(57)【要約】  本発明は、患者におけるガンの治療方法であって、治療上有効な量の（ａ）式Ａの化合物、またはその薬学上許容される塩（Ｒ１〜Ｒ４、ｐおよびｑは定義のとおり）、および（ｂ）ｅｒｂＢ−１、ｅｒｂＢ−２、もしくはｅｒｂＢ−３受容体またはそれらの組み合わせを阻害するｅｒｂＢ阻害剤の患者への投与を含んでなる方法に関する。本発明の方法は、既に開示されている治療法より有効な治療法であるという証拠を示す併用療法を見出し、当分野の必要性に取り組む。
2011519941.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるガンの治療方法であって、治療上有効な量の下記(a)および(b)の患者への投与を含んでなる、方法：
（ａ）式Ａの化合物：
【化１】
2011519941.tif 000024
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたは−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ５）２であり、
Ｒ３は、ＣｌまたはＦであり、
Ｒ４は、ＣｌまたはＦであり、
Ｒ５のそれぞれは、独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキルであるか、またはそれらが結合している窒素原子とともに、モルホリノ、ピペリジニル、またはピラジニル基を形成し、
ｎは、２、３、または４であり、
ｐは、０または１であり、
ｑは、０、１、または２である）
またはその薬学上許容される塩、
（ｂ）ｅｒｂＢ−１、ｅｒｂＢ−２、もしくはｅｒｂＢ−３受容体またはそれらの組み合わせを阻害するｅｒｂＢ阻害剤。
【請求項２】
ｑが０または１であり、Ｒ１がメチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式Ａの化合物が下記式Ｉの化合物：
【化２】
2011519941.tif 000025
またはその薬学上許容される塩により表されるものである、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ｅｒｂＢ阻害剤が下記式ＩＩの化合物：
【化３】
2011519941.tif 000026
またはその薬学上許容される塩である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｅｒｂ阻害剤が、式ＩＩの化合物のジトシル酸塩またはジトシル酸塩一水和物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｅｒｂＢ阻害剤が、下記式ＩＩＩの化合物：
【化４】
2011519941.tif 000027
またはその薬学上許容される塩である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｅｒｂＢ阻害剤が下記式ＩＶの化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【化５】
2011519941.tif 000028
【請求項８】
前記ｅｒｂＢ阻害剤がトラスツズマブである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｅｒｂＢ阻害剤がセツキシマブである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｅｒｂＢ阻害剤がモノクローナル抗ヒトｅｒｂＢ３抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ガンが、胃ガン、肺ガン、食道ガン、頭頸部ガン、皮膚ガン、表皮ガン、卵巣ガン、または乳ガンである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
乳ガンまたは頭頸部ガンに罹患した患者の治療方法であって、治療上有効な量の下記式Ｉの化合物：
【化６】
2011519941.tif 000029
またはその薬学上許容される塩の患者への投与を含んでなる、方法。
【請求項１３】
乳ガンに罹患した患者の治療方法である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
頭頸部ガンに罹患した患者の治療方法である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
薬学上許容される賦形剤が、式Ａの化合物もしくはその薬学上許容される塩、またはｅｒｂＢ阻害剤、またはその組み合わせに含まれる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の参照】
【０００１】
本出願に係る特許請求の範囲は、２００８年５月５日に提出した米国仮出願第６１／０５０３２２号に基づく優先権を享受する。
【発明の背景】
【０００２】
技術分野
本発明は、ＥｒｂＢ阻害剤と組み合わせた、ｃＭＥＴおよびＡＸＬを含むマルチキナーゼを標的とする阻害剤によるガンの治療方法に関する。
【０００３】
背景技術
一般的に、ガンは、細胞の分裂、分化、およびアポトーシス細胞死を制御する正常なプロセスの脱調節から生じる。アポトーシス（プログラム細胞死）は、胚発生ならびに神経変性疾患、心血管疾患、およびガンなどの種々の疾患の病因において最も重要な役割を果たしている。最も広く研究されている経路の一つは、アポトーシスのキナーゼ調節を含むものだが、細胞表面での成長因子受容体から核への細胞情報伝達であり(Crews and Erikson, Cell, 74:215-17, 1993)、特にｅｒｂＢファミリーの成長因子受容体からの細胞情報伝達である。
【０００４】
ｅｒｂＢ−１（ＥＧＦＲまたはＨＥＲ１としても知られる）およびｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２としても知られる）は、ｅｒｂＢファミリーのプロテインチロシンキナーゼ膜貫通型成長因子受容体である。プロテインチロシンキナーゼは、細胞の成長および分化の調節に関わる種々のタンパク質の特定のチロシン残基のリン酸化を触媒する(A.F. Wilks, Progress in Growth Factor Research, 1990, 2, 97-111、 S.A. Courtneidge, Dev. Supp.1, 1993, 57-64、J.A. Cooper, Semin. Cell Biol., 1994, 5(6), 377-387、 R.F. Paulson, Semin. Immunol., 1995, 7(4), 267-277、 A.C. Chan, Curr. Opin. Immunol., 1996, 8(3), 394-401)。
【０００５】
ｅｒｂＢ−３（Ｈｅｒ３としても知られる）は、リガンド結合ドメインを有するが、固有のチロシンキナーゼ活性を持たないｅｒｂＢファミリーの成長因子受容体である。ＨＥＲ３は、その細胞外リガンド（例えばヘレグリン（ＨＲＧ））の一つにより活性化され、次いで二量化の基質に、次いでＨＥＲ１、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ４によるリン酸化の基質になる。有糸分裂促進効果または形質転換効果の細胞情報伝達経路の活性化につながるのは、このリン酸化されたＨＥＲ３である。
【０００６】
これらの受容体チロシンキナーゼは、上皮組織、間葉組織、および神経組織に広く発現し、そこで細胞増殖、生存、および分化の調節に役割を果たしている(Sibilia and Wagner, Science, 269: 234 (1995)、 Threadgill et al., Science, 269: 230 (1995))。野生型ｅｒｂＢ−２もしくはｅｒｂＢ−１の発現増加または構成的活性化された受容体変異体の発現はインビトロで細胞を形質転換する(Di Fiore et al., 1987、 DiMarco et al., Oncogene, 4: 831 (1989)、 Hudziak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84:7159 (1987)、 Qian et al., Oncogene, 10:211 (1995))。ｅｒｂＢ−１またはｅｒｂＢ−２の発現増加は、乳ガンの一部および他の種々の悪性腫瘍における臨床成績の低さと相関づけられている(Slamon et al., Science, 235: 177 (1987)、 Slamon et al., Science, 244:707 (1989)、 Bacus et al., Am. J. Clin. Path, 102:S13 (1994))。ＨＲＧおよび／またはＨＥＲ３の過剰発現が、胃ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、および乳ガンを含む多くのガンで報告されており、予後不良に関連づけられている(B.Tanner,J Clin Oncol. 2006, 24(26):4317-23、 M. Hayashi, Clin. Cancer Res. 2008.14(23):7843-9.、 H. Kaya, Eur J Gynaecol Oncol. 2008; 29(4): 350-6;)。
【０００７】
ｅｒｂＢを標的とする様式には、モノクローナル抗ｅｒｂＢ−２抗体トラスツズマブ、抗ｅｒｂＢ−１抗体セツキシマブ、モノクローナル抗ヒトｅｒｂＢ３抗体ｍａｂ３４８１（ミネソタ州ミネアポリスR&D Systemsから市販）などの抗ｅｒｂＢ３抗体、ならびに小分子チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、例えばｅｒｂＢ−１／ｅｒｂＢ−２選択的阻害剤ラパチニブ(lapatinib)、ｅｒｂＢ−１選択的阻害剤ゲフィチニブ(gefitinib)およびエルロチニブ(erlotinib)がある。それでもやはり、これらの薬剤は単剤として示す活性が限られている(Moasser, British J. Cancer 97:453, 2007)。したがって、種々のガンの治療のためにｅｒｂＢ阻害の効率を上げる治療を見出すことにより、腫瘍学の分野において好都合となる。
【発明の概要】
【０００８】
一つの態様において、本発明は、患者におけるガンの治療方法であって、治療上有効な量の下記(a)および(b)の患者への投与を含んでなる、方法：
（ａ）式Ａの化合物：
【化１】
2011519941.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたは−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ５）２であり、
Ｒ３は、ＣｌまたはＦであり、
Ｒ４は、ＣｌまたはＦであり、
Ｒ５のそれぞれは、独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキルであるか、またはそれらが結合している窒素原子とともに、モルホリノ、ピペリジニル、またはピラジニル基を形成し、
ｎは、２、３、または４であり、
ｐは、０または１であり、
ｑは、０、１、または２である）
またはその薬学上許容される塩、および
（ｂ）ｅｒｂＢ−１、ｅｒｂＢ−２、もしくはｅｒｂ−３受容体またはそれらの組み合わせを阻害するｅｒｂＢ阻害剤。
【０００９】
本発明の方法は、既に開示されている治療法と比較して、有効な治療法である証拠を示す併用療法を見出し、当分野の必要性に取り組むものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＨＧＦ存在下でのＯＥ−３３（ｃＭＥＴ＋およびＨＥＲ２＋）およびＮＣＩ−Ｈ１５７３（ｃＭＥＴ＋およびＨＥＲ１＋）細胞におけるラパチニブ、化合物Ｉ単独、および１：１モル比でのラパチニブと化合物Ｉとの組み合わせによる細胞成長阻害の用量反応曲線を示す。
【図２】図２（左図）は、Ｎ８７  ＨＥＲ２＋およびｃＭＥＴ過剰発現腫瘍系におけるラパチニブおよび１：１モル比でのラパチニブと化合物Ｉとの組み合わせの活性に対するＨＧＦの影響を示す。図２（右図）は、ウェスタンブロット分析により測定される、ＨＧＦ存在下および非存在下でのラパチニブおよび化合物Ｉの処理によるｃＭＥＴ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＡＫＴ、およびＥＲＫのリン酸化の阻害を示す。
【図３】図３は、ＨＧＦ存在下でのＢＴ４７４（ラパチニブおよびトラスツズマブに感受性あり）およびＢＴ４７４−Ｊ４（ラパチニブおよびトラスツズマブに耐性あり）両細胞における、ラパチニブ、化合物Ｉ単独、および１：１モル比でのラパチニブと化合物Ｉとの組み合わせによる細胞成長阻害を示す。
【図４】図４は、ＨＧＦ存在下でのＢＴ−４７４およびＢＴ−４７４−Ｊ４両細胞における、ラパチニブ、化合物Ｉ単独、および１：１モル比でのラパチニブと化合物Ｉとの組み合わせによるアポトーシス誘導（ＤＮＡ断片化およびカスパーゼ３／７活性化）を示す。
【図５】図５は、ＨＧＦの存在下でのＢＴ４７４−Ｊ４細胞における種々の濃度での化合物Ｉとラパチニブとの組み合わせによる細胞成長阻害およびアポトーシス誘導を示す。
【図６】図６は、ＢＴ４７４−Ｊ４細胞における、１）ラパチニブ単独によるＨＥＲ２リン酸化（ｐＨＥＲ２）の阻害、２）化合物Ｉ単独によるＡＸＬリン酸化（ｐＡＸＬ）の阻害、および３）化合物Ｉとラパチニブとの組み合わせを使用したｐＨＥＲ２およびｐＡＸＬの阻害ならびにＡＫＴのリン酸化（ｐＡＫＴ）、ＥＲＫ１／２のリン酸化（ｐＥＲＫ１／２）、およびサイクリンＤ１の減少を示す。
【図７】図７は、ＨＧＦ存在下でＢＴ４７４およびＢＴ４７４−Ｊ４両細胞における化合物処理の５日後の、トラスツズマブ、化合物Ｉ単独、および１：１５のモル比でのトラスツズマブと化合物Ｉとの組み合わせによる細胞成長阻害を示す。
【図８】図８は、ＨＧＦ存在下でのＮＣＩ−Ｈ１６４８（ｃＭＥＴ＋）およびＮＣＩ−Ｈ１５７３（ｃＭＥＴ＋およびＨＥＲ１＋）肺腫瘍細胞中の、エルロチニブ、化合物Ｉ単独、および１：１のモル比でのエルロチニブと化合物Ｉとの組み合わせによる細胞成長阻害の用量反応曲線を示す。
【図９】図９（左図、細胞成長阻害と表示）は、ＨＲＧ存在下および非存在下でのＭＫＮ４５（ｃＭＥＴ＋およびＨＥＲ３過剰発現）腫瘍細胞中の、ラパチニブ、化合物Ｉ単独、および１：１のモル比でのラパチニブと化合物Ｉとの組み合わせによる細胞成長阻害の用量反応曲線を示す。図９（右図、ウェスタンブロット分析と表示）は、ウェスタンブロット分析により測定された、ＨＲＧ存在下および非存在下でのラパチニブおよび化合物Ｉの処理による、ｃＭＥＴ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＡＫＴ、およびＥＲＫのリン酸化の阻害も示す。
【発明の具体的説明】
【００１１】
一つの態様において、本発明は、有効量の式Ａの化合物およびｅｒｂＢ阻害剤を使用するガンの治療に関するが、式Ａの化合物は、下記式：
【化２】
2011519941.tif 000004
またはその薬学上許容される塩により表され、
上記式において
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたは−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ５）２であり、
Ｒ３は、ＣｌまたはＦであり、
Ｒ４は、ＣｌまたはＦであり、
Ｒ５のそれぞれは、独立して、Ｃ１−Ｃ６アルキルであるか、またはそれらが結合している窒素原子とともに、モルホリノ、ピペリジニル、またはピラジニル基を形成し、
ｎは、２、３、または４であり、
ｐは、０または１であり、
ｑは、０、１、または２である。
【００１２】
他の態様において、ｎは３である。
【００１３】
他の態様において、ｐは１である。
【００１４】
他の態様において、ｑは０または１である。
【００１５】
他の態様において、式Ａの化合物は、以下の構造式：
【化３】
2011519941.tif 000005
またはその薬学上許容される塩により表される。
【００１６】
他の態様において、Ｒ１はメチルである。
【００１７】
他の態様において、Ｒ３およびＲ４はそれぞれＦである。
【００１８】
他の態様において、−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｒ５）２は以下のとおりである：
【化４】
2011519941.tif 000006
【００１９】
他の態様において、式Ａの化合物は、以下の構造により示される式Ｉの化合物（化合物Ｉ）またはその薬学上許容される塩である：
【化５】
2011519941.tif 000007
【００２０】
他の態様において、前記ｅｒｂＢ阻害剤は、下記式ＩＩの化合物またはその薬学上許容される塩である：
【化６】
2011519941.tif 000008
【００２１】
他の態様において、前記ｅｒｂ阻害剤は、式ＩＩの化合物のジトシル酸塩(ditosylate salt)またはジトシル酸塩一水和物(ditosylate monohydrate salt)である。
【００２２】
他の態様において、前記ｅｒｂＢ阻害剤は、下記式ＩＩＩの化合物またはその薬学上許容される塩である：
【化７】
2011519941.tif 000009
【００２３】
他の態様において、ｅｒｂＢ阻害剤はトラスツズマブ(trastuzumab)（ハーセプチン（Herceptin）という名称で販売）である。
【００２４】
他の態様において、ｅｒｂＢ阻害剤はセツキシマブ(cetuximab)（アービタックス（Erbitux）という名称で販売）である。
【００２５】
他の態様において、ｅｒｂＢ阻害剤はモノクローナル抗ヒトｅｒｂＢ３抗体である。
【００２６】
他の態様において、ｅｒｂＢ阻害剤はゲフィチニブ（イレッサ（Iressa）という名称で販売）である。
【００２７】
他の態様において、前記ガンは、胃ガン、肺ガン、食道ガン、頭頸部ガン、皮膚ガン、表皮ガン、卵巣ガン、または乳ガンである。
【００２８】
本発明の他の態様において、乳ガンまたは頭頸部ガンに罹患した患者の治療方法であって、前記患者への治療上有効な量の式Ｉの化合物またはその薬学上許容される塩の投与を含んでなる方法が提供される。
【００２９】
本発明の他の態様において、乳ガンまたは頭頸部ガンに罹患した患者の治療方法であって、前記患者への治療上有効な量の式Ｉの化合物またはその薬学上許容される塩の投与を含んでなる方法が提供される。
【００３０】
他の態様において、薬学上許容される賦形剤が、式Ａの化合物もしくはその薬学上許容される塩、またはｅｒｂＢ阻害剤、またはその組み合わせに含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される「有効な量」という用語は、組織、系、動物、またはヒトの所望の生物的または医学的応答を惹起するであろう薬剤または医薬品の量を意味する。さらに、「治療上有効な量」という用語は、そのような量を受け入れなかった対応の被験者に比べ、疾患、障害、もしくは副作用の向上した治療、治癒、予防、もしくは回復または疾患または障害の進行速度の低下をもたらす量を意味する。この用語は、その範囲の中に、正常な生理機能を高めるのに有効な量も含む。複数の化合物を、連続に、実質的に同時に投与できることが理解できよう。
【００３２】
本発明の方法は、経口または非経口を含む任意の好適な手段により投与できる。経口投与用に適合された医薬製剤は、カプセルもしくは錠剤などの個別の単位、粉体もしくは顆粒、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液または水中油型液体エマルションとして呈することができる。経口投与は、当分野に公知なものなど薬学上許容される賦形剤を含んでよい。
【００３３】
非経口投与、特に静脈内投与用に適合された医薬製剤には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および意図される受容者の血液と組成物を等張にする溶質を含むことのある水性および非水性滅菌注射液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含むことのある水性および非水性滅菌懸濁液がある。製剤は、例えば密封したアンプルおよびバイアルなどの最小投薬単位容器または多用量容器に呈することができ、使用の直前に例えば注射用水などの滅菌液体担体を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵してもよい。即席の注射液および懸濁液を、滅菌パウダー、顆粒、および錠剤から調製してもよい。
【００３４】
本明細書で使用される「ｅｒｂＢ阻害剤」は、ｅｒｂＢ−１、もしくはｅｒｂＢ−２、もしくはｅｒｂＢ−３、またはその組み合わせを阻害する化合物、モノクローナル抗体、免疫複合体、またはワクチンを意味する。
【００３５】
本発明は、化合物ならびにその薬学上許容される塩を含む。「化合物またはその薬学上許容される塩」という場合の「または」という言葉は、化合物もしくはその薬学上許容される塩（二者択一）または化合物およびその薬学上許容される塩（組み合わせ）を意味すると理解される。
【００３６】
本明細書で使用される「患者」は、ガンに罹患している哺乳動物、特にヒトである。
【００３７】
本明細書で使用される「薬学上許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、または他の問題もしくは合併症がなく、ヒトおよび動物の組織との接触に使用するのに好適な化合物、物質、組成物、および剤形を意味する。当業者は、本明細書の本発明の方法の化合物の薬学上許容される塩が調製できることを認識するであろう。このような薬学上許容される塩は、化合物の最終的な単離および精製の間にインサイチュで調製してよいが、それとは別に遊離の酸または遊離の塩基形態の精製された化合物をそれぞれ好適な塩基または酸と反応させて調製してもよい。
【００３８】
一般的に、式Ａの化合物およびｅｒｂＢ阻害剤の投薬量は、有効でありかつ許容される量である。好ましくは、式Ａの化合物、より詳細には化合物Ｉの量は、約１ｍｇから１０００ｍｇ／日の範囲であり、ｅｒｂＢ阻害剤の量は、好ましくは約１μｇから２０００ｍｇ／日の範囲である。
【００３９】
化合物Ｉ（Ｎ１−｛３−フルオロ−４−［（６−（メチルオキシ）−７−｛［３−（４−モルホリニル）プロピル］オキシ｝−４−キノリニル）オキシ］フェニル｝−Ｎ１−（４−フルオロフェニル）−１，１−シクロプロパンジカルボキサミド）は、２００５年４月７日に公開された国際公開第２００５／０３０１４０号に記載のとおり製造できる。実施例２５（１９３ページ）、３６（２０２−２０３ページ）、４２（２０９ページ）、４３（２０９ページ）、および４４（２０９−２１０ページ）は化合物Ｉの調製方法を記載している。式Ａの化合物も同様に調製できる。化合物Ｉの一般的な調製をスキーム１に概説する。
【００４０】
スキーム１
【化８】
2011519941.tif 000010
【００４１】
ｅｒｂＢ阻害剤の例には、ラパチニブ、エルロチニブ、およびゲフィチニブがある。ラパチニブ、Ｎ−（３−クロロ−４−｛［（３−フルオロフェニル）メチル］オキシ｝フェニル）−６−［５−（｛［２−（メチルスルホニル）エチル］アミノ｝メチル）−２−フラニル］−４−キナゾリンアミン（示されるとおり、下記式ＩＩにより表される）は、カペシタビンと組み合わせてＨＥＲ２陽性転移性乳ガンの治療に認可されている、強力な経口用の小分子で、ｅｒｂＢ−１およびｅｒｂＢ−２（ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２）チロシンキナーゼの二重阻害剤である。
【００４２】
【化９】
2011519941.tif 000011
【００４３】
式（ＩＩ）の化合物の遊離塩基、ＨＣｌ塩、およびジトシル酸塩は、１９９９年７月１５日に公開された国際公開第９９／３５１４６号、および２００２年１月１０日に公開された国際公開第０２／０２５５２号に開示されている手順に従い調製できる。化合物ＩＩのジトシル酸塩を調製するための一般的なスキームはスキーム２に示されている。
【００４４】
スキーム２
【化１０】
2011519941.tif 000012
【００４５】
スキーム２において、式（Ｉ）の化合物のジトシル酸塩の調製は、４工程で進行する：工程１：示される二環式化合物とアミンとの反応で、示されるインドキナゾリン誘導体を与える、工程２：対応するアルデヒド塩の調製、工程３：キナゾリンジトシル酸塩の調製、および工程４：ジトシル酸塩一水和物の調製。
【００４６】
エルロチニブ、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス｛［２−（メチルオキシ）エチル］オキシ｝−４−キナゾリンアミン（商標タルセバで市販）は、示されるとおり、下記式ＩＩＩにより表される。
【化１１】
2011519941.tif 000013
【００４７】
エルロチニブの遊離塩基およびＨＣｌ塩は、例えば米国特許第５，７４７，４９８号、実施例２０に従い調製できる。
【００４８】
ゲフィチニブ、４−キナゾリンアミン，Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−［３−４−モルホリノ）プロポキシ］は、示されるとおり、下記式ＩＶにより表される。
【００４９】
【化１２】
2011519941.tif 000014
【００５０】
ゲフィチニブは、イレッサという商標で市販されているが（アストラゼネカ）、白金系およびドセタキセル化学療法の両方が奏功しなかった後の、局所進行性または転移性の非小細胞肺ガンの患者の治療に単剤療法として指示されるｅｒｂＢ−１阻害剤である。ゲフィチニブの遊離塩基、塩酸塩、および二塩酸塩は、１９９６年４月２３日に出願され、１９９６年１０月３１日に国際公開第９６／３３９８０号として公開された国際出願第ＧＢ９６／００９６１号の手順に従い調製できる。
【実施例】
【００５１】
方法
細胞系および培養
ヒト乳ガン細胞系、ＢＴ４７４、ＨＣＣ１９５４、およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８、頭頸部扁平上皮ガン系、ＳＣＣ１５、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２、およびＳＣＣ１２、胃ガン細胞系、ＳＮＵ−５、ＨＳ７４６Ｔ、ＡＧＳ、ＳＮＵ−１６、およびＮ８７、肺ガン細胞系、ＮＣＩ−Ｈ１９９３、ＮＣＩ−Ｈ１５７３、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ２３４２、ＮＣＩ−Ｈ１６４８、ＨＯＰ−９２、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、およびＡ５４９、表皮ガン細胞系、Ａ４３１、ならびに結腸ガン細胞系、ＨＴ２９、ＳＷ４８、およびＫＭ１２は、アメリカン・タイプ・カルチャ−・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入した。食道ガン細胞系ＯＥ３３は、ヨ−ロピアン・コレクション・オブ・セル・カルチャーズ（ＥＣＡＣＣ）（英国）から購入した。乳ガン細胞系ＪＩＭＴ−１および胃ガン細胞系ＭＫＮ−４５は、Deutsche Sammlung von MiKroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイツ国）から購入した。ヒト乳ガン細胞系、ＫＰＬ−４は、Ｊ  Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉ教授のご厚意により譲り受けた（川崎医科大学、倉敷、日本）。ＬＬ１−ＢＴ４７４−Ｊ４（ＢＴ４７４−Ｊ４）乳ガン細胞クローンは、３μＭまでの上昇する濃度のラパチニブに曝露させたＢＴ４７４（ＨＥＲ２＋乳ガン細胞、ラパチニブに対して高感受性）の単細胞クローニングにより開発した。ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＮ５頭頸部ガン細胞系（ＨＮ５）は、英国サリーのインスティチュート・オブ・キャンサー・リサーチから贈られた。ＨＮ５Ｃｌ２は、上昇する濃度のラパチニブへの曝露の後ＨＮ５の単細胞クローニングにより開発した。
【００５２】
ＢＴ４７４、ＨＣＣ１９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＳＣＣ１５、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２、ＳＣＣ１２、ＳＮＵ−５、ＨＳ７４６Ｔ、ＡＧＳ、ＮＣＩ−Ｎ８７、Ａ−４３１、ＮＣＩ−Ｈ１９９３、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＨＯＰ−９２、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、Ａ５４９、ＪＩＭＴ−１、ＭＫＮ−４５、ＯＥ−３３、ＳＮＵ−１６、ＳＷ４８、ＫＭ１２、およびＨＴ２９系を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中で、３７℃で９５％空気５％ＣＯ２の加湿されたインキュベーター中で培養した。ＮＣＩ−Ｈ１５７３およびＮＣＩ−Ｈ１６４８の両方は、５０：５０のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２、インスリントランスフェリンセレニウムＸサプリメント、５０ｎＭヒドロコルチゾン、１ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、０．０１ｍＭのエタノールアミン、０．０１ｍＭのホスホリルエタノールアミン、１００ｐＭのトリヨードチロニン、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍＬ）、２Ｌ−グルタミン、０．５ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＡＣＬ−４無血清培地で培養した。ＮＣＩ−Ｈ２３４２は、０．００５ｍｇ／ｍＬのインスリン、０．０１ｍｇ／ｍＬのトランスフェリン、３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム（最終濃度）、１０ｎＭのヒドロコルチゾン（最終濃度）、１０ｎＭのβエストラジオール（最終濃度）、１０ｎＭのＨＥＰＥＳ（最終濃度）、追加の２ｍＭのＬ−グルタミン（最終濃度４．５ｍＭにするため）、および５％ウシ胎児血清（最終濃度）を含む、ＡＴＣＣ処方ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（カタログ番号、３０−２００６）で培養した。ＢＴ４７４−Ｊ４は、１０％ＦＢＳおよび１μＭラパチニブを含むＲＰＭＩ  １６４０で培養した。ＫＰＬ−４およびＨＮ５は、５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した。ＨＮ５  Ｃｌ２は、５％ＦＢＳおよび１μＭのラパチニブを含むＤＭＥＭで培養した。
【００５３】
細胞成長阻害アッセイおよびデータ分析
細胞成長阻害は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存率アッセイにより測定した。細胞を、以下の播種密度で、細胞成長速度によって１０００または２０００細胞／ウェルで、１０％ＦＢＳを含むそれぞれの培地で９６ウェル組織培養プレートに播種した。ＢＴ４７４−Ｊ４およびＨＮ５Ｃｌ２は、ＰＢＳで洗浄し、それぞれの培地にラパチニブなしに播種した。播種のおよそ２４時間後、細胞を化合物に曝露させた。すなわち、１０種の２倍ずつ変わる連続希釈率（最終化合物濃度、１０、５、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、０．１６、０．０８、０．０４、０．０２μＭの範囲）の化合物または１：１の一定のモル対モル比もしくは示されたとおりの２種の薬剤の組み合わせにより細胞を処理した。細胞を、５％または１０％のＦＢＳを含む培地中で、ｃＭＥＴ活性化のリガンドである２ｎｇ／ｍＬのＨＧＦの存在下または非存在下で、３日間または示されるとおり、化合物とともにインキュベートした。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ (Promega)を加え、２０分間インキュベートし、次いで、発光シグナルをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートを使用し積分時間０．５秒で測定し、ＡＴＰレベルを測定した。細胞成長は、ビヒクル（ＤＭＳＯ）処理対照ウェルと比較して計算した。対照細胞成長の５０％を阻害する化合物の濃度（ＩＣ５０）を、以下の４パラメータカーブフィッティング式を利用して外挿した：
ｙ＝（Ａ＋（Ｂ−Ａ）／（１＋１０（ｘ−ｃ）ｄ）
上記式において、Ａは最小応答（ｙｍｉｎ）であり、Ｂは最大応答（ｙｍａｘ）であり、ｃは、曲線の変曲点（ＥＣ５０）であり、ｄはヒル係数であり、ｘはｌｏｇ１０化合物濃度（モル／Ｌ）である。
【００５４】
併用効果は、併用指数（ＣＩ）値およびエクセス・オーバー・ハイエスト・シングル・エージェント（Excess Over Highest Single Agent）（ＥＯＨＳＡ）統計分析により評価した。
【００５５】
ＣＩ値は、外挿されたＩＣ５０値ならびにChouおよびTalalayにより誘導された相互非排他的な式により計算した：
ＣＩ＝Ｄａ／ＩＣ５０（ａ）＋Ｄｂ／ＩＣ５０（ｂ）＋（Ｄａ×Ｄｂ）／（ＩＣ５０（ａ）×ＩＣ５０（ｂ））
上記式において、ＩＣ５０（ａ）は阻害剤ＡのＩＣ５０であり、ＩＣ５０（ｂ）は阻害剤ＢのＩＣ５０であり、Ｄａは細胞成長の５０％を阻害する阻害剤Ｂと組み合わせた阻害剤Ａの濃度であり、Ｄｂは細胞成長の５０％を阻害する阻害剤Ａと組み合わせた阻害剤Ｂの濃度である。一般的に、０．９から１．１０のＣＩ値は、２種の薬剤の併用の相加作用を示している。０．９未満のＣＩは相乗作用を示し（数が小さいほどより強い相乗作用を示す）、１．１０を超えるＣＩは拮抗作用を示す。
【００５６】
エクセス・オーバー・ハイエスト・シングル・エージェント（ＥＯＨＳＡ）は、成分の単独療法に比べた併用における統計的に有意な向上として定義されている。例えば、化合物ＡおよびＢがそれぞれ濃度ｑおよびｒで組み合わされる場合、組み合わせＡｑ＋Ｂｒの平均応答はＡｑまたはＢｒのみの平均応答より著しく良いであろう。統計的には、二つの比較、Ａｑ＋Ｂｒ対ＡｑおよびＡｑ＋Ｂｒ対Ｂｒのｐ値の最大値は、適切なカットオフ、ｐ≦０．０５より低くなければならない。ＥＯＨＳＡは、薬剤併用を評価する通常の手法であり、併用薬剤認可のＦＤＡ基準である（21 CRF 300.50)。例と議論に関して、Borisyら(2003)またはHungら(1993)を参照されたい。交互作用付きの２要因分散分析を利用し（モデルタームは、薬剤Ａの用量、薬剤Ｂの用量、および薬剤ＡおよびＢの用量間の交互作用）、次いで、各併用群と対応する単独療法の間の線形の対比により分析を実施した。分析は、ＳＡＳ（バージョン８、SAS Institute提供、ケーリー、ノースカロライナ州(N.C.)）を利用して実施した。各用量でのＥＯＨＳＡを、適切なＡＮＯＶＡ対比から、併用と各単独療法との間の平均阻害(％)の差の最小値として計算した。阻害％エンドポイントに対して比較が多くあるので、多重比較のためにｐ値の調整を実施した。パワーを向上するためにHommelの手順を実施すると同時に、連続棄却法を利用してファミリーワイズエラー率(Familywise Error Rate)（FWE）を維持した。この調整を利用して、相乗作用と拮抗作用の両方のｐ値を計算した。ＥＯＨＳＡ法を利用すると、相乗は、併用における効果（または応答）が、ｐ≦０．０５で最高の単剤のみより有意に高いことを意味する。相加は、併用の効果が、最高の単剤のみと有意に変わらない（ｐ＞０．０５）ことを意味し、拮抗作用は、併用の効果が、ｐ≦０．０５で最高の単剤のみより有意に低いことを意味する。
【００５７】
細胞アポトーシスアッセイ−細胞死ＥＬＩＳＡＰｌｕｓ（ＤＮＡ断片を測定）およびＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７アッセイ
細胞アポトーシスを、アポトーシスの証明であるＤＮＡ断片を測定する細胞死ＥＬＩＳＡ法並びに細胞中のアポトーシスの実行酵素の一つである、カスパーゼ３／７の活性を検出するＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７アッセイの両方により測定した。
【００５８】
Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ＥＬＩＳＡＰｌｕｓキット（Roche、マンハイム、ドイツ国）を製造業者の説明に従い、使用した。細胞を、ウェルあたり１０，０００で９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞に薬剤を与え、５％ＣＯ２中、３７℃で、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中でさらに４８時間成長させた。対照細胞および処理細胞の細胞質分画を、ストレプトアビジンにコートされた９６ウェルプレートに移し、ビオチン化マウス抗ヒストン抗体およびペルオキシダーゼ結合マウス抗ＤＮＡ抗体とともに室温で２時間インキュベートした。吸光度は、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉマイクロプレートリーダー（Molecular Devices、サニーベール、カリフォルニア州(CA)）を使用し、４０５〜４９０ｎｍで測定した。
【００５９】
Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ ３／７アッセイ(Promega)は、カスパーゼ−３および−７活性を測定する均一発光アッセイである。細胞を、ウェルあたり５，０００で９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞に薬剤を与え、５％ＣＯ２中で３７℃で、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０中でさらに２４時間成長させた。製造業者の説明に従い、カスパーゼ活性、ルシフェラーゼ活性、および細胞溶解に最適化された試薬中で、テトラペプチドシーケンスＤＥＶＤを含む発光用カスパーゼ−３／７基質を加えて、カスパーゼ３／７活性を検出した。
【００６０】
ウェスタンブロット分析
細胞を、ウェルあたり２５０，０００から５００，０００で６ウェルプレートに播種した（Ｆａｌｃｏｎマルチウェル、Becton Dickinson、フランクリンレイクス、ニュージャージー州(NJ)）。翌日、１０％ＦＢＳを含む成長培地中で、細胞を化合物で処理した。処理後、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤（Complete Protease Inhibitor Tablets, Boehringer Mannheim、インディアナポリス、インディアナ州(IN)）を含む細胞溶解緩衝液（４０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０％のグリセロール、５０ｍｍｏｌ／Ｌのβ−グリセロホスフェート、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＧＴＡ、２ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、０．３５ｍｍｏｌ／Ｌのバナジン酸塩、１０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＦ、および０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を使用し、培養皿中で溶解した。対照および処理された細胞溶解物からの、ＢｉｏＲａｄのＤＣ（洗剤適合）プロテインアッセイを利用して測定されたタンパク質サンプル（５０μｇ）を、４％から１２％グラジエントＮｕＰＡＧＥゲル(Novex, Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州)に添加し、還元条件下で電気泳動にかけ、ニトロセルロースメンブレン（０．４５μｍ、Bio-Rad Laboratories）に移した。メンブレンブロットをＰＢＳですすぎ、Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ緩衝液中、室温で１時間ブロックした。ブロッキング緩衝液プラス０．１％Ｔｗｅｅｎ中で、特異的タンパク質に対する抗体でブロットをプローブし、室温で２時間インキュベートした。メンブレンを洗浄し、ブロッキング緩衝液プラス０．１％Ｔｗｅｅｎ中で、ＩＲＤｙｅ  ６８０またはＩＲＤｙｅ  ８００二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ(LI-COR Biosciences、リンカーン、ネブラスカ州)によりメンブレンを現像した。
【００６１】
ウェスタンブロット分析（図６）に利用した条件は以下のとおりであった：細胞を、ラパチニブ（１μＭ）単独、化合物Ｉ単独（１μＭ）、または化合物Ｉ（１μＭ）と組み合わせたラパチニブ（１μＭ）により４時間処理した。細胞溶解物（総タンパク質５０μｇ）または抗ホスホチロシン抗体により免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した。特異的タンパク質に対する抗体をウェスタンブロット分析に利用した。
【００６２】
ウェスタンブロット分析（図２の右図および図９の右図）に利用した条件は以下のとおりであった：細胞を、ラパチニブ（１μＭ）単独、化合物Ｉ単独（０．１μＭ）、または化合物Ｉ（０．１μＭ）と組み合わせたラパチニブ（１μＭ）により、示されるとおりＨＧＦまたはＨＲＧの存在下または非存在下で、２時間処理した。細胞溶解物（総タンパク質５０μｇ）または抗ＭＥＴ抗体または抗ＨＥＲ３抗体により免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した。特異的タンパク質に対する抗体をウェスタンブロット分析に利用した。
【００６３】
化合物Ｉ細胞成長阻害
化合物Ｉは、ｃＭＥＴ、ＲＯＮ、ＡＸＬ、ＶＥＧＦＲ  １／２、ＴＩＥ２、ＰＤＧＦＲβ、ｃＫＩＴ、およびＦＬＴ３を標的とする、強力なマルチキナーゼ阻害剤である。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存率アッセイにより、乳腺腫瘍（ＢＴ４７４、ＨＣＣ１９５４、ＫＰＬ−４、ＪＩＭＴ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、およびＢＴ４７４−Ｊ４）、頭頸部腫瘍（ＳＣＣ１５、ＨＮ５、Ｄｅｔｒｉｏｔ  ５６２、ＳＣＣ１２、およびＨＮ５Ｃｌ２）、胃腫瘍（ＳＮＵ−５、ＭＫＮ−４５、ＨＳ７４６Ｔ、ＡＧＳ、ＳＮＵ−１６、およびＮＣＩ−Ｎ８７）、肺腫瘍（ＮＣＩ−Ｈ１９９３、ＮＣＩ−Ｈ１５７３、ＮＣＩ−Ｈ４４１、ＮＣＩ−Ｈ２３４２、ＮＣＩ−Ｈ１６４８、ＨＯＰ−９２、ＮＣＩ−Ｈ５９６、ＮＣＩ−Ｈ６９、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、Ａ５４９）、食道腫瘍（ＯＥ−３３）、皮膚腫瘍（Ａ４３１）、および結腸腫瘍（ＨＴ２９、ＳＷ４８、およびＫＭ１２）細胞系で、細胞成長阻害を測定した。
【００６４】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、ｃＭＥＴ活性化のリガンドである。それは、細胞増殖の刺激、運動性、および形態発生を含むいくつかの生物活性を持つサイトカインである。ＨＧＦは不活性な前駆体として分泌され、プラスミノーゲン活性化因子などの分泌されるプロテアーゼにより活性なヘテロ二量体形態に変換される。インビトロ細胞培養条件では、腫瘍細胞系のほとんどは、活性形態のＨＧＦを発現しない。ヒトＨＧＦの活性形態を培地に加えると、傍分泌ｃＭＥＴ活性化系を与える。ヒト血清のＨＧＦレベルは、健常なヒトで約０．２ｎｇ／ｍＬ(J. Immunol. Methods 2000; 244: 163-173)であると報告され、肝転移乳ガン患者では２ｎｇ／ｍＬに上昇した(Tumor Biol 2007;28:36-44)。したがって、細胞成長阻害およびアポトーシスアッセイのために、５％または１０％ＦＢＳを含む培地にＨＧＦを２ｎｇ／ｍＬで添加した。
【００６５】
表の略語
以下は、表に使用される略語の説明である。
Ｎ＝２は、実験が独立して２回繰り返されることを意味する。アスタリスクで示される以外、分析は全て二連で実施した。
ＩＣ５０は、４パラメータカーブフィッティング式を利用して外挿された対照細胞成長の５０％を阻害する化合物濃度を意味し、μＭはマイクロモルパーリットルを意味する。
ＨＥＲ増幅＋は、細胞系中で遺伝子ＨＥＲ１（ＨＥＲ１＋）またはＨＥＲ２（ＨＥＲ２＋）が増幅されることを示す。「なし」は、ＨＥＲ１もＨＥＲ２も細胞系中で増幅されないことを意味する。
＞１０は、試験した最高濃度（１０μＭ）までＩＣ５０が得られなかったことを意味する。
ＨＥＲ３−過剰は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ分析により測定してＨＥＲ３  ＲＮＡの過剰発現レベル（ＭＡＳ  ５強度＞３００）を意味する。
ＨＥＲ３−過剰は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ分析により測定してＨＥＲ３  ＲＮＡの過剰発現レベル（ＭＡＳ  ５強度＜１００）を意味する。ｃＭＥＴ＋は、ＳＮＰ−ＣＨＩＰにより測定してＭＥＴ  ＤＮＡが５コピー以上であるｃＭＥＴ遺伝子増幅を意味する。
ｃＭＥＴ＋（＜５）は、ＳＮＰ−ＣＨＩＰにより測定してＭＥＴ  ＤＮＡが５コピー未満であるｃＭＥＴ遺伝子増幅を意味する。
ｃＭＥＴ−過剰は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ分析により測定してｃＭＥＴ  ＲＮＡの過剰発現レベル（ＭＡＳ  ５強度＞３００）を意味する。
ｃＭＥＴ−低は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ分析により測定してｃＭＥＴ  ＲＮＡの低発現レベル（ＭＡＳ  ５強度＜３００）を意味する。
ｃＭＥＴ−突然変異は、ｃＭＥＴ遺伝子中の点突然変異、欠失、挿入、またはミスセンス突然変異を意味する。
−ＨＧＦは、ＨＧＦを加えなかったことを意味する。
＋ＨＧＦは、２ｎｇ／ｍＬのＨＧＦを、５％または１０％のＦＢＳを含む培地に加えたことを意味する。
−ＨＲＧは、ＨＲＧを加えなかったことを意味する。
＋ＨＲＧは、１０ｎｇ／ｍＬのＨＲＧを、１０％のＦＢＳを含む培地に加えたことを意味する。
ＮＡは、薬剤単独の絶対的なＩＣ５０値が測定できなかったので、該当なしである。
【００６６】
化合物Ｉの細胞成長阻害効果
腫瘍細胞系における化合物Ｉ単独の成長阻害効果を表１にまとめる。表１に示すとおり、この化合物は、ｃＭＥＴ＋かつＨＥＲ非増幅（ＨＥＲ＋＝ｎｏ）腫瘍系、ＭＫＮ−４５、ＳＮＵ−５、ＨＳ７４６Ｔ、およびＮＣＩ−Ｈ１９９３の細胞成長を阻害するのに非常に強力であり、１００ｎＭ未満のＩＣ５０値を示す。ｃＭＥＴ増幅肺腫瘍細胞系であるＮＣＩ  Ｈ１６４８は、ＨＧＦの存在下で化合物Ｉに対して感受性がより高く、この系のＨＧＦ−ｃＭＥＴ活性化依存的細胞成長を示唆している。
【００６７】
表１  腫瘍細胞系における化合物Ｉ単独による細胞成長阻害のＩＣ５０値（μＭ）
【表１】
2011519941.tif 000015
【００６８】
表１の結果は、ｃＭＥＴ遺伝子増幅のある腫瘍細胞が、増幅のためにｃＭＥＴに高度に依存していることを示している。表１がさらに示すとおり、化合物Ｉは、膜近傍領域でのｃＭＥＴ突然変異を持つｃＭＥＴ増幅が５コピー未満の細胞系（ＨＯＰ−９２：ｃＭＥＴ−Ｔ１０１０Ｉ、Ｈ６９：ｃＭＥＴ−Ｒ９８８ＣおよびＨ５９６：ｃＭＥＴ−エクソン１４インフレーム欠失）またはそれぞれｃＭＥＴ−過剰もしくはｃＭＥＴ−低と呼ばれる多量もしくは少量のｃＭＥＴ  ＲＮＡを発現するｃＭＥＴ非増殖腫瘍細胞系における細胞成長阻害で０．０４から約５μＭのＩＣ５０値を示す。これらの結果は、化合物Ｉが腫瘍細胞中で複数の腫瘍形成性キナーゼを阻害するという観察と一致する。
【００６９】
ｃＭＥＴおよびＨＥＲ増幅を持つ細胞系に対する、ラパチニブと組み合わせた化合物Ｉの細胞成長阻害効果
表２に示されるとおり、ラパチニブ単独は、低いｃＭＥＴおよびＨＥＲ２＋であるＢＴ４７４乳腺腫瘍細胞系で０．１２および０．１１の（それぞれＨＧＦのある場合とない場合）平均ＩＣ５０を示したが、化合物Ｉ単独は、４．９７μＭ（ＨＧＦあり）および４．９０μＭ（ＨＧＦなし）の平均ＩＣ５０を示した。この結果は驚くべきものではない。ラパチニブは、化合物Ｉとは違い、増幅ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ増幅＋）の強力な阻害剤であると知られているからだ。組み合わせると、ラパチニブおよび化合物Ｉは、ＢＴ４７４乳腺腫瘍細胞系で、ＨＧＦがない場合の０．９５のＣＩに基づく相加作用またはＨＧＦがある場合の０．７１のＣＩに基づく相乗作用を示し、より高い濃度で細胞成長阻害を促進した（図３）。
【００７０】
それと比較し、ラパチニブおよび化合物Ｉの組み合わせによる、同時増幅ｃＭＥＴおよびＨＥＲ２を持つ食道腫瘍細胞株（食道  ＯＥ３３）での細胞成長阻害の効果は顕著であり、予想外の効果である。表２および図１が示すとおり、ＯＥ３３は、ラパチニブに対する耐性を示し（ＨＧＦがない場合ＩＣ５０＝６．５μＭ、ＨＧＦがある場合１０μＭ超）、化合物Ｉ単独には中程度感受性があった（ＨＧＦがない場合ＩＣ５０＝０．４２μＭ、ＨＧＦがある場合０．４０μＭ）。しかし、ラパチニブと化合物Ｉの組み合わせは、ＨＧＦがあってもなくてもＯＥ３３食道腫瘍細胞の細胞成長阻害の強い相乗作用（ＣＩおよびＥＯＨＳＡの両方に基づく）を示した。同様に、表２および図１に示されるとおり、ｃＭＥＴおよびＥＧＦＲ同時増幅を持つ肺腫瘍細胞系であるＮＣＩ−Ｈ１５７３は、別々に投与される場合に、ラパチニブには耐性があり、化合物Ｉには中程度に感受性がある。しかし、これら２種の阻害剤の組み合わせは効力を向上させ（ＩＣ５０値を下げ）、細胞成長阻害活性を高めた（ＥＯＨＳＡに基づく相乗作用）。理論に拘束されるわけではないが、これらの結果は、ｃＭＥＴとＨＥＲとが相互作用（「クロストーク」）でき、ＨＥＲ阻害剤またはｃＭＥＴ阻害剤単独により与えられる細胞成長阻害を逃れることができるが、ラパチニブと化合物Ｉとの組み合わせがｃＭＥＴおよびＨＥＲ同時増幅腫瘍細胞における耐性を克服することを示唆している。
【００７１】
表２  ｃＭＥＴとＨＥＲ１またはＨＥＲ２遺伝子の両方の同時増幅を持つ腫瘍細胞系に対する化合物Ｉとラパチニブとの組み合わせの細胞成長阻害効果
【表２】
2011519941.tif 000016
【００７２】
ｃＭＥＴ増幅、突然変異、または過剰発現のある腫瘍細胞系に対する、ラパチニブと組み合わせた化合物Ｉの細胞成長阻害効果
表３に示されるとおり、ラパチニブと化合物Ｉとの組み合わせは、ｃＭＥＴ増幅、突然変異、または過剰発現の乳腺腫瘍、肺腫瘍、胃腫瘍、頭頸部腫瘍、卵巣腫瘍、および皮膚腫瘍細胞においてＣＩ＜０．９で相乗作用を示した。ＥＯＨＳＡ分析は、ＨＧＦのない場合のＮ８７およびＨＧＦのある場合とない場合のＨ１９９３以外の全ケースで相乗作用を確認した。これらの例外のそれぞれでは、ラパチニブまたは化合物Ｉの単剤それ自体に非常に活性があり、併用効果は相加的である。
【００７３】
驚くべきことに、表３に示されるとおり、ＨＧＦは、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２増幅およびｃＭＥＴ過剰発現腫瘍細胞（ＨＥＲ２＋：Ｎ８７、Ｈ２１７０、およびＨＣＣ１９５４；ＨＥＲ１＋：ＳＣＣ１５、ＨＮ５、およびＡ４３１）においてラパチニブによる細胞成長阻害の効力を低下させた。さらに、ラパチニブを化合物Ｉと組み合わせるとＨＧＦ効果を克服するだけでなく、ＨＧＦのある場合とない場合で、特に細胞系Ｈ２１７０、ＨＣＣ１９５４、ＳＣＣ１５、ＨＮ５、およびＡ４３１において感受性を高めた。対照的に、ＨＧＦは、ｃＭＥＴ  ＲＮＡの低発現またはタンパク質発現を持つ二種のＨＥＲ２増幅乳腺腫瘍細胞系であるＢＴ４７４（表２）およびＫＰＬ−４（表３）におけるラパチニブ活性を低下させなかった。
【００７４】
ＨＧＦ効果は、図２でＮ８７に示されている。図２（左図、細胞成長阻害と表示）は、ＨＧＦの非存在下で、Ｎ８７が、ラパチニブ単独（ＩＣ５０＝０．０５μＭ）または化合物Ｉとのモル（モル比１：１）の組み合わせに対して、非常に感受性が高いことを示す。対照的に、ＨＧＦの存在下で、Ｎ８７はラパチニブに非感受性（ＩＣ５０＝４．８０μＭ）であるが、ラパチニブと化合物Ｉとの組み合わせには非常に感受性がある（ＩＣ５０＝０．０５μＭ）。図２（右図、ウェスタンブロット分析と表示）も、ラパチニブと化合物Ｉとの組み合わせが、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびｃＭＥＴのリン酸化を阻害し、ｐＡＫＴおよびｐＥＲＫの細胞信号伝達を低減することを示し、ＨＧＦの存在下および非存在下の両方での細胞成長阻害と一致している。
【００７５】
表３および図２は、ＨＧＦがｃＭＥＴを活性化するという主張を支持する以前に見出されたものと一致する。上記の結果は、ＨＧＦ媒介ｃＭＥＴ活性化がＨＥＲと相互作用を持ち、ＨＥＲ阻害剤による成長阻害を低減させることをさらに示唆している。これらの結果は、化合物Ｉをラパチニブと併用すると、ｃＭＥＴ過剰発現およびＨＥＲ増幅の腫瘍細胞においてより効果的な療法を提供できることを示している。
【００７６】
表３  ｃＭＥＴ増幅、突然変異、または過剰発現のある腫瘍細胞系に対する、化合物Ｉとラパチニブの組み合わせの細胞成長阻害効果
【表３】
2011519941.tif 000017
＊タンパク質発現に基づく
【００７７】
ラパチニブ耐性ＨＥＲ＋腫瘍細胞系に対する化合物Ｉおよびラパチニブの併用効果
ＢＴ４７４−Ｊ４、ＪＩＭＴ１、およびＨＮ５Ｃｌ２は、ラパチニブ耐性ＨＥＲ２＋またはＨＥＲ１＋細胞系である。ＪＩＭＴ−１は、ラパチニブまたはトラスツズマブに対する耐性が受け継がれた株であり、トラスツズマブに反応しなかった患者から誘導した。ＢＴ４７４−Ｊ４およびＨＮ５Ｃｌ２は両方とも、ラパチニブ獲得耐性クローンである。表４が示すとおり、化合物Ｉとラパチニブの組み合わせは、３種のラパチニブ耐性腫瘍細胞系の全てで細胞成長阻害の相乗作用を示す（ＥＯＨＳＡ分析による）。さらに、図３に示されるとおり、化合物Ｉは、耐性ＢＴ４７４−Ｊ４細胞におけるラパチニブ感受性を回復させ、ＢＴ４７４（ラパチニブに感受性あり）と、ＢＴ４７４−Ｊ４（ラパチニブおよびトラスツズマブに耐性）との両細胞におけるラパチニブ活性を増加させた。化合物Ｉと、ラパチニブ併用との相乗作用を、細胞成長阻害だけでなく、図４に示されるとおりアポトーシス誘発においても検出した。図４が示すとおり、化合物Ｉとラパチニブを併用すると、ＢＴ４７４とＢＴ４７４−Ｊ４細胞の両方で、アポトーシスの証明であるＤＮＡ断片およびカスパーゼ３／７活性化の両方が増加した。しかし、別々に投与すると、高濃度の化合物Ｉまたはラパチニブは、ラパチニブ感受性細胞であるＢＴ４７４だけにアポトーシスを誘発する。
【００７８】
表４  ラパチニブ耐性ＨＥＲ＋腫瘍細胞系に対する、ラパチニブと組み合わせた化合物Ｉの細胞成長阻害効果
【表４】
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【００７９】
ラパチニブ濃度を１μＭに固定して、細胞系ＢＴ４７４−Ｊ４における化合物Ｉの用量反応を測定した。図５Ａが示すとおり、化合物ＩのＩＣ５０は、ラパチニブ濃度１μＭで０．１１μＭであることが分かった。ラパチニブなしでは、化合物ＩのＩＣ５０は３μＭであり、ラパチニブ自体は１．０μＭで最小効果（＜５０％阻害）を示した。さらに、図５Ｂに示されるとおり、同じ投薬条件下で、化合物Ｉとラパチニブとを組み合わせた場合、アポトーシス誘発も検出した。
【００８０】
ＢＴ４７４−Ｊ４細胞における化合物ＩのＡＸＬ阻害によるラパチニブ感受性の回復
ウェスタンブロット分析（図６に示される）により測定され定量的ＲＴ−ＰＣＲにより確認されたとおり、ＡＸＬが予想外にもＢＴ４７４−Ｊ４に高度に発現されリン酸化されているが、ＢＴ４７４細胞には発現されていないことを見出した。ＡＸＬは、いくつかのガンに過剰発現されていることが報告されているが、それらのガンには、結腸ガン（Craven et al., Int J Cancer 1995;60:791-7)、肺ガン(Shieh et al., Neoplasia 2005;7:1058-64)、食道ガン(Nemoto et al., Pathobiology. 1997;65(4):195-203)、甲状腺ガン(Ito et al., Thyroid 1999, 9(6):563-7)、卵巣ガン(Sun et al, Oncology 2004; 66:450-7)、胃ガン(Wu et al, Anticancer Res. 2002; 22(2B):1071-8)、および乳ガン(Berclaz et al., Ann Oncol 2001;12:819-24)があり、予後不良と関連づけられている。組織培養中のＡＸＬの過剰発現はガン化を起こす。したがって、本発明の組み合わせは、これらのＡＸＬ過剰発現腫瘍のいずれの治療にも有用である。
【００８１】
図６がさらに示すとおり、ラパチニブ単独は、ＢＴ４７４およびＢＴ４７４−Ｊ４の両細胞でＨＥＲ２のリン酸化を阻害する。しかし、ラパチニブは、ＢＴ４７４−Ｊ４細胞ではなくＢＴ４７４のみで、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化の下流信号伝達を阻害し、サイクリンＤ１のレベルを低下させる。他方で、化合物Ｉ単独は、ＢＴ４７４−Ｊ４細胞において、ＡＸＬのリン酸化を阻害するが、ＡＫＴのリン酸化の下流信号伝達を阻害しない。驚くべきことに、化合物Ｉと、ラパチニブとの組み合わせは、ＢＴ４７４−Ｊ４細胞において、ＨＥＲ２、ＡＸＬ、ＡＫＴ、およびＥＲＫのリン酸化を実質的に阻害し、サイクリンＤ１のレベルを低下させる。上記の細胞信号伝達阻害効果は、ＢＴ４７４−Ｊ４での細胞成長阻害およびアポトーシス誘発において、化合物Ｉとラパチニブとの組み合わせに検出される強い相乗作用と非常に良好に相関している。これらの結果は、表５および図７に示される結果と合わせて、１）ＡＸＬ過剰発現がラパチニブまたはトラスツズマブに対する耐性機構を与えること、および２）化合物Ｉとラパチニブまたはトラスツズマブとの組み合わせがこれらの腫瘍細胞における耐性を克服することの証拠を与える。
【００８２】
ＨＥＲ２＋腫瘍細胞系に対する、化合物Ｉとトラスツズマブとの組み合わせの効果
トラスツズマブは、ＨＥＲ２受容体の細胞外セグメントに結合しＨＥＲ２信号伝達を阻害するヒト化モノクローナル抗体である。図７に示されるとおり、トラスツズマブ単独は、処理の５日後にＢＴ４７４細胞において４０％（ＨＧＦない場合）および３５％（ＨＧＦある場合）の細胞成長阻害を示すが、ＢＴ４７４−Ｊ４、ＯＥ−３３、およびＮ８７細胞では著しい阻害は示さなかった。表５に示されるとおり、化合物Ｉと、トラスツズマブとの組み合わせは、より低いＩＣ５０値またはＥＯＨＳＡ分析を利用する相乗作用により示されるとおり、４種のＨＥＲ２増幅細胞系の全てで細胞成長阻害を増加させた。その結果は、ＨＥＲ２増幅腫瘍細胞系において、化合物ＩをＨＥＲ２阻害剤と組み合わせる利益をさらに示している。
【００８３】
表５  ＨＥＲ２＋腫瘍細胞系に対する、化合物Ｉおよびトラスツズマブの細胞成長阻害効果
【表５】
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＊＊トラスツズマブは、処理５日後にＢＴ４７４において細胞成長を最大で３５−４０％阻害した。
【００８４】
腫瘍細胞系に対する化合物Ｉおよびエルロチニブの効果
エルロチニブはＥＧＦＲ阻害剤であり、高濃度で細胞培養中のＨＥＲ２も阻害する。エルロチニブ単独は、試験した腫瘍細胞系のほとんどにおいてあまり活性がなかった。化合物Ｉと、エルロチニブとの組み合わせは、表６に列記される肺、頭頸部、乳、卵巣、胃、および表皮の腫瘍細胞系において、ＣＩ＜０．９として示されＥＯＨＳＡ分析により確認されるとおり細胞成長阻害の相乗作用を示した。
【００８５】
とりわけ、図８に示されるとおり、ＮＣＩ−Ｈ１６４８肺腫瘍細胞系はエルロチニブに耐性があり（ＩＣ５０＞１０μＭ）、化合物Ｉに中程度に感受性があるが（ＨＧＦがない場合ＩＣ５０＝０．９６μＭ、ＨＧＦがある場合０．４０μＭ）、エルロチニブと、化合物Ｉとの組み合わせに感受性が高いことが見いだされた。同様に、ｃＭＥＴおよびＥＧＦＲの同時増幅を持つ肺腫瘍細胞系、ＮＣＩ−Ｈ１５３７は、エルロチニブに耐性があり、化合物Ｉには中程度に感受性があるが、この二つの化合物の組み合わせに対して感受性が高まることが見出された。これらの結果は、エルロチニブを式Ｉの化合物と組み合わせれば、これらの腫瘍細胞により効果的な治療を与えられるであろうことを示唆する。
【００８６】
表６  乳、結腸、胃、頭頸部、肺、卵巣、および皮膚の腫瘍細胞系に対する、化合物Ｉとエルロチニブとの組み合わせの細胞成長阻害効果
【表６】
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Ｎ＝１、実験を１回行った。
【００８７】
ＨＥＲ３過剰発現腫瘍細胞系に対する、化合物Ｉとラパチニブまたは抗ＨＥＲ３抗体との併用効果
ＭＫＮ４５細胞は、ｃＭＥＴ＋であり、過剰発現レベルのＨＥＲ３を有する。表７および図９に示されるとおり、ＨＲＧは、ＭＫＮ４５腫瘍細胞において、細胞成長を阻害し（ＩＣ５０値は、ＨＲＧ非存在下の２０ｎＭからＨＲＧ存在下での４５０ｎＭに上昇した）、ＨＥＲ３のリン酸化を阻害する化合物Ｉの感受性を低減した。予想外であることに、ラパチニブは、ＭＫＮ４５細胞中、ＨＲＧ存在下において化合物Ｉと組み合わされる場合、化合物Ｉの感受性を回復させ、ＣＩ＝０．１２およびＥＯＨＳＡ分析に示されるとおり、細胞成長阻害の強い相乗作用を示した。対照として、ＭＥＴ＋およびＨＥＲ３の低い発現を持つＨＳ７４６Ｔ胃腫瘍細胞は、ＨＲＧの存在下でも化合物Ｉに対して感受性を持ったままであった。上記の結果は、化合物Ｉをラパチニブと組み合わせると、ＭＥＴ＋およびＨＥＲ３過剰発現腫瘍細胞において有利であることを示している。さらに、化合物Ｉを、抗ＨＥＲ３抗体（モノクローナル抗ヒトｅｒｂＢ３抗体ｍａｂ３４８１、ミネソタ州ミネアポリスのR&D Systemsから市販）と組み合わせると、ＭＫＮ４５細胞において化合物Ｉの感受性を高め、細胞成長阻害に対して相乗作用（ＥＯＨＳＡ）を示した（表８）。
【００８８】
表７  ＭＥＴ＋およびＨＥＲ３過剰発現腫瘍細胞系における、ラパチニブと組み合わせた化合物Ｉの細胞成長阻害効果
【表７】
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【００８９】
表８  ＨＥＲ３過剰発現ＭＫＮ−４５腫瘍細胞系における、抗ＨＥＲ３抗体と組み合わせた化合物Ｉの細胞成長阻害効果
【表８】
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【００９０】
腫瘍細胞系に対する、化合物Ｉおよびゲフィチニブの効果
ゲフィチニブは選択的ＨＥＲ１阻害剤である。ゲフィチニブ単独は、試験された二つの肺腫瘍細胞系にあまり活性がなく、ＳＣＣ１５頭頸部腫瘍系に中程度の活性を示す。化合物Ｉと、ゲフィチニブとの組み合わせは、表９に列記された肺腫瘍および頭頸部腫瘍細胞系において、ＣＩ＜０．９および／またはＥＯＨＳＡにより示されるとおり、細胞成長阻害の相乗作用を示した。
【００９１】
表９  肺腫瘍および頭頸部腫瘍細胞系に対する、１：１の一定モル比での化合物Ｉとゲフィチニブとの組み合わせの細胞成長阻害効果
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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