(57)【要約】  本発明は、式（１）の化合物または前記化合物の薬学的に許容できる塩（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、本明細書に記載された通りである）、その医薬組成物、および過体重の状態に罹った哺乳動物の治療におけるその使用を提供する。    【化１】2011521940.tif 000012
2011521940.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物。
【化１】
2011521940.tif 000011
【請求項２】
１１．２±０．２、１５．４±０．２、１７．０±０．２、１８．３±０．２、１９．３±０．２および２０．６±０．２の回折角（２θ）でピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
７．８±０．２、１１．２±０．２、１３．７±０．２、１５．９±０．２、１８．７±０．２および２０．２±０．２の回折角（２θ）でピークを含む粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
（ｉ）前記請求項のいずれか一項に記載の化合物、および（ｉｉ）薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項５】
前記化合物が治療有効量で存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
抗肥満薬および抗糖尿病薬からなる群から選択される少なくとも１種の別の薬剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗肥満薬が、ジルロタピド、ミトラタピド、インプリタピド、Ｒ５６９１８（ＣＡＳ番号４０３９８７）、ＣＡＳ番号９１３５４１−４７−６、ロルカセリン、セチリスタット、ＰＹＹ３−３６、ナルトレキソン、オレオイル−エストロン、オビネピチド、プラムリンチド、テソフェンシン、レプチン、リラグルチド、ブロモクリプチン、オルリスタット、エクセナチド、ＡＯＤ−９６０４（ＣＡＳ番号２２１２３１−１０−３）およびシブトラミンからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗糖尿病薬が、メトホルミン、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、ジアビネース、グリベンクラミド、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、グリクラジド、グリペンチド、グリキドン、グリソラミド、トラザミド、トルブタミド、テンダミスタット、トレスタチン、アカルボース、アジポシン、カミグリボース、エミグリテート、ミグリトール、ボグリボース、プラジミシン−Ｑ、サルボスタチン、バラグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、イサグリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン、エキセンディン−３、エキセンディン−４、トロズスクエミン、レセルバトロール、ヒルチオサール抽出物、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチンおよびサクサグリプチンからなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
動物における肥満および肥満関連障害を治療するための方法であって、かかる治療を必要とする動物に、治療有効量の請求項１、２または３に記載の化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項１０】
動物における２型糖尿病および糖尿病関連障害の進行または発症を治療するまたは遅延させるための方法であって、かかる治療を必要とする動物に、治療有効量の請求項１、２または３に記載の化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項１１】
動物における非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または肝臓インスリン抵抗性を治療するための方法であって、かかる治療を必要とする動物に、治療有効量の請求項１、２または３に記載の化合物を投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
動物における肥満および肥満関連障害を治療するための方法であって、かかる治療を必要とする動物に、請求項５から８のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項１３】
動物における２型糖尿病および糖尿病関連障害の進行または発症を治療するまたは遅延させるための方法であって、かかる治療を必要とする動物に、請求項５から８のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項１４】
動物における非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または肝臓インスリン抵抗性を治療するための方法であって、かかる治療を必要とする動物に、請求項５から８のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
動物におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（複数可）の阻害によって調節される疾患、状態または障害を治療するための方法であって、かかる治療を必要とする動物に、
（ｉ）治療量の請求項１、２または３に記載の化合物、および薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む第１の組成物と、
（ｉｉ）抗肥満薬および抗糖尿病薬からなる群から選択される少なくとも１種の別の薬剤、および薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む第２の組成物と
を含む２種の別々の医薬組成物を投与するステップを含み、
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（複数可）の阻害によって調節される前記疾患、状態または障害が、肥満、肥満関連障害、２型糖尿病、糖尿病関連障害、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および肝臓インスリン抵抗性からなる群から選択される、方法。
【請求項１６】
前記抗肥満薬が、ジルロタピド、ミトラタピド、インプリタピド、Ｒ５６９１８（ＣＡＳ番号４０３９８７）、ＣＡＳ番号９１３５４１−４７−６、ロルカセリン、セチリスタット、ＰＹＹ３−３６、ナルトレキソン、オレオイル−エストロン、オビネピチド、プラムリンチド、テソフェンシン、レプチン、リラグルチド、ブロモクリプチン、オルリスタット、エクセナチド、ＡＯＤ−９６０４（ＣＡＳ番号２２１２３１−１０−３）およびシブトラミンからなる群から選択され、前記抗糖尿病薬が、メトホルミン、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、ジアビネース、グリベンクラミド、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、グリクラジド、グリペンチド、グリキドン、グリソラミド、トラザミド、トルブタミド、テンダミスタット、トレスタチン、アカルボース、アジポシン、カミグリボース、エミグリテート、ミグリトール、ボグリボース、プラジミシン−Ｑ、サルボスタチン、バラグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、イサグリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、トログリタゾン、エキセンディン−３、エキセンディン−４、トロズスクエミン、レセルバトロール、ヒルチオサール抽出物、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチンおよびサクサグリプチンからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の組成物および前記第２の組成物を同時に投与する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の組成物および前記第２の組成物を順次および任意の順序で投与する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（複数可）の阻害によって調節される疾患、状態または障害を治療するための医薬の製造における請求項１、２または３に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤として作用する置換ピラゾロスピロケトン化合物およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（複数可）の阻害によって調節される疾患、状態または障害の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）は、ほとんどの種に見られる酵素のファミリーであり、アセチルＣｏＡからのマロニルＣｏＡの生成を触媒することによって脂肪酸の合成および代謝に関連している。哺乳動物では、ＡＣＣ酵素の２つのアイソフォームが確認されている。脂肪および肝臓などの脂質合成組織において高レベルで発現されるＡＣＣ１は、長鎖脂肪酸の生合成の最初の始動反応を制御する。アセチルＣｏＡがマロニルＣｏＡを形成するためにカルボキシル化していなかったら、クレブス回路によって代謝される。肝臓ＡＣＣの微量成分であるが、心臓および骨格筋内で主要なアイソフォームであるＡＣＣ２は、ミトコンドリアのシストリック（ｃｙｓｔｏｌｉｃ）表面でマロニルＣｏＡの生成を触媒し、カルニチンパルミトイル転移酵素を阻害することによってβ酸化においてどれくらい脂肪酸が利用されているか調節する。したがって、脂肪酸利用を増大させ、かつ新規脂肪酸合成の増大を防止することによって、ＡＣＣ阻害剤の慢性投与は、高脂肪食または低脂肪食を摂取している肥満対象における肝臓および脂肪組織ＴＧ貯蔵を激減させることもでき、体脂肪の選択的な減量をもたらす。
【０００３】
Ａｂｕ−Ｅｔｈｅｉｇａらによって実施された研究は、ＡＣＣ２が脂肪酸酸化を制御する上で極めて重要な役割を果たすことを示唆している。したがって、ＡＣＣ２の阻害が、肥満および肥満関連疾患、例えば２型糖尿病に対する治療の標的となると考えられる。Ａｂｕ−Ｅｔｈｅｉｇａ，Ｌ．ら、「Ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ２  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ  ａｒｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｆａｔ／ｈｉｇｈ−ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｄｉｅｔｓ」ＰＮＡＳ、１００（１８）１０２０７〜１０２１２（２００３）を参照のこと。Ｃｈｏｉ，Ｃ．Ｓ．ら、「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｆａｔ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ２  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｏｔａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ，ｒｅｄｕｃｅｓ  ｆａｔ  ｍａｓｓ，ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」ＰＮＡＳ、１０４（４２）１６４８０〜１６４８５（２００７）も参照のこと。肝臓脂質蓄積が肝臓インスリン抵抗性の原因であり、２型糖尿病の病因となることがますます明らかになっている。ＡＣＣ１とＡＣＣ２は両方とも肝細胞における脂肪酸化の調節に関与しているが、ラット肝臓において主要なアイソフォームであるＡＣＣ１は脂肪酸合成の唯一の調節物質であることを、Ｓａｌｖａｇｅらは実証した。さらに、彼らのモデルでは、両アイソフォームの組み合わさった減少（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）には、肝臓マロニルＣｏＡレベルの著しい低減、摂食状態における脂肪酸化の増大、脂質蓄積の低下、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるインスリン作用の改善が必要とされる。したがって、肝臓ＡＣＣ１およびＡＣＣ２阻害剤が非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および肝臓インスリン抵抗性の治療に有用である可能性があることを示している。Ｓａｖａｇｅ，Ｄ．Ｂ．ら、「Ｒｅｖｅｒｓａｌ  ｏｆ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｓ  １  ａｎｄ  ２」Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ２７３００を参照のこと。Ｏｈ，Ｗら、「Ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｆａｔ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｆ  ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ２  ｋｎｏｗｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ」ＰＮＡＳ、１０２（５）１３８４〜１３８９（２００５）も参照のこと。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
その結果、脂肪酸合成を阻害し、脂肪酸酸化を増大させることによって肥満および肥満関連疾患（ＮＡＦＬＤおよび２型糖尿病など）を治療するためにＡＣＣ１およびＡＣＣ２阻害剤を含有する医薬が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の式（１）の構造を有する化合物に関する。
【０００６】
【化１】
2011521940.tif 000003
【０００７】
請求項１の化合物は、図１（１１．２±０．２、１５．４±０．２、１７．０±０．２、１８．３±０．２、１９．３±０．２および２０．６±０．２の回折角（２θ）にピークがある）によって表されるパターンと本質的に同じ粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形で存在することができる。本明細書において多形体Ａ型と呼ぶ。
【０００８】
請求項１の化合物は、図２（７．８±０．２、１１．２±０．２、１３．７±０．２、１５．９±０．２、１８．７±０．２および２０．２±０．２の回折角（２θ）にピークがある）によって表されるパターンと本質的に同じ粉末Ｘ線回折パターンを有する結晶形で存在することができる。本明細書において多形体Ｂ型と呼ぶ。
【０００９】
本発明の別の態様は、（１）本発明の化合物（多形体Ａ型およびＢ型を含む）、および（２）薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物である。この組成物は、治療有効量の本発明の化合物を含むことが好ましい。この組成物は、少なくとも１種の別の薬剤（本明細書に記載されている）も含有することができる。好ましい薬剤には、抗肥満薬および／または抗糖尿病薬（以下に記載されている）が含まれる。
【００１０】
本発明のさらに別の態様には、哺乳動物におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（複数可）の阻害によって媒介される疾患、状態または障害を治療するための方法であって、かかる治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに、治療有効量の本発明の化合物、またはその医薬組成物を投与するステップを含む方法がある。
【００１１】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼの阻害剤によって媒介される疾患、障害または状態には、ＩＩ型糖尿病および糖尿病関連疾患、例えば非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝臓インスリン抵抗性、高血糖、代謝症候群、耐糖能障害、糖尿病性神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、肥満、異脂肪血症、高血圧、高インスリン血症およびインスリン抵抗性症候群が含まれる。好ましい疾患、障害または状態には、ＩＩ型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝臓インスリン抵抗性、高血糖、耐糖能障害、肥満、およびインスリン抵抗性症候群が含まれる。ＩＩ型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、肝臓インスリン抵抗性、高血糖および肥満がより好ましい。ＩＩ型糖尿病が最も好ましい。
【００１２】
好ましい実施形態は、動物における２型糖尿病および糖尿病関連障害の進行または発症を治療するまたは遅延させるための方法であって、かかる治療を必要とする動物に治療有効量の本発明の化合物またはその組成物を投与するステップを含む方法である。
【００１３】
別の好ましい実施形態は、動物における肥満および肥満関連障害を治療するための方法であって、かかる治療を必要とする動物に治療有効量の本発明の化合物またはその組成物を投与するステップを含む方法である。
【００１４】
さらに別の好ましい実施形態は、動物における非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）または肝臓インスリン抵抗性を治療するための方法であって、かかる治療を必要とする動物に治療有効量の本発明の化合物またはその組成物を投与するステップを含む方法である。
【００１５】
本発明の化合物は、他の薬剤（特に、本明細書の以下に記載の抗肥満および抗糖尿病薬）と併せて投与することができる。併用療法は、（ａ）本発明の化合物、本明細書に記載されている少なくとも１種の別の薬剤および薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤もしくは担体を含む単一医薬組成物、または（ｂ）（ｉ）本発明の化合物および薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤もしくは担体を含む第１の組成物と、（ｉｉ）本明細書に記載されている少なくとも１種の別の薬剤および薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤もしくは担体を含む第２の組成物とを含む２種の別々の医薬組成物として投与することができる。医薬組成物は、同時にまたは順次および任意の順序で投与することができる。
【００１６】
定義
Ｘ線回折ピーク位置に関して「本質的に同じ」という用語は、代表的なピーク位置および強度のばらつきを考慮していることを表す。例えば、ピーク位置（２θ）は、装置間の若干のばらつき、通常０．２°ほどを示すであろうことが当業者には理解されよう。さらに、相対ピーク強度は、装置間のばらつきと共に結晶化度、好ましい配向性、調製した試料の表面、および当業者に既知の他の要因によるばらつきを示すことになり、単に定性的尺度として見るべきであることが当業者には理解されよう。
【００１７】
「治療有効量」という表現は、（ｉ）特定の疾患、状態もしくは障害を治療もしくは予防する、（ｉｉ）特定の疾患、状態もしくは障害の１つもしくは複数の症候を減弱、回復、もしくは排除する、または（ｉｉｉ）本明細書に記載の特定の疾患、状態もしくは障害の１つもしくは複数の症候の発症を予防もしくは遅延する、本発明の化合物の量を表す。
【００１８】
「動物」という用語は、ヒト（男性または女性）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコおよびウマ）、食物源の動物、動物園の動物、海生動物、鳥類および他の類似の動物種を意味する。「食用動物」は、ウシ、ブタ、ヒツジおよび家禽などの食物源の動物を意味する。
【００１９】
「薬学的に許容できる」という表現は、物質または組成物が、製剤を構成する他の成分と、および／またはそれを用いて治療される哺乳動物と化学的および／または毒物学的に適合しなければならないことを示す。
【００２０】
「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、予防的な治療、すなわち、予防療法と待期療法の両方を包含する。
【００２１】
「調節した（ｍｏｄｕｌａｔｅｄ）」または「調節すること（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」、または「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ（ｓ））」という用語は、本明細書では、特に指示がない限り、本発明の化合物によるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）酵素（複数可）の阻害を意味する。
【００２２】
「媒介した（ｍｅｄｉａｔｅｄ）」または「媒介すること（ｍｅｄｉａｔｉｎｇ）」または「媒介する（ｍｅｄｉａｔｅ（ｓ））」という用語は、本明細書では、特に指示がない限り、特定の疾患、状態または障害の治療もしくは予防、（ｉｉ）特定の疾患、状態もしくは障害の１つもしくは複数の症候の減弱、回復もしくは排除、または（ｉｉｉ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）酵素（複数可）を阻害することによる本明細書に記載の特定の疾患、状態もしくは障害の１つもしくは複数の症候の発症の予防もしくは遅延を意味する。
【００２３】
「本発明の化合物」という用語は（特に具体的に特定しない限り）、式（Ｉ）の化合物ならびに、全ての互変異性体、配座異性体、および同位体的標識化合物を意味する。本発明の化合物の水和物および溶媒和物は、本発明の組成物と見なされ、その化合物は、それぞれ水または溶媒に関連している。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】式（Ｉ）の化合物のＡ型多形体の粉末Ｘ線回折パターン（ｐｘｒｄ）スペクトルを示す図である。
【図２】式（Ｉ）の化合物のＢ型多形体の粉末Ｘ線回折パターン（ｐｘｒｄ）スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の化合物は、特に本明細書に包含されている説明に照らして、化学分野でよく知られているものに類似したプロセスを含む合成経路によって合成することができる。出発物質は、一般にＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国ウィスコンシン州Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）などの商業供給源から入手可能であり、または当業者によく知られている方法（例えば、Ｌｏｕｉｓ  Ｆ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭａｒｙ  Ｆｉｅｓｅｒ、Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１〜１９巻、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６７〜１９９９編）、もしくは補遺を含めたＢｅｉｌｓｔｅｉｎｓ  Ｈａｎｄｂｕｃｈ  ｄｅｒ  ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ、４、Ａｕｆｌ．編  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎオンラインデータベースによっても入手可能である）に一般に記載されている方法によって調製される）を用いて容易に調製される。
【００２６】
例示のために、以下に示した反応スキームは、本発明の化合物ならびに重要な中間体を合成するための潜在的な経路を提供する。個々の反応ステップのより詳細な説明については、以下の実施例の項を参照のこと。他の合成経路を使用して本発明の化合物を合成するできることが当業者には理解されよう。特定の出発物質および試薬をスキームに示し、以下で論じているが、他の出発物質および試薬と容易に置き換えて、種々の誘導体および／または反応条件を得ることができる。さらに、後述の方法によって調製した多くの化合物は、当業者によく知られている従来の化学的手法を用いて本開示に照らしてさらに修飾することができる。
【００２７】
本発明の化合物の調製では、中間体の離れた官能基（ｒｅｍｏｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）（例えば、第一級または第二級アミン）の保護が必要なこともある。このような保護の必要性は、離れた官能基の性質および調製方法の条件に応じて変わるものである。適当なアミノ保護基（ＮＨ−Ｐｇ）には、アセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢｚ）および９−フルオレニルメチレンオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）がある。同様に、「ヒドロキシ保護基」は、ヒドロキシ官能基を遮断または保護するヒドロキシ基の置換基を意味する。適当なヒドロキシル保護基（Ｏ−Ｐｇ）には、例えば、アリル、アセチル、シリル、ベンジル、パラメトキシベンジル、トリチル、などがある。このような保護の必要性は、当業者により容易に決定される。保護基およびそれらの使用の一般的な説明については、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１を参照のこと。
【００２８】
スキームＩは、式（Ｉ）を有する本発明の化合物を得るために使用できる一般的な手順の概要である。
【００２９】
【化２】
2011521940.tif 000004
【００３０】
中間体ヒドラゾン（１ａ）は、酢酸などの酸性環境において室温でメチルグリオキサル（ＳＭ−１）を１−ｔ−ブチルヒドラジン（ＳＭ−２）で処理することによって形成することができる。還流させた水性酢酸中でヒドラゾン（１ａ）をオキサルアルデヒド（ＳＭ−３）で処理することによって、１−（４−ヒドロキシ−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）エタノン中間体（１ｂ）が得られる。あるいは、１Ｈ−ピラゾール中間体（１ｂ）は、還流させた水性酢酸中でオキサルアルデヒド（ＳＭ−３）を１−ｔ−ブチルヒドラジンオキサレートで処理することによって直接形成することもできる。アミノ保護ピラゾロスピロケトン中間体（１ｃ）は、アミン（好ましくは、ピロリジン）の存在下において室温でアミノ保護４−ピペリドン（好ましくは、ＢＯＣ保護基）を１−（４−ヒドロキシ−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）エタノン中間体（１ｂ）に加えることによって形成することができる。次いで保護基を除去して、ピラゾロスピロケトン中間体（１ｄ）を得ることができる。アミノ保護基を除去するために使用した条件は、どの保護基を使用したかによって決まることになる。例えば、ＢＯＣ保護基は、強酸（例えば、ＨＣｌ）を用いた処理によって除去することができる。次いで最終化合物（Ｉ）は、１Ｈ−インダゾール−５−カルボン酸を用いた標準的なペプチドカップリング反応を使用することによって形成することができる。例えば、ピラゾロスピロケトン中間体（１ｄ）および１Ｈ−インダゾール−５−カルボン酸は、例えばＴＨＦおよび／またはＤＭＦなどの適当な溶媒中に、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）などの活性化剤の存在下または不在下、およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）またはＮ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ）などの適当な塩基の存在下で、１Ｈ−インダゾール−５−カルボン酸とＯ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＡＴＵ）などのペプチドカップリング試薬とを接触させることによって、活性カルボン酸エステルを形成し、次いで活性カルボン酸エステルとピラゾロスピロケトン中間体（１ｄ）とを接触させることによって結合させて、式（１）の化合物を形成することができる。あるいは、式（１）の化合物は、まず例えば塩化チオニルと反応させることによって１Ｈ−インダゾール−５−カルボン酸を酸塩化物に転換し、次いで酸塩化物をピラゾロスピロケトン中間体（１ｄ）と反応させて式（１）の化合物を形成することによって形成することができる。さらに別の代替法は、ＴＨＦおよび／またはＤＭＦなどの適当な溶媒中にＮ−メチルモルフォリンなどの適当な塩基の存在下で、１Ｈ−インダゾール−５−カルボン酸を２−クロロ−４，６−ジメトキシトリアジンで処理することを伴う。活性エステルには、ＴＨＦおよび／またはＤＭＦなどの適当な溶媒に溶かしたピラゾロスピロケトン中間体（１ｄ）とＮ−メチルモルフォリンなどの塩基の溶液を加える。
【００３１】
本発明の化合物は、２種以上の結晶形で存在することができる。本発明の化合物の多形体（溶媒和物および水和物を含む）は、本発明を構成し、異なる条件下における本発明の化合物の結晶化によって調製することができる。例えば、再結晶のための異なる溶媒または異なる溶媒混合物の使用、異なる温度における結晶化、結晶化中に超高速から超低速までの範囲にわたる種々の冷却モードなどである。多形体は、本発明の化合物の加熱または融解とそれに続く段階的または高速冷却によって得ることもできる。多形体の存在は、固体プローブ核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、赤外（ＩＲ）分光法、示差走査熱分析、粉末Ｘ線回折またはこのような他の技術によって確認することができる。
【００３２】
本発明には、１個または複数個の原子を通常自然界に見られる原子量または質量数と異なる原子量または質量数を有する原子と置き換えていることを除けば、式（１）によって記述されたものと等しい、同位体的標識化合物も含まれる。式（Ｉ）の化合物に取り込める同位体の例には、水素、炭素、窒素、酸素、硫黄およびフッ素の同位体、例えばそれぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、１２５Ｉ、１２９Ｉ、および１８Ｆがある。いくつかの本発明の同位体的標識化合物、例えば３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性同位体を取り込んでいるものは、薬物および／または基質組織分布アッセイに有用である。トリチウム化（すなわち、３Ｈ）、および炭素−１４（すなわち、１４Ｃ）、同位体は、それらの調製の容易さおよび検出感度に関して特に好ましい。さらに、より重い同位体、例えば重水素（すなわち、２Ｈ）との置換は、より大きい代謝安定性の結果として生じるいくつかの治療的利点、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増大または必要投与量の低減をもたらす可能性があり、したがって、状況によっては好ましいこともある。本発明の同位体的標識化合物は、同位体的標識されていない試薬の代わりに容易に入手可能な同位体的標識された試薬を使用することにより、以下のスキームおよび／または実施例に開示されている手順を実施することによって、一般に調製することができる。
【００３３】
本発明の化合物は、分離可能であり得る異なる安定な立体配座形態で存在することができる。例えば立体障害または環歪みのための、不斉単結合の周りの束縛回転が原因のねじれ非対称により、異なる配座の分離が可能となり得る。本発明の化合物は、式（１）の化合物の各配座異性体およびその混合物をさらに含む。
【００３４】
本発明の化合物は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（複数可）（特に、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２）の阻害によって調節される疾患、状態および／または障害を治療するのに有用である。したがって、本発明の別の実施形態は、治療有効量の本発明の化合物および薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物である。本発明の化合物（そこに使用した組成物およびプロセスを含む）は、本明細書に記載の治療用途のための医薬の製造に使用することもできる。
【００３５】
代表的な製剤は、本発明の化合物および担体、希釈剤または賦形剤を混合することによって調製する。適当な担体、希釈剤および賦形剤は、当業者によく知られており、炭水化物、蝋、水溶性および／または水膨潤性ポリマー、親水性または疎水性物質、ゼラチン、油、溶媒、水などの物質が含まれる。使用する特定の担体、希釈剤または賦形剤は、本発明の化合物を適用する手段および目的によって決まることになる。溶媒は、一般に哺乳動物に投与するのが安全と当業者によって認められた（ＧＲＡＳ）溶媒に基づいて選択される。一般に、安全な溶媒は、水などの非毒性水性溶媒および水に可溶性または混和性の他の非毒性溶媒である。適当な水性溶媒には、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３００）など、およびその混合物がある。製剤は、１種または複数のバッファー、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、平滑剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、酸化防止剤、不透明化剤、流動促進剤、加工助剤、着色剤、甘味料、芳香剤、矯味矯臭剤および薬物（すなわち、本発明の化合物またはその医薬組成物）の洗練された体裁を与える、または医薬品（すなわち、医薬）の製造に役立つ他の既知の添加剤も含んでいてよい。
【００３６】
製剤は、従来の溶解および混合手順を用いて調製することができる。例えば、原薬（すなわち、本発明の化合物または化合物の安定化形態（例えば、シクロデキストリン誘導体または他の既知の複合体形成剤との複合体））を、上記の１種または複数の賦形剤の存在下で適当な溶媒に溶解させる。低水溶性化合物の溶解速度は、参照により本明細書に組み込む、Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｈ．らによって「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ａ  ｐｏｏｒｌｙ  ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｄｒｕｇ（ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）  ｂｙ  ａ  ｓｐｒａｙ−ｄｒｙｉｎｇ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｄｅｐｏｓｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔｓ」Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、３９、７６９〜７７３（１９８７）、および欧州特許第０９０１７８６Ｂ１号（米国特許出願公開第２００２／００９４９４号）に記載されているものなど、噴霧乾燥した分散体の使用によって高めることができる。本発明の化合物は、通常、容易に制御可能な薬物投与量を提供し、患者に洗練されかつ取り扱いやすい製品を与えるために、医薬剤形に製剤する。
【００３７】
医薬組成物には、本発明の化合物の溶媒和物および水和物も含まれる。「溶媒和物」という用語は、本発明の化合物と１種または複数の溶媒分子との分子複合体を意味する。かかる溶媒分子は、レシピエントに対して無害であることが知られている、製薬技術分野で一般に使用されているもの、例えば、水、エタノール、エチレングリコールなどである。「水和物」という用語は、溶媒分子が水である複合体を意味する。溶媒和物および／または水和物は、結晶形で存在することが好ましい。メタノール、メチルｔ−ブチルエーテル、酢酸エチル、酢酸メチル、（Ｓ）−プロピレングリコール、（Ｒ）−プロピレングリコール、１，４−ブチン−ジオールなど、他の溶媒は、より望ましい溶媒和物の調製における中間溶媒和物として使用することができる。
【００３８】
使用するための医薬組成物（または製剤）は、薬物を投与するために使用する方法に応じて種々の形に包装することができる。一般に、販売用の商品には、適切な形態の医薬製剤が入れられている容器が含まれる。適当な容器は、当業者によく知られており、ボトル（プラスチックおよびガラス）、サッシェ、アンプル、ビニール袋、金属シリンダーなどの材料が含まれる。容器は、包装の中身に不用心に近づくのを防ぐためにいたずら防止セットも含んでいてよい。その上、容器には、容器の中身を説明するラベルを付けている。ラベルは、適切な警告も含んでいてよい。
【００３９】
本発明は、かかる治療を必要とする動物に、治療有効量の本発明の化合物または有効量の本発明の化合物と薬学的に許容できる賦形剤、希釈剤、もしくは担体とを含む医薬組成物を投与することを含む、動物におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（複数可）の阻害によって調節される疾患、状態および／または障害を治療する方法をさらに提供する。この方法は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ酵素（複数可）の阻害から恩恵を受ける疾患、状態および／または障害を治療するのに特に有用である。
【００４０】
本発明の一態様は、肥満、および肥満関連障害（例えば、過体重、体重増加、または体重維持）の治療である。
【００４１】
肥満および過体重は一般に肥満度指数（ＢＭＩ）によって定義され、これは全体脂肪と相関関係があり、疾患の相対危険度を推定する。ＢＭＩは、キログラム表示の体重を、メートル表示の身長の二乗で割って算出される（ｋｇ／ｍ２）。過体重は通常、ＢＭＩが２５〜２９．９ｋｇ／ｍ２と定義され、肥満は通常、ＢＭＩが３０ｋｇ／ｍ２と定義される。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ、Ｔｈｅ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９８−４０８３（１９９８）を参照のこと。
【００４２】
本発明の別の態様は、糖尿病または１型（インスリン依存真性糖尿病、「ＩＤＤＭ」とも呼ばれる）および２型（非インスリン依存真性糖尿病、「ＮＩＤＤＭ」とも呼ばれる）糖尿病、耐糖能障害、インスリン抵抗性、高血糖、ならびに糖尿病性合併症（アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、発作、末梢血管疾患、腎症、高血圧、神経障害、および網膜症など）を含めた糖尿病関連障害の進行または発症を治療または遅延するためである。
【００４３】
本発明のさらに別の態様では、代謝症候群などの肥満同時罹患状態（ｏｂｅｓｉｔｙ  ｃｏｍｏｒｂｉｄｉｔｉｅｓ）の治療である。代謝症候群には、異脂肪血症、高血圧、インスリン抵抗性、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、冠状動脈疾患および心不全などの疾患、状態または障害が含まれる。代謝症候群に関するより詳細な情報については、例えば、Ｚｉｍｍｅｔ，Ｐ．Ｚ．ら、「Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：  Ｐｅｒｈａｐｓ  ａｎ  Ｅｔｉｏｌｏｇｉｃ  Ｍｙｓｔｅｒｙ  ｂｕｔ  Ｆａｒ  Ｆｒｏｍ  ａ  Ｍｙｔｈ  −  Ｗｈｅｒｅ  Ｄｏｅｓ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄ？」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ＆  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、７（２）、（２００５）、およびＡｌｂｅｒｔｉ，Ｋ．Ｇ．ら、「Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  −  Ａ  Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ」、Ｌａｎｃｅｔ、３６６、１０５９〜６２（２００５）を参照のこと。本発明の化合物の投与は、薬物を含有しないビヒクル対照と比較して、血漿レプチン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および／またはコレステロールの低下など少なくとも１種の心臓血管疾患危険因子で統計的に有意な（ｐ＜０．０５）低減をもたらすことが好ましい。本発明の化合物の投与は、グルコース血清レベルでも統計的に有意な（ｐ＜０．０５）低減をもたし得る。
【００４４】
本発明のさらに別の態様では、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および肝臓インスリン抵抗性の治療である。
【００４５】
体重が約１００ｋｇの正常な成人ヒトの場合、体重１キログラム当たり約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲の投与量が通常十分であり、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５．０ｍｇ／ｋｇが好ましく、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇがより好ましい。しかしながら、治療対象の年齢および体重、意図される投与経路、投与される特定の化合物などよって、一般的な投与量範囲にいくらかの変動性が求められてもよい。特定の患者についての投与量範囲および最適投与量の決定は、本開示の利点を有する当業者の能力の十分に範囲内である。本発明の化合物は、徐放、制御放出、および遅延放出製剤に使用でき、その形態も当業者によく知られているという点にも留意されたい。
【００４６】
本発明の化合物は、本明細書に記載の疾患、状態および／または障害の治療のための他の薬剤と併用してもよい。したがって、本発明の化合物を他の薬剤と併せて投与することを含む治療の方法も提供している。本発明の化合物と併せて使用できる適当な薬剤には、抗肥満薬（食欲抑制薬を含む）、抗糖尿病薬、抗高血糖症薬、脂質低下剤、および抗高血圧剤がある。
【００４７】
適当な抗肥満薬には、１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ−１（１１β−ＨＳＤ１型）阻害剤、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ−１）阻害剤、ＭＣＲ−４アゴニスト、コレシストキニン−Ａ（ＣＣＫ−Ａ）アゴニスト、モノアミン再取り込み阻害剤（シブトラミンなど）、交感神経様作用薬、β３アドレナリンアゴニスト、ドーパミンアゴニスト（ブロモクリプチンなど）、メラノサイト刺激ホルモン類似体、５ＨＴ２ｃアゴニスト、メラニン凝集ホルモンアンタゴニスト、レプチン（ＯＢタンパク質）、レプチン類似体、レプチンアゴニスト、ガラニンアンタゴニスト、リパーゼ阻害剤（テトラヒドロリプスタチン、すなわちオルリスタットなど）、食欲抑制薬（ボンベシンアゴニストなど）、ニューロペプチドＹアンタゴニスト（例えば、ＮＰＹ  Ｙ５アンタゴニスト）、ＰＹＹ３−３６（その類似体を含む）、甲状腺模倣剤、デヒドロエピアンドロステロンまたはその類似体、グルココルチコイドアゴニストまたはアンタゴニスト、オレキシンアンタゴニスト、グルカゴン様ペプチド−１アゴニスト、毛様体神経栄養因子（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、米国ニューヨーク州ＴａｒｒｙｔｏｗｎおよびＰｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国オハイオ州Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉから入手可能なＡｘｏｋｉｎｅ（商標）など）、ヒトアグーチ関連タンパク質（ＡＧＲＰ）阻害剤、グレリンアンタゴニスト、ヒスタミン３アンタゴニストまたはインバースアゴニスト、ニューロメジンＵアゴニスト、ＭＴＰ／ＡｐｏＢ阻害剤（例えば、ジルロタピドなどの消化管選択的ＭＴＰ阻害剤）、オピオイドアンタゴニスト、オレキシンアンタゴニストなどがある。
【００４８】
本発明の組み合わせた態様で使用するのに好ましい抗肥満薬には、消化管選択的ＭＴＰ阻害剤（例えば、ジルロタピド、ミトラタピドおよびインプリタピド、Ｒ５６９１８（ＣＡＳ番号４０３９８７）およびＣＡＳ番号９１３５４１−４７−６）、ＣＣＫａアゴニスト（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００５／１１６０３４または米国特許出願公開第２００５−０２６７１００Ａ１号に記載されているＮ−ベンジル−２−［４−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−５−オキソ−１−フェニル−４，５−ジヒドロ−２，３，６，１０ｂ−テトラアザ−ベンゾ［ｅ］アズレン−６−イル］−Ｎ−イソプロピル−アセトアミド）、５ＨＴ２ｃアゴニスト（例えば、ロルカセリン）、ＭＣＲ４アゴニスト（例えば、米国特許第６，８１８，６５８号に記載されている化合物）、リパーゼ阻害剤（例えば、セチリスタット）、ＰＹＹ３−３６（本明細書では「ＰＹＹ３−３６」にはペグ化ＰＹＹ３−３６、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１７８５０１号に記載されているものなどの類似体が含まれる）、オピオイドアンタゴニスト（例えば、ナルトレキソン）、オレオイル−エストロン（ＣＡＳ番号１８０００３−１７−２）、オビネピチド（ｏｂｉｎｅｐｉｔｉｄｅ）（ＴＭ３０３３８）、プラムリンチド（Ｓｙｍｌｉｎ（登録商標））、テソフェンシン（ＮＳ２３３０）、レプチン、リラグルチド、ブロモクリプチン、オルリスタット、エクセナチド（Ｂｙｅｔｔａ（登録商標））、ＡＯＤ−９６０４（ＣＡＳ番号２２１２３１−１０−３）およびシブトラミンがある。本発明の化合物および併用療法は、運動および堅実な食事と併せて投与することが好ましい。
【００４９】
適当な抗糖尿病薬には、ナトリウム−グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ）阻害剤、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）−１０阻害剤、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）１または２阻害剤、スルホニル尿素（例えば、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、ジアビネース、グリベンクラミド、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、グリクラジド、グリペンチド、グリキドン、グリソラミド、トラザミド、およびトルブタミド）、メグリチニド、α−アミラーゼ阻害剤（例えば、テンダミスタット、トレスタチンおよびＡＬ−３６８８）、α−グルコシドヒドロラーゼ阻害剤（例えば、アカルボース）、α−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アジポシン、カミグリボース、エミグリテート、ミグリトール、ボグリボース、プラジミシン−Ｑ、およびサルボスタチン）、ＰＰＡＲγアゴニスト（例えば、バラグリタゾン、シグリタゾン、ダルグリタゾン、エングリタゾン、イサグリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾンおよびトログリタゾン）、ＰＰＡＲα／γアゴニスト（例えば、ＣＬＸ−０９４０、ＧＷ−１５３６、ＧＷ−１９２９、ＧＷ−２４３３、ＫＲＰ−２９７、Ｌ−７９６４４９、ＬＲ−９０、ＭＫ−０７６７およびＳＢ−２１９９９４）、ビグアナイド（例えば、メトホルミン）、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）アゴニスト（例えば、Ｂｙｅｔｔａ（商標）、エキセンディン−３およびエキセンディン−４）、タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）阻害剤（例えば、トロズスクエミン、ヒルチオサール抽出物、およびＺｈａｎｇ，Ｓ．ら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、１２（９／１０）、３７３〜３８１（２００７）によって開示されている化合物）、ＳＩＲＴ−１阻害剤（例えば、レセルバトロール（ｒｅｓｅｒｖａｔｒｏｌ））、ジペプチジルペプチデアーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤（例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチンおよびサクサグリプチン）、インスリン分泌促進物質、脂肪酸酸化阻害剤、Ａ２アンタゴニスト、ｃ−ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）阻害剤、インスリン、インスリン様作用薬、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、ＶＰＡＣ２受容体アゴニストおよびグルコキナーゼ活性化剤がある。好ましい抗糖尿病薬は、メトホルミン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）アゴニスト（例えば、Ｂｙｅｔｔａ（商標））およびＤＰＰ−ＩＶ阻害剤（例えば、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチンおよびサクサグリプチン）である。
【００５０】
上記の全ての米国特許および公開は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００５１】
本明細書の以下に記載されている実施例は、例示的な目的のために過ぎない。本明細書において反映されている組成物、方法、および種々のパラメーターは、本発明の種々の態様および実施形態を例示するものに過ぎず、決して特許請求した発明の範囲を限定するものではない。当業者は、反応の規模および使用した特定の装備に基づいて試薬、溶媒および条件をどのように最適化するのか知っているはずである。
【実施例】
【００５２】
後述の化合物および中間体は、有機化学の命名法およびＣＡＳ索引規則に対するＩＵＰＡＣ（国際純正および応用化学連合）勧告に基づいて一般に命名した。特に指摘がない限り、全ての反応物は、商業的に得た。本明細書の以下に引用した全ての参考文献は、参照により組み込まれている。
【００５３】
フラッシュクロマトグラフィーは、Ｓｔｉｌｌら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９７８、４３、２９２３によって記載されている方法に基づいて行った。
【００５４】
本明細書で論じている全てのＢｉｏｔａｇｅ（登録商標）精製は、ＫＰ−ＳＩＬシリカ（４０〜６３μＭ、６０オングストローム）を含有する４０Ｍまたは４０Ｓ  Ｂｉｏｔａｇｅ（登録商標）カラム（Ｂｉｏａｔｇｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いて行った。
【００５５】
本明細書で論じている全てのＣｏｍｂｉｆｌａｓｈ（登録商標）精製は、充填ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）シリカカラムを利用したＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  Ｉｓｃｏ、米国ネブラスカ州Ｌｉｎｃｏｌｎ）を用いて行った。
【００５６】
質量スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ）Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＩＩ分光計で記録した。特に指定のない限り、質量スペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ（米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ）Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＩＩ分光計で記録した。
【００５７】
プロトンＮＭＲ化学シフトは、テトラメチルシランから低磁場に百万分率で示され、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ４００または５００ＭＨｚ（メガヘルツ）分光計（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）で記録した。ＮＭＲ化学シフトは、テトラメチルシラン（プロトンの場合）またはフルオロトリクロロメタン（フッ素の場合）から低磁場に百万分率で示される。
【００５８】
重要な中間体および出発物質
１Ｈ−インダゾール−５−カルボン酸は、Ｔｙｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、米国ニュージャージー州Ｅｗｉｎｇから入手可能である。
【００５９】
中間体２’−ｔｅｒｔ−ブチル−２’Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，５’−ピラノ［３，２−ｃ］ピラゾール］−７’（６’Ｈ）−オン塩酸塩（Ｉ−１ａ）の調製：
【００６０】
【化３】
2011521940.tif 000005
【００６１】
ピルブアルデヒド（２６．２ｍＬ、１６０ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１２０ｍＬ）溶液を、ｔｅｒｔ−ブチルヒドラジン・ＨＣｌ（２０ｇ、１２４ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（５００ｍＬ）溶液に２０分にわたって加えた。この溶液を室温で５時間撹拌した。次いで反応混合物を酢酸エチル（５回）を用いて抽出した。合わせた有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、減圧下で濃縮した。次いで残留物を、酢酸エチル／ヘプタン（１０：９０〜４０：６０）の勾配を用いて溶離するフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル）によって精製して、２−オキソプロパナールｔｅｒｔ−ブチルヒドラゾン１３．１ｇ（７４％）を琥珀色油としてもたらした。
【００６２】
グリオキサール（２．９ｍＬ、２５．３ｍｍｏｌ）の４０％水溶液を、水（１４ｍＬ）に溶かした２−オキソプロパナールｔｅｒｔ−ブチルヒドラゾン（１．２０ｇ、８．４４ｍｍｏｌ）に加えた。次いで混合物を５時間還流させながら加熱した。反応混合物を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃを用いて４回抽出した。合わせた有機層を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、ろ過し、減圧下で濃縮した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル）によって精製し、ヘプタン／酢酸エチル（１００：０〜９０：１０）の勾配を用いて溶離して、１−（４−ヒドロキシ−１−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）エタノン１．０６ｇ（６９％）を無色油として得た。
【００６３】
１−（４−ヒドロキシ−１−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）エタノン（６．６３ｇ、３６．４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（７３ｍＬ）溶液に、ピロリジン（３．６ｍＬ、４３．７ｍｍｏｌ）および１−（Ｎ−Ｂｏｃ）−４−ピペリドン（８．７ｇ、４３．７ｍｍｏｌ）を加えた。暗赤色溶液を室温で終夜撹拌した。溶液を濃縮し、残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、１Ｎ  ＮａＯＨおよびブラインで洗浄した。層を分離し、次いで有機層を取っておいた。合わせた水層を酢酸エチルで抽出した。層を分離し、有機層を１Ｎ  ＮａＯＨおよびブラインで洗浄した。全ての有機層を合わせ、次いで１Ｎ  ＨＣｌ、およびブラインで洗浄し、乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）させ、ろ過し、減圧下で濃縮して赤色ガム（１１ｇ）を生じさせた。赤色ガムを粉砕し、２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１２５ｍＬ）中で加熱し、ガムは黄色固体に変化したが、還流させながら完全に溶解しなかった。混合物を室温まで冷却し、ろ過して生成物であるオフホワイト固体（１．６９ｇ）を得た。ろ液を約５〜１０ｍＬ（ヘキサン、ＥｔＯＡｃおよびアセトンを含む）まで濃縮し、次いで追加量の２％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１００ｍＬ）を加え、その後固体が沈殿し始めた。混合物を終夜撹拌した。固体をろ過して、別の所望の生成物３．８９ｇをオフホワイト固体として得た。全部で、５．５８ｇ（４２％）のｔｅｒｔ−ブチル２’−ｔｅｒｔ−ブチル−７’−オキソ−６’，７’−ジヒドロ−１Ｈ，２’Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，５’−ピラノ［３，２−ｃ］ピラゾール］−１−カルボキシレートをオフホワイト固体として単離した。
【００６４】
ｔｅｒｔ−ブチル２’−ｔｅｒｔ−ブチル−７’−オキソ−６，７’−ジヒドロ−１Ｈ，２’Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，５’−ピラノ［３，２−ｃ］ピラゾール］−１−カルボキシレート（２．７３ｇ、７．５ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（１５ｍＬ）溶液に室温でＨＣｌ溶液（１，４−ジオキサン中４Ｍ、１５ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌した。次いで反応混合物を濃縮乾固した。得られたピンク色固体（２．６ｇ）を２−メチルテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）および少量のＥｔＯＨ（１ｍＬ）と一緒に粉砕した。固体をろ過し、２−メチルテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）で洗浄し、５０℃で真空乾燥させて、表題化合物（Ｉ−１ａ）２．１５ｇ（９５％）を白色固体としてを得た。
【００６５】
（実施例１）
２’−ｔｅｒｔ−ブチル−１−（１Ｈ−インダゾール−５−イルカルボニル）−２’Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，５’−ピラノ［３，２−ｃ］ピラゾール］−７’（６’Ｈ）−オン（Ｉ）の調製：
【００６６】
【化４】
2011521940.tif 000006
【００６７】
Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶かした１Ｈ−インダゾール−５−カルボン酸（２７ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、２−クロロ−４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン（３６ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）およびＮ−メチルモルフォリン（ＮＭＭ）（１９ｕＬ、０．１７ｍｍｏｌ）の混合物を室温で３５分間撹拌してからＮＭＭ（３当量）、続いて２’−ｔｅｒｔ−ブチル−２’Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，５’−ピラノ［３，２−ｃ］ピラゾール］−７’（６’Ｈ）−オン・ＨＣｌ（Ｉ−１ａ：５０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で終夜撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、飽和水性ＮＨ４Ｃｌで洗浄した。水相をＣＨ２Ｃｌ２（２回）を用いて逆抽出した。合わせた有機抽出物を水および飽和水性ＮａＣｌで洗浄してからＭｇＳＯ４上で乾燥させた。物質をろ過し、濃縮し、分取薄層クロマトグラフィー（９５：５  ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ）によって精製した。所望の物質を続いてＥｔ２Ｏと一緒に粉砕し、ろ過し、固体を真空下に５０℃で乾燥させて、所望の生成物（２１ｍｇ、３１％）を生じさせた。
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm 13.26 (1 H, br. s.), 8.14 (1 H, s), 7.86 (1 H, s), 7.81 (1 H,
s), 7.58 (1 H, d, J=8.54 Hz), 7.40 (1 H, br. s.), 3.18 (2 H, br. s.), 2.75 (2
H, s), 1.99 (2 H, s), 1.88 (2 H, br. s.), 1.74 (2 H, t), 1.51 (9 H, s).
【００６８】
（実施例２）
あるいは、化合物（Ｉ）は、結晶性生成物（本明細書において「Ａ型」と呼ぶ）を生成する以下の手順を用いて調製することができる。
【００６９】
４００Ｌ反応器に、２’−ｔｅｒｔ−ブチル−２’Ｈ−スピロ［ピペリジン−４，５’−ピラノ［３，２−ｃ］ピラゾール］−７’（６’Ｈ）−オン・ＨＣｌ（Ｉ−１ａ：６．６ｋｇ、２２．０モル）、１Ｈ−インダゾール−５−カルボン酸（３．２６ｋｇ、２０．１モル）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（４．８５ｋｇ、２５．３モル）、アセトニトリル（１２４Ｌ）、およびピリジン（１３．９Ｌ、１７２モル）を入れた。溶液を周囲温度で１６時間撹拌し、次いで酢酸エチル（２５０Ｌ）で希釈し、１０ｗｔ％の水性クエン酸（１００Ｌ）で２回洗浄した。５１Ｌの溶液体積まで蒸留するために有機層を加熱し、次いで酢酸エチル（約８５Ｌ）を加え、７６℃の内部温度が得られるまで蒸留した（溶液体積約５５Ｌ）。次いで溶液を３時間にわたって周囲温度まで冷却し、固体をヌッチェフィルターに通してろ過し、酢酸エチル（１７Ｌ）で洗浄し、５０℃で１２時間真空下で乾燥させた。化合物（Ｉ）を白色結晶性固体（３．８９ｋｇ、９．５５モル、４８％）として単離した。融点：２６５℃。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 13.2 (1H, s), 8.11 (1H, s), 7.83 (1H, s), 7.77 (1H, s), 7.55 (1
H, d, J=8.0 Hz), 7.37 (1 H, dd, J=8.0, 1.2 Hz), 4.35-3.45 (2 H, m), 3.30-3.15
(2 H, m), 2.72 (2H, s), 1.98-1.86 (2 H, m),1.73 (2 H, td, J=12.0, 4.0 Hz), 1.48
(9 H, s).
13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 186.5, 170.2, 147.6, 140.6, 134.9, 134.2, 128.6, 125.9, 122.8,
120.5, 114.3, 110.7, 81.6, 61.0, 49.0, 34.0, 29.7.
【００７０】
式（Ｉ）の化合物のＡ型多形体に関するＸ線粉末回折パターンを、銅放射線によるＳｉｅｍｅｎｓ  Ｄ５０００回折計を用いて作成した。この機器は、線状焦点Ｘ線管を備えていた。管電圧およびアンペア数を、それぞれ３８ｋＶおよび３８ｍＡに設定した。発散および散乱スリットを１ｍｍに設定し、受信スリットを０．６ｍｍに設定した。Ｓｏｌ−Ｘエネルギー分散Ｘ線検出器を用いて回折ＣｕＫα１放射線（λ＝１．５４０５６Å）を検出した。３．０〜４０°２θから２．４°２θ／分（１秒／０．０４°２θステップ）でθ２θ連続スキャンを使用した。アルミナ標準物質（ＮＩＳＴ標準参照物質１９７６）を分析して機器アライメントを確認した。データを捕集し、ＢＲＵＫＥＲ  ＡＸＳ  ＤＩＦＦＲＡＣ  ＰＬＵＳソフトウェアバージョン２．０を用いて分析した。分析用に試料を石英ホルダーに取り付けることによって準備した。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社がＳｉｅｍｅｎｓ社を買収したことを留意されたい。したがって、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ５０００機器は、本質的にＳｉｅｍｅｎｓ  Ｄ５０００と同じである。以下の表は、Ａ型結晶について観察されたバックグラウンドに対して５倍閾値を有するピークをまとめて示している。Ａ型の特徴ピーク（２θ）は、１１．２±０．２、１５．４±０．２、１７．０±０．２、１８．３±０．２、１９．３±０．２および２０．６±０．２である。
【００７１】
【表１】
2011521940.tif 000007
【００７２】
アセトンに溶かしたヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）を用いて化合物（Ｉ）を噴霧乾燥分散（ＳＤＤ）させた（２５重量％化合物（Ｉ））場合に、化合物（Ｉ）の溶解が１１倍増大したことが観察された。０．５重量％Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（商標）に懸濁させたモデル絶食十二指腸溶液（０．５重量％タウロコール酸ナトリウム／１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンを溶かしたリン酸緩衝溶液、ｐＨ６．５）中６００μｇ（有効成分））／ｍＬで、化合物およびＳＤＤを比較し試験した。
【００７３】
（実施例３）
実施例３は、式（Ｉ）の化合物の異なる多形形態（本明細書において「Ｂ型」と呼ぶ）を提供する。
【００７４】
実施例２からのＡ型（２０ｍｇ）を、電磁撹拌棒およびアセトン２ｍＬ（２ｍＬ）を含有する４ｍＬバイアルに加えた。固体を２５℃で３週間撹拌した。固体をＰＴＦＥフィルター上でろ過し、ＭＴＢＥ１ｍＬで洗浄した。Ｂ型約１０ｍｇを白色結晶性固体として単離した。
【００７５】
式（Ｉ）の化合物のＢ型に関するＸ線粉末回折パターンを、銅放射線によるＳｉｅｍｅｎｓ  Ｄ５０００回折計および実施例２に上述されている条件を用いて作成した。以下の表は、Ｂ型多形体について観察されたバックグラウンドに対して５倍閾値を有するピークをまとめて示している。Ｂ型の特徴ピーク（２θ）は、７．８±０．２、１１．２±０．２、１３．７±０．２、１５．９±０．２、１８．７±０．２および２０．２±０．２である。
【００７６】
【表２】
2011521940.tif 000008
【００７７】
薬理学的データ
生物学的プロトコル
動物、特に哺乳動物（例えば、ヒト）における疾患（例えば本明細書において詳述しているもの）の治療における本発明の化合物の有用性は、後述のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを含めた当業者に既知の従来のアッセイにおけるその活性によって実証することができる。かかるアッセイは、それによって本発明の化合物の活性が他の既知の化合物の活性と比較できる手段も提供する。
【００７８】
ＡＣＣ１およびＡＣＣ２の活性の直接阻害
本発明の化合物のＡＣＣ阻害活性を標準手順に基づく方法によって実証した。例えば式（１）の化合物に関するＡＣＣ活性の直接阻害を、ラット肝臓ＡＣＣおよび組換えヒトＡＣＣ２の調製物を用いて決定した。
【００７９】
［１］ラット肝臓ＡＣＣの調製。標準手順、例えばＴｈａｍｐｙおよびＷａｋｉｌ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：６３１８〜６３２３；１９８５）によって記載されているものに基づいて以下の方法を用いてラット肝臓からラット肝臓ＡＣＣを得た。
【００８０】
重さが１５０〜２００ｇの雄ＣＤラットを１８〜２４時間絶食させ、その後高スクロース食餌（ＡＩＮ−７６Ａげっ歯類食餌、Ｃａｔ＃Ｄ１０００１、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ  Ｉｎｃ．、米国ニュージャージー州Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ）を３日間与え、その時点でそれらをＣＯ２窒息によって殺した。肝臓を取り出し、氷冷リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中ですすぎ、Ｗａｒｉｎｇ（登録商標）ブレンダー中の５倍の体積量の均質化バッファー（５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭベンズアミジン、０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、各５ｍｇ／Ｌのロイペプチン、アプロチニン、および抗トリプシン）中で、１分間４℃でホモジナイズした。後続の全ての操作を４℃で実施した。５０％ＰＥＧ溶液を加えることによってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に対してホモジネートを３％とし、２０，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。５０％ＰＥＧ溶液を加えて得られた上清を５％ＰＥＧに調節し、５分間撹拌した。２０，０００×ｇで２０分間の遠心分離によってペレット（ＡＣＣ活性を含有する）を捕集し、氷冷二重蒸留水ですすいで過剰ＰＥＧを除去し、均質化バッファーを用いて元のホモジネート体積の４分の１に再懸濁させた。硫酸アンモニウム（２００ｇ／リットル）を撹拌しながらゆっくり加えた。４５分後、２０，０００×ｇで３０分間の遠心分離によって酵素を捕集し、１０ｍＬの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０％グリセリン中に再懸濁させ、同じバッファーで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５カラム（２．５ｃｍ×５０ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、米国ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ現ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で脱塩する。脱塩した酵素調製物をアリコート中に−７０℃で保管した。即時使用の前に冷凍ラット肝臓ＡＣＣアリコートを解凍し、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭクエン酸三カリウム、２．０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、および０．７５ｍｇ／ｍＬの脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するバッファー中に５００μｇ／ｍＬまで希釈し、３７℃で３０分間プレインキュベートした。
【００８１】
［２］ラット肝臓ＡＣＣ阻害の測定。ＡＣＣ活性の測定およびＡＣＣ阻害の評価のために、試験化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解し、アリコート１μＬをクリアボトム、９６穴プレート（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＰＮ＃１４５０−５１４）に加えた。対照穴は、ＤＭＳＯ単独１μＬまたは高阻害化合物１μＬを含有する。上記のようにラット肝臓から得た酵素を、酵素バッファー中３７℃で３０分間活性化させてから化合物プレートに加えた。全穴に、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７．５ｍＭクエン酸三カリウム、２ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するバッファーに溶かした活性酵素（１．３３Ｘ）７５μＬを与える。活性酵素を化合物と一緒に１０分間プレインキュベートしてから、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、７．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７．５ｍＭクエン酸三カリウム、２ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１２０μＭアセチルＣｏＡ、８．０ｍＭ  ＡＴＰ、３８．４ｍＭ  ＫＨＣＯ３、および１．６ｍＭ  ＮａＨ［１４Ｃ］Ｏ３（１００μＣｉ／μＬ）を含有する基質溶液２５μＬを加えることによって反応を開始した。反応中の最終基質濃度は、３０μＭアセチルＣｏＡ、９．６ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．４ｍＭ  ＮａＨ［１４Ｃ］Ｏ３、および２ｍＭ  ＡＴＰであった。３Ｎ  ＨＣｌ  ２５μＬを加えることによって１０分後に反応を停止させ、プレートを５０℃で最低２０時間乾燥させた。水３０μＬを乾燥させたプレートに加え、５分間混合した。Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ液体シンチレーション流体（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国マサチューセッツ州Ｗａｌｔｈａｍ）９５μＬを加え、プレートを２０分間混合する。Ｗａｌｌａｃ  Ｔｒｉｌｕｘ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  ＬＳＣルミネセンスカウンターを用いてＭＣｏＡ中への１４Ｃの取り込みを測定した。
【００８２】
［３］ヒトＡＣＣ２阻害の測定。精製した組換えヒトＡＣＣ２（ｈｒＡＣＣ２）を用いてヒトＡＣＣ２阻害を測定した。簡単に言えば、ＡＣＣ２の完全長ＣｙｔｏｍａｘクローンをＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄから購入し、配列決定し、ＰＣＤＮＡ５  ＦＲＴ  ＴＯ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中にサブクローニングした。テトラサイクリン誘導によってＡＣＣ２をＣＨＯ細胞中で発現させ、１μｇ／ｍＬテトラサイクリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を含む、グルタミン、ビオチン、ハイグロマイシンおよびブラストサイジンを含んだＤＭＥＭ／Ｆ１２  ５リットル中に回収した。次いでＡＣＣ２を含有するならし培地をＳｏｆｔｌｉｎｋ  Ｓｏｆｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ａｖｉｄｉｎカラム（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）に加え、５ｍＭビオチンで溶離した。ＡＣＣ２  ４ｍｇを濃度０．０５ｍｇ／ｍＬ（Ａ２８０によって決定した）、推定純度９５％（Ａ２８０によって決定した）で溶離した。精製したＡＣＣ２を５０ｍＭトリス、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５％グリセリン中で透析した。プールしたタンパク質を凍結し、融解時に活性の損失なしに−８０℃で保管した。ＡＣＣ２活性の測定およびＡＣＣ２阻害の評価のために、試験化合物をＤＭＳＯ中に溶解し、最終ＤＭＳＯ濃度１％の５倍ストックとしてｒｈＡＣＣ２酵素に加えた。５０μＭ  ＡＴＰ反応のための製造条件を用いたＴｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ  ＡＤＰ検出ＦＰアッセイキット（Ｂｅｌｌｂｒｏｏｋ  Ｌａｂｓ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して、ｒｈＡＣＣ２をＣｏｓｔａｒ＃３７６７（Ｃｏｓｔａｒ、米国マサチューセッツ州Ｃａｎｂｒｉｄｇｅ）３８４穴プレート中で検定した。アッセイの最終条件は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭクエン酸三カリウム、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、３０μＭアセチルＣｏＡ、５０μＭ  ＡＴＰ、および８ｍＭ  ＫＨＣＯ３であった。通常、１０μＬ反応を室温で１時間実施し、１０μｌのＴｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒ停止および検出バッファーを加え、さらに１時間インキュベートした。６２０励起Ｃｙ５  ＦＰジェネラルデュアルミラー、６２０励起Ｃｙ５  ＦＰフィルター、６８８発光（Ｓ）および６８８（Ｐ）発光フィルターを用いたＥｎｖｉｓｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅリーダー（Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）上でデータを取得した。
【００８３】
上記ラット肝臓ＡＣＣ放射酵素アッセイおよび組換えｈＡＣＣ２  ｔｒａｎｓｃｒｅｅｎｅｒアッセイを用いた結果を、式（Ｉ）の化合物に関して以下の表にまとめて示す。
【００８４】
【表３】
2011521940.tif 000009
【００８５】
実験動物におけるＡＣＣ阻害の急性ｉｎ  ｖｉｖｏ評価
本発明の化合物のＡＣＣ阻害活性は、治療した動物からの肝臓および筋肉組織のマロニルＣｏＡレベルを低減させるそれらの能力の評価によってｉｎ  ｖｉｖｏで確認することができる。
【００８６】
実験動物におけるマロニルＣｏＡ生成阻害の測定。この方法では、適宜の標準固形飼料および水で維持した雄スプレーグ・ドーリーネズミ（２２５〜２７５ｇ）を、研究する前に無作為化した。動物は、実験を開始する１８時間前に餌を与えるか、または絶食させた。明期に入って２時間後に、動物に５ｍＬ／ｋｇの体積（０．５％メチルセルロース、ビヒクル）または適切な化合物（ビヒクル中で調製）を経口投与した。ビヒクルを与えた対照は、ベースライン組織マロニルＣｏＡレベルを決定するために含め、一方絶食した動物は、マロニルＣｏＡレベルに対して絶食が与えた影響を決定するために含めた。化合物投与の１時間後、動物をＣＯ２で窒息させ、組織を取り出した。特に、血液を心臓穿刺によって捕集し、ＥＤＴＡを含有するＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブ中に入れ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ニュージャージー州）、混合し、氷上に置いた。血漿を用いて薬物暴露を決定した。肝臓および四頭筋を取り出し、直ちに凍結クランプし、金属箔で包み、液体窒素中で保管した。
【００８７】
組織を液体Ｎ２下で微粉砕して、サンプリングにおける均一性を確保した。ＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ１２０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、速度＝５．５、４５秒間）中のＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ａ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＰＮ  ６９１０）に溶かした５倍体積量の１０％トリカルボン酸を用いて組織（１５０〜２００ｍｇ）からマロニルＣｏＡを抽出した。１５０００×ｇで３０分間遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４０２）した後にマロニルＣｏＡを含有する上清を細胞片から取り出した。分析が完了するまで試料を−８０℃で安定して凍結させた。
【００８８】
肝臓および筋肉組織中のマロニルＣｏＡレベルの分析は、以下の方法論を用いて評価することができる。
【００８９】
この方法は、以下の物質を利用する：Ｉｓｏｔｅｃ（米国オハイオ州Ｍｉａｍｉｓｂｕｒｇ）から購入したマロニルＣｏＡテトラリチウム塩およびマロニル−１３Ｃ３−ＣｏＡトリリチウム塩、過塩素酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ  ｎｏ．４１０２４１）、トリクロロ酢酸（ＡＣＲＯＳ、ｃａｔ  ｎｏ．４２１４５）、リン酸（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ｃａｔ  ｎｏ．０２６０−０１）、ギ酸アンモニウム（Ｆｌｕｋａ、ｃａｔ  ｎｏ．１７８４３）、メタノール（ＨＰＬＣグレード、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ｃａｔ  ｎｏ．９０９３−３３）、および水（ＨＰＬＣグレード、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、４２１８−０３）を使用して必要とする移動相を作成した。Ｓｔｒａｔａ−Ｘオンライン固相抽出カラム、２５μｍ、２０ｍｍ×２．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ（ｃａｔ  ｎｏ．００Ｍ−Ｓ０３３−Ｂ０−ＣＢ）をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（米国カリフォルニア州Ｔｏｒｒａｎｃｅ）から得た。ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｃ１８逆相カラム、３．５μｍ、１００ｍｍ×３．０ｍｍ  Ｉ．Ｄ．（ｃａｔ  ｎｏ．１８６００２５４３）をＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ）から購入した。
【００９０】
この方法は、以下の装備を利用して行うことができる。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００バイナリーポンプ、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００クォータナリーポンプおよび２個のＶａｌｃｏ  Ｃｈｅｍｉｎｅｒｔ  ６ポート２位置弁を用いた二次元クロマトグラフィー。１０℃で保持したＰｅｌｔｉｅｒ冷却スタックおよび２０μＬサンプリングループを備えたＬＥＡＰ  ＨＴＣ  ＰＡＬオートサンプラーによって試料を導入した。オートサンプラーのためのニードル洗浄溶液は、Ｗａｓｈ  １が１０％トリクロロ酢酸水溶液（ｗ／ｖ）であり、Ｗａｓｈ  ２が９０：１０  メタノール：水である。ＭｉｃｒｏＴｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｉｃｒｏ−ＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｏｖｅｎを用いて分析用カラム（Ｓｕｎｆｉｒｅ）を３５℃で保持した。Ｔｕｒｂｏ  Ｉｏｎ  Ｓｐｒａｙを備えたＡＢＩ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ３０００三連四重極質量分析計で溶離液を分析した。
【００９１】
オンライン固相抽出および逆相クロマトグラフィーに関して異なる勾配溶離条件を用いて同時に二次元クロマトグラフィーを行った。この方法の一般的な計画は、第１次元をサンプル洗浄および目的の分析物の捕捉のために利用し、続いて第１次元から第２次元上への溶離のために両方の次元を短時間カップリングするようなものであった。両次元を続いて脱共役させて、定量化のために第２次元から分析物を勾配溶離させ、同時に配列中の次の試料のために第１次元を調製した。両次元を簡単に連結した場合、第１次元中の移動相の流れを第２次元上への分析物溶離のために逆流させて、最適ピーク幅、ピーク形状、および溶離時間を可能にする。
【００９２】
ＨＰＬＣ系の第１次元は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ｓｔｒａｔａ−Ｘオンライン固相抽出カラムと溶媒Ａが１００ｍＭ過塩素酸ナトリウム／０．１％（ｖ／ｖ）リン酸および溶媒Ｂがメタノールからなる移動相とを利用した。
【００９３】
ＨＰＬＣ系の第２次元は、Ｗａｔｅｒｓ  ＳｕｎＦｉｒｅ  Ｃ１８逆相カラムと溶媒Ａが１００ｍＭギ酸アンモニウムおよび溶媒Ｂがメタノールからなる移動相とを利用した。勾配の初期条件を２分間保持し、この間に分析物を分析用カラムに移した。分析用で維持している間、オンラインＳＰＥカラムから分析物を溶離するのに初期条件は十分な強度であったことが重要であった。その後、洗浄および再平衡ステップの前に４．５分で７４．５％Ａまで勾配が直線的に上がった。
【００９４】
質量分析は、ＨＰＬＣと連結すると、複雑な基質中の分析物を定量的に測定する場合に高選択的および高感度な方法になり得るが、依然として干渉および抑制を受ける。二次元ＨＰＬＣを質量分析計と連結することによって、これらの干渉は著しく減少する。さらに、三連四重極質量分析計の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）特色を利用することによって、信号対雑音比が著しく改善した。
【００９５】
このアッセイでは、質量分析計を、ＴｕｒｂｏｌｏｎＳｐｒａｙ電圧２２５０Ｖで陽イオンモードにおいて操作した。噴霧ガスを４５０℃まで加熱した。デクラスタリング電位（ＤＰ）、集束電位（ＦＰ）、および衝突エネルギー（ＣＥ）を、それぞれ６０、３４０、および４２Ｖに設定した。四重極１（Ｑ１）分解能をユニット分解能に設定し、四重極３（Ｑ３）を低に設定した。ＣＡＤガスを８に設定した。モニターしたＭＲＭ転移は、停止時間２００ｍｓでのマロニルＣｏＡ：８５４．１→３４７．０ｍ／ｚ（Ｌ．Ｇａｏら（２００７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８５３、３０３〜３１３）、およびマロニル−１３Ｃ３−ＣｏＡ：８５７．１→３５０．０ｍ／ｚに関してであった。溶離液を、予想した分析物の溶離時間付近で質量分析計に分流し、他の場合には、供給源の保持および器械使用の頑健性の向上を助けるために廃棄した。得られたクロマトグラムを、Ａｎａｌｙｓｔソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて組み込んだ。マロニルＣｏＡの組織濃度を、１０％トリクロロ酢酸水溶液で調製した標準曲線から計算した。
【００９６】
組織抽出物中のマロニルＣｏＡの定量化のための標準曲線を含む試料を１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で調製し、０．０１〜１ｐｍｏｌ／μＬの範囲であった。マロニル−１３Ｃ３−ＣｏＡ（最終濃度０．４ｐｍｏｌ／μＬ）を各標準曲線成分および試料に内部標準として加えた。
【００９７】
アッセイ内品質対照を６個調製した。絶食させた動物から調製したプールした抽出物から３個、および餌を与えた動物から作製したプールから３個。これらは、０、０．１または０．３ｐｍｏｌ／μＬの１２Ｃ−マロニルＣｏＡならびにマロニル−１３Ｃ３−ＣｏＡ（０．４ｐｍｏｌ／μＬ）を加えた別々の試料として実行した。各アッセイ内品質対照は、水性組織抽出物を８５％含有し、残りの部分が内部標準（０．４ｐｍｏｌ／μＬ）および１２Ｃ−マロニルＣｏＡによって占められていた。アッセイ間対照を各実験に含めた。それらは１個の絶食させたおよび１個の餌を与えたプールした四頭筋の試料および／または１個の絶食させたおよび１個の餌を与えたプールした肝臓の試料で構成される。かかる全ての対照に、マロニル−１３Ｃ３−ＣｏＡ（０．４ｐｍｏｌ／μＬ）を加えている。
【００９８】
式（Ｉ）の化合物を上記ｉｎ  ｖｉｖｏ試験で使用して、肝臓および筋肉組織中のマロニルＣｏＡレベルに対するそれらの効果を調べた。結果を以下の表に示す。
【００９９】
【表４】
2011521940.tif 000010
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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