(57)【要約】  本発明は、ヘプシジンを結合するモノクローナル抗体並びにこのような抗体を製造及び使用する方法に関する。ヘプシジン関連疾患を治療する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１０−８Ｍ未満の親和性ＫＤで配列番号９のヒトヘプシジンに結合する単離された抗体であって、
（ａ）約７．４のｐＨでの前記ヘプシジンに対するそのＫＤと比べて、約５．５のｐＨで少なくとも約５０倍高いＫＤ；
（ｂ）抗体１Ｓ１と比べて、前記ヘプシジンの少なくとも約５倍速い排除；及び
（ｃ）約ｐＨ５．５で約６×１０−２ｓ−１以上のオフ速度
からなる群から選択される特性の少なくとも１つを示す、単離された抗体。
【請求項２】
約１０−８Ｍ未満の親和性ＫＤで配列番号９のヒトヘプシジンに結合する単離された抗体であって、
（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを、（ｉ）１ｍｇ用量の抗体及び（ｉｉ）１ｍｇ用量の抗体と、３．７μｇのヒトヘプシジンの予め複合体化された単回用量を前記マウスに投与してから約２４時間後に少なくとも９０％低下させる；
（ｂ）マウスにおける血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを、３．７μｇのヒトヘプシジンの単回用量を前記マウスに投与してから約２４時間後に少なくとも９０％低下させる（前記ヘプシジンは、前記マウスが前記抗体を予め投薬されてから３日後に投与される。）；
（ｃ）抗体１Ｓ１と比べて、前記抗体で処理されたマウス中への、総血清ヘプシジンの総蓄積の５０％を超える低下をもたらす；及び
（ｄ）抗体１Ｓ１と比べて、前記抗体とともに温置されたＦｃＲｎ形質移入されたＨＥＫ２９３細胞中にヘプシジンの少なくとも約２倍高い細胞内蓄積をもたらす
からなる群から選択される特性の少なくとも１つを示す、単離された抗体。
【請求項３】
（ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを、（ｉ）１ｍｇ用量の抗体及び（ｉｉ）１ｍｇ用量の抗体と、３．７μｇのヒトヘプシジンの予め複合体化された単回用量を前記マウスに投与してから約２４時間後に少なくとも９０％低下させる；
（ｂ）マウスにおける血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを、３．７μｇのヒトヘプシジンの単回用量を前記マウスに投与してから約２４時間後に少なくとも９０％低下させる（前記ヘプシジンは、前記マウスが前記抗体を予め投薬されてから３日後に投与される。）；
（ｃ）抗体１Ｓ１と比べて、前記抗体で処理されたマウス中への、総血清ヘプシジンの総蓄積の約５０％を超える低下をもたらす；及び
（ｄ）抗体１Ｓ１と比べて、前記抗体とともに温置されたＦｃＲｎ形質移入されたＨＥＫ２９３細胞中にヘプシジンの少なくとも約２倍高い細胞内蓄積をもたらす；
からなる群から選択される特性の少なくとも１つを示す請求項１の抗体。
【請求項４】
抗体の単回投薬後、少なくとも１日間、ヒトヘプシジンを過剰発現するマウス中の循環鉄レベル又はＴｓａｔを増加させる、約１０−８Ｍ未満の親和性ＫＤで配列番号９のヒトヘプシジンに結合する請求項１から３の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項５】
約２０ｎＭ以下のＥＣ５０で、５０ｎｇ／ｍＬヘプシジンで刺激されたフェロポーチン発現細胞中の鉄を減少させる、請求項１から３の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項６】
少なくとも１０−８Ｍの親和性ＫＤで、配列番号９のヒトヘプシジンに結合する単離された抗体であって、
（ａ）前記抗体の重鎖又は軽鎖中のアミノ酸をヒスチジンで置換すること；
（ｂ）異なるｐＨ結合に関して、（ａ）で得られた抗体をスクリーニングすること；
（ｃ）前記抗体の重鎖又は軽鎖中の別のアミノ酸をヒスチジンで置換すること；並びに
（ｄ）前記抗体を
（ｉ）約ｐＨ７．４でのヒトヘプシジンに対するそのＫＤと比べて、約ｐＨ５．５で少なくとも約５０倍高いＫＤ；及び
（ｉｉ）約ｐＨ５．５で約６×１０−２ｓ−１以上のオフ速度；
からなる群から選択される特性の少なくとも１つを有することでスクリーニングすること
によって得られる、単離された抗体。
【請求項７】
ヘモグロビン若しくはヘマトクリットの少なくとも１つ又は両方の対象中レベルを増加させる、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項８】
赤血球数、赤血球ヘモグロビン含量又は赤血球数の赤血球平均細胞容積又はこれらのあらゆる組み合わせの少なくとも１つを対象中で増加させる、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項９】
網状赤血球細胞数、網状赤血球細胞ヘモグロビン含量又は網状赤血球細胞数の網状赤血球細胞平均細胞容積又はこれらのあらゆる組み合わせの少なくとも１つを対象中で増加させる、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項１０】
ヘプシジンの鉄制御活性を阻害する、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項１１】
配列番号１７０又は配列番号１６８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが配列番号１７１から１７６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１７１から１７６の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含む何れかの配列を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項１２】
配列番号１７１から１７３を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項１３】
配列番号１７４から１７６を含む、請求項１から６又は１２の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項１４】
配列番号３３３又は配列番号３３１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが配列番号３３４から３４９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３３４から３４９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含む何れかの配列を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項１５】
配列番号３３４から３４６を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項１６】
配列番号３４７から３４９を含む、請求項１から６又は１５の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項１７】
配列番号３４３又は配列番号３４１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが配列番号３４４から３４９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３４４から３４９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含む何れかの配列を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項１８】
配列番号３４４から３４６を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項１９】
配列番号３４７から３４９を含む、請求項１から６又は１８の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項２０】
配列番号３５３又は配列番号３５１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが配列番号３５４から３５９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３５４から３５９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含む何れかの配列を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項２１】
配列番号３５４から３５６を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項２２】
配列番号３５７から３５９を含む、請求項１から６又は２１の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項２３】
配列番号３６３又は配列番号３６１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが配列番号３６４から３６９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３６４から３６９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含む何れかの配列を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項２４】
配列番号３６４から３６６を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項２５】
配列番号３６７から３６９を含む、請求項１から６又は２４の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項２６】
配列番号３７３又は配列番号３７１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが配列番号３７４から３７９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３７４から３７９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含む何れかの配列を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項２７】
配列番号３７４から３７６を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項２８】
配列番号３７７から３７９を含む、請求項１から６又は２７の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項２９】
配列番号３８３又は配列番号３８１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが配列番号３８４から３８９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３８４から３８９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含む何れかの配列を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項３０】
配列番号３８４から３８６を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項３１】
配列番号３８７から３８９を含む、請求項１から６又は３０の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項３２】
配列番号３９３又は配列番号３９１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドが配列番号３９４から３９９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３９４から３９９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含む何れかの配列を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項３３】
配列番号３９４から３９６を含む、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項３４】
配列番号３８７から３８９を含む、請求項１から６又は３３の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項３５】
配列番号１７０のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列の５２、５７、９９及び１０７位のアミノ酸の少なくとも１つがヒスチジンで置換されている、請求項１から６の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項３６】
配列番号１６８のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列の２７及び８９位のアミノ酸の少なくとも１つがヒスチジンで置換されている、請求項１から６又は２０の何れかに記載の単離された抗体。
【請求項３７】
配列番号１７０の１０７位のアミノ酸がヒスチジンで置換されている、請求項３５又は３６に記載の単離された抗体。
【請求項３８】
配列番号１７０の５７及び１０７位のアミノ酸の両方がヒスチジンで置換されている、請求項３７に記載の単離された抗体。
【請求項３９】
配列番号１７０の１０７位のアミノ酸及び配列番号１６８の２７位のアミノ酸の両方がヒスチジンで置換されている、請求項３６に記載の単離された抗体。
【請求項４０】
配列番号１７０の１０７位のアミノ酸及び配列番号１６８の８９位のアミノ酸の両方がヒスチジンで置換されている、請求項３７に記載の単離された抗体。
【請求項４１】
配列番号１７０の９９及び１０７位のアミノ酸の両方がヒスチジンで置換されている、請求項３７に記載の単離された抗体。
【請求項４２】
モノクローナル抗体である、請求項１から４１の何れか一項に記載の単離された抗体。
【請求項４３】
キメラ、ヒト化又はヒト抗体である、請求項４２に記載の単離された抗体。
【請求項４４】
ヒト抗体である、請求項４２に記載の単離された抗体。
【請求項４５】
ＩｇＧイソタイプの抗体である、請求項４２に記載の単離された抗体。
【請求項４６】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４イソタイプの抗体である、請求項４２に記載の単離された抗体。
【請求項４７】
請求項１から４６の何れか一項に記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項４８】
制御調節配列に作用可能に連結された請求項４７に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項４９】
請求項４８に記載のベクター又は請求項４７に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項５０】
核酸が発現されて抗体を産生するような適切な条件下で、請求項４９に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生するために請求項４９に記載の宿主細胞を使用する方法。
【請求項５１】
宿主細胞培養物から抗体を回収することをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１から４６の何れか一項に記載の抗体及び医薬として許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む組成物。
【請求項５３】
鉄恒常性の疾患の治療を必要としている対象において鉄恒常性の疾患を治療する方法であって、請求項１から４６の何れか一項に記載の抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５４】
鉄恒常性の疾患が、貧血、敗血症、炎症の貧血、癌の貧血、化学療法によって誘発された貧血、慢性炎症性貧血、うっ血性心不全、終末段階腎疾患、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、鉄欠乏性貧血、鉄恒常性の疾患、フェロポーティン病、血色素症、糖尿病、炎症、関節リウマチ、動脈硬化症、腫瘍、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、異常ヘモグロビン症及び赤血球疾患からなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項５２に記載の組成物を投与することを含む、ヘプシジンの上昇したレベルを有するヒトを治療する方法。
【請求項５６】
請求項５２に記載の組成物を投与することを含む、貧血を有するヒトを治療する方法。
【請求項５７】
ヒトが貧血、敗血症、炎症の貧血、癌の貧血、慢性炎症性貧血、うっ血性心不全、終末段階腎疾患、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、鉄欠乏性貧血、鉄恒常性の疾患、フェロポーティン病、血色素症、糖尿病、炎症、関節リウマチ、動脈硬化症、腫瘍、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、異常ヘモグロビン症、赤血球疾患に罹患している、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
エリスロポエチン、エリスロポエチン変形物及びエリスロポエチン受容体を結合する抗体からなる群から選択される赤血球新生刺激物質を前記ヒトに投与することをさらに含む、請求項５５から５６の何れか一項に記載の方法。
【請求項５９】
赤血球新生刺激物質が配列番号７２のヒトエリスロポエチンである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
赤血球新生刺激物質が配列番号７３のダルベポエチンαである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記患者に鉄を投与することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、２００８年５月１日に出願された米国仮出願６１／０４９，６８７号（これは、参照により、本明細書に組み込まれる。）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ヘプシジン、ヘプシジンアンタゴニスト（ヘプシジンを結合する抗体を含む。）及びヘプシジン活性を調節するこれらの能力に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
鉄は、全ての生物の成長及び発達のために必要とされる必須微量元素である。哺乳動物中の鉄含量は、鉄吸収、鉄の再利用及び鉄がその中に貯蔵されている細胞からの鉄の放出を調節することによって制御される。鉄は、腸細胞によって、主に、十二指腸及び空腸上部中において吸収される。鉄が欠乏している個体中での鉄吸収を強化し、鉄の過剰負荷を有する個体中での鉄吸収を低下させるフィードバック機構が存在する（Ａｎｄｒｅｗｓ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１：７５（２０００）；Ｐｈｉｌｐｏｔｔ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３５：９９３（２００２）；Ｂｅｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ−Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２９：４９５（２００１））。鉄は、骨髄、肝臓クッパー細胞及び脾臓中の細網内皮マクロファージによって、分解された赤血球から再利用される。鉄の放出は、フェロポーティン（鉄を血漿中へ放出することができる主な細胞である腸細胞、マクロファージ及び肝細胞の細胞表面上に位置する主要な鉄排出タンパク質）によって調節される。ヘプシジンはフェロポーティンへ結合し、細胞表面からフェロポーティンを内部に取り込ませて、分解することによって、フェロポーティンの機能的活性を減少させる（Ｎｅｍｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６：２０９０−３，２００４；Ｄｅ  ｄｏｍｅｎｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．，８：２５６９−２５７８，２００７）。
【０００４】
ヘプシジンは、鉄の恒常性の重要な制御物質である（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３５：９９３（２００２）；Ｎｉｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９：４３９６（２００２））。ヒトヘプシジンの高いレベルは低下した鉄レベルをもたらし、逆も同様である。ヘプシジン活性の欠如をもたらすヘプシジン遺伝子中の変異は、重篤な鉄過剰負荷疾患である若年性血色素症と関連する（Ｒｏｅｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３３：２１−２２，２００３）。マウスでの研究は、正常な鉄恒常性の調節におけるヘプシジンの役割を示した（Ｎｉｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３４：９７−１０１，２００３；Ｎｉｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：４５９６−４６０１，２００２；Ｎｉｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８：８７８０−８７８５，２００１）。
【０００５】
さらに、炎症の間の鉄の封鎖にヘプシジンが関与することを示唆するデータが蓄積している（例えば、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１００：３７７６−３６７８１，２００２；Ｋｅｍｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０６：１８６４−１８６６，２００５；Ｎｉｃｏｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃ１ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１０：１０３７−１０４４，２００２；Ｎｅｍｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃ１ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：１２７１−１２７６，２００４；Ｎｅｍｅｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１：２４６１−２４６３，２００３及びＲｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０５：１７９７−１８０２，２００５）。ヘプシジン遺伝子発現は、脊椎動物の自然免疫系の急性期応答を誘導する炎症性刺激（感染症など）後に、強固に上方制御されることが観察されている。マウスでは、ヘプシジン遺伝子発現は、リポ多糖（ＬＰＳ）、ターペンタイン、フロイントの完全アジュバント及びアデノウイルス感染によって上方制御されることが示された。ヘプシジン発現は、炎症性サイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）によって誘導される。細菌、真菌及びウイルス感染症などの慢性炎症性疾患を有する患者において、ヘプシジン発現と炎症の貧血の間にも強い相関が見出された。
【０００６】
ヒトヘプシジン（抗微生物活性及び鉄制御活性を有する２５アミノ酸のペプチド）は、新規抗微生物ペプチドを調査する２つのグループによって、独立に発見された（Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４８０：１４７（２０００）；Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７８０６（２００１））。ヘプシジンは、ＬＥＡＰ−１（肝臓発現抗菌ペプチド；ｌｉｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）とも称される。その後、マウス中で８３アミノ酸プレプロペプチドをコードし、ラット及びヒト中で８４アミノ酸のプレプロペプチドをコードするヘプシジンｃＤＡＮが、鉄によって制御される肝臓特異的遺伝子の探索中に同定された（Ｐｉｇｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：７８１１（２００１））。まず、２４残基のＮ末端シグナルペプチドは切断されて、プロヘプシジンを生成し、次いで、プロヘプシジンはさらなるプロセッシングを受けて、成熟ヘプシジンを生成する（血中及び尿中の両方に見出される。）。ヒトの尿中において、主要な形態は２５アミノ酸を含有するが、より短い２２アミノ酸ペプチド及び２２アミノ酸ペプチドも存在する。
【０００７】
成熟ペプチドは、４つのジスルフィド架橋として連結された８つのシステイン残基を含有する点が注目される。ヘプシジンの構造は、尿から精製された原型ヘプシジンと同一のＨＰＬＣ保持時間を有する化学的に合成されたヘプシジンを使用して、ＮＭＲにより、「Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：３７５９７−３７６０３（２００２）」によって研究された。Ｈｕｎｔｅｒ他は、ヘプシジンは隣接するジスルフィド結合（Ｃ１−Ｃ８、Ｃ２−Ｃ７、Ｃ３−Ｃ６、Ｃ４−Ｃ５）を含有するヘアピンループ構造へ折り畳まれるという彼らの測定を報告した。「Ｌａｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０：９２７２−９２８２（２００５）」参照。しかしながら、同時係属の米国特許出願１２／０２２，５１５号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる）で発見及び開示されているように、ヘプシジンの構造は、上記ものとは異なるジスルフィド結合の結合性を有することが決定された。
【０００８】
米国特許出願公開第２００３／０１８７２２８号、第２００４／００９６９８７号、第２００４／００９６９９０号、第２００５／０１４８０２５号、第２００６／００１９３３９号、第２００５／００３７９７１号及び第２００７／０２２４１８６号；米国特許第７，２３２，８９２号及び同第７，２９４，６９０号並びに国際公開ＷＯ０２／９８４４４は、ヘプシジン抗体について考察している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１８７２２８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／００９６９８７号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００９６９９０号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５／０１４８０２５号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００６／００１９３３９号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５／００３７９７１号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００７／０２２４１８６号明細書
【特許文献８】米国特許第７，２３２，８９２号明細書
【特許文献９】米国特許第７，２９４，６９０号明細書
【特許文献１０】国際公開第０２／９８４４４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｎｄｒｅｗｓ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１、２０００年、ｐ．７５
【非特許文献２】Ｐｈｉｌｐｏｔｔ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３５、２００２年、ｐ．９９３
【非特許文献３】Ｂｅｕｔｌｅｒ  他、Ｄｒｕｇ−Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２９、２００１年、ｐ．４９５
【非特許文献４】Ｎｅｍｅｔｈ  他、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０６、２００４年、ｐ．２０９０−３
【非特許文献５】Ｄｅ  ｄｏｍｅｎｉｃｏ  他、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ＣｅＬ１．，８、２００７年、ｐ．２５６９−２５７８
【非特許文献６】Ｐｈｉｌｐｏｔｔ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３５、２００２年、ｐ．９９３
【非特許文献７】Ｎｉｃｏｌａｓ  他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９、２００２年、ｐ．４３９６
【非特許文献８】Ｒｏｅｔｔｏ  他、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３３、２００３年、ｐ．２１−２２
【非特許文献９】Ｎｉｃｏｌａｓ  他、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３４、２００３年、ｐ．９７−１０１
【非特許文献１０】Ｎｉｃｏｌａｓ  他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９、２００２年、ｐ．４５９６−４６０１
【非特許文献１１】Ｎｉｃｏｌａｓ  他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８、２００１年、ｐ．８７８０−８７８５
【非特許文献１２】Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ  他、Ｂｌｏｏｄ，１００、２００２年、ｐ．３７７６−３６７８１
【非特許文献１３】Ｋｅｍｎａ  他、Ｂｌｏｏｄ，１０６、２００５年、ｐ．１８６４−１８６６
【非特許文献１４】Ｎｉｃｏｌａｓ  他、Ｊ．Ｃ１ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１０、２００２年、ｐ．１０３７−１０４４
【非特許文献１５】Ｎｅｍｅｔｈ  他、Ｊ．Ｃ１ｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３、２００４年、ｐ．１２７１−１２７６
【非特許文献１６】Ｎｅｍｅｔｈ  他、Ｂｌｏｏｄ，１０１、２００３年、ｐ．２４６１−２４６３
【非特許文献１７】Ｒｉｖｅｒａ  他、Ｂｌｏｏｄ，１０５、２００５年、ｐ．１７９７−１８０２
【非特許文献１８】Ｋｒａｕｓｅ  他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４８０、２００２年、ｐ．１４７
【非特許文献１９】Ｐａｒｋ  他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６、２００１年、ｐ．７８０６
【非特許文献２０】Ｐｉｇｅｏｎ  他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６、２００１年、ｐ．７８１１
【非特許文献２１】Ｈｕｎｔｅｒ  他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７、２００２年、ｐ．３７５９７−３７６０３
【非特許文献２２】Ｌａｕｔｈ  他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０、２００５年、ｐ．９２７２−９２８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（発明の要約）
本発明の様々な実施形態は、ヒトヘプシジンを特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む。）、このような抗体を作製する方法、ヘプシジンを検出するためにこのような抗体を使用する方法、このような抗体を含む医薬製剤、医薬製剤を調製する方法及び医薬製剤を用いて患者を治療する方法（以下に記載されているような赤血球新生刺激物質との組み合わせ療法を含む。）を提供する。このような抗体をコードする核酸、このような核酸を含むベクター及び組換え宿主細胞並びにこのような抗体を作製する方法も提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
幾つかの実施形態において、（ａ）約７．４のｐＨでのヒトヘプシジンに対するそのＫＤと比べて、少なくとも約５０倍高い約５．５又は約６のｐＨでのＫＤ；（ｂ）抗体１Ｓ１と比べて、少なくとも約５倍速いヒトヘプシジンの排除；及び（ｃ）約５．５又は約ｐＨ６での約６×１０−２ｓ−１以上のオフ速度からなる群から選択される特性の少なくとも１つを示す約１０−８Ｍ未満の親和性ＫＤで、配列番号９のヒトヘプシジンに結合する単離された抗体が提供される。前記特性の１つ以上に代えて又はこれに加えて、抗体は、（ａ）（ｉ）１ｍｇ用量の前記抗体及び（ｉｉ）１ｍｇ用量の前記抗体とヒトヘプシジン３．７μｇの、予め複合体化された単回用量のＣ５７ＢＬ／６マウスへの投与から約２４時間後に、前記マウスにおいて、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％、血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを低下させる；（ｂ）マウスがヒトヘプシジン３．７μｇの単回用量を投与されてから約２４時間後に（前記ヘプシジンは、前記マウスに前記抗体が予め投薬されてから３日後に投与される。）、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％、マウス中の血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを低下させる；（ｃ）抗体１Ｓ１と比べて、前記抗体で処理されたマウス中の総血清ヘプシジンの総蓄積の約５０％より大きな低下をもたらす；及び（ｄ）抗体１Ｓ１と比べて、前記抗体とともに温置されたＦｃＲｎを形質移入されたＨＥＫ２９３細胞中のヘプシジンの少なくとも約２倍高い細胞内蓄積をもたらすことからなる群から選択される特性の少なくとも１つを示す。
【００１３】
幾つかの実施形態において、約１０−８Ｍ未満の親和性ＫＤで配列番号９のヒトヘプシジンに結合し、抗体の単回投与後に、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日間以上、ヒトヘプシジンを過剰発現するマウス中で、循環鉄レベル又はＴｓａｔを増加させる単離された抗体が提供される。
【００１４】
幾つかの実施形態において、少なくとも１０−８Ｍの親和性ＫＤで配列番号９のヒトヘプシジンに結合し、（ａ）抗体の重鎖又は軽鎖中のアミノ酸をヒスチジンで置換し；（ｂ）（ａ）において得られた抗体を異なるｐＨ結合に関してスクリーニングし；（ｃ）前記抗体の重鎖又は軽鎖中の別のアミノ酸をヒスチジンで置換し、並びに（ｄ）（ｉ）約７．４での前記ヘプシジンに対するそのＫＤと比べて、少なくとも約５０から１０００倍高い約５．５又は約ｐＨ６でのＫＤ及び（ｉｉ）約ｐＨ５．５又は約ｐＨ６での約６×１０−２ｓ−１以上のオフ速度からなる群から選択される特性の少なくとも１つを有することに関して前記抗体をスクリーニングすることによって得られる単離された抗体が提供される。
【００１５】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、約２０ｎＭ以下のＥＣ５０で、５０ｎｇ／ｍＬヘプシジンで刺激されたフェロポーチン発現細胞中の鉄を減少させ；及び／又は少なくともヘモグロビン若しくはヘマトクリットの１つ若しくは両方の対象中におけるレベルを増加させ；及び／又は赤血球数、赤血球ヘモグロビン含量若しくは赤血球数の赤血球平均細胞容積の少なくとも１つ若しくはあらゆるこれらの組み合わせを対象中において増加させ；及び／又は少なくとも網状赤血球数、網状赤血球ヘモグロビン含量若しくは網状赤血球数の網状赤血球平均細胞容積の１つ若しくはあらゆるこれらの組み合わせを対象中において増加させ；及び／又はヘプシジンの鉄制御活性を阻害する。
【００１６】
幾つかの実施形態において、抗体は、配列番号１７０又は配列番号１６８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは配列番号１７１から１７６からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号１７１から１７６の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含むあらゆる配列を含む。一態様において、抗体は配列番号１７１から１７３を含む。別の態様において、抗体は配列番号１７４から１７６を含む。
【００１７】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号３３３又は配列番号３３１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは配列番号３３４から３４９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３３４から３４９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含むあらゆる配列を含む。一態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３３４から３４６を含む。別の態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３４７から３４９を含む。
【００１８】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号３４３又は配列番号３４１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは配列番号３４４から３４９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３４４から３４９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含むあらゆる配列を含む。一態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３４４から３４６を含む。別の態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３４７から３４９を含む。
【００１９】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号３５３又は配列番号３５１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは配列番号３５４から３５９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３５４から３５９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含むあらゆる配列を含む。一態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３５４から３５６を含む。別の態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３５７から３５９を含む。
【００２０】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号３６３又は配列番号３６１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは配列番号３６４から３６９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３６４から３６９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含むあらゆる配列を含む。一態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３６４から３６６を含む。別の態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３６７から３６９を含む。
【００２１】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号３７３又は配列番号３７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは配列番号３７４から３７９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３７４から３７９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含むあらゆる配列を含む。一態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３７４から３７６を含む。別の態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３７７から３７９を含む。
【００２２】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号３８３又は配列番号３８１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは配列番号３８４から３８９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３８４から３８９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含むあらゆる配列を含む。一態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３８４から３８６を含む。別の態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３８７から３８９を含む。
【００２３】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号３９３又は配列番号３９１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドは配列番号３９４から３９９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び配列番号３９４から３９９の何れかに対して少なくとも１つのアミノ酸変化を含むあらゆる配列を含む。一態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３９４から３９６を含む。別の態様において、本明細書に記載されている抗体は配列番号３９７から３９９を含む。
【００２４】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号１７０のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列の５２、５７、９９及び１０７位のアミノ酸の少なくとも１つ、２つ、３つ又は４つ全てがヒスチジンで置換されている。このような抗体は、配列番号１６８をさらに含み得る。他の実施形態において、抗体は、配列番号１６８のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列の２７及び８９位のアミノ酸の少なくとも一方又は両方がヒスチジンで置換されている。このような抗体は、配列番号１７０をさらに含み得る。場合によって、前記修飾された配列番号１７０の何れも及び前記修飾された配列番号１６８の何れも、抗体中に組み合わされ得る。一実施形態において、配列番号１７０の５７位及び１０７位のアミノ酸の両方がヒスチジンで置換される。別の実施形態において、配列番号１７０の１０７位のアミノ酸及び配列番号１６８の２７位のアミノ酸の両方がヒスチジンで置換される。別の実施形態において、配列番号１７０の１０７位のアミノ酸及び配列番号１６８の８９位のアミノ酸の両方がヒスチジンで置換される。さらに実施形態において、配列番号１７０の９９位及び１０７位のアミノ酸の両方がヒスチジンで置換されている。
【００２５】
前記抗体の何れもが、モノクローナル抗体又はキメラ、ヒト化若しくはヒト抗体であり得る。幾つかの実施形態において、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４イソタイプなどのＩｇＧイソタイプである。
【００２６】
別の態様において、本発明の実施形態には、前記抗体の何れかをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、制御調節配列へ作用可能に連結された単離された核酸分子の何れかを含む発現ベクター、このような単離された核酸分子又はベクターを含む宿主細胞及び抗体を作製するためにこのような宿主細胞を使用する方法が含まれる。このような作製方法は、抗体を作製するために核酸が発現されるような適切な条件下で、宿主細胞を培養すること、及び場合によって、宿主細胞又は培地から抗体を回収することを含む。関連する実施形態において、前記方法によって作製された単離された抗体又は因子が提供される。
【００２７】
本明細書に記載されている実施形態には、例えば、治療的有効量の前記抗体の何れか及び医薬として許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含有する組成物が含まれる。関連する態様において、本発明の実施形態には、例えば、治療的有効量で前記抗体又は組成物の何れかを投与することによって、鉄恒常性の疾患の治療を必要としている対象中の鉄恒常性の疾患を治療する方法が含まれる。鉄恒常性の典型的な疾患には、貧血、敗血症、炎症の貧血、癌の貧血、化学療法によって誘発された貧血、慢性炎症性貧血、うっ血性心不全、終末段階腎疾患、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、鉄欠乏性貧血、鉄恒常性の疾患、フェロポーティン病、血色素症、糖尿病、炎症、関節リウマチ、動脈硬化症、腫瘍、脈管炎、全身性紅斑性狼瘡、異常ヘモグロビン症及び赤血球疾患が含まれる。関連する態様において、本発明の実施形態は、例えば治療的有効量で前記抗体又は組成物の何れかを投与することによって、ヘプシジンの上昇したレベルを有するヒトを治療する方法又は貧血を有するヒトを治療する方法を提供する。前記対象又は症状の何れかを治療するための医薬の調製における前記抗体の何れかの使用も提供される。
【００２８】
本明細書に記載されているように抗体を第二の治療剤とともに投与することを含む同時投与法は、第二の治療剤とともに同時投与するための医薬の調製において抗体を使用することのみならず、抗体とともに同時投与するための医薬の調製において第二の治療剤を使用することも包含することが理解される。
【００２９】
幾つかの実施形態において、哺乳動物は、哺乳動物は、アフリカ鉄過剰症、アルファサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌の貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、動脈硬化又はアテローム性動脈硬化（冠動脈疾患、脳血管疾患又は末梢閉塞性動脈疾患を含む。）、運動失調、鉄に関連する運動失調、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠乏症、化学療法によって誘発された貧血、慢性腎／腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）（終末段階の腎臓病又は慢性腎／腎臓不全を含む。）、肝硬変、古典的血色素症、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、ヘプシジン過剰を有する症状（上昇したヘプシジン）、先天性赤血球異形成性貧血、うっ血性心不全、クローン病、糖尿病、鉄体内分布の異常、鉄恒常性の異常、鉄代謝の異常、フェロポーティン病、フェロポーティン変異血色素症、葉酸欠乏症、フリードライヒ失調症、索性脊髄症、グラシール症候群（ｇｒａｃｉｌｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｅｌｏｒｉ）感染症又はその他の細菌感染症、ハラーホルデン（Ｈａｌｌｅｒｖｏｒｄａｎ）・スパッツ病、血色素症、トランスフェリン受容体２中の変異に起因する血色素症、異常ヘモグロビン症、肝炎、肝炎（Ｂｒｏｃｋ）、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、遺伝性血色素症、ＨＩＶ又は他のウイルス病、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インシュリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏性疾患、鉄過剰負荷疾患、ヘプシジン過剰を有する鉄欠乏性症状、若年性血色素症（ＨＦＥ２）、多発性硬化症、トランスフェリン受容体２の変異、ＨＦＥ、ヘモジュベリン、フェロポーティン又は鉄代謝の他の遺伝子中の変異、新生児血色素症、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症、膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、偽脳炎、肺血鉄症、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性紅斑性狼瘡、サラセミア、中間型サラセミア、輸血性鉄過剰症、腫瘍、脈管炎、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症及び／又はウィルソン病からなる群から選択される症状に罹患しているヒトである。
【００３０】
幾つかの実施形態において、前記抗体又は組成物の何れか及び赤血球新生刺激物質がヒトに投与される、貧血を治療する方法が提供される。典型的な赤血球新生刺激物質には、エリスロポエチン、エリスロペオチン変形物及びエリスロポエチン受容体を結合及び活性化するペプチド又は抗体が含まれる。他の典型的な赤血球新生刺激物質には、配列番号７２のヒトエリスロポエチン又は配列番号７３のダルベポエチンαが含まれる。このような方法に従って治療され得る貧血の典型的な形態には、炎症の貧血、癌の貧血、化学療法によって誘導された貧血、鉄欠乏性貧血、鉄恒常性の障害、フェロポーティン疾患又は腎臓病に起因する貧血が含まれる。ヒトヘプシジンを特異的に結合する抗体の治療的有効量を投与することを含む、赤血球新生刺激物質を用いた治療に対して低応答性である、又は抵抗性でさえある貧血を有する哺乳動物を治療する方法も提供される。前記方法の何れもが、対象に鉄を投与することも含み得る。
【００３１】
先述の要約は、本発明の全ての態様を確定することを意図するものではなく、詳細な説明などの他の節に、さらなる態様が記載されている。文書全体が統一された開示として関連するものであり、特徴の組み合わせが本文書の同じ文又はパラグラフ又は節内に一緒に見出されない場合でさえ、本明細書に記載されている特徴の全ての組み合わせが想定されることを理解すべきである。
【００３２】
前記に加えて、本発明は、さらなる態様として、本明細書中の特定のパラグラフによって定義される変形より何らかの様式で範囲がより狭い本発明の全ての実施形態を含み得る。例えば、属として記載されている本発明のある態様は、属の全ての要素が個別に本発明の態様であることを理解すべきである。また、属又は属の要素の選択として記載されている態様は、属の２つ以上の要素の組み合わせを包含するものと理解すべきである。
【００３３】
本明細書中の様々な実施形態は、様々な状況下で、「含む」という用語を用いて提示されているが、関連する実施形態は、「からなる」又は「実質的に〜からなる」という用語を用いても記載され得ることを理解すべきである。「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を表すことに留意すべきであり、例えば、「１つの免疫グロブリン分子」は、１つ以上の免疫グロブリン分子を表すことが理解される。従って、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上の」及び「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において互換的に使用することができる。
【００３４】
値の範囲を記載する場合、記載されている特徴は当該範囲内に見出される個別の値であり得ることも理解すべきである。例えば、「約ｐＨ４から約ｐＨ６のｐＨ」は、ｐＨ４、４．２、４．６、５．１、５．５など（但し、これらに限定されない。）及びこのような値の間にあるあらゆる値であり得る。さらに、「約ｐＨ４から約ｐＨ６のｐＨ」は、問題となっている製剤のｐＨが、保存の間に、ｐＨ４からｐＨ６までの範囲で２ｐＨ単位変動することを意味すると解釈すべきでなく、むしろ、値が溶液のｐＨに関するその範囲内で選択され得、ｐＨは概ねそのｐＨに緩衝化された状態を保つ。幾つかの実施形態において、「約」という用語が使用される場合、この用語は、表記数字プラス又はマイナス表記数字の５％、１０％、１５％以上を意味する。意図される実際の変形は文脈から決定できる。出願人は本明細書に記載されている発明の範囲全体を発明したが、出願人は他者の従来技術中に記載されている主題について権利を請求することを意図するものではない。従って、米国特許庁又は他の団体若しくは個人によって、特許請求の範囲に属する法定の従来技術が出願人の知るところとなった場合には、出願人は、このような特許請求の範囲の主題を確定し直して、このような法定の従来技術又は法定の従来技術の明白な変形物をこのような特許請求の範囲から明確に除外するために、適用される特許法に基づいて、補正を行う権利を留保する。このような補正された特許請求の範囲によって定義された本発明の変形も、本発明の態様として予定される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】図１は、抗体１Ｓ１、１Ｓ３、２．７、１８Ｂ１１、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１に対するオフ速度を示す。
【図１Ｂ】図１は、抗体１Ｓ１、１Ｓ３、２．７、１８Ｂ１１、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１に対するオフ速度を示す。
【図１Ｃ】図１は、抗体１Ｓ１、１Ｓ３、２．７、１８Ｂ１１、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１に対するオフ速度を示す。
【図１Ｄ】図１は、抗体１Ｓ１、１Ｓ３、２．７、１８Ｂ１１、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１に対するオフ速度を示す。
【図１Ｅ】図１は、抗体１Ｓ１、１Ｓ３、２．７、１８Ｂ１１、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１に対するオフ速度を示す。
【図１Ｆ】図１は、抗体１Ｓ１、１Ｓ３、２．７、１８Ｂ１１、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１に対するオフ速度を示す。
【図２】図２は、β−ラクタマーゼ鉄応答アッセイにおいて細胞内鉄濃度を低下させるマウス抗ヘプシジン抗体２．７の機能的能力を示す。
【図３】図３は、β−ラクタマーゼ鉄応答アッセイにおいて細胞内鉄濃度を低下させるヒト抗ヘプシジン抗体１８Ｂ１１、２３Ｆ１１及び２４Ｅ４の能力を示す。
【図４Ａ】図４は、抗ヘプシジン抗体がマウス中に注入されたヒトヘプシジンを中和することを示す。
【図４Ｂ】図４は、抗ヘプシジン抗体がマウス中に注入されたヒトヘプシジンを中和することを示す。
【図５Ａ】図５ＡからＥは、ウイルスによって発現されるマウスヒトヘプシジンの抗体中和化が正常な初期の赤血球の特徴を復活させることを示す。
【図５Ｂ】図５ＡからＥは、ウイルスによって発現されるマウスヒトヘプシジンの抗体中和化が正常な初期の赤血球の特徴を復活させることを示す。
【図５Ｃ】図５ＡからＥは、ウイルスによって発現されるマウスヒトヘプシジンの抗体中和化が正常な初期の赤血球の特徴を復活させることを示す。
【図５Ｄ】図５ＡからＥは、ウイルスによって発現されるマウスヒトヘプシジンの抗体中和化が正常な初期の赤血球の特徴を復活させることを示す。
【図５Ｅ】図５ＡからＥは、ウイルスによって発現されるマウスヒトヘプシジンの抗体中和化が正常な初期の赤血球の特徴を復活させることを示す。
【図６Ａ】図６ＡからＢは、抗体１８Ｂ１１での処置が正常な初期の赤血球の特徴を復活させたことを示す。
【図６Ｂ】図６ＡからＢは、抗体１８Ｂ１１での処置が正常な初期の赤血球の特徴を復活させたことを示す。
【図７Ａ】図７ＡからＢは、抗体１８Ｂ１１での処置が総ヘプシジンレベルの著しい低下をもたらすことを示す。
【図７Ｂ】図７ＡからＢは、抗体１８Ｂ１１での処置が総ヘプシジンレベルの著しい低下をもたらすことを示す。
【図８】図８は、アデノウイルス随伴ウイルス（ＡＡＶ）によって媒介されるヘプシジン発現の滴定及びその結果生じた血清鉄濃度を示す。
【図９】図９は、ヘプシジンのウイルスによる過剰発現がエリスロポエチンに対する低反応性を引き起こすことを示す。
【図１０Ａ】図１０ＡからＥは、抗ヘプシジン抗体がウイルスによってヘプシジンを過剰発現しているマウス中でのエリスロポエチンに対する応答性を復活させることを示す。
【図１０Ｂ】図１０ＡからＥは、抗ヘプシジン抗体がウイルスによってヘプシジンを過剰発現しているマウス中でのエリスロポエチンに対する応答性を復活させることを示す。
【図１０Ｃ】図１０ＡからＥは、抗ヘプシジン抗体がウイルスによってヘプシジンを過剰発現しているマウス中でのエリスロポエチンに対する応答性を復活させることを示す。
【図１０Ｄ】図１０ＡからＥは、抗ヘプシジン抗体がウイルスによってヘプシジンを過剰発現しているマウス中でのエリスロポエチンに対する応答性を復活させることを示す。
【図１０Ｅ】図１０ＡからＥは、抗ヘプシジン抗体がウイルスによってヘプシジンを過剰発現しているマウス中でのエリスロポエチンに対する応答性を復活させることを示す。
【図１１Ａ】図１１ＡからＣは、抗ヘプシジン抗体処置によるヘプシジンの中和が、炎症の貧血を有するヒトヘプシジンノックインマウス中でのエリスロポエチンに対する応答性を復活させることを示す。
【図１１Ｂ】図１１ＡからＣは、抗ヘプシジン抗体処置によるヘプシジンの中和が、炎症の貧血を有するヒトヘプシジンノックインマウス中でのエリスロポエチンに対する応答性を復活させることを示す。
【図１１Ｃ】図１１ＡからＣは、抗ヘプシジン抗体処置によるヘプシジンの中和が、炎症の貧血を有するヒトヘプシジンノックインマウス中でのエリスロポエチンに対する応答性を復活させることを示す。
【図１２】図１２は、癌患者の貧血（ＡｏＣ）中で、ヘプシジンレベルが上昇し、正常な患者中で、上昇しないことを示している。
【図１３】図１３は、ヘプシジンレベルが炎症性貧血の診断と相関し、鉄欠乏性貧血とは相関していないことを示している。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ヘプシジン測定の不存在下での、鉄指数及び患者を評価するための病状の決定木を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ヘプシジンレベルの測定を用いて、患者を評価するための理論的決定木を示している。
【図１５Ａ】図１５は、サンドイッチイムノアッセイによって測定されたプロヘプシジン濃度を示し、プロヘプシジンが血清中において検出できないことを示す。
【図１５Ｂ】図１５は、サンドイッチイムノアッセイによって測定されたプロヘプシジン濃度を示し、プロヘプシジンが血清中において検出できないことを示す。
【図１６】図１６は、２つのモノクローナル抗体が一度にヘプシジンに結合できることを示すＢｉａｃｏｒｅ実験の結果を示している。
【図１７】図１７は、成熟ヘプシジンに対して産生されたモノクローナル抗体を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡを構築できることを示す。
【図１８】図１８は、競合結合アッセイによって測定された緩衝液、ウサギ血清及びプールされたヒト血清中に存在するヘプシジンの濃度を示している。
【図１９】図１９は、ヒト血清中のヘプシジンの測定を示している。
【図２０】図２０は、競合結合アッセイを用いて、正常なヒト血清中に存在するヘプシジンの濃度を示している。
【図２１】図２１は、様々な時点における、抗体−ヘプシジン複合体を投与した後の抗体１Ｓ１及び１８Ｂ１１の血清抗体濃度を示している。
【図２２】図２２は、様々な時点における抗体抗原複合体を投与した後の血清ヘプシジン濃度を示している。
【図２３】図２３は、様々な時点における、抗体１Ｓ１又は１８Ｂ１１を予め投薬されたマウスにおける総尿ヘプシジン濃度を示している。
【図２４】図２４は、様々な時点における、抗体１８Ｂ１１及び１Ｓ１を投与した後の血清ヘプシジン濃度を示している。
【図２５】図２５は、様々な時点における、抗体１Ｓ１及び１８Ｂ１１を予め投薬されたマウスにおける血清ヘプシジン濃度を示している。
【図２６】図２６は、抗体１８Ｂ１１が細胞内ヘプシジンの蓄積を引き起こすことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
循環からの増強された標的抗原の排除と関連した１つ以上の特性を示す抗体が本明細書中に記載されている。通常、抗体は細胞内に取り込まれた後、受容体ＦｃＲｎ（配列番号４００）が関与する経路を介して、循環中へ再度リサイクルされる。例えば、「Ｐｒａｂｈａｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  １０４（１４）：５８８９−５８９４  （２００７）」を参照されたい。（単独の又は抗原と複合体を形成した）抗体は、細胞の酸性化されたエンドソーム内部に取り込まれる。次いで、酸性化されたエンドソーム中のこれらの抗体の幾つかはＦｃＲｎに結合し、次いで、ＦｃＲｎは抗体及びあらゆる会合した抗原を細胞外へリサイクルする。ＦｃＲｎに結合しなかった抗体及び／又は抗原は、リソゾームに輸送されて、そこで分解される。
【００３７】
本明細書では、約７．４未満のｐＨにおいて、抗原への異なるｐＨ結合を示す抗体及びこのような抗体を使用する治療の改善された方法が提供される。例えば、幾つかの実施形態において、このような抗体は、（約７．４のｐＨと比べて、約５．５又は約６のｐＨでの、５０倍から１０００倍以上の相対的ＫＤによって測定されるように）約７．４のｐＨと比べて、約５．５又は約６のｐＨで少なくとも約５０倍から１０００倍以上の低下した結合親和性で抗原に結合する。幾つかの実施形態において、抗体は、約６×１０−２ｓ−１若しくはそれ以上又は約１×１０−１ｓ−１若しくはそれ以上の、抗原に対する迅速なオフ速度を示す。このような抗体は、循環中の抗原を結合するが、約５．５又は約６のｐＨで酸性化されたエンドソーム中において抗原を放出する傾向があると予想される。酸性化されたリソゾーム中における抗原のより大きな放出には、標的抗原のより大きな分解及び抗原の増強された排除が伴う。別の特性は、さらなる抗原への結合のために、遊離抗体（抗原に結合していない）が循環中により多くリサイクルされることであり得る。これに対して、抗原を放出しない抗体は、抗体抗原複合体として、循環中により頻繁にリサイクルされ、抗体がさらなる抗原に結合することができなくなり、最終的には、さらなる抗原を循環から排除することができなくなる。
【００３８】
標的抗原の増加した（例えば、少なくとも１．５倍又は２倍）細胞内蓄積及び／又は循環からの抗原の増強された排除及び／又は循環している抗原の低下した蓄積をもたらす抗体及びこのような抗体を使用する改善された治療方法も提供される。このような抗体の他の特性には、循環中の抗体抗原複合体の構築の抑制が含まれ得、旧来の抗体より、抗原を結合するために利用可能なより多くのリサイクルされた遊離抗体、より優れた効力並びに治療的有効性を達成するために低下した用量及び／又は投与頻度が含まれ得る。
【００３９】
標的抗原には、産生の相対的に高いレベル及び／又は約２４時間若しくはそれ以下若しくは約１８、１２、８、４、３、２若しくは１時間若しくはそれ以下若しくは約４５、３０若しくは１５分若しくはそれ以下の短い循環中半減期を有する可溶性抗原が含まれ得る。一般に、抗体は、１×１０−６Ｍ若しくはそれ以下の範囲又は１０−１６Ｍ以下（例えば、約１０−６、約１０−７、約１０−８、約１０−９、約１０−１０、約１０−１１、約１０−１２、約１０−１３、約１０−１４、約１０−１５、約１０−１６以下）のＫＤ（より低いＫＤは、より優れた親和性を示唆する。）で標的抗原に結合する。
【００４０】
約７．４未満のｐＨにおいて、抗原への異なるｐＨ結合を示す抗体を同定すること、及び該抗体が、異なるｐＨ結合を示さない類似の若しくはより優れた結合親和性の抗体と比べて、増強された標的抗原の排除を示すことを場合によって示すこと、並びに／又は該抗体が、異なるｐＨ結合を示さない類似の若しくはより優れた結合親和性の抗体と比べて、標的抗原の増加した細胞内蓄積及び／若しくは循環抗原の低下した蓄積を示すことを場合によって示すことを含む、所望の特性を有する抗体をスクリーニングする方法も提供される。
【００４１】
別の態様において、上記特性を有する抗体の治療的有効量を投与することを含み、前記投与の前又は前記投与と同時に、標的抗原の循環血液レベルを検出すること、及び前記投与後（例えば、前記投与の約２４時間、２日、３、４、５、６、７日又は２週後）に、前記標的抗原の循環血液レベルを検出することを場合によって含む治療の方法が提供される。
【００４２】
ヘプシジンは、本明細書中に記載されている特性を示す抗体に対する優れた標的抗原である。ヘプシジンは、相対的に短い半減期を有する（Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，  １０６：２１９６−２１９９，  ２００５）。ヒトヘプシジン遺伝子は、８４残基のプレプロペプチド（配列番号８）をコードする。対応するｃＤＮＡ及びゲノム配列は、それぞれ、配列番号７及び１００に記載されている。まず、２４残基のＮ末端シグナルペプチド（配列番号８の残基１から２４）が切断されてプロヘプシジンを生成し、次いで、プロドメイン（配列番号８の残基２５から５９）の切断によってさらにプロセッシングされて、２５残基の成熟ヘプシジン（配列番号８の残基６０から８４、配列番号９に記載されている。）を生成する。主要な２５アミノ酸形態の他に、２０又は２２アミノ酸長のさらなるＮ末端切断形態が尿中に同定され得る（２０アミノ酸、配列番号９６及び２２アミノ酸、配列番号９８）。成熟ヒトヘプシジンは、８つのシステイン残基を含有し、本明細書において、順にＣ１からＣ８と称される（Ｎ末端からＣ末端へ付番される。）。
【００４３】
幾つかの実施形態において、本明細書中に記載される抗体は、Ｃ１−Ｃ８、Ｃ２−Ｃ４、Ｃ３−Ｃ６及びＣ５−Ｃ７の間でジスルフィド結合が形成されている正しく折り畳まれた生物活性を有する成熟ヒトヘプシジンに、所望の親和性で結合する。幾つかの実施形態において、抗体は、ヘプシジンの鉄制御活性を阻害する。幾つかの実施形態において、約１０−８Ｍ若しくはそれ以下又は約２０ｎＭ若しくはそれ以下のＥＣ５０で、モノクローナル抗体は細胞内鉄濃度を減少させ、及び／又は循環鉄濃度を増加させる。幾つかの実施形態において、抗体は、赤血球カウント（数）若しくはヘモグロビン若しくはヘマトクリットレベルを増加させる、並びに／又は網状赤血球数、網状赤血球平均細胞容積及び／若しくは網状赤血球ヘモグロビン含量を正常化させるという特性を哺乳動物中で示し、ヒトヘプシジンを過剰発現するマウスにおいて、抗体の単回投薬から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１日間又はそれより長く循環鉄レベル若しくはＴｓａｔを増加させる。
【００４４】
抗ヘプシジン抗体及び特異的結合剤
「抗体」という用語は、最も広義において使用され、完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（二重特異的抗体を含む。）、抗原を結合することができる抗体断片（Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディを含む。）、及び所望の生物活性を示す限りにおいて前述のものを含む組み換えペプチドが含まれる。完全な状態の分子及び／又は断片の多量体又は凝集物（化学的に誘導された抗体を含む。）が想定される。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２又はあらゆるアロタイプを含むあらゆるイソタイプクラス又はサブクラスの抗体が想定される。異なるイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３イソタイプは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。
【００４５】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、抗原への異なるｐＨ結合を示す。本明細書において使用される「異なるｐＨ結合」という用語は、約７．４のｐＨで、高い親和性（より低いＫＤ）で、その抗原に結合するが、より低いｐＨでは、より低い親和性（より高いＫＤ）で抗原に結合する抗体を表す。約７．４のｐＨより酸性のｐＨ（例えば、約７．０、約６．５、約６．０、約５．５、約５．０又は約４．５のｐＨ）で、その抗原に対して、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１０００以上高いＫＤを示す抗体が具体的に想定される。
【００４６】
本明細書において使用される「結合親和性」又は「親和性」という用語は、それぞれの抗原抗体相互作用に伴う平衡解離定数（ＫＤ）を表す。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、約ｐＨ７．４において、１×１０−６Ｍ若しくはそれ以下の範囲の、又は１０−１６若しくはそれ以下（例えば、約１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、１０−１４、１０−１５、１０−１６Ｍ以下）の範囲の、ヘプシジンに対するＫＤによって測定された結合親和性（ＫＤが小さいほど親和性が高いことを示す。）などの望ましい特性を示す。場合によって、さらに、抗体は、約７．４のｐＨと比較すると、約ｐＨ５．５又は約ｐＨ６で、少なくとも５０から１０００倍高い（より低い結合親和性）、ヘプシジンに対するＫＤを示す。平衡解離定数は、実施例３及び４に記載されているような、ＢＩＡｃｏｒｅ及び／又はＫｉｎＥｘＡを使用する溶液平衡アッセイにおいて測定することができる。
【００４７】
結合親和性は、速度論的オン速度（一般に、単位時間当たりの濃度の単位で表される、例えば、Ｍ／ｓ）によって割られた速度論的オフ速度（一般に、時間の逆数の単位で表される、例えば、ｓ−１）の比に直接関連する。遅いオフ速度は長期間にわたる相互作用のより大きな程度を予測するので、オフ速度分析はインビボで起こる相互作用を推測することができる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、約ｐＨ５．５又は約ｐＨ６で、約６×１０−２ｓ−１若しくはそれ以上又は約１×１０−１ｓ−１若しくはそれ以上のオフ速度（より速いオフ速度）を示す。場合によって、抗体は、約ｐＨ７．４で、１×１０−３ｓ−１以下（より遅いオフ速度）のオフ速度も示す。他の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、約ｐＨ７．４でのオフ速度と比較すると、約ｐＨ５．５又は約ｐＨ６において、少なくとも約１０倍、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００倍のオフ速度（ｓ−１で測定される。）を示す。
【００４８】
他の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトヘプシジンに対して特異性を示し、又はヒトヘプシジンに特異的に結合する。本明細書において使用される場合、抗体が、異なるファミリー中の他の無関係なタンパク質と比べて、ヒトヘプシジンに対して有意により高い結合親和性を有し、その結果、識別が可能となる場合に、抗体は、ヒトヘプシジンに「対して特異的」であり、又はヒトヘプシジンを「特異的に結合する」。幾つかの実施形態において、このような抗体は、マウス、ラット又は霊長類ヘプシジンなどの他の種のヘプシジンとも交叉反応し得るのに対して、他の実施形態では、抗体は、ヒト又は霊長類ヘプシジンのみに結合し、げっ歯類のヘプシジンには有意に結合しない。幾つかの実施形態において、抗体は、ヒト及びカニクイザルヘプシジンに結合するが、げっ歯類ヘプシジンには有意に結合しない。幾つかの実施形態において、ヘプシジンに対して特異的な抗体は同じファミリー中の他のタンパク質と交叉反応するのに対して、他の実施形態では、抗体は、他の関連するファミリーの一員（デフェンシン又はマウスｈｅｐｃ２を含む。）からヘプシジンを識別する。
【００４９】
幾つかの実施形態において、抗体は「増大した標的抗原の排除」を示し、抗体が総標的抗原の循環血液レベルのより速い又はより大きな低下をもたらすことを意味する。例えば、異なるｐＨ結合を示さない抗体と比べて増大した抗原の排除は、ある時点で（例えば、抗体の投与から約１２、２４、３６、４８又は７２時間後）、標的抗原の血液レベルを比較することによって測定することができる。増大した抗原の排除は、同じ時点で、血液レベルのより大きな低下をもたらす。あるいは、例えば、増大した抗原の排除は、標的抗原を、抗体の投与前のその血液レベルの例えば、２５％、５０％、７５％又は９０％まで低下させるのに必要とされる時間を比較することによって測定することができる。増大した抗原の排除は、このような低下を達成するためにより短い時間をもたらす。さらに別の例として、増大した抗原の排除は、標的抗原の細胞内蓄積によって測定した場合に、ＦｃＲｎを発現する細胞中への標的抗原のより大きな内部取り込みによって示される。
【００５０】
さらに別の実施形態において、モノクローナル抗体は、インビトロ又はインビボにおいて、ヘプシジンの鉄制御活性を阻害（又は中和）する。このようなヘプシジン中和抗体は、ヘプシジン関連疾患又は鉄恒常性の障害に対して治療的に有用である。ヘプシジン中和活性は、多数のマーカー、例えば、フェリチン／鉄レベル、赤血球数、赤血球の特徴（ヘモグロビン含量及び／又は細胞容積）、早期赤血球の特徴（網状赤血球数、ヘモグロビン含量又は細胞容積）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ；ｅｄｉｔｏｒ  Ｍａｒｙ  Ｌ．Ｔｕｒｇｅｏｎ，１９９９）、フェロポーティン内部取り込み又は鉄輸送を通じて測定することができる。一実施形態において、モノクローナル抗体は、約１０−８Ｍ以下のＥＣ５０で細胞内鉄濃度を減少させ、及び／又は循環鉄濃度を増加させる。
【００５１】
幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されているモノクローナル抗体は、ヒトヘプシジンの効果を拮抗し、又はヘプシジンの鉄制御活性を阻害する。幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されているモノクローナル抗体は、約１×１０−８Ｍ若しくはそれ以下又は約１×１０−７Ｍ若しくはそれ以下のＥＣ５０で効果を発揮する。例えば、抗体は、約１×１０−８Ｍ若しくはそれ以下のＥＣ５０で細胞中の細胞内鉄レベルを減少させ得、又はフェリチンアッセイによって測定された場合に、約１×１０−８Ｍ若しくはそれ以下のＥＣ５０でフェリチン発現を低下させ得る。他の実施形態において、本明細書に記載されているモノクローナル抗体は、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％、遊離血清ヘプシジンレベルを低下させ得る。他の実施形態において、本明細書に記載されているモノクローナル抗体は、赤血球カウント（数）、赤血球の平均細胞容積又は赤血球のヘモグロビン含量を増加させ、ヘモグロビンを増加させ、ヘマトクリットを増加させ、Ｔｓａｔを増加させ、循環（又は血清）鉄レベルを増加させ、及び／又は網状赤血球数、網状赤血球平均細胞容積、網状赤血球ヘモグロビン含量又は網状赤血球数を増加若しくは正常化させ得る。
【００５２】
幾つかの実施形態において、本発明は、以下のものを想定する。１）抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９、１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｂ１１、１８Ｄ８、１９Ｂ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２０Ｅ１２、２２Ｆ１２、２２Ｈ１０、２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２４Ｅ４及び２６Ｆ１１の何れかのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３の何れか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを保持し、１つ又は２つの変異を場合によってこのようなＣＤＲ中に含み、約５．５又は約６のｐＨで異なるｐＨ結合及び／又は迅速なオフ速度（例えば、６×１０−２ｓ−１以上）及び／又は増大したヘプシジンの排除を示すモノクローナル抗体；２）抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９、１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｂ１１、１８Ｄ８、１９Ｂ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２０Ｅ１２、２２Ｆ１２、２２Ｈ１０、２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２４Ｅ４及び２６Ｆ１１の何れかのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３の全て又は重鎖可変領域を保持し、１つ又は２つの変異を場合によってこのようなＣＤＲ中に含み、約５．５若しくは約６のｐＨで異なるｐＨ結合及び／又は迅速なオフ速度（例えば、６×１０−２ｓ−１以上）及び／又は増大したヘプシジンの排除を示すモノクローナル抗体；３）抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９、１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｂ１１、１８Ｄ８、１９Ｂ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２０Ｅ１２、２２Ｆ１２、２２Ｈ１０、２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２４Ｅ４及び２６Ｆ１１の何れかのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３の全て又は軽鎖可変領域を保持し、１つ又は２つの変異を場合によってこのようなＣＤＲ中に含み、約５．５又は約６のｐＨで異なるｐＨ結合及び／又は迅速なオフ速度（例えば、６×１０−２ｓ−１以上）及び／又は増大したヘプシジンの排除を示すモノクローナル抗体；４）例えば、Ｘ線結晶解析学を通じて測定された場合に、抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９；１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｂ１１、１８Ｄ８、１９Ｂ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２０Ｅ１２、２２Ｆ１２、２２Ｈ１０、２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２４Ｅ４及び２６Ｆ１１と同じ成熟ヒトヘプシジンのエピトープに結合し、又は配列番号９のアミノ酸１から５内のアミノ酸及び／又は配列番号９のアミノ酸１０から１３によって形成されるループ内のアミノ酸及び／又は配列番号９のアミノ酸１４から２２によって形成されるループ内のアミノ酸を含む立体構造エピトープに結合し、約５．５若しくは約６のｐＨで、異なるｐＨ結合及び／又は迅速なオフ速度（例えば、６×１０−２ｓ−１以上）及び／又は増大したヘプシジンの排除を示すモノクローナル抗体；５）成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、約７５％超、約８０％超又は約８１％、８２％、８３％���８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％（例えば、競合的ＥＬＩＳＡ又はＢｉａｃｏｒｅ又は本分野で公知の他の方法によって評価される。）、抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９、１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｂ１１、１８Ｄ８、１９Ｂ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２０Ｅ１２、２２Ｆ１２、２２Ｈ１０、２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２４Ｅ４及び２６Ｆ１１と競合し、約５．５若しくは約６のｐＨで、異なるｐＨ結合及び／又は迅速なオフ速度（例えば、６×１０−２ｓ−１以上）及び／又は増大したヘプシジンの排除を示すモノクローナル抗体；６）ＢＩＡｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡによって測定された場合に、１×１０−８Ｍ若しくはそれ以下の範囲又は１０−１６Ｍ以下の範囲（例えば、約１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、１０−１４、１０−１５、１０−１６Ｍ以下）のヘプシジンに対する親和性ＫＤ（平衡解離定数）で、配列番号９のヒトヘプシジンに特異的に結合し、ｉ）約ｐＨ７．４と比較して、約５．５又は約６のｐＨにおいて、少なくとも約５０から１０００倍低い親和性（又はより高いＫＤ）によって示される異なるｐＨ結合；ｉｉ）抗体１Ｓ１と比較して、前記ヘプシジンの少なくとも約５、６、７、８、９又は１０倍速い排除；ｉｉｉ）例えば、約ｐＨ５．５若しくは約ｐＨ６での約６×１０−２ｓ−１若しくはそれ以上のオフ速度又は約ｐＨ５．５若しくは約ｐＨ６での約１×１０−１ｓ−１若しくはそれ以上のオフ速度又は約ｐＨ７．４でのオフ速度と比べて、約ｐＨ５．５若しくは約ｐＨ６での少なくとも約１０倍、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００倍若しくはそれ以上のオフ速度によって測定される迅速なオフ速度；ｉｖ）（ｉ）１ｍｇ用量の抗体及び（ｉｉ）１ｍｇ用量の抗体との３．７μｇのヒトヘプシジンの予め複合体化された単回用量をＣ５７ＢＬ／６マウスに投与してから約２４時間後に、前記マウスにおいて少なくとも約９０％血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを低下させる；ｖ）３．７μｇのヒトヘプシジンの単回用量を前記マウスに投与してから２４時間後に、少なくとも約９０％、マウス中の血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを低下させる（前記ヘプシジンは、前記マウスが前記抗体を予め投薬されてから３日後に投与される。）；ｖｉ）抗体１Ｓと比べて、ＦｃＲｎ形質移入されたＨＥＫ２９３細胞中への少なくとも約１．５倍又は２倍高いヒトヘプシジンの細胞内蓄積をもたらす；ｖｉｉ）抗体１Ｓ１と比べて、例えば、約２４時間に、本抗体で処理されたマウス中に、総血清ヘプシジンの総蓄積の約５０％を超える低下をもたらす；及び／又はｖｉｉｉ）抗体の単回投薬後に、少なくとも約１日間、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１日間若しくはそれ以上、ヘプシジンを発現しているマウス中の循環鉄レベル若しくはＴｓａｔを増加させるからなる群から選択される特性の少なくとも１つ、２つ、���つ以上を示すモノクローナル抗体。
【００５３】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、約ｐＨ７．４と比較して、約５．５又は約６のｐＨにおいて、少なくとも約５０から１０００倍低い親和性（又はより高いＫＤ）によって示される異なるｐＨ結合を示し、並びに（１）抗体１Ｓ１と比較して、前記ヘプシジンの少なくとも約５、６、７、８、９若しくは１０倍速い排除；及び／又は（２）約ｐＨ５．５若しくは約ｐＨ６での迅速なオフ速度（例えば、約６×１０−２ｓ−１以上）；及び／又は（３）（ｉ）１ｍｇ用量の本抗体及び（ｉｉ）１ｍｇ用量の本抗体と３．７μｇのヒトヘプシジンの予め複合体化された単回用量をＣ５７ＢＬ／６マウスに投与してから約２４時間後に、Ｃ５７ＢＬマウスにおいて、少なくとも約９０％血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを低下させる；及び／又は（４）３．７μｇのヒトヘプシジンの単回用量を前記マウスに投与してから約２４時間後に、少なくとも約９０％、マウス中の血清中総ヒトヘプシジンのレベルを低下させる（前記ヘプシジンは、前記マウスが前記抗体を予め投薬されてから３日後に投与される。）；及び／又は（５）抗体１Ｓ１と比べて、ＦｃＲｎ形質移入されたＨＥＫ２９３細胞中での、少なくとも約１．５倍若しくは２倍高いヒトヘプシジンの細胞内蓄積をさらにもたらす；及び／又は（６）抗体１Ｓ１と比べて、本抗体で処理されたマウス中への、総血清ヘプシジンの総蓄積の約５０％を超える低下をもたらす；及び／又は（７）抗体の単回投薬後、少なくとも約１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日間若しくはそれ以上、ヘプシジンを発現しているマウス中の循環鉄レベル若しくはＴｓａｔを増加させる；ことも示す。
【００５４】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、抗体１Ｓ１と比べて、前記ヘプシジンの少なくとも約５、６、７、８、９若しくは１０倍速い排除を示し、（１）（ｉ）１ｍｇ用量の抗体及び（ｉｉ）１ｍｇ用量の抗体ととの３．７μｇのヒトヘプシジンの予め複合体化された単回用量をＣ５７ＢＬ／６マウスに投与してから約２４時間後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、少なくとも約９０％血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを低下させる；及び／又は（２）３．７μｇのヒトヘプシジンの単回用量を前記マウスに投与してから約２４時間後に、少なくとも約９０％、マウスにおいて、血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを低下させる（前記ヘプシジンは、前記マウスが前記抗体を予め投薬されてから３日後に投与される。）；及び／又は（３）抗体１Ｓ１と比べて、ＦｃＲｎ形質移入されたＨＥＫ２９３細胞中への少なくとも約１．５倍若しくは２倍高いヒトヘプシジンの細胞内蓄積をもたらす；及び／又は（４）抗体１Ｓ１と比べて、本抗体で処理されたマウス中への、総血清ヘプシジンの総蓄積の約５０％を超える低下をもたらす；及び／又は（５）抗体の単回投薬後、少なくとも約１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日間若しくはそれ以上、ヘプシジンを発現しているマウス中の循環鉄レベル若しくはＴｓａｔを増加させる。
【００５５】
幾つかの実施形態において、抗体は、約ｐＨ５．５又は約ｐＨ６で、迅速なオフ速度（例えば、約６×１０−２ｓ−１以上）を示し、（１）（ｉ）１ｍｇ用量の抗体及び（ｉｉ）１ｍｇ用量の抗体との、３．７μｇのヒトヘプシジンの予め複合体化された単回用量をＣ５７ＢＬ／６マウスに投与してから約２４時間後に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、少なくとも約９０％血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを低下させる；及び／又は（２）３．７μｇのヒトヘプシジンの単回用量を前記マウスに投与してから約２４時間後に、少なくとも約９０％、マウスにおいて、血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを低下させる（前記ヘプシジンは、前記マウスが前記抗体を予め投薬されてから３日後に投与される。）；及び／又は（３）抗体１Ｓ１と比べて、ＦｃＲｎ形質移入されたＨＥＫ２９３細胞中への少なくとも約１．５倍若しくは２倍高いヒトヘプシジンの細胞内蓄積をもたらす；及び／又は（４）抗体１Ｓ１と比べて、本抗体で処理されたマウス中への、総血清ヘプシジンの総蓄積の約５０％を超える低下をもたらす；及び／又は（５）抗体の単回投薬後、少なくとも約１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日間若しくはそれ以上、ヘプシジンを発現しているマウス中の循環鉄レベル若しくはＴｓａｔも増加させる。
【００５６】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は３．７μｇのヒトヘプシジンの単回用量を前記マウスに投与してから約２４時間後に、マウスにおいて、少なくとも約９０％血清中の総ヒトヘプシジンのレベルを低下させ（前記ヘプシジンは、前記マウスが前記抗体を予め投薬されてから３日後に投与される。）、並びに（１）抗体１Ｓ１と比べて、ＦｃＲｎ形質移入されたＨＥＫ２９３細胞中への少なくとも約１．５倍若しくは２倍高いヒトヘプシジンの細胞内蓄積をもたらす；及び／又は（２）抗体１Ｓ１と比べて、本抗体で処理されたマウス中への、総血清ヘプシジンの総蓄積の約５０％を超える低下をもたらす；及び／又は（３）抗体の単回投薬後、少なくとも約１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日間若しくはそれ以上、ヘプシジンを発現しているマウス中の循環鉄レベル若しくはＴｓａｔも増加させる。
【００５７】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、抗体１Ｓ１と比べて、ＦｃＲｎ形質移入されたＨＥＫ２９３細胞中への少なくとも約１．５倍又は２倍高いヒトヘプシジンの細胞内蓄積をもたらし；並びに抗体１Ｓ１と比べて、本抗体で処理されたマウス中への、総血清ヘプシジンの総蓄積の約５０％を超える低下をもたらし；及び／又は抗体の単回投薬後、少なくとも約１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日間以上、ヘプシジンを発現しているマウス中の循環鉄レベル又はＴｓａｔも増加させる。
【００５８】
別の態様において、異なるｐＨ結合及び／又は増大した標的抗原の排除などの特性を示す抗体を作製するために、このような特性を欠如する抗体を修飾する方法が提供される。抗体は、このような方法によって作製される抗ヘプシジン抗体であり得る。幾つかの実施形態において、ＣＤＲ中の残基及び／又は三次元モデルによれば、約５．５から約７．４のｐＨの範囲のｐＫａを有するアミノ酸の導入によって最も影響を受けると予想される残基が、例えば、ヒスチジンなどのアミノ酸の導入によって変異される。ヒスチジンのイミダゾール側鎖はちょうど６を超えるｐＫａを有する（アミノ酸の環境に応じて、僅かにより高く又はより低く変動し得る。）ので、７．４から６．０へのｐＨシフトに対して感受性を有するアミノ酸である。例えば、ｐＨが約７．４から約６．０又は５．５のより低いｐＨへ変化すると、変異された抗体はアロステリックな立体構造の変化を経験し得、これは、抗原抗体相互作用を破壊する。
【００５９】
変異のための候補残基には、抗原との直接接触部位又は抗体抗原結合界面に沿った電荷−電荷相互作用の形成に寄与する部位である残基が含まれる。他の候補残基には、抗体の保存された領域内の残基が含まれる。さらに別の候補残基には、少なくとも１０％表面露出され、ＣＤＲ残基の４．５オンスグトローム以内にあるフレームワーク残基が含まれる。さらなる候補残基には、ＣＤＲ又は選択されたフレームワーク残基と近接するアミノ酸に関して、３次元構造モデルの視覚的検査によって選択された残基が含まれる。ヒスチジン又は他の所望のアミノ酸は、アミノ酸配列内の単一又は複数の位置において変異させることができる。例えば、幾らかの異なるｐＨ結合効果を単一の変異として生成する変異を、二重、三重以上の多重変異として組み合わせることができる。このようにして変異された抗体は、次いで、異なるｐＨ結合に関してスクリーニングされ、次いで、他の特性に関してさらにスクリーニングされ得る。
【００６０】
一態様において、前記抗体の重鎖可変領域中の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上の残基が欠失され、ヒスチジン残基で置換される。別の態様において、前記抗体の軽鎖可変領域中の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ以上の残基が欠失され、ヒスチジン残基で置換される。幾つかの態様において、前記抗体の軽鎖可変領域からの少なくとも１つの残基及び前記抗体の重鎖可変領域からの少なくとも１つの残基がヒスチジン残基で置換される。一実施形態において、配列番号１７０の５２、５７、９９及び１０７からなる群から選択される位置の重鎖可変領域中の少なくとも１つの残基がヒスチジン残基で置換される。別の実施形態において、配列番号１６８の２７及び８９からなる群から選択される位置の軽鎖可変領域中の少なくとも１つの残基がヒスチジン残基で置換される。別の実施形態において、配列番号１７０の重鎖可変領域の５７位及び１０７位のアミノ酸がヒスチジンで置換される。別の実施形態において、配列番号１７０の重鎖可変領域の１０７位及び配列番号１６８の軽鎖可変領域の２７位のアミノ酸がヒスチジンで置換される。別の実施形態において、配列番号１７０の重鎖可変領域の１０７位のアミノ酸及び配列番号１６８の軽鎖可変領域の８９位のアミノ酸がヒスチジンで置換される。別の実施形態において、配列番号１７０の重鎖可変領域の９９位及び１０７位のアミノ酸がヒスチジンで置換される。
【００６１】
一実施形態において、抗体は、配列番号１６から２１（Ａｂ４３）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２８から３３（２．７ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号４０から４５（２．４１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号５２から５７（Ｒ９ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１１１から１１６（１Ｃ９ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１２１から１２６（３Ｂ３ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号１３１から１３６（４Ｅ１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１４１から１４６（７Ａ３ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１５１から１５６（９Ｄ１２ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１６１から１６６（１２Ｂ９ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号１７１から１７６（１５Ｅ１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３３４から３３９（１８Ｂ１１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３１４から３１９（１８Ｄ８ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３４４から３４９（１９Ｂ８ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３２４から３２９（１９Ｃ１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号２９４から２９９（１９Ｄ１２ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３０４から３０９（１９Ｈ６ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３５４から３５９（２０Ｅ１２ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３６４から３６９（２２Ｆ１２ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３７４から３７９（２２Ｈ１０ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３８４から３８９（２３Ａ１１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号１８１から１３８６（２３Ｆ１１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３９４から３９９（２４Ｅ４ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１９１から１９６（２６Ｆ１１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２０３から２０５及び１３１から１３３（１Ｓ１ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２１４から２１６及び１４４から１４６（１Ｓ２ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。さらに別の実施形態において、抗体は、配列番号２２５から２５７及び１６４から１６６（１Ｓ３ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２３６から２３８及び１７４から１４６（１Ｓ４ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２４７から２４９及び１８４から１４６（１Ｓ５ＣＤＲ）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は全てを含む。
【００６２】
幾つかの実施形態において、抗体は、３つの軽鎖ＣＤＲ全て、３つの重鎖ＣＤＲ全て又は６つのＣＤＲ全てを含む。幾つかの実施形態において、ある抗体由来の２つの軽鎖ＣＤＲは、異なる抗体由来の第三の軽鎖ＣＤＲと組み合わされ得る。あるいは、特にＣＤＲが高度に相同的である場合に、ある抗体由来のＣＤＲＬ１は、異なる抗体由来のＣＤＲＬ２及びさらに別の抗体由来のＣＤＲＬ３と組み合わせることができる。同様に、特に、ＣＤＲが高度に相同的である場合に、ある抗体由来の２つの重鎖ＣＤＲは、異なる抗体由来の第三の重鎖ＣＤＲと組み合わされ得る。すなわち、ある抗体由来のＣＤＲＨ１は、異なる抗体由来のＣＤＲＨ２及びさらに別の抗体由来のＣＤＲＨ３と組み合わせることができる。
【００６３】
コンセンサスＣＤＲも使用され得る。一実施形態において、抗体は、配列番号７４（ＸＡＳＮＬＥＳ）、配列番号７５（ＸＱＳＮＥＥ）及び配列番号７６（ＱＱＸＮＥＸ）、配列番号２８（ＲＡＳＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨ）、配列番号７７（ＷＩＮＴＸＳＧＶＰＴＹＡＤＤＦＸＧ）、配列番号７８（ＸＸＹＹＧＸ＊Ａ＊Ｙ）、配列番号１９（ＴＹＧＭＳ）、配列番号２８４（ＶＩＸＹＸＸＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ）、配列番号２８５（ＷＩＸＡＸＮＧＸＸＸＸＡＸＸＸＱＸ）、配列番号２８６（ＡＱＥＧＸＡＰＤＡＦＤＩ）、配列番号２８７（ＱＡＷＹＳＳＴＮＶＸ）、配列番号２８８（ＱＡＷＤＳＳＴＡＸＸ）、配列番号２８９（ＱＳＤＹＳＳＸＸＸ＊＊）に記載されているアミノ酸配列の１つ以上を含む（Ｘは任意のアミノ酸であり、＊は不存在又は任意のアミノ酸であり得る。）。
【００６４】
さらに別の典型的な実施形態において、抗体は、抗体の軽鎖及び／又は重鎖可変領域、例えば、配列番号１５（Ａｂ４３重鎖可変領域）及び／又は配列番号１３（Ａｂ４３軽鎖可変領域）；配列番号２７（２．７重鎖可変領域）及び／又は配列番号２５（２．７軽鎖可変領域）；配列番号３９（２．４１重鎖可変領域）及び／又は配列番号３７（２．４１軽鎖可変領域）；又は配列番号５１（Ｒ９重鎖可変領域）及び／又は配列番号４９（Ｒ９軽鎖可変領域）、配列番号１１０（１Ｃ９重鎖可変領域）及び／又は配列番号１０８（１Ｃ９軽鎖可変領域）；又は配列番号１２０（３Ｂ３重鎖可変領域）及び／又は配列番号１１８（３Ｂ３軽鎖可変領域）；配列番号１３０（４Ｅｌ重鎖可変領域）及び／又は配列番号１２８（４Ｅ１軽鎖可変領域）；又は配列番号１４０（７Ａ３重鎖可変領域）及び／又は配列番号１３８（７Ａ３軽鎖可変領域）；又は配列番号１５０（９Ｄ１２重鎖可変領域）及び／又は配列番号１４８（９Ｄ１２軽鎖可変領域）；配列番号１６０（１２Ｂ９重鎖可変領域）及び／又は配列番号１５８（１２Ｂ９軽鎖可変領域）；配列番号１７０（１５Ｅ１重鎖可変領域）及び／又は配列番号１６８（１５Ｅ１軽鎖可変領域）；配列番号３３３（１８Ｂ１１重鎖可変領域）及び／又は配列番号３３１（１８Ｂ１１軽鎖可変領域）；配列番号３１３（１８Ｄ８重鎖可変領域）；配列番号３１１（１８Ｄ８軽鎖可変領域）；配列番号３４３（１９Ｂ８重鎖可変領域）及び／又は配列番号３４１（１９Ｂ８軽鎖可変領域）；配列番号３２３（１９Ｃ１重鎖可変領域）及び／又は配列番号３２１（１９Ｃ１軽鎖可変領域）；配列番号２９３（１９Ｄ１２重鎖可変領域）及び／又は配列番号２９１（１９Ｄ１２軽鎖可変領域）；配列番号３０３（１９Ｈ６重鎖可変領域）及び／又は配列番号３０１（１９Ｈ６軽鎖可変領域）；配列番号３５３（２０Ｅ１２重鎖可変領域）及び／又は配列番号３５１（２０Ｅ１２軽鎖可変領域）；配列番号３６３（２２Ｒ１２重鎖可変領域）及び／又は配列番号３６１（２２Ｆ１２軽鎖可変領域）；配列番号３７３（２２Ｈ１０重鎖可変領域）及び／又は配列番号３７１（２２Ｈ１０軽鎖可変領域）；配列番号３８３（２３Ａ１１重鎖可変領域）及び／又は配列番号３８１（２３Ａ１１軽鎖可変領域）；配列番号１８０（２３Ｆ１１重鎖可変領域）及び／又は配列番号１７８（２３Ｆ１１軽鎖可変領域）；配列番号３９３（２４Ｅ４重鎖可変領域）及び／又は配列番号３９１（２４Ｅ４軽鎖可変領域）；配列番号１９０（２６Ｆ１１重鎖可変領域）及び／又は配列番号１８８（２６Ｆ１１軽鎖可変領域）；又は配列番号２０２（１Ｓ１重鎖可変領域）及び／又は配列番号１２８（１Ｓ１軽鎖可変領域）；配列番号２１３（１Ｓ２軽鎖可変領域）及び／又は配列番号１４０（１Ｓ２重鎖可変領域）；配列番号２２４（１Ｓ３軽鎖可変領域）及び／又は配列番号１６０（１Ｓ３重鎖可変領域）；配列番号２３５（１Ｓ４軽鎖可変領域）及び／又は配列番号１７０（１Ｓ４重鎖可変領域；又は配列番号２４６（１Ｓ５軽鎖可変領域）及び／又は配列番号１９０（１Ｓ５重鎖可変領域）を含む。
【００６５】
幾つかの実施形態において、配列番号１５（Ａｂ４３重鎖可変領域）、２７（２．７重鎖可変領域）、３９（２．４１重鎖可変領域）、５１（Ｒ９重鎖可変領域）、１１０（１Ｃ９重鎖可変領域）、１２０（３Ｂ３重鎖可変領域）、１３０（４Ｅｌ重鎖可変領域）、１４０（７Ａ３重鎖可変領域）、１５０（９Ｄ１２重鎖可変領域）、１６０（１２Ｂ９重鎖可変領域）、１７０（１５Ｅ１重鎖可変領域）、３３３（１８Ｂ１１重鎖可変領域）、３１３（１８Ｄ８重鎖可変領域）、３４３（１９Ｂ４重鎖可変領域）、３２３（１９Ｃ１重鎖可変領域）、２９３（１９Ｄ１２重鎖可変領域）、３０３（１９Ｈ６重鎖可変領域）、３５３（２０Ｅ１２重鎖可変領域）、３６３（２２Ｆ１２重鎖可変領域）、３７３（２２Ｈ１０重鎖可変領域）、３８３（２３Ａ１１重鎖可変領域）、１８０（２３Ｆ１１重鎖可変領域）、３９３（２４Ｅ４重鎖可変領域）、１９０（２６Ｆ１１重鎖可変領域）、２０２（１Ｓ１重鎖可変領域）、１３（Ａｂ４３軽鎖可変領域）、２５（２．７軽鎖可変領域）、３７（２．４１軽鎖可変領域）、４９（Ｒ９軽鎖可変領域）、１０８（１Ｃ９軽鎖可変領域）、１１８（３Ｂ３軽鎖可変領域）、１２８（４Ｅ１軽鎖可変領域）、１３８（７Ａ３軽鎖可変領域）、１４８（９Ｄ１２軽鎖可変領域）、１５８（１２Ｂ９軽鎖可変領域）、１６８（１５Ｅ１軽鎖可変領域）、３３１（１８Ｂ１１軽鎖可変領域）、３１１（１８Ｄ８軽鎖可変領域）、３４１（１９Ｂ８軽鎖可変領域）、３２１（１９Ｃ１軽鎖可変領域）、２９１（１９Ｄ１２軽鎖可変領域）、３０１（１９Ｈ６軽鎖可変領域）、３５１（２０Ｅ１２軽鎖可変領域）、３６１（２２Ｆ１２軽鎖可変領域）、３７１（２２Ｈ１０軽鎖可変領域）、３８１（２３Ａ１１軽鎖可変領域）、１７８（２３Ｆ１１軽鎖可変領域）、３９１（２４Ｅ４軽鎖可変領域）、１８８（２６Ｆ１１軽鎖可変領域）、２１３（１Ｓ２軽鎖可変領域）、２２４（１Ｓ３軽鎖可変領域）、２３５（１Ｓ４軽鎖可変領域）、２４６（１Ｓ５軽鎖可変領域）からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む抗体が提供され、前記ポリペプチドは、配列番号１６から２１（Ａｂ４３ＣＤＲ）、２８から３３（２．７ＣＤＲ）、４０から４５（２．４１ＣＤＲ）、５２から５７（Ｒ９ＣＤＲ）、１１１から１１６（１Ｃ９ＣＤＲ）、１２１から１２６（３Ｂ３ＣＤＲ）、１３１から１３６（４Ｅ１ＣＤＲ）、１４１から１４６（７Ａ３ＣＤＲ）、１５１から１５６（９Ｄ１２ＣＤＲ）、１６１から１６６（１２Ｂ９ＣＤＲ）、１７１から１７６（１５Ｅ１ＣＤＲ）、３３４から３３９（１８Ｂ１１ＣＤＲ）、３１４から３１９（１８Ｄ８ＣＤＲ）、３４４から３４９（１９Ｂ８ＣＤＲ）３２４から３２９（１９Ｃ１ＣＤＲ）、２９４から２９９（１９Ｄ１２ＣＤＲ）、３０４から３０９（１９Ｈ６ＣＤＲ）、３５４から３５９（２０Ｅ１２ＣＤＲ）、３６４から３６９（２２Ｆ１２ＣＤＲ）、３７４から３７９（２２Ｈ１０ＣＤＲ）、３８４から３８９（２３Ａ１１ＣＤＲ）、１８１から１８６（２３Ｆ１１ＣＤＲ）、３９４から３９９（２４Ｅ４ＣＤＲ）１９１から１９６（２６Ｆ１１ＣＤＲ）、２０３から２０５（１Ｓ１軽鎖ＣＤＲ）及び１３１から１３３（１Ｓ１重鎖ＣＤＲ）、２１４から２１６（１Ｓ２重鎖ＣＤＲ）及び１４４から１４６（１Ｓ２軽鎖ＣＤＲ）、２２５から２２７（１Ｓ３重鎖ＣＤＲ）及び１６４から１６６（１Ｓ３軽鎖ＣＤＲ）、２３６から２３８（１Ｓ４重鎖ＣＤＲ）及び１７４から１７６（１Ｓ４軽鎖ＣＤＲ）並びに２４７から２４９（１Ｓ５重鎖ＣＤＲ）及び１８４から１８６（１Ｓ５軽鎖ＣＤＲ）に記載されているアミノ酸配列の少なくとも１つ以上をさらに含む。先述されている実施形態の何れかにおいて、ポリペプチドは、配列番号：１６から２１（Ａｂ４３ＣＤＲ）、２８から３３（２．７ＣＤＲ）、４０から４５（２．４１ＣＤＲ）、５２から５７（Ｒ９ＣＤＲ）、１１１から１１６（１Ｃ９ＣＤＲ）、１２１から１２６（３Ｂ３ＣＤＲ）、１３１から１３６（４Ｅ１ＣＤＲ）、１４１から１４６（７Ａ３ＣＤＲ）、１５１から１５６（９Ｄ１２ＣＤＲ）、１６１から１６６（１２Ｂ９ＣＤＲ）、１７１から１７６（１５Ｅ１ＣＤＲ）、３３４から３３９（１８Ｂ１１ＣＤＲ）、３１４から３１９（１８Ｄ８ＣＤＲ）、３４４から３４９（１９Ｂ８ＣＤＲ）３２４から３２９（１９Ｃ１ＣＤＲ）、２９４から２９９（１９Ｄ１２ＣＤＲ）、３０４から３０９（１９Ｈ６ＣＤＲ）、３５４から３５９（２０Ｅ１２ＣＤＲ）、３６４から３６９（２２Ｆ１２ＣＤＲ）、３７４から３７９（２２Ｈ１０ＣＤＲ）、３８４から３８９（２３Ａ１１ＣＤＲ）、１８１から１８６（２３Ｆ１１ＣＤＲ）、３９４から３９９（２４Ｅ４ＣＤＲ）１９１から１９６（２６Ｆ１１ＣＤＲ）、２０３から２０５（１Ｓ１軽鎖ＣＤＲ）及び１３１から１３３（１Ｓ１重鎖ＣＤＲ）、２１４から２１６（１Ｓ２重鎖ＣＤＲ）及び１４４から１４６（１Ｓ２軽鎖ＣＤＲ）、２２５から２２７（１Ｓ３重鎖ＣＤＲ）及び１６４から１６６（１Ｓ３軽鎖ＣＤＲ）、２３６から２３８（１Ｓ４重鎖ＣＤＲ）及び１７４から１７６（１Ｓ４軽鎖ＣＤＲ）並びに２４７から２４９（１Ｓ５重鎖ＣＤＲ）及び１８４から１８６（１Ｓ５軽鎖ＣＤＲ）に記載されているアミノ酸配列の何れかに対して１つ又は２つの修飾を含む配列を含む。
【００６６】
幾つかの実施形態において、抗体は、抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９、１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｂ１１、１８Ｄ８、１９Ｂ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２０Ｅ１２、２２Ｆ１２、２２Ｈ１０、２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２４Ｅ４及び２６Ｆ１１の何れかの重鎖可変領域を含み、並びにヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号４０１から４０２）及びヒトＩｇＧ２重鎖定常領域（配列番号４０３から４０４）からなる群から選択される定常領域を場合によって含む。幾つかの実施形態において、抗体は、抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９、１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｂ１１、１８Ｄ８、１９Ｂ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２０Ｅ１２、２２Ｆ１２、２２Ｈ１０、２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２４Ｅ４及び２６Ｆ１１の何れかの軽鎖可変領域を含み、並びにヒトκ軽鎖定常領域（配列番号４０５から４０６）を場合によって含む。別の実施形態において、抗体は、抗体Ａｂ４３、２．７、２．４１、Ｒ９、１Ｃ９、１Ｓ１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４、１Ｓ５、３Ｂ３；４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１８Ｂ１１、１８Ｄ８、１９Ｂ８、１９Ｃ１、１９Ｄ１２、１９Ｈ６、２０Ｅ１２、２２Ｆ１２、２２Ｈ１０、２３Ａ１１、２３Ｆ１１、２４Ｅ４及び２６Ｆ１１の何れかの軽鎖可変領域を含み、並びにヒトλ軽鎖定常領域Ｃ１型（配列番号４０７から４０８）、ヒトλ軽鎖定常領域Ｃ２型（配列番号４０９から４１０）、ヒトλ軽鎖定常領域Ｃ３型（配列番号４１１から４１２）、ヒトλ軽鎖定常領域Ｃ６型（配列番号４１３から４１４）及びヒトλ軽鎖定常領域Ｃ７型（配列番号４１５から４１６）からなる群から選択される定常領域を場合によって含む。
【００６７】
抗体１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１のそれぞれの完全長軽鎖及び重鎖に対するｃＤＮＡ及びアミノ酸配列も提供される。抗体１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、１２３Ｆ１１、２６Ｆ１１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４及び１Ｓ５の完全長軽鎖（定常領域を含む。）をコードするｃＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号１９７、２０８、２１９、２３０、２４１、２５２、２５６、２６０、２６４、２１７、２２８、２３９及び２５０に記載されている。抗体１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、２３Ｆ１１、２６Ｆ１１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４及び１Ｓ５の完全長軽鎖（定常領域を含む。）をコードするｃＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号１９７、２０８、２１９、２３０、２４１、２５２、２５６、２６０、２６４、２１７、２２８、２３９及び２５０に記載されている。抗体１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、２３Ｆ１１、２６Ｆ１１、１Ｓ２、１Ｓ３、１Ｓ４及び１Ｓ５の完全長軽鎖（定常領域を含む。）のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１９８（その残基１から２０はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２０９（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２２０（その残基１から２０はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２３１（その残基１から２０はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２４２（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２５３（その残基１から２０はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２５７（その残基１から２０はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２６１（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２６５（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２１８（その残基１から２２はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２２９（その残基１から２２はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２４０（その残基１から２２はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）及び２５１（その残基１から２２はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）に記載されている。
【００６８】
抗体１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、２３Ｆ１１、２６Ｆ１１及び１Ｓ１の完全長重鎖（定常領域を含む。）をコードするｃＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号１９９、２１０、２２１、２３２、２４３、２５４、２５８、２６２、２６６及び２０６に記載されている。抗体１Ｃ９、３Ｂ３、４Ｅ１、７Ａ３、９Ｄ１２、１２Ｂ９、１５Ｅ１、２３Ｆ１１、２６Ｆ１１及び１Ｓ１の完全長重鎖（定常領域を含む。）のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２００（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２１１（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２２２（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２３３（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２４４（シグナルペプチドなし）、２５５（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２５９（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２６３（その残基１から２０はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）、２６７（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）及び２０７（その残基１から１９はシグナルペプチドに対応し、残りは成熟ポリペプチドである。）に記載されている。
【００６９】
本発明の幾つかの実施形態において、抗体は、配列番号２０７のアミノ酸２０から４６７（１Ｓ１重鎖）及び配列番号２２０のアミノ酸２１から２３４（１Ｓ１軽鎖）又は配列番号２３３のアミノ酸２０から４６６（１Ｓ２重鎖）及び配列番号２１８のアミノ酸２３から２３４（１Ｓ２軽鎖）又は配列番号２５５のアミノ酸２０から４６６（１Ｓ３重鎖）及び配列番号２２９のアミノ酸２３から２３４（１Ｓ３軽鎖）又は配列番号２５９のアミノ酸２０から４６６（１Ｓ４重鎖）及び配列番号２４０のアミノ酸２３から２３４（１Ｓ４軽鎖）又は配列番号２６７のアミノ酸２０から４６６（１Ｓ５重鎖）及び配列番号２５１のアミノ酸２３から２３４（１Ｓ５軽鎖）を含む。
【００７０】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体（抗体という用語は、本明細書に定義されているとおりである。）を表す。すなわち、該集団を構成する各抗体は、ハイブリドーマから産生されたか、又は組換えＤＮＡ技術から産生されたかを問わず、僅かな量で存在し得る可能性がある天然に存在する変異あるいは翻訳後修飾を除いて同一である。モノクローナル抗体の非限定的な例には、マウス、ウサギ、ラット、ニワトリ、キメラ、ヒト化又はヒト抗体、完全に組み立てられた抗体、多重特異的抗体（二重特異的抗体を含む。）、抗原を結合することができる抗体断片（Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディを含む。）、マキシボディ、ナノボディ及び所望の生物活性を示す限りにおいて前述のものを含む組換えペプチド又はこれらの変形物若しくは誘導体が含まれる。抗体配列をよりヒト様であるようにヒト化又は修飾することは、例えば、「Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５  （１９８６）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１  ６８５５  （１９８４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５  ９２  （１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  １５３６  （１９８８）；  Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２８：４８９  ４９８  （１９９１）；  Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９  ２１７  （１９９４）；  ａｎｄ  Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，ＣＡ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３  ８３  （１９９１）；  Ｃｏ，Ｍ．  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６）；  Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：８０５−８１４  （１９９４）；」（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。ヒトモノクローナル抗体を単離するための１つの方法は、ファージディスプレイ技術の使用である。ファージディスプレイは、例えば、「Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１，ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７，ａｎｄ  Ｃａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）」（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。ヒトモノクローナル抗体を単離するための別の方法は、内在的な免疫グロブリン産生を有さず、ヒト免疫グロブリン遺伝子坐を含有するように操作されたトランスジェニック動物を使用する。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８  （１９９３）；  Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３  （１９９３）；ＷＯ９１／１０７４１，ＷＯ９６／３４０９６���ＷＯ９８／２４８９３又は米国特許出願公開２００３０１９４４０４号、２００３００３１６６７号又は２００２０１９９２１３号（各々、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
【００７１】
「単離された」抗体とは、その天然環境の成分から同定され、及び分離されている抗体（抗体という用語は本明細書に定義されているとおりである。）を表す。その天然環境の夾雑成分は、抗体に対する診断又は治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン及びその他のタンパク質又は非タンパク質性溶質が含まれ得る。ある種の実施形態において、抗体は、（１）抗体の９５重量％超まで、最も好ましくは、９９重量％超まで、（２）Ｎ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クマシーブルー又は好ましくは、銀染色を用いた、還元若しくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一状態まで精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、単離された天然に存在する抗体には、組換え細胞内のインシチュ抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００７２】
「免疫グロブリン」又は「自然抗体」は、四量体の糖タンパク質である。天然に存在する免疫グロブリンにおいて、各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１つの「重」鎖（約５０から７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に必要とされる、約１００から１１０以上のアミノ酸の「可変」（「Ｖ」）領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主として、エフェクター機能のために必要とされる定常領域を規定する。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスへ割り当てることができる。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）及びイプシロン（ε）として分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥとして、抗体イソタイプを規定する。これらの幾つかは、サブクラス又はイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２へさらに分割され得る。異なるイソタイプは、異なるエフェクター機能を有する。例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３イソタイプは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。ヒト軽鎖は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖として分類される。軽鎖及び重鎖内において、可変及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって（重鎖は、約１０より多いアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。）連結されている。一般に、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））」を参照されたい。
【００７３】
アロタイプは、免疫原性であり得及びヒトでは特定の対立遺伝子によってコードされる抗体配列中の（しばしば、定常領域中の）変動である。アロタイプは、ヒトＩＧＨＣ遺伝子、ＩＧＨＧ１、ＩＧＨＧ２、ＩＧＨＧ３、ＩＧＨＡ２及びＩＧＨＥ遺伝子の５つに対して同定されており、それぞれ、Ｇ１ｍ、Ｇ２ｍ、Ｇ３ｍ、Ａ２ｍ及びＥｍアロタイプと表記される。少なくとも１８のＧｍアロタイプが知られている。ｎＧ１ｍ（１）、ｎＧ１ｍ（２）、Ｇ１ｍ（１，２，３，１７）又はＧ１ｍ（ａ、ｘ、ｆ、ｚ）、Ｇ２ｍ（２３）又はＧ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（５、６、１０、１１、１３、１４、１５、１６、２１、２４、２６、２７、２８）又はＧ３ｍ（ｂ１、ｃ３、ｂ５、ｂ０、ｂ３、ｂ４、ｓ、ｔ、ｇ１、ｃ５、ｕ、ｖ、ｇ５）。Ａ２ｍ（１）及びＡ２ｍ（２）という２つのＡ２ｍアロタイプが存在する。
【００７４】
抗体の構造及び作製の詳しい説明に関しては、「Ｒｏｔｈ，Ｄ．Ｂ．，ａｎｄＣｒａｉｇ，Ｎ．Ｌ．，Ｃｅｌｌ，９４：４１１−４１４（１９９８）」（参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。要約すれば、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡを作製するための過程は、主として、発達しているＢ細胞中で起こる。様々な免疫グロブリン遺伝子セグメントの再配置および連結の前に、Ｖ、Ｄ、Ｊ及び定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、一般に、単一の染色体上に相対的に極めて近接して見出される。Ｂ細胞の分化の間、Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子セグメントの（又は軽鎖遺伝子の場合には、Ｖ及びＪのみ）適切なファミリーメンバーのそれぞれの一つは、重及び軽免疫グロブリン遺伝子の機能的に再配置された可変領域を形成するために組み換えられる。この遺伝子セグメントの再配置過程は、逐次的であるようである。まず、重鎖ＤからＪへの連結が行われ、続いて、重鎖ＶからＤＪへの連結及び軽鎖ＶからＪへの連結が行われる。Ｖ、Ｄ及びＪセグメントの再配置の他に、軽鎖中のＶ及びＪセグメントが連結され、並びに重鎖のＤ及びＪセグメントが連結されている位置での可変的組み換えによって、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の一次レパートリー中にさらなる多様性が生成される。軽鎖中のこのような変動は、Ｖ遺伝子セグメントの最後のコドン及びＪセグメントの最初のコドン内で典型的に起こる。連結における同様の不正確さは、ＤとＪＨセグメントの間で重鎖染色体上において起こり、最大１０ヌクレオチドにわたって伸展し得る。さらに、ＤとＪＨの間に、及びＶＨとＤ遺伝子セグメントの間に、ゲノムＤＮＡによってコードされていない幾つかのヌクレオチドが挿入され得る。これらのヌクレオチドの付加は、Ｎ領域多様性として知られている。このような連結の間に起こり得る可変領域遺伝子セグメント中のこのような再配置及び可変的組み換えの正味の効果は、一次抗体レパートリーの産生である。
【００７５】
「超可変」領域という用語は、軽鎖可変ドメイン中の相補性決定領域又はＣＤＲ（すなわち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）によって記載されているように、残基２４から３４（Ｌ１）、５０から５６（Ｌ２）及び８９から９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の３１から３５（Ｈ１）、５０から６５（Ｈ２）及び９５から１０２（Ｈ３））から得られるアミノ酸残基を表す。単一のＣＤＲさえ、抗原を認識及び結合し得るが、ＣＤＲの全てを含有する抗原結合部位全体より低い親和性で結合する。
【００７６】
超可変「ループ」から得られる残基の別の定義が、軽鎖可変ドメイン中の残基２６から３２（Ｌ１）、５０から５２（Ｌ２）及び９１から９６（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメイン中の２６から３２（Ｈ１）、５３から５５（Ｈ２）及び９６から１０１（Ｈ３）として、「Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）」によって記載されている。
【００７７】
「フレームワーク」又はＦＲ残基は、超可変領域残基以外の可変領域残基である。
【００７８】
「抗体断片」は、完全な状態の免疫グロブリン、好ましくは、完全な状態の抗原結合又は可変領域の一部を含み、抗体断片から形成された多重特異的（二重特異的、三重特異的など）抗体が含まれる。免疫グロブリンの断片は、組換えＤＮＡ技術によって、又は完全な状態の抗体の酵素的若しくは化学的切断によって作製され得る。
【００７９】
抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ（可変領域）、ドメイン抗体（ｄＡｂ、ＶＨドメインを含有する。）（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６，１９８９）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ、単一のポリペプチド鎖上にＶＨ及びＶＬドメインを含有し（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６，１９８８，ａｎｄ  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３，１９８８、ポリペプチドリンカーを場合によって含み、場合によって多重特異的、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４））、一本鎖抗体断片、ダイアボディ（別の鎖の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと対を形成する単一のポリペプチド鎖上のＶＨ及びＶＬドメイン）（ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３））、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ（ペプチドリンカー（ヒンジなし）を介して、又はＩｇＧヒンジを介して、ＣＨ３に融合されたｓｃＦｖ）（Ｏｌａｆｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｃｉ．２００４  Ａｐｒ；１７（４）：３１５−２３）、直鎖抗体（直列Ｆｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；キレート化組換え抗体（ｃｒＡｂ、同じ抗原上の２つの隣接するエピトープへ結合することができる。）（Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５）、バイボディ（二重特異的Ｆａｂ−ｓｃＦｖ）又はトリボディ（三重特異的Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２））（Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−５７，２０００；Ｗｉｌｌｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８６：１６１−７６，２００３）、抗体を細胞内に保持又は誘導する細胞シグナル配列も含み得る（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５４２−５１，１９９５；Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１７：１７３３−５，２００３）イントラボディ（Ｂｉｏｃｃａ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１０１−１０８，１９９０；Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄ  ＳｃｉＵＳＡ．１０１：１７６１６−２１，２００４）、トランスボディ（ｓｃＦｖへ融合されたタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含有する細胞透過性抗体（Ｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５−８，２００５）、ナノボディ（重鎖の約１５ｋＤａ可変ドメイン）（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：２８５３−５７，２００４）、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ；ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＷＯ０３／０４１６００、米国特許公開２００３０１３��９３９号及び米国特許公開２００３０１１８５９２）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、（ＶＨが、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有する定常領域と再結合している）ラクダ化された（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０，２００１；Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：３６２８−３６，２００２；米国特許公開２００５０１３６０４９号及び２００５００３７４２１号）、ＶＨＨ含有抗体、重鎖抗体（ＨＣＡｂｓ、構造Ｈ２Ｌ２を有する２つの重鎖のホモ二量体）又はこれらの変形物若しくは誘導体及び抗体が所望の生物活性を保持している限り、ＣＤＲ配列などの、ポリペプチドへの特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが含まれる。
【００８０】
「変形物」という用語は、可変領域中又は可変領域と同等の部分中に少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失又は挿入を含有する抗体のポリペプチド配列を表す（但し、変形物は所望の結合親和性又は生物活性を保持する。）。さらに、本明細書に記載されている抗体は、半減期又はクリアランス、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を含む、抗体のエフェクター機能を修飾するために、定常領域中にアミノ酸修飾を有し得る。このような修飾は、例えば、薬物動態を強化し、又は癌を治療する上での抗体の有効性を強化することができる。「Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）」（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。ＩｇＧ１の場合には、定常領域、特に、ヒンジ又はＣＨ２領域に対する修飾は、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ活性を含むエフェクター機能を増加又は減少させ得る。他の実施形態において、ＩｇＧ２定常領域は、抗体抗原凝集物の形成を減少させるために修飾される。ＩｇＧ４の場合には、定常領域、特に、ヒンジ領域に対する修飾は、半抗体の形成を低減させ得る。
【００８１】
「修飾」という用語は、１つ以上のアミノ酸の変化（置換、挿入又は欠失を含む。）、ヘプシジン結合活性を妨害しない化学的修飾、治療剤又は診断剤への連結による共有結合的修飾、（例えば、放射性核種又は様々な酵素での）標識、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールでの誘導化）などの共有的ポリマー付着及び非天然アミノ酸の化学的合成による挿入又は置換を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本発明の修飾されたポリペプチド（抗体を含む。）は、本発明の修飾されていない分子の結合特性を保持する。
【００８２】
「誘導体」という用語は、治療剤又は診断剤への連結、（例えば、放射性核種又は様々な酵素での）標識、ＰＥＧ化（ポリエチレングリコールでの誘導化）などの共有的ポリマー付着及び非天然アミノ酸の化学的合成による挿入又は置換によって共有的に修飾された抗体又はポリペプチドを表す。幾つかの実施形態において、誘導体は、誘導化されていない分子の結合特性を保持する。
【００８３】
二重特異的抗体又は他の多重特異的抗体を作製するための方法は本分野において公知であり、化学的架橋、ロイシンジッパーの使用（Ｋｏｓｔｅｉｎｙ  ｅｌ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３，１９９２）；ダイアボディ技術（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−４８，１９９３）；ｓｃＦｖ二量体（Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８，１９９４）、直鎖抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７−６２，１９９５）；及びキレート化組換え抗体（Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＭｏｌＢｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５）が含まれる。
【００８４】
従って、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の１つ、２つ及び／又は３つのＣＤＲを含む様々な組成物は、本分野において公知の技術によって作製され得る。
【００８５】
抗体の組換え生産
宿主細胞によって認識される調節配列へ場合によって作用可能に連結された、本明細書に記載されているモノクローナル抗体をコードする単離された核酸、該核酸を含むベクター及び宿主細胞、並びに核酸が発現されるように宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞培養又は培地から場合によって抗体を回収することを含み得る、抗体を生産するための組換え技術も提供される。
【００８６】
目的の免疫グロブリンから得られる関連アミノ酸配列は、直接的なタンパク質の配列決定によって決定され得、汎用コドン表に従って、適切なコードヌクレオチド配列を設計することができる。あるいは、モノクローナル抗体をコードするゲノム又はｃＤＮＡは、慣用の手法を用いて、（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子へ特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）このような抗体を産生する細胞から単離及び配列決定され得る。
【００８７】
クローニングは、標準的な技術を用いて実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（参照により、本明細書に組み込まれる。）参照）。例えば、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、例えば、膜に会合したｍＲＮＡの逆転写によって、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に対して特異的なプローブを用いてライブラリーをスクリーニングし得る。しかしながら、一実施形態において、目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、軽鎖又は重鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（又は完全長ｃＤＮＡの一部）を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用される。増幅された配列は、あらゆる適切なベクター、例えば、発現ベクター、ミニ遺伝子ベクター又はファージディスプレイベクター中へ容易にクローニングすることができる。目的の免疫グロブリンポリペプチドのある一部の配列を決定することが可能であれば、使用される具体的なクローニングの方法は重要ではないことが理解される。
【００８８】
１つの抗体核酸源は、目的の抗原で免疫化された動物からＢ細胞を取得し、これを不死化細胞へ融合することによって産生されたハイブリドーマである。あるいは、免疫化された動物のＢ細胞（又は脾臓全体）から、核酸を単離することができる。抗体をコードする核酸のさらに別の源は、例えば、ファージディスプレイ技術を通じて作製されたこのような核酸のライブラリーである。目的のペプチド（例えば、所望の結合特性を有する可変領域ペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、パニングなどの標準的な技術によって同定することができる。
【００８９】
免疫グロブリンポリペプチドの可変領域全体をコードする配列を決定し得る。しかしながら、時には、可変領域の一部、例えば、ＣＤＲをコードする部分のみを配列決定することが十分である。配列決定は、標準的な技術を用いて実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ  １−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ及びＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７（参照により、本明細書に組み込まれる。）参照）。クローニングされた核酸の配列をヒト免疫グロブリン遺伝子及びｃＤＮＡの公表された配列と比較することによって、配列決定される領域に応じて、当業者は、（ｉ）（重鎖のイソタイプを含む）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチドの生殖系列セグメントの使用並びに（ｉｉ）Ｎ領域の付加及び体細胞変異の過程に起因する配列を含む（重鎖及び軽鎖可変領域の配列）を容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの入手源は、「ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ」である。
【００９０】
本明細書において使用される「単離された」核酸分子又は「単離された」核酸配列は、（１）同定され、当該核酸の天然源中で通常付随している少なくとも１つのきょう雑核酸分子から分離されている核酸分子、又は（２）目的の核酸の配列が決定できるように、クローニングされ、増幅され、タグ付加され、又はその他バックグラウンド核酸から区別されている核酸分子の何れかである。単離された核酸分子は、天然に見出される形態又は状況以外の形態又は状況である。しかしながら、単離された核酸分子には、抗体を通常発現する細胞中に含有され、例えば、天然の細胞の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が含まれる。
【００９１】
一旦単離されたら、ＤＮＡは、発現調節配列へ作用可能に連結され又は発現ベクター中に配置され得、次いで、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を誘導するために、形質移入がなされなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞中に発現調節配列又は発現ベクターが形質移入される。抗体の組換え生産は、本分野において周知である。
【００９２】
発現調節配列は、特定の宿主生物中での作用可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を表す。原核生物に適した調節配列には、例えば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを使用することが知られている。
【００９３】
核酸が、別の核酸配列と、機能的な関連状態に置かれたときに、核酸は作用可能に連結されている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーに対するＤＮＡがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されれば、プレ配列若しくは分泌リーダーに対するＤＮＡはポリペプチドに対するＤＮＡへ作用可能に連結されており、プロモーター若しくはエンハンサーが配列の転写に影響を与えれば、プロモーター又はエンハンサーはコード配列へ作用可能に連結されており、又はリボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置されていれば、リボソーム結合部位はコード配列へ作用可能に連結されている。一般に、作用可能に連結されたとは、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを意味し、分泌性リーダーの場合には、連続しており及びリーディングフェーズ中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続しなければならない必要はない。連結は、都合のよい制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合には、慣用の手技に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【００９４】
多くのベクターが、本分野において公知である。ベクター成分は、以下の１つ以上を含み得る。（例えば、抗体の分泌を誘導し得る）シグナル配列、複製起点、（例えば、抗生物質若しくは他の薬物耐性を付与し、栄養要求性の欠乏を補完し、又は培地中で利用できない不可欠な栄養素を供給し得る）１つ以上の選択的マーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列（これらの全てが、本分野において周知である。）。
【００９５】
細胞、細胞株及び細胞培養は、しばしば、互換的に使用され、本明細書では、このような表記の全てが子孫を含む。形質転換体及び形質転換された細胞には、一次対象細胞及びこれから誘導された培養（移植の数に関わらない。）が含まれる。故意の変異又は偶発的な変異のために、全ての子孫のＤＮＡ含量が正確に同一であるわけではないことも理解される。当初に形質転換された細胞中でスクリーニングされたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体子孫が含まれる。
【００９６】
典型的な宿主細胞には、原核細胞、酵母又はより高等な真核細胞（すなわち、多細胞生物）が含まれる。原核宿主細胞には、真正細菌（グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（例えば、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びシゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）などの腸内細菌科並びにＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｕｔｉｌｉｓ）及びＢ．リシェニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの桿菌が含まれる。糸状菌又は酵母などの真核微生物は、組換えポリペプチド又は抗体に対する適切なクローニング又は発現宿主である。下等真核宿主微生物のうち、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、すなわち、一般的なパン酵母が最も一般的に使用されている。しかしながら、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、例えば、ピー・パストリス（Ｐ．  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、スキゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマ・リイシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）；ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）などのシュワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）；及び、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びエー・ニーヂュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びエー・ニガーなどのアスペルギルス宿主などの糸状菌などの、数多くの他の属、種及び系統が一般的に利用可能であり、本発明において有用である。
【００９７】
グリコシル化されたポリペプチド又は抗体を発現させるための宿主細胞は、多細胞生物に由来し得る。無脊椎生物の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変形物並びにスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（毛虫））、イーデス・アエジプチ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、イーデス・アルボピクタス（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、ドロソフィラ・メラノガスター（ショウジョウバエ）及びボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの宿主から対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。このような細胞の形質移入のための様々なウイルス系統、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変形物及びボンビックス・モリＮＰＶのＢｍ−５系統が公に入手可能である。
【００９８】
脊椎動物宿主細胞も適切な宿主であり、このような細胞からポリペプチド又は抗体を組換え生産することも、定型的な手法となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））などのチャイニーズハムスター卵巣細胞；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児由来腎臓株（懸濁培養中での増殖に関してサブクローニングされた２９３又は２９３細胞［Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）］；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞種細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞若しくはＦＳ４細胞；又は哺乳動物骨髄腫細胞である。
【００９９】
宿主細胞は、抗体産生のために上記核酸又はベクターで形質転換又は形質移入され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切なように改変された旧来の栄養素培地中で培養される。さらに、選択的マーカーによって隔てられた転写単位の複数コピーを有する新規ベクター及び形質移入された細胞株は、抗体を発現するのに特に有用である。
【０１００】
本明細書中に記載されている抗体を生産するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、基礎培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、「Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；米国特許第４，６５７，８６６号；米国特許第４，９２７，７６２号；米国特許第４，５６０，６５５号；又は米国特許第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０号；ＷＯ８７／００１９５号；又は米国特許再審査第３０，９８５号に記載されている培地の何れもが、宿主細胞に対する培地として使用され得る。必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（インシュリン、トランスフェリン又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧｅｎｔａｍｙｃｉｎＴＭ薬など）、微量元素（μＭ域の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される。）及びグルコース又は等価なエネルギー源を、これらの培地の何れにも補充し得る。他のあらゆる必要な補充物も、当業者に公知の適切な濃度で含め得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに以前に使用されていたものであり、当業者に自明である。
【０１０１】
宿主細胞を培養すると、抗体は、細胞内に、細胞膜周辺腔中に産生され得、又は培地中へ直接分泌され得る。第一の工程として、抗体が細胞内に産生される場合、例えば、遠心又は限外ろ過によって、粒状の破砕物（宿主細胞又は溶解された断片の何れか）が除去される。
【０１０２】
例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、陽イオン若しくは陰イオン交換クロマトグラフィー、又はアフィニティーリガンドとして、目的の抗原若しくはプロテインＡ若しくはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーを用いて、抗体を精製することができる。ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖を基礎とする抗体を精製するために、プロテインＡを使用することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは、全てのマウスイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドに付着されたマトリックスは、アガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも利用可能である。制御されたポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの力学的に安定なマトリックスは、アガロースで達成されるより速い流速及び短い処理時間を可能とする。抗体はＣＨ３ドメインを含む場合には、ＢａｋｅｒｂｏｎｄＡＢＸＴＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ．）が精製のために有用である。回収されるべき抗体に応じて、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術も可能である。
【０１０３】
キメラ及びヒト化抗体
キメラ又はヒト化は、親げっ歯類モノクローナル抗体より、ヒトにおいてより低免疫原性であり、ずっと低いアナフィラキシーのリスクで、ヒトの治療のために使用することができる。従って、ヒトへのインビボ投与を含む治療的用途において、これらの抗体が想定される。
【０１０４】
例えば、単独で、又は連結体として、ヒトにインビボ反復投与されると、マウス抗体は、レシピエント中に免疫応答をもたらす（ＨＡＭＡ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）応答と称される場合がある。）。反復投薬が必要な場合、ＨＡＭＡ応答は、医薬の有効性を制限し得る。ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマーでの抗体の化学的修飾によって、又は抗体結合構造をよりヒト様にするために、遺伝子工学の方法を使用することによって、抗体の免疫原性を低下させ得る。
【０１０５】
本明細書において使用される「キメラ抗体」という用語は、通例、異なる種を起源とする２つの異なる抗体に由来する配列を含有する抗体を表す。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒト定常Ｉｇドメインに融合されたげっ歯類モノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインを含む。このような抗体は、本分野において公知の標準的な手法を用いて作製することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｒｅｇｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１，６８４１−６８５５；及びＢｏｕｌｉａｎｎｅ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，６４３−６４６（１９８４）参照）。幾つかのキメラモノクローナル抗体は、ヒトにおいてより低い免疫原性を示すことが明らかとなっているが、げっ歯類の可変Ｉｇドメインは、なお、著しいヒト抗げっ歯類応答をもたらし得る。
【０１０６】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト抗体、典型的には、げっ歯類モノクローナル抗体に由来する抗体を表す。あるいは、ヒト化抗体は、キメラ抗体から誘導され得る。
【０１０７】
例えば、（１）ヒトフレームワーク及び定常領域上に非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植する（本分野において、「ＣＤＲ移植」を通じたヒト化と称される工程）、あるいは（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様表面でこれを「覆い隠す」（本分野において「ベニアリングと称される工程」）など、様々な方法によって、ヒト化抗体を達成し得る。これらの方法は、例えば、「Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２  ５２５（１９８６）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：６８５１  ６８５５（１９８４）；  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４：６５  ９２（１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  １５３６（１９８８）；  Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９  ４９８（１９９１）；  Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１（３）：１６９  ２１７（１９９４）；  ａｎｄ  Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（７）：７７３  ８３（１９９１）」（これらの各々の全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）中に開示されている。
【０１０８】
ＣＤＲ移植は、ヒト可変Ｉｇドメインの適切なフレームワーク領域中にマウス重鎖及び軽鎖可変Ｉｇドメイン由来の６つのＣＤＲの１つ以上を導入することを含む。この技術（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３（１９８８））は、抗原との主要な接触であるＣＤＲループを支える足場として、保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１−ＦＲ４）を使用する。しかしながら、フレームワーク領域のアミノ酸は抗原結合に寄与することができ、ＣＤＲループのアミノ酸が２つの可変Ｉｇドメインの会合に影響を与えることができるので、ＣＤＲ移植の著しい欠点は、元のマウス抗体より大幅に低い結合親和性を有するヒト化抗体をもたらし得ることである。ヒト化されたモノクローナル抗体の親和性を維持するために、元のマウス抗体のフレームワーク領域に最も似たヒトフレームワーク領域を選択することによって、及び抗原結合部位のコンピュータモデル化による補助を受けた、フレームワーク又はＣＤＲ内の単一のアミノ酸の位置指定突然変異誘発によって、ＣＤＲ移植技術を改善することができる（例えば、Ｃｏ，Ｍ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２，２９６８−２９７６）。
【０１０９】
ヒト化抗体の１つの方法は、ヒト重鎖及び軽鎖配列へ非ヒト重鎖及び軽鎖配列を並置すること、このような並置に基づいて、非ヒトフレームワークを選択し、ヒトフレームワークで置換すること、ヒト化された配列の立体構造を予測するために分子モデル化を行うこと、並びに親抗体の立体構造を比較することを含む。この工程に続いて、ヒト化された配列モデルの予想される立体構造が親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲの立体構造に密接に近似されるまで、ＣＤＲの構造を妨害するＣＤＲ領域中の残基を繰り返し逆変異する。このようなヒト化抗体は、例えば、Ａｓｈｗｅｌｌ受容体を介した、取り込み及びクリアランスを促進させるために、さらに誘導化され得る（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号及び米国特許第５，５８５，０８９号参照）。
【０１１０】
合理的設計によるマウスモノクローナル抗体の多数のヒト化が報告されている（例えば、２００２年７月１１日に公開された米国特許出願公開２００２／００９１２４０、ＷＯ９２／１１０１８及び米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，７６６，８６６号参照）。
【０１１１】
Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体
「Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体」という用語は、非ヒト抗体、典型的には、げっ歯類モノクローナル抗体又は可能であればキメラ抗体に由来する抗体を表す。抗体可変ドメインのＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＴＭが、抗体分子の結合活性を維持しながら免疫原性を低下させるための方法として、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ［例えば、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５，７６６，８８６号；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７：８０５−８１４（１９９４）参照］によって記載されている。この方法に従えば、各可変領域アミノ酸に、置換のリスクが割り当てられる。アミノ酸置換は、３つのリスクカテゴリーの１つによって区別される。（１）低リスク変化は、免疫原性を低下させる可能性が最も大きく、抗原結合を崩壊させる確率が最も低い変化であり、（２）中リスク変化は、免疫原性をさらに低下させるが、抗原結合又はタンパク質の折り畳みに影響を及ぼす確率がより大きい変化であり、（３）高リスク残基は、結合のために又は抗体構造を維持するために重要であり、抗原結合又はタンパク質の折り畳みが影響を受ける最も高いリスクを有する残基である。プロリンの三次元構造における役割のために、その位置が、典型的には低リスク位置である場合でさえ、プロリンの修飾は、少なくとも中リスク変化であると一般に考えられる。
【０１１２】
抗原結合又はタンパク質の折りたたみの何れかに悪影響を及ぼす可能性が少ないが、ヒト環境中での免疫原性を低下させる可能性があることが決定された位置のヒトアミノ酸を置換することによって、げっ歯類抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域をＨｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭとすることができる。個別のＶＨ若しくはＶＬ配列又はヒトコンセンサスＶＨ若しくはＶＬ配列又は個別の若しくはコンセンサスヒト生殖系列配列を含むあらゆるヒト可変領域を使用することができるが、置換の数を最小限に抑えるために、げっ歯類配列に対して最も高い同一性又は相同性を有するヒト配列が一般に使用される。低リスク位置のあらゆる数のアミノ酸残基又は低リスク位置の全てのアミノ酸残基を変化させることができる。例えば、並置されたマウス及びヒトアミノ酸残基が異なる各低リスク位置において、げっ歯類残基をヒト残基と置換するアミノ酸修飾が導入される。さらに、中リスク位置のあらゆる数の又は全てのアミノ酸残基を変化させることができる。幾つかの実施形態において、低及び中リスク位置の全てが、げっ歯類配列からヒト配列へ変化される。
【０１１３】
修飾された重鎖及び／又は軽鎖可変領域を含有する合成遺伝子が構築され、ヒトγ重鎖及び／又はκ軽鎖定常領域へ連結される。あらゆるクラス又はサブクラスのあらゆるヒト重鎖及び軽鎖定常領域を、Ｈｕｍａｎ  ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＴＭ抗体可変領域と組み合わせて使用し得る。
【０１１４】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように操作されたトランスジェニック動物から得た抗体
ヘプシジンに対する抗体は、内在性免疫グロブリン産生を有さず、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように操作されたトランスジェニック動物を用いて生産することも可能である。例えば、ＷＯ９８／２４８９３号は、内在性重鎖及び軽鎖遺伝子座の不活化のために、動物が機能的な内在性免疫グロブリンを産生しないヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示する。抗体が霊長類定常及び／又は可変領域を有し、並びに内在性免疫グロブリンをコードする遺伝子座が置換又は不活化されている、免疫原に対する免疫応答を引き起こすことができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主も開示されている。ＷＯ９６／３０４９８号は、定常又は可変領域の全部又は一部を置換して修飾された抗体分子を形成するためなど、哺乳動物中免疫グロブリン遺伝子座を修飾するためにＣｒｅ／Ｌｏｘ系を使用することを開示している。ＷＯ９４／０２６０２号は、不活化された内在性Ｉｇ遺伝子座及び機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示している。米国特許第５，９３９，５９８号は、マウスが内在性の重鎖を欠如し、及び１つ以上の異種性定常領域を含む外来性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを作製する方法を開示している。
【０１１５】
上記トランスジェニック動物を使用して、選択された抗原性分子に対して免疫応答を生産することができ、抗体産生細胞を動物から取り出し、ヒト由来のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するために使用することができる。免疫化プロトコール、アジュバントなどが本分野において公知であり、例えば、ＷＯ９６／３３７３５号に記載されているように、トランスジェニックマウスの免疫化において使用されている。対応するタンパク質の生物活性又は生理的効果を阻害又は中和する能力に関して、モノクローナル抗体を検査することができる。
【０１１６】
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；  Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）；並びに米国特許第５，５９１，６６９号、米国特許第５，５８９，３６９号、米国特許第５，５４５，８０７号；及び米国特許出願公開２００２／０１９９２１３号も参照されたい。米国特許出願公開２００３／００９２１２５号は、動物の免疫応答を所望のエピトープに偏らせる方法を記載している。ヒト抗体は、インビトロ活性化されたＢ細胞によっても作製され得る（米国特許第５，５６７，６１０号及び米国特許第５，２２９，２７５号参照）。
【０１１７】
ファージディスプレイ技術による抗体作製
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーを作製し、糸状バクテリオファージの表面上に、コードされている抗体断片をディスプレイするための技術の発達は、ヒト由来の抗体を作製するための別の手段を提供してきた。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／１７２７１、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９２／０１０４７、及び「Ｃａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）」（これらの各々の全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されている。ファージ技術によって作製される抗体は、通常、抗原結合断片（例えば、Ｆｖ又はＦａｂ断片）として、細菌中で生産され、従って、エフェクター機能を欠如する。エフェクター機能は、２つの戦略のうちの１つによって導入することができる。哺乳動物細胞中での発現のための完全な抗体へと、又はエフェクター機能の引き金を引くことができる第二の結合部位を有する二重特異的抗体断片へと断片を操作することができる。
【０１１８】
典型的には、ＰＣＲによって、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）を別々にクローニングし、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリー中でランダムに再結合し、次いで、特定の抗原への結合に関してこれを選択することができる。抗体断片をファージ表面上に発現し、抗原結合及び再増幅の数巡（パニングと称される操作）を通じて、抗原結合によるＦｖ又はＦａｂ（従って、抗体断片をコードするＤＮＡを含有するファージ）の選択が達成される。抗原に対して特異的な抗体断片が濃縮され、最終的に単離される。
【０１１９】
ファージディスプレイ技術は、「ガイドされた選択」と称される、げっ歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチにおいても使用することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２，８９９−９０３（１９９４）参照）。このために、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片をディスプレイすることが可能であり、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーは、次いで、抗原を用いて選択され得る。これによって、マウスＦｄ断片は、選択を誘導するための鋳型を提供する。その後、選択されたヒト軽鎖は、ヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わされる。得られたライブラリーの選択は、完全なヒトＦａｂを与える。
【０１２０】
ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を得るための様々な手法が記載されている（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７（１９９１）；米国特許第５，５６５，３３２号及び米国特許第５，５７３，９０５号；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２，１７３−１８４（１９９４）参照）。特に、ファージディスプレイライブラリーから得られた抗体のインビトロでの選択及び進化は、強力なツールとなっている（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．，ａｎｄ  ＢａｒｂａｓＩＩＩ，Ｃ．Ｆ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５７，１９１−２８０（１９９４）；及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４３３−４５５（１９９４）；米国特許出願公開第２００２／０００４２１５号及びＷＯ９２／０１０４７号；２００３年１０月９日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１９０３１７号及び米国特許第６，０５４，２８７号；米国特許第５，８７７，２９３号参照）。
【０１２１】
「Ｗａｔｋｉｎｓ，“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｇｅ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｂｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｌｉｆｔ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １７８：１８７−１９３」及び２００３年３月６日に公開された米国特許出願公開２００３／００４４７７２号は、キャプチャーリフト（ｃａｐｔｕｒｅ  ｌｉｆｔ）（固体支持体上への候補結合分子の固定化を含む方法）によって、ファージによって発現された抗体ライブラリー又はその他の結合分子をスクリーニングするための方法を記載している。
【０１２２】
抗体断片
上述されているように、抗体断片は、完全な状態の完全長抗体の一部、完全な状態の抗体の抗原結合又は可変領域を含み、抗体断片には、抗体断片から形成された直鎖抗体及び多重特異的抗体が含まれる。抗体断片の非限定的な例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、直鎖抗体、キレート化組換え抗体、トリボディ又はバイボディ、イントラボディ、ナノボディ、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化された抗体、ＶＨＨ含有抗体、又は変異タンパク質若しくはその誘導体、又は抗体が所望の生物活性を保持している限り、ＣＤＲ配列など、ポリペプチドへの特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが含まれる。このような抗原断片は、完全な抗体の修飾によって作製することができ、又は組換えＤＮＡ技術若しくはペプチド合成を用いて、新規に合成することができる。
【０１２３】
「ダイアボディ」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を表す。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合が不可能であるほど短いリンカーを使用することによって、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ４０４，０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；及び「Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）」中に、より完全に記載されている。
【０１２４】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在し、Ｆｖが抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする、ポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメインの間に場合によって含む（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６，１９８８及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３，１９８８）。Ｆｄ断片は、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる。
【０１２５】
さらなる抗体断片には、ＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）断片が含まれる（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６，１９８９）。
【０１２６】
「直鎖抗体」は、抗原結合領域の一対を形成する直列Ｆｄセグメントの一対を含む（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖抗体は、二重特異的又は単一特異的であり得る（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７−６２（１９９５））。
【０１２７】
ペプチドリンカー（ヒンジなし）を介して、又はＩｇＧヒンジを介してＣＨ３へ融合されたｓｃＦｖからなる「ミニボディ」が、「Ｏｌａｆｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｃｉ．２００４  Ａｐｒ；１７（４）：３１５−２３」に記載されている。
【０１２８】
「マキシボディ」という用語は、免疫グロブリンのＦｃ領域に共有結合された二価のｓｃＦｖを表し、例えば、「Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，１７：９５−１０６（２００４）及びＰｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５１：１２３−１３５（２００１）」を参照されたい。
【０１２９】
軽鎖を欠いた機能的重鎖抗体は、テンジクザメ（ｎｕｒｓｅ  ｓｈａｒｋ）、テンジクザメ（ｗｏｂｂｅｇｏｎｇ  ｓｈａｒｋ）並びにラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ及びラマなどのラクダ科の動物など、動物のある種の中に天然に存在する。抗原結合部位は、これらの動物中において、単一のドメイン、ＶＨＨドメインへ還元される。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成する。すなわち、これらの機能的抗体は、構造Ｈ２Ｌ２のみを有する重鎖のホモ二量体である）（「重鎖抗体」又は「ＨＣＡｂ」と称される。）。報告によれば、ラクダ化されたＶＨＨは、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有し、ＣＨ１ドメインを欠如するＩｇＧ２及びＩｇＧ３定常領域と再結合する。古典的なＶＨのみの断片は可溶性形態で作製することが困難であるが、フレームワーク残基がよりＶＨＨ様であるように変化を受けている場合には、溶解度及び特異的結合の改善を得ることができる（例えば、Ｒｅｉｃｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９９，２３１：２５−３８参照）。ラクダ化されたＶＨＨドメインは、高い親和性で抗原に結合し（Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０，２００１）、溶液中で高い安定性（Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：３６２８−３６，２００２）を有することが見出されている。ラクダ化された重鎖を有する抗体を作製する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３６０４９号及び第２００５／００３７４２１号に記載されている。別の足場は、サメのＶ−ＮＡＲ足場とより密接に合致するヒト可変様ドメインから作製することが可能であり、長い貫通するループ構造に対してフレームワークを与え得る。
【０１３０】
重鎖抗体の可変ドメインは僅か１５ｋＤａの分子量を有する最も小さな、完全に機能的な抗原結合断片であるので、この実体はナノボディと称されている（Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４：２８５３−５７，２００４）。ナノボディライブラリーは、「Ｃｏｎｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５：２８０７−１２，２００１）」に記載されているような免疫化されたヒトコブラクダから作製され得る。
【０１３１】
イントラボディは、細胞内発現を示す一本鎖抗体であり、細胞内タンパク質機能を操作することができる（Ｂｉｏｃｃａ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：１０１−１０８，１９９０；Ｃｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１０１：１７６１６−２１，２００４）。細胞内領域中に抗体構築物を保持する細胞シグナル配列を含むイントラボディは、「Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ（ＥＭＢＯ  Ｊ１４：１５４２−５１，１９９５）」及び「Ｗｈｅｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１７：１７３３−５．２００３）」に記載されているように作製され得る。トランスボディは、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）が一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体と融合されている細胞透過性抗体である（Ｈｅｎｇ他、（ＭｅｄＨｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．６４：１１０５−８，２００５））。
【０１３２】
さらに、ＳＭＩＰ、すなわち標的タンパク質に対して特異的な結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体が想定される。これらの構築物は、抗体エフェクター機能を実施するために必要な免疫グロブリンドメインに融合された抗原結合ドメインを含む一本鎖ポリペプチドである。例えば、ＷＯ０３／０４１６００、米国特許出願公開２００３／０１３３９３９号及び米国特許出願公開２００３／０１１８５９２号を参照されたい。
【０１３３】
多価抗体
幾つかの実施形態において、多価又は多重特異的（例えば、二重特異的、三重特異的など）モノクローナル抗体さえ作製することが望ましい場合があり得る。このような抗体は、標的抗原の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有し得、あるいは、２つの異なる分子に、例えば、標的抗原に及び細胞表面タンパク質若しくは受容体に結合し得る。例えば、二重特異的抗体は、細胞の防御機構を標的発現細胞へ集中させるために、標的に結合するアーム並びにＴ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２又はＣＤ３）などの白血球上のトリガリング分子又はＦｃγＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などのＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）に結合する別のアームを含み得る。別の例として、標的抗原を発現する細胞へ細胞毒性因子を局在化させるために、二重特異的抗体を使用し得る。これらの抗体は、標的結合アーム及び細胞毒性因子（例えば、サポニン、抗インターフェロン−６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート又は放射性同位体ハプテン）を結合するアームを有する。多重特異的抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【０１３４】
さらに、結合親和性、特異性及び／又は増加した血中半減期を改善させ得る多価形態へ折り畳ませるために、本明細書に開示されている抗ヘプシジン抗体を構築することも可能である。抗ヘプシジン抗体の多価形態は、本分野において公知の技術によって調製することができる。
【０１３５】
二重特異的又は多重特異的抗体には、架橋された又は「ヘテロ連結体」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ連結体中の抗体の一方をアビジンに連結し、他方をビオチンに連結させることができる。ヘテロ連結体抗体は、あらゆる都合よい架橋法を用いて作製することができる。適切な架橋剤は本分野において周知であり、多数の架橋技術とともに、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。ストレプトアビジンをコードする配列をｓｃＦｖのＣ末端に付加することによって、四量体を作製するために、別の方法が設計されている。ストレプトアビジンは４つのサブユニットから構成されているので、ｓｃＦｖ−ストレプトアビジンが折り畳まれると、４つのサブユニットは会合して四量体を形成する（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ６（３）：９３−１０１（１９９５）（その開示の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）。
【０１３６】
二重特異的抗体を作製するための別のアプローチに従えば、組換え細胞培養から回収されたヘテロ二量体のパーセントを最大化するために、抗体分子の対間の界面を操作することができる。１つの界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第一の抗体分子の界面から得られる１つ以上の小さなアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と置換される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）と置換することによって、第二の抗体分子の界面上に、大きな側鎖と同一又は類似の大きさの代償的「空洞」が作出される。これは、ホモ二量体などの望ましくない他の最終産物に比べてヘテロ二量体の収率を増加させる機序を与える。１９９６年９月６日に公開されたＷＯ９６／２７０１１号を参照されたい。
【０１３７】
抗体断片から二重特異的又は多重特異的抗体を作製するための技術も、文献中に記載されている。例えば、化学的連結を用いて、二重特異的抗体又は三重特異的抗体を調製することができる。「Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：８１（１９８５）」は、Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するために、完全な状態の抗体がタンパク分解的に切断される手法を記載している。これらの断片は、近接するジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止するために、ジチオール錯化剤である亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元される。次いで、作製されたＦａｂ’断片はチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体へ転化される。次いで、メルカプトエチルアミンを用いた還元によって、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをＦａｂ’−チオールへ再度転化させ、二重特異的抗体を形成させるために、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合する。産生された二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための因子として使用することができる。「Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）」は、細菌からの機能的抗体断片の分泌を開示している（例えば、Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４１（１９８８）参照）。例えば、Ｆａｂ’―ＳＨ断片は、二重特異的抗体を形成するために、イー・コリから直接回収され、化学的に連結することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）；Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２））。
【０１３８】
「Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）」は、完全にヒト化された二重特異的抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製を記載する。各Ｆａｂ’断片は、イー・コリから別々に分泌され、二重特異的抗体を形成するために、インビトロでの誘導された化学的結合に供される。このようにして形成された二重特異的抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞及び正常なヒトＴ細胞に結合することができるとともに、ヒト乳癌標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性の引き金を引くことができた。
【０１３９】
組換え細胞培養から直接二重特異的又は多重特異的抗体断片を作製及び単離するための様々な技術も記載されている。例えば、ロイシジンジッパーを用いて、二重特異的抗体、例えば、ＧＣＮ４が生産されてきた（全般的には、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２））。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。単量体を形成するために、ヒンジ領域において抗体ホモ二量体を還元し、次いで、抗体ヘテロ二量体を形成するために再酸化した。この方法は、抗体ホモ二量体の生産のためにも使用することができる。
【０１４０】
上記されているダイアボディは、二重特異的抗体の一例である。例えば、「Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）」を参照されたい。二価のダイアボディは、ジスルフィド結合によって安定化することができる。
【０１４１】
安定な単一特異的又は二重特異的Ｆｖ四量体は、（ｓｃＦｖ２）２立体配置での非共有的会合によって、又はビス−テトラボディとして作製することも可能である。あるいは、ビス−ｓｃＦｖを形成するために、２つの異なるｓｃＦｖを直列に連結することができる。
【０１４２】
一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異的抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。「Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）」を参照されたい。１つのアプローチは、リンカー又はジスルフィド結合を用いて、２つのｓｃＦｖ抗体を連結することである（Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｖｏｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９９−２０６１９９４，ＷＯ９４／１３８０６及び米国特許第５，９８９，８３０号（これらの開示の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。）。
【０１４３】
あるいは、二重特異的抗体は、「Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）」に記載されているように作製された「直鎖抗体」であり得る。簡潔に述べると、これらの抗体は、抗原結合領域の一対を形成する直列Ｆｄセグメントの一対を含む（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）。直鎖抗体は、二重特異的又は単一特異的であり得る。
【０１４４】
３以上の価数を有する抗体も想定される。例えば、三重特異的抗体を調製することができる。（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））。
【０１４５】
「キレート化組換え抗体」は、標的抗原の隣接する重複していないエピトープを認識し、両エピトープへ同時に結合するのに十分な柔軟性を有する二重特異的抗体である（Ｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２４６：３６７−７３，１９９５）。
【０１４６】
二重特異的Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「バイボディ」）及び三重特異的Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディ」）の作製は、「Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１６５：７０５０−５７，２０００）」及び「Ｗｉｌｌｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７８６：１６１−７６，２００３）」に記載されている。バイボディ又はトリボディに関して、ｓｃＦｖ分子は、ＶＬ−ＣＬ（Ｌ）及びＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖の一方又は両方に融合される。例えば、トリボディを作製するために、２つのｓｃＦｖはＦａｂのＣ末端に融合されるのに対して、バイボディにおいて、１つのｓｃＦｖはＦａｂのＣ末端に融合される。
【０１４７】
さらに別の方法では、遊離のシステインが親タンパク質中に導入された後に、二量体、三量体及び四量体が作製される。目的のタンパク質を遊離のシステインに架橋するために、マレイミド基の可変数（２から４）を有する、ペプチドをベースとする架橋剤が用いられた（Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２（３）：２４１−５０（２０００）（その開示全体が、本明細書中に組み込まれる。）。
【０１４８】
特異的結合剤
他のヘプシジン特異的結合剤は、例えば、抗体由来のＣＤＲを基礎として、又はヒトヘプシジンに対する所望の結合特性を示すペプチド又は化合物に関して、多様なペプチド又は有機化学化合物のライブラリーをスクリーニングすることによって調製することができる。ヘプシジン特異的結合剤には、マウス抗体Ａｂ４３（配列番号１６から２１）；マウス抗体２．７（配列番号２８から３３）；マウス抗体２．４１（配列番号４０から４５）、ラット抗体Ｒ９（配列番号５２から５７）又はヒト抗体１Ｃ９（配列番号１１１から１１６）、ヒト抗体３Ｂ３（配列番号１２１から１２６）、ヒト抗体４Ｅ１（配列番号１３１から１３６）、ヒト抗体７Ａ３（配列番号１４１から４６）、ヒト抗体９Ｄ１２（配列番号１５１から１５６）、ヒト抗体１２Ｂ９（配列番号１６１から１６６）、ヒト抗体１５Ｅ１（配列番号１７１から１７６）、ヒト抗体１８Ｂ１１（配列番号３３４から３３９）、ヒト抗体１８Ｄ８（配列番号３１４から３１９）、ヒト抗体１９Ｂ８（配列番号３４３から３４９）、ヒト抗体１９Ｃ１（配列番号３２４から３２９）、ヒト抗体１９Ｄ１２（配列番号２９４から２９９）、ヒト抗体１９Ｈ６（配列番号３０４から３０９）、ヒト抗体２０Ｅ１２（配列番号３５３から３５９）、ヒト抗体２２Ｆ１２（配列番号３６３から３６９）、ヒト抗体２２Ｈ１０（配列番号３７３から３７９）、ヒト抗体２３Ａ１１（配列番号３８３から３８９）、ヒト抗体２３Ｆ１１（配列番号１８１から１８６）、ヒト抗体２４Ｅ４（配列番号３９３から３９９）、ヒト抗体２６Ｆ１１（配列番号１９１から１９６）又はヒト抗体１Ｓ１（配列番号２０３から２０５及び１３１から１３３）又はヒト抗体１Ｓ２（配列番号２１４から２１６及び１４４から１４６）又はヒト抗体１Ｓ３（配列番号２２５から２２７及び１６４から１６６）又はヒト抗体１Ｓ４（配列番号２３６から２３８及び１７４から１７６）又はヒト抗体１Ｓ５（配列番号２４７から２４９及び１８４から１８６）の１つ以上のＣＤＲと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を含有するペプチドが含まれる。
【０１４９】
ヘプシジン特異的結合剤には、ペプチボディも含まれる。「ペプチボディ」という用語は、少なくとも１つのペプチドに付着された抗体Ｆｃドメインを含む分子を表す。ペプチボディの作製は、２０００年５月４日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ００／２４７８２中に、一般的に記載されている。これらのペプチドの何れもが、リンカーを用いて又は用いずに、直列に（すなわち、連続的に）連結され得る。システイン残基を含有するペプチドは、別のＣｙｓ含有ペプチドと架橋され得、これらの一方又は両方がビヒクルに連結され得る。２以上のＣｙｓ残基を有するあらゆるペプチドは、ペプチド内ジスルフィド結合も形成し得る。これらのペプチドの何れもが誘導体化され得る。例えば、カルボキシル末端をアミノ基でキャップすることができ、システインをキャップすることができ、又はアミノ酸残基以外の部分によって、アミノ酸残基を置換し得る（例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９（１９９６）及びＣｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２８７６−８２（１９９７）（これらの全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）を参照されたい。）。ペプチド配列は、抗体に対する親和性成熟と同様にして最適化され得、又はアラニンスキャニング若しくは無作為若しくは位置指定突然変異誘発後に、最良の結合物質を同定するためにスクリーニングすることによって、その他改変され得る。Ｌｏｗｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４（１９９７）。特異的結合剤の所望の活性を保持しながら、特異的結合剤構造中に（例えば、ペプチド部分そのものの中に、又はペプチドと特異的結合剤のビヒクル部分との間に）、様々な分子を挿入することができる。例えば、Ｆｃドメイン又はその断片などの分子、ポリエチレングリコール又はデキストランなどの他の関連分子、脂肪酸、脂質、コレステロール基、小炭水化物、ペプチド、本明細書に記載されているような検出可能な部分（蛍光因子、放射性同位体などの放射性標識を含む。）、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、干渉（又はその他の）ＲＮＡ、酵素、ホルモンなどを容易に挿入することができる。この様式での挿入に適した他の分子は当業者によって理解され、本発明の範囲内に包含される。これには、例えば、適切なリンカーにより場合によって連結された２つの連続するアミノ酸の間に所望の分子を挿入することが含まれる。
【０１５０】
ヘプシジンペプチボディの開発も想定される。その受容体とのタンパク質リガンドの相互作用は、しばしば、相対的に大きな界面において起こる。しかしながら、ヒト成長ホルモンとその受容体に関して示されたように、界面における２、３の中心的な残基のみが、結合エネルギーの殆どに寄与している。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：３８３−６（１９９５）。タンパク質リガンドの大部分は、結合エピトープを正しい幾何学で提示し、又は結合と無関係な機能を果たすに過ぎない。従って、「ペプチド」長（一般に、２から４０アミノ酸）を有するに過ぎない分子が、ある巨大タンパク質リガンドの受容体タンパク質に結合することができる。このようなペプチドは、巨大なタンパク質リガント（「ペプチドアゴニスト」）の生物活性を模倣し得、又は競合的結合を通じて、巨大なタンパク質リガント（「ペプチドアンタゴニスト」）の生物活性を阻害し得る。
【０１５１】
ファージディスプレイ技術は、このようなペプチドアゴニスト及びアンタゴニストを同定する上での強力な方法として登場した。例えば、Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４（１９９０）；１９９３年６月２９日に付与された米国特許第５，２２３，４０９号；１９９８年３月３１日に付与された米国特許第５，７３３，７３１号；１９９６年３月１２日に付与された米国特許第５，４９８，５３０号；１９９５年７月１１日に付与された米国特許第５，４３２，０１８号；１９９４年８月１６日に付与された米国特許第５，３３８，６６５号；１９９９年７月１３日に付与された米国特許第５，９２２，５４５号；１９９６年１２月１９日に公開されたＷＯ９６／４０９８７号；及び１９９８年４月１６日に公開されたＷＯ９８／１５８３３号（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。ペプチドファージディスプレイライブラリーにおいて、糸状ファージの外被タンパク質との融合によって、無作為なペプチド配列をディスプレイすることができる。ディスプレイされたペプチドは、所望であれば、抗体によって固定化された、受容体の細胞外ドメインに対してアフィニティー溶出することができる。保持されたファージは、アフィニティー精製と再増殖を連続して繰り返すことにょって濃縮され得る。最も優れた結合ペプチドは、ペプチドの構造的に関連する１つ以上のファミリー内の中心的残基を同定するために配列決定され得る。２つの異なるファミリーが同定された、例えば、「Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：１６９６−９（１９９７）」を参照されたい。ペプチド配列は、アラニンスキャニング又はＤＮＡレベルでの突然変異誘発によって、何れの残基が安全に置換され得るかについても示唆し得る。最も優れた結合物質の配列をさらに最適化するために、突然変異誘発ライブラリーを作製し、スクリーニングし得る。Ｌｏｗｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４（１９９７）。
【０１５２】
巨大なタンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを推定するために、タンパク質−タンパク質相互作用の構造的分析も使用し得る。このような分析では、結晶構造が、ペプチドがそこから設計され得る巨大なタンパク質リガンドの重要な残基の種類及び相対的配位を示唆し得る。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：１２６６−７０（１９９７）を参照されたい。これらの分析法は、受容体タンパク質とファージディスプレイによって選択されたペプチドとの間の相互作用を調べるためにも使用され得、結合親和性を増加させるためのペプチドのさらなる修飾を示唆し得る。
【０１５３】
他の方法は、ペプチド研究におけるファージディスプレイと競合する。ペプチドライブラリーは、ｌａｃレプレッサーのカルボキシル末端に融合し、イー・コリ中で発現させることができる。イー・コリをベースとする別の方法は、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合によって、細胞の外膜上へのディスプレイを可能とする。以下、これらの方法及び関連する方法は、「イー・コリディスプレイ」と総称される。別の方法では、リボソーム放出の前に、ランダムなＲＮＡの翻訳が停止され、会合されたそれらのＲＮＡがまだ付着されたままのポリペプチドのライブラリーがもたらされる。以下、これらの方法及び関連する方法は、「リボソームディスプレイ」と総称される。他の方法は、ＲＮＡへのペプチドの化学的連結を使用する。例えば、「Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ  ＮａｔｌＡｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：１２２９７−３０３（１９９７）」を参照されたい。以下、この方法及び関連する方法は、「ＲＮＡ−ペプチドスクリーニング」と総称される。ポリエチレンの棹又は溶媒透過性樹脂などの安定な非生物材料上にペプチドが固定化された、化学的に誘導されたペプチドライブラリーが開発されている。化学的に誘導された別のペプチドライブラリーは、ガラススライド上に固定化されたペプチドを走査するためにフォトリソグラフィーを使用する。以下、これらの方法及び関連する方法は、「化学的ペプチドスクリーニング」と総称される。化学的ペプチドのスクリーニングは、Ｄ−アミノ酸及び他の非天然類縁体並びに非ペプチド要素の使用を可能とする点で有利であり得る。生物学的方法と化学的方法の両方が、「Ｗｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：３５５−６２（１９９２）」中に概説されている。
【０１５４】
概念的には、ファージディスプレイと上述されている他の方法を用いて、あらゆるタンパク質のペプチド模倣物を発見し得る。これらの方法は、エピトープマッピングのために、タンパク質−タンパク質相互作用中の重要なアミノ酸の同定のために、及び新規治療剤を発見するためのリードとして使用されてきた。例えば、「Ｃｏｒｔｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：６１６−２１（１９９６）」を参照されたい。ペプチドライブラリーは、現在、エピトープマッピングなどの免疫学的研究において、最も頻繁に使用されている。「Ｋｒｅｅｇｅｒ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ１０（１３）：１９−２０（１９９６）」を参照されたい。
【０１５５】
本明細書中に記載されているヘプシジンポリペプチドに結合し、又はその活性を調節する（すなわち、増加又は減少させる）能力に関してスクリーニングされ得る化合物の採取源には、（１）無機及び有機化学ライブラリー、（２）天然産物ライブラリー並びに（３）無作為ペプチド又は模倣ペプチド、オリゴヌクレオチド又は有機分子の何れかから構成されるコンビナトリアルライブラリーが含まれる。
【０１５６】
化学的ライブラリーは、容易に合成し、又は多数の市販先から購入することができ、公知の化合物の構造的類縁体又は天然産物のスクリーニングを介した「ヒット」又「リード」として同定された化合物が含まれ得る。
【０１５７】
天然産物ライブラリーの源は、微生物（細菌及び真菌を含む。）、動物、植物又は他の草木又は海洋生物であり、スクリーニングのための混合物のライブラリーは、（１）土壌から得たブロス、植物又は海洋微生物の発酵及び抽出又は（２）生物そのものの抽出によって作製され得る。天然産物ライブラリーには、ポリペプチド（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ）、非リボソーム性ペプチド及び（天然に存在しない）これらの変形物が含まれる。概説として、「Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：６３−６８（１９９８）」を参照されたい。
【０１５８】
コンビナトリアルライブラリーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチド又は有機化合物から構成され、伝統的な自動化された合成法、ＰＣＲ、クローニング又は独自の合成法によって容易に調製することが可能である。特に興味深いのは、ペプチド及びオリゴヌクレオチドのコンビナトリアルライブラリーである。興味深いさらに別のライブラリーには、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、多重平行合成集合物、組換え及びポリペプチドライブラリーが含まれる。コンビナトリアル化学及びそこから作製されたライブラリーの概説として、「Ｍｙｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０１−７０７（１９９７）」を参照されたい。ペプチド模倣ライブラリーの概説及び例として、「Ａｌ−Ｏｂｅｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９（３）：２０５−２３（１９９８）；Ｈｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，１（１）：１１４−１９（１９９７）；Ｄｏｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，４（５）：７０９−１５（１９９６）」（アルキル化されたジペプチド）を参照されたい。
【０１５９】
ヘプシジン特異的結合剤には、「Ｈａｙｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３（１０）：５１４−５２２（２００５）」（その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）によって記載されているような足場タンパク質並びに米国公開２００６−０２８６６０３号及び２００６−０２２３１１４号に記載されているような（何れも、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているようなＡｖｉｍｅｒタンパク質技術も含まれる。
【０１６０】
抗体又は特異的結合剤に対するスクリーニング法
ヘプシジンを結合し、及び／又は本明細書中に記載されている典型的な抗体を交叉遮断し、及び／又はヘプシジン活性を阻害する抗体又は特異的結合剤を同定する方法も提供される。このような方法は、本明細書中に挙げられている（化学的に合成され、又は細菌若しくは非哺乳動物細胞中で産生された）高度に精製され、生物活性を有し、正しく折り畳まれた非尿性ヒトヘプシジンの組成物を使用し得る。
【０１６１】
抗体又は特異的結合剤は、本分野において公知の方法によって、結合親和性に関してスクリーニングされ得る。例えば、ゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射線標識された競合アッセイ、クロマトグラフィーによる同時分画、同時沈殿、架橋、ＥＬＩＳＡなどを使用することができ、これらは、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ」（参照により、その全体が本明細書中に組み込まれる。）中に記載されている。
【０１６２】
まず、標的抗原上の所望のエピトープに結合する抗体又は特異的結合剤に関してスクリーニングするために、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）」中に記載されているような定型的な交叉遮断アッセイを行うことができる。本明細書に記載されている標的特異的抗体への標的の結合を阻害する能力によって、未知の抗体が特徴付けられる定型的な競合結合アッセイも使用され得る。完全な状態の抗原、細胞外ドメインなどのその断片又は直鎖エピトープを使用することができる。エピトープマッピングは、「Ｃｈａｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３８８−１３９４（１９９５）」中に記載されている。抗体抗原相互作用のオフ速度を測定するために、競合結合アッセイも使用し得る。例えば、競合結合アッセイの一例は、標識されていない抗原の増加する量の存在下で、目的の抗体とともに、標識された抗原（例えば、３Ｈ又は１２５Ｉ）又はその断片若しくは変形物を温置すること及び標識された抗原に結合された抗体を検出することを含むラジオイムノアッセイである。
【０１６３】
インビトロ結合アッセイの１つの変形において、（ａ）固定化されたヘプシジンを候補抗体又は特異的結合剤と接触させること、及び（ｂ）ヘプシジンへの候補抗体又は特異的な結合剤の結合を検出することを含む方法が提供される。別の実施形態では、候補抗体又は特異的結合剤が固定化され、ヘプシジンの結合が検出される。固定化は、支持体、ビーズ又はクロマトグラフィーの樹脂への共有結合、及び抗体結合などの非共有高親和性相互作用又は固定化された化合物がビオチン部分を含む、ストレプトアビジン／ビオチン結合の使用など、本分野において周知の方法の何れかを用いて達成される。結合の検出は、（ｉ）固定化されていない化合物上の放射性標識を用いて、（ｉｉ）固定化されていない化合物上の蛍光標識を用いて、（ｉｉｉ）固定化されていない化合物に対して免疫特異的な抗体を用いて、（ｉｖ）固定化された化合物が付着されている蛍光性支持体を励起させる固定化されていない化合物上の標識を用いて、並びに本分野において周知であり、日常的に実施されている他の技術を用いて達成することができる。
【０１６４】
幾つかの実施形態において、ヒトヘプシジン活性を阻害又は中和する抗体又は特異的結合剤は、ヘプシジンを抗体（又は特異的結合剤）と接触すること、検査抗体（又は特異的結合剤）の存在下及び不存在下でヘプシジン活性を比較すること、及び抗体（又は特異的結合剤）の存在がヘプシジンの活性を減少させるかどうかを決定することによって同定され得る。特定の抗体又は特異的結合剤又は抗体若しくは特異的結合剤の組み合わせの生物活性は、適切な動物モデル（本明細書中に記載されている動物モデルの何れもが含まれる。）を用いて、インビボで評価され得る。
【０１６５】
幾つかの実施形態において、標的抗原の生物活性と相互作用し、又は阻害する（すなわち、リン酸化、二量体化、リガンドによって誘導される受容体の活性化又は細胞内シグナル伝達などを阻害する）抗体を同定するために、高情報処理スクリーニング（ＨＴＳ；ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）アッセイも想定される。ＨＴＳアッセイは、多数の化合物のスクリーニングを効率的な様式で可能とする。標的抗原とその結合対の間の相互作用を調べるために、細胞をベースとするＨＴＳシステムが想定される。所望の特性を有し、そこから所望の特性を改善するために修飾を設計することができる「ヒット」又は「リード化合物」を同定するためにＨＴＳアッセイが設計される。
【０１６６】
別の実施形態において、標的抗原ポリペプチドへの適切な結合親和性を有するＣＤＲ内のアミノ酸に対する１、２、３以上の修飾を有する抗体断片又はＣＤＲに対する高情報量スクリーニングが使用される。
【０１６７】
ポリペプチド変形物及び誘導体の作製
本明細書に開示されている抗ヘプシジン抗体は当業者に周知の技術によって容易に修飾することができる。想定可能な変異には、１つ以上の残基の挿入、欠失又は置換が含まれる。幾つかの実施形態において、挿入又は欠失は、約１から５個のアミノ酸、約１から３個、約１又は２個のアミノ酸の範囲である。
【０１６８】
欠失変形物とは、何れかのアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去されているポリペプチドである。欠失は、タンパク質の一端若しくは両端に実施することが可能であり、又はポリペプチド内（すなわち、内部）の１つ若しくはそれ以上の残基の除去によって実施することが可能である。欠失変形物の調製方法は、本分野において一般的である。例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ」（その開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。
【０１６９】
アミノ酸配列の挿入には、一残基の長さから数百以上の残基を含有するポリペプチドにわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端の融合並びに１つ以上のアミノ酸の内部配列挿入が含まれる。本明細書に記載されている様々な変形物の種類の何れとも同様に、挿入変形物は、得られるポリペプチドが同じ生物学的特性を保持し、又は当該挿入変形物を与えた親ポリペプチドに伴わない新しい物理的、化学的及び／又は生物的特性を示すように設計することができる。挿入変形物の調製方法も、本分野において一般的であり、周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。
【０１７０】
本明細書に記載されている抗ヘプシジン抗体と異種のポリペプチドとを含む融合タンパク質は、本発明によって想定される挿入変形物の具体的な種類である。目的のポリペプチドに融合することができる異種のポリペプチドの非限定的な例には、免疫グロブリン定常領域（例えば、Ｆｃ領域）などの（但し、これに限定されない。）長い循環半減期を有するタンパク質、目的のポリペプチドの同定を可能とするマーカー配列、目的のポリペプチドの精製を容易にする配列及び多量体タンパク質の形成を促進する配列が含まれる。
【０１７１】
抗体融合タンパク質の作製方法は、本分野において周知である。例えば、米国特許第６，３０６，３９３号（その開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。ある種の実施形態において、キメラｓｃＦｖ抗体を異種のタンパク質部分に接続する柔軟なリンカーを含み得る融合タンパク質が作製される。適切なリンカー配列は、得られた融合タンパク質が認識される能力に影響を及ぼさず、該タンパク質のＶドメインによって特異的に結合されるエピトープを結合するリンカー配列である（例えば、ＷＯ９８／２５９６５号（その開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。）。
【０１７２】
置換変形物は、ポリペプチドアミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその位置に挿入されている変形物である。抗体の生物学的特性の修飾は、（ａ）置換の領域中のポリペプチド骨格の構造、例えば、シート又はらせん立体構造など、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性又は（ｃ）側鎖の嵩を維持する上での効果が著しく異なる置換を選択することによって達成される。ある実施形態において、置換変形物が設計される。すなわち、１つ以上の特異的な（無作為でない）アミノ酸残基が、特異的なアミノ酸残基と置換される。これらの種類の典型的な変化には、保存的な置換及び／又は固有の残基及び置換する残基の類似の特性を基礎とした、ある残基の別の残基での置換が含まれる。
【０１７３】
保存的置換は、表１に示されている。多くの保存的置換は、「好ましい置換」という表題下に見出される。このような置換は生物活性の変化をもたらさず、従って、より実質的な変化を導入し得、産物をスクリーニングし得る。
【０１７４】
【表１】
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【０１７５】
共通の側鎖特性を有するアミノ酸残基は、しばしば、以下のようにグループ分けされる。
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖の方向性に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
【０１７６】
抗体変形物
ある種の事例では、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基を修飾することを意図して、抗体変形物が調製される。別の実施形態において、エピトープ結合に直接関与していない残基又はいかなる様式でもエピトープ結合に関与していない残基の修飾が、本明細書中に論述されている目的のために望ましい。ＣＤＲ領域及び／又はフレームワーク領域の何れかの中での突然変異誘発が想定される。
【０１７７】
何れの抗体アミノ酸残基がエピトープ認識及び結合のために重要であるかを決定するためには、置換変形物を作製するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施することができる。例えば、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）」（その開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。この方法では、各アミノ酸残基は、一度に１個、アラニン残基で置換され、得られた抗ヘプシジン抗体は、修飾されていない抗体との対比において、その特異的エピトープを結合する能力に関してスクリーニングされる。何れの残基が変化を受けたかを決定するために、低下した結合能を有する被修飾抗体を配列決定し、結合又は生物学的特性におけるその重要性を推測する。
【０１７８】
抗体の置換変形物は、ランダムなアミノ酸変化が親抗体配列中に導入されるアフィニティー成熟によって調製することが可能である。例えば、「Ｏｕｗｅｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ７４（Ｓｕｐｐｌ２）：２２３−２３２，１９９８；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：８９１０−８９１５，１９９８；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：４４３−４５０，１９９８」（これらの開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を参照されたい。アフィニティー成熟は、抗ヘプシジン抗体又はその変形物を調製及びスクリーニングすること、並びに親抗ヘプシジン抗体と比べて増加した結合親和性などの、修飾された生物学的特性を有する変形物を、得られた変形物から選択することを含む。置換変形物を作製するための便利な方法は、ファージディスプレイを使用するアフィニティー成熟である。簡潔に述べると、各部位に全ての可能なアミノ酸置換を生成させるために、幾つかの超可変領域部位を変異させる。このようにして生成された変形物は、各粒子内に封入されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として、糸状ファージ粒子の表面上へ、一価様式で発現される。次いで、ファージディスプレイが行われた変形物は、その生物活性（例えば、結合親和性）に関してスクリーニングされる。例えば、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９３／１１２３６６、ＷＯ９５／１５３８８及びＷＯ９３／１９１７２を参照されたい。
【０１７９】
現在の抗体アフィニティー成熟法は、確率論的及び非確率論的という２つの突然変異誘発カテゴリーに属する。エラープローンＰＣＲ、変異生成細菌株（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０，３５９−６８，１９９６）及び飽和突然変異誘発（Ｎｉｓｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：１２８１３−２０，２０００；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８，２６９−８５，２００２）が、ストキャスティックな突然変異誘発法（Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１０２：８４６６−７１，２００５）の典型的な例である。ノンストキャスティック技術は、特異的な変異タンパク質の限定された集合物を作製するために、アラニンスキャニング又は位置指定突然変異誘発をしばしば使用する。幾つかの方法は、以下でさらに詳しく記載されている。
【０１８０】
パニング法を介したアフィニティー成熟−一般に、組換え抗体のアフィニティー成熟は、抗原の減少する量の存在下で、候補抗体のパニングを数巡繰り返すことによって行われる。一巡毎に抗原の量を減少させることは、抗原に対して最も高い親和性を有する抗体を選択し、これにより、出発材料の巨大なプールから高親和性の抗体が生成される。パニングを介したアフィニティー成熟は本分野において周知であり、例えば、Ｈｕｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：１６３−７１，２００１）に記載されている。ファージディスプレイ技術を用いたアフィニティー成熟の方法は、本明細書の他の箇所に記載されており、本分野において公知である（例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．９７：２０２９−３４，２０００参照）。
【０１８１】
ルックスルー突然変異誘発−ルックスルー突然変異誘発（ＬＴＭ；ｌｏｏｋ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｒａｊｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１０２：８４６６−７１，２００５）は、抗体結合部位を素早くマッピングするための方法を提供する。ＬＴＭでは、抗体の全ての６つのＣＤＲ中のあらゆる位置において、結合に寄与する機能的側鎖を詳細に調べるために、２０の天然アミノ酸によって与えられる主要な側鎖化学を代表する９つのアミノ酸が選択される。ＬＴＭは、９つの選択されたアミノ酸の１つによって各「野生型」残基が系統的に置換されている、単一変異の位置的系列をＣＤＲ内に生成する。変異を受けたＣＤＲは、全ての変異タンパク質の定量的ディスプレイに対して抑制的となることなく、複雑性とサイズが増大したコンビナトリアル一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）ライブラリーを作製するために組み合わされる。陽性選択後に、改善された結合を有するクローンが配列決定され、有益な変異がマッピングされる。
【０１８２】
エラープローンＰＣＲ−エラープローンＰＣＲでは、異なる選択のラウンド間で、核酸の無作為化を行う。使用されるポリメラーゼの固有のエラー率によって、無作為化は低い割合で起こるが、転写の間に、高い固有のエラー率を有するポリメラーゼを用いるエラープローンＰＣＲ（Ｚａｃｃｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５：７７５−７８３，１９９９）によって増大させることができる（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＭｏｌＢｉｏｌ．２２６：８８９−９６，１９９２）。変異サイクルの後、本分野において定型的な方法を用いて、抗原に対して改善された親和性を有するクローンが選択される。
【０１８３】
所望の活性に関して、抗ヘプシジン抗体又はその変形物を調製及びスクリーニングするために、遺伝子シャッフリング及び誘導された進化を用いる技術も使用し得る。例えば、「Ｊｅｒｍｕｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．，９８（１）：７５−８０（２００１）」は、ｓｃＦｖのｏｆｆ速度又は熱力学的な安定性を進化させるために、リボソームディスプレイを基礎とする目的に合わせた（ｔａｉｌｏｅｒｅｄ）インビトロ選択戦略がＤＮＡシャッフリングによるインビトロでの多様化と組み合わされることを示した。「Ｆｅｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．２００４  Ｊａｎ−Ａｐｒ；２５（１−２）：７−１３」は、ＤＮＡシャッフリングと組み合わせたファージディスプレイの使用がほぼ三桁の規模で親和性を上昇させることを報告した。「Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０００Ｆｅｂ．２９；９７（５）：２０２９−２０３４」は、（ｉ）高変異ライブラリー中に、予想外に高い頻度で機能的クローンが出現すること、（ｉｉ）機能獲得変異体が、このようなライブラリー中に良好に提示されること、及び（ｉｉｉ）より高い親和性をもたらすｓｃＦｖ変異の大半は結合部位から離れた残基に対応していることを報告した。
【０１８４】
これに代えて又はこれに加えて、抗体と抗原間の接触点を特定するために、抗原抗体複合体の結晶構造を解析すること、又はこのような接触点をモデル化するためにコンピュータソフトウェアを使用することが有益であり得る。このような接触残基及び隣接する残基は、本明細書に詳述されている技術に従った置換の候補である。一旦、このような変形物が作製されたら、このような変形物を本明細書中に記載されているスクリーニングに供し、１つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択し得る。
【０１８５】
修飾された炭水化物を有する抗体
例えば、特異的結合剤若しくは抗体へ結合された炭水化物部分の１つ若しくはそれ以上を付加若しくは欠失させて、及び／又は特異的結合剤若しくは抗体中の１つ若しくはそれ以上のグリコシル化部位を付加若しくは欠失させて、親抗体に比べて修飾されたグリコシル化パターンを有する抗体変形物も作製することができる。
【０１８６】
抗体を含むポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型又はＯ結合型の何れかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を表す。トリペプチド配列：アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。ポリペプチド中におけるこれらのトリペプチド配列の何れかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作出する。従って、Ｎ結合型グリコシル化部位は、特異的結合剤又は抗体がこれらのトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を変化させることによって、特異的結合剤又は抗体に付加され得る。Ｏ結合型グリコシル化は、糖：Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つの、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的には、セリン又はスレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用し得る。）への付着を表す。元の特異的結合剤又は抗体の配列へ、１つ以上のセリン又はスレオニン残基を挿入又は置換することによって、特異的結合剤又は抗体にＯ結合型グリコシル化部位を付加し得る。
【０１８７】
改変されたエフェクター機能
抗体又はＦｃ含有ポリペプチドのＦｃ領域中において、システイン残基を除去し又は導入することにより、この領域中の鎖間ジスルフィド結合の形成を除去又は増加させ得る。このようにして作製されたホモ二量体の特異的結合剤又は抗体は、改善された内部取り込み能力及び／又は増大された補体媒介性細胞死滅及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。「Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２）」及び「Ｓｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）」を参照されたい。ホモ二量体の特異的結合剤又は抗体は、「Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５３：２５６０−２５６５（１９９３）」に記載されているように、ヘテロ二機能性架橋剤を用いても調製され得る。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、これにより増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有し得る特異的結合剤又は抗体を改作することができる。「Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）」を参照されたい。
【０１８８】
ＣＤＲ内の配列は抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させ、望ましくないヘルパーＴ細胞応答の引き金を引かせ得ることが示されている。保存的置換は、特異的結合剤又は抗体に結合活性を保持させつつ、望ましくないＴ細胞応答の引き金を引く能力を低下させることができる。重鎖又は軽鎖のＮ末端の２０アミノ酸の１つ以上を除去することも想定される。
【０１８９】
幾つかの実施形態において、改善されたＡＤＣＣ活性を示す、フコシル化が存在しない又は低下した抗体分子など、改変されたエフェクター活性をもたらす改変された炭水化物構造を有する抗体分子の作製も想定される。様々な方法が、これを達成するために本分野において公知である。例えば、ＡＤＣＣエフェクター活性は、ＦｃγＲＩＩＩ受容体への抗体分子の結合によって媒介され、これは、ＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７におけるＮ結合型グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。フコシル化されていない抗体は、増大した親和性でこの受容体を結合し、固有のフコシル化された抗体より効率的に、ＦｃγＲＩＩＩによって媒介されるエフェクター機能の引き金を引く。例えば、α−１，６−フコシル転移酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞中での非フコシル化された抗体の組換え生産は、１００倍増加したＡＤＣＣ活性を有する抗体をもたらす（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２００４  Ｓｅｐ  ５；８７（５）：６１４−２２）。類似の効果は、フコシル化経路中のこの酵素又は他の酵素の活性を減少させることを通じて（例えば、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ処理を通じて）、酵素をノックアウトするために細胞株を操作することを通じて、又は選択的なグリコシル化阻害剤とともに培養することを通じて達成することが可能である（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．１９８９Ｄｅｃ；２６（１２）：１１１３−２３）。幾つかの宿主細胞系統、例えば、Ｌｅｃ１３又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、より低いフコシル化レベルを有する抗体を天然に産生する。Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２Ｊｕｌ２６；２７７（３０）：２６７３３−４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｊａｎ  ３１；２７８（５）：３４６６−７３。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞中で抗体を組換え的に生産することを通じて、二つに分岐された炭水化物のレベルを増加させることも、ＡＤＣＣ活性を増加させることが決定されている。Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９  Ｆｅｂ；１７（２）：１７６−８０。２つのフコース残基の１つのみが存在しないことが、ＡＤＣＣ活性を増加させるのに十分であり得ることが予測されている（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｄｅｃ  ５）。
【０１９０】
他の共有結合的修飾
ポリペプチド又は抗体の共有結合的修飾も、本発明の範囲内に含められる。共有結合的修飾は、適宜、化学的合成によって、又はポリペプチド若しくは抗体の酵素的若しくは化学的切断によって作製され得る。選択された側鎖又はＮ若しくはＣ末端残基と反応することができる有機性誘導化剤と、標的とされるアミノ酸残基を反応させることによって、共有結合的修飾の他の種類を導入することができる。
【０１９１】
システイン残基は、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を与えるために、最も一般的には、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドなどのα−ハロアセタート（及び対応するアミン）と反応される。システイン残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスファート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル−２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ水銀ベンゾアート、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導化される。
【０１９２】
ジエチルピロカルボナートはヒスチジン側鎖に対して比較的特異的であるので、ヒスチジン残基は、ｐＨ５．５から７．０でこの試薬と反応させることによって誘導化される。幾つかの実施形態において、ｐ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、反応は、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中において、ｐＨ６．０で行われる。
【０１９３】
リジン及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸の無水物と反応させる。これらの薬剤での誘導化は、リジン残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノを含有する残基を誘導化するための他の適切な試薬には、メチルピコリンイミダートなどのイミドエステル、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロ水素化ホウ素、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン及びトランスアミナーゼによって触媒されるグリオキシラートとの反応が含まれる。
【０１９４】
アルギニン残基は、１つ又は数個の慣用の試薬、とりわけ、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応によって修飾される。グアニジン官能基の高いｐＫａのために、アルギニン残基の誘導化は、アルカリ条件で反応が実施されることを必要とする。さらに、これらの試薬は、リジンの基及びアルギニンのε−アミノ基と反応し得る。
【０１９５】
チロシン残基の特異的な修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によって、チロシン残基中にスペクトル標識を導入することに特に興味を持って行い得る。最も一般的には、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシン種及び３−ニトロ誘導体を形成するために、Ｎ−アセチルイミダゾール及びテトラニトロメタンが使用される。放射性イムノアッセイにおいて使用するために標識されたタンパク質を調製するために、１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いて、チロシン残基がヨウ素化される。
【０１９６】
カルボキシ側鎖基（アスパラギン又はグルタミン）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｎ−Ｒ’）（Ｒ及びＲ’は、異なるアルキル基である。）との反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基は、アンモニウムイオンとの反応によって、アスパラギン及びグルタミン残基へ転化される。
【０１９７】
グルタミン及びアスパラギン残基は、しばしば、それぞれ、対応するグルタミン酸及びアスパラギン酸残基へと脱アミド化される。これらの残基は、中性又は塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化された形態は、本発明の範囲に属する。
【０１９８】
他の修飾には、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリン又はスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化及びあらゆるＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１９９】
共有結合的修飾の別の種類には、特異的結合剤又は抗体へ、化学的又は酵素的にグリコシドを連結することが含まれる。これらの操作は、Ｎ又はＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞中でポリペプチド又は抗体を作製する必要がないという点で有利である。使用されるカップリングの様式に応じて、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離のスルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン若しくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離のヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンのものなどの芳香族残基又は（ｆ）グルタミンのアミド基に糖を付着させ得る。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０号に、及び「Ａｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）」に記載されている。
【０２００】
ポリペプチド又は抗体上に存在するあらゆる炭水化物部分の除去が、化学的に又は酵素的に達成され得る。化学的な脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は同等の化合物へ特異的結合剤又は抗体を曝露させることを必要とする。この処理は、特異的結合剤又は抗体を完全な状態に保ちながら、結合している糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）以外の殆ど又は全ての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、「Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２（１９８７）」によって、及び「Ｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）」によって記載されている。特異的結合剤又は抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、「Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０（１９８７）」によって記載されているように、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用によって達成することができる。
【０２０１】
本明細書に記載されている抗ヘプシジン抗体の共有的修飾の別の種類は、様々な非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化されたポリオール、ポリオキシエチル化されたソルビトール、ポリオキシエチル化されたグルコース、ポリオキシエチル化されたグリセロール、ポリオキシアルキレン又はデキストランなどの多糖ポリマー）の１つへ、ポリペプチド、特異的結合剤又は抗体を連結することを含む。このような方法は本分野において公知であり、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；米国特許第４，４９６，６８９号；米国特許第４，３０１，１４４号；米国特許第４，６７０，４１７号；米国特許第４，７９１，１９２号、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，７６６，１０６号、米国特許第４，１７９，３３７号、米国特許第４，４９５，２８５号、米国特許第４，６０９，５４６号又は欧州特許第３１５４５６号を参照されたい。
【０２０２】
抗ヘプシジン抗体を用いたヘプシジン関連疾患に対する診断方法及び治療の監視
別の態様において、ヒトヘプシジンへの抗体の結合を可能とする条件下で、ヒトから得た試料を先述の抗体の何れかと接触させること、及び結合された抗体を検出することを含む、試料中のヒトヘプシジンを検出する方法が提供される。一実施形態において、ヘプシジンに対する第一の抗体が、固体支持体上へ、捕捉試薬として固定化され、ヘプシジンに対する第二の抗体が検出試薬として使用される。関連する態様において、試料中のヘプシジンの量は、結合された抗体の量を測定することによって定量される。検出方法は、ヘプシジン関連疾患を診断する方法、炎症性疾患を非炎症性疾患から識別する方法及び抗ヘプシジン抗体を用いて治療法を監視する方法など、様々な診断、予後診断及び監視方法において使用することができる。このような方法において、ある閾値を上回るヘプシジンのレベルは、ヘプシジン関連貧血などのヘプシジン関連疾患の存在と相関するのに対して、前記閾値を下回るレベルは、患者がヘプシジン関連疾患を有する可能性が少ないことを示唆する。同様に、ある閾値を上回るヘプシジンのレベルは炎症性疾患の存在と相関するのに対して、前記閾値を下回るレベルは、患者が炎症性疾患を有する可能性が少ないことを示唆する。幾つかの実施形態において、このような方法は、鉄欠乏性貧血、炎症の貧血又は混合型貧血を有する患者を診断する。ヘプシジンレベルを抑制することを目的とした治療法の監視の場合、ある閾値を下回るヘプシジンのレベルは、ヘプシジン抗体の用量が治療的に有効であることを示唆し、前記閾値を上回るレベルは、ヘプシジン抗体の用量が治療的に有効でないことを示唆する。
【０２０３】
ヘプシジン関連貧血又はヘプシジン過剰又はヘプシジン欠乏の他の疾患などのヘプシジン関連疾患を診断するための方法及び本明細書に記載されている抗ヘプシジン抗体を用いた治療法を含むこのような疾病に対する治療の有効性を監視する方法も提供される。ヘプシジン関連貧血の存在又は不存在を決定するために、免疫複合体の形成が可能となるのに十分な条件下及び時間にわたって、患者から得られた生物試料を本明細書に開示されている抗ヘプシジン抗体の１つ以上と接触させる。次いで、生物試料中の抗ヘプシジン抗体とヘプシジン間で形成された免疫複合体が検出される。試料中のヘプシジンの量は、抗体とヘプシジンの間で形成された免疫複合体の量を測定することによって定量される。ある種の方法の中で、生物試料は患者から単離され、本明細書中に開示されている抗ヘプシジン抗体の１つ以上とともに温置され、ある閾値を上回る抗体−ヘプシジン複合体のレベルはヘプシジン関連貧血の存在と相関付けられ、前記閾値を下回るレベルは患者がヘプシジン関連貧血を有する可能性が少ないことを示唆する。例えば、正常な範囲内のレベルは、患者がヘプシジン関連貧血を有する可能性が少ないことを示唆する。血清ヘプシジンの正常な範囲は、ある種のアッセイ、すなわち、共有された米国特許出願１１／８８０，３１３号及び国際特許公開ＷＯ２００８／０１１１５８（これらの開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている質量分析技術によって測定された場合、一般に１０ｎｇ／ｍＬ未満であるが、アッセイに応じて、及び検査されている集団の亜集団に応じて変動する。
【０２０４】
炎症性疾患を非炎症性疾患から識別する方法も提供される。炎症性疾患の存在又は不存在を決定するために、免疫複合体の形成が可能となるのに十分な条件下及び時間にわたって、患者から得られた生物試料を本明細書に開示されている抗ヘプシジン抗体の１つ以上と接触させる。ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノ放射性測定アッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、（例えば、コロイド金、酵素又は放射性同位体標識を使用する）インサイチュイムノアッセイ、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ及び免疫電気泳動アッセイなどの技術を使用する競合及び非競合アッセイ系を含む（但し、これらに限定されない。）、本分野において公知の様々なイムノアッセイを使用することができる。一実施形態において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態において、一次抗体は、一次抗体への二次抗体又は試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施形態において、二次抗体は標識されている。イムノアッセイにおける結合を検出するための多くの手段が本分野において公知であり、本発明の範囲に属する。Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）ｂｙ  Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ若しくはより最近の版；Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｇｏｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｐ．（ｅｄ．）（２００１）若しくはより最近の版；及び／又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）（定期的に新版が発行されている。）。このようなアッセイの例は、表面又はマトリックスに付着された抗体、添加される患者の血清及び複合体が形成される時間、結合されていない複合体を除去するための適切な洗浄操作、この後に行われる、複合体の検出を可能とするための第二の抗体（サンドイッチＥＬＩＳＡ）又は抗体表面（競合ＥＬＩＳＡ）上の遊離のヘプシジン結合部位を検出するためのヘプシジンの検出可能な様式の添加を通常含む。先述の方法によって検出された、ある閾値を上回るヘプシジンのレベルは、炎症性疾患の存在と相関付けられ、前記閾値を下回るレベルは、患者が炎症性疾患を有する可能性が少ないことを示唆する。患者は、ヘプシジンレベルが正常な範囲内にある場合には、炎症性疾患を有する可能性が少ない。ヘプシジンレベルが正常な範囲、例えば、２０ｎｇ／ｍＬを超える場合、特に、レベルが２０と１０００ｎｇ／ｍＬの間にある場合には、患者は、炎症性疾患を有する可能性が高い。典型的なヘプシジン関連炎症性疾患には、癌の貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、化学療法によって誘発された貧血、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、終末段階の腎臓病、慢性腎不全、うっ血性心不全、癌、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、Ｈ．ピロリ感染又は他の細菌感染症、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ及び他のウイルス疾患、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、膵炎、敗血症、脈管炎、鉄欠乏症、低色素性小球性貧血及びヘプシジン過剰を伴う症状が含まれる。
【０２０５】
他の方法において、患者から得られた生物試料は、ヘプシジンのレベルに関して検査される。生物試料は、免疫複合体の形成を可能とするのに十分な条件下及び時間にわたって、本明細書に開示されている抗ヘプシジン抗体の１つ以上とともに温置される。次いで、ヘプシジンとヘプシジンに特異的に結合する生物試料中の抗体との間で形成される免疫複合体が検出される。このような方法において使用するための生物試料は、ヘプシジンを含有することが予想される患者から得られたあらゆる試料であり得る。適切な生物試料には、血液、血清、血漿、尿及び骨髄が含まれる。適切な抗体には、ヒト細胞、げっ歯類、ウサギ、ヤギ、ラクダ又は他のあらゆる種から得られる抗体が含まれる。
【０２０６】
生物試料は、ヘプシジンとヘプシジンに対して免疫特異的である抗体との間で免疫複合体が形成するのに十分な条件及び時間で、反応混合物中において抗体とともに温置される。例えば、生物試料及び１つ以上の抗ヘプシジン抗体は、４℃で、２４から４８時間温置され得る。
【０２０７】
温置後、反応混合物は、免疫複合体の存在に関して検査される。抗ヘプシジン抗体と生物試料中に存在するヘプシジン間で形成される免疫複合体の検出は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び酵素連結免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの様々な公知の技術によって達成され得る。適切なアッセイは本分野において周知であり、科学文献及び特許文献中に多数記載されている（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８）。使用され得るアッセイには、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ技術（米国特許第４，３７６、１１０号）；モノクローナル−ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Ｗｉｄｅ  Ｌ．，“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，””，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １５−１７  １９７０  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｋｉｒｋｈａｍ  Ｈｕｎｔｅｒ，ｅｄｓ．，（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｅｄｅｎｂｕｒｇｈ，（１９７１））ｐｐ．４０５−４１２；「ウェスタンブロット」法（米国特許第４，４５２，９０１号）；標識されたリガンドの免疫沈降（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．．４９８０−４９８３ｍ  １９８０）；酵素連結免疫吸着検定法；蛍光色素の使用を含む免疫細胞化学的技術（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９：４７７，１９８０）；及び活性の中和（Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６：７０１−７０３，１９８４）が含まれるが、これらに限定されない。他のイムノアッセイには、米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第３，９０１，６５４号；米国特許第３，９３５，０７４号；米国特許第３，９８４，５３３号；米国特許第３，９９６，３４５号；米国特許第４，０３４，０７４号及び米国特許第４，０９８，８７６号に記載されているものが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０８】
検出のために、抗ヘプシジン抗体は標識され得、又は非標識とされ得る。非標識抗体は、凝集アッセイにおいて又は免疫複合体に結合する標識された検出試薬（例えば、ヘプシジンに特異的に結合する抗体に結合することができる、抗免疫グロブリン、プロテインＧ，プロテインＡ又はレクチン及び二次抗体又はその抗原結合断片）と組み合わせて使用され得る。抗ヘプシジン抗体が標識されている場合、レポーター基は、放射性同位体、蛍光性の基（例えば、フルオレセイン又はローダミン）、発光性の基、酵素、ビオチン及び色素粒子などの、本分野において公知のあらゆる適切なレポーター基であり得る。それ自体を直接検出できる標識には、蛍光性又は発光性色素、金属又は金属キレート物質、電気化学的標識、放射性核種（例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ又は１３１Ｉ）、磁気標識又はビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）、常磁性標識又は比色分析標識（例えば、コロイド金、着色されたガラス又はプラスチックビーズ）が含まれる。このような検出可能な標識は、抗ヘプシジン抗体若しくは検出試薬へ直接連結され得、又は抗ヘプシジン抗体若しくは検出試薬へ付着されたビーズ若しくは粒子と結合され得る。標識された特異的な結合対の結合を通じて検出可能な標識には、ビオチン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、フェニルヒ酸、ｓｓＤＮＡ又はｄｓＤＮＡが含まれる。検出可能な反応産物の産生によって間接的に検出することができる間接的標識には、適切な基質を切断して着色された又は蛍光性の反応産物を形成する、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ若しくは他の糖オキシダーゼ又はルシフェラーゼなど、本分野において周知の様々な酵素が含まれる。
【０２０９】
ある種のアッセイにおいて、生物試料中のヘプシジンを捕捉する「捕捉剤」（又は試薬）として使用するために、非標識抗ヘプシジン抗体は固体支持体上に固定化される。固体支持体は、抗体を付着させ得る、当業者に公知のあらゆる材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレート又はニトロセルロース又は他の適切な膜中の検査ウェルであり得る。あるいは、支持体は、ガラス、繊維ガラス、ラテックス又はポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン若しくはポリ塩化ビニルなどのプラスチック材料又は多孔性マトリックスなどの、チューブ、ビーズ、粒子又は円板であり得る。他の材料には、アガロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、ナイロン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、セルロース又は多糖が含まれる。支持体は、例えば米国特許第５，３５９，６８１号に開示されているものなどの、磁気粒子又は光ファイバーセンサーでもあり得る。固定化された抗ヘプシジン抗体は、ポリクローナル抗体、又は本明細書中に記載されているものなどの１つ若しくはそれ以上のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体と１つ若しくはそれ以上のモノクローナル抗体の組み合わせであり得る。抗体は、特許文献及び科学文献中に多数記載されている当業者に公知の様々な技術を用いて、固体支持体上に固定化され得る。本発明において、「固定化」という用語は、吸着などの非共有的会合及び共有的付着（抗原と支持体上の官能基の間の直接的結合であり得、又は架橋剤を介した連結であり得る。）の両方を表す。マクロタイタープレート中のウェルへの又は膜への吸着による固定化が想定される。このような事例では、吸着は、適切な時間にわたって、適切な緩衝液中で、抗ヘプシジン抗体を固体支持体と接触させることによって達成され得る。接触時間は温度とともに変動するが、典型的には、約１時間と約１日の間である。一般に、約１０ｎｇから約１０μｇ、好ましくは約１００ｎｇから約１μｇの範囲のペプチドの量と、プラスチックマイクロタイタープレート（ポリスチレン又はポリ塩化ビニルを含む。）のウェルを接触させることが、ペプチドの十分な量を固定化するのに十分である。
【０２１０】
固定化の後、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的には、封鎖される。ウシ血清アルブミン、ＴｗｅｅｎＴＭ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、熱不活化された正常ヤギ血清（ＮＧＳ；ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ）又はＢＬＯＴＴＯ（防腐剤、塩及び消泡剤も含有する無脂肪ドライミルクの緩衝化された溶液）などの、当業者に公知のあらゆる適切なブロッキング剤を使用することができる。次いで、支持体は、ヘプシジンを含有すると疑われる生物試料とともに温置される。試料は、希釈せずに適用することが可能であり、又は、より頻繁には、ＢＳＡ、ＮＧＳ又はＢＬＯＴＴＯなどの、タンパク質の少量（０．１重量％から５．０重量％）を含有する緩衝化された溶液中に、通常希釈するすることができる。一般に、適切な接触時間（すなわち、温置時間）は、ヘプシジンを含有する試料内のヘプシジンに対して免疫特異的である抗体又は抗原結合断片の存在を検出するのに十分な時間である。幾つかの実施形態において、接触時間は、結合された抗体と結合されていない抗体又は抗体断片との間の平衡において達成される結合レベルの少なくとも約９５％である結合レベルを達成するのに十分である。当業者は、平衡状態を達成するのに必要な時間は、ある期間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを認識する。室温では、約３０分の温置時間が一般に十分である。
【０２１１】
次いで、０．１％ＴｗｅｅｎＴＭ２０を含有するＰＢＳなどの適切な緩衝液で固体支持体を洗浄することによって、結合されていない試料を除去し得る。次いで、（捕捉剤と試料からのヘプシジンの結合によって形成された）免疫複合体中のヘプシジンへ結合する検出試薬を添加し得る。このような検出試薬は、ポリクローナル抗体又は本明細書中に記載されているものなどの１つ若しくはそれ以上のモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体と本明細書に記載されているものなどの１つ若しくはそれ以上のモノクローナル抗体との組み合わせ又はあらゆる抗体のＦａｂ画分であり得る。検出試薬は、直接標識され得る、すなわち、少なくとも第一の検出可能な標識又は「レポーター」分子を含む。あるいは、検出試薬は、非標識抗ヘプシジン抗体であり得る。この非標識抗ヘプシジン（一次）抗体は、次いで、一次抗体への標識された二次抗体又は試薬の結合によって検出される。例えば、一次抗体がマウス免疫グロブリンである場合には、二次抗体は、標識された抗マウス免疫グロブリン抗体であり得る。同様に、一次抗体がウサギ免疫グロブリンである場合には、二次抗体は、標識された抗ウサギ免疫グロブリン抗体であり得る。
【０２１２】
検出試薬は、結合された抗体又はその抗原結合断片を検出するのに十分な時間にわたって、免疫複合体とともに温置される。一般に、適切な時間の長さは、ある期間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、結合されていない標識又は検出試薬は除去され、適切なアッセイ又は分析装置を用いて、結合された標識又は検出試薬が検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性標識に関しては、シンチレーションカウンティング又はオートラジオグラフィー法が一般に適切である。色素、発光性又は化学発光性部分及び様々な色素原、蛍光標識などを検出するために、分光学的方法が使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基（一般に、放射性若しくは蛍光性の基又は酵素）に結合されたアビジンを用いて検出され得る。（西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びグルコースオキシダーゼを含む）酵素レポーター基は、（一般に、特定の時間にわたる）基質の添加後における反応産物の分光学的又は他の分析によって一般に検出され得る。使用される具体的な方法に関わらず、バックグラウンド（すなわち、ヘプシジンの正常なレベルを有する個体から得られた生物試料に対して観察されるレベル）より少なくとも２倍大きな結合された検出試薬のレベルは、ヘプシジンの発現と関連する疾患の存在を示唆する。
【０２１３】
代替的な実施形態において、試料と検出試薬は、逐次的に添加されるのではなく、捕捉剤と同時に接触され得る。さらに別の選択肢において、試料と検出試薬は、予め一緒に温置され、次いで、捕捉剤へ添加され得る。他の変形が、当業者に自明である。
【０２１４】
別の実施形態において、試料中に存在するヘプシジンの量は、競合的結合アッセイによって測定される。競合的結合アッセイは、抗ヘプシジン抗体の限定された量との結合に関して、検査試料分析物（ヘプシジンポリペプチド）と競合する標識された標準物質（例えば、ヘプシジンポリペプチド又は免疫学的に反応性を有するその一部）の能力に依存する。遊離の及び結合されたヘプシジンの分離後に、公知の標準物質に対して結合／非結合ヘプシジンの比を関連付けることによって、ヘプシジンが定量される。検査試料中のヘプシジンポリペプチドの量は、抗体に結合された状態となった標準物質の量と反比例する。結合された状態となった標準物質の量の測定を促進するために、抗体に結合された標準物質と分析物質が、結合されていないままの標準物質及び分析物から都合よく分離され得るように、典型的には、抗体は、固体支持体上に固定化される。従って、このような実施形態において、標識された成熟ヘプシジン（又はヘプシジンの抗原性を保持する標識されたその断片）及び成熟ヘプシジンへ結合する抗体と生物試料を接触させること、並びに形成された、抗体標識されたヘプシジン複合体の量を検出することも想定される。
【０２１５】
固体支持体又は検出可能な標識への連結物の調製は、しばしば、化学的架橋剤の使用を含む。架橋試薬は少なくとも２つの反応性の基を含有し、一般に、ホモ官能性架橋剤（同一の反応性基を含有する。）及びヘテロ官能性架橋剤（同一でない反応性基を含有する。）に分けられる。アミン、スルフヒドリルを通じて連結する又は非特異的に反応するホモ二官能性架橋剤は、多くの市販先から入手可能である。マレイミド、ハロゲン化アルキル及びアリール、α−ハロアシル並びにピリジルジスルフィドは、チオール反応性の基である。マレイミド、ハロゲン化アルキル及びアリール並びにα−ハロアシルは、スルフヒドリルと反応して、チオールエーテル結合を形成するのに対して、ピリジルジスルフィドはスルフヒドリルと反応して、混合されたジスルフィドを産生する。ピリジルジスルフィド産物は、切断可能である。イミドエステルは、タンパク質−タンパク質架橋に対しても極めて有用である。
【０２１６】
ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質の特定の基との逐次的連結を可能とする２つ以上の異なる反応性基を有しており、望ましくない重合又は自己連結を最小限に抑える。アミンの修飾が困難である場合にも、ヘテロ二官能性試薬が使用される。アミンは、時には、高分子の活性部位において見出され得、これらの修飾は活性の喪失をもたらし得る。スルフヒドリル、カルボキシル、フェノール及び炭水化物などの他の部分は、より適切な標的であり得る。二段階戦略は、他の接近可能な基を有するタンパク質へのタンパク質のアミンの修飾を耐容することができるタンパク質の結合を可能とする。各々が首尾よい連結のための異なる属性を組み合わせている様々なヘテロ二官能性架橋剤は、市販されている。一端がアミン反応性であり、他端がスルフヒドリル反応性である架橋剤は、極めて一般的である。ヘテロ二官能性試薬を使用するのであれば、効果的な架橋を確保し、望ましくない重合を避けるために、典型的には、最も不安定な基を最初に反応させる。
【０２１７】
同時係属の米国特許出願１２／０２２，５１５号（その開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているように、炎症の貧血及び癌の貧血など、ある種の病状に対する診断となるのは、プロヘプシジン（配列番号８のアミノ酸２５から８４）のレベルではなく、成熟ヘプシジン（配列番号８のアミノ酸６０から８４）のレベルである。従って、好ましい一実施形態において、成熟した、適切に折り畳まれたヘプシジン（配列番号９）に結合する抗体は、捕捉剤と検出試薬の何れとしても使用される。天然に存在するＮ末端切断された様式（例えば、成熟ヘプシジンのＮ末端アミノ酸の最大２個又は最大５個を欠如する。）に結合する抗体も使用され得る。捕捉剤及び検出試薬の様々な組み合わせが想定される。例えば、捕捉剤は、成熟ヘプシジンの第一のエピトープに結合するモノクローナル抗体であり得、検出試薬は、成熟ヘプシジンの第二のエピトープに結合する異なるモノクローナル抗体であり得る。幾つかの実施形態において、捕捉剤と検出試薬間での競合又は干渉を最小限に抑えるために、ヘプシジンの異なるエピトープに対して特異的な抗体が使用される。あるいは、捕捉剤は成熟ヘプシジンに結合するポリクローナル抗体であり得、検出試薬はモノクローナル抗体であり得る。さらに別の選択肢として、捕捉剤は成熟ヘプシジンに結合するモノクローナル抗体であり得、検出試薬はポリクローナル抗体であり得る。前記実施形態の何れにおいても、捕捉剤又は検出試薬の何れもが、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の組み合わせであり得る。
【０２１８】
幾つかの実施形態において、成熟ヘプシジン特異的モノクローナル抗体は、捕捉剤若しくは検出試薬又は両者として、使用される。成熟ヘプシジン特異的抗体は、プロヘプシジンを全く結合せず、又は抗体が成熟ヘプシジンをプロヘプシジンから識別できるほど低い親和性でプロヘプシジンに結合する。例えば、このようなモノクローナル抗体は、成熟ヘプシジンのＮ末端に結合し得、又は（例えば、プロドメインによる遮蔽のために）プロヘプシジン中には検出できない成熟ヘプシジンのエピトープを結合し得る。
【０２１９】
成熟ヘプシジンとプロヘプシジンの両方に存在するエピトープに結合するモノクローナル抗体を使用する実施形態において、さらなる精緻化が場合によって想定される。成熟ヘプシジン単独の量は、同じ試料中に存在する総ヘプシジン（プロヘプシジン＋成熟ヘプシジン）の量から試料中に存在するプロヘプシジンの量を差し引くことによって測定される。プロヘプシジンの量は、上記されているような技術において、プロヘプシジン特異的ポリクローナル及び／又はモノクローナル抗体を使用することによって求めることができる。プロヘプシジン特異的抗体は、成熟ヘプシジンを全く結合せず、又は抗体がプロヘプシジンを成熟ヘプシジンから識別できるほど低い親和性で成熟ヘプシジンに結合する。例えば、このような抗体は、ヘプシジンのプロドメイン（配列番号８のアミノ酸２５から５９）中のみに存在する直鎖又は立体的エピトープに結合し得る。このような実施形態において、総ヘプシジン及びプロヘプシジンの量は、逐次的に又は同時に測定され得る。血清中において、プロヘプシジンは素早くヘプシジンへ分解されるので、幾つかの実施形態において、プロヘプシジンの分解を抑制又は低減するために、フューリン阻害剤が生物試料に添加される。
【０２２０】
２５アミノ酸の成熟ヘプシジンに結合するモノクローナル抗体を使用する幾つかの実施形態において、モノクローナル抗体は、分解産物（すなわち、ヘプシジン−２２及びヘプシジン−２０）を結合しない。
【０２２１】
総ヘプシジン及びプロヘプシジンを検出するための同時アッセイの一実施形態において、捕捉剤は、成熟ヘプシジンとプロヘプシジンの両方に存在するエピトープに結合する抗体であり、２つの検出試薬は同時に適用される。第一の検出試薬は、成熟ヘプシジンとのプロヘプシジンの両方に存在するエピトープに結合する標識された抗体であり、第二の検出試薬は、異なって標識されたプロヘプシジン特異的抗体である。例えば、第一の検出試薬は第一の波長で検出可能な蛍光色素で標識されているのに対して、第二の検出試薬は第二の波長で検出可能な蛍光色素で標識されている。従って、このような例では、捕捉剤は、試料中の総ヘプシジン（成熟ヘプシジン＋プロヘプシジン）を結合し、第一の検出試薬は総ヘプシジンの量を検出し、第二の検出試薬はプロヘプシジンの量を検出する。総ヘプシジンの量からプロヘプシジンの量を差し引くことによって、成熟ヘプシジンの量が得られる。他の別の実施形態において、２つの異なる捕捉剤（成熟ヘプシジンとプロヘプシジンの両者に存在するエピトープに結合する第一の捕捉剤及びプロヘプシジン特異的抗体である第二の捕捉剤）は、場合によって、成熟ヘプシジンとプロヘプシジンの両者に存在するエピトープを結合する検出試薬とともに使用し得る。
【０２２２】
例えば、「Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３（１）４５−５２（Ｊａｎ．２００６）」に記載されている、蛍光性マイクロビーズの異なるコードが与えられた組を用いる多重系など、同時アッセイを実施するための他の実施形態が本分野において周知である。単一の表面に対する多重同時アッセイを実施するための他の実施形態には、複数の異なる分析物を検出するために、複数の分離された指定可能な位置を有する表面が含まれる。このような規格には、タンパク質マイクロアレイ又は「タンパク質チップ」（例えば、Ｎｇ  ａｎｄ  Ｉｌａｇ，Ｊ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｍｅｄ．６：３２９−３４０（２００２）参照）及びキャピラリー装置（例えば、米国特許第６，０１９，９４４号を参照されたい。）が含まれる。これらの実施形態において、それぞれの分離された表面位置は、各位置における検出のために異なる分析物を固定化する異なる抗体を有する。あるいは、表面は、表面の分離した位置に固定化された１つ以上の分離した粒子（例えば、微粒子又はナノ粒子）を有することができ、粒子の各組は、異なる分析物に対する異なる捕捉剤を含有する。
【０２２３】
相補的な抗体対（対がサンドイッチアッセイにおいて使用するのに適するように、ヘプシジン上の異なるエピトープに結合する抗体）は、同定するのが困難であった。競合又は干渉を最小限に抑える相補対の使用は、アッセイの感度を２０倍から５０倍増加させることができる。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されているイムノアッセイは、０．０１ｎｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬの範囲のヘプシジンレベルを測定することができる。
【０２２４】
サンドイッチイムノアッセイにおける使用に適した抗体対には、以下のものが含まれる。（１）前記対の１つの抗体が抗体１Ｓ１と同じエピトープに結合する抗体である場合、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１Ｓ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する場合には、適切な第二の抗体は、以下の抗体であり得る。（ａ）抗体２３Ｆ１１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体２３Ｆ１１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は（ｂ）抗体１５Ｅ１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１５Ｅ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は（ｃ）抗体１２Ｂ９と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１２Ｂ９と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；（２）前記対の１つの抗体が抗体１２Ｂ９と同じエピトープに結合する抗体である場合、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１２Ｂ９と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する場合には、適切な第二の抗体は、以下の抗体であり得る。（ａ）抗体１８Ｄ８と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１８Ｄ８と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は（ｂ）抗体１９Ｃ１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１９Ｃ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は（ｃ）抗体１９Ｄ１２と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１９Ｄ１２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は（ｄ）抗体１９Ｈ６と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１９Ｈ６と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は（ｅ）抗体１Ｓ１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１Ｓ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は（３）前記対の１つの抗体が抗体２３Ｆ１１と同じエピトープに結合する抗体である場合、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体２３Ｆ１１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する場合には、適切な第二の抗体は、以下の抗体であり得る。（ａ）抗体１８Ｄ８と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１８Ｄ８と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は（ｂ）抗体１９Ｃ１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１９Ｃ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は（ｃ）抗体１９Ｄ１２と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１９Ｄ１２と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は（ｄ）抗体１９Ｈ６と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１９Ｈ６と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は（ｅ）抗体１Ｓ１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体４Ｅ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；又は（ｆ）抗体３Ｂ３と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体３Ｂ３と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体；（４）前記対の１つの抗体が抗体１５Ｅ１と同じエピトープに結合する抗体である場合、又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１５Ｅ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する場合には、適切な第二の抗体は、以下の抗体であり得る。（ａ）抗体１Ｓ１と同一のエピトープに結合する抗体又は配列番号９の成熟ヒトヘプシジンへの結合に関して、抗体１Ｓ１と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％若しくはそれ以上競合する抗体。
【０２２５】
幾つかの実施形態において、ヘプシジンアンタゴニストを用いた治療法の有効性を監視するための方法は、試料中の又はヒト患者などの動物中のヘプシジンレベルの変化を監視することを含む。ヘプシジンレベルが監視される方法は、（ａ）本明細書に開示されている抗ヘプシジン抗体の１つ以上を用いた治療法の前に患者から得られた第一の生物試料を温置すること（温置は、免疫複合体の形成を可能とするのに十分な条件下及び時間にわたって行われる。）；（ｂ）生物試料中のヘプシジンとヘプシジンを特異的に結合する抗体又は抗原結合断片の間で形成された免疫複合体を検出すること；並びに（ｃ）後に、例えば、本明細書中に開示されている抗ヘプシジン抗体の１つ以上を用いた治療法の後などに患者から採取された第二の生物試料を用いて工程（ａ）及び（ｂ）を場合によって繰り返すこと；並びに（ｄ）第一及び第二の生物試料中に検出される免疫複合体の数を比較することを含み得る。
【０２２６】
他の監視法は、（ａ）ヘプシジンと治療剤との間の複合体の血液（例えば、血清又は血漿）循環レベルを測定すること、及び（ｂ）循環中に存在する遊離のヘプシジンの量を場合によって測定することを含む。例えば、ヘプシジンと治療用抗体の間の複合体は、複合体の治療用抗体部分に結合する抗ヒトＦｃ抗体及び前記複合体のヘプシジン部分に結合する「対を成す」抗ヘプシジン抗体のＦａｂ断片を用いて検出することができる。あるいは、抗ヒトＦｃ抗体の代わりに、抗イディオタイプ抗体を使用することができる。別の可能性として、非ヒトＦｃを含有する抗ヘプシジン抗体（例えば、ヒトＦｃがマウスＦｃと置換されている。）を、Ｆａｂ断片の代わりに使用することができる。
【０２２７】
別の例として、生物試料からヘプシジン−治療用抗体複合体を除去した後、固体支持体上に固定化された抗ヒトＦｃ抗体又は抗イディオタイプ抗体の何れかを用いて、遊離のヘプシジンを検出することができる。次いで、固体支持体に結合されていない状態を保つ遊離のヘプシジンの量が測定される。遊離のヘプシジンのこのレベルは、利用可能な循環ヘプシジンを除去する上で、治療用抗体の有効性を反映し得る。
【０２２８】
このような方法において使用するための生物試料は、ヘプシジンを含有することが予想される患者から得られたあらゆる試料であり得る。典型的な生物試料には、血液、血漿、血清、尿及び骨髄が含まれる。第一の生物試料は、治療の開始前に、又は治療計画を通じて途中まで、取得され得る。第二の生物試料は、同様の様式で、但し、追加治療の後に取得されるべきである。第二の生物試料は、治療の少なくとも一部が第一及び第二の生物試料の単離の間に行われる限り、治療の完了時に又は治療の途中に取得され得る。
【０２２９】
両試料に対する温置及び検出操作は、一般に、上述のように実施され得る。第一の試料と比べた第二の試料中の免疫複合体の数の減少は、ヘプシジンレベルの減少を示唆しており、治療の成功を反映する。遊離の血清ヘプシジンも同様にして分析され得、遊離の血清ヘプシジンの減少は治療の成功を示唆する。
【０２３０】
診断又は監視法が有用であり得るヘプシジン関連疾患、炎症性疾患及び鉄恒常性の疾病又は疾患には、アフリカ鉄過剰症、アルファサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌の貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、動脈硬化又はアテローム性動脈硬化（冠動脈疾患、脳血管疾患又は末梢閉塞性動脈疾患を含む。）、運動失調、鉄に関連する運動失調、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠乏症、化学療法によって誘発された貧血、慢性腎／腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）（終末段階の腎臓病又は慢性腎／腎臓不全を含む。）、肝硬変、古典的ヘモクロマトーシス、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、ヘプシジン過剰を有する症状（上昇したヘプシジン）、先天性赤血球異形成性貧血、うっ血性心不全、クローン病、糖尿病、鉄体内分布の異常、鉄恒常性の異常、鉄代謝の異常、フェロポーティン病、フェロポーティン変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ失調症、索性脊髄症、グラシール症候群（ｇｒａｃｉｌｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｅｌｏｒｉ）感染症又はその他の細菌感染症、ハラーホルデン・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２中の変異に起因するヘモクロマトーシス、異常ヘモグロビン症、肝炎、肝炎（Ｂｒｏｃｋ）、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、ヘプシジン欠乏、遺伝性ヘモクロマトーシス、ＨＩＶ又は他のウイルス病、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インシュリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏性疾患、鉄過剰負荷疾患、ヘプシジン過剰を伴う鉄欠乏性症状、若年性ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ２）、多発性硬化症、トランスフェリン受容体２、ＨＦＥ、ヘモジュベリン、フェロポーティン又は鉄代謝の他の遺伝子中の変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症、膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、偽脳炎、肺血鉄症、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性紅斑性狼瘡、サラセミア、中間型サラセミア、輸血性鉄過剰症、腫瘍、脈管炎、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症及び／又はウィルソン病が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３１】
本明細書に記載されている病状の診断及び本明細書に記載されている予後の監視に対して適切な閾値を設定する方法は、本分野において周知である。例として、正常対象（例えば、検出されるべき症状を持たない健康な集団）の十分な代表数から得られた流体試料中のヘプシジンのレベルは、同じプロトコールを用いて、罹病対象（例えば、疾病又は症状を有することが確認された集団）の十分な代表数から得られるヘプシジンレベルと比較して分析される。正常な集団の殆どを罹病集団の殆どから識別する閾値カットオフを決定することができる。あるいは、陰性の結果、不明確な結果及び陽性の結果に対する有用な評価項目値をデータから決定することができる。例えば、正常集団の殆どのヘプシジンを含むが、罹病集団の殆ど全てを除外する正常な範囲（陰性結果の指標となる）を決定することができる。対応して、例えば、罹病集団の殆どのヘプシジンを含むが、正常集団の殆ど全てを除外する陽性結果の指標となる範囲を決定することができる。同様に、炎症の貧血に罹患している集団中のヘプシジンレベルを、鉄欠乏性貧血に罹患している集団中のヘプシジンレベルと識別する閾値を決定することが可能である。有用な評価項目の値は、患者が炎症の貧血、鉄欠乏性貧血又は混合型貧血に罹患していることを示唆し得る。閾値に対する適切な評価項目の値は、所望の特異性又は感受性を最適化するために決定することができ、全般的な医学及び疫学的因子も考慮に入れ得る。考慮すべき因子には、研究室検査の臨床的な目的及び高い陽性予測値又は高い陰性予測値を有する必要があるかどうか、並びに検査集団中の疾病の有病率が含まれる。
【０２３２】
抗ヘプシジン抗体に対する治療的用途
治療を必要としている対象を治療するために、ヒトヘプシジンを特異的に結合する本明細書中に記載されている抗ヘプシジン抗体の使用も提供される。幾つかの実施形態において、対象は、ヘプシジンの上昇したレベル、ヘプシジン関連疾患、鉄恒常性の障害又は貧血のリスクがあり、又はこれらに罹患し得る。
【０２３３】
本明細書において使用される「治療」又は「治療する」は、疾病若しくは疾患のリスクを有する又は疾病若しくは疾患に対する素因を有する対象の予防的処置及び疾病又は疾患に罹患している対象の治療的処置の両方を表す。
【０２３４】
予防法における治療剤の投与は、疾病若しくは疾患が予防されるように、あるいは、その進行が遅延されるように、所望されない疾病又は疾患の症候が現れる前に行うことができる。従って、予防的方法と組み合わせて使用される場合、「治療的に有効」という用語は、処理後に、（平均して）対象のより少ない数が、望ましくない疾病若しくは疾患を発症し、症候の重篤度を進行させることを意味する。
【０２３５】
対象が疾病又は疾患の症候を呈した後に、治療剤の投与を含む治療方法と組み合わせて使用される場合には、「治療的に有効」という用語は、処理後に、疾病又は疾患の１つ以上の徴候又は症候が軽減又は除去されることを意味する。
【０２３６】
治療における「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農場動物並びにイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの動物園、スポーツ又はペット動物を含む、哺乳動物として分類されるあらゆる動物を表す。幾つかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０２３７】
本明細書において使用される「ヘプシジン関連疾患」は、鉄恒常性を崩壊させるヘプシジンの異常なレベル（例えば、貧血又は貯蔵された鉄の程度と比べた、ヘプシジンの過剰又はヘプシジンの欠乏）によって引き起こされる、又はヘプシジンの異常なレベルと関連する症状を表す。鉄恒常性の崩壊は、次いで、貧血などの二次的疾病をもたらし得る。急性又は慢性の炎症症状は、貧血を引き起こし得る又は既存の貧血を悪化させ得る減少した循環鉄レベルをもたらし得るヘプシジン発現の上方制御をもたらし得る。典型的なヘプシジン関連炎症性疾患には、癌の貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、化学療法によって誘発された貧血、慢性炎症性貧血、慢性腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）、終末段階の腎臓病、慢性腎不全、うっ血性心不全、癌、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、Ｈ．ピロリ感染又は他の細菌感染症、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ及び他のウイルス疾患、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、肝硬変、膵炎、敗血症、脈管炎、鉄欠乏症、低色素性小球性貧血及びヘプシジン過剰を伴う症状が含まれる。
【０２３８】
本明細書において使用される、「鉄恒常性の疾病（又は障害）」という用語は、対象の鉄レベルが調節を必要とする症状を表す。「鉄恒常性の疾病（又は障害）」という用語には、ヘプシジン関連疾患；ヘプシジンによって引き起こされたものではない鉄恒常性の崩壊など、ヘプシジンの上昇したレベルを伴わないが、ヘプシジン活性の阻害が有益である症状；異常な鉄吸収、再利用、代謝又は排出が正常な鉄血液レベル又は組織分布の崩壊を引き起こす疾病；炎症、癌又は化学療法など、鉄の調節不全が別の疾病又は症状の結果である疾病；異常な鉄血液レベル又は組織分布から生じた疾病又は疾患；及び鉄レベル又は分布を調節することによって処理することができる疾病又は疾患が含まれる。鉄恒常性のこのような疾病又は疾患、ヘプシジン関連疾患及びヘプシジン過剰をもたらし得る炎症性症状の非限定的な例には、アフリカ鉄過剰症、アルファサラセミア、アルツハイマー病、貧血、癌の貧血、慢性疾患の貧血、炎症の貧血、動脈硬化又はアテローム性動脈硬化（冠動脈疾患、脳血管疾患又は末梢閉塞性動脈疾患を含む。）、運動失調、鉄に関連する運動失調、無トランスフェリン血症、癌、セルロプラスミン欠乏症、化学療法によって誘発された貧血、慢性腎／腎臓病（段階Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ又はＶ）（終末段階の腎臓病又は慢性腎／腎臓不全を含む。）、肝硬変、古典的ヘモクロマトーシス、コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）、ヘプシジン過剰を有する症状（上昇したヘプシジン）、先天性赤血球異形成性貧血、うっ血性心不全、クローン病、糖尿病、鉄体内分布の異常、鉄恒常性の異常、鉄代謝の異常、フェロポーティン病、フェロポーティン変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードライヒ失調症、索性脊髄症、グラシール症候群、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｅｌｏｒｉ）感染症又はその他の細菌感染症、ハラーホルデン・スパッツ病、ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２中の変異に起因するヘモクロマトーシス、異常ヘモグロビン症、肝炎、肝炎（Ｂｒｏｃｋ）、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、遺伝性ヘモクロマトーシス、ＨＩＶ又は他のウイルス病、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インシュリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏性疾患、鉄過剰負荷疾患、ヘプシジン過剰を伴う鉄欠乏性症状、若年性ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ２）、多発性硬化症、トランスフェリン受容体２、ＨＦＥ、ヘモジュベリン、フェロポーティン又は鉄代謝の他の遺伝子中の変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症、膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、偽脳炎、肺血鉄症、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性紅斑性狼瘡、サラセミア、中間型サラセミア、輸血性鉄過剰症、腫瘍、脈管炎、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症及び／又はウィルソン病が含まれる。
【０２３９】
鉄制御の崩壊に関連することが推定されている非炎症性症状には、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ペラグラ、索性脊髄症、偽脳炎、パーキンソン病（Ｆａｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９６：９０９（２００６）ａｎｄ  Ｋａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｅｉｎｇ  Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，３：３２７（２００４））、アルツハイマー病、冠状動脈性心臓病、骨減少症及び骨粗しょう症（Ｇｕｇｇｅｎｂｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．１６：１８０９（２００５））、異常ヘモグロビン症及び赤血球代謝の他の疾患（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０５：４１０３（２００５）及び末梢閉塞性動脈疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４０】
様々な他の鉄指数及びその正常な濃度範囲が表２に列記されている。
【０２４１】
【表２】
2011519279.tif 000003
【０２４２】
表２に列記されている正常な範囲外にある患者の鉄指数レベルは、当該患者にとって、本明細書に記載されている抗ヘプシジン抗体を用いた治療が有益であり得ることを示す。ヘプシジンは鉄恒常性において中心的な役割を果たしているので、ヘプシジンレベル及び活性は、鉄恒常性及び／又は鉄指数の崩壊に相関する。上昇したヘプシジンレベルは、表２に示されている正常範囲を下回る血清鉄レベル、低ヘモグロビン及びヘマトクリット、低下した又は正常なＴｓａｔ及び高い又は正常なフェリチン値及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）上昇又は炎症の他のマーカーによって測定される上昇した炎症状態と相関する。
【０２４３】
本明細書に記載されている抗ヘプシジン抗体の「治療的有効量」という用語は、所望の治療効果をもたらす（すなわち、「治療的効力」を与える）量を表す。典型的な治療的効果には、増加した循環鉄レベル又は増加した鉄の利用可能性、増加した赤血球数、増加した赤血球平均細胞容積、増加した赤血球ヘモグロビン含量、増加したヘモグロビン（例えば、０．５ｇ／ｄＬ以上の増加）、増加したヘマトクリット、増加したＴｓａｔ、増加した網状赤血球数、増加した又は正常化された網状赤血球平均細胞容積、増加した網状赤血球ヘモグロビン含量又は血清若しくは血漿中の低下した遊離ヘプシジンレベル又は上記パラメータの何れかの正常化が含まれる。治療的効果のためには、このようなパラメータの正常な範囲への復帰は必要とされない。例えば、正常な方向への測定可能な変化（増加又は低下）は、臨床医による所望の治療効果であると考えることができる。単独で投与された各活性成分に対して適用された場合、この用語はその単独成分を表す。組み合わせに対して適用される場合、この用語は、組み合わせて、連続して又は同時に投与されたかどうかを問わず、治療的効果をもたらす活性成分の組み合わされた量を表す。例えば、抗ヘプシジン抗体が赤血球新生刺激物質と組み合わせて投与される態様において、治療的有効量は、上記パラメータの何れかを増加させ又は正常化する組み合わされた量を表すものとする。
【０２４４】
患者の診断を促進するために、図１４Ｂのような決定木を使用して、ヘプシジンのレベルを解釈することができ、これは、治療の過程及び濃度読み取りの重要性を決定する上で使用者又は解釈者を補助するために使用される。ヘプシジン値は、炎症鉄過剰症及びフェロポーティン病を有する患者中で上昇すると予測され、ヘモクロマトーシス、異常ヘモグロビン症および他の赤血球疾患を有する患者中で抑制すると予測される。図１４Ｂの決定木は、ヘプシジンレベルの測定が、鉄代謝疾患を有すると疑われる患者の診断及び／又は評価をどのように簡略化するかを示している。図１４Ａは、ヘプシジンレベルの測定を行わない決定木評価を示している。
【０２４５】
本明細書中に記載されている治療用組成物および治療の方法は、単独で、又は所望の効果を達成するために他の治療剤と組み合わせて使用される１つ以上の本明細書に記載されている抗ヘプシジン抗体を使用し得る。
【０２４６】
組み合わせ療法
さらに改善された効力を与えるために、（同じ又は異なる標的抗原に結合する）２つ若しくはそれ以上の抗体を一緒に混合すること、又は本明細書に記載されている抗体を第二の治療剤とともに同時投与することがさらに有利であり得る。薬剤が治療効果を発揮している期間に重複が存在する限り、２つの治療剤の同時投与は、薬剤が同時に又は同じ経路によって投与されることを要しない。異なる日又は週に投与されるような、同時又は逐次投与が想定される。
【０２４７】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている方法は、単一の抗体及び異なる抗体の組み合わせ又は「カクテル」の投与を含む。異なるエフェクター機構を活用する抗体を含有するので、このような抗体カクテルは、ある種の利点を有し得る。組み合わせたこのような抗体は、相乗的治療効果を示し得る。
【０２４８】
本明細書に記載されている抗ヘプシジン抗体及び赤血球造血刺激物質を使用する組み合わせ療法が具体的に想定される。様々な実施形態において、貧血を有する患者の治療を改善するために、ヘプシジン活性アンタゴニスト（又はヘプシジン発現阻害剤）及び赤血球造血刺激物質を使用することができる。とりわけ、エリスロポエチン又はその類縁体（エポエチンα、エポエチンβ、ダルベポエチンα）などの赤血球新生刺激物質療法に対して低応答性）（非応答性又は抵抗性を含む。）である患者には、本明細書に記載されている抗ヘプシジン抗体を用いた同時治療が有益である。一実施形態において、組み合わせ療法には、ヒトヘプシジンに結合する少なくとも１つの抗体及び少なくとも１つの赤血球新生刺激物質を用いた治療が含まれる。
【０２４９】
体内の鉄貯蔵を再分配するために、抗ヘプシジン抗体及び鉄キレート物質を用いる組み合わせ療法も想定される。鉄キレート物質は、鉄を結合することができ、組織から又は循環から鉄を除去することができる物質である。例には、デフェロキサミン（Ｄｅｓｆｅｒａｌ（Ｒ））及びデフェラシロックス（Ｅｘｊａｄｅ（Ｒ））及びデフェリプロン（１，２−ジメチル−３−ヒドロキシピリジン−４−オン）が含まれる。幾つかの実施形態において、輸血依存性鉄過剰症に続発する鉄過剰疾患を有する又はフリードライヒ失調症などの鉄の分布不良疾患を有する患者の治療を改善するために、抗ヘプシジン抗体及び赤血球新生刺激物質を使用することができる。
【０２５０】
本明細書において使用される「赤血球新生刺激物質」は、例えば、受容体に結合し、受容体の二量体化を引き起こすことによって、又は内在性エリスロポエチン発現を刺激することによって、エリスロポエチン受容体の活性化を直接又は間接的に引き起こす化学的化合物を意味する。赤血球新生刺激物質には、エリスロポエチン受容体に結合し、これを活性化させるエリスロポエチン及びその変形物、類縁体又は誘導体；エリスロポエチン受容体に結合し、受容体を活性化する抗体；又はエリスロポエチン受容体に結合し、活性化するペプチド；又はエリスロポエチン受容体に結合し、エリスロポエチン受容体を活性化する、（場合によって約１０００ダルトン未満の分子量の）小有機化学的化合物が含まれる。赤血球造血刺激物質には、エポエチンα、エポエチンβ、エポエチンδ、エポエチンω、エポエチンι、エポエチンζ及びこれらの類縁体、ＰＥＧ化されたエリスロポエチン、カルバミル化されたエリスロポエチン、模倣ペプチド（ＥＭＰ１／ヘマチドを含む。）、模倣抗体及びＨＩＦ阻害剤（米国特許出願公開第２００５／００２０４８７号（その開示全体が、参照により、組み込まれる。）参照）が含まれるが、これらに限定されない。典型的な赤血球新生刺激物質には、エリスロポエチン、ダルベポエチン、エリスロポエチンアゴニスト変形物及びエリスロポエチン受容体を結合し、活性化するペプチド又は抗体（及び米国特許出願公開２００３／０２１５４４４号及び２００６／００４０８５８号（それぞれの開示全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に報告されている化合物が含まれる。）並びに以下の特許又は特許出願（それぞれ、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に開示されているエリスロポエチン分子又はその変形物若しくは類縁体が含まれる。米国特許第４，７０３，００８号；第５，４４１，８６８号；第５，５４７，９３３号；第５，６１８，６９８号；第５，６２１，０８０号；第５，７５６，３４９号；第５，７６７，０７８号；第５，７７３，５６９号；第５，９５５，４２２号；第５，８３０，８５１号；第５，８５６，２９８号；第５，９８６，０４７号；第６，３１０，０７８号；第６，３９１，６３３号；第６，５８３，２７２号；第６，５８６，３９８号；第６，９００，２９２号；第６，７５０，３６９号；第７，０３０，２２６号；第７，０８４，２４５号；第７，２１７，６８９号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５８６７；ＷＯ９５／０５４６５；ＷＯ９９／６６０５４；ＷＯ００／２４８９３；ＷＯ０１／８１４０５；ＷＯ００／６１６３７；ＷＯ０１／３６４８９；ＷＯ０２／０１４３５６；ＷＯ０２／１９９６３；ＷＯ０２／２００３４；ＷＯ０２／４９６７３；ＷＯ０２／０８５９４０；ＷＯ０３／０２９２９１；ＷＯ２００３／０５５５２６；ＷＯ２００３／０８４４７７；ＷＯ２００３／０９４８５８；ＷＯ２００４／００２４１７；ＷＯ２００４／００２４２４；ＷＯ２００４／００９６２７；ＷＯ２００４／０２４７６１；ＷＯ２００４／０３３６５１；ＷＯ２００４／０３５６０３；ＷＯ２００４／０４３３８２；ＷＯ２００４／１０１６００；ＷＯ２００４／１０１６０６；ＷＯ２００４／１０１６１１；ＷＯ２００４／１０６３７３；ＷＯ２００４／０１８６６７；ＷＯ２００５／００１０２５；ＷＯ２００５／００１１３６；ＷＯ２００５／０２１５７９；ＷＯ２００５／０２５６０６；ＷＯ２００５／０３２４６０；ＷＯ２００５／０５１３２７；ＷＯ２００５／０６３８０８；ＷＯ２００５／０６３８０９；ＷＯ２００５／０７０４５１；ＷＯ２００５／０８１６８７；ＷＯ２００５／０８４７１１；ＷＯ２００５／１０３０７６；ＷＯ２００５／１００４０３；ＷＯ２００５／０９２３６９；ＷＯ２００６／５０９５９；ＷＯ２００６／０２６４６；ＷＯ２００６／２９０９４；及び米国特許出願公開ＵＳ２００２／０１５５９９８；ＵＳ２００３／００７７７５３；ＵＳ２００３／００８２７４９；ＵＳ２００３／０１４３２０２；ＵＳ２００４／０００９９０２；ＵＳ２００４／００７１６９４；ＵＳ２００４／００９１９６１；ＵＳ２００４／０１４３８５７；ＵＳ２００４／０１５７２９３；ＵＳ２００４／０１７５３７９；ＵＳ２００４／０１７５８２４；ＵＳ２００４／０２２９３１８；ＵＳ２００４／０２４８８１５；ＵＳ２００４／０２６６６９０；ＵＳ２００５／００１９９１４；ＵＳ２００５／００２６８３４；ＵＳ２００５／００９６４６１；ＵＳ２００５／０１０７２９７；ＵＳ２００５／０１０７５９１；ＵＳ２００５／０１２４０４５；ＵＳ２００５／０１２４５６４；ＵＳ２００５／０１３７３２９；ＵＳ２００５／０１４２６４２；ＵＳ２００５／０１４３２９２；ＵＳ２００５／０１５３８７９；ＵＳ２００５／０１５８８２２；ＵＳ２００５／０１５８８３２；ＵＳ２００５／０１７０４５７；ＵＳ２００５／０１８１３５９；ＵＳ２００５／０１８１４８２；ＵＳ２００５／０１９２２１１；ＵＳ２００５／０２０２５３８；ＵＳ２００５／０２２７２８９；ＵＳ２００５／０２４４４０９；ＵＳ２００６／００８８９０６；ＵＳ２００６／０１１１２７９。
【０２５１】
エリスロポエチンには、配列番号７２に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。配列番号７２のアミノ酸１から１６５は、エポエチンと表記されるあらゆる分子（例えば、エポエチンα、エポエチンβ、エポエチンδ、エポエチンω、エポエチンι、エポエチンγ、エポエチンζなど）の成熟タンパク質を構成する。さらに、エポエチンには、例えば、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＥＰＯ−βを含む。）などの１つ以上の水溶性ポリマーで化学的に修飾された前記エポエチンの何れもが含まれる。赤血球新生活性をなお保持する、配列番号７２に対して６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するエリスロポエチンの類縁体も想定される。
【０２５２】
組換えヒトエリスロポエチンの典型的な配列、製造、精製及び使用は、Ｌｉｎの米国特許第４，７０３，００８号及びＬａｉ他の米国特許第４，６６７，０１６号（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を含む（但し、これらに限定されない。）多数の特許公報中に記載されている。ダルベポエチンは、２つのさらなる炭水化物鎖を与える５つの変化をｒＨｕＥＰのアミノ酸配列中に有する高グリコシル化されたエリスロポエチン類縁体である。より具体的には、ダルベポエチンαは、配列番号７２のアミノ酸残基３０及び８８に、２つのさらなるＮ結合型炭水化物鎖を含有する。ダルベポエチン及び他のエリスロポエチン類縁体の典型的な配列、製造、精製及び使用は、Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９１／０５８６７，Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９５／０５４６５，Ｅｇｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ００／２４８９３及びＥｇｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．ＷＯ０１／８１４０５（これらの各々の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）を含む多数の特許公報に記載されている。天然に存在するポリペプチド又は類縁体ポリペプチドの誘導体には、例えば、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ化）、放射性核種又は他の診断若しくは標的化若しくは治療用部分を付着するように化学的に修飾された誘導体が含まれる。
【０２５３】
「赤血球新生活性」という用語は、インビボアッセイ、例えば、エクスハイポキシック多血球血症（ｅｘｈｙｐｏｘｉｃ  ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉｃ）マウスアッセイにおいて示される、赤血球新生を刺激する活性を意味する。例えば、「Ｃｏｔｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｎｇｈａｍ，Ｎａｔｕｒｅ  １９１：１０６５（１９６１）」を参照されたい。
【０２５４】
医薬製剤の投与及び調製
別の態様において、医薬組成物は、本明細書に記載されている抗体の何れかの定量的有効量及び医薬として許容される無菌の担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物が提供される。ヘプシジンの上昇したレベル、ヘプシジン関連疾患、鉄恒常性の障害又は貧血を有するヒトを治療するための医薬の調製におけるこのような抗体の使用も提供される。本明細書に記載されているように、抗体を第二の治療剤とともに投与することを含む同時投与法は、第二の治療剤とともに同時投与するための医薬の調製において抗体を使用することのみならず、抗体とともに同時投与するための医薬の調製において第二の治療剤を使用することも包含する。
【０２５５】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている方法の実施において使用される抗ヘプシジン抗体又は特異的結合剤は、所望の送達方法に適した担体を含む医薬組成物中に調合され得る。適切な担体には、抗ヘプシジン抗体又は特異的な結合剤と組み合わされた場合に、ヘプシジンの高親和性結合を保持し、対象の免疫系と非反応性であるあらゆる材料が含まれる。例には、無菌のリン酸緩衝化された生理的食塩水溶液、静菌水などの多数の標準的な医薬担体の全てが含まれるが、これらに限定されない。様々な水性担体（例えば、水、緩衝化された水、０．４％生理的食塩水、０．３％グリシンなど）が使用され得、穏やかな化学的修飾などに供される、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの増強された安定性のための他のタンパク質を含み得る。
【０２５６】
製剤中の典型的な抗体濃度は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１８０ｍｇ／ｍＬ又は約０．１ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬ又は約０．５ｍｇ／ｍＬから約２５ｍｇ／ｍＬ、あるいは約２ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。抗体の水性製剤は、例えば、約４．５から約６．５又は約４．８から約５．５の範囲あるいは約５．０のｐＨで、ｐＨ緩衝化された溶液中に調製され得る。この範囲内のｐＨに対して適している緩衝液の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸緩衝液が含まれる。緩衝液濃度は、例えば、製剤の緩衝液及び所望の浸透圧に応じて、約１ｍＭから約２００ｍＭ又は約１０ｍＭから約６０ｍＭであり得る。
【０２５７】
抗体を安定化することもできる等張剤を製剤中に含めることができる。典型的な等張剤には、マニトールなどのポリオール、スクロース又はトレハロースが含まれる。幾つかの実施形態において、水性製剤は等張であるが、高張又は低張溶液が適切である場合もあり得る。製剤中のポリオールの典型的な濃度は、約１％から約１５％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【０２５８】
製剤化された抗体の凝集を低下させ、及び／又は製剤中の粒状物の形成を最小限に抑え、及び／又は吸着を低下させるために、界面活性剤も抗体製剤に添加され得る。典型的な界面活性剤には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０）又はポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。界面活性剤の典型的な濃度は、約０．００１％から約０．５％又は約０．００５％から約０．２％あるいは約０．００４％から約０．０１％ｗ／ｖの範囲であり得る。
【０２５９】
一実施形態において、製剤は、上記の物質（すなわち、抗体、緩衝液、ポリオール及び界面活性剤）を含有し、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール及びベンゾエトニウムＣｌなどの１つ以上の防腐剤を実質的に含まない。別の実施形態において、防腐剤は、例えば、約０．１％から約２％の範囲あるいは約０．５％から約１％の範囲の濃度で、製剤中に含まれ得る。製剤の所望の特徴に悪影響を及ぼさなければ、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）」中に記載されているような、医薬として許容される１つ以上の他の担体、賦形剤又は安定化剤を製剤中に含め得る。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、使用される投薬量及び濃度においてレシピエントに対して無毒であり、さらなる緩衝化剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ポリエステルなどの生物分解可能なポリマー及び／又はナトリウムなどの塩形成カウンターイオンが含まれる。
【０２６０】
抗ヘプシジン抗体の治療用製剤は、場合によって使用される、生理的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と、純度の所望の程度を有する抗体を混合することによって、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態で、保存のために調製される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、使用される投薬量及び濃度においてレシピエントに対して無毒であり、ホスファート、シトラート及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンゾアルコニウムクロリド、ベンゾエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、マルトース又はデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２６１】
一実施形態において、適切な製剤は、等張化し、安定化させるポリオール、ソルビトール、スクロース又は塩化ナトリウムなどの等張剤と組み合わせて、ホスファート、アセタート又はＴＲＩＳ緩衝液などの等張性緩衝液を含有する。このような等張剤の一例は、５％ソルビトール又はスクロースである。さらに、製剤は、０．０１から０．０２％ｗｔ／容量で、凝集を抑制するため及び安定化などのために、界面活性剤を場合によって含み得る。製剤のｐＨは、４．５から６．５又は４．５から５．５の範囲であり得る。抗体のための医薬製剤の他の典型的な記述は、ＵＳ２００３／０１１３３１６及び米国特許第６，１７１，５８６号（それぞれ、その全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に見出され得る。
【０２６２】
本明細書中の製剤は、治療されている具体的な適応症に対して必要とされる２以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有する２以上の活性化合物も含有し得る。例えば、免疫抑制剤を提供することがさらに望ましい場合があり得る。このような分子は、好適には、意図される目的のために有効な量で組み合わせて存在する。
【０２６３】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合、例えば、コロイド上薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン、小球体、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中の又はマクロエマルジョン中の、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンミクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリラート）ミクロカプセルによって調製されたミクロカプセル中に封入させることもできる。このような技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）」中に開示されている。
【０２６４】
抗体の懸濁物及び結晶形態も想定される。懸濁物及び結晶形態を作製するための方法は、当業者に公知である。
【０２６５】
インビボ投与のために使用されるべき製剤は、無菌でなければならない。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている組成物は、旧来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。例えば、滅菌は、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成される。得られた溶液は、使用のために梱包され、又は無菌条件下でろ過され、及び凍結乾燥され得る（凍結乾燥された調製物は、投与の前に、無菌溶液と組み合わされる。）。
【０２６６】
特に、ポリペプチドが液体組成物中において相対的に不安定である場合に、ポリペプチドを長期間安定化するために、しばしば、凍結乾燥法が使用される。凍結乾燥サイクルは、通常、凍結、一次乾燥及び二次乾燥という３つの工程から構成される。Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，Ｎｕｍｂｅｒ  ２，ｐａｇｅｓ  ４８−５９（１９８４）。凍結工程において、十分に凍結されるまで、溶液が冷却される。溶液中のバルク水は、この段階で氷を形成する。氷は一次乾燥段階において昇華し、一次乾燥段階は、真空を用いて、氷の蒸気圧を下回るようにチャンバー圧力を低下させることによって実施される。最後に、低下したチャンバー圧力及び上昇した棚温度下で、吸着された又は結合された水は二次乾燥段階において除去される。この工程は、凍結乾燥ケーキとして知られる物質を産生する。その後、使用前に、ケーキを再構成することができる。
【０２６７】
凍結乾燥された物質に対する標準的な再構成の実施は、（典型的には、凍結乾燥の間に除去された容積と等しい）純水の容積を再び添加することであるが、非経口投与用医薬の産生において、抗菌剤の希釈溶液が時折使用される。Ｃｈｅｎ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８，Ｎｕｍｂｅｒｓ  １１  ａｎｄ  １２，ｐａｇｅｓ  １３１１−１３５４（１９９２）。
【０２６８】
賦形剤は、幾つかの事例において、凍結乾燥された産物に対する安定化剤として作用することが注目されてきた。Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ  ７４，ｐａｇｅｓ  ２２５−２３９（１９９１）例えば、公知の賦形剤には、ポリオール（マニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む。）、糖（グルコース及びスクロースを含む。）及びアミノ酸（アラニン、グリシン及びグルタミン酸を含む。）が含まれる。
【０２６９】
さらに、ポリオール及び糖は、凍結及び乾燥によって誘発される損傷からポリペプチドを保護し、乾燥された状態で保存している間に、安定性を増強させるためにも、しばしば使用される。一般に、糖、特に二糖は、凍結乾燥工程及び保存の間の両方において有効である。単糖及び二糖及びＰＶＰなどのポリマーを含む分子の他のクラスも凍結乾燥された産物の安定化剤として報告されている。
【０２７０】
注射のために、医薬製剤及び／又は医薬は、上述されているような適切な溶液を用いた再構成に適した粉末であり得る。これらの例には、凍結乾燥された、回転乾燥された又は噴霧乾燥された粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物又は粒子物が含まれるが、これらに限定されない。注射のために、製剤は、安定化剤、ｐＨ修飾物質、界面活性剤、生物学的利用性修飾物質及びこれらの組み合わせを場合によって含有し得る。
【０２７１】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、マトリックスは成型された物品（例えば、フィルム又はミクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌグルタミン酸とＬ−グルタミン酸エチルの共重合体、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸共重合体（ＬｕｐｒｏｎＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸リュープロリドから構成される注射可能な小球体）など）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日超にわたって、分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルは、より短い期間にわたって、タンパク質を放出する。カプセル封入された抗体が体内に長期間留まると、３７℃で水分に曝露される結果、抗体は変性又は凝集し得、生物活性の喪失及び免疫原性の変化をもたらす可能性がある。関与する機序に応じて、安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集の機序が、チオ−ジスルフィド相互交換を通じた分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見されれば、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を調節し、適切な添加物を使用し、及び特異的なポリマーマトリックス組成物を開発することによって、安定化が達成され得る。
【０２７２】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている製剤は、本明細書に記載されているように、短期作用、迅速放出、長期作用又は徐放であるように設計され得る。従って、医薬製剤は、制御された放出又は遅い放出のために調合することもできる。
【０２７３】
組成物の治療的有効量は変動し、疾病の重度並びに治療されている対象の体重及び一般的な状態に依存するが、一般には、適用当り約１．０μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重又は約１０μｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ又は約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ又は約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与は、必要に応じて、疾患又は症状に対する応答及び対象の治療耐性に応じて、毎日、隔日、毎週、月に２回、毎月以上若しくはそれ以下の頻度であり得る。疾患症候の所望される抑制が起こるまで、４、５、６、７、８、１０若しくは１２週又はそれより長期など、より長い期間にわたる維持投薬量が必要であり得、投薬量は必要に応じて調節され得る。この療法の進行は、慣用の技術及びアッセイによって、容易にモニターされる。
【０２７４】
具体的な投薬量は、疾病の症状、対象の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事、投薬感覚、投与経路、排出速度及び薬物の組み合わせに応じて調整され得る。有効量を含有する上記剤形の何れもが、定型的実験操作の範囲内に十分含まれ、従って、本発明の範囲に属する。
【０２７５】
抗ヘプシジン抗体又は特異的結合剤は、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻内を介するなど、全身的に又は局所的に、所望であれば、局所的治療、病変内投与のためにあらゆる適切な手段によって投与される。非経口経路には、静脈内、動脈内、腹腔内、硬膜外、くも膜下腔内投与が含まれる。さらに、特異的結合剤又は抗体は、好適には、パルス注入によって、特に、特異的結合剤又は抗体の用量を低下させながら投与される。幾つかの実施形態において、投薬は、１つには、投与が短期間であるか又は慢性であるかに応じて、注射によって、例えば、静脈内又は皮下注射によって与えられる。例えば、所望の部位に近接して配置されたカテーテルを通じて、局所、特に経皮、経粘膜、直腸、経口又は局所投与を含む他の投与法が想定される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている特異的結合剤又は抗体は、毎日から毎週、毎月の範囲にわたる頻度で（例えば、毎日、隔日、３日ごと、又は週当たり２、３、４、５若しくは６回）、０．０１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、週当たり２又は３回の頻度で、０．１から４５ｍｇ／ｋｇ、０．１から１５ｍｇ／ｋｇ又は０．１から１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、又は月に１回、最大４５ｍｇ／ｋｇで、生理的溶液中に入れて、静脈内に投与される。
【０２７６】
診断及び治療用キット
別の関連する態様において、上昇したヘプシジンレベルを伴う疾患又はヘプシジン関連疾患又は鉄恒常性の障害又は貧血を有する哺乳動物を治療するためのキットも提供される。一実施形態において、キットは、（ａ）抗ヘプシジン抗体及び（ｂ）赤血球新生刺激物質を含み、場合によって鉄を含む。別の実施形態において、キットは、抗ヘプシジン抗体及び容器に付着された又は容器とともに包装されたラベルを含み、該ラベルは、赤血球新生刺激物質との抗ヘプシジン抗体の使用を記載する。さらに別の実施形態において、キットは、赤血球新生刺激物質及び容器に付着された又は容器とともに包装されたラベルを含み、該ラベルは、抗ヘプシジン抗体との赤血球新生刺激物質の使用を記載する。赤血球新生刺激物質とともに投与するための医薬の調製における抗ヘプシジン抗体の使用及び抗ヘプシジン抗体とともに投与するための医薬の調製における赤血球新生刺激物質の使用も提供される。これらのキット又は使用の何れにおいても、抗ヘプシジン抗体及び赤血球新生刺激物質は、別個の容器中に存在することができ、又は単一の医薬組成物中へ一緒に組み合わせることができる。さらに別の実施形態において、抗ヘプシジン抗体又は赤血球新生刺激物質又は両者は、単一の医薬組成物中において鉄と組み合わせることが可能であり、又は別個の容器中に入れることができる。
【０２７７】
便宜のために、本明細書に開示されている抗体は、キット（すなわち、診断アッセイを実施するための指示書との、所定量の試薬の梱包された組み合わせ）中に提供することができる。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、酵素によって必要とされる基質及び補因子（例えば、検出可能な色素団又は蛍光団を与える基質前駆体）を含む。さらに、安定化剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液又は溶解緩衝液）などの他の添加物を含めることができる。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中における濃度を与えるために、幅広く変動され得る。特に、試薬は、溶解すると直ちに、適切な濃度を有する試薬溶液を与える賦形剤を含む乾燥した（通常、凍結乾燥された）粉末として提供され得る。
【０２７８】
診断試薬及び例えば、ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ型又は競合的フォーマット）などのイムノアッセイなどの様々な診断アッセイにおいて使用するための１つ以上のこのような試薬を含むキットも提供される。幾つかの実施形態において、このようなキットは、少なくとも第一のペプチド（場合によって、本明細書中に記載されているような適切に折り畳まれた成熟ヘプシジン標準物質）又は本発明に記載されている第一の抗体若しくは抗原結合断片、これらの機能的断片又はこれらのカクテル及びシグナル発生用の手段を含み得る。キットの成分は、固体支持体へ予め付着され得、又はキットが使用される時点で、固体支持体の表面へ適用され得る。幾つかの実施形態において、シグナル発生手段は、本発明に記載されている抗体と予め会合され得、又は使用前に、１つ若しくはそれ以上の成分、例えば、緩衝液、抗体−酵素連結体、酵素基質などと組み合わせる必要があり得る。キットは、さらなる試薬、例えば、固相表面への非特異的結合を低下させるためのブロッキング試薬、洗浄試薬、酵素基質なども含み得る。固相表面は、チューブ、ビーズ、ミクロタイタープレート、小球体又はタンパク質、ペプチド若しくはポリペプチドを固定化するのに適した他の材料の形態であり得る。幾つかの実施形態において、化学発光性若しくは色素原性産物の形成又は化学発光性若しくは色素原性基質の減少を触媒する酵素が、シグナル発生手段の成分である。このような酵素は、本分野において周知である。キットは、本明細書に記載されている捕捉剤及び検出試薬の何れをも含み得る。場合によって、キットは、本発明に記載されている方法を実施するための指示書も含み得る。
【０２７９】
バイアル又は瓶などの容器中に梱包された本明細書に記載されている抗ヘプシジン抗体及び赤血球新生刺激物質を含み、容器に付着された又は容器とともに同封されたラベル（ラベルは、容器の内容を記載し、並びに本明細書に記載されている１つ以上の病状を治療するための、容器の内容の使用に関する適応症及び／又は指示を与える）をさらに含むキットも提供される。
【０２８０】
一態様において、キットは、上昇したヘプシジンレベルを伴う疾患を治療するためのキットであり、抗ヘプシジン抗体及び赤血球新生刺激物質を含む。キットは、経口又は非経口（例えば、静脈内）投与のための鉄を、場合によってさらに含み得る。別の態様において、キットは、抗ヘプシジン抗体及び容器に付着され又は容器と同封された、赤血球造血刺激物質との、抗ヘプシジン抗体の使用を記載したラベルを含む。さらに別の態様において、キットは、赤血球造血刺激物質と及び容器に付着された又は容器とともに同封された、抗ヘプシジン抗体との、赤血球造血刺激物質の使用を記載したラベルとを含む。ある種の実施形態において、抗ヘプシジン抗体及び赤血球造血刺激物質及び場合によって使用される鉄は、別個のバイアル中に存在し、又は同じ医薬組成物中に一緒に組み合わされる。さらに別の態様において、本明細書に記載されている抗ヘプシジン抗体は、単一の医薬組成物中において、鉄と組み合わされる。さらに別の実施形態において、赤血球新生刺激物質は、単一の医薬組成物中において、鉄とともに組み合わされる。
【０２８１】
組み合わせ療法の節において上述されているように、治療剤が治療効果を発揮している期間に重複が存在する限り、２つの治療剤の同時投与は、薬剤が同時に又は同じ経路によって投与されることを要しない。異なる日又は週に投与されるような、同時又は逐次投与が想定される。
【０２８２】
本明細書に開示されている抗体、ペプチド、抗原結合断片又はポリヌクレオチドの少なくとも１つと及び組成物を診断試薬又は治療剤として使用するための指示書を含む、本明細書中に開示されている治療用及び診断用キットも調製され得る。このようなキットにおいて使用するための容器は、典型的には、診断用及び／又は治療用組成物の１つ以上がその中に配置され、適切に分取され得る少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器又は他の適切な容器を含み得る。第二の治療剤も提供される場合には、キットは、この第二の診断及び／又は治療用組成物をその中に配置し得る第二の異なる容器も含有し得る。あるいは、複数の化合物を単一の医薬組成物中で調製し得、バイアル、フラスコ、注射器、瓶又は他の適切な単一の容器など単一の容器手段中に梱包し得る。本発明のキットは、典型的には、例えば、その中に所望のバイアルが保持される射出又は中空成型されたプラスチック容器などの、商業的販売のために密封中にバイアルを含有するための手段も含む。検出可能な標識又は検出手段の放射性標識、発色原性、蛍光原性又は他の種類がキット内に含められる場合には、診断用又は治療用組成物そのものと同じ容器中に標識剤を与えることができ、あるいはこの第二の組成物をその中に配置し、好適には分取し得る第二の異なる容器手段中に配置され得る。あるいは、検出試薬及びラベルは、単一の容器手段中に調製され得、多くの場合には、キットは、典型的には、商業的販売及び／又は便利なパッケージング及び送達のための密封中にバイアルを含有するための手段を含む。
【０２８３】
本明細書に記載されている診断又は監視法を実施するための機器又は装置も提供される。このような装置は、その中に試料を入れることができるチャンバー又はチューブ、機器を通じて試料の流れを誘導するためのバルブ又はポンプを場合によって含む流体取り扱いシステム、血漿又は血清を血液から分離するための場合によって使用されるフィルター、捕捉剤又は検出試薬を添加するための混合チャンバー及び捕捉剤免疫複合体に結合された検出可能な標識の量を検出するための場合によって使用される検出機器を含み得る。試料の流れは、（例えば、毛細管、静水圧又は試料が一旦適用されたら、機器のさらなる操作を必要としない他の力による）受動性であり得、又は（例えば、機械的ポンプを介して生成される力の付与、電気浸透圧ポンプ、遠心力又は増加した空気圧力による）能動性であり得、又は能動及び受動力の組み合わせにより得る。
【０２８４】
関連する実施形態において、プロセッサー、コンピュータ読み取り可能なメモリー及び前記コンピュータ読み取り可能なメモリー上に格納され、並びに本明細書に記載されている方法の何れかを実行するために、及び／又は「正常な」範囲外のレベルが本明細書中に記載されている症状の１つ以上と相関するように、ヘプシジンの検出されたレベル及び「正常」と考えられる閾値又は閾値レベルの範囲を出力として生成するためにプロセッサー上で実行されるように適合されたルーチンも提供される。幾つかの実施形態において、プログラム又は類似の機能を実行するためのルーチンを含有するコンピュータ読み取り可能な媒体も提供される。適切な演算系、環境及び／又は機器構成の例には、パーソナルコンピュータ、サーバーコンピュータ、携帯式又はラップトップ機器、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサをベースとするシステム、セットトップボックス、プログラム可能な消費者電子機器、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、上記システム若しくは機器の何れかを含む分散型演算環境又は本分野において公知のあらゆる他のシステムが含まれる。
【０２８５】
ヘプシジン活性アンタゴニストに対する非治療的用途
本明細書に開示されている抗体は、標的抗原に対するアフィニティー精製剤として、又は標的抗原に対する診断用アッセイ（例えば、特異的な細胞、組織又は血清中における標的抗原の発現を検出する。）において使用され得る。抗体は、インビボ診断用アッセイにおいても使用され得る。一般に、これらの目的のために、イムノシンチオグラフィーを用いて部位を局在化することができるように、抗体は、放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ又は３５Ｓなど）で標識される。
【０２８６】
本明細書中に開示されている抗体は、競合的結合アッセイ、直接及び間接的サンドイッチアッセイ（ＥＬＩＳＡなど）及び免疫沈降アッセイなどのあらゆる公知のアッセイ方法において使用され得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９８７）。抗体は、本分野において公知の方法を用いて細胞試料を標識するために、免疫組織化学に対しても使用され得る。
【０２８７】
実施例
【実施例１】
【０２８８】
抗ヒトヘプシジンモノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、同時係属中の米国特許出願第１２／０２２，５１５号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されているように、一般に、様々な手法によって調製することができる。例えば、標準的な方法を用いて、ＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭＩｇＧ２κλ及びＩｇＧ４κλマウスを、ＫＬＨ連結されたヒトヘプシジン（配列番号９）で免疫化した。プレートに固着された、ビオチン化されたヒトヘプシジンに対して、２３，０４０のＩｇＧ２上清及び１１，５２０のＩｇＧ４上清を単一の濃度でスクリーニングした。このスクリーニングから、上清間の濃度差の影響を最小限に抑えるために、捕捉された抗体の量を制限した抗体捕捉ＥＬＩＳＡを用いて、ヒト及びマウスのビオチン化されたヘプシジンの両方への結合に関して、６１７のＩｇＧ２及び１０１３のＩｇＧ４上清を検査した。抗体濃度のある範囲にわたって、溶液相ヘプシジン−抗体結合を測定する架橋ＥＬＩＳＡ中で、最上位の試料（７０のＩｇＧ２及び１１０のＩｇＧ４）をさらに性質決定した。このアッセイによって、抗体結合の相対的な親和性の順位が得られた。
【０２８９】
ＩｇＧ２及びＩｇＧ４パネルのそれぞれから得られた上清は、以下のように表記した。１Ｃ９（配列番号１０７−１１６）、３Ｂ３（配列番号１１７−１２６）、４Ｅ１（配列番号１２７−１３６）、７Ａ３（配列番号１３７−１４６）、９Ｄ１２（配列番号１４７−１５６）、１２Ｂ９（配列番号１５７−１６６）、１５Ｅ１（配列番号１６７−１７６）、１８Ｄ８（配列番号３１０−３１９）、１９Ｃ１（配列番号３２０−３２９）、１９Ｄ１２（配列番号２９０−２９９）、１９Ｈ６（配列番号３００−３０９）、２３Ｆ１１（配列番号１７７−１８６）、２６Ｆ１１（配列番号１８７−１９６）、１８Ｂ１１（配列番号３３１−３３９）、１９Ｂ８（配列番号３４１−３４９）、２０Ｅ１２（配列番号３５１−３５９）、２２Ｆ１２（配列番号３６１−３６９）、２２Ｈ１０（配列番号３７１−３７９）、２３Ａ１１（配列番号３８１−３８９）及び２４Ｅ４（配列番号３９１−３９９）。
【０２９０】
一般に、ヒトヘプシジンへのこれらの抗体の結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅによって測定され、次いで、ＢＩＡｃｏｒｅによって推定されたＫＤが１００ｐＭを下回れば、ＫｉｎＥｘＡによってこれを確認した。しかしながら、抗体１８Ｂ１１の結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイなしのＫｉｎＥｘＡによって測定した。リード抗体に対するＫＤは、１ｐＭと４００ｐＭ超の間の範囲であった。
【０２９１】
競合ＥＬＩＳＡによって、相対的な種交叉反応性及びＨｅｐｃ２０（配列番号９６）への結合を測定した。１８Ｂ１１は、カニクイザルヘプシジンと交叉反応し、マウスヘプシジンとは有意に交叉反応しないことが観察された。抗体１８Ｂ１１は、ヒトヘプシジンへの結合に関して抗体２３Ｆ１１と競合する。
【実施例２】
【０２９２】
ある種の薬物速度論特性を有するヒト抗体の作製及び選択
ＥＬＩＳＡによって、ｐＨ７．４及びｐＨ６．０で、ヒトヘプシジンへの異なる結合特性に関して、２，５２２個のヘプシジン特異的抗体をスクリーニングした。１×ＰＢＳ中、８μｇ／ｍＬのＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）５０μＬを、ＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｐ３８４ウェルプレート上に被覆し、３７℃で１時間温置した。室温で１時間、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いてウェルをブロッキングした後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で、プレートを６回洗浄した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中の５０ｎｇ／ｍＬのモノビオチン化ヘプシジン２５μＬを３８４ウェルプレートに添加し、室温で１時間温置した。次に、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で、プレートを６回洗浄した。ｐＨ５．５及び６．０の条件に関しては１μｇ／ｍＬになるように、ｐＨ７．４の条件に関しては１００ｎｇ／ｍＬになるように、最初のヘプシジン抗体濃度を標準化した。ヘプシジン抗体をＰＢＳ／１％ＮＦＤＭｐＨ７．４中に３倍、ＰＢＳ／１％ＮＦＤＭｐＨ６．０及び５．５中に４倍系列希釈した。希釈及び滴定は、ポリプロピレンの９６ウェル希釈プレート中で行い、次いで、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎが被覆された３８４ウェルプレートへ２つ組みで移した。ビオチン化されたヘプシジン及び抗体を室温で２時間温置した。次に、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で、プレートを６回洗浄した。次に、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に１：７０００希釈したヤギ抗ｈｕＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ２５μＬを、アッセイプレートの各ウェルに添加した。最後に、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で、プレートを６回洗浄した。強化されたＫ−Ｂｌｕｅ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｎｅｏｇｅｎ）を添加し、室温で温置の１０分後、１ＭＨ３ＰＯ４を用いて、反応を停止させた。プレートリーダー上において、４５０ｎｍで吸収を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｒ）ソフトウェアを用いて、ＥＣ５０値を得るために、非線形回帰分析（Ｓ字状用量応答、可変的勾配）によって結合データを分析した。このスクリーニングから、２４３個の抗体がｐＨ７．４対ｐＨ６．０での結合の＞２倍の差を示した。ｐＨ７．４及びｐＨ６．０で、抗体希釈物の範囲にわたって、上位３２ウェルの上清に３回目の再スクリーニングを行った。抗体１８Ｂ１１、１９Ｂ８、２０Ｅ１２、２２Ｃ１１、２２Ｆ１２、２２Ｈ１０、２３Ａ１１、２４Ｅ４及び２５Ｈ６をサブクローニングのために選択した。
【０２９３】
ヒトヘプシジンへのこれらの抗体の結合親和性はＫｉｎＥｘＡによって測定し、オフ速度はＢＩＡｃｏｒｅによって測定した。１：２５０の希釈で、検査された抗体の全てが、ｐＨ７．４と比べて、ｐＨ６で、ヘプシジンに対する親和性の約１０倍の低下を示した。
【実施例３】
【０２９４】
異なるｐＨ結合を有する抗体の操作
抗体の軽及び／又は重可変領域中への１つ以上のヒスチジン残基の導入は、抗原への異なるｐＨ結合を示す抗体を与えることができる。ヒスチジンのイミダゾール側鎖はちょうど６を超えるｐＫａを有する（アミノ酸の環境に応じて、より高く又はより低く変動する。）ので、７．４から６．０へのｐＨシフトに対して最も高い感受性を有するアミノ酸である。この技術は、本明細書に記載されているものを含むあらゆる抗ヘプシジン抗体に適用することが可能である。
【０２９５】
抗ヘプシジン抗体１５Ｅ１のＦｖ部分の結晶構造モデルを調製した。この構造モデルを用いて、少なくとも１０％露出され及びＣＤＲ残基の４．５オングストローム以内に存在するフレームワーク残基とともに（変異のためのさらなる３１残基を与える。）、抗体１５Ｅ１の６２のＣＤＲ残基の全て（Ｋａｂａｔ定義を使用する。）を変異のために選択した。ＣＤＲ又は選択されたフレームワーク残基に近接するアミノ酸に対する構造モデルの視覚的検査によって、変異のためにさらなる位置を選択した。アミノ酸配列内の単一の又は複数の位置にヒスチジン変異を与えるために、コードするＤＮＡを変異させた。幾らかの異なるｐＨ結合効果を単一の変異として生成する変異を、二重、三重以上の多重変異として組み合わせることができる。以下にまとめて示されているヒスチジン変異は、「変異体」配列が以下のダイアグラム中でヒスチジンへの変化を示しているあらゆる１つ以上のアミノ酸において操作された。
【０２９６】
【化１】
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【０２９７】
変異体構築物の発現
ＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅＩＩキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ＃２００５２３）を用いて、ベクターｐＴＴ５（別個のベクター上の重鎖及び軽鎖）中の野生型構築物中に変異を導入し、２９３−６Ｅ細胞（ＮＲＣＣ）中へ一過性に形質移入した。
【０２９８】
【表３】
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【０２９９】
【表４】
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【０３００】
ヒトヘプシジンへの抗体１５Ｅ１、１５Ｅ１変形物及び１８Ｂ１１の結合に関するＫｉｎＥｘＡ溶液平衡結合分析
ビオチン化されたヒトヘプシジン（配列番号９）によってＳＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを予め被覆し、製造業者の指示書に従って、ＢＳＡでブロックした。抗体及びヘプシジンを、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ／０．０５％ＮａＮ３緩衝液中に希釈した。ヒトヘプシジンによって被覆されたビーズを通して走行させる前に、抗体１５Ｅ１、１５Ｅ１Ｗ５２Ｈ、１５Ｅ１Ａ９９Ｈ、１５Ｅ１Ｎ５２Ｈ、１５Ｅ１Ａ１０７Ｈ及び１８Ｂ１１の固定濃度を、室温で８時間、ヒトヘプシジンの様々な濃度とともに温置した。蛍光性（Ｃｙ５）標識されたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＰＡ）によって、ビーズに結合された抗体の量を定量した。結合シグナルは、平衡状態での遊離の抗体の濃度に比例する。二重曲線一部位均一結合モデル（ＫｉｎＥｘＡＴＭＰｒｏソフトウェア）を用いて、競合曲線の非線形回帰から解離平衡定数（ＫＤ）を得た。結果は、下表３に示されている。
【０３０１】
【表５】
2011519279.tif 000009
【０３０２】
次いで、上表３に列記されている抗体の異なるｐＨ結合をＥＬＩＳＡによって測定した。１×ＰＢＳ中、８μｇ／ｍＬのＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）５０μＬを、ＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｐ３８４ウェルプレート上に被覆し、３７℃で１時間温置した。室温で１時間、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いてウェルをブロッキングした後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で、プレートを６回洗浄した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中の５０ｎｇ／ｍＬのモノビオチン化ヘプシジン２５μＬを３８４ウェルプレートに添加し、室温で１時間温置した。次に、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で、プレートを６回洗浄した。ｐＨ５．５及び６．０の条件に関しては１μｇ／ｍＬになるように、ｐＨ７．４の条件に関しては１００ｎｇ／ｍＬになるように、最初のヘプシジン抗体濃度を標準化した。ヘプシジン抗体をＰＢＳ／１％ＮＦＤＭｐＨ７．４中に３倍、ＰＢＳ／１％ＮＦＤＭｐＨ６．０及び５．５中に４倍系列希釈した。希釈及び滴定は、ポリプロピレンの９６ウェル希釈プレート中で行い、次いで、Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎが被覆された３８４ウェルプレートへ２つ組みで移した。ビオチン化されたヘプシジン及び抗体を室温で２時間温置した。次に、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で、プレートを６回洗浄した。次に、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中に１：７０００希釈したヤギ抗ｈｕＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ２５μＬを、アッセイプレートの各ウェルに添加した。最後に、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で、プレートを６回洗浄した。強化されたＫ−Ｂｌｕｅ３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｎｅｏｇｅｎ）を添加し、室温での温置の１０分後、１ＭＨ３ＰＯ４を用いて、反応を停止させた。プレートリーダー上において、４５０ｎｍで吸収を測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｒ）ソフトウェアを用いて、ＥＣ５０値を得るために、非線形回帰分析（Ｓ字状用量応答、可変的勾配）によって結合データを分析した。ｐＨが６．０まで低下されるにつれて、ＥＣ５０の少なくとも１．５倍の増加を与えた野性型１５Ｅ１の単一変異には、Ｌ２７Ｈ（軽鎖）、Ａ８９Ｈ（軽鎖）、Ｗ５２Ｈ（重鎖）、Ｎ５７Ｈ（重鎖）、Ａ９９Ｈ（重鎖）及びＡ１０７Ｈ（重鎖）が含まれた。これらの変異体の二重の組み合わせを作製した。ｐＨが６．０まで低下されるにつれて、ＥＣ５０の少なくとも５．５倍の増加を有する野性型１５Ｅ１の多重変異体には、Ａ１０７Ｈ（重鎖）／Ａ８９Ｈ（軽鎖）、Ａ１０７Ｈ（重鎖）／Ｌ２７Ｈ（軽鎖）、Ａ１０７Ｈ（重鎖）／Ｎ５７Ｈ（重鎖）及びＡ１０７Ｈ（重鎖）／Ａ９９Ｈ（重鎖）が含まれる。代表的な結果は、下表４に示されている。
【０３０３】
【表６】
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【０３０４】
結果は、ｐＨ７．４に比べて、ｐＨ６．０において、ヘプシジンに対して、抗体１８Ｂ１１が２対数低い見かけの結合親和性を示すこと、及び１５Ｅ１Ｎ５７ＨＡ１０７Ｈが１対数低い見かけの結合親和性を示すことを示した。
【実施例４】
【０３０５】
ヒト抗体１８Ｂ１１に対するオフ速度結合分析
異なるｐＨでの解離のオフ速度分析も行った。遅いオフ速度は長期間にわたる増加した結合相互作用を予測すると予想されるのに対して、より速いオフ速度は減少した結合相互作用を予測すると予想される。例えば、より低いｐＨでのより速いオフ速度は、より低いｐＨでの抗原のより大きな放出を予測すると予想される。組換えヒトヘプシジン（配列番号９）とともに抗体１Ｓ１、１Ｓ３、２．７、１８Ｂ１１、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１のオフ速度を研究するために、ＢＩＡｃｏｒｅを用いて溶液平衡結合分析を行った。
【０３０６】
ＢＩＡｃｏｒｅチップ表面の調製
走行緩衝液（（ＤＰＢＳ：ダルベッコのリン酸緩衝液生理的緩衝液１×、ＣａＣｌ又はＭｇＣｌなし、０．００５％Ｂｉａｃｏｒｅ界面活性剤Ｐ−２０添加）の流速１０μＬ／分で、製造業者の指示書に従って、ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ表面への組換えヒトヘプシジン（ｒｈｕＨｅｐｃ）の固定化を行った。まず、０．２ＭＥＤＣ（水中のＮ−エチル−Ｎ−（ジメチルアミン−プロピル）カルボジイミド、ＢＩＡｃｏｒｅから入手）及び０．０５ＭＮＨＳ（水中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｂｉａｃｏｒｅから入手）を含有する混合物の６０μＬ注射によって、センサーチップのカルボキシル化されたマトリックスを活性化した。センサーチップ上に固定化するために、組換えヒトヘプシジン（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０中、１μｇ／ｍＬ）５５μｇを注入した。エタノールアミン６０μＬ（１．０Ｍ、Ｂｉａｃｏｒｅから入手）の注入により、センサーチップの過剰な反応性基を不活化した。
【０３０７】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
ｒｈｕＨｅｐｃをＣＭ５チップに低い密度で固定化させた後、抗体１Ｓ１、１Ｓ３、２．７、１８Ｂ１１、２３Ｆ１１及び２６Ｆ１１の５０ｎＭを、ｐＨ７．４で、ｒｈｕＨｅｐｃ表面上に注入し、結合させた。ｐＨ７．４、ｐＨ６及びｐＨ５．５を有する解離緩衝液を結合された表面上に走行させた。解離曲線が得られた。結果は、ｐＨ５．５に比べて、抗体１８Ｂ１１がｐＨ７．４でオフ速度の著しい差（＞１×１０−２）を示すことを示唆した。検査した他の抗体は、ｐＨ７．４、６．０又は５．５で、オフ速度の著しい差を示さなかった。図１を参照されたい。
【実施例５】
【０３０８】
鉄応答性βラクタマーゼアッセイでのインビトロヘプシジン活性は、抗ヘプシジン抗体によって中和することができる
ヘプシジンはフェロポーティンを内部に取り込ませ、細胞表面から取り除いて、鉄の放出を阻害し、細胞内鉄濃度を上昇させる。ヘプシジンによって媒介された鉄の囲い込みに対する抗ヒトヘプシジン抗体の効果をインビトロで評価した。ドキシサイクリン誘導性フェロポーティン（Ｆｐｎ）発現構築物及びｍＲＮＡの翻訳を制御する以下のヌクレオチドを有するフェリチン由来の５’鉄応答要素（ＩＲＥ）の１コピーを含有するβ−ラクタマーゼ（ＢＬＡ）発現構築物を含有する２９３細胞株を構築した。
【０３０９】
ｔｃｇｇｃｃｃｃｇｃｃｔｃｃｔｇｃｃａｃｃｇｃａｇａｔｔｇｇｃｃｇｃｔａｇｃｃｃｔｃｃｃｃｇａｇｃｇｃｃｃｔｇｃｃｔｃｃｇａｇｇｇｃｃｇｇｃｇｃａｃｃａｔａａａａｇａａｇｃｃｇｃｃｃｔａｇｃｃａｃｇｔｃｃｃｃｔｃｇｃａｇｔｔｃｇｇｃｇｇｔｃｃｃｇｃｇｇｇｔｃｔｇｔｃｔｃｔｔｇｃｔｔｃａａｃａｇｔｇｔｔｔｇｇａｃｇｇａａｃａｇａｔｃｃｇｇｇｇａｃｔｃｔｃｔｔｃｃａｇｃｃｔｃｃｇａｃｃｇｃｃｃｔｃｃｇａｔｔｔｃｃｔｃｔｃｃｇｃｔｔｇｃａａｃｃｔｃｃｇｇｇａｃｃａｔｃｔｔｃｔｃｇｇｃｃａｔｃｔｃｃｔｇｃｔｔｃｔｇｇｇａｃｃｔｇｃｃａｇｃａｃｃｇｔｔｔｔｔｇｔｇｇｔｔａｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｇｃｃａａｃｃ（配列番号１０３）。
【０３１０】
ＢｉｏＣｏａｔポリＤ−リジン被覆されたプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカタログ番号３５−６６４０）中に９０μＬ／ウェル（２５，０００細胞／ウェル）で、ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９６５）、５％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１００９９−１４１）、ＰＳＱ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０３７８−０１６）中に２．８×１０５細胞／ｍＬで、７０から８０％の集密状態の培養物から採取されたこれらの２９３／Ｆｐｎ／ＢＬＡ細胞を播種し、５％ＣＯ２とともに３７℃で温置した。同じ日の終わりに、１００μｇ／ｍＬドキシサイクリンを加えたアッセイ培地（ＤＭＥＭ５％ＦＢＳＰＳＱ）の溶液を作製し、その１０μＬ／ウェルをプレートに添加し、プレートを一晩又は少なくとも２０時間温置した。翌日、ウェルから培地を除去し、ＤＭＥＭ５％ＦＢＳＰＳＱ、２．５μｇ／ｍＬ酢酸第二鉄、５０ｎｇ／ｍＬ合成ヒトヘプシジン及び抗体の系列希釈（２４Ｅ４、２３Ｆ１１、１８Ｂ１１、２．７、２．４１及びＡｂ４３）の予め作製された混合物と置き換えた（全て、アッセイプレートに添加する直前に、９６ウェルポリプロピレンディープウェルブロックプレート中で調製した。）。１００μＬ／ウェルで混合物を添加し、細胞培養温置装置中において、３７℃、５％ＣＯ２で一晩温置した。次いで、温置装置からプレートを取り出し、調製されたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ  ＣＣＦ４  Ａ／Ｍ  展開試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｋｉｔ＃  Ｋ１０８５）の２０μＬ／ウェルを添加し、暗所で９０分間温置する前に、室温で１０分間平衡化した。アッセイ培地１００μＬ（ＤＭＥＭ５％ＦＢＳＰＳＱ）を含有する、細胞なしの対照アッセイプレートの１６ウェルにも、展開試薬を添加し、同じ時間、温置した。４０９ｎｍで励起し、次いで、４４７ｎｍ（青）及び５２０ｎｍ（緑）での発光を読み取ることによって、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．）上で、青及び緑色の蛍光シグナルを読み取った。結果は、図２及び３に図示されている。ｍＡｂ４３、２．７、２．４１、１８Ｂ１１、２３Ｆ１１、２４Ｅ４は、それぞれ、１．３８０×１０−８、１．７００×１０−８、１．６３６×１０−８、２．０×１０−８、２．３×１０−９及び５．０×１０−９のＥＣ５０で、鉄の細胞内濃度を減少させることが示された。
【実施例６】
【０３１１】
抗ヘプシジン抗体はヒトヘプシジンをマウス中で中和する
低鉄血症応答を生成するのに十分な量で、ヒトヘプシジンを投与されたマウス中で、抗ヒトヘプシジン抗体の活性をインビボにおいて評価した。０日目に、ヒトヘプシジンに対して誘導されたマウスモノクローナル（Ａｂ２．７）を雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。対照マウスには、イソタイプ対照としてマウスＩｇＧ１を与えた。３日目に、マウスに、イー・コリ由来の組換えヒトヘプシジン（ｒｈＨｅｐｃ）２５μｇの単回腹腔内注射を与えた。２時間後に、血清鉄レベルを分析した。生理的食塩水で処理された対照動物は正常な血清鉄レベルを有していたのに対して、ヘプシジン及びイソタイプ対照抗体で処理された動物は低鉄血症を示した。結果は、図４Ｂに示されている。ｍＡｂ２．７の１ｍｇ及び０．５ｍｇは何れも、低鉄血症応答からの統計学的に有意な保護を与えた。Ａｂ２．７の０．２５ｍｇ用量で、低鉄血症の低下が観察されたが、より低い用量（０．２５及び０．１ｍｇ）は非中和用量として確定された。統計は、生理的食塩水対照に対して全ての群を比較するダネットの後知恵検定を用いたＡＮＯＶＡを表す。
【実施例７】
【０３１２】
ＡＡＶによって送達されたヘプシジンの抗体中和化は、正常な早期赤血球の特徴を回復させる
マウス中でのＡＡＶによって媒介されたヒトヘプシジン発現は、鉄の枯渇と合致する小球性、低色素性貧血をもたらす。ヒトヘプシジンを過剰発現しているこれらのマウス中で、抗ヒトヘプシジン抗体の活性をインビボにおいて評価した。ヒトヘプシジン又は陰性対照としてのβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）に対する発現カセットを含有するＡＡＶ（１．５×１０１２粒子／マウス、静脈内）を、雄のＣ５７Ｂ１／６マウスに注射した。図５Ａに示されているように、様々な投薬頻度（週に１回、２回及び４回）で、Ａｂ２．７又はイソタイプ対照（ｍｕＩｇＧ１）の１ｍｇ／マウスで処理する前に、ｈｕＨｅｐｃの恒常的産生を可能とするために、マウスを２週間放置した。血清鉄レベル並びに早期赤血球（網状赤血球）の特徴（網状赤血球数、網状赤血球ヘモグロビン含量（ＣＨｒ）及び網状赤血球平均細胞容積（Ｒｅｔｉｃ．ＭＣＶ）の測定のために、第５日目に血液を採取した。
【０３１３】
結果は、図５Ｂから５Ｅに示されている。Ａｂ２．７の投薬を４回受けたマウス中で、血清鉄レベルは正常に回復したが、イソタイプ対照では回復しなかった。Ａｂ２．７を与えた全てのマウスは、増加した網状赤血球産生を示した。Ａｂ２．７の４回及び２回投薬を与えたマウスでは、網状赤血球ヘモグロビン含量（ＣＨｒ）は正常であったが、１回の投薬を受けた群又はイソタイプ対照群では、低色素症がなお見られた。４回及び２回投薬したＡｂ２．７での処理は、網状赤血球の正常容積（ＲｅｔｉｃＭＣＶ）を回復したが、１回及びイソタイプ対照群では、小赤血球症がなお存在した。正常な赤血球特性の回復を探すために、β−ｇａｌが注射された動物のイソタイプ対照処理との統計比較を決定した（ダネットの後知恵検定を用いたＡＮＯＶＡ）。
【０３１４】
別の実験では、抗ヒトヘプシジン抗体１Ｓ１、１８Ｂ１１及び２４Ｅ４の活性を、ヒトヘプシジンを過剰発現するマウス中でインビボで評価した。Ｃ５７Ｂ１／６マウス（４週齢）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。０週目に、尾静脈を介して、ヒトヘプシジン（ｈＨｅｐｃ）又は発現対照としての緑色タンパク質（ＧＦＰ）を含有するＡＡＶをマウス（ｎ＝５／群）に注射した。抗体での処理前に、タンパク質を発現させるために、ウイルス導入後に２週間、マウスを維持した。ウイルス導入から１４日及び１６日後に、各抗体１Ｓ１、１８Ｂ１１及び２４Ｅ４（皮下注射、ＰＢＳ中０．２ｍＬ／マウス）の１ｍｇ又は０．５ｍｇの何れかで、マウスを処理した。１８日目に血液を収集し、ＡＤＶＩＡ  ２１２０  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （Ｂａｙｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，  ＮＹ）を用いて、網状赤血球の特徴の変化（網状赤血球細胞ヘモグロビン含量）の変化として、抗体投与への応答を測定した。複合体形成の程度を測定するために、総血清ヘプシジンレベル（遊離及び結合）をＥＬＩＳＡによって測定した。全ての結果は、平均±平均の標準誤差として表した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ４．０  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を用いて、ＡＮＯＶＡ及びＤｕｎｎｅｔｔの後知恵検定によって、統計学的な有意差を評価した（＊は、ＡＡＶ−ｈＨｅｐｃ＋イソタイプ対照群と比較したｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．０１を表す。）。
【０３１５】
１８日後に、ＡＡＶ−ｈＨｐｅｃ＋イソタイプ処理された対照マウス中の網状赤血球は、低下したヘモグロビン含量（ＣＨｒ）を有しており、網状赤血球を低色素性にした。ＡＡＶ−ＧＦＰ対照マウスと比べて、１ｍｇ又は０．５ｍｇ／マウスの何れかで、抗ヘプシジン抗体１Ｓ１、１８Ｂ１１又は２４Ｅ４で処理された動物は正常なＣＨｒ値を有しており、これらの抗体が、正常な初期赤血球の特徴を回復する上で、このモデルにおいて有効であることを示唆する。図６Ａ及び６Ｂ参照。
【０３１６】
結果は、抗体１Ｓ１又は抗体２４Ｅ４で処理された動物と比べて、抗体１８Ｂ１１の１ｍｇ用量で処理されたマウスが総血清ヘプシジンの１０倍の低下を有することを示した（図７Ａ）。０．５ｍｇ／マウス用量で、同様の結果が得られた（図７Ｂ）。抗体１８Ｂ１１を用いて見られた総ヘプシジンの顕著に低下した量はエンドソームを通じたヘプシジンの排除と合致する。
【実施例８】
【０３１７】
ウイルスヘプシジンの過剰発現は、エリスロポエチンへの低応答性をもたらす
以下の実施例は、エリスロポエチン低応答性マウス中で、ヘプシジン及び抗ヘプシジン抗体の役割を調べた。
【０３１８】
ＡＡＶによって媒介されるマウス中でのヒトヘプシジン発現の滴定は、図８に示されているように、血清ヘプシジンレベル及び用量依存性の低鉄血症の増加を引き起こす。エリスロポエチン耐性表現型を与え、及び以前の研究において（同時係属、共有の米国特許出願１１／８８０３１３号及び国際特許公開ＷＯ２００８／０１１１５８（これらのないよう全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されているとおり）、癌患者の試料中に検出されたものと同様の範囲のヘプシジンのレベルを発現したＡＡＶ−ヒトヘプシジンの用量を選択した。ヒトヘプシジン又は発現対照としてのＧＦＰを発現しているＡＡＶを、雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した（ｎ＝４／群）。尾静脈を通じて、マウスに注射した（ヒトヘプシジン：１×１０１２から３×１０１２粒子／マウス；ＧＦＰ：３×１０１２粒子／マウス）。採集前の２週間、タンパク質発現を発達させた。２週の時点で、マウスから血清を集め、鉄及びヘプシジンレベルを測定した。結果は、図８に報告されている。
【０３１９】
エリスロポエチン耐性に対するヘプシジンの効果を評価するために、ヒトヘプシジン又は陰性対照としてのＧＦＰの何れかに対する発現カセットを含有するＡＡＶ（３×１０１２粒子／マウス、肝臓の門脈送達）を雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した（ｎ＝５／群）。ヒトヘプシジンを恒常的に産生させるために、マウスを３週間放置し、次いで、ベースラインヘモグロビン（Ｈｂ）レベルを測定するために採血した。４週の時点で、ダルベポエチンα（１００μｇ／ｋｇ／マウス）又は陰性対照としての生理的食塩水でマウスを処理した。５週の時点で、ヘモグロビンレベルを再度測定した。結果は、図９に示されている。ヒトヘプシジンを過剰発現しているマウスは、ダルベポエチンαの高用量に対して抵抗性である。ダルベポエチンαに対する抵抗性は、エリスロポチンに対する低応答性を引き起こすのに、上昇したヘプシジンレベルが十分であることを示している。
【実施例９】
【０３２０】
ウイルスヘプシジン過剰発現モデルにおける、ヘプシジン抗体と赤血球新生刺激物質の組み合わせ療法
エリスロポエチン耐性表現型を有するマウスを抗ヘプシジン抗体で処理することによって、ダルベポエチンαでの処理に対する応答性が回復した。ヒトヘプシジン又は発現対照としてのＧＦＰをコードする遺伝子を含有するＡＡＶ（５×１０１２粒子／マウス、静脈内）を、雄のＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した（ｎ＝５／群）。恒常的なタンパク質発現を２週間確立させた後、ベースラインヘモグロビン（Ｈｂ）レベルを測定するためにマウスを採血し、次いで、様々な投薬頻度で、Ａｂ２．７（１ｍｇ／マウス）又はイソタイプ対照で処理した。最初の投薬後の当日に、ダルベポエチンα（１００μｇ／ｋｇ、皮下）でマウスを処理した。投薬スケジュールの模式図が、図１０Ａ示されている。
【０３２１】
ヘプシジンの中和は、ダルベポエチンαに対する応答性を回復させる。抗体を月曜、水曜、金曜に投薬することによって、Ｈｂレベルの増加によって測定されたところにより、ダルベポエチンα処理に対する部分的応答がもたらされた。ダルベポエチンα処理なしに同じ抗体を投薬したコホートは、Ｈｂレベルの上昇を示さなかった（図１０Ｂ参照）。ダルベポエチンαに対する最大応答は、Ａｂ２．７の毎日（月曜から金曜まで）投薬を受けているマウス中において達成された（図１０Ｃ）。ダルベポエチンα処理と組み合わせた抗体の２回及び３回投薬は、Ｈｂレベルによって測定されたところによると、部分的な応答をもたらした（図１０Ｄ参照）。図１０Ｅに示されているように、抗体投薬及びダルベポエチンα処理に対する抗体投薬の近接性は、抗ヘプシジン抗体処理に対する全体的なＨｂ応答に影響を与えた（ダネットの後知恵検定を用いたＡＮＯＶＡによってｐ＜０．０１で対照から変動する結果は、二重アスタリスクで注記されている。）。したがって、上昇したヘプシジンレベルによって引き起こされた貧血に対して、ヘプシジンの抗体媒介性中和は有効な処理であることが示された。
【実施例１０】
【０３２２】
炎症性貧血のマウスモデルにおける、抗ヘプシジン抗体と赤血球新生刺激物質の組み合わせ療法
以下のように、マウス炎症性貧血モデルにおいて、抗ヘプシジン抗体及び赤血球新生刺激物質を用いた組み合わせ療法も評価した。
【０３２３】
マウスヘプシジン１がノックアウトされ、ヒトヘプシジンで置換されたマウスを作製した。第０日目に、雌のマウス（ヒトヘプシジン発現に対してホモ接合及び野生型同腹仔対照の両方）に、ブルセラ・アボルタス（２×１０８粒子／マウス、腹腔内）、次いで、第６日目に、ヘモグロビンレベルを評価するために採血した。次いで、第６から９日目に、抗体２．７又はイソタイプ対照交代（１ｍｇ／マウス／日）でマウスを処理した。第７日目に、ダルベポエチンαを投与し（１００μｇ／ｋｇ／マウス）、第１３日目に、Ｈｂレベルを評価した。プロトコールの模式図が、図１１Ａ示されている。
【０３２４】
マウスヘプシジン１遺伝子をなお有する野生型対照マウスは、Ａｂ２．７あり又はなしで、ダルベポチンαに対して応答しなかった（図１１Ｂ参照）。抗体２．７で処理されたヒトノックインマウスは、安定なヘモグロビンレベルの維持によって示されるように、ダルベポエチンα処理に対する回復された応答性を示した（図１１Ｃ参照）。
【０３２５】
これらの結果は、ヘプシジン過剰の条件下で、ヘプシジンを中和し、炎症の貧血など、ヘプシジンによって媒介される貧血における赤血球新生剤に対する応答性を回復させるために、抗ヘプシジン抗体を使用できることを示している。
【実施例１１】
【０３２６】
患者中のヘプシジンレベルの測定
ヒト患者中のヘプシジンのレベルは、同時係属、共有の米国特許出願１１／８８０，３１３号及び国際公開ＷＯ２００８／０１１１５８（これらの各出願の開示全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に以前記載されたように、分光学的技術によって測した。この方法は、以下で再現される。
【０３２７】
癌の貧血に罹患している患者から得た試料（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘから入手した。）又はボランティア（対照）から得た試料を集めた。ＯａｓｉｓＨＬＢｍＥｌｕｔｉｏｎ９６ウェルプレート（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用するＳＰＥによって、各試料、血清盲検及び２つ組みの７つの非ゼロ濃度からなる較正標準１００μＬ（１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００ｎｇ／ｍＬ）を抽出した。洗浄溶媒は、水酸化アンモニウムで調整された約１０のｐＨを有する３０％メタノール／水であった。溶出溶媒は、酢酸で調整された約５のｐＨを有する９０％メタノール／水溶液であった。ＳＰＥプレートをメタノール５００μＬで活性化し、水５００μＬで馴化し、次いで、血清試料１００μＬ及び内部標準２００μＬを溶出プレート上に搭載し、水３５０μＬ及び洗浄溶媒３５０μＬで洗浄した。溶出溶媒１００μＬを用いて溶出を行い、水１００μＬで希釈した。得られた溶出液２００μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０３２８】
各抽出された試料２０μＬを、ＰｏｌａｒｉｓＣ１８Ａ、５μｍＨＰＬＣカラム（２．１×５０ｍｍ，Ｖａｒｉａｎ）上に注入した。ＬＣ流速は、３００μＬ／分に設定した。ＨＰＬＣ移動相Ａは５：９５メタノール／水であり、移動相Ｂは９５：５メタノール／水であった（何れも、０．１％ギ酸を含有する。）。勾配条件は、以下のように設定した。０から０．１分、均一濃度２％Ｂ／９８％Ａ；０．１から４．５分で２％Ｂから９５％Ｂ；４．５から４．９分で９５％Ｂ；４．９から５．０分で、９５％Ｂから２％Ｂ；５．０から６．０分、均一濃度２％Ｂ。
【０３２９】
ｍ／ｚ９３０．６０からｍ／ｚ１１０．１５へのイオン遷移を有するＭＲＭモードで、ヘプシジン検出のために、ＴｕｒｂｏＥＩＳ源を備えたＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のＳｃｉｅｘＡＰＩ４００三重四極子質力分析装置を使用した。ヘプシジン及び内部標準のＬＣピーク面積の比を、ヘプシジン及び内部標準の量が公知である標準の系列から得られた比と比較することによって、定量を行った。
【０３３０】
この実験によって、健康な多数の個体を含有すると推測される対照集団中のヘプシジンの血清レベル及び癌の貧血（ＡｏＣ）に罹患している患者からのヘプシジンの血清レベルの測定が可能となった。結果は、図１２に示されている。
【０３３１】
次いで、患者が炎症又は鉄欠乏性貧血を有するかどうかを決定するために、他の鉄指数濃度に関して、各患者の試料を分析した（図１３）。パラメータは、以下のようにして測定した。標準的な手法を使用して、ＯｌｙｍｐｕｓＡｕ４００臨床研究室分析装置上で、血清鉄、ＵＩＢＣ、フェリチン及びＣＲＰを測定した。ｓＴｆＲは、標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて測定した（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０３３２】
しかしながら、同時係属の米国特許出願１２／０２２，５１５号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されているように、ＤＲＧプロヘプシジンＥＬＩＳＡキットを用いて測定されたプロヘプシジンレベルは患者の成熟ヘプシジンレベルと相関せず、プロヘプシジンレベルは患者の炎症状態とも相関しない。ヘプシジンは、癌患者の貧血中のＣＲＰと関係を示すが、プロヘプシジンは示さず、従って、ヘプシジンは、炎症のマーカーとして使用することができる。
【０３３３】
一般的に使用される研究室のパラメータの多くは急性期応答によって影響を受けるので、炎症の貧血（ＡＩ）を鉄欠乏性貧血（ＩＤＡ）及び混合型貧血（ＡＩ及びＩＤＡ両方の成分）と識別することは困難である。可溶性トランスフェリン受容体（ｓＴｆＲ）及びフェリチン（Ｔｆ）値を使用する比が、より正確な診断を与えるための手段として文献中に記載されてきた。「Ｐｕｎｎｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，  ８９：１０５２−５７，  １９９７」を参照されたい。炎症の貧血は、低いｓＴｆＲ／ｌｏｇＦｔ指数（１未満の値）によって特徴付けられるのに対して、高い比はＩＤＡの指標となる。従って、混合型貧血の絶対的ＩＤＡからの診断を補助するための炎症マーカーと組み合わせると、ｓＴｆＲ／ｌｏｇＦｔ比は、３つの症状の正確な予測因子としての役割を果たし得る。
【０３３４】
ヘプシジンレベルは、ＡｏＣ患者中のｓＴｆＲ／ｌｏｇＦｔレベルと強く関係しており（ｒ＝−０．６４０７；Ｐ＜０．０００１）、従って、患者の診断を助ける。
【０３３５】
炎症のマーカーとしてのＣＲＰとｓＴｆＲ／ｌｏｇＦｔを組み合わせる決定木を用いて、ＡＩを有する患者、混合型貧血を有する患者、ＩＤＡを有する患者及び未知の起源の貧血を有する患者（「その他」と表記）へ癌の貧血患者をさらに分けることができた（図１４Ａ）。上昇したヘプシジンレベルを有する患者は全て、ＡＩ又は混合型貧血の何れかを有することが観察された（図１５）。低いヘプシジンレベル又は無ヘプシジンレベルを有する患者は、ＩＤＡ又は未知の起源の貧血を有することが観察された。同時係属の米国特許出願１２／０２２，５１５号（参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。）に記載されている抗体を基礎とするイムノアッセイ法又は同時係属の共有米国特許出願１１／８８０，３１３号及び国際公開ＷＯ２００８／０１１１５８（参照により、その開示内容全体が本明細書に組み込まれる。）に記載され並びに上で詳述されている質量分析法を基礎とする定量方法によって測定されたヘプシジンレベルは、炎症性貧血を診断するために使用することができる。
【実施例１２】
【０３３６】
ヘプシジン用のサンドイッチイムノアッセイにおけるモノクローナル抗体
以下の実施例は、試料中のヘプシジンレベルを測定するためのサンドイッチイムノアッセイを記載する。
【０３３７】
Ｂｉａｃｏｒｅ分析を用いて、ヘプシジン及び別の抗体の同時結合に関して、抗体１Ｓ１で被覆された表面を検査した（図１６）。センサーチップ表面への抗Ｈｅｐｃ抗体１Ｓ１の固定化は、０．００５％Ｐ−２０／ＰＢＳ緩衝液の連続流を用いて、製造業者の指示書に従って行った。簡潔に述べれば、０．２ＭＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及び０．０５ＭＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含有する混合物６０μＬを注入することによって、センサーチップ表面上のカルボキシル基を活性化した。この後に、２０μｇ／ｍＬの間の濃度で、１０ｍＭアセタート、ｐＨ４．０中に希釈された１Ｓ１を注入した。１Ｍエタノールアミン６０μＬを注入することによって、表面上の過剰な反応性の基を不活化した。最終的な固定化レベルは、Ａｂ１Ｓ１表面に対して、５，０００から６，０００共鳴単位（ＲＵ）であった。盲検偽結合参照表面も、センサーチップ上に調製した。１Ｓ１抗体表面上に、２０ｎＭイー・コリ由来ヒトヘプシジンを注入し、１Ｓ１抗体表面上に結合させた。次いで、ヘプシジン／１Ｓ１表面上に、５０ｎＭ抗体２．７、２３Ｆ１１、２６Ｆ１１及び１Ｓ１を注入した。抗体注入後、１０ｍＭＨＣｌｐＨ２．０の３０μＬを注入することによって、表面を再生した。
【０３３８】
複合体の形態において、結合の高い選択性が存在した。上記競合アッセイにおいて使用されたマウス抗体２．７は、１Ｓ１とサンドイッチ対を形成することができず、２６Ｆ１１は、１Ｓ１と同時にヘプシジンへ結合する能力が２３Ｆ１１より顕著に低かった。
【０３３９】
１Ｓ１及び２３Ｆ１１をサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットへ組み立てると、ヘプシジンレベルを検出するためのイムノアッセイの感度は５０倍向上した。図１７に示されているように、このアッセイは、５０倍の希釈前工程後に、正常な血清中のヘプシジンのレベルを測定できることが明らかとなった。軸は、希釈前ヘプシジンレベルを表している。
【実施例１３】
【０３４０】
競合的結合アッセイ
以下の実施例は、ヘプシジンレベルを測定するための競合的結合アッセイを記載している。１つのプロトコールにおいて、血清中に存在する非標識ヘプシジンは、抗ヘプシジン抗体（例えば、抗体２．７）への結合に関して、ビオチン化されたヘプシジンと競合する。
【０３４１】
緩衝液（５％ＢＳＡ：Ｉ−ブロック）、ウサギ血清又はプールされたヒト血清中に加えられた様々な濃度（１．４から３００ｎｇ／ｍＬ）のヘプシジン標準を用いて、ヘプシジンレベルを測定した。Ａｂ２．７の４０ｎｇ／ｍＬの等しい容量へ、ヘプシジンを添加し、１２０分間温置した。１から２μｇ／ｍＬＧｘＭ捕捉抗体で被覆されたＢｌａｃｋハーフエリアプレートに、混合された溶液の２５μＬ／ウェルを添加した。ビオチン化されたヘプシジンの２５μＬ／ウェルを０．２５ｎＭで添加した。プレートフィルム密封器を用いてプレートを覆い、約６０分間、約２００ＲＰＭ以下で、プレート振盪装置上にて、室温（２５℃）で温置した。プレートを洗浄し、次いで、１：２０００で、ポリ西洋ワサビペルオキシダーゼ増幅試薬の５０μＬ／ウェルを添加した。プレートを３０分間静置させ、次いで、ＰＢＳ又はＫＰＬ緩衝液を用いて、プレート洗浄装置で６回洗浄した。プレートを叩いて乾燥させ、発光性基質（Ｆｅｍｔｏ又はＰｉｃｏ）を素早く添加した。Ｆｅｍｔｏ又はＰｉｃｏ基質を用いて、光測定装置（励起：Ｌｍａｘ３４０）で、プレートを１秒間読み取った。結果は、ウサギ血清及び緩衝液の両者中で、１から１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲でヘプシジンを測定可能であることを示した。（図１８）。
【０３４２】
プールされたヒト血清は、２０ｎｇ／ｍＬより高い既存のヘプシジンレベルを有するように見受けられた。無作為に選択された様々な血清に関して、１から３０ｎｇ／ｍＬの範囲にわたり、ヘプシジンのレベルはヒト血清中において大幅に変動することが測定された（図１９）。
【０３４３】
上で測定されたウサギ血清中でヘプシジン標準を使用して、正常なヒト対象から得られた２４の無作為な血清を検査した。ヘプシジンレベルは、検出不能から５０ｎｇ／ｍＬ超まで変動した。図２０を参照されたい。これらの値は、同時係属、共有の米国特許出願１１／８８０，３１３号及び国際特許公開ＷＯ２００８／０１１１５８（これらの開示全体が、参照により、本明細書中に組み込まれる。）に記載されている質量分析法をベースとする定量法を通じて測定されたヘプシジンのレベルから得られた結果と相違していた（一般に、ずっと低い値を与えた。）。
【実施例１４】
【０３４４】
抗体ヘプシジン複合体の単回投薬後の抗体の薬物速度論的研究
抗体濃度が抗体ＫＤを上回ることを確保するために、１ｍｇ／マウスの用量での単回腹腔内注射として、０日目に、対照抗体又は抗体１Ｓ１若しくは１８Ｂ１１の何れかを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに予め投薬した。１日目に、抗体ヘプシジン複合体（すなわち、１Ｓ１−ヘプシジン複合体又は１８Ｂ１１−ヘプシジン複合体の何れか）をマウスに投薬した。ヘプシジン投与前並びに抗体ヘプシジン複合体投与の１時間、２４及び９６時間に、ヘプシジン濃度を測定するための尿試料を収集した。結果が、下表５に示されている。
【０３４５】
【表７】
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【０３４６】
抗体ヘプシジン複合体の投与から５分、１時間、２４時間、９６時間、１６８時間、２６４時間及び３３６時間後に、血清抗体及び血清ヘプシジン濃度を測定するための血清試料を収集した。ＥＬＩＳＡによって、血清抗体及びヘプシジン濃度を計算し、結果がそれぞれ図２１及び２１に記載されている。結果は、１８Ｂ１１−ヘプシジン複合体を与えたマウス中における５分の時点での血清ヘプシジンの濃度は、１Ｓ１−ヘプシジン複合体と比べて低いことを示唆した。興味深いことに、１Ｓ１−ヘプシジン複合体で処理されたマウスが１６８時間に血清ヘプシジンの検出可能なレベルをなお有していたのに対して、１８Ｂ１１−ヘプシジン複合体を与えたマウス中で、２４時間後に、ヘプシジンは検出できなかった。
【実施例１５】
【０３４７】
マウスへの遊離ヘプシジンの単回投薬後の抗体の薬物速度論的研究
１ｍｇ／マウスの用量での単回腹腔内注射として、０日目に、対照抗体又は抗体１Ｓ１若しくは１８Ｂ１１の何れかをＣ５７ＢＬ／６マウスを予め投薬した。１日目に、１ｍｇ／マウスの用量での単回静脈内内注射として、マウスに抗体を予め投薬した。４日目に、静脈内注射によって、ヒトヘプシジン（３．７２μｇ／マウス）をマウスに投与した。ヘプシジン投与前に並びにヘプシジン投与の１時間、６時間及び２４時間後に、ヘプシジン濃度を測定するための尿試料を収集した。結果は、１Ｓ１又は１８Ｂ１１を予め投薬されたマウス中で、ヘプシジンが検出されないことを示した。図２３を参照されたい。
【０３４８】
抗体の投与から５分、１時間、２４時間、９６時間、１６８時間、２６４時間及び３３６時間後に、抗体１Ｓ１又は１８Ｂ１１及びヘプシジン濃度を測定するための血清試料を収集した。ＥＬＩＳＡによって、血清抗体及びヘプシジン濃度を計算し、結果がそれぞれ図２４及び２５に記載されている。結果は、抗体１８Ｂ１１が２４時間までに全ての検出可能な血清ヘプシジンを排除するのに対して、ヘプシジンレベルは抗体１Ｓ１で処理されたマウス中では安定化されることを示唆した。
【実施例１６】
【０３４９】
ＦｃＲｎを発現している細胞と接触された抗体によるヘプシジン細胞内蓄積の検出
ＦｃＲｎは、エンドソーム分解から抗体を救出することによる抗体のリサイクルに関与するサルベージ受容体である。この実施例は、総ヘプシジンと比べた細胞内ヘプシジンの相対的レベルに対する抗体の影響を調べ、ＦｃＲｎを発現している細胞によるヘプシジンの内部取り込み及びその後の分解の示唆を与える。Ａｌｅｘａ−６４７標識された１Ｓ１又は１８Ｂ１１抗体を、室温での１０分間の温置によって、ビオチン化されたヘプシジンの過剰と複合体を形成させた。スピンカラムを用いて、遊離のヘプシジンを除去した。０％ＦＢＳ培地中、３７℃、５％ＣＯ２で６時間、抗体−ヘプシジン複合体とともに、２９３Ｔ／ＦｃＲｎ細胞を温置した。温置の終了時に、冷ＦＡＣ緩衝液（ＰＢＳ２％ＦＢＳ）中に細胞を採集した。各群からの細胞を単に固定し（細胞外ヘプシジンの検出）又はＲ＆ＤのＣｙｔｏＦｉｘ及びＣｙｔｏＰｅｒｍ試薬を用いて固定及び透過化した（総ヘプシジンの検出）。ＳＡ−ＰＥで全ての試料を染色し、ＦＡＣＳ上で読み取った。結果は、抗体１Ｓ１と比べて、抗体１８Ｂ１１がヘプシジンのより大きな細胞内蓄積を引き起こすことを示した。図２６を参照されたい。１Ｓ１と接触された細胞とともに検出された総ヘプシジンのうち、ヘプシジンの全てが細胞外であった。１８Ｂ１１と接触された細胞とともに検出された総ヘプシジンのうち、ヘプシジンの約１／３のみが細胞外であり、残りは細胞内であった。
【０３５０】
開示を完全にするために、本明細書中に引用されている全ての特許文献及び論文の全体が、参照により、本明細書中に明示的に組み込まれる。
【０３５１】
前記記述及び実施例は、本発明を例示するために記載されたものに過ぎず、限定を意図するものではない。当業者は本発明の精神及び本質を取り込む上記実施形態の修飾に想到することができるので、本発明は、添付の特許請求の範囲に属する全ての変更及びその均等物を含むように広く解釈されなければならない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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