(57)【要約】  自己分解タンパク質インテインを使用する組換えタンパク質の精製のための方法であって；宿主細胞において標的タンパク質ドメイン、自己分解インテインおよび１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメインを含む融合タンパク質を組換え的に発現させ（該自己分解インテインは該標的タンパク質ドメインおよび該１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメイン間に位置する）；宿主細胞から該融合タンパク質を放出させ、次に疎水性顆粒をそれに加え、それらをインキュベートし；インキュベートした疎水性顆粒を回収し、融合タンパク質の自己分解インテインが自己分解できるように溶解バッファーを加え；疎水性顆粒を分離および除去し、実質的に精製されている標的タンパク質溶液を得る工程を含む方法を提供する。該方法に有用なキットも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え標的タンパク質を精製するための方法であって：
（１）宿主細胞において融合タンパク質を組換え的に発現させ、ここで該融合タンパク質は標的タンパク質ドメイン、自己分解インテインおよび１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメインを含み、そして該自己分解インテインは該標的タンパク質ドメインおよび該１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメイン間に位置する；
（２）該宿主細胞から該融合タンパク質を放出させ、該融合タンパク質を含有する溶液を得；
（３）疎水性顆粒を該溶液に加え、該融合タンパク質と該疎水性顆粒との結合が可能である条件下で溶液をインキュベートし；
（４）インキュベートした疎水性顆粒を該溶液から回収し；
（５）溶菌液を該疎水性顆粒に加え、該融合タンパク質における自己分解インテインが分解することが可能である条件下で該疎水性顆粒を処理し；そして
（６）該疎水性顆粒を除去し、実質的に精製されている該標的タンパク質を含有する溶液を得る
工程を含む方法。
【請求項２】
工程（４）後に該疎水性顆粒を洗浄する任意の工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該宿主細胞が原核生物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該原核生物が大腸菌、ラルストニア・ユートロファ、シュードモナス属およびバチルス属からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該宿主細胞が真核生物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該真核生物がサッカロマイセス・セレヴィシエおよびピキア・パストリスからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該自己分解インテインがＳｓｐ  ＤｎａＢ  ミニインテイン、Ｍｘｅ  ＧｙｒＡ  インテイン、Ｍｔｈ  ＲＩＲ１  インテインおよびＳｃｅ  ＶＭＡ１  インテインからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
該疎水性顆粒結合ドメインがＰｈａｓｉｎ、ＰｈａＺ、ＰｈａＲ、ＰｈａＣ、リパーゼ、ＺＳＢＤおよびＲＳＢＤからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該疎水性顆粒結合ドメインの数が１つ、２つまたは３つである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該複数の疎水性顆粒結合ドメインが正確に同じではない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメインがＰｈａｓｉｎ−Ｐｈａｓｉｎ、Ｐｈａｓｉｎ−Ｐｈａｓｉｎ−Ｐｈａｓｉｎ、ＺＳＢＤ−ＺＳＢＤ−ＺＳＢＤ、ＲＳＢＤ−ＲＳＢＤ−ＲＳＢＤ、ＰｈａＣ−ＰｈａＣ−ＰｈａＣ、Ｐｈａｓｉｎ−ＺＳＢＤ、ＺＳＢＤ−ＲＳＢＤおよびＰｈａｓｉｎ−ＺＳＢＤ−ＲＳＢＤからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該複数の疎水性顆粒結合ドメインがリンカーを介して結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該自己分解インテインがリンカーを介して該１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメインに結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該自己分解インテインが該標的タンパク質ドメインに直接結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該標的タンパク質ドメイン、該自己分解インテインおよび該少なくとも１つの疎水性顆粒結合ドメインが同じリーディング・フレーム内である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該組換え発現が、該融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを該宿主細胞に導入し、次に、該宿主細胞を培養することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該疎水性顆粒がポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリプロピレン、ポリメチル・メタクリレートおよびポリ塩化ビニルからなる群から選択される疎水性ポリマー物質から形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該疎水性顆粒が、ポリヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ酪酸およびヒドロキシ吉草酸のコポリマー、ヒドロキシ酪酸およびヒドロキシヘキサン酸のコポリマー、ポリヒドロキシカプリル酸、ポリヒドロキシエナント酸、ポリヒドロキシデカン酸、ヒドロキシ酪酸およびヒドロキシカプリル酸のコポリマー、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ吉草酸およびヒドロキシヘキサン酸のコポリマーからなる群から選択される疎水性ＰＨＡ物質から形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
該疎水性顆粒の回収および／または単離を遠心分離および／または濾過により行う、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
磁性顆粒が該疎水性顆粒内に包まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
該疎水性顆粒が超常磁性粉からなるコアを含み、コアが疎水性物質により覆われている、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
該超常磁性粉がＦｅ３Ｏ４磁性粉である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
磁石が該疎水性顆粒を回収および／または単離するために使用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
組換え標的タンパク質を精製するためのキットであって：
宿主細胞において融合タンパク質を組換え的に発現させるための発現ベクター、ここで該融合タンパク質は標的タンパク質ドメイン、自己分解インテインおよび１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメインを含み、そして自己分解インテインは該標的タンパク質ドメインおよび該１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメイン間に位置する；および
疎水性顆粒を含むキット。
【請求項２５】
該疎水性顆粒がポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリプロピレン、ポリメチル・メタクリレートおよびポリ塩化ビニルからなる群から選択される疎水性ポリマー物質から形成される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
該疎水性顆粒がポリヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ酪酸およびヒドロキシ吉草酸のコポリマー、ヒドロキシ酪酸およびヒドロキシヘキサン酸のコポリマー、ポリヒドロキシカプリル酸、ポリヒドロキシエナント酸、ポリヒドロキシデカン酸、ヒドロキシ酪酸およびヒドロキシカプリル酸のコポリマー、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ吉草酸およびヒドロキシヘキサン酸のコポリマーからなる群から選択される疎水性ＰＨＡ物質から形成される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２７】
磁性顆粒が該疎水性顆粒内に包まれている、請求項２４に記載のキット。
【請求項２８】
該疎水性顆粒が超常磁性粉からなるコアを含み、コアが疎水性物質により覆われている、請求項２４に記載のキット。
【請求項２９】
該超常磁性粉がＦｅ３Ｏ４磁性粉である、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
磁石をさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、組換えタンパク質の精製、特に、自己分解タンパク質インテインを使用することによる標的組換えタンパク質の精製のための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
現在、タンパク質発現技術は十分に開発されている。多数のオリゴペプチドおよびポリペプチドを生産することができる。しかしながら、これらの産物、例えば、生物学的分野における種々の酵素および臨床用途のための種々のタンパク質医薬は、通常、さらなる適用のためにさらなる精製をしなければならない。伝統的なタンパク質精製方法において、クロマトグラフィーによるいくつかの分離工程が必要であり、そして、異なる最適化プロトコールが異なるタンパク質に対して必要である。加えて、それぞれの工程は、時間がかかり、面倒であり、比較的高価である。さらに、分離および精製の複数の工程は標的タンパク質の収率を大きく減少させる。得られるタンパク質の活性にも、ある程度影響する。
【０００３】
今日までに市販されているアフィニティー精製システムは精製工程が非常に簡略化されたが、しかしながら、付加的なアフィニティータグセグメント、例えば、６  Ｈｉｓ−タグを標的タンパク質に加えなければならない。あるタグ−リムーバブル精製システムにおいて、アフィニティー吸着セグメントを標的タンパク質から開裂するために、高価なプロテアーゼが必要である。しかしながら、このような状況において、得られた標的タンパク質は使用されるプロテアーゼにより汚染され、これらの分離は他の分離工程を必要とする。加えて、プロテアーゼは標的タンパク質内に非特異的開裂をもたらし、標的タンパク質を不活性化させ得る（Guan C. et al., Gene 67 (1987) 21-30; Martinez et al., Biochem. J. 306 (1995) 589-597）。
【０００４】
インテインとして知られている自己分解タンパク質は、ＮＥＢにより生産されたＩＭＰＡＣＴ−ＴＷＩＮシステムおよびＩＭＰＡＣＴ−ＣＮシステムに包含されている（New England Biolabs, 240 County Road, Ipswich, MA 01938-2723, United States）。インテインは、２５℃、ｐＨ６．０−７．０または４℃、ｐＨ８．０−８．５にて、４０ｍＭのメルカプトエタノールの存在下でそれ自体および標的タンパク質間の分解を誘導し、したがって精製されたタンパク質を得ることができる（Evans T. C. et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 18359-18363; Evans T. C. et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 3923-3926; Mathys S. et al., Gene 231 (1999) 1-13; Southworth M. W. et al., Biotechniques 27 (1999) 110-121.）。このようなシステムは伝統的なタンパク質精製方法における多数の欠点を克服するが、しかしながら、比較的低い効率および高価なキチンクロマトグラフィーカラムの使用のため、未だ大規模生産に適当ではない。
【０００５】
ポリヒドロキシアルカン酸（以下、略語ＰＨＡ）は、炭素源およびエネルギー源の貯蔵のための不均衡の培養条件下（例えば、窒素、酸素、リン、マグネシウムなどの不足下）で多数の微生物により合成されるポリマーである（Doi et al., Microbial. 69 (2002) 2498-2504; Anderson et al., Microb. Rev., 54 (1990) 450-472; Lee et al., Biotech. Bioeng., 49 (1996) 1-14）。それは、不溶性の脂肪顆粒の形態にて、種々のＰＨＡを生産する細菌の細胞に存在する。ＰＨＡ顆粒はＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＣ）、ＰＨＡデポリメラーゼ（ＰｈａＺ）、顆粒関連タンパク質（ＰｈａＰ／ｐｈａｓｉｎ）、リプレッサータンパク質（または自己調節因子、略語ＰｈａＲ）、リン脂質単分子層などからなる単分子層膜により覆われていることが報告された（Steinbuechel et al., Can. J. Microbiol. 41 (1995) 94-105; York et al., J. Bacteriol. 183 (1002) 2394-2397; Yamada et al., J. Bacteriol. 189 (2007) 1118−1127）。
【０００６】
ＰＨＡ顆粒は、タンパク質発現のための多数の典型的な株、例えば、大腸菌（Fidler et al., FEMS Microbiol. Rev. 9 (1992) 231-235）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Leaf et al., Microbiology 142 (1996) 1169-1180）、ピキア・パストリス（Poirier et al., FEMS Microbiol. Lett. 207 (2002) 97-102）などにおいて成功裏に生産された。ＰＨＡ−合成に関する遺伝子を含むプラスミドでこれらの株を形質転換すると、ＰＨＡ顆粒が通常ではない程度で合成される。
【０００７】
Ｂａｎｋｉ  ｅｔ  ａｌ．は、タンパク質精製のための新たな恩恵を提供し、タンパク質精製システムの低コストの生産に大きく寄与する、ＰＨＡ顆粒に基づくタンパク質精製システムを発明している。このシステムにおいて、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）−合成遺伝子を含むプラスミドおよびＰＰＰＩ：Ｍ（Ｐｈａｓｉｎ−Ｐｈａｓｉｎ−Ｐｈａｓｉｎ−インテイン−ＭＢＤ）（マルトース結合タンパク質のマルトース結合ドメイン、略語ＭＢＤ）を含むプラスミドの両方で、大腸菌を同時に形質転換させる。発現される融合タンパク質  ＰＰＰＩ：Ｍは、ＰＨＡ顆粒に吸着するＰｈａｓｉｎの能力によって、細胞におけるＰＨＡ顆粒に結合する。超音波破壊後、純粋なＰＨＡ顆粒をスクロース勾配遠心分離により得る。自己分解タンパク質インテインおよびＭＢＤは、ｐＨ６．０および１８−２３℃にて分解および分離を引き起こす。さらなる遠心分離後、標的タンパク質は上清から高純度にて達成される（Banki et al., Protein Sci. 14 (2005) 1387-1395; Banki et al.、ＵＳ公開第ＵＳ２００６／０１４１５７０Ａ１号（これらを出典明示により全体を本明細書に包含させる））。この方法の主な利点は、高価なアフィニティーカラムおよびプロテアーゼを使用することなく大規模にて精製されたタンパク質の生産を可能にし、精製のための費用を大きく減少させることである。しかしながら、このような方法の適用は、以下の理由のためある程度限定される：ＰＨＡおよび融合タンパク質は同じ宿主細胞にて発現すべきである；融合タンパク質およびＰＨＡ顆粒の結合を、複雑な操作を必要とする原核生物の細菌細胞内で起こす；および、ＰＨＡを生産することができる株が限定される。加えて、純粋なＰＨＡ顆粒は、処理が難しく、そして精製費用が増加するスクロース勾配遠心分離により得られる。さらに、臨床用途のためのタンパク質医薬は、活性化されるための翻訳後修飾を受ける必要があり、ほとんど真核生物細胞由来である。しかしながら、ＰＨＡを生産することができる真核細菌、例えば、酵母菌は、有効なタンパク質単離を可能にするために十分でない非常に低い収率にてＰＨＡを生産する。これらの因子は、特に医薬の開発においてこのようなシステムの適用を限定する。
【０００８】
ＰＨＡデポリメラーゼ（ＰｈａＺ）は２つの機能性ドメイン、基質結合ドメイン（略語ＳＢＤ）および触媒ドメインを含む。試験によって、これらの２つのドメインがリンカー領域により分離され、独立して機能することが示されている（Hisano et al., J. Mol. Biol. 356 (2006) 993-1004）。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．は、ＰｈａＺのＳＢＤを緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰと融合させて発現させ、ＰＨＢミクロスフェア顆粒上に固定させた（Lee et al., Anal. Chem. 77 (2005) 5755-5759）。ＰｈａＺのＳＢＤが良い吸着タグであり得ることが示唆される。
【０００９】
ＰＨＡ合成のリプレッサータンパク質であるＰｈａＲは、ＰＨＡ顆粒の形成前のｐｈａＰ遺伝子およびｐｈａＲ遺伝子のプロモーター領域に結合し、したがって両方の遺伝子の発現を抑制することができる。ＰＨＡ顆粒の段階的な形成と共に、リプレッサータンパク質ＰｈａＲはプロモーターから分離され、次にＰＨＡ顆粒に結合する（Maehara et al., J. Bacteriol. 184 (2002) 3992-4002）。ｐｈａＲ遺伝子変異における試験は、リプレッサータンパク質ＰｈａＲが、また、２つの独立の機能性ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよび基質結合ドメインを含むことを示す（Yamada et al., J. Bacteriol. 189 (2007) 1118-1127）。ＰＨＢ表面に加えて、ＰｈａＲは、ポリエチレン、ポリスチレンおよびポリ乳酸の表面上に吸着することができ（Yamashita et al., Biomacromolecules, 7 (2006) 2449-2454）、これはＰｈａＲおよびＰＨＢ間の結合は非特異的であり、恐らく疎水性相互作用によるのみであることが証明される。
【００１０】
したがって、未だ、簡単に操作され、コスト的に有効であり、大規模生産のために適当である、組換えタンパク質を精製するための方法を開発することが望まれている。
【発明の概要】
【００１１】
発明の概要
本発明の目的は、迅速に、効率的に、安価に操作することができ、大規模生産のために適当であり、それによって、例えば、あまりにも多数の工程であり、複雑な操作であり、高い費用がかかり、小規模生産のためのみに適当である現在使用されているタンパク質精製システムの不利益を克服し、高価な物質、例えば、アフィニティーカラムおよびプロテアーゼを使用することを避けることができるタンパク質精製システムを開発することである。
【００１２】
したがって、１の局面において、本発明は、組換え標的タンパク質を精製するための方法であって：
（１）宿主細胞において融合タンパク質を組換え的に発現させ（該融合タンパク質は標的タンパク質ドメイン、自己分解インテインおよび１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメインを含み、そして該自己分解インテインは該標的タンパク質ドメインおよび該１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメイン間に位置する）；
（２）該宿主細胞から該融合タンパク質を放出させ、該融合タンパク質を含有する溶液を得；
（３）疎水性顆粒を該溶液に加え、該融合タンパク質と該疎水性顆粒との結合が可能である条件下で溶液をインキュベートし；
（４）インキュベートした疎水性顆粒を該溶液から回収し；
（５）溶菌液を該疎水性顆粒に加え、該融合タンパク質における自己分解インテインが分解することが可能である条件下で該疎水性顆粒を処理し；そして
（６）該疎水性顆粒を除去し、実質的に精製されている該標的タンパク質を含有する溶液を得る
工程を含む方法を提供する。
【００１３】
該方法は、工程（４）後に該疎水性顆粒を洗浄する任意の工程をさらに含み得る。
【００１４】
他の局面において、本発明は、組換え標的タンパク質を精製するためのキットであって：宿主細胞において融合タンパク質を組換え的に発現させるための発現ベクター（該融合タンパク質は標的タンパク質ドメイン、自己分解インテインおよび１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメインを含み、そして自己分解インテインは該標的タンパク質ドメインおよび該１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメイン間に位置する）；および疎水性顆粒を含むキットを提供する。
【００１５】
本発明の方法は、Ｂａｎｋｉ  ｅｔ  ａｌ．のＰＨＡ顆粒−ベースのタンパク質精製システムの不利益を克服することができる。本発明の方法において、ＰＨＡの生産および融合タンパク質の発現は独立して行われる。原核生物タンパク質は原核生物細胞において発現させることができるが、真核生物タンパク質は真核細胞において発現させることができる；次に融合タンパク質はインビトロにおいて疎水性顆粒に結合することができ、これは精製方法の適用の範囲を拡張する。本発明において、疎水性顆粒は、安価で容易に利用できる一般的に使用される疎水性物質、例えば、ポリスチレン、ポリエチレンおよびポリ乳酸などから作られ、したがって精製方法の適用の範囲を拡張する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、吸着タグとして親油性タンパク質を使用することによる組換えタンパク質精製技術の方法を説明する
【００１７】
【図２】図２は、大腸菌において原核生物的に発現される融合タンパク質のプラスミドマップを説明する。該マップにおいて、“Ｔ７プロモーター”はＴ７プロモーターを示し；“Ｔ７ターミネーター”はＴ７ターミネーターを示し；“ＳＤ配列”はリボソーム結合部位（ＳＤ配列）を示し；“ｌａｃオペレーター”はラクトースオペレーターのオペレーター遺伝子を示し；“ｌａｑＩ”はリプレッサーを発現する遺伝子を示し、そして“Ｓｓｐ  ＤｎａＢ  インテイン”はシネコシスティス種ＰＣＣ６８０３由来のインテインを示す。
【００１８】
【図３】図３は、ピキア・パストリスにより真核生物的に発現される融合タンパク質のプラスミドマップを説明する。“起点”の用語は複製の起点を示し；“α−ファクター”はα−ファクターを示し；“ＯＲＭ１”はヒトα１−酸糖タンパク質を示し；そして“Ｍｔｈ  ＲＩＲ１  インテイン”はメタノサーモバクター・サームオートトロフィカス由来のインテインを示す。
【００１９】
【図４】図４は、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシヘキサン酸）（ＰＨＢＨＨｘ）疎水性顆粒に関するＳＥＭ図を表す。
【００２０】
【図５】図５は、疎水性顆粒結合ドメインが２つの異なる顆粒関連タンパク質ＰｈａｓｉｎからなるｐＰ’ＰＩ−ＥＧＦＰのプラスミドマップを説明する。
【００２１】
【図６】図６は、プラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰを使用することにより精製された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンを表す。Ｍ：タンパク質分子量標準；１：非誘導全細胞；２；誘導全細胞；３：細胞分解後に得られる上清；４：顆粒への結合後に得られる上清；５：結合したタンパク質を有する顆粒；６：第１の溶離剤；７；第２の溶離剤；８：インテイン分解後に得られる顆粒；９：標的タンパク質、ＥＧＦＰ。
【００２２】
【図７】図７は、ｐＰＩ−ｌａｃＺのプラスミドマップを説明する。
【００２３】
【図８】図８は、プラスミドｐＰＩ−ｌａｃＺを使用することにより精製されたβ−ガラクトシダーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンを表す。Ｍ：タンパク質分子量標準；１：非誘導全細胞；２；誘導全細胞；３：細胞分解後に得られる上清；４：顆粒への結合後に得られる上清；５：結合したタンパク質を有する顆粒；６：第１の溶離剤；７；第２の溶離剤；８：インテイン分解後に得られる顆粒；９：標的タンパク質、β−ガラクトシダーゼ。
【００２４】
【図９】図９は、ｐＰＩ−ｐｈａＣのプラスミドマップを説明する。
【００２５】
【図１０】図１０は、プラスミドｐＰＩ−ｐｈａＣを使用することにより精製されたＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＣ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンを表す。Ｍ：タンパク質分子量標準；１：非誘導全細胞；２；誘導全細胞；３：細胞分解後に得られる上清；４：顆粒への結合後に得られる上清；５：結合したタンパク質を有する顆粒；６：第１の溶離剤；７；第２の溶離剤；８：インテイン分解後に得られる顆粒；９：標的タンパク質、ＰｈａＣ。
【００２６】
【図１１】図１１は、ｐＲＩ−ＥＧＦＰのプラスミドマップを説明する。
【００２７】
【図１２】図１２は、プラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰを使用することにより精製された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンを表す。Ｍ：タンパク質分子量標準；１：非誘導全細胞；２；誘導全細胞；３：結合後に得られる上清；４：第１の溶離剤；５：第１の洗浄後に得られる顆粒；６：第２の溶離剤；７：第２の洗浄後に得られる顆粒；８：標的タンパク質、ＥＧＦＰ；９：分解後に得られる顆粒。
【００２８】
【図１３】図１３は、ｐＳＢＤＩ−ＥＧＦＰのプラスミドマップを説明する。
【００２９】
【図１４】図１４は、ｐＰＩ−ｔａｑのプラスミドマップを説明する。
【００３０】
【図１５】図１５は、ｐＰＩ−ｍａｌＥのプラスミドマップを説明する。
【００３１】
【図１６】図１６は、プラスミドｐＰＩ−ｍａｌＥを使用することにより精製されたマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンを表す。Ｍ：タンパク質分子量標準；１：非誘導全細胞；２；誘導全細胞；３：細胞分解後に得られる上清；４：顆粒への結合後に得られる上清；５：結合したタンパク質を有する顆粒；６：溶離剤；７：インテイン分解後に得られる顆粒；８：標的タンパク質、ＭＢＰ。
【００３２】
【図１７】図１７は、ｐＰＩ−ＧＳＴのプラスミドマップを説明する。
【００３３】
【図１８】図１８は、ｐＰＩ−ｌｕｃのプラスミドマップを説明する。
【００３４】
【図１９】図１９は、ＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＣ）を吸着タグとして使用したｐＣＩ−ＥＧＦＰのプラスミドマップを説明する。
【００３５】
【図２０】図２０は、疎水性顆粒結合ドメインが３つの顆粒関連タンパク質ＰｈａｓｉｎからなるｐＰＰＰＩ−ＥＧＦＰのプラスミドマップを説明する。
【００３６】
【図２１】図２１は、疎水性顆粒結合ドメインが２つの異なる親油性タンパク質、ＰｈａＺのＳＢＤおよびＰｈａｓｉｎからなるｐＰＳＩ−ＥＧＦＰのプラスミドマップを説明する。
【００３７】
【図２２−２７】図２２−２７は配列番号：１−１０の核酸配列を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
１の局面において、本発明は、組換え標的タンパク質を精製するための方法であって：
（１）宿主細胞において融合タンパク質を組換え的に発現させ（該融合タンパク質は標的タンパク質ドメイン、自己分解インテインおよび１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメインを含み、そして該自己分解インテインは該標的タンパク質ドメインおよび該１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメイン間に位置する）；
（２）該宿主細胞から該融合タンパク質を放出させ、該融合タンパク質を含有する溶液を得；
（３）疎水性顆粒を該溶液に加え、該融合タンパク質と該疎水性顆粒との結合が可能である条件下で溶液をインキュベートし；
（４）インキュベートした疎水性顆粒を該溶液から回収し；
（５）溶菌液を該疎水性顆粒に加え、該融合タンパク質における自己分解インテインが分解することが可能である条件下で該疎水性顆粒を処理し；そして
（６）該疎水性顆粒を除去し、実質的に精製されている該標的タンパク質を含有する溶液を得る
工程を含む方法を提供する。
【００３９】
該方法は、工程（４）後に該疎水性顆粒を洗浄する任意の工程をさらに含み得る。
【００４０】
組換え融合タンパク質の発現は、該融合タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを該宿主細胞に導入し、次に、該宿主細胞を培養することにより作ることができる。融合タンパク質の発現後、宿主細胞は超音波破壊および／またはリゾチーム処理に付され、該宿主細胞から融合タンパク質を放出し得る。
【００４１】
宿主細胞は原核生物または真核生物由来であり得る。本発明のために適当な典型的な原核生物は、大腸菌、ラルストニア・ユートロファ、シュードモナス属、バチルス属などを含むが、これらに限定されない。典型的な真核生物は、サッカロマイセス・セレヴィシエ、ピキア・パストリスなどを含むが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書において使用される“標的タンパク質”なる用語は、本発明のタンパク質精製方法により得られるタンパク質を示す。特に本発明のために適当な標的タンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ヒトα１−酸糖タンパク質、ｔａｑＤＮＡポリメラーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどを含む。本発明の方法は、治療タンパク質、例えば、ヒト酸性繊維芽細胞増殖因子ａＦＧＦ、インスリン、インターロイキンなどを精製するために特に適当である。
【００４３】
本明細書において使用される“自己分解インテイン”、“インテイン”および“自己分解タンパク質インテイン”なる用語は互換的に使用することができる。それらは翻訳後修飾のために使用されるタンパク質スプライシングエレメントを示す。タンパク質精製において、このようなエレメントは、しばしば、標的タンパク質ドメインおよびアフィニティータグタンパク質ドメイン間に置かれる。それは標的タンパク質およびアフィニティータグタンパク質と融合させ、発現させることができる。次に温度、ｐＨ、塩濃度および／またはメルカプト基の濃度を、インテインの自己分解を誘導して標的タンパク質を放出するように調節するが、インテインおよびアフィニティータグタンパク質の融合フラグメントは固相培地上に吸着して維持され、したがって標的タンパク質の精製を成し遂げることができる。通常、一般的に使用されるインテインは、Ｎ−末端またはＣ−末端各々を自己分解することができる。本発明のために適当な自己分解インテインは、Ｓｓｐ  ＤｎａＢ  ミニインテイン、Ｍｘｅ  ＧｙｒＡ  インテイン、Ｍｔｈ  ＲＩＲ１  インテイン、Ｓｃｅ  ＶＭＡ１  インテインなどを含むが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明において使用される自己分解インテインは、標的タンパク質のＮ−末端開裂可能なインテイン、例えば、Ｓｓｐ  ＤｎａＢ  ミニインテイン（Wu et al., Biochim. Biophys. Acta. 1387 (1998) 422-432）；または標的タンパク質のＣ−末端開裂可能なインテイン、例えば、Ｍｘｅ  ＧｙｒＡ  インテイン（Telenti et al., J. Bacteriol. 179 (1997) 6378-6382）、Ｍｔｈ  ＲＩＲ１  インテイン（Smith et al., J. Bioteriol. 179 (1997) 7135-7155）などであり得る。Ｃ−末端開裂可能なインテインは温度およびｐＨ値に感受性である。温度が２５℃に上昇するか、またはｐＨが８．５から６．０に減少したとき、インテインは有効に分解し得る。ｐＨ値の変化が小さいため、ｐＨ変化により引き起こされるタンパク質変性の発生も、ある程度避けられ得る（Chong S. et al., Gene 192 (1997)）。メルカプト化合物は分解のために誘導物質を必要とし、したがって有効にコントロールすることができるため、Ｎ−末端開裂可能なインテインがより好ましい。９５％の分解比率(disruption ratio)を達成することができる（Chong S. et al., Nucleic Acids Research, 22 (1998) 5109-5115）。
【００４５】
本発明のために特に適当なインテインは、ｐＨ６．０−７．０および／または１８−２５℃にて自己分解することができるＮ−末端開裂可能なＳｓｐ  ＤｎａＢ  ミニインテイン；４０ｍＭのメルカプト基の存在下でｐＨ８．５にて自己分解することができるＣ−末端開裂可能なＭｔｈ  ＲＩＲ１  インテインおよびＭｘｅ  ＧｙｒＡ  インテインを含む。他のインテインに関する詳細はＮＥＢのインテインデータベースにおいて見出すことができる（http://www.neb.com/neb/inteins.html、２００８年５月９日にアクセスされた）。
【００４６】
インテインの自己分解を誘導するために加えられる溶菌液は、水、緩衝液またはメルカプト化合物を含有する水溶液であり得る。当業者は使用されるインテインに基づいて溶菌液を合理的に選択し得る。例えば、Ｓｓｐ  ＤｎａＢ  ミニインテインに対して、好ましい溶菌液は２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、５００ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０−７．０である。Ｍｔｈ  ＲＩＲ１  インテインに対して、好ましい溶菌液は２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび４０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０−８．５である。
【００４７】
本明細書において使用される“疎水性顆粒結合ドメイン”なる用語は、疎水性顆粒にしっかりと結合することができる融合タンパク質の部分を示す。本発明における“疎水性顆粒結合ドメイン”は、無傷の疎水性顆粒結合タンパク質、例えば、顆粒関連タンパク質（Ｐｈａｓｉｎ／ＰｈａＰ）、ＰＨＡシンターゼ（ＰｈａＣ）、ＰＨＡデポリメラーゼ（ＰｈａＺ）、リプレッサータンパク質（ＰｈａＲ）およびリパーゼ；または疎水性顆粒結合タンパク質の基質結合ドメイン、例えば、ＰＨＡデポリメラーゼの基質結合ドメイン（ＰｈａＺの基質結合ドメイン、ＺＳＢＤ）およびＰｈａＲの基質結合ドメイン（ＲＳＢＤ）であり得る。
【００４８】
本発明の“疎水性顆粒結合ドメイン”の数は、１、２、３またはそれ以上であり得る。複数の疎水性顆粒結合ドメインがあるとき、それらは同じ、または互いに異なっていてよい、例えば、Ｐｈａｓｉｎ−Ｐｈａｓｉｎ、Ｐｈａｓｉｎ−Ｐｈａｓｉｎ−Ｐｈａｓｉｎ、ＺＳＢＤ−ＺＳＢＤ−ＺＳＢＤ、ＲＳＢＤ−ＲＳＢＤ−ＲＳＢＤ、ＰｈａＣ−ＰｈａＣ−ＰｈａＣ、Ｐｈａｓｉｎ−ＺＳＢＤ、ＺＳＢＤ−ＲＳＢＤ、Ｐｈａｓｉｎ−ＺＳＢＤ−ＲＳＢＤなど。何ら特定の理論に束縛されることなく、ドメインの数の増加は、疎水性顆粒へのそれらの結合を強化させ、それによって得られた標的タンパク質の純度を増加させ得る。
【００４９】
好ましくは、複数の疎水性顆粒結合ドメインはリンカーにより結合している。適当なリンカーは、活性形態への両側に隣接するタンパク質の正確なフォールディングを確実にするあらゆる柔軟な短ペプチドであり得る。例えばｐＴＷＩＮ２におけるリンカー１、Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｓｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙを含む（Evans T. C. et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 18359-18363）。
【００５０】
好ましくは、自己分解インテインはリンカーを介して１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメインに結合している。何ら特定の理論に束縛されることなく、リンカーの使用が正確な三次元構造へのそれぞれのタンパク質のフォールディングを確実にすることに寄与すると発明者は考えている。
【００５１】
好ましくは、自己分解インテインは標的タンパク質ドメインに直接結合している。
【００５２】
本発明の好ましい態様において、標的タンパク質ドメイン、自己分解インテインおよび少なくとも１つの疎水性顆粒結合ドメインは同じリーディング・フレーム内である。
【００５３】
好ましくは、親油性タンパク質、自己分解タンパク質および標的タンパク質は、微生物において可溶性タンパク質として存在し、これは通常、精製処理を簡単にする。
【００５４】
本明細書において使用される“疎水性顆粒”なる用語は、疎水性物質により形成され、疎水性表面を有する顆粒を示す。本発明の疎水性顆粒は、特定の形に限定されず、疎水性顆粒結合ドメインにしっかりと結合することができる限り、球形、卵形、オリーブ形、四角形または不規則な形であり得る。疎水性顆粒の回収および／または単離は一般的に遠心分離および／または濾過により行うことができる。
【００５５】
本発明の疎水性顆粒は、エマルジョン製造（Sanders et al., J. Am. Chem. Soc. 116 (1993) 2695-2702）またはモノマー重合（Yang et al., Journal of magnetism and magnetic Materials 293 (2005) 187-192）により製造され得る。
【００５６】
例えば、疎水性顆粒を製造するための典型的な方法は以下の通りである：
（１）油相溶液：クロロホルム中に疎水性ポリマー物質（例えば、ＰＨＡ、ＰＣＬ、ＰＭＭＡなど）を５％（ｗ／ｖ）にて溶解し；
（２）水相溶液：水中に界面活性剤（例えば、１０ｍＭのオレイン酸ナトリウム、１％  ｗ／ｖ  ＰＶＡなど）を溶解し；
（３）水相溶液を油相溶液へ体積比２０：１（油性／水性）にて注ぎ、超音波処理を適用してエマルジョンを形成し（出力：５０％；稼働期間：１秒；断続期間：１秒；全期間：１０−３０分）；そして
（４）ロータリー・エバボレーターによりクロロホルムをエマルジョンから除去し、疎水性顆粒の所望のエマルジョンを得、室温で保存し；使用前に、エマルジョンを遠心し、沈殿した顆粒を回収する。
【００５７】
例えば、図４は、本発明において特に好ましいポリ（３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシヘキサン酸）（ＰＨＢＨＨｘ）疎水性顆粒に関するＳＥＭ図を表す。
【００５８】
本発明の疎水性顆粒のサイズにおける特定の要件は存在しない。原則として、より小さい顆粒のサイズ、より広いタンパク質との接触表面は、単位顆粒重量あたりの負荷されるタンパク質の量をより多くするため、顆粒を回収するための遠心分離における困難さが増す。
【００５９】
本発明の疎水性顆粒を製造するために使用される物質は、良い脂溶性を有する疎水性ポリマー物質またはモノマー重合を介して微粉体を形成することができる疎水性ポリマー物質であり得る。適当な特定の疎水性物質は、疎水性ポリマー物質、例えば、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリプロピレン、ポリメチル・メタクリレート、ポリ塩化ビニルなど、特に、疎水性ＰＨＡ物質、例えば、ポリヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ酪酸およびヒドロキシ吉草酸のコポリマー、ヒドロキシ酪酸およびヒドロキシヘキサン酸のコポリマー、ポリヒドロキシカプリル酸、ポリヒドロキシエナント酸、ポリヒドロキシデカン酸、ヒドロキシ酪酸およびヒドロキシカプリル酸のコポリマー、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシ吉草酸およびヒドロキシヘキサン酸のコポリマーを含む。ポリヒドロキシ酪酸ならびにヒドロキシ酪酸およびヒドロキシ吉草酸のコポリマーが特に好ましい疎水性ＰＨＡ物質である。
【００６０】
本発明の特に好ましい態様において、磁性顆粒は疎水性顆粒内に包まれている。このような場合において、磁石が疎水性顆粒を回収および／または単離するために便利に使用され得、精製工程を簡単にする。好ましい態様において、疎水性顆粒は超常磁性粉からなるコアを含み、コアは疎水性物質により覆われている。特に好ましい態様において、超常磁性粉はＦｅ３Ｏ４磁性粉である。本発明における磁性粉は、高い磁気誘導係数を有する。
【００６１】
本発明の特に好ましい態様において、結合溶液はＴｒｉｓ−Ｃｌ、１０ｍＭ、ｐＨ８．５を含み；そして洗浄溶液はＴｒｉｓ−ＣＬ、１０ｍＭ、ｐＨ６．５を含む。
【００６２】
本明細書において使用される“任意”なる用語は、“有していてもよく、有していなくてもよい”、“必須ではない”などを示す。“任意の洗浄工程”は、洗浄工程が含まれるか、または含まれないかを当業者により決定されることを意味する。
【００６３】
本明細書において使用される“実質的に精製されている”標的タンパク質なる用語は、通常のアッセイまたは標的タンパク質が純粋であると分子生物学の分野において一般的に認識される基準に基づいて、当業者が確かめることができることを意味する。例えば、クロマトグラフィー、例えば、ＨＰＬＣが標的タンパク質の純度を分析するために使用されるとき、タンパク質の純度は９０％以上、好ましくは、９５％以上であるか；または、ＳＤＳ−ＰＡＧＥが標的タンパク質の純度を分析するために使用されるとき、分子生物学の分野において共通基準に基づいて存在しないと見なされ得るほど、汚染されているタンパク質のバンドがほとんど見えない。
【００６４】
本発明の組換えタンパク質は以下の典型的な手順により精製することができる：
１）原核生物発現系、例えば、大腸菌または真核生物発現系、例えば、ピキア・パストリスにおいて、標的タンパク質を含む本発明の融合タンパク質を発現させ；
２）リゾチームまたは超音波処理により細胞を溶解させ、遠心分離により上清を回収し；
３）融合タンパク質が疎水性顆粒の表面に結合できるように、上清を疎水性顆粒または包まれている磁性顆粒を有する疎水性顆粒とインキュベートし；
４）遠心分離により、または磁石を使用して疎水性顆粒を回収し、顆粒を数回洗浄し；
５）溶菌液を加え、適当な期間インキュベートし；そして
６）遠心分離により、または磁石を使用して顆粒を沈殿させ、標的タンパク質の溶液である上清を高純度にて回収する。
【００６５】
他の局面において、本発明は、組換え標的タンパク質を精製するためのキットであって：宿主細胞において融合タンパク質を組換え的に発現させるための発現ベクター（該融合タンパク質は標的タンパク質ドメイン、自己分解インテインおよび１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメインを含み、そして自己分解インテインは該標的タンパク質ドメインおよび該１つまたは複数の疎水性顆粒結合ドメイン間に位置する）；および疎水性顆粒を含むキットを提供する。
【００６６】
キットは溶菌液を保持するための容器をさらに含み得る。磁性顆粒が疎水性顆粒内に包まれている場合、疎水性顆粒を回収および／または単離するために、キットは磁石をさらに含み得る。
【００６７】
本発明は、説明の目的のためのみである以下の実施例にて更なる詳細について説明されるが、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００６８】
試験において使用される株およびプラスミドは表１に挙げられている。すべての制限エンドヌクレアーゼはNEB Co. Ltd.から購入した。ＤＮＡポリメラーゼ、２×Ｐｆｕ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘはBeijing Tiangen Biotech Co., Ltd.から購入し、これは４ｋｂ未満のサイズの遺伝子フラグメントをクローニングするために使用した。長い遺伝子フラグメントをクローニングするために使用したＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼは、Takara Co. Ltd.から購入した。ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｖｅｒ．  ２．０はTakara Co. Ltd.から購入した。他の生化学試薬はShanghai Bioengineering Co. Ltd.から購入した。ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡライゲーション、酵素開裂および他の遺伝子操作のための方法の説明は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook et al., 1989)において見出すことができる。
【実施例】
【００６９】
実施例１  顆粒関連タンパク質Ｐｈａｓｉｎ、自己分解タンパク質インテインおよび緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの融合タンパク質の製造ならびにＥＧＦＰの精製
Ｉ．融合タンパク質ｐｈａｓｉｎ−インテイン−ＥＧＦＰおよび融合タンパク質ｐｈａｓｉｎ’−ｐｈａｓｉｎ−インテイン−ＥＧＦＰ各々を発現するための、融合発現プラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰ（図２）およびｐＰ’ＰＩ−ＥＧＦＰ（図５）の構築
所望の発現プラスミドをプラスミドｐＴＷＩＮ１の修飾に基いて構築した。ｐＰＩ−ＥＧＦＰを構築するために、最初に顆粒関連タンパク質ｐｈａｓｉｎをコードする発現遺伝子ｐｈａＰ１（配列番号：１、図２２参照）を得るためにＰＣＲを行った。ｐｈａＰ１は、鋳型としてアエロモナス細菌４ＡＫ４のゲノムを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃２２ｓ）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。次に、ＣＢＤ１を含まないｐＴＷＩＮプラスミドにおけるフラグメントは、ＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃７分１０秒）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。得られたｐｈａＰ１フラグメントおよびＣＢＤ１を含まないｐＴＷＩＮプラスミドをさらなる修飾なしに平滑ライゲーションした。次に、緑色蛍光タンパク質遺伝子ＥＧＦＰをＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素認識部位間に挿入した。ＥＧＦＰは、鋳型としてプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１を使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃４５ｓ）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。プラスミドｐＰ’ＰＩ−ＥＧＦＰを構築するために、他の顆粒関連タンパク質ｐｈａｓｉｎ’の発現遺伝子ｐｈａＰ２（配列番号：２、図２２参照）をプラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰのＮｄｅＩ部位に挿入した。ｐｈａＰ２は、鋳型としてラルストニア・ユートロファＨ１６のゲノムを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃３５ｓ）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。最後に構築されたプラスミドを正確な配列を確認するためにシーケンシングするためＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．に送った。遺伝子操作の簡便なため、対応する酵素開裂部位をＰＣＲプライマーに組み込んだ。使用されるプライマーに関して表２参照。
【００７０】
ＩＩ．  タンパク質の発現
１．  構築された発現プラスミドにて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させた。単一コロニーを２０ｍｌのＬＢ培地（Ａｍｐ、１００μｇ／ｍｌ）に取り、これを一晩３７℃にてインキュベートし、播種用液体を得た。
【００７１】
２．  ２ミリリットル（２ｍｌ）の播種用液体を２００ｍｌのＬＢ培地（Ａｍｐ、１００μｇ／ｍｌ）に植菌比率１％にて加えた。培地をＯＤ６０００．４−０．６まで３７℃にてインキュベートした。ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭに加えた。誘導を一晩１５℃にて行った。
【００７２】
ＩＩＩ．  細胞回収および分解
１．  細胞を遠心分離により回収し、２０ｍｌの蒸留水を使用することにより１回洗浄した。次に細胞をさらなる遠心分離により回収した。
【００７３】
２．  ２０ミリリットル（２０ｍｌ）の結合溶液（Ｔｒｉｓ−ＣＬ、１０ｍＭ、ｐＨ８．５）を加えた。得られた液体を完全に混合し、氷上に維持した。
【００７４】
３．  超音波破壊を適用した（出力：５０％；稼働期間：１秒；断続期間：２秒；全期間：約１０分、細胞が半透明になるまで）。
【００７５】
４．  上清を遠心分離により回収し（１１０００ｒｐｍ、４℃、３０分）、−２０℃にて保存した。
【００７６】
ＩＶ．  結合実験
１．  ２０ミリリットル（２０ｍｌ）のＰＨＢＨＨｘ疎水性顆粒エマルジョンを１０分１１０００ｒｐｍにて遠心した。顆粒を回収した。
【００７７】
２．  ２ミリリットル（２ｍｌ）のタンパク質上清を加え、ピペットチップにより吹き付けた。顆粒を再懸濁した（わずかにボルテックスミックスさせてもよい）。
【００７８】
３．  懸濁液を４℃にて１−４時間維持した。
【００７９】
Ｖ．  洗浄および溶菌
１．  結合した顆粒を１０ｍｌの結合溶液（Ｔｒｉｓ−ＣＬ、１０ｍＭ、ｐＨ８．５）により２回洗浄した。顆粒をピペットにより吹き付け、次にわずかにボルテックスミックスすることに注意する。
【００８０】
２．  顆粒を２ｍｌの溶菌液（Ｔｒｉｓ−ＣＬ、１０ｍＭ、ｐＨ６．５）により１回洗浄した。
【００８１】
３．  １ミリリットル（１ｍｌ）の溶菌液を加えピペットにより混合した。インテイン分解を誘導するために、得られた液体を１２−３６時間２５℃にて維持した。
【００８２】
４．  上清を遠心分離により回収した。得られた上清は、高純度での標的タンパク質の溶液であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンに関して図６参照。
【００８３】
結果は、標的タンパク質ＥＧＦＰが高純度にて得られたことを示した。
【００８４】
実施例２  顆粒関連タンパク質ｐｈａｓｉｎ、自己分解タンパク質インテインおよびβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）の融合タンパク質の製造ならびにβ−ガラクトシダーゼの精製
Ｉ．  融合タンパク質ｐｈａｓｉｎ−インテイン−β−ｇａｌを発現するための融合発現プラスミドｐＰＩ−ｌａｃＺ（図７）の構築
β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子（配列番号：３、図２３参照）は、鋳型として大腸菌Ｓ１７−１のゲノムを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃３分１０秒）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。次に、遺伝子をプラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰのＢｓｒＧＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した。使用されるプライマーに関して表２参照。
【００８５】
ＩＩ．  発現および精製工程は、実施例１における工程ＩＩからＶと同じであった。使用される疎水性顆粒はポリ乳酸（ＰＬＡ）から作った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンに関して図８参照。
結果は、標的タンパク質β−ガラクトシダーゼが高純度にて得られたことを示した。
【００８６】
実施例３  顆粒関連タンパク質ｐｈａｓｉｎ、自己分解タンパク質インテインおよびＰＨＡシンターゼＰｈａＣの融合タンパク質の製造ならびにＰｈａＣの精製
Ｉ．  融合タンパク質ｐｈａｓｉｎ−インテイン−ＰｈａＣを発現するための、融合発現プラスミドｐＰＩ−ｐｈａＣ（図９）の構築
ｐｈａＣ遺伝子（配列番号：４、図２４参照）は、鋳型としてラルストニア・ユートロファＨ１６のゲノムを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃１分５０秒）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。次に、遺伝子をプラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰのＢｓｒＧＩ／ＢａｍＨＩ部位に挿入した。使用されるプライマーに関して表２参照。
【００８７】
ＩＩ．  発現および精製工程は、実施例１における工程ＩＩからＶと同じであった。使用される疎水性顆粒はポリ−３−ヒドロキシ酪酸−コ−３−ヒドロキシ吉草酸（ＰＨＢＶ）から作った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンに関して図１０参照。
ＰＨＡシンターゼＰｈａＣは、また、強い顆粒結合能を有し、インテイン分解の誘導後に得られたすべてのＰｈａＣは疎水性顆粒の表面に結合した。したがって、精製されていない標的タンパク質ＰｈａＣを得た。
【００８８】
実施例４  リプレッサータンパク質ＰｈａＲ、自己分解タンパク質インテインおよび緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの融合タンパク質の製造ならびにＥＧＦＰの精製
Ｉ．  融合タンパク質ＰｈａＲ−インテイン−ＥＧＦＰを発現するための、融合発現プラスミドｐＲＩ−ＥＧＦＰ（図１１）の構築
ｐｈａＲ遺伝子（配列番号：５、図２２参照）は、鋳型としてラルストニア・ユートロファＨ１６のゲノムを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃２５ｓ）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。ｐｈａｓｉｎを含まないフラグメントＩＥを、鋳型としてプラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９８℃２分；３０サイクル（９８℃１０ｓ、５５℃１０ｓおよび７２℃７分１０秒）；７２℃５分および４℃で維持）により増幅した。次に、ｐｈａＲおよびＩＥフラグメントをＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ二重酵素開裂部位によりライゲーションした。使用されるプライマーに関して表２参照。
【００８９】
ＩＩ．  発現および精製工程は、実施例１における工程ＩＩからＶと同じであった。使用される疎水性顆粒はポリ−３−ヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）から作った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンに関して図１２参照。
結果は、標的タンパク質ＥＧＦＰが高純度にて得られたことを示した。
【００９０】
実施例５  ＰＨＡデポリメラーゼＰｈａＺの基質結合ドメイン（ＺＳＢＤ）、自己分解タンパク質インテインおよび標的タンパク質ＥＧＦＰの融合タンパク質の製造
Ｉ．  融合タンパク質ＺＳＢＤ−インテイン−ＥＧＦＰを発現するための、融合発現プラスミドｐＳＢＤＩ−ＥＧＦＰ（図１３）の構築
ＺＳＢＤ遺伝子（配列番号：６、図２２参照）は、鋳型としてラルストニア・ユートロファＨ１６のゲノムを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃２０ｓ）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。ｐｈａｓｉｎを含まないフラグメントＩＥを、鋳型としてプラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９８℃２分；３０サイクル（９８℃１０ｓ、５５℃１０ｓおよび７２℃７分１０秒）；７２℃５分および４℃で維持）により増幅した。次に、ＺＳＢＤおよびＩＥフラグメントをＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ二重酵素開裂部位によりライゲーションした。使用されるプライマーに関して表２参照。
【００９１】
ＩＩ．  発現および精製工程は、実施例１における工程ＩＩからＶと同じであった。使用される疎水性顆粒はポリカプロラクトン（ＰＣＬ）から作った。
結果は、標的タンパク質ＥＧＦＰが高純度にて得られたことを示した。
【００９２】
実施例６  真核生物発現系ピキア・パストリスＧ１１５における発現のための顆粒関連タンパク質ｐｈａｓｉｎ、自己分解タンパク質インテインおよびヒトα１−酸糖タンパク質（ＯＲＭ１）の融合タンパク質の製造ならびにＯＲＭ１の精製
Ｉ．  融合タンパク質ＯＲＭ１−インテイン−ｐｈａｓｉｎを発現するための、酵母菌発現プラスミドｐＳＩＯＰ（図３）の構築
修飾をプラスミドｐＧＡＰＺαＡに基づいて作った。最初に、ｐｈａＰ遺伝子（配列番号：２）をＫｐｎＩ／ＸｂａＩ二重酵素開裂部位に挿入した。ＯＲＭ１遺伝子（配列番号：７、図２５参照）をＮｓｉＩ／ＫｐｎＩ二重酵素開裂部位に挿入した。次に、インテイン遺伝子をＫｐｎＩ酵素開裂部位に挿入した。得られたプラスミドはｐＳＩＯＰであった。ｐｈａＰ遺伝子は、鋳型としてラルストニア・ユートロファＨ１６のゲノムを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃３５ｓ）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。インテイン遺伝子は、鋳型としてｐＴＷＩＮ１を使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃３０ｓ）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。ヒトα１−酸糖タンパク質（ＯＲＭ１）遺伝子は、ＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃３６ｓ）；７２℃５分および４℃で維持）によりヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーから得た。使用されるプライマーに関して表２参照。
【００９３】
ＩＩ．  タンパク質の発現
１．  構築された発現プラスミドにてピキア・パストリスＧＳ１１５を電気的形質転換させ、次にこれを１００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを含むＹＰＤＳ培地プレートに置いた。単一コロニーを２０ｍｌのＹＰＤ培地（Ｚｅｏｃｉｎ、１００μｇ／ｍｌ）に取り、これをＯＤ６００が約１に達するまで３０℃にてインキュベートし、それにより播種用液体を得た。
【００９４】
２．  ２ミリリットル（２ｍｌ）の播種用液体を２００ｍｌのＹＰＤ培地に植菌比率１％にて加えた。培地を２−３日間３０℃にてインキュベートした。
【００９５】
ＩＩＩ．  結合実験
１．  上清を遠心分離（１１０００ｒｐｍ、４℃、３０分）により回収し、次に−２０℃にて貯蔵した。
【００９６】
２．  ２０ミリリットル（２０ｍｌ）のＰＨＢ疎水性顆粒エマルジョンを１０分１１０００ｒｐｍにて遠心した。顆粒を回収した。
【００９７】
３．  ２ミリリットル（２ｍｌ）のタンパク質上清を加え、ピペットチップにより吹き付けた。顆粒を再懸濁した（わずかにボルテックスミックスさせてもよい）。
【００９８】
４．  懸濁液を４℃にて１−４時間維持した。
【００９９】
ＩＶ．  洗浄および溶菌
１．  結合した顆粒を１０ｍｌの結合溶液により２回洗浄した。顆粒をピペットにより吹き付け、次にわずかにボルテックスミックスすることに注意する。
【０１００】
２．  顆粒を２ｍｌの溶菌液（Ｔｒｉｓ−ＣＬ、１０ｍＭ、ｐＨ６．５）により１回再洗浄した。
【０１０１】
３．  １ミリリットル（１ｍｌ）の溶菌液を加えピペットにより混合した。インテイン分解を誘導するために、得られた液体を１２−３６時間２５℃にて維持した。
【０１０２】
４．  上清を遠心分離により回収した。得られた上清は、高純度での標的タンパク質の溶液であった。
【０１０３】
結果は、標的タンパク質ＯＲＭ１が高純度にて得られたことを示した。
【０１０４】
実施例７  顆粒関連タンパク質ｐｈａｓｉｎ、自己分解タンパク質インテインおよびｔａｑＤＮＡポリメラーゼの融合タンパク質の製造ならびにｔａｑＤＮＡポリメラーゼの精製
Ｉ．  融合タンパク質ｐｈａｓｉｎ−インテイン−ｔａｑを発現するための融合発現プラスミドｐＰＩ−ｔａｑ（図１４）の構築
ＰＣＲを介して得られたＴａｑポリメラーゼ遺伝子（配列番号：８、図２６参照）をプラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰのＢｓｒＧＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入した。ＰＣＲ条件（９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃２分３０秒）；７２℃５分および４℃で維持）。ｔａｑ遺伝子はＢａｍＨＩ酵素開裂部位を含み、したがって、ＢｇｌＩＩ（ＢａｍＨＩのイソカウダーナー(isocaudarner)）をプライマーを設計するためにＢａｍＨＩの代わりに使用した。使用されるプライマーに関して表２参照。
【０１０５】
ＩＩ．  発現および精製工程は、実施例１における工程ＩＩからＶと同じであった。使用される疎水性顆粒はポリエチレン（ＰＥ）から作った。
結果は、標的タンパク質ｔａｑＤＮＡポリメラーゼが高純度にて得られたことを示した。
【０１０６】
実施例８  顆粒関連タンパク質ｐｈａｓｉｎ、自己分解タンパク質インテインおよび標的タンパク質マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）の融合タンパク質の製造ならびにＭＢＰの精製
Ｉ．  融合タンパク質ｐｈａｓｉｎ−インテイン−ＭＢＰを発現するための融合発現プラスミドｐＰＩ−ｍａｌＥ（図１５）の構築
ｍａｌＥ遺伝子（ＭＢＰタンパク質をコードする、配列番号：９、図２５参照）は、鋳型としてｐＭＡＬ−Ｃ２ｘを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃１分１０秒）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。次に、ｍａｌＥ遺伝子をプラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰのＢｓｒＧＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入した。使用されるプライマーに関して表２参照。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動パターンに関する図１６参照。
【０１０７】
ＩＩ．  発現および精製工程は、実施例１における工程ＩＩからＶと同じであった。使用される疎水性顆粒はＰＨＢＨＨｘから作った。
結果は、標的タンパク質ＭＢＰが高純度にて得られたことを示した。
【０１０８】
実施例９  顆粒関連タンパク質ｐｈａｓｉｎ、自己分解タンパク質インテインおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の融合タンパク質の製造ならびにＧＳＴの精製
Ｉ．  融合タンパク質ｐｈａｓｉｎ−インテイン−ＧＳＴを発現するための融合発現プラスミドｐＰＩ−ＧＳＴ（図１７）の構築
ＧＳＴ遺伝子（配列番号：１０、図２７参照）は、鋳型としてｐＧＥＸ−４Ｔ３を使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃４０ｓ）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。次に、ＧＳＴ遺伝子をプラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰのＢｓｒＧＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入した。使用されるプライマーに関して表２参照。
【０１０９】
ＩＩ．  発現および精製工程は、実施例１における工程ＩＩからＶと同じであった。使用される疎水性顆粒はＰＨＢから作った。
結果は、標的タンパク質ＧＳＴが高純度にて得られたことを示した。
【０１１０】
実施例１０  顆粒関連タンパク質ｐｈａｓｉｎ、自己分解タンパク質インテインおよびルシフェラーゼの融合タンパク質の製造ならびにルシフェラーゼの精製
Ｉ．  融合タンパク質ｐｈａｓｉｎ−インテイン−ルシフェラーゼを発現するための融合発現プラスミドｐＰＩ−ｌｕｃ（図１８）の構築
Ｌｕｃ遺伝子（配列番号：１１、図２７参照）は、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ二重酵素開裂によりプラスミドｐＧＬ−プロモーターから開裂されたｌｕｃ遺伝子部分である。次に、ｌｕｃ遺伝子をｐＰＩ−ＥＧＦＰの対応する部位に挿入した。
【０１１１】
ＩＩ．  発現および精製工程は、実施例１における工程ＩＩからＶと同じであった。使用される疎水性顆粒はポリスチレン（ＰＳ）から作った。
結果は、標的タンパク質ルシフェラーゼが高純度にて得られたことを示した。
【０１１２】
実施例１１  ＰＨＡシンセターゼＰｈａＣ、自己分解タンパク質インテインおよび緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの融合タンパク質の製造ならびにＥＧＦＰの精製
Ｉ．  融合タンパク質ＰｈａＣ−インテイン−ＥＧＦＰを発現するための融合発現プラスミドｐＣＩ−ＥＧＦＰ（図１９）の構築
ｐｈａＣ遺伝子（配列番号：４）は、鋳型としてラルストニア・ユートロファＨ１６のゲノムを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃１分５０秒）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。次に、遺伝子をプラスミドｐＲＩ−ＥＧＦＰのＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ部位に挿入した。ｐｈａＣ遺伝子はＢｇｌＩＩ酵素開裂部位を含み、したがって、ＢａｍＨＩ（ＢｇｌＩＩのイソカウダーナー）をプライマーを設計するためにＢｇｌＩＩの代わりに使用した。使用されるプライマーに関して表２参照。
【０１１３】
ＩＩ．  発現および精製工程は、実施例１における工程ＩＩからＶと同じであった。使用される疎水性顆粒はポリプロピレン（ＰＰ）から作った。
結果は、標的タンパク質ＥＧＦＰが高純度にて得られたことを示した。
【０１１４】
実施例１２  ３つの顆粒関連タンパク質Ｐｈａｓｉｎ、自己分解タンパク質インテインおよび緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの融合タンパク質の製造ならびにＥＧＦＰの精製
Ｉ．  融合タンパク質ｐｈａｓｉｎ−ｐｈａｓｉｎ−ｐｈａｓｉｎ−インテイン−ＥＧＦＰを発現するための融合発現プラスミドｐＰＰＰＩ−ＥＧＦＰ（図２０）の構築
修飾をｐＲＩ−ＥＧＦＰに基づいて作った。最初に、ｐｈａＰ２（ｐｈａＰ＋リンカー）フラグメントをＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位間に挿入した。次にｐｈａＰ１（ｐｈａＰ＋リンカー）をＢｇｌＩＩ部位に挿入し、ｐｈａＰ３（ｐｈａＰ）をＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。同程度のサイズのｐｈａＰ１、ｐｈａＰ２およびｐｈａＰ３は、鋳型としてプラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件は同じであった：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃２５ｓ）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。使用されるプライマーに関して表２参照。
【０１１５】
ＩＩ．  発現および精製工程は、実施例１における工程ＩＩからＶと同じであった。使用される疎水性顆粒はポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）から作った。
結果は、標的タンパク質ＥＧＦＰが高純度にて得られたことを示した。
【０１１６】
実施例１３  顆粒関連タンパク質ｐｈａｓｉｎ、ＰＨＡデポリメラーゼの基質結合ドメイン（ＺＳＢＤ）、自己分解タンパク質インテインおよび緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰの融合タンパク質の製造ならびにＥＧＦＰの精製
Ｉ．  融合タンパク質ｐｈａｓｉｎ−ＺＳＢＤ−インテイン−ＥＧＦＰを発現するための融合発現プラスミドｐＰＳＩ−ＥＧＦＰ（図２１）の構築
修飾をｐＲＩ−ＥＧＦＰに基づいて作った。最初に、ｐｈａＰフラグメント（ｐｈａＰ＋リンカー）をＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位間に挿入した。次にＺＳＢＤをＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。ｐｈａＰ遺伝子は、鋳型としてプラスミドｐＰＩ−ＥＧＦＰを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃２５ｓ）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。ＳＢＤ遺伝子は、鋳型としてプラスミドｐＲＩ−ＥＧＦＰを使用するＰＣＲ（ＰＣＲ条件：９４℃３分；３０サイクル（９４℃３０ｓ、５５℃３０ｓおよび７２℃２０ｓ）；７２℃５分および４℃で維持）により得た。使用されるプライマーに関して表２参照。
【０１１７】
ＩＩ．  発現および精製工程は、実施例１における工程ＩＩからＶと同じであった。使用される疎水性顆粒はポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）から作った。
結果は、標的タンパク質ＥＧＦＰが高純度にて得られたことを示した。
【０１１８】
特許文献、科学論文および刊行物を含むすべての文献は、全体を出典明示により本明細書に包含させる。
【０１１９】
本発明の精神および範囲から逸脱することなく、変化および修飾が本発明の形態および範囲において当業者により行うことができることを理解すべきである。すべての変化および修飾は本発明の範囲内であると意図する。
【０１２０】
表１：株およびプラスミド
【表１】
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【０１２１】
表２：融合発現プラスミドを構築するために必要であるプライマー
【表２】
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【０１２２】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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2011521917.tif 000034
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