(57)【要約】  本発明は、ＲＡなどの自己免疫疾患に対する薬剤として使用するのに好適なＰＡＤ阻害剤に関する。
2011524170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡＤの活性を阻害可能な化合物であって、ペプチド部分及びアミノ酸Ωにより担持されたチオール反応性求電子基を含み、ここで
（ａ）前記ペプチド部分が、少なくとも約５個の、かつ、約２０個は超えないアミノ酸を含み、
（ｂ）前記ペプチドが、モチーフ（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、又は（ｂ４）の少なくとも１つを含み、
（ｂ１）Ｇ／Ｓ／Ｔ−Ｄ／Ｓ−Ω−Ｄ／Ｇ／Ｓ−Ｇ／Ｓ
（ｂ２）Ｈ／Ｋ／Ｆ／Ｌ／Ｗ−Ｓ／Ｄ／Ｈ−Ω−Ｄ／Ｅ−Ｈ／Ｙ／Ｆ／Ｗ
（ｂ３）Ｙ／Ａ／Ｋ／Ｈ／Ｌ−Ｆ／Ｙ／Ｈ−Ω−Ｎ／Ｇ／Ｈ／Ｙ−Ｋ／Ａ／Ｆ
（ｂ４）Ｙ−Ｄ／Ｓ−Ω−Ｄ／Ｇ／Ｓ−Ｇ／Ｓ
ここで、Ωが、チオール反応性求電子基を担持するアミノ酸を表し、
（ｃ）ペプチド配列のＮ末端及び／又はＣ末端が修飾されていてもよい化合物。
【請求項２】
チオール反応性求電子基が、ハロゲノ−アミジン基、好ましくはフルオロアミジン又はクロロアミジンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ωがオルニチンである、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
（ｂ１）で定義されたモチーフがＧ／Ｓ／Ｔ−Ｄ−Ω−Ｄ−Ｇ／Ｓであり、
（ｂ２）で定義されたモチーフがＨ／Ｋ／Ｆ／Ｌ／Ｗ−Ｄ−Ω−Ｄ−Ｈ／Ｙ／Ｆ／Ｗである、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
モチーフが（ｂ４）である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
ペプチド配列が、７個のアミノ酸を含む又はからなる、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
ペプチド配列のＮ末端がアセチル基により修飾されており及び／又はＣ末端がアミドとして修飾されている、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
ペプチド配列のＮ末端が２−ナフチルスルホニル基の付加により修飾されおり、及び／又はＣ末端がＤ−アミノ酸の付加により修飾されていてもよい、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
ペプチド配列が、ＲがΩで置換されている配列番号４７〜７１、９２〜１０６である表４、５、９、又は１０のいずれか１つで特定されているペプチド配列を含む又はからなる、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
対照ペプチド配列Ｌ２に由来する化合物を除いて、表１１、１２若しくは１５のいずれか１つで又は実施例１で特定されている通りであり、好ましくは、配列番号１２〜２１、１０７〜１４３、好ましくは２０〜２１、１２０、１２２、１２７〜１４３、より好ましくは２０、２１、１２７、１２８、１３６〜１４３、さらにより好ましくは１３８、１４１、１４２、１４３を含む又はからなる、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
ペプチド部分が、実施例９の表２８で特定されている配列番号１２８〜１３５の配列を含む又はからなる、請求項１〜８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物及び少なくとも１つの賦形剤を含み、好ましくは、
局所投与、好ましくは関節への注射又は局所的経皮投与に好適である組成物。
【請求項１３】
免疫抑制剤及び／又は炎症抑制剤をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
薬剤として使用するための、請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物又は請求項１２〜１３のいずれかに記載の組成物であり、好ましくは前記薬剤が自己免疫障害の予防用、遅延用、及び／又は治療用であり、好ましくは前記自己免疫障害がＲＡである、組成物。
【請求項１５】
自己免疫障害の予防用及び／又は治療用薬剤を製造するための、請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物又は請求項１２〜１４のいずれかに記載の組成物の使用であり、好ましくは前記自己免疫障害がＲＡである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学分野、特に自己免疫疾患の予防及び治療、並びに最も具体的には関節リウマチ（ＲＡ、rheumatoid arthritis）に関する。本発明は、酵素学の分野にも関する。本発明は、酵素阻害剤を開発する方法に関しており、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＥＣ３．５．３．１５）酵素の強力な阻害剤を開示する。これらＰＡＤ阻害剤は、自己免疫疾患治療用の薬剤、特にＲＡ、乾癬、及び多発性硬化症（ＭＳ、multiple sclerosis）治療用の薬剤の調製に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
ＲＡは、世界人口の約１％に蔓延している一般的な自己免疫疾患である。ＲＡは、原因が多因子性であり、関節滑膜の炎症を特徴とし、その結果として関節の腫脹及び疼痛がもたらされる。この炎症過程は、軟骨破壊及び不可逆的な骨侵食に結びつくことが多い。
【０００３】
抗ＣＣＰ自己抗体は、ＲＡの発症及び永続化に重要な役割を果たす。まず、抗ＣＣＰ抗体は、ＲＡに対して高度に特異的であることが実証されている。いくつかの研究の結果により、これら抗体に血清反応陽性である各個体は、既にＲＡを有しているか又は今後この疾患を発症することになることが示されている。抗ＣＣＰ抗体の存在は（特に高力価のものが存在する場合）、浸食性疾患の転帰を予測する（Nijenhuis S, Zendman AJ, Vossenaar ER, Pruijn GJM, van Venrooij WJ (2004): Autoantibodies to citrullinated proteins in rheumatoid arthritis: clinical performance and biochemical aspects of an RA-specific marker. Clin Chim Acta 350: 17-34）。最後に、抗ＣＣＰ抗体が炎症部位で局所的に産生されることが実証されている。ＲＡ患者に由来する滑膜物質に見出される総ＩｇＧに対する抗ＣＣＰ抗体の割合は、同一患者の血清中の割合より著しく高いと考えられた（Masson-Bessiere C, Sebbag M, Durieux JJ, Nogueira L, Vincent C, Girbal-Neuhauser E, Durroux R, Cantagrel A, Serre G (2000) : In the rheumatoid pannus, anti-filaggrin autoantibodies are produced by local plasma cells and constitute a higher proportion of IgG than in synovial fluid and serum. Clin Exp Immunol 119: 544-552、Reparon-Schuijt CC, van Esch WJ, van Kooten C, Schellekens GA, de Jong BA, van Venrooij WJ, Breedveld FC, Verweij CL (2001): Secretion of anti-citrulline-containing peptide antibody by B lymphocytes in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 44: 41-47）。滑膜中に抗ＣＣＰ産生形質細胞が存在することにより、炎症部位でのＣＣＰ特異的Ｂ細胞の抗原駆動性成熟が示される。関節炎発生に抗ＣＣＰ抗体が役割を果たしていることに対する支持は、ＦｃγＲＩＩＢノックアウトマウスの研究によりもたらされる。活性ＲＡを罹患している患者由来の血漿又は血清に由来する免疫グロブリンは、炎症及び組織学的病変をこれらマウスに誘導することが実証された（Petkova SB, Konstantinov KN, Sproule TJ, Lyons BL, Awwami MA, Roopenian DC (2006): Human antibodies induce arthritis in mice deficient in the low-affinity inhibitory IgG receptor Fc gamma RIIB. J Exp Med 203: 275-80）。コラーゲン誘導性関節炎モデルでは、シトルリン化タンパク質に対する抗体は組織傷害を増強することが報告されており、これら抗体が自己免疫関節炎の病因に直接的に役割を果たしていることが実証された（Kuhn KA, Kulik L, Tomooka B, Braschler KJ, Arend WP, Robinson WH, Holers VM (2006): Antibodies against citrullinated proteins enhance tissue injury in experimental autoimmune arthritis. J Clin Invest 116: 961-73）。最近の論文で、Hill及び同僚らは、ＤＲ４−ＩＥトランスジェニックマウスにおいて、シトルリン化フィブリノゲンが、滑膜の過形成及びその後の関節強直を特徴とする関節炎を誘導し得ることを報告している。Ｔ細胞エピトープスキャニング及び抗体マイクロアレイ解析により、未修飾フィブリノゲンで免疫されたＤＲ４−ＩＥトランスジェニックマウス又はシトルリン化フィブリノゲンで免疫された野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは見出されなかったシトルリン特異的反応性の固有パターンが識別された。これらの観察により、シトルリン化されたフィブリノゲンは、ＲＡ関連ＭＨＣクラスII分子との関係において、関節炎誘発性として直接的に関連づけられている（Hill JA, Bell DA, Brintnell W, Yue D, Wehrli B, Jevnikar AM, Lee DM, Hueber W, Robinson WH, Cairns E (2008): Arthritis induced by posttranslationally modified (citrullinated) fibrinogen in DR4-IE transgenic mice. J Exp Med 205: 967-79）。
【０００４】
この抗原駆動性機序と一致して、炎症性ＲＡ滑膜中にシトルリン化タンパク質が存在することが実証されている。フィブリンのα及びβ鎖のシトルリン化型の存在は、ＲＡ患者の滑膜中でのみではないことが報告されている（Masson-Bessiere C, Sebbag M, Girbal-Neuhauser E, Nogueira L, Vincent C, Senshu T, Serre G (2001): The major synovial targets of the rheumatoid arthritis-specific antifilaggrin autoantibodies are deiminated forms of the alpha- and beta-chains of fibrin. J Immunol 166: 4177-4184）。Ｓａ抗原の分子的特徴づけにより、Ｓａは、シトルリン化ビメンチンであると同定された。ＲＡ自己抗体によって特異的に標的とされるＳａ抗原は、炎症性滑膜中に存在することが報告されている。炎症性滑膜中に豊富に存在する単球由来マクロファージのカルシウム流入は、ビメンチンのシトルリン化に結びつき、ビメンチンは、炎症促進性シグナル経路に応答してマクロファージにより分泌される場合があるという事実は、ＲＡ発症におけるシトルリン化ビメンチンの役割と一致している（Vossenaar ER, van Venrooij WJ (2004): Citrullinated proteins: the sparks that may ignite the fire in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 6: 107-111）。フィブリン及びビメンチンに加えて、他のシトルリン化自己抗原が、炎症性関節中で産生される場合がある。プロテオミクス手法を用いて、フィブリノゲンを含む１３個の自己抗原性シトルリン化タンパク質が、ＲＡ患者の滑膜組織で同定された（Matsuo K, Xiang Y, Nakamura H, Masuko K, Yudoh K, Noyori K, Nishioka K, Saito T, Kato T (2006): Identification of novel citrullinated autoantigens of synovium in rheumatoid arthritis using a proteomic approach. Arthritis Res Ther 8: R175）。シトルリン化酵素ＰＡＤ４（下記を参照）が、死滅しつつある顆粒球で活性化されることが報告され、これは核タンパク質のシトルリン化に結びつく（Nakashima K, Hagiwara T, Yamada M (2002): Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J Biol Chem, 277: 49562-49568）。炎症性滑膜では、アポトーシス性の顆粒球が適切に除去されない可能性が高く、これは全身性エリテマトーデス患者で以前に観察された現象であり（Ren Y, Tang J, Mok MY, Chan AW, Wu A, Lau, CS (2003): Increased apoptotic neutrophils and macrophages and impaired macrophage phagocytic clearance of apoptotic neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 48: 2888-2897）、その結果として、シトルリン化タンパク質は免疫系に曝されるようになる場合がある。
【０００５】
シトルリン化とは、アルギニン残基のシトルリン残基への翻訳後変換であり、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ、peptidylarginine deiminase）により触媒される。ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ；ＥＣ３．５．３．１５）酵素は、タンパク質のアルギニン残基のシトルリン残基への変換を触媒する。シトルリンのｔＲＮＡは存在せず、タンパク質にシトルリン残基が存在するのは、全く翻訳後修飾の結果である。哺乳動物（ヒト、マウス、及びラット）では、各々が別個の遺伝子によりコードされている５つのＰＡＤアイソタイプ（ＰＡＤ１〜ＰＡＤ６；「ＰＡＤ４」及び「ＰＡＤ５」は同じアイソタイプに使用される）が同定されている（Vossenaar ER, Zendman AJW, van Venrooij WJ, Pruijn,GJM (2003b): PAD, a growing family of citrullinating enzymes: Genes, features and involvement in disease. Bioessays 25: 1106-1118）。これら酵素はすべて、活性がＣａ２＋の存在に強く依存しており、遊離Ｌ−アルギニンを遊離Ｌ−シトルリンに変換することはできない。遊離Ｌ−アルギニンは、真核生物では一酸化窒素合成酵素（ＥＣ１．１４．１３．３９）によって、又は細菌ではアルギニンデイミナーゼ（ＥＣ３．５．３．６）によって、遊離Ｌ−シトルリンに変換することができる。これらの酵素はＣａ２＋依存性ではない。
【０００６】
高度に相同的なＰＡＤ酵素間の最も顕著な相異は、それらの組織特異的発現である。表皮においては、ＰＡＤ１（異名：ＰＡＤＩ、ＰＡＤＩ型）は、ケラチノサイト分化の最終段階中のケラチンフィラメントのシトルリン化に関与しており、これは角化膜の再構築に重要である。表皮におけるシトルリン化の別の部位は毛包であり、これは、ＰＡＤ３（異名  ＰＡＤIII、ＰＡＤIII型）及びその天然基質トリコヒアリン（ＴＨＨ）を含有する。ＴＨＨは、内毛根鞘細胞及び毛包の髄質層の、及びより少ない程度であるが他の特化した上皮の主要な構造タンパク質である。最も最近に同定されたＰＡＤアイソタイプ、ＰＡＤ６（異名：ｅＰＡＤ）は、マウス卵母細胞の細胞質シートに見出されており、これは初期胚形成に重要な役割を果たす。そのヒトオルソログの発現は、卵巣、精巣、及び末梢血白血球に限定されていることが見出された（Chavanas S, Mechin MC, Takahara H, Kawada A, Nachat R, Serre G, Simon M (2004): Comparative analysis of the mouse and human peptidylarginine deiminase gene clusters reveals highly conserved non-coding segments and a new human gene, PADI6. Gene 330:19-27）。元々このＰＡＤアイソタイプはｅＰＡＤと呼ばれていたが、他のＰＡＤの系統的付番に基づいて、このアイソタイプはＰＡＤ６と改名された（Vossenaar ER, Zendman AJW, van Venrooij WJ, Pruijn,GJM (2003b): PAD, a growing family of citrullinating enzymes: Genes, features and involvement in disease. Bioessays 25: 1106-1118）。最も広く発現されるアイソタイプ、ＰＡＤ２（異名  ＰＡＤII、ＰＡＤII型、ＰＡＤ−Ｈ１９）は、骨格筋、脳、脾臓、分泌腺、及びマクロファージなどの多くの異なる組織に存在する。この幅広い発現パターンにもかかわらず、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、myelin basic protein）及びビメンチンのみが、天然基質として同定された。ＭＳ患者は、ＭＢＰに対する自己免疫反応を発生する。ＭＢＰはミエリン鞘に豊富にあるタンパク質であり、そのシトルリン化は、中枢神経系の発生中に生じる。ビメンチンのシトルリン化は、ヒト及びマウスのマクロファージのカルシウムイオノフォア誘導性アポトーシス中に観察され、上述のように、シトルリン化ビメンチンは、ＲＡ特異的抗Ｓａ自己抗体の標的であることが示された。主として細胞の細胞質中にすべてが局在化される上記で考察したＰＡＤとは対照的に、ＰＡＤ４アイソタイプ（異名：ＰＡＤIV、ＰＡＤIV型、ＨＬ−６０ＰＡＤ、ＰＡＤＶ、ＰＡＤＶ型、ＰＡＤＩ４）は、核内に局在化される。ＰＡＤ４の核移行シグナルは、タンパク質のＮ末端領域に見出された。ＰＡＤ４は、主として末梢血顆粒球及び単球で発現される。核内のＰＡＤ４の基質は、ヒストンコアタンパク質（Ｈ２Ａ、Ｈ３、及びＨ４）、及びリボソーム構築、核細胞質間輸送、及び中心体複製で機能する核タンパク質であるヌクレオフォスミン／Ｂ２３である。
【０００７】
これらの発現プロファイルに基づくと、２つのＰＡＤアイソタイプ、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４が、ＲＡにおける免疫応答に関連するタンパク質シトルリン化に役割を果たすシトルリン化酵素の候補である。ＰＡＤ２及びＰＡＤ４は、炎症性滑膜に豊富に存在する細胞である単球、マクロファージ、及び顆粒球に存在する（Chapuy-Regaud et al., 2003）。
【０００８】
ＰＡＤは、局所的カルシウムイオン濃度がそれらの活性化に必要な濃度より低いため、細胞質ゾル又は核質中では通常不活性酵素として存在する。しかしながら、細胞死中に原形質膜の完全性が失われ、その結果として細胞外空間からのＣａ２＋流入がもたらされ（細胞外Ｃａ２＋濃度は約１０−３Ｍであり、ＰＡＤ活性化に十分である）、その後の細胞内ＰＡＤが活性化される。或いは又は同時に、活性化されたＰＡＤ酵素は、死滅しつつある細胞から漏出し、細胞外タンパク質のシトルリン化を触媒する場合がある。
【０００９】
数年前に、ヒトＰＡＤ４タンパク質の結晶構造が報告された（Arita K, Hashimoto H, Shimizu T, Nakashima K, Yamada M, Sato M (2004): Structural basis for Ca(2+)-induced activation of human PAD4. Nat Struct Mol Biol 11: 777-783）。カルシウムイオンの存在下及び非存在下におけるＰＡＤ４の結晶構造と、基質が結合した及び基質が結合していない触媒的に不活性な変異体の結晶構造とを比較することにより、５つのＣａ２＋結合部位が明らかになり、Ｃａ２＋結合が、活性部位溝を形成する立体構造変化を誘導することが示された。この構造データにより、活性部位溝中の他のアルギニン修飾酵素の構造情報に部分的に基づいて触媒部位のコアを表すと以前に提案されていた触媒トライアド、Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ／Ａｓｐの配置が確認された。この保存パターンと、基質結合様式がジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ及びＬ−アルギニンデイミナーゼなどの他のアルギニン変換酵素の結合様式に類似するという仮定とに基づいて、触媒機序が提案された（Shirai H, Blundell TL, Mizuguchi K (2001): A novel superfamily of enzymes that catalyze the modification of guanidino groups. Trends Biochem Sci 26: 465-468）。主なプレーヤーは、アルギニンのグアニジウム基の炭素原子に求核攻撃を仕掛けるＣｙｓ−６４５、及び一般塩基として機能するＨｉｓ−４７１である。
【００１０】
上記で例示したように、抗ＣＣＰ抗体及びそれらの抗原性標的がＲＡの病態生理学に役割を果たすことを支持する根拠は増加しつつある。ＲＡの病因におけるシトルリン化タンパク質の役割は、シトルリン化ペプチドとＲＡ関連ＨＬＡハプロタイプとのシトルリン依存性相互作用によりさらに支持される（Hill JA, Southwood S, Sette A, Jevnikar AM, Bell DA, Cairns E (2003): Cutting Edge: The conversion of arginine to citrulline allows for a high-affinity peptide interaction with the rheumatoid arthritis-associated HLA-DRB1*0401 MHC class II molecule. J. Immunol 171: 538-541）。上記で示したように、同じグループによる最近のデータは、ＤＲ４−ＩＥトランスジェニックマウスでは、シトルリン化フィブリノゲンによって関節炎が実際に誘導されることを示している（Hill JA, Bell DA, Brintnell W, Yue D, Wehrli B, Jevnikar AM, Lee DM, Hueber W, Robinson WH, Cairns E (2008): Arthritis induced by posttranslationally modified (citrullinated) fibrinogen in DR4-IE transgenic mice. J Exp Med 205: 967-79）。まとめると、これらのデータは、ＲＡにおける抗ＣＣＰ抗体の特異的産生が、シトルリン化抗原が免疫系に曝露するレベル及び／又はシトルリン化抗原が免疫系により認識されるレベルで媒介されることを示す。いったん抗ＣＣＰ抗体が産生されれば、滑液中のシトルリン化タンパク質との免疫複合体の形成は、炎症過程の進行を引き起こす場合がある。抗ＣＣＰ抗体がＲＡの病因に役割を果たすことは、ＲＡを罹患している患者のＢリンパ球枯渇実験の結果により支持されている（Cambridge G, Leandro MJ, Edwards JC, Ehrenstein MR, Salden M, Bodman-Smith MD, Webster AD (2003): Serologic changes following B lymphocyte depletion therapy for rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 48: 2146-2154）。
【００１１】
ＰＡＤ酵素及びそれらの産物であるシトルリン化タンパク質は、他のいくつかのヒト疾患、特に乾癬、ＭＳ、及び全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患に役割を果たすことが知られている。
【００１２】
乾癬では、ケラチノサイトが非常に急速に増殖し、わずか約４日で基底層から表面に移動する。皮膚は、これら細胞を十分に速く脱落させることができず、したがってそれらは厚い乾燥パッチ又はプラークに蓄積する。正常なケラチノサイトでは、ケラチンＫ１が、最終分化中にＰＡＤ１によってシトルリン化される。この過程は、ケラチンフィラメントをより小型にし、表皮の正常な角化過程に不可欠である。乾癬性過剰増殖プラーク中のケラチノサイトは、シトルリン化ケラチンＫ１を含有しない（Ishida-Yamamoto A, Senshu T, Takahashi H, Akiyama K, Nomura K, Iizuka H (2000): Decreased deiminated keratin Kl in psoriatic hyperproliferative epidermis. J Invest Dermatol 114: 701-705）。細胞増殖の増加がＰＡＤによる適切なシトルリン化を妨げるのか、又はＰＡＤの不活性がケラチノサイトの過剰増殖及び蓄積を可能にするのかは明らかではない。作用機序は未知であるが、乾癬性表皮の異常なシトルリン化は、ＰＡＤ１と明らかに関係している。
【００１３】
ＭＳは、ミエリン鞘の自己免疫媒介性破壊を特徴とするＣＮＳの慢性炎症性障害である。ミエリン鞘の細胞は、約３：１比率の脂質タンパク質複合体で構成される軸索周囲の多重二重層構造を形成する。主な２つのタンパク質、ＭＢＰ及びプロテオリピドタンパク質が、タンパク質画分の８５％を占める。ＭＢＰは、高度にカチオン性のタンパク質であり、ホスファチジルセリンなどの負荷電リン脂質との強力な相互作用を形成することができる。健康なヒト成人６人（１９人中）のＭＢＰ分子のおよそ１８％で、アルギニンがシトルリン化される（Wood DD, Moscarello MA (1989): The isolation, characterization, and lipid-aggregating properties of a citrulline containing myelin basic protein. J Biol Chem 264: 5121-5127、Wood DD, Bilbao JM, O'Connors P, Moscarello MA (1996): Acute multiple sclerosis (Marburg type) is associated with developmentally immature myelin basic protein. Ann Neurol 40: 18-24）。残りのＭＢＰ分子はシトルリンを含有しない。ＭＳの患者では、ＭＢＰ−ｃｉｔ６の割合は、総ＭＢＰの４５％に増加する。ＭＢＰ−ｃｉｔ６の正味陽電荷の減少は、ＭＢＰ分子の部分的な変性を引き起こし、リン脂質とそれらの相互作用を弱める（Boggs JM, Rangaraj G, Koshy KM, Ackerley C, Wood DD, Moscarello MA (1999): Highly deiminated isoform of myelin basic protein from multiple sclerosis brain causes fragmentation of lipid vesicles. J Neurosci Res 57: 529-535、Pritzker LB, Joshi S, Gowan JJ, Harauz G & Moscarello MA (2000): Deimination of myelin basic protein. 1. Effect of deimination of arginyl residues of myelin basic protein on its structure and susceptibility to digestion by cathepsin D. Biochemistry 39: 5374-5381）。ＭＢＰ−ｃｉｔ６は、非シトルリン化ＭＢＰより迅速に脂質複合体を形成することができるが、形成された複合体は、非シトルリン化ＭＢＰと形成された複合体ほど高密度にパックキングされない（Boggs JM, Rangaraj G, Koshy KM, Ackerley C, Wood DD, Moscarello MA (1999): Highly deiminated isoform of myelin basic protein from multiple sclerosis brain causes fragmentation of lipid vesicles. J Neurosci Res 57: 529-535、Beniac DR, Wood DD, Palaniyar N, Ottensmeyer FP, Moscarello MA, Harauz G (2000): Cryoelectron microscopy of protein-lipid complexes of human myelin basic protein charge isomers differing in degree of citrullination. J Struct Biol 129: 80-95）。ＭＢＰ−ｃｉｔ６は、カテプシンＤによって、非シトルリン化ＭＢＰより４倍早く分解される（Cao L, Goodin R, Wood D, Moscarello MA, Whitaker IN (1999): Rapid release and unusual stability of immunodominant peptide 45-89 from citrullinated myelin basic protein. Biochemistry 38: 6157-6163）。急性の劇症ＭＳ（マールブルク型）のまれな症例では、ＭＢＰ分子の８０％が極度にシトルリン化される（ＭＢＰｃｉｔ１８）（Wood DD, Bilbao JM, O'Connors P, Moscarello MA (1996): Acute multiple sclerosis (Marburg type) is associated with developmentally immature myelin basic protein. Ann Neurol 40: 18-24）。重度に変性したＭＢＰ−ｃｉｔ１８は、正常ＭＢＰより４５倍早くカテプシンＤにより分解される（Cao L, Goodin R, Wood D, Moscarello MA, Whitaker IN (1999): Rapid release and unusual stability of immunodominant peptide 45-89 from citrullinated myelin basic protein. Biochemistry 38: 6157-6163）。抗癌剤タキソールの活性成分であるパクリタキセルによる臨床試験が進行中である（O'Connor PW, Lee L, Moscarello MA, Hunter W, Narayana PA & Wolinsky JS (1999): A phase I study of micellar paclitaxel in the treatment of secondary progressive multiple sclerosis [abstract]. Ann Neurol 46: 470）。低用量のパクリタキセルは、ＰＡＤ２によるＭＢＰ��シトルリン化をインビトロで阻害することができる（Pritzker LB, Moscarello MA (1998): A novel microtubule independent effect of paclitaxel: the inhibition of peptidylarginine deiminase from bovine brain. Biochim Biophys Acta 1388: 154-160）。パクリタキセルによる治療は臨床症状を軽減し、損傷を受けた鞘の再有髄化を誘導し(Moscarello et al., 2002)、脱髄疾患の候補因子としてＰＡＤの重要性が考え得ることを強調する(Moscarello et al., 2002 2x)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Nijenhuis S, Zendman AJ, Vossenaar ER, Pruijn GJM, van Venrooij WJ (2004): Autoantibodies to citrullinated proteins in rheumatoid arthritis: clinical performance and biochemical aspects of an RA-specific marker. Clin Chim Acta 350: 17-34
【非特許文献２】Masson-Bessiere C, Sebbag M, Durieux JJ, Nogueira L, Vincent C, Girbal-Neuhauser E, Durroux R, Cantagrel A, Serre G (2000) : In the rheumatoid pannus, anti-filaggrin autoantibodies are produced by local plasma cells and constitute a higher proportion of IgG than in synovial fluid and serum. Clin Exp Immunol 119: 544-552
【非特許文献３】Reparon-Schuijt CC, van Esch WJ, van Kooten C, Schellekens GA, de Jong BA, van Venrooij WJ, Breedveld FC, Verweij CL (2001): Secretion of anti-citrulline-containing peptide antibody by B lymphocytes in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 44: 41-47
【非特許文献４】Petkova SB, Konstantinov KN, Sproule TJ, Lyons BL, Awwami MA, Roopenian DC (2006): Human antibodies induce arthritis in mice deficient in the low-affinity inhibitory IgG receptor Fc gamma RIIB. J Exp Med 203: 275-80
【非特許文献５】Kuhn KA, Kulik L, Tomooka B, Braschler KJ, Arend WP, Robinson WH, Holers VM (2006): Antibodies against citrullinated proteins enhance tissue injury in experimental autoimmune arthritis. J Clin Invest 116: 961-73
【非特許文献６】Hill JA, Bell DA, Brintnell W, Yue D, Wehrli B, Jevnikar AM, Lee DM, Hueber W, Robinson WH, Cairns E (2008): Arthritis induced by posttranslationally modified (citrullinated) fibrinogen in DR4-IE transgenic mice. J Exp Med 205: 967-79
【非特許文献７】Masson-Bessiere C, Sebbag M, Girbal-Neuhauser E, Nogueira L, Vincent C, Senshu T, Serre G (2001): The major synovial targets of the rheumatoid arthritis-specific antifilaggrin autoantibodies are deiminated forms of the alpha- and beta-chains of fibrin. J Immunol 166: 4177-4184
【非特許文献８】Vossenaar ER, van Venrooij WJ (2004): Citrullinated proteins: the sparks that may ignite the fire in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther 6: 107-111
【非特許文献９】Matsuo K, Xiang Y, Nakamura H, Masuko K, Yudoh K, Noyori K, Nishioka K, Saito T, Kato T (2006): Identification of novel citrullinated autoantigens of synovium in rheumatoid arthritis using a proteomic approach. Arthritis Res Ther 8: R175
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【非特許文献１１】Ren Y, Tang J, Mok MY, Chan AW, Wu A, Lau, CS (2003): Increased apoptotic neutrophils and macrophages and impaired macrophage phagocytic clearance of apoptotic neutrophils in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 48: 2888-2897
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【非特許文献１４】Chapuy-Regaud et al., 2003
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【非特許文献２０】Ishida-Yamamoto A, Senshu T, Takahashi H, Akiyama K, Nomura K, Iizuka H (2000): Decreased deiminated keratin Kl in psoriatic hyperproliferative epidermis. J Invest Dermatol 114: 701-705
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【非特許文献２４】Pritzker LB, Joshi S, Gowan JJ, Harauz G & Moscarello MA (2000): Deimination of myelin basic protein. 1. Effect of deimination of arginyl residues of myelin basic protein on its structure and susceptibility to digestion by cathepsin D. Biochemistry 39: 5374-5381
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【非特許文献２７】O'Connor PW, Lee L, Moscarello MA, Hunter W, Narayana PA & Wolinsky JS (1999): A phase I study of micellar paclitaxel in the treatment of secondary progressive multiple sclerosis [abstract]. Ann Neurol 46: 470
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【非特許文献２９】Moscarello et al., 2002
【非特許文献３０】Moscarello et al., 2002 2x
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
シトルリン化タンパク質（のレベルの変化）に関連する自己免疫疾患に介入するのに有望な標的はＰＡＤである。例えばＲＡ炎症性滑膜の炎症部位でシトルリン化タンパク質の産生を阻止することにより、免疫複合体の形成が妨害され、したがって患部関節の炎症過程の進行が阻害されると予想される。滑膜中のシトルリン化タンパク質には明白な生理学的な役割がないため、それらの産生の妨害は、重度の副作用には結びつかないと予想される。
【００１６】
したがって、好ましくは自己免疫反応が望ましくない部位、例えば炎症性滑膜でＰＡＤ活性を特異的に阻害することを目的とした治療介入は、ＲＡ患者の関節破壊過程に対して高度に特異的だろう。
【００１７】
ＲＡと同様に、ＭＳを罹患している患者においても、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、myelin basic protein）の過剰な又は異常なシトルリン化は、ＰＡＤ阻害剤の投与によって防止することができ、その結果としてミエリンシートにより高密度にパッキングされた脂質複合体、より良好なＭＢＰのフォールディング、及びカテプシンＤによる分解を受けにくいＭＢＰの産生がもたらされるだろう。現在、低用量のパクリタキセルが、ＰＡＤ２によるＭＢＰのシトルリン化を阻害するために臨床試験で使用されている。パクリタキセルによる治療は臨床症状を軽減し、損傷を受けた鞘の再有髄化を誘導する(Moscarello et al., 2002)。しかしながら、パクリタキセルは、低用量でさえ多くの有害副作用を有する非常に毒性の高い薬物である。パクリタキセル及びタキソール化合物は、特異的ＰＡＤ阻害分子ではない。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
現在、ＲＡ、ＭＳ、ＳＬＥ、又は乾癬などの他の自己免疫障害の治療に好適な特異的ＰＡＤ阻害剤は開示されていない。本発明は、可逆的に又は好ましくは不可逆的にＰＡＤ酵素、特にヒトＰＡＤ２及びＰＡＤ４酵素を阻害可能な分子を提供することを目的とする。
【００１９】
ベンゾイルＬ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ、Benzoyl-L-arginine ethyl ester）は、ＰＡＤ活性を決定するための基質として広範に使用されている。関連化合物ベンゾイルＬ−アルギニンアミドは、ＰＡＤ４基質複合体の結晶構造を決定するための基質として使用された。これは、ＰＡＤが遊離Ｌ−アルギニンをＬ−シトルリンに変換しないが、ＢＡＥＥと化学的に関連する化合物は、活性部位溝に適合し、基質分子の結合を競合する可能性があることを示唆する。この点で特に興味深いのは、触媒トライアドの一部であるシステインであり、求核性触媒作用に必要不可欠な役割を果たすと提唱されている。触媒溝の四面体付加物を安定させることによって、シトルリン化産物の形成を防止することができる。したがって、本発明は、好ましくは低用量の阻害剤で阻害の達成を成功させるために、活性部位システインを共有結合により修飾することに基づくＰＡＤ阻害剤を提供する。開示された阻害剤は、可逆的な様式でＰＡＤを阻害することができ、好ましくは不可逆的に及び／又は共有結合で、ＰＡＤ酵素に、最も好ましくは活性部位触媒システイン残基に結合するだろう。
【００２０】
化合物
第１の態様では、本発明は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）を阻害可能な新しい分子又は化合物を提供する。ＰＡＤの阻害は、本明細書中では、実施例４、５、６、及び／又は７のいずれか１つで提供されるようなアッセイを使用して、インビトロでＰＡＤの活性を阻害する化合物の能力として定義される。「阻害」という用語は、当技術分野で認識されており、ＰＡＤ活性（ＰＡＤ２及び／又はＰＡＤ４の活性）の下方制御又は抑制を、２つの組み合わせで又は別々に指す。好ましくは、この阻害は、好ましくは少なくとも０．００００００１ｍＭ、又は０．０００００１ｍＭ，０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、０．５、１、２、５、若しくは１０ｍＭの前記化合物の最小濃度を使用して、前記化合物の存在しない前記酵素の初期活性の少なくとも５％の阻害を意味する。ＰＡＤ酵素の活性は、実施例６に記載のように測定される。より好ましくは、阻害は、少なくとも１０％の阻害、さらにより好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％以上の阻害を意味する。最も好ましくは、ＰＡＤ２及び／又はＰＡＤ４活性は検出可能ではない。
【００２１】
本明細書中で定義された本発明の任意の化合物は、本明細書中で定義されたＰＡＤの活性を阻害することができ、ＲＡなどの自己免疫障害を予防、治療、及び／又は遅延させるために使用される薬剤として機能することが予想される。
【００２２】
好ましくは、本発明の化合物は、ＰＡＤ、より好ましくはＰＡＤ２及び／又はＰＡＤ４の活性を阻害可能である。この化合物は、好ましくは、ペプチド部分及び求電子基、好ましくはアミノ酸Ωにより担持されたチオール反応性求電子基を含み、
（ａ）該ペプチドは、少なくとも約５個のアミノ酸及び多くとも約２０個のアミノ酸を含み、
（ｂ）該ペプチド部分は、モチーフ（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、又は（ｂ４）の少なくとも１つを含み、
（ｂ１）Ｇ／Ｓ／Ｔ−Ｄ／Ｓ−Ω−Ｄ／Ｇ／Ｓ−Ｇ／Ｓ
（ｂ２）Ｈ／Ｋ／Ｆ／Ｌ／Ｗ−Ｓ／Ｄ／Ｈ−Ω−Ｄ／Ｅ−Ｈ／Ｙ／Ｆ／Ｗ
（ｂ３）Ｙ／Ａ／Ｋ／Ｈ／Ｌ−Ｆ／Ｙ／Ｈ−Ω−Ｎ／Ｇ／Ｈ／Ｙ−Ｋ／Ａ／Ｆ
（ｂ４）Ｙ−Ｄ／Ｓ−Ω−Ｄ／Ｇ／Ｓ−Ｇ／Ｓ
ここで、Ωは、求電子基、好ましくはチオール反応性求電子基を担持するアミノ酸を表し、
（ｃ）該ペプチド配列のＮ末端及び／又はＣ末端は修飾されていてもよい。
【００２３】
該ペプチド部分は、ペプチド配列により表されている。したがって、本発明により包含されるペプチド配列は、上記で定義されている（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、及び／又は（ｂ４）モチーフを有する配列からなる又は含み得る。したがって、本発明により包含されるペプチド配列は、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、及び（ｂ４）モチーフのうちの２つ又は３以上の並置であってもよい。しかしながら、好ましいペプチド配列は、（ｂ１）又は（ｂ２）又は（ｂ３）又は（ｂ４）モチーフを含む又はからなり、さらにより好ましくは単一の（ｂ１）又は（ｂ２）又は（ｂ３）又は（ｂ４）モチーフからなる。さらにより好ましくは、ペプチド配列は、（ｂ１）又は（ｂ２）又は（ｂ４）モチーフからなるか又は含む。
【００２４】
好ましい化合物は、配列番号１２〜２１、１０７〜１４３、好ましくは２０〜２１、１２０、１２２、１２７〜１４３、より好ましくは２０、２１、１２７、１２８、１３６〜１４３、さらにより好ましくは１３８、１４１、１４２、１４３を含む又はからなる。
【００２５】
（ｂ１）モチーフを含む又はからなるさらにより好ましいペプチド配列は、実施例１に見出される。対照として使用されるＬ１の配列を除いた表２の全ペプチド配列を参照されたい（配列番号１〜１０、及びＬ１は配列番号１１）。上記で定義されている本発明の対応する阻害剤を取得するために、該表の各ペプチド配列では、ＲはΩに置き換えられるべきである。したがって、好ましいペプチド配列は、配列番号１〜１０を含む又はからなり、そこでは、ＲはΩに置き換えられている。好ましい阻害剤は、実施例１にさらに見出される（配列番号１２〜２０）。したがって、好ましい阻害剤は、配列番号１２〜２０、配列番号１２６、１２７、１４２を含む又はからなる。より好ましい阻害剤は、配列番号２０、１２７、１４２を含む又はからなる。さらにより好ましい阻害剤は、配列番号２０を含む又はからなり、そこではＣ末端がアミドの付加により修飾されている。最も好ましい阻害剤は、配列番号１４２を含む又はからなる。
【００２６】
好ましいペプチド配列は、表５に特定されている（ｂ２）モチーフを含む又はからなり、少なくともＰＡＤ４を特異的に阻害することになる化合物を形成すると予想される。全ペプチド配列は表５を参照されたい（配列番号４７〜７１）。上記で定義されている本発明の対応する阻害剤を取得するために、該表の各ペプチド配列では、ＲはΩに置き換えられるべきである。したがって、好ましいペプチド配列は、配列番号４７〜７１を含む又はからなり、そこでは、ＲはΩに置き換えられている。好ましい阻害剤は、配列番号１０７〜１２５、配列番号１２９〜１４１を含む又はからなる。より好ましい阻害剤は、配列番号１２０、１２２、１２９〜１４１を含む又はからなる。さらにより好ましい阻害剤は、配列番号１３６、１３７、１３８、１３９、１４０を含む又はからなる。最も好ましい阻害剤は、配列番号１３８を含む又はからなる。
【００２７】
好ましいペプチド配列は、表９に特定されている（ｂ３）モチーフを含む又はからなり、少なくともＰＡＤ２を特異的に阻害することになる化合物を形成すると予想される。全ペプチド配列は、対照として使用されるＬ１の配列を除いて、表９を参照されたい（配列番号９２〜１０６及び対照Ｌ１として配列番号１１）。上記で定義されている本発明の対応する阻害剤を取得するために、該表の各ペプチド配列では、ＲはΩに置き換えられるべきである。したがって、好ましいペプチド配列は、配列番号９２〜１０６を含む又はからなり、そこでは、ＲはΩに置き換えられている。
【００２８】
表１０に特定された好ましいペプチド配列（表５及び９で既に特定されたものから選択される）は、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４を特異的に阻害することになる化合物を形成すると予想される。対照として使用されるＬ１及びＬ２の配列を除いた、表１０の全ペプチド配列を参照されたい。上記で定義されている本発明の対応する阻害剤を取得するために、該表の各ペプチド配列では、ＲはΩに置き換えられるべきである。
【００２９】
好ましい阻害剤はペプチド部分を含み、前記ペプチド部分は（ｂ４）モチーフを含む又はからなり、配列番号２１、１２８、１４３を含む又はからなる配列により表される。より好ましい阻害剤は、配列番号１４３を含む又はからなる配列により表される。さらにより好ましい阻害剤は、配列番号２１を含む又はからなり、そこではＣ末端がアミドの付加により修飾されている。この阻害剤は、インビボ動物モデルにおいて著しい阻害活性を示すことが示されたため、好ましい（実施例１０を参照）。
【００３０】
本発明の好ましい化合物は、それらの（ｂ１）モチーフに２つのＤ残基を有する。対応するペプチド配列は、Ｇ／Ｓ／Ｔ−Ｄ−Ω−Ｄ−Ｇ／Ｓからなるか又は含む。
【００３１】
本発明の他の好ましい化合物は、それらの（ｂ２）モチーフに２つのＤ残基を有する。対応するペプチド配列は、Ｈ／Ｋ／Ｆ／Ｌ／Ｗ−Ｄ−Ω−Ｄ−Ｈ／Ｙ／Ｆ／Ｗからなるか又は含む。
【００３２】
さらにより好ましい化合物は、ペプチド配列が表４、５、９、又は１０のいずれか１つに特定されているものである（対照として使用されるＬ１又はＬ２の配列を除いた、これらの表の全ペプチド配列を参照されたい。上記で定義されている本発明の対応する阻害剤を取得するために、該表の各ペプチド配列では、ＲはΩに置き換えられるべきである）。
【００３３】
さらにより好ましい化合物は、化合物が表１１、１２、又は１５のいずれか１つに特定されているものである（対照として使用されるＬ２に由来する配列を除く）。表１５の阻害剤は、配列番号１０７〜１１１により表される。好ましい阻害剤は、配列番号１０７〜１１１を含む又はからなる。
【００３４】
これら化合物の各々は、ＰＡＤ２及び／又はＰＡＤ４阻害剤であることを明確に特徴とする。
【００３５】
本発明による化合物は、少なくとも約５個及び多くとも約３５個、好ましくは多くとも約２５、２０、１５、１０、９、８、７個のアミノ酸のペプチド部分を含み、ＰＡＤ酵素と相互作用可能であり、１ｎＭ〜１ｍＭ、好ましくは１ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは１ｎＭ〜１０μＭの親和性（Ｋｍ）を有することができる。本発明では、本発明者らは、化合物に特異性を付与するのに７個のアミノ酸長が十分であり（ＰＡＤ酵素のみ、好ましくはＰＡＤ２及び／又はＰＡＤ４が阻害され、他の酵素クラスは阻害されないだろう）、強力なＰＡＤ２及び／又はＰＡＤ４阻害剤であることを明確に実証した。そのような化合物は化学的に合成が容易であるため、そのような長さは非常に魅力的である。したがって、本発明による化合物は、少なくとも５個及び多くとも３５個、好ましくは多くとも３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７個のアミノ酸のペプチド部分を含み、本明細書中に定義されているようなＰＡＤ酵素と相互作用可能である。好ましい化合物はペプチド部分を含み、前記ペプチド部分は７個のアミノ酸長を含む。本明細書中では、ペプチド配列は、左から右に読み、アミノ（Ｎ−）末端は左側に位置し、カルボキシ（Ｃ−）末端は右側に位置するように記述されている。
【００３６】
求電子基
本発明による化合物は、好ましくは求電子基、より好ましくはスペーサー部分を介してペプチド部分に連結されていてもよいチオール反応性求電子基を含む。求電子基とは、高電子密度を有する別の部分（求電子剤とも呼ばれる）と反応することができる低電子密度を有する部分（求核剤とも呼ばれる）である。この状況では、低電子密度を有する部分は、この部分が高電子密度を有する部分より低い電子密度を有することを意味してもよい。したがって、高電子密度を有する部分は、この部分が低電子密度を有する部分より高い電子密度を有することを意味してもよい。本出願のチオール反応性求電子基、好ましくはフルオロアミジン又はクロロアミジンの構造及び性質は、室温で（又は３７℃で）、阻害剤のチオール反応性求電子基と、ＰＡＤ酵素の活性中心のチオール基との間で化学反応が可能であり、共有結合で結合された酵素−阻害剤複合体を産出するようなものである。
【００３７】
求電子基又は好ましくはチオール反応性求電子基は、好ましくは本発明の化合物で特定されているようなアミノ酸Ωにより担持される。Ωは任意のアミノ酸であってもよい。Ωは修飾アミノ酸であってもよい。本発明による化合物は、ＰＡＤ酵素、好ましくはＰＡＤ２及び／又はＰＡＤ４と相互作用可能であると予想され、これらに限定されないが、ＰＡＤ酵素の触媒部位（又は溝）にあるシステイン残基のチオール部分と相互作用又は結合することにより、それらの活性を阻害可能である。阻害は、本出願の実施例において広範に実証された。
【００３８】
チオール反応性求電子基又は求電子基又は求電子性トラップは、該分子のペプチド部分に連結されており、スペーサー基又は部分を介していてもよく、当業者であれば容易に選択することができる当技術分野で公知の任意のチオール反応性求電子基であってもよい。以下本明細書中では、チオール反応性求電子基は、生理学的なｐＨの水性条件下でチオール（ＳＨ）基、特にシステインのチオール基と共有結合を形成可能な任意の基を意味する。好ましくは、チオール反応性求電子基は、ハロメチルケトン、α，β−不飽和ケトン、α，β−不飽和エステル、α，β−不飽和スルホン、α，β−不飽和アミド、α，β−不飽和スルホンアミド、α，β−不飽和シアン化物、ビニルホスホネート、ビニルホスホン酸、アジリジン、マレイミド、ジアゾメチルケトン、エポキシド、及びアミジンからなる群から選択される。
【００３９】
さらにより好ましい実施形態では、チオール反応性又は求電子基は、ハロゲノ−アミジン基である。本明細書中では、ハロゲノ−アミジンという用語は、Ｘがハロゲンである構造エレメント−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ２−Ｘを有する基を意味する。したがって、Ｏ（ＦＡ）又はフルオロアミジンは、以下の側鎖：−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ２−Ｆを有するアミノ酸を意味し、Ｏ（ＣＡ）又はクロロアミジンは、以下の側鎖：−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（＝ＮＨ）−ＣＨ２−Ｃｌを有するアミノ酸を意味する。ハロゲノアミジン基は、フルオロアミジン、クロロアミジン、ヨードドアミジン（iododamidine）、又はブロモアミジンであってもよい。最も良好な結果はフルオロアミジンで得られた。
【００４０】
さらにより好ましい実施形態では、チオール反応性求電子基は、本明細書中で特定されているようなアミノ酸Ωにより担持される。最も好ましくは、Ωはオルニチンである。したがって、最も好ましい化合物では、オルニチンは、ハロゲノ−アミジン基である求電子基又はトラップ、フルオロアミジン、クロロアミジン、ヨードアミジン、又はブロモアミジンであるハロゲノアミジン基を担持する。さらにより好ましいのは、前記オルニチンがフルオロアミジン又はクロロアミジンを担持する化合物である。最も好ましいのは、前記オルニチンがフルオロアミジンを担持する化合物である。
【００４１】
スペーサーをペプチドに結合すること、例えばペプチドに一般に見出されるカルボン酸、ヒドロキシル、チオール及びアミン基にスペーサーを結合させることは、十分に当業者の技術範囲内にあり、日常的な作業である。通常、遊離アミン基は、スペーサーを結合させるのに非常に好適である。またスペーサーを求電子基に結合させること、好ましくは、チオール基と反応するチオール反応性求電子基にスペーサーを結合させることには、日常的な実験作業が伴うに過ぎず、本明細書中にさらなる詳細を必要としない。
【００４２】
本発明によるＰＡＤ阻害分子のペプチド部分を、求電子基、好ましくはチオール反応性求電子基に連結させるスペーサーは、１〜１２個の炭素原子を含有する直鎖状又は分岐状、飽和鎖又は（多重）不飽和鎖からなる連結基を表すことができ、そこでは該原子のうちの４〜６個が一緒になって飽和環又は芳香族環を形成してもよく、及び／又は該炭素原子のうちの１〜６個が、１〜４個のＮ−、Ｏ−、若しくはＳ−原子、又はそれらの組み合わせで置換されていてもよい。より好ましくは、該スペーサーは、３〜８個の炭素原子を含有する、分岐状又は直鎖状飽和鎖又は（多重）不飽和鎖で構成される基であり、そこでは該原子のうち４〜６個が一緒になって飽和環又は芳香族環を形成してもよく、及び／又は該炭素原子のうち１〜３個が、１〜３個のＮ−、Ｏ−、若しくはＳ−原子、又はそれらの組み合わせで置換されいてもよい。
【００４３】
好ましい実施形態では、ペプチド骨格と求電子トラップ又は求電子基又はチオール反応性求電子基との間のスペーサーは、３〜６個の炭素原子で構成される直鎖状飽和脂肪族鎖である。
【００４４】
インビトロ及びインビボでＰＡＤ活性を阻害可能な本発明による分子の半減期が十分であることを保証するために、好ましくは該分子のペプチド部分は、生分解性の低減及び十分な生物学的利用能を保証するために修飾されている。或いは、該ペプチドは、例えば末端でのペプチダーゼ分解を回避するために環状化されていてもよい。また、非天然アミノ酸及び／又はヒト体内に通常は存在しないアミノ酸、又はペプチド模倣物が、分解を防止するために、並びに／又は化学的若しくは生物学的な安定性及び生物学的利用能を増強するために、該分子のペプチド部分に使用されてもよい。ＰＡＤ阻害分子のペプチド部分は、治療対象への化合物投与後の生分解を防止、遅延、又は阻害するために、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、α−メチルアミノ酸、及び／又は、α−アルケニルアミノ酸を含んでいてもよい。
【００４５】
ペプチド部分のＣ末端及び／又はＮ末端の修飾
本発明による化合物では、ペプチドのカルボキシ末端は保護基で修飾又は伸長されてもよく、これにより酵素分解が防止され、並びに／又は水溶液中の化学的安定性及び／若しくは溶解度が増加する。本発明の化合物は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、又はハロゲン置換部分を含有していてもよい、合計３〜約２５個の原子を含む直鎖状又は分岐状アルキル、アリール、又はアルキルアリール基であるＣ末端保護基を含んでいてもよい。
【００４６】
好ましくは、Ｃ末端保護基は、ＮＨ２、ＮＨ−ＮＨ２、ＮＨＲ１−８、ＮＨ−ＮＨＲ１−８、ＣＨ２ＣＮ、Ｒ１−８、Ｏ−Ｒ１−８、ＣＨＲ１−８Ｒ１−８、ＣＲ１−８Ｒ１−８Ｒ１−８、ＮＲ１−８Ｒ１−８、及びＣＨ２−ＮＲ１−８Ｒ１−８からなる群から選択され、ここで各Ｒ１−８については、下記に記載されているような１つのＲ１〜Ｒ８が独立して選択される：
−  Ｒ１は、１〜１２個の炭素原子を含有する分岐状又は直鎖状の飽和鎖又は（多重であってもよい）不飽和鎖を表し、
−  Ｒ２は、１〜１２個の炭素原子を含有するアルキル基を表し、該炭素原子のうち４〜８個は環状部分を形成しており、
−  Ｒ３は、１〜４個までの炭素原子が、Ｎ−、Ｏ−、若しくはＳ−原子、又はそれらの組み合わせで置換されているＲ１又はＲ２を表し、
−  Ｒ４は、６〜１２個の環炭素原子を含有するアリール、ビスアリール、又は融合アリール基を表し、
−  Ｒ５は、１〜４個の炭素原子が、Ｎ−、Ｏ−、若しくはＳ−原子、又はそれらの組み合わせで置換されているＲ４を表し、
−  Ｒ６は、アルキルアリール基を表し、該アルキル部分は、直鎖状、分岐状、又は環状であり、１〜６個の炭素原子で構成されており、該アリール部分は６個の炭素原子で構成されており、
−  Ｒ７は、該アルキル部分の１〜３個の原子及び／又は該アリール部分の１〜４個の原子が、Ｎ−、Ｏ−、若しくはＳ−原子、又はそれらの組み合わせで置換されているＲ６を表し、
−  Ｒ８は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）チオアルコキシ、ニトロ、ハロゲン、及び１〜５個が炭素原子であり、１〜３個が、Ｎ−、Ｏ−、若しくはＳ−原子、又はそれらの組み合わせである４〜６個の環原子を有するヘテロ環基からなる群から選択される１〜４個のさらなる置換基で置換されているＲ１〜Ｒ７を表す。
【００４７】
本発明による化合物のペプチド部分は、該ペプチドのアミノ末端も保護されていてもよい。該アミノ末端は、保護基で修飾又は伸長されていてもよく、該Ｎ末端保護基は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、又はハロゲン置換部分を含有していてもよい、合計３〜約２５個の原子を含む直鎖状又は分岐状アルキル、アリール、又はアルキルアリール基であってもよい。好ましくは、Ｎ−保護基は、Ｒ１−８−Ｃ（Ｏ）、Ｒ１−８−Ｏ−Ｃ（Ｏ）、Ｒ１−８、Ｒ１−８−ＳＯ２からなる群から選択されるか、又は同一でもよく又は異なっていてもよいそのような保護基のうち２つが存在していてもよく、式中各Ｒ１−８については、下記に記載されているようなＲ１〜Ｒ８の１つが選択され、
−  Ｒ１は、１〜１２個の炭素原子を含有する分岐状又は直鎖状の飽和鎖又は（多重であってもよい）不飽和鎖を表し、
−  Ｒ２は、１〜１２個の炭素原子を含有するアルキル基を表し、該炭素原子のうち４〜８個は環状部分を形成しており、
−  Ｒ３は、１〜４個までの炭素原子が、Ｎ−、Ｏ−、若しくはＳ−原子、又はそれらの組み合わせで置換されているＲ１又はＲ２を表し、
−  Ｒ４は、６〜１２個の環炭素原子を含有するアリール、ビスアリール、又は融合アリール基を表し、好ましくはＲ４−ＳＯ２又は２−ナフチルスルホニル（2-naphtylsulfonyl）基を表し、式中Ｒ４は１０個の炭素原子を有するアリール基（つまりナフチル（naftyl）基）であり、
−  Ｒ５は、１〜４個の炭素原子が、Ｎ−、Ｏ−、若しくはＳ−原子、又はそれらの組み合わせで置換されているＲ４を表し、
−  Ｒ６は、アルキルアリール基を表し、該アルキル部分は、直鎖状、分岐状、又は環状であり、１〜６個の炭素原子で構成されており、該アリール部分は６個の炭素原子で構成されており、
−  Ｒ７は、該アルキル部分の１〜３個の原子及び／又は該アリール部分の１〜４個の原子が、Ｎ−、Ｏ−、若しくはＳ−原子、又はそれらの組み合わせで置換されているＲ６を表し、
−  Ｒ８は、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ６）チオアルコキシ、ニトロ、ハロゲン、及び１〜５個が炭素原子であり、１〜３個が、Ｎ−、Ｏ−、若しくはＳ−原子、又はそれらの組み合わせである４〜６個の環原子を有するヘテロ環基からなる群から選択される１〜４個のさらなる置換基で置換されているＲ１〜Ｒ７を表す。
【００４８】
好ましい実施形態として、本発明の化合物は、ペプチド配列のＮ末端がアセチル基により修飾されており及び／又はＣ末端がアミドとしてである。これらの化合物は、阻害剤として安定性の増加を示すことが見出された。
【００４９】
他の好ましい実施形態として、本発明の化合物は、ペプチド配列のＮ末端が２−ナフチルスルホニル基を付加することにより修飾されている。そのような化合物は、阻害剤として安定性の増加を示すため魅力的な特性を有し、驚くべきことに、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４の阻害剤として阻害活性の向上又は効能の向上を示すことが見出された（実施例９を参照）。本発明の好ましい化合物はペプチド部分を含み、該ペプチド部分は、実施例９の表２３で特定されているような配列番号１１５又は１１９の配列を含む又はからなる。
【００５０】
他の好ましい実施形態として、本発明の化合物は、ペプチド配列のＣ末端がＤ−アミノ酸を付加することにより修飾されている。そのような化合物は、阻害剤として安定性の増加を示すため魅力的な特性を有し、驚くべきことに、この修飾により影響を受けない阻害活性を示すことが見出された（実施例９を参照）。本発明の好ましい化合物はペプチド部分を含み、該ペプチド部分は、実施例９の表２６で特定されているような配列番号１２０〜１２７の配列を含む又はからなる。
【００５１】
より好ましい実施形態として、本発明の化合物は、ペプチド配列のＮ末端が２−ナフチルスルホニル基を付加することにより修飾されており、ペプチド配列のＣ末端がＤ−アミノ酸を付加することにより修飾されている。本発明の好ましい化合物はペプチド部分を含み、該ペプチド部分は、実施例９の表２８で特定されているような配列番号１２８〜１３５の配列を含む又はからなる。
【００５２】
いくつかの無極性アミノ酸が存在する場合に可溶性が不十分である場合があるペプチド部分の溶解度を増加させるために、該ペプチド部分は、溶解度を増強する極性基を、特に該ペプチド部分のＮ末端及び／又はＣ末端に付加することにより修飾されていてもよい。該可溶化基は、好ましくは、ペプチド部分のＮ末端及び／又はＣ末端と、Ｎ末端保護基又はＣ末端保護基との間に位置するスペーサー部分である。最も好ましい実施形態では、該可溶化基は、構造ＮＨ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｍ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）を有する極性スペーサー部分を表し、式中、ｍ＝１〜６、及びｎ＝０、１、又は２である。
【００５３】
ＰＡＤ活性は細胞外空間で阻害されてもよいが、ＰＡＤ阻害はまた、細胞内で生じて、例えばヒストン及び他の基質のシトルリン化を阻害し、例えば遺伝子発現を変更してもよい。別の実施形態では、本発明によるＰＡＤ阻害分子の細胞内取り込みを促進又は増強するために、阻害ペプチド分子は、タンパク質形質導入ドメイン又は細胞浸透性ペプチドに融合されていてもよい。いくつかのタンパク質及び小型ペプチドは、古典的受容体媒介性経路又はエンドサイトーシス媒介性経路とは無関係に、生体膜を越えて伝達又は移動する能力を有する。これらのタンパク質の例には、ＨＩＶ−１  ＴＡＴタンパク質、単純疱疹ウイルス１（ＨＳＶ−１、herpes simplex virus 1）ＤＮＡ結合タンパク質ＶＰ２２、及びドロソフィラ・アンテナペディア（Ａｎｔｐ、Drosophila Antennapedia）のホメオティック転写因子が含まれる。これらタンパク質に由来する小型タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ、protein transduction domain）は、本明細書によるポリペプチド及び修飾ポリペプチドを含む他の巨大分子、ペプチド、又はタンパク質に融合させることができ、それらを細胞内に輸送することに成功する。該形質導入ドメインの配列アラインメントは、これらの領域と膜中の負荷電脂質との相互作用を促進することができる高塩基性アミノ酸含有量（Ｌｙｓ及びＡｒｇ）を示す。二次構造解析は、３つのドメインすべての間で一貫している構造を示さない。
【００５４】
本発明による化合物は、インビトロ及び／又はインビボで、細胞内で及び／又は細胞外で、ＰＡＤ酵素を阻害可能である。ＰＡＤ２及び／又はＰＡＤ４は、これら酵素が、自己免疫に関連するシトルリン化プロセスに関与する酵素であるため、最も好ましい。
【００５５】
組成物
別の態様では、本発明は、本明細書中で上記に定義されているような化合物及び少なくとも１つの賦形剤を含む組成物を提供し、好ましくは前記組成物は、好ましくはヒトの自己免疫障害の治療及び／又は予防用の医薬組成物又は薬剤である。前記組成物又は化合物は、そのような障害の進行を遅延せるために使用することもできる。自己免疫障害とは、免疫系が内在性抗原を標的とする疾患であり、結果的に組織が損傷を受ける。異常なシトルリン化は、対象体の免疫系による自己抗原の認識に役割を果たすことが多い。本発明による化合物又は組成物は、ＰＡＤ関連及び／若しくはシトルリン化関連の疾患若しくは障害又はＰＡＤが悪化させる疾患又は障害を治療又は予防するための薬剤の製造に使用することができる。特に、本発明によるＰＡＤ阻害化合物又は組成物は、これらに限定されないが、ＲＡ、ＭＳ、乾癬、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ、systemic lupus erythematosus）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、全身性硬化症（強皮症）、新生児狼瘡症候群、特発性炎症性筋障害、若年性慢性関節炎、乾癬性関節炎、自己免疫性肝炎、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ、mixed connective tissue disease）、シェーグレン症候群、及びヴェーゲナー肉芽腫症などの自己免疫障害を治療するための薬剤の製造に使用することができる。
【００５６】
本発明による化合物は、薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することができる。したがって、本発明の組成物は、本発明の化合物及び少なくとも１つの賦形剤を含む。種々の投与方法、非経口又は経口に好適な医薬組成物の製剤は、当技術分野で公知であり、Remmington Pharmaceutical Sciences, Mack publishing co., 1989などの種々の教科書に記載されている。医薬組成物は、当業者であれば、本発明による所与の化合物用に、及び／又は治療される自己免疫障害用に、及び／又は投与方法／体内での位置に関して、好適に適合させることができる。本発明のＰＡＤ阻害化合物は、医薬組成物又は製剤中で、免疫抑制剤及び／又は炎症抑制剤などの他の活性化合物と混合することが好ましい場合がある。本発明のＰＡＤ阻害分子と組み合わせて使用することができる免疫抑制化合物の好ましい例は、アザチオプリン（イムラン）、シクロスポリン（Ａ）、メルカプトプリン（プリネトール、６−ＭＰ）であり、炎症抑制剤の好ましい例は、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド抗炎症薬、non steroid anti-inflammatory drug）又はプレドニゾロンなどのコルチコステロイドである。
【００５７】
好ましい実施形態では、本発明による医薬組成物は、ＲＡ治療用の組成物であり、非経口投与用の、好ましくは炎症性関節に局所的に塗布することができる軟膏又は貯蔵製剤（depository formulation）などの局所投与用の組成物である。最も好ましくは、そのような組成物は、ＰＡＤ阻害化合物の経皮投与を可能にする賦形剤を含み、例えばリポソーム中の製剤である。別の好ましい実施形態では、本発明による組成物は、ＲＡ治療用の組成物であり、非経口投与用の、好ましくはＲＡ罹患関節及び／又は炎症性関節への注射、好ましくは該関節の関節液への直接注射による局所投与用の、又は関節の関節液を置換することによる局所投与用であってもよい組成物であり、濃度は、化合物の親和性及び活性、対象体の関節の大きさ、並びに炎症の重症度に応じて、単回投与の１注射当たり１μｇ〜０．１、０．５、１、２、５、１０ｍｇである。しかしながら、本発明の阻害分子又は化合物が高度に特異的であることを考慮すると、副作用はほとんど予想されず、経口摂取又は静脈内若しくは筋肉内注射によるＰＡＤ阻害剤の全身性投与は、他の実施可能な投与経路である。
【００５８】
特に、本発明による薬剤は、対象体、好ましくはヒトにおける、上記で言及されているような自己免疫疾患を治療及び／又は予防する方法、最も好ましくはＲＡ及びＭＳを治療するための方法に使用することができる。
【００５９】
本発明の状況では、治療される生物又は個体又は対象体は、動物であってもよく又はヒトであってもよい。好ましくは、該生物はヒトである。好ましくは、治療される生物は、例えば、潜在的な遺伝的疾病素質、及び／又は対象体の年齢、及び／又は対象体のライフスタイル（例えば、栄養上の習慣、及び／又は身体活動の非存在）のため、ＲＡなどの自己免疫障害を発症するリスクが高いことが疑われている。
【００６０】
「予防」という用語は、完全な予防（prevention）、予防（prophylaxis）、並びに前記疾患又は状態で病的になる個体のリスクを低下させることを含むと理解されるべきである。該用語は、既に発症した症状の緩和も含むと理解されるべきである。
【００６１】
本明細書中で使用される「遅延させる」という用語は、化合物を生物に投与することを意味し、つまり患者は治療される状態の前期にあり、患者における対応する状態の前形態は当技術分野で公知の方法により診断される。好ましくは、疾患の症状の出現は、少なくとも数か月から１年以上遅延される。
【００６２】
「治療」又は「治療する」という用語は、疾患、状態、又は障害と闘うための患者の管理及び医療と理解される。
【００６３】
本明細書中で定義されているような本発明の各化合物は、本明細書中で定義されているような自己免疫障害の予防、遅延、及び／又は治療に使用するのに好適である。
【００６４】
したがって、好ましい実施形態では、本発明の化合物又は組成物は、本明細書中で上記に定義されているような薬剤として使用するためのものである。
【００６５】
本文書中及びその請求項中では、「含む」という動詞及びその活用型は、その非限定的な意味で使用され、該単語に後続する項目が含まれるが、具体的に言及されていない項目は除外されないことを意味する。加えて、不定冠詞で「ａ」又は「ａｎ」によるある要素への言及は、該要素が１つ存在し、１つしか存在しないことを状況が明白に必要としない限り、複数の該要素が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常「少なくとも１つ」を意味する。加えて、「からなる」という動詞は、「本質的にからなる」に置き換えることができ、本明細書中で定義されているような化合物又は組成物が、具体的に特定されたもの以外の追加的構成要素（複数可）を含んでもよいことを意味し、前記追加的構成要素（複数可）は、本発明の固有な特徴を変更しない。本発明の状況内では、「約」という単語は、ある化合物（つまり約５個のアミノ酸）の状況で使用される場合、５〜６個のアミノ酸が存在することを意味する。
【００６６】
本明細書で引用されている特許及び文献参照はすべて、これによってそれらの全体が参照により組み込まれる。以下の例は、例示目的で提供されているに過ぎず、いかなる点においても本発明の範囲を限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ヒトＰＡＤ２又はＰＡＤ４タンパク質のいずれかを発現するＣＯＳ−１細胞の溶解産物を、１０ｍＭのＣａＣｌ２の存在下で３０分間、３７℃でインキュベートした。溶解産物中のタンパク質のシトルリン化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングを行い、その後シトルリン残基を修飾し、抗修飾シトルリン抗体と共にインキュベーションすることにより視覚化した（レーン１及び４）。シトルリン化タンパク質を、Ｒａ３  ｓｃＦｖ抗体を使用した免疫親和性精製により溶解産物から単離し（レーン３及び６）、無関係なｓｃＦｖ（ＧＳＴに対する）を陰性対照（レーン２及び５）として同時に分析した。
【図２】ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼで発色させたブロットを表す図である。種々の量のビオチン化阻害ペプチド（ビオチン−Ａｈｘ−Ｄ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｈ−Ｄ−Ｏ（ＦＡ）−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｄ−アミド、Ｏ（ＦＡ）＝オルニチンフルオロアミジン、Ａｈｘ＝６−アミノヘキサン酸）及び一定量のＨｉｓタグ化ＰＡＤ４の混合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で分析した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体で発色させ、その後ＮＢＴ／ＢＣＩＰを使用して視覚化した。試料は、表１８で指定されている。
【図３】１つのマウス抗Ｈｉｓ、２つのヤギ抗マウスアルカリホスファターゼで発色させたブロットを表す図である。種々の量のビオチン化阻害ペプチド（ビオチン−Ａｈｘ−Ｄ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｈ−Ｄ−Ｏ（ＦＡ）−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｄ−アミド、Ｏ（ＦＡ）＝オルニチンフルオロアミジン、Ａｈｘ＝６−アミノヘキサン酸）及び一定量のＨｉｓタグ化ＰＡＤ４の混合物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動で分析した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、マウス抗Ｈｉｓ抗体で、その後ヤギ抗マウス−アルカリホスファターゼ結合体で発色させ、その後ＮＢＴ／ＢＣＩＰを使用して視覚化した。試料は、表１８で指定されている。
【図４】表示されているようなＰＡＤによるベンゾイルアルギニンエチルエステルのベンゾイルシトルリンエチルエステルへの変換を阻害する種々の化合物の能力を、ベンゾイルシトルリンエチルエステルを修飾するＤＡＭＯ及びアンチピリンを使用して、比色アッセイにより決定した。あらゆる阻害化合物の非存在下におけるＢＡＥＥの変換を、１００％に設定した。
【図５ａ】ペプチドＤ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｆ−Ｈ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｄ（０７０８−３３、ＭＨ２２＋ｃａｌｃ＝８００．３９、ＭＨ３３＋ｃａｌｃ＝５３３．９３）の、そのシトルリン変異体（ΔＭ＝０．９８Ｄａ）へのＰＡＤ媒介性変換で観察された質量分析データを例示する図である。Ａ：基質ペプチドＤ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｆ−Ｈ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｄ（上段）及び産物ペプチドＤ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｆ−Ｈ−Ｃｉｔ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｄ（下段）の、ＰＡＤによる１００％変換時の質量スペクトル。Ｂ：３＋−シグナルの拡大図。Ｃ：２＋−シグナルの拡大図。
【図５ｂ】ペプチドＤ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｆ−Ｈ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｄ（０７０８−３３、ＭＨ２２＋ｃａｌｃ＝８００．３９、ＭＨ３３＋ｃａｌｃ＝５３３．９３）の、そのシトルリンバリアント（ΔＭ＝０．９８Ｄａ）へのＰＡＤ媒介性変換で観察された質量分析データを例示する図である。Ａ：基質ペプチドＤ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｆ−Ｈ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｄ（上段）及び産物ペプチドＤ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｆ−Ｈ−Ｃｉｔ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｄ（下段）の、ＰＡＤによる１００％変換時の質量スペクトル。Ｂ：３＋−シグナルの拡大図。Ｃ：２＋−シグナルの拡大図。
【図５ｃ】ペプチドＤ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｆ−Ｈ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｄ（０７０８−３３、ＭＨ２２＋ｃａｌｃ＝８００．３９、ＭＨ３３＋ｃａｌｃ＝５３３．９３）の、そのシトルリン変異体（ΔＭ＝０．９８Ｄａ）へのＰＡＤ媒介性変換で観察された質量分析データを例示する図である。Ａ：基質ペプチドＤ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｆ−Ｈ−Ｒ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｄ（上段）及び産物ペプチドＤ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｆ−Ｈ−Ｃｉｔ−Ｇ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｄ（下段）の、ＰＡＤによる１００％変換時の質量スペクトル。Ｂ：３＋−シグナルの拡大図。Ｃ：２＋−シグナルの拡大図。
【図６】コラーゲン抗体誘導性関節炎（ＣＡＩＡ、collagen antibody induced arthritis）モデル（ＭＱＲ；１８．１０１）を使用して、ＰＡＤ阻害剤ＣＸＰ５．７−０１１（配列番号１４３）の治療効果を試験した。０日目に、２，８ｍｇの抗コラーゲン抗体をマウスに腹腔内注射した。ＬＰＳ（２５μｇ／マウス）を３日目に腹腔内注射した。阻害剤（２０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する２００μｌのＰＢＳ中０．５ｍｇのＣＸＰ５．７−０１１）、又はプラセボとして２０ｍＭリン酸ナトリウムを含有する２００μｌのＰＢＳを、３日〜１１日目まで（９日目を除いて）連日投与した。動物は、１４日目まで毎日炎症度をスコア化した。１つの実験群（５匹のマウス）ごとの平均関節炎スコアは、各時点で示されている。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
［実施例］
【実施例１】
【００６９】
天然基質に基づく阻害剤
ＰＡＤの基質はいくつか、タンパク質レベルで同定されている。特にタンパク質のアルギニンは、インビボでシトルリン（Ｃｉｔ）に変換され得るが、他のアルギニンはシトルリンへの変換に対して完全に耐性であると考えられることが示されている。これらの観察から、アルギニン残基の化学的環境が、その基質特性を決定していることは明らかである。ＰＡＤ酵素により変換されるアルギニンの環境に最も頻繁に見出される隣接アミノ酸の同一性を調査するために、ヒトＰＡＤ２及びＰＡＤ４をコードするｃＤＮＡを、真核生物発現ベクターpCI-NEO（Promega社製、ライデン、オランダ）に、ＶＳＶ−Ｇタグをコードする配列とインフレームでクローニングした。培養されたＣＯＳ−１又はＨＥＫ２９３細胞は、その結果生じる構築体で形質移入された。また、これらの細胞のＰＡＤの発現は、免疫ブロットし、形質移入の４８時間後に準備された細胞に由来する抽出物の使用、及びウサギの中で上げられた単一特異的な抗ＰＡＤ抗血清により確認された。結果は、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４は両方とも、これら細胞で効率的に発現されたことを示した。ペプチジルシトルリンを修飾する試薬でウエスタンブロットを処理した後（Senshu T, Sato T, Inoue T, Akiyama K, Asaga H (1992): Detection of citrulline residues in deiminated proteins on polyvinylidene difluoride membrane, Anal Biochem 203: 94-100）、これら細胞の抽出物を抗修飾シトルリン抗体（ＡＭＣ、anti-modified citrulline antibody）で分析することにより、該細胞のカルシウム濃度が低いことに基づいて予測される通り、シトルリン化タンパク質は検出できなかったことが明らかになった。細胞タンパク質のシトルリン化が生じることを可能にさせるため、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、及び無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝液で細胞を溶解し、その後、１０ｍＭの最終濃度になるように塩化カルシウムを添加した後で溶解産物を３０分間３７℃でインキュベートした。対照として、同時に、５ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で溶解産物をインキュベートした。強化ニトロセルロース膜上にエレクトロトランスファーされたタンパク質を化学修飾混合物で処理した後で、ＡＭＣ抗体を用いて免疫ブロット分析することにより、この手順が、溶解産物中で複数の細胞タンパク質のカルシウム及びＰＡＤ依存性シトルリン化に結びつくことが明らかになった（図１）。
【００７０】
重要なことには、異なるＰＡＤ酵素で得られたシトルリン化タンパク質のパターンに相異があることが観察され、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４の基質特異性に違いがあることを示した。続いて、シトルリン化タンパク質を、シトルリン化エピトープに特異的であるＲＡ３単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を使用して免疫親和性精製により細胞溶解産物から単離した（Raats JM, Wijnen EM, Pruijn GJ, van den Hoogen FH, van Venrooij WJ (2003): Recombinant human monoclonal autoantibodies specific for citrulline-containing peptides from phage display libraries derived from patients with rheumatoid arthritis, J Rheumatol 30: 1696-1711）。精製したタンパク質をトリプシンで消化した後、その結果生じたペプチドのアミノ酸配列をタンデム質量分析により決定した。該質量分析法データに基づいて、シトルリン化残基を含有するペプチドを特定した。合計で９０個及び５７個のシトルリン化ペプチドが、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４を発現するＣＯＳ−１細胞に由来するタンパク質でそれぞれ特定され、１０７個及び３８個のシトルリン化ペプチドが、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４のＨＥＫ−２９３細胞物質からそれぞれ取得された。シトルリン化残基から５残基Ｎ末端と５残基Ｃ末端との間の位置の各々にあるアミノ酸の頻度は、これらの部位の混合配列に由来し、表１に例示されている。これらのデータに基づいて、中央部分にアルギニンを含有するＰＡＤ２及びＰＡＤ４特異的１３量体ペプチドを合成した（表２）。これらペプチドがヒトＰＡＤ２及びＰＡＤ４酵素によりシトルリン化された効率を、細菌で発現されＨｉｓ６−タグ化及びＩＭＡＣ精製された組換え酵素と共にそれらをインキュベートし、その後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及びＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析の両方により産物を分析することにより調査した。これらのペプチドのシトルリン化の効率は表２に列挙されている。
【００７１】
【表１】
2011524170.tif 000003
2011524170.tif 000004
【００７２】
シトルリン化細胞溶解産物から免疫親和性精製されたタンパク質を、質量分析にかけてシトルリン化部位を特定した。シトルリン化ペプチドの配列をアラインし、シトルリンを隣接する領域（シトルリンの５残基Ｎ末端〜５残基Ｃ末端）に見出されるアミノ酸の頻度を決定し、ヒトタンパク質におけるアミノ酸の天然出現頻度に対して正規化した。したがって、１を超える値は、それぞれアミノ酸の過剰出現を示すが、１未満の値は、これらのアミノ酸がシトルリン化部位でそれほど頻繁に見出されないことを示す。
【００７３】
【表２】
2011524170.tif 000005
【００７４】
表２は、以下の配列、配列番号１〜１０により表されるペプチドを含む。配列番号１１は、対照Ｌ１を表す。
【００７５】
以下のアミノ酸配列を、阻害剤の合成用に選択した：
ＰＡＤ２用には、Ｉ−Ｅ−Ｉ−Ｍ−Ｔ−Ｄ−Ｒ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｋ−Ｋ−Ｒ（配列番号５）及び
Ｉ−Ｇ−Ｓ−Ｒ−Ｇ−Ｄ−Ｒ−Ｓ−Ｇ−Ｆ−Ｇ−Ｋ−Ｆ（配列番号６）並びに
ＰＡＤ４用には、Ｄ−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｒ−Ｄ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｇ−Ｓ（配列番号１）及び
Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｇ−Ｄ−Ｒ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ（配列番号２）
【００７６】
最初に、これらの配列に由来する８つのペンタペプチド阻害剤を評価した：
Ｔ−Ｄ−Ｏ（ＦＡ）−Ｇ−Ｓ（配列番号１２）
Ｇ−Ｄ−Ｏ（ＦＡ）−Ｓ−Ｇ（配列番号１３）
Ｓ−Ｓ−Ｏ（ＦＡ）−Ｄ−Ｇ（配列番号１４）
Ｇ−Ｓ−Ｏ（ＦＡ）−Ｄ−Ｇ（配列番号１５）
Ｔ−Ｄ−Ｏ（ＣＡ）−Ｇ−Ｓ（配列番号１６）
Ｇ−Ｄ−Ｏ（ＣＡ）−Ｓ−Ｇ（配列番号１７）
Ｓ−Ｓ−Ｏ（ＣＡ）−Ｄ−Ｇ（配列番号１８）
Ｇ−Ｓ−Ｏ（ＣＡ）−Ｄ−Ｇ（配列番号１９）
これらの８つのペンタペプチド阻害剤は配列番号１２〜１９により表される。
（Ｏ（ＦＡ）はオルニチンフルオロアミジンを表し、Ｏ（ＣＡ）はオルニチンクロロアミジンを表す）。
【００７７】
ヒトＰＡＤ２及び４並びにマウスＰＡＤ２及び４のＩＣ５０を、Zendmanらにより開発されたアッセイで決定した（Zendman AJW, Raijmakers R , Nijenhuis S ,Vossenaar ER, van der Tillaart M, Chirivi GS, Raats JMH, van Venrooij WJ, Drijfhout JW, Pruijn GJM (2007): ABAP: Antibody-based assay for peptidylarginine deiminases activity, Anal Biochem 369: 232-240）。この系列のうち、阻害剤Ｔ−Ｄ−Ｏ（ＦＡ）−Ｇ−Ｓ（ＣＸＰ５−１０１）は、最も良好なＰＡＤ２及びＰＡＤ４阻害剤だった。続いて、このリード化合物にいくつかの修飾をもたらした。２巡目のスクリーニングは、Ｇ−Ｄ−Ｏ（ＣＡ）−Ｇ−Ｓ（ＣＸＰ５．２−０７８）（配列番号２０）及びＹ−Ｄ−Ｏ（ＣＡ）−Ｇ−Ｓ（ＣＸＰ５．２−０８１）（配列番号２１）がＴ−Ｄ−Ｏ（ＦＡ）−Ｇ−Ｓより強力だったことを示した。また、より高いインビボ安定性を有することが予測されたため、Ａｃ−Ｇ−Ｄ−Ｏ（ＣＡ）−Ｇ−Ｓ−アミド（ＣＸＰ５．７−０１２）（配列番号１４２）及びＡｃ−Ｙ−Ｄ−Ｏ（ＣＡ）−Ｇ−Ｓ−アミド（ＣＸＰ５．７−０１１）（配列番号１４３）を合成した（実施例１０を参照）。
【００７８】
最も良好な阻害剤を最近発表されたＰＡＤ４不活性化因子であるＣｌ−アミジンと比較するために（(Luo Y,  Arita K, Bhatia M, Knuckley B, Lee Y-H, Stallcup MR, Sato M, Thompson PR (2006): Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization, Biochemistry 45: 11727-11736）、比色アッセイを開発した（実施例６を参照）。
【実施例２】
【００７９】
非天然基質に基づく阻害剤
以前の研究から、Ｄ−Ｓ−Ｑ−Ｆ−Ａ−Ｆ−Ｒ−Ｇ−Ａ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｄ（本明細書ではＬ１と称する：配列番号１１）は、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４の基質であることが知られていた。より良好な基質及びひいては強力な阻害剤を取得するために、本発明者らは、基質特性を向上させる構造的エレメントを特定することを意図した。１組の１５２個の個々のアナログペプチドを生成し、各々は、−４〜−１位又は１〜４位の１箇所の１個のアミノ酸がＬ１と異なっていた。
【００８０】
表３では、各アナログの変換（ＲからＣｉｔへの変換）が表されている。アナログの値は、標準条件下におけるＬ１の変換と比較したアナログの変換に関する（１００は、Ｌ１と等しい変換を意味し、５０は、Ｌ１の変換の５０％の変換を意味し、１７５は、Ｌ１の変換の１７５％の変換を意味する）。したがって１００を超える数値は、基質特性を向上させるアミノ酸置換に関する。
【００８１】
【表３】
2011524170.tif 000006
【００８２】
上記の結果に基づいて、本発明者らは、基質特性を向上させる複数のアミノ酸を含有する２５個のペプチドを設計した（表４を参照）。表示されているペプチドを合成し、最も良好な基質をこの群から特定するために試験を行った。
【００８３】
【表４】
2011524170.tif 000007
【００８４】
表４のペプチドは、以下の配列、配列番号２２〜３１及び３３〜４６によって表される。対照ペプチドは、以下の配列、対照Ｌ１としての配列番号１１及び対照Ｌ２としての配列番号３２によって表される。不運にも、設計したペプチドの相当数が、極性過ぎて本発明者らのＬＣ−ＭＳシステムでは分析できなかった（表４では、ｎ．ｔ．すなわちカラムに捕捉されなかったと示されている）。したがって、本発明者らは、疎水性を増加させるために２個の追加的Ｎ末端Ｆ残基を含有するこれらのペプチドも生成して試験を行った。この形態では、ペプチドがカラムに捕捉され、分析することができた（表５を参照）。
【００８５】
【表５】
2011524170.tif 000008
【００８６】
表５のペプチドは、以下の配列、配列番号４７〜７１によって表される。
【００８７】
これらの結果から、この一組のペプチドが、Ｌ１（０３０８−２９）と比較して向上した基質特性を有するＰＡＤ４基質を含有していることは明らかである。加えて、２個のＦ残基を組み込むことにより、基質特性が特定の場合で向上すると考えられる。
【００８８】
ペプチド０６０８−３１（Ｌ２と称する）を、ＰＡＤ４のさらに良好な基質を得るためのリード化合物として選択した。
【００８９】
上述の方法と非常に類似した方法で、Ｌ２をリードペプチドとして得た。再び、１５２個の単一アミノ酸置換ペプチドを生成して試験を行った。結果は、表６に示されている（説明は表３を参照）。
【００９０】
【表６】
2011524170.tif 000009
【００９１】
上記の結果に基づいて、本発明者らは、基質特性を向上させる複数のアミノ酸を含有する２０個のペプチドを設計した（表７を参照）。表示されているペプチドを合成し、最も良好な基質をこの群から特定するために試験を行った。この場合、本発明者らは、上述の実験と比較してより少ない酵素（３倍未満）での試験系を使用した。
【００９２】
【表７】
2011524170.tif 000010
【００９３】
表７のペプチドは、以下の配列、配列番号７２〜９１及び対照としての配列番号３２（Ｌ２）によって表される。
【００９４】
これらの結果は、２巡目の最適化が、著しく向上した基質特性を有するペプチド基質を提供しなかったことを示す。
【００９５】
ＰＡＤ４に関して類似した方法で、本発明者らは、ＰＡＤ２に対する向上したペプチド基質を特定した。再び、Ｌ１をリード化合物として使用した。表３にある一組の１５２個のペプチドを使用し、前述のように試験を実施した。
【００９６】
【表８】
2011524170.tif 000011
【００９７】
上記の結果に基づいて、本発明者らは、基質特性を向上させる複数のアミノ酸を含有する１５個のペプチドを設計した（表９を参照）。表示されているペプチドを合成し、最も良好な基質をこの群から特定するために試験を行った。
【００９８】
【表９】
2011524170.tif 000012
【００９９】
表９のペプチドは、以下の配列、配列番号９２〜１０６及び対照としての配列番号１１（Ｌ１）によって表される。
【０１００】
これらの結果から、この一組のペプチドが、Ｌ１（０３０８−２９）と比較して向上した基質特性を有するＰＡＤ２基質を含有していることは明らかである。
【０１０１】
ＰＡＤ２及びＰＡＤ４の最適化ペプチド基質を得るために、表４、５、７、及び９で言及されたペプチドのうち３６個を、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４の基質として選択して試験を行った。その後、＊＊で示された５個のペプチドを、さらなる調査のために選択した。
【０１０２】
【表１０】
2011524170.tif 000013
【０１０３】
表示されている５個のペプチドの配列及びＬ２の配列に基づいて、ＰＡＤ阻害剤を生成して試験を行った。基質配列のＲが、求電子トラップ又は求電子基（フルオロアミジン又はクロロアミジンのいずれか）を担持するオルニチンと置換されるように、阻害剤を生成した。加えて、本発明者らは、阻害剤の安定性を増加させるために、Ｎ末端をアセチル基（Ａｃ）で修飾し、Ｃ末端をアミドとして修飾した。表１１及び１２を参照されたい。
【０１０４】
【表１１】
2011524170.tif 000014
【０１０５】
【表１２】
2011524170.tif 000015
【０１０６】
上記の阻害剤を、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４に対するそれらの阻害能力について試験した。手短に言うと、種々の濃度の阻害剤を、一定濃度の基質（ペプチド０７０８−３０）と混合した。その後、ＰＡＤを添加し、インキュベーション後に基質変換を決定した。したがって、変換が低ければ低いほど、阻害剤はより良好である。結果は表１３及び１４に示されている。
【０１０７】
【表１３】
2011524170.tif 000016
【０１０８】
【表１４】
2011524170.tif 000017
【０１０９】
表１３及び１４からの結果により、この群では、Ｏ（ＦＡ）を含有する阻害剤は、Ｏ（ＣＡ）を含有するそれらの対応物と比較して、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４の阻害がより効率的であることが示されている。
【０１１０】
ペプチド長がペプチドの阻害活性に重要であるかどうかを調査するために、阻害剤の中央部由来の対応する７量体としてのペプチドも生成し、試験を行った。表１５を参照されたい。
【０１１１】
【表１５】
2011524170.tif 000018
【０１１２】
これらの短縮バリアントを、上述のようにＰＡＤ２及びＰＡＤ４の阻害剤として試験した。結果は表１６及び１７に示されている。
【０１１３】
【表１６】
2011524170.tif 000019
【０１１４】
【表１７】
2011524170.tif 000020
【０１１５】
これらの結果は、７量体阻害剤が、例えば１３量体及び１５量体ペプチドと比較して、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４のほぼ同等に効率的な阻害剤であり得ることを示す。
【実施例３】
【０１１６】
ＰＡＤに対する阻害剤の結合機序
以下の実験では、種々の量のビオチン化阻害ペプチド（ビオチン−Ａｈｘ−Ｄ−Ｓ−Ｋ−Ｋ−Ｈ−Ｄ−Ｏ（ＦＡ）−Ｄ−Ｆ−Ｌ−Ｙ−Ｓ−Ｄ−アミド、Ｏ（ＦＡ）＝オルニチンフルオロアミジン、Ａｈｘ＝６−アミノヘキサン酸）及び一定量のＨｉｓタグ化ＰＡＤ４の混合物を分析した。手短に言えば、１０μｌのＰＡＤ４溶液を１０μｌの阻害剤溶液と混合し、３７℃で３時間インキュベートした。ＳＤＳを含有するローディング緩衝液を添加した後、試料を５分間沸騰したか又は室温で保管した。試料を１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、電気泳動にかけた（約１時間）。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体（図２）か又はマウス抗Ｈｉｓ抗体で、その後ヤギ抗マウス−アルカリホスファターゼ結合体（図３）で発色させ、その後ＮＢＴ／ＢＣＩＰを使用して視覚化した。試料は、表１８で指定されている。
【０１１７】
【表１８】
2011524170.tif 000021
【０１１８】
図２では、阻害剤のビオチン基が視覚化されている。ビオチン化阻害剤が存在するレーンだけが有色バンドを示す。バンドの位置は、ＰＡＤ４の予測分子量（７７ｋＤａ）付近にある。これは、ビオチン化ペプチドがＰＡＤ４と結合していることを示す。この結合は、ＳＤＳの存在下で試料を沸騰することにより破壊されない。
【０１１９】
図３では、ＰＡＤ４のＨｉｓタグが視覚化されている。ＰＡＤ４が存在するレーンだけが有色バンドを示す。阻害剤のみを含有しているレーン１９は、このバンドを示さない。バンドの位置は、ＰＡＤ４の予測分子量（７７ｋＤａ）付近にあり、図２と同じ位置にあり、該バンドが、両ブロットで同じ分子量を表していることを示す。結論として、ビオチン化阻害ペプチドはＰＡＤ４に結合することが示され、この結合は、ＳＤＳの存在下での試料の沸騰に耐性であり、阻害剤がＰＡＤ４に共有結合で結合していることを示す。
【実施例４】
【０１２０】
阻害ＰＡＤ活性を決定するためのＨＰＬＣアッセイ
このアッセイで、ＰＡＤ活性の阻害を決定した。蛍光性基質Ｄｎｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを使用し、これは、ＰＡＤ２又はＰＡＤ４によってＤｎｓ−Ｇｌｙ−Ｃｉｔに変換される（Ｄｎｓ＝ダンシル）。
【０１２１】
ＰＡＤ２又はＰＡＤ４を、一定濃度の基質及び種々の濃度の阻害剤を含有する混合物と共にインキュベートした。ＨＰＬＣを使用して上記の変換を定量化した。これは阻害剤の効果を示す。
【０１２２】
手短に言えば、ＰＡＤ、基質、及び阻害剤を含有する反応混合物（２５μｌ）を、３７℃でインキュベートした。その後、１２５μｌの酢酸／水  １５／８５（容積／容積）を添加し、変換を停止させた。この混合物のうち７５μｌを、蛍光検出器を備えたＨＰＬＣにアプライした。クロマトグラフィー条件は以下の通りだった：
カラム：Vydac社製２１８ＴＰ５４１５  Ｃ１８カラム。  緩衝液Ａ：水／アセトニトリル  ３／１（容積／容積）中７５ｍＭ酢酸ナトリウム及び３．３ｍＭナトリウムオクタンスルホナート、ｐＨ４．０。  緩衝液Ｂ：アセトニトリル。勾配：ｔ＝０分、１００％Ａ；ｔ＝１３分、１００％Ａ；ｔ＝１５分、０％Ａ；ｔ＝１７分、０％Ａ；ｔ＝１７．５分、１００％Ａ、ｔ＝２３分、１００％Ａ。  検出：蛍光  Ｅｘ  ３３３ｎｍ。Ｅｍ  ５３３ｎｍ。  流速  ０．８ｍｌ／分。
【実施例５】
【０１２３】
ＰＡＤ活性の阻害を決定するためのＡＢＡＰアッセイ
ＰＡＤ２及びＰＡＤ４活性の阻害を決定するために、ModiQuest Research社製から市販されている抗体に基づくＰＡＤ酵素活性アッセイ（カタログ番号：ＭＱ１７．１０１）を、製造業者の仕様書に従って使用した。
【０１２４】
ＰＡＤ酵素（最大の脱イミノ化をもたらす量）を、以下の濃度（４．９、９．８、１９．５、３９、７８．１、１５６、３１３、６２５、１２５０、２５００、及び５０００μＭ）のＰＡＤ阻害剤と混合し、３０分間３７℃で事前インキュベートした。事前インキュベーションした後、ＰＡＤ酵素及び阻害剤の混合物をウエルに添加し、７５分間さらにインキュベーションした。９６ウエルプレートをＰＢＳでよく洗浄した後、コーティングのアルギニンのシトルリンへの変換を、妥当な抗シトルリン抗体を使用して、その後抗シトルリン抗体を認識する２次ＨＲＰ標識抗体を用いて測定した。両抗体を用いたインキュベーションは、１時間３７℃で実施した。その後、ＩＣ５０、ＰＡＤ活性を５０％低減する阻害剤の濃度として、ＰＡＤ阻害を計算することができた。
【０１２５】
下記の表１９及び２０では、最初の８個のペンタペプチド阻害剤及び２巡目のスクリーニングに由来するペプチド阻害剤で得られたＰＡＤ２及びＰＡＤ４阻害の結果が要約されている（実施例１）。
【０１２６】
【表１９】
2011524170.tif 000022
【０１２７】
【表２０】
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【実施例６】
【０１２８】
ＰＡＤ活性の阻害を決定するための比色アッセイ
阻害剤によるＰＡＤ阻害を調査するために使用したアッセイのうちの１つは、以前に記述されている比色アッセイである（Sugawara K, Yoshizawa Y, Tzeng S, Epstein WL, Fukuyama K (1998): Colorimetric determination of citrulline residues in proteins, Anal Biochem 265: 92-96）。このアッセイでは、ベンゾイルアルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ、benzoylarginine ethyl ester）を、表示されている精製組換えＰＡＤ酵素と共に、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのジチオトレイトールを含有する緩衝液中で３時間３７℃でインキュベートする。ＢＡＥＥのベンゾイルシトルリンエチルエステルへの変換をモニターするために、反応産物を、１５％の硫酸、１２％のリン酸、及び０．１６ｍｇ／ｍｌのＦｅＣｌ３の存在下で１．５ｍｇ／ｍｌのＤＡＭＯ（ジアセチルモノキシム、diacetyl monoxime）及び１．０ｍｇ／ｍｌのアンチピリンと共に、１０分間１００℃でインキュベートする。室温に冷却した後、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
【０１２９】
【表２１】
2011524170.tif 000024
【０１３０】
このアッセイで阻害剤（表２１を参照）の効能を試験するために、表示されている組換えＰＡＤ酵素を、種々の濃度の阻害化合物と共に１５分間３７°Ｃで事前インキュベートした。
【０１３１】
この比色アッセイでヒトＰＡＤ２（０．１２μＭ）及びＰＡＤ４（０．２μＭ）を阻害する種々の化合物の能力が、図４に例示されている。
【実施例７】
【０１３２】
質量分析法を使用してＰＡＤ活性を決定するアッセイ
ＰＡＤ２又はＰＡＤ４による基質ペプチド中のアルギニンのシトルリンへ変換を、質量分析法を使用して以下のように実施した。基質ペプチド候補を、表示されているＰＡＤと共に数時間３７℃でインキュベートした。酢酸を添加することにより反応を停止させた。Ｑｔｏｆ質量分析計（Micromass社製、英国）で試料を分析し、その質量スペクトルをＰＡＤで処理されない同じペプチドの質量スペクトルと比較した。通常は、２＋イオン及び３＋イオンが検出される。変換（ΔＭ＝０．９８Ｄａ）を、２＋イオン及び３＋イオンで個々に計算し、その後２＋及び３＋シグナルの相対的ピーク高を考慮に入れて平均を取った（図５を参照）。
【実施例８】
【０１３３】
ＰＡＤ２／４の阻害剤の特異性を決定するアッセイ
ＰＡＤ酵素の阻害剤の特異性をモニターするために、ＰＡＤ酵素のように活性中心（又はＣｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｐトライアド）にシステインを含有する一連の酵素でも、該化合物を試験した。
【０１３４】
選択された酵素には、ペプチダーゼＣ１ファミリーパパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、哺乳動物システインエンドペプチダーゼカスパーゼ−３（ＥＣ３．４．２２．５６）、哺乳動物カルシウム依存性タンパク質−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ又はトランスグルタミナーゼ（ＴＧ、transglutaminase）（ＥＣ２．３．２．１３）、哺乳動物ＡＴＰ：Ｎ−ホスホトランスフェラーゼ又はクレアチンキナーゼ（ＣＫ、creatine kinase）（ＥＣ２．７．３．２）、及び最後には、グアニジノ基修飾酵素（ＧＭＥ、guanidino-group modifying enzyme）ヒトＮ（Ｇ），Ｎ（Ｇ）−ジメチル−Ｌ−アルギニンジメチルアミノヒドロラーゼアイソタイプ１（ｈＤＤＡＨ−１、human N(G), N(G)-dimethyl-L-arginine dimethylaminohydrolase isotype 1）（ＥＣ３．５．３．１８）に由来するシステインプロテアーゼが含まれる。
【０１３５】
ＧＭＥスーパーファミリーは、（メチル化された）グアニジン基の修飾を触媒する酵素で構成される。このスーパーファミリーのメンバーは、これら酵素の特定の基質及び産物は異なるものの、重要な触媒性残基が保存されていることを特徴としており、それらの触媒機序は、活性部位Ｃｙｓ残基の求核攻撃によって形成された同様の共有結合性Ｓ−アルキル−チオウロニウム中間体を介して進行すると提唱されている（Shirai H, Mokrab Y, Mizuguchi K (2006): The guanidino-group modifyng enzymes: structural basis for their diversity and commonality, Proteins 64: 1010-1032）。ＰＡＤ酵素及びｈＤＤＡＨ−１は、このスーパーファミリーに属する。
【０１３６】
ヒトＤＤＡＨ−１は、Ｎ（Ｇ）−メチル−Ｌ−アルギニン（ＭＭＡ、N(G)-methyl-L-arginine）及び不斉Ｎ（Ｇ），Ｎ（Ｇ）−ジメチル−Ｌ−アルギニン（ＡＤＭＡ、asymmetric N(G), N(G)-dimethyl-L-arginine）の、それぞれＬ−シトルリン及びメチルアミン又はジメチルアミンのいずれかへの加水分解を触媒する。
【０１３７】
ｈＤＤＡＨ−１活性を決定する最も一般的に用いられている手順は、Ｌ−シトルリンのウレイド基をジアセチルモノキシム（ＤＡＭＯ）誘導体化して、有色産物を形成することに依存する。このアッセイは、９６ウエル形式でＤＤＡＨ活性のモニターするために最適化されている（Knipp M, Vasak M (2000): A 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline, Anal Biochem 286: 257-264）。
【０１３８】
精製組換えＨｉｓ６タグ化ｈＤＤＡＨ−１を、その基質ＡＤＭＡと共にアッセイ緩衝液（１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０）中で１時間３７℃でインキュベートした。０．３Ｍトリフルオロ酢酸を添加することにより反応を停止させた。形成されたＬ−シトルリンを、１５％の硫酸、１２％のリン酸、及び０．１６ｍｇ／ｍｌのＦｅＣｌ３の存在下で、１．５ｍｇ／ｍｌのＤＡＭＯ（ジアセチルモノキシム）及び１．０ｍｇ／ｍｌのアンチピリンで、１０分間１００℃で修飾した。室温に冷却した後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１３９】
精製組換えカスパーゼ−３を、その市販基質：アセチル−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリド（Ａｃ−ＤＥＶＤｐＮＡ、acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide）と共に、ＣＦＳ緩衝液（２２０ｍＭマンニトール、６８ｍＭスクロース、２ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、加えてプロテアーゼ阻害剤カクテル）中でインキュベーションした際に、基質が切断され、ｐＮＡが放出され、４０５ｎｍにおけるその吸光度をモニターすることができる。
【０１４０】
パパインの活性を、反応緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．６；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中でのｐＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−ｐＮＡの切断に基づいて、同様の実験設定を使用して評価した。
【０１４１】
ＣＫ及びＴＧ（両方ともSigma-Aldrich社（シュネルドルフ、ドイツ）から購入した）の活性を、Human GmbH社製（ヴィースバーデン、ドイツ）の市販キットであるＣＫ  ＮＡＣ活性化liquiUVテスト及びSigma-Aldrich社製（シュネルドルフ、ドイツ）のトランスグルタミナーゼ酵素アッセイの支援を得て、製造業者の説明書に従って分析した。
【０１４２】
典型的には、該化合物の阻害特性は、活性をアッセイする前に種々の濃度の阻害剤（５０μＭ〜２．５ｍＭ）で１０分間で室温で該酵素を処理することにより評価した。これらの実験の結果は、表２２に要約されている。
【０１４３】
【表２２】
2011524170.tif 000025
【０１４４】
表２２から、試験した阻害剤が、それらの活性部位に関するＰＡＤ酵素との類似性に基づいて選択された酵素群のメンバーと比較して、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４に対して高い特異性を示すことは明らかである。
【実施例９】
【０１４５】
Ｎ末端が修飾された及び／又はＣ末端に選択されたＤ−アミノ酸を有する改良された阻害剤
実施例２で上述された阻害剤は、Ｎ末端のアセチル基及びＣ末端アミドを含有している。これらの修飾は、いくつかのエキソペプチダーゼによるタンパク質分解から該阻害剤を保護するが、特定のエキソペプチダーゼは、アセチル化又はアミド化されたペプチドを加水分解することができることが知られている。加えて、本発明者らは、小型の親水性スペーサー基２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ−酢酸（ＡＥＥＡｃ、2-(2-aminoethoxy)-ethoxy-acetic acid）を阻害剤のＣ末端に付加することにより、カルボキシペプチダーゼによる分解に対する保護が提供されるだろうと仮定した。
【０１４６】
したがって、本発明者らは、上述の阻害剤０７４３−５８ＦＡ及び０７４８−０９ＦＡの配列に基づいて、これら修飾の１つ又は両方のいずれかを含有する阻害剤を合成して試験を行った。表２３を参照されたい。
【０１４７】
【表２３】
2011524170.tif 000026
【０１４８】
修飾された阻害剤を、ＰＡＤ２（表２４）又はＰＡＤ４（表２５）を阻害するそれらの能力について試験した。
【０１４９】
【表２４】
2011524170.tif 000027
【０１５０】
【表２５】
2011524170.tif 000028
【０１５１】
驚くべきことに、酵素性分解に対する安定性の向上を有するように設計された阻害剤のいくつかは、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４の阻害剤として効能の向上を示したことに注目されたい。表２４及び表２５から観察することができるように、２−ナフチルスルホニル基をＮ末端に付加することにより、該阻害剤の効力が著しく増加するが、ＡＥＥＡｃ基をＣ末端に付加することにより、この効果が部分的に低減される。
【０１５２】
該阻害剤のＣ末端にＡＥＥＡｃ基を付加することにより、効能が低減されるため、本発明者らは、エキソペプチダーゼ活性を防止することも知られているＤ−アミノ酸の導入に基づいた他のいくつかのＣ末端修飾を試験した。
【０１５３】
表２６には、ＰＡＤ２阻害に使用されたペプチドが含まれており、表２７には、これらの実験の結果が含まれている。表２８には、ＰＡＤ４阻害に使用されたペプチドが含まれており、表２９には、これらの実験の結果が含まれている。
【０１５４】
【表２６】
2011524170.tif 000029
【０１５５】
【表２７】
2011524170.tif 000030
【０１５６】
【表２８】
2011524170.tif 000031
【０１５７】
【表２９】
2011524170.tif 000032
【０１５８】
上記の結果から、カルボキシペプチダーゼによる分解から該阻害剤を保護するために、該阻害剤のＣ末端にＤ−アミノ酸を導入することは、Ｃ末端が未修飾の阻害剤と比較して阻害効能が低減されない阻害剤を提供することができることが明白である。
【０１５９】
上記により、Ｎ末端に２−ナフチルスルホニル基及びＣ末端に選択されたＤ−アミノ酸を含有する、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４の好ましい阻害剤が提供される。
【実施例１０】
【０１６０】
２つのＰＡＤ阻害剤の、インビボ動物モデルにおける阻害効果の実証
ペプチドに基づくヒトＰＡＤ２及びＰＡＤ４阻害剤の１つを、市販のコラーゲン抗体誘導性関節炎（ＣＡＩＡ、commercially available collagen antibody induced arthritis）マウスモデル（Modiquest research B.V.社製、製品番号１８．１０１）で試験した。製造業者の仕様書に従って実験手順を実施して、マウスに関節炎を誘導した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｄｉｑｕｅｓｔｒｅｓｅａｒｃｈ．ｎｌ／ｓｈｏｐ／ｆｉｌｅｓ／１８．１０１−５０ＭＧ％２０＿２００７．０８．２２．ｐｄｆ）。手短に言えば、０日目に、８種の抗コラーゲン抗体の混合物（２，８ｍｇ／マウス）を、８週齢の雄ＤＢＡ／Ｊ１マウス（５匹のマウス／群）に腹腔内注射した。３日目に、マウスは、２５ｕｇのＬＰＳを含有する別の腹腔内注射を受容した（炎症反応を刺激及び同時発生させるために）。
【０１６１】
３日目以降、１群のマウスは、ペプチドに基づく阻害剤（ＣＸＰ５．７−０１１）（配列番号１４３）の静脈内注射剤を、９日目を除いて１１日目まで連日受容した。プラセボ群のマウスは、プラセボ（ＰＢＳ中２０ｍＭリン酸塩）を同じ構成で受容した。
【０１６２】
足の炎症度を毎日スコア化した動物。スコア化は、表３０に従って足ごとに実施した。動物の関節炎スコアは、個々の足の４つのスコアの合計であり、したがって１匹の動物当たりの最大関節炎スコアは８であり得る。
【０１６３】
【表３０】
2011524170.tif 000033
【０１６４】
この用量及びこの投与経路による阻害剤の投与は、マウスの足の膨潤から動物を完全に防御することができなかったが、この実験により、このモデルにおける該阻害剤の阻害能力が明白に実証される（図６を参照）。
【実施例１１】
【０１６５】
本ペプチドを産生するための合成手順
ペプチドはすべて、以下の基本手順を使用して調製した：
【０１６６】
基本手順Ｉ：Ｎ−Ｆｍｏｃ−アミノ酸のＲＩＮＫ  ＡＭ樹脂への結合（必要に応じて）
乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）で１時間膨潤させた後、Ｒｉｎｋ  ＡＭ樹脂（１５０ｍｇ、理論的には０．６８ｍｍｏｌ／ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）をＤＭＦで洗浄し（２×２ｍｌ）、ＤＭＦ中５０％ピペリジンで１５分間処理した（２×２ｍｌ）。該樹脂をＤＭＦで洗浄し（４×２ｍｌ）、乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）中のＦｍｏｃ保護アミノ酸（４当量、０．４ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（４当量、０．４ｍｍｏｌ）、及びＮＭＭ（４当量、０．４ｍｍｏｌ）溶液で、３時間室温で処理した。該樹脂をＤＭＦで洗浄した（５×２ｍｌ）。最後に、該樹脂を減圧下で乾燥し、樹脂に結合したＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸を得た。
【０１６７】
基本手順IIａ：Ｆｍｏｃ脱保護
該Ｆｍｏｃ保護樹脂を、ＤＭＦ（３×２ｍｌ）中２０％のピペリジン溶液に懸濁し、３、１０、及び１０分間撹拌した。該樹脂をＤＭＦで洗浄した（６×２ｍｌ）。
【０１６８】
基本手順IIｂ（合成機）：Ｆｍｏｃ脱保護
適切なＦｍｏｃ保護アミノ酸（１０μｍｏｌ）を担持する事前負荷Tentagel S Ac樹脂、又はTentagel S AM樹脂を、ＮＭＰで洗浄し（３×０．８ｍｌ）、ＮＭＰ中２０％のピペリジンで処理した（３×３分、０．８ｍｌ）。該樹脂をＮＭＰで洗浄した（６×０．８ｍｌ）。
【０１６９】
基本手順IIIａ：ＰｙＢＯＰ／ＮＭＭでのカップリング
Ｆｍｏｃ−アミノ酸（４当量）、ＰｙＢＯＰ（４当量）、及びＮＭＭ（４当量）を、ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶解し、該樹脂に添加した。反応混合物を室温で９０分間振盪し、ＤＭＦで洗浄した（５×２ｍｌ）。
【０１７０】
基本手順IIIｂ（合成機）：ＰｙＢＯＰ／ＮＭＭでのカップリング
該樹脂に、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（６当量、ＮＭＰ中０．６Ｍ）、ＰｙＢＯＰ（６当量、ＮＭＰ中０．６７Ｍ）、及びＮＭＭ（１２当量、ＮＭＰ中の３３％溶液）を添加した。時々振盪させてカップリング反応を９０分間実施し、カップリングの最後に、該樹脂をＮＭＰで洗浄した（６×０．８ｍｌ）。
【０１７１】
基本手順IVａ：アセチル末端基の導入
無水酢酸（５当量）及びＤＩＰＥＡ（１０当量）をＤＭＦ中に溶解して０．５Ｍの溶液を得、それを該樹脂に添加した。反応混合物を室温で２時間振盪し、ＤＭＦ（３×２ｍｌ）及びＤＣＭ（２×２ｍｌ）で洗浄した。
【０１７２】
基本手順IVｂ（合成機）：アセチル末端基の導入
Ｆｍｏｃ−アミノ酸の代りに酢酸を使用して通常のカップリングを実施した。
【０１７３】
基本手順Ｖａ：Ｍｍｔ脱保護
該樹脂を、ＤＣＭ、トリフルオロエタノール、及び酢酸（７：２：１、２ｍｌ）の混合物で１５分間処理した。この手順を７回繰り返した。その後、該樹脂を、ＤＣＭ（２×２ｍｌ）、ＤＭＦ（２×２ｍｌ）、ＤＭＦ中１０％のＮＭＭ（２×２ｍｌ）、及びＤＭＦ（２×２ｍｌ）で洗浄した。
【０１７４】
基本手順Ｖｂ（合成機）：Ｍｍｔ脱保護
該樹脂を、ＤＣＭ、トリフルオロエタノール、及び酢酸（７：２：１）の１．５ｍｌ混合物で２５分間４回処理した。その後、該樹脂を、ＤＣＭ（２×１．５ｍｌ）、ＮＭＰ（２×１．５ｍｌ）、ＮＭＰ中１０％のＮＭＭ（２×１．５ｍｌ、３分間）で洗浄した。
【０１７５】
基本手順VIａ：ハロ−アミジン部分の導入
エチル２−クロロアセトイミダート塩酸塩（５当量）及びＤＩＰＥＡ（１０当量）をＤＭＦ（２ｍｌ）中に溶解し、該樹脂に添加した。反応混合物を室温で４時間振盪し、ＤＭＦで洗浄した（４×２ｍｌ）。
【０１７６】
基本手順VIｂ（合成機）：ハロ−アミジン部分の導入
エチル２−クロロアセトイミダート塩酸塩（１０当量）及びＤＩＰＥＡ（２０当量）をＮＭＰ（０．２ｍｌ）中に溶解し、該樹脂に添加した。１時間の間時々振盪しながら反応を実施した。該樹脂を、ＮＭＰ、ＤＣＭ、及びエーテルで洗浄した。
【０１７７】
基本手順VIIａ：トリフルオロ酢酸による切断
該樹脂を、ＴＦＡ、水、及びトリイソプロピルシラン（９５：２．５：２．５、２ｍｌ）の混合物で、２時間室温で処理した。該樹脂をＴＦＡで洗浄し（２×２ｍｌ）、混合したろ過液を、流動Ｎ２下で濃縮し、トルエンで共蒸発させた（３×２ｍｌ）。ＭｅＯＨ及びＥｔ２Ｏの混合物から粗産物を沈殿させて、白色様固形物として産物を得た。
【０１７８】
基本手順VIIｂ  ペプチド（合成機から取得）：トリフルオロ酢酸による切断
該樹脂を、５％の水を含有する１ｍｌのＴＦＡで２．５時間処理した。Ｗがペプチドに存在する場合、５％トリエチルシランも切断混合物に添加した。ペプチドを、９ｍｌのエーテル／ペンタン  １／１で沈殿させ、遠心分離により単離した。沈殿物を単離し、水又は水／酢酸中に溶解し、凍結乾燥して白色固形物にした。
【０１７９】
Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｍｍｔ）−ＯＨ・ＤＩＰＥＡの合成
ＤＣＭ（３００ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｏｒｎ−ＯＨ・ＨＣｌ（５ｇ、１２．７９ｍｍｏｌ）懸濁液に、クロロトリメチルシラン（５．０７ｍｌ、３９．７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を過熱して還流し、１時間撹拌した。反応物を０℃に冷却した後、ＤＩＰＥＡ（１２．２６ｍｌ、７０．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、混合物を１時間にわたって暖めて室温にさせた。Ｍｍｔ−Ｃｌ（４．３５ｇ、１４．０７ｍｍｏｌ）を添加し、オレンジ色の溶液を４．５時間撹拌した。その後、ＭｅＯＨ（８５ｍｌ）を添加し、反応物を２０分間４０℃に加熱した。鮮黄色溶液を、塩水／Ｈ２Ｏ（２：１、２×２００ｍｌ）で洗浄した。水相をＤＣＭ（１５０ｍｌ）で抽出し、混合した有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：トルエン：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝１０：１０：３：０．２、その後ＥｔＯＡｃ：トルエン：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ＝１０：１０：４：０．２を溶出液として使用）により精製し、その後ＤＣＭ（３×１００ｍｌ）と共に共蒸発して、産物を白色固形物（８．６６ｇ、９０％）として得た。
【０１８０】
エチル２−クロロアセトイミダート塩酸塩の合成
この化合物は、Stillingsらにより記述された手順に従って合成した（Stillings MR, Welbourn AP, Walter DS (1986): Substituted 1,3,4-thiadiazoles with anticonvulsant activity. 2. Aminoalkyl derivatives, J Med Chem 29: 2280-2284）。
【０１８１】
エチル２−フルオロアセトイミダート塩酸塩の合成
この化合物は、Hughesらにより記述された手順に従って合成した（Hughes LR, Jackman AL, Oldfield J, Smith RC, Burrows KD, Marsham PR, Bishop JAM, Jones TR, O'Connor BM, Calvert AH (1990): Quinazoline antifolate thymidylate synthase inhibitors: alkyl, substituted alkyl, and aryl substituents in the C-2 position, J Med Chem 33: 3060-3067）。
【０１８２】
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【図１】
2011524170.tif 000034
【図２】
2011524170.tif 000035
【図３】
2011524170.tif 000036
【図４】
2011524170.tif 000037
【図５ａ】
2011524170.tif 000038
【図５ｂ】
2011524170.tif 000039
【図５ｃ】
2011524170.tif 000040
【図６】
2011524170.tif 000041
【配列表】
2011524170000001.app
【国際調査報告】
2011524170.tif 000042
2011524170.tif 000043
2011524170.tif 000044
2011524170.tif 000045
2011524170.tif 000046
2011524170.tif 000047