(57)【要約】本発明は、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマから選択される少なくとも１種の炎症誘発性サイトカインの産生を阻害することによるか、あるいはＩＬ−８ケモカインおよび／またはＩＬ−１０調節サイトカインを免疫調節することによる、式（Ｉ）の化合物：  【化８】2011524352.tif 000038またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／もしくは溶媒和物の、急性または慢性炎症性疾患の治療用薬剤の調製における使用に関する。また、本発明は、式（Ｉ’） の新規化合物：  【化９】2011524352.tif 000039またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物、ならびに前記化合物を含んでなる医薬組成物に関する。
2011524352.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2011524352.tif 000031
［式中、
Ｒ１は、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または未置換シクロアルキル、置換または未置換アリール、および置換または未置換ヘテロシクリルから選択されるものであり；
Ｒ２は、水素、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または未置換シクロアルキル、およびＮ（Ｒ’Ｒ’’）（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである）から選択されるものであり；
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルラジカルである］
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／もしくは溶媒和物の、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマから選択される少なくとも１種の炎症誘発性サイトカインの産生を阻害することによるか、あるいはＩＬ−８ケモカインおよび／またはＩＬ−１０調節サイトカインを免疫調節することによる、急性または慢性炎症性疾患の治療用薬剤の調製における使用。
【請求項２】
前記急性または慢性炎症性疾患が、急性および慢性の血清陽性または血清陰性少関節炎および多発性関節炎、脊椎関節炎、糸球体腎炎、膠原病、尿細管間質性腎炎、メタボリックシンドローム、アムローム性動脈硬化症、変形性関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、多発性硬化症、脱髄疾患、髄膜炎、脳炎、髄膜脳炎、炎症性神経根障害および末梢神経障害、炎症性腸疾患、肝硬変、肝炎、心不全、虚血性疾患、腎不全、炎症性膀胱炎、良性前立腺過形成、前立腺炎、心筋炎、心膜炎、ブドウ膜炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、じんましん、乾せん、酒さ、アレルギー性鼻炎、敗血症、敗血症性ショック、多発器質不全、全身性自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、血管炎、皮膚筋炎、アミロイドシスもしくはサルコイドーシス、器官特異的自己免疫疾患、例えば、重症筋無力症、甲状腺炎もしくはインスリン症、臓器移植、感染および腫瘍誘発炎症、ＴＮＦ−アルファ依存性細胞変性、壊死、アポプトーシス、移植片対宿主病、悪液質ならびにオートクリンおよびパラクリン病的細胞増殖から選択されるものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記慢性炎症性疾患が、血清陽性または血清陰性慢性多発性関節炎である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記慢性多発性関節炎が、リウマチ様関節炎である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
Ｒ１が、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
Ｒ１が、メチルである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
Ｒ２が、置換または未置換シクロアルキルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
Ｒ２が、シクロペンチルである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
Ｒ３が、メチルである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記式（Ｉ）の化合物が、以下の化合物：
【化２】
2011524352.tif 000032
【化３】
2011524352.tif 000033
【化４】
2011524352.tif 000034
から選択されるものであるか、またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／もしくは溶媒和物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
式（Ｉ’）
の化合物：
【化５】
2011524352.tif 000035
［式中、
Ｒ１は、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または未置換シクロアルキル、置換または未置換アリール、および置換または未置換ヘテロシクリルから選択されるものであり；
Ｒ３はＣ１〜Ｃ６アルキルラジカルである］
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物。
【請求項１２】
Ｒ１が、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１が、メチルである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
下式の化合物から選択される、請求項１１に記載の化合物：
【化６】
2011524352.tif 000036
【化７】
2011524352.tif 000037
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれかで定義されている式（Ｉ’）の化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物ならびに少なくとも１種の薬学的に許容される担体、アジュバントおよび／またはビヒクルを含んでなる医薬組成物。
【請求項１６】
薬剤として使用される、請求項１１〜１４のいずれか一項に定義されている式（Ｉ’）の化合物。
【請求項１７】
請求項１に定義されている式（Ｉ）の化合物の、免疫学的障害、標的細胞および標的分子を見つけるための、イメージング技術および薬理イメージング技術におけるイメージングバイオマーカーとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５−（４−メタンスルホニル−フェニル）−チアゾール由来の化合物の、急性および慢性炎症性疾患または状態、例えばリウマチ様関節炎を治療するための薬剤の調製における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学は、自己と非自己との間の区別の科学的研究である。自己に対する許容の破壊が、自己免疫疾患の原因である。さらに、これまで自己免疫として考えられていなかった他の状態、例えば、移植、アムローム性動脈硬化症、敗血性および非敗血性の急性および慢性炎症性病状ならびに多くの他の疾病が、免疫細胞が介在した発症機序を示す。免疫炎症性エフェクター反応の活性化は、ほとんどの著者によれば、２つのシグナルに基づいていると考えられている：
−シグナル１は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に埋め込んだ同族抗原を認識するクローン抗原受容体（ＴＣＲ−ＣＤ３  Ｔ細胞受容体複合体）のトリガーを意味する。Ｂ細胞において、細胞外可溶性または膜結合抗原が、免疫グロブリンＣＤ７９（Ｉｇ／ＣＤ７９）クローン受容体複合体を架橋して、抗体分泌リンパ球系統にシグナル１を伝達する。
−アネルギーまたはクローン排除による寛容を回避するのには、抗原送達シグナル１の他に、第二のシグナルが必要である。シグナル２は、ヒト単球およびそれらの分裂系統後代のような、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で発現するＣＤ８６等の共刺激により伝達される。
【０００３】
先天性免疫炎症反応において、危険信号が、パターン認識受容体（ＰＲＲ）をトリガーする、微生物および自己改変抗原またはマイトジェンにより、促進される。ＰＲＲシグナル経路、例えばＴＬＲ４（グラム陰性壁バクテリアリポ多糖またはＬＰＳ）は、高レベルの共刺激表面分子（例えば、ＣＤ８０またはＣＤ８６）の発現を伝達する。ひいては、共刺激リガンドＣＤ８０〜ＣＤ８６は、ヘルパーＴ細胞の表面でＣＤ２８を架橋する。シグナル１（すなわち、抗ＣＤ３抗体架橋）＋シグナル２（すなわち、特異的抗体によるＣＤ２８架橋）の組み合わせは、効率的な炎症性エフェクター免疫反応の自然条件に実験的に似ている。特に、認可された免疫抑制薬剤は、高レベルの共刺激の条件下での炎症誘発性サイトカインカスケードの活性化を阻害することから、多少問題がある。高レベルの共刺激の条件は、自己免疫疾患および数多くの他の重症急性および慢性炎症状態で生じる。
【０００４】
ＡＰＣは、エフェクター（すなわち、Ｔ細胞ｈｅｌｐ、Ｔｈ、細胞毒性、Ｔｈ、抗体産生、Ｂ細胞）反応があるか、あるいは障害クローンにより介在された寛容反応（アネルギーまたはアポトーシスによる）があるかに強く影響するので、単に獲得した免疫系が免疫反応の種類を決定するのに不可欠なだけではない。また、ＡＰＣは、それら自体がエフェクター即時免疫反応を送達できる。十分に裏付けされた例が、癌患者における単球による多量の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）の産生および放出である。これらの患者において、ＴＮＦ−アルファは、インターロイキン８（ＩＬ−８）および他の炎症誘発性サイトカインの分泌にともなう血管内皮の増強反応および活性化ならびにプロコアギュラント活性を促進する。要するに、ＴＮＦ−アルファは、癌壊死で血栓形成および虚血を促進する。これにより、カケクチンまたはＴＮＦ−アルファとして最初に定義されることとなった。しかしながら、ＴＮＦ−アルファは、数多くの他の疾病状態に関与する多面的サイトカインである。単球で、ＬＰＳは、敗血症性ショックの発生に強く影響する多量のＴＮＦ−アルファの分泌をトリガーすることがあるという長年にわたる証拠がある。より最近では、不適切な多量のＴＮＦ−アルファの産生および分泌は、自己免疫炎症性疾患、例えば、リウマチ様関節炎、脊椎関節炎、クローン病、ブドウ膜炎および乾せんにおける治療標的として考えられる。したがって、抗ＴＮＦ−アルファの使用は、これらの疾患を取り扱う最新の戦略（生物活性ＴＮＦ−アルファの有効レベルが減少すると患者の状態を改善するのに役立つことがある）として現在広く考えられている。
【０００５】
これに関連して、ＴＮＦ−アルファ拮抗薬での治療から恩恵をうけることができる疾患の数が、急速に増加しており、例えば、アムローム性動脈硬化症、メタボリックシンドローム、脳炎、ウイルス肝炎、糸球体腎炎、他の例として、腫瘍および敗血症性ショックに対する不適切な炎症反応などがある。
【０００６】
一部の体細胞により産生されるものの他に、ＴＮＦ−アルファ産生には、単球およびＴリンパ球の２つの主要源がある。獲得免疫反応の過程において、炎症誘発性指示的シナリオ下での危険信号に対するＡＰＣの提示は、活性化Ｔｈ細胞のサイトカイン分泌プロファイルをＴｈ−１型に分極化する共刺激分子であるＩＬ−１２ｐ７０（ｐ３５およびｐ４０のヘテロダイマー）の分泌をトリガーする。Ｔｈ１細胞は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）分泌が真正のフットプリントである特徴的なサイトカインプロファイルを示す。これらの細胞は、多量のＴＮＦ−アルファも分泌する。
【０００７】
Ｔｈ１により産生されるＩＦＮ−ガンマは、炎症性疾患の理解において関連する数多くの効果を促進する。一方で、ＩＦＮ−ガンマは、さらに単球を活性化し、そして一定の刺激によるＴＮＦ−アルファ分泌のレベルを増加する。他方で、ＩＦＮ−ガンマは、ＴＮＦ−アルファ受容体下流の強力なシグナル経路を促進する。要するに、ＩＦＮ−ガンマは、抗ウイルス活性などのそれ自体の直接の効果の他に、ＭＨＣ−ＩＩにおける発現を増加し、そしてＴＮＦ−アルファのさらに強力な効果を増加することにより炎症および障害に寄与する。
【０００８】
単球におけるＴＮＦ−アルファの産生またはＴｈ１細胞におけるＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファの産生により開始される炎症誘発性カスケードは、他の炎症誘発性サイトカイン経路、例えば、ＩＬ−８を介して増幅する。ＩＬ−８は、その最初の名称にもかかわらず、マクロファージおよび他の細胞型、例えば、上皮細胞により産生されるケモカインとして記載され、そして内皮細胞によっても合成され、したがって、ＣＸＣＬ８とも称される。好中性顆粒球はＩＬ−８の主要な標的細胞であるが、比較的広範囲の細胞がこのケモカインに応答する（内皮細胞、マクロファージ、マスト細胞、ケラチン生成細胞）。ＩＬ−８の主要な機能は、その標的細胞（例えば、好中性顆粒球）における走化性を誘発することである。好中球において、移動および標的機能食作用に必要とされる一連の細胞−生理反応も、細胞内Ｃａ２＋、エクソサイトーシス（例えば、ヒスタミン放出）、呼吸バーストの増加のように誘発される。ＩＬ−８は、固有の免疫反応に関与するＴＬＲを有する細胞により分泌されることができる。ＩＬ−８の主要な機能は、好中球を採用して抗原パターンＴＬＲをトリガーする抗原を食菌することである。ＩＬ−８標的細胞を、内皮および他の標的組織に搬送することにより、ＩＬ−８は、生体防御における役割の他に、ＴＮＦ−アルファ病原性の役割の多くを増殖および実行することに関与する。
【０００９】
白血球遊走および帰還は、ケモカインおよびそれらの受容体だけでなく、多数の接着分子により調節される。それらのうち、セレクチンＣＤ６２Ｌは、リンパ節への白血球移動を防止するための治療標的として認められており、したがって、非ステロイド抗炎症性薬剤（ＮＳＡＩＤ）の生体内効果をランク付けするパラメータとして評価されている。
【００１０】
数多くの免疫抑制剤および抗ＴＮＦ−アルファ分子は、免疫細胞への細胞傷害効果を促進するか、または良好なエフェクター免疫反応に先立つクローン性増殖下にある増殖機構を阻害するので、正常免疫防御機構に影響する。
【００１１】
細胞外空間分泌ＴＮＦ−アルファ（細胞質膜挿入または分泌可溶性形態）の重要性に鑑みて、細胞外ＴＮＦ−アルファと、ＴＮＦ受容体Ｉおよび／またはＴＮＦ−受容体ＩＩの両方との相互作用をブロックする治療剤を設計するために、多くの努力がなされた。ほとんどの関連する手法は、ＴＮＦ−アルファを捕獲し、そして長期間の解離により、細胞受容体との炎症誘発性リガンド相互作用を防止する、可溶性デコイＴＮＦ−受容体の使用であった。
【００１２】
第二の戦略は、同様に一定の疾病に関連する他の分子（リウマチ様関節炎における抗ＶＥＧＦ／抗ＴＮＦ−アルファ）を標的とする、ヒト化抗ヒトＴＮＦ−アルファ抗体（通常のものまたはビス特異的単一鎖分子として生成されたもの）を産生することであった。上記した分子はＴＮＦ−アルファ拮抗薬であるが、それらは、細胞外分泌ＴＮＦ−アルファの阻止に対する作用の機構を制限する。
【００１３】
ＴＮＦ−アルファ産生および分泌させる標的の、網羅的ではあるが完全ではないリストを示せば、以下のとおりである：ａ）ＴＮＦ−アルファの転写発現を促進する分子；ｂ）核から細胞質へのＴＮＦ−アルファ−ＲＮＡ輸送およびＲＮＡスプライシングを促進する分子；ｃ）ＴＮＦ−アルファ翻訳させるようにする分子；ｄ）ＴＮＦ−アルファ−ｍＲＮＡ安定性を調節する分子；ｅ）プロ−ＴＮＦ−アルファ表面形態が固定される膜へゴルジ小胞を向かわせる分子；ｆ）ＴＮＦ−アルファの分泌シェディングに関与するＴＮＦ−アルファ−転化酵素（ＴＡＣＥ）などの分子；およびｇ）プロ−ＴＮＦ−アルファの表面形態の内在化およびそのシグナル伝達を調節する分子。これらの全ては、ＴＮＦ−アルファ産生および分泌の細胞標的を指す。
【００１４】
ＴＮＦ−アルファの産生をブロックする治療剤を設計する種々の手法が存在するが、ＴＮＦ−アルファ産生だけではなく、ＩＦＮ−ガンマである別の主要な炎症誘発性サイトカインの産生を選択的にブロックする新規な薬剤を提案することは非常に望ましいであろう。
【発明の概要】
【００１５】
本発明者等は、驚くべきことに、式（Ｉ）の化合物が、急性および慢性炎症性疾患の病原性機構を制御するのに有効である可能性があり、したがって臨床に用いられる可能性のある、非常に興味深い免疫調節効果を複数示すことを見出した。特に、本発明において用いられる化合物は、リウマチ様関節炎などの慢性炎症性疾患を患う患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＴＮＦ−アルファの産生を阻害する上に、Ｔ細胞刺激後の細胞によるＩＦＮ−ガンマ分泌を阻害することができた。さらに、式（Ｉ）の化合物は、ケモカイン（すなわち、ＩＬ−８）および調節サイトカイン（すなわち、ＩＬ−１０）の分泌の生物反応プロファイルを調節することができ、それを健常と疾病において異なる方法でなすことができた。式（Ｉ）の化合物のこの免疫調節効果全体は、末梢血からの単核細胞に対する毒性効果と関連がなく、そしてさらに、増殖刺激後の活性化および増殖反応はこれらの化合物によって変化しなかった。
【００１６】
唯一の小さな分子における、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマとしてのいくつかの炎症誘発サイトカインに対する阻害効果と、ＩＬ−８ケモカインおよび／またはＩＬ−１０調節サイトカインを変化させる可能性との組み合わせは、それらの全てが全身および器官特異的自己免疫疾患、移植、急性および慢性炎症性疾患、一部の代謝疾患および退行性疾患ならびにアムローム性動脈硬化症の病態生理に重要であることから、式（Ｉ）の化合物を、臨床および治療関連の種々の再プログラム化が可能であるレベルで、炎症誘発／調節サイトカインおよびケモカインのカスケードを標的とする免疫モジュレータの新しい分野に属するものとする。
【００１７】
特に、免疫細胞は固着性であり、そして器官に入って生体組織を巡回し、疾病活動、標的器官および損傷の拡大に応じて、分布している病変部に濃縮して炎症状態に浸潤する。本発明において用いる化合物は、病態生理学的プロセスのある面を変えることが予想されるので、イメージング解析を使用して、受容体数、結合効率、受容体占有および薬剤プローブ濃度を特徴づけることができる。白血球の帰還特性を考えると、治療標的の検出は、同時に標的細胞の位置および病変部位についての情報をもたらたす。
【００１８】
したがって、式（Ｉ）の化合物は、薬剤開発、臨床試験および個別化した医薬において、イメージングバイオマーカーとして使用される可能性もあり、これにより、薬物動態、分配および投薬についてだけでなく、臨床前および臨床試験において個別化反応パターンについての関連データの情報も提供することができる。後者により、臨床評価項目について有効で、信頼性があり、個別化した代理バイオマーカーを定義して、当業者に公知の明確なバイオイメージング技術用に最適化された、効果的な量の式（Ｉ）の化合物またはその医薬組成物の予後および個別化の評価を必要とする患者に投与することができる。
【００１９】
第一の態様によれば、本発明は、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2011524352.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、水素、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または未置換シクロアルキル、置換または未置換アリール、および置換または未置換ヘテロシクリルから選択されるものであり；
Ｒ２は、水素、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または未置換シクロアルキルおよびＮ（Ｒ’Ｒ’’）（式中、Ｒ’およびＲ’’は、独立して、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである）から選択されるものであり；
Ｒ３はＣ１〜Ｃ６アルキルラジカルである］
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／もしくは溶媒和物の、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマから選択される少なくとも１種の炎症誘発性サイトカインの産生を阻害することによるか、あるいはＩＬ−８ケモカインおよび／またはＩＬ−１０調節サイトカインを免疫調節することによる、急性または慢性炎症性疾患の治療用薬剤の調製における使用に関する。
【００２０】
本発明の特定の態様によれば、急性または慢性炎症性疾患は、急性および慢性の血清陽性または血清陰性少関節炎および多発性関節炎、脊椎関節炎、糸球体腎炎、膠原病、尿細管間質性腎炎、メタボリックシンドローム、アムローム性動脈硬化症、変形性関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、多発性硬化症、脱髄疾患、髄膜炎、脳炎、髄膜脳炎、炎症性神経根障害および末梢神経障害、炎症性腸疾患、肝硬変、肝炎、心不全、虚血性疾患、腎不全、炎症性膀胱炎、良性前立腺過形成、前立腺炎、心筋炎、心膜炎、ブドウ膜炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、じんましん、乾せん、酒さ、アレルギー性鼻炎、敗血症、敗血症性ショック、多発器質不全、全身性自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、血管炎、皮膚筋炎、アミロイドシスもしくはサルコイドーシス、器官特異的自己免疫疾患、例えば、重症筋無力症、甲状腺炎もしくはインスリン症、臓器移植、感染および腫瘍誘発炎症、ＴＮＦ−アルファ依存性細胞変性、壊死、アポプトーシス、移植片対宿主病、悪液質ならびにオートクリンおよびパラクリン病的細胞増殖から選択されるものである。
【００２１】
これらの治療指標は、少なくとも異常免疫反応、免疫非調節、免疫性障害、免疫病因、免疫療法、免疫抑制または免疫調節生体反応の結果である。
【００２２】
別の態様によれば、本発明は、式（Ｉ’）の化合物：
【化２】
2011524352.tif 000004
［式中、
Ｒ１は、水素、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または未置換シクロアルキル、置換または未置換アリールおよび置換または未置換ヘテロシクリルから選択されるものであり；
Ｒ３はＣ１〜Ｃ６アルキルラジカルである］
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物に関する。
【００２３】
第三の態様によれば、本発明により、前記で定義されている式（Ｉ’）の化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物ならびに少なくとも１種の薬学的に許容される担体、アジュバントおよび／またはビヒクルを含んでなる医薬組成物が提供される。
【００２４】
本発明の別の態様は、薬剤として使用される、上で定義されている式（Ｉ’）の化合物に関する。
【００２５】
最後に、本発明の別の態様は、上で定義されている式（Ｉ）の化合物の、免疫学的障害、標的細胞および標的分子を見つけるための、イメージング技術および薬理イメージング技術におけるイメージングバイオマーカーとしての使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）の展開用の選択された微粒子の種々の蛍光特徴を示す。
【図２】化合物１２による健常ボランティア（ｎ＝１０）からのＬＰＳ刺激ＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−アルファ産生に対する影響を示す。カラムは、種々の実験条件で各試料においておこなわれた二重培養の中央値および標準誤差を表す。星印は、各実験条件についてのビヒクルに対する対応のデータの統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を表す。
【図３】化合物１２による健常ボランティア（ｎ＝１３）からのＬＰＳ−刺激またはＴＣＲ／ＣＤ３＋ＣＤ２８刺激ＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−アルファ産生に対する影響を示す。カラムは、種々の実験条件で試料においておこなわれた二重培養の平均値および標準誤差を表す。星印は、種々の実験条件の各々についてのビヒクルに対する対応のデータの統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を表す。
【図４】化合物１２によるリウマチ様関節炎を患っている患者（ｎ＝７）からのＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−アルファ産生に対する影響を示す。カラムは、種々の実験条件で各試料においておこなわれた二重培養の平均値および標準誤差を表す。星印は、各異なる実験条件についてのビヒクルに対する対応のデータの統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を表す。
【図５】化合物１２による健常ボランティア（ｎ＝１３）からのＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−ガンマ産生に対する影響を示す。カラムは、種々の実験条件で各試料においておこなわれた二重培養の平均値および標準誤差を表す。星印は、示された実験条件についてのビヒクルに対する対応のデータの統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を表す。
【図６】化合物１２によるリウマチ様関節炎を患っている患者（ｎ＝８）からのＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−ガンマ産生に対する影響を示す。カラムは、種々の実験条件で各試料においておこなわれた二重培養の平均値および標準誤差を表す。星印は、種々の実験条件の各々についてのビヒクルに対する対応のデータの統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を表す。
【図７】化合物１２による健常ボランティア（ｎ＝１３）からのＰＢＭＣにおけるＩＬ−８産生に対する影響を示す。カラムは、種々の実験条件下での各試料においておこなわれた二重培養の平均値および標準誤差を表す。星印は、各実験条件についてのビヒクルに対する対応のデータの統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を表す。
【図８】化合物１２によるリウマチ様関節炎を患っている患者（ｎ＝８）からのＰＢＭＣにおけるＩＬ−８産生に対する影響を示す。カラムは、種々の実験条件で各試料においておこなわれた二重培養の平均値および標準誤差を表す。星印は、各実験条件についてのビヒクルに対する対応のデータの統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を表す。
【図９】化合物１２による健常ボランティア（ｎ＝１３）からのＰＢＭＣにおけるＩＬ−１０産生に対する影響を示す。カラムは、種々の実験条件下での各試料においておこなわれた二重培養の平均値および標準誤差を表す。統計的差はみられなかった。
【図１０】化合物１２によるリウマチ様関節炎を患っている患者（ｎ＝８）からのＰＢＭＣにおけるＩＬ−１０産生に対する影響を示す。カラムは、種々の実験条件で各試料においておこなわれた二重培養の平均値および標準誤差を表す。星印は、ビヒクルに対する対応の統計的に有意な差（ｐ＜０．０５）を表す。
【図１１】ＰＨＡ、ＰＨＡ＋ＩＬ−２またはモノクローナル抗体抗ＣＤ３（Ｔ３）と抗ＣＤ２８との組み合わせによる刺激の存在下または不存在下での健常ボランティア（ｎ＝８）からのＰＢＭＣの増殖反応に対する、化合物１２（ａ）およびビヒクル（ｂ）の影響を示す。
【図１２】健常ボランティアからのＰＢＭＣのリンパ球（ａ）および単球（ｂ）におけるＣＤ６２Ｌのシェディングに対する化合物１２の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明に関連して使用する用語の意味を以下で詳細に説明する。
【００２８】
用語「Ｃ１〜Ｃ６アルキル」は、炭素原子および水素原子からなり、未飽和を含まず、そして単結合により分子の他の部分に結合した直鎖または分岐鎖炭化水素鎖ラジカルを指し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチルなどが挙げられる。Ｃ１〜Ｃ６アルキルラジカルは、１つ以上の置換基、例えば、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、アミノ、ニトロまたはアルキルチオで置換されていてもよい。
【００２９】
用語「シクロアルキル」は、飽和または部分的に飽和しており、炭素原子と水素原子からのみなる安定な３員環または８員環ラジカルを指し、例えば、シクロヘキシルまたはシクロペンチルが挙げられる。明細書で特に断らない限り、用語「シクロアルキル」は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルラジカル、ハロ、ヒドロキシル、−Ｎ（Ｒ３）（Ｒ４）（式中、Ｒ３およびＲ４は独立して水素および直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルラジカルからなる群から選択される）からなる群から独立的に選択される少なくとも１つの置換基により置換されていてもよいシクロアルキルラジカルを含むことを意味する。
【００３０】
用語「アリール」は、炭素原子と水素原子のみからなる安定な５〜８員芳香族環ラジカルを指し、例えば、フェニルまたはシクロオクタテトラエンなどが挙げられる。明細書で特に断らない限り、用語「アリール」は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルラジカル、ハロ、ヒドロキシル、−Ｎ（Ｒ３）（Ｒ４）（式中、Ｒ３およびＲ４は独立して水素および直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルラジカルからなる群から選択される）からなる群から独立的に選択される少なくとも１つの置換基により置換されていてもよいアリールラジカルを含むことを意味する。
【００３１】
「ヘテロシクリル」は、炭素原子と、窒素、酸素およびイオウからなる群から選択される１〜５個のヘテロ原子とからなる安定な３〜８員環ラジカルを指す。本発明の目的のために、複素環は、部分的または完全に飽和または芳香族であることができる。このような複素環は、例えば、ピロリジン、ピリジン、チオフェン、フランなどがあるが、これらには限定されない。明細書で特に断らない限り、用語「ヘテロシクリル」は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキルラジカル、ハロ、ヒドロキシル、−Ｎ（Ｒ３）（Ｒ４）（式中、Ｒ３およびＲ４は独立して水素および直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ６アルキルラジカルからなる群から選択される）からなる群から独立的に選択される少なくとも１個の置換基により置換されていてもよいヘテロシクリルラジカルを含むことを意味する。
【００３２】
用語「ハロ」は、ブロモ、クロロ、ヨードまたはフルオロを指す。
【００３３】
用語「急性および慢性血清陽性または血清陰性少関節炎および多発性関節炎」は、リウマチ性関節炎ならびに一次および二次シェーグレン症候群を含む陽性または陰性リウマチ因子を有する１〜数個の可動関節を含む滑膜炎をともなう疾患を指す。
【００３４】
用語「脊椎関節症」は、仙腸関節および／または脊髄関節および／または末梢関節を含む、免疫病原的ＨＬＡ−Ｂ２７関連炎症性疾患を指し、ブドウ膜炎も含む。
【００３５】
用語「糸球体腎炎」は、腎糸球体の炎症性障害を指す。
【００３６】
用語「尿細管間質性腎炎」は、細管および腎間質を含む炎症性疾患を指す。
【００３７】
用語「膠原病」は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、皮膚筋炎および強皮症を含む病原性免疫機構をともなう全身炎症性疾患を指す。
【００３８】
用語「炎症性腸疾患」は、全身性であるか、あるいは全身性でない病原性免疫機構有する消化管の炎症性疾患を指し、クローン病および潰瘍性大腸炎などが挙げられる。
【００３９】
用語「閉塞性肺疾患」は、フロー呼気ポリューム（ＦＥＶ）の可逆性または不可逆性減少をともなう気管支疾患を指し、喘息および慢性閉塞性肺疾患などが挙げられる。
【００４０】
用語「間質性肺疾患」は、肺間質を含む炎症性疾患を指す。
【００４１】
用語「脱髄疾患」は、ミエリン溶解を引き起こす免疫病原性機構をともなう中枢神経系の炎症疾患を指し、多発性硬化症および眼性神経炎などが挙げられる。
【００４２】
用語「髄膜炎、脳炎および髄膜脳炎」は、中枢神経系の髄膜および／または他の構造体の炎症性疾患を指す。
【００４３】
用語「炎症性神経根障害および末梢神経障害」は、末梢神経系の炎症性疾患を指す。
【００４４】
用語「炎症性膀胱炎」は、膀胱の炎症性疾患を指す。
【００４５】
用語「良性前立腺過形成」は、前立腺の良性肥大および／または肥厚化を指す。
【００４６】
用語「アトピー性皮膚炎、湿疹およびじんましん」は、ＩｇＥが関与するかあるいは関与しない免疫病原性機構を有するアレルギー性皮膚疾患を指す。
【００４７】
用語「乾せん」は、免疫系病原性機構の過剰角化および紅斑性皮膚反応を指す。
【００４８】
用語「酒さ」は、顔中央部上および頬、鼻または額の全域での紅斑（紅潮および赤み）により特徴付けられる、皮膚の一般的な炎症状態を指し、一般的ではないが頸部と胸部に影響することもある。
【００４９】
用語「アレルギー性鼻炎」は、免疫過敏病原性機構の断続性（季節性とも称されることもある）または持続性（通年性とも称される）炎症性鼻粘膜疾患を指す。
【００５０】
用語「敗血症、敗血症性ショックおよび多発器質不全」は、微生物因子および他の病因的因子に対する異常免疫反応により介在される全身炎症性疾患を指す。
【００５１】
用語「サルコイドーシスおよびアミロイドシス」は、異常免疫反応が観察されることがある、器官および／または全身関与およびよく定義されていない病因の特発性免疫疾患を指す。
【００５２】
用語「器官特異的自己免疫疾患」は、病因が明確でない器官の免疫系介在障害を指し、重症筋無力症、甲状腺炎、下垂体炎、副腎炎などが挙げられる。
【００５３】
用語「臓器移植」は、移植細胞、組織および器官の拒絶の予防および治療を指す。
【００５４】
「感染および腫瘍誘発炎症」は、微生物因子または癌刺激にともなう異常免疫反応を指す。
【００５５】
用語「ＴＮＦ−アルファ依存性細胞変性、アポトーシスまたは壊死」は、ＴＮＦ−アルファにより誘発される組織変性または死を指す。
【００５６】
用語「移植片対宿主病」は、移植細胞により誘発される炎症性免疫反応を指す。
【００５７】
用語「悪液質」は、炎症性または腫瘍性疾患により誘発される全身食欲不振または栄養不良ならびに体重減少を指す。
【００５８】
用語「アムローム性動脈硬化症」は、炎症細胞（ほとんどがマクロファージ細胞）および細胞破片（脂質含有）から構成されている動脈壁におけるアテロームまたは蓄積にともなう動脈の硬化を指す。
【００５９】
用語「虚血性疾患」は、心臓および脳血管虚血を含む減少した組織酸素化および／または血液流にともなう器官の障害を指す。
【００６０】
用語「オートクリンおよびパラクリン病的細胞増殖」は、サイトカイン調節活性化および細胞の増殖因子としてのＴＮＦ−アルファの細胞使用による悪性または良性疾患を指す。
【００６１】
特に断らない限り、本発明において用いられる化合物は、１つ以上の同位体濃縮された原子が存在することだけが異なる化合物を含むことを意図している。例えば、水素がデューテリウムまたはトリチウムで置換されているか、または炭素が１３Ｃまたは１４Ｃ濃縮炭素または１５Ｎ濃縮窒素で置換されていることを除いて、本発明の構造を有する化合物は、本発明の範囲内のものである。
【００６２】
用語「薬学的に許容される塩、溶媒和物またはそれらのプロドラッグ」は、レシピエントに投与したときに、本明細書に記載した化合物を直接的または間接的に提供できる塩、溶媒和物またはプロドラッグに関する。しかしながら、薬学的に許容されない塩も、薬学的に許容される塩の調製に有用であることがあることから、本発明の範囲内である。塩、プロドラッグおよび誘導体は、当該技術分野において公知の方法により調製できる。「薬学的に許容される」は、好ましくはヒトまたは動物に投与したときに、生理学的に許容され、典型的にはアレルギー反応または類似の好ましくない反応、例えば、胃疾患、めまいなど生じない分子成分および組成物にかかわる。用語「薬学的に許容される」は、連邦または州政府の監督官庁により承認されること、または動物およびより具体的にはヒトに使用するための米国薬局方または別の一般的に認識されている薬局方に含まれることを意味する。
【００６３】
例えば、本明細書で上記した化合物の薬学的に許容される塩は、通常の科学的方法により、塩基性単位または酸性単位を含有する上記した化合物から合成される。このような塩は、一般的に、例えば、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物を、化学量論量の好適な塩基または酸と、水中または有機溶媒中または水と有機溶媒との混合物中で反応させることにより調製する。非水性媒体、例えば、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルが、一般的に好ましい。酸付加塩として、例えば、鉱酸付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩が挙げられ、そして有機酸付加塩、例えば、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、りんご酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸塩が挙げられる。アルカリ性付加塩として、例えば、無機塩、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、マグネシウム、アルミニウムおよびリチウム、ならびに有機アルカリ塩、例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジアルキレンエタノールアミン、グルカミンおよび塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。
【００６４】
用語「プロドラッグ」は、本明細書にあっては、（医薬用途のために）物理化学的性質、例えば、溶解度またはバイオアベイラビリティを変化させるために、化学的誘導、例えば、被験者に投与後活性化合物自体を生じる活性化合物由来のエステルまたはエーテルなどの追加の化学基の置換または付加などの化学的誘導に附した化学的化合物として定義される。一定の活性化合物からプロドラッグを製造するための周知の方法の例は、当業者に知られており、例えば、Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ等、薬剤設計および発見テキスト（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ（Ａｐｒｉｌ  ２００２）に記載されている。本発明によれば、用語「溶媒和物」は、別の分子（ほとんどの場合、極性溶媒）を非共有結合を介して結合して有しているいずれかの形態の本発明の化合物を意味すると理解される。溶媒和物としては、例えば、水和物およびアルコール和物、例えば、メタノール和物などが挙げられる。
【００６５】
特に好ましいプロドラッグは、患者に投与（例えば、経口投与化合物はより迅速に血液に吸収できる）したときに本発明の化合物のバイオアベイラビリティを増加させるもの、または、生物学的区画（例えば、脳またはリンパ系）への初期化合物の分布を初期種に対して増加するものである。
【００６６】
本発明で使用される化合物は、結晶形態、すなわち、遊離化合物または溶媒和物（例えば、水和物）などの多形体であってもよく、そして両方の形態が本発明の範囲内であることが理解される。溶媒化方法は、一般的に当該技術分野において公知である。好適な溶媒和物は、薬学的に許容される溶媒和物である。特定の実施態様によれば、溶媒和物は、水和物である。
【００６７】
塩、溶媒和物およびプロドラッグは、当該技術分野において公知の方法により調製できる。薬学的に許容されない塩、溶媒和物またはプロドラッグも、薬学的に許容される塩、溶媒和物またはプロドラッグの調製に有用であることがあるので本発明の範囲内であることは分かるであろう。
【００６８】
式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩もしくは溶媒和物は、好ましくは薬学的に許容される形態または実質的に純粋な形態である。薬学的に許容される形態は、とりわけ希釈剤および賦形剤などの通常の医薬添加剤を除き、そして通常の投与量レベルで毒性であると考えられるいずれの物質も含むことなく、薬学的に許容される純度レベルを有するものとして理解される。薬剤用の純度レベルは、好ましくは５０％超、より好ましくは７０％超、さらに好ましくは９０％超である。好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物、またはその塩、溶媒和物またはプロドラッグは９５％超である。
【００６９】
上記した式（Ｉ）により示される本発明に使用される化合物は、キラル中心の存在による鏡像異性体または多重結合の存在による異性体（例えば、Ｚ、Ｅ）を含むことができる。個々の異性体、鏡像異性体、ジアステレオ異性体およびそれらの混合物は、本発明の範囲内である。
【００７０】
特定の実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物を薬剤開発、臨床試験および個別化薬剤におけるイメージング技術および薬理イメージング技術またはバイオマーカーとしてそれらの代わりとして使用するために、式（Ｉ）の化合物を、蛍光または発光タグまたはフラグで標識することができ、このとき、当業者に公知の方法によりマーカーを導入することができる。
【００７１】
本発明の特定の実施態様によれば、Ｒ１は置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。好ましくは、Ｒ１はメチルである。
【００７２】
別の特定の実施態様によれば、Ｒ２は水素、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または未置換シクロアルキルである。好ましくは、Ｒ２は置換または未置換シクロアルキルである。より好ましくは、Ｒ２はシクロペンチルである。
【００７３】
さらに別の特定の実施態様によれば、Ｒ３はメチルである。
【００７４】
別のさらに特定の実施態様によれば、本発明で使用される式（Ｉ）の化合物は、以下の化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび/または溶媒和物から選択されるものである：
【化３】
2011524352.tif 000005
【化４】
2011524352.tif 000006
【化５】
2011524352.tif 000007
【００７５】
本発明において用いられる式（Ｉ）の化合物は、利用可能な合成手順により得ることができる。例えば、これらは、以下のスキームにまとめて示す方法により調製できる。
【化６】
2011524352.tif 000008
【００７６】
この方法は、まず化合物酢酸４−Ｒ３−チオフェニルをエステル化して、そのメチルエステル誘導体を得ることを含んでなる。前記反応は、メチル化剤、例えば、ＭｅＩを使用して、塩、例えば、ＮａＨＣＯ３の存在下で、あるいはメチル化剤としてＭｅＯＨを使用して、酸性媒体の存在下で実施できる。
【００７７】
以下の工程において、メチルエステル誘導体（必要に応じて精製することなく）を、酸化剤、例えば、オキソンを用いてイオウ原子で酸化することにより、チオエーテル基からスルホン化合物を得る。
【００７８】
続いてのＮＢＳなどの薬剤によるハロゲン化により、エステル基のα位置でハロゲン化物を形成する。この化合物を種々のチオアミドにより加熱下で付加環化すると、高純度のＲ１−置換５−（４−Ｒ３−スルホニル−フェニル）−チアゾール−４−オールが得られる。
【００７９】
付加環化に使用されるチオアミドは、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ（３４）２１５８−２１６５、１９９１およびＪ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（６５）、１３、３９７３、２０００に記載のＬａｗｅｓｓｏｎ試薬に対応するアミドから得られる。前記チオアミドには、Ｒ１が前記で定義されているような、水素、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または未置換シクロアルキル、置換または未置換アリールおよび置換または未置換ヘテロシクリルから選択されるものである化合物などがある。
【００８０】
ヒドロキシル基を介してＲ２ラジカルを導入することを、当業者に公知のいずれかの方法により実施して、本発明で使用される式（Ｉ）の化合物を得ることができる。特定の実施態様によれば、ヒドロキシル基を、式Ｒ２−Ｈａｌ、好ましくはＲ２−Ｂｒのハロゲン化物と反応させて、式（Ｉ）の化合物を得る。
【００８１】
上述した反応において使用される全ての反応剤は、市販されている。
【００８２】
さらなる態様によれば、本発明により、式（Ｉ’）の化合物：
【化７】
2011524352.tif 000009
［式中、
Ｒ１は、水素、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または未置換シクロアルキル、置換または未置換アリール、および置換または未置換ヘテロシクリルから選択されるものであり；
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルラジカルである］
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物が提供される。
【００８３】
特定の実施態様によれば、Ｒ１は置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。好ましくは、Ｒ１はメチルである。
【００８４】
別の特定の実施態様によれば、Ｒ３はメチルである。
【００８５】
別の特定の実施態様によれば、本発明の式（Ｉ’）の化合物は、以下の化合物：
【化８】
2011524352.tif 000010
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物から選択されるものである。
【００８６】
さらに、本発明によれば、本発明による式（Ｉ’）の新規化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物ならびに少なくとも１種の薬学的に許容される担体、アジュバントおよび／またはビヒクルを含んでなる、患者への投与用医薬組成物が提供される。
【００８７】
特定の実施態様によれば、急性または慢性炎症性疾患の予防および／または治療における投与のために、式（Ｉ）の化合物、それらの薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物は、治療に有効な量で、１種以上の薬学的に許容される担体、アジュバントおよび／またはビヒクルとともに、好適な医薬組成物に製剤化される。
【００８８】
用語「担体、アジュバントおよび／またはビヒクル」は、活性成分とともに投与する分子成分または物質を指す。このような医薬担体、アジュバントまたはビヒクルは、無菌液、例えば、水および油、例えば、石油由来のもの、または動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油など、賦形剤、崩壊剤、湿潤剤または希釈剤であることができる。好適な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」に記載されている。
【００８９】
医薬組成物は、いずれかの投与に好適な方法、例えば、経口投与、非経口投与（例えば、皮下投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与など）、直腸投与などにより投与でき、典型的には治療される疾患が慢性のため経口投与である。
【００９０】
特定の実施態様によれば、前記医薬組成物は、固形状または液状の経口投与医薬形態であることができる。経口投与医薬形態の具体例として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、溶液、懸濁剤などが挙げられ、通常の賦形剤、例えば、バインダー、希釈剤、崩壊剤、滑剤、湿潤剤などを含むことができ、そして通常の方法により調製できる。また、医薬組成物は、例えば、好適な剤形における無菌、凍結乾燥製品、懸濁剤また溶液の形態で、非経口投与用に適用させることもできる。この場合、前記医薬組成物は、好適な賦形剤、例えば、緩衝剤、界面活性剤などを含むであろう。いずれの場合においても、賦形剤は、選択された投与医薬形態に従って選択される。薬剤を投与するための種々の医薬形態が、Ｃ．Ｆａｕｌｉｉ  Ｔｒｉｌｌｏ、Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ”、第１０版、１９９３、Ｌｕｚａｎ  ５、Ｓ．Ａ．  ｄｅ  Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓで検討されている。
【００９１】
治療に適用するための式（Ｉ）の化合物は、好ましくは薬学的に許容されるまた実質的に純粋な医薬形態から選択される。すなわち、式（Ｉ）の化合物は、薬学的に許容される賦形剤を除いて薬学的に許容される純度レベルを有し、そして通常投与量レベルで毒性があると考えられる物質を含まない。式（Ｉ）の化合物についての純度レベルは、好ましくは５０％超、より好ましくは７０％超、より好ましくは９０％超である。好ましい実施態様によれば、９５％超である。
【００９２】
投与される式（Ｉ）の化合物の治療に有効な量は、一般的に、とりわけ治療される個人、前記個人が患っている疾病の重症度、選択される投与方法などの因子により決まるであろう。このため、本発明において述べる投与量は、当業者の指針としてのみ考えなければならず、そしてその指針により、上記した変数により投与量を調整する必要がある。しかしながら、式（Ｉ）の化合物は、１日当たり１回以上、例えば、１日１回、２回、３回または4回で、１日の標準的な総投与量は０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ体重／日であるように投与できる。
【００９３】
式（Ｉ）の化合物、その薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物ならびにそれらを含有する医薬組成物は、急性および慢性炎症性疾患を治療するのに有効である他のさらなる薬剤とともに使用することができる。前記さらなる薬剤は、同じ医薬組成物の一部を構成してもよいし、または式（Ｉ）の化合物またその薬学的に許容される塩、プロドラッグまた溶媒和物を含んでなる医薬組成物とは、別個の組成物の形態で提供して、同時または別個投与することもできる。
【００９４】
本発明の範囲内において、表現「急性および慢性炎症性疾患」は、異常共刺激が発病機構である条件下で、炎症性／免疫細胞および炎症性サイトカインカスケードの活性化および病原性関与から生じる疾病、障害または状態に関する。関与する主要細胞は、治療のために提案された疾病に関与する、炎症性／免疫細胞、例えば、単球、マクロファージ、ＡＰＣ、Ｔ、Ｂおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、形質細胞、顆粒球およびマスト細胞、または上記細胞亜集団の組み合わせである。
【００９５】
用語「サイトカイン」は、特に免疫系細胞または炎症性反応に関与する細胞間の相互作用の調節に関することから、他の細胞の機能に影響する分泌されたタンパク質を指す。前記サイトカインは、ＴＮＦ−アルファ（腫瘍壊死因子−α）、ＩＦＮ−ガンマ（インターフェロン−γ）、ＩＬ−８（インターロイキン−８）ケモカインおよび調節サイトカインＩＬ−１０（インターロイキン−１０）である。ＩＬ−１０産生は高ＴＮＦ−アルファレベルにより誘発され、そしてＴＮＦ−アルファ産生、炎症誘発性サイトカイン転写の阻止による負のフィードバックを促進する。
【００９６】
本発明の特定の態様によれば、急性または慢性炎症性疾患は、急性および慢性の血清陽性または血清陰性少関節炎および多発性関節炎、脊椎関節炎、糸球体腎炎、膠原病、尿細管間質性腎炎、メタボリックシンドローム、アムローム性動脈硬化症、変形性関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、多発性硬化症、脱髄疾患、髄膜炎、脳炎、髄膜脳炎、炎症性神経根障害および末梢神経障害、炎症性腸疾患、肝硬変、肝炎、心不全、虚血性疾患、腎不全、炎症性膀胱炎、良性前立腺過形成、前立腺炎、心筋炎、心膜炎、ブドウ膜炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、じんましん、乾せん、酒さ、アレルギー性鼻炎、敗血症、敗血症性ショック、多発器質不全、全身性自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、血管炎、皮膚筋炎、アミロイドシスもしくはサルコイドーシス、器官特異的自己免疫疾患、例えば、重症筋無力症、甲状腺炎もしくはインスリン症、臓器移植、感染および腫瘍誘発炎症、ＴＮＦ−アルファ依存性細胞変性、壊死、アポプトーシス、移植片対宿主病、悪液質ならびにオートクリンおよびパラクリン病的細胞増殖から選択されるものである。
【００９７】
好ましい実施態様によれば、急性または慢性炎症性疾患は、血清陽性または血清陰性慢性多発性関節炎、より好ましくはリウマチ様関節炎である。
【００９８】
本発明の別の態様は、急性または慢性炎症性疾患を治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、治療に有効な量の上で定義されている式（Ｉ）の化合物またはその医薬組成物を投与することを含んでなる方法である。
【００９９】
本明細書における用語「治療」または「治療する」は、疾病または前記疾病に関連した１つ以上の症状を予防、軽減または除去するための本発明による処方の化合物を投与することを意味する。また、「治療」は、疾病の生理学的続発症を予防、軽減または除去することを含む。
【０１００】
本発明に関連する用語「軽減する」は、治療した患者の状況が、主観的（患者のまたは患者についての感じ）と客観的（測定されたパラメータ）の両方でのなんからの改善を意味すると理解される。
【０１０１】
本発明の別の態様は、上で定義された式（Ｉ）の化合物の、免疫学的障害、標的細胞および標的分子を見つけるための、イメージング技術および薬理イメージング技術におけるイメージングバイオマーカーとしての使用に関する。
【０１０２】
薬理イメージング技術は、急速に成長している適切な臨床前（分子、細胞、器官および動物全体トラッキング、および概念および機構、効力、評価等の証明の検討）および臨床（ヒト医療）生体内イメージング技術の組み合わせにより得られるバイオマーカーの範囲を、本明細書で記載され、薬剤として使用される化合物により得られる貴重な情報データに広げる。
【０１０３】
本発明を、さらに以下で実施例により説明する。実施例での説明は、特許請求の範囲で定義されている発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０４】
合成
実施例１：（４−メチルチオフェニル）−酢酸メチルエステルの合成
【化９】
2011524352.tif 000011
【０１０５】
４−メチルチオフェニル酢酸１．８２ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ３０ｍＬに溶解した。次に、ＮａＨＣＯ３１．３４ｇ（１６ｍｍｏｌ）を添加する。攪拌混合物を、約１５分間攪拌する。次に、室温で２４時間攪拌しながら、ＩＣＨ３  １．９ｍＬを添加する。この時間が経過したら、混合物を水／氷に注ぐ。沈殿が生じなくなったら、エーテルを添加し、そして抽出する。有機相を、水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、有機相をロータリーエパポレーターで濃縮して、無色油状物を１．９２ｇ（９．７ｍｍｏｌ，収率９７％）得る。この生成物の分光分析データから、予測された構造が確認される。この生成物は、ＴＬＣ（ジクロロメタン／メタノール＝９／１で溶離）で単一の染色が得られるので、精製せずに、合成プロセスの次のステップで使用される。
【０１０６】
ＲＭＮ１Ｈ（ＣＤＣｌ３）：７．２（ｓ，４Ｈ）３．７（ｓ，３Ｈ）３．５（ｓ，２Ｈ）２．４（ｓ，３Ｈ  Ｈ３Ｓ）
ＲＭＮ１３Ｃ（ＣＤＣｌ３）：１７１．５，１３６．９  １３０．４  １２９．４  １２６．４  ５１．６  ４０．２  １５．５
【０１０７】
実施例２：（４−メチルスルホニル−フェニル）−酢酸メチルエステルの合成
【化１０】
2011524352.tif 000012
【０１０８】
オキソン３０．７ｇ（５０ｍｍｏｌ）を水８０ｍＬに添加して調製した溶液を、メタノール１００ｍＬに実施例１で得られた化合物３．４ｇ（１７．３ｍｍｏｌ）を添加して調製した溶液に、水／氷浴で反応させながら、少しずつ添加した。添加後、攪拌を５時間継続して、温度を室温とする。溶媒の一部分を減圧濃縮し、沈殿した固体を濾過し、水で繰り返し洗浄する。乾燥後、この固体を３ｇ秤量する。濾液水をジクロロメタンで抽出する。有機相を水洗し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ロータリーエパポレーターで濃縮し、予想したよりもさらに１ｇ多く得る（収量４ｇ（１７ｍｍｏｌ、収率１００％））。この固体を、５７℃で分解しながら溶解する。その純度は、ＨＰＬＣで分析すると９９％である。分光分析データから、予測した構造であることが確認される。
【０１０９】
ＲＭＮ１Ｈ（ＣＤＣｌ３）：７．９（ｄ，２Ｈ），７．５（ｄ，２Ｈ），３．７（ｓ，ｓ３＋２Ｈ），３．１（ｓ，３Ｈ）
ＲＭＮ１３Ｃ（ＣＤＣｌ３）：１７０．８０  １４０．１３  １３９  １３０．３３  １２７．６３  ５２．３１  ４４．４９  ４０．８２
【０１１０】
実施例３：ブロモ−（４−メチルスルホニル−フェニル）−酢酸メチルエステルの合成
【化１１】
2011524352.tif 000013
【０１１１】
前記エステル２０ｇ（８７．６２ｍｍｏｌ）を、四塩化炭素３００ｍＬに溶解した。Ｎ−ブロモスクシンイミド１９ｇ（１０５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル２ｇ（１２．１８ｍｍｏｌ）および臭素０．１ｍＬを、分割して添加した。反応混合物を８０℃で３時間加熱した後、冷却し、濾過し、ジクロロメタンで洗浄した。濾液を水洗した後、塩水で洗浄した。溶液を、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮して油状物２８ｇを得た。それを、溶離剤としてヘプタン／酢酸エチル（１／１）を用いてフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。より純粋な画分を濃縮して、ブロモ誘導体化合物１９．６３ｇ（収率：７２．９４％）を得た。
【０１１２】
融点：８１．８〜８３．３℃
ＮＭＲ１Ｈ（ＣＤＣｌ３）：δ：７．９（ｄ，２Ｈ），７．７５（ｄ，２Ｈ），５．４（ｓ，１Ｈ），３．８（ｓ，３Ｈ），３，１（ｓ，３Ｈ）
ＮＭＲ１３Ｃ（ＣＤＣｌ３），δ：１６８．０（Ｃ）；１４１．６（Ｃ）；１４１．１（Ｃ）；１２９．８（ＣＨ）；１２７．８（ＣＨ）；５３．７（ＣＨ）；４４．７（ＣＨ３）および４４．２（ＣＨ３）ｐｐｍ
【０１１３】
実施例４：２−メチル−５−（４−メチルスルホニル−フェニル）−チアゾール−４−オールの合成
【化１２】
2011524352.tif 000014
【０１１４】
実施例３で得られたエステル１６．７ｇ（５４．３ｍｍｏｌ）をトルエン４００ｍＬに溶解し、その後ピリジン１９ｍＬおよびチオアミド４．０８ｇ（５４．３４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、攪拌しながら８０℃（浴温）で２時間加熱した。次に、混合物を放冷し、沈殿固体を濾取し、水洗（２ｘ５０ｍＬ）した後、エーテル（２ｘ３０ｍＬ）で洗浄した。生成物を真空乾燥して、融点２１６〜２２６℃のクリーム状固体７ｇ（２６ｍｍｏｌ、収率４７．８６％）を得た。
【０１１５】
分光分析データから、生成物が、予想した生成物の構造であることが確認される。
【０１１６】
ＲＭＮ１Ｈ（ｄ６ＤＭＳＯ）δ：１１．８（ｓ，１Ｈ）  ７．８（ｍ，４Ｈ）  ３．１（ｓ，３Ｈ）  ２．６（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ
ＲＭＮ１３Ｃ（ｄ６ＤＭＳＯ）：１６２．９（Ｃ）；１５９．４（Ｃ）；１４６．２（Ｃ）；１４３．０（Ｃ）；１２８．０（ＣＨ）；１２６．１（ＣＨ）；１０４．４（Ｃ）；４４．２（ＣＨ３）；１９．９（ＣＨ３）ｐｐｍ
【０１１７】
実施例５：４−シクロペンチルオキシ−５−（４−メチルスルホニル−フェニル）−２−メチル−チアゾールの合成
【化１３】
2011524352.tif 000015
【０１１８】
実施例４で得られたヒドロキシチアゾール７．０ｇ（２６ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム８．８ｇ（６３．６７ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ２００ｍＬに溶解した。臭化シクロペンチル１４ｍＬ（１３０ｍｍｏｌ）を滴下し、反応混合物を８０℃で３時間加熱した後、冷却し、氷／水混合物に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機相を、水洗（３ｘ１００ｍＬ）し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して、粗製物質１２ｇを得た。これを、ヘプタン／エーテル（１／１）で結晶化した。生成物をヘプタン／酢酸エチル（２／１）を溶離剤として使用してフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、化合物１２を６．７ｇ（１９．８５ｍｍｏｌ、収率７６．３９％）得た。
【０１１９】
融点：１２４．６〜１２５．２℃
ＮＭＲ１Ｈ（ＣＤＣｌ３），δ：７．９（ｄｄ，４Ｈ），５．４（ｍ，１Ｈ），３．０（ｓ，３Ｈ），２．６（ｓ，３Ｈ），１．７〜２．０（ｍ，８Ｈ）ｐｐｍ
ＮＭＲ１３Ｃ（ＣＤＣｌ３），δ：１６２．６（Ｃ）；１５９．５（Ｃ）；１３８．３（Ｃ）；１３７．１（Ｃ）；１２８．１（ＣＨ）；１２６．８（ＣＨ）；１０９．１（Ｃ）；８３．７（ＣＨ）；４５．０（ＣＨ３）；３３．５（ＣＨ２）；２４．１（ＣＨ２）；２０．４（ＣＨ３）ｐｐｍ
【０１２０】
生物学的分析
材料および方法
１  対象
【０１２１】
この研究は、健常ボランティアおよびリウマチ様関節炎を患っている患者からの静脈穿刺により得られたヘパリン化末梢血について実施した。
【０１２２】
健常ボランティアは、医療活動内の日常管理を受けている献血者であった。
【０１２３】
この研究に含まれるリウマチ様関節炎を患っている患者は、米国リウマチ学会の診断基準に準拠した患者であり、対象患者が１週間当たり２０ｍｇのＭｅｔｈｒｏｔｅｘａｔｅを少なくとも６カ月間経口投与して処置するまでは、臨床的に活動性疾患を示した。疾患活動度は、以下のように定義された：ａ）ＤＡＳ２８＞３，２および／またはｂ）６以上の腫脹関節および６以上の痛みを伴う関節。以下の除外基準が採用された：ａ）試験対象診断で活性感染疾患が判明したこと；ｂ）試験対象前に腫瘍疾患を患っていたこと；３）試験対象診断の少なくとも１年前に完全寛解しなかった別の全身性または器官特異的自己免疫疾患を患っていたこと；ｄ）主要疾患としてリウマチ様関節炎により誘発されたレベルでの変化と関連しない重度の腎臓疾患、心臓疾患または肝臓疾患を患っていること；ｅ）主要疾患に関連しない疾患による全身状態の重度の悪化を患っていること；ｆ）Ｍｅｔｈｒｏｔｅｘａｔｅの指示投与量を除いて、試験対象診断前の年の間に免疫系について既知の活性を有するコルチコステロイド剤、免疫抑制剤、細胞増殖抑制剤または他の薬剤での治療を受けたこと；７）試験対象診断で妊娠または産褥期であることが判明したこと。
【０１２４】
この研究は、スペインのマドリッドにあるＡｌｃａｌa大学の調査委員会（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌｃａｌa  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により承認された。
【０１２５】
２  器具
−組織培養プレート、９６ウエル平底（低蒸発蓋付）、３５３０７３  Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ社、米国ニュージャージー州Ｆｒａｎｌｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ  ０７４１７−１８８６
−非殺菌プレート、９６ウエルＶ底（Ｇｒｅｉｎｅｒ社、スペイン  マドリッドＳｏｒｉａ  Ｇｒｅｉｎｅｒ）
−使い捨てパスツールピペット（ブランド社、ドイツ）
−容量調節式ピペット  ピペットマンＰ  ２０、２００、１０００および５０００μｌ用  （Ｇｉｌｓｏｎ社、フランス）
−エッペンドルフ型マルチピペット４７８０（ドイツ、ハンブルク）
−無菌エッペンドルフ型チップ（ドイツ、ハンブルク）
−未使用プロピレン無菌チップ（Ｄａｓｌａｂ社、スペイン  マドリッド）
−５ｍｌおよび１０ｍｌ無菌プラスチック管（Ｄａｓｌａｂ社、スペイン  マドリッド）
−１５ｍｌおよび５０ｍｌ遠心分離管（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社、米国Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）
−５ｍｌ血球計算器ポリスチレン管（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社、米国Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）
−１０ｍｌヘパリンによる血液抽出管（Ｖｅｎｏｊｅｔ、テルモヨーロッパ、ベルギー）
−１０ｍｌ血漿抽出管（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ、英国、プリマス）
−ピペットフィルター、Ｐｉｐｅｔｂｏｙ  ｐｌｕｓ（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂ社、ドイツ）
−２２μｍ無菌フィルターＭｉｌｌｅｘ−ＧＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、フランス  Ｍｏｌｓｈｅｉｎ）
−クリスタルスライドカバー（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎ、ドイツ）
−血球計算盤Ｎｅｕｂａｕｅｒ（Ｓａａｒｉｎｇｉａ、ドイツ）
−縦型積層フラックスチャンバーＨｅｒａｓａｆｅＨＳ１２（Ｈｅｒａｅｕｓ、ドイツ）
−ＣＯ２調節付細胞培養ストーブＨｅｒａｃｅｌｌ１５０（Ｈｅｒａｅｕｓ、ドイツ）
−Ｂｅｃｋｍａｎ冷凍遠心器。Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ３ＳＲ（Ｈｅｒａｅｕｓ、ドイツ）
−―７０℃フリーザー（Ｓｅｌｅｃｔａ社、スペイン  Ｔａｒｒａｓａ）
−顕微鏡ＯｌｙｍｐｕｓＣＨＳ−２（オリンパス社、日本国東京）
−ソフトウエアおよびアナライザーＢＤ  Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ  Ｐｒｏ  ｖ．  ５．５．１を備えたフローサイトメーターＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、米国Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）
−ＢＤ  ＦＡＣＳ  アレイ  バイオアナライザー
−酵素−免疫分析リーダー（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Pｌｕｓ、Ｆｌｏｗ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
−ベックマン放射能ベータカウンター
【０１２６】
３  細胞サブセットの分離および同定に使用された試薬
−単純塩化物食塩水（ＳＳＦ）Ａｐｉｒｏｓｅｒｕｍ（Ｉｂｙｓ社、スペイン  マドリッド）
−Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ、Ｎｙｅｇａａｒｄ社、ノルウエー、オスロ）
−Ｂｌｕｅ  Ｔｒｙｐａｎ（Ｆｌｕｃｋｅ社、ドイツ  Ｂｕｃｈｓ  ＳＧ）
−ＰＢＳ  ＦＡＣＳ  ＦＬＯＷ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）
−ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｒｅａｃｔｉｖｏｓ  ｄｅ  Ｓｉｇｍａ  ｙ  Ｐａｎｒｅａｃ）
−メチル−３Ｈチミジン（３［Ｈ］−Ｔ）。比活性６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＩＴＩＳＡ、スペイン  マドリッド）
【０１２７】
−免疫蛍光およびフラックスサイトメトリーの研究に使用されたモノクローナル抗体：表１
【表１】
2011524352.tif 000016
【０１２８】
４  細胞培養で使用された試薬
−１％Ｌ−グルタミン２００  ｍＭ  ｙ  ２５ｍＭＨｅｐｅｓ（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂ社、米国カリフォルニア州Ｉｒｖｉｎｅ）添加ＲＰＭＩ−１６４０（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｂ４８００  Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、ベルギー）製完全培地
−ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ社、米国ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ）
−培養培地：完全培地は、１０％ＦＣＳを添加することにより使用した。４５分間５７℃に加熱することにより全ての血清から補体を除去した。
−フィトヘマグルチニンＭ（ＰＨＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ｒｅｆ  ＃Ｌ−８９０２，  Ｌｏｔ＃１１５Ｋ４１３２、Ｓｉｇｍａ社、スペイン  マドリッド）
−ＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４株、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅ社、米国Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ９２１２１）
−抗生物質混合物。ソジウムアンピシリン１０ｍｇ／ｍｌ（Ｂｒｉｔａｐｅｎ，  ＢｅｅｃｈａｍＡ、スペイン国トレド）、ゲンタマイシンスルフェート１．６ｍｇ／ｍｌ（Ｔａｍａｄｉｔ  Ｌａｂ．、Ｄｒ．ＥｓｔｅｖｅＳＡ．、スペイン、マドリッド）およびアンフォテリシンＢ０．５μｇ／ｍｌ（Ｆｕｎｇｉｚｏｎａ、Ｓｑｕｉｂｂ、Ｅｓｐｌｕｇｕｅｓ、スペイン  バルセロナ）の混合物を、培養培地に添加した。
−抗ＣＤ３モノクローナル抗体（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３、Ｒａｒｉｔａｎ、Ｏｒｔｈｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社、米国ニュージャージー州）
−抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎ１５Ｅ８、Ｍｅｎａｒｉｎｉ、スペイン  マドリッド）
【０１２９】
５  生体試料の取得
ａ）静脈血：単核細胞を、肘前静脈穿刺により採集した静脈血から得た。血液５０ｍｌを抽出し、リチウムヘパリン管（Ｖｅｎｏｊｅｔ）に保存し、食塩水でさらに希釈１／１（容積／容積）した。これらの操作の全ては、無菌条件下で実施した。
ｂ）ヒト細胞サブセットの採集。ＰＢＭＣを単離するために、残存血液成分を、フィコールによる密度勾配により分離した。この方法は、血液細胞の密度差に基づくものである。希釈およびヘパリン化血液を入れた５０ｍｌ遠心管に、フィコール−Ｈｉｐａｑｕｅ（密度：１．０７７ｇ／ｍｌ）１５ｍｌを注意深く配置した。４５分の遠心分離（４００ｘｇ）後、３層が得られ（赤血球、フィコールおよび血漿）、２界面により分離した：ＰＢＭＣを、希釈血漿とフィコールとの間に位置しているところに入れる。これはパスツールピペットで吸い込むことにより採取できる。このようにして得られた細胞を、ＳＳＦに再懸濁し、そして遠心分離する（３００ｘｇ、１０分間）；上清を捨て（洗い出しプロセス）、細胞ペレットを、１０％ＰＢＳで、ＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁する。
【０１３０】
６  カウントおよび生存率の検討
全ての細胞懸濁液において、細胞濃度および生存率を、Ｂｌｕｅ  Ｔｒｙｐａｎの０．１％希釈およびＮｅｕｂａｕｅｒチャンバー顕微鏡カウントにより求めた。生存細胞百分率を、染色排除能により明らかとした。細胞生存率が９５％を超えたときのみ、実験を継続した。
【０１３１】
７  ＥＬＩＳＡによる血清サイトカインの定量化
血清サイトカイン濃度を定量化するために、採取した血液（肘前穿刺および動脈カテーテルにより採取）を、抗凝固剤添加と無添加の両方で管に保存した。血液を、実験室において室温で凝固させ、さらに血清を遠心分離により分離（６００ｘｇで２０分間）した。上清を集め、濾過し、アリコットに分割し、−７０℃で保存した。種々のサイトカインについての濃度アッセイを、表２に記載の市販のキットを用いることにより実施した。
【０１３２】
【表２】
2011524352.tif 000017
【０１３３】
上清を解凍して室温とし、それらをプレート底に固定し、種々の時間でインキュベーションすることにより、それぞれの抗サイトカインと対向させた。続いて、洗浄をおこない、対応の会社により推薦されている物質を添加して、上清に存在するサイトカインの量に比例した比色反応をおこなった。結果を、酵素学的免疫分析リーダーＭｕｌｔｉｔｉｔｅｒ  ｐｌｕｓ（Ｔｉｅｒｔｅｋ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ｐｌｕｓ、Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で評価した。これらの結果を、上記会社により提供された各サイトカインの既知濃度から得られた標準曲線と比較した。
【０１３４】
標準曲線の解析と続いての補間を、アップルのマッキントッシュコンピュータでソフトウエアＤｅｌｔａ  Ｓｏｆｔ  ＩＩ  ｖｅｒｓｉｏｎ４．１（Ｂｉｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ社）でおこなった。サイトカイン濃度をモル濃度に変換して、各場合のモル比および可溶性分子数を計算した。
【０１３５】
８  免疫表現型アッセイ
モノクローナル抗体フィコエリトリン標識（ＰＥ）の一色直接免疫蛍光法を使用した。ＰＥは、５７０ｎｍで放出する４８８ｎｍレーザーで励起できる蛍光物質である。フローサイトメーターにより、検出でき且つ容易に区別できる。表１に記載した抗体を使用することにより、直接標識をおこなった：ＰＢＭＣ標識：このプロセスは、９６ウエルＶ底プレートを使用して標識することからなるものであった。各ウエルにおいて、５ｘ１０４細胞を配置し、その後、４００ｘｇで５分間遠心分離する。洗浄後、細胞を再懸濁し、対応のモノクローナル抗体５μｌを添加する。再び細胞を再懸濁し、プレートを、４℃で２０分間、暗闇でインキュベーションする。続いて、ＰＢＳ１５０μｌを添加し、そして２回洗浄する。最後に、ＰＢＳ１５０μｌに再懸濁し、そして血球計算管に集め、ＰＢＳを最終容積０．３ｍｌまで添加する。
カウントするために、アルゴンレーザーを４８８ｎｍに調整して備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して、フィコエリトリン蛍光を誘発させた。蛍光チャンネルとは別に、装置により、サイズ（ＦＳＣ）および細胞複雑性（ＳＳＣ）についての情報も提供された。
【０１３６】
陰性対照として、標識なしの検討細胞、および検討（ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ、ＰＥ  ｙ  ＴＣ、ＩｇＧ２ａ  ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＴＣ）に使用したもの以外の等しいアイソタイプのモノクローナル抗体で標識した無関係の細胞を、使用した。
【０１３７】
９  細胞培養および機能性の検討
培養の一般的条件：全ての細胞培養を、無菌使い捨て材料を用いるか、または酸化エチレンまたは殺菌装置により殺菌した材料を用いた縦型積層フラックスチャンバー内で、無菌条件下でおこなった。培養を、ストーブ中、ＣＯ２５％および相対湿度９５％下、３７℃で保持した。
【０１３８】
１０  ３［Ｈ］−チミジンによる増殖についての検討
マイトジェン刺激させたリンパ球は、芽球化および細胞分化プロセスを受ける。細胞増殖の定量化に使用された方法は、デノボ合成したＤＮＡへの３［Ｈ］−チミジンの取込みのアッセイであり、そして細胞培養乾燥抽出物（トリチウム化した塩基を添加）からのベータ−放射線の放出を、終了および収穫前に検出した。増殖を検討するのにおこなった種々の実験において、精製した細胞製剤を、９６マイクロウエル平底プレートにおいて、３重反復および４日間の培養で、種々の濃度の種々のマイトジェンの存在下で、５ｘ１０４細胞／ウエル（最終容積：２００μｌ）の濃度でインキュベーションした。
【０１３９】
特異的刺激に対する反応は、検討した密度および細胞型、ならびに培養時間および分裂促進剤濃度に依存した。
【０１４０】
細胞培養を終了する２０〜２４時間前に、１マイクロキューリ３［Ｈ］−チミジンを各ウエルに添加した；培養を、特異的培養ハーベスターを用いて、ガラスフィルターによる吸引により収穫した。
【０１４１】
ＤＮＡ合成を、カウント／分（ｃｐｍ）で表した。各アッセイを、三重でおこない、技術的誤差または培養の汚染である可能性から、三重の結果の平均の１０％より高い変動のデータを廃棄した。培養を、１ウエル当たり一定量の細胞（２００μｌの一定容積）を用いておこなった。全てのマイトジェンおよびサイトカインを、まず用量反応曲線および時間反応をおこなうことにより試験した。
【０１４２】
１１  定量的マルチパラメトリックフローサイトメトリーによる分析決定のためのアッセイ（ＢＤ（商標）サイトメトリビーズアレイ（ＣＢＡ）
ＣＢＡプロトコルは、製造業者の説明書に準じた。微粒子の選択は、図１の概要に準じておこなった。スペクトルの重なりの少ないものを、最終的に選択した。
【０１４３】
この実験開発に使用された各試薬のカタログ番号およびバッチは、表３および４に示す。試料をＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＦＡＣＳＡｒｒａｙ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）から取得し、そして結果の分析はＰＣコンピュータ上でソフトウエアＦＣＡＰ  Ａｒｒａｙ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）でおこなった。
【０１４４】
簡単に述べると、実験プロトコルは、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで予め洗浄したプレートから構成されるものであった。デカンテーション後、取得した微粒子の混合物を、攪拌再懸濁した。標準および試料を、適切に希釈して添加した。１時間、十分に攪拌インキュベーション後、ＰＥ検出試薬を添加し、室温で２時間、再びインキュベーションした。洗浄後、得られたものをフローサイトメトリーに附した。
【０１４５】
【表３】
2011524352.tif 000018
【０１４６】
【表４】
2011524352.tif 000019
【０１４７】
統計分析
実験的試験の結果を、分布の種類に従って、平均値ならびに平均値の標準誤差および予測誤差として示した。
統計分析のために、分布の種類を、まずＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｈｉｌｋの正規性のコントラストを用いることにより分析した。Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙＵの非パラメトリックコントラストを使用して、比較した。全ての場合において、有意レベル５％未満のものを評価した（ｐ＜０．０５）。
【０１４８】
統計分析は、ソフトウエアＳＰＳＳ１１．０（ＳＰＳＳ社（本社）、６０６０６イリノイ州シカゴ、Ｓ．Ｗａｃｋｅｒ  Ｄｒｉｖｅ２３３、１１ｔｈ  ｆｌｏｏｒ）を用いておこなった。
【０１４９】
化合物１２の免疫調節効果についての検討の結果
健常ボランティアおよびリウマチ様関節炎を患っている患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＴＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ガンマおよび他のサイトカインの産生についての化合物１２の免疫調節効果
【０１５０】
実施例６：化合物１２のＴＮＦ−アルファ産生への影響
まず、ＬＰＳの存在下または不存在下での健常ボランティアのＰＢＭＣによるＴＮＦ−アルファ産生に対する化合物１２の影響を調査した。１０人の健常ボランティアからのＰＢＭＣ（５ｘ１０４細胞／ウエル、２００μｌ）を、二重並列で、９６ウエル平底組織培養プレート（低蒸発蓋付）（米国ニュージャージー州０７４１７−１８８６Ｆａｌｃｏｎ３５３０７２、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ社）で、ウシ胎仔血清（米国、Ｇｉｂｃｏ  ｒｅｆ．２６１４０−０７９）添加および溶媒濃度１０−６Ｍ単独または化合物１２  １０−６Ｍまたは１０−７Ｍ添加完全培地（グルタミン含有ＲＰＭＩ−１６４０、Ｃａｔ  ＢＥ−１２−７０Ｆ、ベルギー国Ｂ４８８０  Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）において、ＬＰＳ（１０マイクログラム／ｍｌ；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＰＳ０１１１：Ｂ４株、米国サンディエゴＣＡ９２１２１、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅ社）の存在下および不存在下で２４時間培養した。培養の上清を−２０℃で凍結させ、ＴＮＦ−アルファの濃度を、種特異的ＥＬＩＳＡ（腫瘍壊死因子−アルファを定量検知用酵素連結免疫吸着アッセイ：ヒトＴＮＦ−アルファＥＬＩＳＡ  ＢＭ  Ｓ２２３／４ＴＥＵＣＥ（Ｂｅｎｄｅｒ  Ｍｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社、９４０１０カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｎｅ）で定量化した。
【０１５１】
図２は、培養に化合物１２が濃度１０−６Ｍおよび１０−７Ｍで存在すると、統計的に有意な方法で、ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣの培養の上清で定量化したＴＮＦ−アルファ濃度が減少した（ｐ＜０．０５）。さらに、濃度１０−６Ｍの化合物１２も、ＰＭＢＣによる自然ＴＮＦ−アルファ産生を低下させた。
【０１５２】
【表５】
2011524352.tif 000020
【０１５３】
化合物１２の免疫調節効果を、さらにＬＰＳでの単球刺激後またはモノクローナル抗体抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８との組み合わせによるリンパ球活性化後のＰＢＭＣによるサイトカインパネルの産生について特徴付けした。この検討は、健常ボランティアおよびリウマチ様関節炎を患っている患者から得られたＰＢＭＣの培養における漸増投与量の化合物１２の存在下または不存在下でおこなった。
【０１５４】
１３人の健常ボランティアからのＰＢＭＣ（５ｘ１０４細胞／ウエル）は、二重で、最高濃度（１０−６Ｍ）の溶媒または１０−６Ｍおよび１０−７Ｍ化合物１２を添加した完全培地２００μｌにおいて、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下および不存在下で、２４時間培養した。培養の上清を−２０℃で凍結させ、そして定量化を、表示サイトカイン濃度の同時アッセイ用の特定の試薬（ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｓｅｔ  （ＢＤ（商標）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ，ＣＢＡ：ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマ、９２１２１カリフォルニア州サンディエゴ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を使用することにより、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏａｎａｙｌｉｓｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔ  Ｎｏ．３４０１２８９２１２１カリフォルニア州サンディエゴ）によりおこなった。
【０１５５】
培養において化合物１２が濃度１０−６Ｍおよび１０−７Ｍで存在すると、統計的に有意な方法でＬＰＳで刺激した健常ボランティアのＰＢＭＣによるＴＮＦ−アルファ産生が減少した（ｐ＜０．０５）（図３）。これに対して、モノクローナル抗体抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激したＰＢＭＣによるＴＮＦ−アルファ分泌も、自然なもの（外からの刺激の不存在下で観察される）も、化合物１２によっては変化しなかった。
【０１５６】
【表６】
2011524352.tif 000021
【０１５７】
別の実験では、７人のリウマチ様関節炎を患っている患者からのＰＢＭＣ（５ｘ１０４細胞／ウエル）を、二重で、最高濃度（１０−６Ｍ）の溶媒、および１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍ化合物１２を添加した完全培地２００μｌにおいて、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３（１２．５ｎｇ／ｍｌ）（Ｏｒｔｈｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社  Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３  米国ニュージャージー州Ｒａｒｉｔａｎ）＋抗ＣＤ２８（１／３ｘ１０５）（Ｃｌｏｎ  １５Ｅ８、Ｍｅｎａｒｉｎｉ、スペイン  マドリッド）の存在下および不存在下で、２４時間培養した。培養の上清を−２０℃で凍結させ、そしてＴＮＦ−アルファの濃度を、製造業者の説明書に従ってサイトカインの濃度を測定するのに特異的なＣＢＡ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いることにより、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒにより定量化した。
【０１５８】
リウマチ様関節炎を患っている患者からのＬＰＳで刺激したＰＢＭＣにおいて、ＴＮＦ−アルファの産生は、１０−６Ｍの濃度での化合物１２により顕著に阻害された（ｐ＜０．０５）（図４）。培養に化合物１２が存在すると、自然ＴＮＦ−アルファ産生も、リウマチ様関節炎を患っている患者からのＰＢＭＣにおけるモノクローナル抗体抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８での刺激後に得られるものも阻害しなかった。
【０１５９】
【表７】
2011524352.tif 000022
【０１６０】
実施例７：化合物１２のＩＦＮ−ガンマの産生に対する影響
１３人の健常ボランティアからのＰＢＭＣ（５ｘ１０４細胞／ウエル）を、二重で、最高濃度（１０−６Ｍ）の溶媒、および１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍ化合物１２を添加した完全培地２００μｌにおいて、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３（１２．５ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＣＤ２８（１／３ｘ１０５）の存在下および不存在下で、２４時間培養した。培養の上清を−２０℃で凍結させ、そしてＩＦＮ−ガンマの濃度を、製造業者の説明書に従って、ＩＦＮ−ガンマの濃度を測定するのに特異的なＣＢＡ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いることにより、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒにより定量化した。
【０１６１】
化合物１２（濃度１０−６Ｍ）が存在すると、ＬＰＳで刺激したか、あるいはモノクローナル抗体抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激した健常ボランティアからのＰＢＭＣによるＩＦＮ−ガンマの産生が顕著に阻害された（ｐ＜０．０５）（図５）。
【０１６２】
【表８】
2011524352.tif 000023
【０１６３】
健常ボランティアからのＰＢＭＣによるＩＦＮ−ガンマの自然分泌は、化合物１２により変化しなかった。
【０１６４】
８人のリウマチ様関節炎を患っている患者からのＰＢＭＣ（５ｘ１０４細胞／ウエル）を、二重で、最高濃度（１０−６Ｍ）の溶媒、および１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍ化合物１２を添加した完全培地２００μｌにおいて、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３（１２．５ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＣＤ２８（１／３ｘ１０５）の存在下および不存在下で、２４時間培養した。培養の上清を−２０℃で凍結させ、そしてＩＦＮ−ガンマの濃度を、製造業者の説明書に従って、ＩＦＮ−ガンマの濃度を測定するのに特異的なＣＢＡ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔを用いることにより、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒにより定量化した。
【０１６５】
化合物１２（濃度１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍ）が存在すると、モノクローナル抗体抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の刺激により誘発されたとき、リウマチ様関節炎を患っている患者からのＰＢＭＣによるＩＦＮ−ガンマの産生が顕著に低下した（ｐ＜０．０５）（図６）。化合物１２は、健常ボランティアからのＰＢＭＣによる自然ＩＦＮ−ガンマ分泌も、ＬＰＳ誘発も変化しなかった。
【０１６６】
【表９】
2011524352.tif 000024
【０１６７】
実施例８：化合物１２のインターロイキン８（ＩＬ−８）産生に対する影響
健常ボランティアからのＰＢＭＣによるＩＬ−８産生に対する化合物１２の影響を、ＬＰＳ刺激ならびにモノクローナル抗体抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８の存在下と不存在下の両方で調査した。１３人の健常ボランティアからのＰＢＭＣ（５ｘ１０４細胞／ウエル）を、二重で、最高濃度（１０−６Ｍ）の溶媒、および１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍ化合物１２を添加した完全培地２００μｌにおいて、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３（１２．５ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＣＤ２８（１／３ｘ１０５）の存在下および不存在下で、２４時間培養した。培養の上清を−２０℃で凍結させ、そしてＩＬ−８の濃度を、製造業者の説明書に従って、ＩＬ−８の濃度を測定するのに特異的なＣＢＡ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔを用いることにより、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒにより定量化した。
【０１６８】
濃度１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍで、化合物１２は、ＩＬ−８の自然産生を顕著に阻害した（ｐ＜０．０５）（図７）。モノクローナル抗体抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８により誘発したＩＬ−８産生の顕著な阻害が、化合物１２（濃度１０−７および１０−８Ｍ）で観察された。それにもかかわらず、ＰＢＭＣのＬＰＳ刺激下でのＩＬ−８産生に対しての影響は観察されなかった。
【０１６９】
【表１０】
2011524352.tif 000025
【０１７０】
また、リウマチ様関節炎を患っている患者からのＰＢＭＣによるＩＬ−８産生に対する影響も検討した。８人のリウマチ様関節炎を患っている患者からのＰＢＭＣ（５ｘ１０４細胞／ウエル）を、二重で、最高濃度（１０−６Ｍ）の溶媒、および１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍ化合物１２を添加した完全培地２００μｌにおいて、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３（１２．５ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＣＤ２８（１／３ｘ１０５）の存在下および不存在下で、２４時間培養した。培養の上清を−２０℃で凍結させ、そしてＩＬ−８の濃度を、製造業者の説明書に従って、ＩＬ−８の濃度を測定するのに特異的なＣＢＡ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔを用いることにより、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒにより定量化した。
培養に化合物１２が濃度１０−６Ｍおよび１０−８Ｍで存在すると、リウマチ様関節炎を患っている患者からのＰＢＭＣにおけるＩＬ−８のＬＰＳによる誘発産生が顕著に変化したのに対して、自然ＩＬ−８産生も、モノクローナル抗体抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８との組み合わせにより誘発させたものも、変化しなかった（図８）。すなわち、結果から、化合物１２によるＩＬ−８の調節は、興味深いことに明確な健常状態および定義された疾病状態下で、明確な調節パターンを示すことが明らかである。
【０１７１】
【表１１】
2011524352.tif 000026
【０１７２】
実施例９：インターロイキン１０（ＩＬ−１０）産生に対する化合物１２の影響
健常ボランティアおよびリウマチ様関節炎を患っている患者からのＰＢＭＣによるＩＬ−１０の産生に対する化合物１２の影響を、ＬＰＳ刺激およびモノクローナル抗体抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８との組み合わせでの刺激の存在下および不存在下で調査した。１３人の健常ボランティアからのＰＢＭＣ（５ｘ１０４細胞／ウエル）を、二重で、最高濃度（１０−６Ｍ）の溶媒、および１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍ化合物１２を添加した完全培地２００μｌにおいて、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３（１２．５ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＣＤ２８（１／３ｘ１０５）の存在下および不存在下で、２４時間培養した。
【０１７３】
一方、８人のリウマチ様関節炎を患っている患者からのＰＢＭＣ（５ｘ１０４細胞／ウエル）を、二重で、最高濃度（１０−６Ｍ）の溶媒、および１０−６Ｍ、１０−７Ｍおよび１０−８Ｍ化合物１２を添加した完全培地２００μｌにおいて、ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）または抗ＣＤ３（１２．５ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＣＤ２８（１／３ｘ１０５）の存在下および不存在下で、２４時間培養した。培養の上清を−２０℃で凍結させ、そしてＩＬ−１０の濃度を、製造業者の説明書に従って、ＩＬ−１０の濃度を測定するのに特異的なＣＢＡ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔを用いることにより、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏａｎａｌｙｓｅｒにより測定した。
【０１７４】
化合物１２は、両方の検討した刺激の存在下および不存在下での健常ボランティアからのＰＢＭＣによるＩＬ−１０の産生に対して影響はなかった（図９）。しかしながら、培養に化合物１２が濃度１０−８で存在すると、リウマチ様関節炎を患っている患者からのＰＢＭＣのＬＰＳによる刺激後、ＩＬ−１０産生が顕著に増加した（ｐ＜  ０．０５）。化合物１２は、リウマチ様関節炎を患っている患者からのＰＢＭＣによる、ＩＬ−１０の自然産生にも、モノクローナル抗体抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８での刺激後の産生にも、顕著な影響を示さなかった（図１０）。
【０１７５】
【表１２】
2011524352.tif 000027
【０１７６】
【表１３】
2011524352.tif 000028
【０１７７】
免疫細胞に対する化合物１２の他の影響
実施例１０：化合物１２のＰＢＭＣの増殖反応に対する影響
健常ボランティア（ｎ＝８）からのＰＢＭＣの増殖反応に対する化合物１２の影響を、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）１０μｇ／ｍｌ；ＰＨＡ２μｇ／ｍｌ＋外からのＩＬ−２添加（２５ＩＵ／ｍｌ）による刺激およびモノクローナル抗体抗ＣＤ３（１２．５ｎｇ／ｍｌ）と抗ＣＤ２８（１：３２０．０００）との組み合わせによる刺激の存在下および不存在下で調査した。
【０１７８】
ＰＢＭＣを、完全培地において、３７℃で、５％ＣＯ２雰囲気（細胞インキュベーターＨＥＲＡ  Ｃｅｌｌ１５０，Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ、ドイツ  ６３５０５  Ｌａｇｅｎｓｅｌｂｏｌｄ）で４日間培養した（５０，０００細胞／ウエル）。培養刺激は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ  Ｓｉｇｍａ  Ｒｅｆ  ＃Ｌ−８９０２，スペイン  マドリッド）１０μｇ／ｍｌ；ＩＬ−２（２５ＩＵ／ｍｌ、ヒト組み換えＩＬ−２、Ｍａｃｒｏｌｉｎ、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｉｂｅｒｉｃａ、バッチ＃ＳＡ７５３２２８／４、スペイン  マドリッド）を外添したＰＨＡ２μｇ／ｍｌならびにモノクローナル抗体抗ＣＤ３（１２．５ｎｇ／ｍｌ）＋抗ＣＤ２８（１：３２０．０００）の不存在下または存在下の条件でおこなった。培養の最後の８時間の間に、メチル−３Ｈ−チミジンを添加した（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、６０Ｃｉ／ｍｍｏｌメチル−３Ｈ−チミジン、ＩＴＩＳＡ、スペイン  マドリッド）。細胞を、ガラス繊維膜に採集し、シンチレーション媒体（１４５０−４４１  Ｍｅｌｔｉｌｅｘ  Ａ，  ｄｅ  Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ、Ｒｅｆ＃１４５０−４４１）に埋め込んだ。ＤＮＡ組み込み放射能標識を、ベータ粒子カウンターＷａｌｌａｃ  Ｏｙを用いることにより定量化した。培養の細胞生存性の対照として、これらを、媒体の存在下で、他のシグナルなしで、細胞培養の密度および形態について、顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ４０ＣＦＬ、Ｋａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｅｎ社、ドイツ  Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）で観察して、ＰＢＭＣに対する検討分子の可能性のある分裂促進の直接作用を検出し且つ定量化し、そしてインキュベーション後の細胞生存性を測定した。
【０１７９】
培養に化合物１２が存在しても、検討した種々の分裂促進刺激の不存在下および存在下での健常ボランティアからのＰＢＭＣの増殖反応は顕著には変化しなかった（図１１ａおよび図１１ｂ）。
【０１８０】
実施例１１：ＰＢＭＣによるＣＤ６２Ｌのシェディングに対する化合物１２の影響
健常ボランティアからのＰＢＭＣのリンパ球および単球におけるＣＤ６２Ｌのシェディングに対する化合物１２の影響を調査した。
【０１８１】
化合物の１２（濃度０−６Ｍ）の存在下で、ＣＤ６２Ｌシェディング（ＣＤ６２Ｌ-Ｐｈｙｃｏｅｒｉｔｈｒｙｎ（ＰＥ）、クローンＢＤ  ＳＫ１１  Ｃａｔ  Ｎｏ．３４１０１２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が顕著に増加する（ｐ＜０．０５）。特に、これにより、ＣＤ６２Ｌのシェディングがリンパ球に選択的に生じた後に検出されるＣＤ６２Ｌ−ＰＥ標識の幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）が減少するが、単球では顕著な差は観察されなかった（図１２ａおよび図１２ｂ）。
【０１８２】
【表１４】
2011524352.tif 000029
【０１８３】
【表１５】
2011524352.tif 000030
【図１】
2011524352.tif 000040
【図２】
2011524352.tif 000041
【図３】
2011524352.tif 000042
【図４】
2011524352.tif 000043
【図５】
2011524352.tif 000044
【図６】
2011524352.tif 000045
【図７】
2011524352.tif 000046
【図８】
2011524352.tif 000047
【図９】
2011524352.tif 000048
【図１０】
2011524352.tif 000049
【図１１】
2011524352.tif 000050
【図１２】
2011524352.tif 000051
【手続補正書】
【提出日】平成23年5月2日(2011.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2011524352.tif 000052
［式中、
Ｒ１は、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または未置換シクロアルキル、置換または未置換アリール、および置換または未置換ヘテロシクリルから選択されるものであり；
Ｒ２は、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、および置換または未置換シクロアルキルから選択されるものであり；
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルラジカルである］
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／もしくは溶媒和物の、急性または慢性炎症性疾患の治療用薬剤の調製における使用。
【請求項２】
急性または慢性炎症性疾患の治療用薬剤が、ＴＮＦ−アルファおよびＩＦＮ−ガンマから選択される少なくとも１種の炎症誘発性サイトカインの産生を阻害することによるか、あるいはＩＬ−８ケモカインおよび／またはＩＬ−１０調節サイトカインを免疫調節するものである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記急性または慢性炎症性疾患が、急性および慢性の血清陽性または血清陰性少関節炎および多発性関節炎、脊椎関節炎、糸球体腎炎、膠原病、尿細管間質性腎炎、メタボリックシンドローム、アムローム性動脈硬化症、変形性関節症、喘息、慢性閉塞性肺疾患、間質性肺疾患、多発性硬化症、脱髄疾患、髄膜炎、脳炎、髄膜脳炎、炎症性神経根障害および末梢神経障害、炎症性腸疾患、肝硬変、肝炎、心不全、虚血性疾患、腎不全、炎症性膀胱炎、良性前立腺過形成、前立腺炎、心筋炎、心膜炎、ブドウ膜炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、じんましん、乾せん、酒さ、アレルギー性鼻炎、敗血症、敗血症性ショック、多発器質不全、全身性自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、血管炎、皮膚筋炎、アミロイドシスもしくはサルコイドーシス、器官特異的自己免疫疾患、例えば、重症筋無力症、甲状腺炎もしくはインスリン症、臓器移植、感染および腫瘍誘発炎症、ＴＮＦ−アルファ依存性細胞変性、壊死、アポプトーシス、移植片対宿主病、悪液質ならびにオートクリンおよびパラクリン病的細胞増殖から選択されるものである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記慢性炎症性疾患が、血清陽性または血清陰性慢性多発性関節炎である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記慢性多発性関節炎が、リウマチ様関節炎である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
Ｒ１が、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、特にメチルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
Ｒ２が、置換または未置換シクロアルキル、特にシクロペンチルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
Ｒ３が、メチルである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記式（Ｉ）の化合物が、以下の化合物から選択されるものであるか：
【化２】
2011524352.tif 000053
【化３】
2011524352.tif 000054
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／もしくは溶媒和物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
式（Ｉ’）の化合物：
【化４】
2011524352.tif 000055
［式中、
Ｒ１は、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換または未置換シクロアルキル、置換または未置換アリール、および置換または未置換ヘテロシクリルから選択されるものであり；
Ｒ３はＣ１〜Ｃ６アルキルラジカルである］
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物。
【請求項１１】
Ｒ１が、置換または未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、特にメチルである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
下式の化合物から選択される、請求項１０に記載の化合物：
【化５】
2011524352.tif 000056
またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび／または溶媒和物。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかで定義されている式（Ｉ’）の化合物またはその薬学的に許容される塩、プロドラッグまたは溶媒和物ならびに少なくとも１種の薬学的に許容される担体、アジュバントおよび／またはビヒクルを含んでなる医薬組成物。
【請求項１４】
薬剤として使用される、請求項１０〜１２のいずれか一項に定義されている式（Ｉ’）の化合物。
【請求項１５】
請求項１に定義されている式（Ｉ）の化合物の、免疫学的障害、標的細胞および標的分子を見つけるための、イメージング技術および薬理イメージング技術におけるイメージングバイオマーカーとしての使用。
【国際調査報告】
2011524352.tif 000057
2011524352.tif 000058
2011524352.tif 000059