(57)【要約】  タンパク質のゲル内検出および定量化のための新しい計器設計を提供する。累積時間分解発光二次元ゲル電気泳動と呼ばれるこの新しいプラットフォームは、蛍光寿命画像化の差を用いて特定のタンパク質標識からの蛍光と不特定のバックグラウンド蛍光とを区別することにより、現在の技術に比べて感度およびダイナミックレンジが共に大幅に向上する。プラットフォームは主として二次元ゲル電気泳動の画像を得るためのものであるが、一次元ゲルシステムでのタンパク質の検出にも、例えばＰＶＤＦ膜に電気ブロットされたタンパク質の検出にも適用できる。現在の方法に比べて検出の感度およびダイナミックレンジが最大５−６桁高くなるので、本発明はバイオマーカ発見の分野で極めて必要とされる少量の細胞タンパク質の検出に技術的飛躍をもたらす。
2011521247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質に結合された蛍光色素をパルスレーザスキャナで励起して画素毎のレベルで蛍光寿命画像化測定値を与えることを含む、二次元ゲル電気泳動の画像収集の方法。
【請求項２】
前記パルスレーザスキャナは密閉したスキャナ容器内に納めたダイオードレーザである、請求項１記載の画像収集の方法。
【請求項３】
前記パルスレーザスキャナは光ファイバケーブル・コンセントにより外部に取り付けて、用いる励起波長に最適の柔軟性を与える、請求項１記載の画像収集の方法。
【請求項４】
前記方法はグレードアップした現在の計装で行う、請求項１記載の画像収集の方法。
【請求項５】
前記方法は完全に閉じたスキャナシステムで行う、請求項１記載の画像収集の方法。
【請求項６】
蛍光減衰曲線の多次指数関数的当てはめを用いて、後でバックグラウンド除去を行うために、蛍光色素標識化タンパク質種から生じる蛍光と、ゲルマトリクス自身、ゲル内に存在する溶液または粒子、または散乱効果などの他の源から生じる蛍光とを分離することを更に含む、請求項１記載の画像収集の方法。
【請求項７】
励起のために多数のレーザ波長を連続的に用いて、時間分解蛍光と蛍光色素のスペクトル分離との組合せを容易にし、スペクトル分離による多重化を用いて寿命減衰スペクトルの複雑さを減らすことを更に含む、請求項１記載の画像収集の方法。
【請求項８】
二重蛍光寿命画像化測定がある、請求項７記載の画像収集の方法。
【請求項９】
前記蛍光色素に特有の強度蛍光減衰曲線を積分して曲線の下の面積を計算することを更に含む、請求項１記載の画像収集の方法。
【請求項１０】
自動化およびユーザが使いやすい機能を組み込むことを更に含む、請求項１記載の画像収集の方法。
【請求項１１】
前記自動化およびユーザが使いやすい機能は、得られる一次元または二次元のゲル電気泳動の図形的および定量的計算、蛍光寿命画像化解析のための自動化プロトコル、前記バックグラウンド成分の除去、および二次元のゲル電気泳動に用いられる標準蛍光色素のための蛍光色素成分の強度画像のエクスポートの少なくとも１つを含む、請求項１１記載の画像収集の方法。
【請求項１２】
自動化を最大にし、多重化に用いる多数の蛍光色素の連続スキャニングを含むユーザが定義する多数の異なるプロトコルの連続スキャニングのプログラミングを容易にすることを更に含む、請求項１記載の画像収集の方法。
【請求項１３】
ゲルベースのプロテオミクスに用いる蛍光プローブと、スキャン時間の最適化のための可変周波数パルスレーザダイオードとを用いることを更に含む、請求項１記載の画像収集の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質のゲル内検出および定量化のための方法および新しい画像収集技術に関する。累積時間分解発光二次元ゲル電気泳動法（Cumulative Time-resolved Emission 2-Dimensional Gel Electrophoresis）（ＣｕＴＥＤＧＥ）と呼ばれるこの新しいプラットフォームは、蛍光寿命の差を用いて特定のタンパク質標識からの蛍光と不特定のバックグラウンド蛍光とを区別することにより、感度およびダイナミックレンジを共に現在の技術に比べて大幅に改善する。
【背景技術】
【０００２】
「プロテオミックス」はゲノムのタンパク質補体（プロテオーム）の研究を指す用語で、１９９４年にＭａｒｃ  Ｗｉｌｋｉｎｓが造語した。過去１０年にわたって、細胞すなわち組織内の数千のタンパク質を同時に定量化するための多くの方法が開発され、例えば、バイオマーカの発見や細胞プロセスの機構の研究に用いられてきた。二次元ゲル電気泳動（２−ＤＧＥ）はグローバルプロテオミックス解析に適した最初の方法であり、現在でもプロテオミックス研究の有力な方法の１つである。２−ＤＧＥ法では、第１の次元で電荷に従って、第２の次元で寸法に従って、複雑なタンパク質サンプルを分離することにより、タンパク質スポットの２−Ｄマップを得る。理想的には、このマップの各スポットは単一のタンパク質種に対応する。次に、化学量論的にタンパク質に結合するタンパク質染料でタンパク質スポットを可視化して、タンパク質の量に対応する第３の次元を与える。これにより定量的プロテオーム解析が促進される。
【０００３】
元来の２−ＤＧＥ技術に関連する大きなゲル毎の変動が持つ問題に対しては、ディファレンシャルゲル電気泳動（Differential Gel Electrophoresis)（ＤＩＧＥ）法およびアレクサ標識化内部標準（Alexa-Labelled Internal Standard）（ＡＬＩＳ）法などの、内部標準を組み込む方法により対処してきた。この２つの方法は、スペクトル的に分離された蛍光色素でサンプルタンパク質および内部標準タンパク質に標識を付け、同じ２−ＤＧＥゲルで共に分離することに基づいている。レシオメトリック正規化（ratiometric normalization）によりゲル間の変動を訂正することができるので、２−ＤＧＥ法の定量的側面および全統計的パワーを大きく改善することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Wheelock AM, Goto S.，2006，「ゲルベースのプロテオミクスの変動に与える電気泳動後解析の効果（Effects of post-electrophoretic analysis on variance in gel-based proteomics）」，Expert Rev.Proteomics，3: 129-142．
【非特許文献２】Wheelock AM, Buckpitt AR.，2005，「二次元ゲル電気泳動画像解析におけるソフトウエアに起因する変動（ Software-induced variance in two-dimensional gel electrophoresis image analysis）」， Electrophoresis 26: 4508-4520．
【非特許文献３】Wheelock AM, Wheelock CE，2008，「ゲルベースのプロテオミクスにおけるバイオ情報科学。インプラントプロテオミクス：技術、戦略、および応用（Bioinformatics in gel-based proteomics. In Plant Proteomics: Technologies, Strategies and Applications）」, R Rakwal, G Agrawal編, pp. 107-125，Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons Inc.
【非特許文献４】Silva E, O'Gorman M, Becker S, Eklund A, Grunewald J, Wheelock AM.，「観察者の目：熟練者は未熟練者と同じスポットを見るか（ In the eye of the beholder: Does the Master see the SameSpots as the novice? ）」，Journal of Proteome Research,改訂中．
【非特許文献５】Suhling K, French PM, Phillips D.，2005，「時間分解蛍光顕微鏡検査法（Time-resolved fluorescence microscopy）」，Photochem Photobiol Sci 4: 13-22．
【非特許文献６】Wallrabe H, Periasamy A.，2005，「ＦＲＥＴおよびＦＬＩＭ顕微鏡検査法を用いるタンパク質分子の画像化（Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy）」，Curr Opin Biotechnol 16: 19-27．
【非特許文献７】Handl HL, Gillies RJ.，2005，「リガンド・受容体相互作用のためのランタニドベースの発光解析（Lanthanide-based luminescent assays for ligand- receptor interactions）」，Life Sci，77: 361-371．
【非特許文献８】Clapp AR, Medintz IL, Fisher BR, Anderson GP, Mattoussi H.，2005，「発光量子ドットは有機染料ドナーの効率的なエネルギー受容体になり得るか（Can luminescent quantum dots be efficient energy acceptors with organic dye donors?）」，J.Am.Chem Soc.，127: 1242-1250．
【非特許文献９】Alban A, David SO, Bjorkesten L, Andersson C, Sloge E,  Lewis S, Currie I.，2003，「比較二次元ゲル解析のための新しい実験設計：プールされた内部標準を組み込んだ二次元ディファレンスゲル電気泳動（A novel experimental design for comparative two-dimensional gel analysis: two- dimensional difference gel electrophoresis incorporating a pooled internal standard）」，Proteomics. 3: 36-44．
【非特許文献１０】Wheelock AM, Morin D, Bartosiewicz M, Buckpitt AR.， 2006，「定量的二次元ゲル電気泳動を行うための蛍光内部タンパク質標準の使用（Use of a fluorescent internal protein standard to achieve quantitative two-dimensional gel electrophoresis）」，Proteomics 6: 1385-1398．
【非特許文献１１】Lassiter SJ, Stryjewski W, Legendre BL, Jr., Erdmann R, Wahl M, Wurm J,Peterson R, Middendorf L, Soper SA.，2000，「ＤＮＡシークエンシング応用における寿命ベースコーリングのためのスラブゲルの時間分解蛍光画像化（Time-resolved fluorescence imaging of slab gels for lifetime base-calling in DNA sequencing applications）」，Anal Chem 72: 5373-5382．
【非特許文献１２】Stryjewski W, Soper SA, Lassiter SJ, Davis L.，2002，「ゲノミクス材料の検出のための時間分解近赤外蛍光を用いる多重解析（Multiplexed analysis using time-resolved near-IR fluorescence for the detection of genomics material）」，Proceedings of SPIE，4626 : 201 -209．
【非特許文献１３】Bartolome A, Bardliving C, Rao G, Tolosa L.，2005，「タンパク質を結合する蛍光脂肪酸を用いる低コストの寿命支援レシオメトリック検出のための脂肪酸センサ（Fatty acid sensor for low-cost lifetime-assisted ratiometric sensing using a fluorescent fatty acid binding protein）」，Anal.Biochem. 345: 133-139．
【非特許文献１４】Wheelock AM, Zhang L, Tran MU, Morin D, Penn S, Buckpitt AR, Plopper CG.，2004，「齧歯類気道上皮細胞タンパク質の隔離は肺毒性の生体内プロテオミクス研究を促進する（Isolation of rodent airway epithelial cell proteins facilitates in vivo proteomics studies of lung toxicity）」，Am. J. Physiol Lung Cell Mol. Physiol，286: L399-L410．
【非特許文献１５】Spiess PC, Morin D, Jewell WT, Buckpitt AR.，2008，「ゲル電気泳動および多重化蛍光画像化解析を用いた細胞酸化ストレスに応じるタンパク質スルフヒドリル基の測定（Measurement of protein sulfhydryls in response to cellular oxidative stress using gel electrophoresis and multiplexed fluorescent imaging analysis）」，Chem Res Toxicol 21 : 1074-1085．
【非特許文献１６】Rintamaki S.他、Journal of microbiological method, (2002 Aug), Vol.50, No.3, pp.313-8.
【非特許文献１７】Lassiter  S.J.他、Analytical chemistry, 2000 Nov 1, Vol.72, No.21, pp.5373-82.
【非特許文献１８】Llopis S.D.他,Electrophoresis,2004 Nov,Vol.25, No.21-22, pp.3810-9.
【非特許文献１９】Stryjewski他、Proceeding of SPIE - The International Society for Optical Engineering (2002), 4626 (Biomedical Nanotechnology Architectures and Applications), 201-209.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在の２−ＤＧＥ法に残る主な制約は検出の感度に限界があることである。生物サンプル内のタンパク質の量は１２桁にもわたるので、定量的２−ＤＧＥに用いるタンパク質染料（protein stain）の感度およびダイナミックレンジに対する要求は高い。このため、３−４桁のダイナミックレンジを持つ蛍光染料が、これまでの比色染色法（ダイナミックレンジが一般に１−２桁に限定される銀およびクーマシ（commassie）染料など（図１））に代わって使用されるようになった。
【０００６】
蛍光染料は、２−ＤＧＥ分離の前の共有結合標識化（例えば、ＣｙＤｙｅｓ（ＴＭ）、アレクサ染料）にも非共有結合の電気泳動後染色（post-electrophoretic staining）手続き（例えば、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ（ＴＭ）、Ｄｅｅｐ  Ｐｕｒｐｌｅ（ＴＭ））にも利用可能である。しかし、現在市販されているタンパク質の可視化のための最も高性能の蛍光プローブでも、可能な生理学的範囲のごく一部をカバーするだけである。なぜなら、生理学的タンパク質の量の範囲は数分子からマイクロモル濃度までにわたるが、最小ＤＩＧＥの最新の方法の検出限界は一般にナノグラムのタンパク質に制限されるからである(図１）。
【０００７】
２−ＤＧＥでのタンパク質の検出および定量化のための現在の蛍光の用法では、蛍石の刺激と得られる発光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）の測定とを同時に行う。技術的観点から時間効率が良くまた実際的なので、この方法は蛍光スキャナにもＣＣＤカメラベースの２−ＤＧＥ画像収集計器にも用いられている。しかし直接の蛍光測定はこれらの蛍光色素の可能性を十分には用いていない。生理的検査サンプルは多くの自動蛍光成分を含み、ポリアクリルアミドマトリクス自身が或る程度のバックグラウンド蛍光を放射（ｅｍｉｔ）する。信号対雑音比を最適にするには、バックグラウンド蛍光および自動蛍光からの外乱を小さくすることが重要である。
【０００８】
現在の２−ＤＧＥ技術では、生じるバックグラウンドを除去する操作は、電気泳動後のコンピュータ支援定量解析に用いるソフトウエアアルゴリズムにより機械的に行う。しかし、われわれが前に示したように、かかるバックグラウンド除去および訂正のアルゴリズムの多くはデータを変更し、またタンパク質のスポット量の定量化に更なる変動を与えると共に、ゆがんだ、非正規分布を生じる（文献１−４）。
【０００９】
時間分解蛍光（ＴＲＦ）を用いると、所定の画素内に存在する種々の蛍光種の減衰曲線を分離することにより光子の起源を得ることができる。ＴＲＦは現在関連分野の多くの応用（主として、局在、屈折ダイナミックス（folding dynamics）、または溶液内のタンパク質の動きを可視化する顕微鏡検査法応用）に用いられている（文献５、６）。２−ＤＧＥに現在用いられているいくつかの蛍光色素はこれらの関連分野の時間分解蛍光応用に用いられてきた（例えば、ＣｙＤｙｅｓ（ＴＭ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ製）およびアレクサ染料ならびにＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ（ＴＭ）などのルテニウム・キレート（両者ともＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ製）（文献７、８））。しかし、現在の２−ＤＧＥ画像収集装置にはこの機能が欠けているので、２−ＤＧＥでのＴＲＦの使用および開発は現在阻害されている。
【００１０】
（関連技術の説明）
この分野の多くの従来技術は分子間相互作用、分子安定性、または分子内配列変化の研究のための蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）技術に関係し、またいくつかの技術は蛍光寿命画像化（ＦＬＩＭ）に関係する。これらはポリメラーゼ連鎖反応（polymerized chain reaction）（ＰＣＲ）生成物の監視を含み(Rintamaki S.他、Journal of microbiological methods, (2002 Aug), Vol.50, No.3, pp.313-8）、他のものはＤＮＡシークエンシングのベースコーリング用である（Lassiter S. J.他、Analytical chemistry, 2000 Nov 1, Vol.72, No.21, pp.5373-82）。これらの著者たちは、自動化されたＤＮＡシーケンサ内の顕微鏡ヘッドを改造して近赤外時間分解蛍光寿命測定が可能になるようにした。したがって、この計器の設計、能力、および使用方法は本発明とは全く異なる性格のものであった。
【００１１】
このグループが行った計器の改造は、ＤＮＡシークエンシングの精度および速度を改善するために分類を目的として設計された。本質的に、寿命の画像化は、異なる寿命を持つ２つの蛍光色素を区別して、スラブゲル電気泳動法により分別された異なるＤＮＡ断片の存在を示すのに用いられた。追跡研究において、著者たちは、同じ目的で（Llopis S.D.他、 Electrophoresis, 2004 Nov, Vol.25, No.21-22, pp.3810-9.）、並びにＤＮＡマイクロアレイから蛍光シグネチャを読み取るために（Stryjewski他、Proceeding of SPIE - The International Society for Optical Engineering (2002), 4626 (Biomedical Nanotechnology Architectures and Applications), 201-209）、シークエンシング技術をポリママイクロチップ・プラットフォームに拡張した。
【００１２】
本発明のようにバックグラウンド除去のために多次元時間分解蛍光を使用することは、これらのどの応用でも行われていない。対照的に、著者たちは、単一指数関数的ワークフローを維持するためにはどのポリマサポートマトリクスの発生するバックグラウンド蛍光の量が最も少ないかを調査することに力を注ぎ、または負の制御スポットの強度の時間ゲーティングすなわち除去などの従来のバックグラウンド訂正法を用いた。このように、本発明がゲル内（タンパク質）測定において特定のバックグラウンドを除去するために多次指数的関数的時間分解蛍光を用いることは、驚くべき効果と新しい技術を示す。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、グローバルプロテオーム研究における蛍光で標識を付けたタンパク質のゲル内検出および定量化のための新しいプラットフォームを提供することである。本発明は蛍光寿命画像化（ＦＬＩＭ）を用いることを含む。他の目的および利点は以下の開示および請求の範囲から明らかになる。
【００１４】
ＣｕＴＥＤＧＥ技術の中心的な実施の形態は、タンパク質に結合された（共有結合的にまたはイオン力により）蛍光色素をパルスレーザスキャナで励起することを含む。定量的２−ＤＧＥで画像収集に現在用いられている最新の蛍光レーザスキャナは励起に一定光源を用いる。ゲルの持続的な照明は蛍光寿命の差を用いず、検出された発光は蛍光色素とバックグラウンド蛍光の複合ピーク発光に対応する。対照的に、ここに述べる発明を用いてパルスレーザでスキャニングすると、画素毎のレベルのＦＬＩＭ測定値を与える（図２Ａ−２Ｃ）。レーザ（恐らくダイオードレーザ）は密閉したスキャナ容器内に納めてよく、または光ファイバケーブル・コンセントにより外部に取り付けてよく、用いる励起波長（すなわち、特定のダイオードレーザ）に最適な柔軟性を与える。このように、この技術は現在の計装のグレードアップとして、または完全に閉じたスキャナシステムとして与えてよい。
【００１５】
本発明の別の実施の形態は、蛍光減衰曲線の多次指数関数的当てはめ（ｍｕｌｔｉ−ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌｆｉｔｔｉｎｇ）を用いて、蛍光色素標識化タンパク質種から生じる蛍光と、ゲルマトリクス自身、ゲル内に存在する溶液または粒子、または散乱効果などの他の源から生じる蛍光とを分離することを含む。蛍光減衰曲線を分離すると、図２Ａ−２Ｃに示すように光子レベルのバックグラウンドを除去することができる。更に、ＣｕＴＥＤＧＥ技術のこの実施の形態により、その後の画像解析でソフトウエア支援のバックグラウンド除去アルゴリズムが必要でなくなり、またこれらのアルゴリズムに起因することが知られている実験的変動の増加が抑えられる。２−ＤＧＥ画像内の蛍光寿命の分布の例を図４Ａ−４Ｂに示す。これはＣｙ２の疑似カラー寿命画像を示す。
【００１６】
本発明の更に別の実施の形態は、励起のために多数のレーザ波長を連続的に用いて、ＴＲＦと蛍光色素のスペクトル分離との組合せを容易にすることを含む。現在の２−ＤＧＥプロトコルにスペクトル分離を用いて、分離パターン内のゲル間変動の訂正をＤＩＧＥ（文献９）およびＡＬＩＳ（文献１０）方式などの多重化により容易にする。２−ＤＧＥ内の内部標準の組込みのためのプロトコルを多重化することは２−ＤＧＥ法に固有のゲル間変動を訂正するのに極めて重要であり、ゲルベースのプロテオミクスの分野で確立されている。このようにこの実施の形態を用いると、２−ＤＧＥ内の内部標準のための現在のプロトコルを用いて、ＣｕＴＥＤＧＥ計器を現在のプロテオミクス・ワークフロー内で適用しやすくなる。ＴＲＦではなくスペクトル分離による多重化を用いて寿命減衰スペクトルの複雑さを減らすと、ＣｕＴＥＤＧＥ法のバックグラウンド除去能力が向上する。しかしながら、Ｃｙ２／Ｃｙ３染料対の場合（例４）のように、励起波長と、組み込んだ蛍光色素の蛍光寿命とが両立する場合は、二重ＦＬＩＭ測定法を含めてもよい。
【００１７】
十分な感度並びにダイナミックレンジの光子検出器を組み込むことは本発明の別の重要な実施の形態である。伝統的に、ダイナミック検出レンジを広くするために、２−ＤＧＥの画像収集計器に光電子倍増管（ＰＭＴ）技術が用いられてきた。しかし、ＰＭＴ検出器の量子効率（ＱＥ）が限られているため、ＣｕＴＥＤＧＥ応用では検出感度と妥協させることがある。可視範囲内で最大９０％のＱＥを持つアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）検出器は感度の点で有利であるが、検出のダイナミックレンジに限界があるというマイナス面がある。このように、この技術で知られているように、ユーザの個別のニーズに適合する検出器を備えるＣｕＴＥＤＧＥ計器の種々のモデルを設計することができる。
【００１８】
蛍光色素に特有の強度蛍光減衰曲線を積分して曲線下の面積（ＡＵＣ）を計算することは本発明の別の中心的な実施の形態である。出力フォーマットとして成分の振幅寄与ではなくＡＵＣ（蛍光色素成分の全光子数に対応する）を用いると、ダイナミックレンジが更に１−２桁改善すると推定される。
【００１９】
自動化およびユーザの使いやすさは、特に、得られる２−ＤＧＥ画像の図形的および定量的計算の点で、ＣｕＴＥＤＧＥ計器の中心的要素である。ＦＬＩＭ解析のための自動化プロトコル、バックグラウンド成分の除去、および蛍光色素成分の強度画像のエクスポートが、２−ＤＧＥに用いる標準蛍光色素のために含まれる。現在の２−ＤＧＥ画像解析ソフトウエアを使用しやすくするため、このようにＡＵＣは得られたエクスポート画像内で一次元（Ｚ）の強度として表される。現在用いられている１６ビットのフォーマットの代わりに３２ビットのタグ付き画像ファイルフォーマット（ＴＩＦＦ）またはその同等物を用いると１０桁に近いディジタルダイナミックレンジが得られるので、ＣｕＴＥＤＧＥ技術により達成される画素強度の最大のダイナミックレンジが得やすくなる。
【００２０】
自動化を最大にするため、本発明はユーザが定義する多数の異なるプロトコルの連続スキャニング（例えば、多重化に用いる多数の蛍光色素の連続スキャニング）のプログラミングも容易にする。
今日、ゲルベースのプロテオミクスに用いる種々の蛍光プローブに広範囲の蛍光寿命が利用できるので、スキャン時間の最適化のための可変周波数パルスレーザダイオードは本発明の別の実施の形態である。
【００２１】
詳細な説明がよりよく理解されるように、またこの技術への本発明の寄与がよりよく認識されるように、本発明の重要な機能をかなり広範囲に概説した。本発明の更なる機能があるが、それは後で説明する。
この点で、本発明の少なくとも１つの実施の形態を詳細に説明する前に、本発明はその応用の際に、以下の記述で説明しまたは図面に示す構造の詳細や構成要素の配置に限定されないことを理解すべきである。本発明は他の実施の形態が可能であり、また種々の方法で実現しまた実施することができる。また理解されるように、ここに用いる表現および用語は説明のためのものであって、制限するものと見なしてはならない。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】検出されたタンパク質の量に対する、銀染料での実際のタンパク質の量（細い実線）と、最新の蛍光ＤＩＧＥ測定値（点線）と、更にＤＩＧＥ蛍光色素を用いた最初の原理の証明の測定値の比較として、準最適なＴＲＦ計器によるもの（破線）と本発明を用いた測定値によるもの（太い実線）とを示す。
【図２Ａ】ＣｙＤｙｅ標識化タンパク質のゲル内測定値から得られる蛍光減衰曲線（光子数対時間）の多次指数関数的当てはめの一例を示す。
【図２Ｂ】より長い蛍光寿命を持つ蛍光色素を用い、時間ゲート測定のための最適窓を示す、蛍光減衰曲線（光子数対時間）の多次指数関数的当てはめの一例を示す（破線）。
【図２Ｃ】累積バックグラウンド蛍光の寄与と全蛍光とを比較するグラフである。標準の非時間分解測定中の発光レベルを示す（破線）。
【図３Ａ】一定光源で励起中のＣｙ３およびＣｙ５の相対蛍光、波長および時間の三次元グラフを示す。
【図３Ｂ】時間分解測定（すなわち、パルスレーザで励起）中のＣｙ３およびＣｙ５の相対蛍光、波長および時間の三次元グラフを示す。
【図３Ｃ】図３Ａに示す蛍光成分と波長成分の二次元表現で、Ｃｙ３およびＣｙ５についての励起曲線（実線）および発光曲線（破線）を示す。
【図３Ｄ】図３Ｂの時間成分と光子数成分の二次元表現で、Ｃｙ３およびＣｙ５についての寿命発光曲線を示す。
【図４Ａ】Ｃｙ２標識化タンパク質を含む２−ＤＧＥゲル内の種々の寿命成分の分布を表す疑似カラー寿命画像を示す。時間スケールを右上隅に示し、白は最も長い寿命、黒はより短い寿命を表す。画像の非スポット領域内の黒と白が入り混じって見えるところは、アクリルアミドマトリクスに関連する非常に短いバックグラウンド成分（０．２ｎｓ）とより長いバックグラウンド成分（４．２ｎｓ）との混合から生じたものである（図５参照）。
【図４Ｂ】全蛍光強度（寿命分離なし）が寿命画像によく対応していることを示す対応する従来の２−ＤＧＥ画像のタンパク質スポットパターンを示し、寿命蛍光を与えることにより、ポリアクリルアミドゲルのバックグラウンド成分をＣｙＤｙｅ蛍光色素のものから明確に分離できることを示す。
【図５】一次元勾配ゲル内の長い主バックグラウンド成分（４．２ｎｓ）についての光子数に対するアクリルアミド濃度のグラフである。
【図６】可能なＣｕＴＥＤＧＥ計器設計の略図である。
【図７】タンパク質の定量化に用いられるスポット量に寄与する３つの次元を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明はグローバルプロテオーム研究における蛍光で標識を付けたタンパク質のゲル内検出および定量化のための新しいプラットフォームを提供するもので、基本的にここで詳細に説明する以下の実施の形態を有する。ＣｕＴＥＤＧＥ計器の一般的設計の概要を図６に示す。密封したスキャナ容器内に納めた、または光ファイバケーブルにより外部に取り付けたパルスレーザダイオードを、蛍光色素標識化タンパク質（共有結合またはイオン力による）のゲル内励起に用いる。ゲルを保持するガラスプラテンを動かすことにより、またはゲルプラテンの下の２色性ミラーを動かすことにより動作するスキャナ機構は、ゲルの画素毎のスキャニングを容易にする。動く／静止する２色フィルタを通って放射される蛍光は最適なエミッション・フィルタ（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｉｌｔｅｒ）を通り、更に光ファイバケーブルを通って、計器の設計が密閉スキャナシステムか外部の高性能のキットかに従って、内部に納めた検出器または外部に取り付けた検出器に導かれる。光子計数板はデータをソフトウエアモジュールにエクスポートし、転送する。このモジュールは、蛍光減衰曲線の完全に自動化された多次指数関数的寿命当てはめにより蛍光色素標識化タンパク質種から生じる蛍光と、他の望ましくないバックグラウンド蛍光から生じる蛍光とを分離するように設計する。蛍光色素に特有の積分された蛍光減衰曲線は、更なる定量的２−ＤＧＥ画像解析と両立するフォーマットで、蛍光色素毎に１つの強度画像としてエクスポートされる。
【００２４】
本発明では、蛍光色素とバックグラウンド蛍光のそれぞれの蛍光減衰時間の固有の差を用いることにより、ゲルベースのプロテオミクスにおける全信号強度と信号対雑音比とを共に大幅に向上させることができる。パルスレーザを用いることにより、図３Ａ−３Ｄに示すように、蛍光寿命全体の減衰曲線を測定することができる。レーザパルスおよび検出器をゲルにまたがって移動させる機構を用いて、ゲルの画素毎のスキャニングを容易にする。１つの解決法は、ゲルを保持する静止したガラスプラットフォームの下にある一組のミラーをステッパモータコントローラで動かし、ゲルプラットフォームは実際に動かさない。この逆の機構により、スラブゲルを静止状態に保って、壊れやすいポリアクリルアミドゲルが（特に大型のゲルが）破裂するのを防ぐことができる。ミラーを動かすために生じる距離の変化は遅延発生器を適当に置くことにより訂正する。更に、この方式では強い容器でも水がスラブゲル内に浸透しやすくなる。さもないと、多重化に必要な高解像度の連続スキャニング中に完全に乾くことがある。別の解決法はゲルを保持するスキャナ板をステップ状に動かすことである。重要なことは、どちらの機構もパルスダイオードレーザの交換が容易で、励起波長を柔軟に選択できるようにすることである。
【００２５】
ＴＲＦの最も直接的な使用は、検出した光子放出曲線（ｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）から平均寿命を計算することである。多次指数関数的当てはめをしない一層簡単なＴＲＦ測定は、主として既知の蛍光色素が存在するかしないかを決定するのに用いられる。図２Ａに示すＣｙ２標識化タンパク質のゲル内検出などの複雑なシステムでは、バックグラウンド成分の寄与と蛍光色素から得られる発光とを識別することができない。一定光源を用いる非ＴＲＦ測定では全蛍光のピークレベルに対応する一定発光レベルが得られ（実線）、単一指数関数的ＴＲＦ測定に似て、個々のバックグラウンド成分と全蛍光とを識別することができない。
【００２６】
得られる単一指数関数的当てはめでは多数の蛍光成分をうまく分離できないので、バックグラウンドとフルオロフォアからの発光が１つの曲線に集約される（図２Ｃの実線）。このように、得られる単一指数関数的ＦＬＩＭ測定は既知の寿命の蛍光色素が存在するかしないかを識別するのに適している。その例は「関連技術の説明」に述べた単一指数関数的ＴＲＦ計器で、これはマイクロアレイ内のヌクレオチドのサンガ（Sanger）ＤＮＡシークエンシングおよび検出におけるヌクレオチドの2値分類用に構築された（文献１１、１２）。ＣｕＴＥＤＧＥ技術が意図する２−ＤＧＥゲル画像への応用はＤＮＡマイクロアレイのための前のＴＲＦ応用に比べて多くの挑戦を提供する。
【００２７】
最も重要なことは、マイクロアレイ内のスポット位置およびスポット寸法が分かるので、スポット境界を予め決定するのが容易になることである。対照的に、２−ＤＧＥではスポットパターンがタンパク質の生理化学的特性に基づくので、スポット寸法もスポット位置も分からない。スポット分離パターン内のゲル間変動が大きいと２−ＤＧＥ画像内のスポット検出および定量化は更に複雑になる。マイクロアレイ内で用いられる固い表面は２−ＤＧＥで用いられるポリアクリルアミドゲル・マトリクスよりはるかに均質である。２ＤＥ内のタンパク質のゲル内の局在性のために、バックグラウンド蛍光はマイクロアレイ内のヌクレオチドの検出に用いられるオントップ混成より複雑になる。このように、２−ＤＧＥ画像収集にはマイクロアレイ画像化システムに比べて、バックグラウンド検出および除去の点ではるかに強いシステムが必要である。
【００２８】
バックグラウンド蛍光は従来の蛍光応用では定量化できないので、バックグラウンド放射（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ）は、蛍光で標識を付けた分子を囲む画素の強度の評価により推定しなければならない。２−ＤＧＥ画像内のバックグラウンド除去のために現在利用可能なアルゴリズムはあまり正確ではなく、これらのアルゴリズムは再現性の点で強くないので定量的解析にかなりの変動をもたらすことを、われわれはすでに多くの出版物で示した（文献１−４）。
【００２９】
バックグラウンド蛍光と蛍光色素の寿命の差は十分大きいので、単一指数関数的ＴＲＦを適用すると一定照明測定値を改善することができる。すなわち、時間遅延測定によりバックグラウンド雑音を減らすことができる（図２Ｂ）。しかし、バックグラウンド放射を除去することを目的として時間ゲーティングを行うと、一般にフルオロフォアの主発光ピークも除去される（図２Ｂ）。蛍光色素の寿命がバックグラウンド成分より十分長い場合は、時間ゲート測定値を用いてバックグラウンド蛍光を定量化から除去することができる。この戦略は信号対雑音比の改善をいくぶん損なうが、存在する成分の寿命が分かれば、複雑な当てはめアルゴリズムのニーズをなくすことができる。したがって、単一指数関数的時間遅延法をマイクロアレイに適用しようとしたこれまでの試みが示すように、感度およびダイナミックレンジの利益は限られる。（文献１２）
【００３０】
更に、現在２−ＤＧＥに最もよく用いられているシアニンベースのフルオロフォア（ＤＩＧＥ  ＣｙＤｙｅｓ）の蛍光寿命は、周囲のポリアクリルアミドマトリクスの寿命よりはるかに短い（〜１ｎｓに対して〜４ｎｓ、図２Ａ）ので、時間ゲーティング方式は除外される。このように、多次指数関数的減衰のためのデコンボリューションアルゴリズムの使用は、かかる短寿命蛍光色素についてもＦＬＩＭベースのバックグラウンド除去を容易にするためのＣｕＴＥＤＧＥ技術の中心である。
【００３１】
時間分解蛍光（ＴＲＦ）を示す図２Ａでは、励起にパルスレーザを用い（時間０）、その後の蛍光減衰曲線を定量化する。Ｃｙ２標識化タンパク質のゲル内検出の検出から得られる減衰曲線の多次指数関数的当てはめは、蛍光色素成分（１ｎｓ）に加えて、短いバックグラウンド成分（０．２ｎｓ）および長いバックグラウンド成分（４．２ｎｓ）を示す。図５は、主バックグラウンド成分（４．２ｎｓ）の強度と勾配ポリアクリルアミドゲル内のアクリルアミド濃度との強い相関を示し（Ｒ2＝０．６７）、ポリアクリルアミドマトリクスがこのバックグラウンド成分の源であることを示す。成分の寿命はポリアクリルアミド勾配を通して安定しており、成分の強度だけが変化している。このように、ＣｕＴＥＤＧＥ技術に用いられるバックグラウンド除去戦略は強い方法であって、濃度が変化する勾配ゲルにもアイソクラチックゲルにも適用できる。多次指数関数的当てはめはバックグラウンド成分の除去を容易にし、これにより信号対雑音比は大幅に向上する。
【００３２】
３重組の（3-plexed set）ＤＩＧＥ蛍光色素（Ｃｙ２、Ｃｙ３、およびＣｙ５）を用いた原理の証明実験は、バックグラウンド成分と蛍光色素自身の寿命の分布に明確な差があることを示した（図４Ａ）。伝統的な強度画像と疑似カラー寿命画像とを比較すると、タンパク質スポット分離パターンが重ね合わせ可能であることが明らかに分かる。したがって、画素毎に多次指数関数的当てはめを行い、その後に蛍光色素成分を抽出すると、光子レベルでのバックグラウンド除去が容易になる。準最適の計器を用いても、信号対雑音比は現在の最高級のレーザスキャナより１０倍以上向上することを原理の証明測定は示した（改良されたＴＲＦ顕微鏡の最大測定深さが〜１μｍであるのに対して、Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナが測定するゲルの全深さは１ｍｍである）。
【００３３】
図１に示すように、２−ＤＧＥで用いる種々のタンパク質染料の線形検出範囲（ｙ軸）に対して生理タンパク質の量の範囲（ｘ軸）をプロットした。銀染料などの比色法（細い実線）のダイナミックレンジは一般に１−２桁であるが、最小ＤＩＧＥなどの蛍光法（点線）の直線的ダイナミックレンジは３−４桁である。現在のＴＲＦ測定器を用いた原理の証明測定（破線）は、ＴＲＦを標準ＤＩＧＥ測定に適用するとダイナミックレンジを３桁改善することを示した（太い実線）。新しいＣｕＴＥＤＧＥ計器について概説した実施の形態を実現すると、検出のダイナミックレンジおよび感度は更に２−３桁向上すると推定される（実線のボックス）。このように、この中心的な実施の形態だけで、感度およびダイナミックレンジは２−ＤＧＥの現在の画像収集技術より数桁向上することが期待される。
【００３４】
測定の特異性のこのような増加は、より高い感度をもたらすだけでなく、散乱効果から交絡因子を除去したり、またはゲルマトリクス自身、ゲル内に残留する溶媒、粒子または細胞残屑を含む、ゲル内に存在する他の蛍光種も除去する。検出の信号対雑音比の向上に加えて、多次指数関数的ＦＬＩＭ方式はその後の画像解析におけるセグメンテーション（スポット検出）および登録（スポットマッチング）に伴う問題を減らすことにも寄与する。かかる問題は自動化スポット検出およびマッチングの膨大なマニュアル編集が現在必要なので、定量的２−ＤＧＥワークフローにおける別の大きなボトルネックになっている。したがって、ＣｕＴＥＤＧＥ技術により生成されるきれいなバックグラウンドは、画像調整の自動化を改善し、最終的に画像解析の主観性を減らす。２−ＤＧＥ解析ソフトウエアで現在用いられているバックグラウンド除去アルゴリズムが導入するソフトウエアに起因する変動もなくなる。なぜなら、かかるアルゴリズムはもう必要ないからである。
【００３５】
スペクトル的に分離した蛍光色素を用いる多重化は２−ＤＧＥ分離技術に固有の大きなゲル毎の変動を補償するための定着した方法である。しかし多くのＴＲＦ応用で、多重化は種々の蛍光寿命を持つ蛍光色素を用いて行うが、励起と発光のスペクトルは重なる。ＣｕＴＥＤＧＥ技術の汎用性を最大にするため、われわれはスペクトルと時間の分離を１つの応用内で組み合わせる。すなわち、例２に示すように多数のレーザ波長を励起に用いる。これによりＴＲＦと、例えばＤＩＧＥ（文献９）およびＡＬＩＳ（文献１０）方式に現在用いられているスペクトル分離とを組み合わせるのが容易になり、２−ＤＧＥの内部標準のための現在のプロトコルを用いて現在のプロテオミクス・ワークフロー内でＣｕＴＥＤＧＥ計器を容易に実現することができる。現在の画像収集計装を用いる多重化では、収集時間が長くなっても定量化への影響は全く認められない。
【００３６】
図３Ａ−３Ｄはこれをグラフで示す。ゲルベースのプロテオミクスで用いられる現在のレーザスキャナの場合のように、一定光源で励起中は（図３Ａ）、蛍光色素間のクエンチング（quenching）または重なりを避けるために、励起曲線（図３Ｃの実線）と発光曲線（図３Ｃの点線）とは十分分離しなければならない。一定励起のために、重なりは測定中ずっと同じである（図３Ａ）。したがって、測定窓が長くても特定の信号と不特定の（バックグラウンド）信号の増幅は同じである。パルスレーザで励起中は（図３Ｂ）、励起源は時間的にも（図３Ｄ）スペクトル的にも（図３Ｃ）発光から分離される。かかるスペクトル・時間特性は異なる蛍光種の区別に別の次元を加え、光子レベルでのバックグラウンド除去のための手段を提供する（図２参照）。
【００３７】
一定光源を励起に用いるために励起と発光のスペクトルの重なりが残るので（図３Ａ）、狭い帯域フィルタを用いる必要がある。対照的に、ＣｕＴＥＤＧＥ技術によるスペクトル・時間分離は励起と発光のスペクトルを時間的に分離するので（図３Ｂ）より広い帯域フィルタを用いることが可能になり、その結果、ダイナミックレンジおよび感度が向上する。ＴＲＦではなくスペクトル分離による多重化を用いると寿命減衰スペクトルが複雑でなくなるので、ＣｕＴＥＤＧＥ法のバックグラウンド除去能力が向上する。励起波長が一致する場合には、スペクトル分離の方法は多重プローブの同時測定にも用いることができる。われわれの原理の証明測定によると、これはプローブ対Ｃｙ２およびＣｙ３の場合であって、共に４９０ｎｍのダイオードレーザにより十分励起することができる。この場合は、２色性フィルタおよび二重検出器を用いることにより、発光の別々の検出が容易になる（例４参照）。蛍光色素とバックグラウンド成分を共に十分に当てはめることができるような十分大きな寿命の差を持つＴＲＦ多重化のための新しい蛍光色素セットが開発されれば、スペクトル分離法は省いてよい。
【００３８】
現在の画像収集計器は励起された蛍光色素が放出する光子を検出するのにＰＭＴを用いる。ＰＭＴは信号の増幅度は高い（最大１０6）が、光子計数の効率は一般に低い（ＱＥ〜１０％）。ＡＰＤ検出器は可視範囲で最大９０％の量子効率を示すが、各光子を検出した後の中断時間が長いために、これまで画像収集計器として用いられなかった。ＡＰＤ検出器のアクティブクエンチング（active quenching）の新しい方法によりこの問題がなくなったので、ＡＰＤ検出器を用いると感度およびダイナミックレンジが大幅に向上するであろう。しかし広いダイナミックレンジが必要な場合は、ＡＰＤ型の検出器の最大カウント速度が限られることがやはり制限要因になるであろう。したがって、ＣｕＴＥＤＧＥ計器に適した検出器の範囲があり、応用の必要に従って、個々のＣｕＴＥＤＧＥ計器の設計において検出のダイナミックレンジと検出の感度とを比較検討することになる。
【００３９】
ＣｕＴＥＤＧＥに用いられる各蛍光色素のスペクトル・時間特性の抽出は信号の定量化への新しい方法の道を開く。現在のＦＬＩＭ応用では、一般に各成分の信号の振幅を用いて画素内の各成分の寄与を定量化する。ＣｕＴＥＤＧＥ応用では、われわれは代わりに曲線の下の面積（ＡＵＣ）全体を定量化のために用いる。ＡＵＣを用いることは特定の成分毎に当てはまる光子数に対応し、検出の感度並びにダイナミックレンジの向上に寄与する。一定励起を与える伝統的な画像収集では、ＡＵＣの積分は振幅の測定に比べて測定のダイナミックレンジの向上が顕著でない。なぜなら、全ての交絡因子がプローブの信号と入り混じって（convoluted）増幅されるからである。ＣｕＴＥＤＧＥに用いられる多次指数関数的減衰曲線のデコンボリューション（deconvolution）により、蛍光色素に特有のＡＵＣを計算することができる。スペクトル・時間分離を行うと広帯域エミッション・フィルタも使用しやすくなるので、得られる曲線下の容量（ＶＵＣ）を計算することによる信号対雑音の改善は更に進む。
【００４０】
現在のＦＬＩＭソフトウエアで利用可能な寿命当てはめアルゴリズムは複雑な人手の支援および評価が必要なので、ユーザはこの分野の深い知識を要求される。対照的に、ＣｕＴＥＤＧＥの概念は高いレベルの自動化を提供するので、時間分解蛍光の分野の専門知識のないプロテオミクス研究者も時間効率よく正確な測定を行うことができる。ポリアクリルアミド濃度およびバッファが変化しても２−ＤＧＥ内の蛍光成分の寿命は一定に保たれるので、画素毎の寿命当てはめのための自動化プロトコルと、関係する成分の強度画像のその後のエクスポートは、今日２−ＤＧＥに用いられている標準蛍光色素について含まれる。現在の２−ＤＧＥ画像解析ソフトウエアの使用を促進するため、ＡＵＣはエクスポートされる画像内で一次元（Ｚ）の強度として表される（図７参照）。現在用いられている１６ビットのフォーマットの代わりに３２ビットのグレースケール画像ファイルフォーマットを用いると１０桁に近いディジタルダイナミックレンジを与え、ＣｕＴＥＤＧＥ技術により達成されるダイナミックレンジを容易に数桁も改善する。計器の柔軟性を最大にするために、ユーザが誘導する当てはめのため、並びに自動化スキャニング用のルーチンの構築のためのソフトウエアも提供し、新しい蛍光色素またはゲルマトリクスのためのプロトコルを容易に実現することができる。
【００４１】
２−ＤＧＥは時間がかかるので、今日の大規模なプロテオミクス研究での有用性が限られることが多いので、自動化は全てのプロテオミクス・プラットフォームにおいて最も重要である。したがって、上に述べた自動化された寿命当てはめおよびその後の蛍光色素成分のための強度画像の計算に加えて、ユーザが定義する多数のプロトコルの自動化された連続スキャニングはＣｕＴＥＤＧＥ計器の標準的な機能である。時間効率の他に、この機能は種々の蛍光色素の光露出を最小にするのにも寄与する。連続スキャンは、最小ＤＩＧＥプロトコルで例示されているような多重化を促進する（例２）。連続スキャンの他の応用は、飽和ＤＩＧＥの後のＳＹＰＲＯ（ＴＭ）Ｒｕｂｙによる全タンパク質の検出（例５）、または追加のＣｙＤｙｅによる４重化(例４）を含む。
【００４２】
ＣｕＴＥＤＧＥ計器は可変周波数パルスレーザ（例えば、０．１−４０ＭＨｚ）を備えており、現在２−ＤＧＥに用いられている広範囲の蛍光色素の検出および定量化に用いられる方法を微調整することができる。例えば、ルテニウム複合体について報告された〜３５０−５００ｎｓの極めて長い寿命（文献７，８，１３）は時間遅延の累積測定方式を必要とする（図２Ｂ、例１）が、例えば、ＣｙＤｙｅｓの寿命スパンがはるかに短い（〜１ｎｓ(文献８））ことが示すように、バックグラウンドから得られる減衰曲線をその後除去したＦＬＩＭ（図２Ａ、例２）はこれらの蛍光色素について最大感度を得るのに一層適当である。可変周波数モードを用いると後者のスキャン時間は非常に短くなる。
【００４３】
上の説明に関して、理解されるように、サイズ、材料、形状、機能および動作方法、組立ておよび使用の種々の形態を含む本発明の部分の最適な次元関係は当業者に容易に明らかである。
したがって、上に述べたことは本発明の原理の単なる例示と見なすべきである。更に、多くの修正および変更は当業者にすぐに思い浮かべられるので、図示し説明した構造および動作に本発明を厳密に限定することは望ましくなく、したがって、全ての適当な修正および同等物は本発明の範囲内に入るものとする。
【００４４】
（例１）
この例では、タンパク質をまずラットの気道から溶解洗浄により隔離する（文献１４）。これは、２−ＤＧＥ互換の尿素ベース溶解バッファ（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ｗ／ｖＣＨＡＰＳ、０．５％トリトンＸ１００、２％ｖ／ｖプロテアーゼ阻害剤カクテル）内の気道上皮プロテオームを瞬時に可溶性にする隔離法である。サンプルのタンパク質濃度はブラッドフォード（Bradford）の方法を用いて決定し、２−ＤＧＥを用いて分離する。４００μｇのタンパク質／サンプルの部分標本を溶解バッファで３５０μｌまで希釈し、適当なｐＨ範囲用のＩＰＧバッファを１％ｖ／ｖの最終濃度になるまで加える。タンパク質サンプルを室温で一晩再水和によりＩＰＧストリップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の上にロードして、ＭｕｌｔｉｐｈｏｒＩＩ電気泳動ユニットおよびＥＰＳ３５０１ＸＬ電源を２０℃で用いて、次の勾配プロトコル（０−５０Ｖで１分、５０Ｖで１時間、５０−１０００Ｖで３時間、１０００−３５００Ｖで３時間、３５００Ｖで１９時間（全部で７４．９ｋＶｈ）で等電点電気泳動法（ＩＥＦ）を行う。
【００４５】
ＩＥＦの後に、ストリップを平衡バッファ（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．８，６Ｍ尿素、３０％グリセロール、２％ＳＤＳ）内で２ｘ１５分間培養する。第１の培養で６５ｍＭのＤＴＴ、第２の培養で１０ｍＭのヨードアセトアミドを組み込むことによりスルフヒドリルの還元（reduction）およびアルキル化を行う。次にストリップを２０ｃｍｘ２５ｃｍの１０％Ｔ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にロードし、０．５％のＩｓｏＧｅｌアガロースを用いてシールする。第２の次元の分離を、１０℃、１４ｍＡ／ゲルでエタン・ダルト（Ettan Dalt）電気泳動システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）内で、２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、および０．５％のＳＤＳ内で染料フロントが１８ｃｍ移動する（〜１８時間）まで行う。
【００４６】
次にポリアクリルアミドゲルをガラスカセットから取り除き、メーカのプロトコル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）に従ってＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ（ＴＭ）染料を用いてタンパク質を可視化する。手短に述べると、２−ＤＧＥゲルを７％の酢酸および１０％のエタノール内で２ｘ３０分間固定し、次に１００％のＳＹＰＲＯ（ＴＭ）Ｒｕｂｙ染色溶液内で一晩培養する。次に、２−ＤＧＥゲルを１００％のメタノール内で５分間脱染してゲル表面の染料粒子を除いた後、水中で２ｘ１５分間平衡させる。
【００４７】
ＳＹＰＲＯ（ＴＭ）Ｒｕｂｙ染色した２−ＤＧＥゲルをＣｕＴＥＤＧＥスキャナのガラスプラテン上に直接置き、２０−１００μｍの画素寸法を持つ時間遅延多次指数関数的寿命測定レジメン（regimen）を用いてタンパク質を可視化する。励起は波長４９０ｎｍのパルスダイオードレーザにより０．１−０．５ＭＨｚ（２−１０μｓサイクル）の低いパルスレートで行い、ＳＹＰＲＯ（ＴＭ）Ｒｕｂｙ内の蛍光Ｒｕ複合体の極端に長い寿命を完全に減衰させる。
【００４８】
発光はＰＭＴ検出器を用いて検出し、６１０±５０ｎｍ（６１０ｂｐ１００）の帯域エミッション・フィルタまたは６００ｎｍのロングパスフィルタを適用する。データは、最大４つの異なる減衰アルゴリズムを同時に当てはめる能力を有する多次指数関数的蛍光減衰当てはめソフトウエアモジュールにエクスポートする。ＳＹＰＲＯ（ＴＭ）Ｒｕｂｙタンパク質染料内に用いるルテニウムＩＩ−トリス（バソフェナントロリンジスルホネート（bathophenanthrolinedisulfonate））（ＲｕＴＢＳ）分子の極端に長い蛍光寿命に基づき、時間遅延測定方式を用いてバックグラウンド蛍光を除外する（図２Ｂ）。時間間隔１０−５００ｎｓにわたるＲｕＴＢＳ分子の減衰曲線の曲線下の面積（ＡＵＣ）を計算し、スキャナ位置の所定のＸ，Ｙ座標の画素強度と定義する（図７参照）。
【００４９】
時間遅延測定を行うと、ＳＹＰＲＯ（ＴＭ）Ｒｕｂｙ染料（６１０ｂｐ３０）に通常用いられるものより広い帯域エミッション・フィルタにより選択性を保持しやすい。なぜなら、マトリクスおよび生体分子からの自動蛍光の大部分は最初の５ｎｓ内に起こるからである。より広い帯域フィルタによりＲｕＴＢＳの広い発光ピークの大部分を検出することが可能になり、その結果感度が向上する。スキャンが完了した後、Ｘ，Ｙ座標毎の得られるＡＵＣ値を３２ビットのグレースケール・ティフ（ｔｉｆｆ）ファイル内に合併する。これは最適な２−ＤＧＥ解析ソフトウエアで解析することができる。
【００５０】
（例２）
喫煙者および喫煙未経験者から気管支肺胞洗浄により隔離したマクロファージを、２−ＤＧＥ溶解バッファを用いて可溶性にする（例１参照)。研究に含まれた全ての人からの同じ量のタンパク質をプールして内部標準を作成し、メーカの推薦（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に従ってＮＨＳエステル共役Ｃｙ２（最小ＤＩＧＥ試薬）で標識を付ける。喫煙者および喫煙未経験者からのタンパク質サンプルを無作為に２つのグループに分け、Ｃｙ３およびＣｙ５最小ＤＩＧＥ試薬でそれぞれ標識を付ける。例１に述べたプロトコルに従って、２−ＤＧＥゲル上でＣｙ２標識化内部標準を１つのＣｙ３および１つのＣｙ５標識化サンプルと共に分離する。３つの異なるタンパク質標識を、スペクトルおよび時間分解蛍光の組合せを用いた３つの異なるスキャニングプロトコルの自動化されたシーケンスで次のように可視化する。
【００５１】
Ａ）Ｃｙ２蛍光色素（内部標準）を、波長４９０ｎｍ、パルスレート４０ＭＨｚ（２５ｎｓサイクル)のパルスダイオードレーザで励起する。５０ｐｓの応答速度を持つＡＰＤ検出器を用いて発光を検出し、５２０±２０ｎｍ（５２０ｂｐ４０）の帯域エミッション・フィルタを適用する。
Ｂ）Ｃｙ３蛍光色素（サンプル）を、波長５３２ｎｍ、パルスレート４０ＭＨｚ（２５ｎｓサイクル）のパルスダイオードレーザで励起する。５０ｐｓの応答速度を持つＡＰＤ検出器を用いて発光を検出し、５８０±１０ｎｍ（５８０ｂｐ２０）の帯域エミッション・フィルタを適用する。
Ｃ）Ｃｙ５蛍光色素（サンプル）を、波長６４０ｎｍ、パルスレート４０ＭＨｚ（２５ｎｓサイクル）のパルスダイオードレーザで励起する。５０ｐｓの応答速度を持つＡＰＤ検出器を用いて発光を検出し、６７０±１０ｎｍ（６７０ｂｐ２０）の帯域エミッション・フィルタを適用する。
【００５２】
各スキャニング手続きからのデータを、複数の減衰アルゴリズムを同時に当てはめる能力を有する多次指数関数的蛍光減衰当てはめソフトウエアモジュールにエクスポートする。ＣｙＤｙｅの減衰時間は比較的短い（０．９−１．５ｎｓ）ので、各ＣｙＤｙｅに対応する全減衰曲線の下のＡＵＣを画素毎に計算する（図２Ａ）。減衰曲線の多次指数関数的当てはめにより、特定の波長のそれぞれの光子レベルでのバックグラウンド放射を容易に除去することができる。これはソフトウエアモジュール内の自動化機能として与えられる（図６）。各Ｘ，Ｙ毎に得られるＡＵＣ値を、ＤＩＧＥ機能を持つ２−ＤＧＥ解析ソフトウエアで解析するのに適した３つの別個の重ね合わせ可能な３２ビットのグレースケール画像ファイルに合併する。
【００５３】
（例３）
例２に述べたプロトコルの追加のステップとしてＳＹＰＲＯ（ＴＭ）Ｒｕｂｙ染色を行って、ＤＩＧＥゲル内の全タンパク質含有量の定量化を容易にする。現在の技術では、スペクトルが重なるために（特にＳＹＰＲＯ（ＴＭ）Ｒｕｂｙ、Ｃｙ３、およびＣｙ５の発光曲線に関して）、ＤＩＧＥとＳＹＰＲＯ（ＴＭ）Ｒｕｂｙ蛍光色素とを同じ２−ＤＧＥゲル内で用いることができない。本発明の実施の形態は時間次元を用いて、これらを標準プロトコルに合併するのを容易にする（図３に例示するように）。例２に概説した手続きが終了した後、全タンパク質含有量を定量化するためのＳＹＰＲＯ（ＴＭ）Ｒｕｂｙ染料を用いる後染色を、例１に概説したステップＢおよびＣに従って行う。
【００５４】
（例４）
本発明では、Ｃｙ５．５またはＣｙ７などの追加のＣｙＤｙｅを用いた４重化ＤＩＤＥ解析が容易になる。第４のサンプルに追加のＣｙＤｙｅ−ＮＨＳ−エステル共役で標識を付け、例２で述べたように、Ｃｙ２標識化内部標準、Ｃｙ３標識化サンプル、およびＣｙ５標識化サンプルで共に分離する。Ｃｙ７蛍光色素を組み込む場合は、波長７３５ｎｍ、パルスレート４０ＭＨｚ（２５ｎｓサイクル)のパルスダイオードレーザと、７８０±３０ｎｍ（７８０ｂｐ６０）のエミッション・フィルタで励起して、可視化ステップを例２に追加する。Ｃｙ５．５を組み込む場合は、二重検出器を用いる別の方法を適用すれば全スキャン時間を大幅に減らすことができる。原理の証明測定から、Ｃｙ２およびＣｙ３の励起波長の重なりは、４９０ｎｍの単一ダイオードレーザで両蛍光色素を励起するのに十分であることが分かった。
【００５５】
放射光線（ｅｍｉｔｔｅｄ  ｌｉｇｈｔ  ｂｅａｍ）を波長に基づいて分割するのに２色フィルタを適用すると、二重検出器を用いることにより両方の蛍光色素からの発光を同時に検出することができる。Ｃｙ５とＣｙ５．５のスペクトルの重なりは染料対Ｃｙ２／Ｃｙ３のものに似ているので、６４０ｎｍのパルスレーザと、適当な２色フィルタとエミッション・フィルタ６７０ＢＰ２０および７１ＢＰ４０ｎｍとの組合せとをそれぞれ用いて、単一スキャン／二重検出法をこの染料対にも適用することができる。各検出器／スキャンプロトコルからのデータは多次指数関数的蛍光減衰当てはめソフトウエアモジュールにエクスポートする。各ＣｙＤｙｅに対応する当てはめた減衰曲線の下のＡＵＣは画素毎に計算する。減衰曲線の多次指数関数的当てはめにより、各特定の波長の光子レベルでのバックグラウンド放射を容易に除去することができる（図６）。各Ｘ，Ｙ座標毎に得られるＡＵＣ値を、ＤＩＧＥ機能を持つ２−ＤＧＥ解析ソフトウエアで解析するのに適した４つの別個の重ね合わせ可能な３２ビットのグレースケール・ティフファイルに合併する。
【００５６】
（例５）
この例は、最近公表された、Ｓｐｉｅｓｓ他（文献１５）が飽和ＤＩＧＥ多重化を用いて、酸化剤に曝した後のシステインの酸化すなわち付加物形成を検出したという、タンパク質チオールのレドックス状態を決定するための方法の変更を含む。手短に述べると、非チオ尿素溶解バッファを用いて溶解洗浄により気道上皮タンパク質を隔離し（文献１４）、還元したチオールに標識を付けるために過剰なマレイミド共役Ｃｙ３標識（２５０ｎＭ  Ｃｙ３／ｍｇタンパク質、＞１０倍過剰）で培養する。自由（過剰）Ｃｙ３標識の加水分解を完全にするために培養を１６時間行う。次に、トリブチルホスフィンを２４ｍＭの最終濃度になるまで加えてジスルフィド結合を還元する。Ｃｙ５マレイミドを用いる第２の飽和標識化反応を行い、還元されたジスルフィド結合のシステインに標識を付ける。区別して標識を付けたタンパク質サンプルを、例１に述べたように２−ＤＧＥにより分離する。元の方法では、一定光源を励起に用いるＴｙｐｈｏｏｎ８６００蛍光スキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの一部門）を用いてＣｙ３およびＣｙ５のレベルを定量化した。銀染料により決定された全タンパク質含有量（図１参照）を正規化に用いた。
【００５７】
本発明により、上に述べた方法の感度、特異性、およびダイナミックレンジを、例２および例３に述べたプロトコルの組合せにより改善することができる。手短に述べると、これは、例２に述べたＣｕＴＥＤＧＥ技術を用いてＣｙＤｙｅを可視化した後、例３に述べたＣｕＴＥＤＧＥ  ＳＹＰＲＯ（ＴＭ）Ｒｕｂｙプロトコルを用いて全タンパク質含有量を定量化することを含む。
【００５８】
（例６）
ぜんそく患者並びに健康な対象群から得られるブロンキオアルベオラ（broncheoalveolar）洗浄（ＢＡＬ）流体からのタンパク質を、免疫ブロット法によりＩＬ−１３含有量について解析する。手短に述べると、メーカの使用説明書（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｎｔ，ＯＲ）に従ってＢｉｏＭａｘ遠心フィルタを用いてＢＡＬ流体タンパク質を濃縮し、例１に述べたように２−ＤＧＥで分離する。電気泳動の後に、ＩＳＯ−ＤＡＬＴシステムを１０℃、２５０ｍＡで１９時間にわたって、２５ｍＭのトリス、１９２ｍＭのグリシン、１０％（ｖ／ｖ）のメタノール内で用いて、タンパク質をＳｅｑｕｉｂｌｏｔ（ＴＭ）ポリビニルジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（０．２μｍの細孔サイズ）にブロットする（blotted）。その後、ミルクタンパク質で膜のブロッキングを行い、ＰＶＤＦ膜をモノクローナル抗ＩＬ−１３一次抗体で培養する。一次抗体はＣｙ５共役抗マウス二次抗体を用いて検出する。
【００５９】
Ｃｙ５標識を６４０ｎｍのパルスダイオードレーザ（４０ＭＨｚ）で励起して可視化し、５０ｐｓの応答速度を持つＡＰＤ検出器および６７０ｂｐ２０エミッション・フィルタにより蛍光を定量化する。データは、多数の減衰アルゴリズムを同時に当てはめる能力を有する多次指数関数的蛍光減衰当てはめソフトウエアモジュールにエクスポートする。減衰曲線全体の下のＡＵＣを画素毎に計算する。減衰曲線の多次元当てはめにより、各特定の波長の光子レベルでのバックグラウンド放射を容易に除去することができる。各Ｘ，Ｙ座標毎に得られるＡＵＣ値を、２−ＤＧＥ解析ソフトウエアで解析するのに適した３２ビットのグレースケール・ティフファイルに合併する。
【００６０】
本発明について特定の実施の形態を参照して説明したが、認識されるように、多くの変更、修正、および実施の形態が可能である。したがって、全てのかかる変更、修正、および実施の形態は本発明の精神および範囲内にあると見なすべきである。
【図１】
2011521247.tif 000003
【図２Ａ】
2011521247.tif 000004
【図２Ｂ】
2011521247.tif 000005
【図２Ｃ】
2011521247.tif 000006
【図３Ａ】
2011521247.tif 000007
【図３Ｂ】
2011521247.tif 000008
【図３Ｃ】
2011521247.tif 000009
【図３Ｄ】
2011521247.tif 000010
【図４】
2011521247.tif 000011
【図５】
2011521247.tif 000012
【図６】
2011521247.tif 000013
【図７】
2011521247.tif 000014
【国際調査報告】
2011521247.tif 000015
2011521247.tif 000016