(57)【要約】  本発明は、ｍｉＲ−１２２阻害剤およびＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤による併用治療によるＣ型肝炎（ＨＣＶ）感染症の治療に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤、および／または任意にリバビリン（またはそのウイルス的に活性な誘導体）と併用してＣ型肝炎（ＨＣＶ）の治療において用いるための、ｍｉＲ−１２２阻害剤。
【請求項２】
請求項１または２に記載のｍｉＲ−１２２阻害剤であって、ｍｉＲ−１２２阻害剤が次式：
【化１】
2014523429.tif 000038
（式中、小文字は、ＤＮＡ単位を特定し、大文字は、ＬＮＡ単位を特定し、ｍＣは、５−メチルシトシンＬＮＡを特定し、下付き文字ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を特定し、ＬＮＡ単位は、ＬＮＡ残基の後のｏ上付き文字により特定されるベータ−Ｄ−オキシである）からなるかまたは含むオリゴマーである、ｍｉＲ−１２２阻害剤。
【請求項３】
ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤が、ＰＰＩ−４６１（Ｐｒｅｓｉｄｏｌ）、ＡＺＤ−７２９５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＳＺ：ＣＦ１０２、ＢＭＳ−７９００５２およびＢＭＳ−８２４３８３からなる群から選択される、請求項１または２に記載のｍｉＲ−１２２阻害剤。
【請求項４】
ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤が、ＢＭＳ−７９００５２である、請求項１〜２のいずれか一項に記載のｍｉＲ−１２２阻害剤。
【請求項５】
治療が、インターフェロンフリーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のｍｉＲ−１２２阻害剤。
【請求項６】
治療が、ＨＣＶ  ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤およびＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ  ポリメラーゼ阻害剤（例えば、非ヌクレオシド阻害および／またはヌクレオシド阻害剤）からなる群から選択される直接作用型薬剤の使用をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｍｉＲ−１２２阻害剤。
【請求項７】
ｍｉＲ−１２２阻害剤およびＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤の併用治療が１年未満、例えば４〜４８週間等、の併用治療期間に行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｍｉＲ−１２２阻害剤。
【請求項８】
併用治療期間の持続時間が４８週間未満、例えば２４週間未満または１３週間未満等、である、請求項７に記載のｍｉＲ−１２２阻害剤。
【請求項９】
併用治療期間が、リバビリンまたはそのウイルス的に活性な誘導体と併用されていてもよい、ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤の非存在下におけるｍｉＲ−１２２阻害剤の治療前期間に先行される、請求項７または８に記載のｍｉＲ−１２２阻害剤。
【請求項１０】
治療前期間が、１〜１２週間の持続時間である、請求項９に記載のｍｉＲ−１２２阻害剤。
【請求項１１】
対象が、インターフェロンまたはＨＣＶ  ＮＳ３／４プロテアーゼの阻害剤またはＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼの阻害剤等の直接作用型薬剤に対し非応答者、部分応答者、再発応答者または無応答者もしくは非応答者である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｍｉＲ−１２２阻害剤。
【請求項１２】
Ｃ型肝炎の治療のための医薬の調製のためのｍｉＲ−１２２阻害剤の使用であって、前記医薬がＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤と併用して用いるための医薬である、使用。
【請求項１３】
有効量のｍｉＲ−１２２阻害剤および有効量のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤を、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）に感染した対象に投与する工程を含む、ＨＣＶに感染した対象におけるＨＣＶ感染症の治療のための方法。
【請求項１４】
有効量のリバビリンまたはそのウイルス的に活性な誘導体を対象に投与することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
オリゴマーが、次式：
【化２】
2014523429.tif 000039
（式中、小文字は、ＤＮＡ単位を特定し、大文字は、ＬＮＡ単位を特定し、ｍＣは、５−メチルシトシンＬＮＡを特定し、下付き文字ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を特定し、ＬＮＡ単位は、ＬＮＡ残基の後のｏ上付き文字により特定されるベータ−Ｄ−オキシである）からなるかまたは含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤が、ＡＺＤ−７２９５、ＳＺ：ＣＦ１０２、ＢＭＳ−７９００５２およびＢＭＳ−８２４３８３からなる群から選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤が、ＢＭＳ−７９００５２である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
治療が、インターフェロンフリーである、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
複数用量のｍｉＲ−１２２阻害剤および複数用量のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤、ならびに任意にリバビリン（またはそのウイルス的に活性な誘導体）が、４〜４８週間等、１年未満の併用治療期間にわたり投与される、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
治療期間の持続時間が、４８週間未満、例えば２４週間未満または１３週間未満等、である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
併用治療期間が、リバビリン（またはそのウイルス的に活性な誘導体）と併用してもよいｍｉＲ−１２２阻害剤の治療前期間に先行される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
対象が、インターフェロンまたはＨＣＶ  ＮＳ３／４プロテアーゼの阻害剤もしくはＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼの阻害剤等の直接作用型薬剤に対し、非応答者、部分応答者、再発応答者または無応答者もしくは非応答者である、請求項１３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ｍｉＲ−１２２阻害剤およびＨＣＶ  ＮＳ５Ａタンパク質の阻害剤および／またはリバビリンによる併用治療によるＣ型肝炎（ＨＣＶ）感染症の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症は、世界中の人口のおよそ３パーセントが罹患し、多くの場合、肝硬変および肝細胞がんをもたらす。ペグ化インターフェロンおよびリバビリンによる標準療法は、重大な副作用を誘導し、５０％未満の患者においてウイルスの根絶を達成する。リバビリンおよびインターフェロンを含むＨＣＶの併用療法は現在、ＨＣＶの承認された治療法である。残念ながら、このような併用療法も、副作用を生じ、多くの場合耐容性が悪く、かなりの割合の患者において主要な臨床課題が生じる。テラプレビルおよびボセプレビル（両者共に、インターフェロンおよびリバビリンに基づく治療法と共に用いるために２０１１年にｍａ承認された）などの、多数の直接作用型薬剤（ｄｉｒｅｃｔ  ａｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（ＤＡＡ）が、ＨＣＶの治療のために開発されたかまたは開発されているが、直接作用型薬剤は、治療の毒性増加、抵抗性の出現につながり、現在まで、インターフェロンフリー（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｆｒｅｅ）の標準治療（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  ｃａｒｅ）にはなっていない。直接作用型薬剤の併用も、薬物−薬物相互作用を生じることができる。現在まで、インターフェロンフリーのＨＣＶ治療法は、承認されていない。したがって、副作用が減少し、インターフェロンフリーであり、抵抗性の出現が減少し、治療期間が減少しおよび／または治癒率が増強した新たな併用療法の必要がある。
【０００３】
関連出願
本願は、両者共に参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／５０２８８４号および２０１１年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６１／５６６０２７号に対する優先権を主張するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の概要
本発明は、ＮＳ５Ａタンパク質阻害剤および／またはリバビリンなどの少なくとも１種のさらに別の抗ウイルス化合物と併用した、ミラビルセン（ｍｉｒａｖｉｒｓｅｎ）などのマイクロＲＮＡ−１２２阻害剤の治療上の使用に関する。この併用治療は、いくつかの実施形態において、インターフェロンフリーであり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ｍｉＲ−１２２阻害剤（本明細書において、ｍｉＲ−１２２アンタゴニストとも称される）およびＨＣＶ  ＮＳ５Ａタンパク質阻害剤を、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）に感染した対象に投与する工程を含む、ＨＣＶに感染した対象におけるＨＣＶ感染症の治療のための方法を提供する。
【０００６】
治療は、リバビリンまたはそのウイルス的に活性な誘導体を対象に投与する工程をさらに含んでもよい。治療は、いくつかの実施形態において、インターフェロンフリーであり得る。
【０００７】
本発明は、ＨＣＶに感染した細胞を、ｍｉＲ−１２２阻害剤および少なくとも１種のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤と接触させることを含む、細胞におけるＨＣＶ感染のレベルを減少させる方法を提供する。方法は、任意に、リバビリンまたはそのウイルス的に活性な誘導体を、細胞に投与する工程をさらに含んでもよい。
【０００８】
本発明は、Ｃ型肝炎の治療のための医薬の調製のためのｍｉＲ−１２２阻害剤の使用であって、該医薬がＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤と併用して用いるためである、使用を提供する。本発明は、Ｃ型肝炎の治療においてＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤と併用して用いるためのｍｉＲ−１２２阻害剤を提供する。
【０００９】
任意に、使用は、リバビリンまたはそのウイルス的に活性な誘導体と併用してもよい。いくつかの実施形態において、使用は、インターフェロンフリーであり得る。
【００１０】
ｍｉＲ−１２２阻害剤は、いくつかの実施形態において、ミラビルセン（ＳＰＣ３６４９）などの、オリゴマーにわたりｈａｓ−ｍｉＲ−１２２マイクロＲＮＡ配列と相補的なオリゴマー（アンチセンスオリゴマー）とすることができる。
【００１１】
【化１】
2014523429.tif 000002
【００１２】
ｍｉＲ−１２２阻害剤が、ＳＰＣ３６４９などの、アンチセンスオリゴマーである場合を含むがこれに限定されないいくつかの実施形態において、ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤は：ＰＰＩ−４６１（Ｐｒｅｓｉｄｉｏ）、ＡＺＤ−７２９５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＢＭＳ−７９００５２およびＢＭＳ−８２４３８３からなる群またはＡＣＨ−２９２８、ＡＣＨ−３１０２（Ａｃｈｉｌｌｉｏｎ）、ＰＰＩ−４６１；ＰＰＩ−６６８（Ｐｒｅｓｉｄｉｏ）、ＡＺＤ７２９５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、以前はＡｒｒｏｗ）、ＥＤＰ−２３９（Ｅｎａｎｔａ）、ＭＫ４８８２（Ｍｅｒｃｋ）、ＩＤＸ７１９（Ｉｄｅｎｉｘ）、ＢＭＳ−７９００５２（ＢＭＳ）、ＧＳ５８８５（Ｇｉｌｅａｄ）、およびＧＳＫ２３３６８０（ＧＳＫ）からなる群から選択され得る。
ＡＬＳ−２１５８（Ａｌｉｏｓ）、ＡＬＳ−２２００（Ａｌｉｏｓ）、ＡＢＴ−０７２（Ａｂｂｏｔｔ）；ＡＢＴ−３３３（Ａｂｂｏｔｔ）、ＭＫ−３２８１（Ｍｅｒｃｋ）、ＴＭＣ６４９１２８（Ｍｅｄｉｖｉｒ／Ｔｉｂｏｔｅｃ）、ＢＩ  ２０７１２７（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａ）、ＲＧ７１２８（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ：メリシタビン）、ＧＳ−９１９０（テゴブビル）（Ｇｉｌｅａｄ）、ＧＳ−７９７７（Ｇｉｌｅａｄ  −  以前に、ＰＳＩ−７９７７と命名）；ＧＳ−９３８（Ｇｉｌｅａｄ）、ＲＧ７１２８（Ｇｌｉｅａｄ／Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）、ＶＸ−２２２（Ｖｅｒｔｅｘ）、ＶＸ−７５９（Ｖｅｒｔｅｘ）、ＡＮＡ５９８（Ａｎａｄｙｓ／Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）、ＩＤＸ１８４（Ｉｄｅｎｉｘ）およびＩＮＸ−１８９（Ｉｎｈｉｂｉｔｅｘ／ＢＭＳ）からなる群から選択し得る。
【００１３】
適切には、ｍｉＲ−１２２阻害剤は、有効量で投与され得る。適切には、ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤は、有効量で投与され得る。適切には、リバビリンまたはそのウイルス的に活性な誘導体は、用いられる場合、有効量で用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】化合物１または化合物２のいずれかによる、任意に治療前（ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）期間を有し、任意に化合物３および任意に化合物４の存在下、または化合物４の非存在下における、いくつかの併用治療レジメンの模式図。併用治療前期間は、化合物１が化合物２と併せて投与され、任意にさらに別の薬剤、化合物３および任意に化合物４と併用される、４〜４８週間の間の期間を指す。任意に、化合物３および任意に化合物４による治療後期間がある。
【図２】Ｇ４１８および表示濃度のＳＰＣ４７２９、ＳＰＣ３６４９もしくはテラプレビルの存在下で、または細胞培養培地単独とＧ４１８の存在下で、２８日間培養細胞を培養し、クリスタルバイオレットで染色した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
併用治療
化合物１：アンチセンスオリゴマーなどの、ｍｉＲ−１２２阻害剤。
化合物２：ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤。
化合物３：リバビリンまたはそのウイルス的に活性な誘導体。
化合物４：インターフェロン。
化合物５：さらに別の直接作用型薬剤。
【００１６】
本発明は、少なくとも化合物１および２をＨＣＶに感染した対象に投与することを含む併用治療に関する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、併用療法は、化合物１、２および３をＨＣＶに感染した対照に投与することを含む。
【００１８】
適切には、併用治療は、少なくとも化合物１および２をＨＣＶに感染した対象に、および任意に化合物３をＨＣＶに感染した対象に投与することを含み、いくつかの実施形態において、併用治療は、インターフェロンフリーである−即ち、併用治療期間の間、化合物４は、対象に投与されない。
【００１９】
いくつかの実施形態において、併用治療は、化合物１、２、３および４をＨＣＶに感染した対象に投与することを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、併用治療は、化合物１および２をＨＣＶに感染した対象に投与することを含み、化合物３は、併用治療期間において対象に投与されない。
【００２１】
いくつかの実施形態において、併用治療は、化合物１および２をＨＣＶに感染した対象に投与することを含み、化合物４は、併用治療期間において対象に投与されない。
【００２２】
いくつかの実施形態において、併用治療は、化合物１および２をＨＣＶに感染した対象に投与することを含み、化合物３および化合物４は、併用治療期間において対象に投与されない。
【００２３】
上述の実施形態において、任意に化合物５も投与され得る。典型的には、化合物３と併用した、化合物１および化合物５の併用的使用の臨床治験が、計画中または進行中のいずれかである。化合物５は、例えば、非ヌクレオシドまたはヌクレオシドＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤および／またはＨＣＶ  ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤であり得る。いくつかの実施形態において、化合物５は、治療期間において投与されない。
【００２４】
リトナビル；１，３−チアゾール−５−イルメチルＮ−［（２Ｓ，３Ｓ，５Ｓ）−３−ヒドロキシ−５−［（２Ｓ）−３−メチル−２−｛［メチル（｛［２−（プロパン−２−イル）−１，３−チアゾール−４−イル］メチル｝）カルバモイル］アミノ｝ブタンアミド］−１，６−ジフェニルヘキサン−２−イル］カルバメートは、直接作用型薬剤と併用して用いられることが多いＣＹＰ３Ａ４阻害剤であり、併用治療期間等において、本発明の併用療法において用いることができる。リトナビルは、チトクロムＰ４５０、特にＣＹＰ３Ａの媒介する一部のＤＡＡの代謝を阻害し、血液における薬物の量およびそれに続くＤＡＡの有効性を増強すると考えられる。いくつかの実施形態において、チトクロムＰ４５０の阻害剤が、併用治療期間において投与される。
【００２５】
２種以上の併用化合物を共にまたは逐次的に用い得る、即ち、本発明の方法において用いたある１種の化合物は、本発明の方法において言及されている他の治療剤のうち１種または複数種に先立ち、その最中にまたはそれに続いて用いることができる（併用治療）。両方（またはそれ以上）の薬剤の併用的使用は、一方の薬剤の治療効果（即ち、患者に対する測定可能な利益が観察される使用後の期間）が、少なくともいくつかの時点において、第２の薬剤の治療効果の期間と同時発生的となるように適切に重複する。いくつかの実施形態において、化合物１および２ならびに任意に３の併用的使用は、同時発生的であり、同時発生的併用治療は、任意に化合物３および／または４の治療が後続し得る。例えば、いくつかの実施形態において、化合物４の投与は、併用治療期間に続き得る。いくつかの実施形態において、化合物４の投与は、化合物１および／または２の最終用量に続き得る。いくつかの実施形態において、化合物４のその後の投与は、化合物３と併用して用い得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、化合物１および化合物２は、共にまたは逐次的のいずれかで用いられる。いくつかの実施形態において、化合物１の少なくとも１回の投与および化合物２の少なくとも１回の投与は、アンチセンスオリゴマーの投与の同日に、あるいは同じ１週間以内に、あるいは同じ２週間以内に、あるいは３または４週間以内に行われ得る。いくつかの実施形態において、化合物３もまた、化合物１および／または化合物２の投与の同日に、あるいは同じ１週間以内に、あるいは同じ２週間以内に、あるいは３または４週間以内に、化合物１および化合物２と共にまたは逐次的に用いられ得る。
【００２７】
いくつかの実施形態において、このような二重（化合物１および２）または三重（化合物１、２および３）（化合物１、２および５）（化合物１、２、３および５）併用療法は、併用治療期間における化合物４（ペグ化インターフェロンアルファ−２ａなどの、インターフェロン）の投与を含まない。
【００２８】
併用治療期間は、最初の併用治療が投与された時点、即ち、対象が少なくとも化合物１および２の両方を投与された時点から、少なくとも４週間、例えば、少なくとも８週間、少なくとも１２週間、少なくとも１６週間、少なくとも２４週間等であり得る。いくつかの実施形態において、併用治療期間は、最大６ヶ月の持続時間であり得る。化合物１、化合物２ならびに任意に化合物３および／または化合物５それぞれの複数の投与は典型的に、併用治療期間において投与される。いくつかのの他の実施形態において、併用期間において化合物４もまた投与され得るが、インターフェロンフリー治療が好ましいことが認識される。
【００２９】
あるいは、またはさらに、化合物４は、少なくとも約８週間、例えば少なくとも約８週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１６週間、少なくとも約２４週間等、最大約２４週間または最大約４８週間等で、併用期間後に投与され得る。化合物４が投与される場合、典型的には化合物３と共に投与される。
【００３０】
本発明は、化合物１（本明細書において、ｍｉＲ−１２２アンタゴニスト、例えば、ミラビルセンとも称される）および化合物３、例えば、リバビリンまたはそのウイルス的に活性な誘導体を対象に投与する工程を含む、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）に感染した対象におけるＣ型肝炎（ＨＣＶ）感染症の治療のための方法をさらに提供する。治療は、いくつかの実施形態において、インターフェロンフリーとすることができる。いくつかの実施形態において、前記方法は、化合物２の投与を含んでも、含まなくてもよい。この点について、本明細書に提供される結果および第２相臨床治験におけるミラビルセン単独療法から得られた結果は、リバビリンと併用したミラビルセンなどの、化合物１の併用的使用が、本明細書に開示されている通り、別の抗ウイルス治療薬、例えば、化合物４、または化合物２、例えばＨＣＶ  ＮＳ５Ａタンパク質阻害剤および／またはＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤および／またはＨＣＶ  ＮＳ３／４Ａタンパク質阻害剤などの非存在下であっても、ＨＣＶ感染症を有効に治療または治癒するのに十分であると思われることを示す。ミラビルセンおよびリバビリンの併用的使用は、ＤＡＡ／ミラビルセンに関連して本明細書に記載されている通りとすることができる。本発明は、化合物３、例えば、リバビリンと併用したＣ型肝炎の治療における使用のための、ｍｉＲ−１２２阻害剤、例えば、ミラビルセンを提供する。本発明は、Ｃ型肝炎の治療のための医薬の調製のためのｍｉＲ−１２２阻害剤の使用であって、前記医薬が化合物３、例えば、リバビリンと併用して用いるための医薬である使用を提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、併用治療期間は、約４週間または約８週間、または約１２週間である。いくつかの実施形態において、併用治療期間は、最小で約４週間、または最小で約８週間、または最小で約１２週間である。いくつかの実施形態において、併用治療の最大期間は、約２４週間、約３６週間または約４８週間である。いくつかの実施形態において、併用治療期間は、約４〜約８週間、約４〜約１２週間、約４〜約２４週間、約４〜約３６週間、約４〜約４８週間、約８〜約１２週間、約８〜約２４週間、約８〜約３６週間、約８〜約４８週間、約１２〜約２４週間、約１２〜約３６週間、約１２〜約４８週間、約２４〜約３６週間、約２４〜約４８週間の持続時間である。
【００３２】
併用治療期間において、少なくとも１用量の化合物１および１用量の化合物２が、対象（患者）に投与される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、化合物２は、併用治療期間の開始に先立ち、例えば約２〜約１２週間の期間、例えば約４週間等で、併用治療期間の開始に先立ち（即ち、治療前／治療の導入に）投与され得る。
【００３４】
直接作用型薬剤に対するウイルス抵抗性の出現は、インターフェロンフリーの処置的治療法を含むＨＣＶ治療法の開発および適用の成功における主要な制限である。ＨＣＶは、忠実度が低くプルーフリーディング活性を欠くＨＣＶ−ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＮＳ５Ｂを用いて複製する。したがって、ＨＣＶは、ＨＣＶゲノムのコピーにおいて高頻度のエラーを伴う。加えて、ＨＣＶは、高い代謝回転速度を有し、したがって、慢性ＨＣＶ感染症（ＣＨＣ）の患者は、複数のＨＣＶ「疑似（ｑｕａｓｉ）」種に感染することになる。抵抗性関連変異体（ＲＡＶ）と呼ばれるこれらの種の一部は、直接作用型抗ウイルス剤（ＤＡＡ）に対しより低い感受性および／またはそれに対する抵抗性を有することになる。ＤＡＡがＣＨＣ患者に与えられると、ＤＡＡに対し高い感受性を有する疑似種の減少が生じるであろう。すると、ＲＡＶが、ＨＣＶ疑似種のプールにおいて優位に立つようになり、未感染の肝細胞に感染することができる。このいわゆる「複製空間における増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｐａｃｅ）」は、ＣＨＣがＤＡＡ単独療法により治療されると急速に起こる（ＤＡＡ単独療法開始の数日以内に見られるウイルス学的なブレイクスルー）、ウイルス学的な失敗の原因となる。ウイルス学的失敗（血液からＨＣＶ  ＲＮＡの初期クリアランス後に見られるウイルス学的ブレイクスルーまたは再発）は、ペグ−ＩＦＮおよびリバビリンと併用してまたはそれなしで複数のＤＡＡが与えられる場合にも起こり得る。ミラビルセンは、肝臓におけるＨＣＶ蓄積に必須のマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１２２を隔離する。ミラビルセンは、肝臓中に分布し、ｍｉＲ−１２２を隔離し、これによりＨＣＶがｍｉＲ−１２２を用いるのを妨げるであろう。結果的に、ＤＡＡに先立ちおよび／またはそれと共にのいずれかでＭＩＲ治療が与えられる場合、複製空間はＲＡＶ増殖から保護され、ウイルス学的な失敗を妨げるであろう。
【００３５】
いくつかの実施形態において、化合物１は、化合物２の投与の例えば少なくとも約１週間または少なくとも約２週間前、例えば化合物２の投与の少なくとも約３週間前等、少なくとも約４週間前等で、化合物２に先立ち対象に投与される。これは、［化合物１］治療前期間と称され得、治療前期間の間、化合物１は、単独で、または任意に化合物３と併用して投与され得る。治療前期間は、例えば、最大で約１２週間の持続時間であり得る−そのようなものとして、併用治療期間の開始の例えば、約２週間〜約１２週間前に開始され得る。典型的には、治療前期間は、化合物２の投与に先立ち、化合物１に対象におけるウイルス負荷を有効に減少させる。これは、化合物２に対する抵抗性の発生の減少または阻止において有用である。いくつかの実施形態において、治療前期間は、１または２用量の化合物１（例えば）ミラビルセン、を含む。化合物１の各（前）用量は、例えば、約５ｍｇｓ／ｋｇ服用、約５ｍｇｓ／ｋｇ服用または約６ｍｇｓ／ｋｇ服用または約７ｍｇｓ／ｋｇ服用または約８ｍｇｓ／ｋｇ服用、約９ｍｇｓ／ｋｇ服用、約１０ｍｇｓ／ｋｇ服用または約１１ｍｇｓ／ｋｇもしくは約１２ｍｇｓ／ｋｇ服用であり得る。いくつかの実施形態において、化合物１（例えば、ミラビルセン）の（例えば、単一）前用量は、化合物２の最初の投与または併用治療期間の約もしくは少なくとも約１週間または少なくとも約２週間前に、または約もしくは少なくとも３週間前に、または約もしくは少なくとも４週間前に投与される。適切には、化合物１（例えば、ミラビルセン）の（前用量）（複数可）は、化合物２の最初の投与または併用治療期間に先立つこと約１２週間以内、例えば、化合物２の最初の投与または併用治療期間に先立つこと約１０または約８週間以内等、である。治療前期間は、いくつかの実施形態において、リバビリンなどの化合物３の対象への投与をさらに含む。
【００３６】
したがって、代替的な実施形態において、ミラビルセンなどの化合物１は、併用治療期間の開始に先立ち（即ち、化合物１治療前／治療の導入）、例えば約２〜約２４週間の期間、例えば併用治療期間の開始の約４週間または約８週間または約１２週間前等で、投与され得る。いくつかの実施形態において、化合物１の治療前期間は、対象における（対象の肝臓における等）化合物１の濃度の、治療上有効なレベルへの増大化を目標とした、治療前期間にわたる化合物１の一連の投与に関与する。このようなものとして、いくつかの実施形態において、治療前期間における化合物１の各投与間の時間間隔は、例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間および毎週からなる群から選択し得る。いくつかの実施形態において、治療前期間の各用量は、例えば、約０．１ｍｇｓ／ｋｇ〜約１０ｍｇｓ／ｋｇの間または０．１〜約１２ｍｇｓ／ｋｇまで、例えば約０．２ｍｇｓ／ｋｇ、約０．３ｍｇｓ／ｋｇ、約０．４ｍｇｓ／ｋｇ、約０．５ｍｇｓ／ｋｇ、約０．６ｍｇｓ／ｋｇ、約０．７ｍｇｓ／ｋｇ、約０．８ｍｇｓ／ｋｇ、約０．９ｍｇｓ／ｋｇ、約１ｍｇｓ／ｋｇ、約２ｍｇｓ／ｋｇ、約３ｍｇｓ／ｋｇ、約４ｍｇｓ／ｋｇ、約５ｍｇｓ／ｋｇ、約６ｍｇｓ／ｋｇ、約７ｍｇｓ／ｋｇ、約８ｍｇｓ／ｋｇ、約９ｍｇｓ／ｋｇ、約１０ｍｇｓ／ｋｇ、約１１ｍｇｓ／ｋｇ、約１２ｍｇｓ／ｋｇ等であり得る。増大化期（ｂｕｉｌｄｉｎｇ−ｕｐ  ｐｈａｓｅ）の後、化合物１の投与は、本明細書に記載されている通り、例えば、毎週、隔週または毎月とし得る。増大化期の後、最小の必要とされる有効投薬量を用いて疾患を新たな低レベルに維持し、同時に、副作用が最小で、投与間に長い時間間隔を取ることにより患者の不自由さが最も少なくなるように、維持投薬量は、例えば、ウイルス力価が減少または他の疾患パラメータが改善されながら、標的組織における化合物の相対的に高い活性または濃度を維持することを目的とする期間投与することができ、その後、各投薬間の間隔を増加させることができる、あるいは各投薬において与えられる投薬量を減少させることができる、あるいはその両方がなされる。
【００３７】
いくつかの実施形態において、増大化期の後、重要な疾患パラメータにおける所望の効果を得るために、標的組織において有効濃度を維持することを目的とする維持投薬量が投与され、そこでは各投与間の時間間隔がより長いため患者の投与の不自由さが回避され、投薬量が最小に維持されて、選択された疾患パラメータにおける効果を依然として維持しながら副作用を回避するであろう。
【００３８】
いくつかの実施形態において、増大化期は、治療前期間において起こり、維持用量は、併用治療期間（の化合物１部）として投与される。
【００３９】
Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）
いくつかの実施形態において、対象は、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）である。いくつかの実施形態において、対象は、代償性硬変である。いくつかの実施形態において、対象は、インターフェロンが禁忌である対象等、インターフェロン（化合物４）治療に耐容性がない。いくつかの実施形態において、対象は、肝臓移植患者である。いくつかの実施形態において、対象は、ＨＩＶおよびＨＣＶの両方に同時感染している。いくつかの実施形態において、対象は、インターフェロン非応答者（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）である。いくつかの実施形態において、対象は、代償性肝臓疾患である。いくつかの実施形態において、対象は、インターフェロンおよび／またはリバビリンによる治療失敗の病歴を有する。
【００４０】
ＤＡＡの開発は、ＤＡＡ治療に対し応答性が乏しいまたは非応答者である（ＤＡＡ失敗）ＨＣＶ対象の特定をもたらした。いくつかの実施形態において、対象は、ＤＡＡ治療に応答が乏しいまたは応答しなかったあるいはＤＡＡ治療の最中にまたはその後に再発した対象等、ＤＡＡ失敗として特定された対象である。この点において、いくつかの実施形態において、ＤＡＡ失敗に関連するＤＡＡ薬剤は、化合物２以外のものである。いくつかの実施形態において、ＤＡＡ失敗に関連するＤＡＡは、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤および／またはＨＣＶ  ＮＳ３／４Ａタンパク質阻害剤からなる群から選択される。ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤は、例えば、いくつかの実施形態において非ヌクレオシド祖媒材またはいくつかの実施形態においてヌクレオシド阻害剤であり得る。いくつかの実施形態において、ＤＡＡ失敗は、本発明の併用治療において用いられるものとは異なるＮＳ５Ａタンパク質阻害剤による。
【００４１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）患者の有意な集団は、インターフェロンによる標準治療に応答性が乏しい。例えば、非応答者および再発者（ｒｅｌａｐｓｅｒ）は、米国におけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症患者の大集団を構成する。本発明の目的のため、用語「非応答者」は、一部の非限定的な実施形態において、インターフェロン治療の結果として有意なウイルス学的応答を提示せず、治療におけるいかなる時点においてもウイルス陰性とはならない、ＨＣＶに感染した対象、例えば、ＨＣＶに感染した霊長類、例えば、ＨＣＶに感染したヒトを指すよう意図されている。「従前の治療」は、次のＣ型肝炎抗ウイルスレジメンのいずれか：標準インターフェロン（ＩＦＮ）単独療法、リバビリン（ＲＢＶ）による標準ＩＦＮ併用治療、ペグ化ＩＦＮアルファ−２ａ単独療法、ペグ化ＩＦＮアルファ−２ｂ単独療法、ＲＢＶによるペグ化ＩＦＮアルファ−２ａ併用療法、ＲＢＶによるペグ化ＩＦＮアルファ−２ｂ併用療法に関与し得るが、これらに限定されない。用語「緩徐応答者（ｓｌｏｗ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）」は、インターフェロン治療法による治療の始まりから約２４週間後までウイルス学的応答を発生させない、ＨＣＶに感染した対象、例えば、ＨＣＶに感染した霊長類、例えば、ＨＣＶに感染したヒトを指し得る。「部分応答者（ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）」は、インターフェロン治療法による治療の開始から約２４週間後までウイルス学的応答を発生させないが、ウイルス学的応答が治療終了時に維持されない、ＨＣＶに感染した対象、例えば、ＨＣＶに感染した霊長類、例えば、ＨＣＶに感染したヒトを指す。用語「部分応答者」は、１２週目にＨＣＶ  ＲＮＡの２ｌｏｇ１０以上の減少を示すが、ペグインターフェロン／ＲＢＶによる治療終了時にＨＣＶ  ＲＮＡ検出不能を達成しない患者を指す。用語「再発者」は、ＨＣＶ  ＲＮＡ陰性であり、治療の終了まで維持されるウイルス学的応答を有するが、治療後６ヶ月前に再発が起こる、ＨＣＶに感染した対象、例えば、ＨＣＶに感染した霊長類、例えば、ＨＣＶに感染したヒトを指し得る。用語「非応答者」、「緩徐応答者」、「部分応答者」および「再発者」は、必ずしも相互に排他的ではない。いくつかの実施形態において、用語は、下の通りに定義され得る。
【００４２】
【表１】
2014523429.tif 000003
【００４３】
血漿ＨＣＶレベルは、例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＴａｑｍａｎアッセイまたはＲｅａｌＴｉｍｅ  ＨＣＶアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ）を用いて決定し得る。
【００４４】
対象は、１ａ、１ｂ、２、３、４、５または６からなる群から選択される遺伝子型のＨＣＶに感染し得る。いくつかの実施形態において、ＨＣＶの遺伝子型は、１ａである。いくつかの実施形態において、ＨＣＶの遺伝子型は、１ｂである。いくつかの実施形態において、対象は、治療未経験である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、併用治療期間の約２週目または約４週目または約８週目におけるウイルス負荷が、事実上ゼロである（ＲＮＡ−ｖｅ）場合、併用治療等、治療期間の持続時間は、約８〜約２４週間、例えば約１２週間等であり得る。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明の併用治療は、ＨＣＶ感染のレベル（力価）を、少なくとも２倍、例えば少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、減少させることができる。いくつかの実施形態において、併用治療は、対象における持続性ウイルス学的応答（ＳＶＲ）をもたらす。いくつかの実施形態において、併用治療は、治癒をもたらし得る。
【００４７】
ＨＣＶ活性の阻害剤の活性は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）およびインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイを含む、当業者に公知の適切な方法のいずれかにより測定され得る。例えば、式Ｉで表される化合物のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ阻害活性は、Ｂｅｈｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ，  ＥＭＢＯＪ．  １９９６  １５：１２−２２、Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９８  ２４９：１０８−１１８およびＲａｎｊｉｔｈ−Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００１  ７５：８６１５−８６２３に記載されている標準アッセイ手順を用いて決定することができる。
【００４８】
本明細書で使用される用語「治療上有効量」は、個体における疾患の症状の低減に必要とされる量を意味する。用量は、特定の症例それぞれにおける個々の要件に対し調整されるであろう。この投薬量は、治療される疾患の重症度、患者の年齢および一般的健康状態、患者を治療している他の医薬、投与の経路および形態ならびに関与する医師の嗜好性および経験等、多数の因子に応じて幅広い限度内で変動し得る。経口投与のため、１日当たり約０．０１〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重の間の毎日の投薬量は、単独療法および／または併用療法において適切となるべきである。毎日／毎週／毎月の投薬量は、例えば、１日当たり約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重の間、例えば０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の間、０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の間、または１日当たり１．０〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の間であり得る。よって、７０ｋｇの人物への投与のため、いくつかの実施形態において、投薬量範囲は、１日当たり約７ｍｇ〜０．７ｇとなり得る。毎日の投薬量は、単一投薬量として、または分割投薬量、典型的には１日当たり１〜５回の間の投薬量、で投与することができる。一般に、いくつかの実施形態において、治療は、化合物の最適用量に満たないより少ない投薬量で開始される。その後、投薬量は、個々の患者に最適の効果が達成されるまで小さい増分で増加させ得る。本明細書に記載されている疾患の治療における当業者は、過度の実験法によることなく、個人的な知識、経験および本願の開示を信頼して、所定の疾患および患者に対する本発明の化合物の治療上有効量を確認することができるであろう。
【００４９】
本発明の化合物および任意に１つ以上の追加的な抗ウイルス剤の治療上有効量は、ウイルス負荷の減少または治療法に対する持続性ウイルス学的応答の達成に有効な量である。持続性応答の有用な指標は、ウイルス負荷に加えて、肝線維症、血清トランスアミナーゼレベルの上昇および肝臓における壊死性炎症性活性を含むが、これらに限定されない。例示的であって限定的ではないと意図されるマーカーの一般的な一例は、標準臨床アッセイにより測定される血清アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）である。本発明のいくつかの実施形態において、有効な治療レジメンは、ＡＬＴレベルを約４５ＩＵ／ｍＬ血清未満に減少させるレジメンである。
【００５０】
本明細書で用いられる用語、「持続性ウイルス学的応答」（ＳＶＲ；「持続性応答」または「耐久的応答」とも称される）は、血清ＨＣＶ力価の観点から、ＨＣＶ感染の治療レジメンに対する個体の応答を指す。例えば、「持続性ウイルス学的応答」は、治療の休止に続く少なくとも約１ヶ月、少なくとも約２ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約４ヶ月、少なくとも約５ヶ月および／または少なくとも約６ヶ月の期間、患者の血清において見出される検出可能なＨＣＶ  ＲＮＡがないこと（例えば、血清１ミリリットル当たり約５００未満、約２００未満または約１００未満のゲノムコピー）を意味し得る。Ａｂｂｏｔ  ＨＣＶ検出キットを用いる場合、例えば、ＳＶＲは、＜１２ＩＵ／ｍｌであると考慮される。ＳＶＲ２４またはＳＶＲ４８が典型的に用いられる。ＳＶＲ２４は、治療休止に続く２４週目に検出可能なＨＣＶ  ＲＮＡがないことをいう。ＳＶＲ４８は、治療休止に続く４８週目に検出可能なＨＣＶ  ＲＮＡがないことをいう。ＳＶＲ率は、特定の治療レジメンにおいて、ＳＶＲを例証する対象の割合をいう。ＳＶＲ２４は、治療休止に続く２４週目に検出可能なＨＣＶ  ＲＮＡがないことをいう。遺伝子型１および４は通例、ＳＶＲを達成するためにより長い治療持続時間を必要とし、通常、遺伝子型１のＨＣＶに感染した患者の４０〜５０％のみが、ペグインターフェロン／ＲＢＶ治療においてＳＶＲを示す。黒人およびＨＩＶに感染した患者におけるＳＶＲ率は通常、２０〜３０％のみである。本発明の併用治療は、ＳＶＲ達成に必要とされる期間を減少させ得る。本発明の併用治療は、ＳＶＲ率を増加させ得る。
【００５１】
化合物２に対する抵抗性。ＮＳ５Ａポリメラーゼ阻害剤などの、直接作用型薬剤に対する抵抗性の発生は、クリニックにおいてこれらの化合物を利用するにあたっての主要な関心である。したがって、直接作用型薬剤に対する抵抗性の発生を回避するまたは発生の有病率を減少させるＨＣＶの治療を提供する必要がある。本発明の目標は、直接作用型薬剤、ＮＳ５Ａタンパク質阻害剤を、ｍｉＲ−１２２の阻害剤と併用することによりこれが達成できることである。
【００５２】
臨床プロトコールの非限定例
薬物／薬物相互作用試験：これは、例えば、健康な対象において同時投与した場合の、ミラビルセンおよび化合物２の安全性、耐容性および薬物動態を評価するためのオープンラベル薬物相互作用試験である。およそ５名の対象が、１日目に単一用量の化合物２を投与され、２４時間連続的血液採取されて、テラプレビルの単一用量の薬物動態プロファイルを評価する。対象は、ＴＩＤ用量の化合物２を５日間（２〜６日目）受ける。７日目に、対象は、さらなる単一用量の化合物２を受け、２４時間連続的に薬物動態血液試料を採取される。対象は、８、１５、２２、２９および３６日目に単一用量のミラビルセン（７ｍｇ／ｋｇ）を受ける。１５日目に、対象は、２４時間連続的血液および尿採取に供されて、ミラビルセンの単一用量の薬物動態プロファイルを評価する。単一の薬物動態血液試料は、ミラビルセンの第３および第４用量の直前の２２および２９日目に採取され（て、トラフ濃度を決定す）る。３０日目に、単一用量の化合物２が投与され、対象は、２４時間連続的に薬物動態血液試料を採取されるであろう。対象は、ＴＩＤ用量の化合物２を５日間（３１〜３５日目）受ける。３６日目に、対象は、さらなる単一用量の化合物２および単一用量のミラビルセンを受け、続いて２４時間連続的血液採取されて、化合物２およびミラビルセン両方の薬物動態プロファイルを評価する。さらに、尿は、２４時間の期間採取されて、ミラビルセンの薬物動態プロファイルを評価する。対象は、４３、５０、５７、６４および７１日目に毎週の経過観察来診に戻り、合計試験参加持続時間１２週間で（スクリーニングを除外）７８日目に試験来診を終了した。安全性および耐容性は、有害事象、身体検査、バイタルサイン、日常的臨床安全性検査室評価および心電図の評定により評価されるであろう。
【００５３】
複数の異なるＤＡＡの間の臨床治験において、薬物−薬物相互作用は、有害事象をもたらし得る。ミラビルセンは、単独療法臨床治験においてＨＣＶの顕著なノックダウンを示した（例えば、実施例６を参照）。さらに、ミラビルセンは、チトクロム４５０機序により代謝されず、本明細書に記載されているＨＣＶ併用治療における使用に特に適した非直接作用型薬剤であると考慮される。この点において、治療プロファイルは、化合物２および／または化合物３との併用のいずれかにおいて、これをインターフェロンに基づく治療の理想的な代用となる。実際に、本出願人らの結果は、ミラビルセンが、インターフェロンアルファ−２ｂよりも少なくとも１桁大きい治療指数で優れた毒性プロファイルを有することを示す。臨床治験、安全性および耐容性を評価するための４週間臨床治験において、ミラビルセンによる治療は、検出を下回るＨＣＶ力価の低下において有効であった。ミラビルセンは、全ＨＣＶ遺伝子型に対してインビトロで有効であることも証明した。いくつかの実施形態において、併用治療は、リトナビルなどのチトクロムＰ４５０阻害剤の非存在下で行われる。
【００５４】
リバビリンを伴ってもよい化合物１（ミラビルセン）および化合物２（例えば、ＢＭＳ７９００５２−ダクラタスビル）は、併用療法（ＭＩＲ＋ＤＡＡ）の最初の１２週間以内のウイルス学的なブレイクスルーを妨げ、併用療法の最後の用量の後１２、２４および４８週目におけるＳＶＲをもたらし得る。ミラビルセンは、単独療法として（例えば、２９日間にわたる４または５用量）４週間服用され、次に、リバビリンあり（コホート１）およびなし（コホート２）で化合物２と併用してさらに（例えば）１２週間続ける。治療に先立つ血漿ＨＣＶ  ＲＮＡ＞７５，０００ＩＵ／ｍＬを有する２０名の慢性ＨＣＶ、遺伝子型１治療未経験の対象において、ＨＣＶウイルス負荷は、８（ＲＶＲ）、２８（ＳＶＲ１２）および４０（ＳＶＲ２４）週目ならびにＳＶＲ４８に決定される。試料は、抵抗性解析およびウイルスブレイクスルー／再発のために採取される。化合物１（例えば、ミラビルセン）の治療前投薬は、例えば７ｍｇ／ｋｇ×４毎週用量（適切には、１、８、１５、２２日目）であり得る。本明細書において他の治療前用量レジメン（ｒｅｇｉｍｅ）が記載されている（例えば、例えば最大１２ｍｇｓ／ｋｇの１または２（前）用量）。併用期間の投薬は、例えば、７ｍｇ／ｋｇの初期用量、続く５週目／２９日目に開始する５ｍｇ／ｋｇのその後の投薬、および続く１６週目（１１２日目）までの２週間毎の５ｍｇ／ｋｇとし得る。リバビリンは、１００ｍｇ／日＜７５ｋｇｓまたは１２００ｍｇ／日＞７５ｋｇで服用することができる。化合物２（例えば、ＢＭＳ７９００５２−ダクラタスビル）は、例えば併用治療期間において２０〜９０ｍｇＱＤ投与され得、任意にリトナビルと併用して用いられる。
【００５５】
併用治療による進行中または計画中の臨床治験の例
・ＧＳ−９２５６（ＰＩ）＋テゴブビル（ＮＮＩ）＋ＧＳ−５８８５（ＮＳ５Ａ）＋ＲＢＶ（例えば、ＧＴ１治療未経験）
・ＢＭＳ−６５００３２（ＰＩ）＋ＢＭＳ−７９０５２（ＮＳ５ａ）＋／−ｐｅｇＩＦＮ／ＲＢＶ（例えば、ＧＴ１治療経験）
・ＢＭＳ−７９００５２（ＮＳ５Ａ）＋ＰＳＩ−７９７７（ＮＵＣ）＋／−ＲＢＶ（例えば、ＧＴ１治療未経験）
【００５６】
上述の併用は、本発明における化合物２および化合物５（または複数の化合物５）ならびに任意に化合物３を示し得る。
【００５７】
いくつかの実施形態において、化合物５は、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ阻害剤であり得、例えば、次のものからなる群から選択される：
【００５８】
【表２】
2014523429.tif 000004
【００５９】
ＧｉｌｅａｄによるＰｈａｒｍａｓｓｅｔの取得後にＧＩ−７９７７としても知られているＰＳＩ−７９７７は、活性抗ウイルス剤２’−デオキシ−２’−α−フルオロ−β−Ｃ−メチルウリジン−５’−一リン酸へと代謝されるプロドラッグである。
【００６０】
【化２】
2014523429.tif 000005
【００６１】
典型的な用量は、例えば、４００ｍｇである。
【００６２】
ＶＸ−２２２
【００６３】
【化３】
2014523429.tif 000006
【００６４】
いくつかの実施形態において、化合物５は、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤であり得、例えば、次のものからなる群から選択される：
【００６５】
【表３】
2014523429.tif 000007
【００６６】
テラプレビル
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Telaprevir.svgによると、テラプレビルは、次の構造を有する。
【００６７】
【化４】
2014523429.tif 000008
【００６８】
系統的ＩＵＰＡＣ名：（１Ｓ，３ａＲ，６ａＳ）−２−［（２Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−２−シクロヘキシル−２−（ピラジン−２−カルボニルアミノ）アセチル］アミノ］−３，３−ジメチルブタノイル］−Ｎ−［（３Ｓ）−１−（シクロプロピルアミノ）−１，２−ジオキソヘキサン−３−イル］−３，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ｃ］ピロール−１−カルボキサミド
【００６９】
テラプレビルは、例えば、約２５０〜約１０００ｍｇの間、例えば約７５０ｍｇ／ｋｇ等、の単位用量で投与され得る。治療前期間および／または併用治療期間の持続時間において、典型的には、１日１回、２回、３回または４回、例えば１日３回等行われる。
【００７０】
ボセプレビル
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Boceprevir.svgによると、ボセプレビルは、次の構造を有する：
【００７１】
【化５】
2014523429.tif 000009
【００７２】
系統的ＩＵＰＡＣ名：（１Ｒ，２Ｓ，５Ｓ）−Ｎ−［（２Ξ）−４−アミノ−１−シクロブチル−３，４−ジオキソブタン−２−イル）］−３−｛（２Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル）アミノ］−３，３−ジメチルブタノイル｝−６，６−ジメチル−３−アザビシクロ［３．１．０］ヘキサン−２−カルボキサミド
【００７３】
ボセプレビルは、例えば、約２５０〜約１０００ｍｇの間、例えば約８００ｍｇ／ｋｇ等、の単位用量で投与することができる。治療前期間および／または併用治療期間の持続時間において、典型的には、１日１回、２回、３回または４回、例えば１日３回等、行われる。
【００７４】
化合物１：ｍｉＲ−１２２阻害剤
Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＡＣＳ  ２０１０，  １３２，  ７９７６−７９８１（参照により本明細書に組み込まれる）において報告されている通り、ｍｉＲ１２２の小分子阻害剤をアッセイすることが可能であり、下に例証されているもの等、ｍｉＲ−１２２の小分子阻害剤が知られている。
【００７５】
【化６】
2014523429.tif 000010
【００７６】
数値は、ｍｉＲ−１２２抑圧によるルシフェラーゼ発現を示し、１を超える値は、ｍｉＲ−１２２阻害を示す。
【００７７】
化合物１：アンチセンスオリゴマー
ｍｉＲ−１２２阻害剤は、アンチセンスオリゴマーであり得る
いくつかの実施形態において、抗ｍｉＲ−１２２化合物は、マイクロＲＮＡ−１２２を標的化するアンチセンスオリゴマーである。ｍｉＲ−１２２の配列は、異なる哺乳類種間で十分に保存されている（ｍｉｒｂａｓｅ、Ｓａｎｇｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、英国）。
＞ｈｓａ−ｍｉｒ−１２２前駆体配列（ｍｉＲＢａｓｅ）ＭＩ００００４４２：
ＣＣＵＵＡＧＣＡＧＡＧＣＵＧＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧＵＧＵＣＵＡＡＡＣＵＡＵＣＡＡＡＣＧＣＣＡＵＵＡＵＣＡＣＡＣＵＡＡＡＵＡＧＣＵＡＣＵＧＣＵＡＧＧＣ（配列番号４）
成熟ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２配列（ｍｉＲＢａｓｅ）ＭＩＭＡＴ００００４２１：
ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ（配列番号１）
【００７８】
本発明のマイクロＲＮＡ−１２２アンタゴニストは、ｍｉＲ−１２２（例えば、配列番号１または配列番号４）を標的化するアンチセンスオリゴマーを含むが、これらに限定されない化合物である。アンチセンスオリゴマーは、成熟ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２配列などの、ｍｉＲ−１２２配列の部分と相補的な少なくとも６個の連続核酸塩基を含み得る。
【００７９】
いくつかの実施形態において、抗ｍｉＲ−１２２オリゴヌクレオチドは、基本的にＲＮＡｓｅＨを動員することができないミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）として設計される。基本的にＲＮＡｓｅＨを動員することができないオリゴヌクレオチドは、文献においてよく知られており、例として、国際公開第２００７／１１２７５４号、国際公開第２００７／１１２７５３号または国際公開第２００９／０４３３５３号を参照されたい。ミックスマーは、非限定的な例において２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、３フルオロヘキシトールモノマー（３Ｆ  ＨＮＡ）、ＩＮＡモノマー、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡおよびＬＮＡなどの、親和性増強ヌクレオチドアナログの混合物を含むように設計され得る。さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、いかなるＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドも含まず、親和性増強ヌクレオチドアナログ単独で構成され、このような分子は、トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）とも呼ばれ得る。いくつかの実施形態において、ミックスマーは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡと共に１種類の親和性増強ヌクレオチドアナログのみを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、非限定的な例における２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’−フルオロ−ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＩＮＡモノマー、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡ（２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ）、２’フルオロ−ＤＮＡおよびＬＮＡなどの、１つまたは複数の種類のヌクレオチドアナログ単独で構成される。
【００８０】
長さ
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７〜２５個の（連続する）ヌクレオチド、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の（連続する）ヌクレオチド等、の長さを有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７〜１０個の（連続する）ヌクレオチド、あるいは場合によっては、７〜１６個のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも８個の（連続する）ヌクレオチド、１２〜１５個の間の（連続する）ヌクレオチド等、１０〜１７または１０〜１６または１０〜１５個の間の（連続する）ヌクレオチドの長さである。
【００８１】
基本的にＲＮＡｓｅＨを動員することができないオリゴマー
欧州特許第１２２２３０９号は、ＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に用いることのできる、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ方法を提供する。欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５に提供される方法論を用いて、相補的ＲＮＡ標的に与えられたときに、オリゴヌクレオチドにおいて２’置換がなく、全ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する均等なＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドの少なくとも１０％または２０％未満等、少なくとも５％等、少なくとも１％のｐｍｏｌ／ｌ／ｍｉｎで測定される初速度を有する場合、オリゴマーは、ＲＮａｓｅ  Ｈを動員することができると判断される。
【００８２】
いくつかの実施形態において、欧州特許第１２２２３０９号の実施例９１〜９５により提供される方法論を用いて、相補的ＲＮＡ標的およびＲＮａｓｅＨを与えられたときに、ｐｍｏｌ／ｌ／ｍｉｎで測定されるＲＮａｓｅＨ初速度が、オリゴヌクレオチドにおいて２’置換がなく、全ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基を有する均等なＤＮＡのみのオリゴヌクレオチドを用いて決定される初速度の１０％未満または２０％未満等、５％未満等、１％未満である場合、オリゴマーは、基本的にＲＮＡｓｅＨを動員することができないと判断される。
【００８３】
ミックスマーまたはトータルマーであるオリゴヌクレオチドは通例、基本的にＲＮＡｓｅＨを動員することができず、本出願人らが、用語「基本的にＲＮａｓｅＨを動員することができない」を本明細書において用いる場合、いくつかの実施形態において、このような用語は、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡによるＤＮＡミックスマーを用いる場合等、このようなオリゴマーが実際に、ＲＮａｓｅＨを動員する有意な能力を保有する場合であっても、本明細書に定義される用語ミックスマーまたはトータルマーと置き換えることができることを認識するべきである。
【００８４】
本発明において有用なマイクロＲＮＡ−１２２のモジュレーターの例
本発明における使用に特に好ましい化合物は、マイクロＲＮＡ−１２２を標的化する化合物である−そのようなものとして、ＨＣＶに感染した対象における等、細胞におけるマイクロＲＮＡ−１２２を阻害することができるオリゴマーが挙げられる。ｍｉＲ−１２２の配列は、マイクロＲＮＡデータベース「ｍｉｒｂａｓｅ」（http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/）において見出すことができる。マイクロＲＮＡ−１２２の阻害剤は、多数の特許および論文に記載されており、当業者によく知られている。いくつかの実施形態において、有用なマイクロＲＮＡ−１２２モジュレーターについて記載するこのような文書の例は、全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００７／１１２７５４号、国際公開第２００７／１１２７５３号または国際公開第２００９／０４３３５３号である。いくつかの実施形態において、このようなマイクロＲＮＡ−１２２モジュレーターは、全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００９／２０７７１号、国際公開第２００８／９１７０３号、国際公開第２００８／０４６９１１号、国際公開第２００８／０７４３２８号、国際公開第２００７／９００７３号、国際公開第２００７／２７７７５号、国際公開第２００７／２７８９４号、国際公開第２００７／２１８９６号、国際公開第２００６／９３５２６号、国際公開第２００６／１１２８７２号、国際公開第２００５／２３９８６号または国際公開第２００５／１３９０１号に記載されているモジュレーターである。
【００８５】
いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡ−１２２アンタゴニストは、ｍｉＲ−１２２またはその（相当する）連続する核酸塩基配列と相補的なオリゴマーである。このようなものとして、ｍｉＲ−１２２と相補的なオリゴマーは、ヒトｍｉＲ−１２２配列の一部または全長と相補的な少なくとも７個の連続するヌクレオチドの配列を含むかまたはからなる。この文脈において、一部とは、成熟ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２配列等、マイクロＲＮＡ１２２配列内に見出される配列と１００％相補的な、少なくとも７または少なくとも８等、少なくとも６個の連続するヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ｍｉＲ−１２２と相補的なオリゴマーは、ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２シード（ｓｅｅｄ）配列と相補的な連続するヌクレオチド配列を含むかまたはからなる、即ち、本明細書において「シードマッチ領域」と称される、連続するヌクレオチド配列５’−ＣＡＣＴＣＣ−３’を含むかまたはからなる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、配列５’−ＣＡＣＴＣＣ−３’は、３’末端からカウントしたオリゴマーの位置１〜６、２〜７または３〜８に位置する。いくつかの実施形態において、配列５’−ＣＡＣＴＣＣＡ−３’は、３’末端からカウントしてオリゴマーの位置１〜７または２〜８に位置する。連続するヌクレオチド配列からなるオリゴマーは、５’または３’非ヌクレオチドコンジュゲーション基などの、非ヌクレオチド成分をさらに含むことができる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは、例えば、コンジュゲーション基を含まない純正に連続するヌクレオチド配列からなるかまたは含む。ｍｉＲ−１２２と相補的なオリゴマーは、ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２配列の一部または全体と相補的な７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドの連続する配列を含むかまたはからなり得る。ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２配列の一部のみと相補的なオリゴマーは、２２未満のヌクレオチド長であり得、ｍｉＲ−ｈａｓ−ｍｉＲ１２２配列の一部の補体からなる連続するヌクレオチド配列（即ち、ｈａｓ−ｍｉＲ−１２２の相当する小領域と相補的な連続するヌクレオチド配列）からなるかまたは含み得る。
【００８８】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは、２’ＭＯＥ、２’ＯＭｅおよび／または２’フルオロなどの、２’置換されたヌクレオシドを含むかまたはからなり得る。例として、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，  ＮＡＲ  ２００８  Ｖｏｌ  ３７，  Ｎｏ  １は、劇的に改善されたインビボ効力を有する２’−フルオロ／２’−メトキシエチル（２’ＭＯＥ）修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）モチーフを開示する。Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．は、参照により本明細書に組み込まれる。２’ＭＯＥ／２’フルオロオリゴ（例えば、ミックスマー）は、いくつかの実施形態において、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドの長さであり得る。さらに別の２’ＭＯＥ／２’フルオロオリゴ設計のため、参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６１／５６６０２７号明細書（２４頁４行〜２６頁１３行を参照されたい。
【００８９】
化合物１として用い得る他のオリゴマー化合物は、ｍｉＲｂａｓｅにおいて公表されるマイクロＲＮＡを標的化する抗ｍｉＲを開示し、特に参照により本明細書に組み込まれる、本発明の方法において用いることのできるオリゴマーを提供する国際出願ＰＣＴ／ＤＫ２００８／０００３４４号の表１に開示されるオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。均等な抗ｍｉＲは、成熟マイクロＲＮＡ−１２２の−２〜−８／−９または−１０位置（７、８または９塩基長）（マイクロＲＮＡの末端５’ヌクレオチド（即ち、−１位置）からカウントして）をマッチさせることにより設計することができる。
【００９０】
【表４】
2014523429.tif 000011
【００９１】
マイクロＲＮＡ−１２２を標的化するさらに別のＬＮＡ化合物。本発明の方法において用いることのできる国際出願ＰＣＴ／ＤＫ２００８／０００３４４号において開示される次の特異的な化合物。
【００９２】
【表５】
2014523429.tif 000012
【００９３】
用いることのできるｍｉＲ−１２２を標的化するさらに別の特異的な化合物は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００７／１１２７５４号の表１および国際公開第２００７／１１２７５３号において開示される化合物である。用い得るｍｉＲ−１２２を標的化するさらに別の特異的な化合物は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６１／５６６０２７号明細書の表４において開示される化合物である。
【００９４】
ミラビルセン（ＳＰＣ３６４９）
好ましい実施形態において、次式を有するアンチセンスオリゴマーは、ミラビルセン（ＳＰＣ３６４９）である：
【００９５】
【化７】
2014523429.tif 000013
【００９６】
（式中、小文字は、ＤＮＡ単位を特定し、大文字は、ＬＮＡ単位を特定し、ｍＣは、５−メチルシトシンＬＮＡを特定し、下付き文字ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を特定し、ＬＮＡ単位は、ＬＮＡ残基の後のｏ上付き文字により特定されるベータ−Ｄ−オキシである）。
【００９７】
化合物２：ＮＳ５Ａ阻害剤
次表に開示されているような、現在臨床治験下にある多数のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ（タンパク質）阻害剤が存在する。
【００９８】
【表６】
2014523429.tif 000014
【００９９】
【化８】
2014523429.tif 000015
【０１００】
【化９】
2014523429.tif 000016
【０１０１】
【化１０】
2014523429.tif 000017
【０１０２】
ＢＭＳ−７９００５２
いくつかの実施形態において、化合物２はＢＭＳ−７９００５２、ダクラタスビルとしても知られる（Ｂｒｉｓｔｏｌ-Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂより）、である。ＢＭＳ−７９００５２はまた、ＥＢＰ８８３、またはカルバミン酸Ｎ，Ｎ−［［１，１’−ビフェニル］−４，４’−ジイルビス［１Ｈ−イミダゾール−５，２−ジイル−（２Ｓ）−２，１−ピロリジンジイル［（１Ｓ）−１−（１−メチルエチル）−２−オキソ−２，１−エタンジイル］］］ビス−，Ｃ，Ｃ’−ジメチルエステルとしても知られ得る。
【０１０３】
ＢＭＳ−７９００５２はまた、ＡｐｉｓＣｈｅｍｉｃａｌからも利用でき、ＣＡＳ登録番号１００９１１９−６４−５である、ジメチル（２Ｓ，２’Ｓ）−１，１’−（（２Ｓ，２’Ｓ）−２，２’−（４，４’−（ビフェニル−４，４’−ジイル）ビス（１Ｈ−イミダゾール−４，２−ジイル））ビス（ピロリジン−２，１−ジイル））ビス（３−メチル−１−オキソブタン−２，１−ジイル）ジカルバメートとして記載される。
【０１０４】
化合物３および４：標準治療−２０１１年２月より前に、ＨＣＶ感染の標準治療は、化合物４（インターフェロン）と化合物３（リバビリン）の併用であった。２０１２年６月の時点では、ＳＯＣは、依然として、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤、テラプレビルまたはボセプレビルと併せて用いるＩＦＮ／ＲＢＶ併用に依存している。
【０１０５】
典型的な以前の標準治療レジメンは、４８週間の期間のペグインターフェロンアルファ−２ｂ（１．５マイクログラム／ｋｇ週１回）プラスリバビリン（患者体重に基づき、１日８００〜１４００ｍｇ）の治療であり得る。
【０１０６】
インターフェロンの例は、ペグ化ｒＩＦＮ−アルファ２ｂ、ペグ化ｒＩＦＮ−アルファ２ａ、ｒＩＦＮ−アルファ２ｂ、ｒＩＦＮ−アルファ２ａ、コンセンサスＩＦＮアルファ（インフェルゲン）、フェロン、リアフェロン、インターマックスアルファ、ｒ−ＩＦＮ−ベータ、インフェルゲンおよびアクティミューン、ＤＵＲＯＳ含有ＩＦＮ−オメガ、アルブフェロン、ロクテロン、アルブフェロン、レビフ、経口インターフェロンアルファ、ＩＦＮａＩｐ  ｈａ−２ｂ  ＸＬ、ＡＶＩ−００５、ＰＥＧ−インフェルゲンならびにペグ化ＩＦＮ−ベータを含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
リバビリンアナログおよびリバビリンプロドラッグビラミジン（タリバビリン）は、インターフェロンと共に投与されて、ＨＣＶを制御してきた。いくつかの実施形態において、化合物３は、したがって、抗ウイルス性リバビリンアナログおよび抗ウイルス性リバビリン誘導体ならびにリバビリンプロドラッグも含み得る。
【０１０８】
Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）の例示的な治療選択肢は、インターフェロン、例えば、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ａおよびインターフェロンアルファコン−１を含む。より低頻度のインターフェロン投薬は、ペグ化インターフェロン（その薬物動態プロファイルを有意に改善するポリエチレングリコール部分に付着したインターフェロン）を用いて達成することができる。インターフェロンアルファ−２ｂ（ペグ化および非ペグ化）およびリバビリンによる併用療法は、一部の患者集団に効果的であることも示した。いくつかの実施形態において、インターフェロンは、ペグ化インターフェロン−アルファである。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、インターフェロンは、ペグ化インターフェロンアルファ−２ａである。適切なペグ化インターフェロンアルファ−２ａは、製薬会社Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅにおいて発見されたＰｅｇａｓｙｓ（分枝した４０ｋＤａＰＥＧ鎖によりペグ化）抗ウイルス薬である。これは、二重作用機序−抗ウイルス性および免疫系の両方における−を有する。ペグ化として知られる過程によるインターフェロンへのポリエチレングリコールの添加は、その天然型と比較してインターフェロンの半減期を増強する。この薬物は、慢性Ｃ型肝炎（ＨＩＶ同時感染、硬変、「正常」レベルのＡＬＴの患者を含む）の治療のために世界中で承認されている。ペグインターフェロンアルファ−２ａは、長時間作用性インターフェロンである。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、ＨＣＶに感染した対象は、有効量のリバビリンまたはその抗ウイルス誘導体によりさらに治療される。
【０１１１】
化合物３−リバビリン
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Ribavirin.svgによると、リバビリンの構造は、次の通りである。
【０１１２】
【化１１】
2014523429.tif 000018
【０１１３】
また、系統的ＩＵＰＡＣ名は、１−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）オキソラン−２−イル］−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミドである。
【０１１４】
欧州および米国において、経口（カプセルまたは錠剤）形態のリバビリンは、Ｃ型肝炎の治療において、ペグ化インターフェロン薬と併用して用いられる［１］。
【０１１５】
リバビリン（商品名：Ｃｏｐｅｇｕｓ、Ｒｅｂｅｔｏｌ、Ｒｉｂａｓｐｈｅｒｅ、ＶｉｌｏｎａおよびＶｉｒａｚｏｌｅ）は、重度のＲＳＶ感染症（個々）、Ｃ型肝炎感染症（ペグインターフェロンアルファ−２ｂまたはペグインターフェロンアルファ−２ａと併せて用いる）および他のウイルス感染症に適用される抗ウイルス薬である。リバビリンは、代謝されるときにプリンＲＮＡヌクレオチドに似るプロドラッグである。この形態において、これは、ウイルス複製に必要とされるＲＮＡ代謝に干渉する。これがウイルス複製に正確に影響する仕方は不明である。これに関して多くの機序が提案されてきたが（下の作用機序を参照）、これらのいずれも現在まで証明されていない。複数の機序が、この作用の原因であると思われる。
【０１１６】
リバビリンの主要な観察される重大な有害副作用は、既存の心疾患を悪化させ得る溶血性貧血である。この効果の機序は、赤血球内部におけるリババリンの増大化によるものである。赤血球細胞膜の酸化的損傷は通例、グルタチオンにより阻害される。しかし、リバビリンに起因するＡＴＰレベルの低下により、グルタチオンレベルが損なわれ、酸化的赤血球細胞溶解を許す。赤血球の漸進的減少は、貧血を生じる。貧血は、用量依存的であり、用量を減少させることにより時に補正され得る。リバビリンは、一部の動物種において催奇形物質でもあり、よって、ヒトにおける理論的な生殖リスクを課し、薬物が存在する間中危険が残り、これは、薬物終了の経過後６ヶ月の長さとすることができる。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、抗ウイルス性リバビリン誘導体は、リバビリンの代わりに利用され得る。リバビリンは恐らく、不完全プリン６員環を有するリボシルプリンアナログとして考慮されることが多い。この構造的類似点は、第２の環を部分的に「記入する」試みにおいて、トリアゾールの２’窒素の炭素による交換を歴史的に促した（これにより、イミダゾールにおける５’炭素となる）−−−しかし、大きな効果はなかった。このような５’イミダゾールリボシド誘導体は、５’水素またはハライドにより抗ウイルス活性を示すが、より大きな置換基ほど活性は小さくなり、全てリバビリンよりも活性が低いことを証明した［１３］。このイミダゾールリボシド構造を有する２種の天然物が既に知られていることに留意されたい。ＯＨによる５’炭素における置換は、抗ウイルス特性を有するが許容できない毒性の抗生物質であるピラゾマイシン／ピラゾフリンを生じ、アミノ基への交換は、ごく僅かな抗ウイルス特性を有する天然プリン合成前駆体５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミド−１−β−Ｄ−リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）を生じる。トリアゾール５’炭素の誘導体化またはその窒素への交換（即ち、１，２，４，５テトラゾール３−カルボキサミド）も、３’カルボキサミド窒素のアルキル誘導体化と同様に、相当な活性減少を生じる。リバビリンの２’デオキシリボースバージョン（ＤＮＡヌクレオシドアナログ）は、抗ウイルス剤としての活性を持たず、リバビリンが、その抗ウイルス活性のためにＲＮＡ依存性酵素を必要とすることを強く示唆する。抗ウイルス活性は、三リン酸塩および３’，５’環状リン酸塩を含むリボースヒドロキシルの酢酸塩およびリン酸塩誘導のために保持されるが、これらの化合物は、親分子ほど活性が高くなく、身体における高効率のエステラーゼおよびキナーゼ活性を反映する。タリバビリン（ビラミジン）は、現在までに最も成功したリバビリン誘導体であり、親３−カルボキサミドの３−カルボキサミジン誘導体であり、現在タリバビリンと呼ばれている（前の名称はビラミジンおよびリバミジン）。この薬物は、リバビリンと同様の範囲の抗ウイルス活性を示すが、現在これはリバビリンのプロドラッグであることが知られているため、これは驚くべきことではない。しかし、ビラミジンは、リバビリンよりも低い赤血球捕捉および優れた肝臓標的化という有用な特性を有する。第１の特性は、ＲＢＣへの薬物侵入を阻害するビラミジンの塩基性アミジン基により、第２の特性は恐らく、肝臓組織におけるアミジンをアミドに転換する酵素の濃度増加による。ビラミジンは、第ＩＩＩ相ヒト治験下にあり、いつの日か、少なくとも特定の種類のウイルス性肝炎に対し、リバビリンの代わりに用いることができよう。ビラミジンの僅かに優れた毒物学的特性は、最終的に、リバビリンのあらゆる使用においてそれをリバビリンに置き換え得る。
【０１１８】
アンチセンスオリゴマーの投薬
オリゴマーは、例えば、非経口的に投与され得る。非経口的のため、製剤の皮下、皮内または局所的投与は、滅菌希釈剤、バッファー、浸透圧の調節物質および抗菌薬を含み得る。活性化合物は、徐放特性を有するインプラントまたはマイクロカプセルを含む、分解または身体からの即時排出から保護する担体により調製され得る。静脈内投与のため、好ましい担体は、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水である。他の投与方法、例えば経口、経鼻、直腸投与を用いてもよい。
【０１１９】
典型的に、化合物１の少なくとも２回の逐次投与が、治療を必要としている対象に投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも２回の逐次投与間の投薬間隔は、少なくとも２週間であり、任意に２０週間以下である。いくつかの実施形態において、この組成物は、対象への単一投与の全体または一部を形成する各単位用量等、単位用量形態である。投与の回数は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６回以上の治療等、２回を超えてよい。いくつかの実施形態において、化合物１の各投与間の時間間隔は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０または少なくとも１２５日間等、少なくとも１４日間である。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ミラビルセンなどの、化合物１の各投与間の時間間隔は、１日間、または２日間、３日間、４日間、５日間、６日間もしくは毎週等、それ以上であり得る、あるいは８、９、１０、１１、１２、１３日毎にまたは隔週で投薬してよい。化合物１の各投与は、本明細書に記載されている通り最適化して、有効な治療上の量が患者に投与されることを確実にし得る。いくつかの実施形態において、各用量は、約０．１ｍｇｓ／ｋｇ〜約１０ｍｇｓ／ｋｇまたは約１２ｍｇｓ／ｋｇの間、例えば約０．２ｍｇｓ／ｋｇ、約０．３ｍｇｓ／ｋｇ、約０．４ｍｇｓ／ｋｇ、約０．５ｍｇｓ／ｋｇ、約０．６ｍｇｓ／ｋｇ、約０．７ｍｇｓ／ｋｇ、約０．８ｍｇｓ／ｋｇ、約０．９ｍｇｓ／ｋｇ、約１ｍｇｓ／ｋｇ、約２ｍｇｓ／ｋｇ、約３ｍｇｓ／ｋｇ、約４ｍｇｓ／ｋｇ、約５ｍｇｓ／ｋｇ、約６ｍｇｓ／ｋｇ、約７ｍｇｓ／ｋｇ、約８ｍｇｓ／ｋｇ、約９ｍｇｓ／ｋｇ、約１０ｍｇｓ／ｋｇ、約１１ｍｇｓ／ｋｇ、約１２ｍｇｓ／ｋｇ等、とすることができる。
【０１２１】
投薬量の有効性は、例えば、ウイルスのゲノムの量（力価）により測定され得る。いくつかの実施形態において、増大化期の後、目的が標的組織において相対的に高い活性または濃度の化合物を維持することである期間に維持投薬量を与えながら、例えば、ウイルスの力価を減少または他の疾患パラメータを改善させて、それが達成された後には、最小の必要とされる有効な投薬量を用いて新たな低レベルに疾患を維持しつつ、同時に副作用を最小にして、投与間に長い時間間隔を設けて患者の不自由さが最も少なくなるように、各投薬間の間隔を増加させても、各投薬において与えられる投薬量を減少させても、あるいはその両方を行ってもよい。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、増大化期の後、重要な疾患パラメータにおける所望の効果を得るために、目的が標的組織における有効濃度を維持することである維持投薬量が投与され、そこでは各投与間の時間間隔が長いため患者の投与の不自由さが回避され、投薬量が最小に維持されて、選択された疾患パラメータにおける効果を依然として維持しながら副作用を回避するであろう。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、維持投薬量等、化合物１の少なくとも２投薬量間の時間間隔は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日間、あるいは例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４または少なくとも１２５日間のうちいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態において、維持投薬量などの、前記少なくとも２投薬量間の時間間隔は、少なくとも約１週間、例えば少なくとも約２週間等、例えば少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または少なくとも約１８週間等、のうちいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態において、維持投薬量等、前記少なくとも２投薬量間の時間間隔は、少なくとも１／２ヶ月、例えば少なくとも１、１と１／２、２、２と１／２、３、３と１／２、４または少なくとも４と１／２ヶ月等、のうちいずれか１つから選択される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、化合物１の投与は、患者が活動性疾患の症状、例えば検出可能なＨＣＶ力価を有する間中維持されるであろう。いくつかの実施形態において、治療は、ある期間休止し、その後、化合物の有効な組織濃度を再構築するための高濃度または高頻度の投薬の初期期間により再開し、次いで記載に従って維持治療を行い得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、維持投薬量等、化合物１の少なくとも２投薬量間の時間間隔は、少なくとも約１週間、例えば少なくとも約１４日間等である。いくつかの実施形態において、投薬量間の時間間隔は、少なくとも約２１日間である。いくつかの実施形態において、投薬量間の時間間隔は、少なくとも４週間である。いくつかの実施形態において、投薬量間の時間間隔は、少なくとも５週間である。いくつかの実施形態において、投薬量間の時間間隔は、少なくとも６週間である。いくつかの実施形態において、投薬量間の時間間隔は、少なくとも７週間である。いくつかの実施形態において、投薬量間の時間間隔は、少なくとも８週間である。このような投薬量は、維持投薬量であり得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、血漿などの、対象の循環における化合物１、例えば、ミラビルセンなどのアンチセンスオリゴマーの濃度は、０．０４〜２５ｎＭの間、例えば０．８〜２０ｎＭの間等、のレベルで維持される。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、単位用量等、各投薬において投与される化合物１の投薬量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態において、各投薬において投与される化合物の単位用量等、投薬量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態において、各投薬において投与される化合物の投薬量（単位用量等）は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態において、各投薬において投与される化合物の（単位用量等の）投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態において、各投薬において投与される化合物の投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施形態において、各投薬において投与される化合物の投薬量（単位用量等）は、これらそれぞれが個々の実施形態である、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇの範囲内、例えば約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５、４、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５、６、６．２５、６．５、６．７５、７、７．２５、７．５、７．７５、８、８．２５、８．５、８．７５、９、９．２５、９．５、９．７５、１０、１０．２５、１０．５、１０．７５、１１、１１．２５、１１．５、１１．７５、１２、１２．２５、１２．５、１２．７５、１３、１３．２５、１３．５、１３．７５、１４、１４．２５、１４．５、１４．７５、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または約２５ｍｇ／ｋｇ等、である。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、ミラビルセンなどのオリゴマーなどの、化合物１は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲、例えば１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは約１〜約１２ｍｇ／ｋｇの間等、で服用され得る。投薬間隔は、例えば、１日１回から２ヶ月に１回の間、例えば１週間に１回または２週間に１回から１ヶ月に１回または２ヶ月に１回の間等、であり得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、化合物１の組成物（単位用量等）は、非限定的な例において、静脈内、皮下、腹腔内、脳血管内、鼻腔内等、非経口的投与方法のために作製される。いくつかの実施形態において、投与は経口である。
【０１３０】
適切には、このような組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。国際出願ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号は、適切かつ好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントを提供する−この明細書は、参照により本明細書に組み込まれる。適切な投薬量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との併用、プロドラッグ製剤も、国際出願ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号において提供される−この明細書も、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、化合物１は、水または生理食塩水において投与される。いくつかの実施形態において、化合物１は、静脈内または皮下等、非経口的投与経路により投与される。いくつかの実施形態において、投与経路は、経口投与による（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１１／０４８１２５号を参照）。
【０１３１】
本発明において用いられる化合物１は、いくつかの実施形態において、治療下の患者に重大な副作用を引き起こすことなく治療上有効量を患者に送達するために十分な量で、薬学的に許容される担体または希釈剤などで、単位製剤（即ち、単位用量）とされ得る。
【０１３２】
医薬組成物の投薬量は、治療される病状の重症度および応答性ならびに数日から数ヶ月間続く治療経過、あるいは治癒が起こるまたは病状の縮小が達成されるまでに依存する。最適な投薬スケジュールは、患者の身体における薬物蓄積の測定値から計算することができる。最適投薬量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力に応じて変動し得る。一般に、これは、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であると見出されたＥＣ５０に基づき推定することができる。一般に、投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１ｇであり、１日、１週間または１ヶ月に１回以上与えることができる。投薬の反復速度は、体液または組織における薬物の測定された滞留時間および濃度に基づき推定することができる。
【０１３３】
減少標準治療（Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  Ｃａｒｅ）
本発明に係る併用治療は、いくつかの実施形態において、インターフェロンおよび／またはリバビリンの減少治療を可能にし得る、あるいはいくつかの実施形態において、インターフェロンおよびリバビリン治療を含まない治療を可能にし得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、インターフェロンおよび／またはリバビリン治療の期間は、４８週間未満、例えば３６週間未満、２４週間未満または１２週間未満等、へと減少される。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、インターフェロンおよび／またはリバビリンの減少治療は、より低い単位または一日用量の形態であり得る。
【０１３６】
【表７】
2014523429.tif 000019
【０１３７】
いくつかの実施形態において、化合物４（例えばＰＥＧＡＳＹＳ（商標））の投薬量は、本発明に係る併用治療においてあるいは治療前および／または併用治療後期間の一部として用いる場合、１８０ｍｅｇ未満、例えば１５０ｍｅｇ未満、１２０ｍｅｇ未満、１００ｍｅｇ未満等、である。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、化合物３（例えばＣＯＰＥＧＵＳ（商標））の投薬量は、本発明に係る併用治療においてあるいは治療前および／または併用治療後期間の一部として用いる場合、８００ｍｇ未満、例えば７００ｍｇ未満、６００ｍｇ未満、５００ｍｇ未満、または１６ｍｇ／ｋｇ未満、例えば１４ｍｇ／ｋｇ未満、１３ｍｇ／ｋｇ未満、１２ｍｇ／ｋｇ未満、１０ｍｇ／ｋｇ未満、８ｍｇ／ｋｇ未満等、である。
【０１３９】
用語
本発明の文脈における用語「オリゴマー」は、２個以上のヌクレオチドの共有結合により形成される分子（即ち、オリゴヌクレオチド）を指す。本明細書において、単一のヌクレオチド（単位）は、モノマーまたは単位と称することもできる。いくつかの実施形態において、用語「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「単位」および「モノマー」は、互換的に用いられる。ヌクレオチドまたはモノマーの配列について言及する場合、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵ等、塩基の配列が言及されることが認識されよう。
【０１４０】
オリゴマーは通常、７〜２５単位の連続するヌクレオチド配列からなるかまたは含む。
【０１４１】
様々な実施形態において、本発明の化合物は、ＲＮＡ（単位）を含まない。本発明に係る化合物は、線状分子である、あるいは線状分子として合成されることが好ましい。オリゴマーは、一本鎖分子であり、好ましくは、同一オリゴマー内の均等な領域と相補的な、例えば、少なくとも３、４または５個の連続するヌクレオチドの短い領域（即ち、二重鎖）を含まない。この点について、オリゴマーは、（基本的に）二本鎖ではない。いくつかの実施形態において、オリゴマーは基本的に、ｓｉＲＮＡ等の二本鎖ではない。様々な実施形態において、本発明のオリゴマーは、連続するヌクレオチド領域から完全になることができる。よって、オリゴマーは、実質的に自己相補的ではない。
【０１４２】
用語「相当するヌクレオチドアナログ」および「相当するヌクレオチド」は、ヌクレオチドアナログおよび天然起源のヌクレオチドにおけるヌクレオチドが同一であることを示すよう意図される。例えば、ヌクレオチドの２−デオキシリボース単位がアデニンと結合している場合、「相当するヌクレオチドアナログ」は、アデニンと結合したペントース単位（２−デオキシリボースとは異なる）を含有する。
【０１４３】
本明細書における用語「逆補体（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」、「逆相補的」および「逆相補性」は、用語「補体」、「相補的」および「相補性」と互換的である。
【０１４４】
ヌクレオシドおよびヌクレオシドアナログ
いくつかの実施形態において、用語「ヌクレオシドアナログ」および「ヌクレオチドアナログ」は、互換的に用いられる。
【０１４５】
本明細書で用いられる用語、「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分およびリン酸またはホスホロチオエートヌクレオチド間結合基等の共有結合した基（結合基）を含むグリコシドをいい、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の天然起源のヌクレオチドならびに本明細書において「ヌクレオチドアナログ」とも称される修飾糖および／または塩基部分を含む非天然起源のヌクレオチドの両方を網羅する。本明細書において、単一のヌクレオチド（単位）は、モノマーまたは核酸単位と称することもできる。
【０１４６】
生化学の分野において、用語「ヌクレオシド」は一般に、糖部分および塩基部分を含むグリコシドをいうように用いられ、したがって、オリゴマーのヌクレオチド間のヌクレオチド間結合により共有結合したヌクレオチド単位を指す場合に用いられ得る。バイオテクノロジーの分野において、用語「ヌクレオチド」は多くの場合、核酸モノマーまたは単位を指すように用いられ、オリゴヌクレオチドの文脈におけるそのようなものとして、塩基−「ヌクレオチド配列」等をいい、通常、核酸塩基配列をいう（即ち、糖骨格およびヌクレオシド間結合の存在は暗黙の了解である）。同様に、特に、ヌクレオシド間結合基のうち１個または複数個が修飾されたオリゴヌクレオチドの場合、用語「ヌクレオチド」は、「ヌクレオシド」をいい、例えば、ヌクレオシド間の結合の存在または性質を特定する場合であっても、用語「ヌクレオチド」を用い得る。
【０１４７】
当業者であれば認識するであろうが、オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドは、５’末端基を含んでも含まなくてもよいが、５’ヌクレオチド間結合基を含まない。
【０１４８】
非天然起源のヌクレオチドは、２’置換ヌクレオチド等、二環式ヌクレオチドまたは２’修飾ヌクレオチド等、修飾糖部分を有するヌクレオチドを含む。
【０１４９】
「ヌクレオチドアナログ」は、糖および／または塩基部分における修飾による、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド等の天然ヌクレオチドの変異体である。アナログは原理的に、単に「サイレント」またはオリゴヌクレオチドの文脈において天然ヌクレオチドと「均等」となり得る、即ち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現の阻害に作用する経路における機能的効果がない。そうであるにもかかわらず、このような「均等な」アナログは、例えば、製造がより容易またはより安価である場合、あるいは貯蔵または製造条件に対しより安定的である場合、あるいはタグまたは標識を表す場合、有用となり得る。しかし、好ましくは、アナログは、例えば、標的に対する結合親和性増加および／または細胞内ヌクレアーゼに対する抵抗性増加および／または細胞内への輸送の容易さの増加を生じることにより、オリゴマーが発現阻害に作用する経路における機能的効果を有するであろう。ヌクレオシドアナログの特異的な例は、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ  ＆  Ａｌｔｍａｎｎ；  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １９９７，  ２５，  ４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ２０００，  ３（２），  ２９３−２１３によりならびにスキーム１に記載されている。よって、オリゴマーは、２’−デオキシヌクレオチド（本明細書において一般に、「ＤＮＡ」と称される）［リボヌクレオチド（本明細書において一般に、「ＲＮＡ」と称される）も可］等、天然起源のヌクレオチドの単純な配列を含むかまたはからなり得る、あるいはこのような天然起源のヌクレオチドおよび１つまたは複数の非天然起源のヌクレオチド、即ち、ヌクレオチドアナログの併用であってもよい。このようなヌクレオチドアナログは、標的配列に対するオリゴマーの親和性を適切に増強し得る。
【０１５０】
適切なヌクレオチドアナログの例は、国際公開第２００７／０３１０９１号により提供される、あるいはそこに参照されている。
【０１５１】
ＬＮＡまたは２’−置換糖等、オリゴマーにおける親和性増強ヌクレオチドアナログの組み込みは、特異的に結合しているオリゴマーのサイズを低下させることができ、非特異的なまたは異常な結合が起こる前のオリゴマーのサイズの上限を低下させ得る。
【０１５２】
【化１２】
2014523429.tif 000020
【０１５３】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは、少なくとも１個のヌクレオシドアナログを含む。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、少なくとも２個のヌクレオチドアナログを含む。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、３〜８個のヌクレオチドアナログ、例えば、６または７個のヌクレオチドアナログを含む。さらに最も好ましい実施形態において、前記ヌクレオチドアナログのうち少なくとも１種は、ロックト核酸（ＬＮＡ）である。例えば、ヌクレオチドアナログのうち少なくとも３または少なくとも４または少なくとも５または少なくとも６または少なくとも７または８個は、ＬＮＡとすることができる。いくつかの実施形態において、全ヌクレオチドアナログは、ＬＮＡとすることができる。
【０１５４】
ヌクレオチドのみからなる好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列を指す場合、該配列により定義される本発明のオリゴマーは、オリゴマー／標的二重鎖の二重鎖安定性／Ｔｍを高める（即ち、親和性増強ヌクレオチドアナログ）ＬＮＡ単位または他のヌクレオチドアナログ等、前記配列に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の代わりに、相当するヌクレオチドアナログを含むことができることが認識されよう。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、オリゴマーのヌクレオチド配列と標的配列との間のいかなるミスマッチも、本明細書に記す領域Ｂおよび／または本明細書に記す領域Ｄおよび／またはオリゴヌクレオチドにおけるＤＮＡヌクレオチド等の非修飾部位および／または連続するヌクレオチド配列の５’もしくは３’の領域における等、親和性増強ヌクレオチドアナログ外部の領域において好ましくは見出される。
【０１５６】
ヌクレオチドのこのような修飾の例は、結合親和性を増強しヌクレアーゼ抵抗性増加も提供し得る、２’−置換基を提供するまたは架橋された（ロックト核酸）構造を生じる糖部分の修飾を含む。
【０１５７】
好ましいヌクレオチドアナログは、オキシ−ＬＮＡ（ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ等）および／またはアミノ−ＬＮＡ（ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−アミノ−ＬＮＡ等）および／またはチオ−ＬＮＡ（ベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡおよびアルファ−Ｌ−チオ−ＬＮＡ等）および／またはＥＮＡ（ベータ−Ｄ−ＥＮＡおよびアルファ−Ｌ−ＥＮＡ等）などのＬＮＡである。最も好ましくは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマー内に存在するヌクレオチドアナログ（本明細書において言及されている領域ＡおよびＣにおける等）は、例えば：２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、２’−フルオロ−ＡＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ（インターカレーティング核酸−参照により本明細書に組み込まれるＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  ２００２．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２００２  ３０：  ４９１８−４９２５）単位および２’ＭＯＥ単位から独立に選択される。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマーに存在する上述の種類のヌクレオチドアナログのうち単一、またはその連続するヌクレオチド配列が存在する。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（２’ＭＯＥ）、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマーまたはＬＮＡヌクレオチドアナログであり、このようなものとして、本発明のオリゴヌクレオチドは、これら３種類のアナログから独立に選択されるヌクレオチドアナログを含むことができる、あるいはこの３種類から選択される単一種類のアナログを含み得る。いくつかの実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の２’−ＭＯＥ−ＲＮＡヌクレオチド単位等、前記ヌクレオチドアナログのうち少なくとも１個は、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡである。いくつかの実施形態において、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の２’−フルオロ−ＤＮＡヌクレオチド単位等、前記ヌクレオチドアナログのうち少なくとも１個は、２’−フルオロＤＮＡである。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、本発明に係るオリゴマーは、少なくとも１個のロックト核酸（ＬＮＡ）単位、例えば１、２、３、４、５、６、７または８個のＬＮＡ単位、例えば３〜７もしくは４〜８個のＬＮＡ単位、または３、４、５、６もしくは７個のＬＮＡ単位等、を含む。いくつかの実施形態において、全ヌクレオチドアナログは、ＬＮＡである。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよび次のＬＮＡ単位のうち１つまたは複数の両方を含むことができる：ベータ−Ｄもしくはアルファ−Ｌ立体配置のいずれかまたはこれらの組合せの、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、オキシ−ＬＮＡおよび／またはＥＮＡ。いくつかの実施形態において、全ＬＮＡシトシン単位は、５’メチル−シトシンである。本発明のいくつかの実施形態において、オリゴマーは、ＬＮＡおよびＤＮＡ単位の両方を含み得る。好ましくは、組み合わせた合計ＬＮＡおよびＤＮＡ単位は、１０〜２５個、例えば１２〜１６、１０〜１８、１０〜２０、１０〜２４等、である。本発明のいくつかの実施形態において、連続するヌクレオチド配列等、オリゴマーのヌクレオチド配列は、少なくとも１個のＬＮＡからなり、残りのヌクレオチド単位は、ＤＮＡ単位である。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、ホスホロチオエート等、修飾ヌクレオチド間結合を含んでいてもよいＬＮＡヌクレオチドアナログおよび天然起源のヌクレオチド（ＤＮＡヌクレオチド等、ＲＮＡまたはＤＮＡ等）のみを含む。
【０１６１】
用語「核酸塩基」は、ヌクレオチドの塩基部分を指し、天然起源（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ）と共に非天然起源の変異体の両方を網羅する。よって、「核酸塩基」は、公知のプリンおよびピリミジン複素環のみならず、これらの複素環アナログおよび互変異性体も網羅する。
【０１６２】
核酸塩基の例は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンを含むが、これらに限定されない。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、オリゴマーに存在する核酸塩基のうち少なくとも１個は、５−メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピニルウラシル、６−アミノプリン、２−アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２−クロロ−６−アミノプリンからなる群から選択される修飾核酸塩基である。
【０１６４】
ＬＮＡ
用語「ＬＮＡ」は、「ロックト核酸」として知られる二環性ヌクレオシドアナログをいう。これは、ＬＮＡモノマーであり得、または、「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」の文脈において用いる場合、１個または複数個のこのような二環性ヌクレオチドアナログを含むＬＮＡは、オリゴヌクレオチドをいう。ＬＮＡヌクレオチドは、例えば、下に記すビラジカルＲ４＊−Ｒ２＊として示す、リボース糖環のＣ２’およびＣ４’の間のリンカー基（架橋等）の存在により特徴付けられる。
【０１６５】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いられるＬＮＡは、好ましくは、一般式Ｉ
【０１６６】
【化１３】
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【０１６７】
（式中、全キラル中心のため、不斉基は、ＲまたはＳ配向性のいずれかにおいて見出すことができ；
式中、Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（ＲＮ＊）−、−Ｃ（Ｒ６Ｒ６＊）−から選択され、例えば、いくつかの実施形態においては、−Ｏ−であり；
Ｂは、水素、置換されていてもよいＣ１〜４−アルコキシ、置換されていてもよいＣ１〜４−アルキル、置換されていてもよいＣ１〜４−アシルオキシ、天然起源および核酸塩基アナログを含む核酸塩基、ＤＮＡインターカレーター、光化学的な活性基、熱化学的な活性基、キレート基、レポーター基ならびにリガンドから選択され；好ましくは、Ｂは、核酸塩基または核酸塩基アナログであり；
Ｐは、隣接するモノマーまたは５’−末端基とのヌクレオチド間結合を示し、このようなヌクレオチド間結合または５’−末端基は、置換基Ｒ５または等しく適用可能な置換基Ｒ５＊を含んでもよく；
Ｐ＊は、隣接するモノマーまたは３’−末端基とのヌクレオチド間結合を示し；
Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−および＞Ｃ＝Ｚ（式中、Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−および−Ｎ（Ｒａ）−から選択され、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、水素、置換されていてもよいＣ１〜１２−アルキル、置換されていてもよいＣ２〜１２−アルケニル、置換されていてもよいＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、置換されていてもよいＣ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルコキシアルキル、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１〜６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１〜６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的な活性基、熱化学的な活性基、キレート基、レポーター基ならびにリガンドから選択され、アリールおよびヘテロアリールは、置換されていてもよく、２個のジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは共に、置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を示し得、全キラル中心のため、不斉基は、ＲまたはＳ配向性のいずれかにおいて見出し得る）から選択される、１〜４個の基／原子からなる二価リンカー基を示し；
存在する置換基Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊、Ｒ６およびＲ６＊はそれぞれ独立に、水素、置換されていてもよいＣ１〜１２−アルキル、置換されていてもよいＣ２〜１２−アルケニル、置換されていてもよいＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルコキシアルキル、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的な活性基、熱化学的な活性基、キレート基、レポーター基およびリガンドから選択され、アリールおよびヘテロアリールは、置換されていてもよく、２個のジェミナル置換基は共に、オキソ、チオキソ、イミノまたは置換されていてもよいメチレンを示し得；ＲＮは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択され、２個の隣接する（非ジェミナル）置換基は、二重結合を生じる追加的な結合を示し得；存在し、ビラジカルに関与しない場合、ＲＮ＊は、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択される）ならびにその塩基性塩および酸付加塩の構造を有する。全キラル中心のため、不斉基は、ＲまたはＳ配向性のいずれかにおいて見出し得る。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲａＲｂ）−、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−、Ｃ（ＲａＲｂ）−ＮＲａ−、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｓ−およびＣ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−（式中、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に選択されてもよい）からなる群から選択される基からなるビラジカルを示す。いくつかの実施形態において、ＲａおよびＲｂは独立に、メチルや水素等、水素およびＣ１〜６アルキルからなる群から選択されてもよい。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、Ｒ−またはＳ−立体配置のいずれかにおけるビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−（２’Ｏ−メトキシエチル二環性核酸−Ｓｅｔｈ  ａｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ）を示す。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、Ｒ−またはＳ−立体配置のいずれかにおけるビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−（２’Ｏ−エチル二環性核酸−Ｓｅｔｈ  ａｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ）を示す。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、Ｒ−またはＳ−立体配置のいずれかにおけるビラジカル−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を示す。いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、ビラジカル−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−（Ｓｅｔｈ  ａｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ）を示す。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、ビラジカル−Ｏ−ＮＲ−ＣＨ３−（Ｓｅｔｈ  ａｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ）を示す。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、ＬＮＡ単位は、次の基から選択される構造を有する：
【０１７４】
【化１４】
2014523429.tif 000022
【０１７５】
いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は独立に、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換されているＣ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換されているＣ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換されているＣ１〜６アルコキシル、アシル、置換されているアシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換されているＣ１〜６アミノアルキルからなる群から選択される。全キラル中心のため、不斉基は、ＲまたはＳ配向性のいずれかにおいて見出すことができる。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は独立に、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換されているＣ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換されているＣ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換されているＣ１〜６アルコキシル、アシル、置換されているアシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換されているＣ１〜６アミノアルキルからなる群から選択される。全キラル中心のため、不斉基は、ＲまたはＳ配向性のいずれかにおいて見出すことができる。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は、水素である。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、Ｒ５およびＲ５＊はそれぞれ独立に、Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３および−ＣＨ＝ＣＨ２からなる群から選択される。適切には、いくつかの実施形態において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、水素であり、他の基としては（それぞれＲ５またはＲ５＊）、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、置換されているＣ１〜６アルキル、置換されているＣ２〜６アルケニル、置換されているＣ２〜６アルキニルまたは置換されているアシル（−Ｃ（＝Ｏ）−）からなる群から選択され；各置換されている基は、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換されているＣ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、置換されているＣ２〜６アルキニル、ＯＪ１、ＳＪ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、ＣＮ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ，Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｘ）Ｎ（Ｈ）Ｊ２（式中、Ｘは、ＯまたはＳであり；Ｊ１およびＪ２はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換されているＣ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、置換されているＣ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アミノアルキル、置換されているＣ１〜６アミノアルキルまたは保護基である）から独立に選択される置換基で一または多置換されている。いくつかの実施形態において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、置換されているＣ１〜６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、置換されているメチレンであり、好ましい置換基は、Ｆ、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、ＯＪ１、ＳＪ１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ，Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｊ２から独立に選択される１つまたは複数の基を含む。いくつかの実施形態において、Ｊ１およびＪ２はそれぞれ独立に、ＨまたはＣ１〜６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、メチル、エチルまたはメトキシメチルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、メチルである。さらに別の実施形態において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、エチルエニルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、置換されているアシルである。いくつかの実施形態において、Ｒ５またはＲ５＊のいずれかは、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２である。全キラル中心のため、不斉基は、ＲまたはＳ配向性のいずれかにおいて見出すことができる。このような５’修飾二環性ヌクレオチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００７／１３４１８１号において開示されている。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、Ｂは、アデニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシル、および／または５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２’チオ−チミン、５−メチルシトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシンおよび２，６−ジアミノプリン等の修飾または置換されている核酸塩基からなる群から選択される核酸塩基等、本明細書に記述されている核酸塩基等、プリンもしくはピリミジンまたは置換されているプリンもしくは置換されているピリミジン等、核酸塩基アナログおよび天然起源の核酸塩基を含む核酸塩基である。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｃ（ＲｅＲｆ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｃ（ＲｅＲｆ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）-Ｃ（ＲｃＲｄ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｎ（Ｒｅ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−および−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｓ−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｓ−（式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、ＲｅおよびＲｆはそれぞれ独立に、水素、置換されていてもよいＣ１〜１２−アルキル、置換されていてもよいＣ２〜１２−アルケニル、置換されていてもよいＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルコキシアルキル、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１〜６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１〜６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的な活性基、熱化学的な活性基、キレート基、レポーター基ならびにリガンドから選択され、アリールおよびヘテロアリールは、置換されていてもよく、２個のジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは共に、置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を示し得る）から選択されるビラジカルを示す。全キラル中心のため、不斉基は、ＲまたはＳ配向性のいずれかにおいて見出し得る。
【０１８２】
さらなる実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−および−ＣＨ（ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３）−Ｏ−および／または−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ＝ＣＨ−から選択されるビラジカル（二価基）を示す。全キラル中心のため、不斉基は、ＲまたはＳ配向性のいずれかにおいて見出し得る。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、ビラジカルＣ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−（式中、ＲａおよびＲｂは独立に、水素等、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換されているＣ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換されているＣ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換されているＣ１〜６アルコキシル、アシル、置換されているアシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換されているＣ１〜６アミノアルキルからなる群から選択され；Ｒｃは、水素等、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換されているＣ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換されているＣ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換されているＣ１〜６アルコキシル、アシル、置換されているアシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換されているＣ１〜６アミノアルキルからなる群から選択される）を示す。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、ビラジカルＣ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｃ（ＲｃＲｄ）−Ｏ−（式中、Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは独立に、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換されているＣ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換されているＣ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換されているＣ１〜６アルコキシル、アシル、置換されているアシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換されているＣ１〜６アミノアルキルからなる群から選択され、例えば水素である）を示す。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ビラジカル−ＣＨ（Ｚ）−Ｏ−（式中、Ｚは、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、置換されているＣ１〜６アルキル、置換されているＣ２〜６アルケニル、置換されているＣ２〜６アルキニル、アシル、置換されているアシル、置換されているアミド、チオールまたは置換されているチオからなる群から選択され；置換されている基はそれぞれ独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ）Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２およびＣＮ（式中、Ｊ１、Ｊ２およびＪ３はそれぞれ独立に、ＨまたはＣ１〜６アルキルであり、Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＪ１である）から独立に選択される、保護されていてもよい置換基で一または多置換されている）を形成する。いくつかの実施形態において、Ｚは、Ｃ１〜６アルキルまたは置換されているＣ１〜６アルキルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、メチルである。いくつかの実施形態において、Ｚは、置換されているＣ１〜６アルキルである。いくつかの実施形態において、前記置換基は、Ｃ１〜６アルコキシである。いくつかの実施形態において、Ｚは、ＣＨ３ＯＣＨ２−である。全キラル中心のため、不斉基は、ＲまたはＳ配向性のいずれかにおいて見出し得る。このような二環性ヌクレオチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，３９９，８４５号において開示されている。いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３＊は、水素であり、Ｒ５、Ｒ５＊の一方または両方は、上の記述および国際公開第２００７／１３４１８１号の通りに水素以外とすることができる。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、ビラジカル−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−（式中、Ｒｃは、Ｃ１〜１２アルキルオキシである）からなるかまたは含むなどの、架橋において置換されているアミノ基を含むビラジカルを示す。いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、ビラジカル−Ｃｑ３ｑ４−ＮＯＲ−（式中、ｑ３およびｑ４は独立に、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換されているＣ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換されているＣ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換されているＣ１〜６アルコキシル、アシル、置換されているアシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換されているＣ１〜６アミノアルキルからなる群から選択され；置換されている基はそれぞれ独立に、ハロゲン、ＯＪ１、ＳＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＣＯＯＪ１、ＣＮ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ  Ｊ１Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｘ＝Ｎ（Ｈ）Ｊ２（式中、Ｘは、ＯまたはＳであり；Ｊ１およびＪ２はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは保護基である）から独立に選択される置換基で一または多置換されている）を示す。全キラル中心のため、不斉基は、ＲまたはＳ配向性のいずれかにおいて見出し得る。このような二環性ヌクレオチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００８／１５０７２９号において開示されている。いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は独立に、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換されているＣ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換されているＣ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換されているＣ１〜６アルコキシル、アシル、置換されているアシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換されているＣ１〜６アミノアルキルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は、水素であり、Ｒ５、Ｒ５＊の一方または両方は、上の記述および国際公開第２００７／１３４１８１号の通りに水素以外とすることができる。いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は共に、ビラジカル（二価基）Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−（式中、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換されているＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換されているＣ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換されているＣ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、置換されているＣ１〜Ｃ１２アルコキシ、ＯＪ１  ＳＪ１、ＳＯＪ１、ＳＯ２Ｊ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ１、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ１Ｊ２であり；あるいはＲａおよびＲｂは共に、＝Ｃ（ｑ３）（ｑ４）であり；ｑ３およびｑ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン��Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたは置換されているＣ１〜Ｃ１２アルキルであり；置換されている基はそれぞれ独立に、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換されているＣ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換されているＣ２〜Ｃ６アルキニル、ＯＪ１、ＳＪ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ１、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ１、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ１Ｊ２から独立に選択される置換基で一または多置換されており；Ｊ１およびＪ２はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換されているＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換されているＣ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換されているＣ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキル、置換されているＣ１〜Ｃ６アミノアルキルまたは保護基である）を示す。このような化合物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００９００６４７８Ａ号において開示されている。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、Ｒ４＊およびＲ２＊は、ビラジカル−Ｑ−（式中、Ｑは、Ｃ（ｑ１）（ｑ２）Ｃ（ｑ３）（ｑ４）、Ｃ（ｑ１）＝Ｃ（ｑ３）、Ｃ［＝Ｃ（ｑ１）（ｑ２）］−Ｃ（ｑ３）（ｑ４）またはＣ（ｑ１）（ｑ２）−Ｃ［＝Ｃ（ｑ３）（ｑ４）］であり；ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜１２アルキル、置換されているＣ１〜１２アルキル、Ｃ２〜１２アルケニル、置換されているＣ１〜１２アルコキシ、ＯＪ１、ＳＪ１、ＳＯＪ１、ＳＯ２Ｊ１、ＮＪ１Ｊ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪ１、Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪ１Ｊ２、Ｃ（＝Ｏ）Ｊ１、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪ１Ｊ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪ１Ｊ２またはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪ１Ｊ２であり；Ｊ１およびＪ２はそれぞれ独立に、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは保護基であり；任意に、ＱがＣ（ｑ１）（ｑ２）（ｑ３）（ｑ４）であり、ｑ３またはｑ４の一方がＣＨ３である場合、ｑ３もしくはｑ４の少なくとも他の一方またはｑ１およびｑ２の一方は、Ｈ以外である）を形成する。いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。全キラル中心のため、不斉基は、ＲまたはＳ配向性のいずれかにおいて見出すことができる。このような二環性ヌクレオチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８／１５４４０１号において開示されている。いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は独立に、水素、ハロゲン、Ｃ１〜６アルキル、置換されているＣ１〜６アルキル、Ｃ２〜６アルケニル、置換されているＣ２〜６アルケニル、Ｃ２〜６アルキニルまたは置換されているＣ２〜６アルキニル、Ｃ１〜６アルコキシル、置換されているＣ１〜６アルコキシル、アシル、置換されているアシル、Ｃ１〜６アミノアルキルまたは置換されているＣ１〜６アミノアルキルからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５＊は、水素である。いくつかの実施形態において、Ｒ１＊、Ｒ２、Ｒ３は水素であり、Ｒ５、Ｒ５＊の一方または両方は、上の記述および国際公開第２００７／１３４１８１号または国際公開第２００９／０６７６４７号の通りに水素以外とすることができる（アルファ−Ｌ−二環性核酸アナログ）。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いられるＬＮＡは、好ましくは、一般式ＩＩ
【０１８９】
【化１５】
2014523429.tif 000023
【０１９０】
（式中、Ｙは、−Ｏ−、−ＣＨ２Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、Ｎ（Ｒｅ）および／または−ＣＨ２−からなる群から選択され；ＺおよびＺ＊は独立に、ヌクレオチド間結合、ＲＨ、末端基または保護基の中から選択され；Ｂは、天然または非天然ヌクレオチド塩基部分（核酸塩基）を構成し、ＲＨは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択され；Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ＲｄおよびＲｅは独立に、水素、置換されていてもよいＣ１〜１２−アルキル、置換されていてもよいＣ２〜１２−アルケニル、置換されていてもよいＣ２〜１２−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシ、Ｃ２〜１２−アルコキシアルキル、Ｃ２〜１２−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１〜１２−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜１２−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、モノおよびジ（Ｃ１〜６−アルキル）アミノ−Ｃ１〜６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１〜６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１〜６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１〜６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１〜６−アルキルチオ、ハロゲン、ＤＮＡインターカレーター、光化学的な活性基、熱化学的な活性基、キレート基、レポーター基およびリガンドからなる群から選択されてもよく、アリールおよびヘテロアリールは、置換されていてもよく、２個のジェミナル置換基ＲａおよびＲｂは共に、置換されていてもよいメチレン（＝ＣＨ２）を示し得；ＲＨは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択される）の構造を有する。いくつかの実施形態において、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ＲｄおよびＲｅは独立に、水素およびＣ１〜６アルキルからなる群から選択されてもよく、例えばメチルである。全キラル中心のため、不斉基は、ＲまたはＳ配向性のいずれかにおいて見出し得、例えば、２種の例示的な立体化学的異性体は、次の通りに例証することができるベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌアイソフォームを含む。
【０１９１】
【化１６】
2014523429.tif 000024
【０１９２】
特異的な例示的なＬＮＡ単位を以下に示す。
【０１９３】
【化１７】
2014523429.tif 000025
【０１９４】
用語「チオ−ＬＮＡ」は、上述の一般式におけるＹが、Ｓまたは−ＣＨ２−Ｓ−から選択されたロックトヌクレオチドを含む。チオ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−立体配置の両方であってよい。
【０１９５】
用語「アミノ−ＬＮＡ」は、上述の一般式におけるＹが、−Ｎ（Ｈ）−、Ｎ（Ｒ）−、ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−および−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−（式中、Ｒは、水素およびＣ１〜４−アルキルから選択される）から選択されたロックトヌクレオチドを含む。アミノ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−立体配置の両方であってよい。
【０１９６】
用語「オキシ−ＬＮＡ」は、上述の一般式におけるＹが、−Ｏ−を表すロックトヌクレオチドを含む。オキシ−ＬＮＡは、ベータ−Ｄおよびアルファ−Ｌ−立体配置の両方であってよい。
【０１９７】
用語「ＥＮＡ」は、上述の一般式におけるＹが、−ＣＨ２−Ｏ−（式中、−ＣＨ２−Ｏ−の酸素原子が、塩基Ｂに対して２’位に付着している）であるロックトヌクレオチドを含む。Ｒｅは、水素またはメチルである。
【０１９８】
一部の例示的な実施形態において、ＬＮＡは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、アルファ−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ、ベータ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびベータ−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、特にベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡから選択される。
【０１９９】
ヌクレオチド間結合
本明細書に記載されているオリゴマーのモノマーは、結合基を介して一体にカップリングされる。適切には、各モノマーは、結合基を介して３’隣接モノマーに連結される。
【０２００】
当業者であれば、本発明の文脈において、オリゴマーの末端における５’モノマーは、５’末端基を含んでいても含まなくてもよいが、５’結合基を含まないことが理解できよう。
【０２０１】
用語「結合基」または「ヌクレオチド間結合」は、２個のヌクレオチドを一体に共有結合的にカップリングすることができる基を意味するよう意図される。特異的かつ好ましい例は、リン酸基およびホスホロチオエート基を含む。
【０２０２】
本発明のオリゴマーのヌクレオチドまたはその連続するヌクレオチド配列は、結合基を介して一体にカップリングされる。適切には、各ヌクレオチドは、結合基を介して３’隣接ヌクレオチドに連結される。
【０２０３】
適切なヌクレオチド間結合は、国際公開第２００７／０３１０９１号内に収載されている結合、例えば、国際公開第２００７／０３１０９１号（参照により本明細書に組み込まれる）の３４頁目の１段落目に収載されているヌクレオチド間結合を含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、その正常ホスホジエステルから、ホスホロチオエートまたはボラノリン酸等、ヌクレアーゼ攻撃に対しより抵抗性が高いホスホジエステルへとヌクレオチド間結合を修飾することが好ましい。
【０２０５】
本明細書に提供されている適切なイオウ（Ｓ）を含有するヌクレオチド間結合が好ましくなり得る。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合も好ましい。
【０２０６】
適切かつ非特異的に示されている上述の実施形態等、いくつかの実施形態において、残りの結合基は全て、ホスホジエステルもしくはホスホロチオエートのいずれかまたはこれらの混合物である。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、全ヌクレオチド間結合基が、ホスホロチオエートである。
【０２０８】
コンジュゲート
文脈において、用語「コンジュゲート」は、１つまたは複数の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分への本明細書に記載されているオリゴマーの共有結合的付着（「コンジュゲーション」）により形成される異種起源の分子を示すよう意図される。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例は、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマーまたはこれらの組合せ等、巨大分子薬剤を含む。通常、タンパク質は、標的タンパク質の抗体とすることができる。典型的なポリマーは、ポリエチレングリコールとすることができる。
【０２０９】
したがって、様々な実施形態において、本発明のオリゴマーは、通常連続するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド領域と、さらに別の非ヌクレオチド領域の両方を含むことができる。連続するヌクレオチド配列からなる本発明のオリゴマーについて言及する場合、化合物は、コンジュゲート成分等、非ヌクレオチド成分を含み得る。
【０２１０】
本発明の様々な実施形態において、オリゴマー化合物は、例えば、オリゴマー化合物の細胞取込みの増加に用いられ得るリガンド／コンジュゲートに連結される。参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０３１０９１号は、適切なリガンドおよびコンジュゲートを提供する。
【０２１１】
本発明は、本明細書に記載されている本発明に係る化合物と、前記化合物に共有結合的に付着した少なくとも１個の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲートも提供する。したがって、本発明の化合物が本明細書に開示されている特定された核酸またはヌクレオチド配列からなる様々な実施形態において、化合物は、前記化合物に共有結合的に付着した少なくとも１個の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（例えば、１つまたは複数個のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含まない）も含むことができる。
【０２１２】
コンジュゲーション（コンジュゲート部分への）は、本発明のオリゴマーの活性、細胞分布または細胞取込みを増強し得る。このような部分は、抗体、ポリペプチド、コレステロール部分などの脂質部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル−ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族の鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−ｈ−ホスホネート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分を含むが、これらに限定されない。
【０２１３】
本発明のオリゴマーは、活性薬物物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、スルファ薬物、抗糖尿病薬、抗菌薬または抗生物質とコンジュゲートし得る。
【０２１４】
ある特定の実施形態において、コンジュゲートした部分は、コレステロールなどの、ステロールである。
【０２１５】
様々な実施形態において、コンジュゲートした部分は、例えば１〜５０アミノ酸残基の長さ、例えば、３〜１０、２〜２０等、の正電荷を持つペプチドおよび／またはポリエチルグリコール（ＰＥＧ）もしくはポリプロピレングリコール等のポリアルキレンオキシド等、正電荷を持つポリマーを含むかまたはからなる−参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８／０３４１２３号を参照されたい。適切には、ポリアルキレンオキシド等、正電荷を持つポリマーは、国際公開第２００８／０３４１２３号に記載されている遊離可能なリンカーなどのリンカーを介して本発明のオリゴマーに付着することができる。
【０２１６】
例として、本発明のコンジュゲートにおいて次のコンジュゲート部分を用いることができる。
【０２１７】
【化１８】
2014523429.tif 000026
【０２１８】
活性化オリゴマー
本明細書における用語「活性化オリゴマー」は、１つまたは複数個のコンジュゲート部分、即ち、それ自身は核酸またはモノマーではない部分へのオリゴマーの共有結合を可能にする少なくとも１個の官能基部分と共有結合して（即ち、官能化して）、本明細書に記載されているコンジュゲートを形成する本発明のオリゴマーをいう。通常、官能基部分は、例えば、アデニン塩基の３’−ヒドロキシル基または環外ＮＨ２基、好ましくは親水性であるスペーサーおよびコンジュゲート部分と結合することのできる末端基（例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基）を介してオリゴマーと共有結合することのできる化学基を含むであろう。いくつかの実施形態において、この末端基は、保護されておらず、例えば、ＮＨ２基である。他の実施形態において、末端基は保護されており、例えば、Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ  Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒ  Ｇ  Ｍ  Ｗｕｔｓによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」第３版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９９）に記載されている保護基などの、いずれかの適切な保護基により保護されている。適切なヒドロキシル保護基の例は、酢酸エステルなどのエステル、ベンジル、ジフェニルメチルまたはトリフェニルメチルなどのアラルキル基およびテトラヒドロピラニルを含む。適切なアミノ保護基の例は、ベンジル、アルファ−メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルおよびトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルなどのアシル基を含む。いくつかの実施形態において、官能基部分は、自己開裂性である。他の実施形態において、官能基部分は、生分解性である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０８７，２２９号を参照されたい。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、オリゴマーの５’末端へのコンジュゲート部分の共有結合的付着を可能にするため、本発明のオリゴマーは、５’末端において官能化されている。他の実施形態において、本発明のオリゴマーは、３’末端において官能化されていてよい。さらに他の実施形態において、本発明のオリゴマーは、骨格に沿ってまたは複素環塩基部分において官能化されていてよい。なお他の実施形態において、本発明のオリゴマーは、５’末端、３’末端、骨格および塩基から独立に選択される、２個以上の位置において官能化されていてよい。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、本発明の活性化オリゴマーは、官能基部分に共有結合的に付着した１つまたは複数個のモノマーの合成において組み込むことにより合成される。他の実施形態において、本発明の活性化オリゴマーは、官能化されていないモノマーにより合成され、オリゴマーは、合成完了後に官能化される。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、アミノアルキルリンカーを含有するヒンダードエステルにより官能化され、そのアルキル部は、式（ＣＨ２）ｗ（式中、ｗは、１〜１０に及ぶ整数、好ましくは、約６である）を有し、アルキルアミノ基のアルキル部は、直鎖であっても分枝鎖であってもよく、官能基は、エステル基を介してオリゴマーに付着している（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗＮＨ）。
【０２２１】
他の実施形態において、オリゴマーは、（ＣＨ２）ｗ−スルフヒドリル（ＳＨ）リンカー（式中、ｗは、１〜１０に及ぶ整数、好ましくは、約６である）を含有するヒンダードエステルにより官能化され、アルキルアミノ基のアルキル部は、直鎖であっても分枝鎖であってもよく、官能基は、エステル基を介してオリゴマーに付着している（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｗＳＨ）。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、スルフヒドリル活性化されたオリゴヌクレオチドは、ポリエチレングリコールまたはペプチド等、ポリマー部分により（ジスルフィド結合の形成により）コンジュゲートされる。
【０２２３】
上述のヒンダードエステルを含有する活性化オリゴマーは、当技術分野において公知のいずれかの方法により、特に、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開の国際公開第２００８／０３４１２２号およびその実施例において開示されている方法により合成することができる。
【０２２４】
さらに他の実施形態において、本発明のオリゴマーは、米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に実質的に記載されている官能化試薬、即ち、一端にホスホラミダイトを有し、その一端が保護されたまたは保護されていないスルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を含む反対の一端へと親水性スペーサー鎖により連結した、実質的に直線状の（ｌｉｎｅａｒ）試薬を用いて、オリゴマーにスルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を導入することにより官能化される。このような試薬は、オリゴマーのヒドロキシル基と主に反応する。いくつかの実施形態において、このような活性化オリゴマーは、オリゴマーの５’−ヒドロキシル基とカップリングした官能化試薬を有する。他の実施形態において、活性化オリゴマーは、３’−ヒドロキシル基とカップリングした官能化試薬を有する。さらに他の実施形態において、本発明の活性化オリゴマーは、オリゴマーの骨格においてヒドロキシル基とカップリングした官能化試薬を有する。さらにまた別の実施形態において、本発明のオリゴマーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に記載されている官能化試薬のうち２種以上により官能化される。このような官能化試薬を合成し、これをモノマーまたはオリゴマーに組み込む方法は、米国特許第４，９６２，０２９号および第４，９１４，２１０号に開示されている。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、固相結合したオリゴマーの５’末端は、ジエニルホスホラミダイト誘導体により官能化され、続いてディールス−アルダー環化付加反応による、例えば、アミノ酸またはペプチドと脱保護されたオリゴマーとのコンジュゲーションが行われる。
【０２２６】
様々な実施形態において、２’−カルバメート置換されている糖または２’−（Ｏ−ペンチル−Ｎ−フタルイミド）−デオキシリボース糖などの、２’−糖修飾を含有するモノマーのオリゴマーへの組み込みは、オリゴマーの糖へのコンジュゲート部分の共有結合的付着を容易にする。他の実施形態において、１つまたは複数個のモノマーの２’位にアミノ含有リンカーを有するオリゴマーは、例えば、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（ｅ−フタルイミジルアミノペンチル）−２’−デオキシアデノシン−３’−−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−シアノエトキシホスホラミダイト等の試薬を用いて調製される。例えば、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １９９１，  ３４，  ７１７１を参照されたい。
【０２２７】
さらになお別の実施形態において、本発明のオリゴマーは、Ｎ６プリンアミノ基、グアニンの環外Ｎ２、またはシトシンのＮ４もしくは５位置を含む核酸塩基に、アミン含有官能基部分を有することができる。様々な実施形態において、このような官能化は、オリゴマー合成において既に官能化されている市販の試薬を用いることにより達成することができる。
【０２２８】
いくつかの官能基部分は、市販されており、例えば、ヘテロ二官能基およびホモ二官能基連結部分は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｏ．（イリノイ州、ロックフォード）から入手できる。他の市販の連結基は、５’−アミノ−修飾因子Ｃ６および３’−アミノ−修飾因子試薬であり、両者共にＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（バージニア州、スターリング）から入手できる。５’−アミノ−修飾因子Ｃ６は、ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、フォスターシティ）からもＡｍｉｎｏｌｉｎｋ−２として入手でき、３’−アミノ−修飾因子は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、パロアルト）からも入手できる。いくつかの実施形態においていくつかの実施形態において。
【０２２９】
組成物
本発明のオリゴマーは、医薬品製剤および組成物において用いることができる。適切には、このような組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。国際出願ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号−参照により本明細書に組み込まれる−は、適切かつ好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントを提供する。適切な投薬量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との併用、プロドラッグ製剤も、国際出願ＰＣＴ／ＤＫ２００６／０００５１２号−参照により本明細書に組み込まれる−に提供されている。
【０２３０】
さらなる実施形態
１．有効量のｍｉＲ−１２２阻害剤および有効量のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤を、ＨＣＶに感染した対象に投与する工程を含む、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）に感染した対象におけるＣ型肝炎（ＨＣＶ）感染症の治療のための方法。
【０２３１】
２．前記ｍｉＲ−１２２阻害剤が、ｍｉＲ−１２２のアンチセンスオリゴマーおよび小分子阻害剤からなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
【０２３２】
３．ｍｉＲ−１２２阻害剤が、オリゴヌクレオチドの全長にわたり成熟ｈｓａ−ｍｉＲ−１２２配列（配列番号１）と完全に相補的なアンチセンスオリゴマーである、実施形態１または２に記載の方法。
【０２３３】
４．アンチセンスオリゴマーが、ミックスマーまたはトータルマーである、実施形態３に記載の方法。
【０２３４】
５．オリゴマーが、７〜１８個の連続するヌクレオチドの長さである、実施形態２〜４のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２３５】
６．オリゴマーが、非天然起源のヌクレオチドまたはＤＮＡもしくはＲＮＡ以外のヌクレオチドを含む、実施形態２〜５のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２３６】
７．オリゴマーが、ヌクレオチドアナログを含む、実施形態２〜６のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２３７】
８．ヌクレオチドアナログが、ロックト核酸（ＬＮＡ）単位、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、置換されていてもよいヘキシトール核酸単位および２’−フルオロ−ＤＮＡ単位からなる群から独立に選択されてもよい糖修飾されたヌクレオチドなどの、糖修飾されたヌクレオチドである、実施形態７に記載の方法。
【０２３８】
９．ヌクレオチドアナログがＬＮＡである、実施形態８に記載の方法。
【０２３９】
１０．本質的にＲＮＡｓｅＨを動員することができない、実施形態１〜９の一実施形態に記載の方法。
【０２４０】
１１．ミックスマーまたはトータルマーである、実施形態１〜９のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２４１】
１２．７、８、９または１０核酸塩基の長さを有する、実施形態１〜１１のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２４２】
１３．１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６核酸塩基の長さを有する、実施形態１〜１１のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２４３】
１４．ＤＮＡおよびヌクレオチドアナログ核酸塩基、あるいはヌクレオチドアナログ核酸塩基のみを含む、実施形態１〜１３のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２４４】
１５．４個を超えるまたは３個を超えるまたは２個を超える連続的ＤＮＡヌクレオチドの領域を含まない、実施形態１〜１４のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２４５】
１６．オリゴマーの全ヌクレオチドが、ヌクレオチドアナログである、実施形態１〜１５のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２４６】
１７．オリゴマーの全ヌクレオチドが、ＬＮＡヌクレオチドである、実施形態１〜１６のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２４７】
１８．ヌクレオシド間結合が、任意に、ホスホロチオエートおよびホスホジエステルからなる群から独立に選択される、実施形態１〜１７のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２４８】
１９．オリゴマーが、少なくとも１個のホスホロチオエート結合を含む、あるいは全ヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエート結合である、実施形態１〜１８のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２４９】
２０．オリゴマーの連続するヌクレオチド配列が、本明細書に収載されている配列から選択される、実施形態１〜１９のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２５０】
２１．オリゴマーが、次式
【０２５１】
【化１９】
2014523429.tif 000027
【０２５２】
（式中、小文字は、ＤＮＡ単位を特定し、大文字は、ＬＮＡ単位を特定し、ｍＣは、５−メチルシトシンＬＮＡを特定し、下付き文字ｓは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を特定し、ＬＮＡ単位は、ＬＮＡ残基の後のｏ上付き文字により特定されるベータ−Ｄ−オキシである）からなるかまたは含む、実施形態１〜１９のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２５３】
２２．ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤が、ＡＺＤ−７２９５、ＳＺ：ＣＦ１０２、ＢＭＳ−７９００５２、およびＢＭＳ−８２４３８３からなる群から選択される、実施形態１〜２１のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２５４】
２３．ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤が、ＢＭＳ−７９００５２である、実施形態１〜２１のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２５５】
２４．治療が、インターフェロンフリーである、実施形態１〜２３のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２５６】
２５．治療が、インターフェロンおよび任意にリバビリン治療との併用である、実施形態１〜２３のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２５７】
２６．複数用量のｍｉＲ−１２２阻害剤および複数用量のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤、ならびに任意にリバビリンが、１年未満の治療期間にわたり投与される、実施形態１〜２５のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２５８】
２７．治療期間の持続時間が、４８週間未満、例えば２４週間未満または１３週間未満等、である、実施形態２６に記載の方法。
【０２５９】
２８．対象が、インターフェロン非応答者である、実施形態１〜２７のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２６０】
２９．ＨＣＶが、選択された遺伝子型１、２、３、４、５および６、例えば遺伝子型１ａおよび／または遺伝子型１ｂ等、である、実施形態１〜２８のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２６１】
３０．対象が、慢性Ｃ型肝炎（ＣＨＣ）である、実施形態１〜２９のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２６２】
３１．対象が、ＨＩＶおよびＨＣＶの両方に同時感染している、実施形態１〜３０のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２６３】
３２．対象が、インターフェロン非応答者、部分応答者、再発応答者または無応答者（ｎｕｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）である、実施形態１〜３１のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２６４】
３３．ｍｉＲ−１２２阻害剤が、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間の用量で対象に投与される、実施形態１〜３２のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２６５】
３４．少なくとも２回の別個の用量のｍｉＲ−１２２阻害剤が投与され、逐次用量のｍｉＲ−１２２阻害剤の間の時間間隔が、毎日、毎週または毎月である、あるいは時間間隔が毎日〜毎月である、実施形態１〜３３のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０２６６】
３５．ＨＣＶに感染した細胞を、ｍｉＲ−１２２阻害剤および少なくとも１種のＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤と接触させることを含む、細胞におけるＨＣＶ感染のレベルを低下させる方法。
【０２６７】
３６．Ｃ型肝炎の治療のための医薬の調製のためのｍｉＲ−１２２阻害剤の使用であって、前記医薬がＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤と併用して用いるための医薬である使用。
【０２６８】
３７．ＨＣＶ  ＮＳ５Ａ  ＲＮＡタンパク質阻害剤と併用してＣ型肝炎の治療において用いるための、ｍｉＲ−１２２阻害剤。
【実施例】
【０２６９】
実施例１
ミラビルセン（ＳＰＣ３６４９）を単独で検査して、ＥＣ５０（有効性）およびＣＣ５０（細胞性毒性）値を決定した。ミラビルセンのＥＣ５０およびＣＣ５０値を下表に示す。
【０２７０】
【表８】
2014523429.tif 000028
【０２７１】
レポーター細胞株Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴにおいて、承認された実験的抗ＨＣＶ治療法（例えば、ＢＭＳ−７９００５２）（または他のＮＳ５Ａ阻害剤）と併用した、非遺伝子導入型抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドの抗ウイルス有効性および細胞性毒性を決定した。この細胞株は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子−ユビキチン−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質およびＥＴ組織培養適応型突然変異（Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２０８ＩおよびＫ１８４６Ｔ）を含むＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ駆動ＮＳ３−５Ｂ  ＨＣＶコード配列を含む持続的に複製するＩ３８９ｌｕｃ−ｕｂｉ−ｎｅｏ／ＮＳ３−３’／ＥＴレプリコンを有する。非遺伝子導入型抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドの８種の希釈物（計算されたＥＣ５０を括弧で囲む）を、対照化合物（計算されたＥＣ５０を括弧で囲む）それぞれの５種の希釈物を含む３プレートの２回複製セットにおいて３回複製して評価した。１セットのプレートを細胞性毒性の決定に用い、他のセットのプレートを抗ウイルス有効性の決定に用いた。有効性および毒性の結果は、それぞれホタルルシフェラーゼ活性およびＸＴＴ色素低下により定量化し、アッセイの結果をＰｒｉｃｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｈｉｐｍａｎ  ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩソフトウェアプログラムにインポートした。ＭａｃＳｙｎｅｒｙ  ＩＩ解析は、単独で用いた場合の２種（以上）の化合物の用量応答の計算と、続く個々の用量反応曲線に基づき、化合物を共に用いた場合の抗ウイルス阻害または毒性の予想される相加的レベルの計算を含む。濃度データ点それぞれにおける活性の予想されるレベルを、アッセイにおいて実験的に決定された抗ウイルス活性と比較した。実現された活性から予想される活性を差し引き、負の、ゼロのまたは正の値を得た。これらの値をデータの三次元的表示としてプロットし、２因子値として結果を報告して、活性の予想されるレベルを上回る併用平均（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ａｖｅｒａｇｅ）（相乗作用容量（ｓｙｎｅｒｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ））および活性の予想されるレベルを下回る併用平均（拮抗作用容量（ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｖｏｌｕｍｅ））を表す。被験化合物および対照物質の一対毎に２回以上併用解析を行った。ＢＭＳ−７９００５２に対するこの実験の成績を、下表に提示する。
【０２７２】
【表９】
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【０２７３】
実施例２：ＨＣＶ遺伝子型ｌｂレプリコン細胞におけるインターフェロン−ａ２ｂ、リバビリン、２’−メチルシチジン、ＶＸ−２２２、ＢＭＳ−７９００５２およびテラプレビルと併用した非遺伝子導入型ＳＰＣ３６４９抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドの抗ＨＣＶ評価
本実施例は、抗ＨＣＶ薬物および実験的化合物と併用したＳＰＣ３６４９（ミラビルセン）のインビトロ評価に基づいた。インターフェロン、リバビリン、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤テラプレビル、ヌクレオシドＮＳ５Ｂ阻害剤２’−メチルシチジン、非ヌクレオシドＮＳ５Ｂ阻害剤ＶＸ−２２２およびＮＳ５Ａ阻害剤ＢＭＳ−７９００５２を含む、様々なクラスの抗ウイルス活性を表す６種の薬物／化合物と併用してＳＰＣ３６４９を評価した。バイシストロニックＨＣＶ遺伝子型Ｉｂレプリコンを含有するレポーター細胞株Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴを用いて、併用抗ウイルスアッセイを行った。９５％信頼区間におけるＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩソフトウェアを用いて、併用データを解析した。インビトロ併用アッセイを設計して、２種の化合物の抗ウイルス相互作用を定義し、これらの相互作用が相乗的であったか拮抗的であったかを決定する。
【０２７４】
インターフェロン−ａ２ｂ（ｌＦＮ−ａ２ｂ）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州、ミネアポリス）から購入した。リバビリン（ＲＢＶ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州、セントルイス）から購入した。テラプレビル、ＶＸ−２２２およびＢＭＳ−７９００５２は、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（テキサス州、ヒューストン）から購入した。２’メチルシチジン（２−ＭｅＣ）は、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（カナダ、オンタリオ州、ノースヨーク）から購入した。
【０２７５】
細胞調製：レポーター細胞株Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴは、ＩｍＱｕｅｓｔ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓによりＲａｌｆ  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ博士（ドイツハイデルベルク大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、衛生学研究所（Ｈｙｇｉｅｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、分子ウイルス学部（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ））から入手した。この細胞株は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子−ユビキチンネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質およびＥＴ組織培養適応型突然変異（Ｅ１２０２Ｇ、Ｔ１２０８１およびＫＩ８４６Ｔ）を含有するＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ駆動ＮＳ３−５Ｂ  ＨＣＶコード配列を含有する持続的に複製する１３８９ｌｕｃ−ｕｂｉ−ｎｅｏ／ＮＳ３−３’ｌＥＴレプリコンを有する。１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００ｌＵ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００ｆ．ｌｇ／ｍＬ）およびＩＸ非必須アミノ酸プラス１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補充したＤＭＥＭにおける培養により、Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴのストック培養物を増やした。プレーティングに先立ち、細胞を１：４に分割し、同一培地プラス２５０ｆ．ｌｇ／ｍＬ  Ｇ４１８において２継代培養した。細胞をトリプシンで処理し、トリパンブルーで染色することにより計数し、９６ウェル組織培養プレート内にウェル当たり５．０×１０３細胞の細胞培養密度にて、ウェル当たり８５ｆ．ｌＬの容量で播種して、５％ＣＯ２環境下の３℃で２４時間インキュベートした。各々の化合物併用の併用有効性（ＥＣ５０）および細胞毒性（ＴＣ５０）の決定のため、６枚のプレートを樹立した（有効性および毒性毎に３枚のプレート）。
【０２７６】
２４時間インキュベーションの後、Ｇ４１８なしの細胞培養培地におけるＳＰＣ３６４９の８種の２倍系列希釈を調製し（最終ウェル内高被験濃度１．２０μＭ〜２．４０μＭ）、細胞に添加し、Ｇ４１８なしの細胞培養培地における対照化合物の５種の２倍または５倍系列希釈を調製し、細胞に添加した。対照化合物毎の最終ウェル内高被験濃度、希釈スキームおよび濃度範囲を表Ａに表示する。各プレートにおける６ウェルは、処理なし対照として培地単独も収容した。抗ウイルス有効性のために陽性単一化合物対照として１ミリリットル当たり１０．０、２．００、０．４００、０．０８００、０．０１６０および０．００３２単位（Ｕ／ｍｌ）の最終濃度のＩＦＮ−ａ２ｂが３回複製したウェルに添加された、別個の２回複製したプレートを調製した。５％ＣＯ２環境下にて４８時間３７℃で細胞をインキュベートした。インキュベーション後に、ルシフェラーゼレポーター活性の測定により抗ＨＣＶ活性に関して、ＸＴＴ染色により細胞毒性に関してプレートを評価した。
【０２７７】
【表１０】
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【０２７８】
ウイルス複製の測定：製造業者（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、コネチカット州、シェルトン）の説明書に従いｂｒｉｔｅｌｉｔｅ  ｐｌｕｓルミネセンスレポーター遺伝子キットを用いたルシフェラーゼ活性により、レプリコンアッセイ系からＨＣＶ複製を測定した。要約すると、１本のバイアルのｂｒｉｔｅｌｉｔｅ  ｐｌｕｓ凍結乾燥基質を、１０ｍＬのｂｒｉｔｅｌｉｔｅ再構成バッファーにおいて可溶化し、反転により穏やかに混合した。室温における５分間インキュベーションの後、ウェル当たり１００μｌのｂｒｉｔｅｌｉｔｅ  ｐｌｕｓ試薬を９６ウェルプレートに添加した。ウェル内容物を白９６ウェルプレートに移し、Ｗａｌｌａｃ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘ液体シンチレーションカウンターを用いて１５分間以内にルミネセンスを測定した。後述の解析のため、併用解析のデータを、Ｐｒｉｃｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｈｉｐｍａｎ（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：１８１−２０６  ［１９９０］）ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩソフトウェアテンプレートにインポートした。５０％ウイルス阻害濃度（ＥＣ５０）の決定のため、単一化合物ＩＦＮ−ａ２ｂ抗ウイルス対照のデータを、カスタマイズしたＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌワークブックにインポートした。
【０２７９】
細胞毒性：処理細胞由来の細胞培養単層をテトラゾリウム色素ＸＴＴで染色して、化合物の存在下でインキュベートしたＨｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴレポーター細胞株の細胞生存率を評価した。ＸＴＴ−テトラゾリウムは、代謝的に活性な細胞のミトコンドリア酵素により可溶性ホルマザン産物へと代謝され、被験物質による細胞殺傷性の迅速な定量的解析を可能にする。ＰＢＳにおける１ｍｇ／ｍｌストックとしてＸＴＴ溶液を新しく調製した。ＰＢＳに溶解した０．１５ｍｇ／ｍｌのフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）溶液を調製し、使用まで−２０℃にて暗所で保存した。ＸＴＴ溶液１ｍｌにつき４０ｉｌＬのＰＭＳを添加することにより、使用直前にＸＴＴ／ＰＭＳ溶液を調製した。５０マイクロリットルのＸＴＴ／ＰＭＳをプレートの各ウェルに添加し、接着プレートシーラーを用いてプレートを密封し、５％ＣＯ２環境下にて４時間３７℃でプレートをインキュベートした。密封したプレートを数回反転して可溶性ホルマザン産物を混合し、続いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３８４プラスプレートリーダーにより分光光度的に４５０ｎｍで読み取った。支持ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ５．４．２ソフトウェアによりデータを処理し、解析のためＰｒｉｃｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｈｉｐｍａｎ  ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩソフトウェアテンプレートにインポートした。５０％細胞毒性濃度（ＴＣ５０）の決定のため、単一化合物ＩＦＮａ２ｂ抗ウイルス対照のデータを、カスタマイズしたＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌワークブックにインポートした。未処理細胞対照におけるホルマザンの量に対し全細胞毒性値を正規化し、バックグラウンド比色分析対照から差し引いた。
【０２８０】
データ解析：Ｗａｌｌａｃ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘ液体シンチレーションカウンターから生データを採取し、Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ５．４．２ソフトウェアをＰｒｉｃｈａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｈｉｐｍａｎ  ＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩソフトウェアテンプレート（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １４：  １８１−２０６  ［１９９０］）にインポートした。単独で検査した場合の２種の化合物の活性に基づき、薬物併用の効果を計算する。予想される相加的抗ウイルス保護は、各併用濃度において実験的に決定された抗ウイルス活性から差し引かれ、正の値（相乗作用または増強）、負の値（拮抗作用）またはゼロ（相加性）を生じる。併用アッセイの結果を各併用濃度において三次元的に表示し、相加性平面の上に（相乗作用）または下に（拮抗作用）広がる活性の表面（ｓｕｒｆａｃｅ）を生じる。表面の容量が計算され、９５％信頼区間で計算される相乗作用容量（μＭ２％）として表される。結果は、中央値（±標準偏差）（３実験）または個々の値（１または２実験）として表される。
【０２８１】
併用療法評価：Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏＥＴ細胞におけるＨＣＶ遺伝子型Ｉｂレプリコンの阻害のために、６種の公知の抗ＨＣＶ薬剤と併用してＳＰＣ３６４９を評価した。実験設計は、化合物それぞれの２倍または５倍系列希釈のチェッカーボード希釈マトリクスを利用した。解析は、化合物が個々に用いられている、あるいは化合物が添加されていないウェルも含めた。対照化合物の計算されたＥＣ５０の２倍の高被験濃度による対照化合物の１：５希釈スキームを用いて、全併用の解析を最初に行った。化合物毎に２種以上の濃度が単独で用量反応曲線に収まり、単一化合物曲線が抗ウイルス活性における用量依存性応答を実証した場合のみ、これらの解析の結果が妥当であると決定した。対照化合物の計算されたＥＣ５０の２倍の高被験濃度による対照化合物の１：２希釈スキームを用いて複製解析を行った。薬物−薬物相互作用の予想される効果のＢｌｉｓｓ独立数学的定義に基づき薬物の理論的相加的相互作用を計算するＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩプログラムを用いた個々の化合物の用量反応曲線から、２種の化合物の理論的相加的相互作用を決定した。抗ウイルス化合物それぞれとＳＰＣ  ３６４９の併用の抗ＨＣＶ有効性および細胞毒性相乗作用容量は、９５％信頼区間で計算した。結果は、許容性判断基準を満たすアッセイの中央値（±標準偏差）（＞３実験）または個々の値（１または２実験）として表し、表Ｂにまとめる。ＳＰＣ  ３６４９とリバビリンの４種の独立複製のうち３種の相乗作用および拮抗作用容量は、それぞれ４．２〜２５．９μＭ２％および−３．１〜−３１．８μＭ２％の範囲に及び、相加的相互作用を示す。リバビリンと併用したＳＰＣ  ３６４９は、−２９２．６μＭ２％の拮抗作用容量における第４の実験における高度に拮抗的な相互作用をもたらした。ＳＰＣ  ３６４９とリバビリンの全体的相互作用は、それぞれ４．２０μＭ２％および−２４．２μＭ２％の４回複製の中央値相乗作用および拮抗作用容量を有していた。
【０２８２】
【表１１】
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【０２８３】
ＮＳ５Ｂポリメラーゼ非ヌクレオシドＶＸ−２２２と併用したＳＰＣ３６４９は、４．８および０．８μＭ２％の相乗作用容量ならびに−３４．４および−４．２７μＭ２％の拮抗作用容量をもたらした。ＳＰＣ  ３６４９とＮＳ５Ａ阻害剤ＢＭＳ７９００５２の併用の２種の複製アッセイの相乗作用容量は、０および１８．５μＭ２％であり、拮抗作用容量は−２５．５および−０．１μＭ２％であった。
【０２８４】
ＳＰＣ  ３６４９−０９とＮＳ３プロテアーゼ阻害剤テラプレビルの併用も、それぞれ０．００μＭ２％および−３．２２μＭ２％の中央値平均相乗作用および拮抗作用容量により、３種の複製アッセイに対し正の相互作用を示した。
【０２８５】
ＮＳ５Ｂポリメラーゼヌクレオシド阻害剤２−メチルシチジンと併用したＳＰＣ３６４９は、アッセイ複製の２種に対し正の相互作用をもたらし、第３の複製に対し僅かに拮抗的な相互作用であった。ＳＰＣ  ３６４９および２−メチルシチジンの併用の中央値相乗作用および拮抗作用容量は、それぞれ０．０μＭ２％および−２７．６μＭ２％であり、３種の認定されたアッセイ複製の平均から正の相互作用を生じた。インビトロ細胞毒性における併用の影響の評価は、各薬物単独または併用の細胞毒性が皆無かそれに近いことを明らかにした。
【０２８６】
実施例３：野生型および薬物抵抗性ＨＣＶ遺伝子型１ｂレプリコンに対するミラビルセン（ＳＰＣ３６４９）のインビトロ抗ウイルス活性
本試験の目的は、Ｈｕｈ７細胞を利用する一過的遺伝子導入アッセイにおいて野生型ＨＣＶ遺伝子型１ｂレプリコンならびにＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ薬物抵抗性ＨＣＶ遺伝子型１ｂレプリコンに対するミラビルセン（ＳＰＣ３６４９）のインビトロ抗ウイルス活性を評価することである。
【０２８７】
方法：Ｈｕｈ７細胞を利用する一過的遺伝子導入アッセイにおいて、野生型ＨＣＶ遺伝子型１ｂレプリコンならびにＮＳ３プロテアーゼ（Ａ１５６Ｔ、Ｒ１５５Ｋ）、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ（Ｓ２８２Ｔ、Ｍ４２３Ｉ）およびＮＳ５Ａタンパク質（Ｙ９３Ｈ）に主要アミノ酸置換を含有するよう構築されたＨＣＶ遺伝子型１ｂレプリコンに対するミラビルセンのインビトロ抗ウイルス性を評価した。５種の参照化合物（ＢＭＳ−７９００５２（ＮＳ５Ａ）、ＶＸ−２２２（ＮＳ５Ｂ）、テラプレビル（ＮＳ３）、ＢＩＬＮ−２０６１（ＮＳ３）および２’Ｍｅ−Ｃ（ＮＳ５Ｂ））を薬物抵抗性対照として含んだ。Ｈｕｈ７細胞に、エレクトロポレーションにより野生型または突然変異型ＲＮＡコンストラクトのいずれかを遺伝子導入した。化合物処理７２時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、用量反応曲線からＥＣ５０値を決定した。突然変異型ＨＣＶレプリコンのＥＣ５０の野生型ＨＣＶレプリコンのＥＣ５０に対する比率として倍数的抵抗性を表した。
【０２８８】
結果：突然変異を含有するよう構築されたＨＣＶレプリコンは、検査した薬物クラス毎に異なる抵抗性を実証した（表Ｃ）。特に、ＮＳ３にアミノ酸置換Ａ１５６ＴおよびＲ１５５Ｋを有するＨＣＶレプリコンは、プロテアーゼ阻害剤テラプレビルに対しそれぞれ３６．１および４．６倍抵抗性であった。ＮＳ５ＢにＳ２８２Ｔを有するレプリコンは、ＮＳ５Ｂヌクレオシド阻害剤２’Ｍｅ−Ｃに対し４２．８倍抵抗性であった。ＮＳ５ＢにＭ４２３Ｉを有するレプリコンは、ＮＳ５Ｂ非ヌクレオシド阻害剤ＶＸ−２２２に対し４．４倍抵抗性であった。ＮＳ５ＡにＹ９３Ｈを有するレプリコンは、ＮＳ５Ａ阻害剤ＢＭＳ  ７９００５２に対し２９．９倍抵抗性であった。対照的に、ミラビルセンは、抵抗性の２倍未満の倍数的変化により、検査した全薬物抵抗性ＨＣＶ変異体に対し広範な活性を実証した。
【０２８９】
一過的遺伝子導入アッセイにおいて、野生型ＨＣＶ遺伝子型１ｂレプリコンならびにＮＳ３プロテアーゼ（Ａ１５６Ｔ、Ｒ１５５Ｋ）、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ（Ｓ２８２Ｔ、Ｍ４２３Ｉ）およびＮＳ５Ａタンパク質（Ｙ９３Ｈ）に主要アミノ酸置換を含有するよう構築されたＨＣＶレプリコンに対してミラビルセンのインビトロ抗ウイルス性を評価した。５種の参照化合物（ＢＭＳ−７９００５２（ＮＳ５Ａ）、ＶＸ−２２２（ＮＳ５Ｂ）、テラプレビル（ＮＳ３）、ＢＩＬＮ−２０６１（ＮＳ３）および２’Ｍｅ−Ｃ（ＮＳ５Ｂ））を薬物抵抗性対照として含んだ。Ｈｕｈ７細胞に、エレクトロポレーションにより野生型または突然変異型ＲＮＡコンストラクトのいずれかを遺伝子導入した。化合物処理７２時間後にルシフェラーゼ活性を測定し、用量反応曲線からＥＣ５０値を決定した。倍数的抵抗性は、突然変異型ＨＣＶレプリコンのＥＣ５０の、野生型ＨＣＶレプリコンのＥＣ５０に対する比率として表した。結果は、２種の個々の実験の平均として表す。実験の初期セットにおいて、エレクトロポレーション２４時間後に化合物を添加することにより、標準プロトコールを修飾した。標準プロトコールを利用しつつ実験を反復して、変動レベルのＨＣＶ複製適応度を付与するＲＮＡコンストラクトを遺伝子導入した細胞の曝露を最大にし、観察される実験間可変性を低下させた。第３の実験において、野生型ＲＮＡコンストラクトによるエレクトロポレーション前に細胞を２４時間ミラビルセンで前処理して、プレインキュベーションが、ミラビルセン抗ウイルス活性増加をもたらし得るか決定した。
【０２９０】
突然変異を含むよう構築されたＨＣＶレプリコンは、検査した薬物クラス毎に異なる抵抗性を実証した。特に、ＮＳ３にアミノ酸置換Ａ１５６ＴおよびＲ１５５Ｋを有するＨＣＶレプリコンは、プロテアーゼ阻害剤テラプレビルに対しそれぞれ３６．１および４．６倍抵抗性であった。ＮＳ５ＢにＳ２８２Ｔを有するレプリコンは、ＮＳ５Ｂヌクレオシド阻害剤２’Ｍｅ−Ｃに対し４５．８倍抵抗性であった。ＮＳ５ＢにＭ４２３Ｉを有するレプリコンは、ＮＳ５Ｂ非ヌクレオシド阻害剤ＶＸ−２２２に対し４．４倍抵抗性であった。ＮＳ５ＡにＹ９３Ｈを有するレプリコンは、ＮＳ５Ａ阻害剤ＢＭＳ  ７９００５２に対し２９．９倍抵抗性であった。対照的に、ミラビルセンは、抵抗性の２倍未満の倍数的変化により、検査した全薬物抵抗性ＨＣＶ変異体に対し広範な活性を実証した。
【０２９１】
【表１２】
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【０２９２】
結果は、２実験由来の感受性の平均倍数的変化を表す（個々の値）；ＮＴ＝検査されず。これらの試験を行う間に、一過的遺伝子導入アッセイにおける野生型ＨＣＶに対するミラビルセンの抗ウイルス活性（３６．７μＭの平均ＥＣ５０）は、安定的ＨＣＶ細胞株（０．６７１μＭの平均ＥＣ５０）に対して以前に報告された抗ウイルス活性と比較して低下したことが観察された。ミラビルセン添加の時間が、相対的抗ウイルス活性を増加し得るか決定するため、野生型ＲＮＡコンストラクトによるエレクトロポレーション前に、ミラビルセンと共にＨｕｈ７細胞を２４時間プレインキュベートした。しかし、ミラビルセンによる細胞のプレインキュベーションは、抗ウイルス活性に影響を与えなかった（２５．６μＭのＥＣ５０）。
【０２９３】
結論：ＮＳ３プロテアーゼ（Ａ１５６Ｔ、Ｒ１５５Ｋ）、ＮＳ５Ｂポリメラーゼ（Ｓ２８２Ｔ、Ｍ４２３Ｉ）およびＮＳ５Ａタンパク質（Ｙ９３Ｈ）に主要アミノ酸置換を含有するよう構築されたＨＣＶレプリコンは、検査した薬物クラス毎に異なる抵抗性を実証した。対照的に、ミラビルセンは、ＮＳ３、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ阻害剤に抵抗性のＨＣＶレプリコンに対し広範な抗ウイルス活性を実証した。
【０２９４】
実施例４：ＳＰＣ３６４９抵抗性ＨＣＶ−１  ｂレプリコン細胞の選択
本実施例は、ＳＰＣ３６４９抵抗性ＨＣＶレプリコン細胞のインビトロ選択の結果をまとめる。Ｇ４１８および４種の独立な固定された濃度のＳＰＣ３６４９またはＮＳ３プロテアーゼ阻害剤テラプレビルの存在下における選択圧下においてレポーター細胞株Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴを培養した。対照培養物は、Ｇ４１８選択圧下、化合物の非存在下またはスクランブルしたオリゴヌクレオチド対照ＳＰＣ４７２９の存在下で培養したレプリコン細胞を含んだ。ＳＰＣ３６４９の存在下における選択は、細胞増殖の速度の減少をもたらしたが、異なる個々の抵抗性クローン集団の作製に失敗した。テラプレビルの存在下における選択は、細胞増殖の速度の減少および異なる個々のクローン集団の作製をもたらした。化合物の非存在下またはＳＰＣ４７２９の存在下における選択は、細胞増殖の速度を減少させなかった。
【０２９５】
【化２０】
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【０２９６】
細胞培養およびアッセイセットアップ：レポーター細胞株Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴは、以前に記載された通りに入手および調製した。２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有する培養培地において１０ｃｍ組織培養皿にプレート当たり３×１０５細胞の密度で細胞をプレーティングし、２４時間３７℃で５％ＣＯ２環境下においてインキュベートした。２４時間インキュベーションの後、７５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を有する細胞培養培地（上述）においてＳＰＣ３６４９、ＳＰＣ４７２９またはテラプレビルの希釈液を調製した。希釈液のそれぞれを２回複製プレートに添加し、３７℃で５％ＣＯ２環境下においてプレートをインキュベートした。２つの追加的なプレートは、処理なし対照として７５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を有する細胞培養培地を収容した。最終ＳＰＣ３６４９濃度は、１．００μＭ、２．５０μＭ、５．００μＭおよび１０．０μＭ（それぞれ２×、５×、１０×および２０×ＥＣ５０濃度）である。最終テラプレビル濃度は、０．６００μＭ、１．５０μＭ、３．００μＭおよび６．００μＭ（それぞれ２×、５×、１０×および２０×ＥＣ５０濃度）であった。ＳＰＣ４７２９の最終濃度は、１０．０μＭであった。２８日間または培養皿における細胞のコンフルエンスにより決定される細胞成長速度の観察可能な低下が生じるまで、隔週で１：４〜１：３の比率で細胞を分割した。成長速度が減少した後、１：２の比率で細胞を分割した、あるいは新鮮な培地により、細胞を分割することなく培地を補充した。２８日間の継代の後、１セットの皿をクリスタルバイオレットで染色し、他のセットのプレートを増殖および抵抗性細胞培養ストックの樹立に利用した。
【０２９７】
結果：Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ  ＨＣＹ遺伝子型Ｉｂレプリコン細胞を、７５０μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８の存在下における選択圧下において、４種の独立な固定された濃度のＳＰＣ３６４９抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドまたはテラプレビルまたは１種の濃度のスクランブルしたオリゴヌクレオチドＳＰＣ４７２９有りまたは無しで２８日間、組織培養プレートにおいて培養した。２回複製した組織培養皿を樹立し、各培養条件で維持した。２８日間の培養において培地を隔週で交換し、培地補充時に細胞を分割して、コンフルエントな細胞培養単層を維持した。４週間の培養の後、細胞をメタノールで固定してクリスタルバイオレットで染色、あるいはその後の表現型および遺伝子型特徴付けのために増やした。７５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８単独または７５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８と１０．０μＭのスクランブルしたオリゴヌクレオチドＳＰＣ４７２９の存在下で培養した細胞は、新鮮な培地における１：３または１：４の比率で隔週の分割を必要とした（表Ｄ）。７５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８およびＳＰＣ３６４９の存在下における細胞の培養は、培地交換および継代において必要とされる細胞希釈の用量依存的減少により示される通り細胞増殖の速度の減少をもたらした（表Ｅ）。しかし、異なる個々の抵抗性クローン集団は、ＳＰＣ３６４９選択の結果作製されなかった（図２）。テラプレビルの存在下における選択は、細胞増殖の速度の用量依存的減少および異なる別個の抵抗性クローン集団の作製をもたらした（表Ｆおよび図２）。
【０２９８】
【表１３】
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【０２９９】
【表１４】
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【０３００】
【表１５】
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【０３０１】
実施例５：ＨＣＶ遺伝子型ｌｂレプリコン細胞におけるテラプレビルまたはスクランブルしたオリゴヌクレオチドＳＰＣ  ４７２９と併用したリバビリンの抗ＨＣＶ評価
本実施例は、ＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤テラプレビルまたはスクランブルしたオリゴヌクレオチドと併用したリバビリンのインビトロ評価の結果をまとめる。バイシストロニックＨＣＶ遺伝子型Ｉｂレプリコンを含有するレポーター細胞株Ｈｕｈｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴを用いて、併用抗ウイルスアッセイを行った。９５％信頼区間においてＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩソフトウェアを用いて併用データを解析した。インビトロ併用アッセイは、２種の化合物の抗ウイルス相互作用を定義し、この相互作用が相乗的であるか拮抗的であるか決定するよう設計された。
【０３０２】
レポーター細胞株Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴは、以前に記載された通りに入手および調製した。細胞をトリプシンで処理し、トリパンブルーで染色することにより計数し、ウェル当たり５．０×１０３細胞の細胞培養密度、ウェル当たり８５μｌの容量で、９６ウェル組織培養プレートに播種し、３７℃で５％ＣＯ２環境下において２４時間インキュベートした。化合物併用毎の併用有効性（ＥＣ５０）および細胞毒性（ＴＣ５０）の決定のため、６枚のプレートを樹立した（有効性および毒性毎に３枚のプレート）。２４時間インキュベーションの後、Ｇ４１８を含まない細胞培養培地において化合物それぞれの２倍系列希釈を調製し、チェッカーボードパターンでウェルに添加した。リバビリンプラステラプレビル併用解析のため、リバビリンの８種の２倍系列希釈（１４８μＭ〜１．１６μＭの濃度範囲）およびテラプレビルの５種の２倍希釈（１．００μＭ〜６２．５ｎＭの濃度範囲）を細胞に添加した。ＳＰＣ  ４７２９プラスリバビリン併用解析のため、ＳＰＣ  ４７２９の８種の２倍系列希釈（２．４μＭ〜１８．８ｎＭの濃度範囲）およびリバビリンの５種の２倍希釈（１４８μＭ〜９．２５ｎＭの濃度範囲）を細胞に添加した。各プレートにおける６ウェルは、処理なし対照として培地単独も収容した。抗ウイルス有効性のため、陽性単一化合物対照として１ミリリットル当たり１０．０、２．００、０．４００、０．０８００、０．０１６０および０．００３２単位（Ｕ／ｍＬ）の最終濃度のＩＦＮ−ａ２ｂが３回複製したウェルに添加される、別個の２回複製したプレートを調製した。４８時間３７℃で５％ＣＯ２環境下において細胞をインキュベートした。インキュベーションの後、ルシフェラーゼレポーター活性の測定により抗ＨＣＶ活性に関して、ＸＴＴ染色により細胞毒性に関してプレートを評価した。
【０３０３】
ウイルス複製、細胞毒性およびデータ解析の測定：実施例２の通り
併用療法評価：Ｈｕｈ−ｌｕｃ／ｎｅｏ−ＥＴ細胞におけるＨＣＹ遺伝子型Ｉｂレプリコンの阻害のため、テラプレビルおよびスクランブルしたオリゴヌクレオチドＳＰＣ  ４７２９−０３と併用してリバビリンを評価した。実験設計は、化合物それぞれの２倍系列希釈のチェッカーボード希釈マトリクスを利用した。解析は、化合物が個々に用いられた、あるいは化合物が添加されていないウェルも含めた。併用毎に３回の独立実験を行った。薬物−薬物相互作用の予想される効果のＢｌｉｓｓ独立数学的定義に基づき薬物の理論的な相加的相互作用を計算するＭａｃＳｙｎｅｒｇｙ  ＩＩプログラムを用いて、個々の化合物の用量反応曲線から、２種の化合物の理論的な相加的相互作用を決定した。９５％信頼レベルにおいて、併用の抗ＨＣＶ有効性および細胞毒性の相乗作用容量を計算した。リバビリンプラステラプレビル併用解析の結果は、各化合物単独につき２種以上の濃度が用量反応曲線に収まり、単一化合物曲線が抗ウイルス活性または細胞毒性における用量依存的応答を実証した場合に限り妥当であると決定された。リバビリンプラスＳＰＣ  ４７２９併用の結果は、２種以上のリバビリン濃度が用量反応曲線に収まり、リバビリン単一化合物曲線が抗ウイルス活性における用量依存的応答を実証し、ＳＰＣ  ４７２９に関して抗ウイルス活性が観察されなかった場合に妥当であると決定された。表Ｆにまとめる結果は、リバビリンプラステラプレビル併用の２個の独立実験の個々の値およびリバビリンプラスＳＰＣ  ４７２９併用の単一の値として表される。
【０３０４】
【表１６】
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【０３０５】
リバビリンおよびテラプレビルの全体的な相互作用は、不確定であった。リバビリンおよびスクランブルした対照ＳＰＣ  ４７２９の相互作用は、ＳＰＣ３６４９のデータ（実施例２）とは対照的に拮抗的であり、ＳＰＣ３６４９およびリバビリンの間に明らかな相乗作用を示した。インビトロ細胞毒性における併用の影響の評価は、リバビリンプラステラプレビルの拮抗的相互作用（全体的な細胞毒性の低下）およびリバビリンプラスＳＰＣ  ４７２９の相互作用の僅かにより高い細胞毒性を明らかにした。
【０３０６】
実施例６：第２ａ相臨床治験（Ｔｒａｉｌ）−ミラビルセン単独療法
背景：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）複製は、宿主マイクロＲＮＡ−１２２（ｍｉＲ−１２２）およびＨＣＶゲノムの間の機能的相互作用に依存する。ミラビルセンは、肝臓特異的なｍｉＲ−１２２を標的化する、β−Ｄ−オキシ−ロックト核酸（ＬＮＡ）修飾ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドである。ミラビルセンは、インビトロにおける全ＨＣＶ遺伝子型に対する活性および抵抗性がインビボで出現しない長期持続性ＨＣＶ  ＲＮＡ抑制を実証した。この上向きの複数用量の第ＩＩａ相試験は、慢性ＨＣＶ感染患者におけるミラビルセンの安全性および有効性を評価した。
【０３０７】
方法：３６名の治療未経験の慢性ＨＣＶ遺伝子型１感染患者を、３種の逐次的投薬コホートに登録し、５種の毎週の用量のミラビルセン３、５または７ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝２７）またはプラセボ（ｎ＝９）を２９日間にわたり皮下投与し、１８週目まで経過観察した。
【０３０８】
結果：ミラビルセンは、活性治療法の終了を優に超えて延長した、ＨＣＶ  ＲＮＡの用量依存的低下をもたらした。ベースラインからの最大ＨＣＶ  ＲＮＡ減退の平均は、それぞれ３、５および７ｍｇ／ｋｇミラビルセン治療コホートにおいて１．２（ｐ＝０．０１１）、２．９（ｐ＝０．００３）および３．０（ｐ＝０．００２）ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬであった。この減退は、プラセボコホートにおいて０．４ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍＬであった。５ｍｇ／ｋｇを与えた１名の患者および７ｍｇ／ｋｇを与えた４名の患者は、検出不能なＨＣＶ  ＲＮＡを達成した。用量を制限する有害事象は存在せず、ＨＣＶゲノムｍｉＲ−１２２結合部位におけるエスケープ突然変異は観察されなかった。
【０３０９】
結論：ミラビルセンは、患者に投与すべき第一のマイクロＲＮＡ標的化治療法である。慢性ＨＣＶ遺伝子型１感染患者において、ミラビルセンは、安全であり、耐容性が良く、ＨＣＶ  ＲＮＡレベルの延長した用量依存的低下をもたらした。ミラビルセンに対するウイルス抵抗性の出現は見られなかった（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ番号ＮＣＴ０１２００４２０）。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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