(57)【要約】  本発明は、総脂肪酸含量のうち約７〜２６重量％の含量でアラキドン酸を含み、アラキドン酸とγ−リノレン酸との重量パーセント比が約１：１〜約５：１であり、アラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸との重量パーセント比が約１：１〜約５：１である植物種子油に関する。本発明はさらに、該植物種子油の製造方法ならびに該植物種子油の配合物および使用に関する。特に、本発明は、該植物種子油を含有する食品およびベビーフードを利用可能にする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
総脂肪酸含量のうち約７〜約２６重量％を構成するアラキドン酸を含み、アラキドン酸とγ−リノレン酸との重量パーセント比が約１：１〜約５：１であり、アラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸との重量パーセント比が約１：１〜約５：１である植物種子油。
【請求項２】
リノール酸とα−リノレン酸との重量パーセント比が約３：１〜約１２：１である、請求項１に記載の植物種子油。
【請求項３】
アラキドン酸とエイコサペンタエン酸との重量パーセント比が約３：１〜約７：１である、請求項１または２に記載の植物種子油。
【請求項４】
ステアリドン酸をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物種子油。
【請求項５】
ステアリドン酸が総脂肪酸含量の約０．１〜約１重量％を構成して存在する、請求項４に記載の植物種子油。
【請求項６】
配列番号１５、１６または１７に示される核酸構築物を用いて形質転換されたトランスジェニック植物から取得可能である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の植物種子油。
【請求項７】
パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸を含む脂肪酸スペクトルを含む、植物種子油。
【請求項８】
総脂肪酸含量に基づき、約３．２〜５．３％のパルミチン酸、約２．２〜５．３％のステアリン酸、約１０〜２５％のオレイン酸、約２２〜３６％のリノール酸、約４〜１２％のγ−リノレン酸、約３〜８％のα−リノレン酸、約０．２〜１％のステアリドン酸、約３〜９％のジホモ−γ−リノレン酸、約１２〜２５％のアラキドン酸および約１〜４％のエイコサペンタエン酸を含む、請求項７に記載の植物種子油。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物種子油と、植物油、微生物油および魚油からなる群より選択される少なくとも１種のさらなる油とを含む配合物または混合油であって、該植物油、微生物油または魚油はドコサヘキサエン酸を含む、上記配合物または混合油。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物種子油または請求項９に記載の配合物もしくは混合油を含む食品。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物種子油または請求項９に記載の配合物もしくは混合油を含むベビーフード。
【請求項１２】
以下のステップ：
（ａ）配列番号１５、１６または１７に示される核酸構築物を用いた形質転換によりトランスジェニック植物を作製するステップ、
（ｂ）植物種子油の生合成を可能にする条件下でステップ（ａ）からのトランスジェニック植物を栽培するステップ、および
（ｃ）植物種子を回収し、植物種子油を抽出および精製するステップ
を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の植物種子油の製造方法。
【請求項１３】
前記植物種子油を、油、脂質または脂肪酸組成物として配合するステップ（ｄ）をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記油、脂質または脂肪酸組成物をさらに配合して食品、好ましくはベビーフードを提供する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
食品、好ましくはベビーフード、化粧品、および飼料、好ましくは魚飼料、または医薬品の製造のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載されるかもしくは請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法により製造される植物種子油の、または請求項１１に記載の配合物もしくは混合油の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、総脂肪酸含量のうち約７〜約２６重量％を構成するアラキドン酸を含み、アラキドン酸とγ−リノレン酸との重量パーセント比が約１：１〜約５：１であり、かつアラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸との重量パーセント比が約１：１〜約５：１である、植物種子油に関する。本発明はさらに、該植物種子油の製造方法ならびに該植物種子油の配合物および使用にも関する。特に、本発明はまた、上記植物種子油を含む食品およびベビーフードを利用可能にする。
【背景技術】
【０００２】
アラキドン酸（ＡＲＡ）は、ω−６（ｎ−６）クラスの長鎖多価不飽和脂肪酸（Ｃ２０：４ ５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）である。以下、多価不飽和脂肪酸を、ＰＵＦＡ、ＰＵＦＡｓ、ＬＣＰＵＦＡまたはＬＣＰＵＦＡｓ（poly unsaturated fatty acids, ＰＵＦＡ； long chain poly unsaturated fatty acids, ＬＣＰＵＦＡ）と表す。
【０００３】
ＡＲＡは、ヒト血漿中に最も頻繁に存在するＣ２０−ＰＵＦＡである（Siguel and Schaefer (1988) Aging and nutritional requirements of essential fatty acids. In: Dietary Fat Requirments in Health and Development (Beare-Rogers, 編) pp 163-189, American Oil Chemist's Society, Champaign, IL.）。アラキドン酸は、特に、器官、筋肉および血液組織に存在し、そこで、血液、肝臓、筋肉および他の重要な器官系のリン脂質と主に関連している構造脂質として重要な機能を果たす。構造脂質としてのその主要な機能に加えて、ＡＲＡはプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、プロスタサイクリンＩ２（ＰＧＩ２）、トロンボキサンＡ２（ＴｘＡ２）およびロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）およびＣ４（ＬＴＣ４）などの一連の循環エイコサノイドの直接の前駆体としても働く。これらのエイコサノイドは、成長制御、炎症性防御反応、血液流動学、血管緊張、白血球機能および血小板活性化に影響する（Calder 2006, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 75:197-202; Roland et al. 2004, Mini Rev Med Chem. 4:659-68）。
【０００４】
すべての授乳期のヒトの母乳はかなりの割合のＡＲＡを含む。これは総計で総脂肪酸含量の約０．２〜１．０％に達する（Brenna et al. 2007 AJCN 85:1457）。その濃度は、授乳期、母の栄養状態および環境条件に依存する。したがって、「World Association of Perinatal Medicine」、「Early Nutrition Academy」、「Child Health Foundation」、「World Health Organization」、「British Nutrition Foundation」、「European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition」、および「International  Society  for the  Study of Fatty Acids and Lipids」などの組織は、母乳栄養が選択肢でない場合、とりわけＡＲＡを添加したベビーフードの使用を推奨する（Koletzko et al. 2008, J Perinat Med. 2008;36:5-14; Diersen-Schade et al. 2005 Lipid Technology 17:225）。同時に、ＡＲＡは、ますます多くの乳児食製造者によって、乳児食を母乳に適合させるために添加されている。興味深いことに、母乳中のＡＲＡの濃度は、一般に、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の濃度（総脂肪酸含量の０．１〜１．０％以上）未満で変動する（Diersen-Schade 2005 LipTech 17:225; Innis 2007 ProcNutrSoc 66:397; Brenna et al. 2007 AJCN 85:1457）。それは、乳児食に必要なＡＲＡ含量が利用可能であるように、より厳密な生理学的調節に注意を向ける。
【０００５】
ＡＲＡが出生前、分娩前後、および出生後の段階の乳児に提供する潜在的な健康上の利点は、脳の発達および機能およびさらに眼の発達向上の促進にある（Diersen-Schade et al. 2005 Lipid Technology 17:225）。「World Association of Perinatal Medicine」、「Early Nutrition Academy」および「Child Health Foundation」によって推奨される保健医療の同意推奨および実施ガイドラインは、ベビーフードに伴うＡＲＡの適切な摂取の重要性を強調する（Koletzko et al. 2008, J Perinat Med. 2008;36:5-14）。特に胎児および新生児は、最適な視覚発達および認知発達を支援するために適切な量のＬＣ−ＰＵＦＡを摂取するべきである。年齢約２歳までの新生児では、ＡＲＡでの栄養補充によって利益が生じるとされている。
【０００６】
２００１年５月から、ＡＲＡを添加した乳児食はもはやニッチな製品ではなくなった。その理由は、先進国でＡＲＡがほとんど義務的な乳児乳成分になったからである。この展開は、米国「Food and Drug  Administration」（ＦＤＡ）が、ＤＨＡＳＣＯ（登録商標）（ＤＨＡ、Crypthecodinium cohnii）およびＡＲＡＳＣＯ（登録商標）（ＡＲＡ、Mortierella alpina）油混合物の乳児食での使用に関して、Martek's GRAS分類に肯定的な査定を与えた点でも支援された。略語「GRAS」は、本明細書中で、「Generally Recognized as Safe（一般に安全と認識される）」、すなわち食品中での使用に安全である分類を示す。乳児乳、ゆえにＡＲＡ市場へのＡＲＡの添加は、一方で、市場（Martek）の影響の発揮によって促進され、一方では、乳児の発達に関するＡＲＡの潜在的な健康上の利点がますます認識された事実によって促進された。
【０００７】
ＡＲＡ以外に、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）も、乳児食に添加されるべき重要な脂肪酸である。ＤＨＡはヒトの母乳中に存在し、成長中の乳児の脳、神経組織および眼の発達が支援されるとされている。有効濃度のＤＨＡの添加は、予定の時期に生まれた乳児の場合および時期尚早で生まれた乳児の場合の両方で、視力の認知発達を向上させることが示された。
【０００８】
ＡＲＡおよびＤＨＡに加えて、母乳はさらに高級の不飽和脂肪酸を含む。該高級不飽和脂肪酸は十分には研究されていないが、同様に乳児の発達に大きな役割を果たす。これらの脂肪酸は、例えば、γ−リノレン酸（ＧＬＡ、総脂肪酸含量の０．１〜０．２％）、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、総脂肪酸含量の０．２〜０．４％）、ステアリドン酸（stearidonic acid）（ＳＤＡ、総脂肪酸含量の０．１％まで）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、総脂肪酸含量の０．０５〜０．３％）である（Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8）。代替食を母乳にできるだけ適合させるために、これらの高級不飽和脂肪酸を乳児食の脂質内容物に組み入れることが重要である。
【０００９】
高級不飽和ｎ−６−脂肪酸ＧＬＡおよびＤＧＬＡの役割は、現在、調査中である。母乳中のＧＬＡおよびＤＧＬＡの存在は、ＡＲＡとは独立に、それらが養育中の乳児の発達に重要であることを支持する。研究では、乳児のｎ−６脂肪酸はヒト組織の脂質への生理学的組み込みにおいて互いに競合することが示されている（Al et al. 2008, Am J Clin Nutr 71:285S-91S）。したがって、妊娠中および授乳期間中の母親の場合にバランスのとれた脂肪酸パターンを可能にすることが重要である（Geppert et al. 2008, Br. J. Nutrition 99: 360-9）。
【００１０】
早期のＧＬＡ追加投与の潜在的利点には、よくある遺伝的皮膚障害であるアトピー性皮膚炎またはアトピー性湿疹を患っている乳児の場合での生まれた年の総ＩｇＥ値の低下が含まれる（Demmelmair H., Feldl F., Horvath I. et al. Influence of formulas with borage oil or borage oil plus fish oil on the arachidonic acid status in premature infants, Lipids 2001; 36:555-66. Kitz R., Rose MA., Schonborn H., Zielen S., Bohles HJ. Impact of early dietary gamma-linolenic acid supplementation on atopic eczema in infancy. Pediatr. Allergy Immunol. 2006, 17:112-7）。また、アトピー性皮膚炎の高い家族性リスクを有する子供でのＧＬＡの追加投与によって、後期乳児期に該障害を制御下で維持できる傾向が見られる（van Gool et al. 2003, Am J Clin Nutr 77:943）。食物に添加されたＧＬＡによってアトピー性湿疹の頻度に影響を与えるかまたは該頻度を減少させることはできない（Kritz et al. 2006）が、アトピー性湿疹を患っている子供の場合の総ＩｇＥ値は、生まれた年のＧＬＡの追加投与の結果、減少するようである（Kritz et al. 2006）。ＤＧＬＡは、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）およびさらに一連の３つのプロスタグランジンの合成の前駆体である（Das 2008, Lipids in Health and Disease 7:9）。ベビーミルクへのＤＧＬＡ添加の他の利点も示された。例えば、ＤＧＬＡはシクロオキシゲナーゼ活性化とは無関係にヒト末梢血単核細胞でのサイトカイン生産に影響する（Dooper et al. 2003 Immunology 110:348-57）。これは、新生児にとって同様に重要な、ＤＧＬＡによる免疫機能の強化を指摘する。さらに、新生児食中のＤＧＬＡおよびＡＲＡの濃度の増加は、母と子との間のＨＩＶウイルス伝達のリスクを減少させる（Villamor et al. 2007 Am J Clin Nutr 86:682-689）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Siguel and Schaefer (1988) Aging and nutritional requirements of essential fatty acids. In: Dietary Fat Requirments in Health and Development (Beare-Rogers, 編) pp 163-189, American Oil Chemist's Society, Champaign, IL.
【非特許文献２】Calder 2006, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 75:197-202
【非特許文献３】Roland et al. 2004, Mini Rev Med Chem. 4:659-68）
【非特許文献４】Brenna et al. 2007 AJCN 85:1457
【非特許文献５】Koletzko et al. 2008, J Perinat Med. 2008;36:5-14
【非特許文献６】Diersen-Schade et al. 2005 Lipid Technology 17:225
【非特許文献７】Innis 2007 ProcNutrSoc 66:397
【非特許文献８】Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8
【非特許文献９】Al et al. 2008, Am J Clin Nutr 71:285S-91S
【非特許文献１０】Geppert et al. 2008, Br. J. Nutrition 99: 360-9
【非特許文献１１】Demmelmair H., Feldl F., Horvath I. et al. Influence of formulas with borage oil or borage oil plus fish oil on the arachidonic acid status in premature infants, Lipids 2001; 36:555-66.
【非特許文献１２】Kitz R., Rose MA., Schonborn H., Zielen S., Bohles HJ. Impact of early dietary gamma-linolenic acid supplementation on atopic eczema in infancy. Pediatr. Allergy Immunol. 2006, 17:112-7
【非特許文献１３】van Gool et al. 2003, Am J Clin Nutr 77:943
【非特許文献１４】Das 2008, Lipids in Health and Disease 7:9
【非特許文献１５】Dooper et al. 2003 Immunology 110:348-57
【非特許文献１６】Villamor et al. 2007 Am J Clin Nutr 86:682-689
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ゆえに、乳児の最適な発達を支援するために乳児が長鎖多価不飽和脂肪酸を適切に摂取することを可能にするベビーフードの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この技術的問題は、総脂肪酸含量のうち約７〜約２６重量％を構成するアラキドン酸を含み、アラキドン酸とγ−リノレン酸との重量パーセント比が約１：１〜約５：１であり、かつアラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸との重量パーセント比が約１：１〜約５：１である、植物種子油によって解決される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＬＣ−ＰＵＦＡの合成の代謝経路である。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｃは、Brassica napusの形質転換のために構築されたＴプラスミドのプラスミド地図である。割り当てられた配列は、配列番号１５（図２Ａ）、１６（図２Ｂ）および１７（図２Ｃ）に示される。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｃは、Brassica napusの形質転換のために構築されたＴプラスミドのプラスミド地図である。割り当てられた配列は、配列番号１５（図２Ａ）、１６（図２Ｂ）および１７（図２Ｃ）に示される。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｃは、Brassica napusの形質転換のために構築されたＴプラスミドのプラスミド地図である。割り当てられた配列は、配列番号１５（図２Ａ）、１６（図２Ｂ）および１７（図２Ｃ）に示される。
【図３Ａ】図３Ａは、非トランスジェニックアブラナ（Brassica napus）のガスクロマトグラフィーによる脂肪酸分析のクロマトグラムである。ピークに、割り当てられた脂肪酸で注釈し、命名法は表５で説明する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、構築物ＶＣ−ＬＪＢ９１３−１ｑｃｚ（配列番号１５）で形質転換されたトランスジェニックアブラナ（Brassica napus）のガスクロマトグラフィーによる脂肪酸分析のクロマトグラムである。ピークに、割り当てられた脂肪酸で注釈し、命名法は表５で説明する。
【図４】図４は、油の超臨界ＣＯ２抽出のパイロットプラントスケッチを示す図である。
【図５】図５は、液体形式の乳児食の製造を示す図である。
【図６】図６は、完全噴霧による乳児食の製造（最終製品）を示す図である。
【図７】図７は、母乳中の脂肪酸比である。値を個々の国に関して平均し、国の平均中のそれぞれの最大または最小の比を示した（Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以前に実施された、例えばＷＯ２００５／０８３０９３またはKajikawa et al.（Biosci. Biotechno. Biochem., 72, 70549-1-10, 2008）のようなトランスジェニック植物でのアラキドン酸の製造または微生物由来の油、例えばMortierella alpina由来の油の製造のための実験とは対照的に、本発明の植物種子油は驚くべき新規特性を有する。特に、上記の本発明の植物種子油は、母乳中にも存在するような、脂肪酸アラキドン酸（ＡＲＡ）とγ−リノレン酸（ＧＬＡ）との定量比ならびにアラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）との定量比を有する。母乳中では、アラキドン酸（ＡＲＡ）とγ−リノレン酸（ＧＬＡ）との比は約２：１〜４：１であり、アラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）との比は約１：１〜２：１である（Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8）。図７は、この母乳中の脂肪酸比についての点に関する調査を記載する。
【００１６】
本発明の植物種子油では、アラキドン酸とγ−リノレン酸との重量パーセント比は約１：１〜約５：１であり、アラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸との重量パーセント比は約１：１〜約５：１である。
【００１７】
特に記載しない限り、本明細書中に記載の比はそれぞれの脂肪酸の重量パーセント比に関する。
【００１８】
ゆえに、本発明の植物種子油は、生理学的に正の効果を有する高含量のアラキドン酸に加えて、アラキドン酸とＧＬＡおよびアラキドン酸とＤＧＬＡとの有利な比をさらに提供する。アラキドン酸に加えて、ＧＬＡおよびＤＧＬＡは母乳の脂肪部分の重要な成分である（Wang et al. Pediatrics International 2000, 42(1):14-20; Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8）。最も最近の研究では、さらに、乳児のｎ−６脂肪酸はヒト組織の脂質への生理学的組み込みにおいて互いに競合することが示されている（Geppert et al. 2008, Br. J. Nutrition 99: 360-9）。したがって、乳児食中のバランスのとれた脂肪酸比だけが乳児の最適な成長および最適な発達を可能にする。ゆえに、本発明の植物種子油を用いて、母乳の脂肪酸組成に非常に近い組成を取得することが可能であった。
【００１９】
アシル−ＣｏＡ−依存的Δ−６デサチュラーゼを発現するトランスジェニック植物の作製によって、母乳に非常に近いこのアラキドン酸とＧＬＡとの比およびアラキドン酸とＤＧＬＡとの比を達成することが可能であった。このΔ−６デサチュラーゼはOstreococcus tauri由来である。本発明の核酸構築物中に存在する特定のプロモーターと遺伝子の組み合わせでのこの酵素の使用のみが、先行技術に記載の油と比較して低含量のγ−リノレン酸およびジホモ−γ−リノレン酸によって初めて特徴づけられる植物種子油の生産を可能にした。例えばＷＯ２００５／０８３０９３で使用および記載されるような公知のΔ６−デサチュラーゼは、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、またはホスファチジルグリコールなどのリン脂質でｓｎ−２位がエステル化されたリノール酸を基質として使用する。Ostreococcus tauri由来のΔ６−デサチュラーゼでは、ＷＯ２００６／０６９７１０に記載のように、酵母モデル研究で異なる基質利用性を示すことが可能であった。今度は、以下および実施例でさらに記載される本発明の核酸構築物をアブラナ（Brassica napus）の形質転換のために調製し、この特性を有するトランスジェニックアブラナ植物を作製した。驚くべきことに、これらの植物の種子油は低含量のＧＬＡおよびＤＧＬＡを示し（図３Ｂおよび表３）、それから、以下の合成手順を導くことができる：Δ６−デサチュラーゼはリノール酸−ＣｏＡを基質として使用する。生成物γ−リノール酸−ＣｏＡをΔ６−エロンガーゼ（elongase）によって基質として直接反応させて、ジホモ−γ−リノレン酸−ＣｏＡを得る。伸長反応の生成物をリン脂質のｓｎ２位でアシルトランスフェラーゼによって変換させ、Δ５−デサチュラーゼによって反応させて、アラキドン酸−ホスファチジルコリン、または上記の他のリン脂質を得る。アシルトランスフェラーゼを利用して、アラキドン酸をトリアシルグリセリド（すなわち油）に変換させると、それは種子油の成分である。
【００２０】
特に、プロモーターと遺伝子の活性に対応する合成の中間産物の濃度が影響を受けると示すことが可能であった。本明細書中に記載の本発明の核酸構築物では、本発明は、母乳に類似の脂肪酸組成を有し、したがってベビーフードの生産に好適な植物種子油の生産のためのプロモーターと遺伝子の組み合わせを特定する。これは、配列番号１５、１６、および１７の本発明の核酸構築物中に存在する特定のプロモーターと遺伝子の組み合わせを用いてしか達成できなかった。
【００２１】
本発明の植物種子油は、乳児乳または他の乳児用食品に種々の濃度で使用することができる。本明細書中で指定される濃度および配合では、本発明の植物種子油は、従来使用されているすべての製品と比べて、母乳の脂肪酸プロファイルに最も近い脂肪酸プロファイルを有する。ゆえに、本発明の植物種子油は、代替食を母乳にできるだけ適合させるために、乳児食の脂質部分に高級不飽和脂肪酸を直接組み入れることを可能にする。その有利なＡＲＡ、ＧＬＡおよびＤＧＬＡ含量の結果、新生児（newborn infant）または乳児の、特に神経系および眼およびさらに免疫系の、健全な発達を確実にするために、本発明の植物種子油は新生児および年齢約２歳までの乳児の食物に特に適している。本発明の植物種子油を限られた数の植物油および、微生物油または魚油などの非植物油と混合または配合することによって、代替食を母乳の脂肪酸パターンとさらに良好に適合させることを達成できる。本発明の植物種子油は、さらに、とりわけ乳児食に使用されるアブラナまたはナタネ油のバックグラウンド脂肪酸プロファイルに類似のバックグラウンド脂肪酸プロファイルを有する。本発明の植物種子油は、それにより、現在最も使用されているＡＲＡ供給源ＡＲＡＳＣＯ（登録商標）より、ＡＲＡ供給源として良好に適している。例えば、ＡＲＡＳＣＯ（登録商標）は、ヒト母乳と大きく異なる脂肪酸、例えば、Ｃ２２：０、Ｃ２４：０およびＣ２２：５ ｎ−６を３％までの濃度で含む（Australia New Zeland Food Authority 2002, Proposal P93 - Review Of Infant Formula, Supplementary Final Assessment (Inquiry - S.24), Report, 08/02）。本発明の植物種子油は、これらの脂肪酸がＡＲＡＳＣＯ（登録商標）より明らかに少なく、さらに、大量のＣ１８：１ ｎ−９を含む。これは母乳中で最もよくある脂肪酸である（Innis & King, Am J Clin Nutr 1999, 70:383-90）。
【００２２】
本発明の植物種子油は、Mortierella alpinaもしくはCrypthecodinium cohnii由来の微生物油またはサケ、クジラもしくは卵黄由来の魚油などの先行技術に記載の慣用の油とは対照的に、アラキドン酸およびγ−リノレン酸ならびにさらにアラキドン酸およびジホモ−γ−リノレン酸が母乳の比に最も近い良好にバランスのとれた比で初めて存在する点で顕著である。以下の実施例の表４は、アラキドン酸を天然に産生するかまたは代謝経路の遺伝子中に導入された種々の生物由来の油と比較した、本発明の植物種子油中の脂肪酸の上記定量比の典型的な調査を記載する。そして、ＷＯ２００５／０８３０９３に記載のBrassica juncea由来の種子油では、脂肪酸アラキドン酸（ＡＲＡ）とγ−リノレン酸（ＧＬＡ）との比は約１：１以上（approximately 1:1 and greater than 1:1）(すなわち、ＧＬＡはＡＲＡより多い）であり、アラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）との比は約１：５以下（すなわち、ＤＧＬＡはＡＲＡより比１：５よりさらに少ない）である。Marchantia polymorpha由来の油では、脂肪酸アラキドン酸（ＡＲＡ）とγ−リノレン酸（ＧＬＡ）との比は約１：４〜１：５であり、アラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）との比は約１：１０以上（すなわち、ＤＧＬＡはＡＲＡより比１：１０よりさらに少ない）である。ダイズ（Glycine max）由来の油では、脂肪酸アラキドン酸（ＡＲＡ）とγ−リノレン酸（ＧＬＡ）との比は約０．１：１〜０．１５：１であり、アラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）との比は約０．１８：１〜０．２：１である。ダイズ（Glycine）由来の油中のアラキドン酸含量は２〜３％である。その理由は以前の方法ではいかなる商業的に利用可能なアラキドン酸含量も生じさせることができなかったからである。Mortierella alpina由来の油（Suntory TGA40）では、脂肪酸アラキドン酸（ＡＲＡ）とγ−リノレン酸（ＧＬＡ）との比は１０：１より大きく、アラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）との比も同様に１０：１より大きい。
【００２３】
しかし、母乳中では、アラキドン酸（ＡＲＡ）とγ−リノレン酸（ＧＬＡ）との比は約２：１〜約４：１であり、アラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）との比は約１：１〜約２：１である（Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8）。
【００２４】
本発明の植物種子油では、アラキドン酸とγ−リノレン酸との重量パーセント比は約１：１〜約５：１であり、アラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸との重量パーセント比は約１：１〜約５：１であり、これは、母乳中にも存在する範囲内の初めての重量パーセント比である。
【００２５】
ゆえに、本発明は、総脂肪酸含量のうち約７〜約２６または７〜２６重量％の含量を有するアラキドン酸を含み、アラキドン酸とγ−リノレン酸との重量パーセント比が約１：１〜約５：１または１：１〜５：１であり、かつアラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸との重量パーセント比が約１：１〜約５：１または１：１〜５：１である、植物種子油に特に関する。
【００２６】
本発明の植物種子油中のアラキドン酸含量は、総脂肪酸含量中の約７〜約２６重量％の範囲または７〜２６重量％の範囲、好ましくは約１０〜約２６重量％の範囲または１０〜２６重量％の範囲、さらにより好ましくは約１２〜約２６重量％の範囲または１２〜２６重量％の範囲、または約１５〜約２６重量％の範囲または１５〜２６重量％の範囲である。特に好ましくは、本発明の植物種子油中のアラキドン酸含量は総脂肪酸含量の１５重量％である。そのような油の組成は以下および実施例でさらに記載される。
【００２７】
本発明の植物種子油の好ましい実施形態では、リノール酸とα−リノレン酸との重量パーセント比は約３：１〜約１２：１または３：１〜１２：１であり、好ましくは約４：１〜約１２：１または４：１〜１２：１であり、さらにより好ましくは約５：１〜約１２：１または５：１〜１２：１であり、または約６：１〜約１２：１または６：１〜１２：１である。
【００２８】
本発明の植物種子油は、母乳と同様に、必須脂肪酸リノール酸およびα−リノレン酸を含む。リノール酸とα−リノレン酸との比に関して、本発明の植物種子油は、ダイズ油またはヒマワリ油などの、乳児食品中で主に使用される油を補う。本発明の植物種子油によって補われた乳児栄養製品は、母乳中に存在するリノール酸とα−リノレン酸との比に非常に近くなる。ここに該比は約７：１〜１８：１である（Yuhas et al. 2006 Lipids 41: 851-8）。
【００２９】
本発明の植物種子油のさらに好ましい実施形態では、アラキドン酸とエイコサペンタエン酸との重量パーセント比は約３：１〜約７：１または３：１〜７：１であり、好ましくは約４：１〜約７：１または４：１〜７：１であり、さらにより好ましくは約５：１〜約７：１または５：１〜７：１であり、かつさらに、約２：１〜約７：１の、母乳中に存在するＡＲＡ：ＥＰＡの比をここに反映する（Yuhas et al. 2006 Lipids 41: 851-8）。
【００３０】
別の実施形態では、本発明の植物種子油はまた、脂肪酸ステアリドン酸を含む。好ましくは、ステアリドン酸は、総脂肪酸含量の約０．１〜約１または０．１〜１重量％の含量で存在し（特に乳児食中で使用される場合）、好ましくは約０．３〜約１または０．３〜１重量％の含量で存在し、または約０．４〜約１または０．４〜１重量％の含量で存在し、特に好ましくは約０．５〜約１または０．５〜１重量％の含量で存在する。
【００３１】
油の仕様の測定では、生物の個別の発生、消化および抽出プロセスならびに精度を測定する装置に基づく変動範囲が常に適用される。本明細書中に記載の比は、この理由で、用語「約（approximately）」、「約（about）」、または「例えば」によって言及される。
【００３２】
ジホモ−γ−リノレン酸、ＡＲＡおよびＥＰＡは生物活性エイコサノイドの前駆体である（Das 2008 Lipids Health Dis. 7:9）。これは、代謝がまだ十分には発達していない早産児および新生児に特に重要である。ＡＲＡおよびＤＨＡは特定の膜リン脂質の重要な成分であり、神経系、網膜および視覚機能の発達に非常に重要である。ＳＤＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡは母乳に含まれ、したがって早産児および乳児の最初の食物（starting foods）の必須成分である（Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8）。ゆえに、本発明の植物種子油は高含量のＡＲＡを初めて含むだけでなく、先行技術で以前に記載されるすべての油より、バランスのとれたＡＲＡとＧＬＡおよびＤＧＬＡとの比を含む。必須脂肪酸リノール酸およびα−リノレン酸およびさらに高級不飽和脂肪酸ＳＤＡおよびＥＰＡとともに、本発明の植物種子油は、同様に母乳中に存在するさらなる成分を含む。例えば、以下でさらに詳細に記載される他の油と混合することによって、ＤＨＡを加えることができる。本発明の油のバックグラウンド脂肪酸プロファイルは、ゆえに、母乳の脂肪酸組成に非常に近づく。
【００３３】
さらに好ましい実施形態では、植物種子油をトランスジェニック植物から取得する。
【００３４】
用語「トランスジェニック」とは、異種ポリヌクレオチド、すなわちそれぞれの植物に天然には存在しないポリヌクレオチドが植物に挿入されていることを意味すると理解されるものとする。これは、ポリヌクレオチドのランダム挿入または相同組み換えによって達成することができる。当然、ポリヌクレオチドの代わりにベクターを挿入することもできる。ランダム挿入または相同組み換えの目的でポリヌクレオチドまたはベクターを挿入するための方法は先行技術において公知であり、以下でもさらに詳細に記載される。ポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞を同様に植物に挿入して、トランスジェニック植物を得ることができる。しかし、そのような植物はキメラ植物であり、挿入された細胞由来の細胞のみがトランスジェニックであり、すなわち異種ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、配列番号１５、１６または１７に示される本発明の核酸構築物をトランスジェニック植物に挿入する。
【００３５】
好ましくは、トランスジェニック植物は油産生植物であり、すなわち油の生産に使用される植物である。
【００３６】
使用されるトランスジェニック植物は、基本的に、すべての植物であってよく、すなわち双子葉植物および単子葉植物の両者であってよい。好ましくは、それらは、アブラナ、カノーラ、偽サフラン（ベニバナ、Carthamus tinctoria）、アマまたは、トウモロコシなどの他の農作物などの、多量の脂質化合物を含む脂肪種子植物である。
【００３７】
好ましくは、本発明の植物種子油は、配列番号１５、１６または１７に示される核酸構築物を使用して形質転換されたトランスジェニックアブラナ、トランスジェニックダイズ、トランスジェニックアマ、トランスジェニック偽サフランまたはトランスジェニックトウモロコシ中で生産される。
【００３８】
特に非常に好ましくは、トランスジェニック植物はトランスジェニックアブラナである。
【００３９】
以下の実施例の表１は、好ましい脂肪酸組成を有するＡＲＡの合成に好ましく使用される遺伝子を示す。
【００４０】
また、本発明は、配列番号１５、１６および１７に示される核酸構築物および、これらの核酸構築物を使用して形質転換されたトランスジェニック植物および、該核酸構築物がゲノムに安定に組み込まれているその子孫に関する。
【００４１】
ＤＨＡを含む植物種子油を生産しようとするならば、本発明の核酸構築物は、上記遺伝子に加えて、好ましくは配列番号１８に示されるΔ５−エロンガーゼをコードするOstreococcus tauri由来のＤＮＡおよびまたは配列番号２０に示されるΔ４−デサチュラーゼをコードするTraustochytrium ssp.由来のＤＮＡを含む、適したプロモーター遺伝子ターミネーターカセットを含む。上記ＤＮＡおよび適したカセットは、例えばＷＯ２００５／０８３０９３に記載されている。
【００４２】
本発明は、さらに、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸を含む脂肪酸スペクトルを含む植物種子油に関する。そのような脂肪酸スペクトルは、例えば、図３Ｂに示される。
【００４３】
さらにより好ましくは、本発明の植物種子油は、総脂肪酸含量に基づき、約３．２〜５．３％のパルミチン酸、約２．２〜５．３％のステアリン酸、約１０〜２５％のオレイン酸、約２２〜３６％のリノール酸、約４〜１２％のγ−リノレン酸、約３〜８％のα−リノレン酸、約０．２〜１％のステアリドン酸、約３〜９％のジホモ−γ−リノレン酸、約１２〜２５％のアラキドン酸および約１〜４％のエイコサペンタエン酸を含み；または本発明の植物種子油は、総脂肪酸含量に基づき、３．２〜５．３％のパルミチン酸、２．２〜５．３％のステアリン酸、１０〜２５％のオレイン酸、２２〜３６％のリノール酸、４〜１２％のγ−リノレン酸、３〜８％のα−リノレン酸、０．２〜１％のステアリドン酸、３〜９％のジホモ−γ−リノレン酸、１２〜２５％のアラキドン酸および１〜４％のエイコサペンタエン酸を含む。
【００４４】
特に好ましくは、本発明の植物種子油は、以下の重量パーセント（パーセント単位の総脂肪酸含量のうちの脂肪酸の質量）の、乳児食に重要な脂肪酸を含む。
【００４５】
標的脂肪酸                                                  ％
アラキドン酸（２０：４ ｎ−６）                          約１５
必須脂肪酸：
リノール酸（１８：２ ｎ−６）                            約２０〜２５
α−リノレン酸（１８：３ ｎ−３）                        約３〜７
乳児に有用な追加の脂肪酸：
γ−リノレン酸（ＧＬＡ）（１８：３ ｎ−６）              約６〜１１
ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）（２０：３ ｎ−６）    約４〜８
ステアリドン酸（ＳＤＡ）                                約１〜２
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）                          約２〜４；
または
標的脂肪酸                                                  ％
アラキドン酸（２０：４ ｎ−６）                          １５
必須脂肪酸：
リノール酸（１８：２ ｎ−６）                            ２０〜２５
α−リノレン酸（１８：３ ｎ−３）                        ３〜７
乳児に有用な追加の脂肪酸：
γ−リノレン酸（ＧＬＡ）（１８：３ ｎ−６）              ６〜１１
ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）（２０：３ ｎ−６）    ４〜８
ステアリドン酸（ＳＤＡ）                                １〜２
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）                          ２〜４
【００４６】
本発明は、さらに、本発明の植物種子油と、植物油、微生物油および魚油からなる群より選択される少なくとも１種のさらなる油とを含む配合物または混合油であって、該植物油、微生物油または魚油はドコサヘキサエン酸を含む、上記配合物または混合油に関する。
【００４７】
本発明の植物種子油は、例えば１種以上の脂肪酸の含量を変化させる、すなわち増加または減少させるために、１種以上の油と混合することができる。混合される油は、例えば、別の天然に存在する植物油もしくは植物種子油またはトランスジェニック植物油もしくは植物種子油であってよい。挙げることができる例は亜麻仁油であり、亜麻仁油は高い割合のαリノレン酸を含む。それは、微生物油、例えばMortierella alpinaまたはCrypthecodinium cohnii由来の油であってもよい。ここで特に適しているのは、例えば乳児食中で使用される、ＤＨＡＳＣＯ（登録商標）（ＤＨＡ、Crypthecodinium cohnii）およびＡＲＡＳＣＯ（登録商標）（ＡＲＡ、Mortierella alpina）油混合物である。ＤＨＡＳＣＯ（登録商標）（ＤＨＡ、Crypthecodinium cohnii）を本発明の植物種子油に混合することによって、例えば、脂肪酸ＤＨＡを導入することが可能である。しかし、魚油、例えばサケ油、ニシン油、サバ油、マグロ油またはタラ油も、例えば本発明の植物種子油中の脂肪酸の組成を変化させるための、本発明の植物種子油の配合に適している（United States Department of Agriculture 2005, "Nutrition and Your Health: Dietary Guidelines for Americans" EPA and DHA Content of Fish Species, Data From NDB SR 16-1; 例えば、GRAS Notifications 94, 109 and 193も参照のこと）。魚油は、とりわけ高含量の長鎖多価不飽和ω−３脂肪酸によって特徴づけられる。本発明の植物種子油は唯一のさらなる油と混合することができるが、２種、３種またはさらに多数の油と混合することもできる。１種の油またはさらに混合される油は本明細書中で同一生物または異なる生物由来であってよい。例えば、本発明の植物種子油は、微生物油、例えばMortierella alpinaまたはCrypthecodinium cohniiまたはSchizochytrium sp.由来の油（Arterburn et al. 2007_Lipids 42-1011-24）、および／または魚油（例えばサケ油またはマグロ油）と配合することができる。植物種子油の配合物は先行技術に記載されている。例えば、本発明の植物種子油をＢＡＳＦ粉末製品番号３００５６９６７、「Dry n-3（登録商標）5:25 C Powder Microencapsulated fish oil rich in DHA for Infant formula」とともに乳児食中で加工することもできる。あるいは、ＤＨＡＳＣＯ（登録商標）（ドコサヘキサエン酸リッチ単細胞油）を、GRAS Notice No. GRN 000041に記載のようにＤＨＡの供給源として使用することもできる。ここに、本発明の植物種子油は、最初に、上記ＢＡＳＦ製品と同様にマイクロカプセル化粉末に変換するか、または加工および安定化植物種子油として直接使用することができる。そして、これらの粉末または油をともに混合するかまたは所望の量の乳児食品に個別に加えることができる。酸化に対する保護対策を行いながら、乳児食品の生産の終わり頃に添加を行う。生成物を乳児食に加える好ましい濃度は種々の要因に依存する。最終産物に基づく本発明の植物種子油の好ましい添加量は、乳児食品中の１ｇまでのＡＲＡ／１００ｇの総脂肪の濃度を生じさせる油の量である。最終産物に基づくＢＡＳＦ製品番号３００５６９６７またはＤＨＡＳＣＯ（登録商標）油の好ましい添加量は、乳児食品中の１ｇまでのＤＨＡ／１００ｇの総脂肪の濃度を生じさせる粉末または油の量である。本発明の植物種子油およびＢＡＳＦ製品番号３００５６９６７またはＤＨＡＳＣＯ油の好ましい量は、とりわけ���乳児食品が販売される個別の国の法令、製造者の製品要求、および消費者の要求に依存しうる。
【００４８】
本発明は、さらに、本発明の植物種子油を含む食品を利用可能にする。
【００４９】
本発明の植物種子油は、例えば、冷圧油として、例えばサラダ油として直接使用することができる。本発明の植物種子油は、例えば、ミルクまたは、チーズもしくはヨーグルトなどの乳製品中で、使用することもできる。しかし、マーガリン、またはパンもしくはベーカリー製品にそれを加えることも可能である。最後に、それはフードサプリメント（サプリメント）として一般に適している。これらは、医薬品と食品との境界領域の、ヒト代謝への特定の栄養分または活性成分の供給増加ための製品を意味すると理解されるものとする。
【００５０】
法的に、このフードサプリメント製品群はＥＵ法でガイドライン２００２／４６／ＥＣによって監督されている。ここでは、許容される無機質およびビタミンが特に指定されている。これに基づくフードサプリメントについての指示では、フードサプリメントは「一般的栄養を補うことが意図される食品、食物濃縮物または、栄養固有の作用もしくは生理学的作用のみ、もしくは組み合わせを有する他の物質であり、測定された少量を摂取するための服用形式で、特にカプセル、パステル、錠剤、丸剤、発泡錠および他の同様の投与形式、サシェ、液体アンプル、液滴挿入物を有するボトルおよび、液体および粉末の同様の投与形式で販売される」。法的にそれらは食品に属するため、ドイツではLebensmittel- and Futtergesetzbuch（ＬＦＧＢ; German food and feed code）の規制下にある。許容される成分はNahrungsergaenzungsmittelverordnung（ＮｅｍＶ; Food supplement directive）のAppendix 1に列挙されている。
【００５１】
本発明の植物種子油は、ここに、単独でまたは１種以上の油、例えば微生物油、例えばMortierella alpinaもしくはCrypthecodinium cohnii由来の微生物油または魚油と組み合わせて食品補給に使用することができる。トコフェロール、例えばビタミンＥおよびトコトリエノールおよびアスコルビン酸パルミテートまたは植物抽出物、例えばローズマリーおよび植物ステロール、またはカロテノイド、例えばルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンおよびリコペン、または補酵素、例えば補酵素Ｑを加えることもできる。適した投与形式は、ここに、本発明の植物種子油を、測定された少量で摂取するための、カプセル、パステル、錠剤、丸剤、発泡錠および他の適した投与形式、サシェ、液体アンプル、液滴挿入物を有するボトルおよび、液体および粉末の同様の投与形式である。食品補給のための脂肪酸の用量は先行技術に適切に記載されている。
【００５２】
本発明は、好ましくは、ここに、本発明の植物種子油を含むベビーフードに関する。
【００５３】
母乳栄養を受けない場合、ベビーフードは出生後の最初の月に唯一の食物として働く。本明細書中で使用される用語「ベビーフード」は、例えば、早産児食、乳児用人工乳、乳児食、または小児食を含む。本明細書中で早産児食は、予定出産日より前に生まれた新生児用の食物を意味する。乳児用人工乳は、出生後の最初の４〜６ヵ月（すなわち出生から４〜６ヵ月齢まで）の期間中に乳児に特定の栄養を与えるために意図され、かつそれ自体でこの群のヒトの栄養必要量を満たす食物である。乳児食は、乳児用の食物を意味すると理解されるものとし、乳児とは約１２ヵ月まで（出生〜１２ヵ月齢）の小児を意味する。小児食は、約２４ヵ月齢まで（出生〜２４ヵ月）の小児に与えられる食物を意味すると理解されるものとする。乳児または約４〜６ヵ月〜２４ヵ月齢の小児の摂食におけるそのような適用物のＬＣ−ＰＵＦＡ含量は、食物の脂肪含量に基づいて、乳児用人工乳と同一の領域に入る。本発明の植物種子油を含む典型的な乳児用人工乳の組成は以下の実施例に示される。本発明の植物種子油は、例えば代替母乳、（例えば乳児が離乳した後の）フォローアップミルク（follow-on milk）中でまたは補完食として、例えばベビーシリアル、ボトルのベビーフード、再調製乾燥食品、ミルクおよび代用乳飲料、ジュースおよび他の温かいまたは冷たい飲料および食事療法の食品の添加物として用いることができる。しかし、本発明の植物種子油は妊娠中の母およびさらに母乳栄養中の母の食事での適用にも至る。その理由はＬＣ−ＰＵＦＡが母乳に達するからである。さらに、それらは、２４ヵ月齢までの子供の食品補給のために利用することもでき、さらに年長児および成人の食品補給のために利用することもできる。フードサプリメントは任意の形式で提供することができ、例えばミルク、ジュース、ピューレ、シロップ、キャンデー、発酵製品、丸剤、カプセルまたは被覆錠剤の形式で提供することができる。
【００５４】
本明細書中で使用されるベビーフードまたは乳児食は、乳児または２４ヵ月までの小児の栄養摂取に特に適しているすべての食品の総称を意味すると理解されるものとする。これらは母乳も含む。工業上のインスタントベビーフードは、概して、塩、香辛料、糖を含まずにかつ着色剤および保存剤もほとんど含まずに製造される。ここに、乳児用人工乳とフォローアップフードと補完食との区別は食品法の用語法で行われる（Lebensmittel-Lexikon Dr. Oetker [Dr. Oetker Foodstuff Encyclopedia], 4th ed. 2004, infant food article）。
【００５５】
ここに、以下の食品間での区別を行うことができる。
【００５６】
乳児用人工乳（０〜６ヵ月）
乳児用人工乳は、食品法の用語法で、特に生まれて最初の６ヵ月の摂食のために意図され、かつ乳児が必要とするすべての栄養分を含む、すべての食品および製品として指定される。完成品の調製では、水をさらに加えることもある。
【００５７】
フォローアップフード（４〜２４ヵ月）
食品法における乳児用のフォローアップフードは、特に約４ヵ月目からの乳児用に意図され、かつ最初の人工乳（formula）と同様に液体粘度（liquid consistency）を有するが、より多量の炭水化物をデンプンの形式で含む、すべての食品および製品である。
【００５８】
補完食（４〜２４ヵ月）
補完食は、固形食への変化の準備をするために人工乳の代替物として乳児に使用されるすべての食品および調製物として指定される。
【００５９】
特別食（０〜２４ヵ月）
アレルギーへの高い遺伝的傾向を有するアレルギー体質のヒトの乳児および小児用。乳児の場合、腸粘膜は透過性のままであり、かつ異種タンパク質、例えば牛乳由来の異種タンパク質は食品アレルギーを引き起こすため、「低アレルゲン性（hypoallergenic）乳児食」が販売されている。特別食にもＡＲＡを補うべきである。
【００６０】
また、本発明の植物種子油は、上記適用に加えて完全食として適している。ここに、完全食は、健全な成長が最適に保証されるように動物またはヒト個体（例えば乳児）の完全な食物必要性にわたる食物を意味すると理解されるものとする。本発明の植物種子油を加えた完全食は、母乳と類似の濃度のアラキドン酸（ＡＲＡ）を含む。また、完全食は、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、適切な場合には、ＤＨＡを母乳と類似の濃度で含む。したがって、それはベビーフードの製造に特に非常に高度に適している。上記完全食は、例えば、乳児乳、フォローアップミルク、小児用飲料、フルーツジュース、ピューレ製品、ミルク、ヨーグルトまたは発酵製品であってよい。それは、正常な成長および発達を支援するための乳児および子供の摂食を目的にする。完全製品の場合、それは固形ベビーフード、キャンデー、ビスケットまたはゼラチン製品であってもよい。
【００６１】
実施例に示される乳児食中のＡＲＡ含量を、授乳の最初の０〜１２ヵ月間に母乳中で見出されたＡＲＡの総量に適合させた。追加の利点は、乳児乳にＡＲＡを補うために本発明の植物種子油が使用されると、ＧＬＡ、ＤＧＬＡおよびＳＤＡの値も母乳中の濃度範囲内になることにある。これは、本発明の植物種子油が３種の高級不飽和脂肪酸をほぼ母乳中でも見出された比で含むことにある。ＡＲＡ濃度を適合させるために本発明の植物種子油がベビーフードの成分として使用されると、ＧＬＡおよびＤＧＬＡも、特別なベビーフードおよび乳児食に適切な栄養分を提供するために適切な濃度で供給される。この場合、例えば、さらにＧＬＡ、ＤＧＬＡおよびＳＤＡを含む油の例えば混合のような油の変化は必要ではない。
【００６２】
欧州ではベビーフードは食事療法の食品に割り当てられる（例えば「Directive 91/321/EC」を参照のこと）。したがって、乳児食およびベビーフードの品質要求は非常に高く、世界的に厳密に規制される。欧州は、ここに、ＥＣガイドライン91/321/ECおよびCodex Alimentarius Alinorm 03/26aにしたがう。それは、同時に、ＥＣ内の国内法に変換されている。挙げることができる重要な新しい欧州ガイドラインおよび指示は、Codex Alimentarius: International Code of Hygienic Practice for Foods for Infants and Children (2004), VO 852/2004/EC Lebensmittelhygienegesetz [食品衛生法], Annex II (GHP,GMP)(Novellierung des Hygienerechts in Deutschland [ドイツの衛生法の修正], 29.04.2004), およびVO 178/2002/EC: Festlegung der allgemeinen Grundsaetze und Anforderungen des Lebensmittelrechts, zur Festlegung von Verfahren zur Lebensmittelsicherheit [食品の安全性のための手続きの定義のための、食品法の一般原則および要件の定義]. 28.02.2002 (Chain Control, 原材料のトレーサビリティ)である。また、東欧はここにＥＣガイドラインにしたがい、国内の非常に厳格な法的手続きを有する。アジアおよびオーストラリアはＷＨＯ／ＦＡＯのCode、Codex Alimentariusおよび米国のＦＤＡ規制要件と協調する。米国のＦＤＡ規制要件は、主として、ＷＨＯのCodeおよびCodex Alimentariusと一致する。南米および中米の国内法は、米国の規制、ＷＨＯのCodeおよびCodex Alimentariusにしたがう。
【００６３】
ドイツでの重要な法的規制は、Diaet-Verodnung (VO) [食事令（Diet Ordinance）]のセクション14, 14b, 14c, 14d, 22a, 22b（ドイツ）に記載されている。EC Verodnung (VO; EC Ordinance) 683/2004/ECは、乳児食および小児食中のアフラトキシンおよびマイコトキシンに関する。VO 1830/2003/ECは、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）およびＧＭＯ生物から生産された食品のトレーサビリティを規制する（22.09.2003）。ここに、最高量のVOは植物防疫剤または殺虫剤の残留物に関する（05.11.2003）。VO 2377/90/ECは動物起源の食品中の獣医学医薬品の残留物についての最高量の固定に関する（30.12.2000）。有害物質VOは、例えば、ダイオキシンおよびＰＣＢの最大許容含量に関する。
【００６４】
ベビーフードは、例えば、粉末形式で製造することができる。この目的で、ベビーフードを、例えば、噴霧乾燥し、インスタント化（instantiated）し、および塊にする。白色カン（窒素／二酸化炭素でガス処理）またはアルミニウム複合フィルムバッグ（ガス処理、ガス処理なし）にパッケージングする。しかし、ベビーフードは液体および乳化形式で製造することもできる。この目的では、例えば、それらをガラスビン中で最終滅菌するか、またはカンに充填する。ガラスへの無菌充填（Brikpak）または最終滅菌濃縮物のカンへの充填をさらに実施することができる。
【００６５】
ベビーフードの生産に使用される原材料は、例えば、以下の成分であってよい：
牛乳、ヤギ乳（例えば中国、オーストラリア）、カゼイン／カゼイン塩、脱塩ホエイ粉末、アミノ酸、タウリン、カルニチン；植物油（パーム油、ダイズ油、ヒマワリ油、高度に油を含むヒマワリ油、ベニバナ油、ヤシ油、アブラナ油）、乳脂肪、魚油（マグロ油、タラ肝油、オキアミ油）、卵脂質（オボチン（ovothin））、ＡＲＡＳＣＯ（登録商標）、ＤＨＡＳＣＯ（登録商標）；炭水化物（ラクトース、バクガデキストリン、デンプン）、他のタイプの糖、オリゴ糖（プレバイオティクス）、細菌培養（プロバイオティクス）；ビタミン、コリン、ミオ−イノシトール；ミネラル（Ｃａ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｐ、Ｃｌ）、微量元素（Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｃｒ、Ｓｅ、Ｆ、Ｉ）、ヌクレオチド。
【００６６】
最も重要な生産方法では、脂肪を含む半製品を噴霧乾燥し、その後、炭水化物、ビタミンおよび微量栄養素を混合することによってベビーフードの生産を行う。しかし、ベビーフードの生産は、ＬＣ−ＰＵＦＡを脂肪相に組み入れ、タンパク質および炭水化物成分でスプレーして半製品を得ることによって、行うこともできる。
【００６７】
図５は、液状の乳児食の製造を例示的に示し、図６は完全噴霧による乳児食の製造の例を挙げる。
【００６８】
本発明の植物種子油中のＬＣ−ＰＵＦＡの安定化は、ここに、例えばトコフェロールおよびトコトレノール（tocotrenols）を加えることによって達成することができる。トコフェロール、パルミチン酸アスコルビル（ascorbyl pamitate）およびアスコルビン酸ナトリウムを加えると、ＬＣ−ＰＵＦＡが保護され、製品安定性の増加および酸敗リスクの低下によって保存期間が向上する。ここで、乳児食中のビタミンＥ含量に注意を促すＥＳＰＧＨＡＮ推奨に言及することができる（J. Ped. Gastroenterology and Nutrition 26, pp. 351-352, 1996）。ＬＣ−ＰＵＦＡの安定化のためのさらなる添加物は、植物抽出物、例えばローズマリーおよび植物ステロール、またはカロテノイド、例えばルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンおよびリコペン、または補酵素、例えば種々の形式の補酵素Ｑであってよい。安定化添加物が使用される場合、地域および国の法規制が守られるべきである。
【００６９】
粉末状または油状の本発明の植物種子油中に含まれるＬＣ−ＰＵＦＡをベビーフードの生産に利用可能にするために、例えば以下の技術が適している。粉末形式では、粉状状および原材料および半製品と混合して最終製品に得るために単純乾燥混合系（例えばLoedigeミキサー）を使用することができる。油状（例えばガス処理された容器にパッケージされた油状製品）では、乳化剤および酸化防止剤とともに脂肪混合物に組み入れることができる。次いで、水相を有するエマルジョンの生産、および半製品を得るための乾燥（噴霧乾燥）を行う。そして、半製品を残りの配合成分とともに混合乾燥（mixed dry）して最終製品を得る。あるいは、特別な脂肪混合物の生産はＬＣ−ＰＵＦＡとともに行われ、油状製品に関して上に記載されるようにさらに加工される。
【００７０】
単純な取り扱いおよび安全な計測によって、ベビーフードの生産での粉末状のＬＣ−ＰＵＦＡの使用が促進される。不都合として、ＬＣ−ＰＵＦＡの含量がほんの約２５％であり、マイクロカプセル化物質の割合が約７５％であることが挙げられる。現在、多量の油の配合が研究中であり、５０％をずっと超える油の配合が商業的に可能なようである。製品１００ｇあたり１％のＬＣＰＵＦＡを使用する場合、４％の粉末（＝担体物質３ｇ／１００ｇ）が必要である。担体の割合はかなり高く、配合で（特に早産児食中で）考慮に入れるべきである。使用される担体は、例えば、ゼラチン、ショ糖、デンプン、カゼイン塩、レシチン、リン酸三カルシウム、ビタミンＣ、ビタミンＥ、またはアスコルビン酸ナトリウムであってよい。さらなる不都合は均質化を欠くことに見られる（脂肪ビーズサイズ＞１μｍ）。粒子表面の遊離の油（拡散および不完全なカプセル化の結果として）は酸敗を生じさせる場合がある。
【００７１】
ベビーフードの製造での油状のＬＣＰＵＦＡの使用には、利点として、脂肪混合物との単純な加工が伴い、それにより均一な分布が生じる。安定化剤は油状で、より良好にその作用を示すこともできる。均質化は、食物の脂肪相中のＬＣＰＵＦＡの完全な溶解を生じさせる。さらなる利点は、随伴物質の不存在および最終製品の良好な保存期間に見られる。最後に、油状製品はまた、微生物学的問題を伴わない。その理由は、製品が乾燥前に液相で加熱されるからである。
【００７２】
不都合として、粘性が加工中の複雑さを増加させることを挙げることができる。工程管理は、また、噴霧乾燥およびその後の粉末の加工中の酸化を増加させる。噴霧乾燥された半製品（ＬＣＰＵＦＡを含む）は、ガスで処理せずに３〜４週間より長く中間保存するべきではない。したがって、最終製品を得るためのできるだけ高速のさらなる加工および保護ガス（窒素／二酸化炭素）下でのカン中のパッケージングが望ましい。
【００７３】
本発明の植物種子油はすでに油状で存在するため、乳児食の生産に特に適している。油状のＬＣＰＵＦＡの使用は対費用効果が高く、特に高生産量を用いる製品の場合に有利である。図６は、乾燥最終製品を生じさせる完全噴霧の例を用いて本発明の植物種子油の加工を示し、図５は液体ベビーフード製品の製造の例による。
【００７４】
請求項：本発明は、さらに、本発明の植物種子油の製造方法であって、以下のステップ：
（ａ）配列番号１５、１６または１７に示される核酸構築物を用いた形質転換によりトランスジェニック植物を作製するステップ、
（ｂ）植物種子油の生合成を可能にする条件下でステップ（ａ）からのトランスジェニック植物を栽培するステップ、
（ｃ）植物種子を回収し、植物種子油を抽出および精製するステップ
を含む、上記方法に関する。
【００７５】
種子の回収および清浄化後、得られた種子を、本発明の植物種子油を取得するために加工する。加工は種子の圧縮で始まり、油の抽出およびその後の精製、および安定化へと続く。好ましくは、種子を常温圧縮し、続いて減圧ろ過する。この方法は、好ましくは、不活性雰囲気下、好ましくは窒素下で行う。約半分の本発明の植物種子油がこの方法によって得られる。
【００７６】
本発明の方法の一実施形態では、ステップ（ｃ）の植物種子油の抽出はヘキサン抽出を含む。
【００７７】
溶媒、好ましくはヘキサンで、圧縮から残留した圧縮残留物を続いて抽出すると、９０％を超える油の収率が達成される。例えばヘキサンを用いる連続法などの種々の方法が食用油の抽出に適している（Belitz & Grosch, 1999 "Edible Fats and Oils" In: Food Chemistry, 2nd ed. Springer Verlag）。ミセラ（miscella）蒸留は、後にヘキサンを除去して食品の所定の最高量より少なくするために適している。その後、抽出された油を不活性雰囲気下で圧縮油と混合する。この時点で粗製油は精製によるさらなる加工の準備ができている。ヘキサンを用いる抽出はマーガリンへの添加物として食用油に適しているが、バイオディーゼルの生産にも適している。ヘキサン抽出の不都合は、抽出された油が、該抽出された油がすべての適用に、例えばベビーフードでは、等しく非常に適しているわけではないようにヘキサン残留物を含みうる点に見られる。
【００７８】
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）の植物種子油の抽出は超臨界ＣＯ２抽出を含む。そのような方法で抽出された油は、有利に、例えばヘキサン抽出された油のように溶媒残留物を含まない。特に好ましくは、本発明の方法のステップ（ｃ）の植物種子油の抽出は、以下のステップ：
（ｉ）  好ましくは不活性雰囲気下で、０．２ｍｍ未満の粒径に砕くか圧縮することによって植物種子を粉砕するステップ；および
（ｉｉ）  圧力が少なくとも３００ｂａｒであり、４０〜６０℃の範囲の温度であり、抽出処理量がＣＯ２ ６０ｋｇ／時であり、かつ３０〜１２０分後に完了する、超臨界ＣＯ２抽出ステップ
を含む。
【００７９】
超臨界二酸化炭素（ＣＯ２）抽出は抽出剤としての臨界未満または超臨界状態の二酸化炭素の利用に基づき、抽出剤は循環している（Barthet and Daun 2002, JAOCS 79:245-51）。
【００８０】
ここに、本明細書中に記載の砕かれた植物種子を直接使用するか、または本発明の植物油を圧縮することによって得られた圧縮ケーキを、使用される油状成分の部分的除去に使用する。植物種子から油を取得するためのこの方法は、不活性雰囲気下でかつ比較的低温で特に穏やかに実施できる利点を有する。それは油中の酸化プロセスを低減する。
【００８１】
本発明の植物油をできるだけ完全に取得するために、実施例に記載の方法を開発した。該方法では、種子を最初に規定サイズに粉砕し、次いでほぼ完全に抽出する。このために、まず、種子を砕くかまたは圧縮することによって０．２ｍｍ未満の粒径に粉砕した。０．１５ｍｍのギャップサイズを有するロールプレスの使用が特に有利である。その後の超臨界抽出では、好ましい圧力は少なくとも３００ｂａｒであり、特に好ましくは３５０ｂａｒである。温度は、４０〜６０℃の範囲で維持することができ、好ましくは、油中の酸化プロセスを低減するために、４０〜５０℃またはさらに良好には４０〜４５℃のできるだけ低い温度が選択される。最適な収率はＣＯ２ ６０ｋｇ／時の抽出実行で１２０分後に達成される。ここに、達成可能な最大収率の９０％収率を達成するために、最適なＣＯ２質量の処理量は、特に好ましくは基質の質量の８０〜１００倍である。抽出時間が短いほど、抽出が不完全になる。
【００８２】
空気乾燥された種子中に残留する水分（約７％）が通り過ぎて抽出油に入り、凍結乾燥された基質と比較してＣＯ２抽出の総油収率を有利に増加させる。したがって基質の空気乾燥が好ましい。全抽出プロセス中に、その脂肪酸組成およびその酸化パラメータ（酸価、ヨウ素価）に関して大部分が同一のままである油が得られる。本明細書中で指定される最適化された条件下での超臨界ＣＯ２抽出の抽出効率は、ヘキサンを用いる慣用のソックスレー抽出の抽出効率に匹敵した。パイロット規模で実施された超臨界二酸化炭素（ＣＯ２）抽出を、大きく変化させることなく、例えば油８００トン／年についての必要な工業規模に増加させることができる。
【００８３】
本明細書中に記載の方法を用いる超臨界ＣＯ２抽出は、特に本発明の植物種子油の抽出に適している。その理由は、ヘキサン抽出と対照的に、それが溶媒ヘキサンの残留物を含まないからである。ゆえに、そのような方法で抽出された本発明の植物種子油はベビーフードで特に有利に使用される。好ましくは、実施例に記載の方法にしたがって超臨界ＣＯ２抽出を用いて油を取得する。図４は、本発明の植物種子油の超臨界ＣＯ２抽出のためのパイロットプラントの概略を例示的に示す。
【００８４】
本発明の方法の好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）の植物種子油の精製は、本発明の植物種子油に適合させたアルカリ精製技術を含む。それは大型プラントで使用され、以下でさらに詳細に記載される。超臨界ＣＯ２抽出から得られた油の場合の精製はすべての場合で必要なわけではない。上記の本発明の植物種子油のいくつかの適用では、ＳＬＥ超臨界ＣＯ２抽出を用いて得られた油の直接使用が可能であり、すなわちこのために後の精製ステップは必要ではない。これらの製品には、乳児用のミルク、ジュース、ピューレ、シロップ、キャンデーおよび発酵製品が含まれる。
【００８５】
ヘキサン抽出を用いて得られた油では（超臨界ＣＯ２抽出を用いて得られた油でも、必要に応じて）、後の精製ステップを行う。粗製植物油（圧縮および抽出油から得られた混合油）の精製、および充填は、完全に真空下または窒素下で行う。まず、粗製油を１０％の水で水和する（８５℃、４５分、３００ｒｐｍ）。次いで、１．５％クエン酸（２０％強度）での粘泥の除去を８５℃で同様に行う（４５分、３００ｒｐｍ、１０％水）。次いで、７％強度の水酸化ナトリウム溶液で洗浄（９０〜９５℃、２０分、２５０ｒｐｍ、１０％水）し、９０℃で乾燥（１１分、３５０ｒｐｍ 〜３０ｍｂａｒ）することによって中和する。１％漂白土で漂白を行う（Tonsil Optimum 214 FF、９０℃、２０分、３５０ｒｐｍ、〜２０ｍｂａｒ）。次いで、圧力および窒素下でアセテートフィルターを用いて油をろ過する。脱イオン水および脱気水を使用して、２２０℃、２０分、１〜２ｍｂａｒで脱臭を行う。
【００８６】
あるいは、本発明の冷圧植物油を食物に直接用いることもできる。
【００８７】
次いで、安定化添加物の選択の正確に測定された添加によって抽出された本発明の植物油を安定化する。該安定化添加物は：トコフェロール、例えばビタミンＥおよびトコトリエノール、アスコルビン酸パルミテート、植物抽出物、例えばローズマリーおよび植物ステロール、カロテノイド、例えばルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチンおよびリコペン、リン脂質、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルグリコールまたは補酵素、例えば補酵素Ｑを含んでよい。
【００８８】
その後の生化学的品質管理の後、油は、本明細書中で記載されるような用途、例えば食品、食事療法製品、特にベビーフードおよびフードサプリメントで使用できる状態にある。生化学的品質パラメータの典型的な値は：酸価０．１５；検出限界未満の過酸化物価；色ＡＯＣＳ ０．６Ｒおよび２２Ｙである。
【００８９】
本発明の方法によって生産される植物種子油は、好ましい実施形態では、以下の一般式Ｉ：
【化１】
2011519552.tif 000003
【００９０】
式中、変数および置換基は以下の通りであり、
Ｒ１は、ヒドロキシル、補酵素Ａ（チオエステル）、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾジホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトール、スフィンゴ塩基（sphingo base）または式ＩＩ：
【化２】
2011519552.tif 000004
【００９１】
の基であり、
Ｒ２は、水素、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾジホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルセリン、リゾホスファチジルイノシトールまたは飽和もしくは不飽和Ｃ２〜Ｃ２４−アルキルカルボニルであり、
Ｒ３は、水素、飽和もしくは不飽和Ｃ２〜Ｃ２４−アルキルカルボニルであるか、またはＲ２およびＲ３は、互いに独立して、式Ｉａ：
【化３】
2011519552.tif 000005
【００９２】
の基であり、
ｎは２、３、４、５、６、７または９であり、ｍは２、３、４、５または６であり、およびｐは０または３である、
に示される構造を有する物質を含む。
【００９３】
一般式ＩのＲ１は、ヒドロキシル−、補酵素Ａ−（チオエステル）、リゾ−ホスファチジルコリン−、リゾ−ホスファチジルエタノールアミン−、リゾ−ホスファチジルグリセロール−、リゾ−ジホスファチジルグリセロール−、リゾ−ホスファチジルセリン−、リゾ−ホスファチジルイノシトール−、スフィンゴ塩基−、または一般式ＩＩ：
【化４】
2011519552.tif 000006
【００９４】
の基を表す。
【００９５】
上記のＲ１の基は、チオエステルの形式で一般式Ｉの化合物に常に結合している。
【００９６】
一般式ＩＩのＲ２は、水素−、リゾ−ホスファチジルコリン−、リゾ−ホスファチジル−エタノールアミン−、リゾ−ホスファチジルグリセロール−、リゾ−ジホスファチジルグリセロール−、リゾ−ホスファチジル−セリン−、リゾ−ホスファチジルイノシトール−または飽和もしくは不飽和Ｃ２〜Ｃ２４−アルキルカルボニルを表す。
【００９７】
挙げることができるアルキル基は、１個以上の二重結合（群）を含む、置換または非置換の、飽和または不飽和のＣ２〜Ｃ２４−アルキルカルボニル鎖、例えばエチルカルボニル−、ｎ−プロピルカルボニル−、ｎ−ブチルカルボニル−、ｎ−ペンチルカルボニル−、ｎ−ヘキシルカルボニル−、ｎ−ヘプチルカルボニル−、ｎ−オクチルカルボニル−、ｎ−ノニルカルボニル−、ｎ−デシルカルボニル−、ｎ−ウンデシルカルボニル−、ｎ−ドデシルカルボニル−、ｎ−トリデシルカルボニル−、ｎ−テトラデシルカルボニル−、ｎ−ペンタデシルカルボニル−、ｎ−ヘキサデシルカルボニル−、ｎ−ヘプタデシルカルボニル−、ｎ−オクタデシルカルボニル−、ｎ−ノナデシルカルボニル−、ｎ−エイコシルカルボニル−、ｎ−ドコサニルカルボニル−またはｎ−テトラコサニルカルボニル−である。１個以上の二重結合（群）を含む、ｎ−デシルカルボニル−、ｎ−ウンデシルカルボニル−、ｎ−ドデシルカルボニル−、ｎ−トリデシルカルボニル−、ｎ−テトラデシルカルボニル−、ｎ−ペンタデシルカルボニル−、ｎ−ヘキサデシルカルボニル−、ｎ−ヘプタデシルカルボニル−、ｎ−オクタデシルカルボニル−、ｎ−ノナデシルカルボニル−、ｎ−エイコシルカルボニル−、ｎ−ドコサニルカルボニル−またはｎ−テトラコサニルカルボニル−などの飽和または不飽和Ｃ１０〜Ｃ２２−アルキルカルボニル基が好ましい。特に好ましいのは、１個以上の二重結合（群）を含む、Ｃ１０−アルキルカルボニル、Ｃ１１−アルキルカルボニル、Ｃ１２−アルキルカルボニル、Ｃ１３−アルキルカルボニル、Ｃ１４−アルキルカルボニル、Ｃ１６−アルキルカルボニル、Ｃ１８−アルキルカルボニル、Ｃ２０−アルキルカルボニルまたはＣ２２−アルキルカルボニル基などの飽和および／または不飽和Ｃ１０〜Ｃ２２−アルキルカルボニル基である。特に非常に好ましいのは、１個以上の二重結合（群）を含む、Ｃ１６−アルキルカルボニル、Ｃ１８−アルキルカルボニル、Ｃ２０−アルキルカルボニルまたはＣ２２−アルキルカルボニル基などの飽和または不飽和Ｃ１６−Ｃ２２−アルキルカルボニル基である。これらの有利な基は２、３、４、５または６個の二重結合を含むことができる。脂肪酸鎖中に２０または２２炭素原子を有する特に有利な基は６個までの二重結合を含み、有利には３、４、５または６個の二重結合、特に好ましくは５または６個の二重結合を含む。上記のすべての基は、対応する脂肪酸由来である。
【００９８】
一般式ＩＩのＲ３は、水素−、飽和または不飽和Ｃ２〜Ｃ２４−アルキルカルボニルを表す。
【００９９】
挙げることができるアルキル基は、１個以上の二重結合を含む、置換または非置換の、飽和または不飽和のＣ２〜Ｃ２４−アルキルカルボニル鎖、例えばエチルカルボニル−、ｎ−プロピルカルボニル−、ｎ−ブチルカルボニル−、ｎ−ペンチルカルボニル−、ｎ−ヘキシルカルボニル−、ｎ−ヘプチルカルボニル−、ｎ−オクチルカルボニル−、ｎ−ノニルカルボニル−、ｎ−デシルカルボニル−、ｎ−ウンデシルカルボニル−、ｎ−ドデシルカルボニル−、ｎ−トリデシルカルボニル−、ｎ−テトラデシルカルボニル−、ｎ−ペンタデシルカルボニル−、ｎ−ヘキサデシルカルボニル−、ｎ−ヘプタデシルカルボニル−、ｎ−オクタデシルカルボニル−、ｎ−ノナデシルカルボニル−、ｎ−エイコシルカルボニル−、ｎ−ドコサニルカルボニル−またはｎ−テトラコサニルカルボニル−である。１個以上の二重結合を含む、ｎ−デシルカルボニル−、ｎ−ウンデシルカルボニル−、ｎ−ドデシルカルボニル−、ｎ−トリデシルカルボニル−、ｎ−テトラデシルカルボニル−、ｎ−ペンタデシルカルボニル−、ｎ−ヘキサデシルカルボニル−、ｎ−ヘプタデシルカルボニル−、ｎ−オクタデシルカルボニル−、ｎ−ノナデシルカルボニル−、ｎ−エイコシルカルボニル−、ｎ−ドコサニルカルボニル−またはｎ−テトラコサニルカルボニル−などの飽和または不飽和Ｃ１０〜Ｃ２２−アルキルカルボニル基が好ましい。特に好ましいのは、１個以上の二重結合を含む、Ｃ１０−アルキルカルボニル、Ｃ１１−アルキルカルボニル、Ｃ１２−アルキルカルボニル、Ｃ１３−アルキルカルボニル、Ｃ１４−アルキルカルボニル、Ｃ１６−アルキルカルボニル、Ｃ１８−アルキルカルボニル、Ｃ２０−アルキルカルボニルまたはＣ２２−アルキルカルボニル基などの飽和および／または不飽和Ｃ１０〜Ｃ２２−アルキルカルボニル基である。特に非常に好ましいのは、１個以上の二重結合を含む、Ｃ１６−アルキルカルボニル、Ｃ１８−アルキルカルボニル、Ｃ２０−アルキルカルボニルまたはＣ２２−アルキルカルボニル基などの飽和または不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２−アルキルカルボニル基である。これらの有利な基は２、３、４、５または６個の二重結合を含むことができる。脂肪酸鎖中に２０または２２炭素原子を有する特に有利な基は６個までの二重結合を含み、有利には３、４、５または６個の二重結合、特に好ましくは５または６個の二重結合を含む。上記のすべての基は、対応する脂肪酸由来である。
【０１００】
上記のＲ１、Ｒ２およびＲ３の基は、ヒドロキシルおよび／またはエポキシ基で置換することができ、かつ／または三重結合を含むことができる。
【０１０１】
有利には、本発明の方法で製造された、以下に記載の植物種子油は、少なくとも１、２、３、４、５または６個の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を含む。特に有利には、該脂肪酸は４、５または６個の二重結合を含む。該脂肪酸は、有利には、脂肪酸鎖中に１８、２０または２２個のＣ原子を有し、好ましくは該脂肪酸は脂肪酸鎖中に２０または２２個の炭素原子を含む。有利には、該方法で使用される核酸構築物を含む飽和脂肪酸はほとんどまたはまったく反応しない。「ほとんど反応しない」は、多価不飽和脂肪酸と比較して、飽和脂肪酸が５％未満、有利には３％未満、特に有利には２％未満、特に非常に好ましくは１；０．９；０．８；０．７；０．６；０．５；０．４；０．３；０．２５または０．１２５％未満の活性でしか反応しないことを意味すると理解されるものとする。本発明の方法によって製造されたこれらの脂肪酸は、脂肪酸混合物中で植物種子油中に存在する。
【０１０２】
有利には、一般式ＩおよびＩＩの置換基Ｒ２またはＲ３は、互いに独立して、飽和または不飽和Ｃ１８〜Ｃ２２−アルキルカルボニル−を表し、特に有利には、互いに独立して、少なくとも２個の二重結合を有する不飽和Ｃ１８−、Ｃ２０−またはＣ２２−アルキルカルボニル−を表す。
【０１０３】
該方法で生産された植物種子油は、膜脂質および／またはトリアシルグリセリド中で有利には結合している多価不飽和脂肪酸を含むが、該多価不飽和脂肪酸は植物中で遊離脂肪酸として存在するか、または他の脂肪酸エステルの形式で結合していてもよい。ここに、それらは、種々の脂肪酸の混合物または異なるグリセリドの混合物の形式で有利に存在する。トリアシルグリセリド中で結合している種々の脂肪酸は、ここに、４〜６個のＣ原子を有する短鎖脂肪酸、８〜１２個のＣ原子を有する中鎖脂肪酸、または１４〜２４個のＣ原子を有する長鎖脂肪酸由来であってよく、長鎖脂肪酸が好ましく、Ｃ１８−、Ｃ２０−および／またはＣ２２−脂肪酸の長鎖脂肪酸ＬＣＰＵＦＡが特に好ましい。
【０１０４】
本発明の方法では、植物種子油は、脂肪酸エステル中に少なくとも１または２個の二重結合を有する、有利には脂肪酸エステル中に少なくとも３、４、５または６個の二重結合を有する、特に有利には脂肪酸エステル中に少なくとも５または６個の二重結合を有する、単価または多価不飽和Ｃ１８−、Ｃ２０−および／またはＣ２２−脂肪酸分子との脂肪酸エステルを使用して有利に製造され、リノール酸（＝ＬＡ，Ｃ１８：２Δ９，１２）、γ−リノレン酸（＝ＧＬＡ，Ｃ１８：３Δ６，９，１２）、ステアリドン酸（＝ＳＤＡ，Ｃ１８：４Δ６，９，１２，１５）、ジホモ−γ−リノレン酸（＝ＤＧＬＡ，２０：３Δ８，１１，１４）、ω−３−エイコサテトラエン酸（＝ＥＴＡ，Ｃ２０：４Δ５，８，１１，１４）、アラキドン酸（ＡＲＡ，Ｃ２０：４Δ５，８，１１，１４）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，Ｃ２０：５Δ５，８，１１，１４，１７）、ω−６−ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５Δ４，７，１０，１３，１６）、ω−６−ドコサテトラエン酸（Ｃ２２：４Δ，７，１０，１３，１６）、ω−３−ドコサペンタエン酸（＝ＤＰＡ，Ｃ２２：５Δ７，１０，１３，１６，１９）、ドコサヘキサエン酸（＝ＤＨＡ，Ｃ２２：６Δ４，７，１０，１３，１６，１９）またはそれらの混合物の合成を有利に生じさせる。生成される植物種子油は、図３Ｂにも示されるように、好ましくは、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸を含む脂肪酸スペクトルを含む。
【０１０５】
多価不飽和Ｃ１８−、Ｃ２０−および／またはＣ２２−脂肪酸分子を有する脂肪酸エステルは、該脂肪酸エステルの生産に使用された植物から、油または脂質の形式で、例えばスフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、脂質、糖脂質、例えばスフィンゴ糖脂質、リン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールまたはジホスファチジルグリセロール、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドまたは他の脂肪酸エステル、例えば少なくとも２、３、４、５または６個、好ましくは５または６個の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を含むアセチル補酵素Ａエステルなどの化合物の形式で、単離することができ、有利には、それらはジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドの形式で、かつ／またはホスファチジルコリンの形式で、特に好ましくはトリアシルグリセリドの形式で単離される。これらのエステルに加えて、多価不飽和脂肪酸は植物中で遊離脂肪酸として含まれるか、または他の化合物中で結合している。一般に、以前に記載される種々の化合物（脂肪酸エステルおよび脂肪酸）は、８０〜９０重量％のトリグリセリド、２〜５重量％のジグリセリド、５〜１０重量％のモノグリセリド、１〜５重量％の遊離脂肪酸、２〜８重量％のリン脂質の概算の配分で植物中に存在し、種々の化合物の和は１００重量％になる。
【０１０６】
本発明の方法では、総脂肪酸に基づき、少なくとも３重量％、有利には少なくとも５重量％、好ましくは少なくとも８重量％、特に好ましくは少なくとも１０重量％、特に非常に好ましくは少なくとも１５重量％の含量で生産されるＬＣＰＵＦＡをトランスジェニック植物中で製造する。ここに、有利には宿主生物中に存在するＣ１８−および／またはＣ２０−脂肪酸の、少なくとも１０％、有利には少なくとも２０％、特に有利には少なくとも３０％、特に非常に有利には少なくとも４０％までを反応させて、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡまたはＤＨＡ（一例として少数を挙げただけである）などの対応する生成物にする。有利には、脂肪酸を結合型で生産する。本発明の方法で使用された核酸を用いて、これらの不飽和脂肪酸を、有利に生成されたトリグリセリドのｓｎ１、ｓｎ２および／またはｓｎ３位に導くことができる。本発明の方法では、出発化合物リノール酸（Ｃ１８：２）またはリノレン酸（Ｃ１８：３）が複数の反応ステップを通過するため、該方法の生成物、例えばアラキドン酸（ＡＲＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ω−６−ドコサペンタエン酸またはＤＨＡは、完全に純粋な生成物としては得られず、最終産物には少量の前駆体も常に含まれる。リノール酸およびリノレン酸がともに出発植物に存在するならば、ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡなどの最終産物は混合物として存在する。前駆体は、有利には、合計で、それぞれの最終産物の量に基づき、２０重量％を超えない、好ましくは１５重量％を超えない、特に好ましくは１０重量％を超えない、特に非常に好ましくは５、４、３、２、１または０．５重量％を超えない量になるべきである。有利には、本明細書中に記載のトランスジェニック植物では、図３Ｂの脂肪酸スペクトルにも示されるように、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸が最終産物として形成される。
【０１０７】
本発明の方法によって製造された植物種子油に含まれる脂肪酸エステルまたは脂肪酸混合物は、有利には、総脂肪酸含量に基づき、約３．２〜５．３％のパルミチン酸、約２．２〜５．３％のステアリン酸、約１０〜２５％のオレイン酸、約２２〜３６％のリノール酸、約４〜１２％のγ−リノレン酸、約３〜８％のα−リノレン酸、約０．２〜１％のステアリドン酸、約３〜９％のジホモ−γ−リノレン酸、約１２〜２５％のアラキドン酸および約１〜４％のエイコサペンタエン酸を含む。さらに、本発明の方法によって製造された植物種子油に含まれる脂肪酸エステルまたは脂肪酸混合物は、有利には、脂肪酸エルカ酸（１３−ドコサエン酸（13-docosaenoic acid））、ステルクリン酸（９，１０−メチレンオクタデカ−９−エン酸（9,10-methyleneoctadec-9-enoic acid））、マルバル酸（malvalic acid）（８，９−メチレンヘプタデカ−８−エン酸（8,9-methyleneheptadec-8-enonic acid））、チョールムーグラ酸（シクロペンテンドデカン酸）、フラン脂肪酸（９，１２−エポキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸（9,12-epoxyoctadeca-9,11-dienoic acid））、ベルノン酸（vernon acid）（９，１０−エポキシオクタデカ−１２−エン酸（9,10-epoxyoctadec-12-enoic acid））、タリン酸（tarinic acid）（６−オクタデシン酸）、６−ノナデシン酸、サンタルビン酸（santalbic acid）（ｔ１１−オクタデセン−９−イン酸（t11-octadecen-9-ynoic acid））、６，９−オクタデセニン酸（6,9-octadecenynoic acid）、ピルリン酸（pyrulic acid）（ｔ１０−ヘプタデセン−８−イン酸（t10-heptadecen-8-ynoic acid））、クレペニニン酸（crepenyninic acid）（９−オクタデセン−１２−イン酸（9-octadecen-12-ynoic acid））、１３，１４−ジヒドロオロフェイン酸（13,14-dihydrooropheic acid）、オクタデセン−１３−エン−９，１１−ジイン酸（octadecen-13-ene-9,11-diynoic acid）、ペトロセレン酸（petroselenic acid）（シス−６−オクタデセン酸）、９ｃ，１２ｔ−オクタデカジエン酸（9c,12t-octadecadienic acid）、カレンデュラ酸（calendula acid）（８ｔ１０ｔ１２ｃ−オクタデカトリエン酸（8t10t12c-octadecatrienic acid））、カタルピン酸（catalpinic acid）（９ｔ１１ｔ１３ｃ−オクタデカトリエン酸（9t11t13c-octadecatrienic acid））、エレオステリン酸（eleosteric acid）（９ｃ１１ｔ１３ｔ−オクタデカトリエン酸（9c11t13t-octadecatrienic acid））、ジャカル酸（８ｃ１０ｔ１２ｃ−オクタデカトリエン酸（8c10t12c-octadecatrienic acid））、プニカ酸（punicic acid）（９ｃ１１ｔ１３ｃ−オクタデカトリエン酸（9c11t13c-octadecatrienic acid））、パリナリン酸（parinaric acid）（９ｃ１１ｔ１３ｔ１５ｃ−オクタデカデトラエン酸（9c11t13t15c-octadecatetraenic acid））、ピノレン酸（pinolenic acid）（オール−シス−５，９，１２−オクタデカトリエン酸（all-cis-5,9,12-octadecatrienic acid））、ラバレン酸（laballenic acid）（５，６−オクタデカジエンアレン酸（5,6-octadecadienallenic acid））、リシノール酸（１２−ヒドロキシ油酸）および／またはコリオリン酸（coriolinic acid）(１３−ヒドロキシ−９ｃ，１１ｔ−オクタデカジエン酸）からなる群より選択される脂肪酸を含むことができる。上記の脂肪酸は、概して、有利に、本発明の方法によって製造された脂肪酸エステルまたは脂肪酸混合物中に微量にのみ存在し、すなわち、それらは、総脂肪酸に基づき、３０％未満、好ましくは２５％、２４％、２３％、２２％または２１％未満、特に好ましくは２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％または５％未満、特に非常に好ましくは４％、３％、２％または１％未満しか存在しない。有利には、本発明の方法によって製造された脂肪酸エステルまたは脂肪酸混合物は、以下の脂肪酸の１つにおいて、総脂肪酸に基づき０．１％未満しか含まないか、またはより良好には、クルパノドン酸（clupanodoic acid）（＝ドコサペンタエン酸、Ｃ２２：５Δ４，８，１２，１５，２１）およびニシン酸（nisic acid）（テトラコサヘキサエン酸、Ｃ２３：６Δ３，８，１２，１５，１８，２１）を含まない。
【０１０８】
本発明の核酸構築物または本発明の方法で使用された核酸構築物を用いて、ＧＣ分析での比較によって、非トランスジェニック出発植物、例えばアブラナ、アマ、ベニバナまたはダイズと比較して、少なくとも５０％、有利には少なくとも８０％、特に有利には少なくとも１００％、特に非常に有利には少なくとも１５０％の、多価不飽和脂肪酸の収率の増加を達成することができる。
【０１０９】
以前に記載された方法によって化学的に純粋な多価不飽和脂肪酸組成物を調製することもできる。このために、公知の様式で、例えば抽出、蒸留、結晶化、クロマトグラフィーまたはこれらの方法の組み合わせを用いて、植物から脂肪酸組成物を単離する。これらの化学的に純粋な脂肪酸組成物は、食品、特にベビーフードの製造のための食品産業の分野での適用に有利であるが、化粧品産業および医薬品産業での適用にも有利である。
【０１１０】
本発明の核酸構築物は配列番号１５、１６および１７に示され、上記および表１および２で詳細に記載される。原理的に、脂肪酸または脂質代謝のすべての遺伝子は、多価不飽和脂肪酸を使用する植物種子油の製造方法において、本発明の核酸構築物（本出願の意義の範囲内で、複数は単数を含み、またその逆でもあるものとする）と組み合わせて有利に使用することができる。例えば、本発明の核酸構築物で形質転換されたトランスジェニック植物を別の発現ベクターで発現させることができ、該別の発現ベクターを用いて、脂肪酸または脂質代謝の１種以上の遺伝子を発現させることができ、かつさらに、適した形質転換方法を用いてトランスジェニック植物に組み入れることができる。有利には、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（群）、アシル−ＡＣＰ［＝アシルキャリアタンパク質］デサチュラーゼ（群）、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（群）、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ（群）、アシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ、脂肪酸シンターゼ（群）、脂肪酸ヒドロキシラーゼ（群）、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ（群）、アシル−補酵素Ａオキシダーゼ（群）、脂肪酸デサチュラーゼ（群）、脂肪酸アセチレナーゼ、リポキシゲナーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アレンオキシドシンターゼ、ヒドロペルオキシドリアーゼまたは脂肪酸エロンガーゼ（群）からなる群より選択される脂肪酸または脂質代謝の遺伝子を使用する。特に好ましくは、Δ−５−デサチュラーゼ、Δ−６−デサチュラーゼ、Δ−８−デサチュラーゼ、Δ−１２−デサチュラーゼ、ω−３−デサチュラーゼからなる群より選択される遺伝子を本発明の核酸構築物と組み合わせて使用し、その場合、個々の遺伝子または数個の遺伝子を組み合わせて使用することができる。特に好ましくは、すでに記載されているように、この関連で、配列番号５および７を有するΔ−６−デサチュラーゼ、配列番号９を有するΔ−５−デサチュラーゼ、配列番号１１および１３を有するΔ−１２−デサチュラーゼ、配列番号１および３を有するΔ−６−エロンガーゼ、配列番号１８を有するΔ−５−エロンガーゼ、および／または配列番号２０を有するΔ−４−デサチュラーゼを用いることができる。
【０１１１】
有利には、本発明の核酸構築物中で使用されるデサチュラーゼはＣｏＡ−脂肪酸エステルの形式のそれぞれの基質を変換する。これは、伸長ステップが前もって行われていれば、生成物収率を有利に増加させる。それにより、それぞれの不飽和化産物が、より多量に合成される。その理由は、伸長ステップは概してＣｏＡ−脂肪酸エステルに対して行われ、不飽和化ステップは主にリン脂質またはトリグリセリドに対して行われるからである。ゆえに、ＣｏＡ−脂肪酸エステルとリン脂質またはトリグリセリドとの追加の、限定的であると思われる酵素反応が必要になる交換反応は必要ではない。
【０１１２】
本発明の核酸構築物によってコードされるポリペプチドの酵素活性の結果として、最も異なる多価不飽和脂肪酸を本発明の方法で製造することができる。本発明の方法に使用される植物の選択に応じて、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸および／またはＤＨＡなどの種々の脂肪酸の混合物を遊離または結合形式で製造することができる。出発植物中でどの脂肪酸組成が優勢であるか（Ｃ１８：２またはＣ１８：３脂肪酸）に応じて、ＧＬＡ、ＤＧＬＡまたはＡＲＡなどのＣ１８：２脂肪酸由来の脂肪酸またはＳＤＡ、ＥＴＡまたはＥＰＡなどのＣ１８：３脂肪酸由来の脂肪酸が得られる。該方法に使用される植物中に不飽和脂肪酸としてリノール酸（＝ＬＡ、Ｃ１８：２Δ９，１２）のみが存在する場合、遊離脂肪酸または結合型として存在しうるＧＬＡ、ＤＧＬＡおよびＡＲＡのみが該方法の生成物として生じうる。該方法で使用される植物、例えばアマ中に不飽和脂肪酸としてα−リノレン酸（＝ＡＬＡ、Ｃ１８：３Δ９，１２，１５）のみが存在する場合、ＳＤＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡのみが該方法の生成物として生じ、それらは上記のように遊離脂肪酸または結合型として存在しうる。合成に関与する酵素Δ−５−デサチュラーゼ、Δ−６−デサチュラーゼ、Δ−４−デサチュラーゼ、Δ−１２−デサチュラーゼ、Δ−５−エロンガーゼおよび／またはΔ−６−エロンガーゼの活性の改変によって、所望の脂肪酸組成を有する植物種子油を上記植物中で特に生産することができる。Δ−６−デサチュラーゼおよびΔ−６−エロンガーゼの活性のおかげで、出発植物および不飽和脂肪酸に応じて、ＧＬＡおよびＤＧＬＡまたはＳＤＡおよびＥＴＡを含む油が例えば生じる。Δ−５−デサチュラーゼ、Δ−５−エロンガーゼおよびΔ−４−デサチュラーゼが植物内にさらに組み入れられると、ＡＲＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡがさらに生じる。これらは生合成鎖であるため、それぞれの最終産物は植物中に純物質としては存在しない。最終産物には、少量の前駆化合物も常に含まれる。これらの少量は、所望の最終産物、例えばパルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸および／またはＤＨＡまたはそれらの混合物に基づき、２０重量％未満、有利には１５重量％未満、特に有利には１０重量％未満、特に非常に有利には５、４、３、２または１重量％未満である。
【０１１３】
有利に高い含量の多価不飽和脂肪酸を有する植物種子油を製造するための上記方法の収率を増加させるために、脂肪酸合成の出発材料の量を増加させることは有利である；これは、例えばΔ−１２−デサチュラーゼを伴うポリペプチドをコードする核酸を植物に導入することによって達成することができる。これは、例えば、高いオレイン酸含量を有するアブラナ属（Brassica）などのアブラナ科（Brassicaceae）の油産生植物、例えば菜種で特に有利である。これらの生物は少ないリノール酸含量しか有さないため（Mikoklajczak et al., Journal of the American Oil Chemical Society, 38, 1961, 678 - 681）、出発材料リノール酸の製造に上記Δ−１２−デサチュラーゼを使用することが有利である。
【０１１４】
有利には、上記核酸構築物を本発明の方法で用いる。
【０１１５】
好ましい実施形態では、該方法は、該方法で使用される核酸構築物を含む植物細胞または植物全体を取得するステップをさらに含み、該細胞および／または植物は、上記の本発明の核酸構築物を、単独で、または脂肪酸または脂質代謝のタンパク質をコードするさらなる核酸配列と組み合わせて使用して形質転換される。さらに好ましい実施形態では、本方法は、植物または栽培物から油、脂質または遊離脂肪酸を取得するステップをさらに含む。栽培物には、例えば、温室または農作での植物栽培物が含まれる。そうして得られる細胞または植物は、有利には、例えばアブラナ、カノーラ、アマ、ダイズ、ベニバナなどの油果実植物またはトウモロコシなどの農作物植物などの油産生生物の細胞である。
【０１１６】
栽培（growing）とは、例えば植物細胞、組織または器官の場合の栄養培地上もしくは栄養培地中での培養または担体（substrate）上もしくは担体中での、例えばハイドロカルチャー、植物の栽培に使用される容器中の土、または土壌中での植物全体の栽培であると理解されるものとする。
【０１１７】
本発明の方法に適している生物または宿主細胞は、脂肪酸、特に不飽和脂肪酸を合成できるか、または組み換え遺伝子の発現に適している生物または宿主細胞である。植物アブラナ、カノーラ、アマ、ダイズ、ベニバナまたはトウモロコシが好ましい。
【０１１８】
本発明の方法で合成された多価不飽和脂肪酸を含むトランスジェニック植物は、合成された油、脂質または脂肪酸を単離する必要なく直接、有利に市販することができる。本発明の方法での植物は、トランスジェニック植物由来であり、かつ／またはトランスジェニック植物の生産にさらに使用できる、植物全体およびすべての植物部分、植物器官または植物部分、例えば葉、茎（stalk）、種子、根、塊茎、葯、線維、根毛、茎（stem）、胚、カルス、子葉、葉柄、作物、植物組織、生殖組織、細胞培養物を意味すると理解されるものとする。ここに種子は、種皮、表皮細胞および種子細胞、胚乳または胚組織（embyro tissue）などのすべての種子部分を含む。しかし、本発明の方法で生産される化合物を植物または植物部分、例えば種子から油、脂肪、脂質および／または遊離脂肪酸の形式で単離することもできる。本方法で生産される多価不飽和脂肪酸は、植物が培養されている培養物からか、または農作物から該植物を収穫することによって回収することができる。これは、植物部分、好ましくは植物種子の圧縮または抽出によって行うことができる。ここに、油、脂肪、脂質および／または遊離脂肪酸は、「コールドビーティング（cold beating）」または「常温圧縮」による、熱供給なしの圧縮によって取得することができる。植物部分、特に種子をさらに容易につぶすことができるように、それらを前もって粉砕するか、蒸気で処理するか、またはあぶる。このように前処理された種子を、次いで、圧縮するか、または温かいヘキサンなどの溶媒で抽出することができる。次いで、溶媒を再び除去する。植物細胞の場合、これらを、例えばさらなる作業ステップなしで収穫後に直接抽出するか、または当業者に公知の種々の方法を用いてつぶした後に抽出する。このようにして、該方法によって生産される９６％を超える化合物を単離することができる。次いで、得られた生成物をさらに加工、すなわち精製する。ここでは、まず、例えば、粘液および浮遊物を除去する。「脱ガム（degumming）」は酵素的に行うか、または、例えば、リン酸などの酸を加えることによって化学的／物理的に行うことができる。次いで、塩基、例えば水酸化ナトリウム溶液で処理することによって遊離脂肪酸を取り出す。得られた生成物を水で十分に洗浄し、生成物中に残留する塩基の除去のために乾燥する。生成物中に依然として含まれる着色剤を除去するために、生成物を、例えば漂白土または活性炭を用いる漂白に付する。最後に、生成物をさらに例えば蒸気で脱臭する。
【０１１９】
好ましくは、本発明の方法によって生産された植物種子油は、ＰＵＦＡおよびＬＣＰＵＦＡ、すなわちＣ１８−、Ｃ２０−またはＣ２２−脂肪酸分子、有利には脂肪酸分子中に少なくとも１個の二重結合、好ましくは２、３、４、５または６個の二重結合を有するＣ１８−、Ｃ２０−またはＣ２２−脂肪酸分子を含む。これらのＣ１８−、Ｃ２０−またはＣ２２−脂肪酸分子は、植物、特に植物種子から油または脂質の形式で単離することができる。
【０１２０】
したがって、本発明の一実施形態は、総脂肪酸含量中の約７〜約２６重量％の含量でアラキドン酸を含み、アラキドン酸とγ−リノレン酸との重量パーセント比が約１：１〜約５：１であり、かつアラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸との重量パーセント比が約１：１〜約５：１である、植物種子油、脂質または脂肪酸またはそれらのフラクションである。これらの植物種子油、脂質または脂肪酸またはそれらのフラクションは、配列番号１５、１６または１７に示される本発明の核酸構築物がゲノムに組み込まれているトランスジェニック植物を使用する上記方法によって製造することができる。
【０１２１】
ここに本発明の植物種子油は、図３Ｂの脂肪酸スペクトルにも示されるように、好ましくは、脂肪酸パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸を含む脂肪酸スペクトルを含む。
【０１２２】
植物種子油中に存在する脂肪酸エステルまたは脂肪酸混合物は、有利には、総脂肪酸含量に基づき、約３．２〜５．３％のパルミチン酸、約２．２〜５．３％のステアリン酸、約１０〜２５％のオレイン酸、約２２〜３６％のリノール酸、約４〜１２％のγ−リノレン酸、約３〜８％のα−リノレン酸、約０．２〜１％のステアリドン酸、約３〜９％のジホモ−γ−リノレン酸、約１２〜２５％のアラキドン酸および約１〜４％のエイコサペンタエン酸を含む。さらに、上記脂肪酸エステルまたは脂肪酸混合物は、有利には、脂肪酸エルカ酸（１３−ドコサエン酸（13-docosaenoic acid））、ステルクリン酸（９，１０−メチレンオクタデカ−９−エン酸（9,10-methyleneoctadec-9-enoic acid））、マルバル酸（malvalic acid）（８，９−メチレンヘプタデカ−８−エン酸（8,9-methyleneheptadec-8-enoic acid））、チョールムーグラ酸（シクロペンテンドデカン酸）、フラン脂肪酸（９，１２−エポキシオクタデカ−９，１１−ジエン酸（9,12-epoxyoctadeca-9,11-dienoic acid））、ベルノン酸（vernonic acid）（９，１０−エポキシオクタデカ−１２−エン酸（9,10-epoxyoctadec-12-enoic acid））、タリン酸（tarinic acid）（６−オクタデシン酸）、６−ノナデシン酸、サンタルビン酸（santalbic acid）（ｔ１１−オクタデセン−９−イン酸（t11-octadecen-9-ynoic acid））、６，９−オクタデセニン酸（6,9-octadecenynoic acid）、ピルリン酸（pyrulic acid）（ｔ１０−ヘプタデセン−８−イン酸（t10-heptadecen-8-ynoic acid））、クレペニン酸（crepenynic acid）（９−オクタデセン−１２−イン酸（9-octadecen-12-ynoic acid））、１３，１４−ジヒドロオロフェイン酸（13,14-dihydrooropheic acid）、オクタデセン−１３−エン−９，１１−ジイン酸（octadecen-13-ene-9,11-diynoic acid）、ペトロセレン酸（petroselenic acid）（シス−６−オクタデセン酸）、９ｃ，１２ｔ−オクタデカジエン酸（9c,12t-octadecadienoic acid）、カレンデュラ酸（calendula acid）（８ｔ１０ｔ１２ｃ−オクタデカトリエン酸（8t10t12c-octadecatrienoic acid））、カタルピン酸（catalpinic acid）（９ｔ１１ｔ１３ｃ−オクタデカトリエン酸（9t11t13c-octadecatrienoic acid））、エレオステリン酸（eleosteric acid）（９ｃ１１ｔ１３ｔ−オクタデカトリエン酸（9c11t13t-octadecatrienoic acid））、ジャカル酸（８ｃ１０ｔ１２ｃ−オクタデカトリエン酸（8c10t12c-octadecatrienoic acid））、プニカ酸（punicic acid）（９ｃ１１ｔ１３ｃ−オクタデカトリエン酸（9c11t13c-octadecatrienoic acid））、パリナリン酸（parinaric acid）（９ｃ１１ｔ１３ｔ１５ｃ−オクタデカデトラエン酸（9c11t13t15c-octadecatetraenoic acid））、ピノレン酸（pinolenic acid）（オール−シス−５，９，１２−オクタデカトリエン酸（all-cis-5,9,12-octadecatrienoic acid））、ラバレン酸（laballenic acid）（５，６−オクタデカジエンアレン酸（5,6-octadecadienallenic acid））、リシノール酸（ricinolec acid）（１２−ヒドロキシ油酸）および／またはコリオリン酸（coriolic acid）(１３−ヒドロキシ−９ｃ，１１ｔ−オクタデカジエン酸）からなる群より選択される脂肪酸を含むことができる。上記の脂肪酸は、概して、有利に、本発明の方法によって製造された脂肪酸エステルまたは脂肪酸混合物中に微量にのみ存在し、すなわち、それらは、総脂肪酸に基づき、３０％未満、好ましくは２５％、２４％、２３％、２２％または２１％未満、特に好ましくは２０％��１５％、１０％、９％、８％、７％、６％または５％未満、特に非常に好ましくは４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満しか存在しない。有利には、上記脂肪酸エステルまたは脂肪酸混合物は、以下の脂肪酸の１つにおいて、総脂肪酸に基づき０．１％未満しか含まないか、またはより良好には、クルパノドン酸（clupanodonic acid）（＝ドコサペンタエン酸、Ｃ２２：５Δ４，８，１２，１５，２１）およびニシン酸（nisic acid）（テトラコサヘキサエン酸、Ｃ２３：６Δ３，８，１２，１５，１８，２１）を含まない。
【０１２３】
好ましくは、本発明の植物種子油は、産生生物、有利にはトランスジェニック植物、特に有利には油果実植物、例えばダイズ、アブラナ、ベニバナ、アマまたは農作物トウモロコシの総脂肪酸含量に基づき、約７〜約２６重量％のＡＲＡ、および少なくとも１％、１．５％、２％、３％、４％または５％、有利には少なくとも６％、または７％、特に有利には少なくとも８％、９％または１０％のＥＰＡを含む。さらに、上記植物種子油はＥＰＡに関して指定される量のＤＨＡを含むことができる。
【０１２４】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の植物種子油またはそれから抽出されたＬＣ−ＰＵＦＡの、飼料、食品、好ましくはベビーフード、化粧品または医薬品での使用である。本発明の植物種子油またはそれから抽出されたＬＣ−ＰＵＦＡは、当業者に公知の様式で、他の油、脂質、脂肪酸または脂肪酸混合物、例えば植物（上記）または微生物（例えばMortierella alpinaまたはCrythecodinium cohnii由来）または動物起源（魚油など）との混合に使用することができる。（ｉ）植物および微生物または（ｉｉ）植物および動物または（ｉｉｉ）植物および微生物および動物成分からなる油、脂質、脂肪酸または脂肪酸混合物のこれらの混合物を飼料、食品、好ましくはベビーフード、化粧品または医薬品の生産に使用することもできる。
【０１２５】
用語「油」、「脂質」または「脂肪」は、不飽和、飽和、好ましくはエステル型、脂肪酸（群）を含む脂肪酸混合物を意味すると理解される。油、脂質または脂肪は、高い割合の単価および多価不飽和、有利にはエステル型脂肪酸（群）を有することが好ましい。好ましくは、不飽和エステル型脂肪酸の割合は、約３０％、より好ましくは５０％の割合であり、さらにより好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または９９．５％の割合である。測定に関して、例えば、脂肪酸をエステル転移反応によってメチルエステルに変換した後、ガスクロマトグラフィーによって脂肪酸の割合を測定することが可能である。油、脂質または脂肪は、種々の他の飽和または不飽和脂肪酸、例えばカレンディラ酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸などを含むことができる。特に、出発植物に応じて、油または脂肪中の種々の脂肪酸の割合を変動させることが可能である。
【０１２６】
有利には少なくとも２個の二重結合を有する、該方法で生産される多価不飽和脂肪酸は、上記の通りであり、例えばスフィンゴ脂質、ホスホグリセリド、脂質、糖脂質、リン脂質、モノアシルグリセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセロールまたは他の脂肪酸エステルである。
【０１２７】
本発明の方法で生産された、有利には少なくとも１、２、３、４、５または６個の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を含む植物種子油から、例えば有利にはメタノールまたはエタノールなどのアルコールの存在下でのアルカリ処理、例えば水性ＫＯＨまたはＮａＯＨまたは酸加水分解を用いて、または酵素による切断を用いて多価不飽和脂肪酸を放出させ、例えば相分離およびその後の例えばＨ２ＳＯ４を用いる酸性化を用いて単離することができる。脂肪酸の放出は、以前に記載される精密検査（work-up）を行わずに直接行うこともできる。
【０１２８】
植物細胞または植物に導入された後、本方法で使用される核酸構築物は、分離したプラスミドまたは宿主細胞のゲノムに有利に組み込まれる。ゲノムへの組み込みでは、組み込みはランダムであるか、またはネイティブ遺伝子が、導入されたコピーによって置換され、それにより所望の化合物の生産が細胞によって調節されるような組み換えによって、もしくは「トランス」での遺伝子の使用により、遺伝子が、遺伝子の発現を保証する少なくとも１つの配列および転写された機能的な遺伝子のポリアデニル化を保証する少なくとも１つの配列を含む機能的発現単位と機能的に結びついているようにすることによって行うことができる。有利には、多重発現カセットまたは構築物を用いて核酸を植物中で多重並行発現にさせ、有利には遺伝子を植物中で多重並行で種子特異的に発現させる。
【０１２９】
コケおよび藻類は、アラキドン酸（ＡＲＡ）および／またはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）および／またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などのかなりの量の多価不飽和脂肪酸を生産する唯一の公知の植物系である。コケは膜脂質中にＰＵＦＡを含み、一方、藻類、藻類関連生物およびいくつかの真菌はまた、トリアシルグリセロールフラクション中に顕著な量のＰＵＦＡを蓄積する。したがって、そのような系統から単離された核酸分子もトリアシルグリセロールフラクション中にＰＵＦＡを蓄積し、本発明の方法および宿主、特に植物、例えば油果実植物、例えばアブラナ、カノーラ、アマ、ダイズ、ベニバナ中の脂質およびＰＵＦＡ産生系の改変に特に有利である。したがってそれらを本発明の方法で有利に使用することができる。
【０１３０】
配列番号１５、１６または１７を有する核酸構築物を好ましく使用する、本発明の方法での長鎖ＰＵＦＡを含む植物種子油の生産では、多価不飽和Ｃ１８−脂肪酸を最初にデサチュラーゼの酵素活性によって不飽和化し、次いでエロンガーゼによって少なくとも２個の炭素原子を伸長する必要がある。伸長ラウンド後、この酵素活性はＣ２０−脂肪酸を生じさせ、２回の伸長ラウンド後はＣ２２−脂肪酸を生じさせる。本発明の方法で使用されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼの活性は、好ましくは、有利には脂肪酸分子中に少なくとも１個の二重結合を有し、好ましくは２、３、４、５または６個の二重結合を有するＣ１８−、Ｃ２０−および／またはＣ２２−脂肪酸を生じさせ、特に好ましくは、脂肪酸分子中に少なくとも２個の二重結合を有し、好ましくは３、４、５または６個の二重結合を有し、特に非常に好ましくは５または６個の二重結合を分子中に有するＣ１８−、Ｃ２０−および／またはＣ２２−脂肪酸を生じさせる。第１の不飽和化および伸長が行われた後、さらなる不飽和化および伸長ステップ、例えばΔ−５およびΔ−４位でのそのような不飽和化を続いて行うことができる。本発明の方法の産物として特に好ましいのは、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸である。
【０１３１】
有利に使用されるトランスジェニック植物中の脂肪酸、油、脂質または脂肪の好ましい生合成部位は、例えば、一般に、本方法で使用される核酸の種子特異的発現が有利であるような種子または種子の細胞層である。脂肪酸、油または脂質の生合成は種子組織に制限されてはならず、すべての他の植物部分、例えば表皮細胞または塊茎で、組織特異的に行うこともできる。
【０１３２】
とりわけエロンガーゼをコードする、本発明の核酸構築物の使用によって、本方法で生産される多価不飽和脂肪酸を、非組み換え的に該核酸を含む野生型の該植物と比較して、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、特に好ましくは少なくとも２０％、非常に特に好ましくは少なくとも５０％増加させることができる。
【０１３３】
本発明の方法によって、本方法で生産される植物種子油中の多価不飽和脂肪酸を、原理的に、２つのタイプに増加させることができる。有利には、該方法によって生産される遊離多価不飽和脂肪酸のプールおよび／またはエステル型多価不飽和脂肪酸の部分を増加させることができる。有利には、トランスジェニック植物中のエステル型多価不飽和脂肪酸のプールを本発明の方法によって増加させる。
【０１３４】
脂質および脂肪酸、ＰＵＦＡ補助因子および酵素の代謝、または膜を用いる親油性化合物の輸送に関与する本発明の核酸構築物は、本発明の方法で、トウモロコシ、ダイズ、アマ（Linum）種、例えばアマ、油または線維アマ、アブラナ（Brassica）種、例えばアブラナ、カノーラおよび菜種、ベニバナなどのトランスジェニック植物でのＰＵＦＡの生産の調節に直接（例えば脂肪酸生合成タンパク質の過剰発現または最適化が、改変された植物からの脂肪酸の収率、生産および／または生産効率に直接の影響を有する場合）使用され、かつ／または、間接作用を有し、それにもかかわらず、ＰＵＦＡの収率、生産および／または生産効率の増加または望ましくない化合物の減少を生じさせることができる（例えば脂質および脂肪酸、補助因子および酵素の代謝の調節が、収率、生産および／または生産効率または細胞内の所望の化合物の組成の変化を生じさせ、ひいてはそれが１種以上の脂肪酸の生産に影響しうる場合）。
【０１３５】
種々の前駆体分子および生合成酵素の組み合わせは種々の脂肪酸分子の生産を生じさせ、それが脂質の組成に決定的な影響を有する。多価不飽和脂肪酸（＝ＰＵＦＡ）は単にトリアシルグリセロールに組み入れられるだけでなく、膜脂質にも組み入れられる。
【０１３６】
脂質合成は２つのセクション：脂肪酸の合成およびｓｎ−グリセロール３−リン酸へのその結合および極性頭部の付加または修飾に分けることができる。膜中で使用される通常の脂質は、リン脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質およびホスホグリセリドを含む。脂肪酸合成は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼによるアセチル−ＣｏＡからマロニル−ＣｏＡへの変換またはアセチルトランスアシラーゼによるアセチル−ＡＣＰへの変換で始まる。縮合反応後、これらの２つの生成物分子は一緒にアセトアセチル−ＡＣＰを形成し、それがいくつかの縮合、還元および脱水反応によって、所望の鎖長を有する飽和脂肪酸分子が得られるように変換される。これらの分子からの不飽和脂肪酸の生成は特定のデサチュラーゼによって触媒され、具体的には、分子酸素によって好気的にまたは嫌気的に行われる（微生物中での脂肪酸合成に関しては、F.C. Neidhardt et al. (1996) E. coli and Salmonella. ASM Press: Washington, D.C., pp. 612-636および含まれる引用文献; Lengeler et al. (編) (1999) Biology of Procaryotes. Thieme: Stuttgart, New York, および含まれる引用文献, およびMagnuson, K., et al. (1993) Microbiological Reviews 57:522-542および含まれる引用文献を参照のこと）。そのように生成されたリン脂質に結合している脂肪酸は、次いで、脂肪酸ＣｏＡエステルプール中のリン脂質のさらなる伸長のために再変換されなければならない。これはアシル−ＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼによって可能になる。さらに、これらの酵素は、ＣｏＡエステルから再び、伸長された脂肪酸をリン脂質に移すことができる。この反応シーケンスを、適切な場合には数回実行することができる。
【０１３７】
ＰＵＦＡ生合成の前駆体は、例えば、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸である。これらのＣ１８−炭素脂肪酸は、エイコサおよびドコサ鎖型の脂肪酸が取得されるように、Ｃ２０およびＣ２２に伸長される必要がある。本方法で使用される核酸構築物、デサチュラーゼ（例えばΔ−１２−およびΔ−１５、ω−３−、Δ−１２、Δ−４−、Δ−５−およびΔ−６−デサチュラーゼ）および／またはエロンガーゼ（Δ−５−およびΔ−６−エロンガーゼ）のおかげで、例えば、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸またはドコサヘキサエン酸を製造することができ、その後、食品、飼料、化粧品または医薬品の適用において種々の目的で使用することができる。上記酵素を使用すると、脂肪酸分子中に少なくとも１個、有利には少なくとも２、３、４、５または６個の二重結合を有するＣ２０−および／またはＣ２２−脂肪酸、好ましくは、脂肪酸分子中に有利には４、５または６個の二重結合を有するＣ２０−またはＣ２２−脂肪酸を製造することができる。不飽和化は、対応する脂肪酸の伸長前または伸長後に行うことができる。したがって、デサチュラーゼ活性の産物および可能性のあるさらなる不飽和化および伸長は、より高度の不飽和化を有する好ましいＰＵＦＡを生じさせ、それには、Ｃ２０〜Ｃ２２−脂肪酸の、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸などの脂肪酸へのさらなる伸長が含まれる。本発明の方法で使用されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼの基質は、Ｃ１６−、Ｃ１８−またはＣ２０−脂肪酸、例えばリノール酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサテトラエン酸またはステアリドン酸である。好ましい基質は、リノール酸、γ−リノレン酸および／またはα−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸またはアラキドン酸、エイコサテトラエン酸またはエイコサペンタエン酸である。脂肪酸中に少なくとも１、２、３、４、５または６個の二重結合を有する合成されたＣ２０−またはＣ２２−脂肪酸は、本発明の方法で、遊離脂肪酸の形式でまたはそのエステルの形式で、例えばそのグリセリドの形式で取得される。
【０１３８】
用語「グリセリド」は、１、２または３個のカルボン酸基でエステル化されたグリセロール（モノ−、ジ−、またはトリグリセリド）を意味すると理解される。「グリセリド」は、種々のグリセリドの混合物を意味するとも理解される。グリセリドまたはグリセリド混合物はさらなる添加物、例えば遊離脂肪酸、酸化防止剤、タンパク質、炭水化物、ビタミンおよび／または他の物質を含むことができる。本発明の方法の意義の範囲内の「グリセリド」は、グリセロール由来のさらなる誘導体を意味すると理解される。これらには、上記脂肪酸グリセリドに加えて、グリセロリン脂質およびグリセロ糖脂質も含まれる。好ましくは、ここで、一例として、グリセロリン脂質、例えばレシチン（ホスファチジルコリン）、カルジオリピン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンおよびアルキルアシルグリセロリン脂質に言及することができる。
【０１３９】
さらに、次いで、脂肪酸を種々の修飾部位に輸送し、トリアシルグリセロール貯蔵脂質に組み入れる必要がある。脂質合成のさらなる重要なステップは、例えばグリセロール脂肪酸アシルトランスフェラーゼによる極性頭部への脂肪酸の転移である（Frentzen, 1998, Lipid, 100(4-5):161-166を参照のこと）。
【０１４０】
以下の文献中の植物脂肪酸生合成、不飽和化、脂質代謝および脂肪含有化合物の膜輸送、ベータ酸化、脂肪酸修飾および補助因子、トリアシルグリセロール貯蔵および会合（assembling）についての刊行物（その引用文献を含む）を参照されたい：Kinney, 1997, Genetic Engeneering, ed.: JK Setlow, 19:149-166; Ohlrogge and Browse, 1995, Plant Cell 7:957-970; Shanklin and Cahoon, 1998, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 49:611-641; Voelker, 1996, Genetic Engeneering, ed.: JK Setlow, 18:111-13; Gerhardt, 1992, Prog. Lipid R. 31:397-417; Guehnemann-Schaefer & Kindl, 1995, Biochim. Biophys Acta 1256:181-186; Kunau et al., 1995, Prog. Lipid Res. 34:267-342; Stymne et al., 1993, in: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants, ed.: Murata and Somerville, Rockville, American Society of Plant Physiologists, 150-158, Murphy & Ross 1998, Plant Journal. 13(1):1-16。
【０１４１】
本方法で生産される植物種子油は、細菌などの他の生物によって容易に合成することができるが、高等動物がもはや合成できず、ゆえに同化しなければならないか、または高等動物がもはや援助なしで適切に生産できず、ゆえに追加的に同化しなければならない分子群であるＰＵＦＡを含む。例えば、ネコはアラキドン酸をもはや合成できない。
【０１４２】
本発明の意義の範囲内の「リン脂質」は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールおよび／またはホスファチジルイノシトール、より有利にはホスファチジルコリンを意味すると理解されるものとする。用語「生産または生産性」は当業者の間（specialist field）で公知であり、それには、特定のタイムスパンでかつ特定の容量で形成される生成物（式Ｉの化合物）の濃度（例えば生成物ｋｇ／時間／リットル）が含まれる。それはまた、植物細胞または植物内の生産性であって、この細胞または植物中のすべての脂肪酸の含量に基づく、本方法で生産される所望の脂肪酸含量である生産性を含む。用語「生産効率」は、特定の生産量を取得するために必要な時間（例えば細胞が特定のファインケミカル処理速度を立ち上げるために要する時間）を含む。用語「収率または生成物／炭素収率」は当業者の間で公知であり、生成物（すなわちファインケミカル）中の炭素源の変換の効率を含む。これは、通常、例えば、生成物ｋｇ／炭素源ｋｇとして表される。化合物の収率または生産を増加させることによって、固定された期間中に特定の栽培量中で得られる分子の量または特定の栽培量中で得られるこの化合物のうちの適した分子の量が増加する。用語「生合成または生合成経路」は当業者の間で公知であり、例えば多重ステップおよび高度に制御されたプロセスにおける、中間体化合物からの、細胞による化合物、好ましくは有機化合物の合成を含む。用語「分解または分解経路」は当業者の間で公知であり、例えば多重ステップおよび高度に制御されたプロセスにおける、細胞による化合物、好ましくは有機化合物の、分解産物（より一般には、小さい分子または複雑さの低い分子）への切断を含む。用語「代謝」は当業者の間で公知であり、生物中で生じる生化学反応の全体を含む。そして、特定の化合物の代謝（例えば脂肪酸の代謝）は、この化合物に関する、細胞中のこの化合物の生合成、修飾および分解経路の全体を含む。
【０１４３】
本発明の核酸構築物および、適切な場合には、脂質または脂肪酸代謝の酵素をコードするさらなるポリヌクレオチドの使用により、本発明の方法において種々の有利な効果を達成することができる。ゆえに、植物、好ましくは油果実植物中の多価不飽和脂肪酸の収率、生産および／または生産効率が影響を受ける。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの数または活性は、多量の遺伝子産物およびゆえに最終的に多量の一般式Ｉの化合物が生産できるように増加させることができる。対応する遺伝子／遺伝子群の組み入れ前に該化合物の生合成に関する活性および能力が不存在であった、生物中の新規合成も可能である。これは、適宜、さらなるデサチュラーゼまたはエロンガーゼまたは、脂肪酸および脂質代謝由来のさらなる酵素との組み合わせを求める。種々の多岐にわたる配列、すなわちＤＮＡ配列レベルで異なる配列の使用または、例えば種子または油貯蔵組織の成熟度の程度に応じて、異なる時間的遺伝子発現を可能にする遺伝子発現のためのプロモーターの使用もここに有利でありうる。
【０１４４】
本発明の核酸構築物を単独でまたは他の遺伝子と組み合わせて植物に導入することによって、最終産物へ流れる生合成を増加させることができるだけでなく、対応するトリアシルグリセロール組成を増加させるかまたは新規に創出することもできる。同様に、１種以上の脂肪酸、油、極性および／または中性脂質の生合成に必要な栄養分の輸入に関する他の遺伝子の数または活性を増加させて、細胞内または貯蔵区画内のこれらの前駆体、補助因子または中間体化合物の濃度を増加させ、それによりＰＵＦＡを生産する細胞の能力がさらに高まるようにすることができる。これらの化合物の生合成に関与する１種以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性または数の増加の最適化によるか、またはこれらの化合物の分解に関与する１種以上の遺伝子の活性を破壊することにより、植物からの脂肪酸および脂質分子の収率、生産および／または生産効率を高めることが可能である。該方法において得られた植物種子油はさらなる貴重な生成物の化学合成の出発材料として適している。それらは、例えば、互いに組み合わせるかまたは単独で医薬品、食品、特に乳児食またはベビーフード、動物飼料または化粧品の生産に使用することができる。
【０１４５】
好ましくは、本発明の方法は、油、脂質または脂肪酸組成物として植物種子油を配合するさらなるステップ（ｄ）を含む。
【０１４６】
さらに好ましくは、本発明の方法で油、脂質または脂肪酸組成物をさらに配合して、食品、好ましくはベビーフードを得る。
【０１４７】
この方法の好ましい実施形態では、油、脂質または脂肪酸組成物をさらに配合して、医薬品を得るか、化粧品を得るか、食品を得るか、フードサプリメントを得るか、飼料、好ましくは魚飼料もしくは産卵鶏の飼料を得るか、またはフードサプリメントを得る。
【０１４８】
最後に、本発明は、基本的に、油、脂質または脂肪酸組成物の生産のための、本発明の核酸構築物、これらの核酸構築物を含むトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物の使用に関する。そしてこれは、好ましくは、医薬品、化粧品、食品、特にベビーフード、飼料、好ましくは魚飼料もしくは産卵鶏のエサ、またはフードサプリメントとして用いることができる。
【０１４９】
例えば、本発明の植物種子油を、上記適用に加えて、動物の飼料、特に繁殖結果の向上のための飼料適用に関するフードサプリメントとして使用することができる。例えばサケ（Salmonidae）、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリの畜産結果の向上のため、および家畜、例えばネコおよびイヌの健康のための飼料添加物は、若い動物または母親動物のエサにＡＲＡを添加する場合、生殖率の向上に適した濃度のアラキドン酸（ＡＲＡ）を含む。ＡＲＡに加えて、ここに飼料製品はまた、高品質飼料添加物を得るために、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を含む。食物および飼料製品の該添加は、生殖率を高め、若い動物の生存確率を良好にし、および神経学的および視覚的発達を向上させる。
【０１５０】
さらに、本発明の植物種子油は、工業目的で、例えば工業油の形式で用いることもできる。そのような油は、重合成分として二重結合を有する特有の高濃度の不飽和脂肪酸を含む。本発明の植物種子油は、単独でまたは重合剤と組み合わせて、以下の工業的適用に用いることができる：
１．  ラッカーおよびコーティング（酸化的乾燥油としての使用）
２．  床材（floor coverings）用ポリマーまたはプラスチック（酸化的乾燥油としての使用）
３．  他の化学的適用
４．  化粧品適用
５．  電子および半導体テクノロジー分野での適用。
【０１５１】
上記本発明の植物種子油の利点は、その特有の重合特性にある。該油は、高速かつ均一に重合し、強い３次元構造を形成し、それは、該網目構造の強度、耐久性および弾性が必要な場合（コーティングおよび床材またはプラスチック）に有利である。該油のほとんどの脂肪酸中の二重結合の均一分布の結果として、生成物は高弾性をさらに有する。
【０１５２】
本特許出願で引用されるすべての引用文献、特許出願、特許および公開されている特許出願の内容は、それぞれの具体的開示内容への参照によりここに含まれる。
【０１５３】
以下の実施例によって本発明をさらに説明する。実施例は、限定的であると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１５４】
実施例１：一般的クローニング手順
クローニング手順、例えば制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、ニトロセルロースおよびナイロンメンブレンへの核酸のトランスファー、ＤＮＡ断片の連結、大腸菌（Escherichia coli）細胞の形質転換、細菌の培養および組み換えＤＮＡのシーケンス解析はSambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載のように行った。
【０１５５】
実施例２：脂質抽出および植物種子油の分析
植物中の、または所望の化合物（例えば脂肪酸）の産生に対する遺伝子改変の影響は、適した条件（例えば上で記載される条件）下で改変植物を培養し、所望の生成物（すなわち脂質または脂肪酸）の生産の増加に関して培地および／または細胞成分を調査することによって決定することができる。これらの分析技術は当業者に公知であり、分光学、薄層クロマトグラフィー、種々のタイプの染色手順、酵素および微生物学的処理および分析用クロマトグラフィー、例えば高速液体クロマトグラフィーを含む（例えば、Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 89-90 and pp. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Vol. 3, Chapter III: "Product recovery and purification", pp. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A., et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F., and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A., and Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3; Chapter 11, pp. 1-27, VCH: Weinheim; およびDechow, F.J. (1989) Sep
aration and purification techniques in biotechnology, Noyes Publicationsを参照のこと）。
【０１５６】
上記方法に加えて、Cahoon et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (22):12935-12940, およびBrowse et al. (1986) Analytic Biochemistry 152:141-145に記載のように植物材料から植物脂質を抽出する。定性的および定量的な脂質または脂肪酸分析は、Christie, William W., Advances in Lipid Methodology, Ayr/Scotland: Oily Press (Oily Press Lipid Library; 2); Christie, William W., Gas Chromatography and Lipids. A Practical Guide - Ayr, Scotland: Oily Press, 1989, Repr. 1992, IX, 307 S. (Oily Press Lipid Library; 1); "Progress in Lipid Research, Oxford: Pergamon Press, 1 (1952) - 16 (1977) under the title: Progress in the Chemistry of Fats and Other Lipids CODENに記載されている。
【０１５７】
一例は脂肪酸の分析である（略語：ＦＡＭＥ，脂肪酸メチルエステル；ＧＣ−ＭＳ，ガス−液体クロマトグラフィー質量分析；ＴＡＧ，トリアシルグリセロール；ＴＬＣ，薄層クロマトグラフィー）。
【０１５８】
スチールボールで砕く（Retsch mill、１分）ことによって分析対象の材料を破砕した。破砕後に材料を遠心分離し、沈殿を蒸留水に再懸濁し、１００℃で１０分間加熱し、氷上で冷却し、再び遠心分離し、次いで２％ジメトキシプロパンを含むメタノール中の０．５Ｍ硫酸で９０℃で１時間抽出し、それにより加水分解された油および脂質化合物が生じ、メチル基転移された脂質を得た。これらの脂肪酸メチルエステルを石油エーテルに抽出し、最後にキャピラリーカラム（Chrompack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB，２５ミクロン，０．３２ｍｍ）を使用して、１７０℃〜２４０℃の温度勾配で２０分間および２４０℃で５分間のＧＣ分析に付した。市販の供給元（例えばSigma）から入手可能な標準を使用して、得られた脂肪酸メチルエステルが何であるかを明らかにした。
【０１５９】
実施例３：代謝経路に関与する遺伝子の組み合わせおよびＴプラスミド中のそれらの組み立て
アブラナの種子でのＬＣ−ＰＵＦＡの合成のために、代謝経路で必要な遺伝子（表１）を、発現エレメント（プロモーター、ターミネーター、表２）と組み合わせて、形質転換ベクターに導入した。
【表１】
2011519552.tif 000007
【表２】
2011519552.tif 000008
【０１６０】
該遺伝子および該発現エレメントから出発し、ゲートウェイクローニング手順（Invitrogen）を製造元の使用説明書にしたがって使用して、pENTRベクターの多重カセットをバイナリーＴのプラスミドpSUN中に組み合わせた。Hellens et al, Trends in Plant Science (2000) 5: 446-451は、バイナリーベクターの調査およびそれらの使用を記載している。pENTRベクターの組み換え反応によって、バイナリーＴプラスミドＶＣ−ＬＪＢ９１３−１ｑｃｚ（配列番号１５）、ＶＣ−ＬＪＢ１３２７−１ｑｃｚ（配列番号１６）およびＶＣ−ＬＪＢ１３２８−１ｑｃｚ（配列番号１７）を取得した。得られたベクターの機能的発現カセットの配列（プロモーター、遺伝子、ターミネーター）を図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに示す。
【０１６１】
同様に、多価不飽和長鎖脂肪酸ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含む植物種子油の合成のための機能的発現カセットを作製することもできる。ＤＨＡはさらなる重要な母乳成分である。植物でのＤＨＡの合成のために、ＷＯ２００５／０８３０９３に記載のように、アブラナ中に構築物を形質導入することができる。ＤＨＡを含む植物種子油を製造しようとする場合、本発明の核酸構築物は、上記遺伝子に加えて、好ましくは配列番号１８に示されるOstreococcus tauri由来のΔ５−エロンガーゼおよび配列番号２０に示されるTraustochytrium ssp.由来のΔ４−デサチュラーゼをコードする遺伝子を含む。ここで適しているプロモーターは配列番号２２、２４、２６、２８、３０および３３ｇであり、ターミネーターとしては配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３２および３４を用いることができる。
【０１６２】
実施例４：トランスジェニックアブラナ植物の作製（Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8:238-242にしたがって改変）
トランスジェニックアブラナ植物（Brassica napus）の作製では、適切に組み合わされた遺伝子を有する、上記でさらに記載されたｐＳＵＮプラスミドなどのバイナリーベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ｃ５８Ｃ１：ｐＧＶ２２６０中に形質導入した（Deblaere et al, 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788）。アブラナ植物の形質転換では、３％スクロースを含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ培地（Murashige and Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473）（３ＭＳ培地）中の陽性に形質転換されたアグロバクテリウムコロニーの一晩培養物の１：５０希釈物を使用した。新たに発芽させた滅菌アブラナ植物の葉柄または子葉下部（hypocotyledons）（それぞれ〜約１ｃｍ２）をペトリ皿で１：５０アグロバクテリウム希釈液と５〜１０分間インキュベートした。０．８％Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒを含む３ＭＳ培地中で２５℃で暗所で３日間の共インキュベーションを続けて行った。１６時間の明期／８時間の暗期での３日間の後に培養を継続し、５００ｍｇ／ＬのＣｌａｆｏｒａｎ（セフォタキシムナトリウム）、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、２０ｍＭのベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）および１．６ｇ／Ｌのグルコースを含むＭＳ培地上で１週間の周期性で継続した。２％スクロース、２５０ｍｇ／ＬのＣｌａｆｏｒａｎおよび０．８％Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒを含むＭＳ培地に成長中の発芽を移した。３週間後に根が形成されなければ、発根の成長ホルモンとして２−インドール酪酸を培地に加えた。
【０１６３】
カナマイシンおよびＣｌａｆｏｒａｎを有する２ＭＳ培地中で再生された発芽を取得し、発根後に土に移し、２週間の栽培後に気候室または温室で育て、開花させ、熟した種子を収穫し、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ遺伝子の発現に関して、一例としてQiu et al. 2001, J. Biol. Chem. 276, 31561-31566に記載の脂質分析によって調査した。
【０１６４】
（ｂ）トランスジェニックアマ植物の作製
トランスジェニックアマ植物の作製は、例えばBell et al., 1999, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant. 35(6):456-465の方法にしたがって微粒子銃によってもたらすことができる。例えばMlynarova et al. (1994), Plant Cell Report 13: 282-285にしたがってアグロバクテリア媒介性形質転換を生じさせることができる。
【０１６５】
実施例５：作製されたＴプラスミドで形質転換されたトランスジェニックアブラナ植物の脂質分析
実施例３で作製されたプラスミドを実施例４に記載のようにアブラナ（Brassica napus）に形質導入した。ＰＣＲによるトランスジェニック植物の選択後、これらを種子成熟（昼／夜サイクル：１６時間，２００ｍＥ，２１℃，８時間暗，１９℃）まで育て、種子を収穫した。
【０１６６】
収穫された種子を実施例２に記載のように抽出し、ガスクロマトグラフィーによる分析に付した。表３は、これらの構築物の種々の系統の結果を示す。表５は脂肪酸に使用される命名法を示す。表６は、ＡＲＡとすべての測定された脂肪酸の平均値との比を示す。
【０１６７】
驚くべきことに、トランスジェニック植物でのアラキドン酸の産生に関して以前に行われた実験（例えばＷＯ２００５／０８３０９３またはKajikawa et al. Biosci. Biotechno. Biochem., 72, 70549-1-10, 2008）または微生物（例えばMortierella alpina）の油由来のものとは対照的に、新規特性を達成することが可能であることをここに見出すことができた。特に、脂肪酸γ−リノレン酸（ＧＬＡ）とアラキドン酸（ＡＲＡ）およびジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）とアラキドン酸との新規の比を達成した。表４は、アラキドン酸を天然に産生するか、または対応する代謝経路の遺伝子を導入された異なる生物と比較した比の調査を記載する。
【０１６８】
アラキドン酸の生理学的に正の効果に加えて、この時点で、やはり、植物中で得られるＧＬＡおよびＤＧＬＡの有利な比に言及することもできる。アラキドン酸に加えて、ＧＬＡおよびＤＧＬＡは母乳の脂肪部分の重要な成分である。本発明の植物種子油中に存在する比は母乳中の比に非常に近い。さらに、本発明の植物種子油中の脂肪酸組成は母乳中に存在する組成に非常に類似している；図７を比較されたい。
【表３】
2011519552.tif 000009
【０１６９】
2011519552.tif 000010
【表４】
2011519552.tif 000011
【表５】
2011519552.tif 000012
【表６】
2011519552.tif 000013
【０１７０】
実施例６：植物種子油の加工
実施例４で作製されたトランスジェニックアブラナ植物および野生型アブラナ植物の種子の収穫、清浄化および空気乾燥（残留水分約７％）後、本発明の植物種子油および野生型油の取得のために、得られた種子を加工した。加工は、種子の粉砕および圧縮で始まり、抽出が続いた。抽出はヘキサンを用いて１回行い、他方、超臨界ＣＯ２抽出を用いて行った。次いで、ヘキサンで抽出された油の精製および安定化を行った。
【０１７１】
抽出処理および精製処理を以下に詳細に記載する。
【０１７２】
超臨界二酸化炭素（ＣＯ２）抽出は抽出剤としての臨界未満または超臨界状態の二酸化炭素の使用に基づき、抽出剤は循環している（Barthet and Daun 2002, JAOCS 79:245-51）。超臨界液体抽出（ＳＬＥ）を用いる抽出では、実施例４に記載のトランスジェニックアブラナ植物の種子およびBrassica napus野生型の種子を使用した。ＳＬＥでの抽出前に、まず、窒素雰囲気下で事前圧縮（ロールプレス）によって種子を０．１５ｍｍまたは０．０５ｍｍに粉砕した。
【０１７３】
比較のために、ヘキサンを用いる従来のソックスレー抽出を行った。この有機抽出では、主として標準条件を選択した。１０ｇの事前圧縮された種子をセルロースフィルターに入れた。２００ｍＬの有機溶媒（ヘキサン）を含む蒸留フラスコを加熱した。蒸発した溶媒はフラスコ上に取り付けられた濃縮器で濃縮した。濃縮物は、事前圧縮された種子を入れたフィルター中に落ち、脂溶性成分を溶解した。液面が吸引管の限界に達したらすぐに、溶媒は圧力下の蒸留フラスコに流れて戻った。フィルターユニット中の抽出溶媒の色の透明度が一定のままになるとすぐに、ソックスレー抽出が完了したとみなし、それを停止した。その後、真空中での溶媒の蒸発によって抽出物を溶媒から取り出し、抽出物の質量を測定した。
【０１７４】
ＳＬＥでは、９９．９５％の純度を有するＣＯ２を使用した（Sigma Aldrich）。一方では「Ｓｐｅ−ｅｄ  ＳＬＥ」（２５〜５０ｍＬ、寸法１５．８ｃｍ×１．４ｃｍ ｉ．ｄ．、製造元: Applied Chemistry, Allntown, US）を用いて実験室規模でバッチ式ＳＬＥを行い、他方ではパイロットプラント（製造元: Nova, Switzerland, 容量４Ｌ、抽出シリンダーの寸法 高さ２２ｃｍ×７．５ｃｍ ｉ．ｄ．）を使用した（図４を参照のこと）。
【０１７５】
圧力、温度、抽出時間、ＣＯ２処理量（流速）および種子の粉砕の程度などのパラメータを柔軟に変動させることができるように、「Ｓｐｅ−ｅｄ  ＳＬＥ」試験ユニットで実験室規模でまず実験を行った。そして、実験的に測定された最良のパラメータをパイロット規模に移した。
【０１７６】
底面がガラスウールで裏打ちされているパイロットプラントの抽出シリンダーに事前圧縮された種子を設置した。シリンダーを閉じる前に、事前圧縮された種子上にガラスウールを置いた。その後、シリンダーユニットに流入弁および流出弁を連結し、あらかじめ加熱されたオーブン（４Ｌオートクレーヴオーブン）に入れた。そして、ガラスウールで固定された事前圧縮された種子を通して、圧縮されたＣＯ２をポンプすることが可能であった。抽出シリンダーの流出の後ろで、抽出物に満ちているＣＯ２の圧力をエクスパンションバルブによって除き、分離器に放出させた。ここでサンプル材料を回収した。エクスパンションバルブから圧力を放出させ、実験室系では１ｂａｒにし、パイロットプラントでは５０〜７０ｂａｒにした。実験室系でＣＯ２を回収することはできなかった。パイロットプラントでは、分離器からの還流を用いて再びＣＯ２を高圧ポンプに供給し（図４）、したがって閉鎖系を形成させた。
【０１７７】
段階的アプローチで、アブラナ属種子油のできるだけ完全で穏やかな抽出に関する以下の最適化されたパラメータが示された。ギャップサイズ０．１５ｍｍのロールプレスを用いる事前圧縮粒径０．２ｍｍ未満、少なくとも３００ｂａｒ、良好には３５０ｂａｒの好ましい圧力でのＳＬＥ。４０〜６０℃の温度を維持することが可能であった。油中の酸化的プロセスを低減するために、４０℃のできるだけ低い温度がここでは好ましい。最適な収率はＣＯ２ ６０ｋｇ／時の抽出作業で１２０分後に達成された。ここに、達成可能な最大収率の９０％収率を達成するために、最適なＣＯ２質量の処理量は基質の質量の８０〜１００倍であった。抽出時間が短いほど抽出が不完全になるが、抽出コストに関する利点を提供できた。
【０１７８】
アブラナ属種子の抽出に関する本明細書中でさらに発展されたＳＬＥ技術の利点は以下のようにまとめることができる。パイロット規模で本明細書中で開発された方法では、先行技術と比較して、抽出効率が明らかに最適化されている。驚くべきことに、ＣＯ２ ＳＬＥによって、ヘキサンを用いる慣用のソックスレー抽出に匹敵する抽出効率が本明細書中に示される条件下で達成された。ゆえに、パイロット規模で行われたＣＯ２ ＳＬＥは、顕著な変更なく、例えば油８００トン／年の必要とされる工業規模にスケールアップすることができる。そのような方法で抽出された本発明の植物種子油は溶媒残留物をまったく含まず、したがって、特に食品生産、好ましくはベビーフードの生産に適している。
【０１７９】
ヘキサン抽出を用いて得られた植物種子油では、後の精製を実施した。粗製植物油（圧縮油および抽出油から得られる混合油）の精製、および充填を完全に真空下または窒素下で行った。まず、粗製油を１０％の水で水和した（８５℃、４５分、３００ｒｐｍ）。次いで、１．５％クエン酸（２０％強度）での脱ガムを同様に８５℃で行った（４５分、３００ｒｐｍ、１０％水）。次いで、７％強度水酸化ナトリウム溶液で洗浄（９０〜９５℃、２０分、２５０ｒｐｍ、１０％水）することによって中和し、９０℃で乾燥（１１分、３５０ｒｐｍ 〜３０ｍｂａｒ）した。１％漂白土で漂白を行った（Tonsil Optimum 214 FF、９０℃、２０分、３５０ｒｐｍ、〜２０ｍｂａｒ）。次いで、圧力および窒素下でアセテートフィルターを用いて混合物をろ過した。脱イオン脱気水で、２２０℃で２０分、１〜２ｍｂａｒで脱臭を行う。
【０１８０】
植物種子油が超臨界ＣＯ２抽出から得られるすべての事例で精製が必要なわけではない。上記の本発明の植物種子油の一部の用途では、ＳＬＥ超臨界ＣＯ２抽出を用いて得られた油の直接使用が可能であり、すなわちこのために後の精製ステップは必要ではない。これらの製品には、小児用のミルク、ジュース、ピューレ、シロップ、キャンデーおよび発酵製品が含まれる。しかし、ベビーフードでの使用に関する上記理由のために、超臨界ＣＯ２抽出によって得られた植物種子油を精製することが推奨される。
【０１８１】
実施例７：本発明の植物種子油の組成
本発明の植物種子油は、以下の重量パーセント（パーセント単位の、総脂肪酸含量のうちの脂肪酸の質量）の、乳児食に重要な脂肪酸を含む。
【０１８２】
標的脂肪酸                                                      ％
アラキドン酸（２０：４ ｎ−６）                              １５
必須脂肪酸：
リノール酸（１８：２ ｎ−６）                              ２０〜２５
α−リノレン酸（１８：３ ｎ−３）                          ３〜７
乳児に有用な追加の脂肪酸：
γ−リノレン酸（ＧＬＡ）（１８：３ ｎ−６）                  ６〜１１
ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）（２０：３ ｎ−６）        ４〜８
ステアリドン酸（ＳＤＡ）                                    １〜２
エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）                              ２〜４
【０１８３】
実施例８：本発明の植物種子油を含む乳児食
本明細書中に記載の典型的な乳児食中のＡＲＡ含量を、授乳の最初の０〜１２ヵ月間に母乳中で見出されたＡＲＡの総量に適合させた。追加の利点は、乳児乳にＡＲＡを補うために本発明の植物種子油を用いると、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＳＤＡおよびＥＰＡの値も母乳中の濃度範囲内になることにある。これは、本発明の植物種子油が３種の高級不飽和脂肪酸をほぼ母乳中でも見出された比で含むためである。ＡＲＡ濃度を適合させるために本発明の植物種子油が乳児食の成分として同様に使用されると、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＳＤＡおよびＥＰＡは、特別な乳児食、ベビーフードおよびチャイルドフードに、対応する栄養分を利用可能にするために適当な濃度で供給される。この場合、例えば、さらにＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＳＤＡおよびＥＰＡを含む油の例えば混合物のような油の変化は必要ではない。
【０１８４】
ＡＲＡを含む本発明の植物種子油を乳児食に加えた（乳児食中、ＡＲＡ含有油０．５〜７．５ｇ／総脂肪含量１００ｇ）。この添加されたＡＲＡの量は脂肪の総量（乾物１００ｇあたり総脂肪含量約２８ｇ）の一部を構成する。本発明の植物種子油を加えることにより、以下の表７から明らかなように、母乳のＬＣＰＵＦＡに対して乳児食の脂肪酸パターンが決定的に近づく。表７は、米国の栄養素データベース（USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 20 (2007)）で報告されているように、３社の独立した製造者の乳児食の平均脂肪酸パターンを比較する。
【０１８５】
表７：代替母乳を調製するための乾燥粉末として市販されかつＡＲＡで補充されていない３種の市販の乳児食（カラム２, 乳児食: Mead Johnson, Enfamil, 鉄入り, 粉末, NDB No:  03805; Ross, Similac, Isomil, 鉄入り, 粉末, NDB No: 03843; Nestle, Good Start Supreme, 鉄入り, 粉末, NDB No: 03802）、ＡＲＡが添加されている３種の市販の乳児食（カラム３, 乳児食: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, 鉄入り, 粉末(NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, 鉄強化, 粉末(NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, 粉末(NDB No: 03883)）および本発明の植物種子油（カラム５に記載）を用いてＡＲＡが添加された典型的な乳児食（カラム４）の脂肪混合物の平均脂肪酸パターン。カラム６は、種々の国由来の母乳の最も重要なＬＣＰＵＦＡの平均含量を記載する（Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8）。
【表７】
2011519552.tif 000014
【０１８６】
2011519552.tif 000015
【０１８７】
本明細書中で、ＮＤＢは栄養素データベースを意味する。
【０１８８】
乳児の毎日の脂肪吸収の一部分として、０．７５％ＡＲＡの上限がUS GRAS GRN 80（www.cfsan.fda.gov/~rdb/opa-g080.html）で推奨されている。乳児食の総脂肪酸含量中の０．７５％ＡＲＡの標的濃度を達成するためには、５％の本発明の植物種子油の添加が必要であり、それは、その総脂肪酸含量に基づき１５％ＡＲＡを含む。それにより、１．３６％の本発明の植物種子油のトータルの添加が乳児食の乾物に基づいて算出される。乳児食中のＡＲＡの、さらに高いかまたは低い標的濃度は、総脂肪混合物中の本発明の植物種子油の対応する増加または減少によって達成することができる。
【０１８９】
本発明の植物種子油は、乳児食だけでなく、完全食でも用いることができる。本発明の植物種子油に加えられた完全食は、母乳と類似の濃度のアラキドン酸（ＡＲＡ）を含む。また、完全食は、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を母乳と類似の濃度で含む。上記完全食は、例えば、乳児乳、フォローアップ人工乳、小児用飲料、フルーツジュース、穀類粥（cereal gruel）、ミルク、ヨーグルトまたは発酵製品であってよい。完全製品は、固形またはマッシュベビーフード、キャンデー、クッキーまたはゼラチン製品であってもよい。それは、例えば、正常な成長および健全な発達を支援するための乳児、小児および子供の栄養摂取を目的にする。
【０１９０】
乳児食または完全食に本発明の植物種子油を加えることによって、母乳に非常に類似の最も重要な不飽和脂肪酸の比が達成される（表８）。
【０１９１】
表８：乳児食および母乳中の最も重要なＰＵＦＡ（ＤＨＡを除く）の比の比較。カラム２は、ＡＲＡおよびＤＨＡを添加された３種の市販の乳児食（代替母乳を調製するための乾燥粉末）（乳児食: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, 鉄入り, 粉末(NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, 鉄強化, 粉末(NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, 粉末(NDB No: 03883))の最も重要なＰＵＦＡの平均の比を示す。本発明の植物種子油（カラム４）を用いてＡＲＡを添加された典型的な乳児食の最も重要なＰＵＦＡ比（カラム３）。カラム５は種々の国由来の母乳の平均ＰＵＦＡ比を記載する（Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8）。
【表８】
2011519552.tif 000016
【０１９２】
選択された例は、本発明の植物種子油の重要なＰＵＦＡであるＡＲＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＳＤＡおよびＥＰＡの有利な比（表８、カラム４）が乳児食に直接反映される（表８、カラム３および５）ことを示す。本発明の植物種子油では、アラキドン酸とγ−リノレン酸との比は約１：１〜約５：１であり、アラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸との比は約１：１〜約５：１である。したがって、本発明の植物種子油を用いて達成される比は、非常に有利には、母乳中に存在する、アラキドン酸（ＡＲＡ）とγ−リノレン酸（ＧＬＡ）との２：１〜４：１の比およびアラキドン酸とジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）との１：１〜２：１の比を含む（Yuhas et al. 2006_Lipids 41:851-8）；表８、カラム５および図７を参照されたい。
【０１９３】
本発明の植物種子油では、アラキドン酸とステアリドン酸との比は１４：１〜３８：１であり、それもまた、ここに、母乳中に存在する比（ＡＲＡ：ＳＤＡ約７：１〜４５：１）を反映する（Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8）。さらに、本発明の植物種子油中のアラキドン酸とエイコサペンタエン酸との比は３：１〜７：１であり、それもまた、ここに、母乳中に存在する比（ＡＲＡ：ＥＰＡ約２：１〜７：１）を反映する（Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8）。
【０１９４】
本発明の植物種子油はさらに、母乳と同様に、必須脂肪酸リノール酸およびα−リノレン酸を含む。また、リノール酸とα−リノレン酸との比に関して、本発明の植物種子油は母乳に非常に近くなる（表８、カラム３および５）。母乳では、該比は約７：１〜１８：１である（Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8）。
【０１９５】
有利には、本発明の植物種子油を含む乳児食は、重要なＰＵＦＡであるＡＲＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＳＤＡおよびＥＰＡを添加され、濃度および比が母乳中に存在する濃度および比に適合される。さらに、このように添加された乳児食に、ＤＨＡの供給源をさらに添加することができる。
【０１９６】
ＤＨＡに関して、乳児の毎日の脂肪吸収の一部分として、０．５％ＤＡＨの上限がUS GRAS GRN 80（www.cfsan.fda.gov/~rdb/opa-g080.html）で推奨されている。乳児食の総脂肪酸含量中の０．５％ＤＨＡの標的濃度を達成するために、総脂肪１００ｇあたり１．２ｇのＤＨＡＳＣＯ（登録商標）の添加が、例えば、必要であり、それは、その総脂肪酸含量に基づき４０％ＤＨＡを含む（Arterburn et al. 2007, Lipids 42:1011-24）。それにより、０．３２％ＤＨＡＳＣＯ（登録商標）のトータルの添加が乳児食の乾物に基づいて算出される。製品に関して決定されるＤＨＡ含有成分の適切な増加または減少によって、乳児食中のＤＨＡのさらに高いかまたは低い標的濃度を達成することができる。
【０１９７】
したがって、本発明のＡＲＡ含有植物種子油（０．５〜７．５ｇ／脂肪１００ｇ）およびＤＨＡＳＣＯ（登録商標）を乳児食に加えることができる。該例では、添加されたＡＲＡ量は、総脂肪成分の５％を構成し、添加されたＤＨＡ量は総脂肪成分の１．２％を構成する（乾物１００ｇあたり乳児食の総脂肪含量約２８ｇの場合）。両方の油の添加により、以下の表９から明らかなように、母乳のＬＣＰＵＦＡに関して、乳児食の脂肪酸パターンがさらに近くなる。表９は、米国の栄養素データベース（USDA National Nutrient Database for Standard Reference, Release 20 (2007)）で報告されているように、３社の独立した製造者の乳児食の平均脂肪酸パターンを比較する。
【０１９８】
表９：ＡＲＡおよびＤＨＡを添加されていない３種の市販の乳児食（代替母乳を調製するために乾燥粉末）（カラム２, 乳児食: Mead Johnson, Enfamil, 鉄入り, 粉末, NDB No:  03805; Ross, Similac, Isomil, 鉄入り, 粉末, NDB No: 03843; Nestle, Good Start Supreme, 鉄入り, 粉末NDB No: 03802）、ＡＲＡを添加された３種の市販の乳児食（カラム３, 乳児食: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, 鉄入り, 粉末(NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, 鉄強化, 粉末(NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, 粉末(NDB No: 03883)）およびカラム５に記載の本発明の植物種子油を用いてＡＲＡを添加し、かつＤＨＡＳＣＯ（登録商標）（Arterburn et al. 2007, Lipids 42:1011-24）（カラム６）を用いてＤＨＡを添加した典型的な乳児食（カラム４）の脂肪混合物の平均脂肪酸パターン。カラム７は、種々の国の母乳の最も重要なＬＣＰＵＦＡの平均含量を記載する（Yuhas, 上掲）。
【表９】
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【０１９９】
2011519552.tif 000018
【０２００】
本発明の植物種子油の添加およびＤＨＡＳＣＯ（登録商標）での同時添加により、本発明の植物種子油の単独添加よりさらに母乳に類似している最も重要な不飽和脂肪酸の比が達成される（表９）。ＤＨＡの添加による乳児食と母乳とのさらなるこの適合は、他の高ＤＨＡ含有油、例えばＢＡＳＦ粉末製品番号３００５６９６７（Dry n-3（登録商標） 5:25 C Powder Microencapsulated fish oil rich in DHA for Infant formula）を用いて達成することもできる。
【０２０１】
表１０：乳児食および母乳中の最も重要なＰＵＦＡの比の比較。カラム２は、ＡＲＡおよびＤＨＡを添加した３種の市販の乳児食（乳児食: Mead Johnson, Enfamil, Lipil, 鉄入り, 粉末(NDB No: 03808); Ross, Similac, Isomil, 鉄強化, 粉末(NDB No: 03954); PBM Products, Ultra Bright Beginnings, 粉末(NDB No: 03883)）中の最も重要なＰＵＦＡの平均比を示す。本発明の植物種子油（カラム４）を用いてかつＤＨＡＳＣＯ（登録商標）（カラム５、Arterburn et al. 2007, Lipids 42:1011-24）を用いてＡＲＡを添加された典型的な乳児食の最も重要なＰＵＦＡ比（カラム３）。カラム６は種々の国由来の母乳の平均ＰＵＦＡ比を記載する（Yuhas et al. 2006_Lipids 41:851-8）。
【表１０】
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【０２０２】
表１０は、本発明の植物種子油の重要なＰＵＦＡであるＡＲＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＳＤＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡの有利な比（表１０、カラム４）が乳児食（表１０、カラム３）に直接反映されることおよび脂肪酸ＤＨＡとＥＰＡのさらに特に有利な比が達成されることを示す。
【０２０３】
本発明の植物種子油およびＤＨＡＳＣＯ（登録商標）を添加された乳児食では、ＡＲＡとＤＨＡとの比は１．５：１であり、ここに、母乳中に存在する比（ＡＲＡ：ＤＨＡ約０．６：１〜７．２：１）（Yuhas et al. 2006 Lipids 41:851-8）を反映する。さらに、本発明の植物種子油の好ましい実施形態では、ＤＨＡとＥＰＡとの比は３．３：１であり、それもまた、ここに、母乳中に存在する比（ＤＨＡ：ＥＰＡ約２．１：１〜５．０：１）（Yuhas et al. 2006_Lipids 41:851-8）を反映する。
【０２０４】
本発明の植物種子油は、新生児、乳児および小児の最適な成長、視覚的および認知発達および向上した免疫の発達を支援するために開発された。それは、早産児用および０〜６ヵ月（乳児用人工乳）、０〜１２ヵ月（乳児食）、および１２〜２４ヵ月（小児）の月齢の乳児または小児用のベビーフードの添加物として好ましい。
【０２０５】
以下、本発明の植物種子油を特に有利に添加される配合物を一例として列挙する。特に有利には、配合物の成分を定量比で混合して、乳児食が以下の濃度の主要な栄養分を含むようにする（ｇ／乳児食１００ｋｃａｌ単位の詳細）：脂肪、３〜７ｇ；タンパク質、１〜５ｇ；炭水化物、６〜１６ｇ。さらに、乳児食は乳児または小児の対応する年齢に推奨される量のビタミンおよびミネラル、ならびに各事例で乳児食のエネルギーの０．０２５〜０．５％までの、または各事例で０．０５〜１．０ｇ／乳児食の脂肪１００ｇの濃度のＡＲＡおよびＤＨＡを含む。乳児食は、母乳に特に類似する比のＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＳＤＡおよびＥＰＡをさらに含む。機能的脂肪酸ＡＲＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＳＤＡおよびＥＰＡは、ここに、本発明の植物種子油由来である。
【０２０６】
乳児食は、例えば、以下の成分から構成されることができる：低ミネラルホエイ（mineral-reduced whey）、低脂肪乳、植物油（パームオレイン（palmolein）、ダイズ、ココナツ、オレイン酸リッチヒマワリおよび低エルカ酸アブラナ油）、ラクトース、本発明の植物種子油、Crypthecodinium cohnii油または魚油、ビタミンＡパルミタート、ビタミンＤ３、ビタミンＥアセテート、ビタミンＫ１、チアミン塩酸塩、ビタミンＢ６塩酸塩、ビタミンＢ１２、ナイアシンアミド、葉酸、パントテン酸カルシウム、ビオチン、アスコルビン酸ナトリウム、イノシトール、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛、硫酸マンガン、硫酸銅、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、水酸化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、タウリン、ヌクレオチド（アデノシン５−一リン酸、シチジン５−一リン酸、二ナトリウムグアノシン５−一リン酸、２ナトリウムウリジン５−一リン酸）、カロテノイドの供給源、プレバイオティクスの供給源およびプロバイオティクスの供給源。
【０２０７】
本発明の植物種子油を含む乳児食の組成物のさらなる例は、プロバイオティクスを含み、かつ、あるいはプレバイオティクスと混合されたＡＲＡを含む乳児食である。あるいは、上でさらに示されるように、ＡＲＡをドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）とここに組み合わせてもよい。本明細書中のこの乳児食の重要な成分は、改変 無傷または部分的に加水分解されたスイートホエイ（sweet whey）タンパク質、Bifidobacteriaおよび／またはLactobacillaeの形態のプロバイオティクス、あるいは特定の単糖および二糖、オリゴ糖またはデンプンの形態のプレバイオティクスおよび本発明の植物種子油である。この乳児食は、（１００ｋｃａｌあたり）：エネルギー含量（ｋｃａｌ）（１００）、タンパク質（ｇ）（カゼイン／ホエイ：３０／７０）（１．８３）、その総脂肪含量（ｇ）（５．３）リノール酸（ｇ）（０．７〜０．８）、α−リノレン酸（ｍｇ）（９０〜１１０）、ＡＲＡ（ｍｇ）（５〜６０）、ＧＬＡ（ｍｇ）（３〜４０）、ＤＧＬＡ（ｍｇ）（２〜３０）、ＳＤＡ（ｍｇ）（１〜６）、ＥＰＡ（ｍｇ）（１〜１２）、ＤＨＡ（ｍｇ）（５〜６０）、ラクトース（ｇ）（１１．２）、およびミネラル（ｇ）（０．３７）、Ｎａ（ｍｇ）（２３）、Ｋ（ｍｇ）（８９）、Ｃｌ（ｍｇ）（６４）、Ｃａ（ｍｇ）（６２）、Ｐ（ｍｇ）（３１）、Ｍｇ（ｍｇ）（７）、Ｍｎ（μｇ）（８）、Ｓｅ（μｇ）（２）、ビタミンＡ（μｇ ＲＥ）（１０５）、ビタミンＤ（μｇ）（１．５）、ビタミンＥ（ｍｇ ＴＥ）（０．８）、ビタミンＫ１（μｇ）（８）、ビタミンＣ（ｍｇ）（１０）、ビタミンＢ１（ｍｇ）（０．０７）、ビタミンＢ２（ｍｇ）（０．１５）、ナイアシン（ｍｇ）（１６．７）、ビタミンＢ６（ｍｇ）（０．０７５）、葉酸（μｇ）（９）、パントテン酸（ｍｇ）（０．４５）、ビタミンＢ１２（μｇ）（０．３）、ビオチン（μｇ）（２．２）、コリン（ｍｇ）（１０）、Ｆｅ（ｍｇ）（１．２）、Ｉ（μｇ）（１５）、Ｃｕ（ｍｇ）（０．０６）、Ｚｎ（ｍｇ）（０．７５）を栄養分として含む。
【０２０８】
さらに、さらなる例は、本発明の植物種子油およびカロテノイドベータ−カロテン、リコペン、ルテインおよびゼアキサンチンを含む乳児食である。ルテイン、リコペンおよびベータ−カロテンの組み合わせは、０．０５〜０．８ｍｇ／総脂肪含量または栄養配合物１００ｇを構成する。乳児食中の油の総量の質量比は、０．０１〜０．６ｍｇのベータ−カロテン、０．０１〜０．８ｍｇのリコペンおよび０．０１〜０．５ｍｇのルテイン＋ゼアキサンチンである。多価不飽和脂肪酸の割合は、乳児食の総固体中の０．０５〜２０重量％である。多価不飽和脂肪酸は、アラキドン酸（好ましくは）、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＳＤＡ、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、リノール酸および／またはα−リノレン酸である。乳児食に含まれるＡＲＡの量は０．１〜１．０ｇ／総脂肪１００ｇであるか、または総エネルギーの０．０５〜０．５％である。含まれるＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＳＤＡおよびＥＰＡの量は、各事例で０．０６〜０．７、０．０４〜０．５、０．０１〜０．１および０．０２〜０．２ｇ／総脂肪１００ｇである。
【０２０９】
また、液体乳児食を調製した。このために、以下の乾燥成分：ラクトース４４．５％、本発明の植物種子油（１５％ＡＲＡ）０．１〜１．５％、ＤＨＡ含有油（４０％ＤＨＡ）０．１％、無脂肪（fatless）乾燥乳１８．７％、オレイン酸リッチベニバナ油１０．７％、モノおよびジグリセリド０．２７％、ダイズ油８．２％、ホエイタンパク質４．６％、炭酸カルシウム０．３５％、ヤシ油７．５８％、クエン酸０．０２％、クエン酸カリウム０．４０％、アスコルビン酸０．２９％、レシチン０．２７％、塩化マグネシウム０．０４％、塩化カリウム０．１４％、硫酸鉄０．０４％、カラゲナン０．２２％、塩化コリン０．０４％、ヌクレオチドおよびコリンプレ混合物０．２２％、リボフラビン０．００２％、Ｌ−カルニチン０．００２％、水酸化カリウム１．６５％、ルテイン溶液（５％活性）０．６４％、水溶性ビタミンプレ混合物０．２７％、ビタミン−ＡＤＥＫプレ混合物２０％、ビタミンＡ０．０００７％、β−カロテン溶液（３０％）０．０００１％、ルテイン（１．２ｐｐｍ）、リコペン（０．４８ｐｐｍ）で水を加工した。
【表１１】
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【０２１０】
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【０２１１】
実施例９：動物に飼料を与えるための、本発明の植物種子油の使用
本発明の植物種子油はまた、繁殖結果を向上させるための飼料適用のためのフードサプリメント製品として適している。それは、畜産（例えばサケ、ウシ、ブタ、ニワトリの畜産）結果を向上させるため、かつペット（例えばネコおよびイヌ）の健康のための飼料添加物として使用することができる。このために、本発明の植物種子油は、若い動物または母親動物への栄養摂取にＡＲＡを添加した場合に、生殖率を向上させるために適した濃度のアラキドン酸（ＡＲＡ）を含む。
【０２１２】
本発明の植物種子油を加えた結果として、ＡＲＡに加えて、飼料は、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）、ステアリドン酸（ＳＤＡ）およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を加えられる。本発明の植物種子油を栄養製品に添加すると、生殖率が高くなり、若い動物の生存確率が良好になり、かつ神経学的および視覚的発達が向上する。
【０２１３】
実施例１０：本発明の植物種子油の工業的適用
本発明の植物種子油の添加により、工業的適用のための重合成分として二重結合を含む特有の高濃度の不飽和脂肪酸を有する工業油が得られる。
【０２１４】
以下の適用に、単独でまたは重合剤と組み合わせて該油を用いることができる：
１．  ラッカーおよびコーティング（酸化的乾燥油としての使用）
２．  床材用ポリマーまたはプラスチック（酸化的乾燥油としての使用）
３．  他の化学的適用
４．  化粧品適用
５．  電子および半導体テクノロジー分野での適用。
【０２１５】
上記油の利点はその特有の重合特性にある。該油は、高速かつ均一に重合し、強い３次元構造を形成し、それは、（例えばコーティングおよび床材またはプラスチックでのように）網目構造の強度、耐久性および弾性が必要な場合に有利である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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