(57)【要約】目的の遺伝子に作動可能に連結された変異ｌａｃオペレーターを含む核酸、上記核酸を含む宿主細胞、および上記目的の遺伝子を発現させるために上記宿主細胞を用いる方法が、本発明において提供される。ｒｅｃＡが媒介するクローニング方法もまた提供される。一実施形態において、上記変異ｌａｃオペレーターは、ＬａｃＩリプレッサータンパク質に対する上昇した親和性を有し得る。上記核酸はプラスミドまたは染色体であり得る。ＬａｃＩリプレッサータンパク質に対するｌａｃオペレーターの親和性は、少なくとも５倍上昇され得る。変異ｌａｃオペレーターの配列は、配列番号：２から配列番号：６の何れか一つを含み得る。目的の遺伝子は、抗体または酵素のような生物学的活性を有するタンパク質をコードし得る。タンパク質はＴ７遺伝子１またはｔｒｆＡであり得る。
2011505147.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の遺伝子に作動可能に連結されている変異ｌａｃオペレーターを含む核酸であって、ここで該変異ｌａｃオペレーターはＬａｃＩリプレッサータンパク質に対して増加した親和性を有する、核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸であって、ここで該核酸がプラスミドである、核酸。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸であって、ここで該核酸が染色体である、核酸。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸であって、ここで前記増加した親和性が少なくとも５倍である、核酸。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸であって、ここで前記変異ｌａｃオペレーターの配列は配列番号２から配列番号６の何れか一つを含む、核酸。
【請求項６】
請求項１に記載の核酸であって、ここで前記目的の遺伝子がＴ７遺伝子１である、核酸。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸であって、ここで前記目的の遺伝子がｔｒｆＡである、核酸。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項９】
ｌａｃＩ遺伝子をさらに含む、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の宿主細胞であって、ここで前記ｌａｃＩ遺伝子が変異ｌａｃＩ対立遺伝子である、宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載の宿主細胞であって、ここで前記変異ｌａｃＩ対立遺伝子が、増加した親和性でｌａｃオペレーターと結合できる変異ＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードする、宿主細胞。
【請求項１２】
不活性なｌａｃＺ遺伝子をさらに含む、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
以下：
（ａ）請求項８に記載の宿主細胞を提供する工程；
（ｂ）該宿主細胞をＬａｃＩアロステリックエフェクターと接触させる工程、
を包含する、目的の遺伝子を発現させる方法であって、
ここで該ＬａｃＩアロステリックエフェクターは該目的の遺伝子の発現を導く、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、ここで前記ＬａｃＩアロステリックエフェクターがラクトースに由来する、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、ここで前記ＬａｃＩアロステリックエフェクターがラクトースアナログである、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、ここで前記ラクトースアナログが、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドである、方法。
【請求項１７】
以下：
（ａ）宿主細胞を提供する工程であって、ここで該宿主細胞はｒｅｃＡを含む、工程；
（ｂ）第一の核酸を提供する工程であって、ここで該第一の核酸は環状である、工程；
（ｃ）第二の核酸を提供する工程；および
（ｄ）該宿主細胞中で該第一の核酸を該第二の核酸と接触させる工程であって、ここで第一の核酸は該第二の核酸と再結合する、工程、
を含む、該第一の核酸をクローニングする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、ここで前記ｒｅｃＡが前記宿主細胞ゲノム中に位置する、方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、ここで前記ｒｅｃＡがプラスミド上に位置する、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、ここで前記ｒｅｃＡプラスミドが前記第一の核酸および前記第二の核酸の再結合後に除去される、方法。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法であって、ここで前記第一の核酸は、少なくとも二つ、前記第二の核酸上の領域と同一である配列の領域を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１７に記載の方法であって、前記第二の核酸が宿主細胞の染色体である、方法。
【請求項２３】
請求項１７に記載の方法であって、前記第一の核酸がプラスミドである、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、ここで前記プラスミドが選択可能マーカーを含む、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ここで前記選択可能マーカーがカナマイシン耐性をもたらす、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、ここで前記選択可能マーカーが緑色蛍光タンパク質をさらに含む、方法。
【請求項２７】
請求項１７に記載の方法であって、ここで前記宿主細胞がグラム陰性細菌である、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ここで前記細菌がＥ．ｃｏｌｉである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ＬａｃＩリプレッサータンパク質に対する親和性が上昇した変異ｌａｃオペレーターによって調節される目的の遺伝子を発現する方法、変異ｌａｃオペレーターを含む核酸、およびその核酸を含む宿主細胞に関連する。本発明はｒｅｃＡが媒介する組換えを用いて核酸をクローニングする方法にもまた関連する。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
異種の遺伝子発現による薬学的および工業的な利用のためのタンパク質ならびに酵素の製造は、生産の効率的かつ経済的な手段である。グラム陰性細菌であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）は依然として、研究および産業の両方において、目的の遺伝子の発現のために最も一般的に用いられる宿主細胞基盤である。異種のタンパク質発現は、発酵および細胞増殖のパラメーターに対してしばしば感受性であり、そして、一種のタンパク質に対する最適な誘導レジメンは別のタンパク質に対する最適な誘導レジメンとは頻繁に異なるため、任意の産物の生産量を最大化するために変化させられ得る柔軟な誘導の方法を必要としている。宿主の発現システムに対し有毒である遺伝子産物は特に厄介であり、そして遺伝子発現を厳密に調節するための多くの手段は、高スループット、高用量の適用に対して扱い難く、かつ、不適当である。
【０００３】
遺伝子発現のための戦略は、ＲＮＡポリメラーゼ（誘導可能なプロモーターによって制御される遺伝子によってしばしばコードされる）によって調節されるプロモーターの制御下に目的の遺伝子を置くことをしばしば含む。そのような発現システムの一つは、特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４に記載されている（これらの全容が本明細書において援用される）、目的の遺伝子の発現を制御しているバクテリオファージＴ７プロモーター、および、ｌａｃ  プロモーターの制御下のＲＮＡポリメラーゼＴ７遺伝子１である。他の発現システムとしては、それぞれ米国特許出願第１０／５３７，０７５号および特許文献５に記載されている（これらの全容が本明細書において援用される）、ラムノースで誘導可能なＴ７ポリメラーゼ遺伝子およびアラビノースで誘導可能な遺伝子が挙げられる。
【０００４】
現在の遺伝子発現システムは、誘導剤の非存在下でのＲＮＡポリメラーゼの基礎発現レベル（すなわち「漏れやすい」プロモーター）；稀少および高価な誘導剤（例えば、イソプロピルβチオガラクトシド［ＩＰＴＧ］）；宿主システムへの誘導剤の限定された輸送；宿主システムへの誘導剤の導入の際の、ＲＮＡポリメラーゼ発現の動力学的反応が緩慢であること；および、誘導剤の非存在下においてＲＮＡポリメラーゼの望まない発現を導くオペレーター−リプレッサーシステムの調節の欠如、を含む多くの因子が妨げとなる。そこで代替的な発現システムの開発が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，５６９，６６９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８６９，３２０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６９３，４８９号明細書
【特許文献４】米国特許第４，９５２，４９６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，０２８，５３０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の概要）
目的の遺伝子に作動可能に連結されている変異ｌａｃオペレーターを含む核酸が、本明細書中で提供される。変異ｌａｃオペレーターは、ＬａｃＩリプレッサータンパク質に対する上昇した親和性を有し得る。核酸はプラスミドまたは染色体であり得る。ＬａｃＩリプレッサータンパク質に対するｌａｃオペレーターの親和性は、少なくとも５倍上昇され得る。変異ｌａｃオペレーターの配列は、配列番号：２から配列番号：６の何れか一つを含み得る。目的の遺伝子は、抗体または酵素のような生物学的活性を有するタンパク質をコードし得る。タンパク質はＴ７遺伝子１またはｔｒｆＡであり得る。
【０００７】
上記核酸を含む宿主細胞もまた提供される。その宿主細胞は、ｌａｃＩ遺伝子を含み得、このｌａｃＩ遺伝子は変異型であり得る。ｌａｃＩ対立遺伝子は、上昇した親和性でｌａｃオペレーターと結合し得る、変異ＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードし得る。宿主細胞は不活性なｌａｃＺ遺伝子もまた含み得、この不活性なｌａｃＺ遺伝子は宿主細胞が、グルコースおよびガラクトースへのラクトースの切断またはラクトースのアロラクトースへの変換を防ぎ得る。
【０００８】
宿主細胞をＬａｃＩアロステリックエフェクターと接触させることによって、目的の遺伝子を発現させる方法もさらに提供される。上記アロステリックエフェクターは目的の遺伝子の発現を導き得る。ＬａｃＩアロステリックエフェクターはラクトースに由来し得、かつ、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどのラクトースアナログであり得る。
【０００９】
ｒｅｃＡを含む宿主細胞を用いて、第一の核酸をクローニングする方法もまた提供される。上記宿主細胞において、（環状であり得る）第一の核酸は、上記宿主細胞中で第一と第二の核酸が接触することによって、第二の核酸と組換えられ得る。ｒｅｃＡは上記宿主細胞ゲノム中、またプラスミド上に配置され得る。第一の核酸はプラスミドであり得、また第二の核酸は宿主細胞の染色体であり得る。第一の核酸は、少なくとも二つ、第二の核酸上の領域と同一である配列の領域を含み得る。第一の核酸は、カナマイシン耐性をもたらす選択可能マーカーまたは緑色蛍光タンパク質をコードする選択可能マーカーもまた含み得る。核酸の組換えの後、上記ｒｅｃＡプラスミドは除去され得る。この宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどのグラム陰性細菌であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、一次（染色体間の）組換えによるｌａｃ−Ｔ７ポリメラーゼ置換のための構築上の戦略を概略的に表したものである。
【図２】図２は、二次（染色体内の）組換えによるｌａｃ−Ｔ７ポリメラーゼ置換のための構築上の戦略を概略的に表したものである。
【図３】図３は、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼ構築物を作製する工程における、ＰＣＲの第一ラウンドで使用されるプライマーおよび鋳型を示す。
【図４】図４は、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼおよび構築物を作製する工程における、ＰＣＲの第二および第三ラウンドで使用されるプライマーおよび鋳型を示す。
【図５】図５は、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼ構築物およびこれを作製するために使用されるプライマーの概略を示す。
【図６】図６は、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼのクローニングおよび同定のための戦略ならびにこの構築物のクローニングの結果生じるゲルの写真を記載する。
【図７】図７は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム中へのｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼ構築物の組換えを確認するために使用される戦略およびプライマー、ならびに確認の戦略の結果生じるゲルの写真を記載する。
【図８】図８は、ｌａｃＹの５’部分とｌａｃＹのＥ．ｃｏｌｉ染色体のコピーとの間でのＲｅｃＡが媒介する分子内の組換えイベント（このことは内因性ｌａｃＺが存在していたＥ．ｃｏｌｉ染色体領域の「崩壊」を生じる）を確認するためのスクリーニングに使用される戦略およびプライマーならびにゲルの写真を記載する。
【図９】図９は、ｌａｃＺ復帰構築物を作製するために使用されるプライマーならびに鋳型を示す。
【図１０】図１０は、ｌａｃＺ復帰構築物の概略およびこれを作製するために使用されるプライマーの概略を示す。
【図１１】図１１は、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼＥ．ｃｏｌｉ菌株中へのｌａｃＺの導入のための戦略およびこの戦略の結果生じるゲルの写真を示す。
【図１２】図１２は、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼＥ．ｃｏｌｉ菌株中へのｌａｃＺの導入を確認するために使用される戦略およびプライマーならびにこの戦略の結果生じるゲルの写真を示す。
【図１３】図１３は、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼおよびｌａｃＺを含むがカナマイシン耐性を有しないＥ．ｃｏｌｉ菌株の作製を確認するための戦略およびプライマー、ならびにこの戦略の結果生じるゲルの写真を示す。
【図１４】図１４は、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７株の概略およびこれを構築するために使用されるプライマーを示す。
【図１５】図１５は、自殺ベクターがＴｒｆＡタンパク質の存在下で複製することを許容するｏｒｉＶ、緑色蛍光タンパク質−カナマイシン耐性マーカー、およびマルチクローニングサイト（これらは核酸組換え戦略において使用され得る）を含む自殺ベクターの概略を示す。
【図１６】図１６は、核酸組換え戦略の、考えられる第一工程の概略を示す。
【図１７】図１７は、核酸組換え戦略の、考えられる第二工程の概略を示す。
【図１８】図１８は、一次（染色体間の）組換えによるｌａｃ−Ｔ７ポリメラーゼ置換のための、代替的な構築上の戦略を概略的に表したものである。
【図１９】図１９は、二次（染色体内の）組換えによるｌａｃ−Ｔ７ポリメラーゼ置換のための、代替的な構築上の戦略を概略的に表したものである。
【図２０】図２０は、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼ構築物を作製する工程におけるＰＣＲの、代替的な第一ラウンドで使用されるプライマーおよび鋳型を示す。
【図２１】図２１は、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼおよび構築物を作製する工程におけるＰＣＲの、代替的な第二および第三ラウンドで使用されるプライマーおよび鋳型を示す。
【図２２】図２２は、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼ構築物の代替的な概略およびこれを作製するために使用されるプライマーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（詳細な記述）
ｌａｃオペロンは、制御ドメイン、ｌａｃオペレーター、ならびにラクトースの取込みおよび異化に関与する３種の遺伝子ｌａｃＺ、ｌａｃＹ、ｌａｃＡ（Ｖｉｌａｒら，２００３，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１６１（３）：４７１−４７６において概説されている
）を含む。ＬａｃオペレーターはＬａｃＩリプレッサータンパク質（転写調節因子のへリックス−ターン−へリックスファミリーに属する）によって調節される。ＬａｃＩリプレッサータンパク質は、様々な親和性で、ｌａｃオペレーターに存在する３種のサイトのいずれにも結合できるホモ四量体として機能する。ラクトース非存在下では、ＬａｃＩリプレッサータンパク質は、ｌａｃオペレーターを１０００倍を超えるほどにより強く抑制することを媒介する能力を有する。これは主に、ＬａｃＩリプレッサータンパク質とＬａｃオペロンの転写開始部位に近い核酸配列との間での相互作用によって引き起こされるＬａｃＩリプレッサーとＲＮＡポリメラーゼとの間での立体（Ｓｔｅａｒｉｃ）障害によって起こる（Ｂｅｓｓｅら，１９８６，ＥＭＢＯ  Ｊ，５（６）：１３７７  ８１；Ｌｅｈｍｉｎｇら，１９８７，ＥＭＢＯ  Ｊ，６（１０）：３１４５  ３１５３）。ラクトース誘導体は、ＬａｃＩリプレッサータンパク質に結合する能力およびこのタンパク質における構造的な変化を引き起こす能力を有し、このことはｌａｃオペレーターに対するＬａｃＩリプレッサータンパク質の親和性を低下させ、そしてｌａｃオペロンの上昇した発現を可能にする。
【００１２】
ｌａｃシステムの成分を用いて目的の遺伝子を発現させる方法が、本明細書中で提供される。誘導剤の非存在下において、目的の遺伝子の基礎レベルは、ＬａｃＩリプレッサータンパク質がｌａｃオペレーターを占有する時間の上昇、つまりＬａｃＩリプレッサータンパク質による抑制の増強によって減少させられ得、かつ、より厳密に制御され得る。以前、天然から単離されたプロモーター改変体が、この適用において使用されている。これらとしては、ＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードする遺伝子のプロモーターに存在するｌａｃＩｑが挙げられる。ｌａｃＩｑ変異はＬａｃＩリプレッサータンパク質のレベルの上昇を引き起こし、そしてそのため、ｌａｃオペロンの抑制の上昇を引き起こす。ＬａｃＩと非常にしっかりと複合体を形成できるオペレーター配列改変体は、インビトロの研究において、無作為のオリゴヌクレオチドに対するＬａｃＩの結合の体系的な分析によって同定されている（Ｌｅｈｍｉｎｇら；Ｓａｄｌｅｒら；１９８３，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：６７８５−８９）、しかしインビボでの適用のための検査はほとんどされていない。本明細書で提供される方法は、ＬａｃＩリプレッサータンパク質に対して上昇した親和性を有するｌａｃオペレーターの改変体を利用することで、ＬａｃＩリプレッサータンパク質のレベルの上昇に対する必要性を回避し、かつ目的の遺伝子によって生産されるタンパク質の精製を単純にする。
【００１３】
（１．定義）
本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のみのためのものであり、これらによって本発明が限定されることは意図されない。本明細書および添付される特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ある、一つの（ａ、ａｎ）」および「この、その（ｔｈｅ）」は、文脈において複数形を含まないことが明記がなされない限り、複数形の概念を含む。
【００１４】
本明細書における数値範囲の記載について、同程度の正確さを有するその数値範囲の間にある各数値が、明示的に意図される。例えば、６から９の範囲については、数値７および８は、６および９に加えて本明細書において明示的に意図される。そして、６．０から７．０の範囲においては、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が本明細書において明示的に意図される。
【００１５】
（ａ．染色体）
本明細書で用いられる「染色体」は、細胞内に包まれている核酸であり得る。核酸は一片のＤＮＡであり得る。ＤＮＡは直鎖状であっても環状であってもよい。ＤＮＡは１、１０、１００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、または１００００の遺伝子を含み得る。ＤＮＡは調節要素および／または介在ヌクレオチド配列もまた含み得る。ＤＮＡは複製起点もまた含み得る。複製起点は、ｏｒｉＣであり得る。ＤＮＡは細胞にとって天然なものであり得る。ＤＮＡは、細胞にとって外因性なものでもまたあり得る。例えば、ＤＮＡは人工の染色体であり得る。ＤＮＡは、細胞学的に可視である核封入体の中でのように、凝縮もまたされ得る。
【００１６】
（ｂ．遺伝子）
本明細書で用いられる「遺伝子」は、転写および／もしくは翻訳の調節配列ならびに／またはコード領域ならびに／または翻訳されない配列（例えば、イントロン、５’および３’の非翻訳配列）を含む天然のもの（例えば、ゲノム）、あるいは合成の遺伝子であり得る。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡなどの機能的なＲＮＡであり得る。遺伝子は、コード領域に連結されている５’もしくは３’の非翻訳配列を必要に応じて含むコード領域（例えば、エキソンおよびｍｉＲＮＡ）に相当するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡでもまたあり得る。遺伝子は、コード領域および／またはコード領域に連結されている５’もしくは３’の非翻訳配列の全てまたは一部を含む、インビトロで生産される増幅された核酸分子でもまたあり得る。
【００１７】
（ｃ．宿主細胞）
本明細書で用いられる「宿主細胞」は、天然に存在している細胞、またはベクターを含み得る形質転換された細胞およびベクターの複製を支え得る形質転換された細胞であり得る。宿主細胞は培養された細胞、外植片、インビボの細胞などであり得る。宿主細胞は、Ｅ．  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓおよびＳｈｉｇｅｌｌａ種などの原核細胞であってもよい。宿主細胞は、酵母の細胞、昆虫の細胞、および両生類の細胞、またはＣＨＯおよびＨｅＬａのような哺乳類の細胞などの真核細胞であってもまたよい。
【００１８】
（ｄ．不活性）
本明細書で用いられる「不活性」は、不活性な遺伝子を意味し得る。不活性な遺伝子は変異を含み得る。変異は遺伝子の機能喪失を引き起こし得る。不活性な遺伝子は、野生型の配列と比較して欠失された配列もまた含み得る。欠失された配列は、遺伝子の一部を含んでよい。欠失された配列は、遺伝子の全体もまた含んでよい。不活性な遺伝子は、トランスポゾンもまた含んでよい。トランスポゾンは、遺伝子の５’または３’にあってもよい。トランスポゾンは、遺伝子内にあってもまたよい。不活性な遺伝子は、宿主細胞がその遺伝子によってコードされるタンパク質を生産することができないことを保証し得る。
【００１９】
（ｅ．挿入サイト）
本明細書で用いられる「挿入サイト」は、制限酵素部位または組換えサイトを含む配列を有する核酸を意味し得る。制限酵素を用いる制限酵素部位または組換えサイトにおける消化は、第二の核酸が挿入されることを可能にし得る。挿入サイトは、マルチクローニングサイトを含み得る。
【００２０】
（ｆ．変異）
本明細書で用いられる「変異型」または「変異」は、参照される核酸またはポリペプチドと比較して、一つまたはそれより多い置換、欠失、もしくは挿入を含む核酸またはポリペプチドを意味し得る。
【００２１】
（ｇ．核酸）
本明細書で用いられる「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合で連結された少なくとも二つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖の記載は、相補鎖の配列もまた定義する。よって、核酸は、記載される一本鎖の相補鎖もまた包含する。核酸の多くの改変体は、所定の核酸として、同じ目的のために用いられ得る。よって、核酸は実質的に同一である核酸およびそれらの相補体もまた含み得る。一本鎖は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、標的の配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。よって、核酸はストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブもまた包含する。
【００２２】
核酸は一本鎖配列であっても、二本鎖配列であってもよく、または、二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡであるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッド（ここで核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組合せ、ならびに、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組合せを包含してもよい）であってよい。核酸は化学的な合成法または組換え法によって取得されてもよい。
【００２３】
（ｈ．作動可能に連結）
本明細書で用いられる「作動可能に連結」は、空間的につなげられているプロモーターの制御下での遺伝子の発現を意味し得る。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流側）または３’（下流側）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、そのプロモーターが由来する遺伝子においてそのプロモーターが制御をする遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該分野において公知のように、この距離における改変は、プロモーターの機能を失うことなく提供され得る。
【００２４】
（ｉ．ぺプチド）
「ぺプチド」または「ポリぺプチド」は、アミノ酸が連結された配列であり、そして、天然のもの、合成されたもの、または天然のものおよび合成されたものが修飾されたものもしくは天然のものおよび合成されたものの組合せであり得る。
【００２５】
（ｊ．プラスミド）
本明細書で用いられる「プラスミド」は核酸を意味し得、ここで、核酸は環状構造を有する。プラスミドは染色体外であり得る。プラスミドは、１００；１０００；２０００；５０００；１０，０００；２０，０００；３０，０００；４０，０００；５０，０００；６０，０００；７０，０００；８０，０００；９０，０００；１００，０００；１１０，０００；１２０，０００；１３０，０００；１４０，０００；１５０，０００；１６０，０００；１７０，０００；１８０，０００；１９０，０００；２００，０００；２１０，０００；２２０，０００；２３０，０００；２４０，０００；２５０，０００；２６０，０００；２７０，０００；２８０，０００；２９０，０００；３００，０００；３１０，０００；３２０，０００；３３０，０００；３４０，０００；３５０，０００；３６０，０００；３７０，０００；３８０，０００；３９０，０００または４００，０００ヌクレオチドの長さを有し得る。プラスミドは低コピー、中コピーまたは高コピーのプラスミドであり得る。プラスミドは複製の起点を含み得る。プラスミドは選択可能マーカーもまた含み得る。プラスミドはスクリーニングマーカーもまた含み得る。プラスミドはマルチクローニングサイトもまた含み得る。ここで、マルチクローニングサイトは制限酵素部位を含む。制限酵素部位はさらなる核酸のクローニングのために用いられ得る。プラスミドはｐＴＹＢ１、ｐＴＹＢ２、ｐＴＹＢ１１、ｐＴＹＢ１２、ｐＬｉｔｍｕｓ２９、ｐＭＡＬ−Ｃ２Ｘ、ｐＭＡＬ−Ｃ２Ｔ、ｐＭＡＬｐ２、ｐＭＡＬｃ２、ｐＭＡＬｃＲ１、ｐＥＴ３、ｐＥＴ３ａ、ｐＥＴ１１ａ、ｐＥＴ１１ｄ、ｐＥＴ１５ｂ、ｐＥＴ１７、ｐＥＴ２１ｄ（＋）、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＥＴ２８ａ、ｐＥＴ２９ａ、ｐＥＴ３０ａ、ｐＥＴ４２ｂ（＋）、ｐＥＴ４２ｂ（＋）、ｐＥＴ４４ｂ（＋）、ｐＥＴ４４ｂ（＋）、ｐＫＫ２３３−２、ｐＫＫ２２−３３、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＲＳＥＴＢ、ｐＲＳＥＴＣ、ｐＴＰ２Ｐ、ｐＴＲＣ９９Ａ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＧＥＸ３Ｘ、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＡＴ１５３、ＨＡＴ４、ｐＰＲＯＥＸＨＴｂ、ｐＴＺ１８、ｐＴＺ１９、ＰＴＺ１９ＲＪ  Ｌ１、ＰＴＺ１９ＲＪ  Ｌ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４Ａ、ｐＧＥＭ１、ｐＧＥＭ４Ｚ、ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）、ｐＬｉｔｍｕｓ２９、ｐＧＥＭＥＸ−１、ｐＣＤＮＡ３、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（ｓｋ＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）、ｐＳＥＬＥＣＴ−１、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ［−ＴＯＰＯ］、ｐＬｙｓＳ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１２０、ｐＵＣ１２１、ｐＵＣ−４Ｋ、またはこれらの改変体であってもよい。
【００２６】
（ｋ．プロモーター）
本明細書で用いられる「プロモーター」または「オペレーター」は、細胞内の核酸の発現を、もたらす、活性化するもしくは強める能力を有する、合成されたまたは天然から得られた分子を意味し得る。プロモーターは、同じものの発現をさらに強めるまたは空間的発現もしくは時期的な発現を変化させるための、一つまたはそれより多い特異的な転写調節配列を含んでよい。プロモーターは、遠い位置にあるエンハンサーの要素またはリプレッサーの要素（これらは転写の開始サイトから数千塩基対程度のところに存在し得る）もまた含んでよい。プロモーターはウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が起きる細胞、組織もしくは器官に関連して、または発現が起きる発生の段階に関連して、または生理学的なストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤のような外部からの刺激に応答して、遺伝子成分の発現を恒常的にまたは差示的に調節し得る。プロモーターの典型的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターおよびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００２７】
（ｌ．スクリーニングマーカー）
本明細書で用いられる「スクリーニングマーカー」は、宿主細胞中で発現され、遺伝学的構築物を用いてトランスフェクトもしくは形質転換された細胞のスクリーニングまたは検出を容易にするという表現型を宿主細胞に与えるようなあらゆる遺伝子を意味し得る。スクリーニングマーカーの典型的な例としては、βガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）をコードしている遺伝子、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしている遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）をコードしている遺伝子、およびルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
【００２８】
（ｍ．選択可能マーカー）
本明細書で用いられる「選択可能マーカー」は、宿主細胞中で発現され、遺伝学的構築物を用いてトランスフェクトもしくは形質転換された細胞の同定または選択を容易にするという表現型を宿主細胞に与えるようなあらゆる遺伝子を意味し得る。スクリーニングマーカーは。選択可能マーカーの典型的な例としては、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）、細菌のカナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ゼオシン耐性遺伝子、抗生物質オーレオバシジンＡへの耐性を与えるＡＵＲＩ−Ｃ遺伝子、フォスフィノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性遺伝子、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が挙げられる。選択は、選択可能マーカーを含む宿主細胞を抗生物質などの選択剤と接触させることによって行なわれ得る。
【００２９】
（ｎ．実質的に相補的）
本明細書で用いられる「実質的に相補的」は、第一の配列が第二の配列の相補体の８から１００もしくはそれより多いヌクレオチド領域にわたって、少なくとも６０％から９９％同一であること、または二つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００３０】
（ｏ．実質的に同一）
本明細書で用いられる「実質的に同一」は、第一および第二の配列が２から１００もしくはそれより多いヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたって、少なくとも５０％から９９％同一であることを意味し得る。または、核酸に関しては、第一の配列が第二の配列の相補体を実質的に相補する場合を意味し得る。
【００３１】
（ｐ．対称な）
核酸についていうとき、本明細書で用いられる「対称な」または「実質的に対称な」は、配列の第一の半分がその配列の第二の半分と実質的に相補的である配列を含む核酸を意味し得る。対称な配列は、完全な対称であり得る。完全な対称は、配列の第一の半分が、その配列の第二の半分と完全に相補的であることを意味し得る。対称な配列は、対称の中心を有し得る。この中心は２つのヌクレオチドの間の位置を意味し得、ここで、この位置は、対称な配列の第一の半分と第二の半分との間に正確に存在する。
【００３２】
（ｑ．改変体）
ぺプチドまたはポリペプチドについていうとき、本明細書で用いられる「改変体」は、アミノ酸の挿入、欠失、もしくは保存的な置換によってアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも一つの生物学的活性を保っているようなぺプチドまたはポリペプチドを意味し得る。本発明の目的において、「生物学的活性」としては、特異的な抗体によって結合される能力が挙げられるがこれに限定されない。改変体は、参照されるタンパク質配列の一部であっても、参照されるタンパク質と実質的に同一であるタンパク質であってもよい。アミノ酸の保存的な置換、すなわち類似した性質（例えば、親水性、荷電している領域の程度および分布）の異なるアミノ酸によってアミノ酸を置換することは、重要ではない変化を一般的に含むことが当該分野において認識される。これらの重要でない変化は、当該分野で理解されるように、アミノ酸のハイドロパシー指数（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を検討することによって一部は同定され得る（Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２））。アミノ酸のハイドロパシー指数は、アミノ酸の疎水性および荷電についての検討に基づく。類似したハイドロパシー指数のアミノ酸は置換され得、かつ、タンパク質の機能をなお維持し得ることは当該分野において公知である。一つの局面において、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸の間で置換される。生物学的な機能を維持しているタンパク質を生じ得るような置換を明らかにするために、アミノ酸の親水性もまた用いられ得る。ペプチドとの関連においてアミノ酸の親水性について検討することは、そのぺプチドの最も高い局所平均親水性を計算することを可能にする。この値は、抗原性および免疫原性とよい相関があることが報告されている有益な尺度である（米国特許第４，５５４，１０１号、本明細において援用される）。当該分野で理解されているように、類似した親水性の値を有するアミノ酸での置換は、生物学的活性（例えば免疫原性）を維持しているぺプチドを生じ得る。一つの局面において、置換は互いの親水性の値が±２以内であるアミノ酸の間において行われる。アミノ酸の疎水性の指標および親水性の値はいずれも、そのアミノ酸の特有の側鎖によって影響される。この観察と一致して、生物学的機能において匹敵するようなアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、大きさおよび他の性質によって示されるアミノ酸の相対的な類似性、そして特にアミノ酸の側鎖に依存することが理解されている。
【００３３】
核酸についていうとき、本明細書で用いられる「改変体」は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の一部；（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列の相補体もしくはその一部；（ｉｉｉ）参照される核酸と実質的に同一である核酸もしくはその相補体；または（ｉｖ）ストリンジェント条件において参照される核酸とハイブリダイズする核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一である配列を意味し得る。
【００３４】
（ｒ．ベクター）
本明細書で用いられる「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であってもよい。べクターは、ＤＮＡべクターまたはＲＮＡべクターであってもよい。ベクターは、自己複製する染色体外のベクターまたは宿主ゲノム中に組込まれるべクターのいずれかであってもよい。ベクターは選択可能マーカーまたはスクリーニングマーカーを含んでもよい。
【００３５】
（２．核酸）
ＬａｃＩリプレッサータンパク質に対する上昇した親和性を有する変異ｌａｃオペレーターは、目的の遺伝子を発現させるために用いられ得る。挿入サイトに作動可能に連結された変異ｌａｃオペレーターを含む核酸が本明細書中で提供される。核酸はプラスミドなどのベクターであってもよい。核酸はまた、染色体であってもよい。
【００３６】
変異ｌａｃオペレーターは、ＬａｃＩリプレッサータンパク質に結合することが可能であり得る。変異ｌａｃオペレーターは、変異ｌａｃオペレーターに、野生型ｌａｃオペレーターと比較してＬａｃＩリプレッサータンパク質への親和性の上昇を引き起こす変異を含み得る。上記野生型ｌａｃオペレーターの配列は、配列番号１７を含んでもよい。上記野生型ｌａｃオペレーターの配列は配列番号１もまた含んでよい。ＬａｃＩリプレッサータンパク質に対する変異ｌａｃオペレーターの親和性は、ＬａｃＩリプレッサータンパク質に対する野生型ｌａｃオペレーターの親和性より少なくとも２から２０倍高くなり得る。上昇した親和性は、野生型ｌａｃオペレーターへと比較して、ＬａｃＩリプレッサータンパク質による変異ｌａｃオペレーターへのより強い抑制を生じ得る。
【００３７】
変異ｌａｃオペレーターは、野生型ｌａｃオペレーターの配列と比較して、対称性の程度が上昇した配列を有し得る。変異ｌａｃオペレーターは、実質的に対称な配列または完全に対称な配列を含み得る。対称な配列は、少なくとも１８から５０ヌクレオチドを含み得る。対称の中心は、ｌａｃオペレーターにおける転写開始位置から９から１７塩基対下流であり得る。変異ｌａｃオペレーターの配列はまた、配列５’−ＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ−３’（配列番号１８）も含んでよい。変異ｌａｃオペレーターの配列は、配列番号２から８の何れか一つもまた含んでよい。
【００３８】
挿入サイトは、目的の遺伝子の導入を可能にし得る。例えば、挿入サイトは制限酵素部位（例えば、マルチクローニングサイト）を含んでよい。あるいは、挿入サイトは組換えのためのサイトを含んでよい。
【００３９】
目的の遺伝子はｔｒｆＡまたはＴ７遺伝子であってもよい。目的の遺伝子は、生物学的活性を有するタンパク質をコードしてもよい。上記タンパク質は、抗体、酵素、ホルモンまたは構造タンパク質であってもよい。上記タンパク質は、インターフェロンα２ｂ、アルグルセラーゼ、イミグルセラーゼ、ヒトインスリン、インターフェロンβ１ａ、ソマトロピン、エポエチンアルファ、エリスロポエチン、凝固因子ＶＩＩＩ、セルモレリン、トラスツマブ、パリミズマブ、アルテプラーゼ、ヒト成長ホルモン、またはヒトアルブミンであってもまたよい。
【００４０】
（３．宿主細胞）
目的の遺伝子を発現させるために用いられ得る宿主細胞が、本明細書中で提供される。上記宿主細胞は原核生物であってもよい。上記原核生物は、細菌であってもよい。上記細菌はＥ．ｃｏｌｉであってもよい。
【００４１】
上記宿主細胞は、本明細書に記載される核酸を含んでもよい。上記核酸の挿入サイトは、宿主細胞のｌａｃＺ遺伝子を置換し得る。上記挿入はＬａｃＩリプレッサータンパク質の制御下に目的の遺伝子を導入することを可能にし得、同時に、宿主細胞によるラクトースの代謝を低下させるまたはおこらなくすることもまた可能にし得る。
【００４２】
上記宿主細胞はｌａｃＩ遺伝子もまた含んでよい。ベクター上または染色体中で宿主に核酸を導入する方法は当該分野で周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．）ら（２００６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）によって記載されている（この全容が本明細書において援用される）。
【００４３】
ｌａｃＩ遺伝子は、ＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードし得る。上記ｌａｃＩ遺伝子は、変異ｌａｃＩ対立遺伝子であってもよい。上記変異ｌａｃＩ対立遺伝子は、野生型ＬａｃＩリプレッサータンパク質と比較して、上昇した親和性でｌａｃオペレーターと結合できる変異ＬａｃＩリプレッサータンパク質をコードし得る。ｌａｃオペレーターに対する変異ＬａｃＩリプレッサータンパク質の親和性は、ｌａｃオペレーターに対する野生型ＬａｃＩリプレッサータンパク質の親和性より、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、または１０００倍高くなり得る。ＬａｃＩリプレッサータンパク質の配列は配列番号９または１６を含んでよい。ＬａｃＩリプレッサーはまた、配列番号１０からなる配列を有する認識へリックスも含んでよい。上記認識へリックスの配列はまた、配列番号１１から１６の何れか一つから構成されてもよい。
【００４４】
βガラクトシダーゼ活性の非存在下では、ラクトースは代謝されず、そしてそのためラクトースはＬａｃＩリプレッサータンパク質を誘導するために効果的に使用され得ない。上記宿主細胞は、不活性なｌａｃＺ遺伝子を含んでもよい。ｌａｃＺ遺伝子は、βガラクトシダーゼをコードしてもよい。不活性なｌａｃＺ遺伝子は、宿主細胞が、ラクトースをグルコースおよびガラクトースへ切断すること、およびラクトースをアロラクトースへ変換することを防ぎ得る。
【００４５】
（４．発現の方法）
目的の遺伝子を発現させる方法が本明細書中で提供される。目的の遺伝子を発現させる方法は、本明細書中で記載されるように宿主細胞を含んでもよい。目的の遺伝子は、宿主細胞をＬａｃＩリプレッサータンパク質アロステリックエフェクターと接触させることによって発現させられ得る。ＬａｃＩアロステリックエフェクターは、ＬａｃＩリプレッサータンパク質における立体構造の変化を引き起こし得る。この立体構造の変化は、ｌａｃオペレーターに対するＬａｃＩリプレッサータンパク質の親和性を低下させ得る。ＬａｃＩアロステリックエフェクターは、目的の遺伝子の発現を導き得る。ＬａｃＩアロステリックエフェクターは、ラクトースであってもよい。ＬａｃＩアロステリックエフェクターは、ラクトースアナログであってもよく、ラクトースアナログはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）であってもよい。
【００４６】
（５．クローニングの方法）
第一の核酸をクローニングするための方法もまた、本明細書中で提供される。上記方法は、第一の核酸と第二の核酸との間での相同的組換えを誘導するため、宿主細胞中でＲｅｃＡタンパク質を用いることを含み得る。
【００４７】
（ａ．第一の核酸）
第一の核酸は環状の核酸であってもよい。上記第一の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応の産物であってもよい（ポリメラーゼ連鎖反応後、分子内のＤＮＡライゲーションなどによって環状化される）。第一の核酸はまた、べクター上に位置してもよい。第一の核酸は、第一の核酸が宿主細胞中に存在しているか否かを示すことが可能であり得る選択可能マーカーを含んでもよい。選択可能マーカーは、カナマイシンなどへの抗生物質耐性をもたらすことができる遺伝子を含んでもよく、さらに、緑色蛍光タンパク質などの可視的なマーカーもまた含んでよい。
【００４８】
（ｂ．第二の核酸）
第二の核酸は宿主細胞中で複製される能力を有してもよい。上記第二の核酸は、プラスミドなどのベクターまたは宿主細胞の染色体であってもよい。上記第二の核酸は、選択可能マーカーを含んでもよい。上記第二の核酸はまた、上記第一の核酸と同一または実質的に同一であるような少なくとも一つの配列も含んでよい。
【００４９】
（ｃ．ＲｅｃＡ）
ＲｅｃＡタンパク質は、宿主細胞における相同的組換えを誘導することが可能であり得る。ＲｅｃＡは、配列番号２０に記載の配列、または相同的組換えを誘導することが可能であるようなその改変体を含んでもよい。ＲｅｃＡはｒｅｃＡ遺伝子によってコードされ得、この遺伝子はプラスミドのようなベクターまたは宿主細胞の染色体上に位置してもよい。ｒｅｃＡ遺伝子を含有しているベクターは、選択可能マーカーを含んでもよい。ｒｅｃＡ遺伝子は、構成的または調節可能なプロモーターから発現されてもよい。上記遺伝子はＥ．ｃｏｌｉなどの細菌株から単離されてもよく、そして、配列番号２１に記載の配列を含んでもよい。
【００５０】
（ｄ．相同的組換え）
第一および第二の核酸は、相同的組換えを促進するような条件下で第一および第二の核酸が接触することにより、再結合させられ得る。第一および第二の核酸は、形質転換などによって宿主細胞中に導入され得る。宿主細胞は第二の核酸をもともと含んでいてもよく、そして、宿主細胞は第一の核酸によって形質転換されてもよい。宿主細胞は、第一の核酸の選択可能マーカーの存在に対し、選択され得る。
【００５１】
宿主細胞は、ｒｅｃＡ遺伝子を含んでもよい。宿主細胞はまた、ｒｅｃＡ遺伝子を含む核酸を用いて形質転換されてもよい。ｒｅｃＡ遺伝子は、ｒｅｃＡタンパク質を発現するために導入されてもよい。
【００５２】
第一および第二の核酸は、宿主細胞中で接触し得る。そしてこの宿主細胞中で、ｒｅｃＡタンパク質は第一の核酸と第二の核酸との間での相同的組換えを誘導し得る。ｒｅｃＡの発現はその後、ｒｅｃＡ遺伝子発現の誘導因子を除去することなどによって停止させられ得る。ｒｅｃＡ遺伝子を包含しているプラスミドに対する選択剤の除去および宿主細胞がそのプラスミドを失うことを許容することもまた、ｒｅｃＡ発現を停止させ得る。第一の核酸と第二の核酸との間での相同的組換えの産物を含んでいる宿主細胞は、第一の核酸によって含まされる選択可能マーカーの存在に対する選択によって、選択され得る。
【００５３】
本発明は多様な局面を有し、それらは以下の限定的ではない実施例によって説明される。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
（ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼ構築物の作製）
この実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノム中への相同組換えにおいて使用するためのｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼ核酸の構築について記載する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、以下のように、ＰＣＲの第一ラウンドにおいてＤＮＡの４つの部分を増幅するために用いた。
【００５５】
ＰＣＲ１：Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＭＧ１６５５のｌａｃＩ遺伝子の３’部分を、プライマー対
【００５６】
【化１】
2011505147.tif 000003
ＰＣＲ３：カナマイシン耐性遺伝子を、プライマー対
【００５７】
【化２】
2011505147.tif 000004
を用いて菌株ＦＢ２１２８８（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能）から増幅した。
【００５８】
ＰＣＲ４：Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＹ遺伝子の５’部分を、プライマー対
【００５９】
【化３】
2011505147.tif 000005
を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５から増幅した。ＰＣＲの第一ラウンドからのプライマーおよび鋳型を図３に示す。
【００６０】
上記のＰＣＲ反応の産物の精製後、上記のＰＣＲ２およびＰＣＲ３の産物の組合せを増幅するために、ＰＣＲの第二ラウンドをプライマーｏ−ｍｃ−３および０３−Ｋｍ  Ｌａｃ  Ｌを用いて行った。ＰＣＲの第二ラウンドの産物の精製後、ＰＣＲの第一ラウンドからのＰＣＲ１およびＰＣＲ４の産物と共にＰＣＲの第二ラウンドの産物を増幅するために、ＰＣＲの第三ラウンドをネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー対
【００６１】
【化４】
2011505147.tif 000006
を用いて行った。ＰＣＲの第二および第三ラウンドからのプライマーならびに鋳型を図４に示す。
【００６２】
最終的なｌａｃ−Ｔ７ポリメラーゼ構築物の概略図およびこれを作製するために使用されるプライマーを図５に示す。ＰＣＲ１およびＰＣＲ２におけるプライマーｏ−ｍｃ−２およびｏ−ｍｃ−３は、変異ｌａｃオペレーター配列（５’−ＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡ；配列番号：３２）をＴ７ポリメラーゼの上流に導入した。この変異オペレーターは、ＬａｃＩに対する親和性を高めた。したがって、ｌａｃ「スーパーオペレーター」Ｔ７ポリメラーゼ構築物は、５’から３’に以下の成分：（♯１）Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＩの３’部分、（♯２）ｌａｃスーパーオペレーターを有するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、（♯３）Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＹの短い５’部分、（♯４）カナマイシン耐性遺伝子および（♯５）Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃＹの５’部分、を含んだ。最終的な４．９ｋｂのＰＣＲ産物を、ゲルから精製した。ゲル精製の概略およびゲルの写真を図６に示す。
【００６３】
（実施例２）
（Ｅ．ｃｏｌｉ染色体へのｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼ構築物の組換え）
この実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉへのｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼ構築物の組換えの結果について記載する。実施例１からのｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼ構築物をライゲーションによって環状にした。エレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）ＭＤＳ４２  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を環状化された構築物を用いて形質転換し、そして、環状化された構築物とＥ．ｃｏｌｉ染色体との間での組換え体を、ＬＢ＋Ｋｍプレート上で選択した。この戦略の概略を図６に示す。候補組換え体（Ｘ−Ｇａｌプレート上のカナマイシン耐性青色コロニー）を、配列
【００６４】
【化５】
2011505147.tif 000007
を有するプライマーを含むプライマーカプレット（ｃｏｕｐｌｅｔ）１ならびにｏ−ｓｅｑ−Ｔ７  ｐｏｌｙｍ  Ｒ１０および配列５’−ＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＡＣ（０３−ｌａｃ  ｃｈｅｃｋ  Ｒ３、配列番号：３５）を有するプライマーを含むプライマーカプレット２を用いるＰＣＲによってさらに選別した。ＰＣＲスクリーニングの概略および結果を図７に示す。
【００６５】
次に、ｏ−ｓｅｑ−Ｔ７  ｐｏｌｙｍ  Ｒ１０および０３−ｌａｃ  ｃｈｅｃｋ  Ｒ３プライマーを用いて約６．１ｋｂのＰＣＲ断片を産出していたコロニーを、ＬＢにＫｍを加えた液体培地中で一晩培養した。希釈物を、白色コロニーを選別するためにＬＢ＋Ｋｍ＋Ｘ−ＧａｌおよびＩＰＴＧのプレートにまいた。白色コロニーはｌａｃＩの３’部分（実施例１における♯１）とｌａｃＩのＥ．ｃｏｌｉ染色体のコピーとの間での分子内の組換えイベント（ＲｅｃＡが媒介）を経ている（このことは内因性ｌａｃＺが存在していたＥ．ｃｏｌｉ染色体領域の「崩壊」を生じる）と予測した。ｌａｃＺが崩壊しているクローンのコロニーをプライマーｏ−ｓｅｑ−Ｔ７  ｐｏｌｙｍ  Ｒ１０および０３−ｌａｃ  ｃｈｅｃｋ  Ｒ３を用いるＰＣＲによって選別した。１．７５２ｋｂのＰＣＲ産物を生じた増幅反応は、ｌａｃＺ崩壊を確証した。スクリーニングの概略および結果を図８に示す。
【００６６】
（実施例３）
（ｌａｃＺ復帰構築物の構築）
この実施例は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼｌａｃＺ復帰構築物の作製について記載する。以下のように、３種のＤＮＡ断片を増幅するためにＰＣＲを用いた。ＰＣＲａ：Ｔ７遺伝子１の３’末端の短い部分を、プライマー
【００６７】
【化６】
2011505147.tif 000008
を用いてバクテリオファージＴ７ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲｂ：ｌａｃＺ遺伝子をプライマー
【００６８】
【化７】
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を用いてＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＤＳ４２ｒｅｃＡゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲｃ：ｌａｃＹ遺伝子の５’末端の短い部分を、プライマー
【００６９】
【化８】
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および実施例１からのプライマー０３−ｌａｃ  Ｙ−ＡＶＲ  ＩＩを用いてＥ．ｃｏｌｉ菌株ＭＤＳ４２ｒｅｃＡゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。３種のＰＣＲ産物を単離した後、それらを結合させ、そして、プライマーｏ−ｌａｃＺ−１−Ｐａｃ−１および０３−ｌａｃＹ−Ａｖｒ  ＩＩ  ｉｎを用いて増幅した。使用されるプライマーおよび鋳型を図９に示す。ｌａｃＺ復帰構築物の概略およびこれを構築するために用いられるプライマーを図１０に示す。ｌａｃＺ復帰構築物は、以下のように、５’から３’の順に：（１）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの３’部分、（２）ｌａｃＺ、および（３）ｌａｃＹの５’部分を含んだ。
【００７０】
（実施例４）
（ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼＥ．ｃｏｌｉ菌株へのｌａｃＺの導入）
この実施例は、ラクトースを異化する能力をもつｌａｃスーパーオペレーターＴ７Ｅ．ｃｏｌｉ菌株の作製について記載する。実施例３の４．１ｋｂのｌａｃＺ復帰産物をゲルから精製し、そしてｌａｃＺ復帰産物およびＤＮＡトポイソメラーゼＩを有するＴｏｐｏ  ＴＡベクターを一晩インキュベート（ｉｎｃｕｂａｔｅ）することによってＴｏｐｏ  ＴＡベクター中にクローン化した。Ｔｏｐｏ＋ｌａｃＺ復帰プラスミドクローンを調製し、そしてＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、およびＳａｐＩを用いて切断した。クローン化の戦略およびゲルの写真を図１１に示す。次に、ｌａｃＺ復帰断片をライゲーションによって環状にした。ライゲーション産物を実施例２からの、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７／ｌａｃＺ崩壊エレクトロコンピテント細胞中に形質転換した。クローンをＭＭＭ＋０．２％ラクトース＋Ｘ−Ｇａｌ上で選択した。青色コロニーをつつき取り、そしてプライマー
【００７１】
【化９】
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を用いるＰＣＲによってｌａｃＺ復帰組換えの成功について確認した。ＰＣＲスクリーニング戦略および結果を図１２に示す。約２．７ｋｂのＰＣＲ断片を生じるクローンをＬＢ＋ＫｍおよびＬＢ＋Ｘ−Ｇａｌ上にパッチ（ｐａｔｃｈ）した。ＬＢ＋Ｋｍ上で増殖しなかったコロニーを選択し、そしてプライマー対
【００７２】
【化１０】
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を用いるＰＣＲによって確認した。プライマー対ＬａｃＺ１を用いて約２．４ｋｂの断片を生じ、かつ、プライマー対ＬａｃＺ２を用いて約５．３ｋｂの断片を生じたコロニーは、ｌａｃスーパーオペレーターＴ７ポリメラーゼおよびｌａｃＺを含むこと、ならびに、カナマイシン耐性を有しないことが確認された。これらのコロニーを配列決定のために選択した。プライマーおよびＰＣＲの結果を図１３に示す。最終的なｌａｃスーパーオペレーターＴ７株の概略およびこれを構築するために使用するプライマーを図１４に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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