(57)【要約】本発明は、ＣＯＸ−２の活性化と関連する疾患の過程の治療のための、マスリン酸、又は天然、合成もしくは半合成のマスリン酸に富む混合物、又は前記酸を含む組成物の使用に関し、関節症、リウマチ様関節炎、線維筋痛症、座骨神経痛、及び、特にその他の診断が困難な骨関節疾患の症候性治療及び／又は再生治療に関する。本発明は、またこれらの局所投与に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯＸ−２の活性化を含む疾患の治療用の薬物の製造におけるマスリン酸又はその誘導体のいずれかの使用。
【請求項２】
軟骨細胞組織の再生用の薬物の製造におけるマスリン酸又はその誘導体のいずれかの使用。
【請求項３】
関節症、リウマチ様関節炎、座骨神経痛、線維筋痛症、膝蓋骨腱炎及び腱膜瘤からなる群から選択される疾患の治療用の薬物の製造における請求項１又は２に記載のマスリン酸又はその誘導体のいずれかの使用。
【請求項４】
マスリン酸又はその誘導体のいずれかを含む、ＣＯＸ−２の活性化を含む疾患の治療用の医薬品組成物。
【請求項５】
薬学的に許容できる媒体を含む請求項４に記載の医薬品組成物。
【請求項６】
オレアノール酸を含む請求項４又は５に記載の医薬品組成物。
【請求項７】
マスリン酸とオレアノール酸の比が２：１〜６：１である請求項６に記載の医薬品組成物。
【請求項８】
局所投与に適合した形態である請求項４〜７のいずれか１項に記載の医薬品組成物。
【請求項９】
前記マスリン酸又はその誘導体のいずれかがオリーブ属の植物の抽出から得られたものである請求項４〜８のいずれか１項に記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
前記マスリン酸又はその誘導体のいずれかがオリーブ属の植物の工業副産物から得られたものである請求項４〜９のいずれか１項に記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
前記マスリン酸又はその誘導体のいずれかが全組成の０．５％〜３％の割合で存在する請求項４〜９のいずれか１項に記載の医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内因性のシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の阻害を含む病的過程の治療のためのマスリン酸及びその誘導体の使用に関する。より詳しくは、症候性及び／又は無症候性の関節症、リウマチ様関節炎、線維筋痛症、座骨神経痛並びに他の骨関節不快感に対するものである。また、マスリン酸、その誘導体のいずれか、又はマスリン酸もしくはその誘導体に富む、天然、合成、半合成の混合物を含む組成物の局所投与に関する。
【背景技術】
【０００２】
オレアノール酸（３−ベータ−ヒドロキシ−１２−オレアネン−２８−オイック酸）は、植物界に広範囲に分布しているトリテルペン酸である。したがって、アメリカ合衆国農務省（ＵＳＤＡ）の植物化学物質のデータベースには、我々の知るオリーブなどのおよそ１００の植物にそれが存在することと共に、一連の確認された生物活性（抗流産、抗齲蝕、抗受精、抗肝毒、抗炎症、抗肉腫、癌予防、強心作用、利尿効果、肝保護、子宮収縮）が記録されている。
【０００３】
また、マスリン酸（２−アルファ，３−ベータ−ジヒドロキシオレアナ−１２−エン−２８−オイック酸）は、クラテゴール酸とも呼ばれ、自然界にはほとんど分布しない酸であり、約１０の植物で検出されている。その活性は抗ヒスタミン性や抗炎症性として知られているが、その希少性から、十分に研究されていない。前もってクロロホルムで洗浄したオリーブのマスリン抽出物を介したオリーブ果実の表面ワックスのオレアノール酸とマスリン酸の単離が非特許文献１に記載されている。このタイプの酸の分離は、高速向流クロマトグラフィー（ＨＳＣＣＣ）によって説明されている（非特許文献２）。
【０００４】
【化１】
2011516457.tif 000002
【０００５】
今日では、マスリン酸が活性成分として作用するという多くの特許が存在している：抗腫瘍薬（特許文献１又は特許文献２）、アポトーシス誘導物質（特許文献３）、食欲抑制食物（特許文献４、特許文献５）、皮膚の外用薬及び美白薬（特許文献６）、血管病変（特許文献７）。
【０００６】
いくつかの文献では、このトリテルペンが抗炎症活性をも有するであろうことが示されている（非特許文献３）。また、この文献では、マスリン酸が、ＬＰＳ刺激されたマウス腹腔内マクロファージにおけるＩＬ−６及びＴＮＦαの放出、並びにＮＯ及び過酸化水素（ＲＯＳ）の産生を抑制することも記載されている。著者は、ヒト末梢血単核球ではこの効果が見られないとしている。いずれの場合も、これらの矛盾が明らかに示すのは、答えが一様ではないことであり、したがって、それは予測不可能であり、組織モデル及び／又は組織タイプの研究が必要とされる。
【０００７】
一方で、広範囲に分布し、それら全てがプロスタン酸を誘導するプロスタグランジンを生成する前駆体において環を形成し酸素を導入できる酵素であるシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）の代謝経路の後に、プロスタグランジンはアラキドン酸（他の不飽和脂肪酸Ｃ２０は、エイコサノイドと呼ばれる）から合成される。十分に特定された２つの異なるタイプのＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２というシクロオキシゲナーゼが存在する。ＣＯＸ−１は多くの組織で構成的に発現し、重要な生理学的機能を制御している。例えば、ＣＯＸ−１は内皮と胃粘膜においてプロスタグランジンの生成を触媒し、抗血栓及び細胞保護の効果をそれぞれ導く。誘導型のＣＯＸ−２は、ほとんどの組織で検出されない。ＣＯＸ−２は、ＣＯＸ−１をコードする遺伝子と異なる遺伝子に由来する特異的なアイソフォームである。ＣＯＸ−２の発現は、発生や炎症の期間において上昇するが、脳を除いてほとんどの組織において構成的な発現は低いままである。
【０００８】
プロスタグランジン、特にＰＧＥ２は、複数の生理機能及び生理病理機能を実現させる。すなわち、低濃度のＰＧＥ２は、正常な胃粘膜の健全性と、流体及び電解質の恒常性を保つので、炎症過程におけるこのメディエータの濃度は示唆されている。
【０００９】
アラキドン酸の他の代謝物はイソプラスタンである。これらの代謝物は構造的にはプロスタグランジンと同じであり、細胞膜の脂肪酸の酸化によって生成される。
【００１０】
最近では、イソプラスタンが最も良い細胞と酸化ストレスの系統的なマーカーの１つを示すことが広く知られている。マスリン酸の酸化防止作用が示されているので、この化合物がイソプラスタンの形成を阻害することは可能である（非特許文献３、非特許文献４）。
【００１１】
リウマチ様関節炎のための治療に関して、メリーランド大学メディカル・センターによると、この治療は基本的にＣＯＸ−２阻害剤を用いて行うことができ、ＣＯＸ−２阻害剤は炎症を助長するＣＯＸ−２と呼ばれる酵素を阻害するが、局所のための効率的な治療としては完全でないとしている。最初、このタイプの薬剤は、胃を傷めることがほとんどなく、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）と同様に作用すると考えられていた。しかしながら、多くの心臓発作や脳卒中の報告により、ＦＤＡがＣＯＸ−２のリスクと利益の関係を再評価することになった。ロフェコキシブ［Ｖｉｏｘｘ（商標）］及びバルデコキシブ［Ｂｅｘｔｒａ（商標）］は、それらが投与された患者の心臓発作の報告があった後、アメリカでの販売が中止になった。セレコキシブ［Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（商標）］は、現在でも販売されているが、強い警告ラベルが添付され、可能な限りの少ない用量と短い期間で処方されることが推奨される。患者は、この薬剤が自分にとって適切で安全であるかどうかを医師に尋ねなければならない。
【００１２】
また、ヒドロキシクロロキン［Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ（商標）］やスルファサラジン［Ａｚｕｌｆｉｄｉｎｅ（商標）］などの抗マラリア薬も一般的に、メトトレキサートとの併用において有用である。しかし、この薬剤の効果が現れるには何週間も、何カ月間もかかることがあり、それは毒性の副作用に関連しているので、これらの薬剤を使用している間は、頻繁に血液検査を受けることが必須となる。
【００１３】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）阻害物質は、自己免疫疾患を治療するために使用される比較的新しい薬物のタイプである。それらは特に以下のものである。エタネルセプト［Ｅｎｂｒｅｌ（商標）］、インフリキシマブ［Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標）］及びアダリムマブ［Ｈｕｍｉｒａ（商標）］。アダリムマブ及びエタネルセプトは注射剤であり、またインフリキシマブは静脈内に投与される。
【００１４】
別の比較的新しい薬剤としては、炎症性蛋白質インターロイキン−１を阻害する人工蛋白質である注射剤のアナキンラ［Ｋｉｎｅｒｅｔ（商標）］がある。この薬剤は、１剤以上のＤＭＡＲＤ（疾患修飾性抗リウマチ薬）が無効であった１８歳以上の進行性リウマチ患者において、中等度から重症への進行を抑制するために使用される。Ｋｉｎｅｒｅｔは、別のＤＭＡＲＤ又は腫瘍壊死因子阻害物質とともに使用することができる。
【００１５】
アザチオプリン［Ｉｍｕｒａｎ（商標）］や、シクロホスファミド［Ｃｙｔｏｘａｎ（商標）］などの免疫系を抑制する他の薬剤は、他の治療法が成功しなかった人に対して時々使用される。一般的に、毒性の副作用を有するこれらの薬剤は、リウマチ様関節炎が重症な場合に備られている。
【００１６】
直接軟骨細胞に作用し、関節症、リウマチ様関節炎又はその他の診断が困難な骨関節疾患に対して、発現した症状を短時間で長期的に消失できる効果的な治療を実現する症候性治療及び／又は再生治療のための効果的で投与が容易な治療はまだ知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／１５３５３８号
【特許文献２】国際公開第０２５２９５６号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３５７２２４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２０３０３９２７０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０３０１１２６７号パンフレット
【特許文献６】米国特許出願公開第２００３／１３３９５８号
【特許文献７】国際公開第０２０７８６８５号パンフレット
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Bianchi, G., Pozzi, N. And Vlahov, G. Phytochemistry (1994) 37, 205-207
【非特許文献２】Du, Q.Z., Xiong, X.P. and Ito, Y.; Journal of Liquid Chromatography (1995) 18, 1997-2004
【非特許文献３】Marquez-Martin A, De La Puerta R, Fernandez-Arche A, Ruiz-Gutierrez V, Yaqoob P. Cytokine. (2006) Dec; 36 (5-6):211-7
【非特許文献４】Montilla MP, Agil A, Navarro MC, Jimenez MI, Garcia-Granados A, Parra A, Cabo  MM.  Planta Med. (2003) May;69(5):472-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）酵素の活性化を含むあらゆる病状の治療のためのマスリン酸とその誘導体のいずれかの使用について説明する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この意味で、本発明では、ヒトの軟骨細胞で誘導されるＣＯＸ−２活性の阻害物質としてのマスリン酸の活性が示され、したがって、前記のＣＯＸ−２酵素の活性化を含む疾患の治療におけるこの酸の有用性も示される。
【００２１】
また、マスリン酸はこのタイプの疾病に関連する炎症を単に低下させることは出来ないが、症状の減少又は消失及び持続的な効果を示す軟骨細胞組織再生において介在することも示される。
【発明の効果】
【００２２】
前述のように、本発明では、マスリン酸やその誘導体のいずれかを含む組成物を用いた、関節症、リウマチ様関節炎、線維筋痛症、座骨神経痛、ジャンパー症候群、中足指節関節の隆起（腱膜瘤）などの疾患の症候性治療及び／又は再生治療や、ＣＯＸ−２用の特定のＮＳＡＩＤ（非ステロイド性抗炎症薬）に対する反応の過程について言及する。この治療は簡単な投与により実施され、特に直接的に軟骨細胞又は影響を受けた組織に作用するので効果的である。特に、本発明では、症状を短時間で長期的に消失できる関節症とリウマチ様関節炎の症候性治療及び／又は再生治療の有効性が示される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ヒト単球でのＰＧＥ−２産生におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【図２】ヒト単球のＣＯＸ−２発現におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【図３】ヒト単球のＣＯＸ−２活性におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【図４】ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＰＧＥ−２産生におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【図５】初代アストロサイトのＰＧＥ−２産生におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【図６】ＣＯＸ−２の転写活性におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【図７】ヒト単球のＣＯＸ−２発現におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【図８】軟骨細胞のＰＧＥ−２産生におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【図９】軟骨細胞のＩＬ−６産生におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【図１０】単球のＰＧＥ−２産生におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【図１１】Ｐ＋Ｉによって誘導されるＩＬ−６プロモーター活性化におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【図１２】ＩＬ−１によって誘導されるＩＬ−６プロモーター活性化におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【図１３】初代単球のイソプロスタン産生におけるマスリン酸の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明では、局所投与でもその治療の有効性が示される。ＣＯＸ−２の他のＮＳＡＩＤ阻害物質は局所投与したときには有効性を示さず、その上、他の方法による投与は重篤な副作用があるので、この事実を強調することは重要である。
【００２５】
天然に又は合成的にマスリン酸を得ることができる。このマスリン酸を含む組成物には、定義的に、マスリン酸を含む植物抽出物、植物もしくはその果実の工業的処理の副産物の抽出物又は植物に本来存在するよりも高濃度のマスリン酸を含む植物の工業副産物の使用が含まれる。これには制限されないが、例えば、オリーブ属、特にオリーブ種の植物抽出物である。このタイプのマスリン酸の他に、その誘導体も使用できる。ここで本発明における誘導体とは、治療される組織における吸収及び輸送が促進された、薬剤として許容できるこれらの塩又は誘導体である。特に、それらのナトリウム塩、カリウム塩、又は生物学的に許容できるアミンの塩である。
【００２６】
これらの事実は実施された以下の経験により示される。
・  末梢血の初代培養ヒト単球のＣＯＸ−２タンパクの発現に対するマスリン酸とその誘導体の効果が測定された。
・  末梢血の単球のＣＯＸ−２酵素活性に対するマスリン酸とその誘導体の効果が測定された。
・  末梢血の初代培養ヒト単球のイソプロスタンの形成に対するマスリン酸とその誘導体の効果が測定された。
・  初代培養ヒト軟骨細胞のＰＧＥ２放出に対するマスリン酸とその誘導体の効果が測定された。
・  初代培養ラットのアストロサイト及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽腫細胞株のＰＧＥ２放出に対するマスリン酸とその誘導体の効果が測定された。
・  ＣＯＸ−２遺伝子の転写調節及び初代培養アストロサイトのＣＯＸ−２タンパクの発現に対するマスリン酸とその誘導体の効果が測定された。
・萎縮症、関節症、関節炎、線維筋痛、腱症に罹患した患者において、とりわけｉｎ  ｖｉｖｏにおける治療効果、特に局所投与による効果を証明する臨床試験が実施された。
【００２７】
時として、治療された患者に対する事前の診断はそれほど正確ではなく、時として、その症状は単に前述の診断に使用された手段であることを考慮に入れる必要がある。
【００２８】
ＣＯＸ−２の機能性とＰＥＧ２の産生がいくつかの段階で制御され、初代培養ヒト単球ではマスリン酸がＰＧＥ２の産生を阻害することから、特定の動物モデルを用いた実験の前の事前段階として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの異なった細胞株でＣＯＸ−２の発現や機能に対するこのトリテルペンの影響を詳細に検討した。ゆえに、最初に、ヒト軟骨細胞でのＣＯＸ−２誘導の阻害におけるマスリン酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用が示され、特に関節症、関節炎又は線維筋痛症の患者での臨床試験が実施され、これらの症候群を示す領域への簡単な局所投与においてさえ、マスリン酸及びその塩の驚くべき効果が示された。実際、６０歳未満の全ての関節症患者で、症状の改善が認められ、投与の１カ月以内に症状は完全に寛解した。それに加えて、すべての症例で、関節症候群特有の石灰化のゆるやかな再吸収が、まさに症状的に認められた。
【００２９】
８０％以上の症例において、症状に関する効果は、２４／４８時間内、２〜６回の局所投与で顕著に始まった。例えば指に明らかな炎症を有する患者の関節（痛みや硬直）における症状の改善の他に、投与された領域で数分後に体温が上昇し、患者が直ちに体験した血液循環の増加を明白に示した。
【００３０】
マスリン酸は、ＴＣＲを介して刺激されたＴリンパ球の活性化と増殖を抑制し、炎症性サイトカインであるＴＮＦα及びＩＬ−６の産生を抑制し、またそれ以外にも初代培養単球のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生を抑制するため、免疫応答の強力な免疫修飾物質であることが証明された。また、自然免疫及び獲得免疫反応に抑制的に作用するマスリン酸濃度は、腫瘍細胞株のアポトーシスを誘導する濃度よりも顕著に低いことが認められた。
【００３１】
本発明において得られた結果の結論について、実施例の欄では以下のことが示されている。
１．マスリン酸はヒト単球でのＰＧＥ２産生を抑制する。
２．マスリン酸はＣＯＸ−２の酵素活性を抑制する。
３．マスリン酸はＣＯＸ−２の遺伝子プロモーターの転写活性又はタンパク発現を抑制しない。
４．高用量のマスリン酸は軟骨細胞及び神経芽腫由来細胞のＰＧＥ２産生を抑制する。
５．マスリン酸はヒト単球でのイソプロスタン産生を抑制する。
６．マスリン酸はヒト単球と軟骨細胞でのＩＬ−６産生を抑制する。
７．マスリン酸によるＩＬ−６産生の抑制はＩＬ−６遺伝子の転写阻害によるものではない。
【００３２】
骨関節が関節軟骨及び毛細血管又は神経末端を含まない組織で覆われていることを考慮に入れなければならない。全容積の１〜２％を示し、その機能が細胞外マトリックスタンパクの合成である軟骨細胞を含む当該関節軟骨によって、関節運動の間、骨間の摩擦は最小化される。このマトリックスは７０〜８０％の水を含み、圧力緩和に役立つ構造を可能にしている。水分子と硫酸化ムコ多糖の静電的相互作用が、軟骨の水和の維持に必要である。したがって、ヒアルロン酸高分子によって円滑にされたプロテオグリカンは、軟骨保護を維持する物質である。グルコサミノグリカンとプロテオグリカンは、プロテオグリカンも産生する軟骨細胞によって産生されるコラーゲン繊維と密接な関係を維持する。
【００３３】
このすべてについて、本発明の最初の形態は、ＣＯＸ−２の活性化を含む疾患の治療用の薬物の製造のための、上で説明した広義のマスリン酸又はその誘導体のいずれかの使用について述べる。
【００３４】
本発明の別の形態は、軟骨細胞組織の再生も助ける薬物の製造のためのマスリン酸又はその誘導体のいずれかの使用について述べる。
【００３５】
本発明の好適実施形態では、ＣＯＸ−２の活性化を含む疾患、及び／又は、軟骨細胞組織再生が起こる疾患が以下のリストから選択される：関節症、リウマチ様関節炎、座骨神経痛、線維筋痛症、外反母趾又は中足指節関節の隆起（腱膜瘤）、膝蓋骨腱炎（ジャンパー膝）、ＣＯＸ−２に特異的なＮＳＡＩＤに反応する他の疾患。より多くの好適実施形態には関節症又はリウマチ様関節炎の治療のためのその使用が含まれる。
【００３６】
本発明の別の形態は、ＣＯＸ−２の活性化を含む疾患の治療のための広義のマスリン酸（塩、代謝物、それを含む植物の抽出物、植物又はその果実の工業的処理の副産物の抽出物、又はこれらの組成物のいずれかの工業副産物又は組み合わせ）又はその誘導体のいずれかを含む医薬品組成物について述べる。より詳しくは、このＣＯＸ−２阻害を介することは、ヒト又は動物の軟骨細胞でのＣＯＸ−２酵素の活性化を含む疾患の治療に有用である。
【００３７】
好適実施形態では、前記組成物はオレアノール酸及び／又は薬学的に許容できる媒体も含む。より好ましくはマスリン酸とオレアノール酸の比は２：１と６：１の間である。
【００３８】
マスリン酸、その塩、薬学的に許容できる誘導体又はそのプロドラッグは適当な薬学的組成で、治療として有効な量で、ひとつ以上の媒体、アジュバント又は薬学的に許容できる賦形剤と共に製剤化される。より詳しくは、マスリン酸又はマスリン酸とオレアノール酸の混合物は全組成の０．５〜１０％の間の割合であり、特に０．５〜５％の間であり、とりわけ１〜３％の間である。
【００３９】
この組成物は、例えば、腹腔内、経口、口腔内、直腸内、筋肉内、局所、皮下、関節内投与又は吸入などの異なった方法で投与できるが、これには限定されない。
【００４０】
より好ましくは、局所、皮下又は骨関節注入で投与される。別の好適実施形態では、前記組成物は局所投与に適合した形態で提供される。
【００４１】
各症例において、使用される投与方法に、この組成物を適合させる。したがって、上記の組成物は、タブレット、錠剤、カプセル、溶液、乳剤、クリーム、ボディーミルク、軟膏、吸入剤、スプレー剤、座薬又は臨床的に可能な他の投与形態で、治療上有効な量で提供されうる。より好ましくは、溶液、乳剤、クリーム、ボディーミルク又は軟膏の形態である。
【００４２】
別の好適実施形態では、この組成物には、オリーブ属の植物抽出物又はオリーブ属の植物の工業副産物から得られるマスリン酸又はその誘導体のいずれかが含まれる。
【００４３】
薬学的に許容できる誘導体とは、任意の塩、薬学的に許容できる、又は投与後にマスリン酸を直接的又は間接的に供与できる任意の他の化合物を意味する。
【００４４】
本明細書中で用いられる意味において、「薬学的に許容できる媒体」という表現は、薬学的な投与形態の製造に使用され、固体、液体、溶媒、界面活性剤などを含む製薬業界で公知のこれらの物質又は物質の組み合わせについて言及するものである。
【００４５】
本明細書及びクレームに従うと、「含む」という単語及びその変形は、他の技術的な特性、添加物、組成又はステップを除くことを意図しない。対象物についての専門家は、本発明の他の目的、利点及び特徴を本明細書から部分的に導き出し、発明の実施を部分的に形成する。以下の実施例及び図は例示として提供され、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４６】
次に、本発明者らによって実施された評価により本発明を示す。特に、マスリン酸の活性と有効性を明らかにし、上欄で一般的に記述したことを論証する。
【００４７】
全ての実施例について使用された化合物、材料及び方法を総じて説明する。
【００４８】
１．化合物
マスリン酸はナトリウム塩の形態で使用され、保存液（１０ｍＭと５０ｍＭ）としてＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）で溶解される。培養液中のＤＭＳＯの最終的な最大濃度は１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）であり、それは測定されるパラメータを干渉する濃度ではない。
【００４９】
２．細胞培養
・  末梢血の初代単球の単離と培養：健康成人のボランティアドナーから得られた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ法を用いた密度勾配による静脈血遠心によって単離した。その単球をプラスチックに接着させて分離し、その後、５０，０００細胞／ｍｌの密度で、酵素免疫測定（ＥＩＡ）実験のために２４穴プレートで培養し、イムノブロット法のために６穴プレートで培養した。
・  ヒト初代軟骨細胞の培養：軟骨細胞をＰｒｏｍｏｃｅｌｌ社（ハイデルベルク，ドイツ）から購入し、当該細胞のために調製された培養液で培養した。ＰＧＥ２とＩＬ−６を測定するために細胞を２４穴プレートで培養した。
・  ラットアストロサイトの初代培養：アストロサイトの初代培養は新生ラット（１日目）の脳から調製した。脳の上部を開放し、脳髄膜を繊維芽細胞と共に培養の汚染を避けるために慎重に分離した。大脳皮質を単離し、アストロサイト培養のために調製されたＤＭＥＭ培地で培養した細胞懸濁液を得た。培養を６穴プレートに広げ、３回又は４回継代したのち、細胞のＰＧＥ２産生を測定した。
・  細胞株の培養：ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞［米国ティッシュ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ），ＨＴＢ１１］はヒト神経芽腫由来の細胞株であり、２ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミン、抗生物質、１０％のＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で対数増殖期にある。細胞は５％のＣＯ２存在下、３７oＣで培養した。
【００５０】
３．ウエスタンブロット
細胞（初代単球又はＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞）を各事例で示されるように刺激し、５０μｌの溶解液［２０ｍＭヘペス（Ｈｅｐｅｓ）ｐＨ８．０，１０ｍＭ  ＫＣｌ，０．１５ｍＭ  ＥＧＴＡ，０．１５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，５ｍＭ  ＮａＦ，１ｍＭ  ＤＴＴ，ロイペプチン１mｇ／ｍｌ，ペプスタチン０．５mｇ／ｍｌ，アプロチニン０．５mｇ／ｍｌ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ及び０．５％  ＮＰ−４０］で溶解した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社，リッチモンド，ＣＡ，ＵＳＡ）でタンパク濃度を測定し、３０μｇのタンパクをＬａｅｍｍｌｉ溶液中で煮沸し、１０％のＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。分離したタンパクをニトロセルロース膜に１時間かけて転写した（０．５Ａ，１００Ｖ，４℃）。０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）２０と、５％スキムミルクを含むＴＢＳ中でこの膜をブロッキングした。異なるタンパクの免疫検出は、異なった一次抗体で２時間インキュベートした後、ペルオキシダーゼを結合した対応する二次抗体で１．５時間インキュベートし、化学発光システムＥＣＬ［ＧＥヘルスケアライフサイエンス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社］を用いて検出することで実施した。
【００５１】
４．一時的な感染とルシフェラーゼアッセイ
ＪｅｔＰｅｉ（商標）試薬［ポリプラス  トランスフェクション（ＰｏｌｙＰｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）社，フランス］を用いて、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にプラスミドＣＯＸ−２−ＬｕｃとＩＬ−６−Ｌｕｃを使用説明書に従ってトランスフェクションした。両プラスミドには転写活性化マーカーとしてルシフェラーゼ遺伝子を作動させる遺伝子プロモーターが含まれている。実験に依存したトランスフェクション後、細胞を最大２４又は４８時間通常の条件下で培養維持し、いずれの場合も同じ方法で刺激した。刺激後、細胞を溶解液［２５ｍＭリン酸トリスｐＨ７．８，８ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００，及び７％グリセロール］を用いて室温で１５分間溶解した。Ｐｒｏｍｅｇａ社（マディソン，ＷＩ，ＵＳＡ）のルシフェラーゼアッセイのシステム説明書に従って、タンパク抽出物中のルシフェラーゼ活性をルミノメーター  Ａｕｔｏｌｕｍａｔ  ＬＢ９５１０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用いて測定した。
【００５２】
５．異なった細胞タイプのＰＧＥ２産生とＣＯＸ−２活性の測定
培養した軟骨細胞、単球及びアストロサイトをいくつかの濃度のマスリン酸の存在下又は非存在下で、対応する活性化物質（ＩＬ−１，ＬＰＳ又はＰＭＡ＋ｌｏｎｏｍｉｃｉｎｅ）を用いて指示された時間刺激した。その後、上清を集め、刺激された細胞からのＰＧＥ２の放出量を測定した。使用説明書に従いＰＧＥ２をＡｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ社のＥＩＡシステム（カタログ番号９０１−００１）を用いて測定した。
【００５３】
ＣＯＸ−２活性を測定するために、最初に細胞をＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激し、ＣＯＸ−２タンパクの細胞発現を誘導した。その後、培養細胞を洗浄し、新しい無血清の培養液、マスリン酸（異なった濃度）及びアラキドン酸（ＡＡ）を添加し１５分間培養した。この間に、培養液中に含まれるアラキドン酸からのＰＧＥ２産生能によってＣＯＸ−２の酵素活性を測定した。
【００５４】
６．単球におけるイソプロタンとＩＬ−６産生の測定
培養単球をＰＧＥ２産生と同様の方法で刺激し（２４時間のＬＰＳ刺激）、細胞から放出された８−イソプロスタグランジンＦ２α（イソプロスタン）又はＩＬ−６のそれぞれの量をＣａｙｍａｎ社（ＵＳＡ）のＥＩＡシステム（カタログ番号５１６３５１）又はＰｅｌｉｋｉｎｅ社のＥＩＡシステム（カタログ番号ＲＤＩ−Ｍ１９１６ｃｌｂ）を用いて使用説明書に従い測定した。
【００５５】
実施例１
マスリン酸（ＭＡ）は、ＬＰＳ刺激した単球におけるＣＯＸ−２の酵素活性とＰＧＥ２産生を抑制する。
炎症の過程では、単球は特にＴＮＦα、ＩＬ−１β及びＩＬ−６などの多くの炎症誘発性サイトカイン及びロイコトリエン及びプロスタグランジンなどの炎症性メディエーターを産生する。マスリン酸（ＭＡ）は、末梢血から得られ、ＬＰＳ刺激されたヒト単球におけるＰＧＥ２産生を抑制することが証明されている（図１）。
【００５６】
ＰＧＥ２産生に対するマスリン酸の作用機序を特定し、その原因を調べ、その応用を予測するための非常に重要な側面を調べるために、ＣＯＸ−２遺伝子の転写活性及びタンパク発現におけるマスリン酸の影響を検討するための一連の実験を実施した。最初に、末梢血の単球を増殖可能濃度のマスリン酸存在下でＬＰＳ刺激し、１２時間後、ウエスタンブロット法によりＣＯＸ−２発現を検出するために、細胞成分を抽出し、電気泳動にかけた。図２では、マスリン酸がＬＰＳにより誘導されたＣＯＸ−２発現を抑制しなかったことが確認できる。
【００５７】
ＣＯＸ−２活性の阻害物質としてのマスリン酸作用の可能性に対して、本発明者らは、単球をＬＰＳで２４時間処理することによりＣＯＸ−２発現を誘導した。その後、細胞を無血清培地で３回洗浄し、増殖可能濃度のマスリン酸と１５分間インキュベートした。その後、アラキドン酸（１５μＭ）を培養物に添加し、さらに１５分間インキュベートし、ＥＩＡによってＰＧＥ２への変換を測定した。図３では、ＣＯＸ−２の酵素活性をマスリン酸が濃度依存的に阻害することが見られ、このことは、この細胞タイプでのＰＧＥ２産生に対するマスリン酸の影響を説明する（図３）。
【００５８】
実施例２
初代培養アストロサイトとＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞株（神経芽腫細胞）のＰＧＥ２産生におけるマスリン酸（ＭＡ）の２つの効果
次に、ＣＯＸ−２遺伝子プロモーターの転写活性及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞でのタンパク発現に対するマスリン酸の効果を検討した。これらの細胞にＣＯＸ−２遺伝子の完全プロモーターによって作動するルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドを一時的にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を増殖可能濃度のマスリン酸とインキュベートし、ＰＭＡ＋ｌｏｍｏｍｉｃｉｎｅで６時間刺激した。その後、細胞溶解液のルシフェラーゼ活性を測定し、ＣＯＸ−２遺伝子の転写活性にマスリン酸が影響を及ぼさないことが観察された（図５）。
【００５９】
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のＣＯＸ−２タンパクの誘導性発現はマスリン酸の存在に影響されなかった（図６）。
【００６０】
実施例３
ＩＬ−１で刺激されたヒト軟骨細胞のＰＧＥ２及びＩＬ−６産生におけるマスリン酸（ＭＡ）の影響
炎症の現象に関与する他の細胞タイプのＰＧＥ２産生に対してもマスリン酸が影響を及ぼすかどうかを調べるために、初代培養ヒト軟骨細胞に対するマスリン酸の抗炎症活性を検討した。細胞を増殖可能濃度のマスリン酸で処理し、その後、ＩＬ−１（１０Ｕ／ｍｌ）で刺激し、ＰＧＥ２及びＩＬ−６放出を測定した。図７に、軟骨細胞をＩＬ−１で刺激した後のＰＧＥ２産生に対してマスリン酸が２つの効果を有することが示されている（図７）。低用量（０．１及び１μｇ／ｍｌ）ではＰＧＥ２産生は増加し、一方、高用量（２５及び５０μｇ／ｍｌ）ではＩＬ−１により誘導されたこのプロスタグランジンの放出が完全に阻害された。
【００６１】
これに対して、同様の細胞でＩＬ−６産生はマスリン酸によって完全に抑制され、それは濃度依存性であった（図８）。
【００６２】
これらの結果は、以前、ＬＰＳにより誘導されるＩＬ−６がマスリン酸によって抑制されるというヒト単球で見られた結果と完全に一致している（図９）。
【００６３】
次に、ＩＬ−６放出に対するマスリン酸の抑制効果が前記タンパクをコードしている遺伝子の転写に対する作用のためであるかどうかを検討した。すなわち、ＩＬ−６を産生するＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に、ＩＬ−６の完全プロモーターによって作動するルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクションし、増殖可能濃度のマスリン酸の存在下又は非存在下でＩＬ−１又はＰＭＡ＋ｉｏｎｏｍｙｃｉｎの組み合わせで刺激し、処理の４時間後の細胞抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定した。図１０と図１１では、マスリン酸がＩＬ−１プロモーターの転写活性を阻害せず、ＩＬ−６放出に対する阻害活性は確実に転写後レベルでの阻害であることが示される（図１０及び図１１）。
【００６４】
実施例４
ＬＰＳ刺激されたヒト単球でのイソプロスタン産生に対するマスリン酸（ＭＡ）の効果
エンドペルオキシド８−イソプラスタグランジンＦ２α（８−ｉｓｏ−ＰＧＦ２α）などのイソプロスタンはアラキドン酸の酸化代謝物であり、最近では、酸化ストレスの最も良いマーカーの１つであると考えられている。図１２は、マスリン酸が、ＬＰＳ刺激後の末梢血のヒト単球で産生された８−ｉｓｏ−ＰＧＦ２α放出を濃度依存的に抑制することを示している（図１２）。このデータにより、以前、本発明者らによって示されたマスリン酸の抗酸化作用が確認される。イソプロスタン産生に対するマスリン酸の阻害効果はトコフェロールやトロロックスよりも強く、レスベラトロールと同等である（図１３）。
【００６５】
実施例５
マスリン酸のナトリウム塩及び種々の割合の混合物、マスリン酸のナトリウム塩とオレアノール酸及び種々の割合のマスリン酸とオレアノール酸（マスリン酸７０〜８５％、オレアノール酸３０％〜１５％）の局所投与による臨床試験を実施した。塩を用いた場合、局所投与はボディーミルクに十分に分散させ、遊離酸の場合、ｂｅｅｌｅｒ基剤をその投与に使用した。オレアノール酸とマスリン酸に濃縮されたオリーブ粉砕物の残渣抽出物と同様にボディーミルクには約０．５〜１．５％の有効成分（塩）が含まれ、クリームには約１．５〜２．５％の有効成分（遊離酸）が含まれた。
【００６６】
通常の実験方法に従い、メタノール中のＭｅＯＮａ又はＮａＯＨ溶液を用いた基本的な処理によってナトリウム塩を得た。
【００６７】
局所投与によって得られた結果のいくつかを表１に示す。
【００６８】
【表１】
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【００６９】
結果において「有効」とは、局所投与１２〜２４時間後の不快感の明らかな減少と関節の柔軟性のかなりの増加を意味し、軟骨領域の有効な抗炎症剤効果を示す。いくつかの症例では、症状の消失は持続的であり、軟骨細胞の再生が示されている。症状に関する効果が、多く症例において最初の投与で認められたのは驚くべきことである。
【００７０】
１００人以上の患者中、２例だけが「無効」と明確に評価された。まず１例目は、膝と足に２０年以上の関節症の病歴がある６０歳女性であり、投与２ヶ月後に、彼女は足の不快感の顕著な改善を報告した。もう１例は、膝に重症の不快感を有する８５歳を超えた男性であり、治療における改善についての通知はなかった。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図２】
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【国際調査報告】
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