(57)【要約】  本発明は、ＥＢＶタンパク質ＬＭＰ１の細胞内領域に特異的に結合する抗体を含んでなる医薬およびワクチン組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番までのアミノ酸配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１由来のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体の断片を含んでなる、医薬として用いるための組成物。
【請求項２】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番までのアミノ酸配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１由来のポリペプチドのうちの少なくとも１０アミノ酸からなる断片に対して特異的に結合する抗体または抗体の断片を含んでなる、請求項１に記載の医薬として用いるための組成物。
【請求項３】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の３０６番から３１８番までのアミノ酸配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１由来のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体の断片を含んでなる、請求項１に記載の医薬として用いるための組成物。
【請求項４】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番までのアミノ酸配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１由来のポリペプチドのうちの少なくとも１０アミノ酸からなる断片を含んでなる、医薬またはワクチンとして用いるための組成物。
【請求項５】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番までのアミノ酸配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１由来のポリペプチドを含んでなる、請求項４に記載の医薬またはワクチンとして用いるための組成物。
【請求項６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列の３０６番から３１８番までのアミノ酸配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１由来のポリペプチドを含んでなる、請求項４に記載の医薬またはワクチンとして用いるための組成物。
【請求項７】
下記から選択される１種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、医薬またはワクチンとして用いるための組成物：
−  配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番までのアミノ酸配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１由来のポリペプチドのうちの少なくとも１０アミノ酸からなる断片、
−  配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番までのアミノ酸配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１由来のポリペプチド、または
−  配列番号１で示されるアミノ酸配列の３０６番から３１８番までのアミノ酸配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１由来のポリペプチド。
【請求項８】
エプスタイン−バーウイルス陽性の腫瘍の予防または治療のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
鼻咽頭癌、胃癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エイズ患者で引き起こされたリンパ腫、食道および肝内胆管癌、鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、並びに口腔毛髪状白斑症（ＯＨＬ）の予防または治療のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
鼻咽頭癌の予防または治療のための、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
下記から選択されるエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１由来のペプチド：
−  配列番号１の３０６番から３１８番までのアミノ酸配列を有するペプチド、
−  配列番号１の３０６番から３１８番までのアミノ酸配列を有するペプチドのうちの少なくとも５アミノ酸からなる断片。
【請求項１２】
請求項１１に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、ＬＭＰ１の細胞内領域に由来するポリペプチド断片およびこれら断片に特異的に結合する抗体並びにそれらの免疫療法および予防接種における使用に関する。
【０００２】
エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）は数々のヒト癌：鼻咽頭癌、胃癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エイズ患者に誘発するリンパ腫、食道および肝内胆管癌に関連する。最近のデータでは、ＥＢＶは鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫および肝内胆管癌にも関与していることが示されている。エイズ患者に頻発する口腔毛髪状白斑症（ＯＨＬ）もＥＢＶに密接に関連する。ＥＢＶはそれゆえにリンパ親和性かつ上皮親和性である。
【０００３】
放射線療法および化学療法を含めて、ＥＢＶ関連癌のための数々の治療法が用いられてきた。しかしながら、放射線療法および化学療法は、古典的な問題（毒性、投与量など）を引き起こす。同様に、一般的に標的としてのウイルスおよび／または細胞タンパク質に基づいた数々の細胞およびウイルス遺伝子治療が、開発されてきた。しかしながら、これらの治療法は十分によく機能していなかった。
【０００４】
免疫療法においては、ＥＢＶに付随するまたは付随しない上皮腫瘍細胞がＥＧＦＲ（表皮成長因子受容体）を発現しているため、特に癌（ＮＰＣ、胸腺腫（Ｔｈｙｍｏｍｅｓ）、肺、子宮頸癌、大腸、乳、および頭頸部）の治療のために、抗ＥＧＦＲ抗体が同様に提案されている。治療はそれ故に、ＥＢＶ関連癌に限られない。治療（モノクローナル抗体カツマキソマブ）の効果は子宮頸癌および胸腺腫で評価されている。しかし、抗ＥＧＦＲを放射線療法との組合せで用いて治療した患者は放射線耐性となる危険性がある。
【０００５】
鼻咽頭癌（ＮＰＣ）は、後鼻孔の上皮に由来するヒト悪性腫瘍である。絶えずウイルスと関連づけられるヒト悪性腫瘍のもっとも際だった例の一つである。エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の全長ゲノムはすべての悪性ＮＰＣ細胞に含まれており、これはおそらく悪性表現型に寄与するウイルスタンパク質をコードしている（Decaussin G, Sbih-Lammali F, De Turenne-Tessier M, Bougermouh AM, Ooka T. 2000. Cancer Res 60 : 5584-5588; Ooka T : 2005. In. Epstein-Barr Virus. Horizon Press, Annette Griffin: Edited by Erle S. Robertson. Chapter 28 : p.p 613-630）。ヒトにおいてはＥＢＶ感染が遍在しているが、ＮＰＣ発生数は地理学上の地域に依存して極めて大きく変動する。世界における胃癌のおよそ５−１０％もまたＥＢＶに関連する。
【０００６】
ＮＰＣの検査用生体組織は、一貫してＥＢＥＲｓ、ＥＢＮＡ１、ＬＭＰ１、ＬＭＰ２Ａ、ＢＡＲＦ０、そしてＢＡＲＦ１をコードする遺伝子を含む様々なＥＢＶ遺伝子を発現している。これらの中では、ＬＭＰ１とＢＡＲＦ−１のみが齧歯類の線維芽細胞において悪性の形質転換を引き起こす能力があり（Wei and Ooka, 1989, EMBO J. 8 :2897-903 ; Wang D, Liebowitz D and Kieff E. 1985. Cell 43:831-840）、ウイルス癌遺伝子と考えられている。
【０００７】
ＬＭＰ１（潜在性膜タンパク質−１）はＥＢＶが感染した細胞の表面に発現する潜在性の抗原のファミリーに属しており、Ｂ細胞の不死化に不可欠である。ＬＭＰ１は、ヒトヘルペスウイルス４タイプ１に属するエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）のゲノムにコードされている。ＬＭＰ１は６つの膜貫通領域と一つの細胞内Ｃ末端領域を有する。このＣ末端領域は二つの主な機能領域、ＣＴＡＲ１とＣＴＡＲ２を含む。ＬＭＰ１タンパク質の「ショートループ」と呼ばれる細胞外領域はＥＢＶ感染細胞の表面上に存在する。ＬＭＰ１はＢ細胞の不死化に不可欠であり、上皮細胞に導入すると、細胞分化を抑制できるＮＦｋＢ、Ａ２０、およびＥＧＦ−Ｒのような様々な細胞遺伝子を活性化する（Ooka T : 2005. In. Epstein-Barr Virus. Horizon Press, Annette Griffin: Edited by Erle S. Robertson. Chapter 28 : p.p 613-630.）。しかしながら、ＬＭＰ１単独ではＢ細胞を不死化することはできず、５つの他のＥＢＶ遺伝子と協力する必要がある（ＥＢＥＲｓ、ＬＭＰ２Ａ、ＥＢＮＡ３Ａ、ＥＢＮＡ３Ｂ、ＥＢＮＡ２）（Kieff and Rickinson, 2007, Fields Virology 5th Edition-Fields BN, Knipe DM, Howley PM (ed.) Lippincott-Williams & Wilkins Publishers : Philadelphia, 2007, pp. 2603-2654）。古典的には、ＬＭＰ１タンパク質は細胞膜に局在するとされてきた。しかし、最近のデータではＬＭＰ１は、ＬＭＰ１遺伝子組み換えバキュロウイルスに感染した昆虫Ｓｆ９細胞の培養液（Vazirabadi G, Geiger TR, Coffin WF, Martin J M. Links 2003, J Gen Virol. 84 : 1997-2008; Flanagan J, Middeldorp J, Sculley, T. 2003, J Gen Virol 84 :1871-9）やＮＰＣ由来ｃ６６６−１細胞株の培養液（Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh  and T. Ooka. Clin. Cancer Res.  2007 13 : 4993-5000）におけると同様に、Ｂ９５−８細胞（非ヒトマーモセットＢリンパ球）の培養液において、エキソソームの成分中に分泌され、かつ局在することが示されている。これらのエキソソーム成分はＴ細胞の増殖抑制の原因であるらしい（Flanagan J, Middeldorp J, Sculley, T. 2003 J Gen Virol 84 :1871-9）。エキソソーム様小胞内に存在するＬＭＰ１はＦＧＦ２の発現を活性化することが示されている（Ceccarelli S, Visco V, Raffa S, Wakisaka N, Pagano J, Torrissi R. 2007  Int. J. Cancer 121: 1494-506）。
【０００８】
ＬＭＰ１の発ガン性に不可欠な役割は、ＮＦｋＢの活性化により決定される。ＬＭＰ１の発現の抑制は、ＮＦｋＢの発現の減少に関連した細胞死を引き起こす（Kieff and Rickinson, 2007, Fields Virology 5th Edition-Fields BN, Knipe DM, Howley PM (ed.) Lippincott-Williams & Wilkins Publishers : Philadelphia, 2007, pp. 2603-2654）。
【０００９】
近年、ＮＰＣ患者の血清および唾液における二つの癌遺伝子（ＬＭＰ１およびＢＡＲＦ１）の分泌が明らかにされ（Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh  and T. Ooka. Clin. Cancer Res. 2007. 13 :4993-5000）、ＮＰＣ患者の血清から精製されたこれらの癌遺伝子は、イン・ビトロで強力な細胞分裂促進活性を示した。この細胞分裂促進活性は、腫瘍の発達に関連し得る。
【００１０】
ＮＰＣ患者の血清、またはｃ６６６−１細胞の注入後に引き起こされたＮＰＣ由来の腫瘍を発達させるマウスの血清に見いだされるＬＭＰ１の多くは、エキソソーム様小胞と会合している。この複合体形態であるＬＭＰ／エキソソームが自己分泌の機構で細胞周期を活性化することができるが、一方で遊離ＬＭＰ１（エキソソームなし）は細胞周期を活性化できない（Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh and T. Ooka. Clin. Cancer Res. 2007. 13 : 4993-5000）。
【００１１】
米国特許第６，７２３，６９５号はＥＢＶの構造および潜在性タンパク質内のＣＴＬエピトープを記載している。これらのＣＴＬエピトープはＥＢＶ感染に対する抗ウイルス免疫の提供に効果的であり得る。ＥＢＶ陽性リンパ腫の治療のために、臨床試験が開始されている。ＬＭＰ１由来のエピトープは、ＬＭＰ１の細胞外ループに由来する。
【００１２】
免疫療法においては、ＬＭＰ１エピトープを認識するＥＢＶ特異的ＣＴＬは、ホジキン病の患者の治療にもまた用いられる。しかし、この治療は、サイトカインによる抑制効果により成功していない（Gottschalk et al., 2002, Adv. Cancer Res. 8 : 175-201 ; Bollard et al., 2004. J. Exp. Med. 200 : 1623-1633）。
【００１３】
ＷＯ０３／０４８３３７は、ＬＭＰ１に結合する抗体と治療方法におけるその使用を記載している。この抗ＬＭＰ１抗体は、感染細胞の表面に暴露されたＬＭＰ１の細胞外ループに結合する。これらの抗体でみられる細胞増殖の抑制は明確に述べられてはおらず、おそらく、細胞膜に局在するＬＭＰ１の中和によるものであって、培養液内に分泌されたエキソソームに局在するＬＭＰ１との結合によるものではない。
【００１４】
欧州公開第１，２２９，０４３号公報はＬＭＰ１由来の異なるペプチドとこれらと反応する抗体試薬を記載している。記載されたポリペプチドと抗体はＥＢＶ感染またはＥＢＶ陽性腫瘍の治療のための医薬の製造のために用いることができる。ＬＭＰ１の細胞内領域に対する抗体が記載されている。しかしながら、医薬組成物はＬＭＰ１の細胞外ループに対して作製した抗体を記載しているのみである。
【００１５】
Ｂ細胞の不死化に必要な癌遺伝子としてのＬＭＰ１の役割も示されてきた。しかし、他の癌遺伝子が記載されてきており、これらが不死化に必要である。
【００１６】
最新の技術では、免疫療法は、ＥＢＶ感染細胞の表面に露出されるＬＭＰ１の細胞外ループに対して行われている。
【００１７】
本発明では、ＬＭＰ１の機能阻害に基づく新しい免疫治療法を提供する。驚くべきことに、ＬＭＰ１機能の阻害は、腫瘍の発達を防ぎ、抑圧するに十分である。
【００１８】
本発明は予期せぬことに、ＬＭＰ１の細胞内領域に結合する抗体が、イン・ビトロおよびイン・ビボの両方で、ＥＢＶと関連した腫瘍細胞の発達を抑制するに十分であることを示す。ＬＭＰ１の細胞内領域に結合する抗体は、イン・ビボで癌タンパク質を中和する能力を有し、マウスモデルにおいて腫瘍の予防と抑圧の結果を生む。この中和はＬＭＰ１の細胞内領域がエキソソームの表面に露出しているという事実によるのだろう。
【００１９】
ＢＤ．Ｓｃｉｅｎｃｅ、フランスにより市販されているモノクローナル抗ＬＭＰ１抗体が用いられた。この抗体はＬＭＰ１のＣＴＲＡ１とＣＴＲＡ２の間のＬＭＰ１細胞内領域に結合する。ＮＰＣ由来の上皮腫瘍細胞の注入前の、抗ＬＭＰ１抗体の連続的な注入は腫瘍の出現の予防に導く。腫瘍サイズが直径約０．８ｃｍになった後に抗ＬＭＰ１を連続的に注入すると、腫瘍は後退し、完全に消えた。このことは、ＥＢＶ陽性腫瘍を抑圧し、これから防護する、抗ＬＭＰ１抗体を用いた免疫療法に関する最初の報告である。
【００２０】
培養液への抗ＬＭＰ１の添加も同様にＥＢＶ陽性のＢ細胞の増殖を抑制することができ、このことは、抗ＬＭＰ１に基づく免疫療法がＥＢＶ関連リンパ腫の発達を抑制し、これから防護するに効果的であることを示唆する。
【００２１】
さらに、患者はこのウイルスタンパク質に対してとても弱い抗体反応しか示さないため、ＬＭＰ１の細胞内領域を標的とした免疫療法はＮＰＣの予防および治療に有望である（Meij P, Vervoort MBHJ, Aarbiou J, van Dissel P, Brink A, Bloemena E, Meijer CJLM, Middeldorp JM. 1999. J. Infect. Diseases 179 : 1108-15）。
【００２２】
配列表
配列番号１：ヒトヘルペスウイルス４タイプ１からのＬＭＰ１（潜在性膜タンパク質−１）のアミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＹＰ＿４０１７２２．１）
【発明の具体的説明】
【００２３】
本発明の第一の対象は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番までの配列を有するエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）タンパク質ＬＭＰ１に由来するポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片を含んでなる、医薬としての使用のための組成物である。
【００２４】
好ましい態様では、医薬としての使用のための組成物は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番までの配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１に由来するポリペプチドの少なくとも５、７、１０、１５、２０、５０アミノ酸の断片に特異的に結合する抗体または抗体断片を含んでなるものである。
【００２５】
好ましくは、医薬としての使用のための組成物は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２３２番から３５１番までの配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１に由来するポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片を含んでなるものである。
【００２６】
さらにより好ましくは、医薬としての使用のための組成物は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３０６番から３１８番までの配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１に由来するポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体断片を含んでなるものである。
【００２７】
本発明の第二の対象は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番の配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１に由来するポリペプチドの少なくとも１０、２０、５０アミノ酸の断片を含んでなる、医薬としての、またはワクチンとしての使用のための組成物である。
【００２８】
好ましい態様では、医薬としてのまたはワクチンとしての使用のための組成物は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番の配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１に由来するポリペプチドを含んでなるものである。
【００２９】
好ましくは、医薬としてのまたはワクチンとしての使用のための組成物は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２３２番から３５１番の配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１に由来するポリペプチドを含んでなるものである。
【００３０】
もう一つの好ましい態様では、医薬としてのまたはワクチンとしての使用のための組成物は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３０６番から３１８番の配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１に由来するポリペプチドを含んでなるものである。
【００３１】
本発明のもう一つの対象は、下記からなる群：配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番までの配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１に由来するポリペプチドの少なくとも５、７、１０、１５、２０、５０アミノ酸の断片、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番の配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１に由来するポリペプチド、または、配列番号１で示されるアミノ酸配列の３０６番から３１８番の配列を有するエプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１に由来するポリペプチド、から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる、医薬としてのまたはワクチンとしての使用のための組成物である。
【００３２】
本発明は医薬組成物およびワクチン組成物を包含する。
【００３３】
好ましくは、本発明の組成物は、ＥＢＶ陽性腫瘍またはＥＢＶ関連腫瘍の予防または治療のためのものである。
【００３４】
より好ましくは、本発明の組成物は、鼻咽頭癌、胃癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エイズ患者に誘発するリンパ腫、食道および肝内胆管癌、鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、並びに口腔毛髪状白斑症（ＯＨＬ）の予防または治療のためのものである。
【００３５】
さらにより好ましくは、本発明の組成物は鼻咽頭癌の予防または治療のためのものである。
【００３６】
本発明のもう一つの対象は、エプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１に由来し、下記からなる群： 
−  配列番号１で示されるアミノ酸配列の３０６番から３１８番までのアミノ酸配列を有するポリペプチド、
−  配列番号１で示されるアミノ酸配列の３０６番から３１８番までのアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも５、７または１０アミノ酸の断片、
から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３７】
本発明のもう一つの対象は、本発明に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００３８】
本発明はさらに、本発明に記載されるポリヌクレオチドを用いて形質転換した宿主細胞に関する。
【００３９】
本発明は、本明細書に記載されたＬＭＰ１の細胞内領域またはその誘導体に特異的に結合する抗体若しくは抗体断片を含んでなる、医薬としての使用のための組成物に関する。本発明はさらに、ＬＭＰ１の細胞内領域またはその断片を含んでなる、医薬としてのまたはワクチンとしての使用のための組成物に関する。本発明のもう一つの対象は、ＬＭＰ１の細胞内領域またはその断片をコードするポリヌクレオチドを含んでなる、医薬としてのまたはワクチンとしての使用のための組成物である。
【００４０】
配列番号１のアミノ酸配列１８８番から３８６番の配列からなるポリペプチドは、ＥＢＶ感染細胞の表面に露出しないＬＭＰ１の細胞内領域に対応する。しかし、驚くべきことに、本発明において、この領域に結合する抗体はイン・ビボのマウスモデルにおいて腫瘍の発達を防ぎ、減少させることがわかった。
【００４１】
本発明は： 
ａ）本明細書に記載された有効量の抗体若しくは抗体断片、本明細書で記載された有効量のポリペプチド、本明細書で記載された有効量のポリヌクレオチド、および、
ｂ）不活性または生理的に活性であってもよい、薬学上許容可能な担体、
を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００４２】
本発明はさらに： 
ａ）本明細書に記載された有効量のポリペプチドまたは本明細書に記載された有効量のポリヌクレオチド、および、
ｂ）アジュバント
を含んでなるワクチンを提供する。
【００４３】
本明細書で用いられる「薬学上許容可能な担体」には、生理学的に適した任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗バクテリア剤および抗菌物質並びに同様のものが挙げられる。好適な担体、希釈剤および／または賦形剤の例には、一以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等が、これらの混合物同様に挙げられる。多くの事例で、糖、ポリアルコールまたは塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含ませることが好ましい。特に、好適な担体の適切な例としては、（１）約１ｍｇ／ｍｌから２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含む、または含まないｐＨ〜７．４のダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、（２）０．９％生理食塩水（０．９％  ｗ／ｖ  塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが挙げられ、同様にトリプタミンなどの抗酸化剤およびＴｗｅｅｎ２０などの安定剤を含んでいてもよい。
【００４４】
本発明に含まれる医薬組成物は、ＥＢＶに関連する癌の治療のためのさらなる治療剤を含んでいてもよい。
【００４５】
本発明の組成物は様々な形態とすることができる。これらは、例えば、溶液、半固体、そして固体投薬形態とすることができるが、好適な形態は、投薬および治療利用の意図した方式に依存する。典型的に好適な組成物は、注射可能なまたは不溶解性の溶液の形態である。好適な投与方式は、非経口（例えば、静脈注射の、筋肉内の、腹腔内の、皮下の）である。好ましい態様では、本発明の組成物は、一度にまたは時間をかけた連続的な注入により静脈内に投与される。もう一つの好ましい実施例では、筋肉内の、皮下の、関節内の、関節滑液嚢内の、腫瘍内の、腫瘍周囲の、病変部の、または病変周囲の経路で注入され、全身的な治療効果と同様に局所的な治療効果を発揮する。
【００４６】
非経口投与のための滅菌組成物は、適切な溶媒中で、本発明に記載に記載された抗体、抗体断片、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含ませることにより必要量製造することができ、また、その後精密濾過による滅菌を行うことができる。溶媒または賦形剤として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよび同様のものがこれらの組合せと同様に使われうる。多くの事例で、糖、ポリアルコール若しくは塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含むことが好ましい。これらの組成物は、補助剤、特に湿潤剤、等張剤、乳剤、分散剤、および安定剤を含んでいても良い。非経口投薬のための滅菌組成物は、使用時に滅菌水または滅菌した他の任意の注射可能な溶媒に溶解しうる滅菌固体組成物の形態でもまた製造されうる。
【００４７】
本明細書に記載された抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、経口投与してもよい。経口投与のための固体組成物として、錠剤、丸薬、粉末（ゼラチンカプセル、サシェ）または顆粒が用いることができる。これらの組成物においては、本発明による活性成分が、例えばデンプン、セルロース、ショ糖、ラクトースまたはシリカなどの一以上の不活性な希釈剤とアルゴン流の元で混合される。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えばステアリン酸マグネシウムやタルクなどの一以上の滑沢剤、着色剤、コーティング剤（糖コート錠剤）または釉薬をもまた含んでなりうる。
【００４８】
経口投与のための液体組成物として、薬学上許容可能な溶液、懸濁液、乳濁液、シロップ、および、水、エタノール、グリセロール、植物油またはパラフィンオイルなどの不活性な希釈剤を含んだエリキシール剤を用いることができる。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば、湿潤剤、甘味剤、濃縮剤、香料または安定剤を含んでなりうる。
【００４９】
用量は所望の効果、治療の持続時間、用いられる投与経路に依存する。
【００５０】
本発明は、また、鼻咽頭癌、胃癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エイズ患者に誘発するリンパ腫、食道および肝内胆管癌、鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、並びに口腔毛髪状白斑症（ＯＨＬ）などのＥＢＶ陽性腫瘍若しくはＥＢＶ関連腫瘍の予防若しくは治療のための医薬の製造のための、またはワクチンの製造のための、本明細書に記載した抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの使用にも関する。
【００５１】
好ましい態様では、本明細書に記載した抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ＥＢＶ陽性腫瘍の予防または治療のために用いられる。より好ましい態様では、上記で開示した、および本明細書に記載した抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む医薬またはワクチン組成物の一つは、ＥＢＶ陽性腫瘍の予防または治療のために用いられる。より好ましくは、これらは鼻咽頭癌、胃癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エイズ患者に誘発するリンパ腫、食道および肝内胆管癌、鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、並びに口腔毛髪状白斑症（ＯＨＬ）の予防または治療のために用いられる。好ましい態様では、鼻咽頭癌の予防または治療のために用いられる。
【００５２】
本発明はまた、ヒトまたは治療若しくは予防を必要とする患者に本明細書に記載した有効量の抗体、抗体断片、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与することを含むＥＢＶ陽性腫瘍の予防または治療のための方法を提供する。好ましい態様では、本発明は、鼻咽頭癌、胃癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エイズ患者に誘発するリンパ腫、食道および肝内胆管癌、鼻ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、並びに口腔毛髪状白斑症（ＯＨＬ）の予防または治療のための方法に関する。さらにより好ましくは、本発明は鼻咽頭癌の予防または治療のための方法に関する。
【００５３】
最初の態様では、本発明の組成物は、ＬＭＰ１の細胞内領域またはこの誘導体に特異的に結合する抗体若しくは抗体断片を含んでなる。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「結合」は、配列番号１のアミノ酸配列１８８番から３８６番までのペプチドに対応するＬＭＰ１の細胞内領域のエピトープと反応する、若しくは配列番号１のアミノ酸配列１８８番から３８６番までのポリペプチドに対応するＬＭＰ１の細胞内領域に対して作製された、抗体または抗体断片に関する。好ましくは、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列３０６番から３１８番までのペプチドからのエピトープと反応するか、または配列番号１のアミノ酸配列３０６番から３１８番までのポリペプチドに対して作製される。
【００５５】
好ましくは、抗体はＬＭＰ１の細胞内領域に特異的に結合し、他の抗原とは交差反応しない。それ故に、抗体は一つの特定の抗原と反応する。
【００５６】
ＬＭＰ１の細胞内領域と特異的に結合する抗体は、例えば、ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（フランス）からの抗体Ｓ１２などが市販されている。代わりに、ＬＭＰ１の細胞内領域に特異的に結合する抗体またはその断片を標準的な方法で製造しても良い。好適な抗体は、モノクローナル抗体Ｓ１２も同様に特異的に結合する、配列番号１のアミノ酸配列３０６番から３１８番までの配列を有するポリペプチドに結合する抗体である。好ましくは、抗体は、抗体Ｓ１２と同じエピトープに結合する。Ｓ１２抗体のエピトープは、配列番号１のアミノ酸配列３０６番から３８６番までの配列を有するポリペプチドから開始して、当業者に知られる方法で決めることができる。
【００５７】
用語「抗体」は、本明細書では、広義に用い、特にＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどの任意のアイソタイプのモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体および抗体断片を含む。特定の抗原に反応性の抗体は、ファージ若しくは同様のベクターにおける組み換え抗体のライブラリーからの選択などの組み換え法により、または抗原若しくは抗原をコードする核酸を用いて動物を免疫することにより生産することができる。
【００５８】
典型的なＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合に連結した二つの同一の重鎖と二つの同一な軽鎖を含んでなる。各重鎖および軽鎖は定常領域と可変領域からなる。各可変領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）または「超可変領域」と呼ばれる三つの区分からなり、主に抗原のエピトープに結合する原因となっている。これらは通常ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ末端側から連続して番号を振られている。可変領域のより高く保存されている領域は、「フレームワーク領域」と呼ばれる。
【００５９】
本明細書で用いられる「ＶＨ」または「ＶＨ」は、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域をいい、Ｆｖ、ｓｃＦｖ，ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片の重鎖を含む。「ＶＬ」または「ＶＬ」は、抗体の免疫グロブリン軽鎖の可変領域をいい、Ｆｖ、ｓｃＦｖ，ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２断片の軽鎖を含む。
【００６０】
「ポリクローナル抗体」は、一以上の他の非同一な抗体の中から、またはその存在下で製造された抗体である。一般的にはポリクローナル抗体は、非同一の抗体を製造するいくつかの他のＢリンパ球の存在下で、Ｂリンパ球から製造される。通常は、ポリクローナル抗体は免疫された動物から直接得られる。
【００６１】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体であり、すなわち、この集団を形成する抗体は、少量存在しうる自然に生じうる変異を除いて、本質的に同一である。
【００６２】
「エピトープ」は、抗体が結合する抗原の部位である。
【００６３】
本明細書で用いられる「キメラ抗体」は、定常領域またはその一部が改変され、置き換えられ、または交換されており、そのため、可変領域が異なる種の、またはもう一つの抗体クラス若しくはサブクラスに属する定常領域と連結する抗体である。
【００６４】
「キメラ抗体」は、また、可変領域またはその一部が改変され、置き換えられ、または交換されており、そのため、定常領域が異なる種の、またはもう一つの抗体クラス若しくはサブクラスに属する可変領域と連結する抗体でもある。キメラ抗体を製造する方法は、技術的に知られている。
【００６５】
本明細書で用いられる用語「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含むキメラ抗体をいう。ヒト化の目的は、完全な抗原結合親和性と抗体の特異性を維持しながら、ヒトへの導入のために、マウスの抗体などの異種の抗体の免疫原性を低減することである。ヒト化抗体または他の哺乳動物による拒絶反応欠如に適した抗体は、再表面形成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）またはＣＤＲグラフト化などの様々な技術を用いて製造することができる。ヒト化キメラ抗体は、好ましくは、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の定常領域および可変領域であって、対応するヒト抗体領域から実質的にまたは排他的に由来する定常領域および可変領域、およびヒト以外のほ乳類から実質的または排他的に由来するＣＤＲを有する。
【００６６】
本発明の抗体は、上で議論した全長の抗体およびそのエピトープ結合断片の両方を含む。本明細書で用いられる「抗体断片」とは、一般的に「エピトープ結合断片」と称される、全長の抗体により認識されるエピトープに結合する能力を保持した抗体の任意の一部を含む。抗体断片の例としては、下記に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ），単鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）ならびにＶＬまたはＶＨ領域のいずれかを含んでなる断片が挙げられる。エピトープ結合断片は、単鎖抗体を含み、単独または下記：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域の全体若しくは一部との組合せにおいて可変領域を含んでいてもよい。
【００６７】
第二の態様では、本発明の組成物はＬＭＰ１の細胞内領域に対応するポリペプチドまたはその断片を含んでなる。
【００６８】
用語ポリペプチド「断片」とは、それが由来するポリペプチドの全体ではなく一部を含むポリペプチドをいう。本発明による断片は、それが由来するポリペプチドの抗原性の特性を保持している。このように、本発明は配列番号１で示されるアミノ酸配列の１８８番から３８６番までのアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも５、７、１０、１５、２０アミノ酸の断片に関する。
【００６９】
本発明による断片は、好都合には、その抗原性の特性を保持した最小の大きさを有する。
【００７０】
本発明のもう一つの目的は、エプスタイン−バーウイルスタンパク質ＬＭＰ１に由来し、下記からなる群：
−配列番号１で示されるアミノ酸配列の３０６番から３１８番までの配列を有するペプチド、
−配列番号１で示されるアミノ酸配列の３０６番から３１８番までの配列を有するペプチドの少なくとも５、７または１０アミノ酸の断片からなる断片、
から選択されるペプチドである。
【００７１】
第三の態様では、本発明の組成物は、ＬＭＰ１の細胞内領域に対応する上述のポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含んでなる。
【００７２】
本発明による用語「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡもしくはＲＮＡタイプでありうる単鎖ヌクレオチド鎖若しくはその相補鎖、またはｃＤＮＡ（相補的）若しくはゲノムＤＮＡタイプでありうる二本鎖ヌクレオチド鎖をいう。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡタイプ、いわゆる二本鎖ＤＮＡタイプである。同様に用語「ポリヌクレオチド」は、改変されたポリヌクレオチドをも含む。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドは自然環境から単離され、または精製される。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、Sambrook et al. （Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 1989）に記載された技術などの通常の分子生物学技術を用いて、または化学合成により製造することができる。
【００７４】
本発明のもう一つの対象は、本明細書に記載されたようなペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００７５】
本発明は、本発明に記載したポリヌクレオチドで形質転換した宿主細胞にも関する。当業者は、例えばトランスフェクション、リポフェクション、電気穿穴法、マイクロインジェクション法、ウイルス感染、熱衝撃、膜の化学的な透過処理もしくは細胞融合後の形質転換などの、宿主細胞へのポリヌクレオチドの取り込みのための標準的な方法に通じている。
【００７６】
本発明のもう一つの対象は、本発明に記載したポリヌクレオチドを含んでなるベクターであり、ウイルスベクターを含む。
【００７７】
第四の態様では、本発明の組成物は、ＬＭＰ１の細胞内領域に対応する上述のポリペプチドまたはその断片を発現する形質転換した宿主細胞を含んでなる。
【実施例】
【００７８】
腫瘍抑制のための抗ＬＭＰ−１による処理
本発明者らは、抗ＬＭＰ−１抗体での処理が、１）ＮＰＣ由来のおよびＧＣ由来の腫瘍を抑圧したこと、並びに２）ＮＰＣ由来のおよびＧＣ由来の腫瘍の発達から保護したことを示す。
【００７９】
抗ＬＭＰ−１抗体をＥＢＶ関連癌（ＮＰＣおよびＧＣ）の保護および抑制剤として示すために、本発明者らは、本発明者らの研究室で以前開発した動物モデル（ヌードマウス）を用いた（Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh  and T. Ooka.  Clin. Cancer Res.  13 : 4993-5000 ; Sheng W, Decaussin, G., Sumner, S. and Ooka, T. 2001. Oncogene  20: 1176-1185）。
【００８０】
本実施例で用いられたヌードマウスは、Ｈａｒｌａｎ社（フランス）に由来しており、イタリアで作製された：系統：Ｈｓｄ：Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｎｕｄｅ−Ｆｏｘ１ｎｕ。本発明者らはＨｓｄＣｐｂ：ＮＭＲＩ−Ｆｏｘ１ｎｕも同様に分析した。これらの週齢は４週であった。これらの性別はオスであった。これらの４週齢での体重は約１９−２１ｇであった。
【００８１】
抗ＬＭＰ−１抗体の効果についてのイン・ビトロ解析のために、ＥＢＶ陽性ＮＰＣ由来のｃ６６６−１およびＧＣ由来ＥＢＶ−ＡＧＳ上皮細胞株およびＥＢＶ陽性またはＥＢＶ陰性ヒトＢ細胞株において、モノクローナル抗ＬＭＰ−１  Ｓ１２を調べた。
【００８２】
抗ＬＭＰ１抗体Ｓ１２はＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（フランス）から市販されている。カタログ番号：５５９８９８。
【００８３】
この抗体はＬＭＰ１タンパク質のＣ末端領域、ＣＴＡＲ２近傍のアミノ酸配列３０１−３１８ａａを認識する（図１参照）。
【００８４】
ＮＰＣ由来の腫瘍は、ＮＰＣ由来ｃ６６６−１（Cheung ST, Huang DP, Hui AB, Lo KW, Ko CW, Tsang YS, Wong N, Whitney BM, Lee JC. Int J Cancer 1999; 83:121-6）またはＧＣ由来ＥＢＶ陽性ＡＧＳ（Kassis J , Maeda A, Teramoto N, Takada, K, Wu C, Wells A. Int. J. Cancer 2002; 99 : 644-51）上皮細胞がヌードマウスに注入されたときに引き起こされうる。そこで本発明者らは、これらのマウスにおける抗ＬＭＰ１抗体の効果を分析した。
【００８５】
一般的に、ＥＢＶゲノムを持たないＡＧＳ細胞がヌードマウスに注入されたときにはいかなる腫瘍も引き起こさないが、ヌードマウスにおいてはＥＢＶ陽性ＡＧＳによりＧＣ由来の腫瘍の発達が起こった。この報告は今までされたことが無い。
【００８６】
イン・ビトロ実験
最初に、ＥＢＶ陽性ｃ６６６−１およびＥＢＶ陽性ＡＧＳ上皮細胞株、ＥＢＶ陽性ヒトＩＢ４  Ｂ細胞株、ＥＢＶ陽性ヒトＲａｊｉ  Ｂ細胞株およびＥＢＶ陰性ヒトＬｏｕｃｋｅｓ  Ｂ細胞株における、イン・ビトロ培養状態での（培養液に加えられた）抗ＬＭＰ１抗体の効果を分析した。１０５個の細胞に対して５μｇの抗ＬＭＰ１を培養液に加えた。細胞増殖の進展を１２０時間観察した（図２）。
【００８７】
分泌されたＬＭＰ−１癌タンパク質が（培養液に加えられた）５μｇのＳ１２抗ＬＭＰ−１抗体により中和されると、ｃ６６６−１細胞は図２−３の生存曲線により示されるように死滅した。生存細胞は、抗体添加後、２４時間後に７８％に、４８時間後に５０％に、７２時間後に２５％に、９６時間後に７％に減少し、すべてのｃ６６６−１細胞が１２０時間（５日間）後に死滅した。このことは、ＬＭＰ−１／エキソソームの細胞分裂促進活性が主要な細胞活性化プロセスに直接関係していることを示唆する（Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh  and T. Ooka.  Clin. Cancer Res.  13 : 4993-5000）。
【００８８】
同様の抑制効果が、ＥＢＶ陽性ヒトＲａｊｉ（図１−１）およびＩＢ４  Ｂ細胞株（図２−４）においても観察された。この抑制効果は、ＥＢＶ陽性Ｂ細胞株（図２−１および４）において顕著であった：抗体添加後、生存細胞は、２４時間後に７８％に、４８時間後に１３％に、７２時間後に１０％に、９６時間後に５−７％に減少し、そしてすべてのＢ細胞が１２０時間（５日間）後に死滅した。
【００８９】
ＥＢＶ陰性Ｌｏｕｃｋｅｓ  Ｂ細胞株ではそのような抑制効果は見られなかった（図２−２）。
【００９０】
結論として、抗ＬＭＰ−１抗体はＬＭＰ−１タンパク質を発現するＥＢＶ陽性ｃ６６６−１上皮細胞およびＥＢＶ陽性Ｂ細胞の細胞増殖を抑制することができた。
【００９１】
これらの結果は、抗ＬＭＰ−１が細胞から分泌されたＬＭＰ−１／エキソソームと複合体を形成し、その後その複合体が細胞内に入りうることを示唆している。おそらく、一度この複合体が細胞内に入ることがＮＦｋＢの発現を抑制し細胞死を引き起こしたのだろう（イン・ビボ実験の項と図１５を参照）。
【００９２】
この仮説を検証するため、Ｒａｊｉ細胞を図２−１（ヒトＲａｊｉ  Ｂ細胞）と同様の条件で５μｇ  Ｓ１２と共に９６時間培養した。２４時間毎に細胞を回収し、スライドグラス上に置き、透過処理のためにアセトンで固定した。細胞内のエキソソーム／ＬＭＰ−１／Ｓ１２複合体の存在を、フルオレセインを連結した抗マウスＩｇで検出した。
【００９３】
Ｓ１２で処理されなかったＲａｊｉでは蛍光が観察されなかった（図２、Ｒａｊｉ＋Ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ）が、一方で、Ｓ１２処理後２４時間のＲａｊｉは細胞膜近傍に斑点状の免疫蛍光が見られた。９６時間では、重大な免疫蛍光が細胞質および核分画に観察された。このことは腫瘍細胞から分泌されたエキソソーム／ＬＭＰ１がＳ１２と複合体を形成し、そしてＬＭＰ１／エキソソーム／Ｓ１２が細胞内に吸収され、核に到達することができたことを示唆している。Ｓ１２で処理されなかった細胞で反応がみられなかったことは、抗体Ｓ１２単独では細胞に吸収されないことを示す。
【００９４】
本発明者らはそこでＬＭＰ１／エキソソーム複合体（ＥＬＣ）がＥＢＶ陰性細胞株の培養液に直接添加されたときに同様の現象（ＬＭＰ１／エキソソーム複合体の細胞内への吸収）が起こるか否かを検証した。このために、本発明者らは最初にＮＰＣ患者の血清からエキソソーム／ＬＭＰ１複合体を精製し、その後ＥＢＶ陰性細胞の培養液に直接添加した。ヒトＴ細胞株、ＣＥＭ１およびヒトＢ細胞株、Ｌｏｕｃｋｅｓを１μｇのＥＬＣと共に培養した。細胞を固定し、その後透過処理した。エキソソーム／ＬＭＰ１複合体の存在を抗ＬＭＰ−１  Ｓ１２および抗ＣＤ６３（エキソソームの特異的なマーカー）を用いて共焦点顕微鏡法により２４時間観察した。核に局在するために細胞をＤａｐｉで染色した。最初は抗体Ｓ１２または抗ＣＤ６３を１０００分の１希釈で用いて保温し、その後Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏ  ４８８  ＩｇＧヤギ抗マウスＩｇＧを二次抗体として用いてインキュベートした。ＬＭＰ１はローダミンで赤色蛍光とし、ＣＤ６３はフルオレセインで緑色蛍光とした。細胞は３５６ｎｍ（Ｄａｐｉ）と４８８ｎｍ（Ａｌｅｘａ）で励起した。
【００９５】
両方の抗体（抗ＬＭＰ−１および抗ＣＤ６３）が細胞画分：細胞質および核に共局在した。これらは、ＥＬＣで以前観察されたのと同様に、エキソソーム／ＬＭＰ１／Ｓ１２複合体が吸収されうることを示唆する。
【００９６】
これらの細胞内局在を免疫電子顕微鏡法により確かめた。
２種の細胞株を電子顕微鏡解析した：−１）１μｇのＮＰＣ血清由来ＬＭＰ１／エキソソーム複合体で処理されたヒトＬｏｕｃｋｅｓ  Ｂ細胞株および−２）Ｓ１２でのみ処理されたヒトＲａｊｉ  Ｂ細胞株。
【００９７】
Ｌｏｕｃｋｅｓ細胞をＮＰＣから精製されたエキソソーム／ＬＭＰ１複合体で４８時間処理した。細胞塊を冷凍状態でカットし、その後スライドグラス上に置いた。
【００９８】
ＣＤ６３は１０ｎｍ金ビーズを連結した抗ＣＤ６３で検出した。ＬＭＰ−１は５ｎｍ金ビーズを結合したＳ１２により検出した。
【００９９】
Ｒａｊｉ細胞をＳ１２抗体で４８時間処理し、その後固定した。このスライドグラスを抗マウスＩｇ（Ｓ１２用）または抗ＣＤ６３（エキソソーム用）のいずれかで処理した。（５ｎｍ金ビーズを連結した）抗マウスＩｇは、エキソソーム／ＬＭＰ１／Ｓ１２複合体上に局在するＳ１２抗体と反応し、（１０ｎｍ金ビーズを連結した）抗ＣＤ６３は、同じエキソソーム上に局在するＣＤ６３と反応した。エキソソーム小胞、多小胞体、腔および核に陽性反応が見られた。
【０１００】
ＮＰＣ患者の血清から単離されたエキソソーム／ＬＭＰ１複合体は、ＭＴＴ試験において強力な細胞分裂促進活性を有する（Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bougermouh and T. Ooka.  Clin. Cancer Res. 13 : 4993-5000）。
【０１０１】
ＮＰＣ患者の血清からのエキソソーム／ＬＭＰ１複合体（ＥＬＣ）および通常個体からのエキソソーム（ＥＣ）が細胞増殖促進活性を有するか否かを調べるために、多様な細胞株で比較研究を行った。ＡＫＡＴＡ（ＥＢＶ−変種）、Ｌｏｕｃｋｅｓ（Ｂ細胞）、ＣＥＭ−１（Ｔ細胞）、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３（齧歯類線維芽細胞）およびＥＢＶ陰性ヒト上皮ＨａＣａＴ細胞株をこの調査に用いた（図３）。
【０１０２】
ＮＰＣ患者から精製された３００ｎｇのエキソソーム／ＬＭＰ−１複合体（ＳＮＰＣ）と共に５００００細胞／１００μｌの培養液（ＦＣＳ無し）でＭＴＴ試験を行った。ＦＢＳ有りまたは無しの条件および健康な個体から単離されたエキソソーム（ＥＣ−ＳＮＦ）を対照として用いた（図４）。
【０１０３】
ＮＰＣからのエキソソーム／ＬＭＰ１複合体は強力な細胞分裂促進活性を示した。ＥＣＬ（ＳＮＰＣ）で得られたこの値はＦＢＳで得られた値と同等であったが、一方でＰＢＳや健康な個体からのＥＣ（ＳＮＰ）は基底値を示した。エキソソーム／ＬＭＰ１分析におけるＳ１２の添加（ＥＬＣ＋Ｓ１２）が、エキソソーム／ＬＭＰ１複合体により誘導される細胞分裂促進活性をほぼ完全に消失させるため（図４、ＥＬＣ（ＳＮＰＣ）＋Ｓ１２）、ＥＬＣ（ＳＮＰＣ）で得られた細胞分裂促進活性はエキソソーム内のＬＭＰ−１の存在による。
【０１０４】
抗ＬＭＰ−１により誘導される細胞死は、エキソソームと複合体を形成したＬＭＰ−１によるＮＦｋＢ、特にＮＦｋＢの二つの主要構成要素（ｐ６５およびｐ５０）の発現の抑制と関連する（図１１参照）。（エキソソームを付随しない）遊離のＬＭＰ−１は細胞周期を活性化できなかった（Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bouguermouh and T. Ooka. Clin. Cancer Res. 2007. 13 : 4993-5000）。さらには、本発明者らのデータは健康な個体から精製したエキソソーム（ＥＣ：ＳＮＰ）は細胞周期を活性化できかったことを示した（図４）。
【０１０５】
結論として、ＬＭＰ−１の細胞分裂促進活性はエキソソームとの会合を必要とする。最後に、本発明者らのデータはエキソソーム／ＬＭＰ１複合体形態がＮＦｋＢの発現を抑制する能力を有することを示した。
【０１０６】
ＮＦｋＢの発現は、Ｓ１２処理のｃ６６６−１やＳ１２処理のＲａｊｉ細胞で完全に抑制されていた（図１１）。
【０１０７】
本発明者らのデータは今まで文献で報告されていたＬＭＰ−１によるＮＦｋＢの抑制が、おそらく細胞に入ったエキソソームとの複合体からくることを示唆している。この観察は、本発明者らにＬＭＰ−１により誘導される発癌の機構における新しい概念を提供するだろう。
【０１０８】
抗ＬＭＰ−１の効果を、ＥＢＶ−ＡＧＳ細胞株で研究した。ＡＧＳおよびＥＢＶ−ＡＧＳ細胞株を抗ＬＭＰ−１で処理した（図４−１および図４−２）。
【０１０９】
抗ＬＭＰ−１はＡＧＳ細胞増殖において少しも抑制を示さなかったが（図４−１）、その一方で、抗ＬＭＰ−１は７２時間で細胞増殖を止めた。しかし、すべての細胞が１２０時間まで生存していた（図４−２）。
【０１１０】
イン・ビトロで培養したＥＢＶ−ＡＧＳではＬＭＰ−１の転写はほぼ全くなかった。抗ＬＭＰ−１はそれゆえにこれらの細胞で有毒ではない。
しかし、実際には細胞死を伴わない細胞増殖の抑制に関しては説明が無い。
【０１１１】
イン・ビボ実験：
本発明者らは、ＥＢＶ関連癌：ｃ６６６−１細胞（ＮＰＣ由来）またはＥＢＶ陽性ＡＧＳ（ＧＣ由来）からの１０７個の培養細胞を皮下に注射したヌードマウスにおいて抗ＬＭＰ−１抗体の活性を調べた。
【０１１２】
ｃ６６６−１細胞では、抗体処理をしていないマウスで、２日目または３日目までに腫瘍が検出され、その直径は、４日で約２ｍｍ、８日で８ｍｍ、そして１４日で１６ｍｍおよび２０日で２０ｍｍ（図５−１）に達した：ＥＢＶ−ＡＧＳ細胞ではｃ６６６−１細胞での腫瘍よりも約１．５倍大きかった。
【０１１３】
ＥＢＶ陽性ＡＧＳ細胞では、抗体処理をしていないマウスで、２日目または３日目までに腫瘍が検出され、その直径は、４日で約３ｍｍ、８日で１５ｍｍ、そして１４日で２５ｍｍおよび２０日で３０ｍｍ（図６−１）に達した。
【０１１４】
誘発した腫瘍（直径におけるｍｍ単位での腫瘍サイズ）は、ＥＢＶ−ＡＧＳ細胞での腫瘍がｃ６６６−１細胞での腫瘍よりもやや大きく、約１．５倍であった（図５−ａおよび図６−ｅ）。
【０１１５】
抗ＬＭＰ−１の効果を解析するため、マウス１匹に対して２５μｇのモノクローナル抗ＬＭＰ−１  Ｓ１２を３つの手順で、腹腔内に注射した：
手順＃１、予防的手順において、抗ＬＭＰ−１  Ｓ１２が２５μｇの５回の腹腔内注射として５日間隔で投与され、腫瘍接種の３日前に投与を終えた（ｃ６６６−１は図５−ｂおよびＥＢＶ−ＡＧＳは図６−ｆ）。
手順＃２、腫瘍接種と同時に連続した毎日の注射を開始した（ｃ６６６−１は図５−ｃおよびＥＢＶ−ＡＧＳは図６−ｇ）。
手順＃３、腫瘍サイズが直径で約０．８ｃｍになったときに注射（毎日１回の注射）が行われた（ｃ６６６−１は図５−ｄおよびＥＢＶ−ＡＧＳは図６−ｈ）。
手順＃１と＃２は予防のため、手順＃３は腫瘍の治療のためである。
【０１１６】
両方の細胞株に対する抗ＬＭＰ−１での予防的な（手順＃１  ｃ６６６−１は−図５−ｂそしてＥＢＶ−ＡＧＳは図６−ｆ）または同時の（手順＃２  手順＃１  ｃ６６６−１は−図５−ｃそしてＥＢＶ−ＡＧＳは図６−ｇ）処理は、処置したどのマウスにおいても腫瘍の発生を少なくとも３ヶ月間は完全に排除した。
【０１１７】
腫瘍がすでに相当な大きさに達しているときに投与されたとしても、抗ＬＭＰ−１抗体の注射は高い効き目があった。約８ｍｍ（ｃ６６６−１）および約１５ｍｍ（ＥＢＶ−ＡＧＳ）の塊が速やかに安定化し、抗ＬＭＰ−１抗体の５日間の毎日の注射による処置の後、次第に後退した（ｃ６６６−１は図５−ｄ、そしてＥＢＶ−ＡＧＳは図６−ｈ）。処置開始後１１日目には腫瘍塊が完全に消失し、少なくとも３ヶ月間マウスは腫瘍の無い状態であった。
【０１１８】
腫瘍増殖の抑制における抗ＬＭＰ−１の特異性を確かめるために、本発明者らは手順＃１（予防的）において、ＥＢＶにコードされるデオキリシボヌクレアーゼの抗体またはマウスモノクローナル抗Ｉｇ抗体のいずれかを注射した。抗ＥＢＶ−デオキリシボヌクレアーゼまたは抗マウスＩｇのいずれかが、予防的手順において腫瘍接種前に２５μｇの５回の腹腔内注射として５日間隔で投与された。
【０１１９】
手順＃１（予防的）でｃ６６６−１（図７）で抗デオキリシボヌクレアーゼで、若しくは抗ＬＭＰ−１の代わりに抗マウスＩｇ（図８）で処理したまたは未処理のマウスを対照実験として用いたとき、急激な腫瘍成長が見られた（図７および図８）。このことは、腫瘍発達の特異的な抑制がおそらくＳ１２抗ＬＭＰ−１によるＬＭＰ−１タンパク質の中和によることを示唆している。抗マウスＩｇはシグマ（フランス）カタログ番号６２１９７から購入した。
【０１２０】
本実施例で用いたウサギポリクローナル抗デオキリシボヌクレアーゼは、本発明者らの研究室において、バキュロウイルスシステムにより得られたデオキリシボヌクレアーゼから作成された（Sbih-Lammali F, Berger F, Busson P and Ooka T, 1996, Virology, 222: 64-74）（Zeng Y, Middeldorp J, Madjar  JJ and Ooka T , 1997, Virology 239:285-295）。
【０１２１】
その後、本発明者らは抗ＬＭＰ−１およびＬＭＰ−１タンパク質の複合体が腫瘍細胞同様に血清にも存在するか否かを検証した。
【０１２２】
本発明者らは免疫ブロット法により、腫瘍を発達させたマウスからの血清および腫瘍を分析した。
【０１２３】
ＬＭＰ−１はｃ６６６−１（図９−１、ｃ６６６−１）およびＥＢＶ−ＡＧＳ（図９−１、ＥＢＶ−ＡＧＳ）をもつマウスの血清に存在した。この実験で用いられた陽性対照はヒトＰ３ＨＲ１Ｂ細胞の細胞抽出物に由来する。ＬＭＰ−１タンパク質は古典的に知られるｐ６３ｋＤａタンパク質として検出された。
【０１２４】
その後、本発明者らは腫瘍発達後（手順＃３）に抗体で処理したマウスにおけるこれら血清構成成分を調べた。エキソソームと複合体を形成するＬＭＰ−１は超遠心分離により精製した（Houali K, X. Wang, Y. Shimizu, D. Djennaoui, J. Nicholls, S. Fiorini, A. Bouguermouh  and T. Ooka. Clin. Cancer Res. 13 : 4993-5000）。
【０１２５】
ウェスタンブロット法によるｃ６６６−１処理マウスの血清における複合体の分析で、ウサギ免疫グロブリン（図９−２：Ｓ−ｃ６６６−１−Ｉｇ）と会合したＬＭＰ−１（図９−２：Ｓ−ｃ６６６−１）の存在が示された。市販のマウスＩｇを陽性対照として加えた（図９−２：Ｉｇ）。
【０１２６】
同様の複合体が、腫瘍の生検材料（図９−３、ＭＴ−ｃ６６６−１）において、ウサギ免疫グロブリン（図９−３、ＭＴ−ｃ６６６−１−Ｉｇ）と会合した状態で存在した。市販のマウスＩｇを陽性対照（図９−３：Ｉｇ）として加えた。
【０１２７】
ｃ６６６−１腫瘍を発達させるＳ１２処理マウスの血清において、エキソソーム／ＬＭＰ１／マウスＩｇ複合体の存在を調べた（図１０）。
【０１２８】
ｃ６６６−１腫瘍を発達させるマウス血清からのエキソソーム／ＬＭＰ１／Ｓ１２複合体を分画超遠心分離により精製し、抗マウスＩｇ（Ｓ１２検出のため）または抗ＣＤ６３（エキソソーム検出のため）で処理した。エキソソーム／ＬＭＰ１／Ｓ１２複合体を１０ｎｍ金ラベルマウスＩｇにより、および５ｎｍ金ラベル抗ＣＤ６３により検出した。標準のエキソソーム：これらの抗体（抗マウスＩｇおよび抗ＣＤ６３（図１０）  Ｓ１２で処理したｃ６６６−１を注射したマウスからのエキソソーム）で処理されなかったエキソソーム／ＬＭＰ１／Ｓ１２。
【０１２９】
一次抗体の省略またはこれらの非免疫血清（標準のマウスのエキソソーム）による置き換えにより免疫学的特異性が制御された。
【０１３０】
エキソソーム／ＬＭＰ１／マウスＩｇ複合体をより正確に可視化するために、腫瘍の生検材料から抽出し、スライドグラスに広げられ、アセトンで固定されたｃ６６６−１およびＥＢＶ−ＡＧＳ腫瘍細胞においてこの複合体が調べられた。
【０１３１】
驚くべきことに、本発明者らは、適切に処理したマウスからの腫瘍の生検材料から単離された細胞の内部にエキソソーム／ＬＭＰ１／マウスＩｇ複合体を見いだした。この複合体はＳ１２用の抗マウスＩｇにより明らかにされた。両方の腫瘍（ＬＭＰ−１  ｃ６６６−１およびＬＭＰ−１  ＥＢＶ−ＡＧＳ）において、エキソソーム／ＬＭＰ−１／マウスＩｇ複合体が細胞質内および核内の斑点として見られた。通常、細胞分裂促進活性をもつこれらの構成成分はその特異的抗体との結合により無効にされたらしい。
【０１３２】
Ｓ１２抗体で処理したマウスの血清から得た複合体は、抗マウスＩｇおよび抗ＣＤ６３の両方と反応し、ＬＭＰ−１／エキソソーム複合体の存在を確認した。
【０１３３】
抗体は、引き続いて生じる細胞死を伴うＬＭＰ−１／エキソソーム複合体の細胞分裂促進活性を中和するらしい。イン・ビトロで培養したときには検出できるＬＭＰ−１発現が認められないにもかかわらず、Ｓ１２抗体がＥＢＶ−ＡＧＳ移植マウス（図６ｆ、ｇ、ｈ）における腫瘍成長を抑制することは驚くべきことであった（Kassis J , Maeda A, Teramoto N, Takada, K, Wu C, Wells A. Int. J. Cancer 2002; 99 : 644-51）（図９と［００９５］も参照）。
【０１３４】
ｅｘ  ｖｉｖｏおよび培養状態におけるＥＢＶ−ＡＧＳ細胞内のＬＭＰ−１の転写を半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより比較した。本発明者らは、ＬＭＰ−１発現（４７９ｂｐのバンド）がＥＢＶ−ＡＧＳ細胞培養でほとんど消失していること、その一方で腫瘍の生検材料においてはその発現が陽性になることを見いだした。予想される通り、ゲノム配列（非スプライス配列）の増幅で６４０ｂｐのバンドが得られる。ＲＴ−ＰＣＲで増幅される配列はＬＭＰ１  ｍＲＮＡに対応する。本発明者らは、この結果を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより確かめた。相対的な発現をＢＡＲＦ１  ｍＲＮＡ／ａｃｔｉｎ  ｍＲＮＡのパーセンテージ（％）により表した。培養細胞（ｃ６６６−１）から得られる値と比較してｃ６６６−１腫瘍（ｃ６６６−１／ｃ６６６−１−Ｔ）における転写レベルはほぼ７倍であった。ＥＢＶ−ＡＧＳ腫瘍においてはＢＡＲＦ１転写の注目すべき高い活性化が観察されたが、その一方で、培養状態でのＥＢＶ−ＡＧＳ細胞においては転写がほとんど観察されなかった。
【０１３５】
それゆえに、ＥＢＶ−ＡＧＳ腫瘍における抗ＬＭＰ−１の抑制効果は腫瘍におけるＬＭＰ−１発現の活性化による。このような報告は今までなされたことが無い。
【０１３６】
ＬＭＰ−１はＮＦ−ｋＢ発現を活性化する（Kieff and Rickinson, 2007, Fields Virology 5th Edition-Fields BN, Knipe DM, Howley PM (ed.) Lippincott-Williams & Wilkins Publishers : Philadelphia, 2007, pp. 2603-2654）。本発明者らはＥＬＩＳＡ試験（ＴｒａｎｓＡＭ  ＮＦｋＢファミリーキット：商品コード４３２９６、Ａｃｔｉｖｅ−Ｍｏｔｉｆ、フランス）によりＮＦ−ｋＢの５つの構成成分の発現を調べた。本発明者らは、ＲａｊｉおよびＣ６６６−１細胞において、Ｓ１２抗体による処理は、ＮＦｋＢファミリーの重要な構成成分であるＮＦｋＢ  ｐ６５およびｐ５０を完全に抑制することを見いだしたが、このことは、これらの細胞におけるＮＦ−ｋＢ  ｐ６５およびｐ５０の発現がもっぱらＬＭＰ−１の活性化に依存することを示唆している。ＬＭＰ−１を発現しないＥＢＶ−ＡＧＳは、Ｓ１２処理後はＮＦ−ｋＢ  ｐ６５およびｐ５０の基底の発現を示し続けた（図１１ａ）が、このことは代替の活性化経路を示唆する。ｐ６５およびｐ５０は両方の型の腫瘍（ＮＰＣ：ｃ６６６−１ＴｕｍおよびＧＣ：ＥＢＶ−ＡＧＳＴｕｍ）において著しく活性化されていた。ＮＰＣ血清から単離したＬＭＰ１／エキソソーム複合体で、Ｌｏｕｃｋｅｓ細胞をイン・ビトロで処理（Ｌｏｕｃｋｅｓ＋ＥＬＣ）したとき、これらの構成成分の活性化が見られた（図１１ｂ）。この活性化は、Ｓ１２抗体の存在により完全に低減したが、このことはこの活性化がエキソソームと複合体を形成したＬＭＰ−１（Ｌｏｕｃｋｅｓ＋ＥＬＣ＋Ｓ１２）の存在によることを示唆している。陽性対照としてのＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ）におけるｐ６５およびｐ５０の有意な発現もＳ１２抗体によって完全に抑制された（図１１ｂ：Ｒａｊｉ＋Ｓ１２）。抗ＬＭＰ−１による免疫療法を原理とする治療および予防はＮＰＣ型の癌のみならず、ＧＣ型の癌に対しても有効である。抗ＬＭＰ１の抑制効果はイン・ビボおよびイン・ビトロで観察された。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】ＬＭＰ１タンパク質の構造とエキソソーム／ＬＭＰ１複合体におけるＳ１２の認識部位を示した図である。
【図２】ＥＢＶ陽性またはＥＢＶ陰性細胞株における抗ＬＭＰ１の効果を示した図である。抗ＬＭＰ１の効果をＥＢＶ陽性およびＥＢＶ陰性Ｂ細胞株、並びにｃ６６６−１上皮細胞株において分析した。５μｇのモノクローナル抗体Ｓ１２の添加後、細胞の生存を１２０時間モニターした。抗ＬＭＰ１はｃ６６６−１、ＲａｊｉおよびＩＢ４の細胞増殖を効果的に抑制し、一方でＥＢＶ陰性のＬｏｕｃｋｅｓ細胞株では抑制効果は見られなかった。
【図３】ＮＰＣ患者の血清から単離したエキソソーム／ＬＭＰ１で処理したＣＥＭ（ヒトＴ細胞）、ＥＢＶ陰性ＡＫＡＴＡ（Ｂ細胞）、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３（齧歯類線維芽細胞）およびＨａＣａＴ（ヒト上皮細胞）に対するＭＴＴ試験を示した図である。エキソソーム／ＬＭＰ１複合体（ＥＬＣ）を単離した。３００ｎｇのＮＰＣ患者からの複合体を含む５μｌのエキソソーム／ＬＭＰ１複合体を用いて、ＦＢＳ無しの５００００細胞／１００μｌの培養液でＭＴＴ試験を行った（ＳＮＰＣ）。ＦＢＳありまたは無しで、および健康な個体から得たエキソソーム（ＥＣ−ＳＮＰ）を対照として用いた。ＬｏｕｃｋｅｓとＡＫＡＴＡ：ヒトＢ細胞株、ＣＥＭ、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３およびＨａＣａＴ。エキソソーム／ＬＭＰ１へのモノクローナル抗体Ａ１２の添加は細胞分裂促進活性をほぼ完全に破壊した（ＥＬＣ＋Ｓ１２）。
【図４】ＥＢＶ−ＡＧＳ細胞増殖におけるモノクローナル抗体Ｓ１２の効果を示した図である。ＥＢＶ陰性ＡＧＳ（１）およびＥＢＶ陽性ＡＧＳ（２）をＳ１２抗体で分析した。５μｇのモノクローナルＳ１２を培養液に添加した。対照細胞は抗体を入れなかった。細胞生存力をクマシーブルー染色により５日間計測した。
【図５】免疫療法評価分析を示した図である。  抗ＬＭＰ１  Ｓ１２を、ｃ６６６−１細胞の注入の、前に（ｂ）、同時に（ｃ）、後に（ｄ）、注入した。５０μｇの抗体を腹腔内に注入した。１０７細胞（ｃ６６６−１）を皮下に注入した。図中の値はｍｍ単位で計測した平均腫瘍サイズの直径に対応する。プロトコル１：（ｂ）ｃ６６６−１に対しＳ１２を使用した。プロトコル２：（ｃ）ｃ６６６−１に対しＳ１２を使用した。プロトコル３：（ｄ）ｃ６６６−１に対しＳ１２を使用した。いずれの抗体も使用しないｃ６６６−１細胞の導入後の腫瘍発達（ａ）。
【図６】免疫療法評価分析を示した図である。抗ＬＭＰ１  Ｓ１２を、ＥＢＶ−ＡＧＳ細胞の注入の、前に（ｂ）、同時に（ｃ）、後に（ｄ）、注入した。５０μｇの抗体を腹腔内に注入した。１０７細胞（ＥＢＶ−ＡＧＳ）を皮下に注入した。図中の値はｍｍ単位で計測した平均腫瘍サイズの直径に対応する。プロトコル１：（ｂ）ＥＢＶ−ＡＧＳに対しＳ１２を使用した。プロトコル２：（ｃ）ＥＢＶ−ＡＧＳに対しＳ１２を使用した。プロトコル３：（ｄ）ＥＢＶ−ＡＧＳに対しＳ１２を使用した。いずれの抗体も使用しないＡＧＳ−ＥＢＶ細胞の導入後の腫瘍発達（ａ）。
【図７】抗ＥＢＶデオキシリボヌクレアーゼの効果を示した図である。５０μｇのウサギポリクローナル抗ＥＢＶデオキシリボヌクレアーゼを２０日間５日毎に処置のために使用し、その後１０６個のｃ６６６−１細胞を注入した。腫瘍発達をモニターした。腫瘍発達における抗体の抑制効果は無い。
【図８】抗ウサギまたは抗マウスの効果を示した図である。５０μｇの抗マウスＩｇを２０日間５日毎に処置し、その後、その後１０６個のｃ６６６−１細胞を注入した。腫瘍発達をモニターした。腫瘍発達における抗体の抑制効果は無い。
【図９】免疫ブロットによるマウス血清および腫瘍細胞におけるＬＭＰ１／エキソソーム複合体の検出を示した図である。ＬＭＰ１／エキソソーム複合体を単離し、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析した。抗原抗体複合体は増強化学発光システム（ＥＣＬ；アマシャム）により検出した。ｃ６６６−１またはＥＢＶ−ＡＧＳ腫瘍の発達させたマウスからの血清内のＬＭＰ１の存在を分析した（１）。陽性の対照はＰ３ＨＲ１細胞であった。ＬＭＰ１／エキソソーム複合体は血清から単離された：（２）Ｓ−ｃ６６６−１。ＬＭＰ１／エキソソーム複合体は腫瘍から単離された（３）：ＭＴ−ｃ６６６−１。Ｓ１２はウサギ二次抗Ｉｇにより検出された。市販のマウスＩｇが陽性の対照として用いられた：Ｉｇ（１、２、３）。
【図１０】エキソソーム／ＬＭＰ１／Ｓ１２複合体を示した図である。エキソソーム／ＬＭＰ１／Ｓ１２複合体をｃ６６６−１腫瘍の発達しているマウスの血清から精製し、抗マウスＩｇ（Ｓ１２の検出のため）または抗ＣＤ６３（エキソソーム検出のため）で処理した。１０ｎｍ金ラベルマウスＩｇおよび５ｎｍ金ラベル抗ＣＤ６３によりエキソソーム／ＬＭＰ１／Ｓ１２複合体を検出した。通常のエキソソーム：これら抗体で非処理のエキソソーム／ＬＭＰ１／Ｓ１２。免疫学的特異性は、一次抗体の省略または非免疫の血清による置換により制御された。
【図１１】Ａ：ｃ６６６−１、ＡＧＳ、ＥＢＶ−ＡＧＳ、ｃ６６６−１、ｃ６６６−１腫瘍およびＥＢＶ−ＡＧＳ腫瘍におけるＮＦ−ｋＢのタンパク質発現を示した図である。  ａ：ＮＦ−ｋＢの５つの構成要素（ｐ６５、ｐ５０、ｐ５２、ＲｅｌＢおよびｃ−Ｒｅｌ）の発現をＥＬＩＳＡ試験（ＴｒａｎｓＡＭ  ＮＦｋＢファミリーキット：商品コード４３２９６、Ａｃｔｉｖｅ−Ｍｏｔｉｆ、ベルギー）により分析した。ＡＧＳ、ＥＢＶ−ＡＧＳ、ＥＢＶ−ＡＧＳ＋Ｓ１２、ＥＢＶ−ＡＧＳ腫瘍、ｃ６６６−１、ｃ６６６−１＋Ｓ１２、ｃ６６６−１腫瘍、ＲａｊｉおよびＳ１２処理ＲａｊｉをＮＦ−ｋＢの５つの構成要素の発現解析にかけた。ＮＦ−ｋＢの主要な構成要素である、ｐ６５およびｐ５０はＲａｊｉで活性化され、これらの構成要素はＳ１２存在下で有意に抑制された。この構成要素の発現は、腫瘍で活性化されたが、一方で培養中の細胞はこの構成要素の基底の発現を示した。  ｂ：Ｌｏｕｃｋｅｔｓ細胞を、イン・ビボでＮＰＣ血清から単離したＬＭＰ１／エキソソーム複合体で処理したときのこれらの構成要素の活性を見た（Ｌｏｕｃｋｅｓ＋ＥＬＣ）（ｂ）。この活性はＳ１２抗体の存在下で完全に減少しており、このことはこの活性がエキソソームと複合体を形成したＬＭＰ１の存在に起因することを示唆している（Ｌｏｕｃｋｅｓ＋ＥＬＣ＋Ｓ１２）。陽性の対照として、Ｒａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ）におけるｐ６５およびｐ５０の重要な発現も同様にＳ１２抗体によって完全に阻害されていた（Ｒａｊｉ＋Ｓ１２）。
【図１】
2011530277.tif 000002
【図２】
2011530277.tif 000003
【図３】
2011530277.tif 000004
【図４】
2011530277.tif 000005
【図５】
2011530277.tif 000006
【図６】
2011530277.tif 000007
【図７】
2011530277.tif 000008
【図８】
2011530277.tif 000009
【図９】
2011530277.tif 000010
【図１０】
2011530277.tif 000011
【図１１】
2011530277.tif 000012
2011530277.tif 000013
【配列表】
2011530277000001.app
【国際調査報告】
2011530277.tif 000014
2011530277.tif 000015
2011530277.tif 000016