(57)【要約】本発明は、肥満の処置のためのインスリン様成長因子受容体拮抗薬の使用に関する。ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、単独または他の抗肥満薬物と組み合わせて投与される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において体重を調節するための方法であって、当該方法は、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）拮抗薬を、それを必要とする哺乳動物に投与することによってＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達を遮断する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記体重の前記調節が、前記哺乳動物において、体重の減少、体重の維持、または体重の減少後の体重の増加の最小化をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、抗体またはそのフラグメント、低分子、タンパク質、ポリペプチド、ＩＧＦ模倣剤、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ、トリプルヘリックス形成性核酸、ドミナントネガティブ突然変異体、および可溶性受容体発現からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、ＩＧＦ−ＩＲに結合し、リガンド結合を遮断する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、ＩＧＦ−ＩＲに結合し、ＩＧＦ−ＩＲ表面受容体の減少を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、ＩＧＦ−ＩＲに結合し、ＩＧＦ−ＩＲ媒介性シグナル伝達を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、約１０−９Ｍ−１未満であるＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、約１０−１０Ｍ−１未満であるＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、約３×１０−１０Ｍ−１未満であるＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、Ａ１２である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、２Ｆ８である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、キメラであるか、またはヒト化される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、ヒト化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、前記受容体に結合するが、活性化しないＩＧＦ−ＩＲリガンドの模倣剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、３〜３０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３０からなる群より選択される１〜６の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８のＣＤＲを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４のＣＤＲを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３０のＣＤＲを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体またはそのフラグメントが、配列番号２の重鎖可変領域および／または配列番号６もしくは配列番号１０から選択される軽鎖可変領域を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項２２】
Ａ１２が、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８に対応する３つのＣＤＲを有する配列番号２のヒトＶＨフレームワーク領域、ならびに配列番号２６、配列番号２８および配列番号３０に対応する３つのＣＤＲを有する配列番号１０のヒトＶＬフレームワーク領域を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
２Ｆ８が、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８に対応する３つのＣＤＲを有する配列番号２のヒトＶＨフレームワーク領域、ならびに配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４に対応する３つのＣＤＲを有する配列番号６のヒトＶＬフレームワーク領域を有する、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（相互参照）
本出願は、２００６年１１月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／８６１，８２７号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、体重の維持、減量、および肥満の処置のためのインスリン様成長因子受容体拮抗薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
肥満はその割合が高まっており、世界中で１１億人より多い過体重の成人が存在し、そのうち３億１２００万人が肥満であるとみなされている（非特許文献１）。２０００年に米国において１００，０００−３００，０００人の死亡が、肥満に起因するものであった。死亡の危険性を増加させる原因となる肥満に関連する合併症としては、虚血性心疾患、高血圧、脳卒中、糖尿病、変形性関節症、および癌が挙げられる（非特許文献１）。肥満のまん延の現在の状態は、患者を処置する際の努力不足によるものではない。数十億ドルが、肥満患者における体重減少を誘発するために、毎年費やされている。これらの努力により、多くの肥満患者において体重減少がもたらされているという事実があるが、しかし、不可避的に、大多数の患者は、体重が再び増加する（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００４】
肥満において重要であると考えられる生理学的経路の１つは、成長ホルモン−インスリン様成長因子−１（ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ）軸である。ヒト内分泌系は、異なる機能を果たす軸に体系づけられる。ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸は、正常な成熟成長および発育に重要であり（非特許文献４；非特許文献５）、代謝を調節する役割を果たす可能性があるとも考えられる（非特許文献６；非特許文献７）。この軸は、ストレス、運動、栄養および睡眠を含む要因によって調節される。これらの要因に応答する脳の視床下部におけるニューロンは、下垂体における成長ホルモン分泌細胞によって成長ホルモン分泌を調節する（非特許文献８）。ＧＨ分泌は、視床下部ニューロンによる成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）の放出後に増加することができ、ソマトスタチンの放出後に減少することができる。下垂体から放出された成長ホルモンは、その受容体を発現する組織に直接的な作用、またはＧＨが肝臓によってＩＧＦ−Ｉ放出を誘発させた後に間接的な作用を及ぼすことができる。ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉは、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸における活性のパターンを調節するために軸に負のフィードバックを与える。
【０００５】
発育成長におけるＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸の重要性は明確であるが、成人におけるこの軸の役割は、十分に知られていない。多くのホルモンおよび成長因子と同様に、ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉ分泌は、潜在的に成長の低下を反映して、年をとるとともに減少する（非特許文献９；非特許文献１０）。しかしながら、インスリン感受性の増加および体脂肪／筋肉比の減少のような、代謝機能における成長ホルモンおよびＩＧＦ−Ｉの潜在的な役割を示す証拠が存在する。
【０００６】
肥満患者において、成長ホルモン放出は、著しく減少し、ＩＧＦ−Ｉレベルは、健常者に比べて減少する（非特許文献１１）。肥満患者がインスリン抵抗性であり、高い体脂肪／筋肉比を有するという事実に起因して、外因性成長ホルモンまたはＩＧＦ−Ｉをこれらの患者に投与することが、肥満またはその合併症の処置として提案されている（非特許文献１２）。外因性成長ホルモンは、患者において試験されており、血糖または血清インスリンに影響を与えずに、肥満患者における体脂肪の総量を減少させる（非特許文献１２）。外因性ＩＧＦ−Ｉもまた、患者において試験されており、重症のインスリン抵抗性患者においてインスリン感受性を増加させ、グルコースを減少させる。有益な結果にも関わらず、肥満およびその合併症の処置のために外因性成長因子を用いてＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸の活性を増加させる戦略の開発は、ＩＧＦ−Ｉレベルと癌の危険性との間の正の相関関係の発見によって妨げられてきた（非特許文献１３）。
【０００７】
インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）は、正常な胎児ならびに出生後の成長および発育に必須である偏在する膜貫通チロシンキナーゼ受容体である。ＩＧＦ−ＩＲは、細胞増殖、細胞分化を刺激し、細胞の大きさを変化させ、アポトーシスから細胞を保護することができる。それはまた、細胞形質転換にある程度不可欠（ｑｕａｓｉ−ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ）であるとみなされている（非特許文献１４；非特許文献１５に概説されている）。ＩＧＦ−ＩＲは、ほとんどの細胞型の細胞表面に位置し、成長因子ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ（合わせてこれ以降ＩＧＦと呼ぶ）のためのシグナル伝達分子として機能する。ＩＧＦ−ＩＲはまた、それがＩＧＦに結合するより３桁低い大きさの親和性ではあるが、インスリンに結合する。ＩＧＦ−ＩＲは、ジスルフィド結合によって共有結合した２つのα鎖および２つのβ鎖を含むヘテロ四量体を前もって形成する。受容体サブユニットは、１８０ｋｄの単一のポリペプチド鎖の部分として合成され、次いで、それは、α（１３０ｋｄ）およびβ（９５ｋｄ）サブユニットにタンパク質分解的に処理される。α鎖全体は細胞外にあり、リガンド結合のための部位を含む。β鎖は、膜貫通領域、チロシンキナーゼ領域、ならびに細胞分化および形質転換に必要なＣ末端伸張を有するが、マイトジェンシグナル伝達およびアポトーシスからの保護には必要ではない。
【０００８】
ＩＧＦ−ＩＲは、インスリン受容体（ＩＲ）、特に、β鎖配列内で非常に類似（７０％相同）している。この相同性のため、１つのＩＲ二量体および１つのＩＧＦ−ＩＲ二量体を含むハイブリッド受容体を形成することができる（非特許文献１６）。ハイブリッドの形成は、正常な細胞および形質転換細胞の両方で生じ、そのハイブリッド含有量は、細胞内の２つのホモ二量体受容体（ＩＲおよびＩＧＦ−ＩＲ）の濃度に依存する。３９の乳癌検体に関する一研究において、ＩＲおよびＩＧＦ−ＩＲの両方は、全ての腫瘍サンプルにおいて過剰に発現したが、ハイブリッド受容体含有量は、常に、両方のホモ受容体のレベルを約３倍超えた（非特許文献１７）。ハイブリッド受容体は、ＩＲとＩＧＦ−ＩＲとの対から構成されるが、このハイブリッドは、ＩＧＦ−ＩＲの親和性と同様の親和性を有し、ＩＧＦに選択的に結合し、インスリンには弱く結合するだけである（非特許文献１８）。従って、これらのハイブリッドは、正常な細胞および形質転換細胞の両方において、ＩＧＦに結合し、シグナルを伝達することができる。
【０００９】
ＩＧＦ−Ｉの内分泌発現は、成長ホルモンによって主に調節される。ＩＧＦ−Ｉは、肝臓において主に産生されるが、最近の証明では、多くの他の組織型もまた、ＩＧＦ−Ｉを発現することができると示唆されている。従って、このリガンドは、内分泌およびパラクリン調節の対象となり、多くの腫瘍細胞型によっても産生される（非特許文献１９）。
【００１０】
リガンド（ＩＧＦ）の結合の際に、ＩＧＦ−ＩＲは、β鎖の触媒領域内の保存されたチロシン残基で自己リン酸化を受ける。続いて、β鎖内のさらなるチロシン残基のリン酸化により、シグナル伝達カスケードに重要な下流分子の動員のためのドッキング部位が与えられる。ＩＧＦシグナル伝達のための主要経路は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）およびホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）である（非特許文献２０に概説されている）。ＭＡＰＫ経路は、主に、ＩＧＦ刺激後に誘発された細胞増殖シグナルに関与し、ＰＩ３Ｋは、抗アポトーシスまたは生存プロセスのＩＧＦ依存性誘発に関与する。
【００１１】
ＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達の重要な役割は、その抗アポトーシスまたは生存機能である。活性化ＩＧＦ−ＩＲは、ＰＩ３ＫおよびＡｋｔの下流のリン酸化またはプロテインキナーゼＢにシグナルを伝達する。Ａｋｔは、リン酸化を介して、プログラムされた細胞死の開始に必須であるＢＡＤのような分子を効果的に遮断することができ、アポトーシスの開始を阻害することができる（非特許文献２１）。アポトーシスは、正常な発生プロセスに不可欠な重要な細胞機構である（非特許文献２２）。それは、激しく損傷した細胞の除去をもたらし、腫瘍形成を促進する可能性がある突然変異誘発性損傷の潜在的な残留を減少させるのに重要な機構である。そのため、ＩＧＦシグナル伝達の活性化は、トランスジェニックマウスモデルにおいて自然発生癌の形成を促進する可能性があることが示されている（非特許文献２３）。さらに、ＩＧＦの過剰発現は、化学療法によって誘発される細胞死から細胞を救うことができ、腫瘍細胞の薬物耐性において重要な因子である場合がある（非特許文献２４）。従って、ＩＧＦシグナル伝達経路の抑制的調節は、化学療法剤に対する腫瘍細胞の感受性を増加させることが示されている（非特許文献２５）。
【００１２】
多数の調査および臨床研究は、癌の発生、維持および進行におけるＩＧＦ−ＩＲおよびそのリガンド（ＩＧＦ）の関与を示している。腫瘍細胞において、受容体の過剰発現は、しばしば、ＩＧＦリガンドの過剰発現と合わせて、それらのシグナルの相乗作用を導き、結果として、細胞増殖および生存を高める。ＩＧＦ系の活性化はまた、末端肥大症（非特許文献２６）、網膜血管新生（非特許文献２７）、および乾癬（非特許文献２８）を含む癌以外のいくつかの病的状態に関与している。この最近の研究において、ＩＧＦ−ＩＲを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド調製は、マウスモデルにおけるヒトの乾癬皮膚移植において上皮細胞の過剰増殖を著しく阻害するのに効果的であり、抗ＩＧＦ−ＩＲ治療が、この慢性疾患の効果的な処置である可能性を示唆している。
【００１３】
様々な戦略が、細胞内のＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達経路を阻害するために開発されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、乾癬について上で示したようにインビトロおよび実験マウスモデルにおいて効果的である。いくつかの低分子のＩＧＦ−ＩＲ阻害剤が開発されている。さらに、インビトロおよびインビボにおいて抗増殖作用を有する、ＩＧＦ−ＩＲを標的とする阻害性ペプチドが生成されている（非特許文献２９；非特許文献３０）。ＩＧＦ−ＩＲのＣ末端からの合成ペプチド配列は、アポトーシスを誘発し、腫瘍増殖を著しく阻害することが示されている（非特許文献３１）。ＩＧＦ−ＩＲのいくつかのドミナントネガティブ突然変異体もまた、生成されており、それは、腫瘍細胞株における過剰発現の際に、リガンドについて野生型ＩＧＦ−ＩＲと競合し、インビトロおよびインビボにおいて腫瘍細胞増殖を効果的に阻害する（非特許文献３２；非特許文献３３）。さらに、ＩＧＦ−ＩＲの可溶性形態もまた、インビボにおいて腫瘍増殖を阻害することが示されている（非特許文献３４）。ヒトＩＧＦ−ＩＲに対する抗体もまた、インビトロにおいて腫瘍細胞増殖ならびにインビボにおいて、乳癌（非特許文献３５）、ユーイング骨肉腫（非特許文献３６）、および黒色腫（非特許文献３７）由来の細胞株を含む腫瘍形成を阻害することが示されている。抗体は、魅力的な治療法である。その理由は主に、それらは、１）特定のタンパク質抗原に高い選択性を有することができ、２）その抗原に対して高親和性結合を示すことができ、３）インビボにおいて長い半減期を有し、そして、それらは、天然の免疫産物であるため、４）インビボにおいて低い毒性を示すはずだからである（非特許文献３８）。繰り返し適用した後、非ヒト源（例えば、マウス）由来の抗体は、治療抗体に対して向けられた免疫反応に作用し、それによって、抗体の有効性を無効にする場合がある。完全なヒトの抗体は、ヒトの治療方法として成功するための最も高い可能性を与える。なぜなら、それらは、天然に生じる免疫反応抗体と同様に、ヒトにおけるマウスまたはキメラ抗体よりほとんど免疫原性がないようだからである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｈａｓｌａｍ，Ｄ．Ｗ．ら、「Ｌａｎｃｅｔ」，２００５年，３６６，ｐ．１１９７−１２０９
【非特許文献２】Ｇｏｏｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｋ．ら、「Ｊ  Ａｍ  Ｄｉｅｔ  Ａｓｓｏｃ．」，１９９１年，９１，ｐ．１２４３−１２４７
【非特許文献３】Ｗｅｉｎｓｉｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら、「Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．」，２０００年，７２，ｐ．１０８８−１０９４
【非特許文献４】Ｗｏｏｄｓ，Ｋ．Ａ．ら、「Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．」，１９９６年，３３５，ｐ．１３６３−１３６７
【非特許文献５】Ｌａｒｏｎ  Ｚ．，「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．」，１９９９年，８４，ｐ．４３９７−４４０４
【非特許文献６】Ｆｒａｎｃｏ，Ｃ．ら、「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．」，２００５年，９０，ｐ．１４６６−１４７４
【非特許文献７】Ｙａｋａｒ，Ｓ．ら、「Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．」，２００５年，２０，ｐ．２５１−２５４
【非特許文献８】Ｍｕｌｌｉｓ  ＰＥ．，「Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」，２００５年，１５２，ｐ１１−３１
【非特許文献９】Ｒｏｓｅｎ，Ｃ．Ｊ．ら、「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔ．」，１９９７年，８２，ｐ．３９１９−３９２２
【非特許文献１０】Ｔｏｏｇｏｏｄ，Ａ．Ａ．ら、「Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ．」，２００３年，６０（補遺１），ｐ．１０５−１１１
【非特許文献１１】Ｊｏｈａｎｎｓｓｏｎ，Ｇ．ら、「Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔ」，１９９７年，８２，ｐ．７２７−７３４
【非特許文献１２】Ｊｏｈａｎｎｓｓｏｎら、「Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」，２００２年，１４２，ｐ．３９６４−３９７３
【非特許文献１３】Ｊｅｒｏｍｅ，Ｌ．ら、「Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ」，２００３年，１０，ｐ．５６１−５７８
【非特許文献１４】Ａｄａｍｓら、「Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．」，２０００年，５７，ｐ．１０５０−９３
【非特許文献１５】Ｂａｓｅｒｇａ，「Ｏｎｃｏｇｅｎｅ」，２０００年，１９，ｐ．５５７４−８１
【非特許文献１６】Ｐａｎｄｉｎｉら、「Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．」，１９９９年，５，ｐ．１９３５−１９
【非特許文献１７】Ｐａｎｄｉｎｉら、「Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．」，１９９９年，５，ｐ．１９３５−４４
【非特許文献１８】ＳｉｄｄｌｅおよびＳｏｏｓ，「Ｔｈｅ  ＩＧＦ  Ｓｙｓｔｅｍ」，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９年，ｐ．１９９−２２５
【非特許文献１９】Ｙｕ，Ｈ．およびＲｏｈａｎ，Ｊ．，「Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．」，２０００年，９２，ｐ．１４７２−８９
【非特許文献２０】Ｂｌａｋｅｓｌｅｙら、「Ｔｈｅ  ＩＧＦ  Ｓｙｓｔｅｍ」，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９年，ｐ．１４３−１６３
【非特許文献２１】Ｄａｔｔａら、「Ｃｅｌｌ」，１９９７年，９１，ｐ．２３１−４１
【非特許文献２２】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」，１９９１年，１４，ｐ．４５３−５０１
【非特許文献２３】ＤｉＧｉｏｖａｎｎｉら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」，２０００年，６０，ｐ．１５６１−７０
【非特許文献２４】Ｇｏｏｃｈら、「Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．」，１９９９年，５６，ｐ．１−１０
【非特許文献２５】Ｂｅｎｉｎｉら、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」，２００１年，７，ｐ．１７９０−９７
【非特許文献２６】ＤｒａｎｇｅおよびＭｅｌｍｅｄ，「Ｔｈｅ  ＩＧＦ  Ｓｙｓｔｅｍ」，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９年，ｐ．６９９−７２０
【非特許文献２７】Ｓｍｉｔｈら、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．」，１９９９年，１２，ｐ．１３９０−９５
【非特許文献２８】Ｗｒａｉｇｈｔら、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．」，２０００年，１８，ｐ．５２１−２６
【非特許文献２９】Ｐｉｅｔｒｚｋｏｗｓｋｉら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」，１９９２年，５２，ｐ．６４４７−５１
【非特許文献３０】Ｈａｙｌｏｒら、「Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．」，２０００年，１１，ｐ．２０２７−３５
【非特許文献３１】Ｒｅｉｓｓら、「Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓ．」，１９９９年，１８１，ｐ．１２４−３５
【非特許文献３２】Ｓｃｏｔｌａｎｄｉら、「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ」，２００２年，１０１，ｐ．１１−６
【非特許文献３３】Ｓｅｅｌｙら、「ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ」，２００２年，２，ｐ．１５
【非特許文献３４】Ｄ'Ａｍｂｒｏｓｉｏら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」，１９９６年，５６，ｐ．４０１３−２０
【非特許文献３５】ＡｒｔｅｇａおよびＯｓｂｏｒｎｅ，「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」，１９８９年，４９，ｐ．６２３７−４１
【非特許文献３６】Ｓｃｏｔｌａｎｄｉら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」，１９９８年，５８，ｐ．４１２７−３１
【非特許文献３７】Ｆｕｒｌａｎｅｔｔｏら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」，１９９３年，５３，ｐ．２５２２−２６
【非特許文献３８】ＰａｒｋおよびＳｍｏｌｅｎ，「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００１年，ｐ．３６０−４２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、体重を調節するための新規の治療法を提供する。さらに、本発明は、そのような治療に使用するための組成物を提供する。現在の定説（Ｊｏｈａｎｎｓｓｏｎ，Ｇ．ら）ならびにＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸の活性化に焦点を合わせた文献および臨床における取り組みとは対照的に、本発明は、肥満およびその合併症の処置のためにＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達を遮断することに重点を置いている。
【００１６】
従って、本発明は、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）拮抗薬を、それを必要とする哺乳動物に投与することによってＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達を遮断することを含むプロセスにおいて、哺乳動物、例えば、ヒトにおける体重を調節するための方法を提供する。体重の調節により、前記哺乳動物における減量、体重の維持、または体重の減少後の体重の増加の最小化をもたらすことができる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明によれば、ＧＨ／ＩＧＦ−Ｉ軸に対する拮抗薬、特にＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、減量、体重の維持、または体重の減少後の体重増加の最小化、もしくは防止に使用される。ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬はまた、身体組成を調節するため（例えば、体脂肪の割合を減少させるため）に使用される。本発明は、個体の体重または組成を調節するのに効果的であり、特に、過体重または肥満の個体の処置に利点がある、ＩＧＦ−ＩＲ媒介性シグナル伝達を調節するための方法および組成物を提供する。
【００１８】
ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、ＩＧＦ−ＩＲによって媒介されるシグナル伝達を遮断、調節または阻害する分子であり、抗体、低分子、タンパク質、ポリペプチド、ＩＧＦ模倣剤、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、阻害的低分子ＲＮＡ、トリプルヘリックス形成性核酸、ドミナントネガティブ突然変異体、および可溶性受容体発現を含むが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の一実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、ＩＧＦ−ＩＲに結合して、リガンド結合を遮断する。本発明の別の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、ＩＧＦ−ＩＲに結合して、ＩＧＦ−ＩＲ表面受容体の減少を促進する。本発明のさらに別の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、ＩＧＦ−ＩＲに結合して、ＩＧＦ−ＩＲ媒介性シグナル伝達を阻害する。
【００２０】
本発明の一実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、抗体である。特定の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、約１０−９Ｍ−１未満または約１０−１０Ｍ−１未満または約３×１０−１０Ｍ−１未満であるＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する抗体である。抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の非限定的な例としては、Ａ１２および２Ｆ８（以下に記載される）、ならびにＩＧＦ−ＩＲとの結合の面でＡ１２および／または２Ｆ８と競合する抗体が挙げられる。本発明に従って使用することができる抗体としては、キメラ抗体またはヒト化抗体が挙げられる。好ましい実施形態において、抗体はヒト抗体である。別の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、受容体に結合するがそれを活性化しないＩＧＦ−ＩＲリガンドの模倣剤である。さらに別の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、ＩＧＦ−ＩＲのリガンド結合領域に結合して、ＩＧＦ−ＩＲリガンドの結合を遮断する低分子（例えば、コンビナトリアルケミストリーライブラリーの要素、あるいは低分子量の天然産物もしくは合成産物または天然代謝産物もしくは合成代謝産物）である。本発明の別の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、ＩＧＦ−ＩＲとその基質ＩＲＳ−１との相互作用を遮断する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の結合および遮断を示す。（Ａ）固定した組み換えＩＧＦ−ＩＲへのＡ１２および２Ｆ８の結合。（Ｂ）抗体２Ｆ８またはＡ１２、あるいはリガンドＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩによる固定したＩＧＦ−ＩＲへの１２５Ｉ−ＩＧＦ−Ｉ結合の遮断。（Ｃ）ＭＣＦ７細胞における天然ＩＧＦ−ＩＲへの１２５Ｉ−ＩＧＦ−Ｉ結合の遮断。
【図２】ＩＧＦ−ＩＲリン酸化およびＩＧＦ−ＩＲ媒介性シグナル伝達の阻害を示す。（Ａ）抗体Ａ１２および２Ｆ８によるＭＣＦ７乳癌細胞におけるＩＧＦ−ＩＲのＩＧＦ−Ｉ誘導性リン酸化反応の阻害。（Ｂ）抗体Ａ１２によるＭＣＦ７細胞における下流エフェクター分子のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ媒介性リン酸化の阻害。ＭＣＦ７細胞溶解物のウェスタンブロットが、リン酸化ＩＲＳ−１（ｐＩＲＳ−１）、ＭＡＰＫ（ｐＭＡＰＫ）、およびＡｋｔ（ｐＡｋｔ）について調べられた。
【図３】Ａ１２によるインスリン受容体（ＩＲ）結合および遮断活性の欠失を示す。（Ａ）固定したＩＲへのＡ１２の結合。抗ＩＲ抗体４７−９を、ポジティブコントロールとして使用した。（Ｂ）インスリン、ＩＧＦ−Ｉ、Ａ１２、または抗ＩＲ抗体４９−７による固定したＩＲへの１２５Ｉ−インスリン結合の遮断。
【図４】組み換えマウスおよびヒトＩＧＦ−ＩＲへのＡ１２の結合を示す。
【図５】痩せたＢａｌｂ／ｃマウスの体重へのＡ１２の効果を示す。雌のＢａｌｂ／ｃマウスを、１４０ｍｇ／ｋｇの負荷用量を用いて、および用いないで、４０ｍｇ／ｋｇにて、Ｍ−Ｗ−Ｆ（月−水−金）にＡ１２で処置した。コントロールマウスを、４０ｍｇ／ｋｇにて、Ｍ−Ｗ−Ｆ（月−水−金）にヒトＩｇＧで、または０．５ｍｌ／用量にて、Ｍ−Ｗ−Ｆ（月−水−金）にＴＢＳで処置した。マウスは、未成熟（Ａ）またはより成熟（Ｂ）の体重で処置を開始した。処置は、表示した時間で停止した。平均体重±標準偏差をプロットする（１群あたりｎ＝５）。
【図６】肥満のｏｂ／ｏｂマウスにおける食物摂取を示す。ｏｂ／ｏｂマウスは、未処置のままであるか、または齧歯動物用食餌の量を減らした餌を毎日与えることにより食餌制限を受けさせた。食餌制限の後、これらのマウスを、火曜日、金曜日のスケジュールで３０ｍｇ／ｋｇにてヒトＩｇＧまたはＡ１２で処置した。平均食物摂取±標準偏差をプロットする（１群あたりｎ＝７）。＊は、新鮮な食物を不断給餌のマウスに与えた時点を示し、その結果、食物摂取において一時的な急増を生じた。
【図７】肥満のｏｂ／ｏｂマウスの体重へのＡ１２の効果を示す。ｏｂ／ｏｂマウスは、未処置のままであるか、または齧歯動物用食餌の量を減らした餌を毎日与えることにより食餌制限を受けさせた。食餌制限の後、これらのマウスは、火曜日、金曜日のスケジュールで３０ｍｇ／ｋｇにてヒトＩｇＧまたはＡ１２で腹腔内処置を開始してから５時間後に不断給餌を開始した。最終処置を、食餌制限の開始２５日後に施した。平均体重±標準偏差をプロットする（１群あたりｎ＝７）。
【図８】食餌制限を受けた肥満マウスおよび不断給餌の肥満マウスの体重へのＡ１２の効果を示す。食餌制限されたマウスは、１３日間、食物の量を減らされ、次いで、３０ｍｇ／ｋｇにてヒトＩｇＧで、または３、１０もしくは３０ｍｇ／ｋｇにてＡ１２で腹腔内処置を開始してから３時間後に不断給餌を開始した。さらに、食餌制限されたマウスと同じスケジュールで、食餌制限されていないマウスを、３０ｍｇ／ｋｇのＡ１２で処置した。平均体重±標準偏差をプロットする（１群あたりｎ＝４−１２）。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、減量させるため、および体重を維持するため、および体重増加を減少させるためのＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬の使用に関する。本発明の特定の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、過体重または肥満である個体を処置するために使用される。
【００２３】
標準体重は、性別、身長、および年齢で変化し、個体を標準、過体重、または肥満と定義する基準は、時間とともに変化する。さらに、脂肪の重量と除脂肪体重との割合のような身体組成パラメーターは、疾患の危険性の有意な決定因子である。従って、過体重および肥満について特定の測定手段を使用することが有用である。
【００２４】
体脂肪含有量を測定するための１つの方法は、密度測定による。脂肪組織は、筋肉および骨より密度が小さいため、平均密度を得るために、水中でヒトの体重を量ることにより、ヒトの脂肪含有量を推定することは可能である。次いで、体脂肪の割合を、平均密度に基づいて計算することができる。一般に使用される式は、体脂肪率＝（４．９５／ρ−４．５０）×１００である（Ｓｉｒｉ，Ｗ．Ｅ．，１９６１，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｂｏｄｙ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｊ．ＢｒｏｚｅｋおよびＡ．Ｈｅｎｓｃｈｅｌ，編，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．２２３−２４４）。全脂肪量は、全体重×体脂肪率として計算することができる。除脂肪体重（ＬＢＭ）は、全体重と脂肪量との差である。
【００２５】
体脂肪を測定するための別の非観血的アプローチは、二重エネルギーＸ線吸収法（ＤＥＸＡ）である。ＤＥＸＡを、全体脂肪および特定の解剖領域における脂肪を推量するために使用することができる。体脂肪を測定するための簡単だが、あまり信頼できない試験は、皮下脂肪試験であり、それによって、皮下脂肪層の厚さを測定するために身体上のいくつかの基準化した点においてカリパスで皮膚をつまんで測定する。
【００２６】
身体組成（すなわち、脂肪過多症）は、疾患および死亡の危険性に、体重より密接に関連するが、身長で補正した体重の指数は、ほとんどの個人で脂肪含有量の十分な近似値を与えることができる。肥満度指数（ＢＭＩ）は、簡単に測定されて、比較的信頼できる測定手段である。体重がポンド（１ポンド＝約４５３ｇ）で、身長がインチ（１インチ＝約２５．４ｍｍ）で測定される場合、ＢＭＩ（単位＝ｋｇ／ｍ２）は、（体重（ｌｂ）／身長（ｉｎ）２）×７０３として計算される。体重がキログラムで、身長がメートルで測定される場合、この式は、ＢＭＩ（単位＝ｋｇ／ｍ２）＝体重（ｋｇ）／身長（ｍ）２である。この指数は、広範囲の身長について身長で補正した体重を与え、身体の脂肪含有量に関する信頼できる推量近似値である。成人肥満の現在の診断基準は、疾患および死亡の危険性に関する疫学データに基づいている。肥満は、現在、ＢＭＩ≧３０ｋｇ／ｍ２によって示される。病的な肥満は、４０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩ、または１００ポンド(約４５．３ｋｇ)の過体重と相関する。罹患率および死亡率は、ＢＭＩとともに徐々に増加し、３０ｋｇ／ｍ２より下でもＢＭＩと関連する危険性が増加する。従って、ＢＭＩ＝２５から３０ｋｇ／ｍ２未満は、「過体重」の症状とみなされる。
【００２７】
ＢＭＩと肥満との相関関係は、かなり強いが、性別、人種、年齢および状態によって変わる。従って、ＢＭＩは、過体重または肥満関連の疾患を発症させる可能性に関する１つの要因にすぎないことを覚えておくことは重要である。別の重要な予測材料は、個体の腰周りである（なぜなら、腹部脂肪は、肥満関連の疾患の危険性を予測する判断材料だからである）。
【００２８】
本発明は、被験体における脂肪量（または体脂肪率）またはＢＭＩの増加を減少するため、予防するため、あるいは最小化するために使用される。本発明の特定の実施形態において、処置される被験体の体脂肪率は、約１０以上、または約２０以上、または約３０以上である。本発明の他の実施形態において、処置される被験体のＢＭＩは、約２０ｋｇ／ｍ２以上、または約２５ｋｇ／ｍ２以上、または約３０ｋｇ／ｍ２以上、または約４０ｋｇ／ｍ２以上である。
【００２９】
ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、ＩＧＦ−ＩＲ媒介性シグナル伝達を阻害する任意の物質を含む。従って、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、細胞外拮抗薬および細胞内拮抗薬を含む。細胞外拮抗薬は、通常、受容体−リガンド相互作用を減少または遮断する物質である。細胞外拮抗薬はまた、細胞表面受容体を下方制御するように機能することができる。細胞外拮抗薬は、ＩＧＦ−ＩＲに結合する抗体および他のタンパク質またはポリペプチド、ならびにＩＧＦ−ＩＲリガンドに特異的な抗体または他のタンパク質またはポリペプチドを含む。
【００３０】
天然に存在する抗体は、通常、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖を有し、各々の軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって重鎖に共有結合し、複数のジスルフィド結合はさらに、２つの重鎖を互いに結合する。個々の鎖は、同様のサイズ（１１０−１２５アミノ酸）および構造、しかし異なる機能を有する領域に折り畳むことができる。軽鎖は、１つの可変領域（ＶＬ）および／または１つの定常領域（ＣＬ）を含むことができる。重鎖もまた、１つの可変領域（ＶＨ）および/または抗体のクラスもしくはアイソタイプに依存して、３つもしくは４つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含むことができる。ヒトにおいて、このアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭであり、ＩｇＡおよびＩｇＧはさらに、サブクラスまたはサブタイプ（ＩｇＡ１−２およびＩｇＧ１−４）に細かく分けられる。
【００３１】
一般に、可変領域は、１つの抗体ごとに、特に抗原結合部位の位置において多数のアミノ酸配列可変性を示す。超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの領域が、ＶＬおよびＶＨの各々に見出され、それらは、フレームワーク（ＦＷ）と呼ばれるさほど変化しない領域によって支持される。
【００３２】
ＶＬおよびＶＨ領域からなる抗体の一部は、Ｆｖ（可変フラグメント）に指定され、抗原結合部位を構成する。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、１つのポリペプチド鎖上にＶＬ領域およびＶＨ領域を含む抗体フラグメントであり、ここで、１つの領域のＮ末端および他の領域のＣ末端は、可動性リンカーによって連結される（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）；国際公開第８８／０９３４４号（Ｈｕｓｔｏｎら）を参照のこと）。国際公開第９２／０１０４７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら）は、可溶性組み換え遺伝子ディスプレイパッケージ（例えば、バクテリオファージ）の表面におけるｓｃＦｖフラグメントの表示を記載している。
【００３３】
一本鎖抗体を生成するために使用されるペプチドリンカーは、ＶＬとＶＨ領域の適切な三次元フォールディング及び結合を確保するように選択されるフレキシブルペプチドであってもよい。リンカーは、一般に、１０〜５０アミノ酸残基である。好ましくは、リンカーは、１０〜３０アミノ酸残基である。より好ましくは、リンカーは、１２〜３０アミノ酸残基である。最も好ましくは、１５〜２５アミノ酸残基のリンカーである。そのようなリンカーペプチドの非限定的な例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３（配列番号３３）である。
【００３４】
Ｆａｂ（フラグメント、抗原結合）とは、ＶＬ−ＣＬおよびＶＨ−ＣＨ１領域からなる抗体のフラグメントをいう。パパインで全抗体を消化することによって生成されるこのようなフラグメントは、通常２つの重鎖が連結される抗体ヒンジ領域を保有しない。このフラグメントは一価であり、単にＦａｂといわれる。あるいは、ペプシンでの消化は、ヒンジ領域を保有するフラグメントを生じる。２つの重鎖に連結するインタクトな鎖間ジスルフィド結合を有するこのようなフラグメントは、二価であり、Ｆ（ａｂ’）２といわれる。一価のＦａｂ’は、Ｆ（ａｂ’）２のジスルフィド結合が還元され、重鎖が離れる場合に生じる。それらは二価であるため、インタクトな抗体およびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、一価のＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントより、抗原に高い親和性を有する。国際公開第９２／０１０４７号（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら）は、可溶性組み換え遺伝子ディスプレイパッケージ（例えば、バクテリオファージ）の表面におけるＦａｂフラグメントの表示を記載している。
【００３５】
Ｆｃ（フラグメント結晶化）とは、対をなす重鎖定常領域からなる抗体の一部またはフラグメントを指定する。例えば、ＩｇＧ抗体において、Ｆｃは、重鎖ＣＨ２およびＣＨ３領域からなる。ＩｇＡまたはＩｇＭ抗体のＦｃはさらに、ＣＨ４領域を含む。Ｆｃは、Ｆｃ受容体結合、相補体媒介性細胞毒性および抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）の活性化に関連する。複数のＩｇＧ様タンパク質の複合体であるＩｇＡおよびＩｇＭのような抗体に関しては、複合体形成はＦｃ定常領域を必要とする。
【００３６】
最終的に、ヒンジ領域は、抗体のＦａｂおよびＦｃ部分を分け、Ｆａｂ間の可動性およびＦｃに対するＦａｂの可動性を与え、２つの重鎖が共有結合するためにジスルフィド結合を与える。
【００３７】
結合特異性を保持するが望ましい他の特性も有する抗体型が開発されている。望ましい他の特性とは、例えば、二重特異性、多価性（３つ以上の結合部位）、および小型（例えば、結合領域単独）などである。
【００３８】
一本鎖抗体は、それらが由来する全抗体の定常領域のいくらかまたは全てを欠く。従って、一本鎖抗体は、全抗体の使用に伴ういくらかの問題を克服できる。例えば、一本鎖抗体は、重鎖定常領域と他の生体分子との間の特定の好ましくない相互作用を含まない傾向がある。加えて、一本鎖抗体は、全抗体よりかなり小さく、全抗体より大きい透過性を持つことができるので、一本鎖抗体を、より効果的に標的抗原結合部位に集めて結合させることが可能である。さらに、比較的小型の一本鎖抗体は、全抗体より、レシピエントにおける好ましくない免疫反応をほとんど誘発させない。
【００３９】
各々の一本鎖が、最初のペプチドリンカーによって共有結合された１つのＶＨおよび１つのＶＬ領域を有する、複数の一本鎖抗体は、少なくとも１つ以上のペプチドリンカーによって共有結合されて、多価の一本鎖抗体を形成することができ、その多価の一本鎖抗体は、単一特異性であっても、多重特異性であってもよい。多価の一本鎖抗体の各々の鎖は、可変軽鎖フラグメントおよび可変重鎖フラグメントを含み、少なくとも１つの他の鎖にペプチドリンカーによって連結される。ペプチドリンカーは、一般に、少なくとも１５アミノ酸残基からなる。アミノ酸残基の最大数は、約１００である。
【００４０】
２本の一本鎖抗体は結合して、二重特異性抗体（別名、二価二量体）を形成してもよい。二重特異性抗体は、２つの鎖および２つの結合部位を有し、単一特異性であっても、二重特異性であってもよい。二重特異性抗体の各々の鎖は、ＶＬ領域に結合するＶＨ領域を含む。この領域は、同じ鎖における領域間で対になるのを防止するのに十分短いリンカーで結合され、それによって、異なる鎖における相補性領域間の対合を駆動して、２つの抗原結合部位を再形成する。
【００４１】
３本の一本鎖抗体は結合して、三重特異性抗体（別名、三価三量体）を形成してもよい。三重特異性抗体は、ＶＬまたはＶＨ領域のカルボキシル末端に直接結合する（すなわち、リンカー配列を１つも含まない）ＶＬまたはＶＨ領域のアミノ酸末端を用いて構築される。三重特異性抗体は、環状の頭−尾様式で配列されたポリペプチドであり、３つのＦｖヘッドを有する。三重特異性抗体の可能な構造は平面状であり、３つの結合部位が、互いに１２０度の角度で１つの平面に位置している。三重特異性抗体は、単一特異性、二重特異性または三重特異性であってもよい。
【００４２】
従って、本発明の抗体およびそのフラグメントとしては、抗原に特異的に結合する天然に存在する抗体、（Ｆａｂ’）２のような二価フラグメント、Ｆａｂのような一価フラグメント、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一領域抗体、多価一本鎖抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明の抗体およびその特定の可変領域は、当該分野において公知の方法によって得ることができる。これらの方法としては、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）ならびにＣａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｏｄｅｎｔ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｂｕｒｄｏｎら編，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１３巻，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８５）に記載される免疫学的方法、およびＨｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６，１２７５−８１（１９８９）に記載される組み換えＤＮＡ法が挙げられる。抗体はまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂの形態でＶＨとＶＬ領域との組み合わせを保有するファージディスプレイライブラリーから得ることができる。ＶＨおよびＶＬ領域は、合成された、部分的に合成された、または天然に由来するヌクレオチドによってコードされてもよい。特定の実施形態において、ヒト抗体フラグメントを保有するファージディスプレイライブラリーが好ましい場合がある。ヒト抗体の他の起源は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するように操作されたトランスジェニックマウスである。
【００４４】
抗体フラグメントは、全抗体を開裂することによって、またはそのフラグメントをコードするＤＮＡを発現させることによって生成してもよい。抗体のフラグメントは、Ｌａｍｏｙｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５６：２３５−２４３（１９８３）およびＰａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２８９５−２９０２（１９８３）に記載される方法によって調製されてもよい。そのようなフラグメントは、１つまたは両方のＦａｂフラグメントあるいはＦ（ａｂ’）２フラグメントを含んでもよい。そのようなフラグメントはまた、一本鎖フラグメントの可変領域抗体（すなわち、ｓｃＦＶ）、二重特異性抗体、または他の抗体フラグメントを含んでもよい。そのような機能的等価物を生成する方法は、ＰＣＴ出願第９３／２１３１９号、欧州特許出願第２３９，４００号；ＰＣＴ出願第８９／０９６２２号；欧州特許出願第３３８，７４５号；および欧州特許出願第３３２，４２４号に開示されている。
【００４５】
本発明の抗体またはそのフラグメントは、ＩＧＦ−ＩＲに特異的である。抗体特異性とは、抗原の特定のエピトープについての抗体の選択的認識をいう。本発明の抗体またはそのフラグメントは、例えば、単一特異性または二重特異性であってもよい。二重特異性抗体（ＢｓＡｂｓ）は、２つの異なる抗原結合特異性または部位を有する抗体である。抗体が２つ以上の特異性を有する場合、認識されるエピトープは、単一の抗原または２つ以上の抗原と結合してもよい。従って、本発明は、ＩＧＦ−ＩＲについての少なくとも１つの特異性を有し、２つの異なる抗原に結合する二重特異性抗体またはそのフラグメントを提供する。
【００４６】
本発明の抗体またはそのフラグメントのＩＧＦ−ＩＲについての特異性は、親和性および／または結合活性に基づいて測定されてもよい。抗原と抗体との解離についての平衡定数（Ｋｄ）によって表される親和性は、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合強度を測定する。結合活性は、抗体とその抗原との間の結合強度の尺度である。結合活性は、エピトープと、抗体におけるその抗原結合部位との間の親和性、および抗体の価数（特定のエピトープに特異的である抗原結合部位の数をいう）の両方に関連する。抗体は、通常、１０−５〜１０−１１リットル／モルまたはそれよりも優れた解離定数（Ｋｄ）で結合する。１０−４リットル／モル超のＫｄは、一般に、非特異的結合を示すとみなされる。Ｋｄが小さければ小さい程、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合強度がより強くなる。
【００４７】
本発明の抗体またはそのフラグメントはまた、定方向突然変異、親和性成熟法、ファージディスプレイ、または鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によって改良された結合特性のものも含む。親和性および特異性は、ＣＤＲおよび／またはＦＷ残基を変異し、所望の特性を有する抗原結合部位をスクリーニングすることによって修飾または改良されてもよい（例えば、Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３（１９９５）を参照のこと）。１つの方法は、個々の残基または残基の組み合わせをランダム化することであり、それによって、本来は同一の抗原結合部位集団において、２〜２０アミノ酸のサブセットが特定の位置に見出される。あるいは、変異は、エラープロンＰＣＲ法によって種々の残基にわたって誘発されてもよい（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−９６（１９９２）を参照のこと）。別の例において、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉの突然変異誘発株において増殖してもよい（例えば、Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：３５９−６８（１９９６）を参照のこと）。これらの突然変異生成法は、当業者に公知の多くの方法を例示したものである。
【００４８】
保存アミノ酸置換は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質あるいはそれらのフラグメントの１つまたは２つのアミノ酸の変更によるアミノ酸構成の変化と定義される。この置換は、一般に、類似の性質（例えば、酸性、塩基性、芳香族、サイズ、正または負電荷、極性、非極性）を有するアミノ酸の置換であり、それによって、置換は、実質的に、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の特性（例えば、電荷、等電点、親和性、結合活性、構造、溶解度）または活性を変化させない。このような保存アミノ酸置換のために実施され得る典型的な置換は、以下のような一群のアミノ酸であってもよい。
グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）およびイソロイシン（Ｉ）；
アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；
アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）；
ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）；
アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）；
フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）。
【００４９】
保存アミノ酸置換は、例えば、分子、および分子の他の部分（例えば、可変重鎖カセット）の選択的および／または特異的結合特性に主に関与する超可変領域に隣接する領域でなされてもよい。
【００５０】
本発明の抗体の各々の領域は、重鎖または軽鎖可変領域を有する完全な抗体であってもよいし、機能的等価物または変異体または天然に存在する領域の誘導体、または例えば、国際公開第９３／１１２３６号（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら）に記載される技術を用いてインビトロにおいて構築された合成領域であってもよい。例えば、少なくとも１つのアミノ酸を欠失している抗体可変領域に相当する領域を結合することは可能である。重要な特徴付けられる特性は、相補領域と結合して抗原結合部位を形成する各領域の能力である。従って、用語、可変重鎖および軽鎖フラグメントは、特異性に重要な作用を及ぼしていない変異体を排除するものと解釈されるべきではない。
【００５１】
好ましい実施形態において、本発明の抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、いくつかの特性のうちの１つ以上を示すヒト抗体である。一実施形態において、抗体は、ＩＧＦ−ＩＲの外部領域に結合して、ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの結合を阻害する。阻害は、例えば、精製された受容体または膜結合受容体を用いて直接結合アッセイによって測定することができる。この実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、好ましくは、ＩＧＦ−ＩＲの天然のリガンド（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）と少なくとも同じ強さでＩＧＦ−ＩＲに結合する。
【００５２】
本発明の実施形態において、抗体は、ＩＧＦ−ＩＲを無効化する。ＩＧＦ−ＩＲの外部である、細胞外領域へのリガンド（例えば、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ）の結合は、βサブユニットの自己リン酸化ならびにＭＡＰＫ、Ａｋｔ、およびＩＲＳ−１を含むＩＧＦ−ＩＲ基質のリン酸化を刺激する。ＩＧＦ−ＩＲの無効化は、通常、シグナル伝達に関連するそれらの活性のうちの１つ以上の阻害、減少、不活性化および／または崩壊を含む。ＩＧＦ−ＩＲの無効化は、ＩＧＦ−ＩＲ／ＩＲヘテロ二量体およびＩＧＦ−ＩＲホモ二量体の阻害を含む。従って、ＩＧＦ−ＩＲを無効化することは、成長（増殖および分化）、血管形成（血管補充（ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）、侵襲および転移））、ならびに細胞運動および転移（細胞接着および侵襲性）の阻害、減少、不活性化および／または崩壊を含むが、これらに限定されない種々の作用を有する。
【００５３】
ＩＧＦ−ＩＲ無効化の１つの尺度は、受容体のチロシンキナーゼ活性の阻害である。チロシンキナーゼ阻害は、周知の方法、例えば、組み換えキナーゼ受容体の自己リン酸化レベル、および／または天然もしくは合成基質のリン酸化を測定することにより決定できる。従って、リン酸化アッセイは、本発明の文脈において抗体の無効化を測定する際に有用である。リン酸化は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイまたはウェスタンブロットにおいてホスホチロシンに特異的な抗体を用いて検出することができる。チロシンキナーゼ活性についてのいくつかのアッセイは、Ｐａｎｅｋら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａ．２８３：１４３３−４４（１９９７）およびＢａｔｌｅｙら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６２：１４３−５０（１９９８）に記載されている。本発明の抗体は、リガンドに応答する細胞においてＩＧＦ−ＩＲのチロシンリン酸化を少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、およびより好ましくは少なくとも約９０％減少させる。
【００５４】
ＩＧＦ−ＩＲ無効化の別の尺度は、ＩＧＦ−ＩＲの下流基質のリン酸化の阻害である。従って、ＭＡＰＫ、ＡｋｔまたはＩＲＳ−１のリン酸化のレベルを測定することができる。基質リン酸化の減少は、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約８０％である。
【００５５】
さらに、タンパク質発現の検出方法を、ＩＧＦ−ＩＲ無効化を測定するのに利用でき、ここで、測定されるタンパク質は、ＩＧＦ−ＩＲチロシンキナーゼ活性によって調節されている。これらの方法としては、タンパク質発現を検出するための免疫組織化学（ＩＨＣ）、遺伝子増幅を検出するための蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）、競合放射性リガンド結合試験、固体マトリクスブロッティング技術（例えば、ノーザンブロットおよびサザンブロット）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＥＬＩＳＡが挙げられる。例えば、Ｇｒａｎｄｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ，７８：１２８４−９２（１９９６）；Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８５：５６７−７１（１９９４）；Ｓａｕｔｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１４８：１０４７−５３（１９９６）；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｇｌｉａ  １５：２８９−９６（１９９５）；Ｒａｄｉｎｓｋｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：１９−３１（１９９５）；Ｐｅｔｒｉｄｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０：３９３４−３９（１９９０）；Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７：４４１９−２６（１９９７）；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：３１４０−４８（１９９５）を参照のこと。
【００５６】
インビボアッセイもまた、ＩＧＦ−ＩＲ無効化を測定するのに利用できる。例えば、受容体チロシンキナーゼ阻害を、阻害剤の存在および非存在下において受容体リガンドで刺激される細胞株を用いてマイトジェンアッセイによって観察することができる。例えば、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩで刺激されたＭＣＦ７（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、ロックビル、メリーランド州）を、ＩＧＦ−ＩＲ阻害のアッセイに用いることができる。別の方法は、ＩＧＦ−ＩＲ発現腫瘍細胞またはＩＧＦ−ＩＲを発現するためにトランスフェクトされた細胞の増殖の阻害試験に関する。阻害は、腫瘍モデル、例えば、マウスに注入されたヒト腫瘍細胞を用いても観察することができる。本発明は、特定のＩＧＦ−ＩＲ無効化の機構によって制限されるものではない。
【００５７】
本発明の実施形態において、抗体は、ＩＧＦ−ＩＲを下方調節する。細胞表面に存在するＩＧＦ−ＩＲの量は、受容体タンパク質生成、内在化、および分解に依存する。細胞表面に存在するＩＧＦ−ＩＲの量は、受容体または受容体に結合された分子の内在化を検出することによって、間接的に測定されてもよい。例えば、受容体の内在化は、ＩＧＦ−ＩＲを発現する細胞を標識抗体と接触させることによって測定してもよい。膜結合抗体は剥がされ、回収され、カウントされる。内在化抗体は、細胞を溶解して、溶解物の標識を検出することによって測定される。
【００５８】
下方調節を測定するための別の方法は、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体または他の基質で処理した後の細胞に存在する受容体の量を、例えば、ＩＧＦ−ＩＲの表面発現のために染色された細胞を蛍光活性化細胞分類解析することによって、直接、測定することである。染色された細胞は、３７℃でインキュベートされ、蛍光強度を経時的に測定する。コントロールとして、染色された集団の一部を、４℃（受容体の内在化が停止する条件下）でインキュベートしてもよい。細胞表面ＩＧＦ−ＩＲは、ＩＧＦ−ＩＲに特異的で試験される抗体の結合を遮断または競合しない異なる抗体を用いて検出および測定してもよい（Ｂｕｒｔｒｕｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：８９１２−２１（２００３））。
【００５９】
本発明の抗体でＩＧＦ−ＩＲ発現細胞を処理することにより、細胞表面ＩＧＦ−ＩＲの減少が生じる。好ましい実施形態において、この減少は、本発明の抗体での処理に応答して、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％である。顕著な減少を、わずか４時間で観察することができる。
【００６０】
下方調節の別の尺度は、細胞に存在する全受容体タンパク質の減少であり、これにより内部受容体の分解が示される。従って、本発明の抗体で細胞（特に癌細胞）を処理することにより、細胞ＩＧＦ−ＩＲの総量の減少が生じる。好ましい実施形態において、この減少は、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％である。
【００６１】
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、約１０−９Ｍ−１以下のＫｄ、または約３×１０−１０Ｍ−１以下のＫｄ、または約１×１０−１０Ｍ−１以下のＫｄ、または約３×１０−１１Ｍ−１以下のＫｄでＩＧＦ−ＩＲに結合する。
【００６２】
本発明に適切な抗体または抗体のフラグメントの例は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、および配列番号３０からなる群より選択される１、２、３、４、５および／または６の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するヒト抗体である。好ましくは、本発明の抗体（またはそのフラグメント）は、配列番号１４、配列番号１６および配列番号１８のＣＤＲを有する。あるいは、そしてまた好ましくは、本発明の抗体またはそのフラグメントは、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４のＣＤＲを有する。あるいは、そしてまた好ましくは、本発明の抗体またはそのフラグメントは、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３０のＣＤＲを有する。ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の表１に記載される。
【００６３】
【表１】
2011505333.tif 000002
【００６４】
別の実施形態において、本発明の抗体またはそのフラグメントは、配列番号２の重鎖可変領域および／または配列番号６もしくは配列番号１０から選択される軽鎖可変領域を有してもよい。Ａ１２は、本発明の抗体の一例である。この抗体は、ヒトＶＨおよびヒトＶＬフレームワーク領域（ＦＷ）ならびにＣＤＲを有する。Ａ１２のＶＨ可変領域（配列番号２）は、配列番号１４、１６および１８に相当する３つのＣＤＲを有し、ＶＬ領域（配列番号１０）は、配列番号２６、２８および３０に相当する３つのＣＤＲを有する。２Ｆ８は、本発明の抗体の別の例である。この抗体もまた、ヒトＶＨおよびヒトＶＬフレームワーク領域（ＦＷ）ならびにＣＤＲを有する。２Ｆ８のＶＨ可変領域は、Ａ１２のＶＨ可変領域と同一である。２Ｆ８のＶＬ領域（配列番号６）は、配列番号２０、２２および２４に相当する３つのＣＤＲを有する。
【００６５】
別の実施形態において、本発明の抗体は、ＩＧＦ−ＩＲへの結合に関して、Ａ１２および／または２Ｆ８と競合する。つまり、この抗体は、同じまたは類似の重複しているエピトープと結合する。
【００６６】
本発明はまた、上記の抗体またはそのフラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明は、表２に記載される１、２、３、４、５および／または全ての６のＣＤＲをコードする配列を有する核酸を含む。
【００６７】
【表２】
2011505333.tif 000003
【００６８】
ヒト抗体をコードするＤＮＡは、実質的または独占的に、対応するヒト抗体領域に由来するＣＤＲ以外のヒト定常領域および可変領域をコードするＤＮＡ、ならびにヒト由来のＣＤＲをコードするＤＮＡ（例えば、重鎖可変領域ＣＤＲについて配列番号１３、１５および１７ならびに軽鎖可変領域ＣＤＲについて配列番号１９、２１および２３または配列番号２５、２７および２９）を組み換えることによって調製してもよい。
【００６９】
抗体のフラグメントをコードするＤＮＡの他の適切な起源としては、完全長の抗体を発現する細胞、例えば、ハイブリドーマおよび脾臓細胞のような細胞が挙げられる。フラグメントを、抗体等価物としてそれ自体用いてもよいし、上記の等価物に組み換えてもよい。この節に記載されるＤＮＡ組み換えおよび他の技術は、公知の方法によって実施してもよい。ＤＮＡの他の起源は、当該分野において公知のファージディスプレイライブラリーから生成された一本鎖抗体またはＦａｂである。
【００７０】
本発明は、完全長の抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の可変または超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有する抗体も含む。実質的に同じアミノ酸配列とは、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−８（１９９８））のＦＡＳＴＡ検索法によって測定した場合、別のアミノ酸配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を有する配列であると、本明細書において定義される。
【００７１】
さらに、本発明は、発現配列、プロモーターおよびエンハンサー配列に作動可能に連結される上記のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。細菌のような原核生物、ならびに酵母および哺乳動物細胞培養系を含むが、それらに限定されない真核生物系におけるポリペプチド抗体の効果的な合成のための様々な発現ベクターが、開発されている。本発明のベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含んでもよい。
【００７２】
任意の適切な発現ベクターを用いることができる。例えば、原核生物クローニングベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド、例えば、ｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭおよびＲＰ４が挙げられる。また、原核生物ベクターとして、ファージＤＮＡの誘導体、例えば、Ｍ１３および他の糸状一本鎖ＤＮＡファージも挙げられる。酵母に有用なベクターの例は、２μプラスミドである。哺乳動物細胞における発現に適切なベクターとしては、ＳＶ−４０の周知の誘導体、アデノウイルス、レトロウイルス由来ＤＮＡ配列および上記のような機能的哺乳動物ベクターの組み合わせ由来のシャトルベクターならびに機能的プラスミドおよびファージＤＮＡが挙げられる。
【００７３】
さらなる真核生物発現ベクターは、当該分野において公知である（例えば、Ｐ．Ｊ．ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＰ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−４１（１９８２）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−６４（１９８１）；ＫａｕｆｍａｎｎおよびＳｈａｒｐ，「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｇｅｎｅ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−２１（１９８２）；ＫａｕｆｍａｎｎおよびＳｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６４（１９８２）；Ｓｃａｈｉｌｌら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｏｆ  Ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ＤＮＡ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ  Ｃｅｌｌｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，４６５４−５９（１９８３）；ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−２０，（１９８０））。
【００７４】
本発明に有用な発現ベクターは、発現されるＤＮＡ配列またはフラグメントに作動可能に連結される少なくとも１つの発現制御配列を含む。制御配列は、クローニングされたＤＮＡ配列の発現を制御および調節するためにベクターに挿入される。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ラムダファージの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、酵母の解糖プロモーター（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼについてのプロモーター）、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子のプロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、およびシミアンウイルス由来のプロモーター（例えば、初期プロモーターおよび後期プロモーターまたはＳＶ４０）、ならびに原核細胞もしくは真核細胞およびそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが公知の他の配列、あるいはそれらの組み合わせである。
【００７５】
酵母において遺伝子構築物を発現させることが所望される場合、酵母での使用に適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファンにおいて増殖する能力を欠く酵母の変異株（例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１）の選択マーカーを与える（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７））。次いで、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換を検出するための効果的な環境を与える。同様に、Ｌｅｕ２−欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を保有する公知のプラスミドによって補われる。
【００７６】
本発明はまた、上記の発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を提供する。本発明の抗体は、ハイブリドーマ以外の細胞株において発現されてもよい。本発明に従うポリペプチドをコードする配列を含む核酸を、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために使用することができる。
【００７７】
特に好ましい細胞株は、高レベルの発現、目的のタンパク質の構成的発現、および宿主タンパク質由来の雑菌混入の最小化に基づいて選択される。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野において周知であり、多くの不死化細胞株、例えば、非限定的であるが、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞およびリンパ系起源（例えば、リンパ腫、骨髄腫）の細胞株またはハイブリドーマ細胞を含む多くの他のものが挙げられる。適切なさらなる真核細胞としては、酵母および他の菌類が挙げられる。有用な原核細胞宿主としては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＧ−９３６、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ２２８２、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨＩ、およびＥ．ｃｏｌｉ  ＭＲＣｌ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。
【００７８】
組み換え宿主細胞を、抗体または抗体フラグメントの発現を可能にし、宿主細胞または宿主細胞周囲の培地から抗体または抗体フラグメントを精製する条件の下で細胞を培養することによって、抗体またはそのフラグメントを生成するために用いることができる。組み換え宿主細胞で分泌させるために行う、発現させた抗体またはフラグメントの標的化は、目的の抗体コード遺伝子の５’末端にシグナルまたは分泌リーダーペプチドコード配列を挿入することによって促進できる（Ｓｈｏｋｒｉら、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：６５４−６４（２００３）Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６（１９９７）およびｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：４６８３−９０（１９８６）を参照のこと）。これらの分泌リーダーペプチド要素は、原核細胞または真核細胞配列のいずれに由来してもよい。従って、抗体鎖のＮ末端に連結されるアミノ酸である適切な分泌リーダーペプチドは、宿主細胞サイトゾルから抗体鎖を直接培地に分泌させるのに使用される。
【００７９】
形質転換宿主細胞は、同化できる炭素源（グルコースまたはラクトースのような炭水化物）、窒素源（アミノ酸、ペプチド、タンパク質またはそれらの分解産物（例えば、ペプトン）、アンモニウム塩など）、および無機塩源（ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、リン酸塩および／または炭酸塩）を含む液体培地において、当該分野に公知の方法によって培養される。さらに、培地は、例えば、微量元素（例えば、鉄、亜鉛、マンガンなど）のような増殖促進物質を含む。
【００８０】
本発明の抗体を調製するための別の方法は、トランスジェニック動物において抗体をコードする核酸を発現させることである。有用なトランスジェニック動物としては、マウス、ヤギおよびウサギが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態において、抗体をコードする遺伝子は、動物の乳腺において発現され、抗体は、泌乳の間に母乳に産生される。
【００８１】
本発明による高親和性の抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体は、ヒト可変領域を表示するファージディスプレイライブラリーから単離してもよい。一実施形態において、可変領域は、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）として表示される。別の実施形態において、可変領域は、Ｆａｂｓとして表示される。完全な可変領域をコードする生産的に再構成された遺伝子は、末梢血リンパ球から得てもよい。あるいは、可変領域は、部分的または完全に合成されてもよい。一実施形態において、ヒトＶ遺伝子セグメントは、合成ＤおよびＪセグメントと結合される。別の実施形態において、異なる起源由来のヒトＣＤＲおよびＦＷは、組み換えられる。例えば、ＣＤＲは、ヒト配列から増幅され、コンセンサスヒトＦＷに組み換えられてもよい。
【００８２】
単一領域抗体は、天然に存在する抗体またはハイブリドーマからＶＨまたはＶＬ領域を選択することによって得てもよいし、ＶＨ領域のライブラリーまたはＶＬ領域のライブラリーから選択してもよい。単一領域抗体の結合の主要な決定基であるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔによって規定されるＣＤＲ内にあってもよいが、他の残基、例えば、ＶＨ−ＶＬヘテロ二量体のＶＨ−ＶＬ接合部分に本来埋められている残基を含んでもよいことは、理解されている。
【００８３】
以下の実施例において、３ラウンドの選択後に回収されたＦａｂクローンの９０％以上が、ＩＧＦ−ＩＲに特異的であった。スクリーニングされたＦａｂのＩＧＦ−ＩＲへの結合親和性は、ｎＭ範囲内であり、これは、ハイブリドーマ技術を用いて生成された多くの二価の抗ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体と同じくらい高い。
【００８４】
本発明の抗体はまた、定方向突然変異、親和性成熟法、または鎖シャフリングによって結合特性が改良されているものも含む。例えば、親和性および特異性は、ＣＤＲを変異させ、所望の特性を有する抗原結合部位をスクリーニングすることによって修飾または改良してもよい（例えば、Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：３９２−４０３（１９９５）を参照のこと）。ＣＤＲは、種々の方法で変異させる。１つの方法は、個々の残基または残基の組み合わせをランダム化することであり、それによって、本来同一の抗原結合部位の集団において、全ての２０アミノ酸が特定の位置に見出される。あるいは、変異は、エラープロンＰＣＲ法によって、様々なＣＤＲ残基にわたって誘発される（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）を参照のこと）。例えば、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子を含むファージディスプレイベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉの変異株において増殖されてもよい（例えば、Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０：３５９−３６８（１９９６）を参照のこと）。これらの突然変異誘発方法は、当業者に公知の多くの方法の例証例である。
【００８５】
本発明のＩＧＦ−ＩＲ結合抗体を同定するために使用されるタンパク質は、好ましくはＩＧＦ−ＩＲであり、より好ましくはＩＧＦ−ＩＲの細胞外領域である。ＩＧＦ−ＩＲ細胞外領域は、遊離しているか、または別の分子に結合していてもよい。
【００８６】
ＩＧＦ−ＩＲ特異的抗体の他の例としては、ヒト抗体ＣＰ−７５１８７１由来のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（Ｃｏｈｅｎ，Ｂ．ら、２００５，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１１：２０６３−７３）、ヒト化抗体ＥＭ１６４（Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｅ．Ｋ．ら、２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：５０７３−８３）、ヒト化抗体ｈ７Ｃ１０（Ｇｏｅｔｓｃｈ，Ｌ．ら、２００５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１３：３１６−２８）、ＡＭＧ−４７９（Ａｍｇｅｎ）およびｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＩＧＦ−ＩＲ（Ｓａｃｈｄｅｖ，Ｄ．ら、２００３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：６２７−３５）が挙げられる。
【００８７】
本発明の抗体は、さらなるアミノ酸残基と融合してもよい。そのようなアミノ酸残基は、おそらく単離を容易にするためにペプチドタグであってもよい。
【００８８】
他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲのリガンドに結合するＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が使用されてもよい。そのような拮抗薬の例としては、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩに結合する抗体、およびそれらのリガンドに結合する可溶性ＩＧＦ−ＩＲフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
ＩＧＦ−ＩＲ媒介性シグナル伝達を遮断するための別の手段は、ＩＧＦ−ＩＲの低分子阻害剤を介することである。低分子とは、小さい有機化合物、例えば、複素環、ペプチド、サッカライド、ステロイドなどをいう。低分子モジュレータは、好ましくは約２０００ダルトン未満、好ましくは約１０００ダルトン未満、およびより好ましくは約５００ダルトン未満の分子量を有する。この化合物は、効力、安定性、薬学的適合性などを高めるために修飾されてもよい。低分子阻害剤としては、受容体チロシンキナーゼのＡＴＰ結合領域、基質結合領域、またはキナーゼ領域を遮断する低分子が挙げられるが、それらに限定されない。受容体チロシンキナーゼに加えて、低分子は、ＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達経路の他の成分の阻害剤であってもよい。別の実施形態において、低分子阻害剤は、ＩＧＦ−ＩＲのリガンド結合領域に結合して、ＩＧＦ−ＩＲリガンドによる受容体活性化を遮断する。
【００９０】
低分子ライブラリーは、ハイスループット生化学、酵素、または細胞ベースのアッセイを用いて阻害活性についてスクリーニングしてもよい。このアッセイは、ＩＧＦ−ＩＲリガンドまたは基質ＩＲＳ−１へのＩＧＦ−ＩＲの結合を阻害するか、またはＩＧＦ−ＩＲ二量体からの機能的受容体の形成を阻害する試験化合物の能力を検出するように策定されてもよい。ＩＧＦ−ＩＲの低分子拮抗薬としては、例えば、インスリン様成長因子−Ｉ受容体選択的キナーゼ阻害剤ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１（Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，Ｃ．ら、２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２３１−９）およびＮＶＰ−ＡＤＷ７４２（Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｃ．ら、２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５：２２１−３０）、ＩＧＦ−ＩＲおよびＨＥＲ２を選択的に阻害すると報告されているＩＮＳＭ−１８（Ｉｎｓｍｅｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、ならびに基質結合を遮断することによってリン酸化を阻害し、ＩＲリン酸化よりＩＧＦ−ＩＲリン酸化の阻害に著しく低いＩＣ５０を有するチロシンキナーゼ阻害剤トリホスチン（ｔｒｙｐｈｏｓｔｉｎ）ＡＧ１０２４およびＡＧ１０３４（Ｐａｒｒｉｚａｓ，Ｍ．ら、１９９７，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８：１４２７−３３）が挙げられる。シクロリグナン（ｃｙｃｌｏｌｉｇｎａｎ）誘導体ピクロポドフィリン（ｐｉｃｒｏｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎ）（ＰＰＰ）は、ＩＲ活性を阻害せずにＩＧＦ−ＩＲリン酸化を阻害する別のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬である（Ｇｉｒｎｉｔａ，Ａ．ら、２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：２３６−４２）。他の低分子ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬としては、ＩＧＦ−ＩＲおよびＩＲをほとんど等しい強さで阻害するベンズゾイミダゾール誘導体ＢＭＳ−５３６９２４（Ｗｉｔｔｍａｎ，Ｍ．ら、２００５，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８：５６３９−４３）およびＢＭＳ−５５４４１７（Ｈａｌｕｓｋａ  Ｐ．ら、２００６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：３６２−７１）が挙げられる。ＩＧＦ−ＩＲに加えて受容体を阻害する化合物に関して、直接結合アッセイにおいてインビトロで測定されたＩＣ５０値は、エキソビボまたはインボビ（すなわち、インタクトな細胞または生物体）で測定されたＩＣ５０値を反映しない場合があることは、留意されるべきである。例えば、ＩＲの阻害を回避することが所望される場合、インビトロにおいてＩＲを阻害する化合物を、ＩＧＦ−ＩＲを効果的に阻害する濃度でインビボで使用しても、受容体の活性に顕著な効果を与えない場合がある。
【００９１】
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、および阻害的低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ｍＲＮＡの標的化した分解を与え、それによって、タンパク質の翻訳を防止する。従って、受容体チロシンキナーゼおよびＩＧＦシグナル伝達に重要な他のタンパク質の発現は、阻害される。遺伝子発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力は、２５年以上前に発見されている（ＺａｍｅｃｎｉｋおよびＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７５：２８０−２８４（１９７８））。ｍＲＮＡおよびプレｍＲＮＡとのアンチセンスオリゴヌクレオチド塩基対は、スプライシング、ポリアデニル化、輸送、安定性、およびタンパク質翻訳を含む、ＲＮＡプロセシングならびにメッセージ翻訳のいくつかの段階を潜在的に阻害することができる（ＳａｚａｎｉおよびＫｏｌｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２：４８１−４８６（２００３））。しかしながら、２つの最も強力かつ広範に使用されるアンチセンス戦略は、ＲＮａｓｅＨによるｍＲＮＡまたはプレｍＲＮＡの分解、および異常スプライス部位の標的化によるスプライシングの変更である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を認識し、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端との間のおおよそ中間でＲＮＡを開裂する。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＩＧＦ−ＩＲの阻害は、Ｗｒａｉｇｈｔ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５２１−６に例示される。
【００９２】
固有のＲＮＡ媒介機構は、ｍＲＮＡの安定性、メッセージ翻訳、およびクロマチン構成を調節することができる（ＭｅｌｌｏおよびＣｏｎｔｅ  Ｎａｔｕｒｅ．４３１：３３８−３４２（２００４））。さらに、外部から導入された長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、種々の下等生物における遺伝子サイレンシングの効果的なツールである。しかしながら、哺乳動物において、長いｄｓＲＮＡは、ウイルス感染およびインターフェロン生産の作用に関連する高い毒性反応を引き起こす（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２５：５０９−５１３．（１９９７））。これを回避するために、Ｅｌｂａｓｈｉｒおよび共同研究者（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ．４１１：４９４−４９８（２００１））は、各々の鎖の５’にリン酸および３’に２塩基の突出を有する１９量体二重鎖からなるｓｉＲＮＡ（これは、細胞内への導入の際に標的化したｍＲＮＡを選択的に分解する）の使用を開始した。
【００９３】
哺乳動物におけるｄｓＲＮＡ干渉作用は、通常、２つの酵素段階に関与している。最初に、Ｄｉｃｅｒ、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ型酵素が、ｄｓＲＮＡを２１−２３量体ｓｉＲＮＡセグメントに開裂する。次に、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）が、ＲＮＡ二重鎖をほどき、一本鎖を同族ｍＲＮＡにおける相補領域と対にし、ｓｉＲＮＡ鎖の５’末端の１０ヌクレオチド上流の部位において開裂を開始する（Ｈａｎｎｏｎ  Ｎａｔｕｒｅ．４１８：２４４−２５１（２００２））。短く、化学的に合成された１９−２２量体の範囲のｓｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒ段階を必要とせず、ＲＩＳＣ機構に直接、入ることができる。ＲＮＡ二重鎖のいずれかの一本鎖は、ＲＩＳＣ複合体上に負荷される可能性があるが、オリゴヌクレオチドの構成が鎖の選択に影響を及ぼし得ることは留意されるべきである。従って、特定のｍＲＮＡ標的の選択的分解を達成するためには、二重鎖は、その５’末端に比較的弱い塩基対を有することによって、アンチセンス鎖要素を負荷する方をむはずである（Ｋｈｖｏｒｏｖａ  Ｃｅｌｌ．１１５：２０９−２１６（２００３））。外因性ｓｉＲＮＡは、合成されたオリゴヌクレオチドとして与えられてもよいし、プラスミドもしくはウイルス性ベクターから発現されてもよい（ＰａｄｄｉｓｏｎおよびＨａｎｎｏｎ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：２１７−２２４（２００３））。後者の場合において、前駆体分子は、通常、４−８ヌクレオチドのループおよび１９−３０ヌクレオチドのステムを含む短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）として発現され；これらは、次いで、Ｄｉｃｅｒによって開裂されて、機能的ｓｉＲＮＡを形成する。
【００９４】
ＩＧＦ−ＩＲ媒介性シグナル伝達を阻害するための他の手段としては、受容体に結合するが活性化しないＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ模倣剤、ならびにＩＧＦ−ＩＲレベルまたは活性を減少させる遺伝子またはポリヌクレオチド（例えば、トリプルヘリックス阻害因子、およびドミナントネガティブＩＧＦ−ＩＲ突然変異体）の発現が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
本発明によれば、哺乳動物における体重および身体組成の調節は、治療的に有効な量のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬を投与することによって成される。「治療的に有効な量」とは、体重または身体組成を調節する効果を有するＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬の量をいう。また、治療的に有効な量とは、体重または身体組成の調節に効果的であると示されている標的血清濃度を意味する。ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬の治療的に有効な量の決定は、当業者の技術の範囲内であり、慣用の実験以外は必要としない。
【００９６】
当業者は、処置の用量および頻度が、個々の患者の許容範囲ならびに使用されるＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬の薬理学的および薬物動態学的特性に依存することは理解されている。飽和可能な薬物動態を達成するためには、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の負荷用量は、例えば、約１０〜約１０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約２００〜約４００ｍｇ／ｍ２の範囲であってよい。この後、例えば、約２００〜約４００ｍｇ／ｍ２の範囲の投与を一日または一週間単位でさらに数回与えてもよい（ヒトおよび他の哺乳動物のｍｇ／ｋｇとｍｇ／ｍ２の変換に関しては、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．ら、１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．５０：２１９−４４を参照のこと）。患者は、副作用について監視され、そのような副作用がひどい場合、処置は停止される。所望の結果次第では、飽和速度は所望しなくてもよい。
【００９７】
本発明において、任意の適切な方法または経路が、本発明のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬を投与するのに使用されてもよく、必要に応じて、抗肥満薬物または薬剤との同時投与が使用されてもよい。本発明に従って利用される抗肥満薬剤レジメンは、患者の肥満状態の処置のために最も適すると考えられる任意のレジメンを含む。投与経路としては、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与が挙げられる。投与される拮抗薬の用量は、例えば、拮抗薬の種類、処置される肥満の種類および重症度、ならびに拮抗薬の投与経路を含む、多数の要因に依存する。しかしながら、本発明は、いずれかの特定の方法または投与経路に限定されないことは重視されるべきである。
【００９８】
予防または処置の目的のために哺乳動物において使用される場合、本発明のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、薬学的に許容できる担体をさらに含む組成物の形態で投与されると理解されている。適切な薬学的に許容できる担体としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上が挙げられる。薬学的に許容できる担体は、結合タンパク質の保存期間または有効性を高める少量の補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝剤）をさらに含んでもよい。注入組成物は、当該分野において周知であり、哺乳動物への投与後に、活性成分の迅速、持続または遅延放出を与えるように処方されてもよい。
【００９９】
本発明によれば、１つ以上のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬を組み合わせて、および他の抗肥満薬剤もしくは薬物、行動修正または外科的介入と組み合わせて使用してもよい。
【０１００】
抗肥満薬物の例としては、脂肪の身体吸収を遮断するオーリスタット（ｏｒｌｉｓｔａｔｅ）（ゼニカル（Ｘｅｎｉｃａｌ））、セチリスタット（ｃｅｔｉｌｉｓｔａｔ）（ＡＴＬ−９６２）、およびペプティミューン（Ｐｅｐｔｉｍｍｕｎｅ）のＧＴ３８９−２５５のようなリパーゼ阻害剤（すなわち、炭水化物遮断薬または脂肪遮断薬）、代謝を向上させるＡＯＤ９６０４（ｈＧＨ１７７−１９１）、ならびに脂肪組織の消費を誘導するオレオイルエストロン（ｏｌｅｏｙｌ−ｅｓｔｒｏｎｅ）（ＯＥ）が挙げられる。オーリスタット、セチリスタットおよびＧＴ３８９−２５５は、食事脂肪の吸収を阻害することによって作用するリパーゼ阻害剤である。オーリスタットは、胃および膵リパーゼの活性セリン残基部位と共有結合を形成し、それによって、トリグリセリドが、吸収可能な脂肪酸およびモノグリセリドに加水分解するのを防止する。セチリスタットは、オーリスタットと同様に作用するが、ＧＴ３８９−２５５は、リパーゼ阻害剤と脂肪結合ポリマーとの複合体である。単独またはリパーゼ阻害剤と組み合わせて本発明の遮断ＩＧＦ−ＩＲを、肥満を減少させるため、および肥満の再発の防止の処置に使用することができる。併用治療に使用できる抗脂肪薬物の別のクラスは、シブトラミン（Ｍｅｒｉｄｉａ）のような食欲を抑制する薬物である。シブトラミンは、ノルエピネフリン、セロトニン、および程度は小さいが、満腹を生じさせてカロリー摂取を減少させる脳内のドーパミンと呼ばれる特定の化学物質の活性を増加させることによって作用すると考えられる。食欲を抑制する際にシブトラミンと同様に作用する他の薬物は、リモナバント（ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ）（Ａｃｏｍｐｌｉａ）、ＡＰＤ３５６、プラムリンチド（Ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ）／ＡＣ１３７（Ｓｙｍｌｉｎ）、ＰＹＹ３−３６、ＡＣ１６２３５２、オキシントモジュリンおよびＴＭ３０３３８がある。本発明の別の実施形態は、ＩＧＦ−ＩＲ軸の遮断と一緒に使用される併用治療であり、ヒト生理学において満腹および空腹を制御するのに役立つホルモンであるレプチンおよび／またはグレリンの操作に関する。抗グレリンワクチンを、身体におけるグレリンの生理的レベルを操作するのに使用できる。メトホルミン（グルコファージ）は、肥満への効果を有する別の薬物である。メトホルミンを、ＩＩ型糖尿病の処置の際に、血糖（糖）レベルを調節するために使用することができる。これを、ヒトの胃を通して食物から吸収されたグルコースの量を減少させることによって、肥満を処置するために使用することができる。リパーゼ阻害剤および食欲抑制剤に加えて、多くのアンフェタミン製品が、肥満の処置のためにＦＤＡに認可されており、従って、肥満を処置するために併用治療に使用することができる。そのリストとしては、フェンテルミン、フェンジメトラジン、メタンフェタミン、ベンズフェタミン、およびジエチルプロピオンが挙げられ、フェンテルミンが最も一般的に処方されている（Ｓｔａｆｆｏｒｄ  Ｒ．Ｓ．，Ｒａｄｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．Ａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ  １６３：１０４６−５０（２００３））。特定の実施形態において、他の薬物と共に、または他の薬物を用いないＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、食生活の改善（例えば、低カロリー）、運動および／または行動修正を含む、肥満の総合的な治療の一部である。他の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、外科的介入を含む処置の一部である。外科的介入の例としては、内臓脂肪の除去が挙げられ、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬を、病的肥満の処置のための肥満手術（例えば、胃バイパス、胃緊縛術、および垂直胃切除を含む）と組み合わせることもできる。
【０１０１】
併用治療において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、別の薬剤と共に治療開始前、治療開始中または治療開始後、およびその任意の組み合わせ、すなわち、抗肥満剤治療の開始前と開始中、開始前と開始後、開始中と開始後、または開始前、開始中と開始後に投与される。例えば、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、抗肥満薬の投与開始前の１〜３０日の間、好ましくは３〜２０日の間、より好ましくは５〜１２日の間に投与されてもよい。本発明の好ましい実施形態において、抗肥満剤は、抗体治療と共に、またはより好ましくは抗体治療の後に投与される。
【０１０２】
本発明はまた、治療的に有効な量のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬を含む、肥満を処置または改善するためのキットを含む。このキットはさらに、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬と同時投与するための任意の適切な抗肥満剤を含んでもよい。
【０１０３】
本発明のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、当該分野において周知の調査または診断法のためにインビボおよびインビトロにおいて使用することができる。この診断法は、本発明のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬を含むキットを含む。
【０１０４】
もちろん、本明細書に開示される本発明の原理のバリエーションが、当業者によって成し得ることは理解および予想されており、そのような改変が、本発明の範囲内に含まれることは、意図されている。
【０１０５】
以下の実施例はさらに本発明を例示するが、決して本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。ベクターおよびプラスミドの構築、そのようなベクターおよびプラスミド内へのポリペプチドをコードする遺伝子の挿入、宿主細胞内へのプラスミドの導入、その遺伝子および遺伝子産物の発現および測定、ならびに免疫学的技術において使用されるような従来の方法の詳細な説明を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＣｏｌｉｇａｎ，Ｊら、（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄを含む、多数の刊行物から得ることができる。本明細書中に記載される全ての参考文献は、その全体を参照によって援用する。
【実施例】
【０１０６】
（実施例１  抗ヒトＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体の選択および操作）
【０１０７】
ヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に対する高親和性抗体を単離するために、ヒトＩＧＦ−ＩＲの組み換え細胞外部分（ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０００８６６；Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ら、１９８６，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：２５０３−１２を参照のこと）を、３．７×１０１０の固有のクローンを含むヒトの実験に使われていない（免疫化されていない）バクテリオファージＦａｂライブラリー（ｄｅ  Ｈａａｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８２１８−３０（１９９９））をスクリーニングするために使用した。可溶性ＩＧＦ−ＩＲ（５０μｇ／ｍｌ）をチューブにコーティングして、３７℃で１時間、３％ミルク／ＰＢＳで遮断した。ファージを、対数期培養までライブラリーストックを増殖させ、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージで救出し、アンピシリンおよびカナマイシン選択を含む２ＹＴＡＫ培地において３０℃で一晩増幅させることによって調製した。得たファージ調製物を、４％ＰＥＧ／０．５Ｍ  ＮａＣｌで沈殿させて、３％ミルク／ＰＢＳに再懸濁した。次いで、固定した受容体を、室温で１時間、ファージ調製物と共にインキュベートした。その後、チューブをＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で１０回洗浄した後、ＰＢＳで１０回洗浄した。結合したファージを、室温で１０分間、１００ｍＭトリエチルアミンの１ｍｌの新たに調製した溶液で溶出した。溶出したファージを、３７℃で３０分間静置し、３０分間撹拌しながら１０ｍｌの対数期中ごろのＴＧ１細胞と共にインキュベートした。感染させたＴＧ１細胞をペレットにし、数枚のラージ２ＹＴＡＧプレート上にプレーティングし、３０℃で一晩インキュベートした。プレート上で増殖させた全てのコロニーを、３〜５ｍｌの２ＹＴＡ培地に収集し、グリセロール（最終濃度：１０％）と混合し、アリコートし、−７０℃で保存した。２回目のラウンド選択のために、１００μｌのファージストックを、２５ｍｌの２ＹＴＡＧ培地に加え、対数期中ごろまで増殖させた。培養物を、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージで救出し、増幅させ、沈殿させ、上記の手順だが、チューブに固定したＩＧＦ−ＩＲの濃度を減らして（５μｇ／ｍｌ）、結合プロセス後の洗浄の回数を増やした後に、選択のために使用した。合計で２ラウンドの選択を実施した。
【０１０８】
個々のＴＧ１クローンを選び、９６ウェルプレートにおいて３７℃で増殖させ、上記のようにＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージで救出した。増幅させたファージ調製物を、室温で１時間、１８％ミルク／ＰＢＳの１／６容量で遮断し、ＩＧＦ−ＩＲ（１μｇ／ｍｌ×１００μｌ）でコーティングしたマキシソルブ（Ｍａｘｉ−ｓｏｒｂ）９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に加えた。室温で１時間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス抗Ｍ１３ファージＨＲＰ結合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）と共にインキュベートした。プレートを５回洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、サニーベール、カリフォルニア州）を用いて４５０ｎｍで吸光度を読み取った。２ラウンドの選択から、８０％の独立クローンが、ＩＧＦ−ＩＲへの結合に陽性だった。
【０１０９】
２回目のラウンドの選択後、抗ＩＧＦ−ＩＲ  Ｆａｂクローンの多様性を、制限酵素消化パターン（すなわち、ＤＮＡフィンガープリント）によって分析した。個々のクローンのＦａｂ遺伝子挿入を、プライマー：ＰＵＣ１９リバース（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’；配列番号３１）およびファージベクター内の固有のＦａｂ遺伝子領域に隣接する配列に特異的なｆｄｔｅｔ  ｓｅｑ（５’−ＧＴＣＧＴＣＴＴＴＣＣＡＧＡＣＧＴＴＡＧＴ−３’；配列番号３２）を用いてＰＣＲ増幅した。各々の増幅した生成物を、頻繁切断酵素、ＢｓｔＮ  Ｉで消化して、３％アガロースゲル上で分析した。合計で２５の別個のパターンを同定した。各々の消化パターンから得た代表的なクローンのＤＮＡ配列を、ジデオキシヌクレオチド塩基配列決定法によって決定した。
【０１１０】
ＩＧＦ−ＩＲに対して陽性の結合を示す個々のクローン由来のプラスミドおよび固有のＤＮＡプロファイルを、ノンサプレッサーＥ．ｃｏｌｉ宿主ＨＢ２１５１を形質転換するために使用した。ＨＢ２１５１におけるＦａｂフラグメントの発現を、３０℃で、１ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ，Ｓｉｇｍａ）を含む２ＹＴＡ培地において細胞を培養することによって誘導した。細胞の周辺質の抽出物を、２０％（ｗ／ｖ）スクロース、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に細胞ペレットを再懸濁することによって調製し、その後、４℃で１時間、緩やかに撹拌しながら、インキュベートした。１５分間、１５，０００ｒｐｍで遠心分離した後、可溶性Ｆａｂタンパク質を、製造者の指示書（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に従って、プロテインＧカラムを用いてアフィニティクロマトグラフィーによって上清から精製した。
【０１１１】
候補の結合Ｆａｂクローンを、９６ストリップウェルプレート上にコーティングした固定ＩＧＦ−ＩＲ（１００ｎｇ／ウェル）に対する放射線標識ヒトＩＧＦ−Ｉリガンドの競合的遮断を対象にスクリーニングした。Ｆａｂ調製物を希釈して、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ中で室温で０．５〜１時間、ＩＧＦ−ＩＲプレートと共にインキュベートした。次いで、４０ｐＭの１２５Ｉ−ＩＧＦ−Ｉを加え、プレートをさらに９０分、インキュベートした。次いで、ウェルを氷冷のＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで３回、洗浄し、乾燥し、次に、ガンマシンチレーションカウンターでカウントした。シングルポイントアッセイにおいて、コントロールの放射性標識したリガンド結合を３０％超阻害した候補を選択して、インビトロで遮断力価を測定した。４つのクローンを同定した。これらのうちのＦａｂクローン２Ｆ８だけが、約２００ｎＭのＩＣ５０を有し、５０％超でリガンド結合を阻害することを示し、これを、完全長のＩｇＧ１型に変換するために選択した。２Ｆ８についての重鎖可変領域ヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１および配列番号２と規定した。完全長のＩｇＧ１として操作された２Ｆ８重鎖のヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３および配列番号４と規定した。Ｆａｂ  ２Ｆ８は、ラムダ軽鎖定常領域を保有する。２Ｆ８軽鎖可変領域のヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号５および配列番号６と規定した。完全長のラムダ軽鎖の配列を、それぞれ、配列番号７および配列番号８と規定した。結合動態学分析を、ＢＩＡコアユニットを用いて２Ｆ８  ＩｇＧで実施した。この抗体は、０．５〜１ｎＭ（０．５〜１×１０−９Ｍ）の親和性でＩＧＦ−ＩＲに結合すると測定された。
【０１１２】
この抗体の親和性を改良するために、２世代のＦａｂファージライブラリーを生成し、２Ｆ８の重鎖を保存し、軽鎖を、固有種の１０８より高い多様性に変化させた。この方法は、軽鎖シャフリングと呼ばれ、所定の標的抗原用の親和性成熟選択抗体に成功裏に使用されている（Ｃｈａｍｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１０−１８（２００２））。次いで、このライブラリーを、上記の手順後に、ヒトＩＧＦ−ＩＲ（１０μｇ／ｍｌ）への結合についてスクリーニングし、パニングプロセスを、高親和性結合Ｆａｂの濃縮のためにＩＧＦ−ＩＲの濃度を減少させて（２μｇ／ｍｌ）、さらに３ラウンド繰り返した。４ラウンド後に７つのクローンを分析した。７つ全てが、同じＤＮＡ配列および制限消化プロファイルを含んでいた。単一の単離したＦａｂはＡ１２と指定され、ラムダ軽鎖定常領域を保有することを示した。２Ｆ８軽鎖可変領域のヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号９および配列番号１０と規定した。完全長のラムダ軽鎖の配列を、それぞれ、配列番号１１および配列番号１２と規定した。２Ｆ８およびＡ１２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を比較すると、１１のアミノ酸の相違が明らかになった。この相違のうちの９つはＣＤＲ内であり、大多数（６アミノ酸残基）はＣＤＲ３内で生じた。
【０１１３】
ヒトＩＧＦ−ＩＲへの２つの抗体（完全なＩｇＧ）の親和性と、それらのリガンド遮断活性との比較を表３に示す。結合活性を、ヒトＩＧＦ−ＩＲベースのＥＬＩＳＡによって測定した（図１Ａ）。親和性を、製造者の仕様書（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＢＩＡＣＯＲＥ  ３０００）に従って、ＢＩＡコア分析によって測定した。可溶性ＩＧＦ−ＩＲを、センサーチップに固定して、抗体結合動態を測定した。
【０１１４】
【表３】
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【０１１５】
Ａ１２はまた、固定ＩＧＦ−ＩＲへの放射性標識ＩＧＦ−Ｉリガンドの結合を遮断した（図１Ｂ）。このアッセイにおいて、Ａ１２は、約１ｎＭ（０．１５μｇ／ｍｌ）のＩＣ５０を有する冷ＩＧＦ−Ｉと同様の遮断活性を有し、２Ｆ８またはＩＧＦ−ＩＩ（ＩＣ５０＝６ｎＭ）より高いリガンド遮断活性であった。
【０１１６】
（実施例２  Ｆａｂクローン由来の完全なヒトＩｇＧ１抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の操作および発現）
【０１１７】
Ｆａｂ  ２Ｆ８およびＡ１２の重鎖および軽鎖遺伝子をコードするＤＮＡ配列を、製造者の指示書に従って、Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｅｘｐａｎｄキットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。フォワードおよびリバースプライマーは、哺乳動物の発現ベクターにクローニングするための制限エンドヌクレアーゼ部位の配列を含んでいた。重鎖の受容ベクターは、強力な真核生物プロモーターおよび３’ポリアデニル化配列に隣接する完全なヒトガンマ１定常領域ｃＤＮＡ配列を含んでいた。２Ｆ８またはＡ１２の完全長のラムダ軽鎖配列を、哺乳動物細胞における発現のための真核生物調節要素のみを保有する二次ベクターに各々クローニングした。選択可能なマーカーも、哺乳動物細胞内へのプラスミドのトランスフェクション後安定なＤＮＡ組み込み体の選択を行うため、このベクターに存在した。フォワードプライマーも、発現した抗体の適切な分泌のために、強力な哺乳動物のシグナルペプチド配列をコードする配列を用いて操作した。適切にクローニングした免疫グロブリン遺伝子配列の同定後、ＤＮＡの塩基配列を決定し、一過性トランスフェクションにおける発現を試験した。一過性トランスフェクションを、製造者の仕様書に従って、リポフェクションを用いてＣＯＳ７霊長類細胞株で実施した。トランスフェクション後、２４または４８時間で、完全なＩｇＧ抗体の発現を、抗ヒトＦｃ結合ＥＬＩＳＡによって調整培養物の上清において検出した。ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル）を、１００ｎｇ／ウェルのヤギ抗ヒトＦｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）でコーティングすることによって調製し、４℃で一晩、５％ミルク／ＰＢＳで遮断した。次いで、このプレートを、ＰＢＳで５回洗浄した。調整上清をウェルに加え、室温で１．５時間、インキュベートした。結合した抗体を、ヤギ抗ヒトラムダ軽鎖ＨＲＰ抗体（Ｓｉｇｍａ）で検出して、ＴＭＢ試薬および上記のマイクロプレートリーダーで視覚化した。抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体のラージスケール調製を、ＣＯＳ細胞内へのラージスケール一過性トランスフェクション、リポフェクション法のスケールアップ、または適切な宿主細胞（例えば、マウス骨髄腫細胞株（ＮＳ０，Ｓｐ２／０）またはチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ））内への安定なトランスフェクションのいずれかによって達成した。抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体をコードするプラスミドを、エレクトロポレーションによって宿主細胞内にトランスフェクトし、約２週間、適切な薬物選択培地で選択した。安定に選択したコロニーを、抗Ｆｃ  ＥＬＩＳＡによって抗体発現についてスクリーニングし、陽性クローンを、無血清細胞培地中に増幅させた。安定にトランスフェクトされた細胞からの抗体産生を、２週間までの期間、スピナーフラスコまたはバイオリアクター中の懸濁培養で実施した。一過性または安定なトランスフェクションのいずれかによって生成した抗体を、ＰｒｏＡアフィニティクロマトグラフィー（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ．１９８８）によって精製し、中性の緩衝生理食塩水中に溶出し、定量した。
【０１１８】
（実施例３  抗ＩＧＦ−ＩＲモノクローナル抗体のリガンド遮断活性）
【０１１９】
抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を、ヒト腫瘍細胞の天然ＩＧＦ−ＩＲへの放射性標識リガンド結合の遮断について試験した（図１Ｃ）。アッセイ条件は、少しの修正を加えて、ＡｒｔｅａｇａおよびＯｓｂｏｒｎｅ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９：６２３７−４１（１９８９））に従って、実施した。ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞を、２４ウェルディッシュに播種し、一晩、培養した。サブコンフルエント（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な単層を、結合緩衝液（イスコフ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）／０．１％ＢＳＡ）で２〜３回洗浄し、結合緩衝液に抗体を加えた。室温で、抗体と一緒に短時間インキュベートした後、４０ｐＭ１２５Ｉ−ＩＧＦ−Ｉ（約４０，０００ｃｐｍ／ウェル）を各ウェルに加え、さらに１時間、緩やかに撹拌しながらインキュベートした。次いで、ウェルを、氷冷ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで３回洗浄した。次いで、単層を、２００μｌの０．５Ｎ  ＮａＯＨで溶解し、ガンマカウンターでカウントした。ヒト腫瘍細胞において、抗体Ａ１２は、３ｎＭ（０．４５μｇ／ｍｌ）のＩＣ５０でＩＧＦ−ＩＲへのリガンド結合を阻害した。これは、冷ＩＧＦ−Ｉリガンド（ＩＣ５０＝１ｎＭ）の阻害活性よりわずかに低かったが、冷ＩＧＦ−ＩＩ（ＩＣ５０＝９ｎＭ）の阻害活性よりも良かった。２つのＩＧＦリガンドについて観察された相違は、ＩＧＦ−ＩＲへのＩＧＦ−ＩＩの結合反応速度がリガンドＩＧＦ−Ｉより遅いからのようだ（Ｊａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：８１８９−９７（１９９７））。抗体２Ｆ８についてのＩＣ５０は、３０ｎＭ（４．５μｇ／ｍｌ）と測定された。抗体Ａ１２はまた、乳房、膵臓、および結腸直腸組織由来の種々の他のヒト腫瘍細胞株において、内因性細胞ＩＧＦ−ＩＲへの結合、および内因性細胞ＩＧＦ−ＩＲへのリガンド結合の阻害において有効であることを示した（表４）。
【０１２０】
【表４】
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【０１２１】
（実施例４  ＩＧＦ−Ｉ誘導性受容体リン酸化および下流のシグナル伝達の抗体媒介性阻害）
【０１２２】
ＩＧＦ−Ｉシグナル伝達における抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体の阻害効果を視覚化するために、受容体自己リン酸化および下流のエフェクター分子リン酸化分析を、抗体Ａ１２または２Ｆ８の存在下または非存在下において実施した。ＭＣＦ７ヒト乳癌細胞株の使用を、その高ＩＧＦ−ＩＲ濃度の故に選択した。細胞を、１０ｃｍまたは６ウェルの培養ディッシュにプレーティングし、７０〜８０％コンフルエンスまで増殖させた。次いで、単層をＰＢＳ中で２回洗浄し、無血清の規定培地において一晩、培養した。次いで、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体を、新鮮な無血清培地（１００ｎＭ〜１０ｎＭ）に加え、リガンド（１０ｎＭ）の添加前に３０分間、細胞と共にインキュベートした。細胞を１０分間、リガンドと共にインキュベートし、次いで、氷浴に入れ、氷冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を、溶菌液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチンおよび１μｇ／ｍｌアプロチニン）の添加によって溶解し、この細胞を遠心分離管に収集し、氷浴に１５分間、維持した。次いで、溶解物を、４℃で遠心分離によって浄化した。次いで、可溶化ＩＧＦ−ＩＲを、溶解物から免疫沈降（ＩＰ）させた。４μｇ／ｍｌでＡ１２を、４℃で一晩、４００μｌの溶解物と共にインキュベートした。次いで、免疫複合体を、４℃で２時間、プロテインＡアガロースビーズを添加することによって沈殿させ、ペレットにし、溶菌緩衝液で３回洗浄した。プロテインＡビーズに結合したＩＰを、変性ゲルランニング緩衝液中に剥がした。溶解物またはＩＰを、変性ゲル電気泳動で処理して、４〜１２％アクリルアミドゲル上で流し、Ｔｏｗｂｉｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４：１４５−９（１９９２））に従って、ウェスタンブロットによってナイロンまたはニトロセルロース膜にブロットした。チロシンリン酸化受容体タンパク質を、抗ｐチロシン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＃９４１１）および抗マウスＨＲＰ二次抗体を用いて検出した。ＩＧＦ−ＩＲ−βを、モノクローナル抗体Ｃ−２０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．）で検出した。リン酸−Ａｋｔおよび全Ａｋｔを検出するための抗体は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：カタログ番号＃５５９０２９、＃５５９０２８）から得た。ＭＡＰＫリン酸化に関して、リン酸−ｐ４４／４２および全ｐ４４／４２を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ベバリー、マサチューセッツ州；カタログ番号＃９１０１と＃９１０２）から提供される抗体で検出した。リン酸−ＩＲＳ−１および全ＩＲＳ−１を、それぞれ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから提供される＃２３８１および２３８２で検出した。バンドを、Ｘ線フィルム上にＥＣＬ試薬で視覚化した。
【０１２３】
図２Ａに示すように、ＭＣＦ７細胞におけるＩＧＦ−ＩＲの自己リン酸化を、血清枯渇後に停止させた。２Ｆ８またはＡ１２単独のいずれかの添加は、受容体リン酸化を誘導せず、検出可能なアゴニスト活性の欠失を示した。１０ｎＭのＩＧＦ−Ｉの添加の際に、ＩＧＦ−ＩＲリン酸化は、強力に誘導された。抗体２Ｆ８は、ＩＧＦ−ＩＲリン酸化を約５０％減少させたのに対して、高親和性抗体Ａ１２は、ほとんど完全にリン酸化を遮断した。
【０１２４】
Ａ１２は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩによるシグナル伝達を遮断する。ウェスタンブロットを、Ａ１２前処理の存在下または非存在下においてリガンドで処理した細胞で実施した。図２Ｂに示すように、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方に反応して、リン酸化した下流のエフェクター分子ＩＲＳ−１、Ａｋｔ、およびＭＡＰＫのレベルが、Ａ１２で前処理した細胞において著しく減少した。エフェクター分子阻害の程度は、両方のリガンドで同様であり、Ａ１２が、ＩＧＦ−ＩＲに対する両方のリガンドのシグナル伝達を遮断するのに等しく有能であることを示唆している。
【０１２５】
（実施例５  Ａ１２は、ＩＧＦ−ＩＲの選択的拮抗薬であり、インスリン受容体を遮断しない）
【０１２６】
ＩＧＦ−ＩＲは、インスリン受容体（ＩＲ）とかなりの構造的相同性を共有する。ＩＧＦ−ＩＲへのＡ１２の選択性を示すために、抗体を、ヒトＩＲ結合および遮断アッセイで試験した。Ａ１２を、１μＭの濃度から固定したＩＲ上で滴定した。市販の抗ヒトＩＲ抗体を、ＩＲへの結合のためのポジティブコントロールとして使用した。少なくとも１μＭまでの濃度で、ＩＲに結合したＡ１２は検出されなかった（図３Ａ）。ヒトＩＧＦ−ＩＲへのＡ１２の結合のＥＤ５０は０．３ｎＭであり、ＩＲと比較して、３，０００倍より高いＩＧＦ−ＩＲへのＡ１２の選択性を示した。従って、Ａ１２は、１００ｎＭの抗体濃度でさえ、ＩＲへのインスリンの結合を遮断しなかった（図３Ｂ）。このアッセイにおいて、冷インスリンは、約０．５ｎＭのＩＣ５０で効果的に競合したが、市販の抗ＩＲ遮断抗体、４７−９は、適度な活性（５０％の最大阻害）を示し、冷ＩＧＦ−Ｉが、高濃度でのみ競合した。
【０１２７】
（実施例６  Ａ１２は、ヒトおよびマウスＩＧＦ−ＩＲを認識する）
【０１２８】
マウスに対する種交差反応を試験するために、組み換えマウスＩＧＦ−ＩＲ（ｍＩＧＦ−ＩＲ）を発現させ、結合アッセイを実施した。この実験により、Ａ１２は、０．３〜０．５ｎＭのＥＤ５０でＥＬＩＳＡにおいて固定した組み換えｍＩＧＦ−ＩＲを認識し、結合することが示された（図４）。比較のために、ヒトＩＧＦ−ＩＲ結合ＥＬＩＳＡを、このサンプルＡ１２で繰り返し、０．３〜０．５ｎＭのＥＤ５０を得た。これは以前の結果（図１Ａ）と一致した。これらの結果により、Ａ１２は、ｍＩＧＦ−ＩＲと完全に交差反応し、ヒトＩＧＦ−ＩＲと同様の動態で結合することが示唆された。従って、Ａ１２は、患者のＩＧＦ−ＩＲの遮断効果のモデル化にあたり、マウスで使用することができる。
【０１２９】
（実施例７  Ａ１２は、マウスの体重に効果を発揮する）
【０１３０】
雌のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および雌のｏｂ／ｏｂ肥満マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、バーハーバー、メイン州）を、少なくとも１週間、動物施設に順化させた。通常、約１８ｇで体重が安定するＢａｌｂ／ｃマウスを、約１４．５ｇでＡ１２を用いて処置を開始した（図５Ａ）。マウスを、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ヒトＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）、またはＡ１２（ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）のいずれかで腹腔内処置した。抗体をＴＢＳで希釈し、最初の処置として１４０ｍｇ／ｋｇの負荷容量を与えるか、または与えずに、４０ｍｇ／ｋｇで月−水−金に投与した。体重を、週に１度、１〜２回測定した。コントロールマウスを普通に発育させると、５０日間で約１８ｇまで体重が増加した。Ａ１２処置の４５日間、試験マウスは、体重を減らさずに約１５ｇの体重のままであった。次いで、処置を停止し、Ａ１２処置したマウスを、それらの通常の年齢に関連した体重まで回復させた。
【０１３１】
別の実験において、Ｂａｌｂ／ｃ雌のマウスを、処置前に１８ｇの体重まで成熟させた。この研究において、コントロールマウスは、約２０ｇまで体重を増加させ続けた（図５Ｂ）。Ａ１２は再び、体重減少させずに、この体重増加を防止した。処置の４２日後に処置を停止したとき、Ａ１２処置したマウスは、それらの通常の年齢に関連した体重まで回復させた。
【０１３２】
肥満個体における体重減少後の望ましくない体重増加もまた、Ａ１２での処置によって減少した。順化させたｏｂ／ｏｂ肥満マウス（レプチン欠損肥満モデル；Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒ，Ｍ．Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：５４０−５４３（１９９５）を参照のこと）に、最初に、８日間毎日、食物（Ｌａｂ  Ｄｉｅｔ＃５００１，Ｗ．Ｆ．Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．）の量を制限した餌を与え（図６）、次に、不断給餌に戻した。不断給餌に戻す約５時間前に、マウスに、火曜日および金曜日に、３０ｍｇ／ｋｇで、ＵＳＰ生理食塩水（Ｂｒａｕｎ）で希釈したヒトＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）またはＡ１２のいずれかで腹腔内処置を開始した。体重を、週に１〜２回測定し、測定間のケージ上の重量差を測定日数によって割って、一日の食物摂取をｏｂ／ｏｂマウスで推量した（図６）。
【０１３３】
最初の食餌制限により、約１８％の体重減少が生じた。ヒトＩｇＧコントロールは、それらの通常の年齢に関連した体重まで回復した。対照的に、Ａ１２は、食餌制限後に達成した体重と比較して、体重を減少させずに、この体重増加を防止した（図７）。さらに、体重へのＡ１２の有益な効果は、処置を停止した後、少なくとも５５日間依然として存在した。
【０１３４】
本発明の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、単独治療で使用した場合、体重減少または肥満減少を促進する。別の実施形態において、ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬は、脂肪遮断剤と組み合わせた場合、体重減少または肥満減少を促進する。肥満減少を促進するとは、有効量の抗体、または有効量の抗体と脂肪遮断剤との組み合わせの投与が、肥満減少を生じることを意味する。本発明の好ましい実施形態において、肥満減少は、少なくとも約２０日間、より好ましくは少なくとも約４０日間、より好ましくは少なくとも約６０日間、観察され、継続する。肥満減少を、特定の処置レジメンを受けた被験体の群全体の平均として測定してもよいし、肥満が減少した処置群における被験体の数によって測定してもよい。
【０１３５】
（実施例８  マウスの体重増加へのＡ１２効果の用量反応効果）
【０１３６】
この実験は、ｉ）食餌制限後のｏｂ／ｏｂマウスの体重増加を最小化させ、ｉｉ）不断給餌のｏｂ／ｏｂマウスにおける体重減少に作用するＡ１２の能力を試験した。
【０１３７】
雌のｏｂ／ｏｂマウス（ｎ＝４７）を、順応化の期間に約４５ｇまで到達させた。少なくとも１週間にわたる毎日の測定に基づいて、マウスの体重が安定したとき、食物を３６匹のマウスのケージの上部から除去した。これらの食餌制限したマウスに、１３日間、１日約０．１〜０．２ｇの食物を与えた。残っているマウスを不断給餌にさせ、食餌制限していないとみなした。
【０１３８】
食餌制限したマウスが、最初の体重と比較して、平均約２２％の体重減少に到達したとき、次いで、これらのマウスを、４つの処置群：１）ヒトＩｇＧ、３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内；２）Ａ１２、３ｍｇ／ｋｇ、腹腔内；３）Ａ１２、１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内；および４）Ａ１２、３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、に体重によってランダム化した。それらが最初の処置を受けてから３時間後、動物に食物を自由に与えた。用量を、５３日間、１週間に２回、腹腔内投与した。
【０１３９】
食餌制限していないマウスもまた、処置群に体重によってランダム化し、この群からの５匹のマウスを他の食餌制限した群と同時に、３０ｍｇ／ｋｇのＡ１２を用いて腹腔内処置した。残っている食餌制限していないマウスは、未処置のままにした。体重を、この研究期間を通して、１週間に２回、監視した。体重のプロットにより再び、Ａ１２は、ヒトＩｇＧ処置したマウスにおいて観察された食餌制限前の体重に戻るのを防止することが、示された（図８）。食餌制限したＡ１２処置マウスは、体重を減少しなかったが、食餌制限していないＡ１２処置肥満マウスは、Ａ１２処置の約３０日後に体重を減少し始めた。従って、ＩＧＦ−ＩＲシグナル伝達の阻害は、体重増加を防止するだけではなく、食餌制限していない肥満マウスにおける体重減少も誘発する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年5月26日(2009.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年6月1日(2009.6.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において体重を調節する際に使用するためのインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）拮抗薬 。
【請求項２】
該体重の調節が、該哺乳動物において、体重の減少、体重の維持、または体重の減少後の体重の増加の最小化をもたらす、請求項１に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【請求項３】
肥満の処置に使用するためのインスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−ＩＲ）拮抗薬。
【請求項４】
該ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、抗体またはそのフラグメントである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【請求項５】
該ＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬が、抗体である、請求項４に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【請求項６】
該抗体が、キメラであるか、ヒト化されるか、またはヒト抗体である、請求項５に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【請求項７】
該抗体が、ヒト抗体である、請求項６に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【請求項８】
該抗体が、Ａ１２である、請求項５に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【請求項９】
該抗体が、２Ｆ８である、請求項５に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【請求項１０】
該抗体またはそのフラグメントが、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ２および配列番号１８の重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号２６の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２８の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項４に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【請求項１１】
該抗体またはそのフラグメントが、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１８の重鎖ＣＤＲ３、ならびに配列番号２０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３を含む、請求項４に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【請求項１２】
該抗体またはそのフラグメントが、配列番号２の重鎖可変領域および／または配列番号１０の軽鎖可変領域を有する、請求項４に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【請求項１３】
該抗体またはそのフラグメントが、配列番号２の重鎖可変領域および／または配列番号６の軽鎖可変領域を有する、請求項４に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【請求項１４】
該抗体またはそのフラグメントが、抗肥満薬物と組み合わせて投与される、請求項４に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【請求項１５】
該ＩＧＦ−ＩＲ抗体またはそのフラグメントが、３〜３０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量で投与される、請求項４に記載のＩＧＦ−ＩＲ拮抗薬。
【国際調査報告】
2011505333.tif 000032
2011505333.tif 000033