(57)【要約】  本発明は、細胞をリプログラミングする方法、組成物及びキットに関する。一実施形態において、本発明は、細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するステップを具える方法に関する。さらに別の実施形態においては、この方法は、ＨＤＡＣ阻害剤によってＨＤＡＣの活性を抑制するステップと、細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するステップと、を具える。さらに別の実施形態において、本発明は、リプログラミングの方法であって、１よりも多い薬剤に細胞を暴露させて１つよりも多い調節タンパクを抑制するステップを具える方法に関する。さらに別の実施形態において、本発明は、様々な分化細胞種に再分化又はトランス分化できるＥＳ様細胞の特性を有し得るリプログラミング細胞又はリプログラミング細胞の高密度集団に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をリプログラミングする方法において、
ヒストンデアセチラーゼの活性、発現、又は、活性及び発現を抑制する薬剤に細胞の集団を暴露させるステップと、
多能性遺伝子の発現を誘導するステップと、
多能性細胞を示す細胞表面マーカーを発現する細胞を選択するステップと、
前記選択した細胞を増殖させて細胞の集団を作るステップであって、前記細胞が分化能を取り戻すステップと、を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記細胞を選択するステップが、
前記薬剤に細胞を暴露させる前と後とで細胞の遺伝子型を比較するステップと、
多能性細胞と一致する表現型を有する細胞を識別するステップとをさらに具えることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記細胞を選択するステップが、多能性遺伝子によってコードされるタンパクを対象とする抗体又は細胞表面マーカーを用いるステップをさらに具えることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記細胞表面マーカーが、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記細胞を増殖させるステップの前に、前記薬剤への暴露前に存在する前記細胞の多能性遺伝子のクロマチン構造を、前記薬剤への暴露後に得られるクロマチン構造と比較するステップをさらに具えることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、クロマチン構造を比較するステップが、ヒストンのアセチル化状態を比較するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法において、前記多能性遺伝子が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２及びＮａｎｏｇからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記薬剤が、小分子阻害剤、核酸配列及びｓｈＲＮＡ構築物からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記ヒストンデアセチラーゼが、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６及びＳＩＲＴ７からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１０】
細胞をリプログラミングする方法において、
ＨＤＡＣの活性、発現、又は、発現及び活性を抑制する第１薬剤に細胞を暴露させるステップと、
第２調節タンパクの活性、発現、又は、発現及び活性を抑制する第２薬剤に前記細胞を暴露させるステップであって、前記第２調節タンパクがＨＤＡＣとは別個の機能を有するステップと、
多能性遺伝子の発現を誘導するステップと、
細胞を選択するステップであって、前記細胞が分化能を取り戻すステップと、を具えることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記細胞を、前記第１薬剤及び前記第２薬剤に同時に暴露させることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法において、前記細胞を選択するステップが、多能性遺伝子によってコードされるタンパクを対象とする抗体又は細胞表面マーカーを用いて細胞を分離するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、前記細胞表面マーカーが、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法において、前記細胞を選択するステップが、前記第１薬剤及び前記第２薬剤に細胞を暴露させる前と後とで細胞の表現型を比較するステップを具えることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法において、前記第１薬剤及び前記第２薬剤が、小分子阻害剤、核酸配列及びｓｈＲＮＡ構築物からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１０に記載の方法において、前記第２調節タンパクが、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、リジンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデメチラーゼ、リジンデメチラーゼ、サーチュイン及びサーチュイン活性剤からなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
ヒストンデアセチラーゼの活性、発現、又は、活性及び発現を抑制する薬剤に細胞の集団を暴露させるステップと、
多能性遺伝子の発現を誘導するステップと、
多能性細胞を示す細胞表面マーカーを発現する細胞を選択するステップと、
前記選択した細胞を増殖させて細胞の集団を作るステップであって、前記細胞が分化能を取り戻すステップと、を具える方法によって生産されることを特徴とするリプログラミング細胞の高密度集団。
【請求項１８】
請求項１７に記載のリプログラミング細胞の高密度集団において、前記リプログラミング細胞が、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１からなる群より選択される細胞表面マーカーを発現することを特徴とする細胞の高密度集団。
【請求項１９】
請求項１７に記載のリプログラミング細胞の高密度集団において、前記多能性遺伝子が、Ｏｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ−２からなる群より選択されることを特徴とする細胞の高密度集団。
【請求項２０】
請求項１７に記載のリプログラミング細胞の高密度集団において、前記リプログラミング細胞が、前記集団の少なくとも６０％を占めることを特徴とする細胞の高密度集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連特許出願の相互参照］
本出願は、２００６年８月１日に提出した米国特許出願第１１／４９７，０６４号の一部継続出願である。この米国特許出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）に基づいて２００５年８月１日に提出した米国仮出願６０／７０４，４６５の利益を主張し、また、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）に基づいて、２００８年４月７日に提出した米国仮出願第６１／０４２，８９０号；２００８年４月７日に提出した米国仮出願第６１／０４３，０６６号；２００８年４月７日に提出した米国仮出願第６１／０４２，９９５号；及び、２００８年１１月１２日に提出した米国仮出願第６１／１１３，９７１号の利益を主張する。これらの各文献はここで言及することによって全体が組み込まれている。
［技術分野］
本発明の実施形態は、細胞生物学、幹細胞、細胞分化、体細胞核移植及び細胞ベース治療の分野に関する。より詳細には、本発明の実施形態は、細胞リプログラミングのための方法、組成物及びキット並びに細胞ベース治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療は、多数のヒト疾患の治療として高い将来性があるが、低いクローン効率、潜在的多能性組織の供給不足、並びに、どのようにして細胞分化をコントロールするか、及び、選択した治療にどんな種類のＥＳ細胞を用いることができるかに関する全般的知識の欠如といったいくつかの困難な技術的課題が必然的に伴う。万能細胞は、並はずれた創造自在性を有しているが、未分化の万能細胞は、組織型が混在した奇形腫（良性腫瘍）を形成することがある。さらに、１つの源から別のところへの万能細胞の移植は、おそらく新たな細胞の拒絶を防止するための薬剤投与が必要である。
【０００３】
胎児に由来しない組織から幹細胞を生成する新たな手段を確立する試みがなされてきる。１つのアプローチは、自己成体幹細胞の操作を含む。自己成体幹細胞を再生医療に用いる長所は、その細胞が同じ患者に由来し、同じ患者に戻されるので、従って、免疫媒介性拒絶反応を受けることがないという事実である。欠点は、これらの細胞が、万能細胞の創造自在性及び多分化能を充分には有しておらず、従って、潜在能力が不明であるということである。もう１つのアプローチは、成人組織に由来する体細胞をリプログラミングして、多能性ＥＳ様細胞を作成することを目的とする。しかしながら、多細胞生命体内の各細胞種は、細胞が分化するか又は細胞周期から逸脱すると固定されると考えられるユニークな後成的特徴を有しているので、このアプローチは困難であった。
【０００４】
細胞内ＤＮＡは、通常、クロマチン形態、すなわち、核酸とタンパクとからなる複合体で存在する。実際に、ほとんどの細胞内ＲＮＡ分子も、核タンパク複合体の形態で存在する。当業者に知られているように、クロマチンの核タンパク構造は、広く研究の対象とされてきた。一般に、染色体ＤＮＡは、ヌクレオソーム中にパッケージングされる。ヌクレオソームは、コア及びリンカーを含む。ヌクレオソームコアは、染色体ＤＮＡの約１５０塩基対で周囲を包まれたコアヒストン（Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４の各２つ）の８量体を含む。さらに、約５０塩基対のリンカーＤＮＡ部分は、リンカーヒストンＨ１に結合している。ヌクレオソームは、高次クロマチン繊維に組み立てられる。また、クロマチン繊維は、染色体に組み立てられる。例えば、Ｗｏｌｆｆｅ「Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」（３．ｓｕｐ．ｒｄ  Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ，１９９８年）を参照されたい。
【０００５】
クロマチン構造は、不変ではないが、クロマチンリモデリングとしてまとめて知られているプロセスによる修飾を受ける。クロマチンリモデリングは、例えば、ＤＮＡの領域からヌクレオソームを取り除くこと；ＤＮＡの１つの領域から他の領域にヌクレオソームを移動させること；ヌクレオソーム間の間隔の変更；又は、染色体中のＤＮＡの領域にヌクレオソームを加えるように機能できる。クロマチンリモデリングは、結果的に高次構造を変化させることができ、それによって、転写的活性クロマチン（開放クロマチン又はユークロマチン）と転写的不活性クロマチン（閉鎖クロマチン又はヘテロクロマチン）との間のバランスに影響する。
【０００６】
染色体タンパクは、多数の種類の化学的修飾の対象である。これらのコアヒストンの翻訳後修飾の１つのメカニズムは、保存された高塩基性Ｎ末端リジン残基のイプシロンアミノ基の可逆的アセチル化である。ヒストンアセチル化の定常状態は、競合的ヒストンアセチルトランスフェラーゼと、本明細書中においてＨＤＡＣと呼ばれるヒストンデアセチラーゼとの動的平衡によって確立される。
【０００７】
ＨＤＡＣは、配列同一性及びドメイン構成に依存した少なくとも４つのクラス：クラスＩ：ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８；クラスＩＩ：ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０；クラスＩＩＩ：哺乳動物のサーチュイン（ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７）；及び、クラスＩＶ：ＨＤＡＣ１１に分類される。クラスＩ  ＨＤＡＣは、酵母転写調節因子ＲＰＤ３に最も似ている。クラスＩＩ  ＨＤＡＣは、酵母ＨＤＡ１酵素に最も似ている。
【０００８】
ヒストンのアセチル化及び脱アセチルは、長い間、転写調節に関連づけられていた。ヒストンの可逆的アセチル化は、クロマチンをリモデリングすることができるので、遺伝子転写のコントロール機構として作用し得る。一般に、ヒストンの高アセチル化は、遺伝子発現を容易にするが、ヒストン脱アセチルは、転写の抑制に関連している。ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、転写のコアクチベータとして作用することが示されているが、デアセチラーゼは、転写の抑制経路に属することがわかっている。
【０００９】
ヒストンのアセチル化と脱アセチルとの動的平衡は、正常な細胞増殖に不可欠である。ヒストン脱アセチルの阻害は、細胞周期停止、細胞分化、アポトーシス、及び、変化した表現型の逆行を生じさせる。
【００１０】
分化して特殊化した表現型への多能性細胞又は全能細胞の変化は、変化の間に発現される遺伝子群によって決定される。遺伝子発現は、ポジティブな制御又はネガティブな制御のいずれかを生じさせ得る遺伝子調節タンパクの配列特異的結合によって直接的に媒介される。しかしながら、直接的に遺伝子発現を媒介するこれらの調節タンパクの能力のすべては、細胞内ＤＮＡ内のそれらの結合部位の接近容易性に少なくとも一部は依存する。上で論じられているように、細胞内ＤＮＡ中の配列の接近容易性は、多くの場合、細胞内ＤＮＡがパッケージングされる細胞内クロマチンの構造に応じて変化する。
【００１１】
従って、転写抑制に関与するＨＤＡＣの活性を抑制することができる方法、組成物及びキットを含む、多分化能に必要な遺伝子の発現を誘導することができる方法、組成物及びキットを明らかにすることは有用であろう。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、細胞をリプログラミングするための方法、組成物及びキットに関する。本発明の実施形態は、多能性又は分化多能性の遺伝子の発現を誘導するステップを具える方法に関する。さらに別の実施形態においては、本発明は、リプログラミングされた細胞を生産するステップにも関する。本発明のさらに別の実施形態においては、ＨＤＡＣ阻害剤を使用することによって、少なくとも１つのＨＤＡＣの活性、発現、又は、活性及び発現を抑制するステップを具える方法に関する。さらに別の実施形態においては、本発明は、ＨＤＡＣ修飾因子を使用することによって、少なくとも１つのＨＤＡＣの活性、発現、又は、活性及び発現を変化させるステップを具える方法に関する。この方法は、少なくとも１つの多能性又は分化多能性の遺伝子の発現を誘導するステップと、細胞をリプログラミングするステップとをさらに具える。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態は、細胞をリプログラミングする方法であって、細胞、細胞の集団、細胞培養液、細胞培養液から得た細胞の亜群、均一な細胞培養液、又は、不均一な細胞培養液を、ＨＤＡＣ修飾因子に接触させるステップと、少なくとも１つの多能性又は分化多能性の遺伝子の発現を誘導するステップと、細胞をリプログラミングするステップとを具える方法にも関する。この方法は、リプログラミングされた細胞を再分化させるステップをさらに具える。
【００１４】
別の実施形態においては、本発明は、ＨＤＡＣの活性、発現、又は、活性及び発現を抑制するための薬剤の使用に関する。その薬剤は、ＨＤＡＣの発現、活性又は発現及び活性を抑制することができるあらゆる分子又は化合物であってもよい。限定されるものではないが、この薬剤には、ＨＤＡＣ阻害剤、小分子、核酸配列、ＤＮＡ塩基配列、ＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列及びＲＮＡ干渉が含まれる。
【００１５】
別の実施形態においては、本発明は、ＨＤＡＣの活性を抑制するタンパクの活性、発現、又は、活性及び発現を誘導するための薬剤の使用に関する。この薬剤は、ＨＤＡＣを抑制するタンパクの活性、発現、又は、発現及び活性を誘導することができるあらゆる分子又は化合物であってもよい。限定されるものではないが、この薬剤には、小分子、核酸配列、ＤＮＡ塩基配列、ＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列、及びＲＮＡ干渉が含まれる。
【００１６】
ＨＤＡＣ阻害剤を用いて、ＨＤＡＣの活性を抑制することができる。限定されるものではないが、ＨＤＡＣ阻害剤には、ＴＳＡ、ナトリウムブチレート、バルプロ酸、ボリノスタット、ＬＢＨ−５８９、アピシジン、ＴＰＸ−ＨＡ類似化合物、ＣＩ−９９４、ＭＳ−２７５、ＭＧＣＤ０１０３、及び、これらの誘導体又は類似化合物が含まれる。
【００１７】
いくつかの実施形態においては、少なくとも１つのＨＤＡＣ阻害剤が少なくとも１つのＨＤＡＣを抑制してもよい。さらに別の実施形態においては、１よりも多いＨＤＡＣ阻害剤が、同時に又は連続的に少なくとも１つのＨＤＡＣを抑制してもよい。ＨＤＡＣ阻害剤は、クラスＩのＨＤＡＣ、クラスＩＩのＨＤＡＣ、クラスＩＩＩのＨＤＡＣ、クラスＩＶのＨＤＡＣ、又は、未知若しくは未分類のＨＤＡＣを対象としていてもよい。ＨＤＡＣ阻害剤は、１よりも多いクラスのＨＤＡＣ又はすべてのクラスのＨＤＡＣを対象としていてもよい。ＨＤＡＣ阻害剤の組合せは、１よりも多いＨＤＡＣを抑制することができ、同時に又は連続的に用いることができる。
【００１８】
別の実施形態においては、本発明は、細胞をリプログラミングする方法であって：ヒストンデアセチラーゼの活性、発現、又は、活性及び発現を抑制する薬剤に細胞の集団を暴露させるステップと；多能性又は分化多能性の遺伝子の発現を誘導するステップと；多能性又は分化多能性の細胞を示す細胞表面マーカーを発現する細胞を選択するステップと；及び、前記選択した細胞を増殖させて細胞の集団を作るステップであって、前記細胞が分化能を取り戻すステップとを具える方法に関する。
【００１９】
さらに別の実施形態においては、本発明は、細胞をリプログラミングする方法であって：ＨＤＡＣの活性、発現、又は、活性及び発現を抑制する第１薬剤に細胞を暴露させるステップと；第２調節タンパクの活性、発現、又は、活性及び発現を抑制する第２薬剤に前記細胞を暴露させるステップであって、前記第２調節タンパクがＨＤＡＣとは異なる機能を有しているステップと；多能性又は分化多能性の遺伝子の発現を誘導するステップと；細胞を選択ステップであって、前記細胞が分化能を取り戻すステップとを具える方法に関する。別の実施形態においては、細胞又は細胞の集団を、第１薬剤及び第２薬剤に同時に又は連続的に暴露させてもよい。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＨＤＡＣの活性、発現、又は、活性及び発現を抑制する薬剤に第１表現型を有する細胞を暴露させるステップと、その細胞の第１表現型を、その細胞を前記薬剤に暴露させてリプログラミングされた細胞を選択した後に得られる表現型と比較するステップとを具える方法に関する。さらに別の実施形態においては、この方法は、細胞を前記薬剤に暴露させる前の細胞の遺伝子型を、前記細胞を前記薬剤に暴露させた後に得られる細胞の遺伝子型と比較するステップを具える。さらに別の実施形態において、この方法は、少なくとも１つのＨＤＡＣの発現、活性、又は、発現及び活性を抑制する薬剤に細胞を暴露させる前の細胞の表現型及び遺伝子型を、その細胞を前記薬剤に暴露させた後の細胞の表現型及び遺伝子型と比較するステップを具える。
【００２１】
他の実施形態において、この方法は、選択した細胞を培養するか又は増殖させて細胞の集団にするステップを含む。さらに別の実施形態においては、この方法は、多能性又は分化多能性の遺伝子によってコードされるタンパクに結合する抗体、又は、分化多能性マーカー又は多能性マーカーに結合する抗体を用いて細胞を分離するステップを具える。これらのマーカーは、限定されるものではないが、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１を含む。限定されるものではないが、蛍光細胞活性化分類装置、免疫組織化学及びＥＬＩＳＡを含む細胞分離に効率的なあらゆる方法を用いて細胞を分離することができる。別の実施形態においては、この方法は、原細胞よりも未分化な状態の細胞を選択するステップを具える。
【００２２】
さらに別の実施形態において、本発明は、前記薬剤に暴露させる前の多能性又は分化多能性の遺伝子のクロマチン構造を、前記薬剤に暴露させた後に得られるクロマチン構造と比較するステップをさらに具える。
【００２３】
別の実施形態においては、本発明は、細胞をリプログラミングする方法であって：第１転写パターンを有する細胞を、ＨＤＡＣの活性、発現、又は、発現及び活性を抑制する薬剤に暴露させるステップと；多能性又は分化多能性の遺伝子の発現を誘導するステップと；その細胞の第１転写パターンを、前記薬剤に暴露させた後に得られる転写パターンと比較するステップと；及び、細胞を選択するステップであって、前記細胞が分化能を取り戻すステップと、を具える方法に関する。
【００２４】
さらに別の実施形態においては、細胞を選択するステップが、ＥＳ細胞の分析された転写パターンに少なくとも５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜９４％、９５％又は９５％〜９９％類似する転写パターンをその細胞が有することを明らかにするステップを具える。ＥＳ細胞の全転写パターンの比較を行う必要はないが、行ってもよい。限定されるものではないが、代わりに、１〜５、５〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜５００、５００〜１，０００、１，０００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜５，０００、５，０００〜１０，０００、及び、１０，０００を超える遺伝子を含む胚性遺伝子の亜群を比較してもよい。二元的態様で転写パターンを比較してもよい。すなわち、その遺伝子が転写されるか否かを決定するように比較を行ってもよい。別の実施形態においては、各遺伝子又は遺伝子の亜群についての転写の速度及び／又は程度を比較してもよい。限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、マイクロアレイ、サザンブロット、及び、ハイブリダイゼーションを含む当業界において知られているあらゆる方法を用いて転写パターンを測定することができる。
【００２５】
本発明の実施形態は、本明細書に開示されている方法に従って生産したリプログラミング細胞を用いて様々な疾病を治療するステップを具える方法も含む。さらに別の実施形態においては、本発明は、リプログラミング細胞、及び、再分化したリプログラミング細胞の治療的使用にも関する。
【００２６】
本発明の実施形態は、本発明の方法に従って生産されるリプログラミングされた細胞にも関する。リプログラミングされた細胞は、１つ以上の系統に再分化することができる。リプログラミングされた細胞は、分化多能性であってもよいし又は多能性であってもよい。
【００２７】
さらに別の実施形態においては、本発明は、以下のステップ：細胞の集団を、ヒストンデアセチラーゼの活性、発現、又は、活性及び発現を抑制する薬剤に暴露させるステップと；多能性又は分化多能性の遺伝子の発現を誘導するステップと；多能性又は分化多能性の細胞を示す細胞表面マーカーを発現する細胞を選択するステップと、及び、選択した前記細胞を増殖させて細胞の集団にするステップであって、前記細胞が分化能を取り戻すステップと、を具える方法によって生産されるリプログラミング細胞の濃縮された集団に関する。
【００２８】
さらに別の実施形態においては、リプログラミングされた細胞が、多能性細胞を示す細胞表面マーカーを発現する。そのマーカーは、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１からなる群より選択される。さらに別の実施形態においては、限定されるものではないが、リプログラミングされた細胞が、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２及びＮａｎｏｇを含む多能性遺伝子を発現する。さらに別の実施形態においては、リプログラミングされた細胞が、細胞の高密度集団（ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の少なくとも５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜９５％、９６％〜９８％、又は、少なくとも９９％以上を占める。
【００２９】
本発明の実施形態は、本発明の方法及び組成物を作成するためのキットにも関する。このキットは、特に、細胞をリプログラミングすること、及び、ＥＳ様細胞及び幹細胞様細胞を作成するために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、バルプロ酸（ＶＰＡ）で処理した初代ヒト肺細胞におけるＯｃｔ−４のアップレギュレーションを報告する棒グラフである。
【図２】図２は、ＨＤＡＣ阻害剤（ＶＰＡ）で処理した初代ヒト肺細胞における、幹細胞様特性を与えるいくつかの遺伝子のアップレギュレーションを報告する棒グラフである。
【図３】図３は、ＶＰＡで処理した細胞におけるＯｃｔ−４の第１エクソン中の２個のシトシンの脱メチル化を報告する説明図である。
【図４】図４Ａは、ＨＤＡＣ７又はＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の成人ヒト皮膚繊維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された遺伝子Ｎａｎｏｇに対する効果を報告するグラフである。図４Ｂは、ＨＤＡＣ７又はＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の新生児ヒト皮膚繊維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された遺伝子Ｎａｎｏｇに対する効果を報告するグラフである。図４Ｃは、ＨＤＡＣ７又はＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の胎児ヒト皮膚繊維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された遺伝子Ｎａｎｏｇに対する効果を報告するグラフである。
【図５】図５Ａは、ＨＤＡＣ７又はＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の成人ヒト皮膚繊維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された遺伝子Ｏｃｔ−４に対する効果を報告するグラフである。図５Ｂは、ＨＤＡＣ７又はＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の新生児ヒト皮膚繊維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された遺伝子Ｏｃｔ−４に対する効果を報告するグラフである。図５Ｃは、ＨＤＡＣ７又はＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の胎児ヒト皮膚繊維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された遺伝子Ｏｃｔ−４に対する効果を報告するグラフである。
【図６】図６は、ＨＤＡＣ７又はＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の胎児ヒト皮膚繊維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された遺伝子Ｓｏｘ−２に対する効果を報告するグラフである。
【図７】図７は、ＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡ干渉中のヒト皮膚繊維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現によって測定された様々なＨＤＡＣ及びＳＩＲＴ遺伝子に対する効果を報告するグラフである。
【図８】図８は、二重のＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の、成人ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦａ）、新生児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｎ）、及び、胎児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｆ）におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された遺伝子Ｎａｎｏｇに対する効果を報告するグラフである。
【図９】図９は、二重のＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の成人ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦａ）、新生児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｎ）、及び、胎児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｆ）におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された遺伝子Ｏｃｔ−４に対する効果を報告するグラフである。
【図１０】図１０は、二重のＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の、成人ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦａ）、新生児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｎ）、及び、胎児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｆ）におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された遺伝子Ｓｏｘ−２に対する効果を報告するグラフである。
【図１１】図１１は、二重のＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の成人ヒト皮膚繊維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された様々なＨＤＡＣ遺伝子及びＳＩＲＴ遺伝子に対する効果を報告するグラフである。
【図１２】図１２は、二重のＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の胎児ヒト皮膚繊維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された様々なＨＤＡＣ遺伝子及びＳＩＲＴ遺伝子に対する効果を報告するグラフである。
【図１３】図１３は、二重のＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡ干渉中の新生児ヒト皮膚繊維芽細胞におけるｍＲＮＡ発現の倍率変化によって測定された様々なＨＤＡＣ遺伝子及びＳＩＲＴ遺伝子に対する効果を報告するグラフである。
【図１４】図１４Ａは、成人ヒト皮膚繊維芽細胞におけるＨＤＡＣ７ａ及びＨＤＡＣ１１の発現に対するＨＤＡＣ７ａ  ｓｈＲＮＡの効果を報告するグラフである。ピューロマイシンがない状態及びある状態の両方で培養した細胞のデータを報告する。図１４Ｂは、新生児ヒト皮膚繊維芽細胞におけるＨＤＡＣ７ａ及びＨＤＡＣ１１の発現に対するＨＤＡＣ７ａ  ｓｈＲＮＡの効果を報告するグラフである。ピューロマイシンがない状態及びある状態の両方で培養した細胞のデータを報告する。図１４Ｃは、胎児ヒト皮膚繊維芽細胞におけるＨＤＡＣ７ａ及びＨＤＡＣ１１の発現に対するＨＤＡＣ７ａ  ｓｈＲＮＡの効果を報告するグラフである。
【図１５】図１５Ａは、胎児ヒト皮膚繊維芽細胞の写真である。図１５Ｂは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡで影響された胎児ヒト皮膚繊維芽細胞の写真である。図１５Ｃは、ＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡで影響された胎児ヒト皮膚繊維芽細胞の写真である。図１５Ｄは、ＤＮＭＴ１及びＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡで影響された胎児ヒト皮膚繊維芽細胞の写真である。図１５Ｅは、ＤＮＭＴ１及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡで影響された胎児ヒト皮膚繊維芽細胞の写真である。図１５Ｆは、ＨＤＡＣ１１及びＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡで影響された胎児ヒト皮膚繊維芽細胞の写真である。図１５Ｇは、ヒトＥＳ細胞の写真である。
【図１６】図１６Ａは、胎児ヒト皮膚繊維芽細胞の写真である。図１６Ｂは、ＤＮＭＴ１  ｓｈＲＮＡで影響された胎児ヒト皮膚繊維芽細胞の写真である。図１６Ｃは、ＤＮＭＴ１及びＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡで影響された胎児ヒト皮膚繊維芽細胞の写真である。  図１６Ｄは、ＤＮＭＴ１及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡで影響された胎児ヒト皮膚繊維芽細胞の写真である。図１６Ｅは、ＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡで影響された胎児ヒト皮膚繊維芽細胞の写真である。図１６Ｆは、ＨＤＡＣ１１及びＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡで影響された胎児ヒト皮膚繊維芽細胞の写真である。図１６Ｇは、ヒトＥＳ細胞の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
［定義の詳細な説明］
この開示における数値範囲は近似のものであり、従って、別段の定めがない限り、数値範囲の外側の値を含んでいてもよい。任意の低い方の値と任意の高い方の値との間の少なくとも２単位が分離されていれば、数値範囲は、低い方の値と高い方の値との間で１単位ずつ増加させたすべての値を含み、その低い方の値及びその高い方の値を含む。一例として、例えば、分子量、粘度、メルトインデックスなどの組成的特性、物理的特性、その他の特性が１００〜１，０００であれば、１００、１０１、１０２といったすべての個別値、及び、１００〜１４４、１５５〜１７０、１９７〜２００といったすべての部分的範囲が明示的に列挙されていることを意図する。１未満の値を含む範囲又は１よりも大きい小数部分（例えば１．１、１．５など）を含む範囲については、必要に応じて、１単位が０．０００１、０．００１、０．０１又は０．１であるとみなす。１０未満（例えば１〜５）の１桁の数を含む範囲については、１単位は通常０．１であるとみなす。これらは、特に意図されたものの一例に過ぎない。また、列挙されている最低値と列挙されている最高値との数値の可能な組合せは、この開示において明示的に記載されているとみなす。数値範囲は、特に、混合物中の成分の相対量、並びに、この方法に列挙されている様々な温度及びその他のパラメータの範囲のために、この開示において提供されている。
【００３２】
「細胞（ｃｅｌｌ）」又は「細胞（ｃｅｌｌｓ）」には、別段の定めがない限り、あらゆる体細胞、胚幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、器官特異的幹細胞、核移植（ＮＴ）ユニット及び幹様細胞が含まれる。細胞（ｃｅｌｌ）又は細胞（ｃｅｌｌｓ）をあらゆる器官又は組織から得ることができる。細胞（ｃｅｌｌ）又は細胞（ｃｅｌｌｓ）はヒト又はその他の動物であってもよい。例えば、細胞は、マウス、モルモット、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどであってもよい。細胞は、ヒト以外の霊長類から得てもよい。
【００３３】
「培地」又は「増殖培地」は、細胞の増殖をサポートすることができる適切な媒体を意味する。
【００３４】
「分化」は、胚発生中の細胞が構造的及び機能的に特殊化するプロセスを意味する。
【００３５】
「後生遺伝」は、ヌクレオチド配列の変化を伴わずに引き継がれる機能変化に関するＤＮＡの状態を意味する。後成的変化は、ＤＮＡのヌクレオチド配列の変化を伴わないメチル化及び脱メチル化などのＤＮＡの修飾によって生じ得る。
【００３６】
「ヒストン」は、ＤＮＡが核内に収容されるように十分にＤＮＡを圧縮することに関与する染色体中にみられるタンパク分子のクラスを意味する。
【００３７】
「ヒストンデアセチラーゼ阻害剤」及び「ヒストンデアセチラーゼの阻害剤」は、ヒストンデアセチラーゼと相互作用して、その酵素活性を抑制できる化合物を意味する。「ヒストンデアセチラーゼ活性を抑制する」とは、ヒストンデアセチラーゼがヒストン又はその他のタンパクなどの適切な基質からアセチル基を除去する能力を低下させることを意味する。ヒストンデアセチラーゼ活性のそのような低下は、いくつかの実施形態においては少なくとも約１０％〜２５％であり、別の実施形態においては少なくとも約５０％であり、別の実施形態においては少なくとも約７５％であり、また、別の実施形態においては少なくとも約９０％である。さらに、ヒストンデアセチラーゼ活性は、さらに別の実施形態においては少なくとも９５％低下し、他の実施形態においては少なくとも９９％低下する。
【００３８】
「ノックダウン」は、遺伝子特異的態様で遺伝子の発現を抑制することを意味する。１個又はそれ以上の遺伝子の「ノックダウン」を有する細胞を、「ノックダウン」生命体又は単に「ノックダウン」と呼ぶ。
【００３９】
「多能性」は、３つの胚葉又は一次組織種の細胞種に分化できることを意味する。「多能性遺伝子」は、細胞が多能性であるのに寄与する遺伝子を意味する。「多能性細胞培養液」は、由来した元の胎児又は成人の分化細胞と明らかに相違した形態を示していれば、「実質的に未分化である」と考えられる。多能性細胞は、通常、核／細胞質の高い比、顕著な核小体、及び、識別可能性が低い細胞間結合による高密度コロニー形成を有しており、当業者によって容易に認識される。未分化細胞のコロニーは、周囲の分化細胞に囲まれ得ることがわかっている。しかしながら、適切な条件で培養すれば実質的に未分化のコロニーは生存し、培養細胞を分配するときに未分化細胞が増殖細胞の高い割合を構成する。この開示において記載されている有用な細胞集団は、これらの条件を満たす実質的に未分化の多能性細胞を任意の割合で含む。実質的に未分化の細胞培養液は、少なくとも約２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、又は、少なくとも８０％もの未分化多能性細胞を含んでいてもよい（集団における全細胞のパーセンテージ）。
【００４０】
「調節タンパク」は、ポジティブな制御及びネガティブな制御を含む生物学的プロセスを制御するあらゆるタンパクを意味する。調節タンパクは、生物学的プロセスに対する直接的効果又は間接的効果を有し、直接的に又は複合体に加わることを通じて作用を発揮することができる。
【００４１】
「リプログラミング」は、核の後成的マーカーを除去し、その後に、異なる後成的マーカー群を確立することを意味する。異なる細胞及び組織は、多細胞生物の成長中に遺伝子発現の異なるプログラムを獲得する。これらの異なる遺伝子発現パターンは、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾及びその他のクロマチン結合タンパクなどの後成的修飾によって実質的に制御されていると考えられる。従って、多細胞生物内の各細胞型は、従来から、細胞が分化するか又は細胞周期から逸脱すると、「固定され」、かつ、不変になると考えられているユニークな後成的特性を有する。しかしながら、いくつかの細胞は、正常な成長又は特定の疾病状況において大規模な後成的「リプログラミング」を受ける。
【００４２】
「分化全能性」は、完全な胚又は器官に成長できることを意味する。
【００４３】
本発明の実施形態は、細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するステップを具える方法に関する。別の実施形態においては、本発明は、細胞が分化多能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するステップを具える方法に関する。いくつかの実施形態において、この方法は、細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するステップと、少なくとも１系統への誘導された分化が可能なリプログラムされた細胞を生産するステップとを具える。
【００４４】
本発明の実施形態は、クロマチン構造を修飾するステップと、多能性又は分化多能性となるように細胞をリプログラミングするステップとを具える方法にも関する。さらに別の実施形態において、クロマチン構造を修飾するステップは、ＨＤＡＣの活性を抑制するステップを具える。
【００４５】
別の実施形態において、この方法は、ＨＤＡＣの活性を抑制するステップと、細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するステップとを具える。さらに別の実施形態において、この方法は、ＨＤＡＣの活性を抑制するステップと、リプログラミングされた細胞を生産するステップとを具える。
【００４６】
さらに別の実施形態において、本発明は、細胞をリプログラミングする方法であって：ＨＤＡＣの活性、発現、又は、活性及び発現を抑制する薬剤に細胞を暴露させるステップと；多能性又は分化多能性の遺伝子の発現を誘導するステップと；及び、細胞を選択するステップであって、前記細胞が分化能を取り戻すステップと、を具える方法にも関する。多能性又は分化多能性の遺伝子は、限定されるものではないが、発現において０．２５−０．５、０．５−１、１．０−２．５、２．５−５、５−１０、１０−１５、１５−２０、２０−４０、４０−５０、５０−１００、１００−２００、２００−５００及び５００超といったあらゆる倍率増加で誘導してもよい。別の実施形態においては、この方法は、分化細胞を平板培養するステップと、ＨＤＡＣの活性、発現、又は、活性及び発現を抑制する薬剤に前記分化細胞を暴露させるステップと、前記細胞を培養するステップと、リプログラミングされた細胞を識別するステップとを具える。
【００４７】
別の実施形態においては、本発明は、細胞をリプログラミングする方法であって、ＨＤＡＣの活性を抑制する調節タンパクの活性、発現、又は、活性及び発現を誘導する薬剤に細胞を暴露させるステップと、多能性又は分化多能性の遺伝子の発現を誘導するステップと、細胞を選択するステップであって、前記細胞が分化能を取り戻すステップと、を具える方法に関する。調節タンパクの活性又は発現は、限定されるものではないが、１％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％、９９％〜２００％、２００％〜３００％、３００％〜４００％、４００％〜５００％及び５００％以上といった任意の量で増加してもよい。
【００４８】
さらに別の実施形態においては、この方法は、多能性又は分化多能性の遺伝子よってコードされるタンパク若しくはタンパク断片又は多能性表面マーカーに対する抗体を用いて細胞を選択するステップをさらに具える。モノクローナル抗体、ポリクローンナル抗体、抗体の断片、ペプチド疑似分子、活性領域に対する抗体、及び、タンパクの保存領域に対する抗体を含むあらゆる種類の抗体を用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
さらに別の実施形態において、この方法は、多能性若しくは分化多能性の遺伝子又は多能性又は分化多能性の表面マーカーによって駆動されたリポーターを用いて細胞を選択するステップをさらに具える。蛍光タンパク、緑色蛍光タンパク、シアン蛍光タンパク（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク（ＹＦＰ）、細菌ルシフェラーゼ、クラゲエクオリン、強化緑色蛍光タンパク、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｄｓＲＥＤ、β−ガラクトシダーゼ及びアルカリフォスファターゼを含むあらゆる種類のリポーターを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
さらに別の実施形態において、この方法は、抗生物質、殺真菌剤、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、ジヒドロ葉酸還元酵素、チミジンキナーゼ、ネオマイシン抵抗性（ｎｅｏ）、Ｇ４１８抵抗性、ミコフェノール酸抵抗性（ｇｐｔ）、ゼオシン抵抗性タンパク、及び、ストレプトマイシンに対する抵抗性を含む抵抗性を選択可能なマーカーとして用いて、細胞を選択するステップをさらに具える。抵抗性はこれらに限定されるものではない。
【００５１】
さらに別の実施形態において、この方法は、ＨＤＡＣの活性、発現、又は、活性及び発現を抑制する薬剤に前記細胞を暴露させる前の細胞の多能性又は分化多能性の遺伝子のクロマチン構造を、前記薬剤による処理後に得られる多能性又は分化多能性の遺伝子のクロマチン構造と比較するステップをさらに具える。ユークロマチン、ヘテロクロマチン、ヒストンアセチル化、ヒストンメチル化、ヒストン又はヒストンの成分存在及び不存在、ヒストンの位置、ヒストンの配置、及び、クロマチンに関連した調節タンパク存在又は不存在といったクロマチン構造のあらゆる態様を比較することができるが、これらに限定されるものではない。エンハンサー因子、活性化因子、プロモータ、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位の上流領域、転写開始部位の下流領域、エクソン及びイントロンといった任意の遺伝子領域のクロマチン構造を比較することができるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
さらに別の実施形態において、この方法は、少なくとも１つのＨＤＡＣの活性を抑制するステップと、ＣｐＧジヌクレオチド中の少なくとも１個のシトシンを脱メチル化するステップと、細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現の誘導するステップと、を具える。
【００５３】
さらに別の実施形態においては、この方法は、細胞をＨＤＡＣ阻害剤に接触させるステップと；ＨＤＡＣの活性を抑制するステップと；及び、細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導するステップとを具える。さらに別の実施形態において、この方法は、リプログラミングされた細胞を生産するステップをさらに具える。リプログラミングされた細胞は、多能性であってもよいし又は分化多能性であってもよい。
【００５４】
この方法のＨＤＡＣ阻害剤、本発明の組成物及びキットは、あらゆるＨＤＡＣと相互作用してもよい。例えば、本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、４個の知られているクラスのＨＤＡＣの１つに由来するＨＤＡＣと相互作用してもよい。本発明のＨＤＡＣ阻害剤は、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ又はクラスＩＶのＨＤＡＣと相互作用してもよい。ＨＤＡＣ阻害剤は、１つの特定のクラスのＨＤＡＣと相互作用してもよいし、すべてのクラスのＨＤＡＣと相互作用してもよいし、又は、限定されるものではないが、クラスＩ及びクラスＩＩ；クラスＩ及びクラスＩＩＩ；クラスＩ及びクラスＩＶ；クラスＩＩ及びクラスＩＩＩ；クラスＩＩ及びクラスＩＶ；クラスＩＩＩ及びクラスＩＶ；クラスＩ、ＩＩ及びＩＩＩ；クラスＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ；及びクラスＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶといった複数のクラスのＨＤＡＣと相互作用してもよい。ＨＤＡＣ阻害剤は、公知のクラスのいずれにも当てはまらないＨＤＡＣと相互作用してもよい。
【００５５】
ＨＤＡＣ阻害剤は、不可逆的作用機構を有していてもよいし又は可逆的作用作用機構を有していてもよい。限定されるものではないが、ＨＤＡＣ阻害剤は、ミリモル（ｍＭ）、マイクロモル（μＭ）、ナノモル（ｎＭ）、ピコモル（ｐＭ）及びフェムトモル（ｆＭ）といったあらゆる結合親和性を有していてもよい。
【００５６】
そのような阻害は特異的であることが好ましい。すなわち、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、その他の無関係な生物学的作用を生じさせるのに必要な阻害剤の濃度よりも低い濃度において、ヒストンデアセチラーゼがヒストンからアセチル基を除去する能力を低下させることが好ましい。ヒストンデアセチラーゼ抑制活性に必要な阻害剤の濃度は、無関係な生物学的作用を生じさせ得るのに必要な濃度と比べて、少なくとも２倍少ないことが好ましく、少なくとも５倍小さいことがより好ましく、少なくとも１０倍小さいことがさらに好ましく、少なくとも２０倍小さいことが最も好ましい。
【００５７】
別の実施形態においては、ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣの触媒ドメインを含む亜鉛に結合することによって作用してもよい。この作用機構を有するＨＤＡＣ阻害剤は、いくつかのグループ：（ｉ）トリコスタチンＡなどのヒドロキサム酸；（ｉｉ）環状テトラペプチド；（ｉｉｉ）ベンズアミド；（ｉｖ）求電子性ケトン；及び（ｖ）フェニルブチレート及びバルプロ酸などの脂肪酸化合物群に分類される。
【００５８】
さらに別の実施形態においては、ＨＤＡＣ阻害剤は、サーチュインクラスＩＩＩ  ＨＤＡＣを対象としていてもよく、サーチュインクラスＩＩＩ  ＨＤＡＣは、ＮＡＤ＋依存性であり、限定されるものではないが、ニコチン酸アミド、ＮＡＤの誘導体、ジヒドロクマリン、ナフトピラノン及び２−ヒドロキシナフトアルデヒドを含む。
【００５９】
さらに別の実施形態においては、ＨＤＡＣ阻害剤は、非ヒストンエフェクター分子のアセチル化度を変えることによって遺伝子の転写を増加させることができる。本発明の方法、組成物及びキットのＨＤＡＣ阻害剤は、単なるＨＤＡＣの酵素抑制因子として作用するものとして考えるべきではない。限定されるものではないが、ＡＣＴＲ、ｃＭｙｂ、ｐ３００、ＣＢＰ、Ｅ２Ｆ１、ＥＫＬＦ、ＦＥＮ１、ＧＡＴＡ、ＨＮＦ−４、ＨＳＰ９０、Ｋｕ７０、ＮＦκＢ、ＰＣＮＡ、ｐ５３、ＲＢ、Ｒｕｎｘ、ＳＦ１  Ｓｐ３、ＳＴＡＴ、ＴＦＩＩＥ、ＴＣＦ及びＹＹ１といった様々な非ヒストン転写因子及び転写共調節因子は、アセチル化によって修飾されることがわかっている。アセチル化される転写の活性化に関与するあらゆる転写因子又はタンパクの活性を本発明の方法によって増大させることができる。
【００６０】
表１は、ＨＤＡＣ阻害剤として機能し得る化合物の代表的リストを提供する。表１における「アイソタイプ」との表現は、化合物が特定のクラスのＨＤＡＣに対する選択性を有しているかどうかに関する洞察を単に提供するように意図されている。ＨＤＡＣの特定のアイソタイプ又はクラスをリストに記載することは、化合物がそのアイソタイプ又はクラスに対する親和性を有していることを単に意味するように解釈してはならない。本発明のＨＤＡＣ阻害剤には、本明細書中に記載されているすべてのＨＤＡＣ阻害剤の誘導体及び類似化合物が含まれる。
【００６１】
酪酸又は酪酸塩は確認された最初のＨＤＡＣ阻害剤であった。しかしながら、ミリモル濃度において、酪酸塩は、ＨＤＡＣに対して特異的ではなく、核タンパクのリン酸化及びメチル化並びにＤＮＡメチル化を抑制することもある。類似化合物（フェニルブチレート）は同じ態様で作用する。より特異的なものはトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）及びトラポキシン（ＴＰＸ）である。ＴＰＸ及びＴＳＡはヒストンデアセチラーゼの阻害剤として知られるようになった。ＴＳＡはＨＤＡＣ酵素を可逆的に抑制するが、ＴＰＸはＨＤＡＣ酵素に不可逆的に結合して不活性化する。酪酸塩と異なり、その他の酵素系の非特異抑制は、ＴＳＡ又はＴＰＸについてまだ報告されていない。
【００６２】
バルプロ酸もヒストンデアセチラーゼ活性を抑制する。ＶＰＡは、様々な分子の作用機構に依存した複数の生物活性を有する公知の薬剤である。ＶＰＡは抗てんかん剤である。ＶＰＡは催奇性である。ＶＰＡは、妊娠中に抗てんかん剤として用いたとき、生まれた子供の数パーセントにおいて先天性欠損（神経管閉鎖障害及びその他の奇形）を生じさせる可能性がある。マウスにおいては、適切に投薬すると、ＶＰＡは、大多数のマウス胚において催奇性である。ＶＰＡは核ホルモン受容体（ＰＰＡＲデルタ）を活性化する。
【００６３】
表１  ＨＤＡＣ阻害剤として機能し得る化合物の代表的リスト
2011516076.tif 000003
2011516076.tif 000004
【００６４】
様々なＨＤＡＣ阻害剤は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ）から入手可能であり、限定されるものではないが、ＡＰＨＡ化合物；アピシジン；デプデシン；スクリプタイド；シルチノール；及びトリコスタチンＡを含む。また、さらなるＨＤＡＣ阻害剤は、Ｖｉｎｃｉ−Ｂｉｏｃｈｅｍ社（Ｉｔａｌｙ）から入手可能であり、限定されるものではないが、５−アザ−２’−デオキシシチジン；ＣＡＹ１０３９８；ＣＡＹ１０４３３；６−クロロ−２，３，４，９−テトラヒドロ−１Ｈ−カルバゾール−１−カルボキサミド；ＨＣ毒素；ＩＴＳＡ１；Ｍ３４４；ＭＣ１２９３；ＭＳ−２７５；オキサムフラチン；ＰＸＤ１０１；ＳＡＨＡ；スクリプタイド；シルチノール；スプリトマイシンを含む。デクサメタゾンをあらゆるＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせて用いてもよい。例えば、５−アザ−２’−デオキシシチジンデクサメタゾンを含む組成物を、デクサメタゾンと組み合わせて用いることができる。
【００６５】
限定されるものではないが、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１〜１５個、１６〜２０個及び２１〜２５個のＨＤＡＣ阻害剤といったＨＤＡＣ阻害剤のあらゆる数、あらゆる組合せ及びあらゆる濃度を用いることができる。阻害タンパクの１つ又はそれ以上のファミリーが阻害されることもある。限定されるものではないが、小分子阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡ干渉及び小さい干渉ＲＮＡといった阻害の１つ又はそれ以上のメカニズムを用いてもよい。
【００６６】
さらに別の実施形態においては、本発明は、細胞をリプログラミングする方法であって、代償的経路において機能する２つ以上の阻害タンパクを抑制するステップを具える方法に関する。別の実施形態においては、本発明は、細胞をリプログラミングする方法であって、冗長経路において機能する２つ以上のタンパクを抑制するステップを含む方法に関する。さらに別の実施形態において、本発明は、細胞をリプログラミングする方法であって、１つ又はそれ以上のＨＤＡＣタンパクを抑制するステップと、抑制されたＨＤＡＣを補うように機能する１つ又はそれ以上のタンパクを抑制するステップと、を具える方法に関する。１つの阻害タンパク、例えばＨＤＡＣの抑制は、１つ又はそれ以上のその他の阻害タンパクの発現を増加させることがある。冗長的なタンパク、代償的なタンパク、又は、冗長的かつ代償的なタンパクの発現を抑制するステップは、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡ干渉、ＨＤＡＣ阻害剤及び小分子阻害剤といった限定されないあらゆる適切な方法を用いて実行してもよい。
【００６７】
さらに別の実施形態において、本発明は、細胞をリプログラミングする方法において、阻害タンパクの発現、活性、又は、発現及び活性を抑制するステップであって、前記阻害タンパクの抑制は、その他の阻害タンパクの発現、活性、又は、発現及び活性、の増加を生じさせないステップを具える方法に関する。
【００６８】
さらに別の実施形態においては、本発明は、細胞をリプログラミングする方法において、阻害タンパクの発現、活性、又は、発現及び活性を抑制するステップであって、前記阻害タンパクの抑制が、代償的タンパクの発現、活性、又は、発現及び活性の増大を生じさせないステップを具える方法に関する。
【００６９】
さらに別の実施形態においては、本発明は、細胞をリプログラミングする方法において、阻害タンパクの発現、活性、又は、発現及び活性を抑制するステップであって、前記阻害タンパクの抑制が、冗長的タンパク発現、活性、又は、発現及び活性の増大を生じさせないステップを具える方法に関する。
【００７０】
さらに別の実施形態において、本発明は、細胞をリプログラミングする方法であって、調節タンパクの活性、発現、又は、発現及び活性を抑制する１つよりも多い薬剤に細胞を暴露させるステップであって、前記調節タンパクが、同一のファミリー又は異なるタンパクファミリーであってもよいステップを具える方法に関する。さらに別の実施形態においては、本発明は、細胞をリプログラミングする方法であって：第１調節タンパクの活性、発現、又は、発現及び活性を抑制する薬剤に細胞を暴露させるステップと；前記第１調節タンパクとは異なる機能を有する第２調節タンパクの活性、発現、又は、発現及び活性を抑制する第２薬剤に前記細胞を暴露させるステップと、を具える方法に関する。限定されるものではないが、第１調節タンパク及び第２調節タンパクは、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、リジンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、トリコスタチンＡ、ヒストンデメチラーゼ、リジンデメチラーゼ、サーチュイン、及び、サーチュインアクチベータ、核レセプタ、オーファン核受容体、Ｅｓｒｒβ及びＥｓｒｒγといったタンパクの発現の制御又は変化に関与するあらゆるタンパクであってもよい。
【００７１】
本発明の方法に従って生産されるリプログラミングされた細胞は、多能性であってもよいし又は分化多能性であってもよい。本発明の方法に従って生産されるリプログラミングされた細胞は、ＥＳ様細胞特性を含む様々な異なる特性を有し得る。例えば、リプログラミングされた細胞は、未分化状態で少なくとも１０継代、少なくとも１５継代、少なくとも２０継代、又は、少なくとも３０継代以上にわたって増殖することができる。その他の形態では、リプログラミングされた細胞は、分化せずに１年間以上にわたって増殖することができる。リプログラミングされた細胞は、増殖及び／又は分化しても正常核型を維持することもできる。いくつかのリプログラミングされた細胞は、インビトロにおいて未分化状態で無限増殖の能力を有する細胞になり得る。いくつかのリプログラミングされた細胞は、長期的培養を通じて正常核型を維持することもできる。いくつかのリプログラミングされた細胞は、長期的培養の後でさえも、３つの胚性胚葉のすべて（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）の誘導体に分化する能力を維持することができる。いくつかのリプログラミングされた細胞は、生命体中のあらゆる細胞型を形成することもできる。いくつかのリプログラミングされた細胞は、未分化増殖を維持しない媒体による増殖などの特定の条件下で胚様体を形成することができる。例えば、いくつかのリプログラミングされた細胞は、胚盤胞と融合することによってキメラを形成できる。
【００７２】
リプログラミングされた細胞を様々なマーカーによって決定することができる。例えば、いくつかのリプログラミングされた細胞はアルカリフォスファターゼを発現する。いくつかのリプログラミングされた細胞はＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、及び／又は、ＴＲＡ−１−８１を発現する。いくつかのリプログラミングされた細胞は、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ２及びＮａｎｏｇを発現する。例えば、細胞表面又は細胞内において、いくつかのリプログラミングされた細胞がｍＲＮＡのレベルでそれらを発現し、さらに他の細胞がタンパクレベルでそれらを発現することは理解されるであろう。
【００７３】
リプログラミングされた細胞は、リプログラミングされたあらゆる細胞特性若しくはカテゴリと、本明細書に記載されている特性とのあらゆる組合せを有していてもよい。例えば、リプログラミングされた細胞は、アルカリフォスファターゼを発現し、ＳＳＥＡ−１を発現せず、少なくとも２０継代わたって増殖し、あらゆる細胞種に分化することができる。もう１つのリプログラミングされた細胞は、例えば、細胞表面でＳＳＥＡ−１を発現し、内胚葉、中胚葉及び外胚葉組織を形成することができ、分化せずに１年間以上培養することができる。
【００７４】
リプログラミングされた細胞は、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）ポジティブ、ＳＳＥＡ−１ポジティブ及びＳＳＥＡ−４ネガティブになりえる。リプログラミングされた細胞は、Ｎａｎｏｇポジティブ、Ｓｏｘ２ポジティブ及びＯｃｔ−４ポジティブにもなりえる。リプログラミングされた細胞はＴｅｌｌポジティブ及びＴｂｘ３ポジティブにもなりえる。リプログラミングされた細胞は、Ｃｒｉｐｔｏポジティブ、Ｓｔｅｌｌａｒポジティブ及びＤａｚｌポジティブにもなりえる。リプログラミングされた細胞は、モノクローナル抗体ＴＲＡ−１−６０（ＡＴＣＣ  ＨＢ−４７８３）及びＴＲＡ−１−８１（ＡＴＣＣ  ＨＢ−４７８４）の結合特異性を有する抗体と結合する細胞表面抗原を発現することができる。さらに、本明細書中に開示されているように、リプログラミングされた細胞は、支持細胞層を用いることなく、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０継代にわたって又は１年間以上維持することができる。
【００７５】
リプログラミングされた細胞は、繊維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨格筋、内皮、間質、平滑筋、心筋、神経細胞、造血細胞、膵島、又は、身体の実質的にすべての細胞を含む異なる血統の種々様々な細胞種に分化する能力を有し得る。リプログラミングされた細胞は、すべての細胞系統に分化する能力を有していてもよい。リプログラミングされた細胞は、１種、２種、３種、４種、５種、６〜１０種、１１〜２０種、２１〜３０種、及び、３０種を超える系統を含むあらゆる数の系統に分化する能力を有していてもよい。
【００７６】
細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与するあらゆる遺伝子は、本発明の方法によって誘導されてもよく、限定されるものではないが、グリシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（Ｇｎｍｔ）、八量体−４（Ｏｃｔ−４）、Ｎａｎｏｇ、ＳＲＹ（性別決定領域Ｙ）−ｂｏｘ２（Ｓｏｘ２としても知られている）、Ｍｙｃ、ＲＥＸ−１（Ｚｆｐ−４２としても知られている）、インテグリンα−６、Ｒｏｘ−１、ＬＩＦ−Ｒ、ＴＤＧＦ１（ＣＲＩＰＴＯ）、フラジリス、ＳＡＬＬ４（Ｓａｌ様４）、ＧＡＢＲＢ３、ＬＥＦＴＢ、ＮＲ６Ａ１、ＰＯＤＸＬ、ＰＴＥＮ、白血球細胞由来ケモタキシン１（ＬＥＣＴ１）、ＢＵＢ１、並びに、Ｋｌｆ４及びＫｌｆ５などのクルッペル様因子（Ｋｌｆ）を含む。細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与するあらゆる数の遺伝子は、本発明の方法によって誘導することができる。この遺伝子は、限定されるものではないが、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１〜２０個、２１〜３０個、３１〜４０個、４１〜５０個、及び、５０個超の遺伝子を含む。
【００７７】
さらに、Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８，５９７（２００２））、Ｉｖａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８、６０１（２００２））及びＦｏｒｔｕｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２，３９３ｂ（２００３））はそれぞれ、３種類の幹細胞を比較し、幹細胞の機能的特性を付与するのに重要であると提案された一般に発現される「スターンネス（Ｓｔｅｒｎｎｅｓｓ）」遺伝子のリストを明らかにした。前述の研究において明らかにされたあらゆる遺伝子を本発明の方法によって誘導してもよい。表２は、幹細胞の機能的特性の付与に関与すると考えられる遺伝子のリストを提供する。表２に一覧された遺伝子に加えて、公知の遺伝子との相同性がほとんど又は全くない９３個の発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）集団は、Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ，及びＩｖａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，によって明らかにされており、本発明の方法に包含されている。
【００７８】
表２  幹細胞特性の付与に関与する遺伝子
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【００７９】
本発明の実施形態は、細胞をリプログラミングする方法であって、遺伝子のクロマチン構造を修飾するステップと、前記遺伝子の発現を誘導するステップとを具える方法にも関する。別の実施形態において、この方法は、多能性又は分化多能性の遺伝子のクロマチン構造を修飾するステップを具える。さらに別の実施形態において、この方法は、ヒストンを修飾することによってそのクロマチン構造を修飾するステップをさらに具える。限定されるものではないが、ヒストンの修飾には、アセチル化；メチル化；脱メチル化；リン酸化；ユビキチン化；ユビキチン様タンパクによる修飾；ＡＤＰリボシル化；脱イミノ化及びプロリン異性化が含まれる。
【００８０】
本発明の実施形態は、本明細書中において開示されている方法に従って生産されたリプログラミングされた細胞を用いて様々な疾病を治療する方法を含む。当業者は、本明細書中で与えられている開示に基づいて、心臓病、糖尿病、皮膚病及び皮膚移植、脊椎損傷、パーキンソン病、多発性硬化症並びにアルツハイマー病といったこれらに限定されない非常に多くの疾病の治療における再生医療の価値及び能力を理解するであろう。本発明は、新しく損傷されていない細胞の導入によっていくつかの形態の治療的効果が与えられる疾病を治療するために、ヒトを含む動物にリプログラミングされた細胞を投与する方法を含む。
【００８１】
当業者は、リプログラミングされた細胞が、例えばニューロンなどの再分化細胞として動物に投与することができ、その動物の病気に冒された又は破損されたニューロンを置換するのに有用であることを容易に理解するであろう。さらに、リプログラミングされた細胞は、動物に投与可能であり、周辺環境からシグナル及び合図を受けると、近傍の細胞内環境によって指示された所望の細胞種に再分化することができる。代替的に、細胞は、インビトロにおいて再分化することができ、その分化細胞を必要性がある哺乳動物に投与することができる。
【００８２】
リプログラミング細胞を移植のために調製して、インビボ環境における長期生存を確実にすることができる。例えば、細胞を、細胞の増殖及び維持のための前駆体媒体といった適切な培地中で増殖させて、コンフルエンスまで増殖させることができる。例えば、１ｍｇ／ｍｌのグルコースを加えた０．０５％トリプシンを含むホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）；０．１ｍｇ／ｍｌのＭｇＣｌ．ｓｕｂ．２、０．１ｍｇ／ｍｌのＣａＣｌ．ｓｕｂ．２（完全なＰＢＳ）にトリプシンを不活性化するための５％の血清を加えたものなどの緩衝液を用いて細胞を培養基質から遊離させる。細胞を、遠心分離を用いてＰＢＳによって洗浄することができ、次いで、トリプシンを含まない注入用に選択した濃度の完全なＰＢＳ中に再懸濁することができる。
【００８３】
非経口投与に適した医薬品組成物の調合物は、滅菌水又は無菌等張食塩水などの薬学的に許容可能な担体と組み合わされた活性成分を含む。そのような調合物を調製し、パッケージし、又は、ボーラス投与又は連続投与に適した形態で販売することができる。注射可能な調合物を調製し、パッケージし、又は、アンプルなどの単位投薬形態で若しくは防腐剤を含む複数用量容器に入れて販売してもよい。限定されるものではないが、非経口投与用調合物には、懸濁液、溶液、油性又は水性媒質中のエマルション、パスタ剤、及び、徐放性又は生物分解性の移植可能な調合物が含まれる。限定されるものではないが、そのような調合物は、懸濁剤、安定化剤、又は、分散剤を含む１つ以上のさらなる成分をさらに含んでいてもよい。
【００８４】
本発明は、ＣＮＳ、ＰＮＳ、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、膵臓などを含む身体内の疾病又は外傷を治療するその他の治療手段と組み合わせてリプログラミングされた細胞を移植するステップをも包含する。従って、本発明のリプログラミングされた細胞は、副腎から得たクロム親和性細胞、胎児脳組織細胞及び胎盤細胞などの、患者に有益な効果を与える遺伝子操作された細胞及び遺伝子操作されていない細胞といったその他の細胞と共に共移植してもよい。従って、本明細書で開示されている方法は、本明細書で提供されている教示を参照した当業者によって理解されるように、その他の治療手段と組み合わせることができる。
【００８５】
本発明のリプログラミングされた細胞を、それぞれ本明細書に組み込まれている米国特許第５，０８２，６７０号及び第５，６１８，５３１号に記載されているような当業界で公知の技術を用いて患者に、又は、身体内のその他のあらゆる適切な部位に「裸」で移植することができる。
【００８６】
リプログラミングされた細胞は、単一細胞からなる混合物／溶液、又は、細胞集団の懸濁液を含む溶液として移植することができる。そのような集団の直径は、およそ１０〜５００マイクロメートルであり、より好ましくはおよそ４０〜５０マイクロメートルである。リプログラミングされた細胞集団は、１球体当たりおよそ５〜１００個の細胞を含んでいてもよく、より好ましくはおよそ５〜２０個の細胞を含む。移植細胞の密度は、１マイクロリットル当たり細胞数で、およそ１０，０００〜１，０００，０００個まで変わってもよく、より好ましくは１マイクロリットル当たりおよそ２５，０００〜５００，０００個の細胞であってもよい。
【００８７】
本発明のリプログラミングされた細胞の移植は、当業界において周知の技術及び今後開発される技術を用いて、実行することができる。本発明は、リプログラミングされた細胞を動物（好ましくはヒト）に、移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）、移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）、注入、又は、さもなければその他の方法で導入する方法を含む。
【００８８】
リプログラミングされた細胞を、マイクロカプセル化（例えば、本明細書に組み込まれている米国特許第４，３５２，８８３号；第４，３５３，８８８号；及び第５，０８４，３５０号参照）又はマクロカプセル化（例えば、本明細書に組み込まれている米国特許第５，２８４，７６１；第５，１５８，８８１；第４，９７６，８５９；及び第４，９６８，７３３；並びに国際公開ＷＯ９２／１９１９５；ＷＯ９５／０５４５２参照）を含む公知のカプセル化技術に従って、カプセル化して用いることによって生活性分子を送達してもよい。マクロカプセル化するためにそのデバイス中の細胞数を変えてもよく、各デバイスが、好ましくは約１０３個〜１０９個の細胞を含み、最も好ましくは約１０５個〜１０７個の細胞を含む。いくつかのマクロカプセル化デバイスを患者に移植してもよい。細胞のマクロカプセル化及び移植の方法は、当業界において周知であり、例えば米国特許第６，４９８，０１８号に記載されている。
【００８９】
治療目的、又は、患者組織における統合及び分化を追跡する方法のために、本発明のリプログラミングされた細胞を用いて、非自己タンパク又は非自己分子を発現させることができる。従って、本発明は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク）、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク）に記載されているようなリプログラミングされた細胞における外来性ＤＮＡの同時発現と共に、非自己ＤＮＡをリプログラミングされた細胞に導入するための発現ベクター及び方法を含む。
【００９０】
本発明の実施形態は、本発明の方法によって生産された細胞を含む組成物にも関する。別の実施形態においては、本発明は、少なくとも１つのＨＤＡＣの活性を抑制することによってリプログラミングされた細胞を含む組成物に関する。さらに別の実施形態において、本発明は、細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現を誘導することによってリプログラミングされた細胞を含む組成物に関する。
【００９１】
本発明の実施形態は、細胞を少なくとも１つのＨＤＡＣ阻害剤と接触させることによって生産されるリプログラミングされた細胞にも関する。
【００９２】
本発明の実施形態は、本発明の方法及び組成物を準備するためのキットにも関する。このキットは、特に、リプログラミング細胞の生産、ＥＳ様細胞及び幹細胞様細胞の作成、細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与する少なくとも１つの遺伝子の発現の誘導、並びに、少なくとも１つのＨＤＡＣの活性の阻害に使用することができる。このキットは、少なくとも１つのＨＤＡＣ阻害剤を含んでいてもよい。このキットは、複数のＨＤＡＣ阻害剤を含んでいてもよい。ＨＤＡＣ阻害剤を、単一の容器中に又は複数の容器中に提供することができる。
【００９３】
このキットは、細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与する遺伝子の誘導について試験するための試剤、ＨＤＡＣの阻害について試験するための試剤、及び、クロマチン構造のリモデリングについて試験するための試剤といった、これらに限定されない細胞がリプログラミングされたかどうか判断するために必要な試剤を含んでいてもよい。
【００９４】
このキットは、神経単位、骨芽細胞、筋細胞、上皮細胞及び肝細胞などを含む、これらに限定されない特定の系統又は複数の系統にリプログラミングされた細胞を分化させるために用いることができる試剤を含んでいてもよい。
【００９５】
このキットは、キット中に提供されている成分の使用を記載した説明資料を含んでいてもよい。ここで用いられているように、「説明資料」は、出版物、録音、線図、又は、本発明の方法（特に分化細胞のリプログラミングに作用するため）の有用性を伝えるために用いることができるその他の表現の媒体をキット中に含む。選択的に又は代替的に、この資料は、本発明の細胞を再分化及び／又はトランス分化する１つ以上の方法を説明してもよい。本発明のキットの説明資料は、例えば、ＨＤＡＣ阻害剤を含む容器に貼付されていてもよい。代替的に、説明資料及びＨＤＡＣ阻害剤又はその成分がレシピエントによって協調的に用いられることを意図して、説明資料を容器と別に発送してもよい。
【００９６】
以下の実施例を参照して本発明を説明する。これらの実施例は説明のみを目的として提供されており、本発明は、いかなる態様においてもこれらの実施例に限定されるように解釈されないが、むしろ、ここに提供されている教示から明らかになる全ての変形を包含するように解釈されるべきである。米国特許、許可された米国特許出願又は公表された米国特許出願を含む、これらに限定されないすべての参考文献は、この明細書において参照することによってそれらの全体が組み込まれている。
【００９７】
実施例
以下の実施例は例示的なものに過ぎず、請求項によって定義した本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【００９８】
実施例１：
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、ヒストンタンパクをアセチル化し、また、ＤＮＡを脱メチル化し、それによって、少なくとも２つの経路でクロマチン構造を修飾することが示されている。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下及び非存在下において、細胞が多能性であることに寄与する遺伝子の発現レベルを試験した。本実施例においては、バルプロ酸（ＶＰＡ）を用いたが、あらゆるヒストンデアセチラーゼ阻害剤を用いてもよい。
【００９９】
方法
細胞培養液
初代ヒト肺細胞をＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社（サンディエゴ、カリフォルニア）から購入し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び０．５％のペニシリン及びストレプトマイシンを含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）において、５％ＣＯ２、湿度９５％、３７℃で保持した。１ｍＭのＶＰＡの存在下、５ｍＭのＶＰＡの存在下、又は、ＶＰＡの非存在において細胞を３日間培養した。
【０１００】
量的ＲＴ−ＰＣＲ
Ｏｃｔ−４及びＮａｎｏｇの発現を、各培養条件（０ｍＭのＶＰＡ、１ｍＭのＶＰＡ及び５ｍＭのＶＰＡ）についてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。簡潔に、製造社のプロトコルに従って、デオキシリボヌクレアーゼＩ消化と共にトリゾール試剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド）及びＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社；ヴァレンシア、カリフォルニア）を用いて、培養液から全ＲＮＡを調製した。各サンプルから得た全ＲＮＡ（１μｇ）をオリゴ（ｄＴ）プライマー逆転写（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カールズバッド、カリフォルニア）に供した。７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社；フォスターシティ、カリフォルニア）によってＰＣＲマスター混合物を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行う。各サンプルについて１μｌの稀釈したｃＤＮＡ（１：１０）をＰＣＲ反応におけるテンプレートとして加える。Ｏｃｔ−４及びＮａｎｏｇの発現レベルをＧＡＰＤに対して標準化した。
【０１０１】
胚性タックマン低密度配列分析
細胞が多能性であることに寄与するいくつかの遺伝子（「スターンネス遺伝子」）の発現レベルを、ヒト胚性タックマン低密度配列分析（ＴＬＤＡ）を用いて決定した。いくつかのスターンネス遺伝子：ＧＡＢＲＢ３、ＬＥＦＴＢ、ＮＲ６Ａ１、ＰＯＤＸＬ及びＰＴＥＮを分析した。さらに、ＤＮＡメチル基転移酵素ＤＮＭＴ３Ｂの発現レベルを決定した。９０個のＥＳ細胞並びに発生遺伝子及び６個の内因性制御遺伝子を含むＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のヒト胚性ＴＬＤＡを、相対的発現レベルを測定するための量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、フォスターシティ、カリフォルニア）のために用いた。簡潔に言えば、ＡＢＩ高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＡＢＩ；フォスターシティ、カリフォルニア）を用いたＲＮＡの逆転写の後に、１５０ｎｇのサンプルｃＤＮＡを含む５０μｌのｌ核酸分解酵素非含有水＋ユニバーサルタックマン２×ＰＣＲマスター混合物を、ＴＬＤＡマイクロ流体カードの各ポートにピペットで移し、ＡＢＩ７９００ＨＴファストリアルタイムＰＣＲシステムによって分析した。ΔΔＣＴ方法を用いて、処理を行っていないコントロール細胞に対する、処理を行った細胞の遺伝子発現レベルにおける相対量（倍率変化）を算出した。処理を行った細胞を連邦政府が承認したヒトＥＳ細胞と比較してもよい。
【０１０２】
重亜硫酸塩シークエンシング
重亜硫酸塩シークエンシングは、メチル化のパターンを決定するためのＤＮＡの重亜硫酸塩処理の使用である。重亜硫酸塩シークエンシングは、重亜硫酸塩によるＤＮＡの処理がシトシン残基をウラシルに変換するが、５−メチルシトシン残基には作用しないという事実に基づいている。従って、重亜硫酸塩処理は、個々のシトシン残基のメチル化状態に依存するＤＮＡ塩基配列に特定の変化を導入し、ＤＮＡの一部分のメチル化状態に関する非常に分解能が高い情報を与える。
【０１０３】
多能性遺伝子プロモータのメチル化を重亜硫酸塩シークエンシングによって分析した。簡潔に、フェノールクロロホルム−イソアミルアルコール抽出によってＤＮＡを精製した。重亜硫酸塩変換は、製造社のプロトコル（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社；オレンジ、カリフォルニア）に従って、ＥＺ  ＤＮＡメチル化キットを用いて行った。非ＣｐＧジヌクレオチド中の全シトシンのウラシルへの転換率は、１００％であった。変換されたＤＮＡを、ヒトＯｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇ及びＳＯＸ２用プライマーを用いたＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カールズバッド、カリフォルニア）によって大腸菌中にクローンした。各サンプルの１０クローンをＳＰ６及びＴ７のプライマーを用いた配列決定によって確認した。対象とされる各プロモータについての全体メチル化パーセンテージ、及び、既知のＣｐＧについてのメチル化されたシトシンの数を、細胞集団間で比較した。
【０１０４】
結果
図１に示すように、Ｏｃｔ−４の発現は、５ｍＭのＶＰＡで処理した初代ヒト肺細胞において、コントロール細胞（ＭＣ）と比較してアップレギュレートされた（〜２．７倍；ｐ＜０．０１）。これらの結果は、ＨＤＡＣ阻害剤が、細胞が多能性であることに寄与する遺伝子の誘導又は発現増加を生じさせ得ることを実証する。
【０１０５】
５ｍＭのＶＰＡ中で３日間培養した細胞を用いて、いくつかの「スターンネス」遺伝子の発現レベルを分析した。図２に示すように、胚性タックマン低密度配列分析は、以下のスターンネス遺伝子のアップレギュレーション：ＧＡＢＲＢ３（ｐ＜０．０５）；ＬＥＦＴＢ（ｐ＜０．０５）；ＮＲ６Ａ１（ｐ＜０．０３）；ＰＯＤＸＬ（ｐ＜０．０５）；ＰＴＥＮ（ｐ＜０．０１）（１グループ当たりｎ＝３の重複測定）を明らかにした。さらに、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＭＴ３Ｂはダウンレギュレートされた。ＦＯＸＤ３、ＮＲ５Ａ２、ターシャリ、ＬＩＦＲ、ＳＦＲＰ２、ＴＦＣＰ２Ｌ１、ＬＩＮ２８、ＳＯＸ２及びＸＩＳＴといった、コントロール細胞において検出されなかったその他のいくつかのスターンネス関連遺伝子は、ＶＰＡ処理を行った細胞において誘導された。
【０１０６】
重亜硫酸塩シークエンシングによってＯｃｔ−４遺伝子の第１エクソンを分析した。重亜硫酸塩シークエンシングによって、未処理（−）及び処理（＋）細胞においてＯｃｔ−４から上流においてメチル化されたシトシンが明らかになった（３Ｆ−３Ｒ）（図３参照）。さらに、処理を行った細胞のＯｃｔ−４のプロモータ／第１エクソン領域中のＣｐＧジヌクレオチド中の２個のシトシンが脱メチル化されていた（図３参照）。これらのパターンは、いくつかのクローンにおいて一致していた（データは示されていない）。
【０１０７】
ＨＤＡＣ阻害剤が、細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与する遺伝子の発現を誘導することができ、ＤＮＡメチル基転移酵素の発現を減少させることができ、及び、ＤＮＡ中のシトシンを脱メチル化することは、これらの結果によって実証されている。さらに、ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞が多能性又は分化多能性であることに寄与する遺伝子のプロモータ領域中のシトシンの脱メチル化を生じさせることができる。
【０１０８】
実施例２：
ＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡレンチウイルス感染によるＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ２のｍＲＮＡ発現のレベルに対する影響を試験した。さらに、独立した試験群において、ＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡレンチウイルス感染によるＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ２のｍＲＮＡ発現のレベルに対する影響を試験した。３種類のヒト皮膚繊維芽細胞：成人ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦａ）、新生児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｎ）及び胎児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｆ）を用いた。
【０１０９】
方法
ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦａ、ＨＤＦｎ及びＨＤＦｆ）にｓｈＲＮＡレンチウイルスを感染させてＨＤＡＣ７を阻害した。独立した試験群において、ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦａ、ＨＤＦｎ及びＨＤＦｆ）にｓｈＲＮＡレンチウイルス感染させてＨＤＡＣ１１を阻害した。ＲＮＡをＨＤＦ（ピューロマイシン選択を含む）から分離し、ＲＴ−ＰＣＲを適用してターゲット遺伝子（例えばＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、様々なＨＤＡＣ、及び、様々なＳＩＲＴ遺伝子）の発現を分析した。ｓｈＲＮＡ構築物は、ｓｈＲＮＡのトランスフェクションが成功した細胞を選択する方法としてピューロマイシン（抗生物質）耐性を含んでいた。トランスフェクション後に、ピューロマイシンを培地に加えると、抵抗性を示さない（従ってトランスフェクトされていない）細胞が死滅し、それによって、トランスフェクトされた細胞のみが培地に残る。
【０１１０】
細胞培養液
ヒト皮膚繊維芽細胞をＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社（サンディエゴ、カリフォルニア）から購入し、繊維芽細胞増殖培地（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア）において、湿度９５％、３７℃、及び５％ＣＯ２で保持した。
【０１１１】
レンチウイルス感染
ヒト皮膚繊維芽細胞にｓｈＲＮＡ構築物を感染させた。ｓｈＲＮＡ構築物はＤｈａｒｍａｃｏｎ社から入手した。ｓｈＲＮＡ構築物は、ＨＤＡＣ７ａを対象としており、配列番号１：ＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＧＴＧＡの配列を有していた。
【０１１２】
配列番号２：ＡＧＣＧＡＧＡＣＴＴＣＡＴＧＧＡＣＧＡの配列を有するｓｈＲＮＡ構築物はＨＤＡＣ１１を対象としていた。  
【０１１３】
さらに、配列番号３：ＴＧＧＴＧＧＴＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧの配列を有するｓｈＲＮＡ構築物はＨＤＡＣ１１を対象としていた。
【０１１４】
製造社の説明に従ってヒト皮膚繊維芽細胞にｓｈＲＮＡを感染させた。ＨＤＦを、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア）においてピューロマイシン選択及びｈＥＳ培養条件（ｍＴｅＳＲ  Ｍｅｄｉｕｍ社、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、バンクーバー、ＢＣ、カナダ）用いて又は用いずに培養した。これらの試験群においては、ＨＤＡＣ７又はＨＤＡＣ１１のいずれかを対象とするｓｈＲＮＡ構築物を細胞に感染させた。
【０１１５】
量的ＲＴ−ＰＣＲ
Ｏｃｔ−３／４及びＮａｎｏｇの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した。簡潔に、製造社のプロトコルに従って、デオキシリボヌクレアーゼＩ消化と共にトリゾール試剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド）及びＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社；ヴァレンシア、カリフォルニア）を用いて、培養液から全ＲＮＡを調製した。各サンプルから得た全ＲＮＡ（１μｇ）を、オリゴ（ｄＴ）プライマー逆転写（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カールズバッド、カリフォルニア）に供した。７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社；フォスターシティ、カリフォルニア）によってＰＣＲマスター混合物を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行う。各サンプルについて１μｌの稀釈したｃＤＮＡ（１：１０）をＰＣＲ反応におけるテンプレートとして加える。グリセルアルデヒド３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）に対してＯｃｔ−３／４及びＮａｎｏｇの発現レベルを標準化した。
【０１１６】
結果
ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡレンチウイルス感染によるＮａｎｏｇ遺伝子のｍＲＮＡレベルに対する影響を、図４Ａ（ＨＤＦａ）、図４Ｂ（ＨＤＦｎ）及び図４Ｃ（ＨＤＦｆ）に示す。３種類の細胞すべてについて、ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１ノックダウンの両方は、ピューロマイシンの存在下及び非存在下の両方において、Ｎａｎｏｇ遺伝子のｍＲＮＡレベルが増加した（成人及び新生児のヒト皮膚繊維芽細胞について示す）。細胞種ＨＤＦａ及びＨＤＦｎについては、少なくとも６倍の時間にわたってＮａｎｏｇの発現が増加した。ピューロマイシン選択を行っても行わなくてもＮａｎｏｇ  ｍＲＮＡレベルの増加がみられた。図４Ａに報告するように、ＨＤＡＣ１１に対する干渉と比較して、ＨＤＡＣ７に対する干渉は、ＮａｎｏｇのｍＲＮＡ発現の迅速な増加をもたらした。しかしながら、さらに時間が経過すると、Ｎａｎｏｇ遺伝子のｍＲＮＡレベルの増加は、ＨＤＡＣ７又はＨＤＡＣ１１のいずれが干渉されているかにかかわらず、同程度であった。Ｎａｎｏｇ遺伝子のｍＲＮＡレベルの増加は、ＨＤＦｆにおいてもみられたが、ＨＤＦａ及びＨＤＦｎについてみられたほど強いものではなかった。
【０１１７】
ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡレンチウイルス感染によるＯｃｔ−４遺伝子のｍＲＮＡレベルに対する影響を、図５Ａ（ＨＤＦａ）、図５Ｂ（ＨＤＦｎ）及び図５Ｃ（ＨＤＦｆ）に示す。ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１ノックダウンの両方は、細胞種ＨＤＦａ及びＨＤＦｎにおいて、Ｎａｎｏｇ遺伝子のｍＲＮＡレベルを増加させた。Ｏｃｔ−４の発現の増加は、ピューロマイシンの存在下及び非存在下の両方においてみられた（図５Ａ及び図５Ｂ）。Ｎａｎｏｇ遺伝子と比較して、Ｏｃｔ−４遺伝子のｍＲＮＡレベルのより緩やかな増加がみられた。
【０１１８】
図６は、ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡレンチウイルス感染による、胎児ヒト皮膚繊維芽細胞におけるＳｏｘ−２のｍＲＮＡレベルに対する影響を報告する。Ｓｏｘ−２遺伝子のｍＲＮＡレベルの誘導はみられなかった。
【０１１９】
図７は、ＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡレンチウイルス感染による様々なＨＤＡＣ遺伝子及びＳＩＲＴ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに対する影響を報告する。図７に示すように、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ５及びＨＤＡＣ１１  ｍＲＮＡの発現は、ＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡ感染の３日後に誘導された。ＨＤＡＣ７  ｍＲＮＡのレベルは、レンチウイルス感染の３日後に基礎レベルの約５０％に低下した。
【０１２０】
１つのＨＤＡＣの阻害（この場合はＨＤＡＣ７）は、その他のいくつかのＨＤＡＣ遺伝子の発現を増加させた。ＨＤＡＣは密接に関連しており、おそらくは、冗長的機能又は少なくとも同様の機能を有するように発達してきた。１つのファミリーが抑制されると、その抑制されたメンバーを補うように、その他のファミリーメンバーの発現が増加することがある。ＨＤＡＣが重大な役割を果たしており、従って、冗長的及び／又は代償的な経路が発達したのかもしれない。細胞をリプログラミングする１つの機構は、冗長的及び／又は代償的な経路を担うための複数のファミリーメンバーを同時に又は連続的にターゲットにするものであってもよい。細胞をリプログラミングするその他のメカニズムは、同じファミリーの阻害タンパクを同時に又は連続的にターゲットにすること、又は、調節タンパクの異なるファミリーの阻害タンパクをターゲットにするものであってもよい。
【０１２１】
実施例４：
ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡレンチウイルス感染によるＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ２のｍＲＮＡ発現レベルに対する影響を試験した。同じ試験において、ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１を干渉し、様々な遺伝子の発現に対する効果を決定した。３種類のヒト皮膚繊維芽細胞：成人ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦａ）、新生児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｎ）及び胎児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｆ）を用いた。
【０１２２】
方法
ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦａ、ＨＤＦｎ及びＨＤＦｆ）にｓｈＲＮＡレンチウイルスを感染させてＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１を阻害した。ＲＮＡを、ＨＤＦ（ピューロマイシン選択を含む）から分離し、ＲＴ−ＰＣＲを適用して例えばＯｃｔ−４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、様々なＨＤＡＣ、及び、様々なＳＩＲＴ遺伝子といったターゲット遺伝子の発現を分析した。ｓｈＲＮＡ構築物は、ｓｈＲＮＡのトランスフェクションが成功した細胞を選択する方法としてピューロマイシン（抗生物質）耐性を含んでいた。トランスフェクション後に、ピューロマイシンを培地に加えると、抵抗性を示さない（従ってトランスフェクトされていない）細胞が死滅し、それによって、トランスフェクトされた細胞のみが培地に残る。
【０１２３】
細胞培養液
ヒト皮膚繊維芽細胞をＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社（サンディエゴ、カリフォルニア）から購入し、繊維芽細胞増殖培地（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア）において、湿度９５％、３７℃及び５％ＣＯ２で保持した。
【０１２４】
レンチウイルス感染
ヒト皮膚繊維芽細胞にｓｈＲＮＡ構築物を感染させた。ｓｈＲＮＡ構築物をＤｈａｒｍａｃｏｎ社から入手した。このｓｈＲＮＡ構築物は、ＨＤＡＣ７ａを対象としており、配列番号１：ＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＧＴＧＡの配列を有していた。
【０１２５】
配列番号２：ＡＧＣＧＡＧＡＣＴＴＣＡＴＧＧＡＣＧＡの配列を有するｓｈＲＮＡ構築物は、ＨＤＡＣ１１を対象としていた。
【０１２６】
さらに、配列番号３：ＴＧＧＴＧＧＴＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧの配列を有するｓｈＲＮＡ構築物は、ＨＤＡＣ１１を対象としていた。
【０１２７】
製造社の説明に従ってヒト皮膚繊維芽細胞にｓｈＲＮＡを感染させた。ＨＤＦを、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア）においてピューロマイシン選択及びｈＥＳ培養条件（ｍＴｅＳＲ  Ｍｅｄｉｕｍ社、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、バンクーバー、ＢＣ、カナダ）用いて又は用いずに培養した。
【０１２８】
量的ＲＴ−ＰＣＲ
Ｏｃｔ−３／４及びＮａｎｏｇの発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した。簡潔に、製造社のプロトコルに従って、デオキシリボヌクレアーゼＩ消化と共にトリゾール試剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド）及びＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社；ヴァレンシア、カリフォルニア）を用いて、培養液から全ＲＮＡを調製した。各サンプルから得た全ＲＮＡ（１μｇ）を、オリゴ（ｄＴ）プライマー逆転写（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カールズバッド、カリフォルニア）に供した。７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社；フォスターシティ、カリフォルニア）によってＰＣＲマスター混合物を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行う。各サンプルについて１μｌの稀釈したｃＤＮＡ（１：１０）をＰＣＲ反応におけるテンプレートとして加える。Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇ及びＳｏｘ−２の発現レベルを、グリセルアルデヒド３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）に対して標準化した。
【０１２９】
結果
図８に報告するように、Ｎａｎｏｇ発現は、ピューロマイシンの存在下及び非存在下において、細胞種ＨＤＦｆ及びＨＤＦｎの両方について、ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１のダブルノックダウンによって増加した。Ｎａｎｏｇ発現は、細胞種ＨＤＦｆにおいて急速に増加し、第５日まで一致した反応がみられた。細胞種ＨＤＦａにおいては穏やか効果がみられた。
【０１３０】
図９は、ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１の二重又は同時的ｓｈＲＮＡ干渉中におけるＯｃｔ−４のｍＲＮＡ発現に対する効果を報告する。Ｏｃｔ−４発現の増加は、ピューロマイシンの存在下及び非存在下の両方においてみられた。細胞種ＨＤＦｎについて強い効果がみられ、そのｍＲＮＡ発現は、ＨＤＡＣ７又はＨＤＡＣ１１のいずれかのシングルノックダウンと比較して、Ｏｃｔ−４について増加した。
【０１３１】
図１０に報告するように、胎児ヒト皮膚繊維芽細胞においてＳｏｘ−２発現が常に生じていた。Ｓｏｘ−２の発現は、ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１のダブルノックダウンによって維持された。
【０１３２】
図１１は、ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１の二重ｓｈＲＮＡ干渉中の成人ヒト皮膚繊維芽細胞における様々なＨＤＡＣ遺伝子のｍＲＮＡ発現に対する効果を報告する。ＨＤＡＣ９の発現の強い増加がみられた。ＨＤＡＣ５の発現も増加した。その他の遺伝子において穏やかな効果がみられた（図１１参照）。
【０１３３】
図１２は、胎児ヒト皮膚繊維芽細胞におけるＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１の二重ｓｈＲＮＡ干渉中の様々なＨＤＡＣ遺伝子のｍＲＮＡ発現に対する効果を報告する。第７日にピューロマイシン選択によってＨＤＡＣ９発現の強い増加がみられた。第７日にピューロマイシン選択によってその他の様々なＨＤＡＣ遺伝子の発現が低下した（図１２参照）。
【０１３４】
図１３は、新生児ヒト皮膚繊維芽細胞におけるＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１の二重ｓｈＲＮＡ干渉中の様々なＨＤＡＣ遺伝子のｍＲＮＡ発現に対する効果を報告する。ピューロマイシン選択を行っていない日及びピューロマイシン選択を行った第５日にもＨＤＡＣ９の発現の強い増加が見られた。ＨＤＡＣ５の発現も増加した。その他の遺伝子において穏やかな効果がみられた（図１３参照）。
【０１３５】
これらの結果は、ｓｈＲＮＡ構築物が、ＨＤＡＣをコードする遺伝子の発現を抑制するために用いられることができ、また、細胞のリプログラミングに関与する２つの遺伝子であるＯｃｔ−４及びＮａｎｏｇなどの多能性遺伝子の発現を誘導することができることを実証している。さらに、これらの結果は、細胞に分化能力を取り戻させることにおいてＨＤＡＣの阻害が必須の役割を果たすことを実証している。本発明の方法を用いて、あらゆるＨＤＡＣ又はＨＤＡＣ関連タンパクを構造的に又は機能的に阻害することができる。
【０１３６】
代償的経路、冗長的経路、又は、代償性かつ冗長的経路のすべてを説明するために、１つ以上のＨＤＡＣ、又は、多分化能遺伝子のサイレンシングに関与するその他のあらゆるタンパクを抑制してもよい。阻害タンパクの同じファミリーの１つ以上のタンパク、又は、阻害タンパクの２つの異なるファミリーの２つ以上のタンパクを抑制してもよい。細胞をリプログラミングするための効率的な１つの機構は、冗長的な経路、代償的な経路、又は、冗長的かつ代償的な経路内の複数のタンパクを抑制することであってもよい。この抑制経路内で機能するタンパクを、ｓｈＲＮＡ、ＨＤＡＣ阻害剤、小分子阻害剤、又は、上に列挙されているものの任意の組合せによって抑制してもよい。
【０１３７】
実施例５：
ＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡレンチウイルス感染によるＨＤＡＣ１１の発現に対する影響を試験した。３種類のヒト皮膚繊維芽細胞：成人ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦａ）、新生児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｎ）及び胎児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｆ）を用いた。
【０１３８】
方法
細胞培養液
ヒト皮膚繊維芽細胞をＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社（サンディエゴ、カリフォルニア）から購入し、繊維芽細胞増殖培地（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア）において、湿度９５％、３７℃、及び、５％ＣＯ２で保持した。
【０１３９】
レンチウイルス感染
ヒト皮膚繊維芽細胞にｓｈＲＮＡ構築物を感染させた。ｓｈＲＮＡ構築物をＤｈａｒｍａｃｏｎ社から入手した。このｓｈＲＮＡ構築物は、ＨＤＡＣ７ａを対象としており、配列番号１：ＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＧＴＧＡの配列を有していた。
【０１４０】
製造社の説明に従ってヒト皮膚繊維芽細胞にｓｈＲＮＡを感染させた。ＨＤＦを、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア）においてピューロマイシン選択及びｈＥＳ培養条件（ｍＴｅＳＲ  Ｍｅｄｉｕｍ社、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、バンクーバー、ＢＣ、カナダ）用いて又は用いずに培養した。
【０１４１】
量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＨＤＡＣ７ａ及びＨＤＡＣ１１の発現をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した。簡潔に、製造社のプロトコルに従って、デオキシリボヌクレアーゼＩ消化と共にトリゾール試剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド）及びＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社；ヴァレンシア、カリフォルニア）を用いて、培養液から全ＲＮＡを調製した。各サンプルから得た全ＲＮＡ（１μｇ）を、オリゴ（ｄＴ）プライマー逆転写（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；カールズバッド、カリフォルニア）に供した。７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社；フォスターシティ、カリフォルニア）によってＰＣＲマスター混合物を用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行う。各サンプルについて１μｌの稀釈したｃＤＮＡ（１：１０）をＰＣＲ反応におけるテンプレートとして加える。ＨＤＡＣ７ａ及びＨＤＡＣ１１の発現レベルを、グリセルアルデヒド３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）に対して標準化した。
【０１４２】
結果
ＨＤＡＣ７ａ  ｓｈＲＮＡを感染させた胎児ヒト膚線維芽細胞においては、ＨＤＡＣ７ａの発現は減少したが、ＨＤＡＣ１１の発現が増加した（図１４Ａ）。新生児ヒト膚線維芽細胞（図１４Ｂ）及び胎児ヒト膚線維芽細胞（図１４Ｃ）において同様の結果が得られた。この発現の増加は、ピューロマイシンの存在下及び非存在下のいずれにおいてもみられた。ＨＤＡＣ１１発現は、試験を行った３つの細胞種のすべてにおいて代償的態様でアップレギュレートされた。多能性遺伝子の発現を低下させることに関与する調節タンパクをコードする遺伝子の発現を阻害することは、調節タンパクをコードするその他の遺伝子の発現を増加させることがある。調節タンパクの１つのファミリー又は調節タンパクの複数のファミリーを対象とする複数の薬剤は、細胞をリプログラミングする効率的な手段であることもある。その薬剤には、小分子阻害剤及びｓｈＲＮＡ構築物が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１４３】
実施例６
ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ１１又はＤＮＭＴ１を対象とするレンチウイルスｓｈＲＮＡに感染した細胞を、多能性遺伝子の発現に関して染色及び視覚化を行った。この実施例においてはＯｃｔ−４及びＳｏｘ−２のタンパク発現を分析したが、本発明の方法を用いて細胞のリプログラミング又は細胞に分化能力を取り戻させることに関与するあらゆる遺伝子の発現を増加させることができることは、当業者に理解されるであろう。
【０１４４】
方法
細胞培養液
胎児ヒト皮膚繊維芽細胞をＣｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社（サンディエゴ、カリフォルニア）から購入し、繊維芽細胞増殖培地（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア）において、湿度９５％、３７℃、及び、５％ＣＯ２で保持した。
【０１４５】
レンチウイルス感染
胎児ヒト皮膚繊維芽細胞に以下の組成物：（１）ＤＮＭＴ１を対象とするｓｈＲＮＡレンチウイルス；（２）ＨＤＡＣ７を対象とするｓｈＲＮＡレンチウイルス；（３）ＤＮＭＴ１及びＨＤＡＣ７を対象とするｓｈＲＮＡレンチウイルス；及び（４）ＨＤＡＣ７ａ及びＨＤＡＣ１１を対象とするｓｈＲＮＡレンチウイルスの１つを感染させた。ｓｈＲＮＡ構築物をＤｈａｒｍａｃｏｎ社から入手した。ＨＤＡＣ７ａを対象とするｓｈＲＮＡ構築物は、配列番号１：ＧＣＴＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＴＣＧＴＧＡの配列を有していた。
【０１４６】
配列番号２：ＡＧＣＧＡＧＡＣＴＴＣＡＴＧＧＡＣＧＡの配列を有するｓｈＲＮＡ構築物は、ＨＤＡＣ１１を対象としていた。
【０１４７】
さらに、配列番号３：ＴＧＧＴＧＧＴＡＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧの配列を有するｓｈＲＮＡ構築物は、ＨＤＡＣ１１を対象としていた。
【０１４８】
ＤＮＭＴ１を対象とするｓｈＲＮＡ構築物は、配列番号４：ＧＴＣＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡＴＡの配列を有していた。
【０１４９】
製造社の説明に従ってヒト皮膚繊維芽細胞にｓｈＲＮＡを感染させた。ＨＤＦを、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンノゼ、カリフォルニア）においてピューロマイシン選択及びｈＥＳ培養条件（ｍＴｅＳＲ  Ｍｅｄｉｕｍ社、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、バンクーバー、ＢＣ、カナダ）用いて又は用いずに培養した。
【０１５０】
免疫組織化学
免疫組織化学的検査のために、ターゲットｓｈＲＮＡに感染した細胞及びコントロール細胞をチャンバスライド（ＬａｂＴｅｋ社、ネーパービル、イリノイ）において増殖させた。次いで、細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、製造社のプロトコルに従って、多分化能マーカＯｃｔ−３／４（Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ）を対象とする特異的抗体と共にインキュベートした。Ｏｃｔ−３／４の染色を赤色で視覚化した。核をＤＡＰＩ染色（Ｖｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ社）で視覚化すると青色に見えた。
【０１５１】
結果
Ｏｃｔ−４タンパク発現は、胎児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｆ）においてｓｈＲＮＡ干渉によって増加した。図１５Ａは、感染させていないＨＤＦｆ（ネガティブコントロール）の写真である。図１５Ｇは、ヒトＥＳ細胞（ポジティブコントロール）の写真である。ネガティブコントロール細胞において、Ｏｃｔ−４タンパクの発現はほとんど検出されなかった。図１５Ｂは、ＤＮＭＴ１を対象とするｓｈＲＮＡに感染したＨＤＦｆ細胞の写真である。細胞がＤＮＭＴ１ｓｈＲＮＡに暴露されると、Ｏｃｔ−４タンパク発現が明らかに増加する。ＨＤＡＣ７ｓｈＲＮＡを感染させたＨＤＦｆ細胞においては、最小限のＯｃｔ−４タンパクが検出された（図１５Ｃ）。これは、この特定のサンプルの処理によるものであるかもしれない。
【０１５２】
ＤＮＭＴ１ｓｈＲＮＡ及びＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡに感染した細胞は、Ｏｃｔ−４タンパクの発現の劇的な増加を示した（図１５Ｄ）。ＤＮＭＴ１ｓｈＲＮＡ及びＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡの両方で処理した細胞は、ヒトＥＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カリフォルニア）に非常に類似した発現パターンをもたらす（図１５Ｅ）。これらのデータは、Ｏｃｔ−４遺伝子発現の増加がＯｃｔ−４タンパク発現の増加に至るというここで与えられているデータを確証付ける。ＤＮＭＴ及びＨＤＡＣ１１は、転写の活性化の制御及びクロマチンリモデリングに関して別個の機能を有している。２つの独立した調節グループのメンバーの阻害は、Ｏｃｔ−４の発現を劇的に増加させた。ＤＮＭＴ１及びＨＤＡＣ１１に感染した細胞においてもＯｃｔ−４タンパク発現が増加した（図１５Ｅ）。ＤＮＭＴ１及び複数のＨＤＡＣの阻害は、結果的にＯｃｔ−４タンパクの発現を増加させた。
【０１５３】
ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡに感染した細胞においては、Ｏｃｔ−４の発現に検出可能な増加はみられなかった（図１５Ｆ）。これは実験系の限界のせいであるかもしれない。代替的に、この結果は、多能性遺伝子の発現を最適に増加させるためには、複数の経路を抑制すべきであることを示唆している可能性もある。別個の調節性複合体において機能するタンパクをコードする遺伝子の発現を阻害することによって、多能性遺伝子のより高い発現レベルをもたらす可能性がある。あらゆる調節性複合体のあらゆるメンバーを抑制してもよい。
【０１５４】
Ｓｏｘ−２タンパク発現は、胎児ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦｆ）においてｓｈＲＮＡ干渉によって増加した。図１６Ａは、感染していないＨＤＦｆ（ネガティブコントロール）の写真である。図１６Ｇは、ヒトＥＳ細胞（図１６Ｇ）の写真である。ネガティブコントロール細胞においては、Ｓｏｘ−２タンパクの発現がほとんど検出されなかった。図１６Ｂは、ＤＮＭＴ１を対象とするｓｈＲＮＡに感染したＨＤＦｆ細胞の写真である。核染色がみられたが、わずかな量のＳｏｘ−２タンパクが検出された。ＨＤＡＣ７ｓｈＲＮＡ及びＤＮＭＴ１ｓｈＲＮＡに感染したＨＤＦｆ細胞においては、最小限のＳｏｘ−２タンパクが検出された（図１６Ｃ）。これは、この特定のサンプルの処理のせいである可能性がある。
【０１５５】
ＤＮＭＴ１ｓｈＲＮＡ及びＨＤＡＣ１１  ｓｈＲＮＡに感染した細胞は、Ｓｏｘ−２タンパクの発現の劇的な増加を示した（図１６Ｄ）。２つの独立した調節グループのメンバーの阻害によって、Ｓｏｘ−２の発現が劇的に増加した。ＨＤＡＣ７  ｓｈＲＮＡに感染した細胞は、最小限のＳｏｘ−２のタンパク発現を示した（図１６Ｅ）。Ｓｏｘ−２タンパク発現は、ＨＤＡＣ７及びＨＤＡＣ１１に感染した細胞においても増加した（図１６Ｆ）。ＤＮＭＴ１及び複数のＨＤＡＣの阻害は、Ｓｏｘ−２タンパクの発現を増加させた。
【０１５６】
これらの結果は、ヒストンデアセチラーゼ及びＤＮＡメチル基転移酵素の阻害が、細胞のリプログラミングに関与する多能性遺伝子の発現を増加させたことを実証している。２つの別個のｓｈＲＮＡ構築物は、２つの独立した調節タンパクをターゲットにしており、その結果、Ｏｃｔ−４及びＳｏｘ−２タンパクの発現が劇的に増加した。多能性遺伝子の転写の阻害又は抑制に関与する１つよりも多い調節タンパクを阻害することは、細胞をリプログラミングし、細胞に分化能を取り戻させる効率的なメカニズムである可能性がある。
【０１５７】
ヒストンデアセチラーゼ及び関連ファミリーメンバーの阻害を用いて、多能性遺伝子の発現を増加させることができ、また、分化細胞をリプログラミングすることができる。これらのリプログラミング方法は、卵子、胚又はＥＳ細胞に無関係である。更に、これらの方法は、悪影響を与え得るウイルスベクターに無関係である。また、これらの方法は、ｃ−ｍｙｃ及びＫｌｆ４などの腫瘍誘発遺伝子にも無関係である。
【０１５８】
さらに、本発明の方法を用いて体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を用いずに分化細胞をリプログラミングすることができる。ＳＣＮＴは非常に非能率的であり、リプログラミング分野に重大な限定が課される。本方法はＳＣＮＴの必要性を軽減する。
【０１５９】
本方法は、強いリポーター因子を有する人工ベクターに対する効果の測定とは対称的に、多能性の内因性遺伝子及びタンパクの発現の増加を実証した。人工ベクターは、内因性遺伝子と同じクロマチン構造を有しておらず、また、その他の遺伝子及びゲノムの環境を作り出すプロモータ因子を有していない。人工ベクターは、天然ゲノムの環境を再現するために必要な天然因子の多くを有していない。ここで与えられている結果は、ヒト細胞の処理及び内因性遺伝子に対する効果の測定から得られた効果を表している。
【０１６０】
最後に、ここで与えられているデータは、ヒストンデアセチラーゼの機能を抑制又は変更することが、分化細胞のリプログラミング及び分化能力の回復に関与する１つのステップであることを実証している。
【０１６１】
本明細書中においては特定の実施形態を図示及び説明したが、示されている特定の実施形態に代えて同じ目的を達成するように意図されたあらゆる配置を用いてもよいことは当業者に理解されるであろう。本出願は、記載されている本発明の原理に従って機能するあらゆる脚色又は変形を包含するように意図されている。従って、本発明は、特許請求の範囲及びその均等物のみによって限定されるように意図されている。本出願において引用されている特許、参考文献及び刊行物の開示は、参照することによって本明細書中に組み込まれている。
【図１】
2011516076.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
2011516076.tif 000027
2011516076.tif 000028