(57)【要約】  本発明は、血液悪性腫瘍、特に慢性リンパ球性白血病の治療、および自己免疫疾患の治療のためのHVEMのリガンドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療に使用するためのHVEMのリガンドであって、慢性リンパ球性白血病B細胞においてアポトーシスを誘導するLIGHTまたはLIGHTの断片、HVEMに結合する抗HVEM抗体およびその断片からなる群から選択されるHVEMのリガンド。
【請求項２】
血液悪性腫瘍の治療のための、請求項1に記載のHVEMのリガンド。
【請求項３】
自己免疫疾患の治療のための、請求項1に記載のHVEMのリガンド。
【請求項４】
血液悪性腫瘍または自己免疫疾患の治療用の薬剤を製造するためのHVEMのリガンドの使用であって、前記HVEMのリガンドが、慢性リンパ球性白血病B細胞においてアポトーシスを誘導するLIGHT、その断片、HVEMに結合する抗HVEM抗体およびその断片からなる群から選択される使用。
【請求項５】
血液悪性腫瘍が、B細胞リンパ系新生物、T細胞リンパ系新生物、非ホジキンリンパ腫(NHL)、B-NHL、T-NHL、慢性リンパ球性白血病(CLL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、NK細胞リンパ系新生物および骨髄細胞系新生物からなる群から選択される、請求項2に記載のHVEMのリガンドまたは請求項4に記載の使用。
【請求項６】
前記HVEMのリガンドが、慢性リンパ球性白血病B細胞においてアポトーシスを誘導するLIGHTまたはその断片である、請求項1、2、3、および5のいずれか一項に記載のHVEMのリガンドまたは請求項4もしくは5に記載の使用。
【請求項７】
前記HVEMのリガンドがLIGHTの可溶型である、請求項6に記載のHVEMのリガンドまたは使用。
【請求項８】
前記HVEMのリガンドが、HVEMに結合する抗HVEM抗体またはその断片である、請求項1、2、3、および5のいずれか一項に記載のHVEMのリガンドまたは請求項4もしくは5に記載の使用。
【請求項９】
前記抗HVEM抗体または前記その断片が、HVEMを発現する悪性リンパ球の死および/または排除を、アポトーシスの誘導、抗体依存性細胞傷害、補体媒介性細胞傷害ならびに/あるいはサイトカインおよび/またはケモカインの産生を介した免疫エフェクター細胞の活性化により誘導する、請求項8に記載のHVEMのリガンドまたは使用。
【請求項１０】
前記抗HVEM抗体または前記その断片が、悪性リンパ球においてアポトーシスを誘導する、請求項8に記載のHVEMのリガンドまたは使用。
【請求項１１】
前記悪性リンパ球が慢性リンパ球性白血病B細胞である、請求項10に記載のHVEMのリガンドまたは使用。
【請求項１２】
前記HVEMのリガンドが、グループI、II、III、IV、VまたはVIからなる群から選択されるエピトープを認識する抗体である、請求項8から11のいずれか一項に記載のHVEMのリガンドまたは使用。
【請求項１３】
前記HVEMのリガンドがモノクローナル抗体である、請求項8から12のいずれか一項に記載のHVEMのリガンドまたは使用。
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体が、CNCM I-3752、CNCM I-3753およびCNCM I-3754からなる群から選択される、COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM)に寄託されたハイブリドーマから得ることができる、請求項13に記載のHVEMのリガンドまたは使用。
【請求項１５】
HVEMを発現する悪性リンパ球の死および/または排除を、アポトーシスの誘導、抗体依存性細胞傷害、補体媒介性細胞傷害ならびに/あるいはサイトカインおよび/またはケモカインの産生を介した免疫エフェクター細胞の活性化により誘導する、抗HVEMモノクローナル抗体を得るのに適したハイブリドーマ細胞系。
【請求項１６】
HVEMを発現する悪性リンパ球のアポトーシスを誘導する、抗HVEMモノクローナル抗体を得るのに適したハイブリドーマ細胞系。
【請求項１７】
慢性リンパ球性白血病B細胞においてアポトーシスを誘導する、抗HVEMモノクローナル抗体を得るのに適したハイブリドーマ細胞系。
【請求項１８】
前記抗HVEMモノクローナル抗体が、グループI、II、III、IV、VまたはVIからなる群から選択されるエピトープを認識する、請求項15から17のいずれか一項に記載のハイブリドーマ細胞系。
【請求項１９】
CNCM I-3752、CNCM I-3753およびCNCM I-3754からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞系。
【請求項２０】
HVEMを発現する悪性リンパ球の死および/または排除をアポトーシスの誘導、抗体依存性細胞傷害、補体媒介性細胞傷害ならびに/あるいはサイトカインおよび/またはケモカインの産生を介した免疫エフェクター細胞の活性化により誘導する、HVEMに結合する抗HVEM抗体またはその断片。
【請求項２１】
悪性リンパ球においてアポトーシスを誘導する、HVEMに結合する抗HVEM抗体またはその断片。
【請求項２２】
慢性リンパ球性白血病B細胞においてアポトーシスを誘導する、HVEMに結合する抗HVEM抗体またはその断片。
【請求項２３】
前記抗体が、グループI、II、III、IV、VまたはVIからなる群から選択されるエピトープを認識する、請求項20から22のいずれか一項に記載の抗HVEM抗体またはその断片。
【請求項２４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項20から23のいずれか一項に記載の抗HVEM抗体。
【請求項２５】
CNCM I-3752、CNCM I-3753およびCNCM I-3754からなる群から選択される、COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM)に寄託されたハイブリドーマから得ることができるモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液悪性腫瘍、特に慢性リンパ球性白血病(CLL)の治療、および自己免疫疾患の治療のためのHVEMのリガンドに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の細胞
免疫系の細胞は骨髄において発生し、それらの多くはまた成熟している。次いで、それらは遊走して組織を巡回し、血液中およびリンパ系と呼ばれる血管の特殊化した系の中を循環する。
【０００３】
赤血球、血小板および免疫系の白血球を含む血液のすべての細胞エレメントは、骨髄中の同じ前駆(progenitorまたはprecursor)細胞の造血幹細胞に結局由来する。これらの幹細胞は、さまざまな型の血液細胞すべてを発生させることができるので、それらは多くの場合、多能性造血幹細胞と呼ばれる。まず、それらは、i)赤血球(erythrocytesまたはred blood cells)を発生させる赤芽球、ii)血小板の前駆体である巨核球、iii)自然免疫系の顆粒球、マクロファージおよびマスト細胞の前駆体である骨髄系前駆体、iv)適応免疫系の主要な構成要素であるリンパ球を発生する共通のリンパ系前駆体、を含むより能力の限られた幹細胞を発生する。
【０００４】
リンパ球には2つの主要な型:活性化された場合形質細胞に分化するBリンパ球またはB細胞、および2種の主要なクラスが存在するTリンパ球またはT細胞がある。T細胞のうち、1つのクラスは、ウィルス感染した細胞を殺す細胞傷害性T細胞に分化し、一方第2のクラスはヘルパーT細胞に分化する。ヘルパーT細胞は、B細胞などの他のリンパ球を活性化することにより適応免疫系を助け、いくつかの骨髄系細胞を活性化することによって自然免疫系と相互に作用する。すべてのリンパ球は、ヒトの一次的リンパ器官または中枢リンパ器官である骨髄内で発生するが、Bリンパ球のみが骨髄において成熟する。Tリンパ球は、ヒトの他の中枢リンパ器官である胸腺へと遊走し、成熟する。
【０００５】
B細胞とT細胞はどちらも、その表面上に、抗原を認識することを可能にする特殊化した受容体を発現する。全体として、これらの受容体は、それらの抗原特異性において非常に多様であるが、十分に分化した各リンパ球およびその全子孫は、唯一の抗原を認識する受容体を発現するように設計される。全体として、全リンパ球上の受容体は、抗原の非常に大きなレパートリーを認識できる。B細胞抗原受容体(BCR)は、細胞が活性化された場合に分泌される抗体の膜結合型である。T細胞抗原受容体(TCR)は、それらの構造的免疫グロブリン根源が共通しているためBCRと関連があるが、抗原結合領域および抗原との相互作用の様式においてBCRとは全く異なる。ナチュラルキラー細胞またはNK細胞と呼ばれる第3のクラスのリンパ系細胞は、抗原特異的受容体を欠いており、自然免疫系の一部を形成している。
【０００６】
成熟抗原反応性Bリンパ球は、それらが抗原と遭遇するより先に骨髄において発生する。成熟過程は、共通のリンパ系前駆体からプロB、プレB、移行または未熟Bを介して成熟Bリンパ球への一連の順序だった分化段階を通過する。それらが抗原と遭遇した後で、B細胞は、免疫グロブリン遺伝子座の再構成およびB細胞クローンの増殖を特質とする、抗原誘導性の増殖および分化を受ける。この過程は、最終的には、さまざまな重鎖および軽鎖のアイソタイプ抗体を分泌する、またはメモリー細胞になるB細胞の子孫をもたらす。
【０００７】
血液悪性腫瘍
免疫系が関与する病態について、造血細胞の系統および分化段階多様性により、一般的に血液悪性腫瘍と呼ばれる、非常に多くの、異なる不均一な腫瘍がもたらされる。したがって、血液悪性腫瘍または血液新生物は、免疫系または血液、骨髄およびリンパ節を含む造血系の細胞および組織に影響を与える。血液悪性腫瘍は、白血病とリンパ腫をどちらも含む。
【０００８】
白血病という用語は、白血球の異常増殖を特徴とする、血液または骨髄の血液悪性腫瘍を定義するために使用されている。白血病の主要な亜型は、リンパ(例えば、Tリンパ球系またはBリンパ球系)または骨髄(例えば、顆粒球系、赤血球系または巨核球系)細胞に関する悪性腫瘍および疾患の発症が急性か慢性かどうかに基づいて特定される[Freireich, E.J.ら、1991年]。
【０００９】
リンパ腫という用語は、リンパ組織の新生物の混成群をカバーする。リンパ腫は、ホジキンリンパ腫ならびにT細胞(T-NHL)性およびB細胞(B-NHL)性の非ホジキンリンパ腫に広く分類される。世界保健機構(WHO)の分類が最近発行され(本出願の後部において論じる)、この分類に基づく診断ガイドラインが確立されている[Jaffe, E. S.ら、2004年(以下の表3および4を参照されたい)]。
【００１０】
慢性リンパ球性白血病(CLL)は、骨髄および血液におけるリンパ球の、緩慢だが進行性の蓄積を特徴とするリンパ性白血病の形態である。疾患の段階によって、リンパ節および脾臓の肥大が一般的に起こる。CLLはT細胞またはB細胞起源であり得るが、症例の85%以上がB細胞起源である。現在の理解により、CLLは、それらの活性化および成熟の段階ならびに細胞のサブグループが異なるBリンパ球から生じる、不均一な疾患であることが示唆される([Kuppers, R.、2005年]を参照されたい)。この疾患は、アポトーシスの減少からも白血病B細胞の増殖増加からも生じ得る。CLL細胞は、通常起源がクローン性であり、以下の細胞表面マーカー:CD19、CD20、CD21およびCD24を発現する。さらに、それらは、T細胞でより典型的に発見されるCD5を発現する([Chiorazzi, Nら、2005年]を参照されたい)。
【００１１】
CLLは、「非ホジキンリンパ腫」(NHL)のサブグループとみなされ、主にリンパ節に存在する非常に密接に関連する疾患「小リンパ球性リンパ腫」(SLL)と併せて、全NHL症例のおよそ20%に相当する。CLLは、米国および西ヨーロッパの大部分において成人の最も一般的な白血病である。National Cancer Institute(米国立癌研究所) (NCI)は、CLLは、米国において1年に約10.000例の新症例を発症すると予測している。CLLの臨床症状は、大部分が55歳を過ぎて起こる。男性の発症率は女性よりも高く、男性は、女性の約2倍この疾患にかかりやすい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第4,642,334号
【特許文献２】欧州特許公開第0239400号
【特許文献３】欧州特許公開第0125023号
【特許文献４】米国特許第5,202,238号
【特許文献５】米国特許第5,204,244号
【特許文献６】国際公開番号WO97/10354
【特許文献７】欧州特許第239,400号
【特許文献８】国際公開番号WO91/09967
【特許文献９】米国特許第5,225,539号
【特許文献１０】米国特許第5,530,101号
【特許文献１１】米国特許第5,585,089号
【特許文献１２】欧州特許第592,106号
【特許文献１３】欧州特許第519,596号
【特許文献１４】米国特許第5,565,332号
【特許文献１５】欧州特許出願EP125023号
【特許文献１６】国際特許出願WO96/02576
【特許文献１７】国際公開番号WO98/45322
【特許文献１８】国際公開番号WO87/02671
【特許文献１９】米国特許第5,859,205号
【特許文献２０】米国特許第4,816,567号
【特許文献２１】欧州特許第0173494号
【特許文献２２】国際公開番号WO87/05330
【特許文献２３】米国特許第4,640,835号
【特許文献２４】米国特許第4,496,689号
【特許文献２５】米国特許第4,301,144号
【特許文献２６】米国特許第4,670,417号
【特許文献２７】米国特許第4,791,192号
【特許文献２８】米国特許第4,179,337号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁および1570〜1580頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
治療の選択肢が限られているため、CLLでは医療上の要求が満たされていない。NHLの最も一般的な治療は、化学療法、特にCHOP(シトキサン、ヒドロキシルビチン(アドリアマイシン)、オンコビン(ビンクリスチン)、プレドニゾン(Cytoxan、Hydroxyrubicin [Adriamycin]、Oncovin [Vincristine]、Prednisone))と呼ばれる併用投与計画および放射線療法である。いくつかの症例において、外科手術および骨髄移植もまた使用される。より最近、生物医薬品、特にリツキシマブおよびアレムツズマブなどのモノクローナル抗体の使用も増えている。他の併用研究は、生物医薬品、例えばリツキシマブと化学療法の使用を含む。これらの治療は、Bリンパ性悪性疾患の管理が有意に改善されているが、それらの欠陥の中には、これらの投与計画に対して多くの患者が非反応性であること(いくらかの患者は、これらの研究のいくつかまたはすべてに対して不応性になる)、ならびにこれらの治療の使用からもたらされる副作用および合併症が含まれる。化学療法の最も一般的な副作用の中には、吐き気および嘔吐(一般的に、制吐剤の使用により対処する)、脱毛症(一般的に治療終了後時間が経つと戻る)および白血球減少症、特に好中球減少症がある。好中球減少症は、一般的に第2週に発症する。この期間、多くの臨床医は、シプロフロキサシンの予防的使用を推奨している。好中球減少期に発熱した場合、好中球数の少ない患者の感染症は急激に進行するので、好中球減少性敗血症に関する緊急の医学的評価が必要である。リツキシマブに関しては、最初の注入反応、リンパ球減少症B型肝炎および進行性多巣性白質脳症(PML)を含むウィルスの再活性化などの感染合併症、皮膚粘膜反応および腎臓の合併症が報告されている。アレムツズマブの場合は、汎血球減少症、骨髄形成不全、特発性自己免疫性血小板減少症、自己免疫性溶血液性貧血を含む、重篤な血液毒性が起こり得る。いくつかの症例において、これらの毒性は、罹患率および死亡率を加速させ得る。
【００１５】
自己免疫疾患
免疫系は、自己組織を攻撃することを防ぐ調節機序を有する。これらの機序が適切に機能しない場合、またはそれらが機能停止した場合、自己免疫の発生または自己免疫疾患をもたらし得る。自己免疫は、臓器特異的から臓器非特異的までの広範囲な疾患を表す。その範囲の一方の端において、橋本甲状腺炎が、破壊性病変が1つの臓器のみを対象とする高度臓器特異的疾患の典型である。その範囲の他方の端において、紅斑性狼瘡(SLE)が、関係する組織が身体全体の広範囲に及ぶ臓器非特異的疾患を代表する。免疫生物学についての我々の理解の向上および分子および診断ツールの進歩により、以下のリストに示されたように、大部分の臓器または組織系が自己免疫疾患の自己破壊能力に供され得ることの革新的な証拠となる。したがって、自己免疫疾患中には、アジソン病、強直性脊椎炎、無形成性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、クローン病、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、特発性白血球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病)、男性不妊、混合型結合組織疾患、多発性硬化症(MS)、重症筋無力症、類天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性粘液水腫、ライター症候群、関節リウマチ(RA)、硬皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス(SLE)、甲状腺機能高進症、潰瘍性大腸炎およびウェゲナー肉芽腫症が含まれる。
【００１６】
［発明が解決しようとする課題］
自己免疫疾患の病因は、完全には理解されていない。いくつかの例において、生産的抗菌または抗ウィルス反応が、何かの事情で自己組織への免疫反応を発症させ得る、分子模倣の機序が提唱されている。さらに、遺伝的素因(inheritedまたはgenetic predispositions)が多くのこれらの疾患の発症に寄与していることは公知である。
【００１７】
リンパ系および骨髄系細胞はどちらも、自己免疫疾患の発症に関係している。自己反応性Tリンパ球およびBリンパ球は、各疾患および関連する組織の主な臨床病理学的特徴を決定する。Tリンパ球は、自己組織を直接攻撃できるが、一方B細胞は自己反応性抗体を分泌する。SLEでは、二本鎖DNAに対する抗体を含む、大量の自己反応性抗体が産生され、これらは腎臓障害を起こす、または悪化させると考えられている。マクロファージなどの骨髄系細胞は、TNF-αおよびIL-8などのサイトカインおよびケモカイン反応を提供すること、ならびに自己破壊過程に対するエフェクター細胞として機能することによって、自己組織に対する免疫攻撃の維持、拡大および延長を助ける。抗TNF-α療法に対する反応として現在公知であるRAおよびクローン病に関する、TNF-αの役割は明確に確立されている。RAの場合、骨髄系細胞は破骨細胞に分化し、したがって、炎症関節の滑膜表層の骨の損傷および破壊を起こすと考えられている。RAの患者は、抗CD20抗体療法などのB細胞を対象とする治療に対して反応することがさらに示されている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、治療に使用するためのHVEMのリガンドに関し、前記HVEMのリガンドはLIGHT、慢性リンパ球性白血病B細胞においてアポトーシスを誘導するLIGHTの断片、抗HVEM抗体、およびHVEMに結合するその断片からなる群から選択される。
【００１９】
特に、本発明は、血液悪性腫瘍または自己免疫疾患の治療のためのHVEMのリガンドに関する。
【００２０】
本発明はさらに、それを必要とする対象に、治療有効量のHVEMのリガンドを投与することを含む、血液悪性腫瘍または自己免疫疾患の治療方法にも関する。
【００２１】
定義
本明細書で使用する場合、特定のタンパク質(例えば、抗体またはLIGHT)に対する言及は、それらの起源または調製方法に関係なく、天然のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびに変異体および修飾体を含み得る。天然のアミノ酸配列を有するタンパク質は、天然から得られた同じアミノ酸配列を有するタンパク質(例えば、天然に存在するLIGHT)である。このような天然配列のタンパク質は、天然から単離でき、または標準的な組換え方法および/または合成方法を使用して調製できる。天然配列タンパク質は、天然に存在する切断型または可溶型、天然に存在する変異型(例えば、選択的スプライシング型)、天然に存在する対立遺伝子多型および翻訳後修飾を含む形態を特に包含する。天然配列タンパク質は、グリコシル化またはリン酸化などの翻訳後修飾あるいはいくつかのアミノ酸残基の他の修飾後のタンパク質を含む。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「HVEM」という用語は、限定するものではないが、「ヘルペスウィルス進入メディエーター(Herpes Virus Entry Mediator)」、「HVEA」、「ヘルペスウィルス進入メディエーターA」、「TNFRSF 14」、「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー(Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member )14」、「TNR14」、「LlGHTR」、「LIGHT受容体」、「TR2」、「TNF受容体様」、「ATAR」、「別のTRAF関連受容体」を含む全類義語を包含することを意図している。TNFRSF14は、HUGO(Human Genome Organization)Gene Nomenclature Committee (HGNC)に承認された記号である。HVEMに関するUniProtKB/Swiss-Protの「第1受託番号」はQ92956である。「第2受託番号」は、Q8WXR1、Q96J31およびQ9UM65である。
【００２３】
「リガンド」は、受容体分子に結合して受容体-リガンド複合体を形成する、天然または合成の化合物を意味する。
【００２４】
今までのところ、HVEMに結合する4種のリガンドが特定されている。これらのリガンドの2種、LIGHTおよびLTαは、分子のTNFファミリーのメンバーである。(Morel, Y.ら、2000年; Mauri, D.N.ら、1998年およびHarrop, J.A.ら、1998年)。構造的に、TNFファミリーのメンバーは全般に一回膜貫通型(タイプ2)の、ホモ三量体またはヘテロ三量体の糖タンパク質として発現される。膜貫通タンパク質として発現した後、それらはタンパク質分解作用によって切断され、リガンドの可溶型が作製される。HVEMに対する第3のリガンドのBTLA、1型膜貫通糖タンパク質は、分子の免疫グロブリン(Ig)のスーパーファミリーのメンバーであり、CD28と非常に関連がある(Gonzalez, L.C.ら、2005年)。第4のリガンド、糖タンパク質D(gD)は、単純ヘルペスウィルス(HSV)のエンベロープの構成要素であり、HSVの宿主への進入には必須である(Montgomery, R.I.ら、1996年;Hsu, H.ら、1997年;Kwon, B.S.ら、1997年;Tan, K.B.ら、1997年;Marsters, S.A.ら、1997年;Wallach, D.ら、1999年;Collette, Y.ら、2003年;Harrop, J.A.ら、1998年;Gonzalez, .L.C.ら、2005年およびWhitbeck, J.C.ら、1997年)。
【００２５】
後に結晶分析(Compaan, D. M.ら、2005年)により支持された、結合試験(Gonzalez, L.C.ら、2005年およびSedy, J. R.ら、2005年)により、BTLAがHVEMの大部分の膜-遠位CRD領域と相互に作用することが示される。HVEMの膜-遠位CRD1領域は、HSV-gDとの相互作用にも関係しており、さらにCRD2も寄与している(Compaan, D. M.ら、2005年およびCarfi, A.ら、2001年)。BTLAとHSV-gDとの配列および構造的相違にもかかわらず、結晶構造研究により、それらのHVEMにおける結合部位が大きく重複した表面を対象としていることがさらに示された(Compaan, D. M.ら、2005年およびCarfi, A.ら、2001年)。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「LIGHT」という用語は、限定するものではないが、「T細胞により発現される、HVEMに対する単純ヘルペスウィルス(HSV)糖タンパク質Dと競合する、誘導可能なリンホトキシン」、「TNFSF14」、「腫瘍壊死因子のリガンドのスーパーファミリーメンバー14」、「TNF14_HUMAN」、「HVEM-L」、「HVEML」、「HVEM_リガンド」、「ヘルペスウィルス進入メディエーターリガンド(Herpes Virus Entry Mediator Ligand)」、「ヘルペスウィルス進入メディエーターリガンド(Herpesvirus entry mediator-ligand)」、「TL4」、「TNF様4」、「TN14」、「LTγ」および「CD258」を含む全類義語を包含することを意図している。TNFSF14は、HGNCの承認記号である。CD258は、HLDA(ヒト白血球分化抗原(Human Leukocyte Differentiation Antigens))ワークショップのクラスタ指定記号である。LIGHTに関するniProtKB/Swiss-Protの「第1受託番号」は043557である。「第2受託番号」は、O75476、Q8WVF8およびQ96LD2である。
【００２７】
天然抗体では、2つの重鎖がジスルフィド結合によって相互に連結しており、各重鎖はジスルフィド結合により軽鎖と連結している。軽鎖にはラムダ(λ)およびカッパ(κ)の2種類がある。重鎖には、抗体分子の機能的活性を決定する、IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEの5つの主要な重鎖のクラス(またはアイソタイプ)がある。各鎖は、異なる配列ドメインを含む。軽鎖は、2つのドメイン、可変ドメイン(VL)および定常ドメイン(CL)を含む。重鎖は、4つのドメイン、可変ドメイン(VH)および3つの定常ドメイン(CH1、CH2およびCH3、総称してCH)を含む。軽鎖(VL)および重鎖(VH)両方の可変領域は、結合認識および抗原に対する特異性を決定する。軽鎖(CL)および重鎖(CH)の定常領域ドメインは、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、相補的結合およびFc受容体(FcR)との結合などの重要な生物特性を与える。Fv断片は、1つの軽鎖および1つの重鎖の可変部分からなる免疫グロブリンのFab断片のN末端部分である。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性に存在する。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域(CDR)に由来する残基で構成されている。時として、非超可変領域またはフレームワーク領域(FR)に由来する残基が、全ドメイン構造、したがって結合部位に影響を与える。相補性決定領域またはCDRは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Fv領域の結合親和性および特異性を、一緒に決定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ3つのCDRを有し、それぞれL-CDR1、L-CDR2、L-CDR3およびH-CDR1、H-CDR2、H-CDR3と呼ばれる。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖のV領域に由来するCDRのセットを含む、6つのCDRを含む。フレームワーク領域(FR)は、CDRの間に割り込むアミノ酸配列を指す。「抗体」という用語は、抗体、それらの消化断片、特定部分および変異体を包含し、抗体の構造および/または機能を模倣する抗体模倣体または抗体の一部あるいはそれらの特定断片または特定部分を含み、一本鎖抗体およびその断片を含むことをさらに意図する。機能的断片は、哺乳動物のHVEMと結合する抗原結合断片を含む。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」という用語は、抗体分子の実質部分が、アミノ酸配列または構造においてヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列または構造と似ている抗体を指す。「ヒト化抗体」という用語は、遺伝子操作または他の方法によって、構造またはアミノ酸配列が天然に存在するヒト抗体に似するように変更された抗体を指す。「ヒト抗体」または「ヒト化抗体」は、治療、予防または診断目的でヒトに投与するために、抗体の免疫原性が低下することが望ましい場合により適しているとみなすことができる。
【００２９】
「モノクローナル抗体」または「mAb」は、そのさまざまな名称で、特定のエピトープと免疫反応できる抗体結合部位の、唯一の種を含む抗体分子の集団を指す。したがって、モノクローナル抗体は、通常免疫反応する任意のエピトープに対して単一の結合親和性を示す。さらにモノクローナル抗体は、複数の抗体結合部位を有し、それぞれ異なるエピトープに対して免疫特異的である抗体分子と定義することができる。例えば、二重特異性抗体は、2つの抗原結合部位を有し、それぞれが異なる相互作用分子または異なるエピトープを認識する。本明細書で使用する場合、「抗体断片」、「抗体部分」「抗体変異体」などという用語は、前記分子と抗原(例えばHVEM)との特異的相互作用を可能にするような、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含む、任意のタンパク質またはポリペプチドを含む。免疫グロブリン分子の一部は、限定するものではないが、重鎖または軽鎖の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)またはそれらのリガンド結合部分、重鎖または軽鎖の可変領域、重鎖または軽鎖の定常領域、フレームワーク領域またはそれらの任意の部分、あるいは本発明の抗体に組み込み、抗原(例えば、HVEM)と相互作用可能にする少なくとも1部のリガンドまたはカウンター受容体(例えば、LIGHT、BTLAまたはHSV-gD)を含むことができる。
【００３０】
「ハイブリドーマ」という用語は、非ヒト哺乳動物を抗原で免疫化することによって調製されるB細胞を、マウス由来の骨髄細胞または抗原特異性を有する望ましいモノクローナル抗体を産生するような細胞との細胞融合に供することによって得られる細胞を表す。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、げっ歯類、ネコ、イヌおよび霊長類などの哺乳動物を表す。好ましくは、本発明による対象はヒトである。
【００３２】
［発明を実施するための形態］
治療方法および使用
本発明の第1の目的は、治療に使用するためのHVEMのリガンドに関し、前記HVEMのリガンドは、慢性リンパ球性白血病のB細胞においてアポトーシスを誘導するLIGHT、LIGHTの断片、HVEMに結合する抗HVEM抗体およびその断片からなる群から選択される。
【００３３】
通常、前記HVEMのリガンドは、放射線治療およびホルモン療法と組み合わせて使用できる。
【００３４】
通常、前記HVEMのリガンドは、抗癌剤、抗嘔吐剤、造血コロニー刺激因子、鎮痛剤および抗不安剤からなる群から選択される、1種または複数種の薬剤と組み合わせて使用することもできる。
【００３５】
好ましい実施形態において、本発明は、血液悪性腫瘍または自己免疫疾患の治療のためのHVEMのリガンドに関する。
【００３６】
本発明は、血液悪性腫瘍または自己免疫疾患の治療用の薬剤を製造のためのHVEMのリガンドの使用にも関し、前記HVEMのリガンドは、慢性リンパ球性白血病のB細胞においてアポトーシスを誘導するLIGHT、その断片、HVEMに結合する抗HVEM抗体およびその断片からなる群から選択される。
【００３７】
一実施形態において、血液悪性腫瘍は、限定するものではないが、慢性リンパ球性白血病(CLL)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)およびマントル細胞リンパ腫(MCL)などのリンパ系細胞新生物を含む。より具体的には、非ホジキンリンパ腫(NHL)は、BおよびT非ホジキンリンパ腫を含む。さらに、細胞リンパ系新生物は、B、NKおよびT細胞リンパ系新生物を含む。
【００３８】
一実施形態において、自己免疫疾患は、限定するものではないが、アジソン病、強直性脊椎炎、無形成性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、クローン病、皮膚筋炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、特発性白血球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、インスリン依存性糖尿病(1型糖尿病)、男性不妊、混合型結合組織疾患、多発性硬化症(MS)、重症筋無力症、類天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性粘液水腫、ライター症候群、関節リウマチ(RA)、硬皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス(SLE)、甲状腺機能高進症、潰瘍性大腸炎およびウェゲナー肉芽腫症を含む。
【００３９】
好ましい実施形態において、前記HVEMのリガンドは、慢性リンパ球性白血病のB細胞においてアポトーシスを誘導するLIGHTまたはその断片である。
【００４０】
具体的には、前記リガンドは、受託番号がQ92956であり、慢性リンパ球性白血病のB細胞においてアポトーシスを誘導する配列と少なくとも90%の同一性を有する配列を含むポリペプチドからなり得る。別の好ましい実施形態において、本発明のリガンドは、可溶型で使用できるLIGHTである。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、それ自体が当分野において公知である任意の技術、例えば、限定するものではないが、任意の化学的、生物学的、遺伝的または酵素的技術によって、単体または組み合わせてのいずれかで作成することができる。
【００４２】
望ましい配列のアミノ酸配列を知ることにより、当業者は、ポリペプチドの作製に関する標準的技術によって前記ポリペプチドを容易に作成できる。例えば、ポリペプチドは、周知の固相法を使用して、好ましくは市販のペプチド合成装置(例えば、Applied Biosystems、Foster City、California製)を使用して、製造業者の指示書に従って合成できる。
【００４３】
あるいは、本発明のポリペプチドは、現在では当分野において周知である組換えDNA技術により合成できる。例えば、これらの断片は、望ましい(ポリ)ペプチドをコードするDNA配列を発現ベクターに組み込み、このようなベクターを、望ましいポリペプチドを発現する適切な真核生物宿主または原核生物宿主に導入した後で、DNAの発現産物として得ることができ、そこから周知の技術を使用して後に単離できる。本発明のポリペプチドは、単離形態(例えば精製形態)または膜小胞または脂質小胞(例えばリポソーム)などのベクターに含まれた形態で使用できる。
【００４４】
別の好ましい実施形態において、前記HVEMのリガンドは、HVEMに結合する抗HVEM抗体またはその断片である。
【００４５】
前記リガンドは、HVEMを発現する悪性リンパ球の死および/または排除を、アポトーシス誘導、抗体依存性細胞傷害、補体媒介性細胞傷害またはサイトカインもしくはケモカインの産生を介した免疫エフェクター細胞の動員および/もしくは活性化などの機序により誘導できる。
【００４６】
好ましい実施形態において、前記リガンドは、HVEMを発現する悪性リンパ球、特に慢性リンパ球性白血病B細胞において、アポトーシスを誘導する。
【００４７】
HVEMを発現する悪性リンパ球は、急性白血病、慢性リンパ球性白血病、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫またはT細胞リンパ腫を患う患者から得ることができる。
【００４８】
本発明の一実施形態において、前記抗HVEM抗体または前記その断片は、BTLAのHVEMへの結合を阻害しない抗体またはその断片である。
【００４９】
本発明の別の実施形態において、前記抗HVEM抗体または前記その断片は、BTLAのHVEMへの結合を阻害し、ヒトHVEM配列のCPKCSPGYRVKEACGELTGTVCEPC(配列番号1)を含む、またはそれらからなる30アミノ酸の配列に結合しない抗体またはその断片である。
【００５０】
好ましい実施形態において、前記抗HVEM抗体または前記断片は、グループI、II、III、IV、VまたはVIからなる群から選択されるエピトープを認識する抗体またはその断片である。別の好ましい実施形態において、前記抗HVEM抗体または前記断片は、グループII、IVまたはVからなる群から選択されるエピトープを認識する抗体またはその断片である。
【００５１】
HVEM mAbにより認識されるエピトープは、以下の特性:
i)LIGHT、HSV-gDおよび/またはBTLAのHVEMへの結合を阻害するmAbの能力、
ii)HVEMの突然変異体に結合する能力に関してmAbを試験する、突然変異誘発実験
を特徴とする。
【００５２】
使用するHVEM突然変異体は、
i)2欠失突然変異体、
a.CRD1ドメイン欠失および
b.CRD3ドメイン内のアミノ酸129〜133の欠失(del 129〜133)
ii)残基131〜133が置換されたアラニン置換突然変異体(mut 131〜133)、
を含む。
【００５３】
上記の一連の実験により、6つの異なるmAbの群、したがって6つのエピトープが定義される:
1. グループI mAb、CRD1に結合しないが、del 129〜133欠失突然変異体によって影響され、HVEMのLIGHTへの結合のみをブロックするmAbに相当する。
2. グループII mAb、CRD1欠失体に結合するが、del 129〜133欠失体またはmut131〜133突然変異体には結合しないmAbに相当する。
3. グループIII mAb、CRD1欠失突然変異体には結合しないが、del 129〜133欠失体により影響されず、3種のHVEMリガンドの結合を阻害しないmAbに相当する。
4. グループIV mAb、CRD1により影響されず、del 129〜133欠失突然変異体により影響され、3種のHVEMリガンドの結合を阻害しないmAbに相当する。
5. グループV mAb、CRD1欠失体に結合するが、del 129〜133欠失体には結合せず、HVEMが3種のリガンドに結合することをブロックできないmAbに相当する、および
6. グループVI mAb、CRD1欠失体に結合するが、del 129〜133欠失体により、またはmut131〜133突然変異体により一部影響され、HVEMがすべてのリガンドに結合することをブロックできるmAbに相当する。
【００５４】
好ましい実施形態において、前記抗HVEM抗体は、CNCM I-3752、CNCM I-3753およびCNCM I-3754からなる群から選択される、ブダペスト条約に従って2007年4月26日にCOLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM)に寄託されたハイブリドーマから得ることができるモノクローナル抗体である。
【００５５】
さらなる実施形態において、本発明は、抗HVEMモノクローナル抗体を得るのに適したハイブリドーマ細胞系に関し、これらは、悪性リンパ球の死および/または排除を、アポトーシス誘導、抗体依存性細胞傷害、補体媒介性細胞傷害またはサイトカインもしくはケモカインの産生を介した免疫エフェクター細胞の動員および/もしくは活性化などの機序により誘導する。
【００５６】
好ましい実施形態において、本発明は、抗HVEMモノクローナル抗体を得るのに適したハイブリドーマ細胞系に関し、これらは、HVEMを発現する悪性リンパ球、特に慢性リンパ球性白血病B細胞においてアポトーシスを誘導する。
【００５７】
好ましい実施形態において、本発明は、抗HVEMモノクローナル抗体を得るのに適したハイブリドーマ細胞系に関し、これらは、グループI、II、III、IV、VまたはVIからなる群から選択されるエピトープを認識する。
【００５８】
好ましい実施形態において、前記ハイブリドーマ細胞系は、CNCM I-3752、CNCM I-3753およびCNCM I-3754からなる群から選択される。
【００５９】
ポリクローナル抗体も使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。HVEMに特異的に結合できる抗体は、限定するものではないが、げっ歯動物(マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスターなど)、ブタ、ウシ、ウマまたは霊長類などを含む多くの種に由来していてよい。霊長類(サル、ヒヒ、チンパンジーなど)起源の抗体は、ヒトの配列と最も高い程度の類似性を有し、したがって、免疫原性が低いことが期待される。さまざまな種に由来する抗体が、抗体のアミノ酸配列を変更することによって、望ましい抗原と結合するそれらの能力を維持したまま「ヒト化」できる。抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を用いてヒト抗体を発現するように遺伝子改変されている、マウスを含むトランスジェニック動物に由来してもよい。「ポリクローナル抗体」を作製する手順は、当分野において周知である。例えば、ポリクローナル抗体は、HVEMに対して免疫化された動物の血清から得ることができ、これらは、例えば、当業者により周知の標準的方法に従って遺伝子操作によって作製できる。通常、このような抗体は、HVEMタンパク質を、免疫前血清を得るために初めに出血させたニュージーランド白ウサギに皮下投与することによって作製できる。抗原を、全量100μl/部位で6か所の異なる部位に注射できる。各注射材料は、アジュバントと、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後の、タンパク質またはポリペプチドを含む粉砕されたアクリルアミドゲルとを含む、またはアジュバントのみを含むことができる。その後、最初の注射の2週間後にウサギを出血させ、同じ抗原を用いて6週間おきに3回、定期的にブーストした。その後、血清試料を、各ブーストの10日後に収集した。次いで、ポリクローナル抗体を、抗体を捕捉するための対応する抗原を使用して、アフィニティクロマトグラフィーによって血清から回収する。ポリクローナル抗体を産生させるためのこの手順および他の手順は開示されており(Harlowら、1988年)、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
歴史的にモノクローナル抗体は、クローン的に純粋な免疫グロブリン分泌細胞系の不死化によって作製されたが、抗体分子のモノクローン的に純粋な集団は、本発明の方法によっても調製できる。
【００６１】
モノクローナル抗体を調製する実験的方法は当分野において周知である(例えば、Harlowら、1988年を参照されたい)。モノクローナル抗体(mAb)は、マウス、ラット、霊長類などの哺乳動物を、精製されたHVEMタンパク質を用いて免疫化することによって調製できる。免疫化哺乳動物由来の抗体産生細胞を単離し、骨髄腫細胞または異種骨髄腫細胞と融合し、ハイブリッド細胞(ハイブリドーマ)を作製する。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、所望のモノクローナル抗体の供給源として利用できる。ハイブリドーマ培養のこの標準的方法は、(KohlerおよびMilstein、1975年)に記載されている。あるいは、免疫グロブリン遺伝子を単離し、特異的反応性抗体の反応をスクリーニングするライブラリーの調製に使用できる。組換えファージおよび他の発現ライブラリーを含む多くのこのような技術は、当業者に公知である。mAbは、ハイブリドーマ培養により作製できるが、本発明はそれに限定されない。さらに、本発明のハイブリドーマからクローン化された核酸の、クローン化および転写により作製されたmAbの使用が企図される。すなわち、本発明のハイブリドーマによって分泌される分子を発現する核酸を、別の細胞系に転写し、形質転換細胞を作製することができる。形質転換細胞は、遺伝子型により元のハイブリドーマと識別できるが、さらに、ハイブリドーマにより分泌される抗体分子に相当する全抗体分子の免疫学的に活性な断片を含む、本発明の抗体分子を産生できる。例えば、Readingの米国特許第4,642,334号;PCT公開番号;Winterらの欧州特許公開第0239400号およびCabillyらの第0125023号を参照されたい。
【００６２】
特定の実施形態において、HVEMを認識するmAbは、Balb-cマウスを個別の組換えヒトFc-IgG1融合タンパク質を用いて免疫化することによって発生させ得る。脾臓細胞を、X-63骨髄腫細胞と融合させ、すでに記載されている手順に従ってクローン化した(Olive D、1986年)。その後、ハイブリドーマの上清を、形質移入細胞の染色によって、非形質移入細胞が反応性を欠いていることに関してスクリーニングした。
【００６３】
例えば、ファージディスプレイ技術などを使用してナイーブなライブラリー(非免疫化動物由来)を試験する、免疫化によらない抗体作製技術もまた意図される;(Barbasら、1992年およびWaterhouseら、(1993年)を参照されたい)。
【００６４】
本発明の抗体は、例えば、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィーなどの、従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地から適切に分離される。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトキメラ抗体であってよい。本発明の前記ヒトキメラ抗体は、VLおよびVHドメインをコードする核酸配列を得、それらをヒト抗体CHおよびヒト抗体CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクターに挿入することによりヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、それを動物細胞に導入することにより発現ベクターを発現させることによって作製できる。ヒトキメラ抗体のCHドメインは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であってよいが、IgGのクラスのCHドメインは適切であり、IgGl、IgG2、IgG3およびIgG4などのIgGクラスに属するサブクラスのいずれか1つもまた使用できる。さらに、ヒトキメラ抗体のCLは、Igに属する任意の領域であってよく、κクラスまたはλクラスのものも使用できる。従来の組換えDNA技術および遺伝子形質移入技術を含む、キメラ抗体の作製方法は、当分野において周知である(Morrison SL.ら、(1984年)ならびに特許文献米国特許第5,202,238号および米国特許第5,204,244号を参照されたい)。
【００６６】
別の特定の実施形態において、前記抗体は、ヒト化抗体であってよい。前記ヒト化抗体は、CDRドメインをコードする核酸配列を得、それらを、ヒト抗体の重鎖定常領域と同一の重鎖定常領域およびヒト抗体の軽鎖定常領域と同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクターに挿入し、それを動物細胞に導入することによって発現ベクターを発現させて作製できる。
【００６７】
ヒト化抗体発現ベクターは、抗体の重鎖をコードする遺伝子および抗体の軽鎖をコードする遺伝子が別のベクター上に存在するタイプまたは両方の遺伝子が同じベクター上に存在するタイプ(タンデム型)のどちらであってもよい。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さおよび動物細胞における抗体のH鎖およびL鎖の発現レベルのバランスの点では、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターがより好ましい(Shitara Kら、1994年)。タンデム型ヒト化抗体発現ベクターの例は、pKANTEX93(WO97/10354)、pEE18などを含む。従来の組換えDNA技術および遺伝子形質移入技術に基づくヒト化抗体の作製方法は、当分野において周知である(例えば、Riechmann L.ら、1988年;Neuberger MS.ら、1985年を参照されたい)。抗体は、例えば、CDR-グラフト化(欧州特許第239,400号;PCT公開番号WO91/09967;米国特許第5,225,539号、第5,530,101号および第5,585,089号)、べニアリングまたはリサーフェイシング(欧州特許第592,106号、欧州特許第519,596号;Padlan EA(1991年);Studnicka GMら、(1994年);Roguska MA.ら、(1994年))およびチェーンシャッフリング(米国特許第5,565,332号)を含む、当分野において公知のさまざまな技術を使用してヒト化できる。このような抗体の調製のための一般的組換えDNA技術もまた公知である(欧州特許出願EP125023号および国際特許出願WO96/02576を参照されたい)。例えば、限定するものではないが、Fab(例えば、パパイン消化による)、Fab'(例えば、ペプシン消化および部分的還元による)およびF(ab')2(例えば、ペプシン消化)、facb(例えば、プラスミン消化)、pFc'(例えば、ペプシンまたはプラスミン消化による)、Fd(例えば、ペプシン消化、部分的還元および再集合による)、FvまたはscFv(例えば、分子生物学的技術による)の断片を含む、HVEMに結合できる抗体断片またはそれらの一部も本発明に包含される(例えば、Colligan、Immunology上記を参照されたい)。
【００６８】
このような断片は、当分野において公知、および/または本明細書に記載の、酵素的切断、合成技術または組換え技術により作製できる。抗体は、天然の終止部位の上流に、1つまたは複数の終止コドンを導入してある抗体遺伝子を使用して、さまざまな切断型にも作製できる。抗体のさまざまな部分は、従来の技術により化学的に結合でき、または遺伝子操作技術を使用して連続したタンパク質として調製できる。本発明の前記Fab断片は、ヒトHVEMと特異的に反応する抗体を、プロテアーゼのパパインで処理することによって得ることができる。またFabは、抗体のFabをコードするDNAを、原核生物発現系または真核生物発現系用のベクターに挿入し、このベクターを原核生物または真核生物に導入し、Fabを発現させることによっても作製できる。
【００６９】
本発明の前記F(ab')2は、HVEMと特異的に反応する抗体を、プロテアーゼのペプシンで処理することによって得ることができる。さらにF(ab')2は、以下に記載のFab'を、チオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して結合することによって作製できる。前記Fab'は、HVEMと特異的に反応するF(ab')2を、還元剤のジチオスレイトールで処理することによって得ることができる。またFab'は、抗体のFab'断片をコードするDNAを、原核生物用の発現ベクターまたは真核生物用の発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物または真核生物に導入してその発現を達成することによっても作製できる。
【００７０】
前記scFv断片は、先に記載したように、VHおよびVLドメインをコードするcDNAを得、scFvをコードするDNAを構築し、このDNAを、原核生物のための発現ベクターまたは真核生物のための発現ベクターに挿入し、その後この発現ベクターを原核生物または真核生物に導入し、scFv発現させることによって作製できる。ヒト化scFv断片を作製するために、CDRグラフト化と呼ばれる周知の技術が使用でき、これは、ドナーのscFv断片から相補性決定領域(CDR)を選択するステップおよびそれらを公知の三次元構造のヒトscFv断片のフレームワークにグラフト化するステップを含む(例えば、国際公開番号W098/45322、国際公開番号WO87/02671、米国特許第5,859,205号、米国特許第5,585,089号、米国特許第4,816,567号、欧州特許第0173494号を参照されたい)。
【００７１】
特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、一価、二価、多価、単一特異性、二重特異性または多重特異性である。別の好ましい実施形態において、HVEMに対する抗体は結合断片またはコンジュゲートである。例えば、本発明の抗体は、成長阻害剤、細胞傷害性薬剤またはプロドラッグ活性化酵素とコンジュゲートできる。
【００７２】
本発明の抗体を、エフェクター機能に関して、例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害(CDC)を増強するように修飾することが望ましいこともある。これは、抗体のFc領域において、1つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって達成できる。その代わりにまたはそれに加えて、システイン残基をFc領域に導入でき、その結果この領域において、鎖と鎖の間にジスルフィド結合を形成できる。したがって、作製されたホモ二量体型抗体は、内面化能力の改善および/または補体媒介細胞死の増加および/または抗体依存性細胞傷害(ADCC)を有することができる(Caron PC.ら、1992年およびShopes B.1992年)。
【００７３】
本発明の抗体の別のタイプのアミノ酸修飾は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更するために有用であり得る。
【００７４】
「変更」は、この抗体中に見出される1つまたは複数の炭水化物部分を欠失すること、および/またはこの抗体には存在しない1つまたは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【００７５】
抗体のグリコシル化は、通常N結合である。「N結合」は、炭水化物部分の、アスパラギン残基の側鎖への結合を指す。トリペプチド配列の、アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-スレオニン(Xは、プロリン以外の任意のアミノ酸である)は、炭水化物部分の、アスパラギンの側鎖への酵素的結合に対する認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のどちらかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位となる。抗体に対するグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列の1つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を変更することにより都合よく達成される(N結合グリコシル化部位)。
【００７６】
別の型の共有結合修飾は、抗体にグリコシドを、化学的または酵素的にカップリングすることを含む。これらの手順は、N結合グリコシル化またはO結合グリコシル化についてグリコシル化能力を有する宿主細胞において、抗体の産生を必要としないので有利である。使用するカップリング様式に依存して、糖は、(a)アルギニンおよびヒスチジン、(b)遊離のカルボキシル基、(c)システインにあるような遊離のスルフヒドリル基、(d)セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンにあるような遊離のヒドロキシル基、(e)フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンにあるような芳香族残基、あるいは(f)グルタミンのアミド基、に結合できる。例えば、このような方法は、国際公開番号WO87/05330に記載されている。
【００７７】
抗体に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成できる。化学的脱グリコシル化は、抗体が、化合物のトリフルオロメタンスルホン酸または等価の化合物に曝されることが必要である。この処理により、結合糖(N-アセチルグルコサミンまたはN-アセチルガラクトサミン)以外の大部分またはすべての糖が、抗体は無傷のままで切断される。化学的脱グリコシル化は、Sojahr H.ら、(1987年)およびEdge, AS.ら、(1981年)により記載されている。抗体の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura, NR.ら、(1987年)により記載されたようにさまざまなエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用によって達成できる。
【００７８】
抗体の別の型の共有結合修飾は、米国特許第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号、または第4,179,337号に説明されるように、抗体を、さまざまな非タンパク質性ポリマーの1つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンに結合することを含む。
【００７９】
本発明のさらなる目的は、それを必要とする対象に、上で定義した治療有効量のHVEMのリガンドを投与することを含む、血液悪性腫瘍および自己免疫疾患の治療方法にも関する。
【００８０】
本発明の文脈において、本明細書で使用する場合、「治療すること(treating)または「治療(treatment)」という用語は、このような用語が用いられる障害または病態、あるいはこのような障害または病態の症状の1つまたは複数を、回復、緩和、進行の阻害または予防を意味する。
【００８１】
本発明によれば、「患者」または「それを必要とする患者」という用語は、血液悪性腫瘍または自己免疫疾患に冒された、または冒された可能性が高いヒトまたは非ヒトの哺乳動物を意図する。
【００８２】
本発明によれば、「治療有効量」のHVEMのリガンドは、任意の薬物療法に適用できる妥当な利益/危険比で、前記血液悪性腫瘍または自己免疫疾患を治療するために十分な量のHVEMのリガンドを意味する。しかし、HVEMのリガンドおよび本発明の組成物の1日の総使用量は、適切な医療的判断の範囲内で、主治医によって決定されることは理解されるであろう。任意の特定の患者に対する、特定の治療有効用量レベルは、治療する障害および障害の重症度、用いる特定のHVEMのリガンドの活性、用いる特定の組成物、患者の年齢、体重、全体的健康、性別および食生活、投与時間、投与経路および用いる特定の抗体の排出比、治療期間、用いる特定のポリペプチドと組み合わせて、または同時に使用する薬剤、ならびに当医療分野において周知の因子などを含む、さまざまな因子に依存するであろう。例えば、化合物の開始用量は、所望の効果が達成されるために必要な用量より少なく、所望の効果が達成されるまで、徐々に投与量を増やすことは当分野において周知である。
【００８３】
本発明によるHVEMのリガンドは、上記のように障害または病態を治療するための任意の他の治療戦略と組み合わせて使用できる(例えば、外部放射線治療、化学療法またはサイトカイン療法)。
【００８４】
医薬組成物
本発明のさらなる目的は、有効量のHVEMのリガンドを含む医薬組成物に関する。
【００８５】
上記のような本発明の任意の治療薬は、医薬として許容可能な賦形剤、および場合により生分解性ポリマーなどの除放性マトリックスと組み合わせて、治療組成物を形成できる。
【００８６】
「医薬として」または「医薬として許容可能な」は、哺乳動物、特にヒトに、必要に応じて投与した場合、拒絶反応、アレルギー反応または他の有害反応を起こさない分子的実体および組成物を指す。医薬として許容可能な担体または賦形剤は、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料あるいは任意の型の製剤補助剤を指す。
【００８７】
医薬組成物の形態、投与経路、投与量および投与計画は、治療する病態、病気の重篤、患者の年齢、体重、および性別などに当然依存する。
【００８８】
本発明の医薬組成物は、局所、経口、経鼻、眼球内、静脈内、筋肉内または皮下などの投与用に処方できる。
【００８９】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤のための医薬として許容可能な媒体を含む。これらは、特に、等張で、殺菌された生理食塩水溶液(リン酸一ナトリウムまたはリン酸二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウムの塩化物など、あるいはこのような塩の混合物)または乾燥、特に、場合により滅菌水または生理食塩水を加えて注射可能な溶液が構成できる凍結乾燥組成物であってよい。
【００９０】
投与に使用する用量は、さまざまなパラメーターの関数として、特に使用する投与方法、関連する病状またはその代わりに所望の治療期間の関数として適応できる。
【００９１】
医薬組成物を調製するために、HVEMのリガンドの有効量は、医薬として許容可能な担体または水性媒体に溶解または分散できる。
【００９２】
注射可能な使用に適した医薬形態は、滅菌水溶液または分散液、ゴマ油、ピーナッツ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤、滅菌注射溶液または分散液をその場で調製するための滅菌粉末を含む。すべての場合において、この形態は滅菌されなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動体でなければならない。この形態は、製造および保存条件のもとで安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から守られなければならない。
【００９３】
遊離の塩基または薬理学的に許容可能な塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水の中で調製できる。分散液もまたグリセロール、液体ポリエチレングリコール、それらの混合物中で、および油中で調製できる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製剤は、微生物の成長を防ぐための防腐剤を含む。
【００９４】
本発明のHVEMのリガンドは、中性型または塩の形態の組成物に処方できる。医薬として許容可能な塩は、酸付加塩(タンパク質の遊離のアミノ基とで形成する)を含み、それらは、例えば、塩酸またはリン酸などの無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とで形成される。遊離のカルボキシル基とで形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄の水酸化物などの無機塩基およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来し得る。
【００９５】
担体もまた、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)、それらの適切な混合物ならびに植物油を含む溶媒または分散媒体であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合、所要の粒径の維持および界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、などによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの、組成物における使用によってもたらされ得る。
【００９６】
滅菌注射溶液は、所要量の活性化合物を、上に列挙したさまざまな他の成分を必要に応じて含む適切な溶媒に組み込み、その後ろ過滅菌することで調製する。一般的に分散液は、さまざまな滅菌活性成分を、基本の分散媒体および上に列挙したものから所要の他の成分を含む滅菌媒体に組み込むことによって調製する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分+任意のさらなる所望の成分の粉末を、それらのあらかじめろ過滅菌した溶液から得る、真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００９７】
直接注射のための、よりまたは高度に濃縮された溶液もまた意図され、溶媒としてDMSOの使用が想定され、非常に早く浸透し、高濃度の活性薬剤が小型の腫瘍範囲に非常に早く送達される。
【００９８】
製剤においては、溶液は、剤形に合った様式で、治療的に有効な量で投与される。この製剤は、上記の注射用溶液型などのさまざまな剤形で容易に投与されるが、薬剤放出カプセルなども使用できる。
【００９９】
水溶液での非経口投与のために、例えば、溶液を適切に中和し、液体希釈剤に、まず十分な食塩水またはグルコースを用いて等張性を与えることができる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、本開示を考慮すると、使用可能な滅菌水性媒体が、当業者に公知であろう。例えば、1回用量を、1mlの等張NaCl  溶液に溶解し、1000mlの皮下注入流動体に加えるか、または注入予定部位に注射することができる(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁および1570〜1580頁を参照されたい)。投与量のいくらかの変更は、治療する対象の病態によって必然的に起こるであろう。投与の責任者は、いずれの事象においても、個人の対象にとって適切な用量を決定するであろう。
【０１００】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与用に処方された化合物に加えて、他の医薬として許容可能な形態は、例えば、錠剤または経口投与用の他の固体、持続放出カプセルおよび現在使用されている任意の他の形態を含む。
【０１０１】
本発明の組成物は、さらなる治療活性薬剤を含み得る。本発明はまた、上で定義したHVEMのリガンドおよびさらなる治療活性薬剤を含むキットに関する。
【０１０２】
一実施形態において、前記治療活性薬剤は抗癌剤である。例えば、前記抗癌剤は、限定するものではないが、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メトトレキサート、タクソール、タキソテール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシウレア、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンなどの白金錯体、マイトマイシン、ダカルバジン、プロカルビジン、エトポシド、テニポシド、カンプトセシン(campathecins)、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、L-アスパラギナーゼ、ドキソルビシン、エピムビシン(epimbicm)、5-フルオロウラシル、ドセタキセルおよびパクリタキセルなどのタキサン、ロイコボリン、レバミゾール、イリノテカン、エストラムスチン、エトポシド、ナイトロジェンマスタード、BCNU、カルムスチンおよびロムスチンなどのニトロソウレア、ビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド、イマチニブメシラート(imatimb mesylate)、ヘキサメチレンアミン(hexamethyhnelamine)、トポテカン、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、ATPase阻害剤、チロホスチン、プロテアーゼ阻害剤、阻害剤ハービマイシンA、ゲニステイン、エルブスタチンおよびラベンダスチンAを含む。
【０１０３】
一実施形態において、さらなる抗癌剤は、限定するものではないが、以下のクラスの薬剤の1つまたは組み合わせから選択できる:アルキル化剤、植物性アルカロイド、DNAトポイソメラーゼ阻害剤、抗葉酸、ピリミジン類似体、プリン類似体、DNA代謝拮抗剤、タキサン、ポドフィロトキシン、ホルモン療法、レチノイド、光線感作物質または光線力学療法、血管形成阻害剤、抗有糸分裂剤、イソプレニル化阻害剤、細胞周期阻害剤、アクチノマイシン、ブレオマイシン、アントラサイクリン、MDR阻害剤およびCa2+ ATPase阻害剤。
【０１０４】
さらなる抗癌剤を、限定するものではないが、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、成長阻害因子、ホルモン、可溶性受容体、デコイ受容体、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体、モノ体(monobodies)、ポリ体(polybodies)から選択できる。
【０１０５】
さらなる抗癌剤を、限定するものではないが、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンなどの成長因子または造血因子ならびにそれらの成長因子模倣体から選択できる。
【０１０６】
癌治療のための本方法において、さらなる治療活性薬剤は、抗嘔吐薬であり得る。適切な抗嘔吐薬は、限定するものではないが、メトクロプロミド、ドンペリドン、プロクロルペラジン、プロメタジン、クロルプロマジン、トリメトベンズアミド、オンダンセトロン、グラニセトロン、ヒドロキシジン、アセチルロイシンモノエタノールアミン、アリザプリド、アザセトロン、ベンズキナミド、ビエタナウチン(bietanautine)、ブロモプリド、ブクリジン、クレボプリド、シクリジン、ジメンヒドリナート、ジフェニドール、ドラセトロン、メクリジン、メタラタール(methallatal)、メトピマジン、ナビロン、オキシペミジル(oxypemdyl)、ピパマジン(pipamazine)、スコポラミン、スルピリド、テトラヒドロカンナビノール、チエチルペラジン、チオプロペラジンおよびトロピセトロンを含む。好ましい実施形態において、抗嘔吐薬は、グラニセトロンまたはオンダンセトロンである。
【０１０７】
別の実施形態において、さらなる治療活性薬剤は造血コロニー刺激因子であり得る。適切な造血コロニー刺激因子は、限定するものではないが、フィルグラスチム、サルグラモスチム、モルグラモスチムおよびエポエチンαを含む。
【０１０８】
さらに別の実施形態において、他の治療活性薬剤は、オピオイドまたは非オピオイド鎮痛薬であり得る。適切なオピオイド鎮痛薬は、限定するものではないが、モルヒネ、ヘロイン、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、オキシモルフォン、オキシコドン、メトポン、アポモルフィン、ノミオイフィン(nomioiphine)、エトイプビン(etoipbine)、ブプレノルフィン、メペリジン、ロペラミド(lopermide)、アニレジン(anileddine)、エトヘプタジン、ピミニジン、ベタプロジン、ジフェノキシレート、フェンタニル、スフェンタニル、アルフェンタニル、レミフェンタニル、レボルファノール、デキストロメトルファン、フェナゾシン、ペンタゾシン、シクラゾシン、メタドン、イソメタドンおよびプロポキシフェンを含む。適切な非オピオイド鎮痛薬は、限定するものではないが、アスピリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ジクロフェナク、ジフルシナル(diflusinal)、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、インドメタシン、ケトロラク、メクロフェナメート、メフェナム酸、ナブメトン、ナプロキセン、ピロキシカムおよびスリンダクを含む。
【０１０９】
さらに別の実施形態において、さらなる治療活性薬剤は、抗不安薬であり得る。適切な抗不安薬は、限定するものではないが、ブスピロンおよびジアゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、クロラゼプ酸、クロナゼパム、クロルジアゼポキシドおよびアルプラゾラムなどのベンゾジアゼピンを含む。
【０１１０】
スクリーニング方法
慢性リンパ球性白血病B細胞においてアポトーシスを誘導するLIGHTの断片、HVEMを発現する悪性リンパ球、特に慢性リンパ球性白血病B細胞に結合し、アポトーシスを誘導する抗HVEM抗体またはその断片を、当分野において周知の任意のスクリーニング方法により選択できる。
【０１１１】
例えば、HVEMを発現する悪性リンパ球、特に慢性リンパ球性白血病B細胞においてアポトーシスを誘導するHVEMのリガンドをインビトロでスクリーニングする方法は、
(a) LIGHTの断片、抗HVEM抗体またはその断片を、HVEMを発現する悪性リンパ球、例えば慢性リンパ球性白血病B細胞に加えるステップと、
(b)細胞のアポトーシスを誘導する断片または抗体を選択するステップと
を含み得る。
LIGHTの断片または抗HVEM抗体の、慢性リンパ球性白血病B細胞においてアポトーシスを誘導する能力は、実験の項に開示されたように、または当業者に公知の任意の他の方法によって測定できる。
【０１１２】
本発明を、以下の実施例、図面および表を介してさらに例示する。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１Ａは、造血悪性腫瘍におけるHVEMおよびLTβRの発現を示す図である。慢性リンパ球性白血病(CLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)および急性骨髄性白血病(AML)におけるHVEMおよびLTβRの表面発現を、フローサイトメトリーにより観察した。9例のCLL患者の2例、2例のMCL患者の1例および2例のAML患者の1例を表す。オープンヒストグラムは、無関係の特異性のアイソタイプ一致対照mAbを用いて染色した細胞の蛍光を表す。塗りつぶしたヒストグラムは、特異的HVEM-FITCまたはLTβR-PEコンジュゲートmAbを用いた染色を表す。図１Ｂは、造血悪性腫瘍におけるHVEMおよびLTβRの発現を示す図である。バーは、9例のB-CLL患者に実施したHVEMおよびLTβRに対する陽性細胞の平均パーセンテージ(アイソタイプ一致対照に相当するバックグラウンドを差し引いた後)を表す。エラーバーは、平均の標準誤差(SEM)を示す。
【図２】QRT-PCRにより検査した322の遺伝子の中の、HVEMによる刺激の後でB-CLL細胞に有意に誘導された遺伝子を示す図である。  抗HVEM mAbで24時間処理した、または処理しなかったB-CLL細胞において、QRT-PCRによりRNAを定量化した。RNAの発現をβアクチンを内在性対照として使用して標準化し、ΔCt値を、ΔCt=Ct標的-Ct内在性対照を用いて計算した。サイトカインの放出は、抗HVEM mAbで24時間処理した、または処理しなかったB-CLL細胞の上清において、CBAまたはElisa(材料および方法に記載)によって確定した。HVEM mAb処理した状態と未処理との状態との有意な差異を、Wilcoxonの符号順位検定(片側)で試験し、p値をこの表に示した(nは患者の数、nsは有意差なし、ntは未試験を表す)。
【図３Ａ】図３Ａは、LIGHTおよびHVEM mAbがB-CLL細胞の死を誘導することを示す図である。B-CLL細胞を、CD32-細胞(対照)またはLIGHT形質移入L細胞と、10白血病細胞に対して1形質転換体の比でインキュベートした。インキュベートの24時間後、細胞を、材料および方法に記載したように、アネキシンV/PI二重染色で、フローサイトメトリーにより分析した:死細胞はアネキシンV+/PI-(早期アポトーシス)細胞およびアネキシンV+/PI+(後期アポトーシス/ネクローシス)細胞を含む。この図は、15回実施したうちの代表的な実験を示す。図３Ｂは、LIGHTおよびHVEM mAbがB-CLL細胞の死を誘導することを示す図である。B-CLL細胞を、CD32-(対照)またはLIGHT形質移入L細胞と共にインキュベートし、あるいは、30μg/mlの抗HVEM mAbまたは10μg/mlの治療的抗CD20(リツキシマブ)mAbで処理し、アネキシンV/PI染色によって分析した。バーは、観察された死細胞の平均パーセンテージ±SEMを表し、HVEM mAbに関してはn=25、LIGHT形質移入細胞に関してはn=15およびリツキシマブに関してはn=5であった。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
【図３Ｂ】図３Ｃは、LIGHTおよびHVEM mAbがB-CLL細胞の死を誘導することを示す図である。HVEMリガンドの効果を、HVEM mAb刺激と比較した。B-CLL細胞を、CD32-(対照)、CD40L-、LIGHT-、CD40L/LIGHT-、GpDまたはBTLA-形質移入L細胞と共に、24時間共培養し、アネキシンV/PI染色によって分析した。HVEM mAbを使用して達成した細胞死のレベルに対して、HVEMリガンドを形質移入したL細胞によるB-CLL細胞死滅のレベルと比較するために、100%値を使用した。CD40L-L細胞を、陰性対照として使用した。誘導されたアポトーシスを、6例の異なる患者に関して、(形質移入細胞によって誘導されたアポトーシスのパーセント÷HVEM mAbのアポトーシスのパーセント×100)±SEMとして相対的に計算した。*p<0.05。
【図４Ａ】図４Ａは、HVEM mAbが、カスパーゼ-3、8および9の活性化を誘導することを示した図である。B-CLL細胞を、20uMの汎カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKで37℃において30分間予備処理し、または処理せず、その後、未処理のまま放置、または抗HVEM mAbで刺激のいずれかを行った。インキュベーションの24時間後、細胞を回収し、透過処理し、活性カスパーゼ3に関して染色した。平行して、細胞をアネキシンV/PI二重染色で、分析した。データは、7つの独立した実験で観察された、活性カスパーゼ-3に関して陽性の細胞の平均パーセンテージ±SEM(左)および死細胞の平均パーセンテージ±SEM(右)を表す。*p<0.05、**p<0.01。図４Ｂは、HVEM mAbが、カスパーゼ-3、8および9の活性化を誘導することを示した図である。2例の異なる患者由来のB-CLL細胞について、未処理のまま放置、または抗HVEM mAbで刺激のいずれを行った。インキュベーションの24時間後、細胞を回収し、溶解物を調製した。このような試料から調製した免疫ブロット膜を、各免疫ブロットの左に示したように、切断されたカスパーゼ-3またはβ-アクチン(タンパク質負荷の対照)に関して解析した。未刺激の、または抗Fas mAb CH11で処理したジャーカット細胞を、陽性対照として使用した。19および17kDaのバンドに関する、刺激状態対未刺激状態の割合は、それぞれJA16(1.35-++)、UPN10(0.76-1.57)およびUPN11(1.2-1.73)である。
【図４Ｂ】図４Ｃは、HVEM mAbが、カスパーゼ-3、8および9の活性化を誘導することを示した図である。B-CLL細胞について、未処理のまま放置、または抗HVEM mAbで24時間刺激のいずれかを行った。その後、細胞を、特異的カスパーゼ-8または9の蛍光阻害剤と共に、表示の時点で37℃において1時間インキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。データは、6例の異なる患者に関して観察された、活性カスパーゼ-8または9に関して陽性の細胞の平均パーセンテージ(未処理状態に相当するバックグラウンドを差し引いた後)±SEMを表す。
【図５】図５Ａは、HVEM mAbが、ミトコンドリア膜電位を乱し、Bax発現を増加させたことを示す図である。B-CLL細胞を、汎カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKで37℃において30分間予備処理し、または処理せず、その後、未処理のまま放置、または抗HVEM mAbで刺激のいずれかを行った。インキュベーションの24時間後、細胞を回収し、50nMのDiOC2(3)と共に、37℃で30分間インキュベートし、ミトコンドリア膜電位の損失(ΔΨm)を、フローサイトメトリーにより分析した。データは、6例の異なる患者に関する、DiOC2(3)緑色蛍光に関して陽性の細胞の平均パーセンテージ±SEMを表し、対照状態のDiOC2(3)緑色蛍光の%を100%と設定した。*p<0.05。陽性対照は、脱分極剤のCCCPであった(4±1%DiOC2(3)陽性細胞、データ非掲載)。図５Ｂは、HVEM mAbが、ミトコンドリア膜電位を乱し、Bax発現を増加させたことを示す図である。B-CLL細胞について、未処理のまま放置、または抗HVEM mAbで刺激のいずれかを行った。インキュベーションの24時間後、細胞を回収し、透過処理し、抗Baxまたは抗Bcl-2モノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。結果を、6例の異なる患者に関して観察された、陽性細胞の平均パーセンテージ(アイソタイプ一致対照に相当するバックグラウンドを差し引いた後)±SEMとしてここに表した。*p<0.05。
【図６Ａ】図６Ａは、HVEM細胞の死によりFADDの発現が増加し、部分的にTRAIL経路に依存することを示す図である。2例の異なる患者に由来するB-CLL細胞について、未処理のまま放置、または抗HVEM mAbで刺激のいずれかを行った。インキュベーションの24時間後、細胞を回収し、タンパク質溶解物を調製した。このような試料から調製された免疫ブロット膜を、各免疫ブロットの左に示したように、FADDまたはβアクチン(タンパク質負荷の対照)に関して解析した。TFl赤白血病細胞系を、陽性対照として使用した。27kDaのバンドに関する、刺激状態対未刺激状態の割合は、それぞれUPN10が2.39およびUPN11が5である。図６Ｂは、HVEM細胞の死によりFADDの発現が増加し、部分的にTRAIL経路に依存することを示す図である。Cos細胞を、FasLまたはTRAILにより、24時間一次的に形質移入し、その後、HVEM mAbの存在下または不在下で24時間B-CLL細胞を加えた。その後細胞を回収し、アネキシンV/PIで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。データは、3例の異なる患者に関して、((処理細胞のアポトーシスのパーセント-未処理細胞のアポトーシスのパーセント)÷未処理細胞のアポトーシスのパーセント×100)のように計算した誘導倍数として表した。
【図６Ｂ】図６Ｃは、HVEM細胞の死によりFADDの発現が増加し、部分的にTRAIL経路に依存することを示す図である。B-CLL細胞について、100ng/mlのブロッキング抗TRAlL mAb RIK-2の存在下または不在下で、24時間、未処理のまま放置、または抗HVEM mAbで刺激のいずれかを行った。その後、細胞をアネキシンV/PI二重染色し、フローサイトメトリーにより分析した。データは、8例の異なる患者に関する、細胞死の平均パーセンテージ±SEMで表し、HVEM mAb状態で誘導された細胞死を100%に設定した。ブロッキング状態で誘導された細胞死を、その後、(ブロッキング状態のアポトーシスのパーセント÷HVEM mAbのアポトーシスのパーセント×100)のように相対的に計算した。**p<0.01。
【図６Ｃ】図６Ｄは、HVEM細胞の死によりFADDの発現が増加し、部分的にTRAIL経路に依存することを示す図である。
【図７】HVEM mAbおよびLIGHTの作用機序の概略を示す図である。
【図８】さまざまな細胞型におけるHVEM発現のフローサイトメトリー分析を示す図である。
【図９】HVEMにより誘発される細胞死に対する、正常B細胞の感受性の分析を示す図である。
【０１１４】
表：
表1:HVEM mAbの刺激によってCLLにおいて上方制御されたケモカイン、サイトカインおよび受容体遺伝子
B-CLL細胞について、RNAの抽出前に、未処理のまま放置、または抗HVEM mAbで刺激のいずれかを行った。RNA含有量を、材料および方法の項に記載のように、qRT-PCRにより評価した。RNAの発現は1.5を超えた場合に陽性であると考えられる。実験は、4種の異なるB-CLL試料において実施した。
【０１１５】
【表１】
2011521887.tif 000002
【０１１６】
総数180のサイトカイン、ケモカイン、受容体および接着遺伝子を分析し、βアクチンを、cDNA濃度の標準化に使用した。
【０１１７】
表2: HVEM mAbクローンの特徴付けの概要
14種のmAbのクローンを、多くの方法で特徴付けした。このリストは、3種のmAbクローンに関してもたらされたデータのサブセットの概要を表す。この表のデータは、マウス重鎖のIgアイソタイプ、軽鎖の型、フローサイトメトリーによるHVEMに対する50%の結合飽和を表すEC50値、エピトープクラスタおよびmAbがCLL細胞においてアポトーシスを誘導する能力を含む。mAbのこのパネルに関するエピトープは、HVEM突然変異体を用いた結合試験およびLIGHT、BTLAおよびHSV-gDを用いた競合試験により決定した5つのうちの3つを表す。
【０１１８】
【表２】
2011521887.tif 000003
【０１１９】
【表３】
2011521887.tif 000004
【０１２０】
【表４】
2011521887.tif 000005
【０１２１】
［実施例］
(実施例1)
LIGHTおよび抗HVEM抗体は、慢性リンパ球性白血病B細胞のアポトーシスおよびHVEMとの相互作用を介したケモカインの放出の両方を誘導する
【０１２２】
要約
リンパ性悪性疾患の網羅的転写プロフィールにおけるLIGHTの効果を研究することによって、本発明者らは、HVEMの刺激により、IL-8などのケモカイン遺伝子の有意な増加およびアポトーシス遺伝子の予期せぬ上方制御を誘導するが、LTβRの刺激は誘導しないことを発見した。今までのところT-およびB-細胞活性化を共刺激することが知られる、LIGHTまたは抗HVEM mAbは、慢性リンパ球性白血病(CLL)の細胞死を明らかに誘導したのでこのアポトーシスの転写プロフィールは死滅効果と関連があった。この細胞死は、ミトコンドリア膜電位を低下させ、アポトーシス促進タンパク質Baxを上方制御する、カスパーゼ3、8および9の活性化と関係があった。さらに、HVEM刺激は、死分子のTRAILおよびFasの上方制御を誘導し、HVEM仲介アポトーシス機序はTRAIL経路の一部に依存しているように思われる。HVEM刺激は、B細胞-CLL細胞両方のアポトーシスを誘導し、白血病細胞による直接ケモカイン産生を介して免疫エフェクターの動員に関与し得た。HVEMの機能は、gD HSVlおよびBTLAなどの他のリガンドが大抵の場合効果がなかったので、主にそのリガンドの1つであるLIGHTに依存した。結論としてこれらの結果は、ケモカインの放出と併せた、リンパ性悪性疾患における、HVEMを介したLIGHTまたは抗HVEM抗体の、新規な、今のところ未知の死滅効果を示し、それは癌の免疫療法のためのさらなるツールを意味する。
【０１２３】
材料および方法
細胞
本研究は、Institut Paoli-Calmettes、マルセイユ、フランスの審査委員会によって承認された。ヘルシンキ宣言に従ったインフォームドコンセントの後で、末梢血試料を、臨床基準および免疫表現型の基準に基づき、慢性リンパ球性白血病(CLL)と診断された、未治療の患者から得た。単核細胞を、密度勾配遠心分離(Lymphoprep)により単離し、10%のジメチルスルホキシド(SIGMA)を含むウシ胎児血清(PAN Biotech)中で、生存可能に凍結した。
【０１２４】
安定形質移入細胞L-CD40L、L-LIGHT、L-CD40L/LIGHT、L-GpDおよびL-BTLAを、LTKネズミの線維芽細胞に、それぞれ、ヒトCD40L、LIGHT、GpDまたはBTLAをコードするpcDNA3.1ベクター(Invitrogen、Groningen、オランダ)を、エレクトロポレーション(960μF、220V、BIO RAD Gene PulserおよびCapacitance extender)によって形質移入することによって得た。抗生物質に対する耐性によって選択された安定形質移入細胞を、3回のFACSソーティングによって選択した。対象となる分子の発現を、フィコエリトリンコンンジュゲートモノクローナル抗体(mAb)(R&D Systems)を使用して、フローサイトメトリーによって評価した。CD32形質移入線維芽細胞は、Schering-Plough(Dardilly、フランス)のご厚意により提供された。一時形質移入のCos-FasL細胞およびCos-TRAIL細胞を、サルの腎臓のCos細胞系に、それぞれ形質移入することによって作製した。
【０１２５】
B-CLL細胞と、形質移入L細胞または抗体との共培養
B-CLL細胞を、50グレイを照射した、ヒトLIGHT、CD40L、GpDまたはBTLAを形質移入したL細胞と、10B-CLL細胞に対して1形質転換体の割合で、24時間共培養した。細胞を、30μg/mlの抗HVEMモノクローナル抗体(mAb)または10μg/mlの治療抗体リツキシマブで、24ウェルプレートにおいて24時間さらに処理した。いくつかの実験において、B-CLL細胞は、まず20μMの汎カスパーゼ阻害剤のN-カルボベンゾキシ-Val-Ala-Aspフルオロメチルケトン(Z-VAD-FMK)(BD Biosciences)またはブロッキング抗TRAIL mAb RIK-2(BD Biosciences)と共にプレインキュベートした。その後、細胞を回収し、生存率を調べ、使用前に新鮮な培地に再懸濁した。
【０１２６】
細胞表面抗原の免疫蛍光分析
B-CLL細胞の細胞表面分析を、フローサイトメトリーを介して、FACSCantoサイトメーターおよびFACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson、Mountain View、CA)を使用して実施した。B-CLL細胞を、4℃で30分間、以下のmAb:フルオレセインイソチオシアネート(FlTC)コンンジュゲート抗CD19(Beckman Coulter)、FITCコンンジュゲート抗HVEM(BD Biosciences)、フィコエリトリン(PE)コンンジュゲート抗LTβR(R&D)、FITCコンンジュゲート抗Fas(CD95)(Beckman Coulter)、PEコンンジュゲート抗TRAIL(BD Biosciences)、PEコンンジュゲート抗FasL(Biolegend)、PEコンンジュゲート抗DR4またはPEコンンジュゲート抗DR5(R&D)を用いて免疫染色した。FITCまたはPEの標識アイソタイプ一致Igを、陰性対照として使用した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)+2%FCSで2回洗浄後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
【０１２７】
アネキシンV/PI染色
刺激後、細胞死をアネキシンV-Cy5(BD Biosciences)およびヨウ化プロピジウム(PI)二重染色(BD Biosciences)により分析した。アネキシンVは、アポトーシスを起こした細胞表面に露出されるリン脂質のホスファチジルセリンに特異的に結合する。PIとの二重染色により、膜完全性をまだ失っていない早期アポトーシス細胞の特定が可能になる。簡潔に言うと、5×105細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1%FCSで1度洗浄し、5μlアネキシンV-Cy5を含む100μlの1×結合バッファー(BD Biosciences)に、室温で10分間、暗所において再懸濁した。その後、200μlの1×結合バッファーおよび3.5μlのPIを加え、細胞を、室温で5分間、暗所においてインキュベートした。その後、細胞を、FACSCantoサイトメーター(Becton-Dickinson)で分析した。データ分析は、FACSDivaソフトウェア(Becton-Dickinson)を用いて実施した。死細胞を、アネキシンVおよびPI二重陽性細胞のパーセンテージとして測定した。
【０１２８】
カスパーゼの測定、フローサイトメトリーによるBaxおよびBcl-2の活性化
カスパーゼ8およびカスパーゼ9の活性を、以下の細胞透過性蛍光コンンジュゲート化カスパーゼ阻害剤:FAM-LETD-FMK(カスパーゼ-8阻害剤)およびFAM-LEHD-FMK(カスパーゼ-9阻害剤)(CaspGLOW kits、Biovision)を使用して、さまざまな時間において測定した。細胞を、37℃において1時間、暗所において染色し、その後洗浄し、0.5mLのバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリーにより、FACSCantoサイトメーター(Becton-Dickinson)ですぐに分析した。
【０１２９】
活性化細胞内カスパーゼ3、Bcl-2およびBaxを検出するために、細胞を、cytofix/cytopermバッファー(BD Biosciences)を使用して透過性処理し、PEコンンジュゲートした、抗活性カスパーゼ3モノクローナル抗体(BD Biosciences)、抗Baxモノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)または抗Bcl2モノクローナル抗体(BD Biosciences)で染色し、その後フローサイトメトリーにより分析した。
【０１３０】
ミトコンドリア膜電位(ΔΨm)の測定
ミトコンドリア膜電位の変化を、カチオン性シアニン染料のDiOC2(3)を用いて測定した。刺激後、B-CLL細胞を洗浄し、1mlのPBSに再懸濁し、5μlの10μM DiOC2(3)(Molecular Probes)溶液を補い、37℃において30分間、暗所においてインキュベートした。細胞を、再度洗浄し、500μlのPBSに再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。DiOC2(3)の蛍光は、細胞がアポトーシスを起こした場合に減少する。陽性対照はCCCPであった。
【０１３１】
サイトカインおよびケモカインの産生
上清を、刺激後24時間で回収した。サイトカインを、Cytometric Bead Array (CBA) Human Chemokineキット(BD Biosciences)(同じ試料中のいくつかのサイトカイン(IL-8/CXCL8、RANTES/CCL5、MIG/CXCL9、MCP-1/CCL2、IP-1O/CXCL 1O)の定量的検出を可能にする多重免疫学的試験)を使用して、製造業者による記載のように測定した。IL-8もまた、酵素免疫測定法を使用して、製造業者記載のプロトコルに従って、感度3.5pg/ml(R&D systems)で定量化した。
【０１３２】
ウェスタンブロット分析
CLL患者由来のB細胞(107細胞/試料)を、抗HVEM mAbsと共に、または抗HVEM mAbsを含まずに24時間インキュベートした。細胞溶解物を調製するために、細胞を、250gで10分間、4℃において遠心分離器にかけることによって回収し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1度洗浄し、その後、NP-40溶解バッファー(50mMのHEPES(pH7.4)、150mMのNaCl、10mMのNaF、10mMのヨードアセトアミド、1%のNP-40、1mMのフッ化フェニルメチルスルホニル、1μg/mlのプロテアーゼ阻害剤カクテル)中で、氷上で15分間溶解した。溶解物を、21 000gで4℃において10分間遠心分離器にかけることによって、不溶性の残骸を取り除き、上清を-20℃で保存した。変性状態でSDS-PAGE分離後、タンパク質を、5%ミルクを含むトリス緩衝食塩水(TBS)を用いて4℃において一晩ブロックしたニトロセルロース膜に転写し、その後抗切断カスパーゼ3(Cell Signaling)または抗FADD(本発明者らの研究室で作製)抗体を用いて染色した。このバンドを、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンンジュゲート抗マウスまたは抗ウサギIgGおよびウェスタンブロット化学発光試薬(West Pico、Pierce)を用いて視覚化した。βアクチンの発現を、同じブロットで、2%SDSを含むバッファーを用いて、60℃、30分間ストリップした後で測定した。各バンドをスキャン(Powerlook 1000、Umax)し、Phoretix 1D Advancedソフトウェア(Nonlinear Dynamics)を使用して定量化した。データをその後、βアクチンで標準化された刺激状態の値を、βアクチンで標準化された未刺激の細胞に関して測定した値で割ることによって得た倍数変化比に転換した。
【０１３３】
定量的RT-PCR
RNAの単離の前に、すべての細胞をHVEM mAbにより死滅させることができるかどうかについて選択した。QRT-PCR分析を、Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR系を用いて実施した。簡潔に言うと、全RNAを、B-CLL細胞から、標準的TRIzol試薬プロトコル(Invitrogen Life Technologies)を使用して、刺激1日後に単離した。RNAを、オリゴ(dT)15を使用して逆転写した。その後、以下の2つの支持体を使用した。第1の方法において、それぞれ接着性遊走サイトカインをコードする87の遺伝子標的またはアポトーシス分子を光学プレート(Microamp Fast Optical 96ウェル、Applied Biosystems)にスポットした。QRT-PCRを、2×SYBR Green試薬、200nMのプライマーおよび0.5μlのcDNA(総RNAの10ngと同等)を含む20μl反応液で各ウェルにおいて実施した。温度サイクル条件は、95℃15秒、60℃60秒を40サイクルであった。第2の方法において、それぞれ免疫分子をコードする96の遺伝子標的をTaqMan low-density array(Immune Panel Microfluidic Card、Applied Biosystems)にスポットした。簡潔に言うと、5ulのcDNA(総RNAの100ngに相当する)を、100μlの2×TaqMan universal Mix (Applied Biosystems)と混合し、1つのサンプルポートに載せた。温度サイクル条件は、97℃30秒、59.7℃60秒、を40サイクルであった。蛍光の収集は、ABI Prism 7900HTスキャナーに記録し、Ct(閾値サイクル数)を各アッセイに関してSequence Detection System Software 2.1(Applied Biosystems)を使用して計算した。定量的PCRアッセイの標準化を、βアクチンを内在性対照として使用して実施した。その後、データは、式:2-ΔΔCt、式中、ΔCt=Ct標的-Ct内在性対照およびΔΔCt=ΔCt刺激状態-ΔCt未刺激状態で表される倍数変化比に転換した。
【０１３４】
統計分析
結果を、ノンパラメトリックWilcoxon符号順位検定により比較し、HVEM mAb処理状態と未処理状態との間の任意の統計的有意差を評価した。差異は、p<0.05の場合、有意と考えられた。P値は、図面の説明文に示した。
【０１３５】
結果
造血器悪性腫瘍のHVEMおよびLTβRの発現
造血器悪性腫瘍におけるLIGHTの役割を調査するために、その2つの受容体であるHVEMおよびLTβRの発現レベルを明確にすることが重要である。本発明者らの研究室における、Costello RT and alによる先の結果は、HVEMが多くのリンパ性悪性腫瘍、特にB起源の白血病において発現し、検査したすべての慢性リンパ球性白血病(CLL)およびすべてのマントル細胞リンパ腫(MCL)で悪性度が高く、急性リンパ芽細胞性白血病(ALL)においてたびたび観察されたことを示した。図１Ａに示したように、本発明者らは、HVEMが、検査した9例のCLLおよび2例のMCLにおいて強く発現したが、一方HVEMの発現は、骨髄起源の2例の白血病(急性骨髄性白血病、AML)において弱いことを確認した。際だって対照的に、LTβRはAMLにおいて発現するが、MCLでは発現せず、CLLにおいては非常に稀または少ない。図１Ｂに見られるように、検査した9例のCLLにおいて、HVEMは一様に高レベルで発現したが、LTβRは弱いか発現しないかのどちらかであった。
【０１３６】
HVEM刺激は、検査した322の遺伝子の中で、12のケモカイン遺伝子およびアポトーシス遺伝子の過剰発現を誘導する
したがってB-CLLは、HVEMが優勢に発現し、LTβRが弱く発現するまたは発現しない研究モデルであった。したがって、このリンパ球性悪性腫瘍におけるLIGHTの効果を調査するために、本発明者らは、B-CLL細胞を、抗HVEMモノクローナル抗体(HVEM mAb)で24時間刺激した。RNAの調製後、本発明者らは、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカインおよび接着、遊走またはアポトーシスとしての細胞の本質的な機序に関与する分子をコードする、322の遺伝子の発現のリアルタイム定量的PCR網羅的解析を実施した。図２に見られるように、試験したこれらの322の遺伝子の中で、本発明者らの結果は、21の遺伝子が試験したCLL患者において全く発現せず、80の遺伝子は弱く検出され、211の遺伝子は正しい転写レベルで発現したことを示した。すべてのこれらの遺伝子は、HVEM刺激によって修飾されていなかった。実際に、試験した322の遺伝子の中で、わずか12がHVEM刺激の後で有意に過剰発現し、B-CLL細胞におけるLIGHTの転写プロフィールの注目すべきことを示唆している。HVEM刺激は、それぞれ免疫エフェクターの動員にとって重要であるケモカイン:IL-8(インターロイキン8)、IP10(IFN誘導タンパク質10)およびCCR4(ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体4)をコードする3つの遺伝子の発現を上方制御した。HVEM刺激後のこれらの遺伝子の増加は、Wilcoxon符号順位検定により統計的に有意であった(p値<0.01)。この炎症反応促進プロフィールは、HVEM-LIGHTのシグナル伝達が、単球細胞系におけるIL-8およびTNF-αの産生とすでに関係しているので、驚くべきことではなかった。完了させるために、本発明者らは、この転写効果が、タンパク質レベルにおけるケモカインの放出に関与するかどうかをさらに分析した。本発明者らは、刺激を受けたB-CLL細胞におけるケモカインの産生を、サイトメトリックビーズアレイまたはElisaにより測定し、本発明者らは、HVEMが12例の異なる患者において3から10倍のケモカインIL-8(p<0.001)および9例の患者においてRantes(Regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted)(p<0.01)の両方の非常に有意な放出を誘導することを示した。IP1Oの放出の有意な増加は観察されなかった。驚くべきことに、HVEM刺激後に有意に誘導された9の他の遺伝子は、すべてアポトーシスタンパク質をコードする遺伝子に対応し、その大部分がアポトーシス促進性:Bcl-XS、Bid、FasL、(p<0.01);BNIP3、CARDl 1、シトクロムc、p53(p<0.05)であり、他のいくつかは、抗アポトーシスサブグループ:BIRC4およびIEX-I(p<0.05)に属していた。LIGHTがインビトロで腺癌のアポトーシスを誘導することはすでに記載したが、それはLTβRとの相互作用によるもので、このアポトーシス促進効果はIFN-γの存在を必要とした。
【０１３７】
LIGHTおよび抗HVEM mAbは、B-CLL細胞の死を誘導する
本発明者らは、このアポトーシス転写プロフィールがインビトロで機能と相関したかどうかの確定を探求した。まず、B-CLL細胞を、CD32-またはLIGHT-形質移入L細胞と、24時間共培養し、その後アポトーシス細胞のパーセンテージを、アネキシンV/PI二重染色により測定した。アポトーシス細胞は、アネキシンV+/PI-(早期アポトーシス)およびアネキシンV+/PI+(後期アポトーシス/ネクローシス)集団を含む。本発明者らは、LIGHTによる刺激は、この代表的実験においてCD32対照状態(自然発生細胞死)の8%と比較してB-CLL細胞の41%の細胞死を効果的に誘導することを見出した(図３Ａ)。これらの結果は、15例のB-CLL試料において再生された。その後、本発明者らは、白血病細胞をHVEM mAbで24時間刺激した。本発明者らは、この抗体が、HVEMとそのリガンドであるLIGHTとの相互作用をブロックすることを先に示している(データ非掲載)。図３Ｂは、LIGHTおよび抗HVEM mAbの両方が、それぞれ42±3%および52±3%の死細胞でCLL細胞の死を誘導でき、CD32対照状態の22±2%と比較して高度に統計的に有意な(p<0.001)、1.9倍および2.4倍の増加に相当することを示す。したがって、CLLを誘発する、LIGHTまたはHVEMにより引き起こされるアポトーシス転写プロフィールは、インビトロの死誘導機能に相関する。LIGHTのアポトーシス促進効果は、腺癌においてLTβRにより仲介されることを記載したが、本発明者らの研究においては、この効果は「共刺激」分子のHVEMによるものである。HVEMの役割は、他のLTβRリガンドであるrhLTα1β2がCLL細胞死を誘導できないことによってさらに推測された。HVEMの関連のさらなる裏付けとなる証拠として、LTβRを発現しないB-CLL細胞は、それでもやはり抗HVEM mAbによって死滅した(図１Ａ)。さらに、LTβRの発現に関してはやはり陰性である別のB細胞リンパ節症のMCLは、LIGHTを用いた処理によって死滅した(データ非掲載)。注目すべきは、LIGHTまたは抗HVEM mAb誘導性CLL細胞死は、IFN-γを用いた細胞のプライミングを必要としないことである(データ非掲載)。
【０１３８】
CLLの患者のための実際の治療選択肢は比較的限られており、化学療法、同種幹細胞移植またはモノクローナル抗体を用いた受動免疫療法に相当する。抗HVEM mAbおよびリツキシマブを、CLL細胞死の誘導におけるそれらの有効性に関して比較した(図３Ｂ)。HVEM誘導性CLL細胞死は、汎B細胞治療mAbのリツキシマブ誘導性CLL細胞死と比較して遜色がなく、それぞれの死細胞は52±3%および46.2±6%であった。
【０１３９】
さらに、HVEMのいくつかのリガンドが、LIGHTだけでなくgpDおよびBTLAが近年同定された。本発明者らは、HVEM mAbの有効性に対するさまざまなHVEMのリガンドの効果を比較し、B-CLL細胞を、CD32-、LIGHT-、GpD-、またはBTLA-形質移入L細胞と共に24時間共培養し、その後アポトーシス細胞のパーセンテージを、アネキシンV/PI二重染色によって測定した。CD40L-形質移入L細胞を、「非リガンド」陰性対照として使用した。HVEM mAbによる細胞死を100%に設定した。図３Ｃに見られるように、L-LIGHT細胞は、HVEM mAbと比較してより近いより有意な効果を有し(70±15%、p<0.05)、L-GpD細胞は弱い効果を有し(HVEM mAbの41±6%、p<0.05)、L-BTLA細胞はHVEM mAbと比較して有意な有効性を有さなかった(32±10%)。陰性対照として使用したL-CD40L細胞は、B-CLL細胞死に関して効果を有さなかった(24±9%のHVEM mAb)。本発明者らは、L-CD40L/LIGHTの2つの分子はBリンパ球増殖と協力して作用することを先に示したので、本発明者らはL-CD40L/LIGHTもまた試験した。ここで、L-CD40L/LIGHT細胞は、B-CLL細胞のL-LIGHT死滅に影響せず、したがってCD40LおよびLIGHTは細胞死に協力して作用するとは思われなかった。
【０１４０】
HVEM仲介アポトーシスは、カスパーゼ3、8および9の活性化に関与する
Fas、TNFRlなどのTNFRファミリーメンバーならびにTRAIL受容体のDR4およびDR5により誘導されるアポトーシスは、細胞質内デスドメインの存在に依存することが記載されている。しかし、デスドメインにはHVEMが存在しない。HVEM仲介アポトーシス機序を規定するために、本発明者らはまず、カスパーゼの活性化を分析した。細胞質内染色により、本発明者らは、抗HVEM mAbによるB-CLL細胞の刺激が、統計的に有意なカスパーゼ3の活性化(HVEM mAb状態に対して16.5±2%陽性細胞対対照状態に対して5.2±1%、p<0.01)をもたらすことを図４Ａに示した。この観察結果はウェスタンブロット分析により確認され、19kDaおよび17kDaの活性型が増加した(図４Ｂ)。図４Ａは、HVEM mAbにより誘導されたカスパーゼ3の活性化は、汎カスパーゼ阻害剤のZ-VAD-FMKを用いた予備処理により、完全に無効となった(4±1%陽性細胞、左のパネル)ことをさらに示す。対照的に、Z-VAD-FMKを用いた予備処理は、HVEM刺激後に観察されたアネキシンV/PI染色をわずかに部分的にブロックした(それぞれ38±4%および45±5%の死細胞、右のパネル)。さらに本発明者らは、フローサイトメトリーによりエフェクターのカスパーゼ8および9の活性化を分析した(図３Ｃ)。カスパーゼ8およびカスパーゼ9の両方は、抗HVEM mAbによるCLL細胞の処理に応じて活性化された。興味深いことに、カスパーゼ8およびカスパーゼ9は、類似の反応動態で活性化し、カスパーゼ8に関しては0±1.5%(t=3h)、5.4±2.5%(t=6h)、16±3.2%(t=12h)、24.8±3.1(t=24h)、カスパーゼ9に関しては、0.88±2.1%(t=3h)、4.7±2.6%(t=6h)、18.4±4.1%(t=12h)、31.4±5.1(t=24h)であった。
【０１４１】
HVEM仲介アポトーシスは、ミトコンドリア膜電位(ΔΨm)を崩壊させ、Baxの発現を増加させる
ミトコンドリア膜の脱分極は、アポトーシス機序の「内在」経路の一部である。図５Ａは、B-CLL細胞を抗HVEM mAbを用いて処理することはミトコンドリア膜電位の喪失をもたらし、DiOC2(3)緑色蛍光の有意な減少として評価された(活性化細胞において70±8%であり、休止している細胞を100%に設定する、p<0.05)ことを示す。興味深いことに、HVEM仲介ミトコンドリア脱分極は、汎カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMK(71±5% DiOC2(3)陽性細胞)によって阻害されず、このステップがカスパーゼの活性化とは独立していることを示唆する。
【０１４２】
Baxタンパク質とBcl-2タンパク質とのバランスが、ミトコンドリアの活性の維持に重要である。Baxのアポトーシス促進効果が、Bcl-2の抗アポトーシス機能により打ち消される。フローサイトメトリー分析を使用して、本発明者らは、休止している状態において、Bcl-2が、先の研究に記載されたようにB-CLL細胞において高度に発現されたことを示した。HVEM刺激は、Bcl-2の発現を変化させなかったが、対照的にBaxの細胞質レベルの統計的に有意な増加を誘導した(図５Ｂ)(活性化状態において39±4%陽性細胞対休止している状態において22±2%)。この増加は、上記のミトコンドリア膜脱分極に関連すると思われる。
【０１４３】
HVEM細胞死は、FADDの発現を増加し、TRAIL経路に部分的に依存する
HVEMは、デスドメインが欠けているので、HVEM-仲介細胞死に関与する経路は明らかでない。アポトーシスの公知の機序に基づき、本発明者らは、FasおよびTNFR仲介細胞死に関与する主要なアダプター分子であるFADDの発現を分析した。興味深いことに、B-CLL細胞を抗HVEM mAbを用いて処理することにより、ウェスタンブロット分析により、FADD発現において大幅な増加が引き起こされた(図６)。刺激により、2例の示された患者の27kDaのバンドの重要な倍数誘導が引き起こされた(UPN10に関して2.39およびUPN11に関して5)。
【０１４４】
その後、本発明者らは、HVEMのライゲーションにより誘導される細胞死が、他のTNF受容体またはリガンドの活性化を介して間接的であり得るかどうかを調査した。本発明者らは、B-CLL細胞を、HVEM刺激の前後のデスレセプターおよびそれらのリガンド(FasおよびFasL、DR4-DR5およびTRAIL)の発現に関して分析した(図６Ｂ)。これらの分子の各発現レベルは、刺激前の各試料(n=5)についてはごくわずかであった。DR4、DR5およびFasLの発現は、HVEMの刺激後に変化しなかった。対照的に、HVEMのライゲーションは、TRAILの発現の有意な増加(p<0.05)を誘導し、予備処理平均MFI値は、処理後に179±58から375±81であり、Fasの有意でない増加は予備処理平均MFI70±22から104±24であった。注目すべきは、本発明者らがQRT-PCRで試験した322の遺伝子の中から判断したTRAIL mRNAおよびTRAIL遺伝子がCLLにおいて発現したにもかかわらず、HVEM刺激後にCLLは修飾されず、転写後修飾を示唆した。
【０１４５】
HVEM細胞死がFasLまたはTRAILにより影響を受け得るかどうかに対処するために、本発明者らは、FasL、TRAILまたはFasLおよびTRAILの両方を発現したCos細胞から人工細胞毒性エフェクター細胞を作製した。一時的形質移入後のFasLおよびTRAILの両方の発現を、フローサイトメトリーにより確認した(データ非掲載)。さらに、形質移入エフェクター細胞を、それらの能力に関して調べ、FasおよびDR5の両方を発現したジャーカットT細胞のアポトーシスを誘導した。本発明者らは、各Cos-エフェクター細胞の集団を、B-CLL細胞と共に、HVEM mAbの存在下または不在下で24時間共培養した。本発明者らは、共培養の24時間以内に対照状態と比較して、それぞれB-CLL細胞の47±10%、25±7%、45±17%のCos-FasL、Cos-TRAIL、Cos-FasL/TRAIL誘導性アポトーシスを見出した。HVEM mAbとCos-FasLエフェクター細胞の組み合わせは、HVEM mAb単独で観察されたよりも高いと思われるB-CLL細胞の死を誘導した(それぞれ、80±20%および55±5%)。対照的に、HVEM mAbに加えたCos-TRAILエフェクター細胞は、HVEM mAb単独よりも多くのアポトーシスを誘導しなかった(それぞれ、53±16%対55±5%)。これらのデータは、HVEMおよびFasLが相乗的に作用し得るさまざまな経路を介してB-CLL細胞の死滅を誘導するが、一方HVEMおよびTRAIL経路は共有のメディエーターを含み得ることを示唆している。
【０１４６】
さらに、本発明者らは、HVEM誘導性細胞死についての抗TRAIL mAbのブロッキング効果を調べた。B-CLL細胞を、このブロッキングmAbと共に、またはこのブロッキングmAbなしでプレインキュベートし、その後24時間以内にHVEM mAbで処理し、アネキシンV/PI染色に関して評価した。本発明者らは、HVEMがCLLを死滅させることを抗TRAIL mAbにより、試験した7例の患者に関しては部分的に、1例の患者に関しては全体的に有意にブロックしたことを見出し(ブロッキング状態において52±9%の死細胞対HVEM mAb状態において100%;p<0.01)、HVEM細胞死経路がTRAILの活性化に少なくとも部分的に関与し得ることを示唆していることを見出した。
【０１４７】
考察
本研究において、本発明者らは、抗腫瘍反応についてのHVEMおよびLIGHTの新規な役割を強調する。本研究において、本発明者らは、造血器悪性腫瘍におけるLIGHTの効果を調査し、本発明者らは、Bリンパ球の生理におけるLIGHTの重要性に関する本発明者らの先の結果をもたらした、B-CLLに焦点を当てることを選択する。LIGHTの受容体の表面発現分析は、HVEMがB-CLL細胞において高レベルで発現したことを示した。際だって対照的に、LTβRの発現は弱いまたは稀であり、結果として本発明者らは、優勢にHVEMが発現するモデルとしてCLLを考えることができた。その結果として、このリンパ性悪性疾患におけるLIGHTの影響を調査するために、本発明者らは、B-CLL細胞を抗HVEM mAbで処理し、本発明者らは、ケモカイン、サイトカインおよび接着、遊走またはアポトーシスに関与するカギとなる分子をコードする遺伝子の大型パネルの発現のQRT-PCR網羅的解析を実施した。試験した322の遺伝子のうち、わずか12がHVEM刺激後に有意に過剰発現し、B-CLL細胞におけるHVEMの転写プロフィールに注目すべきことが示唆される。HVEMのライゲーションは、それぞれ免疫エフェクターの動員にとって重要であるケモカインのIL-8(インターロイキン8)、IP10(IFN誘導タンパク質10)およびCCR4(ケモカイン(C-Cモチーフ)受容体4)をコードする3つの遺伝子の発現を上方制御した。IL-8は、炎症反応の主要なメディエーターの1つであり、化学誘因物質として機能し、強力な血管新生因子でもあり、IP10は、単球およびT細胞に対する化学的誘因、T細胞の内皮細胞への接着の促進および抗腫瘍活性にかかわり、CCR4は、TARC(胸腺および活性化調節性ケモカイン)およびMDC(マクロファージ由来ケモカイン)の受容体であり、二次リンパ器官において産生される。本発明者らは、HVEMに対する反応におけるケモカインの産生を測定することによってこれらの結果を完了させ、本発明者らは、HVEMがIL-8およびRantes(T細胞、好酸球および好塩基球について走化性であり、白血球を炎症部位に集める積極的役割を果たす)両方の有意な放出を誘導することを確認した。IL-8の産生は、単球および好中球を含むいくつかの細胞系およびここ、白血病細胞において記載されているので、IL-8の産生は、HVEM反応のカギとなる要素であると思われる。HVEM刺激に対するこの大型転写反応を分析する前に、本発明者らは、免疫活性化に関連する遺伝子の上方制御を予想することができ、共刺激反応におけるLIGHTおよびその受容体であるHVEMの機能の確立を示した。しかし驚くべきことに、HVEM刺激後に有意に誘導された9の他の遺伝子は、すべてアポトーシスタンパク質をコードする遺伝子に対応し、その大部分がアポトーシス促進性:BcI-XS、Bid、BNIP3、Bcl-2ファミリーの全メンバーおよびFasL、CARDl 1、シトクロムc、p53であり、他のいくつかは抗アポトーシスサブグループ:BIRC4およびIEX-Iに属する。HVEMは今までのところ共刺激受容体として記載されており、LIGHTのアポトーシス促進性効果はLTβRのみによって仲介されることが公知であったので、この明快なアポトーシス転写プロフィールは、予期しなかった。
【０１４８】
このアポトーシス転写プロフィールが、インビトロの機能性効果と相関したかどうかに対処するために、本発明者らはB-CLL細胞を、LIGHT形質移入細胞またはHVEM mAbと共に共培養し、両方がアネキシンV+細胞を有効に増加させた。さらに、研究室における他の観察結果により、B-CLL細胞についてのLIGHTのアポトーシス促進効果が、1)他のLTβRリガンドであるrhLTα1β2が、CLLの細胞死を誘導することができないこと、2)LTβRを発現しないB-CLL細胞が、それにもかかわらず抗HVEM mAbによって殺されること、および3)別のB細胞リンパ節症の、LTβRの発現がまた陰性であるマントル細胞リンパ腫が、LIGHTを用いた処理により殺される(データ非掲載)ことにより実証されたように、HVEMとのその相互作用を介して仲介されたことが確認された。HVEMのリンパ性悪性疾患についてのこの直接死滅効果は、今までに記載されたことはなかった。
【０１４９】
HVEMは、CD40およびCD30などのTNFR分子のサブグループに属し、デスドメイン(DD)を含まず、細胞生存および共刺激反応に主に関与する。実際に、Fas、DR4、DR5などの、アポトーシスにかかわるTNFRファミリーメンバーの大部分は、それらの細胞質内DDを介してカスパーゼシグナル伝達を誘導する。しかし、デスドメインを含まないTNFRのメンバーもまた、細胞死を誘導できることは現在では明らかであると思われる。例えば、CD27は、バーキットリンパ腫細胞系のアポトーシスを誘導し、CD30は、胸腺の陰性選択に関する細胞死シグナル伝達にかかわり、CD40のライゲーションは、間葉および上皮起源の形質転換細胞においてアポトーシス細胞死を引き起こし、LIGHTは、LTβRとの相互作用を介して、いくつかの腺癌において細胞死を誘導した。本発明者らの結果は、このサブグループにおいてHVEMを含む。それにもかかわらず、デスドメインの不在は、HVEMにかかわる経路の理解を複雑にした。その後、本発明者らは、さまざまな分析を実施し、CLLにおいてHVEMを介して誘導される死の機序を特徴付けた。
【０１５０】
2つの主要なアポトーシス経路:内在性および外因性の経路が特定されており、これらは前者におけるミトコンドリアに関する顕著な役割および後者の経路におけるデスレセプターおよびカスパーゼ8の活性化により識別できる。本発明者らは、HVEM刺激がカスパーゼ3、8および9の活性化を誘導することを見出した。B-CLL細胞と汎カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD-FMKとのプレインキュベートは、カスパーゼ3の活性化を完全に打ち消したが、細胞死は打ち消さず、カスパーゼとは独立した機序の関与を示唆している。さらにHVEM刺激は、ミトコンドリア膜電位を低下させ、アポトーシス促進性Baxタンパク質の発現の上方制御を誘導した。対照的に、抗アポトーシスBcl-2タンパク質は、変化しなかった。ミトコンドリアの活性は、これらのBcl-2ファミリーのメンバー間のバランスにより厳密に調節されていることが示された。さらに、膜電位の喪失は、汎カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD-FMKではブロックされず、この段階がカスパーゼの活性化とは独立していることを示唆した。Baxの上方制御は、観察されたミトコンドリア電位の喪失と関係があり得、これらの結果を合わせると、内在性アポトーシス経路の関与が示唆される。したがってHVEM仲介アポトーシスは、デスレセプター経路(カスパーゼ8の活性化)と、ミトコンドリア経路(ミトコンドリア膜電位の低下およびBaxの上方制御)との両方に明らかに関係する。さらに、カスパーゼ8およびカスパーゼ9は、ほぼ同時に活性化されたので、デスレセプター経路およびミトコンドリア経路は、HVEMを介して刺激されたB-CLL細胞においておそらく平行な経路である。結局、これらのデータは、HVEM誘導性細胞死には、アポトーシス機序において、一方ではカスパーゼの活性化、他方ではカスパーゼとは独立した経路が関与していることを示唆している。
【０１５１】
LIGHTの2つの受容体は、異なる機序を介して明らかに細胞死を誘導する。LIGHTとの結合において、LTβRは、いくつかのTNFR関連因子(TRAF)を用い、それらはアダプターとカップリングし、複数のシグナル伝達カスケードを誘発する。さらなる研究により、TRAF3のカップリングは、LTβR誘導性細胞死の仲介に主に関与するが、一方TRAF2およびTRAF5の関与は、NF-κBの活性化において重要な役割を果たすことが示唆されている。LTβR細胞死は、HT29結腸癌細胞においてカスパーゼの活性化を引き起こさなかったので、LTβRを介したアポトーシス促進の特徴は、HVEMについての本発明者らの観察結果とは異なった。さらに、広範囲のカスパーゼの活性化がMDA-MB-231乳癌細胞について観察されたにもかかわらず、LIGHT仲介アポトーシスは、カスパーゼ独立性であると思われた。ミトコンドリア膜電位の低下は、両方の場合において観察された。LIGHT誘導性腫瘍細胞死は、IFNγによる感作を必要とし、それはB-CLL細胞についての本発明者らの実験において必要ではなく、したがって、両方の受容体のアポトーシス促進経路に関する異なる機序が示唆される。
【０１５２】
注目されるのは、HVEM誘導性CLL細胞死は、汎B細胞治療mAbのリツキシマブ誘導性CLL細胞死と比較して遜色がないことであった。結果として、HVEMは、リツキシマブおよびアレムツズマブのモノクローナル抗体に関して実証されたように、フルダラビンなどの治療薬の有効性を強化できる。
【０１５３】
他の研究では、CD40Lを用いた予備活性化がB-CLL細胞を感作でき、FasLおよびTRAILがアポトーシスを仲介することが発見されている。さらに、CD40LおよびLIGHTの協力が、樹状細胞の成熟、Bリンパ球表面におけるLIGHTタンパク質の誘導またはB細胞の増殖に関して観察されている。これらのデータが、本発明者らをCD40LがHVEM仲介細胞死を増加またはブロックできるかどうかの分析に駆り立てたが、本発明者らは、いずれのCD40L予備活性化効果も検出できなかった(データ非掲載)。興味深いことに、これらの観察結果は、活性化B-CLLが二次リンパ器官に存在し、それらは活性化細胞であり、HVEM処理により死滅させることもできることを示唆している。
【０１５４】
ここで、本発明者らのデータは、LIGHTまたは抗HVEM抗体がBリンパ性悪性疾患の細胞死を、HVEMを介して、一部はアポトーシス経路を介して、一部はネクローシス機序によって直接誘導できることを示している。このことは、カスパーゼの活性化、ミトコンドリア膜電位およびアポトーシス促進タンパク質の上方制御に影響を与える。本発明者らの結果は、HVEM誘導性細胞死において、TRAILの関与を強く示唆した。HVEMのこの新しく特定された役割は別にして、LIGHTもまた、HVEMを介して白血病細胞によりケモカインの放出を直接誘導した。この後者の事象は、自然(NK細胞、単球)免疫系および適応(T細胞)免疫系の細胞の動員においてカギとなる役割を果たし、それらは順にB-CLL細胞についてさらなる調節を発揮することが期待できる(図７と比較されたい)。LIGHT-HVEMシグナル伝達は、癌治療に関する新規な治療標的を表す。可溶性LIGHTまたは抗HVEM mAbは、アポトーシスの誘導などの機序による、HVEMを発現する悪性リンパ球の直接死滅と、ケモカインの産生を介した免疫エフェクター細胞の動員とを組み合わせることの魅力的な有利性を表す。
【０１５５】
(実施例2)
抗HVEM mAbクローンの特徴付け
mAbs
BALB/cマウスを、ヒトHVEM-Ig融合タンパク質のIP注入によって免疫化し、最後の注入後に脾臓細胞を、標準的手順に従ってX63Ag8骨髄腫細胞と融合した。ハイブリドーマの上清を、ヒトHVEM細胞系の細胞表面染色によりスクリーニングした。
【０１５６】
14のmAbクローンを、i)マウス免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の型をタイプ分けするステップ、ii)細胞表面HVEMの結合をフローサイトメトリー分析し、平均蛍光強度(MFI)の値、最大飽和結合および50%飽和結合(EC50値)を測定するステップ、iii)LIGHT、BTLAおよびHSV-gDを用いた競合的ブロッキング研究、iv)mAbsのHVEM突然変異体のパネルへの結合を介した突然変異分析、v)CLL細胞のアポトーシスを誘導するmAbの能力、を含む多くの方法に関して特徴付けた。競合的ブロッキングおよび突然変異性実験からの基準に基づいて、6つのエピトープクラスタを、エピトープI、II、III、IV、VおよびVIとして特定した。表2に表したデータは、3つのmAbのサブセットの概要である。
【０１５７】
(実施例3)
HVEMは、血液悪性腫瘍において発現する
フローサイトメトリー分析により、B細胞リンパ系新生物(図８を参照されたい)ならびにT細胞リンパ系新生物、非ホジキンリンパ腫(NHL)、B-NHL、T-NHL、慢性リンパ球性白血病(CLL)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、NK細胞リンパ系新生物および骨髄細胞系新生物(データ非掲載)について測定されたように、HVEMが発現することが示される。
【０１５８】
さまざまな白血病骨髄腫および骨髄腫の標本を凍結し、フローサイトメトリーにより、HVEMの細胞表面発現に関して試験した。データは、陰性対照と比較した倍数平均蛍光強度で表す。CLLは慢性B細胞白血病に相当し、ALLは急性リンパ球性白血病、MMは多発性骨髄腫細胞、MCLはマントル細胞リンパ腫、FLは濾胞性リンパ腫およびびまん性LBCLはびまん性大細胞型B細胞リンパ腫に相当する。
【０１５９】
(実施例4)
HVEM誘発はB細胞の死を誘導する
HVEMのシグナル伝達は、さまざまなB細胞血液悪性腫瘍の細胞死に関係する(実施例3と比較されたい)。本発明者らは、HVEM刺激が、正常なB細胞の死をも誘導できるかどうかを試験した。
【０１６０】
健康なドナーに由来するPBMCを、Ficoll-Hypaque gradients (Amersham Biosciences、Saclay、フランス)で単離した。Bリンパ球を、MACS CD19マイクロビーズ単離キット(Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、ドイツ)を使用して、製造業者の推奨に従って、CD19+PBMC集団として単離した。調製物の純度をフローサイトメトリー分析により確認し、すべての実験において>98%であった(データ非掲載)。
【０１６１】
Bリンパ球を、30μg/mlの抗HVEMモノクローナル抗体(mAb)(SmithKline Beecham)で24時間処理した、または処理しなかった。その後細胞を回収し、細胞死をアネキシンV-Cy5(BD Biosciences)およびヨウ化プロピジウム(PI)(BD Biosciences)の二重染色により分析した。簡潔に言うと、5×105細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1%FCSで1回洗浄し、5μlのアネキシンV-Cy5を含む100μlの1×結合バッファー(BD Biosciences)に、室温で10分間、暗所において再懸濁した。その後、200μlの1×結合バッファーおよび3.5μlのPIを加え、細胞を室温で5分間、暗所においてインキュベートした。その後細胞を、FACSCantoサイトメーター(Becton Dickinson)で分析した。データ分析は、FACSDivaソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて実施した。死細胞を、アネキシンVおよびPI二重陽性細胞のパーセンテージとして測定した。
【０１６２】
図９に示したように、正常なB細胞は、正常なB細胞の死を誘発するHVEM誘発に対して感受性であった。
【０１６３】
関節リウマチなどの疾患においてCD20 mAbに関して実証された治療的有用性により明らかとなったように、B細胞は現在では、自己免疫疾患(AID)の治療のための重要な標的として公知であるので、この観察結果は興味深い。興味深いことに、CD20 mAbsはB細胞死の弱い誘導因子であるという事実にもかかわらず、それらは自己免疫疾患の治療に有効に使用されている。したがって、本発明者らが正常B細胞においてHVEMに関して特定した特性が、HVEMをAIDの治療における使用にとって魅力的な標的にする。LIGHTまたは慢性リンパ球性白血病B細胞においてアポトーシスを誘導するLIGHTの断片、抗HVEM抗体およびHVEMに結合するその断片からなる群から選択されるHVEMのリガンドは、したがって自己免疫疾患の治療に使用できる。
【０１６４】
(参考文献)
本出願を通じて、さまざまな参考文献が、本発明に付随する現況技術を記載している。これらの参考文献の開示は、参照によって本開示に組み込まれる。
［参考文献］
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［表５Ａ］
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［表５Ｂ］
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［表５Ｃ］
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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