(57)【要約】  本発明は、子癇前症又は早産など、妊娠の合併症を発症する危険性のある対象を同定するための方法及び組成物を提供する。上記組成物は、マイクロＲＮＡ及び関連する核酸である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における生理学的状態を決定する方法であって、対象から得た血清試料中のマイクロＲＮＡのレベルを検出することを含み、対照と異なるマイクロＲＮＡのレベルは前記対象における前記生理学的状態を示す上記方法。
【請求項２】
生理学的状態が妊娠関連障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
妊娠関連障害が子癇前症又は早産である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
マイクロＲＮＡレベルの検出がリアルタイムＰＣＲによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
女性対象が子癇前症を発症する危険性があることの判定を決定又は補助する方法であって、子癇前症を発症する危険性を評価すべき対象からの生物学的試料中における、配列番号５〜１７、そのフラグメント、及びそれらに対して少なくとも約８０％同一性を有する配列からなる群から選択される核酸配列の発現プロファイルを、予め決定された標準の発現プロファイルと比較することを含み、予め決定された標準の発現プロファイルに比べた試料中の該核酸配列の発現プロファイルにおける著しい違いは、対象が子癇前症を発症する危険性があることを示す上記方法。
【請求項６】
予め決定された標準の発現プロファイルが、子癇前症を発症する危険性のない妊娠女性対象における前記核酸配列の発現プロファイルに相当する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的試料が、体液試料及び組織試料からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記組織が、新鮮、凍結、固定、ワックス包埋、又はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組織試料が、胎盤試料又は子宮筋層試料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記体液試料が血清試料である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも２つの核酸配列の発現レベルを測定することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸配列の１つ又は複数の発現比を組み合わせることをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
発現レベルが、核酸ハイブリダイゼーション及び核酸増幅からなる群から選択される方法によって測定される、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
核酸ハイブリダイゼーションが、固相核酸バイオチップアレイ又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
核酸増幅方法がリアルタイムＰＣＲである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
女性対象における早産を検出又はモニターする方法であって、対象からの生物学的試料中における、配列番号１８〜２５、そのフラグメント、及びそれらに対して少なくとも約８０％同一性を有する配列からなる群から選択される核酸配列の発現プロファイルを、予め決定された標準の発現プロファイルと比較することを含み、予め決定された発現プロファイルの標準に比べた試料中の該核酸配列の発現プロファイルにおける著しい違いは、対象が早産であることを示す上記方法。
【請求項１７】
予め決定された標準の発現プロファイルが、早産の危険性のない妊娠女性対象における前記核酸配列の発現プロファイルに相当する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
女性対象が子癇前症を発症する危険性があるか否かを判定するためのキットであって、配列番号５〜１７、そのフラグメント、及びそれに対して少なくとも約８０％同一性を有する配列からなる群から選択される配列に相補的である核酸配列を含むプローブを含む上記キット。
【請求項１９】
女性対象が早産を有する危険性があるか否かを判定するためのキットであって、配列番号１８〜２５、そのフラグメント、及びそれに対して少なくとも約８０％同一性を有する配列からなる群から選択される配列に相補的である核酸配列を含むプローブを含む上記キット。
【請求項２０】
フォワードプライマー及びリバースプライマーをさらに含む、請求項１８又は１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全文が参照によって本明細書に組み入れられる、２００８年１月２７日出願の米国仮出願第６１／０２３，８５９号、２００８年３月３０日出願の米国及び米国仮出願第６１／０４０，６７１号の優先権を米国特許法第１１９条（ｅ）のもとに主張するものである。
【０００２】
本発明は、子癇前症又は早産など、妊娠の合併症を発症する危険性のある対象を同定するための方法及び組成物に関する。組成物は、マイクロＲＮＡ及び関連する核酸である。
【背景技術】
【０００３】
体液中の循環核酸（ＣＮＡ）は、臨床状態を早期診断するための独特な機会を提供してくれる。特異的な臨床用生物マーカーには、異常妊娠などの様々な医学的状態の診断及び処置に革命を起こす可能性がある。多様な生物医学的な研究分野の課題は、血清などの体液中の生物マーカーを同定することであった。近年、無細胞性のＤＮＡ及びｍＲＮＡの両方が血清中、及び他の体液中に存在することが明らかになっており、潜在的な生物マーカーを表している。しかし、通常少量の、体液中のこれらＣＮＡをモニターするには、現在臨床的に適用可能ではない感受性の高い検出方法が必要とされる。
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ）は、豊富な生物学的プロセスに重大な影響を有する、重要な新規なクラスの調節性ＲＮＡとして出現した。これら小型の（通常１７〜２４ヌクレオチド長）ノンコーディングＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分解を促進し、ｍＲＮＡ翻訳を阻害し、また遺伝子転写に影響を及ぼすことによって、タンパク質発現パターンを調節することができる。ｍｉＲは、発生及び分化、細胞増殖の制御、ストレス応答及び代謝などの多様なプロセスにおいて、中心的役割を果たしている。現在、約８５０の既知のヒトｍｉＲが存在する。
【０００５】
子癇前症は妊娠の３〜５％に合併し、母親及び胎児両方に対する実質的な危険性が伴う。子癇前症の病因及び病原に対して多くの理論が存在するが、その直接的な病因は未知のままである。この障害の処置に進歩は殆どなく、治療は依然として胎児の出産及び胎盤の除去である。
【０００６】
早産を同定し、処置するための効果的な管理戦略が、早期出産を防ぐのに必要とされている。早産に起因する早期分娩は、乳児の死亡率及び疾病率の重荷をもたらす。早期出産は、新生児死亡の４分の３、及び小児における長期神経学的障害の半分における要因である。
【０００７】
早産の早期検出及び管理は、早期出産、並びに呼吸窮迫症候群、敗血症、脳室内出血、壊死性腸炎、動脈管開存症、及び高ビリルビン血症を含めたその潜在的な新生児の後遺症を防ぐのに役立つが、早産の徴候及び症状を有する女性に、普及している処置を施しても、早期出産の有病率は大幅に減少せず、早産を検出するための現在の方法を改善する必要性が強調される。
【０００８】
子癇前症又は早産などの妊娠の合併症を発症する危険性のある対象を同定するための信頼できる方法に対して、満たされてない必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、循環マイクロＲＮＡが、安定性が高く、頑健性の高い新規な血清マーカーであることを初めて実証するものである。
【００１０】
本発明は、対象における生理学的状態を決定する方法であって、対象から得た血清試料中のマイクロＲＮＡのレベルを検出することを含み、対照と異なるマイクロＲＮＡのレベルは該対象における該生理学的状態を示す上記方法を提供する。いくつかの実施形態によると、生理学的状態は妊娠関連障害である。他の実施形態によると、妊娠関連障害は子癇前症又は早産である。いくつかの実施形態によると、マイクロＲＮＡレベルの検出はリアルタイムＰＣＲによって測定される。
【００１１】
本発明は、子癇前症又は早産などの妊娠の合併症を同定及び診断するために用いることができる特定の核酸配列をさらに提供する。いくつかの実施形態によると、前記核酸配列は、配列番号１〜１１０、そのフラグメント、及びそれに対して少なくとも約８０％同一性を有する配列からなる群から選択される。
【００１２】
本発明は、女性対象が子癇前症を発症する危険性があることの判定を決定又は補助する方法であって、子癇前症を発症する危険性を評価すべき対象からの生物学的試料中における、配列番号５〜１７、そのフラグメント、及びそれらに対して少なくとも約８０％同一性を有する配列からなる群から選択される核酸配列の発現プロファイルを、予め決定された標準の発現プロファイルと比較することを含み、予め決定された標準の発現プロファイルに比べた試料中の該核酸配列の発現プロファイルにおける著しい違いは、対象が子癇前症を発症する危険性があることを示す上記方法をさらに提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態によると、予め決定された標準の発現プロファイルは、子癇前症を発症する危険性のない妊娠女性対象における前記核酸配列の発現プロファイルに相当する。
【００１４】
他の実施形態によると、前記生物学的試料は、体液試料及び組織試料からなる群から選択される。いくつかの実施形態によると、前記組織は、新鮮、凍結、固定、ワックス包埋、又はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。
【００１５】
一実施形態によると、組織試料は、胎盤試料又は子宮筋層試料である。いくつかの実施形態によると、前記体液試料は血清試料である。
【００１６】
いくつかの実施形態によると、上記方法は、少なくとも２つの核酸配列の発現プロファイルを測定することを含む。いくつかの実施形態によると、上記方法は、１つ又は複数の発現比を組み合わせることをさらに含む。いくつかの実施形態によると、発現レベルは、核酸ハイブリダイゼーション及び核酸増幅からなる群から選択される方法によって測定される。いくつかの実施形態によると、核酸ハイブリダイゼーションは固相核酸バイオチップアレイを用いて行われる。ある実施形態によると、核酸ハイブリダイゼーションはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて行われる。他の実施形態によると、核酸増幅方法はリアルタイムＰＣＲである。一実施形態によると、前記リアルタイムＰＣＲは定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。
【００１７】
本発明は、女性対象における早産を検出又はモニターする方法であって、対象からの生物学的試料中における、配列番号１８〜２５、そのフラグメント、及びそれらに対して少なくとも約８０％同一性を有する配列からなる群から選択される核酸配列の発現プロファイルを、予め決定された標準の発現プロファイルと比較することを含み、予め決定された標準の発現プロファイルに比べた試料中の前記核酸配列の発現プロファイルにおける著しい違いは、対象が早産であることを示す上記方法をさらに提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態によると、予め決定された標準の発現プロファイルは、早産の危険性のない妊娠女性対象における前記核酸配列の発現プロファイルに相当する。
【００１９】
本発明は、対象女性が子癇前症を発症する危険性があるか否かを判定するためのキットであって、配列番号５〜１７、そのフラグメント、及びそれに対して少なくとも約８０％同一性を有する配列からなる群から選択される配列に相補的である核酸配列を含むプローブを含む上記キットをさらに提供する。
【００２０】
本発明は、女性対象が早産を有する危険性があるか否かを判定するためのキットであって、配列番号１８〜２５、そのフラグメント、及びそれに対して少なくとも約８０％同一性を有する配列からなる群から選択される配列に相補的である核酸配列を含むプローブを含む上記キットをさらに提供する。
【００２１】
いくつかの実施形態によると、上記キットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーをさらに含む。
【００２２】
本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の図、記述、及び特許請求の範囲と組み合わせるとより明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】妊娠女性対非妊娠女性における血清中に存在する４種のマイクロＲＮＡの差次的発現を示す図である。発現レベルは、ＣＴがＰＣＲ反応のサイクル閾値である場合には、５０−ＣＴとして規定される。各マイクロＲＮＡのＣＴレベルから、試料中の全体的なマイクロＲＮＡ発現（正規化するために選択された６種のマイクロＲＮＡの平均ＣＴ）を減じることにより、結果を正規化した。Ａ）非妊娠女性１０名（ａ）、妊娠の第一期にある女性１０名（ｂ）、及び妊娠の第三期にある女性１０名（ｃ）の血清中のマイクロＲＮＡ発現レベルを比較した箱ヒゲ図。３種の胎盤由来マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−５２７（配列番号：５３）、ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ（配列番号：６９）、及びｍｉＲ−５２６ａ（配列番号：７５））は、妊娠女性で高度に発現しており、その発現レベルは妊娠の進行に伴い上昇している。ｈｓａ−ｌｅｔ７ｄは、全ての群において発現レベルは類似している。Ｂ）３群の血清中に存在するマイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１４１（配列番号：７８）、及びｍｉＲ−１４９（配列番号：７１）の発現レベルを比較した箱ヒゲ図。Ｃ）妊娠女性対非妊娠女性における血清中に存在する３種のマイクロＲＮＡのレベルに基づく「妊娠分類」。女性血清中のマイクロＲＮＡ発現レベルに基づく、妊娠女性と非妊娠女性の識別。丸印は非妊娠女性、三角印は妊娠女性、点は妊娠の第三期を表す。プロット図中の各シンボルの位置は、ある血清中の全３マイクロＲＮＡの集合的発現を表す。ｙ軸は、ｍｉｒ５２７の発現レベルを表し、ｘ軸はｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ、及びｍｉＲ−５２６ａの平均発現レベルを表す。
【図２】重篤な子癇前症（ＰＥＴ）を有する女性、及び自然分娩が始まる前に帝王切開術を受けた健康な女性から得られた胎盤試料の、バイオチップアレイに基づくｈｓａ−ｍｉＲ−３１（配列番号：５）の差次的発現を示す図である（ｔ検定  ｐ値＜０．０１５）。
【図３】重篤な子癇前症（ＰＥＴ）を有する女性、及び自然分娩が始まる前に帝王切開術を受けた健康な女性から得られた胎盤試料の、バイオチップアレイに基づくａｍｂｉ−ｍｉＲ−７５１０（配列番号：６）の差次的発現を示す図である（ｔ検定  ｐ値＜０．０１５）。
【図４】重篤な子癇前症（ＰＥＴ）を有する女性、及び自然分娩が始まる前に帝王切開術を受けた健康な女性から得られた胎盤試料の、バイオチップアレイに基づくｈｓａ−ｍｉＲ−２１０（配列番号：７）の差次的発現を示す図である（ｔ検定  ｐ値＜０．０１５）。
【図５】重篤な子癇前症（ＰＥＴ）を有する女性、及び自然分娩が始まる前に帝王切開術を受けた健康な女性から得られた胎盤試料の、バイオチップアレイに基づくｈｓａ−ｍｉＲ−１９３ｂ＊（配列番号：８）の差次的発現を示す図である（ｔ検定  ｐ値＜０．０１５）。
【図６】重篤な子癇前症（ＰＥＴ）を有する女性、及び自然分娩が始まる前に帝王切開術を受けた健康な女性から得られた胎盤試料の、バイオチップアレイに基づくｈｓａ−ｍｉＲ−６５２（配列番号：９）の差次的発現を示す図である（ｔ検定  ｐ値＜０．０１５）。
【図７】重篤な子癇前症（ＰＥＴ）を有する女性（ｙ軸）、及び自然分娩が始まる前に帝王切開術を受けた健康な対照女性（ｘ軸）から得られた血清試料のｑＲＴ−ＰＣＲ分析に基づく、平均マイクロＲＮＡ発現レベル（５０−Ｃｔ）を示す図である。差次的に発現したマイクロＲＮＡを丸印で示す（ｔ検定  ｐ値＜０．０５）。
【図８】重篤な子癇前症（ＰＥＴ）を有する女性、及び自然分娩が始まる前に帝王切開術を受けた対照健常女性から得られた血清試料におけるｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ（配列番号：１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３（配列番号：１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−７７０−５Ｐ（配列番号：１２）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ（配列番号：１３）の差次的発現を示す図である（ｔ検定  ｐ値＜０．０１５）。
【図９】重篤な子癇前症（ＰＥＴ）を有する女性、及び自然分娩が始まる前に帝王切開術を受けた対照健常女性から得られた血清試料における、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ＊（配列番号：１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４１１（配列番号：１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ（配列番号：１６）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａ（配列番号：１７）の差次的発現を示す図である（ｔ検定  ｐ値＜０．０１５）。
【図１０】予定日よりも早く自然分娩が始まった女性（ｓＰＴＬ）（ｘ軸）、及び予定日に帝王切開術により出産した対照女性（ｙ軸）から得られた子宮筋層試料のバイオチップアレイに基づく、平均マイクロＲＮＡ発現レベルを示す図である。差次的に発現したマイクロＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−２１０（配列番号：１８）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（配列番号：１９））を丸印で示す（ｔ検定  ｐ値＜０．０５）。
【図１１】予定日よりも早く自然分娩が始まった女性（ｓＰＴＬ）（ｘ軸）、及び予定日に帝王切開術により出産した対照女性（ｙ軸）から得られた胎盤試料のバイオチップアレイに基づく、平均マイクロＲＮＡ発現レベルを示す図である。差次的に発現したマイクロＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９ａ＊（配列番号：２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２１（配列番号：２１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ（配列番号：２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６８（配列番号：２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ａ（配列番号：２４）及びｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号：２５））を丸印で示す（ｔ検定  ｐ値＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、特定の核酸配列（配列番号１〜１１０）を、子癇前症又は早産などの妊娠の合併症の同定及び診断に用いることができるという発見に基づくものである。本発明は、初めて、特定のマイクロＲＮＡの血清レベルが、多様な生理学的及び病態学的状態に対する診断用生物マーカーとして働き得ることを実証するものである。さらに、本発明は、体液のマイクロＲＮＡプロファイルを測定する容易さ及び信頼性を実証し、したがって、検査室及び診療所両方における、その広範な適用への道を開くものである。本発明の方法は感受性及び特異性が高い。
【００２５】
定義
本発明の組成物及び方法を開示及び記載する前に、本明細書において用いられる専門用語は特定の実施形態を記載する目的にすぎず、限定的なものを意図しないことを理解されたい。本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられる、単数形の「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈によって他のものが明らかに指図されなければ、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【００２６】
本明細書において数の範囲を列挙するために、同じ正確さの程度でその間に各々の介在する数字が明確に企図される。例えば、６〜９の範囲に対して、６及び９の他に７及び８の数が企図され、６．０〜７．０の範囲に対して、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０の数が明確に企図される。
【００２７】
約
本明細書で用いられる「約」の語は、＋／−１０％を意味する。
【００２８】
アンチセンス
本明細書で用いられる「アンチセンス」の語は、特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列に相補的であるヌクレオチド配列を意味する。「アンチセンス鎖」の語は、「センス」鎖に相補的である核酸鎖に関して用いられる。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスのプロモータに対してリバース方向における対象の（１つ又は複数の）遺伝子のライゲーションによる合成を含めた、あらゆる方法によって生成されてよい。細胞中に導入された後、この転写された鎖は、細胞によって生成される天然の配列と組み合わさって２本鎖を形成する。これらの２本鎖は、次いで、さらなる転写又は翻訳のいずれかを遮断する。この方法において変異体表現型が産生され得る。
【００２９】
付着している
プローブ及び固体支持体に関して本明細書で用いられる「付着している」又は「固定化されている」は、プローブと固体支持体の間の結合が、結合、洗浄、分析、及び除去の条件下で安定であるのに十分であることを意味し得る。結合は共有性であってもよく、又は非共有性であってもよい。共有結合は、プローブと固体支持体の間で直接形成されてもよく、或いは架橋剤によって、又は固体支持体若しくはプローブ若しくは両方の分子のいずれかの上の特定の反応基の包含によって形成されてもよい。非共有性の結合は、静電気性、親水性、及び疎水性の相互作用の１つ又は複数であってよい。非共有性の結合には、ストレプトアビジンなどの分子の支持体に対する共有性の付着、及びビオチン化されたプローブのストレプトアビジンへの非共有性の結合が含まれる。固定化は、共有結合性及び非共有結合性の相互作用が関与するものであってもよい。
【００３０】
生物学的試料
本明細書において用いられる「生物学的試料」は、核酸を含んでいる生物学的な組織又は液体の試料を意味し得る。このような試料には、それだけには限定されないが、動物から単離された組織又は液体が含まれる。生物学的試料には、生検及び剖検の試料、ＦＦＰＥ試料、組織学的目的で採取した凍結切片、血液、血漿、血清、喀痰、糞便、涙、粘液、毛髪、及び皮膚など、組織の切片も含まれてよい。生物学的試料には、動物又は患者の組織に由来する、外植片、並びに原発の、及び／又は形質転換された細胞培養物も含まれる。生物学的試料は、血液、血液分画、尿、浸出液、腹水、唾液、脳脊髄液、頚管分泌物、膣分泌物、子宮内膜分泌物、消化管分泌物、気管支分泌物、喀痰、細胞系、組織試料、又は胸部からの分泌物であってもよい。生物学的試料は、動物から細胞の試料を除去することによって提供されることもあるが、予め単離された（例えば、別の人間によって、別のときに、及び／若しくは別の目的で単離された）細胞を用いることによって、又はｉｎ  ｖｉｖｏで本明細書に記載した方法を行うことによって達成されてもよい。処置又は結果の履歴を有するものなど、アーカイブ組織も用いることができる。
【００３１】
相補
核酸に関して、本明細書において用いられる「相補」又は「相補性」は、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体間の、ワトソン−クリック（例えば、Ａ−Ｔ／Ｕ、及びＣ−Ｇ）、又はＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成を意味し得る。完全な相補又は完全な相補性は、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体間の、１００％相補的な塩基対形成を意味し得る。
【００３２】
Ｃｔ
Ｃｔシグナルは、増幅が蛍光の閾値（サイクル閾値）を交差するＰＣＲの最初のサイクルを意味する。したがって、Ｃｔの値が低いということはマイクロＲＮＡの存在量又は発現レベルが高いことを意味する。いくつかの実施形態において、ＰＣＲのＣｔシグナルは、正規化されたＣｔが発現レベルに反比例したままとなるように正規化される。他の実施形態において、ＰＣＲのＣｔシグナルは、低い値の、正規化−逆数化されたＣｔが、マイクロＲＮＡの存在量又は発現レベルが低いことを表すように、正規化した後に逆数化してもよい。
【００３３】
検出
「検出」は、試料中の成分の存在を検出することを意味し得る。検出は、成分の非存在を検出することも意味し得る。検出は、定量的又は定性的いずれかで、成分のレベルを測定することも意味し得る。
【００３４】
差次的発現
「差次的発現」は、細胞及び組織内、並びに細胞及び組織間の、一時的な、及び／又は細胞の遺伝子の発現パターンにおける定性的又は定量的な差を意味し得る。したがって、差次的に発現された遺伝子は、例えば、正常組織対罹患組織において、活性化又は非活性化を含めて、定性的にその発現が変化しているものであり得る。遺伝子は、別の状態に比べて、特定の状態においてスイッチオン又はスイッチオフされ、それによって２種以上の状態の比較が可能になり得る。定性的に制御されている遺伝子は、１つの状態又は細胞型の中で、標準技法によって検出され得る発現パターンを示し得る。いくつかの遺伝子は、１つの状態又は細胞型で発現され得るが、両方では発現され得ない。或いは、発現における差は、例えば、転写物の量の増大をもたらす上方制御、又は転写物の量の低下をもたらす下方制御のいずれかで、発現が調節される点で定量的であり得る。それに対する発現が異なる度合いは、発現アレイ、定量的逆転写酵素ＰＣＲ、ノーザン分析、リアルタイムＰＣＲ、及びＲＮａｓｅ保護など、標準的な特性分析技法によって定量するのに十分大きいことだけを必要とする。
【００３５】
子宮外妊娠
「子宮外妊娠」は、受精卵が子宮の外側に着床する、異常な妊娠を意味する。子宮外妊娠のほとんどの場合において、卵子はファロピウス管に定着するが、この語は受精卵が女性の卵巣、腹部、又は頸部において着床する異常な妊娠も包含する。
【００３６】
発現プロファイル
「発現プロファイル」の語は、マイクロＲＮＡの発現プロファイルなど、ゲノムの発現プロファイルを広く含むために用いられる。プロファイルは、例えば、マイクロＲＮＡ、標識化したマイクロＲＮＡ、増幅したマイクロＲＮＡ、ｃＲＮＡなどの定量的ハイブリダイゼーション、定量的ＰＣＲ、定量用ＥＬＩＳＡなど、あるレベルの核酸配列を測定するためのあらゆる便利な手段によって産生され得、２つの試料間の差次的な遺伝子発現の分析を可能にする。対象又は患者の試料（例えば、細胞又はその収集物、例えば組織）がアッセイされる。試料は、当技術分野において知られているあらゆる便利な方法によって採取される。発現プロファイルが、列挙した核酸配列の全てを含む、２、５、１０、２０、２５、５０、１００、又はそれを超えるものに対する発現データを含むことができる場合、対象の核酸配列は、上記に提供した核酸配列を含めた、予測的であることが見出されている核酸配列である。いくつかの実施形態によると、「発現プロファイル」の語は、測定した試料中の核酸配列の存在量を測定することを意味する。
【００３７】
発現比
本明細書において用いられる「発現比」は、生物学的試料中の対応する核酸の相対的な発現レベルを検出することによって測定した、２つ又はそれを超える核酸の相対的な発現レベルを意味する。
【００３８】
フラグメント
本明細書において「フラグメント」は、非全長の部分の核酸を意味するために用いられる。したがって、フラグメントは、それ自体も核酸である。
【００３９】
遺伝子
本明細書において用いられる「遺伝子」は、転写及び／又は翻訳の制御配列、並びに／或いはコード領域、並びに／或いは非翻訳の配列（例えば、イントロン、５’−及び３’−非翻訳配列）を含む、天然の（例えばゲノムの）、又は合成の遺伝子であってよい。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又はｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡなどの機能性ＲＮＡであってよい。遺伝子は、それらに連結している５’−又は３’−非翻訳配列を場合により含んでいるコード領域（例えば、エキソン及びｍｉＲＮＡ）に対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡであってもよい。遺伝子は、コード領域、及び／又はそれらに連結している５’−若しくは３’−非翻訳配列の全て若しくは一部分を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成される増幅されている核酸分子であってもよい。
【００４０】
グルーブバインダー／マイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）
「グルーブバインダー」及び／又は「マイナーグルーブバインダー」は同義的に用いてよく、通常配列特異性な様式において、２本鎖ＤＮＡのマイナーグルーブ中に適合する小分子を意味し得る。マイナーグルーブバインダーは、三日月型をとることができる長く平板な分子であってよく、したがって、しばしば水と置換して２本鎖のマイナーグルーブ中にぴったりと適合することができる。マイナーグルーブ結合分子は、典型的に、フラン、ベンゼン、又はピロール環などのねじれの自由のある結合によって接続されているいくつかの芳香環を含むことができる。マイナーグルーブバインダーは、「化学及び生物学における核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２版、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ及びＧａｉｔ編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年、並びにその内容が参照によって本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開出願第ＷＯ  ０３／０７８４５０号に記載されているものを含む、ネトロプシン、ジスタマイシン、ベレニル、ペンタミジン、及び他の芳香族ジアミジン、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＳＮ６９９９、アウレオリック抗腫瘍薬（例えば、クロモマイシン及びミトラマイシン）、ＣＣ−１０６５、ジヒドロシクロピロロインドールトリペプチド（ＤＰＩ３）、１，２−ジヒドロ−（３Ｈ）−ピロロ［３，２−ｅ］インドール−７−カルボキシレート（ＣＤＰＩ３）、並びに関連化合物及び類似体などの抗生物質であってよい。マイナーグルーブバインダーは、プライマーの成分、プローブ、ハイブリダイゼーションタグ相補体、又はこれらの組合せであってよい。マイナーグルーブバインダーは、プライマー又はそれに対してこれらが付着しているプローブのＴｍを増大することがあり、このようなプライマー又はプローブが高温で効果的にハイブリダイズできるようにする。
【００４１】
同一性
本明細書で２つ又はそれを超える核酸又はポリペプチド配列の文脈において用いられる「同一である」又は「同一性」は、複数の配列が、ある特定の領域にわたって、指示されているパーセント値の同じ残基を有することを意味し得る。パーセント値は、２つの配列を最適にアラインし、特定された領域にわたって２つの配列を比較し、同一の残基がマッチしたポジションの数をもたらすのに両方の配列において生じるポジションの数を測定し、マッチしたポジションの数を特定された領域におけるポジションの総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセント値を得ることによって計算され得る。２つの配列の長さが異なる場合、又はアラインメントにより１つ若しくは複数のねじれた末端が生成され、特定された比較の領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基が計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は等価とみなしてよい。同一性は、手作業によって、又はＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを用いることによって行われてよい。
【００４２】
標識
本明細書において用いられる「標識」は、分光学的、光学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理学的手段によって検出可能な組成物を意味し得る。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度の試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に用いられるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン、及び検出可能にされ得る他の実体が含まれる。標識は、あらゆるポジションの核酸及びタンパク質中に組み入れられてよい。
【００４３】
核酸
本明細書において用いられる「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、共有性に一緒に連結している少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。１本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を規定する。したがって、核酸は、描写された１本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変種を、所与の核酸として同じ目的に用いてもよい。したがって、核酸は、実質的に同一である核酸及びその相補体も包含する。１本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的の配列にハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００４４】
核酸は、１本鎖でも、若しくは２本鎖でもよく、又は２本鎖の配列及び１本鎖の配列の両方の部分を含んでいてもよい。核酸は、ＤＮＡ、ゲノム及びｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、又はハイブリッドであってよく、この場合、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含めた塩基の組合せを含んでいてよい。核酸は、化学合成法によって得てもよく、又は組換え法によって得てもよい。
【００４５】
核酸は一般的にホスホジエステル結合を含むが、例えば、ホスホラミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又はＯ−メチルホスホロアミダイト連結、並びにペプチドの核酸バックボーン及び連結などの、少なくとも１つの異なる連結を有することができる核酸類似体が含まれていてよい。他の類似体の核酸には、参照によって組み入れられる米国特許第５，２３５，０３３号及び第５，０３４，５０６号に記載されているものを含めた、ポジティブのバックボーン、非イオン性バックボーン、及び非リボースのバックボーンを有する核酸が含まれる。天然に存在しない、又は修飾されているヌクレオチドを１つ又は複数含む核酸も、核酸の一定義内に含まれる。修飾されているヌクレオチド類似体は、核酸分子の、例えば５’末端及び／又は３’末端に位置してよい。ヌクレオチド類似体の代表例は、糖修飾又はバックボーン修飾されているリボヌクレオチドから選択されてよい。しかし、核酸塩基修飾されているリボヌクレオチド、すなわち天然に存在する核酸塩基の代わりに天然に存在しない核酸塩基（例えば、５位が修飾されているウリジン又はシチジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８位が修飾されているアデノシン及びグアノシン、例えば、８−ブロモグアノシン；デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザアデノシン；Ｏ−及びＮ−アルキル化されているヌクレオチド、例えば、Ｎ６−メチルアデノシン）を含んでいるリボヌクレオチドも適切であることに留意すべきである。２’−ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、又はＣＮから選択される基によって置換されていてよく、Ｒは、Ｃｌ〜Ｃ６アルキル、アルケニル、又はアルキニルであり、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩである。修飾されているヌクレオチドには、例えば、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔら、Ｎａｔｕｒｅ、４３８巻、６８５〜６８９頁（２００５年）、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ、４３２巻、１７３〜１７８頁（２００４年）、及び参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開第２００５０１０７３２５号に記載されているヒドロキシプロリノール連結によってコレステロールとコンジュゲートしているヌクレオチドも含まれる。さらなる修飾されているヌクレオチド及び核酸は、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許公開第２００５０１８２００５号に記載されている。リボース−リン酸バックボーンの修飾は、生理学的環境におけるこれらの分子の安定性及び半減期を増大するために、細胞膜を通過する拡散を増強するために、又はバイオチップ上のプローブとして、など様々な理由でなされてよい。バックボーンの修飾は、厳しいエンドサイトーシスの細胞の環境におけるなど、分解に対する抵抗性を増強することもある。バックボーンの修飾により、肝臓及び腎臓などにおける肝細胞による核酸のクリアランスが低減してもよい。天然に存在する核酸及び類似体の混合物を作成してもよく、或いは、様々な核酸の類似体の混合物、及び天然に存在する核酸と類似体の混合物を作成してもよい。
【００４６】
妊娠関連障害
本出願において用いられる「妊娠関連障害」の語は、妊娠女性、女性が有する胎児、又は女性及び胎児の両方に影響を及ぼすことがあるあらゆる状態又は疾患を意味する。このような状態又は疾患は、限られた期間の間に、例えば、妊娠若しくは出産の間にその症状が現れることもあり、又は出産後胎児の寿命全体に続くこともある。妊娠関連障害のいくつかの例には、子癇前症、早産、子宮外妊娠、及び胎児染色体異常が含まれる。
【００４７】
子癇前症
本明細書で用いられる「子癇前症」の語は、妊娠の間に生じる状態を意味し、その主な症状は、尿中タンパク質の存在及び浮腫（腫脹）をしばしば伴う様々な形態の高血圧である。子癇前症は、妊娠中毒症と呼ばれることもあり、てんかん発作と一緒の子癇前症である「子癇」と呼ばれるより重症の障害に関連する。これらの状態は、通常妊娠後期（２０週以後）の間に発症するが、出産直後又は妊娠２０週前に発症することもある。
【００４８】
早産
本明細書において用いられる「早産」又は「早期分娩（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｌａｂｏｒ）」の語は、分娩が約４０週の全妊娠期間の３週間を超えて前に開始する状態を意味し、治療しなければ多くの場合早期出産をもたらす。
【００４９】
プローブ
本明細書において用いられる「プローブ」は、１つ又は複数のタイプの化学結合によって、通常、相補的な塩基対形成によって、通常、水素結合の形成によって、標的の核酸の相補配列に結合することができるオリゴヌクレオチドを意味し得る。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列に結合することができる。標的配列と本明細書に記載する１本鎖の核酸との間のハイブリダイゼーションを妨害する、あらゆる数の塩基対のミスマッチが存在してよい。しかし、変異の数が非常に大きいため最小のストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下でもハイブリダイゼーションが起こることができない場合、配列は相補的な標的配列ではない。プローブは１本鎖でもよく、又は部分的に１本鎖で部分的に２本鎖であってもよい。プローブの鎖の数は、標的配列の構造、組成、及び性質によって指示される。プローブは、それに対してストレプトアビジン複合体が後に結合することができるビオチンなどで直接標識されていてもよく、又は間接的に標識されていてもよい。
【００５０】
基準の発現プロファイル
本明細書において用いられる「基準の発現プロファイル」又は「予め決定された標準の発現プロファイル」の句は、妊娠の合併症を発症する危険性のある対象の検出を測定するために、それに対して測定値が比較される発現値の基準値を意味する。基準の発現プロファイルは、核酸の存在量に基づいてもよく、又は組み合わされたその計量スコアに基づいてもよい。
【００５１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書において用いられる「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複合の混合物などにおいて、その下で第１の核酸配列（例えば、プローブ）が、第２の核酸配列（例えば、標的）とハイブリダイズする条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、様々な状況において異なる。ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度ｐＨで、特定の配列に対して、熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択され得る。Ｔｍは、（規定されたイオン強度、ｐＨ、及び核の濃度で）標的に相補的であるプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度であってよい（標的の配列は、Ｔｍで過剰に存在し、プローブの５０％が平衡時に占められているので）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、例えば、ｐＨ７．０から８．３でナトリウムイオン（又は他の塩）濃度が約０．０１〜１．０Ｍであり、温度は、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドを超える）に対して少なくとも約６０℃であるものであってよい。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で実現してもよい。選択的な、又は特異的なハイブリダイゼーションでは、ポジティブなシグナルは、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの少なくとも２から１０倍であってよい。例示のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には以下のものが含まれる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、又は５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ、及び６５℃の０．１％ＳＤＳ中で洗浄。
【００５２】
実質的に相補的な
本明細書で用いられる「実質的に相補的な」は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００若しくはそれを超えるヌクレオチドの領域にわたって、第２の配列の相補体に、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であること、又は２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００５３】
実質的に同一である
本明細書において用いられる「実質的に同一である」は、第１の配列及び第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００若しくはそれを超えるヌクレオチド若しくはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であること、又は核酸に関して、第１の配列が第２の配列の相補体に実質的に相補的である場合を意味し得る。
【００５４】
対象
本明細書において用いられる「対象」の語は、ヒト及び他の哺乳動物の両方を含めた哺乳動物を意味する。本発明の方法はヒト対象に適用されるのが好ましい。
【００５５】
標的の核酸
本明細書において用いられる「標的の核酸」は、別の核酸が結合していてよい核酸又はその変種を意味し得る。標的の核酸はＤＮＡ配列であってよい。標的の核酸はＲＮＡであってよい。標的の核酸は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はＰｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、又はプリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又は抗ｍｉＲＮＡを含むことができる。標的の核酸は、標的のｍｉＲＮＡ結合部位又はその変種を含むことができる。１つ又は複数のプローブが、標的の核酸に結合することができる。標的の結合部位は、５〜１００ヌクレオチド又は１０〜６０ヌクレオチドを含むことができる。標的の結合部位は、合計５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６１、６２、又は６３ヌクレオチドを含むことができる。標的部位の配列は、その内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１１／３８４，０４９号、第１１／４１８，８７０号、又は第１１／４２９，７２０号に開示されている標的のｍｉＲＮＡ結合部位の配列の少なくとも５ヌクレオチドを含むことができる。
【００５６】
組織試料
本明細書において用いられる組織試料は、関連の医学技術分野における当業者にはよく知られている方法を用いて組織生検から得られた組織である。生検から試料を得るための方法には、塊の大まかな配分（ｇｒｏｓｓ  ａｐｐｏｒｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｍａｓｓ）、顕微解剖、レーザーベースの顕微解剖、又は当技術分野で知られている他の細胞分離法が含まれる。
【００５７】
変種
本明細書において核酸に関して用いられる「変種」は、（ｉ）基準のヌクレオチド配列の一部分、（ｉｉ）基準のヌクレオチド配列若しくはその部分の相補体、（ｉｉｉ）基準の核酸若しくはその相補体に実質的に同一である核酸、又は（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、基準の核酸、その相補体、若しくはそれに実質的に同一である配列にハイブリダイズする核酸を意味し得る。
【００５８】
野生型
本明細書において用いられる、「野生型」配列の語は、コード配列、非コード配列、又はインターフェース（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）配列が、その配列に対して天然又は正常の機能を行う対立形質の配列であることを意味する。野生型配列にはある同族配列の多数の対立形質が含まれ、例えば、野生型配列の多数の対立遺伝子は、コード配列がコードするタンパク質配列に対するサイレント又は保存的な変化をコードしていてよい。
【００５９】
発生及び疾患におけるマイクロＲＮＡの中心的役割を考慮すると、本発明は、血清及び他の体液中のマイクロＲＮＡレベルを測定する、医学的に関連性のある可能性を強調するものである。したがって、マイクロＲＮＡは、有用な臨床上の生体マーカーとして役立つ見込みのある新しいクラスのＣＮＡである。
【００６０】
マイクロＲＮＡプロセシング
ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は転写されて、プリｍｉＲＮＡとして知られているｍｉＲＮＡ前駆体の生成をもたらすことがある。プリｍｉＲＮＡは、多数のプリｍｉＲＮＡを含むポリシストロニックＲＮＡの部分であってよい。プリｍｉＲＮＡは、ステム及びループを有するヘアピンを形成することがある。ステムは不適正塩基を含むことがある。
【００６１】
プリｍｉＲＮＡのヘアピン構造は、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼであるＤｒｏｓｈａによって認識され得る。Ｄｒｏｓｈａは、プリｍｉＲＮＡにおける末端ループを認識し、およそ２つのらせん状回転をステムに切断して、プレｍｉＲＮＡとして知られている６０〜７０ｎｔの前駆体を生成し得る。Ｄｒｏｓｈａは、ＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼに典型的である段違い切断でプリｍｉＲＮＡを切断し、５’リン酸、及び約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有するプレｍｉＲＮＡステムループを産生し得る。Ｄｒｏｓｈａ切断部位を越えて伸長するステム（約１０ヌクレオチド）のおよそ１つのらせん状回転が、効率的なプロセシングには不可欠であり得る。次いで、プレｍｉＲＮＡは、Ｒａｎ−ＧＴＰによって核から細胞質に能動輸送され、受容体エクスポーチン−５を運び出し得る。
【００６２】
プレｍｉＲＮＡは、やはりＲＮａｓｅＩＩＩエンドヌクレアーゼであるＤｉｃｅｒによって認識され得る。Ｄｉｃｅｒは、プレｍｉＲＮＡの２本鎖のステムを認識し得る。Ｄｉｃｅｒは、ステムループの塩基の５’リン酸及び３’オーバーハングも認識し得る。Ｄｉｃｅｒは、末端ループの２つのらせん状回転をステムループの塩基から切断して離し、さらなる５’リン酸、及び約２ヌクレオチドの３’オーバーハングを残し得る。得られた、ミスマッチを含み得るｓｉＲＮＡ様の２本鎖は、成熟ｍｉＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡ＊として知られている同様のサイズのフラグメントを含んでいる。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊は、プリｍｉＲＮＡ及びプレｍｉＲＮＡの対立するアームに由来し得る。ｍｉＲＮＡ＊配列は、クローニングしたｍｉＲＮＡのライブラリー中に見出すことができるが、通常ｍｉＲＮＡよりも低頻度である。
【００６３】
最初はｍｉＲＮＡ＊との２本鎖の種として存在するが、ｍｉＲＮＡは最終的に１本鎖ＲＮＡとしてＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られるリボヌクレオタンパク質複合体中に組み入れられるようになり得る。様々なタンパク質がＲＩＳＣを形成することができ、ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊２本鎖、標的の遺伝子の結合部位、ｍｉＲＮＡの活性（抑制又は活性化）に対する特異性における可変性をもたらすことができ、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊２本鎖の鎖はＲＩＳＣにローディングされる。
【００６４】
ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊２本鎖のｍｉＲＮＡ鎖がＲＩＳＣ中にローディングされる場合、ｍｉＲＮＡ＊は除去され、分解され得る。ＲＩＳＣ中にローディングされるｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊２本鎖の鎖は、その５’末端の対形成が強くない鎖であってよい。ｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ＊の両端が大まかに等価な５’対形成を有する場合、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の両方とも遺伝子サイレンシング活性を有することがある。
【００６５】
ＲＩＳＣは、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡの間の高レベルの相補性に基づいて、特にｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７によって、標的の核酸を同定することができる。動物において、ｍｉＲＮＡとその標的の間の相互作用がｍｉＲＮＡの全長に沿った場合が一つだけ報告されている。これは、ｍｉｒ−１９６及びＨｏｘＢ８に対して示されたもので、ｍｉｒ−１９６はＨｏｘＢ８ｍＲＮＡの切断を媒介することもさらに示された（Ｙｅｋｔａら、２００４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４〜５９４頁）。その他の点では、このような相互作用は植物においてのみ知られている（Ｂａｒｔｅｌ及びＢａｒｔｅｌ、２００３年、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、１３２〜７０９頁）。
【００６６】
数々の研究が、翻訳の効率的な阻害を実現するためのｍｉＲＮＡとそのｍＲＮＡ標的の間の塩基対形成の要件を観察してきた（Ｂａｒｔｅｌ、２００４年、Ｃｅｌｌ、１１６〜２８１頁による再考）。哺乳動物の細胞において、ｍｉＲＮＡの最初の８ヌクレオチドが重要であり得る（Ｄｏｅｎｃｈ及びＳｈａｒｐ、２００４年、ＧｅｎｅｓＤｅｖ、２００４〜５０４頁）。しかし、マイクロＲＮＡの他の部分もｍＲＮＡ結合に関与し得る。さらに、３’の十分な塩基対形成が、５’の不十分な対形成を補償することができる（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅら、２００５年、ＰＬｏＳ、３〜ｅ８５頁）。ゲノム全体上のｍｉＲＮＡ結合を分析する計算試験は、標的の結合におけるｍｉＲＮＡの５’の塩基２〜７に特定の役割を示唆しているが、通常「Ａ」であることが見出されている最初のヌクレオチドの役割も認識された（Ｌｅｗｉｓら、２００５年、Ｃｅｌｌ、１２０〜１５頁）。同様に、ヌクレオチド１〜７又は２〜８を用いて、Ｋｒｅｋらによる標的を同定及び確認した（２００５年、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、３７〜４９５頁）。
【００６７】
ｍｉＲＮＡにおける標的部位は、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、又はコード領域であってよい。興味深いことに、多数のｍｉＲＮＡが、同じ、又は多数の部位を認識することによって同じｍＲＮＡ標的を調節することがある。殆どの遺伝子的に同定された標的において多数のｍｉＲＮＡ結合部位が存在することは、多数のＲＩＳＣの共同作業により最も効率的な翻訳阻害がもたらされることを指摘し得る。
【００６８】
ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ切断又は翻訳の抑制の２つの機序のいずれかによって遺伝子発現を下方制御するようＲＩＳＣに指示することがある。ｍＲＮＡがｍｉＲＮＡに対する相補性をある程度有する場合、ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡの切断を特定することがある。ｍｉＲＮＡが切断を先導する場合、切断はｍｉＲＮＡの残基１０と１１に対するヌクレオチド対形成の間であってよい。或いは、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡに対して必要な程度の相補性を有さない場合、ｍｉＲＮＡは翻訳を抑制することがある。動物はｍｉＲＮＡと結合部位の間の相補性の度合いが低いことがあるので、翻訳の抑制は動物においてより一般的である。
【００６９】
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊のあらゆる対の５’及び３’末端において可変性が存在し得ることに留意しなければならない。この可変性は、切断部位に関してＤｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒの酵素プロセシングにおける可変性によるものであり得る。ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊の５’及び３’末端の可変性は、プリｍｉＲＮＡ及びプレｍｉＲＮＡのステム構造におけるミスマッチによるものでもあり得る。ステム鎖のミスマッチは、異なるヘアピン構造の集団をもたらし得る。ステム構造における可変性は、Ｄｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒによる切断の生成物における可変性ももたらし得る。
【００７０】
核酸
本発明において核酸が提供される。核酸は、配列番号１〜１１０の配列、又はそれらの変種を含んでいてよい。変種は、基準のヌクレオチド配列の相補体であってよい。変種は、基準のヌクレオチド配列又はその相補体に実質的に同一であるヌクレオチド配列であってもよい。変種は、ストリンジェントな条件下で、基準のヌクレオチド配列、その相補体、又はそれらに実質的に同一であるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列であってもよい。
【００７１】
核酸の長さは、１０から２５０ヌクレオチドであってよい。核酸の長さは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、又は２５０ヌクレオチドであってよい。核酸は、本明細書に記載する合成遺伝子を用いて、細胞中で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで）合成又は発現されてよい。核酸は、１本鎖分子として合成されてよく、実質的に相補的な核酸にハイブリダイズさせて２本鎖を形成してもよい。核酸は、１本鎖若しくは２本鎖の形態において細胞、組織、若しくは器官に導入されてよく、又は参照によって組み入れられる米国特許第６，５０６，５５９号に記載されているものを含めた、当業者にはよく知られている方法を用いて合成遺伝子によって発現されることも可能である。
【００７２】
核酸複合体
核酸は、以下：ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、抗体、抗体フラグメント、Ｆａｂフラグメント、及びアプタマーの１つ又は複数をさらに含むことができる。
【００７３】
プリｍｉＲＮＡ
核酸は、プリｍｉＲＮＡ又はその変種の配列を含むことができる。プリｍｉＲＮＡ配列は、４５〜３００００、５０〜２５０００、１００〜２００００、１０００〜１５００、又は８０〜１００ヌクレオチドを含むことができる。プリｍｉＲＮＡの配列は、本明細書に記載したプレｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡ＊、並びにそれらの変種を含むことができる。プリｍｉＲＮＡの配列は、配列番号１〜１１０の配列、又はその変種を含むことができる。
【００７４】
プリｍｉＲＮＡはヘアピン構造を形成することがある。ヘアピンは、実質的に相補的である第１の核酸配列及び第２の核酸配列を含んでいてよい。第１の核酸配列及び第２の核酸配列は３７〜５０ヌクレオチドを形成し得る。第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、８〜１２ヌクレオチドからの第３の配列によって隔てられることがある。ヘアピン構造は、その内容が本明細書に組み入れられるＨｏｆａｃｋｅｒら、Ｍｏｎａｔｓｈｅｆｔｅ  ｆ．Ｃｈｅｍｉｅ、１２５巻、１６７〜１８８頁（１９９４年）に記載されている、デフォルトパラメータを有するＶｉｅｎｎａアルゴリズムによって計算して−２５Ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ未満の自由エネルギーを有し得る。ヘアピンは、４〜２０、８〜１２、又は１０ヌクレオチドの末端ループを含んでいてよい。プリｍｉＲＮＡは、少なくとも１９％のアデノシンヌクレオチド、少なくとも１６％のシトシンヌクレオチド、少なくとも２３％のチミンヌクレオチド、及び少なくとも１９％のグアニンヌクレオチドを含んでいてよい。
【００７５】
プレｍｉＲＮＡ
核酸は、プレｍｉＲＮＡの配列又はその変種も含んでいてよい。プレｍｉＲＮＡ配列は、４５〜９０、６０〜８０、又は６０〜７０ヌクレオチドを含んでいてよい。プレｍｉＲＮＡの配列は、本明細書において記載するｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ＊を含んでいてよい。プレｍｉＲＮＡの配列は、プリｍｉＲＮＡの５’及び３’末端からの０〜１６０ヌクレオチドから除外したプリｍｉＲＮＡの配列であってもよい。プレｍｉＲＮＡの配列は、配列番号１〜１１０の配列、又はその変種を含んでいてよい。
【００７６】
ｍｉＲＮＡ
核酸は、ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ＊を含む）の配列又はその変種も含んでいてよい。ｍｉＲＮＡ配列は、１３〜３３、１８〜２４、又は２１〜２３ヌクレオチドを含んでいてよい。ｍｉＲＮＡは、また、合計、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチドを含んでいてよい。ｍｉＲＮＡの配列は、プレｍｉＲＮＡの最初の１３〜３３ヌクレオチドであってよい。ｍｉＲＮＡの配列は、プレｍｉＲＮＡの最後の１３〜３３ヌクレオチドであってもよい。ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号１〜２５、５１〜１１０の配列、又はその変種を含んでいてよい。
【００７７】
抗ｍｉＲＮＡ
核酸は、プリｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ＊に対する結合などによって（例えば、アンチセンス若しくはＲＮＡサイレンシング）、或いは標的の結合部位に結合することによってｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ＊の活性を阻止することができる抗ｍｉＲＮＡの配列も含んでいてよい。抗ｍｉＲＮＡは、合計５〜１００又は１０〜６０ヌクレオチドを含んでいてよい。抗ｍｉＲＮＡは、また、合計、少なくとも、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチドを含んでいてよい。抗ｍｉＲＮＡの配列は、（ａ）ｍｉＲＮＡの５’に実質的に同一若しくは相補的である少なくとも５ヌクレオチド、及びｍｉＲＮＡの５’末端から標的部位のフランキング領域に実質的に相補的である少なくとも５〜１２ヌクレオチド、又は（ｂ）ｍｉＲＮＡの３’に実質的に同一若しくは相補的である少なくとも５〜１２ヌクレオチド、及びｍｉＲＮＡの３’末端から標的部位のフランキング領域に実質的に相補的である少なくとも５ヌクレオチドを含んでいてよい。抗ｍｉＲＮＡの配列は、配列番号１〜１１０の相補体又はその変種を含んでいてよい。
【００７８】
標的の結合部位
核酸は、標的のマイクロＲＮＡ結合部位の配列又はその変種も含んでいてよい。標的部位の配列は、合計５〜１００又は１０〜６０ヌクレオチドを含んでいてよい。標的部位の配列はまた、合計、少なくとも、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、又は６３ヌクレオチドも含んでいてよい。標的部位の配列は、配列番号１〜１１０の配列の少なくとも５ヌクレオチドを含んでいてよい。
【００７９】
合成遺伝子
転写制御配列及び／又は翻訳制御配列に操作可能に連結している、本明細書に記載する核酸を含む合成遺伝子も提供する。合成遺伝子は、本明細書に記載する核酸に対する結合部位を有する標的遺伝子の発現を修飾することが可能であり得る。標的遺伝子の発現は、細胞、組織、又は器官において修飾されてよい。合成遺伝子は、標準の組換え技術によって、天然に存在する遺伝子から合成されてもよく、又は天然に存在する遺伝子に由来してもよい。合成遺伝子は、合成遺伝子配列の転写ユニットの３’末端の転写終結シグナルも含んでいてよい。合成遺伝子は、選択マーカーも含んでいてよい。
【００８０】
ベクター
本明細書に記載する合成遺伝子を含むベクターも提供する。ベクターは発現ベクターであってよい。発現ベクターはさらなるエレメントを含んでいてよい。例えば、発現ベクターは、発現のための１つの宿主細胞、並びにクローニング及び増幅のための第２の宿主細胞（例えば細菌）などの２つの生物体においてその維持を可能にする２つの複製系を有することができる。発現ベクターを組み入れるために、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムに相同である少なくとも１つの配列、及び発現構築物に隣接する好ましくは２つの相同の配列を含んでいてよい。組み込み型ベクターは、ベクターにおける包含に好適な相同の配列を選択することによって、宿主細胞における特定の遺伝子座を指示し得る。ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択マーカー遺伝子も含んでいてよい。
【００８１】
宿主細胞
本明細書に記載するベクター、合成遺伝子、又は核酸を含む宿主細胞も提供する。細胞は、細菌、真菌、植物、昆虫、又は動物の細胞であってよい。例えば、宿主細胞系は、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  ｌｉｎｅｓ）、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸部癌）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩの派生物）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター繊維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス繊維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウスミエローマ）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ細胞）、及び２９３（ヒト腎臓）であってよい。宿主細胞系は、商業サービスから、アメリカ培養細胞系統保存機関から、又は発表された文献から入手することができる。
【００８２】
プローブ
本明細書においてプローブを提供する。プローブは核酸を含んでいてよい。プローブの長さは、８から５００、１０から１００、又は２０から６０ヌクレオチドであってよい。プローブの長さは、また、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、又は３００ヌクレオチドであってよい。プローブは、１８〜２５ヌクレオチドの核酸を含んでいてよい。プローブは、１つ又は複数のタイプの化学結合によって、通常相補的な塩基対形成によって、通常水素結合の形成によって、標的の核酸の相補的な配列に結合することが可能であり得る。プローブは、完全な相補性を欠く標的の配列を、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブ配列と結合することができる。プローブは１本鎖であっても、又は部分的に１本鎖及び部分的に２本鎖であってもよい。プローブの鎖の数は、標的配列の構造、組成、及び性質によって指示される。プローブは、直接標識されていてもよく、又は間接的に標識されていてよい。
【００８３】
テストプローブ
プローブはテストプローブであってよい。テストプローブは、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、プレｍｉＲＮＡ、又はプリｍｉＲＮＡに対して相補的である核酸配列を含んでいてよい。テストプローブの配列は、配列番号１〜１１０又はそのフラグメントから選択されてよい。
【００８４】
リンカー配列
プローブはリンカーをさらに含んでいてよい。リンカーの長さは１０〜６０ヌクレオチドであってよい。リンカーの長さは２０〜２７ヌクレオチドであってよい。リンカーは、プローブを全長４５〜６０ヌクレオチドにするのに十分な長さであってよい。リンカーは、安定な２次構造を形成することができなくてもよく、それ自体の上にフォールディングすることができなくてもよく、又はプローブ中に含まれている核酸の非リンカー部分の上にフォールディングすることができなくてもよい。リンカーの配列は、プローブの非リンカー核酸がそれに由来する動物のゲノム中に出現しなくてもよい。
【００８５】
逆転写
ｃＤＮＡの標的配列は、標的ＲＮＡの逆転写によって産生されてよい。ｃＤＮＡを産生するための方法は、ポリアデニル化したＲＮＡ、又は代替的にアダプター配列をライゲーションしたＲＮＡの逆転写でよい。
【００８６】
ＲＮＡにライゲーションするアダプター配列を用いた逆転写
逆転写の前に、ＲＮＡをアダプター配列にライゲーションしてもよい。ライゲーション反応は、ＲＮＡの３’末端のアダプター配列にライゲーションするためのＴ４  ＲＮＡリガーゼによって行うことができる。次いで、アダプター配列の３’末端に相補的である配列を含むプライマーを用いて、逆転写（ＲＴ）反応を行うことができる。
【００８７】
ＲＮＡにライゲーションするポリアデニル化配列を用いた逆転写
ポリアデニル化ＲＮＡを、５’アダプター配列を含むポリ（Ｔ）プライマーを用いた逆転写（ＲＴ）反応において用いてもよい。
【００８８】
ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡの逆転写物を、標的の核酸及び５’テイル配列に相補的である少なくとも１５個の核酸を含む特異的なフォワードプライマー、アダプター配列の３’末端に相補的であるリバースプライマー、及び標的の核酸に相補的である少なくとも８個の核酸を含むプローブを用いてリアルタイムＰＣＲによって増幅してもよい。プローブは、アダプター配列の５’末端に部分的に相補的であってよい。
【００８９】
標的の核酸のＰＣＲ
標的の核酸を増幅する方法を本明細書に記載する。増幅はＰＣＲを含む方法によってもよい。ＰＣＲ反応の第１サイクルのアニーリング温度は、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、又は６０℃であってよい。第１サイクルは１〜１０サイクルを含むことができる。ＰＣＲ反応の残りのサイクルは６０℃であってよい。残りのサイクルは２〜４０サイクルを含むことができる。アニーリング温度により、より感度の高いＰＣＲがもたらされ得る。ＰＣＲにより、より高いストリンジェンシーのＰＣＲテンプレートとして働き得るより長い生成物が産生され得る。
【００９０】
フォワードプライマー
ＰＣＲ反応はフォワードプライマーを含んでいてよい。フォワードプライマーは、標的の核酸と同一である、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１ヌクレオチドを含んでいてよい。フォワードプライマーの３’末端は、標的の核酸と同胞の核酸の間の配列における相違に感受性であってよい。
【００９１】
フォワードプライマーは、５’オーバーハンギングテイル（ｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ  ｔａｉｌ）も含んでいてよい。５’テイルにより、フォワードプライマーの融解温度は上昇し得る。５’テイルの配列は、標的の核酸がそれから単離される動物のゲノムに同一ではない配列を含んでいてよい。５’テイルの配列は合成であってもよい。５’テイルは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６ヌクレオチドを含んでいてよい。
【００９２】
リバースプライマー
ＰＣＲ反応はリバースプライマーを含んでいてよい。リバースプライマーは、標的の核酸に相補的であり得る。リバースプライマーは、アダプター配列に相補的である配列も含んでいてよい。アダプター配列に相補的である配列は、１２〜２４ヌクレオチドを含んでいてよい。
【００９３】
バイオチップ
バイオチップも提供する。バイオチップは、付属のプローブ、又は本明細書に記載する複数のプローブを含む固体の基質を含んでいてよい。プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることが可能であり得る。プローブは、基質上の空間的に規定された所在に付着することができる。オーバーラッピング（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）プローブ、又は特定の標的配列の異なるセクションに対するプローブいずれかの、標的配列１つあたり１つを超えるプローブが用いられてよい。プローブは、当業者であれば理解される単一の障害に関連する標的配列にハイブリダイズすることが可能であり得る。プローブは、最初に合成され、引き続きバイオチップに付着させてもよく、又はバイオチップ上に直接合成されてもよい。
【００９４】
固体の基質は、プローブの付着又は会合に好適な別々の個々の部位を含むように修飾され得る材料であってよく、少なくとも１つの検出方法に適用できる材料であってよい。基質の代表例には、ガラス、並びに修飾され、又は機能化されたガラス、プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン及びスチレンの共重合体及び他の材料、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）Ｊなどを含む）、多糖、ナイロン又はニトロセルロース、樹脂、シリコン及び修飾シリコンを含むシリカ又はシリカベースの材料、カーボン、金属、無機ガラス及びプラスチックが含まれる。基質は、過度の蛍光なしに光学的検出を可能にする。
【００９５】
基質はプラナーであってよいが、他の形状の基質も用いることができる。例えば、フロースルーの試料分析では試料体積を最小にするために、チューブの内側表面上にプローブを配置してもよい。同様に、基質は、特定のプラスチックでできている独立気泡フォームを含めた軟質フォームなど、柔軟性であってよい。
【００９６】
バイオチップ及びプローブは、２つを引き続き付着するための化学官能基で誘導体化されていてよい。例えば、バイオチップは、それだけには限定されないが、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、又はチオール基を含めた化学官能基で誘導体化されていてよい。これらの官能基を用いて、プローブを、プローブ上の官能基を用いて、直接、又はリンカーを用いて間接的に付着させてもよい。プローブは、５’末端によって、３’末端によって、又は内部ヌクレオチドを介して、固体支持体に付着していてよい。
【００９７】
プローブは、固体支持体に非共有性に付着していてもよい。例えば、ビオチン化したオリゴヌクレオチドを作成することができ、これはストレプトアビジンで共有性にコーティングされている表面に結合し、付着をもたらすことがある。或いは、プローブは、光重合法及びフォトリソグラフィーなどの技術を用いて表面上に合成してもよい。
【００９８】
診断
診断方法も提供する。方法は、様々な発現レベルの、生物学的試料中の核酸に関連する子癇前症又は早産を検出することを含む。試料は女性患者に由来してよい。女性患者における子癇前症又は早産の診断により、予後及び治療戦略の選択が可能になり得る。当業者であれば、所見に基づき、診断、予後、又は予測を行うことができる。
【００９９】
キット
キットも提供し、キットは、本明細書に記載する核酸を、以下の任意のもの又は全てと一緒に含んでいてよい：アッセイ試薬、バッファー、プローブ及び／又はプライマー、並びに滅菌食塩水又は別の薬学的に許容される乳液及び懸濁液ベース。さらに、キットは、本明細書に記載する方法を行うための指示（例えば、プロトコール）を含む説明書を含んでいてよい。
【０１００】
例えば、キットは、標的の核酸配列を増幅、検出、同定、又は定量するためのキットであってよい。キットは、ポリ（Ｔ）プライマー、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブを含んでいてよい。
【０１０１】
本発明のいくつかの実施形態をより完全に説明するために、以下の実施例を示す。しかし、これらを、本発明の広い範囲を限定するものと決して解釈してはならない。
【実施例】
【０１０２】
（例１）
実験手順
１．試験母集団
第１試験群には、妊娠女性２０名が含まれ、このうち１０名が妊娠の第一期（妊娠週令６〜１２週）にあり、１０名が妊娠の第三期（妊娠週令３４〜４１週）にあり、また対照として年齢が一致した非妊娠女性から１０名が含まれた。本試験に要する適格性は、胎児の既知先天異常を伴わない正常で単純な単胎妊娠に限定された。全女性は同意書を提出し、現地の施設内治験審査委員会は、本試験を承認した。
【０１０３】
第２試験群には、自然分娩が始まる前に帝王切開術により出産した子癇前症の女性が含まれた。対照群には、妊娠に伴う高血圧疾患の臨床的エビデンス又は検査エビデンスを有さない、自然分娩開始前に帝王切開術により出産した女性が含まれた。自然陣痛の開始とは、定期的な痛みを伴う収縮、又は頚管拡張≧４ｃｍとして定義された。子癇前症は、妊娠週令２０週後に現れる血圧上昇（収縮期≧１４０ｍｍＨｇ、又は拡張期≧９０ｍｍＨｇ）、及び蛋白尿（≧３００ｍｇ／２４ｈ、又はディップスティックで≧１＋）に基づき定義された。重篤な子癇前症は、下記事項の１つを伴う子癇前症として定義された：収縮期血圧≧１６０ｍｍＨｇ、拡張期血圧≧１１０ｍｍＨｇ、蛋白尿≧５ｇ／２４ｈｒ、頭痛、視力障害又は持続性の上腹部痛、発作、乏尿、クレアチニンレベル上昇、血小板数＜１００，０００個／ｕＬ、肝酵素の上昇、溶血のエビデンス、又はローカルな出生時体重曲線による胎児発育制限の存在。除外基準には、多胎妊娠、慢性高血圧の女性、妊娠週令＜２４週、不確かな妊娠週令、又は絨毛羊膜炎の臨床的若しくは組織学的エビデンスが含まれた。第三試験群には、出産活動期（頚管拡張＞４ｃｍ、及び定期的な収縮）において、予定日前（妊娠週令＜３４週）に自然分娩を開始した女性、及び予定日に出産した女性（絨毛羊膜炎の疑いのある女性は除かれた）の対照群が含まれた。本試験の全ての女性は、帝王切開で出産した。全参加者は同意書を提出し、現地ＩＲＢ委員会は本試験を承認した。
【０１０４】
２．体液、胎盤、及び子宮筋層の採取
帝王切開を開始する前に、血液試料（クエン酸ナトリウムを含む試験管に５ｃｃ）を採取した。帝王切開術の際には、乳児出産後、胎盤を手作業で除去した。肉眼的に剥離又は梗塞のエビデンスを有さない部位の胎盤から、全層試料（それぞれ約１ｇ）を採取した。乳児を出産し、胎盤を除去した後、湾曲したメーヨー剪刀（Ｍａｙｏ  Ｓｃｉｓｓｏｒｓ）を用いて、全層子宮筋層試料、約５×５ｍｍを子宮横切開部の上縁から採取した。胎盤試料、及び子宮筋層試料の両方を、液体窒素中で速やかに凍結し、保管するために−７０℃の冷凍庫に移した。前回の試験では、陣痛の際、胎盤内の遺伝子発現プロファイルに劇的な変化が生ずることが判明したので、全試料は、陣痛開始前に、帝王切開術を受けた女性の胎盤から採取された。
【０１０５】
血清試料
血液８ｍｌを、それぞれの女性から血清収集チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ、ＶＡＣＵＥＴＴＥ（登録商標）血清チューブ４５５０７１）に、直接集めた。全血を、室温、１０分間、１８００ｇで遠心分離する前に、室温で約１時間放置した。得られた血清をエッペンドルフチューブに等分し、−８０℃で保管した。
【０１０６】
尿試料
各個人から尿約４ｍｌを尿容器内に収集した。この尿を、エッペンドルフチューブに等分し、ＲＮＡ抽出に用いるまで−８０℃で凍結保存した。
【０１０７】
３．ｍｉＲマイクロアレイプラットフォーム
６８８種のｍｉＲＮＡ［サンガーデータベース、第９．２版（ｍｉＲＢａｓｅ：マイクロＲＮＡ配列、標的物、及び遺伝子命名法。Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ  Ｓ、Ｇｒｏｃｏｃｋ  ＲＪ、ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ  Ｓ、Ｂａｔｅｍａｎ  Ａ、Ｅｎｒｉｇｈｔ  ＡＪ、ＮＡＲ、２００６年、第３４巻、データベース発行番号、Ｄ１４０〜Ｄ１４４）、及び追加のＲｏｓｅｔｔａ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ社により確認、予測されたｍｉＲ］に相当するＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブをプリントすることにより、特製のマイクロアレイを作製した。各プローブは、コーティングされたガラススライドにプローブを結合させるために用いられるアミン基に加え、ｍｉＲＮＡの相補配列の３’末端に、最長２２−ｎｔのリンカーを有する。各プローブ、２０μＭを２Ｘ  ＳＳＣ  ＋０．００３５％  ＳＤＳに溶解し、Ｓｃｈｏｔｔ  Ｎｅｘｔｅｒｉｏｎ（登録商標）スライドＥがコーティングされたマイクロアレイスライド上に、ＭｉｃｒｏＧｒｉｄメーカー指示書に従い、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（登録商標）ＢｉｏＲｏｂｏｔｉｃｓ  ＭｉｃｒｏＧｒｉｄ  ＩＩを用いて３重スポットした。異なるｍｉＲＮＡのセンス配列を用いて、６４の陰性対照プローブを設計した。２群の陽性対照プローブを設計して、ｍｉＲマイクロアレイにハイブリダイズさせた。標識化効率を確認するための、標識化を行う前に、合成スパイク低分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）をＲＮＡに添加し、十分量の低分子ＲＮＡ（例えば、低分子核ＲＮＡ（Ｕ４３、Ｕ４９、Ｕ２４、Ｚ３０、Ｕ６、Ｕ４８、Ｕ４４）、５．８ｓ及び５ｓリボソームＲＮＡ）に対する（２）プローブをアレイにスポットしてＲＮＡの品質を確認した。スライドを、５０ｍＭエタノールアミン、１Ｍトリス（ｐＨ９．０）、及び０．１％ＳＤＳを含む溶液中で、５０℃、２０分間、ブロックし、次いで水で良く洗い、遠心脱水した。
【０１０８】
４．ｍｉＲマイクロアレイのためのマイクロＲＮＡのＣｙ色素標識化
全ＲＮＡ、１．５〜３．５μｇを、Ｃｙ３又はＣｙ５を用いて３’末端にＲＮＡ−リンカー  ｐ−ｒＣｒＵ−Ｃｙ色素（Ｔｈｏｍｓｏｎら、２００４年、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １、４７〜５３頁）（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）をライゲーションさせることにより、標識化した。標識化反応物は、全ＲＮＡ、スパイク（２０〜０．１ｆｍｏｌ）、ＲＮＡ−リンカー−色素、５００ｎｇ、１５％ＤＭＳＯ、１×リガーゼバッファー、及びＴ４  ＲＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）、２０ユニットを含み、４℃、１時間、さらに３７℃、１時間放置した。ラベルされたＲＮＡを、３×ハイブリダイゼーションバッファー（Ａｍｂｉｏｎ）と混合し、９５℃で３分間過熱し、ｍｉＲマイクロアレイの上部に加えた。スライドを、１２〜１６ｈｒハイブリダイズさせ、次に１×ＳＳＣ及び０．２％ＳＤＳで２回洗浄し、０．１×ＳＳＣで最終洗浄した。
【０１０９】
このアレイを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ  Ｂｕｎｄｌｅ  Ｇ２５６５ＢＡ（解像度は、１００％パワーで１０μｍ）を用いてスキャンした。データを、ＳｐｏｔＲｅａｄｅｒソフトウェアを用いて分析した。
【０１１０】
５．ＲＮＡ抽出
ＲＮＡを、胎盤組織、及び子宮筋層に由来する凍結試料から抽出した。メーカーの指示書に従い、凍結組織由来の全ＲＮＡを、ｍｉＲｖａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出した。
【０１１１】
血清又は尿１００μｌを、０．６５ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ、（Ｓｉｇｍａ  Ｐ２３０８）と共に５６℃、１時間インキュベートした。酸性フェノール：クロロホルム抽出を行う前に、２種の合成ＲＮＡを、対照としてスパイクインし、次いでＲＮＡを、−２０℃でエタノール沈殿した。次に、残渣ＤＮＡ断片を除去するために、ＤＮａｓｅ処理を実施した。最後に、２回目の酸性フェノール：クロロホルム抽出を行った後に、ペレットをＤＤＷ中に再懸濁し、２種の追加の合成ＲＮＡを対照としてスパイクインした。
【０１１２】
６．ｍｉＲ  ｑＲＴ−ＰＣＲプラットフォーム
これまでに説明したように（Ｒｕｉ  Ｓｈｉ及びＶｉｎｃｅｎｔ  Ｌ．Ｃｈｉａｎｇ．リアルタイムＰＣＲにより、マイクロＲＮＡ発現を定量するための簡便な手段（Ｆａｃｉｌｅ  ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （２００５年）第３９巻：５１９〜５２５頁））、ＲＮＡについて、ポリアデニレーション反応を行った。端的には、ＲＮＡを、ｐｏｌｙ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）（Ｔａｋａｒａ−２１８０Ａ）、  ＰＮＫ  ｂｕｆｆｅｒ  （ＮＥＢ）  ＭｎＣｌ２、及びＡＴＰの存在下で、３７℃、１時間インキュンベートした。次いで、コンセンサス配列（逆プライマーに対して相補的）を有するオリゴｄＴプライマーを用いて、全ＲＮＡについて逆転写を行った。その際、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
【０１１３】
次に、リアルタイムＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅した；この反応には、マイクロＲＮＡ特異的な順方向プライマー、特定のマイクロＲＮＡ配列の３’末端側の８ｎｔ、並びにｐｏｌｙＡアダプターの１２ｎｔ、及びオリゴｄＴテイルの５’側の数塩基（２〜４塩基）に対して相補的なＴａｑＭａｎプローブ；及び、オリゴｄＴテイルの３’配列に対して相補的なユニバーサル逆方向プライマーが含まれた。
【０１１４】
（例２）
体液中のマイクロＲＮＡは、新規臨床バイオマーカーを代表する。
発明者らは、体液から細胞を含まないマイクロＲＮＡを抽出するためのプロトコールを開発した（例１を参照）。抽出したマイクロＲＮＡレベルの評価は、非常に高感度の独自のｑＲＴ−ＰＣＲ技法を用いて行った。ｑＲＴ−ＰＣＲ法は、成熟したマイクロＲＮＡ分子を特異的に検出し、１つのヌクレオチドによって異なる同属のマイクロＲＮＡファミリーメンバー間の識別を可能にする。このｑＲＴ−ＰＣＲ法の感度と特異性は、関連性のないＲＮＡバックグラウンドに存在するマイクロＲＮＡの数分子を検出する発明者らの能力により実証される。このように高感度であるため、細胞を含まない体液中に存在するわずかな量のマイクロＲＮＡをモニターするのに、このｑＲＴ−ＰＣＲ法を用いることができる。
【０１１５】
血清中のマイクロＲＮＡを、有用なバイオマーカーとするためには、臨床試料のルーチン処理を可能とするように、合理的な時間安定でなければならない。発明者らは、未凍結血清中の異なるマイクロＲＮＡの発現レベルは、室温で４時間実質的に変化せず、また試料を凍結、融解を２回行っても影響がないことを見出した（データは示さない）。したがって、血清中のマイクロＲＮＡは、臨床バイオマーカー候補として機能するのに十分に強固である。さらに、発明者らは、異なる健常者から採取された血清試料中において、これらのマイクロＲＮＡが、同様に発現していることを観察した。したがって、発明者らは、特定のわずかなマイクロＲＮＡについて生じている、個人間発現差異を、病態を明らかにするのに利用可能であろうと予測する。特に、発明者らの抽出法及びｑＲＴ−ＰＣＲ法を用い、発明者らは、マイクロＲＮＡが、尿、唾液、羊水、及び胸水等のその他の体液中にも存在することを立証した。
【０１１６】
最後に、概念実証として、発明者らは、循環マイクロＲＮＡを病態の識別に利用可能かどうか調査した。循環性妊婦ＲＮＡには、胎盤由来の胚性ＲＮＡを含むことが立証された。発明者らは、胎盤特異的マイクロＲＮＡの他、幅広く発現しているマイクロＲＮＡを含む、２８種のマイクロＲＮＡのレベルを測定した。
【０１１７】
第三期にある妊婦を非妊娠女性と比較したときの、マイクロＲＮＡレベルのメジアン倍率変化を、表１に詳記する。箱ヒゲ図は、非妊娠女性１０名、妊娠の第一期にある女性１０名、及び妊娠の第三期にある女性１０名の血清中の相対的マイクロＲＮＡ発現レベルを示している（図１Ａ）。ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａ（配列番号：７５）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−５２７（配列番号：５３）は、第三期にある妊婦の血清中で劇的に上方制御されており（６００倍以上）、その他数種のマイクロＲＮＡの発現レベルも、妊娠中に顕著に増加している（表１、及び図１Ａ）。胎盤由来マイクロＲＮＡの発現レベルは、妊娠週令と共に上昇している（図１Ａ）。特に、発明者らは、３種の胎盤由来マイクロＲＮＡ発現レベル（ｈｓａ−ｍｉＲ−５２６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２７、及びｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ｄ−５ｐ）が、妊娠女性と非妊娠女性を正確に区別するのに（図１Ｃ）、また妊娠の異なる段階を識別するのにさえも利用可能であることを見出した。
【０１１８】
発明者らは、体液内の細胞を含まないマイクロＲＮＡの抽出、及びその測定を可能にする非常に高感度な方法を開発した。本明細書において、発明者らは、マイクロＲＮＡが、確かに血清中に存在し、またその他の体液中にも存在することを立証する。発明者らは、血清中のマイクロＲＮＡレベルが個人間で一定であり、臨床試料のルーチン処理中においても安定であることを示す。重要なこととして、発明者らは、血清中のある種のマイクロＲＮＡは、異なる生理条件、具体的には妊娠中において、差次的に発現していることを実証する。したがって、循環マイクロＲＮＡは、強固で、感度があり、また容易に入手可能なバイオマーカーとしての有望な候補を代表する。
【０１１９】
【表１−１】
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【表１−２】
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【０１２０】
各マイクロＲＮＡについて、「デルタＣＴ」は、妊娠の第三期妊娠女性（ｎ＝１０）、及び非妊娠女性（ｎ＝１０）の血清間のメジアンＣＴの差異を表している。各試料について、マイクロＲＮＡの相対量は、非胎盤特異的マイクロＲＮＡの平均ＣＴを減じることにより、正規化された。倍率変化は、線形空間におけるメジアン存在量（ｍｅｄｉａｎ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ）の比であり、デルタＣＴの指数（基数２）に等しい。ｐ値は、対応のない両側ｔ検定より計算して求める。
【０１２１】
（例３）
重篤な子癇前症（ＰＥＴ）を有する女性、及び健康な女性から得られた、胎盤試料及び血清試料中のマイクロＲＮＡの差次的発現
女性患者全３３名を評価したが、このうち１５名が重篤なＰＥＴを有し、１８名が対照として機能した。ＰＥＴを有する患者由来の胎盤において、対照群と比較して、マイクロＲＮＡ発現プロファイルに有意な差異が見出された。
【０１２２】
図３〜６に示す通り、ｈｓａ−ｍｉＲ  ３１（配列番号：５）、ａｍｂｉ−ｍｉＲ−７５１０（配列番号：６）、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１０（配列番号：７）、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９３ｂ＊（配列番号：８）は、ＰＥＴを有する患者由来の胎盤において有意に下方制御されており、またｈｓａ−ｍｉｒ−６５２（配列番号：９）は、有意に上方制御されていることが判明した。
【０１２３】
重篤な子癇前症（ＰＥＴ）を有する女性、又は自然分娩が始まる前に帝王切開術を受けた対照健常女性から得られた血清試料について、４００種のマイクロＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。重篤な子癇前症（ＰＥＴ）を有する女性（ｙ軸）、及び健康な女性（ｘ軸）から得られた血清試料の平均マイクロＲＮＡ発現レベル（５０−Ｃｔ）を、図７〜９に示す。差次的に発現しているマイクロＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉＲ−１０ｂ  （配列番号：１０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８３（配列番号：１１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−７７０−５Ｐ（配列番号：１２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−２９ａ（配列番号：１３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０２ｃ＊（配列番号：１４）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４１１（配列番号：１５）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ（配列番号：１６）及びｈｓａ−ｍｉＲ−１２２ａ（配列番号：１７））は、丸印で示されている（ｔ検定  ｐ値＜０．０５）。
【０１２４】
これらの知見は、特定のマイクロＲＮＡは、ＰＥＴの病原論及び診断において重要な役割を演じうることを示唆している。
【０１２５】
（例４）
予定日前に自然分娩を開始した女性（ｓＰＴＬ）及び対照群から得られた、子宮筋層試料及び胎盤試料におけるマイクロＲＮＡの差次的発現
女性患者全１０名を評価したが、このうち５名が予定日前に自然分娩を開始し、５名が予定日出産し、対照として機能した。ｓＰＴＬの患者由来の胎盤及び子宮筋層において、対照群と比較して、マイクロＲＮＡ発現プロファイルに有意な差異が見出された。
【０１２６】
図１０に示す通り、ｈｓａ−ｍｉＲ  ２１０（配列番号：１８）及びｈｓａ−ｍｉＲ−２２３（配列番号：１９）は、ｓＰＴＬの女性から得られた子宮筋層試料において、対照群と比較して、差次的に発現している。
【０１２７】
図１１に示す通り、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９＊（配列番号：２０）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２１（配列番号：２１）、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１９ｂ（配列番号：２２）、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６８（配列番号：２３）、ｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ａ（配列番号：２４）、及びｈｓａ−ｍｉＲ−４２２ｂ（配列番号：２５）は、ｓＰＴＬの女性から得られた胎盤試料において、対照群と比較して、差次的に発現している。
【０１２８】
これらの知見は、特定のマイクロＲＮＡは、ｓＰＴＬの制御及び検出において重要な役割を演じうることを示唆している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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