(57)【要約】本発明は、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）ニガウリ属のニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ  Ｌ.）から分離して得られた、下記一般式に示されるククルビタン型トリテルペン化合物の糖尿病および肥満の予防および治療用の薬剤の調製における医薬用途に関する。前記ククルビタン型トリテルペン化合物は、グルコース取込み促進剤、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行のアゴニスト、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化剤であるので、糖尿病および肥満を予防および治療することができる。 2011510934.tif 000012【選択図】なし
2011510934.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式に示された構造を持つ、 ニガウリから抽出されたククルビタン型トリテルペン化合物の、糖尿病および肥満の予防および治療用の薬剤の調製における用途：
【化１】
2011510934.tif 000006
このうち、Ｒ1は、β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルで、Ｒ2は水素原子で、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5とＲ6はヒドロキシル基で、Ｒ7はメチル基であり、かつＣ５とＣ６は二重結合を形成し、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４のキラリティーは、それぞれＳ、Ｓ、Ｒ立体配置であり；
あるいは、Ｒ1はβ−Ｄ−キシロピラノシル（１→４）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）］−β−Ｄ−グルコピラノシルで、Ｒ2は水素原子で、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5とＲ6はヒドロキシル基で、Ｒ7はメチル基であり、かつＣ５とＣ６は二重結合を形成し、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４のキラリティーは、それぞれＳ、Ｓ、Ｒ立体配置であり；
あるいは、Ｒ2、Ｒ6はヒドロキシル基で、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4とＲ5は水素原子で、Ｒ7はアルデヒド基であり、かつＣ５とＣ６、Ｃ２３とＣ２４は二重結合を形成しており；
あるいは、Ｒ1、Ｒ2は水素原子で、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5とＲ6はヒドロキシル基で、Ｒ7はメチル基であり、かつＣ５とＣ６は二重結合を形成し、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４のキラリティーは、それぞれＳ、Ｓ、Ｒ立体配置である。
【請求項２】
前記化合物がモモルジコシドＡであり、下記一般式に示されることを特徴とする請求項１に記載の用途。
【化２】
2011510934.tif 000007
【請求項３】
前記化合物がモモルジコシドＢであり、下記一般式に示されることを特徴とする請求項１に記載の用途。
【化３】
2011510934.tif 000008
【請求項４】
前記化合物がトリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アルであり、下記一般式に示されることを特徴とする請求項１に記載の用途。
【化４】
2011510934.tif 000009
【請求項５】
前記化合物が２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンであり、下記一般式に示されることを特徴とする請求項１に記載の用途。
【化５】
2011510934.tif 000010
【請求項６】
前記ニガウリから抽出されたククルビタン型トリテルペン化合物が、グルコース取込み促進剤、グルコース輸送体４の膜移行のアゴニスト、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼの活性化剤であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の用途。
【請求項７】
糖尿病および肥満の予防および治療活性を有する薬剤組成物であって、前記組成物が、下記一般式に示される、ニガウリから抽出されたククルビタン型トリテルペン化合物の１種類または多種類を治療有効量で含み、かつ、その薬学的に許容し得る補助剤を含むことを特徴とする薬剤組成物：
【化６】
2011510934.tif 000011
このうち、Ｒ1は、β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルで、Ｒ2は水素原子で、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5とＲ6はヒドロキシル基で、Ｒ7はメチル基であり、かつＣ５とＣ６は二重結合を形成し、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４のキラリティーは、それぞれＳ、Ｓ、Ｒ立体配置であり；
あるいは、Ｒ1はβ−Ｄ−キシロピラノシル（１→４）−［β−Ｄ−グルコピラノシル(１→６)］−β−Ｄ−グルコピラノシルで、Ｒ2は水素原子で、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5とＲ6はヒドロキシル基で、Ｒ7はメチル基であり、かつＣ５とＣ６は二重結合を形成し、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４のキラリティーは、それぞれＳ、Ｓ、Ｒ立体配置であり；
あるいは、Ｒ2、Ｒ6はヒドロキシル基で、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4とＲ5は水素原子で、Ｒ7はアルデヒド基であり、かつＣ５とＣ６、Ｃ２３とＣ２４は二重結合を形成し；
あるいは、Ｒ1、Ｒ2は水素原子で、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5とＲ6はヒドロキシル基で、Ｒ7はメチル基であり、かつＣ５とＣ６は二重結合を形成し、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４のキラリティーは、それぞれＳ、Ｓ、Ｒ立体配置である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬化学分野に属し、より詳しくは、ニガウリから抽出されたククルビタン型トリテルペン化合物およびその薬剤組成物の、糖尿病および肥満の予防および治療における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、全世界における糖尿病の患者は、すでに１．５億人を超えており、２０２５年まで３億人に達すると予測されている。その患者の大部分はＩＩ型糖尿病患者（Ｔ２Ｄ）である。ＩＩ型糖尿病の主な代謝異常はインスリン抵抗性であるので、インスリン抵抗性を改善することにより糖尿病を治療するためのインスリン抵抗性改善薬は、今の糖尿病治療薬研究の重点の一つである。ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲｓ）またはＡＭＰＫという２つの薬理学ルートを通じて、インスリン抵抗性を改善することができる。今よく使われる２種類の薬剤は、チアゾリジンジオン系（ＴＺＤｓ）とビグアニド系薬剤である。チアゾリジンジオン系薬剤は、幅広く使用されているが、例えば肥満、体液貯留や心不全などのような不良反応を起こしている。ビグアニド系のメトホルミンは、肥満を引き起こさないが、筋肉に作用せず、主として肝臓に作用しているので、糖尿病の治療において好ましくない。より好ましいインスリン抵抗性改善薬を探すことが、現在の糖尿病治療薬研究の重点の一つである。
【０００３】
現在、世界における１０億を超える成人が過体重であり、その中の３億人は肥満患者で、その数も急激な上昇傾向にあると同時に、肥満と関連する疾病（例えばＩＩ型糖尿病、心臓病、脳卒中や高血圧など）の発症率の増加を伴っている。過体重と肥満を引き起こす主な原因は、高カロリー高脂肪食、運動不足や都市化の加速である。現在、発売されかつ長期にわたり使用できるダイエット薬は２つだけあり、１つは特異性の胃消化管リパーゼ阻害剤としてのオーリスタットであるが、一般的に胃腸の副作用を有している。もう１つはモノアミン再取り込み阻害剤としてのシブトラミンであるが、血圧上昇と心拍数増加を引き起こしている。したがって、安全かつ有効なダイエット薬を探すことが強く望まれていた。
【０００４】
ニガウリ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ  Ｌ.）は、ウリ科ニガウリ属植物である。長い間、我が国では、ニガウリを解熱、解毒、視力回復、胃の活性化、口渇の軽減、下痢止め薬として、または殺寄生虫薬として広く民間で用いられてきた。ニガウリ中の化学成分としては、トリテルペノイドサポニン、セレブロシド、タンパク質などが挙げられる。ニガウリの血糖低下作用に関する文献は非常に多い。しかし、ニガウリから抽出されたククルビタン型トリテルペン化合物の活性に関する文献は少なく、２００６年にＬｉｖａ  Ｈａｒｉｎａｎｔｅｎａｉｎａらにより、ニガウリから抽出された２つのトリテルペンである５β，１９−エポキシ−３β，２５−ジヒドロキシククルビタ−６,２３（Ｅ）−ジエンと３β，７β，２５−トリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アルが、４００ｍｇ/ｋｇの投与量でアロキサン誘発糖尿病マウスに対し血糖低下作用を示すことが報告されているにすぎない（Ｃｈｅｍ.  Ｐｈａｒｍ.  Ｂｕｌｌ.,  ２００６,  ５４,  １０１７−１０２１；非特許文献１）。しかし、その報告において用いられた糖尿病モデルも信頼できるものではない。その他、これらの化合物が、筋肉細胞と脂肪細胞へのグルコース取り込みを促進し、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行を促進し、かつアデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性を増加させることにより、糖尿病および肥満を予防および治療できることはいずれの文献にも開示されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｈｅｍ.  Ｐｈａｒｍ.  Ｂｕｌｌ.,  ２００６,  ５４,  １０１７−１０２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、以下の構造を持つ、ニガウリから抽出されたククルビタン型トリテルペン化合物およびその薬剤組成物の糖尿病および肥満の予防および治療用の薬剤の調製における用途を提供することである。特に、これらの化合物は、筋肉細胞と脂肪細胞へのグルコース取り込みを刺激し、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行を促進し、かつアデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性を増大させる作用を有するため、糖尿病および肥満の予防および治療をすることが可能である。したがって、前記ニガウリから抽出されたククルビタン型トリテルペン化合物およびその薬剤組成物は、筋肉細胞と脂肪細胞へのグルコース取込み促進剤、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行のアゴニスト、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化剤である。
【０００７】
本発明に係る糖尿病および肥満に対し予防および治療活性を有する、ニガウリから抽出されたククルビタン型トリテルペン化合物は、下記一般式に示された構造を持っている。
【０００８】
【化１】
2011510934.tif 000003
【０００９】
このうち、Ｒ1は、β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルで、Ｒ2は水素原子で、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5とＲ6はヒドロキシル基で、Ｒ7はメチル基であり、かつＣ５とＣ６は二重結合を形成し、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４のキラリティーは、それぞれＳ、Ｓ、Ｒ立体配置であり；
あるいは、Ｒ1はβ−Ｄ−キシロピラノシル（１→４）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）］−β−Ｄ−グルコピラノシルで、Ｒ2は水素原子で、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5とＲ6はヒドロキシル基で、Ｒ7はメチル基であり、かつＣ５とＣ６は二重結合を形成し、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４のキラリティーは、それぞれＳ、Ｓ、Ｒ立体配置であり；
あるいは、Ｒ2、Ｒ6はヒドロキシル基で、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4とＲ5は水素原子で、Ｒ7はアルデヒド基であり、かつＣ５とＣ６、Ｃ２３とＣ２４は二重結合を形成し；
あるいは、Ｒ1、Ｒ2は水素原子で、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5とＲ6はヒドロキシル基で、Ｒ7はメチル基であり、かつＣ５とＣ６は二重結合を形成し、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４のキラリティーは、それぞれＳ、Ｓ、Ｒ立体配置である。
【００１０】
本発明に係る糖尿病および肥満に対し予防および治療活性を有する薬剤組成物は、治療有効量の、ニガウリから抽出されたククルビタン型トリテルペン化合物中の１種類または多種類、およびその薬学的に許容し得る補助剤を含むことを特徴としている。前記薬学的に許容し得る補助剤は、当業者に知られた充填剤、賦形剤などを含むが、それらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、化合物モモルジコシド（ｍｏｍｏｒｄｉｃｏｓｉｄｅ）ＡのＬ６筋肉細胞へのグルコース取り込みに対する影響を示す図である。
【図２】図２は、各化合物のグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行に対する影響を示す図である。
【図３】図３は、化合物としてのトリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アルと２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンの、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性に対する影響を示す図である。
【図４】図４は、化合物２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンの、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行とＡＭＰＫリン酸化に対する用量依存関係の測定を示す図である。
【図５】図５は、インスリンシグナル伝達経路を抑制する条件下で、化合物２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンの、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行に対する影響を示す図である。
【図６】図６は、化合物としてのトリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アルと２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンの、プロテインキナーゼＢ（Ａｋｔ）の活性に対する影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図面と具体的な実施例を参照しながら本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１３】
Ｉ．概要
本発明は、ニガウリから抽出して得られたククルビタン型トリテルペン化合物およびその薬剤組成物の、糖尿病および肥満の予防および治療用薬剤の調製における用途に関する。
【００１４】
本発明における前記糖尿病および肥満の予防および治療活性とは、筋肉細胞と脂肪細胞へのグルコース取り込みを刺激し、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行を促進し、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性を増加させることである。
【００１５】
ＩＩ．化合物
本発明に係る糖尿病および肥満の予防および治療活性を有する、ニガウリから抽出されたククルビタン型トリテルペン化合物は、下記一般式に示された構造を有する。
【００１６】
【化２】
2011510934.tif 000004
【００１７】
このうち、Ｒ1は、β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルで、Ｒ2は水素原子で、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5とＲ6はヒドロキシル基で、Ｒ7はメチル基であり、かつＣ５とＣ６は二重結合を形成し、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４のキラリティーは、それぞれＳ、Ｓ、Ｒ立体配置であり；
あるいは、Ｒ1はβ−Ｄ−キシロピラノシル（１→４）−［β−Ｄ−グルコピラノシル（１→６）］−β−Ｄ−グルコピラノシルで、Ｒ2は水素原子で、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5とＲ6はヒドロキシル基で、Ｒ７はメチル基であり、かつＣ５とＣ６は二重結合を形成し、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４のキラリティーは、それぞれＳ、Ｓ、Ｒ立体配置であり；
あるいは、Ｒ2、Ｒ6はヒドロキシル基で、Ｒ1、Ｒ3、Ｒ4とＲ5は水素原子で、Ｒ7はアルデヒド基であり、かつＣ５とＣ６、Ｃ２３とＣ２４は二重結合を形成しており；
あるいは、Ｒ1、Ｒ2は水素原子で、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5とＲ6はヒドロキシル基で、Ｒ7はメチル基であり、かつＣ５とＣ６は二重結合を形成し、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４のキラリティーは、それぞれＳ、Ｓ、Ｒ立体配置である。
【００１８】
具体的に、モモルジコシドＡ、モモルジコシドＢ、トリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アルと２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンであり、その一般式は、それぞれ以下の通りである。
【００１９】
【化３】
2011510934.tif 000005
【実施例】
【００２０】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）用シリカゲル板およびカラムクロマトグラフィー用シリカゲル（２００〜３００メッシュ）は、青島海洋化学工場により生産され、硫酸−バニリンエタノール溶液を使って、薄層クロマトグラフィーのスポットをスプレーして発色させた。
【００２１】
本明細書において、特に説明したところ以外は、溶媒の比率はすべて体積比である。
【００２２】
［実施例１］
化合物の調製
新鮮なニガウリ８５０ｋｇを取り、低温で冷凍乾燥した後、重量測定した結果、８５ｋｇであった。それを粉砕し、常温下で９０％（体積比）エタノール水溶液でそれぞれ３日間計３回浸漬した。エタノール水溶液の使用量は原料重量の１０倍であった。３回で得られたエタノール溶液を混合した後、減圧蒸留して濃縮し、エタノールの全抽出物を得た。エタノールの全抽出物を水（５０Ｌ）で希釈した後、ジクロロメタン（２０Ｌ）と分液操作を行い、ジクロロメタン部分と水溶液を得た。さらに、その水溶液をｎ−ブタノール（２０Ｌ）と分液操作を行い、ｎ−ブタノール部分を８００ｇ得た。８００ｇのｎ−ブタノール部分を、５００ｇのＡＢ−８型多孔質樹脂（天津骨▲交▼工場製)と混合し、サンプルを混合した樹脂を、３ｋｇのＡＢ−８樹脂を充填したクロマトカラムに添加した。１２Ｌ純水、３０％エタノール（体積比）および９５％エタノール（体積比）でそれぞれ溶出し、それぞれの部分であるＫＧ６を６００ｇ、ＫＧ７を６０ｇ、ＫＧ８を８０ｇ得た。
【００２３】
８０ｇの活性部分抽出物ＫＧ８に対し、１００〜２００メッシュのシリカゲル２ｋｇでカラムクロマトグラフィーを行い、体積比が４０：３：１、２０：３：１、１０：３：１および６５：３５：１０のクロロホルム：メタノール：水の下層液体１０Ｌで順次溶出し、５００ｍｌ毎に１つの画分に濃縮し、ＴＬＣ板により測定した。展開溶媒は、体積比が１０：１、６：１、４：１であるクロロホルム：メタノールまたは体積比が１０：３：１、６５：３５：１０であるクロロホルム：メタノール：水の下層液体であり、５％硫酸−バニリンで発色させ、ＴＬＣ板の発色により、類似成分を混合して濃縮し、Ｒｆ値が０．３〜０．４（展開溶媒；クロロホルム：メタノール＝９：１）である成分を合計することにより、成分１を得た。Ｒｆ値が０．３〜０．４（展開溶媒；クロロホルム：メタノール：水＝１０：３：１下層）である成分を合計することにより、成分８を得た。
【００２４】
前記成分１に対し、クロロホルム：メタノール（２０：１）１０００ｍｌでシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、２０ｍｌ毎に１つの画分に濃縮し、ＴＬＣ板により測定し、展開溶媒はクロロホルム：メタノール＝１０：１であり、５％硫酸−バニリンで発色させ、ＴＬＣ板でのＲｆ値が約０．４であるスポットの溶出液を合計して濃縮することにより、化合物トリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アルを１２０ｍｇ得た。
【００２５】
前記成分８に対しＭＣＩカラムクロマトグラフィーを行い、溶離液として３０〜７０％メタノール水溶液各１０００ｍｌで勾配溶出して、得られた４０％成分に対し、さらにＲＰ−１８カラムクロマトグラフィーを行い、３０〜６０％メタノール水溶液５００ｍｌで勾配溶出して、２０ｍｌ毎に１つの画分に濃縮し、ＴＬＣ板により測定した。展開溶媒はクロロホルム：メタノール：水＝８：３：１（下層液体）であり、５％硫酸−バニリンで発色させ、ＴＬＣ板でのＲｆ値が約０．４、０．３であるスポットの溶出液を合計して濃縮することにより、化合物としての２５０ｍｇモモルジコシドＡと３００ｍｇモモルジコシドＢを得た。
【００２６】
４０ｍｇモモルジコシドＡを、３７℃下で０．１Ｍ酢酸水溶液の中に７日間放置し、得られた生成物に対しさらに薄層クロマトグラフィーを行った。展開溶媒はクロロホルム：メタノール＝５：１であり、Ｒｆ値が０．５〜０．６である箇所を合計して２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンを１０ｍｇ得た。
【００２７】
［実験実施例１］
化合物モモルジコシドＡのＬ６筋肉細胞へのグルコース取り込みに対する影響の測定（図１）
Ｌ６筋肉細胞を筋管に完全に分化した後、０．５％ＢＳＡを含む無血清ＤＭＥＭ培地の中に１６時間培養し、次に化合物モモルジコシドＡ（最終濃度５０μＭ）を入れて１時間２０分間処理した。ブランク対照群に対し等体積のＤＭＳＯを入れた。３７℃に保温された１×ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、インスリンを含まないか、または含む（最終濃度１００ｎＭ）０．５％ＢＳＡのＫｒｅｂｓ緩衝液（ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、ＭｇＳＯ４ ２．５ｍＭ、ＣａＣｌ2 １ｍＭ、ＨＥＰＥＳ ２０ｍＭ、ｐＨ７．４）を添加し、３７℃で４０分間培養した後、２−［１，２−３Ｈ（Ｎ）］−デオキシ−Ｄ−グルコース溶液（最終濃度０．５μＣｉ/ｍｌ）を入れ、３７℃で１０分間作用させ、氷浴させた１×ＰＢＳで３回洗浄し、反応を終了させた後、０．１５ｍｌの０．１％ Ｔｒｉｔｏｎを入れて細胞を分解させ、液体シンチレーション計数法で計数し、タンパク質の量でＣＰＭ値を校正した後、Ｌ６細胞のグルコース取り込み量を算出した。
【００２８】
結果から、モモルジコシドＡを１０μＭの投与量でＬ６細胞に対し２時間作用させた後、その基礎レベルとインスリン刺激下でのグルコース取り込み量は明らかに増加することが示された（図１）。データを平均値±標準誤差（Ｘ±ＳＥ）で示した（ｎ＝３）。*相応の条件下でブランク対照群と比較したところ、ｐ＜０．０５であった。
【００２９】
［実験実施例２］
各化合物のグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行に対する活性測定（図２）
Ｌ６細胞を筋管に完全に分化した後、測定対象化合物であるトリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アル、２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エン、モモルジコシドＡとモモルジコシドＢ（最終濃度各１０μＭ）を添加し、細胞を２時間処理し、１００ｎＭインスリンを陽性対照とした。データを平均値±標準誤差（Ｘ±ＳＥ）で示した（ｎ＝３−４）。***溶媒対照群と比較したところ、ｐ＜０．００１であった。実験結果から、化合物であるトリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アルと２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンは、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の細胞膜移行を促進することにより、グルコースを細胞内に取り込ませることが示された。
【００３０】
［実験実施例３］
化合物のトリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アルと２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンの、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）に対する活性測定（図３）
１０μＭの化合物と２ｍＭの５−アミノ−４−イミダゾールカルボキサミドヌクレオチド（ＡＩＣ、陽性対照）またはＤＭＳＯ溶媒の対照条件下で、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を６０分間培養し、１００ｎＭインスリンで２分間または２５分間処理した後、相応の抗体により細胞分解液中のタンパク質ｐＡＣＣとｐＡＭＰＫを測定した。１４−３−３タンパク質の総量でサンプル量を調節した。結果から、化合物であるトリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アルと２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンは、ＡＭＰＫのシグナル伝達経路を明らかに活性化し、さらに糖尿病および肥満の治療作用を有することが示された。
【００３１】
［実験実施例４］
２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンの、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行とＡＭＰＫリン酸化に対する用量依存関係の測定（図４）
実験実施例２および３の方法に基づき、異なる濃度（１０-10、１０-7、１０-6、１０-5Ｍ）下で、２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンに対し測定を行い、実験結果を図４に示した。その中で、Ａはグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行に対する用量依存曲線であり、Ｂは異なる濃度下で３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性に対する影響を示し、Ｃは異なる濃度下で３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における、リン酸化ＡＭＰＫ（ｐＡＭＰＫ）と総ＡＭＰＫ（ｔＡＭＰＫ）の比例の定量図である。結果から、化合物２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンのグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行に対する作用と、ＡＭＰＫリン酸化に対する効果（すなわち、ＡＭＰＫのシグナル伝達経路の活性化）とは強い相関があり、また、濃度が１０-6 Ｍである場合、最大の効果に達することが示された。
【００３２】
［実験実施例５］
化合物２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンの、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞とＬ６筋肉細胞におけるインスリンシグナル伝達経路［すなわち、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ／プロテインキナーゼＢ（ＰＩ−３Ｋ／Ａｋｔ）経路］に対する影響の測定  
〔Ａ〕分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞において、ＤＭＳＯを溶媒として（ＤＭＳＯの最終濃度は０．２％である）、ワートマニン（ｗｏｒｔｍａｎｉｎ、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼの阻害剤）を入れるか、または入れない条件下で、１０μＭ化合物である２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンまたは１００ｎＭインスリン（陽性対照）を添加し、実験実施例２に記載した方法と同様に、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行活性を測定した。データを平均値±標準誤差（Ｘ±ＳＥ）で示した。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１は、溶媒対照群と比較したものである。実験結果から、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼの阻害剤であるワートマニンは、化合物２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンがグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行活性に影響を与えず、すなわち、化合物２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンのＧＬＵＴ４の膜移行活性に対する影響は、インスリンシグナル伝達経路に依存しないことが示された（図５）。
【００３３】
〔Ｂ〕１０μＭ化合物のトリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アルと２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エン、１００ｎＭインスリン（陽性対照）またはＤＭＳＯ溶媒の対照条件下で、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞とＬ６筋肉細胞を３０分間培養した後、相応の抗体によりリン酸化のプロテインキナーゼＢ［Ａｋｔ （Ｓ４７３）］、総プロテインキナーゼＢ （１４−３−３）を測定した。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１は、溶媒対照群と比較したものである。実験結果から、化合物トリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アルと２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンは、プロテインキナーゼＢのリン酸化を促進することができず、化合物トリヒドロキシククルビタ−５,２３（Ｅ）−ジエン−１９−アルと２２（Ｓ），２３（Ｒ），２４（Ｒ），２５−テトラヒドロキシククルビタ−５−エンは、インスリンシグナル伝達経路に影響を与えないことが示された（図６）。
【００３４】
インスリンシグナル伝達経路とＡＭＰＫシグナル伝達経路は、グルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行とグルコース取り込みを調節する２つの主なシグナル伝達経路であるため、図５と図６における結果は、図３と図４から得られた結果と一致しており、すなわち、前記化合物は、ＡＭＰＫシグナル伝達経路によりグルコース輸送体４（ＧＬＵＴ４）の膜移行とグルコース取り込みを調節することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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