(57)【要約】Ｍｃｌ−１タンパク質の発現を調節するために、Ｍｃｌ−１遺伝子に対するオリゴヌクレオチドが開発される。本組成物は、オリゴヌクレオチド、特に、Ｍｃｌ−１をコードする核酸を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。Ｍｃｌ−１発現の調節、およびＭｃｌ−１の過剰発現と関連している疾患の治療のためにこれらの化合物を使用する方法が提供される。このような疾患の例として、癌および全身性肥満細胞症が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類Ｍｃｌ−１遺伝子の発現をダウンレギュレートできる、１０〜３０ヌクレオチドの長さのオリゴマーであって、前記オリゴマーが、全部で１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、前記連続ヌクレオチド配列が、哺乳類Ｍｃｌ１遺伝子の逆相補体、例えば、Ｍｃｌ１  ｍＲＮＡ、例えば、配列番号１または配列番号７０またはその天然に存在する変異体の対応する領域に対して少なくとも９０％相同的であり、前記オリゴマーが、少なくとも１つのＬＮＡ単位を含むオリゴマー。
【請求項２】
連続ヌクレオチド配列が、ｉ）配列番号１１３もしくは７８、ｉｉ）配列番号１０９もしくは１６またはｉｉｉ）配列番号９５〜１１７もしくは配列番号２〜１８もしくは７７〜８２のいずれかに対応する領域に対して少なくとも９０％相同的である、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
連続ヌクレオチド配列が、配列番号１または７０の対応する領域の逆相補体とのミスマッチを含まず、または、１つもしくは２つのミスマッチしか含まない、請求項１または２に記載のオリゴマー。
【請求項４】
オリゴマーのヌクレオチド配列が、連続ヌクレオチド配列からなる、請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項５】
連続ヌクレオチド配列が、１０〜１８ヌクレオチドの長さである、請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項６】
連続ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド類似体を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項７】
ヌクレオチド類似体が、糖修飾されたヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群から選択される糖修飾されたヌクレオチドである、請求項６に記載のオリゴマー。
【請求項８】
ヌクレオチド類似体がＬＮＡである、請求項６に記載のオリゴマー。
【請求項９】
ギャップマーである、請求項６から８のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項１０】
Ｍｃｌ  １遺伝子またはｍＲＮＡを発現する細胞において、Ｍｃｌ１遺伝子またはｍＲＮＡの発現を阻害する、請求項１から９のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項１１】
【化１】
2011505798.tif 000022
［式中、大文字は、ＬＮＡヌクレオチド、例えば、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドを表し、小文字は、ＤＮＡモノマーを表し、下付文字「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を表し、ＭｅＣは、ＬＮＡシトシンヌクレオチド、例えば、ＬＮＡ５−メチルシトシンヌクレオチドを表す］
から選択される連続ヌクレオチド配列からなる、またはそれを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のオリゴマー。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のオリゴマーと、前記オリゴマーと共有結合している、少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項１２に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物。
【請求項１４】
癌もしくは肥満細胞症などの過剰増殖性障害または関節リウマチなどの炎症性疾患の治療のためなどの医薬として使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
癌もしくは肥満細胞症などの過剰増殖性障害または関節リウマチなどの炎症性疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のオリゴマーまたは請求項１１に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１６】
癌もしくは肥満細胞症などの過剰増殖性障害または関節リウマチなどの炎症性疾患を治療する方法であって、前記障害または疾患を患っているか、患う可能性が高い患者に、請求項１から１１のいずれか一項に記載のオリゴマー、またはそのコンジュゲートもしくは医薬品を有効量投与する工程を含む方法。
【請求項１７】
前記患者に、さらなる有効成分、例えば、シスプラチンなどのアルキル化剤、トリコスタチンＡなどのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびデキサメタゾンなどのグルココルチコイドからなる群から選択されるさらなる有効成分を含む医薬組成物を有効量投与する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｍｃｌ１を発現している細胞におけるＭｃｌ１の阻害方法であって、前記細胞に、請求項１から１０のいずれか一項に記載のオリゴマー、または請求項１１に記載のコンジュゲートを投与して、前記細胞においてＭｃｌ１を阻害する工程を含み、インビボまたはインビトロのいずれかで実施される方法。
【請求項１９】
Ｂｃｌ−２およびＭｃｌ−１を発現している細胞、例えば、癌細胞においてＢｃｌ−２およびＭｃｌ−１の両方の発現を同時に阻害する方法であって、
ａ．前記細胞に、Ｂｃｌ２阻害剤、例えば、Ｂｃｌ２を標的とするオリゴマーまたはそのコンジュゲートを有効量投与して、前記細胞においてＢｃｌ−２を阻害する工程と、
ｂ．前記細胞に、Ｍｃｌ１阻害剤、例えば、Ｍｃｌ１を標的とするオリゴマー、例えば、請求項１から１１のいずれか一項に記載のオリゴマーまたはそのコンジュゲートを有効量投与して、前記細胞においてＭｃｌ１を阻害する工程と
を含み、
工程ａ）およびｂ）は、いずれの順序で実施してもよく、または同時に実施してもよく、前記細胞におけるＭｃｌ−１およびＢｃｌ−２両方の阻害の同時阻害（ダウンレギュレーション）につながり、
インビボまたはインビトロのいずれかで実施される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｍｃｌ−１の発現を調節するための化合物、コンジュゲート、組成物および方法を提供する。特に、本発明は、細胞においてＭｃｌ−１  ｍＲＮＡを標的とし、Ｍｃｌ−１の発現の低下につながるオリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。Ｍｃｌ−１発現の低下は、さまざまな医学的障害、例えば、癌または肥満細胞症などの細胞増殖障害にとって有益である。
【０００２】
関連案件
本出願は、米国特許法第１１９条のもと、２００７年１２月７日に出願された米国仮出願番号ＵＳ６１／０１２１９１および２００８年９月１１日に出願されたＵＳ６１／０９５９５５の利益を主張し、それらの開示内容は両方とも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景
細胞運命の調節におけるＭｃｌ−１の役割のために、Ｍｃｌ−１は、アポトーシスおよび過剰増殖性疾患の多数の研究において注目される標的となっている。多数の報告によって、アポトーシスを増大させ、新生物性疾患を調節するためにＭｃｌ−１発現を阻害することの重要性が実証されている。Ｍｃｌ１  ｍＲＮＡは、プレｍＲＮＡの選択的スプライシングによって生じる２種の形態で存在し、長い方の遺伝子産物（アイソフォーム１）は、アポトーシスを阻害することによって細胞生存を増強するのに対し、選択的スプライシングによる短い方の遺伝子産物は、アポトーシスを促進する。
【０００４】
いくつかの研究で、正常細胞、癌細胞株または異種移殖腫瘍の、Ｍｃｌ−１発現を阻害し、アポトーシスを増大し、細胞生存力を低下させ、かつ／または腫瘍重量を低減するための、Ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡの使用が報告されている。Ｈｅｎｓｏｎら（（２００６）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｉ２（３）：８４５〜８５３頁）には、乳癌細胞株をアポトーシスに対して感作させるＭｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドが開示されている。Ｓｅｌｚｅｒら（（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓ（７２：８７７〜８８４頁）には、Ｍｃｌ−１をターゲッティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する、黒色腫細胞におけるＭｃｌ−１発現の阻害が開示されており、Ｓｋｖａｒａら（（２００５）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２５（４）：２６９７〜２７０３頁）には、ヒト黒色腫細胞を電離放射線誘導性アポトーシスに対して感作させるＭｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドが示されている。Ｓｉｅｇｈａｒｔら（（２００６）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．４４（１）：＼５＼−＼５１）では、Ｍｃｌ−１が、肝細胞癌腫細胞株において過剰発現されるという知見が論じられており、タンパク質発現を低減し、アポトーシスを増大し、細胞生存を低減させ、ＨＣＣ細胞を化学療法に対して感作させるＭｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドが開示されている。同様に、Ｓｏｎｇら（（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４（３）−．２６７〜２７６頁）には、ヒト肺癌細胞ではＭｃｌ−１が過剰発現され、Ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた治療は、アポトーシスの増大をもたらしたことが示されている。Ｍｃｌ−１阻害はまた、化学療法薬および放射線照射によって誘導されるアポトーシスに対する肺癌細胞の感作を引き起こした。
【０００５】
Ａｉｃｈｂｅｒｇｅｒら（（２００５）Ｂｌｏｏｄ  Ｊ０５（８Ｊ：３３０３−３０Ｕ）では、慢性骨髄性白血病細胞においてＭｃｌ−１の発現を阻害し、細胞生存力を低減した、Ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡを論じている。Ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＢＣＲ／ＡＢＬ阻害剤イマチニブと協力して、増殖停止を引き起こした。Ｄｅｒｅｎｎｅら（（２００２）Ｂｌｏｏｄ１００（ｌ）：＼９４−＼９９）およびＺｈａｎｇら（（２００２）Ｂｌｏｏｄ９９（６）：１および８５−ＩＳ９３）では、ＭｃＩ−Ｉ５の発現を低減し、細胞生存力を低減し、多発性骨髄腫細胞株および初代細胞のアポトーシスを増大するための、Ｍｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を論じている。
【０００６】
Ｍｃｌ−１はまた、Ｂ細胞、単球、マクロファージおよび多形核細胞をはじめとする種々の造血細胞株において発現の増大を示すことがわかっており、これらの細胞をＭｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理することは、標的発現を低減し、アポトーシスを増大させる（Ｍｉｃｈｅｌｓら（２００４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２３（２８）：４および１８−４８２７；Ｓｌｙら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉ７０（ｌ）：４３０−４３７；Ｌｉｕら（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４（２）：＼Ｕ−＼２６；Ｍｏｕｌｄｉｎｇら（２０００）Ｂｌｏｏｄ９６（５）＼＼１５６−１７’６３；およびＬｅｕｅｎｒｏｔｈ  ｅ／ｔｆ／．（２０００）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ６８：１５８−１６６）。
【０００７】
Ｔｈａｌｌｉｎｇｅｒら（（２００４）ＣＨｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０：４１８５−４１９１）には、肉腫異種移植片におけるＭｃｌ−１の発現を低減し、シクロホスファミドと併用される場合には、腫瘍重量を低減し、腫瘍細胞アポトーシスを増大させる、Ｍｃｌ−１を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドが開示されている。Ｔｈａｌｌｉｎｇｅｒら（（２００３）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２０（６）：１０８１−１０８６）には、ヒト黒色腫重症複合免疫不全マウス異種移植モデルにおいて、ダカルバジンとともに、または伴わずに、全身投与されたＭｃｌ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的タンパク質発現を低減し、アポトーシスを増大させ、腫瘍重量を低減したことが示されている。
【０００８】
ＵＳ５，４７０，９５５には、Ｍｃｌ−１ポリペプチドと特異的に結合する抗体およびＭｃｌ−１と関連している細胞増殖性障害、例えば、骨髄性細胞白血病を治療するためのそれらの使用が報告されている。ＵＳ５，４７０，９５５にはまた、約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーをはじめとする、Ｍｃｌ−１配列と相補的であり、Ｍｃｌ−１ポリペプチドの産生を阻害できるアンチセンスポリヌクレオチドも言及されている。
【０００９】
ＵＳ６，００１，９９２には、５核酸塩基２'−ＭＯＥウィングおよび１０ＤＮＡヌクレオチドの中心領域からなる、Ｍｃｌ−１をターゲッティングする２０アンチセンスギャップマーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが報告されている。細胞培養におけるＭｃｌ−１のダウンレギュレーションに対するオリゴマーの有効性は、１００ｎＭの投与量で２．６％〜６２．５％の間の範囲であった。５種のオリゴヌクレオチドが、処理された細胞においてＭｃｌ−１  ｍＲＮＡを少なくとも５０％ダウンレギュレートすることがわかった。
【００１０】
ＷＯ２００７／１０９１７４にはまた、５核酸塩基２'−ＭＯＥウィングおよび１０ＤＮＡヌクレオチドの中心領域からなる、Ｍｃｌ−１をターゲッティングするアンチセンスギャップマーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが報告されており、これらの一部は、ＵＳ６，００１，９９２に開示されたものと実質的に重複している。実験系は幾分異なっているようであるが、約８０オリゴヌクレオチドの分析によって、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡを少なくとも７０％阻害する１２種のオリゴヌクレオチドが同定されたが、これらのうちいくつかは、比較的有効でなかったオリゴヌクレオチドと重複している。
【００１１】
ＷＯ２００７／１４７６１３には、ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤およびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＭｃｌ１特異的ＲＮＡｉ構築物の薬剤組合せを用いた、骨髄異形成症候群、例えば、全身性肥満細胞症、リンパ腫および白血病ならびに固形腫瘍の治療方法が報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
例示的一態様では、本発明は、改善されたオリゴヌクレオチド、特に、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡを標的とするロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）化学に基づいたオリゴヌクレオチドを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概略
本発明は、全部で１０〜３０ヌクレオチドの連続（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）ヌクレオチド配列を含む、１０〜５０、例えば、１０〜３０ヌクレオチドの長さのオリゴマーを提供し、前記連続ヌクレオチド配列は、哺乳類Ｍｃｌ１遺伝子またはｍＲＮＡまたはその天然に存在する変異体の逆相補体（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に対応する領域と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）相同的（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）である。
【００１４】
本発明は、全部で１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、１０〜５０、例えば、１０〜３０ヌクレオチドの長さのオリゴマーを提供し、前記連続ヌクレオチド配列は、配列番号２〜１８、配列番号７７〜８２および配列番号９５〜１１７からなる群から選択される核酸配列と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）相同的である。
【００１５】
本発明は、本発明のオリゴマーと、前記オリゴマーと共有結合している、少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を提供する。
【００１６】
本発明は、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートは、医薬であり得る。本発明は、癌または肥満細胞症などの細胞増殖性障害の治療のためなどの医薬として使用するための本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートを提供する。
【００１８】
本発明は、癌または肥満細胞症などの細胞増殖性障害の治療のための医薬の製造のための、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートの使用を提供する。
【００１９】
本発明は、癌または肥満細胞症などの細胞増殖性障害を治療する方法であって、癌または肥満細胞症などの細胞増殖性障害を患っている、または患う可能性が高い患者に、本発明の（例えば、有効量の）オリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明は、ＭＣｌ１を発現している細胞においてＭｃｌ１を阻害する方法であって、前記細胞に、本発明の（例えば、有効量の）オリゴマーまたはコンジュゲートを投与して、前記細胞においてＭｃｌ１の阻害を実施する工程を含む方法を提供する。
【００２１】
いくつかの例示的実施形態では、オリゴマーは、少なくとも１つのＬＮＡ単位を含む。少なくとも１つのＬＮＡ単位は、連続ヌクレオチド配列内にあることが適している。
【００２２】
本発明は、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートと、さらなる有効成分と、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
本発明はさらに、医療において使用するための本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートを提供する。
【００２４】
本発明は、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートと、所望により、さらなる有効成分を含む医薬を提供する。医薬は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを適宜含む。
【００２５】
本発明はさらに、１種または複数の本明細書において言及される疾患、例えば、癌または肥満細胞症などの細胞過剰増殖性障害の治療のための医薬の製造のための本発明のオリゴマーの使用を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、１種または複数の本明細書において言及される疾患、例えば、癌または肥満細胞症などの細胞過剰増殖性障害の治療に使用するための本発明のオリゴマーを提供する。本発明はさらに、１種または複数の本明細書において言及される疾患の治療に使用するための本発明のオリゴマーを提供する。
【００２７】
本発明のオリゴマーを含む医薬組成物およびその他の組成物も提供される。前記細胞または組織においてＭｃｌ−１の発現をダウンレギュレートする方法であって、前記細胞または組織を、インビトロまたはインビボで、１種または複数の本発明のオリゴマー、コンジュゲートまたは組成物と接触させる工程を含む方法がさらに提供される。
【００２８】
前記動物またはヒトに、治療上または予防上有効な量の１種または複数の本発明のオリゴマー、コンジュゲートまたは組成物を投与することによって、Ｍｃｌ−１の発現または過剰発現と関連している疾患または状態を有することが疑われる、またはその傾向がある動物またはヒトを治療する方法も開示される。さらに、Ｍｃｌ−１の発現の阻害、およびＭｃｌ−１の活性と関連している疾患の治療にオリゴマーを使用する方法が提供される。
【００２９】
本発明は、患者において、癌などの細胞過剰増殖性疾患および関節リウマチなどの炎症性疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本発明のオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３０】
本発明は、患者において、細胞過剰増殖性疾患、例えば、骨髄異形成症候群、例えば、全身性肥満細胞症、リンパ腫および白血病ならびに固形腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本発明のオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３１】
本発明は、患者において、関節リウマチなどの炎症性疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本発明のオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３２】
本発明は、細胞または組織においてＭｃｌ−１の発現を阻害または低減する方法であって、前記細胞または組織を、本発明のオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物と接触させ、その結果、Ｍｃｌ−１の発現が阻害または低減される工程を含む方法を提供する。
【００３３】
本発明は、癌細胞などの細胞においてアポトーシスを引き起こす方法であって、前記細胞または組織を、本発明のオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物と接触させ、その結果、Ｍｃｌ−１の発現が阻害されるか、低減され、および／またはアポトーシスが引き起こされる工程を含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】定量的リアルタイムＰＣＲを使用して、トランスフェクトの２４時間後、１５ＰＣ３細胞において、１、５および２５ｎＭの濃度で、表３に提示されるオリゴヌクレオチドを、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡをノックダウンするその可能性について評価したことを示す図である。すべての結果は、ＧＡＰＤＨまたはβ−アクチンに対して正規化し、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡの阻害は、未処理対照（偽）のパーセントとして示されている。
【図２】カスパーゼ３／７活性として測定した、１、５および２５ｎＭの濃度で、トランスフェクトの２４および４８時間後、１５ＰＣ３細胞において、配列番号３６、４２、４７、５０、５５、５８、６１、６４および６６を、アポトーシスを誘導するその可能性について評価したことを示す図である。すべての結果は、未処理対照（偽）に対して正規化し、未処理対照に対する誘導倍数として示されている。
【図３】カスパーゼ３／７活性として測定した、１、５および２５ｎＭの濃度で、トランスフェクションの２４、４８および７２時間後、ＨＵＨ−７細胞において、配列番号３６、４２、４７、５０、５５、５８、６１、６４および６６を、アポトーシスを誘導するその可能性について評価したことを示す図である。すべての結果は、未処理対照（偽）に対して正規化し、未処理対照に対する誘導倍数として示されている。
【図４】本発明のオリゴマーによってターゲッティングされる、ヒトＭｃｌ−１  ｍＲＮＡの好ましい標的領域の位置を示す図である。１６マーの標的部位が示されているが、これらの標的領域は、示される領域の５'または３'に、さらなる４塩基を、すなわち、最大２４の連続ヌクレオチドの領域を、適宜、含み得る。
【図５】配列番号７０：ヒト骨髄系細胞白血病配列１（ＢＣＬ２関連）（ＭＣＬ１）、転写物変異体１、ｍＲＮＡを示す図である。受託番号ＮＭ＿０２１９６０。
【図６】配列番号１：ヒト骨髄系細胞白血病配列１（ＢＣＬ２関連）（ＭＣＬ１）、転写物変異体２、ｍＲＮＡ、受託番号ＮＭ＿１８２７６３を示す図である。
【図７】配列番号７１：ヒト骨髄系細胞白血病配列１（ＢＣＬ２関連）（ＭＣＬ１）、転写物変異体１、タンパク質を示す図である。
【図８】配列番号７２：ヒト骨髄系細胞白血病配列１（ＢＣＬ２関連）（ＭＣＬ１）、転写物変異体２、タンパク質を示す図である。
【図９】配列番号７３：マウスＭｃｌ−１  ｍＲＮＡ配列を示す図である。
【図１０】配列番号７４：マウスＭｃｌ−１タンパク質配列を示す図である。
【図１１】配列番号７５：アカゲザルＭｃｌ−１  ｍＲＮＡ配列を示す図である。
【図１２】配列番号７６：アカゲザルＭｃｌ−１タンパク質配列を示す図である。
【図１３】Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡの２種の選択的スプライシング変異体（配列番号１および配列番号７０）間のアラインメントを示す図である。配列番号１は、Ｍｃｌ−１の短いアポトーシス促進性アイソフォームのｍＲＮＡ配列である。配列番号７０は、Ｍｃｌ−１の長い抗アポトーシス性のアイソフォームのｍＲＮＡ配列である。
【図１４】１５ＰＣ３細胞における、抗Ｍｃｌ１オリゴマー（５μＭ）の援助のない取り込みからの、ＧＡＰＤＨに対して正規化されたＭｃｌ１  ｍＲＮＡのダウンレギュレーションを示す図である。
【図１５】配列番号５０および配列番号６４を、マウス肝臓組織においてインビボでＭｃｌ−１をダウンレギュレートするそれらの可能性について評価したことを示す図である。動物には、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水５ｍｇ／ｋｇを２週間の間、毎日投与した。最後の投与の２４時間後に、肝臓組織を、ＲＮＡ分析のために採取した。
【図１６】配列番号９０、配列番号９１および配列番号９２を、マウス肝臓組織においてインビボでＭｃｌ−１をダウンレギュレートするその可能性について評価したことを示す図である。動物には、１週間に２回、全部で７回の投与についてアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水１０ｍｇ／ｋｇを投与した。最後の投与の４８時間後に、肝臓組織をＲＮＡ分析のために採取した。
【図１７】１５ＰＣ３細胞において５μＭでの自然取り込みを使用して、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡをダウンレギュレートするその可能性について、表５に提示されている選択されたオリゴヌクレオチドを評価したことを示す図である。
【図１８】Ｎａｍａｌｗａ細胞において、５μＭでの９６時間のインキュベーション後に、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡをダウンレギュレートするその可能性について、表５に提示されている選択されたオリゴヌクレオチドを評価したことを示す図である。
【図１９】Ｎａｍａｌｗａ細胞において、５μＭでの０、２４、４８および９６時間のインキュベーション後に、カスパーゼ３／７活性を誘導するその可能性について、表５に提示されている選択されたオリゴヌクレオチドを評価したことを示す図である。
【図２０】５μＭの、表５に提示されている選択されたオリゴヌクレオチドとともに、０、２４、４８および９６時間インキュベーションした後のＮａｍａｌｗａ細胞の細胞生存力を、ＭＴＳアッセイによって測定したことを示す図である。
【図２１】Ｋ５６２細胞において５μＭで９６時間インキュベーションした後に、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡをダウンレギュレートするその可能性について、表５に提示されている選択されたオリゴヌクレオチドを評価したことを示す図である。
【図２２】Ｋ５６２細胞において、５μＭで０、２４、４８および９６時間インキュベーションした後に、カスパーゼ３／７活性を誘導するその可能性について、表５に提示されている選択されたオリゴヌクレオチドを評価したことを示す図である。
【図２３】５μＭの、表５に提示されている選択されたオリゴヌクレオチドとともに、０、２４、４８および９６時間インキュベーションした後の、Ｋ５６２細胞の細胞生存力を、ＭＴＳアッセイによって測定したことを示す図である。
【図２４】５μＭで７２時間インキュベーションした後に、また示された濃度のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤トリコスタチンＡとともに２４時間処理した後に、骨髄性白血病Ｋ５６２細胞において、カスパーゼ３／７活性を誘導するその可能性について、表５に提示されている選択されたオリゴヌクレオチドを評価したことを示す図である。
【図２５】５μＭで７２時間インキュベーションした後に、また示された濃度のアルキル化剤シスプラチンで２４時間処理した後に、骨髄性白血病Ｋ５６２細胞において、カスパーゼ３／７活性を誘導するその可能性について、表５に提示されている選択されたオリゴヌクレオチドを評価したことを示す図である。
【図２６】５μＭの表５に提示されている選択されたオリゴヌクレオチドとともに９６時間インキュベーションした後の、またグルココルチコイドデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｊｈｓａｏｎｅ）で４８時間処理した後のバーキットリンパ腫Ｎａｍａｌｗａ細胞の細胞生存力を示す図である。細胞生存力はＭＴＳアッセイによって測定した。
【図２７】５μＭで、９６時間インキュベーションした後に、また示された濃度のアルキル化剤シスプラチンで４８時間処理した後に、肝細胞癌腫ＨｅｐＧ２細胞において、カスパーゼ３／７活性を誘導するその可能性について、表５に提示されている選択されたオリゴヌクレオチドを評価したことを示す図である。
【図２８】自然取り込みを使用した、１５ＰＣ３細胞株における、Ｍｃｌ−１ターゲッティングオリゴ配列番号：６４および９１を、スクランブル対照オリゴまたはＢｃｌ−２ターゲッティングオリゴ配列番号１２８と組み合わせた場合の細胞生存力を示す図である。
【図２９】自然取り込みを使用した、１５ＰＣ３細胞株における、Ｍｃｌ−１ターゲッティングオリゴ配列番号：６４および９１を、スクランブル対照オリゴまたはＢｃｌ−２ターゲッティングオリゴ配列番号１２８と組み合わせた場合のカスパーゼ３／７誘導を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
オリゴマー
本発明は、哺乳類Ｍｃｌ１をコードする核酸分子、例えば、配列番号１または７０に示されるＭｃｌ１核酸および哺乳類Ｍｃｌ１をコードするこのような核酸分子の天然に存在する変異体の機能の調節において使用するためにオリゴマー化合物（本明細書において、オリゴマーと呼ばれる）を使用する。本発明との関連で、用語「オリゴマー」とは、２種以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）を指す。オリゴマーは、１０〜５０、例えば、１０〜３０ヌクレオチドの長さの連続ヌクレオチド配列からなる、またはそれを含む。本発明との関連で、用語「オリゴマー」とは、２種以上のヌクレオチドの共有結合によって形成される分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）を指す。本明細書において、本発明のオリゴマー中に存在するヌクレオチドなどの単一のヌクレオチドは各々、「モノマー」または「単位」と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、１０〜３０ヌクレオチドの長さの連続ヌクレオチド配列からなる、またはそれを含む（すなわち、１０〜３０の共有結合しているモノマーを含む、またはそれからなる）。
【００３６】
種々の実施形態では、本発明の化合物は、ＲＮＡ（単位）を含まない。本発明の化合物は、線状分子であるか、または線状分子として合成されることが好ましい。オリゴマーは、一本鎖分子であり、例えば、同一オリゴマー内の同等の領域と相補的である少なくとも３、４または５つの連続ヌクレオチドの短い領域（すなわち、二本鎖）を含まないことが好ましく、  この関連で、オリゴマーは、（本質的に）二本鎖ではない。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、本質的に、二本鎖ではない、例えば、ｓｉＲＮＡではない。種々の実施形態では、本発明のオリゴマーは、すべて連続ヌクレオチド領域からなり得る。したがって、オリゴマーは、実質的に自己相補的ではない。ｓｉＲＮＡは、例えば、通常、いずれかの末端に、２ｎｔの３’オーバーハングを含む２１から２３ｎｔ長の２つの相補的な短いＲＮＡ（または同等の核酸塩基単位）配列を含む。インビボ取り込みを増強するために、ｓｉＲＮＡをコンジュゲートしてもよく、例えば、コレステロール基などのステロールとコンジュゲートしてもよい（通常、鎖の一方または両方の３'または５'末端で）。
【００３７】
本発明はさらに、Ｍｃｌ１  ｍＲＮＡまたは遺伝子、またはその対立遺伝子変異体中の標的配列、特に、配列番号２〜１８、７７〜８２および９５〜１１７からなる群から選択される配列に対応するものを提供し、ここで、前記標的配列に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｍｃｌ１をダウンレギュレートできる。変異体配列は、Ｍｃｌ１中の標的配列に対して、少なくとも６０％、より好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の配列相同性を有し得る。通常、前記変異体配列に対応する本発明のオリゴマーは、依然として、Ｍｃｌ１をダウンレギュレートできる。
【００３８】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの特定の設計、例えば、配列番号１９〜３５、８３〜８８、３６〜６９、８９〜９４ｎおよび１１８〜１２７に示されるものも開示されている。本発明のオリゴマーは、Ｍｃｌ１  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の強力な阻害剤であると考えられる。
【００３９】
標的
本発明のオリゴマーは、Ｍｃｌ１遺伝子の発現をダウンレギュレートできることが適している。この関連で、本発明のオリゴマーは、一般に、哺乳類、例えば、ヒト細胞においてＭｃｌ１の阻害を達成できる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、標的核酸と結合し、正常な発現レベルと比較して、少なくとも１０％または２０％の発現の阻害を、より好ましくは、正常な発現レベルと比較して少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％阻害を達成する。いくつかの実施形態では、このような調節は、０．０４から２５ｎＭの間、例えば、０．８から２０ｎＭの間の濃度の本発明の化合物を使用する場合に見られる。同一のまたは異なる実施形態では、発現の阻害は、１００％未満、例えば、９８％未満の阻害、９５％未満の阻害、９０％未満の阻害、８０％未満の阻害、例えば、７０％未満の阻害である。発現レベルの調節は、タンパク質レベルを測定することによって、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、それに続く、標的タンパク質に対して作製された適した抗体を使用するウエスタンブロッティングなどの方法によって調べてもよい。あるいは、発現レベルの調節は、ノーザンブロッティングまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、ｍＲＮＡのレベルを測定することによって調べてもよい。ｍＲＮＡレベルを介して測定する場合には、適当な投与量、例えば、０．０４から２５ｎＭの間、例えば、０．８から２０ｎＭの間の濃度を使用する場合のダウンレギュレーションのレベルは、いくつかの実施形態では、通常、本発明の化合物の不在下の正常レベルの１０〜２０％の間のレベルまでである。
【００４０】
したがって、本発明は、Ｍｃｌ１タンパク質および／またはｍＲＮＡを発現している細胞において、Ｍｃｌ１タンパク質および／またはｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートまたは阻害する方法を提供し、前記方法は、前記細胞に、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートを投与して、前記細胞においてＭｃｌ１タンパク質および／またはｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートまたは阻害する工程を含む。通常、投与は、有効量の前記オリゴマーとして実施する。細胞は、いくつかの実施形態では、癌細胞であり得る。細胞は、いくつかの実施形態では、肥満細胞またはＣＤ３４＋肥満細胞前駆体細胞であり得る。細胞は、いくつかの実施形態では、Ｂ細胞などの免疫細胞であり得る。細胞は、ヒト細胞などの哺乳類細胞であることが適している。投与は、いくつかの実施形態では、インビトロで行うことができる。投与は、いくつかの実施形態では、インビボで行うことができる。
【００４１】
本明細書において、用語「標的核酸」とは、哺乳類Ｍｃｌ１ポリペプチド、例えば、ヒトＭｃｌ１、例えば、配列番号１または７０をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを指す。核酸またはその天然に存在する変異体およびそれに由来するＲＮＡ核酸、成熟ｍＲＮＡも好ましいが、好ましくは、プレｍＲＮＡなどのｍＲＮＡをコードするＭｃｌ１。「標的核酸」は、いくつかの実施形態では、例えば、研究または診断において使用される場合には、上記のＤＮＡまたはＲＮＡ核酸標的から導かれるｃＤＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドであり得る。本発明のオリゴマーは、標的核酸とハイブリダイズできることが好ましい。配列番号１および７０は、ｃＤＮＡ配列であり、したがって、ｃＤＮＡ配列中では、ウラシルがチミジンで置換されているものの、成熟Ｍｃｌ１  ｍＲＮＡ標的配列に対応しているということは認識されよう。
【００４２】
用語「その天然に存在する変異体」とは、規定の分類群、例えば、哺乳類、例えば、マウス、サル、好ましくは、ヒト内に天然に存在するＭｃｌ１ポリペプチドの核酸配列の変異体を指す。通常、ポリヌクレオチドの「天然に存在する変異体」に言及する場合には、この用語はまた、染色体転座または重複による、染色体Ｃｈｒ１：１４８．８１−１４８．８２Ｍｂに見られる、ゲノムＤＮＡをコードするＭｃｌ１のあらゆる対立遺伝子変異体およびＲＮＡ、例えば、それに由来するｍＲＮＡを包含し得る。「天然に存在する変異体」はまた、Ｍｃｌ１  ｍＲＮＡの選択的スプライシングに由来する変異体を含み得る。特異的ポリペプチド配列に言及される場合には、例えば、この用語はまた、したがって、同時修飾または翻訳後修飾、シグナルペプチド切断、タンパク質分解切断、グリコシル化などによってプロセシングされ得るタンパク質の天然に存在する形態を含み得る。
【００４３】
オリゴマー配列
オリゴマーは、配列番号１または７０中に存在するヌクレオチド配列の逆相補体に対応する連続ヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。したがって、いくつかの実施形態では、オリゴマーは、配列番号２〜１８、配列番号７７〜８２および配列番号９５〜１１７からなる群から選択される配列を含み得る、またはそれからなり得、ここで、前記オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、所望により、前記選択された配列に対して１、２または３つのミスマッチを有し得る。
【００４４】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、配列番号１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６および１２７またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチドの部分配列からなる群から選択される核酸塩基（塩基）の配列中に見られる連続ヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
【００４５】
オリゴマーは、哺乳類Ｍｃｌ１をコードする核酸の同等の領域（例えば、配列番号１または７０）に対して十分に相補的な（完全に相補的な）連続ヌクレオチド配列を含み得る、またはそれからなり得る。オリゴマーは、アンチセンスヌクレオチド配列を含み得る、またはそれからなり得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、標的配列とハイブリダイズする場合に、１、２または３つのミスマッチを許容し得、依然として、標的と十分に結合し、所望の効果、すなわち、標的のダウンレギュレーションを示す。ミスマッチは、例えば、オリゴマーヌクレオチド配列の長さの増大および／またはヌクレオチド配列内に存在するヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡの数の増大によって代償され得る。
【００４７】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、標的配列と、例えば、哺乳類Ｍｃｌ１をコードする核酸の対応する領域とハイブリダイズする場合に、３つ、例えば、２つのミスマッチしか含まない。
【００４８】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、標的配列と、例えば、哺乳類Ｍｃｌ１をコードする核酸の対応する領域とハイブリダイズする場合に、１つのミスマッチしか含まない。
【００４９】
本発明のオリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列は、配列番号２〜１８、配列番号７７〜８２および配列番号９５〜１１７からなる群から選択される対応する配列と少なくとも８０％相同的、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％相同的、少なくとも９７％相同的、少なくとも９８％相同的、少なくとも９９％相同的、例えば、１００％相同的（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）（同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ））であることが好ましい。
【００５０】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、配列番号１または７０中に存在する対応する配列の逆相補体と、少なくとも８０％相同的、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％相同的、少なくとも９７％相同的、少なくとも９８％相同的、少なくとも９９％相同的、例えば、１００％相同的（同一）であることが好ましい。
【００５１】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号１または７０中に存在する部分配列と少なくとも８０％相補的である、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％相補的、少なくとも９７％相補的、少なくとも９８％相補的、少なくとも９９％相補的、例えば、１００％相補的（完全に相補的）であることが好ましい。
【００５２】
いくつかの実施形態では、オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６および１１７または配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８、または配列番号  ７７、７８、７９、８０、８１および８２、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチドの部分配列からなる群から選択される配列の１種から選択される、または含み、ここで、前記オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、所望により、配列と比較した場合に、１、２または３つのミスマッチを含み得る。
【００５３】
いくつかの実施形態では、オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６および１２７またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチドの部分配列からなる群から選択される配列の１種から選択される、または含み、ここで、前記オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、所望により、前記配列と比較した場合に、１、２または３つのミスマッチを含み得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、部分配列は、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９の連続ヌクレオチド、例えば、１２〜２２の間、例えば、１２〜１８のヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、部分配列が、本発明のオリゴマーの連続ヌクレオチド配列と同じ長さであることが適している。
【００５５】
しかし、いくつかの実施形態では、オリゴマーのヌクレオチド配列は、標的配列と非相補的である、さらなる５'または３'ヌクレオチド、例えば、独立に、１、２、３、４または５つのさらなるヌクレオチド５'および／または３'を含み得るということが認識される。この点において、本発明のオリゴマーは、いくつかの実施形態では、さらなるヌクレオチドによって５'およびまたは３'にて隣接される（ｆｌａｎｋｅｄ）連続ヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、さらなる５'または３'ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、さらなる５'または３'ヌクレオチドは、本明細書においてギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）オリゴマーとの関連で呼ばれる領域Ｄに相当し得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列は、１０〜１６のヌクレオチドの配列を含む。１４、１５または１６ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列の例が、配列番号２〜１８に示されている。短い配列は、それらに由来し得る。長い配列は、すべて、または例示される配列番号のものに由来する少なくとも１０のヌクレオチドを含み得る。
【００５７】
少数のヌクレオチド、例えば、１０、１１、１２、１３、１４または１５を有するオリゴヌクレオチド配列は、したがって、配列番号２〜１８、配列番号７７〜８２および配列番号９５〜１１７からなる群から選択される配列中に見られる部分配列、例えば、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４または１５の連続ヌクレオチドに対応する連続ヌクレオチド配列を有し得る。したがって、短い配列はそれに由来し得る。長い配列は、例示される配列番号のもののすべてまたは少なくとも１０ヌクレオチドを含み得る。通常、オリゴヌクレオチドの配列のある割合（ａ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）のみが、配列番号２〜１８、配列番号７７〜８２および配列番号９５〜１１７から選択される配列番号を示す場合には、オリゴヌクレオチドの配列の残りの部分は、前記配列番号に隣接する（ｆｌａｎｋｉｎｇ）対応するヌクレオチドと相同的である。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、配列番号１１２、１１３および１１４または配列番号７７、７８および７９などのその部分配列からなる群から選択される配列を含み得る、またはそれからなり得、ここで、前記オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、所望により、前記選択された配列に対して１、２または３つのミスマッチを有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、配列番号１１３、１１４および１１５または配列番号７８、７９および８０などのその部分配列からなる群から選択される配列を含み得る、またはそれからなり得、ここで、前記オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、所望により、前記選択された配列に対して１、２または３つのミスマッチを有し得る。
【００５８】
本発明のオリゴマー（または連続ヌクレオチド配列）と、哺乳類Ｍｃｌ１またはその逆相補体をコードする核酸、例えば、本明細書に開示されるものの間の「相同性」を調べる場合には、相同性の決定は、本発明の化合物の対応するヌクレオチド配列と、哺乳類Ｍｃｌ１（または標的核酸）またはその逆相補体をコードする核酸の対応する領域を用いる簡単なアラインメントによって行ってもよく、相同性は、アラインする塩基の数を計数し、本発明の化合物中の連続ヌクレオチド総数で除し、１００を乗することによって決定する。このような比較では、ギャップが存在する場合には、このようなギャップは、ギャップ内のヌクレオチドの数が、本発明のヌクレオチド配列および標的核酸間で異なる領域というよりは、単にミスマッチであることが好ましい。
【００５９】
用語「に対応する」および「に対応している」とは、オリゴマーのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列（第１配列）と、ｉ）核酸標的、Ｍｃｌ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ、例えば、配列番号１または７０の逆相補体の部分配列、および／またはｉｉ）配列番号２〜１８、配列番号７７〜８２および配列番号９５〜１１７またはそれらの部分配列からなる群などの本明細書に提供されるヌクレオチドの配列のいずれかから選択されるさらなる配列の同等の連続ヌクレオチド配列間の比較を指す。ヌクレオチド類似体は、その同等の、または対応するヌクレオチドと直接比較される。ｉ）またはｉｉ）下のさらなる配列に対応する第１の配列は、通常、その配列と、第１の配列（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さにわたって同一であるか、または、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、対応する配列と少なくとも８０％相同的、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％相同的、少なくとも９８％相同的、少なくとも９９％相同的、例えば、１００％相同的（同一）であり得る。
【００６０】
用語「対応するヌクレオチド類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）」および「対応するヌクレオチド」は、ヌクレオチド類似体のヌクレオチドと、天然に存在するヌクレオチドは同一であるということを示すものとする。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボース単位が、アデニンと連結している場合には、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンと連結しているペントース単位（２−デオキシリボースとは異なる）を含む。
【００６１】
長さ
オリゴマーは、全部で１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の間の連続ヌクレオチドの長さの連続ヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、全部で１０〜２２、例えば、１２〜１８、例えば、１３〜１７または１２〜１６、例えば、１３、１４、１５、１６の間の連続ヌクレオチドの長さの連続ヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、全部で１０、１１、１２、１３または１４の連続ヌクレオチドの長さの連続ヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、２２以下のヌクレオチド、例えば、２０以下のヌクレオチド、例えば、１８以下のヌクレオチド、例えば、１５、１６または１７のヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、２０未満のヌクレオチドを含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、配列番号２、６、９、１０、１３、１４、１５、１６および／または１７、７７、７８、７９、８０、８１および８２またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチドの部分配列、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５または１６の連続ヌクレオチドからなる群から選択される配列の１種から選択される、または含み、ここで、前記オリゴマー（またはその連続ヌクレオチド部分）は、所望により、前記選択された配列に対して１、２または３つのミスマッチを含み得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、配列番号７８または１１３、例えば、配列番号９０または９１からなる群から選択される配列である、または対応する配列からなる、またはそれを含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、配列番号１６または１０９、例えば、配列番号６４からなる群から選択される配列であるか、または対応する配列からなる、またはそれを含む。
【００６８】
本明細書に示されるように、いくつかの例示的態様では、本発明のオリゴマー、例えば、配列番号６４、９１および９０は、自然取り込みを使用して種々の細胞株において、ならびにマウス肝臓組織において、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡの顕著なダウンレギュレーションを示す。ヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞株、ヒトバーキットリンパ腫癌Ｎａｍａｌｗａ細胞株およびヒト肝細胞癌腫ＨｅｐＧ２細胞株では、配列番号６４、９０および９１は、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡダウンレギュレーションの効力に従って、カスパーゼ３／７活性の誘導ならびに細胞生存力の低下を示す。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、（例えば、有効量で）取り込まれている細胞、例えば、癌細胞、例えば、本明細書において言及される（例えば、本明細書に開示されるカスパーゼアッセイにおいて）細胞株においてアポトーシスを誘導することができる。カスパーゼ活性を誘導するのにおいて有効であり得る、本発明者らが見い出したいくつかのオリゴマーとして、配列番号２、配列番号３６、配列番号７７、配列番号６６、配列番号１７および配列番号９２が挙げられる。さらなるこのようなオリゴマーは、実施例に例示されている。
【００６９】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、配列番号２、配列番号３６、配列番号３７および配列番号３８または前記配列中に存在する少なくとも１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続するヌクレオチドの連続する配列からなる群から選択される配列であるか、対応する配列からなり、またはそれを含み、ここで、オリゴマー中に存在するヌクレオチドは、対応するヌクレオチド類似体で置換されていてもよく、前記オリゴマーは、所望により、前記選択された配列に対して１、２または３つのミスマッチを含み得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２または前記配列中に存在する少なくとも１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続する（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ）ヌクレオチドの連続する（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）配列からなる群から選択される配列であるか、対応する配列からなり、またはそれを含み、オリゴマー中に存在するヌクレオチドは、対応するヌクレオチド類似体で置換されていてもよく、前記オリゴマーは、所望により、前記選択された配列に対して、１、２または３つのミスマッチを含み得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、例えば、カスパーゼアッセイによって決定されるように、アポトーシスを誘導しない場合がある。この関連で、アポトーシスは、細胞、例えば、癌細胞を効率的に死滅させるのに望ましいものであり得るが、いくつかの実施形態では、非標的細胞および組織に対する、より毒性の効果と負に関連している場合がある。したがって、治療される医療適応症に応じて、アポトーシスを引き起こすのに極めて有効であるオリゴヌクレオチドを選択することが有益である場合もあれば、おそらくは、医療適応症がすぐには命にかかわらない場合には、アポトーシスを引き起こすことにおいてそれほど強力ではないオリゴマーが適当である場合もある。
【００７２】
図２および３に示されるように、配列番号３６などのＬＮＡオリゴマーは、増殖細胞において、アポトーシスを引き起こすのにおいて著しく効果的であり、したがって、好ましいと考えられ得る。したがって、いくつかの実施形態では、連続ヌクレオチド配列またはその部分配列が、配列番号９５または２、例えば、オリゴマー３６、３７または３８内に見られる。このようなオリゴマーは、好ましくは、ＬＮＡ単位を含み得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号２または９５、例えば、配列番号３６、３７および３８の連続ヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチドの、例えば、１１、１２、１３、１４、１５または１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号３または９６、例えば、配列番号３９のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、１５または１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号４または９７、例えば、配列番号４０のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号５または９８のヌクレオチド配列、例えば、配列番号４１、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号６または９９、例えば、配列番号４２、４３および４４のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号７または１００、例えば、配列番号４５のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号８または１０１、例えば、配列番号４６のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号９または１０２、例えば、配列番号４７、４８および４９のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号１０または１０３、例えば、配列番号５０、５１および５２またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号１１または１０４、例えば、配列番号５３のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号１２または１０５、例えば、配列番号５４のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号１３または１０６、例えば、配列番号５５、５６および５７のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号１４または１０７、例えば、配列番号５８、５９および６０のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号１５または１０８、例えば、配列番号６１、６２および６３のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号１６または１０９、例えば、配列番号６４および６５のヌクレオチド配列またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号１７または１１０、例えば、配列番号６６、６７および６８のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号１８または１１１、例えば、配列番号６９のヌクレオチド配列、またはその少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドの部分配列からなる、またはそれを含む。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号７７または１１２のヌクレオチド配列、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドからなる、またはそれを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号７８または１１３のヌクレオチド配列、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドからなる、またはそれを含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号７９または１１４のヌクレオチド配列、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドからなる、またはそれを含む。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号８０または１１５のヌクレオチド配列、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドからなる、またはそれを含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号８１または１１６のヌクレオチド配列、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドからなる、またはそれを含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、配列番号８２または１１７のヌクレオチド配列、例えば、その１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６の連続ヌクレオチドからなる、またはそれを含む。
【００９６】
ヌクレオチド類似体
本明細書において、用語「ヌクレオチド」とは、糖部分、塩基部分および共有結合しているリン酸基を含むグリコシドを指し、天然に存在するヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは、ＤＮＡならびに本明細書においてまた、「ヌクレオチド類似体」と呼ばれる、修飾された糖および／または塩基部分を含む天然に存在しないヌクレオチドの両方をカバーする。
【００９７】
天然に存在しないヌクレオチドとして、修飾された糖部分、例えば、二環式ヌクレオチドまたは２'修飾ヌクレオチド、例えば、２'置換ヌクレオチドを有するヌクレオチドが挙げられる。
【００９８】
「ヌクレオチド類似体」は、糖および／または塩基部分の修飾による、天然ヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドの変異体である。類似体は、原則として、単に「サイレント」またはオリゴヌクレオチドの関連で天然ヌクレオチドと「同等」であり得る、すなわち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害するよう働く方法に対して機能的効果を有さない。このような「同等の」類似体は、例えば、製造するのがより容易もしくは費用がかからない、または貯蔵もしくは製造条件に対してより安定である、またはタグもしくは標識に相当する場合には、それでも有用であり得る。しかし、類似体は、例えば、標的に対する結合親和性の増大および／または細胞内ヌクレアーゼに対する耐性の増大および／または細胞への輸送の容易性の増大を引き起こすことによってオリゴマーが発現を阻害するよう働く方法に対して機能的効果を有することが好ましい。ヌクレオシド類似体の特定の例が、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ  ＆  Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９９７、２５、４４２９〜４４４３頁およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２０００、３（２）、２９３〜２１３頁およびスキーム１に記載されている：
【００９９】
【化１】
2011505798.tif 000002
【０１００】
したがって、オリゴマーは、単一の配列の天然に存在するヌクレオチド−好ましくは、２'−デオキシヌクレオチド（本明細書において通常、「ＤＮＡ」と呼ばれる）、また、場合により、リボヌクレオチド（本明細書において、通常「ＲＮＡ」と呼ばれる）またはこのような天然に存在するヌクレオチドと、１種または複数の天然に存在しないヌクレオチド、すなわち、ヌクレオチド類似体の組合せを含み得る、またはそれからなり得る。このようなヌクレオチド類似体は、適宜、標的配列に対するオリゴマーの親和性を増強し得る。
【０１０１】
適した、好ましいヌクレオチド類似体の例が、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２によって提供されているか、または本明細書において言及されている。
【０１０２】
オリゴマーへの親和性増強ヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡまたは２'−置換糖の組み込みによって、特異的に結合するオリゴマーの大きさを低減することが可能となり、また、非特異的結合または異常な結合が起こる前にオリゴマーの大きさの上限を低減することもできる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、少なくとも２つのヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、３〜８つのヌクレオチド類似体、例えば、６または７つのヌクレオチド類似体を含む。最も好ましい実施形態では、前記ヌクレオチド類似体のうち少なくとも１種は、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）であり、例えば、ヌクレオチド類似体のうち少なくとも３つまたは少なくとも４つ、または少なくとも５つまたは少なくとも６つまたは少なくとも７つまたは８つは、ＬＮＡであり得る。いくつかの実施形態では、すべてのヌクレオチド類似体は、ＬＮＡであり得る。
【０１０４】
好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチドのみからなるヌクレオチド配列に言及する場合には、その配列によって規定される本発明のオリゴマーは、オリゴマー／標的二本鎖の二本鎖安定性／Ｔｍを高める（すなわち、親和性増強ヌクレオチド類似体）、前記配列中に存在する１つまたは複数のヌクレオチドの代わりに対応するヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位またはその他のヌクレオチド類似体を含み得るということは認識されよう。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、オリゴマーのヌクレオチド配列と、標的配列間の任意のミスマッチは、親和性増強ヌクレオチド類似体の外側の領域、例えば、本明細書において称される領域Ｂ、および／または本明細書において称される領域Ｄ、および／またはオリゴヌクレオチド中のＤＮＡヌクレオチドなどの修飾されていない部位に、および／または連続ヌクレオチド配列の５'または３'である領域中に見られることが好ましい。
【０１０６】
ヌクレオチドのこのような修飾の例として、糖部分を、２'−置換基を提供するよう、結合親和性を増強し、ヌクレアーゼ耐性の増大も提供し得る架橋した（ロックド核酸）構造を生じるよう修飾することが挙げられる。
【０１０７】
好ましいヌクレオチド類似体として、ＬＮＡ、例えば、オキシ−ＬＮＡ（例えば、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）および／またはアミノ−ＬＮＡ（例えば、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ）および／またはチオ−ＬＮＡ（例えば、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−チオ−ＬＮＡ）および／またはＥＮＡ（例えば、β−Ｄ−ＥＮＡおよびα−Ｌ−ＥＮＡ）がある。β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡが最も好ましい。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー内（例えば、本明細書に記載される領域ＡおよびＣ中）に存在するヌクレオチド類似体は、例えば、２'−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２'−アミノ−ＤＮＡ単位、２'−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、２'−フルオロ−ＡＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ（インターカレート核酸−参照によって本明細書に組み込まれる、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、２００２年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２００２  ３０：４９１８〜４９２５頁）単位および２’ＭＯＥ単位から独立に選択される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列中に存在する、上記の種類のヌクレオチド類似体のうち１種のみがある。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体は、２'−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２'ＭＯＥ）、２'−フルオロ−ＤＮＡモノマーまたはＬＮＡヌクレオチド類似体であり、したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、これら３種の類似体から独立に選択されるヌクレオチド類似体を含み得るか、または３種類から選択される１種類のみの類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、前記ヌクレオチド類似体のうち少なくとも１種は、２'−ＭＯＥ−ＲＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の２'−ＭＯＥ−ＲＮＡヌクレオチド単位である。いくつかの実施形態では、前記ヌクレオチド類似体のうち少なくとも１種は、２'−フルオロＤＮＡ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の２'−フルオロ−ＤＮＡヌクレオチド単位である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、少なくとも１つのロックド核酸（ＬＮＡ）単位、例えば、１、２、３、４、５、６、７もしくは８のＬＮＡ単位、例えば、３〜７または４〜８の間のＬＮＡ単位、または３、４、５、６もしくは７のＬＮＡ単位を含む。いくつかの実施形態では、すべてのヌクレオチド類似体は、ＬＮＡである。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡと、以下のＬＮＡ単位のうち１種または複数の両方を含み得る：チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡおよび／またはβ−Ｄまたはα−Ｌ立体配置いずれかまたはそれらの組合せのＥＮＡ。いくつかの実施形態では、すべてのＬＮＡシトシン単位は、５'メチル−シトシンである。本発明のいくつかの実施形態では、オリゴマーは、ＬＮＡおよびＤＮＡ単位の両方を含み得る。組み合わせた全部のＬＮＡおよびＤＮＡ単位は、１０〜２５であることが好ましく、１０〜２０が好ましく、１２〜１６がさらにより好ましい。本発明のいくつかの実施形態では、オリゴマーのヌクレオチド配列、例えば、連続ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＬＮＡからなり、残りのヌクレオチド単位は、ＤＮＡ単位である。いくつかの実施形態では、オリゴマーは、ＬＮＡヌクレオチド類似体および天然に存在するヌクレオチド（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ、最も好ましくは、ＤＮＡヌクレオチド）のみを、所望により、ホスホロチオエートなどの修飾されたヌクレオチド間結合とともに含む。
【０１１１】
用語「核酸塩基」とは、ヌクレオチドの塩基部分を指し、天然に存在する変異体、ならびに（ａ  ｗｅｌｌ  ａｓ）、天然に存在しない変異体の両方をカバーする。したがって、「核酸塩基」は、既知プリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環式類似体およびその互変異性体もカバーする。
【０１１２】
核酸塩基の例として、それだけには限らないが、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンが挙げられる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、オリゴマー中に存在する核酸塩基のうち少なくとも１つは、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンからなる群から選択される修飾された核酸塩基である。
【０１１４】
いくつかの態様では、天然に存在するか、天然に存在しないのいずれかであり得るヌクレオチドを指すために、用語核酸塩基を使用してもよく、−この点において、用語核酸塩基およびヌクレオチドは、本明細書において、いくつかの実施形態では、同義的に使用されるということは認識されるべきである。
【０１１５】
ＬＮＡ
用語「ＬＮＡ」とは、「ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）」として知られる二環式ヌクレオチド類似体を指す。ＬＮＡモノマー指す場合もあり、または「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」との関連で使用される場合には、１つまたは複数のこのような二環式ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを指す。
【０１１６】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物において使用されるＬＮＡは、一般式Ｉの構造
【０１１７】
【化２】
2011505798.tif 000003
［式中、Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（ＲＮ＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−から選択され；
Ｂは、水素、所望により置換されていてもよいＣ１−４−アルコキシ、所望により置換されていてもよいＣ１−４−アルキル、所望により置換されていてもよいＣ１−４−アシルオキシ、核酸塩基、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され；
Ｐは、モノマーの周囲のヌクレオチド間結合または５’−末端基に対する基の位置を指定し、このようなヌクレオチド間結合または５’−末端基は、所望により、置換基Ｒ５または同等に適用可能な置換基Ｒ５＊を含み；
Ｐ＊は、先のモノマーとのヌクレオチド間結合または３’末端基を指定し、
Ｒ４＊およびＲ２＊は、一緒になって、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−および＞Ｃ＝Ｚから選択される１〜４個の基／原子からなるビラジカルを指定し、
ここで、Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｒａ）−から選択され、ＲａおよびＲｂは各々独立に、水素、所望により置換されていてもよいＣ１−１２−アルキル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルケニル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、所望により置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは、一緒になって、所望により置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を指定し、存在する置換基Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊、Ｒ６およびＲ６＊の各々は、水素、所望により置換されていてもよいＣ１−１２−アルキル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルケニル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから独立に選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、所望により置換されていてもよく、２つのジェミナル置換基は、一緒になって、オキソ、チオキソ、イミノまたは所望により置換されていてもよいメチレンを指定してもよく、または一緒になって、所望により、−Ｏ−、−Ｓ−および−（ＮＲＮ）−（ここで、ＲＮは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される）から選択される１個または複数のヘテロ原子／基によって中断および／または終結されていてもよい１〜５個の炭素原子アルキレン鎖からなるスピロビラジカルを形成してもよく、ここで、２個の隣接する（ａｄｊａｃｅｎｔ）（非ジェミナル）置換基は、二重結合をもたらすさらなる結合を指定してもよく、ＲＮ＊は、存在し、ビラジカルに含まれない場合には、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される］およびその塩基性塩および酸付加塩を有する。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、Ｒ５＊は、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３および−ＣＨ＝ＣＨ２から選択される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、Ｒ４＊およびＲ２＊は、一緒になって、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｃ（ＲｅＲｆ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｃ（ＲｅＲｆ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｎ（Ｒｅ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−および−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｓ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｓ−から選択されるビラジカルを指定し、ここで、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、ＲｅおよびＲｆは、各々独立に、水素、所望により置換されていてもよいＣ１−１２−アルキル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルケニル、所望により置換されていてもよいＣ２−１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−１２−アルコキシ、Ｃ２−１２−アルコキシアルキル、Ｃ２−１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１−１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ−およびジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、所望により置換されていてもよく、２個のジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは、一緒になって、所望により置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を指定してもよい。
【０１２０】
さらなる一実施形態では、Ｒ４＊およびＲ２＊は、一緒になって、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−、−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−Ｏ−から選択されるビラジカル（二価の基）を指定する。
【０１２１】
すべてのキラル中心について、ＲまたはＳ配向のいずれかで不斉基が見られ得る。
【０１２２】
本発明のオリゴマー中に使用されるＬＮＡは、次式のいずれかに従う少なくとも１つのＬＮＡ単位を含むことが好ましい
【０１２３】
【化３】
2011505798.tif 000004
［式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−、−ＮＨ−またはＮ（ＲＨ）であり；ＺおよびＺ＊は、独立に、ヌクレオチド間結合、末端基または保護基の間から選択され；Ｂは、天然または非天然ヌクレオチド塩基部分を構成し、ＲＨは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される］。
【０１２４】
特に好ましいＬＮＡ単位は、スキーム２に示されている。
【０１２５】
【化４−１】
2011505798.tif 000005
【化４−２】
2011505798.tif 000006
【０１２６】
用語「チオ−ＬＮＡ」は、上記の一般式中のＹが、Ｓまたは−ＣＨ２−Ｓ−から選択されるロックドヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ−立体配置の両方であり得る。
【０１２７】
用語「アミノ−ＬＮＡ」は、上記の一般式中のＹが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−および−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−（ここで、Ｒは、水素およびＣ１−４−アルキルから選択される）から選択されるロックドヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ−立体配置の両方であり得る。
【０１２８】
用語「オキシ−ＬＮＡ」は、上記の一般式中のＹが、−Ｏ−または−ＣＨ２−Ｏ−を表すロックドヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、β−Ｄおよびα−Ｌ−立体配置の両方であり得る。
【０１２９】
用語「ＥＮＡ」は、上記の一般式中のＹが、−ＣＨ２−Ｏ−（ここで、−ＣＨ２−Ｏの酸素原子は、塩基Ｂに対して２’位と結合している）であるロックドヌクレオチドを含む。
【０１３０】
好ましい実施形態では、ＬＮＡは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびβ−Ｄ−チオ−ＬＮＡから選択され、特に、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【０１３１】
ＲＮアーゼ動員（ＲＮＡｓｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）
オリゴマー化合物は、標的ｍＲＮＡの非ＲＮアーゼ媒介性分解によって、例えば、翻訳の立体障害またはその他の方法によって機能し得るが、好ましい本発明のオリゴマーは、エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、例えば、ＲＮアーゼＨを動員できるということが認識される。
【０１３２】
オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列は、相補的標的ＲＮＡと二本鎖で形成される場合には、ＲＮアーゼを動員できる、少なくとも６、例えば、少なくとも７の連続するヌクレオチド単位、例えば、少なくとも８または少なくとも９の連続するヌクレオチド単位（残基）、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６の連続するヌクレオチドの領域を含むことが好ましい。ＲＮアーゼを動員できる連続する配列は、本明細書において記載されるギャップマーとの関連で言及される領域Ｂであり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮアーゼを動員できる連続する配列、例えば、領域Ｂの大きさは、より大きいもの、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチド単位であり得る。
【０１３３】
ＥＰ１２２２３０９は、ＲＮアーゼＨ活性を測定するインビトロ法を提供し、これを使用して、ＲＮアーゼＨを動員する能力を調べてもよい。オリゴマーは、相補的なＲＮＡ標的とともに提供される場合に、ＥＰ１２２２３０９の実施例９１〜９５によって提供される方法論を使用して、２’置換を含まない、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチド間のホスホロチオエート連結基を含む、同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドの、少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％または２０％未満の、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定される初速度を有する場合に、ＲＮアーゼＨを動員できると判断される。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、相補的なＲＮＡ標的、およびＲＮアーゼＨとともに提供される場合に、ＥＰ１２２２３０９の実施例９１〜９５によって提供される方法論を使用して、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定されるＲＮアーゼＨ初速度が、２’置換を含まない、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチド間のホスホロチオエート連結基を含む、同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて測定される初速度の１％未満、例えば、５％未満、例えば、１０％未満または２０％未満である場合に、本質的にＲＮアーゼＨを動員できないと判断される。
【０１３５】
その他の実施形態では、オリゴマーは、相補的なＲＮＡ標的、およびＲＮアーゼＨとともに提供される場合に、ＥＰ１２２２３０９の実施例９１〜９５によって提供される方法論を使用して、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定されるＲＮアーゼＨ初速度が、２’置換を含まない、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチド間のホスホロチオエート連結基を含む、同等のＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて測定される初速度の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも８０％である場合に、ＲＮアーゼＨを動員できると判断される。
【０１３６】
通常、相補的な標的ＲＮＡとともに二本鎖で形成される場合に、ＲＮアーゼを動員できる、連続するヌクレオチド単位を形成するオリゴマーの領域は、ＲＮＡ標的とともにＤＮＡ／ＲＮＡ様二本鎖を形成するヌクレオチド単位からなり、α−Ｌ立体配置である、ＤＮＡ単位およびＬＮＡ単位の両方を含み、α−Ｌ−オキシＬＮＡが特に好ましい。
【０１３７】
本発明のオリゴマーは、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含み得、ギャップマー、ヘッドマー（ｈｅａｄｍｅｒ）またはミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）の形態であり得る。
【０１３８】
ヘッドマーは、５’末端の非ＲＮアーゼ動員ヌクレオチド類似体の連続するストレッチと、それに続く、３’末端に向かって、ＲＮアーゼによって認識および切断可能な、ＤＮＡまたは修飾されたヌクレオチド単位の連続するストレッチ（例えば、少なくとも７のこのようなヌクレオチド）によって定義され、テイルマー（ｔａｉｌｍｅｒ）は、５’末端でＲＮアーゼによって認識および切断可能な、ＤＮＡまたは修飾されたヌクレオチドの連続するストレッチ（例えば、少なくとも７のこのようなヌクレオチド）と、それに続く、３’末端に向かう非ＲＮアーゼ動員ヌクレオチド類似体の連続するストレッチによって定義される。ＲＮアーゼおよび非ＲＮアーゼ動員ヌクレオチド類似体によって認識および切断可能な、ＤＮＡまたは修飾されたヌクレオチドの代替組成物からなる本発明のその他のキメラは、ミックスマーと呼ばれる。いくつかのヌクレオチド類似体はまた、ＲＮアーゼＨ結合および切断を媒介できる場合もある。α−Ｌ−ＬＮＡは、ＲＮアーゼＨ活性を特定の程度に動員するので、ギャップマー構築物に対して、ＲＮアーゼＨによって認識および切断可能な、ＤＮＡまたは修飾されたヌクレオチドのより小さいギャップが必要とされ得るほど、ミックスマー構築においてより大きい適応性が導入され得る。
【０１３９】
ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）設計
本発明のオリゴマーは、ギャップマーであることが好ましい。ギャップマーオリゴマーは、本明細書において、領域Ｂと呼ばれる、ＲＮアーゼ、例えば、ＲＮアーゼＨを動員できるヌクレオチドの連続するストレッチを含むオリゴマー、例えば、少なくとも６または７のＤＮＡヌクレオチドの領域であり、ここで、領域Ｂは、親和性増強ヌクレオチド類似体の領域、例えば、ＲＮアーゼを動員できるヌクレオチドの連続する（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）ストレッチの５’および３’の１〜６の間のヌクレオチド類似体によって５’および３’の両側に隣接される（ｆｌａｎｋｅｄ）−これらの領域は、それぞれ、領域ＡおよびＣと呼ばれる。
【０１４０】
ギャップマーは、式（５’から３’）、Ａ−Ｂ−Ｃ、または所望により、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤまたはＤ−Ａ−Ｂ−Ｃの（ポリ）ヌクレオチド配列を含むことが好ましく、ここで、領域Ａ（５’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、１〜６の間のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位からなり、またはそれを含み；領域Ｂは、ＲＮアーゼを動員できる、少なくとも５つの連続するヌクレオチド（相補的なＲＮＡ分子、例えば、ｍＲＮＡ標的と二本鎖で形成される場合に）、例えば、ＤＮＡヌクレオチドからなり、またはそれを含み；領域Ｃ（３’領域）は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば、少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、１〜６の間のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位からなり、またはそれを含み；領域Ｄは、存在する場合には、１、２または３のヌクレオチド単位、例えば、ＤＮＡヌクレオチドからなる、またはそれを含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、領域Ａは、１、２、３、４、５または６つのヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位、例えば、２〜５のヌクレオチド類似体、例えば、２〜５のＬＮＡ単位、例えば、３または４のヌクレオチド類似体、例えば、３または４のＬＮＡ単位からなり；および／または領域Ｃは、１、２、３、４、５または６つのヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位、例えば、２〜５の間のヌクレオチド類似体、例えば、２〜５のＬＮＡ単位、例えば、３または４のヌクレオチド類似体、例えば、３または４のＬＮＡ単位からなる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、Ｂは、ＲＮアーゼを動員できる、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の連続するヌクレオチド、またはＲＮアーゼを動員できる、６〜１０の間、または７〜９の間、例えば、８の連続するヌクレオチドからなる、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、領域Ｂは、少なくとも１つのＤＮＡヌクレオチド単位、例えば、１〜１２のＤＮＡ単位、好ましくは、４〜１２のＤＮＡ単位、より好ましくは、６〜１０のＤＮＡ単位、例えば、７〜１０のＤＮＡ単位、最も好ましくは、８、９または１０のＤＮＡ単位からなる、またはそれを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、領域Ａは、３または４のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡからなり、領域Ｂは、７、８、９または１０のＤＮＡ単位からなり、領域Ｃは、３または４のヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡからなる。このような設計として、（Ａ−Ｂ−Ｃ）３−１０−３、３−１０−４、４−１０−３、３−９−３、３−９−４、４−９−３、３−８−３、３−８−４、４−８−３、３−７−３、３−７−４、４−７−３が挙げられ、さらに、１または２のヌクレオチド単位、例えば、ＤＮＡ単位を有し得る領域Ｄを含み得る。
【０１４４】
さらなるギャップマー設計は、ＷＯ２００４／０４６１６０に開示されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
参照により本明細書に組み込まれる、米国仮出願第６０／９７７４０９号では、いくつかの実施形態では、本発明のギャップマーオリゴマーであり得る「ショートマー」ギャップマーオリゴマーに言及している。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、オリゴマーは、全部で１０、１１、１２、１３または１４のヌクレオチド単位の連続ヌクレオチド配列からなり、ここで、連続ヌクレオチド配列は、式（５’−３’）、Ａ−Ｂ−Ｃ、または所望により、Ａ−Ｂ−Ｃ−ＤまたはＤ−Ａ−Ｂ−Ｃのものであり；ここで、Ａは、１、２または３のヌクレオチド類似体単位、例えば、ＬＮＡ単位からなり；Ｂは、相補的なＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ標的）と二本鎖で形成される場合に、ＲＮアーゼを動員できる、７、８または９の連続ヌクレオチド単位からなり；Ｃは、１、２または３のヌクレオチド類似体単位、例えば、ＬＮＡ単位からなる。存在する場合には、Ｄは、単一のＤＮＡ単位からなる。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、Ａは、１つのＬＮＡ単位からなる。いくつかの実施形態では、Ａは、２つのＬＮＡ単位からなる。いくつかの実施形態では、Ａは、３つのＬＮＡ単位からなる。いくつかの実施形態では、Ｃは、１つのＬＮＡ単位からなる。いくつかの実施形態では、Ｃは、２つのＬＮＡ単位からなる。いくつかの実施形態では、Ｃは、３つのＬＮＡ単位からなる。いくつかの実施形態では、Ｂは、７つのヌクレオチド単位からなる。いくつかの実施形態では、Ｂは、８つのヌクレオチド単位からなる。いくつかの実施形態では、Ｂは、９つのヌクレオチド単位からなる。いくつかの実施形態では、Ｂは、１〜９の間のＤＮＡ単位、例えば、２、３、４、５、６、７または８つのＤＮＡ単位を含んでなる。いくつかの実施形態では、Ｂは、ＤＮＡ単位からなる。いくつかの実施形態では、Ｂは、α−Ｌ立体配置にある、少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば、α−Ｌ−立体配置にある２、３、４、５、６、７、８または９つのＬＮＡ単位を含んでなる。いくつかの実施形態では、Ｂは、少なくとも１つのα−Ｌ−オキシＬＮＡ単位を含んでなるか、または、ここで、α−Ｌ−立体配置にあるすべてのＬＮＡ単位は、α−Ｌ−オキシＬＮＡ単位である。いくつかの実施形態では、Ａ−Ｂ−Ｃ中に存在するヌクレオチドの数は、以下からなる群から選択される（ヌクレオチド類似体単位−領域Ｂ−ヌクレオチド類似体単位）：１−８−１、１−８−２、２−８−１、２−８−２、３−８−３、２−８−３、３−８−２、４−８−１、４−８−２、１−８−４、２−８−４、または；１−９−１、１−９−２、２−９−１、２−９−２、２−９−３、３−９−２、１−９−３、３−９−１、４−９−１、１−９−４、または１−１０−１、１−１０−２、２−１０−１、２−１０−２、１−１０−３、３−１０−１。いくつかの実施形態では、Ａ−Ｂ−Ｃ中のヌクレオチドの数は、以下からなる群から選択される：２−７−１、１−７−２、２−７−２、３−７−３、２−７−３、３−７−２、３−７−４および４−７−３。いくつかの実施形態では、ＡおよびＣの両方とも、各々２つのＬＮＡ単位からなり、Ｂは、８または９のヌクレオチド単位、好ましくは、ＤＮＡ単位からなる。
【０１４８】
ヌクレオチド間結合
用語「結合基」または「ヌクレオチド間結合」は、２つのヌクレオチド、２つのヌクレオチド類似体およびヌクレオチドとヌクレオチド類似体などを共有結合によって一緒に結合できる基を意味するものとする。特定の、好ましい例として、リン酸基およびホスホロチオエート基が挙げられる。
【０１４９】
本発明のオリゴマーのヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、結合基を介して一緒に結合している。各ヌクレオチドは、結合基を介して３’隣接（ａｄｊａｃｅｎｔ）ヌクレオチドと連結していることが適している。
【０１５０】
適したヌクレオチド間結合として、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２内に列挙されたもの、例えば、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２の３４頁の第１段落に列挙されたヌクレオチド間結合が挙げられる（参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド間結合を、その正常なホスホジエステルから、ヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性であるもの、例えば、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートへ修飾することが好ましく、これらの２種は、ＲＮアーゼＨによって切断可能であり、また、標的遺伝子の発現の低減におけるアンチセンス阻害の経路を可能にする。
【０１５２】
本明細書において提供される、適切な硫黄（Ｓ）含有ヌクレオチド間結合が好ましいものであり得る。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合はまた、特に、ギャップマーのギャップ領域（Ｂ）にとって好ましい。ホスホロチオエート結合は、隣接（ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域（ＡおよびＣ、また、必要に応じて、ＡもしくはＣとＤを連結するために、また領域Ｄ内で）に使用され得る。
【０１５３】
しかし、領域Ａ、ＢおよびＣは、特に、例えば、ヌクレオチド類似体の使用が、領域ＡおよびＣ内のヌクレオチド間結合を、エンドヌクレアーゼ分解から保護する場合に−例えば、領域ＡおよびＣが、ＬＮＡヌクレオチドを含む場合には、ホスホロチオエート以外のヌクレオチド間結合、例えば、ホスホジエステル結合を含み得る。
【０１５４】
オリゴマー中のヌクレオチド間結合は、標的とされたＲＮＡのＲＮアーゼＨ切断を可能にするような、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートであり得る。ヌクレアーゼ耐性の改善およびその他の理由、例えば、製造が容易であることのために、ホスホロチオエートが好ましい。
【０１５５】
本発明のオリゴマーの一態様では、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート基によって互いに連結されている。
【０１５６】
ホスホジエステル結合、例えば、１または２つの結合を、特に、ヌクレオチド類似体単位間またはそれに隣接する（通常、領域ＡおよびまたはＣ中）、そうではないホスホロチオエートオリゴマーに含めることは、オリゴマーのバイオアベイラビリティおよび／または体内分布を改変し得るということは認識される−参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０５３３１４を参照されたい。
【０１５７】
いくつかの実施形態、例えば、上記で言及される実施形態では、適しており、具体的に示されない場合には、すべての残りの結合基は、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートのいずれか、またはそれらの混合物である。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、すべてのヌクレオチド間結合基は、ホスホロチオエートである。特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列、例えば、本明細書に提供されるものに言及する場合には、種々の実施形態では、結合が、ホスホロチオエート結合である場合には、代替結合、例えば、本明細書に開示されるものを使用してもよい、例えば、特に、ヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ単位間の結合には、リン酸（ホスホジエステル）結合を使用してもよいということは理解されるであろう。同様に、特定のギャップマーオリゴヌクレオチド配列、例えば、本明細書に提供されるものに言及する場合に、Ｃ残基が５’メチル修飾されたシトシンとして注釈をつけられる場合には、種々の実施形態では、オリゴマー中に存在する１つまたは複数のＣは、修飾されていないＣ残基であり得る。
【０１５９】
オリゴマー化合物
本発明のオリゴマーは、いくつかの例示的実施形態では、配列番号１９〜３５および３６〜６９、８９〜９４および１１８〜１２７からなる群から選択され得る。
【０１６０】
コンジュゲート
文脈では、用語「コンジュゲート」は、本明細書に記載されるオリゴマーと、１つまたは複数の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の共有結合（「コンジュゲーション」）によって形成される異種分子を示すものとする。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例として、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーなどの高分子物質またはそれらの組合せが挙げられる。通常、タンパク質は、標的タンパク質に対する抗体であり得る。通常のポリマーは、ポリエチレングリコールであり得る。
【０１６１】
したがって、種々の実施形態では、本発明のオリゴマーは、通常、ヌクレオチドの連続する配列からなるポリヌクレオチド領域と、さらなる非ヌクレオチド領域の両方を含み得る。連続ヌクレオチド配列からなる本発明のオリゴマーに言及する場合には、化合物は、非ヌクレオチド化合物、例えば、コンジュゲート成分を含み得る。
【０１６２】
本発明の種々の実施形態では、オリゴマー化合物は、例えば、オリゴマー化合物の細胞取り込みを増大するために使用してもよいリガンド／コンジュゲートと連結している。ＷＯ２００７／０３１０９１は、適したリガンドおよびコンジュゲートを提供し、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
本発明はまた、本明細書に記載される本発明の化合物と、前記化合物と共有結合している、少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とを含むコンジュゲートを提供する。したがって、種々の実施形態では、本発明の化合物が、本明細書に開示される、特定の核酸またはヌクレオチド配列からなる場合には、化合物はまた、前記化合物と共有結合している、少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（例えば、１つまたは複数ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まない）を含み得る。
【０１６４】
コンジュゲーション（コンジュゲート部分との）は、本発明のオリゴマーの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強し得る。このような部分として、それだけには限らないが、抗体、ポリペプチド、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。
【０１６５】
本発明のオリゴマーはまた、活性な薬剤物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌薬または抗生物質とコンジュゲートされてもよい。
【０１６６】
特定の実施形態では、コンジュゲートされる部分は、コレステロールなどのステロールである。
【０１６７】
種々の実施形態では、コンジュゲートされる部分は、例えば、１〜５０、例えば、２〜２０、例えば、３〜１０個の間の長さのアミノ酸残基の正電荷を有するペプチド、および／またはポリアルキレンオキシド、例えば、ポリエチルグリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールなどの正電荷を有するポリマーを含む、またはそれからなる−参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０３４１２３を参照されたい。適切には、ポリアルキレンオキシドなどの正電荷を有するポリマーは、ＷＯ２００８／０３４１２３に記載される遊離可能なリンカー（ｉｎｋｅｒ）などのリンカーを介して本発明のオリゴマーと結合され得る。
【０１６８】
例として、本発明のコンジュゲートにおいて以下のコンジュゲート部分を使用してもよい：
【０１６９】
【化５】
2011505798.tif 000007
【０１７０】
活性化オリゴマー
本明細書において、用語「活性化オリゴマー」とは、オリゴマーと１または複数のコンジュゲートされる部分、すなわち、それ自体は核酸またはモノマーではなく、本明細書に記載されるコンジュゲートを形成する部分の共有結合を可能にする、少なくとも１つの官能基と共有結合している（すなわち、官能化されている）本発明のオリゴマーを指す。通常、官能部分は、例えば、３’−ヒドロキシル基またはアデニン塩基の環外ＮＨ２基、好ましくは、親水性であるスペーサーおよびコンジュゲートされる部分（例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基）と結合できる末端基を介して、オリゴマーと共有結合できる化学基を含む。いくつかの実施形態では、この末端基は保護されていない、例えば、ＮＨ２基である。その他の実施形態では、末端基は、例えば、任意の適した保護基、例えば、Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ  ＧｒｅｅｎｅおよびＰｅｔｅｒ  Ｇ  Ｍ  Ｗｕｔｓ、第３版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９９年）による「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」に記載されるものによって保護されている。適したヒドロキシル保護基の例として、酢酸エステルなどのエステル、ベンジル、ジフェニルメチルまたはトリフェニルメチルおよびテトラヒドロピラニルなどのアラルキル基が挙げられる。適したアミノ保護基の例として、ベンジル、α−メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニルおよびトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルなどのアシル基が挙げられる。いくつかの実施形態では、官能部分は、自己切断性である。その他の実施形態では、官能部分は、生分解性である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８７，２２９号参照されたい。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーは、コンジュゲートされる部分と、オリゴマーの５’末端の共有結合を可能にするよう、５’末端で官能化される。その他の実施形態では、本発明のオリゴマーは、３’末端で官能化されてもよい。さらにその他の実施形態では、本発明のオリゴマーは、主鎖に沿って、または複素環式塩基部分に官能化されてもよい。さらにその他の実施形態では、本発明のオリゴマーは、５’末端、３’末端、主鎖および塩基から独立に選択される２以上の位置で官能化されてもよい。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本発明の活性化オリゴマーは、合成の間に、官能部分と共有結合している１個または複数のモノマーを組み込むことによって合成される。その他の実施形態では、本発明の活性化されたオリゴマーは、官能化されていないモノマーを用いて合成され、合成の完了時に、オリゴマーを、官能化される。いくつかの実施形態では、アミノアルキルリンカーを含有するヒンダードエステルを用いてオリゴマーは官能化され、ここで、アルキル部分は、式（ＣＨ２）ｗを有し、ｗは、１〜１０の範囲、好ましくは、約６の整数であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖であっても、分枝鎖であってもよく、官能基は、エステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗＮＨ）を介してオリゴマーと結合している。
【０１７３】
その他の実施形態では、（ＣＨ２）ｗ−スルフヒドリル（ＳＨ）リンカーを含有するヒンダードエステルを用いて、オリゴマーは官能化され、ここで、ｗは、１〜１０の範囲、好ましくは、約６の整数であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は、直鎖であっても、分枝鎖であってもよく、官能基は、エステル基（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗＳＨ）を介してオリゴマーと結合している。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドは、ポリエチレングリコールまたはペプチドなどのポリマー部分と（ジスルフィド結合の形成によって）コンジュゲートされる。
【０１７５】
上記のようなヒンダードエステルを含有する活性化オリゴマーは、当技術分野で公知の任意の方法によって、特に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００８／０３４１２２およびその実施例に開示される方法によって合成してもよい。
【０１７６】
さらにその他の実施形態では、本発明のオリゴマーは、実質的に、米国特許第４，９６２，０２９号および同４，９１４，２１０号に記載される官能化試薬、すなわち、保護された、もしくは保護されていないスルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を含む、親水性スペーサー鎖によって、反対側の末端と連結している一方の末端にホスホルアミダイトを有する、実質的に直鎖の試薬によって、オリゴマーに、スルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を導入することによって官能化される。このような試薬は、主にオリゴマーのヒドロキシル基と反応する。いくつかの実施形態では、このような活性化オリゴマーは、オリゴマーの５’−ヒドロキシル基と結合している官能化試薬を有する。その他の実施形態では、活性化オリゴマーは、３’−ヒドロキシル基と結合している官能化試薬を有する。さらにその他の実施形態では、本発明の活性化オリゴマーは、オリゴマーの主鎖上のヒドロキシル基と結合している官能化試薬を有する。なおさらなる実施形態では、本発明のオリゴマーは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９６２，０２９号および同４，９１４，２１０号に記載される２種以上の官能化試薬を用いて官能化される。このような官能化試薬を合成する、モノマーまたはオリゴマーに組み込む方法は、米国特許第４，９６２，０２９号および同４，９１４，２１０号に開示されている。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、オリゴマーと結合している固相の５’末端が、ジエニルホスホルアミダイト誘導体を用いて官能化され、ディールス−アルダー環化付加反応による脱保護されたオリゴマーの、例えば、アミノ酸またはペプチドとのコンジュゲーションが続く。
【０１７８】
種々の実施形態では、２’糖修飾、例えば、２’−カルバメート置換糖または２’−（Ｏ−ペンチル−Ｎ−フタリミド）−デオキシリボース糖を含有するモノマーの、オリゴマーへの組み込みが、コンジュゲートされる部分の、オリゴマーの糖との共有結合を容易にする。その他の実施形態では、例えば、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（ｅ−フタリミジルアミノペンチル）−２’−デオキシアデノシン−３’−−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエトキシホスホルアミダイトなどの試薬を用いて、１個または複数のモノマーの２’−位にアミノ含有リンカーを含むオリゴマーを調製する。例えば、Ｍａｎｏｈａｒａｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９１，３４，７１７１参照されたい。
【０１７９】
なおさらなる実施形態では、本発明のオリゴマーは、Ｎ６プリンアミノ基上、グアニンの環外Ｎ２上、またはシトシンのＮ４もしくは５位上をはじめとする核酸塩基上にアミン含有官能部分を有し得る。種々の実施形態では、このような官能化は、オリゴマー合成においてすでに官能化されている市販の試薬を使用して達成してもよい。
【０１８０】
いくつかの官能部分は、市販されており、例えば、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性連結部分は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．  （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）から入手できる。その他の市販の連結基として、５’−アミノ−モディファイヤーＣ６および３’−アミノ−モディファイヤー試薬があり、両方とも、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖａ．）から入手できる。５’−アミノ−モディファイヤーＣ６はまた、ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）からＡｍｉｎｏｌｉｎｋ−２として入手でき、３’−アミノ−モディファイヤーはまた、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）から入手できる。いくつかの実施形態ではいくつかの実施形態ではいくつかの実施形態ではいくつかの実施形態では。
【０１８１】
組成物
本発明のオリゴマーは、医薬製剤および組成物において使用してもよい。適切には、このような組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２は、適した、好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントを提供し、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２には、適した投与量、製剤、投与経路、組成物、剤形、その他の治療薬との組合せ、プロドラッグ製剤も提供されており、これらも参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８２】
適用
本発明のオリゴマーは、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として利用してもよい。
【０１８３】
研究では、このようなオリゴマーを、細胞および実験動物において、Ｍｃｌ−１タンパク質の合成を特異的に阻害し、それによって、標的の機能分析または治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を容易にするために（通常、ｍＲＮＡを分解または阻害し、それによってタンパク質形成を妨げることによって）使用してよい。
【０１８４】
診断では、オリゴマーを、ノーザンブロッティング、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは同様の技術によって、細胞および組織におけるＭｃｌ−１発現を検出および定量化するために使用してもよい。
【０１８５】
治療では、Ｍｃｌ−１の発現を調節することによって治療できる、疾患または障害を有することが疑われる動物またはヒトを、本発明によるアンチセンス化合物を投与することによって治療する。本明細書において言及されるもの、またはＭｃｌ−１の発現と関連しているものなどの疾患障害または状態を有することが疑われる、またはそれらを起こしやすいマウスもしくはラットなどの動物、またはヒトを、治療上または予防上有効な量の１種または複数の本発明のオリゴマー、コンジュゲートまたは組成物を投与することによって治療する方法がさらに提供される。
【０１８６】
本発明の医薬組成物は、状態、疾患または障害、例えば、本明細書に言及されるものまたはＭｃｌ−１の異常なレベルの発現と関連しているものの治療のために使用できる。
【０１８７】
疾患または障害は、細胞（過剰）増殖性障害、例えば、癌または肥満細胞症からなる群から選択され得る。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、癌は、白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、黒色腫、多発性骨髄腫、肝細胞癌腫および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）からなる群から選択され得る。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、疾患は、炎症性疾患、例えば、関節リウマチである。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、疾患は、骨髄異形成症候群、例えば、全身性肥満細胞症、リンパ腫および白血病ならびに固形腫瘍であり得る。
【０１９１】
本発明はさらに、１種または複数の本明細書において言及される疾患を治療するための医薬の製造のための本発明のオリゴマーの使用を提供する。
【０１９２】
適した投与量、製剤、投与経路、組成物、剤形、その他の治療薬との組合せ、プロドラッグ製剤もまた、ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２において提供され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９３】
本発明はまた、化合物または本明細書に記載されるコンジュゲートまたはコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２には、適した、好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントが提供されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９４】
２種以上の有効成分を含む（すなわち、さらなる治療薬または治療を含む）医薬組成物
本発明の医薬組成物は、その他の有効成分、例えば、過剰増殖性疾患および癌、例えば、本明細書において言及されるものの治療にとって有用であると示されているものをさらに含み得る。
【０１９５】
さらなる有効成分（さらなる治療薬とも呼ばれる）は、例えば、以下のうち１種または複数から選択され得る（さらなる有効成分の、Ｍｃｌ−１ターゲッティングアンチセンスオリゴマーとの組合せの利益を示す参照される参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる）：
ＰＫＣ４１２、ＡＭ１０７および／またはイマチニブ（Ｂｌｏｏｄ．  ２００７年４月１日；１０９（７）：３０３１〜４１頁）
・シクロホスファミド（Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００４年６月１５日；１０（１２  Ｐｔ  １）：４１８５〜９１頁）
・ドセタキセルおよび／またはシスプラチン（Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏ．ｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００６年１０月；５（１０）：１３４８〜５４頁）
・ダカルバジン（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００３年６月；１２０（６）：１０８１〜６頁）
・ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００７／１４７６１３に開示されるもの）、例えば、Ｇｌｅｅｖｅｃ（商標）（メシル酸イマチニブ）。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、対象が、本発明の医薬組成物およびさらなる治療薬、例えば、ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤を、同一組成物中、別個の投与としてのいずれかで投与される併用療法において、さらなる治療薬を使用してもよい。いくつかの実施形態では、このような別個の投与は、本発明の医薬組成物に先立って、その間に、それに続いて提供され得る。適切には、Ｍｃｌ１をターゲッティングするオリゴマーとさらなる有効成分は両方とも、有効量で投与される。この点において、いくつかのさらなる有効成分については、さらなる有効成分を用いる治療に対してＭｃｌ１のダウンレギュレーションが有益であり、さらなる有効成分に対する非反応性または低反応性を軽減し得るということが考えられる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、さらなる有効成分は、シスプラチンなどのアルキル化剤である。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、さらなる有効成分は、トリコスタチンＡなどのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤である。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、さらなる有効成分は、デキサメタゾンなどのグルココルチコイドである。
【０２００】
本発明は、医薬の調製のための、Ｍｃｌ１をターゲッティングするオリゴマー、例えば、１種または複数の本明細書に記載されるオリゴマーの使用を提供し、ここで、前記医薬は、癌の治療において、さらなる有効成分、例えば、シスプラチンなどのアルキル化剤、トリコスタチンＡなどのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびデキサメタゾンなどのグルココルチコイドからなる群から選択されるさらなる有効成分と組み合わせて使用するためのものである。
【０２０１】
本発明は、Ｍｃｌ１をターゲッティングするオリゴマー、例えば、本明細書に記載される１種または複数のオリゴマーを含む医薬を提供し、ここで、前記医薬は、癌の治療において、さらなる有効成分、例えば、シスプラチンなどのアルキル化剤、トリコスタチンＡなどのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびデキサメタゾンなどのグルココルチコイドからなる群から選択されるさらなる有効成分と組み合わせて使用するためのものである。
【０２０２】
本発明は、さらに、癌など、本明細書において言及されるものなどの疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に、細胞においてＭｃｌ１  ｍＲＮＡを標的とするオリゴマーと、さらなる有効成分、例えば、シスプラチンなどのアルキル化剤、トリコスタチンＡなどのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤およびデキサメタゾンなどのグルココルチコイドまたはそれらの薬学的に許容される誘導体からなる群から選択されるさらなる有効成分を有効量投与する工程を含む方法に関する。
【０２０３】
さらなる有効成分は、通常、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントをさらに含む医薬組成物の形態で投与される。
【０２０４】
投与
Ｍｃｌ１をターゲッティングするオリゴマーは、３日から２週間の間、例えば、４、５、６、７、８、９、０、１１、１２、１３日、例えば、約１週間、例えば、６、７または８日の一定の間隔で（投与間隔、ＤＩ）投与してよい。適切には、２回の投与の間に、ＤＩ期間を伴って、少なくとも２用量、例えば、３、４、５、６、７、８、９または１０投与量が提供され、ＬＮＡオリゴマーの各投与の間にそれぞれ投与間隔（ＤＩ）を有する。各投与の間のＤＩ期間は、同一、例えば、３日から２週間の間、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３日、例えば、約１週間、例えば、６、７または８日であってもよい。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、Ｍｃｌ１をターゲッティングするオリゴマーの各用量は、約０．２５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの間、例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態では、Ｍｃｌ１をターゲッティングするＬＮＡオリゴマーの各用量は、約２ｍｇ／ｋｇ〜約８ｍｇ／ｋｇまたは約４〜約６ｍｇ／ｋｇまたは約４ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの間であり得る。いくつかの実施形態では、Ｍｃｌ１をターゲッティングするＬＮＡオリゴマーの各用量は、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ、例えば、２、３、４、５、６、７または８ｍｇ／ｋｇ、例えば、６ｍｇ／ｋｇである。
【０２０６】
オリゴマーの投与は、通常、非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内投与によって実施する。静脈内投与が好ましい。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、最初の投与計画の後に、オリゴマーの投与計画を反復してもよく、実際、投与計画は、疾患を治療する、または疾患の進行を防ぐために、必要に応じて反復してもよい。
【０２０８】
本発明のＭｃｌ１をターゲッティングするオリゴマーの１つの利点は、継続的にというよりも、比較的短期間をかけて投与してもよいということである。これは、患者が長期間病院に縛られる必要がないので、患者の生活の質において著しい改善を提供する。したがって、好ましい実施形態では、Ｍｃｌ１をターゲッティングするＬＮＡオリゴマーは、持続注入によって投与されない。したがって、オリゴマーの各用量は、１２時間未満、例えば、約８時間未満、約４時間未満、例えば、約３時間未満の期間で患者に投与され得る。したがって、ＬＮＡオリゴマーの各用量は、約１から約４時間の間、例えば、約２から約３時間の間または約２時間の期間で患者に投与され得る。オリゴマーは、少なくとも３０分、例えば、少なくとも１時間の期間で患者に投与され得る。このような投与は、例えば、静脈内で行われ得る。
【０２０９】
さらなる有効成分の製薬上有効な用量は、いくつかの実施形態では、Ｍｃｌ１をターゲッティングするＬＮＡオリゴマーの１または複数の製薬上有効な用量の投与に先立って、その間にまたはその後に投与され得る。通常、さらなる有効成分の１または複数の有効用量は、ＬＮＡオリゴマーとさらなる有効成分の両方が、患者または対象内でその治療的利益を同時に提供するよう投与される。
【０２１０】
Ｂｃｌ−２をターゲッティングするアンチセンスオリゴマーとの組合せ
いくつかの態様では、さらなる治療薬（有効成分）は、Ｂｃｌ−２をターゲッティングする化合物であり得る。（Ｍｃｌ−１）本発明のオリゴマーは、いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２をターゲッティングする化合物、例えば、Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡと相補的であるアンチセンスオリゴマー、例えば、ヒトＢＣｌ２配列の最初の６コドンと相補的である（すなわち、配列「ｔｃｔｃｃａｇｃｇｔｃｃｇｃｃａｔ」を有する）、（Ｇ３１３９）と呼ばれるゲナセンス化合物、およびその他のアンチセンスＢｃｌ−２オリゴマー、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００５／０６１７１０、ＵＳ２００５／０１７０３７７、ＵＳ６，２９１，６６８、ＷＯ０２／１７８５２、ＵＳ２００５／００３２７１４、ＷＯ２００４／０４６３２７、米国仮出願ＵＳ６１／０１２１８５およびＵＳ  ６１／１０６２６１に開示されるものと併用され得る。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、Ｍｃｌ１をターゲッティングするオリゴマー、例えば、本明細書に開示されるものと併用され得るＢｃｌ２をターゲッティングするオリゴマーは、ＬＮＡオリゴマー、例えば、全部で１０〜５０のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、ギャップマーおよびショートマーであり得、ここで、前記連続ヌクレオチド配列は、少なくとも８０％、例えば、哺乳類Ｂｃｌ−２をコードする核酸の対応する領域と少なくとも相同的である。
【０２１２】
Ｂｃｌ−２を標的とする、ギャップマーおよびショートマーなどのオリゴマーおよびそのコンジュゲートなどの構造に関して、このようなオリゴマーが、Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡの対応する領域と相補的である、またはある場合には、標的Ｂｃｌ−２の対応する領域に対して１、２、３または４のミスマッチを含むという事実を除いて、それらは、いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマーと同一構造を有し得る（すなわち、特定の配列のヌクレオチドは別として）。
【０２１３】
Ｂｃｌ−２をターゲッティングするオリゴマーを含む医薬組成物の投与は、本明細書に開示されるＭｃｌ１を標的とするオリゴマーごとに実施してよく、本発明のオリゴマーを含む医薬組成物の投与に先立って、その間にまたはその後に実施してよく、同一医薬組成物の一部としてである。
【０２１４】
したがって、本発明は、Ｂｃｌ−２およびＭｃｌ−１を発現する細胞、例えば、癌細胞において、Ｂｃｌ−２およびＭｃｌ−１両方の発現を同時（並行）阻害する方法であって、
ａ．前記細胞に、Ｂｃｌ２阻害剤、例えば、Ｂｃｌ２を標的とするオリゴマー、例えば、配列番号１２８またはそのコンジュゲートもしくは医薬組成物を有効量投与して、前記細胞においてＢｃｌ−２を阻害する工程と、
ｂ．前記細胞に、Ｍｃｌ１阻害剤、例えば、本発明のオリゴマーなどのＭｃｌ１を標的とするオリゴマーまたはそのコンジュゲートまたは医薬組成物を有効量投与して、前記細胞においてＭｃｌ１を阻害する工程と
を含む方法を提供し、
工程ａ）およびｂ）は、いずれの順序で実施してもよく、または同時に実施してもよく、前記細胞におけるＭｃｌ−１およびＢｃｌ−２阻害の同時阻害（ダウンレギュレーション）につながり、前記方法は、インビボまたはインビトロのいずれかで実施する。適切には、細胞は、対象、例えば、癌を患っているヒト対象における癌細胞であり得る。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞死、例えば、細胞のアポトーシスをもたらし得る。
【０２１５】
Ｍｃｌ１阻害剤とともに使用されるべき適したＢｃｌ２阻害剤は、上記で言及されており、また、両方とも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２００７年１２月７日に出願された、米国仮出願出願番号ＵＳ６１／０１２１８５および２００８年１０月１７日に出願されたＵＳ６１／１０６２６１に開示されるものも含む。
【０２１６】
キットオブパーツ
本発明はまた、第１の部分が、本発明のオリゴマー、コンジュゲートおよび／または医薬組成物を含み、さらなる部分が、さらなる有効成分（すなわち、さらなる治療薬）、例えば、本明細書において言及されるものを含むキットオブパーツを提供する。したがって、キットオブパーツは、第１の部分とさらなる部分の両方を、同時にまたは順々にのいずれかで投与することを含む、本明細書において言及される、治療方法において使用され得ると予想される。
【０２１７】
本発明はまた、第１の部分が、本発明のオリゴマー、コンジュゲートおよび／または医薬組成物を含み、さらなる部分が、Ｂｃｌ２の発現を低下させることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むキットオブパーツを提供する。したがって、キットオブパーツは、第１の部分とさらなる部分の両方を、同時にまたは順々にのいずれかで投与することを含む、本明細書において言及される、治療方法において使用され得ると予想される。
【０２１８】
医療方法および使用
本発明のオリゴマー、コンジュゲートおよび組成物は、癌および肥満細胞症などの細胞（過剰）増殖性状態の治療に使用できる。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、疾患は、骨髄異形成症候群、例えば、全身性肥満細胞症、リンパ腫および白血病ならびに固形腫瘍である。
【０２２０】
本明細書において言及される癌は、いくつかの実施形態では、黒色腫、白血病、骨髄腫、リンパ腫、神経膠腫および癌腫からなる群から選択される。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、癌は、白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、悪性神経膠腫、黒色腫、多発性骨髄腫および肝細胞癌腫からなる群から選択される。
【０２２２】
いくつかの実施形態では癌は、白血病、黒色腫、骨髄腫および黒色腫からなる群から選択される。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、癌は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および慢性骨髄性白血病などの白血病である。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、癌は、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫などのリンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、多発性骨髄腫などの骨髄腫（ｍｙｌｅｏｍａ）である。いくつかの実施形態では、癌は、悪性黒色腫などの黒色腫である。一実施形態では、癌は、悪性神経膠腫である。いくつかの実施形態では、癌は、肝細胞癌腫などの癌腫である。
【０２２５】
肥満細胞症は、いくつかの実施形態では、全身性肥満細胞症であり得る。
【０２２６】
オリゴマー、コンジュゲートおよび組成物は、好ましい一実施形態では、癌の治療において使用するためのものであり得る。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、癌は、肝臓または腎臓癌である。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、例えば、脳癌の治療のためである。ホスホロチオエート結合は、本発明の化合物において使用されないことが好ましい。
【０２２９】
オリゴマー、コンジュゲートおよび組成物は、好ましい一実施形態では、癌の治療において使用するためのものであり得る。
【０２３０】
本発明のオリゴマー、コンジュゲートおよび組成物は、関節リウマチなどの炎症性疾患の治療のために使用され得る。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴマー、コンジュゲートおよび組成物は、炎症性障害、例えば、急性および慢性炎症性疾患、例えば、敗血症、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎（ベヒテレフ病）、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、重症乾癬、慢性ブドウ膜炎、サルコイドーシス、ウェジナー肉芽腫症および主要な特徴として炎症を有するその他の疾患からなる群から選択される炎症性障害の治療のために使用され得る。
【０２３２】
Ｍｃｌ−１は、炎症に適応とされるので、抗Ｍｃｌ−１オリゴマー、例えば、本明細書において言及されるオリゴマーはまた、感染性疾患、特に、炎症が特徴である感染性疾患の治療においても使用され得るということが認識される。
【０２３３】
本発明は、さらに、本明細書において言及される、疾患、障害または状態の治療のための医薬の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
【０２３４】
概説すれば、本発明の一態様は、本明細書に開示される疾患、障害または状態またはＭｃｌ−１の発現レベルまたは異常レベルと関連するものを患っている、またはそれにかかりやすい哺乳類を治療する方法であって、前記哺乳類に、１つまたは複数のＬＮＡ単位を含む、Ｍｃｌ−１を標的にするオリゴマーを治療上有効な量投与する工程を含む方法を対象とする。
【０２３５】
本発明の興味深い態様は、本明細書において言及される、疾患、障害または状態の治療のための医薬の調製のための、本明細書において定義されるオリゴマー（化合物）または本明細書に定義されるコンジュゲートとしての使用を対象とする。
【０２３６】
本発明の方法は、異常なレベルのＭｃｌ−１によって引き起こされる疾患に対する治療または予防のために使用されることが好ましい。
【０２３７】
さらに、本明細書に記載される本発明は、疾患を予防または治療する方法であって、このような治療を必要とするヒトに、Ｍｃｌ−１調節性オリゴマーを治療上有効な量含む方法を包含する。本発明は、Ｍｃｌ−１調節性オリゴヌクレオチド化合物の短期間の投与の使用をさらに包含する。このような使用および方法は、本明細書において言及されるものなどのさらなる治療用化合物の投与をさらに（ｆｙｒｔｈｅｒ）含み得る。
【０２３８】
本発明のオリゴマーはまた、活性な薬剤物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌薬または抗生物質にコンジュゲートされ得る。
【０２３９】
別の言い方をすれば、本発明は、異常なレベルのＭｃｌ−１を治療する方法をさらに対象とし、前記方法は、本発明のオリゴマーまたは本発明のコンジュゲートまたは本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含み、さらなる化学療法薬の投与をさらに含む。前記さらなる投与は、医薬組成物中に存在するか、別個の製剤中で投与される、さらなる化学療法薬が、本発明の化合物にコンジュゲートされるようなものであり得る。
【０２４０】
本発明はまた、医薬として使用するための、本明細書において定義されるオリゴマー、組成物またはコンジュゲートに関する。
【０２４１】
本発明は、さらに、本明細書において言及される疾患または障害、例えば、異常なレベルのＭｃｌ−１と関連している疾患または障害の治療のための医薬の製造のための、本明細書において定義される、化合物、組成物またはコンジュゲートの使用に関する。このような治療はまた、本明細書において言及される、さらなる治療薬、例えば、ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤の投与（または使用）を含み得る。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、前記異常なレベルのＭｃｌ−１は、本明細書において言及される疾患または障害、例えば、過剰な細胞増殖、例えば、癌、例えば、本明細書において言及される癌の形態であり、またはそれを引き起こし、またはそれを特徴とする。
【０２４３】
さらに、本発明は、本明細書において言及される疾患または障害または状態、例えば、本明細書において言及される癌などの細胞（過剰）増殖性障害から選択される疾患または障害を患っている対象を治療する方法であって、本明細書において定義される医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法に関する。このような方法は、本明細書において言及される、さらなる治療薬、例えば、ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤またはＢｃｌ１アンチセンスオリゴマーの投与をさらに含み得る。
【０２４４】
治療を必要とする患者とは、疾患または障害を患っているか、患う可能性が高い患者である）。
【０２４５】
実施形態
以下の本発明の実施形態は、本明細書に記載されるその他の実施形態と組み合わせて使用してよい。
【０２４６】
１．全部で１０〜５０の間のヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、１０〜５０ヌクレオチドの長さのオリゴマーであって、前記連続ヌクレオチド配列が、哺乳類Ｍｃｌ−１をコードする核酸の対応する領域と少なくとも８０％相同的であり、前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号９５〜１１７および／または２〜１８および／または７７〜８２からなる群から選択される核酸配列中に存在し、所望により、少なくとも１つのＬＮＡ単位を含むオリゴマー。
２．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号１００、１０１、１０４、１０８、１１０、１１１および１１１、または７、８、１１、１５、１６、１７および１８からなる群から選択される核酸配列中に存在する、実施形態１のオリゴマー。
３．前記連続ヌクレオチド配列が、配列番号９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０５、１０６および１０７（および／または１１３、１１４および１１％）、または配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３および１４（および／または７８、７９および８０）からなる群から選択される核酸配列中に存在し、前記オリゴマーが、少なくとも１つのＬＮＡ単位を含む、実施形態１のオリゴマー。
４．連続ヌクレオチド配列が、哺乳類Ｍｃｌ−１をコードする核酸の対応する領域に対して、３つ、例えば、２つのミスマッチしか含まない、実施形態１〜３のいずれか１つのオリゴマー。
５．前記連続ヌクレオチド配列が、哺乳類Ｍｃｌ−１をコードする核酸の対応する領域に対して、１つのミスマッチしか含まない、実施形態４のオリゴマー。
６．前記連続ヌクレオチド配列が、哺乳類Ｍｃｌ−１をコードする核酸の対応する領域に対して、ミスマッチを含まない（すなわち、相補的である）、実施形態５のオリゴマー。
７．オリゴマーのヌクレオチド配列が、連続ヌクレオチド配列からなる、実施形態１〜６のいずれか１つのオリゴマー。
８．哺乳類Ｍｃｌ−１をコードする核酸が、ヒトＭｃｌ−１ヌクレオチド配列、例えば、配列番号１、またはその天然に存在する対立遺伝子変異体である、実施形態１〜７のいずれか１つのオリゴマー。
９．連続ヌクレオチド配列が、ヒトＭｃｌ−１核酸配列および非ヒト哺乳類Ｍｃｌ−１核酸配列、例えば、マウスまたはサルＭｃｌ−１核酸配列の両方の対応する領域と相補的である、実施形態１〜８のいずれか１つのオリゴマー。
１０．連続ヌクレオチド配列が、相補的なＭｃｌ−１標的ＲＮＡと二本鎖で形成される場合に、ＲＮアーゼＨを動員できる、少なくとも７のヌクレオチド残基の連続する部分配列を含む、実施形態１〜９のいずれか１つのオリゴマー。
１１．連続ヌクレオチド配列が、相補的なＭｃｌ−１標的ＲＮＡと二本鎖で形成される場合に、ＲＮアーゼＨを動員できる、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０のヌクレオチド残基の連続する部分配列を含む、実施形態１０のオリゴマー。
１２．前記連続する部分配列が、相補的なＭｃｌ−１標的ＲＮＡと二本鎖で形成される場合に、ＲＮアーゼＨを動員できる、少なくとも９または少なくとも１０の長さのヌクレオチド、例えば、少なくとも１２のヌクレオチドまたは少なくとも１４の長さのヌクレオチド、例えば、１４、１５または１６のヌクレオチド残基である、実施形態１０または１１のいずれか１つのオリゴマー。
１３．１種または複数の非ヌクレオチド化合物とコンジュゲートしている、実施形態１〜１２のいずれか１つのオリゴマー。
１４．１０〜２２ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１〜１３のいずれか１つのオリゴマー。
１５．１２〜１８ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１〜１３のいずれか１つのオリゴマー。
１６．１４、１５または１６ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１〜１３のいずれか１つのオリゴマー。
１７．前記連続するヌクレオチド配列が、配列番号３６、４２、４７、５０、５５、５８、６１、６４または６６からなる群から選択される核酸配列中に存在する連続ヌクレオチド配列に対応する、実施形態１〜１６のいずれか１つのオリゴマー。
１８．オリゴマーもしくは連続ヌクレオチド配列が、配列番号３６〜６９からなる群から選択されるか、またはオリゴマーもしくは連続ヌクレオチド配列が、配列番号３６〜６９から選択されるヌクレオチド配列と同等のヌクレオチド配列からなる、もしくはそれを含む、実施形態１〜１７のいずれか１つのオリゴマー。
１９．一本鎖である、実施形態１〜１８のいずれかいくつかのオリゴマー。
２０．前記連続ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの親和性増強ヌクレオチド類似体を含む、実施形態１〜１９のいずれか１つのオリゴマー。
２１．前記連続ヌクレオチド配列が、全部で２、３、４、５、６、７、８、９または１０の親和性増強ヌクレオチド類似体、例えば、ＬＮＡ、例えば、５から８の間の親和性増強ヌクレオチド類似体を含む、実施形態２０のオリゴマー。
２２．少なくとも１つの親和性増強ヌクレオチド類似体を含み、残りのヌクレオチドが、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチド、好ましくは、ＤＮＡヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態１〜２１のいずれか１つのオリゴマー。
２３．オリゴマーが、５’から３’方向へ、式Ａ−Ｂ−Ｃ、所望により、式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄのヌクレオチドの配列を含む、実施形態１〜２２のいずれか１つのオリゴマーであって、
Ａは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば、１、２、３、４、５または６のヌクレオチド類似体、好ましくは、２〜５の間のヌクレオチド類似体、好ましくは、２、３または４のヌクレオチド類似体、最も好ましくは、２、３または４の連続するヌクレオチド類似体からなり、またはそれを含み；
Ｂは、ＲＮアーゼＨを動員できる（相補的なＲＮＡ分子、例えば、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡ標的と二本鎖で形成される場合に）、少なくとも５つの連続するヌクレオチド、例えば、ＤＮＡヌクレオチド、例えば、ＲＮアーゼＨを動員できる、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の連続するヌクレオチドまたはＲＮアーゼＨを動員できる、６〜１０の間、または７〜９の間、例えば、８の連続するヌクレオチドからなり、またはそれを含み；
Ｃは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体、例えば、１、２、３、４、５または６のヌクレオチド類似体、好ましくは、２〜５の間のヌクレオチド類似体、例えば、２、３または４のヌクレオチド類似体、最も好ましくは、２、３または４の連続するヌクレオチド類似体からなり、またはそれを含み；
Ｄは、存在する場合には、１つまたは複数のＤＮＡヌクレオチド、例えば、１〜３または１〜２の間のＤＮＡヌクレオチドからなる、またはそれを含む、好ましくは、それからなるオリゴマー。
２４．領域Ａが、２、３また４の連続するヌクレオチド類似体からなる、またはそれを含む、実施形態２３のオリゴマー。
２５．領域Ｂが、相補的なＲＮＡ、例えば、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡ標的と二本鎖で形成される場合に、ＲＮアーゼＨを動員できる、７、８、９または１０の連続するＤＮＡヌクレオチドまたは同等のヌクレオチドからなる、またはそれを含む、実施形態２３〜２４のいずれか１つのオリゴマー。
２６．領域Ｃが、２、３または４の連続するヌクレオチド類似体からなる、またはそれを含む、実施形態２３〜２５のいずれか１つのオリゴマー。
２７．領域Ｄが、存在する場合には、１つまたは２つのＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態２３〜２６のいずれか１つのオリゴマー。
２８．Ａが、３つの連続ヌクレオチド類似体からなり、またはそれを含み；
Ｂが、相補的なＲＮＡ、例えば、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡ標的と二本鎖で形成される場合に、ＲＮアーゼＨを動員できる、７、８、９または１０の連続するＤＮＡヌクレオチドまたは同等のヌクレオチドからなり、またはそれを含み；
Ｃが、３の連続ヌクレオチド類似体からなり、またはそれを含み；
Ｄが、存在する場合には、１つまたは２つのＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態２３〜２７のいずれか１つのオリゴマー。
２９．連続ヌクレオチド配列が、１０、１１、１２、１３または１４のヌクレオチドからなり、
Ａが、１、２または３の連続ヌクレオチド類似体からなり；
Ｂが、相補的なＲＮＡ、例えば、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡ標的と二本鎖で形成される場合に、ＲＮアーゼＨを動員できる、７、８また９の連続するＤＮＡヌクレオチドまたは同等のヌクレオチドからなり；
Ｃが、１、２または３の連続ヌクレオチド類似体からなり；
Ｄが、存在する場合には、１つのＤＮＡヌクレオチドからなる、実施形態２３のオリゴマー。
３０．Ｂが、α−Ｌ立体配置にある、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチド、例えば、α−Ｌ−オキシＬＮＡを含む、実施形態２３〜２８のいずれか１つのオリゴマー。
３１．ヌクレオチド類似体（単数または複数）が、独立に、またはまとめて、ロックド核酸（ＬＮＡ）単位；２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位およびＩＮＡ単位からなる群から選択される、実施形態１〜３０のいずれか１つのオリゴマー。
３２．すべてのヌクレオチド類似体（単数または複数）がＬＮＡ単位である、実施形態３１のオリゴマー。
３３．１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ＬＮＡ単位、例えば、２から８の間のヌクレオチドＬＮＡ単位を含む、実施形態１〜３２のいずれか１つのオリゴマー。
３４．ＬＮＡが、β−Ｄおよびα−Ｌ立体配置のいずれかまたはそれらの組合せのオキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡおよびアミノ−ＬＮＡから独立に選択される、実施形態３０〜３２のいずれか１つのオリゴマー。
３５．ＬＮＡが、すべてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、実施形態３３のオリゴマー。
３６．ヌクレオチド類似体または領域ＡおよびＣのヌクレオチドが、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、実施形態２２〜３４のいずれか１つのオリゴマー。
３７．オリゴマー中に存在するヌクレオチドの少なくとも１つが、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンからなる群から選択される修飾されたヌクレオチドである、実施形態１〜３６のいずれか１つのオリゴマー。
３８．少なくとも４０℃〜５０℃のＴｍを有する、対応する哺乳類Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡとハイブリダイズする、実施形態１〜３７のいずれか１つのオリゴマー。
３９．８０℃以下のＴｍを有する、対応する哺乳類Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡとハイブリダイズする、実施形態１〜３８のいずれか１つのオリゴマー。
４０．ヌクレオシド間結合が、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびボラノホスフェートからなる群から独立に選択される、実施形態１〜３９のいずれか１つのオリゴマー。
４１．少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、実施形態４０のオリゴマー。
４２．ＤＮＡもしくはＲＮＡ単位に隣接する、またはＤＮＡもしくはＲＮＡ単位間の、または領域Ｂ内のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、実施形態４１のオリゴマー。
４３．連続するヌクレオチド類似体の少なくとも１つの対間の結合が、ホスホジエステル結合である、実施形態４０または４１のオリゴマー。
４４．連続するヌクレオチド類似体間のすべての結合が、ホスホジエステル結合である、実施形態４０または４１のオリゴマー。
４５．すべてのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、実施形態４０のオリゴマー。
４６．実施形態１〜４５および前記化合物と共有結合している、少なくとも１つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分のいずれか１つのオリゴマーを含むコンジュゲート。
４７．実施形態１〜４５のいずれかにおいて定義されるオリゴマーまたは実施形態４６において定義されるコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントとを含む医薬組成物。
４８．オリゴマーが、プロドラッグとして構成されている、４７の医薬組成物。
４９．さらなる治療薬、例えば、Ｂｃｌ−２を標的とする有効成分、例えば、Ｂｃｌ−２  ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴマーをさらに含む、実施形態４６〜４８のいずれか１つの医薬組成物。
５０．ＦＬＴ−３キナーゼ阻害剤をさらに含む、実施形態４６〜４９のいずれか１つの医薬組成物。
５１．癌および肥満細胞症などの過剰増殖性障害ならびに関節リウマチなどの炎症性疾患からなる群から選択される疾患または障害の治療のための医薬の製造のための、実施形態１〜４５のいずれか１つにおいて定義されるオリゴマーまたは実施形態４６において定義されるコンジュゲートの使用。
５２．癌および肥満細胞症などの過剰増殖性障害ならびに炎症性疾患からなる群から選択される疾患または障害を治療する方法であって、実施形態１〜４５の１つにおいて定義されるオリゴマー、または実施形態４６において定義されるコンジュゲート、または実施形態４７〜５０のいずれか１つにおいて定義される医薬組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む方法。
５３．細胞または組織中のＭｃｌ−１の発現を低減または阻害する方法であって、前記細胞または組織を、実施形態１〜４５の１つにおいて定義されるオリゴマー、または実施形態４６において定義されるコンジュゲート、または実施形態４７〜５０のいずれか１つにおいて定義される医薬組成物と接触させ、その結果、Ｍｃｌ−１の発現が、低減または阻害される工程を含む方法。
５４．細胞、例えば、癌細胞においてアポトーシスを誘発する方法であって、前記細胞または組織を、実施形態１〜４５の１つにおいて定義されるオリゴマー、または実施形態４６において定義されるコンジュゲート、または実施形態４７〜５０のいずれか１つにおいて定義される医薬組成物と接触させ、その結果、Ｍｃｌ−１の発現が阻害もしくは低減され、かつ／またはアポトーシスが誘発される工程を含む方法。
【実施例】
【０２４７】
実施例１：モノマー合成
ＬＮＡ単量体構築ブロックおよび誘導体は、以下の公開された手順およびそれに引用される参考文献に従って調製した−ＷＯ０７／０３１０８１およびそれに引用された参考文献を参照されたい。
【０２４８】
実施例２：オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドは、ＷＯ０７／０３１０８１に記載される方法によって合成した。表１は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の例を示す。表２〜４は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）の例を示す。
【０２４９】
実施例３：オリゴヌクレオチドの設計
本発明に従って、ヒトＭｃｌ−１の異なる領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２１９６０およびＮＭ＿１８２７６３、配列番号７０および１）を標的とする一連の異なるオリゴヌクレオチドを設計した。
表１．本発明のいくつかの例示的なオリゴマーモチーフ配列
【０２５０】
【表１−１】
2011505798.tif 000008
【表１−２】
2011505798.tif 000009
【表１−３】
2011505798.tif 000010
【０２５１】
表２：本発明の例示的オリゴヌクレオチド設計
配列番号１９〜３５では、大文字は、ヌクレオチド類似体単位、例えば、ＬＮＡ単位を示し、下付文字「ｓ」は、ホスホロチオート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｔｅ）結合を表す。小文字は、ヌクレオチド単位を表す。「ｓ」（もしあれば）がないことは、ホスホジエステル結合を示す。
【０２５２】
【表２】
2011505798.tif 000011
【０２５３】
実施例４：インビトロモデル：細胞培養
標的核酸発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果は、標的核酸が測定可能なレベルで存在する、提供される種々の細胞種のいずれにおいても試験できる。標的は、内因性に、細胞への自然取り込みによって、または前記標的をコードする核酸の一時的なまたは安定なトランスフェクションによって発現され得る。標的核酸の発現レベルは、例えば、ノーザンブロット解析、リアルタイムＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して常套的に決定できる。以下の細胞種が、例示目的で提供されるが、その他の細胞種も、標的が、選択された細胞種において発現されるという条件で常套的に使用できる。
【０２５４】
細胞を、以下に記載される適当な培地で培養し、３７℃、９５〜９８％湿度および５％ＣＯ２で維持した。細胞を、１週間に２〜３回、常套的に継代した。
【０２５５】
１５ＰＣ３：ヒト前立腺癌細胞株１５ＰＣ３は、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ  ＋ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）で培養した。
【０２５６】
Ｎａｍａｌｗａ：ヒトバーキットリンパ腫癌細胞株Ｎａｍａｌｗａは、ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｓｉｇｍａ）＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１ｍＭ  ナトリウムピロベート（ｐｙｒｏｖａｔｅ）＋７，５％  ＦＢＳ＋ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ  １６４０で培養した。
【０２５７】
Ｋ５６２：ヒト慢性骨髄性白血病細胞株は、ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｓｉｇｍａ）＋１０％  ＦＢＳ＋ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ  １６４０で培養した。
【０２５８】
ＨｅｐＧ２：ヒト肝細胞癌腫細胞株は、イーグル最小必須培地（Ｓｉｇｍａ）＋１０％  ＦＢＳ＋ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）で培養した。
【０２５９】
実施例５：インビトロモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる処理
ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥトランスフェクション：実施例４に列挙される細胞株を、トランスフェクションビヒクルとしてカチオン性リポソーム製剤ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００（Ｇｉｂｃｏ）を使用してオリゴヌクレオチドで処理した。細胞を、８０〜９０％コンフルエントで６ウェルの細胞培養プレート（ＮＵＮＣ）に播種し、処理した。使用したオリゴ濃度は、１ｎＭ〜２５ｎＭ最終濃度の範囲であった。オリゴ−脂質複合体の製剤は、血清不含ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）および５μｇ／ｍｌ  ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ２０００の最終脂質濃度を使用し、本質的に製造業者によって記載されるとおりに実施した。細胞は、３７℃で４時間インキュベートし、処理は、オリゴ含有培養培地を除去することによって停止した。細胞を洗浄し、血清含有培地を加えた。オリゴ処理細胞を、２０時間回復させた後、ＲＮＡ分析のために回収した。
【０２６０】
自然取り込み：実施例４において列挙される細胞株１５ＰＣ３、Ｋ５６２およびＮａｍａｌｗａは、トランスフェクションビヒクルを全く含まない滅菌水に溶解したオリゴとともにインキュベートした。細胞を、１０〜３０％コンフルエントで６ウェルの細胞培養プレート（ＮＵＮＣ）に播種し、オリゴとともにインキュベートした。使用したオリゴ濃度は、１μＭ〜１０μＭ終濃度の範囲であった。細胞を、オリゴ含有通常増殖血清中、３７℃で、１５日間インキュベートし、その後、それらをＲＮＡ分析のために回収した。
【０２６１】
実施例６：インビトロモデル：  ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡ合成
全ＲＮＡ単離および第１鎖合成
全ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４１０４）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、上記のようにトランスフェクトされた細胞から抽出した。第１鎖合成は、Ａｍｂｉｏｎ製のＲｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ試薬を使用し、製造業者の使用説明書に従って実施した。
【０２６２】
各サンプル０．５μｇのために、全ＲＮＡを、ＲＮアーゼ不含Ｈ２Ｏを用いて（１０．８μｌ）に調整し、２μｌのランダムデカマー（５０μＭ）および４μｌのｄＮＴＰミックス（各ｄＮＴＰ  ２．５ｍＭ）と混合し、７０℃に３分間加熱し、その後、サンプルを氷上で．迅速に冷却した。氷上でサンプルを冷却した後、各サンプルに、２μｌの１０×バッファーＲＴ、１μｌのＭＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（１００Ｕ／μｌ）および０．２５μｌのＲＮアーゼ阻害剤（１０Ｕ／μｌ）を加え、４２℃で６０分間のインキュベーション、９５℃で１０分間の酵素の熱不活性化を続け、次いで、サンプルを４℃に冷却した。
【０２６３】
実施例７：インビトロモデル：リアルタイムＰＣＲによるオリゴヌクレオチドＭｃｌ−１発現の阻害の分析
Ｍｃｌ−１発現のアンチセンス調節は、当技術分野で公知の種々の方法でアッセイできる。例えば、Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡレベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはリアルタイムＰＣＲによって定量化できる。リアルタイム定量ＰＣＲが目下のところ好ましい。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡで実施しても、またはｍＲＮＡで実施してもよい。
【０２６４】
ノーザンブロット分析などのＲＮＡ単離およびＲＮＡ分析法は、当技術分野では常套的であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓに教示されている。
【０２６５】
リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍから入手可能な、市販のマルチカラーリアルタイムＰＣＲ検出システムを使用して達成できることが好都合であり得る。
【０２６６】
Ｍｃｌ−１  ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量ＰＣＲ分析：ヒトＭｃｌ−１  ｍＲＮＡのサンプル含量を、ヒトＭｃｌ−１  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎアッセイ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｈｓ００７６６１８７＿ｍ１を使用し、製造業者の使用説明書に従って定量化した。
【０２６７】
グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）  ｍＲＮＡ量またはβアクチン（ＡＣＴＢ）  ｍＲＮＡ量を、サンプル調製における任意の分散の正規化のための内因性対照として使用した。
【０２６８】
ヒトＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのサンプル含量は、ヒトＧＡＰＤＨ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎアッセイ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３１０８８４Ｅ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って定量化した。
【０２６９】
ヒトβアクチン  ｍＲＮＡのサンプル含量は、ヒトＡＣＴＢ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎアッセイ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３１０６８１Ｅ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って定量化した。
【０２７０】
マウスＭｃｌ−１  ｍＲＮＡのサンプル含量は、マウスＭｃｌ−１  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎアッセイ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号Ｍｍ００７２５８３２＿ｓ１）を使用し、製造業者の使用説明書に従って定量化した。
【０２７１】
マウスｂ−アクチン  ｍＲＮＡのサンプル含量は、ＡＣＴＢ  Ｍｃｌ−１  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎアッセイ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３５２３４１Ｅ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って定量化した。
【０２７２】
マウスＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのサンプル含量は、マウス  ＧＡＰＤＨ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ＴａｑＭａｎアッセイ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３５２３９Ｅ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って定量化した。
【０２７３】
実施例６に記載されるとおりに実施した第１鎖合成から得たｃＤＮＡを、２〜２０倍希釈し、Ｔａｑｍａｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の７５００ＦＡＳＴまたは７９００ＦＡＳＴを使用してリアルタイム定量ＰＣＲによって分析した。プライマーおよびプローブを、２×Ｔａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲマスターミックス（２×）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号４３６４１０３）と混合し、４μｌ  ｃＤＮＡに加え、最終容量１０μｌとした。各サンプルを２連で分析した。目的のＲＮＡを発現する細胞株から精製した材料で調製したｃＤＮＡの２倍希釈物をアッセイすることによって、分析のための標準曲線を作成した。鋳型なし対照には、ｃＤＮＡの代わりに滅菌Ｈ２Ｏを使用した。ＰＣＲプログラム：６０℃で２分間、次いで、９５℃で３０秒間、続いて、９５℃、３秒、６０℃、２０〜３０秒の４０サイクル。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｆａｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＳＤＳソフトウェアバージョン１．３．１．２１．またはＳＤＳソフトウェアバージョン２．３を使用して、算出された閾値サイクルから標的ｍＲＮＡ配列の相対量を決定した。
【０２７４】
実施例８：インビトロ分析：オリゴヌクレオチド化合物によるヒトＭｃｌ−１発現のアンチセンス阻害
表３に提示されるオリゴヌクレオチドを、Ｍｃｌ−１をノックダウンするその能力について、１、５および２５ｎＭの濃度で評価した（図１参照）。
【０２７５】
表３：オリゴヌクレオチドによるヒト  Ｍｃｌ−１発現のアンチセンス阻害
表３中のデータは、２５ｎＭの偽トランスフェクトされた細胞に対するダウンレギュレーションパーセンテージとして提示されている。小文字は、ＤＮＡ単位を表し、太字の大文字は、ＬＮＡ、好ましくは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ単位を表す。すべてのＬＮＡ  Ｃは、５’メチルＣであることが好ましい。下付文字「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を表す。
【０２７６】
【表３−１】
2011505798.tif 000012
【表３−２】
2011505798.tif 000013
【０２７７】
表３に示されるように、配列番号３６、４２、４７、５０、５５、５８、６１、６４および６６のオリゴヌクレオチドは、これらの実験では、１５ＰＣ３細胞において２５ｎＭでＭｃｌ−１発現の約９０％以上の阻害を実証し、したがって、好ましい。
【０２７８】
例示されたアンチセンスオリゴ配列に基づくさらなるオリゴヌクレオチドを、例えば、長さ（短くまたは長く）および／またはヌクレオチド含量（例えば、類似体単位の種類および／または割合を変えることによって調製してもよい。以下の表において提供されるのは本発明のさらなる例示的オリゴマーである（図１４参照）。
【０２７９】
【表４】
2011505798.tif 000014
【０２８０】
小文字は、ＤＮＡ単位を表し、太字の大文字は、ＬＮＡ、好ましくは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ単位を表す。すべてのＬＮＡ  Ｃは、５’メチルＣであることが好ましい。下付文字「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を表す。
【０２８１】
実施例９：インビトロ分析：ＬＮＡアンチセンスオリゴマー化合物によるアポトーシス誘導
表３に提示されるいくつかの好ましいオリゴ（配列番号３６、４２、４７、５０、５５、５８、６１、６４および６６）を選択し、１５ＰＣ３細胞およびＨＵＨ−７細胞においてアポトーシスを誘導するその能力について評価した。
【０２８２】
１５ＰＣ３細胞を、トランスフェクションの前日に、ＤＭＥＭ中、白色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  １３６１０１）のウェルあたり６，０００個細胞の密度で播種した。ＨＵＨ−７細胞を、トランスフェクションの前日に、ＤＭＥＭ中、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  １３６１０１）のウェルあたり８，５００個細胞の密度で播種した。翌日、細胞を、予温したＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄し、続いて、７２μｌのＯｐｔｉＭＥＭ含有５μｇ／ｍｌリポフェクタミン２０００（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。細胞を７分間インキュベートし、その後、１８μｌのＯｐｔｉＭＥＭで希釈したオリゴヌクレオチドを加えた。最終オリゴヌクレオチド濃度は、１ｎＭ〜２５ｎＭの範囲であった。４時間処理した後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、５０μｌの血清を含有するＤＭＥＭを加えた。オリゴマー化合物で処理した後、細胞を、示された期間回復させ、その後、それらをＣＯ２インキュベーターから回収し、室温に１５分間平衡化した。９６ウェル中の細胞に等容量の高感受性カスパーゼ３／７−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を直接加え、プレートを６０分間インキュベートし、その後、さらなる１分の期間を経た後に、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ製のＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ機器で発光（ルシフェラーゼ活性）を記録した。ルシフェラーゼ活性は、秒あたりの相対光単位（ＲＬＵ／ｓ）として測定される。データは、Ａｓｃｅｎｔソフトウェア２．６で処理し、グラフはエクセルで描いた。（図２および３参照）。
【０２８３】
実施例１０：インビトロ分析：自然取り込みを使用するオリゴヌクレオチド化合物によるヒトＭｃｌ−１発現のアンチセンス阻害
表５中に提示されるいくつかの好ましいオリゴ（配列番号５０、６４、９０、９１、９２、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６および１２７）を選択し、自然取り込みを使用して、１５ＰＣ３細胞においてＭｃｌ−１  ｍＲＮＡをダウンレギュレートするその能力について評価した。
【０２８４】
１５ＰＣ３細胞を、１日目および３日目の回収用には、６ウェル細胞培養プレートのウェルあたり１２００００個細胞の密度で播種し、６日目の回収用には、１５ＰＣ３細胞を６ウェル細胞培養プレートのウェルあたり４００００個細胞の密度で播種した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、その後、滅菌水に懸濁したオリゴを、最終オリゴ濃度５μＭでウェルに加えた。細胞を、オリゴ含有通常増殖血清中、３７℃で、１、３または６日間インキュベートし、その後ＲＮＡ分析のためにそれらを回収した。
【０２８５】
表５：オリゴヌクレオチドによるヒトＭｃｌ−１発現のアンチセンス阻害
【表５】
2011505798.tif 000015
【０２８６】
表５に示されるように、配列番号６４、９０、９１、９２、１１８、１１９、１２０、１２２、１２５、１２６および１２７のオリゴヌクレオチドは、これらの実験において、約６５％以上のＭｃｌ−１発現の阻害を示し、したがって、好ましい。また、例示されるアンチセンスオリゴ配列に基づく、例えば、長さ（短くまたは長く）および／または核酸塩基含量（例えば、類似体単位の種類および／または割合）を変更した、Ｍｃｌ−１発現の良好な阻害も提供するオリゴヌクレオチドも好ましい。
【０２８７】
実施例１１：インビトロ分析：Ｋ５６２細胞における、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤トリコスタチンＡまたはアルキル化剤シスプラチンと組み合わせたヒトＭＣＬ１のアンチセンス阻害によって誘導されるカスパーゼ３／７活性
Ｋ５６２慢性骨髄性白血病細胞を、最終オリゴヌクレオチド濃度５μＭを含む培地４４ｍｌ中、６ウェルプレートのウェルあたり２５００００個細胞の密度でプレーティングした。Ｋ５６２を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ＋ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）で培養した。２日後、トリコスタチンＡを、１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭおよび０．１２５μＭの最終濃度に加えたのに対し、シスプラチンは、５０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび０．０５μｇ／ｍｌの最終濃度に加えた。シスプラチンおよびトリコスタチンＡ添加の１日後、６ウェルプレートの各ウェルから１００μｌを、１００μｌの培地中で白色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に移し、ルミノメーターを使用して、カスパーゼ−Ｇｌｏ３／７アッセイ（ｐｒｏｍｅｇａ）を加えることによってカスパーゼ３／７活性を測定した。（図２４および図２５を参照）。図２４および図２５に示されるように、配列番号５０、６４、９０、９１および９２のオリゴヌクレオチドは、トリコスタチンＡで処理した場合にＫ５６２細胞をアポトーシス（カスパーゼ３／７活性化）に対して感作させ、配列番号５０、６４、９０および９１は、シスプラチンで処理した場合にＫ５６２細胞をアポトーシス（カスパーゼ３／７活性化）に対して感作させ、したがって、好ましい。
【０２８８】
実施例１２：インビトロ分析：グルココルチコイドデキサメタゾンと組み合わせた、ヒトＭＣＬ１のアンチセンス阻害によって影響を受けた、生存Ｎａｍａｌｗａバーキットリンパ腫細胞の測定（ＭＴＳアッセイ）
Ｎａｍａｌｗａバーキットリンパ腫細胞を、最終オリゴヌクレオチド濃度５μＭを含む培地４ｍｌ中、６ウェルプレート中のウェルあたり２５００００個細胞の密度でプレーティングした。Ｎａｍａｌｗａ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋４ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ＋ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）で培養した。２日後、デキサメタゾンを、５μＭ、１μＭ、０．２μＭおよび０．０４μＭの最終濃度に加えたのに対し、シスプラチンは、５０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび０．０５μｇ／ｍｌの最終濃度に加えた。デキサメタゾンの添加の２日後、透明な９６ウェルプレート（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ番号１４７２０３０１００）中、６ウェルプレート中の各ウェルからの１００μｌ、１０μｌのテトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内部塩；ＭＴＳ］および電子カップリング試薬（ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｅｔｈｏｓｕｌｆａｔｅ；ＰＥＳ）（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ溶液細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えることによって生存細胞を測定した。生存細胞を、Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）において４９０ｎｍで測定した（図２６参照）。図２６に示されるように、配列番号６４および９１のオリゴヌクレオチドは、Ｎａｍａｌｗａ細胞（細胞生存力の低下）をデキサメタゾンを用いる処理に対して感作させ、したがって、好ましい。
【０２８９】
実施例１３：インビトロ分析：  ＨｅｐＧ２細胞における、アルキル化剤シスプラチンと組み合わせたヒトＭＣＬ１のアンチセンス阻害によって誘導されるカスパーゼ３／７活性
ＨｅｐＧ２肝細胞癌腫細胞を、最終オリゴヌクレオチド濃度５μＭを含む培地１００μｌ中、白色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中のウェルあたり５０００個細胞の密度でプレーティングした。ＨｅｐＧ２細胞を、ＥＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ＋１×ＮＥＡＡ＋ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）で培養した。２日後、シスプラチンを、４μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび０．２５μｇ／ｍｌの最終濃度に加えた。シスプラチンの添加の２日後、カスパーゼ３／７活性を、ルミノメーターを使用して、１００μｌカスパーゼ−Ｇｌｏ３／７アッセイ（ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することによって測定した（図２７参照）。図２７に示されるように、配列番号９０および９１のオリゴヌクレオチドは、ＨｅｐＧ２細胞において、カスパーゼ３／７活性に対して単剤効果を示し、配列番号５０、６４、９０、９１および９２は、シスプラチンと組み合わせた場合に効果の増大を示し、したがって、好ましい。
【０２９０】
実施例１４：インビトロモデル：  Ｍｃｌ−１をダウンレギュレートするオリゴヌクレオチドによるカスパーゼ３／７活性化
実施例４に列挙される懸濁液細胞株Ｋ５６２およびＮａｍａｌｗａを、６ウェル細胞培養プレートに低コンフルエンスで播種し、どのサンプルも３連で存在するように、実施例５に記載されるオリゴとともにインキュベートした。０時間、２４時間、４８時間および９６時間で、３つの１００μｌサンプルをどのウェルからも取り出し、白色璧マルチウェル細胞培養ルミノメータープレートに移した。プレートを室温に冷却した後、ウェルあたり１００μｌのカスパーゼ３／７−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、ルミノメータープレートに加え、プレートを室温で６０分間インキュベートし、その後、さらに１分の期間を経た後にＴｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ製のＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ機器において発光（ルシフェラーゼ活性）を記録した。ルシフェラーゼ活性は、秒あたりの相対光単位（ＲＬＵ／ｓ）として測定される。データは、Ａｓｃｅｎｔソフトウェア２．６で処理し、グラフはエクセルで描いた（図１９および２２を参照）。図１９に示されるように、配列番号５０、６４、９０、９１および９２のオリゴヌクレオチドは、Ｎａｍａｌｗａ細胞においてカスパーゼ３／７活性を誘導する。図２２に示されるように、配列番号９０および９１のオリゴヌクレオチドは、Ｋ５６２細胞においてカスパーゼ３／７活性を誘導する。したがって、配列番号５０、６４、９０、９１および９２のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【０２９１】
実施例１５．インビトロモデル：ＭＴＳアッセイを使用する生存力測定
実施例４に列挙される懸濁液細胞株Ｋ５６２およびＮａｍａｌｗａを、低コンフルエンスで６ウェル細胞培養プレートに播種し、どのサンプルも３連で存在するよう、実施例５に記載されるオリゴとともにインキュベートした。０時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間に、３つの１００μｌサンプルをどのウェルからも取り出し、透明な９６ウェル細胞培養プレートに移し、ウェルあたり１０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ溶液試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ溶液細胞増殖、Ｇ３５８２、Ｐｒｏｍｅｇａ）を、９６ウェル細胞培養プレートに加えた。プレートを、室温で３時間インキュベートし、その後、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ  Ｘ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用し、４９０ｎｍおよび６５０ｎｍで吸光度を測定した。
【０２９２】
データを処理し、グラフをエクセルで描いた（図２０および２３を参照）。図２０および２３に示されるように、配列番号６４、９０および９１のオリゴヌクレオチドは、Ｎａｍａｌｗａ細胞において、細胞生存力を低下させ、したがって、Ｋ５６２細胞が好ましい。
【０２９３】
実施例１６：インビボ分析：オリゴヌクレオチド化合物によるマウスＭｃｌ−１発現のアンチセンス阻害
オリゴヌクレオチドを、０．５ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／ｍｌで、滅菌ＮａＣｌ０．９％に溶解した。各動物を秤量し、研究開始の前に固有のＩＤ番号を用い、耳穿刺によって同定した。群の大きさは、すべての研究について５匹のマウスとした。動物に、体重１ｋｇあたり１０ｍｌ  ｉ．ｖ．のビヒクル中に製剤された化合物またはビヒクル単独を投与した。動物は、２週間毎日の５ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドまたは合計７用量の、１週間に３回の１０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチドを用いて。動物を、最後の投与の２４または４８時間後に屠殺し、大きな肝葉を細かく刻み、後のＲＮＡ単離、第１鎖合成およびリアルタイムＰＣＲ分析（図１５および１６参照）のためにＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ番号Ｒ−０９０１）に浸漬した。図１５および１６に示されるように、配列番号５０、６４、９０、９１および９２のオリゴヌクレオチドは、肝臓組織において、マウスＭｃｌ−１  ｍＲＮＡの顕著なダウンレギュレーションを示し、したがって、好ましい。
【０２９４】
実施例１７：ポリエチレングリコールを用いるオリゴマーのコンジュゲートの調製
配列番号９０、９１および６４として示される配列を有するオリゴマーを、常套的なホスホルアミダイト化学を使用してＦｍｏｃなどの保護基で保護されたヘキサン−１−アミンなどのアミノアルキル基を、オリゴマーの５’リン酸基と結合すること、得られた化合物を酸化すること、それらを脱保護することおよびそれらを精製して、それぞれ、式（ＩＡ）〜（ＩＣ）を有する官能化されたオリゴマーを達成することによって、５’末端に官能化する：
【０２９５】
【化６】
2011505798.tif 000016
［式中、太字の大文字は、ヌクレオシド類似体モノマーを表し、小文字は、ＤＮＡモノマーを表し、下付文字「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を表し、ＭｅＣは、５−メチルシトシンを表す］。
【０２９６】
活性化されたＰＥＧの溶液、例えば、式（ＩＩ）中に示されるもの：
【０２９７】
【化７】
2011505798.tif 000017
［式中、ＰＥＧ部分は、１２，０００の平均分子量を有し、ＰＢＳバッファー中の式（ＩＡ）および（ＩＢ）の化合物は各々、別個の容器中、室温で１２時間攪拌した。反応溶液を塩化メチレンを用いて３回抽出し、合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、溶媒を減圧下で蒸発させた。得られた残渣を、２回蒸留水に溶解し、陰イオン交換カラムにロードした。未反応のＰＥＧリンカーを水で溶出し、生成物をＮＨＨＣＯ３溶液で溶出する。純粋な生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥（ｌｙｐｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）すると、それぞれ、式（ＩＩＩＡ）および（ＩＩＩＢ）で示されるコンジュゲート配列番号９０、９１および６４が得られる：
【０２９８】
【化８】
2011505798.tif 000018
［式中、配列番号９０、９１および６４のオリゴマーの各々は、放出可能なリンカーを介して１２，０００の平均分子量を有するＰＥＧポリマーと結合している］。
【０２９９】
上記の方法を使用する、配列番号９０、９１および６４に示される配列を有するオリゴマーからなり得るＰＥＧポリマーコンジュゲートの化学構造が、式（ＩＶＡ）、（ＩＶＢ）および（ＩＶＣ）でそれぞれ示されている：
【０３００】
【化９】
2011505798.tif 000019
［式中、太字の大文字は、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡモノマーを表し、小文字は、ＤＮＡモノマーを表し、下付文字「ｓ」は、ホスホロチオエート結合を表し、ＭｅＣは、５−メチルシトシンを表す］。
【０３０１】
式（ＩＶＡ）、（ＩＶＢ）および（ＩＶＣ）で示されるコンジュゲートをそれぞれ作成するために、この方法において使用できる活性化されたオリゴマーは、式（ＶＡ）、（ＶＢ）および（ＶＣ）で示される化学構造を有する：
【０３０２】
【化１０】
2011505798.tif 000020
【０３０３】
実施例１８：インビトロモデル：カスパーゼ３／７誘導および細胞生存力に対する、Ｂｃｌ−２をターゲッティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドと、Ｍｃｌ−１をターゲッティングするアンチセンスオリゴヌクレオチドの組合せ。
カスパーゼ３／７誘導および細胞生存力の評価のために自然取り込みを使用して、１５ＰＣ３細胞において、２種の好ましいＭｃｌ−１ターゲッティングオリゴ配列番号６４および９１を、Ｂｃｌ−２ターゲッティングオリゴ配列番号１２８と組み合わせた。細胞を、各ウェルにおいて総最終濃度１０μＭを与える、各オリゴ５μＭの最終濃度を用いて処理した。組合せを、やはり各オリゴ５μＭの最終濃度を用いて、配列番号６４およびスクランブル対照オリゴ、配列番号９１およびスクランブル対照オリゴならびに配列番号１２８およびスクランブル対照オリゴとともにインキュベートされた細胞と比較した。
【０３０４】
【数１】
2011505798.tif 000021
【０３０５】
細胞生存力測定用には透明な９６ウェル細胞培養プレート、カスパーゼ３／７誘導測定用には白色ルミノメーター９６ウェル細胞培養プレートに、１５ＰＣ３細胞を、オリゴヌクレオチド組合せを含有し、トランスフェクション試薬は全く含まない、１００μｌの正常増殖培地中、ウェルあたり５０００個細胞の密度に、０日目に播種した。細胞を、３７℃で０、１、２および３日間インキュベートした。０、１、２および３日目で、透明な９６ウェル細胞培養プレートに、ウェルあたり１０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ溶液試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ溶液細胞増殖、Ｇ３５８２、Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加することによって細胞生存力を測定した。プレートを、室温で１時間インキュベートし、次いで、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｍｅｔｅｒ）（Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ  Ｘ、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、４９０ｎｍおよび６５０ｎｍで吸光度を測定した（図２８を参照）。３日目の結果に対して標準ｔ−検定を使用すると、配列番号６４＋配列番号１２８の組合せは、配列番号６４＋スクランブル対照よりも有意に（ｐ＜０．０５）低い細胞生存力を示し、配列番号１２８＋スクランブル対照よりも有意に（ｐ＜０．０５）低い細胞生存力は、Ｍｃｌ−１ターゲッティングオリゴ配列番号６４を、ｂｃｌ−２ターゲッティングオリゴと組み合わせることの利点を有する。配列番号９１＋配列番号１２８の組合せは、配列番号９１＋スクランブル対照よりも有意に（ｐ＜０．０５）低い細胞生存力を示し、配列番号１２８＋スクランブル対照よりも有意に（ｐ＜０．０５）低い細胞生存力は、Ｍｃｌ−１ターゲッティングオリゴ配列番号９１を、ｂｃｌ−２ターゲッティングオリゴと組み合わせることの利点を有する。１、２および３日目に、プレートを室温に冷却し、次いで、ルミノメータープレートに、ウェルあたり１００μｌのカスパーゼ３／７−Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、さらにプレートを室温で６０分間インキュベートし、その後、さらに１分の期間を経た後にＴｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ製のＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ機器において発光（ルシフェラーゼ活性）を記録することによってカスパーゼ３／７誘導を測定した。ルシフェラーゼ活性は、秒あたりの相対光単位（ＲＬＵ／ｓ）として測定される。データは、Ａｓｃｅｎｔソフトウェア２．６で処理し、グラフはエクセルで描いた（図２９参照）。カスパーゼ３／７活性について、スクランブル対照処理細胞に対して誘導を比較した。３日目の結果に対する標準ｔ−検定を使用すると、配列番号６４＋配列番号１２８の組合せは、配列番号６４＋スクランブル対照よりも有意に（ｐ＜０．０５）高いカスパーゼ３／７誘導を示し、配列番号１２８＋スクランブル対照よりも有意に（ｐ＜０．０５）高いカスパーゼ３／７誘導は、Ｍｃｌ−１ターゲッティングオリゴ配列番号６４を、ｂｃｌ−２ターゲッティングオリゴと組み合わせることの利点を有する。配列番号９１＋配列番号１２８の組合せは、配列番号９１＋スクランブル対照よりも高いカスパーゼ３／７誘導を示し、配列番号１２８＋スクランブル対照よりも有意に（ｐ＜０．０５）高いカスパーゼ３／７誘導は、Ｍｃｌ−１ターゲッティングオリゴ配列番号９１を、ｂｃｌ−２ターゲッティングオリゴと組み合わせる利点をもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年8月9日(2010.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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