(57)【要約】  本発明は肺癌の評価に関する。本発明には、肺癌の評価におけるタンパク質ASCの使用が開示される。また、本発明は、個体由来の液体試料中のASCを測定することによる、前記試料を使用したインビトロにおける肺癌の評価方法にも関する。ASCの測定は、例えば肺癌を有する患者の早期検出または追跡に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 体液および/または組織抽出物から選択される試料中のカスパーゼ動員ドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ASC）、
(b) 任意に1つ以上の他の肺癌のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに
(c) 工程(a)および任意に工程(b)の測定結果を肺癌の評価に使用する工程、ここでASCの検出が肺癌を示す
を含む、インビトロで肺癌を評価する方法。
【請求項２】
前記1つ以上の他のマーカーがCYFRA21-1、CEA、NSE、proGRPおよびSCCからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記1つ以上の他のマーカーがCYFRA21-1である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記1つ以上の他のマーカーがCEAである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記1つ以上の他のマーカーがSCCである、請求項２記載の方法。
【請求項６】
体液および/または組織抽出物から選択される試料中の肺癌のインビトロ評価における、カスパーゼ動員ドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ASC）の使用であって、ASCの検出が肺癌を示す、使用。
【請求項７】
組織抽出物および体液から選択される試料中の肺癌のインビトロ評価における、カスパーゼ動員ドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ASC）および1つ以上の他の肺癌のマーカーを含むマーカーパネルの使用であって、ASCの検出が肺癌を示す、使用。
【請求項８】
該1つ以上の他のマーカーがCYFRA21-1、CEA、NSEおよびSCCからなる群より選択される、請求項７記載のマーカーパネルの使用。
【請求項９】
少なくともASCおよびCYFRA21-1を含む請求項８記載のマーカーパネルの使用。
【請求項１０】
該体液が、血清、血漿および/または血液から選択される、請求項１〜５いずれか記載の方法または請求項６〜９いずれか記載の使用。
【請求項１１】
少なくともカスパーゼ動員ドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ASC）を特異的に測定するために必要な試薬を含む、請求項１〜５いずれか記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺系の癌または肺癌（=LC）の評価、特に非小細胞肺癌（NSCLC）の評価の補助方法に関する。本発明は、LC、特にNSCLCのマーカーとしての「カスパーゼ動員ドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-associated recruitment domain)」（=ASC）の使用を開示する。さらに、本発明は特に、個体由来の液体試料中のASCの測定による、前記試料からの肺癌の評価方法に関する。ASCの測定は、例えば、肺癌の早期検出または手術を受けている患者のサーベイランスに使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
検出および治療は進歩しているにもかかわらず、癌は大きな公衆衛生課題であり続けている。様々な種類の癌の中で、LCは西洋諸国において頻繁に生じる癌であり、癌に関連する死亡の最も頻度の高い原因である。このことは主に、該疾患の早期検出についての診断の隔たりのためである。LCは大部分が、その早期の病期において無症候性である。全ての肺癌の大部分は、該疾患がすでに手術不能となった後期の病期において検出される。
【０００３】
LC腫瘍のほとんどは、小細胞肺癌（SCLC）と非小細胞肺癌（NSCLC）に分けることができる。SCLCは全ての肺癌症例の約20〜25％の原因となっている。SCLCは攻撃的な神経内分泌型のLCであり、早期病期に検出されたとしても予後は非常に乏しい。SCLCはまれに、切除による治療的処置に従順である。疾患が進行する速度のために、一般的にSCLCは、より複雑なTNM病期決定システム（下記参照）よりもむしろわずか2種類の病期、つまり制限された疾患および広範囲に及ぶ疾患を使用して分類される。LCの症例の約75〜80％は、扁平上皮癌（癌=CA）、腺CA（小葉CA、乳頭CA、気管支肺胞腫瘍、固形腫瘍、および合わせたサブタイプのサブクラスを含む）、および大細胞癌（巨細胞腫、明細胞CA、腺扁平上皮CA、および未分化CAのサブクラスを含む）を含むNSCLCの群に分類される。
【０００４】
後期病期で検出された場合、NSCLCも非常に乏しい予後を有する。癌の病期決定は程度、進行度、細胞の種類および腫瘍の等級に関する疾患の分類である。予後および治療の選択について一般化できるように、病期決定により癌患者を分類する。
【０００５】
今日では、TNMシステムは癌の解剖学的な程度に基づいて最も広く使用されている分類システムである。TNMシステムは国際的に受け容れられた、一定の病期決定システムである。基本的な3個の変数：T（原発性腫瘍の程度）、N（局所的なリンパ節の状態）およびM（遠位の転移の有無）がある。TNM基準はUICC（国際対ガン協会）1997年版（Sobin, L. H., およびFleming, I.D., TNM 80 (1997) 1803-4）により公開されている。
【０００６】
原発性腫瘍の手術による切除は早期病期のNSCLCの治療の選択として広く受け容れられている。NSCLCが進行するにつれて、より具体的には病期IIIa（T3N1M0、T1N2M0、T2N2M0、T3N2M0）からIIIb（T4N0M0、T4N1M0、T4N2M0）へと進行するにつれて、医師のアプローチの大きな変更がせまられる。しかし、より早期の病期（Ia〜IIIa；好ましくは病期T3N1M0まで）の間に癌が検出された場合、5年生存率は35％〜80％で変動する。病期Ia（（T1N0M0）；小さな腫瘍サイズ、転移なし）での検出は、80％までの5年生存率で明らかに最良の予後を有する。
【０００７】
NSCLCの病期IIIb〜IVの管理において手術が使用されることは、あったとしても稀である。病期IVは遠位の転移、つまり肺および局所的なリンパ節を超えた疾患の広がりに相当する。後期の病期IIIおよびIVの5年生存率はそれぞれ15％未満〜1％に落ち込む。
【０００８】
特に重要なことは、NSCLCの早期の診断がより良好な予後につながるということである。病期Ia（T1N0M0）、Ib（T2N0M0）、IIa（T1N1M0）、IIb（T3N0M0）、およびIIIa（T3N1M0）ほどの早期に診断された患者は、適切に治療された場合、診断後80％までの5年生存の見込みを有する。このことは、遠位の転移がすでに存在すると診断された患者について1％未満の生存率と比較されるべきである。
【０００９】
本発明の意味において、LCの早期評価とは、上述で規定されたIa〜IIIaの腫瘍病期での評価のことをいう。
【００１０】
LCがIa〜IIIaの病期で評価されることが好ましい。
【００１１】
ほとんどの肺癌は症候性になったときに検出される。現在の検出法としては、胸部X線、スパイラルコンピューター断層撮影法、喀痰細胞診および気管支鏡術（bronchioscopy）が挙げられる。しかし、大量スクリーニングには、これらの手段の適当性に関して問題がある。
【００１２】
肺癌についての多くの血清腫瘍マーカーは臨床使用されている。可溶性30kDa断片のサイトケラチン（cytoceratin）19（CYFRA21-1）、癌胎児性抗原（CEA）、神経特異的エノラーゼ（NSE）、および扁平上皮癌抗原（SCC）が最も有力なLCマーカーである。しかし、これらの中にはスクリーニングツールに必要な感度および特異性についての基準を満たすものはない（Thomas, L., Labor und Diagnose (2000) TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, Germany）。
【００１３】
臨床的に有用であるためには、新規の診断マーカーは単一マーカーとして当該技術分野に公知な他のマーカーと同等であるか、またはより良好であるべきである。あるいは、新規のマーカーは、単独で使用するかまたは1つ以上の他のマーカーと併用するいずれかの場合で診断の感度および/または特異性に進歩をもたらすべきである。試験の診断の感度および/または特異性は、以下に詳細に説明されるその受信者動作特性によって最もよく評価される。
【００１４】
全血、血清または血漿は最も広く使用される臨床常套手段の試料の供給源である。信頼性の高い癌の検出を補助するかまたは早期の予後情報を提供する早期LC腫瘍マーカーの同定により、この疾患の診断および管理を大きく補助する方法がもたらされる。したがって、LCのインビトロ評価を改善するための緊急な臨床的必要性がある。早期に診断された患者は、進行した疾患の病期で診断された患者と比較して生存の見込みが非常に高いために、LCの早期診断を改善することが特に重要である。特に、LC治療の信頼性のあるモニタリング、LCに関する個体のスクリーニング、およびLC治療後の肺癌の再発に関する試験のための方法の緊急の必要性が存在する。
【００１５】
肺癌における生化学マーカーの臨床的な有用性が最近概説された（Duffy, M.J., Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262）。
【００１６】
CYFRA21-1は現在公知である肺癌の腫瘍マーカーの中で最良のものであると考えられている。臓器特異的ではないがCYFRA21-1は主に肺組織で見られる。肺癌についてのCYFRA21-1の感度は、他の良性肺疾患に対して95％の特異性で、46〜61％であると説明される。CYFRA21-1の高い血清レベルは、顕著な良性肝臓疾患、腎不全および侵襲性膀胱癌にも関連する。CYFRA21-1試験は手術後の治療サーベイランスに推奨される。
【００１７】
CEAは癌胎児性抗原のグループに属しており、通常胚形成期に産生される。CEAは臓器特異的ではなく、主に結腸直腸癌のモニタリングに使用される。高いCEA血清レベルは、悪性腫瘍の他に、肝硬変、気管支炎、膵臓炎および自己免疫疾患などのいくつかの良性疾患にも関連する。肺癌についての感度は、良性肺疾患に対して95％の特異性で、29〜44％であると報告されている。CEAの好ましい使用は、肺癌の治療サーベイランスである。
【００１８】
NSEはSCLCについての腫瘍マーカーである。一般的に、高いNSE血清レベルは神経外胚葉性および神経内分泌性腫瘍との関連において見られる。高い血清レベルは、良性肺疾患、および髄膜炎または脳の他の炎症性疾患などの脳の疾患、ならびに頭部への外傷を有する患者にも見られる。SCLCに対する感度は、95％の特異性で60〜87％であると報告されており、NSCLCについてのNSE試験の性能は低い（7〜25％の感度）。NSEはSCLCの治療サーベイランスに推奨される。
【００１９】
proGRPは、SCLCの検出およびモニタリングに有用な腫瘍マーカーである。特発性肺線維症またはサルコイドーシスなどの非悪性肺/肺系疾患を有する患者においても高い血清レベルが見られる。SCLCの分野におけるproGRPの感度は（95％の特異性で）47〜86％であると報告されており、NSCLCの分野におけるproGRP試験の性能は、感度が10％未満であると報告されているので低い。
【００２０】
SCCは頚部の扁平上皮CAにおいて最初に同定された。一般的にLCについてのSCCの感度は低い（18〜27％）。したがって、SCC試験はスクリーニングには適さないと考えられる。しかし、一般的にCYFRA21-1が良好に機能するが、扁平上皮CAについての感度が高いために、SCCの好ましい使用は治療サーベイランスである。
【００２１】
マーカープロフィールおよび肺癌の改善された診断を目指すことに関して、ファジー理論ベース分類アルゴリズムを使用して、CYFRA21-1、NSEおよび一般的な炎症マーカーであるC反応性タンパク質（CRP）の血清レベルを組み合わせる方法が公開された（Schneider, J. et al., Int. J. Clin. Oncol. 7 (2002) 145-151）。著者は、95％の特異性で92％の感度を報告している。しかし、この研究において、例えば単一腫瘍マーカーとしてのCYFRA21-1の感度は、95％の特異性で72％であると報告されており、これは多くの他の報告された試験よりもかなり高い。Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38 (2001) 225-262においてDuffy, M. J.は、46％〜61％の感度を報告している。Schneiderらにより行われた通常ではないこの高い性能にはいくつかの疑問があり、いくつかの事実のためであり得る。第1に、対照患者の集団は患者集団よりも若いように思われ、つまり、集団の年齢が充分に一致しておらず、患者集団には多くの後期病期が含まれる。第2およびそれ以上に決定的なことに、アルゴリズムの性能は、ファジー理論限定作用素の測定に使用された訓練集団の試料で調べられている。そのために、これらの限定作用素は、厳密に言えば、この集団について「調整された」ものであり、独立した検証集団に適合されていない。正常環境下では、より大きく、独立して、よく均衡の取れた検証集団に適合された同一のアルゴリズムは、有意に低い全体性能を生じると予想されよう。
【発明の概要】
【００２２】
LCの評価に使用し得る生化学マーカーを同定することができるか調べることが本発明の課題である。
【００２３】
驚くべきことに、マーカーASC（アポトーシス関連スペック様CARDタンパク質）の使用は少なくとも部分的に、当該技術分野において現在公知のマーカーのいくつかの課題を克服することができると見出された。
【００２４】
本発明は、試料中のASCの存在および/または濃度を測定する工程、ならびに測定結果、特に測定された濃度を肺癌の評価に使用する工程を含む、インビトロでの肺癌の評価方法に関する。
【００２５】
好ましい態様において、新規のマーカーASCは、モニタリング目的ならびにスクリーニング目的に使用され得る。
【００２６】
患者のモニタリングに使用される場合、本発明による診断方法は、腫瘍負荷量、治療の有効性および患者の追跡における腫瘍再発の評価を補助し得る。ASCのレベルの増加は、腫瘍負荷量に直接相関する。化学療法後、短期間(数時間から14日間)でのASCの増加は、腫瘍細胞死の指標としての機能を果たし得る。患者の追跡において(3ヶ月〜10年間)、 ASCの増大は、腫瘍再発の指標として使用され得る。
【００２７】
好ましい態様において、本発明による診断方法は、スクリーニング目的のために使用される。すなわち、ASCのレベルを測定し、測定されたレベルをLCの有無と相関させることにより、以前にLCの診断のない被験体を評価するために使用される。
【００２８】
本発明はまた、試料中のASCおよび1つ以上の他のLCのマーカーの存在および/または濃度を測定する工程、ならびに測定結果、特に測定された濃度をLCの評価に使用する工程を含む、生化学マーカーによるインビトロでのLCの評価方法に関する。1つ以上の他のLCのマーカーがCYFRA21-1、CEA、NSE、proGRPおよびSCCからなる群より選択されることが好ましい。
【００２９】
また、本発明は、LCの評価における、ASCおよび1つ以上のさらなるマーカーを含むマーカーパネルの使用に関し、好ましいさらなるマーカーは、CYFRA 21-1、CEA、NSE、proGRPおよびSCCからなる群より選択される。
【００３０】
好ましい態様において、本発明はまた、LCの評価における少なくともASCおよびCYFRA21-1を含むマーカーパネルの使用に関する。
【００３１】
本発明はまた、LCの評価における少なくともASCおよびCEAを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００３２】
本発明はまた、LCの評価における少なくともASCおよびSCCを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００３３】
本発明はさらに、少なくともASCを特異的に測定するために必要な試薬、および任意に測定を実施するための補助試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットに関する。
【００３４】
本発明はまた、少なくともASCおよびCYFRA21-1それぞれを特異的に測定するために必要な試薬、ならびに任意に測定を実施するための補助試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００３５】
本発明はまた、少なくともASCおよびCEAそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬、ならびに任意に測定を実施するための補助試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００３６】
本発明はまた、少なくともASCおよびSCCそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬、ならびに任意に測定を実施するための補助試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００３７】
好ましい態様において、本発明は、試料中のa) ASC、およびb) 任意に1つ以上の他の肺癌のマーカーの存在および/または濃度を測定する工程、ならびにc)測定結果、特に工程(a)および任意に工程(b)において測定された濃度を肺癌の評価に使用する工程を含む、インビトロにおける肺癌の評価方法に関する。
【００３８】
用語「測定」は、試料中のASCの定量的または定性的な測定を含む。好ましい態様において、測定は定量的または半定量的測定であり、つまりASCが存在するかどうかが決定されるか、あるいはASCの濃度がカットオフ値より高いか低いかが決定される。当業者が理解するように、はい（存在）またはいいえ（非存在）アッセイにおいて、アッセイ感度は通常カットオフ値に適合するように設定される。例えば、カットオフ値は健常個体の集団の試験から決定することができる。好ましくは、カットオフ値は90％の特異性を生じるように設定されるか、また好ましくは、カットオフ値は95％の特異性を生じるように設定されるか、または好ましくは、カットオフ値は98％の特異性を生じるようにも設定される。カットオフ値を超える値の存在は、例えば肺癌の存在を示し得る。さらに好ましい態様において、測定は定量的測定である。この態様において、ASCの濃度は、例えば疾患の病期、疾患の進行度、または治療に対する応答などの根源的な診断の疑問に相関する。
【００３９】
「カスパーゼ動員ドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質」(ASC)は、「メチル化誘導性サイレンシング1の標的」(TMS1) (Swiss-PROT: Q9ULZ3)としても知られ、配列番号:1に示す配列を特徴とする。ASCは、21,627Daの理論分子量およびpH6.29の理論等電点を有する
【００４０】
カスパーゼ動員ドメイン(CARD)は、APAF1 (アポトーシス性プロテアーゼ活性化因子1) などのアダプタータンパク質と、アポトーシスに参与するカスパーゼ(例えば、CASP 9)のプロ形態との相互作用を媒介する。ASCは、CARD含有アダプタータンパク質ファミリーの構成員である。
【００４１】
前骨髄性細胞株の免疫スクリーニングにより、Masumoto et al.は、ASCをコードするcDNAを単離した。推定195-アミノ酸タンパク質は、N末端ピリン様ドメイン(PYD)および87-残基C末端CARDを含む。ウエスタンブロット解析により、22kDaタンパク質の発現が示され、ASCは、抗癌薬によるアポトーシス刺激に対する白血病細胞株の感受性を増大させることによりプロアポトーシス活性を有し得ることが示された (Masumoto，J，et al.，J. Biol. Chem. 274 (1999) 33835-33838)。
【００４２】
Conway et al.のメチル化感受性制限PCRおよびメチル化特異的PCR(MSP)解析により、ASCのサイレンシングは、エキソン1の周囲のCpG島の過剰メチル化と相関していること、ならびにDNMT1(DNAシトシン-5-メチルトランスフェラーゼ-1)の過剰発現により、ASCの過剰メチル化およびサイレンシングが促進されることが示された。乳癌細胞株はASCの完全なメチル化を示し、ASCメッセージを発現しなかったが、正常乳房組織はそうではなかった。乳癌細胞株におけるASCの発現により生存コロニーの増殖が阻害され、その数が減少した。Conway et al.は、ASCがカスパーゼ依存性アポトーシスの促進において機能を果たし、ASCの過剰発現により乳癌細胞の増殖が阻害されると結論付けた(Conway，K.E.，et al.，Cancer Research 60 (2000) 6236-6242)。
【００４３】
McConnellおよびVertinoにより、ASCの誘導発現によって細胞増殖が阻害され、カスパーゼインヒビターによってブロックされ得るDNA断片化が誘導されることが示された。免疫蛍光顕微鏡検査により、アポトーシスの誘導により、散漫な細胞質発現から球形の核周囲凝集物へのCARD依存性シフトが引き起こされることが示された(McConnell，B.B.，and Vertino，P.M.，Cancer Research 60 (2000) 6243-6247)。Moriani et al.により、乳癌細胞だけでなく胃癌にもASC遺伝子のメチル化が観察された。彼らは、プロアポトーシスASC遺伝子の下方調節が関与している乳癌および胃癌の進行におけるASC遺伝子の異常なメチル化の直接的な役割を示唆した(Moriani，R.，et al.，Anticancer Research 22 (2002) 4163-8)。
【００４４】
Conwayらは、一次乳房組織をTMS1メチル化について検査し、結果を健常組織におけるメチル化と比較した(Conway K.E.，et al.，Cancer Research 60 (2000) 6236-6242)。Levineらは、ASCサイレンシングが、特異的CpG部位のメチル化と相関しているのではなく、ASC CpG島の高密度メチル化と関連していることを見出した。メチル化ASCコピーを排他的に含む乳癌細胞株は、ASCを発現しないが、一部メチル化された細胞株では、ASCの発現レベルが、該細胞集団中に存在するメチル化ASC対立遺伝子の割合と直接的に関連している(Levine，JJ.，et al.，Oncogene 22 (2003) 3475-3488)。
【００４５】
Virmaniらは、肺癌および乳癌組織におけるASCのメチル化状態を調べた。彼らは、乳癌細胞株の46%および乳癌組織の32%にASCの異常なメチル化が存在することを見出した。メチル化は、非悪性乳房組織では稀であった(7%) (Virmani，A.，et al.，Int. J. Cancer 106 (2003) 198-204)。
【００４６】
Zhangらは、ASCが、非小細胞肺癌(NSCLC)においてデノボプロモーターのメチル化によって高頻度に不活化される癌抑制遺伝子であると記載している。著者は、ASCプロモーターの過剰メチル化が、低生存率と関連している原発性NSCLCを有する患者に一般的に見られる事象であると結論づけている(Zhang，Z.，et al.，Clin Lung Cancer. 8(1) (2006) 62-65)。
【００４７】
Shioharaらは、ASCの上方調節が炎症およびヒト好中球のアポトーシスと密接に関連していることを見出した(Shiohara，M.，et al.，Blood 98 (2001) 229a)。
【００４８】
Masumotoらにより、高レベルのASCが上皮細胞および白血球において高い存在度で発現されることが観察された(Masumoto，J.，et al.，Journal of Histochemistry and Cytochemistry 49 (2001) 1269-1275)。
【００４９】
WO 2006/066915 A1およびWO 2006/066917 A2には、直腸結腸癌を示す腫瘍マーカーとしてのASCが記載されている。
【００５０】
WO 2005/040806 A2には、ASCが乳癌の診断に適当なマーカーであることが開示されている。
【００５１】
WO 2008/063655には、試料中の1つ以上の遺伝子の核酸の過剰メチル化およびそれによりもたらされるサイレンシングを検出することにより、転移、特に微小転移を同定するための方法が記載されている。遺伝子として、とりわけ、ASCが挙げられている。
【００５２】
WO 01/29235には、例えば、血液などの試料中のASC(TMSI)遺伝子のメチル化(methylisation)レベルの測定またはTMS1発現プロフィールの測定を含む、癌を診断するための方法が開示されている。後者は、TMS1ポリペプチドの測定を含み、この場合、TMS1の濃度が低いことは癌疾患の存在に起因する。
【００５３】
Machida et al.，Cancer Research，vol. 66，no. 12，June 2006 (2006-06)、第6210〜6218頁には、ASCの過剰メチル化の関連が教示されている。したがって、ASCの過剰メチル化は特に、病期が進行した腫瘍と相関している。
【００５４】
興味深いことに、上述の文献中で、組織抽出物および体液中のASCの測定が肺癌の評価を可能にするということを示唆しているものはない。驚くべきことに、本発明において、組織溶解物試料および/または体液中のASCの存在および/または量の測定により肺癌の評価が可能であることが見出された。さらに、本発明者らは、信頼性のあるLCの評価は、個体由来の液体試料中のASCを測定することにより可能になること、すなわち、タンパク質ASCをマーカーとして使用する場合、LCの診断において組織も生検材料も必要でないことを見出した。さらに驚くべきことに、個体の体液から測定されるASCレベルの増加は肺癌に関連するということが見出された。
【００５５】
当業者には自明のように、本発明は、配列番号:1の完全長のタンパク質ASCに限定されると解釈されるべきでない。ASCの生理学的または人工的断片、ASCの二次修飾体、ならびにASCの対立遺伝子変異体もまた本発明に包含される。人工的断片は、好ましくは、合成により、または組換え技術によって作製され、配列番号:1に開示した配列に由来する少なくとも6個の連続するアミノ酸からなる診断目的の少なくとも1つのエピトープを含むペプチドを包含する。かかる断片は、抗体の作製のため、またはイムノアッセイにおける標準として都合よく使用され得る。より好ましい人工的断片は、サンドイッチイムノアッセイの設定に適切な目的の少なくとも2つのエピトープを含む。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、以下の用語のそれぞれはこのセクションにおける意味と関連する意味を有する。
【００５７】
冠詞「a」および「an」は、本明細書中では1つ〜1つより多く（つまり、少なくとも1つ）の文法上の冠詞の目的語を指すように使用される。例えば、「a marker」は1つまたは1つより多くのマーカーを意味する。用語「少なくとも」は、任意に1つ以上のさらなる対象物が存在し得ることを示すために使用される。例えば、少なくとも（複数のマーカー）ASCおよびCYFRA21-1を含むマーカーパネルは任意に1つ以上の他のマーカーを含む。
【００５８】
表現「1つ以上」は、1〜50、好ましくは1〜20、また好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、12または15を表す。
【００５９】
用語「マーカー」または「生化学マーカー」は、本明細書で使用される場合、患者の試験試料の解析のための標的として使用される分子のことをいう。一態様において、かかる分子標的の例はタンパク質またはポリペプチドである。本発明において、マーカーとして使用されるタンパク質またはポリペプチドは、前記タンパク質の天然に存在するバリアント、および前記タンパク質または前記バリアントの断片、特に免疫学的に検出可能な断片を含むことを企図する。好ましくは、免疫学的に検出可能な断片は、前記マーカーポリペプチドの少なくとも6、7、8、10、12、15または20個の連続したアミノ酸を含む。細胞から放出されるかまたは細胞外マトリックス中に存在するタンパク質は、例えば炎症の際に損傷され得、かかる断片に分解または切断され得ることを当業者は理解しよう。特定のマーカーは、その後タンパク質分解により活性化され得る不活性形態で合成される。当業者が理解するように、タンパク質またはその断片は複合体の一部として存在し得る。本発明の意味において、かかる複合体もマーカーとして使用してもよい。マーカーポリペプチドのバリアントは同一の遺伝子にコードされるが、例えば選択的mRNAまたはプレmRNAプロセッシングの結果、その等電点（=PI）もしくは分子量（=MW）、またはその両方が異なることがある。バリアントのアミノ酸配列は対応するマーカー配列と95％以上同一である。さらに、または代替的に、マーカーポリペプチドもしくはそのバリアントは翻訳後修飾を有し得る。好ましい翻訳後修飾は糖化、アシル化および/またはリン酸化である。
【００６０】
好ましくは、マーカーASCは、特異的結合剤の使用により試料から特異的に測定される。
【００６１】
特異的結合剤は、例えばASCに対するレセプター、ASCに結合するレクチンまたはASCに対する抗体である。特異的結合剤は、その対応する標的分子に対して少なくとも107l/molの親和性を有する。好ましくは、特異的結合剤は、その標的分子に対して108l/mol、またはさらに好ましくは109l/molの親和性を有する。当業者が理解するように、用語、特異的は、試料中に存在する他の生物分子がASCに特異的な結合剤と有意に結合しないことを示すように使用される。好ましくは、標的分子以外の生物分子に対する結合のレベルは、それぞれ標的分子に対する親和性の最大でわずか10％以下、わずか5％以下、わずか2％以下またはわずか1％以下である結合親和性となる。好ましい特異的結合剤は、親和性および特異性についての上述の最低基準の両方を満たす。
【００６２】
好ましくは、特異的結合剤はASCと反応性である抗体である。用語、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、かかる抗体の抗原結合断片、単鎖抗体および抗体の結合ドメインを含む遺伝子構築物のことをいう。
【００６３】
特異的結合剤の上述の基準を保持している任意の抗体断片を使用することができる。抗体は、当該技術分野の技術水準の手法により、例えばTijssen（Tijssen, P., Practice and theory of enzyme immunoassays, 11, Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, 書籍全体、特に43-78頁）に記載されるように作製される。また、当業者は、抗体の特異的な単離に使用できる免疫吸着に基づく方法に精通している。これらの手段により、ポリクローナル抗体の質およびそれによりイムノアッセイにおける該抗体の性能を高めることができる。（Tijssen, P., 上述, 108-115頁）。
【００６４】
本発明に開示される達成のために、ウサギ中で生じたポリクローナル抗体を使用してもよい。しかし、異なる種、例えばラットまたはモルモット由来のポリクローナル抗体、およびモノクローナル抗体も明らかに使用できる。モノクローナル抗体は一定の性能で任意の必要な量で産生することができるので、臨床的常套手段のためのアッセイの開発における理想的なツールである。本発明の方法におけるASCに対するモノクローナル抗体の作製および使用はそれぞれ、さらに他の好ましい態様を示す。
【００６５】
ここで、当業者は、ASCが肺癌の評価に有用なマーカーとして同定されたことを認識したため、種々の免疫診断的手法を用いて本発明の成果と同等な結果を達成することができよう。例えば、抗体を作製するために代替的な戦略を使用してもよい。かかる戦略は、特に免疫についてASCのエピトープを提示する合成ペプチドの使用を含む。あるいは、DNAワクチン化としても公知であるDNA免疫を使用してもよい。
【００６６】
測定のために、個体から得られた試料をASCに特異的な結合剤と共に、結合剤ASC複合体の形成に適した条件下でインキュベートする。当業者は何ら発明の努力をすることなくかかる適切なインキュベーション条件を容易に突き止めることができるので、かかる条件を具体的に示す必要はない。結合剤ASC複合体の量を測定して肺癌の評価に使用する。当業者が理解するように、特異的結合剤ASC複合体の量を測定するために、全て関連の教本（例えば、Tijssen P., 上述、またはDiamandis, E. P. and Christopoulos, T.K. (編), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996)参照）中に詳細に記載された多くの方法がある。
【００６７】
好ましくは、ASCをサンドイッチ型アッセイ形式で検出する。かかるアッセイにおいて、第1の特異的結合剤を使用して一方の面でASCを捕捉し、直接または間接的に検出可能に標識された第2の特異的結合剤を他方の面に使用する。
【００６８】
好ましい態様において、試料中のASCの測定は、ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレートが使用されるサンドイッチイムノアッセイを使用することにより行なわれる。このサンドイッチアッセイでは、ASCに対するビオチン化ポリクローナル抗体が捕捉抗体として使用され、ASCに対するジゴキシゲニン化ポリクローナル抗体が、第2の特異的結合パートナーとして使用される。形成されたサンドイッチ複合体は、最後に抗ジゴキシゲニンホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートおよび適切なペルオキシダーゼ基質によって可視化される。
【００６９】
上記のように、ASCは、個体の試料から得られた液体試料から測定され得る。LCの診断においてマーカーASCを適用するのに組織も生検材料試料も必要とされない。
【００７０】
好ましい態様において、本発明による方法は、液体試料材料として血清を用いて行なわれる。
【００７１】
さらに好ましい態様において、本発明による方法は、液体試料材料として血漿を用いて行なわれる。
【００７２】
さらに好ましい態様において、本発明による方法は、液体試料材料として全血を用いて行なわれる。
【００７３】
さらに好ましい態様において、本発明による方法は、液体試料材料として乳頭吸引液を用いて行なわれる。
【００７４】
本発明の意味において、「肺癌のマーカー」は、マーカーASCと合わせた場合にLCの評価において関連のある情報を付与する任意のマーカーである。LCの評価のために、前記マーカーをすでにマーカーASCを含むマーカー組合せに含ませることによって、所定の特異性で感度または所定の感度で特異性のそれぞれを改善することができる場合、該情報を関連のあるものまたは付加価値があるものとみなす。好ましくは、感度または特異性のそれぞれの改善は、p=.05、.02、.01以下の有意性のレベルで統計的に有意である。好ましくは、LCの1つ以上の他のマーカーはCYFRA21-1、CEA、NSE、proGRPおよびSCCからなる群より選択される。
【００７５】
用語「試料」は、本明細書で使用する場合、インビトロでの評価のために得られた生物学的試料のことをいう。本発明の方法において、試料または患者試料は、好ましくは任意の体液または組織抽出物を含み得る。好ましい試験試料としては、血液、血清、血漿、唾液および気管支洗浄液が挙げられる。好ましい試料は全血、血清、血漿、気管支洗浄液または唾液であり、血漿または血清が最も好ましい。
【００７６】
用語「肺癌の評価」は、本発明の方法が（単独または他のマーカーまたは変量、例えばUICC（上記参照）に記載された基準と共に）、例えばLCの有無の確立または確認のために医師を補助するか、または予後、再発の検出（手術後の患者の追跡）、スクリーニングおよび/または治療、特に化学療法のモニタリングにおいて医師を補助することを示すために使用される。
【００７７】
当業者が理解するように、任意のかかる評価はインビトロで行われる。患者試料はその後廃棄される。患者試料は、本発明のインビトロ診断法のみに使用され、患者試料の材料は患者の体内に戻されない。典型的に、試料は液体試料、例えば全血、血清または血漿である。
【００７８】
好ましい態様において、本発明は、試料中のASCの濃度を測定する工程、および測定された濃度をLCの評価に使用する工程を含む、生化学マーカーによるインビトロでのLCの評価方法に関する。
【００７９】
驚くべきことに、本発明の発明者は、LCを有する患者由来の試料中有意な割合でマーカータンパク質ASCを検出することができた。さらに驚くべきことに、発明者は、個体から得られたかかる試料中のASCの存在および/または濃度を肺癌の評価に使用できることを示すことができた。
【００８０】
診断のための理想的なシナリオは、例えば感染性疾患などのように、単一の事象またはプロセスがそれぞれの疾患を引き起こす状況である。他の全ての症例において、特に疾患の病因がLCの症例のように完全には理解されていない場合、正確な診断は非常に困難であり得る。当業者が理解するように、所定の多元的な疾患、例えばLCについて100％の特異性とともに100％の感度を有する診断用の生化学マーカーはない。むしろ、生化学マーカー、例えばCYFRA21-1、CEA、NSE、proGRP、SCCまたは本明細書に示されるようなASCを使用して、特定の見込みまたは予測値で、例えば疾患の存在、非存在、または重症度を評価することができる。したがって、常套的な臨床的診断において、一般的には様々な臨床的症状および生物学マーカーは、進行中の疾患の診断、治療および管理において一まとめとして考えられる。
【００８１】
生化学的マーカーは、個々に測定することができるか、または本発明の好ましい態様において、チップもしくはビーズ系のアレイ技術を使用して同時に測定することができるかのいずれかである。次いで、生物マーカーの濃度は、例えばそれぞれのマーカーについての個々のカットオフを使用して個々に解釈されるか、または組み合わせて解釈される。
【００８２】
さらに好ましい態様において、本発明のLCの評価は、試料中のa) ASC、およびb) 1つ以上の他の肺癌のマーカーの存在および/または濃度を測定する工程、およびc) 測定結果、例えば工程(a)および工程(b)で測定された濃度のそれぞれを肺癌の評価に使用する工程を含む方法において実施される。
【００８３】
LCの評価において、マーカーASCは1つ以上の下記：スクリーニング；診断補助；予後；化学療法、放射線療法および免疫療法などの治療のモニタリングの局面において有利である。
【００８４】
スクリーニング：
スクリーニングとは、疾患のインジケータ、例えば肺癌の存在について、個体、例えば危険性のある個体を同定するための試験の体系的な適用として規定される。好ましくは、スクリーニング集団は、喫煙者、元喫煙者、およびウラン、石英またはアスベスト曝露労働者のような肺癌のリスクが平均より高いことが知られている個体からなる。1つの好ましい態様において、肺癌のスクリーニングにおける試料として痰が使用される。
【００８５】
多くの疾患について、スクリーニング目的に必要な感度および特異性の基準を常に満たす、循環中の単一の生化学マーカーはない。このことは肺癌についても真実であると思われる。LCスクリーニングには複数のマーカーを含むマーカーパネルが使用されなければならないと予測されよう。本発明において確立されたデータは、マーカーASCがスクリーニング目的に適したマーカーパネルの不可欠な部分を形成することを示す。したがって、本発明は、LCマーカーパネル、つまり、APEXおよびLCスクリーニングのための1つ以上のさらなるマーカーを含むマーカーパネルのマーカーの1つとしてのASCの使用に関する。好ましいさらなるマーカーは、CYFRA21-1、CEA、NSE、proGRPおよびSCCからなる群から選択される。
【００８６】
診断補助:
マーカーは、特定の臓器における良性疾患対悪性疾患の鑑別診断を補助し得るか、異なる組織学的腫瘍型の識別を補助し得るか、または手術前のベースラインマーカー値を確立し得るかのいずれかである。
【００８７】
今日、肺癌の検出に使用される重要な方法は、放射線学および／またはコンピュータ連動断層撮影(CT)スキャンである。小結節、すなわち、疑わしい組織の小領域は、これらの方法によって可視化され得る。しかしながら、これらの結節の多く-CTで90%より多く-は良性組織変化を示し、少数の結節のみが癌性組織を示す。マーカーASCの使用は、良性対悪性結節の識別を補助し得る。
【００８８】
好ましい態様において、マーカーASCは、異なる組織学的LC型を確立または確認するために免疫組織学的方法に使用される。
【００８９】
単独マーカーとしてのASCはCEAまたはNSEなどの他のLCマーカーより卓越し得るため、ASCは、特に、手術前のベースライン値を確立することにより診断補助として使用されるものと期待されよう。したがって、本発明はまた、手術前のLCのベースライン値を確立するためのASCの使用に関する。
【００９０】
予後:
予後インジケータは、一定の尤度で疾患結果を予測する癌患者およびその腫瘍の臨床的、病理学的または生化学的な特徴と定義され得る。その主な使用は、患者管理の合理的な計画を補助すること、すなわち、それぞれ急速進行性疾患の過少治療および無痛性疾患の過剰治療を回避することである。Molina R. et al.，Tumor Biol. (2003)24:209-218では、NSCLCにおけるCEA、CA 125、CYFRA21-1、SSCおよびNSEの予後値が評価された。彼らの研究では、マーカーNSE、CEA、およびLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)の異常血清レベルは、短い生存を示すように思われた。
【００９１】
ASCは単独で、LC患者と健常対照の識別に有意に寄与するため、ASCはLCに苦しむ患者の予後の評価を補助するものと期待されよう。手術前のASCのレベルは、たいてい、LCの1種類以上の他のマーカーおよび／またはTNM病期分類システムと組み合わされる。好ましい態様において、ASCはLCを有する患者の予後に使用される。
【００９２】
化学療法のモニタリング:
Merle，P. et al.，Int. J. of Biological Markers (2004)19:310-315では、導入化学療法で治療された局所進行NSCLCを有する患者におけるCYFRA 21-1血清レベルの変化が評価された。彼らは、CYFRA 21-1血清レベルの早期モニタリングが病期III NSCLC患者の腫瘍応答および生存に有用な予後ツールであり得ると結論づけた。また、報告には、LCを有する患者の治療のモニタリングにおけるCEAの使用が記載された(Fukasawa T. et al.，Cancer & Chemotherapy (1986)13:1862-1867)。これらの研究のほとんどは遡及的で、無作為ではなく、少数の患者を含んだ。CYFRA21-1での研究の場合と同様に、CEA研究は、a)化学療法を受けている間にCEAレベルが減少した患者は、一般的に、CEAレベルが減少しなかった患者よりも良好な結果を有し、(b)ほぼすべての患者で、CEAレベルの増加は疾患の進行と関連したことを示した。
【００９３】
ASCは、それぞれCYFRA21-1またはCEAと少なくとも同程度に良好な化学療法のモニタリングのためのマーカーであることが期待されよう。したがって、本発明はまた、化学療法下のLC患者のモニタリングにおけるASCの使用に関する。
【００９４】
追跡:
癌性組織の完全な除去を目的として外科的切除を受けたLC患者の大部分は、
後に再発性または転移性の疾患を発症する(Wagner，H.，Chest (2000)117:110-118；Buccheri，G. et al.，Ann. Thorac. Surg. (2003)75:973-980)。これらの再発のほとんどは、手術後2〜3年以内に起こる。再発性/転移性疾患は、検出が遅すぎた場合は常に致死的であるため、相当な研究が、初期ひいては潜在的に治療可能な段階でのLC再発に焦点を当てている。
【００９５】
その結果、多くのLC患者は、多くの場合CEAの定期的モニタリングを含む、術後のサーベイランスプログラムを受ける。外科的切除後1年間のCEAによる連続モニタリングにより、再発性/転移性疾患が、疑わしい症状または徴候がない場合であっても、早期の術後再発性/転移性疾患は、ほぼ97%の特異性でほぼ29%の感度で検出されることが示された(Buccheri，G. et al.，Ann. Thorac. Surg. (2003)75:973-980)。したがって、LCを有する患者の手術後の追跡は、適切な生化学的マーカーの使用の最も重要な分野の1つである。調査したLC患者においてASCの感度が高いために、ASCは単独でまたは1種類以上の他のマーカーと組合せて、LC患者の追跡、特に手術後のLC患者の追跡に非常に有用であろう。LC患者の追跡におけるASCおよび1種類以上のLCの他のマーカーを含むマーカーパネルの使用は、本発明のさらに好ましい態様を示す。
【００９６】
本発明は、好ましい態様において、それぞれLCの診断分野またはLCの評価におけるASCの使用に関する。
【００９７】
またさらに好ましい態様において、本発明は、個体から得られた液体試料からの肺癌の評価における、肺癌の1種類以上のマーカー分子と組み合わせた肺癌のマーカー分子としてのASCの使用に関する。ASCの測定が組み合わされ得る好ましい選択される他のLCマーカーは、CYFRA 21-1、CEA、NSE、proGRP、および/またはSCCである。LCの評価に使用されるまたさらに好ましいマーカーパネルは、ASCならびにCYFRA21-1およびCEAからなる群から選択される少なくとも1種類の他のマーカー分子を含む。
【００９８】
当業者が理解し得るように、調査中の診断的疑問を改善するために、2種類以上のマーカーの測定を使用するには多くの方法がある。全く単純に、しかしながら、しばしば効果的なアプローチにおいて、調査された少なくとも1種類のマーカーについて試料が陽性である場合、陽性の結果が仮定される。このことは、例えばAIDSのような感染性の疾患の診断の場合であり得る。
【００９９】
しかしながら、マーカーの組み合わせは頻繁に評価される。好ましくは、マーカーパネルのマーカー、例えばASCおよびCYFRA21-1についての測定値は、数学的に組み合わされ、組み合わされた値は診断的疑問の原因に相関される。マーカー値は、当該技術分野の技術水準の任意の適切な数学的方法により組み合わされ得る。マーカーの組み合わせと疾患を相関する周知の数学的方法には、識別分析（DA）（即ち、一次、二次、標準化DA)、カーネル法（即ちSVM）、ノンパラメトリック法（即ちk-最近接分類）、PLS（部分最小二乗）、ツリーベース法（即ちロジック回帰、CART、ランダムフォレスト法、ブースティング／バギング法）、一般化直線モデル（即ちロジスティック回帰）、主成分ベース法（即ちSIMCA）、一般化付加モデル、ファジーロジックベース法、ニューラルネットワークおよび遺伝的アルゴリズムベース法などの方法を用いる。当業者は、本発明のマーカーの組み合わせを評価するための適切な方法を問題なく選択する。好ましくは、本発明のマーカーの組み合わせを、例えばLCの有無と相関することに用いられる方法は、DA（即ち一次、二次、標準化識別分析）、カーネル法（即ちSVM）、ノンパラメトリック法（即ちk-最近接分類）、PLS（部分最小二乗）、ツリーベース法（即ちロジック回帰、CART、ランダムフォレスト法、ブースティング法）、または一般化線形モデル（即ちロジスティック回帰）から選ばれる。これらの統計的方法に関する詳細は、以下の参考文献、Ruczinski，I.，et al，J. of Computational and Graphical Statistics，12 (2003)475-511；Friedman，J. H. ，J. of the American Statistical Association 84 (1989)165-175；Hastie，Trevor，Tibshirani，Robert，Friedman，Jerome，The Elements of Statistical Learning，Springer Series in Statistics, 2001；Breiman，L.，Friedman，J. H.，Olshen，R. A.，Stone，C. J. (1984)Classification and regression trees，California：Wadsworth；Breiman，L.，Random Forests，Machine Learning，45 (2001)5-32；Pepe，M. S.，The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction，Oxford Statistical Science Series，28 (2003)；およびDuda，R. O.，Hart，P. E., Stork，D. G.，Pattern Classification，Wiley Interscience，第2版 (2001)に見られる。
【０１００】
生物学的マーカーの基礎的な組合せに対して、最適化された多変量カットオフを使用し、状態Aと状態B、例えば、疾患状態と健常を区別することは、本発明の好ましい態様である。この型の解析では、マーカーは、もはや独立的ではなくマーカーパネルを形成する。
【０１０１】
診断方法の精度は、その受信者動作特性(ROC)によって最もよく示される(特にZweig, M. H.およびCampbell, G., Clin. Chem. 39 (1993)561-577参照のこと)。ROCグラフは、観察されたデータの全範囲にわたって判定閾値を連続的に変えることにより得られる全ての感度／特異性ペアのプロットである。
【０１０２】
臨床試験の臨床性能は、その診断精度または被験体を臨床的に関連する亜群に正確に分類する能力に依存する。診断精度は、検査を受けた被験体の２つの異なる状態を正確に区別する試験の能力を評価する。かかる状態は、例えば健常と疾患または良性疾患対悪性疾患である。
【０１０３】
それぞれの場合において、ROCプロットは、判定閾値の全範囲で１−特異性に対して感度をプロットすることにより2つの分布間の重複を示す。Y軸上は感度、すなわち真陽性部分［(真陽性試験結果の数)/(真陽性の数＋偽陰性試験結果の数)として定義される］である。これは、疾患または状態の存在下の陽性度とも称される。これは、罹患亜群のみから算出される。X軸上は偽陽性部分、すなわち1-特異性［(偽陽性結果の数)/(真陰性の数＋偽陽性結果の数)として定義される］である。これは特異性の指標であり、罹患していない亜群全体から算出される。真陽性部分および偽陽性部分は、2つの異なる亜群由来の試験結果を用いて全く別々に算出されるため、ROCプロットは試料中の疾患の有病率とは独立している。ROCプロット上のそれぞれの点は、特定の判定閾値に対応する感度/1-特異性のペアを表す。完全識別を伴う試験(結果の2つの分布に重複がない)は、左上の角を通るROCプロットを有し、この場合、真陽性の割合は1.0または100％（完全な感度）であり、偽陽性部分は0（完全な特異性）である。識別のない試験の理論的プロット（2つの群の結果の分布が同一）は、左下の角から右上の角に向かう45°の対角線である。ほとんどのプロットはこれらの両極間に含まれる。（ROCプロットが45°の対角線の完全に下に含まれる場合、これは「陽性度」についての基準を「より大きい」から「より少ない」に入れ換えることにより容易に修正される。逆も同じ）。定性的には、プロットが左上の角に近づくにしたがって、試験の全体的な精度は高くなる。
【０１０４】
臨床試験の診断精度を定量化するための好ましい方法の１つは、単一の数によりその成績を表すことである。かかる全般的パラメータは、例えば、いわゆる「総エラー」あるいは「曲線下面積=AUC」である。最も一般的な世界的尺度はROCプロット下の面積である。慣例により、この面積は常に≧0.5である（もしそうでなければ、そうなるように決定基準を入れ換えることができる）。数値は1.0（２群の試験値の完全な分離）と0.5（２群間の試験値に明らかな分布の差が無い）の範囲にある。該面積は、対角線に最も近い点または90％特異性での感度などのプロットの特定の部分だけでなく、全プロットに依存する。これは、ROCプロットが完全なもの（面積＝1.0）にどれだけ近いかということの定量的で説明的な表現である。
【０１０５】
好ましい態様において、本発明は、試料中の少なくともASCおよびCYFRA21-1の濃度、ならびに任意にCEA、proGRP、NSE、および／またはSCCの濃度をそれぞれ測定し、測定された濃度をLCの有無と相関させることにより、LC対健常対照の診断精度を改善するための方法であって、改善により、いずれかの単一マーカー単独での調査に基づいた分類と比べて、健常対照に対してより多くの患者がLCに苦しんでいると正確に分類される方法に関する。
【０１０６】
本発明の好ましい方法において、少なくともバイオマーカーASCおよびCYFRA21-1の濃度のそれぞれが測定され、LCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１０７】
本発明の好ましい方法において、少なくともバイオマーカーASCおよびCEAの濃度のそれぞれが測定され、LCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１０８】
本発明のさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーASC、CYFRA21-1、およびCEAの濃度のそれぞれが測定され、LCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１０９】
本発明のさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーASC、CYFRA21-1、およびproGRPの濃度のそれぞれが測定され、LCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１１０】
本発明のまたさらに好ましい方法において、少なくともバイオマーカーASC、CYFRA21-1およびSCCの濃度のそれぞれが測定され、LCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１１１】
以下の実施例および図面は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。記載の手順において、本発明の精神から逸脱することなく変更がなされ得ることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図1は、ASC濃度と肺癌の発生の相関を示す図である。525.1pg/mlのカットオフ値は、LCの存在に有意である。LC（「癌」）を有する患者から得られた60の試料ならびに30名の明らかに健常な個体および30名の見かけ上健常な喫煙者から得た60の対照試料に関してASCの測定を行った。
【図２】図2は、30名の明らかに健常な個体および30名の見かけ上健常な喫煙者から得た60の対照試料と比較したときの、LCを有する患者から得た60の試料の評価に関する受信者動作特性(ROC)のプロットを示す。
【図３】図3は、明らかに健常な個体から得られた50の対照試料と比較したときの、LCを有する患者から得られた365の試料の評価に関する受信者動作特性（ROC）のプロットを示す。
【実施例】
【０１１３】
実施例1
肺癌のマーカーとしてのASCの同定
LC-ESI-MSMS-解析用の試料調製:
組織試料中の可溶性タンパク質画分のタンパク質濃度を、供給業者のマニュアルの使用説明書に従ってBio-Radタンパク質アッセイ(登録商標)(カタログ番号500-0006；Bio-Rad Laboratories GmbH、Muenchen、Germany)を用いて測定する。200μgのタンパク質に相当する容量に、4mlの還元バッファー(9M尿素、2mM DTT、100mM KH2PO4、NaOH pH8.2)を添加し、1時間インキュベートする。Amicon(登録商標)Ultraデバイス(Millipore GmbH、Schwalbach、Germany)内でこの溶液を50μlに濃縮し、アルキル化のために0.5mlの試料バッファー(9M尿素、4mMヨードアセトアミド、100mM KH2PO4、NaOH pH8.2)に移し、6時間インキュベートする。アルキル化後、Amicon(登録商標)Ultraデバイス内で溶液を50μlに濃縮し、0.5mlの9M尿素 10mM KH2PO4、NaOH pH8.2を添加し、溶液を50μlに再度濃縮する。この手順を2回繰返す。続いて、最終50μlを水中4μgのトリプシン(プロテオミクス等級、Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany)を含む990μlに希釈し、一晩消化させる。
【０１１４】
LC-ESI-MSMS-解析：
Nano-LCシステム(Ultimate、Famos、Switchos；LC Packings、Idstein、Germany)での2次元 HPLC (MudPIT)によって、トリプシン消化物(100μl)を分離する。分離は、自己充填2次元カラム(溶融シリカ：PicoFrit 75μm、New Objective；RP：ProntoSil 120-5-C18 AQ+、Bischoff；SCX：Partisil 10、Whatman)を用いて行なう。連続増加量のNH4Ac(0〜1500mM)での段階溶出によって11個のSCX画分を生成させる。これらを、カラムのRP部分でさらに分離し、ESI-MSイオントラップ(LCQ deca XP；Thermo Electron、Massachusetts、USA；パラメータについては表1参照)とともにデータ依存性スキャンを用いてオンライン解析する。各試料について、3回実験を行なう。ベースアルゴリズムとしてSequestを用いて、市販されていないRoche独自のデータ管理システムで生データを処理する(パラメータ表1参照)。反復実験で同定されたペプチドおよびタンパク質の得られたリストを組み合わせた。
【０１１５】
タンパク質ASCは、同定された配列の補助によって同定され、表1に示す。
【０１１６】
肺癌のマーカーとしてのASCの検出:
各患者について、腫瘍試料から同定されたタンパク質および対応するペプチドの数を、隣接正常組織の一致した結果と比較する。この手段によって、タンパク質ASCは、腫瘍組織内に特異的に存在するか、または非常に多量であり、健常対照組織では検出可能でないか、またはかろうじて検出可能であることがわかる。
【０１１７】
タンパク質ASCは、肺癌に苦しむ患者由来の腫瘍組織において強く過剰提示される。タンパク質ASCの以下のペプチド配列は、腫瘍組織のLCQ-MS2-データのデータベース検索によって同定される。ASC由来の以下の配列は上述の方法を用いて同定される。
【０１１８】
2011521240.tif 000002
2011521240.tif 000003
【０１１９】
ASCは、肺腺癌を有する8名の患者のうち5名の腫瘍組織溶解物試料において同定できた。正常組織溶解物では、ASCは同定できなかった。
【０１２０】
実施例2
肺癌マーカータンパク質ASCに対する抗体の作製
免疫検出アッセイ、例えば、ウエスタンブロッティングおよびELISAによるASCの血清レベルおよび血漿レベルおよび血中レベルの測定における抗体のさらなる使用のため、肺癌マーカータンパク質ASCに対するポリクローナル抗体を作製する。
【０１２１】
大腸菌における組換えタンパク質発現:
ASCに対する抗体を作製するため、大腸菌において組換え抗原を作製する。したがって、German Resource Center for Genome Research (RZPD、Berlin、Germany)から入手した全長cDNAクローンIRAT p970H075Dから、適当なフォワードおよびリバースプライマーを使用してASCコーディング領域をPCR増幅する。
【０１２２】
フォワードプライマーは(EcoRIクローニング部位およびリボソーム結合部位に加えて)、ASCポリペプチドにインフレームに導入されたN末端MRGSHHHHHHIEGRペプチド伸長部(配列番号：2)をコードするオリゴヌクレオチドを特徴とする。EcoRI/BamHI消化PCR 断片を対応するpQE-30 (Qiagen、Hilden、Germany)ベクター断片内にライゲートし、続いて、これで大腸菌XL1-blueコンピテント細胞を形質転換する。配列解析後、プラスミドで大腸菌BL21コンピテント細胞を形質転換し、製造業者の使用説明書に従ってpQEベクターシリーズのIPTG誘導T5プロモーター下で発現させる。
【０１２３】
MRGSHHHHHHIEGR-ASC融合タンパク質の精製のため、1lの一夜誘導細菌培養物を遠心分離によってペレット化し、細胞ペレットを、1mg/mlのリボザイムおよびCompleteTM EDTA非含有プロテアーゼインヒビター錠剤を含有する20mMリン酸ナトリウムバッファー、500mM塩化ナトリウム、pH7.4中に再懸濁する。細胞を超音波処理によって破壊し、不溶性物質を遠心分離によってペレット化し、上清をNi-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)金属-アフィニティクロマトグラフィーに適用する。カラムを数床容量の溶出バッファーで洗浄した後、20mMリン酸ナトリウムバッファー、500mM塩化ナトリウム、20mMイミダゾール、pH7.4で洗浄する。最後に、20mMリン酸ナトリウムバッファー、500mM塩化ナトリウム、pH7.4中20〜500mMのイミダゾール勾配で結合抗原を溶出し、75mM HEPESバッファー、pH7.5、100mM塩化ナトリウム、1mM EDTA、6.5%スクロース中に4℃で保存する。
【０１２４】
ポリクローナル抗体の作製:
a)免疫化
免疫化のため、タンパク質溶液の新鮮エマルジョン(100μg/mlのタンパク質ASC)および完全フロイントアジュバントを1:1の比で調製する。1、7、14および30、60および90日目に各ウサギを1mlのエマルジョンで免疫化する。血液を採取し、得られた抗ASC血清を下記のように使用する。
【０１２５】
b)カプリル酸および硫酸アンモニウムでの連続沈殿によるウサギ血清からのIgG (免疫グロブリンG)の精製
1容量のウサギ血清を4容量の酢酸バッファー(60mM、pH4.0)で希釈する。2M Tris-塩基でpHを4.5に調整する。カプリル酸(25μl/mlの希釈試料)を激しい攪拌下で滴下する。30分後、試料を遠心分離し(13000×g、30分、4℃)、ペレットを廃棄し、上清を回収する。2MのTris-塩基を添加して上清のpHを7.5に調整する。
【０１２６】
最終濃度2Mまで4M硫酸アンモニウム溶液を滴下して、激しい攪拌下、上清中の免疫グロブリンを沈殿させる。沈殿した免疫グロブリンを遠心分離(8000×g、15分、4℃)によって回収する。
【０１２７】
上清を廃棄する。ペレットを10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaClに溶解し、充分透析する。透析物を遠心分離し(13000×g、15分、4℃)、濾過する(0.2μm)。
【０１２８】
c)ポリクローナルウサギIgGのビオチン化:
ポリクローナルウサギIgGを10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaClで10mg/mlにする。IgG溶液1mlあたり50μlのビオチン-N-ヒドロキシスクシンイミド(DMSO中3.6mg/ml)を添加する。室温で30分後、試料をSuperdex 200 (10mM NaH2PO4/NaOH、pH7.5、30mM NaCl)上でクロマトグラフィー処理する。ビオチン化IgGを含有する画分を収集する。
【０１２９】
d)ポリクローナルウサギIgGの免疫吸着:
ASC免疫吸着体のため、製造業者のプロトコルに従って10mgの精製組換えASCを1mlのCNBr活性化SepharoseTM 4B (GE Healthcare、Germany カタログ番号17-04-30-01)に結合させる。このアフィニティカラムにPBS、0.05%Tween 20中100mgのポリクローナルウサギIgGを負荷した後、a)PBS、b)0.5M塩化ナトリウム、0.05%Tween 20、c)30mM塩化ナトリウムで洗浄する。結合画分を0.5Mのグリシン、150mM塩化ナトリウムで溶出し、塩酸でpH2.1に調整し、1MのTris-塩基を添加してすぐに中性pHにする。溶出液を10mg/mlに濃縮し、PBS中TSK-Gel(登録商標)G3000SWゲル濾過カラム(Sigma-Aldrich、Germany、カタログ番号815103)上でクロマトグラフィー処理する。IgGモノマーを含有する画分を収集する。
【０１３０】
実施例3
ヒト血清および血漿試料中のASCの測定のためのELISA
ヒト血清または血漿中のASCの検出のために、サンドイッチELISAを開発する。抗原の捕捉のために、抗ASCポリクローナル抗体（実施例2参照）を免疫吸着し、抗原の検出のために、抗ASCポリクローナル抗体をビオチンと結合する。
【０１３１】
96ウェルマイクロタイタープレートを、100μlの免疫吸着した抗ASCポリクローナル抗体とともに60分間、150mM炭酸二ナトリウム、350mM炭酸水素ナトリウム中5μg/mlでインキュベートする。続いて、プレートをPBS、0.05% Tween 20で3回洗浄する。次いで、ウェルを、標準抗原としての組換えタンパク質(実施例2参照)の連続希釈物、または患者由来の希釈血漿試料のいずれかとともに、5μg/mlのビオチン化抗ASCポリクローナル抗体と一緒に2時間インキュベートする。インキュベーションは、10mMリン酸塩、pH7.4、1% BSA、0.9% NaClおよび0.1% Tween 20中で行なった。その後、プレートを3回洗浄して未結合成分を除去する。次の工程では、10mMリン酸塩、pH7.4、1% BSA、0.9% NaClおよび0.1% Tween 20中で、20mU/mlの抗ビオチン-PODコンジュゲートとともにウェルを60分間インキュベートする。続いて、プレートを同じバッファーで3回洗浄する。結合抗原-抗体複合体の検出のため、ウェルを100μlのABTS溶液 (Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany、カタログ番号11685767)とともにインキュベートし、30〜60分後、ELISAリーダーにより405nmでODを測定する。
【０１３２】
実施例4
上皮内層液（ELF）中のASC-気管支鏡マイクロサンプリング
気管支鏡マイクロサンプリング（BMS）により、主に非侵襲性の様式で、肺小結節の付近の上皮内層液（ELF）を回収できる可能性が示唆される。その後、悪性の結節を同定するために、ELF中の腫瘍マーカーの濃度を測定できる。
【０１３３】
気管支鏡によりBMSプローブ（Olympus Medical Systems Corp. Tokyo, Japan, カタログ番号: BC-402C）を肺に挿入し、該BMSプローブは外部ポリエチレンシースおよびステンレス鋼ガイドにつながれた内部コットンプローブで構成される。内部プローブを結節の近位に進め、数秒間BMSを行う。その後、内部プローブを外部シースに引き戻し、両方のデバイスを同時に引き抜く。コットンの先端を切り落として、-80℃で直接凍結する。測定のために、コットンの先端からELFを溶出し、続いて解析することができる。実施例3に記載のようにELF中のASCの濃度をELISAにより測定する。
【０１３４】
実施例5
肺癌の血清マーカーとしてのASC
試験集団
試験1
表2に示されるUICC分類を有する60名の充分に特徴付けられたNSCLC患者（30名の腺CA、30名の扁平上皮細胞CA）由来の試料を使用する。
【０１３５】
2011521240.tif 000004
【０１３６】
表2のLC試料中のASCのレベルを、任意の公知の悪性肺疾患を有さない30名の明らかに健常な個体および30名の見かけ上健常な喫煙者（＝対照コホート）から得た60の対照試料と比較して評価する。
【０１３７】
表2のLC試料中のASCレベルは対照試料中のASCのレベルと比較して高い。
【０１３８】
Zweig, M. H., and Campbell（上掲）に従って、ROC解析を行う。曲線下面積により測定した際のLC集団の患者と健常個体を区別するための識別力は、LC対健常対照について92％であると分かる（図1および図2）。
【０１３９】
95%の特異性で、それぞれ、全てのLC試料の感度は70％、腺癌について67％および扁平上皮細胞癌について73％であった。
【０１４０】
試験2
表3に示されるUICC分類を有する365名の充分に特徴付けられた肺癌患者（146名の腺CA、87名の扁平上皮細胞CA、44名の小細胞CA、88名のその他の肺のCA）由来の試料を使用する。
【０１４１】
2011521240.tif 000005
【０１４２】
明らかに健常な個体（＝対照コホート）から得た50の対照試料と比較して、表3のLC試料中のASCレベルを評価する、AUCは0.94である（図3）。
【図１】
2011521240.tif 000006
【図２】
2011521240.tif 000007
【図３】
2011521240.tif 000008
【配列表】
2011521240000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月22日(2010.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 体液および/または組織抽出物から選択される試料中のカスパーゼ動員ドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ASC）、
(b) 任意に1つ以上の他の肺癌のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに
(c) 工程(a)および任意に工程(b)の測定結果を肺癌の評価に使用する工程、ここでASCの検出が肺癌を示す
を含む、インビトロで肺癌を評価する方法。
【請求項２】
前記1つ以上の他のマーカーがCYFRA21-1、CEA、NSE、proGRPおよびSCCからなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記1つ以上の他のマーカーがCYFRA21-1である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記1つ以上の他のマーカーがCEAである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記1つ以上の他のマーカーがSCCである、請求項２記載の方法。
【請求項６】
体液および/または組織抽出物から選択される試料中の肺癌のインビトロ評価における、カスパーゼ動員ドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ASC）の使用であって、ASCの検出が肺癌を示す、使用。
【請求項７】
組織抽出物および体液から選択される試料中の肺癌のインビトロ評価における、カスパーゼ動員ドメイン含有アポトーシス関連スペック様タンパク質（ASC）および1つ以上の他の肺癌のマーカーを含むマーカーパネルの使用であって、ASCの検出が肺癌を示す、使用。
【請求項８】
該1つ以上の他のマーカーがCYFRA21-1、CEA、NSEおよびSCCからなる群より選択される、請求項７記載のマーカーパネルの使用。
【請求項９】
少なくともASCおよびCYFRA21-1を含む請求項８記載のマーカーパネルの使用。
【請求項１０】
該体液が、血清、血漿および/または血液から選択される、請求項１〜５いずれか記載の方法。
【請求項１１】
該体液が、血清、血漿および/または血液から選択される、請求項６〜９いずれか記載の使用。
【国際調査報告】
2011521240.tif 000009
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