(57)【要約】本発明は、新規バクテリオシン、それを産生し得る微生物菌株、およびそのバクテリオシンおよび菌株の使用に関連する。そのバクテリオシンは、他の細菌を含めて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して有効である。またさらなる局面において、本発明は、２つのペプチド、Ｔｒｎ−αおよびＴｒｎ−βを含むツリシンＣＤ（ｔｈｕｒｉｃｉｎ  ＣＤ）と呼ばれるバクテリオシンを提供し、Ｔｒｎ−αは約２７６３の分子量を有し、そしてＴｒｎ−βは約２８６１の分子量を有する。
2011505126.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号４１４９０の下、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａに寄託された、Ｂ．Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ６４３１、ならびに実質的にそれに類似であり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して有効であるバクテリオシンをもコードする、菌株。
【請求項２】
請求項１に記載の細菌の菌株によって産生された、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して有効である、バクテリオシン。
【請求項３】
２つのペプチド、Ｔｒｎ−αおよびＴｒｎ−βを含むツリシンＣＤ（ｔｈｕｒｉｃｉｎ  ＣＤ）と呼ばれるバクテリオシンであって、Ｔｒｎ−αは約２７６３の分子量を有し、そしてＴｒｎ−βは約２８６１の分子量を有する、バクテリオシン。
【請求項４】
約８５℃まで熱安定性である、請求項３に記載のバクテリオシン。
【請求項５】
約９０℃で１５分間のインキュベーション後に活性が減少し、そして約１００℃で１５分間のインキュベーション後に活性を失う、請求項３または４に記載のバクテリオシン。
【請求項６】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅリボタイプ０２７、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｌｉｔｈｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｉｎｄｏｌｉｓ、およびＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを阻害する能力を有する、請求項３〜５に記載のバクテリオシン。
【請求項７】
ｐＨ２〜１０の範囲で活性である、請求項３〜６のいずれか一項に記載のバクテリオシン。
【請求項８】
ツリシンＣＤが２００ＡＵ／ｍｌの濃度で存在する場合、１ｍｌあたりＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの約５×１０６ＣＦＵが１８０分以内に死滅させられる、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して殺菌効果を有する、請求項２〜７のいずれか一項に記載のバクテリオシン。
【請求項９】
表２に示される阻害スペクトルを有する、請求項２〜８に記載のバクテリオシン。
【請求項１０】
前記成分Ｔｒｎ−αが、
【化９】
2011505126.tif 000018
のアミノ酸配列を有し、ツリシンＣＤ成分Ｔｒｎ−βが、
【化１０】
2011505126.tif 000019
のアミノ酸配列を有する、請求項２〜８のいずれか一項に記載のバクテリオシン。
【請求項１１】
遺伝子Ｔｒｎ−αをコードするツリシンＣＤ成分または遺伝子Ｔｒｎ−βをコードするツリシンＣＤ成分のうちの少なくとも一つを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
図３に示される、Ｔｒｎ−αと記された配列を含む、ツリシンＣＤ成分Ｔｒｎ−α。
【請求項１３】
図３に示される、Ｔｒｎ−βと記された配列を含む、ツリシンＣＤ成分Ｔｒｎ−β。
【請求項１４】
前記遺伝子が、図３に示される核酸配列を有するか、または該核酸配列に実質的に類似であり、そしてまたバクテリオシン活性をコードする配列を有する、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
図３に示されるＴｒｎ−αまたはＴｒｎ−βと記されたアミノ酸配列、または該配列に実質的に類似であり、そしてまたバクテリオシン活性を示す配列のいずれかを有する、ツラシン（Ｔｈｕｒａｃｉｎ）成分。
【請求項１６】
請求項１、２２、または２３に記載の細菌の菌株、請求項１１に記載の宿主細胞、請求項２〜１０のいずれか一項に記載のバクテリオシン、または請求項１２または１３に記載のツリシンＣＤ成分を含む、消毒剤組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の菌株の栄養細胞もしくは芽胞、または請求項１１に記載の宿主細胞を含む、プロバイオティク培養物。
【請求項１８】
請求項１、２２、または２３に記載の菌株、請求項１１に記載の宿主細胞、請求項２〜１０のいずれか一項に記載のバクテリオシン、あるいは請求項１２または１３に記載のツリシンＣＤ成分を含む、殺芽胞性組成物。
【請求項１９】
請求項１、２２、または２３に記載の細菌の菌株、請求項２〜１０のいずれか一項に記載のバクテリオシン、あるいは請求項１１に記載の宿主細胞、あるいは請求項１２または１３に記載のツリシンＣＤ成分を、薬剤学的に許容できる担体と共に含む、医薬品組成物。
【請求項２０】
注腸調製物として調合される、請求項１９に記載の医薬品組成物。
【請求項２１】
結腸を標的にするために適合されるカプセル化ペプチドを含む、請求項１９に記載の医薬品組成物。
【請求項２２】
ツリシンＣＤ、またはツリシンＴｒｎ−α配列もしくはＴｒｎ−β配列を含むペプチドを産生する、細菌の菌株。
【請求項２３】
ツリシンＣＤペプチドを産生するために設計されたプロバイオティクス消化管単離物を含む組換え菌株。
【請求項２４】
家禽におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの阻害を含む、獣医学的使用、ヒトまたは家禽への適用のための、請求項１、２２、または２３に記載の菌株、請求項１１に記載の宿主細胞、または請求項２〜１０に記載のバクテリオシン、あるいは請求項１２または１３に記載のツリシンＣＤ成分の生存培養物または死滅培養物のいずれかの調製物を含む、プロバイオティクス組成物。
【請求項２５】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．によって引き起こされるガス壊疽に対する創傷および皮膚感染症の治療のための、請求項１、２２、または２３に記載の細菌の菌株、請求項２〜１０に記載のバクテリオシン、あるいは請求項１１に記載の宿主細胞、あるいは請求項１２または１３に記載のツリシンＣＤ成分を、担体と共に含む、局所的組成物。
【請求項２６】
実施例または添付の図面を参照して本明細書中に実質的に記載される細菌細胞。
【請求項２７】
実施例または添付の図面を参照して本明細書中に実質的に記載されるバクテリオシン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、狭い阻害スペクトルを有するが、特にＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対して有効であるバクテリオシンを産生する菌株、およびその菌株によって産生されるバクテリオシンに関連する。
【背景技術】
【０００２】
病原体における抗生物質耐性の激増（ｕｐｓｕｒｇｅ）およびＭＲＳＡおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅのような院内感染性の感染症の増加によって、これらの疾患と戦うための新規抗菌化合物を発見する新たな緊急性が存在する。１９３５年に最初に記載された、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅは、１９７０年代まで院内下痢の原因病原体として認識されなかった（Ｇｅｏｒｇｅら、１９７８；ＨａｌｌおよびＯ’Ｔｏｏｌｅ、１９３５）。しかし、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連疾患（ＣＤＡＤ）は、今や最もよくある院内感染性下痢であり、そしてナーシングホームおよび高齢者のためのケア施設において、胃腸炎感染および抗生物質関連下痢の主な問題である。実際、英国の健康保護局（ｈｅａｌｔｈ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｃｙ）は、英国において２００７年の最初の６ヶ月間に３２，１８９例のＣＤＡＤを報告した−（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｐａ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ／ｔｏｐｉｃｓ＿ａｚ／ｈａｉ／ｔａｂｌｅｓｆｏｒｗｅｂｓｉｔｅ／Ｃｄｉｆｆ＿Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ＿Ｎｏｖ＿２００７．ｘｌｓ）。ＣＤＡＤの獲得に対して素因を与える主な因子は、抗生物質治療である。１９７０年代において、クリンダマイシンに続くアンピシリンおよびアモキシシリンの投与が、ＣＤＡＤの誘発要因として関係付けられた；これらは１９８０年代においてはセファロスポリンに、そしてより最近ではフルオロキノロン類によって置換された（Ａｒｏｎｓｓｏｎら、１９８５；Ｂａｒｔｌｅｔｔ、２００６；Ｗｉｎｓｔｒｏｍら、２００１）。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＰＣＲリボタイプ０２７の強毒性株の問題も加わり、その発生数は米国、カナダ、およびヨーロッパにおいて増加している（Ｂａｒｔｌｅｔｔ、２００６）。現在バクテリオシンと呼ばれる、細菌によって産生される抗菌ペプチドは、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  亜種  ｌａｃｔｉｓによるナイシンの、ＲｏｇｅｒｓおよびＷｈｉｔｔｉｅｒによる発見（１９２８）によって約８０年前に最初に有名になり、それは他の乳酸菌（ＬＡＢ）および他のグラム陽性菌に対して広域スペクトルの活性を実証した。ＬＡＢによって産生されるバクテリオシンは、最も広く研究され、そしてそれは概して広域スペクトルの活性を有する傾向があるが、抗菌化合物は、グラム陽性細菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ（Ａｈｅｒｎら、２００３；Ｂｉｚａｎｉら、２００５；Ｃｈｅｒｉｆら、２００３；Ｃｈｅｒｉｆら、２００１；Ｓｅｉｂｉら、２００７；ＴｅｏおよびＴａｎ、２００５）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（Ｋｅｍｐｅｒｍａｎら、２００３）、グラム陰性細菌Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔｒａｕｔｎｅｒら、２００５）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（Ｐａｄｉｌｌａら、２００６）を含む、多くの他の細菌種によって産生される。
【０００３】
様々な株のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓに対して以前に行われた研究が、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ菌株、およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ菌株に対して殺菌特性を実証する、様々なバクテリオシンを生みだした（Ａｈｅｒｎら、２００３、Ｃｈｅｈｉｍｉら、２００７、Ｃｈｅｒｉｆら、２００１、ＦａｖｒｅｔおよびＹｏｕｓｔｅｎ、１９８９、Ｇｒａｙら、２００６ａ、Ｇｒａｙら、２００６ｂ）。しかし、これらのバクテリオシンは、二成分活性（ｔｗｏ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を示さない。
【０００４】
Ｙｕｄｉｎａらによる以前の研究は、嫌気性細菌およびＣ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍおよびＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉに対して抗菌作用を示すことができる、昆虫病原性の細菌Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（亜種  Ｋｕｒｓｔａｋｉ、ｇａｌｌｅｒｉａｅ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｉｓ）からの副芽胞結晶（ｐａｒａｓｐｏｒａｌ  ｃｒｙｓｔａｌ）のタンパク質（Ｃｒｙタンパク質）、およびタンパク質限定分解によって得られた、そのいくつかの断片を記載している。特許文献１は、家禽のＧＩＴから単離されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（８．５．０５に寄託）の新規菌株から単離された、抗菌熱安定性化合物を記載し、それはＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐ．ｃｏｌｉ、およびＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して有効である。特許文献２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを含む）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを含む）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのようなグラム陽性細菌に対して使用するための、新規抗生物質化合物の合成を記載する。特許文献３は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ等のような細菌に対する抗菌ペプチドの人工合成および組換え発現を記載する。しかし、これらのペプチドは、広い範囲のグラム陽性細菌に対して、広域スペクトルの阻害を有する。
【０００５】
天然に存在するランチビオティクスであるラクチシンおよびナイシンを用いた以前の研究は、これらの細菌由来ペプチドは、バンコマイシンおよびメトロニダゾールのような、通常使用される抗生物質に匹敵する濃度で、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを殺菌するのに有効であることを示した（Ｂａｒｔｏｌｏｎｉら、２００４；Ｒｅａら、２００７）。
【０００６】
しかし、これらのランチビオティクスは、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのような、ヒトの腸の健康に有用であると考えられるものを含む、広い範囲のグラム陽性細菌に対して広域スペクトルの阻害を有する。実際、この研究室における以前の研究は、ラクチシン３１４７は糞便発酵におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのレベルに負の影響を与えることを示した（Ｒｅａら、２００７）。
【０００７】
従って、この研究の目的は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを標的とする、狭いスペクトルの抗菌化合物を産生する細菌を単離することであった。この目的のために、ヒト腸における芽胞形成細菌を標的とした；これはＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する抗菌薬の明らかな供給源ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，２４７，２９９号明細書
【特許文献２】米国特許第７，１４４，８５８号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００８／０２１３４３０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の目的
本発明の目的は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して有効であるが、ヒトまたは動物の健康に有用であると考えられる細菌に対しては有効でない薬剤を提供することである。さらなる目的は、消毒薬または防腐薬として、食料品中のプロバイオティクス成分として、または医薬品組成物として使用し得る、そのような薬剤を含む組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によって、受託番号第４１４９０番でｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａに寄託された、細菌株Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ６４３１、およびそれもＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して有効であるがＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種に有効でないバクテリオシンをコードする、実質的にそれに類似の菌株が提供される。その菌株は、２００７年７月９日に寄託された。
【００１１】
都合がよいことに、その菌株は胃腸管のグラム陽性細菌叢に対して有効でないバクテリオシンを産生する。
【００１２】
本発明はまた、この細菌株によって産生される、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して有効なバクテリオシンを提供する。
【００１３】
またさらなる局面において、本発明は、２つのペプチド、Ｔｒｎ−αおよびＴｒｎ−βを含むツリシンＣＤ（ｔｈｕｒｉｃｉｎ  ＣＤ）と呼ばれるバクテリオシンを提供し、Ｔｒｎ−αは約２７６３の分子量を有し、そしてＴｒｎ−βは約２８６１の分子量を有する。そのバクテリオシンは、１５分間のインキュベーション後、約８５℃まで熱安定性であり、約９０℃で活性が減少し、そして約１００℃で活性を失う。熱安定であるによって、我々はそのバクテリオシンが熱によって容易に破壊または変質を受けないことを意味する。ツリシンＣＤは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを阻害する能力を有する。ツリシンＣＤは、ｐＨ２〜１０の範囲で活性である。
【００１４】
都合がよいことに、そのバクテリオシンはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種に有効でない。そのバクテリオシンは、胃腸管で見出されるグラム陽性細菌に対して有効でなくてよい。都合がよいことに、そのバクテリオシンは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ、およびＢ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅリボタイプ０２７、Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｌｉｔｈｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、およびＣ．ｉｎｄｏｌｉｓに対しても有効である。有効でないことによって、我々はそのバクテリオシンが、これらの細菌の生存能に影響を与えないことを意味する。
【００１５】
そのバクテリオシンは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して１ｍｌあたりＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの約５×１０６ＣＦＵの殺菌効果を有し得、ツリシンＣＤが５μＭおよび２００ＡＵ／ｍｌの濃度で存在する場合、それぞれ６０分以内および１８０分以内に殺菌することができる。
【００１６】
そのバクテリオシンは、ナノ分子（ｎａｎｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ）濃度で有効である。
【００１７】
そのバクテリオシンは、プロバイオティクス菌株Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ３３８またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ  Ｂｂ１２の生存能に影響を与えないことが示された。
【００１８】
そのバクテリオシンは、表２に示すような阻害スペクトルを有し得る。
【００１９】
好ましくは、そのバクテリオシンは、成分ツリシンＴｒｎ−αがＮ末端アミノ酸配列
【００２０】
【化１】
2011505126.tif 000003
を有し、そしてツリシンＣＤ成分Ｔｒｎ−βがＮ末端アミノ酸配列
【００２１】
【化２】
2011505126.tif 000004
を有するものである。好ましくは、そのバクテリオシンは、Ｔｒｎ−αおよびＴｒｎ−β成分が、リーダーペプチド配列有りまたは無しの図３に示すようなアミノ酸配列、またはそれに実質的に類似の配列を有するもの、およびバクテリオシン活性も示すものである。
【００２２】
またさらなる局面において、本発明は、ツリシンＣＤ成分Ｔｒｎ−αをコードする遺伝子またはＴｒｎ−βをコードする遺伝子を含む宿主細胞を提供する。その宿主細胞はまた、ツリシンＣＤ成分Ｔｒｎ−αおよびＴｒｎ−βをコードする遺伝子を含み得る。好ましくは、その遺伝子は、図３に示すような核酸配列、またはそれに実質的に類似であり、そしてバクテリオシン活性もコードする配列を有する。
【００２３】
「実質的に類似の」とは、遺伝コードの縮重のために、１つのアミノ酸の別のものとの置換、またはバクテリオシン活性に重要でないアミノ酸配列の領域における変化が、本明細書中で定義した特性を有するバクテリオシン分子中に依然として生じる配列を意味する。
【００２４】
本発明はまた、ツリシンＣＤ成分Ｔｒｎ−α、およびツリシンＣＤ成分Ｔｒｎ−βを提供する。
【００２５】
上記で定義したような、細菌株、宿主細胞、バクテリオシンまたはツリシンＣＤ成分Ｔｒｎ−αまたはＴｒｎ−βを含む消毒薬組成物も提供される。
【００２６】
本発明は、上記で定義したような、栄養細胞（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）または菌株の芽胞または宿主細胞を含むプロバイオティク培養を提供する。その菌株または細胞を、その菌株がもはや生存可能でないように不活性化し得る。
【００２７】
上記で定義したような、細菌株、宿主細胞、バクテリオシンまたはツリシンＣＤ成分Ｔｒｎ−αまたはＴｒｎ−βを含む殺芽胞性組成物も提供される。
【００２８】
上記で定義したような、細菌株、宿主細胞、バクテリオシンまたはツリシンＣＤ成分Ｔｒｎ−αまたはＴｒｎ−βを、薬剤学的に有効な担体または賦形剤と共に含む医薬品組成物も提供される。その医薬品組成物を、注腸調製物として、結腸への標的化送達を有するカプセル封入ペプチドとして、結腸への標的送達のためのカプセル封入プロバイオティクスとして、動物または獣医学的に使用するための調製物として、またはプロバイオティクスまたは精製ペプチドとして調合し得る。
【００２９】
Ｔｒｎ−αおよび／またはＴｒｎ−βペプチドを、食品中のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのコントロールのために、食品成分として、生きた細菌の存在無しに使用し得る。本発明はまた、家禽でのＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのコントロールにおける使用を見出す。
【００３０】
消毒薬、医薬品、殺芽胞剤、食品、または他の組成物を、適当な担体または賦形剤と共に調合し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】（Ａ）Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＤＰＣ６４３１の細胞を含まない上清によるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ４３５９３の阻害、および（Ｂ）プロテイナーゼＫの効果によるタンパク質性の性質の証明。
【図２】（Ａ）Ｐ１およびＴｒｎ−βの分離を示すツリシン６４３１のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム；（Ｂ）Ｔｒｎ−αおよび（Ｃ）Ｔｒｎ−βの分子量を示すＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳクロマトグラフ、および（Ｄ）ある濃度範囲にわたる両ペプチドの等モル濃度の効果を示す、両ペプチドのＷＤＡ。
【図３】ツリシンペプチドＴｒｎ−αおよびＴｒｎ−βをコードする遺伝子の配向。
【図４】Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ４３４９３の増殖を５０％阻害するために必要なツリシンＣＤ  Ｔｒｎ−αおよびＴｒｎ−βの濃度。
【図５】３７℃における、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｒ０２７、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ３３８およびＢ．ｌａｃｔｉｓ  Ｂｂ１２の増殖に対するツリシンＣＤ（２００ＡＵ／ｍｌ）の効果（●コントロール；○＋２００ＡＵ／ｍｌのツリシン）。
【図６】（Ａ）０時間、８時間、および１６時間に加えた場合の、モデル糞便発酵におけるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅリボタイプ００１の増殖に対する５００μｇ／ｍｌのツリシンＣＤの効果。（Ｂ）発酵過程の間のツリシンＣＤの活性。（Ｃ）モデル糞便環境における０時間（黒線）および４時間発酵後の、ツリシンペプチドＴｒｎ−αおよびＴｒｎ−βのＲＰ−ＨＰＬＣによる検出。
【図７】３７℃でインキュベートした、（Ａ）模擬胃液中２時間後の、（Ｂ）模擬回腸液中５時間後の、（Ｃ）模擬結腸液中９時間後の、（Ｄ）ブタ胃液中２時間後の、および（Ｅ）ブタ回腸液中５時間後のツリシンＣＤの安定性。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
使用した菌株
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ４２６３９を、Ｗｅｌｌ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（ＷＤＡ）の標的菌株として使用した。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｒ０２７  ＮＡＰ１を、タイムキル研究（ｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ  ｓｔｕｄｙ）におけるバクテリオシン感受性のために使用した。バクテリオシン産生培養物の阻害スペクトルを決定するために使用した標的細菌およびその供給源の完全なリストを、培地および増殖条件と共に表１に概略を示す。Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ  ＮＣＩＭＢ７００５７７およびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＮＣＩＭＢ７０１１５７を、ｇｙｒＢプライマーを用いたＰＣＲ反応の陽性コントロールとして使用した。
バクテリオシン産生培養物の単離
病気のおよび健康な個人双方からの糞便サンプルを、研究室において受け取り、そして−８０℃で凍結した。分析の日に、サンプルを室温で解凍し、そして等しい容量のエタノールと混合し、そして室温で約３０分間置いた。サンプルを続いて、嫌気性希釈剤で連続的に希釈し、１００μｌをＷｉｌｋｅｎｓ  Ｃｈａｒｇｒｉｎ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ａｇａｒ（ＷＣＡＡ）の表面に広げ、そして嫌気性チャンバー中で、３７℃で５日間増殖させた。生じたコロニーを、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ４３５９３の対数期培養物を１．２５％で播種した約１０ｍｌのＲｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ａｇａｒ（ＲＣＡ）を用いて覆った。そのプレートをさらに１８時間インキュベートし、そして覆った培養物の阻害ゾーンを検査した。明らかな阻害ゾーンを示すコロニーを、滅菌メスを用いて寒天の覆いを最初に除去して、新しいＷＣＡＡ上に継代培養した。約３０，０００コロニーをスクリーニングし、そして覆ったＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株に対して強力な抗菌活性を示す１つのコロニーを精製し、そしてＭｉｃｒｏｂａｎｋ  Ｂｅａｄｓ上で、−８０℃で保存し、そしてＤＰＣ６４３１と命名し、そして産生される阻害物質をツリシンＣＤと命名した。
【００３３】
遺伝子型の特徴付け
ＤＰＣ６４３１の１６ＳｒＤＮＡ配列決定
Ｓｉｍｐｓｏｎら、２００３によって記載されたように、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＤＰＣ６４３１の一晩のブロス培養物からゲノムＤＮＡを単離し、そしてＰＣＲによって増幅した。１６ＳｒＤＮＡ配列の比較を、菌株を特定の種に帰属させることを可能にするＢＬＡＳＴプログラムを用いて得た。
【００３４】
ｇｙｒＢプライマーを用いた種レベルまでの同定
Ｙａｍａｄａら（１９９９）によって記載されたような配列を有する、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、およびＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのｇｙｒＢ遺伝子に対する種特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、ＭＷＧから購入した。ＰＣＲ産物を、分子マーカーとして１００ｂｐラダーを用いて１．５％アガロースゲルで分析し、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ３４００を用いて視覚化した。Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ  ＮＣＩＭＢ７００５７７およびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＮＣＩＭＢ  ７０１１５７を、陽性コントロールとして使用した。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓが病原性の特質（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｓｔａｔｕｓ）であるため、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓの陽性コントロールは無かった。
【００３５】
細胞を含まない上清からのツリシンＣＤの生産
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＤＰＣ６４３１を、ＢＨＩブロスにおいて約６時間、ストックから好気的に増殖させ、そしてＢＨＩにおいて１８時間、０．１％で新しいＢＨＩに継代培養した。増殖後、培養物を８２００ｇで１０分間、２回遠心した。Ｒｙａｎら（１９９６）によって記載されたように、ウェル拡散アッセイ（ｗｅｌｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＷＤＡ）を用いて活性を決定した。ある範囲の標的細菌に対する活性を、ＷＤＡによって決定した。培養物を、表１に概略を示すような様々なブロス培地および温度で一晩増殖させた。２０ｍｌの適する寒天培地に、１００μｌの標的細菌を播種し、そして一旦凝固したら、５０μｌのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＤＰＣ６４３１の細胞を含まない上清（ＣＦＳ）を寒天に作ったウェルに加えた。プレートを、表１に概略を示したような様々な標的細菌に適当な条件下でインキュベートした。阻害ゾーン（ｍｍ）を測定し、そしてゾーンの直径を測定することによって、相対的な感受性を決定した。≦９ｍｍのサイズのゾーンを＋とし、１０−１５ｍｍを＋＋とし、１６−２１ｍｍを＋＋＋とし、≧２２ｍｍを＋＋＋＋とした。
【００３６】
酵素的分解、熱およびｐＨに対するツリシンＣＤの感受性
細胞を含まない上清を、２５ｍｇ／ｍｌの濃度で、以下の酵素に対する感受性に関して試験した：ペプシン、トリプシン、ペプチダーゼ、α−キモトリプシンＶ１１１型、α−キモトリプシン１１型およびプロテイナーゼＫ。全ての酵素を、Ｓｉｇｍａから購入した。細胞を含まない上清を、酵素と３７℃で１時間インキュベートした。酵素処理後の活性を、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ４３５９３を標的細菌として用いて、ウェル拡散法を用いて決定した。５μｌのプロテイナーゼＫ（６．５ｍｇ／ｍｌ）を、サンプルを含むウェルの端に適用することによって、抗菌剤のプロテイナーゼＫに対する感受性も決定した。
【００３７】
ある範囲のｐＨにおける活性を、０．５ＭのＨＣｌまたは１ＭのＮａＣｌのいずれかを用いてｐＨを２から９に調整することによって、ＣＦＳにおいて決定した。標的細菌に対する酸または塩基の影響を、そのｐＨの範囲に調整した未播種ブロス培地を用いて決定した。標的株としてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ４３５９３を用いたＷＤＡアッセイを用いて活性を決定した。ＣＦＳを３７℃から１００℃の範囲の温度で１５分間加熱することによって、熱感受性を決定した；コントロールを３７℃でインキュベートした。標的細菌としてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ４３５９３を用いたＷＤＡを用いて活性を決定した。
【００３８】
増殖中のツリシンＣＤ産生の決定
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＤＰＣ６４３１を、ＢＨＩブロスにおいて２回継代培養し、そして次いで再び１％でＢＨＩブロスに播種した；６００ｎｍにおける吸光度を測定することによって増殖をフォローした。抗菌剤産生の決定のために増殖中間隔をおいて取ったサンプルを、８２００ｇで１０分間、２回遠心し、連続希釈し、そして各希釈物の５０μｌを、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ４３５９３をまいた寒天プレートのウェルに播種した。活性単位をＷＤＡによって決定した。
【００３９】
ツリシンＣＤの精製および分子量決定
ツリシンＣＤの産生：Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＹＢ）を以下のように作製した：Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｏｘｏｉｄ）２．５ｇ；酵母抽出物（Ｏｘｏｉｄ）５．０ｇ；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ  ０．２５ｇ；ＭｎＳＯ４４Ｈ２Ｏ  ０．０５ｇを、９００ｍｌの蒸留水に溶解した。１２１℃で１５分間オートクレーブする前に、プロパン−２−オール洗浄ＸＡＤビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むカラムを通すことによって、培地を清澄にした。使用前に、フィルターで滅菌したグルコースおよびβ−グリセロリン酸塩を加えて、それぞれ１０ｇおよび１９ｇ／ｌの最終濃度および１ｌの最終容量を得た。
【００４０】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ＤＰＣ６４３１を、使用前に３７℃で、ＢＨＩブロスに２回継代培養した。２リットルのＴＹＢに、０．１％の培養物を播種し、そして３７℃で一晩、撹拌しながらインキュベートした。培養物を８，２８０ｇで１５分間遠心した。細胞ペレットおよび上清を保持した。細胞を、１リットルのブロスあたり、２００ｍｌの７０％プロパン−２−オールｐＨ２．０に再懸濁し、そして４℃で４時間撹拌した。その培養上清をＸＡＤビーズに通し、１ｌの蒸留水で予洗した。カラムを５００ｍｌの３０％エタノールで洗浄し、そして阻害活性を４００ｍｌの７０％プロパン−２−オールｐＨ２．０に溶出し、そして保持した（Ｓ１）。７０％プロパン−２−オールｐＨ２．０に再懸濁した細胞を、８，２８０ｇで１５分間遠心し、そして上清（Ｓ２）を保持した；Ｓ１およびＳ２を合わせた。回転式エバポレータ（Ｂｕｃｈｉ）を用いてプロパン−２−オールを蒸発させ、そしてサンプルを、メタノールおよび水でプレ平衡化した６ｇ（２０ｍｌ）のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＣ−１８カラムにアプライした。そのカラムを２カラム容量の３０％エタノールで洗浄し、そして阻害活性を１．５カラム容量の７０％プロパン−２−オールｐＨ２．０に溶出した。この調製物を、回転式蒸発（ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて濃縮した後、以下のようにＨＰＬＣを用いてペプチドを分離した：約２ｍｌのアリコートを、４５％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸ＴＦＡで前に平衡化したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）Ｃ１８逆相（ＲＰ）−ＨＰＬＣカラム（Ｐｒｉｍｅｓｐｈｅｒｅ  １０μＣ１８−ＭＣ３０、２５０×１０．０ｍｍ、１０μｍ）にアプライした。そのカラムを続いて、９．９ｍｌ／分の流速で、４−４０分、０．１％ＴＦＡを含む４５％アセトニトリルから０．１％ＴＦＡを含む６５％アセトニトリルまでの勾配で展開した。生物学的に活性な画分を、ＷＤＡにおいて、標的細菌としてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを用いて同定した。活性ペプチドを含む画分をプールし、凍結乾燥し、そして７０％プロパン−２−オールｐＨ２．０において必要な濃度で再構築し、そして使用まで−２０℃で凍結した。続く希釈を、滅菌５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ６．５で行った。
【００４１】
ツリシンＣＤの分子量決定：Ａｘｉｍａ  ＣＦＲプラスＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析機（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）を用いて、生物学的に活性な画分に対して質量分析を行った。マトリックス溶液（−シアノ４−ヒドロキシ桂皮酸、１０ｍｇ／ｍｌアセトニトリル中−０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸）の０．５μｌのアリコートを、標的の上に置き、そして５秒間おいてから除去した。あらゆる残留溶液を空気乾燥させ、そしてサンプル溶液をプレコーティングしたサンプルスポットに置いた；０．５μｌのマトリックス溶液をその置かれたサンプルに加え、そして空気乾燥させた。続いてサンプルを陽イオン反射（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ  ｒｅｆｌｅｃｔｒｏｎ）モードで分析して、分子量を決定した。
【００４２】
生物学的に活性なペプチドのアミノ酸配列の決定
生物学的に活性な画分のＮ末端アミノ酸決定を、Ａｂｅｒｄｅｅｎ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｂｅｒｄｅｅｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＵＫにおいて、エドマン分解によって行った。
【００４３】
ツリシンＣＤのヌクレオチド配列の決定
２つのペプチドの部分的なアミノ酸配列に基づく縮重プライマーを、以下の配列でデザインした：
【００４４】
【化３】
2011505126.tif 000005
染色体ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＱｉＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｉｓｉｓから抽出した。以下の条件を用いて、抽出したＤＮＡに対してＰＣＲを行った：９４℃×５分；９４℃×１分、６４．５℃×１分、７２℃×１分、６４．５℃−６９．５℃の温度勾配で２５サイクル；最終的な伸長工程７２℃×７分。Ｔｒｎ−α−Ｆ／ＦＣ／Ｔｒｎ−β−Ｒ／ＦＣプライマーの組み合わせは、約２２０ｂｐのＰＣＲ産物を生じた。この産物を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ａ）を用いてクローニングした。製造会社の説明書に従って用いて、ＥｃｏＲ１（ＮＥＢ）による組換えプラスミドの制限分析によって、クローニングされた断片の存在を確認した。次いで組換えプラスミドＤＮＡを、Ｔ７およびＴ３プライミング部位を用いて、Ｌａｒｋ（Ｗｉｎｄｍｉｌｌ  Ｒｏａｄ  Ｈｅａｄｉｎｇｔｏｎ  ＯＸ３  ７ＢＮ  Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）によって商業的に配列決定した。配列の構築および分析を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＳｅｑＢｕｉｌｄｅｒおよびＳｅｑｍａｎプログラムを用いて行った。コンセンサス配列をさらに、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから入手可能な、Ｂｌａｓｔｎ、ＢｌａｓｔｐおよびｔＢｌａｓｔｘプログラムを用いて、データベース検索によって分析した。
【００４５】
周囲のＤＮＡ領域を得るためのインバースＰＣＲ
縮重ＰＣＲ（上記）によって単離された、２つのペプチドをコードする断片のＤＮＡ配列に基づいて、インバースＰＣＲプライマーを以下の配列でデザインした：
【００４６】
【化４】
2011505126.tif 000006
染色体ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＱｉＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｉｓｉｓから抽出し、そして製造会社の説明書に従って、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）で消化した。次いで、単量体分子の形成を促進することが公知の濃度において、消化したＤＮＡを分類（ｒｅｌｅｇａｔｅ）した。製造会社の説明書に従って、Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、インバースＰＣＲを行った。これは、約４５００ｂｐの産物の増幅を引き起こした。この産物を、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、そしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ａ）を用いてクローニングした。製造会社の説明書に従って用いて、ＥｃｏＲ１（ＮＥＢ）による組換えプラスミドの制限分析によって、クローニングした断片の存在を確認した。次いで組換えプラスミドＤＮＡを、Ｔ７およびＴ３プライミング部位およびプライマーウォーキングを用いて、Ｌａｒｋ（Ｗｉｎｄｍｉｌｌ  Ｒｏａｄ  Ｈｅａｄｉｎｇｔｏｎ  ＯＸ３  ７ＢＮ  Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）によって商業的に配列決定した。配列の構築および分析を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＳｅｑＢｕｉｌｄｅｒおよびＳｅｑｍａｎプログラムを用いて行った。コンセンサス配列をさらに、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能な、Ｂｌａｓｔｎ、ＢｌａｓｔｐおよびｔＢｌａｓｔｘプログラムを用いて、データベース検索によって分析した。
【００４７】
比活性の決定
９６穴マイクロタイタープレートを用いて、ツリシンＣＤのＭＩＣ５０を決定した。ＭＩＣ５０は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＡＴＣＣ４３４９３の増殖の５０％阻害が起こるペプチドの濃度として定義した。前に沸騰および冷却した強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ）で１：１０に希釈した、１５０マイクロリットルの３つの一晩の同型培養物を、嫌気性チャンバー中で、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに３組で播種した。ツリシンＣＤＴｒｎ−αおよびＴｒｎ−βを、単独でおよび組み合わせて、様々な濃度でウェルに加え、そして滅菌５０ｍＭリン酸塩緩衝液で最終的な容量を２００μｌにした。コントロールウェルは、１５０μｌの培養物および５０μｌの緩衝液（陽性コントロール）、または１５０μｌの未播種ブロス培地および５０μｌの緩衝液（ブランク）を含んでいた。３７℃で５時間の嫌気性インキュベーション後、６００ｎｍにおける吸光度を記録した。３組の測定値を平均し、そして未播種培地のＯＤ６００ｎｍ値を、各値から引いた。５０％増殖阻害を、コントロール培養物の最終的なＯＤ６００ｎｍ＋／−０．０５の半分として決定した。５０％阻害を引き起こす、Ｔｒｎ−βと組み合わせたＴｒｎ−αの濃度をプロットして、アイソボログラムを作成した。２つのペプチドの比活性および最適な比を、ｘ軸およびｙ軸の交点で決定した。
【００４８】
殺菌曲線を用いたツリシンＣＤの活性の実証
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  Ｒ０２７ＮＡＰ１、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＮＣＴＣ５３４８、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ３３８およびＢ．ｌａｃｔｉｓ  Ｂｂ１２に対するツリシンの効果を、Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＲＣＭ  Ｍｅｒｃｋ）、Ｂｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎブロス（Ｍｅｒｃｋ）、ＭＲＳ（ｄｅ  Ｍａｎｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐｅ）培地（Ｄｉｆｃｏ）および０．０５％システインを含むＭＲＳにおいてそれぞれ決定した。３つの独立な培養物を各菌株に関して調製し、そして３７℃で一晩増殖させた。３つの複製物の１ｍｌ容量の滅菌２倍強度ブロス培地を各菌株に関して調製し、そしてテスト細菌を播種して、１０５−１０６／ｍｌの最初の細胞数を得た。ツリシンを加え、必要な濃度にして、そして滅菌蒸留水で容量を２ｍｌにした。コントロールではバクテリオシンを加えず、容量を滅菌水で置き換えた。間隔をあけてサンプルを抜き取り、連続的に希釈し、そして菌株によって、ＲＣＡ、ＢＨＩ寒天、ＭＲＳ寒天または０．０５％システインを含むＭＲＳ寒天にまいた。３７℃でインキュベートした２４時間（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）後または４８時間（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｌｂ．ｃａｓｅｉ３３８およびＢ．ｌａｃｔｉｓ  Ｂｂ１２）後に、プレートを計測した。
【００４９】
最小発育阻止濃度の決定
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅリボタイプ００１、１０６、および０２７を、−８０℃のストックから取り、そして７％の繊維素を除去したウマ血液を含むＦａｓｔｉｄｉｏｕｓ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ａｇａｒ上で増殖させた。使用前に、コロニーを３つの１０ｍｌ容量のＲＣＭのそれぞれに移し、そして３７℃で一晩増殖させた。次いで培養物を、１０ｍｌの新しいＲＣＭに１％で継代培養した。３つの複製物を各菌株に関して設定した。培養物を嫌気的に３７℃で６時間増殖させた。バンコマイシンおよびメトロニダゾールの溶液を水中で調製し、そしてツリシンの溶液をストック溶液から５０ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ６．５で希釈した。抗菌化合物の３組の連続２倍希釈物（１００μｌ）を、各化合物に関してマイクロタイタープレート内に調製した。Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ菌株を２倍強度のＲＣＭ中で１：１０に希釈し、そして１００μｌを各ウェルに加えた。各菌株のコントロールを、抗菌薬を加えずに設定した。そのマイクロタイタープレートを、嫌気的に３７℃で１６時間インキュベートし、そしてマイクロタイタープレートリーダーを用いて、インキュベーション後にプレートのＯＤを測定した。ＭＩＣを増殖の証拠が存在しない濃度として定義した。
【００５０】
ツリシンＣＤによるＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの溶解の実証
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対するツリシンＣＤの溶解効果を、Ｒｅａら（２００７）によって記載されたように行った。
【００５１】
糞便発酵におけるツリシン安定性の決定
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ接種材料の調製：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＤＰＣ６５３７（ＰＣＲリボタイプ００１）を、−８０℃のストックから取り、そしてＦａｓｔｉｄｉｏｕｓ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ａｇａｒ上に画線し、そして嫌気的に３７℃でインキュベートした。実験前の夜に、約１コロニーを、前に沸騰および冷却した１０ｍｌのＲＣＭに播種し、そして嫌気的に３７℃でインキュベートした。
【００５２】
糞便培地の調製：糞便増殖培地を、以下のように、ＦｏｏｋｓおよびＧｉｂｓｏｎ（２００３）によって記載された方法を少し変更して調製した。成分を８００ｍｌにし、ｐＨを６．８に調整した。１６０ｍｌを各発酵容器に加え、そして１２１℃で１５分間オートクレーブした。接種の前に、糞便培地を、Ｏ２を含まない窒素で約１時間噴霧した。２０％の糞便スラリーを、使用の前に沸騰し、使用の直前に冷却し、そしてストマッカー（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ）を用いて１分より短く混合した、０．０５％のシステインを含む５０ｍＭのリン酸塩緩衝液において、新しい糞便サンプルから作成した。２つの発酵槽に、３５ｍｌのスラリー調製物および２ｍｌのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの一晩培養物を播種した。テスト容器に、１ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌのツリシンを、０、８および１６時間インキュベーション時に加え、そしてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ種の両方の微生物学的分析のために、両方の容器から０、４、８、１２、１６、２０および２４時間にサンプリングした。ＷＤＡおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いたツリシン活性の分析のためにもサンプルを取った。
【００５３】
ツリシンの安定性：発酵中のツリシンの安定性を、以前に記載されたように、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを播種したＲＣＭ寒天プレートを用いたＷＤＡを用いて測定した。１ｍｌのサンプルをまた、遠心し、そして活性化した１ｍｌのＣ１８ＳＰＥカラムを通し、そしてペプチドを７０％のプロパン−２−オールで溶出した。個々のペプチドの存在を、この文書において前に記載されたように、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて測定した。
微生物学的分析：Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅをＣＣＥＹ寒天（ＬａｂＭ）上で、そしてＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種を０．０５％のシステインおよび５０ｍｇのムピロシン／ｌを含む修飾ＭＲＳ寒天上で、３７℃におけるインキュベーションの４８時間および７２時間後にそれぞれ数えた。
【００５４】
これらの実験を２組行った。
【００５５】
模擬の胃液およびブタ胃液におけるツリシンＣＤの安定性
ツリシンＣＤの安定性に対する、模擬の胃液、回腸液、および結腸液の影響
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６４５３９を一晩増殖させ、そしてＲｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ａｇａｒ（ＲＣＡ）に１．２５％で播種した。Ｂｒｅｕｍｅｒら（１９９２）によって概略が述べられたように、模擬の胃液、回腸液、および結腸液を調製した。精製ツリシンＣＤを、７０％ＩＰＡ中で１００ｍｇ／ｍｌにした。７０μｌ（１ｍｇ／ｍｌの最終濃度）のツリシンを、７０００μｌのブタ胃液および回腸液に加え、そして３７℃でインキュベートした。間隔をおいてサンプルを取り、そしてＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを播種したプレートを用いたＷＤＡによって活性を測定した。サンプルを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて、Ｔｒｎ−αおよびＴｒｎ−βペプチドの存在に関してもアッセイした。
【００５６】
ツリシンＣＤの安定性に対するエキソビボのブタ胃液および回腸液の影響
Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ６４５３９を一晩増殖させ、そしてＲｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ａｇａｒ（ＲＣＡ）に１．２５％で播種した。精製ツリシンＣＤを、上記で記載したように調製した。７ｍｌのブタ回腸液および胃液を、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心して残屑を除去した。７０μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のツリシンを、７０００μｌのブタ胃および回腸液に加え、そして３７℃でインキュベートした。間隔をおいてサンプルを取り、そしてＷＤＡを用いて活性を測定し、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いてＴｒｎ−αおよびＴｒｎ−βペプチドの存在に関してチェックした。
【００５７】
結果
この研究の目的は、胃腸管内から、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して高い活性を有するが胃腸管の常在菌叢の最少の混乱しか引き起こさない、狭いスペクトルのバクテリオシンを産生する細菌を単離することであった。
【００５８】
バクテリオシンプロデューサーの最初のスクリーニング
健康および病気の成人の両方からの、ある範囲の糞便サンプルからスクリーニングした約３０，０００のコロニーから、１つのコロニーが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅオーバーレイ培養の大きな阻害ゾーンを生じることを示した（図１）。このコロニーを、ＩＢＳを有する患者の糞便サンプルから単離した。このコロニーの精製およびＢＨＩブロスにおける増殖は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して活性な、強力な抗菌化合物が、発酵培地中に産生されたことを示した；活性はプロテイナーゼＫによる処理で失われ、その抗菌物質はタンパク質性の性質であることを示した（図１）。この培養物を、Ｍｏｏｒｅｐａｒｋ  Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅの培養コレクションにストックし、そしてＤＰＣ６４３１と命名した；そのバクテリオシンをツリシンＣＤと命名した。
【００５９】
種レベルまでのＤＰＣ６４３１の同定
ＤＰＣ６４３１の１６ＳｒＤＮＡ配列決定は、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ／Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ／Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓに対する、その菌株の最も高い相同性（９６％）を示した。Ｌａ  Ｄｕｃら（２００４）は、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、およびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは全て、系統学的に非常に密接なクレイド（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓグループ）にクラスター化しており、そして従って１６ｓｒＤＮＡ配列決定によっては、お互いに区別できないと述べた。続いてｇｙｒＢプライマーを用いて、ＤＰＣ６４３１をＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓと同定した。Ｂ．ｃｅｒｅｕｓまたはＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの正確なサイズ（それぞれ３６５および３６８）に対応するＰＣＲ産物を、これらの細菌それぞれの陽性コントロールによって得た。Ｂ．ｃｅｒｅｕｓまたはＢ．ａｎｔｈｒａｃｉｓのｇｙｒＢプライマーを、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＤＰＣ６４３１由来のＤＮＡで試験した場合には、ＰＣＲ産物は得られなかった。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓが病原性の特質であるために、そのプライマーの陽性コントロールは無かった。
【００６０】
ＤＰＣ６４３１由来のバクテリオシンの特徴付け
最も高い濃度のツリシンＣＤが、おそらく胞子形成の開始と一致して、増殖の対数期後期および定常期の間に産生された。増殖の定常期の間、活性は安定なままであった。指数関数的増殖期の間に、ｐＨは最初の約７．５のｐＨから約５．８まで低下した；定常期の間に、ｐＨは再びその最初の値近くまで上昇した（データは示していない）。
【００６１】
細胞を含まない抽出物の、２５ｍｇ／ｍｌのα−キモトリプシンおよびプロテイナーゼＫとのインキュベーションは、活性の完全な喪失を引き起こした；ペプシンまたはトリプシンとのインキュベーションは、３７℃で１時間のインキュベーション後、それぞれ５０％または２０％の活性の減少を示した。ツリシンの細胞を含まない上清は、２−１０のｐＨ範囲を通じて活性であり、そしてそれぞれの温度で１５分インキュベートした後、８５℃まで熱安定性であり、９０℃で活性の減少があり、そして１００℃で活性は失われた。
【００６２】
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ６４３１の阻害スペクトル
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ６４３１の細胞を含まない上清は、ＷＤＡ法を用いてある範囲のグラム陽性およびグラム陰性細菌に対して試験した場合、Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ、他のＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株、Ｂ．ｍｙｃｏｉｄｅｓおよびＢ．ｆｉｒｍｕｓのような、密接に関連したＢａｃｉｌｌｕｓ種を阻害する、狭い阻害スペクトルを示した；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢ．ｃｏａｇｕｌａｎｓに対して阻害は検出されなかった。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種では、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅリボタイプ０２７（ＮＣＴＣ１３３６６）を含む試験した全てのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ分離菌は、ＤＰＣ６４３１の培養上清に対して非常に感受性であり、大きな阻害ゾーンを示した。Ｃ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃ．ｌｉｔｈｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、およびＣ．ｉｎｄｏｌｉｓも阻害されたが、試験した他のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種は阻害されなかった（Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）または弱く阻害されるのみであった（Ｃ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍおよびＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）。試験した他のグラム陽性病原体のうち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのみがツリシンＣＤに感受性であった。試験したｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種のうち、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍのみが、ツリシンＣＤによって強力に阻害され、全ての他の種は非常に弱く阻害されるのみであった（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓおよびＬ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）か、または全く阻害されなかった。試験したビフィズス菌株は、ツリシン６４３１に対して感受性ではなかった。ツリシンＣＤは、試験したあらゆるグラム陰性細菌に対して活性を示さなかった。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ６４３１の完全な阻害スペクトルを、表１で概略を示す。
【００６３】
【表１−１】
2011505126.tif 000007
【００６４】
【表１−２】
2011505126.tif 000008
１ブレインハートインフュージョンブロス；２０．０５％のシステインを含む修飾ＭＲＳ；３Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ寒天；４Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ寒天；５Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅダイズ寒天；６乳酸ナトリウム寒天；７２５ｍＭのショ糖を含むＴｒｙｐｔｉｃａｓｅダイズ寒天
（阻害ゾーン（ｍｍ）を測定し、そしてゾーンの直径を測定することによって、相対的な感受性を決定した。サイズ≦９ｍｍのゾーンを＋、１０−１５ｍｍを＋＋、１６−２１ｍｍを＋＋＋；≧２２ｍｍを＋＋＋＋とした）
ツリシンＣＤの特徴付け
ＸＡＤビーズを用いたツリシンの精製およびＲＰ−ＨＰＬＣを用いた活性成分の分離は、それぞれ２７８６および２８８３の分子量を有する、２６分および３４分における２つのよく分離したピークを生じた（図２Ａ）。これらの疎水性ペプチドを、ツリシンＣＤ  Ｔｒｎ−α（分子量２８８３）およびＴｒｎ−β（分子量２７８６）と命名した（図２ＢおよびＣ）。活性は、細胞を含まない上清および細胞ペレットのプロパン−２−オール抽出物の両方に存在し、ツリシンは細胞壁にも結合することを示した。両方のペプチドのＷＤＡ研究は、それは二成分バクテリオシンであることを示す；Ｔｒｎ−αは単独で存在する場合に活性を有するが、その活性はＴｒｎ−βの存在によって増強される。低い濃度（約２．５μＭ）では、ＷＤＡを用いた活性に対して両方のペプチドが必要である（図２Ｄ）。
アミノ酸配列の解明
エドマン分解により、ツリシンＣＤＴｒｎ−αの最初の２２個のアミノ酸のアミノ酸配列
【００６５】
【化５】
2011505126.tif 000009
およびツリシンＣＤＴｒｎ−βの２２アミノ酸
【００６６】
【化６】
2011505126.tif 000010
を同定した。繰り返しの努力にも関わらず、この技術を用いてさらなる配列データを決定することは不可能であった。上記の配列をＮＣＢＩデータベース
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ
と比較した場合に、相同的な配列は同定されなかった。
【００６７】
ヌクレオチド配列の最初の決定
２つのペプチドをコードする遺伝子の方向を、図３に示す。得られたＰＣＲ産物は、Ｔｒｎ−βペプチドのＣ’末端およびリボソーム結合部位およびＴｒｎ−βのプロモーター配列、および開始コドンメチオニンおよびＮ末端アミノ酸配列を含む。
【００６８】
インバースＰＣＲ産物の配列分析
２つのペプチドの完全なヌクレオチド配列を、下記で概略を示すような、開始コドンメチオニンおよびリーダーペプチド配列と共に決定した。
【００６９】
【化７−１】
2011505126.tif 000011
両方のペプチドの完全なアミノ酸配列を決定し、そしてリーダーペプチドと共に下記に示す。リーダーペプチドは
【００７０】
【化７−２】
2011505126.tif 000012
において切断される。
【００７１】
【化８】
2011505126.tif 000013
周辺領域の配列分析は、仮定のタンパク質の前に位置する上流の推定プロモーター、続く２つのＡＢＣトランスポーターシステムおよび次いでＴｒｎ−αおよびＴｒｎ−βペプチドを明らかにする。３つの異常なタンパク質である、２つのラジカルＳ−アデノシルメチオニンＳＡＭタンパク質およびＣ末端プロテアーゼがペプチドの下流に位置する。
【００７２】
ツリシンの比活性
アイソボログラム（図３）は、個々のペプチドとして存在する場合、ツリシンＴｒｎ−βのＭＩＣ５０（０．５μＭ）は、Ｔｒｎ−α（５μＭ）より１０倍低いが、それらのペプチドを組み合わせた場合、０．０２５μＭのＴｒｎ−αと組み合わせたときのＴｒｎ−βのＭＩＣ５０は０．０５μＭに低下することを示し、低濃度のＴｒｎ−αを加えた場合にツリシンＴｒｎ−αを１００倍より活性にし得ることを示す。これらの結果は、低濃度（＜１μＭ）で組み合わせた場合、２：１のＴｒｎ−β：Ｔｒｎ−αの比で組み合わせた場合、２つのペプチドは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して非常に阻害性であることを示す。
【００７３】
ツリシンＣＤの殺菌特性を、図５で実証する；最初の実験は、殺菌曲線を用いて、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを殺菌するために必要なツリシンの濃度を決定した。２００ＡＵ／ｍｌのツリシンが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ＰＣＲリボタイプ０２７の生細胞を、２時間以内に約１０６／／ｍｌからゼロまで減少させた。同じ濃度のツリシンが、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの細胞数を１．５  ｌｏｇ  サイクル（ｃｙｃｌｅ）減少させ、そして同じ時間でプロバイオティクスのＬｂ．ｃａｓｅｉ３３８およびＢ．ｌａｃｔｉｓ  ＢＢ１２の生存能に影響を与えなかった（図５）。ツリシンＣＤを対数的に増殖するＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに加えることによって、ＯＤ６００ｎｍが徐々に減少した；このＯＤの減少は、細胞内酵素のアセテートキナーゼの増殖培地中への放出と同時に起こった。対照的に、ツリシンを有さないコントロールサンプルにおいて、アセテートキナーゼの濃度の増加はなかった。
【００７４】
ツリシンＣＤはまた、０、８、および１６時間に加えた場合、モデル糞便環境において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅリボタイプ００１に対しても有効である（図６Ａ）。１０６ｃｆｕのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅリボタイプ００１／ｍｌを加えた糞便発酵物は、５００μｇのツリシンを０、８、および１６時間に加えた場合、１６時間のインキュベーション後のコントロールと比較して、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅが１０００倍以上減少したことを示した。ツリシンＣＤの活性を、図６Ｂで示すように、発酵の過程の間にマッピングした。明らかに見られ得るように、０、８、および１６時間に５００μｇのツリシンを加えることは、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの増殖の低下を引き起こした。ツリシンペプチドＴｒｎ−αおよびＴｒｎ−βを、モデル糞便発酵において、０時間（黒線）および４時間の発酵後に、ＲＰ−ＨＰＬＣによって検出した（図６Ｃ）。ツリシンの存在は、１６時間までのインキュベーションで、コントロールと比較したＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａの数に影響を与えなかった。
【００７５】
模擬の胃液（図７Ａ）、回腸液（図７Ｂ）および結腸液（図７Ｃ）における、ツリシンペプチドＴｒｎ−αおよびＴｒｎ−βの安定性に対する研究は、ツリシンＣＤをそれぞれ胃液、回腸液、および結腸液において２、４、または９時間インキュベートした場合、いずれの模擬消化管環境においても、活性の低下がなかったことを実証した。さらに、エキソビボでそれぞれブタ胃液（図７Ｄ）および回腸液（図７Ｅ）においてツリシンペプチドＴｒｎ−αおよびＴｒｎ−βを２時間および５時間インキュベートすることも、活性の低下を示さないことを実証した。ツリシンの最小発育阻止濃度の決定の結果は、下記の表２に示すように、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの臨床的に重要なリボタイプは、現在治療に使用されている抗生物質バンコマイシンおよびメトロニダゾールと比較した場合、ツリシンにより感受性であることを示す。リボタイプ００１および１０６は共通して、それぞれアイルランドおよび英国の病院におけるＣＤＡＤの流行に関連しており、一方リボタイプ０２７は、症状の重症度の増加および罹患率の増加に関連しており、毒素産生が高まっているために、治療に対してより抵抗性である疾患を生じる。
【００７６】
【表２】
2011505126.tif 000014
考察
病院および高齢者のための施設における、世界的なＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの高い発生率のために、この疾患の治療に対する根治的なアプローチを考えなければならない。二成分ランチビオティクス、ラクチシン３１４７は、低い濃度でＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを殺菌するのに非常に有効であることが示されたが、それは広域スペクトルの抗生物質であるので、単純な糞便発酵において、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを殺菌するために必要な濃度で、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ集団にも影響を与えた（３ｌｏｇ  サイクル）（Ｒｅａら、２００７）。
【００７７】
ここで報告される研究は、この問題に取り組むために、胃腸管において、抗菌剤産生細菌の供給源を探索することに焦点を合わせた。その目的は、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して強力な活性を有するが、消化管の微生物叢の混乱ができるだけ少ない、狭いスペクトルのバクテリオシンプロデューサーを単離することであった。糞便サンプルから約３０，０００コロニーをスクリーニングした結果として、１つのコロニーが、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅオーバーレイの阻害を示すことが検出された。糞便サンプルをエタノールで前処理して、芽胞形成細菌の単離を促進した。低い希釈でただ１つのサンプルからただ１つの抗菌剤産生コロニーが単離されたという事実は、単離されたＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株ＤＰＣ６４３１が、消化管微生物叢の主な構成要素ではないことを示唆する。
【００７８】
ＤＰＣ６４３１によって産生される抗菌ペプチド、ツリシンＣＤの特徴付けは、その抗菌阻害スペクトル（ＷＤＡを用いた）は狭く、そしてＰＣＲリボタイプ０２７を含むＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ分離菌に対しては非常に有効であるが、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ集団のような、有用な細菌叢に対してはほとんどまたは全く活性を有さないことを実証した。
【００７９】
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓは、芽胞形成グラム陽性昆虫病原体であり、長い間生物学的害虫管理において広範囲に使用されてきた。バクテリオシンは、いくらかのＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株から以前に同定された（Ａｈｅｒｎら、２００３；Ｂａｒｂｏｚａ−Ｃｏｒｏｎａら、２００７；Ｃｈｅｃｈｉｍｉら、２００７；Ｃｈｅｒｉｆら、２００３；Ｃｈｅｒｉｆら、２００１；ＦａｖｒｅｔおよびＹｏｕｓｔｅｎ、１９８９；Ｇｒａｙら、２００６ａ；Ｇｒａｙら、２００６ｂ；Ｋａｍｏｕｎら、２００５）。Ａｈｅｒｎら、２００３は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの菌株からＢＬＩＳ物質を特徴付け、その菌株はツリシン４３９ａおよびツリシン４３９ｂと命名された２つの活性ペプチドを産生した；どちらのペプチドも、抗菌活性を示したが、二成分活性は報告されなかった。文献の調査から、ツリシン６４３１の配列および分子量は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ４３９によって産生されるものと最も類似している。Ａｈｅｒｎら（２００３）は、２つのペプチド４３９ａおよび４３９ｂのアミノ酸配列は同一であるが、それらのペプチドは異なる分子量を有することを報告した。ツリシン４３９ａ／ｂに関して報告された配列は、２つの同定されていないアミノ酸（ｘ）を含み、それは著者らがおそらくシステインであろうと示唆しており、従って、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ６４３１および４３９由来のペプチドの最初の１９アミノ酸において、ちょうど２つのアミノ酸の違いがある（バリンの代わりにシステイン、およびバリンの代わりにグルタミン酸）。しかし、ツリシンＣＤのＴｒｎ−αは、ツリシン４３９ペプチドと顕著に異なる。ツリシンＣＤは、ある範囲のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種に対して非常に活性であることが示されたが、ツリシン４３９に関しては、抗クロストリジウム活性は報告されなかった（Ａｈｅｒｎら、２００３）。ツリシンＣＤおよび４３９のアミノ酸配列および分子量および活性スペクトルの間の比較を下記の表３に示す。
【００８０】
【表３】
2011505126.tif 000015
ツリシンペプチドのペプチド１およびペプチド２をコードする遺伝子の核酸配列および方向を、図３に示す。ＮＣＢＩデータベースの検索は、本明細書で同定された配列と相同的な配列を示さなかった。
【００８１】
ツリシンＣＤの、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって（２７６３および２８６１）、およびアミノ酸配列から（２７７０および２８６４）決定された分子量間の不一致は、翻訳後修飾の結果のようである。Ｔｒｎ−αおよびＴｒｎ−βペプチドのＤＮＡ配列から予測される分子量、それぞれ２７６９Ｄａおよび２８７６Ｄａは、ＭＳ（質量分析）から得られたものと６質量単位異なる。Ｔｒｎ−αに関して、質量における違いは、Ｓｅｒ２１、Ｔｈｒ２５、およびＴｈｒ２８それぞれからの２つの水素原子の喪失を示し、そしてＴｒｎ−βに関してはＴｈｒ２１、Ａｌａ２５、およびＴｙｒ２８が全て予測されるよりも２質量単位軽いことを示唆する。両方のペプチドのＣｙｓ残基は、同じ位置(残基５、９、および１３）にあり、一方翻訳後修飾は同じ位置で起こる（残基２１、２５、および２８）。
【００８２】
ツリシンＣＤは、広いｐＨ範囲で活性であり、そして中程度に熱安定性であり、９５℃で１５分間まで活性を保持する。ＭＩＣ５０研究は、単一のペプチドとして存在する場合、０．５および５μＭ（それぞれＴｒｎ−αおよびＴｒｎ−β）と低い濃度で、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅの非常に強力な阻害剤であることを示すが、両方のペプチドが存在する場合にはＭＩＣ５０は０．０５μＭに減少し、ツリシンは、低濃度でＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対して高度に活性な、二成分バクテリオシンであることを示す。殺菌曲線は、ツリシンＣＤが、低濃度でＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅリボタイプ０２７（ＮＡＰ１）の細胞数の減少に非常に有効であり、そして現実には溶解性であることを実証した。この菌株は超病原性であることが示され、その発生率は世界中で上昇しており、重症度の増加、高い再発率、および顕著な死亡率を引き起こす（Ｋｕｉｐｅｒら、２００７）ので、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ０２７に対するツリシンの有効性は、重要である。ツリシンのＭＩＣ値の、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ感染症を治療するために現在使用されている抗生物質であるバンコマイシンおよびメトロニダゾールで得られたものとの比較は、臨床的に重要である。興味深いことに、同様の濃度のツリシンＣＤは、ラクチシン（Ｒｅａら、２００７）の影響と対照的に、Ｌ．ｃａｓｅｉ３３８またはＢ．ｌａｃｔｉｓＢｂ１２の生存能に影響を与えなかったが、それは消化管内の有用な菌叢はこの抗菌薬によって混乱しないことを示す。
【００８３】
疾患の治療または予防のために、微生物由来ペプチドを評価する場合、生物学的利用能の問題に取り組む必要がある。αキモトリプシンおよびペプシンおよびトリプシンによる、インビトロにおけるツリシンＣＤの抗菌活性の分解が示されたことは、このバクテリオシンは、カプセル封入のような保護無しでは、胃の通過を生き残れないことを示唆する。しかし、プロバイオティクスとしてこの細菌の胞子または栄養細胞を与える代替戦略を、このペプチドをＧＩＴ内に送達することを目標とする方法として調査し得る。プロバイトティク培養物は通常、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種のような、ＧＩＴの常在菌である菌種と関連する。しかし、通常のヒト消化管微生物叢の構成成分ではないＳ．ｂｏｕｌａｒｄｉｉが、現在ＣＤＡＤの治療においてプロバイトティクとして使用されている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種は現在、ヒトおよび動物の両方に使用するためのプロバイトティク培養物として使用されている（概説に関してはＨｏｎｇら、２００５およびＳａｎｄｅｒｓら、２００３を参照のこと）。胞子は厳しい環境を生存し得るので、その真の生息地に関する疑問？が生じた。それらは環境からの胞子の摂取の結果として、ヒト消化管に到達すると想定されたが、Ｈｏｎｇら（２００５）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種は、消化管において一時的に生存および増殖し得る、その宿主との内共生関係で存在する可能性があることを述べた。栄養細胞に対して胞子を投与する利点は、その安定性および胃の厳しい環境を通り抜ける能力である。マウスの研究において、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓの栄養細胞は胃の通過を耐えられなかったが、ほとんど全ての投与した胞子は、胃の通過を耐え、そして小腸において回収されたことが示された（Ｄｕｃら、２００３）。
【００８４】
Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓに基づく殺虫剤への職業的な曝露のために、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを排出する温室労働者の研究において、胃腸症状は糞便サンプルにおけるＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの存在と関連しなかった（Ｊｅｎｓｅｎら、２００２）。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ胞子および栄養細胞を与えた、ヒト細菌叢関連ラットの消化管におけるＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの研究は、固有の消化管細菌叢の組成に対する有害作用を検出せず、またベロ毒素アッセイによる消化管サンプルに対する細胞毒性効果を検出しなかった（Ｗｉｌｃｋｓら、２００６）。
【００８５】
精製したタンパク質分解酵素を用いた結果および様々なＧＩ環境における結果の間に不一致があるが、これは、使用される精製酵素の濃度が、ＧＩ環境に存在するものより非常に高いことで説明し得る。これらの結果は、ツリシンペプチドのみを指し、栄養細胞または胞子ではないことに注意すること。
【００８６】
結論として、この研究は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ菌株ＤＰＣ６４３１が、強力な熱安定性二成分バクテリオシンを産生し、それはペプチド形態で、または栄養細胞または胞子型式のいずれかのプロバイオティクスとして、新規ＣＤＡＤ治療薬としての可能性を有することを示している。
【００８７】
本発明のバクテリオシンは、いくつかの利点を有する。ツリシンＣＤと命名された抗菌物質が、発酵培地中に産生され（１リットルの培地は３５０ｍｇのツリシンを生じた）、そして細胞を含まない上清は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種である、ＰＣＲリボタイプ０２７を含むＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを阻害する、狭い阻害スペクトルを示した。ＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種は、非常に弱く阻害されたＬｂ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍおよびＬｂ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓおよびＬｂ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉを除いて、阻害されなかった。そのバクテリオシンは、熱安定性であり、広い範囲のｐＨで活性であり、そしてある範囲のタンパク質分解酵素に感受性である。それは２７６３（Ｔｒｎ−α）および２８６１（Ｔｒｎ−β）の分子量を有するペプチドを有する、二成分バクテリオシンである。ツリシンＣＤは、Ｔｒｎ−βおよびＴｒｎ−αに関してそれぞれ、両方のペプチドが単独で存在する場合、０．５μＭおよび５μＭのＭＩＣ５０を示した。それらのペプチドが一緒に存在する場合、ＭＩＣ５０は、２：１の比で、２５ｎＭのＴｒｎ−αと組み合わせた５０ｎＭのＴｒｎ−βであった。ツリシンＣＤの殺菌効果を、タイムキル（ｔｉｍｅ  ｋｉｌｌ）実験によって示し、ここで１ｍｌあたり約５×１０６ｃｆｕのＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅを、２００ＡＵ／ｍｌの濃度で１８０分以内に殺菌した。ツリシンＣＤは、ナノモル濃度で活性な二成分バクテリオシンである。
【００８８】
【数１】
2011505126.tif 000016
【００８９】
【数２】
2011505126.tif 000017
【図１】
2011505126.tif 000020
【図４】
2011505126.tif 000021
【図７】
2011505126.tif 000022
【図２】
2011505126.tif 000023
【図３】
2011505126.tif 000024
【図５】
2011505126.tif 000025
【図６】
2011505126.tif 000026
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月23日(2010.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2011505126000001.app
【国際調査報告】
2011505126.tif 000027
2011505126.tif 000028