(57)【要約】  本発明は、炎症性腸疾患の病理状態に対する遺伝子発現プロファイリングの方法であって、哺乳動物被検者からの試験試料中における一又は複数のＩＢＤマーカーのコントロールに対する発現差を決定し、試験試料中における発現差が、試験試料が得られた哺乳動物被検者におけるＩＢＤを示す方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物被検者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の存在を診断する方法であって、上記被検者から得られた試験試料における配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１９４、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、及び２３０の何れか一に示されたポリペプチドをコードする核酸の発現レベルがコントロールの発現レベルに対して高いことを決定し、上記高い発現レベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示す方法。
【請求項２】
哺乳動物被検者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の存在を診断する方法であって、上記被検者から得られた試験試料における配列番号：１０８、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、及び２２８のの何れか一に示されたポリペプチドをコードする核酸の発現レベルがコントロールの発現レベルに対して低いことを決定し、上記低い発現レベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示す方法。
【請求項３】
上記哺乳動物被検者がヒト患者である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記発現レベルのエビデンスが遺伝子発現プロファイリング法によって得られる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記方法がＰＣＲベースの方法である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
上記発現レベルが一又は複数の参照遺伝子又はその発現産物の発現レベルに対して正規化される請求項４に記載の方法。
【請求項７】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも二の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも三の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも四の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも五の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
上記ＩＢＤ検出をまとめるレポートを作成する工程を更に含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
上記ＩＢＤが潰瘍性大腸炎である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
上記ＩＢＤがクローン病である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１４】
上記ＩＢＤが潰瘍性大腸炎及びクローン病である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１５】
上記試験試料が結腸組織生検由来である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
上記生検が、 回腸末端、上行結腸、下行結腸、及びＳ状結腸からなる群から選択される組織由来である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
上記生検が炎症結腸領域由来である請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
上記生検が非炎症結腸領域由来である請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
上記決定工程が、上記哺乳動物被検者におけるＩＢＤの再発を示し、上記哺乳動物被検者が過去にＩＢＤと診断され、該過去に診断されたＩＢＤに対して治療されている請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２０】
上記治療が手術からなる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記決定工程が、上記哺乳動物被検者における上記ＩＢＤの突然の再発を示す請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２２】
治療を必要とする哺乳動物被検者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療する方法であって、
（ａ）上記被検者から得られた試験試料における配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１９４、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、及び２３０の何れか一に示されたポリペプチドをコードする核酸の発現レベルがコントロールの発現レベルに対して高いことを決定する工程であって、上記高い発現レベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示す工程と；
（ｂ）有効量のＩＢＤ治療剤を上記被検者に投与する工程
を含む方法。
【請求項２３】
治療を必要とする哺乳動物被検者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療する方法であって、
（ａ）上記被検者から得られた試験試料における配列番号：１０８、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、及び２２８のの何れか一に示されたポリペプチドをコードする核酸の発現レベルがコントロールの発現レベルに対して低いことを決定する工程であって、上記低い発現レベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示す工程と；
（ｂ）有効量のＩＢＤ治療剤を上記被検者に投与する工程
を含む方法。
【請求項２４】
上記哺乳動物被検者がヒト患者である請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記発現レベルのエビデンスが遺伝子発現プロファイリング法によって得られる請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記方法がＰＣＲベースの方法である請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
上記発現レベルが一又は複数の参照遺伝子又はその発現産物の発現レベルに対して正規化される請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも二の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２９】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも三の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項３０】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも四の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項３１】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも五の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項３２】
上記ＩＢＤ検出をまとめるレポートを作成する工程を更に含む請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項３３】
上記ＩＢＤが潰瘍性大腸炎である請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項３４】
上記ＩＢＤがクローン病である請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項３５】
上記ＩＢＤが潰瘍性大腸炎及びクローン病である請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項３６】
上記試験試料が結腸組織生検由来である請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項３７】
上記生検が、 回腸末端、上行結腸、下行結腸、及びＳ状結腸からなる群から選択される組織由来である請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
上記生検が炎症結腸領域由来である請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
上記生検が非炎症結腸領域由来である請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
上記決定工程が、上記哺乳動物被検者におけるＩＢＤの再発を示し、上記哺乳動物被検者が過去にＩＢＤと診断され、該過去に診断されたＩＢＤに対して治療されている請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項４１】
上記治療が手術からなる請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
上記決定工程が、上記哺乳動物被検者における上記ＩＢＤの突然の再発を示す請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項４３】
上記ＩＢＤ治療剤がアミノサリチル酸である請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項４４】
上記ＩＢＤ治療剤がコルチコステロイドである請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項４５】
上記ＩＢＤ 治療剤が免疫抑制剤である請求項２２又は２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（関連出願とのクロスリファレンス）
この出願は、全開示を出典明示によりここに援用する２００７年１１月２９日出願の米国仮出願第６０／９９１２０３号、２００８年９月１７日出願の米国仮出願第６１／１９２２６８号、及び２００８年５月２２日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／６４５６２号の利益と米国特許法第１１９条第（ｅ）項の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、炎症性腸疾患の検出及び診断における使用を含む、炎症性腸疾患病理発生における遺伝子発現プロファイルに関する。
【０００３】
（関連技術の記載）
免疫関連及び炎症疾患は、正常な生理機能では、発作又は傷害に反応して、発作又は傷害からの修復を開始し、外来生物体に対する生得的及び後天的防御を開始するのに重要な、かなり複雑で、多くの場合は多重に相互関連した生物学的経路の現れ又は結果である。疾患又は病理は、これらの正常な生理学的経路が、反応の強さに直接関連してか、異常な調節又は過度な刺激の結果として、自己に対する反応として、又はこれらの組合せとして、更なる発作又は傷害を引き起こすときに生じる。
これらの疾患の発生は、多くの場合、多段階経路及びしばしば多数の異なった生物学的システム／経路に関与しているが、一又は複数のこれら経路の重要な点における介在により改善又は治療効果を有し得る。治療的介在は有害なプロセス／経路の拮抗作用又は有益なプロセス／経路の刺激のいずれかにより生じる。
多くの免疫関連疾患が知られており、広範囲にわたって研究されている。このような疾患には、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染疾患、免疫欠損症、異常増殖等が含まれる。
【０００４】
炎症性腸疾患（「ＩＢＤ」）という用語は、腸管（腸）に炎症を起こし、時に反復性の腹痛又は下痢を起こす原因不明の慢性炎症性障害の一群を意味する。米国におけるＩＢＤの罹患率は、人口１０万人あたり約２００人と推定されている。ＩＢＤ患者は、潰瘍性大腸炎（「ＵＣ」）を伴うグループ、及びクローン病（「ＣＤ」）を伴うグループの、２つの主要グループに分けられる。ＵＣ及びＣＤ共、慢性の再発性疾患であり、まだはっきり分かっていない環境的刺激にさらされている遺伝的に影響されやすい個人で生じる複雑な臨床的実体である。(Bonen及びCho, Gastroenterology. 2003; 124:521-536；Gaya等 Lancet. 2006;367:1271-1284)。
【０００５】
ＩＢＤの原因は依然として不明であるが、遺伝、感染、及び免疫的感受性等の複数の要因が関係していると思われている。ＩＢＤは白人に多く、特にユダヤ系の白人に多い。症状が慢性的炎症性の性質であることにより、感染的原因の可能性に対する熱心な調査が急ぎ行われた。急性炎症を刺激する薬剤が見つかったものの、ＩＢＤに関連して慢性的炎症の原因となるものは見つかっていない。ＩＢＤが自己免疫性疾患であるという仮説は、関節炎など前述したようにＩＢＤが腸以外に症状を有すること、並びに、免疫反応を抑制することが知られている副腎性グルココルチコイド、シクロスポリン及びアザチオプリン等の治療薬によりＩＢＤにポジティブな反応が見られることが既知であることにより支持されている。加えて、胃腸管は、身体の他のどの器官よりも、連続的に食物由来のタンパク質、細菌性副産物（ＬＰＳ）等の抗原性物質の可能性に曝されている。
しばしば所定の患者がどちらの病気に罹っているのか言うのが難しいほど、ＵＣとＣＤの診断基準には十分なオーバーラップがある；しかしながら、局在性のように、典型的に見られる病変のタイプは異なっている。ＵＣは殆どは直腸に近位の結腸中に見られ、特徴的な病変は粘膜の表在性潰瘍であり；ＣＤは腸の何処にでも見られ、胃、食道及び十二指腸にも時折関与し、病変は通常は広汎な直線状の裂溝として記述される。
【０００６】
ＩＢＤの現在の治療法は、通常は、抗炎症剤又は免疫抑制剤、例えばスルファサラジン、コルチコステロイド、６−ルカプトプリン／アザチオプリン、又はシクロスポリンの投与を含み、これは通常は部分的な結果をもたらすだけである。抗炎症／免疫抑制療法が失敗すると、結腸切除術が最後の防御ラインである。直腸に関連しないＣＤに対する典型的な手術は切除術（腸の疾患セグメントの除去）及び造瘻術なしの吻合術（再結合）である。小腸又は大腸の部分は取り除くことができる。ＣＤ患者の約３０％が診断後最初の年の内に手術を必要とする。次の年では、割合は一年当たり約５％である。不幸にも、ＣＤは高い再発率を特徴とする；患者の約５％が最初の手術後、毎年二回目の手術を必要とする。
【０００７】
炎症性腸疾患の診断の精密化は、標準的な分類基準を使用して進行状態を評価することを含む。ＩＢＤにおいて使用される分類システムは、大腸炎を軽度、中程度、又は重篤として分類するＴｒｕｅｌｏｖｅ及びＷｉｔｔｓインデクス（Truelove S.C.及びWitts, L.J. Br Med J. 1955;2:1041-1048）を含み、並びにLennard-Jones（Lennard-Jones JE. Scand J Gastroenterol Suppl 1989;170:2-6）及び単純な臨床大腸炎活性指数（ＳＣＣＡＩ）（Walmsley等 Gut. 1998;43:29-32）である。これらのシステムは、毎日の便通、 直腸出血、体温、心拍数、ヘモグロビン値、 赤血球沈降速度、体重、 ヘマトクリットスコア、及び血清アルブミン値のような変量を追跡する。
【０００８】
症例のおよそ１０−１５％において、潰瘍性大腸炎又はクローン病の確定診断は行うことはできず、かかる症例はしばしば「未定の大腸炎」と称される。診断を補助し得、それぞれが血液中の抗体をアッセイする二つの抗体検出試験が利用できる。抗体は「核周辺型抗好中球抗体」（ｐＡＮＣＡ）と「抗出芽酵母抗体」（ＡＳＣＡ）である。潰瘍性大腸炎の殆どの患者はｐＡＮＣＡ抗体を持っているがＡＳＣＡ抗体を持っておらず、クローン病の殆どの患者は抗体を持っているがｐＡＮＣＡ抗体を持っていない。しかしながら、これらの二つの試験は、ある患者は何れの抗体も持っておらず、あるクローン病患者はpANCA抗体のみを持っている場合があるので、難がある。臨床実務では、多数の変量の測定よりも分子マーカーに基づきＩＢＤの存在及び／又は進行を示しうる信頼性ある試験は、ＩＢＤの患者を同定し及び／又は治療するために有用であろう。無仮説の連鎖・連関研究では、ＵＣに関連している遺伝子座、特に染色体６上のＭＨＣ領域（Rioux等Am J Hum Genet. 2000;66:1863-1870；Stokkers等Gut. 1999; 45:395-401；Van Heel等Hum Mol Genet. 2004;13:763-770）、染色体１２上のＩＢＤ２遺伝子座（Parkes等Am J Hum Genet. 2000;67:1605-1610；Satsangi等Nat Genet. 1996;14:199-202）及び染色体５上のＩＢＤ５遺伝子座（Giallourakis 等 Am J. Hum Genet. 2003;73:205-211；Palmieri等 Aliment Pharmacol Ther. 2006;23:497-506；Russell等 Gut. 2006;55:1114-1123；Waller等 Gut. 2006;55:809-814）が同定されている。染色体７ｑ上にＵＣに対する連関の推定遺伝子座を同定するＵＫ規模の連鎖スキャンの後、更なる研究で、ＵＣの細胞性解毒に関与するＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）遺伝子の変異体を結びつけた(Satsangi等 Nat Genet. 1996;14:199-202；Brant等 Am J Hum Genet. 2003;73:1282-1292；Ho 等 Gastroenterology. 2005;128:288-296)
【０００９】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）において観察される慢性的小腸炎を生じる複雑な遺伝子−遺伝子及び遺伝子−環境関係の同定と理解に向けての補完的アプローチは、マイクロアレイ遺伝子発現解析である。マイクロアレイは、組織及び細胞レベルでの遺伝子発現の包括的な像を明らかにし、根底にある病態生理学的過程の理解を助ける（Stoughton等 Annu Rev Biochem. 2005;74:53-82）。マイクロアレイ解析は最初は１９９７年にＩＢＤの患者に応用され、ＣＤの患者の手術切除中の９６遺伝子の発現を、関節リウマチの患者の滑液組織と比較した（Heller 等 Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:2150-2155）。 ＩＢＤ患者からの手術標本を調べるためにマイクロアレイプラットホームを使用する更なる研究により、疾患試料をコントロールと比較した場合に差次的に調節された多くの新規遺伝子が同定された（Dieckgraefe等 Physiol Genomics. 2000;4:1-11；Lawrance等 Hum Mol Genet. 2001;10:445-456）。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）において観察される慢性的小腸炎を生じる複雑な遺伝子−遺伝子及び遺伝子−環境関係の同定と理解に向けての補完的アプローチは、マイクロアレイ遺伝子発現解析である。マイクロアレイは、組織及び細胞レベルでの遺伝子発現の包括的な像を明らかにし、根底にある病態生理学的過程の理解を助ける（Stoughton等 Annu Rev Biochem. 2005;74:53-82）。マイクロアレイ解析は最初は１９９７年にＩＢＤの患者に応用され、ＣＤの患者の手術切除中の９６遺伝子の発現を、関節リウマチの患者の滑液組織と比較した（Heller 等 Proc Natl Acad Sci U S A. 1997;94:2150-2155）。ＩＢＤ患者からの手術標本を調べるためにマイクロアレイプラットホームを使用する更なる研究により、疾患試料をコントロールと比較した場合に差次的に調節された多くの新規遺伝子が同定された（Dieckgraefe等 Physiol Genomics. 2000;4:1-11；Lawrance等 Hum Mol Genet. 2001;10:445-456）。
【００１０】
内視鏡で採取した粘膜生検は、重篤ではない疾患の患者を包含する大きな範囲の患者由来の組織をマイクロアレイすることを可能にした。Langmann等はマイクロアレイを使用し、結腸及び回腸末端の巨視的に非罹患の領域からの生検標本中の２２２８３の遺伝子を分析した（Langmann 等 Gastroenterology. 2004;127:26-40）。細胞解毒及び生体内分解に関与した遺伝子（プレグナンＸレセプター及びMDR1）はＵＣの患者の大腸において有意にダウンレギュレートされたが、ＣＤの患者からの生検中におけるこれら遺伝子の発現には差がなかった。Costelloと同僚達(Costello 等 PLoS Med. 2005;2:e199)は、健常なコントロール、ＣＤ及びＵＣの患者由来の内視鏡Ｓ状結腸生検中における３３７９２配列の発現を調べた。新規なタンパク質を表す多くの配列が差次的に調節されており、インシリコ解析では、これらのタンパク質が疾患病理−転写因子、シグナル伝達分子及び細胞接着に関する推定機能を有していたことが示唆された。
【００１１】
ＵＣの患者の研究において、Okahara等 (Aliment Pharmacol Ther. 2005;21:1091-1097)は、非炎症生検と比較した場合、炎症生検において、遊走阻止因子関連タンパク質１４（ＭＲＰ１４）、増殖関連癌遺伝子ガンマ（ＧＲＯγ）及び血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）がアップレギュレートされる一方、ＴＩＭＰ１及びｅｌｆｉｎがダウンレギュレートされていることを観察した。４１のケモカインと２１のケモカインレセプターを観察し、Puleston等は、ケモカインＣＸＣＬｓ１−３及び８及びＣＣＬ２０がアクティブな大腸ＣＤ及びＵＣにおいてアップレギュレートされていたことを証明した(Aliment Pharmacol Ther. 2005;21:109-120)。総括してこれらの研究は、初期のマイクロアレイプラットホーム及び組織収集の異質性を例証している。しかしながら、これらの問題にかかわらず、多くの遺伝子の差次的発現が一貫して観察された。
【００１２】
ＩＢＤの研究における上記の進歩にもかかわらず、哺乳動物においてＩＢＤを検出することができ、この疾患を効果的に治療するための更なる診断及び治療剤に対して大なる需要が存在している。従って、本発明は、正常な組織と比較してＩＢＤ中において過剰発現されるポリヌクレオチド及びポリペプチド、及びその哺乳動物被検者におけるＩＢＤの存在を検出又は診断し、ＩＢＤが適切なＩＢＤ治療剤で検出される被検者を続いて治療するために、ポリペプチド及びそのコード核酸を使用する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の存在を検出し、その進行を決定する方法を提供する。
ここに開示した発明は、哺乳動物組織又は細胞試料中の一又は複数の遺伝子発現マーカーの発現を検査する方法及びアッセイを提供し、ここで、一又は複数のかかるバイオマーカーの発現が、組織又は細胞試料が採取された哺乳動物被検者がＩＢＤに罹っている可能性が高いかどうかを予測する。本発明の様々な実施態様では、該方法及びアッセイは、表１、２、及び３に列挙されたもののような遺伝子発現マーカーの発現を検査し、発現がコントロール試料よりも高いか又は低いかを決定する。
本発明のこれらの及び更なる実施態様は当業者には明らかであろう。
【発明の概要】
【００１４】
一態様では、本発明は、哺乳動物被検者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を検出又は診断する方法であって、被検者から得られた生物学的試料において、（ｉ）表１、２、又は３から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸、又は（ｉｉ）表１、２、又は３から選択された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の、発現レベルが、コントロールにおける発現レベルに対して異なっていることを決定し、発現の差が、被検者がＩＢＤである可能性が高いことを示している方法に関する。
一実施態様では、哺乳動物被検者におけるＩＢＤを診断又は検出する方法は、被検者から得られた試験試料において、（ｉ）表１Ａ、２、又は３Ａから選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１Ａ、２、又は３Ａから選択された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の発現レベルが、コントロールにおける発現レベルに対して高いことを決定することを含み、発現の高いレベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示している方法に関する。
他の実施態様では、哺乳動物被検者におけるＩＢＤを診断又は検出する方法は、被検者から得られた試験試料において、（ｉ）表１Ｂ又は３Ｂから選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１Ｂ又は３Ａから選択された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の発現レベルが、コントロールにおける発現レベルに対して低いことを決定することを含み、発現の低いレベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示している方法に関する。
【００１５】
一態様では、該方法は、過去においてＩＢＤと診断され現在は寛解している哺乳動物被検者におけるＩＢＤの突然の再発を診断又は検出することに関する。被検者はＩＢＤに対する治療を完了していてもよいし、又はＩＢＤの治療を現在受けていてもよい。一実施態様では、該方法は、哺乳動物被検者から得られた生物学的試料中において、（ｉ）表１、２、又は３から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１、２、又は３から選択された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の、発現レベルが、コントロールにおける発現レベルに対して異なっていることを決定することを含み、発現の差が、被検者がＩＢＤの突然の再発の可能性が高いことを示している。あるいは、試験試料は、利用できるならば、最初のＩＢＤ診断の診断前、診断後又は診断時に得られた哺乳動物被検者の前の試験試料と比較することができる。
【００１６】
全ての態様において、哺乳動物被検者は好ましくはヒト患者であり、例えばＩＢＤになっているかＩＢＤを発症するリスクがあると診断されたヒト患者である。被検者はまたＩＢＤの治療を以前に受けたがＩＢＤの再発のリスクがあるＩＢＤ患者である。
本発明の方法の全ての態様に対して、ここに記載の一又は複数の遺伝子（あるいはかかる遺伝子の一又は複数によって発現されるポリペプチドをコードする一又は複数の核酸）の発現レベルの決定は、例えば遺伝し発現プロファイリングによって得ることができる。遺伝子発現プロファイリングの方法は、例えば、ＰＣＲベースの方法でありうる。
【００１７】
様々な実施態様では、診断は、例えば免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）及び／又は蛍光インサイツハイブリダイゼーションによる、（ｉ）表１、２、又は３から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１、２、又は３から選択された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の、発現レベルの定量を含む。
本発明の全態様に対して、遺伝子の発現レベルは、一又は複数の参照遺伝子、又はその発現産物の発現レベルに対して正規化されうる。
本発明の全態様に対して、該方法は、上記遺伝子の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０、又はその発現産物の発現レベルのエビデンスを決定することを更に含みうる。
【００１８】
他の態様では、本発明の方法はまたその発現レベルのエビデンスに基づいてそのような遺伝子（つまり、ここに開示されたＩＢＤマーカー）の「パネル」の使用を考える。ある実施態様では、ＩＢＤマーカーのパネルは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のＩＢＤマーカーを含む。該パネルは、コントロールに対してＩＢＤ中において過剰発現されるＩＢＤマーカー、コントロールに対してＩＢＤ中において過小発現されるＩＢＤマーカー、又はコントロールに対してＩＢＤ中において過剰発現されまた過小発現されるＩＢＤマーカーを含みうる。かかるパネルは、ＩＢＤが被検者に存在しているかどうかについて決定をするために一又は複数のＩＢＤマーカーの発現差異について哺乳動物被検者をスクリーニングするために使用することができる。
【００１９】
一実施態様では、パネルを構成するＩＢＤマーカーは表１、２、及び３から選択される。好ましい実施態様では、哺乳動物被検者におけるＩＢＤの存在を診断又は検出する方法は、被検者から得られた試験試料中におけるコントロールにおける発現レベルに対するＩＢＤマーカーのパネルからＲＮＡ転写物又はその発現産物の発現レベル差を決定することを含み、ここで、発現レベル差が、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示す。試験試料における発現差異は、ここで検討されるコントロールに対して高いか、及び／又は低い場合がある。
本発明の全態様に対して、該方法は上記予想をまとめるレポートを作成する工程を更に含みうる。
【００２０】
全態様に対して、本発明の方法に従って診断され又は検出されるＩＢＤはクローン病  （ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、又はＣＤ及びＵＣの双方である。
本発明の全態様に対して、哺乳動物被検者から得られる試験試料は、結腸組織生検由来でありうる。好ましい実施態様では、生検は、回腸末端、上行結腸、下行結腸、及びＳ状結腸からなる群から選択される組織である。他の好ましい実施態様では、生検は炎症結腸領域又は非炎症結腸領域由来である。炎症結腸領域は急性的に炎症状態となっているか又は慢性的な炎症状態でありうる。
全態様に対して、発現レベルの決定は一回を越えて生じうる。本発明の全態様に対して、発現レベルの決定は、患者が手術前及び／又は手術後に何らかの治療を患者が受ける前になされうる。ある実施態様では、決定工程は、手術後の哺乳動物被検者におけるＩＢＤの再発を示し、又は上記哺乳動物被検者における上記ＩＢＤの突然の再発を示している。好ましい実施態様では、ＩＢＤはクローン病である。
他の態様では、本発明は、ＩＢＤの存在がここに記載された方法によって検出されている哺乳動物被検者を治療する方法に関する。例えば、哺乳動物被検者から得られた試験試料がここに記載されたＩＢＤマーカーのＲＮＡ転写物又は対応する遺伝子産物の一又は複数のコントロールに対する発現差異を示していることが決定された後、哺乳動物被検者にＩＢＤ治療剤が投与されうる。
【００２１】
一実施態様では、治療を必要とする哺乳動物被検者においてＩＢＤを治療する方法は、（ａ）上記被検者から得られた試験試料において、（ｉ）表１、２、又は３から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１、２、又は３から選択された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の、コントロールにおける発現レベルに対する発現レベル差を決定し、ここで上記発現の差が、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示し；（ｂ）上記被検者に有効量のＩＢＤ治療剤を投与することを含む。好ましい実施態様では、ＩＢＤを治療する方法は、（ａ）被検者から得られた試験試料において、（ｉ）表１Ａ、２、又は３Ａから選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１Ａ、２、又は３Ａから選択された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の発現レベルが、コントロールにおける発現レベルに対して高いことを決定し、ここで発現の高いレベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示し；（ｂ）上記被検者に有効量のＩＢＤ治療剤を投与することを含む。他の好ましい実施態様では、ＩＢＤの治療方法は、（ａ）被検者から得られた試験試料において、（ｉ）表１Ｂ又は３Ｂから選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１Ｂ又は３Ｂから選択された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の発現レベルが、コントロールにおける発現レベルに対して低いことを決定することを含み、ここで発現の低いレベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示する。ある好ましい実施態様では、ＩＢＤ治療剤は、アミノサリチル酸、副腎皮質ステロイド、及び免疫抑制剤の一又は複数である。
【００２２】
一態様では、上で検討したＩＢＤマーカーのパネルは、哺乳動物被検者におけるＩＢＤを治療する方法において有用である。一実施態様では、哺乳動物被検者はマーカーのパネルに対してスクリーニングされ、ＩＢＤの存在が決定された場合、ＩＢＤ治療剤が上で検討されたように投与されうる。
異なった態様では、本発明は、（１）抽出バッファー／試薬及びプロトコル；（２）逆転写バッファー／試薬及びプロトコル；及び（３）ｑＰＣＲバッファー／試薬及びプロトコルで本発明の方法を実施するのに適したものの一又は複数を含むキットに関する。該キットは、データ検索及び解析ソフトウェアを含みうる。
一実施態様では、発現差異がＩＢＤを示す遺伝子はＧＬＩ１である。他の実施態様では、ＧＬＩ１遺伝子はＧＬＩ１変異体である。好ましい実施態様では、ＧＬＩ１変異体は実施例４に記載したようなｒｓ２２２８２２６Ｃ→Ｇ（Ｑ１１００Ｅ）である。
【００２３】
ここで述べた全ての刊行物は、その刊行物が引用されているものに関連した方法及び／又は材料を開示し記述するために出典明示によりここに援用される。ここに引用された刊行物は本出願の出願日前の開示に対して引用している。本発明のより早い優先日又は先の日付が刊行物に先立つことができないことを発明者が自認していると見なされるべきではない。更に、実際の公開日は示されたものとは異なる場合があり、個々に立証を要する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】目的変数なしの階層的クラスタリングによって解析されたコントロール患者からの組織学的に正常な生検を示す。
【図２】潰瘍性大腸炎患者及びコントロールにおけるデフェンシンα５及び６の発現を示す。
【図３】潰瘍性大腸炎及びコントロールにおけるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）３及び７の発現を示す。
【図４】コントロール及び潰瘍性大腸炎の炎症及び非炎症Ｓ状結腸生検中におけるＳＡＡ１、ＩＬ−８、デフェンシンα５、及びデフェンシンα６のリアルタイムＰＣＲ発現を示す。
【図５】コントロール及び潰瘍性大腸炎の炎症及び非炎症Ｓ状結腸生検中におけるＭＭＰ３、ＭＭＰ７、Ｓ１００Ａ８、及びＴＬＲ４のリアルタイムＰＣＲ発現を示す。
【図６】潰瘍性大腸炎の患者及びコントロールの回腸末端及び結腸におけるデフェンシンα５のインサイツハイブリダイゼーションを示す。
【図７】潰瘍性大腸炎の患者及びコントロールの回腸末端及び結腸におけるデフェンシンα６のインサイツハイブリダイゼーションを示す。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、ヒトＤＥＦＡ６ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１）及びヒトＤＥＦＡ６ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【図９】図９Ａ及び９Ｂは、ヒトＤＥＦＡ５ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：３）及びヒトＤＥＦＡ５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。図９Ｃ及び９Ｄは、ヒトＤＥＦＢ１４ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：２１０）及びヒトＤＥＦＢ１４ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２１１）を示す。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、ヒトＩＬ３ＲＡポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：５）及びヒトＩＬ３ＲＡポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、ヒトＩＬ２ＲＡポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：７）及びヒトＩＬ２ＲＡポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、ヒトＲＥＧ３Ｇポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：９）及びヒトＲＥＧ３Ｇポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、ヒトＲＥＧ１Ｇポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１１）及びヒトＲＥＧ１Ｇポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１２）を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ヒトＫＣＮＤ３ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１３）を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ヒトＫＣＮＤ３ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。
【図１５】図１５Ａ及び１５Ｂは、ヒトＭＩＰ−３ａポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１５）及びヒトＭＩＰ−３ａポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１６）を示す。
【図１６】図１６Ａ及び１６Ｂは、ヒトＥＣＧＦ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１７）及びヒトＥＣＧＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１８）を示す。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂは、ヒトＩＬ１Ｂポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１９）及びヒトＩＬ１Ｂポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【図１８】図１８Ａ及び１８Ｂは、ヒトＭＩＰ２ＢＧＲＯ−ｇポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：２１）及びヒトＭＩＰ２ＢＧＲＯ−ｇポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２２）を示す。
【図１９】図１９Ａ及び１９Ｂは、ヒトＣＸＣＬ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：２３）及びヒトＣＸＣＬ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２４）を示す。
【図２０Ａ−１】図２０Ａは、ヒトＩＡＰ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：２５）を示す。
【図２０Ａ−２】図２０Ａは、ヒトＩＡＰ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：２５）を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ヒトＩＡＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２６）を示す。
【図２１】図２１Ａ及び２１Ｂは、ヒトＣＡＳＰ５ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：２７）及びヒトＣＡＳＰ５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２８）を示す。
【図２２Ａ−１】図２２Ａは、ヒトＤＭＢＴ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：２９）を示す。
【図２２Ａ−２】図２２Ａは、ヒトＤＭＢＴ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：２９）を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ヒトＤＭＢＴ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す。
【図２３Ａ−１】図２２Ａは、ヒトＰＣＤＨ１７ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：３１）を示す。
【図２３Ａ−２】図２２Ａは、ヒトＰＣＤＨ１７ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：３１）を示す。
【図２３Ｂ】図２２Ｂは、ヒトＰＣＤＨ１７ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３２）を示す。
【図２４】図２４Ａ及び２４Ｂは、ヒトＩＦＩＴＭ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：３３）及びヒトＩＦＩＴＭ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３４）を示す。
【図２５】図２５Ａ及び２５Ｂは、ヒトＰＤＺＫ１ＩＰ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：３５）及びヒトＰＤＺＫ１ＩＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【図２６Ａ−１】図２６Ａは、ヒトＩＲＴＡ２ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：３７）を示す。
【図２６Ａ−２】図２６Ａは、ヒトＩＲＴＡ２ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：３７）を示す。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ヒトＩＲＴＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：３８）を示す。
【図２７Ａ−１】図２７Ａは、ヒトＳＬＣ４０Ａ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：３９）を示す。
【図２７Ａ−２】図２７Ａは、ヒトＳＬＣ４０Ａ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：３９）を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、ヒトＳＬＣ４０Ａ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４０）を示す。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ヒトＩＧＨＶ４−４ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：４１）を示す。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、ヒトＩＧＨＶ４−４ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４２）を示す。
【図２９】図２９Ａ及び２９Ｂは、ヒトＲＥＧ３Ｇポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：４３）及びヒトＲＥＧ３Ｇポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４４）を示す。
【図３０】図３０Ａ及び３０Ｂは、ヒトＡＱＰ９ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：４５）及びヒトＡＱＰ９ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４６）を示す。
【図３１Ａ】図３１Ａは、ヒトＯＬＦＭ４ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：４７）を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ヒトＯＬＦＭ４ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４８）を示す。
【図３２】図３２Ａ及び３２Ｂは、ヒトＳ１００Ａ９ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：４９）及びヒトＳ１００Ａ９ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５０）を示す。
【図３３Ａ】図３３Ａは、ヒトＵＮＣ５ＣＬポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：５１）を示す。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、ヒトＵＮＣ５ＣＬポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５２）を示す。
【図３４】図３４Ａ及び３４Ｂは、ヒトＧＰＲ１１０ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：５３）及びヒトＧＰＲ１１０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５４）を示す。
【図３５】図３５Ａ及び３５Ｂは、ヒトＨＬＡ−Ｇポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：５５）及びヒトＨＬＡ−Ｇポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５６）を示す。
【図３６Ａ】図３６Ａは、ヒトＴＡＰ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：５７）を示す。
【図３６Ｂ】図３６Ｂは、ヒトＴＡＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：５８）を示す。
【図３７Ａ】図３７Ａは、ヒトＭＡＰ３Ｋ８ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：５９）を示す。
【図３７Ｂ】図３７Ｂは、ヒトＭＡＰ３Ｋ８ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６０）を示す。
【図３８Ａ−１】図３８Ａは、ヒトＵＢＤ｜ＧＡＢＢＲ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：６１）を示す。
【図３８Ａ−２】図３８Ａは、ヒトＵＢＤ｜ＧＡＢＢＲ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：６１）を示す。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、ヒトＵＢＤ｜ＧＡＢＢＲ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６２）を示す。
【図３９】図３９Ａ及び３９Ｂは、ヒトＤＨＸ５７ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：６３）及びヒトＤＨＸ５７ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６４）を示す。
【図４０】図４０Ａ及び４０Ｂは、ヒトＭＡポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：６５）及びヒトＭＡポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６６）を示す。
【図４１Ａ−１】図４１Ａは、ヒトＩＧＬＪＣＯＲ１８ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：６６）を示す。
【図４１Ａ−２】図４１Ａは、ヒトＩＧＬＪＣＯＲ１８ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：６６）を示す。
【図４１Ｂ】図４１Ｂは、ヒトＩＧＬＪＣＯＲ１８ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６７）を示す。
【図４２】図４２Ａ及び４２Ｂは、ヒトＨＬＡ−Ｇポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：６９）及びヒトＨＬＡ−Ｇポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：７０）を示す。
【図４３】図４３Ａ及び４３Ｂは、ヒトＳＡＡ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：７１）及びヒトＳＡＡ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：７２）を示す。
【図４４】図４４Ａ及び４４Ｂは、ヒトＴＡＰ２ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：７３）及びヒトＴＡＰ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：７４）を示す。
【図４５Ａ−１】図４５Ａは、ヒトＰＣＡＡ１７４４８ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：７５）を示す。
【図４５Ａ−２】図４５Ａは、ヒトＰＣＡＡ１７４４８ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：７５）を示す。
【図４５Ｂ】図４５Ｂは、ヒトＰＣＡＡ１７４４８ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：７６）を示す。
【図４６】図４６Ａ及び４６Ｂは、ヒトＬＣＮ２ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：７７）及びヒトＬＣＮ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：７８）を示す。
【図４７】図４７Ａ及び４７Ｂは、ヒトＺＢＰ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：７９）及びヒトＺＢＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：８０）を示す。
【図４８】図４８Ａ及び４８Ｂは、ヒトＴＮＩＰ３ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：８１）及びヒトＴＮＩＰ３ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：８２）を示す。
【図４９Ａ】図４９Ａは、ヒトＺＣ３Ｈ１２Ａポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：８３）を示す。
【図４９Ｂ】図４９Ｂは、ヒトＺＣ３Ｈ１２Ａポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：８４）を示す。
【図５０】図５０Ａ及び５０Ｂは、ヒトＣＨＩ３Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：８５）及びヒトＣＨＩ３Ｌ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：８６）を示す。
【図５１Ａ】図５１Ａは、ヒトＦＣＧＲ３Ａポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：８７）を示す。
【図５１Ｂ】図５１Ｂは、ヒトＦＣＧＲ３Ａポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：８８）を示す。
【図５２Ａ−１】図５２Ａは、ヒトＳＡＭＤ９Ｌポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：８９）を示す。
【図５２Ａ−２】図５２Ａは、ヒトＳＡＭＤ９Ｌポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：８９）を示す。
【図５２Ａ−３】図５２Ａは、ヒトＳＡＭＤ９Ｌポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：８９）を示す。
【図５２Ｂ】図５２Ｂは、ヒトＳＡＭＤ９Ｌポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：９０）を示す。
【図５３Ａ】図５３Ａは、ヒトＭＭＰ９ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：９１）を示す。
【図５３Ｂ】図５３Ｂは、ヒトＭＭＰ９ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：９２）を示す。
【図５４】図５４Ａ及び５４Ｂは、ヒトＭＭＰ７ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：９３）及びヒトＭＭＰ７ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：９４）を示す。
【図５５Ａ】図５５Ａは、ヒトＢＦポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：９５）を示す。
【図５５Ｂ】図５５Ｂは、ヒトＢＦポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：９６）を示す。
【図５６】図５６Ａ及び５６Ｂは、ヒトＳ１００Ｐポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：９７）及びヒトＳ１００Ｐポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：９８）を示す。
【図５７】図５７Ａ及び５７Ｂは、ヒトＧＲＯポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：９９）及びヒトＧＲＯポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１００）を示す。
【図５８】図５８Ａ及び５８Ｂは、ヒトＩＮＤＯポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１０１）及びヒトＩＮＤＯポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１０２）を示す。
【図５９Ａ】図５９Ａは、ヒトＴＲＩＭ２２ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１０３）を示す。
【図５９Ｂ】図５９Ｂは、ヒトＴＲＩＭ２２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１０４）を示す。
【図６０】図６０Ａ及び６０Ｂは、ヒトＳＡＡ２ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１０５）及びヒトＳＡＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１０６）を示す。
【図６１】図６１Ａ及び６１Ｂは、ヒトＮＥＵ４ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１０７）及びヒトＮＥＵ４ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１０８）を示す。
【図６２Ａ−１】図６２Ａは、ＩＲＴＡ２／ＦＣＲＨ５ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１０９）を示す。
【図６２Ａ−２】図６２Ａは、ＩＲＴＡ２／ＦＣＲＨ５ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１０９）を示す。
【図６２Ｂ】図６２Ｂは、ＩＲＴＡ２／ＦＣＲＨ５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１１０）を示す。
【図６３Ａ−１】図６３Ａは、ＩＧＬＪＣＯＲ１８ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１１１）を示す。
【図６３Ａ−２】図６３Ａは、ＩＧＬＪＣＯＲ１８ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１１１）を示す。
【図６３Ｂ】図６３Ｂは、ＩＧＬＪＣＯＲ１８ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１１２）を示す。
【図６４Ａ】図６４Ａは、ヒトＩＧＨＶ４−４ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１１３）を示す。
【図６４Ｂ】図６４Ｂは、ヒトＩＧＨＶ４−４ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１１４）を示す。
【図６５Ａ】図６５Ａは、ヒトＭＭＰ９ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１１５）を示す。
【図６５Ｂ】図６５Ｂは、ヒトＭＭＰ９ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１１６）を示す。
【図６６】図６６Ａ及び６６Ｂは、ヒトＧＲＯポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１１７）及びヒトＧＲＯポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１１８）を示す。
【図６７】図６７Ａ及び６７Ｂは、ヒトＭＩＰ２ＢＧＲＯ−ｇポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１１９）及びヒトＭＩＰ２ＢＧＲＯ−ｇポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１２０）を示す。
【図６８】図６８Ａ及び６８Ｂは、ヒトＩＬ１Ｂポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１２１）及びヒトＧＲＯポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１２２）を示す。
【図６９】図６９Ａ及び６９Ｂは、ヒトＩＬ３ＲＡポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１２３）及びヒトＩＬ３ＲＡポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１２４）を示す。
【図７０】図７０Ａ及び７０Ｂは、ヒトＣＡＳＰ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１２５）及びヒトＣＡＳＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１２６）を示す。
【図７１】図７１Ａ及び７１Ｂは、ヒトＢＶ８ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１２７）及びヒトＢＶ８ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１２８）を示す。
【図７２Ａ−１】図７２Ａは、ＨＤＡＣ７Ａポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１２９）を示す。
【図７２Ａ−２】図７２Ａは、ＨＤＡＣ７Ａポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１２９）を示す。
【図７２Ｂ】図７２Ｂは、ＨＤＡＣ７Ａポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１３０）を示す。
【図７３Ａ】図７３Ａは、ヒトＡＣＶＲＬ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１３１）を示す。
【図７３Ｂ】図７３Ｂは、ヒトＡＣＶＲＬ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１３２）を示す。
【図７４Ａ】図７４Ａは、ヒトＮＲ４Ａ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１３３）を示す。
【図７４Ｂ】図７４Ｂは、ヒトＮＲ４Ａ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１３４）を示す。
【図７５Ａ】図７５Ａは、ヒトＫ５Ｂポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１３５）を示す。
【図７５Ｂ】図７５Ｂは、ヒトＫ５Ｂポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１３６）を示す。
【図７６Ａ】図７６Ａは、ヒトＳＩＬＶポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１３７）を示す。
【図７６Ｂ】図７６Ｂは、ヒトＳＩＬＶポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１３８）を示す。
【図７７Ａ−１】図７７Ａは、ＩＲＡＫ３ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１３９）を示す。
【図７７Ａ−２】図７７Ａは、ＩＲＡＫ３ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１３９）を示す。
【図７７Ｂ】図７７Ｂは、ＩＲＡＫ３ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１４０）を示す。
【図７８】図７８Ａ及び７８Ｂは、ヒトＩＬ−４ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１４１）及びヒトＩＬ−４ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１４２）を示す。
【図７９Ａ】図７９Ａは、ヒトＩＬ−１３ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１４３）を示す。
【図７９Ｂ】図７９Ｂは、ヒトＩＬ−１３ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１４４）を示す。
【図８０Ａ−１】図８０Ａは、ＲＡＤ５０ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１４５）を示す。
【図８０Ａ−２】図８０Ａは、ＲＡＤ５０ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１４５）を示す。
【図８０Ｂ】図８０Ｂは、ＲＡＤ５０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１４６）を示す。
【図８１】図８１Ａ及び８１Ｂは、ヒトＩＬ−５ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１４７）及びヒトＩＬ−５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１４８）を示す。
【図８２】図８２Ａ及び８２Ｂは、ヒトＩＲＦ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１４９）及びヒトＩＲＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１５０）を示す。
【図８３】図８３Ａ及び８３Ｂは、ヒトＰＤＬＩＭ４ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１５１）及びヒトＰＤＬＩＭ４ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１５２）を示す。
【図８４Ａ】図８４Ａは、ヒトＣＳＦ２ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１５３）を示す。
【図８４Ｂ】図８４Ｂは、ヒトＣＳＦ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１５４）を示す。
【図８５】図８５Ａ及び８５Ｂは、ヒトＩＬ−３ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１５５）及びヒトＩＬ−３ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１５６）を示す。
【図８６】図８６Ａ及び８６Ｂは、ヒトＭＭＰ３ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１５７）及びヒトＭＭＰ３ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１５８）を示す。
【図８７】図８７Ａ及び８７Ｂは、ヒトＩＬ−８ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１５９）及びヒトＩＬ−８ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１６０）を示す。
【図８８Ａ−１】図８８Ａは、ＴＬＲ４ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１６１）を示す。
【図８８Ａ−２】図８８Ａは、ＴＬＲ４ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１６１）を示す。
【図８８Ｂ】図８８Ｂは、ＴＬＲ４ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１６２）を示す。
【図８９】図８９Ａ及び８９Ｂは、ヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１６３）及びヒトＨＬＡ−ＤＲＢ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１６４）を示す。
【図９０】図９０Ａ及び９０Ｂは、ヒトＭＭＰ１９ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１６５）及びヒトＭＭＰ１９ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１６６）を示す。
【図９１】図９１Ａ及び９１Ｂは、ヒトＴＩＭＰ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１６７）及びヒトＴＩＭＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１６８）を示す。
【図９２】図９２Ａ及び９２Ｂは、ヒトＥｌｆｉｎポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１６９）及びヒトＥｌｆｉｎポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１７０）を示す。
【図９３】図９３Ａ及び９３Ｂは、ヒトＣＸＣＬ１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１７１）及びヒトＣＸＣＬ１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１７２）を示す。
【図９４】図９４Ａ及び９４Ｂは、ヒトＤＦＫＺＰ５８６Ａ０５２２ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１７３）及びヒトＤＦＫＺＰ５８６Ａ０５２２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１７４）を示す。
【図９５Ａ−１】図９５Ａは、ＳＬＣ３９Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１７５）を示す。
【図９５Ａ−２】図９５Ａは、ＳＬＣ３９Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１７５）を示す。
【図９５Ａ−３】図９５Ａは、ＳＬＣ３９Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１７５）を示す。
【図９５Ｂ】図９５Ｂは、ＳＬＣ３９Ａ５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１７６）を示す。
【図９６Ａ−１】図９６Ａは、ＧＬＩ−１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１７７）を示す。
【図９６Ａ−２】図９６Ａは、ＧＬＩ−１ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１７７）を示す。
【図９６Ｂ】図９６Ｂは、ＧＬＩ−１ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１７８）を示す。
【図９７Ａ−１】図９７Ａは、ＨＭＧＡ２ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１７９）を示す。
【図９７Ａ−２】図９７Ａは、ＨＭＧＡ２ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１７９）を示す。
【図９７Ｂ】図９７Ｂは、ＨＭＧＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１８０）を示す。
【図９８Ａ−１】図９８Ａは、ＳＬＣ２２Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１８１）を示す。
【図９８Ａ−２】図９８Ａは、ＳＬＣ２２Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１８１）を示す。
【図９８Ｂ】図９８Ｂは、ＳＬＣ２２Ａ５ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１８２）を示す。
【図９９】図９９Ａ及び９９Ｂは、ヒトＳＬＣ２２Ａ４ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１８３）及びヒトＳＬＣ２２Ａ４ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１８４）を示す。
【図１００】図１００Ａ及び１００Ｂは、ヒトＰ４ＨＡ２ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１８５）及びヒトＰ４ＨＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１８６）を示す。
【図１０１】図１０１Ａ及び１０１Ｂは、ヒトＴＳＬＰポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１８７）及びヒトＴＳＬＰポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１８８）を示す。
【図１０２】図１０２Ａ及び１０２Ｂは、ヒトチューブリンα５／α３ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１８９）及びヒトチューブリンα５／α３ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１９０）を示す。
【図１０３】図１０３Ａは、ヒトチューブリンα６ポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１９１）を、１０３Ｂは、ヒトチューブリンα６ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１９２）を示す。
【図１０４】Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ法を使用するスコットランド、ケンブリッジ及びスウェーデンにおける非同義ＧＬＩ１ ＳＮＰ ｒｓ２２２８２２６のメタアナリシスを示す。
【図１０５Ａ】Ｑ１１００ＥがＧＬＩ１タンパク質の保存領域を乱し、ＧＬＩ１転写活性を低減させることを示す。
【図１０５Ｂ】Ｑ１１００ＥがＧＬＩ１タンパク質の保存領域を乱し、ＧＬＩ１転写活性を低減させることを示す。
【図１０６Ａ】健常なヒト成人結腸（ＨＣ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）におけるヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達成分の発現を示す。
【図１０６Ｂ】健常なヒト成人結腸（ＨＣ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）におけるヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達成分の発現を示す。
【図１０６Ｃ】健常なヒト成人結腸（ＨＣ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）におけるヘッジホッグ（ＨＨ）シグナル伝達成分の発現を示す。
【図１０７】Ｇｌｉ１＋／−動物がＤＳＳ処置後に死亡率、重篤な臨床症状、及び重度の体重減少を示す結果を示す。
【図１０８Ａ】Ｇｌｉ１＋／−動物がＤＳＳ処置に応答してＷＴ同腹仔よりも深刻な小腸炎を示すことを示す。
【図１０８Ｂ】Ｇｌｉ１＋／−動物がＤＳＳ処置に応答してＷＴ同腹仔よりも深刻な小腸炎を示すことを示す。
【図１０９】ＤＳＳ処置後のＧｌｉ１＋／−及びＷＴマウスが強い炎症誘発性サイトカイン活性化を示すというサイトカイン分析を示す。
【図１１０】図１１０Ａは、（Ａ）  ヒトアレスチンドメイン含有５（ＡＲＲＤＣ５）（ＬＯＣ３４２９５９）をコードする核酸配列を、図１１０Ｂは、（Ｂ）ヒトＡＲＲＤＣ５ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１１１】ヒトアタキシン３−様（ＡＴＸＮ３Ｌ）に対応する核酸配列を示す。
【図１１２Ａ】図１１２Ａは、（Ａ）ヒト卵胞刺激ホルモンレセプター（ＦＳＨＲ）（ＬＯＣ９２５５２）をコードする核酸配列を示す。
【図１１２Ｂ】図１１２Ｂは、（Ｂ）ヒトＦＳＨＲポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１１３Ａ−１】図１１３Ａは、（Ａ）ヒト血小板由来増殖因子レセプター，αポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）をコードする核酸配列を示す。
【図１１３Ａ−２】図１１３Ａは、（Ａ）ヒト血小板由来増殖因子レセプター，αポリペプチド（ＰＤＧＦＲＡ）をコードする核酸配列を示す。
【図１１３Ｂ】図１１３Ｂは、（Ｂ）ヒトＰＤＧＦＲＡポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１１４Ａ】図１１４Ａは、（Ａ）ヒトトランスフォーミング増殖因子β３（ＴＧＦＢ３）をコードする核酸配列を示す。
【図１１４Ｂ】図１１４Ｂは、（Ｂ）ヒトＴＧＦＢ３ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１１５Ａ】図１１５Ａは、（Ａ）ヒトカリウムチャンネル四量体化ドメイン含有８（ＫＣＴＤ８）をコードする核酸配列を示す。
【図１１５Ｂ】図１１５Ｂは、（Ｂ）ヒトＫＣＴＤ８ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１１６Ａ】図１１６Ａは、（Ａ）ヒトトランスグルタミナーゼ４（ＴＧＭ４）をコードする核酸配列を示す。
【図１１６Ｂ】図１１６Ｂは、（Ｂ）ヒトＴＧＭ４ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１１７】図１１７Ａは、（Ａ）ヒトＴＰＤ５２Ｌ３腫瘍タンパク質Ｄ５２−様３（ＮＹＤ−ＳＰ２５）をコードする核酸配列を、図１１７Ｂは、（Ｂ）ヒトＮＹＤ−ＳＰ２５ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１１８】ｍｉｓｃ＿ＲＮＡ（Ｃ３ｏｒｆ５３），ＦＬＪ３３６５１に対応する核酸配列を示す。
【図１１９】染色体１０上のＥＭＸ２  逆ストランド（非タンパク質コード化）（ＥＭＸ２ＯＳ）に対応する核酸配列を示す。
【図１２０Ａ】図１２０Ａは、（Ａ）ヒト無翅型ＭＭＴＶ組み込み部位ファミリー，メンバー１６（ＷＮＴ１６）をコードする核酸配列を示す。
【図１２０Ｂ】図１２０Ｂは、（Ｂ）ヒトＷＮＴ１６ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
【図１２１Ａ−１】図１２１Ａは、（Ａ−Ｂ）ヒトｓｐｒｏｕｔｙ関連，ＥＶＨ１ドメインドメイン含有２（ＳＰＲＥＤ２）をコードする核酸配列を示す。
【図１２１Ａ−２】図１２１Ａは、（Ａ−Ｂ）ヒトｓｐｒｏｕｔｙ関連，ＥＶＨ１ドメインドメイン含有２（ＳＰＲＥＤ２）をコードする核酸配列を示す。
【図１２１Ｂ】図１２１Ｂは、（Ａ−Ｂ）ヒトｓｐｒｏｕｔｙ関連，ＥＶＨ１ドメインドメイン含有２（ＳＰＲＥＤ２）をコードする核酸配列を示す。
【図１２１Ｃ】図１２１Ｃは、（Ｃ）ヒトＳＰＲＥＤ２のアミノ酸配列を示す。
【図１２２】図１２２Ａ−Ｃは、（Ａ−Ｂ）ヒト染色体１６オープンリーディングフレーム６５（Ｃ１６ｏｒｆ６５）をコードする核酸配列と（Ｃ）ヒト染色体１６オープンリーディングフレーム６５（Ｃ１６ｏｒｆ６５）のアミノ酸配列を示す。
【図１２３】図１２３Ａ−Ｂは、（Ａ）ヒト染色体１２オープンリーディングフレーム２（Ｃ１２ｏｒｆ２）をコードする核酸配列と（Ｂ）ヒト染色体１２オープンリーディングフレーム２（Ｃ１２ｏｒｆ２）のアミノ酸配列を示す。
【図１２４Ａ−１】図１２４Ａは、ヒトマルチプルＰＤＺドメインタンパク質（ＭＰＤＺ）をコードする核酸配列を示す。
【図１２４Ａ−２】図１２４Ａは、ヒトマルチプルＰＤＺドメインタンパク質（ＭＰＤＺ）をコードする核酸配列を示す。
【図１２４Ａ−３】図１２４Ａは、ヒトマルチプルＰＤＺドメインタンパク質（ＭＰＤＺ）をコードする核酸配列を示す。
【図１２４Ｂ】図１２４Ｂは、（Ｂ）ヒトＭＰＤＺのアミノ酸配列を示す。
【図１２５】図１２５Ａ−Ｂは、（Ａ）ヒトフェニルアラニン−ｔＲＮＡシンテターゼ２（ＦＡＲＳ２）をコードする核酸配列と（Ｂ）ヒトＦＡＲＳ２のアミノ酸配列を示す。
【図１２６】図１２６Ａ−Ｂは、（Ａ）ヒトカスパーゼ８，アポトーシス関連システインプロテアーゼ（ＣＡＳＰ８）をコードする核酸配列と（Ｂ）ヒトＣＡＳＰ８のアミノ酸配列を示す。
【図１２７Ａ】図１２７Ａは、ヒト５’−ヌクレオチダーゼ，エクト（ＣＤ７３）  （ＮＴ５Ｅ）をコードする核酸配列を示す。
【図１２７Ｂ】図１２７Ｂは、（Ｂ）ヒトＮＴ５Ｅのアミノ酸配列を示す。
【図１２８】図１２８はヒト奇形癌腫誘導増殖因子３（ＴＤＧＦ３）に対応する核酸配列を示す。
【図１２９】図１２９Ａ−Ｂは、（Ａ）ヒトブチロフィリン−様３（ＢＴＮＬ３）をコードする核酸配列と（Ｂ）ヒトＢＴＮＬ３のアミノ酸配列を示す。
【図１３０】図１３０Ａ−Ｂは、（Ａ）ヒトＳ１００Ａ８をコードする核酸配列と（Ｂ）ヒトＳ１００Ａ８のアミノ酸配列を示す。
【図１３１】図１３１Ａ−Ｂは、（Ａ）ヒトＣＣＬ２０をコードする核酸配列と（Ｂ）ヒトＣＣＬ２０のアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ａ．定義
特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。Singleton 等, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2版, J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)、及びMarch, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4版, John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)により当業者は本出願に使用した多くの用語の一般的な理解が得られる。
当業者は、本発明の実施に使用することができるであろう、ここに記載のものと同様もしくは等価な多くの方法及び材料が分かるであろう。実際、本発明は記載された方法及び材料に決して限定されるものではない。本発明の目的のために、次の用語を以下に定義する。
【００２６】
「炎症性腸疾患」又は「ＩＢＤ」なる用語は、潰瘍性大腸炎及びクローン病に対する集合的な用語として使用される。該二種の疾患は一般には二つの異なった実体と考えられているが、表面上皮の斑状壊死、腺性陰窩に隣接した白血球の局所性蓄積、及び増加した数の上皮内リンパ球（ＩＥＬ）及びある種のマクロファージサブセットのようなその共通する特性は単一の疾患群としてのその治療を正当なものにする。
「クローン病」又は「ＣＤ」なる用語は、ここでは胃腸管の慢性的な炎症を含む症状を意味するために使用される。クローン関連炎症は通常は腸管を冒すが口から肛門までの至る所で発生しうる。ＣＤは、腸管壁の全層にわたって広がり、腸間膜並びにリンパ節を含む点でＵＣとは異なる。該疾病はしばしば非連続的であり、つまり、腸の重篤に罹患しているセグメントが明らかに疾患がない領域から分離している。ＣＤでは、腸壁がまた厚くなり、これが閉塞を生じ得、瘻孔及び裂溝の発生が珍しくはない。ここで使用される場合、ＣＤは、限定するものではないが、（回腸及び大腸を冒す）回結腸炎；（回腸を冒す）回腸炎；胃十二指腸ＣＤ（胃及び十二指腸の炎症）；空回腸炎（空腸における炎症の斑状パッチ）；及びクローン（肉芽腫性）大腸炎（大腸のみを冒す）を含むＣＤの幾つかのタイプの一又は複数でありうる。
【００２７】
「潰瘍性大腸炎」又は「ＵＣ」なる用語は、ここでは大腸及び直腸の炎症を含む症状を意味するために使用される。ＵＣの患者では、結腸粘膜を主として含む炎症反応がある。炎症は典型的には一様で連続的であり、正常な粘膜が介在する領域はない。表面粘膜細胞並びに陰窩上皮及び粘膜下層が好中球浸潤を伴う炎症反応に関与する。最終的には、この反応は典型的には上皮損傷及び上皮細胞の消失まで進行し、多発性潰瘍、線維症、異形成及び結腸の縦方向の退縮を生じる。
「非活動的」ＩＢＤなる用語は、ここでは、個体において過去に診断されたが現在は寛解しているＩＢＤを意味するために使用される。これは、個体が診断されたが治療を受けていない活動的ＩＢＤと対照的なものである。加えて、活動的ＩＢＤは、 寛解（つまり、不活動的ＩＢＤになる）になった過去に診断され治療されたＩＢＤの再発でありうる。かかる再発はここではＩＢＤの「突然の再発」とも称されうる。ＩＢＤのような活動的な自己免疫疾患を有する哺乳動物被検者は、高まった疾患活動の期間又は対応する徴候の戻りである突然の再発を被りうる。突然の再発は、深刻な感染、アレルギー反応、肉体的ストレス、情動性トラウマ、手術、又は環境因子に応答して生じうる。
【００２８】
「調節する」なる用語は、ここでは、遺伝子の発現、又は一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子又は等価なＲＮＡ分子のレベル、又は一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットの活性が、発現、レベル又は活性がモジュレーターの不存在下で観察されたものより大きいか又は少ないように、アップレギュレートされ又はダウンレギュレートされることを意味するために使用される。
「阻害する」、「ダウンレギュレートする」、「過小発現する」及び「減少する」なる用語は、交換可能に使用され、遺伝子の発現、又は一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子又は等価なＲＮＡ分子のレベル、又は一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットの活性が、一又は複数のコントロール、例えば一又は複数のポジティブ及び／又はネガティブコントロールに対して減少することを意味する。
「アップレギュレートする」又は「過剰発現する」なる用語は、遺伝子の発現、又は一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子又は等価なＲＮＡ分子のレベル、又は一又は複数のタンパク質又はタンパク質サブユニットの活性が、一又は複数のコントロール、例えば一又は複数のポジティブ及び／又はネガティブコントロールに対して上昇されることを意味する。
【００２９】
「診断」なる用語は、ここでは、分子又は病理学的状態、疾患又は症状の同定、例えばＩＢＤの同定を意味するために使用される。
「予後」なる用語は、ここでは、自己免疫の突然の再発及び手術後の再発を含むＩＢＤの発生又は進行の可能性の予測を意味する。予後因子は、ＩＢＤをひとたび発症したら患者の再発率及び結果に影響を及ぼすＩＢＤの自然経過に関連した変量である。悪い予後に関連しうる臨床的パラメータは、例えば、腹部腫瘤又は圧痛、皮疹、関節腫脹、 口腔内潰瘍、及び腹鳴（腸にわたる腹鳴又は振とう音）を含む。予後因子は、異なったベースライン再発リスクを持つサブグループに患者を分類するために使用することができる。
【００３０】
ＩＢＤの「病理」は、患者の良好な状態を危うくさせる全ての現象を含む。ＩＢＤの病理は、主として、任意の既知の外来抗原の不在下での慢性又は急性炎症と続いての潰瘍を生じうる腸内の免疫系の異常な活性化に起因する。臨床的には、ＩＢＤは、しばしば慢性的な予測できない経過を生じる多様な徴候によって特徴付けられる。血性下痢及び腹痛はしばしば熱及び体重減少を伴う。貧血は重度の疲労のように、希ではない。関節痛から急性関節炎にわたる関節の症状並びに肝機能の異常が通常ＩＢＤに伴う。ＩＢＤの急性の「攻撃」の間、仕事や他の正常な活動は通常不可能であり、患者はしばしば入院させられる。
これらの疾患の病因論は知られておらず、初期の病変ははっきりとは定まっていない；しかし、表面上皮の斑状壊死、腺性陰窩に隣接する白血球の局所性蓄積、及び増加した数の上皮内リンパ球及びある種のマクロファージサブセットが、特にクローン病における推定される初期の変化として記述されている。
【００３１】
「治療」なる用語は、目的が標的の病理症状又は疾患を防止し又は遅延させ（低減させ）ることである治癒的処置と予防又は防止的処置の双方を意味する。治療を必要とする者は、既にＩＢＤである者並びにＩＢＤになる傾向がある者又はＩＢＤが防止されなければならない者を含む。ＩＢＤの診断がここに開示された方法によってひとたびなされたら、治療の目標は寛解を誘導し維持することである。
【００３２】
「ＩＢＤ治療剤」としての使用に適した様々な薬剤は当業者に知られている。ここに記載しているように、かかる薬剤には、限定なしに、アミノサリチル酸類、副腎皮質ステロイド、及び免疫抑制剤が含まれる。
「試験試料」なる用語は、ＩＢＤになっていることが疑われ、ＩＢＤであることが知られ、又はＩＢＤからの寛解にあることが知られている哺乳動物被検者からの試料を意味する。試験試料は、限定しないが、血液、精液、血清、尿、骨髄、粘膜、組織等を含む哺乳動物被検者における様々な供給源から由来しうる。
【００３３】
「コントロール」又は「コントロール試料」なる用語は、ネガティブな結果が試験試料におけるポジティブな結果を相関付けるのに役立つことが期待されるネガティブコントロールを意味する。本発明に適したコントロールには、限定しないが、正常なレベルの遺伝子発現を有していることが知られている試料、ＩＢＤとなっていないことが知られている哺乳動物被検者から得られた試料、及び正常であることが知られている哺乳動物被検者から得られた試料が含まれる。コントロールはまた過去にＩＢＤと診断され治療され現在は寛解にある被検者から得られた試料であり得；かかるコントロールは寛解にある被検者におけるＩＢＤの再発を決定するのに有用である。また、コントロールは、試験試料に含まれる細胞と同じ由来の正常細胞を含む試料でありうる。当業者であれば本発明での使用に適した他のコントロールが分かるであろう。
「マイクロアレイ」は、基質上の、ハイブリダイズ可能なアレイ要素、好ましくはポリヌクレオチドプローブの秩序だった配置を意味する。
【００３４】
単数又は複数で使用される場合、「ポリヌクレオチド」なる用語は、一般に任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、これは未修飾ＲＮＡ又はＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ又はＤＮＡでもよい。よって、例えば、ここで定義されるポリヌクレオチドには、限定するものではないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖及び二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖であってもよく、又はより典型的には二本鎖であっても又は一本鎖又は二本鎖領域を含んでもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含む混成分子が含まれる。またここで使用される「ポリヌクレオチド」なる用語はＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの双方を含む三本鎖領域を意味する。そのような領域のストランドは同じ分子由来でも又は異なった分子由来でもよい。その領域は一又は複数の分子の全てを含みうるが、より典型的には幾らかの分子の領域のみを含む。三本ヘリックス領域の分子の一つがしばしばオリゴヌクレオチドである。「ポリヌクレオチド」なる用語は特にｃＤＮＡｓを含む。その用語には、一又は複数の修飾塩基を含むＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）及びＲＮＡが含まれる。よって、安定性又は他の理由のために修飾された骨格を持つＤＮＡ又はＲＮＡは、その用語がここで意図するところの「ポリヌクレオチド」である。更に、イノシンのような希な塩基又はトリチウム化塩基のような修飾された塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡはここで定義される「ポリヌクレオチド」という用語内に含まれる。一般に、「ポリヌクレオチド」という用語は未修飾のポリヌクレオチドの全ての化学的、酵素的及び／又は代謝的に修飾された形態並びに単純細胞及び複雑細胞を含む細胞及びウイルスに特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学的形態を包含する。
【００３５】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、限定するものではないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖又は二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド及び二本鎖ＤＮＡを含む比較的短いポリヌクレオチドを意味する。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドは、例えば市販されている自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して、化学的方法によってしばしば合成される。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、インビトロ組換えＤＮＡ媒介法を含む様々な他の方法によって、及び細胞及び生物中でのＤＮＡの発現によって、作製することができる。
【００３６】
「差次的に発現された遺伝子」、「差次的遺伝子発現」という用語及びその同義語は、交換可能に使用され、正常な又はコントロール患者でのその発現と比較して、疾患、特にＵＣ又はＣＤのようなＩＢＤに罹患している患者においてより高いか又はより低いレベルまで発現が活性化される遺伝子を意味する。その用語はまた発現が同じ疾患の異なった段階でより高いか又はより低いレベルまで活性化される遺伝子を含む。差次的に発現された遺伝子は核酸レベル又はタンパク質レベルで活性化されるか又は阻害されうるか、あるいは選択的スプライシングを受けて異なったポリペプチド産物になりうることがまた理解される。そのような差異は、例えばｍＲＮＡレベル、ポリペプチドの表面発現、分泌又は他の分割の変化によって裏付けられうる。差次的遺伝子発現は、正常な被験者と疾患、特にＩＢＤに罹患している患者との間で、あるいは同じ疾患の様々な段階の間で異なる、二又はそれ以上の遺伝子又はその遺伝子産物間での発現の比較、又は二又はそれ以上の遺伝子又はその遺伝子産物間での発現の比の比較、又は更には同じ遺伝子の二つの異なってプロセシングされた産物の比較を含む。差次的発現は、例えば正常細胞及び疾患細胞の間、又は異なった疾患事象又は疾患段階を被った細胞間で、遺伝子又はその発現産物における時間的又は細胞性発現パターンの定量的な差異並びに定性的な差異の双方を含む。本発明の目的に対して、「差次的遺伝子発現」は、正常な被験者と疾患の患者における、又は疾患の患者の疾患の進行の様々な段階における所与の遺伝子の発現において少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約４倍、より好ましくは少なくとも約６倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍の差があるときに、存在すると考えられる。
【００３７】
ＲＮＡ転写物に関する「過剰発現」なる用語は、ｍＲＮＡの検体又は特定の参照セットにおいて検出される全ての転写物であるかもしれない、参照ｍＲＮＡのレベルに対する正規化によって決定される転写物のレベルを意味するために使用される。
「遺伝子増幅」なる語句は、遺伝子又は遺伝子断片の複数コピーが特定の細胞又は細胞株中で形成されるプロセスを意味する。複製領域（増幅ＤＮＡの伸展）はしばしば「増幅産物」と称される。通常、生産されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、つまり遺伝子発現のレベルは、発現した特定の遺伝子から作製されたコピー数の割合でまた増加する。
一般に、「マーカー」又は「バイオマーカー」なる用語は、その遺伝がモニターできる制限酵素認識部位又は遺伝子のような染色体上の同定可能な物理的位置を意味する。該マーカーは「遺伝子発現マーカー」と称される遺伝子の発現領域、又は既知のコード化機能のないＤＮＡのあるセグメントでありうる。ここで使用される「ＩＢＤマーカー」は表１、２、及び３に列挙された遺伝子を意味する。
【００３８】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に相補鎖がその融点より低い環境で存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望のホモロジーの度合いが高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにするが、低い温度はストリンジェンシーを低下させる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００３９】
ここに定義される「ストリンジェントな条件」又は「高いストリンジェントな条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃で０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いる；（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃で７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーによる５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを用いる；又は（３）０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０％ホルムアミド中での４２℃での洗浄とその後の５５℃でのＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高いストリンジェンシーの洗浄を伴う、４２℃での５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を用いる。
【００４０】
「中程度のストリンジェントな条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているようにして同定され、上述のものよりストリンジェンシーが低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェントな条件の一例は、３７℃で、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液での終夜にわたるインキュベーションと、それに続く３７−５０℃で１×ＳＳＣでのフィルターの洗浄である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかが分かるであろう。
本発明の文脈において、任意の特定の遺伝子セットに列挙された遺伝子の「少なくとも一つ」、「少なくとも二つ」、「少なくとも５つ」等の標記は、列挙された遺伝子の何れか一つ又は任意のかつ全ての組合せを意味する。
【００４１】
「スプライシング」及び「ＲＮＡスプライシング」なる用語は交換可能に使用され、イントロンを除去し、エキソンを結合させて、真核生物細胞の細胞質中に移動する連続したコード化配列を有する成熟ｍＲＮＡを生産するＲＮＡプロセシングを意味する。
理論的には、「エキソン」なる用語は、成熟ＲＮＡ産物に提示される介在遺伝子の任意のセグメントを意味する(B. Lewin. Genes IV Cell Press, Cambridge Mass. 1990)。理論的には、「イントロン」なる用語は、転写されているがその何れかの側のエキソンを共にスプライシングすることによって転写物内から除去されるＤＮＡの任意のセグメントを意味する。作用的には、エキソン配列は参照配列番号によって定義される遺伝子のｍＲＮＡ配列で生じる。作用的には、イントロン配列は、エキソン配列によって一括されその５’及び３’境界にＧＴ及びＡＧスプライスコンセンサス配列を有する遺伝子のゲノムＤＮＡ内の介在配列である。
【００４２】
「干渉ＲＮＡ」又は「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」は、標的遺伝子の発現を低減させる通常は約３０ヌクレオチド長未満の二本鎖ＲＮＡ分子である。干渉ＲＮＡは既知の方法を使用して同定し合成することができ（Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003)、国際公開第２００３０５６０１２号及び国際公開第２００３０６４６２１号）、ｓｉＲＮＡライブラリーは例えば Dharmacon, Lafayette, Coloradoから商業的に入手できる。
「天然配列」ポリペプチドは、天然に生じる又は対立遺伝子変異体を含む天然由来のポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するものである。かかる天然配列ポリペプチドは天然から単離することができ、又は組換え又は合成手段によって生産されうる。よって、天然配列ポリペプチドは、天然に生じるヒトポリペプチド、マウスポリペプチド、又は任意の他の哺乳動物種由来のポリペプチドのアミノ酸配列を有しうる。
【００４３】
ここでの「抗体」なる用語は最も広義に使用され、特にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片を包含する。本発明はここに開示されたＩＢＤマーカーの一又は複数に対する抗体を特に考慮する。かかる抗体は「抗ＩＢＤマーカー抗体」と称されうる。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、その集団を構成する個々の抗体が、モノクローナル抗体の生産中に生じ得、一般には少量で存在しうる可能な変異体を除いて、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。かかるモノクローナル抗体には典型的には標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体が含まれ、ここで、標的結合ポリペプチド配列は複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含む方法によって得られた。
【００４４】
ここに記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来するか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である一方、鎖の残りが、他の種から由来するか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限りはその抗体の断片を含む（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。ここで興味のあるキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿等）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「プリマタイズ」抗体、並びに「ヒト化」抗体を含む。
非ヒト（例えば齧歯類）抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含むキメラ抗体である。大部分では、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【００４５】
ここでの「インタクトな抗体」は二つの抗原結合領域とＦｃ領域を含むものである。好ましくは、インタクトな抗体は機能性Ｆｃ領域を有する。
「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、インタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００４６】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン（ＶＨ）を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００４７】
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲ領域に近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD(1991)を参照)。
【００４８】
ここで使用される場合の「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含む；つまり、ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲの最大の多様性を示し、特にＨ３は抗体に微細な特異性を付与するのに独特の役割を果たすと考えられている。例えばXu等, Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson及びWu, Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)を参照。確かに、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ抗体は軽鎖の不存在下で機能的で安定である。例えば、Hamers-Casterman等, Nature 363:446-448 (1993)及びSheriff等, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照。
【００４９】
多数の高頻度可変領域の描写が使用され、ここに包含される。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。カバット番号付け法を使用して番号付けした場合Chothia ＣＤＲ−Ｈ１ループは、ループの長さに応じてＨ３２とＨ３４の間（以下参照）で変化する（これは、カバット番号付けスキームはＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を置き；３５Ａも３５Ｂも存在しないならば、ループは３２で終わり；３５Ａだけが存在するならば、ループが３３で終わり；３５Ａと３３Ｂが両方とも存在するならば、ループは３４で終わるためである）。ＡｂＭ高頻度可変領域は、カバットＣＤＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらの高頻度可変領域のそれぞれからの残基を以下に示す。
ループ  カバット   ＡｂＭ      Chothia        接触
−−−−−−      −−−      −−−−     −−−−
L1    L24-L34     L24-L34     L24-L34          L30-L36
L2    L50-L56     L50-L56     L50-L56          L46-L55
L3    L89-L97     L89-L97     L89-L97          L89-L96
H1    H31-H35B   H26-H35B   H26-H32,33又は34  H30-H35B (Kabat番号付け)
H1    H31-H35     H26-H35     H26-H32          H30-H35  (Chothia番号付け)
H2    H50-H65     H50-H58     H52-H56          H47-H58
H3    H95-H102   H95-H102   H95-H102        H93-H101 
【００５０】
高頻度可変領域は次の通り「伸展高頻度可変領域」を含みうる：ＶＬ中にの２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）と、ＶＨ中の２６−３５Ｂ（Ｈ１）、５０−６５、４７−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２（Ｈ３）。これらの伸展高頻度可変領域は典型的にはカバットの定義とChothiaの定義の組合せであり、場合によっては接触の定義を使用して同定される残基を更に含んでいてもよい。これらの定義の各々に対して上掲のKabat等に従って、可変ドメイン残基を番号付けした。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、各々が単一の抗原結合部位と、名前が容易に結晶化するその能力を反映する残留「Ｆｃ」断片を有する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を持ち、抗原になお架橋できるＦ(ａｂ')２断片を生じる。
【００５１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、強固な非共有結合の一つの重鎖と一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの高頻度可変領域が相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成するのはこの構造においてである。集団的には、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つの高頻度可変領域だけを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性でではあるが、抗原を認識しそれに結合する能力を有している。
Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）をまた含んでいる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に２，３の残基が付加される点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、ここでは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ’についての標記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片対として元々は生産された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた知られている。
【００５２】
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる二つの明確に区別される型を割り当てることができる。
ここでの「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端までの位置のアミノ酸残基から伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え的に操作することによって、取り除かれてもよい。従って、インタクトな抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。
【００５３】
別の定義が示されていないならば、ここでは、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、出典明示によりここに明示的に援用されるKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)におけるようなＥＵインデクスのものである。「カバットにおけるようなＥＵインデクス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃ領域には、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域；並びにその自然に生じる変異体が含まれる。
【００５４】
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも一のアミノ酸修飾、好ましくは一又は複数のアミノ酸置換により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも一のアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域に約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。ここでの変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と好ましくは少なくとも約８０％の相同性を有し、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性を、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有するであろう。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体は異なる「クラス」に分類できる。インタクトな抗体の五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更に「サブクラス」(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
【００５５】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメイン間に更に含む。ｓｃＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照のこと。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持ち、その断片が同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体断片を指す。非常に短いために同一鎖上で二つのドメイン間での対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば欧州特許出願公開第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)に更に十分に記載されている。
【００５６】
「ネイキッド抗体」は、小分子又は放射標識等の異種分子にコンジュゲートされていない抗体である。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の研究、診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれうる。好ましい実施態様では、抗体は、（１）ローリー法で測定して９５重量％抗体を越えるまで、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで、精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００５７】
「親和性成熟」抗体とは、その変更を有しない親抗体と比較し、抗原に対する抗体の親和性に改善を生じせしめる抗体の一又は複数の高頻度可変領域における一又は複数の変更を伴っている抗体である。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルさえの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該分野において知られている手順を使用して生産される。Marks等 Bio/Technology, 10:779-783(1992)は、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟について記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、Barbas等, Proc Nat Acad. Sci, USA 91: 3809-3813(1994)；Schier 等, Gene, 169:147-155(1995)；Yelton等, J. Immunol., 155:1994-2004(1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9(1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226:889-896(1992)に記載されている。
【００５８】
ここでの「アミノ酸配列変異体」抗体は、主な種抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。通常、アミノ酸配列変異体は、主な種抗体と少なくとも約７０％の相同性を有し、好ましくは、それらは主な種抗体と少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性である。アミノ酸配列変異体は、主な種抗体のアミノ酸配列内の、又は主な種抗体のアミノ酸配列に隣接した、所定の位置で置換、欠失及び／又は付加を有する。ここでのアミノ酸配列変異体の例には、酸性変異体(例えば脱アミド化された抗体変異体)、塩基性変異体、抗体の一又は二の軽鎖上にアミノ末端リーダー伸展(例えばＶＨＳ-)を有する抗体、抗体の一又は二の重鎖上にＣ末端リジン残基を有する抗体などが含まれ、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に対する変異体の組合せが含まれる。ここで特に興味のある抗体変異体は、抗体の一又は二の軽鎖上にアミノ末端リーダー伸展を含み、場合によっては主な種抗体に対して他のアミノ酸配列及び／又はグリコシル化の相違を更に含んでなる抗体である。
【００５９】
ここでの「グリコシル化変異体」抗体は、主な種抗体に結合した一又は複数の炭水化物部分と異なる一又は複数のそれに結合した炭水化物部分を有する抗体である。ここでのグリコシル化変異体の例には、そのＦｃ領域に接着した、Ｇ０オリゴ糖構造の代わりにＧ１又はＧ２オリゴ糖構造を有する抗体、その一又は二の軽鎖に結合した一又は二の炭水化物部分を有する抗体、抗体の一又は二の重鎖に結合した炭水化物がない抗体等、及びグリコシル化変異の組合せを有する抗体が含まれる。
抗体がＦｃ領域を有する場合、オリゴ糖構造は、例えば残基２９９（残基のＥｕ番号付けでは２９８）で、抗体の一又は二の重鎖に結合していてもよい。パーツズマブでは、Ｇ０が主要なオリゴ糖構造で、例えばＧ０−Ｆ、Ｇ−１、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｇ１−１、Ｇ１（１−６）、Ｇ１（１−３）及びＧ２のような他のオリゴ糖構造はパーツズマブ組成物中により少量で見出される。
特に明記しない限り、ここでの「Ｇ１オリゴ糖構造」にはＧ−１、Ｇ１−１、Ｇ１（１−６）及びＧ１（１−３）構造が含まれる。
【００６０】
ここでの「アミノ末端リーダー伸展」は、抗体の何れか一又は複数の重鎖又は軽鎖のアミノ末端に存在するアミノ末端リーダー配列の一又は複数のアミノ酸残基を指す。例示的なアミノ末端リーダー伸展は、抗体変異体の一方又は両方の軽鎖に存在する３つのアミノ酸残基、ＶＨＳを含むか又はこれらからなる。
「脱アミド化」抗体は、その一又は複数のアスパラギン残基が、例えばアスパラギン酸、スクシンイミド又はイソ-アスパラギン酸に誘導体化されているものである。
【００６１】
Ｂ．１  発明の一般的記載
本発明の実施には、別段の記載がない限り、当業者の技量の範囲内にある分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の一般的な技術を使用する。かかる技術は、例えば“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, ２版 (Sambrook等, 1989)；“Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait編, 1984)；“Animal Cell Culture” (R. I. Freshney編, 1987)；“Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.)；“Handbook of Experimental Immunology”, 4版(D.M. Weir及びC.C. Blackwell編, Blackwell Science Inc., 1987)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(J.M. Miller及びM.P. Calos編, 1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F. M. Ausubel等編, 1987)；及び“PCR:  The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis等編, 1994)のような文献に十分に説明されている。
【００６２】
上で検討されたように、ＩＢＤの検出又は診断は、患者に観察される多くの変量に依存する様々な分類システムによって現在は達成されている。本発明は、ＩＢＤに関連する遺伝子の同定に基づく。従って、かかる遺伝子の発現レベルは、ＩＢＤの患者を同定するための診断マーカーとなりうる。実施例に記載されているように、ＩＢＤ患者における多くの遺伝子の発現差異が観察されている。よって、本発明によれば、表１Ａ−Ｂ、２、及び３Ａ−Ｂに列挙された遺伝子はＩＢＤで差次的に発現されるものとして同定されている。
【００６３】
表１ＡはＩＢＤにおいてアップレギュレートされている遺伝子リストを提供する。
2011509071.tif 000002
2011509071.tif 000003
2011509071.tif 000004
【００６４】
表１ＢはＩＢＤにおいてダウンレギュレートされている遺伝子リストを提供する。
2011509071.tif 000005
【００６５】
表２はＩＢＤにおいてアップレギュレートされている遺伝子リストを提供する。これらの遺伝子は遺伝子の免疫応答インシリコ（ＩＲＩＳ）コレクションから同定された(その全体を出典明示によりここに援用するAbbas, A.等Genes and Immunity, 6:319-331 (2005))。
2011509071.tif 000006
【００６６】
表３ＡはＩＢＤにおいてアップレギュレートされており、実施例２に記載した実験に基づいて同定された遺伝子リストを提供する。幾つかの例では、遺伝子の遺伝子座／染色体が与えられている。
2011509071.tif 000007
【００６７】
表３ＢはＩＢＤにおいてダウンレギュレートされており、実施例２に記載した実験に基づいて同定された遺伝子リストを提供する。幾つかの例では、遺伝子の遺伝子座／染色体が与えられている。
2011509071.tif 000008
【００６８】
ａ．発明のバイオマーカー
本発明は表１Ａ、１Ｂ、２、３Ａ、及び３Ｂに列挙されたＩＢＤに対する数多くの遺伝子発現マーカー又はバイオマーカーを提供する。本発明の一実施態様では、バイオマーカーは（ここに記載の）マーカーパネルでの使用に適している。かかるパネルは、表１Ａからの一又は複数のマーカー；表１Ｂからの一又は複数のマーカーｌ表２からのマーカー；表３Ａからの一又は複数のマーカー；及び表３Ｂからの一又は複数のマーカーを含みうる。加えて、本発明はまた表１Ａ、１Ｂ、２、３Ａ、及び３Ｂの二以上から選択されたマーカーのパネルを考慮する。例えば、パネルは、表１Ａからの一又は複数のマーカーと表１Ｂからの一又は複数のマーカー; 又は表１Ａからの一又は複数のマーカーと表２からのマーカー；又は表１Ｂからの一又は複数のマーカーと表２からのマーカー；又は表１Ａからの一又は複数のマーカーと表３Ａからの一又は複数のマーカー等々を含むかもしれない。当業者であれば、ここに記載のパネルで使用するのに適した表１−３からのバイオマーカーの様々な組合せが分かるであろう。
【００６９】
本発明の一実施態様では、マイクロアレイ解析によって同定されるＩＢＤマーカーの好ましいセットは、ＩＢＤにおいてアップレギュレートされるマーカーを含む。好ましくは、アップレギュレートされるマーカーのセットは、表１ＡにおけるＤＥＦＡ５（配列番号：３−４）、ＤＥＦＡ６（配列番号：１−２）、ＴＮＩＰ３（配列番号：８１−８２）、ＲＥＧ３−γ（配列番号：９−１０）、ＭＭＰ７（配列番号：９３−９４）、及びＳＡＡ１（配列番号：７１−７２）；及び表３ＡにおけるＩＬ−８（配列番号：１５９−１６０）、Ｋｅｒａｔｉｎ ５Ｂ（Ｋ５Ｂ）（配列番号：１３５−１３６）、ＳＬＣ２２Ａ４（配列番号：１８３−１８４）、ＳＬＣ２２Ａ５（配列番号：１８１−１８２）、ＭＭＰ３（配列番号：１５７−１５８）、及びＭＭＰ１９（配列番号：１６５−１６６）を含む。好ましいダウンレギュレートされるマーカーは、表３Ｂ中のＧＬＩ−１（配列番号：１７５−１７６）である。ここに記載のバイオマーカーのパネルは、これらのマーカーの一つ、二以上、又は全てを含む。あるいは、マーカーセットは、表１Ａからの表示マーカーの１、２、３、４、５、６、及び／又は表３Ａからの表示マーカーの１、２、３、４、５、６及び／又は表３Ｂの表示マーカーの１又は２を含む。  
【００７０】
上に提供されたリストのメンバーは、単一のマーカーとして又は任意の組合せで、本発明の予後及び診断アッセイに使用するのに好ましい。本発明のＩＢＤマーカーは差次的に発現された遺伝子又は遺伝子の領域である。哺乳動物被検者からの試験試料中のコントロールに対する一又は複数のマーカーの発現のレベル差は、以下に更に詳細に記載する方法の一又は複数によって検出されるＲＮＡ転写物又は発現産物のレベルから決定することができる。
正常細胞及びＩＢＤの哺乳動物被検者からの細胞におけるＲＮＡ転写物の発現差異のエビデンスに基づいて、本発明はＩＢＤのための遺伝子マーカーを提供する。本発明によってもたらされるＩＢＤマーカーと関連した情報によって、医師はより賢明な処置の決定をなし、個々の患者の必要性に対してＩＢＤの治療をあつらえ、それによって治療の恩恵を最大にし、有意な恩恵を提供せず毒性の副作用による深刻な危険性をしばしばもたらす不要な治療に患者を暴露することを最小にする。
【００７１】
多重分析物遺伝子発現試験は、幾つかの関連する生理プロセス又は成分細胞性特性の各々に関与する一又は複数の遺伝子の発現レベルを測定することができる。ある例では、試験の予測力と従ってその有用性は、個々の遺伝子の発現値よりも結果に高度に相関するスコアを計算するために個々の遺伝子に対して得られた発現値を使用することによって改善できる。例えば、エストロゲン受容体陽性でリンパ節陰性の乳癌の再発の可能性を予測する定量スコア（再発スコア）の計算は米国特許出願公開第２００５００４８５４２号に記載されている。そのような再発スコアを計算するために使用される等式は再発スコアの予測値を最大にするために遺伝子をグループ化する場合がある。遺伝子のグループ化は、上で検討されたような生理機能又は成分細胞性特性へのその寄与の知識に少なくとも部分的に基づいて実施されうる。グループの形成はまた様々な発現値の再発スコアに対する寄与の数学的重み付けを容易にしうる。生理学的プロセス又は成分細胞性特性を表す遺伝子群の重み付けは、ＩＢＤの病理及び臨床的結果に対するそのプロセス又は特性の寄与を反映しうる。従って、重要な態様では、本発明はまた併せて個々の遺伝子又は同定された遺伝子のランダムな組合せよりも更に信頼性があり強力な結果の予測指標であるここで同定される遺伝子の特定の群を提供する。
【００７２】
また、再発スコアの決定に基づいて、再発スコアの特定の値で患者をサブグループに分割するよう選択することができ、ここで、与えられた範囲に値を有する全ての患者を特定のリスクグループに属するものとして分類できる。よって、選択される値がそれぞれより大なる又は小なるリスクを持つ患者のサブグループを定めるであろう。
ＩＢＤの発症又は進行の予測における遺伝子マーカーの有用性はそのマーカーに独特なものでなくともよい。特定の試験マーカーと非常に類似した発現パターンを有する代替マーカーを試験マーカーに置換するか又は試験マーカーに加えて使用することができ、試験の全体的な予測上の有用性に影響は殆どない。二つの遺伝子の非常に類似した発現パターンは、特定のプロセスにあり、及び／又は共通の調節コントロール下にある双方の遺伝子の関連から生じうる。本発明は、本発明の方法でのそのような代替遺伝子又は遺伝子セットの使用を含み、また考える。
ＩＢＤの発症及び／又は進行を予測する本発明によって提供されるマーカー及び関連情報はまたＩＢＤの患者の治療のための薬剤化合物の効能を試験する臨床治験に含める患者をスクリーニングする際に有用性を有している。
【００７３】
ＩＢＤの存在、発症及び／又は進行を予測する本発明によって提供されるマーカー及び関連情報は、ＩＢＤ治療が適切かどうかを決定するための基準として有用である。例えば、試験の結果が、ＩＢＤマーカーがコントロール試料に対して個体からの試験試料で差次的に発現されることを示している場合、ＩＢＤ治療が適切でありうる。個体は、ＩＢＤであることが知られていない個体、ＩＢＤであることが知られている個体、ＩＢＤであると過去に診断されＩＢＤの治療を受けている個体、又はＩＢＤであると過去に診断されＩＢＤに立ち向かうために手術をした個体でありうる。また、本発明はＩＢＤを治療する方法を考える。以下に記載のように、本発明の診断方法は、一又は複数のＩＢＤマーカーの発現差異がコントロールに対して観察された試験試料を提供した哺乳動物被検者にＩＢＤ治療剤を投与する工程を更に含みうる。かかる治療方法はよって（ａ）哺乳動物被検者におけるＩＢＤの存在を決定し、（ｂ）哺乳動物被検者にＩＢＤ治療剤を投与することを含む。
他の実施態様では、ＩＢＤマーカー及び関連する情報は、遺伝子の転写物又はその発現産物のレベル又は活性を調節する試薬を設計し又は製造するために使用される。上記試薬には、限定しないが、アンチセンスＲＮＡ、低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボザイム、モノクローナル又はポリクローナル抗体が含まれうる。更なる実施態様では、上記遺伝子又はその転写物、又はより特定的には上記転写物の発現産物は薬剤化合物を同定する（スクリーニング）アッセイにおいて使用され、ここで、上記薬剤化合物はＩＢＤを治療するための薬剤の開発において使用される。
本発明の様々な実施態様では、以下に記載される様々な技術的アプローチ法が、開示された遺伝子の発現レベルの決定に利用できる。特定の実施態様では、各遺伝子の発現レベルは、エキソン、イントロン、タンパク質エピトープ及びタンパク質活性を含む遺伝子の発現産物の様々な特徴に関して決定されうる。他の実施態様では、遺伝子の発現レベルは、遺伝子の構造の解析から、例えば遺伝子のプロモーターのメチル化パターンの解析から推量されうる。
【００７４】
ｂ．発明の診断方法
本発明はＩＢＤマーカーの発現差異に基づき哺乳動物被検者におけるＩＢＤを検出又は診断する方法を提供する。一実施態様では、該方法は上で検討されたＩＢＤマーカーのパネルの使用を含む。パネルは表１−３から選択される一又は複数のＩＢＤマーカーを含みうる。
ある実施態様では、ＩＢＤマーカーのパネルは、少なくとも１のＩＢＤマーカー、少なくとも２のＩＢＤマーカー、少なくとも３のＩＢＤマーカー、少なくとも４のＩＢＤマーカー、少なくとも５のＩＢＤマーカー、少なくとも６のＩＢＤマーカー、少なくとも７のＩＢＤマーカー、少なくとも８のＩＢＤマーカー、少なくとも９のＩＢＤマーカー、少なくとも１０のＩＢＤマーカー、少なくとも１１のＩＢＤマーカー、少なくとも１２のＩＢＤマーカー、少なくとも１３のＩＢＤマーカー、少なくとも１４のＩＢＤマーカー、少なくとも１５のＩＢＤマーカー、少なくとも１６のＩＢＤマーカー、少なくとも１７のＩＢＤマーカー、少なくとも１８のＩＢＤマーカー、少なくとも１９のＩＢＤマーカー、又は少なくとも２０のＩＢＤマーカーを含むであろう。一実施態様では、パネルは５の増分でマーカーを含む。他の実施態様では、パネルは１０の増分でマーカーを含む。該パネルは、コントロールに対してＩＢＤにおいて過剰発現されるＩＢＤマーカー、コントロールに対してＩＢＤにおいて過小発現されるＩＢＤマーカー、又はコントロールに対してＩＢＤにおいて過剰発現及び過小発現の双方が生じるＩＢＤマーカーを含みうる。好ましい実施態様では、該パネルは、ＣＤにおいてアップレギュレートされた一又は複数のマーカーと、ＣＤにおいてダウンレギュレートされた一又は複数のマーカーを含む。他の好ましい実施態様では、該パネルは、ＵＣにおいてアップレギュレートされた一又は複数のマーカーと、ＵＣにおいてダウンレギュレートされた一又は複数のマーカーを含む。
【００７５】
他の実施態様では、本発明のパネルは、コントロールに対して活動的ＩＢＤにおいて過剰発現されるＩＢＤマーカー、コントロールに対して活動的ＩＢＤにおいて過小発現されるＩＢＤマーカー、又はコントロールに対して活動的ＩＢＤにおいて過剰発現及び過小発現の双方が生じるＩＢＤマーカーを含みうる。他の実施態様では、本発明のパネルは、本発明のパネルは、コントロールに対して非活動的ＩＢＤにおいて過剰発現されるＩＢＤマーカー、コントロールに対して非活動的ＩＢＤにおいて過小発現されるＩＢＤマーカー、又はコントロールに対して非活動的ＩＢＤにおいて過剰発現及び過小発現の双方が生じるＩＢＤマーカーを含みうる。好ましい実施態様では、活動的ＩＢＤはＣＤである。他の好ましい実施態様では、非活動的ＩＢＤはＣＤである。
好ましい実施態様では、哺乳動物被検者においてＩＢＤの存在を診断又は検出する方法は、被検者から得られた試験試料中のＩＢＤマーカーのパネルからのＲＮＡ転写物又はその発現産物の、コントロールにおける発現レベルに対する発現レベル差を決定することを含み、ここで、発現レベルの差が、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示している。試験試料中の発現差異は、ここで検討されたようにコントロールに対して高い及び／又は低いものでありうる。
【００７６】
コントロールに対して、患者から得られた生物学的試料中の上記リストに提供された遺伝子の一又は複数の発現又は活性の差が患者におけるＩＢＤの存在を示している。コントロールは、例えば、ＩＢＤ患者においてアップレギュレート（又はダウンレギュレート）されることが知られている同じ細胞中に存在する遺伝子（ポジティブコントロール）でありうる。あるいは、又は加えて、コントロールは、同じ細胞型の正常細胞中の同じ遺伝子（ネガティブコントロール）の発現レベルでありうる。発現レベルは、例えばグリセルアルデヒド-３-ホスフェート-デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及び／又はβ-アクチンのようなハウスキーピング遺伝子の発現レベルに、あるいは試験された試料中の全ての遺伝子の発現レベルに正規化することがまたできる。一実施態様では、上述の遺伝子の一又は複数の発現は、それが例えば同じ型の他の試料と比較して中央値以上ならばポジティブな発現と見なされる。中央値発現レベルは遺伝子発現の測定と本質的に同時に決定することができるか、又はこれまでのようにして決定されうる。これら及び他の方法は当該分野でよく知られており、当業者には明らかである。
ＩＢＤ患者を同定するための方法がここに提供される。この患者集団のうち、ＩＢＤの患者は、患者から得られた細胞を含む生物学的試料中における遺伝子、対応するＲＮＡ分子又はコード化タンパク質の一又は複数の発現レベルを決定することによって同定することができる。生物学的試料は、例えばここに記載された組織生検でありうる。
【００７７】
本発明の方法は、ＩＢＤ診断アッセイ及びイメージング方法に関する。一実施態様では、アッセイは、ここに記載された抗体を使用して実施される。本発明はまたタンパク質の検出及び定量のために有用な様々な免疫学的アッセイを提供する。これらのアッセイは、限定しないが、様々なタイプのラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光アッセイ（ＥＬＩＦＡ）等を含む当該分野でよく知られた様々な免疫学的アッセイ様式で実施される。また、限定しないが、標識された抗体を使用する放射シンチグラフィーイメージング法を含むここに記載された分子の発現によって特徴付けられるＩＢＤを検出可能な免疫学的なイメージング法がまた本発明によって提供される。かかるアッセイは、ここに記載された一又は複数の分子の発現によって特徴付けられるＩＢＤの検出、モニター、診断及び予後に臨床的に有用である。
本発明の他の態様は、ここに記載された分子を発現する細胞を同定するための方法に関する。ここに記載の分子の発現プロファイルは、それをＩＢＤに対する診断マーカーにする。従って、分子の発現の状態は、疾患の進行段階の罹患率、進行速度、及び／又は活動的ＩＢＤ又は非活動的ＩＢＤにおける徴候の突然で深刻な発症、つまり突然の再発を含む様々な因子を予測するのに有用な情報を提供する。
【００７８】
一実施態様では、本発明はＩＢＤを検出する方法を提供する。哺乳動物被検者からの試験試料と既知の正常な哺乳動物からのコントロール試料がそれぞれ抗ＩＢＤマーカー抗体又はその断片に接触させられる。ＩＢＤマーカーの発現レベルが測定され、コントロール試料に対する試験試料中の発現レベルの差が、試験試料が得られた哺乳動物被検者におけるＩＢＤを示すものである。ある実施態様では、試験試料中におけるＩＢＤマーカー発現のレベルは、コントロールにおける発現のレベルよりも高いことが決定され、高い発現レベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示す。他の実施態様では、試験試料中におけるＩＢＤマーカー発現のレベルは、コントロールにおける発現のレベルよりも低いことが決定され、低い発現レベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示す。
他の実施態様では、本発明の方法によって検出されるＩＢＤは、哺乳動物被検者におけるＩＢＤの再発又は突然の再発である。
【００７９】
好ましい実施態様では、該方法は、薬剤療法又は外科手術ようなＩＢＤの治療を受けたＩＢＤと過去に決定された哺乳動物被検者においてＩＢＤの突然の再発又はＩＢＤの再発を検出するために用いられる。ＩＢＤの最初の検出後に、更なる試験試料を、ＩＢＤとなっていることが見出された哺乳動物被検者から得てもよい。更なる試料は、最初の試料が取られた後、数時間後、数日後、数週間後、又は数ヶ月後に得ることができる。当業者であれば、第二、第三、第四、第五、第六等の試験試料を含みうるかかる更なる試料を得るために適切なスケジュールは分かるであろう。最初の試験試料と更なる試料（及び代わりにここに記載されたコントロール試料）が抗ＩＢＤマーカー抗体と接触させられる。ＩＢＤマーカーの発現レベルを測定し、最初の試験試料と比較した更なる試験試料中の発現レベルの差が、試験試料が得られた哺乳動物被検者におけるＩＢＤの突然の再発又は再発を示すものである。
【００８０】
一態様では、本発明の方法は決定工程に関する。一実施態様では、決定工程は、コントロールに対しての試験試料中の一又は複数のＩＢＤマーカーの発現レベルを測定することを含む。典型的には、ここに記載されたように、ＩＢＤマーカーの発現レベルの測定は、ここに記載された技術の一又は複数を実施することにより、コントロールに対してＩＢＤマーカーの発現差異について試験試料を分析することを含む。試験試料とコントロールから得られた発現レベルデータを、発現レベル差について比較する。他の実施態様では、決定工程は、試験試料が得られた被検者にＩＢＤが存在しているかどうかを評価するための試験試料及びコントロール発現データの検査を更に含む。
ある実施態様では、決定工程は、（ｉ）試験試料及びコントロールにおけるＩＢＤマーカーの発現レベル差を測定し； 及び／又は（ｉｉ） 試験試料及びコントロールにおけるＩＢＤマーカーの発現レベル差の測定から得られるデータを分析する目的で、適切なプロセッサーによって実行されるソフトウェアプログラムの使用を含む。適切なソフトウェア及びプロセッサーはよく知られており、商業的に入手できる。該プログラムは、有形媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、フロッピーディスク、ハードドライブ、ＤＶＤ、又はプロセッサーに伴うメモリーに保存したソフトウェアで具体化できるが、当業者ならば、プログラム全体又はその一部をプロセッサー以外の装置で実行し、及び／又はよく知られた形でファームウェア及び／又は専用のハードウェアで具現化できることを直ぐに理解するであろう。
【００８１】
決定工程後、測定結果、所見、診断、予想及び／又は推奨治療が典型的には記録され、例えば技師、医師及び／又は患者に伝えられる。ある実施態様では、コンピュータを使用して、患者及び／又は担当医師のような関係者にそのような情報を伝える。ある実施態様では、結果又は診断が伝えられる国又は管轄区域とは異なる国又は管轄区域で、アッセイが実施され又はアッセイ結果が解析される。
好ましい実施態様では、ここでのＩＢＤマーカーの一又は複数を有する被検者において測定されたここに開示された一又は複数のＩＢＤマーカーの発現レベルに基づく診断、予測及び／又は推奨治療は、アッセイが完了し、診断及び／又は予測が作成された後に出来るだけ早く被検者に伝えられうる。結果及び／又は関連情報は、被検者を治療する医師によって被検者に伝えられうる。あるいは、結果は、書面、伝達の電子形態、例えば電子メール、又は電話を含む任意の伝達手段によって被検者に直接伝えることができる。伝達は、電子メール通信の場合におけるように、コンピュータの使用により容易にすることができる。ある実施態様では、診断試験の結果及び／又は導かれた結論及び／又は試験に基づく治療の推奨を含む伝達が作成され、テレコミュニケーションの熟練した技術者にはよく知られているコンピュータハードウェア及びソフトウェアの組合せを使用して被検者に自動的に配信されうる。ヘルスケア向けのコミュニケーションシステムの一例は米国特許第６２８３７６１号に記載されている；しかしながら、本発明はこの特定のコミュニケーションシステムを利用する方法に限られるものではない。本発明の方法のある実施態様では、試料のアッセイ、疾患の診断、及びアッセイ結果又は診断の伝達を含む方法工程の全て又は一部が異なった（例えば外国の）管轄区域で実施されうる。
【００８２】
本発明は、限定しないが、上行結腸組織、下行結腸組織、Ｓ状結腸組織、及び回腸末端組織を含む胃腸管に関連した組織におけるＩＢＤマーカーの発現差異と血清、精液、骨、前立腺、尿、細胞調製物等のような他の生物学的試料における発現も検出するためのアッセイを提供する。ＩＢＤマーカーの発現差異を検出するための方法はまたよく知られており、例えば免疫沈降、免疫組織化学分析、ウェスタンブロット分析、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ等を含む。例えば、生物学的試料中のＩＢＤマーカーの発現差異を検出する方法は、最初に試料を抗ＩＢＤマーカー抗体、そのＩＢＤマーカー反応性断片、又は抗ＩＢＤマーカー抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質に接触させ；ついで試料中のＩＢＤマーカータンパク質の結合を検出することを含む。
本発明の様々な実施態様では、限定しないが、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）及びMassively Parallel Signature Sequencing（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析（以下に詳細に検討する）を含む様々な技術的アプローチ法が、開示された遺伝子の発現レベルの決定に利用できる。特定の実施態様では、各遺伝子の発現レベルは、エキソン、イントロン、タンパク質エピトープ及びタンパク質活性を含む遺伝子の発現産物の様々な特徴に関連して決定れうる。他の実施態様では、遺伝子の発現レベルは、遺伝子の構造解析から、例えば遺伝子プロモータのメチル化パターンの解析から推定されうる。
【００８３】
ｃ．発明の治療方法
本発明は、ここに記載の診断方法によって哺乳動物被検者におけるＩＢＤの存在を検出し、ついで該哺乳動物被検者にＩＢＤ治療剤を投与することを含む治療を必要とする被検者においてＩＢＤを治療する方法を提供する。当業者であれば、本発明での使用に適しているであろう様々なＩＢＤ治療剤を把握できる（その全体を出典明示によりここに援用するSt Clair Jones, Hospital Pharmacist, May 2006, Vol. 13; pages 161-166を参照）。本発明は治療を必要とする被検者に一又は複数のＩＢＤ治療剤が投与されるＩＢＤの治療方法を考慮する。一実施態様では、ＩＢＤ治療剤は、アミノサリチル酸、副腎皮質ステロイド、及び免疫抑制剤の一又は複数である。好ましい実施態様では、アミノサリチル酸は、スルファサラジン、オルサラジン、メサラミン、バルサラジド、及びアサコールの一つである。他の好ましい実施態様では、例えばスルファサラジンとオルサラジンの組合せのような複数のアミノサリチル酸類が同時投与される。他の好ましい実施態様では、副腎皮質ステロイドは、ブデソニド、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、アザチオプリン、メトトレキセート、及びシクロスポリンでありうる。他の好ましい実施態様では、ＩＢＤ治療剤は抗生物質、例えばシプロフロキサシン及び／又はメトロニダゾール；又は抗体ベースの薬剤、例えばインフリキシマブ  （レミケード（登録商標））でありうる。
【００８４】
患者が典型的に治療される毒性が最小のＩＢＤ治療剤はアミノサリチル酸類である。典型的には一日４回投与されるスルファサラジン（アザルフィジン）は、スルファピリジンにアゾ結合によって結合されるアミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）の活性分子からなる。結腸中の嫌気性菌がアゾ結合を分裂させて活性な５−ＡＳＡを放出する。しかしながら、少なくとも20%の患者は、可逆性精子異常、胃腸障害又はスルファ成分に対するアレルギー反応のような顕著な副作用が伴うため、スルファピリジンに耐えることができない。これらの副作用はオルサラジンを摂る患者では低減される。しかしながら、スルファサラジンもオルサラジンも何れも小腸炎症の治療に効果的ではない。小腸に放出される５−ＡＳＡの他の製剤（例えばメサラミン及びアサコール）が開発されている。通常は、５−ＡＳＡ治療法が十分な効能を示すのに６−８週かかる。５−ＡＳＡ治療法に応答しない患者又はより重篤な疾患を持つ患者には、副腎皮質ステロイド類が処方される。しかしながら、これは、短期の治療法であり、維持療法として使用することはできない。臨床的寛解が副腎皮質ステロイドを用いて２−４週内で達成されるが、副作用が顕著であり、クッシングゴールドフェース(Cushing goldface)、顔ひげ、深刻な気分変動及び不眠を含む。スルファサラジン及び5-アミノサリチル酸調製物への応答はＣＤでは乏しく、初期の潰瘍性大腸炎ではまずまずから中程度で、重篤なＵＣでは乏しい。これらの薬剤が失敗した場合、強力な免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、プレドニゾン、６−メルカプトプリン又はアザチオプリン（肝臓において６−メルカプトプリンに転換）が典型的には試される。ＣＤの患者に対しては、副腎皮質ステロイド類及び他の免疫抑制剤の使用は、この疾患にありふれた瘻孔及び膿瘍に由来する腹部内敗血症の高いリスクのため、注意深くモニターされなければならない。およそ２５％のＩＢＤ患者が疾患の過程で手術（結腸切除術）を必要とする。
【００８５】
ＩＢＤの治療は、限定しないが、腸切除術、吻合術、結腸切除術、直腸結腸切除術、及び造瘻術、又はその任意の組合せを含む外科手技を含みうる。
薬学的医薬及び手術に加えて、栄養療法のようなＩＢＤに対する非常套的な治療法もまた試みられている。例えば、Ｆｌｅｘｉｃａｌ（登録商標）という半成分的処方物が、ステロイドのプレドニゾロンと同じ効果を有することが示されている。Sanderson等、Arch. Dis. Child. 51:123-7 (1987)。しかしながら、半成分的処方物は比較的高価であり、通常は好まれず、その使用は制限されている。タンパク質全体を導入する栄養療法はまたＩＢＤの症状を軽減するために試みられてきた。Giafer等、Lancet 335:816-9 (1990)。米国特許第５４６１０３３号には、牛乳から単離された酸性カゼイン及びＴＧＦ−２の使用が開示されている。Beattie等, Aliment. Pharmacol. Ther. 8:1-6 (1994)には、ＩＢＤの子供の幼児期の処方にカゼインを使用する方法が開示されている。米国特許第５９５２２９５号には、ＩＢＤの治療用の腸溶性製剤にカゼインを使用する方法が開示されている。しかしながら、栄養療法は、非毒性ではあるが対症療法に過ぎず、疾病の根源にある原因を治療することはできない。
【００８６】
本発明は、例えばインビトロ、エキソビボ及びインビボ治療法を含むＩＢＤ治療方法を考慮している。本発明は、増加した及び／又は減少したＩＢＤマーカーの発現のようなここに開示された一又は複数のＩＢＤマーカーの発現を伴う被検者においてＩＢＤ疾患状態を検出した際に、治療を必要とする被検者におけるＩＢＤを治療するための有用な方法を提供する。好ましい一実施態様では、該方法は、（ａ）該被検者から得られた試験試料において、（ｉ）表１、２、又は３から選択された一又は複数のポリペプチドをコードする一又は複数の核酸；又は（ｉｉ）表１、２、又は３に列挙された一又は複数の遺伝子のＲＮＡ転写物又はその発現産物の、発現レベルが、コントロールにおける発現レベルに対して高い、及び／又は低いことを決定し、上記発現の高い及び／又は低いレベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示しており；（ｂ）上記被検者に有効量のＩＢＤ治療剤を投与することを含む。決定工程（ａ）は多重ＩＢＤマーカーの発現の測定を含みうる。
【００８７】
該治療方法はＩＢＤを検出し、かかる治療を必要とする被検者に有効量のＩＢＤ治療剤を投与することを含む。ある実施態様では、ＩＢＤ疾患状態には、一又は複数のＩＢＤマーカーの発現の増加及び／又は減少が伴う。
一態様では、本発明は、ＩＢＤを治療又は予防するための方法を提供し、該方法は、被検者におけるＩＢＤの存在を検出し、被検者に有効量のＩＢＤ治療剤を投与することを含む。ここで検討されるようにアミノサリチル酸類、副腎皮質ステロイド類、及び免疫抑制剤を含む任意の適切なＩＢＤ治療剤を治療方法において使用することができる。
【００８８】
ここでの方法の何れにおいても、ここで検討された単一のＩＢＤ治療剤と共に、被検者又は患者に、治療を必要とする被検者の症状を治療することができる他の活性剤である有効量の第二の医薬（ここでの単一のＩＢＤ治療剤が第一の医薬である）を投与することができる。例えば、アミノサリチル酸は、副腎皮質ステロイド、免疫抑制剤、又は他のアミノサリチル酸と同時投与されうる。かかる第二医薬のタイプは、ＩＢＤのタイプ、その重篤度、患者の状態及び年齢、用いた第一医薬のタイプと用量等を含む様々な因子に依存する。
第一医薬と第二医薬を使用するかかる治療は、併用投与（二以上の薬剤が同じ又は別個の製剤に含まれる）、及び第一医薬の投与が第二医薬の投与の前、及び／又は次に生じうる別個の投与を含む。一般に、かかる第二医薬は、第一医薬が投与された後、４８時間以内に、又は２４時間以内に、又は１２時間以内に、又は第一医薬後３−１２時間以内に投与され得、あるいは、好ましくは約１から２日、約２から３日、約３から４日、約４から５日、約５から６日、又は６から７日である予め選択された時間にわたって投与されうる。
【００８９】
第一及び第二医薬は、同時に、連続的に、又は第一及び第二医薬を交互に、又は他の治療法で応答性がない場合に投与することができる。よって、第二医薬の併用投与は、別個の製剤又は単一の薬学的製剤を使用する同時投与（同時的投与）と、好ましくは双方の（又は全ての）医薬が同時にその生物学的活性を作用させる間には時間間隔がある何れかの順の連続投与を含む。これらの第二医薬は全て第一医薬と互いに又はそれら自体と併用されて使用され得、よって、ここで使用される「第二医薬」という表現はそれが第一医薬とは別の唯一の医薬であることは意味していない。従って、第二医薬は一つの医薬である必要はなく、一を越えるかかる医薬を構成し又は含みうる。ここで記載するこれら第二医薬は、一般に第一医薬と同じ投薬量及び投与経路で、又は第一医薬の投薬量のおよそ１から９９％で使用される。かかる第二医薬が仮に使用される場合、好ましくは、それらは、それらによって引き起こされる副作用を除去し又は減少させるため、第一医薬が存在していない場合よりも低い量で、特に第一医薬での初期投薬量を越えた続く投薬量で使用される。
【００９０】
本発明の方法がＩＢＤを治療又は予防するために一又は複数のＩＢＤ治療剤を投与することを含む場合、ＩＢＤを治療又は予防するためにまた実施される外科手技と投与工程を結合することが特に望ましい場合がある。本発明によって考えられるＩＢＤ外科手技は、限定しないが、腸切除術, 吻合術、結腸切除術、直腸結腸切除術、及び造瘻術、又はその任意の組合せを含む。例えば、ここに記載されたＩＢＤ治療剤は、例えばＩＢＤの治療における治療スキームにおいて結腸切除術と組み合わせることができる。かかる併用療法は、ＩＢＤ治療剤の投与が外科手技の前、及び／又は後に生じうる別個の投与を含む。
一又は複数のＩＢＤ治療剤の組合せ、又は一又は複数の治療剤とここに記載の外科手技の組合せでの治療は、好ましくはＩＢＤの徴候又は症状の改善を生じる。例えば、かかる治療法は、ＩＢＤの病理の重篤性の減少によって裏付けられるように、ＩＢＤ治療剤治療計画と外科手技を受ける被検者に改善を生じうる。
【００９１】
ＩＢＤ治療剤は、非経口、皮下、 腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含む任意の適切な手段によって投与され、局所治療が望まれるならば、病巣内投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、投与が短期か慢性的かどうかに部分的に依存して、任意の適した経路、例えば静脈内又は皮下注射のような注射によってなされうる。
本発明の方法に従って投与されるＩＢＤ治療剤は、良好な医療実務に一致した態様で製剤され、用量決定され、投与される。この点において考慮される因子には、治療されている特定の疾患、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療実務者に知られている他の因子が含まれる。第一医薬はその必要はないが、場合によってはここに記載された一又は複数の更なる医薬（例えば第二、第三、第四等の医薬）と共に製剤化される。かかる更なる医薬の有効量は、製剤中に存在する第一医薬の量、疾患又は治療のタイプ、及び上で検討した他の因子に依存する。これらは一般にこれまで使用したものと同じ投薬量及び投薬経路で使用され、又はこれまで用いられた投薬量のおよそ１から９９％で用いられる。
【００９２】
ＩＢＤの予防又は治療のために、（単独で又は他の薬剤との併用で使用される場合）ＩＢＤ治療剤の適切な投薬量は、治療される疾患のタイプ、ＩＢＤ治療剤のタイプ、疾患の重篤度及び経過、ＩＢＤ治療剤が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるか、患者の臨床病歴及びＩＢＤ治療剤に対する応答性、及び担当医師の裁量に依存する。ＩＢＤ治療剤は一度に又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)のＩＢＤ治療剤が、例えば一又は複数の分割投与でも又は連続注入でも、患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日投薬量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であるかもしれない。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、疾患症状の所望の抑制が得られるまで持続される。ＩＢＤ治療剤の例示的な一投薬量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。よって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又は任意のその組合せ）を患者に投与することができる。このような用量は、間欠的、例えば毎週又は３週ごとに投与されうる（例えば患者に約２から約２０、例えば約６用量のＩＢＤ治療剤が投与されるように)。初期のより高い負荷投与量の後、一又は複数のより低い用量が投与されうる。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇのＩＢＤ治療剤の毎週の維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画も有用であり得る。この治療法の進行は、常套的な技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【００９３】
Ｂ．２．遺伝子発現プロファイリング
一般に、遺伝子発現プロファイリングの方法は、二つの大きなグループに分けることができる：ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション解析に基づく方法と、生化学的検出又はポリヌクレオチドの配列決定に基づく他の方法である。試料中のｍＲＮＡ発現を定量化するために当該分野で最も広く用いられている方法には、ノーザンブロット及びインサイツハイブリダイゼーション（Parker及びBarnes, Methods in Molecular Biology 106: 247-283(1999)；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（Hod, Biotechniques 13: 852-854(1992)；及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Weis等, Trends in Genetics 8: 263-264(1992)）が含まれる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ-タンパク質二重鎖を含む特定の二重鎖を認識できる抗体を用いてもよい。ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を決定するための様々な方法には、限定されないが、遺伝子発現プロファイリング、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、例えばアフィメトリックス・ジーンチップ技術を用いるなど、製造者のプロトコルに従って市販の装置によって実施することができるマイクロアレイ解析、連続遺伝子発現解析（ＳＡＧＥ）（Velculescu等, Science 270:484-487 (1995)；及びVelculescu等, Cell 88:243-51 (1997)）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ，Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS)による遺伝子発現解析（Brenner等, Nature Biotechnology 18:630-634 (2000)）、プロテオミクス、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）等が含まれる。好ましくは、ｍＲＮＡが定量される。かかるｍＲＮＡ解析は、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術を使用して、又はマイクロアレイ解析によって実施される。ＰＣＲが用いられる場合、ＰＣＲの好ましい形態は定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。
【００９４】
ａ．逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
上に列挙した技術のうち、最も感度が良く最も柔軟性がある定量法はＲＴ−ＰＣＲであり、これは、正常及び試験試料中の異なった試料集団におけるｍＲＮＡレベルを比較し、遺伝子発現のパターンを特徴付けし、密接に関連したｍＲＮＡ間を識別し、ＲＮＡ構造を解析するために使用することができる。
第一工程は標的試料からのｍＲＮＡの単離である。出発材料は典型的には結腸組織生検から単離された全ＲＮＡである。よって、ＲＮＡは、限定されないが、回腸末端、上行結腸、下行結腸、及びＳ状結腸を含む様々な組織から単離することができる。また、生検が得られる結腸組織は、炎症及び／又は非炎症結腸領域由来でありうる。
【００９５】
一実施態様では、ｍＲＮＡは、左結腸又は右結腸から得られた生検である上で定義された生検から得られる。ここで使用される場合、「左結腸」はＳ状結腸及び直腸Ｓ状結腸を意味し、「右結腸」は盲腸を意味する。
ｍＲＮＡ抽出に関する一般的方法は当該分野で良く知られており、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)を含む分子生物学の標準的教科書に開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、Ｑｉａｇｅｎ等の商業的製造者の精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを、製造者の指示書に従って使用することで実施することができる。組織試料からの全ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離できる。生検から調製したＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離できる。
【００９６】
ＲＮＡはＰＣＲのテンプレートとならないので、ＲＴ-ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの最初のステップはＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写と、それに続くＰＣＲ反応でのそれの指数関数的な増幅である。２つの最も広く用いられている逆転写酵素はトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ-ＲＴ）及びモロニーマウス白血球ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ-ＲＴ）である。逆転写段階は、典型的には、発現プロファイリングの環境及び目的に依存し、特異的プライマー、ランダムヘキサマー、又はオリゴ-ｄＴプライマーを使用してプライムされる。例えば、製造者指示書に従い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ ＰＣＲキット（Perkin Elmer, CA, USA）を使用して抽出ＲＮＡを逆転写することができる。誘導したｃＤＮＡは、ついで、後のＰＣＲ反応のテンプレートとして使用できる。
ＰＣＲ工程では、様々な熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるが、典型的には、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いる。よって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲでは、典型的には、Ｔａｑ又はＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を用いて、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、５’ヌクレアーゼ活性と同等の任意の酵素を用いることができる。ＰＣＲ反応にとって典型的なアンプリコンを生成するために２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。三番目のオリゴヌクレオチド、又はプローブを、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計する。該プローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長せず、レポーター蛍光色素及び消光蛍光色素で標識される。このレポーター色素のどんなレーザー誘導放射も、プローブ上でこの２つの色素が近接して位置している場合には、消光色素によって消光する。増幅反応の間、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレートに依存する形でプローブを切断する。生じたプローブ断片は溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、二番目のフルオロフォアの消光効果とは無関係である。新しい分子が合成される度にレポーター色素の１分子が遊離させられ、消光しないレポーター色素の検出がデータの定量的な解釈の基礎を提供する。
【００９７】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ ７７００（商品名）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）（Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）、又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany）等の商業的に入手可能な装置を使用しておこなうことができる。好ましい実施態様では、５' ヌクレアーゼ手法は、ＡＢＩ ＰＲＩＺＭ ７７００（商品名）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名）等のリアルタイム定量ＰＣＲ装置ですすめられる。該システムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ及びコンピューターからなる。該システムでは、サーモサイクラー上の９６−ウェルフォーマットで試料を増幅する。増幅の間、９６ウェル全てに関する光ファイバーケーブルを通してレーザー励起した蛍光シグナルがリアルタイムで収集され、ＣＣＤカメラで検出される。該システムは、装置を作動し、データを分析するソフトウェアを含む。
【００９８】
５'-ヌクレアーゼアッセイのデータは、Ｃｔ又は閾値サイクルとして最初に表される。上で検討したように、蛍光値は毎サイクルの間に記録され、増幅反応においてそのポイントまでに増幅した産物の量を表す。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録されたポイントが閾値サイクル（Ｃｔ）である。
エラー及び試料と試料間の変化による効果を最小限にするために、通常は内部標準を使用してＲＴ-ＰＣＲを実施する。理想的な内部標準は、異なる組織間では一定のレベルで発現し、実験上の処理によって影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されているＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド-３-リン酸-デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びβ-アクチンのｍＲＮＡである。
【００９９】
RT-PCR技術のより最近の変形例は、二重標識蛍光発生プローブ（つまり、TaqMan（登録商標）プローブ）によってＰＣＲ産物の蓄積を測定するリアルタイム定量的ＰＣＲである。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対する内部競合体が正規化のために使用される定量的競合ＰＣＲと、試料内に含まれる正規化遺伝子、又はＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較ＰＣＲの双方に匹敵する。更なる詳細については、例えばHeld等, Genome Research 6:986-994 (1996)を参照のこと。
【０１００】
本発明の一態様によれば、増幅される遺伝子中に存在するイントロン配列に基づいてＰＣＲプライマー及びプローブが設計される。この実施態様では、プライマー／プローブ設計の第一工程は遺伝子内のイントロン配列の 描写である。これは、公に入手可能なソフトウェア、例えばKent, W.J., Genome Res. 12(4):656-64 (2002)によって開発されたＤＮＡ ＢＬＡＴソフトウェア、あるいはその変形形を含むＢＬＡＳＴソフトウェアによって行うことができる。ＰＣＲプライマー及びプローブ設計の十分に確立された方法が次の工程として続く。
非特異的シグナルを避けるために、プライマーとプローブを設計する場合、イントロン内において反復配列をマスクすることが重要である。これは、反復エレメントのライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復エレメントがマスクされる問い合わせ配列を返すベイラー医科大学からオンラインで入手可能なＲｅｐｅａｔ Ｍａｓｋｅｒプログラムを使用して容易に達成することができる。ついで、マスクされたイントロン配列を使用し、例えばＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ(Applied Biosystems)；ＭＧＢアッセイ−バイ−デザイン(Applied Biosystems)；プライマー３(Steve Rozen及びHelen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S編 Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)のような任意の商業的に又は他の好適に入手できるプライマー／プローブ設計パッケージを使用して、プライマー及びプローブ配列を設計することができる。
【０１０１】
ＰＣＲプライマー設計で考慮される最も重要な因子は、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、及びＧ／Ｃ含有量、特異性、相補的プライマー配列、及び３’末端配列を含む。一般に、最適なＰＣＲプライマーは、一般に１７−３０塩基長であり、約２０−８０％、例えば約５０−６０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。５０から８０℃の間、例えば約５０から７０℃のＴｍが典型的には好ましい。
ＰＣＲプライマー及びプローブ設計のための更なる指針については、その開示全体が出典明示によりここに明示的に援用される例えばDieffenbach, C.W.等, “General Concepts for PCR Primer Design” in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155；Innis 及びGelfand, “Optimization of PCRs” in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11；及びPlasterer, T.N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520-527 (1997)を参照のこと。
【０１０２】
更なるＰＣＲベース技術は、例えば、ディファレンシャルディスプレイ(Liang及びPardee, Science 257:967-971 (1992))；増幅断片長多型（ｉＡＦＬＰ）(Kawamoto 等, Genome Res. 12:1305-1312 (1999))；ＢｅａｄＡｒｒａｙ（登録商標）技術 (Illumina, San Diego, CA;  Oliphant 等, Discovery of Markers for Disease  (Supplement to Biotechniques), June 2002；Ferguson等, Analytical Chemistry 72:5618 (2000))；遺伝子発現のための迅速なアッセイで市販のＬｕｍｉｎｅｘ１００ ＬａｂＭＡＰシステム及び多重カラーコードミクロスフィアを使用する遺伝子発現の検出のためのＢｅａｄｓＡｒｒａｙ（ＢＡＤＧＥ）(Luminex Corp., Austin, TX)(Yang等, Genome Res. 11:1888-1898 (2001))；及び高適用範囲の発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ）解析(Fukumura等, Nucl. Acids. Res. 31(16) e94 (2003))を含む。
【０１０３】
ｂ．マイクロアレイ
ディファレンシャル遺伝子発現も、マイクロアレイ技術を用いて同定し、又は確かめることができる。よって、ＩＢＤ関連遺伝子の発現プロファイルを、マイクロアレイ技術を使用して新鮮組織又はパラフィン包埋組織の何れかで測定することができる。この方法では、興味あるポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを含む）をマイクロチップ基板上にプレートし、整列させる。ついで、この整列させた配列を、興味ある細胞又は組織からの特異的ＤＮＡプローブでハイブリダイズする。丁度ＲＴ-ＰＣＲ法のように、ｍＲＮＡのソースは、典型的にはＩＢＤの患者から得られた細胞由来の生検組織又は細胞株、及び対応する正常な組織又は細胞株からの全ＲＮＡである。よって、様々な結腸組織又は結腸組織由来細胞株からＲＮＡを単離することができる。
【０１０４】
マイクロアレイ技術の特定の実施態様では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅挿入部分を高密度アレイの基板へ塗布する。好ましくは、少なくとも１００００のヌクレオチド配列を基板へ塗布する。それぞれ１００００エレメントがマイクロチップ上に固定化された、マイクロアレイ遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適している。蛍光標識ｃＤＮＡプローブは、興味ある組織から抽出したＲＮＡの逆転写によって蛍光ヌクレオチドを取り込むことで作製できる。チップへ塗布した標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上の各スポットのＤＮＡと特異性をもってハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除くためにストリンジェントに洗浄した後、チップを共焦点レーザー顕微鏡によって又はＣＣＤカメラのような他の検出法によってスキャンする。各整列したエレメントのハイブリダイゼーションの定量化によって、対応するｍＲＮＡ発生量の評価が可能となる。二色蛍光によって、２つのソースのＲＮＡから作製した別々の標識ｃＤＮＡプローブを２つ１組でアレイへハイブリダイズする。従って、各特定の遺伝子に対応する２つのソースからの転写物の相対発生量が、同時に決定される。小型化したハイブリダイゼーションのスケールによって、非常に多くの遺伝子に関する発現パターンの簡便で迅速な評価が可能となる。このような方法が、細胞当たり少しのコピーが発現する希な転写物の検出するため、また発現レベルにおける少なくともおよそ２倍の違いを再現可能に検出するために必要とされる感度を有していることが示されている（Schena等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(20): 106-49(1996)）。マイクロアレイ解析は、製造者のプロトコルに従って、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎＣｈｉｐ技術、又はＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術、又はＡｇｉｌｅｎｔの全ヒトゲノムマイクロアレイ技術を使用することによって、市販の装置によって実施することができる。
【０１０５】
ｃ．遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）
遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）は、各転写物に対して個々のハイブリダイゼーションプローブを提供することを要せず、多数の遺伝子転写物の同時の定量解析を可能にせしめる方法である。先ず、タグが各転写物内の独特の位置から得られるとの前提で、転写物をユニークに同定するのに十分な情報を含む短い配列タグ（約１０−１４ｂｐ）が生成される。ついで、多くの転写物を互いに結合させて長い連続の分子を形成し、これを配列決定して、複数タグの同一性を同時に明らかにすることができる。転写物の任意の集団の発現パターンは、個々のタグの存在量を決定し、各タグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価することができる。更なる詳細については、例えばVelculescu等, Science 270:484-487 (1995)；及びVelculescu等, Cell 88:243-51 (1997)を参照のこと。
【０１０６】
ｄ．ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術
ＲＮＡの単離及び逆転写の後に、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ社(San Diego, CA)によって開発されたＭａｓｓＡＲＲＡＹベースの遺伝子発現プロファイリング法では、得られたｃＤＮＡに、単一の塩基を除く全ての位置で標的ｃＤＮＡ領域に一致し内部標準となる合成ＤＮＡ分子（競合体）が添加される。ｃＤＮＡ／競合体混合物をＰＣＲ増幅し、これにＰＣＲ後エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素処理を施し、残りのヌクレオチドの脱リン酸化を生じせしめる。アルカリホスファターゼの不活化後、競合体及びｃＤＮＡからのＰＣＲ産物にプライマー伸長を施し、これが競合体及びｃＤＮＡ駆動ＰＣＲ産物の区別される質量シグナルを生成する。精製後、これらの産物をチップアレイ上に分配し、これを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）での解析に必要なコンポーネントと共に前負荷する。ついで、反応物中に存在するｃＤＮＡを、生成された質量スペクトルにおけるピーク面積の比を解析することによって定量する。更なる詳細については、例えばDing及びCantor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:3059-3064 (2003)を参照のこと。
【０１０７】
ｅ．Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析
Brenner 等, Nature Biotechnology 18:630-634 (2000)によって記載されたこの方法は、非ゲルベースのサイン配列決定を、別個の５ｍｍ径のマイクロビーズでの何百万のテンプレートのインビトロクローニングと組み合わせる配列決定アプローチである。先ず、ＤＮＡテンプレートのマイクロビーズライブラリーがインビトロクローニングによって構築される。これに、高密度(典型的には３×１０６マイクロビーズ／ｃｍ２より多い）でのフローセル中のテンプレート含有マイクロビーズの平面状アレイのアセンブリが続く。各マイクロビーズ上のクローン化テンプレートの遊離端を、ＤＮＡ断片分離を必要としない蛍光ベースのサイン配列決定法を使用して、同時に分析する。この方法は、酵母ｃＤＮＡライブラリーから何十万ものサイン配列を単一の操作で同時にかつ精確に提供することが示されている。
【０１０８】
ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長及び増幅を含むＲＮＡ源として固定したパラフィン包埋組織を使用する遺伝子発現をプロファイリングするための代表的なプロトコルの工程は、様々な刊行されたジャーナル記事（例えば、Godfrey等 J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000)；Specht等, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)）に与えられている。簡単に述べると、代表的な方法は、パラフィン包埋組織試料の約１０ミリグラム厚の切片を切り取ることで始まる。ついで、ｍＲＮＡが抽出され、タンパク質とＤＮＡが取り除かれる。ｍＲＮＡ抽出に関する一般的方法は当該分野でよく知られており、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)を含む分子生物学の標準的な教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出法は、例えば、Rupp及びLocker, Lab Invest. 56:A67 (1987)、及びDe Andres等, BioTechniques 18:42044 (1995)に開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、Ｑｉａｇｅｎ等の商業的製造者の精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを、製造者の指示書に従って使用することで実施することができる。例えば、培養している細胞からの全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用して単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットは、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅａ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ及びＲＮＡ精製キット(EPICENTREO, Madison, WI)、及びパラフィンブロックＲＮＡ単離キット(Ambion, Inc.)を含む。組織試料からの全ＲＮＡは、ＲＮＡ Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離できる。組織から調製したＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離できる。ＲＮＡ濃度の分析後、必要ならば、ＲＮＡ修復及び／又は増幅工程を含めることができ、ＲＮＡは、ＰＣＲの前に、遺伝子特異的プロモーターを使用して逆転写される。好ましくは、各標的配列に対する内部競合体が正規化のために使用される定量的競合ＰＣＲと、試料内に含まれる正規化遺伝子、又はＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較ＰＣＲの双方に匹敵するリアルタイムＰＣＲが使用される。 更なる詳細については、例えば“PCR:  The Polymerase Chain Reaction”, Mullis等編, 1994；及びHeld等, Genome Research 6:986-994 (1996)を参照のこと。最後に、データを解析して、検査した試料中に同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて患者が利用できる最善の治療選択肢を同定する。
【０１０９】
ｆ．免疫組織化学
免疫組織化学法はまた本発明のＩＢＤマーカーの発現レベルを検出するのに適している。よって、抗体又は抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、最も好ましくは各マーカーに特異的なモノクローナル抗体が発現の検出に使用される。抗体は、例えば、放射標識、蛍光標識、ハプテン標識、例えばビオチンを用いて抗体自体の直接的標識によって、又は西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼのような酵素によって、検出することができる。あるいは、未標識一次抗体が、抗血清、ポリクローナル抗血清又は一次抗体に特異的なモノクローナル抗体を含む、標識二次抗体との関連で使用される。免疫組織化学プロトコル及びキットは当該分野でよく知られており、商業的に入手可能である。
発現レベルはまた例えば様々なタイプのイムノアッセイ又はプロテオミクス技術を使用して、タンパク質レベルで決定することができる。
【０１１０】
イムノアッセイでは、標的診断タンパク質マーカーは、マーカーに特異的に結合する抗体を使用して検出される。抗体は典型的には検出可能な部分で標識される。一般に次の範疇に分類できる数多くの標識が利用できる：
放射性同位体、例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ。抗体は、例えばCurrent Protocols in Immunology, 1及び2巻, Coligen等編, (1991) Wiley-Interscience, New York, Pubs.に記載された技術を用いて放射性同位体で標識され、放射能はシンチレーションカウンターを使用して測定できる。
蛍光標識、例えば希土類キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、リサミン(Lissamine)、フィコエリトリン及びテキサスレッドが利用できる。蛍光標識は、例えば上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示された技術を用いて抗体にコンジュゲートさせることができる。蛍光は蛍光光度計によって定量できる。
【０１１１】
様々な酵素−基質標識が利用でき、米国特許第４２７５１４９号は、これらの幾つかの概説を提供している。酵素は一般に様々な技術を用いて測定可能な色素原基質の化学変換を触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒し、それは分光学的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光又は化学発光を変化させうる。蛍光変化を定量する技術は上述した。化学発光基質は化学反応によって電子的に励起され、ついで（例えば化学発光計を用いて）測定されうる光を放出するか、又は蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-ホスフェートデヒドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が含まれる。酵素を抗体に結合させる技術は、O'Sullivan等 (1981) Methods for Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone及びH. Van Vunakis編), Academic press, New York, 73: 147-166に記載されている。
【０１１２】
酵素−基質の組み合わせの例は、例えば以下を含む：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての過酸化水素で、過酸化水素が染料前駆物質（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）又は３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と色素原基質としてのパラ-ニトロフェニルホスフェート；及びβ-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）と色素原基質（例えば、ｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光原基質４-メチルウンベリフェリル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ。
数多くの他の酵素−基質の組み合わせが当業者には利用可能である。これらの一般的な概説は、米国特許第４２７５１４９号及び第４３１８９８０号を参照のこと。
【０１１３】
標識は抗体に間接的に結合される場合もある。当業者であれば、これを達成するための様々な技術を知っているであろう。例えば、抗体をビオチンに結合させ、上述した３つの広い範疇の標識の何れかをアビジンに結合させるか、又はその逆が可能である。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、よってこの間接的な方式で抗体に標識をコンジュゲートさせることができる。あるいは、抗体との標識の間接的な結合を達成するために、抗体に小さなハプテン（例えばジゴキシン）をコンジュゲートさせ、上述の異なるタイプの標識を抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）にコンジュゲートさせる。よって、抗体との標識の間接的なコンジュゲートを達成できる。
イムノアッセイ技術の他の型では、抗体は標識される必要はなく、その存在が、抗体に結合する標識抗体を用いて検出されうる。
よって、ここでの診断イムノアッセイは、例えば競合結合アッセイ、直接及び間接サンドウィッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイを含む任意のアッセイ形式でありうる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。
【０１１４】
競合結合アッセイは、限られた量の抗体との結合について試験試料分析物と競合する標識標準物質の能力に依存する。試験試料中の抗原の量は抗体に結合するようになる標準物質の量に反比例する。結合するようになる標準物質の量の決定を容易にするために、抗体は一般に競合の前又は後に不溶化され、抗体に結合する標準物質と分析物が未結合のままの標準物質と分析物から簡便に分離されうる。
サンドウィッチアッセイは、それぞれが検出されるタンパク質の異なった免疫原性部分又はエピトープに結合可能である二つの抗体の使用を含む。サンドウィッチアッセイでは、試験試料分析物に、固形担体に固定された第一抗体が結合し、その後、第二抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３部分複合体を形成する。例えば米国特許第４３７６１１０号を参照のこと。第二抗体自体は検出可能な部分で標識され（直接的サンドウィッチアッセイ）、又は検出可能な部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定されうる（間接的サンドウィッチアッセイ）。例えば、サンドウィッチアッセイの一つのタイプは、検出可能な部分が酵素であるＥＬＩＳＡアッセイである。
【０１１５】
ｇ．プロテオミクス
「プロテオーム」なる用語は、ある時点での試料（例えば組織、生物、又は細胞培養物）中に存在するタンパク質の全体として定義される。 プロテオミクスは、とりわけ、試料中のタンパク質発現の網羅的変化の研究を含む（「発現プロテオミクス」とも称される）。プロテオミクスは典型的には次の工程を含む：    (1) 2-D ゲル電気泳動(2-D PAGE)による試料中の個々のタンパク質の分離; (2) 例えば質量スペクトル又はＮ末端配列決定によるゲルから回収された個々のタンパク質の同定、及び(3)バイオインフォマティクスを使用するデータ解析。プロテオミクス法は、遺伝子発現プロファイリングの他の方法に対する貴重な補充手段であり、単独で又は他の方法と組み合わせて、本発明のマーカーの産物を検出するために使用することができる。
【０１１６】
ｈ．逆転写の５’−マルチプレックス遺伝子特異的プライミング
ＲＴ−ＰＣＲは第一工程として試験ＲＮＡ集団の逆転写を必要とする。逆転写のために最も一般的に使用されるプライマーはオリゴ−ｄＴであり、これはＲＮＡがインタクトな場合に良好に機能する。しかしながら、このプライマーは、ＲＮＡが高度に断片化されている場合は効果的ではないであろう。
本発明は、５８℃と６０℃の間に最適なＴｍを有し大ざっぱに２０塩基長である遺伝子特異的プライマーの使用を含む。これらのプライマーはまたＰＣＲ  ＤＮＡ増幅を駆動する逆方向プライマーとなる。
代替アプローチ法は、ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとしてランダムヘキサマーを使用することに基づいている。しかしながら、我々は、多重の遺伝子特異的プライマーの使用方法がランダムヘキサマーを使用する既知のアプローチ法よりも優れていることを実験的に証明した。
【０１１７】
ｉ．プロモーターメチル化分析
ＲＮＡ転写物（遺伝子発現解析）又はそのタンパク質翻訳産物の多くの定量方法をここで検討する。遺伝子の発現レベルは、例えば遺伝子プロモーター及び他の調節エレメントのメチル化状態及びヒストンのアセチル化状態のようなクロマチン構造に関する情報から推測することもできる。
特に、プロモーターのメチル化状態はそのプロモーターによって調節される遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす。特定の遺伝子プロモーターの異常なメチル化は、例えば腫瘍抑制因子遺伝子のサイレンシングのような発現調節に関係していた。よって、遺伝子のプロモーターのメチル化状態の検査はＲＮＡレベルの直接の定量の代替として利用することができる。
メチル化特異的ＰＣＲ(Herman J.G.等(1996) Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 93, 9821-9826.)及び亜硫酸水素ＤＮＡ配列決定(Frommer M.等(1992) A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 89, 1827-1831.)を含む特定のＤＮＡエレメントのメチル化状態を測定するための幾つかのアプローチ法が案出されている。更に最近では、マイクロアレイベースの技術がプロモーターメチル化状態を特徴付けるために使用されている(Chen C.M. (2003) Methylation target array for rapid analysis of CpG island hypermethylation in multiple tissue genomes. Am. J. Pathol. 163, 37-45.)。
【０１１８】
ｊ．遺伝子の同時発現
本発明の更なる態様は遺伝子発現クラスターの同定である。遺伝子発現クラスターは、ピアソン相関係数に基づく相関の対解析(Pearson K.及びLee A. (1902) Biometrika 2, 357)を含む当該分野で知られている統計解析法を使用する発現データの解析によって同定することができる。
一実施態様では、ここで同定された発現クラスターは、左結腸でアップレギュレートされた遺伝子を含む（図１）。
他の実施態様では、ここで同定された発現クラスターは、右結腸でアップレギュレートされた遺伝子を含む（図１）。
他の一実施態様では、ここで同定された発現クラスターは、回腸末端でアップレギュレートされた遺伝子を含む（図１）。
他の実施態様では、ここで同定された発現クラスターは、ＩＢＤ２遺伝子座（表７）又はＩＢＤ５遺伝子座（表８）に遺伝子を含む。
ある実施態様では、ここで同定された発現クラスターは、免疫応答下で分類された遺伝子を含む。
他の実施態様では、ここで同定された発現クラスターは、創傷への応答下で分類される遺伝子を含む。
【０１１９】
ｋ．イントロンベースのＰＣＲプライマー及びプローブの設計
本発明の一態様によれば、増幅される遺伝子中に存在するイントロン配列に基づいてＰＣＲプライマー及びプローブが設計される。従って、プライマー／プローブ設計の第一工程は遺伝子内のイントロン配列の 描写である。これは、公に入手可能なソフトウェア、例えばKent, W.J., Genome Res. 12(4):656-64 (2002)によって開発されたＤＮＡ ＢＬＡＴソフトウェア、あるいはその変形形を含むＢＬＡＳＴソフトウェアによって行うことができる。ＰＣＲプライマー及びプローブ設計の十分に確立された方法が次の工程として続く。
非特異的シグナルを避けるために、プライマーとプローブを設計する場合、イントロン内において反復配列をマスクすることが重要である。これは、反復エレメントのライブラリーに対してＤＮＡ配列をスクリーニングし、反復エレメントがマスクされる問い合わせ配列を返すベイラー医科大学からオンラインで入手可能なＲｅｐｅａｔ Ｍａｓｋｅｒプログラムを使用して容易に達成することができる。ついで、マスクされたイントロン配列を使用し、例えばＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ(Applied Biosystems)；ＭＧＢアッセイ−バイ−デザイン(Applied Biosystems)；プライマー３(Steve Rozen及びHelen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S編 Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)のような任意の商業的に又は他の好適に入手できるプライマー／プローブ設計パッケージを使用して、プライマー及びプローブ配列を設計することができる。
【０１２０】
ＰＣＲプライマー設計で考慮される最も重要な因子は、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、及びＧ／Ｃ含有量、特異性、相補的プライマー配列、及び３’末端配列を含む。一般に、最適なＰＣＲプライマーは、一般に１７−３０塩基長であり、約２０−８０％、例えば約５０−６０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。５０から８０℃の間、例えば約５０から７０℃のＴｍが典型的には好ましい。
ＰＣＲプライマー及びプローブ設計のための更なる指針については、その開示全体が出典明示によりここに明示的に援用される例えばDieffenbach, C.W.等, “General Concepts for PCR Primer Design” in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155；Innis 及びGelfand, “Optimization of PCRs” in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11；及びPlasterer, T.N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70:520-527 (1997)を参照のこと。
【０１２１】
ｌ．ＩＢＤ遺伝子セット、アッセイした遺伝子サブ配列、及び遺伝子発現データの臨床的利用
本発明の重要な態様は、結腸組織によるある種の遺伝子の測定した発現を使用して、診断情報を提供することである。この目的のために、アッセイされたＲＮＡの量の差と使用されたＲＮＡの質の変動の双方について修正する（標準化する）ことが必要である。従って、該アッセイは、よく知られたハウスキーピング遺伝子、例えばＧＡＰＦＤＨ及びＣｙｐ１を含むある種の基準化遺伝子の発現を典型的には測定し取り込む。あるいは、基準化はアッセイされた遺伝子の全て又はその大きなサブセットの平均又は中央値シグナル（Ｃｔ）に基づくことができる（包括的正規化アプローチ）。遺伝子毎のベースで、患者の結腸組織ｍＲＮＡの測定された基準化量が、適切な組織参照セットに見出される量と比較される。この参照セット中の組織の数（Ｎ）は、異なった参照セットが（全体として）本質的に同じように挙動するようにするためには十分に多くしなければならない。この条件が満たされる場合、特定のセットに存在する個々の結腸組織の同一性はアッセイされる遺伝子の相対量に有意な影響は持たないであろう。通常、組織参照セットは少なくとも約３０，好ましくは少なくとも約４０の異なったＩＢＤ組織検体からなる。別の記載がなされない限り、各ｍＲＮＡ／試験組織／患者の正規化発現レベルは、参照セットにおいて測定された発現レベルの割合として表される。より詳細には、ＩＢＤ試料の十分に多い数（例えば４０）の参照セットが、各ｍＲＮＡ種の正規化レベルの分布を生じる。分析される特定の試料において測定されるレベルはこの範囲内のあるパーセンタイルになり、これは当該分野でよく知られた方法によって決定することができる。以下、別段の記載がない場合は、遺伝子の発現レベルに対する参照は、これは常に明示的に述べるとは限らないが、参照セットに対して正規化された発現を想定する。
【０１２２】
ｍ．抗体の産生
本発明は抗ＩＢＤマーカー抗体を更に提供する。例示的な抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性、及びヘテロコンジュゲート抗体が含まれる。ここで検討したように、抗体はＩＢＤの診断方法において、ある場合にはＩＢＤの治療方法において使用されうる。
【０１２３】
（１）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射することにより動物に産生されうる。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲによりコンジュゲートさせることが有用でありうる。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１か月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【０１２４】
（２）モノクローナル抗体
ここでのモノクローナル抗体を作製するための様々な方法が当該分野で利用できる。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いてミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
【０１２５】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親のミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を含みうる適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親のミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失しているならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むであろう（ＨＡＴ培地）。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞には、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション、Rockville, Maryland USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものが含まれる。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；及びBrodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０１２６】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０１２７】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて（例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
【０１２８】
更なる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
ＤＮＡはまた、例えばヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０１２９】
（３）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法の例は当該分野で記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は非ヒト由来のものに導入した一又は複数のアミノ酸残基を有する。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる（Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536(1988)）。ヒト化は、本質的には、ウィンター及び共同研究者（Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って、高頻度可変領域配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施されうる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかの高頻度可変領域残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。ＩＢＤを治療するために使用されるヒト化抗体の例は、操作されたマウス−ヒトキメラモノクローナル抗体であるインフリキシマブ（レミケード（登録商標））である。抗体はサイトカインＴＮＦ−αに結合し、そのレセプターへの結合を防止して炎症反応を惹起し維持する。インフリキシマブはＣＤとＵＣの双方を治療するために使用される。
【０１３０】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【０１３１】
抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが更に重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは入手可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性を高めるといった、望ましい抗体特徴が得られるように、ＦＲ残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗体の様々な形態が考えられる。例えば、ヒト化抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、場合によっては免疫コンジュゲートを作成するために一又は複数の細胞傷害剤とコンジュゲートされたものであってもよい。あるいは、ヒト化抗体又は、親和性成熟抗体は、インタクトな抗体、例えばインタクトなＩｇＧ１抗体であってもよい。
【０１３２】
（４）ヒト抗体
ヒト化の代わりにヒト抗体を産生することができる。例えば、内在性の免疫グロブリン産生がない状態で、ヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作ることが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合欠損が内因性抗体産生を完全に阻害することが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列イムノグロブリン遺伝子列の移入は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例としてJakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggermann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５９１６６９号、第５５８９３６９号及び第５５４５８０７号を参照。あるいは、ファージディスプレイ技術（McCafferty等, Nature 348：552-553(1990)）を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３またはｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子の何れかにインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片としてディスプレイさせる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性の幾つかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントの幾つかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダムコンビナトリアルライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に従って単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
上で検討したように、ヒト抗体はまたインビトロ活性化Ｂ細胞により産生されうる（米国特許第５５６７６１０号及び同第５２２９２７５号を参照）。
【０１３３】
（５）抗体断片
一又は複数の抗原結合領域を含む抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上記した抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は熟練した実務者に明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は一本鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような直鎖状抗体であってもよい。このような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。
【０１３４】
（６）二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的二重特異性抗体はＩＢＤマーカータンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。二重特異性抗体はＩＢＤマーカータンパク質を発現する細胞に薬剤を局在化させるために使用することもできる。
これらの抗体はＩＢＤマーカー結合アームと薬剤(例えば、アミノサリチル酸)に結合するアームを有している。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えばF(ab')2 二重特異性抗体)として調製することができる。
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において知られている。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０１３５】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが好ましい。免疫グロブリン重鎖の融合体と、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の一実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１３６】
米国特許第５７３１１６８号に開示された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１３７】
二特異性抗体は架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合しうる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／００３７３号及び欧州特許出願公開第０３０８９号)への用途が提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の簡便な架橋方法によって作製できる。適切な架橋剤は当該分野において周知であり、多くの架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) はインタクトな抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')<SUB>２</SUB>断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生産された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化のための薬剤として使用することができる。
【０１３８】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作製する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片の製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１３９】
（７）他のアミノ酸配列の修飾
ここに記載された抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製されうる。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入及び置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、またグリコシル化部位の数又は位置を変化させるなど、抗体の翻訳後プロセスを変更してもよい。
突然変異誘発に好ましい位置である抗体のある種の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWells Science, 244:1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基又は残基の組が同定され(例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電した残基)、中性の又は負に荷電したアミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。ついで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、更なる又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、与えられた部位における突然変異のパーフォーマンスを分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実施し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
【０１４０】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ末端融合及び／又はカルボキシ末端融合、並びに単一又は複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。端末挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体又は細胞傷害性ポリペプチドに融合させた抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴのための)酵素への抗体のＮ末端又はＣ末端の融合が含まれる。
【０１４１】
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換された抗体分子に少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。置換突然変異について最も興味ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ改変も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、次表に「例示的置換」と題した又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
【０１４２】
2011509071.tif 000009
【０１４３】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす置換を選択することにより達成される。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる(A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：無極性：Ａｌａ（Ａ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｌｅｕ（Ｌ），Ｉｌｅ（Ｉ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），Ｔｒｐ（Ｗ），Ｍｅｔ（Ｍ）；無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ），Ｓｅｒ（Ｓ），Ｔｈｒ（Ｔ），Ｃｙｓ（Ｃ），Ｔｙｒ（Ｙ），Ａｓｎ（Ｎ），Ｇｌｎ（Ｑ）；酸性：Ａｓｐ（Ｄ），Ｇｌｕ（Ｅ）；及び塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ），Ａｒｇ（Ｒ），Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０１４４】
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０１４５】
抗体の適切な高次構造を維持するために関与しない任意のシステイン残基も、一般的には、セリンと置換して、分子の酸化的安定性を改善して、異常な架橋を防いでもよい。逆に、システイン結合を抗体に付加して、その安定性を改善してもよい(特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合)。
ある好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、更なる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異である。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子III産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択することができる。
【０１４６】
二以上（好ましくは４の）機能的抗原結合部位を有する操作された抗体もまた考えられる（Miller等の米国特許出願公開第２００２／０００４５８７Ａ１号）。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介性(又は部位特異的)突然変異による調製、ＰＣＲ突然変異誘発、及び前もって調製された変異体又は抗体の非変異型のカセット変異導入法を含むが、これらに限定されない。
【０１４７】
Ｂ．３  発明のキット
本発明の方法で使用するための材料は、良く知られた手順に従って生産されるキットの調製に適している。よって、本発明は、ＩＢＤに対する開示された遺伝子の発現を定量するための遺伝子特異的又は遺伝子選択的プローブ及び／又はプライマーを含みうる薬剤を含むキットを提供する。このようなキットは、場合によっては、試料、特にパラフィン包埋組織試料からＲＮＡを抽出するための試薬、及び／又はＲＮＡ増幅のための試薬を含みうる。加えて、キットは、本発明の方法での使用に関する記載又はラベル又は指示書と共に試薬を含んでいてもよい。該キットは、例えば、それぞれ、前もって製造されたマイクロアレイ、バッファー、適切なヌクレオチド三リン酸（例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；又はｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ及びＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及び本発明の一又は複数のプローブ及びプライマー（例えばＲＭＡポリメラーゼと反応性のプロモーターに結合した適切な長さのポリ（Ｔ）又はランダムプライマー）を含む該方法で利用される（典型的には濃縮形態の）様々な試薬の一又は複数と共に、（方法の自動化された実施に使用するのに適したマイクロタイタープレートを含む）容器を含みうる。
【０１４８】
Ｂ．４  発明のレポート
この発明の方法は、商業的な診断目的に対して実施される場合、選択された遺伝子の一又は複数の正規化された発現レベルのレポート又はまとめを一般に作成する。この発明の方法及びレポートは、データベース中にレポートを保存することを更に含みうる。あるいは、該方法は、被検者のためにデータベース中に記録を更に作成し、記録にデータを追加することができる。 一実施態様では、レポートは紙のレポートであり、他の実施態様では、レポートは聴覚性レポートであり、他の実施態様では、レポートは電子的レポートである。レポートは医師及び／又は患者に提供されることが考えられる。レポートの受領は、データ及びレポートを含むサーバーコンピュータにネットワーク接続を樹立し、サーバーコンピュータからデータ及びレポートを要求することを更に含みうる。
本発明によって提供される方法はまた全体を又は部分的に自動化することもできる。
【０１４９】
本発明の全ての態様は、開示された遺伝子に加えて、及び／又はその代わりに、例えば高いピアソン相関係数によって裏付けられているように、開示された遺伝子と同時発現される限られた数の更なる遺伝子が予後又は予想試験に含められるようにまた実施することができる。
【０１５０】
本発明を記載したが、本発明は、例示のために提供され、発明を限定するものでは決してない次の実施例を参照すると、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１５１】
実施例１−マイクロアレイ解析
臨床的に、ＩＢＤは、しばしば慢性的な予測できない経過を生じる多様な徴候によって特徴付けられる。血性下痢及び腹痛はしばしば熱及び体重減少を伴う。貧血は重度の疲労のように一般的である。関節痛から急性関節炎にわたる関節の症状並びに肝機能の異常が通常ＩＢＤに伴う。ＩＢＤの患者はまた一般の集団と比較して結腸癌のリスクが高い。ＩＢＤの急性の「攻撃」の間、仕事や他の正常な活動は通常不可能であり、患者はしばしば入院させられる。
【０１５２】
ＩＢＤの原因は依然として不明であるが、遺伝、感染、及び免疫的感受性等の複数の要因が関係している。ＩＢＤは白人、特にユダヤ系の白人家系においては更に一般的である。症状が慢性的炎症性の性質であることにより、感染的原因の可能性に対する熱心な調査が急ぎ行われた。急性炎症を刺激する物質は見つかったものの、ＩＢＤに関連して慢性的炎症の原因となるものは見つかっていない。ＩＢＤが自己免疫性疾患であるという仮説は、関節炎などのようにこれまでに述べられたＩＢＤの腸外出現と、免疫反応を抑制することが知られている副腎性グルココルチコイド、シクロスポリン及びアザチオプリン等の治療薬を用いた治療によるＩＢＤに対する既知のポジティブな反応により支持されている。加えて、胃腸管は、身体の他のどの器官よりも、食物由来のタンパク質、細菌性副産物（ＬＰＳ）等の潜在的な抗原性物質に連続的に曝されている。ＩＢＤのサブタイプはＵＣとＣＤである。
【０１５３】
ＣＤは、炎症が腸管壁の全層にわたって広がり、腸間膜並びにリンパ節を含む点でＵＣとは異なる。ＣＤは口から肛門まで消化管の至る所で発生しうる。該疾病はしばしば非連続的であり、つまり、腸の重篤に罹患しているセグメントが明らかに疾患がない領域とは離れている。ＣＤでは、腸壁がまた厚くなり、これが閉塞に至るおそれがある。更に、瘻孔及び裂溝は珍しくはない。
【０１５４】
ＵＣ及びＣＤの双方とも、罹患領域を示す内視鏡検査により、典型的には診断される。しかしながら、マイクロアレイ技術の使用は、ＵＣの分子病理学に光明を投じるものである。２０００年に公開された研究では、８人のＵＣ患者を分析するためにマイクロアレイ技術が使用されている。(Dieckgraefeら, Physiol. Genomics 2000; 4:1-11)。６５００の遺伝子がこの研究で分析され、結果として、以前よりＵＣ病変形成に関係している遺伝子、すなわちＩＬ-１、ＩＬ-１ＲＡ及びＩＬ-８の発現が増加していることが確認された。粘膜生検を少量切り取る能力を組み合わせた内視鏡診断により、研究者が、マイクロアレイ解析を使用してＵＣを更に診断することが可能となり、研究者が、正常な組織に対して罹患領域を分析し、様々な程度の重症度を有するより広い範囲の患者からの組織を分析することが可能となる。大腸及び回腸末端の肉眼では罹患していない領域の生検を、マイクロアレイ解析した。(Langmanら, Gastroent. 2004; 127:26-40)。Langmanは２２２８３の遺伝子を分析し、細胞解毒に関与している遺伝子、例えばプレグナンＸレセプター及びＭＤＲ１が、ＵＣの患者の結腸において有意にダウンレギュレートされたが、ＣＤの患者におけるこれら遺伝子の発現に変化はなかった。
【０１５５】
しばしば何千もの遺伝子配列を含む核酸マイクロアレイは、その正常な対応物と比較して、病変組織において差次的に発現した遺伝子を同定するのに有用である。核酸マイクロアレイを使用し、試験用及びコントロール組織試料からの試験及びコントロールｍＲＮＡ試料を逆転写させ、標識してｃＤＮＡプローブを作製する。次に、ｃＤＮＡを、固体担体に固定された核酸のアレイにハイブリダイズさせる。アレイの各メンバーの配列と位置が分かるようにアレイを設定する。例えば、ある疾患状態で発現することが知られている遺伝子の選択物が固体担体上に整列されうる。特定のアレイメンバーとの標識プローブのハイブリダイゼーションは、プローブが派生した試料がその遺伝子を発現することを示す。試験用(例えば病変組織)試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルが、コントロール、正常組織の試料からのプローブのハイブリダイゼーションシグナルよりも大きいならば、病変組織で過剰発現した遺伝子又は遺伝子群が同定される。この結果から示唆されることは、病変組織において過剰発現したタンパク質は、病状の存在についての診断マーカーとしてのみでなく、病状の処置の治療標的としても有用であることである。
【０１５６】
核酸のハイブリダイゼーション及びマイクロアレイ技術の方法は、当該分野でよく知られてる。一例において、ハイブリダイゼーション用の核酸の特定の調製、及びプローブ、スライド、及びハイブリダイゼーション条件は、ここに出典明示により援用される２００１年３月３０日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１０４８２号に詳述されている。
【０１５７】
マイクロアレイ解析を、正常な腸組織と比較して、ＣＤにおいて過剰発現している遺伝子を見出すのに使用した。この研究では、ＣＤを患っている６７人の患者と、大腸内視鏡検査を受けた３１人のコントロール患者を採用した。患者の病状を単純な臨床大腸炎活性指数（ＳＣＣＡＩ）（Walmsley等 Gut. 1998;43:29-32）を使用し、大腸内視鏡の時間で評価した。組織学的炎症を示さない静止状態の病気は、ＳＣＣＡＩが２又はそれ未満のものであると定義した。組織学的に急性又は慢性の炎症を有する活性な病気は、ＳＣＣＡＩが２より大であると定義した。ＣＤそれ自体の重症度は、Leonard-Jonesの判断基準により決定した(Lennard-Jones Scand. J. Gastroent. 1989; 170:2-6)。分子レベルで、ＣＤの炎症経路を分析するために、ＣＤ患者からは、十分な表現型の生検が提供され、よって治療介入のための、新規の候補遺伝子及び潜在的経路を同定した。対にした生検を、各解剖学的位置から取り出した。
【０１５８】
全ての生検を、ＲＮＡ単離の準備ができるまで−７０℃で保存した。生検を６００μｌのＲＬＴバッファー(＋ＢＭＥ)中でホモジナイズし、製造者のガイドラインに従い、オンカラムＤＮアーゼ処理と共にQiagenＴＭ Rneasy Mini columns (Qiagen)を使用して、ＲＮＡを単離した。ＲＮＡの単離後、製造者のガイドラインに従いRiboGreenＴＭ(Molecular Probes)を使用してＲＮＡを定量し、完全性をアガロースゲルでチェックした。適切な量のＲＮＡをマイクロアレイ解析用に標識し、試料を、私有のGenentechマイクロアレイ及びAffymetricsＴＭマイクロアレイで操作した。その発現が正常な腸に対してＵＣ組織でアップレギュレートされていた遺伝子を比較し、同じ患者からのＣＤ組織と正常な腸からの生検をマッチさせた。この実験の結果、表１Ａ、１及び２Ａ(上に提供)に示される核酸が、正常な組織と比較して、ＣＤ及び／又はＵＣ組織において差次的に発現されていることが示された。
【０１５９】
表１Ａ-１Ｂに列挙された遺伝子は、最小で１．５倍の発現差を示し、また許容可能な程度のプローブハイブリダイゼーション強度が観察された。表２に列挙された遺伝子は、約０．６５の最小群内ピアソン相関を有することが見出され、遺伝子発現の３倍のアップレギュレーションが観察された。
【０１６０】
より詳細には、表１Ａ及び２に列挙された配列番号は、ＣＤ及び／又はＵＣにおいて有意にアップレギュレートされ／過剰発現したポリヌクレオチド及びそれらのコードされたポリペプチドを表す。
表１Ｂに列挙された配列番号は、ＣＤ及び／又はＵＣにおいて有意にダウンレギュレートされ／過小発現したポリヌクレオチド及びそれらのコードされたポリペプチドを表す。
表３Ａに列挙された配列番号は、ＵＣにおいて有意にアップレギュレートされ／過剰発現したポリヌクレオチド及びそのコードされたポリペプチドを表す。
表３Ｂに列挙された配列番号は、ＵＣにおいて有意にダウンレギュレートされ／過小発現したポリヌクレオチド及びそれらのコードされたポリペプチドを表す。
【０１６１】
実施例２：マイクロアレイ解析による潰瘍性大腸炎における明確な腸遺伝子発現プロファイルの特徴付け
マイクロアレイ解析により、細胞レベルでの遺伝子発現の包括的画像が可能になった。この研究の目的は、潰瘍性大腸炎(ＵＣ)を患っている患者及びコントロールの差次的腸遺伝子発現を研究することである。
【０１６２】
方法：６７人のＵＣ及び３１人のコントロール患者−内２３人は正常で８人は炎症性の非炎症性腸疾患の患者で研究した。対となった内視鏡生検を、ＲＮＡ抽出及び組織診断用に、５つの特異的な解剖学的部位から取り出した。４１０５８の発現配列タグを、Ａｇｉｌｅｎｔプラットフォームを使用し、２１５の生検で分析した。結果の確認を、リアルタイムＰＣＴ及び免疫組織化学的検査により行った。結果：健常なコントロール生検において、クラスター分析では、右と左の結腸との間の遺伝子発現において差異が見られた。(χ２＝２５．１、ｐ＜０．０００１)。先ず、発生遺伝子 ＨＯＸＡ１３(ｐ＝２．３×１０−１６)、ＨＯＸＢ１３(ｐ＜１×１０−４５)、ＧＬＩ１(ｐ＝４．０×１０−２４)、及びＧＬＩ３ (ｐ＝２．１×１０−２８)が主にこの分離を駆動した。全てのＵＣ生検及びコントロール生検を比較したところ、１４３の配列ではＵＣ生検において＞１．５の倍率変化があり(０．０１＞ｐ＞１０−４５)、５４の配列では＜−１．５の倍率変化があった(０．０１＞ｐ＞１０−２０)。ＵＣ遺伝子おいて差次的にアップレギュレートされるものには、ＳＡＡ１(ｐ＜１０−４５)αデフェンシン、ＤＥＦＡ５及び６(それぞれｐ＝０．００００３及びｐ＝６．９５×１０−７)、ＭＭＰ３(ｐ＝５．６×１０−１０)及びＭＭＰ７(ｐ＝２．３×１０−７)が含まれる。増加したＤＥＦＡ５及び６発現を、免疫組織化学的検査及びインサイツハイブリダイゼーションにより、パネート細胞異形成に対して、更に特徴付けした。ＩＢＤ２及びＩＢＤ５遺伝子座、及びＡＢＣトランスポーター遺伝子のサブ分析により、ＵＣ生検における差次的に調節された多くの遺伝子が明らかになった。結論：これらのデータは、新規の多くの遺伝子ファミリー、並びにＵＣ病変形成において実証された候補遺伝子に関連しており、潜在的な治療標的の特徴付けが可能となり得る。
【０１６３】
本研究の目的は、マイクロアレイ遺伝子発現解析を使用し、ＵＣを患っている患者及びコントロールの内視鏡粘膜生検におけるゲノムにわたる発現を研究することである。先の矛盾を解決し、更にＵＣにおける炎症経路を描写するために、過去の研究よりも大幅に多くの患者及び生検を含めた。
【０１６４】
材料及び方法
患者及びコントロール。ＵＣを患っている６７人の患者と３１人のコントロール患者で、大腸内視鏡検査を受けた者を採用した。それぞれのデモグラフィックを表４に示す。
2011509071.tif 000010
【０１６５】
ＵＣを患っている６７人の患者と３１人のコントロール患者で、大腸内視鏡検査を受けた者を採用した(表４)。全てのＵＣ患者をエジンバラのWestern General Hospitalの診療所で看護し、ＵＣの診断をLennard-Jonesの判断基準を順守した(Lennard-Jones JE. Scand J Gastroenterol Suppl 1989;170:2-6)。表現型データを問診及び症例記録問診により収集し、該データは、デモグラフィック、診断日、病気の位置、病気性状、進行度、腸外徴候、外科手術、現在の投薬、喫煙歴、関節症状、家系及び民族性からなる。内視鏡検査時に、単純な臨床大腸炎活性指数(ＳＣＣＡＩ)を使用し、患者の症状を評価した(Walmsley等 Gut. 1998;43:29-32)。
【０１６６】
大腸内視鏡検査をそれらの指数提示の時間で実施し、経口／ＩＶ治療の２４時間未満であるならば、患者を、ＵＣの「新規の診断」と記録した。静止状態の病気を、ＳＣＣＡＩが２又はそれ未満のものであると定義し、炎症を示さない又は軽度の慢性の炎症を示す組織診断及び急性の疾患を、ＳＣＣＡＩが２を越えるものであると定義し、急性又は慢性の炎症を示す組織診断も同様とした。
【０１６７】
コントロールの１１人は男性であり、２０人は女性で、内視鏡検査時に年齢中位数は４３であった。コントロールの６人は大腸癌スクリーニング用の通常の大腸内視鏡検査を受け、９人のコントロールは過敏性腸症候群と一致した症状を示し、通常の大腸鏡検査研究を受け、７人の患者は他の徴候についての大腸内視鏡検査を受け、組織学的に正常な生検を得た。８人のコントロール患者は、異常な炎症性大腸生検(１人は偽膜性大腸炎、１人は憩室炎、１人はアメーバ症、２人は顕微鏡的大腸炎、１人はエオシン好性浸潤、２人は散在性リンパ凝集(scattered lymphoid aggregates)及び胃腸炎の病歴)を患っている。全ての患者から書面によるインフォームドコンセプトを得た。 Lothian Local Research Ethics Committeeが研究プロトコルを承認した: REC 04/S1103/22。
【０１６８】
生検収集。解剖学的部位を、熟練した施術者、Scope GuideＴＭを使用しての内視鏡の挿入距離及び内視鏡配置により確認した。対となった生検を各解剖学的部位から取り出した。一方の生検を組織学的検査に送り、他方を、ＲＮＡ抽出用に液体窒素で簡易冷凍した(snap frozen)。熟練した胃腸病理学者により、各生検を、炎症の証拠がないもの、慢性の炎症及び優位の慢性炎症性細胞浸潤の症候のある生検、又は単純に急性炎症及び急性炎症性細胞浸潤を有するものに、組織学的に等級分けした。１３９の対になったＵＣ生検と７６の対になったコントロール生検を収集した。解剖学的部位からの、ＵＣ患者及びコントロールにおける対になった生検の数を表５に示す。
2011509071.tif 000011
【０１６９】
ＲＮＡ単離。重量中位数５．５ｍｇを有する、０．２ｍｇと１６．５ｍｇの間の生検を計量した。製造者の使用説明書に従い動物組織プロトコルからマイクロトータルＲＮＡ単離を使用し、各生検から全ＲＮＡを抽出した(Qiagen, Valencia, CA)。１μｌの全ＲＮＡの純度及び完全性を評価するために、Pico LabChip試薬(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)を使用するＡｇｉｌｅｎｔテクノロジーズ２１００バイオアナライザーを用い、各試料を評価した。
【０１７０】
マイクロアレイ解析。１μｇの全ＲＮＡを、低ＲＮＡインプット蛍光線形増幅プロトコル(Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification protocol)(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)を使用して増幅させた。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの一回の線形増幅を実施し、ｃＲＮＡにシアニン-３及びシアニン-５標識を導入した。ＲＮイージーミニキット(RNeasy Mini Kit)(Qiagen, Valencia, CA)を使用し、ｃＲＮＡを精製した。ナノドロップ(NanoDrop)ＮＤ-１０００分光光度計(NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware)を使用し、１μｌのｃＲＮＡを定量した。
【０１７１】
シアニン-３で標識化された７５０ｎｇのユニバーサル・ヒューマン・リファレンス(Universal Human Reference)(Stratagene, La Jolla, CA)のｃＲＮＡ、及びシアニン-５で標識化７５０ｎｇの試験用試料のｃＲＮＡを６０℃で３０分断片化し、Ａｇｉｌｅｎｔ・ホール・ヒューマン・ゲノム・マイクロアレイ(Agilent Whole Human Genome microarrays)(Agilent technologies, Palo Alto, CA)に充填した。一定に回転させつつ、６０℃で１８時間、試料をハイブリダイズさせた。マイクロアレイを洗浄し、乾燥させ、製造者のプロトコル(Agilent technologies, Palo Alto, CA)に従い、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナーにおいてスキャンした。マイクロアレイの画像フィルムを、Ａｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウエア第７．５版(Agilent’s Feature Extraction software version 7.5)(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)を使用して分析した。各試料に対する対数強度の分布をプロトし、異常値試料(すなわち、平均から２以上の標準偏差のもの)を分析から除外した。これらの基準を使用し、１０のＵＣ試料と３のコントロール試料を異常値とした。
【０１７２】
リアルタイムＰＣＲ。リアルタイムＰＣＲ分析の確認を、８つの遺伝子−ＳＡＡ１、ＩＬ８、ＤＥＦＡ５、ＤＥＦＡ６、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、Ｓ１００Ａ８及びＴＬＲ４で実施した。１０の正常な組織を有する健常なコントロールＳ状結腸生検、９の静止状態のＵＣＳ字結腸生検、及び急性(６生検)又は慢性(５生検)炎症性細胞浸潤を有する１１のＵＣＳ字結腸生検を選択し、ＳＡＡ１及びＩＬ-８の発現の範囲を表すために階層化した後の異なる疾病群を表す。
【０１７３】
ＲＴＰＣＲ分析の前に、メッセージ(Message)ＡｍｐＴＭ ＩＩ ａＲＮＡ増幅キットプロトコル(Ambion technologies, Austin, TX)を使用し、ＲＮＡ増幅サイクルを実施した。ついで、ストラタジーンモデルＭＸ４０００(La Jolla, Ca, USA)を使用し、５０ｎｇのＲＮＡにおいて、逆転写ＰＣＲを実施した。ＴａｑＭａｎプライマー及びプローブを室内で製造した(Genentech Inc, South San Francisco, CA)。順方向プローブ、逆方向プローブ、及びＴａｑＭａｎプローブの配列は以下の通りである−
ＳＡＡ１、順方向−agcgatgccagagagaata、逆方向−ggaagtgattggggtctttg、Ｔａｑ−ctttggccatggtgcggagg、[配列番号：２３５]
ＩＬ-８、順方向−actcccagtcttgtcattgc、逆方向−caagtttcaaccagcaagaa、Ｔａｑ−tgtgttggtagtgctgtgttgaattacgg、[配列番号：２３６]
ＤＥＦＡ５、順方向−gctacccgtgagtccctct、逆方向−tcttgcactgctttggtttc、Ｔａｑ−tgtgtgaaatcagtggccgcct、[配列番号：２３７]
ＤＥＦＡ６、順方向−agagctttgggctcaacaag、逆方向−atgacagtgcaggtcccata、Ｔａｑ−cacttgccattgcagaaggtcctg, [配列番号：２３８]
ＭＭＰ３、順方向−aagggaacttgagcgtgaat、逆方向−gagtgcttccccttctcttg、Ｔａｑ−ggcattcaaatgggctgctgc、[配列番号：２３９]
ＭＭＰ７、順方向−cacttcgatgaggatgaacg、逆方向−gtcccatacccaaagaatgg、Ｔａｑ−ctggacggatggtagcagtctaggga、[配列番号：２４０]
Ｓ１００Ａ８、順方向−ttgaccgagctggagaaag、逆方向−tcaggtcatccctgtagacg、Ｔａｑ−tccctgataaaggggaatttccatgc [配列番号：２４１]及び
ＴＬＲ４、順方向−agagccgctggtgtatcttt、逆方向−ccttctgcaggacaatgaag、Ｔａｑ−tggcagtttctgagcagtcgtgc [配列番号：２４２]。
【０１７４】
ＰＣＲ条件は、４８℃で３０分、９５℃で１０分保持、続いて、３０秒９５℃での溶解、及び１分６０℃でのアニール／展伸の４０サイクルからなる。生成物の絶対的定量をＲＰＬ１９に対して標準化することにより算出した。結果をＳＡＳ及びＪＭＰソフトウェア(SAS, North Carolina)を使用して分析した。
【０１７５】
デフェンシンα５のインサイツハイブリダイゼーション
ｎｔ５５-３７２のＮＭ＿０２１０１０(上方-５’catcccttgctgccattct [配列番号：２４３]及び下位-５’gaccttgaactgaatcttgc [配列番号：２４４])からスパンニングするＤＥＦＡ５の３１８ｂｐフラグメントを増幅するために、ＰＣＲプライマーを設計した。プライマーには、増幅生成物から、それぞれセンス又はアンチセンスプローブのインビトロ転写を可能にする２７-ヌクレオチドＴ７又はＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ開始部位が含まれる。内視鏡生検を１０％の中性緩衝ホルマリンにおいて固定し、パラフィン包埋した。５μｍ厚の切片を脱パラフィンし、１０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫにおいて、３７℃で４５分脱タンパクし、先に記載したようにして、インサイツハイブリダイゼーション用に更にプロセシングした。(Jubb 等 Methods Mol Biol. 2006;326:255-264)。３３Ｐ-ＵＴＰ標識化されたセンス及びアンチセンスプローブを、５５℃で一晩、切片に対してハイブリダイズさせた。ハイブリダイズされていないプローブを、３７℃で３０分、２０μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡにおいてインキュベートし、続いて０．１×ＳＳＣにおいて５５℃で２時間、高緊縮洗浄し、グレイデッドエタノールを通して脱水することにより除去した。スライドをＮＴＢ核トラックエマルション(Eastman Kodak)に浸漬し、４℃で４週間、乾燥剤を収容した密封のプラスチックスライドボックスにおいて暴露し、ヘマトキシリン及びエオシンで発色及び対比染色した。
【０１７６】
ウサギ抗ヒトリゾチーム及びウサギ抗ヒトデフェンシンαについての免疫組織化学
ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織切片を、内在性ペルオキシダーゼ活性をクエンチし(KPL, Gathersburg, MD)、アビジン及びビオチンでブロックする(Vector, Burlingame, CA)前に再水和させた。３％のＢＳＡとＰＢＳに１０％の正常なヤギ血清が入ったもので、切片を３０分ブロックした。ついで組織切片を、室温で６０分一次抗体と、３０分ビオチン化された二次抗体と共にインキュベートし、ＡＢＣ試薬(Vector, Burlingame, CA)において３０分、続いて金属強化(metal enhanced)ＤＡＢ(Pierce, Rockford, IL)において５分、インキュベートした。ついで、切片をメイヤーのヘマトキシリンで対比染色した。使用した一次抗体は、５．０μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトリゾチーム(Dako, Carpinteria, CA)、及び５．０μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＤＥＦＡ６(Alpha Diagnostics, SanAntonio, TX)であった。使用した二次抗体は、７．５μｇ／ｍｌのビオチン化したヤギ抗ウサギＩｇＧ(Vector, Burlingame, CA)であった。ＤＥＦＡ６α染色には、９９℃で２０分の、標的回収高ｐＨ(Target Retrieval High pH)(Dako, Carpenteria,CA)を用いた前処置が必要であり、リゾチーム染色には前処理の必要がなかった。全ての他の工程を室温で実施した。
【０１７７】
データ解析。マイクロアレイデータをロゼッタ・レゾルバ・ソフトウェア(Rosetta Resolver software)(Rosetta Inpharmatics, Seattle)を使用して解析した。マイクロアレイデータの統計的有意性を、スチューデントアンペアｔ検定により決定した。ｐ＜０．０１及び大なり小なり１．５の倍率変化が、統計的有意であると考えられる。倍率変化のデータをロゼッタ・レゾルバ・ソフトウェアを使用して算出した。インジェニュイティー(Ingenuity)ソフトウェア(Ingenuity Systems, Mountain View, CA)を使用し、ジーンオントロジーを分析した。マンホイットニーのＵ検定を使用し、リアルタイムＰＣＲデータを分析した。ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０１７８】
結果
健常な大腸及び回腸末端における遺伝子発現での解剖学的部位の影響。コントロール患者からの５６の組織学的に正常な生検を、教師なしの階層的クラスタリングにより分析した。デンドログラムの片側では、２５／２５の生検が左結腸(下行結腸又はＳ状結腸)からのものであり、デンドログラムの反対側では、２０／３１の生検が上行結腸(χ２＝２５．１、ｐ＜０．０００１) (図1)からのものであるという、解剖学的部位による明確な分離が観察された。６／６の回腸末端生検を、一緒にクラスター化した。個々の患者からの生検は、一緒にクラスター化しなかった。観察されたクラスター化の原因である、右及び左の結腸との間の差次的発現を促進させる遺伝子は、ＧＩ管の発生学的発達に優位に関与しており−ＨＯＸＡ１３(ＦＣ＋４．９３、ｐ＝２．３×１０−１６)、ＨＯＸＢ１３(ＦＣ＋１６．９６、ｐ＜１×１０−４５)、ＧＬＩ１(ＦＣ＋２．２、ｐ＝４．０×１０−２４）、及びＧＬＩ３(ＦＣ＋２．３、ｐ＝２．１×１０−２８)は、全て左結腸でアップレギュレートしていた。
【０１７９】
ＵＣ及びコントロール生検における発現の分析。
教師なしの階層的クラスタリングを使用しても、ＵＣ患者及びコントロール患者からの生検の間に差異を見出すことはできなかった。更に、生体の炎症状態に基づくクラスタリングは観察されなかった。観察された唯一のクラスタリングは、回腸末端からの生検であり、ここでＵＣ及びコントロール生検は共にクラスター化していた。全てのＵＣ生検(１２９)及びコントロール生検(７３)を比較し、ＵＣ生検において、１４３の配列では１．５以上の倍率変化があり(０．０１＞ｐ＞１０−４５)、５４の配列では１．５未満の倍率変化があった(０．０１＞ｐ＞１０−２０)(データを示さず)。
【０１８０】
血清アミロイドＡ１(ＳＡＡ１)は、最もアップレギュレートされた遺伝子であった(倍率変化(ＦＣ)＋８．１９、ｐ＜１０−４５)。他の顕著にアップレギュレートした遺伝子は、Ｓ１００Ａ８(ＦＣ＋３．５０、ｐ＝２．３×１０−１７）、Ｓ１００Ａ９(ＦＣ＋３．０６、ｐ＝４．１×１０−１３）、αデフェンシン、α５(ＤＥＦＡ５)(ＦＣ＋３．２５、ｐ＝０．００００３)、α６(ＤＥＦＡ６)(ＦＣ＋２．１８、ｐ＝６．９５×１０−７)及びマトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ３(ＦＣ＋２．１７、ｐ＝５．６×１０−１０)及びＭＭＰ７(ＦＣ＋２．２９、ｐ＝２．３×１０−７)であった。
【０１８１】
正常な患者と比較した場合、ＵＣ患者で差次的に発現したことが見出された遺伝子の列挙を、上述した表１Ａ、１Ｂ及び２Ａに見出すことができる。
一以上の実験にわたる多くの候補遺伝子の差次的遺伝子発現を表６に示す。表６には、倍率変化及びｐ値が、４つの異なる実験において、多くの異なる遺伝子で示されていることが表されている。各実験で分析された生検の数を括弧内に示す。一以上の実験をまたがって、発現における有意の一貫した変化が、この表の関心ある遺伝子で観察された。
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【０１８２】
差次的に発現した遺伝子の優位性を示す、ＵＣとコントロール生検との間で差次的に発現した遺伝子に関与するジーンオントロジー分析は、生体系であると考えられる場合に、免疫反応(免疫反応下で分類された全６７９遺伝子の４８遺伝子、ｐ＝２．１×１０−９、ＯＲ２．６１、ＣＩ １．８５-３．５６)及び創傷に対する反応(創傷に対する反応下で分類された全３５９遺伝子の３０遺伝子、ｐ＝６．４２×１０−９、ＯＲ３．１４、ＣＩ ２．０９−４．５３)に関与していた。
【０１８３】
静止状態のＵＣを患っている患者のＳ状結腸生検及び非炎症性のコントロール生検における発現の分析。急性炎症シグナルを有さない生検における発現を比較し、解剖学的変異の影響を除外するために、ＵＣを患っている患者からの炎症の組織学的証拠を有さないＳ状結腸の２２の生検を、１８の組織学的に正常なコントロールＳ状結腸生検と比較した。１０２の配列では、１．５以上の倍率変化があり(０．０１＞ｐ＞４．７７×１０−１３)、８４の配列では、１．５未満の倍率変化があった(０．０１＞ｐ＞１．８×１０−２１) (データを示さず)。
【０１８４】
アップレギュレートされた遺伝子には、デフェンシンβ１４（ＦＣ＋２．１１、ｐ＝０．００００２)及びＳＡＡ１(ＦＣ＋２．０１、ｐ＝０．０００２４)が含まれる。ダウンレギュレートされた関心ある遺伝子には、ＨＬＡ-ＤＲＢ１(ＦＣ−３．０、ｐ＝０．００１０)及びＴＳＬＰ(ＦＣ−２．７３、ｐ＝２．７×１０−１０)が含まれる(表６)。
【０１８５】
活性ＵＣを患っている患者のＳ状結腸生検及び炎症性のコントロール生検における発現の分析。ＵＣを患っている患者からの、３５の組織学的炎症Ｓ状結腸生検の発現を、８の組織学的炎症性のコントロールＳ字結腸生検と比較した。ＵＣ生検におけるより重度の炎症を表す、急性炎症反応に関与する多くの遺伝子が、コントロール生検に対してＵＣ生検においてアップレギュレートしていた−ＳＡＡ１(ＦＣ＋１７．５、ｐ＝２．９×１０−２１)、ＭＭＰ３(ＦＣ＋１１．０、ｐ＝１．２２×１０−３７)、ＭＭＰ７(ＦＣ＋７．３１、ｐ＝４．９×１０−２４)及びＩＬ-８(ＦＣ＋６．３６、ｐ＝９．２７×１０−１７)(表６)。全体で６２３の配列では、１．５以上の倍率変化があり、５０９の配列では、−１．５未満の倍率変化があった(ｐ＜０．０１)(データを示さず)。
【０１８６】
炎症性対非炎症性のＵＣＳ状結腸生検。発現シグナルを、３５の組織学的炎症、及び２２の炎症Ｓ状結腸ＵＣ生検との間で比較した場合、炎症生検において、７００の配列では、１．５以上の倍率変化があり(０．０１＞ｐ＞１×１０−４５)、５１８の配列では、１．５未満の倍率変化があった(０．０１＞ｐ＞１×１０−４５)(データを示さず)。
【０１８７】
顕著にアップレギュレートした遺伝子には、ＳＡＡ１(ＦＣ＋１６．５１、ｐ＝＜１０−４５)、ＴＮＦＡＩＰ３相互作用プロテイン３(ＴＮＩＰ３)(ＦＣ＋１０．５、ｐ＝１×１０−３８)、ＤＥＦＡ５(ＦＣ＋８．４４、ｐ＝＜１０−４５)、ＤＥＦＡ６(ＦＣ＋６．７２、ｐ＝４．１６×１０−１９)、及び再生膵島誘導３ガンマ(ＲＥＧ３γ)(ＦＣ＋６．９９、ｐ＝＜１０−４５)が含まれる。
【０１８８】
特定の遺伝子ファミリー−αデフェンシン５及び６の分析。
関心ある多くの遺伝子の発現を、解剖学的部位及びＵＣ試料における炎症度合いを考慮して、更に分析した。ＤＥＦＡ５及びＤＥＦＡ６を分析すると、正常なコントロール及び非炎症ＵＣ生検における発現は、異なる解剖学的部位をまたがって類似しており、回腸末端に高度な発現が存在し、生検位置が結腸の更に遠位となるにつれて発現が低下した(図２)。
【０１８９】
図２において、各アレイ試料の発現をＡｇｉｌｅｎｔユニバーサル参照に対してプロットした。各内視鏡生検を、患者の状態、生検炎症状態、及び解剖学的部位によって分けた。各解剖学的部位についての平均発現レベルを青でリンクさせる。αデフェンシン５(パネルＡ)及び６(Ｂ)(ＤＥＦＡ５及びＤＥＦＡ６)の高発現レベルが、コントロールの回腸末端と非炎症ＵＣ試料において見られる。これら２つのグループにおける発現は、生検が回収される結腸がより遠位のときに低減した。急性及び慢性の炎症ＵＣ試料において、また炎症コントロール試料においてより小さな程度で、上行、下行及びＳ状結腸にわたってＤＥＦＡ５及びＤＥＦＡ６発現に際だった増加があった−Ｓ状結腸の炎症対非炎症ＵＣ試料で、ＤＥＦＡ５について(ＦＣ＋８．４４、ｐ＝＜１０−４５)、ＤＥＦＡ６について(ＦＣ＋６．７２、ｐ＝４．１６×１０−１９)。
急性及び慢性の炎症ＵＣ生検においては、上行、下行及びＳ状結腸にわたって、ＤＥＦＡ５及びＤＥＦＡ６発現に際だったアップレギュレートがあった(表６)。
【０１９０】
マトリックスメタロプロテイナーゼ３及び７。
非炎症のＵＳ生検と比較した場合、急性及び慢性的に炎症したＵＣ生検においてはＭＭＰ３及びＭＭＰ７の発現増加が観察された−Ｓ状結腸の炎症対非炎症ＵＣ試料ＭＭＰ３(ＦＣ＋８．１５、ｐ＝２．３×１０−３５)及びＭＭＰ７(ＦＣ＋５．５３、ｐ＝１．０×１０−２３)(図３)。
図３において、各アレイ試料の発現をＡｇｉｌｅｎｔユニバーサル参照に対してプロットする。各内視鏡生検を、患者の状態、生検炎症状態、及び解剖学的部位によって分ける。各解剖学的部位についての平均発現レベルを青で結びつける。非炎症のＵＣ生検と比較した場合、急性及び慢性的に炎症したＵＣ生検においてはＭＭＰ３(パネルＡ)及びＭＭＰ７(Ｂ)の発現増加が観察された−Ｓ状結腸の炎症対非炎症ＵＣ試料ＭＭＰ３(ＦＣ＋８．１５、ｐ＝２．３×１０−３５)及びＭＭＰ７(ＦＣ＋５．５３、ｐ＝１．０×１０−２３)。炎症及び非炎症のコントロール試料を分析した場合と比較して、炎症コントロール生検におけるＭＭＰ３及びＭＭＰ７の発現レベルの低下が観察された(それぞれ、ＦＣ−１．６２、ｐ＝０．０１２及びＦＣ−２．０、ｐ＝０．０００２)。
【０１９１】
ＡＴＰ結合カセット(ＡＢＣ)トランスポーターファミリー及び生体異物転写レギュレーター。この遺伝子ファミリーを更に研究するために、４８の転写遺伝子及びそれらの鍵となるメディエーター(ＰＸＲ、ＦＸＲ、ＬＸＲ及びＣＡＲ)を表すプローブからの発現パターンを分析した。これらの遺伝子を全てのＵＣ及びコントロール生検で比較した場合、７つの遺伝子は、コントロール試料と比較して、ＵＣ試料においてかなりダウンレギュレートしていることが見出された−ＡＢＣＡ１(ｐ＝０．０１)、ＡＢＣＡ８(ｐ＝０．００６４)、ＡＢＣＢ１(ｐ＝０．００９１)、ＡＢＣＣ６(ｐ＝０．００５０)、ＡＢＣＢ７(ｐ＝０．００６８)、ＡＢＣＦ１(ｐ＝０．０００５)及びＡＢＣＦ２(ｐ＜０．００００１)。ＡＢＣＢ２を表す唯一のプローブは、ＵＣにおいて有意にアップレギュレートした(ｐ＝０．００４８)。
【０１９２】
多くのＡＢＣ遺伝子が、正常な患者と比較して、ＩＢＤ患者ではダウンレギュレートしていることが見出された(データを示さず)。ＡＢＣＢ１発現において観察された変化は、主としてＳ状結腸における非炎症のＵＣ生検と比較した場合にかなりダウンレギュレートしている炎症ＵＣ生検により促進されることが明らかとなった(ＦＣ−１．８２、ｐ＝５．６×１０−６)(表６)。興味があることに、ＵＣとコントロールとの間のＰＸＲの発現における差異は、疾患位置及び活性を含む任意の分析で観察されなかった。
【０１９３】
ＲＴＰＣＲ分析。マイクロアレイ発現結果に関連した８の遺伝子の場合、正常な組織を有する１０の健常なコントロールＳ字結腸生検、９の静止状態のＵＣＳ字結腸生検、及び急性(６生検)又は慢性(５生検)の炎症性細胞浸潤を有する１１のＵＣＳ字結腸生検を使用した、確認のリアルタイムＰＣＲ分析を開始した。正常なコントロールＳ状結腸生検及び非炎症ＵＣＳ状結腸生検(それぞれ、ｐ＝０．０４１及びｐ＝０．０４４)と比較して、炎症ＵＣＳ状結腸生検におけるＳＡＡ１の発現増加が観察された。また、コントロールＳ字結腸生検(ｐ＝０．０３１)と比較した場合、炎症ＵＣＳ字結腸生検において、ＩＬ-８発現の上昇が確認され、非炎症ＵＣ生検(ｐ＝０．０８９)と比較した場合、炎症ＵＣＳ状結腸生検において、ＩＬ-８発現が高まる傾向が観察された(図４)。
【０１９４】
図４は、正常な組織を有する１０の健常なコントロールＳ字結腸生検、９の静止状態のＵＣＳ字結腸生検、及び急性又は慢性の炎症性細胞浸潤を有する１１のＵＣＳ字結腸生検における発現を比較する、リアルタイムＰＣＲ発現データを示す。ＳＡＡ１(Ａ)、ＩＬ-８(Ｂ)、デフェンシンα５(Ｃ)及びデフェンシンα(Ｄ)の発現を、コントロール、及び炎症及び非炎症のＵＣ生検の間で比較した。標準誤差バーを各グラフにおいて緑で例示する。
【０１９５】
非炎症ＵＣＳ字結腸生検(それぞれ、ｐ＝０．０００８及びｐ＝０．０００５)及びコントロールＳ状結腸生検(それぞれ、ｐ＝０．０００２及びｐ＝０．０００１)と比較した場合、炎症ＵＣＳ字結腸生検において、ＤＥＦＡ５及びＤＥＦＡ６の発現増加が観察された(図４)。また、非炎症ＵＣＳ字結腸生検と比較した場合、炎症ＵＣＳ字結腸生検における発現増加は、ＭＭＰ７、(ｐ＝０．０００５)、Ｓ１００Ａ８、(ｐ＝０．００２９) 及びＴＬＲ４、(ｐ＝０．０１９)を試験した際に観察された(図５)。
【０１９６】
図５には、正常な組織を有する１０の健常なコントロールＳ字結腸生検、９の静止状態のＵＣＳ字結腸生検、及び急性又は慢性の炎症性細胞浸潤を有する１１のＵＣＳ字結腸生検における発現を比較する、リアルタイムＰＣＲ発現データを示す。ＭＭＰ３(Ａ)、ＭＭＰ７(Ｂ)、Ｓ１００Ａ８(Ｃ)及びＴＬＲ４(Ｄ)の発現を、種々の患者間で比較した。標準誤差バーを各グラフにおいて緑で例示する。ＭＭＰ３発現における有意な変化は、炎症、非炎症ＵＣＳ字結腸生検及びコントロールＳ状結腸生検を分析した際には観察されなかった。
【０１９７】
インサイツハイブリダイゼーション及び免疫組織化学。
ＵＣを患っている患者の結腸における、過剰のＤＥＦＡ５＆６発現の細胞局在化を更に研究するために、インサイツハイブリダイゼーション及び免疫組織化学的検査を、ＵＣを患っている患者及びコントロール生検のコホートで試みた(図６及び７)。
図６は、パネート細胞位置と一致する基底陰窩における強ハイブリダイゼーションを示すＤＥＦＡ５に対する、回腸末端生検のインサイツハイブリダイゼーションを示す。上部パネル回腸末端(ＴＩ)において、アンチセンスプローブは、パネート細胞位置と一致する基底陰窩における強ハイブリダイゼーションを示す。下部パネル回腸末端(ＴＩ)においては、センスコントロールプローブでは、何も有意なハイブリダイゼーションは観察されなかった。パネルＡは、非炎症コントロール患者のＳ状結腸生検を示す。パネルＢ、Ｃ及びＤは、パネート細胞異形成と一致して、ＵＣＳ状結腸生検の基底陰窩領域における、強い多巣性ハイブリダイゼーションを示す。Ｓ状結腸からのＵＣ生検においては、これらの生検の基底陰窩領域に多巣性ハイブリダイゼーションが観察され、これはパネート細胞異形成と一致した。このことは、非炎症コントロール生検には観察されなかった。
【０１９８】
図７は、ＤＥＦＡ６に対する、回腸末端生検のインサイツハイブリダイゼーションを示す。パネルＡにおいて、回腸末端免疫組織化学的検査は、パネート細胞位置と一致する基底陰窩におけるポジティブ染色を示す。パネルＢ及びＣでは、非炎症コントロール患者において、有意な染色が観察されなかった。パネルＤ、Ｅ及びＦにおいては、パネート細胞異形成と一致する、Ｓ状結腸ＵＣ生検の基底陰窩領域において、強い、多巣性染色が示された。ＤＥＦＡ６についての免疫組織化学では、Ｓ状結腸ＵＣ生検において、染色がパネート細胞異形成と一致するこれらの生検の基底陰窩領域で観察されたことが確認された。再度、非炎症コントロール生検では、このことは観察されなかった(図７)。
【０１９９】
ＩＢＤ２遺伝子座内の遺伝子の発現。ＩＢＤ２遺伝子座を定めるマーカーを使用し、染色体１２におけるこの遺伝子座内で発現した配列タグ、又は５２６Ａｇｉｌｅｎｔプローブを表す遺伝子を同定した。１２のプローブが、急性及び慢性の炎症ＵＣＳ字結腸生検の発現を非炎症ＵＣＳ字結腸生検と比較した場合に、ｐ＜０．０１で１．５の倍率変化より多いか少ない発現であった(図７)。
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【０２００】
ＩＢＤ２遺伝子座内に位置する５２６の発現プローブを分析し、炎症ＵＣＳ字結腸生検を非炎症ＵＣＳ字結腸生検と比較した場合に、有意に差次的に調節される１２のプローブが同定された。
表３Ａ(上掲)には、正常な患者と比較した場合、ＩＢＤ患者においてアップレギュレートしたことが見出された、染色体１２上のＩＢＤ２遺伝子座からの遺伝子を列挙する。
表３Ｂ(上掲)には、正常な患者と比較した場合、ＩＢＤ患者においてダウンレギュレートしたことが見出された、染色体１２上のＩＢＤ２遺伝子座からの遺伝子を列挙する。
【０２０１】
炎症ＵＣＳ字結腸試料において差次的に調節される関心ある候補遺伝子には、ｋｅｒａｔｉｎ ５Ｂ(ＦＣ＋２．３８、ｐ＝０．０００４)、ＭＭＰ１９(ＦＣ＋１．９５、ｐ＝０．００８４)、ＧＬＩ １(ＦＣ−１．５４、ｐ＝７．３×１０−９)、インターロイキン-１レセプター関連キナーゼ３(ＦＣ＋１．７４、ｐ＝３．１×１０−１５)及びインターロイキン-１レセプター関連キナーゼＭ(ＦＣ＋１．７１、ｐ＝０．００１４)が含まれる。
【０２０２】
急性炎症シグナルを除去し、非炎症ＵＣＳ字結腸生検及び非炎症コントロールＳ字結腸生検を比較した場合、１．５より多いか少ない倍率変化を有する配列はなかった。しかしながら、顕著にダウンレギュレートした遺伝子は、チューブリンα５(ＦＣ−１．３２、ｐ＝９．０×１０−６)及びチューブリンα６(ＦＣ−１．４５、ｐ＝１．２×１０−５)を含み、該分子は腸の障壁完全性及び微小管細胞骨格に関与している。
【０２０３】
ＩＢＤ５遺伝子座内の遺伝子の発現。ＩＢＤ５遺伝子座内にＡｇｉｌｅｎｔプローブを表す１１の遺伝子を同定し、健常なコントロール、非炎症及び炎症のＵＣ生検において比較した(表８)。表８は、それらのＳ字結腸生検生検において観察された炎症の度合いにより階層化された、コントロール及びＵＣを患っている患者を比較する、ＩＢＤ５遺伝子座内の遺伝子の発現における倍率変化を示す。非炎症ＵＣＳ字結腸生検と比較した場合、有機のカチオントランスポーターＳＬ２２Ａ４及びＳＬＣ２２Ａ５の有意のダウンレギュレートが観察された。
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【０２０４】
表３Ａ(上掲)には、アップレギュレートが見出された、染色体５上のＩＢＤ５遺伝子座からの遺伝子を列挙する。
ＩＲＦ１及びＰＤＬＩＭ４の発現を炎症及び非炎症のＵＣＳ状結腸生検、(それぞれ、ＦＣ＋１．１２、ｐ＝２．９×１０−６及びＦＣ＋１．１４、ｐ＝０．０００３９)で比較した場合、有意ではないが、発現において一致した折り畳み増加が観察された。
【０２０５】
表３Ｂ(上掲)には、正常な患者と比較した場合、ＩＢＤ患者においてダウンレギュレートしたことが見出された、染色体５上のＩＢＤ５遺伝子座からの遺伝子を列挙する。炎症ＵＣＳ字結腸生検を非炎症ＵＣＳ字結腸生検(ＦＣ−１．５０、ｐ＝２．２×１０−６)と比較した場合、ＳＬＣ２２Ａ５(ＯＣＴＮ２)は、コントロール(ＦＣ−１．２６、ｐ＝３．３７×１０−６)と比較して、ＵＣ生検においてダウンレギュレートしていた。また非炎症ＵＣＳ字結腸生検(ＦＣ−１．７９、ｐ＝１．５×１０−９)と比較して、ＳＬＣ２２Ａ４(ＯＣＴＮ１)の発現は、炎症ＵＣＳ字結腸生検においてダウンレギュレートしていたが、全てのＵＣ生検をコントロールと比較すると、何の変化も観察されなかった(ＦＣ−１．１８、ｐ＝０．１１)。
【０２０６】
遺伝子発現及び疾患活動性。内視鏡検査を受け、新たに診断されたＵＣ患者からのＳ字結腸生検(８生検)と、確立されている活性ＵＣを患っている患者からのＳ字結腸生検(１８生検)とを比較した。新たに診断されたＵＣＳ字結腸生検において、８６１配列は、１．５以上の倍率変化及びｐ＜０．０１にアップレギュレートされており、３７３配列は、１．５未満の倍率変化及びｐ＜０．０１にダウンレギュレートしていた(データは示さず)。
新たに診断された患者において、最もアップレギュレートした３つの遺伝子はＳｅｌｅｃｔｉｎ Ｅ(ＦＣ＋１０．９５、ｐ＝１．８×１０−６)、ＣＣＬ１９(ＦＣ＋７．４２、ｐ＝４．７×１０−１５)及びＩＬ-８(ＦＣ＋７．３２、ｐ＝２．９×１０−７)であり、ダウンレギュレートした遺伝子はＳ１００Ｐ(ＦＣ−６．４、ｐ＝２．０×１０−９)を含む。
【０２０７】
２以上の単純な臨床大腸炎活性指数(ＳＣＣＡＩ)を有するＵＣ患者からのＳ字結腸(２７生検)を、２以下のＳＣＣＡＩを有するＵＣ患者からのＳ状結腸生検(３０生検)と比較した。８１３の配列がアップレギュレートし、４４４の配列がダウンレギュレートした。最もアップレギュレートした遺伝子は、急性炎症反応に関与するもので、ＩＬ-８(ＦＣ＋８．８６、ｐ＝４．４×１０−１２)、ＭＭＰ３(ＦＣ＋６．５、ｐ＝３．２×１０−１９)、ＭＭＰ７(ＦＣ＋５．３、ｐ＝３．４×１０−２１)及びＤＥＦＡ６(ＦＣ＋４．５、ｐ＝２．７×１０−１２)であった。ダウンレギュレートした遺伝子には、ＵＧＴ２Ｂ１５(ＦＣ−４．５、ｐ＝０．００１３)、ＵＧＴ２Ｂ１７(ＦＣ−２．８、ｐ＝０．００５９)及びＵＧＴ２Ｂ１０(ＦＣ−２．２、ｐ＝０．００３８)、細胞解毒及び排出に関与するＵＧＴファミリーの全てのメンバーが含まれる。
【０２０８】
表３Ａ(上掲)には、正常な患者と比較して、ＵＣ患者においてアップレギュレートが観察された本研究で同定された更なる遺伝子が列挙される一方、表３Ｂ(上掲)には、正常な患者と比較して、ＵＣ患者においてダウンレギュレートが観察された、本研究で同定された更なる遺伝子が列挙されている。
【０２０９】
検討
本研究は、正常なコントロールと、ＵＣを患っている患者、並びに他の原因の大腸炎症を患っている患者における、腸の遺伝子発現を比較して報告した最も正確なマイクロアレイ解析を表す。右及び左結腸で興味深い差異を有する健常な結腸における遺伝子発現の解剖学的パターンの重要な情報が、本データにより提供される。更に、ＵＣにおける調節不全の遺伝子発現の特徴についての強力な証拠が提供され、これら全てのデータが、正常な生理学的ホメオスタシスにおける遺伝子発現、及びＵＣの病理過程に、価値ある見識を提供する。
【０２１０】
このデータセットの長所は、実施した研究規模、疾患表現型の細心の評定、各生検に対する解剖学的部位の実証性、及び試料をプールするための交絡的影響の回避性にある。よって、過去の研究を妨害していたバックグラウンド変動のかなりの量を除去することができる(Marshall E. Science 2004;306:630-631; Ioannidis JP. Lancet 2005;365:454-455)。
更に、本研究は、非特異的な急性炎症のサインの強度の潜在的に重要な交絡的影響に対処している。コントロールとＵＣを患っている患者からの静止状態の生検を比較し、これらの分析から、ＵＣの病原において価値ある病識を得ることができた。また更に、本研究により、新たに診断された疾患を患っている患者の割合へのアクセスが提供され、遺伝子発現における処置に関連した変化が克服された。我々の研究の更なる長所は、リアルタイムＰＣＲ分析が、関心ある候補遺伝子の一つではなく全ての発現における有意な変化を常に確認でき、データの解釈に関連して、信頼性がかなり増加しているという事実にある。
これは、健常な成人の結腸に沿った多くの遺伝子の発現における勾配を示す最初のマイクロアレイ研究である。これらの結果は、盲腸、横行結腸、下行結腸及びＳ状結腸からの生検を比較した場合に、発現パターンに何の有意な差異は観察されなかったコステロ及び共同研究者からのデータ(Costello CM,等PLoS Med 2005;2:e199)とは対照的である。これらのデータセットにおいて観察された差異は、コステロがコントロール及び疾患患者で研究したのに対し、非炎症コントロール試料でのみ見られる我々の分析により説明され得る。
【０２１１】
発生経路に関与する遺伝子−ＨＯＸファミリー及びヘッジホッグシグナル伝達経路が、健常な結腸の解剖学的長さに沿って、最も差次的に調節されることが明らかとなった。ＨＯＸＡ１３は、尾腸の発生において重要な役割を担っていることが示されており、遺伝子における変異により、泌尿生殖器奇形に至り(De Santaら, Development. 2002；129；551-561)、興味深いことに、ＨＯＸＢ１３発現が遠位左結腸からの結腸直腸腫瘍においてダウンレギュレートされることが示されている(Jung 等 Br J Cancer. 2005;92:2233-2239)。
【０２１２】
また、ヘッジホッグシグナル伝達経路は、ヒトの胃腸管系の正常な成長及び発育にとって重要であり、この経路に関与する遺伝子における変異のため、腸に影響を及ぼす多くの先天性疾患である。(Lees 等 Gastroenterology. 2005;129:1696-1710)ＧＬＩ-１はヘッジホッグシグナル伝達経路の主要なエフェクター分子の一つであり、ＧＬＩ-１遺伝子はＩＢＤ２遺伝子座内の、ＵＣに関連していることが以前から示されている領域に領域に存在している。(Parkes 等 Am J Hum Genet. 2000;67:1605-1610; Satsangi等, Nat. Genet. 1996;14:199-202)また本研究からのデータにより、ＧＬＩ-１が、ＵＣを患っている患者からの非炎症生検と比較して、炎症ＵＣ生検においてダウンレギュレートしていることが示唆される。我々のユニットからの近年のデータでは、ＵＣとＧＬＩ-１遺伝子の変異との間の強い関連性が示されている。
【０２１３】
Ｖａｒｎａｔ及び共同研究者により公開された更に最近のデータでは、ＰＰＡＲβが、インド人のヘッジホッグ、ヘッジホッグシグナル伝達経路における他の主要なエフェクター分子の発現をダウンレギュレートすることにより、パネート細胞分化を負に調節することが示唆されている(Varnat 等 Gastroenterology. 2006;131:538-553)。我々のデータでは、コントロール及びＵＣを患っている患者からの非炎症生検と比較して、炎症ＵＣを患っている患者の結腸において、αデフェンシン５及び６のアップレギュレートが見られ、免疫組織化学的検査及びインサイツハイブリダイゼーションでは、このことが、パネート細胞異形成によりかなり媒介されることが示されている。ＵＣを患っている患者において、ヘッジホッグシグナル伝達経路における未だ不確定の欠陥により、パネート細胞分化の未調節、パネート細胞異形成、αデフェンシン５及び６発現の増加、及び粘膜炎症に至ると推測されることは興味深い。
【０２１４】
実際、本研究で最も刺激的な観察は、ＵＣを患っている患者におけるαデフェンシン５及び６のアップレギュレートを示すデータである。α デフェンシン５及び６は自然免疫反応の一部である、小さなカチオン性タンパク質であり、グラム陽性及びグラム陰性菌に対して強力な抗菌性を有する。(Ouellette AJ. Springer Semin Immunopathol. 2005;27:133-146)それらは、健常な結腸では、回腸末端にかなり限定され、粘膜に放出される、パネート細胞にプロ分子として保存され、トリプシンにより、活性な抗菌ペプチドに切断される。(Ghosh等. Nat Immunol. 2002;3:583-590)
【０２１５】
我々のデータセットにおいて、高レベルのαデフェンシン発現は、ＵＣを患っている患者、及び非炎症コントロールの回腸末端生検において観察された。コントロール患者及び静止状態のＵＣを患っている患者における発現レベルは、生検が回収された位置が、結腸−上行結腸、下行結腸及びＳ状結腸において更に遠位になる場合に低下した。しかしながら、炎症ＵＣ生検においては、αデフェンシン５及び６の双方での発現増加が、生検を行った各解剖学的部位で観察された。Ｌａｗｒａｎｃｅ及び共同研究者は、デフェンシンα５及び６が、コントロールと比較して、ＵＣを患っている患者においてアップレギュレートしていることを言及している(Lawrance 等 Hum Mol Genet. 2001;10:445-456)が、ＲＮＡは外科的切除から抽出され、これらの検体の解剖学的位置についての詳細は与えられていない。
【０２１６】
回腸末端においてＣＤを患っている患者でのαデフェンシン５及び６の発現を試験する最近のデータでは、発現レベルが、コントロールの回腸末端組織と比較した場合、炎症の度合いに関係なく低下し、これはＣＤに観察される回腸末端表現型に原因があると示唆される。(Wehkamp 等 Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102:18129-18134)我々のデータセットにおけるαデフェンシン５及び６発現増加の観察が、病因に関連した一次的現象であるろうとなかろうと、又はそれが、細菌浸潤に対して、以前から損傷を受けていた上皮表面を保護する二次的現象であろうとなかろうと、疾患感受性に関連し、これらのペプチドの機能を変化させるこれらの遺伝子内の重要な変異について探すことにより解決され得る。
【０２１７】
我々の結果の全てではないが多くの結果が、ＩＢＤにおける２つの重量なマイクロアレイ論文と広く一致したことは、興味あることである。Ｌａｗｒａｎｃｅ及び共同研究者からのデータ(Lawrance等 Hum Mol Genet. 2001;10:445-456)と一致して、我々は、ＵＣにおいて、Ｓ１００Ａ８及びＡ９、及びαデフェンシン５及び６がアップレギュレートしていることを示す。しかしながら、本研究とＬａｗｒａｎｃｅの研究において、ＩＢＤ２遺伝子座において差次的に発現したプローブでは、重複は観察されなかった。Ｄｉｅｃｋｇｒａｅｆｅ及び共同研究者(Dieckgraefe等. Physiol Genomics. 2000;4:1-11)は、我々のデータと一致して、多くのＭＭＰ遺伝子のアップレギュレートを観察しており、ＲＥＧファミリーの興味あるメンバーが、おそらくパネート細胞異形成の結果として、ＵＣを患っている患者の結腸においてアップレギュレートしていることを示した。
【０２１８】
我々のデータセットにおけるＡＢＣＢ１のダウンレギュレートは、非常に興味のあることであり、Ｌａｎｇｍａｎ、Ｄｉｅｃｋｇｒａｅｆｅ及びＬａｗｒａｎｃｅ及び共同研究者からの初期のマイクロアレイデータと一致している。(Dieckgraefe等. Physiol Genomics. 2000;4:1-11; Lawrance 等 Hum Mol Genet. 2001;10:445-456; Langmann 等 Gastroenterology. 2004;127:26-40)これに加えて、我々は、ＡＢＣＢ１における発現が、ＵＣでのＳ状結腸で最も低い遺伝子発現を有する減少勾配を示すことを観察している。このパターンの発現は、おそらくＵＣにおけるＰ-糖タンパク質(ＡＢＣＢ１の遺伝子産物)の機能損失に関連した仮説と一致し、ＵＣの臨床症状と一致する。現在のデータは、近年の遺伝的及び動物機能のデータで強調されているように、ＵＣの病因におけるＡＢＣＢ１の重要性を例証している。(Moodie等 Glucocorticoid access and action in the rat colon:expression and regulation of multidrug resistance 1a gene (mdr1a), glucocorticoid receptor (GR), mineralocorticoid receptor (MR) and 11-beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (11BHDS2). 197版. 2003)。
【０２１９】
ＡＢＣＢ１は、Ｐ-糖タンパク質１７０、腸の障壁防御及び異物代謝に関与する排出表皮トランスポーターをコードする。それは、ＡＢＣＢ１との相同性を共有しているタンパク質の全クラスを分析すると、ＡＢＣトランスポーターの４８の遺伝子のうち６(１２．５％)が、ＵＣにおいてはかなり調節不全であることと関連しており、ＵＣの病因における、このクラスのタンパク質の重要な役割が示唆される。
【０２２０】
Ｌａｎｇｍａｎｎにより作製されたデータに対して、我々は、転写レギュレータープレグナン-Ｘレセプターの発現において、何の変化も観察しなかった。これらの負のデータは、ハプロタイプタギングアプローチを使用し、エディンバラのＩＢＤ集団で実施した遺伝子研究と一致し、ＡＢＣＢ１遺伝子とＵＣトン及び愛大には関連性がある(Ho等 Hum Mol Genet. 2006;15:797-805)が、プレグナン-ＸレセプターとＵＣとの間に関連性はない(Ho GT等 Gut. 2006;55:1676-1677)。研究設定の側面は、我々の分析が生検の炎症状態及び解剖学的部位を考慮する場合、我々のデータとＬａｎｇｍａｎｎ及び共同研究者とのデータとの間に観察される差異を説明するものである。我々のデータセットにおいて、我々は試料をプールせず、よって多数のマイクロアレイを実施したのに対し、Ｌａｎｇｍａｎｎ及び共同研究者は回腸末端及び結腸生検をプールしたもので、方法におけるこの差異が異なる結果の主な原因であり得る。
【０２２１】
マトリックスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)は、形態形成及び組織リモデリング中、余分な細胞マトリックス成分の分解に関与している最終段階のエフェクター分子である、２３を越える亜鉛依存性酵素のファミリーを含む。(Brinckerhoff等 Nat Rev Mol Cell Biol. 2002;3:207-214)我々のデータと一致して、ＩＢＤを患っている患者における以前の研究では、非炎症生検及びコントロール生検と比較した場合、炎症生検において、ＭＭＰ３の際だった発現増加が示されている。(Heuschkel等 Gut. 2000;47:57-62; von LB等 Gut. 2000;47:63-73)また、ＭＭＰ３−／−マウスについてのデータには、細菌のクリアランス遅延、ＭＭＰ７における代償性増加、及び固有層へのＣＤ４＋Ｔリンパ球補充の低減が示されている。(Li等 J Immunol. 2004;173:5171-5179)更に、近年のデータには、結腸細胞系において用量依存性好中球補充を引き起こすＣＸＣＬ７によって媒介されるＭＭＰ３の炎症誘発効果が示されている。(Kruidenier等 Gastroenterology. 2006;130:127-136)
【０２２２】
我々のデータセットにおいて、我々は、我々の非炎症コントロールと比較して、我々の炎症コントロールにおけるＭＭＰ３の発現が低下していることを観察しており、ＵＣにおいてＭＭＰ３及びＭＭＰ７発現で観察された変化が、疾患に特異的であることが示唆される。ドイツ人集団における５Ａ変異体の伝達不均衡試験により、ＣＤには関係するが、ＵＣには関係しないことが示され、イギリス人集団に置き換えられるものではなかった。(Pender等 J Med Genet. 2004;41:e112)
【０２２３】
また我々は、このデータセットを使用し、特にＩＢＤ２及びＩＢＤ５における全ゲノム分析により、関連した感受性遺伝子座に対する遺伝子マッピングの相対発現を分析する。本データは、遺伝子の同定、繊細マッピング研究の相補結果、及び現在進行中の全ゲノムケースでのコントロール研究に使用されるであろう。この点で、２０００年に全ゲノムスキャニングにより最初に発見された、多くの魅力ある候補遺伝子を含むサイトカインクラスターをスパンするＩＢＤ５遺伝子座に関連した我々のデータを再検討することは、非常に興味のあることである。(Rioux等 Am J Hum Genet. 2000;66:1863-1870; Ma等 Inflamm Bowel Dis. 1999;5:271-278)ＩＢＤ５結合の間隔をスパンするタイトな結合不平衡が、以前の遺伝子研究を制限しており、これらはこの領域内の感受性遺伝子を同定するために十分な力がなかった。(Waller等, Gut. 2006;55:809-814; Fisher等 Hum Mutat. 2006;27:778-785; Noble等 Gastroenterology. 2005;129:1854-1864)
【０２２４】
有機カチオントランスポーターＳＬＣ２２Ａ５(ＯＣＴＮ２)をコードする位置的な候補遺伝子のダウンレギュレーションが、ＵＣ生検をコントロール生検と比較した場合に、ＳＬＣ２２Ａ４(ＯＣＴＮ１)及びＳＬＣ２２Ａ５の双方で観察され、ダウンレギュレーションは非炎症Ｓ字結腸生検と比較して、炎症ＵＣＳ字結腸生検でも観察された。これらの刺激的データにより、これらの遺伝子の発現低下が、結局のところ、ＵＣの病原に関与している可能性が示唆され、よって、これらのデータはこれらの遺伝子における関心を維持している。Ｐｅｌｔｅｋｏｖａ及び共同研究者は、これらの遺伝子における２つの変異体−ＳＬＣ２２Ａ４(１６７２Ｃ→Ｔ)及びＳＬＣ２２Ａ５変異体(−２０７Ｇ→Ｃ)が、ＣＤに対する疾患感受性に寄与していることを示唆している(Peltekova等 Nat Genet. 2004;36:471-475)が、この研究において、これらの変異についての遺伝子型が同定された少数の患者で発現を比較した場合、野生型とＴＣホモ接合体患者との間には、発現に何の変化も観察されなかった(データを示さず)。また、双方がＩＢＤ５におけるもっともらしい候補であるＩＲＦ-１及びＰＤＬＩＭ４の発現は調節不全であり、現在のところ、この遺伝子座に関連する不正確さが強調されている。ＩＢＤ２遺伝子座内においては、一連の調節不全遺伝子が本データセットで同定され、ＧＬＩのみが詳述された変異分析にかけられる。
【０２２５】
結論として、これらのデータは、ＵＣ及びコントロールの患者の回腸末端及び結腸の全ゲノムの発現を正確に特徴付けしている。本研究は、健常な結腸における遺伝子発現の領域差に新たな見識を提供するものであり、ＵＣにおける過去の研究をかなり拡大する。これらのデータは、小腸炎の多くの重要なレギュレーター、特にαデフェンシンファミリー、ヘッジホッグシグナル伝達分子、及びマトリックスメタロプロテイナーゼを同定する。
【０２２６】
実施例３−免疫組織化学検査
ＩＢＤ生検中におけるＤｅｆＡ６の発現
デフェンシンα６は、通常、小腸陰窩上皮においてパネート細胞により発現し、結腸上皮細胞では発現しない。我々は、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイを使用し、潰瘍性大腸炎及びクローン病患者において、また生検溶菌液でのｔａｑｍａｎで、ＲＮＡレベルでＤｅｆＡ６の発現が増加することを観察した。この実験は、ＤｅｆＡ６タンパク質発現の増加がホルマリン固定された結腸生検において見られるかどうかを評価するものである。
予期したように、我々の実験は、炎症の組織的証拠のない非ＩＢＤコントロール患者からの結腸生検において、ＤｅｆＡ６の染色がなかったことを示す。また我々は、顕微鏡的大腸炎と診断された非ＩＢＤコントロール患者も評価した。その患者において、ＤｅｆＡ６はＳ状結腸陰窩上皮細胞に存在していた。 
【０２２７】
潰瘍性大腸炎患者において、２１人の患者では、Ｓ状結腸、下行結腸、横行結腸、又は直腸の陰窩上皮細胞で、散在化及びクラスター化したＤｅｆＡ６が染色された。２１人の陽性患者の２０人には、彼らの生検組織に慢性又は慢性-活動的炎症の組織学的証拠が見られた。残った患者には、主として急性(好中球の)炎症があった。結腸に陽性のＤｅｆＡ６染色がある患者は非炎症生検を有さなかった。
１８人の潰瘍性大腸炎患者では、結腸上皮にＤｅｆＡ６染色の証拠がなかった。これらの患者の多く(１０)に、生検組織に炎症の組織学的証拠はなかった。残った患者の６人には、主として好中球炎症(急性炎症)があり、２人には慢性／慢性-活動的炎症があった。
【０２２８】
要約すると、潰瘍性大腸炎におけるＤｅｆＡ６発現は、生検に観察される局所的炎症状態と相関していると思われる。非炎症生検のいずれも、ＤｅｆＡ６染色されなかった。更に、慢性又は慢性-活動的炎症を患っている患者は、急性炎症を患っている患者より、より陽性ＤｅｆＡ６染色となると思われる。
【０２２９】
実験設計：炎症状態のスコアリングは、炎症細胞型の優位性に基づいた：好中球優位＝急性炎症；好中球及び単核炎症細胞＝慢性活性；及び単核炎症細胞優位＝慢性。
表９は組織学的所見を示す。ＤｅｆＡ６の発現は「−」、「＋」又は「＋＋」で示し、対応する炎症スコアを幾つかの場合に提供する。
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【０２３０】
実施例４−生殖系列ＧＬＩ１変異の分析
潰瘍性大腸炎(ＵＣ)及びクローン病(ＣＤ)は、かなりの罹患率を有する高有病率の多遺伝子性慢性炎症性腸疾患(ＩＢＤ)である。ヘッジホッグ(ＨＨ)シグナル伝達経路は、胃腸管発育、ホメオスタシス、及び悪性腫瘍において、生命維持の役割を担っている。我々は、ＩＢＤを患っている患者における、ＧＬＩ１(ＩＢＤ２結合領域、１２ｑ１３)での生殖系列変異を同定した。このＩＢＤ-関連変異体は、還元型機能を有するＧＬＩ１タンパク質をコードするため、還元Ｇｌｉ１活性を有するマウスが化学的に誘発された大腸炎に対して感受性である。遺伝子ワイドのハプロタイプ-タギングアプローチを使用し、生殖系列ＧＬＩ１変異を、全体で５０００人以上の、ＩＢＤ患者、及び北ヨーロッパ(スコットランド、イングランド及びスウェーデン)の健常なコントロールの３つの独立した集団で試験した。対数尤度分析において、スコットランド及びイングランドでは、ＧＬＩ１はＩＢＤ、主としてＵＣと関連していた(ｐ＜０．０００１)。ＧＬＩ１のエクソン１２(Ｑ１１００Ｅ)における非同義ＳＮＰ(ｒｓ２２２８２２６Ｃ→Ｇ)は、１．１９４(Ｃ．Ｉ＝１．０９−１．３１、ｐ＝０．０００２)のプールされたオッズ比を有し、強く関与していた。ＧＬＩ１変異体を、ルシフェラーゼアッセイにおける転写活性について、インビトロで試験した。Ｑ１１００Ｅは、ＧＬＩ１のＣ末端近傍の保存モチーフ内に入り；変異ＧＬＩタンパク質は、インビトロで還元トランス活性化機能を示した。相補的な発現研究において、我々は、ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ及びＨＨＩＰを含む、結腸ＨＨ反応が、ＵＣを患っている患者においてダウンレギュレートしていることを言及する。最後に、ＧＬＩ１＋／−マウスを、ＤＳＳ-誘発性大腸炎に対する感受性について試験した。臨床反応、組織検査及び炎症サイトカインの発現を記録した。ＧＬＩ１＋／−マウスでは、野生型と比較して、かなりの罹患率及び死亡率を有する重度の小腸炎を急速に発症した。局所骨髄細胞はＨＨシグナルの直接標的であることが示され、サイトカイン発現研究により、このモデルにおけるＩＬ-１２、ＩＬ-１７及びＩＬ-２３の強いアップレギュレートが明らかとなった。ＧＬＩ１を介したＨＨシグナル伝達は、急性炎症誘発に対する腸反応の適切な調製にとって必要である。還元ＧＬＩ１機能はＩＢＤ病変形成の素因になりやすく、新規の治療手段が提案される。
【０２３１】
潰瘍性大腸炎(ＵＣ；ＭＩＭ１９１３９０)及びクローン病 (ＣＤ；ＭＩＭ２６６６００)は、高い有病率(北ヨーロッパ及び北アメリカで、１０００００人当たり２００-４００ケース[Loftus EV, Jr. (2004) Gastroenterology 126: 1504-1517])を有する、慢性で再発性のの炎症性腸疾患(ＩＢＤ)であり、かなりの罹患率に関連している。正確な病原メカニズムは理解されていないが、幾つかの系統の証拠が、腸内細菌に反応する、最も重要な調節不全宿主に関連している[Xavier RJ, Podolsky DK (2007) Nature 448: 427-434]。疫学データ、詳細な分子研究、及びゲノム-ワイド関連研究は、ＵＣ及びＣＤが感受性遺伝子座を共有する多遺伝子性疾患に関連していることを強く示唆している(ＩＬ-２３Ｒ、ＩＬ-１２Ｂ、及びＮＫＸ２．３ [Wellcome Trust Case Control Consortium (2007) Nature 447: 661-678；Duerr等(2006) Science 314: 1461-1463；Parkes等(2007) Nat Genet Jul;39(7):830-2. Epub 2007 Jun 6])が、他では異なり: ＮＯＤ２、ＡＴＧ１６Ｌ１及びＩＲＧＭは特異的ＣＤ遺伝子であり; ＥＣＭ１遺伝子座はＵＣに関連している[Parkes等(2007) Nat Genet Jul;39(7):830-2. Epub 2007 Jun 6；Fisher等(2008). Nat Genet 40(6):710-2. Epub 2008 Apr 27；Hampe等(2007) Nat Genet 39: 207-211；Hugot等(2001). Nature 411: 599-603; Ogura Y等(2001). Nature 411: 603-606]。染色体１２ｑ１３上のＩＢＤ２遺伝子座 (ＯＭＩＭ  ６０１４５８)は、最初、ＵＣ及びＣＤ患者の双方に関連しているＵＫゲノム-ワイドスキャン(Ｄ１２Ｓ８３でのピークＬＯＤスコア５．４７) [Satsangi等(1996). Nat Genet 14: 199-202]において同定された。最近の研究では、ＩＢＤ２がＵＣ、特に広範囲の疾患、おそらくＣＤ感受性において、更に少ない方法で寄与している[Achkar等(2006). Am J Gastroenterol 101: 572-580；Parkes M等(2000) Am J Hum Genet 67: 1605-1610]。ＩＢＤ２遺伝子座にマッピングする強力な候補遺伝子はＧＬＩ１であり、分泌ヘッジホッグ(ＨＨ)シグナルを変換する３つの関連ＧＬＩ転写因子の一つである。ＨＨシグナル伝達は腸発育、ホメオスタシス及び悪性腫瘍の鍵となるものであるが、ＩＢＤにおいては、入念に研究されてはいない[Lees等(2005) Gastroenterology 129: 1696-1710]。.腸の発育において、音(ＳＨＨ)及びインディアン ヘッジホッグ(ＩＨＨ)は、上皮から間葉性反応パッチ(mesenchymal receptor patched)(ＰＴＣＨ)にパラクリンシグナルを提供する。ＰＴＣＨは、膜タンパク質平滑化(membrane protein smoothened)(ＳＭＯ)及びジンクフィンガー転写因子ＧＬＩ１、ＧＬＩ２及びＧＬＩ３を介して、組織パターン及び細胞運命を直接コントロールする[Madison等(2005) Development 132: 279-289]。慢性損傷、炎症及び修復はＩＢＤの重要な側面であり、よって、ＨＨ経路は筋肉[Pola等(2003) Circulation 108: 479-485]、肝臓[Jung等(2008) Gastroenterology 134: 1532-1543; Omenetti等(2008) Gut May;134(5):1532-43. Epub 2008 Feb 14.]、及び肺[Stewart等(2003) J Pathol 199: 488-495; Watkins等(2003) Nature 422: 313-317]を含む、幾つかの他の組織におけるこれらのプロセスに中心的に関与していることが妥当である。実際、ＨＨシグナル伝達は、ＳＨＨがＴリンパ球発生[El Andaloussi等(2006). Nat Immunol 7: 418-426]、成人のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞活性化[Lowrey等(2002) J Immunol 169: 1869-1875; Stewart等(2002). J Immunol 169: 5451-5457]、及び脾臓における骨髄細胞の変異[Varas等, (2008) J Leukoc Biol Jun;83(6):1476-83. Epub 2008 Mar 11]にとって重要であるため、免疫反応では中心的な役割を担っている。またＨＨ経路の成分の調節不全は、バレット���道、慢性胃炎及びＩＢＤ[Nielsen等, (2004) Lab Invest 84: 1631-1642]を含む、腸の炎症疾患において留意されている。大腸鏡検査の生検のマイクロアレイ遺伝子発現解析を使用し、近年、我々は、ＧＬＩ１が非炎症試料と比較して、炎症ＵＣにおける腸粘膜でダウンレギュレートしていることを示した[Noble等(2008) Gut. Oct;57(10):1398-405. Epub 2008 Jun 3]。ＧＬＩ１及びＩＢＤ 感受性の間の可能性のある関連性を更に探究するために、我々は、遺伝子-ワイドハプロタイプ-タギングアプローチを使用し、北ヨーロッパの幾つかの集団において、ＧＬＩ１遺伝子座におけるハプロタイプ変異を試験した。我々は、ＧＬＩ１のＣ末端領域において、非同義ＳＮＰに強く関与している、ＩＢＤとの有意の関連性を同定した。 ＧＬＩ１転写活性化において、インビトロで５０％低減を示す関連変異体の機能分析により、機能的変異体が、病気の危険性を増加させ得ることが証明された。これらの知見は、機能的ＧＬＩ１タンパク質の投与量を減らすことが大腸炎症において重要な役割を担うかもしれないという仮説に、我々を導いた。このことを直接試験するために、我々は、デキストラン硫酸ナトリウム(ＤＳＳ)を、ＧＬＩ１＋／− マウス及びそれらの野生型(ＷＴ)及びそれらの同腹仔に投与し、急性小腸炎を誘発させた。ＧＬＩ１＋／− マウスには、重度の大腸炎が急速に発症し、機能的ＧＬＩ１活性が、マウス及び人間における炎症性刺激に対する反応にとって極めて重要であることが示唆される。
【０２３２】
被験者及び試料。表１０には、スコットランド人及びケンブリッジのＩＢＤ集団における、詳細なデモグラフィック及び表現型データが提供される。（ＨＣ−健常なコントロール；ＣＤ−クローン病；ＵＣ−潰瘍性大腸炎；ＩＣ−未定の大腸炎。
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【０２３３】
遺伝子型同定：スコットランド及びスウェーデン：ゲノムＤＮＡを、過去に記載されたような修正塩析技術、及び核子キットを使用し、血液試料から抽出した。対立遺伝子識別のために、Ｔａｑｍａｎシステムを使用して遺伝子型を誘導し；アッセイは、イルミナプラットフォームにおいて遺伝子型を同定する、ＳＮＰ ｒｓ１０７８３８１９、ｒｓ３８０９１１４、ｒｓ５０７５６２、ｒｓ５４２２７８、ｒｓ７３０５６０、ｒｓ１６６９２９６、ｒｓ７７５３２２を除き、Ｔａｑｍａｎ ＳＮＰ遺伝子型同定アッセイ(7900HT sequence detection system; Applied Biosystems)として、Applied Biosystemsから入手可能である。各Ｔａｑｍａｎアッセイの正確性を、１００％一致を有する５％の場合では分析を繰り返すことによりチェックした。コントロール集団における遺伝子型分布は、全てのＳＮＰについて、ハーディ-ワインベルグ平衡(ｐ＞０．０１)と一致した。Ｔａｑｍａｎにより誘導できなかった４つのｔＳＮＰについての場合では、遺伝子型は直接配列化することにより得た。ケンブリッジ：核子キットを使用して、ＤＮＡを抽出した。ＣＤの症例及びコントロールの遺伝子型同定を、ＡＢＩ７９００ＨＴ分析器(Applied Biosystems)を使用する、Ｔａｑｍａｎ二対立遺伝子識別システムを用いて実施した。ＵＣ症例の遺伝子型同定を、１５３６ＳＮＰ Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ ｂｅａｄ ａｒｒａｙ(Illumina)を使用して実施した。プラットフォーム間の一致は、それぞれ１００％及び９７．９％の一致率を有するＳＮＰｓ ｒｓ２２２８２２４及びｒｓ２２２８２２６については、９２のＵＣ症例の遺伝子型を同定することにより評価し、プラットフォーム間の系統的バイアスの証拠はなかった。症例及びコントロール集団における遺伝子型同定は、全てのＳＮＰについて、ハーディ-ワインベルグ平衡(ｐ＞０．０１)と一致した。
【０２３４】
マイクロアレイ及びＱＰＣＲによる遺伝子発現。患者のコホートを、６７のＵＣを患っている患者、５３のＣＤ患者及び３１の健常なコントロール(ＨＣ)からなるマイクロアレイ研究に使用した。デモグラフィクスについては、マイクロアレイデータセット及びＱＰＣＲ方法の生成[Noble等(2008) Gut. Oct;57(10):1398-405. Epub 2008 Jun 3を参照]。
【０２３５】
ＤＳＳ誘発性大腸炎の導入及び組織学的分析。混合ケージ(Ｃ５７ＢＬ／６ バックグラウンド)において、野生型ＧＬＩ１+/ｌａｃＺ又は野生型同腹仔コントロールの２〜４のグループに、飲み水に入った３％ＤＳＳを、４-６日間投与した。消費されるＤＳＳの量は、ＷＴとＧＬＩ１＋／−動物の間で有意な差はなかった(データを示さず)。ＧＬＩ１＋／−動物は、それらのＷＴ同腹仔よりも体重が重くなる傾向にあった(ＧＬＩ１＋／−動物の平均＝２８ｇ、ＷＴ動物については２４ｇ)。よって、ＤＳＳ処理して体重を適合させたＷＴ Ｃ５７Ｂｌ／６動物(ｎ＝４)を、ＧＬＩ１＋／− 動物及びＷＴ同腹仔と共に試験した。ＷＴ同腹仔と体重適合させたＣ５７Ｂｌ／６の間には、何の差異もないことが証明された。全ての動物を下痢、血便及び体重減少について、毎日モニターした。臨床スコアリングは次の通りである：０＝症状なし、１＝下痢、２＝血便、４＝重度の直腸出血及び不動といった病的状態／死亡。組織診断について、同じ動物の等しい長さ及び位置の大腸組織のセグメントを、４％のパラホルムアルデヒドにおいて一晩固定し、脱水し、パラフィンで浸潤させ、５μｍに切断した。スライドをヘマトキシリン／エオシンで染色し、組織源をかくして、胃腸の病理学者(ＨＡ)により、組織学的にスコアリングした。
【０２３６】
タンパク質変異原性及びルシフェラーゼアッセイ。イメージクローン＃３５３１６５７から、ＧＬＩ１Ｅ１１００を増幅させ、ｐＣＭＶＴａｇ２ｂにクローン化した。製造者のプロトコルに従い、クイックチェンジ(QuikChange)ＩＩ部位特異的変異原性キット(Stratagene)を使用し、点変異を誘発させることにより、ＧＬＩ１ Ｑ１１００を得た。８ｘＧｌｉ-ルシフェラーゼ、ｍ８ｘＧｌｉ-ルシフェラーゼ(変異したＧｌｉ部位)及びＧｌｉ２△Ｎをコードするプラスミドは、Ａｎｄｒｚｅｊ・Ｄｌｕｇｏｓｚ博士からの贈り物である。２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレートに植え付け、０．７μg/ウェルの転写因子、０．４μg/ウェルのレセプタープラスミド、及び２ｎｇ/ウェルのｐＲＬ-ＴＫ  Ｒｅｎｉｌｌａ(Promega)を用いて形質移入させ、製造者のプロトコルに従い、ドゥラ(Dur)-ルシフェラーゼレポーターキット(Promega)を使用し、形質移入の３６時間後に、ルシフェラーゼ発現について試験した。ホタルのルシフェラーゼ発現を、ウミシイタケに対して十分に標準化させ、倍率変化を８ｘＧｌｉ-ルシフェラーゼ 形質移入単独と比較することにより算出した。
【０２３７】
サイトカイン発現ＱＰＣＲ全結腸ｍＲＮＡを、トリゾールを使用して収集し、ＲＮイージーミニキット(Qiagen)を使用して、ＤＮアーゼ消化で、ＲＮＡを浄化した。ｉＳｃｒｉｐｔｃＤＮＡ合成キット(Biorad)を使用して、ｃＤＮＡを合成し、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ＱＰＣＲを、Ｂｉｏｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ機で実施した。発現レベルをＧＡＰＤＨに対して標準化し、スチューデントｔ検定を使用し、統計的分析を実施した。
【０２３８】
統計的分析。ｔＳＮＰのハプロタイプ頻度を、期待値最大化アルゴリズムを使用して推測し、これらを、ハプロタイプ頻度が、ＥＨ及びＰＭプログラマーに実施される場合に、各ケースとコントロールとで異なるかどうかを試験するために使用した。ｎ−１の自由度のχ２分布(ここでは、ｎ＝可能なハプロタイプの数)を有する試験統計値２*(In(Ｌケース) + In(Ｌコントロール) - In(Ｌケース/Ｌコントロール))を算出し、データを１０００００回並び替えることにより、経験的ｐ値を得た。ハプロビュー(Haploview)プログラムｖ３．２（www.hapmap.org）を使用することにより、ハプロタイプを試験した。適切であるならば、与えられ両側ｐ値と９５％信頼区間(Ｃ.Ｉ.)で提示されたオッズ比(ＯＲ)を用いて、個々のＳＮＰ分析を、χ２又はフィッシャー直接検定を使用して実施した。ＳＮＰ ｒｓ２２２８２２６のメタアナリシスは、固定効果モデル(R-software package)を使用するマンテル-ヘンツェル法を用いて実施した。偽陽性報告の確率の算出法の詳細を、補足的方法に提供する。発現プロファイルをマンホイットニーのＵ検定及びクラスカル-ワリス検定を使用して分析し、全てのデータセットの非パラメータ分布を推測した(GraphPad Prism 4, GraphPad Software Inc.)。
【０２３９】
結果
ＧＬＩ１における遺伝子全体の変異は、ＩＢＤと関連しており、スコットランド人の集団では、非同義ＳＮＰ(ｒｓ２２２８２２６)に起因していた。
４つのマルチマーカータギングシングルヌクレオチド多形性(ｔＳＮＰｓ；ｒ２≧０．８)を同定し(ｒｓ３８１７４７４、ｒｓ２２２８２２５、ｒｓ２２２８２２４、及びｒｓ２２２８２２６)、頻度＞１％のハプロタイプで検出されるＧＬＩ１のハプロタイプ変異を記述した。我々は、４７４のＵＣ及び３３５のＣＤ症例、及び１３６４の十分に適合させた健常なコントロールからなるスコットランド人のＩＢＤ集団における、これら４つのｔＳＮＰの遺伝子型同定を実施した(表１０)。ついで、我々は、ＧＬＩ１及びＩＢＤ感受性の関連性を試験するために、モデル-フリー分析を使用した。スコットランド人の集団において、我々は、ＩＢＤ(ｐ＜０．０００１)とＵＣ(ｐ＜０．０００１)との間の極めて有意な関連性、及び境界有意性(ｐ＝０．０３)のＣＤとの関連性を示した。ハプロビューにおける個々の推定ハプロタイプ頻度の分析において、３つの共通したハプロタイプが記述された(データを示さず)。我々は、この影響を、１６６のＣＤ及び１７０のＵＣ患者において、フェーズＩＩハップマップ(HapMap)データから選択される付加的な７つのハプロタイプタギングＳＮＰの遺伝子型を同定することにより、ＧＬＩ１遺伝子が制限され、隣接ブロックにタグ化されることを確認した。このことは、隣接遺伝子に伸長しないＧＬＩ１スパンニングハプロタイプブロックの存在により確認された（ＩＮＨＢＥ及びＡＲＨＧＡＰ９）(データを示さず)。
【０２４０】
表１１は、スコットランド人、イングランド人、スウェーデン人の健常なコントロール(ＨＣ)、及び炎症性腸疾患(ＩＢＤ)、クローン病(ＣＤ)及び潰瘍性大腸炎(ＵＣ)における、ＧＬＩ１非同義ＳＮＰ ｒｓ２２２８２２６(ｔＳＮＰ４)に対する小さな対立遺伝子頻度を示す。
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【０２４１】
ＩＢＤ対ＨＣ、ＵＣ対ＨＣ、及びＣＤ対ＨＣのこれら３つの集団において、χ２分析についてのオッズ比及び両側ｐ値を付与する。これらのデータのメタアナリシスを図１に提示する。３つ全ての集団における推定ハプロタイプの頻度、及びスコットランド人の集団についての、全遺伝子型データを補足資料(補足表１及び２)に詳述する。
ハプロタイプ検定及び対数尤度分析における関連性は、ＧＬＩ１のエキソン１２における非同義ＳＮＰ(ｒｓ２２２８２２６Ｃ→Ｇ；ｔＳＮＰ４)に大きく起因している。ｒｓ２２２８２２６は、ＩＢＤ (対立遺伝子頻度ＯＲ＝１．２３、Ｃ.Ｉ.１．０７−１．４０、ｐ＝０．００２６; ホモ接合体ＯＲ＝１．５６、Ｃ.Ｉ.１．１５−２．１１、ｐ＝０．００４７)、ＣＤ(対立遺伝子頻度ＯＲ＝１．３０、Ｃ.Ｉ.１．０８−１．５５、ｐ＝０．００５３、ホモ接合体ＯＲ＝１．７９、Ｃ.Ｉ.１．２１−２．６５、ｐ＝０．００４８)及びＵＣ(対立遺伝子頻度ＯＲ＝１．１９、Ｃ.Ｉ.１．０１−１．３９、ｐ＝０．０４)と関連している(表１１及びデータを示さず)。これらのデータでは、ヘテロ接合体患者よりも、ホモ接合体の方が、より大きなオッズ比を有する、対立遺伝子特異性用量反応であることが示唆される。直接配列化することによるＧＬＩ１コード領域の変異スクリーニングでは、新規のＳＮＰの同定に失敗した。ｄｂＳＮＰ及びＩＢＤからの７つの付加的なＧＬＩ１変異の間に関連性はなかった(データを示さず)。
【０２４２】
２つの独立した北ヨーロッパ人のＩＢＤおけるＧＬＩ１関連性の再現及びメタアナリシス。ついで、我々は、他の集団におけるこれらの発見を再現することを探究した。ケンブリッジ、イングランドからの大きなＩＢＤパネル(ｎ＝９２８ＵＣ、７３７ＣＤ、８３の未定の大腸炎及び５８９のＨＣ)において、ＧＬＩ１との関連性を、ＩＢＤ(ｐ＝０．００９)及びＵＣ(ｐ＜０．０００１)における対数尤度分析により再現した。この集団において、ｒｓ２２２８２２６はＩＢＤ (ＯＲ１．１７、Ｃ.Ｉ.１．００−１．３６、ｐ＝０．０４２)及びＵＣ(ＯＲ１．２１、Ｃ.Ｉ.１．０３−１．４２、ｐ＝０．０１７)とは関連しているが、ＣＤとは関連していない(表１１)。スコットランドの場合、ｔＳＮＰｓ１-３との関連性はない(データを示さず)。より小さなスウェーデン人のコホート(ｎ＝７００)において、ＩＢＤ(ＯＲ１．１４、Ｃ.Ｉ.０．９０−１．４５)とｒｓ２２２８２２６との関連性に、有意な傾向はなかった(表１１)。
【０２４３】
図１０４は、スコットランド、イングランド及びスウェーデンにおけるＩＢＤ症例及び健常なコントロールでの固定効果モデルを用いたマンテル-ヘンツェル法を使用し、ｒｓ２２２８２２６(ＯＲ１．１９４、Ｃ.Ｉ.１．０８９−１．３０９、ｐ＝０．０００２)との関連性を確認するメタアナリシスを示す。メタアナリシスは、マンテル-ヘンツェル法(ｎ＝５３５２個人)を使用する、スコットランド、ケンブリッジ及びスウェーデンにおける、非同義ＧＬＩ１ＳＮＰ ｒｓ２２２８２２６(ｔＳＮＰ４)のものである。３つのコホート(ｐ＝０．８２５)の間のｒｓ２２２８２２６による不均一性の証拠は存在しなかった。遺伝的関連性の研究における偽陽性発見の公開に伴う現問題を認識すると、我々は、ＧＬＩ１ＳＮＰ ｒｓ２２２８２２６のメタアナリシスに見出される病気の危険性との関連は、Wacholder等(2004) J Natl Cancer Inst 96: 434-442に記載されているような、偽陽性報告の確率(ＦＰＲＰ)を適合させることによる、本物の(偽陽性よりむしろ)関連性を表す、という可能性を推定した。これにより、これらの所見が少なくとも９２％(ＦＰＲＰ＜０．０８)の真の所見となるという推定確率が付与される。この方法は、真の陽性を意味するとは思えない統計的に有意な発見の過剰解釈を回避できるように設計されているが、我々の研究では、これらのデータの我々の解釈を明らかに支持するものであった。
【０２４４】
ｒｓ２２２８２２６によりコードされるＧＬＩ１変異体は、インビトロでのＧＬＩ反応性転写の活性化において、機能的に欠損しており、ｒｓ２２２８２２６Ｃ→Ｇは、グルタミンからグルタミン酸(Ｑ１１００Ｅ)への変化をコードするＧＬＩ１のエキソン１２におけるミスセンス変異である。
【０２４５】
図１０５は、Ｑ１１００ＥがＧＬＩ１タンパク質の保存領域を乱し、ＧＬＩ１転写活性を低減させることを示す。Ａ）Ｇｌｉ１タンパク質における既知の機能ドメインの保存。先に記載したＳｕｆｕ結合、ＤＮＡ結合、及びトランス活性化ドメイン[Yoon等(1998) J Biol Chem 273: 3496-3501; 27 Kinzler等(1988) Nature 332:371-374; Kogerman等(1999) Nat Cell Biol 1: 312-319]を模式的に示す。各ドメインのアミノ酸保存は、ドメインの下のバーのシェーディングにより、また数値的に表される。赤いボックスは、ＧＬＩ１タンパク質の安定性を調節することが知られている領域を示す[Huntzicker等(2006) Genes Dev 20: 276-281]。Ｑ１１００Ｅを含む保存さＲたＣ末端ドメインは、既知のトランス活性化ドメインに隣接している。Ｂ）哺乳動物Ｇｌｉ１タンパク質のＣ末端のアラインメント。この領域(ＡＡ１０８０−１１０６)は、哺乳動物系統に高度に保存されている。Ｃ、Ｄ）ＧＬＩ１ Ｑ１１００及びＥ１１００は、２９３ＴＳＡ細胞において、類似した細胞局在性を有する。Ｅ）ＧＬＩ１ Ｅ１１００は、ＧＬＩ１ Ｑ１１００と比較して、８ｘＧｌｉ-ルシフェラーゼレポーターの活性化促進に欠損がある。Ｇｌｉ△Ｎは８ｘＧｌｉ-ルシフェラーゼの強力なアクチベーターであり、ＧＬＩ１活性化の正のコントロールとして供給される。８ｘＧｌｉ-ルシフェラーゼコンストラクトは、唯一の変異Ｇｌｉ結合部位を含み、負のコントロールとして供給される。データは、２つの異なるプラスミド調製物(Ｎ＝１８)を使用して実施された６つの３組の実験から示す。
【０２４６】
変異は、認識されたトランス活性化ドメイン近傍の、哺乳動物ＧＬＩ１タンパク質のＣ末端で、十分に保存されたモチーフ内に入る(図１０５ａ)[Yoon等(1998) J Biol Chem 273: 3496-3501]。Ｑ１１００残基は試験した全ての動物においてそれ自体が１００％保存されている(図１０５ｂ)。Ｑ１１００Ｅ変異の機能的結論を評価するために、我々は、ＧＬＩ１Ｑ１１００又は変異体ＧＬＩ１ Ｅ１１００のいずれかを、２９３Ｔ細胞に形質移入させた。発現レベル又は細胞局在性における差異は、これらのＧＬＩ１変異体の間では検出されず；双方のタンパク質は、形質移入細胞の核において、容易に検出された(図１０５ｃ-ｄ)。我々は更に、、十分に定義されたＧＬＩ１レポーター ８ｘＧｌｉ-ルシフェラーゼを活性化させる各変異体の能力を評価した[Saitsu等(2005) Dev Dyn 232: 282-292]。我々は、ＧＬＩ１転写活性についてのポジティブコントロールとして、８ｘＧｌｉ-ルシフェラーゼの非常に強力なアクチベーターであるＧｉｌ△２Ｎを利用した[Roessler等(2005) Hum Mol 遺伝子t 14: 2181-2188]。双方のＧＬＩ１変異体は、ベースラインの上の８ｘＧｌｉ-ルシフェラーゼを活性化させるが、ＷＴ ＧＬＩ１ Ｑ１１００は、変異体ＧＬＩ１ Ｅ１１００よりも転写アクチベーターとして２倍以上有効であった。
【０２４７】
ヘッジホッグ経路活性は、大腸炎症においては調節不全である。我々は先に、ＧＬＩ１発現は、ヒトにおいて、近位の結腸と比較して、更に遠位にあることを報告している[Noble等(2008) Gut. Oct;57(10):1398-405. Epub 2008 Jun 3]。
【０２４８】
図１０６は、健常なヒト成人結腸(ＨＣ)及び潰瘍性大腸炎(ＵＣ)におけるヘッジホッグ(ＨＨ)シグナル伝達成分の発現を示す。Ａ）パッチ(ＰＴＣＨ)、ヘッジホッグ-相互作用タンパク質(ＨＨＩＰ)、及びＧＬＩ１のｍＲＮＡレベルは、健常な成人結腸、上行結腸(ＡＣ)から下行結腸(ＤＣ)及びＳ状結腸(ＳＣ)の長さに沿って増加している。Ｂ）管腔表面で末期的に分化している腸細胞におけるＨＨタンパク質発現は、近位と比較して、遠位結腸においての方がより大きい。Ｃ）非炎症ＨＣと比較して、ＵＣにおける、インディアンヘッジホッグ(ＩＨＨ)、ＰＴＣＨ、ＧＬＩ１、及びＨＨＩＰのｍＲＮＡレベルの定量分析。健常な結腸(ａ-ｄ)の長さに沿って同定された勾配について説明するために、ＳＣのみからのデータを示す。ＱＰＣＲデータは、この遺伝子がＡｇｉｌｅｎｔマイクロアレイチップ上に存在しない場合に、ＩＨＨについて定義される。病気の検体は非炎症(Ｎ-Ｉ)及び炎症(Ｉ)組織に下位範疇化される。非ＩＢＤ炎症、又はＨＣと比較してＵＣ又はＣＤのいずれかにおいて、ＤＨＨ、ＰＴＣＨ２、ＧＬＩ２、ＧＬＩ３、ＳＵＦＵ又はＤＩＳＰ１のレベルに、何の変化もなかった(データを示さず)。ＳＨＨ ｍＲＮＡの分析により、炎症細胞における公知のＳＨＨの発現と一致し、炎症に関連して発現レベルに穏やかな増加が示された(データを示さず) [Lowrey等(2002) J Immunol 169: 1869-1875]。
【０２４９】
個々のデータポイントを、各データセットについての中央値を表す水平線と共にプロットする。付与されたｐ値は、ＡＣ、ＤＣ及びＳＣにおけるレベルと比較するラスカル-ワリス検定、及びマンホイットニーのＵ検定(ＵＳ対ＨＣ(Ｎ-Ｉ))から得る。
【０２５０】
このマイクロアレイデータセットの拡張コンピュータ解析により、ＨＨタンパク質と共に、ＰＴＣＨ及びＨＨＩＰのｍＲＮＡ転写物が、この発現勾配に酷似していることが示された(図１０６ａ-ｂ)。ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ及びＨＨＩＰは、その発現レベルが経路活性を予期している、経路反応エレメントである。ＧＬＩ１(ｐ＝０．０００３)、ＰＴＣＨ(ｐ＝０．００２)、及びＨＨＩＰ(ｐ＝０．０００３)は、、同じ位置からのＨＣと比較して、炎症ＵＣにおいて低下した(図１０６ｃ)。ＩＨＨは炎症に関係なく、ＵＣにおいて低下した(ｐ＝０．０２)。ＧＬＩ１発現は、炎症状態に関係なく、ＨＣ(ｐ＝０．００４)よりＣＤにおいて低下し(データを示さず)、またスコットランドでは、ＧＬＩ１変異が付与される注目されるべき発見が、ＣＤと関連していた。ＰＴＣＨは、非炎症ＣＤ及びＨＣ(ｐ＝０．００７)と比較して、炎症ＣＤにおいて低下していた。ＧＬＩ１及びＰＴＣＨは、双方とも、ＨＣに対して、非ＩＢＤ炎症において低下していた(データを示さず)。これらのデータは、大腸炎症の領域における、ＧＬＩ１、ＰＴＣＨ、及びＨＨＩＰを含むＨＨ経路活性の全体的なダウンレギュレーションを示す。
【０２５１】
ＧＬＩ１＋／−動物は、３％のＤＳＳ処理により誘発される小腸炎に応じた死亡率及び上昇した罹患率を示す。ＧＬＩ１ １１００Ｅ変異体のインビトロ分析により、ＷＴ ＧＬＩ１と比較して、トランス活性化機能における５０％欠損が示され、我々の遺伝子分析では、対立遺伝子特異性用量反応が示され、ＧＬＩ１機能において中程度低下すると、腸の炎症疾患に罹りやすくするには十分であることが示唆された。特異的な試験のこの仮説に対し、我々は、ＧＬＩ１＋／− マウス [Park等(2000) Development 127: 1593-1605]、及びそれらのＷＴ同腹仔を、３％のＤＳＳで６日間処理し、急性小腸炎を誘発させた。ＤＳＳ処理により、ＧＬＩ１＋／−動物は、素早く、重度の影響を受けた。
【０２５２】
図１０７は、ＤＳＳ処置後に、Ｇｌｉ１＋／−動物が死亡率、重篤な臨床症状、及び重度の体重減少を示す結果を示す。Ａ）ＷＴ動物は６日の処理期間を超えて、１００％生存している(Ｎ＝１４)。 ほぼ５０％のＧＬＩ１＋／−動物(４−／９)が３％のＤＳＳ処理により６日間で死亡する。Ｂ）ＧＬＩ１＋／−動物は、３％のＤＳＳでの処理の４又は６日後、ＷＴ動物よりも際だって重度の兆候を示す。１＝下痢、２＝血便、４＝重度の出血/死亡。それぞれの点は個々の動物を表し、実線は、各コホートにおける平均観察値を示す。Ｃ）ＧＬＩ１＋／−動物(Ｎ＝９)は、それらの 同腹仔(Ｎ＝１０)よりも迅速に、体重が減少する。＊＝ｐ＜０．０５。
【０２５３】
６日後、４／９が死亡し、生存した３匹は、かなりの直腸出血を有する重度の罹患率を示し、ほとんど不動となる(図１０７ａ)。対して、ＷＴ動物(Ｎ＝１４)は死亡せず、全てが可動であり、処理の５及び６日後、罹患率の低下がみられた。ＧＬＩ１＋／−動物は血性下痢を発症し、４日までにかなりの体重減少があったが、ＷＴ動物は臨床的サインを発していないか、又は６日目まで測定できる程の体重減少はなかった(図１０７ｂ-ｃ)。
【０２５４】
ＧＬＩ１＋／−動物は、ＤＳＳ処理に応じて、ＷＴ同腹仔よりも重度の結腸の病気を発症する。割れ話ＥＲは、ＤＳＳ４処理の４及び６日後の、ＧＬＩ１＋／− 及びＷＴ動物から結腸組織を取り出し、試験した。ＧＬＩ１＋／−動物は、ＷＴよりも素早く、重度の組織病変を発症した。
【０２５５】
図１０８は、Ｇｌｉ１＋／−動物がＤＳＳ処置に応答してＷＴ同腹仔よりも深刻な小腸炎を示すことを示す。Ａ）ＷＴ動物(Ｎ＝４)は軽度の大腸炎症を示すが、ＤＳＳ処理の４日以内に、実質的表皮又は潰瘍性の炎症を発症しない。Ｂ）ＧＬＩ１＋／−動物(Ｎ＝４)は、ＤＳＳ処理の４日以内に、かなりの炎症性浸潤、上皮損傷、及び潰瘍を発症する。Ｃ-Ｄ）ＧＬＩ１＋／−動物は、３％のＤＳＳ処理に応じて、長時間のうちに、それらの結腸粘膜(Ｎ＝９)に重度の上皮損傷を有する深在性の小腸炎を発症する。Ｅ）ＤＳＳ処理の６日後の、結腸損傷の盲検的組織学的スコアリング。中結腸及び遠位の下行結腸からの組織の標準的な長さを、各動物でスコアリングする。ＧＬＩ１＋／−動物(Ｎ＝６)は、ＷＴ動物(Ｎ＝６)より、全体的に炎症性の病巣及びより長い病巣(１０＋陰窩ユニットに影響を及ぼす)を有する。各点は、個々の動物で観察された病巣の数を表し；実線は各コホートの平均観察値を示す。赤い点は、サイトカイン発現について分析した動物を示す。Ｆ）常在性の粘膜骨髄細胞は、Ｈｈスクリーニング伝達に直接反応し、ＧＬＩ１＋／−動物の恒常性結腸にＬａｃＺを発現する。矢印は、ＬａｃＺ-正電荷原子核を有する細胞及びＣｄ１１ｂ膜を示す。
【０２５６】
４日後、ＷＴ結腸は、幾つかの破壊性病変を除き、炎症性変化の証拠を示し(図１０８ａ）、一方、広範囲にわたる炎症性浸潤及び破壊性結腸潰瘍は、ＧＬＩ１＋／− マウスで顕著である(図１０８ｂ)。６日後、生存しているＧＬＩ１＋／−動物の炎症は際だって酷くなっていた。炎症性病変の数(図１０８ｅ)、大きさ及び感染度(図１０８ｃ-ｅ)は、ＧＬＩ１＋／−動物よりもかなり大であった。共に、これらの結果には、単一のＧｉｌ１対立遺伝子が損なわれると、重度の腸の炎症及び明らかな臨床的兆候により表されるような、ＤＳＳ処理に対する敏感度が増すことが示された。
【０２５７】
腸の骨髄細胞は、ＨＨシグナルに直接反応する。我々は、ＨＨシグナル伝達がマウスの腸及び結腸における、独占的パラクリンであることを示している[Madison等(2005) Development 132: 279-28914]。ここで、我々は、Ｈｈ反応性細胞を容易に可視化できる、ＧＬＩ１＋／−ｌａｃＺ動物を利用し、Ｇｉｌ１がマウスにおいて炎症細胞を発現することを確認した[Park等(2000) Development 127: 1593-1605]。安静にした成人の結腸において、固有層常在性ＣＤ１１ｂポジティブ骨髄細胞ではＬａｃＺが発現し、よってＨｈシグナルに直接反応していた(図１０８ｅ)。
ＧＬＩ１＋／−動物では、ＩＬ-２３ｐ１９及び炎症誘発性サイトカインの発現が増加している。
【０２５８】
図１０９は、ＤＳＳ処置後のＧｌｉ１＋／−及びＷＴマウスが強い炎症誘発性サイトカイン活性化を示すというサイトカイン分析を示す。Ａ）３％のＤＳＳ処理の６日後の、ＷＴ及びＧＬＩ１＋／−動物(Ｎ＝４)におけるサイトカイン発現。ＧＡＰＤＨに対して標準化されたサイトカイン発現を、ＧＬＩ１＋／−マウスについてはＹ軸、ＷＴ動物についてはＸ軸にプロットする。統計的に有意な方式で変化した遺伝子発現レベルを、星で示す。ドットで打たれた斜めのトレンドラインは、ＷＴとＧＬＩ１＋／−マウスとの間で同一の発現レベルを示す。Ｂ）表は、ＷＴコントロール(＊＝ｐ＜０．０５)と比較した、ＧＬＩ１＋／−動物における、平均サイトカイン発現、標準偏差、及び倍率変化を示す。幾つかの炎症誘発性サイトカインは、ＧＬＩ１＋／−動物ではアップレギュレートされたが、抗炎症性サイトカインは大部分は変化しなかった。
【０２５９】
ＤＳＳの６日後に取り出された全結腸組織についてのサイトカイン発現のＱＰＣＲ試験は、組織学的及び臨床的データを確認する；ＧＬＩ１＋／−動物はＷＴと比較して非常に有意な炎症性を示した(図１０９)。我々は、ＧＬＩ１＋／−動物において、驚くことではないが、ＤＳＳ誘発性大腸炎におけるＴＨ１細胞の突起、及びこれらの動物における重度の炎症を付与する、ＩＮＦγを含むＴＨ１サイトカインの強力な発現を検出した。我々は、ＧＬＩ１＋／−及びＷＴ動物の間のＩＬ-１０及びＴＧＦβにおいて有意な差異を検出せず、抗炎症性サイトカインのダウンレギュレートが、このモデルにおける炎症増加の一次的メカニズムではないことが示唆された。ＧＬＩ１＋／−動物において最も高度に発現したサイトカインは、ＴＨ１７リンパ球の分化を促進することが知られており、ＩＢＤを含む、幾つかの系で炎症の鍵となるメディエーターのＩＬ-２３ｐ１９である[Hue等(2006) J Exp Med 203: 2473-2483; Yen等(2006) J Clin Invest 116: 1310-1316]。また、ＩＬ-１２及びＩＬ-１７、ＩＬ-２３に密接に関連したサイトカインはＧＬＩ１＋／−動物においてアップレギュレートしていた。これらのデータは、近年、ＩＬ-２３経路が、ヒト[Duerr等(2006) Science 314: 1461-1463] 及びマウス [Yen等(2006) J Clin Invest 116: 1310-1316]の双方においてＩＢＤ病変形成に強力に関与付けられたため、特に重要である。我々のデータは、ＧＬＩ１用量又は機能の低下が見られる強力な炎症とこの鍵となる炎症経路との間の潜在的関連性を提供する。
【０２６０】
検討
ここに提示されるデータは、無傷のＨＨシグナル伝達が、炎症性攻撃に応じて、哺乳動物の腸において重要であり、ＧＬＩ１の機能低下が、ＩＢＤ病変形成に関与しているという、第１の証拠を提供する。我々は、ＨＨシグナル伝達経路が、ヒトの大腸炎症でダウンレギュレートしていることを確認した。また我々は、ＵＣ／ＩＢＤに高度に関連した、特異的ＧＬＩ１変異体を同定し、変異体タンパク質は、インビトロにおいて、転写アクチベーターとして機能的に不十分であることが示されている。最後に、我々は、マウスＧｌｉ１における５０％低減により、ＩＬ-２３経路の有意なアップレギュレートと、ＤＳＳに対する腸の炎症反応が高まることを示した。これらの発見のみが治療介入に対して可能性のあるＩＢＤ病変形成の理解に、明確に関与しているものではなく、それらは、腸炎症のけるＧＬＩ１とＨＨシグナル伝達についての機能的役割の第１の明確な記載である。我々が検出したＧＬＩ１遺伝子における遺伝的変異は、オッズ比１．１９を有し、５０００人以上の個人のメタアナリシスにより確認されたｒｓ２２２８２２６についての発見と共に、スコットランド及びイングランドの双方において、ＩＢＤ及びＵＣと関連している。ＣＤにおける影響についての証拠が近年の研究で示されているが、優位な影響は、明らかにＵＣに関連している。この関連性における指針は、ＣＤ、結腸直腸癌Tenesa等(2008) Nat Genet 40: 631-637]、及びセリアック病[Hunt等(2008) Nat Genet 40: 395-402]を含む、複雑な病気の遺伝学の近年の多くの研究に記述されたエフェクトサイズと完全に一致している。獲得した有意性レベルは、遺伝子-中心体研究についての、ｐ＜１０−４-１０−６という提案された基準を満たしている[Burton等(2007) Nat Genet 39: 1329-1337; Thomas等(2004) J Natl Cancer Inst 96: 421-423]。研究された３つの北ヨーロッパ人の集団では、以前から、他のＩＢＤ感受性 遺伝子 / ＮＯＤ２及びＩＢＤ５を含む遺伝子座[Gaya等(2006) Lancet 367: 1271-1284]の類似した寄与が示されている。このＳＮＰに対する少ない対立遺伝子頻度は、スコットランド及びスウェーデンでは非常に類似している(３０．３％と３０．６％)が、スコットランドとケンブリッジ(３０．３％と２６．４％)との間では３．９％異なっている。この差異は維持されており、近年のＷＴＣＣＣ研究[Wellcome Trust Case Control Consortium (2007) Nature 447: 661-678]における、集団階層化ついて分析された多くのＳＮＰについて言及されている。我々の再配列化の取り組みにより、ＩＢＤに関連した唯一のコード化変異体として、ｒｓ２２２８２２６が同定されたが、ハプロタイプ分析及び対数尤度分析では、他の生殖系列変異体がＩＢＤの危険性に寄与しているかもしれないという可能性が上昇した。これらは、形式的に−特にイントロン変異体、長期にわたるプロモーター効果及び／又はコピー数の変動の役割を研究するのに必要である。ここで、ＮＯＤ２[Hugot等(2001). Nature 411: 599-603; Ogura Y等(2001). Nature 411: 603-606]を含む幾つかの複雑な疾患の遺伝子は、病気の危険性を付与する多数の独立した変異を有し、幾つかの疾患はコード化配列内に原因となる変異を有さず(例えば、 IRGM in CD [Parkes等 Am J Hum Genet. 2000;67:1605-16105])、同義ＳＮＰは機能的影響に関連している[Kimchi-Sarfaty等(2007) Science 315: 525-528]。ｒｓ２２���８２２６Ｃ→Ｇは、グルタミンからグルタミン酸(Ｑ１１００Ｅ)への変化をコードする。我々のインビトロデータには、適切に合成及び局在化しても、ＧＬＩ１ １１００ＥがＷＴ ＧＬＩ１と比較して副次的転写アクチベーターであることが示されている。Ｑ１１００Ｅ変異により、ＧＬＩ１の公知のトランス活性化領域に直接隣接する保存領域において、かなりの荷電変化が引き起こされ；この変化がトランス活性化活性を直接修飾し、トランス活性化ドメインの構造を破壊し、又はタンパク質の安定化に影響を及ぼし[Huntzicker等(2006) 遺伝子s Dev 20: 276-281]、活性を低下させる可能性がある。また、我々のデータから、ＧＬＩ１の活性又は量が低減すると、強力な表現型が生成されることが示唆される。Ｇｌｉ１のＷＴレベルの５０％のみを有しているＧＬＩ１＋／−動物は、中程度の刺激に反応して、素早く重度の炎症を発症する。Ｇｌｉ１の機能低下についての表現型の記述[Park等(2000) Development 127: 1593-1605]である、我々の知識に対するこれらのデータは、Ｈｈ反応の全補体が、炎症疾患からの保護において、鍵となる役割を担っていることを示している。更に我々のインビトロデータには、ＧＬＩ１ Ｅ１１００が幾つかのＧｌｉ反応を活性化可能であることが示されており、ホメオスタシス条件下で、ＧＬＩ１ Ｅ１１００が適切に機能可能であることが示唆される。しかしながら、ＧＬＩ１＋／−動物における状況と類似して、炎症性ストレスの条件下では、ＧＬＩ１ Ｅ１１００は、ＷＴ ＧＬＩ１の５０％しか機能できない。これらの系における炎症に対する傾向により、炎症細胞内のＨＨシグナル伝達が直接低下するか、又はストローマ標的細胞におけるＨＨシグナルの低下による影響を表すかどうかにかかわらず、上皮層の完全性に影響を与えるシグナルが放出されることは、未だ明らかではない。この問題への取り組みは、未来の研究の鍵となる手段となるであろう。我々は、ＨＨ経路が骨髄標的細胞へのシグナル伝達を介して、自然免疫反応を直接修飾し得ることを示した。この発見は、脾臓における骨髄細胞変異におけるＨｈシグナル伝達にとっての重要な役割を示す近年のデータと一致している[Varas等, (2008) J Leukoc Biol Jun;83(6):1476-83. Epub 2008 Mar 1123]。興味あることに、骨髄細胞集団は、ＩＬ-２３／ＩＬ-１７経路におけるかなりの衝撃を介して、腸の炎症環境を差次的に修飾することができる[Denning等(2007) Nat Immunol 8: 1086-1094]。共に、ＧＬＩ１＋／−動物におけるＤＳＳ処理後のＩＬ-２３の増加及び自然免疫集団による、ＨＨの直接的反応を示す我々の発見は、粘膜骨髄細胞における免疫寛容誘発性表現型を、通常は促進させることが示唆され；ＨＨシグナル伝達の低下が、これらの細胞における、炎症反応を代わりに誘発させ得る。
【０２６１】
結論として、我々は、ＩＢＤにおける発生シグナル伝達経路の変化した発現をここで初めて証明し、研究の新規な方向性を開いた。更に、我々は、ＩＢＤ２遺伝子として、ＧＬＩ１に関与する証拠を用い、これらの効果が、部分的に遺伝的に決定され、低下した転写活性を有する特異的な変異体が同定されることを示す。Ｇｌｉ１の機能的関連性は、大腸炎の樹立されたマウスモデルにおいてＧｌｉ１濃度の５０％低下に直面して発生する重篤の腸炎症により証明される。併せて、これらのデータは、炎症性刺激に対する腸粘膜の保護反応における強力なＨＨ経路活性化の重要性について、強く主張する。これらの知見は、ＵＣの病変形成に対して、また潜在的には慢性炎症の他の形態について重要な関連性を有している[Lees等(2006) Gastroenterology 131: 1657-1658]。
【０２６２】
実施例５−全血試料からのＩＢＤ発現プロファイル
ヒト内視鏡結腸生検からのゲノムワイド発現プロファイルを開始し、ＩＢＤにおける細胞レベルでの病原性炎症経路の精査を補助した(Noble CL等. Gut, 2008 Jun 3. [Epub ahead of print])。全血のゲノムワイド発現プロファイルは、従来からの内視鏡技術を補完するもので、ＩＢＤ-クローン病(ＣＤ)及び潰瘍性大腸炎(ＵＣ)の診断を補助する。この研究の目的は、ＩＢＤ-ＣＤ、ＵＣ及びコントロール(ＨＣ)を患っている患者を識別するために、全血の遺伝子発現プロファイルを研究することである。
【０２６３】
患者。ＵＣ２１、ＣＤ１９、及びコントロール(ＨＣ)１０を研究した。ＵＣ患者の２人は新たに診断されており、１５人は静止状態の疾患であり、４人は活性化した疾患であった。ＣＤにおいて、新たに診断され１人、静止状態の１１人、活性化した疾患の７人の患者を研究した。
【０２６４】
方法。４１０５８発現配列タグ(３３２９６遺伝子と表す)を、Ａｇｉｌｅｎｔプラットフォームを使用し、５０の全血試料において分析した。動物組織のプロトコルからのマイクロ全ＲＮＡ単離を使用し、血液から全ＲＮＡを抽出した(Qiagen, Valencia, CA)。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの線形増幅を１回実施し、ｃＲＮＡにシアニン-３及びシアニン-５標識を導入した。試料を６０℃で１８時間、定常領域とハイブリダイズさせた。マイクロアレイを洗浄し、乾燥させ、製造者のプロトコルに従い、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナーにかけてスキャンした。マイクロアレイの画像フィルムを、Ａｇｉｌｅｎｔの特徴抽出ソフトウエア第７．５版を使用して分析した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅユニバーサルヒト参照を使用し、遺伝子を標準化させた。
【０２６５】
全てのＩＢＤ及びＨＣ患者、及び発現において＞又は＜１．５の倍率変化を有するプローブを用いるクラスター分析を使用すると、ＨＣ患者は、デンドログラム１／２１対９／２９の一方に、更に広がっていた(ｐ＝０．０２又は１．８)(データを示さず)。ＣＤ及びＵＣ試料の分布に、何の差異も観察されなかった。全てのＩＢＤ試料をＣＴＴ及び比較した場合、４９３の配列が、１．５以上の倍率変化(１．７×１０−４１＜ｐ＜０．０１)を有し、５９５の配列が１．５未満の倍率変化(４．０×１０−４０＜ｐ＜０．０１)を有していた。ＣＤ及びＵＣを比較した場合、２９３の配列が１．５以上の倍率変化(５．４×１０−２７＜ｐ＜０．０１)の倍率変化を有し、３０１の配列が１．５未満の倍率変化(５．２×１０−１８＜ｐ＜０．０１)を有していた。
【０２６６】
アップレギュレートされまたダウンレギュレートされた遺伝子配列の１０のパネルを使用することにより、我々は、＞９０％の感度でコントロールからＩＢＤ試料を予測することができた。以下の表１２には、コントロールと比較してＩＢＤにおいて差次的に調節された２０の遺伝子を列挙する。
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全血ゲノムワイド発現の特徴により、ＩＢＤを患っている患者とコントロールとの間の区別化に対する出発点が提供され、これが、ＩＢＤの診断の素晴らしい診断の証拠が提供され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ−１】
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【図２０Ａ−２】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ−１】
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【図２２Ａ−２】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ−１】
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【図２３Ａ−２】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ−１】
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【図２６Ａ−２】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ−１】
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【図２７Ａ−２】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ−１】
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【図３８Ａ−２】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ−１】
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【図４１Ａ−２】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５Ａ−１】
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【図４５Ａ−２】
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【図４５Ｂ】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５２Ａ−１】
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【図５２Ａ−２】
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【図５２Ａ−３】
2011509071.tif 000096
【図５２Ｂ】
2011509071.tif 000097
【図５３Ａ】
2011509071.tif 000098
【図５３Ｂ】
2011509071.tif 000099
【図５４】
2011509071.tif 000100
【図５５Ａ】
2011509071.tif 000101
【図５５Ｂ】
2011509071.tif 000102
【図５６】
2011509071.tif 000103
【図５７】
2011509071.tif 000104
【図５８】
2011509071.tif 000105
【図５９Ａ】
2011509071.tif 000106
【図５９Ｂ】
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【図６０】
2011509071.tif 000108
【図６１】
2011509071.tif 000109
【図６２Ａ−１】
2011509071.tif 000110
【図６２Ａ−２】
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【図６２Ｂ】
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【図６３Ａ−１】
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【図６３Ａ−２】
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【図６３Ｂ】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６５Ａ】
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【図６５Ｂ】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２Ａ−１】
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【図７２Ａ−２】
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【図７２Ｂ】
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【図７３Ａ】
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【図７３Ｂ】
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【図７４Ａ】
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【図７４Ｂ】
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【図７５Ａ】
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【図７５Ｂ】
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【図７６Ａ】
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【図７６Ｂ】
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【図７７Ａ−１】
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【図７７Ａ−２】
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【図７７Ｂ】
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【図７８】
2011509071.tif 000141
【図７９Ａ】
2011509071.tif 000142
【図７９Ｂ】
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【図８０Ａ−１】
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【図８０Ａ−２】
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【図８０Ｂ】
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【図８１】
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【図８２】
2011509071.tif 000148
【図８３】
2011509071.tif 000149
【図８４Ａ】
2011509071.tif 000150
【図８４Ｂ】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８Ａ−１】
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【図８８Ａ−２】
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【図８８Ｂ】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５Ａ−１】
2011509071.tif 000164
【図９５Ａ−２】
2011509071.tif 000165
【図９５Ａ−３】
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【図９５Ｂ】
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【図９６Ａ−１】
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【図９６Ａ−２】
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【図９６Ｂ】
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【図９７Ａ−１】
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【図９７Ａ−２】
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【図９７Ｂ】
2011509071.tif 000173
【図９８Ａ−１】
2011509071.tif 000174
【図９８Ａ−２】
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【図９８Ｂ】
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【図９９】
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【図１００】
2011509071.tif 000178
【図１０１】
2011509071.tif 000179
【図１０２】
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【図１０３】
2011509071.tif 000181
【図１０４】
2011509071.tif 000182
【図１０５Ａ】
2011509071.tif 000183
【図１０５Ｂ】
2011509071.tif 000184
【図１０６Ａ】
2011509071.tif 000185
【図１０６Ｂ】
2011509071.tif 000186
【図１０６Ｃ】
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【図１０７】
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【図１０８Ａ】
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【図１０８Ｂ】
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【図１０９】
2011509071.tif 000191
【図１１０】
2011509071.tif 000192
【図１１１】
2011509071.tif 000193
【図１１２Ａ】
2011509071.tif 000194
【図１１２Ｂ】
2011509071.tif 000195
【図１１３Ａ−１】
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【図１１３Ａ−２】
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【図１１３Ｂ】
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【図１１４Ａ】
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【図１１４Ｂ】
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【図１１５Ａ】
2011509071.tif 000201
【図１１５Ｂ】
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【図１１６Ａ】
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【図１１６Ｂ】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０Ａ】
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【図１２０Ｂ】
2011509071.tif 000209
【図１２１Ａ−１】
2011509071.tif 000210
【図１２１Ａ−２】
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【図１２１Ｂ】
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【図１２１Ｃ】
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【図１２２】
2011509071.tif 000214
【図１２３】
2011509071.tif 000215
【図１２４Ａ−１】
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【図１２４Ａ−２】
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【図１２４Ａ−３】
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【図１２４Ｂ】
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【図１２５】
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【図１２６】
2011509071.tif 000221
【図１２７Ａ】
2011509071.tif 000222
【図１２７Ｂ】
2011509071.tif 000223
【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年8月3日(2010.8.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物被検者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の存在を診断する方法であって、上記被検者から得られた試験試料における配列番号：７０に示されたポリペプチドをコードする核酸の発現レベルがコントロールの発現レベルに対して高いことを決定し、上記高い発現レベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示す方法。
【請求項２】
上記哺乳動物被検者がヒト患者である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記発現レベルのエビデンスが遺伝子発現プロファイリング法によって得られる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記方法がＰＣＲベースの方法である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
上記発現レベルが一又は複数の参照遺伝子又はその発現産物の発現レベルに対して正規化される請求項３に記載の方法。
【請求項６】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも二の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも三の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも四の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも五の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記ＩＢＤ検出をまとめるレポートを作成する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
上記ＩＢＤが潰瘍性大腸炎である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
上記ＩＢＤがクローン病である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記ＩＢＤが潰瘍性大腸炎及びクローン病である請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上記試験試料が結腸組織生検由来である請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
上記生検が、回腸末端、上行結腸、下行結腸、及びＳ状結腸からなる群から選択される組織由来である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
上記生検が炎症結腸領域由来である請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
上記生検が非炎症結腸領域由来である請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
上記決定工程が、上記哺乳動物被検者におけるＩＢＤの再発を示し、上記哺乳動物被検者が過去にＩＢＤと診断され、該過去に診断されたＩＢＤに対して治療されている請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
上記治療が手術からなる請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記決定工程が、上記哺乳動物被検者における上記ＩＢＤの突然の再発を示す請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
治療を必要とする哺乳動物被検者における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療する方法であって、
（ａ）上記被検者から得られた試験試料における配列番号：７０に示されたポリペプチドをコードする核酸の発現レベルがコントロールの発現レベルに対して高いことを決定する工程であって、上記高い発現レベルが、試験試料が得られた被検者におけるＩＢＤの存在を示す工程と；
（ｂ）有効量のＩＢＤ治療剤を上記被検者に投与する工程
を含む方法。
【請求項２２】
上記哺乳動物被検者がヒト患者である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
上記発現レベルのエビデンスが遺伝子発現プロファイリング法によって得られる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記方法がＰＣＲベースの方法である請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
上記発現レベルが一又は複数の参照遺伝子又はその発現産物の発現レベルに対して正規化される請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも二の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも三の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも四の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
上記遺伝子又はその発現産物の少なくとも五の発現レベルのエビデンスを決定することを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
上記ＩＢＤ検出をまとめるレポートを作成する工程を更に含む請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
上記ＩＢＤが潰瘍性大腸炎である請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
上記ＩＢＤがクローン病である請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
上記ＩＢＤが潰瘍性大腸炎及びクローン病である請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
上記試験試料が結腸組織生検由来である請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
上記生検が、回腸末端、上行結腸、下行結腸、及びＳ状結腸からなる群から選択される組織由来である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
上記生検が炎症結腸領域由来である請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
上記生検が非炎症結腸領域由来である請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
上記決定工程が、上記哺乳動物被検者におけるＩＢＤの再発を示し、上記哺乳動物被検者が過去にＩＢＤと診断され、該過去に診断されたＩＢＤに対して治療されている請求項２１に記載の方法。
【請求項３９】
上記治療が手術からなる請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
上記決定工程が、上記哺乳動物被検者における上記ＩＢＤの突然の再発を示す請求項２１に記載の方法。
【請求項４１】
上記ＩＢＤ治療剤がアミノサリチル酸である請求項２１に記載の方法。
【請求項４２】
上記ＩＢＤ治療剤がコルチコステロイドである請求項２１に記載の方法。
【請求項４３】
上記ＩＢＤ 治療剤が免疫抑制剤である請求項２１に記載の方法。
【国際調査報告】
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