(57)【要約】  本発明は、例えば、心筋梗塞後、CABG（冠動脈バイパス移植）、PCI（経皮冠動脈インターベンション）、移植手術などの心臓手術の間及び後に、虚血又は再灌流事象によって引き起こされる心臓の障害又は間接的な後遺症の治療又は予防用の、並びに冠動脈疾患又は心不全、例えば、うっ血性心不全の治療又は予防用の、医薬を製造するための、尿酸オキシダーゼ、好ましくは、組換え尿酸オキシダーゼ、例えば、ラスブリカーゼの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血又は再灌流事象によって引き起こされる心臓の障害又は間接的な後遺症の治療又は予防用の医薬を製造するための尿酸オキシダーゼの使用。
【請求項２】
心不全の治療又は予防用の医薬を製造するための、請求項１に記載の尿酸オキシダーゼの使用。
【請求項３】
うっ血性心不全の治療又は予防用の医薬を製造するための、請求項１又は２に記載の尿酸オキシダーゼの使用。
【請求項４】
心臓手術の間及び後に虚血又は再灌流事象によって引き起こされる心臓の障害又は間接的な後遺症の治療又は予防用の医薬を製造するための、請求項１に記載の尿酸オキシダーゼの使用。
【請求項５】
冠動脈バイパス移植、経皮冠動脈インターベンション又は移植手術の間及び後に虚血又は再灌流事象によって引き起こされる心臓の障害又は間接的な後遺症の治療又は予防用の医薬を製造するための、請求項１又は４に記載の尿酸オキシダーゼの使用。
【請求項６】
心筋梗塞の治療又は予防用の医薬を製造するための、請求項１に記載の尿酸オキシダーゼの使用。
【請求項７】
尿酸オキシダーゼが組換え尿酸オキシダーゼである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
尿酸オキシダーゼがラスブリカーゼである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
H2O2スカベンジャーと共の、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
H2O2スカベンジャーがアスコルビン酸である、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、心筋梗塞後、CABG（冠動脈バイパス移植）、PCI（経皮冠動脈インターベンション）、移植手術などの心臓手術の間及び後に、虚血又は再灌流事象によって引き起こされる心臓の障害又は間接的な後遺症の治療又は予防用の、並びに冠動脈疾患又は心不全、例えば、うっ血性心不全の治療又は予防用の、医薬を製造するための、尿酸オキシダーゼ、好ましくは、組換え尿酸オキシダーゼ、例えば、ラスブリカーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿酸は、鳥、爬虫類動物、霊長類動物及びヒトにおけるプリン代謝の最終産物であり、キサンチン及びヒポキサンチンの酸化によって肝臓において産生される。全ての他の哺乳動物において、尿酸は、酵素、尿酸オキシダーゼによってアラントインへさらに酸化される。しかし、ヒトは、この酵素を欠いている。尿酸は水溶性（water solubitlity）が比較的低いので、尿酸の血漿中濃度の増加は、痛風などのいくつかの疾患の原因となることが公知である。尿酸の急激な上昇は、尿細管における尿酸の結晶の析出によって引き起こされる急性腎不全へ至る（非特許文献１）。
【０００３】
尿酸産生の増加は、遺伝性高尿酸血症（hereditable hyperuricaemia）などのプリン代謝障害に苦しむ患者において一般的に引き起こされる。しかし、高濃度の尿酸の急激な上昇は、細胞増殖抑制剤での癌治療の間などに大量の細胞死を経験する患者においても観察される。後者は、いわゆる腫瘍崩壊症候群へ至ることが公知であり、ここで、大量の細胞死が、プリン代謝によって最終産物として尿酸へ容易に異化される核酸の遊離へ至る。一般的に、細胞の大量死は、虚血及び再灌流の病態生理学的状況においても観察され、従って、心臓手術、例えば、CABG（冠動脈バイパス移植）、PCI（経皮冠動脈インターベンション）、移植手術、心筋梗塞後、冠動脈疾患又は心不全の間にも観察される。
【０００４】
記載した後者の急性発作に加えて、増加された血漿中尿酸濃度が、うっ血性心不全での死亡も予測することが最近見出された（非特許文献２）。これについての原因となる相関もまた、最近、議論された（非特許文献３）。
【０００５】
現在、３つの異なる原理が、尿酸の病態生理学的な上昇した濃度を減らすために使用され得る。（ｉ）尿酸の腎排泄の増進、（ii）尿酸生成の障害、又は（iii）アラントインへの尿酸の変換。
【０００６】
ｉ）ベンズブロマロン
ベンズブロマロン（(2−エチル−3−ベンゾフラニル)−(3,5−ジブロム−4−ヒドロキシフェニル)ケトン)）での治療は、腎尿酸再吸収を標的化することによって、尿酸の腎排泄を高める。ベンズブロマロン（benzbromeron）治療下での最終的な効果は、尿酸の増加された排泄である。ベンズブロマロン自体が腎臓又は尿道（urether）における尿酸の析出を誘発し得るので、治療は閾値下位の投薬（subtreshold dosing）によって開始されなければならない。
【０００７】
ii）アロプリノール
別のアプローチは、プリン代謝における重要な酵素であるキサンチンオキシダーゼの阻害によって尿酸へのプリンの異化を標的化する：キサンチンのアナログである、アロプリノール（4−ヒドロキシプリノール）は、キサンチンオキシダーゼの阻害剤であり、尿酸
生成を減少させる。アロプリノールでの治療は、痛風などの高尿酸血症関連疾患についての標準的薬理学的治療と現在考えられている。アロプリノールでの治療の間、尿酸の代わりに、前駆体であるキサンチンが蓄積し、腎臓によって主に排泄される。アロプリノールでの治療は、予防的であり、高尿酸濃度を回避するが、既に上昇した尿酸濃度の場合は不適切であり、さらに、それ自体が痛風を誘発することが公知である。癌治療の間の腫瘍崩壊症候群の予防の場合、アロプリノールは、細胞障害性治療の前に提供される。アロプリノールの適用に加えて、代謝異常を正常化し、さらなる腎損傷を予防することに、管理が向けられる。
【０００８】
iii）尿酸オキシダーゼ
尿酸オキシダーゼの作用機構は、アロプリノールと相違する。尿酸オキシダーゼ（尿酸酸化酵素、尿酸酸素オキシドレダクターゼ、EC 1.7.3.3）は、腎臓によって容易に排泄される水溶性生成物であるアラントインへの尿酸の酸化を触媒する（スキーム１）。タンパク質酵素である尿酸オキシダーゼは、例えば、アスペルギルス・フラブス（Aspergillus flavus）から得ることができる。
【０００９】
このタンパク質をコードするcDNAが、大腸菌（Escherichia coli）（非特許文献４）、アスペルギルス・フラブス（非特許文献５）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）（非特許文献６）において、クローニングされ、発現された。
【００１０】
組換え尿酸オキシダーゼは、遺伝子操作された微生物によって産生される尿酸オキシダーゼであり、例えば、上述の大腸菌及びサッカロマイセス・セレビシエの遺伝子操作された株から得ることができる。ラスブリカーゼは、アスペルギルス・フラブスの株由来のcDNAを用いてクローニングされたサッカロマイセス・セレビシエの遺伝子操作された株から産生された組換え尿酸オキシダーゼ酵素である（非特許文献６、７）。ラスブリカーゼは、天然のアスペルギルス・フラブス尿酸オキシダーゼと同様の、各々約34kDaの分子質量の同一のサブユニットを有する四量体タンパク質である（図１）（非特許文献８）。
【００１１】
【化１】
2011509920.tif 000002
【００１２】
スキーム１：プリン異化に対する尿酸オキシダーゼ、ラスブリカーゼ、アロプリノール及びオキシプリノール（アロプリノールの活性代謝産物）の効果。
【化２】
2011509920.tif 000003
は、アロプリノール及びオキシプリノールによるキサンチンオキシダーゼの阻害を示し；
【化３】
2011509920.tif 000004
は、ラスブリカーゼ又は尿酸オキシダーゼによる尿酸の代謝を示す。
【００１３】
その作用様式に起因して、アロプリノールでの治療の代わりに、ラスブリカーゼを使用することは、腫瘍崩壊症候群の予防に関連して急性のかつ大量に増加した血漿中尿酸濃度の状況において、現在、好ましい治療である。
【００１４】
尿酸オキシダーゼ治療の明白な不利益は、化学量論的当量の過酸化水素の発生であり（スキーム２）、これは、現在の知識によれば、特に、心臓血管適応症における尿酸オキシダーゼの意図される使用に関して問題と考えられる。
【００１５】
【化４】
2011509920.tif 000005
【００１６】
スキーム２
H2O2は、それ自体はラジカルではないが、フェントン反応によってヒドロキシルラジカルへ容易に変換され得る。様々な種類の内因的に発生される酸素ラジカルは、容易に変換されるヒドロキシルラジカル又はスーパーオキシドアニオンなどの他のタイプも含む、活性酸素種（ROS）と呼ばれる。それらのROSは、種々の細胞酵素系によって、例えば、NADPHオキシダーゼによって発生され得る。過去において、ROSは、多くの生理学的及び病態生理学的プロセスに関与することが示された。多数の研究によって、心臓血管適応症に関してのROSの有害な役割が明らかにされた（非特許文献９、１０、１１、１２、１３；概要については、非特許文献１４を参照のこと）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ejaz A.A. et al., Clin. J. Am. Nephrol. (2007) 2:16−21
【非特許文献２】Anker SD et al., Circulation (2003); 107:1991−1997
【非特許文献３】Hare JM et al., Circulation (2003) 107:1951−1953
【非特許文献４】Legoux R. et al., J. Biol. Chem., 1992, 267, (12), 8565−8570
【非特許文献５】Chevalet L. et al., Curr. Genet., 1992, 21, 447−453
【非特許文献６】Leplatois P. et al., Gene., 1992, 122, 139−145
【非特許文献７】Oldfield V et al., Drugs (2006) 66 (4):529−545
【非特許文献８】Bayol A. et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 2002, 36, 21−31
【非特許文献９】Lo SK et al., Am. J. Physiol (1993) 264:L406−412; PMNs
【非特許文献１０】Gasic AC et al., Circulation (1991) Nov; 84(5): 2154−2166
【非特許文献１１】Bradley JR et al., Am. J. Pathol. (1995); 147(3): 627−641;
【非特許文献１２】Kevil CG et al., Am. J. Physiol. Cell Physiol. (2000) Jul; 279(1): C21−30
【非特許文献１３】Zafari AM et al., Hypertension (1998) Sep; 32(3): 488−495
【非特許文献１４】Cai H, Cardiovascular Research (2005) 68:26−36
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発生される過酸化水素によって引き起こされるその予想される心臓への有害効果について、尿酸と組み合わせて、尿酸オキシダーゼ、ラスブリカーゼをテストするために、実験を行った。驚いたことに、実験によって、高濃度のラスブリカーゼ単独によっても又は高濃度の尿酸と組み合わせても、心臓機能は有意には影響されないことが示された。さらに、ラスブリカーゼと尿酸との組み合わせは、該組み合わせが虚血及び再灌流の前及び間に存在する場合に、心臓機能及び心臓力学を改善さえした。
【００１９】
従って、本発明は、例えば、心筋梗塞後、CABG（冠動脈バイパス移植）、PCI（経皮冠動脈インターベンション）、移植手術などの心臓手術の間及び後に、虚血又は再灌流事象によって引き起こされる心臓の障害又は間接的な後遺症の治療又は予防用の、並びに冠動脈疾患又は心不全、例えば、うっ血性心不全の治療又は予防用の、医薬を製造するための、尿酸オキシダーゼ、好ましくは、組換え尿酸オキシダーゼ、例えば、ラスブリカーゼの使用に関する。
【００２０】
別の実施態様において、H2O2についてのスカベンジャー、例えば、ビタミンＡ、Ｃ若しくはＥ、トロロクス、オリゴマープロアントシアニジン（Oligomere Proanthocyanidine）、グルタチオン（Gluthation）、L−N−アセチルシステイン、エブセレン、リコピン（Lycopin）、フラボノイド、カテキン及びアントシアニン、より好ましくはL−アスコルビン酸での追加の治療が好ましい。
【００２１】
薬学的製剤は、通常の薬学的に許容し得る担体及び助剤に加えて、活性成分として、有効量のラスブリカーゼ、及び場合によりさらに１つ又はそれ以上の他の活性な薬理学的成分、例えば、アスコルビン酸を含む。薬学的製剤は、通常、ラスブリカーゼを0.1〜90質量％含有する。
【００２２】
薬学的製剤は、それ自体公知の様式で製造され得る。この目的のために、１つ又はそれ以上の固体又は液体の薬学的担体及び／又は助剤と共に、有効成分及び／又はそれらの生理学的に適合性の塩が、好適な投与形態又は投薬形態へ変換され、これは次いで人の医療における医薬として使用され得る。
【００２３】
ラスブリカーゼを含む医薬は、例えば、非経口的に、静脈内に、経直腸的に、経鼻的に、吸入によって又は局所的に、投与され得、好ましい投与は、特定のケースに依存する。
【００２４】
所望の薬学的製剤に好適である賦形剤は、専門知識に基づいて当業者によく知られている。溶媒、ゲル形成剤、坐剤基剤、錠剤賦形剤及び他の有効成分担体に加えて、例えば、抗酸化剤、分散剤、乳化剤、消泡剤、矯味矯臭剤、防腐剤、可溶化剤、デポー効果を達成するための薬剤、緩衝物質又は着色剤を使用することが可能である。
【００２５】
皮下、筋肉内又は静脈内投与について、使用される活性化合物は、必要に応じてこの目的について通常の物質、例えば、可溶化剤、乳化剤又はさらなる賦形剤と共に、液剤、懸濁剤又はエマルジョンへ変換される。有用な溶媒の例は以下である：水、生理食塩水又はアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、グリセロール、及びさらにまた糖溶液、例えば、グルコース若しくはマンニトール溶液、又は、記載した種々の溶媒の混合物。
【００２６】
エアロゾル又はスプレーの形態での投与について好適な薬学的製剤の例は、水中又は薬学的に許容し得る水混和性若しくは油性溶媒、又はこのような溶媒の混合物中の、有効成分又はそれらの生理学的に適合性の塩の、液剤、懸濁剤、エマルジョン又は小胞及びミセル医薬形態である。エアロゾル又はスプレーの形態での投与について、例えば、経鼻投与について、有効成分又はそれらの生理学的に適合性の塩の散剤も好適である。必要であれば、全ての製剤はまた、他の薬学的な賦形剤、例えば、等張化添加剤、界面活性剤、乳化剤及び安定剤、並びにまた噴射剤ガスを含み得る。記載した製剤は、さらに、凍結乾燥製品の形態であり得る。
【００２７】
本発明に従って投与されるラスブリカーゼの投薬量は、個々のケースに依存し、最適な作用については、通常通り、個々のケースの状況に調節されるべきである。例えば、それは、当然ながら、治療又は予防についての各場合に使用される化合物の効能及び作用持続時間並びに投与頻度に依存するだけでなく、治療される疾患の性質及び重篤度、並びにまた、治療されるヒト又は動物の性別、年齢、体重及び個々の応答性、並びに急性又は慢性治療又は予防が実施されるかどうかにも依存する。
【００２８】
ラスブリカーゼの投薬量は、典型的に、１日１人当たり（体重約75kg）１mg〜１ｇ、好ましくは１日１人当たり５〜750mg、例えば、１日１人当たり100〜150mgの範囲内で異なり得る。しかし、より高い用量も好適であり得る。有効成分の１日量が、一度に全て投与され得、又はそれは、複数の、例えば、２、３若しくは４回の投与に分割され得る。
【実施例】
【００２９】
実験の部
略語リスト
Asc.A          アスコルビン酸
kDa            キロダルトン
n              動物の数
P              圧力
Rasb           ラスブリカーゼ
Reperf.        再灌流
UA             尿酸
【００３０】
薬学的調製物の例
実施例Ａ：静脈内投与についての水溶液
１ml当たり活性化合物を50μg含む溶液を10ml調製するために、ラスブリカーゼ0.5mgを等張（0.9％）塩化ナトリウム溶液10mlに溶解した。
【００３１】
摘出ワーキングラット心臓についての実験
生物学的材料として、本発明者のLaboratory Animal Science and Welfare（LASW）から購入した雄性Wistarラットの摘出心臓を使用した。心臓機能（冠血流量及び収縮性）を、以前記載されたように（Itter G et al., Laboratory Animals (2005) 39; 178−193）、「摘出ワーキング心臓（Isolated Working Heart）」モデルについて調べた。先ず、心臓を、Langendorff法に従って、以下の組成（mmol／L）の酸素化した（95％O2, ５％CO2）非循環のKrebs−Henseleit溶液で灌流した：NaCl、118；KCl、4.7；CaCl2、2.5；MgSO4、1.6；NaHCO3、24.9；KH2PO4、1.2；グルコース、5.5；ピルビン酸Na、2.0。肺動脈中へ配置したカテーテルは、冠動脈の流れ出る灌流液を排出し、これを、冠血流量及び静脈PO2測定値の測定のために回収した。左心耳の切開によって、左心房にカニューレを挿入した。60mmHgの固定灌流圧での15分間の平衡期間後、心臓を、11mmHgの固定充満圧でのワーキングモードへ切り替えた。冠血流量（CF）及び圧力シグナル（dP／dtmax）を、500Hzでサンプリングし、２秒毎に平均した。
【００３２】
心臓の冠血流量及び収縮性に対する効果
高いラスブリカーゼ濃度を、種々の尿酸濃度と組み合わせて、摘出ワーキングラット心臓に対して、発生される過酸化水素（H2O2）によって引き起こされるそれらの可能性のある心臓への有害効果についてテストした。
【００３３】
表１は、100μM H2O2よりも高い濃度は冠血流量及び収縮性を強力に減少させたことを示している。
【００３４】
表１：摘出ラット心臓中における冠血流量（CF）及び収縮性（dP／dtmax）に対する増加するH2O2濃度の効果；n＝４、*ｐ＜0.05 vs基底値
【表１】
2011509920.tif 000006
【００３５】
増加するラスブリカーゼ濃度（0.5、1.5、５、15、50μg／mL）は、冠血流量及び収縮性のほんの僅かな（有意ではない）減少を誘発し、これは、尿酸（６mg／L）の存在下では影響されなかった（表２）。高ラスブリカーゼ（50μg／mL）をより高い濃度の尿酸（６〜30mg／L）と共に灌流した場合、同様の効果が観察された（表３）。
【００３６】
表２：摘出ラット心臓中における冠血流量（CF）及び収縮性（dP／dtmax）に対する尿酸（UA ６mg／L）有り及び無しでの増加するラスブリカーゼ濃度の効果；n＝６〜７／群
【表２】
2011509920.tif 000007
【００３７】
表３：摘出ラット心臓中における冠血流量（CF）及び収縮性（dP／dtmax）に対する増加する尿酸及び高ラスブリカーゼ（Rasb 50μg／mL）濃度の効果；n＝４〜５／群
【表３】
2011509920.tif 000008
【００３８】
全脳虚血（global ischemia）及び再灌流を有する心臓の冠血流量及び収縮性に対する効果：
高尿酸濃度（15又は30mg／L）と組み合わせての高ラスブリカーゼ（50μg／mL）は、濃度依存的に、虚血／再灌流後の回復を改善した（表４、５）。
【００３９】
表４：全脳虚血及び再灌流を有する摘出ラット心臓中における冠血流量（CF）及び収縮性（dP／dtmax）に対する高ラスブリカーゼ（Rasb 50μg／mL）及び尿酸（UA 15mg／L）濃度の効果；n＝５／群；*ｐ＜0.05 vsコントロール
【表４】
2011509920.tif 000009
【００４０】
表５：全脳虚血及び再灌流を有する摘出ラット心臓中における冠血流量（CF）及び収縮性（dP／dtmax）に対する高ラスブリカーゼ（Rasb 50μg／mL）及び尿酸（UA 30mg／L）濃度の効果；n＝５／群；*ｐ＜0.05 vsコントロール
【表５】
2011509920.tif 000010
【００４１】
アスコルビン酸（１mM）の添加によって、虚血／再灌流後に冠血流量の正常化及び収縮性の改善に至った（表６）。
【００４２】
表６：全脳虚血及び再灌流を有する摘出ラット心臓中における冠血流量（CF）及び収縮性（dP／dtmax）に対する高ラスブリカーゼ（Rasb 50μg／mL）、尿酸（UA 30mg／L）及びアスコルビン酸（Asc.A. １mM）濃度の効果；n＝６／群；*ｐ＜0.05 vsコントロール
【００４３】
【表６】
2011509920.tif 000011
【００４４】
上記において示されたように、高濃度のラスブリカーゼ単独によっても又は高濃度の尿酸と組み合わせても、心臓機能は有意には影響されなかった。
【００４５】
驚いたことに、尿酸の存在下でのラスブリカーゼの使用は、虚血／再灌流の前及び間に存在する場合に、心臓機能を改善さえした。
【００４６】
心臓手術及び心不全の場合、ラスブリカーゼでの治療は、適切かつ安全であると考えられる。本発明者の虚血／再灌流実験において、ラスブリカーゼは、虚血後の心臓力学を改善さえした。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明で使用される組み換え尿酸オキシダーゼ酵素、ラスブリカーゼのタンパク質サブユニットを示す。
【図１】
2011509920.tif 000012
【国際調査報告】
2011509920.tif 000013
2011509920.tif 000014
2011509920.tif 000015