(57)【要約】  Ｇｌｏｂｏ  Ｈまたはそのフラグメントを標的とする免疫反応を引き起こすためのＧｌｏｂｏ  Ｈまたはそのフラグメント（例えば、ＳＳＥＡ３）およびアジュバント（例えば、α−ＧａｌＣｅｒ）を含む免疫組成物、それらの癌に対する治療。ＦＵＴ１およびＦＵＴ２のいずれか、またはＧｌｏｂｏ  Ｈの生合成を包含する両方の活性を阻害することにより癌を治療する方法を開示する。
2011524375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリカンと、α−ガラクトシル−セラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）とからなり、前記グリカンはＧｌｏｂｏ  Ｈまたはそれらのフラグメントである、免疫組成物。
【請求項２】
前記グリカンは、Ｇｌｏｂｏ  Ｈである、請求項１に記載の免疫組成物。
【請求項３】
前記グリカンは、ＳＳＥＡ３である、請求項１に記載の免疫組成物。
【請求項４】
前記グリカンまたはそのフラグメントは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合している、請求項１に記載の免疫組成物。
【請求項５】
ＳＳＥＡ３と、アジュバントとからなる、免疫組成物。
【請求項６】
有効量の請求項１に記載の免疫組成物をその必要のある対象へ投与することからなる、癌の治療方法。
【請求項７】
前記癌は、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、および肺癌からなる群から選択される、請求項６に記載の癌の治療方法。
【請求項８】
前記癌は、乳癌である、請求項６に記載の癌の治療方法。
【請求項９】
前記グリカンは、Ｇｌｏｂｏ  Ｈであり、かつ前記免疫組成物は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈに対して免疫反応を引き起こす、請求項６に記載の癌の治療方法。
【請求項１０】
前記グリカンは、ＳＳＥＡ３であり、かつ前記免疫組成物は、ＳＳＥＡ３に対して免疫反応を引き起こす、請求項６に記載の癌の治療方法。
【請求項１１】
有効量の請求項５に記載の免疫組成物をその必要のある対象へ投与することからなる、癌の治療方法。
【請求項１２】
前記癌は、乳癌、肺癌、肝臓癌、口腔癌、胃癌、結腸癌、鼻咽頭癌、皮膚癌、腎臓癌、脳腫瘍、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、および膀胱癌からなる群から選択される、請求項１１に記載の癌の治療方法。
【請求項１３】
前記癌は、乳癌である、請求項１２に記載の癌の治療方法。
【請求項１４】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈまたはそのフラグメントに結合する抗体の産生を誘導するために有効量のＧｌｏｂｏ  Ｈ  またはそのフラグメントおよびα−ガラクトシル−セラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）を含む組成物を、ヒト以外の哺乳類に投与する、および
前記抗体を単離する、Ｇｌｏｂｏ  Ｈまたはそのフラグメントに特異性抗体の産生方法。
【請求項１５】
前記組成物は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈを含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記組成物は、ＳＳＥＡ３を含む、請求項１４の方法。
【請求項１７】
２−フコシルトランスフェラーゼ  １（ＦＵＴ１）または２−フコシルトランスフェラーゼ  ２（ＦＵＴ２）の活性を阻害する第一因子を有効量その必要のある対象へ投与することからなり、
前記第一因子は、ＦＵＴ１またはＦＵＴ２と、その基質またはＦＵＴ１もしくはＦＵＴ２の発現を抑制する干渉ＲＮＡと、の間の相互作用を阻害する抗体である、癌の治療方法。
【請求項１８】
前記第一因子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｓｉＲＮＡは、ｓｉＦＵＴ１またはｓｉＦＵＴ２である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第一因子はＦＵＴ１の活性を阻害し、ＦＵＴ２の活性を阻害する第二因子を有効量対象へ投与し、前記第二因子は、ＦＵＴ２とその基質またはＦＵＴ２の発現を抑制する干渉ＲＮＡとの間の相互作用を阻害する抗体である、請求項１７の癌の治療方法。
【請求項２１】
前記第一因子および第二因子は、ｓｉＲＮＡである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一因子および第二因子は、ｓｉＦＵＴ１またはｓｉＦＵＴ２である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌は、乳癌である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容全体を参照としてここに組み入れる、２００８年６月１６日出願の米国仮出願第６１／０６１、９６８号について優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｇｌｏｂｏ  Ｈは、多様な上皮癌中で広範に発現する癌抗原である。これは、癌免疫療法における標的としての役割を果たし得ると提案されてきた。ワクチンがＧｌｏｂｏ  Ｈに対する抗体反応を引き起こすために開発されてきた一方で、それらの抗癌効果はＧｌｏｂｏ  Ｈの低い抗原性のために不十分である。したがって、Ｇｌｏｂｏ  Ｈを標的とする高レベルの免疫反応を引き起こし得る新規なワクチンが必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、（１）ＳＳＥＡ３、すなわちＧｌｏｂｏ  Ｈの直接前駆体、が乳癌幹細胞中に高レベルで発現し、それゆえ乳癌治療の適当な標的として機能し得る、および（２）α−ガラクトシル−セラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）は、抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈおよび抗ＳＳＥＡ３抗体の生産を促進する効果的なアジュバントである、という予期せぬ発見に基づく。
【０００４】
したがって、本発明の一態様は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈまたはそのフラグメント（例えば、ＳＳＥＡ３）およびアジュバント（例えば、α−ＧａｌＣｅｒ）を含む免疫組成物によって特徴付けられる。Ｇｌｏｂｏ  Ｈまたはそのフラグメントは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合し得る。患者（例えばヒト）に投与されるとき、この免疫組成物は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈまたはそのフラグメントを標的とする免疫反応（例えば抗体生産）を引き起こすため、癌（例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌および肺癌）治療に効果的である。
【０００５】
本発明の他の態様は、非ヒト哺乳類（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはウマ）に上記免疫組成物を投与し、Ｇｌｏｂｏ  Ｈまたはそのフラグメントに結合する哺乳類の抗体から単離することにより、Ｇｌｏｂｏ  Ｈまたはそのフラグメントに特異的な抗体を生産する方法に関する。
【０００６】
他の態様では、本発明は２−フコシルトランスフェラーゼ１（ＦＵＴｌ）または２−フコシルトランスフェラーゼ２（ＦＵＴ２）の活性を抑制する第一剤（ｆｉｒｓｔ  ａｇｅｎｔ）で癌を治療する方法に特徴づけられる。ＦＵＴｌおよびＦＵＴ２双方はＧｌｏｂｏ  Ｈ生合成に関与する。本薬剤は、ＦＵＴ１／ＩＦＵＴ２および、その基質または、ＦＵＴｌもしくはＦＵＴ２の発現を抑制する干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＦＵＴｌまたはｓｉＦＵＴ２）の間の相互作用を遮断する抗体であり得る。選択的に、ＦＵＴｌを標的とする第一剤は、ＦＵＴ２の活性を阻害する第二剤と組み合わせることができる。一例として、第一剤はｓｉＦＵＴｌであり第二剤はｓｉＦＵＴ２である。
【０００７】
また、本発明の範囲には、癌治療および、癌の治療のための薬剤の製造における免疫組成物または第一および第二剤の使用も含まれる。
【０００８】
本発明の一以上の実施形態の詳細は、以下に説明する。本発明の他の特徴または有利な点は、以下の図面、いくつかの実施例の詳細な説明、および添付の請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
始めに図面を説明する。
【図１】図１は、Ｇｌｏｇｏ  Ｈ（ＧＨ）中の第六糖類エピトープおよびこのエピトープのフラグメントの構造を示す概略図である。パネルＡ：第六糖類エピトープの構造。パネルＢ：第六糖類エピトープおよびその７フラグメントの構造。
【図２】図２は、ＫＬＨ結合Ｇｌｏｂｏ  Ｈ単独で免疫性を与えたマウスおよびα−ＧａｌＣｅｒを伴うＫＬＨ結合Ｇｌｏｂｏ  Ｈで免疫性を与えたマウス中の抗Ｇｌｏｂｏ  Ｈおよび抗ＳＳＥＡ３抗体レベルを示すチャートである。
【図３】図３は、乳癌細胞中のＦＵＴｌおよびＦＵＴ２発現におけるｓｉＦＵＴｌおよびｓｉＦＵＴ２の影響を示す概略図である。パネルＡ：ＭＢ１５７細胞中のｓｉＦＵＴｌによるＦＵＴｌ発現の抑制。パネルＢ：それぞれ、Ｔ−４７Ｄ細胞中のｓｉＦＵＴｌおよびｓｉＦＵＴ２によるＦＵＴｌおよびＦＵＴ２抑制。
【図４】図４は、乳癌異種移植片の成長阻害における、ｓｉＦＵＴｌおよびｓｉＦＵＴ２の影響を示す概略図である。パネルａ：ｓｉＦＵＴｌおよびｓｉＦＵＴ２が乳房の腫瘍の成長を阻害することを示すチャート。パネルｂ：ｓｉＦＵＴｌおよびｓｉＦＵＴ２が腫瘍の重量を減少させることを示すチャート。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
我々はＧｌｏｂｏ  Ｈおよびその直接前駆体ＳＳＥＡ３双方が癌治療における標的として機能し得ることを発見した。
【００１１】
したがって、本発明の一実施形態は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈまたはそのフラグメント（例えば、ＳＳＥＡ３、Ｇｂ５としても知られている）いずれかおよびアジュバントを含む免疫組成物の有効量を、必要とする患者に投与することによる癌を治療する方法である。標的の癌の種類としては、これらに限定はされないが、乳癌（ステージ１〜４を含む）、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、肝癌（例えば、肝細胞癌および胆管癌）、口腔癌、胃癌（Ｔ１〜Ｔ４を含む）、結腸癌、鼻咽頭癌、皮膚癌、腎癌、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、グリア芽腫および髄膜腫）、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、および子宮内膜、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、および消化管間質腫瘍が挙げられる。ここで使用される「治療」の語は、癌、癌の症状または癌傾向の体質を治療（ｃｕｒｅ）、治癒、緩和、軽減、変化、治療（ｒｅｍｅｄｙ）、改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、改善（ｉｍｐｒｏｖｅ）または影響する目的で、一以上の活性薬剤を含む組成物の、癌、癌の症状または癌傾向の体質を有する患者への適用または投与を参照する。ここで使用する「有効量」は、単独でまたは一以上の他の活性薬剤と組み合わせて、治療効果を患者に与えるのに必要とされる各活性薬剤の量を参照する。有効量は、当業者に理解されるように、投与経路、腑形剤の使用、および他の活性薬剤を共に使用することによって変化する。
【００１２】
上記の方法で使用される免疫組成物は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈまたはそのフラグメントおよびアジュバントである、グリカン（すなわち、糖部分を含む分子）を含み得る。Ｇｌｏｂｏ  Ｈは、図１、パネルＡに示す第六糖類エピトープおよび選択的に非糖部分を含むグリカンである。そのフラグメントは、第六糖類エピトープのフラグメント、適用可能であれば、非糖部分を含むグリカンである。第六糖類エピトープのフラグメントは、図１、パネルＢに示される。これらのオリゴ糖は、通常の方法によって調製できる。例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０３：１５−２０（２００６）参照。もし所望であれば、それらは非糖部分と結合し得る。
【００１３】
上記のグリカンはいずれも、ＫＬＨ等のタンパク質担体に結合し得る。
【００１４】
したがってそれらは、アジュバントおよび従来の方法を通して免疫組成物（例えば、ワクチン）を形成するために、選択的に製薬上許容し得る担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水または重炭酸塩溶液）と混合することができる。例えば、米国特許第４、６０１、９０３号、第４、５９９、２３１号、第４、５９９、２３０号および第４、５９６、７９２号参照。組成物は注射剤、液状の溶液、またはエマルジョンとして調製でき、担体は標準的な薬務の基礎に基づくと共に、投与の形態および経路の基礎に基づいて選択される。適当な医薬担体および希釈剤ならびにそれらの使用のための医薬上の必要品は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。免疫組成物は、好ましくはアジュバントとしてα−ＧａｌＣｅｒを含む。アジュバントの他の例としては、これらに限定はされないが、コレラ毒素、大腸菌易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、リポソーム、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、または免疫活性化配列オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＳＳ−ＯＤＮ）が挙げられる。組成物はｉｎ  ｖｉｖｏでの送達を促進するポリマーをも含んでもよい。Ａｕｄｒａｎ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：１２５０−５、２００３およびＤｅｎｉｓ−Ｍｉｚｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２５：１２−２０、２００３参照。必要であれば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤等の補助的な物質を、Ｇｌｏｂｏ  Ｈまたはそのフラグメント中の糖部分に対する免疫反応を引き起こす組成物の能力を向上するために、さらに含むことができる。
【００１５】
ここで説明する免疫組成物は、非経口投与（例えば、静脈注射、皮下注射または筋肉注射）することができる。そうでなければ、座薬および経口製剤を含む他の投与形態が好ましい。座薬には、例えば、ポリアルキレン（ポリａｌｋａｌｅｎｅ）グリコールまたはトリグリセライド等の結合剤および担体が含まれてもよい。経口製剤は通常使用される初期物（ｉｎｃｉｐｉｅｎｔｓ）、例えば、医薬品グレードのサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等を含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤または粉末の形態を取り、ここに記載する免疫組成物１０〜９５％を含む。
【００１６】
免疫組成物は、投与処方に適合する方法で、治療として有効な、保護し得る、かつ免疫原性の量で投与される。投与量は、例えば、抗体を生産しかつ必要であれば細胞性免疫反応を生じるための、個々の免疫系の許容量を含む、治療しようとする患者に依存する。投与が求められる活性成分の正確な量は、施術者の判断に委ねられる。しかしながら、適当な投与量範囲は、当業者によって容易に決定され得る。初期投与および追加抗原投与量のための適当な投与計画も変化し得るが、しかし、その後の投与を伴う初期投与を含み得る。ワクチンの投与量は、投与経路に依存し、かつ、ホストの大きさによって変化する。
【００１７】
本発明の免疫組成物は、癌治療および診断の両方に使用できる、抗体生産のための動物中で、抗体を生産するために使用することができる。動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはウマ）中で、モノクローナルおよびポリクローナル抗体およびそのフラグメントを作る方法は、この技術分野において周知である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、（１９８８）  抗ｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。「抗体」の語は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）およびｄＡｂ（ドメイン抗体；Ｗａｒｄ、ｅｔ．ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４）等の、フラグメントと共に、無傷の免疫グロブリン分子を含む。
【００１８】
本発明の他の実施形態は、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ生合成に両方が影響するＵＴｌおよび／またはＦＵＴ２の活性を阻害することによる、癌を治療する方法である。ＦＵＴｌおよびＦＵＴ２は、オリゴ糖基質の還元末端にα１、２結合を介してフコースユニットを転移する、周知の２−フコシルトランスフェラーゼである。例えば、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２５２３およびＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：２５２４参照。
【００１９】
一つの例では、上記記載した方法は、ＦＵＴ１／ＦＵＴ２およびこれらの基質間に相互作用を及ぼす抗体、換言すると、ＦＵＴ１／ＦＵＴ２またはこれらの基質に特異的な抗体を有効量その必要のある対象へ投与することにより機能するものである。
【００２０】
一般的に、抗体、ＦＵＴ１／ＦＵＴ２、それらのフラグメント、またはそれらの基質を産生するということは、キャリアタンパク（例えば、ＫＬＨ）に結合されうるということであり、もし必要であれば、アジュバントを混合する、および宿主動物に注入されうる。動物で産生される抗体は、クロマトグラフィーなどの便利な方法で精製されうる。
一般的に使用される宿主動物としては、ウサギ、マウス、モルモット、およびラットを含む。免疫学的応答を増大させる種々のアジュバントは、宿主種に依存し、フロインドアジュバント（不完全および完全を含む）、水酸化アルミニウム、ＣｐＧ、リゾレシチンなどの天然ゲルや、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの界面活性成分を含む。有益な人のアジュバントは、ＢＣＧ（ＢＣＧワクチン）およびコリネバクテリウム‐パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）を含む。
【００２１】
ポリクローナル抗体や、抗体分子の不均一集合は、免疫性を与えられた目的物の血清内に存在する。モノクローナル抗体や、ＦＵＴ１／ＦＵＴ２またはこれらの基質への抗体の不均一集合は、一般的なハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５；Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，５１１；Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６，２９２；およびＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）モノクローナル抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．参照）を用いて調製される。
【００２２】
特に、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５、および米国特許４３７６１１０号；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ４，７２；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０，２０２６、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄＣａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６などに記載されているように、培養液中で連続細胞株によって抗体分子の産出を提供するいかなる技術を用いてもよい。
【００２３】
かかる抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびそれらのいずれかのサブクラスを含む免疫グロブリンクラスであってもよい。本発明のモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により調製するが、インビトロでもインビボでもよい。インビボで高い力価のモノクローナル抗体を調製することができると、それは、特に有益な調製方法になりうる。さらに、キメラ抗体の産生を開発する技術は、有益になりうる。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６０４；およびＴａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２を参照。キメラ抗体は、異なる動物種から由来の異なる部分を備えた分子であり、例えば、マウスのモノクローナル抗体およびヒト免疫グロブリンの定常部から由来の種々の領域を有する。またあるいは、一本鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許４９４６７７８号および４７０４６９２号）を、一本鎖Ｆｖ抗体のファージライブラリーに提供しても良い。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖およびＬ鎖フラグメントに結合することにより形成される。さらに、抗体フラグメントは公知の方法で調製されうる。例えば、抗体分子のペプシン消化を促しうるＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させうるＦａｂフラグメントなどを含むが、これらに限定されるわけではない。抗体は公知の技術の方法によりヒト化されうる。例えば、所望の特異性を結合したモノクローナル抗体は、ヒト化されたものが市販されている（Ｓｃｏｔｇｅｎｅ、  Ｓｃｏｔｌａｎｄ；および  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  Ｃａｌｉｆ）。完全にヒト化抗体、形質転換動物に発現された抗体群は、本発明の特徴である。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７，１３；および米国特許５５４５８０６号および米国特許５５６９８２５号を参照。
【００２４】
その他の例としては、上記記載した方法は、ＲＮＡ干渉を介し、Ｇｌｏｂｏ  Ｈの発現量を低減させることによりＦＵＴ１および／またはＦＵＴ２の発現を阻害する１つ以上にダブルストランドＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を有効量その必要のある対象へ投与することにより機能するものである。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、メッセンジャーＲＮＡの相同性配列に特異的な分解を管理する方法である。哺乳類細胞において、ＲＮＡｉは、宿主インタフェロン応答を活性化することなしに、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の２１−ヌクレオチド２本鎖によりきっかけとなりうる。
【００２５】
ｄｓＲＮＡは、公知の技術で合成されうる。Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９，；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４；Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ．Ｂｉｏ．７４、５９、Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５，およびＢｒｅｎｎａｎ，米国特許６００１３１１号参照。発現ベクターから転写され、通常の方法を用いて単離されうる。
【００２６】
上記のｄｓＲＮＡまたはベクターは、例えば、Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２，１３９に記載の方法により癌細胞に運ばれうる。例えば、リポソーム、ハイドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、または生体接着マイクロスフェアーを用いて細胞に取り込まれる。あるいは、ｄｓＲＮＡまたはベクターは、直接注入や点滴ポンプを用いて直接輸送されうる。他のアプローチは、種々のトランスポートおよびキャリアシステム、例えば会合および生分解性ポリマーを用いる手法を採用することを含む。
【００２７】
例えば、上記ｄｓＲＮＡは、ＣＧＣＧＧＡＣＴＴＧＡＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴに相補的な第一ストランドまたはそれの相補体（例えば、下記実施例２に記載のｓｉＦＵＴｌ）を含む。その他の例としては、当該ｄｓＲＮＡは、ＣＴＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＡＡに相補的な第一ストランドまたはそれの相補体（例えば、下記実施例２に記載のｓｉＦＵＴ２）を含む。
【００２８】
輸送を容易にするために、上記のｄｓＲＮＡ、またはそれを発現するＤＮＡプラスミドをシャペロン剤とコンジュゲートさせてもよい。ここで用いる「コンジュゲート」とは、関連のある２つの構成要素を意味し、好ましくは、２つの構成要素間の関連性の治療効果が実現される十分な親和性をいう。コンジュゲートとは、共有結合または非共有結合であってもよく、一つの構成要素が他の構成要素の上や内に取り込まれた形態や、第三の構成要素（例えば、ミセル）上や内にどちらかの構成要素か両構成要素が取り込まれてもよいといった他の形態も含む概念である。
【００２９】
前記シャペロン剤は、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、低密度リポプロテイン、または、グロブリン）、糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）、または脂質のように自然と作用する物質であってもよい。また、シャペロン剤は、ポリアミノ酸高分子（例えば、ポリリジン、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物共重合体、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコイル）共重合体、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物共重合体、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド重合体、およびポリフォスファジン）などの組み換えまたは合成分子であってもよい。あるいは、シャペロン剤は、ミセル、リポソーム、ナノ粒子、またはマイクロスフェアーであってもよく、これらにｄｓＲＮＡまたはＤＮＡプラスミドが包摂されうる。
【００３０】
一事例として、シャペロン剤は、１以上の融合誘導因子、凝集剤、または標的剤の付着する基質として作用する。
【００３１】
融合誘導因子は、局所的ｐＨに応答する。例えば、エンドソーム内のｐＨに遭い、周囲の環境（浸透圧の変化、つまりエンドソーム膜の浸透圧を崩壊させたり増加させたりする）に物理的変化を起こし、それによりｄｓＲＮＡまたはＤＮＡプラスミドが宿主細胞のサイトプラズムにリリースすることを促進させる。好ましい融合誘導因子は電荷を変化するものであり、例えば生理学的範囲（例えば、ｐＨ４．５−６．５）より低いｐＨでプロトン化されるものである。
【００３２】
融合誘導因子は、特定のｐＨ範囲にさらされると電荷変化能を示すアミノ基（例えばプロトン化）を有する分子であってもよい。これらの融合誘導因子は、ポリアミノ鎖（例えば、ポリエチレンイミン）および膜崩壊剤（例えば、メルリチン（ｍｅｌｌｉｔｔｉｎ））を含むポリマーを包含する。他の例としては、ポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、メルリチン（ｍｅｌｌｉｔｉｎ）、およびポリアセタール基質（例えば、カチオン性ポリアセタール）。
【００３３】
凝集剤は、ｄｓＲＮＡまたはＤＮＡプラスミドと何らかの相互作用（例えば、引きつけたり、包含したり、または結合したり）する、そしてｄｓＲＮＡまたはＤＮＡプラスミドを凝集させ（例えば、ｄｓＲＮＡ／プラスミドの大きさを減少させる）、その結果ｄｓＲＮＡ／プラスミドの分解を抑制する。好ましくは、凝集剤は、例えば、イオン性相互作用を介してｄｓＲＮＡまたはＤＮＡプラスミドと相互作用する部分（例えば、荷電性部分）を含む。前記凝集剤の例は、ポリリジン、スペルミン、スペルミジン、ポリアミンまたはそれらの４級塩、擬ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣薬ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、およびアルファヘリカルペプチドを含む。
【００３４】
更なる苦労を必要とすることなく、当業者であれば上記の詳細な説明の基づき、本発明の最大限の範囲を用いることができる。本発明の好ましい実施態様を記載するものであり、説明のために示したものである。本発明を開示されている形態のみに限定するものではない。本明細書で引用している文献のすべての内容は、本願に包含されている。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ＫＬＨ−コンジュゲートＧｌｏｂｏ  Ｈおよびα−ＧａｌｃｅｒによるＧｌｏｂｏ  ＨおよびＳＳＥＡ３に特異的抗体の誘導。
【００３６】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＫＬＨは、オプティマーファーマシューティカルズから購入した。６週齢雌ＢＡＬＢ／ｂマウス（ＢｉｏＬＡＳＣＯ）を、それぞれの群を二匹づつの３群に対して、ＰＢＳ（“コントロールマウス”）、０．６μｇＫＬＨ−Ｇｌｏｂｏ  Ｈ（“Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  マウス”）、および０．６μｇＫＬＨ−Ｇｌｏｂｏ  Ｈと２μｇα−ＧａｌＣｅｒを混合したもの（“Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＧａｌＣｅｒ  マウス”）を、それぞれの群に１週間に１回３週間皮下注射した。最後の皮下注射から１０日後、それぞれの群のマウスから血清を採取し、「Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬＵＳＡ１０３：１５−２０（２００６）」に記載の方法で、Ｇｌｏｂｏ  ＨおよびＳＳＥＡ３に特異的な抗体を検出した。つまり、血清を３％のＢＳＡ／ＰＢＳバッファーで１：２５の割合で希釈し、それぞれの希釈した血清５０ｍｌを、加湿チャンバー内で１時間ゆっくりスライドでインキュベートさせ、Ｇｌｏｂｏ  ＨおよびＳＳＥＡ３に加えた。前記スライドを０．０５％ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０  （ＰＢＳＴ）溶液で３回洗浄し、次いで同じチャンバー内においてＣｙ５−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ抗マウスＩｇＧ  抗体（ｌ：２００）１００μｌでインキュベートさせた。自然乾燥の後、前記スライドをそれぞれ３回づつ、ＰＢＳＴ  および水で洗浄し、そしてマイクロアレイスキャナー（ＧｅｎεＰｉｘ  ４０００Ｂ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で蛍光強度を測定した。その結果は、ジーンピクスプロソフトウェアで解析した。
【００３７】
Ｇｌｏｂｏ  Ｈマウスの場合は、抗−Ｇｌｏｂｏ  Ｈ  ＩｇＧ抗体は、低レベルだけ検出され、抗−ＳＳＥＡ  ＩｇＧ抗体は、検出できなかった（図２を参照）。それとは異なり、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−ＧａｌＣｅｒマウスの場合は、高レベルの抗−Ｇｌｏｂｏ  Ｈ及び抗−ＳＳＥＡ３  ＩｇＧ抗体を示した（図２参照）。α−ＧａｌＣｅｒとＧｌｏｂｏ  Ｈ−ＫＬＨとを混合すると、抗−Ｇｌｏｂｏ  Ｈおよび抗−ＳＳＥＡ３抗体も両方を誘導する効果的なワクチンであることがこれらの結果から確認された。
【００３８】
実施例２：  Ｇｌｏｂｏ  Ｈレベルを低減させるＲＮＡ干渉を用いたＦＵＴｌおよびＦＵＴ２の阻害。
【００３９】
３つの乳癌細胞株である、ＭＣＦ−７、  ＭＢ１５７、およびＴ−４７ＤにおけるＦＵＴｌおよびＦＵＴ２  ｍＲＮＡの発現量は、以下の定量ＲＴ−ＰＣＲによって決定されうる。全ＲＮＡを、これらの乳癌細胞株から抽出し、かつｃＤＮＡを、テンプレートとしてのＲＮＡやプライマーとしてのオリゴ（ｄＴ）を用いて逆転写から調製した。５０ナノグラムのｃＤＮＡは、以下のプライマー：Ｌ−ｆｕｔｌ：ＣＣＴＧＣＣＡＧＡＣＴＣＴＧＡＧＴＴＣＣおよびＡＧＧＣＴＴＡＧＣＣＡＡＴＧＴＣＣＡＧＡと、さらに、Ｌ−ｆｕｔ２：ＧＧＧＡＧＴＴＡＣＣＧＧＴＧＣＡＧＡＴＡおよびＲ−ｆｕｔ２：ＧＴＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＴＴＧＡＴＧＴＴを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を受けた。
【００４０】
当該ＲＴ−ＰＣＲ反応は、次の条件で行った。：５０℃  ２．５分、９５℃  １０分、その後９５℃  １０分および６０℃  １分を４０サイクル、ＡＢＩプリズム７０００配列検出システム（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用、実験結果の解析はＡＢＩ  プリズム  ７０００  ＳＤＳ（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用して、それぞれの細胞株におけるＦＵＴｌおよびＦＵＴ２のｍＲＮＡ量に対するＣｔ値、すなわち閾値に達した時のサイクル数（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）を算出した。前記Ｃｔ値は、同一細胞株におけるＨＰＲＴｌのｍＲＮＡ発現量に対して標準化してΔＣｔ値を算出した。ＭＣＦ−７におけるＦＵＴ１のΔＣｔ値は、同一細胞株内のＦＵＴ１またはＦＵＴ２のいずれかのΔＣｔ値を標準化するために用いられた。ｍＲＮＡ発現量の増減の変化（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）を、以下の式を元に算出した。
【００４１】
【数１】
2011524375.tif 000003
【００４２】
ＨＰＲＴ１およびＧＡＧＤＨのｍＲＮＡ発現量は、内部コントロールとして使用した。
【００４３】
上記３つの乳癌細胞株のうち、ＦＵＴ１のｍＲＮＡ発現量における有意差が見られた。一方、ＦＵＴ２ｍＲＮＡは、ＭＣＦ−７およびＭＢ１５７細胞でかろうじて検出することができたが、Ｔ４７Ｄ細胞中におけるＦＵＴ２  ｍＲＮＡの発現量は、他の２つの細胞株と比較して６０００ｆｏｌｄ以上の発現差がみられた。
【００４４】
ＦＵＴｌまたはＦＵＴ２の発現量は、以下のＲＮＡ干渉を介して減少した。ｓｉＦＵＴｌ（ＣＧＣＧＧＡＣＴＴＧＡＧＡＧＡＴＣＣＴＴＴに相補的な配列を含む）およびｓｉＦＵＴ２  （ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＣＴＡ  ＴＧＴＣＣＡＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＡＡに相補的な配列を含む）をコードするヌクレオチド配列をＶＳＶ−Ｇ−偽型レンチウイルスベクターに複製し、かつパッケージングプラスミド  ｐＭＤ．ＧおよびｐＣＭＶ  ΔＲ８．９１とともに２９３Ｔ  ｃｅｌｌｓを取り込んだ。トランスフェクションの４８時間後および７２時間後に、レンチウイルスベクター粒子を、それ故採取し、遠心分離機（２５、０００ｒｐｍ、９０分）で濃縮した。ｓｉＦＵＴｌまたはｓｉＦＵＴ２の発現能があるこれらのウイルス粒子は、８μｇ／ｍＬポリブレン（シグマ−アルドリッチ社製）の存在下で、ＴｈＴ−４７ＤまたはＭＢ  １５７（６−ウェルプレート中、２ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ固定）とインキュベートした。９６時間後この細胞を採取し、ＦＵＴｌおよびＦＵＴ２の発現量を上記の定量ＲＴ−ＰＣＲで測定した。図３に示すように、ｓｉＦＵＴｌは、ＭＢ１５７細胞のＦＵＴ１ｍＲＮＡの発現量を減少させることに成功した（パネルＡ参照）。同様に、ｓｉＦＵＴｌおよびｓｉＦＵＴ２は各々、Ｔ−４７ＤにおけるＦＵＴｌおよびＦＵＴ２  ｍＲＮＡｓの発現量を低減させている（パネルＢ参照）。
【００４５】
ＭＢ１５７およびＴ−４７Ｄ細胞におけるＧｌｏｂｏ  Ｈの発現量を、以下のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−ＶＫ−９抗体を用いて、フローサイトメトリ―により測定した。それぞれ１ｘ１０５細胞を含むアリコートを、氷上において抗−ＧｌｏｂｏＨ−Ａｌｅｘａ４８８（Ｖｋ９；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：１１６６７−１１６７２（２００８）参照）でまず１時間インキュベートし、次いで、氷上においてビオチン化された−ＵＥＡｌ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｔｏｒｉｅｓ）で１時間インキュベートし、そして最後に氷上においてＦＩＴＣ−コンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で１時間インキュベートした。この細胞を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによりフローサイトメトリーを行い、実験データをセルクエストプログラム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で解析した。この研究による結果から、ＭＢ１５７細胞におけるＲＮＡ干渉を介するＦＵＴｌの発現の抑制が、Ｇｌｏｂｏ  Ｈの発現量の減少をもたらし、かつＦＵＴ２の発現の抑制が、Ｔ−４７Ｄ細胞におけるＧｌｏｂｏ  Ｈの発現量の減少をもたらすことが確認された。
【００４６】
実施例３：  ＳｉＦＵＴｌ  および  ＳｉＦＵＴ２の抗癌作用。
【００４７】
癌細胞の増殖を阻害
乳癌細胞ＭＢ１５７およびＴ−４７Ｄを、９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）１ウェルあたり１ｘ１０４細胞で播種した。これらを、ｓｉＦＵＴｌまたはｓｉＦＵＴ２を発現した上記実施例２のウイルス粒子と混合した、または混合しなかったものを調製し、３００ｇを５分間スピンインフェクションに遠心分離した。２４時間後、アラマーブルー（ａｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ  （ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ））は、細胞に添加し、最終濃度を１：１０に希釈し、３７℃、５％ＣＯ、３時間で培養した。その後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２リーダーを用いて、５４４ｎｍおよび５９０ｎｍでの吸収を測定した。細胞を新しい培地で同じ条件下培養し、当初の培地に播種してから４８時間、７２、および９６時間後、再度５４４ｎｍおよび５９０ｎｍでの吸収を測定した。前記ウイルス粒子で感染されたＭＢ１５７およびＴ−４７Ｄ細胞は、ウイルスに感染しなかったものと比較して成長速度が減少したことが測定結果から確認された。これらのデータは、ｓｉＲＮＡによりＦＵＴｌまたはＦＵＴ２の発現を阻害されることから癌細胞の成長を抑制することが確認された。
【００４８】
ｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ形態の阻害
ｓｉＦＵＴｌまたはｓｉＦＵＴ２を発現させるウイルス粒子で感染させたＭＢ１５７およびＴ−４７Ｄ細胞を、０．４％ＢＳＡ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍ
ｂＦＧＦ、５ｕｇ／ｍｌインスリン、ｌμＭ  ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ、４μｇ／ｍｌヘパリン、１ｘ  Ｂ２７サプリメント、および１％メチルセルロース（シグマ−アルドリッチ社製）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にけん濁させ、１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。このけん濁した細胞溶液をウルトラローアタッチメントプレート（Ｃｏｓｔａｒ）上にまき、ｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ形態に許容な好ましい条件下で培養した。当初のｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅは、週が進むにつれて培養培地であった。次のｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ培養に対しては、当初のｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅを採取し、トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）で分散し、球状のけん濁された上記の１０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの培養培地であった。けん濁した細胞を上記の方法に従って、第二のｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅの形態が許容する条件で培養した。ｓｉＦＵＴ１を発現するＭＢ１５７およびＴ−４７Ｄ細胞により形成されたｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅの数は、感染していないｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅの数の５０％程度であったが、ｓｉＦＵＴ１は、癌細胞のｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ形態能を顕著に低減させることが確認された。ｓｉＦＵＴ２を発現するＴ−４７Ｄ細胞により形成されたｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅの数は、感染していないｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅの数の１７％程度であった。この結果から、ｓｉＦＵＴ１、ｓｉＦＵＴ２などは、顕著に癌細胞のｍａｍｍｏｓｐｈｅｒｅ形態能を顕著に低減させることが確認された。
【００４９】
腫瘍発生の減少
６週齢ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕｄｅマウスおよびＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、１７−β−エストラジオール（１．７ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれのマウスの側面から皮下注射した。５０％マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）０．１ｍｌおよび５０％添加培地ＲＰＭＩ−１６４０に浮遊している、（ｉ）ＭＢ１５７細胞（１ｘ１０７）安定発現ｓｉＦＵＴ、（ｉｉ）賦形剤コントロールＭＢ１５７細胞（１ｘ１０７）、（ｉｉｉ）Ｔ−４７Ｄ細胞（５ｘ１０６）安定発現ｓｉＦＵＴｌ、（ｉｖ）Ｔ−７Ｄ細胞（５ｘ１０６）安定発現ｓｉＦＵＴ２、および（ｖ）賦形剤コントロールＴ−４７Ｄ細胞（５ｘ１０６）を６週齢雌ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕｄｅマウスの乳腺上皮周辺の脂肪帯に注入した。これらの処置をしたマウスに形成された腫瘍の大きさは、種々の異なる点で正しく長さ（ｌ）および幅（ｗ）を測定することにより監視された。腫瘍容積は、以下の式：Ｖ＝ｐ／６×ｌ×ｗ×［ｌ＋ｗ］／２で計算される。動物は最終的に屠殺されて、腫瘍は摘出および秤量された。
【００５０】
図４のパネルａで示すように、時間経過とともに賦形剤コントロールを投与されたマウスの腫瘍は成長を続けた。マウスにｓｉＦＵＴ１またはｓｉＦＵＴ２を発現する細胞で処理した間、腫瘍の成長は急激に減少した。これらのマウス群の腫瘍重量は、賦形剤コントロールを投与されたマウスと比較して明らかに減少した（図４  パネルｂを参照）。
【００５１】
細胞形態および接着能の変化
正常なＴ−４７Ｄ細胞は、四角形状であったが、ｓｉＦＵＴ１およびｓｉＦＵＴ２を発現しているＴ−４７Ｄ細胞は、小さく高密度のクラスターを形成する円状の細胞であった。類似の細胞形態の変化は、ｓｉＦＵＴ１を発現するＭＢ−１５７細胞でも観測された。
【００５２】
細胞接着は、ＲＴ−ＣＥＳ機器（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｃｅｌｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｓｅｎｓｉｎｇ、  ＡＣＥＡＢＩＯ）を用いて決定した。簡単に説明すると、ＡＣＥＡ’ｓ  ９６マイクロティタープレートをフィブロネクチン（２５ｕｇ／ｍｌ、シグマ社製）、ｔｙｐｅ  ＩＶコラーゲン（２ｕｇ／ｍｌ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはラミニン（５ｕｇ／ｍｌ、シグマ社製）でコートし、ＰＢＳ中ですべて適切に希釈され、７℃  １時間保持し、１％ＢＳＡで１時間３７℃ブロックした．ＭＢ１５７およびＴ−４７Ｄ細胞を、コートされたＡＣＥＡ’ｓ  ９６マイクロティタープレート内に培養培地１００μｌに対して２．５ｘ１０４播種した。細胞接着は、ＲＴ−ＣＥＳを用いて、１０分に１回１時間モニターされた。Ｇｌｏｂｏ−Ｈセラミド（５０μｇ／ｍｌ  血清培地中）を、当該細胞に添加し、ｓｉＦＵＴｌおよびｓｉＦＵＴ２の効果を打ち消すか否か試験された。ｓｉＦＵＴｌおよびｓｉＦＵＴ２は、ｓｉＲＮＡを発現していない細胞と比較すると、癌細胞がポリスチレンへの接着を低減させることが結果から確認され、Ｇｌｏｂｏ−ＨセラミドがｓｉＲＮＡに起因する接着阻害を低減させることも確認された。
【００５３】
細胞遊走の阻害
ｓｉＦＵＴｌまたはｓｉＦＵＴ２を発現させる細胞の遊走能は、まず以下の外傷治癒アッセイで分析する。ＭＢ１５７およびＴ−４７Ｄ細胞を、６０％のコンフルエンスに達するまで血清を含む培地内の１２穴プレートにいれる。細胞は、上記実施例１に記載のウイルス粒子またはコントロールプラスミドで取り込まれたものを感染させた。これらの細胞は、培地２日間で１００％のコンフルエンスに達した。当該細胞を一晩飢餓状態にさせて、細胞の融合単層を鋭利な２０ｕｌプラスティックピペットで外傷状態にした。血清を添加したＲＰＭＩ培養を洗浄した後、当該細胞をＲＰＭＩ培養でインキュベートし、温度とＣＯ濃度をコントロールしながら、低速度撮影のマイクロスコープを用いて分析をした。細胞のフェーズコントラストイメージを、３日間４時間毎、１日２時間撮影した。細胞の遊走率は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ  ５  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、所定時間の間細胞が移動する距離を測定した。コントロールプラスミドをトランスフェクションした細胞と比較すると、ｓｉＦＵＴｌが、２．８１および２．１３の差をつけて、Ｔ−４７Ｄ細胞およびＭＢ１５８細胞の遊走を抑制することが実験結果から確認された。
Ｇｌｏｂｏ  Ｈ−セラミドの外因性の添加は、ｓｉＦＵＴｌまたはｓｉＦＵＴ２を発現させる細胞の遊走能を減少させた。この実験結果から、ＲＮＡ干渉を介してＦＵＴｌおよびＦＵＴ２の発現の抑制からＧｌｏｂｏ  Ｈの発現量の低下により、細胞の遊走能の減少を引き起こすものであることが確認された。
【００５４】
上記の結果から、ｓｉＦＵＴｌおよびｓｉＦＵＴ２は、ＦＵＴｌおよびＦＵＴ２の発現を抑制し、結果としてＧｌｏｂｏ  Ｈの発現量を低減させることで、効果的に癌を治療できることを裏付けるものであると考えられる。
【００５５】
一実施形態
本明細書で開示された特徴の全ては、いかなるものと組み合わせをすることができる。本明細書のそれぞれの特徴は、同様の作用、目的を有する二者択一的特徴と置換することができる。したがって、本明細書に記載されていなくても、他のいかなるそれぞれの特徴は、全体の系や類似、均等の特徴の一例にすぎない。
【００５６】
当業者であれば上記明細書の内容をみれば、本発明の意義や観点からかけ離れること無しに、本発明の本質的特徴を容易に想到できるため、本発明の種々の変化や改変
してさまざまな利用や条件を本発明の範囲に採用することができる。したがって、それらの他の実施形態も本発明の権利範囲である。
【図１】
2011524375.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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