(57)【要約】本発明は、軟骨へ浸透する能力がある抗原結合性ポリペプチドを提供する。開示のポリペプチド、組成物、および方法は、軟骨変性の治療、予防、および／または進行の遅延に適している。１つの実施形態において、本発明は、本明細書に開示された抗原結合性ポリペプチドを含む組成物、ならびに軟骨変性およびそれに関連した任意の障害、特に変形性関節症の治療、予防、および／または進行の遅延のための前記組成物の使用を包含する。さらにもう１つの実施形態において、軟骨変性の治療のための方法であって、抗原結合性ポリペプチドが、特に関節内投与によって、局所投与される、方法が提供される。
2011510667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨変性の治療、予防、および／または進行の遅延のための抗原結合性ポリペプチドであって、該軟骨へ浸透する能力がある抗原結合性ポリペプチド。
【請求項２】
一本鎖抗体である、請求項１に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項３】
少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する、請求項１または２に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項４】
少なくとも１０ｋＤａ、かつ５０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項５】
サイトカイン、特にＩＬ−１もしくはＴＮＦα、サイトカイン受容体、または軟骨プロテオグリカン分解酵素に特異的に結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１と少なくとも９０％同一性、より好ましくは少なくとも９５％同一性を有するＶＬ；および／または
配列番号２と少なくとも９０％同一性、より好ましくは少なくとも９５％同一性を有するＶＨ
を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号３を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項８】
前記抗原結合性ポリペプチドのｐＩが、７．０より高い、特に７．４より高い、より詳細には７．８または７．８より高い、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド。
【請求項９】
軟骨変性、特に変形性関節症の治療、予防、および／または進行の遅延のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドの使用。
【請求項１０】
軟骨変性、特に変形性関節症の治療、予防、および／もしくは進行の遅延のため、または軟骨変性、特に変形性関節症の検出のためのインビトロ診断剤としての医薬品の製造のための、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドの使用。
【請求項１１】
請求項１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドを含む組成物、特に薬学的組成物。
【請求項１２】
６．０より高いｐＨを有する水性ｐＨ緩衝溶液を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
関節内投与に適した製剤、特に徐放性製剤を有する、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドに全体的な正電荷を与える製剤を有する、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドがｓｃＦｖであり、かつＴＮＦαを特異的に結合する、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチド、または請求項１１から１５のいずれか一項に記載の組成物を保持する容器を含む製品。
【請求項１７】
軟骨変性および軟骨変性に関連した任意の障害、特に変形性関節症の治療、予防、および／または進行の遅延のための、請求項１１から１５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１８】
請求項１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項１９】
請求項１８に記載のＤＮＡ配列を含有するクローニングベクターまたは発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９に記載の発現ベクターで形質転換された適切な宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドの産生のための方法であって、請求項２０に記載の宿主細胞を、該抗原結合性ポリペプチドの合成を可能にする条件下で培養するステップ、および該抗原結合性ポリペプチドを該培養物から回収するステップを含む方法。
【請求項２２】
軟骨変性の治療、予防、および／または進行の遅延のための方法であって、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗原結合性ポリペプチドが、特に関節内投与によって局所投与される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨変性に対する薬学的作用物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨は、細胞外マトリックスに埋め込まれた軟骨細胞で構成される。前記マトリックスは、主に水で構成され、さらに、ＩＩ型コラーゲン、および軟骨特異的プロテオグリカンである、アグリカンを含む。コラーゲン部分は、軟骨に引っ張り強さを与え、一方、プロテオグリカン部分は水を吸収し、それによって、圧迫に抵抗し、負荷を分散させる能力を提供する。
【０００３】
軟骨変性は、いくつかの状態、中でも変形性関節症（ＯＡ）に観察される。変性は、多数のサイトカイン、成長因子、およびプロテアーゼによって引き起こされる。最初、変性は、関節表面で細線維化の形として観察することができ、亀裂の出現へとつながる。その後、軟骨厚さの進行性損失が観察され、それは、プロテオグリカン−ヒアルロン酸複合体の過剰異化反応に起因する。変性は、グリコシダーゼおよびヘキソサミニダーゼなどのメタロプロテイナーゼによって触媒される（例えば、特許文献１参照）。最後に、コラーゲンネットワークが攻撃される。ポジティブフィードバックループが観察される場合があり、その場合、マトリックス分子の分解産物が分解を刺激する。前述のフィードバックループに対する細胞応答は、ＩＬ−１およびＴＮＦαなどのサイトカインの産生を伴い、それらのサイトカインが、マトリックスメタロプロテアーゼの発現を誘導することは公知である（Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ２０００年、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４３巻  １９１６〜１９２６頁；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．ら、（２００５年）：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ．    Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、５２巻（１号）、１２８〜１３５頁；およびＧｅｒｗｉｎ，  Ｎ．ら、（２００６年）、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ５８巻、２２６〜２４２頁参照）。
【０００４】
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．ら（２００５年）は、インビトロで、ＩＬ−１および／またはＴＮＦαの抑制が、ＯＡ軟骨におけるＩＩ型コラーゲンおよびプロテオグリカンの分解を停止することを示した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．ら、（２００５年）：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｃ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ．    Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、５２巻（１号）、１２８〜１３５頁参照）。それゆえに、細胞外マトリックスの分解および変性の制御が、関節疾患の治療につながると考えられる（ＥＰ１５４７６１７参照）。
【０００５】
変性関節炎としても公知のＯＡは、欧州、米国、および日本において、最も一般的な型の関節炎であり、身体障害の主要原因であり、推定有病率が人口の３６〜４８％である。高齢者の割合が増大していくこと、およびＯＡについての他のリスク因子（例えば、肥満および活動しない生活様式）の発生率が増加しているので、前記の数は、増大することが予想される（Ｇｅｒｗｉｎ，  Ｎ．ら（２００６年）、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ５８巻、２２６〜２４２頁）。効果的なＯＡ治療の必要性の増加にもかかわらず、現在の治療は、徴候および症状を治療するのみであり、すなわち、根本的な関節軟骨の構造的変化ではなく、痛みの軽減である。現在の治療は、単純な鎮痛薬、非ステロイド系抗炎症薬の投与、またはグルココルチコイドおよびヒアルロン酸製剤の関節内注射を含む。したがって、ＯＡの治療の満たされていない医学的必要性が大いにある。
【０００６】
軟骨変性の治療の複雑化の要因として、関節軟骨は、無血管性かつ無リンパ性である；結果として、栄養分または医薬品などの分子が、滑液から高密度の軟骨マトリックスを通って拡散して、軟骨細胞に達することが可能でなければならない（Ｇｅｒｗｉｎ，  Ｎ．ら（２００６年）、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  ５８巻、２２６〜２４２頁）。溶質の浸透性、特に軟骨を通っての巨大分子、中でもＩｇＧ抗体の浸透性は、試験されている（Ｍａｒｏｕｄａｓ  Ａ．、（１９７６年）、Ｊ．  Ａｎａｔ．  １２２巻（２号）、３３５〜３４７頁）。分配係数は、溶質のサイズが増加するにつれて、非常に急勾配で減少することが見出された。結果的には、より大きな分子の通過は、マトリックス網目構造のポアサイズに制限され、したがって、グリコサミノグリカンの局所濃度に強く依存する。様々なサイズおよび様々なｐＩのタンパク質の、関節軟骨の浸透および関節軟骨における残留性に関する追加の試験は、ｖａｎ  Ｌｅｎｔのチームによって行われている。彼らは、陽イオン性タンパク質の、関節軟骨の浸透および関節軟骨内での残留性が、陰イオン性タンパク質と比較して、はるかにより顕著であることを見出した（ｖａｎ  Ｌｅｎｔ，  Ｐ．  Ｌ．  Ｅ．  Ｍ．ら（１９８７年）、Ｊ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  １４巻（４号）、７９８〜８０５頁）。ｖａｎｔ  Ｌｅｎｔらによって実施されたマウスのインビボ試験は、彼の以前の所見を大部分、確認した（ｖａｎ  Ｌｅｎｔ，  Ｐ．  Ｌ．  Ｅ．  Ｍ．ら（１９８９年）、Ｊ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  １６巻（１０号）、１２９５〜１３０３頁）。彼は、特定のタンパク質が小さければ小さいほど、かつ陽イオン性が強ければ強いほど（高いｐＩ）、軟骨浸透が良くなることを見出した。他方、軟骨保持は、巨大陽イオン性タンパク質について最も顕著であり、これらのタンパク質が負に帯電した軟骨成分グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に効果的に結合し、一方、小さい陽イオン性タンパク質による軟骨結合はずっと非効率的であることを示している。インビトロでの強陽イオン性タンパク質の軟骨浸透の上部範囲は、２４０ｋＤａ〜４４０ｋＤａであることが見出された。軟骨浸透についてのｐＩの重要性は、以下の例によって指摘されている。異なるｐＩ値を有する３つの異なるバージョンのＩｇＧ抗体（１５０ｋＤａ）が試験された。９．０のｐＩを有する操作されたＩｇＧ変異体は、軟骨へ深く浸透したが、７．０〜８．０のｐＩ値を有する天然ＩｇＧについて、浸透を検出することができなかった。４．５のｐＩを有する第３の変異体は、もはや試験されなかった。ＢＳＡ（６７ｋＤａ）について、ｐＩ８．５〜９．０変異体は、軟骨の深い浸透を生じ、７．０〜８．０変異体は、軟骨表面で保持され、天然の４．５ｐＩ変異体はいかなる検出可能なシグナルも現さなかった（ｖａｎ  Ｌｅｎｔ，  Ｐ．  Ｌ．  Ｅ．  Ｍ．ら（１９８７年）、Ｊ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  １４巻（４号）、７９８〜８０５頁）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／１９７４７１号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、軟骨の分解に対する、特に、変形性関節症の治療のための薬学的作用物質を提供することが本発明の目的である。
【０００９】
本発明は、軟骨変性、ひいてはそれに関連した任意の障害の治療、予防、および／または進行の遅延のための抗原結合性ポリペプチドであって、軟骨へ浸透する能力がある抗原結合性ポリペプチドを提供する。
【００１０】
驚くべきことに、特異的抗原結合性ポリペプチド、特に一本鎖抗体が、効果的な様式で、軟骨へ浸透する能力があり、それらが、軟骨マトリックス内でサイトカイン、サイトカイン受容体、またはメタロプロテイナーゼなどの標的タンパク質を結合できることが、見出された。標的分子の結合により、それらの生物学的機能がそれらの発生部位でブロックされ得、軟骨変性は、減少および／または抑制することができる。したがって、本発明のポリペプチドは、特定の標的分子に直接的様式で作用することができる。ポリペプチドへ正電荷を付加することによって、軟骨内の保持時間を増強することができ、それによって、標的タンパク質とのより長い接触を可能にする。
【００１１】
さらに、より大きい分子は、軟骨マトリックスを浸透することができないため、より大きいタンパク質分子と比較した場合、本発明の薬学的作用物質の投与によって、より大きな分布量が利用可能である。
【００１２】
本発明はまた、軟骨変性、特に変形性関節症の治療、予防、および／または進行の遅延のための前記抗原結合性ポリペプチドの使用を提供する。
【００１３】
本明細書に開示された抗原結合性ポリペプチドは、軟骨変性のインビトロ診断および／またはインビボ診断に用いることもできる。
【００１４】
さらに、本発明は、本明細書に開示された抗原結合性ポリペプチドを含む組成物、ならびに軟骨変性およびそれに関連した任意の障害、特に変形性関節症の治療、予防、および／または進行の遅延のための前記組成物の使用を包含する。
【００１５】
さらにもう１つの実施形態において、軟骨変性の治療のための方法であって、抗原結合性ポリペプチドが、特に関節内投与によって、局所投与される、方法が提供される。
【００１６】
本発明は、以下のその詳細な説明を考慮すると、より良く理解され、かつ上記で示されたもの以外の目的が明らかになるだろう。そのような説明は、添付された図面を参照している。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、インビトロの軟骨浸透実験について設定された実験の模式図である。以下の構成要素が描かれている：ポンプ（１）、チューブシステム、矢印は流れ方向を示している（２）、緩衝液リザーバ（３）、ＦＩＴＣ標識プローブを含むリザーバ（４）および貫流チャンバー（５）を有する拡散チャンバー、浸透チャンバーへクランプで固定された、関節面を上向き（プローブリザーバの方向）にした軟骨（６）。大きな矢印は、ＦＩＴＣ標識分子の軟骨の中へ入って、通過する浸透を示す。
【図２】図２は、軟骨浸透について用いられるＦＩＴＣ標識タンパク質を希釈し（１：２、１：４、１：８、１：１６）、スライドガラス上にスポットし、ＵＶ下でシグナル強度を決定したものを示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、示された時間の後のＥＳＢＡ１０５−ＦＩＴＣおよびインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））−ＦＩＴＣの浸透を、ＵＶ光下で撮影した軟骨切片の写真によって可視化している図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、示された時間の後のＥＳＢＡ１０５−ＦＩＴＣおよびインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））−ＦＩＴＣの浸透を、ＵＶ光下で撮影した軟骨切片の写真によって可視化している図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、示された時間の後のＥＳＢＡ１０５−ＦＩＴＣおよびインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））−ＦＩＴＣの浸透を、ＵＶ光下で撮影した軟骨切片の写真によって可視化している図である。
【図４】図４は、ＦＩＴＣ標識ＴＮＦ−αインヒビターとのインキュベーション後のウシ軟骨の先端面からの規定された距離における蛍光強度を示す図である。
【図５Ａ】図５Ａは、約１０００ｍｃｇ／動物の用量レベルでの［１２５Ｉ］−ＥＳＢＡ１０５の単回静脈内投与（Ａ）または単回関節内投与（Ｂ）後の雄ウサギの下肢における放射能濃度の比較を示す図である。関節内投与後の関節軟骨について、６時間目の時点で、定量化の範囲内の値を得ることができなかったことに注目されたい。それゆえに、この組織についてはグラフに実線が引かれなかった。
【図５Ｂ】図５Ｂは、約１０００ｍｃｇ／動物の用量レベルでの［１２５Ｉ］−ＥＳＢＡ１０５の単回静脈内投与（Ａ）または単回関節内投与（Ｂ）後の雄ウサギの下肢における放射能濃度の比較を示す図である。関節内投与後の関節軟骨について、６時間目の時点で、定量化の範囲内の値を得ることができなかったことに注目されたい。それゆえに、この組織についてはグラフに実線が引かれなかった。
【図６】図６は、［１２５Ｉ］−ＥＳＢＡ１０５の静脈内注射および関節内注射後の膝関節組織の体内分布を示す図である。関節内注射（点線）および静脈内注射（実線）後の血漿中の［１２５Ｉ］−ＥＳＢＡ１０５レベルの時間経過を示す。
【図７】図７は、Ｌ９２９マウス線維芽細胞のＴＮＦ−α誘導性アポトーシスからの救出を示す図である。アクチノマイシンＤの存在によって感作されたＬ９２９マウス線維芽細胞を、異なる濃度のＥＳＢＡ１０５またはインフリキシマブのｒｈＴＮＦ−α（１００ｐｇ／ｍｌの最終濃度）とあらかじめインキュベートされた混合物に曝した。インフリキシマブと類似して、ＥＳＢＡ１０５は、ＴＮＦ−αのアポトーシス促進効果を用量依存性様式でブロックする。それぞれ、ＥＳＢＡ１０５について１２．５ｎｇ／ｍｌおよびインフリキシマブについて１４．０ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０値によって決定されているように、ＥＳＢＡ１０５の効力は、インフリキシマブとほとんど同一である。
【図８Ａ】図８は、ラット単関節炎モデルにおける関節内ＥＳＢＡ１０５による抑制：１０μｇのｒｈＴＮＦ−αの関節内注射によって誘発された急性単関節炎への、関節内注射されたＥＳＢＡ１０５とインフリキシマブ、それぞれの抑制可能性の比較を示す図である。（カリパスの使用によって定量化された）関節腫脹、滑膜炎（ＨＥ染色；Ｂも参照）、およびプロテオグリカン損失（トルイジンブルー染色；Ｂも参照）への効果を評価した。
【図８Ｂ】図８は、ラット単関節炎モデルにおける関節内ＥＳＢＡ１０５による抑制：１０μｇのｒｈＴＮＦ−αの関節内注射によって誘発された急性単関節炎への、関節内注射されたＥＳＢＡ１０５とインフリキシマブ、それぞれの抑制可能性の比較を示す図である。（カリパスの使用によって定量化された）関節腫脹、滑膜炎（ＨＥ染色；Ｂも参照）、およびプロテオグリカン損失（トルイジンブルー染色；Ｂも参照）への効果を評価した。
【図８Ｃ】図８は、ラット単関節炎モデルにおける関節内ＥＳＢＡ１０５による抑制：１０μｇのｒｈＴＮＦ−αの関節内注射によって誘発された急性単関節炎への、関節内注射されたＥＳＢＡ１０５とインフリキシマブ、それぞれの抑制可能性の比較を示す図である。（カリパスの使用によって定量化された）関節腫脹、滑膜炎（ＨＥ染色；Ｂも参照）、およびプロテオグリカン損失（トルイジンブルー染色；Ｂも参照）への効果を評価した。
【図９】図９は、ラット単関節炎モデルにおける関節内ＥＳＢＡ１０５の用量応答：ＥＳＢＡ１０５およびインフリキシマブ、それぞれのインビボ用量応答を示す図である。滑膜炎およびプロテオグリカン損失に関するデータは示されていない。
【図１０】図１０は、ＦＷ２．３、または２０ｕｇ／ｍｌもしくは１００ｕｇ／ｍｌのＥＳＢＡ１０５で処理された軟骨培養物の上清における５日目のＭＭＰ活性を示す図である。ヒト変形性関節症軟骨外植片のＥＳＢＡ１０５での処理は、アイソタイプ対照と比較した場合、ＭＭＰの活性を有意に低下させた。絶対値については、対照状態（ＦＷ２．３）を１００％に設定することによって各患者について別々に標準化した。＊ｐ＜０．０５。各培養条件についてのＭＭＰ活性の絶対平均値は、図の下の表の行に示されている。
【図１１】図１１は、全ての時点のプールされた培地におけるＰＧＥ２を示す図である。両方の濃度のＥＳＢＡ１０５は、軟骨培養物の上清におけるＰＧＥ２レベルを有意に低下させた。絶対値については、対照状態（ＦＷ２．３）を１００％に設定することによって各患者について別々に標準化した。＊ｐ＜０．０５。各培養条件における測定されたＰＧＥ２レベルの絶対平均値は、図の下の表の行に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、下記で、より詳細に記載される。様々な実施形態、選択性、および範囲を随意に組み合わせてもよいことは理解されている。さらに、特定の実施形態によっては、選択された定義、実施形態、または範囲が当てはまらない場合がある。
【００１９】
本発明の範囲において、以下の定義が適用される：
用語「抗原結合性ポリペプチド」は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸の重合体が抗原に特異的に結合する能力を指す。これらのポリペプチドとして、選択された抗原に対する十分な結合能力を有する、完全長抗体の任意の抗原結合性断片または一本鎖が挙げられる。本発明に包含される抗原結合性断片の例として、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片；単一ドメインまたはｄＡｂ断片、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；任意で合成リンカーによって連結されてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せ、および一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。「完全長抗体」には、１つの起源の抗原結合性可変ドメインが、異なる起源の定常ドメインに結合している、例えば、マウス抗体の可変ドメインＦｖがヒト抗体の定常ドメインＦｃに結合している、キメラ抗体が挙げられる。上記で列挙された抗体および抗体断片は、当業者に公知の通常の技術を用いて得られ、断片は、無傷抗体がスクリーニングされるのと同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。抗原結合性ポリペプチドという用語はさらに、当技術分野において周知である代替スキャフォールドに基づいている抗原結合性ポリペプチドを包含し、それらには、ＣＴＬＡ−４、テンダミスタット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）、フィブロネクチン（ＦＮ３）、ネオカルチノスタチン、ＣＢＭ４−２、リポカリン、Ｔ細胞受容体、プロテインＡドメイン（プロテインＺ）、Ｉｍ９、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、設計ＴＰＲタンパク質、Ｚｎフィンガー、ｐＶＩＩＩ、トリ膵臓ポリペプチド、ＧＣＮ４、ＷＷドメイン、Ｓｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）、Ｓｒｃ相同ドメイン２（ＳＨ２）、ＰＤＺドメイン、ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼ、ＧＦＰ、チオレドキシン、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）ヌクレアーゼ、ＰＨＤフィンガー、ＣＩ−２、ＢＰＴ１  ＡＰＰＩ、ＨＰＳＴＩ、エコチン、ＬＡＣＩ−Ｄ１、ＬＤＴＩ、ＭＴＩ−ＩＩ、サソリ毒、昆虫デフェンシンＡペプチド、ＥＥＴＩ−ＩＩ、Ｍｉｎ−２３、ＣＢＤ、ＰＢＰ、チトクロームｂ５６２、Ｌｄｌ受容体ドメインＡ、γ−クリスタリン、ユビキチン、トランスフェリン、およびＣ型レクチン様ドメインが挙げられるが、それらに限定されるわけではない（Ｂｉｎｚら（２００５年１０月）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２３巻（１０号）：１２５７〜６８頁参照）。本明細書に開示された方法および組成物の好ましい実施形態において、抗原結合性ポリペプチドは一本鎖抗体である。
【００２０】
本発明の抗原結合性ポリペプチドは、組換え遺伝学の分野における日常的技術を用いて作製してもよい。ポリペプチドの配列がわかっている場合には、それらをコードするｃＤＮＡは遺伝子合成によって作製することができる。
【００２１】
本明細書に開示された抗原結合性ポリペプチドは、例えば、放射活性をもって、もしくは蛍光剤で標識してもよいし、または例えばＰＥＧ化により、化学的に修飾してもよい。
【００２２】
「軟骨変性」は、いくつかの方法によって測定することができる。軟骨外植片培養物を用いた前臨床実験において、コラーゲンおよび／またはプロテオグリカンの損失を、治療を適用する前に外植片の重さを量ることによって、かつ培地へ放出されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の量および軟骨に残存するＧＡＧ含有量を決定することによって、直接測定することができる。さらに、ＩＬ−１およびＴＮＦαなどの特定のサイトカインの発現プロファイリングは、炎症／異化過程の指標を与えることができる。コラーゲン崩壊は、培地へ放出されたコラーゲン分解産物ＣＴＸ−ＩＩを測定することによって決定することができる。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）発現もしくは活性の測定、またはプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）濃度の測定は、軟骨変性の間接的指標である。ＣＴＸ−ＩＩはまた、ヒトにおける軟骨変性のバイオマーカーとしての役割を果たすことができる。それは、市販のキット（例えば、ＯＳＴＥＯ  ｍｅｄｉｃａｌ  ＧｍｂＨ、Ｂｕｎｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ製のＣＴＸ−ＩＩ−Ｕｒｉｎ（ＣａｒｔｉＬａｐｓ（登録商標））、ヒト）を用いて尿中で測定することができる。ヒトにおいて軟骨変性を評価するための現在の標準方法はＸ線であるが、この方法は磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に取って代わられるであろうことは予見できる。ＭＲＩは、関節軟骨容積および形態を定量化することを可能にする（Ｐｅｔｅｒｆｙ，  ＣＧら（２００６年）Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ、１４巻、Ａ９５〜Ａ１１１頁）。抗原結合性ポリペプチドの治療有効量は、疾患もしくは状態を治療する、寛解させる、もしくは予防する、または検出可能な治療効果もしくは予防効果を示すのに必要とされる量を指す。
【００２３】
用語「薬学的製剤」は、対象に投与し、明白に有効であり得る抗原結合性ポリペプチドの生物活性を保持することができ、かつ毒性である追加成分を含まない調製物を指す。薬学的に許容される賦形剤（溶媒、添加剤）は、用いられる活性成分の有効量を提供するように対象哺乳動物へ合理的に投与することができるものである。
【００２４】
第１の態様において、本発明は、軟骨変性の治療、予防、および／または進行の遅延のための抗原結合性ポリペプチドであって、軟骨へ浸透する能力がある抗原結合性ポリペプチドを提供する。
【００２５】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは一本鎖抗体である。
【００２６】
軟骨浸透は、例えば、標識抗原結合性ポリペプチドを軟骨外植片に、例えば、実施例１に記載され、かつ図３に示された実験設定によって、適用することにより、インビトロで測定してもよい。或いは、軟骨浸透は、放射標識タンパク質によって評価することができる（例えば、ｖａｎ  Ｌｅｎｔ，  Ｐ．  Ｌ．  Ｅ．  Ｍ．ら（１９８７年）、Ｊ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  １４巻（４号）、７９８〜８０５頁参照）。放射標識はまた、実施例２、またはｖａｎ  Ｌｅｎｔ，  Ｐ．  Ｌ．  Ｅ．  Ｍ．ら（１９８９年）、Ｊ．  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．  １６巻（１０号）、１２９５〜１３０３頁に記載されているように、インビボで軟骨浸透を決定するのにも適している。
【００２７】
さらなる好ましい実施形態において、ＡｔｈａおよびＩｎｇｈａｍ（１９８１年）の方法に従って測定した場合の本発明のポリペプチドの溶解度は、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、および最も好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｍｌである。
【００２８】
特に、安定かつ可溶性の抗体、好ましくは、ＷＯ０３／０９７６９７に記載されているような安定かつ可溶性のフレームワークを有する一本鎖抗体は、高度に濃縮された製剤が達成され得る；その結果として、少ない適用量を用いることができるため、有利である。言及されているような安定かつ可溶性の抗体は、好ましくは、以下の特徴の１つまたは複数を有する：
−それは、ＷＯ０１／４８０１７に開示されているような酵母相互作用アッセイ、いわゆる品質管理システムで測定される場合の還元条件下で安定である、
−それは、ＰＢＳ中、２０℃〜４０℃、好ましくは３７℃で、少なくとも１カ月間、好ましくは少なくとも２カ月間、最も好ましくは少なくとも６カ月間、安定である、
−それは、生理的条件下で単量体を保持する、
−それは、ＰＢＳ中外界温度で、約１ｍｇ／ｍｌより高い、好ましくは約４ｍｇ／ｍｌより高い、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌより高い、さらにより好ましくは約２５ｍｇ／ｍｌより高い、最も好ましくは約５０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で可溶性である、
−それは、少なくとも１．５Ｍ、好ましくは少なくとも１．７５Ｍ、より好ましくは少なくとも１．９Ｍ、最も好ましくは少なくとも２Ｍの塩酸グアニジン滴定における遷移の中間点を示す、すなわち、変性に対して抵抗性である。
【００２９】
好ましい実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１０ｋＤａで、かつ５０ｋＤａ未満の分子量を有する。好ましくは、ポリペプチドは、約２６〜２７ｋＤａの分子量を有する。
【００３０】
さらに、ポリペプチドは、好ましくは、サイトカインまたはサイトカイン受容体を特異的に結合する。より好ましくは、前記サイトカインまたはサイトカイン受容体は、炎症促進性である。前記炎症促進性サイトカインは、好ましくは、ＴＮＦαまたはインターロイキン、例えば、ＩＬ−１もしくはＩＬ−６、または列挙されたサイトカインのいずれかの結合について特異的である任意のサイトカイン受容体である。別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、軟骨プロテオグリカン分解酵素を特異的に結合する。そのような酵素として、アグリカナーゼおよびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）が挙げられる。
【００３１】
標的分子の特異的結合を通して、軟骨変性におけるそれらの生物活性を調節および／またはブロックすることができる。
【００３２】
別の好ましい実施形態において、抗原結合性ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも９０％同一性、より好ましくは少なくとも９５％同一性、最も好ましくは少なくとも９９％同一性を有する可変軽鎖ＶＬ；および／または配列番号２と少なくとも９０％同一性、より好ましくは少なくとも９５％同一性、最も好ましくは少なくとも９９％同一性を有する可変重鎖ＶＨを含む。
【００３３】
別の好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３の配列と少なくとも９０％同一性、より好ましくは少なくとも９５％同一性、最も好ましくは少なくとも１００％同一性を有する。
【００３４】
本発明の配列は以下である：
配列番号１  ＥＳＢＡ１０５のＶＬ
【００３５】
【化１】
2011510667.tif 000003
配列番号２  ＥＳＢＡ１０５のＶＨ
【００３６】
【化２】
2011510667.tif 000004
配列番号３  ＥＳＢＡ１０５
【００３７】
【化３】
2011510667.tif 000005
２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、当業者に周知である数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。本明細書で言及される同一性は、インターネットでアクセス可能なＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所アラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌｓ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．、Ｇｉｓｈ，  Ｗ．、Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｗ．、Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．Ｗ．、およびＬｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．（１９９０年）「Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ」Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５巻：４０３〜４１０頁参照）を用いることによって決定することになっている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、アミノ酸配列を本発明のタンパク質分子と比較するために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行することができる。比較を目的としてギャップドアラインメントを得るために、ギャップドＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁に記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。
【００３８】
さらに別の好ましい実施形態において、浸透効率は、軟骨内に見出されるｐＨまたは投与部位との関連において抗原結合性ポリペプチドのサイズおよびｐＩに依存する。例えば、健康な膝関節内のｐＨは、約７．４である。炎症関節において、ｐＨは約７まで下がり得る。好ましくは、抗原結合性ポリペプチドのｐＩは、７．０より高く、より好ましくは７．４より高く、最も好ましくはそれは７．８以上である。
【００３９】
さらに別の好ましい実施形態において、抗原結合性ポリペプチドは、軟骨浸透を促進するために、かつ軟骨保持を最適化するために、抗原結合性ポリペプチドに全体的な正電荷を供給する製剤中に適用される。
【００４０】
第２の態様において、本発明は、軟骨変性、特に変形性関節症の治療、予防、および／または進行の遅延のための開示された抗原結合性ポリペプチドの使用を提供する。
【００４１】
本明細書に開示された抗原結合性ポリペプチドはまた、軟骨変性、特に変形性関節症のインビトロ診断および／またはインビボ診断に用いてもよい。
【００４２】
さらに別の態様において、抗原結合性ポリペプチドは、軟骨変性、特に変形性関節症の治療、予防、および／もしくは進行の遅延のための医薬品の製造のために、または軟骨変性、特に変形性関節症の検出のためのインビトロ診断剤として用いることができる。
【００４３】
さらに、本発明は、本明細書に開示された抗原結合性ポリペプチドを含む組成物を包含する。組成物は、好ましくは、薬学的組成物であり、薬学的に許容される担体、または１つもしくは複数のさらなる有効な作用物質をさらに含んでもよい。
【００４４】
好ましい実施形態において、組成物の抗原結合性ポリペプチドは、ｓｃＦｖであり、ＴＮＦαを特異的に結合する。抗原結合性ポリペプチドは、それの組成物への組み入れの前に凍結乾燥に供してもよい。好ましくは、組成物は、水性製剤である。前記水性製剤は、ポリペプチドをｐＨ緩衝溶液に溶解して調製してもよく、その緩衝液は、６．０より上のｐＨ、好ましくは６．０の上から７．８までの範囲のｐＨを有する。この範囲内にｐＨを調節する緩衝液の例として、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、およびクエン酸塩などの有機酸緩衝液が挙げられる。
【００４５】
本発明の抗体および組成物は、いくつかの様々な対象、好ましくは温血動物、より好ましくはヒトおよび非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ウマ、ネコを含む哺乳動物に投与することができる。本明細書に開示された、方法、抗原結合性ポリペプチド、および／または組成物の好ましい実施形態において、対象はヒトである。
【００４６】
本明細書に開示された方法、抗原結合性ポリペプチド、および／または組成物の投与様式は、好ましくは非経口であり、最も好ましくは関節内である。
【００４７】
哺乳動物において実施された（実施例１参照）本発明によって開示されている実験は、本発明の抗原結合性ポリペプチドの関節内投与後、ポリペプチドは、静脈内適用経路に従うより軟骨へはるかに効率的な様式で浸透すること（図５ＡおよびＢ参照）を示した。血漿中において、本発明の抗原結合性ポリペプチドの測定された最大濃度（Ｃｍａｘ）は、関節内投与後、静脈内注射後より低かった。特定の実験設定において、その差は１０倍であった。さらに、血漿中のＣｍａｘは、関節内投与から数時間後にピークに達し、それは、関節内注射の部位から循環への比較的遅い吸収を示し、それは、徐放性効果に匹敵する。これらの所見は、注射部位におけるより高い局所濃度のポリペプチドおよび血漿へのクリアランスの遅延が観察されているため、抗原結合性ポリペプチドの局所投与が全身投与より好ましいという仮説を確認している。さらに、関節内適用後、ポリペプチドの全身曝露は、静脈内投与と比較して、より低く、それは潜在的全身性有害反応を低下させる。
【００４８】
好ましくは、本明細書に開示されたポリペプチドおよび／または組成物は、関節内投与の際、血漿中のポリペプチドのピーク濃度Ｃｍａｘが、静脈内注射後の約１０分の１、好ましくは静脈内注射後の１０分の１より低いように選択される。さらに、ポリペプチドおよび／または組成物は、関節軟骨における、関節内投与での前記ポリペプチドのピーク濃度Ｃｍａｘは、好ましくは静脈内注射後の少なくとも４０倍、好ましくは静脈内注射後の少なくとも４５倍であるように選択される。好ましくは、ＡＵＣ０−６に基づいた関節軟骨におけるポリペプチド曝露は、本明細書に開示されたポリペプチドまたは組成物の静脈内適用と比較して、関節内に関して、約１３５倍であり、および／またはＡＵＣ０−２４０は、１５０倍〜５００倍である。上記で述べたように、抗原結合性ポリペプチドは、好ましくは、それが７．０より高いｐＩを有するように選択され、および／または組成物は、抗原結合性ポリペプチドに全体的な正電荷を供給する製剤を有するように選択される。
【００４９】
非経口および／または関節内使用用の組成物は、薬学的組成物の製造のための当技術分野にとって公知の任意の方法に従って調製してもよく、本発明の有効物質以外に、保存剤および／またはアジュバントなどの１つまたは複数の作用物質を含んでもよい。組成物は、活性成分を適切な生理的に許容される賦形剤と混合して含んでもよい。そのような賦形剤として、例えば、不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）、造粒剤および崩壊剤（例えば、コーンスターチまたはアルギン酸）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、またはアラビアゴム）、および潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク）が挙げられる。
【００５０】
好ましい実施形態において、組成物は、鎮痛性および／または抗炎症性を有するポリペプチドを含む。これは、具体的には、ポリペプチドがＴＮＦαを特異的に結合する場合である。さらなる好ましい実施形態において、組成物はさらに、本明細書に記載されたポリペプチド以外に鎮痛薬および／または非ステロイド系抗炎症薬を含む。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、組成物は、ヒアルロン酸および／または関節内注射されるグルココルチコイドを含む。
【００５２】
本明細書に開示された組成物は、好ましくは、安定な様式で製剤化される。安定な製剤は、その中の抗原結合性ポリペプチドが本質的にその生物活性、好ましくは、保存時のその物理的安定性および／または化学的安定性を保持するものである。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技術が当技術分野において利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２４７〜３０１頁、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  Ｐｕｂｓ．（１９９１年）、およびＪｏｎｅｓ，  Ａ．  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．  １０巻：２９〜９０頁（１９９３年）に概説されている。安定性は、選択された期間、選択された温度で測定することができる。好ましくは、製剤は、室温（約２５℃）または４０℃で、少なくとも１カ月間安定であり、および／または約２〜８℃で少なくとも１年間、好ましくは少なくとも２年間、安定である。さらに、製剤は、好ましくは、製剤の凍結（例えば、−７０℃まで）および解凍後、安定である。
【００５３】
関節内注射は侵襲的手法を要求しているため、それらを頻繁すぎる回数で投与することは勧められない。それゆえに、薬学的活性のある化合物が、注射部位および／または関節組織中において長い滞留時間を示すことが好ましい。本明細書に記載されたポリペプチドは、軟骨を浸透する能力があるので、関節内投与の際、関節からの前記ポリペプチドの放出は、長期間にわたって起こる。好ましい実施形態において、長期の滞留時間はさらに、本明細書で開示された薬学的組成物を徐放性組成物として製剤化する、すなわち、投与後の有効化合物の、好ましくはゼロ次速度での、長期放出を可能にする製剤によって達成される。
【００５４】
そのような製剤は、一般的に、周知のテクノロジーを用いて流動性水性コロイド懸濁液として調製することができる。製剤は、好ましくは、容易に注射可能であるのに十分、流動性である。さらに、製剤は、好ましくは、液体の形で安定で、生体適合性かつ生分解性で、無毒性で、非免疫原性であり、優れた局所耐性を有する。徐放性製剤は、好ましくは、比較的一定のレベルのモジュレータ放出を提供する。いくつかのアプローチが当技術分野において公知である。１つのアプローチにおいて、製剤は、液体で、かつ注射可能であり、ｐＨおよび／または温度の変化によって対象への投与後、より粘稠性になる、少なくとも１つのポリマーおよび１つの活性物質を含む。もう１つの代替物は、ゲル状沈殿物の形成物である。対象の温度がゲル化剤のゲル化点より上であるため、投与により、液体はゲル化する。さらにもう１つのアプローチは、後で対象に投与されるミクロスフェアまたは移植片へ活性物質を組み入れることにある。第４のアプローチは、抗原結合性ポリペプチドを有するナノ粒子の負荷である。その後、その粒子は、低粘性液体懸濁液として投与される。
【００５５】
本明細書に開示されたポリペプチドおよび／または組成物は、例えば、軟骨変性およびそれに関連した任意の障害の治療、予防、および／または進行の遅延に用いることができる。好ましくは、前記障害は変形性関節症である。本発明の範囲内において、軟骨変性に関連した前記障害は、とりわけ、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、および若年性特発性関節炎を包含する。
【００５６】
好ましくは、本明細書に開示されたポリペプチドおよび／または組成物の治療有効量が、それを必要としている対象に投与される。適切な用量は、治療されるべき状態、状態の重症度および経過、抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、薬歴、患者の病歴および抗原結合性ポリペプチドに対する応答、用いられる抗原結合性ポリペプチドの型、ならびに主治医の裁量などの多数の因子に依存する。
【００５７】
本発明はさらに、組成物を保持する１つまたは複数の容器を含む製造品を包含する。適切な容器として、例えば、ボトル、バイアル、およびシリンジが挙げられ、それらは、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されていてもよい。製造品はさらに、商業的観点およびユーザー観点から望ましい他の材料を含んでもよく、それらには、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明書を含む添付文書が挙げられる。さらに、本発明は、本明細書に開示された抗原結合性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を包含する。
【００５８】
別の態様において、本発明はまた、前記ＤＮＡ配列を含むクローニングベクターまたは発現ベクターを包含する。
【００５９】
本発明はさらに、前記発現ベクターで形質転換された適切な宿主細胞を開示する。前記宿主細胞は、原核生物の宿主細胞、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ、または酵母、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、昆虫細胞、哺乳動物細胞、もしくは植物細胞などの真核生物の宿主細胞であり得る。好ましくは、前記方法は、Ｅ．ｃｏｌｉ封入体から、または用いられるｓｃＦｖ構築物が、ポリペプチドを周辺質へ方向付けるシグナル配列を含む場合には、Ｅ．ｃｏｌｉ周辺質から精製されたｓｃＦｖ抗体を提供する。
【００６０】
さらに別の態様において、本発明は、軟骨変性の治療、予防、および／または進行の遅延のための方法であって、
（ａ）少なくとも１０ｋＤａで、かつ５０ｋＤａ未満の分子量を有し、さらに７．０より高いｐＩを有する抗原結合性ポリペプチドを供給するステップと、
（ｂ）前記ポリペプチドをそれを必要としている対象に局所投与するステップと
を含む方法を包含する。
【００６１】
前記ポリペプチドは、好ましくは、本明細書に開示されたポリペプチドである。特に、前記ポリペプチドは、好ましくは、サイトカインまたはサイトカイン受容体、好ましくはＴＮＦαまたはインターロイキンに結合する。より好ましくは、前記ポリペプチドは安定かつ可溶性である。最も好ましくは、前記ポリペプチドは、配列番号３の配列と少なくとも９０％同一性、より好ましくは９５％、および最も好ましくは１００％同一性を有する。
【００６２】
場合によって、ポリペプチドは、前記ポリペプチドの正電荷を増加させるように操作され、および／または前記ポリペプチドは、抗原結合性ポリペプチドに全体的な正電荷を供給する製剤を有する組成物において適用される。ポリペプチドの正電荷は、遺伝子操作、例えば、１つもしくは複数のアミノ酸の置換によって、および／またはポリペプチドの化学的修飾によって、例えば増加させることができる。それにより、軟骨浸透を促進させることができ、および／または軟膏保持を増強することができる。
【００６３】
投与方法は、好ましくは非経口投与、より好ましくは関節内投与である。
【００６４】
典型的には、治療有効量のポリペプチドは、それを必要としている対象に投与される。前記対象は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
ＦＩＴＣ標識ＴＮＦαアンタゴニストのウシ軟骨へのサイズ依存的浸透
実験の目的は、抗ＴＮＦα一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）ＥＳＢＡ１０５（図においてＥ１０５と呼ぶこともある）のエキソビボ軟骨浸透を完全長抗ＴＮＦα抗体インフリキシマブと比較することであった。
【００６６】
材料および方法：
ＥＳＢＡ１０５をＷＯ０８／００６２３５に記載されているように作製した。インフリキシマブ／Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）については、公認のスイス薬局で購入した。
【００６７】
軟骨標本を、（屠殺場から新鮮に入手した）ウシ大腿骨から切開し、図１に模式的に描かれているように角膜灌流チャンバーに取り付けた。天然では滑液に曝されている軟骨層を、３００ｍｃｌのＦＩＴＣ標識抗体溶液に曝した。ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中のＦＩＴＣ標識抗体の試験された濃度は、Ｅ１０５−ＦＩＴＣについては１ｍｇ／ｍｌであり、インフリキシマブ−ＦＩＴＣについては、それぞれ、１ｍｇ／ｍｌおよび２．２ｍｇ／ｍｌであった。チャンバー、チューブ、およびリザーバを通って循環する総液体容積は、５ｍｌであった。指定されたインキュベーション時間（２時間、４時間、６時間、または８時間）後、軟骨組織を、２０ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回、洗浄し、その後、ＯＣＴコンパウンド（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ）に包埋し、液体窒素で凍結した。試料をパラフィンフイルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）でラップし、薄片作製まで−２０℃で保存した。
【００６８】
薄片作製については、ＭＩＣＲＯＭクリオスタット（ＯＴ：−１８℃、ナイフ：−２０℃）を用いて１４ｍｃｍの切片厚さで行った。マウントされた切片を分析し、４０〜１００ｘの倍率でＵＶ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）下で写真撮影した。写真上のシグナル強度を、ＩＭＡＧＥ  ＱＵＡＮＴ（５．０）ソフトウェアを用いて分析した。
【００６９】
ＦＩＴＣ標識を以下の通り実行した：７５ｍｃｌの新鮮に調製された１ｍｇ／ｍｌ  ＮＨＳ−ＦＩＴＣ／ＤＭＳＯ溶液を、ボルテックスしながら、１ｍｌの２ｍｇ／ｍｌ抗体溶液に加え、室温で４５分間、インキュベートした。結合していないＦＩＴＣの標識タンパク質からの分離については、４℃で、５ｌのＰＢＳ、ｐＨ６．５中、５ｍｌの透析カセットを用いる透析によって行った。透析を４８時間にわたって行い、その間、透析緩衝液を４回、完全に交換した。
【００７０】
軟骨標本は、骨からメスで切除したため厚さが様々であった。製剤に曝された軟骨表面は、各写真の下端へ向けられている。図「インビトロ軟骨浸透」の写真３〜５（左から右へ）は、続いて撮られた２枚の写真（３つのうちの写真４）で構成され、オーバーレイして、調べられた軟骨組織全体の概要を作製した。
【００７１】
結果：
ＥＳＢＡ１０５−ＦＩＴＣおよびインフリキシマブ−ＦＩＴＣのウシ軟骨への浸透試験の結果は図３に示されている。時間経過試験により、ＥＳＢＡ１０５−ＦＩＴＣは、ウシ軟骨へ時間依存的様式で効率的に浸透したが、インフリキシマブ−ＦＩＴＣは浸透しなかった。インフリキシマブ−ＦＩＴＣについて、時間依存的浸透は観察されず、８時間後で、かつ２．２ｍｇ／ｍｌの濃度においてさえも、写真は、ＰＢＳ処理軟骨と区別ができない。異なる標識タンパク質調製物の比較を可能にするために、それらを軟骨浸透実験に用いる前に、それらのアリコートを希釈し（１：２、１：４、１：８、１：１６）、ガラススライド上にスポットし、ＵＶ下でシグナル強度を決定した。この希釈系列の結果は、図２に示されており、その図は、ＦＩＴＣ標識は両方のタンパク質について等しく効率的に働き、したがって、浸透実験の結果は、定性的な基準において直接比較できることを示している。
【００７２】
図４Ａは、時間経過試験中に頂端から距離０．５［任意単位］（ルーラーについて図４Ｂ参照）で測定されたシグナル強度の定量化を示す。ＰＢＳについてとインフリキシマブ−ＦＩＴＣについて、測定された値は、ほとんど同一で、インフリキシマブ−ＦＩＴＣは軟骨を浸透しなかったことを示す。ＥＳＢＡ１０５について、定量的分析により、時間と共にシグナル強度がほぼ直線的に増加することが明らかにされた。
【００７３】
（実施例２）
インビボ試験および体内分布試験
材料および方法：
ＴＮＦ−αインヒビター。記載されているようにＥＳＢＡ１０５をＥ．ｃｏｌｉ中に発現させ、そこから精製し、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５中で用いた。インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））およびエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））を施設内薬局で購入した。
【００７４】
細胞培養中のＴＮＦ−α誘導性アポトーシス。継代ｐｘ６〜ｐｘ１５のマウスＬ９２９線維芽細胞を９６ウェルプレート（１６７００８、Ｎｕｎｃ、Ｌａｎｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の１００μｌのアッセイ培地（Ｌ−グルタミン＋５％ＦＣＳを含む、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ）に２０，０００細胞／ウェルの細胞密度まで蒔いた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で、一晩、インキュベートした。その翌日、組換えヒトｒｈＴＮＦ−α（３００−０１Ａ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）および様々な量のＥＳＢＡ１０５またはインフリキシマブを含むアゴニスト−インヒビター混合物を調製し、周囲温度で３０分間、インキュベートした。５０μｌのアゴニスト−インヒビター混合物（最終ｒｈＴＮＦ−α濃度１００ｐｇ／ｍｌ）を、各ウェルに、５０μｌのアクチノマイシンＤ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）の添加後、細胞に与えた。細胞を２０時間、インキュベートした。その後、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ中の１ｍｇ／ｍｌのＸＴＴおよび２５μＭのＰＭＳ（Ｐ９６２５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む５０μｌの溶液を細胞培養物に加え、細胞を、さらに９０分間、３７℃でインキュベートした。増殖性細胞はミトコンドリアのコハク酸テトラゾリウムリダクターゼ系を発現し、その系は、テトラゾリウム塩ＸＴＴを赤色生成物へ代謝する。赤色強度を、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、Ｇｅｎｉｏｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で４５０ｎｍにおける吸収を測定することによって評価した。
【００７５】
単関節炎モデル。それぞれ、４０μのＰＢＳ中として注射されるＥＳＢＡ１０５、インフリキシマブ、またはＥＳＢＡ１０５と同じ可変ドメインフレームワークからなるが無関連な特異性を有するｓｃＦｖ（本明細書では「ナイーブ」ｓｃＦｖ；ＥＳＢＡＴｅｃｈと名付ける）、続いて、５分後、１０μｌのＰＢＳ中のｒｈＴＮＦ−αを、Ｂｏｌｏｎら、２００４年に従って２８ゲージ針を用いて１０週齢の雌ルイスラット（Ｊａｃｋｓｏｎ）の膝の膝蓋下靱帯を通して関節内に注射した。このために、ラットを５０ｍｇ／ｋｇのケタミンで麻酔した。試験前および試験中、ラットをモニターし、膝直径を、試験前およびｒｈＴＮＦ−α注射から４８時間後、カリパス（Ｄｙｅｒ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、ＰＡ）で測定した。組織病理学的評価（Ｂｏｌｏｎ  Ｂ、Ｃａｍｐａｇｎｕｏｌｏ  Ｇ、Ｚｈｕ  Ｌ、Ｄｕｒｙｅａ  Ｄ、Ｚａｃｋ  Ｄ、Ｆｅｉｇｅ  Ｕ．  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ｂｅｔａ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ，  ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｋｎｅｅ．  Ｖｅｔ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４年；４１巻：２３５〜２４３頁）について、ラットを４８時間目に安楽死させた。脱灰された膝切片を、ＨＥまたはトルイジンブルー染色後に評価した。以前に記載されているように（Ｂｏｌｏｎ  Ｂら（２００４年）、上記参照）、切片を炎症（０〜４）および軟骨（０〜４）についてスコア化した。倫理的承認は、全ての動物手順について得られている。
【００７６】
体内分布試験。ＥＳＢＡ１０５を、ＭＤＳ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  ＡＧ（Ｆｅｈｒａｌｔｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によるクロラミンＴ方法を用いて１８．６ＭＢｑ／ｍｇの開始比放射能まで１２５ヨウ素（１２５Ｉ）で標識した。
【００７７】
体内分布試験を、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．（Ｈａｒｒｏｇａｔｅ、ＵＫ）で実施し、医薬品安全性試験実施基準（法典化、改正など）により改正されたＵｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ（ＧＬＰ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ、Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ａｇｅｎｃｙ（ＭＨＲＡ））Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  １９９９、Ｓｔａｔｕｔｏｒｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  １９９９年  Ｎｏ．３１０６に従って行い、施設内倫理委員会によって承認された。ニュージーランドホワイト雄ウサギに、１０００μｇ／動物のＥＳＢＡ１０５用量レベルの標的における［１２５Ｉ］−ＥＳＢＡ１０５の単回の静脈内または関節内投与を施した。投与された用量は、０．７０７〜０．８２７ＭＢｑの放射性用量に等しい、８８４〜１０３４μｇ／動物の範囲であった。投与後、試料を、表１に記載されているように動物から採取した。
【００７８】
【表１】
2011510667.tif 000006
血液試料を遠心分離して血漿を調製し、それをγ計数（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｏｂｒａ  ２γカウンター、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に供して、薬物動態についての放射能濃度を決定した（Ａ群）。Ｂ群およびＣ群について、動物を、ペントバルビトン過剰投与、続いて、瀉血によって屠殺した。各動物の右後肢（膝関節を含む）を切除し、ヘキサンおよび固体二酸化炭素の混合物に少なくとも１５分間、浸漬した。いったん完全に凍結させたならば、肢を、凍結２％（ｗ／ｖ）水性カルボキシメチルセルロースペーストを含む型に包埋した。その塊を、約−２０℃で維持されたＬｅｉｃａ  ＣＭ３６００クリオミクロトームのステージ上に載せ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｃｋｓ、ＵＫ）、矢状切片（名目厚さ３０μｍ）を膝関節から得た。「インビジブルテープ（Ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ−Ｔａｐｅ）」（Ｓｕｐａｐａｋ、Ｓｈｉｐｌｅｙ、ＵＫ）上にマウントした切片をＧＶＤ０３卓上凍結乾燥機（Ｇｉｒｏｖａｃ  Ｌｔｄ．、Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＵＫ）で凍結乾燥し、ＦＵＪＩイメージングプレート（ＢＡＳ  ＭＳ型、Ｒａｙｔｅｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、ＵＫ）と接触させて置いた。（同様に３０μｍの名目厚さで切片を作製した）適当な活性の１２５Ｉ血液標準を、全てのイメージングプレートと接触させて置いた。銅で裏打ちされた鉛の曝露箱での１４日間の曝露後、イメージングプレートをＦＵＪＩ  ＦＬＡ−５０００  Ｘ線撮影システム（Ｒａｙｔｅｋ  Ｓｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ  Ｌｔｄ）を用いて処理した。電子的画像を、ＰＣベースの画像分析パッケージ（Ｓｅｅｓｃａｎ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙソフトウェア、ＬａｂＬｏｇｉｃ  Ｌｔｄ、Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、ＵＫ）を用いて分析した。各オートラジオグラムと共に含まれていた１２５Ｉ標準を用いて、放射能濃度の範囲に対するキャリブレーション線を作成した。投与から約２カ月後（１２５Ｉ減衰についての約１半減期に相当する）、いくつかの切片および対応する標準を４日間、再び露光させ、高レベルの放射能の定量化を可能にした。加えて、Ｂ群からの残存する屠殺体から採取された組織を、部分をγ計数に供する前に、浸軟させ、および／またはホモジナイズした。
【００７９】
薬物動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌソフトウェア（バージョン４．０．１、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて計算した。
【００８０】
結果
作用様式。ＥＳＢＡ１０５は、ＴＮＦ−αの受容体結合部位への競合的結合によってＴＮＦ−αリガンド−受容体相互作用をブロックする。分析用サイズ排除クロマトグラフィーからのデータにより、３つの単量体ＥＳＢＡ１０５分子が１つのＴＮＦ−α三量体に結合し（データ示さず）、それぞれが３つのＴＮＦ−α単量体のうちの１つと相互作用することが示されている。ＥＳＢＡ１０５は、２．１９×１０−９ＭのＫＤでｒｈＴＮＦ−αに結合する。ＥＳＢＡ１０５のｒｈＴＮＦ−αへの結合動態は、５．７２×１０６Ｍ−１Ｓ−１および０．０１２５６Ｓ−１、それぞれの速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆによって特徴づけられる（データ示さず）。したがって、ヒトＴＮＦ−αからの解離速度は、インフリキシマブの解離速度とエタネルセプトの解離速度の間にある（Ｓｃａｌｌｏｎ  Ｂら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ２００２年；３０１巻：４１８〜２６頁）。
【００８１】
インビトロ効力。細胞培養物においてＴＮＦ−αの生物活性を中和するＥＳＢＡ１０５の能力を、マウスＬ９２９線維芽細胞を用いて実証した。この細胞系は、ＴＮＦ受容体ＩおよびＩＩを発現し、アクチノマイシンＤでの感作により、ＴＮＦ−αに曝されたとき、アポトーシスを起こす。インフリキシマブと同様に、ＥＳＢＡ１０５は、ｒｈＴＮＦ−αのアポトーシス効果を濃度依存性様式でブロックする。Ｌ９２９  ＴＮＦ−αアッセイにおけるＥＣ５０値は、ＥＳＢＡ１０５について１２．５ｎｇ／ｍｌ、およびインフリキシマブについて１４．０ｎｇ／ｍｌであった（図７）。
【００８２】
単関節炎モデル。１０μｇのｒｈＴＮＦ−αの関節内注射後、ラット膝は、予想された炎症反応（Ｂｏｌｏｎ  Ｂ、Ｃａｍｐａｇｎｕｏｌｏ  Ｇ、Ｚｈｕ  Ｌ、Ｄｕｒｙｅａ  Ｄ、Ｚａｃｋ  Ｄ、Ｆｅｉｇｅ  Ｕ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｂｅｔａ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ，  ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｋｎｅｅ．  Ｖｅｔ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４年；４１巻：２３５〜２４３頁参照）：膝の腫脹、滑膜炎、および軟骨中のプロテオグリカンの損失を示した（図９におけるｒｈＴＮＦ−α対照を参照）。無関連の特異性を有するナイーブｓｃＦｖは、炎症反応の重症度へ効果を示さなかった（図９）。対照的に、ＥＳＢＡ１０５は、用量依存的に、ｒｈＴＮＦ−α誘発性炎症反応を抑制した（図９）。興味深いことに、ｒｈＴＮＦ−αに対して１１倍モル（１６倍ｗ／ｗ）過剰量のＥＳＢＡ１０５は、膝の腫脹の９０％抑制をもたらした（図９）。ＥＳＢＡ１０５およびインフリキシマブは、この試験において類似した効力を示した（図９）。炎症スコアもまた、同じ程度で低下した（図８）。さらに、軟骨中のプロテオグリカン損失は、図８に示されているように、防止することができた。
【００８３】
体内分布試験。ＥＳＢＡ１０５は、局所治療用、特に関節への関節内適用として設計されている。最初に、全身性薬物動態について、［１２５Ｉ］−ＥＳＢＡ１０５の静脈内適用と関節内適用を比較して試験した。図１１Ａに示されているように、静脈内適用は、予想された薬物動態学的挙動を示す（Ｌａｒｓｏｎ  ＳＭ、ＥＩ−Ｓｈｉｒｂｉｎｙ  ＡＭ、Ｄｉｖｇｉ  ＣＲ、Ｓｇｏｕｒｏｓ  Ｇ、Ｆｉｎｎ  ＲＤ、Ｔｓｃｈｍｅｌｉｔｓｃｈ  Ｊら、Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｓＦｖ  ＣＣ４９）−  Ｆｉｒｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｔｏ  ｌｉｖｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ  １９９７年；８０巻：２４５８〜６８頁；Ｆｉｔｃｈ  ＪＣ、Ｒｏｌｌｉｎｓ  Ｓ、Ｍａｔｉｓ  Ｌ、Ａｌｆｏｒｄ  Ｂ、Ａｒａｎｋｉ  Ｓ、Ｃｏｌｌａｒｄ  ＣＤら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ，  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃ５  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｂｙｐａｓｓ  ｇｒａｆｔ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｄｉｏｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｂｙｐａｓｓ．  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９９年；１００巻：２４９９〜５０６頁）。測定されたピーク濃度は、投与から２分後（最初の試料採取時間）に生じた。その後、放射能は、おそらく分布相（投与後約１時間）を表す二相様式で減少し、続いて、最終的に排出された（表２）。
【００８４】
【表２−１】
2011510667.tif 000007
【００８５】
【表２−２】
2011510667.tif 000008
対照的に、関節内注射後、血漿中のＣｍａｘは、６〜１２時間後にやっと達しており、長期吸収相を示唆している。しかしながら、血漿中のＡＵＣ０−２４は、静脈内適用および関節内適用の両方について類似している。
【００８６】
局所治療の利点の１つは、局所的に高薬物レベルを達成する可能性である。［１２５Ｉ］−ＥＳＢＡ１０５の関節内膝注射の１時間後および２４時間後、滑膜腔における５７４，０００ｎｇ当量／グラムおよび１４，３００ｎｇ当量／グラムのレベルが観察されている（図５Ｂ）。興味深いことに、関節軟骨中のＥＳＢＡ１０５レベルは、大きさおよび経過においてほとんど同一である（図５Ｂ）。膝蓋骨において、ＥＳＢＡ１０５は、よりゆっくり吸収され、６時間目で１５，１００ｎｇ当量／グラムのＣｍａｘを有する；このレベルは、滑膜腔および軟骨に見出されるレベルの約２０分の１である。海綿骨において、関節内注射後のＥＳＢＡ１０５は、６時間後に３４４０ｎｇ当量／グラムのＣｍａｘに達する（図５Ｂ）。１２時間目から以降、放射能は、ほとんどの組織で減少し、約４時間のＴ１／２を有する。より長いＴ１／２は、血漿（１３．５時間）、骨髄（２３．０時間）、脛骨（１４．６時間）、筋上膜（１４．３時間）、皮膚（１２．１時間）、および大腿骨（９．０２時間）に見出される。興味深いことに、滑液および関節軟骨中のレベルは、膝蓋骨、海綿骨、および血漿中より約２０倍、留まっている。
【００８７】
膝への関節内適用とは対照的に、静脈内適用後、実質的により低いレベルのＥＳＢＡ１０５が膝関節に見出される（図１１Ｃ）。ＡＵＣ０−２４に基づいた関節軟骨における曝露は、［１２５Ｉ］−ＥＳＢＡ１０５の静脈内適用と比較して、関節内に関して１５０倍〜５００倍である。静脈内適用後の組織における最終半減期（それらが測定可能であった場合）は、関節内注射後のそれらと匹敵することが見出された（データ示さず）。
【００８８】
考察
理想的には、ＯＡの治療は、徴候および症状のほかに構造改変にも取り組むべきである。しかしながら、そのような治療は、現在、利用できない（概説として、Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ＆  Ｇｏｌｄｒｉｎｇ、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２００７年；２１３巻：６２６〜３４頁参照）。それゆえに、両方の病態生理学的過程に優位に関与する薬理学的標的が理想であろう。ＴＮＦ−αは、（ａ）ＴＮＦ−αへの（持続的）局所曝露が（持続的）痛覚過敏を引き起こすこと（Ｓａｃｈｓ  Ｄら、Ｐａｉｎ  ２００２年；９６巻：８９〜９７頁；Ｓｃｈａｆｅｒｓ  Ｍら、Ｐａｉｎ  ２００３年；１０４巻：５７９〜８８頁）、（ｂ）ＴＮＦ−αは、ＯＡにおいて滑膜組織（Ｂｅｎｉｔｏ  ＭＪら、Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ２００５年；６４巻：１２６３〜７頁；Ｂｒｅｎｎａｎ  ＦＭら、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５年；４２巻：１５８〜６５頁）および軟骨（Ａｍｉｎ  ＡＲ．  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １９９９年；７巻：３９２〜４頁）によって産生されること、ならびに（ｃ）ＴＮＦ−αは炎症性過程（Ｇｏｌｄｒｉｎｇ  ＳＲおよびＧｏｌｄｒｉｎｇ  ＭＢ、Ｃｌｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｌａｔ  Ｒｅｓ  ２００４年；（４２７号別冊）：Ｓ２７〜３６頁；Ｓｃｈｏｔｔｅｌｉｕｓ  ＡＪら、Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２００４年；１３巻：１９３〜２２２頁）および軟骨分解（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍら、Ａｒｔｈｒｉｔ  Ｒｈｅｕｍ  ２００５年；５２巻：１２８〜３５頁）の推進因子であることから、そのような標的として働く。さらにＨｉｌｌらは、膝ＯＡの経過中における痛みの変化と滑膜炎の変化との相関を記載した（Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ２００７年；６６巻：１５９９〜６０３頁）。ＴＮＦ−αインヒビターは、（ａ）痛みおよび痛覚過敏を抑制すること（Ｓａｃｈｓ  Ｄら、Ｐａｉｎ  ２００２年；９６巻：８９〜９７頁；Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＭＪら、Ｌａｎｃｅｔ  １９９４年；３４４巻：１１０５〜１０頁；Ｓｈｅｒｇｙ  ＷＪら、Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２００２年；２９巻：６６７〜７７頁；Ａｌｓｔｅｒｇｒｅｎ  ＰおよびＫｏｐｐ  Ｓ、Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２００６年；３３巻：１７３４〜９頁）、（ｂ）炎症過程を低下させること（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＭＪら、Ｌａｎｃｅｔ  １９９４年；３４４巻：１１０５〜１０頁；Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ＭおよびＭａｉｎｉ  ＳＲ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２００８年；２２３巻：７〜１９頁）、ならびに（ｃ）ＯＡ軟骨をエキソビボで異化状態から同化状態へ逆転させ得ることが示されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍら、Ａｒｔｈｒｉｔ  Ｒｈｅｕｍ  ２００５年；５２巻：１２８〜３５頁）。
【００８９】
多くの患者において、ＯＡは、膝または股関節などの単一の関節に影響する局所現象である（Ｗｉｅｌａｎｄ  ＨＡら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２００５年；４巻：３３１〜３４４頁；Ａｂｒａｍｓｏｎ  ＳＢおよびＹａｚｉｃｉ  Ｙ、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ２００６年；５８巻：２１２〜２２５頁）。それゆえに、全身性ＴＮＦ−α抑制は、安全性を考慮すれば適当であるようには思われない。そのようなわけで、強力なＴＮＦ−α抑制、滑膜組織および軟骨への浸透性の良さによって特徴づけられるが、結果として低い全身性ＴＮＦ−α抑制のみを生じる作用物質での局所治療は、最適な治療介入であろう。同じ議論は、「古典的な」炎症性関節炎（乾癬性関節炎など）の単関節炎または少関節炎疾患経過の治療についても当てはまる。ここで、本発明者らは、インビボでのＴＮＦ−αの局所的中和、エキソビボでの軟骨浸透、およびインビボの関節内注射後のウサギの膝関節腔から滑膜組織および軟骨への体内分布に取り組むモデルにおける局所治療のためのそのような候補（ＥＳＢＡ１０５）の性質を特徴づけた。ＥＳＢＡ１０５は、わずか２６ｋＤａの分子量を有する。対照的に、現在利用可能な、インフリキシマブ、エタネルセプト、およびアダリムマブなどのＴＮＦ−αインヒビターは全て、約１５０ｋＤａの分子量を有する。
【００９０】
ＥＳＢＡ１０５は、ＴＮＦ−αへのナノモル結合親和性を有し、その結果として、細胞アッセイにおいてインフリキシマブと同程度にＴＮＦ−αを抑制する（図７）。インビボで、ラットのｒｈＴＮＦ−α誘発性膝関節炎症モデルにおいて、ＥＳＢＡ１０５はまた、局所ＴＮＦ−αを強力に抑制する。実際、ｒｈＴＮＦ−αに対して１１倍モル（１６倍ｗ／ｗ）過剰量のＥＳＢＡ１０５は、ＴＮＦ−α誘発炎症性の膝の腫脹、滑膜炎、および軟骨からのプロテオグリカン損失を９０％抑制した（図８、９）。ＥＳＢＡ１０５の組織浸透能力をさらに特徴づけるために、本発明者らは、ＥＳＢＡ１０５の正常ウシ関節軟骨への浸透を試験した（実施例１参照）。数時間のうちにＥＳＢＡ１０５は軟骨に浸透した。タンパク質の軟骨浸透は、分子量依存性および電荷依存性である（Ｍａｒｏｕｄａｓ  Ａ、Ｊ  Ａｎａｔ  １９７６年；１２２巻（Ｐｔ  ２）：３３５〜４７頁；ｖａｎ  Ｌｅｎｔ  ＰＬら、Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９８７年；１４巻：７９８〜８０５頁；ｖａｎ  Ｌｅｎｔ  ＰＬら、Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １９８９年；１６巻：１２９５〜３０３頁）。その結果から、ＥＳＢＡ１０５は、治療的に関節内で用いるのに適当なサイズ（２６ｋＤａ）および電荷を有することは明らかである。ＥＳＢＡ１０５の軟骨浸透が直線的であることは注目すべきである（図４）。現在に至るまで存在するデータは、インビボで、関節内注射後のＥＳＢＡ１０５がＯＡ軟骨においてＴＮＦ−αを抑制するだろうという示唆を支持している。これは、結果として、変形性関節症軟骨における代謝の現在の理解に従って、少なくとも一部の患者で異化から同化への逆転を生じると予想される（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍら、Ａｒｔｈｒｉｔ  Ｒｈｅｕｍ  ２００５年；５２巻：１２８〜３５頁と比較されたい）。ＥＳＢＡ１０５と対照的に、インフリキシマブなどのＩｇＧ（約１５０ｋＤａ）は大きすぎて、軟骨へ浸透することができない（図３、４）。
【００９１】
ウサギにおける［１２５Ｉ］−ＥＳＢＡ１０５を用いた体内分布試験は、関節内注射後、それが膝関節から分布され、関節内投与後の全ＯＡ関連組織において、同じ用量の静脈内投与後より有意に高いレベルに達した（図１１、表４）。これは、滑液（１，７００倍）、関節軟骨（４６倍）、および膝蓋骨（１２７倍）におけるＣｍａｘについて最も顕著であった。関節内投与後の下肢の組織への放射能の分布は、遅延性の過程であり、ピークレベルは６〜１２時間目に最も頻繁に見られた（図５Ａ、５Ｂ）。
【００９２】
対照的に、血漿中のＥＳＢＡ１０５のＣｍａｘは、膝関節への注射後において、静脈内注射後の約１０分の１であった（図５Ａ）。この所見と一致して、関節内投与後の血漿中のＣｍａｘは、投与後６時間目〜１２時間目に観察され、膝関節腔から循環への比較的遅い吸収を示唆した（図５Ａ）。したがって、ＴＮＦ−αの全身性抑制は、ＥＳＢＡ１０５の関節内注射後、低いことが予想され得る。ＥＳＢＡ１０５が、エタネルセプト、インフリキシマブ、またはアダリムマブ（Ｎｅｓｔｏｒｏｖ  Ｉ．  Ｓｅｍｉｎ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００５年；３４巻（５号別冊１）：１２〜８頁）より循環から迅速にクリアランスされる（ウサギにおける７時間のＴ１／２（Ｆｕｒｒｅｒ  Ｅら、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．  ２００９年２月、５０巻（２号）：７７１〜８頁、電子出版２００８年８月２９日））ため、なおさらそうである。
【００９３】
概要および結論
ウサギにおけるＰＫ試験により、関節内注射後、［１２５Ｉ］−ＥＳＢＡ１０５からの放射能が膝関節へ分布され、そこでは、関節内投与後、同じ用量の静脈内投与後より有意に高いレベルに達したことが示された。これは、滑液（１，７００倍）、関節軟骨（４６倍より高い）、および膝蓋骨（１２５倍）について最も顕著であった。静脈内投与後および関節内投与後の経時的な［１２５Ｉ］−ＥＳＢＡ１０５分布について、それぞれ、図５Ａおよび５Ｂを参照。インビトロの結果により、ＥＳＢＡ１０５の膝軟骨への効率的浸透が確認されたが、インフリキシマブの浸透は確認されなかった（実施例１参照）。関節内投与後の下肢の組織への放射能の分布は遅延性過程であり、ほとんどの組織におけるレベルのピークは６時間目に生じた（図５Ｂ参照）。この所見と一致して、関節内投与後の血漿中のＣｍａｘは、６〜１２時間の間に観察され、膝関節腔から循環への比較的遅い吸収を示唆した。静脈内投与後および関節内投与後、それぞれの経時的な［１２５Ｉ］−ＥＳＢＡ１０５の血漿濃度の比較について図６参照。放射能分布は、静脈内投与後、身体中に広く行き渡り、最高レベルは排泄器官（腎臓および胃腸管）に関連していた。総合すれば、これらの結果より、膝関節において高くかつ持続的なレベルのＥＳＢＡ１０５を得るために、関節軟骨への最大浸透を達成するために、関節内投与経路が静脈内投与より優れていることが確認された。
【００９４】
（実施例３）
ＯＡ患者由来のヒト関節軟骨外植片における変形性関節症に関連したバイオマーカーへのＴＮＦ抑制性ｓｃＦｖ  ＥＳＢＡ１０５の効果
方法
試験概略およびヒト軟骨外植片の培養
８つの変形性関節症ドナー由来のヒト膝関節軟骨外植片におけるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性およびＰＧＥ２の産生へのＥＳＢＡ１０５の効果を評価した。
【００９５】
膝ＯＡを患っている８人の異なるドナー由来のヒト軟骨を、関節置換手術で入手した。各ドナー由来の８つの軟骨複写物の群を、合計３つの異なる試験条件で培養した（ＥＳＢＡ１０５の非特異的ｓｃＦｖフレームワーク（ＦＷ２．３）および２つの異なる濃度のＥＳＢＡ１０５、表３も参照）。
【００９６】
完全深度３ｍｍ直径軟骨パンチを、人工膝関節全置換術（ＴＫＡ）を受けた患者の膝関節から得た。軟骨パンチの重さを量り、培養した。パンチを９６ウェルプレート中で培養し、各ウェルは１つの外植片および２００ｕｌの培地（ＤＭＥＭ＋加水分解ラクトアルブミン＋５０ｕｇ／ｍｌのビタミンＣ＋ペントマイシン／ストレプトマイシン＋ＩＴＳ）を含んだ。軟骨外植片を３週間、培養し、培地を週２回、新しくした。培地を、５日目、８日目、１２日目、１５日目、１９日目、および２１日目に収集し、分析まで−８０℃で保存した。
【００９７】
【表３】
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ＭＭＰ活性測定
ＭＭＰ活性を、Ｔｃｈｅｔｖｅｒｉｋｏｖら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００３年；２１巻：７１１頁）に記載されているように、蛍光ＭＭＰ基質ＴＮＯ２１１−Ｆを用いて測定した。この基質は、主に、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、およびＭＭＰ−１３によって変換される。それはまた、より低い率であるとはいえ、ＭＭＰ−１によっても変換される。ＭＭＰ活性を、５ｕＭのＢＢ９４（一般的なＭＭＰインヒビター）の存在下または非存在下で６．２５ｕＭのＴＮＯ２１１−Ｆを用いて測定した。軟骨培養上清をＭＭＰ緩衝液中に希釈し（最終希釈度１：１２）、ＥＤＴＡを含まない完全セリンおよびシステインプロテアーゼインヒビターを全試料に加えた。ＢＢ９４添加あり、または添加なしでの試料間の基質変換の初速度（時間における蛍光の直線的増加）の違いを、ＭＭＰ活性の測定として用いた。蛍光を３０℃で６時間、測定した。試験結果は、フレームワーク（ＦＷ）対照と比較した試験条件の％ＭＭＰ活性として報告されている。統計的解析を、ｔ検定を用いて行い、ＦＷ２．３をＥＳＢＡ１０５低、またはＦＷ２．３をＥＳＢＡ１０５高のいずれかと比較した。
【００９８】
ＰＧＥ２
軟骨培養上清におけるＰＧＥ２レベルを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；カタログ番号ＫＧＥ００４）のＰＧＥ２アッセイキットを用いて測定した。アッセイを、２倍希釈された細胞培養上清を用いて製造会社の使用説明書に従って行った。簡単には、このアッセイは、試料中に存在するＰＧＥ２が、マイクロプレート上にコーティングされたマウスモノクローナル抗体の部位に対して固定量の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ＰＧＥ２と競合する、競合的結合技術に基づいている。過剰コンジュゲートおよび結合していない試料を除去した後、発色基質をウェルに加え、結合したＨＲＰ活性を決定した。色の強度は、試料中のＰＧＥ２の濃度に反比例する。試験結果は、フレームワーク（ＦＷ）対照と比較した各試験条件で測定された％ＰＧＥ２として報告されている。統計的解析を、ｔ検定を用いて行い、ＦＷ２．３をＥＳＢＡ１０５低、またはＦＷ２．３をＥＳＢＡ１０５高のいずれかと比較した。
【００９９】
結果
ＭＭＰ活性
ＭＭＰ活性の測定について最適な時点を決定するために、試験分析を行った。それぞれの単一の時点における８つの複製物の上清をプールし、これらのプールされた上清におけるＭＭＰ活性を、アイソタイプ対照およびＥＳＢＡ１０５高の培養条件において全時点（５日目、８日目、１２日目、１５日目、１９日目、２１日目）で４つのドナーについて分析した。最良結果は５日目に得られた。したがって、最終分析を、５日目の上清を用いて行った。
【０１００】
ヒト変形性関節症軟骨外植片のＴＮＦ抑制性ｓｃＦｖ  ＥＳＢＡ１０５での処理は、フレームワーク対照（ＦＷ２．３）と比較した場合、ＭＭＰの活性を有意に低下させた。全体的な効力は、両方の濃度のＥＳＢＡ１０５について類似していた（図１０）。
【０１０１】
ＰＧＥ２
ＰＧＥ２濃度を、全複製物の培養中の全時点のプールされた培地において決定した。両方の濃度のＥＳＢＡ１０５は、疾患軟骨培養物の上清においてＰＧＥ２濃度を有意に低下させた（図１１）。
【０１０２】
今、本発明の好ましい実施形態が示され、記載されているが、本発明が、それらに限定されず、以下の特許請求の範囲内で、別なふうに様々に具体化され得、実施され得ることは明確に理解するべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図３Ａ】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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