(57)【要約】  親油性細胞傷害薬を含むＮＰをＭＡｂとカップリングし、続いて肺へ局所送達することの利点には、肺への直接送達、標的組織中への長い滞留時間、腫瘍部位でのかなり強力な薬物投与量の連続的放出、および効力向上を可能にする、腫瘍における、細胞傷害薬のより良好な内部移行が含まれる。本発明は、ポリマーをベースにしたナノ粒子；ならびに前記ナノ粒子に非共有結合でアンカーリングされた第１部分であって、前記第１部分の少なくとも一部は前記ナノ粒子中に包埋された疎水性／親油性セグメントを含む第１部分；および前記ナノ粒子の外表面に露出されたカップリング基、好ましくはマレイミド化合物を含む第２部分を含むリンカーを含み、好ましくは吸入によって肺へ投与される送達システムに関する。一実施形態によれば、該送達システムは、それぞれが前記カップリング基、好ましくはマレイミド化合物に共有結合で結合された１種または複数のターゲティング薬剤を含み、肺癌または気管支異形成症の治療または診断においてエアロゾルとして投与される。さらに別の実施形態によれば、該送達システムは、薬物および／または放射性医薬品および／またはコントラスト剤を含む。本発明によるリンカーの具体例は、オクタデシル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸アミド（ＯＭＣＣＡ）である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
局所的肺送達に使用するための、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
（ｉ）ポリマーをベースとするナノ粒子；
（ｉｉ）前記ナノ粒子に非共有結合でアンカリングされた第１部分であって、前記第１部分の少なくとも一部が前記ナノ粒子中に埋め込まれた親油性セグメントを含む第１部分；および前記ナノ粒子の外表面に露出され、リガンド（ターゲティング部分）が共有結合で連結されているカップリング基を含む第２部分を含むリンカー；ならびに
（ｉｉｉ）薬物、放射性医薬品、およびコントラスト剤からなる群から選択される活性薬剤、
を含む、送達システム。
【請求項２】
吸入によるおよび／または静脈内適用による局所的肺送達において使用するための、請求項１に記載の送達システム。
【請求項３】
吸入による局所的肺送達において使用するための、請求項１または２のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項４】
カップリング基が、マレイミド、ＮＨＳ−エステル、カルボジイミド、ヒドラジド、ＰＦＰ−エステル、ヒドロキシメチルホスフィン、ソラレン、イミドエステル、二硫化ピリジル、イソシアネート、ビニルスルホン、α−ハロアセチル類、アリールアジド、ジアジリン、およびベンゾフェノンからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項５】
吸入による局所的肺送達のための、特に請求項１〜４のいずれか一つに記載の、送達システムであって、以下：
（ｉ）ポリマーをベースとするナノ粒子；
（ｉｉ）前記ナノ粒子に非共有結合でアンカリングされた第１部分であって、前記第１部分の少なくとも一部が前記ナノ粒子中に埋め込まれた親油性セグメントを含む第１部分；および前記ナノ粒子の外表面に露出されたマレイミド化合物を含む第２部分を含むリンカー；
（ｉｉｉ）薬物、ならびに
（ｉｉｉｉ）リガンド（ターゲティング部分）；
を含む送達システム。
【請求項６】
前記リンカーが、両親媒性分子である、請求項１〜５のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項７】
前記親油性部分が、少なくとも８個の炭素を含む炭化水素または脂質を含む、請求項１〜６のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項８】
前記リンカーが、次の一般式（Ｉ）
【化１】
2011516443.tif 000014
［式中、
Ｙは、ヘテロ原子、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキレンまたはアルケニレン、Ｃ５〜Ｃ２０のシクロアルキレンまたはシクロアルケニレン、Ｃ６〜Ｃ２０のアルキレン−シクロアルキレン（ここで、前記アルキレンまたはアルケニレン中の炭素原子の１つは、ヘテロ原子で置き換えられていてもよい）を表し、
Ｘは、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ２−Ｒ１、または−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１（ここで、Ｒ１は、少なくとも８個の炭素を含む炭化水素または脂質を表し、Ｒ２は親水性ポリマーを表す）から選択されるカルボニル含有部分を表す］を有する、請求項１〜７のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項９】
前記Ｒ１が、モノもしくはジアシルグリセロール、リン脂質、スフィンゴ脂質、スフィンゴリン脂質または脂肪酸から選択される脂質である、請求項８に記載の送達システム。
【請求項１０】
前記Ｙが、アルキレン−シクロヘキサンである、請求項８または９に記載の送達システム。
【請求項１１】
前記Ｙが、式−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ１０−を有するアルキレン−シクロアルキレンを表し、Ｘが、式−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１（ここで、Ｒ１は脂肪酸である）を有するカルボニル含有部分を表す、請求項１０に記載の送達システム。
【請求項１２】
前記リンカーが、オクタデシル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸アミド（ＯＭＣＣＡ）、Ｎ−１ステアリル−マレイミド（ＳＭ）、オレイン酸スクシンイミジル、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）２０００］、およびこれらの混合物から選択される、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項１３】
前記リンカーが、オクタデシル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸アミド（ＯＭＣＣＡ）である、請求項１０〜１２のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項１４】
活性薬剤、好ましくは薬物および／または放射性医薬品および／またはコントラスト剤を含む、請求項１〜１３のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項１５】
前記活性薬剤が、前記粒子中に埋め込まれるか、含浸されるか、またはカプセル化されるか、あるいは粒子の表面に吸着される、請求項１〜１４のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項１６】
薬物が、化学療法薬、好ましくは抗腫瘍性化学療法薬または化学予防薬である、請求項１〜１５のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項１７】
薬物が、パクリタキセル、ゲフィチニブ、エルロチニブ、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、酒石酸ビノレルビン、シスプラチン、ドキソルビシン、イフォスファミド、硫酸ビンクリスチン、塩酸ゲムシタビン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、メトトレキサート、塩酸トポテカン、イリノテカン、５−フルオロウラシル、ジロイトン、セレコキシブ、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１〜１６のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項１８】
前記薬物の誘導体が、脂肪酸誘導体、特にパルミチン酸誘導体である、請求項１〜１７のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項１９】
放射性医薬品が、カルシウム−４７、炭素−１１、炭素−１４、クロム−５１、コバルト−５７、コバルト−５８、エルビウム−１６９、フッ素−１８、ガリウム−６７、ガリウム−６８、水素−３、インジウム−１１１、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、鉄−５９、クリプトン−８１ｍ、窒素−１３、酸素−１５、リン−３２、サマリウム−１５３、セレン−７５、ナトリウム−２２、ナトリウム−２４、ストロンチウム−８９、テクネチウム−９９ｍ、タリウム−２０１、キセノン−１３３、イットリウム−９０、および前記放射性核種の少なくとも１種を含む物質からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項２０】
放射性医薬品が、テクネチウム−９９ｍまたはフッ素−１８−ＦＤＧである、請求項１〜１９のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項２１】
コントラスト剤が、ヨウ素−、ガドリニウム−、マグネタイト−、またはフッ素−含有コントラスト剤からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項２２】
コントラスト剤が、イオプロミド、イオキシタラメート、イオキサグレート、イオヘキソール、イオパミドール、イオトラロン、メトリザミドからなる群から選択される、請求項１〜２１のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項２３】
前記ポリマーが、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリシアノアクリレート、ポリ（アミノ酸）、ポリカーボネート、ポリ無水物、ポリアルキルシアノアクリレート、およびこれらの混合物から選択される生分解性ポリエステルである、請求項１〜２２のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項２４】
前記ポリエステルが、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、またはポリエチレングリコール−ｃｏ−ラクチド（ＰＥＧ−ＰＬＡ）である、請求項２３に記載の送達システム。
【請求項２５】
前記親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ポリ乳酸（ポリラクチドとも称される）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとも称される）、ポリ乳酸−ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリアスパルタミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシエチルアクリレート、誘導体化セルロース、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースから選択される、請求項６に記載の送達システム。
【請求項２６】
前記親水性ポリマーが、２，０００〜５，０００Ｄａの範囲の平均分子量を有するＰＥＧである、請求項２５に記載の送達システム。
【請求項２７】
前記活性薬剤が、薬物、コントラスト剤、またはこれらの混合物である、請求項１〜２６のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項２８】
それぞれが前記マレイミド化合物に共有結合で結合された１種または２種以上のターゲティング薬剤（ターゲティング部分）を含む、請求項１〜２７のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項２９】
前記ターゲティング薬剤が、アミノ酸をベースとする、核酸をベースとする、または糖をベースとするポリマー、およびこれらの組合せから選択されるポリマーである、請求項２８に記載の送達システム。
【請求項３０】
前記ターゲティング・ポリマーが、リガンド、抗体、抗原、糖タンパク質から選択される、請求項２９に記載の送達システム。
【請求項３１】
前記ターゲティング薬剤が、低分子量リガンドである、請求項２８〜３０のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項３２】
前記抗体が、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体（ＭＡｂ）である、請求項３０に記載の送達システム。
【請求項３３】
リガンドが、ヒト化および／またはキメラモノクロナール抗体、あるいはヒト化および／またはキメラモノクロナール抗体フラグメントである、請求項１〜３２のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項３４】
リガンドが、ＥＰ−ＣＡＭ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ−４、Ｈフェリチンからなる群から選択される抗原に対して作用する抗体または抗体フラグメントである、請求項１〜３３のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項３５】
リガンドが、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ＭＤＸ−４４７、オエゴボマブ（Ｏｅｇｏｖｏｍａｂ）、ペルツズマブ、イピリムマブ、ＡＭＢ８ＬＫ、抗マウスＥｐＣＡＭ、抗ヒトＥｐＣＡＭからなる群から選択される、請求項１〜３４のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項３６】
前記ＭＡｂが、天然または遺伝子操作型抗体である、請求項３２〜３５のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項３７】
それぞれが異なる結合特異性を有する少なくとも２種の抗体または抗体フラグメントを含む、請求項３０または３２〜３６のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項３８】
前記遺伝子操作型抗体が、トラスツズマブ、ＡＭＢ８ＬＫ、Ｅｐ−ＣＡＭ、またはこれらのうちの２種の組合せである、請求項３２〜３７のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項３９】
ナノ粒子が、ペグ化ポリ（ラクチド酸）をベースとし；
リンカーが、モノクロナール抗ＥＰ−ＣＡＭ抗体が連結されているオクタデシル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシルであり；
薬物が、パルミチン酸パクリタキセルである、
請求項１〜３８のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項４０】
特にｉｎ  ｖｉｖｏでの経肺投与のための、吸入薬として使用するための、請求項１〜３９のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項４１】
エアロゾルとして使用するための、請求項１〜４０のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項４２】
治療によってヒトまたは動物の身体を治療する方法において、あるいはヒトまたは動物の身体で実施される診断方法で使用するための、請求項１〜４１のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項４３】
癌および／または異形成症の治療または診断において使用するための、請求項１〜４２のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項４４】
肺癌および／または気管支異形成症の治療または診断において使用するための、請求項１〜４３のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項４５】
非小細胞肺癌の治療または診断において使用するための、請求項１〜４４のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項４６】
造影方法において、好ましくは腫瘍−ＰＥＴ（ここで、ＦＤＧ−ＰＥＴが特に好ましい）でグルコース代謝を検査することなどによるＰＥＴにおいて、またはＣＴにおいて使用するための、請求項１〜４５のいずれか一つに記載の送達システム。
【請求項４７】
好ましくは吸入薬として、特にエアロゾルとして形成される特に請求項４２〜４６のいずれか一つに記載の使用のための薬剤を製造するための、請求項１６〜１８のいずれか一つに記載の薬物を好ましくは含む、請求項１〜３９のいずれか一つに記載の送達システムの使用。
【請求項４８】
好ましくは吸入薬として、特にエアロゾルとして形成される特に請求項４２〜４６のいずれか一つに記載の使用のための診断薬を製造するための、請求項１９〜２０のいずれか一つに記載の放射性医薬品および／または請求項２１〜２２のいずれか一つに記載のコントラスト剤を好ましくは含む、請求項１〜３９のいずれか一つに記載の送達システムの使用。
【請求項４９】
請求項１〜３９のいずれか一つに記載の送達システムを薬学上許容可能な担体と組み合わせて含む組成物。
【請求項５０】
請求項１〜３９のいずれか一つに記載の送達システムの製造方法であって、
溶媒置換法によって、ＭＷ１００，０００ＤａのｍＰＥＧ−ＰＬＡポリマーを好ましくは使用して、ポリマーをベースとするナノ粒子を調製すること；
ナノ粒子の形成に先立って、該ポリマーに、リンカー、好ましくはＯＭＣＡを添加すること；
ナノ粒子の形成に続いて、活性薬剤、好ましくはモノクロナール抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体または抗マウスＥｐＣＡＭ抗体をリンカーにカップリングすること
を含む製造方法。
【請求項５１】
肺に関連する疾患または障害、特に請求項４３〜４５のいずれか一つに記載の疾患または障害を治療または予防するための方法であって、必要とする対象に、ある量の請求項１〜３９のいずれか一つに記載の送達システムを、または請求項４９に記載の組成物を提供することを含み、前記送達システムが薬物を含み、該薬物の量が前記疾患または障害を治療または予防するのに有効である方法。
【請求項５２】
対象の体内の標的細胞または標的組織を、特に、請求項４３〜４５のいずれか一つに記載の疾患または障害によって影響を受けた標的細胞または標的組織を造影する方法であって、
（ａ）前記対象に、好ましくはｉｎ  ｖｉｖｏでの経肺投与によって、コントラスト剤を携行している請求項１〜３９のいずれか一つに記載の送達システムであって、ナノ粒子が前記送達システムが前記標的細胞または標的組織を標的とするのに有効な１種または２種以上のターゲティング薬剤と結び付けられており、かつ該ターゲティング薬剤が好ましくは請求項３２〜３８のいずれか一つに記載の抗体である送達システムを提供すること；
（ｂ）前記体内の前記コントラスト剤を造影すること、
を含む造影方法。
【請求項５３】
前記コントラスト剤が、クマリン−６、または請求項２１〜２２のいずれか一つに記載のコントラスト剤、または請求項１９〜２０のいずれか一つに記載の放射性医薬品である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記送達システムが、前記粒子中に埋め込まれた薬物を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記薬物が、細胞傷害薬または化学予防薬、好ましくは請求項１６〜１８のいずれか一つに記載の薬物である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞傷害薬が、ドセタキセルおよびパルミチン酸パクリタキセルから選択される抗癌薬である、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、静脈内適用によるおよび／または吸入による、肺に向けた局所送達用ビヒクルとして使用するための、ポリマーをベースとするナノ粒子に関する。
【０００２】
従来技術の一覧
次の文献は、本発明の分野における到達水準を説明するのに直接関係すると思われる先行技術の一覧である。
Takeshi Matsuyaら、Anal.Chem.75:6124〜6132(2003)（非特許文献１）
Terro Soukkaら、Clinical Chemistry 47(7):1269〜1278(2001)（非特許文献２）
Terro Soukkaら、Anal.Chem.73:2254〜2260(2001)（非特許文献３）
Arai Kら、Drug Des.Deliv.2(2):109〜120(1987)（非特許文献４）
Harma H.ら、Luminescence 15(6):351〜355(2000)（非特許文献５）
Olivier JC.ら、Pharm.Res.19(8):1137〜1143(2002)（非特許文献６）
Olivier JC.NeuroRx.2(1):108〜119(2005)（非特許文献７）
Lu ZR.ら、Nature Biotechnology 17:1101〜1104(1999)（非特許文献８）
Gref R.ら、Biomaterials 24(24):4529〜4537(2003)（非特許文献９）
Nobs L.ら、Eur.J.Pharm.Biopharm.58(3);483〜490(2004)（非特許文献１０）
Ezpeleta Iら、Int.J.Pharm.191(1):25〜32(1999)（非特許文献１１）
Lundberg BBら、J Pharm Pharmacol.51(10):1099〜105(1999)（非特許文献１２）
米国特許出願公開第２００５／０４２２９８号（特許文献１）
国際公開第１９８７／０７１５０号（特許文献２）
国際公開第２００３／０８８９５０号（特許文献３）
米国特許第６２２１３９７号（特許文献４）
国際公開第２００５／０７７４２２号（特許文献５）
【背景技術】
【０００３】
コロイド表面へ特定のリガンドを結合することによる特定細胞への「アクティブ・ターゲティング（ａｃｔｉｖｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」は、リガンドの、標的部位上の表面エピトープまたは受容体への選択的結合をもたらす可能性がある［Moghimi SMら、Pharmacol.Rev.53(2):283〜318(2001)（非特許文献１３）］。正常細胞に害を及ぼさない、癌細胞をターゲティングする手段として、モノクロナール抗体（ＭＡｂ）の使用が、癌治療のために提案された。ＭＡｂは、リポソーム（免疫リポソームを形成するため）、エマルジョン（免疫エマルジョンを形成するため）およびナノ粒子（免疫ナノ粒子を形成するため）などのコロイド状担体とカップリングされている。これらの免疫複合体は、かくして、抗体による抗原部位の特異的認識、および腫瘍抗原を過剰発現している近づき難い病理学的標的組織の近傍へのコロイド状送達システムによる種々の細胞傷害薬の放出を確実にする。長期循環性脂質ＮＰの抗体によるターゲティングは、腫瘍への局在化を増大しないが、動物モデルにおける内部移行を増大することが最近発表された。これは標的腫瘍における、ペグ化脂質ＮＰおよび免疫脂質ＮＰの同等の局在化の増大にもかかわらず、免疫脂質ＮＰだけが、標的である癌性細胞における薬物の急速な内部移行を促進し、一方、脂質ＮＰは除去されたことを、立証している（Kirpotinら、2006）。
【０００４】
免疫リポソームは、既に発表されている［Park JWら、J.Cont Rel.74(1〜3):95〜113(2001)（非特許文献１４）；Park JWら、Clin Cancer Res.8(4):1172〜81(2002)（非特許文献１５）；Nam SMら、Oncol Res.11(1):9〜16(1999)（非特許文献１６）］。さらに、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にカップリングされたＦａｂ’フラグメントを担持する免疫リポソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏで長い循環時間およびターゲティングされた固形腫瘍中への高い管外遊出を誘発することが示されている［Maruyama Kら、FEBS Lett.413(1):177〜80(1997)（非特許文献１７）］。しかし、これらは、物理化学的に不安定であることが見出された。加えて、これらのリポソーム性担体のほとんどは、意味のある投与量の親油性／疎水性活性成分を組み込むことができず、それらの潜在的臨床効力を制約した。特に、肺への適用において、潜在的脂質毒性および潜在的脂肪性肺炎は、このような担体の使用を制約している。
【０００５】
免疫エマルジョンも、発表されている。例えば、Lundberg BBらは、ポリ（エチレングリコール）をベースにしたヘテロ二官能性カップリング剤を使用し、かつ薬物担体として同じものを使用することによる、抗Ｂ細胞リンパ腫モノクロナール抗体（ＬＬ２）の脂質−エマルジョン小球の表面への結合を発表している［Lundberg BBら、J.Pharm Pharmacol.51(10):1099〜105(1999)（非特許文献１２）］。今までのところ、脂質エマルジョンは、このように、著しい貧水溶性を示す高親油性薬物のみを組み込むことができる。強力な中度に親油性の癌化学療法薬を、無限希釈の際に、油滴内に保持することの困難性は、これらの剤形の治療的応用を制約する。例えば、パクリタキセルは、静脈内注射に続いて、脂質エマルジョンから急速に放出されることが見出された［Lundberg BB.J.Pharm.49(1):16〜20(1997)（非特許文献１８）］。
【０００６】
油性エマルジョンを利用するさらなる研究は、陽性の水中油型エマルジョン、すなわち、その常態で油−水の界面に遊離のＮＨ２基を呈示する化合物と抗体とを含むエマルジョンの形成を必要とし、ここで、上記化合物は、ＮＨ２基を抗体のヒンジ領域上のＳＨ基に連結するヘテロ二官能性リンカーによって上記抗体に連結される［Benita S.ら、国際公開第２００５／０７７４２２号（特許文献５）］。肺へのエマルジョン送達に関する問題点は、脂質に関連する潜在的副作用、例えば、気道から潜在的に有害な物質を除去する際に機能する繊毛細胞の運動を制限すること、および脂肪肺炎の可能性である。
【０００７】
過去数１０年にわたって、有効な薬物送達システムとしての生分解性および生体適合性ナノ粒子（ＮＰ）の開発に少なからぬ関心が寄せられた。従来のＮＰは、静脈内（ｉｖ）投与に続いて、細網内皮系（ＲＥＳ）による急速なクリアランスを受ける。粒子表面上にアンカーリングされ、かつ水相に向かって配向されたＭＷが２０００Ｄａ〜５０００Ｄａの範囲の親水性線状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子は、立体的安定化を付与し、ＲＥＳによるＮＰのオプソニン化および取込みを防止する。これらのステルスＮＰは、長期の血漿循環時間を示した［Avgoustakis Kら、Int J Pharm.259(1〜2):115〜27(2003)（非特許文献１９）；Li Yら、J Control Release.71(2):203〜11(2001)（非特許文献２０）；Matsumoto Jら、Int J Pharm.185(1):93〜101(1999)（非特許文献２１）；Stolnik Sら、Pharm Res.11(12):1800〜8(1994)（非特許文献２２）］。
【０００８】
ＮＰは、ワクチン、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよび抗癌薬などの種々の親水性でかつ中度に親油性の薬物を封じ込めることができる［Soppimath KS、J.Control Release.70(1〜2):1〜20(2001)（非特許文献２３）；Brigger Iら、Adv Drug Deliv Rev.54(5):631〜51(2002)（非特許文献２４）］。ＮＰ中への抗腫瘍薬の内包化は、ＮＰが、抗腫瘍薬の副作用を著しく低減しながら強力な薬物の治療指数を向上させるのに適した手段であるので、広範に研究されて来た。ＮＰ中に組み込まれる有望な抗腫瘍薬の中で、ドキソルビシン［Soma CEら、J Control Release.68(2):283〜9(2000)（非特許文献２５）］、イリノテカン［Onishi Hら、Biol Pharm Bull.26(1):116〜9(2003)（非特許文献２６）］およびパクリタキセル［Xu Zら、Int J Pharm.288(2):361〜8(2005)（非特許文献２７）；Dong Y,Feng SS.Biomaterials.25(14):2843〜9(2004)（非特許文献２８）］ＮＰは、有望な結果を示している。
【０００９】
大きな臨床的潜在能力にもかかわらず、臓器への、ＭＡｂを介したターゲティングＮＰ（免疫ナノ粒子）の取組みは、十分には開発されなかった。抗癌薬装填型ＮＰを、悪性細胞中に過剰発現された抗原に対して特異的なリガンドを介して選択的にターゲティングする能力は、免疫ナノ粒子（免疫ＮＰ）製剤の治療効力を向上させ、かつ化学療法に付随する有害副作用を低減する可能性がある。
【００１０】
ＨｕＣ２４２−ＤＭ４およびＣＭＤ−１９３などの種々の免疫毒素、ならびにＭＯＲＡｂ−００３、セツキシマブ、パニツムマブ、および肺癌だけでほぼ４８の臨床試験に参加している世界中に及ぶ臨床試験ではるかに最も広範に使用されるＭＡｂであるベバシズマブなどのモノクロナール抗体をはじめとするいくつかの抗体が、種々の段階の肺癌の治療について現在試験されている（http://www.cancer.gov/lung 2007（非特許文献２９））。最近、進行性ＮＳＣＬＣを有する患者に、事前の放射線療法または化学療法の失敗に続いて体系的または腫瘍内で与えられるキメラ抗体を用いるインジウム−１１１で標識された腫瘍壊死治療を使用する、重要な登録試験が中国で実施された。有望な結果は、それぞれ３．７％および３０．８％の患者の完全および部分奏功を示した（Chenら、2005）。
【００１１】
全身性で投与される薬物送達システムのターゲティング薬剤としてのＭＡｂの使用は、最近の数年の間に出現した。Cirstoiu-Hapcaら、およびNobsらは、抗−ＨＥＲ２および抗−ＣＤ２０ＭＡｂと結合したＰＬＡ  ＮＰを製造した（Nobsら、2004;Nobsら、2006a;Nobsら、2006b;Cirstoiu-Hapcaら、2007）。ＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞（ＨＥＲ２を過剰発現する）およびＤａｕｄｉリンパ腫細胞（ＣＤ２０を過剰発する）とＭＡｂ−ＮＰとの間の特異的相互作用が測定された。結果は、特異的抗原を過剰発現している腫瘍細胞へのＭＡｂ−ＮＰの選択的指向性を示したが、これらのＮＰの毒性プロファイリングは実施されなかった。Olivierらは、また、抗トランスフェリン受容体ＭＡｂをマレイミドでグラフトされたＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰへ結合することによって免疫ＮＰを合成したが、毒性評価は実施されなかった（Olivierら、2002）
【００１２】
モノクロナール抗体（ＭＡｂ）と結合された微粒子状薬物の肺内への送達は、肺内の特定組織へのターゲティングおよび取込み増大を可能にする。例として、オマリズマブは、喘息治療に関して米国食品医薬品庁によって承認された、ＩｇＥを標的とした療法として現在使用されている（Kuhn、2007）。
【００１３】
ナノメートルの大きさの生分解性ポリマー担体の吸入は、高い局所薬物濃度、初回通過効果、および多剤耐性回避を達成できるなら、有益であり得る。肺中での粒子堆積は、ＮＰを用いて達成できるが、この粒径範囲は、考え得る安全性の問題のためほとんど開発されていない［P.G.Roguedaら、Expert Opin.Drug Deliv.4;595(2007)（非特許文献３０）］。ヒトの肺は、遠位肺中の巨大な吸着表面積（１４０ｍ２）および薄い吸着粘膜（０．１〜０．２μｍ）のため、全身性および局所性薬物投与にとって極めて魅力的である（Courrierら、2002）。
【００１４】
肺癌は、確かに、世界中で最も一般的でかつ致命的な癌である。肺癌ターゲティングの現在のプロトコールは、主として静脈内をベースにしたプロトコールであり、局所的な肺への薬物送達は、極めて魅力的である可能性がある。しかし、ＮＰの肺送達は、毒性増大に関する懸念を高めるだけではなく、治療効果の増大および投与量の低減に関する可能性を開く。これまで利用可能な毒性データは、主として非治療用分子に関するものであり、そのデータが薬物分子に適用されるどうかについては、議論の段階に留まっている（RoguedaおよびTrani、2007）。Daileyらは、生分解性ジエチルアミノプロピルアミン・ポリ（ビニルアルコール）でグラフトされたポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＤＥＡＰＡ−ＰＶＡＬ−ｇ−ＰＬＧＡ）ＮＰの気管内点滴注入後の潜在的炎症促進能を研究した。（Daileyら、2006）。彼らは、種々の大きさの生分解性ＤＥＡＰＡ−ＰＶＡＬ−ｇ−ＰＬＧＡ  ＮＰと非生分解性ポリスチレンＮＰとを比較し、小さな生分解性ＮＰが、特に多形核細胞の肺内補充（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）において有意により低い炎症応答を呈示することを見出した。彼らの結論は、気道中でのＮＰの安全性を完全に調べるためには、より総合的な毒物学的研究を計画すべきであるということであった。Daileyらの研究において、ほとんどの動物研究におけるように、肺へのＮＰの送達方式として、吸入ではなく点滴注入が使用されたが、動物でなされた病理学的観察のヒトとの関連付けは、確立されるべき課題である（Medinaら、2007）。Tsengらは、ＳＣＩＤマウスモデルの癌性肺へのエアロゾル投与による肺癌ターゲティング用に、ビオチン化ＥＧＦと結合されたゼラチンＮＰの肺癌に対するｉｎ  ｖｉｖｏ送達を実施し、癌性肺中での特異的集積が、画像定量化によって確認された。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性の問題は扱われず、単回の肺送達の後にＮＰのターゲティングが認められた（Tsengら、2007）。
【００１５】
例えば、広範な範囲の様々な大きさのＮＰの中で、１４０〜２４０ｎｍの粒子は、胸リンパ系中にほとんど確認できないことが示された（Liuら、2006）。この結果は、本研究中で作られるＮＰが類似の大きさの範囲であったので、特に重要である。さらに、ＰＬＡ微小球は、肺組織中で別々の群の状態で密集することが観察され、一様に分布しなかった（Courrierら、2002）。しかし、この現象は、マイクロメートル尺度の範囲の大きさで観察され、ナノメートルでは観察されなかった。肺内での局所ＮＰ療法の主な欠点は、大きさに依存する排出である。一般に、０．５μｍ未満の質量メディアン空気力学的直径（ＭＭＡＤ）を有する粒子の８０％は、呼息中に排出されることが見出された。しかし、呼吸を止めると、この現象を防止することができる（Asgharianら、2003）。さらに、これらのＮＰが、ブラウン拡散により深部肺内に効果的に沈積し、かつ良好な肺内侵入を呈示するので、大きさに依存するこの欠点は、長所と考えることさえできる。
【００１６】
ナノ粒子（ＮＰ）は、疎水性の強力な細胞傷害薬をはじめとする増大する数の活性分子のための担体システムとして大きな可能性を示している。単純な粒子に比較して標的組織中への高い集積が可能とはいえ、ＮＰは、それらにモノクロナール抗体（ＭＡｂ）などの特定のリガンドを結び付けないと、ターゲティングを提供できない。ＭＡｂのＮＰへのカップリングは、粒子表面への抗体分子の共有結合によって達成される。これらの免疫ナノ粒子（免疫ＮＰ）は、抗体による抗原部位の特異的認識、およびこのような腫瘍抗原を過剰発現している接近し難い病理学上の肺内標的組織の近傍への、コロイド状担体による、パクリタキセルの親油性プロドラッグであるパルミチン酸パクリタキセルの放出を確実にするはずである。
【００１７】
微粒子状の薬物担体システムを使用するエアロゾル療法は、治療用化合物を局所または全身性のどちらかで送達するための人気のある方法になりつつある［１２］。エアロゾルまたは粉末用の定量投与吸入装置を使用する肺内送達は、ＮＰなどのナノ構造体を含むことができる。肺送達についての研究は、この経路によるタンパク質およびペプチドの成功的送達に向けた可能性によって活発化されている。肺内薬物送達は、呼吸器疾患の治療のための局所へのターゲティングを提供する。
【００１８】
しかし、タンパク質薬物の肺内送達の成功は、それら薬物の総合的なバイオアベイラビリティーを低下させる肺中のプロテアーゼおよびマクロファージによって、および毛細管血と肺胞気との間の障壁によって縮小される。ターゲティングの機構は、したがって、薬物製剤および投与経路の双方を利用することができ、かつ受動的または能動的のどちらかであることができる。パッシブ・ターゲティングの例が、健常組織と比較した腫瘍組織の血管新生の差異の結果としての、固形腫瘍中での化学療法薬の優先的な集積である。
【００１９】
ナノメートル領域の直径（好ましくは２５０ｎｍ未満）を有する肺内送達のための生分解性粒子への関心が、増大している。
【００２０】
今日まで、われわれが知る限り、免疫ＮＰは、エアロゾル療法では投与されなかったことを強調したい。ＮＰと比較した場合の免疫ＮＰの生体内運命（ｂｉｏｆａｔｅ）を評価することは興味深い。しかし、それらの広大な表面積のため、肺中でのこれらのシステムの安全性および毒物学がいくぶん問題である可能性がある。ポリスチレンおよびＴｉＯ２からなる種々の大きさの「不活性」粒子は、それらの肺への導入に続いて、表面積依存性の肺の炎症応答を誘導した。
【００２１】
したがって、特に肺癌の治療および診断における、活性薬剤の安全かつ容易な局所的肺送達に適切なシステムに対する大きな必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０４２２９８号
【特許文献２】国際公開第１９８７／０７１５０号
【特許文献３】国際公開第２００３／０８８９５０号
【特許文献４】米国特許第６２２１３９７号
【特許文献５】国際公開第２００５／０７７４２２号
【特許文献６】米国特許第５０４９３２２号
【特許文献７】米国特許第５１１８５２８号
【非特許文献】
【００２３】
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【非特許文献２】Terro Soukkaら、Clinical Chemistry 47(7):1269〜1278(2001)
【非特許文献３】Terro Soukkaら、Anal.Chem.73:2254〜2260(2001)
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【非特許文献４１】Smith P.K.ら、Anal.Biochem.150:76〜85(1985)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明の目的は、したがって、特に癌または異形成症の治療および診断のために、安全で容易な局所的肺送達のための手段を利用可能にすることである。
【００２５】
この目的のために、特許請求の範囲に記載のような方策および実施形態の実施は、これらの要求を満たすのにふさわしい手段を満足できる方式で提供する。
【００２６】
したがって、本発明は、その種々の態様および実施形態で、特許請求の範囲に従って実施される。
【００２７】
本研究では、ＮＰおよび免疫ＮＰの形成に関してそれらの安全な生体適合および生分解特性ゆえにＦＤＡにより注射用に承認されたポリマーであるＰＬＡ／ＰＬＧＡを利用する。親油性細胞傷害薬を含むＮＰをＭＡｂとカップリングし、続いて肺へ局所送達することの利点には、肺への直接的送達、標的組織中での長い滞留時間、腫瘍部位での極めて強力な薬物投与量の連続的放出、および効力向上を可能にする細胞傷害薬の腫瘍中へのより良好な内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）が含まれる。
【００２８】
未発表の研究は、直接吸入による免疫ナノ粒子の肺への局所送達を明らかにしたことを強調したい。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明は、抗体などのターゲティング薬剤を、ポリマーをベースにしたナノ粒子（好ましくは、治療上の活性薬剤を含むもの）と結び付けるための簡単な方法（活性薬剤と合わせた粒子形成ポリマーへのターゲティング薬剤の事前の化学結合形成を必要としない）の開発が、標的部位、例えば、癌または異形成症に襲われた肺中の組織または細胞への活性薬剤の迅速、安全かつ容易な送達を可能にする製品をもたらすという驚くべき発見に基づく。これは、粒子のポリマーマトリックスに非共有結合でアンカリングされる親油性部分、および次の段階でターゲティング薬剤に結合することが可能であるカップリング基、好ましくはマレイミド化合物を含む第２部分を有する分子リンカーを使用することによって達成された。この新規な方法は、それぞれの異なるターゲティング薬剤に合わせて異なるナノ粒子組成物を作る必要性を排除し、必要によりリンカーへ種々のターゲティング薬剤（リガンド）を単に結合することによって、強化された局所的肺送達のための様々な標的システムを調製するのに使用できる「ユニバーサル」ナノ粒子リンカー（細胞傷害薬などの活性薬剤を含む）を形成することを可能にする。
【００３０】
したがって、本発明は、特に静脈内適用によるおよび／または好ましくは吸入での経肺投与による局所的肺送達における、以下：
（ｉ）ポリマーをベースとするナノ粒子；
（ｉｉ）前記ナノ粒子に非共有結合でアンカリングされた第１部分であって、前記第１部分の少なくとも一部が前記ナノ粒子中に埋め込まれた親油性セグメントを含む第１部分；および前記ナノ粒子の外表面に露出され、リガンド（ターゲティング部分）が共有結合でカップリングされているカップリング基を含む第２部分を含むリンカー；ならびに
（ｉｉｉ）薬物、放射性医薬品およびコントラスト剤からなる群から選択される活性薬剤、
を含む送達システムの使用に関する。
【００３１】
カップリング基は、好ましくは、マレイミド、ＮＨＳ−エステル、カルボジイミド、ヒドラジド、ＰＦＰ−エステル、ヒドロキシメチルホスフィン、ソラレン、イミドエステル、二硫化ピリジル、イソシアネート、ビニルスルホン、α−ハロアセチル類、アリールアジド、ジアジリン、およびベンゾフェノンからなる群から選択される。
【００３２】
したがって、その最初の態様によれば、本発明は、吸入による局所的肺送達のための、以下：
（ｉ）ポリマーをベースとするナノ粒子；
（ｉｉ）前記ナノ粒子に非共有結合でアンカリングされた第１部分であって、前記第１部分の少なくとも一部が前記ナノ粒子中に埋め込まれた疎水性セグメントを含む第１部分；および前記ナノ粒子の外表面に露出されたマレイミド化合物を含む第２部分を含むリンカー；
（ｉｉｉ）薬物、ならびに
（ｉｉｉｉ）リガンド（ターゲティング部分）、
を含む送達システムを提供する。
【００３３】
ナノ粒子は、好ましくは、前記粒子中に埋め込まれるか（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）、複合されるか（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）、含侵されるか（ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅｄ）、カプセル化された（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）、または該粒子の表面に吸着された薬物、コントラスト剤、およびこれらの組合せなど、粒子によって携行される活性薬剤を含む。
【００３４】
上記のナノ粒子−リンカーは、該リンカーがターゲティング薬剤との共有結合に適しているので、後に続く最終の標的化製品の製造で使用できる。
【００３５】
１つの好ましい実施形態によれば、ナノ粒子は、前記マレイミド化合物にそれぞれ共有結合で結合される１つまたは２つ以上のターゲティング薬剤（ターゲティング部分）を含む。
【００３６】
本発明は、また、本発明の送達システムを含む組成物を提供する。一実施形態によれば、該組成物は、薬学上許容可能な担体を含む。いくつかの他の実施形態によれば、該組成物は、前記ナノ粒子によって携行される活性薬剤を含有する。
【００３７】
本発明は、また、肺に関連した疾患または障害を治療または予防するための方法であって、必要とする対象に、前記疾患または障害を治療または予防するのに有効な量の本発明の送達システムを吸入によって提供することを含む方法を提供する。
【００３８】
さらに、本発明は、対象の体内の標的細胞または標的組織を診断する方法であって、
（ａ）前記対象にコントラスト剤を携行する本発明の送達システムであって、ナノ粒子が前記送達システムが肺中の前記標的細胞または標的組織を標的とするのに有効な１種または２種以上のターゲティング薬剤と結び付けられている送達システムを提供すること；
（ｂ）前記体内の前記コントラスト剤を造影すること、
を含む方法を提供する。
【００３９】
さらに、本発明は、局所的肺送達のための送達システムの製造方法を提供する。
【００４０】
本発明を理解し、本発明をどのように実際に実施できるかをみるために、好ましい実施形態を、添付の図を参照して、非限定的な例で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】本発明による送達粒子の概略を示す図である。図中、リンカー（ＯＭＣＣＡ）は、粒子中にアンカリングされた第１部分、および粒子の表面に露出され、かつ抗体（Ｙ）に結び付けられた第２部分（マレイミド）を有する。
【図１Ｂ】本発明による送達粒子の概略を示す図である。図中、送達粒子は、さらに、ポリエチレングリコールで修飾されたポリマー部分を含むことができる。
【図１Ｃ】本発明による送達粒子の概略を示す図である。図中、送達粒子は、また、ポリマーマトリックス中に埋め込まれた薬物を携行することができる。
【図２】非結合型粒子（ブランク）、トラスツズマブ結合型粒子（免疫ＮＰ）、トラスツズマブ結合薬物装填型粒子（免疫ＤＣＴＸ  ＮＰ）に関するゼータ電位の測定値を示す三次元棒グラフを示す図である。
【図３Ａ】１２ｎｍの金で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧを使用した、本発明による抗体結合型ナノ粒子の２００ｎｍスケールでの透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図３Ｂ】１２ｎｍの金で標識したヤギ抗ヒトＩｇＧを使用した、本発明による抗体結合型ナノ粒子の１００ｎｍスケールでの透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図４】５連続日にわたってＮＰおよび免疫ナノ粒子を点滴注入されたマウスにおける３および１４日間の回復後の動物体重の変化を示す図である。
【図５Ａ】５連続日にわたってＮＰおよび免疫ナノ粒子を点滴注入されたマウスにおける３および１４日間の回復後の総ＢＡＬ細胞数を示す図である。
【図５Ｂ】５連続日にわたってＮＰおよび免疫ナノ粒子を点滴注入されたマウスにおける３および１４日間の回復後の総ＢＡＬマクロファージ数を示す図である。
【図５Ｃ】５連続日にわたってＮＰおよび免疫ナノ粒子を点滴注入されたマウスにおける３および１４日間の回復後の総ＢＡＬリンパ球数を示す図である。
【図５Ｄ】５連続日にわたってＮＰおよび免疫ナノ粒子を点滴注入されたマウスにおける３および１４日間の回復後の総ＢＡＬ好中球数を示す図である。
【図６】種々の製剤を点滴注入されたマウスにおける３日間の回復後（図Ａ）のおよび１４日間の回復後（図Ｂ）の両肺内のマクロファージ、鬱血および炎症の評点を示す図である。
【図７】種々の製剤を点滴注入され実験８日目（図Ａ）および実験１９日目（図Ｂ）に屠殺されたマウスからの肺組織の画像を示す図である。
【図８】実験初日の体重と比較した、実験８日目（黒色棒）および実験１９日目（灰色棒）後のマウスの体重増加を示す図である。
【図９Ａ】総ＢＡＬ細胞数を示す図である。結果は、実験８日目の（灰色棒）および実験１９日目の（黒色棒）双方に対するものである。
【図９Ｂ】ＢＡＬ内のマクロファージ数を示す図である。結果は、実験８日目の（灰色棒）および実験１９日目の（黒色棒）双方に対するものである。
【図９Ｃ】ＢＡＬ内のリンパ球数を示す図である。結果は、実験８日目の（灰色棒）および実験１９日目の（黒色棒）双方に対するものである。
【図９Ｄ】ＢＡＬ内の顆粒球数を示す図である。結果は、実験８日目の（灰色棒）および実験１９日目の（黒色棒）双方に対するものである。
【図１０】各種の製剤を点滴注入されたマウスの両肺内の、実験８日目（Ａ図）および実験１９日目（Ｂ図）のマクロファージ、鬱血および炎症の評点（ｓｃｏｒｉｎｇ）を示す図である。結果は、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３として示される。マクロファージの順位指標（Ｒａｎｋｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ）は、１−いくつかの肺胞中に少数のマクロファージ、２−肺胞の１０〜２０％に少数のマクロファージ、３−肺胞の１０〜２０％に群（２〜３）になったマクロファージ、４−肺胞の３０％超に群（２〜３）になったマクロファージとした。炎症指標（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）は、１−炎症なし、２−リンパ凝集物の極めて少数の病巣（おそらく、反応性ＢＡＬＴ−気管支関連リンパ組織）、３−肺の間質組織中に分散された慢性浸潤物の少数の病巣、４−肺間質組織中に分散された慢性浸潤物の病巣数のわずかな増加とした。鬱血の指標化（ｉｎｄｅｘｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｎｇｅｓｔｉｏｎ）は、１−鬱血なし、２−肺胞中隔における毛細管の中度充血の病巣、３−関連隔膜のわずかな浮腫および肥厚化を伴う肺胞中隔における毛細管の中度充血の病巣とした。
【図１１】各種の製剤を点滴注入され、実験８日目（ａ〜ｅ）および実験１９日目（ｆ〜ｊ）に屠殺されたマウスからの肺組織を示す図である。示した写真の倍率は、×４００である。示した写真は、ａ、ｆが対照生理食塩水、ｂ、ｇがＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰ、ｃ、ｈはＳＡ−ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰ、ｄ、ｉは対照ＥｐＣＡＭ生理食塩水、ｅ、ｊはＥｐＣＡＭ  ＮＰである。
【図１２】対照生理食塩水（Ａ、Ｂ、ａ、ｂ）、対照ＥｐＣＡＭ生理食塩水（Ｃ、Ｄ、ｃ、ｄ）、およびＥｐＣＡＭ結合型ＮＰ（Ｅ、Ｆ、ｅ、ｆ）を点滴注入され、実験８日目に屠殺されたマウス肺組織切片のＥｐＣＡＭ免疫組織化学の代表的写真を示す図である。各種の処置（Ａ、ａ、Ｃ、ｃ、Ｅ、ｅ）は、一次ＥｐＣＡＭ抗体および二次ラット抗−マウス抗体と共に、あるいは陰性対照としての二次ラット抗−マウス抗体のみ（Ｂ、ｂ、Ｄ、ｄ、Ｆ、ｆ）と共にインキュベートされた。元々の倍率は×１０（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）または×４０（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）である。
【図１３】対照ＥｐＣＡＭ生理食塩水（Ａ、Ｂ、ａ、ｂ）およびＥｐＣＡＭ結合型ＮＰ（Ｃ、Ｄ、ｃ、ｄ）を点滴注入され、実験１９日目に屠殺されたマウス肺のＥｐＣＡＭ免疫組織化学の代表的な写真を示す図である。ＥｐＣＡＭ発現に関する陽性対照を、マウス結腸の結腸組織中で示す（Ｅ、ｅ、Ｆ、ｆ）。各種の処置（Ａ、ａ、Ｃ、ｃ、Ｅ、ｅ）を、一次ＥｐＣＡＭ抗体および二次ラット抗マウス抗体と共に、または陰性対照としての二次ラット抗マウス抗体のみ（Ｂ、ｂ、Ｄ、ｄ、Ｆ、ｆ）と共にインキュベートした。元々の倍率は×１０（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）または×４０（ａ、ｂ、ｃ、ｄ）である。
【図１４】気管支内投与法の図解を示す。
【図１５】試験期間中の群内体重変化を示す。
【図１６】１日目から７日目までの％体重変化の群間差を示す。
【図１７】血球数（単球）を示す。
【図１８ａ】ＢＡＬ中のＬＤＨ／総細胞数を示す。
【図１８ｂ】ＢＡＬ中のＬＤＨ／総細胞数を示す。
【図１９】ＢＡＬ中のマクロファージを示す。
【図２０】ＩＮＰの点滴注入に続く主要気道における有意に増加したＥｐＣＡＭの染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本発明は、１種または２種以上のターゲティング薬剤の薬物装填型ナノ粒子（ｄｒｕｇ−ｌｏａｄｅｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）への新規な１ステップ結合法をベースにした、肺に対する薬物送達療法の改善を提供することを目的とする。詳細には、本発明は、選択したターゲティング薬剤に引き続き結合できる万能型ナノ粒子リンカー（場合によっては薬物と組み合わせた）の調製を可能にし、その結果、それぞれ異なるターゲティング薬剤に対して専用のナノ粒子を設計する必要がない。本発明により設計されたナノ粒子は、２つの表面膜に低い抗原密度を呈示している標的細胞のより良好な認識を可能にする。
【００４３】
本発明は、したがって、とりわけ静脈内適用による、および／または吸入による局所的肺送達における送達システムとしての
（ｉ）ポリマーをベースとするナノ粒子；
（ｉｉ）前記ナノ粒子に非共有結合でアンカリングされた第１部分であって、前記第１部分の少なくとも一部が前記ナノ粒子中に埋め込まれた親油性セグメントを含む第１部分；および前記ナノ粒子の外表面に露出されたカップリング基を含む第２部分であって、リガンド（ターゲティング部分）が前記カップリング基に共有結合で（共有結合を介して）カップリングされている第２部分を含むリンカー；ならびに
（ｉｉｉ）薬物、放射性医薬品およびコントラスト剤からなる群から選択される活性薬剤
を含む製品を提供する。
【００４４】
静脈内適用の文脈内で、送達システムは、身体に全身性で適用されるが、肺への局所性送達は、したがって、体内における薬物の容易で効率的なターゲティングを可能にして実施される。
【００４５】
予想外に、本発明による送達システムの吸入は、活性薬剤の肺への特に安心で有効な送達を可能にすることが見出された。
【００４６】
かくして、本発明により、吸入による局所的肺送達のための送達システムを使用することが、特に好ましい。
【００４７】
好ましくは、本発明によるカップリング基は、マレイミド、ＮＨＳ−エステル、カルボジイミド、ヒドラジド、ＰＦＰ−エステル、ヒドロキシメチルホスフィン、ソラレン、イミドエステル、二硫化ピリジル、イソシアネート、ビニルスルホン、α−ハロアセチル、アリールアジド、ジアジリン、およびベンゾフェノンからなる群から選択される化学基であり、ここで、リガンドは、前記化学基に化学反応により共有結合でカップリングされる。
【００４８】
本発明は、かくして、ポリマーをベースとするナノ粒子、ならびに前記ナノ粒子に非共有結合でアンカリングされた第１部分であって、前記第１部分の少なくとも一部が前記ナノ粒子中に埋め込まれた疎水性セグメントを含む第１部分；および前記ナノ粒子の外表面に露出されたマレイミド化合物を含む第２部分を含むリンカーを含む送達システムを提供する。
【００４９】
マレイミドは、後記の一般式（Ｉ）で図示されるような２，５−ピロールジオン骨格を備えた有機化合物の基である。
【００５０】
マレイミドは、航空宇宙産業における先端の複合材料から合成における試薬としての使用に及ぶ広範な範囲の応用分野で使用される。例えば、航空宇宙産業は、その双方とも、ビスマレイミドによって提供される優れた熱安定性および剛性骨格を有する材料を必要とする。いくつかの応用分野において、ポリシロキサンおよびホスホネートなどの各種リンカーは、それらなどから作られるポリマーを強化するためにビスマレイミド（ｂｉｓｍａｌｅｉｍｉｎｄｅｓ）に複合される。
【００５１】
マレイミドは、また、タンパク質を表面に結合するための可撓性連結分子として使用されることの多いポリエチレングリコール鎖に連結することができる。二重結合は、システイン上に見出されるチオール基と容易に反応して安定な炭素−硫黄結合を形成する。ポリエチレン鎖の他端をビーズまたは固体支持体に結合すると、タンパク質を溶液中のその他の分子から（但し、これらの分子が同様にチオール基を保持しないなら）容易に分離することが可能になる。
【００５２】
本発明の文脈で、マレイミドは、ポリマーをベースにしたナノ粒子中に非共有結合で組み込まれる予定のリンカーに複合され、マレイミド−リンカーとナノ粒子の組合せは、各種活性薬剤のための送達システムのプラットフォームを提供する。
【００５３】
用語「送達システム」は、本明細書中で用語「送達ナノ粒子」と互換的に使用することができ、生理学上許容可能なポリマーをベースとするナノ粒子を意味し、該粒子は、リンカーと結び付けられた場合、１マイクロメートル以下、好ましくは約５０〜１０００ｎｍの範囲の、より好ましくは約２００〜３００ｎｍの範囲の直径を有する。同時に、ナノ粒子は、好ましくは、１種または２種以上のポリマーから形成されたマトリックス構造を有する。さらに、ナノ粒子は、ポリマー以外の物質から形成することもできるが、該粒子は、本質的にポリマーをベースとし、あるいは少なくともそれらの外表面は、ポリマーをベースにすること理解されたい。したがって、用語「ナノ粒子」は、本発明の文脈で、リポソームまたはエマルジョンの形態を除外する。
【００５４】
用語「ポリマーをベースとする粒子」、「ポリマーをベースとするナノ粒子」または「粒子形成性ポリマー」は、本明細書中で使用する場合、適切な条件下でナノ粒子を形成する能力を有する、任意の生分解性、そして好ましくは生体適合性のポリマーを意味する。各種の生分解性ポリマーが、当技術分野で入手可能であり、このようなポリマーが、本発明で応用できる。ナノ粒子の調製で主として使用される生分解性、生体適合性があり、かつ安全な承認済みのポリマーは、Gilding DKらによって記載されている［Gilding DKら、Polymer 20:1459〜1464(1979)（非特許文献３１）］。
【００５５】
粒子形成性生分解性ポリマーの非制限的例は、限定はされないが、ポリヒドロキシ酪酸類、ポリヒドロキシ吉草酸類、ポリカプロラクトン類、ポリエステルアミド類、ポリシアノアクリレート類、ポリ（アミノ酸）類、ポリカーボネート類、ポリ無水物類、およびこれらの混合物などのポリエステル類である。
【００５６】
好ましくは、ポリマーは、ポリ乳酸（ポリラクチド）、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリエチレングリコール−ｃｏ−ラクチド（ＰＥＧ−ＰＬＡ）およびこれらの任意の混合物から選択される。
【００５７】
送達システム内のさらなる成分は、ナノ粒子に非共有結合でアンカリングされた第１部分および前記ナノ粒子の外表面に露出されたマレイミド化合物を含む第２部分を含むリンカーである。第１部分は、同部分の少なくとも一部がナノ粒子の表面に埋め込まれた疎水性セグメントを含むように構成される。
【００５８】
用語「アンカー（ａｎｃｈｏｒ）」は、本明細書中で使用する場合、リンカーと粒子との安定な結び付きを獲得するように、リンカーの第１部分の少なくとも一部が粒子の外表面を経て貫入することを意味する。アンカリング（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）は、リンカーの第１部分に、ポリマーと類似の物理的性質を有する部分（本明細書中で「アンカー部分」と称する）を組み込むことによって達成することができる。化学に精通した人々は、粒子を本質的に構成する物質と相溶性であるべきであるアンカー部分の選択方法を熟知しているであろう。例えば、粒子マトリックスを形成するのに疎水性ポリマーを使用するなら、アンカー部分の好ましい選択は、親水性および／または親油性部分である。換言すれば、アンカー部分は、好ましくは、ポリマーと、そして結局は組み込まれる薬物と相溶性であるべきである。
【００５９】
アンカー部分と粒子との間の結び付きは、アンカーのポリマーマトリックスへの機械的固定による（例えば埋め込みによる）のが好ましい。機械的固定は、ポリマーを、ポリマーの固化過程中にリンカーと組み合わせて使用すると、粒子の形成と同時に達成される。ポリマーが、微粒子の形態で一旦固化すると、それは、リンカーのアンカー部分を「捕獲」し、結果として本発明の送達システムを形成する。
【００６０】
本発明の文脈におけるリンカーは、両親媒性分子、すなわち、疎水性／親油性部分（アンカーを提供する）および親水性部分の一部を形成するマレイミド化合物を有する分子である。以下で用語「親油性」を使用する場合はいつでも、その用語は、疎水性／親油性部分がナノ粒子を形成するポリマーと相溶性である限り、用語「親水性」と互換的に解釈できることに留意されたい。したがって、親油性部分は、等しく親水性部分を指すことができる。いくつかの実施形態によれば、疎水性／親油性部分は、炭化水素骨格中に少なくとも８個の炭素原子を含む炭化水素または脂質を含む。典型的な範囲は、Ｃ８〜Ｃ３０炭素原子である。親油性部分は、直鎖、分枝および／または環状の飽和または不飽和の炭化水素であってよい。
【００６１】
リンカーは、ナノ粒子の表面に組み込むことのできる１つまたは２つ以上のアンカーを有することができることに留意されたい。例えば、二重アンカーは、２つの親油性部分を含む後記の表１に示す１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）２０００］を含むリンカーを使用することによって達成できる。
【００６２】
リンカーは、また、ターゲティング薬剤（後に開示するような）が結合する第２部分を有する。ターゲティング薬剤の結合は、共有結合による結び付きが好ましいが、時には非共有結合性の結び付きも応用できる。共有結合による結び付きは、親水性部分に化学反応性のある基、当該発明ではマレイミドを組み込むことによって達成される。マレイミドは、ターゲティング薬剤のチオール基と安定なチオ−エーテル結合を形成できる。
【００６３】
いくつかの実施形態によれば、リンカーは、次の一般式（Ｉ）
【００６４】
【化１】
2011516443.tif 000002
［式中、
Ｙは、ヘテロ原子、Ｃ１〜Ｃ２０のアルキレンまたはアルケニレン、Ｃ５〜Ｃ２０のシクロアルキレンまたはシクロアルケニレン、Ｃ６〜Ｃ２０のアルキレン−シクロアルキレン（ここで、前記アルキレンまたはアルケニレン中の炭素原子の１つはヘテロ原子で置き換えられていてもよい）を表し、
Ｘは、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｒ２−Ｒ１、または−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１から選択されるカルボニル含有部分を表し、Ｒ１は、少なくとも８個の炭素を含む炭化水素または脂質を表し、Ｒ２は親水性ポリマーを表す］を有する。
【００６５】
このような実施形態によれば、Ｒ１は脂質を、Ｒ２は親水性ポリマーを表すことができる。一実施形態によれば、脂質は、モノもしくはジアシルグリセロール、リン脂質、スフィンゴ脂質、スフィンゴリン脂質、または脂肪酸から選択される。
【００６６】
Ｒ１は、ポリマーナノ粒子マトリックスと相溶性であるべきであり、かつ親油性であるべきであることに留意されたい。この実施形態によれば、Ｙは、好ましくはアルキレン−シクロヘキサンを表す。
【００６７】
親水性ポリマーは、任意の表面改質剤ポリマーであってよい。表面改質剤として典型的に使用されるポリマーには、それらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリシアル酸、ポリ乳酸（ポリラクチドとも称される）、ポリグリコール酸（ポリグリコリドとも称される）、ポリ乳酸−ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリアスパルタミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリビニルメチルエーテル、ポリヒドロキシエチルアクリレート、誘導体化セルロース（ヒドロキシメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースなど）が含まれる。ポリマーは、ホモポリマーとして、またはブロックもしくはランダムコポリマーとして採用できる。
【００６８】
好ましくは、親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ部分は、好ましくは、約７５０Ｄａ〜約２０，０００Ｄａの分子量を有する。より好ましくは、分子量は、約７５０Ｄａ〜約１２，０００Ｄａ、最も好ましくは約２．０００Ｄａ〜約５，０００Ｄａである。
【００６９】
好ましくは、ポリエチレングリコールは、モノメトキシポリエチレングリコール（モノメトキシまたは規則的ペグ）である。したがって、本発明により利用される好ましい脂質ポリマーは、ステアリルアミン−モノメトキシポリ（エチレングリコール）（ＳＡ−ｍＰＥＧ）である。
【００７０】
別法として、親水性ポリマーは、図１Ｂに概略的に図示されるように、粒子を形成するポリマー、例えば、ｍＰＥＧ−ポリラクチドに共有結合で連結することができる。
【００７１】
本発明の１つの詳細な実施形態は、式中のＹが、式−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ１０−を有するアルキレン−シクロアルキレンを表し、Ｘが、式−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ１（ここで、Ｒ１は脂肪酸である）を有するカルボニル含有部分を表す、式（Ｉ）の化合物に関する。
【００７２】
本発明の別の詳細な実施形態は、そのリンカーが、オクタデシル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸アミド（ＯＭＣＣＡ）、Ｎ−１ステアリル−マレイミド（ＳＭ）、オレイン酸スクシンイミジル、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）２０００］、およびこれらの混合物から選択される式（Ｉ）の化合物に関する（表１）。
【００７３】
いくつかの実用的なリンカーの化学構造を次表１に示す。
【００７４】
2011516443.tif 000003
【００７５】
本発明による１つの好ましいリンカーであるＯＭＣＣＡは、下記のスキーム１により合成することができる。
【００７６】
【化２】
2011516443.tif 000004
【００７７】
オレイン酸スクシンイミジルは、Ｓｉｇｍａ社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州、米国）から市販されており；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）２０００］は、ＡＶＡＮＴＩ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、アラバマ州）から市販されている。
【００７８】
本発明の送達システムは、標的化送達システム、すなわちターゲティング薬剤に結び付けたれた送達システムの形態で提供できる。ターゲティング薬剤が抗体またはその結合形成フラグメントである場合、本発明の標的化送達システムは、「免疫ナノ粒子」と呼ばれることもある。
【００７９】
ターゲティング薬剤は、結合を形成する対の一方のメンバーであり、対の他方のメンバーは、本発明の標的化送達システムが選択的／優先的に送達されるべき、細胞、組織上の標的であると見なすことができる。用語「結合形成対（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｕｐｌｅ）」は、本明細書中で使用する場合、互いに特異的に結合する能力（親和性）がある２つの物質を意味する。結合形成対の非限定的例には、当技術分野に精通した者にとって周知のように、ビオチン−アビジン、抗原−抗体、受容体−リガンド、オリゴヌクレオチド−相補的オリゴヌクレオチド、糖−レクチンが含まれる。
【００８０】
ターゲティング薬剤は、ターゲティング・ポリマーまたはオリゴマーでもよい。該ポリマー（およびその免疫学的機能性フラグメント）の非限定的例は、アミノ酸をベースにしたポリマー（例えば、抗体、抗原、糖タンパク質）、核酸をベースにしたポリマー（例えば、免疫賦活性オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ））、センスおよびアンチセンスセンス干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）など、または糖をベースにした糖タンパク質（例えばレクチン）などのポリマーを包含する。
【００８１】
上で言及したように、上記ターゲティング薬剤の任意のフラグメントも、それらが、標的への特異的結合特性を保持する限り、本発明により使用することができる。ターゲティング薬剤が、抗体（後記の定義を参照のこと）である場合、後者は、ポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体を含む、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体のいずれか１つでよい。抗体のフラグメントは、抗体の抗原結合ドメイン、例えば、Ｆｃ部分のない抗体、単鎖抗体、本質的に単に可変部だけからなるフラグメント、抗体の抗原結合ドメインなどを含むことができる。
【００８２】
いくつかの実施形態によれば、ターゲティング薬剤は、葉酸またはチアミンなどの低分子量化合物である。例えば、チアミンは、ポリマーをベースにしたナノ粒子にアンカリングされたリンカーに結合されることができ、このようにした形成されたナノ粒子は、次いで、チアミン受容体の高められた発現を有する組織に特異的に標的化される。このような標的細胞としては、癌細胞を挙げることができる。
【００８３】
いくつかの好ましい実施形態において、ターゲティング薬剤は、リンカーを経由して粒子と結び付けられたタンパク質である。免疫ナノ粒子について言及する場合、ターゲティング薬剤は、好ましくは、リンカーへの共有結合を介して粒子と結び付けられた抗体である（該リンカーは、粒子に非共有結合で結び付けられている）。結合形成対の他のメンバーは、抗体が特異的に結合する抗原である。前に示したように、ターゲティング薬剤は、また、抗体の免疫学的フラグメントであってもよい。
【００８４】
本発明の文脈で、用語「抗体」は、天然供給源、組み換え供給源に由来する、または当技術分野で周知の合成手段の使用による実質上無傷の免疫グロブリンを意味し、全てにおいて、抗原決定基に結合する能力を有する抗体がもたらされる。抗体は、例えば、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、単鎖抗体、軽鎖抗体、重鎖抗体、二重特異性抗体、またはヒト化抗体、および上記の任意の免疫学的フラグメントを含む種々の形態で存在できる［Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY（非特許文献３２）；Harlowら(1989),Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York（非特許文献３３）；Houstonら(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879〜5883（非特許文献３４）；Birdら(1988),Science 242:423〜426（非特許文献３５）］。
【００８５】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫学的フラグメント」は、抗原決定基に結合する能力を有する抗体の機能性フラグメントを指す。適切な免疫学的フラグメントは、例えば、免疫グロブリン軽鎖（「軽鎖」）の相補性決定領域（ＣＤＲ）、免疫グロブリン重鎖（「重鎖」）のＣＤＲ、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域、軽鎖、重鎖、Ｆｄフラグメント、およびＦｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２などの軽鎖および重鎖の双方の全可変領域を本質的に含む免疫学的フラグメントでよい。
【００８６】
本発明の好ましい実施形態によれば、抗体は、モノクロナール抗体（ＭＡｂ）である。抗体は、天然のタンパク質または遺伝子操作産生物（すなわち、組み換え抗体）、あるいは合成産物に対して作り出された抗体でよい。
【００８７】
好ましくは、リガンドは、ヒト化および／またはキメラモノクロナール抗体、あるいはヒト化および／またはキメラモノクロナールのフラグメントである。
【００８８】
本発明によれば、リガンドは、詳細には、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＣＡ１２５、ＣＴＬＡ−４、Ｈ−フェリチンからなる群から選択される抗原に向けられる抗体または抗体フラグメントであり、ここで、リガンドは、好ましくは、トラスツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、マツズマブ、ニモツズマブ、ＭＤＸ−４４７、オエゴボマブ（Ｏｅｇｏｖｏｍａｂ）、ペルツズマブ、イピリムマブ、ＡＭＢ８ＬＫ、抗マウスＥｐＣＡＭ、抗ヒトＥｐＣＡＭからなる群から選択される。
【００８９】
本発明により使用できるＭＡｂの非限定的例が、ベバシズマブ、オマリズマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ（すべて、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）、モノクロナール抗体１７−１Ａ（ＥｐＣＡＭ）（ＢＤ）、抗−ＣＤ１６０、およびＡＭＢ８ＬＫ（ＭＡＴ  Ｅｖｒｙ、フランス）、ムロモナブ−ＣＤ３（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、アブシキシマブ（Ｃｅｎｔｒｏｃｏｒ）、リツキシマブ（Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ）、バシリキシマブ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｒｏｃｏｒ）、セツキシマブ（Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ダクリズマブ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ）、パリビズマブ（Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ）、アレムツズマブ（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ／ＩＮＥＸ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｗｙｅｔｈ）、イブリツモマブチウキセタン（Ｂｉｏｇｅｎ−ＩＤＥＣ）、トシツモマブ−Ｉ１３１（Ｃｏｒｉｘａ）およびアダリムマブ（Ａｂｂｏｔ）である。
【００９０】
より好ましくは、ＭＡｂは、ＥｐＣＡＭである。ＥｐＣＡＭは、上皮細胞接着分子に対して高い親和性を有するＭＡｂであり、後者は、肺癌細胞などの悪性腫瘍細胞中に過剰発現されている。したがって、本発明の一実施形態によれば、該送達システムを使用して、細胞接着分子を過剰発現している細胞に細胞傷害薬を送達することができる。
【００９１】
いくつかの実施形態によれば、ＮＰは、異なる結合特性（例えば、異なる結合特異性）を有する２つの抗体を携行する。単一ナノ粒子上の２つの異なる抗体のこの構造は、２つの抗体が、ナノ粒子によって、真の二重特異性単一分子を化学的に複合するまたは遺伝子操作する必要なしに、比較的簡単かつ費用のかからない方式で、互いに近接して配置される「機能的二重特異性−様（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｌｉｋｅ）」の抗体構造物を創り出した。
【００９２】
この文脈では、二特異性抗体も使用できる。二特異性抗体は、細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））および酵母（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））中に機能性形態でかつ高収率で発現させることのできる、小さな二価の二重特異性抗体フラグメントの部類である。二特異性抗体は、あまりに短くて同一鎖上で２つのドメイン間で対を形成できないペプチドリンカーによって連結された、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）上の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）へ連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。このことは、別の鎖の相補性ドメインとの対形成を強制し、２つの機能性抗原結合部位との二量体分子の組み立てを促進する。二重特異性をもつ二特異性抗体を構成するためには、抗体Ａおよび抗体ＢのＶ−ドメインを融合して、２つの鎖ＶＨＡ−ＶＬＢ、ＶＨＢ−ＶＬＡを創り出す。各鎖は、抗原に対する結合において不活性であるが、他の鎖との対形成で抗体ＡおよびＢの機能性抗原結合部位を再創生する。
【００９３】
本発明のナノ粒子は、各種の方法、例えば、ポリマー界面堆積法（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、溶媒蒸発、噴霧乾燥、コアセルベーション、界面重合、および当業者に周知のその他の方法によって形成することができる。
【００９４】
好ましくは、本発明のナノ粒子は、Fessi Hらによって発表されているようなポリマー界面堆積法によって調製される［Fessi Hら、Int.J.Pharm.1989;55:R1〜R4（非特許文献３６）］。本発明のナノ粒子は、米国特許第５０４９３２２号（特許文献６）および５１１８５２８号（特許文献７）に開示されているようにして調製することができる。
【００９５】
Fessi Hらによる方法によれば、粒子形成用ポリマーを、アセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトニトリルなどの水と混和性の有機溶媒に溶解する。このポリマー含有有機相に、前に定義したようなリンカーを添加する。生じる有機相を、次いで、界面活性剤を含む水性相に添加して、分散液を形成し、続いて９００ｒｐｍで１時間混合し、次いで減圧下で蒸発させてナノ粒子を形成し、次いで、該ナノ粒子をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）などの適切な緩衝液で洗浄する。有機相は、本発明の送達システムによって携行される予定の活性薬剤の溶解を促進するために、有機溶媒の組合せに加えて他の界面活性剤を含むこともできる。同様に、水性相は、界面活性剤の組合せを含むことができ、その組合せのすべては、Fessiらによって発表されている通りである。
【００９６】
指摘したように、送達粒子は、好ましくは、１種または２種以上の活性薬剤を携行し、ここで、該１種または複数の活性薬剤は、好ましくは、薬物および／または放射性医薬品、および／またはコントラスト剤である。この目的のため、薬剤、好ましくは、乾燥活性薬剤は、リンカーの添加に先立ってまたはリンカーの添加と一緒に有機相へ添加される。
【００９７】
ナノ粒子の形成を可能にするために、ポリマーおよび活性薬剤（もし組み込むなら）は、好ましくは、有機相に可溶性、水性相に不溶性であるべきであり、同時に、有機溶媒および水性相は、混和性であるべきである。
【００９８】
前記３成分、すなわち、粒子形成用ポリマー、活性薬剤およびリンカーを単に混合することによって、ある量のリンカーが粒子の表面に露出され、その量が粒子表面でターゲティング薬剤の化学的結合を可能にするのに十分であることが見出された。かくして、ターゲティング薬剤は、粒子表面に露出されたリンカーの反応基とのその交差反応を可能にする適切な条件を準備することによって、形成した粒子（活性薬剤を装填された）に化学的に結び付けられる。
【００９９】
図１Ａ〜１Ｃは、本発明のいくつかの実施形態による送達粒子の概略説明図である。図１Ａは、その外表面（１２）に、外表面を経て粒子中にアンカリングされた第１部分（１６）、および前記表面に露出され、ターゲティング薬剤（２０）が化学的に結合される第２部分（１８）を有してなるリンカー（１４）を有する送達粒子（１０）を示す。この詳細な説明図において、リンカーは、粒子中にアンカリングされた親油性部分、および表面に露出されたマレイミド部分を有するＯＭＣＣＡである。マレイミドは、例えば、ターゲティング薬剤の遊離チオール基とスルフィド橋を形成することによって、ターゲティング薬剤と化学的に結合することができる。図１Ｂには、図１Ａのそれと同様ではあるが、薬物送達用ビヒクルに関わる当技術分野に精通した者によって認識されるように、とりわけ体内での粒子の循環時間を増大させるためにその表面にＰＥＧなどの親水性基（２２）を有する送達粒子を図示する。図１Ｃには、図１Ｂのそれと同様の送達粒子を図示するが、さらに、粒子の内部マトリックス（２６）内に薬物（２４）を埋め込んでいることを示している。
【０１００】
図１Ａ〜１Ｃは、リンカーの第１部分が粒子中に完全に埋め込まれていることを図示しているが、この部分は、粒子のマトリックス中に部分的に封入されていても、あるいは中心部に封入またはカプセル化されていてもよいことを認識されたい。唯一の必須条件は、アンカリングが本質的に安定であること、すなわち、リンカーを粒子から脱着できないことである。
【０１０１】
本発明の送達システムによって携行できる広範な種類の活性薬剤が存在する。携行は、当技術分野に精通した者にとって周知であるように、ポリマーマトリックス中への活性薬剤（活性薬剤のクラスターまたは非クラスター）の結合または埋め込み、粒子表面での吸着、粒子の内部空間への活性薬剤の分散、粒子を形成するポリマー内への活性薬剤の溶解、ナノ粒子の油性中心部へのカプセル化などによって達成できる。
【０１０２】
活性薬剤は、薬物（治療または予防用薬剤）、または診断（コントラスト形成）用薬剤でよい。エアロゾル製剤で投与される活性薬剤は、タンパク質、ペプチド、気管支拡張薬、コルチコステロイド、エラスターゼ阻害薬、鎮痛薬、抗真菌薬、嚢胞性線維症治療薬、喘息治療薬、肺気腫治療薬、呼吸窮迫症候群治療薬、慢性気管支炎治療薬、慢性閉塞性肺疾患治療薬、臓器移植拒絶治療薬、肺の結核およびその他の感染症のための治療薬、真菌感染症治療薬、後天性免疫不全症候群に付随する呼吸器疾患の治療薬、腫瘍用薬物、制吐薬、鎮痛薬および心血管用薬剤からなる群から好ましくは選択される。
【０１０３】
本発明によれば、薬物は、好ましくは、化学療法薬、特に、抗腫瘍性化学療法薬または化学予防薬である。
【０１０４】
本発明によれば、特に肺癌または気管支異形成症の治療において、薬物は、パクリタキセル、ゲフィチニブ、エルロチニブ、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、酒石酸ビノレルビン、シスプラチン、ドキソルビシン、イフォスファミド、硫酸ビンクリスチン、塩酸ゲムシタビン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、メトトレキサート、塩酸トポテカン、イリノテカン、５−フルオロウラシル、ジロイトン、セレコキシブ、およびこれらの誘導体（ここで、前記薬物の誘導体は、好ましくは、脂肪酸誘導体、特に、おそらく（ｍａｙ  ｂｅ）パルミチン酸パクリタキセルなどのパルミチン酸誘導体である）からなる群から選択されることが好ましい。
【０１０５】
本発明による肺癌の文脈内で、薬物は、パクリタキセル、エトポシド、カルボプラチン、ドセタキセル、酒石酸ビノレルビン、シスプラチン、ドキソルビシン、イフォスファミド、硫酸ビンクリスチン、塩酸ゲムシタビン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、メトトレキサート、塩酸トポテカン、およびこれらの薬物の誘導体、ならびに前記薬物またはそれらの誘導体の組合せからなる群から選択されることが特に好ましい。
【０１０６】
本発明による異形成症の文脈内で、薬物は、化学予防薬ジロイトン、セレコキシブ、およびこれらの誘導体からなる群から選択されることが好ましい。
【０１０７】
本発明による用語「異形成症」は、軽度および／または重度の異形成症を指し、ここで、「軽度異形成症」は、詳細には細胞内部に微小の異常型を有する病変を指し、「重度異形成症」はまた軽いまたは中度の異形成症を含む。本発明による用語「気管支異形成症」は、詳細には、肺異形成症を指す。
【０１０８】
本発明による用語「肺」または「肺（複数）」は、詳細には、哺乳動物、特にマウスおよび好ましくはヒトの呼吸器官を指す。より詳細には、用語「肺」は、非小細胞肺癌を患うまたはそれになり易いマウスまたは好ましくはヒト患者などの、肺癌または気管支異形成症の治療または診断を必要とするマウスまたは好ましくは人間の呼吸器官に関する。
【０１０９】
本発明の別の好ましい実施形態、特に肺癌または気管支異形成症の診断および／または治療において、活性薬剤は、カルシウム−４７、炭素−１１、炭素−１４、クロム−５１、コバルト−５７、コバルト−５８、エルビウム−１６９、フッ素−１８、ガリウム−６７、ガリウム−６８、水素−３、インジウム−１１１、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、鉄−５９、クリプトン−８１ｍ、窒素−１３、酸素−１５、リン−３２、サマリウム−１５３、セレン−７５、ナトリウム−２２、ナトリウム−２４、ストロンチウム−８９、テクネチウム−９９ｍ、タリウム−２０１、キセノン−１３３、イットリウム−９０、および前記放射性核種の少なくとも１種を含む物質からなる群から選択される放射性医薬品である。
【０１１０】
特に、ＰＥＴおよび／またはＣＴによる診断または造影方法で使用する場合、放射性医薬品は、本発明による、テクネチウム−９９ｍ（例えば、テクネチウム−９９ｍシンチグラフィーまたはＣＴにおいて）またはフッ素１８−ＦＤＧ（例えば、フッ素１８−ＦＤＧ  ＰＥＴにおいて）であることが好ましい。
【０１１１】
本発明のさらなる好ましい実施形態、特に肺癌または気管支異形成症の診断において、活性薬剤は、ヨウ素−、ガドリニウム−、マグネタイト−、またはフッ素−含有コントラスト剤からなる群から選択されるコントラスト剤であり、ここで、該コントラスト剤は、ヨウ素含有薬剤からなる群から、特に、イオプロミド、イオキシタラメート、イオキサグレート、イオヘキソール、イオパミドール、イオトラロン、およびメトリザミドからなる群から好ましくは選択される。
【０１１２】
抗癌性活性薬剤は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、天然物、ホルモンおよび拮抗薬、ならびに放射線増感剤などの種々の薬剤から好ましくは選択される。アルキル化剤の例には、（１）例えば、クロルメチン、クロルアンブシル、メルファラン、ウラムスチン、マンノムスチン、リン酸エキストラムスチン、メクロレ−タミノキシド（ｍｅｃｈｌｏｒｅ−ｔｈａｍｉｎｏｘｉｄｅ）、シクロホスファミド、イフォスファミド、およびトリフォスファミドなどの、ビス−（２−クロロエチル）−アミン基を有するアルキル化剤、（２）例えば、トレタミン、チオテパ、トリアジコン、およびミトマイシンなどの、置換アジリジン基を有するアルキル化剤、（３）例えば、ブスルファン、ピポスルファン、およびピポスルファムなどの、アルキルスルホネート型のアルキル化剤、（４）例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、またはストレプトゾトシンなどの、アルキル化Ｎ−アルキル−Ｎ−ニトロソウレア誘導体、ならびに（５）ミトブロニトール、ダカルバジン、およびプロカルバジン型のアルキル化剤が含まれる。
【０１１３】
代謝拮抗薬の例には、（１）例えば、メトトレキサートなどの葉酸類似体、（２）例えば、フルオロウラシル、フロクスリジン、テガフール、シタラビン、イドクスリジン、およびフルシトシンなどのピリミジン類似体、ならびに（３）例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、アザチオプリン、チアミプリン、ビダラビン、ペントスタチン、およびプロマイシンなどのプリン誘導体が含まれる。
【０１１４】
天然物の例には、（１）例えば、ビンブラスチンおよびビンクリスチンなどのビンカアルカロイド、（２）例えば、エトポシドおよびテニポシドなどのエピポドフィロトキシン、（３）例えば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、ドクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトラマイシン、ブレオマイシン、およびミトマイシンなどの抗生物質、（４）例えば、Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素、（５）例えば、α−インターフェロンなどの生物学的応答改変薬（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、（６）カンプトテシン、（７）タキソール、ならびに（８）レチノイン酸などのレチノイドが含まれる。
【０１１５】
ホルモンおよび拮抗薬の例には、（１）例えば、プレドニゾンなどの副腎皮質ステロイド、（２）例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲストロールなどのプロゲスチン類、（３）例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールなどのエストロゲン類、（４）例えば、タモキシフェンなどの抗エストロゲン薬、（５）例えば、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンなどのアンドロゲン類、（６）例えば、フルタミドなどの抗アンドロゲン薬、（７）例えば、リュープロリドなどのゴナドトロピン放出ホルモン類似体が含まれる。種々の雑多な薬剤の例には、（１）例えば、１，２，４−ベンゾトリアジン−３−アミン１，４−ジオキシド（ＳＲ４８８９）および１，２，４−ベンゾトリアジン７−アミン１，４−ジオキシド（ＷＩＮ５９０７５）などの放射線増感剤、（２）シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金配位錯体、（３）例えば、ミトキサントロンなどのアントラセンジオン類、（４）例えば、ヒドロキシウレアなどの置換尿素類、ならびに（５）例えば、ミトタンおよびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制薬が含まれる。
【０１１６】
加えて、抗癌薬は、例えば、シクロススポリン、アザチオプリン、スルファサラジン、メトクスサレン（ｍｅｔｈｏｘｓａｌｅｎ）、およびサリドマイドなどの免疫抑制薬であり得る。
【０１１７】
鎮痛性活性薬剤には、例えば、ＮＳＡＩＤまたはＣＯＸ−２阻害薬が含まれる。本発明の粒子中で製剤できる典型的なＮＳＡＩＤには、限定はされないが、適切な非酸性および酸性化合物が含まれる。適切な非酸性化合物には、例えば、ナブメトン、チアラミド、プロクアゾン、ブフォキサマク（ｂｕｆｏｘａｍａｃ）、フルミゾール、エピラゾール、チノリジン、チメガジン、およびダプソンが含まれる。適切な酸性化合物には、例えば、カルボン酸およびエノール酸が含まれる。適切なカルボン酸系ＮＳＡＩＤには、例えば、（１）アスピリン、ジフルニサール、ベノリレート、およびフォスフォサルなどのサリチル酸およびそのエステル類、（２）ジクロフェナク、アルクロフェナク、およびフェンクロフェナクを含むフェニル酢酸などの酢酸類、（３）エトドラク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、フェンチアザク、およびチロミソールなどの炭素−およびヘテロ環式酢酸類、（４）カルプロフェン、フェンブレン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、オキサプロジン、スプロフェン、チアプロフェン酸、イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、インドプロフェン、およびピルプロフェンなどのプロピオン酸類、ならびに（５）フルテナム酸（ｆｌｕｔｅｎａｍｉｃ）、メフェナム酸、メクロフェナム酸、およびニフルミン酸などのフェナム酸類が含まれる。適切なエノール酸系ＮＳＡＩＤには、例えば、（１）オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、アパゾン、およびフェプラゾンなどのピラゾロン類、ならびに（２）ピロキシカム、スドキシカム、イソキシカム、およびテノキシカムなどのオキシカム類が含まれる。
【０１１８】
典型的なＣＯＸ−２阻害薬には、限定はされないが、セレコキシブ（ＳＣ−５８６３５、ＣＥＬＥＢＲＥＸ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｓｅａｒｌｅ  ＆  Ｃｏ．）；ロフェコキシブ（ＭＫ９６６、Ｌ−７４８７３１、ＶＩＯＸＸ、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）；メロキシカム（ＭＯＢＩＣ＠、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｈｉｃａｇｏ、イリノイ州およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによる共販）；バルデコキシブ（ＢＥＸＴＲＡ＠、Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ  ＆  Ｃｏ．）；パレコキシブ（Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ  ＆  Ｃｏ．）、エトリコキシブ（ＭＫ−６６３、Ｍｅｒｃｋ）；ＳＣ−２３６（４−＆ｌｓｑｂ；５−（４−クロロフェニル）−３−；（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）＆ｒｓｑｂ；ベンゼンスルホンアミドの化学名、Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ  ＆  Ｃｏ．、Ｓｋｏｋｉｅ，イリノイ州）；ＮＳ−３９８（Ｎ−（２−シクロヘキシルオキシ−４−ニトロフェニル）メタンスルホンアミド、大正製薬、日本）；ＳＣ−５８１２５（メチルスルホンスピロ（２，４）ヘプタ−５−エン１、Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｓｅａｒｌｅ  ＆  Ｃｏ．）；ＳＣ−５７６６６（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｓｅａｒｌｅ  ＆  Ｃｏ．）；ＳＣ−５５８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｓｅａｒｌｅ  ＆  Ｃｏ．）；ＳＣ−５６０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ｓｅａｒｌｅ  ＆  Ｃｏ．）；エトドラク（Ｌｏｄｉｎｅ、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）；ＤＦＵ（５，５−ジメチル−３−（３−フルオロフェニル）−４−（４−ｉメチルスルホニル）フェニル２（５Ｈ）−フラノン）；モンテリューカスト（ｍｏｎｔｅｌｅｕｋａｓｔ）（ＭＫ−４７６）、Ｌ−７４５３３７（（５−メタンスルホンアミド−６−（２，４−ジフルオロチオ−フェニル）−１−インダノン）、Ｌ−７６１０６６、Ｌ−７６１０００、Ｌ−７４８７８０（すべてＭｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）；ＤＵＰ−６９７（５−ブロモ−２−（４−フルオロフェニル）−３−（４−（メチルスルホニル）フェニル、Ｄｕｐｏｎｔ  Ｍｅｒｃｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．）；ＰＧＶ２０２２９（１−（７−ｔｅｒｔ−ブチル−２，３−ジヒドロ−３，３−ジメチルベンゾ（ｂ）フラン−５−イル）−４−シクロプロピルブタン−１−オン；Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；イグラチモド（Ｔ−６１４、３−ホルミルアミノ−７−＆ｒｓｑｂ；メチルスルホニルアミノ−６−フェノキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、富山化学工業、日本）；ＢＦ３８９（Ｂｉｏｆｏｒ、米国）；ＣＬ１００４（ＰＤ１３６０９５）、ＰＤ１３６００５、ＰＤ１４２８９３、ＰＤ１３８３８７、およびＰＤ１４５０６５（すべてＰａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ／Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｃｏ．）；フルルビプロフェン（ＡＮＳＡＩＤ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）；ナブメトン（ＦＥＬＡＦＥＮ、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、ｐｌｃ）；フロスリド（ＣＧＰ２８２３８、Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｃｉｂａ  Ｇｅｉｇｙ）；ピロキシカム（ＦＥＬＤＡＮＥ、Ｐｆｉｚｅｒ３）；ジクロフェナク（ＶＯＬＴＡＲＥＮおよびＣＡＴＡＦＬＡ��、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ルミラコキシブ（ＣＯＸ−１８９、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；Ｄ１３６７（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｃｈｉｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｐｌｃ）；Ｒ８０７（３−ベンゾイルジフルオロメタンスルホンアニリド、ジフルミドン）；ＪＴＥ−５２２（日本たばこ、日本）；ＦＫ−３３１１（４’−アセチル−２’−（２，４−ジフルオロフェノキシ）メタンスルホンアニリド）、ＦＫ８６７、ＦＲ１４０４２３およびＦＲ１１５０６８（すべて藤沢製薬、日本）；ＧＲ２５３０３５（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）；ＲＷＪ６３５５６（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）；ＲＷＪ２０４８５（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）；ＺＫ３８９９７（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）；Ｓ２４７４（（Ｅ）−（５）−（３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシベンジリデン）−２−エチル−１，２−イソチアゾリジン−１，１−ジオキシドインドメタシン、塩野義製薬、日本）；ＲＳ５７０６７およびＲＳ１０４８９７などのゾメピラク類似体（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）；ＲＳ１０４８９４（Ｈｏｆｆｍａｎｎ  Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）；ＳＣ４１９３０（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）；プランルカスト（ＳＢ２０５３１２、Ｏｎｏ−１０７８、ＯＮＯＮ、ＵＬＴＡＩＲ＠、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）；ＳＢ２０９６７０（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）；およびＡＰＨＳ（ヘプチニルスルフィド）が含まれる。
【０１１９】
これらの部類の薬物および診断薬の説明ならびに各部類内の種のリストは、例えば、参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Martindale、「The Extra Pharmacopoeia」29版、The Pharmaceutical Press、London、1989（非特許文献３７）中に見出すことができる。該薬物および診断薬は、市販されており、かつ／または当技術分野で周知の技術で調製できる。
【０１２０】
本発明の実施で適切に使用できる貧水溶性の薬物には、限定はされないが、ベクロメタゾン、ブデソニド、シプロフロキサシン、シスプラチン、クラリスロマイシン、エトポシド、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ケトプロフェン、メチルプレドニゾロン、モメタゾン、ナブメトン、ノルフロキサシン、パクリタキセル、ピロキシカム、トリアムシノロン、ドセタキセル、または前記薬物のいずれかの薬学上許容可能な塩が含まれる。
【０１２１】
診断薬は、本発明の送達用粒子で送達することができる診断薬は、単独で、または１種または２種以上の前記のような薬物と組み合わせて投与することができる。診断薬は、各種の技術によって標識することができる。診断薬は、放射能標識化合物、蛍光標識化合物、酵素標識化合物であってもよく、かつ／またはＸ線、超音波、磁気共鳴造影（ＭＲＩ）、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、または蛍光透視検査などの技術を使用して検出できる磁性化合物またはその他の材料を包含する。
【０１２２】
好ましい一実施形態によれば、本発明の送達システムによって送達される活性薬剤は、細胞傷害薬（抗腫瘍薬）である。本明細書中で例示される細胞傷害薬は、ドセタキセル、パクリタキセルおよびパルミチン酸パクリタキセルである。具体的な細胞障害薬は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を治療するのに最上の好ましい薬物の１つであることが知られているドセタキセル（ＤＣＴＸ）である。
【０１２３】
いくつかの事例で、送達粒子は、１種を超える活性薬剤を含むことができることが認識される。さらに、該粒子には、活性薬剤、および適切なその補助薬、すなわち主要活性薬剤の作用を促進または修正する成分を装填することができる。例えば、免疫療法において、補助薬は、ワクチンの免疫賦活特性を強化または修正するためにワクチン製剤中に含められる物質である。別の実施形態によれば、該粒子は、薬物と、薬物作用を増強するための多剤耐性（ＭＤＲ）阻害薬との組合せを含有することができ、このような組合せは、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）に対するＭＤＲを抑制することが知られているベラパミルを含むことができる。
【０１２４】
さらに、ターゲティング薬剤は、また、治療または診断上の利点を有することが生じる可能性がある。したがって、いくつかの実施形態によれば、粒子は、主要活性薬剤としてターゲティング薬剤のみを、あるいはターゲティング薬剤に加えて粒子のマトリックスまたはコアに埋め込まれた活性薬剤を含むことができる。ターゲティング薬剤が活性成分としても役立つことのできる例が、後に具体的にさらに例示されるトラスツズマブである。
【０１２５】
本発明の免疫ナノ粒子は、それらが特定の受容体または抗原に選択的に結合し、活性薬剤を所望の部位で放出するする能力を有するので、有利である。ターゲティング薬剤の特定の受容体または抗原への結合は、内在性受容体の介在するトランスサイトーシスおよびエンドサイトーシス系を使用して、生物学的障壁を横切るナノ粒子の移動をトリガーする。このことが、ターゲティング薬剤の不在の場合に免疫粒子製剤の治療効力を向上し、かつ活性薬剤に付随する有害副作用を低減する。
【０１２６】
ナノ粒子は、ＩＶ投与に続いて細網内皮系（ＲＥＳ）による急速なクリアランスを受ける。ＲＥＳによるナノ粒子の取込みを阻止するために、ナノ粒子を、それらの表面で親水性ポリマーによって修飾することができる。粒子を形成するポリマーへの親水性ポリマーの結び付きは、共有結合性または非共有結合性の結び付きでよいが、好ましくは、粒子表面にアンカリングされたリンカーへの共有結合の形成による。リンカーは、ターゲティング薬剤が結合されるリンカーと同一または異なってよい。親水性ポリマー鎖の最外側の表面被覆は、ｉｎ  ｖｉｖｏで長い血液循環寿命を有する粒子を提供するのに効果的である。
【０１２７】
一実施形態によれば、親水性ポリマーは、脂質に結合され、かくして、脂質ポリマーを形成し、その脂質部分は粒子表面に繋ぎとめられる。
【０１２８】
本発明の文脈で、特に、肺癌の治療または診断で使用する場合、
・ナノ粒子が、ペグ化されたポリ（ラクチド酸）をベースにし；
・リンカーが、モノクロナール抗ＥＰ−ＣＡＭ抗体、特に抗ヒトまたは抗マウスＥＰ−ＣＡＭ抗体が連結されているオクタデシル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキシルであり、かつ／または
・薬物が、パルミチン酸パクリタキセルである、送達システムが好ましく、前記特徴のすべてを組み合わせることが、肺癌の治療にとって特に好ましい。
【０１２９】
本発明の送達システムは、治療または診断に、すなわち、活性成分の標的部位（細胞または組織）への標的化送達に利用することができる。したがって、本発明は、また、本発明の送達システムを含む医薬組成物を提供する。一実施形態によれば、医薬組成物は、疾患または障害の治療または予防のために存在し、送達システムは、生理学および薬学上許容可能な担体と組み合わせられる。
【０１３０】
用語「治療または予防」は、本明細書中で使用する場合、疾患に付随する望ましくない症状を改善するのに有効な、このような症状の発現をそれらが発生する前に予防するのに有効な、疾患の進行を減速するのに有効な、症状の悪化を減速するのに有効な、疾患の緩解期間の開始を早めるのに有効な、疾患の進行性慢性段階に起因する不可逆的傷害を減速するのに有効な、前記進行段階の開始を遅延させるのに有効な、重症度を低くするか疾患を治癒するのに有効な、生存率またはより急速な回復を向上させるのに有効な、あるいは疾患が起こるのを予防するのに有効な、あるいは前記の２つ以上の組合せに有効な、送達システム内のある量の活性薬剤を投与することを意味する。
【０１３１】
この実施形態による「有効量」は、疾患または障害を治療するのに十分な所定の治療計画において、送達粒子中に埋め込まれる活性薬剤の量である。例えば、癌を治療する場合、活性薬剤、例えば、細胞傷害薬の量は、例えば、原発性腫瘍の増殖停止、転移性腫瘍の発生率の低下、または個体に現れる転移性腫瘍数の減少、または癌関連死亡率の低下をもたらす、薬物装填型送達粒子の量である。別法として、薬物装填型送達システムを癌予防のために投与する場合、有効量は、被治療個体における原発性腫瘍の発生を抑制または低減するのに十分な前記粒子の量である。ここでの目的のための薬学上の「有効量」は、したがって、当技術分野で周知であるような考察によって決定される。その量は、限定はされないが、生存率の改善またはより急速な回復、あるいは当業者によって適切な尺度として選択されるような症状およびその他の指標の改善または排除を含む、改善を達成するのに有効でなければならない。例えば、その量は、治療予定患者のタイプ、年齢、性別、身長および体重、治療すべき状態、状態の進行または緩解、投与経路、および送達される活性薬剤の種類に依存する可能性がある。
【０１３２】
有効量は、典型的には、適切に計画された臨床試験（用量範囲研究）の中で決定され、当技術分野に精通した者は、有効量を決定するためにこのような試験を適切に実施する方法を熟知しているであろう。一般に周知であるように、有効量は、投与方式、ナノ粒子を形成するポリマーおよびその他の成分の種類、活性薬剤の反応性、ターゲティング薬剤の種類およびその対応する結合メンバーへの親和性、体内での送達システムの分布プロフィール、ナノ粒子から放出された後の体内での活性薬剤の半減期などの各種薬理学的パラメーターを含む多様な因子に、もしあれば望ましくない副作用に、被治療対象の年齢および性別などの因子に依存する。
【０１３３】
この場合、治療目的のために、本発明の薬物装填型送達粒子を、神経系への傷害を防ぐために、１日１回の投与（例えば、累積有効量をもたらすために）で、１日数回の投与で、数日に１回の投与として、等々で長期にわたって投与することができる。
【０１３４】
特定の好ましい実施形態において、本発明による送達システムは、肺送達用の、特にｉｎ  ｖｉｖｏでの経肺投与用の吸入薬として使用される。
【０１３５】
本発明による用語「吸入薬」は、詳細には、肺中に吸い込まれ、肺を通して吸収される、本発明による送達システムのエアロゾル、分散液、またはコロイドのすべての形態を指す。
【０１３６】
本発明による用語「エアロゾル」は、詳細には、気体中の本発明による送達システムの懸濁物、または気体中の本発明による送達システムを含む液滴の懸濁物を指す。この文脈内で、本発明による用語「エアロゾル」は、また、エアロゾルスプレーを指すこともできる。本発明の文脈内で、用語「エアロゾルスプレー」は、詳細には、本発明による送達システムを含む液体粒子のエアロゾルミストを作り出す任意のタイプの投薬装置に関し、ここで、この装置は、加圧下の液体を含む缶または瓶（容器）と共に使用される。したがって、本発明による用語「エアロゾル」は、また、エアロゾルスプレー用の缶（または瓶）、および本発明による送達システムを収容しているこのような缶（または瓶）からの流出物に関する。
【０１３７】
詳細には、送達システムのエアロゾルとしての使用は、予想外にも、特に効率的な局所的肺送達を示した。したがって、局所的肺送達用エアロゾルとしての送達システムは、本発明により特に好ましい。
【０１３８】
本発明の好ましい実施形態において、送達システムは、ヒトまたは動物の身体を治療薬によって治療するための方法において、あるいはヒトまたは動物の身体に対して実行される診断方法において使用される。
【０１３９】
したがって、送達システムは、局所的肺送達用の好ましくは吸入薬として、より好ましくはエアロゾルとして構成された、治療薬または診断薬として提供される。
【０１４０】
本発明の文脈内の治療は、好ましくは、特に、本発明による送達システムを含有するエアロゾルの肺投与による、より好ましくは吸入によるエアロゾル治療である。したがって、本発明による経肺投与は、好ましくはエアロゾル投与である。
【０１４１】
それぞれ、本発明の文脈内の診断は、好ましくは、本発明による送達システムを含有するエアロゾルの経肺投与、より好ましくは吸入に基づく。
【０１４２】
特に好ましい実施形態において、本発明による送達システムは、癌および／または異形成症の、好ましくは肺癌および／または気管支異形成症、特に非小細胞肺癌の治療または診断で使用される。
【０１４３】
したがって、送達システムは、癌および／または異形成症の、好ましくは肺癌および／または気管支異形成症の、特に非小細胞肺癌の局所的肺送達による治療または診断のための吸入薬として、より好ましくはエアロゾルとして好ましくは構成されている治療薬または診断薬として提供される。
【０１４４】
別の好ましい実施形態において、本発明による送達システムは、癌および／または異形成症の、好ましくは肺癌および／または気管支異形成症の、特に非小細胞肺癌の治療または診断における、造影法において、好ましくは腫瘍−ＰＥＴでグルコース代謝を検査することなどによるＰＥＴにおいて（ここで、ＦＤＧ−ＰＥＴが特に好ましい）、またはＣＴにおいて使用される。
【０１４５】
したがって、送達システムは、より好ましくは、癌および／または異形成症の、好ましくは肺癌および／または気管支異形成症の、特に非小細胞肺癌の局所的肺送達による診断のための、吸入薬として、より好ましくはエアロゾルとして構成されている造影法のための（特にＰＥＴ、シンチグラフィーまたはＣＴのための）診断薬として提供される。
【０１４６】
さらに好ましい実施形態において、好ましくは本明細書に記載のような薬物を含有する本発明による送達システムは、特に、癌および／または異形成症の、好ましくは肺癌および／または気管支異形成症の、特に非小細胞肺癌の治療のための薬剤を製造するのに使用され、ここで、該薬剤は、好ましくは吸入薬として、特にエアロゾルとして構成される。
【０１４７】
別の好ましい実施形態において、好ましくは本明細書に記載のような放射線薬剤および／または本明細書に記載のようなコントラスト剤を含有する本発明による送達システムは、特に、癌および／または異形成症の、好ましくは肺癌および／または気管支異形成症の、特に非小細胞肺癌の診断のための診断薬を製造するのに使用され、ここで、該診断薬は、好ましくは、吸入薬として、特にエアロゾルとして構成される。
【０１４８】
前に指摘したように、本発明によるナノ粒子は、１種または２種以上の薬学上許容可能な担体と合わせて投与することができる。担体の特性および選択は、部分的には、個々の活性薬剤、個々のナノ粒子によって、および組成物を投与するのに使用される個々の方法によって決定される。好ましくは、本発明の送達システムの投与経路は、吸入である。
【０１４９】
ナノ粒子は、固体状態で吸入することができ、あるいは医薬用担体中の生理学上許容可能な希釈剤、例えば無菌の液体または液体混合物、例えば、薬学上許容可能な界面活性剤およびその他の医薬用補助薬を添加されたまたは添加されていない水、生理食塩水、デキストロースおよび関連糖の水性溶液、グリセロール中に分散させることができる。
【０１５０】
当業者は、活性薬剤の至適濃度、長期にわたって効果的な投与量の活性薬剤を送達するための投与量および投与経路を容易に決定することができる。さらに、当業者は、とりわけ、封じ込められたまたはカプセル化された活性薬剤の放出についての調節レベルに応じて本発明のナノ粒子を使用する治療計画および至適投与量を決定することができる。
【０１５１】
上記を考慮して、本発明は、また、必要とする対象に有効量の本発明の薬物装填型送達システムを投与することを含む、肺に関連する疾患または障害の治療方法を提供する。
【０１５２】
本発明の送達システムで治療できる状態の種類は、当技術分野に精通した者によって認識されるように、非常に多い。状態の非限定的リストには、癌；感染症などの炎症状態に関連する状態（炎症または自己免疫状態）；アレルギー状態（例えば、気管支喘息、薬物過敏症）；呼吸器疾患（症候性サルコイドーシス、レフレル症候群、吸引性肺炎、結核）が含まれる。
【０１５３】
本発明の別の態様は、本発明による送達システムの製造方法であって、
・溶媒置換法によって、ＭＷ１００，０００ＤａのｍＰＥＧ−ＰＬＡポリマーを好ましくは使用して、ポリマーをベースとするナノ粒子を調製すること、
・ナノ粒子を形成するに先立って、ポリマーにリンカー、好ましくはＯＭＣＣＡを添加すること、
・ナノ粒子の形成に続いて、活性薬剤、好ましくはモノクロナール抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体または抗マウスＥｐＣＡＭ抗体をリンカーにカップリングすること、
・ポリマーおよび／またはナノ粒子を薬物と接触させること、ならびに
・好ましくは、詳細には本発明の送達システムを含有する液体を容器（缶または瓶）に充填すること、および前記液体を加圧すること、詳細には、容器のバルブを開け、液体を小さな孔から押し出し、本発明による送達システムを含有するエアロゾルまたはミストを発生させることを含む、送達システムを含有するエアロゾルまたはエアロゾルスプレーを製造すること
を含む方法に関する。
【０１５４】
一実施形態によれば、本発明は、抗癌薬（例えば、イリノテカン、ドセタキセルおよびパルミチン酸パクリタキセル）を装填した送達システムを、適切なＭＡｂを使用して肺内の標的細胞にターゲティングすることによって、癌を治療する方法を提供する。
【０１５５】
本発明は、さらに、肺内の標的細胞または標的組織を対象の体内で造影する方法であって、
（ａ）前記対象に、コントラスト剤を携行する本発明の送達システムであり、免疫ナノ粒子が前記送達システムを前記の標的細胞または標的組織にターゲティングするのに有効な１種または複数のターゲティング薬剤と結び付けられている送達システムを提供すること；
（ｂ）前記体内の前記コントラスト剤を造影すること
を含む方法に関する。
【０１５６】
前に指摘したように、本発明の送達システムは、コントラスト剤（造影剤）と治療薬との組合せを含むことができる。したがって、本発明のターゲティングシステムを使用することによって、薬物の送達を画像化することもできる二重の効果を達成できる。
【０１５７】
コントラスト剤を装填した本発明の送達デバイスは、医学診断法で典型的に採用される種々の造影技術の中で採用される。このような技術には、限定はされないが、Ｘ線（ＣＡＴ走査式コンピューター断層写真撮影法（ＣＴ））、超音波、γ−シンチグラフィー、またはＭＲＩ造影が含まれる。
【０１５８】
コントラスト剤は、造影の技術分野で周知の任意の薬剤でよい。例には、限定はされないが、クマリン−６、ＦＩＴＣ、ローダミン、ガドリニウム誘導体などの蛍光ポリマー結合体が含まれる。
【０１５９】
認識されるように、本発明を、医薬組成物および診断用組成物に関してこの詳細な説明の中で説明するが、他の応用分野のためのおよび他の形態での送達システムの使用も本発明の範囲に包含されることを理解されたい。
【０１６０】
明細書および特許請求の範囲中で使用する場合、名詞（ｔｈｅ  ｆｏｒｍｓ  “ａ”，“ａｎ”ａｎｄ“ｔｈｅ”）は、文脈が、そうでないことを明白に指示しない限り、単数および複数の事柄を包含する。例えば、用語「抗体」は、１種または複数の種々の抗体を包含し、用語「コントラスト剤」は、１種または複数のコントラスト剤を包含する。
【０１６１】
さらに、本明細書中で使用する場合、用語「含む」は、送達システムが、列挙した要素を含むことを意味するが、他の要素を除外することを意味しないと解釈される。用語「本質的に〜からなる」は、治療または造影方法に関して本質的重要性を有する可能性のある列挙された要素を含むが、他の要素を含まない送達システムを定義するのに使用される。「〜からなる」は、したがって、微量な要素を超える他の要素を除外することを意味するものとする。これらの推移用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲に包含される。
【０１６２】
さらに、すべての数値は、例えば、デバイスの層を構成する要素の量または範囲に言及する場合、指定値から±２０％まで、時には１０％まで変化する概数値である。たとえ必ずしも明確に指定されていなくても、すべての数値指定には、用語「約」が前に付いていることを理解されたい。
【実施例】
【０１６３】
（具体例の説明）
（例１）：クロスリンカー（ＯＭＣＣＡ）の合成
オクタデシル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸アミド（ＯＭＣＣＡ）を合成するために、１００ｍｇの４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スルホスクシンイミジル（ＳＭＣＣ  Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州、米国）および８０ｍｇのステアリルアミン（ＳＡ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州、米国）を８ｍＬのクロロホルムおよび４１μＬのトリエチルアミン（Ｒｅｉｄｅｌ−ｄｅ−Ｈａｅｎ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）中に溶解し、反応物を５０℃で４時間インキュベートした。溶液を１％ＨＣｌで３回洗浄し、クロロホルムを減圧下で蒸発させた。生成物を一夜乾燥し、重量を測定した。収率は約９０％であり、リンカーの形成が、Ｈ−ＮＭＲ（Ｍｅｒｃｕｒｙ  ＶＸ３００、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、米国）、ＩＲ（Ｖｅｃｔｏｒ２２、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、米国）およびＬＣ−ＭＳ（Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱＤｕｏ、ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ、ニューヨーク州、米国）によって確認された。
【０１６４】
Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲおよびＬＣ−ＭＳ分析
Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３中のＯＭＣＣＡ）：ピーク：０．００８、０．８４９、．０８９３、１．００９、１．２４５、１．４５０、１．５５７、２．１５７、２．１６０、２．１６７、２．１７３、２．１７８、２．１８１、３．３４９、３．３７２、６．６９２、７．２５７ｐｐｍ
ＩＲ：ピーク：６２６．８９、６９５．６３、７２２．３５、８３４．４６、８９９．５２、９１０．５９、９３４．７９、１０４５．９４、１１２０．０５、１１６３．３０、１２１４．６０、１２６０．８２、１３６２．１５、１４０８．４０、１４３１．３８、１４６８．０４、１５４１．０２、１６２９．８６、１７０１．３５、２８５０．８０、２９２３．８４、３０８７．４３、３３１８．８１、３４５３．９１ｃｍ−１
ＬＣ−ＭＳ：ピーク：４９０．１７、４９１．２６
【０１６５】
ＮＭＲおよびＩＲスペクトルの分析は、リンカーＯＭＣＣＡの形成を確証しており、一方、ＬＣ−ＭＳスペクトルは、生成物の分子量が４９０ｇ／モルであることを確証している。
【０１６６】
（例２）：ポリマーの合成
（Ａ）ＰＥＧ−ＰＬＡの合成および特徴付け
ＰＥＧ−ＰＬＡ（５：２０）は、Bazile.D.らによって発表されているような周知の方法により合成した［Bazile Dら、J.Pharma Sci.84:493〜498(1995)（非特許文献３８）］。簡潔には、２ｇのメトキシポリエチレングリコール（ＭＷ５０００）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）を無水条件下で１２ｇのＤ，Ｌ−ラクチド（Ｐｕｒａｓｏｒｂ，Ｐｕｒａｃ，Ｇｏｒｉｎｃｈｅｍ、オランダ）と１３５℃で２時間混合した。
【０１６７】
ポリマーを、Ｈ−ＮＭＲ（Ｍｅｒｃｕｒｙ  ＶＸ３００、Ｖａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、米国）で、および示差走査熱量測定法（ＳＴＡＲｅ、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ、オハイオ州、米国）で分析した。
【０１６８】
ポリエチレングリコール（ＭＷ５０００）とポリラクチド（ＭＷ２００００）とのジブロックポリマー（ＰＥＧ−ＰＬＡ５：２０）を上記のように合成した。ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）は、２００００のＭＷ、および１．４７の多分散性指数［ＰＤ．Ｉ］を示した。ポリマーを、Ｈ−ＮＭＲおよび示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）で分析した。
【０１６９】
Ｈ−ＮＭＲおよびＤＳＣ分析
１Ｈ−ＮＭＲ（ＰＥＧ−ＰＬＡ（５：２０）の）：ピーク：−０．０１０、−０．００８、−０．００１、１．２０６、１．５４３、１．５６０、１．５６７、１．５８１、１．５９１、３．６４１、５．１３６、５．１４５、５．１５９、５．１６９、５．１８２、５．１９２、５．２０７、５．２１５、５．２３１、７．２５６
ＤＳＣ（ＰＥＧ−ＰＬＡ（５：２０、３．９８ｍｇ）：
ピーク１：積算値−１１８．８８ｍＪ、開始  ２８．７０℃、ピーク  ４３．２４℃、加熱速度１０℃／分
ピーク２：積算値−１２３４．１２ｍＪ、開始  ２３７．５４℃、ピーク  ２７３．９８℃、加熱速度１０℃／分
【０１７０】
ＮＭＲおよびＤＳＣスペクトルの分析は、ジブロックポリマーの形成を明瞭に示している。ＰＥＧは、ＰＬＡに共有結合で結び付けられていると推定することができる。
【０１７１】
（Ｂ）ポリラクチドおよびポリ（エチレングリコール−ｃｏ−ラクチド）の合成
ポリマー：ポリラクチド（ＰＬＡ）およびポリ（エチレングリコール−ｃｏ−ラクチド）（ｍＰＥＧ−ＰＬＡ）は、触媒としての１−エチルヘキサン酸第一錫（４）の存在下での開環重合法を使用して合成した。ＰＬＡの合成の場合、Ｄ，Ｌ−ラクチド（３０ｇ）および共触媒としてのベンジルアルコール（３２ｍｇ）を２５０ｍＬの無水トルエンに溶解し、一方、ｍＰＥＧ−ＰＬＡの合成の場合は、１．５ｇのメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ、ＭＷ５０００）を共触媒として使用し、既に３０ｇのＤ，Ｌ−ラクチドを含む２５０ｍＬの無水トルエンに添加した。水を共沸除去するために、還流混合物をディーンスターク装置上で４時間にわたって撹拌した。残留水分の除去に続いて、１−エチルヘキサン酸第一錫（２４５ｍｇ）を添加した。次いで、混合物を４時間で１３５℃まで加熱した。粗ポリマーを、塩化メチレンに溶解し、４Ｌの冷プロピルエーテル／石油エーテル混合物（３：２）中で２回沈殿させた。特徴付けに先立って、ポリマーを真空乾燥した。コポリマーの合成を、次のスキーム２に示す：
【０１７２】
【化３】
2011516443.tif 000005
【０１７３】
ポリラクチドおよびポリ（エチレングリコール−ｃｏ−ラクチド）の特徴付け
コポリマーを、２４１０型屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）および２０μＬのループを備えたＲｈｅｏｄｙｎｅ（Ｃｏｔａｔｉ、カリフォルニア州）注入バルブを具備したＷａｔｅｒｓ１５１５型アイソクラティック高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ポンプからなるゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）装置で特徴付けた。サンプルは、リニアーＳｔｙｒｏｇｅｌ  ＨＲカラム（Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州）に１ｍＬ／分の流速でクロロホルムを通して溶離した。分子量は、ＢＲＥＥＺＥ３．２０バージョン（著作権２０００、Ｗａｔｅｒｓ社のコンピュータープログラム）を使用し、５４〜２７７．７ＫＤａの分子量範囲をもつポリスチレン標準（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ペンシルヴェニア州）と比較して決定した。熱分析は、ＺｎおよびＩｎ標準で較正されたＭｅｔｔｌｅｒ  ＴＡ４０００−ＤＳＣ示差走査熱量測定装置（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ、Ｓｃｈｗｅｒｚｚｅｎｂａｃｈ、スイス）で、窒素雰囲気下に２０℃／分の加熱速度で測定した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３中）は、内部標準としてＴＭＳを使用し、Ｖａｒｉａｎ  ３００ＭＨｚ分光計で記録した（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州、米国）。
【０１７４】
２００００〜１４６０００の範囲の分子量を有するポリマーが得られた。ＰＬＡおよびｍＰＥＧ−ＰＬＡポリマーの基本的化学構造は、それらの組成に相応する１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって確認された。１．５５ｐｐｍの重なり合ったダブレットは、Ｄ−およびＬ−乳酸の繰返し単位のメチル基に帰属される。５．２ｐｐｍのマルチプレットは、乳酸のＣＨ基に対応する。ｍＰＥＧ−ＰＬＡのスペクトルを解析すると、ｍＰＥＧのメチレン基に相応する３．６５ｐｐｍのピークが検出された。
【０１７５】
サーモグラフから得られたデータ（表１参照）によれば、ＰＥＧ：ＰＬＡ２００００のみが、４３．２℃に融点熱事象（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｅｖｅｎｔ）の出現を伴う結晶性領域を示した。観察される結晶性領域は、ガラス転移温度Ｔｇのみを示すＰＬＡ４００００、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ１０００００およびＰＬＡ１０００００のサーモグラフ中に融点事象を欠くことによって示唆されるように（表１参照）、おそらく、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ２００００コポリマー鎖中に結晶性ＰＥＧ５０００が顕著に存在していることと関係しているのであろう。実際、Ｔｇは、表１に示すように、ＰＬＡ鎖が４００００から１０００００へ増加するに伴って上昇する。高度に配列されたｍＰＥＧ鎖が結晶性を誘発し、一方、ＰＬＡ鎖は、より低度に配列され、非晶質状態を示すことが広く知られている。ｍＰＥＧ−ＰＬＡ中のＰＥＧを犠牲にしたＰＬＡ鎖のこの増加は、コポリマーの非晶性を増大させ、結果としてＴｇが上昇する。
【０１７６】
2011516443.tif 000006
【０１７７】
（例３）
（Ａ）ナノ粒子（ＮＰ）の調製および特徴付け
ＮＰの調製
ＰＬＡナノ粒子は、Fessi Hらによって発表されているようなナノ粒子−ポリマー界面堆積法によって調製した［Fessi Hら、Int.J.Pharm.55:R1〜R4(1989)（非特許文献３６）］。簡潔には、８８ｍｇのＰＬＡポリマー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから購入した３０ＫＤａのポリラクチド）および３８ｍｇのＰＥＧ−ＰＬＡ（５：２０）コポリマー（ＭＷ５０００のポリエチレングリコールとＭＷ２０，０００のポリラクチド）を、水混和性有機溶媒である２０ｍＬのアセトンに溶解した。この有機相に、１０ｍｇの薬物ドセタキセルを添加した。抗体をカップリングさせる場合には、有機相に２０ｍｇのリンカーＯＭＣＣＡを添加した。次いで、生じた有機相を、界面活性剤として１００ｍｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５（ヒドロキシステアリン酸マクロゴール１５）（ＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ）を含む５０ｍＬの水相に添加した。分散液を、９００ｒｐｍで１時間にわたって混合し、減圧下で２０ｍＬまで蒸発させた、ＮＰを、カットオフが３００ＫＤａのＶｉｖａｓｐｉｎを使用して、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で５〜６回洗浄した。ナノメートル（１００〜５００ｎｍ）の球状ポリマー性粒子が、これらの条件下で自発的に形成された。
【０１７８】
2011516443.tif 000007
【０１７９】
薬物組込み効果
薬物カプセル化（組込み）の効果を、Ｋｏｎｔｒｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗａｔｆｏｒｄ、英国）３２５ポンプ、２２７ｎｍに調製されたＫｏｎｔｒｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ３３２検出器、およびＫｏｎｔｒｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ３６０オートサンプラーからなるＨＰＬＣ装置を使用して測定した。分離は、ＬｉｃｈｒｏＣＡＲＴ（Ｍｅｒｃｋ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×４ｍｍ）を用いて達成された。移動相は、流速が１ｍＬ／分の５０％アセトニトリル／水とした。ドセタキセルの保持時間は１０分であった。
【０１８０】
ナノ粒子の特徴付け
（１）粒径分析
平均直径および粒径分布の測定は、ＡＬＶ  Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｂａｃｋ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｇｏｒｍａｎｃｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ（ＡＬＶ−ＮＩＢＳ  ＨＰＰＳ、Ｌａｎｇｅｎ、ドイツ）を利用し、希釈剤として水（屈折率：１．３３２、粘度：０．８９４５４３）を使用し、２５℃で実施した。６３２ｎｍのレーザービームを使用した、感度範囲は、０．５ｎｍ〜５μｍであった。
（２）ゼータ電位の測定
ＮＰ／免疫ＮＰのゼータ電位は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ｚｅｔａｓｉｚｅｒ、（Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）を使用し、２回蒸留水で希釈して測定した。
（３）ＴＥＭを使用する組織形態学的評価
免疫ＮＰに関する組織形態学的評価は、金で標識化したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルヴェニア州、米国）を使用する透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって実施した。
【０１８１】
ブランクのトラスツズマブ免疫ＮＰ（活性成分を含まない）を、金で標識した抗ヒトＩｇＧと共にインキュベートし、２％リンタングステン酸（ＰＴＡ）（ｐＨ６．４）で陰性染色した。
【０１８２】
結果
薬物組込み効率
ナノ粒子および免疫ナノ粒子中への細胞傷害薬ドセタキセル（ＤＣＴＸ）のカプセル化効率を、ＨＰＬＣで測定し、精製前でそれぞれ１００％および４９％であることが見出された。ＤＣＴＸ装填型ＮＰ（ＰＬＡ：ＰＥＧ−ＰＬＡ：ＤＣＴＸの当初重量比＝８８：３８：１０）の理論的である７．４％ｗ／ｗの薬物含有量は、ＤＣＴＸ免疫ナノ粒子（ＰＬＡ：ＰＥＧ−ＰＬＡ：ＤＣＴＸ：ＯＭＣＣＡの当初重量比＝８８：３８：１０：２０）の３．３％ｗ／ｗである薬物含有量よりも有意に大きいことは注目に値する。ＤＣＴＸ含有量のこの顕著な差異は、ポリマーマトリックス中のリンカーの存在に帰すことができる。ナノ粒子の形成中に、リンカーは、おそらく、ＤＣＴＸと競合し、その組込み度を７．４％から３．３％へ低下させるのであろう。
【０１８３】
粒径分析
各種ＮＰの平均粒径および粒径分布を、ＡＬＶ法を使用して測定した。ブランクＮＰ（活性成分不含）の平均直径は６０ｎｍであり、一方、ブランク免疫ＮＰ（活性成分不含）およびＤＣＴＸ装填型免疫ＮＰの直径は、それぞれ１５０および１８０ｎｍであることが観察された。ＮＰの直径の顕著な増加は、リンカーの存在に関連しているはずであり、リンカーは、おそらくは、アセトンの水相へ向かう拡散を減少させ、より大きなＮＰの形成を可能にするのであろう。
【０１８４】
ゼータ電位の測定
ブランクＮＰのゼータ電位は、−１８ｍＶであり、抗体結合型ＮＰでは−７ｍＶに縮小した（図２）。ゼータ電位の縮小は、その等電点が９であるので、ｐＨ７．４でのトラスツズマブの陽電荷に帰せられるはずである。
【０１８５】
ＴＥＭを使用する組織形態学的評価
図３Ａ〜３Ｂに図示する結果から、それぞれの金黒スポットは、ナノ粒子表面に結び付けられた１つのトラスツズマブ分子を表すと言ってよい。ＭＡｂは、リンカーによってナノ粒子の表面に効率的に複合しており、反応の際の諸条件は、Ｍａｂの二次抗体への初期親和性に影響を及ぼさなかったと推論できる。
【０１８６】
（Ｂ）ターゲティング部分との複合
チオール基生成のための抗体修飾
ＭＡｂ上でのチオール基の増強は、２−イミノチオラン試薬［Ｔｒａｕｔ試薬、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ、Traut RRら、Biochemistry 12(17):3266〜73(1973)（非特許文献３９）；Jue Rら、Biochemistry 17(25):5399〜406(1978)（非特許文献４０）］を使用して実施した。Ｔｒａｕｔ試薬を、精製トラスツズマブとそれぞれ３０：１のモル比で４５分間インキュベートした。Ｔｒａｕｔで修飾されたＭａｂを、ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）で分離した。修飾されたＭＡｂを含む画分は、２８０ｎｍのＵＶで判定した。遊離チオール基は、５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（Ｅｌｌｍａｎ試薬、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）を用い、４１２ｎｍでの吸光度変化を監視することによって判定した。ＭＡｂは、一旦、Ｔｒａｕｔ試薬と反応すると、ＯＭＣＣＡのようにスルフヒドリルと反応性のあるマレイミド基を所持する架橋試薬との結合プロトコールの中で使用できる反応性スルフヒドリルを手に入れる。次のスキーム（３）は、還元された抗体とリンカー中のマレイミド基との間の考え得る結合反応を図示する。
【０１８７】
【化４】
2011516443.tif 000008
【０１８８】
カップリング反応
ブランクナノ粒子では総量が１４６ｍｇに等しい、あるいはＤＣＴＸナノ粒子では総量が１５６ｍｇに等しい、８８ｍｇのＰＬＡポリマー（ポリラクチド、３０ＫＤａ）、３８ｍｇのＰＥＧ−ＰＬＡ（５：２０）コポリマー、０または１０ｍｇの薬物ドセタキセル、２０ｍｇのクロスリンカーＯＭＣＣＡからなる新たに調製したナノ粒子（ＰＬＡ：ＰＥＧ−ＰＬＡ：ＤＣＴＸ：ＯＭＣＣＡ＝８８：３８：０／１０：２０）を、０．１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨ６．５に調整し、Ｔｒａｕｔで修飾されたトラスツズマブ（最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）と共に、窒素雰囲気下で連続的に撹拌しながら４℃で一夜インキュベートした。未反応マレイミド基は、２−メルカプトエタノール（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州、米国）と共に３０分間インキュベートすることによって封鎖した。結合されていない抗体および２−メルカプトエタノールを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）でのゲル濾過によって免疫ナノ粒子から分離した。カップリング効率は、発表されているようなＢＣＡタンパク質アッセイ（ビシンコニン酸タンパク質アッセイ）（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州、米国）によって評価した［Smith P.K.ら、Anal.Biochem.150:76〜85(1985)（非特許文献４１）］。
【０１８９】
結合された異なる量の抗体を有する免疫粒子を調製するために、マレイミドで活性化された粒子に対するＴｒａｕｔで修飾されたトラスツズマブの当初比率を変化させた。実際に調べた比は、２６ｍｇのＭＡｂに対して、１４６ｍｇのブランクＮＰまたは１５６ｍｇのＤＣＴＸ  ＮＰとした。
【０１９０】
最終免疫ナノ粒子の組織形態学的評価は、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）で、金標識化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ペンシルヴェニア州、米国）を使用して実施した。
【０１９１】
薬物含有量の測定
ナノ粒子中の最終的な薬物含有量は、次のように評価した：最終容積が２０ｍＬのコロイド状分散液を、まず、カットオフが３００００ダルトンのＶｉｖａｓｐｉｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）を使用して限外濾過し、２〜３ｍＬの澄明な限外濾液を得る。限外濾液中のＤＣＴＸ濃度をＨＰＬＣで測定する。コロイド状分散液の残りの全量を、次いで、凍結乾燥し、重量を測定し、ＨＰＬＣを使用する全ＤＣＴＸ含有量の分析に供し、ナノ粒子中の薬物含有量を最終的に計算する。当初の薬物比率を様々に増大させて試験し、最適処方を突き止める。さらに、コロイド状分散液中での考え得る小さな薬物結晶の存在も、監視する。
【０１９２】
ブランクナノ粒子へのトラスツズマブの吸収
この測定の目的は、トラスツズマブ分子が、ブランクナノ粒子、すなわち、粒子表面にアンカリングされるリンカーをもたないナノ粒子上に物理的に吸収されるかどうかを評価することである。この目的のため、１００μＬ（１ｍｇ）のトラスツズマブ溶液（７．５ｍｇ／ｍＬ）を、全量で１２５ｍｇのナノ粒子を含む１ｍＬの正または負に帯電したブランクナノ粒子水性分散液と、室温で１時間以上混合した。次いで、混合物（７５０μＬ）を、３０ｍＬのＰＢＳで５回洗浄し、希釈された分散液を、遠心力（４０００ｒｐｍ、３０分）を利用して、カットオフが３００ｋＤａのＶｉｖａｓｐｉｎを通して濾過し、吸収されていないＭＡｂ分子を除去した。
【０１９３】
タンパク質濃度は、ナノ粒子の上清液中のＭＡｂ分子の存在を検出するためのＰＣＡタンパク質アッセイを利用して測定した。
【０１９４】
結果
ＳＨ基の測定
修飾されたＭＡｂ上のスルフヒドリル基の数を、Ｅｌｌｍａｎ試薬を使用し、標準としてのシステアミンと対比して測定した。そのままのトラスツズマブおよびＴｒａｕｔで修飾されたトラスツズマブを、０．１Ｍ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８）で希釈し、Ｅｌｌｍａｎ試薬と共にインキュベートした。そのままのトラスツズマブでの１．４個に比較して、Ｔｒａｕｔで修飾されたトラスツズマブのＳＨ基は、ＭＡｂ当たりで３１．５個であると判定された。
【０１９５】
カップリング効率の測定
ＮＰに複合したＭＡｂの量は、ＢＣＡタンパク質アッセイを使用して測定した。ＮＰを、０．１Ｎ  ＮａＯＨを用いて５０℃で分解し、アッセイ試薬と共にインキュベートした。免疫ＮＰ（薬物ＤＣＴＸ不含）およびＤＣＴＸ装填型免疫ＮＰのカップリング効率は、それぞれ７１％および７７％であった。
【０１９６】
ブランクナノ粒子へのトラスツズマブの吸収
トラスツズマブ量の分離前後の比率は、陽性および陰性製剤に関してそれぞれ４．２％および２．７％であった。
【０１９７】
免疫ナノ粒子を調製する際の後に続くすべての洗浄および精製工程は、同様の希釈度のＰＢＳを使用して実施するので、これらの結果は、後に続くＰＢＳでの洗浄の後でも、ナノ粒子上へのＭＡｂ分子の吸収が存在せず、それゆえ、リンカーを含有しているナノ粒子へのＭＡｂのカップリングは、ほとんどが、おそらく、共有結合性の結合によって仲介されていることを確実にする。
【０１９８】
Ｖｉｖａｓｐｉｎ膜上へのＭＡｂの吸着が存在しないことは、ＭＡｂ水溶液を同一実験条件に供した場合、上清液および限外濾液中のＭＡｂ濃度が同様であることが見出された以前の実験で検証された。
【０１９９】
（例４）
（Ａ）ｉｎ  ｖｉｖｏ研究用ＮＰの調製
１．ナノ粒子の調製
ナノ粒子は、ポリマー界面堆積法を使用して調製した。有機相には、３００ｍｇのｍＰＥＧ−ＰＬＡポリマー（ＭＷ１００，０００ダルトン）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、１００ｍｇのＴｗｅｅｎ８０（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、および５０ｍＬのアセトン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｄｅｖｅｎｔｅｒ、オランダ）に溶解した２０ｍｇのステアリルアミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を含めた。該有機相を、１００ｍｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５（ＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ）を含む水溶液１００ｍＬに添加した。懸濁液を、９００ｒｐｍで１時間撹拌し、続いて、蒸発させて１０ｍＬまで濃縮した。すべての製剤に関して、０．１％Ｔｗｅｅｎ ８０溶液１００ｍＬでダイアフィルトレーションを行い（Ｖｉｖａｓｐｉｎ３００，０００ＭＷＣＯ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ、英国）、１．２μｍのフィルター（ＦＰ３０／１．２ＣＡ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ社、Ｄａｓｓｅｌ、ドイツ）を通して濾過した。典型的なカチオン性ＮＰ製剤は、ｗ／ｗ％で、ｍＰＥＧ  ＰＬＡ（ＭＷ１００，０００）、１％のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、０．２％のステアリルアミン、１％のＴｗｅｅｎ８０、および１００％までの２回蒸留水からなる。アニオン性ＮＰ製剤の組成は、カチオン性脂質を除外した（すなわちステアリルアミンを欠く）カチオン性ＮＰ製剤のそれと同様とした。
【０２００】
２．免疫ナノ粒子の調製
免疫ＮＰを調製するには、ＮＰを形成するに先立って有機相内のポリマーにクロスリンカーＯＭＣＣＡ（２０ｍｇ）を添加した。ラット抗マウスＥｐＣＡＭ抗体（ＩｇＧ２ＡＫ、バッチＧ８．８  １１／２００４）を、まず、トリスアジド緩衝液に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。脱塩およびホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８〜８．５）への溶解は、Ｎａｎｏｓｅｐ遠心分離デバイス３０Ｋ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ミシガン州、米国）を使用して実施した。次いで、抗体を、Ｔｒａｕｔ試薬としても知られる２−イミノチオラン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）と、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８）中、１：５０のモル比で、４℃で１時間混合した。溶液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用するゲル濾過によって過剰のＴｒａｕｔ試薬から精製した。抗体を０．３ｍＬの画分で捕集した。ＭＡｂを含む画分を、２８０ｎｍのＵＶを使用して測定し、一緒にプールし、アニオン性ＮＰへカップリングさせるまで、窒素雰囲気下に４℃で保持した。
【０２０１】
新たに調製したアニオン性ＮＰをｐＨ８に調整し、Ｔｒａｕｔで修飾されたＥｐＣＡＭ抗体（最終抗体濃度＝１ｍｇ／ｍＬ）と共に、穏やかに振とうしながら窒素雰囲気中、４℃で一夜インキュベートした。次いで、製剤に対して、０．１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液６０ｍＬでダイアフィルトレーションを行った（Ｖｉｖａｓｐｉｎ３００，０００ＭＷＣＯ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ、英国）。カップリング効率は、ＢＣＡタンパク質アッセイによって評価した。調製したすべての製剤は、滅菌ガラス瓶中に、窒素雰囲気下に４℃で貯蔵した。試験されるＮＰ製剤の等張性は、５％グルコースを使用して調整した。
【０２０２】
大きさおよびゼータ電位の測定によるナノ粒子の特徴付けは、前記のように実施した。
【０２０３】
結果
種々の製剤のゼータ電位および大きさの値を表３に示す。以前の研究により、肺用ナノ粒子の毒性に関する表面電荷依存性ならびに大きさおよび表面積の効果が明らかになっているので、評価された各種ＮＰ製剤の１２９ｎｍ〜１４８ｎｍに及ぶ大きさの均一性は、重要である（Tetley、2007）。ＮＰの２６０ｎｍ未満の大きさは、エンドサイトーシス小胞の大きさよりも小さいゆえに、肺胞マクロファージによる取込みの低下（Daileyら、2006）、および細胞内部移行のためのエンドサイトーシス機構の利用を保証する（Harush-Frenkelら、2007）。われわれの体内の様々な細胞型の中で利用されるすべてのエンドサイトーシス機構の中で、肺内小胞カベオラ（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｃａｖｅｏｌａｅ）の機能について、最近考察された（BormおよびKreyling、2004;Ohら、2007）。肺内の小胞カベオラは、表皮および内皮細胞の内腔側から粘膜側への輸送に貢献している（Bormら、2006）。興味深いことに、Harush-Frenkelらによって、カベオラが、ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰの表皮ＭＤＣＫ細胞中でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのエンドサイトーシスに貢献できることが示された（Harush-Frenkelら、2007）。
【０２０４】
免疫ＮＰは、Benita教授のグループにおけるＭＡｂのカチオン性エマルジョンおよびＮＰへの結合の際に得られた経験に基づいて、ＥｐＣＡＭ  ＭＡｂをＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰへ結合することによって製造した。ＮＰに結合されたＥｐＣＡＭ  ＭＡｂの総量は、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて評価した。ＥｐＣＡＭ抗体の結合効率は、７７％（ＮａＯＨ中でのＢＣＡに基づいて）および８０％（ＤＤＷ中での直接ＢＣＡ法に基づいて）であった。
【０２０５】
2011516443.tif 000009
【０２０６】
（Ｂ）マウスモデルにおける肺に送達された免疫ＮＰの安全性評価
非侵襲性の局所的肺送達を、マウスモデルを使用する気管内点滴注入によって実施した。マウス肺内へ連続５日間毎日、気管内投与を実施し、最初の投与から８日目（３日間の回復）および１９日目（１４日間の回復）の時点で安全性評価を実施した。５日間の点滴注入期間中、マウスの体重を毎日測定した。健康な雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢）を必要とする処置は、実験動物の世話および使用に関するＮＩＨ指針に由来するガイドラインに基づいて、ヘブライ大学（エルサレム）の動物施設当局によって承認され、すべての実験について従った。
【０２０７】
投与は、前に説明したように、高圧シリンジ（ＦＭＪ−２５０、Ｐｅｎｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ）に取り付けられたマウスに適したＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（商標）エアロゾライザー（ＩＡ−１Ｃ；Ｐｅｎｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルヴェニア州、米国）を使用する気管内経路により実施した（Bivas-Benitaら、2005）。処置に先立って、マウスを、ケタミンおよびキシラジン（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ、アイオワ州、米国）の腹膜内注入で麻酔した。該方法は、Bivas-Benitaらによって報告されているように、抜き取ったマウス胸腔の肉眼検査にしたがって検証された。
【０２０８】
投与濃度範囲は、マウスの肺内に点滴注入された（気管内で適用されたのではない）、ジエチルアミノプロピルアミンポリビニルアルコールでグラフトされたポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＤＥＡＰＡ−ＰＶＡＬ−ｇ−ＰＬＧＡ）ＮＰの潜在的炎症促進能を調べたDaileyらの研究に基づいて選択した。
【０２０９】
結果
１．方法のバリデーション
気管内適用の直後に、マウス胸腔内の染料局在について評価されたすべてのマウス（すなわち、１０／１０）は、肺外染色のまったくない特異的な肺染色を示した。
２．マウスの生存および重量変化
５日間のＮＰ適用およびそれに続く３または１４日間の回復中に，どの動物も、ＮＰ適用に由来する結果として死亡することはなかった。体重減少または増加しない体重は、起こり得る毒性の一般的なマーカーである。５日間の点滴注入中に体重変動が観察されたが、統計的に有意でなかった。図４に示すように、種々の治療間で有意でない体重変化が、３および１４日間の回復の後でも示された。
【０２１０】
図４：連続５日間にわたってＮＰを点滴注入されたマウスにおける３および１４日間の回復の後でのマウスの体重変化
【０２１１】
（Ｃ）気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）の細胞分析
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、前に説明したように実施した（Segelら、2005）。簡潔には、マウスを、致死量のペントバルビタール（Ｐｅｎｔａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ；ＣＴＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＴｅｌＡｖｉｖ、イスラエル）の腹腔内注入を使用して屠殺した。ＢＡＬを１０００ｒｍｐで１０分間遠心分離した。総ＢＡＬ細胞の計数を、血球計を使用して実施した。分類細胞計数を、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Ｂａｘｔｅｒ）で染色したサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）スライドを使用することによって２００個の細胞について実施した。各種ＢＡＬ細胞型の細胞数は、総細胞数と、ＢＡＬ液中の細胞／ｍＬとして表現される分類計数値とから得られるパーセンテージとの積であり、総細胞数、分類細胞数、およびマクロファージについて分析した。
【０２１２】
結果
ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰに関する総ＢＡＬ値は、実験８および１９日目の双方で対照のそれと同様であった（図５Ａ）。１４日間の回復時点で、マクロファージレベルの増大が観察された。ＥｐＣＡＭ結合型ＮＰを適用すると、当初は総ＢＡＬ細胞の増加をもたらさず、細胞値は、対照およびアニオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ ＮＰのそれと同様であった（図５Ａ）。しかし、ＢＡＬ内の好中球およびリンパ球数の増加が観察された（図５Ｂ〜Ｄ）。さらに、長い方のＢＡＬ中総細胞数は、生理食塩水対照または抗体生理食塩水対照に比較して、またアニオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰに比較して有意に増加した（図５Ａ）。特に、ＢＡＬマクロファージ、リンパ球および好中球が増加した（図５Ｂ〜Ｄ）。この製剤の効が１４日間の回復後においてのみ示されたことは明白である。それは、長期の免疫応答が、マウス肺へのラット抗体の導入に続いて起こったことを示している可能性がある。しかし、この製剤の効果は、対照である抗体生理食塩水と異なるので、免疫ＮＰ複合体のポリマー的性質が、特異的効果を有する可能性がある。
【０２１３】
図５：５連続日にわたってＮＰを点滴注入されたマウスにおける３および１４日間の回復後のマウスのＢＡＬ。総ＢＡＬ細胞（Ａ）、総ＢＡＬマクロファージ（Ｂ）、総ＢＡＬリンパ球（Ｃ）、総ＢＡＬ好中球（Ｄ）。
【０２１４】
（Ｄ）血液学的データ
３および１４日間の回復後に、血液検体を、マウスの頬袋から顎下採血法を使用して採取した（Goldeら、2005）。この静脈に穿刺し、血液をＫ３ＥＤＴＡチューブ中に採取した（Ｇｒｅｉｎｅｒ社、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ、オーストリア）。同一日に、Ｓｙｓｍｅｘ  Ｋ−２１血液アナライザー（Ｓｙｓｍｅｘ社、神戸、日本）を使用して全血計数を実施した。白血球分類は手作業で実施した。
【０２１５】
結果
表４に示したデータは、８日間のＮＰ適用を経て、好中球比率の増加およびリンパ球比率の減少が観察されたが、他の群と比較して有意な変化はなかったことを示している。免疫ＮＰ製剤は、すべてが基準値範囲内である、安定性、好酸球、および単球比率、ならびに血小板の増加を示した。
【０２１６】
１９日間の実験中に、ＮＰで血小板レベルの低下が観察された（表５）。ＮＰは、また、好酸球の最も高い濃度を示したが、その濃度は基準範囲内であった。免疫ＮＰは、対照と比較してＷＢＣレベルの低下を示したが、評価した種々の製剤間で有意な変化は観察されなかった。免疫ＮＰ群の場合、種々のＷＢＣ集団は、リンパ球の減少を伴う、好中球および単球の双方の特異的増加を示したが、変動は、統計的に有意ではなかった。
【０２１７】
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【０２１８】
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【０２１９】
（Ｅ）組織病理学
両肺、心臓、肝臓および腎臓の検体をホルムアルデヒド中に保存した。病理学者に対して治療を知らせないで各バイアル瓶に番号を割り当てた。肺は、さらなる処理の前に少なくとも７日間固定した。ホルマリンで固定された検体を、標準的な組織病理学的技術を使用して、パラフィン中に包埋し、薄片に切断し、ガラス顕微鏡スライド上に載せた。切片を、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、光学顕微鏡で検査した。
【０２２０】
結果
短期および長期実験の双方において、肺外臓器、すなわち、心臓、肝臓および腎臓中に病理学的変化は見出されなかった。両肺の三つ組みを別々に評価したが、両肺の間に有意な変化は観察されなかった。検査した肺検体中の病理学的変化は、わずかであり、極く小さかった。主な所見は、肺胞空間中での反応性マクロファージの発見であった。異なる群における極めて少数のマクロファージ間の差異は、あったとしても、ほとんど検出できず、正確な目標物の定量化は、実際的でなくかつ可能ではなかった。同じことは、炎症および鬱血の極めて穏やかな所見における微妙な差異を定量し画定する試みにも発生した。しかし、肺内の炎症、鬱血およびマクロファージの順位付けを実施した（図６ＡおよびＢ）。３日間の回復後に、ＮＰ、免疫ＮＰおよびＥｐＣＡＭ対照を適用されたマウス肺内の肺胞の１０〜２０％に少数のマクロファージが実際に観察され、マクロファージのこれらのレベルは、長期の実験中、免疫ＮＰについてのみ同じままであったことを観察できる。興味深いことに、ＮＰは、また、短期実験において炎症および鬱血に関して比較的高い評点を示し、その評点は、さらなる１４日間の回復中に正常値まで低下した。免疫ＮＰ製剤についてのみ、１９日間の実験中に、対象に比較して炎症評点の増加が観察された。各群の代表的な写真も示す（図７ＡおよびＢ）。
【０２２１】
図６：各種の製剤を点滴注入されたマウスの両肺の、３日間（Ａ図）および１４日間（Ｂ図）の回復後のマクロファージ、鬱血および炎症の評点を示す図である。結果は、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３として表した。順位指標：マクロファージ：１−いくつかの肺胞中に少数のマクロファージ、２−肺胞の１０〜２０％に少数のマクロファージ、３−肺胞の１０〜２０％に群（２〜３）になったマクロファージ、４−肺胞の３０％超に群（２〜３）になったマクロファージ。炎症：１−炎症なし、２−リンパ凝集物（おそらく、反応性ＢＡＬＴ−気管支関連リンパ組織）の極めて少数の病巣、３−肺間質組織中に分散された慢性浸潤物の少数の病巣、４−肺間質組織中に分散された慢性浸潤物の病巣数のわずかな増加。鬱血：１−鬱血なし、２−肺胞中隔における毛細管の中度充血の病巣、２−関連中隔のわずかな浮腫および肥厚化を伴う肺胞中隔における毛細管の中度充血の病巣。
【０２２２】
図７：種々の製剤を点滴注入され、実験の８日目（Ａ図）および１９日目（Ｂ図）に屠殺されたマウスからの肺組織。示した写真の倍率は×４００である。示した写真：ａ．対照生理食塩水、ｂ．ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰ、ｃ．対照ＥｐＣＡＭ生理食塩水、およびｅ．ＥｐＣＡＭ  ＮＰ。
【０２２３】
全体的な結果は、免疫ナノ粒子は、吸入により肺へ局所送達するのに使用することができ、かつ肺癌を患う動物モデルに使用すると治療活性を誘発することを明白に示した。
【０２２４】
本発明のさらなる適用可能範囲および好ましい特徴も、以下に示す例から明らかとなろう。しかし、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を指摘するが、本発明の精神および範囲内での種々の変化および修正は、当業者にとって、この例および詳細な説明から明らかとなるので、単なる例示として呈示されることを理解されたい。
【０２２５】
局所的肺薬物送達に関するＥｐＣＡＭ免疫ナノ粒子の安全性および耐容性研究
この研究では、肺に送達される免疫ナノ粒子（ＩＮＰ）の安全性および耐容性を調べた。具体的には、生分解性ポリエチレングリコールポリ（乳酸）（ＰＥＧ−ＰＬＡ）ポリマーＩＮＰに結合されたＥｐＣＡＭモノクロナール抗体を、純粋なＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰと比較した。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を採取し、血液学、組織化学および免疫組織化学的パラメーターを検討した。これは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して５日間毎日の気管内点滴注入後の、ＥｐＣＡＭ結合型ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＩＮＰ、アニオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰ、またはカチオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰの肺投与に続く局所性および全身性効果の双方を評価するために行われ、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、実験８日目または１９日目に屠殺した。注目すべきことに、カチオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰは、８日目および１９日目の双方で局所性および全身性毒性効果の増加を誘発した。対照的に、大きさが類似のアニオン性ＮＰは、実験８日目にのみ観察される局所性炎症効果を伴う有意に低い局所性および全身性応答を誘発した。ＥｐＣＡＭ  ＩＮＰ製剤は、おそらく局所性免疫応答によるであろう肺への炎症性効果を誘発した。ＢＡＬの結果は、ＩＮＰを適用されたマウスの肺へのＰＭＮ、リンパ球およびマクロファージの補充を明らかにしたが、局所性の組織病理学的変化は、ほんのわずかであった。しかし、免疫組織化学は、実験１９日後でさえも、ＥｐＣＡＭ  ＩＮＰの肺への特異的局在を示唆した。全体的に、これらの観察は、アニオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰが、肺用薬物の担体としての潜在能力を示し、かくして、原発性および転移性肺癌を治療するための有望な治療薬送達システムと見なされるべきであることを示している。
【０２２６】
省略形：ＢＡＬ：気管支肺胞洗浄、Ｄ８：実験８日目、Ｄ１９：実験１９日目、ＤＥＡＰＡ−ＰＶＡＬ−ｇ−ＰＬＧＡ：ジエチルアミノプロピルアミンポリ（ビニルアルコール）でグラフトされたポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン、ＥＧＦ：上皮細胞増殖因子、ＥｐＣＡＭ：表皮細胞接着分子、ＦＤＡ：米国食品医薬品庁、ＩＮＰ：免疫ナノ粒子、ＭＡｂ：モノクロナール抗体、ＮＰ：ナノ粒子、ＰＭＮ：多形核白血球、ＳＣＩＤ：重症複合免疫不全症。
【０２２７】
癌療法における最も大きな課題および機会の１つが、化学療法薬の腫瘍部位へのターゲティングである。局所性薬物送達は、高度の全身性薬物暴露およびそれに付随する薬物毒性を防止し、肝臓の初回通過効果を回避し、かつ腫瘍部位での薬物の滞留時間を延長するのが理想的である。肺癌における薬物装填型の生分解性ナノ粒子（ＮＰ）の肺送達は、肺内への薬物送達を増大させるための有望な機会を提供する。しかし、肺へ薬物を送達するためのＮＰの吸入は、それが安全上の懸念を提起するため、まだ、局所性薬物投与の妥当な経路とは考えられておらず、それゆえ、真剣な研究の主題である１〜４。実際、最近発表されているように、ポリマー性ＮＰのモノクロナール抗体（ＭＡｂ）への結合を介する特定癌性組織への標的化薬物送達は、過剰発現された抗原の認識によって仲介される特定細胞との結合を可能にする５〜１３。したがって、ＭＡｂがナノ粒子に結合された薬物送達システム（免疫ナノ粒子）は、ターゲティングおよび肺内の特定組織への取込み増加を可能にする。例えば、オマリズマブは、喘息の治療に関してＦＤＡによって承認された、免疫グロブリンＥを標的とした療法として現在使用されているＭＡｂである１４。薬物装填型免疫ナノ粒子（ＩＮＰ）の吸入は、したがって、特異性の増強および標的肺細胞中への長期局在化の結果として、極めて価値のあることが判明する可能性がある。しかし、肺気道中への吸入または点滴注入に続く、ＮＰの適用または堆積部位から体循環、特にリンパ節への移動に関する矛盾する結果が報告されていることが、強調されるべきである１５。したがって、ナノ毒物学が、最近になって、大気中の汚染物質および微粒子の肺および全身への潜在的な有害効果を研究するための新たな分野の毒性学として出現していることは、驚きではない３、１６、１７。これらのＮＰに起因する肺損傷の主な機構の１つは、種々の炎症促進因子の活性化をもたらす酸化ストレスによる１８。したがって、医薬用ナノ担体をベースにした製剤の安全性および毒性の問題を評価すべきである。確かに、ポリマーをベースにしたＮＰの種々の製剤は、肺に対して種々の効果を有する可能性がある。ナノ担体の生分解性、大きさおよび表面電荷ならびにＮＰを適用する技術などの問題は、ナノスケールの送達システムの増大した表面積のため、局所性の肺での生体内運命に影響を及ぼす可能性がある１。
【０２２８】
肺へ薬物を送達するために、種々の部類のポリマーが、考えられて来た。これらには、ポリ（エーテル−無水物）、ゼラチン、キトサン、およびアミンで修飾された分枝ポリエステルをベースにしたポリマーが含まれる３、１９〜２１。これに関して、Daileyらは、生分解性のあるジエチルアミノプロピルアミンポリ（ビニルアルコール）でグラフトされたポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＤＥＡＰＡ−ＰＶＡＬ−ｇ−ＰＬＧＡ）ＮＰの気管内点滴注入後における潜在的な炎症促進能を研究した１。生分解性ＤＥＡＰＡ−ＰＶＡＬ−ｇ−ＰＬＧＡ  ＮＰと種々の大きさの非生分解性ポリスチレンＮＰとの比較は、小さな生分解性ＮＰが、特に多形核細胞の肺での補充において、有意に低い炎症応答を呈示することを明らかにした。著者らは、気道中でのＮＰの安全性を完全に探索するために、より包括的な毒物学的研究を実施すべきであることを提案した。しかし、Daileyおよびその共同研究者らは、ほとんどの動物研究におけると同様、ＮＰを肺に適用するのに、エアロゾル吸入ではなく溶液の点滴注入を使用した。このような動物モデルでなされた病理学的観察のヒトへの妥当性は、確立されていないままである１６。
【０２２９】
最近、Tsengらは、ＳＣＩＤマウスモデルの癌性肺へのエアロゾル投与によって標的に向けられた、ビオチン化されたＥＧＦと結合されたゼラチンＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ送達を実施した。マウスの癌性肺中への特異的集積が、造影定量によって確認され、単回の肺送達に続くＮＰのターゲティングを証明した。それにもかかわらず、これらの製剤の安全性は調べられなかったことに留意すべきである２２。
【０２３０】
本研究の目的は、以前にBivas-Benitaらによって発表されているような２３、マウスモデルにおける非侵襲性気管内点滴注入による局所的肺送達に続くＩＮＰの潜在的有害効果を表面電荷の関数として評価することである。最近の研究では、ＩＮＰを、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を認識する抗体を使用して調製した。この抗原は、最近報告されているように、癌性腫瘍、特に肺の癌性腫瘍中で頻繁に過剰発現される２４。本発明者らの知識の及ぶ限り、気管内で送達された抗体結合型ＮＰの起こり得る毒性効果は、まだ評価されていない。したがって、様々に帯電した標的化ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰの局所的肺送達に続く、起こり得る肺および全身性効果を評価した。吸入に続くＩＮＰの安全性および耐容性に関するデータを報告する。
【０２３１】
方法
ナノ粒子
Ａ．ナノ粒子の調製
ナノ粒子は、溶媒置換法を使用して調製した。有機相には、３００ｍｇのｍＰＥＧ−ＰＬＡポリマー（ＭＷ１００，０００ダルトン）、１００ｍｇのＴｗｅｅｎ８０（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、および５０ｍＬのアセトン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｄｅｖｅｎｔｅｒ、オランダ）に溶解した２０ｍｇのステアリルアミン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を含めた。該有機相を、１００ｍｇのＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５（ＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、ドイツ）を含む１００ｍＬの水溶液に添加した。懸濁液を、９００ｒｐｍで１時間撹拌し、続いて真空蒸発で１０ｍＬまで濃縮した。製剤全体に関して０．１％のＴｗｅｅｎ８０を含む１００ｍＬの溶液でダイアフィルトレーションを行い（Ｖｉｖａｓｐｉｎ３００，０００ＭＷＣＯ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ、英国）、１．２μｍのフィルター（ＦＰ３０／１．２ＣＡ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ社、Ｄａｓｓｅｌ、ドイツ）を通して濾過した。典型的なカチオン性ＮＰ製剤は、％ｗ／ｗで、３％のｍＰＥＧ−ＰＬＡ（ＭＷ１００，０００）、１％のＳｏｌｕｔｏｌ（登録商標）ＨＳ１５、０．２％のステアリルアミン、１％のＴｗｅｅｎ８０、および残り１００％までの２回蒸留水からなる。アニオン性ＮＰ製剤の組成は、カチオン性脂質を除いて、カチオン性ＮＰのそれと同一である（すなわち、ステアリルアミンを欠く）。
【０２３２】
Ｂ．免疫ナノ粒子の調製
ＩＮＰを調製する場合には、ＮＰを形成するに先立って、有機相内のポリマーにリンカーであるオクタデシル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸アミド（ＯＭＣＣＡ）（２０ｍｇ）を添加した。ＥｐＣＡＭに対するラット抗マウスＣＤ３２６精製モノクロナール抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  ドイツ）を、まず、トリスアジド緩衝液に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。脱塩およびホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８〜８．５）への溶解は、ナノセップ（Ｎａｎｏｓｅｐ）遠心分離デバイス３０Ｋ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ミシガン州、米国）を使用して実施した。抗体を、Ｔｒａｕｔ試薬としても知られる２−イミノチオラン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）と、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８）中、１：５０のモル比で、４℃で１時間混合した。溶液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用するゲル濾過によって過剰のＴｒａｕｔ試薬から精製した。抗体を０．３ｍＬの画分で集めた。ＭＡｂを含む画分を、２８０ｎｍのＵＶを使用して判定し、一緒にプールし、アニオン性ＮＰへカップリングさせるまで、窒素雰囲気下で４℃に保持した。
【０２３３】
新たに調製したアニオン性ＮＰをｐＨ８に調整し、Ｔｒａｕｔで修飾されたＥｐＣＡＭ抗体と共に、穏やかに振とうしながら窒素雰囲気中、４℃で一夜インキュベートした。次いで、製剤に関して０．１％のＴｗｅｅｎ８０を含む溶液１００ｍＬでダイアフィルトレーションを行った（Ｖｉｖａｓｐｉｎ３００，０００ＭＷＣＯ、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｔｏｎｅｈｏｕｓｅ、英国）。カップリング効率は、ＢＣＡタンパク質アッセイによって評価した。調製したすべての製剤は、窒素雰囲気下で滅菌ガラス瓶中に４℃で貯蔵した。
【０２３４】
ナノ粒子の物理化学的特性
粒径分布および平均直径の測定は、ＡＬＶ非侵入後方散乱型高速粒径測定機（ＡＬＶ−ＮＩＢＳ  ＨＰＰＳ、Ｌａｎｇｅｎ、ドイツ）を使用して２５℃で実施した。ＮＰ製剤は、前に説明したように２回蒸留水で希釈した２５、２６。
【０２３５】
ゼータ電位の測定は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．、Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）を使用して実施した。サンプルは、前に実施したように２回蒸留水で希釈した１、２５、２７。
【０２３６】
動物
ｉｎ  ｖｉｖｏでの肺内投与には、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１０週齢、Ｈａｒｌａｎ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）を使用した。動物が関わる処置は、ヘブライ大学（エルサレム）の動物施設当局によって、ＮＩＨの実験動物の管理および使用に関する指針に基づいて承認された。すべての実験で、これらの指針に従った（承認番号、ＭＤ１１４．２０〜２）。マウスは、硬質木材の削りくず上のプラスチック製ケージ中の特殊な病原菌のない環境にケージあたり３〜８匹の動物で収容した。１２時間の明／暗周期を維持し、マウスは、水およびマウス用実験室食物に随意に接近した。治療を開始する前に、マウスを、これらの状態で３〜７日間順化させた。
【０２３７】
実験計画
マウスの肺中への５日間毎日の気管内点滴注入に続いて、５種の異なる製剤の安全性評価を実施した。２種の対照群、すなわち滅菌生理食塩水、ＥｐＣＡＭ抗体の滅菌生理食塩水溶液、ならびに３種のＮＰ製剤、すなわち、カチオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰ、アニオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰおよびＥｐＣＡＭ結合型アニオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰを評価した。各マウス群は、７匹の動物からなり、５連続日にわたって治療を受け、続いて、実験８日目および１９日目の時点で動物を屠殺し、分析し、１種の製剤につき全部で１４匹の動物となった。点滴注入されるポリマーの投与量は、５％グルコース溶液２５μＬ中に０．１５ｍｇを含む。
【０２３８】
気管内点滴注入
抗体に結合されたまたは複合されていない種々のナノスケールの製剤または対照を、健康な雌性ＢＡＬＢ／ｃに毎日投与した。投与は、前に説明したように２３、高圧シリンジ（ＦＭＪ−２５０；Ｐｅｎｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルヴェニア州、米国）に取り付けられた、マウスに適したＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（商標）エアロゾライザー（ＩＡ−１Ｃ；Ｐｅｎｎ−Ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ペンシルヴェニア州、米国）を使用して気管内経路を経由して実施した。処置に先立って、マウスを、１００ｍｇ／ｋｇ体重のケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇ体重のキシラジン（Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ、ｌｏｗａ、米国）の腹膜内注射で麻酔した。マウスを、上側歯で４５°の角度に吊り下げた。光源（Ｅｕｒｏｍｅｘマイクロスコープ、Ａｒｎｈｅｍ、オランダ）の可撓性光ファイバーアームを、マウスの気管を最適に照明するように調節した。小型スパチュラを使用してマウスの下顎を開け、中咽頭を最大限に暴露するため圧迫鉗子を使用して舌の転置を助けた。気管の明瞭な視野が得られた後、ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒのチップを気管内で挿入し、２５μＬの溶液または懸濁液を噴霧した。チップを、直ちに引き抜き、マウスを支持体から開放した。
【０２３９】
方法のバリデーション
肺に対する製剤の気管内投与のバリデーションを実施した。１０匹のマウスの肺へトリパンブルーを気管内で適用した直後に、マウスを屠殺した。胸郭の評価を実施して青色染色の正確な位置を示した。気管内投与直後のトリパンブルーの局在について評価したマウスのすべては、肺外染色を伴わない肺の特異的染色を示した（すなわち、１０匹のマウスから１０の肺）。
【０２４０】
血液検体および分析
実験８日目および１９日目に、血液検体を、マウスの頬袋から顎下採血法を使用して採取した１２８。この静脈に穿刺し、血液をＫ３ＥＤＴＡチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ、オーストリア）中に採取した。同一日に、Ｓｙｓｍｅｘ  Ｋ−２１血液アナライザー（Ｓｙｓｍｅｘ社、神戸、日本）を使用して全血液の計数を実施した。白血球分類は手作業で実施した。血液学的分析は、承認を受け誓約した下請け業者（Ｈｅｒｚｌｉｙａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｈｅｒｚｌｉｙａ、イスラエル）によって実施された。
【０２４１】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、ＢＡＬ細胞の計数および分類
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）は、Segelおよびその共同研究者によって以前に発表されている技術を使用して実施した２９。簡潔には、マウスを、致死量のペントバルビタール（Ｐｅｎｔａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ；ＣＴＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ、イスラエル）の腹腔内注入を使用して屠殺した。平滑なゲージ２２のニードルを用いて気管にカニューレを挿入し、４ｍＬの滅菌生理食塩水の注入および回収によってＢＡＬを実施した。ＢＡＬ液を、１０００ｒｍｐで１０分間遠心分離した。総ＢＡＬ細胞の計数は、血球計を使用して実施した。血球分類は、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ（Ｂａｘｔｅｒ、Ｍｃ  Ｇｒａｗ  Ｐａｒｋ、イリノイ州）で染色したサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）スライドを使用することによって、２００の細胞に関して実施した。
【０２４２】
組織病理学的検査
肺洗浄を完結した後、肺、心臓、肝臓および腎臓を摘出し、ホルムアルデヒド中に保存した。肺は、さらなる処理の前に少なくとも７日間固定した。固定した検体を、標準的な組織病理学的技術を使用して、パラフィン中に包埋し、薄片に切断し、ガラス顕微鏡スライド上に載せた。肺およびその他の臓器のスライドを検査する病理学者（Ｙ．Ｓ）は、治療群または対照群についてブラインド（ｂｌｉｎｄ）された。切片を、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、光学顕微鏡を用い三つ組みで検査した。
【０２４３】
免疫組織病理学的評価
肺の検体を、解剖し、４％中性緩衝ホルマリン中で固定した。厚さ５μｍの組織学的切片を、脱パラフィンし、段階的アルコール系列を通して再水和し、蒸留水で４分間洗浄した。切片をプロテイナーゼＫ（Ｄａｋｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）で５分間処理し、蒸留水中で５分間洗浄するステップの後、内在性ペルオキシダーゼ活性を、ペルオキシダーゼ遮断試薬（Ｄａｋｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）で５分間遮断した。その後、切片を、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（洗浄緩衝液）で５分以上洗浄し、タンパク質遮断血清不含試薬（Ｄａｋｏ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）と共に１０分間インキュベートした。ＥｐＣＡＭに対するラットの抗マウスＣＤ３２６精製モノクロナール抗体とのインキュベーションを４℃で一夜実施した。洗浄ステップに続いて、切片を、ビオチン化したリンク・ユニバーサル二次抗体（ＤＡＫＯ  ＬＳＡＢ＋Ｋｉｔ，Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）で１５分間被覆し、再び洗浄した。免疫活性の可視化には、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ−複合試薬（（ＤＡＫＯ  ＬＳＡＢ＋Ｋｉｔ，Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を使用した。ヘマトキシリンでの対比染色の後に、切片を、光学顕微鏡下での検査のために、脱水し、カバーガラスで覆った。
【０２４４】
統計
治療間の差異は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して比較した。同一治療での実験日数（初日と比較して８日目、および初日と比較して１９日目）間での体重増加の差異を、対応のある両側ｔ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）を使用して比較した。
【０２４５】
結果
ナノ粒子の物理化学的な、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特徴付け
種々の製剤、アニオン性ＮＰ、カチオン性ＮＰおよびＩＮＰの平均ＮＰ直径およびゼータ電位値は、それぞれ、１２９．３±１．１２、１４１．３±１．３、１４８．３±１．８ｎｍ、および−３０．７±０．９、３１．６７±２．１、−２７．６±０．８ｍＶであった。ＥｐＣＡＭ  ＭＡｂの粒子への複合効率は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）で測定すると、７７％であり、以前に報告された計算３０、３１に拠れば単一ＮＰにつき１７６個のＭＡｂ分子が結合されたことを意味する。陽性およびアニオン性ＮＰの定量的比色ＭＴＴアッセイ３２、３３を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性の評価を、極性ＨＥＬＡ、極性表皮ＭＤＣＫの双方、およびヒト肺腺癌Ａ５４９細胞で実施した。総合的結果は、双方のＮＰ製剤が、それらの表面電荷に関係なく、著しい細胞傷害効果を誘発することはなく、様々に帯電した製剤間で、誘発される細胞効果に統計的有意差は存在しなかった（データは示さない）。ＭＴＴアッセイを使用して、抗体結合型ＩＮＰのＡ５４９細胞株に対する細胞傷害性を、非標的化アニオン性ＮＰおよびＥｐＣＡＭ生理食塩水と比較して評価したが、４時間の暴露後に細胞に対して著しい効果はなかった（データは示さない）。
【０２４６】
マウスの生存および体重増加
カチオン性ステアリルアミン−ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰは、１匹の動物死を引き起こした唯一の製剤であり、その死亡は、この製剤の毒性増加のためであった可能性がある。各種製剤の５日間の点滴注入中に毎日測定した体重増加に有意な変化は観察されなかった（データは示さない）。種々のＮＰ製剤の吸入は、実験８日目（Ｄ８）まで有意な体重変化を誘発しなかった（図８）。実験１９日目（Ｄ１９）に、陰性ＮＰおよびカチオン性ＮＰは、体重増加の縮小を明確に示した。アニオン性ＮＰ製剤の適用が、アニオン性ＩＮＰと比較して１９日目に体重増加の縮小をもたらすことに注目することは興味深い。さらに、対照ＥｐＣＡＭ  ＭＡｂ生理食塩水溶液、およびＮＰに結合されたＥｐＣＡＭ  ＭＡｂの投与は、双方とも、対照の生理食塩水群と同様の体重増加をもたらした（図８）。
【０２４７】
気管支肺胞洗浄液の評価
ＢＡＬ内の総ＢＡＬ細胞数、マクロファージ数、リンパ球数および多形核（ＰＭＮ）細胞数を、それぞれ、図９Ａ〜９Ｄに示す。好酸球は、０、８、１９日目のすべての時点において確認されなかった。８日目に、種々の製剤間で、総ＢＡＬ細胞の数値に関して著しい差異は測定されなかった（図９Ａ）。しかし、８日目に、マクロファージ、リンパ球およびＰＭＮ細胞数に関して有意な差異が観察された（ｐ＜０．０００１）（図９Ｂ〜９Ｄ）。アニオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰの投与は、各種ＢＡＬ細胞集団内において対照生理食塩水と比較していかなる有意な変化も誘発しなかった。８日目に、カチオン性ＮＰは、他の製剤と比較して特異的に、ＢＡＬマクロファージを有意に誘発した（ｐ＜０．０００１）（図９Ｂ）。８日目に、対照生理食塩水に比較して、マクロファージ数の減少を伴うＰＭＮ細胞数およびリンパ球数の増加がＩＮＰで観察された。加えて、ＩＮＰ製剤では、対照ＭＡｂ生理食塩水での治療群と比較して、ＰＭＮ細胞数の著しい増加（ｐ＜０．００１）が観察された。
【０２４８】
１９日目に、総ＢＡＬ細胞数は、種々の製剤間で有意に異なった（ｐ＜０．０５）（図９Ａ）。陰性ＮＰでは、対照生理食塩水およびカチオン性ＮＰに比較して有意に高められたマクロファージ数が測定された（ｐ＜０．０５）。１９日目に、ＩＮＰ製剤は、肺内で細胞応答の増大をもたらした。具体的には、ＩＮＰの適用に続いて、１９日目に、試験した他の製剤のすべてに比較して有意に高められた、マクロファージ、リンパ球およびＰＭＮ細胞のレベルが示された（ｐ＜０．０１）。これらの高められた肺内マクロファージ、リンパ球およびＰＭＮ細胞数は、ＩＮＰ投与に続く肺内での非特異的な局所性免疫応答を示唆した（図９）。
【０２４９】
血液学的データ
全体的に、各種製剤の肺内投与に続いて、マウスの血球数に、ほんの穏やかな変化が誘発された。カチオン性ＮＰの適用に続いて、８日目に白血球数の減少が観察された（表６）。白血球集団内で、好中球（ｐ＜０．０００１）、杆状核白血球（ｐ＜０．０００１）、リンパ球（ｐ＜０．０００１）、単球（ｐ＜０．０００１）および好酸球（ｐ＜０．０００１）の間に有意な差異が観察された。血小板（ｐ＜０．０５）、ＨＧＢ（ｐ＜０．０１）、ＭＣＶ（ｐ＜０．０１）およびＭＣＨＣ（ｐ＜０．０１）に関して観察された穏やかな変化は、実際、有意であった。特に、カチオン性ＮＰでは、８日目に単球レベルの低下が示された。全身性単球レベル低下を伴うこれらの全身性白血球減少の発見は、肺内での特にカチオン性ＮＰの適用に続く８日目のＢＡＬ細胞およびマクロファージの増加の発見に一致している。しかし、１９日目に、カチオン性ＮＰで、正常な生理学的数値に整える１０３％の白血球数の増加が示された（表７）。しかし、好中球（ｐ＜０．０００１）、リンパ球（ｐ＜０．０００１）、単球（ｐ＜０．０００１）、好酸球（ｐ＜０．０００１）では、異なる群間で有意な差異が示され、杆状核白血球では、１９日目にゼロまで下落した。有意な差異は、また、各種ＮＰ製剤の間で、赤血球（ｐ＜０．０１）、ＨＣＴ（ｐ＜０．００１）、ＭＣＶ（ｐ＜０．０００１）、ＭＣＨ（ｐ＜０．０５）、およびＭＣＨＣ（ｐ＜０．００１）の数値に関して観察された。
【０２５０】
肺の組織学的変化
８日目および１９日目の双方で、肺外臓器、すなわち心臓、肝臓および腎臓中に病理学的変化は見出されなかった。左右双方の肺の三つ組み切片を別々に評価したが、それらの間に有意な変化は観察されなかった。試験した肺検体の病理学的変化は、希薄かつ極小であった。主な所見は、肺胞空間中での反応性マクロファージの発見であった。少数のマクロファージ、炎症および鬱血の種々の群間での差異は、存在しても、ほとんど検出できず、正確な目的物の定量化は、実際的でないか、あるいは不可能であった。しかし、各肺内の炎症、鬱血およびマクロファージの半定量的順位付けを実施した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【０２５１】
カチオン性ＮＰの吸入は、肺内にいかなる病理学的徴候をも誘発しなかった。このことは、気管支および肺胞壁の細胞に結び付けられなかったカチオン性ＮＰの食細胞による取込み増大によって説明することができる。さらに、ほんの少数のマクロファージが、８日目に、アニオン性ＮＰ、ＩＮＰ、および対照ＥｐＣＡＭ生理食塩水を適用されたマウスの肺内の肺胞の１０〜２０％に検出され、それらの数は１９日目までに減少した。加えて、アニオン性ＮＰは、８日目で、炎症および鬱血評点の上昇を示し、その評点は１９日目までに対照と同様の値に低下した。ＩＮＰ製剤は、１９日間の実験中に、対照に比較して炎症評点の上昇を誘発した。このことは、この製剤におけるＢＡＬの結果と一致している（図１０Ｂ）。各群の代表的な実例を図１１Ａ〜１１Ｊに示す。
【０２５２】
免疫組織化学
ＥｐＣＡＭ生理食塩水溶液またはＩＮＰの場合、８日目および１９日目の双方で、肺外での効果または局在化のいずれも認められなかった（データは示さない）。８日目および１９日目の双方での、ＥｐＣＡＭ生理食塩水溶液およびＩＮＰの代表的なスライドを、図５および６に示す。予想されるように、ＥｐＣＡＭの肺気管支内への特異的局在化が、ＥｐＣＡＭ生理食塩水溶液（図１２ｃ、Ｅ）およびＥｐＣＡＭ結合型ＩＮＰ（図１２ｅ、Ｅ）の双方で観察された。しかし、ＩＮＰは、１９日目でさえも肺気管支内に存在していることが見出された（図１３ｃ、Ｃ）。ＩＮＰは、肺内マクロファージ中ではなく気管支壁に結び付けられて局在化している。ＥｐＣＡＭの発現は、図１２Ａ、ａに示したように健康な動物の肺内では低いことに留意するべきである。マウス結腸内でのＥｐＣＡＭの著しい発現（図１３ｅ、Ｅ）は、単にバリデーションの目的で準備される。観察されるシグナルは、ラットの二次抗マウス抗体のみに暴露された切片の陰性対照によって検証されるように、ＥｐＣＡＭに特異的である（図１２および図１３ｂ、Ｂ、ｄ、Ｄ、ｆ、Ｆ）。
【０２５３】
考察
この研究は、肺内に点滴注入されたＮＰおよびＩＮＰの安全性および耐容性の理解を増進することを目的とした。局在化、および吸入されたマイクロメートル領域の粒子によって誘発される効果は、広く発表されているが２、吸入されたＮＰについては、広範囲にわたるデータを欠いている。ＮＰの肺内送達は、投与量および結果として投与頻度を低減しながら、局所性治療の効果を高める可能性を開く。しかし、吸入されたＮＰは、安全上の懸念を高める可能性がある。これまで入手可能な毒性データには、吸入された非治療的な環境上の微粒子状物質の影響が主として含まれ、そのデータを、薬物装填型ＮＰへ外挿できるかどうかに関して疑問の余地が残ったままである３４。さらに、吸入されたＮＰにより誘発される肺への影響は、大きさおよび表面電荷に依存することがあると報告されている４、３５。通常、肺中に存在する食細胞は、本研究におけるような大きさが１２０〜１５０ｎｍの領域のＮＰを検知しない１、３、４。肺への局所性微粒子送達の主な欠点は、大きさに依存する排出である。一般に、０．５μＭ未満の質量メディアン空気力学的直径を有する粒子の８０％は、呼気の際に排出されることが見出された３６。この大きさに依存する落とし穴は、ＮＰが、ブラウン拡散により深部肺内で効果的に沈積し、かつ良好な肺への浸透を提供すると思われるので、有利である可能性がある３７。したがって、吸入に続くＮＰの生体内運命を追跡することが重要である。ＰＬＡ微小球は、肺組織中で離散した群の状態で密集することが観察され、一様には分布されなかった２。それにもかかわらず、この現象は、大きさがマイクロメートルの領域で観察されたが、ナノメートルの領域では観察されなかった。Laiらは、最近、ヒト粘液中でのＰＥＧ化および非ＰＥＧ化されたポリマーＮＰの輸送を研究し、より大きなＰＥＧ化ＮＰ（５００および２００ｎｍのＮＰ）は、より小さな非ＰＥＧ化ＮＰ（１００ｎｍ）と比較して、膣頸管および肺を含む種々の器官を被覆する粘液中で急速に移動することができることを明らかにした３８。Stuartらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生物物理学的方法を使用して、ゼラチンＮＰと、人工的なジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）をベースにした肺用界面活性剤との間の相互作用を調べた３９。彼らの結果は、ＮＰと肺用界面活性剤膜との間の相互作用が単層を不安定化しないことを示し、かくして、ＮＰの送達が、実行可能でかつ安全な投与経路であることを示した。
【０２５４】
実際のＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの毒性を評価するため、Ａ５４９細胞を選択した。なぜなら、このヒト肺腺癌細胞株は、ＥｐＣＡＭエピトープを過剰発現するからである４０。細胞培養研究は、ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰは、それらの表面電荷に無関係に、細胞傷害性を欠いていることを立証した。本研究中で試験するポリマーの投与量（５％グルコース溶液２５μＬ中に０．１５ｍｇ）は、マウスモデルにおけるマウス当たり５％グルコース溶液１００μＬ中０．１〜０．２５ｍｇのＮＰ投与量範囲を使用する気管内単回点滴注入でのＤＥＡＰＡ−ＰＶＡＬ−ｇ−ＰＬＧＡ  ＮＰの肺への潜在的な炎症促進能を調べた他の著者によって報告された毒性結果に基づいて選択した１。
【０２５５】
異なる表面電荷特性を有する類似のＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰ製剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏで異なる毒性プロフィールを誘発した。カチオン性ＮＰの投与は、死亡率の増加、体重増加の縮小、および特に８日目の総ＢＡＬ細胞およびマクロファージの上昇をもたらした。ＮＰ、特にカチオン性ＮＰの表面電荷の肺に対する影響を評価することが重要であることが強調されるべきである。それらの陽電荷のため、これらのＮＰは、タンパク質およびリン脂質部分の存在のため正味で負電荷を所持する肺細胞膜との静電引力のため、吸入に続いて肺組織中に浸透すると予想される。このことは、また、活性成分の肺胞外側表面層への効率的な送達、および長い滞在時間を可能にするはずである。安全性および耐容性の研究に基づき、この製剤で、血液学的パラメーター、例えば、全身性白血球減少、好中球および杆状核白血球レベルの上昇（左へ移行）における最も明白な変化が観察された。８日目での、ＢＡＬマクロファージ数値の上昇を伴う血中マクロファージレベルの低下は、静電引力による食細胞とカチオン性ＮＰとの相互作用の増大をもたらす、肺への食細胞の補充を暗示することができる。全体的に、これらの結果は、カチオン性ＮＰの肺内局在化を示唆している可能性があり、そのＮＰの除去は、８日目まではマクロファージによって介在され、一方、ＩＮＰは、１９日目でさえも肺中になお存在していた。データは、ｉｎ  ｖｉｖｏで固形腫瘍に標的化された、ＭＡｂで方向付けられたナノメートルの免疫リポソーム（ＭＡｂ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｎａｎｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ）の新規な機構を発表したKirpotinらによって最近公表された発見と一致している。彼らの結果は、ＭＡｂフラグメントとの結合が、静脈内で投与されたリポソームの生体内分布または長期循環特性に影響を及ぼさないことを示した。さらに、標的化されたリポソームおよび標的化されていないリポソームの双方とも、ＨＥＲ−２を過剰発現している乳癌異種移植片（ＢＴ−４７４）中で高レベルの腫瘍組織への集積を同様に達成したので、結合は、免疫リポソームの腫瘍への局在化を増大させなかった。しかし、抗ＨＥＲ２免疫リポソームは、癌細胞内に集積し、一方、匹敵する標的化されないリポソームは、主として、細胞外ストロマ中またはマクロファージ内に配置された。標的化されないリポソームと対照的に、抗ＨＥＲ２免疫リポソームは、ＭＡｂの介在するエンドサイトーシスを介して細胞内薬物送達を達成した。そして、このことは、腫瘍組織への取込み増加よりも、優れた抗腫瘍活性と関連していた４１。
【０２５６】
アニオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰの投与は、動物の死をもたらさず、１９日目で、対照に比較して体重減少が観察されたが、マウスの全般的な様子は、良好であった。１９日目に、総ＢＡＬ細胞数値は、マクロファージレベルの増加を伴う対照生理食塩水のそれと同様であった。血液学的パラメーターの変化は、カチオン性ＮＰ製剤によって誘発される変化に比較して穏やかであった。８日目の時点での肺へのマクロファージの局在化および鬱血および炎症過程は、１９日目までに正常に戻った。アニオン性ＮＰによって誘発された全般的な毒性効果は、重要でなく、かつ可逆的であると思われた。これらの有望なデータは、肺への投与に続く治療および診断上の肺内適用のためのアニオン性ＮＰの広範な使用に対する機会を増加させる。この時点で、ＮＰが、肺中に局在化されるか、あるいは、肺胞上皮の障壁を横切り、それによって体循環に入るかどうかは明らかでない。
【０２５７】
ＭＯＲＡｂ−００３、セツキシマブ、パニツムマブ、および肺癌治療だけで約４８の臨床試験で、極めて最も広範に評価されているＭＡｂであるベバシズマブを含む種々のＭＡｂが、種々の段階の肺癌の治療に向けて、最近試験されている（http://www.cancer.gov/lung 2007（非特許文献２９））。最近の研究で、ＩＮＰは、ＭＡｂのカチオン性エマルジョンおよびＮＰへの結合から得られた経験に基づいて、ＥｐＣＡＭ  ＭＡｂをＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰに複合させることによって製造された３０、３１。上皮細胞接着分子は、ほとんどのヒト上皮細胞上に発現される〜４０ｋＤａの膜貫通型糖タンパク質である４２、４３。初期の研究において、ＥｐＣＡＭは、細胞−細胞接着分子であると提唱された４４、４５。しかし、最近の識見は、ＥｐＣＡＭが、生物体における上皮の始まり、発達、維持、修復および機能で重要な役割を有する多面発現性分子であることを示している。ＥｐＣＡＭの種々の機能は、また、癌療法と重要な関連を有する。癌腫において、ＥｐＣＡＭの上向きに調節された発現を、細胞の異常な増殖および分化を促進し、ＥｐＣＡＭを汎癌腫抗原にする因子と見なすことができる４６。いくつかの状況において、ＭＡｂを使用してＥｐＣＡＭを遮断することは、腫瘍の増殖を減少させるだけではなく、転移の成立を防止する可能性がある４２、４７。ＭＡｂを薬物送達システムのターゲティング部分として使用することは、最近の数年の間に現れた。Cirstoiu-Hapcaら、およびNobsらは、抗ＨＥＲ２および抗ＣＤ−２０ＭＡｂ結合型ＰＬＡ  ＮＰを製造した４８〜５１。ＳＫＯＶ−３ヒト卵巣癌細胞（ＨＥＲ２を過剰発現する）およびＤａｕｄｉリンパ腫細胞（ＣＤ２０を過剰発現する）とＭＡｂ結合型ＮＰとの特異的相互作用が測定された。その結果は、ＭＡｂ結合型ＮＰの特異的抗原を過剰発現している腫瘍細胞への選択的指向を示した。しかし、これらのＮＰでの安全性研究は実施されなかった。Oliverらは、また、抗トランスフェリン受容体のＭＡｂをマレイミドグラフト型ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰへ複合することによってＩＮＰを合成したが、やはり、安全性評価は実施されなかった５２。さらに、Debottonおよびその共同研究者らは、最近、ＩＮＰの薬物動態挙動が、裸のＭＡｂの薬物動態プロフィールと著しく異なることを示し、かくして、該ＭＡｂは、ＮＰへの結合の後にその本来の分子薬物動態特性を失うと推論した３０、３１。具体的には、ＥｐＣＡＭ結合型ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰの投与は、マウスの生育能力、様相および体重に否定的影響を及ぼすことはなかった。総ＢＡＬ細胞は、初めは増加せず、対象およびアニオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰのそれと同様であった。しかし、８日目に、ＢＡＬ内でのＰＭＮおよびリンパ球数の増加が観察された。さらに、１９日目に、ＢＡＬ中の総細胞数が有意に増加した。具体的には、ＢＡＬのマクロファージ、リンパ球およびＰＭＮ集団が増加した。ＥｐＣＡＭ結合型ＩＮＰの投与に続いて８日目に、血中杆状核白血球、単球および好中球数値の増加が観察され、免疫応答の開始を示唆した。１９日目に、血液学的な好中球および単球数値の増加を伴う変化は、より穏やかであった。肺切片の免疫組織化学の結果は、８日目および１９日目の双方で、気管支壁に特異的であり、マクロファージに関連しない、この製剤の特異的な肺への局在化を示した。最近、ＥｐＣＡＭが、細胞増殖を、それゆえ、腫瘍の成長を促進する可能性のあることが示唆された。したがって、結合されたＥｐＣＡＭが、肺癌の場合のようにＥｐＣＡＭ抗原を過剰発現する病理学的肺組織を特異的に認識し、それに特異的に結合するので、ＥｐＣＡＭ結合型ＩＮＰを、吸入に続く潜在的な薬物送達システムと見なすことができる。肺の組織病理学的評価は、炎症反応の存在を示した。この製剤は、１９日目までに誘発された効果に基づく他の製剤と異なると思われる。この製剤の効果は、対照抗体生理食塩水と異なるので、ＩＮＰ複合体が、肺への局所的滞留をそれ自体引き起こす微粒子送達システムに由来する特異的効果を有することができる可能性がある。ＥｐＣＡＭ抗体は、ラット起源であり、かくして、対照抗体生理食塩水への応答で示されるように、種に関係する免疫応答を誘導できたことが強調されるべきである（図９）。したがって、ＩＮＰで観察されるＢＡＬマクロファージ、ＰＭＮおよびリンパ球の増加を、免疫応答を強化する、抗体のＮＰへの結合に帰すことができると考えることは妥当であろう。
【０２５８】
結論
ここに示された結果に基づけば、ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰおよびＥｐＣＡＭ結合型ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰは、ＮＰ反復投与に続く肺への局所性送達および標的化された送達の双方のための、肺用薬物の担体である。ＮＰ表面の正電荷は、全身毒性に加えて、肺に対する効果の増大をもたらし、したがって、局所的肺投与には推奨されないと思われる。ＥｐＣＡＭを標的とした療法を、パクリタキセルまたはビノレリンなどの肺癌療法用の選択的抗増殖薬と組み合わせることは、行う価値があると思われる。さらに、ＭＡｂ  ＥｐＣＡＭをＮＰに結合すると、それは、主として、それ自身の薬学的および薬物動態学的特性のほとんどを失っているターゲティング部分として作用する。したがって、化学療法薬を装填したＥｐＣＡＭ結合型ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの肺癌モデルでの効果は、さらに評価する価値がある。
【０２５９】
したがって、本発明の文脈内で、好ましくはアニオン性ナノ粒子（負の表面電荷を有するＮＰ）、特にアニオン性ＰＥＧ−ＰＬＡ  ＮＰをベースにしたナノ粒子が使用される。
【０２６０】
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【０２６１】
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【０２６２】
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【０２６３】
非小細胞肺癌のための治療としての標的化薬物装填型免疫ナノ粒子の肺送達
背景：肺癌（ＬＣ）は、癌による死亡率の主要原因であり、すべての癌死のほぼ３０％を占める。残念ながら、ＬＣの化学療法は、無差別のおよび全身性毒性により設定している制約された投与量により失敗させられる。吸入による化学療法薬の送達は、このような制約のいくつかを克服し、全身性薬物暴露、およびかくして有害効果を低減しながら、有効な治療的投与量の腫瘍部位への堆積を可能にする可能性がある。さらなる進歩は、癌性細胞を特異的に認識する薬物装填型免疫ナノ粒子（ＩＮＰ）の肺送達であり、それによってそれら粒子の病的肺細胞中への内在化を高める。
【０２６４】
目的：非小細胞肺癌のトランスジェニックマウスモデルにおける肺に送達されたＩＮＰの安全性を調べること。
【０２６５】
方法：パルミチン酸パクリタキセル（ｐｃｐｌ）を装填したペグ化ポリ（乳酸）ナノ粒子（ＮＰ）を、表皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を認識する抗体（Ａｂ）に複合させた。肺腫瘍を所持するトランスジェニックマウスに、エアロゾルの気管内投与（図１４）を介して４日間にわたって製剤を与え、７日目に該マウスを屠殺した。治療には、ブランク（ＢＬＫ）ＮＰ（１．５ｍｇポリマー）、生理食塩水で１：５に希釈されたｐｃｐｌ  ＮＰ（０．３ｍｇのポリマー、１ｍｇ／ｋｇのｐｃｐｌ）、および非希釈および生理食塩水で希釈されたＥｐＣＡＭ−ｐｃｐｌ  ＩＮＰ（それぞれ、１ｍｇ／ｋｇのｐｃｐｌを含む０．３ｍｇのポリマー、または５ｍｇ／ｋｇのｐｃｐｌを含む１．５ｍｇのポリマー）を含めた。体重（ＢＷ）、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、全血球数、組織化学、および免疫組織化学を使用して、局所性および全身性効果の双方を評価した。
【０２６６】
結果：群内で、１日目から７日目までの動物体重の減少は、せいぜい８％までであり、傾向は、全般的に、統計的に有意ではなかった（図１５）。ＢＬＫ  ＮＰおよび非希釈ＩＮＰの双方内で、同様の体重減少が観察され、２群間の動物の一般的な健康状態に差異がないことを示唆した。群間で、希釈ＩＮＰのみが、希釈ｐｃｐｌ  ＮＰに比較して統計的に有意に高い体重減少を引き起こしたが（図１６）、おそらく、後者の最も軽い初期体重のためであろう（図１５）。
【０２６７】
ＩＮＰでの治療において、標的化されないＢＬＫおよびｐｃｐｌ  ＮＰに比較して単球数の増加も観察されたが、おそらく、ラット抗体に対する急性免疫応答のためであろう（図１７）。
【０２６８】
気管支肺胞洗浄は、より高いＬＤＨ放出（図１８ａ）によって反映されるように、ｐｃｐｌ−ＥｐＣＡＭ  ＩＮＰが、単純なＮＰに比べてより大きな局所性の細胞傷害および炎症応答を誘発することを示す。これは、より高い薬物暴露および標的腫瘍細胞の溶解のためである。高い局所性好中球数は、ラット抗体に対する応答に帰せられる（図１８ｂ）。
【０２６９】
対照的に、純粋なＮＰは、ＩＮＰに比べて２倍高いマクロファージの補充を誘発した（図１９）。これは、純粋なＮＰが、肺中でより高い非特異的な食細胞の応答を生じさせ、一方、ＩＮＰは、食作用をどうにか免れ、マクロファージの補充を低下させ、かくして標的細胞の傷害を誘導することを示している可能性がある。
【０２７０】
加えて、免疫組織化学は、肺中におけるＥｐＣＡＭの存在を証明し（図２０）、ＥｐＣＡＭ  ＩＮＰ療法による腫瘍病巣の溶解の証拠を提供する。
【０２７１】
結論：投与されたポリマーの比較的高い濃度および動物のわずかな体重減少にもかかわらず、１匹を除くすべての動物は、４日間の実験を７日目の屠殺まで生き延びた。全体的に見て、結果は、ＥｐＣＡＭ陽性肺癌の治療における薬物装填型ＩＮＰの安全性および特異的なターゲティングを示している。
【０２７２】
親油性の細胞傷害薬を含むＮＰをＭＡｂとカップリングさせること、好ましくは前記送達システムを含むエアロゾルを形成し、続いて肺へ局所的に送達することの利点には、肺への直接送達、標的組織中での長い滞留時間、腫瘍部位での極めて強力な薬物投与量の連続的放出、および効力向上を可能にする細胞傷害薬の肺腫瘍中へのより良好な内在化が含まれる。それぞれ、本発明は放射性医薬品および／または診断薬を肺へ直接送達するための強化されたシステムを提供する。本発明は、好ましくは吸入によって肺へ投与される、ポリマーをベースにしたナノ粒子；および前記ナノ粒子に非共有結合でアンカリングされた第１部分であって、該第１部分の少なくとも一部が前記ナノ粒子中に埋め込まれた疎水性／親油性セグメントを含む第１部分；および前記ナノ粒子の外表面に露出されたカップリング基、好ましくはマレイミド化合物を含む第２部分を含むリンカーを含む送達システムに関する。一実施形態によれば、該送達システムは、それぞれ前記カップリング基、好ましくはマレイミド化合物に共有結合で結合される１種または２種以上のターゲティング薬剤を含む。さらに別の実施形態によれば、該送達システムは、薬物および／または放射性医薬品および／またはコントラスト剤を含む。本発明によるリンカーの具体例は、オクタデシル−４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸アミド（ＯＭＣＣＡ）である。
【０２７３】
前述の説明、その後の図面、および特許請求の範囲中で開示されている本発明の特徴は、本発明をその異なる実施形態中で実行するために、単独および任意の組合せの双方で重要であることもある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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