(57)【要約】  本発明は、トリサイトカインをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなり、速現性又は亜病原性腫瘍退縮ＲＮＡニューキャッスル病ウイルスから得られる、組換え腫瘍退縮ＲＮＡニューキャッスル病ウイルスに関する。天然宿主細胞におけるサイトカインのウイルス媒介発現は、トリ種に対する、ウイルスの病原性を低減させる。さらに、当該ウイルスゲノムは、結合タンパク質、プロドラッグ変換酵素、又は／及びプロテアーゼをコードできる。これらの分子のウイルス感染腫瘍における選択的発現は、当該ウイルスの抗腫瘍効果を増加させる。
2011510638.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリサイトカインをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなり、速現性（ｖｅｌｏｇｅｎｉｃ）又は亜病原性（ｍｅｓｏｇｅｎｉｃ）腫瘍退縮ＲＮＡニューキャッスル病ウイルスから得られる、組換え腫瘍退縮ＲＮＡニューキャッスル病ウイルス。
【請求項２】
ウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を含んでなる、請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
前記少なくとも１つのさらなる導入遺伝子が、宿主に対して部分的な同種異系又は同系である、請求項２に記載のウイルス。
【請求項４】
前記ウイルスの病原性がトリ種で低減される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項５】
前記ウイルスの病原性が、前記組換えウイルスが得られるウイルスに対して、トリ種で低減される、請求項４に記載のウイルス。
【請求項６】
前記トリ種が家禽類から選択される、請求項４又は５に記載のウイルス。
【請求項７】
前記トリ種がニワトリである、請求項４〜６のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項８】
トリ病原体、具体的には家禽類の病原体、より具体的にはニワトリの病原体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項９】
亜病原性株ＭＴＨ６８から得られる、請求項１〜８のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのさらなる導入遺伝子が、ウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する結合タンパク質をコードする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項１１】
前記結合タンパク質が、以下の、天然リガンド、遺伝子改変リガンド、天然受容体の組換え可溶性ドメイン及びその改変バージョン、ペプチドリガンド、ポリペプチドリガンド、抗体分子及びその断片及び誘導体、並びにアンキリン反復タンパク質及びその断片及び誘導体のような抗体様分子、からなる群から選択される、請求項１０に記載のウイルス。
【請求項１２】
前記結合タンパク質が、哺乳類、例えばヒト、マウス又は近縁起源のもの、又はキメラタンパク質である、請求項１０又は１１に記載のウイルス。
【請求項１３】
前記結合タンパク質が、単量体、二量体、三量体、四量体、又は多量体タンパク質である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項１４】
前記結合タンパク質が、単一特異的、二重特異的、又は多重特異的である、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項１５】
前記結合タンパク質が、少なくとも１つの結合ドメイン及び少なくとも１つの異種ドメインを含んでなる融合タンパク質である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項１６】
前記結合タンパク質が、ヒトＲＮＡｓｅ（シュードモナス外毒素、ジフテリア毒）等の毒を含んでなる融合タンパク質、又はベーターグルクロニダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ等の酵素を含んでなる融合タンパク質、又はＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ベータもしくはＦＭ−ＣＳＦ等のサイトカイン活性を有する免疫刺激タンパク質を含んでなる融合タンパク質である、請求項１５に記載のウイルス。
【請求項１７】
前記結合タンパク質が、自律活性増殖因子受容体の阻止タンパク質（例えば、ＥＧＦＲ、Ｍｅｔ）、増殖因子への競合結合剤（アンタゴニスト）、Ｒｂ−リン酸化の阻止タンパク質、Ｅ２Ｆ依存性転写の阻止タンパク質；ｐ５３の安定化剤；抗アポトーシスタンパク質の拮抗結合剤（例えばＢｃｌ−２）；サイクリンの拮抗結合剤；Ｒａｓエフェクターの拮抗結合剤（例えば、ＧＥＦ）；低酸素誘導タンパク質の拮抗結合剤（例えば、ＨＩＦ１α）；二量化、ＤＮＡ結合及び／もしくは補因子結合を干渉する転写因子の阻害剤（例えばＭｙｃ／Ｍａｘ）；分化誘導剤；ｓｍａｄシグナル伝達／転座の阻害剤；細胞接着相互作用の阻害剤（カドヘリン、インテグリン、例えばα５β１、αｖβ３）；細胞外マトリクスを分解する酵素の阻害剤（例えば、ＭＭＰ）；血管新生誘導リガンドの拮抗結合剤（例えば、可溶性ＶＥＧＦ−Ｒ）；血管新生誘導受容体への拮抗結合剤；スキャホールド複合体形成の阻害剤（例えば、ＫＳＲ／Ｒａｓ）；翻訳開始の阻害剤（例えば、ｅＩＦ４Ｅ、ＥＩＦ２ａ）；及び有糸分裂キナーゼの阻害剤（例えば、Ｐｌｋ−１）からなる群から選択される、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのさらなる導入遺伝子が、ウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有するプロドラッグ変換酵素をコードする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのさらなる導入遺伝子が、ウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有するプロテアーゼをコードする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項２０】
トリサイトカインをコードする少なくとも１つの導入遺伝子が、ニワトリインターフェロンから選択される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項２１】
トリサイトカインをコードする少なくとも１つの導入遺伝子が、ニワトリＩ型インターフェロンから選択される、請求項２０に記載のウイルス。
【請求項２２】
前記病原性の低減が、細胞バイアビリティの増加により測定されるＭＯＩ０．０１で、感染後約４８時間での鳥細胞溶解を低減するウイルスの性能であり、それにより、当該細胞バイアビリティは、組換えウイルスが得られるウイルスに対して、生存細胞が少なくとも約２５％〜約５０％まで、より好ましくは生存細胞が少なくとも約５０％〜約７５％まで、及び最も好ましくは生存細胞が少なくとも約７５％〜約１００％まで増加する、請求項５〜２１のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項２３】
前記病原性の低減が、平均死亡時間（ＭＤＴ）決定法により測定される、１１日齢孵化卵におけるウイルス感染ニワトリ胚の生存期間の延長であり、これにより、組換えウイルスが得られるウイルスに対して、ＭＤＴが少なくとも約１５時間〜約２０時間まで、より好ましくは少なくとも約２０時間〜約３０時間まで、及び最も好ましくは３０時間超まで延長される、請求項５〜２１のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項２４】
ヒト腫瘍細胞への前記ウイルスの腫瘍退縮活性が、基本的に低減しない、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項２５】
感染後４８時間後に、細胞バイアビリティにより測定される、前記ヒト腫瘍細胞へのウイルスの腫瘍退縮活性が、組換えウイルスが得られるウイルスと比較して、５０％超は低減しない、そしてより好ましくは、組換えウイルスが得られるウイルスに対し基本的に低減しない、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組換え腫瘍退縮ＲＮＡウイルスのヌクレオカプシド。
【請求項２７】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組換え腫瘍退縮ＲＮＡウイルスのゲノム。
【請求項２８】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組換え腫瘍退縮ＲＮＡウイルスのゲノム及び／又はアンチゲノムをコードするＤＮＡ分子。
【請求項２９】
転写制御配列に作動的に連結される、請求項２７に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３０】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組換え腫瘍退縮ウイルス、請求項２７に記載のウイルスゲノム、又は／及び請求項２８もしくは２９に記載のＤＮＡ分子、を含んでなる細胞。
【請求項３１】
活性成分として、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組換え腫瘍退縮ウイルス、請求項２７に記載のウイルスゲノム、又は／及び請求項２８もしくは２９に記載のＤＮＡ分子を、任意に、医薬的に許容される担体、希釈剤及び／又はアジュバントと一緒に含んでなる、医薬組成物。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのさらなる導入遺伝子によりコードされるプロドラッグ変換酵素により、治療活性化合物に変換できるプロドラッグをさらに含んでなる、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組換え腫瘍退縮ウイルス、請求項２７に記載のウイルスゲノム、又は／及び請求項２８もしくは２９に記載のＤＮＡ分子を、それを必要とする対象に、医薬有効量で投与することを含んでなる、増殖性疾患の治療のための方法。
【請求項３４】
（i）プロドラッグ変換酵素をコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組換え腫瘍退縮ウイルス、請求項２７に記載のウイルスゲノム、又は／及び請求項２８もしくは２９に記載のＤＮＡ分子、及び
（ii）前記ウイルスと組み合わせて増殖性疾患の治療に適するプロドラッグであって、（i）のプロドラッグ変換酵素により医薬活性化合物に変換できる、プロドラッグ、
を、それを必要とする対象に、医薬有効量で投与することを含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象がヒト患者である、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
サイトカインをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなる核酸を含んでなる、家禽類のために弱毒化された組換え腫瘍退縮ＲＮＡウイルス。
【請求項３７】
ニワトリのために弱毒化される、請求項３６に記載のウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリサイトカインをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなり、速現性（ｖｅｌｏｇｅｎｉｃ）又は亜病原性（ｍｅｓｏｇｅｎｉｃ）腫瘍退縮ＲＮＡニューキャッスル病ウイルスから得られる、組換え腫瘍退縮ＲＮＡニューキャッスル病ウイルスに関する。天然の宿主細胞におけるサイトカインのウイルス媒介発現は、トリ種のウイルスの病原性低減をもたらす。
【０００２】
本発明におけるウイルスは、疾患の治療、特に腫瘍退縮腫性の腫瘍の治療に適する。トリサイトカインをコードする組換えウイルスが作製され、ここで当該ウイルスの病原性はトリ種について低減され、ウイルスの環境毒性の軽減をもたらす。当該ウイルスの腫瘍退縮活性は、記載される病原性低減方法により損なわれない。当該ウイルスゲノムは、追加の治療導入遺伝子、好ましくは結合タンパク質（抗体、アンキリン反復分子、ペプチド等）、プロドラッグ変換酵素、又は／及びプロテアーゼをコードしてよい。これらの結合タンパク質、プロドラッグ変換酵素、又は／及びプロテアーゼの活性は、ウイルスの抗腫瘍効果を増加させる。さらに、本発明は、癌治療のためのかかる改変ウイルスの製造及び使用について記載する。
【背景技術】
【０００３】
ニューキャッスル病ウイルス
腫瘍の治療のための一般的な腫瘍退縮ウイルスは、Ｃｈｉｏｃｃａ（２００２）において概説される。ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、４０年以上にわたり実験的治療剤として使用されており、そしてＳｉｎｋｏｖｉｃｓ及びＨｏｒｖａｔｈ（２０００）により概説される。一般的にニューキャッスル病ウイルスは、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（１９８８）による書籍において報告されている。ＮＤＶ株ＰＶ７０１は、グリア芽腫の抗癌治療として開発されている（Ｌｏｒｅｎｃｅ等、２００３）。ＮＤＶ株ＭＴＨ６８は、実験的癌治療として使用されており、そして３０年以上にわたりヒトに投与されている（Ｃｓａｔａｒｙ等、２００４）。
【０００４】
Ｓｔｏｊｄｌｅ等（２００３）による論文には、全ての試験された腫瘍細胞系列の８０％の範囲で、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）への感染後、インターフェロン応答において欠陥が存在することが記載されている。ＶＳＶ及びＮＤＶの両方がモノネガウイルス種の構成ウイルスであるために、腫瘍細胞系列の同様の割合が、ＮＤＶに感染し易くなるはずであると考えられる。腫瘍細胞におけるＮＤＶの選択的複製のメカニズムは、ウイルスに対する細胞性インターフェロン応答における欠陥に基づくことが示されている（例えば、ＵＳ２００３００４４３８４を参照されたい）。
【０００５】
パラミクソウイルスは、１５〜１９ｋｂ長のゲノムを有するネガティブ極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを含み（野生型）、そして当該ゲノムは、６〜１０個の遺伝子を含有する。このウイルスエンベローブは、表面糖タンパク質及び宿主細胞由来の膜部分により形成される。当該表面糖タンパク質（Ｆ及びＨＮ又はＨ又はＧ）は、宿主細胞からのウイルスの出入を媒介する。ヌクレオカプシドは、エンベローブの内側にあり、そしてＲＮＡゲノム及びヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、細胞間ウイルス転写及び複製に関与するホスホプロテイン（Ｐ）及び巨大タンパク質（Ｌ）を含む。マトリクス（Ｍ）タンパク質は、ウイルス性エンベローブ及びヌクレオカプシドに接続する。これらの構造タンパク質をコードするこれらの遺伝子に加え、パラミクソウイルス科は、「アクセサリー」遺伝子を含んでもよく、これは上記の遺伝子が散在する追加の転写単位になることができる。当該アクセサリー遺伝子は、Ｐ遺伝子転写単位と重複する主要なＯＲＦである。パラミクソウイルス科の包括的な記載は（Ｌａｍｂ、２００１）にある。
【０００６】
ＮＤＶは、モノネガウイルス種に属するパラミクソウイルス科のファミリーの、アブラウイルスのプロトタイプな構成ウイルスである。当該ウイルスゲノムは、６つの主要なタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）、ホスホプロテイン（Ｐ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）、融合タンパク質（Ｆ）、ヘマグルチニンタンパク質（ＨＮ）、及びポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、をコードする一本鎖ネガティブセンスＲＮＡである。Ｐタンパク質ｍＲＮＡの編集により、１又は２個の追加のタンパク質、Ｖ（及びＷ）が翻訳される。
【０００７】
ＮＤＶは、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（１９８８）及びＬａｍｂ（２００１）において詳細に特性決定されている。
【０００８】
トリ病原体としてのニューキャッスル病ウイルス
ＮＤＶ株は、全齢のニワトリの急性致死的感染をもたらす速現性株（高毒性）、若いニワトリにおいてのみ致死的である亜病原性単離物（中間的ウイルス）、及び疾患の軽度又は明白ではない状態において明示されるレントジェニック株（無毒性）として、ニワトリに対するその病原性が分類される。速現体、亜病原体、又はレントジェニック体におけるＮＤＶ単離物の分類は、胚を死亡させる最小致死用量の接種後、９日齢の孵化卵におけるニワトリ胚の平均死亡時間（ＭＤＴ）により決定される。ＮＤＶ毒性の決定因子の１つは、前駆体Ｆタンパク質の切断部位のようである。
【０００９】
ＮＤＶの最初の発生は、１９２６年、イングランドのタインのニューキャッスル及びインドネシアのジャワで観察された。当該疾患の最初の出現から、３つのＮＤＶ動物性流行病が報告されている。
【００１０】
ＮＤＶは、主に、感染し易い鳥により吸入されたエアロゾル又は巨大な液滴により伝播される。感染の過程で、新規な感染性ウイルス粒子は、感染した気道から噴出されるか、排泄物中に排泄されることになる。この健常な鳥によるウイルスが含有物質の摂取により、新規な感染が確立され、且つある鳥から別の鳥へのウイルス伝播を維持できる。
【００１１】
トリ病原体としてのＮＤＶは、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（１９９７）、Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙに詳細に記載されている。
【００１２】
ニューキャッスル病ワクチン接種
家禽農業の脅威としてのＮＤＶ及びワクチン接種の必要性は、前世紀の初期に既に認識されていた。Ｉｙｅｒ及びＤｏｂｓｏｎは、毒性ＮＤＶ株の弱毒化について、１９３０年代に研究を行い、いくつかの亜病原性ＮＤＶワクチン株の開発へと導いた。生ワクチンの開発は、今日では最も広く使用されるＮＤＶワクチンである、レントジェニックワクチン株ＨｉｔｃｈｎｅｒＢ１及びＬａＳｏｔａの確立により前進した。さらなるワクチン戦略には、担体アジュバント（水酸化アルミニウム、オイルエマルション）と一緒に提供される、不活性化ＮＤＶワクチンの使用（例えば、フォルマリン、β−プロピオラクトンによるなど）がある。
【００１３】
ＮＤＶワクチンの開発の歴史及び現状は、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ（１９９７）、Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ Ｐｏｕｌｔｒｙに記載されている。
【００１４】
逆遺伝法により作製される、組換えＮＤＶに基づく獣医学的使用のための次のワクチンの作製は、Ｈｕａｎｇ等（２００３）で概説され、組換えＮＤＶワクチンは、以下の特許に記載がある。
【００１５】
ＵＳ６,６９９,４７９ Ｂ１は、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）であって、低減したレベルでそのＶタンパク質を発現し、且つ孵化の前に胚のワクチン化に使用されるＮＤＶを記載している。
【００１６】
ＵＳ２００４／００４３０３５は、核タンパク質（ＮＰ）の免疫優勢エピトープを発現できず、且つマーカーワクチン株に適する、組換えＮＤＶ突然変異体に関する。
【００１７】
ＵＳ２００３／０２２４０１７は、組換えＮＤＶワクチンの作製のためのＮＤＶ用の逆遺伝子システムについて記載する。このシステムは、ＮＤＶゲノム由来の導入遺伝子、例えばトリサイトカイン（ニワトリＩＬ−２、ニワトリＩＬ−４）の発現により、ＮＤＶワクチン株を作製することを可能にする。
【００１８】
ＥＰ１ ３００ １５７は、ＨＮ及び／又はＦ糖タンパク質をコードする遺伝子配列における変異を含んでなる、トリ種の卵内ワクチン化に適する、弱毒化変異ニューキャッスル病ウイルス株に関する。
【００１９】
ＵＳ６,７１９,９７９は、クローン化完全長ＤＮＡに完全に由来する感染性ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）の作製のためのプロセス、及びワクチンの使用、及び当該プロセスと共に作製されそして当該プロセスに由来する診断アッセイに関する。
【００２０】
ＷＯ２００７／０２５４３１は、組換え弱毒化ニューキャッスル病Ｌａ Ｓｏｔａ株を作製するための方法、及びニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）により引き起こされる疾患の予防のためのワクチンの調製におけるその使用を記載する。
【００２１】
ＷＯ２０００／０６７７８６は、弱毒化感染性ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）を作るためのｃＤＮＡに関する。弱毒化感染性ＮＤＶを含んでなるワクチンは、当該発明の範囲内である。
【００２２】
組換えパラミクソウイルス
ＥＰ−Ａ−０ ７０２ ０８５は、ウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム、擬似遺伝子領域、又は遺伝子間領域における挿入及び／又は欠失を含んでなる、遺伝子組換え感染性複製非セグメント化ネガティブ一本鎖ＲＮＡウイルス変異体に関する。
【００２３】
ＷＯ９９／６６０４５は、ウイルスゲノムの全長ｃＤＮＡ分子から得られる、遺伝子改変ＮＤＶウイルスに関する。
【００２４】
ＷＯ００／６２７３５は、インターフェロン感受性の複製可能なクローンＲＮＡウイルス、例えばＮＤＶを投与することを含んでなる、腫瘍治療の方法に関する。
【００２５】
ＷＯ０１／２０９８９（ＰＣＴ／ＵＳ００／２６１１６）では、組換え腫瘍退縮パラミクソウイルスを伴う腫瘍を有する患者を治療するための方法を記載する。当該腫瘍は、複製可能なパラミクソウイルス科のウイルスを投与することにより低減される。腫瘍退縮特性を向上させるため、ウイルスゲノムを設計するために使用できる様々な方法が、報告されている。
【００２６】
ＷＯ０３／００５９６４は、サイトカインをコードする核酸を含んでなる、組換えＶＳＶに関する。
【００２７】
ＵＳ２００４／０１７０６０７は、一般的なヒト病原体ではないウイルスを投与することによるメラノーマの治療に関する。
【００２８】
ＮＤＶの遺伝子組換え
ＮＤＶは、例えばＥＰ−Ａ−０ ７０２ ０８５に記載されるような逆遺伝子法を用いる遺伝子組換えを行うことができる。例えば、分泌アルカリホスファターゼ（Ｚｈａｏ及びＰｅｅｔｅｒｓ、２００３）、緑色蛍光タンパク質（Ｅｎｇｅｌ−Ｈｅｒｂｅｒｔ等、２００３）、感染性嚢疾患のＶＰ２タンパク質（Ｈｕａｎｇ等、２００４）、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（Ｎａｋａｙａ等、２００１）及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｈｕａｎｇ等、２００１）（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ等、２０００）をコードする追加の核酸を含んでなる、組換えＮＤＶ構築物を作製することが既知である。これらの組換えＮＤＶのうちで、ヒト疾患の治療における使用のために構築されているものはない。当該組換えＮＤＶは、ＮＤＶの基本的なウイルス学を研究するためか、又は家禽のためのワクチン株を開発するためのいずれかのために作製された。これらの株は、顕著な腫瘍退縮特性を有さない。
【００２９】
ウイルスの遺伝子操作
遺伝子操作ＲＮＡウイルスのための方法は、上記の通り周知である。さらに、腫瘍退縮ウイルスの遺伝子操作は、例えば、Ｂｅｌｌ等（２００２）に概説される。ウイルス療法剤としてのＲＮＡウイルスは、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００２）に概説される。これらの文書の任意の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
トリサイトカイン
トリサイトカインは、Ｓｔａｅｈｅｌｉ等（２００１）に概説されている。ニワトリサイトカイン及びケモカインの遺伝子解析は、Ｋａｉｓｅｒ等（２００５）で記載された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
腫瘍退縮ＮＤＶ株は、１９６０年代初期から、腫瘍療法として研究されている。腫瘍退縮腫瘍療法に使用される大半のウイルス株は、亜病原性ウイルスのクラスに属し、家禽の病原体として記載される。抗腫瘍生物薬物としての腫瘍退縮ＮＤＶを開発するため、潜在的に存在する環境毒素、特に家禽への病原体を低減するべきである。しかしながら、家禽のために弱毒化されるＮＤＶは、腫瘍細胞を溶解させ、且つその腫瘍退縮の潜在力を維持する継続能力を有する必要がある。ワクチンの開発のための現存する戦略は、これらが、完全に不活性化したウイルス粒子の応用か、非病原性レントジェニックウイルス株のいずれかにより、鳥免疫システムの刺激に焦点を当てるために適用できない。いずれのワクチンタイプも、癌細胞においてそれ以上複製できず、且つ腫瘍細胞を溶解する潜在力を実質的に失っている。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明では、ウイルスの腫瘍退縮活性を軽減することなく、逆遺伝子法を活用して、家禽用のＮＤＶ弱毒化を達成することができる。組換え弱毒化ＮＤＶは、サイトカイン、特に抗ウイルス性又は免疫刺激性のサイトカインをコードする導入遺伝子の挿入により創作される。
【００３３】
さらに、ワクチンの目的が二次感染に対して動物を保護する長時間継続免疫性を有する、強力な免疫応答を誘導することであるため、ＮＤＶワクチンにはかかるアプローチが適さない。本発明において、記載されるＮＤＶの弱毒化は、動物に（不所望の）一次感染を制御させ、そしてその結果、増殖性疾患の療法において適用される場合、環境毒性を低減させ、当該ウイルスの安全性を増加させることを可能にするという主要な目標がある。
【００３４】
本発明の主題は、腫瘍退縮ウイルスによる腫瘍細胞の溶解である。かかる腫瘍退縮ウイルスアプローチの適応症は、ヒトにおける癌療法である。対照的に、ＵＳ２００３／０２２４０１７に開示されるような家禽のためのＮＤＶは、動物に適用され、そして動物の健康管理の分野に位置する。すなわち、本発明の目的は、トリサイトカインをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなる、組換え腫瘍退縮ＲＮＡニューキャッスル病ウイルスであって、ここで当該組換え腫瘍退縮ＲＮＡニューキャッスル病ウイルスが、速現性又は亜毒性腫瘍退縮ＲＮＡニューキャッスル病ウイルスから得られる。
【００３５】
本発明のウイルスは、ウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を含んでもよい。
【００３６】
当該少なくとも１つのさらなる導入遺伝子は、宿主に対して部分的な同種異系又は同系である。
【００３７】
本発明の別の態様によれば、本発明のウイルスは、弱毒化ウイルスであってよい。
【００３８】
「弱毒化」又は「弱毒化した」には、トリ種に対するウイルスの病原性の低減、及びトリ種について予測される生物学的アッセイシステムにおける病原体の低減がある（実施例５を参照されたい）。
【００３９】
本発明のさらなる態様は、サイトカインをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなる核酸を含んでなる、家禽用の、弱毒化組換え腫瘍退縮ＲＮＡウイルスである。具体的には、当該ウイルスは、ニワトリ用に弱毒化される。「サイトカインをコードする導入遺伝子」は、本明細書において記載される場合、具体的には「トリサイトカインをコードする導入遺伝子」である。
【００４０】
さらに、本発明は、カプシドタンパク質と複合化したウイルス性ＲＮＡを含んでなる、本発明の組換えウイルスのヌクレオカプシドに関する。さらに、本発明は、本発明のウイルスのＲＮＡである、ＲＮＡに関する。本発明は、本発明のウイルスのＲＮＡに相補的なＲＮＡにも関する。
【００４１】
さらには、本発明は、ＤＮＡ、例えば、本発明のＲＮＡをコードするｃＤＮＡ及び／又は本発明のＲＮＡに相補的なＤＮＡに関する。さらに、本発明は、腫瘍疾患、癌又は／及び増殖性疾患の予防又は治療に関する。
【００４２】
本発明のＲＮＡ又は／及びＤＮＡは、単離状態で提供されてよい。
【００４３】
本発明によれば、本明細書に記載の導入遺伝子によりコードされるサイトカインは、その適切な隣接細胞上のインターフェロン受容体に結合後、本発明のウイルスにより感染される鳥細胞から分泌されてもよく、受容体保持細胞において抗ウイルス状態を誘導してもよい。したがって、インターフェロン刺激鳥細胞における、本発明のウイルスの複製は、少なくとも部分的に阻害されてよい。ニワトリＩ型インターフェロンと、哺乳類Ｉ型インターフェロンとの間の類似性は、非常に低い（アミノ酸レベルで＜２５％同一）（Ｓｔａｅｈｅｌｉ等、２００１）。このため、鳥細胞におけるかかる抗ウイルス効果を発揮するサイトカインは、ヒト細胞において基本的に生物活性を示さず、且つヒト腫瘍細胞におけるウイルス複製への影響は基本的になくてもよい。さらに、ヒト生命体においては、これらのサイトカインによる副作用は基本的に期待されない。
【００４４】
本明細書に記載されるサイトカインをコードする導入遺伝子の発現は、トリ種、具体的には家禽、具体的にはニワトリ用のウイルスの病原性の低減をもたらし、それにより、環境毒素の軽減をもたらす。本明細書に記載のサイトカインをコードする導入遺伝子の活性は、ウイルスの治療効果に、基本的に有害影響をもたらさない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＮＤＶの完全ゲノムと、ニワトリインターフェロン−アルファ（ＣｈＩＦＮ−アルファ）導入遺伝子を含んでなる転写カセットとを含んでなる、プラスミドｐｆＩＭＴＨ６８ＣｈＩＦＮ−アルファについて記載する。
【図２】図２は、ＮＤＶの完全ゲノムと、ニワトリインターフェロン−ベータ（ＣｈＩＦＮ−ベータ）導入遺伝子を含んでなる転写カセットとを含んでなる、プラスミドｐｆＩＭＴＨ６８ＣｈＩＦＮ−ベータについて記載する。
【図３ａ】図３ａは、トリＣＥＣ−３２細胞系列が、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファでの感染後４８時間で、溶解から部分的に保護され、且つＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータでの感染後は強力に保護されることを実証する。ＧＦＰ発現ＮＤＶでの感染は、ＣＥＣ−３２単分子層を完全に破壊する。対照的に、腫瘍形成Ｈｅｌａ細胞系列の感染後、３つのウイルス、ＮＤＶ−ＧＦＰ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ及びＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータの間の溶解効果には違いが見られない。使用したウイルスとは独立に、Ｈｅｌａ細胞単分子膜は、感染後４８時間で、完全に破壊される。
【図３ｂ】図３ｂは、ウイルスＮＤＶ−ＧＦＰ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ及びＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータで感染後４８時間でのＣＥＣ−３２及びＨｅｌａ細胞の生存細胞の定量を示す。ＮＤＶ−ＧＦＰでの感染は、ＣＥＣ−３２細胞のほぼ完全な死滅が観察され、細胞の３％しか生き残らない。ウズラ細胞のＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファでの感染は、感染細胞の２６％を生き続けさせる。最良の保護は、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータウイルスでの感染後に観察され、ＣＥＣ−３２細胞の９６％が生き残る。対照的に、腫瘍形成Ｈｅｌａ細胞の感染後４８時間のバイアビリティは、組換えＮＤＶを使用とは独立に、１０％未満に低下する。
【図４】図４は、巨大な治療域が、腫瘍及び線維芽細胞を、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ及びＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータで感染後に存在することを示す。腫瘍退縮ウイルスＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ及びＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータの増殖阻害は、腫瘍細胞においては非常に強力であり、対照的に、初期の線維芽細胞の感染後は、特に０．１等の低ＭＯＩ及びＭＯＩ０．０１では、増殖阻害がほとんど観察されない。
【図５ａ】図５ａは、４つのウイルス、ＮＤＶ−ＧＦＰ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータ及び非病原性株ＬａＳｏｔａによる、ＮＤＶ感染孵化ニワトリ卵の生存曲線を示す。ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ及びＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータで感染させたニワトリ胚は、ＮＤＶ−ＧＦＰ感染胚よりも長期間生存する。当該曲線は、レントジェニックＮＤＶＬａＳｏｔａ株の生存曲線の方向に明らかにシフトする。
【図５ｂ】図５ｂは、生存曲線の結果から、各感染群についてＭＤＴ（平均死亡時間）を計算する。当該ＭＤＴは、ＮＤＶ−ＧＦＰと比較して、ウイルスＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ及びＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータでは増加する。最高のＭＤＴは、非病原性株ＬａＳｏｔａで観察された。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
ウイルス
本発明は、一般的に、ＲＮＡウイルス、好ましくはネガティブ鎖ＲＮＡウイルス、より好ましくは腫瘍退縮特性を有し、且つ遺伝子設計できるようなウイルスに関する。かかるウイルスは：
−パラミクソウイルス、好ましくはニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、はしかウイルス、おたふく風邪ウイルス、センダイウイルス；
−オルソミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス；
−ラブドウイルス、好ましくは小胞性口内炎ウイルス、である。
【００４７】
本発明のウイルスは、トリ病原体、好ましくは家禽の病原体、より好ましくはニワトリの病原体であることが好ましい。
【００４８】
本発明のウイルスは、ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスであることも好ましい。本発明の組換えＲＮＡウイルスは、パラミクソウイルス、好ましくはニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）であってよい。当該ＮＤＶは、亜病原性又は速現性の株であってよい。ＮＤＶは亜病原性ＮＤＶであることが好ましい。
【００４９】
本発明のウイルスは、速現性又は亜病原性の腫瘍退縮ＲＮＡニューキャッスル病ウイルス、具体的には株ＭＴＨ６８から得られる。
【００５０】
本発明のウイルスは、好ましくは複製成分である。
【００５１】
本発明のウイルスは、具体的には、組換えウイルスが得られるウイルスに対して、トリ種への病原性が低減されていてよい。
【００５２】
本発明のウイルスにおいて、病原性低減とは、細胞バイアビリティの増加により測定される、ＭＯＩ０．０１で、感染後約４８時間のトリ細胞溶解を低減させるウイルスの能力であり、これにより、細胞バイアビリティは、組換えウイルスが得られるウイルスに対して、生存細胞が少なくとも約２５％（例えば、少なくとも約２５％〜約５０％まで）、より好ましくは生存細胞が少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５０％〜約７５％まで）、及び最も好ましくは生存細胞が少なくとも約７５％（例えば、少なくとも約７５％〜約１００％まで）増加することが好ましい。
【００５３】
本発明のウイルスにおいて、病原性低減は、平均死亡時間（ＭＤＴ）決定法により測定された、１１日齢孵化卵におけるウイルス感染ニワトリ胚の生存期間の延長であり、これにより、組換えウイルスが得られるウイルスに対して、ＭＤＴが少なくとも約１５時間（例えば、約１５時間〜約２０時間まで）、より好ましくは少なくとも約２０時間（例えば、約２０時間〜約３０時間まで）、及び最も好ましくは３０時間超にまで延長されることが好ましい。
【００５４】
さらなる別の実施態様によれば、ヒト腫瘍に対する本発明のウイルスの腫瘍退縮活性は、基本的に低減されない。
【００５５】
本発明のウイルスにおいて、感染後４８時間後に、細胞バイアビリティにより測定される、ヒト腫瘍細胞へのウイルスの腫瘍退縮活性が、組換えウイルスが得られるウイルスと比較して、５０％超は低減しない、そしてより好ましくは、組換えウイルスが得られるウイルスに対し基本的に低減しないことが好ましい。
【００５６】
サイトカイン
本明細書に指示されるような少なくとも１つの導入遺伝子によりコードされるサイトカインは、任意のサイトカインでよい。特に、当該サイトカインは、鳥細胞において、具体的には家禽細胞において、より具体的には、ニワトリ細胞において、少なくとも部分的にウイルス複製を阻害できるサイトカインであってよい。ウイルス複製は、基本的に、完全に阻害されることが好ましい。
【００５７】
当該サイトカインは、哺乳類において、具体的には人間において基本的に生物活性のないサイトカインであってよい。これに関連して、「生物活性」は、少なくとも部分的にウイルス複製、具体的には本発明のウイルスの複製を阻害するサイトカインの能力のことを言う。「生物活性」は、非哺乳類細胞又は／及び非哺乳類において呈示されてよいサイトカインの他の活性のことも言う。
【００５８】
サイトカインは、トリにおける、具体的には家禽における、より具体的にはニワトリにおける少なくとも部分的なウイルス複製を阻害できるサイトカインであってよく、そして哺乳類、具体的には人間において基本的に生物活性を有さなくてもよい。
【００５９】
当該サイトカインは、トリサイトカイン、具体的には家禽サイトカイン、より具体的にはニワトリサイトカインから選択されてよい。
【００６０】
サイトカインは、インターフェロン、具体的にはトリインターフェロン、より具体的にはニワトリインターフェロン、より具体的にはニワトリＩ型インターフェロンから選択されてよい。
【００６１】
当該インターフェロンは、インターフェロン−ベータであるか、インターフェロン−アルファファミリーの構成インターフェロンであってよい。
【００６２】
好ましい実施態様によれば、組換え腫瘍退縮ＲＮＡウイルスは、ニワトリインターフェロン−アルファ又は／及びニワトリインターフェロン−ベータをコードする導入遺伝子を含んでなる核酸を含んでなるＮＤＶである。
【００６３】
導入遺伝子
導入遺伝子は、ウイルスゲノムに導入される追加の核酸として、ＮＤＶゲノムに関連して定義される。当該核酸は、異なるゲノム供給源（例えば、ＮＤＶゲノム、異なるウイルスクラス、原核生物もしくは真核生物の供給源、哺乳類もしくは非哺乳類の種）から選択できる。２以上の異なるゲノム供給源からの融合導入遺伝子も可能である。核酸配列のデノボ合成に基づいて合成導入遺伝子も構築できる。当該核酸は、少なくとも１つの転写カセット内に位置する必要がある。好ましくは、当該導入遺伝子は、感染細胞においてタンパク質に翻訳される。このため、当該導入遺伝子配列は、翻訳開始及び停止コドンを含むべきである。
【００６４】
本発明の組換え腫瘍退縮ウイルスは、結合タンパク質、プロドラッグ変換酵素、及びプロテアーゼをコードする導入遺伝子から独立に選択される、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子をコードする核酸を含んでもよい。
【００６５】
少なくとも１つのさらなる導入遺伝子は、好ましくは、ウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する結合タンパク質をコードする。
【００６６】
別の好ましい実施態様によれば、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子は、ウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有するプロドラッグ変換酵素をコードする。
【００６７】
さらに別の好ましい実施態様によれば、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子は、ウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有するプロテアーゼをコードする。
【００６８】
特に断りがなければ、本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」又は「少なくとも１つの導入遺伝子」は、トリサイトカインをコードする導入遺伝子のことを言うか、又はウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する少なくとも１つのさらなる導入遺伝子、又はその組み合わせのことを言う。「導入遺伝子」の定義は、特に断りがなければ、具体的には、本明細書で記載される、ウイルスゲノム内の導入遺伝子の位置及び数に適用される。
【００６９】
本発明のＲＮＡウイルス、ゲノム、アンチゲノム、ヌクレオカプシド及び／又はＤＮＡ分子は、本明細書に記載される導入遺伝子を含んでもよく、それは本明細書に記載される転写カセット内に位置してもよい。
【００７０】
本発明の組換え腫瘍退縮ウイルスは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの、各々本明細書に記載される導入遺伝子を含んでなる核酸を含んでもよい。本発明の組換え腫瘍退縮ウイルスは、各々本明細書に記載の導入遺伝子を含んでなる最大５つの核酸を含んでもよい。具体的には、本発明の組換え腫瘍退縮ウイルスは、各々本明細書に記載の導入遺伝子を含んでなる、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの核酸を含んでなる。本発明の組換えウイルスが、少なくとも２つの導入遺伝子を含んでなる場合、これらは同一であっても、異なってもよい。
【００７１】
少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなる核酸は、ウイルス遺伝子のリーディングフレーム間の任意の位置に位置してよい。具体的には、少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなる核酸は、Ｎ遺伝子の５'、ＮとＰ遺伝子との間、ＰとＭ遺伝子との間、ＭとＦ遺伝子との間、ＦとＨＮ遺伝子との間、ＨＮとＬ遺伝子との間、又は／及びＬ遺伝子の３'に位置してよい。核酸は、５１位以上、例えば、Ｎ遺伝子の５１、ＮとＰ遺伝子との間、又は／及びＰとＭ遺伝子との間に位置してよく、これはかかる位置が３’位置以上と比較して発現の向上がもたらされるからである。
【００７２】
好ましくは、本発明のウイルスは、本明細書に記載の導入遺伝子の腫瘍選択的発現をもたらす、腫瘍選択的感染を呈する。
【００７３】
本発明の組換えＲＮＡウイルスは、総計で、最大５つの導入遺伝子、最大４つの導入遺伝子、又は最大３つの導入遺伝子を含んでもよい。
【００７４】
本発明において、トリサイトカインをコードする導入遺伝子、又はウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する少なくとも１つのさらなる導入遺伝子、又はその組み合わせは、好ましくは、本発明の組換えＲＮＡウイルスがそれに基づく腫瘍退縮ＲＮＡウイルスに対して異種である。本明細書で使用される場合「異種」なる用語は、遺伝子のコード領域又はその部分であってよい、完全遺伝子又はその部分のことを言う。
【００７５】
異種核酸は、人工核酸であっても、天然供給源から得られても、又は天然供給源から得られる核酸及び／又は人工核酸から選択される少なくとも２つの核酸の組換えによってもよい。「天然供給源」には、本発明の腫瘍退縮ＲＮＡウイルスとは異なってもよい、哺乳類等の動物、植物、真菌、及び細菌、原生動物及びウイルス等の微生物が含まれる。
【００７６】
導入遺伝子は、融合タンパク質をコードしてもよい。
【００７７】
本発明の別の実施態様によれば、トリサイトカインをコードする導入遺伝子、及びウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する少なくとも１つのさらなる導入遺伝子は、少なくとも２つの別々の転写単位に位置してよい。
【００７８】
トリサイトカインをコードする少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなる核酸を含んでなる少なくとも１つの転写単位は、本明細書に記載の腫瘍細胞において転写されてもよい。
【００７９】
ウイルス感染腫瘍により発現される場合に治療活性を有する少なくとも１つの第二の導入遺伝子を含んでなる核酸を含んでなる少なくとも１つの転写単位は、本明細書に記載の鳥細胞において転写されてもよい。
【００８０】
少なくとも２つの別々の転写単位の各々は、本明細書に記載の腫瘍細胞において、及び本明細書に記載の鳥細胞において転写されてよい。
【００８１】
別の好ましい実施態様によれば、トリサイトカインをコードする少なくとも１つの導入遺伝子、及びウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する少なくとも１つのさらなる導入遺伝子は、本明細書に記載の腫瘍細胞において、及び本明細書に記載の鳥細胞において翻訳される。
【００８２】
結合タンパク質
本明細書の腫瘍退縮組換えＲＮＡウイルスにおいて、ウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する少なくとも１つのさらなる導入遺伝子は、結合タンパク質をコードしてよい。
【００８３】
したがって、本発明の主題は、活性成分として、本発明の組換え腫瘍退縮ウイルス、本発明のウイルスゲノム、本発明のウイルスアンチゲノム、及び／又は本発明のＤＮＡ分子と、任意に、医薬的に許容される担体、希釈剤及び／又はアジュバントと一緒に含んでなる医薬組成物であり、ここでウイルス、ウイルスゲノム、アンチゲノム及び／又はＤＮＡ分子は、結合タンパク質をコードするウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を含んでなる。
【００８４】
結合タンパク質は、標的細胞において発現される場合、当該細胞及び／又は隣接細胞の成分に結合できるタンパク質である。好ましくは、結合タンパク質は、細胞内成分に結合するタンパク質である。
【００８５】
好ましい実施態様によれば、結合タンパク質は、以下の、天然リガンド、遺伝子改変リガンド、天然受容体の組換え可溶性ドメイン及びその改変バージョン、ペプチドリガンド、ポリペプチドリガンド、抗体分子及びその断片及び誘導体、並びにアンキリン反復タンパク質及びその断片及び誘導体のような抗体様分子、からなる群から選択される。
【００８６】
高親和性の結合フレームワークの不完全な概説は、Ｌａｄｎｅｒ及びＬｅｙ（２００１）によって提供されている。
【００８７】
本明細書に記載の結合タンパク質は、ヒト、マウスもしくは近縁起源のもの、又はキメラバージョン、例えば異なる種、例えばヒトとマウス由来の配列を含んでなる融合タンパク質であってよいタンパク質であってよい。
【００８８】
上の記載に基づく組換え結合分子は、単量体、二量体、三量体、四量体、又は多量体タンパク質であってよい。上の記載に基づく組換え結合分子は、単一特異的、二重特異的、又は多重特異的であってよい。
【００８９】
好ましい結合タンパク質は、治療活性を有する結合タンパク質から選択される。
【００９０】
本明細書に記載の天然リガンドは、増殖因子又はペプチドであってよい。遺伝子改変リガンドは、天然の増殖因子又はペプチドの類似体であってよい。
【００９１】
本明細書に記載の天然受容体の組換え可溶性ドメイン又はその改変バージョンは、細胞表面受容体の組換え法により発現された可溶性細胞外ドメイン、及び／又はその断片、細胞接着分子の組換え法により発現された可溶性細胞外ドメイン及び／又はその断片である。
【００９２】
上記の抗体分子は、任意の既知の特異性及びアイソタイプのモノクローナル免疫グロブリン抗体、その断片及び／又はエフェクタータンパク質に融合したその断片であってよい。抗体分子は、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体であってよい。抗体断片は、抗体の少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。抗体断片は、文献に広範囲にわたり記載されている（Ａｌｌｅｎ（２００２）、参照により本明細書に組み込まれる）。好ましい例は、一本鎖Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ２'）、ミニボディと呼ばれるドメイン欠失バージョン、及び他の免疫活性タンパク質、断片、セグメント及び他のより小さい又はより大きい部分抗体構造物であり、ここで最後のものは、本発明の方法内で治療に有用であるように、十分な標的特性、又は免疫学的な刺激もしくは阻害活性を有する。
【００９３】
かかる抗体は、遺伝子組換えマウスの使用によりハイブリドーマクローニング実験から、又はヒト抗体配列を含む抗体ライブラリーのファージディスプレイセレクション、リボソームディスプレイセレクション、又はコロニーフィルタースクリーニング、又は関連方法から得てよい。
【００９４】
本明細書に記載の抗体用特性を有する結合タンパク質は、遺伝子改変タンパク質か、そのドメインであってよく、ここで１又は複数のペプチドループは、アミノ酸のレベルを無作為化し、当該手法で、高い特異性を有する高親和性結合分子を、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、コロニーフィルタースクリーニング又は関連方法によるか、かる分子のライブラリーからの任意の抗原を濃縮してもよい。通常、選択タンパク質は、高い熱的及び熱力学的安定性を有し、且つＥ．ｃｏｌｉ、酵母、虫、及び哺乳類の発現システム等の組換え発現システムにおいてよく発現される。抗体様特性を有するかかる結合タンパク質の例は、Ｂｉｎｚ等（２００４）に記載されるアンキリン反復タンパク質、Ｓｋｅｒｒａ（２０００）に記載されるリポカリン、ＤＥ１９９ ３２ ６８８.６に記載されるガンマ−クリスタリン、Ｈｏｇｂｏｍ等（２００３）又はＮｏｒｄ等（２０００）に記載される改変タンパク質Ａスキャホールド（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、又はフィブロネクチンフレームワーク等である。抗体様分子は、単量体であるか、又は一本鎖分子か、もしくは多重鎖分子のいずれかとして構築された反復分子であってよく、ここで、当該抗体様分子は、本発明の方法内で治療に有用であるよう、十分な標的特性又は免疫学的刺激もしくは阻害活性を有する。
【００９５】
本発明の別の主題は、本明細書に記載の結合タンパク質をコードするウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有するすくなくとも１つのさらなる導入遺伝子を含んでなる、本発明の組換え腫瘍退縮ウイルス、本発明のウイルスゲノム、本発明のウイルスアンチゲノム、及び／又は本発明のＤＮＡ分子を、それを必要とする対象に、医薬有効量で投与することを含んでなる、増殖性疾患、具体的には過剰増殖性疾患、例えば腫瘍又は癌の治療のための方法である。
【００９６】
追加の機能を有する結合分子
結合タンパク質は、少なくとも１つの結合ドメイン、例えば、抗体由来、及び少なくとも１つの異種ドメインを含んでなる融合タンパク質であってよい。「異種」は、異種遺伝子に関連して上で議論された意味を有する。
【００９７】
上記の結合タンパク質は、いわゆる細胞内抗体又は細胞外利用可能な結合タンパク質として、疾患特異的部位（例えば、腫瘍）へのペイロードを送達することができる。送達されたペイロードは異種ドメイン、例えばヒトＲＮＡｓｅ（Ｄｅ Ｌｏｒｅｎｓｚｏ等、２００４）（Ｚｅｗｅ等、１９９７）、シュードモナス外毒素（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ等、１９８９）（Ｋｒｅｉｔｍａｎ及びＰａｓｔａｎ、１９９５）（Ｂａｔｒａ等、１９９２）、ジフテリア毒素（Ｋｒｅｉｔｍａｎ等、１９９３）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ等、１９９０）（Ｂａｔａｒａ等、１９８１）等の毒素、又は治療活性を有する、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ（Ｒｏｆｆｌｅｒ等、１９９１）（Ｗａｎｇ等、１９９２）（Ｂｏｓｓｌｅｔ等、１９９２）、ベータ−グルコシダーゼ（Ｒｏｗｌｉｎｓｏｎ−Ｂｕｓｚａ、１９９２）、カルボキシペプチダーゼ（Ａｎｔｏｎｉｗ等、１９９０）、（Ｂａｇｓｈａｗｅ等、１９８８）、ベータ−ラクタマーゼ等の酵素、又はＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ又はＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカイン活性を有する免疫刺激タンパク質（例えば、Ａｌｌｅｎ（２００２）による概説を参照されたい）であってよい。
【００９８】
別の例によれば、上記の結合タンパク質は、治療的に有用である、それ自身の拮抗的又は作動的効果を有する。拮抗的／阻止的結合分子の例は、ＶＥＧＦ阻害抗体アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）Ｆｅｒｒａｒａ等、２００４）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体結合抗体ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（Ｎｏｏｎｂｅｒｇ及びＢｅｎｚ、２０００）、又はＥＧＦ−受容体阻止抗体アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）（Ｈｅｒｂｓｔ及びＬａｎｇｅｒ、２００２）である。作動的結合タンパク質は、例えばアポトーシス（Ｇｅｏｒｇａｋｉｓ等、２００５）を含むか、又はＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質への調整活性（例えば、転写の誘導、タンパク質の安定化）を有する結合タンパク質があり得る。（Ａｄａｍｓ及びＷｅｉｎｅｒ、２００５）によるが概説では、腫瘍退縮ウイルスへ組み込むこともできる様々な治療抗体について記載している。
【００９９】
プロドラッグ変換酵素
本発明の腫瘍退縮組換えＲＮＡウイルスにおいて、ウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する少なくとも１つのさらなる導入遺伝子は、プロドラッグ変換酵素をコードしてもよい。
【０１００】
プロドラッグは、治療活性化合物の誘導体又は前駆体であり、これは活性化合物に酵素的に変換できる。プロドラッグ変換酵素は、プロドラッグを治療活性なドラッグへ変換できる酵素である。
【０１０１】
したがって、本発明の主題は、活性成分として、本発明の組換え腫瘍退縮ウイルス、本発明のウイルスゲノム、本発明のウイルスアンチゲノム、及び／又は本発明のＤＮＡ分子と、任意に、医薬的に許容される担体、希釈剤、及び／又はアジュバントを一緒に含んでなる医薬組成物であり、ここでウイルス、ウイルスゲノム、アンチゲノム、及び／又はＤＮＡ分子は、プロドラッグ変換酵素をコードするウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を含んでなる。
【０１０２】
当該医薬組成物は、ウイルス、ウイルスゲノム、アンチゲノム、及び／又はＤＮＡ分子によりコードされるプロドラッグ変換酵素により治療活性化合物に変換されることができるプロドラッグをさらに含んでもよい。当該医薬組成物は、増殖性疾患の治療及び／又は緩和に適してもよい。
【０１０３】
当該プロドラッグは、活性成分として、本発明の組換え腫瘍退縮ウイルス、本発明のウイルスゲノム、本発明のウイルスアンチゲノム、及び／又は本発明のＤＮＡ分子を有する単一組成物として製剤化されても、腫瘍退縮ウイルス調製物とは異なる組成物中に製剤化されてもよい。
【０１０４】
本発明の腫瘍退縮組換えＲＮＡウイルスがプロドラッグ変換酵素をコードする場合、本発明の腫瘍退縮ウイルスは、プロドラッグ変換酵素を通常発現しないか、又は十分に発現しない、ウイルス感染標的細胞（具体的には、腫瘍細胞）におけるプロドラッグ変換酵素の選択的発現を引き起こす。すなわち、それを必要とする対象の治療の間、当該プロドラッグは、標的細胞、具体的には腫瘍細胞において、医薬活性化合物に選択的に変換されるが、非標的細胞、具体的には治療される対象の健常な細胞において、基本的に治療活性化合物に変換されなくてよい。すなわち、治療活性化合物の不所望の副作用は、治療活性化合物単独の治療と比較して低減される。
【０１０５】
本発明に関連して、当該プロドラッグは、プロドラッグをプロドラッグ変換酵素により変換できる、増殖性疾患、腫瘍、又は／及び癌の治療及び／又は緩和に適する治療活性化合物の誘導体もしくは前駆体であってよい。当該プロドラッグは、当該技術分野の通常の知識を有する者により既知の化合物であってよい。誘導体及び／又は前駆体は、当該技術分野の通常の知識を有する者に既知である。
【０１０６】
プロドラッグは、基本的に医薬的に不活性及び／又は無毒性であることが好ましい。
【０１０７】
本発明のプロドラッグ変換酵素の例は、ベータ−グルクロニダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼである。さらなる例は、当該技術分野の通常の知識を有する者に既知である。
【０１０８】
プロドラッグ変換酵素は、非腫瘍細胞においては基本的に発現されないことが好ましい。
【０１０９】
プロドラッグ変換酵素は、哺乳類、植物、真菌、並びに細菌、原生動物及びウイルス等の微生物から選択される生物から得てもよい。
【０１１０】
プロドラッグ変換酵素及びプロドラッグの最も好ましい組み合わせは、Ｅ．ｃｏｌｉベータ−グルクロニダーゼと、ベータ−グルクロニダーゼにより活性細胞毒化合物に変換できるプロドラッグである。例としては、癌の治療のための化合物として知られるドキソルビシンに変換できる、ＨＭＲ１８２６（ドキソルビシン−グルクロニド）がある。
【０１１１】
本発明の別の主題は、本明細書に記載のプロドラッグ変換酵素をコードする、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を含んでなる、本発明の組換え腫瘍退縮ウイルス、本発明のウイルスゲノム、本発明のウイルスアンチゲノム、及び／又は本発明のＤＮＡ分子を、それを必要とする対象に、医薬有効量で投与することを含んでなる、増殖性疾患、具体的には腫瘍もしくは癌等の過剰増殖性疾患の治療のための方法である。
【０１１２】
具体的には、本発明の主題は、（i）プロドラッグ変換酵素をコードする、少なくとも１つの導入遺伝子を含んでなる本発明の組換え腫瘍退縮ウイルス、本発明のウイルスゲノム、本発明のウイルスアンチゲノム、及び／又は本発明のＤＮＡ分子、及び（ii）増殖性疾患の治療に適するプロドラッグであって、（i）のプロドラッグ変換酵素により医薬活性化合物に変換えきるプロドラッグを、それを必要とする対象に、医薬有効量で投与することを含んでなる、増殖性疾患、具体的には腫瘍もしくは癌等の過剰増殖性疾患の治療のための方法である。
【０１１３】
当該方法は、（i）及び（ii）の両方を含んでなる単一医薬組成物の投与を含んでもよく、あるいは、一方は成分（i）を含んでなり、他方は（ii）を含んでなる２つの異なる医薬組成物の投与を含んでもよい。
【０１１４】
プロテアーゼ
本発明の腫瘍退縮組換えＲＮＡウイルスにおいて、ウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する少なくとも１つのさらなる導入遺伝子は、プロテアーゼをコードしてもよい。
【０１１５】
したがって、本発明の主題は、活性成分として、本発明の組換え腫瘍退縮ウイルス、本発明のウイルスゲノム、本発明のウイルスアンチゲノム、及び／又は本発明のＤＮＡ分子と、任意に、医薬的に許容される担体、希釈剤及び／又はアジュバントと一緒に含んでなる医薬組成物であり、ここでウイルス、ウイルスゲノム、アンチゲノム及び／又はＤＮＡ分子は、プロテアーゼをコードするウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を含んでなる。当該医薬組成物は、増殖性疾の治療及び／又は緩和に適してよい。
【０１１６】
本発明の腫瘍退縮組換えＲＮＡウイルスが、プロテアーゼをコードする場合、本発明の腫瘍退縮組換えＲＮＡウイルスは、プロテアーゼを通常発現しないか、もしくは十分に発現しないウイルス感染標的細胞（具体的には腫瘍細胞）においてプロテアーゼの選択的発現を引き起こしてよい。すなわち、それを必要とする対象の治療の間、当該プロテアーゼは、標的細胞において、標的ポリペプチドを不可逆的に切断し、それにより当該標的細胞の増殖及び／又は生育を阻害するか、又は当該標的細胞を死滅させてもよいが、非標的細胞、具体的には治療される対象の健常細胞においては、当該標的分子を基本的に切断しなくてよい。この戦略により、プロテアーゼ治療の不所望の副作用は低減される。
【０１１７】
当該プロテアーゼは配列特異的なプロテアーゼであることが好ましい。標的ポリペプチドを特異的に切断するプロテアーゼがより好ましい。当該プロテアーゼは、天然起源且つ任意の種由来であっても、設計されてもよい。既定の標的ポリペプチドの特異的切断に適するアミノ酸配列は、当該技術分野における通常の知識を有する者により、例えば一般に利用可能な配列データベースに基づいて決定できる。ＵＳ２００５−０１７５５８１及びＵＳ２００４−００７２２７６は、既定の基質特異性を有する、設計タンパク質プロテアーゼの作製について記載している。これらの２つの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
プロテアーゼの標的分子は、以下の結合タンパク質の標的として記載される任意の標的分子であってもよい。
【０１１９】
本発明の別の主題は、活性成分として、プロテアーゼをコードするウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する、少なくとも１つのさらなる導入遺伝子を含んでなる、本発明の組換え腫瘍退縮ウイルス、本発明のウイルスゲノム、本発明のウイルスアンチゲノム、及び／又は本発明のＤＮＡ分子を、それを必要とする対象に、医薬有効量で投与することを含んでなる、増殖性疾患、具体的には腫瘍もしくは癌等の過剰増殖性疾患の治療のための方法である。
【０１２０】
本発明の導入遺伝子は、上記のプロドラッグ変換酵素、上記の結合分子、及び／又は上記のプロテアーゼの融合タンパク質をコードしてよい。プロドラッグ変換酵素及び結合分子の融合タンパク質、又はプロテアーゼ及び結合分子の融合タンパク質が特に好ましい。
【０１２１】
治療的応用
本発明は、活性成分として、本明細書に記載のウイルス、当該ウイルスのヌクレオカプシド、当該ウイルスのゲノム、又は当該ウイルスのゲノムもしくは／及びアンチゲノムをコードするＤＮＡ分子と、任意に、医薬的に許容される担体、希釈剤、及び／もしくはアジュバントを含んでなる医薬組成物に関する。
【０１２２】
当該医薬組成物は、溶液、懸濁物、凍結乾燥物として、又は任意の他の好適な状態で提供されてよい。活性成分に加え、当該組成物は、当該技術分野で既知の担体、緩衝剤、界面活性剤及び／又はアジュバントを含んでもよい。当該組成物は、例えば、経口、経鼻、経肺、又は局所もしくは静脈内注入により投与してよい。医薬組成物は、障害のタイプ、患者の症状及び体重、投与の経路等に依存して医薬有効量で投与される。好ましくは、１投与当たり、１０９〜１０１２ウイルス粒子、１０８〜１０１１、１０７〜１０１０、又は１０６〜１０９ウイルス粒子が投与される。腫瘍退縮療法は、任意に他の腫瘍療法、例えば外科、放射線及び／又は化学療法、例えばシクロホスファミド治療及び／又は異常好熱治療と組み合わせてもよい。
【０１２３】
さらに別の態様は、組換え腫瘍退縮ウイルスであって、ここで本明細書に記載の通り、当該ウイルスのヌクレオカプシド、当該ウイルスのゲノム、又は当該ウイルスのゲノムもしくは／及びアンチゲノムをコードするＤＮＡ分子を含んでなるウイルスと、任意に、医薬的に許容される担体、希釈剤、及び／もしくはアジュバントを、それを必要とする対象に投与に、医薬有効量投与することを含んでなる、増殖性疾患又は／及び癌の治療のための方法である。
【０１２４】
本発明によれば、組換え腫瘍退縮パラミクソウイルスは、感染細胞にそのまま残っても、分泌されてもよい、可溶性結合タンパク質、プロドラッグ変換酵素及び／又はプロテアーゼ、例えば、抗体、抗体断片、アンキリン反復タンパク質又は以下に特定される別の結合分子等であってよい。
【０１２５】
ＮＤＶの例として、本発明において株ＮＴＨ６８が選択され、これは患者の実験的臨床治療からの期待の持てるデータで、固有の腫瘍退縮特性を有するためである（Ｓｉｎｋｏｖｉｃｓ及びＨｏｒｖａｔｈ、２０００）。しかしながら、原理上は、マルチベーシック（ｍｕｌｔｉｂａｓｉｃ）融合タンパク質切断部位を有する大部分のＮＤＶ株を、腫瘍の治療のための腫瘍退縮剤として使用してよい。当該逆遺伝子法は、全ての株に適用できる。
【０１２６】
本明細書に記載の結合タンパク質は、高い治療潜在力を有することが実証されている。
【０１２７】
上記の特性の治療結合タンパク質、プロドラッグ変換酵素及び／又はプロテアーゼを有する腫瘍退縮ＮＤＶの組み合わせは、追加の、又は２つの治療原理のさらに相乗的な効果を有することになる。腫瘍退縮自己複製ウイルスは、それが局所濃度が高いインサイチュで発現される場合、好ましい作用部位で、結合タンパク質ドラッグ、プロドラッグ変換酵素及び／又はプロテアーゼを標的とする。かかるタンパク質発現は、非常に選択的であることが期待され、且つそれぞれの作用様式を有する結合タンパク質、プロドラッグ変換酵素及び／又はプロテアーゼを、ＮＤＶの内因性の治療腫瘍退縮活性に追加することになる。使用されるウイルスの複製成分の性質及び腫瘍細胞中での選択的複製に基づくと、発現導入遺伝子［結合タンパク質、プロドラッグ変換酵素、及び／又はプロテアーゼ］の量は、大まかに腫瘍の質量に比例することが期待される。
【０１２８】
抗体分子又は抗体様分子又はその誘導体は、ＮＤＶシステムで使用される理想的な結合タンパク質である。抗体分子は、集中的な研究の対象であり、且つ非免原性で、非常に選択性が高く、且つ高親和性である抗体分子を作製する技術は、現在利用可能である。高濃度での抗体分子の局所発現は、非常に顕著な作用的もしくは拮抗的効果をもたらすか、又は標準的な療法と比較して低減した毒性プロファイルを有するエフェクター分子を効率的に標的とする。
【０１２９】
ＮＤＶシステムにおける抗体様分子の使用は、さらに優れていると期待される。これらの分子は、通常の抗体と比較して、非常に高い熱的安定性を有する選択的な高親和性の結合のために設計され、そして生み出される。アンキリンベースの抗体様分子の場合、分子の反復性質は、最適化したターゲティング、結合、阻害又は活性化のために、個別の標的について微調整することができる。異なる結合特異性を有する複数単位が１つのアンキリン反復分子へ加わる可能性を有効に利用して、異なる結合特性を１つのアンキリン分子内で組み合わせることもできる。このモジュール構造は、タンパク質−タンパク質相互作用の阻止において非常に重要となり得る抗体に、それが可能であるよりもより大きいタンパク質表面の多価結合をせることができる。当該モジュール構造は、アンキリン反復タンパク質のたった１度の単一の阻止で、複数のエフェクターを阻止するためにも有効に利用することができる。
【０１３０】
アンキリン反復分子は還元条件下でさえ非常に安定であるため、これらの分子は、細胞内でタンパク質を標的とするよう設計することができる（「細胞内抗体」）。
【０１３１】
インビボ標的同定のために、ＮＤＶを有する結合タンパク質コード配列のライブラリーの使用も可能である。
【０１３２】
結合分子又は／及びプロテアーゼの可能性ある標的は、標的細胞又は当該標的細胞を囲む細胞外マトリクスの全ての構造である可能性があり、これは記載の結合タンパク質又は／及びプロテアーゼにより認識でき、且つ病理学的表現型の特定のタイプと関連する。これらは、構造タンパク質、酵素、増殖因子、増殖因子受容体、インテグリン、転写因子等であってよい。
【０１３３】
本発明により、小分子（タンパク質−タンパク質相互作用、ＤＮＡ−結合等）で薬物になり得る（ｄｒｕｇａｂｌｅ）標的でさえ、記述することができる。
【０１３４】
腫瘍退縮ＮＤＶと、本明細書に記載の治療結合タンパク質、プロドラッグ変換酵素及び／又はプロテアーゼとの組み合わせは、炎症性疾患、例えばリウマチ様関節炎の、及び癌の治療用として想定することができる。
【０１３５】
癌の治療のために、癌の進行に寄与する全ての経路を標的とすることができる。これらの経路は：増殖シグナルにおける自給自足、増殖阻害（抗増殖）シグナルへの非感受性、アポトーシスの回避、無限の複製潜在力、血管新生の持続、並びに組織侵襲及び転移である。これらの経路のまとめは、（Ｈａｎａｈａｎ及びＷｅｉｂｅｒｇ、２０００）に提供されている。腫瘍形成に関与し、且つ記載のアプローチで標的とすることができるシグナル伝達経路は、受容体チロシンキナーゼ経路（ＲＴＫ）経路、ＲＢ及びｐ５３経路、アポトーシス経路、ＡＰＣ経路、ＨＩＦ１経路、ＧＬＩ経路、Ｐ１３Ｋ経路、及びＳＭＡＤ経路である。これらのシグナル伝達経路の詳細な記載は、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ及びＫｉｎｚｌｅｒ（２００４）に提供されている。
【０１３６】
記載の結合タンパク質が干渉できるはずである他のシグナル伝達経路は、ｒａｓ、Ｗｎｔ及びＨｅｄｇｅｈｏｇ経路であり、例えば、タンパク質−タンパク質相互作用が阻止され得る。
【０１３７】
癌細胞における上記の経路において、有利に介在する結合タンパク質の例には、以下のものがある。
−自立活性増殖因子受容体の阻止タンパク質（例えば、ＥＧＦＲ、Ｍｅｔ）
−増殖因子に対する競合的結合剤（アンタゴニスト）
−Ｒｂ−リン酸化の阻止タンパク質
−Ｅ２Ｆ依存性転写の阻止タンパク質
−ｐ５３の安定化剤
−抗アポトーシスタンパク質の拮抗結合剤（例えばＢｃｌ−２）
−サイクリンの拮抗結合剤
−Ｒａｓエフェクターの拮抗結合剤（例えば、ＧＥＦ）
−低酸素誘導タンパク質の拮抗結合剤（例えば、ＨＩＦ１α）
−二量化、ＤＮＡ結合及び／もしくは補因子結合を干渉する転写因子の阻害剤（例えばＭｙｃ／Ｍａｘ）
−分化誘導剤
−ｓｍａｄシグナル伝達／転座の阻害剤
−細胞接着相互作用の阻害剤（カドヘリン、インテグリン、例えばα５β１、αｖβ３）
−細胞外マトリクスを分解する酵素の阻害剤（例えば、ＭＭＰ）
−血管新生誘導リガンドの拮抗結合剤（例えば、可溶性ＶＥＧＦ−Ｒ）
−有糸分裂キナーゼの阻害剤（例えば、Ｐｌｋ−１）
−血管新生誘導受容体への拮抗結合剤
−スキャホールド複合体形成の阻害剤（例えば、ＫＳＲ／Ｒａｓ）
−翻訳開始の阻害剤（例えば、ｅＩＦ４Ｅ、ＥＩＦ２ａ）
【０１３８】
本発明のプロテアーゼ、プロドラッグ変換酵素及び／又は当該プロドラッグ変換酵素により本発明のプロドラッグから得られる治療活性化合物も、上記の癌細胞経路に有利に介在することができる。
【０１３９】
組換えウイルス
組換えウイルスは、そのゲノムＲＮＡ配列において設計された規定の変更を有するウイルスを意味する。この変更は、１又は複数の挿入、欠失、部位特異的変異導入又はその組み合わせであってよい。
【０１４０】
本発明の組換えＲＮＡウイルスは、天然の（非改変の）ＲＮＡウイルスの完全ゲノム配列、又はその誘導化配列を含んでよく、且つ少なくとも１つの組換え転写カセットを追加的に含んでもよい。少なくとも１つの転写カセットは、当該ウイルスゲノムの２つの遺伝子の間に位置してよい（転写単位）。この場合、当該少なくとも１つの転写カセットは、転写開始及び停止配列と隣接する。当該少なくとも１つの転写カセットはまた、ウイルスゲノムの転写単位内に位置してもよい。この場合、追加の転写開始及び停止配列は必要ない。
【０１４１】
当該少なくとも１つの転写カセットは、Ｐａｄ又は／及びＡｓｃｌ等、特有であってもよい制限部位を含んでよい。２つの転写カセットが存在する場合、これらは異なる制限部位を含んでよい。
【０１４２】
本発明のＲＮＡウイルスは、１又は２つの組換え転写カセットを含んでなることが好ましい。
【０１４３】
本発明の少なくとも１つの転写カセットに位置づけされた、本明細書に記載の結合タンパク質、プロドラッグ変換酵素、及び／又はプロテアーゼをコードしてよい、導入遺伝子がある。
【０１４４】
当該ウイルスゲノムの２つの遺伝子（転写単位）の各々の間の任意の遺伝子間領域は、少なくとも１つの組換え転写カセットの誘導に適する。１以上の組換え転写カセットが存在する場合、これらは同じであるか異なる遺伝子間領域に位置してよい。具体的には本発明のＲＮＡウイルスが組換えニューキャッスル病ウイルスである場合、少なくとも１つの組換え転写カセットがウイルスＦとＨＮ遺伝子との間に位置することが好ましい。
【０１４５】
パラミクソウイルス科のゲノムのサイズの上限はわかっていない。したがって、本発明の組換えＲＮＡウイルスに誘導される導入遺伝子の数及びサイズの上限はわかっていない。導入遺伝子（本明細書に記載される、トリサイトカインをコードする導入遺伝子、又はウイルス感染腫瘍細胞により発現される場合に治療活性を有する少なくとも１つのさらなる導入遺伝子、又はその組み合わせ）は、独立に、約１０ｋｂまで、より好ましくは約５ｋｂまで、最も好ましくは約２ｋｂまでのサイズを有することが好ましい。
【０１４６】
本明細書に記載の導入遺伝子の発現（ウイルスＲＮＡのｍＲＮＡへの転写、及びｍＲＮＡの翻訳等）において、転写開始及び停止配列等の発現制御配列と、翻訳制御配列が使用される。ＲＮＡウイルスの発現制御配列は、本発明の組換えＲＮＡウイルスがそれに基づくＲＮＡウイルスであってもよいＲＮＡウイルスを使用できる。具体的には、転写開始及び停止配列は、ＲＮＡウイルスから得てよい。発現制御配列はまた、標的細胞、具体的には、翻訳及び／又はタンパク質輸送を制御する配列から得てもよい。
【０１４７】
パラミクソウイルス科の複製メカニズムのために、ゲノム又はアンチゲノムＲＮＡは、通常ネイキッドＲＮＡとみられない。ゲノム及びアンチゲノムＲＮＡは、核タンパク質の集積である。したがって、本発明のさらなる主題は、本発明の組換え腫瘍退縮ＲＮＡウイルスのヌクレオカプシドである。当該ヌクレオカプシドは、ゲノムをコードするＲＮＡ分子又は／及びＲＮＡウイルスのアンチゲノム及びヌクレオカプシドタンパク質を含んでなる。当該ヌクレオカプシドはまた、ポリメラーゼタンパク質Ｌ又は／及びホスホプロテインＰを含んでもよい。
【０１４８】
本発明の主題はまた、本明細書に記載の本発明のゲノムのアンチゲノムである。
【０１４９】
本発明のさらなる態様は、本発明のゲノム又は／及び組換え腫瘍退縮ＲＮＡウイルスのアンチゲノムをコードするＤＮＡ分子である。ＤＮＡ分子は、プラスミドでもよい。本発明のＤＮＡ分子は、本発明のＲＮＡウイルスを遺伝的に設計するために使用できる。さらに、当該ＤＮＡ分子は、本発明のＲＮＡウイルスを作製するために使用してもよい。したがって、当該ＤＮＡ分子は、転写制御配列、例えば、原核生物又は真核生物の転写制御配列と、作動的に連結してもよい。
【０１５０】
本発明の別の態様は、本発明の組み換え腫瘍退縮ウイルス、具体的には本発明の組換え腫瘍退縮ＮＤＶのゲノム及び／又はアンチゲノムをコードするＤＮＡ分子から発現される、組換え腫瘍退縮ＲＮＡウイルスを作製するための方法である。
【０１５１】
本発明のさらなる態様は、本発明の組換え腫瘍退縮ウイルス、本発明のウイルスゲノム、本発明のウイルスアンチゲノム、及び／又は本発明のＤＮＡ分子を含んでなる細胞である。当該細胞は、原核生物細胞又は真核生物細胞であってよい。当該細胞は、細胞系列、具体的には哺乳類細胞系列、より具体的にはヒト又はマウス細胞系列であってよい。当該細胞は、本発明のＲＮＡを作製するために本発明の方法において使用してよい。ＤＮＡ分子を転写するための好適なシステムは、当該技術分野の通常の技能を有する者に既知であり、例えばＥ．ｃｏｌｉ等の原核生物システム又はＨｅＬａもしくはＣＨＯ等の真核生物システムがある。
【０１５２】
さらなる別の態様は、パラミクソウイルス科の遺伝子の完全セット又はパラミクソウイルス科の遺伝子のセットを含んでなる、腫瘍退縮ＲＮＡウイルス、そのゲノムもしくはアンチゲノム、又はＤＮＡ分子であり、ここで、少なくとも１つの遺伝子もしくは遺伝子間領域は、遺伝的に改変されており、且つ本明細書に記載の少なくとも１つの組換え転写カセットをさらに含んでなる。かかるウイルス、ゲノムもしくはアンチゲノム、又はＤＮＡ分子は、癌の医薬の製造及び／又は治療のために使用されてよい。かかるＲＮＡウイルス、ゲノム、アンチゲノム、又はＤＮＡ分子は、転写カセットに組換え配列を誘導するために、遺伝子設計法による、組換えパラミクソウイルス科、具体的には組換えニューキャッスル病ウイルスに適する。この目的によれば、少なくとも１つの転写カセットは、制限部位を含んでよい。１以上の転写カセットが存在する場合、転写カセットの特有の制限部位は異なってよい。一例は、ＷＯ２００６／０５０９８４の図１のプラスミドｐｈ１ＭＴＨ６８ Ａｓｃ Ｐａｃであり、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。別の例は、ＷＯ２００６／０５０９８４の図２に開示されるｐｆ１ＭＴＨ６８マウスＩｇＧ ＥＤＢであり、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
治療関連
癌又は／及び腫瘍の治療には、腫瘍増殖の阻害、好ましくは感染によるタイムギャップにおける、腫瘍細胞の死滅又は増殖の阻止がある。ＮＤＶは、腫瘍細胞において選択的に複製する。
【０１５４】
本発明のウイルスは、増殖性疾患、具体的には過剰増殖性疾患の治療に使用することができる。好ましくは、新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）を記載のウイルスで治療することができ、好ましくは肺、結腸、前立腺、乳房、及びの脳癌からなる群から選択される癌を治療することができる。
【０１５５】
より好ましくは、固形腫瘍を治療できる。
より好ましくは、低増殖率の腫瘍を治療できる。低増殖率の腫瘍の例は、前立腺癌又は乳癌である。
より好ましくは、脳腫瘍を治療できる。
より好ましくは、グリア芽腫を治療できる。
哺乳類には、人間、マウス、及びラットが含まれる。
【０１５６】
組換えＲＮＡウイルスの製造
本発明の組換えＲＮＡウイルス、具体的には組換えＮＤＶは、Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒ等（１９９９）に記載の通り構築できる。新規な核酸配列の構築物は、以下の開始プラスミドである、ｐＣＩＴＥ Ｐ、ｐＣＩＴＥ Ｎ、ｐＣＩＴＥ Ｌ、ｐＸ８δＴ ｆＩＮＤＶを使用する真核性細胞内のＲＮＡに翻訳されるｃＤＮＡの水準である。
【０１５７】
ＮＤＶは、ニューキャッスル病ウイルスの任意の株、より好ましくはその野生型状態で腫瘍退縮性の株であってよい。
【０１５８】
プラスミドｐＸ８δＴは、ＥＰ０ ７０２ ０８５（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ ＫＫ）に記載されている。
【０１５９】
本発明の組換えＲＮＡウイルス、具体的には組換えＮＤＶは、Ｔ７ポリメラーゼ発現細胞、例えば、ＢＨＫ Ｔ７細胞から最初に、又はＴ７ポリメラーゼ形質転換ＣＨＯ細胞と同時に回収できる。それは、２９３、ＣＥＣ３２、ＨＴ２９又はＡ４３１当の細胞において増幅できる。それはまた、孵化ニワトリ卵の尿膜腔液において増殖することができる。
【０１６０】
組換えＲＮＡ、具体的には組換えＮＤＶは、以下の条件で保存される。組換えＲＮＡウイルス、具体的にはＮＤＶは、５％Ｄ−マンニトール／１％（ｗ／ｖ）Ｌ−リジン／ｐＨ８．０又は標準的細胞培養培地において安定である。−２０℃で１月まで。−８０℃で１０年まで。
【０１６１】
本発明の組換えＲＮＡウイルスは、野生型ウイルス又は組換えウイルスを出発物質として使用して製造してもよい。核酸、例えばＤＮＡ、例えば野生型又は組換え配列等を使用してもよい。例えば、ＷＯ２００６／５０９８４に記載されるような組換えＲＮＡウイルス及び／又はＤＮＡ分子を出発物質として使用してよい。一例は、ＷＯ２００６／０５０９８４の図１のプラスミドｐｈ１ＭＴＨ６８ Ａｓｃ Ｐａｃであり、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。別の例は、ＷＯ２００６／０５０９８４の図２に開示されるｐｆ１ＭＴＨ６８マウスＩｇＧ ＥＤＢであり、このＷＯ２００６／０５０９８４の開示は参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、組換え腫瘍退縮ＲＮＡウイルス及びその構築物に関するＷＯ２００６／０５０９８４の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６２】
医薬としての組換えＮＤＶの使用
本発明の組換えＲＮＡウイルス、具体的には本発明による精製組換えＮＤＶは、薬学的効果を示すために、医薬として使用できる。
【０１６３】
組換えＲＮＡウイルス、具体的には本発明のＮＤＶ、本発明のウイルスゲノム、アンチゲノム、ヌクレオカプシド及び／又はＤＮＡ分子は、特に癌、腫瘍又は／及び増殖性疾患の予防、緩和、又は／及び治療のための、特に肺癌、前立腺癌、脳癌、結腸癌、乳癌等の癌の予防、緩和又は／及び治療のための、医薬の製造のために使用できる。
【０１６４】
本発明の医薬組成物は、任意に、医薬的に許容される担体及び希釈剤を含んでなる。かかる担体及び希釈剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ,Ｅａｓｔｏｎ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）に記載がある。医薬組成物で使用され、又は／及び本発明の治療方法に適用されるウイルス力価は、治療の適応症に依存して、用量当たり、１０９〜１０１２ｐｆｕの範囲、１０８〜１０１１ｐｆｕの範囲、１０７〜１０１０ｐｆｕの範囲、又は１０６〜１０９ｐｆｕの範囲でよい。
【０１６５】
本発明の医薬組成物は、癌等の増殖性疾患の予防又は／及び治療のために使用されてよい。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、本発明の組換え腫瘍退縮ＲＮＡウイルス、具体的には本発明のＮＤＶのエマルションを含んでよく、そして吸入、静脈注入、皮下注入、腹腔内注入、又は腫瘍内注入により投与してよい。
【０１６７】
腫瘍増殖性疾患、具体的には癌の予防又は／及び治療のための本発明の方法において、医薬有効量は、当該疾患を予防、緩和又は／及び抑制する、本発明の腫瘍退縮ＲＮＡウイルス、具体的には本発明のＮＤＶ、本発明のウイルスゲノム、又は本発明のＤＮＡ分子の力価である。
【０１６８】
治療効果に対して、許容される用量は、例えば、構築物、患者、投与方法、及び癌のタイプに依存してよい。
【０１６９】
対象（患者）は、哺乳類、より好ましくはヒト患者であることが好ましい。
【０１７０】
本発明は、以下の図及び実施例によりさらに例示される。
【実施例１】
【０１７１】
ニワトリサイトカインの発現をもたらすトリ誘導化導入遺伝子を有する組換えＮＤＶの作製
ＮＤＶの腫瘍退縮株ＭＴＨ６８を、ウイルスＲＮＡを得るために使用した。ＲＴ−ＰＣＲを使用し、ｃＤＮＡの複数の断片を得て、そしてマルチステップクローニング手法で、これらは、プラスミドｐｆＩＭＴＨ６８を生み出すベクターｐＸ８δＴ（Ｓｃｈｎｅｌｌ等、１９９４）にクローニングされた完全ゲノムｃＤＮＡへと組み立てられた。このベクターは、組換えウイルスをＴ７−ポリメラーゼ発現細胞系列からレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）するために形質移入のために使用することができる。
【０１７２】
追加の転写カセットを、特有のＳｆｉＩ制限部位内の、Ｆペプチド及びＨＮタンパク質をコードするゲノム間に、ＮＤＶ ＭＴＨ６８（ｐｆＩＭＴＨ６８）の完全長ゲノムプラスミドをクローニングした。２つのＤＮＡオリゴヌクレオチドである、
Ｓｆｉ ｆｗ（５’−ａｇｇｃｃｔｔａａｔｔａａｃｃｇａｃａａｃｔｔａａｇａａａａａａｔａｃｇｇｇｔａｇａａｃｇｇｃｃｔｇａｇ−３'、配列番号１）及び
Ｓｆｉ ｂａｃｋ（５’−ａｇｇｃｃｇｔｔｃｔａｃｃｃｇｔａｔｔｔｔｔｔｃｔｔａａｇｔｔｇｔｃｇｇｔｔａａｔｔａａｇｇｃｃｔｃｔｃ−３’、配列番号２）
をアニーリングし、その後ｐｆＩＭＴＨ６８のＳｆｉＩ部位にライゲーションした。
【０１７３】
ＣｈＩＦＮ−アルファ（ＮＭ ２０５４２７）及びＣｈＩＦＮ−ベータ（ＮＭ ００１０２４８３６）をコードする２つのＤＮＡ導入遺伝子は、ＰＣＲにより増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応のテンプレートとして、Ｓｃｈｕｌｔｚ等、１９９５及びＳｉｃｋ等、１９９６に記載されるＣｈＩＦＮ−アルファ及びＣｈＩＦＮ−ベータ発現構築物を使用した。ＣｈＩＦＮ−アルファの増幅のために、以下のプライマー対：
ＣｈｌＦＮ−アルファ ｆｗ（５'−ｃｃｔｔａａｔｔａａｇｃｃａｃｃａｔｇｇｃｔｇｔｇｃｃｔｇｃａａｇｃｃｃ−３’、配列番号３）及び
ＣｈｌＦＮ−アルファ−ｒｅｖ（５'−ｃｃｔｔａａｔｔａａｃｔａａｇｔｇｃｇｃｇｔｇｔｔｇｃｃｔｇｔｇ−３’、配列番号４）を使用し、そしてＣｈＩＦＮ−ベータの増幅のために、以下の２つのプライマー
Ｐａｄ ＣｈＩＦＮ−ベータ ｆｗ（５’−ｃｃｔｔａａｔｔａａｃｇｃａｃｃａｔｇａｃｔｇｃａａａｃｃａｔｃａｇｔｃｔｃｃａｇｇ−３’、配列番号５）及び
ＣｈＩＦＮ−ベータ−ｒｅｖ（５’−ｃｃｔｔａａｔｔａａｔｃａｃｔｇｇｇｔｇｔｔｇａｇａｃｇｔｔｔｇｇａｔｇ−３’、配列番号６）を使用した。
【０１７４】
２つのＣｈＩＦＮ導入遺伝子の各々を、ｐｇＩＭＴＨ６８ＰａｃのＰａｄ部位にそれぞれクローニングした。当該ゲノムの総長さを、ウイルスゲノムの長さについて「ｒｕｌｅ ｏｆ ６」に従い、６の倍数に調整した。ＣｈＩＦＮ−ベータインサートの配列同一性を、ヌクレオチド配列決定により確認した。ＣｈＩＦＮ−アルファインサートにおいて、配列ＮＭ ２０５４２７と比較して、位置８９に、ＧからＡへのヌクレオチド変換が１つ検出された。組換えウイルスは、標準的ウイルスレスキュー法により、ＣｈＩＦＮ−アルファ（図１）又はＣＨＩＦＮ−ベータ（図２）の遺伝子を含む完全長ウイルスゲノムプラスミドで形質移入されたＴ７発現細胞からレスキューした。得られたＣｈＩＦＮ−アルファ発現ウイルスをＮＤＶ−ＣＨＩＦＮ−アルファとし、ＣｈＩＦＮ−ベータ発現ウイルスをＮＤＶ−ＣＨＩＦＮ−ベータとした。当該ウイルスを組織培養又はニワトリ卵の尿膜腔のいずれかにおいて培養し、高力価とした。
【実施例２】
【０１７５】
組換えＮＤＶから発現されたＣｈＩＦＮ−アルファ及びＣｈＩＦＮ−ベータは生物活性である。
【０１７６】
原料と方法：
ＣＥＣ−３２細胞（トリウズラ細胞系列）、又はＨｅｌａ細胞（頸部癌細胞系列）を、１×１０５細胞／ウェルで６つのプレートに播種した。接着性になった後、細胞を、ＧＦＰ−発現コントロールウイルスＮＤＶ−ＧＦＰ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータ又はＭＯＣＫで、０．０１のＭＯＩで感染させた。６４時間後、上清を回収し、感染ウイルス粒子をＵＶ照射により不活性化させた。
【０１７７】
ウイルス感染細胞の懸濁物中のＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ及びＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータの生物活性を実証するため、ニワトリインターフェロン特異的バイオアッセイを使用した（Ｓｃｈｗａｒｚ等、ＪＩＣＲ、２００５）。当該アッセイは、ＩＦＮ感受性ニワトリＭｘプロモーターにより調整されるルシフェラーゼ遺伝子を保持する安定な形質移入ウズラ細胞系列ＣＥＣ−５１１に基づく。ＥＣ−５１１指標細胞である場合、当該ルシフェラーゼ活性は、ＣｈＩＦＮ−アルファ又はＣｈＩＦＮ−ベータでインキュベートされた場所で誘導される。このアッセイを行うために、１５．０００のＣＥＣ−５１１細胞を９６ウェルプレートに播種した。播種から２４時間後、当該細胞を、ウイルス感染Ｈｅｌａ又はＣＥＣ０３２細胞のＵＶ処理した上清で処理した。細胞を７５μｌの各上清の１：１００希釈物と共にインキュベートした。ポジティブコントロールとして、細胞を、ＣｈＩＦＮ−アルファ又はＣｈＩＦＮ−ベータ（Ｓｉｃｋ等、１９９６）の発現プラスミドで形質移入した２９３Ｔ細胞からの上清の１：１００希釈物と共に、又は培地だけでインキュベートした。６時間のインキュベーション時間後、Ｓｔｅｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、製造業者により提供されるプロトコルに従い行った。平均値を決定するため、各データポイントを三重に測定した。
【０１７８】
結果
インキュベーション後６４時間の、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ及びＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータを感染させたＣＥＣ−３２及びＨｅｌａ細胞の上清は、感染細胞におけるＣｈＩＦＮ−アルファ及びＣｈＩＦＮ−ベータのウイルス媒介発現を示すＣＥＣ−５１１細胞での強力なルシフェラーゼ誘導活性を有する。対照的に、ＭＯＣＫ感染細胞、又はＧＦＰを発現するコントロールウイルスで感染したものの上清は、ＣＥＣ−５１１指標細胞系列に対するルシフェラーゼ誘導活性を示さない。組換えＣｈＩＦＮ−アルファ及びＣｈＩＦＮ−ベータを含んでなる上清の１：１０００希釈物も、ＣｈＩＦＮ依存性Ｍｘプロモーター誘導活性を示す。
【０１７９】
表１：組換えＮＤＶ発現ＣＨＩＦＮ−アルファ又はＣＨＩＦＮ−ベータに感染したＣＥＣ−３２及びＨｅｌａ細胞の上清におけるインターフェロン活性。ＩＦＮ応答は、Ｍｘプロモーター制御ルシフェラーゼレポーター遺伝子を保持する指標細胞において測定する。測定値は、相対的ルシフェラーゼ数で提供される。
【０１８０】
【表１】
2011510638.tif 000003
【実施例３】
【０１８１】
組換えＮＤＶ発現ＣｈＩＦＮ−アルファ又はＣｈＩＦＮ−ベータに感染した腫瘍細胞でないトリ細胞は、ウイルス溶解から保護される。
【０１８２】
原料と方法
３ａ）ＣＥＣ−３２細胞（トリウズラ細胞系列）、又はＨｅｌａ細胞（頸部癌細胞系列）を、１×１０５細胞／ウェルで６つのプレートに播種した。接着性になった後、細胞を、ＧＦＰ−発現コントロールウイルスＮＤＶ−ＧＦＰ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータ又はＭＯＣＫで、０．０１のＭＯＩに感染させた。４８時間後、細胞を４％のホルムアルデヒド溶液で固定化し、そしてＧｉｅｍｓａ溶液で染色した。その後、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｈｏｔ画像化システムを用いてフォトドキュメンテーションを行った。
【０１８３】
３ｂ）ＣＥＣ−３２細胞（トリウズラ細胞系列）、又はＨｅｌａ細胞（頸部癌細胞系列）を、１×１０５細胞／ウェルで６つのプレートに播種した。接着性になった後、細胞を、ＧＦＰ−発現コントロールウイルスＮＤＶ−ＧＦＰ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータ又はＭＯＣＫ（＝非感染）で、０．０１のＭＯＩに感染させた。４８時間のインキュベーション時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、製造業者により提供されるプロトコルに従い行い、細胞バイアビリティを測定した。平均値を決定するため、各データポイントを６つの独立した値から作製した。
【０１８４】
結果：
図３ａ）４８時間後の、トリＣＥＣ−３２細胞をＧＦＰ発現ＮＤＶ（ＮＤＶ−ＧＦＰ）により溶解する。対照的に、ＣｈＩＦＮ−アルファ発現ウイルスに感染した細胞は、溶解から保護される。ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ感染ＣＥＣ−３２単分子膜は、２５〜５０％が無損傷である。より強い保護は、ＮＤＶ発現ＣｈＩＦＮ−ベータで観察される。４８時間後、ＣＥＣ−３２単分子膜のほぼ９０〜１００％は無損傷であり、且つウイルス溶解から保護される。この単分子膜の密度は、ＣＥＣ−３２細胞感染ＭＯＣＫの単分子膜と同程度である。
【０１８５】
腫瘍形成Ｈｅｌａ細胞系列上の３つのウイルスによる感染は、ウイルスＮＤＶ−ＧＦＰ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ、及びＮＤＶ−ＣＨＩＦＮ−ベータの間で同程度の腫瘍退縮活性を示す。４８時間後、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ、及びＮＤＶ−ＣＨＩＦＮ−ベータ感染Ｈｅｌａ細胞の単分子膜は、ほぼ完全に破壊される。ＭＯＣＫ感染Ｈｅｌａ細胞の細胞単分子膜は、無損傷であり、これはＧｉｅｍｓａ染色細胞の青色により示される。
【０１８６】
図３ｂ）第二の実験において、細胞バイアビリティを、ＣｈＩＦＮ−発現ＮＤＶ感染後、４８時間で定量した。ＮＤＶ−ＧＦＰ感染鳥ＣＥＣ−３２細胞は、３％の残存細胞バイアビリティしか示さなかった。ＮＤＶ−ＣｈＩＦＢ−アルファ感染ＣＥＣ−３２細胞においては、残存細胞の２６％が無損傷である。ＣＥＣ−３２ウズラ細胞系列のＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータ感染後４８時間では、細胞の９４％が生存可能であり、且つウイルス溶解に対して保護される。
【０１８７】
対照的に、腫瘍形成Ｈｅｌａ細胞系列上の３つのウイルスＮＤＶ−ＧＦＰ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ、又はＮＤＶ−ＣＨＩＦＮ−ベータでの感染後には、細胞破壊におけるほとんどどの違いも観察可能である。４８時間後、生存可能細胞の値は、３つの全てのウイルスについて、３％〜９％の間であり、ほとんど完全な腫瘍細胞破壊を示す。
【実施例４】
【０１８８】
組換えＮＤＶ発現ＣｈＩＦＮ−アルファ又はＣｈＩＦＮ−ベータによる、初代細胞ではない腫瘍細胞の選択的腫瘍退縮
【０１８９】
原料と方法：
５０００個の初代線維芽細胞又は３０００個のＨｅｌａ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。播種後１６時間で、ＮＤＶ−ＧＦＰ（ＮＤＶ−ＧＦＰ）、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ（ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ）、及びＮＤＶ−ＣＨＩＦＮ−ベータ（ＮＤＶ−ＣＨＩＦＮ−ベータ）のウイルス希釈物を調製した。線維芽細胞を、指示したウイルス濃度で感染させた。ネガティブコントロールとして、線維芽細胞をＭＯＣＫ感染させた。１時間後、接種物を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして２００μｌ細胞培養培地で、４日間、細胞培養インキュベータでインキュベートした。その後、残存する細胞を４％のホルムアルデヒド溶液で固定化し、クリスタルバイオレットで染色した。当該染色剤を１０％の氷酢酸で可溶化し、各ウェルの吸収を５９５ｎｍで、ＥＬＩＳＡ Ｒｅａｄｅｒにおいて測定した。
【０１９０】
結果：
感染から４日後、３つのウイルスＮＤＶ−ＧＦＰ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ、及びＮＤＶ−ＣＨＩＦＮ−ベータを、ＭＯＩ０．００１〜ＭＯＩ０．１までのＭＯＩを用いて、感染させた初代線維芽細胞は、増殖阻害を示さない（図４）。増殖阻害の最初の兆候は、感染のために１細胞当たり１〜１０ウイルス粒子が用いられる場合のＭＯＩでしか観察されない。対照的に、ＭＯＩ０．００１とＭＯＩ１０との間のＭＯＩで感染させた腫瘍形成Ｈｅｌａ細胞は、非常に強力な増殖阻害を示す。この結果は、組換えＮＤＶは、特にＭＯＩ０．１ＭＯＩ０．００１のような低ＭＯＩで非常に良好な治療域を有し、初代細胞における溶解効果はほぼ測定されず、且つ非常に強力な阻害効果が、腫瘍形成Ｈｅｌａ細胞で測定される。腫瘍細胞と初代細胞における死滅（ｋｉｌｌ）曲線の形状は、コントロールウイルスＮＤＶ−ＧＦＰと、ＣｈＩＦＮ−発現ウイルスであるＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ及びＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータとの間で違いは観察されない。
【実施例５】
【０１９１】
組換えＮＤＶ発現ＣｈＩＦＮ−アルファ又はＣｈＩＦＮ−ベータ感染したニワトリ胚の延長した生存期間
【０１９２】
原料と方法：
１５個の１１日齢孵化ニワトリ卵の群を、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータ、ＮＤＶ−ＧＦＰ、又は非病原性ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａにそれぞれ感染させた。感染物質として、滅菌ＰＢＳで希釈した尿膜腔液中の卵増殖（ｅｇｇ−ｇｒｏｗｎ）ウイルスを使用した。総容量２００μｌ中、４０００ＰＦＵの感染用量を適用した。接種物を尿膜腔に接種した。感染後、当該卵を３７℃、５０％〜６０％の湿度で、卵ブリーダー（ｂｒｅａｄｅｒ）においてインキュベートした。卵を、指示した時点（図５）で、１日に２回ろうそくにかざし（ｃａｎｄｌｅ）、そして胚を、生命力の兆候について確認した。このアッセイは、感染胚の生存期間を比較することにより、異なるＮＤＶの病原性を比較できる。当該方法は、Ｒ．Ｐ．Ｈａｎｓｏｎ（１９８０）に記載される決定法、「Ｍｅａｎ Ｄｅａｔｈ Ｔｉｍｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｌｅｔｈａｌ Ｄｏｓｅ（ＭＤＴ／ＭＬＤ）」に基づく。当該プロトコルは、致死用量より高い濃度での既定ウイルス用量感染の代わりに、ウイルスストックの非連続希釈を卵に接種する点を修正した。倫理的理由から、このアッセイ修正法は、試験のために使用する胚の数を低減した。ＭＤＴは、以下の式によって決定される。
ＭＤＴ＝（（Ｘ時間での非死亡）×（Ｘ時間）＋（Ｙ時間での非死亡）×（Ｙ時間）等）／総死亡数
【０１９３】
結果：
ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−アルファ及びＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータ感染ニワトリ胚の生存は、ＮＤＶ−ＧＦＰ感染胚との比較で増加する。ＮＤＶ−ＧＦＰ感染孵化卵は、２４時間と６２時間との間で生命力の兆候を失い、５０時間のＭＤＴ（平均死亡時間）となっている。ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータ感染胚は、最大９６時間まで生存しており、計算されたＭＤは６９時間である。７４時間のＭＤＴと同程度の生存期間は、ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータ感染胚で測定される。ＮＤＶ−ＣｈＩＦＮ−ベータ感染胚の大部分は、４８時間と６時間の間で死亡している。当該アッセイの感受性は、非病原性又はレントジェニック株ＬａＳｏｔａの利用により示される。ＮＤＶ ＬａＳｏｔａ株で接種した孵化卵でさえ、６２時間〜１１５時間の間で死亡し、そのＭＤＴは８５時間と計算される。この実験は、亜病原性ＮＤＶ ＭＴＨ６８のＭＤＴがレントジェニックＮＤＶ株へとシフトすることを示す。
【０１９４】
【表２】
2011510638.tif 000004
【０１９５】
【表３】
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【０１９６】
【表４】
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【０１９７】
【表５】
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【０１９８】
【表６】
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【０１９９】
【表７】
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【０２００】
【表８】
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【０２０１】
【表９】
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【０２０２】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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