(57)【要約】【解決手段】本発明は、キマーゼ（EC 3.4.21.39）に結合するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、以下よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらアミノ酸配列からなる、ポリペプチドに関する：(a) GVTLFVALYDY(X1)A(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)LSFHKGEKFQIL(X7)(X8)(X9)(X10)(X11)(X12)G(X13)(X14)WEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ（配列番号1）、式中、(X1)はR、N、Q、E、K、H、S、T、CまたはDであり；(X2)はE、T、D、Q、L、P、A、S、C、M、N、E、G、A、VまたはIであり；(X3)はR、T、H、N、K、S、C、NまたはQであり；(X4)はS、W、T、C、N、Q、FまたはYであり；(X5)はT、H、L、F、C、S、M、N、Q、R、K、G、A、V、I、P、YまたはWであり；(X6)はD、Q、H、E、S、T、C、N、RまたはKであり；(X7)はD、N、R、E、Q、S、T、C、KまたはDであり；(X8)はM、W、G、F、A、S、T、C、S、N、Q、Y、V、L、IまたはPであり；(X9)はT、H、S、D、C、N、Q、R、K、Eであるか、または存在せず；(X10)はV、T、Q、G、A、L、I、P、S、C、M、Nであるか、または存在せず；(X11)はP、A、D、G、K、V、L、I、E、R、M、Hであるか、または存在せず；(X12)はN、V、P、I、E、T、S、A、G、L、C、M、QまたはDであり；(X13)はD、E、T、P、G、A、V、L、I、S、C、M、NまたはQであり、および(X14)はW、Y、L、G、A、V、I、P、MまたはFであり；(b) (a)のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列であって、同一性の決定がアミノ酸位置(X1)〜(X14)を除く、アミノ酸配列。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キマーゼ（EC 3.4.21.39）に結合するポリペプチドであって、該ポリペプチドが以下よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなる、ポリペプチド：
(a) GVTLFVALYDY(X1)A(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)LSFHKGEKFQIL(X7)(X8)(X9)(X10)
(X11)(X12)G(X13)(X14)WEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ（配列番号1）
式中、
(X1)はR、N、Q、E、K、H、S、T、CまたはDであり；
(X2)はE、T、D、Q、L、P、A、S、C、M、N、E、G、A、VまたはIであり；
(X3)はR、T、H、N、K、S、C、NまたはQであり；
(X4)はS、W、T、C、N、Q、FまたはYであり；
(X5)はT、H、L、F、C、S、M、N、Q、R、K、G、A、V、I、P、YまたはWであり；
(X6)はD、Q、H、E、S、T、C、N、RまたはKであり；
(X7)はD、N、R、E、Q、S、T、C、KまたはDであり；
(X8)はM、W、G、F、A、S、T、C、S、N、Q、Y、V、L、IまたはP；
(X9)はT、H、S、D、C、N、Q、R、K、Eであるか、または存在せず；
(X10)はV、T、Q、G、A、L、I、P、S、C、M、Nであるか、または存在せず；
(X11)はP、A、D、G、K、V、L、I、E、R、M、Hであるか、または存在せず；
(X12)はN、V、P、I、E、T、S、A、G、L、C、M、QまたはD；
(X13)はD、E、T、P、G、A、V、L、I、S、C、M、NまたはQ、および
(X14)はW、Y、L、G、A、V、I、P、MまたはFであり；
(b) (a)のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列であって、同一性の決定がアミノ酸位置(X1)〜(X14)を除く、アミノ酸配列。
【請求項２】
請求項1のポリペプチドであって、
(X1)はR、N、Q、EまたはK；
(X2)はE、T、D、Q、L、PまたはA；
(X3)はR、T、HまたはN；
(X4)はSまたはW；
(X5)はT、H、LまたはF；
(X6)はD、QまたはH；
(X7)はD、N、R、E、QまたはS；
(X8)はM、W、G、F、A、SまたはT；
(X9)はT、H、S、Dであるか、または存在せず；
(X10)はV、T、Qであるか、または存在せず；
(X11)はP、A、D、G、Kであるか、または存在せず；
(X12)はN、V、P、I、E、TまたはS；
(X13)はD、E、TまたはP、および
(X14)はW、YまたはLである、
ポリペプチド。
【請求項３】
請求項1または2のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号2〜15のいずれかよりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか一項のポリペプチドであって、該ポリペプチドがキマーゼ活性を阻害する、ポリペプチド。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか一項のポリペプチドであって、該キマーゼが、配列番号16のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【請求項６】
抗体、アルブミンバインダー、アルブミン、IgGバインダーまたは抗体のFcドメインに融合する、請求項1〜5のいずれか一項のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項７】
請求項1〜5のいずれか一項のポリペプチドまたは請求項6の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項８】
請求項7の核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
請求項7の核酸分子または請求項8のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
薬学的活性化合物、診断的活性化合物および／または血中半減期を調節する成分に融合する、請求項1〜5のいずれか一項のポリペプチドを含む、融合構築物。
【請求項１１】
請求項10の融合構築物であって、薬学的活性化合物または診断的活性化合物が、以下よりなる群から選択される、融合構築物。
(a) 蛍光色素、
(b) 光増感剤、
(c) 放射性核種、
(d) 医療用画像のための造影剤、
(e) サイトカイン、
(f) 毒性化合物、
(g) ケモカイン、
(h) 凝結促進因子、
(i) プロドラッグ活性化酵素、または
(k) ACE阻害剤、レニン阻害剤、ADH阻害剤、アルドステロン阻害剤、またはアンジオテンシン受容体遮断薬。
【請求項１２】
請求項1〜5のいずれか一項のポリペプチド、請求項6の融合タンパク質、請求項7の核酸分子、請求項8のベクター、請求項9の宿主細胞または請求項10または11の融合構築物を含む、医薬または診断用組成物。
【請求項１３】
臓器障害、炎症性疾患、心血管系疾患または癌の治療における使用のための、請求項12の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項13に記載の使用のための医薬組成物であって、炎症性疾患、心血管系疾患または癌が、アレルギー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、糖尿病、クローン病、心筋症、心筋梗塞、左心室肥大、頻脈誘発心不全、不安定狭心症、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、皮膚炎、バルーンカテーテル傷害後の血管増殖、および子宮頸癌よりなる群から選択される、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項13に記載の使用のための医薬組成物であって、臓器障害が、大動脈瘤、糖尿病性網膜症、線維症、潰瘍性大腸炎または別の炎症性疾患によって誘発される、医薬組成物。
【請求項１６】
キマーゼ（EC 3.4.21.39）に結合するポリペプチドの同定方法であって、以下の工程を含む、方法：
(a) 配列番号17のアミノ酸配列を有するFYNキナーゼSH3ドメインに由来する、突然変異体のライブラリーを構築する工程、
(b) (a)で構築された突然変異体のライブラリーをキマーゼ（EC 3.4.21.39）と接触させる工程、および
(c) キマーゼに結合する突然変異体を単離する工程。
【請求項１７】
請求項16の方法であって、工程(a)において、突然変異体のライブラリーが、配列番号17のアミノ配列を有するFYNキナーゼSH3ドメインの、srcループ内の少なくとも1つのアミノ酸またはsrcループの2つ隣のアミノ酸までに位置する少なくとも1つのアミノ酸の同時ランダム化、および、RTループ内の少なくとも1つのアミノ酸またはRTループの2つ隣のアミノ酸までに位置する少なくとも1つのアミノ酸のランダム置換、欠失または添加によって産生される、方法。
【請求項１８】
請求項16または17の方法であって、ライブラリーが少なくとも1 x 107の突然変異体を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キマーゼ（EC 3.4.21.39）に結合するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、以下よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列からなる、ポリペプチドに関する：(a) GVTLFVALYDY(X1)A(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)LSFHKGEKFQIL(X7)(X8)(X9)(X10)(X11)(X12)G(X13)(X14)WEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ（配列番号1）、式中、(X1)はR、N、Q、E、K、H、S、T、CまたはDであり；(X2)はE、T、D、Q、L、P、A、S、C、M、N、E、G、A、VまたはIであり；(X3)はR、T、H、N、K、S、C、NまたはQであり；(X4)はS、W、T、C、N、Q、FまたはYであり；(X5)はT、H、L、F、C、S、M、N、Q、R、K、G、A、V、I、P、YまたはWであり；(X6)はD、Q、H、E、S、T、C、N、RまたはKであり；(X7)はD、N、R、E、Q、S、T、C、KまたはDであり；(X8)はM、W、G、F、A、S、T、C、S、N、Q、Y、V、L、IまたはPであり；(X9)はT、H、S、D、C、N、Q、R、K、Eであるか、または存在せず；(X10)はV、T、Q、G、A、L、I、P、S、C、M、Nであるか、または存在せず；(X11)はP、A、D、G、K、V、L、I、E、R、M、Hであるか、または存在せず；(X12)はN、V、P、I、E、T、S、A、G、L、C、M、QまたはDであり；(X13)はD、E、T、P、G、A、V、L、I、S、C、M、NまたはQであり、および(X14)はW、Y、L、G、A、V、I、P、MまたはFであり；(b) (a)のアミノ酸配列に少なくとも85%同一であるアミノ酸配列である、但し、同一性の決定はアミノ酸位置(X1)〜(X14)を除く、アミノ酸配列。
【０００２】
この明細書では、特許申請書および製造元の説明書を含む、多数の文書を引用する。これらの文書の開示内容は、本発明の特許性に関連しないと見なされるが、参照することにより全体として本書に援用される。より具体的には、全ての参考文書は参照により、それぞれ個別の文書が参照により援用されることを特別にかつ個別に示された場合と同程度に、援用される。
【背景技術】
【０００３】
免疫介在性炎症性疾患においては、好中球、単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞およびリンパ球等の非常に多くの免疫系の細胞型が、主要な原因として働くことが多い。これらの細胞の積極的動員(recruitment)および蓄積は、ある環境（例えば、細菌または線虫感染症）では命を救うが、他（例えば、アレルギー）では命を脅かす。特に、肥満細胞は、サイトカイン、ケモカイン、プロテアーゼ、ロイコトリエン、および生物活性ポリアミンの放出によって、特にアレルギー反応に関与すると長年考えられてきた。最近、肥満細胞の新たな働きが確認され、先天性免疫および適応免疫の両者並びに病的炎症状態における肥満細胞の関連性が明らかになった（シア-ドノフ(Shea-Donohue) T.ら, (2010年), Curr Gastroenterol Rep., 12(5) 349-357頁）。
【０００４】
セリンプロテアーゼキマーゼ（EC = 3.4.21.39）は、肥満細胞の分泌顆粒中に発現されるキモトリプシン様酵素である（ミラー(Miller) H.およびペムベルトン(Pemberton) A., (2002年), Immunity, 105, 375-390頁）。放出に際し、細胞外マトリックス（例えば、プロテオグリカン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン）を分解し、白血球遊走およびサイトカイン産生を誘導し、TGF-βおよびMMP-9を活性化し、組織のリモデリングを促進することが記載されている（デ・ガラヴィッラ(de Garavilla) Lら, (2005年) J Biol Chem, 280(18), 18001-18007頁およびタカイ(Takai) S.ら, (2010) J Pharmacol Sci, 113(4), 301-309頁）。種々の型の組織中の肥満細胞の微小体からの放出に際するこれらの炎症誘発作用に加えて、キマーゼはヒト心臓の肥満細胞中に見つかっており、ここでアンジオテンシンIを切断してアンジオテンシンIIを形成する（ウラタ(Urata)ら, (1993年) J Clin Invest, 91(4), 1269-1281頁）。血中のアンジオテンシンIIは、細動脈収縮およびアルドステロン分泌などの、心血管系に対する多数の様々な生理作用を有する。心臓自体では、陽性の変力(inotrpic)および変時性(chronotropic)効果を有する（ピーチ(Peach)ら, (1977年), Physiol. Rev., 57, 313-370頁）。心血管の病理（高血圧等）において、アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤およびアンジオテンシン受容体遮断薬による、アンジオテンシンII媒介作用の遮断は、これらの疾患の治療に有用であることを示しており、このことは、多数の異なる市販化合物によって実証されている（リュルマン(Lullmann) H.およびモア(Mohr) K., Taschenatlas der Pharmakologie, 第4版, ゲオルグ・ティエメ・フェルラーク(Georg Thieme Verlag) シュトゥットゥガルト/ニューヨーク, 2001年, 126-127頁）。
【０００５】
キマーゼの炎症誘発酵素活性により、およびキマーゼが心臓においてACE非依存性経路によってアンジオテンシンIIを産生するため、キマーゼの阻害が、炎症性疾患および心血管疾患における臓器および組織の損傷を防ぐための新たな治療アプローチを約束すると主張されている。この原理的説明に従って、キマーゼ阻害剤は、多数のインビボの研究において、抗炎症剤および心臓保護薬として生産・研究され、これらの研究により、キマーゼの阻害が炎症過程を減じることが実証された：例えば、初期の研究では、ラットの急性腹膜炎モデルにおいて、キマーゼの阻害が血漿および／または腹膜における炎症誘発性サイトカインのアップレギュレーションを減じ、好中球の腹腔への流入を減じた（デ・ガラヴィッラ(de Garavilla) L.ら, (2005年) J Biol Chem, 280(18) 18001-18007頁）。この成功を基礎として、キマーゼ阻害が喘息および慢性閉塞性肺疾患（COPD）の治療に適しているか研究された。アレルギー性喘息および／またはCOPDの形で現れるものに関連する、病的反応を伴う炎症の3種の動物モデルが研究された（マヤノフ(Maryanoff) B.ら, (2010), Am J Respir Crit Care Med, 181, 247-253頁）：(1) オボアルブミン感作ラットにおける肥満細胞介在性炎症、(2) アレルギー性羊における、アレルゲン誘導気管支収縮および気道過敏症、および(3) マウスにおける、タバコの煙に誘導される好中球増加症。著者らが提示する結果は、キマーゼ阻害剤が、喘息およびCOPDに関連する疾患と関係がある動物モデルにおいて、炎症性の後遺症を阻止できることを示す（マヤノフB.ら, (2010年), Am J Respir Crit Care Med, 181, 247-253頁）。さらに、キマーゼ阻害剤は、イヌのモデルにおいて、バルーンカテーテル損傷後の血管増殖を抑制した（タカイ(Takai) S.ら, (2003年), J Pharmacol Exp Ther, 304, 841-844頁）。加えて、ACEおよびキマーゼ阻害剤の組み合わせで処置したハムスターが、ACE阻害単独と比較して、左心室機能が向上し、有害な心臓のリモデリングが減じられ、心筋梗塞後の生存率が上昇したことが示された。他の動物実験により、心筋梗塞、心筋症および頻脈誘発心不全の動物モデルにおける、キマーゼ阻害剤の有効性が実証された（ドッグレル(Doggrell) Sh.およびワンスタール(Wanstall) J., (2005年), Can J Physiol Pharmacol, 83, 123-130頁）。タカイらは、キマーゼ阻害剤が、大動脈瘤、糖尿病性網膜症、線維症、潰瘍性大腸炎および他の炎症性疾患等の多数の疾患において、臓器の損傷の抑制に有用であり得ることを教示する（タカイS.ら, (2010年) J Pharmacol Sci, 113(4), 301-309頁）。
【０００６】
要約すると、キマーゼの阻害は炎症性疾患において有用な方法であると考えられ、キマーゼの阻害は、アレルギー、喘息、COPD、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、糖尿病、クローン病、心筋症、心筋梗塞、左心室肥大、不安定狭心症、再狭窄およびアテローム動脈硬化性プラーク等において求められている。ごく最近、ディアコヌ(Diaconu)らは、(2011年), Arch Dermato Res.の前段で、癌、特に子宮頸癌におけるキマーゼの役割を記載した。
【０００７】
一般に、プロテアーゼの標的（プロテアーゼは500を超えるファミリーメンバーを含む）を高親和性で特異的に阻害する化合物の開発は、過去には困難であった。このことは、プロテアーゼが重要な標的分類と見なされているが（無秩序なタンパク質分解により、キマーゼについて上記で例示した通り、多くの病状を招くため）、市販されている薬剤はごくわずかである（HIVプロテアーゼ阻害剤、アンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤、カリクレイン阻害剤、プロテアゾーム阻害剤ボルテゾミブ、最近認可されたレニン阻害剤アリスキレン、抗凝固薬およびDPP4阻害剤等）ことが注目されるという事実に反映される。新たなプロテアーゼ阻害剤の発見における主要課題は、強力かつ特異的な薬剤を特定する能力であり（ドラッグ(Drag) M.およびサルヴェセン(Salvesen) G., (2010年), Nat Rev Drug Discov.,9(9), 690-701頁）、これは、ほとんどのタンパク質分解酵素ファミリーの活性部位内の構造的類似性により、いくつかのファミリーメンバーの同時阻害が起こり、薬物の許容できない毒性プロフィールにつながる可能性があるためである。
【０００８】
所望の薬物速度論的特性および薬力学的特性を有する、親和性および特異性の高いキマーゼ阻害剤を得る一つの手段は、抗体およびそれに代わる結合技術（後者は「足場タンパク質(scaffolds)」と言う、以下参照）を使用することである。抗体は、薬学的バイオテクノロジーの分野で、結合分子の最も確立された部類を表す。しかし、抗体は、製造が容易であり、実質的にあらゆる所望の標的抗原に対する親和性および特異性が高いことから、分析、精製、診断および医療目的で日常的に使用されているが、なおも多数の重大な欠点があり、例えば、複雑な哺乳類細胞の産生系の必要性、安定性のためのジスルフィド結合への依存、いくつかの抗体断片の凝集傾向、溶解性が低いことなどであり、最後に大切なことだが、抗体は、ヒト化した場合であっても、望まない免疫反応を引き起こす可能性がある。その結果、最近、新規な部類の万能結合タンパク質を産生するための足場タンパク質として、小さな球状タンパク質の開発に注目が集まっている。多様性および標的特異性を産生するため、典型的には、好適な生物物理学的特性を有するタンパク質の足場タンパク質の表面成分（例えば、細胞外ループ）を組合わせ的に変化させて、目的とする標的結合特異性をスクリーニングするタンパク質ライブラリーを製造する（ビンツ(Binz), H. K.およびプルックスン(Pluckthun), A., (2005年) Curr. Opin. Biotechnol.16, 459-469頁）。
【０００９】
これらの非免疫グロブリン由来の結合試薬は、集合的に規定された「足場タンパク質」である（スケッラ(Skerra) A., (2000年) J. Mol. Recognit. 13, 167-187頁）。過去10〜15年にわたって、50を超える種々のタンパク質の足場タンパク質が提案されているが、この分野の最先端のアプローチは（ゲバウアー(Gebauer) MおよびスケッラA., (2009年) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255頁に要約）：アフィボディ類（ブドウ球菌プロテインAのZドメインに基づく）、クニッツ方ドメイン類、アドネクチン類（ヒトフィブロネクチンの第10ドメインに基づく）、アンチカリン類（リポカリン由来）、DARPin類（アンキリン反復タンパク質由来）、アビマー類（多量体化LDLR-Aに基づく）、アフィチン類（超高熱古細菌由来のSac7dに基づく）、およびヒトFyn SH3ドメインに由来するフィノマー類である。
【００１０】
一般に、SH3ドメインは、細胞間情報伝達に関与する、多種多様なタンパク質中に存在する（ムサッキオ(Musacchio)ら, (1994年) Prog. Biophys. Mol. Biol. 61; 283-297頁）。これらのドメインは、タンパク質中で一定の位置を占有せず、独立して発現および精製され得る。現在、約300のヒトSH3ドメインを含む、1000を超えるドメインの存在が知られている（ムサッキオA., (2003年) Advances in Protein Chemistry. 61; 211-268頁）。SH3ドメインには広範な配列多様性があるが、SH3ドメインは全て、保存された折りたたみ構造：2つの逆平行βシートで形成されたコンパクトなβバレルを共有する（ムサッキオA., (2003年) Advances in Protein Chemistry. 61; 211-268頁）。典型的には、SH3ドメインは、PXXPコア結合モチーフを含む、高プロリン含有ペプチドに結合する（レン(Ren)ら, (1993年) Science 259; 1157-1161頁）が、非従来型のSH3結合部位の例も記載されている（カーッカイネン(Karkkainen)ら, (2006年) EMBO Rep.7; 186-191頁）。これまでに配列決定したSH3ドメインの多くは、アミノ酸の全長がおよそ60〜65個であるが、それらのいくつかは、二次構造の主要な保存エレメントに接続するループ中への挿入のため、85個のアミノ酸の特徴を有することがある（コヤマ(Koyama)ら, (1993年) Cell 72(6); 945-952頁）。種々のSH3ドメインのアラインメントにより、適切な構造形成および標準的な高プロリン含有モチーフの認識に関与する、保存アミノ酸残基が明らかになった（ラーソン(Larson)ら, (2000年) Protein Science 9; 2170-2180頁）。
【００１１】
最近、Fyn SH3ドメインが、結合タンパク質の産生に魅力的な足場タンパク質（「フィノマー」）であることが実証されたが、これは、このドメインが、(i) 細菌中、溶解形態で多量に発現され得ること、(ii) 単量体であり、溶液中に保存した場合に凝集しないこと、(iii) 非常に安定であること（Tm 70.5℃）、(iv) システイン残基がないこと、および(v) マウスからヒトへ完全に保存されたアミノ酸配列を特徴とするヒト由来のものであり、そのため非免疫原性であることによる（グラブロフスキ(Grabulovski)ら, (2007年) JBC, 282, 3196-3204頁; 欧州特許EP 2054432号）。
【００１２】
本発明者の知る限りでは、キマーゼは治療に魅力的な標的である一方で、今までのところ、当技術分野では、フィノマーに基づくバインダーは記載されていない。従って、治療適用性にも影響を与えると思われる、キマーゼに結合する分子に必要な特徴を特定および記載することは、挑戦的であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の根底にある目的は、新規で強力なキマーゼ結合分子を提供することであり、特にキマーゼに高い特異性および高親和性を有するものを提供することである。さらなる目的は、キマーゼ結合分子を提供することであり、好ましくは、研究、診断および治療に好適なキマーゼ阻害剤であって、好ましくはキマーゼ介在性の疾患および医学的症状を治療および／または予防する医薬における使用のためのキマーゼ阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、本発明は、第一の態様において、キマーゼ（EC 3.4.21.39）に結合するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、以下よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそのアミノ酸配列よりなる、ポリペプチドに関する：(a) GVTLFVALYDY(X1)A(X2)(X3)(X4)(X5)(X6)LSFHKGEKFQIL(X7)(X8)(X9)(X10)(X11)(X12)G(X13)(X14)WEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ（配列番号1）、式中、(X1)はR、N、Q、E、K、H、S、T、CまたはDであり；(X2)はE、T、D、Q、L、P、A、S、C、M、N、E、G、A、VまたはIであり；(X3)はR、T、H、N、K、S、C、NまたはQであり；(X4)はS、W、T、C、N、Q、FまたはYであり；(X5)はT、H、L、F、C、S、M、N、Q、R、K、G、A、V、I、P、YまたはWであり；(X6)はD、Q、H、E、S、T、C、N、RまたはKであり；(X7)はD、N、R、E、Q、S、T、C、KまたはDであり；(X8)はM、W、G、F、A、S、T、C、S、N、Q、Y、V、L、IまたはPであり；(X9)はT、H、S、D、C、N、Q、R、K、Eであるか、または存在せず；(X10)はV、T、Q、G、A、L、I、P、S、C、M、Nであるか、または存在せず；(X11)はP、A、D、G、K、V、L、I、E、R、M、Hであるか、または存在せず；(X12)はN、V、P、I、E、T、S、A、G、L、C、M、QまたはDであり；(X13)はD、E、T、P、G、A、V、L、I、S、C、M、NまたはQであり、および(X14)はW、Y、L、G、A、V、I、P、MまたはFであり；(b) (a)のアミノ酸配列に少なくとも85%同一であるアミノ酸配列である、但し、同一性の決定はアミノ酸位置(X1)〜(X14)を除く、アミノ酸配列。
【００１５】
本発明の好ましい態様では、アミノ酸位置(X1)〜(X14)は、(X1)はR、N、Q、EまたはKであり；(X2)はE、T、D、Q、L、PまたはAであり；(X3)はR、T、HまたはNであり；(X4)はSまたはWであり；(X5)はT、H、LまたはFであり；(X6)はD、QまたはHであり；(X7)はD、N、R、E、QまたはSであり；(X8)はM、W、G、F、A、SまたはTであり；(X9)はT、H、S、Dであるか、または存在せず；(X10)はV、T、Qであるか、または存在せず；(X11)はP、A、D、G、Kであるか、または存在せず；(X12)はN、V、P、I、E、TまたはSであり；(X13)はD、E、TまたはPであり、および(X14)はW、YまたはLであることから選択される。
【００１６】
本書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、約50を超えるアミノ酸を含有する、単鎖タンパク質またはそれらの断片を含む、アミノ酸の線状分子鎖を言う。ポリペプチドは、少なくとも2つの同一または異なる分子よりなるオリゴマーをさらに形成してもよい。このようなマルチマーの対応するより高次の構造は、それぞれ対応して、ホモ-またはヘテロダイマー、ホモ-またはヘテロトリマー等と呼ばれる。ホモダイマー、トリマー等もまた、「ポリペプチド」の用語の定義内である。さらに、アミノ酸(類)／またはペプチド結合(類)が機能性アナログによって置換されている、このようなポリペプチドのペプチドアナログ体もまた、本発明に包含される。このような機能性アナログとしては、セレノシステイン等の、20の遺伝子がコードされたアミノ酸以外の、全ての知られているアミノ酸が挙げられる。また、「ポリペプチド」という用語は、天然に修飾されたポリペプチドであって、修飾が、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、および当業界でよく知られた同様の修飾によって達成されるものにも言及する。
【００１７】
また、本発明は、実質的にキマーゼへの結合を保持する、本発明のポリペプチドの断片も含む。この点において、断片が少なくとも30のアミノ酸、少なくとも35のアミノ酸、少なくとも40のアミノ酸、または少なくとも45のアミノ酸を含むことがさらに好ましい。さらに好ましくは、断片において、本書に以下で規定する通り、RT-およびsrc-ループ、およびこれらのループに隣接する（1、2または3つ隣のアミノ酸位置）アミノ酸に対応する、アミノ酸位置が保持される。
【００１８】
「キマーゼに結合する」という用語は、本発明のポリペプチドが、キマーゼに対して、好ましくはヒトキマーゼ、より好ましくは配列番号16のキマーゼに対して、特異的な（インビボおよび／またはインビトロ）結合親和性を有することを必要とする。好ましくは、本発明のポリペプチドは、キマーゼに、KDが10-7〜10-12 M、より好ましくは10-8〜10-12 M、最も好ましくは10-9〜10-12 Mで結合する。
【００１９】
配列番号17は、ヒトFynキナーゼのSH3ドメインのアミノ酸配列である（1986年にカワカミ(Kawakami)らおよびセンバ(Semba)らが報告した、Fynキナーゼのaa 83-145）。配列番号17を記す：
【００２０】
2014523234.tif 000002
【００２１】
上記に示す配列番号17において、RT-Srcおよびn-Srcループの配列に、それぞれ下線および二重下線を付す。エーペル(Erpel)ら（「Src SH3ドメインの突然変異分析：リガンド結合表面の同一の残基は分子内および分子間相互作用に重要である(Mutational analysis of the Src SH3 domain: the same residues of the ligand binding surface are important for intra- and intermolecular interactions.)。」 Embo J. 14(5): 963-75頁）は、Src SH3ドメインのRTおよびn-Srcループにおける突然変異の影響を検討し、疎水表面に隣接する両ループにおける突然変異が、このドメインの分子内および分子間の集合に関与する能力に影響し得ることを実証した。さらに、欧州特許EP 2054432号は、RT-Srcおよび／またはn-Srcループ内の、およびそれらに隣接する突然変異がSH3ドメインの結合特異性を決定することを示す。上記の項目(b)による配列計算は、(X1)と(X2)との間のアミノ酸位置Aおよび(X12)と(X13)との間のアミノ酸位置Gをさらに排除することが、本発明に関して好ましく、これは、これらのアミノ酸位置が、RT-Srcおよびn-Srcループ内であるか、またはこれらのループに隣接するためである。
【００２２】
Fyn SH3のアミノ酸配列は、ヒト、マウス、ラットおよびサル（テナガザル）では完全に保存されている。対応するヒトのドメインから、ニワトリのFyn SH3はアミノ酸位置が1つ異なり、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)ではアミノ酸位置が2つ異なる。他のSH3ドメインと同じように、Fyn SH3は2つの逆平行βシートより構成され、他のタンパク質と相互作用するため2つの柔軟ななループ（RT-Srcおよびn-Srcループと呼ばれる）を含む。
【００２３】
本書において上記で列挙した配列番号1は、ヒトFynキナーゼのSH3ドメインのアミノ酸配列（配列番号17）に由来する。さらに詳細には、配列番号1は、配列番号2〜15のアラインメントから得られるコンセンサス配列である（図1参照）。図1から明らかなように、位置(X1)〜(X14)は、配列番号17のFynキナーゼSH3ドメインのRT-およびsrc-ループ内であるか、それらループに隣接する。これらのアミノ酸位置は、キマーゼに対する結合特異性を決定する。
【００２４】
本発明に従って、「パーセント（%）配列同一性」という用語は、鋳型核酸またはアミノ酸配列の全長を構成するヌクレオチドまたはアミノ酸残基と比較して、2以上の整列核酸またはアミノ酸配列の同一のヌクレオチド／アミノ酸の一致（「ヒット」）の数を言う。換言すれば、（部分）配列を比較し、比較の範囲に渡って、または当業界で知られている配列比較アルゴリズムを用いて測定される指定領域に渡って、最大の対応に整列する場合、または、手動で整列し、視覚的に調査する場合、2以上の配列または部分配列のアラインメントを用いて、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの百分率（例えば85%、90%または95%の同一性）を定量してもよい。従って、配列同一性を定量するために比較される配列は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、付加または欠失によって異なっていてもよい。この規定は、試験配列の相補性(complement)にも適用する。
【００２５】
当業者であれば、核酸配列のアラインメントに好適なプログラムも知っている。ポリペプチド配列のパーセント配列同一性は、例えば、上記で説明したプログラムCLUSTLAW, FASTAおよびBLASTで定量し得る。好ましくは、BLASTプログラム、即ちNCBI BLASTアルゴリズムを使用する（ステファン(Stephen) F. アルチュル(Altschul), トーマス(Thomas) L. マッデン(Madden), アレジャンドロ(Alejandro) A. シェッファー(Schaffer), ジング・ツァン(Jinghui Zhang), ツェン・ツァン(Zheng Zhang), ウェッブ・ミラー(Webb Miller), およびデイヴィッド(David) J. リプマン(Lipman) (1997年), 「Gapped BLASTおよびPSI-BLAST：新世代のタンパク質データベース検索プログラム(Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs)」, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402頁）。
【００２６】
本書の上記の項目(b)に示した、配列同一性に関して、配列同一性が少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%であることがさらに好ましい。
【００２７】
本書で使用される場合、「同一性の定量はアミノ酸位置(X1)〜(X14)を除く」という語句は、配列番号1に関して、配列同一性の計算は、アミノ酸位置(X1)〜(X14)を考慮に入れないが、配列番号1の51のアミノ酸位置の残部に限定することを特定する。
【００２８】
「キマーゼ」という用語は酵素を指し、より詳細にはEC番号EC 3.4.21.39のセリンプロテアーゼを言う。本書において上記した通り、キマーゼはペプチド分解活性を示し、多様な機能および疾患に関与する。より詳細には、キマーゼは、肥満細胞の分泌顆粒中に発現される、キモトリプシン様酵素である（ミラー(Miller) H.およびペムベルトン(Pemberton) A., (2002年), Immunity, 105, 375-390頁）。放出に際し、キマーゼは、細胞外マトリックス（例えば、プロテオグリカン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン）を分解し、白血球遊走およびサイトカイン産生を誘導しTGF-βおよびMMP-9を活性化し、組織のリモデリングを促進する（デ・ガラヴィッラ(de Garavilla) L.ら. (2005年) J Biol Chem, 280(18), 18001-18007頁およびタカイ(Takai) S.ら, (2010年) J Pharmacol Sci, 113(4), 301-309頁）。種々の型の組織中の肥満細胞の顆粒球からの放出に際の、これらの炎症誘発作用に加えて、キマーゼはヒト心臓の肥満細胞中に見つかっており、ここでアンジオテンシンIを切断してアンジオテンシンIIを形成する（ウラタ(Urata)ら. (1993年) J Clin Invest, 91(4), 1269-1281頁）。
【００２９】
図1の配列番号2〜15の配列アラインメントから明らかなように、アミノ酸位置(X1)〜(X14)は、FynキナーゼSH3ドメインのRT-およびsrc-ループ内であるか、それらループに隣接する。本書において上記で論じたとおり、RT-および／またはsrc-ループ内のアミノ酸位置は、標的分子に対する結合特異性を決定する。本書の以下の例により、アミノ酸位置(X1)〜(X14)について列挙したアミノ酸が、キマーゼ、特に配列番号16を有するキマーゼに結合特異性を与えることが示される。より詳しくは、図1における本発明の配列番号2〜15の配列アラインメントにより、アミノ酸位置(X1)〜(X14)が、(X1)がR、N、Q、EまたはKであり；(X2)がE、T、D、Q、L、PまたはAであり；(X3)はR、T、HまたはNであり；(X4)はSまたはWであり；(X5)はT、H、LまたはFであり；(X6)はD、QまたはHであり；(X7)はD、N、R、E、QまたはSであり；(X8)はM、W、G、F、A、SまたはTであり；(X9)はT、H、S、Dであるか、または存在せず；(X10)はV、T、Qであるか、または存在せず；(X11)はP、A、D、G、Kであるか、または存在せず；(X12)はN、V、P、I、E、TまたはSであり；(X13)はD、E、TまたはPであり、および(X14)はW、YまたはLであることより選択されることが示される。本書において上記で挙げた本発明の第一の態様では、アミノ酸位置(X1)〜(X14)について列挙した他のアミノ酸は、保存的アミノ酸置換を特定する。本書において以下により詳細に規定する通り、保存的置換は、アミノ酸を、置換されるアミノ酸に類似の化学的特性を有する別のアミノ酸で置換することを特定する。従って、アミノ酸位置(X1)〜(X14)について列挙した全てのアミノ酸が、キマーゼに結合特異性を与えることが期待され得る。
【００３０】
図1において配列番号2〜15の配列アラインメントよりさらに明らかであるが、アミノ酸位置(X1)〜(X14)は、配列番号2〜15のアミノ酸配列の間で異なってもよいだけではなく、FynキナーゼのSH3ドメイン（配列番号17）のRT-および／またはsrc-ループ内でないか、それらに直接隣接しない、さらなるアミノ酸位置において異なってもよい。これらのアミノ酸の差は、配列番号2〜15の結合特異性に不可欠ではない。従って、配列番号1のポリペプチドにおいて、FynキナーゼのSH3ドメインのRT-および／またはsrc-ループ以外のさらなるアミノ酸位置、およびそれらに隣接するアミノ酸位置以外のさらなるアミノ酸位置、特にアミノ酸位置(X1)〜(X14)以外のさらなるアミノ酸位置は、実質的にキマーゼに対する結合特異性を阻害することなく、交換または欠失してもよく、さらなるアミノ酸を加えてもよい。アミノ酸を交換する場合、保存的な交換が好ましい。保存的置換は、アミノ酸を、置換されるアミノ酸に類似の化学的特性を有する別のアミノ酸で置換することを含む。好ましくは、保存的置換は、(i) 塩基性アミノ酸の、別の塩基性アミノ酸での置換；(ii) 酸性アミノ酸の、別の酸性アミノ酸での置換；(iii) 芳香族アミノ酸の、別の芳香族アミノ酸での置換；(iv) 非極性脂肪族アミノ酸の、別の非極性脂肪族アミノ酸での置換；および(v) 極性非荷電アミノ酸の、別の極性非荷電アミノ酸での置換よりなる群から選択される置換である。塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンおよびリシンよりなる群から選択される。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩より選択される。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンよりなる群から選択される。非極性脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、イソロイシンおよびプロリンよりなる群から選択される。極性非荷電アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンよりなる群から選択される。保存的アミノ酸置換と対照的に、非保存的アミノ酸置換は、1つのアミノ酸の、上記で概説した保存的置換(i)〜(v)に該当しない、あらゆるアミノ酸との交換である。
【００３１】
従って、さらに好ましい態様において、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列に、さらに好ましくは少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一であるアミノ酸配列も包含し、ここで、(X1)〜(X14)は、上記で示した独特なアミノ酸より選択されるか、さらに好ましくは配列番号1のアミノ酸配列に、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一であるアミノ酸配列であって、(X1)〜(X14)は上記で示した明確なアミノ酸より選択され、同一性の測定はアミノ酸位置(X1)〜(X14)を除く。
【００３２】
好ましい態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号2〜15のいずれかよりなる群から選択される、アミノ酸配列を含む。
【００３３】
本書における以下の実施例に示す通り、配列番号2〜15は、キマーゼに結合することが分かり、より詳細には、配列番号16を有するキマーゼに結合することが分かった。よく知られていることだが、1つ、2、3またはいくつかのアミノ酸の欠失、添加または置換等の、アミノ酸配列の若干の変化により、実質的に同一の特性を有する、元のタンパク質の変異形態がもたらされる可能性がある。従って、本発明は、配列番号2〜15のいずれかに、少なくとも85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドも包含する。
【００３４】
さらに好ましい態様では、本発明のポリペプチドはキマーゼ活性を阻害する。
【００３５】
本書で使用される場合、「ポリペプチドがキマーゼ活性を阻害する」という語句は、ポリペプチドがキマーゼの酵素活性を減じるか完全に消失させる能力を有することを規定し、これは本書において上記で詳細に説明される。この点で、ポリペプチドがキマーゼの活性を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%阻害することがさらに好ましい。
【００３６】
別の好ましい態様では、本発明のキマーゼは、配列番号16のアミノ酸配列を有する。
【００３７】
本書において以下の実施例から明らかである通り、配列番号16を有するヒトキマーゼは、配列番号2〜15を有するポリペプチドを特定するための標的タンパク質として使用されている。
【００３８】
本発明は、さらに、抗体のFcドメイン、アルブミンバインダー、アルブミン、IgGバインダーまたは抗体に融合した本発明のポリペプチドを含む、融合タンパク質に関する。
【００３９】
本書で使用される場合「融合タンパク質」という用語は、一般論として、別々のポリペプチドをコードする2以上の遺伝子の結合によって産生される、ポリペプチド構築物を対象にする。換言すれば、この融合遺伝子の翻訳により、元のポリペプチドのそれぞれに由来する機能特性を有する、一本鎖のポリペプチドが得られる。ポリペプチドは、直接融合しても、リンカー、即ち短いペプチド配列を用いてもよい。一般に、融合タンパク質は、当業者によく知られた組み換えDNA技術によって人工的に産生される。しかし、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、平易な有機合成戦略、固相支援合成技術等の、多くの従来からのよく知られた技術のいずれかによって、または市販の自動合成装置によって調製してもよい。融合タンパク質は、生物学的研究または治療に使用されることもある。
【００４０】
また、本発明は、サイトカインまたはケモカインに融合した本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質を包含する。このような融合タンパク質は、本書において以下に、本発明の融合構築物と関連して、より詳細に説明される。本書において以下にさらに詳細に説明され、また当業者に知られている様に、サイトカインまたはケモカインを含む融合タンパク質は、医療目的に特に有用である。
【００４１】
好ましくは、Fcドメインは、本発明のポリペプチドのインビボの半減期を延長させる、1以上のヒト機能性Fcドメインであり、それらのいくつかは、例えば本書において以下で説明する通りの治療的、予防的および／または診断的適用において、哺乳類の免疫反応を、融合タンパク質の本発明のポリペプチド成分の特異的標的結合部位に誘導する。本発明のポリペプチドは、1以上の機能性FcドメインのN-またはC-末端に融合するか、1以上のFcドメインのN-およびC-末端の両者に融合され得る。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、本発明のポリペプチドのマルチマーを含み、好ましくはテトラマー、トリマー、または最も好ましくはダイマーを含み、本発明のポリペプチドは、1以上のFcドメイン、好ましくは1つのFcドメインの、少なくとも片側に、好ましくはN-末端に融合している。
【００４２】
抗体の「機能性Ｆｃドメイン」は、当業者によく知られている用語であり、抗体のパパイン消化に基づいて規定される。重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは以下のクラス：IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに分類され、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3およびIgG4、IgA1およびIgA2に分類されることがある。重鎖の定常領域によって、免疫グロブリンの種々のクラスはそれぞれ［α］、［δ］、［ε］、［γ］および［μ］と呼ばれる。抗体の機能性Fcドメインは、補体活性化、C1q結合およびFc受容体結合に基づいて、ADCC（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）およびCDC（補体依存性細胞傷害）に直接的に関与する。4つのヒトIgGアイソタイプは、新生児Fc受容体、活性化Fcγ受容体、FcγRI、FcγRIIaおよびFcγRIIIa、抑制性受容体FcγRIIb、およびC1q等の、親和性の異なる種々の受容体に結合し、非常に異なる活性を与える。ヒト抗体のFcドメインの活性化および抑制性受容体への親和性は、操作および修飾し得る（ストロール(Strohl) W., (2009年) Curr Opin Biotechnol, 20, 685-691頁参照）。従って、上記の通り、本発明は、本発明のポリペプチドのインビボでの半減期を延長することができる、好ましくはヒト由来の機能性Fcドメイン、好ましくはIgG1抗体のヒト機能性Ｆｃドメインを含有する、Fc融合体を含む。
【００４３】
本発明のより好ましい態様において、Fcドメインは、活性化またはサイレンシングされたエフェクター機能を有するIgG1の1以上の改変ヒト機能性Fcドメインであり、好ましくは、サイレンシングされたエフェクター機能を有するIgG1の1以上の改変ヒト機能性Fcドメインであり、さらにより好ましくは、L234およびL235に突然変異を有する、サイレンシングされたエフェクター機能を有するIgG1の1以上の改変ヒト機能性Fcドメインであり、番号はカバト(Kabat)のEUインデックスに従う（ジョンソン(Johnson) G.およびウ(Wu) T.T. (2000年) Nucleic Acids Res. 28, p. 214-218参照）が、最も好ましくは突然変異L234AおよびL235Aを有する。
【００４４】
アルブミンバインダーおよびIgGバインダーの例は、ゲバウアー(Gebauer) Mおよびスケッラ(Skerra) A. (2009年) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255頁に記載されている。従って、アルブミンバインダーおよびIgGバインダーの好ましい例は、ヒト単鎖Igドメイン（dubbledアルブミンDab）、ナノ体、大腸菌プロテインGに由来する自然発生アルブミン結合ドメイン（ABD）、およびIgGに結合するドメインである。
【００４５】
このような融合タンパク質は、例えば、患者への投与に際して、特に血液循環系において、本発明のポリペプチドの半減期を延長する。
【００４６】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドおよび本発明の融合タンパク質をコードする、核酸分子に関する。
【００４７】
本発明では「核酸分子」という用語には、DNA、RNAおよびPNAが含まれる。本書で使用される場合、「RNA」という用語は、mRNA等のRNAの全ての形態を含むと理解される。「核酸分子」という用語は、本発明では「ポリヌクレオチド」という用語と区別しないで使われる。
【００４８】
本発明の核酸分子は、調節領域または他の非翻訳領域も含んでもよい。前記の核酸分子は、異種タンパク性物質をコードし、例えば本書において上述した融合タンパク質を生じる、異種核酸を含んでもよい。
【００４９】
本発明は、配列番号1のいずれかによって示され、本発明の第一の態様において本書の上記で規定した項目(b)に従う、ポリペプチドと、アミノ酸レベルで少なくとも85%の同一性（より好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%および最も好ましくは少なくとも98%の同一性）を有するポリペプチドをコードする、核酸分子を包含する。
【００５０】
また、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。
【００５１】
好ましくは、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージまたは、例えば遺伝子工学において慣用的に使用される別のベクターである。
【００５２】
本発明の核酸分子は、いくつかの市販のベクター中に挿入されてもよい。非制限的な例としては、pUC-シリーズ、pBluescript（ストラタジーン(Stratagene)）、発現ベクターのpET-シリーズ（ノバゲン(Novagen)）またはpCRTOPO（インビトロゲン(Invitrogen)）等の原核細胞プラスミドベクター、および、pREP（インビトロゲン）、pcDNA3（インビトロゲン）、pCEP4（インビトロゲン）、pMC1neo（ストラタジーン）、pXT1（ストラタジーン）、pSG5（ストラタジーン）、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、 pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、pLXIN、pSIR（クロンテック(Clontech)）、pIRES-EGFP（クロンテック）、pEAK-10（エッジ・バイオシステムズ(Edge Biosystems)）、 pTriEx-Hygro（ノバゲン）およびpCINeo（プロメガ(Promega)）等の、哺乳類細胞での発現に適合するベクターが挙げられる。植物発現ベクターは、pGEM-T（プロメガ）、pCAMBIA 1391（キャンビア(Cambia)）、GATEWAY (インビトロゲン)、pGreenおよびpGreenII（プグリーン(PGREEN)）を含む。ピキア・パストリスに好適なプラスミドベクターの例は、例えば、プラスミドpAO815、pPIC9KおよびpPIC3.5K（全てインビトロゲン）を含む。
【００５３】
上記で言及した核酸分子は、別のポリヌクレオチドとの翻訳融合が産生されるようなベクター中に挿入されてもよい。他のポリヌクレオチドは、例えば溶解性、半減期を増し、および／または融合タンパク質の精製を容易にし得るタンパク質をコードしてもよい。ベクターもまた、正確なタンパク質の折り畳みを容易にする1以上のシャペロンをコードする、さらなる発現可能なポリヌクレオチドを含有してもよい。ベクター修飾技術については、サムブルックおよびルセル(Sambrook and Russel) (2001年), loc. cit.を参照のこと。一般的に、ベクターは、クローニングまたは発現のための1以上の複製起点（ori）および遺伝系、例えば抗生物質耐性である、宿主における1以上の選択マーカー、および1以上の発現カセットを含有し得る。好適な複製起点（ori）としては、例えばCol E1、SV40ウイルス性およびM13複製起点が挙げられる。
【００５４】
ベクターに挿入されたコード配列は、例えば標準的な方法で合成されるか、天然物から単離され得る。コード配列の転写調節要素および／または他のアミノ酸コード配列への連結反応は、確立された方法を用いて実施され得る。原核生物または真核細胞における発現を確実にする転写調節要素（発現カセットの一部）は、当業者によく知られている。これらの要素は、転写開始を確実にする調節配列（例えば、自然結合または異種のプロモーターおよび／またはインシュレーター等の、翻訳開始コドン）、内部リボソーム侵入部位（IRES）（オウェンズ(Owens), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001年), 1471-1476頁）、および任意に、転写終結および転写産物の安定化を確実にするポリAシグナルを含む。さらなる調節要素としては、転写および翻訳エンハンサーが挙げられる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、原核生物または真核細胞における発現を可能にする、このような発現制御配列に操作的に連結される。ベクターは、さらなる調節要素として、分泌シグナルをコード化するヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。このような配列は、当業者によく知られている。さらに、使用される発現系によっては、発現されたポリヌクレオチドを細胞性コンパートメントに誘導することができるリーダー配列を、本発明のポリヌクレオチドのコード化配列に加えてもよい。このようなリーダー配列は当業界でよく知られている。
【００５５】
さらに、ベクターは選択可能なマーカーを含むことが好ましい。選択可能なマーカーの例としては、ネオマイシン、アンピシリン、およびハイグロマイシン、カナマイシン抵抗性等が挙げられる。特別に設計されたベクターにより、細菌−真菌細胞または細菌−動物細胞（例えばインビトロジェン(Invitrogen)より入手可能なゲートウェイ(Gateway(R))システム）等の、異なる宿主間のシャトリングが可能になる。
【００５６】
本発明による発現ベクターは、本発明のポリペプチドおよびコードされた酵素の、複製および発現を管理することができる。説明した調節要素を含む好適な発現ベクターは、当業界で知られている。
【００５７】
本書において上記で説明した核酸分子は、細胞への直接の導入、またはリポソーム、ファージベクターまたはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入用に設計されてもよい。さらに、バキュロウイルス系またはワクシニアウイルスまたはセムリキ森林熱ウイルスに基づく系が、本発明の核酸分子のための真核細胞発現系として使用され得る。
【００５８】
代表的な哺乳類発現ベクターは、mRNAの転写開始を仲介するプロモーター要素、タンパク質コード化配列、および転写の終結および転写物のポリアデニル化に要するシグナルを含む。さらに、複製起点、薬剤耐性遺伝子、調節遺伝子（誘導プロモーターの一部として）等の要素も含まれ得る。lacプロモーターは、原核細胞に有用な、代表的な誘導プロモーターであり、ラクトース・アナログであるイソプロピルチオール-b-D-ガラクトシド（「IPTG」）を使用して誘導され得る。組み換え発現および分泌には、興味のあるポリヌクレオチドを、例えば、ペリプラズム中の組み換えタンパク質を管理するPelBリーダーシグナルと、pHEN4と呼ばれるファージミド中のgene IIIとの間に結合してもよい（ガーロウディ(Ghahroudi)ら, 1997年, FEBS Letters 414:521-526頁に記載）。さらなる要素としては、エンハンサー、コザック配列、およびRNAスプライシングのためドナーおよびアクセプター部位を横に配置した介在配列が挙げられることもある。SV40由来の早期および後期プロモーター、レトロウイルス、例えば、RSV、HTLVI、HIVI由来の長末端反復（LTR）、およびサイトメガロウイルス（CMV）の早期プロモーターを用いて、効率の高い転写が達成され得る。しかし、細胞成分もまた使用し得る（例えば、ヒトアクチンプロモーター）。あるいは、組み換えポリペプチドが、染色体中に組み込まれる遺伝子構築物を含有する、安定な細胞系中に発現され得る。dhfr、gpt、ネオマイシン、ハイグロマイシン等の選択可能なマーカーとのコトランスフェクションにより、トランスフェクト細胞の特定および単離が可能になる。トランスフェクト核酸もまた、増幅されて、多量のコードポリペプチドを発現し得る。上記に示した通り、発現ベクターとしては、好ましくは、少なくとも1つの選択可能なマーカーが挙げられる。このようなマーカーとしては、真核細胞培養にはジヒドロ葉酸還元酵素、G418またはネオマイシン抵抗性、および大腸菌および他の細菌における培養にはテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピリシリン抵抗遺伝子が挙げられる。
【００５９】
さらなる態様では、本発明は、本発明の核酸分子または本発明のベクターを含む、宿主細胞に関する。
【００６０】
好ましい態様では、宿主細胞は、細胞培養物の一部であってもよい、単離細胞である。
【００６１】
好適な原核宿主細胞は、例えば、エシェリキア属、バシラス属、ストレプトマイセス属およびネズミチフス菌である細菌を含む。好適な真核宿主細胞は、例えば、真菌細胞、とりわけ、サッカロマイセス・セレヴィシエまたはピキア・パストゥス等の酵母菌、またはショウジョウバエS2およびヨトウガSf9細胞等の昆虫細胞、および植物細胞ならびに哺乳類細胞である。
【００６２】
使用され得る哺乳類宿主細胞としては、ヒトHela、HEK293、H9およびジャーカット細胞、マウスNIH3T3およびC127細胞、Cos 1、Cos 7およびCV1、ウズラQC1-3細胞、マウスL細胞およびチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞が挙げられる。
【００６３】
より好ましい態様では、前記の細胞は、初代細胞または初代細胞系である。初代細胞は、生物から直接得られる細胞である。好適な初代細胞は、例えば、マウス胎児線維芽細胞、マウス初代肝細胞、心筋細胞および神経細胞、ならびにマウス筋幹細胞（衛星細胞）およびそれらに由来する安定な不死化細胞系である。また、マウス胎児線維芽細胞（MEF）等の初代哺乳類細胞も、本発明の範囲内である。あるいは、組み換え（ポリ）ペプチドは、染色体に組み込まれた遺伝子構築物を含有する安定な細胞系において発現され得る。
【００６４】
上述の宿主細胞に適当な培地および条件は、当業界でよく知られている。
【００６５】
また、本発明は、薬学的活性化合物、診断的活性化合物および／または血中半減期を調節する成分に融合する、本発明のポリペプチドを含む、融合構築物に関する。
【００６６】
本書で使用される場合、「融合構築物」は、本発明のポリペプチドの化合物への融合物を規定する。この化合物は、薬学的活性化合物、診断的活性化合物および／または血中半減期を調節する成分よりなる群から選択してもよい。この化合物は、タンパク質化合物または非タンパク質化合物であってもよい。化合物がタンパク質化合物（例えば本書において以下で説明するサイトカインまたはケモカイン）である場合、融合構築物は、本書において上記で規定した融合タンパク質でもある。換言すれば、「融合構築物」という用語は、融合タンパク質を含む。化合物は、直接ポリペプチドに融合してもよく、またはリンカーを介してもよい。本発明によるリンカーは、好ましくは、1〜30の炭素原子を有するアルキル、1〜20のエチレン部分を有するポリエチレングリコール、1〜20の残基を有するポリアラニン、カプロン酸、置換または非置換ポリ-p-フェニレンおよびトリアゾールよりなる群から選択される。
【００６７】
さらに好ましい態様では、前記のリンカーは、アミノ-n-アルキル、メルカプト-n-アルキル、アミノ-n-アルキル-X-アルキル、メルカプト-n-アルキル-X-アルキルであって、XがO、S-SおよびSO2よりなる群から選択され、アルキル基が互いに独立して1〜30の炭素原子を有し、好ましくは3、6または12の炭素原子を有するもの；または1〜約10のエチレングリコール部分、好ましくはトリ-またはヘキサ-エチレングリコールを有する、オリゴエチレングリコールよりなる群から選択される。これらおよびさらなる好適なリンカーは当業界でよく知られており、市販されている（例えば、グレン・リサーチ(Glen Research), 22825デイヴィス・ドライブ(Davis Drive), スターリング、バージニア州, 20164米国、のカタログ参照）。リンカーのさらなる例は以下である：5'-アミノ-修飾物質（例えば、B.A.コンノリー（Connolly）およびP. ライダー(Rider), Nucleic Acids Res., 1985年, 13, 4485頁; B.S.スポロート(Sproat), B.S.ベイジャー(Beijer), P.ライダー（Rider）,およびP.ノイネル(Neuner), Nucleic Acids Res., 1987年, 15, 4837頁; R.ズッケルマン(Zuckerman), D.コレイ(Corey),およびP.シュルツ(Shultz), Nucleic Acids Res., 1987年, 15, 5305頁; P.リ(Li)ら, Nucleic Acids Res., 1987年, 15, 5275頁; G.B.ドレヤー(Dreyer)およびP.B.デルバン(Dervan), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985年, 82, 968頁参照）；5'-チオール-修飾物質C6（例えば、B.A.コンノリーおよびP.ライダー, Nucleic Acids Res., 1985年, 13, 4485頁; B.S.スポロート, B.S.ベイジャー, P.ライダー,およびP.ノイネル, Nucleic Acids Res., 1987年, 15, 4837頁; R.ズッケルマン, D.コレイ,およびP.シュルツ, Nucleic Acids Res., 1987年, 15, 5305頁; P.リら, Nucleic Acids Res., 1987年, 15, 5275頁参照）；5'-チオール修飾物質C6 S-Sおよび3'-末端でのチオール基（例えば、B.A.コンノリーおよびR.ライダー, Nucleic Acids Res., 1985年, 13, 4485頁; B.A.コンノリー, Nucleic Acids Res., 1987年, 15, 3131-3139頁; N.D.シンハ(Sinha)およびR.M.クック(Cook), Nucleic Acids Res., 1988年, 16, 2659頁; A.クマー(Kumar), S.アドヴァニ(Advani), H.ダワー(Dawar),およびG.P.タルワー(Talwar), Nucleic Acids Res., 1991年, 19, 4561頁; R.ズッケルマン, D.コレイ,およびP.シュルツ, Nucleic Acids Res., 1987年, 15, 5305頁; K.C.グプタ(Gupta), P.シャルマ(Sharma), S.サチャナラヤナ(Sathyanarayana),およびP.クマー(Kumar), Tetrahedron Lett., 1990年, 31, 2471-2474頁; U.アッセリン(Asseline), E.ボンフィルズ(Bonfils), R.クルフルスト(Kurfurst), M.シャシニョル(Chassignol), V.ロイグ(Roig),およびN.T.スオン(Thuong), Tetrahedron, 1992年, 48, 1233-1254頁; グレッグ・モリン(Gregg Morin), Geron Corporation, 個人的情報交換参照）；スペーサーC3、スペーサーC12、およびdスペーサー・ホスホラミダイト（例えば、M.ドゥラード(Durard), K.シェヴリエ(Chevrie), M.シャシニョル, N.T.スオン,およびJ.C.マウリゾート(Maurizot), Nucleic Acids Res., 1990年, 18, 6353頁; M.サルンケ(Salunkhe), T.F.ウ(Wu),およびR.L.レッツィンガー(Letsinger), J. Amer. Chem. Soc., 1992年, 114, 8768-8772頁; N.G.ドリンナヤ(Dolinnaya), M.ブルメンフェルド(Blumenfeld), I.N.メレンコワ(Merenkova), T.S.オレツカヤ(Oretskaya), N.F.クリネツカヤ(Krynetskaya), M.G.イワノフスカヤ(Ivanovskaya), M.ヴァッセウ(Vasseur),およびZ.A.シャバロワ(Shabarova), Nucleic Acids Res., 1993年, 21, 5403-5407頁; M.タケシタ(Takeshita), C.N.チャン(Chang), F.ジョンソン(Johnson), S.ウィル(Will),およびA.P.グロルマン(Grollman), J. Biol. Chem., 1987年, 262, 10171-10179頁; M.W.カルニク(Kalnik), C.N.チャン, A.P.グロルマン,およびD.J.パテル, Biochemistry, 1988年, 27, 924-931頁参照）；3'-アミノ-修飾物質C7 CPG（例えば、J.G.ゼンデグイ(Zendegui), K.M.ヴァスケス(Vasquez), J.H.ティンスレイ(Tinsley), D.J.ケッセラー(Kessler),およびM.E.ホーガン(Hogan), Nucleic Acids Res., 1992年, 20, 307頁参照）；3'-アミノ光解離性C6 CPG（例えば、D.J.ヨー(Yoo)およびM.M.グリーンバーグ(Greenberg), J. Org. Chem., 1995年, 60, 3358-3364頁; H.ヴェンカテサン(Venkatesan)およびM.M.グリーンバーグ, J. Org. Chem., 1996年, 61, 525-529頁; D.L.マックミン(McMinn)およびM.M.グリーンバーグ, Tetrahedron, 1996年, 52, 3827-3840頁参照）。
【００６８】
血中半減期を調節する成分は、好ましくはポリエチレングリコール（PEG）である。
【００６９】
本発明の好ましい態様では、薬学的活性化合物または診断的活性化合物が、以下よりなる群から選択される：
(a) 蛍光色素
(b) 光増感剤
(c) 放射性核種
(d) 医療用画像のための造影剤
(e) サイトカイン
(f) 毒性化合物
(g) ケモカイン
(h) 凝結促進因子
(i) プロドラッグ活性化酵素、または
(k) ACE阻害剤、レニン阻害剤、ADH阻害剤、アルドステロン阻害剤、またはアンジオテンシン受容体遮断薬。
【００７０】
蛍光色素は、好ましくは、アレクサフルオルまたはCy色素から選択される成分である。
【００７１】
光増感剤は、好ましくは、光毒性赤色蛍光タンパク質キラーレッドまたはヘマトポルフィリンである。
【００７２】
放射性核種は、好ましくは、γ放射性アイソトープ、より好ましくは99mTc、123I、111Inの群、および／または、ポジトロン放射体、より好ましくは18F、64Cu、68Ga、86Y、124Iの群、および／または、β放射体、より好ましくは131I、90Y、177Lu、67Cuの群、またはα放射体、好ましくは213Bi、211Atの群から選択される。
【００７３】
本書で使用される場合、造影剤は、医療用画像において体内の構造または体液のコントラストを強調するために使用される物質である。通常の造影剤は、X線減弱および磁気共鳴信号の増強に基づいて機能する。
【００７４】
サイトカインは、好ましくは、IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10、IL-15、IL-24、GM-CSF、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、LIF、CD80、B70、TNF-β、LT-β、CD-40リガンド、Fas-リガンド、TGF-β、IL-1αおよびIL-1βよりなる群から選択される。当業界でよく知られているように、サイトカインは、免疫系の炎症誘発反応または抗炎症反応に有利に働くことがある。従って、治療される疾患によって、炎症誘発性または抗炎症性サイトカインを有する融合構築物のいずれかが有利に働くことがある。例えば、炎症性疾患の治療には、一般に、抗炎症性サイトカインを含む融合構築物が好ましく、一方、癌の治療には、一般に、炎症誘発性サイトカインを含む融合構築物が好ましい。
【００７５】
毒性化合物は、好ましくは有機小分子またはポリペプチドであり、より好ましくは、カリケアミシン、マンタンシノイド、ネオカルチノスタチン、エスペラミシン、ダイネミシン、ケダルシジン、マデュロペプチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、アウリスタチン、リシン−Ａ鎖、モデシン、トランケートした緑膿菌外毒素Ａ、ジフテリア毒素および組み換えゲロニンよりなる群から選択される毒性化合物である。
【００７６】
ケモカインは、好ましくは、IL-8、GROα、GROβ、GROγ、ENA-78、LDGF-PBP、GCP-2、PF4、Mig、IP-10、SDF-1α/β、BUNZO/STRC33、I-TAC、BLC/BCA-1、MIP-1α、MIP-1β、MDC、TECK、TARC、RANTES、HCC-1、HCC-4、DC-CK1、MIP-3α、MIP-3β、MCP-1-5、エオタキシン、エオタキシン-2、I-309、MPIF-1、6Ckine、CTACK、MEC、リンホタクチンおよびフラクタルカインよりなる群から選択される。
【００７７】
凝血促進因子は、好ましくは組織因子である。
【００７８】
プロドラッグ活性化酵素は、好ましくは、カルボキシペプチダーゼ、グルクロニダーゼおよびグルコシダーゼよりなる群から選択される酵素である。
【００７９】
本発明は、さらに、本発明のポリペプチド、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸分子、本発明のベクター、本発明の宿主細胞または本発明の融合構築物を含む、医薬または診断用組成物に関する。
【００８０】
本書において上記した通り、キマーゼは、多くの疾患に関与する。従って、本発明のポリペプチド、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸分子、または本発明の融合構築物は、記載した核酸分子の標的化、または記載したポリペプチドの機能の阻害に有用である。
【００８１】
医薬組成物は、好ましくは、家畜および愛玩動物等の哺乳類に投与される（以下も参照）。最も好ましくは、ヒトに投与される。本書に記載される医薬組成物は、対象に適切な投与量が投与される。
【００８２】
本発明による使用のための医薬組成物は、1以上の生理的担体または賦形剤を用い、当業界で見られる方法による慣用法で処方し得るが、例えば、アンセル(Ansel)ら、「医薬投与形態および薬物送達システム(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)」、第7版、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンズ・パブリッシャーズ(Lippincott Williams & Wilkins Publishers)、1999年を参照のこと。従って、医薬組成物は、慣用の薬学的に許容される賦形剤を任意に含む投与単位製剤で、経口的に投与してもよく、または、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、経皮的、経粘膜的、硬膜下、局所的またはイオン導入による局所的、舌下、吸入噴霧、エアロゾルによって、または直腸的等の非経口的に投与してもよい。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、有効成分を単独で投与してもよく、または、例えば補助剤として併用して、または他の薬剤と組み合わせて投与してもよく、他の薬剤としては、例えば上記の疾患の治療または予防のための、例えば免疫抑制剤または免疫調節剤、または他の抗炎症剤が挙げられる。例えば、本発明の結合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、免疫抑制性モノクローナル抗体と組み合わせて使用してもよく、例えば、白血球受容体に親和性を有するモノクローナル抗体、例えばMHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD28、CD40、CD45、CD58、CD80、CD86またはそれらのリガンド；他の免疫調整化合物、例えばCTLA4またはその変異体の細胞外ドメインの少なくとも一部を有する組み換え結合分子、例えば非CTLA4タンパク質配列に結合する、CTLA4またはその変異体の少なくとも細胞外部分、例えばCTLA4Ig（例えばATCC 68629と表されたもの）またはその変異体、例えばLEA29Y；接着分子阻害剤、例えばLFA-I拮抗剤、ICAM-Iまたは-3拮抗剤、VCAM-4拮抗剤またはVLA-4拮抗剤と組み合わせて使用してもよい。加えて、本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質は、DMARD（疾患修飾性抗リウマチ薬）、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、メトトレキサート、D-ペニシラミン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、シクロスポリンA、タクロリムス、シロリムス、ミノサイクリン、レフルノミド、グルココルチコイド；カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンAまたはFK 506；リンパ球再循環のモジュレーター、例えばFTY720およびFTY720アナログ；mTOR阻害剤、例えばラパマイシン、40-O-(2-ヒドロキシエチル)-ラパマイシン、CCI779、ABT578、AP23573またはTAFA-93；免疫抑制性を有するアスコマイシン、例えばABT-281、ASM981等；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン(azathioprene)；メトトレキサート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；15-デオキシスペルグアリンまたは免疫抑制性ホモログ、そのアナログまたは誘導体；または化学療法剤、例えばパクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチナム、ドキソルビシンまたは5-フルオロウラシル；抗TNF剤、例えばTNFに対するモノクローナル抗体、例えばインフリキシマブ、アダリムマブ、CDP870、またはTNF-RIまたはTNF-RIIに対する受容体構築物、例えばエタネルセプト、PEG-TNF-RI；炎症性サイトカイン阻害剤、IL-1阻害剤、例えばアナキンラまたはIL-1トラップ、AAL160、ACZ885、IL-6阻害剤；プロテアーゼの阻害剤または活性化剤、例えばメタロプロテアーゼ、抗IL-15抗体、抗IL-6抗体、抗IL-23抗体、抗IL-22抗体、抗IL-21抗体、抗IL-12抗体、抗IFNγ抗体、抗IFNα抗体、抗CD20抗体、抗IL-17抗体、抗IgGE抗体、アスピリン等のNSAIDまたは抗感染症薬と組み合わせて使用してもよい。他の薬剤としては、ACE阻害剤、レニン阻害剤、ADH阻害剤、アルドステロン阻害剤、およびアンジオテンシン受容体遮断薬が挙げられる。当然ながら、この併用薬のリストは限定的ではなく、完全でもない。
【００８４】
一般論として、本発明の医薬組成物は、キマーゼ介在疾患またはキマーゼ介在臓器障害の治療または予防に使用される。
【００８５】
本発明の診断用組成物は、例えば種々の細胞、組織または別の好適なサンプル中の、望まない生理的キマーゼレベル、特に配列番号16のキマーゼの検出に有用であり、検出は、サンプルを、本発明のポリペプチド、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸分子、または本発明の融合構築物と接触させること、および、サンプル中のキマーゼの存在、特に配列番号16のキマーゼの存在を検出することを含む。従って、本発明の診断的組成物は、発病または疾患の状態を評価するために使用してもよい。本書において以下に規定する通り、特に臓器障害、炎症性疾患、心血管疾患または癌は、本発明のポリペプチド、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸分子、または本発明の融合構築物による標的とされ得る。本書において上記に記載された本発明の1つの様相では、本発明のポリペプチドは、蛍光色素、光増感剤、放射性核種、または医療用画像のための造影剤に結合する。このような融合構築物は、診断的適用に特に好適である。
【００８６】
本発明の診断用組成物は、単独の有効成分として投与されてもよく、または、診断用組成物が、例えば対象内で生理学的キマーゼレベルが望ましくない部位を特定するために使用される場合、他の薬剤と併用してもよい。一般論として、本発明の診断用組成物は、キマーゼ介在疾患またはキマーゼ介在臓器障害の診断に使用される。
【００８７】
本発明の診断用および医薬組成物の投与量は、勿論、特定の本発明のポリペプチド、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸分子、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、または本発明の融合構築物、個々の患者群または患者、さらなる医学的活性化合物の任意の存在、および治療している病状の性質および重篤度によって異なる。しかし、診断用または医薬組成物は、体重1 kg当たり約0.01 mg〜約20 mg、好ましくは体重1 kg当たり約0.1 mg〜約5 mgの投与量で使用されることが、現在のところ好ましい。好ましくは、診断用または医薬組成物の投与頻度は、毎日からおよそ3ヶ月毎に1回の範囲内であり、好ましくはおよそ2週間毎に1回からおよそ10週間毎に1回の範囲内、より好ましくは4〜8週間毎に１回の範囲内である。好ましい投薬計画としては、本発明の診断用または医薬組成物を月に1回から2〜3ヶ月毎に1回、またはより低頻度で投与することが挙げられる。
【００８８】
1つの態様では、本発明の医薬組成物は、臓器障害、炎症性疾患、心血管疾患または癌の治療に使用される。
【００８９】
本書において上記に詳しく述べたように、キマーゼは、臓器障害、炎症性疾患、心血管疾患および癌における役割が知られている。
【００９０】
好ましい態様では、炎症性疾患、心血管疾患または癌は、アレルギー、喘息、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性関節炎、潰瘍性大腸炎、糖尿病、クローン病、心筋症、心筋梗塞、左心室肥大、頻脈誘発心不全、不安定狭心症、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、皮膚炎、バルーンカテーテル傷害後の血管増殖、および子宮頸癌よりなる群から選択される。
【００９１】
別の好ましい態様では、臓器障害は、大動脈瘤、糖尿病性網膜症、線維症、潰瘍性大腸炎または別の炎症性疾患によって誘発される。
【００９２】
さらなる態様では、本発明は、キマーゼ（EC 3.4.21.39）に結合するポリペプチドの同定方法であって、以下の工程を含む、方法に関する：(a) 配列番号17のアミノ酸配列を有するFYNキナーゼSH3ドメインに由来する、突然変異体のライブラリーを構築する工程、(b) (a)で構築された突然変異体のライブラリーをキマーゼ（EC 3.4.21.39）と接触させる工程、および(c) キマーゼに結合する突然変異体を単離する工程。
【００９３】
本書で使用する場合、「突然変異体」は、配列番号17のポリペプチドと比較して、少なくとも1つの突然変異を有するポリペプチドを定義する。突然変異は、アミノ酸の付加、欠失および置換を含む、アミノ酸のあらゆる変化を規定する。突然変異は、突然変異体をコードする核酸分子中に導入されてもよい。突然変異体の産生方法は、当業界でよく知られており、例えば、ランダム変異導入技術および部位特異的変異導入技術が挙げられる。
【００９４】
この方法を実施することは、当業者の知識の範囲内である。詳細な実験ガイダンスは、例えば、グラブロフスキ(Grabulovski)ら、(2007年)、JBC、282、3196-3204頁および欧州特許EP 2054432号より知られている。この関連で、キマーゼはビオチン化キマーゼであること、および／または、工程(b)および(c)はELISA法を含むことが好ましい。
【００９５】
本発明の方法の好ましい態様では、工程(a)において、突然変異体のライブラリーは、配列番号17のアミノ配列を有するFYNキナーゼSH3ドメインの、srcループ内の少なくとも1つのアミノ酸またはsrcループの2つ隣のアミノ酸までに位置する少なくとも1つのアミノ酸の同時ランダム化、および、RTループ内の少なくとも1つのアミノ酸またはRTループの2つ隣のアミノ酸までに位置する少なくとも1つのアミノ酸のランダム置換、欠失または添加によって産生される。
【００９６】
本発明の方法の別の好ましい態様では、ライブラリーは少なくとも1 x 107の突然変異体を含む。
【００９７】
この点において、より好ましくはライブラリーが少なくとも1 x 108の突然変異体を含み、さらにより好ましくはライブラリーが少なくとも1 x 109の突然変異体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図1は、配列番号2〜15の配列アラインメントである。
【図２】図2は、本発明の表示されたFyn SH3由来のポリペプチドの、キマーゼに対する結合によるELISAシグナルを示す。関連性のないタンパク質であるウシ血清アルブミン（BSA）に対する結合では、ELISAシグナルは検出できなかった。
【図３−１】図3は、本発明の以下のFyn SH3由来のポリペプチドの、単量体のサイズ排除プロファイルを示す：A) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドF12（配列番号5）、B) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドG2.3（配列番号6）、C) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドE3（配列番号9）、D) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドB5（配列番号3）、E) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドD7（配列番号7）、E) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドE4（配列番号2）、F) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドH2（配列番号8）、G) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドA4（配列番号4）。
【図３−２】図3は、本発明の以下のFyn SH3由来のポリペプチドの、単量体のサイズ排除プロファイルを示す：A) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドF12（配列番号5）、B) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドG2.3（配列番号6）、C) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドE3（配列番号9）、D) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドB5（配列番号3）、E) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドD7（配列番号7）、E) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドE4（配列番号2）、F) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドH2（配列番号8）、G) 本発明のFyn SH3由来のポリペプチドA4（配列番号4）。
【図４】図4は、本発明のFyn SH3由来のポリペプチドA4（配列番号4）（マゼンダ）のキマーゼ（緑）との複合体を示す。本発明のFyn SH3由来のポリペプチドA4（配列番号4）は活性部位（*で示す）をブロックする。
【図５】図5は、A4−キマーゼ（緑／シアン）複合体およびE4−キマーゼ（配列番号2）（プラム／灰色）複合体を示す。キマーゼ−E4複合体は、キマーゼ−A4（配列番号4）複合体と全く同じ結合様式を示す。
【図６】図6は、キマーゼ−A4（配列番号4）の複合体を緑／シアンで、キマーゼ−B5（配列番号3）の複合体を黄色／サーモンで示す。キマーゼ−B5複合体は、キマーゼ−A4複合体と全く同じ結合様式を示す。
【実施例】
【００９９】
実施例により本発明を説明する。
【０１００】
実施例1：  本発明のFyn SH3由来のポリペプチドを含有する細菌溶解物上澄を使用したモノクローナルELISAによって測定された通り、本発明のFyn SH3由来のポリペプチドはキマーゼに結合する
【０１０１】
方法：
配列番号2〜15で示されるアミノ酸をコードするDNAを、C-末端にmycおよびヘキサヒスチジンタグを有する細胞質発現ベクターpQE-12にクローニングした。細菌電気穿孔後、Fyn SH3由来のポリペプチドを含有する細菌溶解物を、バーチンガー(Bertschinger)らの記載の通り産生させた（バーチンガーら, (2007年) Protein Eng Des Sel, 20(2), 57-68頁）。キマーゼは、パースピケース(Perspicase)らの記載の通り産生させた（パースピケースら, (2009年) J Biomol Screen, 14(4), 337-349頁）。タンパク質は、製造元の使用説明書に従って、EZ-リンクスルホ-NHS-SS-ビオチン（ペルビオ(Perbio)）を使用してビオチン化し、最終的にキマーゼ1分子当りビオチン3分子を含有させた。ELISA実験では、ビオチン化したキマーゼを、ストレプトアビジンでコートしたウェル（ストレプタウェルズ(StreptaWells)、ハイバインド(High Bind)、ロシュ(Roche)）に100 nMの濃度で添加し、PBS、2%ミルク（ラピライト(Rapilait)、ミグロス(Migros)、スイス）でブロッキングした後、対応するFyn SH3由来のポリペプチドを含有する細菌上澄40μlを、10μlの抗myc抗体（9E10、PBS、2%ミルク中の最終濃度10μg/ml）と共にウェルに添加した。1時間インキュベーションし、洗浄した後、抗マウスIgG HRP抗体複合体（シグマ(Sigma)）を用いて検出を行った。BMブルーPOD基質（ロシュ）を加えてペルオキシダーゼ活性を検出し、1M H2SO4を加えて反応を停止した。
【０１０２】
バインダーのDNA配列は、DNAシークエンシングによって検証した（ビッグダイ・ターミネーター(BigDye Terminator) v3.1 サイクル・シークエンシング・キット、ABI PRISM 3130 遺伝子分析器、アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)）。
【０１０３】
結果：
Fyn SH3由来キマーゼバインダーのアミノ酸配列は、配列表に付記した通りの、配列番号2〜15で示される。配列番号2〜15を記す：
【０１０４】
配列番号2 (E4)
GVTLFVALYDYNATRWTDLSFHKGEKFQILEFGPGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ
配列番号3 (B5)
GVTLFVALYDYNATRWTDLSFHKGEKFQILDGDSGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ
配列番号4 (A4)
GVTLFVALYDYQADRWTDLSFHKGEKFQILDASPPGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ
配列番号5 (F12)
GVTLFVALYDYRAERSTDLSFHKGEKFQILDMTVPNGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ
配列番号6 (G2.3)
GVTLFVALYDYNATRWTDLSFHKGEKFQILDWTTANGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ
配列番号7 (D7)
GVTLFVALYDYQADRWTDLSFHKGEKFQILSFHVGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ
配列番号8 (H2)
GVTLFVALYDYQADRWTDLSFHKGEKFQILRFDIGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ
配列番号9 (E3)
GVTLFVALYDYQADRWTDLSFHKGEKFQILNASGPGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ
配列番号10 (D2)
GVTLFVALYDYEAQTWHDLSFHKGEKFQILNSSEGEYWEARSLTTGETGLIPSNYVAPVDSIQ
配列番号11 (H11)
GVTLFVALYDYKAQRWTDLSFHKGEKFQILQAHQKTGDWWEARSLTTGETGLIPSNYVAPVDSIQ
配列番号12 (B10)
GVTLFVALYDYEALHWHQLSFHKGEKSQILNSSEGTYWEARSLTTGETGWIPSNYVAPGDSIQ
配列番号13 (E5)
GVTLFVALYDYKAQRWLDLSFHEGEKFQILSTDSGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ
配列番号14 (C5)
GVTLFVALYDYEAPTWLHLSFHKGEKFQILNSSEGPWWEARSLTTGETGFIPSNYVAPVDSIQ
配列番号15 (A8)
GVTLFVALYDYEAANWFQLSFHKGEKFQILNSSEGPLWEARSLTTGETGGIPSNYVAPVDSIQ
【０１０５】
実施例2：  本発明の精製Fyn SH3由来のポリペプチドは、ELISAで測定された通り、キマーゼに特異的に結合する
【０１０６】
方法：
Fyn SH3由来のポリペプチド（配列番号2〜9）を、グラブロフスキ(Grabulovski)ら（グラブロフスキら, (2007年) JBC, 282, 3196-3204頁）の記載の通り、発現および精製した。ビオチン化キマーゼまたは、関連性のない標的タンパク質としてビオチン化ウシ血清アルブミン（BSA）（シグマ(Sigma)；ビオチン化は、製造元の使用説明書に従い、EZリンクスルホ-NHS-SS-ビオチン（ペルビオ(Perbio)）を用いて実施した）を、ストレプトアビジンでコートしたウェル（ストレプタウェルズ(StreptaWells)、ハイバインド(High Bind)、ロシュ(Roche)）に100 nMの濃度で添加し、PBS、2%ミルク（ラピライト(Rapilait)、ミグロス(Migros)、スイス）でブロッキングした後、対応するFyn SH3由来のポリペプチド50μlを、50μlの抗myc抗体（9E10、PBS、2%ミルク中の最終濃度5μg/ml）と共にウェルに添加した。1時間インキュベーションし、洗浄した後、抗マウスIgG HRP抗体複合体（シグマ(Sigma)）を用いて検出を行った。BMブルーPOD基質（ロシュ）を加えてペルオキシダーゼ活性を検出し、1M H2SO4を加えて反応を停止した。
【０１０７】
結果：
図2は、キマーゼおよびBSAでコートされたウェルのELISAシグナルを示し、キマーゼに対する特異的結合を示唆する。
【０１０８】
実施例3：  本発明のFyn SH3由来のポリペプチドは単量体であり、サイズ排除クロマトグラフィーによる判定では凝集しない
【０１０９】
方法
実施例2に記載した通り、Fyn SH3由来のポリペプチド（配列番号2〜9）の精製後、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を、スーパーデックス75カラム（5/150）（GEヘルスケア(Healthcare)）を用いたAKTA FPLCシステムで実施した。
【０１１０】
結果
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）のプロファイルにより、全ての選択された構築物は、主に単一の単量体ピークとして溶出したことが実証された（図3参照）。
【０１１１】
実施例4：  本発明のFyn SH3由来のポリペプチドは、表面プラスモン共鳴実験によって測定された通り、キマーゼに高親和性で結合する
【０１１２】
方法：
選択されたFyn SH3由来のポリペプチド（配列番号2〜9）の親和性測定を、バイアコア(BIAcore)3000装置（バイアコア）を用いて実施した。ビオチン化キマーゼと単量体Fyn SH3由来のポリペプチドとの相互作用分析のため、ストレプトアビジンSAチップ（バイアコア）を、1331 RUビオチン化キマーゼで固定化した。ランニングバッファーは、PBS、0.005%ツイーン20であった。相互作用は、流速30μl／分で、種々の濃度のFyn SH3由来キマーゼ結合ポリペプチドを注入して測定した。相互作用の速度論的データ（個別のkon/koff）は全て、BIAエバリュエーション3.2RC1ソフトウェアを用いて評価した。
【０１１３】
結果：
結合特性をバイアコア(BIAcore)チップでのリアルタイム相互作用分析によって分析し、Fyn SH3由来のポリペプチドについて、以下の解離定数（KD）およびkoff値が明らかになった（表I）。
【０１１４】
【表１】
2014523234.tif 000003
【０１１５】
実施例5：  本発明のFyn SH3由来のポリペプチドは、キマーゼのプロテアーゼ活性を阻害する
【０１１６】
以下に記載するMR121ペプチドの蛍光分析は、MR121がトリプトファンと非蛍光性の規定状態の複合体を形成するという事実に基づく。溶液中では、ミリモル濃度のトリプトファン濃度でこの形成が起こる。本書では、基質のペプチドは、一方の末端をトリプトファンで、他方の末端をフルオロフォアMR121で標識される。プロテアーゼ活性の非存在下では、基質は元の状態のままであり、MR121の蛍光は、局所的高濃度のトリプトファンにより減弱する。基質がキマーゼにより解裂される場合、MR121の蛍光が記録され得る。従って、酵素反応に続いて、反応時間中に増加したMR121の蛍光を検出する、反応速度を測定し得る。反応速度の直線範囲の傾きを計算することによって、酵素活性の値が得られる。
【０１１７】
方法：
キマーゼ蛍光性基質の反応速度分析を、96穴マイクロタイタープレート（コスター(Costar)）において室温で三重に実施した。各ウェルには、100 μlの分析緩衝液（100 mM Hepes、pH 7.4；0.01%トリトンX-100、80μg/mlヘパリン）を1 nMキマーゼ、1μM非標識および100 mM MR121ペプチド（MR121-CAAPFW；ビオシンタン(Biosyntan GmbH)、ベルリン）と共に加えた。Fyn SH3由来のもの（配列番号2〜9）を分析緩衝液（100 mM Hepes、pH 7.4；0.01%トリトンX-100、80μg/mlヘパリン）で連続的に希釈し、上記で明記した反応液に添加した。酵素反応は、プレートリーダー（テカン・ウルトラ(Tecan Ultra)、テカン）において、612 nmの励起および670 nmの発光で20分間反応速度を測定し、反応時間中の、MR121蛍光の増加を検出した。反応速度の直線範囲の傾きを計算し、Fyn SH3由来のポリペプチドのIC50値を、曲線に適合させるための、4つのパラメータの式を用いて計算した。
【０１１８】
結果：
滴定したFyn SH3由来のポリペプチドは、容量反応曲線を示し、これは、これらのポリペプチドがキマーゼ活性の強力な阻害剤であることを実証する（表II参照）。
【０１１９】
【表２】
2014523234.tif 000004
【０１２０】
実施例6：  キマーゼおよび本発明のFyn SH3由来のポリペプチドの結晶構造により、本発明のFyn SH3由来のポリペプチドによるキマーゼの触媒部位の遮断が明らかになる
【０１２１】
3つの選択されたFyn SH3由来のポリペプチドである、B5（配列番号3）、A4（配列番号4）およびE4（配列番号2）を、キマーゼと共結晶化した。
【０１２２】
方法：
結晶化実験に先立ち、Fyn SH3由来のポリペプチド−キマーゼ複合体を15 mg/mlまで濃縮した。インデックス・スクリーン(INDEX screen)（ハンプトン・リサーチ(Hampton Research)）での結晶化のスクリーニングを、21℃で、蒸気拡散によるシッティング・ドロップまたはマイクロバッチ実験で実施した。開始後、1日以内に結晶が現れ、3日以内に最終的な大きさまで成長した。
【０１２３】
全例で、データはXDS（カブシュ(Kabsch) W., (2010年) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. (66) 125-132頁）で処理し、SADABS（ブルカー(Bruker)AXSより入手）で補正した。リファインメントを、CCP4スーツ（CCP4スーツ：タンパク質の結晶学のためのプログラム(programs for protein crystallography). (1994年) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., (50), 760-763頁）のRefmc5（ムルシュドフ(Murshudov) GN.ら, (1997年). Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., (53) 240-255頁）、またはBUSTER（ブリコーニ(Bricogne) G., (1993年) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. (49), 37-60頁, ロベルシ(Roversi) Pら, (2000年), Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., (56), 1316-23頁, ブランク(Blanc) E.ら, (2004年), Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. (60), 2210-2221頁）で実施し、モデル構築をCOOT（エムスレイ(Emsley) Pら, (2004年) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr., (60), 2126-2132頁）で行った。
【０１２４】
結果：
キマーゼに結合する、3つの異なるFyn SH3由来のポリペプチド（B5（配列番号3）、A4（配列番号4）およびE4（配列番号2））をキマーゼと共結晶化した。
【０１２５】
【表３】
2014523234.tif 000005
【０１２６】
表IV：キマーゼとFyn SH3由来のポリペプチドA4（配列番号4）との接触
【０１２７】
全ての<3.5Aの原子−原子の接触を表にする。いくつかの残基が交互立体配座(alternate coformation)を有する場合、重複(duplicate)が起こり得る。フィノマーの番号付けは、第一の電子密度においてよく見える第一の残基を2と番号付けする。キマーゼ配列は、1から順次番号付けし、触媒のセリンは182である。
【０１２８】
【表４】
2014523234.tif 000006
【０１２９】
A4のTrp16がキマーゼの主要な特異性ポケットに挿入することが明らかに見られ得るが、これは上述のように阻害される。
【０１３０】
【表６】
2014523234.tif 000007
【０１３１】
表VII：キマーゼとE4（配列番号2）との接触
【０１３２】
全ての<3.5Aの原子−原子の接触を表にする。いくつかの残基が交互立体配座(alternate coformation)を有する場合、重複(duplicate)が起こり得る。フィノマーの番号付けは、第一の電子密度においてよく見える第一の残基を2と番号付けする。キマーゼ配列は、1から順次番号付けし、触媒のセリンは182である（この構造中、最も近い接触は3.52Aである）。
【０１３３】
この構造中、接触の数が増加するのは、単に、より高い解像度で、側鎖に対してより多くの交互立体配座(alternate conformation)をアサインすることができたためであり、2回カウントする。
【０１３４】
【表７】
2014523234.tif 000008
【０１３５】
【表８】
2014523234.tif 000009
【０１３６】
表IX：キマーゼとB5（配列番号3）との接触
【０１３７】
全ての<3.5Aの原子−原子の接触を表にする。いくつかの残基が交互立体配座(alternate coformation)を有する場合、重複(duplicate)が起こり得る。フィノマーの番号付けは、第一の電子密度においてよく見える第一の残基を2となるように選択する。キマーゼ配列は、1から順次番号付けし、触媒のセリンは182である。
【０１３８】
この構造において、接触の数が増加するのは、一部はB5のTrp16が2つの交互立体配座(alternate conformation)をアサインしたためであり、また、一部はB5のArg15におけるわずかな違いのためである。
【０１３９】
【表９】
2014523234.tif 000010
【０１４０】
解決された構造から、Fyn SH3由来のポリペプチドとキマーゼとの間の相互作用の主要素が、Fyn SH3由来のポリペプチドの配列モチーフArg15-Trp16であることが分かるが、これらによりキマーゼの活性部位に強力に結合する。活性部位におけるこのような結合により、酵素の活性が阻害され、従って、酵素分析において定量された強力なIC50値（実施例5）が説明される。
【０１４１】
Fyn SH3由来のポリペプチドの、他の示されたアミノ酸により、キマーゼの24のループとのさらなる表面接触が生じる。
【０１４２】
6つの複合体構造は全て非常に類似している。Fyn SH3由来のポリペプチド−キマーゼ配向のわずかな差は、配列の差および結晶充填の両者によってもたらされ、おおよそ、キマーゼのS1ポケットにおけるTrp16の周囲の剛体回転である。Fyn SH3由来のポリペプチドの存在は、キマーゼの全体構造には小さな影響しかない。最も目立った変化は、わずかに結合に適合すると思われる、キマーゼの24のループに影響する。
【０１４３】
分解されたFyn SH3由来のポリペプチドは全て、典型的なSH3ドメインの折り畳みを採用する。
【図１】
2014523234.tif 000011
【図２】
2014523234.tif 000012
【図３−１】
2014523234.tif 000013
【図３−２】
2014523234.tif 000014
【図４】
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【図５】
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【図６】
2014523234.tif 000017
【配列表】
2014523234000001.app
【国際調査報告】
2014523234.tif 000018
2014523234.tif 000019
2014523234.tif 000020
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