(57)【要約】  本発明は、ヒトにおける非常に優れた平均余命に関連するエキソヌクレアーゼ１（ＥＸＯ１）プロモータ多型に関する。より具体的には本発明は、遺伝子が突然変異していることが分かっているＥＸＯ１のプロモータ領域に関する。さらに本発明は、ＥＸＯ１の転写リプレッサーとして転写因子Ｅ４７を伴う遺伝子制御機構に関する。【選択図】図３
2011510615.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非常に優れた平均余命に関連しない核酸分子を有する人を同定する方法であって、
（ａ）人のヌクレオチド配列内の配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、
（ｉ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、
（ｉｉ）相補的な鎖が（ｉ）の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子、及び
（ｉｉｉ）配列が遺伝子コードの縮重のために（ｉｉ）の核酸分子の配列とは異なる核酸分子の群から選択される人のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を増幅する工程と、
（ｂ）前記増幅されたＤＮＡ断片をシークエンシングする工程と、
（ｃ）該人のヌクレオチド配列を、配列番号２で示されるヌクレオチド配列と比較する工程と、
（ｄ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列の２１位での該人のヌクレオチド配列における多型変異の非存在を決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
配列番号１で示されるＥＸＯ１遺伝子のＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８０の２１位での多型の存在に起因する非常に優れた平均余命に関連する核酸分子を有する人を同定する方法であって、
（ａ）人のヌクレオチド配列内の配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、
（ｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含む核酸分子、
（ｉｉ）相補的な鎖が（ｉ）の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子、及び
（ｉｉｉ）配列が遺伝子コードの縮重のために（ｉｉ）の核酸分子の配列とは異なる核酸分子の群から選択される人のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を増幅する工程と、
（ｂ）前記増幅されたＤＮＡ断片をシークエンシングする工程と、
（ｃ）該人のヌクレオチド配列を、配列番号２で示されるヌクレオチド配列と比較する工程と、
（ｄ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列の２１位での該人のヌクレオチド配列における多型変異の存在を決定する工程であって、前記多型変異が、ＧがＣに置換される単一のヌクレオチド多型である、決定する工程と、
を含む、方法。
【請求項３】
感染性及び／又は悪性の疾患、及び／又は加齢に関連する疾患の治療のために医薬組成物を調製するための、配列番号１のヌクレオチド配列を含むベクターの使用。
【請求項４】
生殖細胞系の保護及び安定性のために医薬組成物を調製するための、配列番号１のヌクレオチド配列を含むベクターの使用。
【請求項５】
ＥＸＯ１遺伝子の発現に作用する物質のスクリーニングのための転写因子Ｅ４７の使用。
【請求項６】
Ｅ４７を、物質と、
（ｉ）配列番号２で示されるヌクレオチド配列、
（ｉｉ）相補的な鎖が（ｉ）の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子、及び
（ｉｉｉ）配列が遺伝子コードの縮重のために（ｉｉ）の核酸分子の配列とは異なる核酸分子の群から選択されるヌクレオチド配列との結合に関する競合因子として使用することを特徴とする、請求項５に記載の転写因子Ｅ４７の使用。
【請求項７】
Ｅ４７を、該ＥＸＯ１遺伝子の発現に作用する物質のスクリーニングに関する標的として使用することを特徴とする、請求項５に記載の転写因子Ｅ４７の使用。
【請求項８】
感染性及び／又は悪性の疾患、及び／又は加齢に関連する疾患の治療のために医薬組成物を調製するための、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び／又は配列番号４２で示されるヌクレオチド配列の使用。
【請求項９】
生殖細胞系の保護及び安定性のために医薬組成物を調製するための、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び／又は配列番号４２で示されるヌクレオチド配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおいて非常に優れた平均余命に関連することが分かっているエキソヌクレアーゼ１（ＥＸＯ１）の遺伝子に関する。より具体的には本発明は、遺伝子が突然変異していることが分かっているＥＸＯ１のプロモータ領域に関する。さらに本発明は、ＥＸＯ１の転写リプレッサーとして転写因子Ｅ４７を伴う遺伝子制御機構に関する。
【背景技術】
【０００２】
体細胞突然変異がヒトを含む様々な種で年齢と共に徐々に蓄積することが次第に明らかになっている（非特許文献１、非特許文献２）。広範な外因性因子（例えばＵＶ光）及び細胞代謝の副生成物（例えば活性酸素種）が、遺伝物質に悪影響を与えることが知られている。また突然変異は、自然複製エラーに起因し得る（非特許文献３）。ＤＮＡ損傷が細胞機能の制御異常、アポトーシス、発癌性形質転換、ゲノムの不安定性及び老化を引き起こし得るので、維持システムが細胞及び生物の恒常性及び生存の両方に重要である（非特許文献４）。したがって、ＤＮＡ損傷を阻止する又は消失させる、多くの遺伝的に決定される経路が、強く保存された「長寿命保証機構（longevity assurance mechanisms）」として展開されている（非特許文献３）。Hart & Setlowは１９７４年には既に、様々な種における修復機構の固有の忠実性及び活性が年齢に関連した機能低下速度に影響を与え得ることを示唆していた。ＤＮＡ修復と加齢とを結び付ける別の証拠は、多くのヒト分節性早老障害、例えばウェルナー症候群がＤＮＡ維持に関与する遺伝子における突然変異により引き起こされることである（非特許文献２でレビューされる）。同様に、マウスモデル試験により、ゲノムの完全性に作用する遺伝的欠陥が、幾つかの加齢表現型の促進の基礎となることが示されている（非特許文献２、非特許文献４）。
【０００３】
またこれらの研究結果は、体細胞の維持及び修復機能のレベルを制御する遺伝子における変異が、正常な加齢過程を調節し、且つ「保証された長寿命」期間を決定することができるという考えを支持している（非特許文献５）。ヒトにおいて、遺伝的素因及び／又は環境要因の影響のために、これらの生存機構の限定により、虚弱、年齢に関連する機能障害及び平均余命の低下がもたらされ得ると考えられる。反対に、これらの機能がより効率的であれば、人が良好な身体及び認知状態で高齢に達する可能性が高くなり、寿命（life span）だけでなく「健康寿命（health span）」が延びる。実際、加齢過程の減速及び年齢に関連する疾患の発症遅延を特徴とすることが多い高齢者（ＬＬＩ、すなわち９０歳代の人及び１００歳以上の人）（非特許文献６）は、若齢の対照と比較して「長寿命保証遺伝子」における有利な変異が豊富であることを前提としている（非特許文献７）。最近の疫学試験は、ヒトの平均余命に対する遺伝的関与（約２５％〜３２％）は６０歳を前に最小となるが、非常に高齢での生存に特に重要となることを示すことにより、この仮説を強固なものにしている（非特許文献８）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Vijg, J. Somatic mutations and aging: a re-evaluation. Mutat. Res. 447, 117-135 (2000)
【非特許文献２】Hasty, P., Campisi, J., Hoeijmakers, J., van Steeg, H., Vijg, J. Aging and genome maintenance: lessons from the mouse? Science 299, 1355-1359 (2003)
【非特許文献３】Hasty, P. The impact of DNA damage, genetic mutation and cellular responses on cancer prevention, longevity and aging: observations in humans and mice. Mech. Ageing Dev. 126, 71-77 (2005)
【非特許文献４】Lombard, D.B. et al. DNA repair, genome stability, and aging. Cell 120, 497-512 (2005)
【非特許文献５】Kirkwood, T.B. Understanding the odd science of aging. Cell 120, 437-447 (2005)
【非特許文献６】Hitt, R., Young-Xu, Y., Silver, M., Perls, T. Centenarians: the older you get, the healthier you have been. Lancet 354, 652 (1999)
【非特許文献７】Perls, T., Kunkel, L.M., Puca, A.A. The genetics of exceptional human longevity. J. Am. Geriatr. Soc. 50, 359-368 (2002)
【非特許文献８】Hjelmborg, J. et al. Genetic influence on human lifespan and longevity. Hum. Genet. 119, 312-321 (2006)
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、ヒトにおける非常に優れた平均余命に関する新規の感受性遺伝子としてエキソヌクレアーゼ１（ＥＸＯ１）を同定した。ＥＸＯ１はゲノム安定性に作用する様々なＤＮＡ代謝経路に関与する。本発明の詳細な機能的及び遺伝的な解析により、４０９人の若齢の対照と比較して、３８１人の１００歳以上のドイツ人で有意に濃縮されるＥＸＯ１プロモータにおけるＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８０の共通の対立遺伝子（Ｃ）が明らかになった。この研究結果は、５５９人の１００歳以上のフランス人及び対照の独立試料で再現される。Ｃ対立遺伝子は、転写因子Ｅ４７に対する結合部位を欠失しており、そのためＥＸＯ１発現が高くなる。このようにして本発明者らは、ＥＸＯ１転写の負の制御因子としてのＥ４７に関するこれまでに説明されていない役割を見つけた。ＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８０のＣ対立遺伝子に関連する、観察された延命効果（survival advantage）を考慮すると、ＥＸＯ１は、新規の長寿命を可能にする遺伝子であると見なすことができる。Ｅ４７及びＥＸＯ１の両方がリンパ細胞系統の発生に重要であるので、ＥＸＯ１活性の増強の有益な効果は、加齢中に起こる免疫不全の軽減にあると仮定することができる。さらに観察される効果は、ＥＸＯ１及びＥ４７の同時発現を示す全ての組織で重要であり得る。
【０００６】
本試験において、本発明者らは、３８１人の１００歳以上のドイツ人及び４０９人の若齢の対照（６０歳〜７５歳）の広範な試料集合において、４９個のＤＮＡ修復遺伝子で合計９２個のコーディングＳＮＰ（ｃＳＮＰ）を解析し、エキソヌクレアーゼ１（ＥＸＯ１）をコードする遺伝子である新規の長寿命感受性遺伝子座を同定した。詳細な機能的及び遺伝的な解析により、１００歳以上の人で濃縮され、且つ転写因子Ｅ４７の異なる結合を介して遺伝子発現に影響を与えるＥＸＯ１プロモータにおける共通の対立遺伝子変異体が明らかになった。
【０００７】
そのため本発明の目的は、長寿命若しくは年齢に関連した疾患、又は長寿命に関連した形質（例えば癌）に相関がある遺伝的変異を保有する人を同定する方法であって、ｒｓ１７７６１８０を１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する、方法を提供することである。本発明の別の目的は、平均余命の増大をもたらす突然変異を同定する方法を提供することである。さらに本発明の目的は、例えば人の免疫系又は生殖細胞を支持すること、及び例えば癌又は一般的な機能低下をもたらすＤＮＡ損傷の蓄積を防ぐことによる疾患の治療のために医薬調製物を調製する方法を提供することである。最後に、本発明の目的は、非常に優れた平均余命に影響を与えるＥ４７依存的な遺伝子制御ネットワークを同定する方法を提供することである。
【０００８】
遺伝的感受性検査の当業者には、本発明が、
突然変異のないＥＸＯ１遺伝子を有する、そのためＥＸＯ１遺伝子に基づき平均余命が増大しているとはいえない人を同定するために、
ＥＸＯ１遺伝子に基づき平均余命の増大に関連した突然変異が起こったＥＸＯ１遺伝子を有する人を同定するために、
ＥＸＯ１遺伝子の発現に影響を与える物質を同定するために、
感染性及び／又は悪性の疾患、及び／又は加齢に関連した疾患の治療のための医薬組成物を調製するために、並びに
遺伝子治療を行うために特に有用であることが分かっている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＥＸＯ１遺伝子構造及び解析したＳＮＰの位置の概略図である。
【図２】コーディングＳＮＰがＵＶ  Ｂ処理後にＥＸＯ１のＤＮＡ修復能に影響を与えないことを示す図である。
【図３】ＥＸＯ１のＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８０ＣのＣ対立遺伝子がプロモータ活性の増大に寄与することを示す図である。
【図４−１】転写因子Ｅ４７がＥＸＯ１転写リプレッサーとして働くことを示す図である。
【図４−２】転写因子Ｅ４７がＥＸＯ１転写リプレッサーとして働くことを示す図である。
【図５】ＥＸＯ１の５’ＵＴＲハプロタイプの解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ＤＮＡ修復遺伝子のスクリーニングにより候補遺伝子としてＥＸＯ１が明らかになる
本発明者らは、長寿命表現型との関連性に関して、４９個の選択されたＤＮＡ修復遺伝子において９２個のｃＳＮＰを調べた（表３を参照）。スクリーニングは、さらなる機能的及び遺伝的な追跡検査に有力なマーカーを同定する働きをした本実験の調査段階を表す。関連性解析のために、ヒトの遺伝的長寿命調査で最も一般的に使用される試験設計を、１００歳以上の人（ｎ＝３８１、年齢１００歳〜１１０歳）を若齢及び具体的に適合させた対照（ｎ＝４０９、年齢６０歳〜７５歳）と比較することにより適用した。このアプローチの妥当性及び有効性はこれまでに実証されている（Nebel et al. 2005）。解析したｃＳＮＰは全て、少なくとも１％の最小対立遺伝子頻度と、９５％の最小全呼率（minimaloverall call rate）とを有し、対照においてハーディ・ワインベルグ平衡（ＨＷＥ）からの有意な逸脱は示されなかった（ＰＨＷＥ値＞０．０５）。遺伝子マーカーに関して、対立遺伝子（ＰＣＣＡ）及び遺伝子型（ＰＣＣＧ）症例対照比較を行った。
【００１１】
最も重要なｃＳＮＰ、ｒｓ７３５９４３は、ＥＸＯ１遺伝子のエキソン１０に位置していた（８.１６×１０−４のＰＣＣＡ及びＰＣＣＧ  ０．００１２、表１）。さらなる関連性シグナル（ｒｓ４１４９９６５）は同じ遺伝子のエキソン１１に存在していた（表１）。２つの異なる遺伝子にマッピングされた、２つの他の名目上重要なｃＳＮＰをこの解析で得た。そのＰＣＣＡ又はＰＣＣＧ（０．０８＞Ｐ＞０．０１）がＥＸＯ１のｃＳＮＰ  ｒｓ７３５９４３に対応する値よりもずっと高かったので（表４）、これらをさらに試験することはなかった。ＥＸＯ１のリードＳＮＰ  ｒｓ７３５９４３が最高の（top-ranking）マーカーとして同定され、且つ隣接エキソンにおける別のシグナルによりさらに支持されるので、ＥＸＯ１遺伝子に関して、より徹底した研究を行った。世界中の１００歳以上の人の試料が入手しにくいことを考慮して、機能的に関連したＳＮＰのみを複製することにした。以下の突然変異の検出において、精細マッピング及び機能的試験を、関連性の基礎となる多型を同定及び確認するために適用した。全ての既知のエキソン、４７人の１００歳以上の人でのＥＸＯ１におけるエキソン−イントロン境界及びプロモータ領域のシークエンシングにより、遺伝子全体に広がる４３個のＳＮＰを使用して、続く精細マッピングに含まれていた幾つかの既知の及び１つの新規の多型が明らかになった（表５）。１４個のこれらのＳＮＰは関連性シグナルの程度をカバーし（図１ａ）、そのうち７個が潜在的に機能的な領域に位置している（表２ａ及び図１ｂ）。
【００１２】
図１ａを参照して、染色体１上のＥＸＯ１領域の概観が与えられる。対立遺伝子に基づくＰ値（−ｌｏｇ１０、ｘ軸）と共に、全ての遺伝子型分類したＳＮＰ（ｙ軸）の物理的位置、及びＮＭ＿１３０３９８に関する遺伝子構造の概略図を示す。Ｐ＝０．０５の有意閾値を示す。座標はＮＣＢＩゲノムアセンブリｂｕｉｌｄ３６を表す。遺伝子座のＬＤプロット（ｒ２）を、対照のドイツ人の遺伝子型を使用してＨａｐｌｏｖｉｅｗ３．３２により作成した。新規のＳＮＰ  ＥＸＯ１＿ｅ０８に関するより多くの情報に関しては、表５を参照されたい。
【００１３】
７個の関連したＥＸＯ１のＳＮＰは、潜在的に機能的な関連性を有する
一貫して平均余命に影響を与えることが分かっている唯一の遺伝子であるＡＰＯＥ（Christensen et al. 2006）に関して調整を行い、ロジスティック回帰により別々にこれらの潜在的に機能的なＳＮＰを解析すると、７個のＳＮＰ全てが調整なしのものよりも強い効果を示した（表２ａ）。任意の２つのＳＮＰの間、又はＳＮＰとＡＰＯＥとの間には有意な相互作用は観察されなかった。対立遺伝子変異は潜在的に長寿命表現型に男性と女性とで異なる影響を与え得るので（Franceschiet al. 2000、Candore et al. 2006）、さらに性別層別解析を行った。男性では、有意な関連性は検出されず（データ図示せず）、これは研究した男性の数が少なかったことにより解析能力がなかったためだと思われる（７９人の１００歳以上の人対７７人の対照）。女性では、１つを除く全てのＳＮＰが、複合解析（表２ａ）よりも強い効果を示した（表２ｂ）。
【００１４】
図１ｂを参照して、潜在的に機能的に関連したＳＮＰの位置と共にＥＸＯ１遺伝子モデルの図が与えられる。ＥＸＯ１は幾つかのアイソフォームを有するが、ここでは本発明者らは、１６個のエキソンを含有するＮＭ＿１３０３９８を表す（その中の１３個のエキソンがコーティング領域（大きい四角で示す）を示し、３個のエキソン（エキソン１、エキソン２及び代替的にエキソン２ａ）が５’ＵＴＲを示し、最後のエキソン（名目上のエキソン１５）がコーティング配列と３’ＵＴＲ（小さい四角）とを含有する）。本試験で解析する７個のＳＮＰは、機能的に関連した領域内に位置している：５’近位プロモータ領域における２つのＳＮＰ（ｒｓ１７７６１８１Ａ／Ｇ、ｒｓ１７７６１８０Ｃ／Ｇ）、５’ＵＴＲにおける３つのＳＮＰ（ｒｓ１７７６１７８Ａ／Ｇ、ｒｓ１６３５５１７Ｇ／Ａ、ｒｓ１７７６１７７Ｃ／Ｔ）及びコーティング領域における２個の非同義ＳＮＰ（アミノ酸置換Ｈ３５４Ｒが起こるｒｓ７３５９４３Ａ／Ｇ、アミノ酸置換Ｖ４５８Ｍが起こるｒｓ４１４９９６５Ｇ／Ａ）。ＡＴＧ：名目上のエキソン３における開始コドン、ＴＡＡ：名目上のエキソン１５における終止コドン。Ｅｐｏｎｉｎｅ予測プログラムで予測される転写開始部位の位置をアスタリスク（＊）で示す。
【００１５】
７個の関連したＳＮＰの中でどれがＥＸＯ１タンパク質の発現又は機能に影響を与えるかを評価するために、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを適用した。
【００１６】
コーディングＳＮＰは、ＵＶ  Ｂ処理後にＥＸＯ１のＤＮＡ修復能に影響を与えない
ヒトＥＸＯ１タンパク質は、ＵＶ  Ｂ放射により引き起こされるＤＮＡ損傷を防ぐ際にその酵母ホモログを補うことができる（Qiu et al. 1999）。そのため、同じ遺伝子ファミリーに属する別のエキソヌクレアーゼである酵母ｅｘｏ１及びｒａｄ５１を欠いたサッカロマイセス・セレヴィシエ（S.cerevisiae）酵母株が、ヒトＥＸＯ１機能を解析するのに十分に確立されたモデルを表す。２つのＥＸＯ１のｃＳＮＰの効果を評価するために、本発明者らは、ＵＶ  Ｂ感受性ＦＤＥＲ酵母細胞(Δｅｘｏ１／Δｒａｄ５１）においていずれかの変異体（ｒｓ７３５９４３Ａ／Ｇに起因するＨ３５４Ｒ及びｒｓ４１４９９６５Ｇ／Ａに起因するＶ４５８Ｍ）を有するヒトＥＸＯ１タンパク質を過剰発現させた。本試験でのＥＸＯ１タンパク質は全て、酵母細胞をＤＮＡ損傷誘導性の細胞死に対して脱感作させることができた（図２）。
【００１７】
図２は実験結果を示し、ここではｅｘｏ１及びｒａｄ５１を遺伝的に欠いた酵母細胞（Δｅｘｏ１／Δｒａｄ５１）を、ヒトＥＸＯ１タンパク質変異体に対する３つの独立クローン（ＥＸＯ１＿３５４Ｈ＿４５８Ｖ、ＥＸＯ１＿３５４Ｒ＿４５８Ｖ及びＥＸＯ１＿３５４Ｈ＿４５８Ｍ）を確立するのに使用した。図２ａは、酵母ゲノムへの構築物の挿入を、ヒトＥＸＯ１に関するプライマー又は対照として酵母グリセルアルデヒド−３−リン酸（phosphat）デヒドロゲナーゼ（ｔｄｈ１）を使用するＰＣＲにより調べた結果を示す。図２は、細胞を成長プレート上に広げ、様々なＵＶ線量に曝し、ＤＮＡ損傷を誘導した結果を示す。４８時間後、コロニーを計測し、ＵＶ  Ｂ線量に応じて生存率を算出した。試験したＥＸＯ１タンパク質変異体全てが、酵母細胞をＤＮＡ損傷誘導性の細胞死から部分的に守る（ｃｔｒｌ株：ＵＶ  Ｂ非感受性サッカロマイセス・セレヴィシエＭａＶ２０３、ｖｃ：対照ベクター（ｖｃ）として空の発現ベクターｐＤＢ２０で形質転換したΔｅｘｏ１／Δｒａｄ５１株。データは、各構築物に対して３つの独立クローンによる独立実験（ｎ＝３）の平均±ＳＤを示す）。
【００１８】
酵母細胞をＵＶ  Ｂ誘導性のＤＮＡ損傷から保護するそれらの能力において３つのタンパク質変異体間には定量的な差異は観察されなかった。ヒトＥＸＯ１タンパク質変異体の突然変異回避を容易にさせる能力は、同じ実験設定を使用した本発明者らのこれまでの研究結果に一致している（Qiu et al. 1999）。ＥＸＯ１のｃＳＮＰ対立遺伝子はＵＶ誘導性のＤＮＡ損傷を修復する能力に影響を与えないと結論付けられた。しかしながら、ゲノム安定性の維持におけるＥＸＯ１の複合的な役割を考えると、２つの解析したｃＳＮＰが、ここで調べたもう１つのものとは異なる内容で機能的に関連し得る可能性は排除できない。
【００１９】
ＥＸＯ１の５’ＵＴＲハプロタイプは、レポーター遺伝子活性に対して異なる影響を示さない
本願の発明者らは、本発明の試料で観察された、４つの最も一般的なＥＸＯ１の５’ＵＴＲハプロタイプ（ｒｓ１７７６１７８、ｒｓ１６３５５１７及びｒｓ１７７６１７７に関してハプロタイプＡＧＣ、ＧＡＴ及びＧＡＣを表す、図５ａを参照されたい）の効果を、異種レポーター遺伝子の前にそれらを挿入し、ＨｅＬａ細胞を用いてデュアルルシフェラーゼアッセイを行うことにより解析した。
【００２０】
図５は、ＥＸＯ１の５’ＵＴＲハプロタイプの解析結果を示す。図５ａは、ハプロタイプがｒｓ１７７６１７８、ｒｓ１６３５５１７及びｒｓ１７７６１７７の順番でＳＮＰにより規定されていることを示す。３つのＳＮＰ対のｒ２値は０．４５２〜０．８９７の範囲である。対照の人において頻度が３％を超えるものだけが一般的なハプロタイプを与える。図５ｂは、５’ＵＴＲハプロタイプの解析に関するデュアルルシフェラーゼアッセイ結果を示す。ハプロタイプ特異的構築物を、補足方法に記載されるようにレポーター遺伝子ベクターｐＧＬ３対照を使用して確立した。調べたハプロタイプ全てで、空のベクター（ｖｃ）と比較してレポーター遺伝子の活性が減少した。ハプロタイプ間では有意な差異は観察されなかった。ＲＬＵ：相対発光量（relative light units）、ｖｃ：対照ベクター。
【００２１】
４つ全てのＥＸＯ１の５’ＵＴＲハプロタイプの挿入により、レポーター遺伝子の発現が４分の１〜６分の１に減少し、このことからＲＮＡプロセシング及び／又は翻訳効率におけるこの制御領域の阻害的役割が論じられた。しかしながら、４つのハプロタイプには互いに有意な差異はなく（図５ｂ）、このことは解析した５’ＵＴＲ変異体がＥＸＯ１の転写後プロセシング又は翻訳効率に影響を与えないことを示していた。
【００２２】
ＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８０は対立遺伝子特異的にＥＸＯ１プロモータ活性に影響を与える
プロモータＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８０及びｒｓ１７７６１８１の機能的影響を研究するために、４つの可能性のあるハプロタイプに基づいたレポーター遺伝子構築物を確立した。図３ａは、対照の人で観察された４つのハプロタイプの頻度を示す（ハプロタイプは、ｒｓ１７７６１８１及びｒｓ１７７６１８０の順番でＳＮＰにより規定され、ＳＮＰ対に関するｒ２値は０．４３１である）。
【００２３】
任意のプロモータ断片の挿入により、空のベクターと比較して最大９０倍にレポーター遺伝子活性が増大した。より重要なことは、本発明者らのデータは、ＥＸＯ１プロモータ活性に対するｒｓ１７７６１８０対立遺伝子の顕著な影響を示している。図３ｂは、プロモータ活性を定量するために、ＥＸＯ１プロモータハプロタイプを表すレポーター遺伝子構築物を用いたデュアルルシフェラーゼアッセイの結果を示す。ＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ２９３細胞（図示せず）は記載のようにトランスフェクトし、構成的プロモータの活性を定量するのに使用した。対照ベクター（ｖｃ）として、空ベクターｐＧＬ３エンハンサーを使用した。ｒｓ１７７６１８０のＣ対立遺伝子を含有するハプロタイプが両方とも、ｒｓ１７７６１８１での対立遺伝子に関係なくＧ対立遺伝子を保有する対応するハプロタイプよりも６倍〜９倍高い活性を示していた（＊＊、両方の構築物でＰ＜０．０１）。データを相対発光量（ＲＬＵ）で表し、平均値＋ＳＤ（ｎ＝３）を示す。
【００２４】
ｒｓ１７７６１８０のＣ対立遺伝子を含有するハプロタイプが両方とも、ｒｓ１７７６１８１での対立遺伝子に関係なくＧ対立遺伝子を保有する対応するハプロタイプよりも６倍〜９倍高い活性を示していた（両方の構築物でＰ＜０．０１）。ｒｓ１７７６１８１でいずれかの変異を保有する２つの構築物間でプロモータ活性に対する有意な影響は全く観察されなかった。このため、ｒｓ１７７６１８０のＣ対立遺伝子は、ＥＸＯ１のプロモータ活性を高めることに関して自立している（self-sufficient）と考えられる。興味深いことに、ｒｓ１７７６１８０のＣ対立遺伝子は１００歳以上の人で統計的に有意に過剰発現している（表２ａ）。
【００２５】
ＥＸＯ１のｍＲＮＡレベルがＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８０のＣ対立遺伝子を保有する女性で上方制御される
上記の結果が、本発明者らにｒｓ１７７６１８０遺伝子型に関してＥＸＯ１発現のｅｘ  ｖｉｖｏ解析を行うことを促した。有意な遺伝子型依存的なＥＸＯ１のｍＲＮＡ制御は、男性に由来するリンパ芽球細胞株では全く観察されなかった。これに対して、ＥＸＯ１転写レベルは、ＧＧ遺伝子型の女性（ｎ＝２３）と比較して、ＣＣ遺伝子型の女性（ｎ＝１０）に由来する細胞株において有意に上方制御された（Ｐ＝０．０３４、１．３４倍誘導）（ＥＸＯ１の遺伝子型特異的な発現を示す図３ｃにおけるＲＴ−ＰＣＲデータを参照されたい。リアルタイムＰＣＲを、ｒｓ１７７６１８０遺伝子型に関してヒトリンパ芽球細胞においてＥＸＯ１のｍＲＮＡの相対的発現レベルを定量するのに使用した。データは、ハウスキーピング遺伝子β−アクチンに対して正規化したＥＸＯ１の発現レベルを表し、中央値±ＳＤで示す。女性では、ｒｓ１７７６１８０の遺伝子型ＣＣ（ｎ＝１０）が、遺伝子型ＧＧ（ｎ＝２３）と比較して相対的に１．３９倍高いＥＸＯ１発現に関連している）。さらに、Ｇ対立遺伝子の女性保有者（carriers）に比べてＥＸＯ１のｍＲＮＡレベルの増大がＣＣ遺伝子型の女性において見られた（ｎ＝５９、Ｐ＝０．０１６、１．３７倍誘導、図示せず）。
【００２６】
これらのデータは、既に遺伝子解析において観察されたように、女性に特異的な機能的効果があるという考えを裏付けている。
【００２７】
Ｅ４７の対立遺伝子特異的な結合がＥＸＯ１の転写抑制に寄与する
ＥＸＯ１の対立遺伝子依存的なプロモータ活性に続く機能的機構にさらに焦点を当てるために、本発明者らはｒｓ１７７６１８０周辺の領域を表すオリゴヌクレオチドと、異なるヒト細胞株に由来する核抽出物のパネルとを用いてバンドシフトアッセイを行った。調べた全ての抽出物でｒｓ１７７６１８０のＧ対立遺伝子に関してタンパク質結合の著しい増大が検出された（図４ａ、左側のパネルを参照）。結合特異性を競合実験で実証した（図４ａ、右側のパネルを参照）。
【００２８】
転写因子Ｅ４７がＥＸＯ１の転写リプレッサーとして働くことを示す図４において、図１ａは、ｒｓ１７７６１８のＧ対立遺伝子の存在が核タンパク質の結合増大をもたらすことを示す。それぞれｒｓ１７７６１８０のＧ対立遺伝子又はＣ対立遺伝子を表すオリゴヌクレオチドと、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＴＨＰ１細胞、ジャーカット細胞及び膵臓癌細胞の核抽出物とを用いて、バンドシフトアッセイを行った。解析した全ての核抽出物で、Ｇ対立遺伝子に対するタンパク質結合の増大が観察される（左側のパネル）。１００倍又は２００倍モル過剰で非標識の特異的オリゴヌクレオチド又は非特異的オリゴヌクレオチドを使用する競合実験によりＧ対立遺伝子に対する結合特異性が示された（右側のパネル）。ＦＰ：遊離プローブ、ＰＣ：膵臓癌、矢印：特異的バンドシフト。
【００２９】
これらの研究結果は、プロモータ活性の変化に対する決定因子として転写の潜在的な負の制御因子を示す。Ｃｏｎｓｉｔｅ転写因子結合部位予測ツールは、ｒｓ１７７６１８０のＣ対立遺伝子により、転写因子Ｅ４７に特異的な結合部位が失われることを示した。Ｅ４７は遺伝子ＴＣＦ３（別名Ｅ２Ａ）によりコードされる。遺伝子座でのほとんどの対立遺伝子変異をカバーするＳＮＰによるＴＣＦ３の解析では、長寿命との関連性に対する証拠は与えられなかった（表７）。Ｅ４７とＥＸＯ１制御との間の機能的クロストークのさらなる解析のために、Ｅ４７のＲＮＡｉ媒介性の遺伝子ノックダウンとＥ４７−ＥＹＦＰ融合タンパク質の一時的過剰発現とを利用した。
【００３０】
図４ｂはＥ４７タンパク質レベルのＲＮＡｉ媒介性のノックダウンを示す。ＨｅＬａ細胞に、Ｅ４７に指向性を有する独立した標的配列（ｓｉ１〜ｓｉ４）又は非特異的な対照配列（ｓｉ−ｃｔｒｌ）を保有するｐＳＵＰＥＲ構築物を一次的にトランスフェクトした。タンパク質を４８時間後に抽出し、抗Ｅ４７抗体を使用してウェスタンブロット解析を行った。構築物ｓｉ１及びｓｉ３で、Ｅ４７タンパク質発現の顕著な低減が起こったので、これらをデュアルルシフェラーゼアッセイで使用するために選択した。図４ｃは、プロモータハプロタイプｒｓ１７６１８１＿Ａ／ｒｓ１７７６１８０＿Ｇを表すｐＧＬ３エンハンサー構築物を用いるデュアルルシフェラーゼアッセイの結果を示す。ｓｈＲＮＡ構築物ｓｉ１及びｓｉ３によるＥ４７の遺伝子サイレンシングがプロモータ活性を有意に増大させたが、非特異的な対照ｓｈＲＮＡは対照ベクター（ｖｃ、空のｐＧＬ３エンハンサー）との比較で全く効果を示さなかった。さらに、Ｅ４７−ＥＹＦＰ融合タンパク質の過剰発現により、レポーター遺伝子の発現が損われた。（＋）はｃｔｒｌ−ｓｉに対する有意な上方制御を示し、（−）はｃｔｒｌ−ｓｉに対する有意な下方制御を示している（＊Ｐ＜０.０５、＊＊Ｐ＜０.０１）。図４ｄはＥＸＯ１及びＥ４７／ＴＣＦ３の重複組織発現パターンを示す。市販のヒトｃＤＮＡ組織パネルを、ＲＴ−ＰＣＲによる組織分布を解析するのに使用した（詳細に関しては以下の「補足方法」を参照されたい）。発現の重複を、脾臓、胸腺、肝臓、精巣及び卵巣で検出することができる。ＧＡＰＤＨの発現を対照として示す。
【００３１】
予想通り、ＲＮＡｉによるＥ４７のノックダウンにより、ＥＸＯ１プロモータ活性の統計的に有意な増大が起こり（図４ｂ）、Ｅ４７の過剰発現により、ルシフェラーゼ活性が低減した（図４ｃ）。この新規の制御機構は、ＥＸＯ１及びＥ４７／ＴＣＦ３の両方を発現する組織及び細胞型にしか関連しないので、両方の遺伝子の組織分布パターンを解析した。図４ｄに示されるように、ＥＸＯ１は胸腺、脾臓及び精巣で強く発現し、脳、肝臓及び卵巣では検出可能ではあったが弱い発現しか示さなかった。最も興味深いことには、Ｅ４７／ＴＣＦ３のｍＲＮＡが、脾臓、胸腺、肝臓及び精巣において最も高いシグナルで顕著に類似した発現パターンを示し、心臓、脳及び卵巣ではより低い発現しか示さなかった。このため、ＥＸＯ１及びＥ４７／ＴＣＦ３の同時発現はリンパ組織及び生殖管で最も顕著であった。
【００３２】
まとめると、本発明者らのデータは、ＥＸＯ１転写制御に対するプロモータＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８０の対立遺伝子変異体の大きな影響を示し、ＥＸＯ１発現のリプレッサーとしてのＥ４７に関する重要で且つこれまでに記載されていない役割を示唆している。
【００３３】
１００歳以上のフランス人女性で確認されたプロモータＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８０と長寿命表現型との関連性
機能的多型ｒｓ１７７６１８０と長寿命との間の関連性の独立検証を得るために、４５０人の１００歳以上のフランス人及び年齢範囲が対照のドイツ人のものと同程度であった１０９人の若齢者の集団においてＳＮＰを解析した。マーカーの効果はドイツ人女性でのみ明らかであったので（表２ｂ及び図３ｃ）、複製に関しては、女性だけを考慮した。フランス人では、ＡＰＯＥに関して調整した解析により関連性シグナルが確認された（ＰＡＰＯＥ＝０．０４４）（表２ｃ）。両方の集団で、対立遺伝子及び遺伝子型の頻度は非常に類似しており、対照と比較して１００歳以上の人でＣ対立遺伝子が濃縮された。このため、複合的な遺伝子及び機能解析により、極めて高齢まで生存する能力に影響を与えるＥＸＯ１の対立遺伝子特異的な制御におけるｒｓ１７７６１８０の極めて重要な役割が指摘される。
【００３４】
考察
本願の発明者らは、ヒトにおける非常に優れた平均余命に関する新規の感受性遺伝子座としてエキソヌクレアーゼ１遺伝子（ＥＸＯ１）を同定している。関連のプロモータＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８０は、ＥＸＯ１発現に影響することにより機能的に関連することが見出された。興味深いことに、この関連性は、男性よりも女性でより強く現れた。ｒｓ１７７６１８０周辺のプロモータ領域は、Ｇ対立遺伝子が存在する場合に限り、Ｅ４７に対する結合部位を含有する。Ｃ対立遺伝子が１００歳以上の人で濃縮され、結合部位が失われる。Ｅ４７がＥＸＯ１転写のリプレッサーとして働くので、結果としてｒｓ１７６１８０でのＧのＣへの置換によりプロモータ活性が高くなる。女性において遺伝子発現の統計的に有意な増大を示したリンパ芽球細胞株でのＥＸＯ１のｍＲＮＡレベルのｅｘ  ｖｉｖｏ解析により、裏付けとなる証拠が得られた。
【００３５】
ＥＸＯ１は、ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）、並びに有糸分裂性及び減数分裂性の組換え、二本鎖破壊及びＵＶ損傷修復を含む、ゲノム安定性に作用する他のＤＮＡ代謝経路、並びにテロメア完全性に関与する５’−３’エキソヌクレアーゼを表す（Qiu et al. 1999、Liberti & Rasmussen 2004）。ＥＸＯ１はヒト早老疾患の１つであるウェルナー症候群に関与する遺伝子によりコードされるＷＲＮタンパク質に物理的に相互作用する（Sharmaet al. 2003）。ＷＲＮはゲノム安定性の全体の維持に重要であり、またＥＸＯ１のように、ＤＮＡ修復及びテロメア代謝に必要とされる（非特許文献４）。両方のタンパク質の結合により、ＥＸＯ１の強い活性化が引き起こされる（Sharmaet al. 2003）。ＥＸＯ１のＷＲＮ刺激は、テロメアの複製及び安定性、及び／又はテロメアが短くなるのに対するＤＮＡ損傷及びシグナルチェックポイント経路の活性化に重要であり得ることが示唆されている（Sharmaet al. 2003）。ＥＸＯ１がこれらの経路に関与することが、テロメア機能不全酵母及びマウスモデルの両方で示されている（Maringele &Lydall 2002、Schaetzlein et al. 2007）。
【００３６】
平均余命の制御におけるＥＸＯ１の重要な役割が、この遺伝子のヌクレアーゼドメインにおける欠失に関してホモ型である２つの異なるノックアウトマウス株（Ｅｘｏ１−／−）でこれまでに報告されてきた。これらの動物は生存することができたが、その寿命は非常に短かった（Wei et al. 2003、Schaetzlein et al. 2007）。１匹目のＥｘｏ１−／−ノックアウトマウスを混合遺伝的背景で生成した。これらの動物はそのＭＭＲ系を欠いており、癌の自然発生率がわずかに高かった（Weiet al. 2003）。これらの結果は、寿命に対するＥＸＯ１活性増大の有益な影響が突然変異回避をもたらし、これにより腫瘍形成が予防されるという可能性を提起している。しかしながら、最近の試験により、これまでのものとは異なる遺伝的背景のノックアウトマウスでのＥｘｏ１不活性化が（Weiet al. 2003）、有意に癌形成を起こすことなく生存を大幅に妨げたことが示されており、このことは他の因子がＥｘｏ１−／−マウスの寿命の減少に寄与していることを示している（Schaetzleinet al. 2007）。同様に、ヒトにおいて突然変異によるＥＸＯ１効率の変化が発癌性に作用するかどうかについても明らかになってはいない（Liberti& Rasmussen 2004でレビューされる）。ＥＸＯ１変異と、癌と、平均余命とが関係する可能性をさらに解明する必要がある。
【００３７】
本発明のデータは、Ｅ４７を、ＥＸＯ１転写のリプレッサーとして見なす。Ｅ４７（遺伝子ＴＣＦ３／Ｅ２Ａによりコードされる）は、ベーシックへリックス−ループ−へリックス転写因子のファミリーに属しており、細胞の寄与（commitment）、成長及び分化の制御に関与している（Slattery et al. 2007）。ＴＣＦ３／Ｅ２Ａ欠損マウスリンパ腫細胞株を使用した最近の試験及びＤＮＡマイクロアレイデータの階層的クラスター解析が細胞周期の進行、脂質代謝、ストレス応答及び細胞生存に寄与するＥ４７依存的な遺伝子発現パターンを同定した（SchwartzR et al., 2006）。興味深いことに、Ｅ４７と加齢プロセスとを結び付ける幾つかの証拠が存在する：Ｅ４７のｍＲＮＡレベル及び活性が若齢のマウスと比較して高齢のマウスの脾臓及び骨髄で低減する（FrascaD. et al., 2003）。さらに、Ｅ４７活性の低下が、老化Ｂ細胞における免疫グロブリンクラススイッチの低減に相関があることが分かっている（FrascaD. et al., 2004）。細胞加齢プロセスへのＥ４７の寄与が、Ｅ４７の遺伝子サイレンシングがヒト線維芽細胞における細胞の老化の開始を遅らせるという研究結果からさらに強調されている（ZhengW et al., 2004）。その上、Ｅ４７はリンパ系統の発生に重要である。Ｅ４７は成熟Ｂ細胞及びＴ細胞並びにその前駆体の両方で検出されており（Murre2005）、造血活性のある領域である組織、すなわち成人の骨髄（Liberti & Rasmussen 2004）、脾臓及び胸腺で高い発現を示す（図４ｄ）。この試験で観察されたＥＸＯ１発現に対するＥ４７の制御機構は、ｒｓ１７７６１８０のＣ対立遺伝子が有益となるには、両方の遺伝子の同時発現が必要とされることを示唆している。厳密には、本発明者らのデータにより、肝臓、胸腺、脾臓、精巣及び卵巣を含む多くの組織での発現プロファイルの重複が明らかになる。生殖器における両方の遺伝子の同時発現は、ＥＸＯ１の対立遺伝子特異的な発現が減数分裂性組換え中のＤＮＡ損傷からの生殖細胞系の保護に関与し得るという見解を支持する。生殖細胞成熟中の突然変異回避が平均余命の増大と結び付くかどうかについては依然として明らかになっていない。一方で、Ｅ４７/ＴＣＦ３及びＥＸＯ１の重複発現はリンパ組織でも検出可能であり、これにより造血及び免疫応答の制御に特異的な役割が論じられた。このシナリオは、Ｅ４７及びＥＸＯ１の両方が例えばクラススイッチ組換え及びＢ細胞発生中の抗体多様性の発生に関与するという見解により支持される（Liberti& Rasmussen 2004、Murre 2005）。このため、ＥＸＯ１活性の増強が、加齢中に起こる体液性及び細胞性の免疫不全を軽減させることができると仮定される。
【００３８】
本試験において、女性に特異的であると考えられる、ＥＸＯ１プロモータＳＮＰと長寿命との関連性が観察された。性別が、様々な年齢に関連する疾患頻度における重要な差異を説明しており、また極めて高齢に達する能力に対して遺伝的影響における役割を果たすと考えられることから、この研究結果は何ら驚くべきものではない。高齢者の中で女性の有病率は異なっており、１００歳以上の人（centenarians and super-centenarians）の集団によっては最大８５％にも達することもある（Perls& Terry 2003）。男性及び女性における死亡率は加齢中の異なる軌跡に従い、環境要因と遺伝的要因との複雑な相互作用が長寿命を達成する性別特異的な可能性に影響を与えると考えられることが示唆されている（Franceschiet al. 2000、Candore et al. 2006）。
【００３９】
ＥＸＯ１遺伝子に関する本発明の結果は、遺伝的な長寿命の調査における１００歳以上の人の重要性のもう１つの例である。超高齢者は、各出生コホート特異的な年齢分布の最上部のパーセンタイルに属し、ほとんどの同格人（peers）よりも数十年、長生きする。平均余命に対する遺伝的関与が非常に高齢で最も強いので（非特許文献８）、１００歳以上の人は、長寿命を可能にする遺伝子において有益な変異が特に豊富であり得る（非特許文献７）。この仮説は、ＥＸＯ１の変異が非常に高齢での遺伝子発現の増大及び延命効果をもたらすことを実証する、本試験での研究結果により強固なものとなる。したがって、ＥＸＯ１は新規の長寿命を可能にする遺伝子であると考えることができる。
【実施例】
【００４０】
実施例
方法
試験参加者
ドイツ人のＤＮＡコレクション及び採用方法は他で詳細に報告された（Nebel et al. 2005）。試料には、３８１人の１００歳以上の人（１００歳〜１１０歳（確認済（at ascertainment））、平均１０１．３歳）（その７９％が女性であった）が含まれていた。１００歳以上の人の症例試料を、性別及び国内の地理的起源を考慮することにより、４０９人の若齢の対照群（６０歳〜７５歳、平均６６．６歳）に特異的に適合させた。１００歳以上の人及び対照を地域及び性別で適合し、ドイツ人において異なる集団間で非常に低いＦＳＴ値が報告されたので、結果を潜在的な集団基礎構造（substructure）に関しては補正しなかった（Steffenset al. 2006）。さらに、本発明者らの長寿命試験集団の妥当性及び有効性がこれまでに実証されている（Nebel et al. 2005）。フランス人の試料集合は、これまでに示されたように、４５０人の１００歳以上の女性（平均年齢１０３．７歳）と、１０９人の対照女性（年齢６０歳〜７０歳、平均年齢６４．５歳）とから成っていた（Blanche et al. 2001）。標準的な方法を用いて全ての参加者の血液試料からＤＮＡを単離した。全ての被験者は、参加する前に書面によるインフォームド・コンセントを行った。試験は、参加センターの審査委員会組織のそれぞれで承認された。
【００４１】
遺伝子及びｃＳＮＰ選択
研究した９２個のコーディングＳＮＰ（表３）は、ＤＮＡ修復プロセスに関与する４９個の遺伝子に位置しており、他で記載のｃＳＮＰパネルのサブセットを表している（Hampe et al. 2007、以下のＵＲＬを参照されたい）。
【００４２】
遺伝子型決定
遺伝子型決定を、ＳＮＰｌｅｘ（商標）遺伝子型決定システム及びＴａｑＭａｎ（登録商標）ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイ（Applied Biosystems, Foster City, USA）を使用して行った。
【００４３】
統計解析
単一マーカーの症例対照解析を、Ｇｅｎｏｍｉｚｅｒ（以下のＵＲＬを参照されたい）を用いて行った。タギングＳＮＰをヨーロッパ人のＨａｐＭａｐ遺伝子型に基づき選択し（以下のＵＲＬを参照されたい）、ペアワイズタギングオプションをＨａｐｌｏｖｉｅｗ  ｖ３．３２プログラムで実行した（以下のＵＲＬを参照されたい）（最小対立遺伝子頻度０．０３、ペアワイズｒ２≧０．８、ＰＨＷＥ＞０．０１、タグＳＮＰに関しては表５を参照されたい）。Ｈａｐｌｏｖｉｅｗを、対照におけるＳＮＰ間の連鎖不均衡（ＬＤ）の評価基準ｒ２を決定するのにも使用した。ドイツ人の試料において分類された７つのＥＸＯ１のＳＮＰ（表２ａ）と、フランス人の試料集合で分類された機能的に関連したＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８０との両方を、統計プログラムＲ（以下のＵＲＬを参照されたい）による遺伝子型に関する乗法効果モデルを使用し、ＡＰＯＥに関して調整して、ロジスティック回帰により解析した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意であるとみなした。
【００４４】
突然変異検出
ＥＸＯ１のエキソン、イントロン−エキソン境界及びプロモータ領域のシークエンシングを、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Applied Biosystems）を用いて４７人の１００歳以上の人で行った（プライマー配列に関しては、表７を参照されたい）。「ヒトＤＮＡに関する第１エキソン及びプロモータ予測プログラム（FirstExon and Promoter Prediction Program for Human DNA）」（以下のＵＲＬを参照されたい）によりＥＸＯ１プロモータの位置を特定した。シークエンシングトレースを、ｎｏｖｏＳＮＰを使用してＳＮＰ及びインデルの存在に関して検査した（Weckxet al. 2005）。
【００４５】
ヒト細胞株の細胞培養及びトランスフェクション
ヒト細胞株を、補足方法（以下を参照されたい）に記載のような標準的な条件下で培養した。トランスフェクションを、製造業者のマニュアルに従ってＦｕｇｅｎｅ６（商標）（Roche, Basel, Switzerland）を使用して行った。
【００４６】
プラスミドの構築
酵母におけるヒトＥＸＯ１タンパク質変異体の過剰発現（２つのｃＳＮＰ  ｒｓ７３５９４３Ａ／Ｇ［Ｈ３５４Ｒ］及びｒｓ４１４９９６５Ｇ／Ａ［5４５８Ｍ］で異なる対立遺伝子による）のためのプラスミドの構築、及びＥＸＯ１の５’ＵＴＲ及び５’プロモータ領域の定量解析を、補足方法（以下を参照されたい）に記載のような標準的なクローニング法を使用して行った。
【００４７】
酵母株及びＤＮＡ損傷処理
ＵＶ  Ｂ感受性酵母株ＦＤＥＲ（Δｅｘｏ１／Δｒａｄ５１、Qiu et al. 1999）を、標準的な酵母形質転換法を使用して、ヒトＥＸＯ１タンパク質変異体に関する過剰発現クローンの作製に使用した。ＵＶ  Ｂ誘導性のＤＮＡ損傷の定量のために、酵母細胞を成長プレート上に広げ、０ｍＪ／ｃｍ２〜４０ｍＪ／ｃｍ２の範囲の様々なＵＶ線量に曝し、３０℃で４８時間インキュベートした。さらなる詳細は、補足方法（以下を参照されたい）で与えられる。
【００４８】
デュアルルシフェラーゼアッセイ
５’ＵＴＲ及び５’近位プロモータ領域の定量解析のために、ｐＧＬ３構築物を、以前に記載されたようなデュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイに使用した（Till et al. 2005）。さらなる情報は、補足方法（以下を参照されたい）で与えられる。
【００４９】
電気泳動移動度シフトアッセイ
ヒト細胞株由来の核抽出物の調製及びバンドシフトアッセイを、これまでに記載されたように行った（Arlt et al. 2004）。使用するオリゴヌクレオチドの配列及びさらなる詳細は、補足方法（以下を参照されたい）に概説される。
【００５０】
転写因子結合部位の解析
ＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８１及びｒｓ１７７６１８０に対立遺伝子変異を含有するＥＸＯ１プロモータ領域の解析のために、この配列を、Ｃｏｎｓｉｔｅ（以下のＵＲＬを参照されたい）を使用して潜在的な転写因子結合部位に関して解析した。
【００５１】
リンパ芽球細胞株におけるＥＸＯ１転写レベルの定量
合計１２３個のリンパ芽球細胞株を、標準的なＥＢＶ形質転換法を使用して、非関連の健常ドナーのヘパリン化血液試料（Ｐｏｐｇｅｎバイオバンクのもの、Krawczak et al. 2006）から得た。ＤＮＡを標準的な方法で単離し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＳＮＰ遺伝子型決定アッセイ（AppliedBiosystems, Foster City, USA）を使用して、ｒｓ１７７６１８０に関して遺伝子型分類した。総ＲＮＡを抽出し、製造業者のガイドライン（Qiagen,Hilden, Germany）に従ってQiagenのＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔでプロセシングした。リアルタイムＰＣＲを、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ−Ｓｙｓｔｅｍ（AppliedBiosystems, Foster City, USA）を使用して行った。ＥＸＯ１の発現レベル（アッセイＨｓ００２４３５１３＿ｍ１）を、標準的な曲線法により算出した（Livak& Schmittgen 2001）。有意性をマンホイットニーＵ検定を使用して求めた。
【００５２】
組織特異的な発現パターンの解析
ＥＸＯ１及びＥ４７／ＴＣＦ３の組織発現パターンを解析するために、市販のヒトｃＤＮＡ組織パネル（Clontech）及び標準的なＰＣＲ法を使用した。プライマー配列及びさらなる情報に関しては、以下の「補足方法」を参照されたい。
【００５３】
補足方法
細胞培養
ヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３（ＡＣＣ３０５）、子宮頸癌ＨｅＬａ細胞（ＡＣＣ５７）、ヒト急性単球細胞株ＴＨＰ−１（ＡＣＣ１６）及びヒトＴ細胞白血病ジャーカット細胞（ＡＣ２８２）をＧｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ、Braunschweig, Germany）から購入し、ＤＭＥＭ（ＨＥＫ２９３）又はＲＰＭＩ１６４０（ＴＨＰ−１、ジャーカット、ＨｅＬａ（全てPAALaboratories（Paschberg, Austria）の培地））で培養した。膵臓癌細胞（ＰＣ）は、Ming-Sound Tsao（Ontario,Canada）により無償で提供され、ＲＰＭＩで培養した。培地に、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（それぞれ５０μｇ／ｍｌ）を添加し、細胞を５％  ＣＯ２において３７℃で成長させた。トランスフェクションを、製造業者のマニュアルに従ってＦｕｇｅｎｅ６（商標）（Roche,Basel, Switzerland）を使用して行った。
【００５４】
プラスミドの構築
酵母細胞におけるヒトＥＸＯ１タンパク質の過剰発現のためのプラスミドを、ＥＸＯ１の全長ｃＤＮＡを、発現ベクターｐＤＢ２０の２つのＮｏｔ  Ｉ部位間に挿入することにより作製した。ＥＸＯ１の５’ＵＴＲの解析のための構築物を、ヒトｃＤＮＡ組織パネル（Clontech, Palo Alto, CA）から５８４ｂｐの５’ＵＴＲ領域を増幅し、ｐＧＬ３対照（Promega, Madison,WI）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位及びＮｃｏ  Ｉ部位に挿入することにより設計した。ＥＸＯ１の５’近位プロモータの解析のための構築物を、ヒトゲノムＤＮＡから１１９９ｂｐのプロモータ領域を増幅し、ｐＧＬ３エンハンサー（Promega）のＮｈｅ  Ｉ部位及びＸｈｏ  Ｉ部位に挿入することにより設計した。対立遺伝子特異的な構築物を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発キット（Stratagene,La Jolla, CA）を使用する部位特異的（site-directed）突然変異により確立した。過剰発現構築物ｐＭｙｃ−Ｅ４７−ＥＹＦＰは、NaiheJing（上海の生物科学研究所（Shanghai Institutes for Biological Sciences）, Shanghai, China)により無償で提供された。Ｅ４７／ＴＣＦ３発現のＲＮＡｉ媒介性ノックダウンのために、Ｅ４７／ＴＣＦ３のｍＲＮＡに指向性を有する４つの独立標的配列（Ｅ４７＿ｓｉ１（配列番号３９）：ＴＧＡＡＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＡＴ、Ｅ４７＿ｓｉ２（配列番号４０）：ＧＡＡＧＧＴＣＣＧＧＡＡＧＧＴＣＣＣＧ、Ｅ４７＿ｓｉ３（配列番号４１）：ＧＧＴＧＴＣＡＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＡ、Ｅ４７＿ｓｉ４（配列番号４２）：ＧＣＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＧＣＣＧＧＧＣ）を、ｐＳＵ−ＰＥＲ．Ｎｅｏ＋ＧＦＰ（OligoEngine,Seattle, WA）に挿入し、ウェスタンブロッティングによるＥ４７タンパク質発現のサイレンシングに関して確認した。Ｅ４７発現をノックダウンさせる効率が最も高い２つの構築物をさらなる実験のために選択した。
【００５５】
酵母株及びＤＮＡ損傷処理
ＵＶ  Ｂ感受性酵母株ＦＤＥＲ（Δｅｘｏ１／Δｒａｄ５１）を、標準的な酵母形質転換法を適用して、ＥＸＯ１の対立遺伝子特異的な変異体に関する過剰発現クローンの作製に使用した。酵母ゲノムへの構築物の挿入を、ヒトＥＸＯ１に関するプライマー又は対照として酵母グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｄｈ１）を用いてＰＣＲにより調べた。以下のプライマーを使用した：Ｓｃ＿ＴＤＨ１−２２５Ｆ（配列番号４３）：ＣＣＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＡＡＣ、Ｓｃ＿ＴＤＨ１−８５５Ｒ（配列番号４４）：ＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＡＣＧ、ＥＸＯ１−９９６Ｆ（配列番号４５）：ＧＡＴＧＣＣＣＣＡＣＡＡＴＴＧＡＡＧＧ、ＥＸＯ１−１５１０Ｒ（配列番号４６）：ＣＧＴＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＣＡＡＣＣ。３つの独立クローンを各構築物で作製し、空の発現ベクター（ｐＤＢ２０）を含有するクローンは陰性対照として働き、ＵＶ  Ｂ非感受性酵母株ＭａＶ２０３は特異性対照として働いた。ＵＶ  Ｂ誘導性のＤＮＡ損傷の定量のために、酵母細胞を成長プレート上に広げ、０ｍＪ／ｃｍ２〜４０ｍＪ／ｃｍ２の範囲の様々なＵＶ線量に曝し（ＵＶＢ光源、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＴＬ２０／Ｗ１２、Eindhoven, Netherlands）、３０℃で４８時間インキュベートした。得られたコロニー数を計測し、非処理対照の割合として算出した。
【００５６】
デュアルルシフェラーゼアッセイ
５’ＵＴＲ及び５’近位プロモータ領域の定量解析のために、ｐＧＬ３構築物を、以前に記載されたようなデュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイに使用した（Till A. et al. 2005）。要するに、ＨｅＬａ細胞又はＨＥＫ２９３（図示せず）に、ｐＲＬ−ＴＫ参照プラスミド（Promega）と組合せてｐＧＬ３レポーター遺伝子構築物をトランスフェクトした。幾つかの実験で、細胞に、Ｅ４７を標的とするｐＳＵＰＥＲのｓｈＲＮＡ構築物又は過剰発現構築物ｐＭｙｃ＿Ｅ４７＿ＥＹＦＰを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Promega）中で溶解し、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔＰｌｕｓ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Berthold,Germany）を使用してレポーター遺伝子活性に関して化学分析した。
【００５７】
電気泳動移動度シフトアッセイ
ヒト細胞株由来の核抽出物の調製及びバンドシフトアッセイを、これまでに記載されたように行った（Arlt et al. 2004）。ＥＸＯ１プロモータの対立遺伝子変異を表すオリゴヌクレオチドの配列は、ＥＸＯ１Ｐ＿ｒｓ１７７６１８０＿Ｃ（配列番号１）：５’−ＣＧＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＧＴＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣ−３'及びＥＸＯ１Ｐ＿ｒｓ１７７６１８０＿Ｇ（配列番号２）：５’−ＣＧＧＧＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＡＧＴＣＧＴＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＣＴＧＴＣＴＡＣＣ−３’であった（変異を受ける（affected）ヌクレオチド位置を下線処理している）。記載のように、特異的な結合の競合を、１００倍モル過剰で非標識オリゴヌクレオチドＥＸＯ１Ｐ＿ｒｓ１７７６１８０＿Ｇを添加することにより調べ、また非特異的な競合を、１００倍及び２００倍モル過剰で非標識ｏｃｔ−１オリゴ（Promega）を添加することにより調べた。
【００５８】
ウェスタンブロッティング
Ｅ４７／ＴＣＦ３を標的とするｐＳＵＰＥＲ構築物を一時的にトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞をプロテアーゼ阻害剤の存在下でＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中に溶解した。透明になった（Cleared）タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ウェスタンブロッティングをこれまでに記載されたように行った（Till, A.et al. 2005）。Ｅ４７タンパク質レベルを特異的なマウス抗Ｅ４７抗体（Ｇ９８−２７１、BD Biosciences, San Jose, CA）を使用して検出し、挿入量（equalloading）をβ−アクチン（マウス抗アクチン抗体、Sigma-Aldrich Corp.（St. Louis, MO）から購入）の可視化により明らかにした。
【００５９】
組織特異的な発現パターンの解析
ＥＸＯ１及びＥ４７／ＴＣＦ３の組織発現パターンを解析するために、市販のヒトｃＤＮＡ組織パネル（Clontech）及び標準的なＰＣＲ法を使用した。以下のプライマーを使用した：ヒトＥＸＯ１の解析では、ＥＸＯ１−９９６Ｆ（配列番号４５）：ＧＡＴＧＣＣＣＣＡＣＡＡＴＴＧＡＡＧＧ、ＥＸＯ１−１５１０Ｒ（配列番号４６）：ＣＧＴＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＣＡＡＣＣ、Ｅ４７/ＴＣＦ３の解析では、ＴＣＦ３−２６６Ｆ（配列番号４７）：ＣＣＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＴＴＣＣＴＧ、ＴＣＦ３−１８９３Ｒ（配列番号４８）：ＣＣＡＣＡＣＣＴＧＡＣＡＣＣＴＴＴＴＣＣＴＣ。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを対照として使用し、以下のプライマーを使用して増幅した：ＧＡＰＤＨ＿Ｆ（配列番号４９）：ＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ、ＧＡＰＤＨ＿Ｒ（配列番号５０）：ＣＡＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣ。
【００６０】
産業上の利用可能性
本発明は特に、非常に優れた平均余命に関連するヌクレオチド配列を有する人のスクリーニングに有用である。さらに、本発明は、生殖細胞系の保護と、感染性及び悪性の疾患並びに加齢に関連する疾患の治療とのために医薬組成物を調製するのに有用である。さらに、本発明は、競合結合因子として転写因子Ｅ４７を使用することによるＥＸＯ１遺伝子の発現に作用する物質のスクリーニングに有用であることが理解される。最後に、転写因子Ｅ４７自体が、治療、例えばＲＮＡ干渉を介した遺伝的標的化の基礎となり得る。
【００６１】
【表１】
2011510615.tif 000003
【００６２】
表２ａ：関連したＥＸＯ１のＳＮＰの潜在的な機能的関連性（ドイツ人試料）
【表２ａ】
2011510615.tif 000004
【００６３】
表２ｂ：ＥＸＯ１のＳＮＰに関する女性のサブグループ解析（ドイツ人試料）
【表２ｂ】
2011510615.tif 000005
【００６４】
表２ｃ：フランス人試料集団（女性）におけるＥＸＯ１プロモータＳＮＰ  ｒｓ１７７６１８０に関する複製結果
【表２ｃ】
2011510615.tif 000006
【００６５】
表２ａ〜表２ｃに対する説明
ＭＡ：最小対立遺伝子
ＭＡＦ：最小対立遺伝子頻度
ＰＣＣＡ：対立遺伝子に基づく症例対照χ２検定により得られたＰ値
ＰＣＣＧ：遺伝子型に基づく症例対照χ２検定により得られたＰ値
ＰＡＰＯＥ：乗法モデルでＡＰＯＥに関して調整した後にロジスティック回帰解析により得られたＰ値
ＯＲＡＰＯＥ：ＡＰＯＥに関して調整した、参照対立遺伝子として対照において最小対立遺伝子で高齢に達するオッズ比；ＣＩ：ＯＲＡＰＯＥでの９５％信頼区間
【００６６】
表３：解析した４９個の修復遺伝子における９２個のｃＳＮＰのリスト
【表３ａ】
2011510615.tif 000007
【表３ｂ】
2011510615.tif 000008
【表３ｃ】
2011510615.tif 000009
【表３ｄ】
2011510615.tif 000010
【００６７】
表４：他のＤＮＡ修復遺伝子におけるわずかに有意なＳＮＰに関する相関性統計（ドイツ人試料）
【表４】
2011510615.tif 000011
【００６８】
表５：ＥＸＯ１領域の精細マッピング
【表５ａ】
2011510615.tif 000012
【表５ｂ】
2011510615.tif 000013
【００６９】
表６：ＴＣＦ３遺伝子領域の精細マッピング
【表６】
2011510615.tif 000014
【００７０】
表７：ＥＸＯ１の突然変異検出に使用したプライマー配列
【表７ａ】
2011510615.tif 000015
【表７ｂ】
2011510615.tif 000016
【００７１】
エキソンの数字は、ＮＭ＿００３６８６に関するＮＣＢＩ命名法に従う。ＮＭ＿１３０３９８アイソフォームの付加的なエキソンをここでは０２ａと称する。表７で与えられるヌクレオチド配列は、配列番号３〜配列番号３８に等しい。
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【図１】
2011510615.tif 000017
【図２】
2011510615.tif 000018
【図３】
2011510615.tif 000019
【図４−１】
2011510615.tif 000020
【図４−２】
2011510615.tif 000021
【図５】
2011510615.tif 000022
【配列表】
2011510615000001.app
【国際調査報告】
2011510615.tif 000023
2011510615.tif 000024
2011510615.tif 000025