(57)【要約】      基礎培地と、高い用量の添加物とを含有するチャイニーズハムスター卵巣細胞の大規模培養のための濃縮培養液を公開した。さらに、ＣＨＯ細胞の大規模な流加回分培養において前述濃縮培養液を添加する方法を公開した。    【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基礎培地と、濃縮培養液の総体積に基づく計算で、以下の成分からなる添加物とで構成される濃縮培養液であって、
ビタミンＣ                            １０−２５ｍｇ／Ｌ
トランスフェリン                      ５−１８ｍｇ／Ｌ
エタノールアミン                      １−１０ｍｇ／Ｌ
亜セレン酸塩                          ０．０１−０．０４５ ｍｇ／Ｌ
ヒドロキシ酪酸ナトリウム              ０．５−１．５ｍｇ／Ｌ
ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                    ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
ＡｇＮＯ３                             ０．０２−０．０４５ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                    ０．０５−０．３ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                    ０．００２−０．００４ｍｇ／Ｌ
ＫＢｒ                                ０．０００５−０．０００８ｍｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    ０．５−１．５ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＳｉＯ３                          ０．００５−０．０４５ｍｇ／Ｌ
ＬｉＣｌ                              ０．０００５−０．００１ｍｇ／Ｌ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                    ０．０２−０．２５ ｍｇ／Ｌ
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                    ２．００−８．００ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ６                          ０．０１−０．２ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１２                        ０．０１−０．５ｍｇ／Ｌ
ビオチン                              ０．０５−０．１８ｍｇ／Ｌ
葉酸                                  ０．０２−８．００ｍｇ／Ｌ
リボフラビン                          ０．１−０．１５ｍｇ／Ｌ
還元型グルタチオン                    ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
アデニン                              ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
グアニン                              ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
ウラシル                              ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
チミン                                ０．２５−１．５ｍｇ／Ｌ
シトシン                              ５．５−８．５ｍｇ／Ｌ
リボース                              ２．０−８．５ｍｇ／Ｌ
デオキシリボース                      ２．０−８．５ｍｇ／Ｌ
プリマトーン                          ５００−３５００ｍｇ／Ｌ
４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）      ５００−３０００ｍｇ／Ｌ
β−メルカプトエタノール              ０．２−２ｍｇ／Ｌ
前述濃縮液において、以下に示す成分は、濃度が以下の通りであることを特徴とする、チャイニーズハムスター卵巣細胞の大規模培養のための濃縮培養液。
１０００−９０００ ｍｇ／Ｌ            塩化ナトリウム
２００−４０００ ｍｇ／Ｌ              アスパラギン酸
２００−９０００ ｍｇ／Ｌ              アスパラギン
１００−５０００ ｍｇ／Ｌ              グルタミン酸
２００−３０００ ｍｇ／Ｌ              イソロイシン
３００−４５００ ｍｇ／Ｌ              ロイシン
５０−１０００ ｍｇ／Ｌ                メチオニン
１００−２０００ ｍｇ／Ｌ              フェニルアラニン
５００−１００００ ｍｇ／Ｌ            セリン
５０−１５００ ｍｇ／Ｌ                トレオニン
２５−１０００ ｍｇ／Ｌ                トリプトファン
４０−１０００ ｍｇ／Ｌ                バリン
１５０−２０００ ｍｇ／Ｌ              アルギニン
０．０１−０．５ ｍｇ／Ｌ              ビオチン
２−１００ ｍｇ／Ｌ                    パントテン酸カルシウム
３−２７０ ｍｇ／Ｌ                    塩化コリン
１−３０ ｍｇ／Ｌ                      葉酸
５−９００ ｍｇ／Ｌ                    イノシトール
０．１−１０ ｍｇ／Ｌ                  ニコチン酸アミド
０．０１−１ ｍｇ／Ｌ                  リボフラビン
１−１００ ｍｇ／Ｌ                    チアミン
０．０１−５ ｍｇ／Ｌ                  ビタミンＢ６
【請求項２】
前述濃縮液において、以下に示す成分は、濃度が以下の通りであることを特徴とする、請求項1に記載の濃縮培養液。
１５００−６５９９ ｍｇ／Ｌ        塩化ナトリウム
３５０−２０００ ｍｇ／Ｌ          アスパラギン酸
５５０−５０００ ｍｇ／Ｌ          アスパラギン
２５０−３０００ ｍｇ／Ｌ          グルタミン酸
５００−２５００ ｍｇ／Ｌ          イソロイシン
５００−２５００ ｍｇ／Ｌ          ロイシン
８０−７００ ｍｇ／Ｌ              メチオニン
２００−１２５０ ｍｇ／Ｌ          フェニルアラニン
２０００−７０００ ｍｇ／Ｌ        セリン
１００−７００ ｍｇ／Ｌ            トレオニン
８０−３５０ ｍｇ／Ｌ              トリプトファン
８０−４００ ｍｇ／Ｌ              バリン
３００−１２００ ｍｇ／Ｌ          アルギニン
０．０５−０．２ ｍｇ／Ｌ          ビオチン
１０−７０ ｍｇ／Ｌ                パントテン酸カルシウム
１０−１２０ ｍｇ／Ｌ              塩化コリン
２−１５ ｍｇ／Ｌ                  葉酸
２５−５００ ｍｇ／Ｌ              イノシトール
０．５−５ ｍｇ／Ｌ                ニコチン酸アミド
０．１−０．５ ｍｇ／Ｌ            リボフラビン
５−５０ ｍｇ／Ｌ                  チアミン
０．１−２ ｍｇ／Ｌ                ビタミンＢ６
【請求項３】
基礎培地と、濃縮培養液の総体積に基づく計算で、以下の成分からなる添加物とを混合する工程を含む濃縮培養液の製造方法であって、
ビタミンＣ                        １０−２５ｍｇ／Ｌ
トランスフェリン                  ５−１８ｍｇ／Ｌ
エタノールアミン                  １−１０ｍｇ／Ｌ
亜セレン酸塩                      ０．０１−０．０４５ ｍｇ／Ｌ
ヒドロキシ酪酸ナトリウム          ０．５−１．５ｍｇ／Ｌ
ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ               ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
ＡｇＮＯ３                        ０．０２−０．０４５ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ３・６Ｈ２Ｏ               ０．０５−０．３ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ               ０．００２−０．００４ｍｇ／Ｌ
ＫＢｒ                           ０．０００５−０．０００８ｍｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ              ０．５−１．５ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＳｉＯ３                    ０．００５−０．０４５ｍｇ／Ｌ
ＬｉＣｌ                         ０．０００５−０．００１ｍｇ／Ｌ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ              ０．０２−０．２５ ｍｇ／Ｌ
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ              ２．００−８．００ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ              ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ６                    ０．０１−０．２ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１２                  ０．０１−０．５ｍｇ／Ｌ
ビオチン                        ０．０５−０．１８ｍｇ／Ｌ
葉酸                            ０．０２−８．００ｍｇ／Ｌ
リボフラビン                    ０．１−０．１５ｍｇ／Ｌ
還元型グルタチオン              ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
アデニン                        ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
グアニン                        ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
ウラシル                        ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
チミン                          ０．２５−１．５ｍｇ／Ｌ
シトシン                        ５．５−８．５ｍｇ／Ｌ
リボース                        ２．０−８．５ｍｇ／Ｌ
デオキシリボース                ２．０−８．５ｍｇ／Ｌ
プリマトーン                    ５００−３５００ｍｇ／Ｌ
４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）          ５００−３０００ｍｇ／Ｌ
β−メルカプトエタノール        ０．２−２ｍｇ／Ｌ
以下に示す成分の濃度を以下のように調整し、
１０００−９０００ ｍｇ／Ｌ      塩化ナトリウム
２００−４０００ ｍｇ／Ｌ        アスパラギン酸
２００−９０００ ｍｇ／Ｌ        アスパラギン
１００−５０００ ｍｇ／Ｌ        グルタミン酸
２００−３０００ ｍｇ／Ｌ        イソロイシン
３００−４５００ ｍｇ／Ｌ        ロイシン
５０−１０００ ｍｇ／Ｌ          メチオニン
１００−２０００ ｍｇ／Ｌ        フェニルアラニン
５００−１００００ ｍｇ／Ｌ      セリン
５０−１５００ ｍｇ／Ｌ          トレオニン
２５−１０００ ｍｇ／Ｌ          トリプトファン
４０−１０００ ｍｇ／Ｌ          バリン
１５０−２０００ ｍｇ／Ｌ        アルギニン
０．０１−０．５ ｍｇ／Ｌ        ビオチン
２−１００ ｍｇ／Ｌ              パントテン酸カルシウム
３−２７０ ｍｇ／Ｌ              塩化コリン
１−３０ ｍｇ／Ｌ                葉酸
５−９００ ｍｇ／Ｌ              イノシトール
０．１−１０ ｍｇ／Ｌ            ニコチン酸アミド
０．０１−１ ｍｇ／Ｌ            リボフラビン
１−１００ ｍｇ／Ｌ              チアミン
０．０１−５ ｍｇ／Ｌ            ビタミンＢ６
好ましくは、前述の基礎培地は、ダルベッコ改良イーグル培地(ＤＭＥＭ)であることを特徴とする、請求項1に記載の濃縮培養液の製造方法。
【請求項４】
チャイニーズハムスター卵巣細胞を接種してから１−５日後、請求項１記載の濃縮培養液を、総添加量が初期の培養体積の１０−１００％となるように添加する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の濃縮培養液の使用方法。
【請求項５】
前述の細胞の接種密度が２×１０５／ｍｌ−２×１０６／ｍｌであることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前述のチャイニーズハムスター卵巣細胞株がｓＴＮＦＲ融合遺伝子チャイニーズハムスター卵巣細胞、ｓＣＴＬＡ４融合タンパク質を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞、或いはヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞から選ばれることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
総添加量が初期の培養体積の１５−６０％であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
濃縮培養液を、毎日１〜５回、或いは１〜５日おきに１回、好ましくは、毎日２〜４回、或いは２〜４日おきに１回添加することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
濃縮培養液を、合計で５−２０日間、より好ましくは８−１６日間添加することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
毎回の濃縮培養液の添加体積が同様で、あるいは、最初の１〜５日間では添加される濃縮培養液の重量の１５〜２５％を、途中の３〜９日間では添加される濃縮培養液の重量の５０〜７０％を、最後の１〜５日間では添加される濃縮培養液の重量の１５〜２５％を添加することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養の分野に関する。より具体的に、大規模な動物細胞培養に適する濃縮培養液及びその添加方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞の大規模培養は、すでにモノクローナル抗体、ウイルスワクチン、免疫調節因子、成長因子、特定の腫瘍抗原及び各種の遺伝子組み換えタンパク質薬物のような各種類の生物活性物質の生産に幅広く応用されている。動物細胞は、微生物と比べると、転写後の修飾の能力を持ち、各種類の品質のいいタンパク質を効率的に発現・生産することができる。
【０００３】
動物細胞培養は、付着細胞でも浮遊細胞でも、操作方式について、主に回分式（Ｂａｔｃｈ）、流加回分式（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）及び灌流式（Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）の３種に分かれている。現在、流加回分式（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養は、動物細胞の大規模培養による分泌型遺伝子組み換えタンパク質薬物の生産において高く評価されている操作方式である。
【０００４】
動物細胞において、チャイニーズハムスター卵巣細胞、即ちＣＨＯ細胞(Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ)は、今、モノクローナル抗体、融合タンパク質、ワクチン、サイトカイン、特定の腫瘍抗原及び各種の遺伝子組み換えタンパク質薬物のような各種の遺伝子工学によるタンパク質製品の生産に広く使用されている。細胞培養に適する培地は、その由来及び成分の明確さによって分けると、その発展が概ねに天然培地段階、合成培地段階及び無血清培地段階の三つの段階に分かれている。国内外において無血清培地に関する開発が多岐にわたっているが、中では、姚偉がＣＨＯ−Ｃ２８細胞を培養するための「国産改良型ＤＭＥＭ培地」（「中国生物由来製品学雑誌」  2003、16（6）：380-383）を公開し、ＣＨＯ−Ｃ２８細胞の大規模培養中に肥厚化・脱落しやすく、維持しにくいという難題を解決した。趙国勝が「ヒトＣＤ３４＋細胞を精製する無動物血清培養」の方法（「国外医学輸血及び血液学分冊」  1998、21（4）:263-264）を公開し、無動物血清基質液（ＡＳＦ）によってヒト骨髄及び末梢血から分離されるＣＤ３４＋細胞を培養し、このＡＳＦ系において、異なる成長因子の組合せを用いてＣＤ３４＋細胞を培養することを紹介した。１０％ウシ胎児血清含有培地と比べると、ＡＳＦ培養細胞は前駆細胞と同様に良好に生長する。ＣＮ００８１６０２０(発明名称：無タンパク質・無血清培養細胞用培地)では、無タンパク質・無血清培養細胞、特に哺乳動物細胞に用いられる、一定の比率で大豆加水分解物を含有する培地が記載されている。ＷＯ２００１２３５２７では、大豆加水分解物を含有する無血清・無タンパク質培地が公開されている。この培地の組成は、乾燥重量で１０％未満の大豆加水分解物、含有量が５００Ｕ／ｇ未満の内毒素である。培地には、さらに、アミノ酸（システイン、プロリン、トリプトファン）或いはアミノ酸の混合物が含まれる。培地には、さらに、他の補助成分、緩衝因子、酸化防止物及びプロテアーゼ阻害剤などが含まれる。また、大規模な動物細胞培養中に細胞密度とタンパク質発現量が低いという問題を解決した、ＣＨＯ細胞の大規模培養に適する無血清・動物由来成分フリーの培地もある。
【０００５】
出願者が、ＣＮ２００７１００８５１４２．２で公開したＣＨＯ細胞の大規模培養に適する無血清・動物由来成分フリーの培地は、大規模な動物細胞培養中に細胞密度とタンパク質発現量が低いという問題を解決した。前述培地は、連続灌流培養プロセスに応用され、優れた効果が得られた。しかし、同時に、流加培養プロセス（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）において、細胞に対して流加回分培養を行い、培養の効果の重要な課題は、細胞培養の後期の栄養成分の補充にもある。
【０００６】
そのため、本分野において、ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養プロセスの細胞培養の結果に対して重要な培地であって、細胞培養の後期で補充可能で、栄養成分を含有する培地が切望されている。
【０００７】
発明の内容
本発明の目的は、ＣＨＯ細胞の大規模培養のための濃縮培養液を提供することにある。
【０００８】
また、本発明の目的は、前述濃縮培養液の製造方法を提供することにある。
【０００９】
さらに、本発明の目的は、前述濃縮培養液の使用方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の第一は、基礎培地と、濃縮培養液の総体積に基づく計算で、以下の成分からなる添加物とで構成され、
ビタミンＣ                            １０−２５ｍｇ／Ｌ
トランスフェリン                      ５−１８ｍｇ／Ｌ
エタノールアミン                      １−１０ｍｇ／Ｌ
亜セレン酸塩                          ０．０１−０．０４５ ｍｇ／Ｌ
ヒドロキシ酪酸ナトリウム              ０．５−１．５ｍｇ／Ｌ
ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                    ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
ＡｇＮＯ３                             ０．０２−０．０４５ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                    ０．０５−０．３ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                    ０．００２−０．００４ｍｇ／Ｌ
ＫＢｒ                                ０．０００５−０．０００８ｍｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    ０．５−１．５ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＳｉＯ３                          ０．００５−０．０４５ｍｇ／Ｌ
ＬｉＣｌ                              ０．０００５−０．００１ｍｇ／Ｌ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                    ０．０２−０．２５ ｍｇ／Ｌ
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                    ２．００−８．００ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ６                          ０．０１−０．２ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１２                        ０．０１−０．５ｍｇ／Ｌ
ビオチン                              ０．０５−０．１８ｍｇ／Ｌ
葉酸                                  ０．０２−８．００ｍｇ／Ｌ
リボフラビン                          ０．１−０．１５ｍｇ／Ｌ
還元型グルタチオン                    ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
アデニン                              ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
グアニン                              ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
ウラシル                              ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
チミン                                ０．２５−１．５ｍｇ／Ｌ
シトシン                              ５．５−８．５ｍｇ／Ｌ
リボース                              ２．０−８．５ｍｇ／Ｌ
デオキシリボース                      ２．０−８．５ｍｇ／Ｌ
プリマトーン                          ５００−３５００ｍｇ／Ｌ
４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）      ５００−３０００ｍｇ／Ｌ
β−メルカプトエタノール                  ０．２−２ｍｇ／Ｌ
前述濃縮液において、以下に示す成分は、濃度が以下の通りである、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の大規模培養のための濃縮培養液を提供する。
【００１１】
１０００−９０００ｍｇ／Ｌ               塩化ナトリウム
２００−４０００ ｍｇ／Ｌ                アスパラギン酸
２００−９０００ ｍｇ／Ｌ                アスパラギン
１００−５０００ ｍｇ／Ｌ                グルタミン酸
２００−３０００ ｍｇ／Ｌ                イソロイシン
３００−４５００ ｍｇ／Ｌ                ロイシン
５０−１０００ ｍｇ／Ｌ                  メチオニン
１００−２０００ ｍｇ／Ｌ                フェニルアラニン
５００−１００００ ｍｇ／Ｌ              セリン
５０−１５００ ｍｇ／Ｌ                  トレオニン
２５−１０００ ｍｇ／Ｌ                  トリプトファン
４０−１０００ ｍｇ／Ｌ                  バリン
１５０−２０００ ｍｇ／Ｌ                アルギニン
０．０１−０．５ ｍｇ／Ｌ                ビオチン
２−１００ ｍｇ／Ｌ                      パントテン酸カルシウム
３−２７０ ｍｇ／Ｌ                      塩化コリン
１−３０ ｍｇ／Ｌ                        葉酸
５−９００ ｍｇ／Ｌ                      イノシトール
０．１−１０ ｍｇ／Ｌ                    ニコチン酸アミド
０．０１−１ ｍｇ／Ｌ                    リボフラビン
１−１００ ｍｇ／Ｌ                      チアミン
０．０１−５ ｍｇ／Ｌ                    ビタミンＢ６
別の好ましい例では、前述濃縮液において、以下に示す成分は、濃度が以下の通りである。
【００１２】
１５００−６５９９ ｍｇ／Ｌ              塩化ナトリウム
３５０−２０００ ｍｇ／Ｌ                アスパラギン酸
５５０−５０００ ｍｇ／Ｌ                アスパラギン
２５０−３０００ ｍｇ／Ｌ                グルタミン酸
５００−２５００ ｍｇ／Ｌ                イソロイシン
５００−２５００ ｍｇ／Ｌ                ロイシン
８０−７００ ｍｇ／Ｌ                    メチオニン
２００−１２５０ ｍｇ／Ｌ                フェニルアラニン
２０００−７０００ ｍｇ／Ｌ              セリン
１００−７００ ｍｇ／Ｌ                  トレオニン
８０−３５０ ｍｇ／Ｌ                    トリプトファン
８０−４００ ｍｇ／Ｌ                    バリン
３００−１２００ ｍｇ／Ｌ                アルギニン
０．０５−０．２ ｍｇ／Ｌ                ビオチン
１０−７０ ｍｇ／Ｌ                      パントテン酸カルシウム
１０−１２０ ｍｇ／Ｌ                    塩化コリン
２−１５ ｍｇ／Ｌ                        葉酸
２５−５００ ｍｇ／Ｌ                    イノシトール
０．５−５ ｍｇ／Ｌ                      ニコチン酸アミド
０．１−０．５ ｍｇ／Ｌ                  リボフラビン
５−５０ ｍｇ／Ｌ                        チアミン
０．１−２ ｍｇ／Ｌ                      ビタミンＢ６
別の好ましい例では、前述濃縮液において、以下に示す成分は、濃度が以下の通りである。
【００１３】
２０００−４５００ ｍｇ／Ｌ          塩化ナトリウム
４５０−１２００ ｍｇ／Ｌ            アスパラギン酸
１０００−４５００ ｍｇ／Ｌ          アスパラギン
７００−２２００ ｍｇ／Ｌ            グルタミン酸
９００−１８００ ｍｇ／Ｌ            イソロイシン
７００−１４００ ｍｇ／Ｌ            ロイシン
３００−５００ ｍｇ／Ｌ              メチオニン
２５０−５００ ｍｇ／Ｌ              フェニルアラニン
３０００−５５００ ｍｇ／Ｌ          セリン
２５０−５００ ｍｇ／Ｌ              トレオニン
９０−２７０ ｍｇ／Ｌ                トリプトファン
１２０−３５０ ｍｇ／Ｌ              バリン
４００−７００ ｍｇ／Ｌ              アルギニン
０．０７−０．１２ ｍｇ／Ｌ          ビオチン
２０−６０ ｍｇ／Ｌ                  パントテン酸カルシウム
２０−９０ ｍｇ／Ｌ                  塩化コリン
３−１２ ｍｇ／Ｌ                    葉酸
６５−３００ ｍｇ／Ｌ                イノシトール
０．８−３ ｍｇ／Ｌ                  ニコチン酸アミド
０．１２−０．３ ｍｇ／Ｌ            リボフラビン
１０−３５ ｍｇ／Ｌ                  チアミン
０．２−１．５ ｍｇ／Ｌ              ビタミンＢ６
別の好ましい例では、前述の基礎培地は、ダルベッコ改良イーグル培地(Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ)である。
【００１４】
本発明の第二は、基礎培地と、濃縮培養液の総体積に基づく計算で、以下の成分からなる添加物とを混合する工程を含み、
ビタミンＣ                              １０−２５ｍｇ／Ｌ
トランスフェリン                        ５−１８ｍｇ／Ｌ
エタノールアミン                        １−１０ｍｇ／Ｌ
亜セレン酸塩                            ０．０１−０．０４５ ｍｇ／Ｌ
ヒドロキシ酪酸ナトリウム                ０．５−１．５ｍｇ／Ｌ
ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                      ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
ＡｇＮＯ３                               ０．０２−０．０４５ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                      ０．０５−０．３ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                      ０．００２−０．００４ｍｇ／Ｌ
ＫＢｒ                                  ０．０００５−０．０００８ｍｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                      ０．５−１．５ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＳｉＯ３                            ０．００５−０．０４５ｍｇ／Ｌ
ＬｉＣｌ                                ０．０００５−０．００１ｍｇ／Ｌ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                      ０．０２−０．２５ ｍｇ／Ｌ
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                      ２．００−８．００ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                      ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ６                            ０．０１−０．２ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１２                          ０．０１−０．５ｍｇ／Ｌ
ビオチン                                ０．０５−０．１８ｍｇ／Ｌ
葉酸                                    ０．０２−８．００ｍｇ／Ｌ
リボフラビン                            ０．１−０．１５ｍｇ／Ｌ
還元型グルタチオン                      ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
アデニン                                ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
グアニン                                ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
ウラシル                                ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
チミン                                  ０．２５−１．５ｍｇ／Ｌ
シトシン                                ５．５−８．５ｍｇ／Ｌ
リボース                                ２．０−８．５ｍｇ／Ｌ
デオキシリボース                        ２．０−８．５ｍｇ／Ｌ
プリマトーン                            ５００−３５００ｍｇ／Ｌ
４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）      ５００−３０００ｍｇ／Ｌ
β−メルカプトエタノール                 ０．２−２ｍｇ／Ｌ
以下に示す成分の濃度を以下のように調整する、上述のような濃縮培養液の製造方法を提供する。
【００１５】
１０００−９０００ ｍｇ／Ｌ              塩化ナトリウム
２００−４０００ ｍｇ／Ｌ                アスパラギン酸
２００−９０００ ｍｇ／Ｌ                アスパラギン
１００−５０００ ｍｇ／Ｌ                グルタミン酸
２００−３０００ ｍｇ／Ｌ                イソロイシン
３００−４５００ ｍｇ／Ｌ                ロイシン
５０−１０００ ｍｇ／Ｌ                  メチオニン
１００−２０００ ｍｇ／Ｌ                フェニルアラニン
５００−１００００ ｍｇ／Ｌ              セリン
５０−１５００ ｍｇ／Ｌ                  トレオニン
２５−１０００ ｍｇ／Ｌ                  トリプトファン
４０−１０００ ｍｇ／Ｌ                  バリン
１５０−２０００ ｍｇ／Ｌ                アルギニン
０．０１−０．５ ｍｇ／Ｌ                ビオチン
２−１００ ｍｇ／Ｌ                      パントテン酸カルシウム
３−２７０ ｍｇ／Ｌ                      塩化コリン
１−３０ ｍｇ／Ｌ                        葉酸
５−９００ ｍｇ／Ｌ                      イノシトール
０．１−１０ ｍｇ／Ｌ                    ニコチン酸アミド
０．０１−１ ｍｇ／Ｌ                    リボフラビン
１−１００ ｍｇ／Ｌ                      チアミン
０．０１−５ ｍｇ／Ｌ                    ビタミンＢ６
前述の基礎培地は、ダルベッコ改良イーグル培地(Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ)であることが好ましい。
【００１６】
本発明の第三は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を接種してから１−５日後、上述のような濃縮培養液を、総添加量が初期の培養体積の１０−１００％となるように添加する工程を含む、上述のような濃縮培養液の使用方法を提供する。
【００１７】
別の好ましい例では、前述の細胞の接種密度が２×１０５／ｍｌ−２×１０６／ｍｌである。
【００１８】
別の好ましい例では、前述のＣＨＯ細胞株がｓＴＮＦＲ融合遺伝子ＣＨＯ細胞、ｓＣＴＬＡ４融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞、或いはヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を発現するＣＨＯ細胞から選ばれる。
【００１９】
別の好ましい例では、総添加量が初期の培養体積の１５−６０％である。
【００２０】
別の好ましい例では、濃縮培養液を、毎日１−５回、或いは１−５日おきに１回添加する。濃縮培養液を、毎日２−４回、或いは２−４日おきに１回添加することがより好ましい。
【００２１】
別の好ましい例では、濃縮培養液を、合計で５−２０日間、より好ましくは８−１６日間添加する。
【００２２】
別の好ましい例では、毎回の濃縮培養液の添加体積が同様で、あるいは、最初の１−５日間では添加される濃縮培養液の重量の１５−２５％を、途中の３−９日間では添加される濃縮培養液の重量の５０−７０％を、最後の１−５日間では添加される濃縮培養液の重量の１５−２５％を添加する。
【００２３】
これによって、本発明は、ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養プロセスの細胞培養の結果に対して重要な培地であって、細胞培養の後期で補充可能で、栄養成分を含有する培地を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、異なる補充液を添加する５Ｌタンクにおける細胞回分培養の生長曲線である。それぞれは、毎日バックグランド体積の２％の３００Ｆ、３００Ｓ、３００Ｓ１、３００Ｓ２、３００Ｓ３を添加する場合及び無特殊添加の場合である。
【図２】図２は、異なる補充液を添加する５Ｌタンクにおける細胞回分培養の発現結果である。それぞれは、毎日バックグランド体積の２％の３００Ｆ、３００Ｓ、３００Ｓ１、３００Ｓ２、３００Ｓ３を添加する場合及び無特殊添加の場合である。
【図３】図３は、異なる添加量の３００Ｓを添加する５Ｌタンクにおける細胞回分培養の生長曲線である。毎日の添加量がバックグランド培養体積の１％、２％、３％、４％及び５％である。
【図４】図４は、異なる添加量の３００Ｓを添加する５Ｌタンクにおける細胞回分培養の発現結果である。毎日の添加量がバックグランド培養体積の１％、２％、３％、４％及び５％である。
【図５】図５は、異なる時期から３００Ｓを添加する５Ｌタンクにおける細胞回分培養の生長曲線である。それぞれは、培養の１−５日目から添加を始め、毎日の添加量がバックグランド培養体積の３％である。
【図６】図６は、異なる時期から３００Ｓを添加する５Ｌタンクにおける細胞回分培養の発現結果である。それぞれは、培養の１−５日目から添加を始め、毎日の添加量がバックグランド培養体積の３％である。
【図７】図７は、異なる頻度で３００Ｓを添加する５Ｌタンクにおける細胞回分培養の生長曲線である。総添加量がバックグランド培養体積の３６％で、毎回の添加量が同様である。Ａ：毎日２回、Ｂ：毎日１回、Ｃ：２日おきに１回、Ｄ：３日おきに1回、Ｅ：４日おきに１回。
【図８】図８は、異なる頻度で３００Ｓを添加する５Ｌタンクにおける細胞回分培養の発現結果である。総添加量がバックグランド培養体積の３６％で、毎回の添加量が同様である。Ａ：毎日２回、Ｂ：毎日１回、Ｃ：２日おきに１回、Ｄ：３日おきに１回、Ｅ：４日おきに１回。
【図９】図９は、異なるプランで３００Ｓを添加する５Ｌタンクにおける細胞回分培養の生長曲線である。毎回の添加量が同様で、総添加量がバックグランド培養体積の３６％である。添加の時期はいずれも培養開始後の３、６、９、１２日目で、添加量はそれぞれバックグランド体積に対して、Ａ：９％(ｄ３)−９％(ｄ６)−９％(ｄ９)−９％(ｄ１２)、Ｂ：６％(ｄ３)−１２％(ｄ６)−１２％(ｄ９)−６％(ｄ１２)、Ｃ：１２％(ｄ３)−１２％(ｄ６)−６％(ｄ９)−６％(ｄ１２)、Ｄ：６％(ｄ３)−６％(ｄ６)−１２％(ｄ９)−１２％(ｄ１２)である。
【図１０】図１０は、異なるプランで３００Ｓを添加する５Ｌタンクにおける細胞回分培養の発現結果である。毎回の添加量が同様で、総添加量がバックグランド培養体積の３６％である。添加の時期はいずれも培養開始後の３、６、９、１２日目で、添加量はそれぞれバックグランド体積に対して、Ａ：９％(ｄ３)−９％(ｄ６)−９％(ｄ９)−９％(ｄ１２)、Ｂ：６％(ｄ３)−１２％(ｄ６)−１２％(ｄ９)−６％(ｄ１２)、Ｃ：１２％(ｄ３)−１２％(ｄ６)−６％(ｄ９)−６％(ｄ１２)、Ｄ：６％(ｄ３)−６％(ｄ６)−１２％(ｄ９)−１２％(ｄ１２)である。
【図１１】図１１は、異なる培養規模の細胞生長曲線である。細胞はそれぞれ５Ｌ、３０Ｌ及び５００Ｌのタンクで培養し、以下のプランで３００Ｓを添加する。接種後７２時間経過の時点で３００Ｓの補充を始め、３日おきに１回補充し、毎回の添加量はそれぞれバックグランド体積に対して、６％(ｄ３)−１２％(ｄ６)−１２％(ｄ９)−６％(ｄ１２)である。
【図１２】図１２は、異なる培養規模の細胞発現結果である。細胞はそれぞれ５Ｌ、３０Ｌ及び５００Ｌのタンクで培養し、以下のプランで３００Ｓを添加する。接種後７２時間経過の時点で３００Ｓの補充を始め、３日おきに１回補充し、毎回の添加量はそれぞれバックグランド体積に対して、６％(ｄ３)−１２％(ｄ６)−１２％(ｄ９)−６％(ｄ１２)である。
【００２５】
具体的な実施形態
発明者は、幅広く深く研究したところ、高い用量の栄養成分を含有する培地を見出し、さらに、ＣＨＯ細胞の大規模な流加回分式（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養中に、一定の方式でこの培地を補充することにより、細胞生長の状況に非常に顕著な改善と向上をもたらすことができることを見出した。
【００２６】
本文で用いられるように、「濃縮培養液」と「高い用量の栄養成分を含有する培地」は入替えて使用することができ、いずれも中国特許出願ＣＮ２００７１００８５１４２．２で公開されたＣＨＯ細胞の大規模培養のための培地に基づき、ある成分の濃度を調整したものである。ここで、出願者は、中国特許出願ＣＮ２００７１００８５１４２．２の全文も参考として取り入れる。
【００２７】
本文で用いられるように、「一般培地」とは上述中国特許出願ＣＮ２００７１００８５１４２．２で公開されたＣＨＯ細胞の大規模培養のための培地で、以下の成分からなるものである。
【００２８】
ビタミンＣ                            １０−２５ｍｇ／Ｌ
トランスフェリン                      ５−１８ｍｇ／Ｌ
エタノールアミン                      １−１０ｍｇ／Ｌ
亜セレン酸塩                          ０．０１−０．０４５ ｍｇ／Ｌ
ヒドロキシ酪酸ナトリウム              ０．５−１．５ｍｇ／Ｌ
ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                    ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
ＡｇＮＯ３                             ０．０２−０．０４５ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                    ０．０５−０．３ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                    ０．００２−０．００４ｍｇ／Ｌ
ＫＢｒ                                ０．０００５−０．０００８ｍｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    ０．５−１．５ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＳｉＯ３                          ０．００５−０．０４５ｍｇ／Ｌ
ＬｉＣｌ                              ０．０００５−０．００１ｍｇ／Ｌ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                    ０．０２−０．２５ ｍｇ／Ｌ
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                    ２．００−８．００ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                    ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ６                          ０．０１−０．２ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１２                        ０．０１−０．５ｍｇ／Ｌ
ビオチン                              ０．０５−０．１８ｍｇ／Ｌ
葉酸                                  ０．０２−８．００ｍｇ／Ｌ
リボフラビン                          ０．１−０．１５ｍｇ／Ｌ
還元型グルタチオン                    ０．５−２．５ｍｇ／Ｌ
アデニン                              ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
グアニン                              ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
ウラシル                              ５．５−８．５ ｍｇ／Ｌ
チミン                                ０．２５−１．５ｍｇ／Ｌ
シトシン                              ５．５−８．５ｍｇ／Ｌ
リボース                              ２．０−８．５ｍｇ／Ｌ
デオキシリボース                      ２．０−８．５ｍｇ／Ｌ
プリマトーン                          ５００−３５００ｍｇ／Ｌ
４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）      ５００−３０００ｍｇ／Ｌ
β−メルカプトエタノール                ０．２−２ｍｇ／Ｌ
発明者は、上述一般培地に基づき、以下の表１の成分の用量を調整し、本発明の濃縮培養液を構成した。調製方法は、中国特許出願ＣＮ２００７１００８５１４２．２で公開された方法と同様で、調製後ｐＨを６．８−７．２に、浸透圧を３００−１０００ｍＯｓｍ／ｋｇの間に調整した。
【表１】
2011516086.tif 000002
【００２９】
細胞培養中に、例えば細胞接種密度、濃縮培養液の添加方式及び時期、ｐＨ値、ブドウ糖、曝気などの要素の影響及び制御も受ける。
【００３０】
１．細胞接種密度の影響
大規模細胞培養の起点は非常に重要である。高すぎる初期密度によっては、後続の培養中に、より良い増殖空間がなくなり、培養液における栄養及び酸素の供給に障害が生じ、代謝廃棄物の累積が厳重になり、細胞生存率が早めに低下し、培養周期が短くなり、発現が低下する。低すぎる密度によっては、後続の培養が所要の細胞数に達することなく、培養周期が長くなり、密度が低く、発現が少ない。我々の研究によって、２×１０５／ｍｌ−２×１０６／ｍｌの密度が好適な密度で、特に好ましくは３×１０５／ｍｌ−１×１０６／ｍｌ、最も好ましくは５×１０５／ｍｌの初期密度であることが見出された。好適な密度で接種してから４−７日後、細胞が６×１０６／ｍｌ−１×１０７／ｍｌ程度と最高の密度に達し、細胞生存率が９０−９５％で、増殖を継続するか、回分培養に入ることができる。
【００３１】
２．濃縮培養液の添加方式及び時期
細胞を接種してから１−５日後、細胞密度が１−５×１０６／ｍｌで、濃縮培養液の添加を開始し、この液を回分で添加し、総添加量が初期培養体積の１０％−１００％、特に好ましくは１５−６０％で、最も好ましい補充体積が初期培養体積の３０％−４０％である。
【００３２】
補充の回数は、毎日２回或いは１−５日おきに１回で、最も好ましい補充方式が３日おきに１回である。
【００３３】
毎回の補充量は、互いに同じでも異なってもよい。補充時間は合計で１２日間程度で、最初と最後の３日間は補充量がやや少なく、補充量が総補充量の３０％−５０％で、途中の６日間の補充量が総量の５０％−７０％で、最適化された補充分布は１７％−６４％−１７％（最初３日間−途中６日間−最後３日間）である。
【００３４】
３．ｐＨの制御
培養中に、ｐＨの制御が重要で、好適なｐＨが６．５−７．５の間で、特に好ましくは６．７−７．３の間で、最も好ましくは６．８−７．１の間である。タンクに入った初期は、ＣＯ２或いはＮａＨＣＯ３を補充する手段で、６．９−７．１の間に制御する。濃縮培養液を添加した後、細胞培養中に、ｐＨを６．８−７．０の間に制御し、培養の後期はでは、６．９−７．１の間に戻す。
【００３５】
４．ブドウ糖の制御
回分培養において、好適なブドウ糖濃度が非常に重要で、低すぎるブドウ糖濃度が「飢餓」による細胞の死亡を起こし、高すぎるブドウ糖濃度が細胞の生長を抑制し、浸透圧を向上させ、乳酸の過剰発生を引起す。毎日２０％−５０％のブドウ糖溶液を補充することによって、培養物におけるブドウ糖濃度を好適な範囲にすることが重要である。好適なブドウ糖濃度は０．５−１０ｇ／Ｌ、特に好ましくは１−５ｇ／Ｌで、最も好ましくは２．５−３．５ｇ／Ｌである。
【００３６】
５．曝気の調整
培養中に、無泡曝気或いは微泡曝気を用いることができる。吹き込まれる気体は、空気、酸素及び二酸化炭素を含む。発酵タンクは、空気と酸素の比率を自動的に調整することによって溶解酸素を設定値の付近に維持する。二酸化炭素と発酵液のｐＨは関連する。無泡曝気の場合、曝気量を毎分間０．５−２倍タンク体積程度に制御する。微泡曝気の場合、曝気量を毎分間０．００１−０．０１倍タンク体積に制御し、ｐＨ及び溶解酸素を有効に制御できれば、できるだけ曝気量を減少する。
【００３７】
本発明で説明された上述特徴、或いは実施例で説明された特徴は任意に組み合わせることができる。本願説明書で開示されたすべての特徴はいずれの組成物の様態とも併用することができ、説明書で開示された各特徴は、いずれの相同、同等或いは類似の目的の代替性特徴にも任意に替えることができる。そのため、特に説明しない限り、開示された特徴は同等或いは類似の特徴の一般的な例にすぎない。
【００３８】
本発明の主な利点は以下の通りである。
【００３９】
１、ＣＨＯ細胞の大規模培養に用いられる濃縮培養液の処方を見出した。
【００４０】
２、本発明によって提供される濃縮培養液を有効にＣＨＯ細胞のＦｅｄ−ｂａｔｃｈ大規模培養中に応用する。
【００４１】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常、通常の条件、或いはメーカーの薦めの条件で行われた。別の説明がない限り、すべての百分率と部は、重量で計算される。
【００４２】
別の定義がない限り、本文に用いられるすべての専門用語と科学用語は、本分野の技術者に知られている意味と同様である。また、記載の内容と類似或いは同等の方法及び材料は、いずれも本発明の方法に用いることができる。ここで記載の好ましい実施方法及び材料は例示のためだけである。
【００４３】
実施例１
培地３００Ｆと４種類の濃縮培養液の調製
基礎培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ社から購入）に基づき、以下の物質を添加し、培地３００Ｆを得た。
【００４４】
ビタミンＣ                          １０．５ ｍｇ／Ｌ
トランスフェリン                    ６．２ｍｇ／Ｌ
エタノールアミン                    ３．１ｍｇ／Ｌ
亜セレン酸塩                        ０．０２５ｍｇ／Ｌ
ヒドロキシ酪酸ナトリウム              ０．８５ｍｇ／Ｌ
ＣＨＯ細胞培地の総体積で計算される。
【００４５】
微量元素：
ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ                  １．２ ｍｇ／Ｌ
ＡｇＮＯ３                                ０．０３ ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                  ０．２１ ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ                  ０．００２７ｍｇ／Ｌ
ＫＢｒ                              ０．０００６１ ｍｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                  ０．７２ ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＳｉＯ３                       ０．００５−０．０４５ ｍｇ／Ｌ
ＬｉＣｌ                            ０．０００８３ ｍｇ／Ｌ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ                  ０．０４２ ｍｇ／Ｌ
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                  ２．１２ ｍｇ／Ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                  １．５８ ｍｇ／Ｌ
ビタミン：
ビタミンＢ６                        ０．１８ ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１２                      ０．３８ ｍｇ／Ｌ
ビオチン                            ０．１２ ｍｇ／Ｌ
葉酸                                ３．１２ ｍｇ／Ｌ
リボフラビン                        ０．１２ ｍｇ／Ｌ
及び以下の物質：
還元型グルタチオン                  ０．６８ ｍｇ／Ｌ
アデニン                            ６．５ ｍｇ／Ｌ
グアニン                            ６．５ ｍｇ／Ｌ
ウラシル                            ６．５ ｍｇ／Ｌ
チミン                              ０．７ ｍｇ／Ｌ
シトシン                            ６．５ ｍｇ／Ｌ
リボース                            ２．０ ｍｇ／Ｌ
デオキシリボース                    ２．０ ｍｇ／Ｌ
ＨＥＰＥＳ（４−ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸）      ２１００ ｍｇ／Ｌ
β−メルカプトエタノール            １．５ ｍｇ／Ｌ
３００Ｆに基づき、以下の成分を調整し、用量が下述表２の通りで、濃縮培養液を形成し、計４種類で、それぞれ３００Ｓ、３００Ｓ１、３００Ｓ２及びＳ３００３と名づけた。調製は、最終体積が８０％−９０％となるように注射用水で粉剤を溶解させ、十分に３−４時間撹拌し、ｐＨを測定し、１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム或いは１ｍｏｌ／Ｌの希塩酸で６．８−７．２に調整し、注射用水で最終体積に定量する。
【表２】
2011516086.tif 000003
【００４６】
実施例２
３００Ｓ、３００Ｓ１、３００Ｓ２、３００Ｓ３の追加の細胞生長及び発現に対する影響
細胞：特に説明しない限り、実施例における細胞はｓＴＮＦＲ融合遺伝子ＣＨＯ細胞（中国発明特許０１１３２０７４．５の実施例で公開された方法によって製造されたもの）から選ばれ、以下同様である。
【００４７】
細胞は種タンクで対数増殖期に生長し、５×１０５／ｍｌで５Ｌ発酵タンクに接種し、液が３００Ｆで、初期体積がタンク動作体積の６０％で、ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ細胞培養プロセスを開始した。細胞培養中の曝気は無泡曝気であった。細胞培養中に７．５％重炭酸ナトリウムの補充或いは二酸化炭素ガスの吹き込みによってｐＨを６．８−７．１の間に制御した。毎日培養液における残留糖濃度を測定し、且つ３０％のブドウ糖を補充することによってタンクにおける残留糖を２．５−３．５グラム/リットルとした。酸素と圧縮空気で調節することによって、溶解酸素を４０−６０％に制御した。後続の補充は六つの場合に分かれた。第一は、必要な時だけにブドウ糖とアルカリ溶液を補充し、別に他の栄養成分を補充しなかった。第二は、接種の７２時間後から、毎日初期体積の２％の用量で３００Ｆを補充した。第三は、接種の７２時間後から、毎日初期体積の２％の用量で３００Ｓを補充した。第四は、接種の７２時間後から、毎日初期体積の２％の用量で３００Ｓ１を補充した。第五は、接種の７２時間後から、毎日初期体積の２％の用量で３００Ｓ２を補充した。第六は、接種の７２時間後から、毎日初期体積の２％の用量で３００Ｓ３を補充した。毎日タンクにおける生細胞を計数した。細胞培養の終点は、１５日間の細胞培養を完成した、或いは生細胞が１０×１０５／ｍｌ未満になった時点であった。細胞培養終了後、培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ法で発現されたタンパク質に対して濃度を測定した。
【００４８】
その結果、図1に示すように、液の補充を一切しなかった場合、細胞が１５日目まで維持できなかった。３００Ｆを補充した場合、細胞が１５日目まで維持できたが、高いレベルにはなれなかった。一方、３００Ｓ、３００Ｓ１、３００Ｓ２及び３００Ｓ３を補充した場合、生細胞の密度が顕著に増加し、維持時間が顕著に延び、中でも、300Sの補充による効果が最も好ましい。図２は、３００Ｓ、３００Ｓ１、３００Ｓ２、３００Ｓ３を補充した場合、細胞の発現量の結果を示し、中でも３００Ｓのこの細胞のｆｅｄ−ｂａｔｃｈ細胞培養プロセスに対する促進効果が最も好ましい。
【００４９】
実施例３
３００Ｓの用量と細胞の生長及び発現の比較
細胞は種タンクで対数増殖期に生長し、５×１０５／ｍｌで５Ｌ発酵タンクに接種し、液が３００Ｆで、初期体積がタンク動作体積の６０％で、ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ細胞培養プロセスを開始した。細胞培養中の曝気は無泡曝気であった。細胞培養中に７．５％重炭酸ナトリウムの補充或いは二酸化炭素ガスの吹き込みによってｐＨを６．８−７．１の間に制御した。毎日培養液における残留糖濃度を測定し、且つ３０％のブドウ糖を補充することによってタンクにおける残留糖を２．５−３．５グラム/リットルとした。酸素と圧縮空気で調節することによって、溶解酸素を４０−６０％に制御した。接種の７２時間後から、毎日それぞれ初期タンク体積の１％、２％、３％、４％及び５％の用量で３００Ｓを補充し、毎日タンクにおける生細胞を計数した。細胞培養の終点は、１５日間の細胞培養を完成した、或いは生存細胞が１０×１０５／ｍｌ未満になった時点であった。細胞培養終了後、培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ法で発現されたタンパク質に対して濃度を測定した。
【００５０】
その結果、図３に示すように、３％の比率で３００Ｓを補充した場合、生細胞の密度が一番高く、図４の結果は、その発現量も一番高かったことを示すため、初期細胞培養体積の３％の比率で３００Ｓを毎日補充することは、この細胞のｆｅｄ−ｂａｔｃｈ細胞培養プロセスに対する促進が最も顕著である。
【００５１】
実施例４
３００Ｓの補充開始時期と細胞の生長及び発現の関係
細胞は種タンクで対数増殖期に生長し、５×１０５／ｍｌで５Ｌ発酵タンクに接種し、液が３００Ｆで、初期体積がタンク動作体積の６０％で、ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ細胞培養プロセスを開始した。細胞培養中の曝気は無泡曝気であった。細胞培養中に７．５％重炭酸ナトリウムの補充或いは二酸化炭素ガスの吹き込みによってｐＨを６．８−７．１の間に制御した。毎日培養液における残留糖濃度を測定し、且つ３０％のブドウ糖を補充することによってタンクにおける残留糖を２．５−３．５グラム/リットルとした。酸素と圧縮空気で調節することによって、溶解酸素を４０−６０％に制御した。それぞれ接種後の１日目、２日目、３日目、４日目及び５日目から、毎日初期タンク体積の３％の用量で３００Ｓを補充し、毎日タンクにおける生細胞を計数した。細胞培養の終点は、１５日間の細胞培養を完成した、或いは生存細胞が１０×１０５／ｍｌ未満になった時点であった。細胞培養終了後、培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ法で発現されたタンパク質に対して濃度を測定した。
【００５２】
その結果、図５に示すように、３日目から３００Ｓを補充した場合、生細胞の密度が一番高く、図６の結果は、その発現量も一番高かったことを示すため、３日目から３００Ｓを補充することは、この細胞のｆｅｄ−ｂａｔｃｈ細胞培養プロセスに対する促進が最も顕著である。
【００５３】
実施例５
３００Ｓの補充間隔時期と細胞の生長及び発現の関係
細胞は種タンクで対数増殖期に生長し、５×１０５／ｍｌで５Ｌ発酵タンクに接種し、液が３００Ｆで、初期体積がタンク動作体積の６０％で、ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ細胞培養プロセスを開始した。細胞培養中の曝気は無泡曝気であった。細胞培養中に７．５％重炭酸ナトリウムの補充或いは二酸化炭素ガスの吹き込みによってｐＨを６．８−７．１の間に制御した。毎日培養液における残留糖濃度を測定し、且つ３０％のブドウ糖を補充することによってタンクにおける残留糖を２．５−３．５グラム/リットルとした。酸素と圧縮空気で調節することによって、溶解酸素を４０−６０％に制御した。それぞれ接種の７２時間後から、３００Ｓの補充を開始し、計５種の異なる補充方法に分かれた。第一は、１２時間おきに１回補充し、毎回の補充量が初期タンク内の液量の１．５％であった。第二は、毎日１回補充し、毎回の補充量が初期タンク内の液量の３％であった。第三は、２日おきに１回補充し、毎回の補充量が初期タンク内の液量の６％であった。第四は、３日おきに１回補充し、毎回の補充量が初期タンク内の液量の９％であった。第五は、４日おきに１回補充し、毎回の補充量が初期タンク内の液量の１２％であった。毎日タンクにおける生存細胞を計数した。細胞培養の終点は、１５日間の細胞培養を完成した、或いは生存細胞が１０×１０５／ｍｌ未満になった時点であった。細胞培養終了後、培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ法で発現されたタンパク質に対して濃度を測定した。
【００５４】
その結果、図７に示すように、接種の７２時間後から、３００Ｓの補充を開始し、毎日２回、毎日１回、２日に１回及び３日に１回で補充した４つの場合では、生細胞の密度が近く、図８の結果は、４組の発現量も大きな差がなかったことを示すが、４日に１回補充した場合だけで、細胞密度が顕著に低下し、発現量も顕著に低下した。そのため、簡単な操作を優先することも考えて、接種の７２時間後から、３００Ｓを３日に１回で補充するのが最も好ましい補充方式である。
【００５５】
実施例６
３００Ｓの異なる補充プランと細胞の生長及び発現の関係
細胞は種タンクで対数増殖期に生長し、５×１０５／ｍｌで5L発酵タンクに接種し、液が３００Ｆで、初期体積がタンク動作体積の６０％で、ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ細胞培養プロセスを開始した。細胞培養中の曝気は無泡曝気であった。細胞培養中に７．５％重炭酸ナトリウムの補充或いは二酸化炭素ガスの吹き込みによってｐＨを６．８−７．１の間に制御した。毎日培養液における残留糖濃度を測定し、且つ３０％のブドウ糖を補充することによってタンクにおける残留糖を２．５−３．５グラム/リットルとした。酸素と圧縮空気で調節することによって、溶解酸素を４０−６０％に制御した。接種の７２時間後から、３００Ｓの補充を開始し、３日に１回で補充し、総補充量が同様で、いずれも初期体積の３６％であったが、下述表３に示すように、計４種類の異なる補充方法があった。毎日タンクにおける生存細胞を計数した。細胞培養の終点は、１５日間の細胞培養を完成した、或いは生存細胞が１０×１０５／ｍｌ未満になった時点であった。細胞培養終了後、培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ法で発現されたタンパク質に対して濃度を測定した。
【表３】
2011516086.tif 000004
【００５６】
その結果、図９に示すように、接種の７２時間後から、３００Ｓの補充を開始し、３日に１回で補充し、プラン1及びプラン２は生細胞の密度が近く、プラン３及びプラン４は密度が低く、図１０の結果はプラン２の発現量が一番高かったことを示す。
【００５７】
実施例７
細胞培養プロセスの拡大
３００Ｓの細胞に対する作用をさらに検証するため、主に５Ｌ、３０Ｌ及び５００Ｌの異なる規模の発酵タンクにおいて上述プロセスを拡大した。細胞は種タンクで対数増殖期に生長し、５×１０５／ｍｌで発酵タンクに接種し、液が３００Ｆで、初期体積がタンク動作体積の６０％で、ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ細胞培養プロセスを開始した。５Ｌタンクの細胞培養中の曝気は無泡曝気で、３０Ｌ及び２５０Ｌのタンクは微泡曝気であった。細胞培養中に７．５％重炭酸ナトリウムの補充或いは二酸化炭素ガスの吹き込みによってｐＨを６．８−７．１の間に制御した。毎日培養液における残留糖濃度を測定し、且つ３０％のブドウ糖を補充することによってタンクにおける残留糖を２．５−３．５グラム/リットルとした。酸素と圧縮空気で調節することによって、溶解酸素を４０−６０％に制御した。接種の７２時間後から、３００Ｓの補充を開始し、３日に１回で補充し、３日目の補充量が初期体積の６％で、６日目の補充量が初期体積の１２％で、９日目の補充量が初期体積の１２％で、１２日目の補充量が初期体積の６％であった。毎日タンクにおける生存細胞を計数した。細胞培養の終点は、１５日間の細胞培養を完成した、或いは生存細胞が１０×１０５／ｍｌ未満になった時点であった。細胞培養終了後、培養上清を取り、ＥＬＩＳＡ法で発現されたタンパク質に対して濃度を測定した。
【００５８】
その結果、図１１及び図１２に示すように、異なる細胞培養の規模及び異なる曝気方式では、いずれも類似の生長曲線と発現量を得たので、この細胞に対して、この濃縮培養液及びその補充添加方式がパイロット規模或いは生産規模に拡大して応用することができる。
【００５９】
本発明の発明者は、さらに、別の２種の細胞、すなわち、ｓＣＴＬＡ４融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞及びヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を発現するＣＨＯ細胞（それぞれ中国発明特許０１１３２０７５．３及び０１１３２２２５．Ｘの実施例で公開された方法によって製造されたもの）を使用し、上述２種の細胞の代謝特性に合わせてそれぞれ３００Ｓ−１（３００Ｓの代わりにｓＣＴＬＡ４融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞の培養に使用）及び３００Ｓ−２（３００Ｓの代わりにヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を発現するＣＨＯ細胞の培養に使用）の濃縮培養液を表４のように調製した。その後、３００Ｓの代わりにそれぞれ３００Ｓ−１及び３００Ｓ−２を用い、上述実施例２−７における方法に従って検証を重複し、同様な実験結果を得た。本発明における濃縮培養液及びその添加方式は同様に他のＣＨＯ細胞をパイロット規模或いは生産規模に拡大して応用できることが示唆される。
【表４】
2011516086.tif 000005
【００６０】
細胞培養中の一般培地でも、細胞の流加回分培養中に添加される濃縮培養液でも、その成分及び濃度の変化がいずれも培養される特定の細胞株に関連する。例えば、上述実施例におけるｓＴＮＦＲ融合遺伝子ＣＨＯ細胞に対する３００Ｓ、ｓＣＴＬＡ４融合タンパク質を発現するＣＨＯ細胞に対する３００Ｓ−１、及びヒト化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体を発現するＣＨＯ細胞に対する３００Ｓ−２のように、特定の細胞株に対して調製される一般培地及び/又は濃縮培養液は、無論、その細胞により優れた培養効果がある。本発明の濃縮培養液は、通常細胞の生長に必要な成分を含有するため、通常の細胞株の細胞培養に用いることにより、細胞の生長状況も顕著に改善、向上する。
【００６１】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、この分野の技術者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるべきである。
【図１】
2011516086.tif 000006
【図２】
2011516086.tif 000007
【図３】
2011516086.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2011516086.tif 000012
【図８】
2011516086.tif 000013
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2011516086.tif 000017
【国際調査報告】
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