(57)【要約】  対応する未変更型ポリメラーゼに比較して改善された伸長速度を有する変異型ＤＮＡポリメラーゼが開示される。該変異型ポリメラーゼは、様々な開示されるプライマー伸長方法において有用である。例えば変異型ＤＮＡポリメラーゼの生産に有用である、組み換え核酸、ベクター及び宿主細胞を包含する関連組成物も開示される。【選択図】図１
2011502467.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)  Ｘa1−Ｘa2−Ｘa3−Ｘa4−Ｒ−Ｘa6−Ｘa7−Ｘa8−Ｋ−Ｌ−Ｘa11−Ｘa12−Ｔ−Ｙ−Ｘa15−Ｘa16（配列番号１）；ここでＸa1はＩ又はＬであり；Ｘa2はＬ又はＱであり；Ｘa3はＱ，Ｈ又はＥであり；Ｘa4はＹ，Ｈ又はＦであり；Ｘa6はＥ，Ｑ又はＫであり；Ｘa7はＩ，Ｌ又はＹであり；Ｘa8はＱ，Ｔ，Ｍ，Ｇ又はＬ以外のアミノ酸であり；Ｘa11はＫ又はＱであり；Ｘa12はＳ又はＮであり；Ｘa15はＩ又はＶであり；そしてＸa16はＥ又はＤであり；
b)  Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘb7−Ｘb8−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎ（配列番号２）；ここでＸb7はＳ又はＴであり；そしてＸb8はＤ，Ｅ又はＮ以外のアミノ酸であり；そして
c)  Ｘc1−Ｘc2−Ｘc3−Ｘc4−Ｘc5−Ｘc6−Ｘc7−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｑ−Ｉ−Ｅ−Ｌ−Ｒ（配列番号３）；ここでＸc1はＧ，Ｎ又はＤであり；Ｘc2はＷ又はＨであり；Ｘc3はＷ，Ａ，Ｌ又はＶであり；Ｘc4はＩ又はＬ以外のアミノ酸であり；Ｘc5はＶ，Ｆ又はＬであり；Ｘa6はＳ，Ａ，Ｖ又はＧ以外のアミノ酸であり；そしてＸc7はＡ又はＬである
から成る群より選択されたポリメラーゼドメイン中の少なくとも１つのモチーフを含んで成るＤＮＡポリメラーゼであって、
ここでＸa8がＱ，Ｔ，Ｍ，Ｇ又はＬから選択されたアミノ酸であり；Ｘb8がＤ，Ｅ又はＮから選択されたアミノ酸であり；そしてＸc1がＳ，Ａ，Ｖ又はＧから選択されたアミノ酸である別の同等のＤＮＡポリメラーゼに比較して、改善された核酸伸長速度及び／又は改善された逆転写効率を有する、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
前記ポリメラーゼがモチーフb)及びc）を含んで成り、そしてＸb8がＤ，Ｅ又はＮ以外のアミノ酸であり、そしてＸc6がＳ，Ａ，Ｖ又はＧ以外のアミノ酸である、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
前記ポリメラーゼがモチーフa), b)及びc)を含んで成り、そして
位置Ｘa8のアミノ酸がＲであり；
位置Ｘb8のアミノ酸がＧであり；
位置Ｘc4のアミノ酸がＦであり；そして
位置Ｘc6のアミノ酸がＦである
請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
前記ＤＮＡポリメラーゼが次のもの：
(a) ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ；
(b) ＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼ；
(c) サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）ＤＮＡポリメラーゼ；
(d) サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）ＤＮＡポリメラーゼ；
(e) サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）ＤＮＡポリメラーゼ；
(f) サーマス・フラブス（Thermus flavus）ＤＮＡポリメラーゼ；
(g) サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）ＤＮＡポリメラーゼ；
(h) サーマス種sps17 ＤＮＡポリメラーゼ；
(i) サーマス種Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼ；
(j) サーモトガ・ネオポリタナ（Thermotoga neopolitana）ＤＮＡポリメラーゼ；
(k) サーモトガ・アフリカヌス（Thermotoga africanus）ＤＮＡポリメラーゼ；及び
(l) サーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）ＤＮＡポリメラーゼ
から成る群より選択されたポリメラーゼに対して少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ又はＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼであり、そして640位のアミノ酸がＧ，Ｔ，Ｒ，Ｋ及びＬから成る群より選択される、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＺ05 ＤＮＡポリメラーゼであり、そして580位のアミノ酸がＧ，Ｔ，Ｒ，Ｋ及びＬから成る群より選択される、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
前記ポリメラーゼがキメラポリメラーゼである、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記キメラポリメラーゼが、配列番号18のＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ又は配列番号19のＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼに対して少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項７に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
前記キメラポリメラーゼが、配列番号18又は配列番号19に比較して、Ｇ46Ｅ，Ｌ329Ａ，Ｑ601Ｒ，Ｄ640Ｇ，Ｉ669Ｆ，Ｓ671Ｆ及びＥ678Ｇから成る群より選択された１又は複数のアミノ酸置換を含んで成る、請求項８に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
熱可逆性の共有結合修飾を更に含んで成る、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
前記熱可逆性の共有結合修飾を含んで成るポリメラーゼが、約25℃未満である温度でアルカリ性pHにおいて実施される、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと
(a) 式Ｉ：
【化１】
2011502467.tif 000028
（ここでＲ1とＲ2は水素であるか、又は連結してもよい有機基である）；及び
(b) 式II：
【化２】
2011502467.tif 000029
（ここでＲ1とＲ2は連結してもよい有機基であり、そして２つの水素はシスである）
から成る群より選択された一般式を有するジカルボン酸無水物
との混合物の反応により生成される、請求項１０に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換え核酸を含んで成る発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターを含んで成る宿主細胞。
【請求項１５】
ＤＮＡポリメラーゼを生産する方法であって、該ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸の発現に適当な条件下で請求項１４に記載の宿主細胞を培養することを含んで成る方法。
【請求項１６】
プライマー伸長を実施する方法であって、プライマーの伸長に適当な条件下で、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼをプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、及び遊離ヌクレオチドと接触させ、それにより伸長したプライマーを生成することを含んで成る方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチド鋳型がＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記伸長に適当な条件がMg++及びMn++を含んで成る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記遊離ヌクレオチドが特殊ヌクレオチドを含んで成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡポリメラーゼを、ポリヌクレオチドの増幅に適当な条件下で、前記ＤＮＡポリメラーゼをプライマー対、ポリヌクレオチド鋳型及び遊離ヌクレオチドと接触させることを含んで成る、ポリヌクレオチド増幅のための方法である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチド鋳型がＲＮＡである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅に適当な条件がMg++及びMn++を含んで成る、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
伸長したプライマーを作製するためのキットであって、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含んで成るキット。
【請求項２４】
(a) プライマー伸長条件下で、予め決められたポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズすることができるプライマーを提供する容器；
(b) 遊離ヌクレオチドを提供する容器；及び
(c) プライマー伸長に適当な緩衝液を提供する容器
から成る群より選択された１又は複数の追加の容器を更に含んで成る、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ポリヌクレオチド鋳型及び遊離ヌクレオチドを含んで成る反応混合物。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチド鋳型がＤＮＡである、請求項２５に記載の反応混合物。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチド鋳型がＲＮＡである、請求項２５に記載の反応混合物。
【請求項２８】
前記反応混合物がMg++及びMn++を含んで成る、請求項２６に記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼの分野、並びに核酸プライマー伸長及び増幅をはじめとする様々な用途でのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼはゲノムの複製と維持を担っており、その役割は世代から世代へ遺伝情報を正確に伝達することが中心である。ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ合成を担当する酵素として細胞内で機能する。それらは、金属活性化剤、例えばＭｇ2+の存在下で、コピーされるＤＮＡ鋳型又はポリヌクレオチド鋳型によって書かれている順序で、デオキシリボヌクレオシド三リン酸を重合する。生体内では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、組換え及び遺伝子増幅をはじめとするＤＮＡ合成過程の分布に関与する。各ＤＮＡ合成過程の間に、ＤＮＡ鋳型が１回又は多くても数回コピーされて同一の複製物を生成する。対照的に試験管内では、ＤＮＡ複製は、例えばポリメラーゼ連鎖反応の間のように、多数回繰り返すことができる（例えばMullisの米国特許第4,683,202号明細書を参照のこと）。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた最初の研究では、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ複製の各ラウンドの開始点に添加された（前掲の米国特許第4,683,202号を参照のこと）。その後、高温で増殖する細菌から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが得られ、そしてそれらの酵素が一回のみ添加すればよいことが決定された（Gelfandの米国特許第4,889,818号明細書及びMullisの米国特許第4,965,188号明細書を参照のこと）。ＰＣＲ中に用いられる高温で、それらの酵素は不可逆的に不活性化されることはない。結果として、各合成付加工程の開始点で新しい酵素を添加することなく、ポリメラーゼ連鎖反応の反復サイクルを実施することができる。ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性ポリメラーゼは、組換えＤＮＡ研究及び医学的な病気診断における様々な技術にとって重要である。特に診断用途では、標的核酸配列が問題のＤＮＡ又はＲＮＡの小部分のみである場合があるので、増幅せずに標的核酸配列の存在を検出することは困難であるかもしれない。バイオテクノロジーや医学におけるＤＮＡポリメラーゼの重要性のため、所望の酵素的性質、例えば向上されたプライマー伸長速度、逆転写効率又は増幅能力を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を作製することは非常に有利であろう。
【０００４】
ポリメラーゼの全体的折り畳みパターンはヒトの右手に似ており、手のひら、指及び親指という３つの異なるサブドメインを含む（Beese他、Science 260:352-355,1993; Patel他、Biochemistry 34:5351-5363,1995を参照のこと）。指と親指のサブドメインの構造は、サイズと細胞機能の点で異なるポリメラーゼ間で大きく異なっているが、一方で触媒性手のひらサブドメインは全部重なり合う。例えば、次のｄＮＴＰと相互作用し且つ化学触媒反応中の遷移状態を安定化するモチーフＡは、哺乳類polαと原核生物polＩファミリーのＤＮＡポリメラーゼ間で約１Åの平均偏差で重なり合う（Wang他、Cell 89:1087-1099, 1997）。モチーフＡは、構造上、優先的に疎水性残基を含有するアンチパラレルβ鎖のところで始まり、そしてαヘリックスにまで続く。ＤＮＡポリメラーゼの活性部位の一次アミノ酸配列は、完全に保存されている。モチーフＡの場合、例えば、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、クラミジア・トラコマティス（Chlamydia trachomatis）及びエシェリキア・コリ（Escherichia coli）をはじめとする、何百万年間の進化により分けられた生物体からのポリメラーゼ中に、配列ＤＹＳＱＩＥＬＲが保持されている。一緒に考慮すると、それらの知見は、ポリメラーゼが同様の触媒機構により機能することを示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
十分に保存されることに加えて、ＤＮＡポリメラーゼの活性部位は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有意に減少させることなく或る種のアミノ酸置換を実施できる、比較的変異可能であることも示された（例えばPatel他の米国特許第6,602,695号明細書を参照のこと）。そのような変異型ＤＮＡポリメラーゼは、例えば核酸合成反応を含んで成る診断及び研究用途において、様々な選択的利点を提供することができる。よって、例えば、高められた伸長速度、逆転写効率又は増幅能力をはじめとする改善されたポリメラーゼ活性をもたらすために変異を受けられるアミノ酸位置の同定が当業界で必要とされている。本発明は、本明細書中に記載するように、それらの及び他の必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、対応する未変更のポリメラーゼに比較して改善された酵素活性を有し、且つ様々な核酸合成用途に有用である、変異型ＤＮＡポリメラーゼを提供する。或る態様では、該ポリメラーゼはポリメラーゼドメイン中に下記モチーフの少なくとも１つ：
a)  Ｘa1−Ｘa2−Ｘa3−Ｘa4−Ｒ−Ｘa6−Ｘa7−Ｘa8−Ｋ−Ｌ−Ｘa11−Ｘa12−Ｔ−Ｙ−Ｘa15−Ｘa16（配列番号１）；ここでＸa1はＩ又はＬであり；Ｘa2はＬ又はＱであり；Ｘa3はＱ，Ｈ又はＥであり；Ｘa4はＹ，Ｈ又はＦであり；Ｘa6はＥ，Ｑ又はＫであり；Ｘa7はＩ，Ｌ又はＹであり；Ｘa8はＱ，Ｔ，Ｍ，Ｇ又はＬ以外のアミノ酸であり；Ｘa11はＫ又はＱであり；Ｘa12はＳ又はＮであり；Ｘa15はＩ又はＶであり；そしてＸa16はＥ又はＤであり；
b)  Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘb7−Ｘb8−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎ（配列番号２）；ここでＸb7はＳ又はＴであり；そしてＸb8はＤ，Ｅ又はＮ以外のアミノ酸であり；そして
c)  Ｘc1−Ｘc2−Ｘc3−Ｘc4−Ｘc5−Ｘc6−Ｘc7−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｑ−Ｉ−Ｅ−Ｌ−Ｒ（配列番号３）；ここでＸc1はＧ，Ｎ又はＤであり；Ｘc2はＷ又はＨであり；Ｘc3はＷ，Ａ，Ｌ又はＶであり；Ｘc4はＩ又はＬ以外のアミノ酸であり；Ｘc5はＶ，Ｆ又はＬであり；Ｘa6はＳ，Ａ，Ｖ又はＧ以外のアミノ酸であり；そしてＸc7はＡ又はＬである
を有するアミノ酸配列を含んで成り、ここで前記ポリメラーゼは、Ｘa8がＱ，Ｔ，Ｍ，Ｇ又はＬから選択されたアミノ酸であり；Ｘb8がＤ，Ｅ又はＮから選択されたアミノ酸でありそして／又はＸc6がＳ，Ａ，Ｖ又はＧから選択されたアミノ酸である別の同等のポリメラーゼ（即ち参照ポリメラーゼ）に比較して改善された核酸伸長速度及び／又は改善された逆転写効率を有する。
【０００７】
参照ポリメラーゼの或る態様では（例えばＺ05又はＣＳ5／ＣＳ6）、Ｘa8がＱ，Ｔ，Ｍ，Ｇ又はＬであり、Ｘb8がＤ，Ｅ又はＮであり、Ｘc4がＩ又はＬであり、そしてＸc6がＳ，Ａ，Ｖ又はＧである（配列番号23及び24）。参照ポリメラーゼの或る態様では、Ｘb8がＤ，Ｅ又はＮである（配列番号25及び26）。
【０００８】
モチーフa) Ｘa1−Ｘa2−Ｘa3−Ｘa4−Ｒ−Ｘa6−Ｘa7−Ｘa8−Ｋ−Ｌ−Ｘa11−Ｘa12−Ｔ−Ｙ−Ｘa15−Ｘa16（配列番号１）に関して、或る態様では、Ｘa8がＡ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｎ，Ｐ，Ｒ，Ｓ，Ｖ，Ｗ，Ｙから成る群より選択されたＤ−又はＬ−アミノ酸及（配列番号27）及びその類似体である。或る態様では、Ｘa8がＲ，Ｋ及びＮから成る群より選択されたアミノ酸である（配列番号28）。或る態様では、Ｘa8がアルギニン（Ｒ）である（配列番号29）。
【０００９】
モチーフb) Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘb7−Ｘb8−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎ（配列番号２）に関して、或る態様では、Ｘ b8がＡ，Ｃ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｐ，Ｑ、Ｒ，Ｓ，Ｔ、Ｖ，Ｗ，Ｙから成る群より選択されたＤ−又はＬ−アミノ酸（配列番号30）及びその類似体である。或る態様では、Ｘ b8がＧ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｒ，Ｋ，Ｑ，Ｌ，Ｖ及びＩから成る群より選択されたアミノ酸（配列番号31）である。或る態様では、Ｘb8がＧ，Ｔ，Ｒ，Ｋ及びＬから成る群より選択されたアミノ酸である（配列番号32）。
【００１０】
モチーフc) Ｘc1−Ｘc2−Ｘc3−Ｘc4−Ｘc5−Ｘc6−Ｘc7−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｑ−Ｉ−Ｅ−Ｌ−Ｒ（配列番号３）に関して、或る態様では、Ｘc4がＡ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，Ｙから成る群より選択されたＤ−又はＬ−アミノ酸（配列番号33）及びその類似体である。或る態様では、Ｘc4がＦ及びＹから成る群より選択されたアミノ酸（配列番号34）である。或る態様では、Ｘc4がフェニルアラニン（Ｆ）である（配列番号35）。或る態様では、Ｘc6がＣ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｈ，Ｉ，Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｔ，Ｗ及びＹから成る群より選択されたアミノ酸である（配列番号36）。或る態様では、Ｘc6がＦ及びＹから成る群より選択されたアミノ酸である（配列番号37）。或る態様では、Ｘc6がフェニルアラニン（Ｆ）である（配列番号38）。
【００１１】
或る態様では、改良型ポリメラーゼ（例えばＺ05又はＣＳ5／ＣＳ6）は、位置Ｘa8にアルギニン（Ｒ）；位置Ｘb8にグリシン（Ｇ）；位置Ｘc4にフェニルアラニン（Ｆ）及び／又は位置Ｘc6にフェニルアラニン（Ｆ）の少なくとも１つを含んで成る（配列番号39〜68）。
【００１２】
或る態様では、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、未変更ポリメラーゼの変更型である。その未変更形では、ポリメラーゼはポリメラーゼドメイン中に次のモチーフを有するアミノ酸配列を包含する：
【００１３】
Ｘa1−Ｘa2−Ｘa3−Ｘa4−Ｒ−Ｘa6−Ｘa7−Ｘa8−Ｋ−Ｌ−Ｘa11−Ｘa12−Ｔ−Ｙ−Ｘa15−Ｘa16（配列番号69）；ここでＸa1はＩ又はＬであり；Ｘa2はＬ又はＱであり；Ｘa3はＱ，Ｈ又はＥであり；Ｘa4はＹ，Ｈ又はＦであり；Ｘa6はＥ，Ｑ又はＫであり；Ｘa7はＩ，Ｌ又はＹであり；Ｘa8はＱ，Ｔ，Ｍ，Ｇ又はＬであり；Ｘa11はＫ又はＱであり；Ｘa12はＳ又はＮであり；Ｘa15はＩ又はＶであり；そしてＸa16はＥ又はＤである；
Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘb7−Ｘb8−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎ（配列番号70）；ここでＸb7はＳ又はＴであり；そしてＸb8はＤ，Ｅ又はＮである；及び
Ｘc1−Ｘc2−Ｘc3−Ｘc4−Ｘc5−Ｘc6−Ｘc7−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｑ−Ｉ−Ｅ−Ｌ−Ｒ（配列番号71）；ここでＸc1はＧ，Ｎ又はＤであり；Ｘc2はＷ又はＨであり；Ｘc3はＷ，Ａ，Ｌ又はＶであり；Ｘc4はＩ又はＬであり；Ｘc5はＶ，Ｆ又はＬであり；Ｘa6はＳ，Ａ，Ｖ又はＧであり；そしてＸc7はＡ又はＬである。
【００１４】
様々なＤＮＡポリメラーゼが本発明に従った変異を受けることができる。特に適当であるのは、様々な種類の耐熱性菌からの野生型又は天然の耐熱性ポリメラーゼ、並びにアミノ酸置換、挿入もしくは欠失又は他の変異によりそのような野生型又は天然の酵素から誘導される耐熱性ポリメラーゼである。未変更型のポリメラーゼの例としては、例えば、ＣＳ5，ＣＳ6またはＺ05 ＤＮＡポリメラーゼ、又はそれに対して少なくとも90％、91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％もしくは99％の配列同一性を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。別の未変更型ポリメラーゼとしては、例えば、次の種の耐熱性菌のいずれかに由来するＤＮＡポリメラーゼ（又はそのようなポリメラーゼに対して少なくとも90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％もしくは99％の配列同一性を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼ）が挙げられる：サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）；サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）；サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）；サーマス・フラブス（Thermus fravus）；サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）；サーマス種sps17；サーマス種Z05；サーモトガ・ネオポリタナ（Thermotoga neopolitana）；サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）；サーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）；又はバシラス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）。適当なポリメラーゼとして、逆転写酵素（ＲＴ）活性及び／又は普通でないヌクレオチド、例えばリボヌクレオチドもしくは別の２′−修飾ヌクレオチドを組み込む能力を有するものも挙げられる。
【００１５】
或る態様では、未変更型ポリメラーゼはキメラポリメラーゼを含んで成る。一態様では、例えば、未変更型のキメラポリメラーゼはＣＳ5 ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号18）、ＣＳ6 ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号19）、又はＣＳ5 ＤＮＡポリメラーゼもしくはＣＳ6 ＤＮＡポリメラーゼに対して少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％もしくは99％の配列同一性を有するポリメラーゼである。特定の変形では、未変更型のキメラポリメラーゼは、配列番号18又は配列番号19に関してＧ46Ｅ，Ｌ329Ａ及びＥ678Ｇから選択される１又は複数のアミノ酸置換を含んで成る。例えば、未変更型の変異ポリメラーゼは、Ｇ46Ｅ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｅ678Ｇ ＣＳ5；又はＧ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ ＣＳ5であることができる。典型的態様では、それらの未変更型は、Ｓ671Ｆ，Ｄ640Ｇ，Ｑ601Ｒ及びＩ669Ｆから選択された１又は複数のアミノ酸置換を含んで成る変異型ポリメラーゼを提供するように置換される。例えば、変異型ＤＮＡポリメラーゼは、次のもののいずれか１つであることができる：Ｇ46Ｅ Ｓ671Ｆ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｄ640Ｇ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｑ601Ｒ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｉ669Ｆ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｓ671Ｆ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｄ640Ｇ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｑ601Ｒ ＣＳ 5；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｉ669Ｆ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｄ640Ｇ Ｅ678Ｇ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｑ601Ｒ Ｅ678Ｇ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｉ669Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｄ640Ｇ Ｅ678ＧＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｑ601Ｒ Ｅ678Ｇ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｑ601Ｒ Ｄ640Ｇ Ｉ669Ｆ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ5；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｉ669Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ5等。
【００１６】
或る態様では、ポリメラーゼが、Ｘb8がＧ，Ｔ，Ｒ，Ｋ及びＬから成る群より選択されたアミノ酸であるＣＳ5ポリメラーゼ（配列番号15）、ＣＳ6ポリメラーゼ（配列番号16）又はＺ05ポリメラーゼ（配列番号６）である。例えば、ＣＳ5又はＣＳ6ポリメラーゼは、Ｄ640Ｇ、Ｄ640Ｔ、Ｄ640Ｒ、Ｄ640Ｋ及びＤ640Ｌから選択することができる。Ｚ05ポリメラーゼは、Ｄ580Ｇ、Ｄ580Ｔ、Ｄ580Ｒ、Ｄ580Ｋ及びＤ580Ｌから成る群より選択することができる。
【００１７】
変異型ポリメラーゼは、別の非置換修飾を含むことができる。１つのそのような修飾は、酵素を不活性化するが、高められた温度、例えばプライマー伸長に典型的に用いられる温度でのインキュベーションの際に該酵素を活性化するように逆転する、熱可逆的な共有結合修飾である。一態様では、熱可逆的な共有結合修飾を含んで成る変異型ポリメラーゼは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと下式Ｉ又はIIのうちの１つを有するジカルボン酸無水物との混合物の、約25℃未満の温度でアルカリ性ｐＨにて実施される反応により製造される：
【００１８】
【化１】
2011502467.tif 000003
（上式中、Ｒ1とＲ2は水素であるか又は連結してもよい有機基である）；又は
【化２】
2011502467.tif 000004
（上式中、Ｒ1とＲ2は連結してもよい有機基であり、そして２つの水素はシスである）。そのような酵素の特定の変形では、未変更型ポリメラーゼがＧ64Ｅ ＣＳ5である。
【００１９】
或る態様では、適当なプライマー（例えば、核酸配列
5’-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC-3’（配列番号72）を有するポリヌクレオチド）を使って感作した、鋳型として一本鎖ＤＮＡ（例えばM13mp18, HIV）を使って伸長速度を測定し、そして本明細書中に記載のように規則的な時間間隔で（例えば5, 10, 15, 20, 30又は60秒毎に）蛍光色素の取り込みを測定することにより二本鎖ＤＮＡの形成を検出する。本発明のポリメラーゼの伸長速度は、本明細書中に記載の通り、予め決められた時間単位に渡り、参照ポリメラーゼ（例えば天然又は未変更型ポリメラーゼ）の伸長速度と比較することができる。
【００２０】
種々の別の観点では、本発明は、本明細書に記載の通り変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸、該組換え核酸を含んで成るベクター、及び該ベクターにより形質転換された宿主細胞を提供する。或る態様では、該ベクターが発現ベクターである。そのような発現ベクターを含んで成る宿主細胞は、組換え核酸の発現に適当な条件下で該宿主細胞を培養することによって変異型ポリメラーゼを産生させるために本発明の方法において有用である。本発明のポリメラーゼは、反応混合物及び／又はキットに含めることができる。組換え核酸、宿主細胞、ベクター、発現ベクター、反応混合物及びキットの態様は上記及び下記に記載の通りである。
【００２１】
更に別の観点では、プライマー伸長を実施する方法が提供される。該方法は一般に、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼを、プライマーの伸長に適当な条件下で、プライマー、ポリヌクレオチド鋳型、及び遊離ヌクレオチドと接触せしめ、それにより伸長されたプライマーを製造することを含んで成る。ポリヌクレオチド鋳型は、例えばＲＮＡ又はＤＮＡ鋳型であることができる。遊離ヌクレオチドは、例えばリボヌクレオチド及び／又は標識ヌクレオチドといった特殊のヌクレオチドを包含することができる。更に、プライマー及び／又は鋳型は１又は複数のヌクレオチド類似体を含むことができる。或る変形では、プライマー伸長法は、ポリヌクレオチドの増幅に適当な条件下で、変異型ＤＮＡポリメラーゼをプライマー対、ポリヌクレオチド鋳型及び遊離ヌクレオチドと接触せしめることを含んで成る、ポリヌクレオチド増幅方法である。
【００２２】
本発明はまた、そのようなプライマー伸長法において有用であるキットも提供する。一般に、該キットは、本明細書中に記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも1つの容器を包含する。或る態様では、該キットは更に１又は複数の追加の試薬を提供する１又は複数の追加の容器を含む。例えば特定の変形では、１又は複数の追加の容器は、遊離ヌクレオチド；プライマー伸長に適当な緩衝液；及び／又はプライマー伸長条件下で、予め決められたポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能なプライマーを提供する。
【００２３】
本発明のポリメラーゼを含んで成る反応混合物も更に提供される。該反応混合物は、鋳型核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、１又は複数のプライマー又はプローブポリヌクレオチド、遊離ヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、標識ヌクレオチド、特殊ヌクレオチド）、緩衝液、塩類、標識（例えば蛍光色素）も含有することができる。
【００２４】
定義
特に断らない限り、本明細書中で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本質的に本明細書に記載のものと同様であるどんな方法及び材料でも本発明の実施又は試験に用いることができるけれども、単に例示的な方法と材料のみが記載される。本発明の目的上、下記の用語が定義される。
【００２５】
用語“a”, “an”及び“the”は前後関係が明らかに別の意味を示さない限り、複数の指示対象を包含する。
【００２６】
「アミノ酸」とは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質中に組み込むことができる任意の単量体単位を指す。本明細書中に用いる時、「アミノ酸」なる用語は次の20個の天然の又は遺伝的にコードされるα−アミノ酸を包含する：アラニン（Ala又はＡ）、アルギニン（Arg又はＲ）、アスパラギン（Asn又はＮ）、アスパラギン酸（Asp又はＤ）、システイン（Cys又はＣ）、グルタミン（Gln又はＱ）、グルタミン酸（Glu又はＥ）、グリシン（Gly又はＧ）、ヒスチジン（His又はＨ）、イソロイシン（Ile又はＩ）、ロイシン（Leu又はＬ）、リジン（Lys又はＫ）、メチオニン（Met又はＭ）、フェニルアラニン（Phe又はＦ）、プロリン（Pro又はＰ）、セリン（Ser又はＳ）、スレオニン（Thr又はＴ）、トリプトファン（Trp又はＷ）、チロシン（Tyr又はＹ）及びバリン（Val又はＶ）。それらの20種の天然アミノ酸の構造は、例えばStryer他、Biochemistry, 第５版，Freeman and Company (2002)の中に記載されている。追加のアミノ酸、例えばセレノシステインやピロリジンも遺伝的にコードされ得る〔Stadtman (1996) “Selenocystein”, Annu Rev Biochem. 65:83-100及びIbba他 (2002) “Genetic code: introducing pyrrolysine,” Curr Biol. 12(13): R464-R466〕。用語「アミノ酸」は非天然アミノ酸、修飾アミノ酸（例えば修飾された側鎖及び／又は骨格を有するもの）、及びアミノ酸類似体も包含する。例えばZhang他 (2004) “Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24): 8882-8887; Anderson他 (2004) “An expanded genetic code with a functional quadruplet codon” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20): 7566-7571; Ikeda他 (2003) “Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo,” Protein Eng. Des. Sel. 16(9): 699-706; Chin他 (2003) “An Expanded Eukaryotic Genetic Code,” Science 301(5635): 964-967; James他 (2001) “Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues,” Protein Eng. Des. Sel. 14(12): 983-991; Kohrer他 (2001) “Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins,” Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25): 14310-14315; Bacher他 (2001) “Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue”, J. Bacteriol. 183(18): 5414-5425; Hamano-Takaku他 (2000) “A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine,” J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328及びBudisa他 (2001) “Proteins with ｛beta｝-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids,” Protein Sci. 10(7): 1281-1292を参照のこと。
【００２７】
例えば更に、アミノ酸は、典型的には置換又は未置換アミノ基、置換又は未置換カルボキシル基、及び１もしくは複数の側鎖もしくは基、又はそれらの基のいずれかの類似体を包含する有機酸である。典型的な側鎖としては、例えば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、ヘテロシクリック、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、又はそれらの基の任意組合せが挙げられる。別の代表的アミノ酸としては、非限定的に、光活性化可能な架橋剤を含んで成るアミノ酸、金属結合性アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、共有結合的に又は非共有結合的に別の分子と相互作用するアミノ酸、光ケージド及び／又は光異性化性アミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含んで成るアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、別の炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含んで成るアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に開裂可能な及び／又は光開裂可能なアミノ酸、炭素結合した糖を含むアミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び１又は複数の毒性成分を含んで成るアミノ酸が挙げられる。
【００２８】
本発明のＤＮＡポリメラーゼの文脈中の用語「変異型」は、対応する機能的ＤＮＡポリメラーゼに比較して１又は複数のアミノ酸置換を含んで成る、典型的には組換え体の、ポリペプチドを意味する。
【００２９】
変異型ポリメラーゼの文脈中の用語「未変更型」は、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼを定義する目的で用いられる用語である。用語「未変更型」は、変異型ポリメラーゼを特徴付けるものとして特定された１又は複数のアミノ酸位置を除いて変異型ポリメラーゼのアミノ酸配列を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼを指して言う。よって、(a)その未変更型及び(b)１又は複数の特定のアミノ酸置換の点での変異型ＤＮＡポリメラーゼへの参照は、特定された１又は複数のアミノ酸置換を除いて、別の点では変異体ポリメラーゼが、特定のモチーフ中に未変更型と同一のアミノ酸配列を有することを意味する。ポリメラーゼは、所望の機能性、例えばジデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、リボヌクレオチド類似体、色素標識ヌクレオチドの改善された取り込み、５′−ヌクレアーゼ活性の活性調節、３′−ヌクレアーゼ（又はプルーフリーディング）活性の活性調節等、を提供するような追加の変異を含むことができる。従って、本明細書に記載のように本発明を実施する際、未変更型のＤＮＡポリメラーゼが予め決定される。未変更型のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、野生型及び／又は天然に存在するＤＮＡポリメラーゼ、又は既に意図的に変更されているＤＮＡポリメラーゼであることができる。未変更型のポリメラーゼは、好ましくは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば様々な耐熱性菌からのＤＮＡポリメラーゼ、並びに野生型又は天然の耐熱性ポリメラーゼに対して実質的な配列同一性を有するそれの機能的変異体である。そのような変異体としては、例えば、キメラＤＮＡポリメラーゼ、例えば米国特許第6,228,628号及び米国特許出願公開第2004/0005599号明細書中に記載されたキメラＤＮＡポリメラーゼを含むことができる。或る態様では、未変更型ポリメラーゼは、逆転写酵素（ＲＴ）活性を有する。
【００３０】
用語「耐熱性ポリメラーゼ」は、熱に対して安定性であり、耐熱性であり、且つその後のプライマー伸長反応を行うのに十分な活性を保持しており、且つ二本鎖核酸の変性を果たすのに必要な時間の間高温にさらされた時に、不可逆的に変性される（不活性化される）ことはない酵素のことを言う。核酸の変性に必要な加熱条件は当業界で周知であり、例えば米国特許第4,683,202号、同第4,683,195号及び同第4,965,188号明細書中に例示されている。本明細書中で用いる時、耐熱性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）のような温度循環反応での使用に適当である。この目的上の不可逆的変性とは、酵素活性の永久的且つ完全な喪失を言う。耐熱性ポリメラーゼの場合、酵素活性とは、鋳型核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物を形成させる適切な形でのヌクレオチドの結合の触媒のことを言う。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）；サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）；サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）；サーマス・フラブス（Thermus fravus）；サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）；サーマス種sps17；サーマス種Z05；サーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）；バシラス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）；サーモトガ・ネオポリタナ（Thermotoga neopolitana）；及びサーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）からのＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００３１】
本明細書中で用いる時、「キメラ」タンパク質とは、そのアミノ酸配列が少なくとも２つの異なるタンパク質からのアミノ酸配列の部分配列の融合生成物を表すタンパク質を言う。キメラタンパク質は、典型的にはアミノ酸配列の直接操作により生成されるのではなく、むしろキメラアミノ酸配列をコードする「キメラ」遺伝子から発現される。或る態様では、例えば、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼの未変更型が、サーマス種ＤＮＡポリメラーゼ由来のアミノ末端（Ｎ末端）領域とTma ＤＮＡポリメラーゼ由来のカルボキシ末端（Ｃ末端）領域から成るキメラタンパク質である。Ｎ末端領域とは、Ｎ末端（アミノ酸位置１）から内部アミノ酸までに及ぶ領域を言う。同様に、Ｃ末端領域とは、内部アミノ酸からＣ末端までに及ぶ領域を言う。
【００３２】
変異型ＤＮＡポリメラーゼの文脈中、別の配列（例えば領域、断片、ヌクレオチド又はアミノ酸位置など）に対する「対応」は、ヌクレオチド又はアミノ酸位置番号に従って番号付けを変更し、次いで配列同一性の割合を最大にするように配列を整列することに基づく。与えられた「対応領域」内の全ての部位が同一である必要はないので、対応領域内の一致しない位置が「対応位置」とみなされる場合もある。従って、本明細書中で用いる時、特定のＤＮＡポリメラーゼの「アミノ酸位置〔Ｘ〕に相当するアミノ酸位置」への照会は、別の認められたＤＮＡポリメラーゼや構造的相同体及びファミリー中の同等の位置の収集物への照会を表す。本発明の典型的な態様では、アミノ酸位置の「対応」は、本明細書中に更に説明する通り、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の１又は複数のモチーフを含んで成るポリメラーゼの一領域に関して決定される。
【００３３】
本明細書中で用いる時、「組換え」とは、組換え法により意図的に変更されているアミノ酸配列又はヌクレオチド配列のことを言う。「組換え核酸」なる用語は、エンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、天然には通常見つからない形で、試験管内で最初に作製された核酸を意味する。直鎖状の単離された変異型ＤＮＡポリメラーゼ核酸、又は通常では連結されないＤＮＡ分子を連結せしめることにより試験管内で形成された発現ベクターは、共に本発明の目的上組換え体と見なされる。一旦組換え核酸が作製されそして宿主細胞中に再導入されると、それは非組換え的に、即ち、試験管内操作よりもむしろ宿主細胞の生体内細胞機構を使って複製するだろう；しかしながら、そのような核酸は、一旦組換え生産されるとその後非組換え的に複製するが、本発明の目的上まだ組換え体と見なされることを理解すべきである。「組換えタンパク質」は、組み換え技術を使って、即ち、上述した組換え核酸の発現を通して、製造されたタンパク質である。組換えタンパク質は、典型的には少なくとも１又は複数の特徴により、天然のタンパク質から識別される。
【００３４】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれる時、「作用可能に連結される」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に連結されており；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置されるならば、作用可能に連結されている。
【００３５】
用語「宿主細胞」は、単細胞原核生物と真核生物の両方（例えば細菌、酵母及びアクチノマイセス属）を指し、そして細胞培養において増殖させる時にはより高等の植物又は動物からの単細胞を指す。
【００３６】
用語「ベクター」とは、典型的には二本鎖のＤＮＡ片を指し、それは外来ＤＮＡ片中に挿入されていてもよい。又はベクターは、例えばプラスミド由来のものであってもよい。ベクターは、宿主細胞中での該ベクターの自律複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含有する。外来ＤＮＡは、宿主細胞中に本来見つからないＤＮＡである異種ＤＮＡとして定義され、それは例えば、ベクター分子を複製し、選択可能もしくはスクリーニング可能なマーカーをコードするか、又は導入遺伝子（transgene）をコードする。ベクターは、外来又は異種ＤＮＡを適当な宿主細胞に輸送するために用いられる。一旦宿主細胞に入れば、ベクターは宿主の染色体ＤＮＡとは独立に又はそれと同時に複製することができ、そしてベクターの複数コピーとその挿入ＤＮＡの複数コピーを生成することができる。加えて、ベクターは、挿入ＤＮＡからｍＲＮＡ分子への転写を許容するか、または他の方法で挿入ＤＮＡの多重コピーＲＮＡへの複製を引き起こす、必要な要素も含有することができる。幾つかの発現ベクターは更に、発現されたｍＲＮＡの半減期を増加させそして／又は該ｍＲＮＡからのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入ＤＮＡに隣接した配列要素を含む。このようにして挿入ＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡとポリペプチドの多数の分子を迅速に合成することができる。
【００３７】
天然のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドモノマーへの言及に加えて用語「ヌクレオチド」は、本明細書中では、文脈が明確に他のことを示さない限り、該ヌクレオチドが用いられている（例えば相補的塩基へのハイブリダイゼーション）特定の文脈に関して機能的に同等である、それの誘導体及び類似体を含む関連の構造変異体のことも指すと理解すべきである。
【００３８】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、リボース核酸（ＲＮＡ）もしくはデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）ポリマー又はそれの類似体に相当し得るポリマーのことを言う。この用語はＲＮＡやＤＮＡといったヌクレオチドのポリマーの他に、合成形、修飾された（例えば化学的又は生化学的に修飾された）形、及び混合ポリマー（例えばＲＮＡサブユニットとＤＮＡサブユニットの両方を含むもの）を包含する。典型的な修飾としては、メチル化、類似体による天然ヌクレオチドの１又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば無電荷の連結（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）、懸垂部分（例えばポリペプチド）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラーレン等）、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾結合（例えばαアノマー核酸等）が挙げられる。水素結合や他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力の点でポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。典型的には、ヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合を介して連結されるが、核酸の合成形は別の結合（例えばNielsen他、Science 254:1497-1500, 1991中に記載されるようなペプチド核酸）を含むことができる。核酸は、例えば染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡ又はＲＮＡポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の生成物、オリゴヌクレオチド、プローブ及びプライマーであることができ、又はそれを含有することができる。核酸は例えば、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であることができ、特定の長さに限定されない。異なって示されない限り、特定の核酸配列は、明示された任意の配列に加えて、場合により相補的配列を含んで成るか又はコードする。
【００３９】
用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つの核酸モノマー単位（例えばヌクレオチド）を含有する核酸のことを言う。オリゴヌクレオチドは、典型的には約６〜約175の核酸モノマー単位を含有し、より典型的には約８〜約50の核酸モノマー単位を含有し、そして更により典型的には約10〜約50の核酸モノマー単位（例えば約15、約20、約25、約30、約35、又はそれ以上の核酸モノマー単位）を含有する。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、該オリゴヌクレオチドの最終的機能又は使用をはじめとする多くの要因に依存するだろう。オリゴヌクレオチドは場合により、任意の適当な方法、例えば非限定的に、現存するか又は天然の配列の単離、ＤＮＡ複製又は増幅、逆転写、適当な配列のクローニング及び制限消化、或いは、Narang他（Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979）のホスホトリエステル法；Brown他（Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979）のホスホジエステル法；Beaucage他（Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981）のジエチルホスホルアミダイト法；Matteucci他（J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981）のトリエステル法；自動合成法；又はCaruthers他に1984年７月３日に付与された、”PROCESS FOR PREPARING POLYNUCLEOTIDEDS”という発明の名称の米国特許第4,458,066号の固相支持体法；又は当業者に既知の他の方法、といった方法による直接化学合成により合成される。
【００４０】
用語「プライマー」は、本明細書中で使用する時、プライマー発現が開始される条件下〔例えば、適当な緩衝液中及び適当な温度又は温度の循環（例えばポリメラーゼ連鎖反応におけるような）での必要なヌクレオシド三リン酸（コピーされる鋳型により決定付けられるような）及びポリメラーゼの存在を含んで成る条件下〕に置かれた時、鋳型指令の核酸合成の開始点として作用することができるポリヌクレオチドのことを言う。例えば更に、プライマーは様々な別のオリゴヌクレオチド媒介合成方法において、例えばデノボＲＮＡ合成及び試験管内転写関連工程（例えば核酸配列ベースの増幅（NASBA），転写媒介増幅（TMA）等）の開始剤として、使用することもできる。プライマーは典型的には一本鎖オリゴヌクレオチド（例えばオリゴデオキシリボヌクレオチド）である。プライマーの適当な長さはプライマーの意図する用途に依存するが、典型的には６〜40ヌクレオチド、より典型的には15〜35ヌクレオチドの範囲に及ぶ。短鎖プライマー分子は一般に、鋳型と充分安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低温を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、プライマー伸長が起こるために鋳型とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。或る態様では、用語「プライマー対」は、増幅させるべき核酸配列の５′末端の相補体とハイブリダイズする５′センスプライマー（時折「正」プライマーと呼ばれる）と、増幅させるべき核酸配列の３′末端とハイブリダイズする３′アンチセンスプライマー（時折「逆」プライマーと呼ばれる）とを包含するプライマーセットを意味する（標的配列がＲＮＡとして発現されるか又はＲＮＡである場合）。プライマーは、所望であれば、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手法により検出することができる標識を取り込むことにより、標識することができる。例えば、有用な標識としては、32Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（ELISAアッセイに汎用される）、ビオチン、又はそれに対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能であるハプテン及びタンパク質が挙げられる。
【００４１】
核酸塩基、ヌクレオシド三リン酸、又はヌクレオチドに言及する時の「従来の」又は「天然の」という用語は、記載されたポリヌクレオチド中に本来存在するもの（即ちＤＮＡの場合にはｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ）のことを言う。加えて、試験管内ＤＮＡ合成反応、例えば配列決定においては、ｄＧＴＰの代わりにｄＩＴＰ及び７−デアザ−ｄＧＴＰが頻繁に用いられ、そしてｄＡＴＰの代わりに７−デアザ−ｄＡＴＰを用いることができる。まとめて、それらをｄＮＴＰｓと称することができる。
【００４２】
核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドに言及する時の「特殊の」又は「修飾された」という用語は、特定のポリヌクレオチド中に天然に存在する従来の塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドの修飾体、誘導体又は類似体を包含する。或る特殊ヌクレオチドは、従来のｄＮＴＰｓに比較してリボース糖の２′位のところで修飾されている。よって、ＲＮＡの場合は天然のヌクレオチドはリボヌクレオチド（即ちＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰ，総称してｒＮＴＰｓ）であるけれども、それらのヌクレオチドは、比較して本明細書中で用いる時のｄＮＴＰｓ中には存在しない、糖の２′位にヒドロキシル基を有するため、リボヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼの基質として特殊ヌクレオチドである。本明細書中で用いる時、特殊ヌクレオチドとしては、非限定的に、核酸配列分析に終結剤（terminator）として用いられる化合物が挙げられる。代表的な終結剤化合物としては、非限定的に、２′，３′−ジデオキシ構造を有し且つジデオキシヌクレオシド三リン酸と称される化合物が挙げられる。ジデオキシヌクレオシド三リン酸ddＡＴＰ，ddＴＴＰ，ddＣＴＰ及びddＧＴＰは総称的にddＮＴＰｓと呼ばれる。終結剤化合物の追加の例としては、リボヌクレオチドの２′−PO 4類似体（例えば米国出願公報第2005/0037991及び2005/0037398を参照のこと）が挙げられる。別の特殊ヌクレオチドとしては、ホスホロチオエートｄＮＴＰｓ（〔[α]-Ｓ〕ｄＮＴＰｓ）、５′−[α]−ボラノ−ｄＮＴＰｓ、[α]−メチルホスホネートｄＮＴＰｓ、及びリボヌクレオシド三リン酸（ｒＮＴＰｓ）が挙げられる。特殊塩基は、32Ｐ，33Ｐ又は35Ｓのような放射性同位体；蛍光標識；化学発光標識；生物発光標識；ハプテン標識、例えばビオチン；酵素標識、例えばストレプトアビジン又はアビジンにより標識されてもよい。蛍光標識としては、負に帯電した色素、例えばフルオレセイン族の色素、又は電荷が中性である色素、例えばローダミン族の色素、又は正に帯電した色素、例えばシアニン族の色素を挙げることができる。フルオレセイン族の色素としては、例えば、ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＪＯＥ，ＮＡＮ及びＺＯＥが挙げられる。ローダミン族の色素としては、テキサスレッド、ＲＯＸ，Ｒ110，Ｒ６Ｇ及びＴＡＭＲＡが挙げられる。ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＴＥＴ，ＪＯＥ，ＮＡＮ，ＺＯＥ，ＲＯＸ，Ｒ110，Ｒ６Ｇ，テキサスレッド及びＴＡＭＲＡにより標識された様々なヌクレオチド及び色素はPerkin-Elmer（Boston, MA）、Applied Biosystems（Foster City, CA）又はInvitrogen/Molecular Probes（Eugene, OR）により販売されている。シアニン族の色素としてはCy2，Cy3, Cy5及びCy7が挙げられ、それらはGE Healthcare UK Limited（Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England）により販売されている。
【００４３】
本明細書中で、「配列同一性の割合」は、比較窓を通して２つの最適に配列された配列を比較することにより決定され、ここで比較窓中の配列の部分は、２つの配列の最適整列のための参照配列（付加又は欠失を含まない）に比較して付加又は欠失（即ちギャップ）を含むことができる。割合は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を測定して合致した位置の数を与え、その合致した位置の数を比較窓の中の位置の総数により割り、そしてその結果を100倍して配列同一性の割合を求めることにより算出する。
【００４４】
２以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈内の用語「同一」又は「同一性」度は、同一であるか、又は比較窓の上で比較しそして最大の対応となるよう整列した時に、同一である（例えば、特定領域に渡り60％同一性、場合により65％、70％、75％、80％、85％、90％又は95％同一性である）特定の割合のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する２以上の配列又は部分配列を指すか、或いは下記の配列比較演算法の１つを使って又はマニュアル整列と視覚検査により測定した時の指定領域のことを指す。配列は、それらが少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％又は少なくとも55％同一であるならば、互いに「実質的に同一」である。それらの定義は、試験配列の相補体についても言う。場合により、同一性は少なくとも長さ約50ヌクレオチド、又はより典型的には長さ100〜500もしくは1000以上のヌクレオチドである領域に渡って存在する。
【００４５】
２以上のポリペプチド配列の文脈内での用語「類似性」又は「類似性度」は、比較窓上で最大対応になるように比較しそして整列した時、保存的アミノ酸置換により定義されるように同一か又は類似のいずれかであるアミノ酸残基の特定比率（例えば特定領域に渡り60％類似性、場合により65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％類似性）を有する、２以上の配列又は部分配列を指すか、或いは、下記の配列比較演算法の１つを使って又はマニュアル整列と視覚検査により測定した時の指定領域を指す。配列は、それらが互いに少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％類似であるならば、互いに「実質的に類似」である。場合により、この類似性は、少なくとも長さ約50アミノ酸、より典型的には少なくとも長さ約100〜500もしくは1000以上のアミノ酸である領域に渡って存在する。
【００４６】
配列比較用には、典型的には、１つの配列がそれと試験配列を比較するための参照配列として働く。配列比較演算法を使った時、試験及び参照配列はコンピューターに入力され、必要ならば部分配列候補が指定され、そして配列演算プログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが通常用いられ、あるいは代替パラメーターを指定することができる。次いで該プログラムパラメーターに基づいて、配列比較演算法が参照配列に対する試験配列の同一性又は類似性％を算出する。
【００４７】
本明細書中で用いる「比較窓」という用語は、20〜600、普通は約50〜約200、より普通には約100〜約150から成る群より選択された連続する位置の数のうちのいずれか１つのセグメントへの参照を包含し、その比較窓中で２つの配列を最適に整列した後で同数の連続位置の参照配列と比較することができる。比較用の配列の最適整列は、例えば、Smith & Waterman（Adv. Appl. Math. 2:482, 1970）の局所相同性演算法により、Needleman & Wunsch（J. Mol. Biol. 48:443, 1970）の相同性整列演算法により、Pearson & Lipman（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988）の相同性研究法により、それらの演算法のコンピューター化実施（例えばWisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis中のGAP, BESTFIT, FASTA及びTFASTA）により、又はマニュアル整列と視覚検査（例えばAusubel他、Current Protocols in Molecular Biology (1995増補)を参照のこと）により実施できる。
【００４８】
有用な演算法の一例はPILEUPである。PILEUPは、関連と配列同一性度を示すのにプログレッシブ対整列を使って、関連配列の一群から多数の配列整列を構築する。それはまた、整列を構築するのに使ったクラスター関係を示す階層又はデンドログラム（枝分かれ図）をプロットする。PILEUPは、Feng & Doolittle（J. Mol. Evol. 35:351-360, 1987）のプログレッシブ整列法の簡易化法を用いる。使用する方法は、Higgins & Sharp（CABIOS 5:151-153, 1989）により記載された方法と同様である。該プログラムは、各々が5,000ヌクレオチド又はアミノ酸の最大長さである300配列までを整列することができる。多重整列手順は、２つの最も類似の配列の対整列により始まり、２つの整列された配列のクラスターを生成する。このクラスターを次いで次の最大関連配列又は整列配列のクラスターに整列させる。配列の２つのクラスターが、２つの各配列の対整列の単純な伸長により整列される。最終的な整列は、一連のプログレッシブ対整列により達成される。該プログラムは、特定の配列及びそれらのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することにより、そして該プログラムパラメーターを指定することにより実施される。PILEUPを使って、参照配列を別の試験配列と比較して、次のパラメーターを使って配列同一性％を決定する：
デフォルトギャップ加重（3.00）、デフォルトギャップ長加重（0.10）、及び加重エンドギャップ。PILEUPは、ＧＣＧ配列分析ソフトウエアパッケージ（例えばバージョン7.0（Devereaux他、Nucl. Acids Res. 12:387-95, 1984）又はそれ以降）から得ることができる。
【００４９】
配列同一性度及び配列類似性を決定するのに適当である演算法の別の例は、それぞれAltschul他（Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977）及びAltschul他（J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990）に記載されたBLAST及びBLAST 2.0演算法である。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して入手可能である。この演算法は、クエリー配列中の長さＷの短い単語を同定することにより高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定し、それはデータベース配列中の同じ長さの単語と整列した時に、或る正の値を有する閾値Ｔスコアと一致するか又は満足する。Ｔは近隣の単語スコア閾値と呼ばれる（Altschul他、前掲）。それらの最初の近隣単語は、それらを含有するより長いＨＳＰｓを見つけるためのサーチを開始するための種（seed）として働く。該単語ヒットは、整列スコアを増加させることができる限り、各配列に沿って両方向で拡張される。蓄積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメーターＭ（一致する残基対についての報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使って計算される。アミノ酸配列の場合、得点行列を使って累積スコアを計算する。各方向での単語ヒットの拡張は、次の時に止められる：累積した整列スコアが、それの最大達成値から量Ｘだけ下がる；１又は複数の負のスコアの残基整列の累積のために、累積スコアがゼロか又はそれ以下になる；又はいずれかの配列の末端に到達する。BLAST演算法パラメーターＷ、Ｔ及びＸは、整列の感度と速度を決定づける。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして11の単語長（Ｗ）、10の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BSASTPプログラムはデフォルトとして３の単語長、10の期待値（Ｅ）、及びBLOSUM62得点表（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989を参照）、50の整列（Ｂ）、10の期待値、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較を使用する。
【００５０】
BLAST演算法は、２つの配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばKarlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9:5873-87, 1993）。BLAST演算法により提供される類似性の１尺度は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に起こるであろう確率の指標を提供する、最小和確率（Ｐ(Ｎ)）である。例えば、試験核酸と参照核酸との比較において最小和確率が約0.2未満、典型的には約0.01未満、更に典型的には約0.001未満である時、その核酸は参照配列に類似していると考えられる。
【００５１】
用語「核酸伸長速度」は、生体触媒（例えば酵素、例えばポリメラーゼ、リガーゼ等）が、１又は複数のヌクレオチドを核酸に結合する（例えば共有結合的に）ことにより核酸（例えばプライマー又は別のオリゴヌクレオチド）を鋳型依存又は鋳型独立方式で伸長する速度を言う。例えば、本明細書中の或る種の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、それらが与えられた反応条件セットの下で未変更型よりも高い反応速度でプライマーを伸長できるように、それらのＤＮＡポリメラーゼの未変更型に比較して改善された核酸伸長速度を有する。
【００５２】
用語「逆転写効率」は、与えられた転写反応においてｃＤＮＡとして逆転写されるＲＮＡ分子の割合を言う。或る態様では、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、それらのＤＮＡポリメラーゼの未変更型に比較して改善された逆転写効率を有する。即ち、それらの変異型ＤＮＡポリメラーゼは、特定の反応条件セットの下で未変更型よりも高い割合のＲＮＡ鋳型を逆転写する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、様々な種の耐熱性菌からの代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメインからの一領域のアミノ酸配列整列を表す：サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）(Tth)（配列番号４）、サーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）(Tca)（配列番号５）、サーマス種Z05(Z05)（配列番号６）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）(Taq)（配列番号７）、サーマス・フラブス（Thermus flavus）（Tfl）（配列番号８）、サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）(Tfi)（配列番号９）、サーマス種sps17（Sps17）（配列番号10）、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）（Tma）（配列番号11）、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）（Tne）（配列番号12）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）（Taf）（配列番号13）及びバシラス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）（Bca）（配列番号14）。アミノ酸配列整列は、各々のキメラ耐熱性ポリメラーゼ、即ち、CS5（配列番号15）及びCS6（配列番号16）のポリメラーゼドメインからの一領域も包含する。加えて、それらの代表的配列間の共通アミノ酸残基を示す配列（Cons）（配列番号17）も含まれる。更に、図示されるポリペプチド領域は、アミノ酸モチーフＸＸＸＸＲＸＸＸＫＬＸＸＴＹＸＸ（配列番号１）、ＴＧＲＬＳＳＸＸＰＮＬＱＮ（配列番号２）及びＸＸＸＸＸＸＸＤＹＳＱＩＥＬＲ（配列番号３）を含んで成り、それの可変性部分は更に下記に定義される。それらのモチーフは各ポリメラーゼ配列について太字体で強調表示される。本発明に従った突然変異を受けやすいアミノ酸位置は星印（＊）で示される。整列内のギャップはドット（・）で示される。
【００５４】
【図２】図２Ａは、キメラ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＣＳ５のアミノ酸配列（配列番号18）を表す。  図２Ｂは、キメラ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＣＳ５をコードする核酸配列（配列番号20）を表す。
【００５５】
【図３】図３Ａは、キメラ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＣＳ６のアミノ酸配列（配列番号19）を表す。  図３Ｂは、キメラ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼＣＳ６をコードする核酸配列（配列番号21）を表す。
【００５６】
【図４】図４は、Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ（ＧＬＥ）ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼの様々な変異体の標準化伸長速度を示す棒グラフである。ｙ軸は相対伸長速度を表し、一方でｘ軸は特定の点変異（Ｇ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ、Ｉ＝Ｉ669Ｆ、Ｓ＝Ｓ671Ｆ、及びＥ＝Ｅ678Ｇ）を有するＤＮＡポリメラーゼを表す。変異型ポリメラーゼについて得られた伸長速度値は、ＧＬＥ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼについて得られた値（これは1.00に設定される）に比較して標準化される。
【００５７】
【図５】図５は、Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ(ＧＬＥ)ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼの様々な変異体の標準化伸長速度を示す棒グラフである。ｙ軸は相対伸長速度を表し、一方でｘ軸は特定の点変異（Ｇ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ、Ｉ＝Ｉ669Ｆ、Ｓ＝Ｓ671Ｆ及びＥ＝Ｅ678Ｇ）を有するＤＮＡポリメラーゼを表す。変異型ポリメラーゼについて得られた伸長速度値は、ＧＬＥ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼについて得られた値（これは1.00に設定される）に比較して標準化される。
【００５８】
【図６】図６は、Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼ、ΔＺ05 ＤＮＡ（図６中のｄＺ05）ポリメラーゼ（例えば、Abramson他に1995年10月３日に付与された“MUTATED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMUS SPECIES Z05”という発明の名称の米国特許第5,455,170号明細書、及びAbramson他に1997年10月７日に付与された“DNA ENCODING THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMUS SPECIES Z05”という発明の名称の米国特許第5,674,738号明細書を参照のこと）及びＧ46Ｅ Ｌ329Ａ (ＧＬ)ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼの様々な変異体の標準化伸長速度を示す棒グラフである。ｙ軸は相対伸長速度を表し、一方でｘ軸は特定の点変異（Ｇ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ、Ｉ＝Ｉ669F、Ｓ＝Ｓ671Ｆ及びＥ＝Ｅ678Ｇ）を有するＤＮＡポリメラーゼを表す。変異型ポリメラーゼについて得られた伸長速度値は、ＧＬＥ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼについて得られた値（これは1.00に設定される）に比較して標準化される。
【００５９】
【図７】図７は、Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼ、ΔＺ05（図７中のｄＺ05）ＤＮＡポリメラーゼ、及びＧ46Ｅ Ｌ329Ａ (ＧＬ)ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼの様々な変異体の標準化伸長速度を示す棒グラフである。ｙ軸は相対伸長速度を表し、一方でｘ軸は特定の点変異（Ｇ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ、Ｉ＝Ｉ669F、Ｓ＝Ｓ671Ｆ及びＥ＝Ｅ678Ｇ）を有するＤＮＡポリメラーゼを表す。変異型ポリメラーゼについて得られた伸長速度値は、ＧＬＥ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼについて得られた値（これは1.00に設定される）に比較して標準化される。
【００６０】
【図８】図８は、変動する塩（KOAc）濃度の下での異なるＤＮＡポリメラーゼの伸長速度を示すプロットである。ｙ軸は伸長速度を表し（任意単位）、一方でｘ軸はKOAc濃度（mM）を表す。プロットに付随する説明文は、該プロット中の各トレースに相当するＤＮＡポリメラーゼを示す。特に、デルタＺ05はΔＺ05 ＤＮＡポリメラーゼを指し、そしてＺ05はＺ05 ＤＮＡポリメラーゼを指し、一方で指摘された別の酵素は、特定の点変異（Ｇ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ、Ｓ＝Ｓ671Ｆ及びＥ＝Ｅ678Ｇ）を有する変異型ＣＳ5 ＤＮＡポリメラーゼを指す。
【００６１】
【図９】図９は、変動する塩（KOAc）濃度の下での異なるＤＮＡポリメラーゼの伸長速度を示すプロットである。ｙ軸は伸長速度を表し（任意単位）、一方でｘ軸はKOAc濃度（mM）を表す。プロットに付随する説明文は、該プロット中の各トレースに相当するＤＮＡポリメラーゼを示す。特に、指摘した別の酵素は、特定の点変異（Ｇ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ、Ｓ＝Ｓ671Ｆ及びＥ＝Ｅ678Ｇ）を有する変異型ＣＳ5 ＤＮＡポリメラーゼを指す。
【００６２】
【図１０】図10は、ＲＴ−ＰＣＲにおいて様々な変異型ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼについて得られた閾値サイクル（Ｃｔ）を示す棒グラフである。ｙ軸はＣｔ値を表し、一方でｘ軸は特定の点変異（Ｇ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ及びＳ＝Ｓ671Ｆ）を有するＤＮＡポリメラーゼを表す。
【００６３】
【図１１】図11は、様々なＲＴインキュベーション時間を有するMg2+活性化ＲＴ−ＰＣＲにおける様々な変異型ＣＳ５ ＤＮＡポリメターゼについて得られた閾値サイクル（Ｃｔ）を示す棒グラフである。ｙ軸はＣｔ値を表し、ｘ軸は特定の点変異（Ｇ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ及びＳ＝Ｓ671Ｆ）を有するＤＮＡポリメラーゼを表す。
【００６４】
【図１２】図12は、様々なＲＴインキュベーション時間を有するMn2+活性化ＲＴ−ＰＣＲにおける様々な変異型ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼについて得られたＣｔ値を示す棒グラフである。ｙ軸はＣｔ値を表し、ｘ軸は特定の点変異（Ｇ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ及びＳ＝Ｓ671Ｆ）を有するＤＮＡポリメラーゼを表す。
【００６５】
【図１３Ａ】図13Ａ及びＢは、リボヌクレオチドを含む様々な条件の下で全長アプリコン（単位複製配列）を作製する本明細書中に記載の幾つかの酵素の能力を描写するアガロースゲルの写真である。写真上に表示されるように、試験した酵素はＧＱＤＳＥ，ＣＳ６−ＧＱＤＳＥ，ＧＬＱＤＳＥ，ＧＤＳＥ，ＧＬＤＳＥ，ＧＬＤＥ，ＧＥ（Ｇ46Ｅ ＣＳ５Ｒ），及びＧＬとＧＬＥ（ＧＬ ＣＳ５／ＧＬＥ）の４：１混合物であった。ここでＧ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ、Ｓ＝Ｓ671Ｆ及びＥ＝Ｅ678Ｇ。全ての酵素がＣＳ６−ＧＱＤＳＥと命名したものを別にしてＣＳ５酵素であった。
【図１３Ｂ】図13Ａ及びＢは、リボヌクレオチドを含む様々な条件の下で全長アプリコン（単位複製配列）を作製する本明細書中に記載の幾つかの酵素の能力を描写するアガロースゲルの写真である。写真上に表示されるように、試験した酵素はＧＱＤＳＥ，ＣＳ６−ＧＱＤＳＥ，ＧＬＱＤＳＥ，ＧＤＳＥ，ＧＬＤＳＥ，ＧＬＤＥ，ＧＥ（Ｇ46Ｅ ＣＳ５Ｒ），及びＧＬとＧＬＥ（ＧＬ ＣＳ５／ＧＬＥ）の４：１混合物であった。ここでＧ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ、Ｓ＝Ｓ671Ｆ及びＥ＝Ｅ678Ｇ。全ての酵素がＣＳ６−ＧＱＤＳＥと命名したものを別にしてＣＳ５酵素であった。
【００６６】
【図１４Ａ】図14Ａは、試験した様々なｒＡＴＰ条件（ｙ軸）に対する、図13ＡとＢに関して記載した酵素についてのデルタＣｔｓ（ｙ軸）のプロットである。
【図１４Ｂ】図14Ｂは、試験した様々なｒＮＴＰ条件（ｙ軸）に対する図13ＡとＢに関して記載した酵素についての％ｒＮＴＰ取り込み（ｙ軸）のプロットである。
【００６７】
【図１５Ａ】図15ＡとＢは、ビオチニル化リボヌクレオチドを含む様々な条件の下で全長アンプリコンを形成する本明細書に記載の或る酵素の能力を描写するアガロースゲルの写真である。写真上に記したように、試験したＣＳ５酵素はＧＱＤＳＥ，ＧＤＳＥ，ＧＥ（Ｇ46Ｅ ＣＳ５Ｒ）、及びＧＬとＧＬＥの４：１混合物（ＧＬ／ＧＬＥブレンド(4:1)）であった。ここでＧ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ、Ｓ＝Ｓ671Ｆ及びＥ＝Ｅ678Ｇ。
【図１５Ｂ】図15ＡとＢは、ビオチニル化リボヌクレオチドを含む様々な条件の下で全長アンプリコンを形成する本明細書に記載の或る酵素の能力を描写するアガロースゲルの写真である。写真上に記したように、試験したＣＳ５酵素はＧＱＤＳＥ，ＧＤＳＥ，ＧＥ（Ｇ46Ｅ ＣＳ５Ｒ）、及びＧＬとＧＬＥの４：１混合物（ＧＬ／ＧＬＥブレンド(4:1)）であった。ここでＧ＝Ｇ46Ｅ、Ｌ＝Ｌ329Ａ、Ｑ＝Ｑ601Ｒ、Ｄ＝Ｄ640Ｇ、Ｓ＝Ｓ671Ｆ及びＥ＝Ｅ678Ｇ。
【００６８】
【図１６Ａ】図16Ａは、試験した様々なｒＣＴＰ条件について図15ＡとＢに関して記載した酵素（ｘ軸）についてのデルタＣｔｓ（ｙ軸）のプロットである。
【図１６Ｂ】図16Ｂは、試験した様々なビオチン標識ｒＣＴＰ（説明文）についてのそれらの酵素（ｘ軸）に対するデルタＣｔｓ（ｙ軸）のプロットである。
【００６９】
【図１７】図17は、Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ（ＧＬＥ）ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼを使った加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）における閾値サイクル（Ｃｔ）に対する酵素濃度の影響を示す棒グラフである。ｙ軸はＣｔ値を表し、ｘ軸は酵素濃度（nM）を表す。プロットに付随する説明文は、グラフ中の各トレースに相当する鋳型核酸のコピー数を示す（鋳型核酸の無コピー(no temp)、鋳型核酸の１ｅ4コピー(1 E4/rxn)、鋳型核酸の１ｅ5コピー(1 E5/rxn)、及び鋳型核酸の１ｅ6コピー(1 E6/rxn)）。
【００７０】
【図１８】図18は、Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ（ＧＬＤＳＥ）ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼを使った加ピロリン酸分解活性化重合（ＰＡＰ）における閾値サイクル（Ｃｔ）に対する酵素濃度の影響を示す棒グラフである。ｙ軸はＣｔ値を表し、ｘ軸は酵素濃度（nM）を表す。プロットに付随する説明文は、グラフ中の各トレースに相当する鋳型核酸のコピー数を示す（鋳型核酸の０コピー(no temp)、鋳型核酸の１ｅ4コピー(1 E4/rxn)、鋳型核酸の１ｅ5コピー(1 E5/rxn)、及び鋳型核酸の１ｅ6コピー(1 E6/rxn)）。
【００７１】
【図１９】図19は、サーマス種Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼの様々な変異体の標準化伸長速度を示す棒グラフである。ｙ軸は相対伸長速度を表し、そしてｘ軸はサーマス種Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ05）及び特定の点変異（Ｑ＝Ｔ541Ｒ、Ｄ＝Ｄ580Ｇ、及びＳ＝Ａ610Ｆ）を有する様々なＺ05 ＤＮＡポリメラーゼを表す。ｘ軸はまた、ＥＳ112（Ｅ683Ｒ Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼ；Smith他により2001年３月30日に出願された“High temperature reverse transcription using mutant DNA polymerases”という発明の名称の米国特許出願第20020012970号明細書を参照のこと）及びＥＳ112−Ｄ（Ｄ580Ｇ Ｅ683Ｒ Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼ）も表す。変異型ポリメラーゼについて得られた伸長速度は、Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼについて得られた伸長速度値（1.00に設定される）に関して標準化される。
【００７２】
【図２０】図20は、ＰＡＰ関連ＨＩＶ ＤＮＡ鋳型滴定を含む分析からのＰＣＲ生成物の検出を示す、ゲルの写真である。
【００７３】
【図２１】図21は、ブロックされた又はブロックされていないプライマーを含む増幅において使用した様々な変異体Ｋ−Ｒａｓプラスミド鋳型コピー数について観察された閾値サイクル（ＣT）値を示すグラフである。
【００７４】
【図２２】図22は、Ｋ−Ｒａｓプラスミド鋳型を含む増幅において使用した様々な酵素及び酵素濃度について観察された閾値サイクル（ＣT）を示すグラフである。
【００７５】
【図２３】図23は、ＨＣＶ ＲＮＡに対するＰＡＰ逆転写反応についてのデータを示す棒グラフであり、ここでＨＣＶ ｃＤＮＡに特異的な定量的ＰＣＲアッセイを使ってｃＤＮＡ反応の生成物を測定した。ｙ軸はＣｔ値を表し、ｘ軸は反応に使用した酵素の単位を表す。指摘したように、この反応で使用した酵素はＺ05 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ05）又はＧ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｑ601Ｒ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ（ＧＬＱＤＳＥ）とＧ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｑ601Ｒ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ（ＧＬＱＤＳ）ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼのブレンドであった。
【００７６】
【図２４】図24は、双方向ＰＡＰを実施した時に生成したＢＲＡＦ腫瘍遺伝子増幅物のＰＣＲ増殖曲線を示す。ｘ軸は標準化した蓄積蛍光を示し、そしてｙ軸はＰＡＰ  ＰＣＲ増幅のサイクルを示す。
【００７７】
本発明は、ポリメラーゼドメイン中の１又は複数のアミノ酸が機能性ＤＮＡポリメラーゼに比較して変異されている新規変異型ＤＮＡポリメラーゼを提供する。本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、未変更型のポリメラーゼに比較してヌクレオチド取り込みの速度が改善されている活性酵素であり、そして或る態様では、逆転写酵素活性及び／又は増幅能力において付随の増加を有する活性酵素である。該変更型ＤＮＡポリメラーゼは、親酵素より優れた又は同等の性能のためにより低い濃度で使用することができる。或る態様では、本明細書に記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、親酵素に比較して改善された熱安定性を有する。従って、変異型ＤＮＡポリメラーゼは、プライマー伸長やポリヌクレオチド鋳型の逆転写又は増幅といった様々な用途、例えば、組換えＤＮＡ研究及び病気の医学診断における用途において有用である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本発明に従った変異を受けやすい未変更型ＤＮＡポリメラーゼは、次のアミノ酸モチーフを含んで成る機能的ポリメラーゼ領域を有するものである：
(a) Ｘaa−Ｘaa−Ｘaa−Ｘaa−Arg−Ｘaa−Ｘaa−Ｘaa−Lys−Leu−Ｘaa−Ｘaa−Thr−Tyr−Ｘaa−Asp
（本明細書では一文字記号でＸa1−Ｘa2−Ｘa3−Ｘa4−Ｒ−Ｘa6−Ｘa7−Ｘa8−Ｋ−Ｌ−Ｘa11−Ｘa12−Ｔ−Ｙ−Ｘa15−Ｘa16（配列番号１）とも称する）；
ここでＸa1はIle（Ｉ）又はLeu（Ｌ）であり；
Ｘa2はGln（Ｑ）又はLeu（Ｌ）であり；
Ｘa3はGln（Ｑ），His（Ｈ）又はGlu（Ｅ）であり；
Ｘa4はTyr（Ｙ），His（Ｈ）又はPhe（Ｆ）であり；
Ｘa6はGlu（Ｅ），Gln（Ｑ）又はLys（Ｋ）であり；
Ｘa7はIle（Ｉ），Leu（Ｌ）又はTyr（Ｙ）であり；
Ｘa8はGln（Ｑ），Thr（Ｔ），Met（Ｍ），Gly（Ｇ）又はLeu（Ｌ）であり；
Ｘa11はLys（Ｋ）又はGln（Ｑ）であり；
Ｘa12はSer（Ｓ）又はAsn（Ｎ）であり；
Ｘa15はIle（Ｉ）又はVal（Ｖ）であり；そして
Ｘa16はGlu（Ｅ）又はAsp（Ｄ）である；
【００７９】
(b) Thr−Gly−Arg−Leu−Ser−Ser−Ｘaa−Ｘaa−Pro−Asn−Leu−Gln−Asn
（本明細書では一文字記号でＴ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘb7−Ｘb8−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎ（配列番号２）とも称する）；
ここでＸb7はSer（Ｓ）又はThr（Ｔ）であり；そして
Ｘb8はAsp（Ｄ），Glu（Ｅ）又はAsn（Ｎ）である；及び
【００８０】
(c) Ｘaa−Ｘaa−Ｘaa−Ｘaa−Ｘaa−Ｘaa−Ｘaa−Asp−Tyr−Ser−Gln−Ile−Glu−Leu−Arg
（本明細書では一文字記号でＸc1−Ｘc2−Ｘc3−Ｘc4−Ｘc5−Ｘc6−Ｘc7−Ｄ−Ｙ−Ｓ−Ｑ−Ｉ−Ｅ−Ｌ−Ｒ（配列番号３）とも称する）；
ここでＸc1はGly（Ｇ），Asn（Ｎ）又はAsp（Ｄ）であり；
Ｘc2はTrp（Ｗ）又はHis（Ｈ）であり；
Ｘc3はTrp（Ｗ），Ala（Ａ），Leu（Ｌ）又はVal（Ｖ）であり；
Ｘc4はIle（Ｉ）又はLeu（Ｌ）であり；
Ｘc5はVal（Ｖ），Phe（Ｆ）又はLeu（Ｌ）であり；
Ｘc6はSer（Ｓ），Ala（Ａ），Val（Ｖ）又はGly（Ｇ）であり；そして
Ｘc7はAla（Ａ）又はLeu（Ｌ）である。
【００８１】
これらのモチーフは、多くのファミリーＡ型ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、特に耐熱性菌からの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性部位中の約100アミノ酸領域の中に存在する。例えば、図１は、次の数種の耐熱性菌からのＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメインからの一領域のアミノ酸配列整列を示す：サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、サーマス・フラブス（Thermus fravus）、サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）、サーマス種sps17、サーマス種Z05、サーモトガ・ネオポリタナ（Thermotoga neopolitana）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、バシラス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）及びサーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）。図１に示されるアミノ酸配列整列は、代表的なキメラ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメインからの一領域も包含する。図示されるように、配列番号１，２及び３の各モチーフが、それらのポリメラーゼの各々に存在し、この事実は活性部位のそれらの領域に保存された機能があることを示唆する。
【００８２】
従って、或る態様では、ＤＮＡポリメラーゼの未変更型は野生型の又は天然に存在するＤＮＡポリメラーゼ、例えば、上記に列挙した耐熱性菌の種のいずれかからのポリメラーゼである。一態様では、未変更ポリメラーゼがサーマス（Thermus）属の種からのものである。本発明の別の態様では、未変更ポリメラーゼがサーマス属以外の耐熱性菌種に由来する。多数の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼについての全長核酸配列及びアミノ酸配列が入手可能である。サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）（Taq）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Tth）、サーマス種Z05、サーマス種sps17、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）（Tma）及びサーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）（Taf）ポリメラーゼの各配列はＰＣＴ国際特許公報WO 92/06200において発表されている。サーマス・フラブス（Thermus flavus）からのＤＮＡポリメラーゼの配列は、Akhmetzjanov及びVakhitov（Nucleic Acids Research 20:5839, 1992）において発表されている。サーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配列はEMBL/GenBank受入番号U62584 に見つかる。サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配列は、例えば米国特許第4,889,818号中に提供された方法、並びに第１表に与えられた配列情報を使って、ATCC寄託番号No.42380から回収することができる。サーモトガ・ナポリタナ（Thermotoga neapolitana）ＤＮＡポリメラーゼの配列は、GeneSeq特許データベース受入番号R98144及びＰＣＴ WO 97/09451からものである。バシラス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）からの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの配列は、例えばUemori他（J. Biochem(Tokyo) 113(3):401-410, 1993；更にSwiss-Protデータベース受入番号Q04957並びにGeneBank受入番号D12982及びBAA02361も参照のこと）に記載されている。本明細書に記載のように変更することができる未変更型ＤＮＡポリメラーゼの例は、例えば、Gelfand他に2001年５月８日に付与された“Mutant chimeric DNA polymerase”という発明の名称の米国特許第6,228,628号明細書；Gelfand他に2002年２月12日に付与された“Thermostable DNA polymerases incorporating nucleoside triphosphates labeled with fluorescein family dyes”という発明の名称の米国特許第6,346,379号明細書；Ankenbauer他に2006年４月18日に付与された “Thermostable enzyme promoting the fidelity of thermostable DNA polymerases-for improvement of nucleic acid synthesis and amplification in vitro”という発明の名称の米国特許第7,030,220号明細書 ；Sobek他に2005年４月19日に付与された“Mutant B-type DNA polymerases exhibiting improved performance in PCR”という発明の名称の米国特許第6,881,559号明細書；Markau他に2004年９月21日に付与された“Modified DNA polymerase from carboxydothermus hydrogenoformans and its use for coupled reverse transcription and polymerase chain reaction”という発明の名称の米国特許第6,794,177号明細書；Ankenbauer他に2002年10月22日に付与された“Thermostable DNA polymerase from carboxydothermus hydrogenoformans”という発明の名称の米国特許第6,468,775号明細書；Schoenbrunner他により2003年３月26日に出願された“Thermostable or thermoactive DNA polymerase molecules with attenuated 3’-5’exonuclease activity”という発明の名称の米国特許出願第20040005599号明細書；Smith他により2001年３月30日に出願された“High temperature reverse transcription using mutant DNA polymerases”という発明の名称の米国特許出願第20020012970号明細書；Ankenbauer他により2005年９月29日に出願された“Thermostable enzyme promoting the fidelity of thermostable DNA polymerases-for improvement of nucleic acid synthesis and amplification in vitro”という発明の名称の米国特許出願第20060078928号明細書；及びSobek他により2002年12月11日に出願された“Reversibly modified thermostable enzymes for DNA synthesis and amplification in vitro”という発明の名称の米国特許出願第20040115639号明細書中にも記載されている。
【００８３】
同じく本明細書に記載の変異に適しているのは、前もって変更されたポリメラーゼが配列番号１，２及び３のアミノ酸モチーフを保持していることを前提として、前もって変更されている（例えばアミノ酸置換、付加又は削除により）機能的ＤＮＡポリメラーゼである。よって、適当な未変更ポリメラーゼは、野生型又は天然のポリメラーゼの機能的変異体も包含する。そのような変更体は、典型的には野生型又は天然のポリメラーゼに対して実質的な配列同一性又は類似性、典型的には少なくとも80％の配列同一性、より典型的には少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有するだろう。或る態様では、未変更型ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素（ＲＴ）活性及び／又はリボヌクレオチドもしくは別の２′−修飾ヌクレオチドを取り込む能力を有する。
【００８４】
適当なポリメラーゼとしては、例えば、２以上の酵素からのポリペプチド領域を含んで成る或るキメラＤＮＡポリメラーゼも挙げることができる。そのようなキメラＤＮＡポリメラーゼの例は、例えば米国特許第6,228,628号明細書に記載されている。特に適当であるのは、ＣＳ５（配列番号18）及びＣＳ６（配列番号19）ポリメラーゼ並びに配列番号18又は配列番号19に対する実質的な配列同一性（典型的には少なくとも80％の配列同一性、より典型的には少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性）を有するそれの変異体を包含する、キメラＣＳファミリーＤＮＡポリメラーゼである。ＣＳ５及びＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼは、サーマス種Ｚ05及びサーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）(Tma)ＤＮＡポリメラーゼに由来するキメラ酵素である。それらはサーマス酵素のＮ末端５′−ヌクレアーゼドメインと、Tma酵素のＣ末端の３′−５′エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼドメインとを含んで成る。それらの酵素は効率的な逆転写酵素活性を有し、ヌクレオチド類似体含有プライマーを伸長することができ、そしてα−ホスホロチオエートｄＮＴＰｓ，ｄＵＴＰ，ｄＩＴＰ並びにフルオロセイン−及びシアニン−色素ファミリーで標識されたｄＮＴＰｓを取り込むことができる。ＣＳ５及びＣＳ６ポリメラーゼは効率的なMg2+活性化ＰＣＲ酵素でもある。ＣＳ５及びＣＳ６ポリメラーゼをコードする核酸配列は図２Ｂ及び３Ｂにそれぞれ提供される。ＣＳ５及びＣＳ６キメラポリメラーゼは、例えば米国特許出願第2004/0005599号明細書に更に記載されている。
【００８５】
或る態様では、未変更型のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、幾つかの選択的利点を付与するために、典型的には組換え手段により、前もって変更されているポリメラーゼである。そのような変更としては、例えば、ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ中のアミノ酸置換Ｇ46Ｅ、Ｌ329Ａ及び／又はＥ678Ｇ、ＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼ、又は別のポリメラーゼ中の対応する（1又は複数の）変異が挙げられる。従って、特定の変形では、未変更型のＤＮＡポリメラーゼは次のものの１つである（各々、指定した置換を除いて配列番号18又は配列番号19のアミノ酸配列を有する）：Ｇ46Ｅ；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ；Ｇ46Ｅ Ｅ678Ｇ；又はＧ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ。Ｅ678Ｇ置換は、例えば、リボヌクレオチドや他の２′−修飾ヌクレオチドの取り込みを考慮するが、この変異は感作された鋳型を伸長する能力の損傷をもたらすようである。或る態様では、変異型ポリメラーゼのより迅速な伸長速度をもたらす本発明に従った変異は、Ｅ678Ｇ変異のこの特定の特徴を改善する。
【００８６】
本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、未変更型ポリメラーゼに比較して活性部位中に１又は複数のアミノ酸置換を含んで成る。或る態様では、該アミノ酸置換は次のアミノ酸位置の少なくとも１つである：
配列番号１中に記載のモチーフの位置Ｘa8；
配列番号２中に記載のモチーフの位置Ｘb8；
配列番号３中に記載のモチーフの位置Ｘc4；及び
配列番号３中に記載のモチーフの位置Ｘc6。
【００８７】
それらの位置の１又は複数におけるアミノ酸置換は、改善されたヌクレオチド取り込み活性を付与し、未変更型ポリメラーゼに比較して改善された（より速い）核酸伸長速度を有する変異型ＤＮＡポリメラーゼを与える。加えて、１又は複数のそれらの位置におけるアミノ酸置換は、未変更型ポリメラーゼに比較して増加した３′−５′エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を付与する。いずれの特定理論に限定することなく、本発明者らは、本発明の変異型ポリメラーゼの改善された核酸伸長速度が鋳型への堅固な結合、即ち、鋳型からの頻繁な解離が少なく、それがより高い「処理能力（processivity）」の酵素をもたらす結果であると信じる。それらの特徴は、例えば未変更型ポリメラーゼを含む反応に比較してプライマー伸長反応においてより低い濃度の変異型ＤＮＡポリメラーゼを使えるようにする。よって、十分に高い酵素濃度では、未変更のポリメラーゼ（即ち本発明の主題である特定の変異を欠いている）の伸長速度は変異型酵素のそれとほぼ等しいだろう。変異型ポリメラーゼは、高イオン強度では未変更型のよりもずっと良く作用するようである。しかしながら、十分に高い酵素濃度では、低イオン強度での未変更型ポリメラーゼの性能は変異型ポリメラーゼのそれに匹敵するだろう。
【００８８】
未変更型ＤＮＡポリメラーゼはユニークであるので、Ｘa8，Ｘb8，Ｘc4及びＸc6の各々に対応するアミノ酸位置は、典型的には各変異型ポリメラーゼで異なる。アミノ酸及び核酸配列整列プログラムは容易に利用可能であり（例えば前掲に言及したものを参照のこと）、そして本明細書中に同定された特定モチーフを考えると、本発明に従った変更のための正確なアミノ酸（及び対応するコドン）の同定を助ける働きをする。Ｘa8，Ｘb8，Ｘc4及びＸc6の各々に対応するアミノ酸位置は、代表的なキメラ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及び典型的な耐熱性菌種からの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼについて下の第１表に示される。
【００８９】
【表１】
2011502467.tif 000005
【００９０】
或る態様では、アミノ酸置換は一アミノ酸置換である。変異型ポリメラーゼは、例えば位置Ｘa8，Ｘb8，Ｘc4及びＸc6のアミノ酸置換のいずれか１つを含んで成ることができる。あるいは、変異型ポリメラーゼは、それらの位置の２，３又は４箇所全部に置換の様々な組み合わせのいずれか１つを含んで成ることができる。例えば、一態様では、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは位置Ｘb8とＸc6の各々の所にアミノ酸置換を含んで成る。典型的には、位置Ｘa8，Ｘb8，Ｘc4又はＸc6のアミノ酸が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３に記載のような各モチーフに相当しないアミノ酸により置換されている。よって、典型的には、位置Ｘa8のアミノ酸は、置換される場合、Ｑ，Ｔ，Ｍ，Ｇ又はＬではなく；位置Ｘb8のアミノ酸は、置換される場合、Ｄ，Ｅ又はＮでなく；位置Ｘc4のアミノ酸は、置換される場合、Ｉ又はＬでなく；そして／又は位置Ｘc6のアミノ酸は、置換される場合、Ｓ，Ａ，Ｖ又はＧでない。或る態様では、アミノ酸置換は位置Ｘa8でのアルギニン（Ｒ）、位置Ｘb8でのグリシン（Ｇ）、位置Ｘc4でのフェニルアラニン（Ｆ）、及び／又は位置Ｘc6でのフェニルアラニン（Ｆ）を含む。同定された１又は複数の部位における別の適当なアミノ酸置換は、部位特異的変異誘発の既知方法及び本明細書中に記載のアッセイにおけるプライマー伸長性能の測定又は当業者に既知の他の方法を使って決定することができる。
【００９１】
前に記載したように、或る態様では、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号18）、ＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号19）又はそれらのポリメラーゼの変異体（例えばＧ46Ｅ；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ；Ｇ46Ｅ Ｅ678Ｇ；Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ等）から誘導される。上記に言及したように、ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ又はＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼ中、位置Ｘa8は601位のグルタミン（Ｑ）に相当し；位置Ｘb8は640位のアスパラギン酸（Ｄ）に相当し；位置Ｘc4は669位のイソロイシン（Ｉ）に相当し；そして位置Ｘc6は671位のセリン（Ｓ）に相当する。よって、本発明の或る態様では、変異型ポリメラーゼは、ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ又はＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼに比較して、Ｓ671，Ｄ640，Ｑ601及び／又はＩ669の所に少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成る。代表的なＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ変異体及びＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼ変異体としては、アミノ酸置換：Ｓ671Ｆ，Ｄ640Ｇ，Ｑ601Ｒ及び／又はＩ669Ｆを含んで成るものが挙げられる。或る態様では、変異型ＣＳ５ポリメラーゼ又は変異型ＣＳ６ポリメラーゼは、例えば、Ｄ640とＳ671の両方にアミノ酸置換（例えばＤ640ＧとＳ671Ｆ）を含んで成る。他に、代表的なＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ変異体及びＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼ変異体としては、下記のものが挙げられる（各々指定した置換を除いて配列番号18又は配列番号19のアミノ酸配列を有する）：
【００９２】
【表２】
2011502467.tif 000006
【００９３】
本明細書に記載のような配列番号１，２及び／又は３のモチーフの変異に加えて、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、別の非置換的変異も含むことができる。そのような変異としては、例えば、プライマー伸長を含んで成る用途において追加の利点を付与する、当業界で既知の共有結合修飾を挙げることができる。例えば、或る態様では、変異型ＤＮＡポリメラーゼは、熱可逆性の共有結合修飾を更に含んで成る。それらの態様では、修飾基がタンパク質に共有結合で取り付けられ、酵素活性の完全な、またはほぼ完全な損失を引き起こす。その修飾基は、高温でのインキュベーションにより修飾が撤回されるように選択される。そのような熱可逆性修飾を含んで成るＤＮＡポリメラーゼは、特にホットスタート用途、例えば、様々なホットスタートＰＣＲ技術に適当である。本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼに従った使用に適する熱可逆性修飾試薬は、例えばBirch他への米国特許第5,773,258号明細書中に記載されている。代表的な修飾としては、例えば、リジン残基のε−アミノ基の化学的修飾によるリジン残基の可逆的ブロックが挙げられる（Birch他、前掲）。或る変形では、熱可逆性共有結合修飾として、Birch他（前掲）中に記載のようなジカルボン酸無水物の、リジン残基のε−アミノ基への共有結合が挙げられる。
【００９４】
例えば、熱可逆性共有結合修飾を含んで成る特に適当な変異型ポリメラーゼは、アルカリ性ｐＨで約25℃未満の温度で実施される、耐熱性酵素と下記の式Ｉに示されるような一般式を有するジカルボン酸無水物との混合物の反応により製造される：
【００９５】
【化３】
2011502467.tif 000007
（式中、Ｒ1及びＲ2は水素であるか、又は連結されてもよい有機基である）；又はBirch他、前掲に本質的に記載されるような、下記式II：
【化４】
2011502467.tif 000008
（式中、Ｒ1及びＲ2は連結されてもよい有機基であり、そして２つの水素はシスである）を有する。熱可逆性共有結合修飾を含んで成る特定の態様では、未変更型ポリメラーゼはＧ64Ｅ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼである。
【００９６】
本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、対応する未変更型ポリメラーゼ（例えば野生型ポリメラーゼ又は本発明の変異型ポリメラーゼが誘導される対応する変種）をコードするＤＮＡ配列を、例えば部位特異的変異誘発と一般に呼ばれる技術を使って変更することにより作製することができる。未変更型ポリメラーゼをコードする核酸分子を、当業者に周知の様々なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により変異せしめることができる。（例えば、PCR Strategies (M.A. Innis, D.H. Gelfand & J.J. Sninsky編, 1995, Academic Press, San Diego, CA)の第14章；PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White編, Academic Press, NY, 1990)参照）。
【００９７】
非限定的な例により、未変更型ポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド中に部位特異的変異を導入するために、Clontech社からのTransformer Site-Directed Mutagenesisキットを用いる２プライマー法を使うことができる。この方法での標的プラスミドの変性の後、２つのプライマーを同時に該プラスミドにアニールせしめる；これらのプラスミドのうちの一方は所望の部位特異的変異を含み、他方は制限部位の削除をもたらすプラスミド中の別の箇所に変異を含む。次いで第二鎖合成を実施してそれら２つの変異をしっかりと連結せしめ、そして生じたプラスミドを用いてＥ．コリのmutＳ株を形質転換させる。形質転換された菌からプラスミドＤＮＡを単離し、関連する制限酵素で制限消化し（それにより未変異のプラスミドを線状化する）、次いでＥ．コリ中に形質転換する。この方法は、サブクローニング又は一本鎖ファジミドの作製を必要とせずに、発現プラスミド中に直接変異を作製できる。２つの変異のタイトな結合及びその後の未変異プラスミドの線状化は、高い変異効率をもたらし、最少のスクリーニングを要する。最初の制限部位プライマーの合成の後、この方法は変異部位当たりただ１つの新規プライマー型の使用を必要とする。各位置の変異体を個別に調製するよりも、与えられた部位に所望の変異の全てを同時に導入するために１組の「指定した縮重」オリゴヌクレオチドプライマーを合成することができる。変異誘発された領域を通してプラスミドＤＮＡを配列決定することにより変異体クローンを同定し且つ選別することにより、形質転換体をスクリーニングすることができる。次いで各変異型ＤＮＡを制限消化し、電気泳動、例えばMutation Detection Enhancementゲル（Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ）上での電気泳動により分析して、配列中に他の変更が起こらなかったことを確かめる（変異誘発されない対照へのバンドシフト比較により）。あるいは、完全なＤＮＡ領域を配列決定して標的領域の外側で追加の変異現象が起こらなかったことを確かめる。
【００９８】
確認したpET（又は他の）過剰発現ベクター中の変異型二本鎖は、変異タンパク質の高効率生産と標準プロトコルによる精製用に、Ｅ．コリ、例えばＥ．コリBL12(DE3) pLysS株を形質転換せしめるのに使用できる。FAB-MSマッピングの方法は、例えば、変異体発現の精度を迅速に調べるのに使用できる。この技術は、タンパク質全体を通してセグメントを配列決定し、そして配列割り当てにおける必要な信頼度を提供する。この型のマッピング実験では、タンパク質をプロテアーゼで消化する（このセグメントが特に着目のものであり且つ残りの地図は変異誘発されないタンパク質の地図と同一であるだろうから、プロテアーゼの選択は変更しようとする特定領域に依存するだろう）。開裂断片のセットを例えば微孔質HPLC（同じく変更しようとする特定領域に依存して、逆相又はイオン交換）により分画し、各画分中に数種のペプチドを提供し、そして該ペプチドの分子量を標準法、例えばFAB−MSにより決定する。各断片の測定質量を、次いで推定配列の消化から予想されるペプチドの分子量と比較し、そして該配列の正確さを迅速に確認する。このタンパク質修飾への変異誘発アプローチが指示され、MSデータが推定値と一致するならば、変更されたペプチドの配列決定は必要でないだろう。変更された残基を確かめる必要があるなら、CAD−タンデムMS/MSを使用して問題の混合物中のペプチドを配列決定するか、あるいは変更の位置に応じて減算エドマン消化又はカルボキシペプチダーゼＹ消化用に標的ペプチドを精製することができる。
【００９９】
１以上のアミノ酸が置換されている変異型ＤＮＡポリメラーゼは、様々な方法で作製することができる。ポリペプチド鎖中に接近して一緒に存在するアミノ酸の場合（配列番号３中に示されるモチーフのアミノ酸Ｘc4とＸc6アミノ酸に関するような）、所望のアミノ酸置換の全てをコードする単一オリゴヌクレオチドを使って同時にそれらを変異させることができる。しかしながら、そのアミノ酸が互いに或る距離を置いて位置している（例えば10アミノ酸以上離れている）場合、所望の変化の全てをコードする単一オリゴヌクレオチドを作製することは困難である。代わりに、２つの代用法の１つを使用できる。第一の方法では、置換しようとする各アミノ酸について別々のオリゴヌクレオチドを作製する。次いで該オリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングし、そして該鋳型から合成されるＤＮＡの第二鎖が、所望のアミノ酸置換の全てをコードするであろう。別の方法は、所望の変異体を生成する２ラウンド以上の変異誘発を包含する。第一ラウンドは単一変異について記載された通りである：未変更ポリメラーゼをコードするＤＮＡを鋳型に使用し、第一の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングし、次いでヘテロ二本鎖ＤＮＡを作製する。変異誘発の第二ラウンドは、変異誘発の第一ラウンドで生成した変異型ＤＮＡを鋳型として使用する。こうして、この鋳型はすでに１又は複数の変異を含む。追加の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドを次いでこの鋳型にアリーリングすると、生じたＤＮＡ鎖は、新たに変異誘発の第一ラウンドと第二ラウンドの両方からの変異をコードするようになる。この生じたＤＮＡ鎖は変異誘発の第三ラウンド等々において鋳型として利用できる。或いは、Seyfang & Jin（Anal. Biochem. 324:285-291, 2004）の多部位変異誘発法を使用してもよい。
【０１００】
従って、本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼのいずれかをコードする組換え核酸も提供される。変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードする本発明の核酸を使って、様々なベクターを作製することができる。宿主細胞と適合できる種に由来するレプリコンと調節配列を含有する任意のベクターは、本発明の実施に使用できる。一般に、発現ベクターは、変異型ＤＮＡポリメラーゼに作用可能に連結された転写及び翻訳調節核酸領域を包含する。「調節配列」という用語は、特定の宿主生物における作用可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指して言う。原核生物に適当である調節配列としては、例えば、プロモーター、任意のオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が挙げられる。加えて、ベクターは、転写されたｍＲＮＡの半減期を増加させるPositive Rertoregulatory Element (PRE)を含んでもよい（Gelfand他、米国特許第4,666,848号明細書を参照のこと）。転写及び翻訳調節核酸領域は、一般にポリメラーゼを発現させるのに使われる宿主細胞に適当なものであろう。様々な宿主細胞のための様々な型の適当な発現ベクター及び適当な調節配列が当業界において知られている。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又は活性化配列が挙げられる。典型的な態様では、調節配列はプロモーターと転写開始及び終結配列とを含む。ベクターは典型的には、外来ＤＮＡの挿入のための数個の制限部位を含むポリリンカー領域を含んで成る。或る態様では、精製を促進するため、及び所望により、tag／flag配列の後の除去を促進するために「融合フラッグ」、例えば“His-Tag”が用いられる。しかしながら、それらは一般に、“heat-step”を使用できる中温性宿主から熱活性及び／又は熱安定性タンパク質を精製する時には不要である。反復配列、調節配列、表現型選択遺伝子及び着目の変異型ポリメラーゼをコードする適当なベクターの作製は、標準的な組換えＤＮＡ法を使って行われる。当業界で周知のようにして〔例えばSambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, 第二版, 1989)〕、単離されたプラスミド、ウイルスベクター及びＤＮＡ断片を開裂せしめ、加工し、特定の順序で一緒に連結して所望のベクターを作製する。
【０１０１】
或る態様では、発現ベクターは形質転換された宿主細胞の選択を可能にするような選択可能なマーカー遺伝子を含有する。選択遺伝子は当該技術分野で周知であり、使用する宿主細胞により異なり得る。適当な選択遺伝子としては、例えば、それらのベクターにより形質転換された細胞を抗生物質の存在下で増殖できるようにする、アンピシリン及び／又はテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を挙げることができる。
【０１０２】
本発明の一観点では、変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸は、単独で又はベクターと共に細胞中に導入される。「〜に導入される」またはそれの文法的同等語は、核酸がその後の核酸の組み込み、増幅及び／又は発現に適当な形で細胞の中に入ることを意味する。導入の方法は標的指向される細胞型により大きく左右される。代表的な方法としては、CaPO4沈澱、リポゾーム融合、LIPOFECTIN（登録商標）、エレクトロポレーション、ウイルス感染などが挙げられる。
【０１０３】
原核生物は、典型的には本発明の最初のクローニング段階のための宿主として用いられる。それらは、大量のＤＮＡの迅速生産のため、部位特異的変異誘発に用いられる一本鎖ＤＮＡ鋳型の生産のため、多数の変異体を同時にスクリーニングするため、及び作製された変異体のＤＮＡ配列決定のために特に有用である。適当な原核生物宿主細胞としては、Ｅ．コリ K12株94（ATCC No. 31,446）、Ｅ．コリ W3110株（ATCC No. 27,325）、Ｅ．コリK12株DG116（ATCC No. 53,606）、Ｅ．コリX1776（ATCC No. 31,537）及びＥ．コリＢが挙げられる；しかしながら、他の多数のＥ．コリ株、例えばHB101, JM101, NM522, NM538, NM539、並びに他の多数の原核生物の種及び属、例えばバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、別の腸内細菌属、例えばサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）又はセラチア・マルセサンス（Serratia marcesans）、及び様々なシュードモナス（Pseudomonas）種はどれも宿主として使用することができる。原核宿主細胞又は堅い細胞壁を有する他の宿主細胞は、Sambrook他（前掲）の項目1.82に記載されているような塩化カルシウム法を使って形質転換される。或いは、それらの細胞の形質転換にエレクトロポレーションを使用することができる。原核生物形質転換技術は、例えばDower, Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan他、Meth. Enzymol., 204:63, 1991中に記載されている。Ｅ．コリの形質転換に典型的に用いられるプラスミドとしては、pBR322，pUC18, pUC19, pUCI18, pUC119及びBluescript M13が挙げられ、それらは全てSambrook他（前掲）の項目1.12−1.20中に記載されている。しかしながら、他の多くの適当なベクターも同様に利用可能である。
【０１０４】
本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、典型的には該変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸を含有する発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、該変異型ＤＮＡポリメラーゼの発現を誘導するか又は引き起こすのに適当な条件下で培養することにより生産される。形質転換された宿主細胞をタンパク質発現に適当な条件下で培養する方法は、当業界で周知である（例えばSambrook他、前掲を参照のこと）。λpLプロモーター含有プラスミドベクターからの変異型ポリメラーゼの生産に適当な宿主細胞としては、Ｅ．コリ株DG116（ATCC No. 53606）（米国特許第5,079,352号明細書及びLawyer, F.C.他、PCR Methods and Applications 2:275-87, 1993を参照のこと）が挙げられる。発現後、変異型ポリメラーゼを収穫し、単離することができる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの精製方法は例えばLawyer他（前掲）中に記載されている。
【０１０５】
一端精製されれば、感作された鋳型を伸長する変異型ＤＮＡポリメラーゼの能力を、ヌクレオチド取り込みを測定するための様々な既知アッセイのいずれにおいても試験することができる。例えば、感作された鋳型分子（例えばＭ13 ＤＮＡ等）、適当な緩衝液、ｄＮＴＰｓ（例えばｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）の完全セット及び金属イオンの存在下で、ＤＮＡポリメラーゼはプライマーを伸長し、一本鎖ＤＮＡ（ssＤＮＡ）を二本鎖ＤＮＡ（dsＤＮＡ）に変換する。この変換は、例えば、dsＤＮＡ結合性色素、例えばSYBR Green Iを添加することにより、検出しそして定量することができる。動力学的熱循環器（Watson他、Anal. Biochem. 329:58-67, 2004を参照のこと、そしてまた例えばApplied Biosystems, Stratagene及びBioRadから入手可能である）を使って、反応プレートのデジタル画像を撮り（例えば10〜30秒間隔で）、それにより反応の進行を追跡することができる。検出された蛍光の量は、容易に伸長速度に変換できる。そのようなルーチン分析を使って、未変更型ポリメラーゼに比較した変異型ポリメラーゼの伸長速度を決定することができる。
【０１０６】
本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼは、そのような酵素が必要又は所望である任意の目的に使用できる。従って、本発明の別の観点では、該変異体ポリメラーゼを使ったプライマー伸長方法が提供される。プライマー伸長に適当な条件は当業界で既知である（例えば、Sambrook他、前掲を参照のこと。Ausubel他、Short Protocols in Molecular Biology (第４版，John Wiley & Sons 1999)も参照のこと）。一般に、プライマーを標的核酸にアニーリングし、即ちハイブリダイズせしめて、プライマー−鋳型複合体を形成させる。該プライマー−鋳型複合体を適当な環境下で変異型ＤＮＡポリメラーゼ及び遊離ヌクレオチドと接触せしめ、該プライマーの３′末端に１又は複数のヌクレオチドを付加し、それにより標的核酸に相補的な伸長プライマーを生成させる。該プライマーは、例えば１又は複数のヌクレトチド類似体を含むことができる。加えて、遊離ヌクレオチドは通常ヌクレオチド、特殊ヌクレオチド（例えばリボヌクレオチドもしくは標識ヌクレオチド）、又はそれらの混合物であることができる。或る変形では、プライマー伸長反応が標的核酸の増幅を含んで成る。ＤＮＡポリメラーゼとプライマー対を使った核酸増幅に適した条件は当業界で既知である（例えばＰＣＲ増幅法）。（例えばSambrook他、前掲；Ausubel、前掲；PCR Applications: Protocols for Functional Genomics (Innis他編、Academic Press 1999)を参照のこと）。別の相互排他的でない態様では、プライマー伸長反応はＲＮＡ鋳型の逆転写（例えばＲＴ−ＰＣＲ）を含んで成る。改善された伸長速度を提供する本発明の変異型ポリメラーゼの使用は、例えば、そのようなプライマー伸長反応を比較的短いインキュベーション時間、減少した酵素濃度及び／又は増加した生成物収率で実施する能力を可能にする。
【０１０７】
更に別の態様では、変異型ポリメラーゼはＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ標識、又はプライマー伸長生成物の標識との関連でプライマー伸長のために使用される。例えば、サンガーのジデオキシヌクレオチド法（Sanger他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463, 1977）によるＤＮＡ配列決定は、特殊な連鎖停止ヌクレオチドを取り込むことができるポリメラーゼのために本発明により改善される。基本的サンガー他の方法における利点は、新規ベクター（Yanisch-Perron他、Gene 33:103-119, 1985）及び塩基類似体（Mills他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2232-2235, 1979；及びBarr他、Biotechniques 4:428-432, 1986）を提供した。一般に、ＤＮＡ配列決定は、連鎖停止塩基類似体の存在下での鋳型依存性プライマー伸長を必要とし、その後サイズにより分離される部分断片の分布をもたらす。機能的ジデオキシ配列決定法は、(i)任意に標識された、オリゴヌクレオチドプライマーを鋳型にアニーリングし；(ii) 各反応が未標識ｄＮＴＰｓの混合物と限定量の１つの連鎖停止剤、例えば任意に標識されたｄｄＮＴＰを含有する、４つの個別の反応においてＤＮＡポリメラーゼによりプライマーを伸長し；そして(iii)反応生成物の４セットを高分解能変性ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で分離するという段階、を含んで成る。反応生成物は、使用する標識に依存して、オートラジオグラフィーにより又は蛍光検出によりゲル中で検出することができ、そしてイメージを検査してヌクレオチド配列を推測することができる。それらの方法は、Ｅ．コリ Pol Ｉのクレノウ断片又は改変型Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼを使用する。
【０１０８】
耐熱性ポリメラーゼ、例えばTaq ＤＮＡポリメラーゼの入手可能性は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使った配列決定の改良法（Innis他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9436, 1988）及び「サイクル配列決定」（Murray, Nuc. Acids Res. 18:8889, 1989）と呼ばれるそれの変形をもたらした。従って、本発明の変異型耐熱性ポリメラーゼは、そのような方法と組み合わせて使用することができる。基本的なジデオキシ配列決定法に代わるものとして、サイクル配列決定法は、連鎖停止剤の存在下での鋳型配列に相補的な標的配列の直鎖状で非対象の増幅である。単一サイクルが全ての可能な長さの伸長生成物のファミリーを生成する。ＤＮＡ鋳型からの伸長反応生成物の変性後、プライマーアニーリングとプライマー伸長の複数サイクルがddＮＴＰｓのような停止剤の存在下で起こる。サイクル配列決定は、通常の連鎖停止配列決定よりも少ない鋳型ＤＮＡを必要とする。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、サイクル配列決定法において幾つかの利点を有する；それらは、核酸標的へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションに必要とされる緊縮なアニーリング温度を許容し、その上、各サイクルで起こる高温変性、例えば90〜95℃の多重サイクルに耐える。この理由のため、AMPLITAQ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ及びその誘導体並びに派生物、例えばAmpliTaq CS ＤＮＡポリメラーゼ及びAmpliTaq FS ＤＮＡポリメラーゼは、Perkin-Elmer (Norwalk, CT)及びApplied Biosystems (Foster City, CA)のような会社により市販されているTaqサイクル配列決定キット中に含められている。
【０１０９】
連鎖停止配列決定法の変形としては、色素プライマー配列決定及び色素停止剤配列決定法が挙げられる。色素プライマー配列決定法では、ddＮＴＰ停止剤が未標識であり、そして標識されたプライマーを使って伸長生成物を検出する（Smith他、Nature 32:674-679, 1986）。色素−停止剤ＤＮＡ配列決定法では、ｄＮＴＰｓと蛍光標識ddＮＴＰｓをＤＮＡプライマーの末端に組み込むのにＤＮＡポリメラーゼが使われる（Lee他、Nuc. Acids Res. 20:2471, 1992）。この方法は、色素標識プライマーを合成しなくてよいという利点を提供する。更に、色素−停止剤反応は、４反応全てを同一試験管内で実施できるという点でより便利である。
【０１１０】
色素プライマー法と色素停止剤法は両方とも、Applied Biosystems (Foster City, CA)により製造された自動化配列決定装置を使って自動化することができる（米国特許第5,171,534号）。該装置を使った時、完成した配列決定反応混合物は、装置の上に搭載した変性ポリアクリルアミドゲル又はキャピラリー上で分画される。ゲルを通してサイズに従って電気泳動されると、該装置の底にあるレーザーが蛍光生成物を検出する。
【０１１１】
色素−停止剤配列決定法で負に帯電した蛍光色素と両イオン性蛍光色素に使用される停止剤を標識するのに、２つの型の蛍光色素が一般に用いられる。負に帯電した蛍光色素としては、フルオレセイン及びBODIPYファミリーのものが挙げられる。BODIPY色素（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３a，４a−ジアザ−ｓ−インダセン）は、国際特許公報WO 97/00967中に記載されている。両イオン性蛍光色素としては、ローダミンファミリーのものが挙げられる。市販のサイクル配列決定キットは、ローダミン誘導体で標識された停止剤を使用する。しかしながら、ローダミン標識された停止剤は高価であり、ゲル上に負荷する前に、生成物を取り込まれなかった色素−ddＮＴＰｓから分離しなければならない。何故ならそれらは配列決定する生成物と同時移動するからである。ローダミン色素ファミリー停止剤は、高ＧＣ領域においてヘアピン構造を安定化するようである。これは異常に移動する生成物を引き起こす。これは、二次構造を緩めるが停止剤の取り込みの効率にも影響を及ぼす、ｄＩＴＰの使用を必要とする。
【０１１２】
対照的に、フルオレセイン標識停止剤は、大きな正味負電荷を有し且つ配列決定する生成物よりも速く移動するので、ゲル負荷前の分離段階を削除する。加えて、フルオロセイン標識配列決定生成物は、ローダミンで標識された配列決定生成物よりも良好な電気泳動移動を有する。野生型Taq ＤＮＡポリメラーゼはフルオレセインファミリー色素で標識された停止剤を効率的に取り込まないけれども、これは、米国特許出願公開第2002/0142333号中に記載されているように今や変異型酵素の使用により効率的に達成することができる。従って、米国特許出願第2002/0142333号に記載のような変更は、改善されたプライマー伸長速度を有するフルオロセインファミリー色素を取り込んだ耐熱性ポリメラーゼを作製するために、本発明に関連して使用することができる。例えば、或る態様では、本発明に従った未変更型ＤＮＡポリメラーゼは、米国出願第2002/0142333号公報に記載されており且つ配列番号１，２及び３に記載のモチーフを有する変異型耐熱性ポリメラーゼである。
【０１１３】
本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼを使用できる別の代表的な核酸配列決定方式としては、リボヌクレオチドの２′-PO4類似体を包含する停止剤化合物を含むもの（例えば、米国出願公開第2005/0037991及び2005/0037398号公報、並びにBodepudi他により2004年６月29日に出願された“SYNTHESIS AND COMPOSITIONS OF NUCLEIC ACIDS COMPRISING 2’-TERMINATOR NUCLEOSIDES”という発明の名称の国際出願第WO 2005/026184号公報及びGelfand他により2004年６月29日に出願された“2’-TEMINATOR RELATED PYROPHOSPHOROLYSIS ACTIVATED POLYMERIZATION”という発明の名称の国際出願第WO 2005/005667号公報を参照のこと。本明細書中に記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼは一般に、例えば循環する伸長反応に必要な時間を短縮することによりそして／又は十分な性能のために使われる酵素の量もしくは濃度を減らすことにより、それらの配列決定法を改善する。
【０１１４】
本発明の別の面では、本明細書に記載のプライマー伸長法に用いられるキットが提供される。典型的には、該キットは、使用の簡易性のために区分され且つ本発明に係る変異型ＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含有する。追加の試薬を提供する１又は複数の追加の容器も含めることができる。そのような追加の容器は、上述した方法に従ったプライマー伸長法に使用される当業者により認識される任意の試薬又は他の要素、例えば核酸増幅手順（例えばＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲ）、ＤＮＡ配列決定手順又はＤＮＡ標識手順に使用される試薬を含むことができる。例えば、或る態様では、該キットは、プライマー伸長条件下で、予め決められたポリヌクレオチド鋳型にハイブリダイズ可能な５′センスプライマー、又は５′センスプライマーと対応する３′アンチセンスプライマーを含んで成るプライマー対を提供する容器を更に含んで成る。別の、非相互排他的な変形では、該キットは遊離ヌクレオチド（通常の及び／又は特殊の）を提供する１又は複数の容器を含んで成る。特定の態様では、該キットはα−ホスホロチオエートｄＮＴＰｓ，ｄＵＴＰ，ｄＩＴＰ及び／又は標識ｄＮＴＰｓ、例えばフルオレセイン−もしくはシアニン−色素ファミリーｄＮＴＰｓを含む。更に別の非相互排他的な態様では、該キットは、プライマー伸長反応に適当な緩衝液を提供する１又は複数の容器を含んで成る。
【実施例】
【０１１５】
ここに記載の実施例及び態様は例示目的のみであり、本発明の請求の範囲を限定するものではない。また、ここに記載の実施例及び態様に照らした様々な改良又は変更は、当業者に示唆され且つ本明細書及び添付の請求の範囲の精神及び範囲内に含まれると理解すべきである。
【０１１６】
実施例１：改善された酵素活性を有する変異型ＤＮＡポリメラーゼの同定及び特徴付け
例えば遊離ヌクレオチドの存在下で感作された鋳型ＤＮＡを伸長する改善された能力を提供するＣＳファミリーポリメラーゼ中の変異を同定した。簡単に言えば、このスクリーニング工程中の段階は、ライブラリー作製、変異型酵素の発現及び部分的精製、所望の性質についての該酵素のスクリーニング、ＤＮＡ配列決定、クローン精製、及び選択された変異体候補の更なる特徴付け、並びに選択された変異体からの変異の組み合わせの作製、精製及び特徴付けを含んだ。それらの各段階は下記に更に記載する。
【０１１７】
この工程により同定された変異としては、個別又は様々な組み合わせでのＳ671Ｆ，Ｄ640Ｇ，Ｑ601Ｒ及びＩ669Ｆが挙げられる。それらの変異は、Ｇ46Ｅ ＣＳ５，Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ ＣＳ５，Ｇ46Ｅ Ｅ678Ｇ ＣＳ５及びＧ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ ＣＳ５をはじめとする数種類のＣＳファミリーポリメラーゼ中に置かれた。それらの変異型ポリメラーゼの幾つかを第２表に示す。作製された別の代表的変異型ポリメラーゼとしてはＣＳ６ Ｇ46Ｅ Ｑ601Ｒ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＤＮＡポリメラーゼ及び幾つかのサーマス種Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼ変異体が挙げられる。生じた変異型ＤＮＡポリメラーゼは、一連の動的熱循環（Kinetic Thermal Cycling (KTC)）実験においてそれらの性能を分析することにより特徴付けた。
【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
同定された変異Ｓ671Ｆ，Ｄ640Ｇ，Ｑ601Ｒ及びＩ669Ｆは、例えば、感作された鋳型を伸長する能力の改善をもたらした。リボヌクレオチド及び別の２′−修飾ヌクレオチドの取り込みに備えるが感作された鋳型を伸長する能力が損傷したＥ678Ｇ変異の特定の関係では、Ｓ671Ｆ，Ｄ640Ｇ，Ｑ601Ｒ及びＩ669Ｆ変異が、損傷されたプライマー伸長能力のこの性質を緩和した。同定された変異、特に単独のＳ671Ｆ及びＳ671Ｆ＋Ｄ640Ｇ変異は、Ｇ46Ｅ ＣＳ５及びＧ46Ｅ Ｌ329Ａ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ中に置くと、改善された逆転写効率を示した。本発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼの追加の特徴を更に下記に記載する。
【０１２０】
クローンライブラリー作製：ＣＳ５ Ｅ678Ｇ ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼドメインをコードする核酸を、この核酸配列を含むプラスミドのBglIIとHindIII制限部位の間でエラープローン（変異誘発）ＰＣＲにかけた。ＰＣＲは、変異速度の対応範囲を有するライブラリーを作製するために、1.8〜3.5 mMのMg2+濃度範囲を使って実施した。緩衝液条件は次の通りであった：50 mM Bicine pH 8.2, 115 mM KOAc, 8% w/v グリセロール, 0.2 mMの各dNTPs及び0.2×SYBR Green I。GeneAmp（登録商標）AccuRT Hot Start ＰＣＲ酵素を0.15Ｕ/μlで使用した。５×105コピーの線状化ＣＳ５ Ｅ678ＧプラスミドＤＮＡ／50μlの反応容量で出発して、60℃で15秒間のアニーリング温度、72℃で45秒間の伸長温度及び95℃で15秒間の変性温度を使って30サイクルの増幅を実施した。
【０１２１】
得られたアンプリコンをQiaquickスピンカラム（Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA）上で精製し、そしてBglII及びHindIIIで切断し、次いで再精製した。BgIIIとHindIII部位の間のポリメラーゼドメイン中に大きな欠失を有しているＧ46Ｅ Ｌ329Ａ ＣＳ５変異体のベクタープラスミドを、前記２酵素で切断しそして仔牛腸ホスファターゼ（CIP）で処理することにより調製した。切断ベクターと変異挿入断片を異なる比で混合し、15℃で一晩Ｔ４リガーゼにより処理した。得られた連結物を精製し、エレクトロポレーションによりＥ．コリ宿主株中に形質転換せしめた。
【０１２２】
各形質転換でのユニーク形質転換体の数を測定するために、発現された培養物のアリコートをアンピシリン選択培地上に塗布した。各変異誘発において最大のユニーク形質転換体を有する形質転換体を、凍結保存物としてグリセロールの存在下−70〜−80℃で保存した。
【０１２３】
次いで各ライブラリーを大型のアンピシリン選択寒天板培地上で画線培養した。個々のコロニーを、自動コロニーピッカー（QPix2, Genetix Ltd）を使って、アンピシリンと10％w/v グリセロールを含有する２×Luriaブロスの入った384ウエルプレートに移した。それらのプレートを30℃で一晩インキュベートして培養物を増殖させ、次いで−70〜−80℃で保存した。２×Luriaブロスに添加したグリセロールは、培養物の増殖を可能にするのに十分な位低く、且つ凍結保護を提供するのに十分な位まだ高かった。数回の突然変異誘発（Mg2+）レベルでの数千個のコロニーを後の使用のためにこの方法で調製した。
【０１２４】
抽出物ライブラリー調製Part 1−発酵：上記のクローンライブラリーから、スクリーニング目的に適当な部分精製された抽出物の対応するライブラリーを調製した。この方法の第一段階は、各クローンの小規模の発現培養物を作製することであった。それらの培養物を96ウエル方式で増殖させた；従って、それらは各384ウエルライブラリープレートについて４枚の発現培養プレートであった。１μlをクローンライブラリープレートの各ウエルから、150μlの培地Ａ（下記第３表を参照のこと）を含有する96ウエルの種プレートのウエルへと移した。この種プレートを、iEMSプレートインキュベーター／シェーカー（ThemoElectron）中で、1150 rpmで30℃にて一晩振盪培養した。それらの種培養物を用いて同培地に接種し、今度は、大型の94ウエルプレート（Nunc  #267334）中の300μlの培地Ａ中に10μlを接種した。それらのプレートを37℃で一晩インキュベートした。発現プラスミドは、37℃で発現を許容するが30℃では許容しない転写調節要素を含有した。一晩インキュベション後、培養物は、典型的には全細胞タンパク質の１〜10％でクローンタンパク質を発現した。それらの培養物から細胞を遠心分離により収得した。それらの細胞を凍結（−20℃）保存するか又は後述のようにすぐに処理した。
【０１２５】
【表４】
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【０１２６】
抽出物ライブラリー調製２−抽出：発酵段階からの細胞ペレットを30μlの溶解緩衝液（下記第４表参照)中に再懸濁し、そして384ウエルの熱循環プレートに移す。リゾチームを含む緩衝液は細胞溶解を助けるためであり、そして２つのヌクレアーゼは抽出物からＲＮＡとＤＮＡの両方を除去するためであることに注意されたい。該プレートを３ラウンドの凍結−解凍（−70℃凍結、37℃解凍、各ラウンドで少なくとも15分間）にかけて細胞を溶解させた。硫酸アンモニウム（0.75Ｍ溶液の５μl）を添加し、そして余分に添加したヌクレアーゼを含む汚染タンパク質を沈澱させ不活性化するために、該プレートを75℃で15分間インキュベートした。プレートを3000×ｇで15分間遠心し、その上清を新しい384ウエル熱循環プレートに移した。それらの抽出物プレートを後のスクリーニングでの後の使用のために−20℃で凍結保存した。各ウエルは0.5〜３μＭの変異型ライブラリーポリメラーゼ酵素を含有した。
【０１２７】
【表５】
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【０１２８】
改善された伸長速度についての抽出物ライブラリーのスクリーニング：次の配列を有するオリゴヌクレオチド：
5’-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC-3’（配列番号72）
により感作されたM13mp18一本鎖ＤＮＡ（Ｍ13；GenBank受入番号 X02513）を伸長アッセイスクリーニングにおける鋳型分子として使用した。0.5〜1.0μlの抽出物を、384ウエルのＰＣＲプレート中で0.5〜１nMの感作Ｍ13鋳型を含有する10〜20μlの反応マスター混合物に添加した。感作された鋳型の伸長は、ＣＣＤカメラを使って改良型動的熱循環器中で10〜30秒毎にモニタリングした（Watson，前掲参照）。典型的な反応マスター混合物は下記に記載する。マスター混合物は、金属イオン、通常は１〜４ mMのマグネシウム、４つのｄNTPs又はｄNTP類似体の混合物、ｐＨ及びイオン強度を調節するための緩衝成分、典型的には25 mM Tricine pH 8.3／35 mM KOAc、及びプライマー鎖伸長の蛍光検出に備える0.6×SYBR Green I (Molecular Probes)を常に含有した。バックグラウンド蛍光から伸長に由来する蛍光を識別するために、例えばEDTAのような金属キレート化剤を添加するか、又は反応マスター混合物からヌクレオチドを取り除くことにより、プライマー鎖伸長を防止した、並行ウエルを実験に含めた。
【０１２９】
リボヌクレオチドの存在下で改善された核酸伸長速度を有する変異型酵素を見つけるために、リボヌクレオチドの存在下と不在下で伸長反応を実施し、そして生じた伸長速度を上述した方法を使って比較した。高レベルのリボヌクレオチド（例えば、ｒＡＴＰとｄＡＴＰの50：50混合物）を添加すると、親の酵素Ｇ46Ｅ L329Ａ Ｅ678Ｇ ＣＳ５の伸長速度を減少させた。リボヌクレオチドによる阻害レベルの減少を示す変異型抽出物を、このスクリーニングで同定した。数千の抽出物のスケールで一次スクリーニングを実施した。それらのうちのトップ数％を再スクリーニング用に選択した。そのトップ抽出物に相当する培養物ウエルを、新鮮な増殖培地にサンプリングしそして再増殖させて、トップ生成物の全部と、更に比較に使用するための多数の親培養物とを含有する新たな培養プレートを作製した。それらの培養プレートを次いで同じスクリーニング工程に供給し、変異体候補に関する更なるデータを得た。この二次スクリーニングラウンドの後、比較的少数の抽出物がまだ親クローンに比較して改善された伸長速度を一貫して示すことがわかった。
【０１３０】
それらのクローンを更なる試験のために選択した。それらをまず選択寒天プレート上に画線してクローン純度を確実なものにし、次いでポリメラーゼ遺伝子の変異領域のＤＮＡ配列を配列決定して、いずれか１つのクローン中に存在していた１又は複数の変異を決定した。この実験と並行して、部分的精製後、一次抽出物を調製するのに用いたのと同様な方法で、振盪培養においてゲルベースの濃度測定により測定するのに十分な濃度に変異型酵素を生産せしめた。それらの定量した抽出物を、該スクリーニングで使用した条件であるが等しいタンパク質濃度で親酵素と比較した。この最終スクリーニングは、観察された差が単にタンパク質濃度の効果でないことを確証した。
【０１３１】
この最終ラウンドのスクリーニング後、４つのクローンがまだリボヌクレオチドの存在下で改善された伸長速度を有するように見えた。それら４つのクローンの配列は、親株に関する次のアミノ酸変化をコードすることが決定された：
【０１３２】
クローン１：Ｓ553Ｔ Ｄ640Ｇ Ｄ664Ｇ Ｅ830Ａ
クローン２：Ｓ671Ｆ
クローン３：Ｆ557Ｌ Ｉ669Ｆ
クローン４：Ｑ601Ｒ Ｙ739Ｃ Ｖ749Ａ
【０１３３】
クローン２の場合、Ｓ671Ｆ変異は該クローンの唯一のアミノ酸変異であったので、該変異が観察される表現型の原因であるに違いないことは明白であった。その他の３つのクローンの場合、どの変異又は変異の組み合わせが観察される表現型の原因であるかを告げることは最初は不可能であった。従って、制限断片スワップを使って、変異体プラスミドからのＤＮＡを親のプラスミドと結合することにより、個々の変異を互いに分離した。これは、ベクター−ユニーク制限部位が分離しようとする変異間に存在する場合には容易に行われる。クローン１の場合、そのような部位は４つの変異の全ての間に存在し、従って各変異を個別に含有するプラスミド、及び元の４変異のうちのいずれか２つもしくは３つを担持する別のプラスミドを調製することが可能であった。クローン４の場合、Ｙ739ＣとＶ749Ａの間にはそのような部位は１つもなかったが、Ｑ601ＲとＹ739Ｃの間には１部位あった。従って、Ｑ601Ｒ変異だけを担持するポリメラーゼをコードするプラスミドＤＮＡ、及びＹ739Ｃ／Ｖ749Ａ組み合せを担持する別のプラスミドを調製することが可能であった。
【０１３４】
それらの新規プラスミドを用いてＥ．コリ宿主を形質転換せしめ、そしてポリメラーゼタンパク質を発現させ、均質にまで精製し、そして定量した。それらの得られた新規変異酵素を、元のスクリーニングの条件下で親の酵素及び元の変異酵素と比較した。このデータから、変異Ｄ640Ｇだけが変異体クローン１の改善された表現型の原因であり、変異Ｉ669Ｆが変異体クローン３の改善の原因であり、そして変異Ｑ601Ｒが変異体クローン４の改善の原因であることが明らかであった。
【０１３５】
それらの機能的な変異を次いで互いに組合せ、そして再び制限断片スワップを使って異なるＣＳ型バックボーン（例えば上記の第２表を参照のこと）中に移動し、所望の発現プラスミドを構築し、次いで該プラスミドをＥ．コリ宿主中に形質転換し、そして最後に上述した通りに変異型ポリメラーゼを発現させ、均質に精製し、そして定量した。それらの新規組合せ変異体を、リボヌクレオチドの存在下での感作されたＭ13 ＤＮＡを伸長する能力について試験した。興味深いのは、変異Ｄ640Ｇ，Ｓ671Ｆ及びＱ601Ｒを組み合わせると、単変異のみを担持するクローンに比較して、伸長速度の増加を引き起こした。Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ及びＱ601Ｒ Ｓ671Ｆを含む、試験した二重組み合わせ変異体も、単変異のみを担持する株に比較して改善された伸長速度を示した。更に、組み合わせ変異体は、ｄＮＴＰｓだけが存在した時、親型のものに比較して、感作したＭ13 ＤＮＡに対する改善した伸長速度を示し、そして更に、親型に比較した改善の程度は、低い酵素濃度又は比較的高い塩濃度で伸長速度実験を行った時に最大であると観察された。それらの観察結果は、組み合わせ変異を、リボ取り込み変異Ｅ678Ｇを含まない遺伝子バックボーン中に移動した時にも反復された。驚くべきことに、Ｅ678Ｇ背景中であっても、個別の変異酵素及び組み合わせ変異酵素は、それらの対応するＥ678“親”よりもずっと“速”かった。本発明の変異型ポリメターゼのそれらの及び他の特徴を、下記に提供する実施例において更に例証する。
【０１３６】
実施例II：様々な塩濃度の下でのＧ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼの変異体の特徴
Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼの様々な変異体の核酸伸長速度を、90％リボアデノシン三リン酸（リボATP又はｒATP）の存在下で測定した。反応混合物は25 mM Tricine pH 8.3, 20 mM（図４）又は60 mM（図５）KOAc, 3 mM MgCl2, 2.5％v/v 保存緩衝液（50％ v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5％Tween 20），１％DMSO, １×SYBR Green I, 0.5 nM感作済Ｍ13及び5 nM酵素を含有した。これに、0.1 mM dGTP, 0.1 mM dTTP, 0.1 mM dCTP, 0.01 mM dATP及び0.09 mMリボATPの最終濃度にヌクレオチドを添加した。ヌクレオチドを含まない並行反応も設定した。全ての反応を384ウエルの熱循環器プレート中で20μl容量において４通りに実施した。64℃に設定した動的熱循環器中で蛍光により感作済Ｍ13鋳型の伸長をモニタリングし、10秒毎に読みを取った。複製の同一反応を平均化し、そしてヌクレオチド無しの並行反応を差し引いた。伸長速度は得られたデータの線形回帰分析により評価した。
【０１３７】
上記に示したように、図４と図５は、それらの分析から得られた結果を示す。例えば、図４と５は、反応混合物中にリボヌクレオチドが存在しそしてＤＮＡ鋳型上に取り込まれた時、本明細書に記載の様々な変異体から改善された核酸伸長速度が生じることを示す。更に示すように、例えば或る変異体が単変異酵素中に組み合わされると、更に伸長速度の改善が観察される。
【０１３８】
実施例III：変動する塩濃度の下でのＧ46Ｅ Ｌ329Ａ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼの変異体の性質
Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、並びにサーマス種Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼ及びその切断型、ΔＺ05ＤＮＡポリメラーゼ（例えばAbramson他に1995年10月３日に付与された、“MUTATED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMUS SPECIES Z05”という発明の名称の米国特許題5,455,170号明細書、Abramson他に1997年10月7日に付与された“DNA ENCODING THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMUS SPECIES Z05”という発明の名称の米国特許題5,674,738号明細書を参照のこと）の様々な変異体の核酸伸長速度を測定した。反応混合物は、25 mM Tricine pH 8.3, 0 mM（図６）又は60 mM（図７）KOAc, 3 mM MgCl2, 2.5％v/v 保存緩衝液（50％ v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5％Tween 20），１％DMSO, １×SYBR Green I, 0.5 nM感作済Ｍ13及び5 nM酵素を含有した。これに、0.1 mM dGTP, 0.1 mM dTTP, 0.1 mM dCTP及び0.1 mM dATPの最終濃度にヌクレオチドを添加した。ヌクレオチドを含まない並行反応も設定した。全ての反応を384ウエルの熱循環器プレート中20μl容量で４通りに実施した。64℃に設定した動的熱循環器中で蛍光により感作済Ｍ13鋳型の伸長をモニタリングし、10秒毎に読み取った。複製の同一反応を平均化し、そしてヌクレオチド無しの並行反応を差し引いた。伸長速度は得られたデータの線形回帰分析により評価した。
【０１３９】
図６と図７に示したデータは、他の性質の中でも特に、例えば本明細書中に記載の或る変異体が、リボヌクレオチドが反応混合物中に存在しない時であっても、又はリボヌクレオチド取り込み変異Ｅ678Ｇを含まない遺伝子背景中であっても、改善された核酸伸長速度をもたらすことを示す。更に示すように、この速度改善は、変異を単変異酵素中に組合せた時に更に大きい。
【０１４０】
実施例IV：様々な変異型ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼの伸長速度に対する塩濃度の効果
Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、並びにサーマス種Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼ及びその切断型、ΔＺ05ＤＮＡポリメラーゼの様々な変異体の核酸伸長速度を測定した。反応混合物は、25 mM Tricine pH 8.3, 0−100 mM KOAc, 3 mM MgCl2, 2.5％v/v 保存緩衝液（50％ v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5％Tween 20），１％DMSO, １×SYBR Green I, 0.5 nM感作済Ｍ13、及び25 nM（図８）又は5 nM（図９）酵素を含有した。これに、0.1 mM dGTP, 0.1 mM dTTP, 0.1 mM dCTP及び0.1 mM dATPの最終濃度にヌクレオチドを添加した。ヌクレオチドを含まない並行反応も設定した。全ての反応を384ウエルの熱循環器プレート中20μl容量で４通りに実施した。64℃に設定した動的熱循環器中で蛍光により感作済Ｍ13鋳型の伸長をモニタリングし、10秒毎に読み取った。複製の同一反応を平均化し、そしてヌクレオチド無しの並行反応を差し引いた。伸長速度は得られたデータの線形回帰分析により評価した。
【０１４１】
図８と図９に示したデータは、他の性質の中でも特に、例えば本明細書中に記載の或る変異体により付与される増加された核酸伸長速度が、広範囲の塩濃度及び酵素濃度に渡って維持されること、そして該変異体が完全なプルーフリーディング活性を含む遺伝的背景において伸長速度の増加を付与することを証明する。
【０１４２】
実施例Ｖ：ＲＴ−ＰＣＲにおける様々な変異型ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼの使用
Mg2+ベースのＲＴ：変異Ｑ601Ｒ，Ｄ640Ｇ及びＳ671Ｆを、個別に及び組み合わせて、Mg2+の存在下でのＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ効率に対するそれらの効果について評価した。反応混合物は全て次の成分を含んだ：50 mM Tricine pH 8.0, 2.5 mM Mg(OAc)2, 6％v/v 保存緩衝液（50％ v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2％Tween 20），0.2×SYBR Green I, 0.02単位/μL UNG, 各0.2 mM dATP, dCTP及びdGTP, 0.3 mM dUTP, 0.03 mM dTTP並びに200 nMの各プライマー（ここで該プライマーは３′末端に２′−アミノ−Ｃを含んで成る）。
【０１４３】
酵素は、その予め決められた濃度及び最適KOAcで使用した。それらは第５表に与えられる。
【０１４４】
【表６】
2011502467.tif 000012
【０１４５】
各酵素は、106コピー／50μl反応液のＤＮＡ鋳型（pAW109プラスミドＤＮＡ）及び106コピー／50μl反応液のＲＮＡ鋳型（pAW109転写産物）を用いて試験した。反応は動的熱循環器（ABI 5700熱循環器）中で行った。熱循環パラメーターは次の通りであった：50℃で２分間；65℃で45分間；93℃で１分間；次いで93℃で15秒間を40サイクル；及び65℃で30秒間。蛍光データを分析してＣｔ値（基底線を超える蛍光の発生）を求めた（図10）。より詳しくは、図10に示したデータ（図11も参照）は、他の性質の中でも特に、本明細書に記載の単独の又は組み合わせのいずれかの変異が、対応する親の酵素又は非変異型酵素に比較して変異型酵素のMg2+−活性化逆転写活性の効率を改善することを示す。例えば、ＧＬＤＳ酵素は、例えば、図11に示すように、逆転写酵素に備える時間を５分に減少した時、良好に働いた（付加的に下記に言及する）。
【０１４６】
ＲＴ時間を削減したMg2+−ベースのＲＴ：変異Ｑ601Ｒ，Ｄ640Ｇ及びＳ671Ｆを個別に又は組み合わせて、45分又は５分のＲＴ時間を使って、Mg2+の存在下でのＲＴ−ＰＣＲ効率に対するそれらの効果について評価した。反応混合物は全て次の成分を含んだ：50 mM Tricine pH 8.0, 2.5 mM Mg(OAc)2, 6％v/v 保存緩衝液（50％ v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2％Tween 20），１％DMSO, 0.2×SYBR Green I, 0.02単位/μL UNG, 各0.2 mM dATP, dCTP及びdGTP, 0.3 mM dUTP, 0.03 mM dTTP並びに200 nMの各プライマー（ここで該プライマーは３′末端に２′−アミノ−Ｃを含んで成る）。
【０１４７】
酵素は、その予め決められた濃度及び最適KOAcで使用した。それらは第６表及び第７表に与えられる。
【０１４８】
【表７】
2011502467.tif 000013
【０１４９】
【表８】
2011502467.tif 000014
【０１５０】
各酵素は、106コピー／50μl反応液のＲＮＡ鋳型（pAW109プラスミド転写産物）を用いて試験した。反応は動的熱循環器（ABI 5700熱循環器）中で行った。熱循環パラメーターは次の通りであった：50℃で２分間；65℃で５分又は45分間；93℃で１分間；次いで93℃で15秒間を40サイクル；及び65℃で30秒間。蛍光データを分析してＣｔ値（ベースラインを超える蛍光の発生）を求めた（図11）。
【０１５１】
ＲＴ時間を削減したMn2+−ベースのＲＴ：変異Ｑ601Ｒ，Ｄ640Ｇ及びＳ671Ｆを個別に又は組み合わせて、45分又は５分のＲＴ時間を使って、Mn2+の存在下でのＲＴ−ＰＣＲ効率に対するそれらの効果について評価した。反応混合物は全て次の成分を含んだ：50 mM Tricine pH 8.0, 1 mM Mn(OAc)2, 6％v/v 保存緩衝液（50％ v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2％Tween 20），1％DMSO, 0.2×SYBR Green I, 0.02単位/μL UNG, 各0.2 mM dATP, dCTP及びdGTP, 0.3 mM dUTP, 0.03 mM dTTP並びに200 nMの各プライマー（ここで該プライマーは３′末端に２′−アミノ−Ｃを含んで成る）。
【０１５２】
酵素は、その予め決められた濃度／最適KOAcで使用した。それらは下の第８表及び第９表に与えられる。
【０１５３】
【表９】
2011502467.tif 000015
【０１５４】
【表１０】
2011502467.tif 000016
【０１５５】
各酵素は、105コピー／50μl反応液のＲＮＡ鋳型（pAW109転写物）を用いて試験した。反応は動的熱循環器（ABI 5700）中で行った。熱循環パラメーターは次の通りであった：50℃で２分間；65℃で５分又は45分間；93℃で１分間；次いで93℃で15秒間を40サイクル；及び65℃で30秒間。蛍光データを分析してＣｔ値（ベースラインを超える蛍光の発生）を求めた（図12）。より詳しくは、図12に示したデータは、他の性質の中でも特に、Mn2+−活性化逆転写効率の改善が、本明細書に記載の単独の又は組み合わせのいずれかの変異に由来すること、及びこの改善が、逆転写に用意される時間を減少させると増大すること示す。
【０１５６】
実施例VI：低レベルリボヌクレオシド三リン酸取り込みを使った断片化
時には、例えばハイブリダイゼーションアッセイにおいて生成物を分析する場合、ＰＣＲ生成物を断片化することが有用である。断片化は、リボヌクレオチドがＰＣＲ生成物に取り込まれているならば、アルカリでの処理及び加熱により容易に達成することができる。そのような用途には、最適な長さの断片を得るのに比較的低レベルのリボ置換で十分であろう。長さ１kbのリボ置換ＰＣＲ生成物を生成する様々な変異型ＤＮＡポリメラーゼの能力を、次の実施例で証明した。
【０１５７】
反応混合物は100 mM Tricine pH 8.3, 75 mM KOAc, 5％ v/vグリセロール, 2.5 mM Mg(OAc)2, 50 nM酵素, 0.1％v/v DMSO及び2.5％v/v 酵素保存緩衝液（50％ v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5％Tween 20）から成った。ｄＮＴＰとｒＮＴＰの様々な混合物を試験した。どの場合も、ｒＡＴＰとｄＡＴＰの合計は200μMであり、ｄＣＴＰとｒＣＴＰの合計及びｄＧＴＰとｒＧＴＰの合計も同じであった。ｄＴＴＰとｒＴＴＰの合計は40μMであり、ｄＵＴＰとｒＵＴＰの合計は360μMであった。この分析では、４種全てのｒＮＴＰｓを一緒に総量の10％にまで添加し（図13ＡとＢの“ｒＮＴＰシリーズ”を参照のこと（％ｒＮＴＰはゲル中の関連レーンの上側に示される））または、ｒＡＴＰのみを総量の50％まで添加した（図13ＡとＢの“ｒＡＴＰシリーズ”を参照のこと（％ｒＡＴＰはゲル中の関連レーンの上側に示される）。試験した酵素は、ＧＱＤＳＥ，ＣＳ６−ＧＱＤＳＥ，ＧＬＱＤＳＥ，ＧＤＳＥ，ＧＬＤＳＥ，ＧＬＤＥ，ＧＥ、及びＧＬとＧＬＥの４：１混合物であった（Ｇ＝Ｇ46Ｅ，Ｌ＝Ｌ329Ａ，Ｑ＝Ｑ601Ｒ，Ｄ＝Ｄ640Ｇ，Ｓ＝Ｓ671Ｆ及びＥ＝Ｅ678Ｇ）。
【０１５８】
この反応混合物はＭ13鋳型からの１kb生成物を作製するために用いるプライマーを含んだ。該プライマーは各々200 nMで使用し、ここで該プライマーは３′末端に２′−アミノ−Ｃを含んで成る。
【０１５９】
反応はABI 9700熱循環器中で行った。熱循環パラメーターは次の通りであった：50℃で15秒間；92℃で１分間；次いで92℃で15秒間を30サイクル；その後62℃で４分間。２％egel-48（Invitrogen）上に各レーン当たり５μLの各反応液を負荷する、アガロースゲル電気泳動により、試験した様々な条件下で全長アンプリコンを作製する能力について調べた（図13Ａ及び13Ｂ）。より詳しくは、それらの図は、例えば、本明細書中に記載のある種の変異型酵素が、対応する並行の又は非変異型のＧ46Ｅ ＣＳ５Ｒ酵素よりも、高レベルで反応混合物中に存在するリボヌクレオチドで全長（１kb）アンプリコンを生成することができることを示す。例えば、ＧＬ ＣＳ５とＧＬＥの混合物の酵素は、本実施例でアッセイしたリボヌクレオチドの最高レベルでアンプリコンを生成した。しかしＧＬ ＣＳ５ポリメラーゼはリボヌクレオチドを取り込むことができず、それらのアンプリコンは該アンプリコン中に取り込まれた比較的低レベルのリボヌクレオチドを含んだ。
【０１６０】
それらのアンプリコンを次の通りに断片化した：２μlのアンプリコンを0.3Ｎ NaOHと20 mM EDTA中に27.5倍希釈し、次いで98℃で10分間加熱した。2.5μlの6Ｎ HClを加えることにより、断片化したアンプリコンを中和した。達成した断片化の程度を決定するために、アンプリコンの内部断片のコピー数を、ＵＮＧ無しの定量的ＰＣＲを使って、断片化前と後で比較した。断片化のために観察されるサイクル遅延は、断片化の程度（及びヌクレオチド取り込み）の指標である。増加されたリボヌクレオチド取り込みは、増加されたＣｔ遅延を引き起こす。この増幅用の反応混合物は100 mM Tricine pH 8.3, 50 mM kOAc, 5％ v/vグリセロール, 2.5 mM Mg(OAc)2, 20 nM GQDS, 0.5％DMSO, 0.1×SYBR Green I, 2.5％v/v 酵素保存緩衝液（50％ v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5％Tween 20）, 200μMの各dCTP、dGTP及びdATP，360μM dUTP並びに40μM dTTPから成った。この反応混合物を用いて、断片化されたアンプリコンと断片化されていないアンプリコンから340 bp生成物を作製し、次いでそれらの鋳型を断片化に使用した希釈液から更に10,000倍希釈した。プライマー配列は各々200 nMで使用し、ここで該プライマーは３′末端に２′−アミノ−Ｃを含んで成る。
【０１６１】
反応は384ウエルプレート中、動的熱循環器中で反応当たり20μlにおいて実施した。熱循環パラメーターは次の通りであった：50℃で15秒間；92℃で１分間；次いで92℃で15秒間を46サイクル；その後で62℃で１分間の伸長段階。閾値Ｃｔを測定し、対応する断片化Ｃtと未断片化Ｃｔを比較し、試験した各酵素／ｒＮＴＰ条件についてデルタＣｔを作製した。この例では、取り込まれたＮＴＰの量（ｄＮＴＰｓの存在下でＮＴＰｓを取り込む改善された能力を反映する）が大きければ大きいほど、デルタＣｔが大きくなるか又はアルカリ誘導される断片化の後のＣｔ遅延が大きくなるであろう。それらは図14Ａと14Ｂに示される。該データは、例えば、本発明の変異型酵素が、リボヌクレオチド置換の程度が増加されているＰＣＲ生成物を作製するという点でＡＴＰ又はＮＴＰの取り込みで優れていることを示す。例示した酵素の全てを親の混合“物ＧＬ／ＧＬＥ”と又は“Ｃ５Ｒ”と比較した。増加した断片化は、増加したリボヌクレオチド取り込み、及びデオキシヌクレオチドの存在下で限定濃度のリボヌクレオチドを取り込む能力の改善に由来する。
【０１６２】
ハイブリダイゼーションアッセイは、検出しようとする分子へのビオチンの結合を頻繁に必要とする。従って、それはＰＣＲ生成物中へのビオチンの取り込みに有用である。ビオチンがリボヌクレオチドに結合されれば、各断片（別のプライマーに通常相補的であり、従って無益である、３′最遠位断片を除く）は単一のビオチン成分を担持し、それが各断片による等しいシグナル生成をもたらすだろう。
【０１６３】
ビオチンに連結したリボヌクレオチドをＰＣＲ生成物中に取り込む様々な酵素の能力を、後述するように測定した。反応混合物は、100 mM Tricine pH 8.3, 75 mM KOAc, 5％ v/vグリセロール, 2.5 mM Mg(OAc)2, 50 nM 酵素, 0.1％DMSO, 2.5％v/v 酵素保存緩衝液（50％ v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5％Tween 20）, 200μMの各dCTP＋類似体、dGTP及びdATP，360μM dUTP並びに40μM dTTPから成った。合計の40％までのrCTP又は合計の50％までのビオチン−LC−rCTPを試験した。試験した酵素（ＣＳ５ポリメラーゼ）はＧＥ，ＧＱＤＳＥ，ＧＤＳＥ及びＧＬとＧＬＥの４：１混合物であった（Ｇ＝Ｇ46Ｅ，Ｌ＝Ｌ329Ａ，Ｑ＝Ｑ601Ｒ，Ｄ＝Ｄ640Ｇ，Ｓ＝Ｓ671Ｆ及びＥ＝Ｅ678Ｇ）。
【０１６４】
反応混合物を用いて、各々200 nMの２′−アミノ−Ｃを含んで成るプライマー配列を使って、Ｍ13鋳型から１kb生成物を作製した。Ｍ13 ＤＮＡは50μl反応溶液当たり５×105コピーに添加した。反応はABI 9700熱循環器中で行った。熱循環パラメーターは次の通りであった：50℃で15秒間；92℃で１分間；次いで92℃で15秒間を30サイクル；その後62℃で４分間の伸長段階。試験した様々な条件下で全長アンプリコンを作製する能力を、２％egel-48（Invitrogen）上に各レーン当たり５μLの各反応液を負荷する、アガロースゲル電気泳動により調べた（図15Ａ及び15Ｂ）。より詳しくは、図15ＡとＢは、例えば、変異型ＧＱＤＳＥ及びＧＤＳＥが両方とも、対応する親の又は非変異型のＧ46Ｅ ＣＳ５Ｒ酵素が可能であるよりも、より高レベルのｒＣＴＰ及びビオチン化ｒＣＴＰにおいてアンプリコンを生成することができることを示す。更にＧＬ／ＧＬＥ混合物はアンプリコンを生成できるが、このアンプリコンは、ＧＬ酵素がそれらの化合物を取り込むことができないため、低レベルのｒＣＴＰ又はビオチン化ｒＣＴＰ取り込みのいずれかを有するだろう。
【０１６５】
これらのアンプリコンを次いで次の通りに断片化した：２μlのアンプリコンを0.3Ｎ NaOHと20 mM EDTA中に27.5倍希釈し、次いで98℃で10分間加熱した。2.5μlの6Ｎ HClを加えることにより、断片化したアンプリコンを中和した。達成した断片化の程度を決定するために、アンプリコンの内部断片のコピー数を、ＵＮＧ無しの定量的ＰＣＲを使って断片化前と後で比較した。断片化のために観察されるサイクル遅延は、断片化の程度（及びヌクレオチド取り込み）の指標である。よって、増加されたリボヌクレオチド取り込みは増加されたＣｔ遅延を引き起こす。この増幅用の反応混合物は100 mM Tricine pH 8.3, 50 mM KOAc, 5％ v/vグリセロール, 2.5 mM Mg(OAc)2, 20 nM GQDS, 0.5％DMSO, 0.1×SYBR Green I, 2.5％v/v 酵素保存緩衝液（50％ v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5％Tween 20）, 200μMの各dCTP、dGTP及びdATP，360μM dUTP並びに40μM dTTPから成った。この反応混合物を用いて、断片化されたアンプリコンと断片化されていないアンプリコンから340 bp生成物を作製し、次いでそれらの鋳型を断片化に使用した希釈液から更に10,000倍希釈した。プライマー配列は各々200 nMで使用し、ここで該プライマーは３′末端に２′−アミノ−Ｃを含んで成る。
【０１６６】
反応は384ウエルプレート中、動的熱循環器中で反応当たり20μlにおいて実施した。熱循環パラメーターは次の通りであった：50℃で15秒間；92℃で１分間；次いで92℃で15秒間を46サイクル；その後で62℃で１分間の伸長段階。閾値Ｃｔを測定し、対応する断片化又は未断片化Ｃｔｓを比較し、試験した各酵素／ｒＮＴＰ条件についてデルタＣｔを作製した。それらを図16Ａと16Ｂに示す。より詳しくは、図16Ａと16Ｂは、例えば、変異型酵素は対応する親酵素よりも高いレベルのリボヌクレオチド取り込みを有するアプリコンを生成することができるため、ｒＣＴＰ又はビオチン化ｒＣＴＰのいずれかを使った時に変異型酵素により断片化の程度の増加が達成されることを示す。
【０１６７】
実施例VII：加ピロリン酸分解活性化重合
加ピロリン酸分解活性化重合（“ＰＡＰ”）を行うＧ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼとＧ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメーゼの能力を比較した。反応緩衝液は100 mM Tricine pH 8.0, 2.5〜50 mM Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ又は2.5〜50 mM Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ, 50 nM KOAc, 10％ v/vグリセロール, 0.04Ｕ/μl UNG, 4 mM Mg(OAc)2, 1％DMSO, 0.2×SYBR Green I, 2.5％v/v 酵素保存緩衝液（50％ v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5％Tween 20）, 0.2 mMの各dATP, dCTP, dGTP，0.4 mM dUTP並びに100μM ピロリン酸から成った。Ｍ13鋳型と酵素は相互滴定した。使用したＭ13濃度は、20μl反応容量当たり0，104，105及び106コピーであった。使用した酵素濃度は2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 15 nM, 20 nM, 25 nM, 35 nM及び50 nMであった。反応は384ウエルの熱循環器中で、次の循環パラメーターを使って三通りで実施した：50℃で２分間；90℃で１間；次いで90℃で15秒間を46サイクル；その後で62℃で60秒間の伸長温度。
【０１６８】
プライマーの一方は３′末端に２′−アミノ−Ｃを含み、他方のプライマーは３′末端に２′−PO4−Ａ（即ち２′−停止ヌクレオチド）を含んだ。それらのプライマーは、各々0.1μMで反応混合物に添加すると、Ｍ13鋳型から348 bp生成物をもたらすだろう。しかしながら、第二プライマーの３′末端のところの２′−PO4−Ａ残基が停止剤として効率的に働く。プライマーとして働くためには、末端残基の加ピロリン酸分解的除去によりそれが活性されなければならない。
【０１６９】
蛍光データを分析してエルボー値（Ｃ(ｔ)）値（ベースラインを超える蛍光の発生）を求めた。Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼについてのＣ(ｔ)値を図17に示す。Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメーゼについてのＣ(ｔ)値を図18に示す。更に、図17と18は、例えば、変異型酵素が、対応する非変異型又は親酵素よりも、低い酵素濃度でより効率的なＰＡＰ−ＰＣＲをもたらすことを示す。ゲル分析により、この実施例の鋳型なしの反応でのアンプリコンは、周囲のＭ13に起因する特異的生成物であった。
【０１７０】
実施例VIII：サーマス種Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼの伸長速度に対する特定変異の効果
実施例Ｉに記載したスクリーニングにより単離された数個の変異を、サーマス種Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Abramson他に1995年10月３日に付与された“MUTATED THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMUS SPECIES Z05”という発明の名称の米国特許第5,455,170号明細書、及びAbramson他に1997年10月７日に付与された“DNA ENCODING THERMOSTABLE NUCLEIC ACID POLYMERASE ENZYME FROM THERMUS SPECIES Z05”という発明の名称の米国特許第5,674,738号明細書を参照のこと）中に移入した。第一に、該変異に相当するアミノ酸位置を、図１に示される整列を使って決定した。それらを次のように命名した：“Ｑ”＝Ｔ541Ｒ；“Ｄ”＝Ｄ580Ｇ；及び“Ｓ”＝Ａ610Ｆ。それらの変異を、重複伸長ＰＣＲとして知られる方法（例えばHiguchi,R., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, Gelfand, Sninsky & White編、Academic Press, 1990, 及びSilver他、“Site-specific Mutagenesis Using the Polymerase Chain Reaction”, PCR Strategies中、Innis, Gelfand & Sninsky編, Academic Press, 1995を参照）を使うことにより、Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼをコードするプラスミド中に導入した。この方法では、１つは変異誘発しようとする部位の上流そしてもう１つはその下流で、２つのアンプリコンを作製し、ここで各反応のプライマーの１つの中に変異が導入される。次いでそれらの増幅生成物を結合し、そして外側の非変異誘発プライマーを使って再増幅せしめた。生じたアンプリコンは導入された変異を含み、ベクターユニーク制限部位を包含するようにデザインされ、次いでそれを用いてベクタープラスミドＤＮＡ中に該アンプリコンをクローニングした。生じたクローンからの所望の変異の選択を促進するために、必要ならば診断用制限部位を変異誘発プライマー中に導入してもよい。それは変異型と野生型クローンの混合物を含んでもよい。この手順は、低信頼性ＰＣＲにより引き起こされる望ましくない変異を導入する可能性があるので、生じたクローンを配列決定して、望ましい変異だけが作製されたことを確かめることが必要である。一端変異が確認されたら、上述したような制限断片スワップにより、それらを互いに又は予め単離されたＥ683Ｒ変異（ＥＳ112）（Smithらにより2001年３月30日に出願された“High temperature reverse transcription using mutant DNA polymerases”という発明の名称の米国特許出願第20020012970号明細書を参照のこと）と組み合わせた。
【０１７１】
こうして作製された発現プラスミドを使って、実施例Iに記載したように、様々な変異体の精製タンパク質を生産させた。次いで様々な変異体の核酸伸長速度を測定した。反応混合物は、25 mM Tricine pH 8.3, 100 mM KOAc, 3 mM MgCl2, 2.5％v/v 酵素保存緩衝液（50％ v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5％Tween 20）, １％DMSO, 1×SYBR Green I, 0.5 nM感作Ｍ13、及び5 nM酵素を含有した。これに、0.1 mM dGTP, 0.1 mM dTTP, 0.1 mM dCTP、及び0.1 mM dATPの最終濃度にヌクレオチドを添加した。ヌクレオチドを含まない並行反応も設定した。全ての反応は384ウエル熱循環器プレート中で20μlの容量において４通りに実施した。感作されたＭ13鋳型の伸長を、64℃に設定した動的熱循環器中で蛍光によりモニタリングし、10秒毎に読み取った。同一反応を平均化し、そしてヌクレオチド不含有の並行反応を差し引いた。得られたデータの線形回帰分析により伸長速度（図19参照）を推定した。このデータは、或る場合に本明細書に記載の変異が、非キメラサーマスＤＮＡポリメラーゼに関連しても有益な効果をもたらすことを示す。
【０１７２】
実施例IX：ＨＩＶ ＤＮＡ鋳型滴定
ゲノムＤＮＡの存在下又は不在下でＰＡＰ関連ＨＩＶ ＤＮＡ鋳型滴定を実施した。図20は、この分析に使用した変動する反応条件下でのＰＣＲ生成物の検出を示すゲルの写真である。このデータは、例えば、それらのプライマーを使用しない反応に比較して、本明細書に記載のブロックされたプライマーを使って達成できる、改善された増幅特異性及び感度を示す。
【０１７３】
より詳しくは、反応は次の温度一覧表に関し、ABI 5700配列検出系を使って実施した。
50℃で２分
93℃で１分
93℃で15秒→52℃で４分×４サイクル
90℃で15秒→55℃で４分×56サイクル
次の反応条件が全反応に共通であった：
【０１７４】
【表１１】
2011502467.tif 000017
【０１７５】
“ＧＬＱＤＳＥ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ”は、Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｑ601Ｒ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼを指すことに注意。更に、“Tth保存緩衝液”は、0.2％Tween 20，20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 1 mM DTT及び50％ v/vグリセロールを含むことに注意。加えて、各反応容量はジエチルピロカルボン酸（DEPC）処理した水で50μLに調整した。
【０１７６】
変動する反応成分は、ブロックされないプライマー（例えば、図20中の“ブロックされないプライマー”と指定した反応を参照のこと）及び２′−リン酸−Ｕ（即ち２′位にリン酸基を含む２′−停止剤ヌクレオチド、図20中の“ブロックしたプライマー”と指定した反応を参照のこと）を包含した。反応は、更に該混合物に添加された25 ngのヒトゲノムＤＮＡを含有する（図20中の“25 ng ゲノムＤＮＡ”と記載した反応を参照のこと）か又は欠いている（図20中の“クリーン標的”と記載した反応を参照のこと）のいずれかであった。図20中に更に示すように、反応は、１μlのＨＩＶ検体希釈液（10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, 20μg/mLポリＡ及び0.09％NaN3）又は“Neg”反応では１μlのＨＩＶ検体希釈液中に希釈された、標的核酸を含有する105，104，103、102又は101コピーの線状化プラスミドＤＮＡも包含した。指摘したプライマー対はプラスミドＤＮＡから170塩基対の生成物を増幅せしめた。
【０１７７】
実施例Ｘ：野生型Ｋ−rasプラスミド鋳型の背景中の変異型Ｋ−rasプラスミド鋳型の増幅
野生型Ｋ−rasプラスミドの背景中の様々なコピー数の変異型Ｋ−rasプラスミド鋳型、並びに比較用のブロックされた又はブロックされないプライマーを使用する増幅を実施した。図21は、それらの反応に使用した様々な変異型Ｋ−rasプラスミド鋳型コピー数（ｘ軸）について観察された閾値サイクル（ＣT）値（ｙ軸）を示すグラフである。図21は更に、例えば、本明細書に記載のブロックされたプライマーを使って達成することができる改善された識別を示す。
【０１７８】
反応は次の温度一覧表に関し、ABI 5700配列検出系を使って実施した。
50℃で2分
93℃で１分
92℃で15秒→65℃で2分×60サイクル
【０１７９】
次の反応条件が全反応に共通であった：
【表１２】
2011502467.tif 000018
【０１８０】
“ＧＤＳＥ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ”は、Ｇ46Ｅ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼを指すことに注意。加えて、各反応容量はDEPC処理水で50μLに調整した。
【０１８１】
変動する反応成分は、ブロックされないプライマー（例えば、図21中の“ブロックされないプライマー”と指定した反応を参照のこと）及び２′−リン酸−Ｃ又は２′−リン酸−Ａ（即ち２′位にリン酸基を含む２′−停止剤ヌクレオチド）を包含する。加えて、106，105，104，103，102，101又は０コピー（ＮＴＣ反応）（図21中のそれぞれ10e6c, 10e5c, 10e4c, 10e3c, 10e2c, 10e1c及びＮＴＣ）の線状化された変異型Ｋ−rasプラスミドＤＮＡを反応液に添加した。変異型プラスミドＤＮＡの関連する部分配列は、ブロックしたプライマーとブロックされないプライマーセットの両方に完全に一致した。更に、変異型Ｋ−rasプラスミドＤＮＡを１μlのＨＩＶ検体希釈剤（上記参照）又は“ＮＴＣ”反応では１μlのＨＩＶ検体希釈剤中に希釈した。更に、106コピーの線状化野生型Ｋ−rasプラスミドＤＮＡが全ての反応液に存在した。野生型Ｋ−rasプラスミドＤＮＡは、それがプライマー５及び７中の最後の３′塩基（ｄＣ）とＣ：Ｃ不正対合を形成すること以外は、変異型プラスミドＤＮＡに配列が同一であった。ブロックされたプライマー対とブロックされないプライマー対は、共に変異型線状化プラスミド鋳型上に92塩基対のアンプリコンを形成した。
【０１８２】
実施例XI：変動する濃度での様々な酵素によるＫ−rasプラスミド鋳型の増幅
変動する濃度での様々な酵素によるＫ−rasプラスミド鋳型を含む増幅を実施した。図22は、それらの反応に使用した様々な酵素及び酵素濃度（ｘ軸）について観察された閾値サイクル（ＣT）値（ｙ軸）を示すグラフである。それらのデータは、例えば、本明細書中に記載のある種の酵素を使って達成することができる改善されたＰＡＰ増幅効率を示す。
【０１８３】
反応は次の温度一覧に関し、ABI 5700配列検出系を使って実施した。
50℃で２分
93℃で１分
92℃で15秒→60℃で２分×60サイクル
次の反応条件が全反応に共通であった：
【０１８４】
【表１３】
2011502467.tif 000019
【０１８５】
反応成分は２′−リン酸−Ｕ又は２′−リン酸−Ａ（即ち、２′位にリン酸基を含有する２′−停止剤ヌクレオチド）でブロックされたプライマーを含んだ。該プライマー対は、線状化Ｋ−rasプラスミド鋳型上に92塩基対のアンプリコンを構築した。加えて、各反応容量は、ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水により50μlに調整した。
【０１８６】
ポリメラーゼ濃度及びKOAc濃度は、次のように各個々のポリメラーゼに対して最適化された。
【０１８７】
【表１４】
2011502467.tif 000020
【０１８８】
“ＧＬＱＤＳＥ”はＧ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｑ601Ｒ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼを指し、“ＧＬＤＳＥ”はＧ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼを指し、そして“ＧＬＥ”はＧ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼを指すことに注意。
【０１８９】
実施例XII：未ブロックの及びブロックされたＲＴプライマーを比較するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）
ブロックされないＨＣＶ ＲＴプライマーの伸長を、ＨＣＶ ＲＮＡ鋳型における逆転写反応においてブロックされたプライマーの伸長と比較した。それらのＲＴ比較は様々なポリメラーゼを使って実施した。要約すると、図23は、それらの反応に使った様々な酵素（ｘ軸）について観察された閾値サイクル（Ｃｔ）値（ｙ軸）を示すグラフであり、ここで５′−ヌクレアーゼプローブを使用するリアルタイムＰＣＲを使って、ｃＤＮＡを測定した。
【０１９０】
次の反応条件が全ＲＴ反応に共通であった：
【０１９１】
【表１５】
2011502467.tif 000021
【０１９２】
変動する反応成分は、３′−OH未ブロックプライマー（図23中の“３′OHプライマー（未ブロック）”と指定された反応を参照）と２′−リン酸−Ａ又は２′−モノリン酸−３′−ヒドロキシルアデノシンヌクレオチド（即ち２′位にリン酸基を含んで成る２′停止剤ヌクレオチド、図23中の“２′PO4（ブロックされた）”を参照のこと）を含んだ。更に、次のポリメラーゼ条件をｃＤＮＡ反応において比較した（図23参照）：
【０１９３】
Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼ（13 nM）
ＧＬＱＤＳ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ（25 nM）と組み合わされたＧＬＱＤＳＥ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ（100 nM）
ＧＬＱＤＳ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ（50 nM）と組み合わされたＧＬＱＤＳＥ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ（50 nM）
ここで“ＧＬＱＤＳＥ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ”とは、Ｇ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｑ601Ｒ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼのことを指して言い、そして“ＧＬＱＤＳ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ”とはＧ46Ｅ Ｌ329Ａ Ｑ601Ｒ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼのことを指して言う。加えて、各反応液はジエチルピロカルボン酸（DEPC）処理水で20μlに調整した。
【０１９４】
ＲＴ反応液をABI 9600熱循環器中で60℃にて60分間インキュベートした。ＲＴインキュベーション後、ＲＴ反応液をDEPC処理水で100倍希釈した。ＲＴ反応のＨＣＶ ｃＤＮＡ生成物を特異的に測定するように企画された５′ヌクレアーゼプローブベースのリアルタイムＨＣＶ ＰＣＲ反応により、ｃＤＮＡの存在を確認しそして定量した。それらの反応は、次の温度一覧に関し、ABI Prism 7700配列検出器を使って実施した：
50℃  ２分
95℃  15秒→60℃  １分×50サイクル。
【０１９５】
実施例XIII：BRAF変異の検出のための双方向ＰＡＰ
図24は、双方向ＰＡＰを実施した時に生成したBRAF腫瘍遺伝子増幅のＰＣＲ増殖曲線を示す。ｘ軸は標準化された蓄積蛍光を示し、そしてｙ軸はＰＡＰ ＰＣＲ増幅のサイクルを示す。より詳しくは、それらのデータは、BRAF腫瘍遺伝子（Brose他(2002) Cancer Res. 62:6997-7000を参照のこと）中のＶ599Ｅコドン変化の原因であるＴ→Ａ変異の変異特異的増幅を、該変異の正確な位置の所でそれらの３′末端ヌクレオチドと重複する、２′位が停止剤でブロックされたプライマーを使って実施した時に得られた。野生型配列に特異的なプライマーを野生型標的又は変異型標的と反応させた時、野生型標的のみが検出された。逆に、変異型配列に特異的なプライマーを野生型標的又は変異型標的と反応させた時、変異型標的のみが検出された。
【０１９６】
次の反応条件が全ＲＴ反応に共通であった：
【０１９７】
【表１６】
2011502467.tif 000022
【０１９８】
ここで“GLQDSE”は、Ｇ46E Ｌ329Ａ Ｑ601Ｒ Ｄ640Ｇ Ｓ671Ｆ Ｅ678Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼを指す。
【０１９９】
変動する反応成分は、２′−リン酸−Ａ、２′−モノリン酸−３′−ヒドロキシルアデノシンヌクレオチド、２′−リン酸−Ｕ又は２′−モノリン酸−３′−ヒドロキシルウリジンヌクレオチド（即ち、２′位にリン酸基を含んで成る２′−停止剤ヌクレオチド、図24中で“Ｆ５Ｗ／Ｒ５Ｗ”と表示したもの）によりブロックされた野生型BRAFプライマーを含んだ。
【０２００】
加えて、各反応液はDEPC処理水で50μLに調整した。野生型反応液（図24中“ＷＴ”と表示）はBRAF野生型配列の線状化ＤＮＡプラスミドを含み、そして変異型反応液（図24中“ＭＴ”と表示）はBRAF変異型配列の線状化ＤＮＡプラスミドを含んだ。負の反応液（図24中“ＮＥＧ”と表示）は、ＤＮＡを含まないＨＩＶ検体希釈剤（10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, 20μg/mLのポリＡ及び0.09％NaN3）を含んだ。ＰＣＲ中での該プライマーの組み合わせは50 bpアンプリコンを生成した。更に、該反応は次の温度一覧表に関して、ABI 7700配列検出器を使って実施した：
50℃で１分
93℃で１分
90℃で15秒
60℃で150秒→×60サイクル。
【０２０１】
実施例XIV：蛍光ＰＡＰ放出生成物の検出
この机上の実施例は、ブロックされたプライマーが活性化されそして伸長されると検出可能なシグナルの生成をもたらすという、ＰＡＰ活性化を伴うリアルタイムモニタリングプロトコルを例証する。
【０２０２】
３′停止で二重標識されたオリゴヌクレオチドプライマーの作製
下記のプライマーＱＸは、３′末端から13番目のヌクレオチド（Ａ）に結合された消光性色素分子Black Hole Quencher（登録商標）(BHQ)（Biosearch Technologies, Inc.）を含むＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【０２０３】
ＱＸのオリゴヌクレオチドプライマーを溶液状態で、ハイブリッド二重鎖を形成するような相補的オリゴヌクレオチドＲ１（下記参照）と混合する。この二重鎖を、特にフルオレセイン標識デオキシリボアデニン四リン酸（即ち、フルオレセイン標識２′−停止剤ヌクレオチド）及びそのような標的四リン酸を取り込むことができるＤＮＡポリメラーゼを含む、下記に提供される第10表中の試薬と更に混合する。2004年６月28日に出願の“SYNTHESIS AND COMPOSITIONS OF 2’-TERMINATOR NUCLEOTIDES”という発明の名称の米国特許出願第10／879,494号明細書、及び2004年６月28日に出願の“2’-TERMINATOR NUCLEOTIDE-RELATED METHODS AND SYSTEMS”という発明の名称の米国特許出願第10／879,493号明細書を参照のこと。60℃の温度で例えば１時間の該混合物のインキュベーションは、配列ＱＸの３′末端を、鋳型指令の方法で１ヌクレオチドだけ伸長させることができ、これはフルオレセイン標識デオキシリボアデニン２′−リン酸ヌクレオチドによりそれらの３′末端が伸長されているＱＸオリゴヌクレオチドの少なくとも1部分をもたらし、それは下記ではプライマーＱＸFAMと表わされる。
【０２０４】
【表１７】
2011502467.tif 000023
【０２０５】
新たに伸長されたプライマーＱＸFAMは、当業者に既知の任意の数の精製方法を使って上記混合物から精製される。混合物からプライマーＱＸFAMを精製することができるそのような方法の一例は、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）である。HPLC精製パラメーターは、プライマーＱＸFAMの調製物が、伸長されないプライマーＱＸとフルオレセイン標識アデニン四リン酸を実質的に含有しないように選択される。二元HPLC（逆相とアニオン交換HPLC）はそのような分子を精製する方法として知られている。
【０２０６】
一旦精製されれば、ＢＨＱ消光分子とフルオレセイン分子を同一オリゴヌクレオチド上に含有するプライマーＱＸFAMのような分子は、通常、ＢＨＱ２「消光(quencher)」分子によるエネルギー吸収のため、抑制されたフルオレセインシグナルを示す。
【０２０７】
場合により、プライマーＱＸFAMは、例えば米国特許公報No. 2007/0219361中に記載されるように化学的に合成される。
【０２０８】
本実施例で言及される配列は次の通りである：
プライマーＱＸ：  5’-GCAAGCACCCTATCAQGGCAGTACCACA-3’（配列番号73）
（ここでQはＢＨＱ分子の存在を表す）
Ｒ１：  3’-PCGTTCGTGGGATAGTCCGTCATGGTGTT-5’（配列番号74）
（ここでＰは３′リン酸を表す）
プライマーＱＸFAM：  5’-GCAAGCACCCTATCAQGGCAGTACCACAF-3’（配列番号75）
（ここでQはＢＨＱ分子の存在を表し、そしてFはフルオレセイン標識２′リン酸アデニンを表す）
プライマーＨＣ２：  5’-GCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCTTA-3’（配列番号76）。
【０２０９】
ＰＣＲにおける該プライマーの使用
上述したプライマーＱＸFAMを第11表中の試薬と組み合わせる。
【０２１０】
【表１８】
2011502467.tif 000024
【０２１１】
加えて、各反応液をDEPC処理水で50μlに調整した。幾つかの反応はＰＣＲ増幅のための基質として働く標的配列を含み、他のものは標的を含まない。例えば、標的はＨＣＶゲノムの５′ＵＴＲ領域に等しいＤＮＡ配列であることができる。ＰＣＲでのそれらのプライマーの組み合わせは、約244 bpアンプリコンを生成すると期待される。
【０２１２】
反応は次の温度一覧表に関し、ABI Prism 7700配列検出器を使って実施することができる：
50℃で１分
93℃で１分
90℃で15秒
60℃で150秒→×60サイクル
【０２１３】
そのようなＰＣＲを進行させるには、フルオレセイン停止プライマーＱＸFAMのＰＡＰ活性化が必要であり、そしてフルオレセイン標識デオキシアデニン四リン酸分子の放出をもたらすであろう。そのような放出は、約520 nm波長での蛍光シグナルの増加を引き起こすと期待される。約520 nm波長でのシグナルのモニタリングを使って、標的を含まない反応においては全く蛍光の増加を観察することなく、標的核酸を含有するそれらの反応においては蛍光の増加を観察できるだろう。
【０２１４】
実施例XV：Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼの伸長速度に対するＤ580Ｋ，Ｄ580Ｌ，Ｄ580Ｒ及びＤ580Ｔ変異の効果
Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼの核酸伸長速度に対するＤ580位での様々な置換の効果を調べた。まず、重複ＰＣＲ技術を使って、Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼ中に変異を作製し、そして前に記載した通りに変異型酵素を精製しそして定量した。感作したＭ13（一本鎖ＤＮＡ）鋳型に対する伸長速度を、金属補因子としてMg2+とMn2+の両方を使って、上記実施例IIとその他のどこかに記載のようにしてSYBR Green I蛍光の増加をモニタリングすることにより測定した。この実施例では、反応混合物は50 mM Tricine pH 8.3, 40 mM KOAc, 1 mM Mn(OAc)2又は2.5 mM Mg(OAc)2, 1.25％v/v 保存緩衝液（50％v/v グリセロール, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5％Tween 20）, 1％DMSO, 0.6×SYBR Green I, 1.0 nM感作Ｍ13及び／又は5 nM酵素を含有した。これに、0.2 mM dGTP, 0.2 mM dTTP, 0.2 mM dCTP及び0.2 mM dATPの最終濃度になるようにヌクレオチドを添加した。ヌクレオチドを全く含まない並行実験も設定した。全ての反応は384ウエルの熱循環器プレート中で20μlの容量で４通りに行った。感作したＭ13鋳型の伸長を、64℃に設定した動的熱循環器中で蛍光をモニタリングし、それを15秒毎に読み取った。複製の同一反応を平均化し、ヌクレオチド無しの並行反応を差し引いた。伸長速度は、得られたデータの線形回帰分析により推定した。結果を下の第12表に示す。
【０２１５】
【表１９】
2011502467.tif 000025
【０２１６】
データは、Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼの580位の５種類のアミノ酸置換全てが、試験した条件下でより迅速な伸長速度をもたらした。
【０２１７】
実施例XVI：ＲＴ−ＰＣＲにおける様々な変異型Ｚ05 ＤＮＡポリメラーゼの使用
Mn2+ベースのＲＴ：変異Ｄ580Ｇ，Ｄ580Ｋ及びＤ580Ｒを、Mn2+の存在下でのＲＴ−ＰＣＲ効率に対する効果について評価した。反応液は全て次の成分を含んだ：55 mM Tricine pH 8.3, 4％v/v グリセロール, 5％v/v DMSO, 110 mM KOAc, 2.7 mM Mn(OAc)2, 3.6％v/v保存緩衝液（50％v/v グリセロール，100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.2％Tween 20），0.04単位/μlのUNG, 0.45 mMの各dATP, dCTP, dUTP, dGTP; 750 nMの各プライマー（ここで各プライマーは、３′末端にｔ−ブチルベンジルｄＡを含んで成る）、及びシクロヘキシル−FAM、ブラックホール消光剤（BHQ-2）、３′−リン酸、で標識された150 nMのTaqManプローブ。一緒になってそれらの２つのプライマーはＨＣＶ−１Ｂ転写物上に241 bpアンプリコンを生成する。105コピーのＲＮＡ転写物ＨＣＶ−１Ｂを各100μl反応液に添加した。
【０２１８】
転写物を含まない並行反応も設定した。各酵素を27 nMの最終濃度に添加した。反応はRoche LC480動的熱循環器中で行った。熱循環条件は、50℃で5分（“UNG”段階）；66℃で２，５又は30分（“ＲＴ”段階）；95℃で15秒に次いで58℃で50秒を２サイクル；及び91℃で15秒に次いで58℃で50秒を50サイクル。
【０２１９】
第13表は、TaqManプローブの開裂によるFAMシグナル増加から得られたＣｔ値を示す。
【表２０】
2011502467.tif 000026
【０２２０】
この結果は、Ｄ580位におけるそれらの３つの変異が、同等のＲＴ効率を維持しながら、ずっと短いＲＴ時間にするという効果があることを示す。
【０２２１】
Mg2+ベースのＲＴ：変異Ｄ580ＧとＤ580Ｋを、Mg2+の存在下でＲＴ−ＰＣＲを果たす能力についてＥＳ112（Ｚ05 Ｅ683Ｒ）と比較した。親酵素のＺ05 ＤＮＡポリメラーゼは、ＥＳ112に比較して大幅に遅延したＣｔ値でMg2+ベースのＲＴ−ＰＣＲを実施することが知られているので、この実験では再試験しなかった。使用した条件は、KOAcが50 mMに変更され、Mn(OAc)2が2 mM Mg(OAc)2に置換され、そして酵素濃度が10 nMに減少されたことを除いて、すぐ上に記載したものと同一であった。熱循環条件は、30分ＲＴ時間のみを試験したことを除いて同一であった。
【０２２２】
第14表は、TaqManプローブの開裂によるFAMシグナル増加から得られたＣｔ値を示す：
【０２２３】
【表２１】
2011502467.tif 000027
【０２２４】
この結果は、Ｄ580Ｇ変異体がＥＳ112とほぼ同じ効率でMg2+ベースのＲＴ−ＰＣＲを果たすこと、そしてＤ580変異体が、それらの条件下でずっと高いＲＴ効率の指標である、有意に早いＣｔ値をもたらすことを示す。
【０２２５】
本明細書中に記載の実施例及び実施態様は例示目的のものであり、それの様々な変更又は軽微な変化は、当業者に示唆されるだろうし、且つ本願の精神及び範囲並びに添付の請求の範囲内に含めることができることは理解されよう。
【図１】
2011502467.tif 000030
【図２Ａ】
2011502467.tif 000031
【図２Ｂ−１】
2011502467.tif 000032
【図２Ｂ−２】
2011502467.tif 000033
【図２Ｂ−３】
2011502467.tif 000034
【図３Ａ】
2011502467.tif 000035
【図３Ｂ−１】
2011502467.tif 000036
【図３Ｂ−２】
2011502467.tif 000037
【図３Ｂ−３】
2011502467.tif 000038
【図４】
2011502467.tif 000039
【図５】
2011502467.tif 000040
【図６】
2011502467.tif 000041
【図７】
2011502467.tif 000042
【図８】
2011502467.tif 000043
【図９】
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【図１０】
2011502467.tif 000045
【図１１】
2011502467.tif 000046
【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
2011502467.tif 000049
【図１４Ａ】
2011502467.tif 000050
【図１４Ｂ】
2011502467.tif 000051
【図１５Ａ】
2011502467.tif 000052
【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
2011502467.tif 000054
【図１６Ｂ】
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【図１７】
2011502467.tif 000056
【図１８】
2011502467.tif 000057
【図１９】
2011502467.tif 000058
【図２０】
2011502467.tif 000059
【図２１】
2011502467.tif 000060
【図２２】
2011502467.tif 000061
【図２３】
2011502467.tif 000062
【図２４】
2011502467.tif 000063
【配列表】
2011502467000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年6月18日(2009.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼドメイン中に少なくとも次のモチーフ：
Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘb7−Ｘb8−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎ（配列番号32）
（ここでＸb7はＳ又はＴであり；そしてＸb8はＧ，Ｔ，Ｒ，Ｋ又はＬから選択されたアミノ酸である）
を含んで成るＤＮＡポリメラーゼであって、ここで該ポリメラーゼは３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を有し、そしてＸb8がＤ，Ｅ又はＮから選択されたアミノ酸である別の同等のＤＮＡポリメラーゼに比較して、改善された核酸伸長速度及び／又は改善された逆転写効率を有する、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
Ｘb8がＧ又はＫから選択されたアミノ酸である、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ又はＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼであり、そして640位のアミノ酸がＧ，Ｔ，Ｒ，Ｋ及びＬから成る群より選択される、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＺ05 ＤＮＡポリメラーゼであり、そして580位のアミノ酸がＧ，Ｔ，Ｒ，Ｋ及びＬから成る群より選択される、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記ポリメラーゼがキメラポリメラーゼであり、ここで該キメラポリメラーゼが配列番号18のＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ又は配列番号19のＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼに対して少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
前記キメラポリメラーゼが配列番号18又は配列番号19に比較して、Ｇ46Ｅ，Ｌ329Ａ，Ｑ601Ｒ，Ｄ640Ｇ，Ｉ669Ｆ，Ｓ671Ｆ及びＥ678Ｇから成る群より選択された１又は複数のアミノ酸置換を含んで成る、請求項５に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
熱可逆性の共有結合修飾を更に含んで成る、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
前記熱可逆性の共有結合修飾を含んで成るポリメラーゼが、約25℃未満である温度でアルカリ性pHにおいて実施される、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼと
(a) 式Ｉ：
【化１】
2011502467.tif 000064
（ここでＲ1とＲ2は水素であるか、又は連結してもよい有機基である）；及び
(b) 式II：
【化２】
2011502467.tif 000065
（ここでＲ1とＲ2は連結してもよい有機基であり、そして２つの水素はシスである）
から成る群より選択された一般式を有するジカルボン酸無水物
との混合物の反応により生成される、請求項７に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換え核酸を含んで成る発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターを含んで成る宿主細胞。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼを生産する方法であって、該ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸の発現に適当な条件下で請求項１１に記載の宿主細胞を培養することを含んで成る方法。
【請求項１３】
プライマー伸長を実施する方法であって、プライマーの伸長に適当な条件下で、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼをプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、及び遊離ヌクレオチドと接触させ、それにより伸長したプライマーを生成することを含んで成る方法。
【請求項１４】
伸長したプライマーを作製するためのキットであって、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含んで成るキット。
【請求項１５】
請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ポリヌクレオチド鋳型及び遊離ヌクレオチドを含んで成る反応混合物。
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月12日(2010.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼドメイン中に少なくとも次のモチーフ：
Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘb7−Ｘb8−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎ（配列番号32）
（ここでＸb7はＳ又はＴであり；そしてＸb8はＧ，Ｔ，Ｒ，Ｋ又はＬから選択されたアミノ酸である）
を含んで成るＤＮＡポリメラーゼであって、ここで該ポリメラーゼは３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を有し、そしてＸb8がＤ，Ｅ又はＮから選択されたアミノ酸である別の同等のＤＮＡポリメラーゼに比較して、改善された核酸伸長速度及び／又は改善された逆転写効率を有する、ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
Ｘb8がＧ又はＫから選択されたアミノ酸である、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ又はＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼであり、そして640位のアミノ酸がＧ，Ｔ，Ｒ，Ｋ及びＬから成る群より選択される、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
前記ＤＮＡポリメラーゼがＺ05 ＤＮＡポリメラーゼであり、そして580位のアミノ酸がＧ，Ｔ，Ｒ，Ｋ及びＬから成る群より選択される、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
前記ポリメラーゼがキメラポリメラーゼであり、ここで該キメラポリメラーゼが配列番号18のＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ又は配列番号19のＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼに対して少なくとも90％の配列同一性を有する、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼをコードする組換え核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の組換え核酸を含んで成る発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを含んで成る宿主細胞。
【請求項９】
ＤＮＡポリメラーゼを生産する方法であって、該ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸の発現に適当な条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養することを含んで成る方法。
【請求項１０】
プライマー伸長を実施する方法であって、プライマーの伸長に適当な条件下で、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼをプライマー、ポリヌクレオチド鋳型、及び遊離ヌクレオチドと接触させ、それにより伸長したプライマーを生成することを含んで成る方法。
【請求項１１】
伸長したプライマーを作製するためのキットであって、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼを提供する少なくとも１つの容器を含んで成るキット。
【請求項１２】
請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのプライマー、ポリヌクレオチド鋳型及び遊離ヌクレオチドを含んで成る反応混合物。
【国際調査報告】
2011502467.tif 000066
2011502467.tif 000067
2011502467.tif 000068
2011502467.tif 000069