(57)【要約】本発明は、特に癌の診断および処置における、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ  ｎａｎｔａｉｓ、ＭＳＴ１Ｒ）に結合する抗体およびその使用に関する。ＲＯＮが媒介する生存促進および腫瘍増殖経路を阻害する特異的抗体、ならびにその変異体、フラグメント、および誘導体を提供する。また、ＲＯＮに結合するリガンドであるＭＳＰの能力を遮断する特異的抗体、ならびにかかる抗体のフラグメント、変異体、および誘導体も提供する。また、本発明は、上記の抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、ならびにかかるポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞を含む。本発明は、本発明の抗体を使用して癌を診断および処置する方法をさらに含む。
2011509687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＲＯＮエピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体が、ＲＯＮに結合するのを競合的に阻害する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体のものと同一の抗原結合ドメインを含む、前記抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントの重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１１５、配列番号１２５、配列番号１３５、および配列番号１４５からなる群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントの軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項６】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＨは、２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１１５、配列番号１２５、配列番号１３５、および配列番号１４５からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項７】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＬは、２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項８】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＨは、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１１５、配列番号１２５、配列番号１３５、および配列番号１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項９】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＬは、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、および配列番号１５０からなる群から選択されるアミノ酸配列含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＨおよびＶＬは、それぞれ、配列番号４および配列番号９、配列番号１４および配列番号１９、配列番号２４および配列番号２９、配列番号３４および配列番号３９、配列番号４４および配列番号４９、配列番号５４および配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９、配列番号７４および配列番号７９、配列番号８４および配列番号８９、配列番号９４および配列番号９９、配列番号１１５および配列番号１２０、配列番号１２５および配列番号１３０、配列番号１３５および配列番号１４０、ならびに配列番号１４５および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１１】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＨおよびＶＬは、それぞれ２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４および配列番号９、配列番号１４および配列番号１９、配列番号２４および配列番号２９、配列番号３４および配列番号３９、配列番号４４および配列番号４９、配列番号５４および配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９、配列番号７４および配列番号７９、配列番号８４および配列番号８９、配列番号９４および配列番号９９、配列番号１１５および配列番号１２０、配列番号１２５および配列番号１３０、配列番号１３５および配列番号１４０、ならびに配列番号１４５および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をそれぞれ含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１２】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＨおよびＶＬは、配列番号４および配列番号９、配列番号１４および配列番号１９、配列番号２４および配列番号２９、配列番号３４および配列番号３９、配列番号４４および配列番号４９、配列番号５４および配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９、配列番号７４および配列番号７９、配列番号８４および配列番号８９、配列番号９４および配列番号９９、配列番号１１５および配列番号１２０、配列番号１２５および配列番号１３０、配列番号１３５および配列番号１４０、ならびに配列番号１４５および配列番号１５０からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１３】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＨは、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１１６、配列番号１２６、配列番号１３６、および配列番号１４６からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列と同一の、Ｋａｂａｔの重鎖相補性決定領域−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１４】
前記ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１１６、配列番号１２６、配列番号１３６、および配列番号１４６からなる群から選択される、請求項１３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１５】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＨは、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６、配列番号４６、配列番号５６、配列番号６６、配列番号７６、配列番号８６、配列番号９６、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、および配列番号１４７からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列と同一の、Ｋａｂａｔの重鎖相補性決定領域−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１６】
前記ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６、配列番号４６、配列番号５６、配列番号６６、配列番号７６、配列番号８６、配列番号９６、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、および配列番号１４７からなる群から選択される、請求項１５に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１７】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＨは、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、および配列番号１４８からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一の、Ｋａｂａｔの重鎖相補性決定領域−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１８】
前記ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、および配列番号１４８からなる群から選択される、請求項１７に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項１９】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＬは、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１２１、配列番号１３１、配列番号１４１、および配列番号１５１からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列と同一の、Ｋａｂａｔの軽鎖相補性決定領域−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項２０】
前記ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１２１、配列番号１３１、配列番号１４１、および配列番号１５１からなる群から選択される、請求項１９に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項２１】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＬは、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１、配列番号５１、配列番号６１、配列番号７１、配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４２、および配列番号１５２からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列と同一の、Ｋａｂａｔの軽鎖相補性決定領域−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項２２】
前記ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１、配列番号５１、配列番号６１、配列番号７１、配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４２、および配列番号１５２からなる群から選択される、請求項２１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項２３】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１２３、配列番号１３３、配列番号１４３、および配列番号１５３からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一の、Ｋａｂａｔの軽鎖相補性決定領域−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項２４】
前記ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１２３、配列番号１３３、配列番号１４３、および配列番号１５３からなる群から選択される、請求項２３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項２５】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＨは、配列番号５、６、および７、配列番号１５、１６、および１７、配列番号２５、２６、および２７、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４５、４６、および４７、配列番号５５、５６、および５７、配列番号６５、６６、および６７、配列番号７５、７６、および７７、配列番号８５、８６、および８７、配列番号９５、９６、および９７、配列番号１１６、１１７、および１１８、配列番号１２６、１２７、および１２８、配列番号１３６、１３７、および１３８、ならびに配列番号１４６、１４７、および１４８からなる群から選択されるＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むが、但し、前記ＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つの１、２、３、または４個のアミノ酸置換は除かれる、抗体またはそのフラグメント。
【請求項２６】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＨは、配列番号５、６、および７、配列番号１５、１６、および１７、配列番号２５、２６、および２７、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４５、４６、および４７、配列番号５５、５６、および５７、配列番号６５、６６、および６７、配列番号７５、７６、および７７、配列番号８５、８６、および８７、配列番号９５、９６、および９７、配列番号１１６、１１７、および１１８、配列番号１２６、１２７、および１２８、配列番号１３６、１３７、および１３８、ならびに配列番号１４６、１４７、および１４８からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項２７】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントのＶＬは、配列番号１０、１１、および１２、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３０、３１、および３２、配列番号４０、４１、および４２、配列番号５０、５１、および５２、配列番号６０、６１、および６２、配列番号７０、７１、および７２、配列番号８０、８１、および８２、配列番号９０、９１、および９２、配列番号１００、１０１、および１０２、配列番号１２１、１２２、および１２３、配列番号１３１、１３２、および１３３、配列番号１４１、１４２、および１４３、ならびに配列番号１５１、１５２、および１５３からなる群から選択されるＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むが、但し、前記ＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つの１、２、３、または４個のアミノ酸置換は除かれる、抗体またはそのフラグメント。
【請求項２８】
ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントは、配列番号１０、１１、および１２、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３０、３１、および３２、配列番号４０、４１、および４２、配列番号５０、５１、および５２、配列番号６０、６１、および６２、配列番号７０、７１、および７２、配列番号８０、８１、および８２、配列番号９０、９１、および９２、配列番号１００、１０１、および１０２、配列番号１２１、１２２、および１２３、配列番号１３１、１３２、および１３３、配列番号１４１、１４２、および１４３、ならびに配列番号１５１、１５２、および１５３からなる群から選択される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、抗体またはそのフラグメント。
【請求項２９】
ＶＨフレームワーク領域が、５個以下のアミノ酸置換を除いてヒトである、請求項１〜２８のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３０】
ＶＬフレームワーク領域が、５個以下のアミノ酸置換を除いてヒトである、請求項１〜２９のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３１】
線状エピトープに結合する、請求項１〜３０のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３２】
非線状の立体構造エピトープに結合する、請求項１〜３０のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３３】
多価であり、少なくとも２本の重鎖および少なくとも２本の軽鎖を含む、請求項１〜３２のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３４】
多特異性である、請求項１〜３３のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３５】
二重特異性である、請求項３４に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３６】
二重特異性である、請求項１〜３５のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３７】
重鎖および軽鎖可変ドメインが、マウスである、請求項１〜３６のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３８】
前記重鎖および軽鎖可変ドメインは、１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択されるモノクローナル抗体からのものである、請求項３７に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３９】
重鎖および軽鎖可変ドメインが完全にヒトである、請求項１〜３６のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４０】
前記重鎖および軽鎖可変ドメインは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメントからのものである、請求項３９に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４１】
ヒト化される、請求項１〜３６のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４２】
キメラである、請求項１〜３６のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４３】
霊長類化される、請求項１〜３６のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４４】
完全にヒトである、請求項１〜３６のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４５】
Ｆａｂフラグメントである、請求項１〜４４のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４６】
Ｆａｂ’フラグメントである、請求項１〜４４のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４７】
Ｆ（ａｂ）２フラグメントである、請求項１〜４４のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４８】
Ｆｖフラグメントである、請求項１〜４４のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４９】
単鎖抗体である、請求項１〜４４のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５０】
ヒトカッパ定常領域およびヒトラムダ定常領域からなる群から選択される、軽鎖定常領域を含む、請求項１〜４６および４９のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５１】
重鎖定常領域またはそのフラグメントを含む、請求項１〜４６および４９のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５２】
前記重鎖定常領域またはそのフラグメントは、ヒトＩｇＧ４、ＩｇＧ４アグリ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ１アグリからなる群から選択される、請求項５１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５３】
前記参照モノクローナル抗体の解離定数（ＫＤ）より小さいＫＤによって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに特異的に結合する、請求項１〜５２のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５４】
５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに特異的に結合する、請求項１〜５３のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５５】
マウスＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントと比較して、ヒトＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントに優先的に結合する、請求項１〜５４のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５６】
細胞の表面に発現したＲＯＮに結合する、請求項１〜５５のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５７】
前記細胞は、悪性細胞、新生細胞、腫瘍細胞、転移性細胞、または腫瘍関連マクロファージである、請求項５６に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５８】
ＭＳＰのＲＯＮへの結合を遮断する、請求項１〜５７のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５９】
ＲＯＮのＭＳＰ依存性活性化を阻害する、請求項１〜５８のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６０】
ＲＯＮのＭＳＰ非依存性活性化を阻害する、請求項１〜５９のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６１】
ＲＯＮが媒介するＲＡＳ／ＭＡＰＫシグナリング経路の活性化を阻害する、請求項１〜６０のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６２】
ＲＯＮが媒介するＥＲＫまたはＡＫＴのリン酸化を阻害する、請求項１〜６１のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６３】
ＲＯＮが媒介する細胞増殖を阻害する、請求項１〜６２のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６４】
腫瘍細胞成長、腫瘍細胞浸潤、または腫瘍細胞転移を阻害する、請求項１〜６３のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６５】
アポトーシスを誘発する、請求項１〜６４のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６６】
融合される異種ポリペプチドをさらに含む、請求項１〜６５のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６７】
前記抗体は、細胞傷害性薬剤、治療薬、細胞分裂阻害剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体もしくはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびいずれかの前記薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤に共役される、請求項１〜６６のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６８】
前記細胞傷害性薬剤は、放射性核種、生体毒素、酵素的に活性な毒素、細胞分裂阻害治療薬もしくは細胞傷害性治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、またはいずれかの前記細胞傷害性薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項６７に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項６９】
前記検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、またはいずれかの前記検出可能な標識のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項６８に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項７０】
請求項１〜６９のうちのいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント、および担体を含む、組成物。
【請求項７１】
抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１１５、配列番号１２５、配列番号１３５、および配列番号１４５からなる群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であり、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項７２】
前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１１５、配列番号１２５、配列番号１３５、および配列番号１４５からなる群から選択される、請求項７１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７３】
前記ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記ＶＨポリペプチドの前記アミノ酸配列を変化させずに、発現を増加するために最適化される、請求項７１または７２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７４】
前記最適化は、スプライス供与部位およびスプライス受容部位の同定および除去を含む、請求項７３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７５】
前記最適化は、前記ポリヌクレオチドを発現する細胞に対するコドン使用頻度の最適化を含む、請求項７３または７４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７６】
前記核酸は、配列番号３、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３３、配列番号４３、配列番号５３、配列番号６３、配列番号７３、配列番号８３、配列番号９３、配列番号１１４、配列番号１２４、配列番号１３４、および配列番号１４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７１〜７５のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であり、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項７８】
前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、および配列番号１５０からなる群から選択される、請求項７７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７９】
前記ＶＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、前記ＶＬポリペプチドの前記アミノ酸配列を変化させずに、発現を増加するために最適化される、請求項７７または７８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８０】
前記最適化は、スプライス供与部位およびスプライス受容部位の同定および除去を含む、請求項７９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
前記最適化は、前記ポリヌクレオチドを発現する細胞に対するコドン使用頻度の最適化を含む、請求項７９または８０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８２】
前記核酸は、配列番号８、配列番号１８、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、および配列番号１４９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項７７〜８１のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８３】
抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１１５、配列番号１２５、配列番号１３５、および配列番号１４５からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一であり、前記ＶＨポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項８４】
抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一であり、前記ＶＬポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項８５】
２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１１６、配列番号１２６、配列番号１３６、および配列番号１４６からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列と同一である、ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨ−ＣＤＲ１を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項８６】
前記ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１１６、配列番号１２６、配列番号１３６、および配列番号１４６からなる群から選択される、請求項８５に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
【請求項８７】
４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６、配列番号４６、配列番号５６、配列番号６６、配列番号７６、配列番号８６、配列番号９６、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、および配列番号１４７からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列と同一である、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨ−ＣＤＲ２を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項８８】
前記ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６、配列番号４６、配列番号５６、配列番号６６、配列番号７６、配列番号８６、配列番号９６、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、および配列番号１４７からなる群から選択される、請求項８７に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
【請求項８９】
４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、および配列番号１４８からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一である、ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項９０】
前記ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、および配列番号１４８からなる群から選択される、請求項８９に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
【請求項９１】
４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１２１、配列番号１３１、配列番号１４１、および配列番号１５１からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列と同一である、ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＬ−ＣＤＲ１を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項９２】
前記ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１２１、配列番号１３１、配列番号１４１、および配列番号１５１からなる群から選択される、請求項９１に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
【請求項９３】
２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１、配列番号５１、配列番号６１、配列番号７１、配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４２、および配列番号１５２からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列と同一である、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＬ−ＣＤＲ２を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項９４】
前記ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１、配列番号５１、配列番号６１、配列番号７１、配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４２、および配列番号１５２からなる群から選択される、請求項９３に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
【請求項９５】
４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１２３、配列番号１３３、配列番号１４３、および配列番号１５３からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一である、ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項９６】
前記ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１２３、配列番号１３３、配列番号１４３、および配列番号１５３からなる群から選択される、請求項９５に記載のポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
【請求項９７】
抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＨポリペプチドは、配列番号５、６、および７、配列番号１５、１６、および１７、配列番号２５、２６、および２７、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４５、４６、および４７、配列番号５５、５６、および５７、配列番号６５、６６、および６７、配列番号７５、７６、および７７、配列番号８５、８６、および８７、配列番号９５、９６、および９７、配列番号１１６、１１７、および１１８、配列番号１２６、１２７、および１２８、配列番号１３６、１３７、および１３８、ならびに配列番号１４６、１４７、および１４８からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項９８】
抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、前記ＶＬポリペプチドは、１０、１１、および１２、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３０、３１、および３２、配列番号４０、４１、および４２、配列番号５０、５１、および５２、配列番号６０、６１、および６２、配列番号７０、７１、および７２、配列番号８０、８１、および８２、配列番号９０、９１、および９２、配列番号１００、１０１、および１０２、配列番号１２１、１２２、および１２３、配列番号１３１、１３２、および１３３、配列番号１４１、１４２、および１４３、ならびに配列番号１５１、１５２、および１５３からなる群から選択される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、ポリヌクレオチド。
【請求項９９】
前記抗体ＶＨポリペプチドに融合されたシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項７１〜９８のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１００】
前記抗体ＶＬポリペプチドに融合されたシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項７１〜９８のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
前記ＶＨポリペプチドに融合された重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをコードする核酸をさらに含む、請求項７１〜１００のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
前記ＶＨポリペプチドに融合された重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをコードする核酸をさらに含む、請求項７１〜１０１のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
前記ＶＨポリペプチドに融合された重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをコードする核酸をさらに含む、請求項７１〜１０２のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
前記ＶＨポリペプチドに融合された重鎖ヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む、請求項７１〜１０３のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４、ＩｇＧ４アグリ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ１アグリからなる群から選択される、請求項１０１〜１０４のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
前記ＶＬポリペプチドに融合された軽鎖定常領域ドメインをコードする核酸をさらに含む、請求項７１〜１０５のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
前記軽鎖定常領域は、ヒトカッパである、請求項１０６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＲＯＮエピトープに特異的に結合する、請求項７１〜１０７のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
前記核酸によってコードされるポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８Ｏ−ＢＯ３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体を競合的に阻害する、請求項７１〜１０８のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
前記ＶＨポリペプチドのフレームワーク領域が、５個以下のアミノ酸置換を除いてヒトである、請求項７１〜１０９のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
前記ＶＬポリペプチドのフレームワーク領域が、５個以下のアミノ酸置換を除いてヒトである、請求項７１〜１１０のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、線状エピトープに結合する、請求項７１〜１１１のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、非線状の立体構造エピトープに結合する、請求項７１〜１１２のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、多価であり、少なくとも２本の重鎖および少なくとも２本の軽鎖を含む、請求項７１〜１１３のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、多特異性である、請求項７１〜１１４のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、二重特異性である、請求項７１〜１１５のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、完全にヒトである重鎖および軽鎖可変ドメインを含む、請求項７１〜１１６のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
前記重鎖および軽鎖可変ドメインは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメントのものと同一である、請求項１１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１９】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、マウスである重鎖および軽鎖可変ドメインを含む、請求項７１〜１１６のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
前記重鎖および軽鎖可変ドメインは、１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択されるモノクローナル抗体のものと同一である、請求項１１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒト化される、請求項７１〜１１６のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、キメラである、請求項７１〜１１６のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、霊長類化される、請求項７１〜１１６のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、完全にヒトである、請求項７１〜１１６のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂフラグメントである、請求項７１〜１２４のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２６】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントである、請求項７１〜１２４のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２７】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｆ（ａｂ）２フラグメントである、請求項７１〜１２４のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２８】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｆｖフラグメントである、請求項７１〜１２４のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２９】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、単鎖抗体である、請求項７１〜１２４のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３０】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに特異的に結合する、請求項７１〜１２９のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３１】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、マウスＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントと比較して、ヒトＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントに優先的に結合する、請求項７１〜１３０のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３２】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、細胞の表面に発現したＲＯＮに結合する、請求項７１〜１３１のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３３】
前記細胞は、悪性細胞、新生細胞、腫瘍細胞、転移性細胞、または腫瘍関連マクロファージである、請求項１３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３４】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＭＳＰのＲＯＮへの結合を遮断する、請求項７１〜１３３のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３５】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＭＳＰ依存性のＲＯＮの活性化を阻害する、請求項７１〜１３４のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３６】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＭＳＰ非依存性のＲＯＮの活性化を阻害する、請求項７１〜１３５のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３７】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮが媒介するＲａｓ／ＭＡＰＫシグナリング経路の活性化を阻害する、請求項７１〜１３６のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３８】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮが媒介するＥＲＫまたはＡＫＴのリン酸化を阻害する、請求項７１〜１３７のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３９】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮが媒介する細胞増殖を阻害する、請求項７１〜１３８のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４０】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、腫瘍細胞成長、腫瘍細胞浸潤、または腫瘍細胞転移を阻害する、請求項７１〜１３９のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４１】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、アポトーシスを誘発する、請求項７１〜１４０のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４２】
異種ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項７１〜１４１のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４３】
前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、細胞傷害性薬剤、治療薬、細胞分裂阻害剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体もしくはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびいずれかの前記薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤に共役される、請求項７１〜１４２のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４４】
前記細胞傷害性薬剤は、放射性核種、生体毒素、酵素的に活性な毒素、細胞分裂阻害治療薬もしくは細胞傷害性治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、またはいずれかの前記細胞傷害性薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項１４３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４５】
前記検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、またはいずれかの前記検出可能な標識のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項１４３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４６】
請求項７１〜１４５のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、および担体を含む、組成物。
【請求項１４７】
請求項７１〜１４５のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１４８】
前記ポリヌクレオチドは、プロモーターと操作可能に関連する、請求項１４７に記載のベクター。
【請求項１４９】
請求項１４７または請求項１４８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５０】
ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを産生する方法であって、請求項１４９に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記抗体またはそのフラグメントを回収するステップと、を含む、方法。
【請求項１５１】
請求項１５０に記載の方法によって産生される、単離されたポリペプチド。
【請求項１５２】
請求項７１〜１４５のうちのいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項１５３】
前記ポリペプチドを含む抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、請求項１５２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１５４】
請求項１５２または１５３に記載のポリペプチドを含む、単離された抗体またはそのフラグメント。
【請求項１５５】
単離されたＶＨコードポリヌクレオチドおよび単離されたＶＬコードポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨコードポリヌクレオチドおよび前記ＶＬコードポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４および配列番号９、配列番号１４および配列番号１９、配列番号２４および配列番号２９、配列番号３４および配列番号３９、配列番号４４および配列番号４９、配列番号５４および配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９、配列番号７４および配列番号７９、配列番号８４および配列番号８９、配列番号９４および配列番号９９、配列番号１１５および配列番号１２０、配列番号１２５および配列番号１３０、配列番号１３５および配列番号１４０、ならびに配列番号１４５および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸を含み、前記ＶＨコードポリヌクレオチドおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、組成物。
【請求項１５６】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドおよび前記ＶＬコードポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４および配列番号９、配列番号１４および配列番号１９、配列番号２４および配列番号２９、配列番号３４および配列番号３９、配列番号４４および配列番号４９、配列番号５４および配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９、配列番号７４および配列番号７９、配列番号８４および配列番号８９、配列番号９４および配列番号９９、配列番号１１５および配列番号１２０、配列番号１２５および配列番号１３０、配列番号１３５および配列番号１４０、ならびに配列番号１４５および配列番号１５０からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸を含む、請求項１５５に記載の組成物。
【請求項１５７】
単離されたＶＨコードポリヌクレオチドおよび単離されたＶＬコードポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨコードポリヌクレオチドおよび前記ＶＬコードポリヌクレオチドは、それぞれ、２０個未満の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４および配列番号９、配列番号１４および配列番号１９、配列番号２４および配列番号２９、配列番号３４および配列番号３９、配列番号４４および配列番号４９、配列番号５４および配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９、配列番号７４および配列番号７９、配列番号８４および配列番号８９、配列番号９４および配列番号９９、配列番号１１５および配列番号１２０、配列番号１２５および配列番号１３０、配列番号１３５および配列番号１４０、ならびに配列番号１４５および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一である、アミノ酸配列をコードする核酸を含み、前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する、組成物。
【請求項１５８】
単離されたＶＨコードポリヌクレオチドおよび単離されたＶＬコードポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記ＶＨコードポリヌクレオチドは、配列番号５、６、および７、配列番号１５、１６、および１７、配列番号２５、２６、および２７、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４５、４６、および４７、配列番号５５、５６、および５７、配列番号６５、６６、および６７、配列番号７５、７６、および７７、配列番号８５、８６、および８７、ならびに配列番号９５、９６、および９７からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＨポリペプチドをコードし、前記ＶＬコードポリヌクレオチドは、配列番号１０、１１、および１２、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３０、３１、および３２、配列番号４０、４１、および４２、配列番号５０、５１、および５２、配列番号６０、６１、および６２、配列番号７０、７１、および７２、配列番号８０、８１、および８２、配列番号９０、９１、および９２、配列番号１００、１０１、および１０２、配列番号１１６、１１７、および１１８、配列番号１２６、１２７、および１２８、配列番号１３６、１３７、および１３８、ならびに配列番号１４６、１４７、および１４８からなる群から選択される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＬポリペプチドをコードし、前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。
【請求項１５９】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドは、前記抗体ＶＨポリペプチドに融合されたシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項１５５〜１５８のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６０】
前記ＶＬコードポリヌクレオチドは、前記抗体ＶＬポリペプチドに融合されたシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項１５５〜１５８のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６１】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドは、前記ＶＨポリペプチドに融合された重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをコードする核酸をさらに含む、請求項１５５〜１６０のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６２】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドは、前記ＶＨポリペプチドに融合された重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをコードする核酸をさらに含む、請求項１５５〜１６１のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６３】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドは、前記ＶＨポリペプチドに融合された重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをコードする核酸をさらに含む、請求項１５５〜１６２のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６４】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドは、前記ＶＨポリペプチドに融合された重鎖ヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む、請求項１５５〜１６３のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６５】
前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４、ＩｇＧ４アグリ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ１アグリからなる群から選択される、請求項１５５〜１６４のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６６】
前記ＶＬコードポリヌクレオチドは、前記ＶＬポリペプチドに融合された軽鎖定常領域ドメインをコードする核酸をさらに含む、請求項１５５〜１６５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６７】
前記軽鎖定常領域は、ヒトカッパである、請求項１６６に記載の組成物。
【請求項１６８】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＲＯＮエピトープに特異的に結合する、請求項１５５〜１６７のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６９】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体を競合的に阻害する、請求項１５５〜１６７のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７０】
前記ＶＨおよびＶＬポリペプチドのフレームワーク領域は、５個以下のアミノ酸置換を除いてヒトである、請求項１５５〜１６９のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７１】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、線状エピトープに結合する、請求項１５５〜１７０のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７２】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、非線状の立体構造エピトープに結合する、請求項１５５〜１７０のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７３】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、多価であり、少なくとも２本の重鎖および少なくとも２本の軽鎖を含む、請求項１５５〜１７０のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７４】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、多特異性である、請求項１５５〜１７３のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７５】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、二重特異性である、請求項１５５〜１７４のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７６】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、完全にヒトである重鎖および軽鎖可変ドメインを含む、請求項１５５〜１７５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７７】
前記重鎖および軽鎖可変ドメインは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメントのものと同一である、請求項１７６に記載の組成物。
【請求項１７８】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、マウスである重鎖および軽鎖可変ドメインを含む、請求項１５５〜１７５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７９】
前記重鎖および軽鎖可変ドメインは、１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択されるモノクローナル抗体のものと同一である、請求項１７８に記載の組成物。
【請求項１８０】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ヒト化される、請求項１５５〜１７５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８１】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、キメラである、請求項１５５〜１７５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８２】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、霊長類化される、請求項１５５〜１７５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８３】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、完全にヒトである、請求項１５５〜１７５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８４】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、Ｆａｂフラグメントである、請求項１５５〜１８３のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８５】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントである、請求項１５５〜１８３のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８６】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、Ｆ（ａｂ）２フラグメントである、請求項１５５〜１８３のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８７】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、Ｆｖフラグメントである、請求項１５５〜１８３のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８８】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、単鎖抗体である、請求項１５５〜１８３のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８９】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに特異的に結合する、請求項１５５〜１８８のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９０】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、マウスＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントと比較して、ヒトＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントに優先的に結合する、請求項１５５〜１８９のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９１】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、細胞の表面に発現したＲＯＮに結合する、請求項１５５〜１９０のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９２】
前記細胞は、悪性細胞、新生細胞、腫瘍細胞、転移性細胞、または腫瘍関連マクロファージである、請求項１９１に記載の組成物。
【請求項１９３】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＭＳＰのＲＯＮへの結合を遮断する、請求項１５５〜１９２のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９４】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＭＳＰ依存性のＲＯＮの活性化を阻害する、請求項１５５〜１９３のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９５】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＭＳＰ非依存性のＲＯＮの活性化を阻害する、請求項１５５〜１９４のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９６】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮが媒介するＲａｓ／ＭＡＰＫシグナリング経路の活性化を阻害する、請求項１５５〜１９５のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９７】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮが媒介するＥＲＫまたはＡＫＴのリン酸化を阻害する、請求項１５５〜１９６のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９８】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮが媒介する細胞増殖を阻害する、請求項１５５〜１９７のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９９】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、腫瘍細胞成長、腫瘍細胞浸潤、または腫瘍細胞転移を阻害する、請求項１５５〜１９８のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２００】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、アポトーシスを誘発する、請求項１５５〜１９９のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０１】
前記ＶＨコードポリヌクレオチド、前記ＶＬコードポリヌクレオチド、または前記ＶＨコードポリヌクレオチドおよび前記ＶＬコードポリヌクレオチドの両方が、異種ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項１５５〜２００のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０２】
前記ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、細胞傷害性薬剤、治療薬、細胞分裂阻害剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体もしくはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびいずれかの前記薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される薬剤に共役される、請求項１５５〜２０１のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０３】
前記細胞傷害性薬剤は、放射性核種、生体毒素、酵素的に活性な毒素、細胞分裂阻害治療薬もしくは細胞傷害性治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、またはいずれかの前記細胞傷害性薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項２０２に記載の組成物。
【請求項２０４】
前記検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、またはいずれかの前記検出可能な標識のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項２０２に記載の組成物。
【請求項２０５】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドは、第１のベクター上に含有され、前記ＶＬコードポリヌクレオチドは、第２のベクター上に含有される、請求項１５５〜２０４のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０６】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドは、第１のプロモーターと操作可能に関連し、前記ＶＬコードポリヌクレオチドは、第２のプロモーターと操作可能に関連する、請求項２０５に記載の組成物。
【請求項２０７】
前記第１および第２のプロモーターは、同一プロモーターの複製物である、請求項２０６に記載の組成物。
【請求項２０８】
前記第１および第２のプロモーターは、同一ではない、請求項２０６に記載の組成物。
【請求項２０９】
前記第１のベクターおよび前記第２のベクターは、単一宿主細胞に含有される、請求項２０５〜２０８のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１０】
前記第１のベクターおよび前記第２のベクターは、別個の宿主細胞に含有される、請求項２０５〜２０８のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１１】
ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを産生する方法であって、請求項２０９に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記抗体またはそのフラグメントを回収するステップと、を含む、方法。
【請求項２１２】
ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを産生する方法であって、請求項２１０に記載の別個の宿主細胞を共培養するステップと、前記抗体またはそのフラグメントを回収するステップと、を含む、方法。
【請求項２１３】
ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを産生する方法であって、請求項２１０に記載の別個の宿主細胞を別個に培養するステップと、前記ＶＨコードポリペプチドおよび前記ＶＬコードポリペプチドを組み合わせるステップと、前記抗体またはそのフラグメントを回収するステップと、を含む、方法。
【請求項２１４】
請求項２１１〜２１３のうちのいずれか１項に記載の方法によって産生される、ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。
【請求項２１５】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドおよび前記ＶＬコードポリヌクレオチドは、同一ベクター上にある、請求項１５５〜２０４のうちのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１６】
請求項２１５に記載のベクター。
【請求項２１７】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドおよび前記ＶＬコードポリヌクレオチドは、それぞれプロモーターと操作可能に関連する、請求項２１６に記載のベクター。
【請求項２１８】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドおよび前記ＶＬコードポリヌクレオチドは、インフレームで融合され、それらと操作可能に関連する単一プロモーターから共転写され、単鎖抗体またはその抗原結合性フラグメントに共翻訳される、請求項２１６に記載のベクター。
【請求項２１９】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドおよび前記ＶＬコードポリヌクレオチドは、それらと操作可能に関連する単一プロモーターから共転写されるが、別個に翻訳される、請求項２１６に記載のベクター。
【請求項２２０】
前記ＶＨコードポリヌクレオチドと前記ＶＬコードポリヌクレオチドとの間に配列されるＩＲＥＳ配列をさらに含む、請求項２１９に記載のベクター。
【請求項２２１】
ＶＨをコードする前記ポリヌクレオチドおよびＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドは、別個に転写され、それぞれ別個のプロモーターと操作可能に関連する、請求項２１６に記載のベクター。
【請求項２２２】
前記別個のプロモーターは、同一プロモーターの複製物である、請求項２１１に記載のベクター。
【請求項２２３】
前記別個のプロモーターは、同一ではない、請求項２２１に記載のベクター。
【請求項２２４】
請求項２１６〜２２３のうちのいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２２５】
ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを産生する方法であって、請求項２２４に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記抗体またはそのフラグメントを回収するステップと、を含む、方法。
【請求項２２６】
請求項２２５に記載の方法によって産生される、ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。
【請求項２２７】
動物の過剰増殖性疾患を処置するための方法であって、処置を必要とする動物に、
ａ）請求項１〜６９、１５４、２１４、および２２６のうちのいずれか１項に記載の単離された抗体またはそのフラグメントと、
ｂ）薬剤として許容される担体と、を含む組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項２２８】
前記過剰増殖性疾病または疾患は、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、またはそれらの転移からなる群から選択される、請求項２２７に記載の方法。
【請求項２２９】
前記抗体またはそのフラグメントは、悪性細胞の表面に発現したＲＯＮに特異的に結合する、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３０】
前記抗体またはそのフラグメントの前記悪性細胞への結合は、前記悪性細胞の成長阻害をもたらす、請求項２２９に記載の方法。
【請求項２３１】
前記抗体またはそのフラグメントは、腫瘍細胞増殖を阻害する、請求項２２７〜２３０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３２】
腫瘍細胞増殖は、転移成長の阻止または遅延を通じて阻害される、請求項２３１に記載の方法。
【請求項２３３】
前記抗体またはそのフラグメントは、腫瘍細胞遊走を阻害する、請求項２２７〜２３０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３４】
腫瘍細胞増殖は、腫瘍の隣接組織への拡散の阻止または遅延を通じて阻害される、請求項２３１に記載の方法。
【請求項２３５】
前記過剰増殖性疾病または疾患は、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎、副甲状腺、脳下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭部、頸部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、または尿生殖路に位置する新生物である、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３６】
前記過剰増殖性疾病は、癌であり、前記癌は、扁平上皮癌、黒色腫、白血病、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項２２８に記載の方法。
【請求項２３７】
前記癌は、胃癌、腎臓癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、および前立腺癌からなる群から選択される、請求項２３６に記載の方法。
【請求項２３８】
前記動物は、哺乳動物である、請求項２２７〜２３７のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３９】
前記哺乳動物は、ヒトである、請求項２３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ  ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ  ｎａｎｔａｉｓ、ＭＳＴ１Ｒとしても知られる）は、胚発生に必須であり、炎症反応においても重要な役割を果たす、受容体型タンパク質チロシンキナーゼである（非特許文献１）。ＲＯＮはほとんどの場合、上皮由来の細胞型において発現され、ＲＯＮは、多くの他の受容体型チロシンキナーゼと同様、悪性上皮癌の進行において役割を果たし得ることが示唆されている（非特許文献２）。
【０００２】
受容体型タンパク質チロシンキナーゼは、該して成長因子およびホルモン等の細胞外リガンドに結合する細胞外ドメイン、ならびにキナーゼ機能ドメインを有する細胞内ドメインからなる。受容体型タンパク質チロシンキナーゼは多くのクラスに細分化されており、ＲＯＮは、Ｓｔｋ、ｃ−Ｍｅｔ、およびｃ−Ｓｅａも同様に含む、受容体チロシンキナーゼのＭＥＴファミリーのメンバーである（非特許文献１）。ＲＯＮおよびｃ−Ｍｅｔのみが、ヒトに見られる該ファミリーのメンバーであり、これらは全体で約６５％の相同性を共有する。Ｃ−Ｍｅｔは肝細胞成長因子／散乱因子（ＨＧＦ／ＳＦ）の受容体であり、癌原遺伝子としてかなりよく特徴付けられている。
【０００３】
ＲＯＮのリガンドである、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）も同定されており、ｃ−ＭｅｔリガンドであるＨＧＦ／ＳＦと約４０％の相同性を共有する。ＭＳＰおよびＨＧＦは、クリングルドメインによって特徴付けられる、プラスミノーゲン−プロトロンビンファミリーに属する。興味深いことに、ＭＳＰも癌と関連があるとされている。例えば、ＷｅＩｍらは近年、ＭＳＰと乳癌の転移および予後不良との関連を認めた（非特許文献３）。
【０００４】
ＭＳＰは、セマフォリン（ｓｅｍａ）ドメインと称される、ＲＯＮの細胞外部分の特定のドメインに結合することが示されている。ＲＯＮおよびｃ−Ｍｅｔのみが、細胞外ｓｅｍａドメインを有する受容体チロシンキナーゼであり、ＲＯＮの同一ドメインが、そのリガンド結合部位を含むことが示されている。ＭＳＰのＲＯＮへの結合により、ＲＯＮのキナーゼドメイン内でリン酸化が生じ、ＲＯＮのキナーゼ活性の増加につながる。あるいは、β１インテグリンが、Ｓｒｃ依存性経路を通じてＲＯＮをリン酸化し、活性化することができる（非特許文献１）。ＲＯＮの活性化が、ＰＩ３−Ｋ、Ｒａｓ、ｓｒｃ、βカテニン、およびＦａｋシグナリングを含む多くの経路のシグナリングを開始する。ＲＯＮによって活性化されるシグナリング経路の多くが、増殖およびアポトーシスの阻害等の、癌に関連する過程と関係付けられる。
【０００５】
より近年では、多くの理由から、ＲＯＮ自体が癌の進行と関係付けられている。例えば、ＲＯＮは、乳癌、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌、および膵臓癌を含む、多くのヒト腫瘍に発現する。加えて、ＲＯＮは、細胞増殖および運動性を増加させることが、生体外で示されている。さらに、ＲＯＮは、ＲＯＮ遺伝子導入マウスにおける腫瘍の成長および転移を誘発する。（非特許文献４）。故に、抗ＲＯＮ抗体を含む、ＲＯＮシグナリング経路を阻害し得る分子が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．７２：２７３−２８１（２００５）
【非特許文献２】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓｉｓ  ２３：１２９１−１２９７（２００３）
【非特許文献３】ＰＮＡＳ  １０４：７５０７−７５７５（２００７）
【非特許文献４】Ｗａｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６：１１９６７−１１９７４（２００６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
幾つかの実施形態では、本発明は、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＲＯＮエピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【０００８】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、該抗体またはフラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体の、ＲＯＮへの結合を競合的に阻害する。
【０００９】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体のものと同一である、抗原結合ドメインを含む。
【００１０】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントの重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１１５、配列番号１２５、配列番号１３５、および配列番号１４５からなる群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントの軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＨは、２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１１５、配列番号１２５、配列番号１３５、および配列番号１４５からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＬは、２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
【００１４】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＨは、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１１５、配列番号１２５、配列番号１３５、および配列番号１４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＬは、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、および配列番号１５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＨおよびＶＬは、それぞれ、配列番号４および配列番号９、配列番号１４および配列番号１９、配列番号２４および配列番号２９、配列番号３４および配列番号３９、配列番号４４および配列番号４９、配列番号５４および配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９、配列番号７４および配列番号７９、配列番号８４および配列番号８９、配列番号９４および配列番号９９、配列番号１１５および配列番号１２０、配列番号１２５および配列番号１３０、配列番号１３５および配列番号１４０、ならびに配列番号１４５および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＨおよびＶＬは、それぞれ、２０個以下ずつの保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４および配列番号９、配列番号１４および配列番号１９、配列番号２４および配列番号２９、配列番号３４および配列番号３９、配列番号４４および配列番号４９、配列番号５４および配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９、配列番号７４および配列番号７９、配列番号８４および配列番号８９、配列番号９４および配列番号９９、配列番号１１５および配列番号１２０、配列番号１２５および配列番号１３０、配列番号１３５および配列番号１４０、ならびに配列番号１４５および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＨおよびＶＬは、それぞれ、配列番号４および配列番号９、配列番号１４および配列番号１９、配列番号２４および配列番号２９、配列番号３４および配列番号３９、配列番号４４および配列番号４９、配列番号５４および配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９、配列番号７４および配列番号７９、配列番号８４および配列番号８９、配列番号９４および配列番号９９、配列番号１１５および配列番号１２０、配列番号１２５および配列番号１３０、配列番号１３５および配列番号１４０、ならびに配列番号１４５および配列番号１５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１９】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＨは、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１１６、配列番号１２６、配列番号１３６、および配列番号１４６からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列と同一である、Ｋａｂａｔの重鎖相補性決定領域−１（ＶＨ−ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１１６、配列番号１２６、配列番号１３６、および配列番号１４６からなる群から選択される。
【００２０】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＨは、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６、配列番号４６、配列番号５６、配列番号６６、配列番号７６、配列番号８６、配列番号９６、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、および配列番号１４７からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列と同一である、Ｋａｂａｔの重鎖相補性決定領域−２（ＶＨ−ＣＤＲ２）のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６、配列番号４６、配列番号５６、配列番号６６、配列番号７６、配列番号８６、配列番号９６、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、および配列番号１４７からなる群から選択される。
【００２１】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＨは、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、および配列番号１４８からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一である、Ｋａｂａｔの重鎖相補性決定領域−３（ＶＨ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、および配列番号１４８からなる群から選択される。
【００２２】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＬは、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１２１、配列番号１３１、配列番号１４１、および配列番号１５１からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列と同一である、Ｋａｂａｔの軽鎖相補性決定領域−１（ＶＬ−ＣＤＲ１）のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１２１、配列番号１３１、配列番号１４１、および配列番号１５１からなる群から選択される。
【００２３】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＬは、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１、配列番号５１、配列番号６１、配列番号７１、配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４２、および配列番号１５２からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列と同一である、Ｋａｂａｔの軽鎖相補性決定領域−２（ＶＬ−ＣＤＲ２）のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１、配列番号５１、配列番号６１、配列番号７１、配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４２、および配列番号１５２からなる群から選択される。
【００２４】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＬは、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１２３、配列番号１３３、配列番号１４３、および配列番号１５３からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一である、Ｋａｂａｔの軽鎖相補性決定領域−３（ＶＬ−ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１２３、配列番号１３３、配列番号１４３、および配列番号１５３からなる群から選択される。
【００２５】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＨは、配列番号５、６、および７、配列番号１５、１６、および１７、配列番号２５、２６、および２７、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４５、４６、および４７、配列番号５５、５６、および５７、配列番号６５、６６、および６７、配列番号７５、７６、および７７、配列番号８５、８６、および８７、配列番号９５、９６、および９７、配列番号１１６、１１７、および１１８、配列番号１２６、１２７、および１２８、配列番号１３６、１３７、および１３８、ならびに配列番号１４６、１４７、および１４８からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むが、但し、該ＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つにおいて、１、２、３、または４個のアミノ酸置換は除かれる。
【００２６】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＨは、配列番号５、６、および７、配列番号１５、１６、および１７、配列番号２５、２６、および２７、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４５、４６、および４７、配列番号５５、５６、および５７、配列番号６５、６６、および６７、配列番号７５、７６、および７７、配列番号８５、８６、および８７、配列番号９５、９６、および９７、配列番号１１６、１１７、および１１８、配列番号１２６、１２７、および１２８、配列番号１３６、１３７、および１３８、ならびに配列番号１４６、１４７、および１４８からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＬは、配列番号１０、１１、および１２、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３０、３１、および３２、配列番号４０、４１、および４２、配列番号５０、５１、および５２、配列番号６０、６１、および６２、配列番号７０、７１、および７２、配列番号８０、８１、および８２、配列番号９０、９１、および９２、配列番号１００、１０１、および１０２、配列番号１２１、１２２、および１２３、配列番号１３１、１３２、および１３３、配列番号１４１、１４２、および１４３、ならびに配列番号１５１、１５２、および１５３からなる群から選択される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むが、但し、該ＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つにおいて、１、２、３、または４個のアミノ酸置換は除かれる。
【００２８】
幾つかの実施形態では、本発明は、ＲＯＮに特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントを提供し、該抗体またはそのフラグメントのＶＬは、配列番号１０、１１、および１２、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３０、３１、および３２、配列番号４０、４１、および４２、配列番号５０、５１、および５２、配列番号６０、６１、および６２、配列番号７０、７１、および７２、配列番号８０、８１、および８２、配列番号９０、９１、および９２、配列番号１００、１０１、および１０２、配列番号１２１、１２２、および１２３、配列番号１３１、１３２、および１３３、配列番号１４１、１４２、および１４３、ならびに配列番号１５１、１５２、および１５３からなる群から選択される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
上記の抗体またはそのフラグメントの種々の実施形態において、ＶＨフレームワーク領域および／またはＶＬフレームワーク領域は、５個以下のアミノ酸置換を除いてヒトである。
【００３０】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、線状エピトープまたは非線状の立体構造エピトープに結合する。
【００３１】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは多価であり、少なくとも２本の重鎖および少なくとも２本の軽鎖を含む。
【００３２】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、多特異性である。さらなる実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、二重特異性である。
【００３３】
上記の抗体またはそのフラグメントの種々の実施形態において、重鎖および軽鎖可変ドメインは、マウスである。さらなる実施形態では、重鎖および軽鎖可変ドメインは、１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される、モノクローナル抗体からのものである。
【００３４】
上記の抗体またはそのフラグメントの種々の実施形態において、重鎖および軽鎖可変ドメインは、完全にヒトである。さらなる実施形態では、重鎖および軽鎖可変ドメインは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される、モノクローナルＦａｂ抗体フラグメントからのものである。
【００３５】
種々の実施形態において、上記の抗体またはそのフラグメントは、ヒト化される。
【００３６】
種々の実施形態において、上記の抗体またはそのフラグメントは、キメラである。
【００３７】
種々の実施形態において、上記の抗体またはそのフラグメントは、霊長類化される。
【００３８】
種々の実施形態において、上記の抗体またはそのフラグメントは、完全にヒトである。
【００３９】
特定の実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、またはＦｖフラグメントである。
【００４０】
特定の実施形態では、上記の抗体は、単鎖抗体である。
【００４１】
特定の実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、ヒトカッパ定常領域およびヒトラムダ定常領域からなる群から選択される、軽鎖定常領域を含む。
【００４２】
特定の実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、重鎖定常領域またはそのフラグメントを含む。さらなる実施形態では、重鎖定常領域またはそのフラグメントは、ヒトＩｇＧ４、ＩｇＧ４アグリ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ１アグリからなる群から選択される。
【００４３】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、該参照モノクローナル抗体の解離定数（ＫＤ）より小さいＫＤによって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに特異的に結合する。さらなる実施形態では、解離定数（ＫＤ）は、
５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、
１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下である。
【００４４】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、マウスＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントと比較して、ヒトＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントに優先的に結合する。
【００４５】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、細胞の表面に発現したＲＯＮに結合する。さらなる実施形態では、該細胞は、悪性細胞、新生細胞、腫瘍細胞、転移性細胞、または腫瘍関連マクロファージ細胞である。
【００４６】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、ＭＳＰのＲＯＮへの結合を遮断する。
【００４７】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮのＭＳＰ依存性活性化を阻害する
【００４８】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮのＭＳＰ非依存性活性化を阻害する。
【００４９】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮが媒介するＲａｓ／ＭＡＰＫシグナリング経路の活性化を阻害する。
【００５０】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮが媒介するＥＲＫまたはＡＫＴのリン酸化を阻害する。
【００５１】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮが媒介する細胞増殖、腫瘍細胞成長、腫瘍細胞遊走、腫瘍細胞浸潤、または腫瘍細胞転移を阻害する。
【００５２】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、アポトーシスを誘発する。
【００５３】
さらなる実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、それらに融合される異種ポリペプチドをさらに含む。
【００５４】
幾つかの実施形態では、上記の抗体またはそのフラグメントは、細胞傷害性薬剤、治療薬、細胞分裂阻害剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体もしくはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびいずれかの前記薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、薬剤に共役される。さらなる実施形態では、細胞傷害性薬剤は、放射性核種、生体毒素、酵素的に活性な毒素、細胞分裂阻害治療薬もしくは細胞傷害性治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、またはいずれかの該細胞傷害性薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。さらなる実施形態では、検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、またはいずれかの該検出可能な標識のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００５５】
さらなる実施形態において、本発明は、上記の抗体またはそのフラグメント、および担体を含む組成物を含む。
【００５６】
本発明の特定の実施形態は、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを含み、該ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１１５、配列番号１２５、配列番号１３５、および配列番号１４５からなる群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であり、該ＶＨポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。さらなる実施形態では、ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１１５、配列番号１２５、配列番号１３５、および配列番号１４５からなる群から選択される。
【００５７】
特定の実施形態では、該ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、該ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列を変化させずに、発現を増加するために最適化される。さらなる実施形態では、最適化は、スプライス供与部位およびスプライス受容部位の同定および除去、ならびに／または該ポリヌクレオチドを発現する細胞に対するコドン使用頻度の最適化を含む。さらなる実施形態では、該核酸は、配列番号３、配列番号１３、配列番号２３、配列番号３３、配列番号４３、配列番号５３、配列番号６３、配列番号７３、配列番号８３、配列番号９３、配列番号１１４、配列番号１２４、配列番号１３４、および配列番号１４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
幾つかの実施形態では、本発明は、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、該ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一であり、該ＶＬポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。さらなる実施形態では、該ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、および配列番号１５０からなる群から選択される。
【００５９】
特定の実施形態では、該ＶＬポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、該ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列を変化させずに、発現を増加するために最適化される。さらなる実施形態では、最適化は、スプライス供与部位およびスプライス受容部位の同定および除去、ならびに／または該ポリヌクレオチドを発現する細胞に対するコドン使用頻度の最適化を含む。さらなる実施形態では、該核酸は、配列番号８、配列番号１８、配列番号２８、配列番号３８、配列番号４８、配列番号５８、配列番号６８、配列番号７８、配列番号８８、配列番号９８、配列番号１１９、配列番号１２９、配列番号１３９、および配列番号１４９からなる群から選択される、ヌクレオチド配列を含む。
【００６０】
特定の他の実施形態では、本発明は、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、該ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列は、２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４、配列番号１４、配列番号２４、配列番号３４、配列番号４４、配列番号５４、配列番号６４、配列番号７４、配列番号８４、配列番号９４、配列番号１１５、配列番号１２５、配列番号１３５、および配列番号１４５からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一であり、該ＶＨポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。
【００６１】
幾つかの実施形態では、本発明は、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、該ＶＬポリペプチドのアミノ酸配列は、２０個以下の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号９、配列番号１９、配列番号２９、配列番号３９、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７９、配列番号８９、配列番号９９、配列番号１２０、配列番号１３０、配列番号１４０、および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一であり、該ＶＬポリペプチドを含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。
【００６２】
幾つかの実施形態では、本発明は、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１１６、配列番号１２６、配列番号１３６、および配列番号１４６からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列と同一である、ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、ＶＨ−ＣＤＲ１を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。さらなる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１１６、配列番号１２６、配列番号１３６、および配列番号１４６からなる群から選択される。
【００６３】
幾つかの実施形態では、本発明は、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６、配列番号４６、配列番号５６、配列番号６６、配列番号７６、配列番号８６、配列番号９６、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、および配列番号１４７からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列と同一である、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、ＶＨ−ＣＤＲ２を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。さらなる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６、配列番号４６、配列番号５６、配列番号６６、配列番号７６、配列番号８６、配列番号９６、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、および配列番号１４７からなる群から選択される。
【００６４】
幾つかの実施形態では、本発明は、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、および配列番号１４８からなる群から選択される参照ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一である、ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、ＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。さらなる実施形態では、ＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、および配列番号１４８からなる群から選択される。
【００６５】
幾つかの実施形態では、本発明は、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１２１、配列番号１３１、配列番号１４１、および配列番号１５１からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列と同一である、ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、ＶＬ−ＣＤＲ１を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。さらなる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１２１、配列番号１３１、配列番号１４１、および配列番号１５１からなる群から選択される。
【００６６】
幾つかの実施形態では、本発明は、２個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１、配列番号５１、配列番号６１、配列番号７１、配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４２、および配列番号１５２からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列と同一である、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、該ＶＬ−ＣＤＲ２を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。さらなる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１、配列番号５１、配列番号６１、配列番号７１、配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４２、および配列番号１５２からなる群から選択される。
【００６７】
幾つかの実施形態では、本発明は、４個以下のアミノ酸置換を除いて、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１２３、配列番号１３３、配列番号１４３、および配列番号１５３からなる群から選択される参照ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と同一である、ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列をコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、該ＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。さらなる実施形態では、ＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１２３、配列番号１３３、配列番号１４３、および配列番号１５３からなる群から選択される。
【００６８】
幾つかの実施形態では、本発明は、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、該ＶＨポリペプチドは、配列番号５、６、および７、配列番号１５、１６、および１７、配列番号２５、２６、および２７、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４５、４６、および４７、配列番号５５、５６、および５７、配列番号６５、６６、および６７、配列番号７５、７６、および７７、配列番号８５、８６、および８７、配列番号９５、９６、および９７、配列番号１１６、１１７、および１１８、配列番号１２６、１２７、および１２８、配列番号１３６、１３７、および１３８、ならびに配列番号１４６、１４７、および１４８からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、ＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。
【００６９】
幾つかの実施形態では、本発明は、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、該ＶＬポリペプチドは、配列番号１０、１１、および１２、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３０、３１、および３２、配列番号４０、４１、および４２、配列番号５０、５１、および５２、配列番号６０、６１、および６２、配列番号７０、７１、および７２、配列番号８０、８１、および８２、配列番号９０、９１、および９２、配列番号１００、１０１、および１０２、配列番号１２１、１２２、および１２３、配列番号１３１、１３２、および１３３、配列番号１４１、１４２、および１４３、ならびに配列番号１５１、１５２、および１５３からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、該ＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。
【００７０】
幾つかの実施形態では、上記のポリヌクレオチドは、抗体ＶＨポリペプチドまたは抗体ＶＬポリペプチドに融合されるシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む。
【００７１】
特定の他の実施形態では、上記のポリヌクレオチドは、該ＶＨポリペプチドに融合される重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをコードするか、該ＶＨポリペプチドに融合される重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをコードするか、該ＶＨポリペプチドに融合される重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをコードするか、または該ＶＨポリペプチドに融合される重鎖ヒンジ領域をコードする、核酸をさらに含む。さらなる実施形態では、該重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４、ＩｇＧ４アグリ、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ１アグリからなる群から選択される。
【００７２】
幾つかの実施形態では、上記のポリヌクレオチドは、該ＶＬポリペプチドに融合される軽鎖定常領域ドメインをコードする核酸を含む。さらなる実施形態では、該軽鎖定常領域は、ヒトカッパである。
【００７３】
上記のポリヌクレオチドの種々の実施形態において、該核酸によってコードされるポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、およびＭ８０−Ｂ０３からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＲＯＮエピトープに特異的に結合する。
【００７４】
上記のポリヌクレオチドの種々の他の実施形態において、該核酸によってコードされるポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体を競合的に阻害する。
【００７５】
上記のポリヌクレオチドの種々の実施形態において、該ＶＨポリペプチドまたはＶＬポリペプチドのフレームワーク領域は、５個以下のアミノ酸置換を除いてヒトである。
【００７６】
上記のポリヌクレオチドの種々の実施形態において、本発明は、線状エピトープまたは非線状の立体構造エピトープに結合する、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。
【００７７】
上記のポリヌクレオチドの種々の実施形態において、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは多価であり、少なくとも２本の重鎖および少なくとも２本の軽鎖を含む。
【００７８】
上記のポリヌクレオチドの特定の実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、多特異性である。さらなる実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、二重特異性である。
【００７９】
上記のポリヌクレオチドの種々の実施形態において、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、完全にヒトである重鎖および軽鎖可変ドメインを含む。さらなる実施形態では、重鎖および軽鎖可変ドメインは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメントのものと同一である。
【００８０】
上記のポリヌクレオチドの種々の実施形態において、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、マウスである重鎖および軽鎖可変ドメインを含む。さらなる実施形態では、該重鎖および軽鎖可変ドメインは、１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択されるモノクローナル抗体のものと同一である。
【００８１】
上記のポリヌクレオチドの種々の実施形態において、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒト化される。
【００８２】
上記のポリヌクレオチドの種々の実施形態において、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、霊長類化される。
【００８３】
上記のポリヌクレオチドの種々の実施形態において、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、キメラである。
【００８４】
上記のポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、完全にヒトである。
【００８５】
上記のポリヌクレオチドの種々の実施形態において、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、またはＦｖフラグメントである。上記のポリヌクレオチドの特定の実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、単鎖抗体である。
【００８６】
上記のポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに特異的に結合する。
【００８７】
上記のポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、マウスＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントと比較して、ヒトＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントに優先的に結合する。
【００８８】
上記のポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、細胞の表面に発現したＲＯＮに結合する。さらなる実施形態では、該細胞は、悪性細胞、新生細胞、腫瘍細胞、または転移性細胞である。
【００８９】
上記のポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＭＳＰのＲＯＮへの結合を遮断する。
【００９０】
上記のポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＭＳＰ依存性のＲＯＮの活性化を阻害する。
【００９１】
上記のポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＭＳＰ非依存性のＲＯＮの活性化を阻害する。
【００９２】
上記のポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナリング経路の活性化を阻害する。
【００９３】
上記のポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮが媒介するＥＲＫのリン酸化を阻害する。
【００９４】
上記のポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮが媒介する細胞増殖または腫瘍細胞成長を阻害する。
【００９５】
上記のポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、アポトーシスを誘発する。
【００９６】
幾つかの実施形態では、上記のポリヌクレオチドは、異種ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。
【００９７】
上記のポリヌクレオチドの幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、細胞傷害性薬剤、治療薬、細胞分裂阻害剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体もしくはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびいずれかの該薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、薬剤に共役される。さらなる実施形態では、細胞傷害性薬剤は、放射性核種、生体毒素、酵素的に活性な毒素、細胞分裂阻害治療薬もしくは細胞傷害性治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、またはいずれかの該細胞傷害性薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。特定の他の実施形態では、検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、またはいずれかの該検出可能な標識のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００９８】
幾つかの実施形態では、本発明は、上記のポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００９９】
特定の他の実施形態では、本発明は、上記のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。さらなる実施形態では、該ポリヌクレオチドは、プロモーターと操作可能に関連する。さらなる実施形態では、本発明は、かかるベクターを含む宿主細胞を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、該ポリヌクレオチドがプロモーターと操作可能に関連する、ベクターを提供する。
【０１００】
さらなる実施形態では、本発明は、上記のポリヌクレオチドを含むベクターを含有する宿主細胞を培養するステップと、該抗体、またはそのフラグメントを回収するステップと、を含む、ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを産生する方法を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、上記の方法によって産生される、単離されたポリペプチドを提供する。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、本発明は、上記のポリヌクレオチドによってコードされる、単離されたポリペプチドを提供する。
【０１０２】
上記のポリペプチドのさらなる実施形態では、該ポリペプチドを含む抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。他の実施形態は、上記のポリペプチドを含む、単離された抗体またはそのフラグメントを含む。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、本発明は、単離されたＶＨコードポリヌクレオチドおよび単離されたＶＬコードポリヌクレオチドを含む組成物を提供し、該ＶＨコードポリヌクレオチドおよび該ＶＬコードポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４および配列番号９、配列番号１４および配列番号１９、配列番号２４および配列番号２９、配列番号３４および配列番号３９、配列番号４４および配列番号４９、配列番号５４および配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９、配列番号７４および配列番号７９、配列番号８４および配列番号８９、配列番号９４および配列番号９９、配列番号１１５および配列番号１２０、配列番号１２５および配列番号１３０、配列番号１３５および配列番号１４０、ならびに配列番号１４５および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と、少なくとも９０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸を含み、該ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。さらなる実施形態では、該ＶＨコードポリヌクレオチドおよび該ＶＬコードポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４および配列番号９、配列番号１４および配列番号１９、配列番号２４および配列番号２９、配列番号３４および配列番号３９、配列番号４４および配列番号４９、配列番号５４および配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９、配列番号７４および配列番号７９、配列番号８４および配列番号８９、配列番号９４および配列番号９９、配列番号１１５および配列番号１２０、配列番号１２５および配列番号１３０、配列番号１３５および配列番号１４０、ならびに配列番号１４５および配列番号１５０からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする、核酸を含む。
【０１０４】
特定の他の実施形態では、本発明は、単離されたＶＨコードポリヌクレオチドおよび単離されたＶＬコードポリヌクレオチドを含む組成物を提供し、該ＶＨコードポリヌクレオチドおよび該ＶＬコードポリヌクレオチドは、それぞれ、２０個未満の保存的アミノ酸置換を除いて、配列番号４および配列番号９、配列番号１４および配列番号１９、配列番号２４および配列番号２９、配列番号３４および配列番号３９、配列番号４４および配列番号４９、配列番号５４および配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９、配列番号７４および配列番号７９、配列番号８４および配列番号８９、配列番号９４および配列番号９９、配列番号１１５および配列番号１２０、配列番号１２５および配列番号１３０、配列番号１３５および配列番号１４０、ならびに配列番号１４５および配列番号１５０からなる群から選択される参照アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする核酸を含み、該ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。
【０１０５】
さらなる実施形態では、該ＶＨコードポリヌクレオチドは、配列番号５、６、および７、配列番号１５、１６、および１７、配列番号２５、２６、および２７、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４５、４６、および４７、配列番号５５、５６、および５７、配列番号６５、６６、および６７、配列番号７５、７６、および７７、配列番号８５、８６、および８７、配列番号９５、９６、および９７、配列番号１１６、１１７、および１１８、配列番号１２６、１２７、および１２８、配列番号１３６、１３７、および１３８、ならびに配列番号１４６、１４７、および１４８からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＨポリペプチドをコードし、該ＶＬコードポリヌクレオチドは、配列番号１０、１１、および１２、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３０、３１、および３２、配列番号４０、４１、および４２、配列番号５０、５１、および５２、配列番号６０、６１、および６２、配列番号７０、７１、および７２、配列番号８０、８１、および８２、配列番号９０、９１、および９２、配列番号１００、１０１、および１０２、配列番号１２１、１２２、および１２３、配列番号１３１、１３２、および１３３、配列番号１４１、１４２、および１４３、ならびに配列番号１５１、１５２、および１５３からなる群から選択される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含むＶＬポリペプチドをコードし、該ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。
【０１０６】
上記の組成物の種々の実施形態において、該ＶＨコードポリヌクレオチドは、抗体ＶＨポリペプチドに融合されるシグナルペプチドをコードする、核酸をさらに含む。
【０１０７】
上記の組成物の種々の実施形態において、該ＶＬコードポリヌクレオチドは、抗体ＶＬポリペプチドに融合されるシグナルペプチドをコードする、核酸をさらに含む。
【０１０８】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該ＶＨコードポリヌクレオチドは、該ＶＨポリペプチドに融合される重鎖定常領域ＣＨ１ドメインをコードする核酸をさらに含むか、該ＶＨポリペプチドに融合される重鎖定常領域ＣＨ２ドメインをコードする核酸をさらに含むか、該ＶＨポリペプチドに融合される重鎖定常領域ＣＨ３ドメインをコードする核酸をさらに含むか、または該ＶＨポリペプチドに融合される重鎖ヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む。さらなる実施形態では、該重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ４、ＩｇＧ４アグリ、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ１アグリからなる群から選択される。
【０１０９】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該ＶＬコードポリヌクレオチドは、該ＶＬポリペプチドに融合される軽鎖定常領域ドメインをコードする、核酸をさらに含む。さらなる実施形態では、該軽鎖定常領域は、ヒトカッパである。
【０１１０】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅｌ２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＲＯＮエピトープに特異的に結合する。
【０１１１】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体の、ＲＯＮへの結合を競合的に阻害する。
【０１１２】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該ＶＨおよびＶＬポリペプチドのフレームワーク領域は、５個以下のアミノ酸置換を除いてヒトである。
【０１１３】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、線状エピトープまたは非線状の立体構造エピトープに結合する。
【０１１４】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは多価であり、少なくとも２本の重鎖および少なくとも２本の軽鎖を含む。
【０１１５】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、多特異性である。さらなる実施形態では、該ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、二重特異性である。
【０１１６】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、完全にヒトである重鎖および軽鎖可変ドメインを含む。さらなる実施形態では、該重鎖および軽鎖可変ドメインは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８Ｏ−ＢＯ３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される、モノクローナルＦａｂ抗体フラグメントのものと同一である。
【０１１７】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該ＶＨおよびＶＬコードポリヌクレオチドによってコードされる抗体またはそのフラグメントは、マウスである重鎖および軽鎖可変ドメインを含む。さらなる実施形態では、該重鎖および軽鎖可変ドメインは、１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される、モノクローナル抗体のものと同一である。
【０１１８】
上記の組成物の種々の実施形態において、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ヒト化される。
【０１１９】
上記の組成物の種々の実施形態において、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、霊長類化される。
【０１２０】
上記の組成物の種々の実施形態において、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、キメラである。
【０１２１】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、完全にヒトである。
【０１２２】
上記の組成物の種々の実施形態において、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、またはＦｖフラグメントである。上記の組成物の特定の実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、単鎖抗体である。
【０１２３】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５−Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに特異的に結合する。
【０１２４】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、マウスＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントと比較して、ヒトＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントに優先的に結合する。
【０１２５】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、細胞の表面に発現したＲＯＮに結合する。さらなる実施形態では、該細胞は、悪性細胞、新生細胞、腫瘍細胞、転移性細胞、または腫瘍関連マクロファージである。
【０１２６】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＭＳＰのＲＯＮへの結合を遮断する。
【０１２７】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＭＳＰ依存性のＲＯＮの活性化を阻害する。
【０１２８】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＭＳＰ非依存性のＲＯＮの活性化を阻害する。
【０１２９】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナリング経路の活性化を阻害する。
【０１３０】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮが媒介するＥＲＫまたはＡＫＴのリン酸化を阻害する。
【０１３１】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮが媒介する細胞増殖、腫瘍細胞成長、腫瘍細胞遊走、腫瘍細胞浸潤、または腫瘍細胞転移を阻害する。
【０１３２】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、アポトーシスを誘発する。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、上記の組成物、該ＶＨコードポリヌクレオチド、該ＶＬコードポリヌクレオチド、または該ＶＨコードポリヌクレオチドおよび該ＶＬコードポリヌクレオチドの両方は、異種ポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。
【０１３４】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該核酸によってコードされる該ポリペプチドを含む、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、細胞傷害性薬剤、治療薬、細胞分裂阻害剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、リンホカイン、異種抗体もしくはそのフラグメント、検出可能な標識、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびいずれかの該薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、薬剤に共役される。さらなる実施形態では、細胞傷害性薬剤は、放射性核種、生体毒素、酵素的に活性な毒素、細胞分裂阻害治療薬もしくは細胞傷害性治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、生体応答修飾物質、またはいずれかの該細胞傷害性薬剤のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。特定の他の実施形態では、検出可能な標識は、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、放射性標識、またはいずれかの該検出可能な標識のうちの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【０１３５】
上記の組成物の幾つかの実施形態では、該ＶＨコードポリヌクレオチドは第１のベクター上に含有され、該ＶＬコードポリヌクレオチドは第２のベクター上に含有される。さらなる実施形態では、該ＶＨコードポリヌクレオチドは第１のプロモーターと操作可能に関連し、該ＶＬコードポリヌクレオチドは第２のプロモーターと操作可能に関連する。特定の他の実施形態では、第１および第２のプロモーターは、同一プロモーターの複製物である。さらなる実施形態では、第１および第２のプロモーターは、同一ではない。
【０１３６】
上記の組成物の種々の実施形態において、第１のベクターおよび第２のベクターは、単一宿主細胞に含有される。
【０１３７】
上記の組成物の特定の他の実施形態では、第１のベクターおよび第２のベクターは、別個の宿主細胞に含有される。
【０１３８】
幾つかの実施形態では、本発明は、上記の宿主細胞を培養するステップと、該抗体、またはそのフラグメントを回収するステップと、を含む、ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを産生する方法を提供する。
【０１３９】
他の実施形態では、本発明は、別個の宿主細胞を共培養するステップと、該抗体、またはそのフラグメントを回収するステップと、を含む、ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを産生する方法を提供する。上記の方法のさらなる実施形態では、本発明は、該ＶＨコードポリペプチドおよび該ＶＬコードポリペプチドを組み合わせるステップと、該抗体、またはそのフラグメントを回収するステップと、を提供する。
【０１４０】
幾つかの実施形態では、本発明は、上記の方法によって産生される、ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。
【０１４１】
幾つかの実施形態では、本発明は、該ＶＨコードポリヌクレオチドおよび該ＶＬコードポリヌクレオチドが、同一ベクター上にある組成物とともに、その中にベクターを提供する。
【０１４２】
上記のベクターの種々の実施形態において、該ＶＨコードポリヌクレオチドおよび該ＶＬコードポリヌクレオチドは、それぞれ、プロモーターと操作可能に関連する。
【０１４３】
上記のベクターの種々の実施形態において、該ＶＨコードポリヌクレオチドおよび該ＶＬコードポリヌクレオチドは、インフレームで融合され、それらと操作可能に関連する単一プロモーターから共転写され、単鎖抗体またはその抗原結合性フラグメントに共翻訳される。
【０１４４】
上記のベクターの種々の実施形態において、該ＶＨコードポリヌクレオチドおよび該ＶＬコードポリヌクレオチドは、それらと操作可能に関連する単一プロモーターから共転写されるが、別個に翻訳される。さらなる実施形態では、該ベクターは、該ＶＨコードポリヌクレオチドと該ＶＬコードポリヌクレオチドとの間に配列される、ＩＲＥＳ配列をさらに含む。特定の他の実施形態では、ＶＨをコードするポリヌクレオチドおよびＶＬをコードするポリヌクレオチドは、別個に転写され、それぞれ別個のプロモーターと操作可能に関連する。さらなる実施形態では、該別個のプロモーターは、同一プロモーターの複製物であるか、あるいは該別個のプロモーターは、同一ではない。
【０１４５】
幾つかの実施形態では、本発明は、上記のベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１４６】
他の実施形態では、本発明は、上記の宿主細胞を培養するステップと、該抗体、またはそのフラグメントを回収するステップと、を含む、ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを産生する方法を提供する。
【０１４７】
幾つかの実施形態では、本発明は、上記の方法によって産生される、ＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。
【０１４８】
幾つかの実施形態では、本発明は、動物の過剰増殖性疾患を処置するための方法を提供し、該方法は、ａ）上記の単離された抗体またはフラグメントと、ｂ）薬剤として許容される担体と、を含む組成物を、処置を必要とする動物に投与するステップを含む。さらなる実施形態では、過剰増殖性疾病または疾患は、癌、新生物、腫瘍、悪性腫瘍、またはそれらの転移からなる群から選択される。
【０１４９】
上記の方法の種々の実施形態において、該抗体またはそのフラグメントは、悪性細胞の表面に発現したＲＯＮに特異的に結合する。さらなる実施形態では、該抗体またはそのフラグメントの悪性細胞への結合は、悪性細胞の成長阻害をもたらす。
【０１５０】
上記の方法の種々の実施形態において、該抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮのリン酸化を阻害するか、または腫瘍細胞増殖を阻害する。さらなる実施形態では、腫瘍細胞増殖は、転移成長の阻止または遅延を通じて阻害される。
【０１５１】
上記の方法の種々の実施形態において、該抗体またはそのフラグメントは、腫瘍細胞遊走を阻害する。さらなる実施形態では、腫瘍細胞増殖は、腫瘍の隣接組織への拡散の阻止または遅延を通じて阻害される。
【０１５２】
上記の方法の種々の実施形態において、過剰増殖性疾病または疾患は、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎、副甲状腺、脳下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭部、頸部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、または尿生殖路に位置する新生物である。
【０１５３】
上記の方法の種々の実施形態において、過剰増殖性疾病は癌であり、該癌は、扁平上皮癌、黒色腫、白血病、骨髄腫、胃癌、脳癌、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、前立腺癌、精巣癌、甲状腺癌、および頭頸部癌からなる群から選択される。さらなる実施形態では、該癌は、胃癌、腎臓癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、および前立腺癌からなる群から選択される。
【０１５４】
上記の方法の種々の実施形態において、動物は、哺乳動物である。さらなる実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】ＳＷ４８０細胞に結合された抗体の、代表的なＦＡＣＳ結合曲線を示す。
【０１５６】
【図２Ａ】ＲＯＮに結合するＭＳＰに対する、モノクローナルマウス抗ＲＯＮ抗体およびヒトモノクローナル抗ＲＯＮ  Ｆａｂへの効果を示す。
【図２Ｂ】ＲＯＮに結合するＭＳＰに対する、モノクローナルマウス抗ＲＯＮ抗体およびヒトモノクローナル抗ＲＯＮ  Ｆａｂへの効果を示す。
【０１５７】
【図３Ａ】ＭＢ−４５３乳癌細胞およびＢｘＰＣ−３膵臓癌細胞における、ＭＳＰが誘発するＲＯＮのリン酸化に対する抗ＲＯＮ抗体の効果を示す。
【図３Ｂ】ＭＢ−４５３乳癌細胞およびＢｘＰＣ−３膵臓癌細胞における、ＭＳＰが誘発するＲＯＮのリン酸化に対する抗ＲＯＮ抗体の効果を示す。
【図３Ｃ】ＭＢ−４５３乳癌細胞およびＢｘＰＣ−３膵臓癌細胞における、ＭＳＰが誘発するＲＯＮのリン酸化に対する抗ＲＯＮ抗体の効果を示す。
【０１５８】
【図４Ａ】野生型ＲＯＮを過剰発現する２９３細胞、ＲＯＮの構成的に活性なキナーゼドメイン突然変異体を発現する細胞、およびＢｘＰＣ−３膵臓細胞における、ＭＳＰ非依存性のＲＯＮシグナリングに対する、抗ＲＯＮ抗体の効果を示す。
【図４Ｂ】野生型ＲＯＮを過剰発現する２９３細胞、ＲＯＮの構成的に活性なキナーゼドメイン突然変異体を発現する細胞、およびＢｘＰＣ−３膵臓細胞における、ＭＳＰ非依存性のＲＯＮシグナリングに対する、抗ＲＯＮ抗体の効果を示す。
【図４Ｃ】野生型ＲＯＮを過剰発現する２９３細胞、ＲＯＮの構成的に活性なキナーゼドメイン突然変異体を発現する細胞、およびＢｘＰＣ−３膵臓細胞における、ＭＳＰ非依存性のＲＯＮシグナリングに対する、抗ＲＯＮ抗体の効果を示す。
【０１５９】
【図５】ＢｘＰＣ３およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３腫瘍細胞における、ｐＡＫＴのリン酸化に対する抗ＲＯＮ抗体の効果を示す。
【０１６０】
【図６】ヒトＲＯＮスプライス変異体である、ＲＯＮｄｅｌｔａ１６０を発現する細胞に結合された抗体の、ＦＡＣＳ結合曲線を示す。
【０１６１】
【図７】ＲＯＮ抗体の可溶性ＲＯＮへの結合を測定する、ＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。
【０１６２】
【図８】ＲＯＮを発現する２９３細胞に結合された抗体の、ＦＡＣＳ結合曲線を示す。
【０１６３】
【図９】ＲＯＮを発現するＣＨＯ細胞に結合された抗体を測定する、ＦＡＣＳ検定の結果を表す棒グラフである。
【０１６４】
【図１０】ＲＯＮ抗体で処置した腫瘍細胞における、ＥＲＫおよびリン酸化ＥＲＫのウエスタンブロットを示す。棒グラフは、抗体１Ｐ３Ｂ２．２を使用して得られたウエスタンブロットの結果の定量化を示す。
【０１６５】
【図１１Ａ】ＲＯＮ抗体で処置した腫瘍細胞における、ＡＫＴおよびリン酸化ＡＫＴのウエスタンブロットを示す。
【図１１Ｂ】抗体１Ｐ３Ｂ２．２を使用して得られたウエスタンブロットの結果の定量化を示す、棒グラフを表す。
【０１６６】
【図１２】無処置、対照抗体で処置、ＭＳＰで処置、またはＭＳＰおよび抗ＲＯＮ抗体で処置した種々の腫瘍細胞における、リン酸化ＡＫＴおよびリン酸化ＥＲＫのウエスタンブロットを示す。
【０１６７】
【図１３Ａ】可溶性のヒトＲＯＮおよびＣｙｎｏＲＯＮへのＲＯＮ抗体の結合を測定する、ＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。
【図１３Ｂ】可溶性のヒト（図１３Ｃ）ＲＯＮおよびｃｙｎｏ（図１３Ｂ）ＲＯＮへのヒトＭＳＰの結合を測定する、ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１３Ｃ】可溶性のヒト（図１３Ｃ）ＲＯＮおよびｃｙｎｏ（図１３Ｂ）ＲＯＮへのヒトＭＳＰの結合を測定する、ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【０１６８】
【図１４Ａ】ＨＴ１０８０およびＨＴ１０８０−ＲＯＮ（図１４Ａ）、ＡＧＳ（図１４Ｂ）、ならびにＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１４Ｃ）細胞株を使用した、腫瘍細胞浸潤検定の結果を示す。高い棒は、細胞浸潤の増加を示す。
【図１４Ｂ】ＨＴ１０８０およびＨＴ１０８０−ＲＯＮ（図１４Ａ）、ＡＧＳ（図１４Ｂ）、ならびにＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１４Ｃ）細胞株を使用した、腫瘍細胞浸潤検定の結果を示す。高い棒は、細胞浸潤の増加を示す。
【図１４Ｃ】ＨＴ１０８０およびＨＴ１０８０−ＲＯＮ（図１４Ａ）、ＡＧＳ（図１４Ｂ）、ならびにＭＤＡ−ＭＢ−２３１（図１４Ｃ）細胞株を使用した、腫瘍細胞浸潤検定の結果を示す。高い棒は、細胞浸潤の増加を示す。
【０１６９】
【図１５】可溶性ヒトＲＯＮ（ＳｅｍａおよびＰＳＩドメイン）およびＲＯＮのＰＳＩドメインへの、ＲＯＮ抗体の結合を測定する、ＥＬＩＳＡ検定の結果を示す。
【０１７０】
【図１６】マウスＲＯＮを発現する２９３細胞へ結合する、抗マウスＲＯＮ抗体のＦＡＣＳ結合曲線を示す。
【０１７１】
【図１７Ａ】マウスＲＯＮを発現し、抗マウスＲＯＮ抗体で処置したＣＨＯ細胞における、ＡＫＴおよびリン酸化ＡＫＴのウエスタンブロットを示す。
【図１７Ｂ】その定量化を示す。
【０１７２】
【図１８Ａ】マウス（図１８Ａ）ＲＯＮタンパク質またはヒト（図１８Ｂ）ＲＯＮタンパク質のいずれかを発現する２９３細胞に結合する、抗マウスＲＯＮ抗体および抗ヒトＲＯＮ抗体のＦＡＣＳ結合曲線を示す。
【図１８Ｂ】マウス（図１８Ａ）ＲＯＮタンパク質またはヒト（図１８Ｂ）ＲＯＮタンパク質のいずれかを発現する２９３細胞に結合する、抗マウスＲＯＮ抗体および抗ヒトＲＯＮ抗体のＦＡＣＳ結合曲線を示す。
【０１７３】
【図１９】種々の癌細胞型における、ＲＯＮの発現レベルならびにリン酸化ＥＲＫおよびリン酸化ＡＫＴの増加を示す表である。
【０１７４】
【図２０】腫瘍細胞を投与し、抗ＲＯＮ抗体で処置したＳＣＩＤマウスにおける、腫瘍の大きさを表示するグラフを示す。矢印は、抗体が投与された時点を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７５】
Ｉ．定義
【０１７６】
「ａ」または「ａｎ」要素という用語は、１つ以上のその要素を指すことに留意されたく、例えば、「ａｎ  ＲＯＮ抗体」は、１つ以上のＲＯＮ抗体を表すことが理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書で交換可能に使用することができる。
【０１７７】
本明細書で使用される、「ポリペプチド」という用語は、は、単数形の「ポリペプチド」、ならびに複数形の「ポリペプチド」を包含することが意図され、アミド結合（ペプチド結合としても知られる）によって線状に連結されるモノマー（アミノ酸）からなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の１つまたは複数の鎖を指し、産物の具体的な長さを指さない。故に、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の１つまたは複数の鎖を指すために使用されるいずれの他の用語も、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のうちのいずれかの代わりに、あるいはそれと交換可能に使用することができる。また、「ポリペプチド」という用語は、制限されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む、該ポリペプチドの発現後の修飾の産物を指すことが意図される。ポリペプチドは、天然の生物学的源に由来するか、あるいは組換え技術によって産生されてもよいが、必ずしも指定された核酸配列から翻訳される必要はない。化学合成を含む、いずれの様態で生成されてもよい。
【０１７８】
本発明のポリペプチドは、アミノ酸約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または２，０００個以上の大きさであり得る。ポリペプチドは、明確な３次元構造を有し得るが、必ずしもかかる構造を有する必要はない。明確な３次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると称され、明確な３次元構造を有さず、むしろ多数の異なる立体構造を取るポリペプチドは、折り畳まれていないと称される。本明細書で使用される、糖タンパク質という用語は、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基等のアミノ酸残基の、酸素を含有する、または窒素を含有する側鎖を介してタンパク質に付着する少なくとも１個の炭水化物部分にカップリングされる、タンパク質を指す。
【０１７９】
「単離された」ポリペプチドまたはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体とは、その天然の環境にはないポリペプチドを意図する。特定の精製レベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その未変性または天然の環境から取り出すことができる。宿主細胞中に発現した、組換えにより産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的上、任意の好適な技法によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された、未変性のまたは組換えポリペプチドと同様、単離されたと見なされる。
【０１８０】
また、本発明のポリペプチドとして、前述のポリペプチドのフラグメント、誘導体、類似体、もしくは変異体、およびこれらの任意の組み合わせが含まれる。本発明のＲＯＮ抗体または抗体ポリペプチドに言及する場合、「フラグメント」、「変異体」、「誘導体」、および「類似体」という用語には、対応する未変性の抗体またはポリペプチドの抗原結合性の少なくとも一部を保持する、いずれのポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドのフラグメントには、本明細書の別の箇所で説明される特定の抗体フラグメントに加えて、タンパク質分解フラグメント、ならびに欠失フラグメントが含まれる。本発明のＲＯＮ抗体および抗体ポリペプチドの変異体には、上記のようなフラグメント、ならびにアミノ酸置換、欠失、または挿入によって改質されたアミノ酸配列を有する、ポリペプチドが含まれる。変異体は、天然に存在してもよく、または天然に存在しなくてもよい。天然に存在しない変異体は、当技術分野において既知の突然変異誘発技法を用いて、産生することができる。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。本発明のＲＯＮ抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、未変性のポリペプチドにおいては認められない、さらなる特徴を示すように改質された、ポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは、本明細書において「ポリペプチド類似体」と称される場合もある。本明細書で使用される、ＲＯＮ抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能性側基の反応によって化学的に誘導される１個以上の残基を有する、主題のポリペプチドを指す。また、「誘導体」として、２０個の標準アミノ酸の、１個以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有する、ペプチドが含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンと置換することができ、５−ヒドロキシリジンはリジンと置換することができ、３−メチルヒスチジンはヒスチジンと置換することができ、ホモセリンはセリンと置換することができ、オルニチンはリジンと置換することができる。
【０１８１】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数形の核酸、ならびに複数形の核酸を包含することが意図され、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）等の、単離された核酸分子またはコンストラクトを指す。ポリヌクレオチドは、従来のリン酸ジエステル結合、または従来にない結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に認められるもの等のアミド結合）を含み得る。「核酸」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在する、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメント等の、任意の１つ以上の核酸セグメントを指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドとは、その天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含有されるＲＯＮ抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的上、単離されたと見なされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種の宿主細胞中に維持される組換えポリヌクレオチド、または溶液中の精製された（部分的にもしくは実質的に）ポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のポリヌクレオチドの生体内または生体外ＲＮＡ転写物が挙げられる。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸には、合成的に産生された、かかる分子がさらに含まれる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写終結因子等の調節要素であり得るか、またはそれを含み得る。
【０１８２】
本明細書で使用される、「コード化領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、コード化領域の一部と見なすことができ、しかし例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写終結因子、イントロン等のいずれかのフランキング配列は、コード化領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード化領域は、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば、単一ベクター上、または別個のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば、別個の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、いずれのベクターも、単一のコード化領域を含有することができ、あるいは２つ以上のコード化領域を含んでもよく、例えば、単一のベクターが、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を、別個にコードすることができる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、ＲＯＮ抗体またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸に融合されるか、あるいは融合されないかのいずれかである、異種のコード化領域をコードすることができる。異種のコード化領域には、分泌シグナルペプチドまたは異種の機能ドメイン等の、特殊化された要素またはモチーフが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８３】
特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡである場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコード化領域と操作可能に関連する、プロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御要素を含み得る。操作可能な関連とは、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのコード化領域が、遺伝子産物の発現を、１つまたは複数の調節配列の影響または制御下に置くように、１つ以上の調節配列と関連する場合である。２つのＤＮＡフラグメント（ポリペプチドコード化領域、およびそれに関連するプロモーター等）は、プロモーター機能の誘発が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、ならびに、２つのＤＮＡフラグメント間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示する発現調節配列の能力を妨げないか、あるいはＤＮＡ鋳型が転写される能力を妨げない場合、「操作可能に関連」する。したがって、プロモーター領域は、該プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を生じさせることができる場合、その核酸と操作可能に関連するであろう。該プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を指示する、細胞に特異的なプロモーターであり得る。プロモーターに加えて、例えばエンハンサー、オペレーター、抑制因子、および転写終結シグナル等の他の転写制御要素が、該ポリヌクレオチドと操作可能に関連して、細胞に特異的な転写を指示することができる。好適なプロモーターおよび他の転写制御領域を、本明細書で開示する。
【０１８４】
種々の転写制御領域が、当業者に既知である。これらには、限定されないが、サイトメガロウイルス（前初期プロモーター、イントロン−Ａと併用）、サルウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルス等）からのプロモーターおよびエンハンサーセグメント等の脊椎動物細胞において機能する、転写制御領域が含まれるが、これらに限定されない。他の転写制御領域には、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ−グロブリン等の脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核細胞における遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。さらなる好適な転写制御領域には、組織に特異的なプロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘発性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘発可能なプロモーター）が含まれる。
【０１８５】
同様に、種々の翻訳制御要素が当業者に既知である。これらには、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来する要素（特に内部リボソーム侵入部位（即ちＩＲＥＳ）、ＣＩＴＥ配列とも称される）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８６】
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
【０１８７】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コード化領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する、分泌またはシグナルペプチドをコードするさらなるコード化領域と関連し得る。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗面小胞体を通る成長するタンパク質鎖の排出が開始されると、成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、概して、ポリペプチドのＮ末端に融合されるシグナルペプチドを有し、これは、完全なまたは「全長」ポリペプチドから切断されて、分泌型または「成熟」形態のポリペプチドを産生することを認識する。特定の実施形態では、未変性のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖のシグナルペプチド、またはそれと操作可能に関連するポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する配列の、機能的誘導体が使用される。代替として、異種の哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能的誘導体を使用してもよい。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβグルクロニダーゼのリーダー配列と置換することができる。
【０１８８】
本発明は、特定のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を対象とする。天然に存在する抗体等の、完全な大きさの抗体を具体的に指していない限り、「ＲＯＮ抗体」という用語は、完全な大きさの抗体、ならびにかかる抗体の抗原結合性フラグメント、変異体、類似体、もしくは誘導体、例えば、天然に存在する抗体もしくは免疫グロブリン分子、または抗体分子と類似の様態で抗原に結合する、改変抗体分子もしくはフラグメントを包含する。
【０１８９】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書で交換可能に使用される。抗体または免疫グロブリンは、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常は少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系の基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、ＨａｒｌｏｗらのＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照されたい。
【０１９０】
以下でより詳細に説明するように、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に識別することができる、種々の広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはエプシロン、（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、それらの中に幾つかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４）を有することを理解するであろう。抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥと決定するのが、この鎖の性質である。免疫グロブリンのサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等は、よく特徴付けられており、機能的特殊化を付与することが知られている。本開示に照らして、当業者は、これらのクラスおよびアイソタイプの各々の修飾型を容易に識別可能であり、したがって、本発明の範囲内である。免疫グロブリンの全てのクラスが明らかに本発明の範囲内にあるが、以下の説明は、概してＩｇＧのクラスの免疫グロブリン分子を対象とする。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２本の同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量５３，０００〜７０，０００の２本の同一の重鎖ポリペプチドを含む。典型的には、４本の鎖がジスルフィド結合によって「Ｙ」字型に接合し、軽鎖が、「Ｙ」の口から始まって可変領域まで続く重鎖をひとまとめにしている。
【０１９１】
軽鎖はカッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかとして分類される。重鎖の各クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。概して、軽鎖および重鎖は相互に共有結合し、２本の重鎖の「尾」の部分は、免疫グロブリンが、ハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子改変宿主細胞によって生成されると、共有ジスルフィド結合または非共有結合によって相互に結合する。重鎖では、アミノ酸配列が、Ｙ字型の分岐した側のＮ末端から、各鎖の下部のＣ末端へと続く。
【０１９２】
軽鎖および重鎖の両方が、構造的および機能的相同性の領域に分けられる。「定常」および「可変」という用語は、機能的に使用される。この点に関して、軽鎖および重鎖の両方の部分の可変ドメイン（それぞれＶＬおよびＶＨ）が、抗原認識および特異性を決定することが、理解されるであろう。逆に、軽鎖および重鎖の定常ドメイン（それぞれＣＬならびにＣＨ１、ＣＨ２、もしくはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移行、Ｆｃ受容体結合、補体結合等の重要な生物学的特性を付与する。慣例により、定常領域ドメインの付番は、抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠位になるに従って増加する。Ｎ末端部は可変領域であり、Ｃ末端部には定常領域があり、ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際にはそれぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【０１９３】
上述のように、可変領域によって、抗体は、抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することができる。つまり、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、３次元の抗原結合部位を定義する可変領域を形成する。この抗体の四次構造が、Ｙのそれぞれの腕の末端に存在する、抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖のそれぞれの上にある、３つのＣＤＲによって定義される。場合によっては、例えば、ラクダ種に由来するか、またはラクダ免疫グロブリンに基づいて改変された、特定の免疫グロブリン分子であるが、完全な免疫グロブリン分子が、軽鎖を伴わず、重鎖のみで構成され得る。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−ＣａｓｔｅｒｍａｎらのＮａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）を参照されたい。
【０１９４】
天然に存在する抗体では、各抗原結合ドメインに存在する、６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性の環境でその３次元構成をとる時に、抗原結合ドメインを形成するように特定的に位置する、短い、非連続的な配列のアミノ酸である。抗原結合ドメイン内の残りのアミノ酸は、「フレームワーク」領域と称され、さほど分子間の多様性を示さない。フレームワーク領域は主としてβシート立体構造をとり、ＣＤＲは、βシート構造を接続し、場合によってはその一部を形成する、ループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合性相互作用によって、正しい配向へのＣＤＲの位置付けを提供する、足場を形成する役割を果たす。位置付けられたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに相補的な表面を定義する。この相補的表面が、その同族エピトープへの抗体の非共有結合を促進する。ＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸は、明確に定義されているため、それぞれ任意の所定の重鎖または軽鎖可変領域について、当業者によって容易に同定され得る（”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）、およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ，７９６：９０１−９１７（１９８７）を参照されたく、これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１９５】
当技術分野において使用および／または許容される用語に２つ以上の定義がある場合、本明細書で使用される用語の定義は、明示的にそうではない旨が記載されていない限り、かかる全ての意味を含むことが意図される。具体的な例は、重鎖および軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域内に認められる、非連続的な抗原結合部位を説明するための、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．７９５：９０１−９１７（１９８７）（参照することにより本明細書に組み込まれる）によって説明され、その定義は、相互に対して比較されると、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それでもなお、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すためのいずれかの定義の適用は、本明細書で定義され、使用される用語の範囲内にあることが意図される。前掲の参考文献のそれぞれによって定義されるＣＤＲを包含する、適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表１に記載する。特定のＣＤＲを包含する正確な残基の数は、ＣＤＲの配列および大きさに依存して異なる。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むのか、日常的に断定することができる。
【表１】
2011509687.tif 000003
【０１９６】
また、Ｋａｂａｔらは、いずれの抗体にも適用可能である、可変ドメイン配列のための付番システムも定義している。当業者は、配列自体を超える、いかなる実験データにも依存することなく、任意の可変ドメイン配列にこの「Ｋａｂａｔの付番」システムを疑いなく割り当てることができる。本明細書で使用される、「Ｋａｂａｔの付番」とは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）に記載される付番システムを指す。特に指定のない限り、本発明のＲＯＮ抗体またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体中の特定のアミノ酸残基位置の付番への言及は、Ｋａｂａｔの付番システムによる。
【０１９７】
ラクダ種において、ＶＨＨと称される重鎖可変領域は、抗原結合ドメイン全体を形成する。ラクダＶＨＨ可変領域と従来の抗体（ＶＨ）に由来するものとの間の主要な差異には、（ａ）ＶＨＨ内の対応する領域と比較して、ＶＨ軽鎖接触面におけるより疎水性のアミノ酸、（ｂ）ＶＨＨ内におけるより長いＣＤＲ３、および（ｃ）ＶＨＨ内のＣＤＲｌとＣＤＲ３との間での、ジスルフィド結合の頻発が挙げられる。
【０１９８】
本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体には、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性、ヒト、ヒト化、霊長類化、もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合性フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書で開示されるＲＯＮ抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が含まれるが、これらに限定されない。ＳｃＦｖ分子は当技術分野において既知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載される。本発明の免疫グロブリンまたは抗体は、いずれの型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。
【０１９９】
単鎖抗体を含む抗体フラグメントは、１つまたは複数の可変領域を単独で、またはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体または一部分と組み合わせて、含み得る。また、本発明には、１つまたは複数の可変領域のヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせを同様に含む、抗原結合性フラグメントが含まれる。本発明の抗体またはその免疫特異的フラグメントは、鳥類および哺乳類を含む、任意の動物起源のものであり得る。好ましくは、該抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体である。別の実施形態では、可変領域は、コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）（例えば、サメ）起源であってもよい。本明細書で使用される、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、以下、および例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号に記載されるような、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つ以上のヒト免疫グロブリンの遺伝子導入動物から単離され、内因性免疫グロブリンを発現しない、抗体が含まれる。ヒト抗体は、抗体内でアミノ酸置換が行われても、やはり「ヒト」である。
【０２００】
本明細書で使用される、「重鎖部分」という用語には、免疫グロブリの重鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中央、および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらの変異体もしくはフラグメントのうちの少なくとも１つを含む。例えば、本発明で使用する結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびＣＨ２ドメインを含むポリペブチド鎖、ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペブチド鎖、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、およびＣＨ３ドメインを含むポリペブチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部分、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペブチド鎖を含み得る。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペブチド鎖を含む。さらに、本発明で使用する結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部分（例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部）を欠いてもよい。上述のように、当業者には、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）が、天然に存在する免疫グロブリン分子とはアミノ酸配列が異なるように、修飾され得ることが理解されるであろう。
【０２０１】
本明細書で開示される、特定のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体では、多量体の１本のポリペブチド鎖の重鎖部分は、該多量体の第２のポリペブチド鎖上のものと同一である。あるいは、本発明の重鎖部分を含有する単量体は、同一ではない。例えば、それぞれの単量体が、例えば、二重特異性抗体を形成する、異なる標的結合部位を含み得る。
【０２０２】
本明細書で開示される診断方法および処置方法で使用するための、結合ポリペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ３分子に由来する、ヒンジ領域を含み得る。別の例では、重鎖部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ４分子に由来する、キメラヒンジを含み得る。
【０２０３】
本明細書で使用される、「軽鎖部分」という用語には、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインのうちの少なくとも１つを含む。
【０２０４】
本明細書で開示される、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、抗原の１つもしくは複数のエピトープまたは１つもしくは複数の部分、例えば、それらが認識するか、または特異的に結合する、標的ポリペプチド（ＲＯＮ）に関して、説明または特定することができる。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの部分が、「エピトープ」、または「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは単一のエピトープを含み得るが、典型的には少なくとも２つのエピトープを含み、抗原の大きさ、立体構造、および型に依存して、任意の数のエピトープを含み得る。さらに、標的ポリペプチド上の「エピトープ」は、非ポリペプチド要素であり得るか、またはそれを含むことができ、例えば、「エピトープ」は、炭化水素側鎖を含み得ることに留意されたい。
【０２０５】
抗体のペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小の大きさは、約４〜５個のアミノ酸であると考えられる。ペプチドまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、最も好ましくは少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含有する。ＣＤＲは、３次形態の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを認識することができるため、エピトープを含むアミノ酸は、連続的である必要はなく、場合によっては、同一ペプチド鎖上にもなくともよい。本発明では、本発明のＲＯＮ抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドエピトープは、ＲＯＮの少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または約１５〜約３０個の連続的または非連続的なアミノ酸の配列を含有する。
【０２０６】
「特異的に結合する」は、概して、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、その結合が、抗原結合ドメインとエピトープとの間に何らかの相補性を伴うことを意味する。この定義に従うと、抗体が、その抗原結合ドメインを介して、無作為の、関係のないエピトープに結合するであろうよりも容易にエピトープに結合する時、抗体は、そのエピトープに「特異的に結合する」と考えられる。「特異性」という用語は、本明細書において、特定の抗体が特定のエピトープに結合する相対的親和性を条件付けるために使用される。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも、あるエピトープに対してより高い特異性を有すると見なすことができ、あるいは、抗体「Ａ」は、関連するエピトープ「Ｄ」に対してそれが有するよりも高い特異性で、エピトープ「Ｃ」に結合すると考えることができる。
【０２０７】
「優先的に結合する」は、抗体が、関連する、同様な、相同的な、または類似のエピトープに結合するであろうよりも容易に、エピトープに特異的に結合することを意味する。したがって、あるエピトープに「優先的に結合する」抗体は、かかる抗体が関連するエピトープと交差反応し得るとしても、関連するエピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が高いであろう。
【０２０８】
非限定的な例として、抗体は、第１のエピトープに、第２のエピトープに対する該抗体の解離定数（ＫＤ）より小さなＫＤで結合する場合、該第１のエピトープに優先的に結合すると見なすことができる。別の非限定的な例では、抗体は、第１のエピトープに、第２のエピトープに対する該抗体のＫＤより少なくとも１桁低い親和性で結合する場合、第１の抗原に優先的に結合すると見なすことができる。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープに対する該抗体のＫＤより、少なくとも２桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合すると見なすことができる。
【０２０９】
別の非限定的な例では、抗体は、第１のエピトープに、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）より低いオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合すると見なすことができる。別の非限定的な例では、抗体は、第２のエピトープに対する抗体のｋ（ｏｆｆ）より少なくとも１桁低い親和性で、第１のエピトープに結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合すると見なすことができる。別の非限定的な例では、抗体は、第１のエピトープに、第２のエピトープに対する該抗体のｋ（ｏｆｆ）より少なくとも２桁低い親和性で結合する場合、第１のエピトープに優先的に結合すると見なすことができる。
【０２１０】
本明細書で開示される抗体または抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１または１０−３秒−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、本明細書で開示される標的ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合すると考えることができる。より好ましくは、本発明の抗体は、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１、または１０−７秒−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、本明細書で開示される標的ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合すると考えることができる。
【０２１１】
本明細書で開示される、抗体または抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、または５×１０４Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で、本明細書で開示される標的ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合すると考えることができる。より好ましくは、本発明の抗体は、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、５×１０６Ｍ−１秒−１、または１０７Ｍ−１秒−１以下のオン速度（ｋ（ｏｎ））で、本明細書で開示される標的ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合すると考えることができる。
【０２１２】
抗体は、あるエピトープへの参照抗体の結合を幾分遮断する程度まで、そのエピトープに優先的に結合する場合、該エピトープへの参照抗体の結合を競合的に阻害すると考えられる。競合的阻害は、当技術分野において既知である任意の方法、例えば、競合的ＥＬＩＳＡ検定によって、断定することができる。抗体は、あるエピトープへの参照抗体の結合を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％、競合的に阻害すると考えることができる。
【０２１３】
本明細書で使用される、「親和性」という用語は、個々のエピトープの、免疫グロブリン分子のＣＤＲとの結合の強度の度合いを指す。例えば、ＨａｒｌｏｗらのＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）の２７〜２８ページを参照されたい。本明細書で使用される、「結合力」という用語は、免疫グロブリンの集合と抗原との間の、複合体の全体的な安定性、つまり、抗原との免疫グロブリン混合物の機能的結合強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４ページを参照されたい。結合力は、該集合内の個々の免疫グロブリン分子の特定のエピトープとの親和性、ならびに免疫グロブリンおよび抗原の結合価の双方に関連する。例えば、二価のモノクローナル抗体と、ポリマー等の非常に繰り返しの多いエピトープ構造を有する抗原との相互作用が、高結合力の１つであろう。
【０２１４】
また、本発明のＲＯＮ抗体またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、それらの交差反応性に関しても、説明または特定することができる。本明細書で使用される、「交差反応性」という用語は、１つの抗原に特異的である抗体が、第２の抗原と反応する能力、つまり２つの異なる抗原性物質の間の関連性の度合いを指す。したがって、抗体は、その形成を誘発したもの以外のエピトープに結合する場合、交差反応する。交差反応性エピトープは、概して誘発エピトープと同一の相補的な構造特徴の多くを含有し、場合によっては、実際、元のものより良好に適合する。
【０２１５】
例えば、特定の抗体は、関連するが、同一ではないエピトープ、例えば、参照エピトープと少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性（当技術分野において既知であり、本明細書に記載する方法を用いて算出される）を有するエピトープに結合するという点において、ある程度の交差反応性を有する。抗体は、参照エピトープと９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性（当技術分野において既知であり、本明細書に記載する方法を用いて算出される）を有するエピトープに結合しない場合、交差反応性がほとんどまたは全くないと考えることができる。抗体は、そのエピトープのいずれの他の類似体、オルソログ、または相同体にも結合しない場合、特定のエピトープに「高度に特異的」であると見なすことができる。
【０２１６】
また、本発明のＲＯＮ抗体またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、本発明のポリペプチドへのそれらの結合親和性に関しても、説明または特定することができる。好ましい結合親和性には、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄを有するものが含まれる。
【０２１７】
本発明のＲＯＮ抗体またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、「多特異性」、例えば、二重特異性、三重特異性、またはそれを超える多特異性であり得、つまり、それは、１つ以上の異なる抗原（例えば、タンパク質）上に存在する２つ以上の異なるエピトープを、同時に認識して結合する。したがって、ＲＯＮ抗体が「単一特異性」または「多特異性」、例えば、「二重特異性」であるかどうかは、結合するポリペプチドが反応する、異なるエピトープの数を指す。多特異性抗体は、本明細書に記載される標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、あるいは標的ポリペプチド、ならびに異種ポリペプチドまたは固体支持材等の異種エピトーに特異的であり得る。
【０２１８】
本明細書で使用される「結合価」という用語は、可能性のある結合ドメイン、例えば、ＲＯＮ抗体、結合ポリペプチド、または抗体内に存在する抗原結合ドメインの数を指す。それぞれの結合ドメインが、１つのエピトープに特異的に結合する。ＲＯＮ抗体、結合ポリペプチド、または抗体が、１つを超える結合ドメインを含む時には、各結合ドメインが、２つの結合ドメインを有する抗体について、同一エピトープに特異的に結合し（「二価の単一特異性」と称される）、または２つの結合ドメインを有する抗体について、異なるエピトープに特異的に結合する（「二価の二重特異性」と称される）ことができる。また、抗体は、それぞれの特異性について二重特異性および二価であり得る（「二重特異性の四価抗体」と称される）。別の実施形態では、四価のミニボディまたはドメイン欠失抗体を作製することができる。
【０２１９】
二重特異性の二価抗体、およびそれらの作製方法は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、第５，８０７，７０６号、第５，８２１，３３３号、ならびに米国出願公開第２００３／０２０７３４号および第２００２／０１５５５３７号に記載され、それら全ての開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。二重特異性の四価抗体、およびそれらの作成方法は、例えばＷＯ第０２／０９６９４８号およびＷＯ第００／４４７８８号に記載され、これらの双方の開示は、参照することにより本明細書に組み込まれる。概して、ＰＣＴ公開ＷＯ第９３／１７７１５号、ＷＯ第９２／０８８０２号、ＷＯ第９１／００３６０号、ＷＯ第９２／０５７９３号、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）、米国特許第４，４７４，８９３号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５，６４８号、第５，５７３，９２０号、第５，６０１，８１９号、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７４５：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい。
【０２２０】
前述のように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域の、サブユニット構造および３次元構成は、周知である。本明細書で使用される、「ＶＨドメイン」という用語には、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端の可変ドメインが含まれ、「ＣＨ１ドメイン」という用語には、免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインが含まれる。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側に位置する。
【０２２１】
本明細書で使用される「ＣＨ２ドメイン」という用語には、例えば、従来の付番スキームを使用して、抗体の約残基２４４から残基３６０へと延びる、重鎖分子の部分が含まれる（Ｋａｂａｔの付番システムでは残基２４４〜３６０、およびＥＵの付番システムでは残基２３１〜３４０、Ｋａｂａｔ  ＥＡらの前掲書を参照）。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対をなさないという点において、独特である。そうなるのではなく、２つのＮ結合型分岐糖鎖が、無傷の未変性ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に入る。また、ＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ末端へと延び、約１０８個の残基を含むことが、十分に裏付けられている。
【０２２２】
本明細書で使用される、「ヒンジ領域」という用語には、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに接合する、重鎖分子の部分が含まれる。このヒンジ領域は約２５個の残基を含み、柔軟であるため、２つのＮ末端の抗原結合領域は、独立して動くことができる。ヒンジ領域は、上部、中央、および下部ヒンジドメインの、３つのはっきりと異なるドメインにさらに分割することができる（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７６７：４０８３（１９９８））。
【０２２３】
本明細書で使用される「ジスルフィド結合」という用語には、２個の硫黄原子の間に形成される共有結合が含まれる。アミノ酸システインは、チオール基を含み、これは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成することができる。ほとんどの天然に存在するＩｇＧ分子では、ＣＨ１およびＣＬ領域がジスルフィド結合によって連結され、２本の重鎖は、Ｋａｂａｔの付番システムを使用すると２３９および２４２に相当する位置（位置２２６または２２９、ＥＵ付番システム）で、２つのジスルフィド結合によって連結される。
【０２２４】
本明細書で使用される、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応領域または部位が第１の種から得られるか、またはそれに由来し、定常領域（無傷、部分であるか、または本発明にしたがって修飾され得る）が第２の種から得られる、任意の抗体を意味するとする。好ましい実施形態では、標的結合領域または部位は、非ヒト起源（例えばマウスまたは霊長類）のものであり、定常領域は、ヒトである。
【０２２５】
本明細書で使用される、「改変抗体」という用語は、重鎖および軽鎖または両方のいずれかの可変ドメインが、既知の特異性の抗体から１つ以上のＣＤＲを少なくとも部分的に置換することにより、また必要な場合は、部分的なフレームワーク領域の置換および配列の変更によって改質される、抗体を指す。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラス、またはさらにはサブクラスの抗体に由来し得るが、ＣＤＲが異なるクラスの抗体、好ましくは異なる種からの抗体に由来することが想定される。既知の特異性の非ヒト抗体からの１つ以上の「供与体」ＣＤＲが、ヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域に移植される改変抗体を、本明細書では「ヒト化抗体」と称する。１つの可変ドメインの抗原結合能を別のものに移入するために、必ずしも、全てのＣＤＲを供与体の可変領域からの完全なＣＤＲと置換する必要があるとは限らない。むしろ、標的結合部位の活性を維持するために必要である残基を移入することのみが、必要であり得る。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１８０，３７０号に記載される説明を考慮すると、日常的な実験または試行錯誤による試験のいずれかを行うことによって、機能的な改変抗体またはヒト化抗体を得ることは、十分に当業者の能力内であるだろう。
【０２２６】
本明細書で使用される「適切に折り畳まれたポリペプチド」という用語には、該ポリペプチドを成す機能ドメインの全てが明瞭に活性を有する、ポリペプチド（例えば、ＲＯＮ抗体）が含まれる。本明細書で使用される、「不適切に折り畳まれたポリペプチド」という用語には、該ポリペプチドの機能ドメインのうちの少なくとも１つが活性を有しない、ポリペプチドが含まれる。一実施形態において、適切に折り畳まれたポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されるポリペブチド鎖を含み、逆に、不適切に折り畳まれたポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されないポリペブチド鎖を含む。
【０２２７】
本明細書で使用される「改変された」という用語には、合成手段による（例えば、ペプチドの酵素もしくは化学的結合による、組換え技法、生体外ペプチド合成、またはこれらの技法の何らかの組み合わせによる）、核酸またはポリペプチド分子の操作が含まれる。
【０２２８】
本明細書で使用される、「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、交換可能に使用される。これらの用語は、化学的共役または組換え手段を含む任意の手段によって、２つ以上の要素または構成成分を共に接合することを指す。「インフレーム融合」とは、２つ以上のポリヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を接合して、元のＯＲＦの正しい翻訳読み枠を維持する様態で、連続的なより長いＯＲＦを形成することを指す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦ（通常では、セグメントが本来そのように接合されていない）によってコードされるポリペプチドに対応する、２つ以上のセグメントを含有する、単一のタンパク質である。該読み枠は、このように融合されたセグメントを通じて連続的にされるが、該セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって、物理的または空間的に分離することができる。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを、インフレームで融合することができるが、「融合された」ＣＤＲが、連続的なポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって、分離することができる。
【０２２９】
ポリペプチドの文脈において、「線状配列」または「配列」とは、配列内で相互に隣り合う残基が、ポリペプチドの一次構造中で連続的である、アミノからカルボキシル末端への方向の、ポリペプチド中のアミノ酸の順序である。
【０２３０】
本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子が、生化学物質、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生する過程を指す。該過程には、限定されないが、遺伝子ノックダウン、ならびに一過性発現および安定発現の両方を含む、細胞内の遺伝子の機能的存在の、任意の操作が含まれる。それには、遺伝子の、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物の転写、ならびにかかるｍＲＮＡの１つまたは複数のポリペプチドへの翻訳が含まれるが、これらに限定されない。所望の最終産物が生化学物質である場合、発現には、該生化学物質およびいずれかの前駆体の生成が含まれる。遺伝子の発現が、「遺伝子産物」を産生する。本明細書で使用される、遺伝子産物とは、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物には、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を伴う核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの関連付け、タンパク質切断等を伴うポリペプチドが、さらに含まれる。
【０２３１】
本明細書で使用される、「処置する」または「処置」という用語は、治療的処置および予防もしくは阻止措置を指し、目的は、癌の発生または拡散等の所望されない生理学的変化または疾患を、阻止または鈍化（軽減）することである。有益または所望の臨床結果には、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず、症状の緩和、疾病の程度の軽減、病状の安定化（即ち、悪化しない）、疾病の進行の遅延もしくは鈍化、病状の回復もしくは緩和、および緩解（部分的であるか完全であるかにかかわらず）が含まれるが、これらに限定されない。また、「処置」は、処置を受けない場合に予期される生存と比較した、生存の延長を意味することができる。処置を必要とするものには、すでに該病態または疾患を有するもの、ならびに該病態もしくは疾患を有する傾向があるもの、または該病態または疾患を阻止すべきであるものが含まれる。
【０２３２】
「対象」または「個人」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」によって、診断、予後、または療法が所望される任意の対象、特に哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、ヒト、家畜、飼育動物、ならびにイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、雌ウシ等の動物園、スポーツ、もしくは愛玩動物が挙げられる。
【０２３３】
本明細書で使用される、「結合分子の投与から利益を得るであろう対象」および「処置を必要とする動物」等の語句には、例えば、結合分子によって認識される抗原の検出に（例えば、診断法として）使用される、結合分子の投与から、および／またはある標的タンパク質に特異的に結合する結合分子を用いた、処置、即ち、癌等の疾病の緩和もしくは阻止から、利益を受けるであろう、哺乳動物対象等の対象が含まれる。本明細書でより詳細に説明するように、該結合分子は、非共役型で使用することができ、あるいは、例えば、薬物、プロドラッグ、または同位体に共役することができる。
【０２３４】
「過剰増殖性疾病または疾患」は、悪性であるか良性であるかにかかわらず、全ての形質転換細胞および組織、ならびに全ての癌性細胞および組織を含む、全ての新生細胞の成長および増殖を意味する。過剰増殖性疾病または疾患には、前癌性病変、異常細胞成長、良性腫瘍、悪性腫瘍、および「癌」が含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態において、過剰増殖性疾病または疾患、例えば、前癌性病変、異常細胞成長、良性腫瘍、悪性腫瘍、または「癌」は、ＲＯＮを発現、過剰発現、または異常発現する、細胞を含む。
【０２３５】
過剰増殖性疾病、疾患、および／または病態のさらなる例には、良性であるか悪性であるかにはかかわらず、前立腺、結腸、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経（中枢および抹消）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および尿生殖路に位置する新生物が含まれるが、これに限定されない。かかる新生物は、特定の実施形態において、ＲＯＮを発現、過剰発現、または異常発現する。
【０２３６】
他の過剰増殖性疾患には、高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖性疾患、異常蛋白血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および、新形成以外の、上に列記した器官系に位置する任意の他の過剰増殖性疾病が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態において、該疾病は、ＲＯＮを発現、過剰発現、または異常発現する細胞を伴う。
【０２３７】
本明細書で使用される、「腫瘍」または「腫瘍組織」という用語は、過剰な細胞分裂に起因する組織、特定の場合においては、ＲＯＮを発現、過剰発現、または異常発現する細胞を含む組織の異常な集団を指す。腫瘍または腫瘍組織は、異常な成長特性を伴い、有用な生体機能を持たない新生細胞である、「腫瘍細胞」を含む。腫瘍、腫瘍組織、および腫瘍細胞は、良性または悪性であり得る。また、腫瘍または腫瘍組織は、「腫瘍に関連する非腫瘍細胞」、例えば、腫瘍または腫瘍組織に供給するための血管を形成する、血管細胞を含むことができる。非腫瘍細胞は、例えば、腫瘍または腫瘍組織における血管新生の誘発のように、腫瘍細胞によって複製または発生を誘発され得る。
【０２３８】
本明細書で使用される、「悪性腫瘍」という用語は、非良性腫瘍または癌を指す。本明細書で使用される、「癌」という用語は、無秩序な、または制御されない細胞成長によって特徴付けられる悪性腫瘍を含む、過剰増殖性疾病の種類を含意する。癌の例には、細胞腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病もしくはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。かかる癌のより特定の例は、以下に記され、有棘細胞癌（例えば扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、および肺の有棘細胞腫を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）もしくは胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、へパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎癌もしくは腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が挙げられる。「癌」という用語には、原発性悪性細胞または腫瘍（例えば、細胞が、対象体内の、元の悪性腫瘍または腫瘍の部位以外の部位に遊走していないもの）、ならびに続発性悪性細胞または腫瘍（例えば、転移、即ち悪性細胞または腫瘍細胞の、元の腫瘍の部位とは異なる二次的な部位への遊走から生じるもの）が含まれる。本発明の処置方法につながる癌は、ＲＯＮを発現、過剰発現、または異常発現する細胞を伴う。
【０２３９】
癌または悪性腫瘍の他の例には、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキン病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部組織肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂尿管癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視経路グリオーマ、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視経路および視床下部グリオーマ、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、内分泌性膵島細胞腫、子宮内膜癌、上衣腫、上皮性癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、外分泌性膵臓癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、胃腸腫瘍、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼球内黒色腫、膵島細胞種、膵島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎癌、喉頭癌、口唇癌および口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ球増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性不明原発扁平上皮頸部癌、転移性原発扁平上皮頸部癌、転移性扁平上皮頸部癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄性白血病、骨髄増殖性疾患、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、転移性不明原発扁平上皮頸部癌、中咽頭癌、骨／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、異常蛋白血症、紫斑病、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂尿管癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞性リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂尿管移行上皮癌、移行腎盂尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管および腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視経路および視床下部グリオーマ、外陰部癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに、新形成以外の、上に列記した器官系に位置する任意の他の過剰増殖性疾病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４０】
本発明の方法を使用して、前悪性状態を処置し、上記の疾患を含むが、これらに限定されない、新生物または悪性の状態への進行を阻止することができる。かかる使用は、新形成もしくは癌への進行に先行すると知られるか、またはそれが疑われる状態、特に、過形成、化生、もしくは中でもとりわけ異形成からなる非新生細胞成長が生じた場合、望ましい（かかる異常成長状態の概説としては、Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ａｎｇｅｌｌ，Ｂａｓｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ．６８−７９（１９７６）を参照されたい）。細胞がＲＯＮを発現、過剰発現、または異常発現し始めるかかる状態は、本発明の方法によって特に処置可能である。
【０２４１】
過形成は、構造または機能を著しく変化させることなく、組織または器官中の細胞数の増加を伴う、制御された細胞増殖の形態である。本発明の方法によって処置され得る過形成疾患には、血管濾胞性縦隔リンパ節過形成、好酸球増多を伴う血管リンパ組織過形成、異型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、良性巨大リンパ節過形成、セメント質過形成、先天性副腎過形成、先天性皮脂腺過形成、嚢胞性過形成、乳房嚢胞性過形成、義歯性過形成、乳管過形成、子宮内膜過形成、線維筋性過形成、局所性上皮過形成、歯肉過形成、炎症性線維性過形成、炎症性乳頭過形成、血管内乳頭内皮過形成、前立腺結節性過形成、結節性再生性過形成、偽上皮腫性過形成、老年性皮脂腺過形成、および疣贅性過形成が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４２】
化生は、ある種の成熟または完全に分化した細胞が、別の種類の成熟細胞と置き換わる、制御された細胞成長の形態である。本発明の方法によって処置され得る化生疾患には、原因不明性骨髄様化生、アポクリン化生、異型化生、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸上皮化生、化生性貧血、化生性骨形成、化生性ポリープ、骨髄様化生、原発性骨髄様化生、続発性骨髄様化生、扁平上皮化生、羊膜の扁平上皮化生、および症候性骨髄様化生が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４３】
異形成は、高い頻度で癌の前兆であり、主として上皮に認められる、個々の細胞の均一性、および細胞の構造上の方向性の喪失を伴う、非新生細胞成長の最も無秩序な形態である。異形成細胞は、しばしば異常に大きな濃染する核を有し、多形性を呈する。異形成は、慢性的な刺激または炎症が存在する箇所に特徴的に発生する。本発明の方法によって処置され得る異形成疾患には、無汗性外胚葉異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成、気管支肺異形成、大脳異形成、子宮頸部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋骨手根骨足根骨形成不全（ｃｒａｎｉｏｃａｒｐｏｔａｒｓａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、骨端半肢性異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ  ｈｅｍｉｍｅｌｉａ）、多発性骨端異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）、点状骨端異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ  ｐｕｎｃｔａｔａ）、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成（ｆａｃｉｏｄｉｇｉｔｏｇｅｎｉｔａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、家族性線維性顎異形成（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ  ｏｆ  ｊａｗｓ）、家族性白色襞性異形成（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｗｈｉｔｅ  ｆｏｌｄｅｄ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、線維筋性異形成、線維性骨異形成、開花性骨性異形成（ｆｌｏｒｉｄ  ｏｓｓｅｏｕｓ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、遺伝性腎網膜異形成（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｒｅｎａｌ−ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、発汗性外胚葉異形成、発汗低下性外胚葉異形成、リンパ性減少性胸腺異形成（ｌｙｍｐｈｏｐｅｎｉｃ  ｔｈｙｍｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ異形成（Ｍｏｎｄｉｎｉ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成（ｍｕｃｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成（ｏｃｕｌｏａｕｒｉｃｕｌｏｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼歯指異形成、眼脊椎異形成（ｏｃｕｌｏｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、歯牙異形成（ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、眼下顎四肢形成不全、根尖性セメント質異形成（ｐｅｒｉａｐｉｃａｌ  ｃｅｍｅｎｔａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、多骨性線維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成（ｐｓｅｕｄｏａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｔｉｃ  ｓｐｏｎｄｙｌｏｅｐｉｐｈｙｓｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、網膜異形成、中隔視神経異形成、脊椎骨端異形成、および心室橈骨異形成（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｒａｄｉａｌ  ｄｙｓｐｌａｓｉａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２４４】
本発明の方法によって処置され得るさらなる前腫瘍性疾患には、良性の非増殖性疾患（例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性病態、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、および食道異形成）、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、および日光角化症が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４５】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、癌、特に上に列記したものの成長、進行、および／または転移を阻害するために使用される。
【０２４６】
さらなる過剰増殖性疾病、疾患、および／または病態には、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、および赤白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）を含む）、真性多血症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、有棘細胞腫、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭部癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌腫、へパトーマ、胆管癌腫、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮性癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、神経芽腫、および網膜芽腫等の肉腫および細胞腫が含まれるが、これらに限定されない、固形腫瘍等の悪性腫瘍および関連疾患の進行および／または転移が含まれるが、これらに限定されない。
ＩＩ．ＲＯＮ
【０２４７】
天然に存在する成熟ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ  ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ  ｎａｎｔａｉｓ）は、小さなアルファ鎖と、膜貫通ドメインおよびキナーゼドメインを含むより大きなベータ鎖とからなる、ヘテロ二量体である。この成熟型のＲＯＮは、単鎖前駆体である、プロＲＯＮの切断によって形成される。切断後、アルファ鎖およびベータ鎖は、ジスルフィド連結を介して会合し続ける。
【０２４８】
以下のポリペプチド配列がヒトＲＯＮ配列として報告され、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号ＮＰ００２４３８を有する。
【０２４９】
ヒトＲＯＮ（配列番号１）：
【化１】
2011509687.tif 000004
【０２５０】
マウスＲＯＮポリペプチドは、以下の配列を有すると報告され、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号ＮＰ０３３１００を有する（配列番号２）：
【化２】
2011509687.tif 000005
【０２５１】
本明細書で使用されるＲＯＮポリペプチドドメインの指定を以下に定義する。
【表２】
2011509687.tif 000006
【０２５２】
当業者には理解されるように、列記したドメインの開始および終了残基は、ドメインを決定するために使用されるコンピュータモデリングプログラム、またはそのために使用される方法に依存して、異なり得る。
【０２５３】
また、ヒトＲＯＮ配列の変異体である、ＲＯＮｄｅｌｔａ１６０も同定されている。ＲＯＮｄｅｌｔａ１６０（ｐ１６０）は、以下のアミノ酸配列を有する（配列番号１１３）：
【化３】
2011509687.tif 000007
【０２５４】
また、本発明は、非ヒトＲＯＮタンパク質、例えば、齧歯動物またはヒト以外の霊長動物からのＲＯＮに、特異的、優先的、または競合的に結合する、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を対象とする。
【０２５５】
ＲＯＮは、乳癌（Ｃａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．７２：２７３−２８１（２００５））、結腸直腸癌、肺癌、卵巣癌、肝細胞癌、頭頸部扁平上皮癌、甲状腺癌（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２／３：４０２−４１１（２００７））、皮膚癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌（Ｏ’Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６：９１６２−９７１０（２００６））、肝臓癌、および腎癌を含むが、これらの特定のものに限定されない、多数の腫瘍細胞において発現する。
ＩＩＩ．ＲＯＮ抗体
【０２５６】
一実施形態において、本発明は、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を対象とする。例えば、本発明は、少なくとも、表３および４に示す特定のモノクローナル抗体の抗原結合ドメイン、ならびにそのフラグメント、変異体、および誘導体を含む。表３に、ファージディスプレイライブラリーから同定されたヒト抗ＲＯＮ  Ｆａｂ領域を列記する。表４に、ハイブリドーマに由来するマウス抗ＲＯＮ抗体を列記する。
【表３】
2011509687.tif 000008
【表４】
2011509687.tif 000009
【０２５７】
２００７年１２月４日、１．Ｐ２Ｅ７．３、１Ｐ３Ｂ２．２、１．Ｐ４Ａ３．３、１．Ｐ４Ａ１２．２、および１．Ｐ５Ｂ１０．３．１０のハイブリドーマが、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託され、それぞれ、ＰＴＡ−８８１６、ＰＴＡ−８８１３、ＰＴＡ−８８１４、ＰＴＡ−８８１５、およびＰＴＡ−８８１７のＡＴＣＣ特許寄託指定が与えられた。寄託したハイブリドーマ１．Ｐ２Ｅ７．３は、本明細書に記載されるモノクローナル抗体１Ｐ２Ｅ７を産生する。寄託したハイブリドーマ１Ｐ３Ｂ２．２は、本明細書に記載されるモノクローナル抗体１Ｐ４Ａ３を産生する。寄託したハイブリドーマ１．Ｐ４Ａ３．３は、本明細書に記載されるモノクローナル抗体１Ｐ３Ｂ２を産生する。寄託したハイブリドーマ１．Ｐ４Ａ１２．２は、本明細書に記載されるモノクローナル抗体１Ｐ４Ａ１２を産生する。寄託したハイブリドーマｌ．Ｐ５Ｂ１０．３．１０は、本明細書に記載されるモノクローナル抗体１Ｐ５Ｂ１０を産生する。
【０２５８】
本明細書で使用される、「抗原結合ドメイン」という用語には、抗原上のエピトープ（例えば、ＲＯＮのエピトープ）に特異的に結合する部位が含まれる。抗体の抗原結合ドメインは、典型的には、免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも一部分、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも一部分を含む。これらの可変領域によって形成される結合部位が、抗体の特異性が決定される。
【０２５９】
本発明は、より具体的にはＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を対象とし、該ＲＯＮ抗体は、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＲＯＮエピトープに、特異的に結合する。
【０２６０】
本発明は、ＲＯＮ抗体が、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体の、ＲＯＮへの結合を競合的に阻害する、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体をさらに対象とする。
【０２６１】
また、本発明は、ＲＯＮ抗体が、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体のものと同一の抗原結合ドメインを含む、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体をも対象とする。
【０２６２】
抗体を作製する方法は、当技術分野において周知であり、また本明細書に記載される。シグナル配列を伴わない全長ＲＯＮに対する、またはその種々のフラグメントに対する抗体が産生された時点で、ＲＯＮのどのアミノ酸、またはエピトープが、どの抗体または抗原結合性フラグメントに結合するのかの決定を、本明細書に記載されるエピトープマッピングプロトコル、ならびに当技術分野において既知の方法（例えば、”Ｃｈａｐｔｅｒ  １１−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｖ．２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）に記載される、二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）によって、決定することができる。さらなるエピトープマッピングプロトコルを、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に見出すことができ、これらは共に、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。また、エピトープのマッピングは、市販の手段（即ちＰｒｏｔｏＰＲＯＢＥ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））によって行うことができる。
【０２６３】
さらに、次いで、ＲＯＮの拮抗物質として作用して、例えば、ＭＳＰのＲＯＮへの結合を阻害、ＰＩ３−Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化の阻害、Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナリング経路の活性化の阻害、ｓｒｃシグナリング経路の活性化の阻害、βカテニンシグナリング経路の活性化の阻害、Ｆａｋ経路の活性化の阻害、Ｅｒｋ１／２のリン酸化の阻害、Ｅｒｋ１／２の活性化の阻害、アポトーシスの誘発、アノイキスの誘発、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の活性の阻害、ＶＥＧＦの分泌の阻止、ＥＧＦＲ、ＴＧＦβ受容体、およびＭｅｔを含むが、これらに限定されない、他の受容体キナーゼの活性の阻止、細胞傷害性の一酸化窒素（ＮＯ）の分泌の誘発、ＩＬ−１２の分泌の誘発、ＭＳＰの分泌の阻止、または腫瘍細胞成長、増殖、癒着、運動性、浸潤もしくは転移の阻害を行う能力について、ＲＯＮの任意の部分に結合する、産生された抗体をスクリーニングすることができる。実施例の項で詳細に説明する方法に従って、これらおよび他の特性について、抗体をスクリーニングすることができる。本発明の抗体の他の機能は、本明細書の実施例に記載されるような他の検定を使用して、試験することができる。
【０２６４】
他の実施形態では、本発明は、ＲＯＮの少なくとも１つのエピトープに特異的または優先的に結合する抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を含み、該エピトープは、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号１１３の少なくとも約４〜５個のアミノ酸、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号１１３の少なくとも７、少なくとも９、もしくは少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。記載される配列番号１、配列番号２、または配列番号１１３の所定のエピトープのアミノ酸は、連続的または線状であってもよいが、そうある必要はない。特定の実施形態では、ＲＯＮの少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面に発現する、または例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に融合される可溶性フラグメントとしての、ＲＯＮの細胞外ドメインによって形成される非線状エピトープを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。したがって、特定の実施形態において、ＲＯＮの少なくとも１つのエピトープは、配列番号１、配列番号２、または配列番号１１３の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、約１５〜約３０、または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００個の連続的もしくは非連続的なアミノ酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、非連続的なアミノ酸が、タンパク質の折り畳みを通じてエピトープを形成する。
【０２６５】
他の実施形態では、本発明は、ＲＯＮの少なくとも１つのエピトープに特異的または優先的に結合する抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を含み、該エピトープは、さらに、上記の配列番号１、配列番号２、または配列番号１１３の１、２、３、４、５、６個以上の連続的もしくは非連続的なアミノ酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、ＲＯＮ抗体が、修飾された標的タンパク質に対して、該タンパク質の非修飾型に対してよりも高い親和性で結合するように、タンパク質を修飾するさらなる部分、例えば、炭水化物部分を含むことができる。あるいは、ＲＯＮ抗体は、該標的タンパク質の非修飾型に全く結合しない。
【０２６６】
特定の態様において、本発明は、所定の参照モノクローナル抗体の解離定数（ＫＤ）より低いＫＤによって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を対象とする。
【０２６７】
特定の実施形態では、本発明の抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、上記のＲＯＮまたはフラグメントもしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するか（即ち、関係のない無作為のエピトープに対して結合するであろうよりも容易に、かかるエピトープに結合する）、上記のＲＯＮまたはフラグメントもしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合するか（即ち、関連する、同様な、相同的な、または類似のエピトープに対して結合するであろうよりも容易に、かかるエピトープに結合する）、上記のＲＯＮの特定のエピトープまたはフラグメントもしくは変異体に、それ自体が特異的または優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害するか、あるいは、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍ、または約１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤによって特徴付けられる親和性で、上記のＲＯＮまたはフラグメントもしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに結合する。特定の態様において、該抗体またはそのフラグメントは、マウスＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントと比較して、ヒトＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントに優先的に結合する。別の特定の態様において、該抗体またはそのフラグメントは、１つ以上のＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメント、例えば、１つ以上の哺乳動物ＲＯＮポリペプチドに、優先的に結合する。
【０２６８】
抗体結合の解離定数の文脈で使用される、「約」という用語は、抗体親和性を測定するために利用される方法に内在する、ある程度の変動を許容する。例えば、使用される計測手段の精度、測定される試料の数に基づく標準誤差、および丸め誤差のレベルに依存して、「約１０−２Ｍ」という用語は、例えば、０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを含む可能性がある。
【０２６９】
具体的な実施形態では、本発明の抗体、またはその抗原結合性フラグメント、免疫特異的フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、５×１０−２秒−１、１０２秒−１、５×１０−３秒−１、または１０−３秒−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合する。あるいは、本発明の抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１、または１０−７秒−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合する。
【０２７０】
他の実施形態では、本発明の抗体、またはその抗原結合性フラグメント、免疫特異的フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、または５×１０４Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で、ＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合する。あるいは、本発明の抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、５×１０６Ｍ−１秒−１、または１０７Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で、ＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合する。
【０２７１】
種々の実施形態において、本明細書に記載されるＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ＲＯＮ活性の拮抗物質である。特定の実施形態では、例えば、腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージに発現するＲＯＮに対する、拮抗物質ＲＯＮ抗体の結合は、ＭＳＰのＲＯＮへの結合を阻害するか、ＭＳＰが誘発するＲＯＮのシグナリングを阻害するか、ＰＩ３−Ｋ／Ａｋｔ経路、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路、ｓｒｃ経路、Ｆａｋ経路、もしくはβカテニン経路の活性化を阻害するか、ＥＲＫ１／２のリン酸化もしくは活性化を阻害するか、ＶＥＧＦの分泌を阻止するか、ＥＧＦＲ、ＴＧＦβ受容体、およびＭｅｔを含むが、これらに限定されない、他の受容体キナーゼの活性を阻止するか、細胞傷害性の一酸化窒素（ＮＯ）の分泌を誘発するか、ＩＬ−１２の分泌を誘発するか、ＭＳＰの分泌を阻止するか、または腫瘍細胞の増殖、運動性、もしくは転移を阻害するか、またはアポトーシスもしくはアノイキスを促進する。
【０２７２】
特異的に記されない限り、本明細書で使用される、抗体に関連する「そのフラグメント」とは、抗原結合性フラグメント、即ち、抗原に特異的に結合する抗体の一部分を指す。一実施形態において、ＲＯＮ抗体、例えば、本発明の抗体は、二重特異性ＲＯＮ抗体、例えば、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン欠失抗体、あるいは１つを超えるエピトープ、例えば、１つを超える抗原もしくは同一抗原上の１つを超えるエピトープに対する結合特異性を有する融合タンパク質である。一実施形態において、二重特異性ＲＯＮ抗体は、本明細書で開示される標的ポリペプチド、例えば、ＲＯＮ上の少なくとも１つのエピトープに対して特異的である、少なくとも１つの結合ドメインを有する。別の実施形態では、二重特異性ＲＯＮ抗体は、標的ポリペプチド上のエピトープに特異的である少なくとも１つの結合ドメインと、薬物または毒素に特異的である少なくとも１つの標的結合ドメインを有する。また別の実施形態では、二重特異性ＲＯＮ抗体は、本明細書で開示される標的ポリペプチド上のエピトープに特異的である少なくとも１つの結合ドメインと、プロドラッグに特異的である少なくとも１つの結合ドメインとを有する。二重特異性ＲＯＮ抗体は、本明細書で開示される標的ポリペプチドのエピトープに特異的である、２つの標的結合ドメインと、第２の標的に特異的である２つの標的結合ドメインとを有する、四価抗体であり得る。したがって、四価の二重特異性ＲＯＮ抗体は、それぞれの特異性に対して二価である。
【０２７３】
当業者には認識されるように、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、１つ以上のエフェクター機能を媒介する定常領域を含み得る。例えば、抗体の定常領域への補体のＣ１構成成分の結合は、補体系を活性化することができる。補体の活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。また、補体の活性化は炎症反応を刺激し、自己免疫性過敏症にも関与し得る。さらに、抗体は、Ｆｃ領域を介して種々の細胞上の受容体に結合し、抗体のＦｃ領域上のＦｃ受容体結合部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（エプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）、およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含む、抗体の異なるクラスに特異的である、多数のＦｃ受容体が存在する。細胞表面のＦｃ受容体への抗体の結合は、抗体被覆粒子の貪食および破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞の溶解（抗体依存性細胞傷害、またはＡＤＣＣと称される）、炎症メディエーターの放出、胎盤通過、および免疫グロブリン産生の制御を含む、多数の重要かつ多様な生物学的応答を誘発する。
【０２７４】
したがって、本発明の特定の実施形態は、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を含み、定常領域ドメインのうちの１つ以上の少なくともごく一部が、エフェクター機能の低下、非共有的に二量体化する能力、腫瘍の部位に局在する能力の向上、血清半減期の短縮、もしくは全体と比較した時の血清半減期の延長、ほぼ同一の免疫原性の非改質抗体等の、所望の生化学的特性を提供するように、欠失もしくは別様に改質されている。例えば、本明細書に記載される診断方法および処置方法において使用する特定の抗体は、免疫グロブリン重鎖と類似したポリペブチド鎖を含むが、１つ以上の重鎖ドメインの少なくとも一部分を欠く、ドメイン欠失抗体である。例えば、特定の抗体では、修飾された抗体の定常領域の１つのドメイン全体が欠失され、例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部が欠失される。例えば、Ｆｃ領域を改質されたＲＯＮ抗体は、癌または炎症に関与するマクロファージを枯渇させ得る。他の実施形態では、本明細書に記載される診断方法および処置方法において使用する特定の抗体は、定常領域、例えば、ＩｇＧ４重鎖定常領域を有し、これは、グリコシル化を排除するように改質され、本明細書の別の箇所で「アグリ（ａｇｌｙ）」抗体と称される。理論に束縛されないが、「アグリ」抗体は、改善された生体内安全および安定性プロファイルを有し得ると考えられる。所望のエフェクター機能を有するアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体を産生する方法は、例えばＷＯ第２００５０１８５７２号に見出され、これは、参照することによりその全体が組み込まれる。
【０２７５】
本明細書に記載される特定のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体では、当技術分野において既知の技法を使用して、エフェクター機能を低下させるように、Ｆｃ部分を突然変異させることができる。例えば、定常領域ドメインの欠失または不活性化（点突然変異もしくは他の手段を通じて）は、循環する修飾された抗体のＦｃ受容体結合を減少させ、それによって腫瘍の局在化を高めることができる。他の場合には、本発明に従う定常領域の修飾が補体結合を抑え、これによって血清半減期、および共役された細胞毒素の非特異的会合を減少する可能性がある。定常領域のさらに他の修飾を使用して、抗原特異性または抗体の柔軟性の増加によって、局在化を高めることを可能にする、ジスルフィド連結またはオリゴ糖部分を修飾することができる。腫瘍の局在化、体内分布、および血清半減期等の、得られた生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティ、および修飾の他の生化学的効果は、過度の実験を伴わずに、周知の免疫学的技法を使用して、容易に測定および定量化することができる。
【０２７６】
本発明のＲＯＮ抗体の修飾型、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、当技術分野において既知の技法を使用して、前駆体または親抗体全体から作製することができる。典型的な技法を本明細書でより詳細に説明する。
【０２７７】
特定の実施形態において、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体の可変および定常の両方の領域は、完全にヒトである。完全ヒト抗体は、当技術分野において既知であり、本明細書に記載される技法を使用して、作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原投与に応答して、かかる抗体を産生するように修飾されたが、その内在的な遺伝子座が無能化された、遺伝子導入動物に抗原を投与することによって、調製することができる。かかる抗体を作製するために使用することができる典型的な技法は、米国特許第６，１５０，５８４号、第６，４５８，５９２号、第６，４２０，１４０号に記載される。他の技法が、当技術分野において既知である。同様に、種々のディスプレイ技術、例えば、ファージディスプレイ、または本明細書の別の箇所でより詳細に記載される、他のウイルスディスプレイシステムによって、完全ヒト抗体を産生することができる。
【０２７８】
本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、当技術分野において既知である技法を使用して、作製または製造することができる。特定の実施形態では、抗体分子またはそのフラグメントは、「組換えにより産生される」、即ち、組換えＤＮＡ技術を使用して産生される。抗体分子またはそのフラグメントを作製するための典型的な技法を、本明細書の別の箇所でより詳細に説明する。
【０２７９】
また、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体には、例えば、共有結合が、抗体のその同族エピトープへの特異的結合を阻止しないような、任意の種類の分子の該抗体への共有結合によって修飾される、誘導体が含まれる。例えば、制限する目的ではないが、該抗体の誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／封鎖基による誘導体化、タンパク質切断、細胞性リガンドもしくは他のタンパク質への連結等によって修飾された、抗体が含まれる。特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含むが、これらに限定されない既知の技法によって、多数の化学修飾のうちのいずれを行ってもよい。加えて、該誘導体は、１個以上の非古典的アミノ酸を含有することができる。
【０２８０】
特定の実施形態では、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、処置を受ける動物、例えば、ヒトにおいて、有害な免疫応答を引き出さない。一実施形態において、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、当技術分野において認識される技法を使用して、それらの免疫原性を低下するように修飾される。例えば、抗体は、ヒト化、霊長類化、脱免疫化、またはキメラ抗体を作製することができる。これらの種類の抗体は、親抗体の抗原結合性を保持または実質的に保持するが、ヒトにおいて免疫原性が低い、非ヒト抗体、典型的にはマウスまたは霊長類抗体に由来する。これは、（ａ）非ヒト可変ドメイン全体をヒト定常領域上に移植して、キメラ抗体を生成するか、（ｂ）決定的なフレームワーク残基を保持しながら、もしくは保持せずに、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの１つ以上の少なくとも一部を、ヒトフレームワークおよび定常領域に移植するか、または（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってそれらをヒト様切片で「覆う」ことを含む、種々の方法によって達成することができる。かかる方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２５：４８９−４９８（１９９１）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．５７：１６９−２１７（１９９４）、ならびに米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１９０，３７０号で開示され、これらの全ては、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８１】
また、抗体の免疫原性を低下させるために、脱免疫化を使用することができる。本明細書で使用される、「脱免疫化」という用語には、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の改質が含まれる（例えば、ＷＯ第９８５２９７６Ａ１号、ＷＯ第００３４３１７Ａ２号を参照）。例えば、開始抗体からのＶＨおよびＶＬ配列、ならびに該配列内の相補性決定領域（ＣＤＲ）および他の主要な残基に対するエピトープの位置を示す、ヒトＴ細胞エピトープ「マップ」を分析する。最終抗体の活性を変えるリスクの低い代替アミノ酸置換を同定するために、Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープを分析する。種々の代替ＶＨおよびＶＬ配列が、アミノ酸置換の組み合わせを含むように設計され、これらの配列は、その後、一連の結合ポリペプチド、例えば、本明細書で開示される診断方法および処置方法において使用するための、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントに組み込まれ、そして、機能について試験される。典型的には、１２〜２４個の変異体抗体が生成され、試験される。次いで、修飾されたＶおよびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子を、発現ベクターにクローン化し、その後のプラスミドを全抗体の産生のために細胞株に導入する。次いで、適切な生化学および生物学的検定で抗体を比較し、最適な変異体が同定される。
【０２８２】
本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、当技術分野において既知の任意の好適な方法によって生成することができる。対象の抗原に対するポリクローナル抗体は、当技術分野において周知の種々の手技によって、産生することができる。例えば、ＲＯＮ抗体、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ハムスター、ヤギ、ロバ等を含むが、これらに限定されない、種々の宿主動物に投与して、抗原に特異的である血清を含有するポリクローナル抗体の産生を誘発することができる。種々のアジュバントを、宿主種に依存して、免疫学的応答を高めるために使用することができ、これらには、フロイント（完全および完全）、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（ウシ型弱毒結核菌ワクチン）およびコリネバクテリウム・パルバム等の可能性として有用なヒトアジュバント等が含まれるが、これらに限定されない。また、かかるアジュバントは、当技術分野において周知である。
【０２８３】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野において既知の多岐にわたる技法を使用して、調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において既知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ＣｅＩｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）（該参照文献は、参照することによりその全体が組み込まれる）で教示されるものを含む、ハイブリドーマ技法を使用して、産生することができる。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通して産生された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核性、原核性、またはファージクローンを含む、単一クローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法にはよらない。したがって、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通して産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、エピトープ認識領域を増加させるように、ＲＯＮノックアウトマウスを使用して調製することができる。モノクローナル抗体は、本明細書の別の箇所に記載される、ハイブリドーマの使用ならびに組換えおよびファージディスプレイ技術を含む、当技術分野において既知の多岐にわたる技法を使用して、調製することができる。
【０２８４】
当技術分野において認識されるプロトコルを使用して、一例では、抗体は、該当する抗原（例えば、精製されたＲＯＮ、またはＲＯＮを含む細胞もしくは細胞抽出物）およびアジュバントの、頻回皮下または腹腔内注射によって、哺乳動物中で産生される。この免疫化が、典型的には、活性化された脾細胞またはリンパ球からの抗原に反応する抗体の産生を含む、免疫応答を引き出す。ポリクローナル調製物を提供するために、得られた抗体を動物の血清から収集するが、しばしば、脾臓、リンパ節、または末梢血から個々のリンパ球を単離して、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均質な調製物を提供することが望ましい。好ましくは、リンパ球は、脾臓から得られる。
【０２８５】
この周知の過程（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））では、抗原を注射された哺乳動物からの比較的短命、または致死性のリンパ球を、不死の腫瘍細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）と融合し、これにより、不死性であり、かつＢ細胞の遺伝子的にコード化された抗体を産生することができる、ハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」を産生する。得られたハイブリッドは、選択、希釈、および単一の抗体を形成するための特定の遺伝子を含む、それぞれの個々の株で再成長させることによって、単一の遺伝子株に分離される。それらは、所望の抗原に対して均質である抗体を産生し、それらの純粋な遺伝起源（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐａｒｅｎｔａｇｅ）に基づいて、「モノクローナル」と称される。
【０２８６】
こうして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合されない、親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する、好適な培養基に播種され、生育される。当業者は、ハイブリドーマを形成、選択、および成長させるための試薬、細胞株、および培地は、多数の供給源から市販されており、標準的なプロトコルが十分に確率されていることを理解するであろう。概して、ハイブリドーマ細胞を成長させる培養基は、所望の抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定される。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）等の生体外検定によって、決定される。所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の同定後、限界希釈法によってクローンをサブクローン化し、標準的な方法によって成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ  ５９−１０３（１９８６））。サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動法、透析法、または親和性クロマトグラフィ等の従来の精製法によって、培養基、腹水、または血清から分離し得ることが、さらに理解されよう。
【０２８７】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、既知の技法によって生成することができる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、パパイン（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生するため）等の酵素を使用して、組み換えにより、または免疫グロブリン分子のタンパク質切断によって、産生することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
【０２８８】
また、当業者には、抗体または抗体フラグメント（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡが、ファージディスプレイライブラリー等の抗体ライブラリーにも由来し得ることが理解されよう。特に、かかるファージを利用して、レパートリーまたは組み合わせ抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現した抗原結合ドメインを、提示することができる。対象の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原、例えば、標識された抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して、選択または同定することができる。これらの方法で使用されるファージは、典型的には、Ｆａｂ、Ｆｖ  ＯＥ  ＤＡＢ（軽鎖または重鎖からの個々のＦｖ領域）、またはファージ遺伝子ＩＩもしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えにより融合された、ジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するファージから発現された、ｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含む、繊維状ファージである。典型的な方法は、例えば、欧州特許第ＥＰ３６８  ６８４  Ｂ１号、米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２７：３７１（２０００）、Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：８０１（２００２）、Ｈｕｉｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ９５：２６８２（２００１）、Ｌｕｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．５／５：１０６３（２００２）に記載され、これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる。幾つかの刊行物（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７０：７７９−７８３（１９９２））が、鎖シャフリングによる高親和性ヒト抗体の産生、ならびに大きなファージライブラリーを構築するための戦略として、組み合わせ感染および生体内組換えについて記載している。別の実施形態では、リボソームディスプレイを使用して、ディスプレイプラットホームとしてバクテリオファージを置換することができる（例えば、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７５：１２８７（２０００）、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ９８：３７５０（２００１）、またはＩｒｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：３１（２００１）を参照されたい）。また別の実施形態では、細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングすることができる（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ９７：１０７０１（２０００）、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４３：２１１（２０００））。かかる手技は、モノクローナル抗体の単離およびその後のクローン化のための、従来のハイブリドーマ技法に対する代替法を提供する。
【０２８９】
ファージディスプレイ法では、ファージ粒子の表面に機能的抗体ドメインが提示され、これらは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有する。例えば、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列が増幅されるか、または別様に、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ組織のヒトもしくはマウスｃＤＮＡライブラリー）、または合成ｃＤＮＡライブラリーから単離される。特定の実施形態では、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡが、ＰＣＲによって、ｓｃＦｖリンカーにより共に接合され、ファージミドベクター（例えば、ｐ  ＣＡＮＴＡＢ  ６またはｐＣｏｍｂ  ３  ＨＳＳ）にクローン化される。該ベクターを大腸菌に電気穿孔し、大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で使用されるファージは、典型的にはｆｄおよびＭ１３を含む繊維状ファージであり、ＶＨまたはＶＬ領域は、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに、組換え融合される。対象の抗原（即ち、ＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメント）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは補足される抗原を使用して、選択または同定することができる。
【０２９０】
該抗体を作製するために使用することができる、ファージディスプレイ法のさらなる例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０（１９９５）、Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６（１９９５）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）、Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ７５７：９−１８（１９９７）、Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５７：１９１−２８０（１９９４）、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号、ＰＣＴ公開ＷＯ第９０／０２８０９号、ＷＯ第９１／１０７３７号、ＷＯ第９２／０１０４７号、ＷＯ第９２／１８６１９号、ＷＯ第９３／１１２３６号、ＷＯ第９５／１５９８２号、ＷＯ第９５／２０４０１号、ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号、および第５，９６９，１０８号で開示されるものが挙げられ、これらはそれぞれ、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９１】
上記参照文献に記載されるように、ファージの選択後、ファージからの抗体コード化領域を、ヒト抗体、または任意の他の所望の抗原結合性フラグメントを含む全抗体を生成するために単離して使用し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主中で発現させることができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第９２／２２３２４号、Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−８６９（１９９２）、およびＳａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ，ＡＪＲＩ  ３４：２６−３４（１９９５）、ならびにＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（前記参照文献は、参照することによりその全体が組み込まれる）で開示されるもの等の、当技術分野において既知の方法を使用する、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換えによって産生する技法も用いることができる。
【０２９２】
単鎖Ｆｖおよび抗体を産生するために使用することができる技法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）、Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）、ならびにＳｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されるものが挙げられる。ヒト内での抗体の生体内使用、および生体外検出検定を含む一部の使用については、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体等の、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を産生する方法は、当技術分野において既知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）、Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）、Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２（１９８９）、米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第４，８１６３９７号を参照されたく、これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライスすることによる、「キメラ抗体」を産生するために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５））を使用することができる。本明細書で使用される、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域とを有するもの等の、異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えば、ヒト化抗体である。
【０２９３】
ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域とを有する、所望の抗原に結合する非ヒト種抗体からの抗体分子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を変更、好ましくは改善するために、ＣＤＲ供与体抗体からの対応する残基と置換される。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において周知の方法、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、および特定の位置での普通でないフレームワーク残基を同定するための配列比較によって、同定される。（例えば、Ｑｕｅｅｎらの米国特許第５，５８５，０８９号、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）を参照されたく、これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。抗体は、例えば、ＣＤＲ移植（欧州特許第ＥＰ２３９，４００号、ＰＣＴ公開ＷＯ第９１／０９９６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、および第５，５８５，０８９号）、ベニアリングもしくは再表面化（欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号、欧州特許第ＥＰ５１９，５９６号、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）、Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４））、ならびに鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む、当技術分野において既知の種々の技法を使用して、ヒト化することができる。
【０２９４】
ヒト患者の治療的処置には、完全にヒトの抗体が特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用する、上記のファージディスプレイ法を含む、当技術分野において既知の種々の方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ第９８／４６６４５号、ＷＯ第９８／５０４３３号、ＷＯ第９８／２４８９３号、ＷＯ第９８／１６６５４号、ＷＯ第９６／３４０９６号、ＷＯ第９６／３３７３５号、およびＷＯ第９１／１０７４１号も参照されたく、これらのそれぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９５】
また、ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができる、遺伝子導入マウスを使用して産生することもできる。例えば、ヒトの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、マウスの胚性幹細胞に無作為または相同的組換えによって、導入することができる。代替として、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を、マウスの胚性幹細胞に導入してもよい。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同的組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別個にまたは同時に、非機能的にすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失が、内因性抗体の産生を阻止する。修飾された胚性幹細胞を拡大し、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを産生する。次いで、キメラマウスを、ヒト抗体を発現するホモ接合の子孫を産生するために飼育する。遺伝子導入マウスは、選択した抗原、例えば、所望の標的ポリペプチドの全てまたは一部分を用いて、通常の様式で免疫化する。該抗原を対象とするモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫化された、遺伝子導入マウスから得ることができる。遺伝子導入マウスによって宿されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子が、Ｂ細胞分化の間に再編成し、その後クラス転換および体細胞突然変異を受ける。したがって、かかる技法を使用して、治療的に有用であるＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するための当該技術の概説には、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するための当該技術、ならびにかかる抗体を産生するためのプロトコルの詳細な説明には、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第９８／２４８９３号、ＷＯ第９６／３４０９６号、ＷＯ第９６／３３７３５号、米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、および第５，９３９，５９８号を参照されたく、これらは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）等の企業が、上記のものと類似した技術を使用して、選択した抗原を対象とするヒト抗体の提供に携わっている可能性がある。
【０２９６】
選択したエピトープを認識する完全にヒトの抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と称される技法を使用して生成することができる。この手法では、選択した非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して、同一エピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択が誘導される。（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８９９−９０３（１９８８）。米国特許第５，５６５，３３２号も参照されたい）。
【０２９７】
さらに、本発明の標的ポリペプチドに対する抗体を利用して、今度は、当業者に周知の技法を使用して、標的ポリペプチドを模倣する抗イディオタイプ抗体を生成することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  ＆  Ｂｏｎａ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７−４４４（１９８９）、およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照されたい）。例えば、ポリペプチドに結合し、その多量体化および／または本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に阻害する抗体を使用して、ポリペプチドの多量体化および／または結合ドメインを模倣し、その結果、ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合して中和する、抗イディオタイプを生成することができる。かかる中和する抗イディオタイプまたはかかる抗イディオタイプのＦａｂフラグメントは、ポリペプチドリガンドを中和する治療レジメンにおいて使用することができる。例えば、かかる抗イディオタイプ抗体を使用して、所望の標的ポリペプチドを結合、および／またはそのリガンド／受容体を結合し、それによって、その生物学的活性を遮断することができる。
【０２９８】
別の実施形態では、所望のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手技を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができる、オリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離および配列決定することができる。単離されてサブクローン化されたハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい起源として機能する。単離されると、該ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いで、限定されないが、別様には免疫グロブリンを産生しない、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞等の原核または真核宿主細胞に形質移入される。より具体的には、単離されたＤＮＡ（本明細書に記載されるように合成であってもよい）を使用して、１９９５年１月２５日出願の、Ｎｅｗｍａｎらによる米国特許第５，６５８，５７０号に記載されるような、製品抗体のための定常および可変領域配列をクローン化することができ、該特許は、参照することにより本明細書に組み込まれる。本質的に、これには、選択した細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの転換、およびＩｇ特異的プライマーを使用するＰＣＲによる増幅を伴う。この目的のための好適なプライマーも、米国特許第５，６５８，５７０号に記載される。以下でより詳細に説明するように、所望の抗体を発現する形質転換細胞を比較的大量に成長させて、免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を提供することができる。
【０２９９】
一実施形態において、本発明のＲＯＮ抗体は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明のＲＯＮ抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明のＲＯＮ抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明のＲＯＮ抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明のＲＯＮ抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。別の実施形態では、本発明のＲＯＮ抗体は、１つ以上の抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。対象ＲＯＮ抗体に含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む典型的な抗体分子を、本明細書に記載する。
【０３００】
具体的な実施形態では、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を調べて、当技術分野において周知である方法、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の既知のアミノ酸配列を比較して、配列の超可変性の領域を決定することにより、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定することができる。日常的な組換えＤＮＡ技法を用いて、フレームワーク領域内、例えば、ヒトフレームワーク領域内にＣＤＲのうちの１つ以上を挿入して、非ヒト抗体をヒト化することができる。フレームワーク領域は、天然に存在するもの、またはコンセンサスフレームワーク領域、好ましくはヒトフレームワーク領域であり得る（ヒトフレームワーク領域の一覧については、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）を参照されたい）。好ましくは、フレームワーク領域とＣＤＲとの組み合わせによって生成されたポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド、例えば、ＲＯＮの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換をフレームワーク領域内で行うことができ、好ましくは、該アミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、かかる方法を使用して、鎖内ジスルフィド結合に関与して、１つ以上の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成する、１つ以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行うことができる。ポリヌクレオチドへの他の改質が本発明に包含され、当技術分野の技能内である。
【０３０１】
代替として、単鎖抗体の産生について記載された技法（米国特許第４，６９４，７７８号、Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４４２（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、およびＷａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５５４（１９８９））を用いて、単鎖抗体を産生してもよい。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介した、Ｆｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントの連結によって形成され、単鎖抗体をもたらす。また、大腸菌中で機能的Ｆｖフラグメントを構築するための技法も使用することができる（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
【０３０２】
本発明のまた他の実施形態は、内因性免疫グロブリンを産生することができない遺伝子導入動物（例えば、マウス）における、ヒトまたは実質的にヒトの抗体の生成を含む（例えば、米国特許第６，０７５，１８１号、第５，９３９，５９８号、第５，５９１，６６９号、および第５，５８９，３６９号を参照されたく、これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。例えば、キメラおよび生殖系突然変異マウスにおける、抗体重鎖接合領域のホモ接合型欠失は、内因性の抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖系突然変異マウスへのヒト免疫グロブリン遺伝子アレイの移入によって、抗原投与時にヒト抗体の産生がもたらされる。ＳＣＩＤマウスを使用してヒト抗体を生成する、別の好ましい手段が米国特許第５，８１１，５２４号で開示され、該特許は、参照することにより本明細書に組み込まれる。これらのヒト抗体に関連する遺伝子材料も、本明細書に記載されるように、単離および操作可能であることが理解されよう。
【０３０３】
組換え抗体を生成するための、また別の非常に効率的な手段が、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１４５５−１４６０（１９９２）によって開示されている。具体的には、この技法は、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含有する、霊長類化抗体の生成をもたらす。本参照文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、本技法は、同一出願人による米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号、および第５，７５６，０９６号でも記載され、これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０３０４】
別の実施形態では、顕微操作および単離された可変遺伝子によって、リンパ球を選択することができる。例えば、免疫化された哺乳動物から末梢血単核球を単離し、生体外で約７日間培養することができる。スクリーニング基準に合う特定のＩｇＧについて、培養物をスクリーニングすることができる。陽性のウェルからの細胞を、単離することができる。Ｉｇを産生する個々のＢ細胞は、ＦＡＣＳによって、または補体媒介溶血プラーク検定でそれらを同定することによって、単離することができる。Ｉｇを産生するＢ細胞を管へと顕微操作することができ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＶＨおよびＶＬ遺伝子を増幅することができる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子を抗体発現ベクター中にクローン化し、発現のために細胞（例えば、真核または原核細胞）に形質移入することができる。
【０３０５】
代替として、当業者に周知の技法を用いて、抗体を産生する細胞株を選択および培養してもよい。かかる技法は、種々の実験マニュアルおよび一次刊行物に記載される。この点について、以下に記載される、本発明における使用に好適な技法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載され、これは、参照することにより、捕捉を含めてその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３０６】
本発明の抗体は、抗体を合成するための、当技術分野において既知の任意の方法、特に化学合成によって、好ましくは、本明細書に記載されるような組換え発現技法によって、産生することができる。
【０３０７】
一実施形態において、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、１つ以上のドメインが部分的または完全に欠失した合成定常領域を含む（「ドメイン欠失抗体」）。特定の実施形態では、適合する修飾された抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が除去された（ΔＣＨ２コンストラクト）、ドメイン欠失コンストラクトまたは変異体を含む。他の実施形態については、短い接続ペプチドを欠失したドメインと置換して、可変領域に柔軟性および運動の自由度を提供することができる。当業者には、かかるコンストラクトが、抗体の異化率に関するＣＨ２ドメインの規則的な性質により、特に好ましいことが理解されよう。ドメイン欠失コンストラクトは、ＩｇＧ１ヒト定常ドメインをコードするベクターを使用して、誘導することができる（例えば、ＷＯ第０２／０６０９５５Ａ２号およびＷＯ第０２／０９６９４８Ａ２を参照）。このベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失し、ドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを提供するように、改変される。
【０３０８】
特定の実施形態では、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ミニボディである。ミニボディは、当技術分野において記載される方法を使用して、作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ第９４／０９８１７Ａ１号を参照）。
【０３０９】
一実施形態において、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、それが単量体サブユニット間の会合を可能にする限り、幾つかまたはさらには単一アミノ酸の欠失または置換を有する、免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択した領域での単一アミノ酸の突然変異が、実質的にＦｃ結合を弱め、それにより腫瘍局在を高めるのに十分であり得る。同様に、調節されるエフェクター機能（例えば補体結合）を制御する、１つ以上の定常領域ドメインの一部を単に欠失させることが、望ましくあり得る。かかる定常領域の部分的欠失は、対象の定常領域ドメインと関連する他の望ましい機能を無傷のまま残しながら、抗体の選択した特性（血清半減期）を改善することができる。さらに、上記で簡潔に述べたように、開示される抗体の定常領域は、結果として生じるコンストラクトのプロファイルを高める、１つ以上のアミノ酸の突然変異または置換による、合成のものであってもよい。この点に関して、修飾された抗体の構成および免疫原性プロファイルを実質的に維持しながら、保存された結合部位（例えばＦｃ結合）によって提供される活性を破壊することが可能であり得る。また他の実施形態は、エフェクター機能等の望ましい特性を高めるため、またはより多くの細胞毒素または炭水化物結合を提供するための、定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含む。かかる実施形態では、選択した定常領域ドメインに由来する特定の配列を、挿入または複製することが、望ましくあり得る。
【０３１０】
また、本発明は、本明細書に記載される抗体分子（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）の変異体（誘導体を含む）を含む、から本質的になる、またはからなる抗体を提供し、該抗体またはそのフラグメントは、ＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に免疫特異的に結合する。当業者に既知の標準的な技法を使用して、限定されないが、アミノ酸置換をもたらす部位特異的な突然変異誘発、およびＰＣＲ媒介突然変異誘発を含む、ＲＯＮ抗体をコードするヌクレオチド配列内に突然変異を導入することができる。好ましくは、該変異体（誘導体を含む）は、参照ＶＨ領域、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、ＶＨ−ＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３と比較して、５０個未満のアミノ酸置換、４０個未満のアミノ酸置換、３０個未満のアミノ酸置換、２５個未満のアミノ酸置換、２０個未満のアミノ酸置換、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換をコードする。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。類似の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。代替として、飽和突然変異誘発等によって、コード化配列の全てまたは一部に沿って、無作為に突然変異を導入することができ、生物学的活性について、得られた突然変異体をスクリーニングして、活性（例えば、ＲＯＮポリペプチドに結合する能力）を保持する突然変異体を同定することができる。
【０３１１】
例えば、フレームワーク領域のみ、または抗体分子のＣＤＲ領域のみに、突然変異を導入することが可能である。導入された突然変異は、サイレントまたは中立のミスセンス突然変異、即ち、抗体の抗原に結合する能力に全くあるいはほとんど影響を与えない可能性があり、実際に一部のかかる突然変異は、アミノ酸配列を全く変えることがない。これらの種類の突然変異は、コドン使用頻度の最適化、またはハイブリドーマの抗体産生の改善に有用であり得る。本発明のＲＯＮ抗体をコードするコドン最適化コード領域は、本明細書の別の箇所で開示されている。あるいは、非中立のミスセンス突然変異は、抗体の抗原に結合する能力を改質し得る。最もサイレントで中立のミスセンス突然変異の位置は、フレームワーク領域内である可能性が高く、一方、最も非中立のミスセンス突然変異の位置は、ＣＤＲ域内である可能性が高いが、これは絶対的な要件ではない。当業者は、抗原結合活性における改質がないか、または結合活性に改質があるか（例えば、抗原結合活性の改善または抗体特異性における変化）等の所望の特性を有する突然変異分子を設計し、試験することができよう。突然変異誘発後、コードされたタンパク質を慣例的に発現させることができ、コードされたタンパク質の機能的および／または生物学的活性（例えば、ＲＯＮポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに免疫特異的に結合する能力）は、本明細書に記載される技法を使用して、または当技術分野において既知の技法を慣例的に修正することによって、決定することができる。
ＩＶ．ＲＯＮ抗体をコードするポリヌクレオチド
【０３１２】
また、本発明は、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする核酸分子も提供する。
【０３１３】
一実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供し、該重鎖可変領域のＣＤＲのうちの少なくとも１つ、または該重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つは、本明細書で開示されるモノクローナルＲＯＮ抗体からの参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。代替として、該ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書で開示されるモノクローナルＲＯＮ抗体からの参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。したがって、本実施形態によれば、本発明の重鎖可変領域は、配列番号５、配列番号１５、配列番号２５、配列番号３５、配列番号４５、配列番号５５、配列番号６５、配列番号７５、配列番号８５、配列番号９５、配列番号１１６、配列番号１２６、配列番号１３６、および配列番号１４６；配列番号６、配列番号１６、配列番号２６、配列番号３６、配列番号４６、配列番号５６、配列番号６６、配列番号７６、配列番号８６、配列番号９６、配列番号１１７、配列番号１２７、配列番号１３７、および配列番号１４７；ならびに配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、配列番号７７、配列番号８７、配列番号９７、配列番号１１８、配列番号１２８、配列番号１３８、および配列番号１４８のポリペプチド配列と関連する、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３のポリペプチド配列を有する。
【０３１４】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、単離されたポリヌクレオチドを提供し、該軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つ、または該軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つは、本明細書で開示されるモノクローナルＲＯＮ抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。代替として、該ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書で開示されるモノクローナルＲＯＮ抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。したがって、本実施形態によれば、本発明の軽鎖可変領域は、配列番号１０、配列番号２０、配列番号３０、配列番号４０、配列番号５０、配列番号６０、配列番号７０、配列番号８０、配列番号９０、配列番号１００、配列番号１２１、配列番号１３１、配列番号１４１、および配列番号１５１；配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１、配列番号５１、配列番号６１、配列番号７１、配列番号８１、配列番号９１、配列番号１０１、配列番号１２２、配列番号１３２、配列番号１４２、および配列番号１５２；ならびに配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号８２、配列番号９２、配列番号１０２、配列番号１２３、配列番号１３３、配列番号１４３、および配列番号１５３のポリペプチド配列と関連する、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３のポリペプチド配列を有する。
【０３１５】
当技術分野において既知であるように、２つのポリペプチド間または２つのポリヌクレオチド間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアミノ酸または核酸配列を、第２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの該配列と比較することによって、決定される。本明細書で説明される場合、任意の特定のポリペプチドが、別のポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｕｎｉｘ（登録商標）用バージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１１）等を含むが、これに限定されない、当技術分野において既知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを使用して決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の最良の相同性のセグメントを見出す。特定の配列が、本発明による参照配列と例えば、９５％同一であるかどうかを決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する際、パラメータは、勿論、同一率が、参照ポリペプチド配列の全長にわたって算出され、参照配列内のアミノ酸総数の最高５％の相同性におけるギャップが許容されるように、設定する。
【０３１６】
特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。特定の実施形態では、該ＶＨポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それによってコードされるアミノ酸配列を変更せずに、変更される。例えば、ある種におけるコドン使用頻度の改善、スプライス部位の除去、または制限酵素部位を除去するように、該配列を変更することができる。これらのもの等の配列最適化は、実施例で説明され、当業者には周知であり、日常的に行われている。
【０３１７】
特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３１８】
幾つかの実施形態では、本発明は、抗体ＶＨポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、該ＶＨポリペプチドは、配列番号５、６、および７、配列番号１５、１６、および１７、配列番号２５、２６、および２７、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４５、４６、および４７、配列番号５５、５６、および５７、配列番号６５、６６、および６７、配列番号７５、７６、および７７、配列番号８５、８６、および８７、配列番号９５、９６、および９７、配列番号１１６、１１７、および１１８、配列番号１２６、１２７、および１２８、配列番号１３６、１３７、および１３８、ならびに配列番号１４６、１４７、および１４８からなる群から選択される、ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、ＶＨ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。
【０３１９】
特定の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上によってコードされるＶＨを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる抗体もしくはその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一の、ＲＯＮエピトープに特異的または優先的に結合するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体またはフラグメントがＲＯＮに結合するのを競合的に阻害する。
【０３２０】
特定の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上によってコードされるＶＨを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、抗体もしくはその抗原結合性フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに特異的または優先的に結合する。
【０３２１】
特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３２２】
幾つかの実施形態では、本発明は、抗体ＶＬポリペプチドをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、該ＶＬポリペプチドは、配列番号１０、１１、および１２、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３０、３１、および３２、配列番号４０、４１、および４２、配列番号５０、５１、および５２、配列番号６０、６１、および６２、配列番号７０、７１、および７２、配列番号８０、８１、および８２、配列番号９０、９１、および９２、配列番号１００、１０１、および１０２、配列番号１２１、１２２、および１２３、配列番号１３１、１３２、および１３３、配列番号１４１、１４２、および１４３、ならびに配列番号１５１、１５２、および１５３からなる群から選択される、ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、該ＶＬ−ＣＤＲ３を含む抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的に結合する。
【０３２３】
特定の実施形態では、上記ポリヌクレオチドのうちの１つ以上によってコードされるＶＬを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる抗体もしくはその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８Ｏ−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＲＯＮエピトープに特異的または優先的に結合するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体またはフラグメントがＲＯＮに結合するのを競合的に阻害する。
【０３２４】
特定の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上によってコードされるＶＬを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる抗体もしくはその抗原結合性フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに、特異的または優先的に結合する。
【０３２５】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１１５、１２５、１３５、および１４５からなる群から選択される参照ＶＨポリペプチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一のＶＨをコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３２６】
別の態様では、本発明は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１１５、１２５、１３５、および１４５からなる群から選択される、ポリペプチド配列を有するＶＨをコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３２７】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３、１１４、１２４、１３４、および１４４からなる群から選択される参照核酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるＶＨをコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、そのようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３２８】
別の態様では、本発明は、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリヌクレオチドを含み、該ＶＨのアミノ酸配列は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１１５、１２５、１３５、および１４５からなる群から選択される。本発明は、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリヌクレオチドをさらに含み、該核酸の配列は、配列番号３、１３、２３、３３、４３、５３、６３、７３、８３、９３、１１４、１２４、１３４、および１４４からなる群から選択される。特定の実施形態では、そのようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３２９】
特定の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上によってコードされるＶＨを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、抗体もしくはその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＲＯＮエピトープに、特異的または優先的に結合するか、そのようなモノクローナル抗体またはフラグメントがＲＯＮに結合するのを競合的に阻害するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体がＲＯＮに結合するのを競合的に阻害する。
【０３３０】
特定の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上によってコードされるＶＨを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに、特異的または優先的に結合する。
【０３３１】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１２０、１３０、１４０、および１５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する参照ＶＬポリペプチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である、ＶＬをコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１１９、１２９、１３９、および１４９からなる群から選択される参照核酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である、ＶＬをコードする核酸を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、そのようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３３２】
別の態様では、本発明は、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１２０、１３０、１４０、および１５０からなる群から選択される、ポリペプチド配列を有するＶＬをコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明は、本発明のＶＬをコードする核酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリヌクレオチドをさらに含み、該核酸の配列は、配列番号８、１８、２８、３８、４８、５８、６８、７８、８８、９８、１１９、１２９、１３９、および１４９からなる群から選択される。特定の実施形態では、そのようなポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３３３】
特定の実施形態では、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上によってコードされるＶＬを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＲＯＮエピトープに、特異的または優先的に結合するか、そのようなモノクローナル抗体またはフラグメントがＲＯＮに結合するのを、競合的に阻害する。
【０３３４】
特定の実施形態では、上記ポリヌクレオチドのうちの１つ以上によってコードされるＶＬを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに特異的または優先的に結合する。
【０３３５】
上記のポリヌクレオチドのいずれも、例えば、コードされたポリペプチドの分泌を指示するシグナルペプチド、本明細書に記載されるような抗体の定常領域、または本明細書に記載されるような他の異種ポリペプチドをコードする、追加的な核酸をさらに含むことができる。
【０３３６】
また、本明細書の別の箇所でより詳細に記載されるように、本発明は、上記のポリヌクレオチドのうちの１つ以上を含むポリヌクレオチドを含む、組成物を含む。一実施形態において、本発明は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含む、組成物を含み、該第１のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるＶＨポリペプチドをコードし、該第２のポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるＶＬポリペプチドをコードする。具体的には、組成物は、ＶＨポリヌクレオチド、およびＶＬポリヌクレオチドを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、該ＶＨポリヌクレオチドおよび該ＶＬポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号４および９、１４および１９、２４および２９、３４および３９、４４および４９、５４および５９、６４および６９、７４および７９、８４および８９、９４および９９、１１５および１２０、１２５および１３０、１３５および１４０、ならびに１４５および１５０からなる群から選択される参照ＶＨおよびＶＬポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるポリペプチドをコードする。あるいは、組成物は、配列番号３および８、１３および１８、２３および２８、３３および３８、４３および４８、５３および５８、６３および６８、７３および７８、８３および８８、９３および９８、１１４および１１９、１２４および１２９、１３４および１３９、ならびに１４４および１４９からなる群から選択される参照ＶＬおよびＶＬ核酸配列と、それぞれ、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である、ＶＨポリヌクレオチド、およびＶＬポリヌクレオチドを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。特定の実施形態では、そのような組成物内のポリヌクレオチドによってコードされるＶＨおよびＶＬを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３３７】
また、本発明は、別の箇所に記載されるように、本発明のポリヌクレオチドのフラグメントを含む。さらに、融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂフラグメント、および本明細書に記載されるような他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも、本発明によって想到される。
【０３３８】
該ポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の任意の方法によって、産生または製造することができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が分かっている場合、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７７：２４２（１９９４）に記載されるような）から、該抗体をコードするポリヌクレオチドを構築することができ、これは簡潔に述べると、該抗体をコードする配列の部分を含有するオーバーラップするオリゴヌクレオチドの合成、これらのオリゴヌクレオチドのアニールおよび連結、次いでＰＣＲによる連結したオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
【０３３９】
代替として、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、好適な源に由来する核酸から生成することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンは入手できないが、抗体分子の配列が分かっている場合は、該抗体をコードする核酸は、該配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅、または、例えば、該抗体もしくは他のＲＯＮ抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するクローン化によって、化学的に合成、または好適な源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現するように選択されるハイブリドーマ細胞等の、該抗体もしくは他のＲＯＮ抗体を発現するいずれかの組織もしくは細胞から生成されるｃＤＮＡライブラリー、または該組織もしくは細胞から単離される核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から得ることができる。ＰＣＲによって生成された、増幅された核酸は、その後、当技術分野において周知の任意の方法を用いて、複製可能なクローニングベクター中にクローン化することができる。
【０３４０】
ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体のヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列が決定されると、ヌクレオチド配列を操作するための当技術分野において周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技法、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ等（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９８）に記載される技法を参照されたく、これらは共に、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）を用いて、そのヌクレオチド配列を操作し、例えばアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を生じさせるように、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成することができる。
【０３４１】
ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドから構成され得、これらは非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。例えば、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得る、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。加えて、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む、三本鎖領域から構成され得る。また、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾された塩基、または安定性もしくは他の理由から修飾されたＤＮＡもしくはＲＮＡ骨格をも含有し得る。「修飾された」塩基には、例えば、トリチル化された塩基およびイノシン等の通常でない塩基が含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡに種々の修飾を行うことができるため、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された型を包含する。
【０３４２】
免疫グロブリン（例えば、免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分）に由来するポリペプチドの、非自然変異体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失が、コードされたタンパク質に導入されるように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することによって、生じさせることができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発等の標準的技法によって、導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の非必須アミノ酸残基で行われる。
Ｖ．ＲＯＮ抗体ポリペプチド
【０３４３】
本発明は、ＲＯＮ抗体を形成する単離されたポリペプチド、およびかかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、さらに対象とする。本発明のＲＯＮ抗体は、ポリペプチド、例えば、免疫グロブリン分子に由来するＲＯＮに特異的な抗原結合領域をコードするアミノ酸配列を含む。指定されたタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、特定のアミノ酸配列を有するポリペプチドの起源を指す。特定の場合において、特定の開始ポリペプチドまたはアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、開始配列、またはその一部分のものと本質的に同一であるアミノ酸配列を有し、該部分は、少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、少なくとも３０〜５０個のアミノ酸からなるか、あるいは当業者には、その起源を開始配列中に有することが、別様に同定可能である。
【０３４４】
一実施形態において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリペプチドを提供し、該重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つ、または該重鎖可変領域のＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つは、本明細書で開示されるモノクローナルＲＯＮ抗体からの、参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、またはＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。代替として、該ＶＨのＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、本明細書で開示されるモノクローナルＲＯＮ抗体からの、参照重鎖ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。ＶＨ−ＣＤＲは、Ｋａｂａｔのシステムによって定義することができるが、他のＣＤＲ定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａのシステムによって定義されるＶＨ−ＣＤＲも、本発明に含まれる。特定の実施形態では、該ＶＨを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３４５】
幾つかの実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリペプチドを提供し、該ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、該ＶＨ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つにおける１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸置換を除いて、配列番号５、６、および７、配列番号１５、１６、および１７、配列番号２５、２６、および２７、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４５、４６、および４７、配列番号５５、５６、および５７、配列番号６５、６６、および６７、配列番号７５、７６、および７７、配列番号８５、８６、および８７、配列番号９５、９６、および９７、配列番号１１６、１１７、および１１８、配列番号１２６、１２７、および１２８、配列番号１３６、１３７、および１３８、ならびに配列番号１４６、１４７、および１４８からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する。
【０３４６】
幾つかの実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリペプチドを提供し、該ＶＨ−ＣＤＲ１、ＶＨ−ＣＤＲ２、およびＶＨ−ＣＤＲ３領域は、配列番号５、６、および７、配列番号１５、１６、および１７、配列番号２５、２６、および２７、配列番号３５、３６、および３７、配列番号４５、４６、および４７、配列番号５５、５６、および５７、配列番号６５、６６、および６７、配列番号７５、７６、および７７、配列番号８５、８６、および８７、配列番号９５、９６、および９７、配列番号１１６、１１７、および１１８、配列番号１２６、１２７、および１２８、配列番号１３６、１３７、および１３８、ならびに配列番号１４６、１４７、および１４８からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する。
【０３４７】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１１５、１２５、１３５、および１４５からなる群から選択される参照ＶＨポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である、ＶＨポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる単離されたポリペプチドを含む。特定の実施形態では、該ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３４８】
別の態様では、本発明は、配列番号４、１４、２４、３４、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１１５、１２５、１３５、および１４５からなる群から選択されるＶＨポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリペプチドを含む。特定の実施形態では、該ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３４９】
特定の実施形態では、上記のＶＨポリペプチドのうちの１つ以上を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−ＦｌＯ、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＲＯＮエピトープに、特異的または優先的に結合するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体またはフラグメントがＲＯＮに結合するのを競合的に阻害する。
【０３５０】
特定の実施形態では、上記のＶＨポリペプチドのうちの１つ以上を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに、特異的または優先的に結合する。
【０３５１】
別の実施形態では、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリペプチドを提供し、該軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つ、または該軽鎖可変領域のＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも２つは、本明細書で開示されるモノクローナルＲＯＮ抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、またはＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。代替として、該ＶＬのＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、本明細書で開示されるモノクローナルＲＯＮ抗体からの参照軽鎖ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一である。該ＶＬ−ＣＤＲは、Ｋａｂａｔのシステムによって定義することができるが、他のＣＤＲの定義、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａのシステムによって定義されるＶＬ−ＣＤＲも、本発明に含まれる。特定の実施形態では、該ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３５２】
幾つかの実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリペプチドを提供し、該ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、該ＶＬ−ＣＤＲのうちの少なくとも１つにおける１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸置換を除いて、配列番号１０、１１、および１２、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３０、３１、および３２、配列番号４０、４１、および４２、配列番号５０、５１、および５２、配列番号６０、６１、および６２、配列番号７０、７１、および７２、配列番号８０、８１、および８２、配列番号９０、９１、および９２、配列番号１００、１０１、および１０２、配列番号１２１、１２２、および１２３、配列番号１３１、１３２、および１３３、配列番号１４１、１４２、および１４３、ならびに配列番号１５１、１５２、および１５３からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する。
【０３５３】
幾つかの実施形態では、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＬ）を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリペプチドを提供し、該ＶＬ−ＣＤＲ１、ＶＬ−ＣＤＲ２、およびＶＬ−ＣＤＲ３領域は、配列番号１０、１１、および１２、配列番号２０、２１、および２２、配列番号３０、３１、および３２、配列番号４０、４１、および４２、配列番号５０、５１、および５２、配列番号６０、６１、および６２、配列番号７０、７１、および７２、配列番号８０、８１、および８２、配列番号９０、９１、および９２、配列番号１００、１０１、および１０２、配列番号１２１、１２２、および１２３、配列番号１３１、１３２、および１３３、配列番号１４１、１４２、および１４３、ならびに配列番号１５１、１５２、および１５３からなる群から選択されるポリペプチド配列を有する。
【０３５４】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１２０、１３０、１４０、および１５０からなる群から選択される参照ＶＬポリペプチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一であるＶＬポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリペプチドを含む。特定の実施形態では、該ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３５５】
別の態様では、本発明は、配列番号９、１９、２９、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１２０、１３０、１４０、および１５０からなる群から選択されるＶＬポリペプチドを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、単離されたポリペプチドを含む。特定の実施形態では、該ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３５６】
特定の実施形態では、上記のＶＬポリペプチドのうちの１つ以上を含むか、それらから本質的になる、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一の、ＲＯＮエピトープに特異的または優先的に結合するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体またはフラグメントがＲＯＮに結合するのを、競合的に阻害する。
【０３５７】
特定の実施形態では、上記のＶＬポリペプチドのうちの１つ以上を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、ＲＯＮポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＲＯＮ変異体ポリペプチドに、特異的または優先的に結合する。
【０３５８】
他の実施形態では、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、ＶＨポリペプチド、およびＶＬポリペプチドを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、該ＶＨポリペプチドおよび該ＶＬポリペプチドは、それぞれ、配列番号４および９、１４および１９、２４および２９、３４および３９、４４および４９、５４および５９、６４および６９、７４および７９、８４および８９、９４および９９、１１５および１２０、１２５および１３０、１３５および１４０、ならびに１４５および１５０からなる群から選択される参照ＶＨおよびＶＬポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である。特定の実施形態では、これらのＶＨおよびＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合性フラグメントは、ＲＯＮに特異的または優先的に結合する。
【０３５９】
上記のポリペプチドのいずれも、例えば、コードされたポリペプチドの分泌を指示するシグナルペプチド、本明細書に記載されるような抗体の定常領域、または本明細書に記載されるような他の異種ポリペプチド等の、追加的なポリペプチドをさらに含むことができる。さらに、本発明のポリペプチドは、別の箇所に記載される、ポリペプチドフラグメントを含む。さらに、本発明のポリペプチドは、融合ポリペプチド、Ｆａｂフラグメント、および本明細書に記載されるような他の誘導体を含む。
【０３６０】
また、本明細書の別の箇所でより詳細に記載されるように、本発明は、上記のポリペプチドを含む組成物を含む。
【０３６１】
また、当業者には、本明細書で開示されるＲＯＮ抗体ポリペプチドが、それらが由来する天然に存在する結合ポリペプチドとは、アミノ酸配列が異なるように、修飾し得ることが理解されよう。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、類似していてもよく、例えば、開始配列と特定の同一率を有し、例えばそれは、開始配列と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であり得る。
【０３６２】
さらに、「非必須」アミノ酸領域での保存的置換または変化をもたらす、ヌクレオチドまたはアミノ酸置換、欠失、または挿入を行うことができる。例えば、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、１つ以上の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個以上の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失を除いて、開始配列と同一であり得る。指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、１つ以上の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個以上の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失を除いて、開始配列と同一であり得る。他の実施形態では、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下、６個以下、７個以下、８個以下、９個以下、１０個以下、１５個以下、または２０個以下の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失を除いて、開始配列と同一であり得る。特定の実施形態では、指定されたタンパク質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、開始配列と比較して、１〜５、１〜１０、１〜１５、または１〜２０個の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する。
【０３６３】
本発明の特定のＲＯＮ抗体ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。しかし、特定のＲＯＮ抗体ポリペプチドは、別の哺乳動物種に由来する、１つ以上の連続するアミノ酸を含む。例えば、本発明のＲＯＮ抗体は、霊長類の重鎖部分、ヒンジ部分、または抗原結合領域を含み得る。別の例では、１つ以上のマウス由来のアミノ酸が、非マウス抗体ポリペプチド内、例えば、ＲＯＮ抗体の抗原結合部位に、存在してもよい。別の例では、ＲＯＮ抗体の抗原結合部位は、完全にマウスである。特定の治療用途では、ＲＯＮに特異的な抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは類似体を、抗体が投与される動物内で免疫原性を有さないように、設計することができる。
【０３６４】
特定の実施形態では、ＲＯＮ抗体ポリペプチドは、抗体と通常関連しない、アミノ酸配列または１つ以上の部分を含む。典型的な修飾を、以下でより詳細に説明する。例えば、本発明の単鎖ｆｖ抗体フラグメントは、可動性リンカー配列を含んでもよく、機能的部分（例えば、ＰＥＧ、薬物、毒素、または標識）を付加するように修飾してもよい。
【０３６５】
本発明のＲＯＮ抗体ポリペプチドは、融合タンパク質を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。融合タンパク質は、例えば、少なくとも１つの標的結合部位を有する免疫グロブリンの抗原結合ドメインと、少なくとも１つの異種部分、即ち、本来天然では連結されない部分とを含む、キメラ分子である。アミノ酸配列は、融合ポリペプチド内で引き合わされる別個のタンパク質内に普通に存在し得るか、あるいは、同一タンパク質内に普通に存在し得るが、融合ポリペプチド内では新しい配置に置かれる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係にコードされるポリヌクレオチドを生成および翻訳することによって、生成することができる。
【０３６６】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに適用される「異種の」という用語は、該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、それが比較される要素の残りものとはっきりと異なる要素に由来することを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは類似体に融合される「異種ポリペプチド」は、同一種の非免疫グロブリンポリペプチド、または異なる種の免疫グロブリンもしくは非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。
【０３６７】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、免疫グロブリンポリペプチド内の非必須アミノ酸残基が、好ましくは同一側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と置換される。別の実施形態では、一連のアミノ酸を、順序および／または側鎖のファミリーメンバーの組成が異なる、構造的に類似した一連のアミノ酸と置換することができる。
【０３６８】
代替として、別の実施形態では、飽和突然変異誘発等により、免疫グロブリンのコード化配列の全てまたは一部に沿って、無作為に突然変異を導入することができ、得られた突然変異体を、本明細書で開示される診断方法および処置方法において使用するＲＯＮ抗体に組み込み、所望の抗原、例えば、ＲＯＮへのそれらの結合能について、スクリーニングすることができる。
ＶＩ．融合タンパク質および抗体共役体
【０３６９】
本明細書の別の箇所でより詳細に説明されるように、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ＮもしくはＣ末端で異種ポリペプチドにさらに組換え融合するか、またはポリペプチドまたは他の組成物に化学的に共役させることができる（共有結合共役および非共有結合共役を含む）。例えば、ＲＯＮに特異的なＲＯＮ抗体は、検出検定において標識として有用な分子、ならびに異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素等のエフェクター分子に組換え融合または共役させることができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第９２／０８４９５号、ＷＯ第９１／１４４３８号、ＷＯ第８９／１２６２４号、米国特許第５，３１４，９９５号、および欧州特許第ＥＰ３９６，３８７号を参照されたい。
【０３７０】
本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、修飾される（即ち、共有結合が、抗体のＲＯＮへの結合を阻止しないような、任意の種類の分子の該抗体への共有結合によって）誘導体を含む。例えば、制限する目的ではないが、該抗体の誘導体には、既知の保護／封鎖基、タンパク質切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質への連結等による、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、ホスフィル化（ｐｈｏｓｐｈｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、誘導体化によって修飾された、抗体を含む。多数の化学修飾のうちのいずれも、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含むが、これらに限定されない、既知の技法によって実行することができる。さらに、本誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。
【０３７１】
本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、即ち、ペプチドアイソスターによって互いに接合されるアミノ酸で構成されてもよく、２０個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有してもよい。ＲＯＮに特異的な抗体は、翻訳後プロセシング等の自然過程によって、または、当技術分野において周知である化学修飾技法によって、修飾することができる。かかる修飾は、基本的な教科書およびより詳細な研究書、ならびに膨大な研究文献で、十分説明されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシル末端、または炭水化物等の部分上を含む、ＲＯＮに特異的な抗体のいずれの箇所でも生じ得る。同一種類の修飾が、所定のＲＯＮに特異的な抗体の幾つかの部位で、同一または異なる程度で存在し得ることが理解されよう。また、所定のＲＯＮに特異的な抗体は、多くの種類の修飾を含んでもよい。ＲＯＮに特異的な抗体は、例えば、ユビキチン化の結果、分岐状であってもよく、分岐を伴うか、または伴わない、環状であってもよい。環状、分岐状、および分岐環状のＲＯＮに特異的な抗体は、翻訳後の自然過程からもたらされてもよく、あるいは合成法によって作製されてもよい。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）等のアミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介付加、ならびにユビキチン化が含まれる。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２ｎｄ  Ｅｄ．，（１９９３）、Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：６２６−６４６（１９９０）、Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｄ  ６６３：４８−６２（１９９２）を参照されたい）。
【０３７２】
また、本発明は、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体、および異種ポリペプチドを含む、融合タンパク質も提供する。該抗体が融合される異種ポリペプチドは、機能に対して有用であり得、あるいはＲＯＮポリペプチドを発現する細胞を標的とするのに有用である。一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、本発明の抗体のＶＨ領域のうちのいずれか１つ以上のアミノ酸配列、あるいは本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは変異体のＶＬ領域のうちのいずれか１つ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。別の実施形態では、本明細書で開示される診断方法および処置方法において使用する融合タンパク質は、ＲＯＮに特異的な抗体、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体のＶＨ−ＣＤＲのうちのいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列、あるいはＲＯＮに特異的な抗体、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体のＶＬ−ＣＤＲのうちのいずれか１つ、２つ、３つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一実施形態において、該融合タンパク質は、本発明のＲＯＮに特異的な抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは変異体のＶＨ−ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、融合タンパク質がＲＯＮの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、異種ポリペプチド配列とを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、本発明のＲＯＮに特異的な抗体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列、および本発明のＲＯＮに特異的な抗体またはそのフラグメント、誘導体、もしくは変異体の少なくとも１つのＶＬ領域のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含む。好ましくは、該融合タンパク質のＶＨおよびＶＬ領域は、ＲＯＮの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する、単一起源の抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂフラグメント）に対応する。また別の実施形態では、本明細書で開示される診断方法および処置方法で使用する融合タンパク質は、ＲＯＮに特異的な抗体のＶＨ  ＣＤＲのいずれか１つ、２つ、または３つ以上のアミノ酸配列、およびＲＯＮに特異的な抗体、またはそのフラグメントもしくは変異体のＶＬ  ＣＤＲのいずれか１つ、２つ、または３つ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドと、異種ポリペプチド配列とを含む。好ましくは、１つもしくは複数のＶＨ−ＣＤＲまたは１つもしくは複数のＶＬ−ＣＤＲの２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ以上が、本発明の単一起源の抗体（またはｓｃＦｖもしくはＦａｂフラグメント）に対応する。これらの融合タンパク質をコードする核酸分子も、本発明に包含される。
【０３７３】
文献に報告される典型的な融合タンパク質には、Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ  ８４：２９３６−２９４０（１９８７））、ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−５３１（１９８９）、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：６８−７０（１９８９）、Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９：３４７−３５３（１９９０）、およびＢｙｒｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：６６７−６７０（１９９０））、Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９（１９９０）、およびＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：１６４−１６７（１９９１））、ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ６１：１３０３−１３１３（１９９０））、ＣＤ２８およびＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））、ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９（１９９１））、ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ６６：１１３３−１１４４（１９９１））、ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）、Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６（１９９１）、およびＰｅｐｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１））、ならびにＩｇＥ受容体α（Ｒｉｄｇｗａｙ  ａｎｄ  Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１４４８（１９９１））の融合が挙げられる。
【０３７４】
本明細書の別の箇所で説明されるように、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、ポリペプチドの生体内半減期を延長させるため、または当技術分野において既知の方法を使用する免疫測定で使用するために、異種ポリペプチドに融合させることができる。例えば、一実施形態において、本発明のＲＯＮ抗体にＰＥＧを共役させて、その生体内半減期を延長させることができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６（２００１）、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）、またはＷｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０：５１２（２００２）。
【０３７５】
さらに、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体をペプチド等のマーカー配列に融合して、それらの精製または検出を促進することができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、数ある中でも特に、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．，９１３１１）中で提供されるタグ等の、ヘキサヒスチジンペプチドであるが、これらの多くが市販されている。Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）で説明されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。精製に有用である他のペプチドタグには、インフルエンザ血球凝集素タンパク質（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４））に由来するエピトープに対応する「ＨＡ」タグ、および「ｆｌａｇ」タグが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７６】
融合タンパク質は、当技術分野において周知である方法を使用して、調製することができる（例えば米国特許第５，１１６，９６４号および第５，２２５，５３８号を参照）。融合が行われる正確な部位を実験により選択して、融合タンパク質の分泌または結合を最適化することができる。次いで、融合タンパク質をコードするＤＮＡが、発現のために宿主細胞に形質移入される。
【０３７７】
本発明のＲＯＮ抗体は、非共役型で使用されてもよく、あるいは、種々の分子のうちの少なくとも１つに共役させて、例えば、該分子の治療的特性を改善するか、標的検出を促進するか、または患者の撮像もしくは療法を行うことができる。本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、精製が行われる場合、精製の前または後のいずれかに、標識化または共役させることができる
【０３７８】
特に、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、治療薬、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、またはＰＥＧと共役させることができる。
【０３７９】
当業者は、選択した共役される薬剤に依存して種々の技法を使用して、共役体も構築し得ることを理解するであろう。例えば、ビオチンとの共役体は、例えば、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等の、ビオチンの活性化されたエステルと結合ポリペプチドを反応させることによって、調製される。同様に、蛍光マーカーとの共役体は、カップリング剤、例えば本明細書に列記されるものの存在下で、またはイソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン−イソチオシアネートとの反応によって、調製することができる。本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体の共役体は、類似の様態で調製される。
【０３８０】
本発明は、診断薬または治療薬と共役された本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体をさらに包含する。該ＲＯＮ抗体を診断に使用して、例えば、所定の処置および／または阻止レジメンの有効性を判定するための、臨床的試験手順の一部として、例えば、神経学的疾病の発生または進行を監視することができる。検出は、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を検出可能な物質にカップリングすることによって、容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、種々の陽電子放射断層撮影法を用いる陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。本発明による診断法として使用するための抗体に共役することができる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられ、発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、好適な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９Ｔｃが挙げられる。
【０３８１】
また、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、それを化学発光化合物にカップリングすることによって、検出可能に標識することができる。次いで、化学発光タグを付けたＲＯＮ抗体の存在を、化学反応の過程において生じる発光の存在を検出することによって、判定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【０３８２】
ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を検出可能に標識することができる手段のうちの１つは、それを酵素に連結し、連結された産物を酵素免疫測定（ＥＩＡ）で使用することによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，”Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７（１９７８）、Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）、Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＩａ．，（１９８０）、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。ＲＯＮ抗体に結合される酵素は、例えば、分光光度的、蛍光定量的、または視覚的手段によって検出することができる、化学的部分を産生する様態で、適切な基質、好ましくは発色基質と反応する。該抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素には、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイド異性化酵素、酵母アルコール脱水素酵素、アルファグリセロリン酸塩、脱水素酵素、トリオースリン酸異性化酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、検出は、酵素の代わりに発色基質を用いる、比色法によって達成することができる。また、検出は、同様に調製された標準物質と比較する、基質の酵素反応の程度の目視比較によって、達成することもできる。
【０３８３】
また、検出は、種々の他の免疫測定のいずれを使用しても、達成することができる。例えば、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を放射活性で標識することにより、放射免疫測定（ＲＩＡ）の使用によって該抗体を検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，（Ｍａｒｃｈ，１９８６）を参照されたく、これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。放射性同位体は、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィを含むが、これらに限定されない手段によって、検出することができる。
【０３８４】
また、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、１５２Ｅｕ等の蛍光放射金属、またはランタニド系列の他のものを使用して、検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属キレート基を使用して、該抗体に付着させることができる。
【０３８５】
種々の部分を、ＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体に共役させるための技法は周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．６２３−５３（１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）、“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３０３−１６（１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．５２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい。
【０３８６】
特に、本明細書で開示される診断方法および処置方法で使用する結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、細胞毒素（放射性同位体、細胞傷害性薬物、または毒素等）、治療薬、細胞分裂阻害剤、生物毒素、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生体応答修飾物質、医薬品、免疫学的に活性なリガンド（例えば、結果として生じる分子が、新生細胞およびＴ細胞等のエフェクター細胞の両方に結合する、リンホカインもしくは他の抗体）、またはＰＥＧと、共役させることができる。別の実施形態では、本明細書で開示される診断方法および処置方法で使用する結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを、腫瘍の血管新生を減少させる分子と共役させることができる。他の実施形態では、開示される組成物は、薬物またはプロドラッグにカップリングされる結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを含み得る。本発明のさらに他の実施形態は、リシン、ゲロニン、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素等の特定の生体毒素、またはそれらの細胞傷害性フラグメントと共役させた結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントの使用を含む。どの共役または非共役結合分子を使用するかの選択は、癌の種類および段階、付加的な処置（例えば、化学療法または外部放射）の使用、ならびに患者の病態に依存する。当業者は、本明細書の教示を考慮して、かかる選択を容易に行い得ることが理解されよう。
【０３８７】
先の研究で、同位体で標識された抗腫瘍抗体を使用して、動物モデルにおける、および場合によってはヒトにおける固形腫瘍、ならびにリンパ腫／白血病の細胞の破壊に成功していることは、理解されよう。典型的な放射性同位体には、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、および１８８Ｒｅが挙げられる。放射性核種は、核ＤＮＡに複数の鎖切断を引き起こし、細胞死につながる、電離放射線を産生することによって、機能する。治療用共役体を産生するために使用される同位体は、典型的には、短い経路長を有する高エネルギーのαまたはβ粒子を産生する。かかる放射性核種は、近接する細胞、例えば、共役体を付着させた、または進入させた新生細胞を死滅させる。それらは、非局在化細胞にはほとんどまたは全く影響を与えない。放射性核種は、本質的には非免疫原性である。
【０３８８】
本発明と併せて放射標識された共役体を使用することに関して、結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを直接標識してもよく（ヨウ素化を通じて等）、またはキレート剤の使用を通じて間接的に標識してもよい。本明細書で使用される、「間接標識」および「間接標識法」という語句は、ともに、キレート剤が結合分子と共有結合し、少なくとも１つの放射性核種が該キレート剤と会合することを意味する。そのようなキレート剤は、典型的には、ポリペプチドおよび放射性同位体の両方を結合するため、二官能性キレート剤と称される。特に好ましいキレート剤は、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン５酢酸（「ＭＸ−ＤＴＰＡ」）およびシクロヘキシルメチルジエチレントリアミン５酢酸（「ＣＨＸ−ＤＴＰＡ」）誘導体を含む。他のキレート剤は、Ｐ−ＤＯＴＡおよびＥＤＴＡ誘導体を含む。間接標識のための特に好ましい放射性核種には、１１１Ｉｎおよび９０Ｙが含まれる。
【０３８９】
本明細書で使用される、「直接標識」および「直接標識法」という語句は、ともに、放射性核種がポリペプチドに直接共有結合される（典型的にはアミノ酸残基を介して）ことを意味する。より具体的には、これらの連結技術には、無作為標識および部位特異的標識が含まれる。後者では、標識は、共役体のＦｃ部分のみに存在するＮ結合型糖残基等の、ポリペプチド上の特定の部位を対象とする。さらに、種々の直接標識法およびプロトコルが、本発明と適合する。例えば、Ｔｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９で標識されたポリペプチドは、リガンド交換過程によって、過テクネート（ｐｅｒｔｅｃｈｎａｔｅ）（ＴｃＯ４−）をスズイオン溶液で還元し、還元したテクネチウムをＳｅｐｈａｄｅｘカラム上でキレートして、結合ポリペプチドをこのカラムに適用することによって、あるいは、例えば、過テクネート、ＳｎＣｌ２等の還元剤、フタル酸ナトリウムカリウム溶液等の緩衝液、および抗体を培養することによるバッチ標識法によって、調製することができる。いずれの場合も、抗体の直接標識に好ましい放射性核種は、当技術分野において周知であり、直接標識に特に好ましい放射性核種は、チロシン残基を介して共有結合した１３１Ｉである。本明細書で開示される診断方法および処置方法で使用する結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、例えば、放射性ヨウ化ナトリウムもしくはカリウムと、次亜塩素酸ナトリウム、クロラミンＴ等の化学酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼ、グルコース酸化酵素等の酵素酸化剤と、グルコースとを用いて、得ることができる。
【０３９０】
キレーターおよびキレーター共役体に関連する特許は、当技術分野において既知である。例えば、Ｇａｎｓｏｗの米国特許第４，８３１，１７５号は、多置換ジエチレントリアミン５酢酸キレートおよびそれを含有するタンパク質共役体、ならびにそれらの調製方法を対象としている。Ｇａｎｓｏｗの米国特許第５，０９９，０６９号、第５，２４６，６９２号、第５，２８６，８５０号、第５，４３４，２８７号、および第５，１２４，４７１号も、多置換ＤＴＰＡキレートに関する。これらの特許は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。適合する金属キレーターの他の例は、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，４，８，１１−４酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−４酢酸等である。シクロヘキシル−ＤＴＰＡまたはＣＨＸ−ＤＴＰＡが特に好ましく、以下で広範に例証する。さらに他の適合するキレーターは、これから発見されるものも含めて、当業者によって容易に識別可能であり、明らかに本発明の範囲内である。
【０３９１】
適合するキレーターは、キレート化を促進するために使用される特定の二官能性キレーターを含めて（米国特許第６，６８２，１３４号、第６，３９９，０６１号、および第５，８４３，４３９号、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、好ましくは、三価金属に対して高い親和性を提供するように選択され、腫瘍対非腫瘍比の増加および骨摂取の減少、ならびに標的部位、即ち、Ｂ細胞リンパ腫の腫瘍部位での放射性核種のより強い生体内保持を呈する。しかし、これらの特性の全てを有し得る、または有しなくともよい他の二官能性キレーターが当技術分野において既知であり、腫瘍治療において有益でもあり得る。
【０３９２】
また、本明細書の教示によって、診断および治療目的で、結合分子を異なる放射標識に共役させ得ることが理解されよう。この目的のために、前述の米国特許第６，６８２，１３４号、第６，３９９，０６１号、および第、５，８４３，４３９号は、治療用抗体の投与の前の、腫瘍の「画像」診断のための、放射標識された治療用共役体を開示している。「Ｉｎ２Ｂ８」共役体は、二官能性キレーター、即ち、１−イソチオシアネートベンジル−３−メチル−ＤＴＰＡと１−メチル−３−イソチオシアネートベンジル−ＤＴＰＡとの１：１混合物を含むＭＸ−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン５酢酸）を介して、１１１Ｉｎに結合する、ヒトＣＤ２０抗原に特異的であるマウスモノクローナル抗体、２Ｂ８を含む。１１１Ｉｎは、約１ｍＣｉ〜約１０ｍＣｉの間では、検出可能な毒性を伴わずに安全に投与することができ、画像データは、概してその後の９０Ｙで標識された抗体の分布を予測するため、診断用放射性核種として特に好ましい。ほとんどの画像研究は、５ｍＣｉの１１１Ｉｎで標識された抗体を利用するが、これは、この線量が、抗体投与の３〜６日後に最適な画像が生じ、安全であり、かつより低い線量と比較して画像効率の向上が見られるためである。例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：３３２８（１９８５）、およびＣａｒｒａｇｕｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．２６：６７（１９８５）を参照されたい。
【０３９３】
上述のように、種々の放射性核種を本発明に適用することが可能であり、当業者は、種々の状況下で、どの放射性核種が最も適切であるか、容易に決定することができる。例えば、１３１Ｉは、標的とされた免疫療法に使用される、周知の放射性核種である。しかしながら、１３１Ｉの臨床的有用性は、８日間の物理的半減期、血中および腫瘍部位の両方でのヨウ素化抗体の脱ハロゲン化、ならびに腫瘍中の局在化した線量析出に対して準最適であり得る放射特性（例えば、大きなガンマ成分）を含む、幾つかの因子によって制限される。より優れたキレート剤の出現で、金属キレート基をタンパク質に結合する機会には、１１１Ｉｎおよび９０Ｙ等の他の放射性核種を利用する機会が増加した。９０Ｙは、放射免疫治療用途での利用に幾つかの利点を提供する。９０Ｙの６４時間の半減期は、腫瘍による抗体の蓄積を可能にするのに十分な長さであり、例えば、１３１Ｉとは異なり、９０Ｙは、その減衰時に付随するガンマ照射を伴わず、組織内で１００〜１，０００の細胞直径を有する、高エネルギーの純粋なβ放射体である。さらに、最小限の透過する放射線量は、９０Ｙで標識された抗体の外来投与を可能にする。さらに、細胞殺滅のための標識された抗体の内部移行を必要とせず、電離放射線の局所放射は、標的分子を欠く隣接する腫瘍細胞に致命的であるはずである。
【０３９４】
結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントとの共役に好ましい、さらなる薬剤は、細胞傷害性薬物、特に癌療法に使用されるものである。本明細書で使用される、「細胞毒素または細胞傷害性薬剤」は、細胞の成長および増殖に有害であり、細胞または悪性腫瘍を減少、阻害、または破壊するように作用し得る、任意の薬剤を意味する。典型的な細胞毒素には、放射性核種、生体毒素、酵素的に活性な毒素、細胞分裂阻害治療薬もしくは細胞傷害性治療薬、プロドラッグ、免疫学的に活性なリガンド、ならびにサイトカイン等の生体応答修飾物質が含まれるが、これらに限定されない。免疫反応細胞または悪性細胞の成長を遅延または鈍化するように作用する、いずれの細胞毒素も、本発明の範囲内にある。
【０３９５】
典型的な細胞毒素には、概して、細胞分裂阻害剤、アルキル化剤、抗代謝剤、抗増殖剤、チューブリン結合剤、ホルモン、およびホルモン拮抗薬等が挙げられる。本発明と適合する典型的な細胞分裂阻害剤には、メクロレタミン、トリエチレンホスホルアミド、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、またはトリアジコン等のアルキル化物質、またカルムスチン、ロムスチン、またはセムスチン等のニトロソウレア化合物が含まれる。細胞傷害性薬剤の他の好ましいクラスには、例えば、マイタンシノイドファミリーの薬物が含まれる。細胞傷害性薬剤の他の好ましいクラスには、例えば、アントラサイクリンファミリーの薬物、ビンカ薬、マイトマイシン、ブレオマイシン、細胞傷害性ヌクレオシド、プテリジンファミリーの薬物、ジイネン（ｄｉｙｎｅｎｅ）、およびポドフィロトキシンが含まれる。これらのクラスの特に有用なメンバーには、例えば、アドリアマイシン、カルミノマイシン、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン、アミノプテリン、メトトレキサート、メトプテリン、ミトラマイシン、ストレプトニグリン、ジクロロメトトレキサート、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン−Ｄ、ポルフィロマイシン、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、フトラフル、６−メルカプトプリン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ポドフィロトキシンまたはエトポシドもしくはエトポシドリン酸塩等のポドフィロトキシン誘導体、メルファラン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ロイロシジン、ビンデシン、ロイロシン等が含まれる。本明細書の教示に適合するさらに他の細胞毒素には、タキソール、タキサン、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、テノポシド、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体もしくは相同体が含まれる。コルチコステロイド類、例えばプレドニゾン、プロゲスチン類、例えばヒドロキシプロゲステロンもしくはメドロプロゲステロン、エストロゲン類、例えばジエチルスチルベストロール、抗エストロゲン類、例えばタモキシフェン、アンドロゲン類、例えばテストステロン、ならびにアロマターゼ阻害薬、例えばアミノグルテチミド等のホルモンおよびホルモン拮抗薬も、本明細書の教示に適合する。当業者は、本発明の共役体を調製するために、所望の化合物の反応をより簡便にするように、当該化合物に化学修飾を行うことができる。
【０３９６】
特に好ましい細胞毒素の一例には、カリチアマイシン、エスペラミシン、またはダイネミシンを含む、エンジインファミリーのメンバーまたは誘導体の抗腫瘍抗生物質が含まれる。これらの毒素は極めて強力であり、核ＤＮＡを切断することによって作用し、細胞死につながる。生体内で切断されて、不活性であるが、免疫原性である多くのポリペプチドフラグメントを生じることができるタンパク質毒素とは異なり、カリチアマイシン、エスペラミシン、および他のエンジイン等の毒素は、本質的に非免疫原性である小分子である。これらの非ペプチド毒素は、モノクローナル抗体および他の分子を標識するためにすでに使用された技法によって、二量体または四量体に化学的に連結される。これらの連結技術には、コンストラクトのＦｃ部分のみに存在するＮ結合型糖残基を介する、部位特異的な連結が含まれる。かかる部位特異的な連結方法は、連結の、コンストラクトの結合特性に対する可能性のある影響を軽減する利点を有する。
【０３９７】
すでに簡潔に述べたように、共役体の調製に適合する細胞毒素は、プロドラッグを含み得る。本明細書で使用される、「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞傷害性が低く、酵素的に活性化されるか、またはより活性な親型へと変換され得る、薬剤として活性な物質の前駆体または誘導体型を指す。本発明に適合するプロドラッグには、より活性な細胞傷害性のない薬物に変換され得る、リン酸塩を含有するプロドラッグ、チオリン酸塩を含有するプロドラッグ、硫酸塩を含有するプロドラッグ、ペプチドを含有するプロドラッグ、βラクタムを含有するプロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミドを含有するプロドラッグ、または任意に置換されたフェニルアセトアミドを含有するプロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用するプロドラッグ型に誘導体化され得る細胞傷害性薬物のさらなる例は、上記の化学療法剤を含む。
【０３９８】
他の細胞毒素の中でも、本明細書で開示される結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、リシンサブユニットＡ、アブリン、ジフテリア毒素、ボツリヌス、シアンギノシン（ｃｙａｎｇｉｎｏｓｉｎ）、サキシトキシン、志賀毒素、破傷風、テトロドトキシン、トリコテシン、ベルコロゲン（ｖｅｒｒｕｃｏｌｏｇｅｎ）、または毒性酵素等の生体毒素とも関連または共役させ得ることが理解されよう。好ましくは、そのようなコンストラクトは、抗体−毒素コンストラクトの直接発現を可能にする遺伝子工学技法を用いて作製される。本明細書で開示される結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントと関連し得る他の生体応答修飾物質には、リンホカインおよびインターフェロン等のサイトカインを含む。本開示に照らして、当業者は、従来の技法を用いて、かかるコンストラクトを容易に形成し得ると考えられる。
【０３９９】
開示される結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントと関連して使用、またはそれと共役させることができる、適合する細胞毒素の別のクラスは、腫瘍または免疫反応細胞へ効果的に導くことができる、放射線感作薬である。そのような薬物は、電離放射線に対する感受性を高めることにより、放射線療法の有効性を高める。腫瘍細胞によって内在化された抗体共役体は、放射線増感剤を、放射線増感が最大である核のより近傍へ送達する。非結合放射線増感剤と連結した本発明の結合分子は、血液から迅速に除去され、標的腫瘍内に残る放射線増感剤を局在化し、正常組織内の摂取を最小限に抑える。血液から迅速に除去された後、１．）腫瘍に特異的に照射される体外照射、２．）腫瘍に直接移植される放射活性、または３．）同一標的抗体を用いる全身放射線療法の３つの手段のうちの１つで、付加的な放射線療法が実施されよう。本手法の可能性として興味をそそる変形は、放射線で感作された免疫共役体への治療用放射性同位体の付着であり、これにより、患者への単一薬物の簡便な投与をもたらす。
【０４００】
特定の実施形態では、結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントの安定性または有効性を高める部分を、共役することができる。例えば、一実施形態において、ＰＥＧを本発明の結合分子と共役させて、その生体内半減期を延長することができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６（２００１）、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）、またはＷｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ３０：５１２（２００２）。
【０４０１】
本発明は、診断薬または治療薬に共役される結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体または免疫特異的フラグメントの使用をさらに包含する。該結合分子を診断に使用して、例えば、所定の処置および／または阻止レジメンの有効性を判定するための、臨床的試験手順の一部として、例えば、腫瘍の発生または進行を監視することができる。結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを、検出可能な物質にカップリングすることによって、検出を容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性材料、種々の陽電子放射断層撮影法を用いる陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。本発明による診断法として使用するための抗体に共役することができる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、好適な蛍光材料の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられ、発光材料の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、好適な放射性材料の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、または９９Ｔｃが挙げられる。
【０４０２】
また、結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、それを化学発光化合物にカップリングすることによって、検出可能に標識することができる。次いで、化学発光タグを付けた結合分子の存在を、化学反応の過程において生じる発光の存在を検出することによって、判定する。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【０４０３】
結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを検出可能に標識することができる手段のうちの１つは、それを酵素に連結し、連結された産物を酵素免疫測定（ＥＩＡ）で使用することによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，”Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７（１９７８）、Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３７：５０７−５２０（１９７８）、Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｒｙｍｏｌ  ７５：４８２−５２３（１９８１）、Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＩａ．，（１９８０）、Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。結合分子に結合される酵素は、例えば、分光光度的、蛍光定量的、または視覚的手段によって検出することができる、化学的部分を産生する様態で、適切な基質、好ましくは発色基質と反応する。該抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素には、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイド異性化酵素、酵母アルコール脱水素酵素、アルファグリセロリン酸塩、脱水素酵素、トリオースリン酸異性化酵素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、ベータガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが含まれるが、これらに限定されない。さらに、検出は、酵素の代わりに発色基質を用いる、比色法によって達成することができる。また、検出は、同様に調製された標準物質と比較する、基質の酵素反応の程度の目視比較によって、達成することもできる。
【０４０４】
また、検出は、種々の他の免疫測定のいずれを使用しても、達成することができる。例えば、該結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを放射活性で標識することにより、放射免疫測定（ＲＩＡ）の使用によって癌抗原を検出することが可能である（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，（Ｍａｒｃｈ，１９８６））を参照されたく、これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。放射性同位体は、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィを含むが、これらに限定されない手段によって、検出することができる。
【０４０５】
また、結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、１５２Ｅｕ等の蛍光放射金属、またはランタニド系列の他のものを使用して、検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属キレート基を使用して、該抗体に付着させることができる。
【０４０６】
結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントと種々の部分を共役させる技法は、周知であり、例えば、Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．６２３−５３（１９８７）、Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）、“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３０３−１６（１９８５）、およびＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい。
ＶＩＩ．抗体ポリペプチドの発現
【０４０７】
周知であるように、ＲＮＡは、グアニジンイソチオシアネート抽出および沈殿後の遠心分離もしくはクロマトグラフィ等の標準的な技法によって、元のハイブリドーマ細胞または他の形質転換細胞から単離することができる。望ましい場合は、オリゴｄＴセルロース上のクロマトグラフィ等の標準的な技法によって、全ＲＮＡからｍＲＮＡを単離することができる。好適な技法は、当技術分野でよく知られている。
【０４０８】
一実施形態では、周知の方法によって、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを使用して、同時または別個のいずれかで、該抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡを作製することができる。コンセンサス定常領域プライマーによって、または公開された重鎖および軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって、ＰＣＲを開始することができる。上述のように、ＰＣＲを使用しても、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することができる。この場合、コンセンサスプライマー、またはマウス定常領域プローブ等のより大きな同種プローブによって、ライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０４０９】
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは、当技術分野において既知の技法を用いて細胞から単離し、例えば、組換えＤＮＡ技法に関連する前述の参照文献に詳細に記載される、標準的な周知の技法によって、制限酵素マッピングおよび配列決定することができる。勿論、ＤＮＡは、単離過程またはその後の分析の間のいずれの時点においても、本発明による合成のものであってもよい。
【０４１０】
本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体を提供するように、単離された遺伝子材料を操作した後、該ＲＯＮ抗体をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所望の量のＲＯＮ抗体を産生するために使用することができる宿主細胞内に導入するために、発現ベクターに挿入される。
【０４１１】
本明細書に記載される標的分子、例えば、ＲＯＮに結合する、抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは類似体、例えば、抗体の重鎖または軽鎖の組換え発現は、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはその部分（好ましくは、重鎖もしくは軽鎖可変ドメインを含有する）をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野において周知の技法を用いる組換えＤＮＡ技術によって、抗体分子を産生するためのベクターを産生することができる。したがって、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによって、タンパク質を調製するための方法を、本明細書に記載する。当業者に周知である方法を使用して、抗体をコード化する配列ならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、生体外組換えＤＮＡ技法、合成技法、および生体内遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモーターと操作可能に連結される、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。かかるベクターは、該抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ第８６／０５８０７号、ＰＣＴ公開ＷＯ第８９／０１０３６号、および米国特許第５，１２２，４６４号を参照）、重鎖または軽鎖全体の発現のために、該抗体の可変ドメインをかかるベクター中にクローン化することができる。
【０４１２】
宿主細胞に、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクター、および軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターの、本発明の２つの発現ベクターを同時形質移入することができる。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする、同一の選択可能なマーカーを含有し得る。代替として、重鎖および軽鎖の両方のポリペプチドをコードする、単一ベクターを使用してもよい。かかる状況では、過剰な毒性のない重鎖を回避するために、有利に、重鎖の前に軽鎖が配置される（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５２（１９８６）、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖のためのコード化配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０４１３】
「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、本明細書において、宿主細胞内に導入して所望の遺伝子を発現させるための媒体として、本発明に従って使用されるベクターを意味するために使用される。当業者に既知であるように、かかるベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス、およびレトロウイルスからなる群から容易に選択することができる。概して、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローン化を促進する適切な制限酵素部位、ならびに真核または原核細胞内に進入および／またはその中で複製する能力を含む。
【０４１４】
本発明のために、多数の発現ベクター系を用いることができる。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、もしくはＭＯＭＬＶ）、またはＳＶ４０ウイルス等の、動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用する。他のクラスは、内部リボソーム結合部位を有する多シストロン系の使用を伴う。さらに、ＤＮＡを染色体に統合した細胞は、形質移入された宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって、選択することができる。該マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、または銅等の重金属に対する耐性を提供することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結されるか、または同時形質転換によって同一細胞に導入されるかのいずれかであり得る。また、ｍＲＮＡの最適な合成には、さらなる要素が必要であり得る。これらの要素には、シグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルが含まれ得る。
【０４１５】
特に好ましい実施形態では、クローン化された可変領域遺伝子が、上述のように合成された重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（好ましくはヒト）と共に、発現ベクターに挿入される。一実施形態において、これは、ＮＥＯＳＰＬＡと称されるＢｉｏｇｅｎ  ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．専売の発現ベクター（米国特許第６，１５９，７３０号で開示）を使用して達成される。当該ベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロブリンの主要プロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、およびリーダー配列を含有する。当該ベクターは、可変および定常領域遺伝子の組み込み、ＣＨＯ細胞中の形質移入、その後のＧ４１８含有培地での選択およびメトトレキサート増幅時に、抗体の非常に高レベルの発現をもたらすことが認められている。勿論、真核細胞で発現を誘起することができるいずれの発現ベクターも、本発明に使用することができる。好適なベクターの例としては、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＶＡＸｌ、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より入手可能）、ならびにプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）より入手可能）が含まれるが、これらに限定されない。概して、多量の形質転換細胞からの、好適に高レベルの免疫グロブリン重鎖および軽鎖を発現する細胞のスクリーニングは、例えば、ロボットシステムによって行うことができる、日常的な実験である。ベクター系は、米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号でも教示されており、これらのそれぞれは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。この系は、高い発現レベル、例えば、＞３０ｐｇ／細胞／日を提供する。他の典型的なベクター系は、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示される。
【０４１６】
他の好ましい実施形態では、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体は、２００２年１１月１８日出願の米国特許出願公開第２００３−０１５７６４１  Ａ１号に開示されるもの等の、多シストロン性コンストラクトを使用して、発現させることができ、該出願は、その全体が本明細書に組み込まれる。これらの新規の発現系では、抗体の重鎖および軽鎖等の、対象の複数の遺伝子産物を、単一の多シストロン性コンストラクトから産生することができる。これらの系は、有利に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用して、真核宿主細胞内で、比較的高レベルのＲＯＮ抗体、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを提供する。適合するＩＲＥＳ配列が米国特許第６，１９３，９８０号で開示され、該特許は、同様に本明細書に組み込まれる。当業者には、このような発現系を使用して、本出願において開示されるあらゆる種類のＲＯＮ抗体を、効果的に産生し得ることが理解されよう。
【０４１７】
より一般的には、ＲＯＮ抗体の単量体サブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されると、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者に周知の種々の技法によって達成することができる。これらには、形質移入（電気泳動法および電気穿孔法を含む）、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープを有するＤＮＡとの細胞融合、微量注入法、および無傷のウイルスでの感染が含まれるが、これらに限定されない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２（１９８８）を参照されたい。典型的には、宿主へのプラスミドの導入は、電気穿孔法による。発現コンストラクトを宿す宿主細胞を、該軽鎖および重鎖の産生に適切な条件下で成長させ、重鎖および／または軽鎖のタンパク質合成について検定する。典型的な検定技法には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、または蛍光標識細胞分取法（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学的検査等が含まれる。
【０４１８】
発現ベクターは、従来の技法によって宿主細胞に移入され、次いで、形質移入された細胞を従来の技法によって培養し、本明細書に記載される方法で使用する抗体を産生する。したがって、本発明は、異種プロモーターと操作可能に連結される、本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する、宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現に好ましい実施形態では、以下に詳述するように、免疫グロブリン分子全体を発現するために、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターを、宿主細胞内で同時発現させることができる。
【０４１９】
本明細書で使用される、「宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技法を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを宿す細胞を指す。宿主からの抗体の単離過程の記載における、「細胞」および「細胞培養物」という用語は、別様に明記されていない限り、抗体の起源を示すために交換可能に使用される。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠沈された全細胞から、または培地および細胞浮遊液の両方を含有する細胞培養物からのいずれかを意味し得る。
【０４２０】
種々の宿主発現ベクター系を利用して、本明細書に記載される方法で使用する抗体分子を発現させることができる。かかる宿主発現系は、対象のコード化配列が産生され、その後精製される媒体であるが、適切なヌクレオチドコード化配列で形質転換または形質移入された時に、原位置で本発明の抗体分子を発現することができる、細胞でもある。これらには、抗体コード化配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）等の微生物；抗体コード化配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス属、ピキア属）；抗体コード化配列を含有する組換えウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス）；抗体コード化配列を含有する、組換えウイルス発現ベクターに感染した、または組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された、植物細胞系（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））；あるいは哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現コンストラクトを宿す、哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれるが、これらに限定されない。特に全組換え抗体分子の発現には、好ましくは、大腸菌等の細菌性細胞、より好ましくは、真核細胞が、組換え抗体分子を発現させるために使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主中間初期遺伝子プロモーター要素（ｍａｊｏｒ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）等のベクターと併用した、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等の哺乳動物細胞は、抗体の効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８６）、Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２（１９９０））。
【０４２１】
タンパク質発現に使用される宿主細胞株は、しばしば哺乳動物起源のものであり、当業者は、中に発現される所望の遺伝子産物に最も好適である特定の宿主細胞株を、選択的に決定する能力があると考えられる。典型的な宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０のＴ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−ＩｃＩＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、ならびに２９３（ヒト腎臓）が含まれるが、これらに限定されない。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞株は、典型的には、商業サービス、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、または既刊文献から入手可能である。
【０４２２】
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする、宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のかかる修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、該タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に対して、特有かつ特定の機序を有する。適切な細胞株または宿主系を選んで、発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを保証することができる。このために、一次転写物のプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用することができる。
【０４２３】
組換えタンパク質の長期にわたる高収率の産生には、安定発現が好ましい。例えば、該抗体分子を安定に発現する細胞株を改変することができる。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりも、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位等）によって制御されるＤＮＡ、および選択可能なマーカーを用いて、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、改変された細胞を強化培地中で１〜２日間成長させ、その後選択培地に切り替えることができる。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、それらの染色体にプラスミドを安定に取り込んで、増殖巣を形成するように成長することを可能にし、今度はこれを細胞株にクローン化および拡大することができる。本方法を有利に使用して、該抗体分子を安定に発現するように細胞株を改変することができる。
【０４２４】
ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐｒｔ細胞内で用いることができる、それぞれ単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７  １９８０）遺伝子を含むが、これらに限定されない、多くの選択系を使用することができる。また、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ７７：３５７（１９８０）、Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）、およびＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）、ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（Ｍａｙ，１９９３））、ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））の遺伝子の選択の基準として、抗代謝剤耐性を用いることができる。使用することができる、組換えＤＮＡ技術の技術分野において一般に既知である方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、およびＣｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載され、これらは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４２５】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（概説には、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）を参照されたい）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である時には、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加が、マーカー遺伝子の複製物の数を増加させる。増幅領域は抗体遺伝子と関連するため、抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
【０４２６】
生体外産生によって、大量の所望のポリペプチドを得るための拡大が可能になる。組織培養条件下での哺乳動物細胞の培養のための技法は、当技術分野において既知であり、例えばエアリフト反応器もしくは連続撹拌反応器中の、均質懸濁培養、または例えば中空線維中、マイクロカプセル中、アガロースマイクロビーズ上、もしくはセラミックカートリッジ上の固定化もしくは封入された細胞培養が含まれる。必要および／または所望である場合、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的な生合成後、または本明細書に記載されるＨＩＣクロマトグラフィステップの前もしくは後に、通例のクロマトグラフィ法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥ−セルロース上のクロマトグラフィ、または（免疫）親和性クロマトグラフィによって、ポリペプチドの溶液を精製することができる。
【０４２７】
また、本発明のＲＯＮ抗体、またはその抗原結合性フラグメント、変異体、もしくは誘導体をコードする遺伝子は、細菌、または昆虫、または酵母または、植物細胞等の非哺乳動物細胞に発現することができる。核酸を容易に取り込む細菌には、大腸菌もしくはサルモネラ菌、枯草菌等のバシラス科、肺炎球菌、連鎖球菌、およびヘモフィルス・インフルエンザエの株等の腸内細菌科のメンバーが含まれる。細菌中に発現されると、異種ポリペプチドが、典型的には封入体の一部となることがさらに理解されよう。異種ポリペプチドは、単離、精製、次いで機能分子に構築しなければならない。四価形態の抗体が所望される時には、次いで、サブユニットが四価抗体に自己組織化する（ＷＯ第０２／０９６９４８Ａ２号）。
【０４２８】
細菌系では、発現される抗体分子に意図される用途に依存して、多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物を生成するために、大量のかかるタンパク質を産生する時には、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を導くベクターが、望ましくあり得る。かかるベクターには、融合タンパク質が産生されるように、ｌａｃＺコード化領域とインフレームで、個々にベクター中に連結することができる、大腸菌発現ベクター、ｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１（１９８３））、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）、Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））等が含まれるが、これらに限定されない。また、ｐＧＥＸベクターを使用して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として、外来ポリペプチドを発現することもできる。概して、かかる融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、その後の遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から簡単に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出することができるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼの切断部位を含むように設計されている。
【０４２９】
また、原核生物に加えて、真核微生物を使用することもできる。出芽酵母、または一般的なパン酵母が、真核微生物の中で最も一般的に使用されるが、多くの他の株、例えば、ピキア・パストリスが一般的に入手可能である。
【０４３０】
酵母菌属中の発現には、例えばプラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２５２：３９（１９７９）、Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ７：１４１（１９７９）、Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０：１５７（１９８０））が一般的に使用される。このプラスミドは、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２（１９７７））等の、トリプトファン内で成長する能力を欠く酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する、ＴＲＰ１遺伝子をすでに含有する。酵母宿主細胞ゲノムの特性としてのｔｒｐｌ損傷の存在は、次いで、トリプトファンの不在下での成長による形質転換を検出するための、効果的な環境を提供する。
【０４３１】
昆虫系では、外来遺伝子を発現するためのベクターとして、オートグラファ・カルフォルニカ多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が典型的に使用される。このウイルスは、ヨトウガ細胞中で成長する。該ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に、抗体コード化配列を個々にクローン化して、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０４３２】
本発明の抗体分子が組換え発現されると、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特定抗原に対する親和性によるもの、およびサイジングカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、示差溶解度（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的技法による、免疫グロブリン分子の精製のための当技術分野において既知の任意の方法によって、それを精製することができる。代替として、本発明の抗体の親和性を高めるために好ましい方法が、米国第２００２  ０１２３０５７  Ａ１号に開示されている。
ＶＩＩＩ．治療用のＲＯＮに特異的な抗体、またはその免疫特異的フラグメントを使用した処置方法
【０４３３】
本発明の一実施形態は、過剰増殖性疾病もしくは疾患、例えば、癌、悪性腫瘍、腫瘍、もしくはそれらの転移に罹患するか、またはかかる疾病に罹患しやすい動物において、かかる疾病を処置するための方法を提供し、該方法は、ＲＯＮまたはＲＯＮの変異体に結合する、有効量の抗体またはその免疫特異的フラグメントを該動物に投与するステップを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。好適な抗体には、本明細書に記載される全ての抗体、および抗原に特異的なそのフラグメントが含まれる。例としては、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＲＯＮエピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性フラグメント、ＲＯＮに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−ＦｌＯ、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択される参照モノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体の、ＲＯＮへの結合を競合的に阻害する、抗体またはそのフラグメント、あるいは、ＲＯＮに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、Ｍ８０−Ｂ０３、Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、およびＭ９８−Ｅ１２からなる群から選択されるモノクローナルＦａｂ抗体フラグメント、または１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ４Ａ１２、および１Ｐ５Ｂ１０からなる群から選択される参照モノクローナル抗体のものと同一の抗原結合ドメインを含む、抗体またはそのフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
【０４３４】
特定の実施形態では、ＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、ＭＳＰのＲＯＮへの結合を阻害する。さらなる実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、細胞増殖、運動性、および／または転移に関与する下流シグナル伝達分子の活性化を阻害する。かかる分子には、ＰＩ３−Ｋ、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、およびＲａｃが含まれるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、Ｒａｓ／ＭＡＰＫシグナリング経路の活性化を阻害する。さらなる実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、ｓｒｃシグナリング経路の活性化を阻害する。さらなる実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、βカテニンシグナリング経路の活性化を阻害する。またさらなる実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、ＲＯＮのＭＳＰとの相互作用を阻害する。別の実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、ＰＩ３−Ｋ／Ａｋｔ経路、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路、ｓｒｃ経路、Ｆａｋ経路、およびβカテニンシグナリング経路を含む、ＲＯＮによって活性化される経路の活性化を阻害する。また別の実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、Ｅｒｋ１／２のリン酸化または活性化を阻害する。またさらなる実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、細胞増殖、運動性、および／または転移を阻害する。またさらなる実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、アポトーシスまたはアノイキスを促進する。またさらなる実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、ＶＥＧＦの分泌を阻止する。またさらなる実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、ＥＧＦＲ、ＴＧＦβ受容体、およびＭｅｔを含むが、これらに限定されない、他の受容体キナーゼの活性を阻止する。またさらなる実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、細胞傷害性の一酸化窒素（ＮＯ）の分泌を誘発する。またさらなる実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、ＩＬ−１２の分泌を誘発する。またさらなる実施形態では、細胞、特に腫瘍細胞または腫瘍関連マクロファージ上に発現したＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、ＭＳＰの分泌を阻止する。
【０４３５】
本明細書で開示される処置方法において使用される、ＲＯＮまたはその変異体に特異的に結合する本発明の抗体は、細胞の過剰増殖に関与する細胞活動、例えば、しばしば過剰増殖性疾病または疾患に関連する、変化したまたは異常なパターンの血管新生を誘発する細胞活動を停止、減少、阻止、または阻害する治療薬として、調製および使用することができる。
【０４３６】
本発明の抗体またはその免疫特異的フラグメントには、ＲＯＮ等の腫瘍に関連するタンパク質に特異的に結合するモノクローナル、キメラ、またはヒト化抗体、および抗体のフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。該抗体は、一価、二価、多価、または二官能性抗体であってもよく、抗体フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖが含まれる。
【０４３７】
本発明による治療用抗体は、非標識型もしくは非共役型で使用されてもよく、または放射標識および生化学的細胞毒素等の細胞傷害性部分にカップリングもしくは連結して、治療効果を発揮する薬剤を産生することもできる。
【０４３８】
特定の実施形態では、本発明の抗体、またはその免疫特異的フラグメントは、抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインは、抗体によって異なる抗体可変領域によって形成される。天然に存在する抗体は、少なくとも２つの抗原結合ドメインを含み、即ち、それらは少なくとも二価である。本明細書で使用される、「抗原結合ドメイン」という用語には、抗原（例えば、細胞表面または可溶性抗原）上のエピトープに特異的に結合する部位が含まれる。抗体の抗原結合ドメインには、典型的には、免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも一部分、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも一部分が含まれる。これらの可変領域によって形成される結合部位が、抗体の特異性を決定する。
【０４３９】
本発明は、例えば、哺乳動物における腫瘍成長を阻害するステップによって、種々の過剰増殖性疾患を処置するための方法を提供し、該方法は、ＲＯＮ、例えば、ヒトＲＯＮに特異的または優先的に結合する有効量の抗体またはその抗原結合性フラグメントを、哺乳動物に投与するステップを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０４４０】
本発明は、より具体的には、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトにおける、過剰増殖性疾病の処置、例えば、腫瘍形成、腫瘍成長、腫瘍侵襲性、および／または転移形成の阻害または阻止方法を対象とし、該方法は、それを必要とする動物に、ＲＯＮの１つ以上のエピトープに特異的または優先的に結合する、有効量の抗体またはその免疫特異的フラグメントを投与するステップを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【０４４１】
他の実施形態では、本発明は、動物、例えば、ヒト患者における、過剰増殖性疾病の処置、例えば、腫瘍形成、腫瘍成長、腫瘍侵襲性、および／または転移形成の阻害のための方法を含み、該方法は、かかる処置を必要とする動物に、薬剤として許容される担体に加えて、ＲＯＮの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体、またはその免疫特異的フラグメントを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、有効量の組成物を投与するステップを含み、該エピトープは、配列番号１、配列番号２、または配列番号１１３の少なくとも約４〜５個のアミノ酸、配列番号１、配列番号２、または配列番号１１３の少なくとも７、少なくとも９、または少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。記載される配列番号１、配列番号２、または配列番号１１３の所定のエピトープのアミノ酸は、連続的であってもよいが、そうである必要はない。
【０４４２】
特定の実施形態では、ＲＯＮの少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面に発現されるようなＲＯＮの細胞外ドメインによって形成される、非線状エピトープを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。したがって、特定の実施形態では、ＲＯＮの少なくとも１つのエピトープは、配列番号１、配列番号２、または配列番号１１３の、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、約１５〜約３０、または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００個の連続的もしくは非連続的アミノ酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、非連続的なアミノ酸が、タンパク質の折り畳みを通じてエピトープを形成する。
【０４４３】
他の実施形態では、本発明は、動物、例えば、ヒト患者における、過剰増殖性疾病の処置、例えば、腫瘍形成、腫瘍成長、腫瘍侵襲性、および／または転移形成の阻害のための方法を含み、該方法は、かかる処置を必要とする動物に、薬剤として許容される担体に加えて、ＲＯＮの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体、またはその免疫特異的フラグメントを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、有効量の組成物を投与するステップを含み、該エピトープは、さらに、上記の配列番号１、配列番号２、または配列番号１１３の１、２、３、４、５、また６個以上の連続的もしくは非連続的なアミノ酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、該結合分子が、修飾された標的タンパク質に対して、該タンパク質の非修飾型に対してよりも高い親和性で結合するように、該タンパク質を修飾するさらなる部分、例えば、炭水化物部分を含むことができる。あるいは、該結合分子は、標的タンパク質の非修飾型に全く結合しない。
【０４４４】
より具体的には、本発明は、ヒトにおける癌を処置する方法を提供し、該方法は、処置を必要とするヒトに、有効量のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントと、薬剤として許容される担体とを含む組成物を投与するステップを含む。処置される癌の種類には、胃癌、腎臓癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、および前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０４４５】
特定の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、上記のＲＯＮまたはフラグメントもしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するか（即ち、関係のない無作為のエピトープに対して結合するであろうよりも容易に、かかるエピトープに結合する）、上記のＲＯＮまたはフラグメントもしくは変異体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合するか（即ち、関連する、同様な、相同的な、または類似のエピトープに対して結合するであろうよりも容易に、かかるエピトープに結合する）、上記のＲＯＮまたはフラグメントもしくは変異体の特定のエピトープに、それ自体が特異的または優先的に結合する、参照抗体の結合を競合的に阻害するか、あるいは、約５×１０−２Ｍ、約１０−２Ｍ、約５×１０−３Ｍ、約１０−３Ｍ、約５×１０−４Ｍ、約１０−４Ｍ、約５×１０−５Ｍ、約１０−５Ｍ、約５×１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ、約５×１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ、約５×１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ、約５×１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ、約５×１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ、約５×１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ、約５×１０−１２Ｍ、約１０−１２Ｍ、約５×１０−１３Ｍ、約１０−１３Ｍ、約５×１０−１４Ｍ、約１０−１４Ｍ、約５×１０−１５Ｍ、もしくは約１０−１５Ｍ未満の解離定数ＫＤによって特徴付けられる親和性で、上記のＲＯＮのフラグメントまたは変異体の少なくとも１つのエピトープに結合する。抗体結合の解離定数の文脈で使用される、「約」という用語は、抗体親和性を測定するために利用される方法に内在する、ある程度の変動を許容する。例えば、使用される計測手段の精度、測定される試料の数に基づく標準誤差、および丸め誤差のレベルに依存して、「約１０−２Ｍ」という用語は、例えば、０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを含む可能性がある。特定の実施形態では、本発明の抗体およびそのフラグメントは、それらが産生されたものとは別の種のＲＯＮタンパク質と交差反応し、例として、ヒトＲＯＮに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントは、マウスＲＯＮにも結合する。本発明の他の好適な抗体またはそのフラグメントには、高度に種に特異的なものが含まれる。
【０４４６】
具体的な実施形態では、本明細書で開示される抗体またはその免疫特異的フラグメントは、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１、または１０−３秒−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合する。本明細書で開示される他の抗体またはその免疫特異的フラグメントは、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０５秒−１、１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１、または１０−７秒−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で、ＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合する。
【０４４７】
他の実施形態では、本明細書で開示される抗体またはその免疫特異的フラグメントは、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、または５×１０４Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で、ＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合する。本明細書で開示される診断方法および処置方法で使用する、他の抗体またはその免疫特異的フラグメントは、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、５×１０６Ｍ−１秒−１、または１０７Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で、ＲＯＮポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体に結合する。
【０４４８】
種々の実施形態において、上記の１つ以上の結合分子は、ＲＯＮ活性の拮抗物質であり、例えば、拮抗物質であるＲＯＮ抗体の、腫瘍細胞上に発現したＲＯＮへの結合は、ＭＳＰの結合を阻害するか、シグナル伝達経路の下流の分子、例えば、ＰＩ３−Ｋ、Ａｋｔ、Ｒａｓ、ＭＡＰＫ、ｓｒｃ、Ｆａｋ、βカテニン、およびＥＲＫ１／２の活性化を阻害するか、または腫瘍細胞増殖、運動性、もしくは転移を阻害する。
ＩＸ．ＲＯＮに特異的な結合分子を使用する診断もしくは予後方法ならびに核酸増幅検定
【０４４９】
ＲＯＮに特異的な抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは類似体は、ＲＯＮの異常発現および／または活性に関連する疾病、疾患、および／または病態を検出、診断、または監視するために、診断目的で使用することができる。ＲＯＮの発現は、腫瘍組織および他の新生物性病態において増加する。
【０４５０】
ＲＯＮに特異的な抗体またはそのフラグメントは、哺乳動物、好ましくはヒトにおける、過剰増殖性疾患の診断、処置、阻止、および／または予後に有用である。かかる疾患には、癌、新生物、腫瘍、ならびに／または本明細書の別の箇所に記載されるように、胃癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、および前立腺癌等の特にＲＯＮに関連する癌が含まれるが、これらに限定されない。
【０４５１】
例えば、本明細書で開示されるように、ＲＯＮの発現は、少なくとも胃、脳、膀胱、結腸、肺、乳房、膵臓、卵巣、および前立腺腫瘍組織に関連する。したがって、ＲＯＮを対象とする抗体（および抗体フラグメント）を使用して、高レベルのＲＯＮを発現する特定の組織を検出することができる。これらの診断検定は、生体内または生体外、例えば、血液試料、生検組織、または剖検組織等に行うことができる。
【０４５２】
したがって、本発明は、癌および他の過剰増殖性疾患の診断中に有用な診断方法を提供し、該方法は、個体からの組織または他の細胞もしくは体液中のＲＯＮタンパク質または転写物の発現レベルを測定するステップと、測定した発現レベルを正常な組織または体液中の標準的なＲＯＮの発現レベルと比較するステップとを含み、それによって、標準物質と比較した発現レベルの上昇は、疾患を示す。
【０４５３】
一実施形態は、体液または組織試料中の異常な過剰増殖性細胞、例えば、前癌または癌性細胞の存在を検出する方法を提供し、該方法は、個体の組織または体液試料中のＲＯＮの発現について検定するステップと、該試料中のＲＯＮの発現の存在またはレベルを、標準組織または体液試料のパネル中のＲＯＮの発現の存在またはレベルと比較するステップとを含み、ＲＯＮの発現の検出または標準物質を超えるＲＯＮの発現の上昇は、異常な過剰増殖性細胞成長を示す。
【０４５４】
より具体的には、本発明は、体液または組織試料中の異常な過剰増殖性細胞の存在を検出する方法を提供し、該方法は、（ａ）本発明のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを使用して、個体の組織または体液試料中のＲＯＮの発現について検定するステップと、（ｂ）該試料中のＲＯＮの発現の存在またはレベルを、標準組織または体液試料のパネル中のＲＯＮの発現の存在またはレベルと比較するステップとを含み、したがって、ＲＯＮの発現の検出または標準物質を超えるＲＯＮの発現の上昇は、異常な過剰増殖性細胞成長を示す。
【０４５５】
癌に関して、個人からの生検組織中の比較的高量のＲＯＮタンパク質の存在は、腫瘍もしくは他の悪性増殖の存在を示し得るか、かかる悪性腫瘍もしくは腫瘍の発生の素因を示し得るか、または実際の臨床症状が現れる前に、該疾病を検出するための手段を提供し得る。この種類のより確定的な診断により、医療従事者は、早期に阻止措置または積極的処置を用い、癌の発生またはさらなる進行を阻止することができる。
【０４５６】
本発明のＲＯＮに特異的な抗体は、当業者に既知の標準的な免疫組織学的方法を使用して、生体試料中のタンパク質レベルを検定するために使用することができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）を参照）。タンパク質発現の検出に有用な他の抗体に基づく方法には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）および放射免疫測定（ＲＩＡ）等の免疫測定が挙げられる。好適な抗体検定標識は、当技術分野において既知であり、グルコース酸化酵素等の酵素標識；ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）等の放射性同位体；ルミノール等の発光標識；ならびにフルオレセインおよびローダミン等の蛍光標識、ならびにビオチンが含まれる。好適な検定は、本明細書の別の箇所でより詳細に説明する。
【０４５７】
本発明の一態様は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける、ＲＯＮの異常発現に関連する過剰増殖性疾病または疾患の生体内検出または診断のための方法である。一実施形態において、診断は、ａ）ＲＯＮに特異的に結合する、有効量の標識された本発明の抗体またはそのフラグメントを対象に投与（例えば、非経口、皮下、もしくは腹腔内に）するステップと、ｂ）投与後、ＲＯＮが発現する対象内の部位に、標識された結合分子が優先的に集中することを可能にするため（かつ結合しない標識された分子がバックグラウンドレベルまで除去されるように）、ある時間間隔の間待機するステップと、ｃ）バックグラウンドレベルを決定するステップと、ｄ）対象中の標識された分子を検出するステップと、を含み、その結果、バックグラウンドレベルを上回る標識された分子の検出は、対象が、ＲＯＮの異常発現に関連する特定の疾病または疾患を有することを示す。バックグラウンドレベルは、検出された標識された分子の量を、特定の系について予め決定された標準値と比較するステップを含む、種々の方法によって決定することができる。
【０４５８】
当技術分野において、対象の大きさおよび使用される画像化システムによって、診断画像の作成に必要な画像化部分の量が決定されることが理解されよう。放射性同位体部分の場合、ヒト対象に対しては、注入される放射活性の量は、通常、例えば、９９Ｔｃでは約５〜２０ミリキュリーの範囲である。標識された結合分子、例えば、抗体または抗体フラグメントは、次いで、優先的に特定のタンパク質を含有する細胞の位置に蓄積する。腫瘍の生体内画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ，“Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．”  （Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｓ．，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２））に記載される。
【０４５９】
使用される標識の種類および投与方法を含む、幾つかの変数に依存して、投与後の、標識された分子が優先的に対象内の部位に集中し、結合しない標識された分子がバックグラウンドレベルまで除去されるのを可能にする時間間隔は、６〜４８時間、または６〜２４時間、または６〜１２時間である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は、５〜２０日間または７〜１０日間である。
【０４６０】
患者における標識された分子の存在は、生体内スキャニングのための当技術分野において既知の方法を使用して、検出することができる。これらの方法は、使用される標識の種類に依存する。当業者は、特定の標識を検出するのに適切な方法を決定することができよう。本発明の診断方法に使用することができる方法および装置には、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）等の全身スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および超音波検査が含まれるが、これらに限定されない。
【０４６１】
具体的な実施形態では、該結合分子を放射性同位体で標識し、放射線反応性外科機器を使用して、患者内で検出する（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態では、該結合分子を蛍光化合物で標識し、蛍光応答性のスキャニング機器を使用して、患者内で検出する。別の実施形態では、該結合分子を陽電子放射金属で標識し、陽電子放射断層撮影法を使用して、患者内で検出する。また別の実施形態では、該結合分子を常磁性標識で標識し、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して、患者内で検出する。
【０４６２】
ＲＯＮ発現の生体内画像化のための抗体標識またはマーカーには、Ｘ線撮影、核磁気共鳴画像法（ＮＭＲ）、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、または電子スピン共鳴画像法（ＥＳＲ）によって検出可能なものが含まれる。Ｘ線撮影について、好適な標識には、検出可能な放射線を放射するが、対象にとって明らかに有害ではない、バリウムまたはセシウム等の放射性同位体が含まれる。ＮＭＲおよびＥＳＲに対して好適なマーカーには、関連するハイブリドーマのための栄養分を標識することによって、抗体に組み込むことができる、重水素等の検出可能な特有のスピンを有するものが含まれる。ヒトでの診断のために、生体内画像化を使用して、高レベルのＲＯＮの発現を検出する場合、本明細書の別の箇所に記載される、ヒト抗体または「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが、好ましくあり得る。
【０４６３】
上記のものに関連する実施形態では、該疾病または疾患を診断するための方法のうちのいずれか１つを、例えば、初期診断の１ヵ月後、初期診断の６ヵ月後、初期診断の１年後等に繰り返すことによって、すでに診断された疾病または疾患の監視が行われる。
【０４６４】
腫瘍の診断を含む疾患の診断が、従来の方法に従ってすでになされている場合、本明細書で開示される検出方法は、予後指標として有用であり、それにより、ＲＯＮの高発現を呈し続ける患者には、発現レベルが標準レベル近くまで低下する患者と比較して、低い臨床成績が認められるだろう。
【０４６５】
「腫瘍に関連するＲＯＮポリペプチドの発現レベルの検定」によって、第１の生体試料中のＲＯＮポリペプチドのレベルを、直接的（例えば、絶対的なタンパク質レベルを決定または推定することによって）、または相対的（例えば、第２の生体試料中の癌に関連するポリペプチドのレベルを比較することによって）のいずれかで、定性的または定量的に測定または推定することが意図される。第１の生体試料中のＲＯＮポリペプチドの発現レベルを測定または推定し、標準的なＲＯＮポリペプチドのレベルと比較することが好ましく、該標準は、該疾患を有しない個人から得られた第２の生体試料から取られるか、または該疾患を有しない個体の集団からのレベルを平均することによって決定される。当技術分野において理解されるように、「標準的な」ＲＯＮポリペプチドのレベルが一旦分かれば、比較のための標準として、繰り返し使用することができる。
【０４６６】
「生体試料」は、個体、細胞株、組織培養物、または可能性としてＲＯＮを発現する他の細胞源から得られる、任意の生体試料を意図する。示したように、生体試料には、体液（血清、血漿、尿、滑液、および髄液等）、ならびに可能性としてＲＯＮを発現する細胞を含有する他の組織源が含まれる。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当技術分野において周知である。
【０４６７】
さらなる実施形態では、ＲＯＮの立体構造エピトープを対象とする抗体、または抗体の免疫特異的フラグメントを使用して、ＲＯＮ遺伝子産物またはその保存変異体もしくはペプチドフラグメントの存在を定量的または定性的に検出することができる。これは、例えば、光学顕微鏡的、フローサイトメトリー、または蛍光定量的検出を併用した、蛍光標識された抗体を用いる免疫蛍光法によって、達成することができる。
【０４６８】
上記の方法を使用して診断および／または予知することができる癌には、胃癌、腎臓癌、脳癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、および前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。
Ｘ．免疫測定
【０４６９】
本明細書で開示される、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、当技術分野において既知の任意の方法によって、免疫特異的結合について検定することができる。使用することができる免疫測定には、ほんの数例を挙げれば、ウエスタンブロット、放射免疫測定、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」免疫測定、免疫沈降検定、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散検定、凝集検定、補体結合検定、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定、プロテインＡ免疫測定等の技法を使用する、競合的および非競合的検定システムが含まれるが、これらに限定されない。このような検定は、当技術分野において日常的な周知のものである（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４）を参照されたく、これは、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。典型的な免疫測定を以下に簡潔に説明する（しかし、制限するものとしてではない）。
【０４７０】
免疫沈降プロトコルは、概してタンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）を補充した、ＲＩＰＡ緩衝液（１％  ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％  ＳＤＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、１％  Ｔｒａｓｙｌｏｌ）等の溶解緩衝液中の細胞の集団の溶解、対象の抗体の該細胞可溶化物への添加、４度Ｃで一定の時間（例えば、１〜４時間）のインキュベート、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズの細胞可溶化物への添加、４度Ｃで約１時間以上のインキュベート、該ビーズの溶解緩衝液での洗浄、ＳＤＳ／試料緩衝液中での該ビーズの再懸濁を含む。対象の抗体の特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によって評価することができる。当業者は、抗体の抗原への結合を増加させ、バックグラウンドを減少させるように修正することができる（例えば、細胞可溶化物をセファロースビーズで予め除去する）パラメータに精通しているだろう。免疫沈降プロトコルに関するさらなる説明には、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４）ａｔ  １０．１６．１を参照されたい。
【０４７１】
ウエスタンブロット分析は、概して、タンパク質試料の調製、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中でのタンパク質試料の電気泳動、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはナイロン等の膜へのタンパク質試料の移入、ブロッキング溶液（例えば、３％  ＢＳＡもしくは脱脂乳を含むＰＢＳ）中での該膜のブロッキング、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）中での該膜の洗浄、該膜のブロッキング緩衝液中に希釈した一次抗体（対象の抗体）でのブロッキング、該膜の洗浄緩衝液中での洗浄、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）またはブロッキング緩衝液中に希釈した放射性分子（例えば、３２ｐもしくは１２５１）に共役した二次抗体（一次抗体を認識する、例えば、抗ヒト抗体）での、該膜のブロッキング、該膜の洗浄緩衝液中での洗浄、ならびに抗原の存在の検出を含む。当業者は、検出されたシグナルを増加させ、暗雑音を減少させるように修正することができるパラメータに精通しているだろう。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる説明には、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｖｏｌ．１（１９９４）ａｔ  １０．８．１を参照されたい。
【０４７２】
ＥＬＩＳＡは、抗原の調製、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルの抗原でのコーティング、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）等の検出可能な化合物に共役した対象の、抗体のウェルへの添加および一定時間のインキュベート、ならびに抗原の存在の検出を含む。ＥＬＩＳＡでは、対象の抗体を検出可能な化合物に共役させる必要はなく、代わりに、検出可能な化合物に共役した（対象の抗体を認識する）第２の抗体を、ウェルに添加してもよい。さらに、抗原でウェルをコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合、コーティングしたウェルへの対象の抗原の添加後、検出可能な化合物に共役した第２の抗体を添加することができる。当業者は、検出されるシグナルを増加させるように修正することができるパラメータ、ならびに当技術分野において既知のＥＬＩＳＡの他の変形物に、精通しているだろう。ＥＬＩＳＡに関するさらなる説明には、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４）ａｔ  １１．２．１を参照されたい。
【０４７３】
抗体の抗原への結合親和性および抗体抗原相互作用のオフ速度は、競合的結合検定によって決定することができる。競合的結合検定の一例は、増加量の標識されていない抗原の存在下での、対象の抗体との標識された抗原（例えば、３Ｈもしくは１２５Ｉ）のインキュベート、および標識された抗原に結合した抗体の検出を含む、放射免疫測定である。特定の抗原に対する対象の抗体の親和性および結合オフ速度は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット分析によるデータから決定することができる。第２の抗体との競合も、放射免疫測定を使用して決定することができる。この場合、抗原は、増加量の標識されていない第２の抗体の存在下で、標識された化合物（例えば、３Ｈもしくは１２５Ｉ）に共役される対象の抗体と共にインキュベートされる。
【０４７４】
ＲＯＮに特異的な抗体は、さらに、癌抗原の遺伝子産物、またはその保存変異体もしくはペプチドフラグメントの原位置検出のための、免疫蛍光法、免疫電子顕微法、または非免疫学的検定等において、組織学的に用いることができる。原位置検出は、患者から組織学的標本を取り出し、そこに標識されたＲＯＮに特異的な抗体またはそのフラグメントを塗布することによって達成することができ、好ましくは標識された抗体（またはフラグメント）を生体試料上に重ね合わせることによって塗布される。かかる手順の使用を通じて、ＲＯＮタンパク質、または保存変異体もしくはペプチドフラグメントの存在だけでなく、検査される組織中のその分布も決定することができる。本発明を使用して、当業者は、多岐にわたる組織学的方法（染色法等）のいずれも、かかる原位置検出を達成するように修正し得ることに、容易に気付くであろう。
【０４７５】
ＲＯＮ遺伝子産物またはその保存変異体もしくはペプチドフラグメントに対する免疫測定および非免疫測定は、典型的には、ＲＯＮまたはその保存変異体もしくはペプチドフラグメントに結合することができる、検出可能に標識された抗体の存在下での、生体液、組織抽出物、収集したばかりの細胞、または細胞培養でインキュベートした細胞可溶化物等の試料のインキュベート、ならびに当技術分野において周知の多くの技法のうちのいずれかによる、結合した抗体の検出を含む。
【０４７６】
生体試料を、ニトロセルロース等の固相支持体もしくは担体、または細胞、細胞粒子、もしくは可溶性タンパク質を固定化することができる他の固相支持体と接触させて、その上に固定化することができる。次いで、該支持体を好適な緩衝液で洗浄し、その後、検出可能に標識されたＲＯＮに特異的な抗体で処理することができる。次いで、固相支持体に緩衝液で２度目の洗浄を行い、非結合抗体を除去する。任意選択的に、その後、抗体を標識する。次いで、固相支持体に結合した標識の量を、従来の手段によって検出することができる。
【０４７７】
「固相支持体または担体」は、抗原または抗体に結合することができる任意の支持体を意図する。周知の支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ類、天然および変性セルロース類、ポリアクリルアミド類、斑糲岩、およびマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明のために、ある程度可溶性、または不溶性のいずれかであり得る。支持材は、事実上、カップリングされた分子が抗原または抗体に結合することができる限り、いずれの可能な構造的構成を有してもよい。したがって、支持体の構成は、ビーズのような球状、または試験管の内面もしくはロッドの外面のような円筒状であってもよい。代替として、表面は、シート、試験片等のように平坦でもよい。好ましい支持体には、ポリスチレンビーズが含まれる。当業者は、抗体もしくは抗原の結合に好適な多くの他の担体を知っているか、あるいは日常的な実験によってそれらを確定することができるだろう。
【０４７８】
あるロットのＲＯＮに特異的な抗体の結合活性は、周知の方法によって決定することができる。当業者は、日常的な実験によって、それぞれの決定に際して有効かつ最適な検定条件を決定することができよう。
【０４７９】
抗体抗原相互作用の親和性を測定するために利用可能な種々の方法があるが、速度定数を決定するためのものは比較的少ない。ほとんどの方法は、抗体または抗原のいずれかの標識化に頼り、これは必然的に日常的な測定を複雑にし、測定量に不確実性が生じる。
【０４８０】
ＢＩＡｃｏｒｅ上で行われる表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）は、抗体抗原相互作用の親和性を測定する、従来の方法に勝る多くの利点を提示する：（ｉ）抗体または抗原のいずれかを標識する必要がない、（ｉｉ）前もって抗体を精製する必要がなく、細胞培養上澄みをそのまま使用することができる、（ｉｉｉ）異なるモノクローナル抗体の相互作用の迅速な半定量的比較を可能にする、実時間測定が可能になり、多くの評価目的にとって十分である、（ｉｖ）一連の異なるモノクローナル抗体を、同一条件下で容易に比較することができるように、生体分子に特異的な表面を再生することができる、（ｖ）分析法が完全に自動化され、広範にわたる一連の測定を、ユーザーが干渉することなく行うことができる。ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＢ（ｒｅｐｒｉｎｔｅｄ  １９９８），ＢＩＡＣＯＲＥ  ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＢＲ−１００１−８６、ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ＡＢ（ｒｅｐｒｉｎｔｅｄ  １９９８），ＢＩＡＣＯＲＥ  ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＢＲ−１００１−８４。
【０４８１】
ＳＰＲに基づく結合研究には、結合対のうちの１つのメンバーをセンサー表面上に固定化することが必要である。固定化された結合パートナーは、リガンドと称される。溶液中の結合パートナーは、分析物と称される。場合によっては、リガンドは、捕捉分子と称される、別の固定化された分子との結合を介して、間接的に表面に付着される。ＳＰＲ応答は、分析物が結合または解離する際の、検出器の表面の質量濃度の変化を反映する。
【０４８２】
ＳＰＲに基づき、実時間ＢＩＡｃｏｒｅ測定は、相互作用が生じる間に、それを直接監視する。本技法は、動態パラメータの決定に非常に好適である。親和性の比較ランク付けは、非常に実行しやすく、動態および親和性の両方の定数を、センサーグラムデータから得ることができる
【０４８３】
分析物がリガンド表面にわたって離散パルスで注入される際、結果として生じるセンサーグラムは、（ｉ）試料注入中の分析物とリガンドとの会合、（ｉｉ）分析物の結合速度が複合体からの解離によって釣り合う、試料注入中の平衡または定常状態、（ｉｉｉ）緩衝液が流れる間の、表面からの分析物の解離の３つの本質的な位相に分割することができる。
【０４８４】
会合相および解離相は、分析物とリガンドとの相互作用の、動態に関する情報を提供する（ｋａおよびｋｄ、複合体の形成および解離速度、ｋｄ／ｋａ＝ＫＤ）。平衡相は、分析物とリガンドとの相互作用の、親和性に関する情報を提供する（ＫＤ）。
【０４８５】
ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアは、数値積分法および全体的フィッティングアルゴリズムの両方を使用して、カーブフィッティングのための総合的な便宜を提供する。データの好適な分析により、相互作用に関する分離速度および親和定数を、単純なＢＩＡｃｏｒｅ検査から得ることができる。本技法によって測定可能な親和性の範囲は、ｍＭからｐＭの非常に広い範囲である。
【０４８６】
エピトープ特異性は、モノクローナル抗体の重要な特性である。ＢＩＡｃｏｒｅを用いるエピトープマッピングは、放射免疫測定、ＥＬＩＳＡ、または他の表面吸着法を用いる従来の技法とは対照的に、抗体の標識または精製を必要とせず、幾つかのモノクローナル抗体の配列を使用する、多重部位特異性試験を可能にする。さらに、多数の分析を自動的に処理することができる。
【０４８７】
ペアワイズ結合実験は、２つのＭＡｂが同一抗原に同時に結合する能力を試験する。別個のエピトープを対象とするＭＡｂは、独立して結合するが、一方、同一または密接に関連するエピトープを対象とするＭＡｂは、互いの結合に干渉する。ＢＩＡｃｏｒｅを用いるこれらの結合実験は、簡単に行うことができる。
【０４８８】
例えば、第１のＭａｂの結合に捕捉分子を使用し、その後抗原および第２のＭＡｂを連続して添加することができる。センサーグラムは、１．どれだけの抗原が第１のＭａｂに結合するか、２．どの程度、第２のＭＡｂは表面に付着した抗原に結合するか、３．第２のＭＡｂが結合しない場合、ペアワイズ試験の順序を逆にすることが、結果を変えるかどうかを明らかにするであろう。
【０４８９】
エピトープマッピングに用いられる別の技法は、ペプチド阻害である。本方法は、ペアワイズ抗体結合研究を補完することができ、抗原の一次配列が既知である時には、機能的エピトープを構造的特徴と関連付けることができる。異なるＭＡｂの固定化された抗原への結合の阻害について、ペプチドまたは抗原フラグメントが試験される。あるＭＡｂの結合に干渉するペプチドは、該ＭＡｂによって定義されるエピトープと、構造的に関連すると見なされる。
ＸＩ．医薬組成物および投与方法
【０４９０】
ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントの調製方法およびそれを必要とする対象への投与方法は、当業者に周知であるか、あるいは容易に決定される。結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントの投与経路は、例えば、経口的、非経口的、吸入による、または局所的であってもよい。本明細書で使用される非経口という用語は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、または膣内投与を含む。これらの全ての投与形態は、明らかに本発明の範囲内であると想到されるが、投与の一形態は、特に静脈内または動脈内注射または点滴には、注射液であろう。通常、注射に好適な医薬組成物は、緩衝液（例えば酢酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、任意選択的に安定剤（例えばヒトアルブミン）等を含み得る。しかしながら、本明細書の教示に適合する他の方法では、結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを、有害な細胞集団の部位に直接送達し、それによって病変組織の該治療薬への曝露を増加させることができる。
【０４９１】
非経口投与用の調製物には、滅菌した水溶液もしくは非水溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、乳濁液、または食塩水および緩衝培地を含む懸濁液が含まれる。主題の発明では、薬剤として許容される担体は、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液、または０．８％の食塩水を含むが、これらに限定されない。他の一般的な非経口媒体には、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が含まれる。静脈内媒体には、リンゲルのブドウ糖に基づくもの等の、体液および栄養素補充液、電解質補充液が含まれる。また、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等の保存料および他の添加剤が存在してもよい。
【０４９２】
より具体的には、注射可能な用途に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性である）もしくは分散液、および注射可能な滅菌溶液もしくは分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。このような場合、該組成物は無菌でなくてはならず、容易な注入能力（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで、流体でなければならない。それは、製造および保存条件下で安定でなければならず、好ましくは細菌および真菌等の微生物の汚染作用から守られる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散液の場合必要とされる粒度の維持、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。本明細書で開示される治療方法で使用するために好適な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１６ｔｈ  ｅｄ．（１９８０）に記載される。
【０４９３】
微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合、該組成物に、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール類、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、該組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって、もたらすことができる。
【０４９４】
いずれの場合も、注射可能な滅菌溶液は、必要に応じて本明細書に列挙される成分のうちの１つまたはその組み合わせと共に、適切な溶媒中に必要量の活性のある化合物を（例えば、結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを、それ自体または他の活性のある薬剤と組み合わせて）組み込み、その後濾過滅菌によって、調製することができる。概して、分散液は、該活性のある化合物を、塩基性分散媒および上記に列挙したものからの必要とされる他の成分を含有する、滅菌媒体に組み込むことによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これらは、予め滅菌濾過されたその溶液から、活性成分、およびいずれかのさらなる所望の成分の粉末をもたらす。注射用調製物は、加工され、アンプル、袋、ビン、注射器、またはバイアル等の容器に充填され、当技術分野において既知の方法による無菌条件下で密封される。さらに、該調製物は、同時係属のＵＳＳＮ第０９／２５９，３３７号（米国第２００２−０１０２２０８  Ａ１号）に記載されるもの等のキットの形態にパッケージ化して、販売することができ、該出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。かかる製造品は、好ましくは、関連する組成物が、自己免疫疾患もしくは腫瘍性疾患に罹患するか、またはそれにかかりやすい対象の処置に有用であることを示す、表示もしくは添付文書を有する。
【０４９５】
本明細書に記載されるような過剰増殖性疾患を処置するために効果的な、本発明の組成物の用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか、動物であるか、投与されている他の薬物、および処置が予防的であるか、または治療的であるかを含む、多くの異なる因子に依存して異なる。通常、患者はヒトであるが、遺伝子導入哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も、処置することができる。処置投薬量は、当業者に既知の日常的な方法を使用して滴定し、安全性および有効性を最適化することができる。
【０４９６】
抗体またはそのフラグメントを用いる過剰増殖性疾患の処置には、投薬量は、宿主の体重１ｋｇあたり、例えば、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ等）の範囲であり得る。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇであり得る。上記の範囲の中間の用量も、本発明の範囲内にあると意図される。対象には、かかる用量を毎日、隔日、毎週、または実験的分析によって決定された任意の他の日程に従って、投与することができる。典型的な処置は、長期、例えば、少なくとも６ヶ月にわたる、複数回投薬の投与を伴う。さらなる典型的な処置レジメンは、２週間毎に１回、または１ヶ月に一回、または３〜６ヶ月毎に１回の投与を伴う。典型的な投薬日程には、連日の１〜１０ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇ、隔日の３０ｍｇ／ｋｇ、または毎週の６０ｍｇ／ｋｇが含まれる。方法によっては、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与されるそれぞれの抗体の投薬量は、示した範囲内にある。
【０４９７】
本明細書で開示されるＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、複数の機会に投与することができる。単回投薬間の間隔は、毎週、毎月、または毎年であり得る。また、間隔は、患者内の標的ポリペプチドまたは標的分子の血中レベルを測定することによって示される通り、不規則であってもよい。方法によっては、投薬量は、１〜１０００μｇ／ｍｌ、方法によっては、２５〜３００μ／ｍｌの血漿ポリペプチド濃度を達成するように調整される。代替として、結合分子は、徐放性製剤として投与されてもよく、この場合、より少ない頻度の投与が必要とされる。投薬量および頻度は、抗体の患者内の半減期に依存して異なる。また、結合分子の半減期は、安定なポリペプチドまたは部分、例えば、アルブミンまたはＰＥＧへの融合によって、延長することができる。概して、ヒト化抗体が最も長い半減期を示し、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。一実施形態において、本発明の結合分子は、非共役型で投与されてもよく、別の実施形態では、本明細書で開示される方法で使用する結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントが、共役型で複数回投与されてもよい。さらに別の実施形態では、本発明の結合分子を非共役型で、その後共役型で、またはその逆もまた同様に、投与することもできる。
【０４９８】
投与の投薬量および頻度は、処置が予防的であるのか、または治療的であるのかに依存して異なり得る。予防的用途では、患者の耐性を高めるために、抗体を含む組成物またはそのカクテルを、すでに病状にはない、または病気にかかる前の状態の患者に投与する。かかる量は、「予防効果的用量」と定義される。この用途では、正確な量はやはり患者の健康状態および全身免疫に依存するが、概して１用量当たり０．１〜２５ｍｇ、特に１用量当たり０．５〜２．５ｍｇの範囲である。比較的低い投薬量が、長期間にわたって、比較的頻度の低い間隔で投与される。患者によっては、生涯継続して処置を受ける。
【０４９９】
治療用途では、比較的短い間隔で、比較的高い投薬量（例えば、１用量当たり約１〜４００ｍｇ／ｋｇの結合分子、例えば、抗体であり、放射性免疫共役体には５〜２５ｍｇの投薬量がより一般的に使用され、細胞毒素−薬物共役分子にはより高用量）が、場合によっては、該疾病の進行が減速または停止するまで、好ましくは患者が疾病の症状の部分的または完全な回復を示すまで、必要とされる。その後、患者には予防的レジメンが実施される。
【０５００】
一実施形態において、対象を、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメント（例えば、ベクター中の）をコードする核酸分子で処置することができる。ポリペプチドをコードする核酸の用量は、患者当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇのＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターの用量は、１用量当たり１０〜１００以上ビリオンにわたって異なる。
【０５０１】
治療薬は、予防的および／または治療的処置のための、非経口的、局所的、静脈内、経口的、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、または筋肉内手段によって、投与することができる。方法によっては、ＲＯＮを発現する細胞が蓄積した特定の組織に、薬剤が直接注射され、例としては、頭蓋内注射である。筋肉内注射または静脈内注入が、抗体の投与に好ましい。方法によっては、特定の治療用抗体が頭蓋内に直接注射される。方法によっては、抗体が、徐放性組成物またはＭｅｄｉｐａｄ（商標）装置等の装置として、投与される。
【０５０２】
本発明のＲＯＮ抗体またはそのフラグメントは、任意選択的に、処置を必要とする疾患または病態の処置に効果的である（例えば、予防的または治療的）、他の薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０５０３】
９０Ｙで標識された結合ポリペプチドの効果的な単回処置投薬量（即ち、治療有効量）は、約５〜約７５ｍＣｉ、より好ましくは約１０〜約４０ｍＣｉの範囲である。１３１Ｉで標識された抗体の、骨髄を破壊しない効果的な単回処置投薬量は、約５〜約７０ｍＣｉ、より好ましくは約５〜約４０ｍＣｉの範囲である。１３１Ｉで標識された抗体の、破壊する効果的な単回処置投薬量（即ち、自家骨髄移植を必要とし得る）は、約３０〜約６００ｍＣｉ、より好ましくは約５０〜約５００ｍＣｉ未満の範囲である。キメラ抗体と併せる場合、マウス抗体と比べてより長い循環半減期のために、ヨウ素１３１で標識されたキメラ抗体の、骨髄を破壊しない効果的な単回処置投薬量は、約５〜約４０ｍＣｉの範囲、より好ましくは約３０ｍＣｉ未満である。例えば、１１１Ｉｎ標識の画像化基準は、典型的には約５ｍＣｉ未満である。
【０５０４】
１３１Ｉおよび９０Ｙを用いて多くの臨床経験が得られているが、他の放射標識が当技術分野において既知であり、同様の目的に使用されている。画像化にはさらに他の放射性同位体が使用される。例えば、本発明の範囲に適合するさらなる放射性同位体には、１２３Ｉ、１２５Ｉ、３２Ｐ、５７Ｃｏ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、７７Ｂｒ、８１Ｒｂ、８１Ｋｒ、８７Ｓｒ、１１３Ｉｎ、１２７Ｃｓ、１２９Ｃｓ、１３２Ｉ、１９７Ｈｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、４７Ｓｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１５３Ｓｍ、１８８Ｒｅ、１９９Ａｕ、２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、および２１３Ｂｉが含まれるが、これらに限定されない。この点に関して、アルファ、ガンマ、およびベータ放射体は、全て本発明に適合する。さらに、本開示に照らして、当業者は、過度な実験を行うことなく、どの放射性核種が選択した一連の処置と適合するのか、容易に決定し得ると考えられる。この目的のために、臨床診断ですでに使用されているさらなる放射性核種には、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、ならびに１１１Ｉｎが含まれる。また、抗体は、標的免疫療法における潜在的用途のために、種々の放射性核種で標識されている（Ｐｅｉｒｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６５：１１１−１２５（１９８７））。これらの放射性核種には、それほどではないにせよ、１８８Ｒｅおよび１８６Ｒｅならびに１９９Ａｕおよび６７Ｃｕが含まれる。米国特許第５，４６０，７８５号は、そのような放射性同位体に関するさらなるデータを提供し、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０５０５】
本明細書で開示される、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントが、共役型または非共役型で使用されるかどうかにはかかわらず、本発明の主要な利点は、骨髄抑制患者、特に放射線療法または化学療法等の補助療法を受けている、または受けたことのある患者に、これらの分子を使用する能力であることが理解されよう。つまり、該分子の有益な送達プロファイル（即ち、比較的短い血中滞留時間、高い結合親和性、および強化された局在性）により、それらは、赤色骨髄の貯蔵が減少し、骨髄毒性に感受性である患者を処置するために、特に有用である。この点に関して、該分子独自の送達プロファイルにより、それらは、骨髄抑制癌患者への放射標識された共役体の投与に非常に効果的である。したがって、本明細書で開示されるＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、体外照射または化学療法等の補助療法を以前に受けた患者において、共役型または非共役型で有用である。他の好ましい実施形態では、結合分子、例えば、結合ポリペプチド、例えば、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメント（やはり共役型または非共役型の）は、化学療法剤と組み合わせた治療レジメンで使用することができる。当業者には、かかる治療レジメンが、開示される抗体もしくは他の結合分子と、１つ以上の化学療法剤との、連続、同時、併用、または同一の広がりをもつ投与を含み得ることが理解されよう。本発明の本態様の特に好ましい実施形態は、放射標識された結合ポリペプチドの投与を含む。
【０５０６】
ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、すぐ上に記載したように投与することができるが、他の実施形態では、共役および非共役結合分子を、第一選択治療薬として、別様に健康な患者に投与できることが、重視されなければならない。そのような実施形態では、結合分子は、正常な、もしくは平均的な赤色骨髄の貯蔵を有する患者、ならびに／または体外照射もしくは化学療法等の補助療法を受けたことがない、また現在受けていない患者に投与することができる。
【０５０７】
しかしながら、上述のように、本発明の選択された実施形態は、放射線療法もしくは化学療法等の１つ以上の補助療法と組み合わせた、または併用した（即ち組み合わせ治療レジメン）、骨髄抑制患者へのＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントの投与を含む。補助療法と併用した、または組み合わせた、本明細書で使用される、ＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントの投与とは、該療法および開示される結合分子の連続、同時、同一の広がりをもつ、併用する、付随する、または同時期の投与もしくは適用を意味する。当業者には、組み合わせ治療レジメンの種々の構成要素の投与または適用は、該処置全体の有効性を高めるように時期を選べることが理解されよう。例えば、一連の標準的な周知の処置において、化学療法剤、その後数週間以内に本明細書に記載される放射性免疫共役体を投与することができよう。逆に、細胞毒素と共役した結合分子を静脈内投与し、その後腫瘍に限局した体外照射を実施することができよう。さらに他の実施形態では、結合分子が、単回の来院で、１つ以上の選択した化学療法剤と併用して投与されてもよい。当業者（例えば経験を積んだ腫瘍学者）は、選択した補助療法および本明細書の教示に基づき、過度の実験を行うことなく、効果的な組み合わせ治療レジメンを容易に識別することができよう。
【０５０８】
この点に関して、結合分子（細胞毒素を伴う、または伴わない）と化学療法剤との組み合わせは、いずれの順序でも、かつ患者に治療的有用性を提供するいずれの時間枠内でも、投与できることが理解されよう。つまり、化学療法剤およびＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、いずれの順序でも、または併用して投与することができる。選択された実施形態では、本発明のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、これまでに化学療法を受けたことがある患者に投与される。さらに他の実施形態では、本発明のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、化学療法的処置と実質的に同時にまたは併用して、投与される。例えば、患者は、一連の化学療法を受けながら、結合分子を与えられてもよい。好ましい実施形態では、該結合分子は、任意の化学療法剤または処置の１年以内に投与される。他の好ましい実施形態では、該ポリペプチドは、任意の化学療法剤または処置の１０、８、６、４、または２ヶ月以内に投与される。さらに他の好ましい実施形態では、該結合分子は、任意の化学療法剤または処置の４、３、２、または１週間以内に投与される。また他の実施形態では、該結合分子は、選択した化学療法剤または処置の５、４、３、２、または１日以内に投与される。２つの薬剤または処置が、数時間または数分以内（即ち実質的に同時）に患者に投与され得ることが、さらに理解されよう。
【０５０９】
さらに、本発明によれば、骨髄抑制患者とは、血球数の低下を呈するいずれの患者をも意味するものとする。当業者には、骨髄抑制の臨床指標として従来使用される幾つかの血球数パラメータがあり、骨髄抑制が患者内で生じている程度を容易に測定し得ることが理解されよう。当技術分野において許容される骨髄抑制測定の例は、好中球絶対数（ＡＮＣ）または血小板数である。このような骨髄抑制または部分的骨髄破壊は、種々の生化学的疾患もしくは疾病の結果、あるいは、おそらくは、以前の化学療法もしくは放射線療法の結果であり得る。この点に関して、当業者には、従来の化学療法を受けた患者は、典型的には赤色骨髄の貯蔵の低下を呈することが理解されよう。上述のように、このような対象は、しばしば、死亡率または罹患率の増加をもたらす、貧血症または免疫抑制等の容認できない副作用のために、最適なレベルの細胞毒素（即ち放射性核種）を使用して処置することができない。
【０５１０】
より具体的には、本発明の、共役または非共役型のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを使用して、約２０００／ｍｍ３より低いＡＮＣ、または約１５０，０００／ｍｍ３より低い血小板数を有する患者を、効果的に治療することができる。より好ましくは、本発明のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを使用して、約１５００／ｍｍ３未満、約１０００／ｍｍ３未満、またはさらに好ましくは約５００／ｍｍ３未満のＡＮＣを有する患者を、治療することができる。同様に、本発明のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを使用して、約７５，０００／ｍｍ３未満、約５０，０００／ｍｍ３未満、またはさらには約１０，０００／ｍｍ３未満の血小板数を有する患者を、治療することができる。より全般的な意味では、当業者は、政府が施行するガイドラインおよび手順を使用して、いつ患者の骨髄が抑制されるのか、容易に断定することができよう。
【０５１１】
上述のように、多くの骨髄抑制患者は、化学療法、埋め込み放射線療法、または体外照射療法を含む一連の処置を受けている。後者の場合、外部放射源は、悪性腫瘍の局部照射用のものである。放射線療法の埋め込み方法については、悪性腫瘍内に放射性試薬を外科的に位置付け、それによって該疾病の部位を選択的に照射する。いずれの場合にも、本発明のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントを使用して、原因にかかわらず、骨髄抑制を呈する患者の疾患を治療することができる。
【０５１２】
この点に関して、本発明のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、新生細胞の成長を生体内で排除、減速、阻害、または制御する、任意の化学療法剤または薬剤と併用するか、または組み合わせて（例えば組み合わせ治療レジメンを提供するように）、使用できることがさらに理解されよう。説明したように、そのような薬剤は、しばしば赤色骨髄の貯蔵の減少をもたらす。この減少は、有利に、かかる患者における新形成の積極的処置を可能にする、本発明の化合物の減弱された骨髄毒性によって、全体または部分的に相殺され得る。他の実施形態では、本明細書で開示される放射標識された免疫共役体は、新生細胞の放射性核種に対する感受性を増す放射線増感剤と共に、効果的に使用することができる。例えば、放射標識された結合分子の大部分が血流から除去された後だが、１つまたは複数の腫瘍の部位に、依然として治療有効レベルで残存する時に、放射線感作化合物が投与されてもよい。
【０５１３】
本発明のこれらの態様に関して、本発明に適合する典型的な化学療法剤には、アルキル化剤、ビンカアルカロイド類（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、プロカルバジン、メトトレキサート、およびプレドニゾンが挙げられる。４つの薬物を組み合わせたＭＯＰＰ（メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）、プロカルバジン、およびプレドニゾン）は、種々の種類のリンパ腫の治療に非常に効果的であり、本発明の好ましい実施形態を成す。ＭＯＰＰ耐性患者には、ＡＢＶＤ（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、およびダカルバジン）、ＣｈｌＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾン）、ＣＡＢＳ（ロムスチン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびストレプトゾトシン）、ＭＯＰＰに加えてＡＢＶＤ、ＭＯＰＰに加えてＡＢＶ（ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびビンブラスチン）、またはＢＣＶＰＰ（カルムスチン、シクロホスファミド、ビンブラスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾン）の組み合わせを使用することができる。Ａｒｎｏｌｄ  Ｓ．Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ  Ｍ．Ｎａｄｌｅｒ，Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７７４−１７８８（Ｋｕｒｔ  Ｊ．Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，１３ｔｈ  ｅｄ．１９９４）、およびＶ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）、ならびに標準的な用量および日程計画について本明細書で引用された参照文献。これらの療法は、本発明の１つ以上のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントと組み合わせて、特定の患者に対して必要に応じて、変更せずに、または変化させて、使用することができる。
【０５１４】
本発明の文脈において有用であるさらなるレジメンには、シクロホスファミドもしくはクロラムブシル等の単一のアルキル化剤、またはＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（ＣＶＰおよびドキソルビシン）、Ｃ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）、ＣＡＰ−ＢＯＰ（ＣＨＯＰに加えてプロカルバジンおよびブレオマイシン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（ＣＨＯＰに加えてメトトレキサート、ブレオマイシン、およびロイコボリン）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、およびロイコボリンに加えて標準的なＭＯＰＰ）、ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、シタラビン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、メトトレキサート、およびロイコボリン）、ならびにＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、固定用量のプレドニゾン、ブレオマイシン、およびロイコボリン）等の組み合わせの使用が挙げられる。当業者は、これらのレジメンのそれぞれの標準的な投薬量および日程計画を、容易に決定することができよう。また、ＣＨＯＰは、ブレオマイシン、メトトレキサート、プロカルバジン、ナイトロジェンマスタード、シトシンアラビノシド、およびエトポシドと組み合わされている。他の適合する化学療法剤には、２−クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ）、２’−デオキシコホルマイシン、およびフルダラビンが含まれるが、これらに限定されない。
【０５１５】
寛解を達成することができないか、または再発する、中悪性度および高悪性度の悪性腫瘍を有する患者には、救済療法が用いられる。救済療法は、単独でまたは組み合わせて与えられる、シトシンアラビノシド、シスプラチン、カルボプラチン、エトポシド、およびイホスファミド等の薬物を用いる。再発型または侵攻型の特定の腫瘍性疾患では、しばしば以下のプロトコルが用いられる：それぞれ周知の投与速度および日程での、ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキサート、およびエトポシド）、ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イホスファミド、メトトレキサート、およびエトポシド）、ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量のシタラビン、およびシスプラチン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、ＨＤシタラビン、シスプラチン）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾン、およびブレオマイシン）、ならびにＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビン、およびプレドニゾン）。
【０５１６】
本発明のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントと組み合わせて使用される、化学療法剤の量は、対象によって異なり得るか、または当技術分野において既知のものに従って投与され得る。例えば、Ｂｒｕｃｅ  Ａ  Ｃｈａｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，ｉｎ  Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １２３３−１２８７（Ｊｏｅｌ  Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，９ｔｈ  ｅｄ．（１９９６））を参照されたい。
【０５１７】
別の実施形態では、本発明のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、生物学的製剤と併用して投与される。癌の処置に有用な生物学的製剤は、当技術分野において既知であり、本発明の結合分子は、例えば、そのような既知の生物学的製剤と併用して、投与することができる。
【０５１８】
例えば、ＦＤＡは、乳癌の処置に以下の生物学的製剤を承認している：Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、ＨＥＲ２陽性乳癌に抗腫瘍活性を有するヒト化モノクローナル抗体）、Ｆａｓｌｏｄｅｘ（登録商標）（フルベストラント、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、乳癌の処置に使用されるエストロゲン受容体拮抗薬）、Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標）（アナストロゾール、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ、エストロゲンの形成に必要とされる酵素である、アロマターゼを遮断する非ステロイド系アロマターゼ阻害薬）、Ａｒｏｍａｓｉｎ（登録商標）（エキセメスタン、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、乳癌の処置に使用される、不可逆的なステロイド系アロマターゼ失活剤）、Ｆｅｍａｒａ（登録商標）（レトロゾール、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪ）、乳癌の処置にＦＤＡによって承認された、非ステロイド系アロマターゼ阻害薬）、ならびにＮｏｌｖａｄｅｘ（登録商標）（タモキシフェン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＰ、乳癌の処置にＦＤＡによって承認された、非ステロイド系抗エストロゲン）。本発明の結合分子と組み合わせることができる他の生物学的製剤には、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）（ベバシズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、血管新生を阻害するように設計された第一選択ＦＤＡ承認療法）、およびＺｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、Ｂ細胞リンパ腫の処置に現在承認されている、放射標識モノクローナル抗体）が含まれる。
【０５１９】
加えて、ＦＤＡは、結腸直腸癌の処置に以下の生物学的製剤を承認している：Ａｖａｓｔｉｎ（商標）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標）（セツキシマブ、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、およびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を対象とするモノクローナル抗体）、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（メシル酸イマチニブ、タンパク質キナーゼ阻害剤）、ならびにＥｒｇａｍｉｓｏｌ（登録商標）（レバミゾール塩酸塩、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＬＰ（Ｔｉｔｕｓｖｉｌｌｅ，ＮＪ）、ＤｕｋｅｓのステージＣの結腸癌を有する患者における外科的切除後の、５−フルオロウラシルと組み合わせたアジュバント処置として、１９９０年にＦＤＡによって承認された免疫調節物質）。
【０５２０】
非ホジキンリンパ腫の処置に使用される、現在承認されている療法には、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）（トシツモマブおよびヨウ素Ｉ−１３１トシツモマブ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）、放射性分子（ヨウ素Ｉ−１３１）に連結されたマウスモノクローナル抗体（トシツモマブ）を伴う、多段階処置）、Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）Ａ（インターフェロンアルファ−２ｂ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）、アントラサイクリンを含む組み合わせ化学療法（例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン［ＣＨＯＰ］）と併用する、濾胞性非ホジキンリンパ腫の処置に承認されたインターフェロンの１種類）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、およびＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、非ホジキンリンパ腫の処置に承認されたモノクローナル抗体）、Ｏｎｔａｋ（登録商標）（デニロイキンジフチトクス、Ｌｉｇａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、インターロイキン−２に遺伝子的に融合されたジフテリア毒素のフラグメントからなる、融合タンパク質）、ならびにＺｅｖａｌｉｎ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の処置用にＦＤＡによって承認された、放射標識モノクローナル抗体）が含まれる。
【０５２１】
白血病の処置のための、本発明の結合分子と組み合わせて使用することができる典型的な生物学的製剤には、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）−１Ｈ（アレムツズマブ、Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）、慢性リンパ性白血病の処置に使用されるモノクローナル抗体の１種類）が含まれる。加えて、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（オブリメルセン、Ｇｅｎｔａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｒｋｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＮＪ）、白血病を処置するための、開発中のＢＣＬ−２アンチセンス療法であり、（例えば、単独で、またはフルダラビンおよびシクロホスファミド等の１つ以上の化学療法薬と組み合わせて）使用することができる）が、特許請求される結合分子と共に投与されてもよい。
【０５２２】
肺癌の処置のための、典型的な生物学的製剤には、Ｔａｒｃｅｖａ（商標）（エルロチニブＨＣＬ、ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）、ヒト上皮成長因子受容体１（ＨＥＲ１）経路を標的とするように設計された小分子）が含まれる。
【０５２３】
多発性骨髄腫の処置のための、典型的な生物学的製剤には、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（ボルテゾミブ、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、プロテアソーム阻害剤）が含まれる。さらなる生物学的製剤には、Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄ（登録商標）（サリドマイド、Ｃｌｅｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ）、免疫調節剤であり、骨髄腫細胞の成長および生存を阻害する能力、ならびに抗血管新生を含む、複数の作用を有すると見られる）が含まれる。
【０５２４】
他の典型的な生物学的製剤には、ＩｍＣｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）によって開発された、ＭＯＡＢ  ＩＭＣ−Ｃ２２５が含まれる。
【０５２５】
すでに説明したように、本発明のＲＯＮに特異的な抗体もしくはその免疫特異的フラグメント、またはその組換え体は、哺乳動物の過剰増殖性疾患の生体内処置のために、薬剤として有効な量で投与することができる。この点に関して、開示される抗体が、投与を容易にし、該活性剤の安定性を促進するように、製剤化されることが理解されよう。好ましくは、本発明による医薬組成物は、生理食塩水、無毒の緩衝液、保存料等の、薬剤として許容される無毒の滅菌担体を含む。本出願の目的では、治療薬に共役された、もしくは非共役型である、薬剤として有効な量の、本発明のＲＯＮに特異的な抗体もしくはその免疫特異的フラグメント、またはその組換え体は、標的への効果的な結合を達成し、例えば、疾病もしくは疾患の症状を回復するか、または物質もしくは細胞を検出する利益を達成するのに十分な量を意味するものとする。腫瘍細胞の場合、該結合分子は、好ましくは、新生細胞もしくは免疫反応細胞上、または非新生細胞、例えば、新生細胞に関連する血管細胞上で、選択した免疫反応性抗原と相互作用することができ、これらの細胞死の増加をもたらす。勿論、本発明の医薬組成物は、薬剤として有効な量の該結合分子を提供するために、単回または複数回投与で投与することができる。
【０５２６】
本開示の範囲を踏まえて、本発明のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、治療的または予防的効果を産生するために十分な量で、前述の処置方法に従って、ヒトまたは他の動物に投与することができる。本発明のＲＯＮに特異的な抗体またはその免疫特異的フラグメントは、本発明の抗体を、既知の技法によって従来の薬剤として許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって調製される従来の剤形で、そのようなヒトまたは他の動物に投与することができる。当業者には、薬剤として許容される担体または希釈剤の形態または特性が、組み合わされる活性成分の量、投与経路、および他の周知の変数によって決定されることが認識されよう。当業者には、１つ以上の種の本発明による結合分子を含むカクテルが、特に効果的であることを立証し得ることがさらに理解されよう。
【０５２７】
本発明の実践は、別様に示されていない限り、当技術分野の技能内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換え生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技法を用いる。かかる技法は文献に完全に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８５）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，（１９８４）、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，１９５号、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＶｏＩｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照されたい。
【０５２８】
抗体工学の一般的原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９５）に記載される。タンパク質工学の一般的原理は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ，Ｅｄｓ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．（１９９５）に記載される。抗体および抗体−ハプテン結合の一般的原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４）、およびＳｔｅｗａｒｄ，Ｍ．Ｗ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）に記載される。さらに、当技術分野において既知であり、具体的には記載していない、免疫学における標準的な方法は、概して、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ），Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  −Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ  ｅｄ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）、およびＭｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）に従う。
【０５２９】
免疫学の一般的原理について記載する標準的な参考資料には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ＳｅＩｆ−Ｎ  ｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）、Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ  Ｂｕｒｄｅｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４）、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  ｅｄ．Ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ．Ｋｉｎｄｔ  ａｎｄ  Ｂａｒｂａｒａ  Ａ．Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ  ＆  Ｃｏ．（２０００）、Ｒｏｉｔｔ，Ｌ，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍａｌｅ  Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６ｔｈ  ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）、Ａｂｂａｓ  Ａ．，Ａｂｕｌ，Ａ．ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｅｄ．５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｎ（２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）、Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩＩ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ（２００３）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）が含まれる。
【０５３０】
上記に引用した参照文献の全て、ならびにここで引用した全ての参照文献は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０５３１】
実施例１
ファージディスプレイから抽出されるＦａｂ抗体の生成および変換
【０５３２】
組換えヒトおよびマウスＲＯＮ外部ドメインタンパク質を使用して、３．５×１０１０のユニーククローンを含有するヒト未処理ファージミドのＦａｂライブラリーをスクリーニングした（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：３４４−８（２００５））。ファージライブラリーを用いてインキュベートする前に、ビオチン化ＲＯＮタンパク質を、ストレプトアビジンをコーティングした電磁ビーズ上に捕捉した。選択は、すでに記載したように行った（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（３）：３４４−８（２００５））。ヒトＲＯＮｓｅｍａ外部ドメイン、およびヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合された全長マウス外部ドメイン（ｍｕＲＯＮ−Ｆｃ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用する、３つのはっきり異なるパニングアームが続いた。アーム１は、ヒトＲＯＮｓｅｍａドメインタンパク質を３ラウンドパニングした。アーム２は、ｍｕＲＯＮ−Ｆｃタンパク質を３ラウンドパニングした。アーム３は、ヒトタンパク質を２ラウンド、およびマウスタンパク質を３ラウンド目にパニングした。３ラウンドのパニング後、４７９ｂｐ遺伝子ＩＩＩ断端をＭｌｕＩ消化によって除去し、該ベクターを、ＴＧ１細胞中での可溶性Ｆａｂ発現のために再連結した。ヒトＲＯＮｓｅｍａドメインのパニング（アーム１）からの９６０個のクローンのＥＬＩＳＡ分析から、５２個の固有配列を含有する、３１４個の陽性クローンが得られた。アーム２および３からの１９２０個のクローンのＥＬＩＳＡ分析から、６５個の固有配列を含有する、２８２個の陽性クローンが得られた。ユニーククローンを精製し、ＥＬＩＳＡ、ならびに全長ヒトおよびマウスＲＯＮを安定に形質移入したＣＨＯ細胞によって、組換えヒトＲＯＮｓｅｍａ外部ドメインおよびｍｕＲＯＮ−Ｆｃへの結合が確認された。結合データに基づき、アーム１から単離された４個のクローン、およびアーム２および３から単離された５個のクローンを、さらなる分析のために選択した：Ｍ９３−Ｄ０２、Ｍ９６−Ｃ０５、Ｍ９７−Ｄ０３、Ｍ９８−Ｅ１２、Ｍ１４−Ｈ０６、Ｍ１５−Ｅ１０、Ｍ１６−Ｃ０７、Ｍ２３−Ｆ１０、およびＭ８０−Ｂ０３。
実施例２
マウスモノクローナル抗体の生成
免疫化および血液採取
【０５３３】
９週齢の雌Ｒｂｆマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ））を、１．６ｍｇ／ｍｌ樹脂の最終ビーズ密度の２５μｌのＴａｌｏｎ金属キレート樹脂（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）に固定化した、４０．５μｇのｈＲＯＮ−１０  Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）で、腹腔内（ＩＰ）免疫化した。続いて、同様に１．６ｍｇ／ｍｌ樹脂の最終ビーズ密度で、さらに２回の２５μｇの注射を腹腔内に実施した。２回の２５μｇの注射後、リンパ組織を収集する３日前に、ＲＩＢＩアジュバント中の５０μｇの前融合投与（ＩＰ）を行った。
【０５３４】
免疫化されたマウスからの血清試料は、最初の免疫化の前、最初の追加免疫の７日後、続く２回の免疫化のそれぞれの後、およびリンパ球回収の直前に、後部眼窩叢（ｒｅｔｒｏ  ｏｒｂｉｔａｌ  ｐｌｅｘｕｓ）回収方法によって回収した。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ検定を用いて、血清力価を測定した。
固相検定（ＥＬＩＳＡ）
【０５３５】
Ｍａｘｉｓｏｒｐの９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）を、５０μｌ／ウェルの、ダルベッコのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の１μｇ／ｍｌ試料のｈＲＯＮ−１０  Ｈｉｓで、終夜コーティングした。次いで、プレートを空にして、自動プレート洗浄機（Ｓｋａｔｒｏｎ）を使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０の溶液で３回洗浄した。洗浄手順後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の濾過された１％  ＢＳＡのブロッキング溶液をウェルに充填し、１時間室温でインキュベートさせた。プレートのブロッキング後、プレートを軽く打ってきれいにし、血清、前血清（ｐｒｅ−ｓｅｒｕｍ）、対照試料、またはブロッキング緩衝液中の希釈されたｍＡｂ上澄み（モノクローナルを産生するハイブリドーマからの）の５０μｌの連続希釈液をすぐに添加し、ＥＬＩＳＡプレートを１時間室温でインキュベートさせた。プレートを上記のように４回洗浄し、その後ブロッキング緩衝液中の５０μｌの１：５０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）を各ウェルに添加し、再び１時間室温でインキュベートさせた。プレートを上記のように５回洗浄し、その後５０μｌのＵｌｔｒａ  ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）基質を添加し、次いで約１０分間触媒させた。等容量の２．０Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して酵素反応を止め、プレートを、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３８４  Ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）自動プレートスキャナーによって４５０ｎｍで読み取った。Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）分析ソフトウェアを使用して、ＥＬＩＳＡ分析を完了した。
フローサイトメトリー検定
【０５３６】
ＳＷ４８０およびＨＴ１０８０細胞株に対して、フローサイトメトリー検定を行った。細胞単離は、まず成長培地を除去し、２０ｍｌの滅菌ＰＢＳで細胞単層を穏やかに２回洗浄し、細胞残屑および代謝された成長培地を除去することによって、Ｔ１６２フラスコ（Ｎｕｎｃｌｏｎ）から細胞単層を持ち上げることによって実行した。それぞれの洗浄後、吸引によってＰＢＳ洗浄液を穏やかに除去した。次いで、１０ｍｌの非酵素Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ、カタログＣ５９１４）を各フラスコに添加し、組織培養プラスチックから細胞単層が剥離するように、断続的に軽く叩いて振盪させながら、２〜５分間インキュベートさせた。１５〜２０ｍｌの成長培地を各フラスコに添加し、５０ｍｌ滅菌管に移す前に、細胞を穏やかに混合した。細胞を１２００ＲＰＭで４分間遠心分離して、細胞ペレットを沈降させた。計数およびＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中の１％  ＢＳＡ）に懸濁させる前に、２０ｍｌの滅菌ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。
【０５３７】
蛍光を可視化するために、細胞染色を実行した。全ての細胞染色ステップは、氷上または４℃で実行した。まず、洗浄した細胞を、血球計数器によってトリパンブルー排除法を使用して計数し、ＦＡＣＳ緩衝液中の１〜２×１０６／ｍｌに懸濁し、９６ウェルのＶ底またはＵ底プレートのいずれかに、１ウェル当たり５０μｌを蒔いた。次に、５０μｌの一次抗体（希釈し精製された対照抗体、血清抗体、またはｍＡｂの上澄み）を各ウェルに添加し、プレートを３０分間氷上に放置した。該細胞を３回洗浄した。各洗浄サイクルは、１５０μｌのＦＡＣ緩衝液を各ウェルに添加し、プレートを１３００ｒｐｍで４分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、細胞ペレットを軽く叩いてほぐし、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を各ウェルに添加し、その後プレートを１３００ｒｐｍで４分間遠心分離して、実行した。３回目の洗浄後、上澄みを廃棄して、細胞ペレットを軽く叩いてほぐした。次に、５０μｌの二次抗体のワーキング溶液（製造会社の推奨に従って１：２００）を、各ウェルに添加した。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂからの、種に特異的なフルオレセイン（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）に共役した、第２の抗体を使用した。二次抗体の添加後、プレートをホイルで被覆し、振盪させ、その後氷上または４℃で３０分間保存した。次いで、固定化する前に、細胞を（上記のように）３回洗浄した。細胞を固定化するために、２００μｌの固定緩衝液（ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒド）を各ウェルに添加した。次いで、プレートを振盪させて、フローサイトメトリーによって読み取るか、または４℃で保存した。４８時間または７２時間後にプレートを読み取った。これらの検定では、以下の抗体対照を使用した：マウス免疫血清、マウス前血清、マウスｍＡｂ６９１（Ｒ＆Ｄ）。
ハイブリドーマの発生
【０５３８】
Ｉｇ−／ＨＧＰＲＴ−Ｂａｌｂ／ｃマウス骨髄腫細胞株のＡＰＲＴ−誘導体である、ＦＬ６５３、およびＩｇ−／ＨＧＰＲＴ−Ｂａｌｂ／ｃマウス骨髄腫細胞株である、ＳＰ２／０−Ａｇｌ４を、リンパ球細胞融合実験前の少なくとも１０日間、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、Ｌ−グルタミン、および２０μｇ／ｍｌの８−アザグアニン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を含有する、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中の１０％ウシ胎仔血清中で培養した。骨髄腫細胞は、空気雰囲気中３７℃、７％  ＣＯ２を含む９８％の湿潤環境を維持するようにプログラムされた、Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ（商標）モデルのウォータージャケット式インキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ））中で培養した。
【０５３９】
ｈＲＯＮ  １０  Ｈｉｓ抗原に特異的な抗体について、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳで陽性であるとスクリーニングされたマウスを殺処理し、脾臓Ｂリンパ球を無菌的に収集した。脾臓Ｂリンパ球を洗浄し、Ｋｅｎｎｅｔら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２））による、ＦＬ６５３またはＳＰ２／０−Ａｇｌ４のいずれかの骨髄腫に融合される、ＰＥＧが媒介するリンパ球の体細胞融合で使用するために調製した。融合した細胞を、２４ウェルの滅菌組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｇｌａｓｓ  Ｗｏｒｋｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ））に蒔き、ＦＬ６５３またはＳＰ２／０−Ａｇｌ４骨髄腫に基づく融合に、培養基を含有するそれぞれアデニン、アミノプテリン、およびチミジン（ＡＡＴ）、またはヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを与えた。細胞培養環境は、空気雰囲気中３７°Ｃ、７％  ＣＯ２を含む９８％の湿潤環境を維持した。
【０５４０】
１０日後、ＡＡＴまたはＨＡＴ耐性培養物を単離し、すでに記載したように、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ型）およびＦＡＣＳ（ＳＷ４８０  ｈＲＯＮ＋／ＨＴ１０８０  ｈＲＯＮ−）型のｈＲＯＮの両方に特異的な免疫反応性について、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。その後、陽性培養物をクローン化し、拡大し、凍結した。クローン化は、限界希釈（約１細胞／ウェル）によって実行し、選択したクローンのクローン起源を確実にするように、成長時に顕微鏡によってスコア化した。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳの両方の形式の検定で陽性とスクリーニングされたクローンを凍結のために拡大しＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してサブクラスを特徴付け、モノクローナル産生レベルについて検定し、ミリグラムレベルの量の選択したモノクローナル抗体のために、１Ｌｉｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｇｓ（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）へ移した。
実施例３
マウス抗ヒトＲＯＮ機能遮断Ｍａｂのクローン化
マウスハイブリドーマの免疫グロブリン可変領域のクローン化
【０５４１】
マウスハイブリドーマ細胞からの全細胞ＲＮＡを、製造会社の推奨プロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニキットを使用して調製した。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを、１本鎖ｃＤＮＡの刺激に無作為の六量体を使用して、全細胞ＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲによってクローン化した。無傷のシグナル配列を有する、マウス免疫グロブリン可変ドメインのＰＣＲ増幅のために、複数のマウス免疫グロブリン遺伝子ファミリーのシグナル配列にハイブリダイズする縮重順方向プライマーと、マウス定常ドメインの５’末端に特異的な単一逆方向プライマーとのカクテル。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクターに、製造会社の推奨プロトコルに従って、そのＴＯＰＯクローン化キットを使用してサブクローン化した。複数の独立したサブクローンからの挿入断片を配列決定して、コンセンサス配列を確立した。推定された成熟免疫グロブリンのＮ末端は、ハイブリドーマからのＥｄｍａｎ分解によって決定されたものと一致した。特定の亜群への割当は、  
Ｋａｂａｔデータベースからのコンセンサス免疫グロブリン可変ドメイン配列を使用する、ＢＬＡＳＴ分析に基づく。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義を用いて指定される。
１Ｐ３Ｂ２．２
【０５４２】
配列番号５４として以下に示すものは、１Ｐ３Ｂ２．２成熟重鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線が引かれている。
【化４】
2011509687.tif 000010
【０５４３】
これは、マウス亜群ＩＩ（Ａ）重鎖である。配列番号５３として以下に示すものは、１Ｐ３Ｂ２．２重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ３６３から）のＤＮＡ配列であり、シグナル配列に下線が引かれている（重鎖コードシグナルは、ＭＧＷＩＣＩＦＬＦＬＶＳＶＴＴＧＶＨＳである（配列番号１０３））。
【化５】
2011509687.tif 000011
【０５４４】
配列番号５９として以下に示すものは、１Ｐ３Ｂ２．２成熟軽鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線が引かれている。
【化６】
2011509687.tif 000012
【０５４５】
これは、マウス亜群Ｖカッパ軽鎖である。（ＣＤＲ３の普通でない不対システインに留意されたい）。配列番号５８として以下に示すものは、軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ３５９から）ＤＮＡ配列であり、シグナル配列に下線が引かれている（軽鎖コードシグナルは、ＭＲＡＰＡＱＦＬＧＬ  ＬＬＬＷＬＴＧＡＲＣである（配列番号１０４））。
【化７】
2011509687.tif 000013
１Ｐ４Ａ３．３
【０５４６】
配列番号６４として以下に示すものは、１Ｐ４Ａ３．３成熟重鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線が引かれている。
【化８】
2011509687.tif 000014
【０５４７】
これは、マウス亜群ＩＩ（Ａ）重鎖である。配列番号６３として以下に示すものは、１Ｐ４Ａ３．３重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ３６７から）のＤＮＡ配列であり、シグナル配列に下線が引かれている（重鎖コードシグナルは、ＭＧＷＳＷＶＦＬＬＩ  ＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１０５））。
【化９】
2011509687.tif 000015
【０５４８】
配列番号６９として以下に示すものは、１Ｐ４Ａ３．３成熟軽鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線が引かれている。
【化１０】
2011509687.tif 000016
【０５４９】
これは、マウス亜群Ｖカッパ軽鎖である。配列番号６８として以下に示すものは、軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ３６０から）のＤＮＡ配列であり、シグナル配列に下線が引かれている（軽鎖コードシグナルは、ＭＲＳＰＡＱＦＬＧＬ  ＬＬＬＷＬＴＧＡＲＣ（配列番号１０６））。
【化１１】
2011509687.tif 000017
【０５５０】
１Ｐ３Ｂ２．２および１Ｐ４Ａ３．３のＭＡｂは、高度に相同である。以下に示すものは、１Ｐ３Ｂ２．２（上）および１Ｐ４Ａ３．３（下）の重鎖のアラインメントであり、９４．８％の同一性を共有する。
【化１２】
2011509687.tif 000018
【０５５１】
以下に示すものは、１Ｐ３Ｂ２．２（上）および１Ｐ４Ａ３．３（下）の軽鎖のアラインメントであり、９０．７％の同一性を共有する。
【化１３】
2011509687.tif 000019
１Ｐ５Ｂ１０．３
【０５５２】
配列番号７４として以下に示すものは、１Ｐ５Ｂ１０．３成熟重鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線が引かれている。
【化１４】
2011509687.tif 000020
【０５５３】
これは、マウス亜群ＩＩ（Ａ）重鎖である。配列番号７３として以下に示すものは、１Ｐ５Ｂ１０．３重鎖可変ドメイン（ｐＹＬ３５８から）のＤＮＡ配列であり、シグナル配列に下線が引かれている（重鎖コードシグナルは、ＭＧＣＳＷＶＭＬＦＬ  ＬＳＧＴＡＧＶＨＳ（配列番号１０７））。
【化１５】
2011509687.tif 000021
【０５５４】
配列番号７９として以下に示すものは、１Ｐ５Ｂ１０．３成熟軽鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線が引かれている。
【化１６】
2011509687.tif 000022
【０５５５】
これは、マウス亜群Ｉカッパ軽鎖である。配列番号７８として以下に示すものは、軽鎖可変ドメイン（ｐＹＬ３６８から）のＤＮＡ配列であり、シグナル配列に下線が引かれている（軽鎖コードシグナルは、ＭＶＳＳＡＱＦＬＶＦ  ＬＬＦＷＩＰＡＳＲＧ（配列番号１０８））。
【化１７】
2011509687.tif 000023
１Ｐ４Ａ１２．２
【０５５６】
配列番号８４として以下に示すものは、１Ｐ４Ａ１２．２成熟重鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線が引かれている。
【化１８】
2011509687.tif 000024
【０５５７】
これは、マウス亜群ＩＩ（Ａ）重鎖である。配列番号８３として以下に示すものは、１Ｐ５Ｂ１０．３重鎖可変ドメイン（ｐＣＮ５５８から）のＤＮＡ配列であり、シグナル配列に下線が引かれている（重鎖コードシグナルは、ＭＧＣＳＣＶＭＬＦＬ  ＬＳＧＴＡＧＶＲＳ（配列番号１０９））。
【化１９】
2011509687.tif 000025
【０５５８】
配列番号８９として以下に示すものは、１Ｐ５Ｂ１０．３成熟軽鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線が引かれている。
【化２０】
2011509687.tif 000026
【０５５９】
これは、マウス亜群カッパＩ軽鎖である。配列番号８８として以下に示すものは、軽鎖可変ドメイン（ｐＣＮ５５９から）のＤＮＡ配列であり、シグナル配列に下線が引かれている（軽鎖コードシグナルは、ＭＶＳＳＡＱＦＬＶＦ  ＬＬＦＷＩＰＡＳＲＧ（配列番号１１０））。
【化２１】
2011509687.tif 000027
【０５６０】
１Ｐ５Ｂ１０．３および１Ｐ４Ａ１２．２のＭＡｂは、高度に相同である。以下に示すものは、１Ｐ５Ｂ１０．３（上）および１Ｐ４Ａ１２．２（下）の重鎖のアラインメントであり、９２．５％の同一性を共有する。
【化２２】
2011509687.tif 000028
【０５６１】
以下に示すものは、１Ｐ５Ｂ１０．３（上）および１Ｐ４Ａ１２．２（下）の軽鎖のアラインメントであり、９７．２％の同一性を共有する。
【化２３】
2011509687.tif 000029
１Ｐ２Ｅ７．３
【０５６２】
配列番号９４として以下に示すものは、１Ｐ２Ｅ７．３成熟重鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線が引かれている。
【化２４】
2011509687.tif 000030
【０５６３】
これは、マウス亜群Ｉ（Ａ）重鎖である。配列番号９３として以下に示すものは、１Ｐ２Ｅ７．３重鎖可変ドメイン（ｐＣＮ５５６から）のＤＮＡ配列であり、シグナル配列に下線が引かれている（重鎖コードシグナルは、ＭＲＶＬＩＬＬＷＬＦ  ＴＡＦＰＧＩＬＳ（配列番号１１１））。
【化２５】
2011509687.tif 000031
【０５６４】
配列番号９９として以下に示すものは、１Ｐ２Ｅ７．３成熟軽鎖可変ドメインのタンパク質配列であり、ＣＤＲに下線が引かれている。
【化２６】
2011509687.tif 000032
【０５６５】
これは、マウス亜群ＩＩカッパ軽鎖である。配列番号９９として以下に示すものは、１Ｐ２Ｅ７．３軽鎖可変ドメイン（ｆｒｏｍ  ｐＣＮ５５７）のＤＮＡ配列であり、シグナル配列に下線が引かれている（重鎖コードシグナルは、ＭＭＳＰＡＱＦＬＦＬ  ＬＶＬＳＩＱＥＩＮＧ（配列番号１１２））。
【化２７】
2011509687.tif 000033
実施例４
フローサイトメトリーによるマウスモノクローナル抗体のＲＯＮを発現する腫瘍細胞への結合
【０５６６】
ＲＯＮを発現する腫瘍細胞へのＲＯＮ抗体の結合を、フローサイトメトリーによって分析し、見かけの親和性を算出した。集密的なＳＷ４８０細胞を５ｍＭ  ＥＤＴＡで剥離し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＦＣＳ、０．０５％アジ化ナトリウム、１倍ＰＢＳ）で１回洗浄し、０．５〜１．０×１０７／ｍｌで再懸濁した。該細胞を、９６ウェルのＶ底ポリプロピレンプレートに１００μｌ／ウェルで添加した。抗体希釈液を、ＦＡＣＳ緩衝液中２倍最終濃度で作製し、１００μｌ／ウェルでプレートに添加した。プレートを１時間４℃でインキュベートし、その後ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。次いで、細胞ペレットを、１５０μｌのＰＥ標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ二次抗体中で再懸濁し、１／２００に希釈し、１時間４℃でインキュベートした。次いで、該細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、１５０μｌの３％ホルムアルデヒドを用いて、室温で１０分間固定化した。細胞ペレットを１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、ＦＡＣＳによって分析した。ＳＷ４８０のＲＯＮ細胞上の抗体１Ｐ５Ｂ１０、１Ｐ４Ａ３、１Ｐ２Ｅ７、１Ｐ３Ｂ２、および１Ｐ４Ａ１２の代表的なＦＡＣＳ滴定を図１に示す。結合のＥＣ５０は、標準的な４Ｐ近似式を使用して、結合曲線から算出された。幾つかの抗体の見かけの親和性を表５に示す。これらのデータは、該抗体がヒトＲＯＮに結合することを示す。
【表５】
2011509687.tif 000034
実施例５
抗ＲＯＮ抗体はＭＳＰ−ＲＯＮ結合を遮断する
【０５６７】
標準的なＥＬＩＳＡプロトコルを使用して、抗体またはＦａｂがＭＳＰのＲＯＮへの結合を遮断する能力を測定した。手短に述べると、可溶性ＲＯＮタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ１９４７）を、終夜４℃で、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの濃度でＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。プレートを、自動洗浄機を用いて、ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄した。次いで、プレートを、ＰＢＳ＋１％プロテアーゼフリー、ＩｇＧフリーのＢＳＡ（Ｊａｃｋｓａｎ  Ｌａｂｓ  ００１−０００−１６２）中で、１〜２時間室温でブロッキングした。洗浄後、ブロッキング緩衝液中の抗体またはＦａｂの連続希釈液をプレートに添加した（２００μｌ／ウェル）。ブロッキング緩衝液中２００ｎｇ／ｍｌの濃度のＭＳＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃４３０６−ＭＳ）をプレートに添加し（１０μｌ／ウェル）、混合物を１〜２時間、室温でインキュベートした。プレートを再び自動洗浄機（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で４回洗浄した。次に、プレートを、ブロッキング緩衝液中０．５μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化ヤギ抗ＭＳＰポリクローナル（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＢＡＦ  ３５２）中で、０．５〜１時間室温でインキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、ブロッキング緩衝液中で１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＤＹ９９８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、０．５〜１時間室温でインキュベートした。最終洗浄ステップ後、プレートを、ＴＭＢ溶液（２５ｍｌ  １００ｍＭ酢酸ナトリウム、クエン酸によりｐＨ６、４μｌ  ３０％  Ｈ２Ｏ２、２５０μｌのＤＭＳＯ中４２ｍＭのＴＭＢ）で５分間展開し、１００μｌ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。プレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５によって、４５０ｎｍの波長で読み取り、Ｓｏｆｔｍａｘ  ｐｒｏ  Ｖ５ソフトウェアを使用してデータを分析した。マウスモノクローナル抗体およびヒトＦａｂを使用したＥＬＩＳＡ検定の結果が、それぞれ図２Ａおよび２Ｂに示され、マウスモノクローナル抗体およびヒトＦａｂは、ＭＳＰのＲＯＮへの結合を遮断できることを示している。
実施例６
抗ＲＯＮ抗体はＭＳＰ依存性のＲＯＮの活性を遮断する
【０５６８】
ＭＳＰが誘発するリン酸化されたＲＯＮの抗体遮断を測定するために、総ＲＯＮタンパク質量をＥＬＩＳＡプレートに捕獲し、その後抗リン酸化チロシン抗体（ｐＲＯＮ  ＤｕｏＳｅｔ  ＩＣ  ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＤＹＣ１９４７）で検出する、ＥＬＩＳＡ捕獲方法を使用した。これらの実験のために、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞（図３Ａ〜Ｂ）、またはＢｘＰＣ−３（図３Ｃ）膵臓癌細胞のいずれかを、ＲＰＭＩ／１０％  ＦＣＳ中、６ウェルの組織培養皿に約８×１０５細胞／ウェルで蒔き、終夜付着させた。翌日、細胞を２．５時間血清不足状態にした。次いで、抗体を１０μｇ／ｍｌの最終濃度（図３Ａおよび３Ｃ）、または各種濃度（図３Ｂ）で該皿に添加して、１５分間インキュベートし、その後、さらに１５分間、１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度でＭＳＰを添加した。次いで、製造会社のプロトコルに従ってプレートを収集した。抗リン酸化チロシン抗体の検出の結果が図３Ａ〜Ｃに示され、マウスモノクローナル抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳癌細胞中でＭＳＰが誘発するＲＯＮのリン酸化を遮断し、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中で、ＲＯＮのリン酸化の用量依存的な遮断が存在し、該抗体は、ＢｘＰＣ−３膵臓癌細胞中でＭＳＰが誘発するＲＯＮのリン酸化を遮断することを示している。
実施例７
抗ＲＯＮ抗体はＭＳＰ非依存性のＲＯＮ活性を遮断する
【０５６９】
ＭＳＰ非依存性シグナリングに対する抗ＲＯＮ抗体の遮断可能性を測定するために、ｐＥＲＫ  ＥＬＩＳＡ検定を使用した（ｐＥＲＫ  １／２  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＫＣＢ１０１８）。リン酸化ＥＲＫは、ＲＯＮ経路の既知の下流シグナルメディエーターである。形質移入のために２９３Ｅ細胞を蒔き（１０ｃｍ皿に３×１０６細胞）、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中で終夜付着させた。２日目、細胞に、空ベクター、野生型ＲＯＮ（図４Ａ）をコードするプラスミド、またはＲＯＮＣＡ（構成的に活性なＭ１２５４Ｔキナーゼドメイン突然変異体、図４Ｂ）をコードするプラスミドを形質移入した。３日目、形質移入した細胞を、黒色／透明底の９６ウェルの組織培養プレートに蒔き、無血清培地中の３０もしくは３μｇ／ｍｌの抗体（または２００ｎｇ／ｍｌのＭＳＰ）で処理した。４日目および５日目、製造会社の指示に従って、プレートを処理した。野生型ＲＯＮおよび構成的に活性なＲＯＮの結果が、それぞれ図４Ａおよび４Ｂに示され、マウスモノクローナル抗体がｐＥＲＫリン酸化を阻止することを示している。これらのデータは、該抗体が、ＭＳＰ非依存性のＲＯＮのシグナリングを遮断することを示している。
【０５７０】
ＢｘＰＣ−３膵臓癌細胞を使用して、同様の実験を行った。これらの実験では、該細胞を黒色／透明底の９６ウェルプレートに直接蒔き、形質移入ステップは行わなかった。結果を図４Ｃに示す。該抗体と共に該ウェルに添加されたＭＳＰで、該抗体の同様の遮断活性が認められた（データ示さず）。
実施例８
抗ＲＯＮ抗体は腫瘍細胞中のｐＡＫＴを遮断する
【０５７１】
腫瘍細胞中のｐＡＫＴのシグナリングに対する抗ＲＯＮ抗体の遮断可能性を、２つの腫瘍細胞株：ＢＸＰＣ３およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３を使用して評価した。これらの実験では、午前中に百万細胞／ウェルを６ウェル皿に蒔き、その後終夜１８時間、ＤＭＥＭ＋１％  ＢＳＡ中で血清不足状態にした。培地を除去し、抗ＲＯＮ抗体を、ＤＭＥＭ中１０μｇ／ｍｌで添加した。細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。ＭＳＰを２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、３０分間３７℃でインキュベートした。細胞可溶化物を調製し、１５μｇを１０％トリス−グリシンゲル上で流出させ、ニトロセルロースに移した。ウエスタンブロットをリン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ＃９２７１）（図５、上パネル）でプローブし、取り除いて、ＡＫＴ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ＃９２７２）（図５、下パネル）で再プローブした。抗体１Ｐ３Ｂ２および１Ｐ４Ａ３を使用して得られた結果が図５に示され、マウスモノクローナル抗体が、腫瘍細胞中でｐＡＫＴのリン酸化を阻止することを示している。
実施例９
抗ＲＯＮ抗体はＲＯＮスプライス変異体に結合する
【０５７２】
抗ＲＯＮ抗体が、ヒトＲＯＮスプライス変異体ＲＯＮｄｅｌｔａ１６０に結合するかどうかを判定するために、２９３Ｅ細胞に、Ｈｕ−ＲＯＮ−Ｐ  １６０（ＭＺ２３６）コンストラクト、またはベクターのみ（偽）を形質移入した。形質移入の２４時間後、細胞をＰＢＳ−５ｍＭ  ＥＤＴＡでプレートから除去し、５μｇ／ｍｌの濃度の抗体で染色し、その後抗マウス二次抗体をＰＥに共役して、ＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳ分析の結果が図６に示され、マウスモノクローナル抗体がＲＯＮｄｅｌｔａ１６０に結合することを示している。
実施例１０
抗ＲＯＮ抗体は高い親和性で可溶性抗原に結合する
【０５７３】
標準的なＥＬＩＳＡプロトコルを使用して、可溶性ＲＯＮに結合する該抗体の能力を測定した。手短に述べると、可溶性ＲＯＮタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ１９４７）を、終夜４℃で、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの濃度でＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中、自動洗浄機で４回プレートを洗浄した。ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ中で１〜２時間、室温でプレートをブロッキングした。洗浄後、ブロッキング緩衝液中の抗体の連続希釈液をプレートに添加し（１００μｌ／ウェル）、１〜２時間室温でインキュベートした。プレートを再び自動洗浄機で４回洗浄した（ＰＢＳ、０．０５％  ｔｗｅｅｎ  ２０）。次に、プレートを、ブロッキング緩衝液中１：４０００の希釈の、ＨＲＰで標識したロバ抗マウスポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  ７１５−０３５−１３０）（１００μｌ／ウェル）で、０．５〜１時間室温でインキュベートした。プレートを再び自動洗浄機で４回洗浄した（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）。最終洗浄ステップ後、プレートをＴＭＢ溶液（２５ｍｌ  １００ｍＭ酢酸ナトリウム、クエン酸によりｐＨ６、４μｌ  ３０％Ｈ２０２、２５０μｌのＤＭＳＯ中４２ｍＭのＴＭＢ）で５分間展開した。反応を１００μｌ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。プレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５によって４５０ｎｍの波長で読み取り、Ｓｏｆｔｍａｘ  ｐｒｏ  Ｖ５ソフトウェアを使用してデータを分析した。結果が図７に示され、該抗体が、高い親和性で可溶性ＲＯＮに結合することを示している。
実施例１１
抗ＲＯＮ抗体はＲＯＮを発現する細胞に結合する
【０５７４】
ＲＯＮを発現する２９３Ｅ細胞へのＲＯＮ抗体の結合を、フローサイトメトリーによって分析し、見かけの親和性を算出した。集密的な２９３Ｅ／ヒトＲＯＮ細胞をトリプシンで剥離し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＦＣＳ、０．０５％アジ化ナトリウム、１倍ＰＢＳ）を用いて０．６×１０７／ｍｌで再懸濁した。該細胞を、９６ウェルの丸底ポリプロピレンプレートに５０μｌ／ウェルで添加した。抗体希釈液を、ＦＡＣＳ緩衝液中２倍最終濃度で作製し、プレートに５０μｌ／ウェルで添加した。プレートを１時間４℃でインキュベートし、その後ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。次いで、細胞ペレットを、１００μｌのフィコエリトリン（ＰＥ）Ｆａｂ’２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃｇ二次抗体（１／２００に希釈）中で再懸濁し、暗所で１時間、４℃でインキュベートした。次いで、該細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドで固定化し、ＦＡＣＳによって分析した。結合曲線から、結合のＥＣ５０を算出した。結果が図８に示され、該抗体が、高い親和性でＲＯＮを発現する２９３細胞に結合することを示している。
実施例１２
抗ＲＯＮ抗体はＲＯＮを発現する細胞へのＭＳＰの結合を遮断する
【０５７５】
ＲＯＮ抗体が、ＲＯＮを発現するＣＨＯ細胞へのＭＳＰの結合を遮断する能力を、フローサイトメトリーで分析した。集密的なＣＨＯ／ヒトＲＯＮ細胞をトリプシンで剥離し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＦＣＳ、０．０５％アジ化ナトリウム、１倍ＰＢＳ）を用いて０．６×１０７／ｍｌで再懸濁した。該細胞を、９６ウェルの丸底ポリプロピレンプレートに５０μｌ／ウェルで添加した。抗体希釈液を、ＦＡＣＳ緩衝液中２倍最終濃度で作製し、プレートに５０μｌ／ウェルで添加した。プレートを１時間４℃でインキュベートし、その後ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。ＭＳＰ（１μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ウェルの容積で細胞ペレットに添加し、３０分間室温でインキュベートし、その後ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。ヤギ抗ヒトＭＳＰ（１０μｇ／ｍｌ）を、３０分間室温で細胞ペレットに添加し、その後ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄した。次いで、細胞ペレットを、１００μｌのＰＥ  Ｆａｂ’２フラグメントロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（１／２００に希釈）中で再懸濁し、暗所で３０分間、室温でインキュベートし、その後、ＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄した。次いで、該細胞を２００μｌのＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドで固定化し、ＦＡＣＳによって分析した。結果が図９に示され、抗ＲＯＮ抗体が、ＲＯＮタンパク質を発現するＣＨＯ細胞へのＭＳＰの結合を減少させたことを示している。
実施例１３
抗ＲＯＮ抗体は腫瘍細胞中でＭＳＰが誘発するｐＥＲＫおよびｐＡＫＴのシグナリングを遮断する
【０５７６】
ＭＳＰが誘発する、ｐＥＲＫおよびｐＡＫＴのシグナリングの抗体遮断を測定するために、２色の赤外蛍光ウエスタンブロット法を使用した。これらの実験のために、細胞を、１２ウェルの組織培養皿に、約５×１０５細胞／ウェルで完全培地／１０％  ＦＢＳに蒔き、終夜付着させた。翌日、細胞を３時間、ＤＭＥＭ中で血清不足状態にした。次いで、抗体を、図１０に示す濃度で該皿に添加し、１５分間インキュベートした。次いで、ＭＳＰを２００ｎｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、細胞をさらに１５分間インキュベートした。全細胞可溶化物を調製し、２０μｇの試料を１０％トリス−グリシンゲル上で分析し、ニトロセルロースへ移した。
【０５７７】
リン酸化ＥＲＫレベルを評価するために、ブロットを、リン酸化ｐ４４／４２  Ｍａｐ  Ｋｉｎａｓｅ（Ｔｈｒ  ２０２／Ｔｙｒ  ２０４）ウサギ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ＃９１０１）、およびｐ４４／４２  Ｍａｐ  Ｋｉｎａｓｅ（Ｌ３４Ｆ１２）マウスｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ＃４６９６）と同時にプローブした。リン酸化ＡＫＴレベルを評価するために、ブロットを、リン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）（５８７Ｆ１１）マウスｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ＃９２７１）およびＡＫＴウサギ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ＃９２７２）と同時にプローブした。検出には、ｐＥＲＫおよびｐＡＫＴの両方のブロットに、ＩＲ  Ｄｙｅで標識された二次抗体を使用し、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージャー（Ｌｉ−ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してブロットをスキャンした。結果は、図１０および１１に示されるように、抗ＲＯＮ抗体が、リン酸化ＥＲＫおよびリン酸化ＡＫＴレベルを低下させることを示している。これは、抗ＲＯＮ抗体が、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞中のＥＲＫおよびＡＫＴのシグナリングを遮断し得ることを示している。また、これらの実験は、他の種類の腫瘍細胞でも行われ、図１２に示すように、抗ＲＯＮ抗体は、他の腫瘍細胞中のＥＲＫおよびＡＫＴのシグナリングも減少させた。
実施例１４
ヒトＭＳＰは可溶性ヒトおよびＣｙｎｏＲＯＮに結合する
【０５７８】
ヒトＭＳＰ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃４３０６）が、可溶性ヒトおよびカニクイザル（マカカ・ファシクラリス）ＲＯＮ（「ＣｙｎｏＲＯＮ」）に結合する能力を、標準的なＥＬＩＳＡプロトコルを使用して測定した。手短に述べると、可溶性ヒトＲＯＮタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ１９４７）または可溶性ＣｙｎｏＲＯＮタンパク質を、終夜４℃で、ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの濃度でＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。ＣｙｎｏＲＯＮのＥＬＩＳＡのために、ＣｙｎｏＲＯＮからの対応するタンパク質配列を、ＣＨＯ細胞から産生および精製した。プレートを、ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０中、自動洗浄機で４回洗浄した。次いで、プレートを、ＰＢＳ＋１％プロテアーゼフリー、ＩｇＧフリーのＢＳＡ（Ｊａｃｋｓａｎ  Ｌａｂｓ  ００１−０００−１６２）中で、１〜２時間室温でブロッキングした。洗浄後、ブロッキング緩衝液中のＭＳＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ  ＃４３０６−ＭＳ）の連続希釈液をプレートに添加し（１００ｍｌ／ウェル）、１〜２時間室温でインキュベートした。プレートを再び自動洗浄機で４回洗浄した（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）。次に、プレートを、ブロッキング緩衝液中０．５ｍｇ／ｍｌの濃度の、ビオチン化ヤギ抗ＭＳＰポリクローナル（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＢＡＦ  ３５２）抗体中で、０．５〜１時間室温でインキュベートした。さらなる洗浄ステップ後、ブロッキング緩衝液中で１：２００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＤＹ９９８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、０．５〜１時間室温でインキュベートした。最終洗浄ステップ後、プレートをＴＭＢ溶液（２５ｍｌ  １００ｍＭ酢酸ナトリウム、クエン酸によりｐＨ６、４μｌ  ３０％Ｈ２Ｏ２、２５０μｌのＤＭＳＯ中４２ｍＭのＴＭＢ）で５分間展開し、１００μｌ  Ｈ２ＳＯ４で停止させた。プレートを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５によって４５０ｎｍの波長で読み取り、Ｓｏｆｔｍａｘ  ｐｒｏ  Ｖ５ソフトウェアを使用してデータを分析した。図１３ＢおよびＣに示すように、ＭＳＰは、ｃｙｎｏＲＯＮおよびヒトＲＯＮの両方に結合する。図１３Ａは、抗ＲＯＮ抗体がｃｙｎｏＲＯＮ、ならびにヒトＲＯＮに結合することを示している。実施例１０に記載したように、抗体結合実験を行った。
実施例１５
抗ＲＯＮ抗体は細胞の浸潤を遮断する
【０５７９】
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が誘発する、またはＭＳＰが誘発する腫瘍細胞の浸潤の、抗体の遮断を測定するために、８．０ミクロンのマトリゲルでコーティングされたＦｌｕｏｒｏｂｌｏｋ（商標）トランスウェルインサートを使用した（ＢＤ、カタログ＃３５４１６６）。手短に述べると、マトリゲルをコーティングしたインサートを、２時間３７℃の非ＣＯ２環境中、５００μｌのＰＢＳで再水和した。再水和後、ＰＢＳを除去した。血清不足状態にあった腫瘍細胞をトリプシンで剥離し、５×１０４細胞／ｍｌの無血清培地中で再懸濁した。次いで、腫瘍細胞を、検定に添加する前に、抗体で３０分間前インキュベートした。次に、７５０μｌの化学誘引物質（１０％  Ｈｅａｔ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ−ＦＢＳまたは２００ｎｇ／ｍｌ  ＭＳＰ）を下部チャンバーに添加し、５００μｌの細胞＋／−抗体を上部チャンバーに添加した。該細胞および化学誘引物質を、５％  ＣＯ２中、４８時間３７℃でインキュベートした。インキュベート後、培地を上部チャンバーから除去した。次いで、インサートを、５００μｌ／ウェルのハンクス液（ＨＢＳＳ）中４μｇ／ｍｌカルセインアセトキシメチルエステル（ＡＭ）を含む、第２の２４ウェルのプレートに移し、１時間３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。浸潤した細胞の蛍光は、ＴＥＣＡＮ  ＧＥＮｉｏｓ  Ｐｒｏ蛍光プレートリーダーを使用して、４９４／５１７ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ）の波長で読み取った。結果が図１４に示され、抗ＲＯＮ抗体が、腫瘍細胞の浸潤を遮断し得ることを示している。
実施例１６
抗ＲＯＮ抗体のマッピング
【０５８０】
ＲＯＮのＰＳＩドメイン（Ｇ５０２−Ｐ５４４）を、チオレドキシン融合タンパク質として大腸菌に発現させた。タンパク質をＮｉＮＴＡアガロース（ｑｉａｇｅｎ）上、その後調製用サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）で精製した。このタンパク質を使用して、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、実施例１０で可溶性ＲＯＮへの抗体の結合について上述したものと同一プロトコルを使用して、結合について抗体を分析した。図１５に示す結果は、抗ＲＯＮ抗体が、ＳＥＭＡおよびＰＳＩドメインを含有する可溶性ＲＯＮタンパク質に結合する一方、ＰＳＩドメインのみには結合しないことを示している。
実施例１７
抗マウスＲＯＮ抗体は２９３細胞上のマウスＲＯＮに結合する
【０５８１】
マウスＲＯＮを発現する２９３Ｅ細胞へのＲＯＮ抗体の結合を、フローサイトメトリーによって分析し、見かけの親和性を算出した。集密的な２９３Ｅ／マウスＲＯＮ細胞をトリプシンで剥離し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＦＣＳ、０．０５％アジ化ナトリウム、１倍ＰＢＳ）を用いて０．６×１０７ｍｌで再懸濁した。該細胞を、９６ウェルの丸底ポリプロピレンプレートに５０μｌ／ウェルで添加した。抗体希釈液を、ＦＡＣＳ緩衝液中２倍最終濃度で作製し、プレートに５０μｌ／ウェルで添加した。プレートを１時間４℃でインキュベートし、その後ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。次いで、細胞ペレットを、１００μｌのＰＥ  Ｆａｂ’２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃｇ二次抗体（１／２００に希釈）中で再懸濁し、暗所で１時間、４℃でインキュベートした。次いで、該細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドで固定化し、ＦＡＣＳによって分析した。結合曲線から、結合のＥＣ５０を算出した。データが図１６に示され、該抗体が、高い親和性でマウスＲＯＮを発現する細胞に結合することを示している。
実施例１８
抗マウスＲＯＮ抗体はｐＡＫＴのシグナリングを遮断する
【０５８２】
抗マウスＲＯＮ抗体が、ＲＯＮのシグナリングも遮断することができるかどうかを判定するために、マウスＲＯＮを発現するＣＨＯ細胞株中のｐＡＫＴのシグナリングを測定した。細胞を、ＭＳＰの存在下または不在下で、各種濃度の抗マウスＲＯＮ抗体中で培養した。リン酸化されたＡＫＴのレベルは、実施例１３に記載したプロトコルを使用して評価した。結果を図１７に示す。ＲＯＮ抗体の存在下でのリン酸化ＡＫＴのレベルの低下は、抗マウスＲＯＮ抗体がｐＡＫＴのシグナリングを遮断することを示している。
実施例１９
抗マウスＲＯＮ抗体はヒトＲＯＮに弱く結合する
【０５８３】
抗マウスＲＯＮ抗体が、ヒトＲＯＮにも結合するかどうかを判定するために、マウスおよびヒトＲＯＮタンパク質を２９３細胞に発現させた。該ＲＯＮを発現する細胞への抗体の結合は、実施例８および１６で上述したＦＡＣＳ分析を使用して判定された。図１８に示す結果は、抗マウスＲＯＮ抗体が、マウスおよびヒトの両方のＲＯＮタンパク質に結合するが、マウスＲＯＮにより大きな親和性を有することを示している。
実施例２０
ＲＯＮは複数のヒト腫瘍細胞株上に発現してシグナリングする
【０５８４】
ＲＯＮを発現する腫瘍へのＲＯＮ抗体の結合を、フローサイトメトリーによって分析した。これらの実験では、周密的な腫瘍細胞をトリプシンで剥離し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％  ＦＣＳ、０．０５％アジ化ナトリウム、１倍ＰＢＳ）を用いて０．６×１０７／ｍｌで再懸濁した。該細胞を、９６ウェルの丸底ポリプロピレンプレートに５０μｌ／ウェルで添加した。抗体希釈液を、ＦＡＣＳ緩衝液中２倍最終濃度で作製し、プレートに５０μｌ／ウェルで添加した。プレートを１時間４℃でインキュベートし、その後ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、細胞ペレットを、１００μｌのＰＥ  Ｆａｂ’２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃｇ二次抗体（１／２００に希釈）中で再懸濁し、暗所で３０分間、室温でインキュベートした。次いで、該細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドで固定化し、ＦＡＣＳによって分析した。該細胞上の相対的レベルのＲＯＮの発現が、ＭＦＩから判定された。結果を、図１９に示す表に要約する。試験されたヒト腫瘍細胞株のほとんどがＲＯＮを発現した。加えて、ＭＳＰが誘発するｐＡＫＴおよびｐＥＲＫのレベルを判定する実験は、実施例１３に記載したように行った。図１９は、無処置試料中のｐＡＫＴおよびｐＥＲＫと比較した、ＭＳＰが誘発するｐＡＫＴおよびｐＥＲＫの増大倍数を示す。ＭＳＰが誘発するｐＡＫＴおよびｐＥＲＫの高レベルは、ＲＯＮが、これらの腫瘍細胞株のうちの多くでシグナリングすることを示している。
実施例２１
抗ＲＯＮ抗体は腫瘍成長を鈍化させる
【０５８５】
腫瘍成長に対する抗ＲＯＮ抗体の効果を判定するために、乳腺腫瘍モデルに対する抗ヒトＲＯＮ抗体の効果を観察した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＡＴＣＣ）乳癌細胞を、５％  ＣＯ２環境中で３７℃に維持し、１０％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で、抗生物質を伴わずに培養した。７週齢の雌ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウス（ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＮＣｒＣｒｌ）の右側腹部に、Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックス（ＢＤ）と１：１で混合した、２００μｌの培地（血清を含まない）中に懸濁した５×１０６細胞を、皮下（ＳＣ）接種した。体重および腫瘍測定（長さ（Ｌ）および幅（Ｗ））を、少なくとも週２回記録した。腫瘍容積は、式：Ｌ×Ｗ２／２＝ｍｍ３を使用して算出した。腫瘍の大半が１５０〜３００ｍｍ３に達した時に（２９日目）、マウスを処置群および対照群に割り当てた。腫瘍は、群全体でサイズ適合した。２９日目から、４０ｍｇ／ｋｇの１Ｐ３Ｂ２を、腹腔内（ＩＰ）注射で週２回、合計１３の用量を投与した。同一日程で、対照群に滅菌食塩水（０．９％）をＩＰ投与した（１０ｍｌ／ｋｇ）。さらに、２９日目および５０日目に、対照群にクエン酸塩媒体（１０ｍＭクエン酸塩緩衝液、ｐＨ５．５、１３５ｍＭ塩化ナトリウム）を静脈内（ＩＶ）投与した（１０ｍｌ／ｋｇ）。対照群の投薬は、本研究で使用された投薬レジメンのうちの最も厳密なものをモデルとし、本明細書で言及されていない、本研究に含まれる他の群のレジメンを反映している。
【０５８６】
各データ点で、ＳｔｕｄｅｎｔのＴ検定（片側、両側）を使用して、対照群の平均腫瘍容積と比較した、１Ｐ３Ｂ２試験群の平均腫瘍容積における差異の統計的有意性を判定した。結果は、図２０にグラフ化され、１Ｐ３Ｂ２処置マウスの腫瘍が、食塩水で処置したマウスのものより有意に小さいことを示している。本データは、抗ヒトＲＯＮ抗体が腫瘍成長を減少させることを示している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年9月27日(2010.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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