のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記抗体のＶＨポリペプチドに融合されたシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ１４７．Ｅ１１８〜Ｅ１４６のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記抗体のＶＬポリペプチドに融合されたシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ１４８．Ｅ１１８〜Ｅ１４７のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記のＶＨポリペプチドに融合された重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ１４９．Ｅ１１８〜Ｅ１４８のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記のＶＨポリペプチドに融合された重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ１５０．Ｅ１１８〜Ｅ１４９のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記のＶＨポリペプチドに融合された重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ１５１．Ｅ１１８〜Ｅ１５０のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記のＶＨポリペプチドに融合された重鎖ヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む。
Ｅ１５２．Ｅ１１８〜Ｅ１５１のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ４である。
Ｅ１５３．Ｅ１５２のポリヌクレオチドであって、グリコシル化部位を除くように前記ＩｇＧ４を突然変異させている。
Ｅ１５４．Ｅ１５３のポリヌクレオチドであって、前記突然変異はカバット番号付与方式を用いたＳ２４１ＰとＴ３１８Ａを含む。
Ｅ１５５．Ｅ１１８〜Ｅ１５４のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記のＶＬポリペプチドに融合された軽鎖定常領域ドメインをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ１５６．Ｅ１５５のポリヌクレオチドであって、前記軽鎖定常領域がヒトκである。
Ｅ１５７．Ｅ１１８〜Ｅ１５６のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体と同一のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する
Ｅ１５８．Ｅ１１８〜Ｅ１５７のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体を競合的に阻害する。
Ｅ１５９．Ｅ１１８〜Ｅ１５８のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのフレームワーク領域が、５つ以下のアミノ酸置換を除いてヒト型である。
Ｅ１６０．Ｅ１１８〜Ｅ１５９のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドのフレームワーク領域が、５つ以下のアミノ酸置換を除いてヒト型である。
Ｅ１６１．Ｅ１１８〜Ｅ１６０のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、線形のエピトープに結合する。
Ｅ１６２．Ｅ１１８〜Ｅ１６０のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、非線形立体構成のエピトープに結合する。
Ｅ１６３．Ｅ１１８〜Ｅ１６２のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、多価であり、少なくとも２つの重鎖と少なくとも２つの軽鎖を含む。
Ｅ１６４．Ｅ１１８〜Ｅ１６３のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、多重特異性である。
Ｅ１６５．Ｅ１１８〜Ｅ１６４のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、二重特異性である。
Ｅ１６６．Ｅ１１８〜Ｅ１６５のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、完全にヒト型である重鎖と軽鎖の可変ドメインを含む。
Ｅ１６７．Ｅ１６６のポリヌクレオチドであって、前記重鎖と軽鎖の可変ドメインが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片のそれと同一である。
Ｅ１６８．Ｅ１１８〜Ｅ１６５のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、マウス型である重鎖と軽鎖の可変ドメインを含む。
Ｅ１６９．Ｅ１６８のポリヌクレオチドであって、前記重鎖と軽鎖の可変ドメインが、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体のそれと同一である。
Ｅ１７０．Ｅ１１８〜Ｅ１６５及びＥ１６８〜Ｅ１６９のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がヒト化されている。
Ｅ１７１．Ｅ１１８〜Ｅ１６５及びＥ１６８〜Ｅ１６９のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がキメラである。
Ｅ１７２．Ｅ１１８〜Ｅ１６５及びＥ１６８〜Ｅ１６９のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が霊長類化されている。
Ｅ１７３．Ｅ１１８〜Ｅ１６７のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が完全にヒト型である。
Ｅ１７４．Ｅ１１８〜Ｅ１７３のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がＦａｂ断片である。
Ｅ１７５．Ｅ１１８〜Ｅ１７３のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がＦａｂ’断片である。
Ｅ１７６．Ｅ１１８〜Ｅ１７３のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がＦ（ａｂ）２断片である。
Ｅ１７７．Ｅ１１８〜Ｅ１７３のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片がＦｖ断片である。
Ｅ１７８．Ｅ１１８〜Ｅ１７３のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が単鎖抗体である。
Ｅ１７９．Ｅ１１８〜Ｅ１７８のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、５×１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性でＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片又はＩＧＦ−１Ｒ変異体ポリペプチドに特異的に結合する。
Ｅ１８０．Ｅ１１８〜Ｅ１７９のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片又は非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片に比べてヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片に優先的に結合する。
Ｅ１８１．Ｅ１１８〜Ｅ１７９のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片に結合するが、非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片にも結合する。
Ｅ１８２．Ｅ１１８〜Ｅ１８１のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、細胞の表面に発現されたＩＧＦ−１Ｒに結合する。
Ｅ１８３．Ｅ１８２のポリヌクレオチドであって、前記細胞は、悪性腫瘍細胞、新生物細胞、腫瘍細胞又は転移細胞である。
Ｅ１８４．Ｅ１１８〜Ｅ１８３のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、インスリン成長因子がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻止する。
Ｅ１８５．Ｅ１８４のポリヌクレオチドであって、前記インスリン成長因子はインスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）である。
Ｅ１８６．Ｅ１８４のポリヌクレオチドであって、前記インスリン成長因子はインスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）である。
Ｅ１８７．Ｅ１８４のポリヌクレオチドであって、ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の双方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻止する。
Ｅ１８８．Ｅ１１８〜Ｅ１５３のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片は、ＩＧＦ−１Ｒが介在する細胞増殖を阻害する。
Ｅ１８９．Ｅ１１８〜Ｅ１８８のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片は、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する。
Ｅ１９０．Ｅ１１８〜Ｅ１８９のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片は、腫瘍細胞の増殖を阻害する。
Ｅ１９１．Ｅ１１８〜Ｅ１９０のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、ＩＧＦ−１Ｒの内部移行を阻害する。
Ｅ１９２．Ｅ１１８〜Ｅ１９１のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、異種ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む
Ｅ１９３．Ｅ１１８〜Ｅ１９２のいずれか１つのポリヌクレオチドであって、前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体又はその抗原結合断片が、細胞傷害剤、治療剤、細胞静止剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体反応調節剤、医薬剤、リンホカイン、異種抗体若しくはその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び２以上の前記剤の組み合わせから成る群から選択される剤と複合体化される。
Ｅ１９４．Ｅ１９３のポリヌクレオチドであって、細胞傷害剤が、放射性核種、生体毒素、酵素的に活性のある毒素、細胞静止性若しくは細胞傷害性の治療剤、プロドラッグ、免疫的に活性のあるリガンド、生体反応調節剤、又は２以上の前記細胞傷害剤の組み合わせから成る群から選択される。
Ｅ１９５．Ｅ１９３のポリヌクレオチドであって、前記検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射活性標識、又は２以上の前記検出可能な標識の組み合わせから成る群から選択される。
Ｅ１９６．Ｅ１１８〜Ｅ１９５のいずれか１つのポリヌクレオチドと担体を含む組成物。
Ｅ１９７．Ｅ１１８〜Ｅ１９６のいずれか１つのポリヌクレオチドを含むベクター。
Ｅ１９８．Ｅ１９７のベクターであって、前記ポリヌクレオチドを操作可能にプロモータに会合されている。
Ｅ１９９．Ｅ１９７又はＥ１９８のベクターを含む宿主。
Ｅ２００．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片を製造する方法であって、Ｅ１９９の宿主細胞を培養し、前記抗体又はその断片を回収することを含む。
Ｅ２０１．Ｅ２００の方法によって産生される単離されたポリペプチド。
Ｅ２０２．Ｅ１１８〜Ｅ１６１のいずれか１つのポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチド。
Ｅ２０３．Ｅ２０２の単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドを含む抗体又はその断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ２０４．Ｅ１６８又はＥ１６９のポリペプチドを含む単離された抗体又はその断片
Ｅ２０５．単離されたＶＨをコードするポリヌクレオチドと単離されたＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドと前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドがそれぞれ、配列番号４と配列番号６８；配列番号８と配列番号７３；配列番号１４と配列番号７８；配列番号２０と配列番号８３；配列番号２６と配列番号８８；配列番号３２と配列番号９３；配列番号３８と配列番号９８；配列番号４３と配列番号１０３；配列番号４８と配列番号１０８；配列番号５３と配列番号１０３；配列番号５８と配列番号１１３；及び配列番号６３と配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含み、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ２０６．Ｅ２０５の組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドと前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドがそれぞれ、配列番号４と配列番号６８；配列番号８と配列番号７３；配列番号１４と配列番号７８；配列番号２０と配列番号８３；配列番号２６と配列番号８８；配列番号３２と配列番号９３；配列番号３８と配列番号９８；配列番号４３と配列番号１０３；配列番号４８と配列番号１０８；配列番号５３と配列番号１０３；配列番号５８と配列番号１１３；及び配列番号６３と配列番号１１８から成る群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む。
Ｅ２０７．単離されたＶＨをコードするポリヌクレオチドと単離されたＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドと前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドがそれぞれ、２０未満の保存的なアミノ酸置換を除いて、配列番号４と配列番号６８；配列番号８と配列番号７３；配列番号１４と配列番号７８；配列番号２０と配列番号８３；配列番号２６と配列番号８８；配列番号３２と配列番号９３；配列番号３８と配列番号９８；配列番号４３と配列番号１０３；配列番号４８と配列番号１０８；配列番号５３と配列番号１０３；配列番号５８と配列番号１１３；及び配列番号６３と配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含み、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ２０８．単離されたＶＨをコードするポリヌクレオチドと単離されたＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、配列番号５、６及び７；配列番号１０、１１及び１２；配列番号１５、１６及び１７；配列番号２１、２２及び２３；配列番号２７、２８及び２９；配列番号３３、３４及び３５;配列番号３９、４０及び４１；配列番号４４、４５及び４６；配列番号４９、５０及び５１；配列番号５４、５５及び５６；配列番号５９、６０及び６１；並びに配列番号６４、６５及び６６から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＨポリペプチドをコードし、前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドが、配列番号６９、７０及び７１；配列番号７４、７５及び７６；配列番号７９、８０及び８１；配列番号８４、８５及び８６；配列番号８９、９０及び９１；配列番号９４、９５及び９６；配列番号９９、１００及び１０１；配列番号１０４、１０５及び１０６：配列番号１０９、１１０及び１１１；配列番号１１４、１１５及び１１６並びに配列番号１１９、１２０及び１２１から成る群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＬポリペプチドをコードし、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片がＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ２０９．Ｅ２０５〜Ｅ２０８のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、前記抗体のＶＨポリペプチドに融合されたシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ２１０．Ｅ２０５〜Ｅ２０８のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドが、前記抗体のＶＬポリペプチドに融合されたシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ２１１．Ｅ２０５〜Ｅ２１０のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、前記ＶＨポリペプチドに融合された重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ２１２．Ｅ２０５〜Ｅ２１１のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、前記ＶＨポリペプチドに融合された重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ２１３．Ｅ２０５〜Ｅ２１２のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、前記ＶＨポリペプチドに融合された重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ２１４．Ｅ２０５〜Ｅ２１３のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドが、前記ＶＨポリペプチドに融合された重鎖ヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む。
Ｅ２１５．Ｅ２０５〜Ｅ２１４のいずれか１つの組成物であって、前記重鎖定常領域は、ヒトのＩｇＧ４である。
Ｅ２１６．Ｅ２１５の組成物であって、グリコシル化部位を除くように前記ＩｇＧ４を突然変異させる。
Ｅ２１７．Ｅ２１６の組成物であって、前記突然変異はカバット番号付与方式を用いたＳ２４１ＰとＴ３１８Ａを含む。
Ｅ２１８．Ｅ２０５〜Ｅ２１７のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドが、前記ＶＬポリペプチドに融合された軽鎖定常領域ドメインをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ２１９．Ｅ１７４の組成物であって、前記軽鎖定常領域はヒトκである。
Ｅ２２０．Ｅ２０５〜Ｅ２１９のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体と同一のＩＧＦ−１Ｒエピトープに特異的に結合する。
Ｅ２２１．Ｅ２０５〜Ｅ２２０のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
Ｅ２２２．Ｅ２０５〜Ｅ２２１のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬのポリペプチドのフレームワーク領域が、５つ以下のアミノ酸置換を除いてヒト型である。
Ｅ２２３．Ｅ２０５〜Ｅ２２２のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、線形エピトープに結合する。
Ｅ２２４．Ｅ２０５〜Ｅ２２２のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、非線形立体構成のエピトープに結合する。
Ｅ２２５．Ｅ２０５〜Ｅ２２２のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、多価であり、少なくとも２つの重鎖と少なくとも２つの軽鎖を含む。
Ｅ２２６．Ｅ２０５〜Ｅ２２５のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、多重特異性である。
Ｅ２２７．Ｅ２０５〜Ｅ２２６のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、二重特異性である。
Ｅ２２８．Ｅ２０５〜Ｅ２２７のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、完全にヒト型である重鎖と軽鎖の可変ドメインを含む。
Ｅ２２９．Ｅ２２８の組成物であって、前記重鎖と軽鎖の可変ドメインが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片のものと同一である。
Ｅ２３０．Ｅ２０５〜Ｅ２２７のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、マウス型である重鎖と軽鎖の可変ドメインを含む。
Ｅ２３１．Ｅ２３０の組成物であって、前記重鎖と軽鎖の可変ドメインが、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体のものと同一である。
Ｅ２３２．Ｅ２０５〜Ｅ２２７及びＥ２３０〜Ｅ２３１のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片がヒト化されている。
Ｅ２３３．Ｅ２０５〜Ｅ２２７及びＥ２３０〜Ｅ２３１のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片がキメラである。
Ｅ２３４．Ｅ２０５〜Ｅ２２７及びＥ２３０〜Ｅ２３１のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が霊長類化されている。
Ｅ２３５．Ｅ２０５〜Ｅ２２９のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が完全にヒト型である。
Ｅ２３６．Ｅ２０５〜Ｅ２３５のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片がＦａｂ断片である。
Ｅ２３７．Ｅ２０５〜Ｅ２３５のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片がＦａｂ’断片である。
Ｅ２３８．Ｅ２０５〜Ｅ２３５のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片がＦ（ａｂ）２断片である。
Ｅ２３９．Ｅ２０５〜Ｅ２３５のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片がＦｖ断片である。
Ｅ２４０．Ｅ２０５〜Ｅ２３５のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が単鎖抗体である。
Ｅ２４１．Ｅ２０５〜Ｅ２４０のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、５×１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性でＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片又はＩＧＦ−１Ｒ変異体ポリペプチドに特異的に結合する。
Ｅ２４２．Ｅ２０５〜Ｅ２４１のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、マウスＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片又は非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片に比べてヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド若しくはその断片に優先的に結合する。
Ｅ２４３．Ｅ２０５〜Ｅ２４１のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、ヒトＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片に結合するが、非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片にも結合する。
Ｅ２４４．Ｅ２０５〜Ｅ２４３のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、細胞の表面に発現されたＩＧＦ−１Ｒに結合する。
Ｅ２４５．Ｅ２２４の組成物であって、前記細胞は、悪性腫瘍細胞、新生物細胞、腫瘍細胞又は転移細胞である。
Ｅ２４６．Ｅ２０５〜Ｅ２４５のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片は、インスリン成長因子がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻止する。
Ｅ２４７．Ｅ２４６の組成物であって、前記インスリン成長因子はインスリン成長因子−１（ＩＧＦ−１）である。
Ｅ２４８．Ｅ２４６の組成物であって、前記インスリン成長因子はインスリン成長因子−２（ＩＧＦ−２）である。
Ｅ２４９．Ｅ２４６の組成物であって、ＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の双方がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを阻止する。
Ｅ２５０．Ｅ２０５〜Ｅ２４９のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片は、ＩＧＦ−１Ｒが介在する細胞増殖を阻害する。
Ｅ２５１．Ｅ２０５〜Ｅ２５０のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片は、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２が介在するＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する。
Ｅ２５２．Ｅ２０５〜Ｅ２５１のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、腫瘍細胞の増殖を阻害する。
Ｅ２５３．Ｅ２０５〜Ｅ２５２のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、ＩＧＦ−１Ｒの内部移行を阻害する。
Ｅ２５４．Ｅ２０５〜Ｅ２５３のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチド、前記ＶＬをコードするポリヌクレオチド、又は前記ＶＨと前記ＶＬの双方をコードするポリヌクレオチドが異種ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。
Ｅ２５５．Ｅ２０５〜Ｅ２５４のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨとＶＬをコードするポリヌクレオチドによってコードされる抗体又はその断片が、細胞傷害剤、治療剤、細胞静止剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体反応調節剤、医薬剤、リンホカイン、異種抗体若しくはその断片、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び２以上の前記剤の組み合わせから成る群から選択される剤と複合体化される。
Ｅ２５６．Ｅ２５５の組成物であって、細胞傷害剤が、放射性核種、生体毒素、酵素的に活性のある毒素、細胞静止性若しくは細胞傷害性の治療剤、プロドラッグ、免疫的に活性のあるリガンド、生体反応調節剤、又は２以上の前記細胞傷害剤の組み合わせから成る群から選択される。
Ｅ２５７．Ｅ２５５の組成物であって、前記検出可能な標識が、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射活性標識、又は２以上の前記検出可能な標識の組み合わせから成る群から選択される。
Ｅ２５８．Ｅ２０５〜Ｅ２５７のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドが第１のベクターに含有され、前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドが第２のベクターに含有される。
Ｅ２５９．Ｅ２５８の組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドが第１のプロモータに操作可能に会合され、前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドが第２のプロモータに操作可能に会合される。
Ｅ２６０．Ｅ２５９の組成物であって、前記第１と第２のプロモータは同一プロモータのコピーである。
Ｅ２６１．Ｅ２５９の組成物であって、前記第１と第２のプロモータは同一ではない。
Ｅ２６２．Ｅ２５８〜Ｅ２６１のいずれか１つの組成物であって、前記第１のベクターと前記第２のベクターが単一の宿主細胞に含有される。
Ｅ２６３．Ｅ２５８〜Ｅ２６１のいずれか１つの組成物であって、前記第１のベクターと前記第２のベクターが別々の宿主細胞に含有される。
Ｅ２６４．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片を製造する方法であって、Ｅ２６２の宿主細胞を培養し、前記抗体又はその断片を回収することを含む。
Ｅ２６５．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片を製造する方法であって、Ｅ２６３の別々の宿主細胞を同時培養し、前記抗体又はその断片を回収することを含む。
Ｅ２６６．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片を製造する方法であって、Ｅ２６３の別々の宿主細胞を別々に培養し、前記ＶＨとＶＬをコードするポリペプチドを組み合わせて、前記抗体又はその断片を回収することを含む。
Ｅ２６７．Ｅ２６４〜Ｅ２６６のいずれか１つの方法によって製造されるＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片。
Ｅ２６８．Ｅ２０５〜Ｅ２６７のいずれか１つの組成物であって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドと前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドが同一のベクターにある。
Ｅ２６９．Ｅ２６８のベクター
Ｅ２７０．Ｅ２６９のベクターであって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドと前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドがそれぞれ操作可能にプロモータに会合される。
Ｅ２７１．Ｅ２６９のベクターであって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドと前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドがインフレームで融合され、それと操作可能に会合させた単一のプロモータから同時に転写され、単鎖の抗体又はその抗原結合断片に同時翻訳される。
Ｅ２７２．Ｅ２６９のベクターであって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドと前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドが、それと操作可能に会合させた単一のプロモータから同時に転写されるが、別々に翻訳される。
Ｅ２７３．Ｅ２７２のベクターであって、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドと前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドの間に配置されるＩＲＥＳ配列をさらに含む。
Ｅ２７４．Ｅ２６９のベクターであって、それぞれ別々のプロモータに操作可能に会合させた、前記ＶＨをコードするポリヌクレオチドと前記ＶＬをコードするポリヌクレオチドが別々に転写される。
Ｅ２７５．Ｅ２７４のベクターであって、前記別々のプロモータは同一プロモータのコピーである。
Ｅ２７６．Ｅ２７４のベクターであって、前記別々のプロモータは同一ではない。
Ｅ２７７．Ｅ２６９〜Ｅ２７６のいずれか１つのベクターを含む宿主細胞。
Ｅ２７８．ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片を製造する方法であって、Ｅ２７７の宿主細胞を培養し、前記抗体又はその断片を回収することを含む。
Ｅ２７９．Ｅ２４４の方法によって製造されるＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する抗体又はその断片。
Ｅ２８０．以下を含む組成物を治療の必要がある動物に投与することを含む動物における過剰増殖性の障害を治療する方法：
ａ）Ｅ１〜Ｅ８２、Ｅ１７０、Ｅ２３３及びＥ２４５のいずれか１つの単離された抗体又はその断片と、
ｂ）薬学上許容可能な担体
Ｅ２８１．Ｅ２８０の方法であって、前記過剰増殖性疾患又は障害が、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、又はその転移から成る群から選択される。
Ｅ２８２．Ｅ２８１の方法であって、前記抗体又はその断片は悪性腫瘍細胞の表面に発現されたＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する。
Ｅ２８３．Ｅ２８２の方法であって、前記悪性腫瘍細胞への前記抗体又はその断片の結合は結果的に前記悪性腫瘍細胞の増殖阻害を生じる。
Ｅ２８４．Ｅ２８０〜Ｅ２８３のいずれか１つの方法であって、前記抗体又はその断片が前記悪性腫瘍細胞へのＩＧＦの結合を阻害する。
Ｅ２８５．Ｅ２８４の方法であって、前記ＩＧＦはＩＧＦ−１である。
Ｅ２８６．Ｅ２８４の方法であって、前記ＩＧＦはＩＧＦ−２である。
Ｅ２８７．Ｅ２８４の方法であって、前記ＩＧＦはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２である。
Ｅ２８８．Ｅ２８７の方法であって、前記抗体又はその断片は、前記悪性腫瘍細胞へのＩＧＦ−１の結合を阻害するが、ＩＧＦ−２を阻害しない。
Ｅ２８９．Ｅ２８７の方法であって、前記抗体又はその断片は、前記悪性腫瘍細胞へのＩＧＦ−２の結合を阻害するが、ＩＧＦ−１を阻害しない。
Ｅ２９０．Ｅ２８０〜Ｅ２８３のいずれか１つの方法であって、前記抗体又はその断片は、ＩＧＦ−１Ｒの前記悪性腫瘍細胞への内部移行を促進する。
Ｅ２９１．Ｅ２８０〜Ｅ２８３のいずれか１つの方法であって、前記抗体又はその断片は、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害する。
Ｅ２９２．Ｅ２８０〜Ｅ２８３のいずれか１つの方法であって、前記抗体又はその断片は、腫瘍細胞の増殖を阻害する。
Ｅ２９３．Ｅ２９２の方法であって、腫瘍細胞の増殖は転移増殖の予防又は遅延を介して阻害される。
Ｅ２９４．Ｅ２８０〜Ｅ２８３のいずれか１つの方法であって、前記抗体又はその断片は、腫瘍細胞の移動を阻害する。
Ｅ２９５．Ｅ２９２の方法であって、腫瘍細胞の増殖は腫瘍の隣接組織への散らばりの予防又は遅延を介して阻害される。
Ｅ２９６．Ｅ２８１の方法であって、前記過剰増殖性の疾患又は障害は、前立腺、結腸、腹部、骨、胸、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭部、頚部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、又は泌尿生殖器に位置する新生物である。
Ｅ２９７．Ｅ２８１の方法であって、前記過剰増殖性疾患は癌であり、上皮扁平細胞癌、悪性黒色腫、白血病、骨髄腫、胃癌、脳腫瘍、肺癌、膵臓癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌及び頭頚部の癌から成る群から選択される前記癌。
Ｅ２９８．Ｅ２９７の方法であって、前記癌が、胃癌、腎臓癌、脳腫瘍、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌及び前立腺癌から成る群から選択される。
Ｅ２９９．Ｅ２８０〜Ｅ２９８のいずれか１つの方法であって、前記動物は哺乳類である。
Ｅ３００．Ｅ２９９の方法であって、前記哺乳類はヒトである。
Ｅ３０１．２以上の抗体又はその断片の組み合わせを投与することを含む、動物における過剰増殖性の障害を治療する方法であって、前記抗体又はその断片は少なくとも２つの異なったＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する。
Ｅ３０２．Ｅ３０１の方法であって、前記２以上の抗体又はその断片はＩＧＦ−１及び／又はＩＧＦ−２リガンドの結合を阻害する。
Ｅ３０３．Ｅ３０１の方法であって、前記２以上の抗体又はその断片はＩＧＦ−１Ｒのシグナル伝達を阻害する。
Ｅ３０４．Ｅ３０１〜Ｅ３０３のいずれか１つの方法であって、前記２以上の抗体又はその断片はリガンドの結合を競合的に且つアロステリックに阻害する。
Ｅ３０５．Ｅ３０１〜Ｅ３０４のいずれか１つの方法であって、前記２以上の抗体又はその断片は、前記抗体又はその断片のいずれか単独よりも組み合わせでより効果的に腫瘍細胞の増殖又はＩＧＦ−１Ｒのシグナル伝達を阻害し、抗体又はその断片の組み合わせと単独の場合と比較すると、ほぼ同一の最終の総モル濃度の前記抗体又はその断片となる。
Ｅ３０６．Ｅ３０１〜Ｅ３０４のいずれか１つの方法であって、前記２以上の抗体又はその断片は、腫瘍細胞の増殖又はＩＧＦ−１Ｒのシグナル伝達の阻害に対して相乗効果を有する。
Ｅ３０７．Ｅ３０１〜Ｅ３０４のいずれか１つの方法であって、前記２以上の抗体又はその断片は、前記抗体又はその断片のいずれか単独よりも組み合わせでより効果的にＩＧＦ−１及び／又はＩＧＦ−２のＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害し、抗体又はその断片の組み合わせと単独の場合と比較と比較すると、ほぼ同一の最終の総モル濃度の前記抗体又はその断片となる。
Ｅ３０８．Ｅ３０１〜Ｅ３０４のいずれか１つの方法であって、前記２以上の抗体又はその断片は、ＩＧＦ−１及び／又はＩＧＦ−２のＩＧＦ−１Ｒへの結合の阻害に対して相乗効果を有する。
Ｅ３０９．Ｅ３０１〜Ｅ３０８のいずれか１つの方法であって、前記動物はヒトである。
Ｅ３１０．Ｅ３０１〜Ｅ３０９のいずれか１つの方法であって、前記過剰増殖性の障害は癌である。
Ｅ３１１．Ｅ３０１〜Ｅ３１０のいずれか１つの方法であって、前記過剰増殖性の障害は腫瘍である。
Ｅ３１２．ヒトＩＧＦ−１ＲのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン１（ＦＮＩＩＩ−１）を含む又はそれから成る単離されたポリペプチド。
Ｅ３１３．ヒトＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチの繰り返しドメイン（ＣＲＲ）とロイシンリッチの繰り返しドメイン２（Ｌ２）を含む又はそれから成る単離されたポリペプチド。
Ｅ３１４．ヒトＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチの繰り返しドメイン（ＣＲＲ）含む又はそれから成る単離されたポリペプチド。
Ｅ３１５．長さ３００アミノ酸残基以下を有し、ある配列を含む単離されたポリペプチドであって、その配列は、ａ）ＧｌｕＳｅｒＡｓｐＶａｌＬｅｕＨｉｓＰｈｅＴｈｒＳｅｒＴｈｒ、ｂ）ＴｈｒＴｈｒＳｅｒＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＩｌｅＩｌｅＴｈｒ、ｃ）ＴｒｐＨｉｓＡｒｇＴｙｒＡｒｇＰｒｏＰｒｏＡｓｐＴｙｒＡｒｇ、ｄ）ＡｓｐＬｅｕＩｌｅＳｅｒＰｈｅＴｈｒＶａｌＴｙｒＴｙｒＬｙｓ、ｅ）ＧｌｕＡｌａＰｒｏＰｈｅＬｙｓＡｓｎＶａｌＴｈｒＧｌｕＴｙｒ、ｆ）ＡｓｐＧｌｙＧｌｎＡｓｐＡｌａＣｙｓＧｌｙＳｅｒＡｓｎＳｅｒ、ｇ）ＴｒｐＡｓｎＭｅｔＶａｌＡｓｐＶａｌＡｓｐＬｅｕＰｒｏＰｒｏ、ｈ）ＡｓｎＬｙｓＡｓｐＶａｌＧｌｕＰｒｏＧｌｙＩｌｅＬｅｕＬｅｕ、ｉ）ＨｉｓＧｌｙＬｅｕＬｙｓＰｒｏＴｒｐＴｈｒＧｌｎＴｙｒＡｌａ、ｊ）ＶａｌＴｙｒＶａｌＬｙｓＡｌａＶａｌＴｈｒＬｅｕＴｈｒＭｅｔ、ｋ）ＶａｌＧｌｕＡｓｎＡｓｐＨｉｓＩｌｅＡｒｇＧｌｙＡｌａＬｙｓ、及びｌ）ＡｓｐＨｉｓＩｌｅＡｒｇＧｌｙＡｌａＬｙｓＳｅｒＧｌｕＩｌｅから成る群から選択される。
Ｅ３１６．Ｅ３１５のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは長さ２００以下のアミノ酸である。
Ｅ３１７．Ｅ３１５のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは長さ２５０以下のアミノ酸である。
Ｅ３１８．Ｅ３１５のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは長さ１５０以下のアミノ酸である。
Ｅ３１９．Ｅ３１５のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは長さ１００以下のアミノ酸である。
Ｅ３２０．Ｅ３１５のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは長さ５０以下のアミノ酸である。
Ｅ３２１．Ｅ３１５のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは長さ４０以下のアミノ酸である。
Ｅ３２２．Ｅ３１５のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは長さ３０以下のアミノ酸である。
Ｅ３２３．Ｅ３１５のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは長さ２０以下のアミノ酸である。
Ｅ３２４．Ｅ３１５のポリペプチドであって、前記ポリペプチドな長さ１０のアミノ酸である。
Ｅ３２５．Ｅ３１５〜Ｅ３２４のいずれか１つのポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、 ａ）ＦａｂＭ１３−Ｃ０６、ｂ）ＦａｂＭ１４−Ｃ０３、ｃ）Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、及びｄ）Ｍ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙから成る群から選択される抗体によって特異的に結合される。
Ｅ３２６．ａ）Ｇｌｕ−４５９、ｂ）Ｓｅｒ−４６０、ｃ）Ａｓｐ−４６１、ｄ）Ｖａｌ−４６２、ｅ）Ｈｉｓ−４６４、ｆ）Ｔｈｒ−４６６、ｇ）Ｓｅｒ−４６７、ｈ）Ｔｈｒ−４７８、ｉ）Ｈｉｓ−４８０、ｊ）Ｔｙｒ−４８２、ｋ）Ａｒｇ−４８３、ｌ）Ｇｌｕ−５３３、ｍ）Ｉｌｅ−５６４、ｎ）Ａｒｇ−５６５、ｏ）Ｌｙｓ−５６８、ｐ）Ｇｌｕ−５７０、及びｑ）Ｉｌｅ−５７１から成る群から選択される１以上のアミノ酸を含むヒトＩＧＦ−１Ｒのエピトープであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３２７．長さ３００以下のアミノ酸残基を有し、ある配列を有する単離されたポリペプチドであって、該配列は、ａ）ＡｓｐＡｒｇＡｓｐＰｈｅＣｙｓＡｌａＡｓｎＩｌｅＬｅｕＳｅｒ、ｂ）ＡｌａＧｌｕＳｅｒＳｅｒＡｓｐＳｅｒＧｌｕＧｌｙＰｈｅＶａｌ、ｃ）ＩｌｅＨｉｓＡｓｐＧｌｙＧｌｕＣｙｓＭｅｔＧｌｎＧｌｕＣｙｓ、ｄ）ＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｎ、ｅ）ＳｅｒＭｅｔＴｙｒＣｙｓＩｌｅＰｒｏＣｙｓＧｌｕＧｌｙＰｒｏ、及びｆ）ＣｙｓＧｌｕＧｌｙＰｒｏＣｙｓＰｒｏＬｙｓＶａｌＣｙｓＧｌｕから成る群から選択される。
Ｅ３２８．Ｅ３２７のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ２００以下のアミノ酸である。
Ｅ３２９．Ｅ３２７のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ２５０以下のアミノ酸である。
Ｅ３３０．Ｅ３２７のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ１５０以下のアミノ酸である。
Ｅ３３１．Ｅ３２７のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ１００以下のアミノ酸である。
Ｅ３３２．Ｅ３２７のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ５０以下のアミノ酸である。
Ｅ３３３．Ｅ３２７のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ４０以下のアミノ酸である。
Ｅ３３４．Ｅ３２７のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ３０以下のアミノ酸である。
Ｅ３３５．Ｅ３２７のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ２０以下のアミノ酸である。
Ｅ３３６．Ｅ３２７のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ１０のアミノ酸である。
Ｅ３３７．Ｅ３２７〜Ｅ３３６のいずれか１つのポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、 ａ）ＦａｂＭ１４−Ｇ１１、及びｂ）Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙから成る群から選択される抗体によって特異的に結合される。
Ｅ３３８．ａ）Ａｓｐ−２４８、ｂ）Ａｓｐ−２５０、ｃ）Ａｓｎ−２５４、ｄ）Ｓｅｒ−２５７、ｅ）Ｇｌｕ−２５９、ｆ）Ｓｅｒ−２６０、ｇ）Ｓｅｒ−２６３、ｈ）Ｇｌｙ−２６５、及びｉ）Ｇｌｕ−３０３から成る群から選択される１以上のアミノ酸を含むヒトＩＧＦ−１Ｒのエピトープであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３３９．長さ３００以下のアミノ酸残基を有し、ある配列を有する単離されたポリペプチドであって、該配列は、ａ）ＡｓｐＡｒｇＡｓｐＰｈｅＣｙｓＡｌａＡｓｎＩｌｅＬｅｕＳｅｒ、及びｂ）ＬｅｕＳｅｒＡｌａＧｌｕＳｅｒＳｅｒＡｓｐＳｅｒＧｌｕＧｌｙから成る群から選択される。
Ｅ３４０．Ｅ３３９のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ２００以下のアミノ酸である。
Ｅ３４１．Ｅ３３９のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ２５０以下のアミノ酸である。
Ｅ３４２．Ｅ３３９のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ１５０以下のアミノ酸である。
Ｅ３４３．Ｅ３３９のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ１００以下のアミノ酸である。
Ｅ３４４．Ｅ３３９のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ５０以下のアミノ酸である。
Ｅ３４５．Ｅ３３９のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ４０以下のアミノ酸である。
Ｅ３４６．Ｅ３３９のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ３０以下のアミノ酸である。
Ｅ３４７．Ｅ３３９のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ２０以下のアミノ酸である。
Ｅ３４８．Ｅ３３９のポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、長さ１０のアミノ酸である。
Ｅ３４９．Ｅ３３９〜Ｅ３４８のいずれか１つのポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、ａ）キメラ抗体Ｐ１Ｅ２、及びｂ）細胞株Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２によって発現された抗体から成る群から選択される抗体によって特異的に結合される。
Ｅ３５０．ａ）Ａｓｐ−２４８、ｂ）Ａｓｎ−２５４、ｃ）Ｓｅｒ−２５７、及びｄ）Ｇｌｙ−２６５から成る群から選択される１以上のアミノ酸を含むヒトＩＧＦ−１Ｒのエピトープであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３５１．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｇｌｕ−４５９〜Ｈｉｓ−４６４を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３５２．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−４６０〜Ｔｈｒ−４６６を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３５３．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｓｐ−４６１〜Ｔｈｒ−４６６を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３５４．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｖａｌ−４６２〜Ｓｅｒ−４６７を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３５５．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｈｉｓ−４６４〜Ｔｈｒ−４７８を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３５６．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｔｈｒ−４６６〜Ｔｈｒ−４７８を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３５７．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−４６７〜Ｔｈｒ−４７８を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３５８．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｔｈｒ−４７８〜Ｔｙｒ−４８２を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３５９．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｈｉｓ−４８０〜Ｇｌｕ−５３３を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３６０．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｔｙｒ−４８２〜Ｇｌｕ−５３３を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３６１．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｒｇ−４８３〜Ｇｌｕ−５３３を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３６２．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｇｌｕ−５３３〜Ｉｌｅ−５６４を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３６３．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｉｌｅ−５６４〜Ｇｌｕ−５７０を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３６４．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｒｇ−５６５〜Ｇｌｕ−５７０を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３６５．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｒｇ−５６５〜Ｉｌｅ−５７１を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３６６．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｇｌｕ−４５９〜Ａｒｇ−４８３を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３６７．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｒｇ−４８３〜Ｇｌｕ−５３３を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３６８．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｇｌｕ−５３３〜Ｉｌｅ−５７１を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３６９．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｇｌｕ−４５９〜Ｉｌｅ−５７１を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３７０．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｓｐ−２４８〜Ａｓｎ−２５４を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３７１．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｓｐ−２５０〜Ｓｅｒ−２５７を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３７２．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ａｓｎ−２５４〜Ｇｌｕ−２５９を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３７３．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−２５７〜Ｓｅｒ−２６３を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３７４．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｇｌｕ−２５９〜Ｇｌｙ−２６５を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３７５．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−２６０〜Ｇｌｙ−２６５を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３７６．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−２６３〜Ｇｌｕ−３０３を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３７７．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−２６５〜Ｇｌｕ−３０３を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｅ３７８．ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸残基Ｓｅｒ−２５４〜Ｇｌｙ−２６５を含む単離されたポリペプチドであって、前記アミノ酸は、表２０に示される、シグナルペプチド配列の最初の３０アミノ酸を入れないヒトＩＧＦ−１Ｒの配列に相当する。
Ｆ１．ａ）第１の剤とｂ）第２の剤を含む１以上の組成物を治療が必要な動物に投与することを含む動物において過剰増殖性の障害を治療する方法であって、前記第１の剤が単離されたＩＧＦ−１Ｒ（インスリン様成長因子−１受容体）抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片はＩＧＦ−１Ｒが介在するシグナル伝達を阻害し、前記第２の剤は過剰増殖性の障害を治療するのに治療上有用である。
Ｆ２．Ｆ１の方法であって、前記第２の剤が、ａ）細胞成長、ｂ）細胞増殖及びｃ）細胞の生存から成る群から選択される１以上の生物過程を阻害する。
Ｆ３．Ｆ１の方法であって、前記第２の剤が、ａ）細胞成長、ｂ）細胞増殖及びｃ）細胞の生存成る群から選択される１以上の生物過程を調節する１以上のシグナル伝達経路を阻害する。
Ｆ４．Ｆ１〜Ｆ３のいずれか１つの方法であって、前記第２の剤が、ａ）セリン／スレオニンキナーゼ、ｂ）チロシンキナーゼ、ｃ）Ｇ−タンパク質（グアニンヌクレオチド結合タンパク質）、ｄ）ＧＰＣＲ（Ｇ−タンパク質結合受容体）、ｅ）アデニル酸シクラーゼ、ｆ）ｃＡＭＰ（サイクリックＡＭＰ）、ｇ）ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子−１）、ｈ）ＩＧＦ−２（インスリン様成長因子−２）、ｉ）ＩＧＦ−１Ｒ（インスリン様成長因子−１受容体）、ｊ）ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ｋ）ＩＲＳ−１（インスリン受容体基質−１）ｌ）ＡＫＴ（タンパク質キナーゼＢ）、ｍ）ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）ｎ）ｍＴＯＲ（ラパマイシンの哺乳類の標的）、ｏ）Ｐ１３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）、ｐ）Ｓ６キナーゼ、ｑ）ｐ４２／４４、ｒ）ＥＲＫキナーゼ、ｓ）ＭＥＫ、ｔ）Ｒａｓ、ｕ）ＥＧＦＲ、ｖ）ＨＥＲ２、及びｗ）ヒストンデアセチラーゼから成る群から選択される１以上の分子が介在するシグナル伝達を阻害する。
Ｆ５．Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つの方法であって、前記第２の剤が小分子である。
Ｆ６．Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つの方法であって、前記第２の剤がａ）タンパク質、ｂ）ポリヌクレオチド、ｃ）脂質及びｄ）炭水化物から成る群から選択される巨大分子である。
Ｆ７．Ｆ１〜Ｆ４のいずれか１つの方法であって、前記第２の剤が、第２の単離された抗体又はその断片である。
Ｆ８．Ｆ７の方法であって、前記第２の単離された抗体又はその断片が、ａ）ＥＧＦＲ（表皮成長因子受容体）抗体又はその断片、ｂ）ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）又はその断片、ｃ）ベクチビックス（登録商標）（パニツムマブ）又はその断片、ｄ）ボロシキシマブ（登録商標）（Ｍ２００）又はその断片、ｅ）ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標）（ナタリズマブ）又はその断片、ｆ）ヘルセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）又はその断片、及びアバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）又はその断片から成る群から選択される。
Ｆ９．Ｆ５の方法であって、前記小分子が、ａ）エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））、ｂ）エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））の変異体、類似体又は誘導体、ｃ）ラパマイシン、ｄ）ラパマイシンの変異体、類似体又は誘導体、ｅ）テムシロリムス、ｆ）テムシロリムスの変異体、類似体又は誘導体、ｇ）ＰＤ０３２５９０１、ｈ）ＰＤ０３２５９０１の変異体、類似体又は誘導体、ｉ）ＰＩ−１０３、ｊ）ＰＩ−１０３の変異体、類似体又は誘導体、ｋ）ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、ｌ）ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））の変異体、類似体又は誘導体、グリーベック（登録商標）（イマチニブメシレート）、グリーベック（登録商標）（イマチニブメシレート）の変異体、類似体又は誘導体、ｏ）ステント（登録商標）（スニチニブマレート）、ｐ）ステント（登録商標）（スニチニブマレート）の変異体、類似体又は誘導体、ｑ）ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）（ソラフェニブトシレート／ＢＡＹ４３−９００６）、ｒ）ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）（ソラフェニブトシレート／ＢＡＹ４３−９００６）の変異体、類似体又は誘導体、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ｔ）スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）の変異体、類似体又は誘導体、ｕ）ゲムシタビン、ｖ）ゲムシタビンの変異体、類似体又は誘導体、ｗ）ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）（ラパチニブ）ｘ）ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）（ラパチニブ）の変異体、類似体又は誘導体、ｙ）ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ｚ）ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）の変異体、類似体又は誘導体、ａａ）デフォロリムス（ＡＰ２３５７３）及びａｂ）デフォロリムス（ＡＰ２３５７３）の変異体、類似体又は誘導体から成る群から選択される。
Ｆ１０．Ｆ１〜Ｆ９のいずれか１つの方法であって、前記動物は哺乳類である。
Ｆ１１．Ｆ１０の方法であって、前記哺乳類はヒトである。
Ｆ１２．Ｆ１〜Ｆ１１のいずれか１つの方法であって、前記過剰増殖性の障害が、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、又はその転移から成る群から選択される。
Ｆ１３．Ｆ１２の方法であって、前記過剰増殖性の障害が、前立腺、結腸、腹部、骨、胸、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭部、頚部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、又は泌尿生殖器に位置する新生物である。
Ｆ１４．Ｆ１３の方法であって、前記過剰増殖性の障害が癌であって、上皮扁平細胞癌、悪性黒色腫、白血病、骨髄腫、胃癌、脳腫瘍、骨癌、肺癌、膵臓癌、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、頭頚部の癌、非小細胞肺癌、肉腫及び骨肉腫から成る群から選択される前記癌。
Ｆ１５．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体又はその断片である。
Ｆ１６．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、ａ）Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．、ｂ）  Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．、 ｃ）Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．、ｄ）Ｍ１４−Ｂ０１．Ｇ４．Ｐ．、ｅ）Ｍ１２−Ｅ０１．Ｇ４．Ｐ．、ｆ）Ｍ１２−Ｇ０４．Ｇ４．Ｐ．ｂ）Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、ｃ）Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、ｄ）Ｍ１４−Ｂ０１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、ｅ）Ｍ１２−Ｅ０１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、及びｆ）Ｍ１２−Ｇ０４．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙから成る群から選択される単離された抗体又はその断片である。
Ｆ１７．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、ａ）Ｍ１３−Ｃ０６、ｂ）Ｍ１４−Ｇ１１、ｃ）Ｍ１４−Ｃ０３、ｄ）Ｍ１４−Ｂ０１、ｅ）Ｍ１２−Ｅ０１、及びｆ）Ｍ１２−Ｇ０４から成る群から選択される単離されたＦａｂ抗体である。
Ｆ１８．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、ａ）Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、ｂ）２０Ｃ８．３Ｂ８、ｃ）Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、ｄ）２０Ｄ８．２４Ｂ１１、ｅ）Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びｆ）Ｐ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生される単離された抗体である。
Ｆ１９．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、ａ）寄託番号ＰＴＡ−７４４４でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ｂ）寄託番号ＰＴＡ−７４４５でＡＴＣＣに寄託され、指定されたＣＨＯ細胞株、ｃ）寄託番号ＰＴＡ−７８５５でＡＴＣＣに寄託されたＣＨＯ細胞株、ｄ）寄託番号ＰＴＡ−７４８５でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株、ｅ）寄託番号ＰＴＡ−７７３２でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株、ｆ）寄託番号ＰＴＡ−７４５７でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株、ｇ）寄託番号ＰＴＡ−７４５６でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株、ｈ）寄託番号ＰＴＡ−７７３０でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株、及び寄託番号ＰＴＡ−７７３１でＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株から成る群から選択される細胞株によって産生される単離された抗体である。
Ｆ２０．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、Ｆ１９の細胞株によって産生される単離された抗体であり、前記細胞株は、ａ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｃ０６−４０Ｂ５、ＣＨＯＤＧ４４バイオゲンＩｄｅｃＥＡ０３．１４．０６、ｂ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）：Ｃ０３−２ＣＨＯＤＧ４４バイオゲンＩｄｅｃＤＡ０３．１４．０６、ｃ）チャイニーズハムスター卵巣細胞株：Ｇ１１  ７０  ８ｅ６細胞、０８．０９．２００６、ｄ）ハイブリドーマ、８．Ｐ２Ａ７．３Ｄ１１、ｅ）ハイブリドーマ細胞株：７．２０Ｃ８．３Ｂ８、ｆ）ハイブリドーマ、５．Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、ｇ）ハイブリドーマ、７．２０Ｄ８．２４Ｂ１１、ｈ）ハイブリドーマ細胞株：９．Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２、及びｉ）ハイブリドーマ細胞株：５Ｐ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるＡＴＣＣ寄託記載によって指定される。
Ｆ２１．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、インスリン様成長因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン−１（ＦＮＩＩＩ−１）から成るポリペプチドドメインに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片である。
Ｆ２２．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）及びインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）のＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害する単離された抗体又は抗原結合断片である。
Ｆ２３．Ｆ２２の方法であって、前記阻害はアロステリックである。
Ｆ２４．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合断片であり、前記結合の親和性が、ａ）Ｇｌｕ−４５９、ｂ）Ｓｅｒ−４６０、ｃ）Ａｓｐ−４６１、ｄ）Ｖａｌ−４６２、ｅ）Ｈｉｓ−４６４、ｆ）Ｔｈｒ−４６６、ｇ）Ｓｅｒ−４６７、ｈ）Ｔｈｒ−４７８、ｉ）Ｈｉｓ−４８０、ｊ）Ｔｙｒ−４８２、ｋ）Ａｒｇ−４８３、ｌ）Ｇｌｕ−５３３、ｍ）Ｉｌｅ−５６４、ｎ）Ａｒｇ−５６５、ｏ）Ｌｙｓ−５６８、ｐ）Ｇｌｕ−５７０、及びｑ）Ｉｌｅ−５７１から成る群から選択される１以上のＩＧＦ−１Ｒ残基の突然変異によって低下する。
Ｆ２５．Ｆ２４の方法であって、前記突然変異は、ａ）Ｇｌｕ−４５９からＡｌａへ、ｂ）Ｓｅｒ−４６０からＡｌａへ、ｃ）Ａｓｐ−４６１からＡｌａへ、ｄ）Ｖａｌ−４６２からＴｈｒへ、ｅ）Ｈｉｓ−４６４からＡｌａへ、ｆ）Ｈｉｓ−４６４からＧｌｕへ、ｇ）Ｔｈｒ−４６６からＬｅｕへ、ｈ）Ｓｅｒ−４６７からＴｙｒへ、ｉ）Ｔｈｒ−４７８からＡｒｇへ、ｊ）Ｈｉｓ−４８０からＧｌｕへ、ｋ）Ｔｙｒ−４８２からＡｌａへ、ｌ）Ａｒｇ−４８３からＴｒｐへ、ｍ）Ｇｌｕ−５３３からＨｉｓへ、ｎ）Ｉｌｅ−５６４からＴｈｒへ、ｏ）Ａｒｇ−５６５からＡｌａへ、ｐ）Ｌｙｓ−５６８からＡｌａへ、ｑ）Ｇｌｕ−５７０からＡｌａへ、及びｒ）Ｉｌｅ−５７１からＴｈｒへ、から成る群から選択される置換変異である。
Ｆ２６．Ｆ２４又はＦ２５の方法であって、前記抗体の結合親和性は、約２．５〜約１０倍の間で低下する。
Ｆ２７．Ｆ２４又はＦ２５の方法であって、前記抗体の結合親和性は、約１０〜約１００倍の間で低下する。
Ｆ２８．Ｆ２４又はＦ２５の方法であって、前記抗体の結合親和性は、１００倍を超えて低下する。
Ｆ２９．Ｆ２４又はＦ２５の方法であって、前記抗体の結合親和性はなくなる。
Ｆ３０．Ｆ２４〜Ｆ２９のいずれか１つの方法であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２リガンドのＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害する。
Ｆ３１．Ｆ３０の方法であって、前記阻害はアロステリックである。
Ｆ３２．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、ＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチ領域（ＣＲＲ）から成るポリペプチドドメインに特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合断片である。
Ｆ３３．Ｆ３２の方法であって、前記抗体は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２リガンドのＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害する。
Ｆ３４．Ｆ３３の方法であって、前記阻害は競合的である。
Ｆ３５．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合断片であり、前記抗体結合の親和性が、ａ）Ａｓｐ−２４８、ｂ）Ａｓｐ−２５０、ｃ）Ａｓｎ−２５４、ｄ）Ｓｅｒ−２５７、ｅ）Ｇｌｕ−２５９、ｆ）Ｓｅｒ−２６０、ｇ）Ｓｅｒ−２６３、ｈ）Ｇｌｙ−２６５、及びｉ）Ｇｌｕ−３０３から成る群から選択される１以上のＩＧＦ−１Ｒ残基の突然変異によって低下する。
Ｆ３６．Ｆ３５の方法であって、前記突然変異は、ａ）Ａｓｐ−２４８からＡｌａへ、ｂ）Ａｓｐ−２５０からＳｅｒへ、ｃ）Ａｓｎ−２５４からＡｌａへ、ｄ）Ｓｅｒ−２５７からＰｈｅへ、ｅ）Ｓｅｒ−２５７からＬｙｓへ、ｆ）Ｇｌｕ−２５９からＬｙｓへ、ｇ）Ｓｅｒ−２６０からＡｓｎへ、ｈ）Ｓｅｒ−２６３からＡｒｇへ、ｉ）Ｇｌｙ−２６５からＴｙｒへ、及びｊ）Ｇｌｕ−３０３からＧｌｙへ、から成る群から選択される置換変異である。
Ｆ３７．Ｆ３５又はＦ３６の方法であって、前記抗体の結合親和性は、約２．５〜約１０倍の間で低下する。
Ｆ３８．Ｆ３５又はＦ３６の方法であって、前記抗体の結合親和性は、約１０〜約１００倍の間で低下する。
Ｆ３９．Ｆ３５又はＦ３６の方法であって、前記抗体の結合親和性は、１００倍を超えて低下する。
Ｆ４０．Ｆ３５又はＦ３６の方法であって、前記抗体の結合親和性はなくなる。
Ｆ４１．Ｆ３５〜Ｆ４０のいずれか１つの方法であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２リガンドのＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害する。
Ｆ４２．Ｆ４１の方法であって、前記阻害は競合的である。
Ｆ４３．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、ＩＧＦ−１Ｒのシステインリッチ領域（ＣＲＲ）及び第２のロイシンリッチ繰り返しドメイン（Ｌ２）から成るポリペプチドドメインに特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合断片である。
Ｆ４４．Ｆ４３の方法であって、前記抗体はＩＧＦ−１リガンドのＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害するが、ＩＧＦ−２リガンドの結合を阻害しない。
Ｆ４５．Ｆ４４の方法であって、前記阻害はアロステリックである。
Ｆ４６．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤が、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する単離された抗体又は抗原結合断片であり、前記抗体結合の親和性が、ａ）Ａｓｐ−２４８、ｂ）Ａｓｎ−２５４、ｃ）Ｓｅｒ−２５７、及びｄ）Ｇｌｙ−２６５から成る群から選択される１以上のＩＧＦ−１Ｒ残基の突然変異によって低下する。
Ｆ４７．Ｆ４６の方法であって、前記突然変異は、ａ）Ａｓｐ−２４８からＡｌａへ、ｂ）Ａｓｎ−２５４からＡｌａへ、ｃ）Ｓｅｒ−２５７からＬｙｓへ、及びｄ）Ｇｌｙ−２６５からＴｙｒへ、から成る群から選択される置換変異である。
Ｆ４８．Ｆ４６又はＦ４７の方法であって、前記抗体の結合親和性は、約１０〜約１００倍の間で低下する。
Ｆ４９．Ｆ４６又はＦ４７の方法であって、前記抗体の結合親和性はなくなる。
Ｆ５０．Ｆ４６〜Ｆ４９のいずれか１つの方法であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＩＧＦ−１リガンドのＩＧＦ−１Ｒへの結合を阻害するが、ＩＧＦ−２リガンドの結合を阻害しない。
Ｆ５１．Ｆ５０の方法であって、前記阻害はアロステリックである。
Ｆ５２．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体と同一のインスリン様成長因子受容体−１（ＩＧＦ−１Ｒ）のエピトープに特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片である。
Ｆ５３．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗体又はその断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体がＩＧＦ−１Ｒに結合するのを競合的に阻害する。
Ｆ５４．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗体又はその断片は、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体断片、又はＰ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される参照モノクローナル抗体のそれと同一の抗原結合ドメインを含む。
Ｆ５５．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片の重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８及び配列番号６３から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
Ｆ５６．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３及び配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
Ｆ５７．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＨは、２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８及び配列番号６３から成る群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
Ｆ５８．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＬは、２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３及び配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
Ｆ５９．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＨは、配列番号４、配列番号９、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号５８及び配列番号６３から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
Ｆ６０．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＬは、配列番号６８、配列番号７３、配列番号７８、配列番号８３、配列番号８８、配列番号９３、配列番号９８、配列番号１０３、配列番号１０８、配列番号１１３及び配列番号１１８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
Ｆ６１．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＨとＶＬはそれぞれ、配列番号４と配列番号６８、配列番号９と配列番号７３、配列番号１４と配列番号７８、配列番号２０と配列番号８３、配列番号２６と配列番号８８、配列番号３２と配列番号９３、配列番号３８と配列番号９８、配列番号４３と配列番号１０３、配列番号４８と配列番号１０８、配列番号５３と配列番号１０３、配列番号５８と配列番号１１３及び配列番号６３及と配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
Ｆ６２．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＨとＶＬはそれぞれ、２０以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４と配列番号６８、配列番号９と配列番号７３、配列番号１４と配列番号７８、配列番号２０と配列番号８３、配列番号２６と配列番号８８、配列番号３２と配列番号９３、配列番号３８と配列番号９８、配列番号４３と配列番号１０３、配列番号４８と配列番号１０８、配列番号５３と配列番号１０３、配列番号５８と配列番号１１３及び配列番号６３と配列番号１１８から成る群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
Ｆ６３．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＨとＶＬはそれぞれ、配列番号４と配列番号６８、配列番号９と配列番号７３、配列番号１４と配列番号７８、配列番号２０と配列番号８３、配列番号２６と配列番号８８、配列番号３２と配列番号９３、配列番号３８と配列番号９８、配列番号４３と配列番号１０３、配列番号４８と配列番号１０８、配列番号５３と配列番号１０３、配列番号５８と配列番号１１３及び配列番号６３と配列番号１１８から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。
Ｆ６４．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＨは、２つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９及び配列番号６４から成る群から選択される参照の重鎖相補性決定領域−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のカバットによるＶＨ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。
Ｆ６５．Ｆ６４の方法であって、前記ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号５、配列番号１０、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号５９及び配列番号６４から成る群から選択される。
Ｆ６６．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＨは、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５配列番号６０及び配列番号６５から成る群から選択される参照の重鎖相補性決定領域−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のカバットによるＶＨ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。
Ｆ６７．Ｆ６６の方法であって、前記ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５５配列番号６０及び配列番号６５から成る群から選択される。
Ｆ６８．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＨは、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号７、配列番号１２、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１及び配列番号６６から成る群から選択される参照の重鎖相補性決定領域−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のカバットによるＶＨ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
Ｆ６９．Ｆ６８の方法であって、前記ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２９、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１及び配列番号６６から成る群から選択される。
Ｆ７０．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＬは、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４及び配列番号１１９から成る群から選択される参照の軽鎖相補性決定領域−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）アミノ酸配列と同一のカバットによるＶＬ−ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。
Ｆ７１．Ｆ７０の方法であって、前記ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号６９、配列番号７４、配列番号７９、配列番号８４、配列番号８９、配列番号９４、配列番号９９、配列番号１０４、配列番号１０９、配列番号１１４及び配列番号１１９から成る群から選択される。
Ｆ７２．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＬは、２つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５及び配列番号１２０から成る群から選択される参照の軽鎖相補性決定領域−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）アミノ酸配列と同一のカバットによるＶＬ−ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。
Ｆ７３．Ｆ７２の方法であって、前記ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７０、配列番号７５、配列番号８０、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９５、配列番号１００、配列番号１０５、配列番号１１０、配列番号１１５及び配列番号１２０から成る群から選択される。
Ｆ７４．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＬは、４つ以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６及び配列番号１２１から成る群から選択される参照の軽鎖相補性決定領域−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列と同一のカバットによるＶＬ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。
Ｆ７５．Ｆ７４の方法であって、前記ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号７１、配列番号７６、配列番号８１、配列番号８６、配列番号９１、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１６及び配列番号１２１から成る群から選択される。
Ｆ７６．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＨは、前記ＶＨ−ＣＤＲの少なくとも１つにおける１つ、２つ、３つ又は４つのアミノ酸置換を除いて、配列番号５、６及び７；配列番号１０、１１及び１２；配列番号１５、１６及び１７；配列番号２１、２２及び２３；配列番号２７、２８及び２９；配列番号３３、３４及び３５;配列番号３９、４０及び４１；配列番号４４、４５及び４６；配列番号４９、５０及び５１；配列番号５４、５５及び５６；配列番号５９、６０及び６１；並びに配列番号６４、６５及び６６から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
Ｆ７７．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＨは、配列番号５、６及び７；配列番号１０、１１及び１２；配列番号１５、１６及び１７；配列番号２１、２２及び２３；配列番号２７、２８及び２９；配列番号３３、３４及び３５;配列番号３９、４０及び４１；配列番号４４、４５及び４６；配列番号４９、５０及び５１；配列番号５４、５５及び５６；配列番号５９、６０及び６１；並びに配列番号６４、６５及び６６から成る群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２及びＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
Ｆ７８．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＬは、前記ＶＬ−ＣＤＲの少なくとも１つにおける１つ、２つ、３つ又は４つのアミノ酸置換を除いて、配列番号６９、７０及び７１；配列番号７４、７５及び７６；配列番号７９、８０及び８１；配列番号８４、８５及び８６；配列番号８９、９０及び９１；配列番号９４、９５及び９６；配列番号９９、１００及び１０１；配列番号１０４、１０５及び１０６：配列番号１０９、１１０及び１１１；配列番号１１４、１１５及び１１６並びに配列番号１１９、１２０及び１２１から成る群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
Ｆ７９．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合する、単離された抗体又はその断片であり、前記抗体又はその断片のＶＬは、配列番号６９、７０及び７１；配列番号７４、７５及び７６；配列番号７９、８０及び８１；配列番号８４、８５及び８６；配列番号８９、９０及び９１；配列番号９４、９５及び９６；配列番号９９、１００及び１０１；配列番号１０４、１０５及び１０６：配列番号１０９、１１０及び１１１；配列番号１１４、１１５及び１１６並びに配列番号１１９、１２０及び１２１から成る群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２及びＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
Ｆ８０．Ｆ５２〜Ｆ７９のいずれか１つの方法であって、５つ以下のアミノ酸置換を除いて抗体のＶＨのフレームワーク領域がヒト型である。
Ｆ８１．Ｆ５２〜Ｆ８０のいずれか１つの方法であって、５つ以下のアミノ酸置換を除いて抗体のＶＬのフレームワーク領域がヒト型である。
Ｆ８２．Ｆ５２〜Ｆ８１のいずれか１つの方法であって、前記抗体が非線形立体構成のエピトープに結合する。
Ｆ８３．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、アミノ酸残基バリン−４６２を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片である。
Ｆ８４．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、アミノ酸残基ヒスチジン−４６４を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片である。
Ｆ８５．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、アミノ酸残基バリン−４６２とヒスチジン−４６４を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片である。
Ｆ８６．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、残基、バリン−４６２から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４オングストロームの溶媒接触可能表面半径を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片である。
Ｆ８７．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、残基、ヒスチジン−４６４から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４オングストロームの溶媒接触可能表面半径を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片である。
Ｆ８８．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、残基、バリン−４６２とヒスチジン−４６４から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４オングストロームの溶媒接触可能表面半径を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片である。
Ｆ８９．Ｆ１４の方法であって、前記第１の剤は、ヒトＩＧＦ−１Ｒの残基、バリン−４６２とヒスチジン−４６４の中心から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４オングストロームの溶媒接触可能表面半径を含むＩＧＦ−１Ｒのエピトープに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合断片である。
Ｆ９０．Ｆ５２〜Ｆ８９のいずれか１つの方法であって、前記抗体は線形エピトープに結合する。
Ｆ９１．Ｆ５２〜Ｆ９０のいずれか１つの方法であって、前記抗体は、多価であり、少なくとも２つの重鎖と少なくとも２つの軽鎖を含む。
Ｆ９２．Ｆ５２〜Ｆ９１のいずれか１つの方法であって、前記抗体は、多重特異性である。
Ｆ９３．Ｆ５２〜Ｆ９２のいずれか１つの方法であって、前記抗体の重鎖と軽鎖の可変ドメインは完全にヒト型である。
Ｆ９４．９３の方法であって、前記重鎖と軽鎖の可変ドメインは、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４から成る群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体断片に由来する。
Ｆ９５．Ｆ５２〜Ｆ９４のいずれか１つの方法であって、前記抗体の重鎖と軽鎖の可変ドメインはマウス型である。
Ｆ９６．９５の方法であって、前記抗体の重鎖と軽鎖の可変ドメインが、Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１、２０Ｃ８．３Ｂ８、Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１、２０Ｄ８．２４Ｂ１１、Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２及びＰ１Ｇ１０．２Ｂ８から成る群から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体に由来する。
Ｆ９７．Ｆ５２〜Ｆ９２及びＦ９５〜Ｆ９６のいずれか１つの方法であって、前記抗体はヒト化されている。
Ｆ９８．Ｆ５２〜Ｆ９２及びＦ９５〜Ｆ９６のいずれか１つの方法であって、前記抗体はキメラである。
Ｆ９９．Ｆ５２〜Ｆ９２及びＦ９５〜Ｆ９６のいずれか１つの方法であって、前記抗体は霊長類化されている。
Ｆ１００．Ｆ５２〜Ｆ９４のいずれか１つの方法であって、前記抗体は完全にヒト型である。
Ｆ１０１．Ｆ５２〜Ｆ１００のいずれか１つの方法であって、前記抗体はＦａｂ断片である。
Ｆ１０２．Ｆ５２〜Ｆ１００のいずれか１つの方法であって、前記抗体はＦａｂ’断片である。
Ｆ１０３．Ｆ５２〜Ｆ１００のいずれか１つの方法であって、前記抗体はＦ（ａｂ）２断片である。
Ｆ１０４．Ｆ５２〜Ｆ１００のいずれか１つの方法であって、前記抗体はＦｖ断片である。
Ｆ１０５．Ｆ５２〜Ｆ１００のいずれか１つの方法であって、前記抗体は単鎖抗体である。
Ｆ１０６．Ｆ５２〜Ｆ１０３及びＦ１０５のいずれか１つの方法であって、前記抗体は、ヒトκ定常領域及びヒトλ定常領域から成る群から選択される軽鎖定常領域を含む。
Ｆ１０７．Ｆ５２〜Ｆ１０３及びＦ１０５のいずれか１つの方法であって、前記抗体は、重鎖定常領域又はその断片を含む。
Ｆ１０８．Ｆ１０７の方法であって、前記重鎖定常領域又はその断片は、ヒトＩｇＧ４である。
Ｆ１０９．Ｆ１０８の方法であって、グリコシル化部位を除くように前記ＩｇＧ４を突然変異されている。
Ｆ１１０．Ｆ１０９の方法であって、前記突然変異はカバット番号付与方式を用いたＳ２４１ＰとＴ３１８Ａを含む。
Ｆ１１１．Ｆ５２〜Ｆ１１０のいずれか１つの方法であって、前記抗体は、前記参照モノクローナル抗体の解離定数（ＫＤ）より小さいＫＤを特徴とする親和性でＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片又はＩＧＦ−１Ｒ変異体ポリペプチドに特異的に結合する。
Ｆ１１２．Ｆ５２〜Ｆ１１１のいずれか１つの方法であって、前記抗体は、５×１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、又は１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）を特徴とする親和性でＩＧＦ−１Ｒポリペプチド又はその断片又はＩＧＦ−１Ｒ変異体ポリペプチドに特異的に結合する。
Ｆ１１３．Ｆ５２〜Ｆ１１２のいずれか１つの方法であって、前記抗体の親和性は、約１×１０−１０Ｍ〜約５×１０−９Ｍの範囲内の解離定数（ＫＤ）を特徴とする。
Ｆ１１４．Ｆ５２〜Ｆ１１３のいずれか１つの方法であって、前記抗体の親和性は、（ａ）約１．１×１０−１０Ｍ、（ｂ）約１．３×１０−１０Ｍ、（ｃ）約３．６×１０−１０Ｍ、（ｄ）約１．３×１０−９Ｍ、（ｅ）約４．０×１０−９Ｍ、及び（ｆ）約４．９×１０−９Ｍから成る群から選択される解離定数（ＫＤ）を特徴とする。
Ｆ１１５．Ｆ５２〜Ｆ１１４のいずれか１つの方法であって、前記抗体の親和性は、（ａ）約１．１×１０−１０Ｍ、（ｂ）約１．３×１０−１０Ｍ、（ｃ）約３．６×１０−１０Ｍ、（ｄ）約１．３×１０−９Ｍ、（ｅ）約４．０×１０−９Ｍ、及び（ｆ）約４．９×１０−９Ｍから成る群から選択される解離定数（ＫＤ）を特徴とする。
Ｆ１１６．Ｆ１〜Ｆ１１５のいずれか１つの方法であって、前記１以上の組成物が、第１と第２の剤に加えて複数の剤を含み、前記複数の追加の剤が過剰増殖性障害を治療するのに治療上有用である。
Ｆ１１７．Ｆ１１６の方法であって、前記複数の追加の剤が、ａ）第３の剤、ｂ）第４の剤、ｃ）第５の剤、ｄ）第６の剤、ｅ）第７の剤、ｆ）第８の剤、ｇ）第９の剤、ｈ）第１０の剤、ｉ）１０〜２０の間の任意の数の追加の剤、ｊ）２０〜１００の間の任意の数の追加の剤、ｋ）１００〜１０００の間の任意の数の追加の剤、ｌ）１０００〜１，０００，０００の間の任意の数の追加の剤、及びｍ）１，０００，０００を超える追加の剤から成る群から選択される多数の剤を含む。
【実施例】
【０５３９】
（実施例１）
ファージライブラリーからのＩＧＦ−１Ｒ特異的Ｆａｂの選択
組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメインを使用して、３．５×１０１０個の独特なクローンを含有するヒト未感作ファージミドＦａｂライブラリをスクリーニングした（Hoet, R.M., et al. Nat Biotechnol. 23(3):344-8 (2005)、（「Ｈｏｅｔら」）、これは参照することによりその全体が本明細書に組込まれる）。その後、ビオチン化ＩＧＦ１Ｒ−ｈｉｓ及びＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃタンパク質を使用して、２つの異なるパニング集団をスクリーニングした。タンパク質をステプタビジン（ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ）コーティング磁気ビーズで捕捉し、その後ファージライブラリーと共にインキュベーションした。ＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃの場合、ビオチン化抗Ｆｃ抗体を磁気ビーズで捕捉し、その後Ｆｃ融合タンパク質を捕捉した。Ｈｏｅｔらに記載されているように選択を実施した。３巡のパニング後、４７９ｂｐの遺伝子ＩＩＩ断端をＭｌｕＩ消化で取り除き、ベクターを、ＴＧ１細胞での可溶性Ｆａｂ発現用に再ライゲーションした。ビオチン化ＩＧＦ１Ｒ−ｈｉｓ集団からの９２０種のクローンをＥＬＩＳＡ分析することにより、３３種の異なる配列を含有する５９３種の陽性クローンがもたらされた。ＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ集団からの９２０種のクローンをＥＬＩＳＡ分析することにより、１２種の独特な配列を含有する１６３種の陽性クローンがもたらされた。全クローンを配列解析することにより、１２種のクローンがパニング戦略の両集団で単離されたことが判明した。独特なクローンを精製し、組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン並びに全長ヒトＩＧＦ−１Ｒで安定的に形質移入した３Ｔ３細胞に対する結合を、ＥＬＩＳＡにより再確認した（図１Ａ＆１Ｂ）。結合データに基づいて、両集団で単離された１２種の独特なクローンのうちの６種をさらなる分析用に選択した。
【０５４０】
（実施例２）
腫瘍細胞上で発現されたＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂの結合活性
野生型ＩＧＦ−１Ｒに結合するＦａｂの能力を、ＭＣＦ−７腫瘍細胞系を使用して、フローサイトメトリーにより決定した。
【０５４１】
ＭＣＦ−７細胞（ＮＣＩに由来するヒト乳腺癌）を、アッセイ準備の２４時間前に分割して、７０％コンフルエントな単層を得た。規定通りに、ＭＣＦ−７細胞系を２０継代内に維持した。細胞を、細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ社製  カタログ＃１３１５１−０１４）を用いて取り上げ、計数し、洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌに調整し、その後１ｍｌの細胞を各チューブ（１２×７５ｍｍチューブ、Ｆａｌｃｏｎ社製  カタログ＃３５２０５４）に添加した。１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより細胞をペレット化し、上清を取り除き、その後１００μｌの希釈抗体を細胞ペレットに添加した。精製したＦａｂを、２１０又は６０μｇ／ｍｌのいずれかの開始濃度で０．００１μｇ／ｍｌまでＦＡＣＳ緩衝液中に１：３希釈して試験した。アッセイ全体にわたって使用したＦＡＣＳ緩衝液は、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製  カタログ＃Ａ−７９０６；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国））及び０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社製  カタログ＃Ｓ２００２）を含有するＰＢＳ（Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋非含有）であった。陽性対照として、マウス抗体であるＩＲ３（Ａｂ−１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製  ＃ＧＲ１１Ｌ）を使用した。試料を氷上で１時間１５分インキュベートさせ、その後２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、４℃で５分間１２００ｒｐｍで遠心分離した。上清を吸引し、１００μｌの二次検出抗体を、各対応チューブ中のＦＡＣＳ緩衝液に加えた。その後、試料を、氷上で３０分間暗所でインキュベートした。細胞を上述のように洗浄し、１チューブ／試料当たり２５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。
【０５４２】
細胞に結合したＦａｂは、ＦＩＴＣに結合された親和性精製Ｆ（ａｂ’）２断片特異的ヤギ抗ヒト−ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ社製  カタログ＃１０９−０９６−００６；５μｇ／ｍｌで使用）を使用して検出し、陽性マウス対照抗体は、Ｆ（ａｂ’）２ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ社製、カタログ＃１１５−０９６−０６２；５μｇ／ｍｌで使用）を使用して検出した。細胞を、ヨウ化プロピジウム染色溶液を用いて生細胞を決定するために染色した（死細胞除外用のＰＩ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製  カタログ＃５１−６６２１１Ｅ又は５５６４６３Ｅ；ＦＡＣＳ緩衝液中１：５００の終濃度で使用）。試料をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）にかけ、１試料当たり１０，０００生細胞事象を収集した。データ分析は、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン４．０ソフトウェア（ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製、１１４５２  エルカミノレアル、＃２１５、サンディエゴ  カリフォルニア州  ９２１３０  アメリカ合衆国）を使用して実施した。
【０５４３】
試料を装置にかけ幾何平均を決定した後、抗体濃度（Ｘ軸）対幾何平均（Ｙ軸）を、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ（Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈ）グラフプログラムを使用して、ｌｏｇ１０でグラフ化した。その後、データセットを、Ｘ＝Ｌｏｇ（Ｘ）に変換し（Ｘ値データセット＝抗体濃度）、非線形回帰曲線フィッティング、シグモイド型用量応答を使用してグラフ化した。ＥＣ５０値及びＲ２値を、Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈソフトウェアを使用して生成した。
【０５４４】
６種のＦａｂ全てが、ＭＣＦ−７腫瘍細胞上で発現された野生型ＩＧＦ−１Ｒに対する良好な結合活性示した（図２）。結合のＥＣ５０は、９〜４２ｎＭの範囲にあった（表３）。
【０５４５】
（実施例３）
ＦａｂによるＩＧＦ−１Ｒへのリガンド結合の阻害。
ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２リガンド結合を阻止するＦａｂの能力を、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して決定した。
【０５４６】
リガンド阻止アッセイ（ＲＩＡ）。組換えヒトＩＧＦ−１（カタログ＃２９１−Ｇ１）、ＩＧＦ−２（カタログ＃２９２−Ｇ２）、インスリン（カタログ＃  Ｃｕｓｔｏｍ０２）、ヒトインスリン受容体（カタログ＃１５４４−１Ｒ）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、米国ミネソタ州）から購入した。インスリン（Ａｒｇ−インスリン（カタログ＃０１−２０７）は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社（レークプラシッド、米国ニューヨーク州（現在はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社、コンコード、マサチューセッツ州（アメリカ合衆国）の一部）から購入した。１２５Ｉ−ｒｈＩＧＦ−１（カタログ＃ＩＭ１７２）、１２５Ｉ−ｒｈＩＧＦ−２（カタログ＃ＩＭ２３８）、及び１２５Ｉ−ｒｈインスリン（カタログ＃ＩＭ１６６）は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（ピスカタウエイ、米国ニュージャージー州）から購入した。ＡｆｆｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異抗体（カタログ＃１０９−００５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製、ウエストグローブ、米国ペンシルベニア州）を、ＩＧＦ−ＩＲ−Ｆｃ捕捉に使用した。検出抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（カタログ＃１０３０−０５、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ社製、米国アラバマ州）を使用した。
【０５４７】
ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２阻止の陽性対照として、ＩＲ３（Ａｂ−１、カタログ＃ＧＲ１１ＬＳＰ５、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、ラホーヤ、米国カリフォルニア州）及び１Ｈ７（ＩＧＦ−１Ｒ  α鎖、ｓｃ−４６１、ＩｇＧ１に特異的なマウスモノクローナル、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、サンタクルーズ、米国カリフォルニア州）を、それぞれ使用した。ヒトインスリン受容体αサブユニット特異的抗体であるクローン８３−１４（カタログ＃ＡＨＲ０２２１、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、カマリロ、米国カリフォルニア州）及び４７−９（カタログ＃Ｅ５５５０２Ｍ、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、ソーコ、米国メーン州）を、インスリン−インスリン受容体結合阻止実験の陽性対照として使用した。組換えＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社（ケンブリッジ、米国マサチューセッツ州）で生産された。
【０５４８】
アイソタイプ一致マウス陰性対照抗体として、２Ｂ８（マウスα−ＣＤ２０．ＩｇＧ１）及び２Ｂ８  ｍｋｍ．Ｇ２ａ（マウスα−ＣＤ２０ＭＡｂ、ＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社製、ロット＃ＮＢ３３０４−８７、サンディエゴ、米国カリフォルニア州）を使用した。Ｆａｂの陰性対照は、Ｃｈｒｉｓｔｉｌｙｎ  Ｇｒａｆｆ氏（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社製、ケンブリッジ、米国マサチューセッツ州）により提供されたＲ００１−１Ｂであった。緩衝液に使用したＰＢＳは、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社製（カタログ＃１７−５１３Ｆ、ウォーカーズビル、米国メリーランド州）であった。
【０５４９】
組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ（ヒスチジンタグ型）又はＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを、ＩＭＭＵＬＯＮ２  ＨＢ（高結合）Ｒｅｍｏｖａｗｅｌｌストリップ（ＤｙｎｅｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  カタログ＃６３０２）にコーティングし、炭酸塩コーティング緩衝液ｐＨ９．５で２５０ｎｇ／ウエルの濃度に希釈した。 ４℃で終夜インキュベーションした後、ウエルを、洗浄緩衝液（０．０５％ツイーン２０／ＰＢＳ）で３回洗浄し、その後ブロッキング緩衝液（３％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で１時間室温でブロッキングした。ブロッキング緩衝液を取り除き、ウエルをさらに３回洗浄した。抗体、Ｆａｂ、又はリガンド調製物を、希釈緩衝液（１％ＢＳＡ／０．０５％ツイーン２０／ＰＢＳ）で所望の濃度に希釈し、１ウエル当たり５０μｌで二重反復して播種した。室温で４５分後に、５０μｌ希釈緩衝液中の［１２５Ｉ］ｒｈＩＧＦ−１又は［１２５Ｉ］ｒｈＩＧＦ−２のいずれかを１００，０００ｃｐｍでウエル毎に添加した。これをさらに１時間室温でインキュベートした。ウエルを再びさらに３回洗浄し、最後の洗浄後は液体を残さなかった。空気乾燥したウエルを、Ｉｓｏｄａｔａガンマカウンターで計数した。
【０５５０】
別法として、プレートに固定化した抗ヒトＩｇＧを使用してＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを捕捉した改良型捕捉アッセイにより、Ｆａｂを評価した。固定化は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的抗体（２００ｎｇ／ウエル）を炭酸塩コーティング緩衝液中で終夜インキュベーションすることにより実施した。ウエルを洗浄し、ブロッキングし、２５０ｎｇのＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃをウエル毎に添加した。
【０５５１】
ＩＧＦ−１若しくはＩＧＦ−２又は両リガンドの結合を阻止する６種の異なるＦａｂの能力は、表３に示されている。様々な阻止活性を示した上位６種のＦａｂをさらなる分析用に選択した。
【０５５２】
（実施例４）
Ｆａｂは、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２媒介のＩＧＦ−１Ｒリン酸化を阻害した。
細胞系：ＩＧＦ１Ｒを発現するヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７（ＮＣＩ）を、３７℃及び５％ＣＯ２で、１０％ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、並びに１０００Ｕ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシンを含有するＭＥＭイーグル（ＡＴＣＣ）中で維持した。細胞を、維持及びアッセイ用に週２回継代培養し、最大１２継代して使用した。
【０５５３】
ＭＣＦ−７細胞を、ポリ−Ｄ−リジンコーティング１２ウエルプレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、＃３５−６４７０）において、２×１０５〜４．０×１０５細胞／ウエルで２ｍｌの増殖培地に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。４８時間の時点で、培地を取り除き、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で終夜血清飢餓させた。無血清培地を取り除き、指定された濃度の対照又は抗体を３５０μｌの新しい無血清培地に添加し、室温で又はその代わりに３７℃で１時間インキュベートした。Ｆａｂを、２００ｎＭ、２０ｎＭ、及び２ｎＭの濃度で試験し、ｍＡｂｓを、６７、６．７、及び０．６７ｎＭで試験した。使用した市販の抗ＩＧＦ−１Ｒ対照抗体は、αＩＲ３（ＥＭＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製品、＃Ｄ２７２４９）であった。１３ｎＭのヒト組換えＩＧＦ−１又は２７ｎＭのＩＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、＃２９１−Ｇ１、＃２９２−Ｇ２）を、ウエル中の３５μｌ無血清培地に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。３７℃抗体実験の場合、リガンドを室温でインキュベートした。１ｍＭのＰＭＳＦを有する１×細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、＃９８０３）で、細胞を１時間室温で溶解した。
【０５５４】
細胞溶解産物を、ＩＧＦ−１Ｒβ抗体（クローン１−２、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、＃ＡＨＲ０３６１）であらかじめコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加し、２時間インキュベートした。その後プレートを洗浄し、プレートに結合したリン酸化受容体を、ビオチン標識抗ホスホチロシン抗体４Ｇ１０（カタログ＃１６−１０３、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製、レークプラシッド、米国ニューヨーク州（現在は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、コンコード、マサチューセッツ州（アメリカ合衆国）の一部）及びストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製、＃５５４０６６）で検出した。ＴＭＢ基質（Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ社製、＃５０−７６−００）を添加することによりアッセイを発色させ、４ＮのＨ２ＳＯ４．−４（ＬａｂＣｈｅｍ社製、カタログ＃ＬＣ２５８３０−１）を添加することにより発色を停止させた。光学密度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで測定し、リガンド対照に対する阻害パーセントを、各抗体−リガンド試料について計算した。
【０５５５】
表３には、ＭＣＦ−７細胞におけるＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２媒介性ＩＧＦ−１Ｒリン酸化のＦａｂによる阻害が要約されている。合計１６種のＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂを、ＥＬＩＳＡにより、受容体リン酸化の阻害についてスクリーニングした。９種の抗体が、２００ｎＭの濃度で、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、又は両方に対して「＋」又はより良好な陽性応答を示した。これら抗体をスケールアップ産生用に選択し、用量依存的阻害応答について再び試験した。リガンド結合及び受容体リン酸化を阻害する能力に基づいて、４種のＦａｂを全長抗体変換のリード候補として選択した（実施例６を参照）。
【０５５６】
図３（Ａ及びＢ）は、上位６種のＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂのスケールアップ物質のＩＧＦ−１Ｒリン酸化の阻害を示す。
【０５５７】
（実施例５）
ＩＮＳＲと比較したＩＧＦ−１Ｒに対する抗体結合特異性及び親和性
パートＩ：可溶性ＩＮＳＲと比較した可溶性ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体結合の、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用した分析
【０５５８】
ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、インスリン受容体と比較した、可溶性ＩＧＦ−１Ｒに対するＦａｂ断片抗体の特異的結合を決定した。プレートを、１０μｇ／ｍｌのｒｈ−ＩＧＦ−１Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、＃３０５−ＧＲ）又はｒｈ−ＩＮＳＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、＃１５４４−ＩＲ）で終夜コーティングし、５％ミルクでブロッキングした。抗体を、Ｆａｂの場合は２μＭ〜０．２ｎＭ、又はマウスＭＡｂの場合は６６７〜０．０６７ｎＭの範囲で１：１０連続希釈して添加し、室温で１時間インキュベートした。Ｆａｂの場合は、ＨＲＰＯ標識ヤギα−ヒトκ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社製、＃２０６０−０５）、及びマウスＭＡｂの場合は、ヤギα−マウスＩｇＧ  Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ社製、＃１１５−０３５−１６４）を用いて、結合した抗体を検出した。発色促進を４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の添加により停止させ、光学密度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで測定し、結合曲線を生成した。
【０５５９】
ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂは、どの濃度でも可溶性インスリン受容体に対する特異的結合を示さなかったが（表３）、予想通り、ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対して良好な結合性を示した。
【０５６０】
図４（Ａ及びＢ）には、ＦａｂであるＭ１４−Ｂ０１、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１２−Ｇ０４を用いて取得した代表的な結合曲線が例示されている。同様の結合パターンが、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、及びＭ１２−Ｅ０１で観察された（データ非表示）。
【０５６１】
パートＩＩ：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び時間分解型蛍光共鳴エネルギー転移（ｔｒ−ＦＲＥＴ）を使用した、可溶性ＩＮＳＲと比較した可溶性ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体結合の分析。
【０５６２】
可溶性ヒトＩＧＦ−１Ｒ及びインスリン受容体細胞外ドメインに対するＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１抗体の結合親和性を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）及び時間分解型蛍光共鳴エネルギー転移（ｔｒ−ＦＲＥＴ）を使用して比較し、Ｍ１３−Ｃ０６抗体がインスリン受容体であるマウスＩＧＦ−１Ｒ、又は短縮型ヒトＩＧＦ−１Ｒ（つまり、第１及び第２のロイシンに富む反復ドメイン並びにシステインに豊む反復ドメインのみを含有するが、ＩＧＦ−１Ｒの３つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを欠如するｈＩＧＦ−１Ｒアミノ酸残基１〜４６２）との著しい交差反応性を示さないことがさらに示された。
【０５６３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
【０５６４】
ＳＰＲ解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を使用して実施した。この装置を２５℃に設定し、Ｂｉａｃｏｒｅ社から購入したランニング緩衝液ＨＢＳ−ＥＰ  ｐＨ７．２（Ｂｉａｃｏｒｅ社製、カタログ番号ＢＲ−１００１−８８）を用いてアッセイを実施した。完全ヒト抗体であるＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１を、Ｂｉａｃｏｒｅ社が提供するプロトコールに従って標準的ＮＨＳ／ＥＤＣアミン反応化学を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ社製ＣＭ５研究用センサーチップ表面に約１０，０００ＲＵで固定化した。固定化をするために、抗体を１０ｍＭアセテートｐＨ４．０緩衝液で４０μｇ／ｍＬに希釈した。ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１〜９０２）−Ｈｉｓ１０（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製））及びヒトＩＮＳＲ（２８〜９５６）−Ｈｉｓ１０（ＩＮＳＲ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製））の全長細胞外ドメインの、ヒト抗体の各々に対する結合及び解離の相対的動力学を調査するために、濃度を増加させたｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０又はＩＮＳＲを、センサーチップ表面に注入した。一連のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０濃度は、１．０ｎＭから２５０ｎＭの範囲であり、ＩＮＳＲ濃度は、１．０ｎＭから２μＭの範囲であった。抗体表面は全て、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．０を用いて高い信頼性で再生した。反復再生は、いずれの抗体表面でも活性消失に結びつかなかった。流速は２０μｌ／分であった。（「Ｈｉｓ１０」とは、構築体のＣ末端にある１０残基のヒスチジンタグを指す。）
【０５６５】
時間分解型蛍光共鳴エネルギー転移（ｔｒ−ＦＲＥＴ）アッセイ
【０５６６】
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０及びＭ１３−Ｃ０６を、色素の製造業者のプロトコールに従って標準的ＮＨＳ化学検査を使用して、それぞれＣｙ５及びユウロピウムキレート剤に共有結合で結合させた。幾つかの未標識可溶性細胞外ドメイン受容体競合剤、すなわち（１）ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０、（２）ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１〜９０３）−ＦｌａｇＨｉｓ１０（ｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｌａｇＨｉｓ１０、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社製）、（３）ヒトＩＧＲ−１Ｒ（１〜９０３）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社製）、（４）ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）−Ｆｃ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社製）、（５）マウスＩＧＦ−１Ｒ（１〜９０３）−Ｆｃ（ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社製）、又は（６）ＩＮＳＲの、６．２５μｇ（５０μｌの４μｇ／ｍｌ原液）から始まる連続希釈液を、０．１μｇ  ｈＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５（２５μｌの４μｇ／ｍｌ原液）及び０．０７５μｇ  Ｅｕ−Ｃ０６（２５μｌの３μｇ／ｍｌ原液）と、９６ウエルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ社製の黒色）において混合した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５の結合レベルは、タンパク濃度に対する各色素の吸光度により決定したところ、６．８：１（Ｃｙ５：ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０）であり、Ｅｕ−Ｃ０６の場合は、１０．３：１（Ｅｕ：Ｃ０６）であった。総容積は、各試料につき１００μｌであった。プレートを、室温で１時間プレート撹拌器でインキュベートした。蛍光測定は、励起波長が３４０ｎｍで発光波長が６６５ｎｍのＬＡＮＣＥプロトコールを使用して、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２蛍光プレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）で実施した。構築体は全て、少なくとも２つの重複でサンプリングした。
【０５６７】
Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社製品に由来する可溶性ＩＧＦ−１Ｒ受容体細胞外ドメイン構築体は全て、記述されている方法（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を使用して、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社製のＣＨＯ発現用ＰＶ−９０ベクターにサブクローニングした。Ｃ末端ＩｇＧ−Ｆｃタグを含有する各受容体を、前に記述されているように、プロテインＡセファロースＦＦ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅ社製）の１段階ステップを使用して親和性精製し、ｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｌａｇＨｉｓ１０を、Ｎｉ２＋−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、以前に記述されているように精製した（Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０５６８】
結果：
完全ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であるＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、可溶性ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲ細胞外ドメイン構築体に対するそれらの相対的結合活性について評価した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０及びＩＮＳＲを、同一のプロトコールを使用して、固定化した抗体表面に注入した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０は、最低濃度である０．５ｎＭででさえも３種全ての抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体に対する結合を示した（データ非表示：濃度は、１から２５０ｎＭの範囲であり、受容体注入段階は４００〜２２００秒であり、次いで緩衝液解離段階、その後グリシン、ｐＨ２．０による再生が続いた）。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０結合は、Ｍ１３−Ｃ０６表面で最も強力であった。対照的に、ＩＮＳＲは、ＩＧＦ−１Ｒ結合で観察された濃度より１０００倍を超えて高い２μＭ受容体という高濃度ででさえ、Ｍ１３−Ｃ０６表面に対する活性をほとんど示さなかった（データ非表示：濃度は１．０ｎＭから２μＭの範囲であり、受容体注入段階は５００〜１０００秒であり、その後緩衝液解離段階が続いた）。Ｍ１４−Ｃ０３及びＭ１４−Ｇ１１表面も、ＩＮＳＲに対する結合活性をほとんど示さなかった。
【０５６９】
次に、種々の組換えＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲ構築体のＭ１３−Ｃ０６に対する親和性を、競合に基づくｔｒ−ＦＲＥＴアッセイを使用して決定した。全ての組換え受容体構築体の最良なフィッティング結合曲線（下記に記載）を決定した（データ非表示）。データは全て、対応するＩＣ５０値を決定した１部位結合モデルにフィッティングした。３種の全長ヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン構築体（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０、及びｈＩＧＦ−１Ｒ−ＦｌａｇＨｉｓ１０）は全て、濃度依存的な様式で競合し、ＩＣ５０値は、それぞれ２．９、２．０、５．２μｇ／ｍｌであった。短縮ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）−Ｆｃ構築体、全長マウスＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ構築体、及び全長ヒトＩＮＳＲ−Ｈｉｓ１０構築体は、組換え全長ヒトＩＧＦ−１Ｒ構築体のＩＣ５０より１００倍高い濃度でも、Ｃｙ５標識ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を阻害せず、これら前者の構築体が、後者の全長ヒトＩＧＦ−１Ｒと比較して、Ｍ１３−Ｃ０６に対する著しい結合活性を示さないことが示唆された。
【０５７０】
パートＩＩＩ：マウスＩＧＦ−１Ｒと比較した可溶性ヒトＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６抗体の相対的結合親和性。
【０５７１】
ヒトＩＧＦ−１Ｒと比較したマウスＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６の相対的結合親和性を比較した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、マウスＩＧＦ−１Ｒ  Ｆｃ及びヒトＩＧＦ−１Ｒ  Ｆｃに対するＭ１３−Ｃ０６の親和性を決定した。ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製、カタログ番号Ｂｒ−１００１−８８）を使用して、２５℃に設定したＢｉａｃｏｒｅ３０００で実験を実施した。抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社製の２Ｃ１１、カタログ番号５２１８−９８５０）を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中５００ｎＭで注入することによりＢｉａｃｏｒｅ社製ＣＭ５チップ（カタログ番号ＢＲ−１０００−１４）表面に飽和するまで固定化した。ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ又はｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを、４０μＬの２０ｎＭ受容体を３μＬ／分で注入することにより、チップ表面で捕捉した。受容体の捕捉後、４０μＬのＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂを、３μＬ／分で注入した。Ｆａｂの解離を、約２７分間測定した。Ｆａｂを２５ｎＭから０．４ｎＭまで連続希釈して、濃度依存的動力学結合曲線を得た。チップ表面の再生は、一連の各注入の間で、１００ｍＭグリシンｐＨ２．０の３×１０μＬ注入を使用して６０μＬ／分で実施した。各曲線は、（１）抗ＩｇＧ抗体２Ｃ１１を有していないＣＭ５チップ表面から得たデータ及び（２）受容体を最初に注入しその後ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を２番目に注入したデータを使用して、二重に基準化した。各受容体に対するＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂの一連の濃度を、製造業者のＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア内で提供されている１：１結合モデルにフィッティングした。ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＭ１３−Ｃ０６結合のｋｄを取得するために、２５ｎＭのＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ及び２０ｎＭのｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを用いて実験を繰り返したが、元のプロトコールからの唯一の変更点は、解離時間を３時間に延長したことであった。
【０５７２】
結果：
Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂを、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ又はｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを含有するＢｉａｃｏｒｅ表面に加えて、２種の受容体に対する抗体の相対的親和性を決定した。Ｃ末端ＩｇＧ１−Ｆｃタグの存在は、その結果としてＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ受容体構築体のさらなる多量体化をもたらし（データ非表示）、したがって結合モデルフィッティングは、各受容体に対するＭ１３−Ｃ０６の相対的又は見かけ上の親和性の尺度を提供する。ヒト及びマウスＩＧＦ−１Ｒ  Ｆｃに対するＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂの親和性は、それぞれ０．９７８ｎＭ及び８９．１ｎＭであることが見出された。結合曲線及び解離曲線、動力学的速度定数、並びに平衡解離定数が表示されている図２５Ａ及びＢを比較すると、マウスＩＧＦ−１Ｒに対する結合が１００分に１に減少したことが、直ちに明らかになる。図２５Ａは、ヒトＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂの濃度依存的結合特性を示す（ｋａ（１／Ｍｓ）＝８．５２ｅ５Ｍ−１ｓ−１；ｋｄ（１／ｓ）＝８．３３ｅ−４ｓ−１；及びＫＤ＝９．７８ｅ−１０Ｍ）。図２５Ｂは、ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＭ１３−Ｃ０６の結合及び解離が遅いという結合特性を示す（ｋａ（１／Ｍｓ）＝４７１Ｍ−１ｓ−１；ｋｄ（１／ｓ）＝４．２０ｅ−５ｓ−１；ＫＤ＝８．９１ｅ−８Ｍ）。ｍＩＧＦ−１Ｒ−ＦｃからのＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂの解離が非常に遅いため、初期データセットを使用して動力学的解離速度定数、ｋｄを決定することができなかった。３時間の解離時間を使用して第２の実験を実施し、４．２０ｅ−５ｓ−１の解離速度定数、ｋｄを取得し、それを使用して、元のデータセットから平衡解離定数、ＫＤ（上述）を得た。Ｃ末端ＩｇＧ１−Ｆｃタグの存在は、その結果としてＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ受容体構築体のさらなる多量体化をもたらし（データ非表示）、したがって結合モデルフィッティングは、各受容体に対するＭ１３−Ｃ０６の相対的又は見かけ上の親和性の尺度を提供する。
【０５７３】
パートＩＶ：Ｍ１３−Ｃ０６全長抗体は、哺乳動物細胞で発現されたＩＧＦ−１Ｒに特異的に結合するが、ＩＮＳＲには結合しない。
【０５７４】
組換えＩＧＦ−１Ｒ及びインスリン受容体（ＩＲ）を、哺乳動物細胞（３Ｔ３又はＣＨＯ）で独立して発現させた。細胞を１％トリトンＸ−１００で可溶化し、受容体を、陰性対照抗体（ＩＤＥＣ−１５１）、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（Ｃ０６）、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（Ｇ１１）、又はＩＮＳＲ抗体（α−ＩＲ）と結合させたプロテインＡ／Ｇビーズで免疫沈殿した。抗体／抗原複合体を、酸処理によりビーズから放出させ、Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけ、ニトロセルロース膜にブロッティングした。検出は、マウス抗ヒトＩＲ（図２４Ａ）又はマウス抗ヒトＩＧＦ−１Ｒ（図２４Ｂ）及びヤギα−マウスＩｇＧを使用して実施した。結果：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、哺乳動物細胞で発現されたＩＧＦ−１Ｒに結合するが、ＩＮＳＲには結合しない。
【０５７５】
（実施例６）
全長抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧの構築
４種のＦａｂを、ＩｇＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ型に変換し、ＣＨＯ細胞で発現させた。４種の異なる抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＦａｂであるＭ１３−Ｃ０６（配列番号１３、１４、７７、７８）、Ｍ１４−Ｃ０３（配列番号２５、２６、８７、８８）、Ｍ１４−Ｇ１１（配列番号３１、３２、９２、９３）、及びＭ１４−Ｂ０１（配列番号１９、２０、８２、８３）をコードするＤＮＡ配列を、組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質に対してバイオパニングすることにより、ヒト抗体ファージライブラリー（Ｄｙａｘ社製）から選択した。４種の抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂの各々は、ＶＨ３−２３ヒト重鎖生殖細胞系フレームワークを含有しており、κ軽鎖であった。Ｆａｂ遺伝子配列を使用し、哺乳動物細胞における抗体産生用のｐＶ９０ＡＳ発現ベクター系を使用して、全長抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体をコードする発現プラスミドを構築した。ｐＶ９０ＡＳは、一次転写産物の選択的スプライシングにより単一プロモータから２つの転写産物を産生するように設計された修飾ｐＶ９０発現ベクターである（参考文献：米国特許出願  国際公開第２００５／０８９２８５号パンフレット）。天然ＣＭＶスプライス供与体は、部分的に損なわれたスプライス受容体にスプライスされて抗体軽鎖をコードする転写産物を産生するか、又は天然ＣＭＶスプライス受容体にスプライスされて抗体重鎖をコードする転写産物を産生するかのいずれかである。部分的に損なわれたスプライス受容体は、結果として重鎖及び軽鎖転写産物が両方とも同じような量でもたらされるように遺伝子操作されている。各抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ（Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、及びＭ１４−Ｂ０１）の軽鎖可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）領域（配列番号１５３及び１５４）を、ＰＣＲで増幅した（表７）。５’軽鎖ＰＣＲプライマーＩＧＦ１Ｒ−ＦＫは、その全体が参照することにより本明細書に組込まれるNakamura T, et al., Int J Immunopharmacol. 22:131-41 (2000)に記載されている方法に従った、ＶＬ領域のアミノ末端に対応する配列にインフレームで免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチドＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号１５７）をコードする配列が後続するＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいた。４種の成熟ＩＧＦ１Ｒ軽鎖配列は全て、同一のアミノ末端を有していた。３’軽鎖ＰＣＲプライマーＩＧＦ１Ｒ−ＲＫは、ＣＬ領域のカルボキシル末端に対応する配列及びＡｓｃＩ部位を含んでいた。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動、及びＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキットのプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ社製  米国カリフォルニア州）を使用した抽出により精製し、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉＩ及びＡｓｃＩで消化し、ＳｆｉＩ／ＡｓｃＩで消化したｐＨＬＰ０２５ベクター（Ｈｏｌｌｙ  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ社製）を用いてライゲーションした。ｐＨＬＰ０２５ベクターは、天然ＣＭＶスプライス供与部位配列、部分的に損なわれたスプライス受容部位配列、及びポリＡシグナル配列に加えて、ＳｆｉＩ／ＡｓｃＩで消化したＰＣＲ断片としての抗体軽鎖（シグナルペプチド−ＶＬ−ＣＬ）を受容するためのＳｆｉＩ／ＡｓｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する（参照：米国特許出願  国際公開２００５／０８９２８５号パンフレット）。
【０５７６】
各抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ（Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、及びＭ１４−Ｂ０１）の重鎖可変（ＶＨ）領域を、ＰＣＲで増幅した。５’重鎖ＶＨ  ＰＣＲプライマーＩＧＦ１Ｒ−ＦＨは、上述のように、ＶＨ領域のアミノ末端に対応する配列にインフレームで合成重鎖シグナルペプチドＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳ（配列番号１２２）をコードする配列が後続するＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでいた。３’重鎖ＶＨ  ＰＣＲプライマーＩＧＦ１Ｒ−ＲＨは、ＶＨ領域のカルボキシル末端に対応する配列及びＳｆｉＩ部位を含んでいた。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動、及びＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキットのプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ社製  米国カリフォルニア州）を使用した抽出により精製し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩ及びＳｆｉＩで消化し、ＮｃｏＩ／ＳｆｉＩで消化したｐＨＬＰ０２５ベクター（Ｈｏｌｌｙ  Ｐｒｅｎｔｉｃｅ社製）にライゲーションした。ｐＨＬＰ０２９ベクターは、上流のポリＡシグナル配列、天然ＣＭＶスプライス受容部位配列、及び下流のポリＡシグナル配列に加えて、ＮｃｏＩ／ＳｆｉＩで消化したＰＣＲ断片としての抗体シグナルペプチド−ＶＨ配列を受容するためのＮｃｏＩ／ＳｆｉＩ部位を含有する（参照：米国特許出願  国際公開第２００５／０８９２８５号パンフレット）。
【０５７７】
ｐＨＬＰ０２５において（ＳｆｉＩ部位−軽鎖シグナルペプチド−抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＬ及びＣＬ）を、及びｐＨＬＰ０２９において（重鎖シグナルペプチド−抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＨ−ＳｆｉＩ部位）をコードする遺伝子配を、上述のように、５’軽鎖ＩＧＦ１Ｒ−ＦＫ及び３’重鎖ＶＨ  ＩＧＦ１Ｒ−ＲＨ  ＰＣＲプライマーを使用して、両ベクターに存在する共通の重複配列によるＰＣＲ増幅によって単一のＤＮＡ断片中に構築した。その結果生じたＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動、及びＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＧｅｌＥｘｔｒａｔｉｏｎキットのプロトコール（ＱＩＡＧＥＮ社製  米国カリフォルニア州）を使用した抽出により精製し、制限エンドヌクレアーゼＳｆｉＩで消化し、ＤｒａＩＩＩで消化したｐＸＷＵ００７ベクターにライゲーションした。手短に言えば、ＥＵ付番方式（Kabat, E, Wu, TT, Perry, HM, Gottesman, KS, Foeller, C: Sequences of Proteins of Immunological Interest. Bethesda, US Department of Health and Human Services, NIH, 1991）で、ＩｇＧ４ヒンジ領域に２２８Ｐ突然変異、及びＣＨ２ドメインにＴ２９９Ａ突然変異（配列番号１５５及び１５６）を含有するＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩヒトＩｇＧ４定常領域断片を、ｐＥＡＧ１８０８プラスミド（Ｅｌｌｅｎ  Ｇａｒｂｅｒ氏から提供）から、ＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩで消化したｐＨＬＰ０２８ベクターにサブクローニングすることにより、最初にｐＸＷＵ００７を構築した。ｐＨＬＰ０２８は、ＳｆｉＩで消化した単一のＰＣＲ産物を受容するためのＤｒａＩＩＩ部位を含有するように修飾した上述の、ｐＶ９０ＩｇＧ４ベクターである（参照：米国特許出願  国際公開第２００５／０８９２８５号パンフレット）。
【０５７８】
その結果じるプラスミドは、選択的スプライシングの際に、その結果としてほぼ化学量論的量の翻訳的に活性な抗体重鎖及び軽鎖ｍＲＮＡがもたらされるバイシストロン性の前駆体転写産物を産生する。全長脱グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ４．Ｐ抗体産生用の中間体ベクター及び発現ベクターは、表８に示されている。正確な配列をＤＮＡ配列解析で確認した。哺乳動物細胞におけるプラスミドｐＸＷＵ０２０、ｐＸＷＵ０２２、ｐＸＷＵ０２４、及びｐＸＷＵ０２５からの全長抗体の発現により、その結果として安定的な脱グリコシル化ヒトＩｇＧ４．Ｐ抗体の産生がもたらされる。
【表８】
2011516549.tif 000018
【表９】
2011516549.tif 000019
【０５７９】
（実施例７）
哺乳動物細胞における発現を向上させるための全長抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧの構築。
抗体発現収量及び産生物品質を向上させるために、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＦａｂであるＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、及びＭ１４−Ｂ０１に由来する元のＶＨ遺伝子配列を修飾した。最初に、抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＨ配列を、公開されている配列認識プログラムを用いて推定スプライス部位を含有する配列について分析した（www.tigr.org/tdb/GeneSplicer/gene_spl.html（ゲノム研究所、９７１２  メディカルセンタードライブ、ロックビル、米国メリーランド州  ２０８５０）、www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html（Ｍａｒｔｉｎ  Ｇ．Ｒｅｅｓｅ氏及びＦｒａｎｋ  Ｈ．Ｅｅｃｋｍａｎ氏、ローレンスバークレー国立研究所、ゲノム情報科学グループ、１  サイクロトロンロード、バークレー、米国カリフォルニア州、９４７２０；Reese MG, Eeckman, FH, Kulp, D, Haussler, D, 1997. “Improved Splice Site Detection in Genie”. J Comp Biol 4(3), 311-23も参照））。次に、抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂの重鎖可変領域のコドンを、ＣＨＯ細胞で発現が成功した抗体由来の同一カバット位置（Ｋａｂａｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）に対応するコドンと、元の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＶＨポリペプチド配列にいかなる変化も起こさずに置換した。この第２のステップでは、推定スプライス部位をほとんど取り除くが、スプライス部位をさらに分析し、その後に同義語コドン交換を実施して、推定スプライス部位が存在する予測可能性を減少させた。
【０５８０】
抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ−Ｍ１３−Ｃ０６（配列番号１８）、Ｍ１４−Ｃ０３（配列番号３０）、Ｍ１４−Ｇ１１（配列番号３６）、及びＭ１４−Ｂ０１（配列番号２４）の配列最適化ＶＨ配列とインフレームで合成重鎖リーダーをコードするＤＮＡ断片を、商業的供給業者（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ボセル、米国ワシントン州）から、化学的に合成された二本鎖ＤＮＡ配列として取得した。合成断片には、５’及び３’にＮｃｏＩ及びＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼ部位が含まれていた。リーダー及び抗ＩＧＦ１Ｒ配列最適化ＶＨ領域断片を、上記の実施例６に記載されているように、ＮｃｏＩ／ＳｆｉＩで消化したｐＨＬＰ０２９ベクターにクローニングした。ｐＨＬＰ０２５における適切な対応する軽鎖との組換え及びその後のｐＸＷＵ００７への単一断片のクローニングは、上記の実施例６に記載されている通りである。配列最適化全長脱グリコシル化ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ４．Ｐ抗体を産生する発現構築体が、表９に示されている。正確な配列をＤＮＡ配列解析で確認した。哺乳動物細胞における一連のプラスミドｐＸＷＵ０２９〜ｐＸＷＵ０３２からの全長抗体の発現により、その結果として安定的な脱グリコシル化ヒトＩｇＧ４．Ｐ抗体の産生がもたらされる。
【表１０】
2011516549.tif 000020
【０５８１】
（実施例８）
ＩＧＦ−１Ｒ抗体の一過性発現及び特徴付け。
プラスミドＤＮＡを使用して、抗体タンパク質の一過性産生用のＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を形質転換した。２０μｇのプラスミドＤＮＡを、０．４ｍＬの１×ＰＢＳ中の４×１０６細胞と混合した。混合物を、０．４ｃｍキュベット（ＢｉｏＲａｄ社製）に添加し、１５分間氷上に置いた。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、６００μＦ及び３５０ボルトで、細胞をエレクトロポレーションした。細胞を、１００μＭヒポキサンチン及び１６μＭチミジンを加えたＣＨＯ−ＳＳＦＭ  ＩＩ培地を含有するＴ−２５フラスコに入れて、３７℃で４日間インキュベートした。上清を回収し、ウェスタンブロットで生化学的に特徴付け、抗原結合をＥＬＩＳＡで試験した。
【０５８２】
別法として、選択したＦａｂも、全長ヒトＩｇＧ４．Ｐ型に変換し、下記に記載の方法により異なるベクター系を使用して発現させた。５種の異なる抗ＩＧＦ１Ｒ  Ｆａｂ抗体、すなわちＭ１２−Ｅ０１、Ｍ１２−Ｇ０４、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１をコードするＤＮＡ配列を、全長ヒトＩｇＧ４．Ｐの発現用ベクターに移植した。５種全ての抗体では、ＶＨ３−２３ヒト重鎖生殖細胞系断片が使用されている。可変重鎖を、制限酵素ＭｆｅＩ及びＢｓｔＥＩＩによる消化により可溶性Ｆａｂ発現ベクターから取り出した。その結果生じた断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製、米国カリフォルニア州）を使用してアガロースゲル電気泳動により精製し、ＭｆｅＩ／ＢｓｔＥＩＩで消化したｐＲＲ２５３ベクター（Ｒａｃｈｅｌ  Ｒｅｎｎａｒｄ氏）にライゲーションした。その結果生じたプラスミドは、ヒトＩｇＧ４．Ｐの抗ＩＧＦ１Ｒ  ＶＨ及び定常領域が後続する重鎖シグナルペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＨＳ、配列番号１２７）を含有する。
【０５８３】
５種の抗体のうち４種の、Ｍ１２−Ｇ０４、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１は、κ軽鎖を含有する。可変軽鎖をプライマーによるＰＣＲで増幅して、ＥｃｏＲＶ部位５’及びＢｓｇＩ３’を可変領域に導入した。その結果生じた断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製、米国カリフォルニア州）を使用してアガロースゲル電気泳動により精製し、ＴＯＰＯ２．１ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国カリフォルニア州）にライゲーションした。可変κ軽鎖を、制限酵素ＥｃｏＲＶ及びＢｓｇＩで消化することによりＴＯＰＯベクターから取り出し、精製した。免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド（ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ、配列番号１２８）及び定常κドメインを含有する、ＥｃｏＲＶ／ＢｓｇＩで消化したｐＲＲ２３７ベクターに、断片をライゲーションした。その結果生じたベクターをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、発現カセット全体（シグナル配列、可変及び定常κドメイン）を精製し、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで消化したｐＲＲ２２３にライゲーションした。
【０５８４】
Ｍ１２−Ｅ０１抗体は、λ軽鎖を含有する。可変軽鎖をプライマーによるＰＣＲで増幅して、可変領域のＡｇｅＩ部位５’を導入した。その結果生じた断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社製、米国カリフォルニア州）を使用してアガロースゲル電気泳動により精製し、ＴＯＰＯ２．１ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国カリフォルニア州）にライゲーションした。可変λ軽鎖を、制限酵素ＡｇｅＩ及びＡｖｒＩＩで消化することによりＴＯＰＯベクターから取り出し、精製した。免疫グロブリン軽鎖シグナルペプチド（ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ、配列番号１２９）及び定常λドメインを含有する、ＡｇｅＩ／ＡｖｒＩＩで消化したｐＸＷ３４７ベクター（Ｘｉｎ  Ｗａｎｇ氏）に、断片をライゲーションした。その結果生じたベクターをＮｏｔＩで消化し、発現カセット全体（シグナル配列、可変及び定常λドメイン）を精製し、ＮｏｔＩで消化したｐＲＲ２２３にライゲーションした。
【０５８５】
プラスミドＤＮＡを使用して、抗体タンパク質の一過性発現用の２９３Ｅ細胞を形質移入した。1.２μｇの各（重鎖及び軽鎖）プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ社製Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ形質移入プロトコール（Ｑｉａｇｅｎ社製、米国カリフォルニア州）を用いて２×１０６細胞に形質移入した。細胞を３７℃で３日間インキュベートした。上清を回収し、全長抗体をウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡ法の両方で確認した。全長ＩｇＧ４．ＰがＩＧＦ−１Ｒに結合する能力を、ＥＬＩＳＡにより確認した。
【０５８６】
（実施例９）
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を産生するＣＨＯ細胞系の開発
この例では、全長ヒンジ修飾ａｇｌｙガンマ４、κ（本明細書では「ａｇｌｙ．ＩｇＧ４．Ｐ」又は「Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ」と呼ぶ）抗体として、Ｆａｂ  Ｍ１３−Ｃ０６の結合ドメインを含む抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の発現に関する詳細な説明を提供する。本明細書に記載されている他のＦａｂ、つまり表３に列挙されているものを、同様の方法で発現させた。Ｍ１３−Ｃ０６の可変及び定常領域はヒト配列由来である。軽鎖及び重鎖可変領域全体は、ＤＹＡＸファージディスプレイ技術によりヒトＩＧＦ−１Ｒに対して産生されたＦａｂに由来する。可変並びに軽鎖定常領域を、選択的スプライス発現ベクターにサブクローニングした。この選択的スプライス配置は、２つのスプライス受容体を有する単一スプライス供与体の使用により軽鎖及び重鎖を連結し、各スプライス受容体が２つの鎖のうちの１つをコードする転写産物を産生する。免疫グロブリン遺伝子をコードする発現ベクターＤＮＡを、インスリン非依存性チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ  ＤＧ４４ｉ）にエレクトロポレーションした。ＣＨＯトランスフェクトーマ（細胞系４０Ｂ５）を産生用に選択した。
【０５８７】
「空」発現ベクターであるｐＸＷＵ００７は、ヒトガンマ４定常領域（重鎖）並びに哺乳動物細胞における遺伝子発現用に別々のプロモータ−エンハンサー及びポリアデニル化領域を含有するが、可変ドメインを含有しない。発現及び翻訳されると、重鎖ポリペプチドは、２つのアミノ酸置換、Ｓ２２８Ｐ及びＴ２９９Ａを含有し、それぞれ「半抗体（half-antibody）」形成を低減し、Ｎ結合グリコシル化を除去する。
【０５８８】
Ｍ１３−Ｃ０６の軽鎖遺伝子の対応する可変（ＶＬ）及び定数（ＣＬ）ドメイン、並びにＭ１３−Ｃ０６の重鎖遺伝子の可変（ＶＨ）ドメインに由来する相補的ＤＮＡを、発現ベクターｐＸＷＵ００７にクローニングした。ｐＸＷＵ００７ベクターは、ヒト重鎖定常領域のすぐ上流に軽鎖及び可変重鎖ｃＤＮＡ全体を挿入するためのクローニング部位を含有する。Ｉｇ遺伝子に加えて、この発現ベクターは、哺乳動物細胞での選択に使用することができるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含有する。
【０５８９】
その後、その結果生じた発現ベクターをＣＨＯ細胞に形質移入して、抗ＩＧＦ−１Ｒを分泌するＣＨＯ細胞系（４０Ｂ５）の産生を開始させる。
【０５９０】
ＰＸＷＵ０２２を、ＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションした。免疫グロブリン軽鎖特異的ＰＣＲプライマーを使用して、Ｆａｂ軽鎖ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。５’特異的オリゴ配列は、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社製抗ＣＤ２３分子の軽鎖に由来する天然シグナルペプチドを含んでいた。５’及び３’オリゴは、中間体ベクター（ｐＨＬＰ０２５）にサブクローニングするためのＳｆｉＩ及びＡｓｃＩ制限エンドヌクレアーゼ認識配列をそれぞれ含有する。合成重鎖シグナルペプチドを含んでいた５’オリゴを使用して、ＶＨ  ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。５’及び３’オリゴは、中間体ベクター（ｐＨＬＰ０２９）にサブクローニングするためのＮｃｏＩ及びＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼ認識配列をそれぞれ含有する。
【０５９１】
軽鎖５’ オリゴ及びＶＨ３’オリゴと、テンプレートとしてｐＨＬＰ０２５及びｐＨＬＰ０２９とを使用したオーバーラップＰＣＲを使用して、軽鎖及びＶＨ領域を１つのｃＤＮＡセグメントに組合せた。その結果生じた産物をｐＸＷＵ００７のＤｒａＩＩＩ部位にサブクローニングし、このようにして最終の選択的スプライス発現ベクターｐＸＷＵ０２２を生成した。この選択的スプライス配置は、一次転写産物の選択的スプライシングにより単一プロモータから２つの転写産物を産生する。天然ＣＭＶスプライス供与体は、準最適なスプライス受容体にスプライスされて軽鎖をコードする転写産物を産生するか、又は天然ＣＭＶスプライス受容体にスプライスされて重鎖をコードする転写産物を産生するかのいずれかである。準最適なスプライス受容体は、両転写物を同じような量で産生するように設計されている。
【０５９２】
ＣＨＯ細胞にエレクトロポレーションする前に、ＤＮＡベクター（ｐＸＷＵ０２２）を、ＨＥＢＳ緩衝液で約７００ｎｇ／μＬの濃度に調製した。５回のエレクトロポレーションを、種々の濃度のＤＮＡ（１５、２０、３０、４０、及び４５μｇ）を使用して実施した。各エレクトロポレーションは、０．７ｍｌ無菌ＨＥＢＳ緩衝液に４×１０６個の対数増殖期ＣＨＯ細胞、及び０．１ｍＬ  ＨＥＢＳ中のＤＮＡを含有する（全容積は０．８ｍＬ）０．４ｃｍ使い捨てキュベット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で実施した。２９０ボルト、９５０マイクロファラデーに設定したＢｉｏ−Ｒａｄ社製Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸＣＥＬＬを使用して、細胞にショックを与えた。次いで、ショックを与えた細胞を室温で１０分間静置させ、その後１０ｍＬの室温無インスリンＣＨＯＭ１６培地と混合し、遠心分離し（１０００ｒｐｍで３分間）、吸引した。その後、細胞を１２ｍＬの（室温）無インスリンＣＨＯＭ１６培地に再懸濁し、Ｔ−７５組織培養フラスコに移した。
【０５９３】
細胞及び培地：エレクトロポレーション前に、１×ヌクレオシドを添加した無血清培地（ＣＨＯＭ２４）でＣＨＯ細胞を増殖させた。ＣＨＯＭ２４は、いかなる動物成分も含有しない化学的に明確な自家製調合培地である。メトトレキサート選択を、無ヌクレオシドの化学的に明確なＣＨＯＭ１６及びＣＨＯＭ２４培地で実施した。
【０５９４】
エレクトロポレーション後に、４×１０６個のＣＨＯ細胞をＴ−７５フラスコに貯溜した。ＤＨＦＲ発現の選択は、細胞を無ヌクレオシド培地に接種して直ぐに開始した。最終的に１２５ｍＬ振とうフラスコ中のＣＨＯＭ２４で細胞を増殖させた（約３週間）。クローン細胞系を単離するために、形質移入した安定的貯留を希釈し、４つの９６ウエルプレートの２００μＬ  ＣＨＯＭ１６に１細胞／ウエルで播種した。抗体力価についてスクリーニングするまで、プレートを３６℃で維持した。
【０５９５】
ヒトκ鎖に特異的なＥＬＩＳＡを使用して細胞上清をアッセイすることにより、ＣＨＯコロニーを免疫グロブリン産生についてスクリーニングした（播種後２１日目〜２８日目）。ＥＬＩＳＡで使用した捕捉抗体は、ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）であり、検出抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したポリクローナルヤギ抗ヒトκ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）であった。最も大量の免疫グロブリンを分泌するコロニーを増殖させた。
【０５９６】
接種した１９２０個のウエルのうち合計３８１個のほぼコンフルエントなウエルをアッセイした。３８１個のウエルのうち、６０個をさらなる研究用に増殖させ、これら６０個のうち４個を増幅用に選択した（１５Ａ７、４０Ｂ３、４０Ｂ５、４０Ｆ６）。
【０５９７】
（実施例１０）
完全ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ  ＩｇＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の精製及び特徴付け：
ＣＨＯ細胞で産生された抗体を、下記の方法により精製及び特徴付けした。
【０５９８】
プロテインＡ捕捉：３カラム容積の１×ＰＢＳ（平衡緩衝液）を用いて１００〜１５０ｃｍ／時間でプロテインＡカラムを事前に平衡化する。レジン１ミリリットル当たり最高１０ｍｇのαＩＧＦ−１Ｒを有する上清を１５０ｃｍ／時間で負荷する。負荷後、５カラム容積の平衡緩衝液でカラムを洗浄する。その後、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．０で上向流方向にステップ溶出する。所望の画分を収集し、２ＭのＴｒｉ塩基を用いて中性ｐＨに滴定する。収集画分を１×ＰＢＳに対して透析し、物質を濃縮してサイズ排除ステップ用に調製する。
【０５９９】
ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００（サイズ排除）凝集体除去ステップでは、ＳＵＰＥＲＤＥＸ（商標）２００を、１．５カラム容積の１×ＰＢＳを用いて３６ｃｍ／時間の流速で平衡化し、その後タンパク質を負荷し、所望の画分を収集することが含まれた。
【０６００】
同一性試験を以下のように実施した：
１）分子量測定がエレクトロスプレー質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳＤ）で実施された質量分析法による完全質量の分析。解析前に試料を還元して、ジスルフィド結合を除去した。デコンボリューションした質量スペクトルは、重鎖及び軽鎖の質量を表す。
【０６０１】
２）Ｎ末端配列解析を、オンラインＰＴＨアナライザーを装備したＡＢＩ社製タンパク質配列決定装置を使用して、エドマン分解により実施した。軽鎖及び重鎖の最初のアミノ酸の配列を同定した。
【０６０２】
３）質量分析によるペプチドマッピング：トリプシンペプチドマップ又は／及びＥｎｄｏＬｙｓＣペプチドマップを実施して、各ペプチドから生成されたＬＣ／ＭＳデータを解析することにより完全な配列範囲を取得した。加えて、酸化及び脱アミド化の部位及び量の決定を検出した。
【０６０３】
純度試験を以下のように実施した。１）ＳＤＳ−Ｐａｇｅ又はＣＥ−ＳＤＳ：還元及び非還元試料、この技術を使用して抗体切断、凝集体、及び不純物を測定し、２）ＬＳ及びＲＩ技術と共にＳＥＣ−ＨＰＬＣを使用して、凝集体及び断片を測定し、光散乱により、試料成分のモル質量を決定した。３）ＳＤＳゲル又はキャピラリーＩＥＦ法を使用して、Ｃ−及びＮ−末端の不均質性及び／又は脱アミド化から起因し得る電荷アイソフォームの等電点電気泳動パターン及びｐＩ分布を決定した。
【０６０４】
最後に、エンドトキシン濃度を、リムルス属変形細胞溶解物（ＬＡＬ）動的混濁法（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｔｕｒｂｉｄｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）により測定した。
【０６０５】
図５は、Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ型の完全ヒトＭ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３抗体の非還元及び還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ｇ４．Ｐ型及びＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ型の抗体Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｂ０１、及びＭ１４−Ｇ１１が両方とも産生された。Ｍ１２−Ｅ０１及びＭ１２−Ｇ０４は、Ｇ４．Ｐ型として産生された。
【０６０６】
（実施例１１）
完全ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合活性
ＥＬＩＳＡで試験したＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ型及びＧ４．Ｐ型抗体の可溶性ＩＧＦ−１Ｒに対する結合活性。０．０２５Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中２．５μｇ／ｍｌの可溶性ＩＧＦ−１受容体融合タンパク質（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社製）を、９６ウエルプレート（ＩＭＭＵＬＯＮ２  ＨＢ、Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ＃３４５５）に５０μｌ／ウエルでコーティングし、４℃で終夜インキュベーションした。プレートを、０．０２５％ツイーン２０を加えたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カタログ＃９２４０）、ｐＨ７．４を用いて、Ｓｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ３００（Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）で洗浄し、ｐＨ７．４のＰＢＳ中１％脱脂乳、０．０５％ツイーン２０を含有する緩衝液でブロッキングし、その後室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、０．０２５％ツイーン２０を加えたＰＢＳを用いてＳｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ３００でプレートを洗浄した。アッセイのために、次に、可溶性ＩＧＦ−１受容体でコーティングしたプレートを、ＰＢＳ中１％脱脂乳、０．０５％ツイーン２０で５０μｌ／ウエルに希釈した様々な濃度の対照及び試験抗体と共にインキュベートした。室温で１時間インキュベーションした後、０．０２５％ツイーン２０を加えたＰＢＳを用いてＳｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ３００でプレートを洗浄した。ＰＢＳ中１％脱脂乳、０．０５％ツイーン２０で２０００倍に稀釈したヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製  カタログ＃２０６００５）を５０μｌ／ウエルで添加して、結合した抗体を検出した。室温で１時間インキュベーションしたプレートを、０．０２５％ツイーン２０を加えたＰＢＳを用いてＳｋａｎ  Ｗａｓｈｅｒ３００で洗浄した。ＴＭＢ溶液（ＫＩＲＫＥＧＡＡＲＤ＆ＰＥＲＲＹ  ＬＡＢＳ社製  カタログ番号５０−７６−００）を１００μｌ／ウエルで添加し、２分後、５０μｌ／ウエルの４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４（ＬａｂＣｈｅｍ社製、カタログ＃ＬＣ２５８３０−１）で反応を停止させた。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製プレートリーダーを使用して、４５０ｎｍの吸光度を測定し、ＴＭＢのバックグラウンドを５４０ｎｍで測定した。ＳＯＦＴＭＡＸ  ＰＲＯソフトウェアパッケージ  バージョン４．３  ＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用して、データを分析した。
【０６０７】
図６（Ａ）は、Ｇ４型のＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４の濃度依存的結合を示しているが、対照抗体ＩＤＥＣ−１５１（Ｇ４．Ｐ）は、ＩＧＦ−１Ｒ．Ｆｃに対するいかなる結合も示さなかった。
【０６０８】
図６（Ｂ）は、ＥＬＩＳＡによる、可溶性ＩＧＦ−１Ｒ．Ｆｃに対するＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ型のＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｂ０１の濃度依存的結合を示す。陰性対照として使用した特異性が無関係なＧ４．Ｐ抗体（ＩＤＥＣ−１５１）は、ＩＧＦ−１Ｒ．Ｆｃに対するいかなる結合も示さなかった。
【０６０９】
腫瘍細胞上に発現される野生型ＩＧＦ−１Ｒに対するヒト抗体の結合活性を、フローサイトメトリーで決定した。腫瘍細胞系ＭＣＦ−７及びＣａｌｕ−６を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カタログ＃３０００Ａ）及び５０μ／ｍｌゲンタミシン（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ＃１５７５００６０）で補完した最小必須イーグル培地（ＡＴＣＣ、カタログ＃３０−２００３）で培養した。Ｐａｎｃ−１、Ｃｏｌｏ−２０５、ＮＣＩ−Ｈ２３、及びＺＲ−７５を、１０％ＦＢＳ及び５０μｇ／ｍｌゲンタミシンで補完したＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ、カタログ＃３０−２００１）で培養した。トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ＃Ｔ４０４９；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国））溶液を使用して、培養容器から接着細胞を取り出した。
【０６１０】
細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カタログ＃  ９２４０）、ｐＨ７．４で２回すすぎ、トリプシン処理し、ＰＢＳ及び１０％ＦＢＳで１回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中０．０５％アジ化ナトリウム、２％ＦＢＳ、１０％正常ヤギ血清、及び１００μｇ／ｍｌ正常ヤギＩｇＧ）で１０７細胞／ｍｌに調節し、少なくとも１５分間氷上に置いた。対照及び試験抗体を、コーニング社製３７９０プレートに等分した。５０μｌ／ウエルの細胞を、コーニング社製３７９９プレートに添加した。コーニング社製３７９０プレートからの一次抗体を、コーニング社製３７９９プレートのそれぞれのウエルに５０μｌ／ウエルで添加した。次に、細胞（０．５×１０６細胞／試料）を氷上で４５分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを４分間１５００ｒｐｍで遠心分離し、その後上清を吸引した。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。プレートを４分間１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を吸引した。ＦＡＣＳ緩衝液で７５０倍に稀釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＲＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、カタログ＃２０４０−０９）を、１００μｌ／ウエルで添加した。次に、細胞（０．５×１０６細胞／二次抗体）を氷上で４５分間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で５００倍に稀釈した７ＡＡＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製、カタログ＃Ａ１３１０）を、５０μｌ／ウエルで添加し、氷上で５分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを４分間１５００ｒｐｍで遠心し、その後上清を吸引した。細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。プレートを４分間１５００ｒｐｍで遠心分離し、上清を吸引した。細胞を１００μｌ／ウエルのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。細胞を、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を有する１２×７５ｍｍ  ＦＡＣＳチューブに移した。最後に、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（両方ともＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）で、細胞の蛍光強度を試験した。
【０６１１】
図７は、ＭＣＦ−７細胞上で発現されたＩＧＦ−１Ｒに対する、Ｍ１３Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、及びＭ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐの濃度依存的結合を示す（図７（Ａ））。抗体の細胞表面結合特異性を、ＩＧＦ−１Ｒ／３Ｔ３形質移入体及び３Ｔ３親細胞に対する結合性を試験することにより確認した。全てのリード抗体が、ＩＧＦ−１Ｒを発現する３Ｔ３に対して特異的活性を示したが、３Ｔ３細胞に対しては示さなかった（図７（Ｂ））。
【０６１２】
（実施例１２）
完全ヒト抗体によるＩＧＦ−１Ｒに対するリガンド結合の阻害
可溶性ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２結合を阻止するＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ型及びＧ４．Ｐ型のヒト抗体の能力を決定した。ＩｇＧ４型のＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｍ１４−Ｂ０１、Ｍ１２−Ｅ０１、及びＭ１２−Ｇ０４は、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２結合を両方とも阻止したが、この実験では、Ｍ１４−Ｃ０３は、ＩＧＦ−２のみを阻止した（図８（Ａ）及び（Ｂ））。
【０６１３】
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のリガンド阻止能力を、実施例３に記載されている、固相ＲＩＡ捕捉法により決定した。手短に言えば、種々の濃度の抗体（１００ｎＭ〜０．０１ｎＭ）を、１００，０００ｃｐｍの１２５Ｉ標識ＩＧＦ−１又は１２５Ｉ−ＩＧＦ−２と共に、ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを事前に固定化（２００ｎｇ／ウエル）しておいた９６ウエルＩＭＭＵＬＯＮ２プレートのウエルで同時インキュベートした。室温で１時間インキュベーションした後、ウエルを洗浄し、ガンマ計数器で結合放射能を計数した。アイソタイプ一致陰性抗体対照ＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）を使用した。阻害パーセント（％）は、［１−（Ａｂの平均ＣＰＭ）／（緩衝液の平均ＣＰＭ）］×１００％として計算した。
【０６１４】
結果は、完全ヒト抗体Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４−Ｂ０１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１２−Ｅ０１．Ｇ４．Ｐ、及びＭ１２−Ｇ０４．Ｇ４．Ｐは、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の結合を両方とも阻止するが、この実験では、抗体Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ及びＭ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−２の結合のみを阻止したことを示している。図８（Ａ）及び（Ｂ）を参照されたい。
【０６１５】
（実施例１３）
完全ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体による腫瘍細胞増殖の阻害
ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２促進性腫瘍細胞増殖を阻止する抗体の能力を、細胞生存率アッセイを使用して試験した。
【０６１６】
ＮＣＩ−Ｈ２３、Ｃａｌｕ−６、Ｃｏｌｏ−２０５、Ｐａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ）腫瘍系は、ＡＴＣＣから購入した。細胞系を、ＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、及び５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含有する完全増殖培地で増殖させた。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）を使用して、培養容器から接着細胞を取り出した。リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２は、ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社製であった。発光アッセイ用の９６ウエル透明底プレートは、Ｗａｌｌａｃ社から購入した。
【０６１７】
８０％単層に増殖した細胞を、トリプシン処理し、洗浄し、再懸濁し、９６ウエルプレート中の２００μｌの２％増殖培地に、ＮＣＩ−Ｈ２３及びＣｏｌｏ−２０５細胞の場合は８×１０３細胞／ウエルで、及びＣａｌｕ−６、Ｐａｎｃ−１、及びＢｘＰＣ−３細胞の場合は５×１０３細胞／ウエルで播種した。２４時間後、培地を、１００μｌの無血清培地（ＳＦＭ）と置換し、５０μｌの連続希釈した４×濃度の抗体を添加した。３７℃でさらに１時間インキュベーションした後、４×濃度の５０μｌ  ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２を添加し、細胞増殖を測定した４８時間まで３７℃でインキュベートした。処理は全て三重反復で実施した。細胞増殖を、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、マディソン、米国ウィスコンシン州）を使用して測定した。試薬及びＳＦＭの１：１混合液を、２００μｌ／ウエルで添加した。発光を、Ｗａｌｌａｃ社製（ボストン、米国マサチューセッツ州）プレートリーダーで検出した。
【０６１８】
種々のヒトＩｇＧ４型の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、Ｈ−２３（ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２）、Ｃａｌｕ−６（ＩＧＦ−２）細胞においてＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２促進性細胞増殖の阻害を示した。（図９（Ａ）〜（Ｃ））。他の細胞系は同様の傾向を示した（例えば、実施例２０を参照）。
【０６１９】
（実施例１４）
完全ヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体によるＩＧＦ−１Ｒの内部移行
ＭＣＦ−７細胞を、染色手順の４８時間前に、１ウエル当たり５０，０００個の細胞で８ウエルチャンバースライド（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のコラーゲン１型コーティング培養スライド、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）  ＃３５４６３０）に播種した。細胞を、規定通りに２０継代未満で維持した。染色手順の当日に、各ウエルから培地を取り除き、５００μｌの冷インキュベーション緩衝液（ＭＥＭイーグルＡＴＣＣ＃３０−２００３＋１％ＢＳＡ）と置換した。細胞をこの緩衝液で２回洗浄し、各洗浄は３分間であった。その後、２５０μｌの各試験ｍＡｂ又はヒトＧ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、１０μｇ／ｍｌの濃度で適切なウエルに添加し、インキュベーション培地で希釈し、氷上で１時間インキュベートした。マウス抗ヒト−ＩＧＦ−１Ｒ抗体（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ／ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ社製、クローン２４−３１  カタログ＃ＭＳ−６４１）を陽性対照抗体として使用して、内部移行の度合いを比較した。氷上で１時間インキュベーションした後、時点ゼロ（ｔ＝０’）のスライドを５００μｌの冷洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋２％ヤギ血清）で洗浄し、各洗浄は３分間であった。その後、ｔ＝０のスライドを、５００μｌの４％パラホルムアルデヒド（１６％原液からＰＢＳで希釈；ＥＭＳ社製  ＃１５７１０）を用いて室温で１５分間固定した。その後、ｔ＝０のスライドを、冷洗浄緩衝液で３回再洗浄し、各洗浄は３分間であり、その後氷上に静置した。その間、残りのスライドを、指定の時点（１５及び６０分）まで３７℃のインキュベーターに収納した。それらのインキュベーション時間の終わりで、各スライドを、上記と同じ手順に従って洗浄し、固定し、氷上に置いた。その後、スライドは全て、２００μｌの冷透過化緩衝液（洗浄緩衝液＋０．５％トリトン−Ｘ）を用いて１０分間氷上で透過化した。その後、スライドは全て、５００μｌの冷却洗浄緩衝液で３回洗浄し、各洗浄は３分間であった。最初に４℃で１０分間１０，０００ｒｐｍで原液バイアル遠心した後で、二次抗体を、洗浄緩衝液で１：１０００に稀釈して調製した（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ｍＡｂｓはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製  ＃Ａ１１０２９、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｇ４抗体はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製＃Ａ１１０１３）。２５０μｌの希釈二次抗体を各ウエルに添加し、暗所で（覆いをして）４０分間室温でインキュベートした。スライドを５００μｌの冷洗浄緩衝で３回再洗浄した。最終洗浄時に、緩衝液を廃棄してウエルを全て空にしておいた。その後、提供されている分解ツールを使用して、チャンバーをスライドから取り外し、カバーガラスを、ＤＡＰＩを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤でマウントした（Ｖｅｃｔｏｒ社製＃Ｈ−１５００、Ｈａｒｄ  Ｓｅｔ（商標））。スライドを暗所で終夜４℃で保管して、封入剤を乾燥させた。
【０６２０】
スライドの写真を、ＬａｓｅｒＳｈａｒｐ２０００プログラム（ＢｉｏＲａｄ社製  ｖ５．２）を使用して共焦点顕微鏡で撮影し、カルマン１０平均した青色成分及び緑色成分の重ね合わせとして表示した。
【０６２１】
Ｍ１３−Ｃ０６によるＩＧＦ−１Ｒの内部移行。Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、０、１５、及び６０分の時点で共焦点顕微鏡により観察した。抗マウスＩＧＦ−１Ｒ抗体クローン２４−３１は陽性対照であった。マウス７Ｆ２抗体及びヒトＧ４．Ｐ抗体ＩＤＥＣ−１５１．Ｇ４．Ｐは、アイソタイプ一致陰性対照であった。Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、６０分でＩＧＦ−１Ｒの迅速な内部移行を示したことが観察された（データ非表示）。Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ及びＭ１４−Ｇ１１．４．Ｐは両方とも全て、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体に類似した内部移行特性を示した（データ非表示）。予想通り、陽性対照であるクローン２４−３１も受容体を内部移行させたが、アイソタイプ一致陰性対照（マウス７Ｆ２及びヒトＧ４、ＩＤＥＣ−１５２．Ｇ．Ｐ（霊長類化抗体））は、結合も内部移行もしなかった（データ非表示）。
【０６２２】
加えて、受容体内部移行の速度を、特定のマウスモノクローナル抗体についてＦＡＣＳに基づく方法により測定した。７０％コンフルエント単層に増殖したＭＣＦ−７細胞を、細胞解離緩衝液（Ｇｉｂｃｏ社製  カタログ＃１３１５１−０１４）を用いてフラスコから取り上げた。細胞を培地に再懸濁し、５×１０６個の細胞を、１２×７５ｍｍチューブ（ファルコン社製  カタログ＃３５２０５４）に添加し、各チューブは、異なる試験ｍＡｂを表した。アジ化物（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）を含有しない０．５ｍｌ  ＦＡＣＳ緩衝液中１０μｇ／ｍｌのｍＡｂを、その対応するチューブに添加し、並びに対照チューブは内部移行の実験誤差を測定するために抗体を有していなかった。チューブを氷上で１時間１５分インキュベートし、その後洗浄し、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液で再構成した。１００μｌの各試料を取り出して、内部移行を防止するために氷上に置いておいた９６ウエルＵ型底プレート（ＮＵＮＣ社製  ＃１６３３２０）の１つのウエルに入れ、時点ゼロ（ｔ＝０）と称した。これを１００％のＡｂ結合対照として使用した。その後、チューブを３７℃水浴に移動し、１００μｌ試料を時点（ｔ）＝５、１０、２０、４０、及び６０分（後に５、１０、１５、３０、及び６０分に変更）で取り出し、氷上の９６ウエルＵ型底プレートの別々のウエルに入れた。全ての試料を収集した後で、プレートを４℃の遠心機で１２００ｒｐｍで遠心して細胞をペレットにした。受容体の内部移行を検出するために添加した抗体は、細胞表面に残っている受容体を検出するための抗ＣＤ２２１−ＰＥ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製  カタログ＃５５５９９９−抗ＩＧＦ−１Ｒ；１０μ／１００μｌ試料）、又は細胞表面に残っている抗体を検出するためのヤギ抗マウス−ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂ社製  カタログ＃１１５−１１６−１４６；５μｇ／ｍｌ）のいずれかであった。試料を、０．１％アジ化ナトリウムを含有するＦＡＣＳ緩衝液で１時間インキュベートし、１回洗浄し、アジ化物を含有するＦＡＣＳ緩衝液で２００μｌの最終容積にした。その後、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（ＢＤ社製）を使用して、試料を実行及び収集し、幾何平均を決定した。また、細胞表面に結合したＰＥ分子の数を定量化するためにＰＥ標識Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズ（ＢＤ社製  ＃３４０４９５）を実行し、Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズは試料と同じＦＬ２設定で実行する。ビーズに結合したＰＥ分子の数はそれらの包装に示されており、試料幾何平均及びビーズの幾何平均を使用して、細胞表面に結合したＰＥ分子の数を定量化することが可能である。ＦＡＣＳアッセイは、試験したマウスモノクローナル抗体が、ＩＧＦ−１Ｒの内部移行を促進したことを示した（データ非表示）。
【０６２３】
（実施例１５）
完全ヒト抗体によるＩＧＦ−１Ｒ媒介性シグナル伝達の阻害
パートＩ：ＭＣＦ−７細胞におけるシグナル伝達の阻害  
【０６２４】
ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達に対するヒト抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の効果を、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳腺癌細胞）を使用して評価した。ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２媒介性ＩＧＦ−１Ｒ受容体リン酸化を阻止する抗体の能力を、実施例４に記載のように決定した。ＩｇＧ４型の完全ヒト抗体は全て良好な阻害を示し（ＥＣ５０＜１ｎＭ）、ＩＧＦ−１Ｒのリン酸化を阻害した（図１０（Ａ及びＢ））。
【０６２５】
下流のシグナル伝達に対する効果を検出するために、細胞溶解産物を、実施例４に記載のように生成した。シグナル伝達実験のため、対照及び試験抗体を、血清飢餓後に、１００ｎＭ、１５ｎＭ、５ｎＭ、及び１ｎＭで、３５０μｌの新しい無血清培地に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。１３ｎＭのヒト組換えＩＧＦ−１又は２７ｎＭのＩＧＦ−ＩＩ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、＃２９１−Ｇ１及び＃２９２−Ｇ２）を、３５μｌ無血清培地のウエルに添加し、１５分間室温でインキュベートした。細胞を溶解し、回収した試料を、４〜１２％Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓゲルを使用して分離し、ニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に固定化した。.  ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達経路を、Ｔｈｒ３０８部位でのホスホ−Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、＃４０５６（ダンバーズ、マサチューセッツ州  アメリカ合衆国））及びＴｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４部位でのホスホ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、＃９１０１）及び抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、＃７０７１）で検出した。バンドを、ＥＣＬルミノール試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、＃ＲＰＮ２１０９）及びオートラジオグラフィーを使用して視覚化した。各ブロットから抗体を取り除き、それぞれ総Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、＃９２７２）又は総ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、＃９１０２）及び抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰを再探索した。バンドを、ＥＣＬルミノール試薬及びオートラジオグラフィーを使用して視覚化した。
【０６２６】
Ａｋｔ及びＭＡＰＫリン酸化などの下流のシグナル伝達事象に対する抗体の効果を決定した。自己リン酸化からの細胞溶解産物を、ポリクローナルＩＧＦ−１Ｒβ抗体−アガロース結合体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃ＳＣ−７１３）で免疫沈殿した。回収した受容体タンパク質を、４〜１２％Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓゲルを使用して分離し、ニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に固定化した。. 受容体を、抗ホスホ−ＩＧＦ−１Ｒ部位Ｔｙｒ１１３１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、＃３０２１）又は抗ＩＧＦ−１Ｒβ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、＃ＳＣ−９０３８）及び抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、＃７０７１）で検出した。バンドを、ＥＣＬルミノール試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、＃ＲＰＮ２１０９）及びオートラジオグラフィーを使用して視覚化した。（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
【０６２７】
図１１Ａ及びＢは、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２媒介性のＡｋｔ及びｐ４２／４４  ＭＡＰＫのリン酸化を、用量依存的様式で阻害したことを示す。特に、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ  ＩＧＦ−１Ｒ抗体は、アミノ酸残基Ｓｅｒ４７３におけるＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２誘導性Ａｋｔリン酸化の阻害により実証されるように、ＭＣＦ７細胞におけるリガンド誘導性Ａｋｔシグナル伝達を、試験した全ての濃度（つまり、１〜１００ｎＭ）で阻害した（図１７）。対照抗体は１００ｎＭで試験したが、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．ｐ．ａｇｌｙは１００、１５、５、及び１ｎＭで試験した。特異性が無関係のヒトＧ４型の抗体である抗体ＩＤＥＣ−１５２を、陰性対照として使用した。ＩＧＦ−１Ｒに対するマウスモノクローナル抗体である抗体ＩＲ３を、陽性対照として使用した。加えて、Ｍ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ及びＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ全長抗体も、Ａｋｔ及びｐ４２／４４  ＭＡＰＫ活性化のＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２促進性シグナル伝達を阻害した（データ非表示）。
【０６２８】
パートＩＩ：Ａ５４９、Ｃａｌｕ−６、及びＨ１２９９細胞におけるシグナル伝達の阻害
【０６２９】
Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の調節サブユニットであるｐ８５とインスリン受容体基質（ＩＲＳ−１）との結合を分断させる能力を、共免疫沈降アッセイにより腫瘍細胞系を用いて決定した。特に、ＩＲＳ−１は、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体に感受性のあるＮＳＣＬＣ細胞系では、ＰＩ３Ｋサブユニットｐ８５にＩＧＦ−１Ｒ依存的様式で結合する。したがって、２つの非小細胞肺癌細胞系（ＮＳＣＬＣ）Ａ５４９及びＨ１２９９（Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙに応答する）並びに１つのＮＳＣＬＣ細胞系Ｃａｌｕ−６（Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙにそれほど応答しない）を、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ又は対照抗体（ＩＤＥＣ−１５１）の存在下で２４時間増殖させた。細胞溶解産物を抗ｐ８５抗体で免疫沈殿し、抗ＩＲＳ−１抗体（上段のブロット）及び抗ｐ８５（下段のブロット）抗体を用いたウェスタンブロット解析にかけた（図２３）。
【０６３０】
このアッセイのために、ヒト肺腫瘍細胞系Ａ５４９、Ｃａｌｕ−６、及びＮＣＩ−１２９９細胞を、ＡＴＣＣから購入し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ培地１６４０で維持した。１００ｍｍシャーレに１シャーレ当たり３×１０６細胞で細胞を播種し、２４時間培養し、その後５％ＦＢＳの存在下で２４時間、１００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ又はＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４．Ｐアイソタイプ一致陰性対照抗体）で処理した。細胞溶解産物を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製（ダンバーズ、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）の１％トリトンＸ−１００溶解緩衝液で調製した。免疫沈降のために、抗ｐ８５抗体（カタログ＃０６６４９、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製（現在はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社、コンコード、マサチューセッツ州（アメリカ合衆国）の一部）を、溶解産物に添加し（溶解産物１〜２ｍｇ当たり４μｇの抗体）、４℃で終夜インキュベートした。その後、免疫複合体を、４℃で２時間プロテインＧアガロースビーズと混合することにより捕捉した。免疫沈降物を氷冷溶解緩衝液で洗浄し、２×ＬＤＳ（ドデシル硫酸リチウム）試料緩衝液中で沸騰させた後で、ＮＵＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ  ４〜１２％Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓゲル電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カールズバッド、カリフォルニア州（アメリカ合衆国））により分離し、ニトロセルロース膜に移動させた。ＩＲＳ−１（カタログ＃０６−２４８、Ｕｐｓｔａｔｅ社製）及びｐ８５（カタログ＃０６−６４９、Ｕｐｓｔａｔｅ社製）抗体はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入し、イムノブロッティングを製造業者のプロトコールに従って実施した。
【０６３１】
結果：
Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、Ａ５４９及びＨ１２９９細胞系では、血清の存在下でＩＲＳ−１とＰＩ３Ｋのｐ８５調節サブユニットとの結合を阻害したが、Ｃａｌｕ−６では阻害しなかった（図２３）。
【０６３２】
（実施例１６）
非ヒト霊長類ＩＧＦ−１Ｒへの抗体交差反応性
抗ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体が、非ヒト霊長類由来のＩＧＦ−１Ｒを認識する能力を試験した。最初に、アカゲザル及びカニクイザルのＩＧＦ−１Ｒをクローニングし、ＣＨＯ細胞で発現させた。抗体全ての結合をフローサイトメトリーにより決定し、共焦点顕微鏡により確認した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、及びＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐは全て、アカゲザル及びカニクイザルＩＧＦ−１Ｒの両方に対して特異的結合活性を示した（データ非表示）。種間交差反応性をさらに研究することにより、Ｍ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ及びＭ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが、マウスＩＧＦ−１Ｒを発現するＣＨＯ細胞に結合することが示された（データ非表示）。
【０６３３】
ＣＨＯ細胞上で表現されたカニクイザルＩＧＦ−１Ｒに加えて、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、この種に由来する顆粒球及び単球上で発現されたカニクイザルマカクＩＧＦ−１Ｒとも交差反応する。（結合の特異性は、可溶性組換えヒトＩＧＦ−１ＲがＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体結合を阻止する能力により実証した（データ非表示））。同様に、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、確立したカニクイザル線維芽細胞系にも結合する。（実施例２５、図２１を参照）。これらの結果は、カニクイザルマカクが、毒性試験を実施した理想的な非げっ歯動物種であることを示す。
【０６３４】
霊長類におけるＩＧＦ−１Ｒ受容体での結果とは対照的に、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＦＡＣＳ分析により評価したところ、免疫細胞（顆粒球、単球、リンパ球）上で発現されたラット又はマウスＩＧＦ−１Ｒに対する交差反応性を示さなかった。
【０６３５】
（実施例１７）
ＩＧＦ−１Ｒ特異的マウスＭａｂの産生
ヒトＩＧＦ−１Ｒに特異的なマウスモノクローナル抗体を、標準的ハイブリドーマ技術により産生した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに由来する脾細胞を、ＩＧＦ−１Ｒを発現するＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞及びＩＧＦ−１Ｒで免疫した。Ｉｇ融合タンパク質を、ＰＥＧ誘導性体細胞融合用に使用した。表４には、抗ＩＧＦ−１Ｒマウスモノクローナル抗体の特性が要約されている。
【０６３６】
選択されたマウス抗体が、幾つかのヒト腫瘍系（肺、Ｈ−２３、Ｃａｌｕ−６；膵臓、ＢｘＰｃ−３、Ｐａｎｃ−１、ＭｉａＰａＣａ、及び結腸、Ｃｏｌｏ２０５）のＩＧＦ／ＩＧＦ−１Ｒ依存性ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖を阻害する能力を、実施例１３に記載のような増殖アッセイにより測定した。図１２（Ａ）〜（Ｆ）は、マウス抗体のうち８種の、１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１の存在下における腫瘍細胞増殖に対する抗体濃度依存性阻害効果を示す。
【０６３７】
ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２促進性腫瘍細胞増殖を阻止する抗体の能力を、ＮＣＩ−Ｈ２３肺腫瘍細胞系を使用して試験した。図１３は、マウスＭＡｂ（Ｐ２Ａ７−３Ｅ１１、２０Ｃ８−３Ｅ８、Ｐ１Ａ２−２Ｂ１１）のうちの３種、及び完全ヒト抗体のうちの１種であるＭ１３Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙに見られた増殖阻害効果の例を示す。全ての抗体が、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２促進性腫瘍増殖の阻害を示した。市販の抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩＲ３）を、陽性対照として使用した。特異性が無関係のマウスＩｇＧ（抗Ｉデクチン、ＩｇＧ１）及びヒトガンマ４型のＩＤＥＣ−１５２抗体を、この実験のアイソタイプ一致対照として使用した。
【０６３８】
（実施例１８）
マウス抗ヒトＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂのクローニング
抗−ＩＧＦ−１ＲマウスハイブリドーマＰ２Ａ７．３Ｅ１１免疫グロブリン可変領域のクローニング  マウスハイブリドーマ細胞に由来する全細胞ＲＮＡを、製造業者の推奨プロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ社製ＲＮｅａｓｙミニキットを使用して調製した。重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製の第一鎖ｃＤＮＡ合成キットを製造業者の推奨プロトコールに従って使用し、ランダム六量体をプライミングのために使用して、全細胞ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによりクローニングした。
【０６３９】
Ｐ２Ａ７．３Ｅ１１可変ドメインのクローニング及びキメラ化を例として詳述する（他のｍＡｂ可変ドメインを同様の方法でクローニング及び特徴付けたが、抗体工学の当業者によく知られている標準的分子生物学的技術を使用したので、簡潔さのため詳述しない）。完全シグナル配列を有するマウス免疫グロブリン可変ドメインのＰＣＲ増幅のために、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）に記載のように、複数のマウス免疫グロブリン遺伝子ファミリーシグナル配列にハイブリダイズする縮重順方向プライマー、及びマウス定常ドメインの５’端部に特異的な単一の逆方向プライマーの混合液を使用した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｔａｑポリメラーゼを使用したＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で２分の初期変性、その後９４℃で１分間の変性、４５℃で１分間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長を３０サイクル。Ｐ２Ａ７重鎖可変ドメインを以下のプライマーを用いて増幅した：５’ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＲ  ＡＴＧ  ＳＡＧ  ＣＴＧ  ＫＧＴ  ＭＡＴ  ＳＣＴ  ＣＴＴ  ３’（Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、及びＳ＝Ｃ／Ｇ）（配列番号１３０）、及び５’ＡＧＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＹＣ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＲＲＣ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＧＡＣ  ３’（Ｒ＝Ａ／Ｇ、及びＹ＝Ｃ／Ｔ）（配列番号１３１）。そのシグナル配列を有するＰ２Ａ７軽鎖可変ドメインを以下のプライマーで増幅した：５’ＧＧＧ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ３’（配列番号１３２）及び５’ＧＣＧ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＧＡ  ３’（配列番号１３３）。ＰＣＲ産物を、製造業者の推奨プロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ社製Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してゲル精製した。精製したＰＣＲ産物を、製造業者の推奨プロトコールに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＴＯＰＯクローニングキットを使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターにサブクローニングした。複数の独立したサブクローンに由来するインサートを配列決定して、ＰＣＲエラーから保護した。
【０６４０】
可変ドメイン配列のＢｌａｓｔ解析により、それらの免疫グロブリンを特定確認した。Ｐ２Ａ７重鎖可変ドメインは、マウスサブグループＩＩ（Ａ）のメンバーである。Ｐ２Ａ７成熟重鎖可変ドメインの配列を、そのＣＤＲ（ＣＤＲ、相補性決定領域はカバット命名に基づく）に下線を引いて以下に示す。
1    QVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGNTFT DYVINWVKQR TGQGLEWIGE
51   IYPGNENTYY NEKFKGKATL TADKSSNTAY MQLSSLTSED SAVYFCARGI
101  YYYGSRTRTM DYWGQGTSVT VSS（配列番号３８）
【０６４１】
Ｐ２Ａ７軽鎖可変領域は、マウスκサブグループＩＶのメンバーである。Ｐ２Ａ７成熟軽鎖可変ドメインの配列を、そのＣＤＲに下線を引いて以下に示す：
1    EVVLTQSPTA MAASPGEKIT ITCSASSTLS SNYLHWYQQK PGFSPKLLIY
51   RTSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTIGTME AEDVATYYCQ QGSSIPLTFG
101  AGTKLELK （配列番号９８）
【０６４２】
ｃｈＰ２Ａ７の構築及び発現
重鎖及び軽鎖のマウスＰ２Ａ７可変領域をコードするｃＤＮＡを使用して、ｍｕＰ２Ａ７可変領域がヒトＩｇＧ４及びκ定常領域に連結されているマウス−ヒトキメラ（ｃｈＰ２Ａ７）発現用ベクターを構築した。重鎖キメラ構築のために、Ｐ２Ａ７重鎖サブクローンｐＣＮ３６３に由来する０．４７ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｓｍＢＩ断片、及びｐＥＡＧ１９９５（ＩｇＧ４  Ｃ末端リジン残基が遺伝子的に取り除かれている配列確認済みの脱グルコシル化Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ（カバットＥＵ命名法）変異体ｈｕＩｇＧ４重鎖定常ドメインｃＤＮＡを含有するプラスミド）に由来する１．０ｋｂのＢｓｍＢＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＶ９０（異種性遺伝子発現がＣＭＶ−ＩＥプロモータ及びヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより制御される、ＳＶ４０初期プロモータ促進性のｄｈｆｒ選択可能マーカーを含有する配列確認済みのｐＵＣに基づくＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社独占販売の発現ベクター）のホスファターゼ処理した６．１ｋｂのＮｏｔＩ線形化ベクター骨格にサブクローニングした。その結果生じたプラスミドｐＥＡＧ２０４５の重鎖ｃＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。キメラＰ２Ａ７重鎖ｃＤＮＡインサート（シグナル配列の開始因子ＡＴＧから終止因子ＴＧＡまで）の配列を、配列番号１３４として下に示す：
1     ATGGAATGGA GCTGTGTCAT GCTCTTCATC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51    CCACTCCCAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG ACCTGAGCTA GTGAAGCCTG
101   GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGAAACAC ATTCACTGAC
151   TATGTTATAA ACTGGGTGAA GCAGAGAACT GGACAGGGCC TTGAGTGGAT
201   TGGAGAGATT TATCCTGGAA ATGAAAATAC TTATTACAAT GAGAAGTTCA
251   AGGGCAAGGC CACACTGACT GCAGACAAAT CCTCCAACAC AGCCTACATG
301   CAGCTCAGTA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCGGTCTATT TCTGTGCAAG
351   AGGGATTTAT TACTACGGTA GTAGGACGAG GACTATGGAC TACTGGGGTC
401   AAGGAACCTC AGTCACCGTC TCCTCAGCCT CCACCAAGGG CCCATCCGTC
451   TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGATCTACC TCCGAGAGCA CAGCCGCCCT
501   GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA
551   ACTCAGGCGC CCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCGGC TGTCCTACAG
601   TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAG
651   CTTGGGCACG AAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA
701   CCAAGGTGGA CAAGAGAGTT GAGTCCAAAT ATGGTCCCCC ATGCCCACCG
751   TGCCCAGCAC CTGAGTTCCT GGGGGGACCA TCAGTCTTCC TGTTCCCCCC
801   AAAACCCAAG GACACTCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG
851   TGGTGGTGGA CGTGAGCCAG GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC
901   GTGGATGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA
951   GTTCAACAGC GCGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG
1001  ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC
1051  CCGTCCTCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA
1101  GCCACAAGTG TACACCCTGC CCCCATCCCA GGAGGAGATG ACCAAGAACC
1151  AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC
1201  GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC
1251  TCCCGTCCTC GATTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AGGCTAACCG
1301  TGGACAAGAG CAGGTGGCAG GAGGGGAATG TCTTCTCATG CTCCGTGATG
1351  CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACACAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCT
1401  GGGTTGA
【０６４３】
予測される成熟ｃｈＰ２Ａ７重鎖タンパク質配列を、配列番号１３５として下に示す：
1    QVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGNTFT DYVINWVKQR TGQGLEWIGE
51   IYPGNENTYY NEKFKGKATL TADKSSNTAY MQLSSLTSED SAVYFCARGI
101  YYYGSRTRTM DYWGQGTSVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC
151  LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG
201  TKTYTCNVDH KPSNTKVDKR VESKYGPPCP PCPAPEFLGG PSVFLFPPKP
251  KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN
301  SAYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ
351  VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
401  LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLG
【０６４４】
マウス可変ドメインは、残基１〜１２２であり、ヒトＩｇＧ４重鎖定常ドメインは、残基１２３〜４５９である。カバットＥＵ命名のＳ２２８Ｐヒンジ置換（半抗体を形成するＩｇＧ４の傾向を修正するため）は、上記の残基２３１であり、Ｎ結合グリコシル化を遺伝子的に取り除ためのＣＨ２におけるＴ２９９Ａ置換は、上記配列の残基３０２である。
【０６４５】
軽鎖キメラ構築のために、ＰＣＲで増幅したＰ２Ａ７軽鎖を、製造業者の推奨プロトコールに従ってＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットを使用して、固有のＮｏｔＩ部位に重鎖シグナル配列の５’を導入した突然変異用プライマー５’ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＴＧ  ３’（配列番号１３６）及びその逆方向相補体、並びに軽鎖変数／κ定常ドメイン接合部のすぐ下流に固有のＢｓｉＷＩを導入した５’ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＣＧＧ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡＡ  ＣＴＧ  ＴＡＴ  ＣＣ  ３’（配列番号１３７）及びその逆方向相補体を用いて部位特異的変異誘発にかけた。突然変異プラスミドを、導入したＮｏｔＩ及びＢｓｉＷＩ部位変更をスクリーニングすることにより特定した。軽鎖配列をＤＮＡ配列決定により確認した。上述のように生成した０．４２ｋｂのＮｏｔＩ−ＢｓｉＷＩ軽鎖可変ドメイン断片、及び配列確認済みのヒト化抗ＬＴｂＲκ軽鎖定常ドメインｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＥＡＧ１５７２に由来する０．３４ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＮｏｔＩ断片を、発現ベクターｐＥＡＧ１２５６（異種性遺伝子発現がＣＭＶ−ＩＥプロモータ及びヒト成長ホルモンポリアデニル化シグナルにより制御される、ホスホグリセロキナーゼプロモーター促進性のｎｅｏ選択可能マーカーを含有するｐＵＣに基づく配列確認済みの発現ベクター）のＮｏｔＩ部位にサブクローニングした。その結果生じたプラスミドの軽鎖ｃＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。キメラＰ２Ａ７軽鎖ｃＤＮＡインサート（シグナル配列の開始因子ＡＴＧから終止因子ＴＡＧまで）の配列を、下に示す(配列番号１３８)：
1    ATGGATTTTC AGGTGCAGAT TTTCAGCTTG CTGCTAATCA GTGTCACAGT
51   CATAGTGTCT AATGGAGAAG TTGTGCTCAC CCAGTCTCCA ACCGCCATGG
101  CTGCATCTCC CGGGGAGAAG ATCACTATCA CCTGCAGTGC CAGCTCAACT
151  TTAAGTTCCA ATTACTTGCA TTGGTATCAG CAGAAGCCAG GATTCTCCCC
201  TAAACTCTTG ATTTATAGGA CATCCAATCT GGCCTCTGGA GTCCCAGGTC
251  GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT ACTCTCTCAC AATTGGCACC
301  ATGGAGGCTG AAGATGTTGC CACTTACTAC TGCCAGCAGG GTAGTAGTAT
351  ACCGCTCACG TTCGGTGCTG GGACCAAGCT GGAGCTGAAG CGTACGGTGG
401  CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT
451  GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC
501  CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG
551  AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC
601  ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG
651  CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA
701  GGGGAGAGTG TTAG
【０６４６】
予測される成熟ｃｈＰ２Ａ７軽鎖タンパク質配列を、下に示す（配列番号１３９）：
1    EVVLTQSPTA MAASPGEKIT ITCSASSTLS SNYLHWYQQK PGFSPKLLIY
51   RTSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTIGTME AEDVATYYCQ QGSSIPLTFG
101  AGTKLELKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK
151  VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ
201  GLSSPVTKSF NRGEC
【０６４７】
マウス可変ドメインは、上記の残基１〜１０８であり、ヒトκ定常ドメインは、上記配列の残基１０９〜２１５である。
【０６４８】
ｃｈＰ２Ａ７重鎖発現ベクター及びｃｈＰ２Ａ７軽鎖発現ベクターを、２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時形質移入し、形質移入した細胞を、抗体分泌及び特異性に関して試験した。空ベクターで形質移入した細胞、及びｈｕ５ｃ８−Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４（分子的にクローニングしたＣＤ４０Ｌに特異的なｍＡｂ）で形質移入した細胞を、対照として用いた。培養上清のウェスタンブロット分析（抗ヒト重鎖及び軽鎖抗体で発色させた）により、ｃｈＰ２Ａ７で形質移入した細胞は、重鎖及び軽鎖を合成し効率的に分泌したことが示された。形質移入した細胞に由来する培養上清を用いて染色したＩＧＦ−１Ｒ発現ＭＣＦ７ヒト乳腺腺癌細胞のＦＡＣＳ分析は、ｃｈＰ２Ａ７抗体が結合したことを示し、ｍｕＰ２Ａ７の染色パターンに類似した染色パターンを生成したが、擬似的に形質移入した細胞及びｈｕ５ｃ８で形質移入した細胞に由来する培養上清は、ＭＣＦ７細胞を染色しなかった（ＰＥ結合抗ヒト重鎖及び軽鎖抗体で検出した）。希釈滴定により、ｃｈＰ２Ａ７  ｍＡｂを含有する培養上清による特異的染色が用量応答性を示したことが示された。ＣＨＯ細胞を、ｃｈＰ２Ａ７重鎖発現ベクター及びｃｈＰ２Ａ７軽鎖発現ベクターで同時形質移入し、キメラＰ２Ａ７脱グルコシル化ｈｕＩｇＧ４、κｍＡｂを発現する安定的系統を生成した。
【０６４９】
抗ＩＧＦ−１Ｒマウスハイブリドーマ２０Ｃ８．３Ｂ８免疫グロブリン可変領域のクローニング
他の抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂの可変ドメインを、Ｐ２Ａ７  ｍＡｂについて記載した技術に類似した標準的組換えＤＮＡ技術によりクローニング及びキメラ化した。
【０６５０】
マウスサブグループＩ（Ａ）に属する２０Ｃ８．３Ｂ８  ｍＡｂ重鎖可変ドメインの予測される成熟配列を、ＣＤＲに下線を引いて下に示す：
1    DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG 
51   YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG 
101  YGYRSAYYFD YWGQGTTVTV SS（配列番号４３）
【０６５１】
マウスκサブグループＩＩＩに属する２０Ｃ８軽鎖可変ドメインの予測される成熟配列を下に示す：
1    DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSAYSYMHWY QQKPGQPPKL 
51   LIYLASNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRELPY 
101  TFGGGTKLEI K（配列番号１０３）
【０６５２】
キメラ２０Ｃ８重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡの発現ベクターを、上述のように構築した。プラスミドインサートの免疫グロブリンｃＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。キメラ２０Ｃ８重鎖ｃＤＮＡインサート（シグナル配列の開始因子ＡＴＧから終止因子ＴＧＡまで）の配列を、配列番号１４０として下に示す：
1     ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CACCAGGTGC
51    CCACTCCGAC GTCCAACTGC AGGAGTCTGG ACCTGACCTG GTGAAACCTT
101   CTCAGTCACT TTCACTCACC TGCACTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT
151   GGTTATAGCT GGCACTGGAT CCGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG
201   GATGGGCTAC ATACACTACA GTGGTGGCAC TAACTACAAC CCATCTCTCA
251   AAAGTCGAAT CTCTATCACT CGAGACACAT CCAAGAACCA GTTCTTCCTC
301   CAGTTGAATT CTGTGACTAC TGAGGACACA GCCACATATT ACTGTGCAAG
351   ATCGGGGTAC GGCTACAGGA GTGCGTACTA TTTTGACTAC TGGGGCCAAG
401   GGACCACGGT CACCGTCTCC TCAGCTTCCA CCAAGGGCCC ATCCGTCTTC
451   CCCCTGGCGC CCTGCTCCAG ATCTACCTCC GAGAGCACAG CCGCCCTGGG
501   CTGCCTGGTC AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT
551   CAGGCGCCCT GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCGGCTGT CCTACAGTCC
601   TCAGGACTCT ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAGCTT
651   GGGCACGAAG ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA
701   AGGTGGACAA GAGAGTTGAG TCCAAATATG GTCCCCCATG CCCACCGTGC
751   CCAGCACCTG AGTTCCTGGG GGGACCATCA GTCTTCCTGT TCCCCCCAAA
801   ACCCAAGGAC ACTCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG
851   TGGTGGACGT GAGCCAGGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG
901   GATGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTT
951   CAACAGCGCG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT
1001  GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCG
1051  TCCTCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAGCC
1101  ACAAGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCAGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG
1151  TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG
1201  GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC
1251  CGTCCTCGAT TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAGG CTAACCGTGG
1301  ACAAGAGCAG GTGGCAGGAG GGGAATGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT
1351  GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACACAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCTGGG
1401  TTGA
【０６５３】
予測される成熟ｃｈ２０Ｃ８重鎖タンパク質配列を、配列番号１４１として下に示す：
1    DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG
51   YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG
101  YGYRSAYYFD YWGQGTTVTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL
151  VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT
201  KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK
251  DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS
301  AYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV
351  YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
401  DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLG
【０６５４】
マウス可変ドメインは、残基１〜１２２であり、ヒトＩｇＧ４重鎖定常ドメインは、残基１２３〜４５９である。
【０６５５】
キメラ２０Ｃ８軽鎖ｃＤＮＡインサート（シグナル配列の開始因子ＡＴＧから終止因子ＴＡＧまで）の配列を、配列番号１４２として下に示す：
1    ATGGAGACAG ACACACTCCT GTTATGGGTA CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG
51   TTCCACTGGT GACATTGTGC TGACACAGTC TCCTGCTTCC TTAGCTGTAT
101  CTCTGGGGCA GAGGGCCACC ATCTCATGCA GGGCCAGCAA AAGTGTCAGT
151  ACATCTGCCT ATAGTTATAT GCACTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC
201  ACCCAAACTC CTCATCTATC TTGCATCCAA CCTAGAATCT GGGGTCCCTG
251  CCAGGTTCAG TGGCAGTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT
301  CCTGTGGAGG AGGAGGATGC TGCAACCTAT TACTGTCAGC ACAGTAGGGA
351  GCTTCCGTAT ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GCTGGAAATC AAACGTACGG
401  TGGCTGCACC ATCTGTCTTC ATCTTCCCGC CATCTGATGA GCAGTTGAAA
451  TCTGGAACTG CCTCTGTTGT GTGCCTGCTG AATAACTTCT ATCCCAGAGA
501  GGCCAAAGTA CAGTGGAAGG TGGATAACGC CCTCCAATCG GGTAACTCCC
551  AGGAGAGTGT CACAGAGCAG GACAGCAAGG ACAGCACCTA CAGCCTCAGC
601  AGCACCCTGA CGCTGAGCAA AGCAGACTAC GAGAAACACA AAGTCTACGC
651  CTGCGAAGTC ACCCATCAGG GCCTGAGCTC GCCCGTCACA AAGAGCTTCA
701  ACAGGGGAGA GTGTTAG
【０６５６】
予測される成熟ｃｈ２０Ｃ８軽鎖タンパク質配列を、配列番号１４３として下に示す：
1   DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS TSAYSYMHWY QQKPGQPPKL 
51   LIYLASNLES GVPARFSGSG SGTDFTLNIH PVEEEDAATY YCQHSRELPY 
101  TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV 
151  QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV 
201  THQGLSSPVT KSFNRGEC
【０６５７】
マウス可変ドメインは、上記の残基１〜１１１であり、ヒトκ定常ドメインは、上記配列の残基１１２〜２１８である。
【０６５８】
ｃｈ２０Ｃ８重鎖発現ベクター及びｃｈ２０Ｃ８軽鎖発現ベクターを、２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時形質移入し、形質移入した細胞を、抗体分泌及び特異性に関して試験した。空ベクターで形質移入した細胞、及びｈｕ５ｃ８−Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４（分子的にクローニングしたＣＤ４０Ｌに特異的なｍＡｂ）で形質移入した細胞を、対照として用いた。培養上清のウェスタンブロット分析（抗ヒト重鎖及び軽鎖抗体で発色させた）により、ｃｈ２０Ｃ８で形質移入した細胞は、重鎖及び軽鎖を合成し効率的に分泌したことが示された。形質移入した細胞由来の培養上清を用いて染色したＩＧＦ−１Ｒ発現ＭＣＦ７ヒト乳腺腺癌細胞のＦＡＣＳ分析は、ｃｈ２０Ｃ８抗体が滴定可能な用量依存性で結合したことを示したが、擬似的に形質移入した細胞及びｈｕ５ｃ８で形質移入した細胞に由来する培養上清は、ＭＣＦ７細胞を染色しなかった（ＰＥ結合抗ヒト重鎖及び軽鎖抗体で検出した）。ＣＨＯ細胞を、ｃｈ２０Ｃ８重鎖発現ベクター及びｃｈ２０Ｃ８軽鎖発現ベクターで同時形質移入し、キメラ２０Ｃ８脱グルコシル化ｈｕＩｇＧ４、κｍＡｂを発現する安定的系統を生成した。
【０６５９】
抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  ２０Ｄ８．２４Ｂ１１免疫グロブリン可変領域のクローニング
ｍＡｂ  ２０Ｄ８．２４Ｂ１１は、２０Ｃ８．３Ｂ８の姉妹クローンであると考えられ（両方とも融合体７由来）、共通の軽鎖を共有し、ＦＲ４の単一残基が２０Ｃ８の残基と異なる重鎖を有する。マウスサブグループＩ（Ａ）に属する２０Ｄ８．２４Ｂ１１  ｍＡｂ重鎖可変ドメインの予測される成熟配列を、ＣＤＲに下線を引いて下に示す：
1    DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG
51   YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG
101  YGYRSAYYFD YWGQGTTLTV SS（配列番号５３）
【０６６０】
２０Ｄ８（上段）及び２０Ｃ８（下段）重鎖可変ドメインのアラインメントを、ＦＲ４カバット残基１０９（下記の残基１１８）に対応する単一の保存的相違を強調して下に示す：
1      DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMG 50
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1      DVQLQESGPDLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSGYSWHWIRQFPGNKLEWMG 50
51     YIHYSGGTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSG 100
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
51     YIHYSGGTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARSG 100
101    YGYRSAYYFDYWGQGTTLTVSS 122（配列番号５３）
|||||||||||||||||.||||
101    YGYRSAYYFDYWGQGTTVTVSS 122（配列番号４３）
【０６６１】
キメラ２０Ｄ８重鎖ｃＤＮＡの発現ベクターを構築し、プラスミドｐＣＮ３８０の重鎖ｃＤＮＡインサートをＤＮＡ配列決定により確認した。キメラ２０Ｄ８重鎖ｃＤＮＡインサート（シグナル配列の開始因子ＡＴＧから終止因子ＴＧＡまで）の配列を、配列番号１４４として下に示す：
1     ATGGACTGGA CCTGGAGGGT CTTCTGCTTG CTGGCTGTAG CACCAGGTGC
51    CCACTCCGAC GTCCAACTGC AGGAGTCTGG ACCTGACCTG GTGAAACCTT
101   CTCAGTCACT TTCACTCACC TGCACTGTCA CTGGCTACTC CATCACCAGT
151   GGTTATAGCT GGCACTGGAT CCGGCAGTTT CCAGGAAACA AACTGGAATG
201   GATGGGCTAC ATACACTACA GTGGTGGCAC TAACTACAAC CCATCTCTCA
251   AAAGTCGAAT CTCTATCACT CGAGACACAT CCAAGAACCA GTTCTTCCTC
301   CAGTTGAATT CTGTGACTAC TGAGGACACA GCCACATATT ACTGTGCAAG
351   ATCGGGGTAC GGCTACAGGA GTGCGTACTA TTTTGACTAC TGGGGCCAAG
401   GGACCACGTT GACAGTCTCC TCAGCTTCCA CCAAGGGCCC ATCCGTCTTC
451   CCCCTGGCGC CCTGCTCCAG ATCTACCTCC GAGAGCACAG CCGCCCTGGG
501   CTGCCTGGTC AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT
551   CAGGCGCCCT GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCGGCTGT CCTACAGTCC
601   TCAGGACTCT ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAGCTT
651   GGGCACGAAG ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA
701   AGGTGGACAA GAGAGTTGAG TCCAAATATG GTCCCCCATG CCCACCGTGC
751   CCAGCACCTG AGTTCCTGGG GGGACCATCA GTCTTCCTGT TCCCCCCAAA
801   ACCCAAGGAC ACTCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG
851   TGGTGGACGT GAGCCAGGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG
901   GATGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCGCGGG AGGAGCAGTT
951   CAACAGCGCG TACCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTCCTG CACCAGGACT
1001  GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCG
1051  TCCTCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAGCC AAAGGGCAGC CCCGAGAGCC
1101  ACAAGTGTAC ACCCTGCCCC CATCCCAGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG
1151  TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG
1201  GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACGCCTCC
1251  CGTCCTCGAT TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAGG CTAACCGTGG
1301  ACAAGAGCAG GTGGCAGGAG GGGAATGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT
1351  GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACACAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCTGGG
1401  TTGA
【０６６２】
上記配列によりコードされる予測される成熟ｃｈ２０Ｄ８重鎖タンパク質配列を、配列番号１４５として下に示す：
1    DVQLQESGPD LVKPSQSLSL TCTVTGYSIT SGYSWHWIRQ FPGNKLEWMG
51   YIHYSGGTNY NPSLKSRISI TRDTSKNQFF LQLNSVTTED TATYYCARSG
101  YGYRSAYYFD YWGQGTTLTV SSASTKGPSV FPLAPCSRST SESTAALGCL
151  VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT
201  KTYTCNVDHK PSNTKVDKRV ESKYGPPCPP CPAPEFLGGP SVFLFPPKPK
251  DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS
301  AYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV
351  YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
401  DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLG
【０６６３】
マウス可変ドメインは、残基１〜１２２であり、ヒトＳ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４重鎖定常ドメインは、残基１２３〜４５８である。
【０６６４】
２０Ｄ８軽鎖可変配列は、２０Ｃ８の軽鎖可変配列と同一である。２０Ｃ８については前述の情報を参照されたい。
【０６６５】
抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  Ｐ１Ｇ１０．２Ｂ８免疫グロブリン可変領域のクローニング
成熟Ｐ１Ｇ１０重鎖可変ドメインの予測配列を、ＣＤＲに下線を引いて下に示す：
1    QIQLVQSGPD LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKDLKWMGW
51   INTNTGEPTY ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCASPL
101  YYRNGRYFDV WGAGTTVTVS S
【０６６６】
Ｐ１Ｇ１０は、マウス重鎖可変ドメインサブグループＩＩ（Ａ）に属すると考えられるが、重鎖ＩＩ（Ａ）コンセンサス配列とは５５％同一性しか有していない。
【０６６７】
キメラＰ１Ｇ１０重鎖ｃＤＮＡの発現ベクターを構築し、そのｃＤＮＡインサートを配列決定により確認した。キメラＰ１Ｇ１０重鎖ｃＤＮＡインサート（シグナル配列の開始因子ＡＴＧから終止因子ＴＧＡまで）の配列を、配列番号１４６として下に示す：
1     ATGGGTTGGA TCTGTATCTT TCTATTCTTG GTGGCAGCTG CCCAAAGTGC
51    CCAAGCACAG ATCCAGTTGG TGCAGTCTGG ACCTGACCTG AAGAAGCCTG
101   GAGAGACAGT CAAGATCTCC TGCAAGGCTT CTGGGTATAC CTTCACAAAC
151   CATGGAATGA ACTGGGTGAA GCAGGCTCCA GGAAAGGATT TAAAGTGGAT
201   GGGCTGGATA AACACCAACA CTGGAGAGCC AACATATGCT GATGACTTCA
251   AGGGACGGTT TGCCTTCTCT TTGGAAACCT CTGCCAGCAC TGCCTATTTG
301   CAGATCAACA ACCTCAAAAA TGAGGACACG GCTACATATT TCTGTGCAAG
351   TCCCCTCTAC TATAGGAACG GGCGATACTT CGATGTCTGG GGCGCAGGGA
401   CCACGGTCAC CGTCTCCTCA GCTTCCACCA AGGGCCCATC CGTCTTCCCC
451   CTGGCGCCCT GCTCCAGATC TACCTCCGAG AGCACAGCCG CCCTGGGCTG
501   CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG
551   GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA
601   GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG
651   CACGAAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG
701   TGGACAAGAG AGTTGAGTCC AAATATGGTC CCCCATGCCC ACCGTGCCCA
751   GCACCTGAGT TCCTGGGGGG ACCATCAGTC TTCCTGTTCC CCCCAAAACC
801   CAAGGACACT CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG
851   TGGACGTGAG CCAGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAT
901   GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTTCAA
951   CAGCGCGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC
1001  TGAACGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCGTCC
1051  TCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC GAGAGCCACA
1101  AGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCAGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA
1151  GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG
1201  TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CGCCTCCCGT
1251  CCTCGATTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAGGCTA ACCGTGGACA
1301  AGAGCAGGTG GCAGGAGGGG AATGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG
1351  GCTCTGCACA ACCACTACAC ACAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCTGGGTTG
1401  A
【０６６８】
上記の配列がコードされた予測される成熟ｃｈＰ１Ｇ１０重鎖タンパク質配列を、配列番号１４７として下に示す：
1    QIQLVQSGPD LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKDLKWMGW
51   INTNTGEPTY ADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCASPL
101  YYRNGRYFDV WGAGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV
151  KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTK
201  TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD
251  TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNSA
301  YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY
351  TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
401  SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLG
【０６６９】
マウス可変ドメインは、残基１〜１２１であり、ヒトＳ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４重鎖定常ドメインは、残基１２２〜４５７である。
【０６７０】
マウスκサブグループＶに属する成熟Ｐ１Ｇ１０軽鎖可変ドメインの予測される配列を、配列番号１１３としてＣＤＲに下線を引いて下に示す：
1    DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGSVKLLIYY
51   TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GKTLPWTFGG
101  GTKLEIK
【０６７１】
キメラＰ１Ｇ１０軽鎖ｃＤＮＡの発現ベクターを構築し、そのｃＤＮＡインサートを配列決定により確認した。キメラＰ１Ｇ１０軽鎖ｃＤＮＡインサート（シグナル配列の開始因子ＡＴＧから終止因子ＴＡＧまで）の配列を、配列番号１４８として下に示す：
1    ATGAGGTCCC CTGCTCAGTT TCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG
51   TGCCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT
101  CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGT
151  AATTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGATCTG TTAAACTCCT
201  GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251  GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAA
301  GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAAAGACGC TTCCGTGGAC
351  GTTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT
401  CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC
451  TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA
501  GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA
551  CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG
601  CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC
651  CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT
701  GTTAG
【０６７２】
上記の配列によりコードされた予測される成熟ｃｈＰ１Ｇ１０軽鎖タンパク質配列を、配列番号１４９として下に示す：
1    DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGSVKLLIYY
51   TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GKTLPWTFGG
101  GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
151  DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
201  LSSPVTKSFN RGEC
【０６７３】
マウス可変ドメインは、上記の残基１〜１０７であり、ヒトκ定常ドメインは、上記配列の残基１０８〜２１４である。
【０６７４】
ｃｈＰ１Ｇ１０重鎖発現ベクター及びｃｈＰ１Ｇ１０軽鎖発現ベクターを、２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時形質移入し、形質移入した細胞を、抗体分泌及び特異性に関して試験した（空ベクターで形質移入した細胞及びｈｕ５ｃ８−Ｓ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４（分子的にクローニングされたＣＤ４０Ｌ特異的ｍＡｂ）で形質移入した細胞を対照として用いた）。培養上清のウェスタンブロット分析（抗ヒト重鎖及び軽鎖抗体で発色させた）により、ｃｈＰ１Ｇ１０で形質移入した細胞は、重鎖及び軽鎖を合成し効率的に分泌したことが示された。形質移入した細胞由来の培養上清を用いて染色したＩＧＦ−１Ｒ発現ＭＣＦ７ヒト乳腺腺癌細胞のＦＡＣＳ分析は、ｃｈＰ１Ｇ１０抗体が滴定可能な用量依存性で結合したことを示したが、擬似的に形質移入した細胞及びｈｕ５ｃ８で形質移入した細胞に由来する培養上清は、ＭＣＦ７細胞を染色しなかった（ＰＥ結合抗ヒト重鎖及び軽鎖抗体で検出した）。ＣＨＯ細胞を、ｃｈＰ１Ｇ１０重鎖発現ベクター及びｃｈＰ１Ｇ１０軽鎖発現ベクターで同時形質移入し、キメラｃｈＰ１Ｇ１０脱グルコシル化ｈｕＩｇＧ４、κｍＡｂを発現する安定的系統を生成した。
【０６７５】
抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  Ｐ１Ａ２．２Ｂ１１免疫グロブリン可変領域のクローニング
マウスサブグループＩＩ（Ａ）に属する成熟Ｐ１Ａ２重鎖可変ドメインの予測される配列を配列番号４８として下に示す：
1    QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKGLKWMGW
51   NTSTGEPTYA DDFKGRFAFS LETSASTAFL QINNLKNEDT ASYFCASPLY
101  YMYGRYIDVW GAGTAVTVSS
【０６７６】
Ｐ１Ａ２重鎖は、Ｐ１Ｇ１０の重鎖と９２．６％同一であり（両方とも融合体５由来）、１つのＦＲ１、１つのＦＲ２、２つのＣＤＲ２、２つのＦＲ３、２つのＣＤＲ３、及び１つのＦＲ４が異なる。Ｐ１Ａ２（上段の行）及びＰ１Ｇ１０（下段の行）重鎖可変ドメインのアラインメントを下に示す：
1    QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNHGMNWVKQAPGKGLKWMGW 50
|||||||||:||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||
1    QIQLVQSGPDLKKPGETVKISCKASGYTFTNHGMNWVKQAPGKDLKWMGW 50
51   .NTSTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAFLQINNLKNEDTASYFCASPL 99
||.|||||||||||||||||||||||||:||||||||||||.|||||||
51   INTNTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCASPL 100
100    YYMYGRYIDVWGAGTAVTVSS 120（配列番号４８）
||  ||| ||||||| |||||
101    YYRNGRYFDVWGAGTTVTVSS 121（配列番号５８）
【０６７７】
キメラＰ１Ａ２重鎖及び軽鎖の発現ベクターを、上述の方法により構築した。そのプラスミドによりコードされたｃｈＰ１Ａ２重鎖の予測される配列は以下の通りである（配列番号１５０）：
1    QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NHGMNWVKQA PGKGLKWMGW
51   NTSTGEPTYA DDFKGRFAFS LETSASTAFL QINNLKNEDT ASYFCASPLY
101  YMYGRYIDVW GAGTAVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK
151  DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT
201  YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCPPCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT
251  LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSAY
301  RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT
351  LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS
401  DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG
【０６７８】
マウス可変ドメインは、残基１〜１２０であり、ヒトＳ２２８Ｐ／Ｔ２９９Ａ  ＩｇＧ４重鎖定常ドメインは、残基１２１〜４５６である。
【０６７９】
マウスκサブグループＶに属する成熟Ｐ１Ａ２軽鎖可変ドメインの予測される配列を、配列番号１０８として、ＣＤＲに下線を引いて下に示す：
1   DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTIKLLIYY
51   TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDFATYFCQQ GKTLPWTFGG
101   GTKLEIK
【０６８０】
Ｐ１Ａ２軽鎖は、Ｐ１Ｇ１０の軽鎖と９７．２％同一であり（両方とも融合体５由来）、２つのＦＲ２、１つのＦＲ３が異なるが、同一のＣＤＲを共有する。Ｐ１Ａ２（上段の行）及びＰ１Ｇ１０（下段の行）軽鎖可変ドメインのアラインメントを下に示す：
1   DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLIYY 50
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||.:||||||
1   DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGSVKLLIYY 50
51  TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDFATYFCQQGKTLPWTFGG 100
|||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||
51  TSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGKTLPWTFGG 100
101 GTKLEIK 107（配列番号１０８）
|||||||
101 GTKLEIK 107（配列番号１１３）
【０６８１】
キメラＰ１Ａ２軽鎖ｃＤＮＡの発現ベクターを構築し、そのｃＤＮＡインサートを配列決定により確認した。キメラＰ１Ａ２軽鎖ｃＤＮＡインサート（シグナル配列の開始因子ＡＴＧから終止因子ＴＡＧまで）の配列を、配列番号１５１として下に示す：
1    ATGAGGTCCC CTGCTCAGTT TCTTGGAGAC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG
51   TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTATCTGCCT
101  CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC
151  AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTA TTAAACTCCT
201  GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG
251  GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAA
301  GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTAAAACGC TTCCGTGGAC
351  GTTCGGTGGA GGCACCAAGC TGGAAATCAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT
401  CTGTCTTCAT CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC
451  TCTGTTGTGT GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA
501  GTGGAAGGTG GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA
551  CAGAGCAGGA CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTCAGCAG CACCCTGACG
601  CTGAGCAAAG CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC
651  CCATCAGGGC CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT
701  GTTAG
【０６８２】
ｐＣＮ３７９によりコードされた予測される成熟ｃｈＰ１Ａ２軽鎖タンパク質配列を、配列番号１５２として下に示す：
1    DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTIKLLIYY
51   TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDFATYFCQQ GKTLPWTFGG
101  GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
151  DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
201  LSSPVTKSFN RGEC
【０６８３】
マウス可変ドメインは、上記の残基１〜１０７であり、ヒトκ定常ドメインは、上記配列の残基１０８〜２１４である。
【０６８４】
抗ＩＧＦ−１Ｒ  ｍＡｂ  Ｐ１Ｅ２．３Ｂ１２免疫グロブリン可変領域のクローニング
Ｐ１Ｅ２可変ドメインのクローニングを、上述の方法により実施した。したがって、抗体「Ｐ１Ｅ２」を、ヒトＩｇＧ４Ｐａｇｌｙ／κ定常ドメインに融合されたＰ１Ｅ２．３Ｂ１２ハイブリドーマ細胞系により発現された抗体に由来するマウスＶＨ及びＶＬを含有するキメラ抗体（表４を参照）として発生させた。
【０６８５】
（実施例１９）
ＩＧＦ−１Ｒ  Ｆａｂ抗体は、可溶性ＩＧＦ−１Ｒと高親和性で結合する
方法：可溶性ＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂの結合活性を、表面プラズモン共鳴を使用して測定した。ビオチン化ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製）を、ストレプトアビジンでコーティングしたセンサーチップに固定化した。可溶性／二量体ＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ抗体によりその表面上に捕捉した。Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、又はＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂ（０．５ｎＭ〜１０００ｎＭ）の第２の注入を実施した。表面は、アセテート、ｐＨ４．０を３回短時間注入することにより再生した。
【０６８６】
結果：Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂは、最も親和性が高く、ＫＤ＝１．３ｎＭで組換えＩＧＦ−１Ｒと結合したが、Ｍ１４−Ｇ１１  Ｆａｂは、ＫＤ＝４．０ｎＭで結合し、Ｍ１４−Ｃ０３  ＦａｂはＫＤ＝４．９ｎＭで結合した（データ非表示）。
【０６８７】
（実施例２０）
完全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体によるＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２刺激性腫瘍細胞増殖の阻害。
方法：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍増殖に対する抗体の効果を、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、２８００  ウッズホローロード、マディソン、ウィスコンシン州、５３７１１  アメリカ合衆国）を使用して測定した。ＲＰＭＩ培地を含有する１０％ＦＢＳ中のＢｘＰＣ３細胞を、Ｗａｌｌａｃ社製９６ウエル透明底ＴＣ処理プレートで培養した（８０００細胞／ウエル）。２４時間後、培地を無血清条件に変更し、様々な濃度（１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、及び０．１ｎＭ）の抗体を添加した。３０分間のインキュベーション後、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２を１００ｎｇ／ｍｌで添加した。細胞を、溶解するまでさらに４８時間インキュベートし、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（商標）試薬を使用してＡＴＰ存在量を決定した。阻害は、［１−（Ａｂ−ＳＦＭ）／（ＩＧＦ−ＳＦＭ）］×１００％として計算した。アイソタイプ一致抗体ＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）抗体を陰性対照として使用した。
【０６８８】
結果：完全ヒト抗体Ｍ１３Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ、及びＭ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、組換えヒトＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２により促進されるＢｘＰＣ３（ヒト膵臓腺癌）細胞増殖を阻害した（図１４）。ヒト肺癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ２３（図１５；Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体）及びヒト肺癌細胞系Ａ５４９（図１６；Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体）における組換えヒトＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２促進性細胞増殖に対して、同様の増殖阻害結果が、これら抗体で得られた。３つ全ての細胞系で、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、Ｍ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ型と同様の結果を示した（データ非表示）。
【０６８９】
（実施例２１）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの完全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体による腫瘍細胞増殖の細胞周期停止
方法：完全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体が細胞周期進行を停止する能力を、ＦＡＣＳ分析により評価し、ＢｘＰＣ３細胞培養でヨウ化プロピジウムの取り込みをモニターした。ＢｘＰＣ３細胞（４×１０５細胞／ウエル）を、６ウエルプレートに播種した。２４時間後、細胞を無血清培養（ＳＦＭ）に変更してさらに２４時間続けた。次に、１３３．３ｎＭの終濃度のＩＧＦ−１Ｒ抗体（２０マイクログラム／ｍｌ）及び２００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−１を培地に添加した。２４時間後、細胞をトリプシン処理し、エタノールで固定した。ＤＮＡ内容物を、ＦＡＣＳ分析前にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。アイソタイプ一致抗体ＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）を陰性対照として使用した。
【０６９０】
結果：完全ヒト抗体Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（表１１）、Ｍ１４−Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、及びＭ１４−Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、細胞周期のＧ０／Ｇ１期でＢｘＰＣ３腫瘍細胞を停止させた。
【表１１】
2011516549.tif 000021
【０６９１】
（実施例２２）
膵癌モデルにおけるＩｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害
方法：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の単剤ｉｎ  ｖｉｖｏ効力を、ＢｘＰＣ３（膵癌）細胞を使用して、異種移植膵癌モデル系で評価した。ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスに２×１０６細胞を接種し、腫瘍増殖をモニターした。治療開始時の平均腫瘍体積は、約２００ｍｍ３であった。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、６０、３０、及び１５ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、５週間週１回で投与した。アイソタイプ一致抗体ＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）を、陰性対照として６０ｍｇ／ｋｇで５週間週１回投与した。腫瘍を接種後の指定間隔で抽出し（図１８）、総腫瘍体積を測定した。
【０６９２】
結果：完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、用量依存的様式で腫瘍増殖を阻害した（図１８）。５週間週１回で投与した６０、３０、及び１５ｍｇ／ｋｇの抗体は、統計学的に有意な単剤効力を示した。さらに、抗体は、週１回で投与した１５ｍｇ／ｋｇの低用量でも有効であった（図１８）。
【０６９３】
（実施例２３）
肺癌モデルにおけるＩｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害
方法：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の単剤ｉｎ  ｖｉｖｏ効力を、Ａ５４９（肺癌）細胞を使用して、異種移植肺癌モデル系で評価した。ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウスに３〜５×１０６細胞を接種し、腫瘍増殖をモニターした。治療開始時の平均腫瘍体積は、約１５０ｍｍ３であった。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、３０及び１５ｍｇ／ｋｇで腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、４週間週２回で投与した。アイソタイプ一致抗体ＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４）を、陰性対照として３０ｍｇ／ｋｇで投与した。腫瘍を接種後に指定間隔で抽出し（図１９）、総腫瘍体積を測定した。
【０６９４】
結果：完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、用量依存的様式で腫瘍増殖を阻害した（図１９）。４週間にわたって投与した３０及び１５ｍｇ／ｋｇの抗体は、統計学的に有意な単剤効力を示した（図１９）。このモデルで実施した追加研究は、Ｃ０６が、７．５ｍｇ／ｋｇの週１回注射の低用量でも有効であることを示した（データ非表示）。
【０６９５】
（実施例２４）
併用療法を使用したｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖阻害
方法：腫瘍増殖阻害における、ゲムシタビン（非小細胞肺癌、膵癌、膀胱癌、及び乳癌を治療するために一般に使用される薬物）と組合せたＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の効力を、ＢｘＰＣ３異種移植モデルで試験した。週２回７週間３０ｍｇ／ｋｇ（データ非表示）で、又は週１回５週間６０ｍｇ／ｋｇ（図２０）で腹腔内（ｉ．ｐ．）投与したＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の効力を、現行の治療基準（つまり、３日に１回４週間８０ｍｇ／ｋｇ）に従って投与したゲムシタビンと組合せて評価した。ゲムシタビン単独、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体単独、及び送達媒体単独の擬似注射を陰性対照として投与した。治療開始時の腫瘍体積は、およそ２００ｍｍ３であった。
【０６９６】
結果：単剤としての（つまり、単独投与した）Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体及びゲムシタビンは、同様の効力を示した。ゲムシタビンと組合せた、週２回スケジュールで３０ｍｇ／ｋｇ（データ非表示）の、又は週１回スケジュールで６０ｍｇ／ｋｇ（図２０）のＭ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、単剤治療と比較して相加的効力を示した。加えて、１５ｍｇ／ｋｇでの併用も相加的効力を示した（データ非表示）。
【０６９７】
（実施例２５）
完全ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体は、カニクイザルマカク線維芽細胞系に結合する。
方法：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、カニクイザルマカクから確立された線維芽細胞系に結合する。線維芽細胞系を皮膚生検から生成した。細胞解離緩衝液で線維芽細胞を取り上げ、ビオチン化Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙと共に４℃で４５分間インキュベートすることにより、抗体結合を評価した。細胞を洗浄した後、ストレプトアビジン−ＰＥを添加し、４℃で３０分間暗所でさらにインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、２００μｌの冷却ＰＢＳを添加し、その後１％ホルムアルデヒドで固定し、穏やかにボルテックスした。抗体結合をＦＡＣＳ分析により評価した。
【０６９８】
結果：Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、濃度依存的様式で、カニクイザル線維芽細胞系上で発現されたＩＧＦ−１Ｒに結合する（図２１）。
【０６９９】
（実施例２６）
パートＩ：完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の生物学的特徴の要約
完全ヒトＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体について評価した生物学的特徴は、表１１及び１２に示されている。これらの特徴は、本明細書に記載の方法、実験、及び例により確認されたか、及び／又は当業者に既知であり、当業者により実施されている方法及び実験によってごく普通に決定することができる。
【表１２】
2011516549.tif 000022
【０７００】
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の血清半減期
非担癌マウスにおける薬物動態学（ＰＫ）研究を、３ｍｇ／ｋｇのＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（１用量レベル、腹膜腔内注射）を使用してＳＣＩＤマウスで実施した。ＳＣＩＤマウス血清中のＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、ＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡを使用して検出した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１００ｎｇ／ウエル）をｉｍｍｕｌｏｎプレートに固定化した。血清を、１：２５から始めて２倍連続希釈して三重反復で滴定した。結合を、ヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰを使用して決定した。この研究の結果では、約１１．５日の血清半減期がこのマウスモデル系で示された（データ非表示）。
【０７０１】
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの血清濃度を、ＭＣＦ−７担癌動物（３０μｇ／ｋｇの抗体）及びＢｘＰＣ３担癌動物（１５μｇ／ｋｇの抗体）への腹腔内注射後に評価した。９６ウエル（ＩＭＭＵＬＯＮ２  ＨＢ、Ｄｙｎａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ＃３４５５）に固定化したヤギ抗ヒトＩｇＧ（１００ｎｇ／ウエル）に対するＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の結合を、ＥＬＩＳＡにより測定した。検量線を、１０μｇ／ｍｌから始めて３倍連続希釈で滴定した。血清を、１：２５希釈から始めて２倍連続希釈して滴定した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、ヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰを使用して検出した。ＳＯＦＴＭＡＸＰＲＯソフトウェアパッケージ  バージョン４．３  ＬＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を使用して、抗体濃度を決定した。  
【０７０２】
平均血清濃度が下記に示されているように観察された：
【表１３】
2011516549.tif 000023
【０７０３】
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体の薬物動態を、１０ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇ用量の注射後のカニクイザルでも調査し、血清半減期は、約１０〜１２日であることが観察された（データ非表示）。
【０７０４】
表１２及び１３は、Ｍ１３−Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を、ＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２で補完した細胞培地（表１２）、又は１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）若しくはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補完した細胞培地（表１３）に添加した際の、種々の肺、膵臓、及び結腸腫瘍細胞系で観察されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖の用量依存的阻害（阻害パーセント）を示す。
【表１４】
2011516549.tif 000024
【表１５】
2011516549.tif 000025
【０７０５】
パートＩＩ：抗体親和性の測定
目的：
目的は、ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合親和性を測定することであった。
【０７０６】
方法：
Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂの調製
Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂ抗体を、固定化したパパイン（Ｐｉｅｒｃｅ社製  カタログ番号２０３４１（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ロックフォード、米国イリノイ州）で消化することにより調製した。パパインレジンを、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．０；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ；２０ｍＭシステインで洗浄した。抗体を、５００ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭシステインｐＨ７．０中でパパインレジンと混合し、３７℃水浴で３時間消化し、その後室温で倒立振とう器で終夜混合した。各消化の終了を、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定した。焼結ガラス漏斗フィルターを用いて、消化したタンパク質からレジンを取り除き、２０ｍＭアセテートｐＨ５．０で洗浄した。通過液を収集し、２０ｍＭアセテートｐＨ５．０で１０倍に希釈した。Ｆａｂ断片を、線形塩濃度勾配を使用して、Ｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）陽イオン交換クロマトグラフィにより精製した。溶出画分に対して分析用ＳＥＣを実施し、所望の画分を貯留し、ＰＢＳで透析した。その後Ｆａｂをアルキル化して、（Ｆａｂ）２産生が結果としてもたらされるヒンジジスルフィドの再形成を阻害した。アルキル化は、１Ｍ  Ｔｒｉｓ；２００ｍＭ  ヨード酢酸ｐＨ８．５をＦａｂ溶液に１０倍希釈することにより実施した。混合液を、倒立振とう器で２０分間室温でインキュベートし、その後１×ＰＢＳで十分に透析した。各Ｆａｂの最終精製は、分取サイズ排除クロマトグラフィを使用して実施した。
【０７０７】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）親和性測定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験は全て、ランニング緩衝液としてＨＢＳ−ＥＰ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製、カタログ番号ＢＲ−１００１−８８）を使用して、２５℃に設定したＢｉａｃｏｒｅ３０００で実施した。ビオチン標識抗ＨｉｓＴａｇ抗体（ビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ社製  カタログ番号３４４４０）を、ＨＢ−ＥＰ緩衝液中５００ｎＭで注入することにより、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡチップ（カタログ番号ＢＲ−１０００−３２）表面に飽和するまで固定化した。組換えヒトＩＧＦ−１Ｒ−１０Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製、カタログ番号３０５−ＧＲ−０５０）を、２０μＬの４０ｎＭタンパク質を２μＬ／分で注入することにより、ビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ表面で捕捉した。ＩＧＦ−１Ｒ注入後、流速を２０μＬ／分に増加させた。第２の１３０μＬの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体又はＦａｂの注入を実施して、受容体との相互作用を調べた。各抗体及びＦａｂを、６４ｎＭから０．５ｎＭまで連続希釈して、濃度依存的動力学結合曲線を得た。一連の各注入は、１０μＬの１０ｍＭアセテートｐＨ４．０を２０μＬ／分で３回注入して再生した。各曲線は、（１）ＩＧＦ−１Ｒを有していないストレプトアビジン表面から得たデータ及び（２）ＩＧＦ−１Ｒを最初に注入しその後ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を２番目に注入したデータを使用して、二重に基準化した。各抗体及びＦａｂの一連の濃度を、製造業者のＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア内に提供されている１：１結合モデルにフィッティングした。
【０７０８】
結果
３種の組換え抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体、すなわちＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１を、ＩＧＦ−１Ｒに対する結合について、上述のように表面プラズモン共鳴を使用して試験した。３種の抗体は全て、受容体に対して強い結合性を示した。固定化した組換えヒトＩＧＦ−１Ｒに対する各抗体の濃度依存的結合（６４ｎＭから０．５ｎＭまで連続希釈）が観察された（データ非表示）。種々の濃度で添加した際に、ＩＧＦ−１Ｒでコーティングした表面に抗体が蓄積する速度、並びに抗体が純粋な緩衝液の添加中に解離する速度を、１：１結合モデルにフィッティングすることにより調べた。近似的な動力学速度定数及び平衡解離定数を計算した（表１４）。
【表１６】
2011516549.tif 000026
【表１７】
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【０７０９】
個別の親和性を取得するために、各抗体のＦａｂ断片を上述のようにパパイン消化を使用して生成した。抗原結合部位が１つしか存在しないため、Ｆａｂは、全長抗体について説明されているのと同じ様式でＩＧＦ−１Ｒ受容体に添加した際に、単相性結合及び解離曲線を一様に示した（データ非表示）。ＩＧＦ−１Ｒに対する各Ｆａｂの親和性は、表１５に提供されている。
【０７１０】
（実施例２７）
パートＩ：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、他のＩＧＦ−１Ｒ抗体と比較して独特なエピトープ結合特性を有する
交差競合抗体結合研究を実施して、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ及び他のＩＧＦ−１Ｒ抗体のＩＧＦ−１Ｒ抗体結合エピトープを比較した。図２２を参照されたい。未標識競合抗体を、可溶性ＩＧＦ−１Ｒに対する結合を５種の異なる標識抗体と交差競合するそれらの能力について分析した。使用した５種の標識抗体は、ビオチン標識Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（「ビオチン−Ｃ０６」）、ビオチン標識Ｍ１４−Ｇ１１（「ビオチン−Ｇ１１」）、ｚｅｎｏｎ標識Ｐ１Ｂ１０−１Ａ１０（「Ｚｅｎｏｎ−Ｏ」）、ｚｅｎｏｎ標識２０Ｃ８−３Ｂ４（「Ｚｅｎｏｎ−Ｍ」）、又はｚｅｎｏｎ標識ＩＲ３抗体（「Ｚｅｎｏｎ−ＩＲ３」）であった。図２２を参照されたい。
【０７１１】
Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製のビオチン化キット（＃２１３３５）を使用して、抗体をビオチンで標識した。Ｚｅｎｏｎ標識化は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製のＺｅｎｏｎマウスＩｇＧ標識化キット（Ｚ２５０００）を使用して実施した。
＋＋＋＋＋＝それ自体に対する抗体結合競合（９０〜１００％）
＋＋＋＋＝７０〜９０％競合
＋＋＋＝５０〜７０％競合
＋＋＝３０〜５０％競合
＋＝１０〜３０％競合
＋／−＝０〜１０％競合
Ｎ／Ａ＝該当結果無し。
この分析の結果は、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ及びＭ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体が、試験した他の全ての抗体と異なるＩＧＦ−１Ｒの同一領域又は類似領域に結合することを示す。特に、ビオチン標識Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体のみが、未標識Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ又は未標識Ｍ１４．Ｃ０３．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙによるＩＧＦ−１Ｒ結合と効果的に競合した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが、よく研究されているＩＲ３抗体と交差競合しないことも特筆すべきことである。したがって、特に、これら２種の抗体は、異なるＩＧＦ−１Ｒエピトープに結合する。
【０７１２】
パートＩＩ：Ｍ１３−Ｃ０６は、ＦｎＩＩＩ−１ドメインのＮ末端領域に対する抗体結合により、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１の結合親和性をアロステリック的に減少させる。
目的：
目的は、ＩＧＦ−１ＲにあるＭ１３−Ｃ０６抗体の結合エピトープ、及びＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合阻害の背景にある機序を解明することであった。
【０７１３】
背景：
ＩＧＦ−１Ｒは、６つのドメインで構成される（図２７Ａ）。Ｌ１（ロイシンに富む反復ドメイン１）、ＣＲ（システインに豊む反復ドメイン）、及びＬ２と称するＩＧＦ−１Ｒの最初の３つのドメイン、並びにドメイン５のペプチドループ領域（ＦｎＩＩＩ−２、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン２）における突然変異は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２結合に負の効果を及ぼすことが発表されている（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。ここで、本発明者らは、Ｍ１３−Ｃ０６抗体が、増殖因子結合部位と競合的に相互作用することにより、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２結合を阻止しないが、その代りＦｎＩＩＩ−１に結合し、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２シグナル伝達をアロステリック的に阻害することを示す。ＦｎＩＩＩ−１は、ＩＧＦ−１Ｒ及びＩＮＳＲの両方の受容体ホモ二量体化を促進すると考えられ（ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）、リガンドに結合すると、四次構造変化により、活性化シグナルが膜貫通領域からＣ末端チロシンキナーゼドメインへと伝達される。この例のデータは、Ｍ１３−Ｃ０６抗体が、下流の受容体シグナル伝達に結びつくＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２により誘導される立体構造変化を阻害することを示唆する。
【０７１４】
方法：
Ｍ１３−Ｃ０６抗体の存在下及び非存在下でのＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ結合実験
以下の幾つかの構築体を使用して、ＩＧＦ−１Ｒ受容体又はインスリン受容体に対する抗体／ＩＧＦ−１結合を調べた：ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１〜９０２）−Ｈｉｓ１０（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０と称する、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ヒトＩＮＳＲ（２８〜９５６）−Ｈｉｓ１０（ＩＮＳＲと称する、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１〜９０３）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃと称する、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社により産生された）、ヒトＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）−Ｆｃ（ｈＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）−Ｆｃと称する、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社により産生された）、及びマウスＩＧＦ−１Ｒ（１〜９０３）−Ｆｃ（ｍＩＧＦ−１ＲＦｃと称する、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ社製により産生された）。「Ｈｉｓ１０」とは、構築体のＣ末端にある１０残基のヒスチジンタグを指す。「Ｆｃ」とは、Ｃ末端ヒトＩｇＧ１−Ｆｃタグを指す。
【０７１５】
ヒトＩＧＦ−１は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定した。ビオチン標識抗ＨｉｓＴａｇ抗体（ビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ社製  カタログ番号３４４４０）を、ＨＢ−ＥＰ緩衝液中５００ｎＭで注入することにより、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡチップ（カタログ番号ＢＲ−１０００−３２）表面に飽和するまで固定化した。各センサーグラムについて、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０（実施例５（パートＩＩ）で説明）を、２０μＬの４０ｎＭタンパク質を２μＬ／分で注入することにより、ビオチン−ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ表面で捕捉した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０注入の後、流速を２０μＬ／分に増加させた。ＩＧＦ−１Ｒを含有する第２の１３０μＬの注入を実施して、増殖ホルモンとその受容体との相互作用を調べた。ＩＧＦ−１を６４ｎＭから０．１２５ｎＭまで連続希釈して、濃度依存的動力学結合曲線を得た。一連の各注入は、１０μＬの１０ｍＭアセテートｐＨ４．０を２０μＬ／分で３回注入して再生した。各曲線は、（１）ＰＥＮＴＡ−Ｈｉｓ抗体を有していないストレプトアビジン表面から得たデータ及び（２）ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を最初に注入しその後ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を２番目に注入したデータを使用して、二重に基準化した。ＩＧＦ−１の一連の濃度を、製造業者のＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア内に提供されている１：１結合モデルにフィッティングした。１つはランニング緩衝液、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０注入緩衝液、及びＩＧＦ−１注入緩衝液中４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６の非存在化、もう１つは存在下の２組のデータを取得した。
【０７１６】
ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ／Ｍ１３−Ｃ０６抗体三重複合体のプルダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）及びウェスタンブロット解析
再懸濁したプロテインＡ／Ｇビーズ（３００μｌ、Ｐｉｅｒｃｅ社製  カタログ番号２０４２２）を、１×ＰＢＳで洗浄し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブにおいて１．０ｍｇ  Ｍ１３−Ｃ０６と室温で２時間回転振とう器で混合した。別のチューブで、１２μｇのｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及び４６０ｎｇのヒトＩＧＦ−１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製  カタログ番号ＧＦ００６）を、室温で１時間混合した（１：１タンパク質：タンパク質比率）。Ｍ１３−Ｃ０６と結合したプロテインＡ／Ｇを、ＰＢＳで洗浄し、室温で３０分間ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０／ＩＧＦ−１混合物と共に培養した。タンパク質と結合したプロテインＡ／ＧをＰＢＳで洗浄し、その後３００μＬの１００ｍＭグリシン、ｐＨ３．０で結合タンパク質を溶出した。陰性対照の場合、１２μｇのヒトＩＧＦ−１Ｒ（１〜９０２）−Ｈｉｓ１０の添加を省略した。溶出したタンパク質を、抗ヒトＩＧＦ−１抗体（ウサギ抗ヒトＩＧＦ−１ビオチン、ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製  カタログ番号Ｉ７６６１−０１Ｂ）及び抗ヒトＩＧＦ−１Ｒ抗体（ＩＧＦ−１Ｒα  １Ｈ７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製  カタログ番号ｓｃ−４６１）を一次抗体として用いて、その後ＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製  カタログ番号７１００−０５）及びＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製  カタログ番号Ｉ１９０４−４０Ｊ）を二次抗体として用いて、ウェスタンブロットにより検出した。ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−１Ｒ／Ｍ１３−Ｃ０６が、三重複合体を形成する能力を示すため、この実験の中で使用したＩＧＦ−１及びＩＧＦ−１Ｒの濃度は、これらタンパク質（特に、血清中のＩＧＦ−１）の通常の生理学的レベルを十分に超過しており（１５倍を超える）、並びにＩＧＦ−１Ｒ／ＩＧＦ−１の実測平衡解離定数も超過していた。例えば、Ｈａｎｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７を参照されたい。
【０７１７】
ＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）−Ｆｃの構築、及び全長受容体細胞外ドメインと比べた相対的抗体結合研究
ヒトＩＧＦ−１ＲのＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合ドメイン、Ｌ１−ＣＲ−Ｌ２（残基１〜４６２）の構築は、以前に発表されている（ＭｃＫｅｒｎ  １９９７）。この情報を使用して、本発明者らは、ヒトＩＧＦ−１Ｒ残基１〜４６２を（Ｎ末端シグナル配列と共に）、全長ヒト細胞外ドメイン（残基１〜９０３、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ）を生成するために使用したのと同じ自家製ＰＶ９０ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯでの発現を、以前に記載されている方法を使用して促進した（Ｂｒｅｚｉｎｓｋｙ  ２００３）。タンパク質を、他のＦｃ融合タンパク質用について以前に記述されているように、プロテインＡ親和性カラムを通過させることによりＣＨＯ上清から精製した（Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ２００６）。このタンパク質構築体を、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）−Ｆｃと称する。
【０７１８】
Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１抗体がｈＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）−Ｆｃ、及び全長細胞外ドメイン構築体ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに結合する能力を、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を使用してＳＰＲにより決定した。この装置を、２５℃に設定し、ランニング緩衝液はＨＢ−ＥＰ、ｐＨ７．２（Ｂｉａｃｏｒｅ社製、カタログ番号ＢＲ−１００１−８８）であった。完全ヒト抗体Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１を、Ｂｉａｃｏｒｅ社が提供するプロトコールに従って標準的ＮＨＳ／ＥＤＣアミン反応化学を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５研究用センサーチップ(カタログ番号ＢＲ−１０００−１４)表面に約１０，０００ＲＵで固定化した。固定化のために、抗体を１０ｍＭアセテートｐＨ４．０緩衝液で４０μｇ／ｍＬに希釈した。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ及びｈＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）−Ｆｃのヒト抗体の各々に対する結合及び解離の相対的動力学を調べるために、各受容体構築体を、濃度を増加させてセンサーチップ表面に注入した。一連のｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ濃度は、１．０ｎＭから１００ｎＭの範囲であり、一連のｈＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）−Ｆｃ濃度は、１．０ｎＭから２μＭの範囲であった。抗体表面は全て、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．０を用いて高い信頼性で再生した。反復再生は、いずれの抗体表面でも活性消失に結びつかなかった。流速は２０μｌ／分であった。
【０７１９】
エピトープマッピング突然変異
ＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６抗体のエピトープを探索する突然変異の選択は、Ｂｉａｃｏｒｅ及びＦＲＥＴ結合実験（実施例５（パートＩＩＩ））において、マウスＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１３−Ｃ０６の結合親和性が著しく低減されたか又は検出不能であったという観察に基づいていた。マウス及びヒトＩＧＦ−１Ｒは、９５％の一次アミノ酸配列同一性を共有する。ヒトＩＧＦ−１Ｒ及びヒトＩＮＳＲは、５７％の同一性（７３％の類似性）を共有する。本発明者らは、細胞外ドメインにおいてマウスＩＧＦ−１ＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとで異なる３３残基を特定した（表１６）。ＩＮＳＲ細胞外ドメイン内の相同的位置は、最近のＩＮＳＲ結晶構造（ｐｄｂコード２ＤＴＧ、ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）に基づくと溶媒に露出していたため、これら残基のうちの２０個を突然変異の標的とした。接触可能表面積は、１．４Åプローブを用いてＳｔｒｕｃＴｏｏｌｓ（http://molbio.info.nih.gov/structbio/basic.html）を使用して計算した。ＩＮＳＲ構造中にはない４個の追加的な残基は、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合に重要であることが実証されているＦｎＩＩＩ−２ドメインの非構造ループ領域に存在したため、それらも突然変異誘発用に選択した（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。エピトープマッピング研究用に選択した２４個の突然変異のリストは、表１７に示されている。
【表１８】
2011516549.tif 000028
【０７２０】
２４個の突然変異体エピトープマッピングライブラリーを、製造業者のプロトコールに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製の部位特異的変異誘発キットを使用して、野生型ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ＰＶ−９０プラスミドを突然変異させることにより構築した。各突然変異体（又はＳＤ００４、ＳＤ０１１、ＳＤ０１４、ＳＤ０１６、及びＳＤ０１９ライブラリメンバーの場合は二重突然変異体）のＰＶ−９０ベクターへの組み込みは、本発明者らの組織内ＤＮＡ配列決定施設により確認された。プラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ社製ミニプレップキット及びＱｉａｇｅｎ社製無エンドトキシンマキシキットを使用して、それぞれミニプレップ及びマキシプレップした。２００μｇの各突然変異プラスミドを、ＰｏｌｙＦｅｃｔ形質移入キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、１００ｍＬのＨＥＫ２９３Ｔ細胞に２×１０６細胞／ｍＬで一過性に形質移入して、可溶性タンパク質を培地に分泌させた。細胞を、３７℃のＣＯ２恒温器において、ＤＭＥＭ（ＩｖｒｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、１０％ＦＢＳ（低ＩｇＧウシ血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、２０ｍＬプロテインＡカラムに通過させてウシＩｇＧをさらに低減させた）中で培養した。７日後、各ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ突然変異体を含有する上清を、１２００ｒｐｍの遠心分離で収集し、０．２μｍフィルターでろ過した。１×ＰＢＳで事前に平衡化した１．２ｍＬプロテインＡセファロースＦＦカラムに上清を通過させることにより、各突然変異体を親和性精製した。突然変異体を、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０を使用してカラムから溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、０．１％トウィーン８０で中和し、ＶｉｖａＳｐｉｎ６  ＭＷＣＯ３０，０００遠心濃度デバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、カタログ番号ＶＳ０６２１）を使用して約３００μＬに濃縮した。
【０７２１】
ＩＧＦ−１Ｒ突然変異体のウェスタンブロット分析
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ突然変異体試料を、標準的な製造業者のプロトコールに従ってＸｃｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋミニセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  カタログ番号ＥＩ０００１）を使用して、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  カタログ番号ＥＣ６０２８）に流した。標準的な製造業者のプロトコールに従ってｉＢｌｏｔ  Ｄｒｙ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  カタログ番号ＩＢ１００１）及びＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  カタログ番号ＩＢ３０１０−０１又は３０１０−０２）を使用して、試料をニトロセルロースに移した。膜を、２５ｍｌのＰＢＳＴ；５ｍｇ／ｍｌの脱脂乳中で終夜４℃でブロッキングした。ブロッキングの後、膜を、２５ｍｌのＰＢＳＴで５分間室温で１回洗浄した。１０ｍｌ  ＰＢＳＴ中１：１００の一次抗ＩＧＦ−１Ｒβ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製  カタログ番号ｓｃ−９０３８）と共に、膜を室温で１時間インキュベートした。その後、膜を５分間２５ｍｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。検出のために、１０ｍｌ  ＰＢＳＴ中１：１０００に稀釈した二次ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃ抗体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製  カタログ番号Ｉ１９０４−４０Ｊ）と共に、膜を室温で１時間インキュベートした。膜を、５分間２５ｍｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、その後２０分間２５ｍｌのＰＢＳＴで１回洗浄した。タンパク質のバンドを、標準的な製造業者のプロトコールに従ってＡｍｅｒｓｈａｍ社製ＥＣＬウエスタンブロッティング分析システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製  カタログ番号ＲＰＮ２１０８）を使用して検出した。
【０７２２】
ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ突然変異体ライブラリのＢｉａｃｏｒｅ分析
ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ及びｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃは両方とも、２つの別々のホモ二量体領域（ＩＧＦ−１Ｒ及びＩｇＧ１−Ｆｃ）が組込まれていることにより高度に多価性の性質を持つため、上述のＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１センサーチップ表面に見かけ上の高親和性で結合する。Ｍ１３−Ｃ０６に対するｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの実際の高親和性結合と、Ｍ１３−Ｃ０６に対するｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの低親和性結合とを区別するため、受容体−Ｆｃ融合体をＭ１３−Ｃ０６センサーチップ表面で捕捉し、その後さらなる可溶性Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ結合事象を続けた。６０μＬの親和性精製した濃縮物質を1μＬ／分の流速で注入することにより、受容体−Ｆｃ構築体をＭ１３−Ｃ０６チップ表面で捕捉した（上述のように調製した）。受容体−Ｆｃ負荷ステップの完了後、流速を５μｌ／分に上昇させた。１０ｎＭ、３ｎＭ、及び１ｎＭのＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ濃度を、各受容体−Ｆｃ構築体の負荷後に注入した（５０μＬ）。各センサーグラムの終わりで、流速を３０μｌ／分に上昇させ、チップ表面を、１０μＬの０．１Ｍグリシン、ｐＨ２の２回注入により再生した。
【０７２３】
ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ突然変異体スクリーニングのための時間分解型蛍光共鳴エネルギー転移（ｔｒ−ＦＲＥＴ）アッセイ
０．２５〜０．５μｇ（２５μｌ）から開始した突然変異受容体の連続希釈液を、３８４ウエルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ社製、白色）において０．０５μｇのＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５（１２．５μｌ）及び０．００３７５μｇのＥｕ：Ｃ０６（１２．５μｌ）と混合した。ＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０−Ｃｙ５の結合レベルは、６．８：１  Ｃｙ５：ＩＧＦ１Ｒ−Ｈｉｓ１０であり、Ｅｕ−Ｃ０６の場合は１０．３：１  Ｅｕ：Ｃ０６であった。総容積は、各試料につき５０μｌであった。プレートを、室温で１時間プレート撹拌器でインキュベートした。蛍光測定は、励起波長が３４０ｎｍで発光波長が６６５ｎｍのＬＡＮＣＥプロトコールを使用して、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２蛍光プレートリーダ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）で実施した。データは全て、１部位結合モデルにフィッティングし、そこから対応するＩＣ５０値を決定した。
【０７２４】
結果：
Ｍ１３−Ｃ０６による、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＩＧＦ−１及び／又はＩＧＦ−２結合の阻害が、実施例３に前述されているように示された。飽和条件でさえ、ほとんどの抗体は、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２結合を完全には阻害しない。特に、Ｍ１３−Ｃ０６の場合、本発明者らは、リガンド結合の阻害が、非競合的又はアロステリック的である可能性があるという仮説をたてた。この仮説を試験するために、本発明者らは、４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６抗体（ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対する抗体の親和性より４０００倍高い）の存在下及び非存在化で、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の親和性を決定した。ＳＰＲを使用し、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０を、抗Ｈｉｓｔａｇ抗体を使用してチップ表面に固定化し、その後濃度を増加させてＩＧＦ−１を注入した（６４ｎＭまで）。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１結合は、４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６の非存在下及び存在下で明白であった。（データ非表示：表面プラズモン共鳴は、４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６の非存在下及び存在下における、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１の結合を示す。ＳＰＲ結合相は１４００〜１８００秒の間であり、解離相は１８００〜３０００秒の間であった。Ｍ１３−Ｃ０６の非存在下で、ＩＧＦ−１は、ＫＤ＝１７ｎＭ（ｋａ＝２．４×１０−５／Ｍ＊ｓ）で、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合した。４００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６の存在下では、ＩＧＦ−１は、ＫＤ＝５９ｎＭ（ｋａ＝７．１×１０−４／Ｍ＊ｓ）で、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に結合した。）   ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１結合の動力学的結合速度定数は、Ｍ１３−Ｃ０６の存在下ではおよそ３倍に低下し、Ｍ１３−Ｃ０６が受容体に対するリガンドの親和性をアロステリック的に低下させることを示唆した。
【０７２５】
Ｍ１３−Ｃ０６がｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対する結合をＩＧＦ−１と直接競合しないことを支持する根拠は、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０に対するＩＧＦ−１及びＭ１３−Ｃ０６の見かけ上の親和性を両方とも十分に超えた濃度のＭ１３−Ｃ０６を使用して、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０及びＩＧＦ−１の共免疫沈降を実施することによりもたらされた。ウェスタンブロット分析は、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０と混合したＩＧＦ−１物質の約７０〜１００％がＭ１３−Ｃ０６と共にプルダウンしたことを示し、それにより、Ｍ１３−Ｃ０６及びＩＧＦ−１がｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｈｉｓ１０と共結合して三重複合体を形成する可能性がことが示された。これらの結果は、ＩＧＦ−１結合のＭ１３−Ｃ０６による阻害が、通常のＩＧＦ−１血清濃度でアロステリック的性質を持つことを示し、Ｍ１３−Ｃ０６の結合部位が、ＩＧＦ−１Ｒリガンド結合ポケットと重複しないことを示唆する。
【０７２６】
次に、本発明者らは、Ｍ１３−Ｃ０６が、ＩＧＦ−１Ｒの推定リガンド結合ドメイン（Ｌ１−ＣＲ−Ｌ２）に結合するかどうかを調査した。本発明者らは、ＩｇＧ１−Ｆｃに融合されたＮ末端の３つのドメイン（残基１〜４６２）を含有する短縮型の受容体を生成し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１と結合するその能力を、全長受容体細胞外ドメイン構築体ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃの能力と比較した。Ｍ１４−Ｇ１１は、短縮型の受容体に対する同様の結合性を示したが、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３の結合性は劇的に低減された。（データ非表示：Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１抗体を固定化した表面を、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１〜９０３）Ｆｃ及び短縮型ｈＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）−Ｆｃに対する結合について、２μＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、及び１ｎＭの範囲の濃度で試験した。ＳＰＲ結合相は４８０〜９６０秒の間であり、解離相は９６０〜１１７０秒の間であった。）  残存結合性はＭ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３の両方で明白であったが、このデータは、これら抗体のエピトープの少なくとも相当部分が、リガンド結合ドメイン外のＩＧＦ−１Ｒ領域に存在することを示唆する。
【０７２７】
本発明者らは、マウスＩＧＦ−１ＲがＭ１３−Ｃ０６抗体に結合しないという事実を利用して、ＩＧＦ−１ＲにあるＭ１３−Ｃ０６結合部位の位置を評価するためにｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ内のマウス突然変異のライブラリを設計した。試験したｈＩＧＦ−１Ｒの種々の突然変異は、表１７に示されている。ウェスタンブロット分析を使用して、各ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ突然変異体の発現を確認し、陽性対照として精製ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを使用して、各突然変異体タンパク質の相対的濃度を近似する標準曲線を導き出した（データ非表示）。
【表１９】
2011516549.tif 000029
【０７２８】
ＳＰＲ及びｔｒ−ＦＲＥＴを使用して、Ｍ１３−Ｃ０６に対するＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ結合を阻害する突然変異についてスクリーニングした。ＳＤ０１５突然変異体を除いて、全ての突然変異ＩＧＦ−１Ｒ構築体が、ＳＰＲ実験でＭ１３−Ｃ０６結合活性又はＭ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ結合活性を示した。図２６、表１７、及び非表示のデータを参照されたい（競合阻害分析を使用して、未標識ｈＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ（ＳＤＷＴ）、マウスＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ（ｍＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ）、及び突然変異ｈＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ構築体の濃度を増加させることにより、Ｃｙ５標識ＩＧＦ１Ｒに結合したＥｕ−Ｍ１３−Ｃ０６の置換に関する結合曲線を確立した）。
【０７２９】
発現及びウェスタンブロットによる定量化には自然変動があるため、ｔｒ−ＦＲＥＴを使用して決定したＩＣ５０値及びＳＰＲを使用して決定した相対的結合強度にはある程度のばらつきがあったが、ＳＤ０１５は、両アッセイでＭ１３−Ｃ０６に対する結合活性を事実上示さず、ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ対照について決定した結果と類似していた唯一の突然変異体であった。Ｈｉｓ４６４は、短縮型ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ構築体（つまり、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）−Ｆｃ）のＣ末端に向かって、一次アミノ酸配列で２個アミノ酸だけＣ末端側に位置する。短縮型ｈＩＧＦ−１Ｒ（１〜４６２）に対するＭ１３−Ｃ０６の残存結合活性は、Ｍ１３−Ｃ０６結合エピトープが残基Ｖａｌ４６２〜Ｈｉｓ４６４を最小限に包含することを示唆する。Ｍ１３−Ｃ０６のエピトープが立体構造に依存するという根拠が示されているため、さらなる残基が抗体エピトープ結合相互作用に関与している可能性が高い。しかしながら、特筆すべきは、残基Ｖａｌ４６２及びＨｉｓ４６４が、ＦｎＩＩＩ−１ドメインの外部表面に存在すると予測されていることである（図２７）。
【０７３０】
Ｍ１３−Ｃ０６エピトープの範囲（つまり、４６２〜４６４の周囲にあるどの残基が、抗体結合及び活性にとって重要であるか）を特徴付ける試みでは、本発明者らは構造モデリング手法を採用した。ヒトＩＧＦ−１Ｒ及びヒトＩＮＳＲは、５７％同一性（７３％類似性）及び類似の三次構造を共有する。Ｘ線結晶構造のタンパク質抗原：抗体結合表面は、平均結合表面が７００Å２（オングストローム二乗）であり、結合エピトープの中心から半径およそ１４Åであることが、以前の解析により示唆されている（Ｄａｖｉｅｓ  １９９６）。ＩＮＳＲの相同性細胞外ドメインのＸ線結晶構造（ｐｄｂコード２ＤＴＧ、（ＭｃＫｅｒｎ  ２００６））を使用して、本発明者らは、ＩＧＦ−１Ｒ残基Ｖ４６２からＨ４６４までをＩＮＳＲ残基Ｌ４７２及びＫ４７４にマッピングすることにより、残基４６２〜４６４の半径１４Å内のＦｎＩＩＩ−１ドメイン表面の残基を計算した。１４Å内の任意の原子間距離にカットオフ距離を適用し、平均距離は、表面パッチ内の各残基に対するＬ４７２及びＫ４７４のＣα間距離から計算した。計算した平均距離は、Ｃα間距離が１４Åを超えるが側鎖は１４Åカットオフ内にある残基の場合、１４Åとして列挙されている。Ｍ１３−Ｃ０６結合及び活性に重要である可能性が高い残基が、表１８に列挙されている。
【０７３１】
表１８．  Ｍ１３−Ｃ０６結合及び活性に重要であると予測されるＩＧＦ−１Ｒ内の残基。残基４６２及び４６４は、ＩＧＦ−１Ｒ結合エピトープの予測される中心であり、Ｍ１３−Ｃ０６結合におけるこれら残基の重要性が実験データにより示されているため、イタリック体にしてある。
【表２０】
2011516549.tif 000030
【０７３２】
発表されている研究により、残基４４０〜５８６を認識する抗体は、ＩＧＦ−１結合に対して阻害性及びアゴニスト性の両方であり得ることが示されている（Ｓｏｏｓ  １９９２；Ｋｅｙｈａｎｆａｒ  ２００７）。４４０〜５８６は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体に接近可能な多くの潜在的非重複表面を有するＬ２及びＦｎＩＩＩ−１の全てを表す。本発明者らの研究は、本発明者らの知る限り、ＩＧＦ−１Ｒの阻害性エピトープが特定の残基（複数可）にマッピングされた最初の研究である。ＩＮＳＲの最近の構造は、その受容体に対するインスリン結合を阻害することが知られている抗ＩＮＳＲ抗体と共に共結晶化されていた（Ｓｏｏｓ  １９８６；ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）。ＩＧＦ−１ＲのＨｉｓ４６４（ＩＮＳＲのＫ４７４）に対する相同性残基は、この抗体とＩＮＳＲとの結合表面の一部である。Ｍ１３−Ｃ０６が、アンタゴニスト的抗ＩＮＳＲ抗体と同じような、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１結合阻害の阻害機序を共有している可能性がある。
【０７３３】
（実施例２８）
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで効果的に腫瘍細胞へと局在化し、Ｋｉ６７発現を阻害し、ＩＧＦ−１Ｒの発現を下方制御する。
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで効果的に腫瘍細胞へと局在化する。
方法：ＳＣＩＤベージュマウスに、エストロゲン存在下の２×１０６個ＭＣＦ−７細胞（マトリゲル中の）を注射した（０．３６ｍｇペレット、９０日間放出（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ社製））。腫瘍を３００〜５００ｍｍ３に増殖させ、その後マウスに、３０ｍｇ／ｋｇのＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体を腹腔内注射した。マウスを屠殺し、注射の２、６、１２、２４、及び４８時間後に腫瘍を取り出し、ＯＣＴで凍結し、免疫組織化学的分析（ＩＨＣ）用に６μｍで切片化した。抗体注射をしなかった腫瘍を対照として切除した。腫瘍をＯＣＴで凍結し、ＩＨＣ用に６μｍで切片化した。基質は、紫色染料であるＶｅｃｔｏｒ社製ＶＩＰである。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ又はＩＤＥＣ１５１（陰性対照抗体）で処置した腫瘍に結合した抗体を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ（ヒトＥｌｉｔｅ  ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社製）を使用して検出した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ又はＩＤＥＣ１５１で処置した腫瘍上のＩＧＦ−１Ｒ発現を、α−ＩＧＦ−１Ｒ  Ｍａｂ（クローン２４−３１、ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ／Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ社製）を使用して検出した。同様の研究をＢｘＰＣ３膵癌異種移植モデルで実施した。
【０７３４】
結果（データ非表示）：マウスＭＣＦ−７乳腺腫瘍又はＢｘＰＣ３膵腫瘍の異種移植モデルを使用したｉｎ  ｖｉｖｏ効力実験は、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの腹腔内注射が、３０及び１５ｍｇ／ｋｇで腫瘍細胞増殖の阻害に効果的であったことを明らかにした。経時的実験を実施して、Ｍ１３．ｃ０６．ｇ４．ｐ．ａｇｌｙを３０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇで、それぞれＭＣＦ−７腫瘍又はＢｘ−Ｐｃ３腫瘍のいずれかを保持するマウスに単回投与した際の薬動力学を研究した。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、免疫組織化学的分析（ＩＨＣ）により決定したところ、処置のわずか６時間後には腫瘍に局在化し、４８時間で局在化は最大になった。ウエスタン分析及びＩＨＣ分析で決定したＩＧＦ−１Ｒの発現は、処置の６時間後にＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙで処置した腫瘍の顕著な消失を示し、２４時間でほとんど完全に消失した。アイソタイプ一致対照抗体で処置した腫瘍には変化が観察されなかった。腫瘍溶解産物をシグナル経路に関して分析すると、２〜１２時間でリン酸化Ｅｒｋ及びＡｋｔが一時的に低減されたことが明らかになった。
【０７３５】
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体はＫｉ６７発現を阻害する。
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙで処置された腫瘍のＫｉ６７染色は、対照抗体処置腫瘍と比較して、増殖細胞数の減少も示した（データ非表示）。これらのデータは、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙがｉｎ  ｖｉｖｏで効果的に腫瘍へと局在化し、ＩＧＦ−１Ｒの下方制御及びＩＧＦ−１Ｒ媒介性シグナル伝達の阻害により腫瘍増殖を阻害することを示す。
【０７３６】
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、腫瘍のＩＧＦ−１Ｒを下方制御及び分解する
ＩＧＦ−１Ｒを、ヒト膵細胞（ＢｘＰＣ３；図２８（Ａ））及び乳癌細胞（ＭＣＦ−７；図２８（Ｂ））で生成されたＳＣＩＤマウス腫瘍の溶解産物から免疫ブロットした。Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ又はＩＤＥＣ−１５１陰性対照抗体による処置後の指定の時点で、腫瘍を切除した。腫瘍を瞬間冷凍し、微粉砕し、溶解した。腫瘍細胞溶解産物のタンパク濃度を、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＳＤ、米国カリフォルニア州）で正規化及び分離した。ゲルをニトロセルロースフィルターにブロットし、ポリクローナル抗ＩＧＦ−１Ｒβを用いてプローブし、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体との酵素反応により検出した。結果は、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが、陰性対照抗体と比較して、ＩＧＦ−１Ｒの下方制御及び分解をもたらしたことを示す。
【０７３７】
（実施例２９）
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、様々な腫瘍モデル系でｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す。
前述の例に記載したように肺及び膵臓モデル系においてＭ１３．ｃ０６．ｇ４．ｐ．ａｇｌｙに関して示された腫瘍増殖のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害に加えて、以下の実験は、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙが活性を示す腫瘍細胞モデルの多様性をさらに実証する。
【０７３８】
ＭｉａＰａＣａ２膵癌細胞で生成された腫瘍におけるＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの抗腫瘍活性。
【０７３９】
雌ＳＣＩＤマウスの右側腹部に、５０％マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）／ＰＢＳ中の２×１０６個のＭｉａＰａＣａ２膵癌細胞を接種した。腫瘍が１５０ｍｍ３（Ｌ×Ｗ２／２）の体積に達するようにし、マウスを分類し、単剤（抗体単独）及び併用処置（Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体及びゲムシタビン）で腹腔内投与した。ゲムシタビン単独（２０ｍｇ／ｋｇ、Ｑ４Ｄ×３）及びＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（３０ｍｇ／ｋｇ）との組合せ、並びにＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ単独（１５ｍｇ／ｋｇ及び３０ｍｇ／ｋｇの両方；１×週×６）は、腫瘍増殖を阻害した。
【０７４０】
ゲムシタビンに加えて、他の多くの併用療法も試験することができ、本発明により包含される抗体と共に使用することができる可能性がある。例えば、少数の代表的な例を列挙すると、以下の分類の化合物の併用療法を、本発明により包含される抗体と共に使用できる可能性がある：
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤、例えば：
Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブ）
Ｉｒｅｓｓａ（ゲフィチニブ）
ＥＧＦＲ抗体、例えば：
ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）
ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）（パニツムマブ）
ｍＴＯＲ阻害剤、例えば：
テムシロリムス
ラパマイシン
及び他の抗癌化合物、例えば：
ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（メシル酸イマチニブ）
ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（リンゴ酸スニチニブ）
ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）（トシル酸ソラフェニブ／ＢＡＹ４３−９００６）
ＳＡＨＡ（スベロイルアニリドヒドロキサム酸；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤）
ＶＯＬＯＣＩＸＩＭＡＢ（商標）（Ｍ２００）。
【０７４１】
原発性ヒト結腸腺癌に由来する細胞で生成した腫瘍におけるＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの抗腫瘍活性。
【０７４２】
雌ＳＣＩＤマウスの右側腹に、１ｍｍ３の結腸腫瘍断片を接種した。腫瘍断片は、結腸腺癌の患者から腫瘍を外科的に切除して得た結腸腫瘍組織の連続継代（５×）に由来した。腫瘍が１５０ｍｍ３（Ｌ×Ｗ２／２）の体積に達するようにし、マウスを分類し、指定の処置を投与した（ｎ＝６）（図２９）。１５ｍｇ／ｋｇ又は３０ｍｇ／ｋｇの抗体を、週１回腹腔内投与した。
【０７４３】
結果：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＳＣＩＤマウスの原発性結腸腫瘍（ＣＴ３）増殖を効果的に阻害した（図２９）。
【０７４４】
ＭＣＦ−７乳癌細胞で生成された腫瘍におけるＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙの抗腫瘍活性。
【０７４５】
雌ＳＣＩＤベージュマウスの右側腹に、５０％マトリゲル／ＰＢＳ中の２×１０６個のＭＣＦ−７細胞（エストロゲン依存性）を接種した。エストラジオールペレットを、細胞接種の２４時間前に左側腹に埋め込んだ（０．３６ｍｇペレットエストラジオール、９０日間放出（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ社製）。腫瘍が１５０ｍｍ３（Ｌ×Ｗ２／２）の体積に達するようにし、マウスを分類し、指定の処置を投与した（ｎ＝１０）（図３０）。各投薬計画について、抗体を週１回腹腔内投与し、落花生油中のクエン酸タモキシフェン（Sigma-Aldrich社製、（セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国））を週５回皮下投与した。対応スチューデントｔ検定を使用して、統計分析を実施した。
【０７４６】
結果：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙは、ＭＣＦ−７乳癌腫瘍の増殖を効果的に阻害した（図３０）。
【０７４７】
無論、本発明により包含される抗体の腫瘍阻害効力は、多くの他の癌細胞タイプでも容易に試験することができる（例えば、少数の代表的な例を挙げると、肺癌細胞系Ｈ−１２９９、Ｈ−４６０、Ｈ−２３；結腸癌細胞系Ｃｏｌｏ２０５及びＨＴ−２９；Ｐａｎｃ−１などの膵癌細胞系；及びＰＣ−３などの前立腺癌細胞系）。
【０７４８】
（実施例３０）
Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＤＣＣ活性を示さない。
方法：
ヒト末梢血単核細胞を、標準的Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ分離法によりヘパリン処理全血から精製した。細胞を、１０％ＦＢＳ及び２００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ−２を含有するＧＩＢＣＯ（商標）ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、細胞を収集し、培地で１回洗浄し、１×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０７４９】
標的細胞（ＭＣＦ−７、乳癌細胞）を、３７℃で１時間１００μＣｉの５１Ｃｒと共にインキュベートした。標的細胞を１回洗浄して取り込まれなかった５１Ｃｒを除去し、１×１０４細胞／ウエルの体積で播種した。標的細胞を、５０μｌのエフェクター細胞及び５０μｌの抗体と共にインキュベートした。１：５０の標的対エフェクター比を、実験全体にわたって使用した。含まれていた対照を抗体と共に及び抗体無しでインキュベートし、これら抗体には、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ、ハーセプチン（陽性対照）、及びＩＤＥＣ−１５１（陰性対照、ＣＤ４に特異的なマカク／ヒトキメラＩｇＧ１モノクローナル抗体）が含まれる。３７℃で４時間インキュベーションした後、上清を収集し、ガンマカウンター（Ｉｓｏｄａｔａガンマカウンター、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製）で計数した。溶解％を、以下の計算式を使用して決定した：
【０７５０】
溶解％＝［試料放出（ＣＰＭ）−自然放出（ＣＰＭ）］÷［最大放出（ＣＰＭ）−自然放出（ＣＰＭ）］×１００％
【０７５１】
結果：ハーセプチン抗体陽性対照とは対照的に、Ｍ１３−Ｃ０６抗体及びＩＤＥＣ−１５１抗体は両方ともＡＤＣＣ活性を示さず、これにより、これら後者の抗体にはエフェクター機能が欠如していることが示された（図３１）。
【０７５２】
（実施例３１）
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体を使用したヒト癌の治療
この例では、ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体を使用して、悪性細胞、例えばＩＧＦ−１Ｒ発現が検出された過剰増殖する細胞を標的とする癌治療法を記述する。
【０７５３】
特定の実施形態では、Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（又は本発明により包含される別の抗体）を精製し、注射に好適な医薬媒体と共に製剤化する。過剰増殖性障害を有するヒト患者に、静脈内点滴により、約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重のＭ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ抗体（又は本発明により包含される別の抗体）の複数回投与を、例えば２週に１回又は月に１回、少なくとも６か月に１回投与する。間隔は、患者の予後指標の測定が示す結果にに従って、不定期であってもよい。
【０７５４】
抗体は、標準的放射線治療計画の前に、同時に、又はその後に、本明細書に記載されているように投与することができる。治療が、その結果として、例えば腫瘍退縮、新しい腫瘍発生の低減、腫瘍抗原発現の低下、又は疾患予後を評価する他の手段に基づく抗腫瘍性応答をもたらしたかどうかを決定するために、患者をモニターする。
【０７５５】
（実施例３２）
ＩＧＦ−１Ｒのアロステリック的及び競合的抗体阻害剤の残基特異的エピトープマッピング
目的
目的は、阻害性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の結合エピトープ及びＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２遮断の背後にある機序を解明することであった。
【０７５６】
背景  ＩＧＦ−１Ｒ（１型インスリン様増殖因子受容体）は、多数の正常細胞タイプ上で発現される受容体チロシンキナーゼである（Ｐｏｌｌａｋ  ２００４）。ＩＧＦ−１Ｒは、腫瘍増殖及び生存にも関与しており、したがって、抗体に基づく治療介入手法及び低分子に基づく治療介入手法の両手法の標的となっている。阻害性抗体は、受容体の細胞外リガンド結合ドメインを標的としてきた。ＩＧＦ−１Ｒ細胞外領域は、以下の６つのタンパク質ドメインで構成されている：Ｌ１として知られているＮ末端のロイシンに富む反復ドメイン、システインに富む領域（ＣＲＲ）、第２のロイシンに富む反復ドメイン（Ｌ２）、並びにＦｎＩＩＩ−１、ＦｎＩＩＩ−２、及びＦｎＩＩＩ−３と称される３つのＣ末端フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（図３５）。ここで、本発明者らは、ＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメインの表面にある２つの別々のエピトープが、受容体の阻害をもたらすことができることを示す。本発明者らは、４６個の個別又は二重ＩＧＦ−１Ｒ突然変異のデータセットに基づいて、これら２つのエピトープに関する新規の残基特異的エピトープマッピング情報を生成した。第１のエピトープは、ＦｎＩＩＩ−１に存在し、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２両結合のアロステリック的遮断をもたらす。第２のエピトープは、ＣＲＲドメイン内にあり、推定ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合部位の近くにある。本発明者らは、この領域内の抗体エピトープの微妙な相異により、単一リガンドＩＧＦ−１の結合をアロステリック的に阻止する能力と、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方を競合的に阻止する能力とが区別されることを発見した。両リガンドの競合的遮断を達成するために標的としなければならない特定の残基は、ここで初めて特定された。
【０７５７】
物質
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＰ１Ｅ２を上述のように精製した（例えば、実施例１０を参照）。市販の阻害性ＩＧＦ−１Ｒ抗体（αＩＲ３（Ｊａｃｏｂｓ  １９８６））をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（カタログ番号ＧＲ１１ＬＳＰ５）から購入した。Ｎ末端オクタヒスチジンタグを有するヒトＩＧＦ−１を、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）中で組換え的に産生させ、Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースを使用して精製した。Ｃ末端１０ヒスチジンタグを含有する組換え可溶性ヒトＩＧＦ−１Ｒ細胞外ドメイン構築体を、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社（カタログ番号３０５−ＧＲ−０５０）から購入し、ｈＩＧＦ−１Ｒ（１〜９０２）−Ｈｉｓ１０と称した。ヒト及びマウスＩＧＦ−１Ｒ（１〜９０３）−ＩｇＧ１−Ｆｃ融合タンパク質を構築し、標準的プロテインＡクロマトグラフィ法を使用して精製した。
【０７５８】
方法
抗体交差阻止研究
種々の抗体がＭ１３−Ｃ０６又はＭ１４−Ｇ１１を阻止する能力を、ビオチン化型の抗体及びｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを両方とも使用して決定した。手短に言えば、５０μＬの１×ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ  ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを、９６ウエル透明ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエルに、室温で２時間コーティングした（室温、振とうしない）。プレートを１×ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ溶液を使用して、２〜８℃で終夜ブロッキングした。プレートを洗浄し、ビオチン化Ｍ１３−Ｃ０６又はビオチン化Ｍ１４−Ｇ１１（８０ｎｇ／ｍＬ）及び阻害剤抗体の１００μＬ混合液と共に室温で１時間インキュベートした。阻害抗体を、４０μｇ／ｍＬから３ｎｇ／ｍＬまで連続希釈した（５倍希釈）。Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｇ１１を、製造業者により提供されたプロトコールに従ってＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社製、カタログ番号２１３３５）を使用してビオチン化した。ＩＧＦ−１Ｒ非特異的ＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体を、ビオチン化Ｍ１３−Ｃ０６又はビオチン化Ｍ１４−Ｇ１１で連続希釈することにより、対照も実施した。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウエルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（ブロッキング緩衝液で１：４０００に希釈、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製  カタログ番号７１００−０５）と共に室温で１時間振とうした。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウエルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社製、カタログ番号５３−００−０１）をウエルに添加した。ビオチン化Ｍ１３−Ｃ０６又はＭ１４−Ｇ１１の存在の検出を、Ｗａｌｌａｃ社製１４２０−０４１型Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒプレートリーダーを使用して、５分毎に６５０ｎｍの吸光度を読み取ることにより実施した。
【０７５９】
種々の抗体がマウスαＩＲ３を阻止する能力を、「Ｚｅｎｏｎ−Ｆａｂ−ＨＲＰ」標識αＩＲ３及びｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを使用して決定した。αＩＲ（ＩｇＧ１）を、製造業者により記述されているようにＺｅｎｏｎ（登録商標）−Ｆａｂ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  カタログ番号Ｚ２５０５４）で標識した。手短に言えば、５０μＬの１×ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ  ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを、９６ウエル透明ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエルに、室温で２時間コーティングした（振とうしない）。プレートを１×ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ溶液を使用して、２〜８℃で終夜ブロッキングした。プレートを洗浄し、Ｚｅｎｏｎ標識αＩＲ３（４０ｎｇ／ｍＬ）及び阻害抗体の１００μＬ混合液と共に室温で１時間インキュベートした。阻害抗体を、４０μｇ／ｍＬから３ｎｇ／ｍＬまで連続希釈した（５倍希釈）。Ｚｅｎｏｎ標識αＩＲ３を有するＩＧＦ−１Ｒ非特異的ＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体を連続希釈することにより、対照阻害を実施した。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウエルのＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社製、カタログ番号５３−００−０１）をウエルに添加した。Ｚｅｎｏｎ標識αＩＲ３の検出を、Ｗａｌｌａｃ社製１４２０−０４１型Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒプレートリーダーを使用して、５分毎に６５０ｎｍの吸光度を読み取ることにより実施した。
【０７６０】
ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２阻止
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを、製造業者により提供されたプロトコールに従ってＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社製、カタログ番号２１３３５）を使用してビオチン化した。５μｇ／ｍｌのビオチン化ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃを、ＳｉｇｍａＳｃｒｅｅｎストレプトアビジンコーティング９６ウエルプレート（Ｓｉｇｍａ社製、カタログ番号Ｍ５４３２−５ＥＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国））のウエルに、１００μＬ／ウエルで添加し、２〜８℃で終夜インキュベートした。その後、プレートを、２００μＬ／ウエルのＰＢＳＴで４回洗浄した。ヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓを、ＰＢＳＴ、１．０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡで３２０ｎＭに調製した。抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２、及びαＩＲ３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、カタログ番号ＧＲ１１ＬＳＰ５）の連続希釈液を、３２０ｎＭのＩＧＦ−１  Ｈｉｓ溶液で作製した。希釈液は、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３の場合は１．３μＭから１０ｐＭまで、Ｍ１４−Ｇ１１の場合は５．２μＭから１０ｐＭまで、並びにＰ１Ｅ２及びαＩＲ３の場合は両方とも２．６μＭから１０ｐＭまでで作製した。ヒトＩＧＦ−２  Ｈｉｓを、ＰＢＳＴ、１．０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡで３２０ｎＭに調製した。３２０ｎＭのＩＧＦ−２  Ｈｉｓ溶液を使用して、抗体を連続希釈した（Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３の場合は１．３μＭから５ｐＭまで、Ｍ１４−Ｇ１１及びαＩＲ３の場合は５．２μＭから５ｐＭまで、及びＰ１Ｅ２の場合は５．２μＭから２０ｐＭまで）。希釈液を１００μＬ／ウエルで重複してプレートに添加し、プレートを１時間室温でインキュベートした。その後、プレートを２００μＬ／ウエルのＰＢＳＴで４回洗浄した。ＨＲＰ結合抗Ｈｉｓｔａｇ抗体（Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ  ＨＲＰ結合体、ＱＩＡＧＥＮ社製、カタログ番号１０１４９９２）を、ＰＢＳＴで１：１０００に希釈し、１００μＬ／ウエルでプレートに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを、２００μＬ／ウエルのＰＢＳＴで４回洗浄した。ＳｕｒｅＢｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＴＭＢ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ社製、カタログ番号５３−００−０１）を、１００μＬ／ウエルでプレートに添加し、その後所望の反応が観察された際に１％リン酸を１００μＬ／ウエルで添加した。各ウエルの吸光度を４５０ｎｍで決定し、その結果を正規化し、抗体濃度の対数に対してプロットした。
【０７６１】
エピトープマッピング突然変異
４６個の突然変異体エピトープマッピングライブラリーを、製造業者のプロトコールに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製の部位特異的変異誘発キットを使用して、野生型ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ  ＰＶ−９０プラスミドに突然変異を誘発させることにより構築した。ＰＶ−９０ベクター内の各突然変異（又は二重突然変異）の組み込みを、ＤＮＡ配列決定により確認した。ＤＮＡ生成のために、プラスミドをＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号１８２５８−０１２）に形質転換し、３７℃で終夜培養し、それぞれＱｉａｇｅｎ社製ミニプレップキット又はＱｉａｇｅｎ社製無エンドトキシンマキシプレップキットを使用して、ミニプレップ又はマキシプレップした。可溶性タンパク質を培地に分泌されるために、ＰｏｌｙＦｅｃｔ形質移入キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）使用して、２００μｇの各突然変異プラスミドを１００ｍＬの２×１０６細胞／ｍＬ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性に形質移入した。細胞を、３７℃のＣＯ２恒温器で、ＤＭＥＭ（ＩｖｒｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、１０％ＦＢＳ（低ＩｇＧウシ血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、２０ｍＬのプロテインＡカラムに通過させてウシＩｇＧをさらに低減させた）中で、培養した。７日後に、各ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ突然変異体を含有する上清を、１２００ｒｐｍで遠心分離し、０．２μｍフィルターでろ過することにより収集した。各突然変異体を、１×ＰＢＳで事前に平衡化した１．２ｍＬのプロテインＡセファロースＦＦカラムにその上清を通過させることにより親和性精製した。突然変異体を、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０を使用してカラムから溶出させ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５、０．１％トウィーン８０で中和し、ＶｉｖａＳｐｉｎ６  ＭＷＣＯ３０，０００遠心濃縮デバイス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製、カタログ番号ＶＳ０６２１）を使用して約３００μＬに濃縮した。
【０７６２】
ＩＧＦ−１Ｒ突然変異体のウェスタンブロット分析
ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ突然変異体試料を、標準的な製造業者のプロトコールに従ってＸｃｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋミニセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号ＥＩ０００１）を使用して、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  カタログ番号ＥＣ６０２８）にかけた。標準的な製造業者のプロトコールに従ってｉＢｌｏｔ  Ｄｒｙブロッティングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号ＩＢ１００１）及びＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｔａｃｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号ＩＢ３０１０−０１又は３０１０−０２）を使用して、試料をニトロセルロースに移した。膜を、２５ｍｌのＰＢＳＴ；５ｍｇ／ｍｌ脱脂乳で終夜４℃でブロッキングした。ブロッキング後、膜を、２５ｍｌのＰＢＳＴで５分間室温で１回洗浄した。膜を、１０ｍＬのＰＢＳＴ中１：１００の一次抗ＩＧＦ−１Ｒβ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製  カタログ番号ｓｃ−９０３８）と共に室温で１時間インキュベートした。その後、膜を、５分間２５ｍｌのＰＢＳＴで３回洗浄した。検出のために、１０ｍＬのＰＢＳＴで１：１０００に稀釈した二次ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ−Ｆｃ抗体（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社製  カタログ番号Ｉ１９０−４４０Ｊ）と共に、膜を１時間室温でインキュベートした。膜を、５分間２５ｍＬのＰＢＳＴで３回洗浄し、その後２０分間２５ｍＬのＰＢＳＴで１回洗浄した。タンパク質のバンドを、標準的な製造業者のプロトコールに従ってＡｍｅｒｓｈａｍ社製ＥＣＬウエスタンブロッティング分析システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、カタログ番号ＲＰＮ２１０８）を使用して検出した。
【０７６３】
ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ突然変異体ライブラリの表面プラズモン共鳴分析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、２５℃に設定したＢｉａｃｏｒｅ３０００装置で実施した。ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ及びｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃは両方とも、固定化Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１を含有する研究用ＣＭ５センサーチップ表面に見かけ上の高親和性で結合する。抗体センサーチップ表面を、製造業者の標準的プロトコールに従ってＥＤＣ／ＮＨＳ活性化センサーチップ表面に各抗体（１０ｍＭアセテート、ｐＨ４．０で１００μｇ／ｍＬに希釈した）を注入することにより調製した。ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃが抗体表面に結合する能力は、このタンパク質の見かけ上の高結合活性の結果であった。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ及びｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃタンパク質は両方とも、２つの別々なホモ二量体領域（ＩＧＦ−１Ｒ及びＩｇＧ１−Ｆｃ）が組込まれているため多量体化する。ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する実際の高親和性抗体結合と、ｍＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対する低親和性抗体結合とを区別するために、受容体−Ｆｃ融合体を、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｇ１１センサーチップ表面で捕捉し、その後抗体（αＩＲ３及びＰ１Ｅ２）又は抗体Ｆａｂ（Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１）をさらに注入した。６０μＬの親和性精製した濃縮物質を１μｌ／分でセンサーチップ表面に注入することにより、受容体−Ｆｃ構築体を抗体表面で捕捉した。受容体−Ｆｃ負荷ステップの完了後、流速を５μｌ／分に上昇させた。各受容体−Ｆｃ構築体を負荷した後で、Ｍ１３−Ｃ０６  Ｆａｂ若しくはαＩＲ３を１０ｎＭ、３ｎＭ、若しくは１ｎＭで、又はＭ１４−Ｃ０３Ｆａｂ、Ｍ１４−Ｇ１１  Ｆａｂ、若しくはＰ１Ｅ２抗体を３０ｎＭ、１０ｎＭ、若しくは３ｎＭで含む溶液を注入した（５０μＬ）。抗体注入が完了した後、解離を７分間測定した。最後に、流速を３０μＬ／分に上昇させ、１０μＬの０．１Ｍグリシン、ｐＨ２を２回注入することにより、チップ表面を再生した。
【０７６４】
結果：
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２阻止特性
５種の抗体（Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２、及びαＩＲ３）を、ＥＬＩＳＡに基づく競合アッセイで、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２とＩＧＦ−１Ｒとの結合を阻止するそれらの能力について試験した。Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３は、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２結合を両方とも阻止する（図３２及び図３３）。飽和レベルのＭ１３−Ｃ０６又はＭ１４−Ｃ０３の存在下でさえ、アッセイでのリガンド濃度を増加させることにより、部分的なＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２結合を回復することができた。加えて、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３の阻害曲線の中間点（ＩＣ５０）は、アッセイでのＩＧＦ−１又はＩＧＦ−２濃度に依存しなかった。両結果は、リガンド遮断のアロステリック的機序を示唆する。飽和レベルのＭ１３−Ｃ０６の存在下及び非存在下でヒトＩＧＦ−１Ｈｉｓをアッセイで滴定することにより、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するリガンドの見かけ上の親和性低下を測定することが可能となった。データは、Ｍ１３−Ｃ０６抗体の存在が、ｈＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃに対するヒトＩＧＦ−１  Ｈｉｓ親和性のおよそ５０倍の減少をもたらすことを示唆する（図３４）。Ｐ１Ｅ２及びαＩＲ３も、ＩＧＦ−１をアロステリック的に阻止するが、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−２結合にほとんど影響を与えない（図３２及び図３３）。αＩＲ３に関するこれらの結果は、発表されている結果と一致する（Ｊａｃｏｂｓ  １９８６）。Ｍ１４−Ｇ１１は、競合的な様式でＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方を阻止すると考えられた（図３２及び図３３）。Ｍ１４−Ｇ１１のＩＣ５０は、アッセイで使用したＩＧＦ−１濃度に依存した。アロステリック的遮断剤のＩＣ５０よりはるかに高いＭ１４−Ｇ１１濃度ではあるが、飽和レベルのＭ１４−Ｇ１１は、両リガンドをどうにか１００％阻止した。
【０７６５】
抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の交差阻止特性
抗体は全て、ＩＧＦ−１Ｒ  ＥＬＩＳＡ結合アッセイでそれらが互いに交差阻止する能力を試験した（表１９）。Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３は、このアッセイで互いに交差阻止したが、このアッセイではＰ１Ｅ２、αＩＲ３、又はＭ１４−Ｇ１１に対しては交差阻止活性を示さなかった。Ｐ１Ｅ２及びαＩＲ３は両方とも、このアッセイで標識αＩＲ３及びＭ１４−Ｇ１１を完全に交差阻止することができた。Ｍ１４−Ｇ１１は、αＩＲ３に対して中程度の交差阻止活性を示し、Ｍ１４−Ｇ１１のエピトープは重複している可能性があり、αＩＲ３及びＰ１Ｅ２のエピトープ（複数可）と同一ではない可能性があることを示唆した。
【０７６６】
予備的エピトープマッピング−エピトープ位置の決定
一組の予備的な１９種の突然変異を構築し、阻害性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体エピトープの位置を決定した。Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１が、マウスＩＧＦ−１Ｒに対する活性をほとんど示さなかったという観察に基づいて、本発明者らは、阻害性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体のエピトープ位置を特定する本発明者らの能力を可能にするはずであるヒトＩＧＦ−１Ｒ内の一組の限定的な突然変異を特定した（例えば、実施例２７を参照）。マウス及びヒトＩＧＦ−１Ｒは、９５％の一次アミノ酸配列同一性を共有する。細胞外ドメインでは、マウスＩＧＦ−１ＲとヒトＩＧＦ−１Ｒとの間で３３個の残基が異なっている。これら残基のうち２０個は、相同性ＩＮＳＲ細胞外ドメイン構造内のそれらの相同的位置が溶媒に露出しているため（ｐｄｂコード  ２ＤＴＧ、（ＭｃＫｅｒｎ  ２００６））、それらを突然変異の標的とした。接触可能表面積を、１．４Åプローブ半径を用いて、ＳｔｒｕｃＴｏｏｌｓ（ハイパーテキスト転送プロトコール：//molbio.info.nih.gov/structbio/basic.html）を使用して計算した。これら突然変異のうち４対の突然変異は、提唱された突然変異が一次配列で互いに隣り合っていることが特定された。これらの場合、各対を、単一構築体内で二重突然変異させた。したがって、２０残基位置から、１６種の初期突然変異構築体が導かれた。４つのさらなる突然変異を、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合に重要であることが知られているＦｎＩＩＩ−２ドメインの非構造ループ領域内のマウス／ヒトＩＧＦ−１Ｒのアミノ酸相異により構築した（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。これらの位置のうちの２つは、一次配列で接近しており、単一突然変異構築体内で組合せることができた。１９種の予備的突然変異（ＳＤ００１〜ＳＤ０１９）の最終リストは、表２０に提供されている。表２０に示されている残基付番では、３０残基ＩＧＦ−１Ｒシグナル配列が切断されていることが仮定されている。構築体の各々を、１週間１００ｍＬのＨＥＫ２９３細胞に一過性に形質移入することにより発現させ、プロテインＡクロマトグラフィを使用して精製した。精製した突然変異ＩＧＦ−１Ｒ構築体を濃縮し、ウェスタンブロット分析により発現／折り畳みをアッセイした。発現は、全ての突然変異構築体で１０〜３０μｇであった。
【０７６７】
Ｍ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２及びαＩＲ３を、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、突然変異ＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合構築体の各々と相互作用するそれらの能力についてアッセイした。アッセイの可変要素としてのＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃ融合体の不確定濃度を取り除くため、各突然変異構築体を、約１０，０００ＲＵの固定化Ｍ１３−Ｃ０３、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１抗体を含有する研究用グレードのＣＭ５チップで捕捉した。捕捉した突然変異ＩＧＦ−１Ｒ構築体に対する抗体結合の低減を視覚化する本発明者らの能力を増強するために、本発明者らは、酵素的に誘導したＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、及びＭ１４−Ｇ１１抗原結合性断片（Ｆａｂ）を使用した。
【０７６８】
これら１９種の予備的突然変異構築体のうち、ＳＤ０１５（Ｅ４６４Ｈ）のみが、ＩＧＦ−１Ｒに結合するＭ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３Ｆａｂの能力に影響を与えた。残基４６４をヒスチジンに突然変異させると、両Ｆａｂの結合反応の完全な消失をもたらした。他の全ての突然変異ＩＧＦ−１Ｒ構築体は、同程度の平衡解離定数（Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３Ｆａｂの場合、それぞれＫＤ＝１ｎＭ及び５ｎＭ）で結合した。これらの実験は、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３抗体のエピトープがＦｎＩＩＩ−１ドメイン表面にあると特定する。２つの抗体のＶＨＣＤＲ領域は高度に類似しているが（３８残基のうちの２６残基が同一）、ＶＬドメインのＣＤＲ領域は関連性がなく、抗原認識に対してＶＨが強く偏って優先されていることを示唆する。驚くほどのことではないが、２つの抗体は互いに効果的に交差阻止する。Ｓｏｏｓ及びその同僚らは、ＩＲ／ＩＧＦ−１Ｒキメラを使用して、第２のロイシンに富む反復ドメイン（Ｌ２）及び第１のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦｎＩＩＩ−１）内の１つ又は複数のエピトープが、受容体阻害をもたらし得ることを示している（Ｓｏｏｓ  １９９２）。これは残基３３３〜６０９、計２７６残基に及ぶ。本発明者らは、初めて、この阻害性エピトープの位置を直接的にＦｎＩＩＩ−１ドメイン内の単一残基（Ｅ４６４）に特定する。
【０７６９】
１９種の突然変異体のうち、それぞれシステインに富む反復ドメイン（ＣＲＲ）及びＬ２ドメインの突然変異であるＳＤ００８（Ｓ２５７Ｆ）及びＳＤ０１２（Ｅ３０３Ｇ）のみが、ヒトＩＧＦ−１Ｒを認識するＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂの能力を低減させた（表２０）。両方の場合、突然変異は、実測ＫＤに基づいて親和性の３倍低減をもたらした。ＳＤ０１５を含む他の全ての突然変異ＩＧＦ−１Ｒ構築体は、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３に対する反応性を示さず、野生型の親和性（ＫＤ  約４〜６ｎＭ）でＭ１４−Ｇ１１  Ｆａｂに結合した。
【０７７０】
αＩＲ３及びＰ１Ｅ２も、予備的突然変異体ライブラリに対してスクリーニングした。これら抗体は両方とも、野生型ヒトＩＧＦ−１Ｒ−Ｆｃと比較して、ＳＤ０１２に対する親和性の同様な低減を示したが、Ｐ１Ｅ２のみがＳＤ００８に対する結合性の低減を示した（表２０）。
【０７７１】
詳細なエピトープマッピング：Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３抗体エピトープの残基特異的定義
Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３エピトープ（複数可）の位置をＩＧＦ−１ＲのＦｎＩＩＩ−１ドメインに特定した予備的ＩＧＦ−１Ｒ突然変異体ライブラリの結果に基づいて、第２の組の突然変異を設計し、抗体結合性の消失をもたらした元の突然変異Ｅ４６４Ｈを取り囲むＩＧＦ−１Ｒの表面をプローブした。Ｅ４６４と３次元的に近接していることに基づいて、計２１残基を突然変異誘発のために選択した（元のヒスチジン突然変異とは異なる残基４６４における突然変異を含む）。インスリン受容体の３次元構造を使用して、４６４を取り囲む近傍の残基を評価した。７対の残基を、一次配列が隣接した突然変異のために特定した。これら残基対の突然変異を同時に実施して、二重突然変異体を産生した。したがって、第２の組の突然変異は、ＳＤ１０１〜ＳＤ１１４として表２０に列挙した計１４種の構築体で構成されていた。
【０７７２】
１４種の突然変異構築体の発現、精製、及び品質管理を、第１の組の予備的突然変異（ＳＤ００１〜ＳＤ０１９）について説明したように実施した。１４種の構築体は、ウェスタンブロット分析に基づくと、ＳＤ１１４以外は全て良好に発現され、折り畳まれていると考えられた。この構築体（ＳＤ１１４）の発現は不良であり、本発明者らのＢｉａｃｏｒｅ実験において、完全に異なるエピトープを認識するＭ１３−Ｃ０６、Ｍ１４−Ｃ０３、又はＭ１４−Ｇ１１と反応しなかった。したがって、この突然変異構築体に関するデータは除外した。他の１３種の構築体により、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３エピトープの正確な残基特異的定義が可能となった。残基特異的結果は、表２０に列挙されている。要約すると、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３のエピトープは、ほぼ同一であり、ＦｎＩＩＩ−１ドメイン内に完全に収容されていた。最も重要な（恐らく核心の）残基は、４６１及び４６２であった。ＳＤ１０３は、残基４６１及び４６２における突然変異を含有しており、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３  Ｆａｂに対する活性を示さず、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３表面に対する活性を示さなかった。Ｍ１４−Ｇ１１表面に対するＳＤ１０３の結合は、他の任意のＦｎＩＩＩ−２突然変異構築体と変わらず、この完全な消失がエピトープ特異的であったことを示した。ＩＧＦ−１Ｒに対する抗体親和性の消失又は大きな減少をもたらした他の突然変異（親和性が１００倍を超えて減少）は、ＩＧＦ−１Ｒ残基４５９、４６０、４６４、４８０、４８２、４８３、５７０、及び５７１に見出された。野生型ヒトＩＧＦ−１Ｒと比較して、抗体親和性のわずかな減少をもたらした突然変異（２．５≧ＫＤ≧１０ｎＭ）は、残基４６６、４６７、５６４、５６５に見出された。これら残基の位置を、相同性ＩＲ構造の表面にマッピングした（図３５、ＭｃＫｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３に対する突然変異体ＩＧＦ−１Ｒ結合に対して、２つの異なる効果のみが観察された。残基５３３における突然変異は、Ｍ１４−Ｃ０３結合に強い影響を与えたが、Ｍ１３−Ｃ０６の結合には弱い影響しか及ぼさなかった。残基５６８における突然変異は、Ｍ１４−Ｃ０３結合をわずかに減少させたが、Ｍ１３−Ｃ０６結合に影響に及ぼさなかった。
【０７７３】
エピトープの位置及び表面積範囲に基づくと、Ｍ１３−Ｃ０６及びＭ１４−Ｃ０３が両方とも、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２とＩＧＦ−１Ｒとの結合をアロステリック的に阻害したことが示されたことは驚くべきことではない。エピトープは、既知のリガンド結合表面の反対側の受容体にある（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。発表されている研究により、残基４４０〜５８６を認識する抗体は、ＩＧＦ−１結合に対して阻害性及びアゴニスト性の両方であり得ることが示されている（Ｓｏｏｓ  １９９２；Ｋｅｙｎａｎｆａｒ  ２００７）。ＩＧＦ−１Ｒ内では、アミノ酸残基４４０〜５８６は、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体に接近可能な多くの潜在的な非重複表面を有するＬ２及びＦｎＩＩＩ−１の全てを表す。本発明者らの研究は、本発明者らが知る限り、阻害性エピトープの位置を残基特異的な分解能で受容体の特定の区域に特定した最初の研究である。インスリン受容体（ＩＲ）の最近の構造は、その受容体に対するインスリン結合を阻害することが知られている抗ＩＲ抗体と共に共結晶化された（ＭｃＫｅｒｎ  ２００６）。ＩＧＦ−１ＲのＨｉｓ４６４（ＩＲのＫ４７４）に相同性の残基は、この抗体のＩＲとの結合表面の一部である。Ｍ１３−Ｃ０６が、アンタゴニスト的抗ＩＲ抗体と同様の、ＩＧＦ−１Ｒに対するＩＧＦ−１結合阻害の阻害機序を共有している可能性がある。Ｂｉａｃｏｒｅの結果に基づくと（例えば、実施例２７を参照）、Ｍ１３−Ｃ０６は、動力学的結合速度を低減することによりＩＧＦ−１（及び恐らくはＩＧＦ−２）を阻害すると考えられる。この抗体は、受容体細胞外ドメインを、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２が受容体結合部位に接近することを困難にする立体構造に固定すると考えられる。
【０７７４】
詳細なエピトープマッピング：Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２、及びαＩＲ３抗体エピトープの残基特異的定義
Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２、及びαＩＲ３エピトープ（複数可）の位置をＩＧＦ−１ＲのＣＲＲ及びＬ２ドメインに特定した予備的ＩＧＦ−１Ｒ突然変異体ライブラリの結果に基づいて、受容体に対する抗体親和性の低減に結びついた元の突然変異であるＳ２５７Ｆ及びＥ３０３Ｇを取り囲むＩＧＦ−１Ｒ表面を網羅する第３の組の突然変異を設計した。Ｓ２５７Ｆ及びＥ３０３Ｇと３次元的に近接していることに基づいて、計１５残基を突然変異誘発のために選択した（元のフェニルアラニン突然変異とは異なる残基２５７における突然変異を含む）。インスリン受容体の３次元構造を使用して、Ｓ２５７Ｆ及びＥ３０３Ｇを取り囲む近傍の残基を評価した。２対の残基を、一次配列が隣接した突然変異のために特定した。これら残基対の突然変異を同時に実施して、二重突然変異体を産生した。したがって、第２の組の突然変異は、ＳＤ２０１〜ＳＤ２１３として表２０に列挙した計１３種の構築体で構成されていた。
【０７７５】
１３種の突然変異構築体の発現、精製、及び品質管理を、第１の組の予備的突然変異（ＳＤ００１〜ＳＤ０１９）について記載したように実施した。これら構築体は、ウェスタンブロット分析に基づくと、ＳＤ２１３以外は全て良好に発現され、折り畳まれていると考えられた。ＳＤ２１３のデータは、受容体の折り畳み状態に関する曖昧さのため除外した。他の１２種の構築体により、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２、及びαＩＲ３エピトープの正確な残基特異的定義が可能となった。残基特異的結果は、表２０に列挙されている。エピトープは、Ｍ１４−Ｇ１１、Ｐ１Ｅ２、及びαＩＲ３間で異なっていた。Ｍ１４−Ｇ１１は、ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２の両方の競合的阻害剤であることが示されたが、Ｐ１Ｅ２及びαＩＲ３は、ＩＧＦ−１の結合のみをアロステリック的に阻害することが示されたことを考慮すると、これは驚くべきではなかった。Ｍ１４−Ｇ１１のエピトープは、リガンド結合に影響を及ぼすことが知られている残基と直接接触する表面上のＣＲＲドメインの中心近くにある（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  ２００１；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ  ２００４）。Ｍ１４−Ｇ１１結合性を消失させた突然変異は、２４８位及び２５０位に見出された。残基２５４における突然変異は、受容体に対する抗体親和性の中程度の減少をもたらした（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤを超える１０≧ＫＤ≧１００倍）。残基２５７、２５９、２６０、２６３、２６５、及び３０３を含む、主にＣＲＲにある他の多くの突然変異は、受容体に対するＭ１４−Ｇ１１親和性をわずかに低減させた（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤを超える２．５≧ＫＤ≧１０倍）。これら残基の位置を、ＩＧＦ−１Ｒの最初の３つの細胞外ドメインの公開構造の表面にマッピングした（図３６（Ｇａｒｒｅｔｔ  １９９８））。
【０７７６】
Ｐ１Ｅ２及びαＩＲ３のエピトープは、少数の軽微な相異があるが共に互いに類似している。エピトープは、主としてＣＲＲドメイン内でＭ１４−Ｇ１１のエピトープと重複する残基にあるが、ＩＧＦ−１／ＩＧＦ−２結合ポケットからわずかに遠ざかるように回転した受容体の表面に存在する。加えて、ＣＲＲドメインのＣ末端にあり、Ｌ２ドメインの中に十分に入っている（Ｍ１４−Ｇ１１結合に任意の影響を及ぼしたものを越えて）残基は、αＩＲ３の親和性のみをわずかに低減することが見出された（表２０）。ＩＧＦ−１Ｒに対するＰ１Ｅ２結合は、残基２５４及び２６５における突然変異により消失し、残基２５７における突然変異により中程度に低減され（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤを超える１０≧ＫＤ≧１００倍）、残基２４８及び３０３における突然変異によりわずかに低減された（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤを超える２．５≧ＫＤ≧１０倍）。ＩＧＦ−１Ｒに対するαＩＲ３結合は、残基２４８及び２６５における突然変異により消失し、残基２５４における突然変異により中程度に低減され（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤを超える１０≧ＫＤ≧１００倍）、残基２６３、３０１、３０３、３０８、３２７、及び３７９における突然変異によりわずかに低減された（野生型ＩＧＦ−１ＲのＫＤを超える２．５≧ＫＤ≧１０倍を超える）。ＩＧＦ−１Ｒに対するＰ１Ｅ２及びαＩＲ３結合に影響（２つの抗体に対する平均的影響）を及ぼす残基の位置を、ＩＧＦ−１Ｒの最初の３つの細胞外ドメインの公開構造の表面にマッピングした（図３７（Ｇａｒｒｅｔｔ  １９９８））。αＩＲ３及びＰ１Ｅ２は、最近の文献に記載されている２つの抗体と同じアロステリック的な／ＩＧＦ−１のみの阻止特徴を有すると考えられる（Ｋｅｙｈａｎｆａｒ  ２００７）。残基２４１、２４２、２５１、及び２６６は、受容体に結合するこれら抗体の能力に影響を及ぼすことが示された。本発明者らのデータは、この報告と一致しており、残基２５７及び２６５のさらなる重要性を示唆する。
【０７７７】
Ｍ１４−Ｇ１１（競合的ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２遮断剤）とＰ１Ｅ２／αＩＲ３エピトープとの間の主要な相異は、ＩＧＦ−１結合部位に隣接する区域にある。残基２４８、２５０、及び２５４を同時に認識する能力は、Ｍ１４−Ｇ１１がＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２結合の両方を競合的に阻止することを可能にする決定的要因である可能性がある。Ｐ１Ｅ２及びαＩＲ３は両方とも、受容体に対するＭ１４−Ｇ１１結合を完全に消失させるＤ２５０Ｓ突然変異による影響を全く受けない。ＩＧＦ−１Ｒに対するＭ１４−Ｇ１１の結合は、ＩＧＦ−１結合部位付近にあるＣＲＲドメインの内部裂溝における突然変異に（残基２５９及び２６０、図３６及び図３７）よっても低減され、この抗体がどのようにして立体的に及び競合的に受容体とのリガンド結合を阻止するかを説明している可能性が高い。これらの位置における突然変異は、Ｐ１Ｅ２又はαＩＲ３結合に影響を及ぼさなかった。Ｐ１Ｅ２及びαＩＲ３親和性は、ＩＧＦ−１結合溝のすぐ外部の表面における突然変異により低減される（図３６及び図３７）。したがって、競合的リガンド遮断をもたらす可能性のある、Ｍ１４−Ｇ１１により特異的に認識されると考えられる残基は、Ｄ２５０、Ｅ２５９、及びＳ２６０である。
【０７７８】
ＩＧＦ−１Ｒに対するαＩＲ３及びＭ１４−Ｇ１１結合を低減する残基突然変異は、ＣＲＲドメインの中心部からＬ２ドメインへと伸長する。平均的な抗体エピトープ区域が説明されている発表結果に基づくと、これら全ての残基が、抗体との同時的直接相互作用に関与している可能性は低い（Ｄａｖｉｅｓ  １９９６）。最近のデータは、反復タンパク質の安定性及び折り畳みが、ほとんどの球状ドメインとは異なることを示している（Ｋａｊａｎｄｅｒ  ２００５）。反復ドメインは、単離α−ヘリックスのヘリックス‐コイル転移と類似した非協同的な折り畳み／変性反応を起こす細長い構造をとる傾向がある。単純化して見ると、球状ドメインは、一般的に協同的に折り畳まれ、単一の天然折り畳み状態又は変性状態のいずれかで存在する。球状ドメインの構造は、突然変異がドメインの全体的変性に結びつかなければ、単一の突然変異により部分的に破壊されることはない。対照的に、折り畳まれた反復ドメインは、突然変異を起こすと、変性ドメインへと徐々に戻っていく可能性がある。したがって、抗体結合に影響を及ぼすＩＧＦ−１Ｒ  ＣＲＲ又はＬ２ドメインの表面に沿った突然変異は、これらドメインの全体的な構造（又は次元）を改変することにより、そうなる可能性がある。この機序は、特定のＣＲＲ又はＬ２ドメイン立体構造の抗体安定化が、ＣＲＲドメインのリガンドとの動的結合反応にどのように影響を及ぼす可能性があるかも説明する。抗体がリガンド結合を立体的にも阻止しないとすれば（Ｍ１４−Ｇ１１について観察されるように）、これは、アロステリックな様式で起るだろうと予想されるだろう（Ｐ１Ｅ２及びαＩＲ３について観察されるように）。
【表２１】
2011516549.tif 000031
【表２２】
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2011516549.tif 000033
2011516549.tif 000034
【０７７９】
（実施例３３）
別々のＩＧＦ−１Ｒエピトープとリガンド阻止抗体とを組合せて標的とすると、その結果として腫瘍細胞増殖阻害の増強がもたらされる
目的：細胞に基づく腫瘍増殖アッセイで、非重複エピトープに結合する阻害性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の組合せの機能的効果を調べる。
【０７８０】
背景：本明細書に記載の生化学的研究は、非重複エピトープに結合する阻害性抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の組合せが、受容体に対するＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２リガンド阻止の相乗効果的向上に結びつき得ることを示す。そのような組合せは、より大きな効力で（つまり、より低抗体濃度での）完全なリガンド遮断のをもたらし得る。
【０７８１】
物質及び方法：細胞増殖阻害アッセイ
抗体がＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２促進性腫瘍細胞増殖を阻止する能力を、細胞生存率アッセイを使用して試験した。ＢｘＰＣ３（ヒト膵臓腺癌）及びＨ３２２Ｍ（ヒト非小細胞肺腫瘍）（ＡＴＣＣ）腫瘍系は、ＡＴＣＣから購入した。細胞系を、ＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ）及び１０％ウシ胎仔血清（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製（サンタアナ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国））を含有する完全増殖培地で増殖させた。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（セントルイス、ミズーリ州、アメリカ合衆国））を使用して、培養容器から接着細胞を取り出した。リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２は、ＭｅｄｉａＴｅｃｈ社製（ハーンドン、バージニア州、アメリカ合衆国）であった。発光アッセイ用の９６ウエル透明底プレートは、Ｗａｌｌａｃ社から購入した。８０％コンフルエント単層に増殖した細胞を、トリプシン処理し、洗浄し、再懸濁し、ＢｘＰＣ３及びＨ３２２Ｍ細胞の両方の場合、９６ウエルプレートにおいて２００μｌの０．５％増殖培地に８×１０３細胞／ウエルで播種した。２４時間後、培地を、５０μｌ又は１００μｌの無血清培地（ＳＦＭ）と置換し、５０μｌの連続希釈した抗体を（図３８〜図４０に示されている４×濃度で）添加した。３７℃でさらに３０分間インキュベーションした後、５０μｌの４×濃度ＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２を添加した。処理は全て三重反復で実施した。細胞をさらに７２時間インキュベートした後で溶解し、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、２８００  ウッズハローロード、マディソン、ウィスコンシン州  ５３７１１  アメリカ合衆国）を使用して、ＡＴＰ存在量を決定した。試薬及びＳＦＭの１：１混合液を、２００μｌ／ウエルで添加した。発光を、Ｗａｌｌａｃ社製（ボストン、米国マサチューセッツ州）プレートリーダーで検出し、相対的発光単位（ＲＬＵ）を用いて定量化した。阻害は、［１−（Ａｂ−ＳＦＭ  ＲＬＵ）／（ＩＧＦ−ＳＦＭ  ＲＬＵ）］×１００％として計算した。アイソタイプ一致抗体ＩＤＥＣ−１５１（ヒトＧ４．Ｐ抗体）を陰性対照として使用した（図３８〜図４０の「ｃｔｒ」又は「ｃｔｒｌ」）。
【０７８２】
結果：Ｍ１３．Ｃ０６．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｃ０６）及びＭ１４．Ｇ１１．Ｇ４．Ｐ．ａｇｌｙ（Ｇ１１）抗ＩＧＦ１−Ｒ抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞増殖を阻害する能力を、代謝活性の尺度としての細胞性ＡＴＰの相対的比較により間接的に測定した。Ｃ０６及びＧ１１は両方とも、無血清条件下でのＩＧＦ−１及びＩＧＦ−２刺激性ＢｘＰＣ３膵臓腫瘍細胞系増殖を、用量依存的な様式で阻害した（図３８）。重要なことには、等モル量のＣ０６及びＧ１１混合抗体と接触させた細胞には、その結果として、いずれか一方の抗体単独の阻害と比較して、１０及び１ｎＭ濃度で、増殖阻害の著しい増強がもたらされた（図３８）。これらの結果を、幅広い範囲の抗体濃度（１μＭ〜０．１５ｎＭ）でＣ０６及びＧ１１の組合せを試験した実験でさらに確認した。図３９は、５００ｎＭから５ｎＭ濃度の等モル量のＣ０６及びＧ１１抗体の組合せが、その結果として、同じ対応する抗体濃度のいずれか一方の抗体単独で観察された阻害と比較して、細胞増殖阻害の著しい増強がもたらされたことを示す。
【０７８３】
膵癌細胞系（ＢｘＰＣ３）で観察された阻害が、他の腫瘍タイプにも応用可能であることを示すために、Ｃ０６及びＧ１１の組合せを、非小細胞肺癌由来のＨ３２２Ｍ細胞系で評価した。図４０は、１０％ウシ胎仔血清の存在下の標準的細胞培養条件下で増殖させたＨ３２２Ｍで観察された効果の例を示し、いずれか一方の抗体単独と比較して、著しく大きな細胞増殖の阻害が、Ｃ０６／Ｇ１１抗体の組合せからもたらされた。
【０７８４】
（実施例３４）
Ｍ１３−Ｃ０６（ヒトＩｇＧ４Ｐａｇｌｙ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体）は、ＮＳＣＬＣ細胞系、膵癌細胞系、及び結腸癌細胞系においてエルロチニブの抗腫瘍増殖活性を増強した。
小分子ＥＧＦＲ阻害剤ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（ジェネンテック社製、サンフランシスコ、米国カリフォルニア州、及びＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製、メルビル、米国ニューヨーク州）（別名エルロチニブ）は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び膵癌の癌患者治療用に承認された。
エルロチニブ：
化学名：Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン；化学式：Ｃ２２Ｈ２３Ｎ３Ｏ４
化学構造：
【化１】
2011516549.tif 000035
【０７８５】
Ｍ１３−Ｃ０６（ヒトＩｇＧ４Ｐａｇｌｙ抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体）は、複数の固形腫瘍用に現在臨床開発中である。本発明者らは、一団のＮＳＣＬＣ細胞系、膵癌細胞系、及び結腸癌細胞系の成長（増殖）に対する、エルロチニブ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、カタログ＃１８３３１９−６９−９（サンディエゴ、米国カリフォルニア州））と組合せた抗ＩＧＦ−１Ｒ  Ｍ１３−Ｃ０６の効果を評価した。細胞を、１ウエル当たり５０００細胞で、９６ウエル組織培養プレートにおいてＲＰＭＩ−１６４０（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製  カタログ＃Ｓｈ３００７１．０３）を含有）に播種し、その後、単剤としてＭ１３−Ｃ０６又はエルロチニブで処理、又はそれぞれ２００ｎＭ及び２０μＭの開始濃度で１：３連続希釈したＭ１３−Ｃ０６及びエルロチニブの組合せで処理した。細胞生存率は、製造業者のプロトコール（ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（商標）発光細胞生存率アッセイを参照）に従ってＰｒｏｍｅｇａ社製（カタログ＃Ｇ７５７１（マディソン、米国ウィスコンシン州））のＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（商標）試薬を用いて、ＡＴＰレベルを測定することにより５日後に決定した。結果は、試験した細胞系のうち少数のみが、マイクロモル未満の濃度で単剤としてのエルロチニブ誘導性の細胞増殖阻害に感受性であるが、Ｍ１３−Ｃ０６は、ナノモル濃度で幾つかの腫瘍細胞系の増殖を阻害し、併用使用の際に幾つかの細胞系のエルロチニブに対する感受性も増加させたことを示した。図４１Ａ及び４１Ｂに示されているように、単剤としてのエルロチニブは、Ｈ３２２Ｍ及びＨ１６５０細胞系の増殖のみ（試験した７つのＮＳＣＬＣ細胞系の中で）を実質的に阻害した。対照的に、エルロチニブと組合せたＭ１３−Ｃ０６は、幾つかの細胞系、最も著しくは、組み合わせず単剤としてのエルロチニブに対して中程度の応答細胞であるＡ５４９においてエルロチニブの阻害効果を増強した。Ｍ１３−Ｃ０６は、エルロチニブに対する膵細胞系ＢｘＰＣ３及びＳＵ８６．８６の感受性も増加させたが、ＭｉａＰａｃａ２、Ｐａｎｃ−１、又はＣａｐａｎ−２細胞にあまり効果を示さなかった（図４２）。図４３に示されているように、５つの結腸癌細胞系はいずれもエルロチニブに応答した実質的な増殖阻害を示さなかったが、Ｍ１３−Ｃ０６は、Ｃｏｌｏ２０５、ＷｉＤｒ、及びＨＴ−２９細胞で単剤活性を示した。本発明者らのデータは、ＥＧＦＲ阻害剤ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）及び抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体Ｍ１３−Ｃ０６の組合せが、ＮＳＣＬＣ及び膵臓腫瘍を有する患者のサブセットの治療に、治療上の利点を提供することができることを示唆する。
【０７８６】
（実施例３５）
Ｍ１３−Ｃ０６及びエルロチニブの組合せは、ＡＫＴ生存及びＭＡＰＫ増殖シグナル経路の両方の効率的な阻害をもたらす。
本発明者らは、ＮＳＣＬＣ細胞系においてエルロチニブ及びＭ１３−Ｃ０６の組合せが抗腫瘍効果を増強したという観察の根底にある分子機序を決定することにした。ＡＫＴ及びＭＡＰＫは、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥＧＦＲの共通の下流シグナル伝達標的であるため、ＡＫＴ及びＭＡＰＫ活性化状態を、単剤として又は組合せのエルロチニブ及びＭ１３−Ｃ０６による処理後に評価した。腫瘍細胞系を、６ウエルプレートにおいて１ウエル当たり１．２×１０６個でＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ培地に播種し、終夜接着させた。翌日、ウエルから培地を取り除き、培地（単剤対照）又は培地中１０μＭエルロチニブのいずれかと組合せた１００ｎＭのＭ１３−Ｃ０６又はＩＤＥＣ１５１（ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体）と置換した。アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベーターで３時間インキュベートし、細胞性タンパク質を、細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ＃９８０３（ダンバーズ、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国））で抽出した。溶解産物中のタンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社製、カタログ＃２３２２７（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、ロックフォード、米国イリノイ州））を使用して測定し、等量のタンパク質を、ＮＵＰＡＧＥ  ４〜１２％Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓゲルに流し、ニトロセルロース膜（０．４５μｍ細孔）に移した。リン酸化は、ホスホ−ＡＫＴ、総ＡＫＴ、ホスホ−ＭＡＰＫ、又はＭＡＰＫに特異的な抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、カタログ＃９２７１、９２７２、９１０１、９１０２）で処理し、その後抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製  カタログ＃４０５０−０５）で処理することにより検出した。ブロットを、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌウエスタン基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ社製、カタログ＃３４０９５）で発色させ、化学発光画像をＢｉｏＲａｄ社製Ｍａｘ２  ｉｍａｇｅｒで取り込んだ。図４４に示されているように、エルロチニブは、Ｈ３２２Ｍ細胞においてＭＡＰＫの検出可能なリン酸化を完全に消失させ、Ａ５４９細胞においてＭＡＰＫリン酸化の部分的阻害をもたらし、Ｈ１２９９及びＮＣＩ−Ｈ２３細胞では効力をほとんどもたらさなかった。Ｍ１３−Ｃ０６は、試験した４つの細胞系全てにおいて、ＡＫＴのリン酸化に対して強力な阻害効果を示し、ＭＡＰＫのリン酸化に対してはほとんど効果を示さなかった。Ｍ１３−Ｃ０６及びエルロチニブは、併用すると、ＡＫＴ及びＭＡＰＫリン酸化に相加的な阻害効果を示した。一般的に、下流シグナル伝達分子ＡＫＴ及びＭＡＰＫに対するＭ１３−Ｃ０６及びエルロチニブの効果は、図４１に示されているように、細胞増殖に対するそれらの効果と相関する。
【０７８７】
（実施例３６）
Ｍ１３−Ｃ０６は、播種性Ａ５４９肺異種移植モデルにおいてエルロチニブの抗腫瘍増殖活性を増強した。
本発明者らは、単剤（図４５Ａ）として又はＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｙｅｒｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、米国ニューヨーク州から購入、ＮＤＣ＃５０２４２−０６３−０１；医薬品等級エルロチニブ；ＯＳＩ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社製造）と組合せたＭ１３−Ｃ０６の抗腫瘍活性を試験するために播種性Ａ５４９肺腫瘍モデルを開発した。Ａ５４９細胞（１×１０６個）の静脈内接種の３日後に、複数群のＳＣＩＤマウス（ｎ＝１０）を、Ｍ１３−Ｃ０６又はＩＤＥＣ−１５１（アイソタイプ一致対照抗体）又はＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）又は組合せ（Ｍ１３−Ｃ０６＋ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））で処理した。Ｍ１３−Ｃ０６（１５又は７．５ｍｇ／ｋｇ）及びＩＤＥＣ−１５１（１５ｍｇ／ｋｇ）を、週１回４週間Ｉ．Ｐ．注射した。ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）を、２２日間５０ｍｇ／ｋｇで１日１回投与した。３０日目に肺を回収し、計量して腫瘍量を評価した。腫瘍量パーセント（％）を、処置肺の重量を平均正常肺重量で差し引くことより計算し、肺腫瘍重量の％として表した。図４５Ａ及び４６Ｂに示されているように、単剤としてのＭ１３−Ｃ０６は、肺腫瘍量を低減させた。しかしながら、Ｍ１３−Ｃ０６及びＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）の組合せは、肺腫瘍増殖を完全に消失させた（図４５Ｂ）。
【０７８８】
（実施例３７）
Ｍ１３−Ｃ０６は、ＮＳＣＬＣ細胞系、膵癌細胞系、結腸癌細胞系、及び肉腫細胞系においてラパマイシンの抗腫瘍増殖活性を増強した。
ラパマイシンは、ＡＫＴ生存経路の重要なシグナル伝達分子であるｍＴＯＲを阻害し、それにより細胞増殖を阻害する。ラパマイシン誘導体であるテムシロリムスは、腎癌患者の治療用に承認されており、少数の他のものが、肉腫を含む複数の腫瘍タイプについて臨床試験中である。本発明者らは、ラパマイシンで処理した腫瘍細胞において、細胞増殖に対するＭ１３−Ｃ０６の効果を検討した。
テムシロリムス：
化学名：（３Ｓ，６Ｒ，７Ｅ，９Ｒ，１０Ｒ，１２Ｒ，１４Ｓ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ，２１Ｓ，２３Ｓ，２６Ｒ，２７Ｒ，３４ａＳ）−９，１０，１２，１３，１４，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ヘキサデカヒドロ−９，２７−ジヒドロキシ−３−［（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル］−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２ １４，２０，２６−ヘキサメト３Ｈ−ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロヘントリアコンチン−１，５，１１，２８，２９（４Ｈ，６Ｈ，３１Ｈ）−ペンタオン４’−［２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオナート］；又はラパマイシン、４２−［３−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）−２−メチルプロパノアート］。
化学式：Ｃ５６Ｈ８７ＮＯ１６
化学構造：
【化２】
2011516549.tif 000036
ラパマイシン：
化学名：（１６Ｚ，２４Ｚ，２６Ｚ，２８Ｚ）−１，１８−ジヒドロキシ−１２−［１−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）プロパン−２−イル］−１９−メトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−３０−（５−メチルチオフェン−２−ｙｌ）−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０＾｛４，９｝］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−２，３，１０，１４，２０−ペンタオン。
化学式：Ｃ５１Ｈ７９ＮＯ１３
化学構造：
【化３】
2011516549.tif 000037
【０７８９】
細胞増殖アッセイのために、細胞を、９６ウエル組織培養プレートにおいて１ウエル当たり５０００細胞で１０％ウシ胎仔血清（ほとんどの細胞系用）又は１５％ＦＢＳを加えたＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ（肉腫細胞系用）を含有するＲＰＭＩ−１６４０に播種した。細胞を、Ｍ１３−Ｃ０６の場合は２００ｎＭの、ラパマイシンの場合は１００ｎＭ又は１μＭの開始濃度で１：３連続希釈して、単剤として又は組合せで、Ｍ１３−Ｃ０６及びラパマイシン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製  カタログ＃５３１２３−８８−９）により３日間又は５日間処理した。細胞生存率を、ＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ  ＧＬＯ（商標）試薬を用いてＡＴＰレベルを測定することにより決定した。図４６Ａ及び４６Ｂは、７つのＮＳＣＬＣ細胞系に対するＭ１３−Ｃ０６及びラパマイシンの組合せの効果を表しており、結果は、Ｍ１３−Ｃ０６が、Ａ５４９、Ｈ３２２Ｍ、Ｈ２３、及びＨ１２９９細胞に対するラパマイシンの抗腫瘍活性を著しく増強したことを示す。膵癌細胞系に対するＭ１３−Ｃ０６及びラパマイシンの効果は相加的であると考えられ（図４７）、ＢｘＰＣ３が最も感受性の細胞系であった。図４８は、試験したほとんどの結腸癌細胞系がラパマイシンに十分応答しなかったが、Ｍ１３−Ｃ０６は、ＷｉＤｒ及びＨＴ−２９細胞に対するラパマイシンの効果を増強したと考えられたことを示す。４つの肉腫細胞系の研究では、Ｍ１３−Ｃ０６及びラパマイシンの組合せは、いずれか１つの作用剤を単独で使用した場合より高い抗腫瘍活性を示した（図４９）。興味深いことには、ＳＪＳＡ−１細胞は、Ｍ１３−Ｃ０６又はラパマイシン単独には応答しなかったが、これら２つの薬物の組合せにより増殖が阻害された。
【０７９０】
（実施例３８）
Ｍ１３−Ｃ０６はラパマイシン誘導性ＡＫＴ活性化を阻害する
ｍＴＯＲのラパマイシンによる阻害が、Ｓ６Ｋ（Ｓ６キナーゼ）及びＩＧＦ−１Ｒ／ＩＲＳ−１（インスリン受容体基質−１）依存性フィードバックループによりＡＫＴ活性化を誘導することが報告されている（O’Reilly, et al., Cancer Research, vol. 66, p.1500-1508 (2006)）。したがって、本発明者らは、Ｍ１３−Ｃ０６がラパマイシンの抗腫瘍活性を増強した選択された肉腫及び肺腫瘍細胞系における、ＡＫＴ及びＳ６Ｋシグナル伝達に対するＭ１３−Ｃ０６及びラパマイシンの効果を検討した。細胞を、１２ウエルプレートにおいて１ウエル当たり６×１０５個で、肉腫の場合は１５％ＦＢＳを加えたＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地、ＮＳＣＬＣ細胞系の場合は１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ−１６４０に播種し、終夜接着させた。翌日、ウエルの培地を取り除き、培地（単剤対照）又は培地中１００ｎＭラパマイシンのいずれかと組合せた１００ｎＭ  Ｍ１３−Ｃ０６又はＩＤＥＣ１５１と置換した。アッセイプレートを、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで３時間インキュベーターし、細胞を、細胞シグナル伝達溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、＃９８０３）で溶解し、溶解産物を、タンパク濃度により正規化し、ＮＵＰＡＧＥ  ４〜１２％Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓゲルに流し、その後ニトロセルロース膜に移した。ＡＫＴ及びＳ６Ｋのリン酸化状態を、ホスホ−ＡＫＴ、総ＡＫＴ、ホスホ−Ｓ６Ｋ、又は総Ｓ６Ｋに特異的な抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ＃２２１５、２２１７）で処理し、その後抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ＃７０７１）で処理することにより検出した。ブロットを、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌウエスタン基質キットで発色させ、化学発光画像をＢｉｏＲａｄ社製Ｍａｘ２  ｉｍａｇｅｒで取り込んだ。図５０及び５１に示されているように、ラパマイシンは、予想通りＳ６Ｋのリン酸化を阻害したが、試験した全ての細胞系でＡＫＴリン酸化を誘導した。誘導されたＡＫＴリン酸化は、Ｍ１３−Ｃ０６により効率的に阻止されたが、アイソタイプ一致対照抗体ＩＤＥＣ１５１によっては阻止されなかった。したがって、ラパマイシン誘導性ＡＫＴ活性化に対するＭ１３−Ｃ０６の阻害効果は、Ｍ１３−Ｃ０６／ラパマイシンの組合せを使用した際に観察された抗腫瘍活性の増強と良好に相関する。
【０７９１】
（実施例３９）
Ｍ１３−Ｃ０６は、ＳＫ−ＥＳ−１ユーイング肉腫モデルで抗腫瘍増殖活性を示した
ＳＫ−ＥＳ−１ユーイング肉腫（未分化骨肉腫）モデルを使用して、単剤としてのＭ１３−Ｃ０６の抗腫瘍活性を試験した。ヌードマウス（８〜１０週齢）の側腹領域に、５×１０６個のＳＫ−ＥＳ−１細胞（寄託番号：ＨＴＢ−８６（商標）；アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、マナッサス、米国バージニア州）を皮下接種した。２１日目に、腫瘍を有するマウスを複数群に分類した（ｎ＝１０）。治療開始時の群の平均腫瘍体積は、１５０〜２００ｍｍ３であった。マウスに、Ｍ１３−Ｃ０６（１５又は３０ｍｇ／ｋｇ）又は対照抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）を、週１回で計３回腹腔内注射した。Ｍ１３−Ｃ０６は、ＳＫ−ＥＳ−１肉腫モデルにおいて、用量依存的な様式で腫瘍増殖を阻害した（図５２）。ｍＴＯＲ阻害剤としてのラパマイシン誘導体の使用は、肉腫患者の治療用に現在臨床試験中である。したがって、Ｍ１３−Ｃ０６などのＩＧＦ−１Ｒ抗体をｍＴＯＲ阻害剤と組合せて使用することは、肉腫などの過剰増殖性疾患の治療に治療上有用であるはずである。
【０７９２】
（実施例４０）
Ｍ１３−Ｃ０６は、ＮＳＣＬＣ細胞系、膵癌細胞系、及び結腸癌細胞系において、ＰＤ０３２５９０１の抗腫瘍増殖活性を増強した
ＰＤ０３２５９０１は、ＩＧＦ−１Ｒの下流のＭＡＰＫ増殖経路のシグナル伝達分子であるＭＥＫの小分子阻害剤である。他のＭＥＫ阻害剤と共に、ＰＤ０３２５９０１は、種々の腫瘍タイプについて臨床試験中であり、臨床活性を示している。本発明者らは、ＰＤ０３２５９０１を合成し、種々の腫瘍細胞系の増殖に対する、Ｍ１３−Ｃ０６と組合せたＰＤ０３２５９０１の効果を試験した。
【０７９３】
ＰＤ０３２５９０１：
化学名：（Ｒ）−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロポキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨードフェニルアミノ）ベンズアミド。
化学式：Ｃ１６Ｈ１４Ｆ３ＩＮ２Ｏ４
化学構造：
【化４】
2011516549.tif 000038
【０７９４】
細胞を、９６ウエル組織培養プレートにおいて、５０００細胞／ウエルで１０％ウシ胎仔血清含有するＲＰＭＩ−１６４０に播種し、その後Ｍ１３−Ｃ０６の場合は２００ｎＭ、ＰＤ０３２５９０１の場合は１０μＭの開始濃度で１：３連続希釈したＭ１３−Ｃ０６及びＰＤ０３２５９０１により、単剤として又は組合せで処理した。細胞生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ  ＧＬＯ（商標）試薬を用いてＡＴＰレベルを測定することにより、３日後又は５日後に決定した。試験した７つのＮＳＣＬＣ細胞系の中では、それらのうちの５つがＰＤ０３２５９０１阻害に感受性であったが、Ｍ１３−Ｃ０６は、それらのうちの４つでＰＤ０３２５９０１の効力を向上させた（図５３Ａ及び５３Ｂ）。Ｈ４６０及びＨ１６５０は、ＰＤ３２５９０１に対する応答が低いこと示した。しかしながら、特にＭ１３−Ｃ０６は、ＰＤ０３２５９０１の効力並びにＨ４６０細胞の最大増殖阻害の程度を大きく増強した。
【０７９５】
図５４は、試験した４つの膵細胞系による結果を例示し、ＢｘＰＣ３及びＰａｎｃ−１は、ＰＤ０３２５９０１に対する中程度の応答を示したが、Ｍ１３−Ｃ０６及びＰＤ０３２５９０１の組合せは相加効果を示し、対照的に、ＭｉａＰａＣａ２及びＳｕ８６．８６は、単剤としてのＰＤ０３２５９０１に感受性であり、Ｍ１３−Ｃ０６を添加してもほとんど効果を示さなかった。
【０７９６】
５つの結腸癌細胞系を試験し、これらのうち、Ｍ１３−Ｃ０６は、ＨＴ−２９細胞のみでＰＤ０３２５９０１の増殖阻害活性を中程度に増強した（図５５）。本発明者らは、現在のところ、選択された細胞系で観察されたＰＤ０３２５９０１及びＭ１３−Ｃ０６の組合せの抗腫瘍活性増強の根底にある分子機序を研究中である。
【０７９７】
（実施例４１）
Ｍ１３−Ｃ０６は、ＮＳＣＬＣ細胞系及び膵癌細胞系において、ＰＩ−１０３の抗腫瘍増殖活性を増強した
ＩＧＦ−１Ｒ活性化は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ生存経路を誘導する。本発明者らは、ＰＩ−３Ｋ及びｍＴＯＲに対して２重阻害活性を有する小分子であるＰＩ−１０３を使用して、Ｍ１３−Ｃ０６がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路阻害剤の増殖阻害効果を増強する能力を評価した。
ＰＩ−１０３：
化学名：３−［４−（４−モルフォリニル）ピリド［３’，２’：４，５］フロ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル］−フェノール。
化学式：Ｃ１９Ｈ１６Ｎ４Ｏ３
化学構造：
【化５】
2011516549.tif 000039
【０７９８】
細胞を、９６ウエル組織培養プレートにおいて、５０００細胞／ウエルで１０％ウシ胎仔血清を含有する細胞培養培地に播種し、その後Ｍ１３−Ｃ０６及びＰＩ−１０３について、それぞれ２００ｎＭ及び１０μＭの開始濃度で１：３連続希釈したＭ１３−Ｃ０６又はＰＩ−１０３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製  カタログ＃３７１９３５−７４−９）により、単剤として又は組合せで処理した。細胞生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ  ＧＬＯ（商標）試薬を用いてＡＴＰレベルを測定することにより、３日後又は５日後に決定した。図５６Ａ及び５６Ｂに示されているように、Ｍ１３−Ｃ０６は、試験したほとんどのＮＳＣＬＣ細胞系（Ａ５４９、Ｈ３２２Ｍ、Ｈ１２９９、Ｈ２３、及びＨ４６０）でＰＩ−１０３の効力を増加させた。４つの膵癌細胞系の中で、Ｍ１３−Ｃ０６は、ＰＩ−１０３阻害に対するＰａｎｃ−１及びＳｕ８６．８６の感受性を増強した（図５７）。結腸癌細胞系はいずれも、Ｍ１３−Ｃ０６がＨＴ−２９及びＷｉＤｒに対して単剤活性を示したという事実にもかかわらず、ＰＩ−１０３阻害に感受性であるとは考えられなかった（図５８）。
【０７９９】
（実施例４２）
Ｍ１３−Ｃ０６は、ＨＣＣ細胞においてソラフェニブの抗腫瘍増殖活性を増強した
トシル酸ソラフィニブ（Ｓｏｒａｆｉｎｉｂ  ｔｏｓｙｌａｔｅ）（「ソラフェニブ」）は、Ｒａｆ、ＶＥＧＦＲ、及びＰＤＧＦＲを含む複数のキナーゼの小分子阻害剤である。ソラフェニブは、進行性肝細胞癌（ＨＣＣ）の患者の治療用に承認されている。ＩＧＦ−１Ｒシグナル伝達は、ＨＣＣの発生に関与しており、ＨＣＣの潜在的な治療標的である。本発明者らは、２つのＨＣＣ細胞系において、Ｍ１３−Ｃ０６抗体がソラフェニブの増殖阻害効果を増強する能力を評価した。ＨｅｐＧ２及びＳｋ−Ｈｅｐ−１細胞を、９６ウエル組織培養プレートにおいて、５０００細胞／ウエルで１０％ウシ胎仔血清を含有する細胞培養培地に播種し、その後Ｍ１３−Ｃ０６及びトシル酸ソラフェニブについて、それぞれ２００ｎＭ及び１０μＭの開始濃度で１：３連続希釈したＭ１３−Ｃ０６又はトシル酸ソラフェニブ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製  カタログ＃４７５２０７−５９−１）により、単剤として又は組合せで処理した。細胞生存率を、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＣＥＬＬ  ＴＩＴＥＲ  ＧＬＯ（登録商標）試薬を用いてＡＴＰレベルを測定することにより、３日後に決定した。図５９に示されているように、Ｍ１３−Ｃ０６抗体は単剤活性を示し、ＨｅｐＧ２細胞においてソラフェニブの効力を増加させたが、Ｓｋ−Ｈｅｐ−１細胞においては増加させなかった。Ｍ１３−Ｃ０６などの抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体と組合せるとソラフェニブなどの抗癌剤の効果が増強されることが観察されたことにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでそのような併用療法を使用した抗腫瘍効力の増強が期待される。
トシル酸ソラフィニブ：
化学名：４−（４−｛３−［４−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］ウレイド｝フェノキシ）Ｎ２−メチルピリジン−２−カルボキサミド４−メチルベンゼンスルフォナート
化学式：Ｃ２１Ｈ１６ＣｌＦ３Ｎ４Ｏ３・Ｃ７Ｈ８ＳＯ３
化学構造：
【化６】
2011516549.tif 000040
【０８００】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2011516549.tif 000120
2011516549.tif 000121