(57)【要約】  【解決手段】  温熱療法に適用した際に増強した加熱能を示す磁性ナノ粒子を、そうしたナノ粒子を複合体化する幾つかの戦略として記述した。複合体化ナノ粒子の利用方法もまた提供する。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の磁性領域を形成するアミノ官能性ナノ粒子；前記アミノ官能性ナノ粒子と結合した少なくとも１つのリンカー；および前記アミノ官能性ナノ粒子または前記リンカーと結合した少なくとも１つのリガンドを有する、リガンド結合粒子。
【請求項２】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記磁性ナノ粒子はバイオナイズド・ナノフェライト（ｂｉｏｎｉｚｅｄ  ｎａｎｏｆｅｒｒｉｔｅ）を有するものである、リガンド結合粒子。
【請求項３】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記磁性ナノ粒子は５０％（ｗ／ｗ）以上の鉄含量を有するものである、リガンド結合粒子。
【請求項４】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記リンカーは二官能基性化合物である、リガンド結合粒子。
【請求項５】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記リンカーは、ハロアルキル、エポキシド、ビニルヘテロクムレン、エポキシプロペン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレン、またはそれらの組み合わせから選択される１若しくはそれ以上のサブユニットを有するマルチサブユニット組成物である、リガンド結合粒子。
【請求項６】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記リンカーは１若しくはそれ以上の親水性サブユニットを有するものである、リガンド結合粒子。
【請求項７】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記リンカーは化学的に異なる化合物の混合物を有するものである、リガンド結合粒子。
【請求項８】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記リンカーは、少なくとも１つのジエポキシド、少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）エポキシエーテル、少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、少なくとも１つのエピクロルヒドリン、またはそれらの組み合わせを有するものである、リガンド結合粒子。
【請求項９】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記リンカーはエピクロルヒドリンおよびポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルを有するものである、リガンド結合粒子。
【請求項１０】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記アミノ官能性粒子は基礎構造を有し、前記基礎構造は少なくとも１つのリンカー、少なくとも１つのリガンド、少なくとも１つのキレート剤、またはそれらの組み合わせを有するものである、リガンド結合粒子。
【請求項１１】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記リンカーは、アミン、チオール、ヒドラジン、アジド、ジスルフィド、スルホン酸、カルボン酸、マレイミド、またはそれらの組み合わせから選択される１若しくはそれ以上の末端反応性基を有するものである、リガンド結合粒子。
【請求項１２】
請求項１１記載のリガンド結合粒子において、末端基の反応性は置換または付加化学に基づくものである、リガンド結合粒子。
【請求項１３】
請求項１１記載のリガンド結合粒子において、前記カルボン酸はポリ（エチレングリコール）エーテルを基とするカルボン酸である、リガンド結合粒子。
【請求項１４】
請求項１１記載のリガンド結合粒子において、前記アジドは５−アジド−２ニトロベンズアミドである、リガンド結合粒子。
【請求項１５】
請求項１１記載のリガンド結合粒子において、前記ジスルフィドは３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドである、リガンド結合粒子。
【請求項１６】
請求項１１記載のリガンド結合粒子において、前記マレイミドは１，２−ジアシルエテンまたは３−マレイミジルプロピオンアミドである、リガンド結合粒子。
【請求項１７】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記リガンドは抗体である、リガンド結合粒子。
【請求項１８】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記リガンドはチオールまたはアミンから選択される基の取り込みによって修飾されるものである、リガンド結合粒子。
【請求項１９】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記リガンドはＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテートによって修飾されるものである、リガンド結合粒子。
【請求項２０】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、このリガンド結合粒子は、さらに、
生体適合性コーティングを有するものである、リガンド結合粒子。
【請求項２１】
請求項２０記載のリガンド結合粒子において、前記アミノ官能性ナノ粒子の表面は前記生体適合性コーティングを形成するものである、リガンド結合粒子。
【請求項２２】
請求項１記載のリガンド結合粒子において、前記粒子は温熱療法剤である、リガンド結合粒子。
【請求項２３】
リガンド結合粒子であって、
官能性磁性ナノ粒子と、
前記官能性磁性ナノ粒子と結合した少なくとも１つのリンカーとを有し、
前記リガンド結合粒子の比吸収率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅ：ＳＡＲ）は２０ｎｍ  ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ−ｓｐｉｏ粒子と比較して少なくとも５倍高いものである、
リガンド結合粒子。
【請求項２４】
請求項２３記載のリガンド結合粒子において、このリガンド結合粒子は、さらに、
前記官能性磁性ナノ粒子または前記リンカーに結合したリガンドを有するものである、リガンド結合粒子。
【請求項２５】
被験者の疾患を治療する方法であって、請求項１記載のリガンド結合粒子の有効量を前記被験者に投与する工程を有する方法。
【請求項２６】
リガンド結合粒子を調製する方法であって、
（ｉ）アミノ基またはニトロ基を有する単一の磁性領域を形成する粒子を官能化する工程と、
（ｉｉ）当該官能性粒子をリンカーと接触させる工程と、
（ｉｉｉ）前記粒子または前記リンカーにリガンドを結合させ、リガンド結合粒子を形成する、前記結合させる工程と
を有する方法。
【請求項２７】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記単一の磁性領域を形成するナノ粒子はバイオナイズド・ナノフェライトを有するものである、方法。
【請求項２８】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記単一の磁性領域を形成するナノ粒子は、５０％（ｗ／ｗ）以上の鉄含量を有するものである、方法。
【請求項２９】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記リンカーは二官能基性化合物である、方法。
【請求項３０】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記リンカーは、ハロアルキル、エポキシド、ビニルヘテロクムレン、エポキシプロペン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレン、またはそれらの組み合わせから選択される１若しくはそれ以上のサブユニットを有するマルチサブユニット組成物である、方法。
【請求項３１】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記リンカーは１若しくはそれ以上の親水性サブユニットを有するものである、方法。
【請求項３２】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記リンカーは化学的に異なる化合物の混合物を有するものである、方法。
【請求項３３】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記リンカーは少なくとも１つのジエポキシド、少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）エポキシエーテル、少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、少なくとも１つのエピクロルヒドリン、またはそれらの組み合わせを有するものである、方法。
【請求項３４】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記リンカーはエピクロルヒドリンおよびポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルの混合物を有するものである、方法。
【請求項３５】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記リンカーはアミン、チオール、ヒドラジン、アジド、ジスルフィド、スルホン酸、カルボン酸、マレイミド、またはそれらの組み合わせから選択される１若しくはそれ以上の末端反応性基を有するものである、方法。
【請求項３６】
請求項３５記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、末端基の反応性は置換または付加化学に基づくものである、方法。
【請求項３７】
請求項３５記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記カルボン酸はポリ（エチレングリコール）エーテルを基とするカルボン酸である、方法。
【請求項３８】
請求項３５記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記アジドは５−アジド−２ニトロベンズアミドである、方法。
【請求項３９】
請求項３５記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記ジスルフィドは３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドである、方法。
【請求項４０】
請求項３５記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記マレイミドは１，２−ジアシルエテンまたは３−マレイミジルプロピオンアミドである、方法。
【請求項４１】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記リガンドは抗体である、方法。
【請求項４２】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記リガンドはチオールまたはアミンから選択される基の取り込みによって修飾されるものである、方法。
【請求項４３】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記リガンドはＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテートによって修飾されるものである、方法。
【請求項４４】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記官能化する工程は約７〜約９のｐＨにおいて実施されるものである、方法。
【請求項４５】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、この方法は、さらに、
前記リガンド結合粒子を水性緩衝溶液で洗浄する追加の工程を有するものである、方法。
【請求項４６】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、この方法は、さらに、
前記リガンド結合粒子を滅菌する追加の工程を有するものである、方法。
【請求項４７】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記洗浄する工程は約５〜約８のｐＨにおいて実施されるものである、方法。
【請求項４８】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記粒子または前記リンカーにリガンドを結合させ、リガンド結合粒子を形成する、前記結合させる工程は、前記官能性粒子を前記リンカーと接触させる工程から１２時間以内に実施されるものである、方法。
【請求項４９】
請求項２６記載のリガンド結合粒子を調製する方法において、前記リガンド結合粒子のサイズは１０〜８０ｎｍである、方法。
【請求項５０】
（ｉ）単一の磁性領域を形成する粒子を、アミノ基またはニトロ基によって官能化する工程と、
（ｉｉ）当該官能性粒子をリンカーと接触させる工程と、
（ｉｉｉ）前記粒子または前記リンカーとリガンドを結合させ、リガンド結合粒子を形成する、前記結合させる工程と
を有する方法によって調整される温熱療法用ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願明細書は２００７年１１月１３日に出願された米国仮出願第６１／０１３，４１２号の米国特許法１１９条（ｅ）の下における優先権を主張するものであり、その開示内容は参照によってその全体が取り込まれるものである。
【０００２】
本発明は、治療用ナノ粒子組成物、およびより具体的には温熱療法用のリガンド結合ナノ粒子およびそのような粒子の作成方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
例えば癌および病原体に基づく疾患等の疾病の標準的な治療は、侵襲的でしばしばほんのささやかな成功のための外傷性治療過程に終わる有害な副作用（例えば、正常細胞への毒性、通常の身体機能の崩壊）を伴うであろう治療を含む。癌の標準的な治療は、例えば、放射線および／または化学療法等の全身的治療に先んじて行われる手術を含む局所的治療を典型的に含む。それら技術はいつも有効というわけではなく、有効だとしても、それらは特定の欠陥によって特徴付けられる。例えば、手術による治療は外観の損傷をもたらし、影響された組織の不完全な除去は癌再発のより重大なリスクを伴う。放射線療法および化学療法は患者の身体を疲弊させる可能性があり、再発に対して完全に効果的ではない。
【０００４】
他の１例として、病原体に基づく疾患の治療は、最初の段階として広域抗生物質の投与をしばしば含む。この行為はウイルス性病原体に対しては無効であり、食物の適切な消化に必要な腸内の良性の腸内細菌叢をしばしば排除し、良性細菌が再度増殖するまでの間、胃腸障害を引き起こす。他の例では、抗生物質耐性病原菌は抗生物質治療に反応しない。さらに、ウイルス性疾患治療のために設計した治療法はしばしば侵入するウイルスそのもののみを標的としている。ウイルスのさらなるコピーを生産するためにウイルスが侵入して感染した細胞は生存したままとなる。従って、抗生物質治療によって疾患の進行は停止するのではなく、ただ遅延するだけである。
【０００５】
標準的な治療に代わるものは免疫療法であり、癌を含む様々なヒト疾患の治療に急速に広まっているアプローチである。抗原結合能、分子構造、および特異性等の変化した特性を有する抗体、抗体フラグメント、およびペプチドが作製可能であることで、ヒト中での免疫原性反応を軽減するためにマウス抗体のキメラ化およびヒト化において進展があり、治療でのそれらの利用が広がった。さらに、ファージディスプレイ技術、リボソームディスプレイ法、およびＤＮＡシャフリングによって、リガンドのターゲティングでの利用において高いアフィニティおよび低い免疫原性を有する抗体フラグメントおよびペプチドの発見が可能となった。それらの進歩はとりわけ、特異的な抗原結合能および最小限の免疫反応を伴う特異性を有する免疫療法の方法設計を可能とした。
【０００６】
免疫療法は少なくとも３つの種類に分かれる：（１）成長受容体を標的とする抗体によってサイトカイン経路を乱す、または補体または抗体依存的な細胞毒性を誘導する；（２）抗体に結合した毒、放射性核種、またはサイトカインによって攻撃能力を直接的に与えた抗体；（３）毒を含む免疫リポソームと結合した、または免疫的細胞エフェクターと結合して攻撃能力を間接的に与えた抗体（二重特異性抗体）。毒または放射性核種の輸送に依存する免疫療法の難点は、それら薬剤が常に活性を有することである。そのため、非腫瘍細胞への障害および免疫療法に伴う毒性の問題の可能性がある。例えば、癌細胞は通常、表面に発現する抗原を血流中へ放出し、それらが免疫療法剤の標的となる。その結果、癌細胞ではなく放出された抗原と抗体との相互作用によって、病変組織への到達前に多くの抗体に基づいた治療法は希釈され、従って病変組織に輸送される実際の用量は減少する。
【０００７】
それらおよび他の関連する理由から、疾患治療のための代替的および改善された技術、特に既存技術よりも侵襲性および患者に対する外傷性が低い技術を提供することが望ましい。また、病変組織、病原体、または身体中の他の望ましくない物質等の標的部位でのみ有効で、不都合な副作用を最小化して有効性を改善する治療法を提供することが望ましい。さらには、患者による遵守を促すために、１回または非常に少ない治療回数で実施可能な技術を提供することが望ましい。
【０００８】
温熱療法は、即座の壊死（典型的には「温熱切除（ｔｈｅｒｍｏ−ａｂｌａｔｉｏｎ）」と言及される）および／または細胞中の熱ショック反応（古典的な加温療法（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ））を誘導して細胞内の一連の生化学的変化を介した細胞死を引き起こすことから、癌および他の疾患の治療法として有望である。約４０℃〜約４６℃の温度は病変細胞に不可逆な障害を引き起こすことができ、正常細胞は約４６．５℃までの温度への曝露において生存可能なため、病変組織中の細胞の温度を約４０℃と約４６℃との間まで上昇させることで正常で健康な組織に障害をもたらすことなく病変細胞を選択的に破壊する治療の選択肢を提供することができる。さらに、４６℃以上の温度は即座に温熱切除応答（ｔｈｅｒｍｏ−ａｂｌａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を引き起こすことにより、癌および他の疾患の治療に有効である。しかし、正常組織の最小量がそのような温度に曝露されることを保証するためには、正確で的確なターゲティングが必要である。
【０００９】
紫外線、Ｘ線、ガンマ、ベータ、アルファ、中性子等の電離放射線、または化学療法と併用して細胞または病変組織へ温熱療法を適用するとしばしば、電離放射線または化学療法の用量の相加的な組み合わせから期待されるよりも著しく大きな、増強された細胞毒性効果をもたらす。例えば、温熱療法と併用した場合、その温熱療法もまた致死量以下で行われた場合であったとしても、併用しなかった場合には致死量以下の用量での化学療法剤または電離放射線のいずれかに対して、細胞は高レベルの感受性を示す。熱または電離放射線のいずれかの用量による障害性の副作用を最小化または回避できるため、そうした併用療法は優れた臨床的な可能性を有している。
【００１０】
温熱療法の有益な効果は、温熱療法剤（すなわち、サセプタ）の病変細胞、組織、または病原体への適切なターゲティングによってさらに増加させることができる。
【００１１】
一部の温熱療法システムは、患者の深部に位置する腫瘍の領域的な加熱のエネルギーを調整するために、位相同期輪状配列システム（ａｎｎｕｌａｒ  ｐｈａｓｅｄ  ａｒｒａｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ＡＰＡＳ）等、マイクロ波または高周波（ｒａｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：ＲＦ）の加温療法を採用している。それらの技術は、組織導電率および高灌流組織のそれの不均質性によって制限される。典型的な課題は正常組織中の「ホットスポット」とそれに付随する病変組織中での用量不足、および所望の領域へ到達させる熱用量の十分な精度での測定の困難さである。後者は、再現可能および予測可能な治療後の患者の便益を確保するために必要な規定の臨床プロトコルの開発を妨げる。それら全ての要因は、そうした温熱療法システムによる特定領域の選択的な加熱を非常に困難にしている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願明細書に記述する発明はリガンド結合粒子に関するものであり、特定の実施形態では、リガンド結合粒子は温熱療法剤とすることができる。
【００１３】
様々な実施形態のリガンド結合粒子は、単一の磁性領域を形成するアミノ官能性ナノ粒子；アミノ官能性ナノ粒子と結合した少なくとも１つのリンカー；およびアミノ官能性ナノ粒子またはリンカーと共有結合した少なくとも１つのリガンドを含むことができる。いくつかの実施形態では、リンカーは二官能基性化合物である。他の実施形態では、リンカーは、ハロアルキル、エポキシド、ビニルヘテロクムレン、エポキシプロペン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレン、またはそれらの組み合わせから選択した１若しくはそれ以上のサブユニットを有するマルチサブユニット組成物とすることができる。さらに他の実施形態では、リンカーは１若しくはそれ以上の親水性サブユニットを含むことができ、特定の実施形態では、リンカーは化学的に異なる化合物の混合物とすることができる。例えば、特定の実施形態では、リンカーは少なくとも１つのジエポキシド、少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）エポキシエーテル、少なくとも１つのポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、少なくとも１つのエピクロルヒドリン、またはそれらの組み合わせを含むことができ、および一部では、リンカーはエピクロルヒドリンおよびポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルの混合物を含むことができる。
【００１４】
さらなる実施形態のリンカーは、アミン、チオール、ヒドラジン、アジド、ジスルフィド、スルホン酸、カルボン酸、マレイミド、またはそれらの組み合わせから選択した１若しくはそれ以上の末端反応性基を含むことができ、他の実施形態では、リガンド結合粒子の末端基の反応性は置換または付加の化学反応に基づくものとすることができる。特定の実施形態では、カルボン酸はポリ（エチレングリコール）エーテルをベースとしたカルボン酸とすることができ；アジドは５−アジド−２ニトロベンズアミドとすることができ；ジスルフィドは３−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミドとすることができ；マレイミドは１，２−ジアシルエテンまたは３−マレイミジルプロピオンアミドとすることができる。
【００１５】
様々な実施形態でのアミノ官能性粒子は基礎構造を含み、前記基礎構造は少なくとも１つのリンカー、少なくとも１つのリガンド、および少なくとも１つのキレート剤、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１６】
特定の実施形態では、リガンドは抗体とすることができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、チオールまたはアミンから選択した基の取り込みによって修飾でき、特定の実施形態では、リガンドはＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテートで修飾することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態に従って、リガンド結合粒子はさらに生体適合性コーティングを含むことができる。特定の実施形態では、アミノ官能性ナノ粒子の表面が生体適合性コーティングを形成する。
【００１８】
様々な実施形態のリガンド結合粒子は温熱療法剤とすることができる。
【００１９】
他の実施形態のリガンド結合粒子は、官能性磁性ナノ粒子、および官能性磁性ナノ粒子に結合した少なくとも１つのリンカーを含み、前記リガンド結合粒子の比吸収率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅ：ＳＡＲ）は２０ｎｍ  ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ−ｓｐｉｏ粒子の少なくとも５倍以上である。特定の実施形態では、リガンド結合粒子は官能性磁性ナノ粒子またはリンカーと共有結合したリガンドをさらに有するものである。
【００２０】
様々な実施形態では、本発明の１態様のリガンド結合粒子の有効量を被験者へ投与する工程を含む、被験者で疾患を治療する方法を提供する。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、アミノまたはニトロ基を有する単一の磁性領域を形成する粒子を官能化する工程と、官能性粒子をリンカーと接触する工程と、リガンド結合粒子を形成するためにリガンドを粒子またはリンカーと共有結合する工程とを含むリガンド結合粒子の調製方法を含む。特定の実施形態では、官能化する工程は約７〜約９のｐＨにて行う。他の実施形態では、リガンド結合粒子の調製方法は、水性緩衝溶液によってリガンド結合粒子を洗浄する追加工程を含む。いくつかの実施形態では、洗浄する工程は約５〜約８のｐＨにて行う。さらに他の実施形態では、リガンド結合粒子の調製方法は、リガンド結合粒子を滅菌する工程を含む。いくつかの実施形態に従って、リガンド結合粒子を形成するためにリガンドを粒子またはリンカーと共有結合する工程は、官能性粒子をリンカーと接触する工程から１２時間以内に行う。
【００２２】
いくつかの実施形態に従ったリガンド結合粒子は１０〜８０ｎｍの大きさの範囲である。
【００２３】
様々な実施形態では、アミノまたはニトロ基を有する単一の磁性領域を形成する粒子を官能化する工程と、官能性粒子をリンカーと接触する工程と、リガンド結合粒子を形成するためにリガンドを粒子またはリンカーと共有結合する工程とを含む処理によって調製した温熱療法用ナノ粒子を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
本発明の本質および利点のより完全な理解のために、以下の詳細な記述を添付図と関連付けて参照すべきである。
【図１】図１は、本発明の実施形態に従ったサセプタ複合体を図示したものである。
【図２】図２は、サセプタ複合体の調製のための４つの合成戦略を図示したものである。
【図３】図３は、２５ｎｍ（黒）、５０ｎｍ（濃灰色）、７０ｎｍ（淡灰色）の直径を有し、アミノ官能性粒子（ＩＩ）のサイズ分布のグラフである。
【図４】図４は、２００Ｈｚでの平均直径７０ｎｍを有する磁性粒子の室温における単位体積当たりの磁化率のインピーダンス分光法データを描いたグラフである。
【図５】図５ａは、粒子表面に結合したウサギ抗ヤギ抗体と相互作用可能な２次ヤギ抗ウサギ抗体の２つの可能な方法の概略図である。    図５ｂは、ウサギ抗ヤギが適切な配置である場合にのみ、ヤギ抗マウス抗体はウサギ抗ヤギ抗体複合体と相互作用可能であることの概略図である。
【図６】図６は、結合した全ての抗体を、図２に図示した戦略を用いて調製した抗体結合粒子の鉄１ｍｇ当たりの免疫活性と比較して描いた棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
特定の処理、組成物、または記述した方法論は変更ができるため、本発明はそれらに限定されない。また、記述に用いた用語は特定の型または実施形態のみを記述する目的のものであって、本発明の範囲を限定する意図はない。
【００２６】
ほかに定義しない限り、本願明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本願明細書に記述したものと類似または同等のあらゆる方法が、本発明の実施例の実施または試験で使用可能であるにもかかわらず、好ましい方法はここに記述するものである。
【００２７】
本願明細書で言及する全ての刊行物および参考文献は参照によって取り込まれる。本願明細書中の何物も、先行発明という理由によってそれらの開示に本発明が先行するに値しない事の承認として解釈すべきではない。
【００２８】
本願明細書および添付の請求項中で用いる場合、文脈が明らかにそうでないと述べていない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数形への言及を含む。
【００２９】
本願明細書で用いる場合、「約」という用語は、それと共に用いる数字の数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。従って、約５０％とは４０％〜６０％の範囲を意味する。
【００３０】
本発明の治療用ナノ粒子組成物と共に「投与する」を本願明細書で用いる場合、標的組織中または上へ直接治療物を投与すること、または患者へ治療物を投与することで治療物が標的とする組織にインパクトを与えることを意味する。治療物の「投与」は２〜３例を挙げると、注射、注入、または他の既存技術といずれかの方法の組み合わせによって達成することができる。それら組み合わせる技術は、限定するわけではないが、加熱、放射線、および超音波を含む。
【００３１】
本願明細書で用いる場合「交番磁界」または「ＡＭＦ（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｉｅｌｄ）」という用語は、その場のベクトルが周期的に方向を変化させ、典型的には正弦曲線、三角形、長方形または類似した形状のパターンとなる磁場であって、周波数が約８０ｋＨｚ〜約８００ｋＨｚの範囲であるものに言及するものである。ＡＭＦはまた、静磁場に加えることで結果として得られる磁場ベクトルのＡＭＦ成分のみが方向を変化させるようにすることもできる。ＡＭＦは交流電場を伴い、実際は電磁気である。
【００３２】
本願明細書で用いる場合「抗体」という用語は特定の抗原に反応性の免疫グロブリン分子への言及を含み、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む。
【００３３】
本願明細書で用いる場合「病変組織」という用語は、骨、肺、血管、神経、結腸、卵巣、乳、および前立腺癌等のあらゆる種類の固形腫瘍に関連する組織または細胞に言及するものである。病変組織という用語はまた、ＡＩＤＳに影響された組織または細胞等の免疫系の組織または細胞；細菌性、ウイルス性、寄生性、または真菌性等の病原体を有する疾患、病原体を有する疾患の例はＨＩＶ、結核、およびマラリアを含む；肥満等のホルモン関連疾患；血管系疾患；多発性硬化症等の中枢神経系疾患；および有害な血管形成、再狭窄アミロイドーシス、毒、臓器移植に伴う反応副生成物、および他の異常な細胞または組織増殖等の望ましくない物体にもまた言及する。
【００３４】
本願明細書で用いる場合、組成物の「有効量」または「治療有効量」とは、所望の効果を達成するために計算した所定量である。
【００３５】
本願明細書で用いる場合「エネルギー源」とは、治療物中の潜在的な放射能源を活性化する目的で治療物へＡＭＦ以外の形態でエネルギーを伝達可能な機器に言及するものである。
【００３６】
本願明細書で用いる場合「加温療法（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）」とは、４０℃〜６０℃の温度まで組織を加熱することに言及するものである。
【００３７】
「インパクト」という用語は、治療を提供、適用、投与する患者の組織、細胞、または領域の外観、形態、特性および／または物理的特性の変化を伝えるために用いる。
【００３８】
本願明細書で用いる場合「兆候（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）」という用語は、癌等の病状に伴う病状または症状に言及するものである。例えば、疲労または発熱は病的状態にある患者の兆候である。
【００３９】
「リガンド」という用語は、分子を特異的に標的とする化合物に言及するものである。
【００４０】
「選択的な」または「選択的に」とは、続いて記述する構造、イベント、または状況が起こるまたは起こらないこと、およびイベントが生じる事例および生じない事例を記述が含むことを意味する。
【００４１】
本願明細書で用いる場合「標的」とは、不活性化、破裂、崩壊、または破壊が望まれる物質に言及するものである。例えば、病変組織は治療の標的とすることができる。
【００４２】
「組織」という用語は、特定の機能の実行において一体となる同様に専門化した細胞のあらゆる集合に言及するものである。
【００４３】
その最も基本的な形態において本発明は本願明細書にて、温熱療法での使用のためのリガンド結合粒子に関して記述している。本発明の様々な実施形態は、粒子、少なくとも１つのリンカーまたは架橋化合物、および少なくとも１つのリガンドを含む。
【００４４】
様々な実施形態の粒子は磁性粒子であり、他の実施形態では粒子は交番磁界（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｉｅｌｄ：ＡＭＦ）または他のエネルギー源中に設置した場合に熱を発生可能な磁性粒子である。そうした粒子は磁性エネルギー感受性粒子または「サセプタ」として言及し、温熱療法の提供に有用である。
【００４５】
本願明細書で用いる場合「サセプタ」および「ターゲティングしていないサセプタ（ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｏｒ）」と言う用語は、特定の細胞種、分子、または他の標的と相互作用するよう修飾していないサセプタに言及するものである。対称的に、「ターゲティングしたサセプタ」、「リガンド結合」粒子またはサセプタ、および「サセプタ複合体（ｓｕｓｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」は、例えばサセプタに共有結合した抗体を用いて特定の標的と相互作用するよう修飾してある。ターゲティングしていないサセプタはそのようなターゲティング機構を含まない。
【００４６】
図１は本発明の実施形態に従ったサセプタ複合体１００を図示したものである。サセプタ複合体１００は磁性エネルギー感受性粒子またはサセプタ１４２を含む。このサセプタはサセプタ１４２を完全または部分的に被覆するコーティング１４４を含むことができる。例えば、限定するわけではないが、抗体等の少なくとも１つのターゲティングリガンド１４０が、サセプタ１４２の外側部分に位置することができる。ターゲティングリガンド１４０は、細胞または病変組織の種類等の特定の標的を探し出して結合するように選択することができる。サセプタ１４２がＡＭＦ等のエネルギー源に曝露された場合に、サセプタ１４２中で熱が発生する。特にコーティング１４４が例えば高分子材料等のように高粘度を有する場合、コーティング１４４はサセプタ１４２の加熱特性を増強する。
【００４７】
サセプタについて具体的に言及すると、ＡＭＦ中に設置した場合にサセプタが生成する熱は、サセプタの磁性材料がＡＭＦに反応して振動することによるエネルギー損失を表す。磁場のサイクル当たりに発生する熱量およびエネルギー損失に関与するメカニズムは、サセプタ材料および適用する磁場の両方の具体的特性に依存する。本発明の実施形態では、サセプタは単一の磁性領域を形成する。
【００４８】
いくつかの態様に従って、ＡＭＦまたは他のエネルギー源に曝した場合、サセプタはキュリー温度と呼ばれる固有の温度まで加熱する。キュリー温度は、サセプタの磁性材料の強磁性体から常磁性体への可逆的な遷移が生じる温度である。この温度以下では適用したＡＭＦ中で磁性材料は熱を発生するが、キュリー温度以上では磁性材料が常磁性体であり磁性領域はＡＭＦに無反応である。従って、キュリー温度以上でＡＭＦに曝露された場合、磁性材料は熱を発生しない。磁性材料がキュリー温度以下まで冷却すると、材料は磁気特性を回復してＡＭＦを適用した場合の加熱を再開する。このサイクルはＡＭＦへの曝露中ずっと繰り返される。そのように、サセプタの磁性材料は加熱温度を自身で制御することができる。本発明の実施形態では、磁性材料は約４０℃〜約１５０℃のキュリー温度を有するように選択することができる。
【００４９】
サセプタがどの温度まで加熱するのかは、様々な要因の中でも、サセプタ材料の磁気特性、磁界の特性、および標的部位の冷却能力に依存する。サセプタ材料およびＡＭＦ特性の選択は、特定の標的のタイプに対する治療効率を最適化するように調整することができる。材料組成、サイズ、および形状等のサセプタの多くの態様は、加熱特性に直接的に影響し、それらの特徴は所望の加熱特性を達成するために調整することができる。例えば、温熱療法に利用するサセプタのサイズは、サセプタを利用する特定の適用（すなわち、達成すべき温度）、およびサセプタを構成する材料に依存する。
【００５０】
サセプタの大きさは、例えばリンカーおよびリガンドを含む「サセプタ複合体」の全体の大きさもまた決定する。様々な実施形態では、サセプタの大きさは約０．１ｎｍ〜約２５０ｎｍである。サセプタ複合体の大きさは、兆候、サセプタおよびサセプタ複合体を構成する材料、投与経路、および使用方法にもまた依存する。いくつかの実施形態では、例えば静脈注射により患者へ投与するサセプタまたはサセプタ複合体は、治療組成物の濃度増加および血流中での長い滞留時間を達成するために、細網内皮系（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍ：ＲＥＳ）による摂取、およびそれに続いては肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、および骨髄への分布を回避することが望ましい。ＲＥＳによる摂取をうまく回避するためには、サセプタまたはサセプタ複合体の直径は約３０ｎｍ以下であり、特にサセプタが磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）を含む実施例ではサセプタ複合体の直径は約８ｎｍと約２０ｎｍとの間であろう。そうしたサセプタ複合体のサセプタは適用するＡＭＦ中での加熱のために十分な磁気モーメントを保持しつつ、ＲＥＳによる治療組成物の摂取の回避を可能とする。いくつかの実施形態では、約８ｎｍ以上の直径を有する強磁性体サセプタが温熱療法への適用に適切である。他の実施形態では、例えばコバルト等の他の元素が磁鉄鉱サセプタ中に含まれる。第２の元素の含有は、そのようなサセプタを含むサセプタおよびサセプタ複合体の大きさの範囲を小さくすることを可能とする。例えば、コバルトは磁鉄鉱より小さいものの、磁鉄鉱より大きな磁気モーメントを有しており、治療組成物の大きさを減少しつつ、コバルト含有磁鉄鉱サセプタの全体の磁気モーメントに貢献するであろう。
【００５１】
本発明の実施形態で使用するサセプタは適切な磁気モーメントおよびサイズを提供するあらゆる数の材料を含むことができる。サセプタの材料組成物は特定の標的に基づいて選択する。例えば、実施形態でのサセプタは、限定するわけではないが、酸化鉄粒子およびＦｅＣｏ／ＳｉＯ２粒子を含む。標的へ伝達される全熱量と同じく、自己制御式のキュリー温度はサセプタ材料と直接的に関連しているため、サセプタ組成物は異なる標的の種類に応じて設計する。標的の組成および患者の体内での位置に基づいた固有の加熱および冷却能力を考慮すると、それぞれの標的の種類の所望の加熱を達成するためにはそうした調整が必要であろう。例えば、血液供給が貧弱で比較的に隔離された患者の領域中に位置する腫瘍は、主要な血管近傍に位置する腫瘍と比較して、有効な温熱療法のためにより低いキュリー温度のサセプタ材料を必要とする。血流中に位置する標的は同様に特異的なキュリー温度を有するサセプタ材料を必要とする。そのように、磁鉄鉱に加えて、様々な実施形態のサセプタは、例えば、コバルト、鉄、希土類金属およびそれに類するもの、およびそれらの組み合わせを含むことができる。
【００５２】
サセプタ材料の選択では、比吸収率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅ：ＳＡＲ）もまた考慮する。所与の材料のＳＡＲは、ＲＦ磁場に曝露した場合に材料が吸収する高周波（ｒａｄｉｏ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：ＲＦ）エネルギーの率として記述される。例えば、Ｆｅｒｒｏｔｅｃ  Ｃｏｒｐ．（ニューハンプシャー州Ｎａｓｈｕａ）から入手可能な直径約１１０ｎｍのシリーズＥＭＧ７００およびＥＭＧ１１１１酸化鉄粒子は、１，３００のＯｅｒｓｔｅｄｔ束密度および１５０ｋＨｚの周波数で、粒子１グラム当たり約３１０ワットのＳＡＲを有する。Ｉｎｆｒａｍａｔ  Ｃｏｒｐ．（コネチカット州Ｗｉｌｌｉｎｇｔｏｎ）から入手可能なＦｅＣｏ／ＳｉＯ２粒子等の他の粒子は、同様の磁場条件下で粒子１グラム当たり約４００ワットのＳＡＲを有する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、サセプタはコーティングを含む。適切なコーティング材は、限定するわけではないが、合成および生体高分子、共重合体およびポリマーブレンド、および無機物を含む。コーティング材として合成高分子を使用する実施形態では、それらコーティングは、例えば、アクリレート、シロキサン、スチレン、酢酸塩、アルキレン、グリコール、アルキレン、酸化アルキレン、パリレン、乳酸、グリコール酸、およびそれらの組み合わせを含み、特定の実施形態では、それらコーティングはヒドロゲルポリマー、ヒスチジン含有ポリマー、およびヒドロゲルポリマーおよびヒスチジン含有ポリマーの組み合わせを含む。さらなる実施形態は、例えば、多糖、ポリアミノ酸、タンパク質、脂質、グリセロール、脂肪酸、およびそれらの組み合わせ等の生体高分子を含むコーティング材を包含し、他の実施形態では、コーティング材として使用する生体材料は、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン、キトサン、セルロース、デキストラン、アルギン酸塩、澱粉、炭水化物、およびグリコサミノグリカンを含む。タンパク質コーティング材を使用する実施例では、それらタンパク質は、細胞外マトリックスタンパク質、プロテオグリカン、糖タンパク質、アルブミン、およびゼラチンを含む。さらに他の実施形態では、生体コーティング材は適切な合成高分子材料と組み合わせて使用する。
【００５４】
本発明の他の実施形態は、限定するわけではないが、金属、金属合金、および例えばヒドロキシアパタイト等のセラミックス、炭化ケイ素、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、フェライト、ホスホン酸塩、元素周期表の第４族元素の酸化物等の無機コーティング材を有するサセプタを含む。他の実施形態では、無機コーティング材は、生体または合成高分子もまた含む複合コーティングの成分である。
【００５５】
サセプタが生体適合性の磁性材料から形成されるいくつかの実施形態では、サセプタ自体の表面が生体適合性コーティングとして働く。他の実施形態では、コーティング材はサセプタを生体適合性にする役目を果たすことができる。さらに他の実施形態では、コーティング材は、例えば、トランスフェクションによる細胞中へのサセプタの輸送を促進することができる。トランスフェクション剤と呼ばれるそれらコーティング材は、例えば、プラスミド、ウイルス、ファージ等のベクター、バイロンまたはウイルスコート、プリオン、ポリアミノ酸、カチオン性リポソーム、両親媒性物質、非リポソーム脂質、またはそれらのあらゆる組み合わせを含む。他の実施形態では、生体適合性コーティング材は、トランスフェクション剤と有機および／または無機物質との混合物とすることができる。そうした実施形態では、コーティング材および／またはトランスフェクション剤の組み合わせは、特定の種類の細胞または病変組織および患者体内中の特定の位置に従って調整できる。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態では、リンカーはサセプタまたはサセプタのコーティングに共有結合する。いくつかの実施形態では、リンカーはサセプタの外側表面へ接触および結合しつつ、リガンドと共有結合することでリガンドをサセプタの外側表面へ付着させる二官能基性化合物とすることができる。他の実施形態では、リンカーはサセプタの外側表面に結合して、サセプタによる細網内皮系（ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｙｓｔｅｍ：ＲＥＳ）の回避を促進する。例えば、当該技術分野で「ペグ化」として知られる処理を通したポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）リンカーによるサセプタへの官能化は、ＲＥＳによる検出および摂取の回避に有効であり、ＥＰＲ（Ｅｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果を介して腫瘍の変化した血管系の透過を促進して、腫瘍間質へのサセプタの好ましい蓄積をもたらす結果となる。
【００５７】
リンカーが短いかまたは長いか、堅いかまたは柔軟性があるか、疎水性かまたは親水性かに依存して、リンカーは最終的な複合体の特性に影響する。様々な実施形態のリンカーは疎水性または親水性の有機物、無機物、または化学的に異なる化合物の混合を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、アルキル、アルケン、アルキン、ハロアルキル、エポキシド、ビニル、またはヘテロクムレン化合物を含むことができ、他の実施形態では、リンカーはマルチサブユニット化合物を含む。それら実施形態のリンカーは、マルチサブユニット化合物中のサブユニットの数および／または種類によって限定されず、例えば、エポキシプロペン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、およびそれらに類するもの、およびそれらの組み合わせを含むことができる。さらに他の実施形態では、リンカーは１若しくはそれ以上のエピクロルヒドリン、ジエポキシド、またはそれらの組み合わせを含む。本発明の実施形態によって包含されるリンカーの例は、限定するわけではないが、ポリ（エチレングリコール）エポキシエーテル、ポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル、およびエピクロルヒドリンおよびポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテルの混合物を含む。
【００５８】
様々な実施形態のリンカーは、１若しくはそれ以上の末端反応性基をさらに含む。末端反応性基の種類は、特定の種類のサセプタを特定の種類のリガンドへ共有結合するため、特定のリガンドとの共有結合を形成するため、またさもなければサセプタをそうしたリガンドへ結合するために必要な反応化学の種類に依存して変化する。特定の実施形態では、末端基の反応性は置換または付加化学に基づくことができる。例となる末端反応性基は、限定するわけではないが、カルボン酸、アミン、ヒドラジン、アジド、チオール、ジスルフィド、スルホン酸、ビニル、１，２−ジアシルエチレンおよび誘導体、およびそれらの組み合わせを含むことができ、特定の実施形態では、末端反応性基は、アミン、チオール、またはカルボン酸部分とすることができる。いくつかの実施形態では、カルボン酸末端基はポリ（エチレングリコール）エーテルをベースとしたカルボン酸とすることができ、アジド末端基は５−アジド−２−ニトロベンズアミドとすることができ、ジスルフィド末端基は３−（２−ピリジリチオ）プロピオンアミドとすることができ、１，２−ジアシルエテン末端基はマレイミドまたは３−マレイミジルプロピオンアミドとすることができる。
【００５９】
本発明の実施形態のリガンドは選択した標的に対してサセプタが選択的に確かに付着する、または結合するように選択する。いくつかの実施形態では、リガンドは細胞上の癌または疾患マーカーのターゲティングを可能にする。他の実施形態では、リガンドは患者の特異的な種類の生体物質のターゲティングを促進する。様々な実施形態は、限定するわけではないが、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、単糖類、炭水化物、グリカン、サイトカイン、ケモカイン、ヌクレオチド、レクチン、脂質、受容体、ステロイド、神経伝達物質、クラスター表記／分化（Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ／Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ＣＤ）マーカー、インプリントしたポリマー、およびそれらの組み合わせ等のリガンドを含む。特定の実施形態では、タンパク質リガンドは、例えば、細胞表面タンパク質、膜タンパク質、プロテオグリカン、糖タンパク質、ペプチド、およびそれらに類するものを含み；ヌクレオチドリガンドは、例えば、１本鎖ヌクレオチド、２本鎖ヌクレオチド、相補的ヌクレオチド、およびポリヌクレオチド断片を含み；脂質リガンドは、例えば、リン脂質、糖脂質、およびそれらに類するものを含む。他の実施形態では、リガンドは抗体または抗体フラグメントである。
【００６０】
本発明の実施形態において有用な抗体は特定の種類の抗体に限定されない。いくつかの実施形態において有用な抗体は遺伝的に改変した、例えばキメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロ結合抗体（例えば二重特異性抗体）である。抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびｒＩｇＧ、および組み換え１本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ：ｓｃＦｖ）等の抗原結合能を有するフラグメントを含む抗原結合形態もまた含む。それらフラグメントは当該技術分野で周知であり、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９４〜１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ  ａｎｄ  Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３．ｓｕｐ．ｒｄ  Ｅｄ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ&Ｃｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）で容易に見付けられる。他の実施形態の抗体は、限定するわけではないが、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７（１９９２），Ｐａｃｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１５７９（１９９２），Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｓｕｐｒａ，（１９９３），Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５３６８（１９９４），Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ６：７８１（１９９７）、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５（１９９６），Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，５３：４０２６（１９９３）、およびＭｃＣａｒｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：３０１（１９９５）等に記述されている２価または二重特異性分子を包含する。
【００６１】
本発明の実施形態のリガンドは、当該技術分野で周知のあらゆるマーカーまたは抗原に結合するよう調製することができる。マーカーの選択は選択する標的に依存して変化するが、本発明の実施形態において有用なマーカーは、限定するわけではないが、細胞表面マーカー、血管内皮増殖因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＶＥＧＦＲ）ファミリー、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ）ファミリーの１員、抗イディオタイプｍＡＢの１種、ガングリオシドミミックの１種、クラスター表記／分化（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ＣＤ）抗原、上皮細胞増殖因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ）ファミリーの１員、細胞接着分子の１種、ＭＵＣ−タイプのムチンファミリーの１員、癌抗原（ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＡ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ、糖タンパク質抗原、メラノーマ関連抗原（ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＭＡＡ）、タンパク質分解酵素、カルモジュリン、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ）受容体ファミリーの１員、血管新生マーカー、Ｔ細胞に認識されるメラノーマ抗原（ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：ＭＡＲＴ）抗原、メラノーマ抗原をコードする遺伝子（ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ：ＭＡＧＥ）ファミリーの１員、前立腺膜特異的抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＭＳＡ）、小細胞性肺癌抗原（ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＳＣＬＣＡ）、Ｔ／Ｔｎ抗原、ホルモン受容体、癌抑制遺伝子抗原、細胞周期調節因子抗原、癌遺伝子抗原、癌遺伝子受容体抗原、増殖マーカー、細胞外マトリックスの分解に関わるタンパク質分解酵素、悪性形質転換の関連因子、アポトーシス関連因子、およびヒト癌抗原（ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ）を含む。例えば、乳癌の特異的マーカーは、限定するわけではないが、ＭＵＣ−タイプのムチンファミリー、上皮細胞増殖因子受容体（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｅｒ：ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ）、ヒト癌抗原、血管内皮増殖因子受容体（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＶＥＧＦＲ）抗原、メラノーマ抗原（ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ：ＭＡＧＥ）、ファミリー抗原、Ｔ／Ｔｎ抗原、ホルモン受容体、増殖因子受容体、クラスター表記／分化（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ＣＤ）抗原、腫瘍抑制遺伝子産物、細胞周期調節因子、癌遺伝子産物、癌遺伝子受容体、増殖マーカー、接着分子、細胞外マトリックスの分解に関わるタンパク質分解酵素、悪性形質転換の関連因子、アポトーシス関連因子、ヒト癌抗原、糖タンパク質抗原、ＤＦ３、４Ｆ２、ＭＧ���Ｍ抗原、乳癌抗原ＣＡ１５−３、カルポニン、カテプシン、ＣＤ３１抗原、増殖性細胞核抗原１０（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  １０：ＰＣ１０）、およびｐＳ２等の細胞表面抗原から選択することができる。
【００６２】
他の１実施形態では、リガンドの標的を患者の免疫系の疾患と関連する抗原とすることができる。例えば、マーカーまたはリガンドの標的とするマーカーは、例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞等の生きた標的を含むように選択することができ、リガンドは例えば、タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、感染性微生物、およびそれらに類するもの等の免疫系疾患に関連した標的へのアフィニティを有する。
【００６３】
さらに他の１実施形態では、リガンドは病原体を有する状態に関連する抗原を標的とすることができる。病原体は、例えば、細菌、ウイルス、微生物、真菌、寄生生物、またはプリオン等の疾患を引き起こすあらゆる病原体を含む。この実施形態のリガンドは、細胞マーカーまたは病原体に関連したマーカーまたは感染細胞上の標的に相当するマーカーまたは複数のマーカーへのアフィニティを有する。例えばリガンドは、限定するわけではないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓを含む細菌；限定するわけではないが、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ）、エプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ：ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス等の肝炎ウイルス、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２等のヒト免疫不全ウイルス、ヘルペスウイルス６型等のヘルペスウイルスを含むウイルス；限定するわけではないが、トリパノソーマ・クルージ、キネトプラスト、マンソン住血吸虫、日本住血吸虫、またはＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉを含む寄生生物；または、限定するわけではないが、アスペルギルス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、リゾムコールを含む真菌状態（ｆｕｎｇｕｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）等の病原体自体を標的とするよう選択できる。
【００６４】
本発明の特定の実施形態では、抗体または抗体フラグメントと変性剤との反応によって修飾抗体を作製可能である。例えば、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）といったアミン反応性変性剤を利用して部位非特異的に有機部分を抗体へ結合可能である。本発明の他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントのジスルフィド結合（例えば、鎖間のジスルフィド結合）の還元によって修飾ヒト抗体または抗原結合フラグメントを調製する。還元した抗体または抗原結合フラグメントは次に、抗体をリンカーへ共有結合させるためにチオール反応性変性剤と反応させる。本発明の態様の、抗体の特定の部位に結合した有機部分を含む修飾ヒト抗体または抗原結合フラグメントは、逆タンパク質分解（Ｆｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１４７  １５３（１９９２）；Ｗｅｒｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：４１１  ４１７（１９９４）；Ｋｕｍａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６（１９）２２３３  ２２４１（１９９７）；Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２４（１）：５９  ６８（１９９６）；Ｃａｐｅｌｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，５６（４）：４５６  ４６３（１９９７））およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６）に記述の方法等の適切な方法を用いて調製可能である。
【００６５】
さらに他の１実施形態では、リガンドは望ましくない状態に関する細胞または組織を標的とすることができる。そうした望ましくない状態は疾患と関連することもあるが、正常な状態でもまた存在する可能性がある。リガンドは望ましくない状態に関するタンパク質または他の抗原、または望ましくない状態に関する生体分子経路に関連する他の分子を直接標的とすることができる。例えば、低密度リポタンパク質（ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ：ＬＤＬ）上のアポリポタンパク質Ｂは動脈硬化症治療の標的分子として利用でき、また胃抑制ポリペプチド受容体は肥満治療の標的とすることができる。さらなる例は、ホルモン関連疾患に関する標的であって、標的はホルモン自体またはホルモン生産に関連するホルモンまたはシグナリングペプチドであるところのホルモン関連疾患に関する標的、および病変組織に関連した抗原またはペプチドが標的である癌以外の病変組織、または癌以外の病変組織の堆積物に関連したタンパク質またはペプチドに向けたリガンドを含む。
【００６６】
さらなる実施形態では、リガンドは臓器移植後の臓器拒絶に関連する抗原またはタンパク質を標的とすることができる。それら実施形態での標的は移植臓器の特定の種類に依存して変化し、例えばＴ細胞またはＢ細胞等の免疫細胞を含む。
【００６７】
さらなる実施形態では、リガンドは患者中の毒を標的とすることができる。それら毒は、限定するわけではないが、細菌毒素、植物毒素、昆虫毒、動物性毒素、およびヒトが生産する毒素等の生物が生産するあらゆる毒を含む。
【００６８】
本発明の実施形態のリガンドのさらなる例は米国特許出願第１０／６９６，３９９号に見ることができ、その全体はこの参照によって本願明細書に取り込まれる。
【００６９】
特定の実施形態のリガンドはサセプタ、サセプタに結合したコーティング、またはサセプタ表面に結合したリンカーに共有結合することができる。いくつかの実施形態では、リガンドがリンカーまたはコーティングに共有結合する能力を増強するためにリガンドを修飾することができ、実施例は修飾の種類によって限定されない。例えば、特定の実施形態では、リガンドはチオールで修飾できる。修飾リガンドの調製方法は当該技術分野で周知であり、市販されている。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態は、リガンド結合粒子または「サセプタ複合体」の調製方法を含む。サセプタ複合体の様々な調製方法の概要は図２に提供しており、それら方法は粒子（Ｉ）を調製する工程と、粒子にアミノ基を導入する（ＩＩ）工程と、例えば、粒子（ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、およびＸＩ）を形成するために、上述したようにアミノ官能性粒子（ＩＩ）にリンカーを反応させる工程と、リガンド結合粒子またはサセプタ複合体（ＩＶ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、およびＸ）を形成するためにリンカー上の第２の官能基をリガンドと反応させる工程とを含む。図２に提供および本願明細書に記述した概要のあらゆる工程に対して当該技術分野で周知の様々な変更を加えることができ、または１若しくはそれ以上の工程を他の同等の工程で置換することができる。それら変更は本発明の範囲中に包含される。例えば、粒子または「サセプタ」はチオールまたは他の反応基を導入することができ、または１種類以上のリンカーまたはリガンドをサセプタへ共有結合するように様々な工程を組み合わせることができる。本発明の他の実施形態では、疾患治療用サセプタにリンカーまたはリガンドの有効量を結合するために、結合の非結合領域に対する具体的な比率についてサセプタを最適化する。さらなる実施形態では、サセプタ複合体を洗浄および／または滅菌する工程を方法に含める。洗浄および／または滅菌する工程は精密濾過または当該技術分野で周知の他のそのような方法を含む。
【００７１】
本発明の他の実施形態は、単一の磁性領域を形成する粒子にアミノまたはニトロ基を導入する工程と、官能性粒子をリンカーと接触させる工程と、リガンド結合粒子を形成するようにリガンドを粒子またはリンカーへ共有結合する工程とを含むリガンド結合粒子の調製方法を含む。
【００７２】
さらに他の実施形態は、本発明のサセプタまたはサセプタ複合体を用いた疾患治療方法を含む。サセプタ複合体を用いて治療できる疾患は広範囲の疾患を包含し、疾患のマーカーの入手可能性によってのみ限定される。ターゲティングしていないサセプタの利用はそれらマーカーの入手可能性によって限定されない。従って、既知のまたは将来発見されるあらゆる疾患は実施形態の方法に包含される。例えば、１実施形態では、リガンドが癌細胞を標的としたサセプタ複合体を患者へ投与して、サセプタ複合体が癌細胞へ接着または結合し、交番磁界（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｉｅｌｄ：ＡＭＦ）に患者を曝露する。ＡＭＦによってサセプタが生じる熱は即座にまたは時間をかけて癌細胞を破壊（すなわち、アポトーシスを誘導する）またあるいは不活性化する。さらに、サセプタが生じた熱および／またはアポトーシスは、例えば、その存在があらゆる残存癌細胞に対する免疫反応を刺激可能なＨＳＰ７０等の熱ショックタンパク質の生産および放出を促す。それら刺激された免疫反応は癌および他の疾患の将来の進行から個体を保護するようにも働く。
【００７３】
本発明の他の実施形態では、改変した表面電荷および粒子サイズが疾患治療でのサセプタまたはサセプタ複合体の有効性に寄与する。例えば、本発明の１態様では、ナノ粒子のクリアランスを減少させるようにサセプタの表面電荷を改変する。本発明の１実施形態では、所望の表面電荷およびゼータ電位を提供するためにサセプタ表面の多くの部分を官能化する。他の１実施形態では、例えば、スルホ−ＮＨＳ−アセテート等のサセプタ表面の選択的官能化を可能とするブロッキング剤を用いて表面電荷およびゼータ電位を微調整する。
【００７４】
サセプタまたはサセプタ複合体のリガンドの表面化学または多孔性は、サセプタまたはサセプタ複合体が標的細胞外に残存するように、またあるいは標的細胞内に入るように調整することもまたできる。標的細胞の外側または内側のいずれかに一旦結合したならば、サセプタまたはサセプタ複合体はＡＭＦエネルギーを吸収することでエネルギーを与えられ、例えば加熱し、生じた熱は、例えば、伝達、伝導、放熱、または熱伝導機構の組み合わせによってコーティングまたはリンカーおよび格子間領域を標的細胞まで通り抜ける。熱に曝露された標的細胞は傷害を受け、特定の実施形態では、それら標的細胞は傷害が回復不能な程度まで傷害を受ける。特定の実施形態では、十分な量のエネルギーが標的細胞へ伝達された場合に、標的細胞は壊死、アポトーシス、または他の機構を介して死滅する。
【００７５】
患者へ投与するサセプタまたはサセプタ複合体の量は変化させることができ、治療する疾患および病変組織の位置に依存させることができる。さらに、用量は投与形態に従って変化させることができる。例えば、もしサセプタまたはサセプタ複合体を、例えば腫瘍の内部または近傍領域へ局所的に、または全身的に投与するならば低用量が必要である。投与する用量は治療対象（例えば、年齢、体重、性別、健康状態、併用療法の種類およびもしある場合は治療頻度）の特性にさらに依存する。それらの情報を前提として、治療有効量を構成するサセプタまたはサセプタ複合体の量の決定は熟練者（例えば、臨床医）の範囲内である。具体的な投与経路および投与計画の選択は、最適な臨床反応を得るために当該技術分野で周知の方法に従ってそれら臨床医が調節または調整する。
【００７６】
様々な投与経路を本発明の実施形態で熟慮しており、サセプタおよびサセプタ複合体はそれらが活性となるあらゆる経路で標準的方法にて投与可能である。例えば、限定するわけではないが、投与は、全身的、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、局所的、経皮的、経口、口腔、または眼球経路、または膣内、吸入、蓄積注射、またはインプラントによることが可能である。本発明の特定の実施形態のサセプタまたはサセプタ複合体の投与形態（単独または他の医薬品との組み合わせのいずれでも）は、限定するわけではないが、舌下、注入物質（短時間作用型、持続性薬剤、インプラント、および皮下または筋肉内注射するペレット形態を含む）、または膣クリームの利用、坐薬、ペッサリー、膣リング、肛門坐薬、子宮内避妊器具、およびパッチおよびクリーム等の経皮形態とすることが可能である。さらに、いくつかの実施形態では、投与方法は、限定するわけではないが、血管注入、静脈注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉注射を含む。他の実施形態では、サセプタまたはサセプタ複合体は、限定するわけではないが、スポンジまたは他の医療用布によるすすぎ洗いとしての洗浄、洗浄（ｌａｖａｇｅ）を含む週術期投与技術を用いて投与することができる。他の実施形態では、投与経路は、限定するわけではないが、加熱、放射線、および超音波を含む他の周知の技術と組み合わせた注射、または注入を含む。
【００７７】
本発明の特定の実施形態の方法は医薬的に許容可能な賦形剤、媒体または担体を有する医薬組成物中でのサセプタまたはサセプタ複合体の製剤化をさらに含む。例えば、１実施形態では、サセプタまたはサセプタ複合体の分散または単離、サセプタまたはサセプタ複合体と医薬的に許容可能な賦形剤、媒体または担体、および選択的に、医薬組成物を製剤化するための他の原料との混合によって医薬組成物を調製する。
【００７８】
本発明の態様のサセプタおよびサセプタ複合体を含む医薬製剤および適切な担体は、限定するわけではないが、錠剤、カプセル、カプセル（ｃａｃｈｅｔｓ）、ペレット、ピル、粉末および顆粒を含む個体剤型；限定するわけではないが、溶液、粉末、流体エマルジョン、流体懸濁液、半固体、軟膏、ペースト、クリーム、ゲルおよびゼリー、および泡を含む局所投与形態；限定するわけではないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、および乾燥粉末を含む非経口剤型とすることが可能である。医薬的に許容可能な希釈剤、充填剤、崩壊剤、結合剤、滑剤、界面活性剤、疎水媒体、水可溶性媒体、乳化剤、緩衝液、保湿剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔｓ）、保湿剤、可溶化剤、防腐剤、およびそれらに類するものを有する製剤に有効成分を含ませるのが可能なこともまた当該技術分野で周知である。投与の手段および方法は当該技術分野で周知であり、当業者は指針として様々な薬理学的参考文献を参照可能である。例えば、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｂａｎｋｅｒ  &  Ｒｈｏｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９７９）；およびＧｏｏｄｍａｎ  &  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ‘Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）を調べることができる。
【００７９】
非経口投与経路について具体的に言及すると、本発明の特定の実施形態のサセプタおよびサセプタ複合体は注射（例えば、ボーラス注入または連続的な輸液）による非経口投与用に製剤化可能である。サセプタおよびサセプタ複合体は約１５分〜約２４時間にわたる皮下での連続的な輸液によって投与できる。注射用製剤は防腐剤を添加した単位剤型（例えば、アンプル剤またはマルチドーズ容器）とすることができる。製剤は懸濁液、溶液、または油性または水性媒体中のエマルジョン等の形態をとることが可能であり、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤等の製剤化剤を含むことが可能である。
【００８０】
経口投与では、サセプタおよびサセプタ複合体は、それら化合物を当該技術分野で周知の医薬的に許容可能な担体と組み合わせて製剤化することが可能である。それら担体はサセプタおよびサセプタ複合体を、患者による経口摂取用の錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、およびそれらに類するものとして製剤化することを可能にする。経口投与用の医薬製剤は固体賦形剤の添加、選択的に得られた混合物の製粉、およびもし望むならば錠剤または糖衣錠のコアを得るために適切な助剤を添加した後の顆粒混合物の加工によって得ることが可能である。適切な賦形剤は、限定するわけではないが、限定するわけではないが、乳糖、蔗糖、マンニトール、およびソルビトールを含む糖等の充填剤、限定するわけではないが、トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、じゃがいも澱粉、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ：ＰＶＰ）等のセルロース調製物を含む。もし望むならば、限定するわけではないが、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、またはアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム等のそれらの塩等の崩壊剤を添加することが可能である。
【００８１】
糖衣錠のコアは適切なコーティングと共に提供可能である。この目的のためには、濃縮糖溶液を使用可能であり、同溶液は選択的に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または２酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合液を含むことが可能である。活性化合物の用量の異なる組み合わせを識別または示すために、錠剤または糖衣錠のコーティングへ染料または顔料を添加可能である。
【００８２】
経口で使用可能な医薬製剤は、限定するわけではないが、ゼラチンで製造した押し込み型カプセル、およびグリセロールまたはソルビトール等の可塑剤およびゼラチンで製造した柔らかい密閉軟カプセルをさらに含む。押し込み型カプセルは、例えば乳糖等の充填剤、澱粉等の結合剤、および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウム等の滑剤、および選択的に安定化剤との混合物としてサセプタまたはサセプタ複合体を含むことが可能である。軟カプセルでは、サセプタまたはサセプタ複合体は脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール等の適切な溶液中に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を選択的に添加できる。経口投与用の全ての製剤はそのような投与形態に適切な用量とすべきである。
【００８３】
口腔投与経路では、サセプタまたはサセプタ複合体は、当該技術分野で周知の標準的技術を用いて錠剤またはトローチ剤として製剤化できる。
【００８４】
吸入による投与では、サセプタまたはサセプタ複合体は、適切な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、２酸化炭素、または他の適切なガス）を用いて加圧したパックまたは噴霧器からのエアロゾールスプレーまたは霧の形態で供給する。加圧エアロゾール投与の場合では、測定した量を供給するバルブの提供によって投与単位を測定可能である。例えば、吸入器または吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で使用するゼラチンのカプセルおよび薬包は、サセプタまたはサセプタ複合体および乳糖または澱粉等の適切な粉末ベースの粉末混合物を含むように製剤化可能である。
【００８５】
本発明の他の態様のサセプタまたはサセプタ複合体は、例えば、ココアバターまたは他のグリセリド等の標準的な坐薬基剤を含む保持浣腸または坐薬等の直腸用組成物にて製剤化可能である。
【００８６】
サセプタまたはサセプタ複合体は持続性薬剤としてもまた製剤化可能である。それら長時間作用型製剤は、１実施形態では、インプラント（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与する。持続性薬剤注射は約１〜約６ヶ月またはそれ以上の間隔で投与可能である。そのように、サセプタまたはサセプタ複合体は適切な高分子または疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂によって、または例えば持続または制御放出を促すやや難溶性の塩等のやや難溶性の誘導体として製剤化する。
【００８７】
経皮投与経路では、本発明の特定の実施形態のサセプタまたはサセプタ複合体は、硬膏剤または当該技術分野で周知の他の経皮治療システムに適用可能である。
【００８８】
サセプタまたはサセプタ複合体の医薬組成は適切な固相またはゲル相の担体または賦形剤をさらに含む。それら担体または賦形剤の例は、限定するわけではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、２酸化ケイ素、糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ：ＰＬＡ）、ポリ（Ｄ、Ｌ−グリコリド）（ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）：ＰＬＧ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）：ＰＬＧＡ）、およびポリ（シアノアクリレート）（ｐｏｌｙ（ｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅ）：ＰＣＡ）を含む。
【００８９】
本発明の態様のサセプタおよびサセプタ複合体は、それらの組み合わせが本願明細書に記述する方法の目的とする効果の達成において望ましいまたは有利であると思われる場合には、例えば、アジュバント、プロテアーゼ阻害剤、または他の相性の良い薬剤または化合物等の他の有効成分と組み合わせて投与できる。
【００９０】
患者へ一旦投与したならば、サセプタまたはサセプタ複合体の標的への輸送は、粒子の磁気特性に基づいて、病変組織領域において患者へ静磁場を適用することで促進できる。
【００９１】
実施例
本願明細書で開示する発明をより効果的に理解せしめる目的で、以下に実施例を提供する。それら実施例は説明の目的のためだけのものであり、いかなる意味でも本発明を限定すると解釈すべきものではないと理解すべきである。
【実施例１】
【００９２】
ＢＮＦサセプタの調製および特性解析
バイオナイズド・ナノフェライト（ｂｉｏｎｉｚｅｄ  ｎａｎｏｆｅｒｒｉｔｅ：ＢＮＦ）サセプタを、Ｇｒｕｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｍａｇｎ．Ｍａｔｅｒ．３１１：１８１（２００６）中に記述されているコアシェル法（ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って高圧均質化（ｈｉｇｈ−ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ：ＨＰＨ）によって作製する。単分散酸化鉄水性懸濁液（２５ｍｇ／ｍｌ）を５００ｂａｒ以上の圧力および７０℃以上の温度下にて過剰量のデキストランと３０分間ホモジナイズした。ＮｄＦｅＢ永久磁石上の結晶化ディスク中での磁気沈降および脱イオン水での洗浄の後に５０％（ｗ／ｗ）以上の鉄含量のＢＮＦサセプタが得られた。サセプタの鉄含量を粒子濃度の重量測定法、および濃塩酸による酸化鉄の分解後の粒子懸濁液（Ｓｐｅｃｔｒｏｑｕａｎｔ（登録商標）−Ｋｉｔ、Ｍｅｒｃｋ）の鉄濃度の分光光度測定で測定した。
【００９３】
ＢＮＦサセプタは改変したＪｏｓｅｐｈｏｓｏｎ  ｍｅｔｈｏｄでＭＷ＝５２６のポリ（エチレングリコール）ジグリシジルエーテル（Ａｌｄｒｉｃｈ）およびエピクロルヒドリン（ＡＣＲＯＳ）を用いてｐＨ１１〜１２にて室温下で２４時間かけて架橋した。磁性による分離および脱イオン水での洗浄後、鉄濃度２０〜２５ｍｇ／ｍｌのＢＮＦサセプタ懸濁液を得た。サセプタは室温下で２４時間のあいだアンモニアとの振盪でアミノ基を導入した。ＢＮＦサセプタは磁性による分離によって脱イオン水で３回洗浄し、０．２２ｍｍ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ  ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過した。
【００９４】
調製条件に従ってそれぞれ７０〜１００、４０〜７０、および２０〜４０ｎｍの３つの異なる直径範囲で粒子サイズの狭い分布を有するＢＮＦサセプタを得た。架橋およびアミノ化は最初の粒子径に影響しなかった。図３は光子相関分光法（ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＰＣＳ）によって測定した平均直径２５ｎｍ（＃０８５０６８４Ｇ）、５０ｎｍ（＃０８４０６８４Ｇ）、および７０ｎｍ（＃０４４０６８４Ｇ）の架橋およびアミノ官能性ＢＮＦサセプタ（図２ＩＩ）の３つのロットのサイズ分布を示している。
【００９５】
インピーダンス分光法（ｉｎｐｅｄａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＩＳ）による磁場中での体積磁化率の周波数依存の測定によって、ＢＮＦサセプタ懸濁液の磁性特性の予備的な評価を得た。磁性特性解析のために、０．１〜０．５ｍＴの範囲の外部磁場の振幅にて磁場の周波数に基づいてＢＮＦサセプタの体積磁化率をＩＳによって測定した。図４は約２００Ｈｚで平均直径７０ｎｍを有する磁性粒子（＃０４４０６８４Ｇ）の室温下での単位体積当たりの磁化率のインピーダンス分光法のデータを表す。約２００Ｈｚでのロット＃０４４０６８４ＧのＢＮＦサセプタの室温下での磁化率の虚数部の共振ピークは一般的なブラウン緩和特性に関連する期待値と一致する。サセプタ懸濁液の高い磁鉄鉱含有率ゆえに、対応する低周波の実際の磁化率は０．１１５の値を有する。それらの結果は、それら周波数および室温において、ＢＮＦサセプタが熱的に遮断された単一領域粒子のかなりの割合を含むことを示唆している。
【００９６】
固定周波数１５３７１ｋＨｚおよび様々な流束密度を有するＡＭＦによる粒子の加熱を誘導することで、適切に改変したＡＭＦ熱量計中でＢＮＦサセプタの比吸収率（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｒａｔｅ：ＳＡＲ）を測定した。表１に示すとおり、ソレノイドコイル中で発生させたＡＭＦによって粒子懸濁液を加熱した場合の、水中で測定した温度上昇率からサセプタの各種類のＳＡＲ値を計算した。適切な参照のブランク、水、またはリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）を用いて、ＳＡＲ値を熱量計およびコイルの温度特性について修正し、鉄含量によって標準化した。表１にさらに示すとおり、ＢＮＦサセプタのＳＡＲデータは２０ｎｍ  ｎａｎｏｍａｇ（登録商標）−Ｄ−ｓｐｉｏ粒子の対応するデータよりも６〜７倍高い。それら結果は、抗腫瘍モノクローナル抗体に結合したＢＮＦサセプタの有効濃度が癌細胞に到達し、それらが外部ＡＭＦ源によって加熱を誘導された場合に、腫瘍反応の顕著な増加が生じるはずであることを示唆する。
【００９７】
【表１】
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【実施例２】
【００９８】
ＢＮＦサセプタ表面への抗体の共有結合
モデル抗体であるウサギ抗ヤギＩｇＧのＢＮＦサセプタへの共有結合の様々な戦略を、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）およびヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを用いて評価した。抗体分子のアミノ基との反応に基づいた抗体結合の戦略を、スルフヒドリル基標識抗体を必要とするものと比較した。
【実施例３】
【００９９】
ポリエチレングリコールのＣＯＯＨ基を表面に有するＢＮＦサセプタの合成およびウサギ抗ヤギＩｇＧとの結合。
【０１００】
５ミリグラム（２６μｍｏｌ）のＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＥＤＣ）および１４μｌ（２６μｍｏｌ）のポリエチレングリコール６００ジアシッドを１ｍｌの０．５Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ＝６．３）中で溶解して５０℃で１０分間インキュベートした。混合物を４ｍｌのアミノ官能性ＢＮＦサセプタ（図２ＩＩ）（３４．４ｍｇ鉄、４８ｍｇ粒子）に添加し、Ｌａｂｑｕａｋｅ（登録商標）ｍｉｘｅｒ上で室温にて２時間振盪した。結果として得たＢＮＦ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨサセプタを磁性による分離によって脱イオン水で３回洗浄して、０．２２ｍｍ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ  ｆｉｌｔｅｒで濾過して、５．３ｍｇ／ｍｌの鉄濃度の５ｍｌ懸濁液（図２ＩＩＩ）を得た。
【０１０１】
この懸濁液５００マイクロリッターを１２５ｍｌの０．５Ｍ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ＝６．３）中の０．６ｍｇ（３μｍｏｌ）ＥＤＣおよび１．２ｍｇ（１０μｍｏｌ）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）の溶液と混合して、室温で９０分間振盪した。粒子をリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）（ｐＨ＝７．４）にて洗浄と磁性による分離を２回行った後、１００ｍｌのウサギ抗ヤギＩｇＧ（４００ｍｇ／ｍｌ）を添加した。混合物を３時間振盪して、ＰＢＳ中のグリシン添加によって反応を終了し、磁性による分離によってＰＢＳバッファーで３回洗浄して、２ｍｇ／ｍｌの鉄濃度の抗体結合ＢＮＦ−ＰＥＧ−ＣＯＯＨサセプタ（図２ＩＶ）を１．２ｍｌ得た。
【実施例４】
【０１０２】
表面にＡＮＢ基を有するＢＮＦサセプタの合成およびウサギ抗ヤギＩｇＧとの結合
Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（Ｎ−５−ａｚｉｄｏ−２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｙｌｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＡＮＢ−ＮＯＳ）に関わる全ての反応は光遮断下で行った。炭酸溶液（ｐＨ＝８．５）中のＡＮＢ−ＮＯＳ（１ｍＭで１．５ｍｌ）を５００μｌのアミノ官能性ＢＮＦサセプタ（図２ＩＩ）（４．３ｍｇ鉄、６ｍｇ粒子）と混合して、室温で２時間振盪した。ＢＮＦ−ＡＮＢサセプタはリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）（ｐＨ＝７．４）での２回の洗浄と磁性による分離を行い、３．８ｍｇ／ｍｌの鉄濃度の１ｍｌ懸濁液（図２Ｖ）を得た。１００マイクロリッターのウサギ抗ヤギＩｇＧ（４００ｍｇ／ｍｌ）をサセプタへ添加し、混合物を３０２ｎｍの光に曝露しつつ２時間振盪した。反応はＰＢＳ中のグリシン添加によって停止し、次に２回のＰＢＳバッファーによる洗浄と磁性による分離を行って、２．１ｍｇ／ｍｌの鉄濃度の抗体結合ＢＮＦ−ＡＮＢサセプタ（図２ＩＶ）の懸濁液１．２ｍｌを得た。
【実施例５】
【０１０３】
ウサギ抗ヤギＩｇＧのスルフヒドリル標識
ウサギ抗ヤギＩｇＧを、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ：ＳＡＴＡ）との反応と、それに続く製造者の使用説明書を用いたヒドロキシルアミンでの脱アセチル化によってスルフヒドリル基で標識した。５００マイクロリッターのウサギ抗ヤギＩｇＧ（４００ｍｇ／ｍｌ）およびジメチルホルムアミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ：ＤＭＦ）（４ｍｇ／ｍｌ）中の２ｍｌのＳＡＴＡ溶液を室温で３０分間インキュベートした。０．１Ｍ  ＰＢＳバッファー、０．００５Ｍ  ＥＤＴＡ（５ｍｇ／１００ｍｌ）中の２０マイクロリッターのヒドロキシルアミン溶液を抗体溶液へ添加して室温で２時間インキュベートした。抗体は次にＧ２５カラムで精製した。ＳＨ−標識ウサギ抗ヤギＩｇＧの濃度を２８０ｎｍの吸収測定で測定した。
【実施例６】
【０１０４】
表面に２−ピリジルジスルフィド基を有するＢＮＦサセプタの合成およびスルフヒドリル標識ウサギ抗ヤギＩｇＧとの結合
５００マイクロリッターのアミノ官能性ＢＮＦサセプタ（図２ＩＩ）（４．３ｍｇ鉄、６ｍｇ粒子）を、５００ｍｌのＰＢＳバッファーおよび８００μｌの２０ｍＭ  Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ：ＳＰＤＰ）と混合した。混合物を室温で１時間振盪して、磁性による分離によってリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）での３回の洗浄を行って、４．１ｍｇ／ｍｌの鉄濃度のＢＮＦ−ＳＰＤサセプタ（図２ＶＩＩ）懸濁液を１ｍｌ生産した。結合した２−ピリジルジスルフィド基の数は製造者の使用説明書を用いて測定した。ＰＢＳ中の１００マイクロリッターのＢＮＦ−ＳＰＤＰサセプタ（図２ＶＩＩ）（４．１ｍｇ／ｍｌ鉄）およびＰＢＳ中の基準とするアミノ官能性ＢＮＦサセプタ（図２ＩＩ）（４．０ｍｇ／ｍｌ鉄）１００ｍｌのそれぞれを、ＰＢＳ中の１００ｍｌの５０ｍＭ  ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ：ＤＴＴ）溶液と共にインキュベートして室温で１５分間振盪した。サセプタを次に１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、上清の３４３ｎｍでの吸収を測定して記録した。ＢＮＦ−ＳＰＤＰサセプタの上清および基準とするアミノ官能性ＢＮＦサセプタの吸収の差異を用いて、３４３ｎｍでの８０８０Ｍ−１ｃｍ−１のモル吸光係数を用いて２−ピリジルジスルフィド濃度を計算した。結果として得られたＢＮＦ−ＳＰＤＰサセプタ（図２ＶＩＩ）表面の２−ピリジルジスルフィド基の濃度は３７ｎｍｏｌ／ｍｇ鉄であった。
【０１０５】
４．１ｍｇ／ｍｌの鉄濃度の９００マイクロリッターのＢＮＦ−ＳＰＤＰサセプタ（図２ＶＩＩ）懸濁液を、ＰＢＳ中の１ｍｌのスルフヒドリル修飾ウサギ抗ヤギＩｇＧ（９６μｇ／ｍｌ）と共に室温で３時間インキュベートして、磁性による分離によってＰＢＳバッファーで３回洗浄し、結果として３．６ｍｇ／ｍｌの鉄濃度を有する抗体結合ＢＮＦ−ＳＰＤＰサセプタ（図２ＶＩＩＩ）の懸濁液１ｍｌを得た。
【実施例７】
【０１０６】
表面にマレイミド基を有するＢＮＦサセプタの合成およびスルフヒドリル標識ウサギ抗ヤギＩｇＧとの結合
７．５ｍｍｏｌのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＥＤＣ）および７．７ｍｍｏｌのＮ−マレオイル−ｂ−アラニンを１２５ｍｌの０．５Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ：ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ＝６．３）に溶解して、５０℃で１０分間インキュベートした。混合物を５００ｍｌのアミノ官能性ＢＮＦサセプタ（図２ＩＩ）（４．３ｍｇ鉄、６ｍｇ粒子）に添加して室温で２時間振盪した。結果として得られたＢＮＦ−マレイミドサセプタ（図２ＩＸ）を磁性による分離によって脱イオン水で３回洗浄して、０．２２ｍｍ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ  ｆｉｌｔｅｒで濾過することで鉄濃度４．０ｍｇ／ｍｌの懸濁液１ｍｌを得た。このＢＮＦ−マレイミドサセプタ懸濁液をリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）中の１ｍｌのスルフヒドリル修飾ウサギ抗ヤギＩｇＧ（９６ｍｇ／ｍｌ）と共に室温で３時間インキュベートして、磁性による分離によってＰＢＳバッファーで３回洗浄し、結果として鉄濃度３．８ｍｇ／ｍｌの抗体結合ＢＮＦ−マレイミドサセプタ（図２Ｘ）の懸濁液１ｍｌを得た。
【実施例８】
【０１０７】
ＢＮＦ−抗体サセプタ複合体の免疫活性試験
図２に描いた異なる抗体結合戦略の有効性を比較するために２段階のイムノアッセイを開発した。第１段階では、結合したウサギ抗ヤギＩｇＧの総量を、ＨＲＰ−標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを２次抗体として用いて明らかにした。この２次抗体はウサギ抗ヤギ粒子複合体と様々な方法で相互作用可能である。図５ａはヤギ抗ウサギ２次抗体がＢＮＦサセプタ表面に結合したウサギ抗ヤギ抗体と相互作用する２つの方法の概要を図示したものである。第２段階では、結合した免疫反応性のウサギ抗ヤギＩｇＧの総量をＨＲＰ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧを用いて測定した。この２次抗体は、１次抗体が正しい配置で結合した場合にのみ、サセプタ表面に結合する。図５ａは、ウサギ抗ヤギが適切な配置の場合にのみ、ヤギ抗マウス抗体がウサギ抗ヤギ抗体複合体と相互作用可能であることの概要を図示したものである。
【０１０８】
ウサギ抗ヤギＩｇＧ標識サセプタ（図２ＩＶ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、およびＸ）を、０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）を含有する０．０１Ｍ  リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）（ｐＨ＝７．４）で２回洗浄した。０．０５％ポリソルベート２０を含有する０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）１ｍｌおよび１％ビス（トリメチルシリ）アセトアミド（ｂｉｓ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙ）ａｃｅｔａｍｉｄｅ：ＢＳＡ）と共に室温にて２時間振盪することでサセプタをブロッキングした。０．０５％ポリソルベート２０を含有する０．０１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で３回洗浄した後、サセプタ懸濁液の鉄濃度を分析して、各懸濁液が同じ鉄濃度を有するように調整した。振盪機上でＨＲＰ−標識ヤギ抗ウサギＩｇＧと共に２時間インキュベートした後、サセプタを２３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。結合していないＨＲＰ−標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを含む上清２００ｍｌを、０．０１２％  ３０％過酸化水素を含有する２．２ｍＭ  １、２−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（１，２−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：ＯＰＤ）５０ｍｌと共に室温で１０分間展開した。反応は５０ｍｌの１．８Ｍ硫酸の添加によって停止して、４９２ｎｍの吸収を測定した。サセプタ表面に共有結合したウサギ抗ヤギＩｇＧの量は、ウサギ抗ヤギＩｇＧ標識サセプタ（図２ＩＶ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、およびＸ）とのインキュベーション後の２次ＨＲＰ−標識ヤギ抗ウサギＩｇＧの消失をモニターすることで測定した。
【０１０９】
サセプタ表面の免疫反応性抗体の割合は、ＨＲＰ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧを２次抗体として用いて、上述したものと同様の方法で測定した。結合したＨＲＰ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧ２次抗体の量はサセプタ表面の免疫反応性の１次抗体分子のみに相当する。コントロールのアミノ官能性ＢＮＦサセプタ（図２ＩＩ）と比較した場合、非特異的に結合したＨＲＰ−標識ヤギ抗ウサギおよびヤギ抗マウス抗体の量は無視できるほどわずかである。
【０１１０】
抗体標識ＢＮＦサセプタ（図２ＩＶ、ＶＩ、ＶＩＩＩ、およびＸ）を得るための４つの異なる抗体−サセプタ結合戦略のイムノアッセイの結果比較を図６に示す。図６は、図２に図示した戦略を用いて調製した抗体結合サセプタの鉄１ｍｇ当たりの免疫活性と比較して、全ての結合した抗体を描いた棒グラフである。ＳＰＤＰおよびマレイミドに基づいた結合法を用いてサセプタ表面に結合した抗体の総量は、表面のＰＥＧ−ＣＯＯＨまたはＡＮＢ基を用いて結合した抗体と比較して２８〜３０％高い。ＰＥＧ−ＣＯＯＨおよびＡＮＢ−ＮＯＳに基づいた結合戦略がサセプタ表面のたった約２４〜２７％の免疫反応性抗体という結果になった一方で、ＳＰＤＰおよびマレイミドに基づいた方法は共有結合した１次抗体の総量の６６〜６７％の免疫反応性抗体をもたらした。
【０１１１】
実験結果は、安定した高ＳＡＲ磁性サセプタの生体適合性材料での合成が可能であることを示した。さらに、粒子の全体性およびコロイド安定性を保ちつつ、様々な技術を用いてサセプタへ抗体を結合することが可能である。
【実施例９】
【０１１２】
【実施例１０】
【０１１３】
ＢＮＦ−抗体サセプタ複合体の調製および特性解析
まず、２−イミノチオランを用いて、トラスツズマブをチオールへ変換する。次に、脱気リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）中の約２×１０−５Ｍチオール基導入トラスツズマブの１〜２ｍｌ全量を、脱気ＰＢＳ中のＢＮＦ−マレイミドサセプタ２０ｍｌ（４００ｍｇ）へ添加する。反応混合物を室温で少なくとも１時間振盪する。次に十分なＮ−エチルマレイミド（Ｎ−ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ：ＮＥＭ）を添加して、その試薬中で１０ｍＭ溶液となるようにする。混合物を約４０分間振盪して、次に約３０分間磁性による分離を行う。上清を除去して、次の磁性による分離のために新鮮なバッファーを添加する。２若しくはそれ以上の回数洗浄して、次にサセプタ複合体を２ｍＭメルカプトエタノールに再懸濁する。懸濁液を次に振盪して、連続的な洗浄を２若しくはそれ以上の回数続けて抗体付加サセプタ複合体をＰＢＳ中で再懸濁する。
【０１１４】
サセプタ複合体の最終懸濁液で鉄の分析を行った。測定した鉄濃度と、２０ｍｇ／ｍｌ粒子標準（同じＭｉｘｒｏｍｏｄのロットからのもの）のそれとの比較によって、約２０ｍｇ／ｍｌのサセプタ複合体を得るための最終的な体積調節を首尾良く行った。
【０１１５】
比吸収率（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ：ＳＡＲ）（鉄のＷ／ｇ）は、ＦＩＳＯ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＵＭＩ４  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔとＦＩＳＯ  Ｃｏｍｍａｎｄｅｒ  ２  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｔｅｃｈｔｒｏｎｉｘ  ＴＤＳ  ２０２４Ｂによる較正曲線を用いて得た。
【０１１６】
サセプタ複合体の結合能は、Ｌｉｎｄｍｏ  ｅｔ  ａｌ．が公表した方法である直接的な細胞結合アッセイを用いて測定した。標的抗原を発現した不死化ヒト腫瘍細胞を組織培養から採取した。細胞は洗浄して、反応チューブ中に過剰な抗原を提供するのに十分な細胞濃度、典型的には細胞上の抗原発現に従ってチューブ当たり２〜５千万にてブロッキングバッファー中に再懸濁した。細胞濃度を増加させた複数のマイクロチューブを準備した。少量、典型的には２μｇ以下のサセプタ−抗体複合体を各マイクロチューブに添加した。細胞およびサセプタ−抗体複合体を持続的に攪拌しながら４℃で４時間インキュベートした。５ミクロンのナイロンフィルターを用いて、結合していないサセプタ複合体を結合したものから分離した。結合した分量の鉄含量は、結合していない分量中の鉄を測定して、試験に加えた鉄の最初の量から差し引くことで計算した。結果は結合したサセプタ複合体の分量を、過剰量の抗原となる細胞濃度に対してプロットして報告した。サセプタ複合体の非特異的結合は、無関係の抗体に結合するサセプタ複合体を用いた同様のアッセイの実施によって測定した。
【０１１７】
結合試験の準備として、適切な培地を入れた９６穴プレート中で、接着細胞（ＩＮＧ−１に対してはＨＴ−２９、ハーセプチンに対してはＳＫＢＲ−３）をコンフルエントになるまで培養した。
【０１１８】
飽和結合実験のために、０〜１０００ｍＭの範囲の濃度の１２５−Ｉ標識リガンド（ＩＮＧ−１、ハーセプチン、またはＢＮＦ−サセプタ複合体）を９６穴プレートの列方向に段階希釈（典型的には１：１または１：３）で、典型的なウェル当たりの最終体積が１００μｌとなるように準備した。平衡結合を達成するために、プレートを４℃または室温で（振盪あり、またはなしで）２〜２０時間インキュベートした。結合後、１００μｌの洗浄バッファー（典型的には、１×ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ、またはマッコイ５ａ／１０％ＦＣＳ）でウェルを３回洗浄した。結合した計数対象は、１００μｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨで室温にて２０〜３０分間かけてウェルから剥離した。ストリッピング溶液をチューブへ移してガンマカウンター中で計数した。計数対象をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ中へ入れて、そこで非線形曲線フィッティングを実行して、ＢｍａｘおよびＫｄ値を計算した。
【０１１９】
競合的結合実験では、９６穴プレートの列方向に段階希釈で調製した０〜１０００ｎＭの範囲の濃度となる非標識リガンドを典型的な最終体積がウェル当たり１００μｌとした中で、１２５−Ｉ標識高特異性活性リガンド（ｔｒａｃｅ−ｔｙｐｉｃａｌ［ｔｒａｃｅ］＝０．１〜５．０ｎＭとして）を非標識リガンドと混合した。プレートを４℃または室温にて（振盪あり、またはなしで）２〜２０時間インキュベートして、平衡結合を達成した。結合後、１００μｌの洗浄バッファー（典型的には、１×ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ、またはマッコイ５ａ／１０％ＦＣＳ）でウェルを３回洗浄した。結合した計数対象は、１００μｌの０．１Ｎ  ＮａＯＨで室温にて２０〜３０分間かけてウェルから剥離した。ストリッピング溶液をチューブへ移してガンマカウンター中で計数した。計数対象をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ中へ入れて、そこで非線形曲線フィッティングを実行して、ＥＣ５０およびＫｉ値を計算した。
【０１２０】
【表１】
2011519342.tif 000003
【０１２１】
本発明は、その特定の好ましい態様への言及によってかなりの詳細まで記述したにもかかわらず、他の変形も可能である。従って、添付の請求項の精神および範囲は記述に限定されず、好ましい変形は本願明細書中に含まれる。
【図１】
2011519342.tif 000004
【図２】
2011519342.tif 000005
【図３】
2011519342.tif 000006
【図４】
2011519342.tif 000007
【図５】
2011519342.tif 000008
【図６】
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