(57)【要約】  宿主において免疫応答を刺激、増強又は促進する組成物及び方法を提供する。一実施態様では有効量のＢ７−Ｈ４アンタゴニスト、好ましくはｓＨ４又はその改変体を投与することによって宿主の免疫応答を刺激、増強又は促進する組成物及び方法を提供する。免疫応答を増強して感染、癌を処置するために、又はワクチンの一部としてｓＨ４の組成物を用いることができる。他の好適なＢ７−Ｈ４アンタゴニストとしては、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体特異的抗体、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体特異的阻害核酸及びＢ７−Ｈ４活性をインビボで阻害又は妨害する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物投与単位であって、これを必要とする個体においてＢ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニスト及び医薬用として許容可能な担体を含む医薬組成物投与単位。
【請求項２】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストがｓＨ４又はその改変体である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｂ７−Ｈ４受容体抗体、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体抗体に特異的な阻害核酸、ｓＨ４をコードする核酸及びこれらの組合せからなる群から選択される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記阻害核酸がアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びミクロＲＮＡからなる群から選択される請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記Ｂ７−Ｈ４活性が細胞表面受容体へのＢ７−Ｈ４の結合である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記細胞表面受容体がＴ細胞上の受容体である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記Ｂ７−Ｈ４活性がＴ細胞活性の阻害である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
第２の治療剤をさらに含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記第２の治療剤が成長因子受容体又は腫瘍特異抗原に特異的な抗体又はその抗原結合断片、サイトカイン、ケモカイン、増殖阻害剤及び細胞毒性剤からなる群から選択される請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
個体において免疫応答を刺激又は増強する方法であって、
該個体においてＢ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストを該個体に投与する工程を含む方法。
【請求項１１】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストがｓＨ４又はその改変体である請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｂ７−Ｈ４受容体抗体、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に特異的な阻害核酸、ｓＨ４をコードする核酸及びこれらの組合せからなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記阻害核酸がアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びミクロＲＮＡからなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｂ７−Ｈ４活性が細胞表面受容体へのＢ７−Ｈ４の結合である請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞表面受容体がＴ細胞上の受容体である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｂ７−Ｈ４活性がＴ細胞活性の阻害である請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が前記個体において感染又は癌を処置するために用いられる請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が膀胱、脳、乳腺、頸部、結腸−直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣及び精巣の癌からなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記感染がウイルス、細菌、真菌及び原生動物によるものである感染を処置するための請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ワクチン組成物であって、
抗原及び個体においてＢ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストを含む組成物。
【請求項２１】
前記抗原が該抗原をコードする発現ベクターである請求項２０に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記抗原が抗原性ポリペプチドを含む請求項２０に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記抗原性ポリペプチドがウイルス性、真菌性、細菌性又は原生動物性である請求項２２に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
前記抗原性ポリペプチドが腫瘍特異抗原を含む請求項２２に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
癌を処置する方法であって、
腫瘍細胞上のＢ７−Ｈ４分子に結合するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストを被検体に投与して該Ｂ７−Ｈ４分子が免疫細胞上のＢ７−Ｈ４受容体に結合するのを阻害する工程を含む方法。
【請求項２６】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが抗体又はその抗原結合断片及びｓＨ４からなる群から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記被検体に第２の治療剤を投与する工程をさらに含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２の治療剤が成長因子受容体又は腫瘍特異抗原に特異的な抗体又はその抗原結合断片、サイトカイン、ケモカイン、増殖阻害剤及び細胞毒性剤からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
有効量の放射線を投与する工程をさらに含む請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００６年１２月２７日に出願された米国特許出願第６０／８７７，３１９号および２００７年７月１３日に出願された米国特許出願第６０／９４９，７４２号の利益と米国特許出願第６０／８７７，３１９号および米国特許出願第６０／９４９，７４２号に対する優先権を主張する。米国特許出願第６０／８７７，３１９号および米国特許出願第６０／９４９，７４２号の両方は、その許される全体が参考として援用される。
【０００２】
政府の支援
明細書中に記載される研究のための基金は、Ｌｉｅｐｉｎｇ  Ｃｈｅｎに対して国立衛生研究所により与えられた補助金番号第Ｒ０１  ＣＡ９８７３１により一部は提供された。連邦政府は、本発明における一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、宿主の免疫応答を増強する組成物及び方法、特に癌又は感染症を処置又は抑制する組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
免疫応答を調節することは多くの疾患及び障害の重要な処置法である。例えば、癌又は感染症に罹患している患者の免疫応答を増強することは有益であると考えられる。現在の癌治療は複製細胞を無差別に殺傷する薬物及び／又は放射線の使用をベースとしている。その考え方は、患者の正常細胞を殺傷するより癌細胞よりも速やかに殺傷することである。外科手術は腫瘍塊を減少させるのに用いられるが、癌が一旦転移してしまうと効果はほとんどない。放射線は限局部分においてのみ有効である。
【０００５】
癌処置は、維持療法の場合でさえ、それ自体患者を殺傷し、又は不具にする可能性がある。例えば、一部のタイプの癌の場合、普通なら致命的となる量の化学療法剤による処置後の患者を維持するために、骨髄移植が行われている。しかしながら、固形腫瘍の処置の場合、有効性が証明されていない。攻撃的な癌を処置するためには、各種化学治療剤の「カクテル」並びに超高用量の化学治療剤と回復推進剤、例えば、血小板及び白血球レベルを回復させる顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、エリスロポエチン、トロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｅｔｉｎ）、顆粒球刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、マクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ−ＣＳＦ」）及び幹細胞因子（「ＳＣＦ」）、との併用が用いられている。こうした支持的治療又は制限的治療の場合でも副作用は重篤である。
【０００６】
死亡率及び罹患率を低下させようとして他の処置法が試行されてきた。患者の免疫系を刺激するワクチンが試みられてきたが、大して成功していない。癌を殺すために腫瘍壊死因子、インターフェロンガンマ、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）などの各種サイトカインが単独又は併用で用いられてきたが、治癒をもたらすには至っていない。最近になって、サリドマイドなどの抗血管新生化合物が例外的使用の許可を得た（ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎａｔｅ  ｕｓｅ）症例において試みられ、腫瘍の寛解をもたらすことが示されている。動物実験では、プロテインＣの阻害剤などの凝固促進状態を誘導する化合物を用いて腫瘍の寛解が得られている。新たな研究によって、正常細胞に比し高い濃度で腫瘍細胞から可溶型として放出される腫瘍壊死因子受容体（「ＴＮＦＲ」）などのサイトカイン受容体の阻害剤が腫瘍細胞に対する免疫系の攻撃を回復し得ることができることが示された（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００７】
マウス及びヒトにおける研究は、免疫応答のより特異的な賦活因子としてのサイトカイン蛋白をｉ．ｐ．又は静脈内（ｉ．ｖ．）投与するものであった（非特許文献３；非特許文献４）。マウス卵巣腫瘍を組換えＩＬ−２蛋白とＧＭ−ＣＳＦ蛋白との併用により処置すると、腹水生成の阻害にある程度有益な効果があったが、ＩＬ−２は、ＧＭ−ＣＳＦと併用した場合にのみ有効であった（非特許文献５）。同様に、ＩＬ−２とリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞との併用によってマウスのｉ．ｐ．肉腫を縮小させることができたが、ＩＬ−２蛋白単独では有効ではなかった（非特許文献６）。卵巣癌患者のＩＬ−２蛋白治療を評価したヒト臨床試験では、ある程度の抗腫瘍効果が示された（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。
【０００８】
マウスにおける他の研究は、「自殺」遺伝子をコードするＤＮＡ構築物を注射後、プロドラッグで処置するものであった。この方法により一部の小さな腫瘍の退縮をもたらすことに成功したが、より大きな腫瘍塊に対しては余りうまくいかなかった（非特許文献１２；非特許文献１３）。別の研究において、ＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現する卵巣癌を有するマウスに対しリポソーム媒介性Ｅ１Ａ遺伝子治療が行われた結果、こうした担腫瘍マウスの死亡率が低下した（非特許文献１４）。同様に、ｉ．ｐ．注射によりＩＦＮガンマをコードするＤＮＡ構築物のシスプラチン誘導遺伝子移入を行ってマウス卵巣癌の処置（ＭＯＴ）に成功したことが明らかにされている（非特許文献１５）。しかしながら、この研究から、腫瘍がＩＦＮガンマ遺伝子又はシスプラチン単独に対しては反応性に乏しいことが明らかとなり、シスプラチン利用の遺伝子治療プロトコルの有効性は、主にＩＦＮ遺伝子によるトランスフェクションに対するシスプラチン曝露腫瘍細胞の感受性上昇の増強によるものであることが示唆された（非特許文献１６）。
【０００９】
従って、本発明の目的は、宿主において免疫応答を増強又は促進する組成物及び方法を提供することにある。
【００１０】
別の目的は、感染症又は癌を処置するために宿主の免疫応答を増強する方法及び組成物を提供することにある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊａｂｌｏｎｓｋａ及び  Ｐｅｉｔｒｕｓｋａ、Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．（Ｗａｒｓｚ）１９９７年、４５（５−６）：ｐ．４４９−４５３
【非特許文献２】Ｃｈｅｎほか、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．  １９９７年、５６（５）：ｐ．５４１−５５０
【非特許文献３】Ａｄａｃｈｉほか、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ３７：ｐ．１−６、（１９９３年）
【非特許文献４】Ｌｉｓｓｏｎｉほか、Ｔｕｍｏｒｉ．  ７８：ｐ．１１８−２０（１９９２年）
【非特許文献５】Ｋｉｋｕｃｈｉほか、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、４３：ｐ．２５７−２６１（１９９６年）
【非特許文献６】Ｏｔｔｏｗほか、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０４：ｐ．３６６−３７６（１９８７年）
【非特許文献７】Ｃｈａｐｍａｎほか、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ、６：ｐ．１７９−１８８．（１９８８年）
【非特許文献８】Ｌｉｓｓｏｎｉほか、Ｔｕｍｏｒｉ、７８：ｐ．１１８−１２０（１９９２年）
【非特許文献９】Ｓｐａｒａｎｏほか、Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、１６：２１６−２２３（１９９４年）
【非特許文献１０】Ｆｒｅｅｄｍａｎほか、Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、１６：ｐ．１９８−２１０（１９９４年）
【非特許文献１１】Ｅｄｗａｒｄｓほか、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．、１５：ｐ．３３９９−３４０７  １９９７年）
【非特許文献１２】Ｓｚａｌａほか、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、３：ｐ．１０２５−１０３１（１９９６年）
【非特許文献１３】Ｓｕｇａｙａほか、Ｈｕｍ.  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７：ｐ．２２３−２３０（１９９６年）
【非特許文献１４】Ｙｕほか、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１１：ｐ．１３８３−１３８８（１９９５年）
【非特許文献１５】Ｓｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４：ｐ．３９１−３９６（１９９７年）
【非特許文献１６】Ｓｏｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４：  ３９１−３９６  （１９９７年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
有効量のＢ７−Ｈ４アンタゴニスト、好ましくはｓＨ４又はその改変体を投与することにより宿主の免疫応答を刺激、増強又は促進する組成物及び方法を開発した。ｓＨ４の組成物は、感染症、癌を処置するために、又はワクチンの一部として、免疫応答を増強するために用いることができる。他の好適なＢ７−Ｈ４アンタゴニストとしては、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体特異的抗体、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体特異的阻害核酸及びＢ７−Ｈ４活性をインビボで阻害又は妨害する他の分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
一実施態様において、癌は、宿主の免疫応答を刺激、増強又は促進するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストを宿主に投与することによって処置する。処置することができる代表的な癌としては、膀胱、脳、乳腺、頸部、結腸直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣及び精巣の癌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに別の実施態様では、宿主の免疫応答を刺激、増強又は促進するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストを宿主に投与することによって感染症を処置又は抑制する組成物及び方法を提供する。処置することができる好適な感染症としては、細菌、ウイルス、真菌及び原生動物感染症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
別の実施態様では、Ｂ７−Ｈ４アンタゴニスト、好ましくはｓＨ４を含むワクチン組成物を提供する。このワクチンは抗原供給源をも含む。この抗原供給源はウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は原生動物抗原を供給することができる。好ましい実施態様では、この抗原は腫瘍特異的抗原である。上記ワクチン組成物は任意選択的にアジュバントを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ｂ７−Ｈ４遺伝子の破壊を示す概略図である。マウスＢ７−Ｈ４遺伝子のＩｇＶ及びＩｇＣドメインをコードするエクソンを含有する４．７ｋｂ  ＤＮＡ断片がネオマイシン耐性（Ｎｅｏ）遺伝子をコードする１．７ｋｂ断片によって置換されている。閉四角形はＢ７−Ｈ４をコードするエクソンを表す。エクソン間の線はイントロン配列を表す。開四角は非翻訳エクソンを表す。Ｎｅｏは斜線を施した四角により表されている。
【図２ａ】野生型マウス（◆）又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウス（□）におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ）感染後日数に対する生残百分率を示す折れ線グラフである。
【図２ｂ】ＬＭを感染させた野生型マウス（○）又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウス（▲）の２又は３日目における脾臓１ｇ当たりのＣＦＵ（×１０８）を示すグラフである。
【図２ｃ】ＬＭを感染させた野生型マウス（◆）又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウス（□）におけるＬＭ感染後日数に対する脾臓顆粒球百分率を示す折れ線グラフである。
【図２ｄ】リステリア菌感染の２４時間前に１５０ｐｇのＧｒ−１  ｍＡｂ又は対照ラットＩｇＧ（ＬＰＳ不含）をｉ．ｐ．注射した３匹のＢ７−Ｈ４ＫＯマウス又は同腹仔対照における肝臓１ｇ当たりのＣＦＵ×１０４を示す棒グラフである。次いで、マウスに３×１０６ＣＦＵのリステリア菌をｉ．ｐ．注射した。感染後２４時間に、マウスを屠殺し、肝臓中のリステリア菌を計数した。
【図３】野生型マウス（◆）又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウス（□）におけるＬＭ感染後の時間に対する顆粒球当たりのＬＭ  ＣＦＵを示す棒グラフである。
【図４】ＲＫＯマウス（◆）又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウス（□）におけるＬＭ感染後の日数に対する生存百分率を示す折れ線グラフである。
【図５ａ】図に示した濃度の組換えＧ−ＣＳＦと３日間平板培養した野生型マウス（◆）又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウス（□）の２×１０６個の骨髄細胞におけるＧ−ＣＳＦ（ｎｇ／ｍｌ）に対するＣＰＭを示す折れ線グラフである。培養液は、培養終了前１８時間３ＨＴｄＲでパルスし、収集してシンチレーションカウンターにより計数した。
【図５ｂ】フローサイトメトリーにより分析したゲートされたＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋顆粒球中のＣＦＳＥの希釈度の線グラフのパネルである。そこに示したマウスからの２×１０６個の骨髄細胞をＣＦＳＥで標識し、５日間培養した。細胞は収集してＧｒ−１／ＣＤ１１ｂ  ｍＡｂで二重に染色した。
【図６】日数に対するＣＰＭの折れ線グラフである。正常Ｂ６マウスからの２×１０６個の骨髄細胞を、組換えマウスＧ−ＣＳＦの非存在下（Ａ）、０．１ｎｇ／ｍｌの存在下（Ｂ）又は１ｎｇ／ｍｌの存在下（Ｃ）に２０μｇ／ｍｌの組換えマウスＢ７−Ｈ４Ｉｇ（△）又はマウスＩｇ対照蛋白（▲）で被覆した９６−穴プレート中で平板培養した。図に示したように、２乃至５日目に細胞を収集した。培養液は培養終了前１８時間３ＨＴｄＲでパルスし、収集してシンチレーションカウンターにより計数した。＊Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
Ｉ．定義
本明細書に用いている科学技術用語は全て、別に定義しない限り、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。本発明を実施するために本明細書に記載したものと同様もしくは同等の方法および材料を用いることができるが、以下では好適な方法および材料を記載する。本明細書に記載した刊行物、特許出願、特許その他の文献は全て、許容される場合その全体が参照として本明細書に援用される。係争の場合には、定義を含めて、本明細書が制限するであろう。なお、これらの材料、方法および実施例は、単に例示的なものであり、それに限定することを意図するものではない。
【００１７】
「有効量」又は「治療的有効量」という用語は、宿主の免疫応答を刺激又は増強するか、そうでない場合は所望の薬理学的及び／又は生理学的効果をもたらすのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、対象に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健全性など）、疾患及び実施される処置などの種々の要因によって異なることになる。
【００１８】
ｓＨ４ポリペプチドの「断片」とは完全長のｓＨ４ポリペプチドよりも短いｓＨ４ポリペプチドの断片である。一般に、断片は長さがアミノ酸５個以上である。抗原断片は抗体によって認識され、結合される能力を有する。
【００１９】
「個体」、「宿主」、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では互換可能に用いており、マウス、サル、ヒト、家畜用哺乳動物、スポーツ用哺乳動物及びペット用哺乳動物を含む哺乳動物を意味するが、それに限定するものではない
本明細書に用いている「動作可能なように連結された」とは、発現制御配列が所望のコーディング配列の発現を効果的に制御するように遺伝子構築物に組み込まれることを意味する。
【００２０】
「ポリペプチド」及び「蛋白」という用語は互換可能に用いており、長さ又は翻訳後修飾の有無とは関係なく、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖のことを意味する。実施態様としては、保存的置換を有するｓＨ４ポリペプチドが挙げられる。保存的置換としては、通常、以下のグループ内での置換が挙げられる：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン及びスレオニン；リジン、ヒスチジン及びアルギニン；並びにフェニルアラニン及びチロシン。
【００２１】
「ｓＨ４」又は「ｓＨ４ポリペプチド」という用語は、Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメインの生物活性断片を含むＢ７−Ｈ４の可溶性断片を意味する。可溶性断片は、一般に細胞内及び／又は膜貫通ドメインの一部又は全部を欠落している。
【００２２】
本明細書に用いている「処置する」という用語は、処置対象の疾患に伴う１種以上の症状を軽減、予防又は除去することを含む。
【００２３】
「Ｂ７−Ｈ４」アンタゴニストという用語は、Ｂ７−Ｈ４の生物活性を妨げもしくは阻害し、Ｂ７−Ｈ４の発現もしくはバイオアベイラビリティを低下させ、もしくは阻害し、又はＢ７−Ｈ４とその天然のリガンド／受容体との相互作用を阻害する化合物を意味する。
【００２４】
ＩＩ．組成物
１種以上のＢ７−Ｈ４アンタゴニストを含む組成物を提供する。好適なＢ７−Ｈ４アンタゴニストとしては、ｓＨ４、Ｂ７−Ｈ４に対する抗体とその抗原結合断片、Ｂ７−Ｈ４受容体に対する抗体とその抗原結合断片、Ｂ７−Ｈ４の発現を下方制御する阻害核酸、及びＢ７−Ｈ４受容体の発現を下方制御する阻害核酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
Ａ．可溶性Ｈ４（ｓＨ４）
可溶性Ｈ４（ｓＨ４）は免疫応答を促進することが見出されている。ｓＨ４がインビボでＢ７−Ｈ４受容体と結合することによりＢ７−Ｈ４とＢ７−Ｈ４受容体との相互作用が低下又は阻害されると考えられる。可溶性Ｈ４はＢ７−Ｈ４に由来するものである。Ｂ７−Ｈ４は、細胞内ドメイン、１回膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを有する、膜貫通蛋白として細胞で発現される。本明細書ではｓＨ４を含む組成物を提供する。
【００２６】
一実施態様において、Ｂ７−Ｈ４受容体へのＢ７−Ｈ４の結合を、対照に比し、少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上低下させるｓＨ４ポリペプチドを提供する。別の実施態様では、Ｂ７−Ｈ４受容体をその表面に発現する細胞においてＢ７−Ｈ４受容体活性を活性化しないか、または検出可能な量のＢ７−Ｈ４活性を生じるｓＨ４組成物を提供する。一部の実施態様において、ｓＨ４組成物はＢ７−Ｈ４受容体をその表面に発現する細胞においてＢ７−Ｈ４受容体の１種以上の活性を低下させ、又は阻害することができる。さらに別の実施態様において、この細胞はリンパ球、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｂ細胞、形質細胞、マクロファージ、好中球又はＮＫ細胞である。
【００２７】
ｓＨ４ポリペプチドとしては、Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメイン全体又はその断片を挙げることができる。他の実施態様では、ｓＨ４ポリペプチドとしてＢ７−Ｈ４の細胞外ドメインの断片が挙げられる。ｓＨ４ポリペプチドは任意の元の種に由来することができる。好ましい実施態様では、そのｓＨ４ポリペプチドはヒト起源のものである。
【００２８】
本明細書に開示したｓＨ４ポリペプチドには改変体ポリペプチドが含まれる。本明細書に用いている「改変体」ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸配列改変を含有する。アミノ酸配列改変は、例えば、１個以上のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入であり得る。
【００２９】
改変体ｓＨ４ポリペプチドは任意の組み合せのアミノ酸置換、欠失又は挿入を有することができる。一実施態様において、単離されたｓＨ４改変体ポリペプチドには、そのアミノ酸配列が対応する野生型アミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５又は１００％の同一性を共有するような整数個のアミノ酸の改変がある。好ましい実施態様では、ｓＨ４改変体ポリペプチドは対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、９９．５又は１００％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する。
【００３０】
配列同一性百分率はコンピュータプログラム又は直接配列比較法を用いて算出することができる。２つの配列間の同一性を測定するための好ましいコンピュータプログラムによる方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮ（例えば、Ｄ．  Ｗ．  Ｍｏｕｎｔ、２００１年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．  Ｙ．参照）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮプログラムはＮＣＢＩ及び他の供給源から公に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性測定に用いることができる。
【００３１】
アミノ酸配列比較のための例示的なパラメータとしては、以下のものが挙げられる：１）Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８：ｐ．４４３−４５３  （１９７０年））；２）Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆのＢＬＯＳＳＵＭ６２比較マトリックス（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：ｐ．１０９１５−１０９１９  （１９９２年））；３）ギャップペナルティ＝１２；及び４）ギャップ長ペナルティ＝４。これらのパラメータを用いる有用なプログラムが「ギャップ」プログラムとして公に入手可能である（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。上記のパラメータ類は、（末端ギャップに対するペナルティのない）ポリペプチド比較のためのデフォルトパラメータ類である。
【００３２】
或いは、ポリペプチド配列の同一性は、式：同一性％＝（同一残基数）／（アミノ酸残基のアラインメント長）＊１００を用いて算出することができる。この計算において、アラインメント長には内部ギャップを含めるが、末端ギャップは含めない。
【００３３】
ｓＨ４改変体ポリペプチドにおけるアミノ酸置換は「保存的」でも「非保存的」でもよい。本明細書に用いている「保存的」アミノ酸置換とは、置換アミノ酸が同様な構造的又は化学的性質を有する置換であり、「非保存的」アミノ酸置換とは置換アミノ酸の電荷、疎水性又は嵩が著しく変化する置換である。非保存的置換は、（ａ）置換領域のペプチド主鎖の、例えばシートもしくはヘリカル構造としての構造、（ｂ）標的部位におけるその分子の電荷もしくは疎水性、又は（ｃ）その側鎖の嵩、の維持に及ぼす影響がさらにいちじるしく異なる。
【００３４】
保存的アミノ酸置換の例としては、置換が以下の５グループのうちの１つ内で行われる置換が挙げられる：１）小型で脂肪族の非極性又は軽度極性残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；２）極性の負荷電残基及びそれらのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ）；極性の正荷電残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；大型で脂肪族の非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）；及び大型の芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）。非保存的アミノ酸置換の例には、１）親水性残基、例えばセリルもしくはスレオニルが疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルと置換する、もしくはこれによって置換される置換；２）システインもしくはプロリンが任意の他の残基と置換する、もしくはこれによって置換される置換；３）電気的陽性側鎖を有する残基、例えばリジル、アルギニルもしくはヒスチジルが電気的陰性残基、例えばグルタミルもしくはアスパルチルと置換する、もしくはこれによって置換される置換；又は４）嵩高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが側鎖を有しない残基、例えばグリシンと置換する、もしくはこれによって置換される置換がある。
【００３５】
ｓＨ４ポリペプチドは、正常な細胞環境でポリペプチド中に存在し得る化学的機能基によって改変することができる：例えば、リン酸化、メチル化、アミド化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、ＳＵＭＯ化及びユビキチン化。ｓＨ４改変体ポリペプチドも検出可能なシグナルを直接又は間接にもたらすことができる標識で改変することができ、この標識としては、放射性同位体及び蛍光化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
また、ｓＨ４ポリペプチドは細胞環境においてポリペプチドに正常には付加されない化学的機能基によって改変することもできる。このような改変は、特定の側鎖又は末端残基と反応することができる有機誘導体化剤とポリペプチドの標的アミノ酸残基とを反応させることによって分子中に導入することができる。別の改変はその蛋白の環化である。
【００３７】
そのポリペプチドの化学的誘導体の例としては、リジニル（ｌｙｓｉｎｙｌ）及びアミノ末端残基を無水コハク酸又は他の無水カルボン酸で誘導体化したポリペプチドが挙げられる。無水環状カルボン酸（ｃｙｃｌｉｃ  ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）による誘導体化には、リジニル残基の電荷を反転させる効果がある。アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、メチルピコリニミデート（ｍｅｔｈｙｌｐｉｃｏｎｉｍｉｄａｔｅ）などのイミドエステル類、ピリドキサールリン酸、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートによるトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。カルボキシル側鎖基アスパルチル又はグルタミルは、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド、１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド類（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾することができる。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基はアンモニアと反応させることによりアスパルチル及びグルタミル残基に変換することができる。また、ポリペプチドとしては、１種以上のＬ−アミノ酸を置換する１種以上のＤ−アミノ酸も含み得る。
【００３８】
ｓＨ４ポリペプチドは他のポリペプチドと結合させることにより融合蛋白を形成させることができる。ｓＨ４ポリペプチドとして、（ｉ）第２のポリペプチドに直接融合した、又は（ｉｉ）任意選択的に、第２のポリペプチドに融合するリンカーペプチド配列に融合した、ｓＨ４ポリペプチドの全部又は一部を含む、第一の融合パートナーを有するｓＨ４ポリペプチドを提供する。この融合パートナーが存在することによってｓＨ４ポリペプチドの溶解度、親和性及び／又は結合価を変化させることができる。本明細書に用いている「結合価（ｖａｌｅｎｃｙ）」とは、分子当たり利用可能な結合部位の数を意味する。本明細書に記載したｓＨ４融合蛋白は、上記のようなアミノ酸の改変（即ち、置換、欠失又は挿入）、断片及び／又は修飾の任意の組合せを含む。
【００３９】
その第２のポリペプチド結合パートナーは上記ｓＨ４ポリペプチドに対してＮ末端又はＣ末端側とすることができる。好ましい実施態様では、この第２のポリペプチドは上記ｓＨ４ポリペプチドに対してＣ末端側にある。
【００４０】
融合蛋白結合パートナーとして日常的に用いられる多数のポリペプチド配列が当該分野で周知である。有用なポリペプチド結合パートナーの例としては、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジン、ｍｙｃ、ヘマグルチニン、ＦｌａｇＴＭタグ（Ｋｏｄａｋ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ）、マルトースＥ結合蛋白、プロテインＡ、並びに、好ましくはヒト免疫グロブリンＣγ鎖のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域に相当するアミノ酸配列を有するＩｇ重鎖定常領域の１種以上のドメインが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
Ｂ．  Ｂ７−Ｈ４及びＢ７−Ｈ４受容体に対する抗体
Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に対する抗体はＢ７−Ｈ４アンタゴニストとして用いることができる。Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に特異的に結合する抗体又は抗体断片はＴ細胞上の受容体へのＢ７−Ｈ４の結合を低下させ、又は阻害するのに用いることができる。抗体を作製する方法は周知であり、当業者の能力の範囲内にあるが、以下にさらに詳細に記載する。
【００４２】
本明細書に開示した抗体はＢ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に特異的に結合し、Ｂ７−Ｈ４の結合を低下又は阻害することができる。こうした抗体は「遮断」、「機能阻害」又は「アンタゴニスト」抗体と定義される。好ましい実施態様では、上記アンタゴニスト抗体はＢ７−Ｈ４の細胞外ドメインの一部に特異的に結合する。
【００４３】
上記抗体を作製するために用いる免疫原は、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体の任意の免疫原性部分とすることができる。好ましい免疫原としては、ヒトＢ７−Ｈ４の細胞外ドメインの全部又は一部が挙げられ、この場合、それらの残基は天然のＢ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に見られるグリコシル化などの翻訳後修飾を含有する。上記細胞外ドメイン又はその免疫原性断片を含む免疫原は、当該分野で公知の各種方法、例えば、従来の組換え法を用いたクローン化遺伝子の発現、元の細胞、高レベルのＢ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体を発現する細胞集団からの単離によって作製する。
【００４４】
本明細書に開示した抗体は、ＧＥＮＢＡＮＫ・受託番号ＡＡＰ３７２８３のヒトＢ７−Ｈ４と少なくとも約７０％、より好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を有するＢ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体ポリペプチドに結合することができる。
【００４５】
その抗体はポリクロナール抗体であってもモノクロナール抗体であってもよい。こうした抗体は、異種抗体、同種異系抗体、同系抗体又はヒト化もしくはキメラ抗体などのこれらの改変体であってよい。その抗体は抗イディオタイプ抗体とすることもできる。本明細書に用いている抗体としては、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２断片を含む抗体断片並びに正常の多量体構造ではなく一本鎖抗体又はｓｃＦｖとして作製される抗体も含まれる。その抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のようなＩｇＧ又はＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥもしくはＩｇＤアイソタイプであってよい。抗体重鎖の定常ドメインは所望のエフェクター機能に応じて選択することができる。軽鎖定常ドメインはカッパ又はラムダ定常ドメインであってよい。
【００４６】
Ｃ．  Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に特異的な阻害核酸
別の実施態様において、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体の発現は１種以上の阻害核酸を供給することによって下方制御され、このような核酸としては、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体をコードする核酸に特異的なリボザイム、三重鎖形成（ｔｒｉｐｌｅｘ−ｆｏｒｍｉｎｇ）性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びミクロＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体アンタゴニストは、上記のような他の免疫調節剤と組み合わせて供給することもできる。
【００４７】
「ｓｉＲＮＡ」という用語は、毒性のない長さの短い二本鎖ＲＮＡである低分子干渉ＲＮＡを意味する。一般に、ｓｉＲＮＡの長さは、これが毒性を示さない限り特に限定されない。「ｓｉＲＮＡ」は、例えば、１５乃至４９ｂｐ、好ましくは１５乃至３５ｂｐ、より好ましくは２１乃至３０ｂｐ長とすることができる。或いは、発現対象のｓｉＲＮＡの最終転写産物の二本鎖ＲＮＡ部分は、例えば、１５乃至４９ｂｐ、好ましくは１５乃至３５ｂｐ、より好ましくは２１乃至３０ｂｐ長とすることができる。２本のＲＮＡ鎖が対になるｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ部分は完全に対をなすものに限定されず、ミスマッチ（対応するヌクレオチドが相補性でない）、バルジ（一方の鎖に対応する相補性ヌクレオチドに欠落がある）などによる対にならない部分を含有していてもよい。対にならない部分は、ｓｉＲＮＡの形成を妨げない程度であれば含有してもよい。本明細書に用いている「バルジ」は、好ましくは対にならないヌクレオチドを１乃至２個含み、２本のＲＮＡ鎖が対となるｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域は、バルジを好ましくは１乃至７箇所、より好ましくは１乃至５箇所含有する。さらに、本明細書に用いている「ミスマッチ」は、２本のＲＮＡ鎖が対となるｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域中に好ましくは１乃至７箇所、より好ましくは１乃至５箇所含有される。好ましいミスマッチとしては、そのヌクレオチド対のうちの一方がグアニンであり、他方がウラシルである。このようなミスマッチは、センスＲＮＡをコードするＤＮＡにおけるＣからＴもしくはＧからＡへの改変又はこれらの組合せによるものであるが、特にこれらに限定されるものではない。さらに、特定の実施態様では、２本のＲＮＡ鎖が対となるｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域にはバルジ及びミスマッチの両方を合計で、好ましくは１乃至７箇所、より好ましくは１乃至５箇所含有する。
【００４８】
ｓｉＲＮＡの末端構造は、ｓｉＲＮＡがそのＲＮＡｉ効果によって標的とする遺伝子発現をサイレンシングし、低下させ、又は阻害し得る限り、平滑末端でも付着（オーバーハング）末端でもよい。この付着（オーバーハング）末端構造は３’側のオーバーハングのみに限定されるものではなく、ＲＮＡｉ効果を誘導することができる限り、５’側のオーバーハング構造を含めることができる。さらに、オーバーハングヌクレオチド数は、既に報告されている２又は３に限定されず、そのオーバーハングがＲＮＡｉ効果を誘導することができる限り、任意の数とすることができる。例えば、このオーバーハングは１乃至８個、好ましくは２乃至４個のヌクレオチドからなる。本明細書では、付着末端構造を有するｓｉＲＮＡの全長は、対を形成する二本鎖部分の長さと両端のオーバーハング一本鎖を含む対の長さの和として表している。例えば、両端に４個のオーバーハングヌクレオチドを有する１９ｂｐの二本鎖ＲＮＡ部分の場合、全長は２３ｂｐとして表される。さらに、このオーバーハング配列は、標的遺伝子に対する特異性が低いので、標的遺伝子配列と必ずしも相補的（アンチセンス）又は同一（センス）ではない。さらに、ｓｉＲＮＡが標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング作用を維持することができる限り、ｓｉＲＮＡには、例えばその一端のオーバーハング部分に、低分子量ＲＮＡ（ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡもしくはウイルスＲＮＡのような天然ＲＮＡ分子であっても人工ＲＮＡ分子であってもよい）を含有してよい。
【００４９】
さらに、ｓｉＲＮＡの末端構造は、両端が必ずしも上記のようにカットオフ構造ではなく、二本鎖ＲＮＡの片側の両端がリンカーＲＮＡによって結合されているステム−ループ構造を有していてもよい。この二本鎖ＲＮＡ領域（ステム−ループ部分）の長さは、例えば、１５乃至４９ｂｐ、好ましくは１５乃至３５ｂｐ、より好ましくは２１乃至３０ｂｐ長とすることができる。或いは、発現対象のｓｉＲＮＡの最終転写産物である二本鎖ＲＮＡ領域の長さは、例えば、１５乃至４９ｂｐ、好ましくは１５乃至３５ｂｐ、より好ましくは２１乃至３０ｂｐ長である。さらに、そのリンカーの長さは、これがステム部分の対形成を妨げないような長さを有する限り、特に限定されない。例えば、ステム部分の対形成を安定させ、この部分をコードするＤＮＡ間の組換えを抑制するために、そのリンカー部分はクローバー葉ｔＲＮＡ構造を有することができる。そのリンカーがステム部分の対形成を妨げる長さを有していても、例えば、前駆体ＲＮＡから成熟ＲＮＡへのプロセッシングの過程でイントロンが切り取られるようにイントロンを含ませてこのリンカーを構築することによりステム部分に対形成させることが可能である。ステム−ループｓｉＲＮＡの場合、ループ構造を含まないＲＮＡのどちらか一方の端（頭部または尾部）は低分子量ＲＮＡを有し得る。上記のように、この低分子量ＲＮＡは、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡもしくはウイルスＲＮＡのような天然ＲＮＡ分子又は人工ＲＮＡ分子とすることができる。
【００５０】
ＭｉＲＮＡは短ステム−ループ前駆体をＤｉｃｅｒ様酵素によって切断することにより作製されるが、ｓｉＲＮＡは長二本鎖ＲＮＡ分子の切断によって作製される。ＭｉＲＮＡは一本鎖であるが、ｓｉＲＮＡは二本鎖である。
【００５１】
ｓｉＲＮＡを作製する方法は当該分野で公知である。Ｂ７−Ｈ４の配列は知られているので、当業者は、公に入手可能な情報を利用して宿主のＢ７−Ｈ４発現を下方制御するｓｉＲＮＡを容易に作成することができる。
【００５２】
Ｄ．ｓＨ４含有ワクチン
宿主に対してワクチン接種するために、ｓＨ４及び／又はこれをコードしている核酸を単独又は任意の他の好適な処置との組合せで投与することができる。一実施態様では、ｓＨ４及び／又はこれをコードしている核酸は、ワクチン組成物と共に、又はその一成分として投与することができる。ワクチン組成物の好適な成分としては抗原及び任意選択的にアジュバントが挙げられる。本明細書に記載したｓＨ４組成物は、ワクチン又はその成分の投与前、投与と同時、又は投与後に投与することができる。一実施態様では、そのｓＨ４組成物はワクチンの投与と同時に投与する。ｓＨ４は免疫応答を増大させるので、ｓＨ４は、そのワクチンの特定の抗原に対する免疫応答を促進することによってワクチンの効果を増大させることができると考えられる。
【００５３】
本明細書に記載したｓＨ４組成物は、病原体に接触した場合に備えて対象に抵抗性を付与する予防ワクチンとの併用で、又は癌を患う被検体の腫瘍抗原もしくはウイルスに感染している被検体のウイルス抗原などのすでに存在する抗原に対する被検体の免疫応答を惹起もしくは増強するのに用い得る処置ワクチンとの併用で投与することができる。
【００５４】
予防的、処置的又は脱感作免疫応答の望まれる結果は、当該分野で周知の原則に従って疾患により異なり得る。例えば、病原体に対する免疫応答は病原体のコロニー形成及び複製を完全に阻止し得、「滅菌免疫性（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」に作用して及び疾患の如何なる症状も非存在となる。しかしながら、病原体に対するワクチンを有効とみなすことができるのは、これが症状の数、重症度もしくは持続期間を減少させる場合、症状を有する集団の個体数を減少させる場合、又は病原体の伝播を抑える場合である。同様に、癌、アレルゲンもしくは病原体に対する免疫応答は疾患を完全に処置することができ、症状を軽減することができ、又は疾患に対する全体的な治療的介入における一側面とすることができる。例えば、癌に対する免疫応答の刺激は、処置に影響を及ぼすために外科的、化学療法的、放射線学的、ホルモン的及び他の免疫学的方法を併用することができる。
【００５５】
１．抗原
上記ワクチン組成物に用いることができる抗原は、ペプチド、蛋白、多糖、糖、脂質、核酸又はこれらの組合せとすることができる。この抗原はウイルス、細菌、寄生生物、植物、原生動物、真菌、組織、又は癌もしくは白血病細胞などの形質転換細胞から得ることができ、細胞全体又はその免疫原性成分、例えば、細胞壁成分もしくはその分子成分であり得る。
【００５６】
好適な抗原は当該分野で公知であり、商業的、政府機関及び科学的供給源から入手可能である。一実施態様では、こうした抗原は、完全に不活化又は弱毒化した有機体である。これらの有機体はウイルス、寄生生物、細菌などの感染性有機体とすることができる。こうした有機体は腫瘍細胞でもよい。その抗原は腫瘍又はウイルスもしくは細菌供給源由来の精製又は部分精製ポリペプチドとすることができる。その抗原は、異種発現系においてポリペプチド抗原をコードするＤＮＡを発現させることにより作製する組換えポリペプチドとすることができる。その抗原は抗原性蛋白の全部又は一部をコードするＤＮＡとすることができる。このＤＮＡはプラスミドＤＮＡなどのベクターＤＮＡの形をとることができる。
【００５７】
抗原は単一抗原として与えることができ、又は組み合わせて与えることができる。また、抗原はポリペプチド又は核酸の複合混合物として与えることもできる。
【００５８】
ｉ．ウイルス抗原
ウイルス抗原は、以下の任意のウイルス科のウイルスを含むがそれに限定されない任意のウイルスから単離し、又はこのウイルスからの核酸によってコードさせることができる：Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓ、Ｂａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓ、Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ、Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓ、Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスなどのＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｅｌｔａｖｉｒｕｓ、Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ、Ｅｎａｍｏｖｉｒｕｓ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ  （例えば、マルブルクウイルス及びエボラウイルス（例えば、ザイール、レストン、象牙海岸もしくはスーダン株））、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ  （例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、デング熱ウイルス１型、デング熱ウイルス２型、デング熱ウイルス３型及びデング熱ウイルス４型）、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ  （例えば、ヒトヘルペスウイルス１、３、４、５及び６並びにサイトメガロウイルス）、Ｈｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ  （例えば、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ及びＣ）、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ，  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ  （例えば、麻疹、おたふく風邪及びヒト  ＲＳ  ウイルス）、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ  （例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス及びアフトウイルス）、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ  （例えば、ワクシニア及び痘瘡ウイルス）、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ  （例えば、ロタウイルス）、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ  （例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１及びＨＩＶ２などのレンチウイルス）、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ  （例えば、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ  （例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）並びにＴｏｔｉｖｉｒｉｄａｅ。また、好適なウイルス抗原としては、デング蛋白Ｍ、デング蛋白Ｅ、デングＤ１ＮＳ１、デングＤ１ＮＳ２及びデングＤ１ＮＳ３の全部又は一部も挙げられる。
【００５９】
ウイルス抗原は、例えば以下の特定の株から得ることができる：パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、即ち、単純疱疹１及び２；肝炎ウイルス、例えばＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ肝炎Ｄウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）及びＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）、ダニ媒介脳炎ウイルス；パラインフルエンザ、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バー、ロタウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、ウマ脳炎、日本脳炎、黄熱病、リフトバレー熱及びリンパ球性脈絡髄膜炎。
【００６０】
ｉｉ．細菌抗原
細菌抗原は、以下に挙げるがそれに限定されない任意の細菌から由来し得、又はこれらの細菌からの核酸によってコードさせることができる：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｎａｂａｅｎａ，  Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  Ｂ  （ＨＩＢ）  、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  Ａ、Ｂ及びＣ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ，  Ｖｉｂｒｉｏ並びにＹｅｒｓｉｎｉａ。
【００６１】
ｉｉｉ．寄生生物抗原
寄生生物抗原は、限定されない例として挙げられる以下の寄生生物由来の抗原などの寄生生物抗原から得られ、又はこれらによりコードされる核酸によってコードさせることができる：Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ及びＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ。こうした抗原としては、胞子虫抗原、スポロゾイト周囲蛋白、種虫表面蛋白、肝臓段階抗原（ｌｉｖｅｒ  ｓｔａｇｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）、頂端膜関連蛋白（ａｐｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）又はメロゾイト表面蛋白の全部又は一部のようなマラリア原生動物抗原が挙げられる。
【００６２】
ｉｖ．アレルゲン及び環境抗原
限定されない例として挙げられる花粉アレルゲン（樹木、ハーブ、雑草及び草花粉アレルゲン）、昆虫アレルゲン（吸入抗原、唾液抗原及びハチ毒抗原）、動物の毛及びふけアレルゲン並びに食物アレルゲンなどの天然アレルゲン由来抗原などの抗原は、アレルゲン又は環境抗原とすることができる。樹木、草及びハーブからの重要な花粉アレルゲンは、とりわけ樺の木（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンの木（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、クマシデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）及びオリーブ（Ｏｌｅａ）、ヒマラヤスギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａａｎｄ  Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ）、スズカケノキ（Ｐｌａｔａｎｕｓ）を含むＦａｇａｌｅｓ、Ｏｌｅａｌｅｓ、Ｐｉｎａｌｅｓ及びｐｌａｔａｎａｃｅａｅの分類上の目、とりわけＬｏｌｉｕｍ、Ｐｈｌｅｕｍ、Ｐｏａ、Ｃｙｎｏｄｏｎ、Ｄａｃｔｙｌｉｓ、Ｈｏｌｃｕｓ、Ｐｈａｌａｒｉｓ、Ｓｅｃａｌｅ及びＳｏｒｇｈｕｍ属の草を含むイネ目、とりわけＡｍｂｒｏｓｉａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ及びＰａｒｉｅｔａｒｉａ属のハーブを含むＡｓｔｅｒａｌｅｓ及びＵｒｔｉｃａｌｅｓ目から得られる。用いることができる他のアレルゲン抗原としては、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ及びＥｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ属の室内塵ダニ、貯蔵庫ダニ、例えばＬｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ、Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ及びＴｙｒｏｐｈａｇｕｓからのアレルゲン、ゴキブリ、ヌカカ及びノミ、例えばＢｌａｔｅｌｌａ、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ及びＣｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓからのアレルゲン、ネコ、イヌ、ウマなどの哺乳類、鳥類からのアレルゲン、ミツバチ（上科Ａｐｉｄａｅ）、スズメバチ（上科Ｖｅｓｐｉｄｅａ）及びアリ（上科Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）を含むＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａの分類上の目からのものなどの刺咬昆虫に由来するようなものを含む毒物アレルゲンが挙げられる。用いることができるさらに別のアレルゲン抗原としてはＡｌｔｅｒｎａｒｉａ及びＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ属からなどの真菌からの吸入アレルゲンが挙げられる。
【００６３】
ｖ．腫瘍抗原
好ましい実施態様において、以下のものが挙げられるがそれに限定されない腫瘍関連又は腫瘍特異的抗原を含む抗原は、腫瘍抗原とすることができる：アルファ−アクチニン−４、Ｂｃｒ−Ａｂｌ融合蛋白、Ｃａｓｐ−８、ベータ−カテニン、ｃｄｃ２７、ｃｄｋ４、ｃｄｋｎ２ａ、ｃｏａ−１、ｄｅｋ−ｃａｎ融合蛋白、ＥＦ２、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１融合蛋白、ＬＤＬＲ−フコシルトランスフェラーゼＡＳ融合蛋白、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ１１、ｈｓｐ７０−２、ＫＩＡＡＯ２０５、Ｍａｒｔ２、Ｍｕｍ−１、２及び３、ｎｅｏ−ＰＡＰ、クラスＩミオシン、ＯＳ−９、ｐｍｌ−ＲＡＲα融合蛋白、ＰＴＰＲＫ、Ｋ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、Ｂａｇｅ−１、Ｇａｇｅ  ３、４、５、６、７、ＧｎＴＶ、Ｈｅｒｖ−Ｋ−ｍｅｌ、Ｌａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−Ａｌ、２、３、４、６、１０、１２、Ｍａｇｅ−Ｃ２、ＮＡ−８８、ＮＹ−Ｅｓｏ−ｌ／Ｌａｇｅ−２、ＳＰ１７、ＳＳＸ−２及びＴＲＰ２−Ｉｎｔ２、ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ  １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５（５８）、ＣＥＡ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ（ＬＡＧＥ）、ＳＣＰ−１、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ−４０、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、Ｈ−Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタイン‐バーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈｌ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２−４、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ  １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１６、ＴＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、テロメラーゼ、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、１３ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３（ＣＡ２７．２９／ＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８／ＫＰ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０（Ｍａｃ−２結合蛋白／シクロフィリンＣ関連蛋白）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ並びにＴＰＳ。
【００６４】
２．アジュバント
上記ワクチンには、任意選択的に１種以上のアジュバントを含ませることができる。こうしたアジュバントは、ワクチン組成物に添合、又はこの組成物と共に投与、又はこの組成物とは別々に投与することができる。そのアジュバントは、限定されない例として挙げられる以下のもののうちの１種以上とすることができる：油乳剤（例えば、フロイントアジュバント）；サポニン調合物；ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）及びウイルス様粒子；細菌及び微生物誘導体；免疫刺激性オリゴヌクレオチド；ＡＤＰ−リボシル化毒素及び無毒化誘導体；ミョウバン；ＢＣＧ；無機物含有組成物（例えば、アルミニウム塩、カルシウム塩などの無機塩類、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩など）；生体付着剤及び／又は粘膜付着剤；微小粒子；リポソーム；ポリオキシエチレンエーテル及びポリオキシエチレンエステル調合物；ポリフォスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）、ムラミルペプチド；イミダゾキノロン化合物；並びに界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノール）。
【００６５】
また、アジュバントとして、サイトカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−ガンマ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などの免疫調節因子；及びＢ７ファミリーの分子などの共刺激分子も挙げることができる。蛋白性アジュバントは、完全長ポリペプチドもしくはその活性断片として、又はプラスミドＤＮＡなどのＤＮＡの形で供給することができる。
【００６６】
ＩＩＩ．免疫応答を刺激する方法
宿主、好ましくはヒト宿主において、宿主のＢ７−Ｈ４の生物活性を阻害することによって免疫応答を刺激又は増強することができる。ｓＨ４はＢ７−Ｈ４リガンドに対してＢ７−Ｈ４と競合する。従って、治療的有効量のｓＨ４又はその改変体を宿主に投与することにより免疫応答を増強又は促進することができる。
【００６７】
別の実施態様では、Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストを宿主のＢ７−Ｈ４の量又はバイオアベイラビリティを減少させるのに有効な量で宿主に投与する。Ｂ７−Ｈ４の代表的なアンタゴニストとしては、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に特異的な抗体及びＢ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体をコードする核酸に特異的な阻害核酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
Ａ．感染症の処置方法
一実施態様では、宿主において、宿主のＢ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のｓＨ４を投与することにより免疫応答を刺激又は増強する。Ｂ７−Ｈ４の他のアンタゴニストを単独又はｓＨ４との組合せで用いることもできることはいうまでもない。Ｂ７−Ｈ４をｓＨ４で阻害すると、宿主の免疫応答が促進又は増強されると考えられる。通常、Ｂ７−Ｈ４活性の阻害については従来の方法を用いて適切な対照又は所定量の活性と比較する。例えば、ｓＨ４の投与前に宿主におけるＢ７−Ｈ４の閾値活性を測定することができる。ｓＨ４投与後のＢ７−Ｈ４活性がＢ７−Ｈ４閾値活性よりも低いことにより、Ｂ７−Ｈ４活性の阻害及び免疫応答の刺激又は増強が明らかとなる。
【００６９】
宿主の免疫応答を刺激することは、例えば、その宿主がウイルス感染症、細菌感染症、真菌、原生動物感染症又は癌などの過剰増殖性症候に罹患している場合に望ましい。従って、一実施態様として、宿主のＢ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のｓＨ４を投与することにより感染症を処置する方法を提供する。
【００７０】
処置することができる代表的な感染症としては、以下に挙げるがそれに限定するものではない微生物を含む微生物によって引き起こされた感染症が挙げられるが、これらに限定されるものではない：Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｔｙｐｅ  Ｂ  （ＨＩＢ）  、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｓｐｉｒｏｓｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ  Ａ、Ｂ及びＣ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｎ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｒｉｃｋｅｔｓｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎａｌｉｓ並びにＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ。
【００７１】
Ｂ．癌の処置方法
別の実施態様として、宿主においてＢ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のｓＨ４を投与することにより癌を処置するための宿主の免疫応答を刺激又は増強する方法及び組成物を提供する。Ｂ７−Ｈ４の他のアンタゴニストを単独又はｓＨ４との組合せで用いることもできることはいうまでもない。その提供する組成物及び方法で処置することができる癌の型としては、以下の癌が挙げられるが、これらに限定されるものではない：膀胱、脳、乳腺、頸部、結腸−直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣、精巣など。投与は既に存在する腫瘍又は感染性疾患の処置に限定されるのではなく、個体におけるそのような疾患の発症のリスクを阻止又は低下させるために、即ち、予防的用途のために行うこともできる。予防的ワクチン接種のための有力候補としては、癌発症のリスクが高い、即ち、特定の型の癌の既往歴又は家族歴を有する個体が挙げられる。
【００７２】
処置することができる悪性腫瘍を、本明細書ではその腫瘍が由来する組織の胚起源によって分類する。カルチノーマは、皮膚又は内部器官及び腺の上皮内層などの内胚葉又は外胚葉性組織から生じる腫瘍である。肉腫は、生じる頻度は少ないが、骨、脂肪、軟骨などの中胚葉結合組織由来である。白血病及びリンパ腫は骨髄の造血細胞の悪性腫瘍である。白血病は単一細胞として増殖するのに対して、リンパ腫は腫瘍塊として成長する傾向がある。悪性腫瘍は体の多くの臓器又は組織に現れて癌を確立することができる。
【００７３】
別の実施態様として、宿主においてＢ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のｓＨ４を投与することにより宿主の感染を処置する方法を提供する。この感染はウイルス性、細菌性又は原生動物性であり得る。一つの理論にとらわれるわけではないが、Ｂ７−Ｈ４の、例えばその天然のリガンドに結合する活性に干渉すると、Ｂ７−Ｈ４によるＴ細胞応答の阻害が阻止され、又は低下すると考えられる。Ｂ７−Ｈ４の活性を阻害することによって、免疫応答は向上し、感染と闘う能力を高めることができる。
【００７４】
Ｃ．遺伝子治療
ｓＨ４アンタゴニストをコードする核酸は、これを必要とする個体に対して炎症反応又は自己免疫疾患を処置するのに有効な量で投与することができる。ＤＮＡの送達では「外来」ＤＮＡを細胞内に、最終的には生きている動物体内に導入することが含まれる。遺伝子の送達はウイルスベクター又は非ウイルスベクターを用いて達成することができる。１つの方法は、培養一次細胞中に核酸を移入した後、この生体外で形質転換された細胞を個体に、全身性又は特定の器官又は組織中へ自家移植することを含む。
【００７５】
核酸による治療は、哺乳動物の体細胞組織又は器官中にインビボで機能的に活性なＤＮＡを直接移入することにより達成することができる。ＤＮＡの移入は以下に記載するいくつかの方法を用いて実現することができる。こうした系について選択可能なマーカ（例えば、Ｇ４１８抵抗性）を用いてインビトロでの発現に成功するかどうかを試験し、そのＤＮＡを発現する形質移入された（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）クローンを選択した後、（誘導系の場合は誘導剤で処理した後）  Ｂ７−Ｈ４発現産物の存在を適切なイムノアッセイでその産物に対する抗体を用いて検出することができる。ＤＮＡの取り込み、プラスミドの組込み及び組込みプラスミドの安定性を含むこの方法の効率性は、既知の方法を用いてプラスミドＤＮＡを線状化し、「担体」として高分子量哺乳動物ＤＮＡを用いて同時形質移入することにより改善することができる。
【００７６】
レトロウイルス媒介ヒト治療では両栄養性複製欠損性レトロウイルス系が利用される（Ｗｅｉｓｓ及びＴａｙｌｏｒ、Ｃｅｌｌ、８２：ｐ．５３１−５３３  （１９９５年））。このようなベクターは、機能性ＤＮＡをヒトの細胞又は組織に、例えば、アデノシンデアミナーゼ遺伝子をリンパ球に、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子及び腫瘍壊死因子遺伝子を腫瘍浸潤リンパ球に導入するのに用いられてきた。一般に、レトロウイルス媒介遺伝子送達では遺伝子移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）のために標的細胞の増殖が必要となる（Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：ｐ．４７０−４７５  （１９９５年））。この条件は今回のＤＮＡ分子が導入されることになる好ましい細胞の一部、即ち、活発に増殖している腫瘍細胞によって満たされる。いくつかの方法のいずれかを利用するプラスミド及びレトロウイルスベクターによる形質移入を用いた嚢胞性線維症の遺伝子治療がＣｏｌｌｉｎｓほかの米国特許第５，２４０，８４６号に記載されている。
【００７７】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド又は融合蛋白をコードするＤＮＡ分子は、当該分野でよく知られているように、複製欠損性レトロウイルスをもたらすパッケージング細胞株を用いてレトロウイルスベクターに詰め込むことができる（例えば、Ｓｔｏｎｅ，Ｄ．ほか、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６４：ｐ．１０３−１１８  （２０００年）参照）。遺伝子送達のための追加のウイルスがＲｅｙｎｏｌｄｓほか、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ、５：ｐ．２５−３１（１９９９年）に記載されている。
【００７８】
また、組換えアデノウイルス（Ｍｕｒｐｈｙほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：ｐ．１３９２１−１３９２６  （１９９７年））、神経細胞特異的に送達させ存続させるための単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎほか、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、３０：ｐ．１６９−１７５（１９９５年））を含む他のウイルスベクターを用いることもできる。ヒト遺伝子処置におけるアデノウイルスベクターの利点としては、組換えがまれであり、このようなウイルスとヒトの悪性腫瘍とに関連がなく、アデノウイルスのゲノムが最大７．５ｋｂの大きさの外来遺伝子を受け入れさせるように操作することができる二本鎖ＤＮＡであり、生アデノウイルスが安全なヒトワクチン有機体であるという事実が挙げられる。また、アデノ関連ウイルスもまたヒトの治療用に有用である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ほか、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：ｐ．３９４１（１９９１年））。
【００７９】
上記の開示されたＤＮＡ分子を発現することができ、特にヒトにおける今回の治療設定に有用である別のベクターは、複製しないようにすることができるワクシニアウイルスである（Ｐｅｐｌｉｎｋｓｋｉ，Ｇ．Ｒ．ほか、Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、ｐ．７５７５−５８８  １９９８年））。組換えワクシニアウイルス及び異種ＤＮＡを含有する他のウイルス並びに免疫化及びＤＮＡ治療におけるそれらの使用に関する記載については、Ｍｏｓｓ，Ｂ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．  ３：ｐ．８６−９０（１９９３年）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：ｐ．３４５−３６２  （１９９２年）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８：ｐ．２５−３８（１９９２年）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：ｐ．１６６２−１６６７（１９９１年）；Ｐｉｃｃｉｎｉ，Ａほか、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．３４：ｐ．４３−６４（１９８８年）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．ほか、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆ  Ａｎａｌ  ３：ｐ．２０１−２１３（１９８３年）に概説されている。
【００８０】
裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ又はウイルスベクターの他に、設計された細菌をベクターとして使用することができる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＢＣＧ及びＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ）を含む多くの細菌株（Ｈｏｉｓｅｔｈ  ＆  Ｓｔｏｃｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９１：ｐ．２３８−２３９（１９８１年）；Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｔ  Ｐほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：ｐ．２５−３２（１９８８年）；（Ｓａｄｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．ほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，ｐ．３３６−３３８（１９８８年）；Ｓｔｏｖｅｒ，Ｃ．Ｋ．ほか、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，ｐ．４５６−４６０（１９９１年）；Ａｌｄｏｖｉｎｉ，Ａ．ほか、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，ｐ．４７９−４８２（１９９１年）；Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｒ．ほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，ｐ．５３−５９（１９９２年）；Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ，Ｇ．ほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，ｐ．２２０９−２２１８（１９９４年））。これらの微生物はワクチンベクターとして用いるための２つの有望な特性を示す：（１）経口的にワクチンを送達させる能力をもたらす腸内感染経路；及び（２）単球／マクロフェージの感染により抗原がフェッショナルＡＰＣの標的となる、というものである。
【００８１】
インビボでのウイルス媒介遺伝子移入の他に、ＤＮＡを直接的に移入するために、プラスミドＤＮＡの投与（Ｗｏｌｆｆほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：ｐ．１４６５−１４６８  （１９９０年）；Ｈｉｃｋｍａｎ，Ｍ．Ａ．ほか、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５：ｐ．１４７７−１４８３（１９９４年））及び微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）媒介遺伝子移入（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．ほか、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｐｒｏｔｃｏ、１０：ｐ．１２−１５（２００２年））を含む、当該分野で周知の物理的手段を用いることができる。さらに、インビトロで遺伝子を細胞中に移入するための周知の手段である電気穿孔法を用いてＤＮＡ分子をインビボで組織に移入することができる（Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖ，Ａ．Ｖ．ほか、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：ｐ．１３１（（１９９１年））。
【００８２】
「担体媒介遺伝子移入」についても記載がある（Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：ｐ．１６９８５（１９８９年）；Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：ｐ．１４６２１（１９８８年）；Ｓｏｒｉａｎｏ，  Ｐ．  ほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：ｐ．７１２８（１９８３年）；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｙ．ほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：ｐ．７８５１（１９８２年）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：ｐ．９６３（１９９２年））。好ましい担体は、アシル化ｍＡｂを脂質二重層に取り込むことができる免疫リポソームなどの標的化リポソーム（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、１０：ｐ．１３０７−１３１５（２００３年））である。アシアログリコプロテイン／ポリリジン（Ｗｕほか、１９８９年、上掲）などのポリカチオンを用いることができ、この場合、この結合体は標的組織を認識する分子（例えば、肝臓用のアシアロオロソムコイド）及びＤＮＡに結合して形質移入されるＤＮＡ結合性化合物を含む。ポリリジンは、ＤＮＡに損傷を与えることなくそれに結合するＤＮＡ結合性分子の１例である。次に、この結合体はプラスミドＤＮＡと複合体を形成して移入される。
【００８３】
形質移入又は微量注入のために用いるプラスミドＤＮＡは、当該分野で周知の方法を用いて、例えば、Ｑｕｉａｇｅｎ法（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いた後、本明細書に例示した方法などの既知の方法を用いてＤＮＡを精製することにより調製することができる。
【００８４】
Ｄ．組合せ治療
上記の開示した組成物は単独又は１種以上の追加の治療剤との組合せで投与することができる。例えば、その開示組成物は、成長因子受容体又は腫瘍特異抗原に特異的な抗体又はその抗原結合断片と共に投与することができる。代表的な成長因子受容体としては、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＨＥＲ１）；ｃ−ｅｒｂＢ２（ＨＥＲ２）；ｃ−ｅｒｂＢ３  （ＨＥＲ３）；ｃ−ｅｒｂＢ４（ＨＥＲ４）；インスリン受容体；インスリン様成長因子受容体１（ＩＧＦ−１Ｒ）；インスリン様成長因子受容体２／マンノース−６−リン酸受容体（ＩＧＦ−ＩＩＲ／Ｍ−６−Ｐ受容体）；インスリン受容体関連キナーゼ（ＩＲＲＫ）；血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）；コロニー刺激因子−１受容体（ＣＳＦ−１Ｒ）（ｃ−Ｆｍｓ）；スチール（ｓｔｅｅｌ）受容体（ｃ−Ｋｉｔ）；Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３；線維芽細胞増殖因子受容体１（Ｆｌｇ／Ｃｅｋｌ）；線維芽細胞増殖因子受容体２（Ｂｅｋ／Ｃｅｋ３／Ｋ−Ｓａｍ）；線維芽細胞増殖因子受容体３；線維芽細胞増殖因子受容体４；神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）（ＴｒｋＡ）；ＢＤＮＦ受容体（ＴｒｋＢ）；ＮＴ−３受容体（ＴｒｋＣ）；血管内皮成長因子受容体１（Ｆｌｔ１）；血管内皮成長因子受容体２／Ｆｌｋ１／ＫＤＲ；肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦ−Ｒ／Ｍｅｔ）；Ｅｐｈ；Ｅｃｋ；Ｅｅｋ；Ｃｅｋ４／Ｍｅｋ４／ＨＥＫ；Ｃｅｋ５；Ｅｌｋ／Ｃｅｋ６；Ｃｅｋ７；Ｓｅｋ／Ｃｅｋ８；Ｃｅｋ９；Ｃｅｋ１０；ＨＥＫ１ｌ；９Ｒｏｒ１；Ｒｏｒ２；Ｒｅｔ；Ａｘｌ；ＲＹＫ；ＤＤＲ；及びＴｉｅが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
追加の治療剤としては、化学療法剤、サイトカイン、ケモカイン及び放射線治療などの通常の癌治療剤が挙げられる。化学療法剤の大部分は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤及びその他の抗腫瘍剤に分類することができる。これらの薬剤はすべて、何らかの方法で細胞分裂又はＤＮＡの合成及び機能に影響を及ぼす。追加の治療剤としてはモノクロナール抗体、並びにある型の癌（慢性骨髄性白血病及び消化管間質腫瘍）において分子異常を直接標的にする新規チロシンキナーゼ阻害剤、例えばメシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）又はＧＬＩＶＥＣ（登録商標））が挙げられる。
【００８６】
代表的な化学療法剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、タキソール及びその誘導体、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、エピポドフィロトキシン、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、セツキマブ及びリツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）又はＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））並びにこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８７】
ＩＶ．医薬組成物
Ｃ．医薬組成物
Ｂ７−Ｈ４アンタゴニスト及びこれを含有するベクターを含む医薬組成物を提供する。こうした医薬組成物は、経口、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）又は皮下注射）、経皮（受動的に、又はイオン電気導入法もしくは電気穿孔法により）、経粘膜（鼻、膣、直腸又は舌下）の投与経路によって、或いは生体内分解性挿入物を用いて投与することができ、各投与経路に適した剤型に調合することができる。
【００８８】
Ａ．非経口投与用調合物
好ましい実施態様において、上記ペプチドは水溶液として非経口注射により投与する。この調合物は懸濁剤又は乳剤の形態をとることもできる。一般には、有効量のＢ７−Ｈ４アンタゴニスト又は誘導体生成物を含む医薬組成物が提供され、これは、任意選択的に、医薬用として許容可能な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤及び／又は担体を含む。このような組成物は、希釈滅菌水、各種緩衝剤含有量（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の緩衝生理食塩水；並びに任意選択的に、界面活性剤、可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）及び保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）及び増量物質（例えば、乳糖、マンニトール）を含む。非水性溶媒又はビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油、とうもろこし油などの植物油、ゼラチン及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルがある。これら調合物は、凍結乾燥し、使用直前に再溶解／再懸濁することができる。上記調合物は、例えば細菌保定フィルターを通して濾過すること、又は滅菌剤を上記組成物に混合すること、又は上記組成物に放射線照射すること、又は上記組成物を加熱すること、によって滅菌することができる。
【００８９】
Ｂ．  経腸的投与用調合物
Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストは経口送達用に調合物化することができる。経口用固形剤型については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．  １８０４２）の第８９章に概ね記載されている。固形剤型としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤もしくはロゼンジ、カシェ剤、ペレット剤、散剤又は顆粒剤、或いは原料をポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の微粒子調製物もしくはリポソームに取り込ませたものが挙げられる。このような組成物は本発明の蛋白質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を与え得る。例えば、許容される場合に参照として本明細書に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版  （１９９０年、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．  １８０４２）  ｐ．１４３５−１７１２を参照されたい。こうした組成物は液状に調製することができ、又は乾燥粉末（例えば、凍結乾燥）状にすることができる。また、リポソームまたはプロテイノイド封入を行うことにより（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号で報告されているプロテイノイドミクロスフェアとして）その組成物を調合することができる。リポソーム封入を利用することができ、そのリポソームを各種ポリマーで誘導体化することができる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．：Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ及びＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編、第１０章、１９７９年をも参照されたい。概して、上記調合物は、上記ペプチド（又はその化学的改変体）並びに胃の環境中でペプチドを保護し、腸内でこの生物活性物質を遊離させる不活性成分を含む。
【００９０】
上記ポリペプチドアンタゴニストは、化学的に改変してその誘導体の経口的送達が有効なものであるようにすることができる。概して、想定されている化学的改変とは、少なくとも１つの機能基を上記成分分子自体に結合させることであり、そこでは、所望の機能基が、（ａ）蛋白分解の阻害及び（ｂ）胃又は腸から血流中への取り込みを可能にする。また、上記成分（単数または複数）の全体的安定性が高まり、体内における循環時間が長くなることも望まれる。ＰＧＥ化は、医薬的使用に好ましい化学的改変である。用いることができる他の機能基としては、プロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロリン、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンが挙げられる（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ及びＤａｖｉｓ（１９８１年）  ”Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ，”  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ．  Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ及びＲｏｂｅｒｔｓ編（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）  ｐｐ．３６７−３８３；並びに  Ｎｅｗｍａｒｋほか、（１９８２年）  Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４：ｐ．１８５−１８９参照）。
【００９１】
別の実施態様として、医薬用として許容可能な乳剤、液剤、懸濁剤及びシロップ剤を含む、経口投与用液状剤型を提供する。こうした剤型には不活性希釈剤；湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤などの佐剤；及び甘味剤、矯味矯臭剤及び芳香剤を含む他の成分を含むことができる。
【００９２】
徐放性経口調合物が望ましい。上記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストは、拡散又は浸出機構による放出を可能にする不活性マトリックス、例えばガム、に取り込ませることができる。ゆっくりと変性するマトリックスをその調合物に取り込ませることもできる。別の徐放の形態はＯｒｏｓ治療系（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づくものであり、即ち、浸透圧効果により単一の小開口を通って水を侵入させ、薬剤を押し出すことを可能にする半透膜にその薬剤を封入する。経口調合物の場合、放出場所は胃、小腸（十二指腸、空腸もしくは回腸）又は大腸とすることができる。この放出は、そのペプチド（もしくは誘導体）を保護するか、腸内など胃環境を超えた場所でこのペプチドを放出することによって胃環境の有害な影響を避けることが好ましい。胃における抵抗性を完全なものにするためには、少なくともｐＨ５．０に対して不浸透性のコーティングが不可欠である。腸溶コーティングとして用いられるより一般的な不活性成分の例には、トリメリト酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ  ５０、ＨＰＭＣＰ  ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ及びＳｈｅｌｌａｃが挙げられる。これらのコーティングは混合膜として用いることができる。
【００９３】
Ｃ．局所送達用調合物
組成物は局所に適用することができる。この用量は多くのペプチド調合物では働かないが、特に肺、鼻、口（舌下、頬）、膣又は直腸粘膜に適用された場合、有効であり得る。
【００９４】
Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストは、吸引しながら肺に送達させることができ、空気動力学的直径が約５ミクロン未満のエアロゾル又は噴霧乾燥粒子として送達させる場合、肺の上皮層を超えて血流まで横断する。
【００９５】
治療産物を肺に送達するために設計された様々な機械装置を用いることができ、このようなものとして、当業者にその全てがよく知られている噴霧器、計量吸入器及び粉末吸入器が挙げられるが、これらに限定されるものではない。市販の装置のいくつかの具体例としてはＵｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）；Ａｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ計量吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎ．Ｃ．）；及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）がある。Ｎｅｋｔａｒ、Ａｌｋｅｒｍｅｓ及びＭａｎｎｋｉｎｄは全て吸入用インスリン粉末調製物を有しており、これらは許可されているか、この技術を本明細書に記載した調合物に適用できた臨床試験が行われている。
【００９６】
粘膜への投与用調合物は通常、噴霧乾燥薬物粒子となるが、これらは錠剤、ゲル剤、カプセル剤、懸濁剤又は乳剤に取り込ませることができる。標準的な医薬用賦形剤はどの製剤業者からでも入手可能である。経口調合物は、チューインガム、ゲルストリップ、錠剤又はロゼンジの形をとることができる。
【００９７】
経皮調合物を調製することもできる。通常、これは、軟膏剤、ローション剤、噴霧剤又はパッチ剤となるが、これらは全て標準的な技術を用いて調製することができる。経皮調合物には浸透促進剤を含ませることが必要になる。
【００９８】
Ｄ．送達制御用ポリマーマトリックス
ポリマーのデバイス（棒、円柱、フィルム、円板）又は注入物（微粒子）の埋設後、全身性に長期放出させるための放出制御用ポリマーデバイスを作製することができる。このマトリックスはミクロスフェアなどの微粒子の形をとることができ、この場合、ペプチドが固体のポリマーマトリックス又はマイクロカプセル内に分散され、コアはポリマーシェルと異なる材料のものであり、そのペプチドは本質的に液体又は固体とすることができるコアに分散又は懸濁される。本明細書において明確に定義していない限り、微粒子、ミクロスフェア及びマイクロカプセルは互換可能に用いている。或いは、上記ポリマーは、数ナノメートルから４センチメートルの範囲の薄いスラブもしくはフィルム、磨砕その他の標準的な技法で作製した粉末、又はヒドロゲルなどのゲルとしても成型することができる。
【００９９】
非生分解性及び生分解性マトリックスのいずれもＢ７−Ｈ４アンタゴニストの送達に用いることができるが、生分解性マトリックスが好ましい。これらは天然又は合成ポリマーとすることができるが、分解及び放出プロフィールがよりよく特徴付けられているため、合成ポリマーが好ましい。このポリマーは、所望の放出期間に基づいて選択する。ある場合には線形放出が最も有用であることがあるが、別の場合にはパルス放出又は「バルク放出」がより効果的な結果をもたらすことがある。上記ポリマーは、（通常、重量で最大約９０％の水を吸収する）ヒドロゲルの形をとることができ、任意選択的に、多価イオン又はポリマーと架橋させることができる。
【０１００】
上記マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出及び当業者に公知の他の方法によって形成させることができる。生体内分解性ミクロスフェアは、例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ及びＬａｎｇｅｒ、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５，ｐ．１３−２２  （１９８７年）；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚほか、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６：ｐ．２７５−２８３  （１９８７年）；並びにＭａｔｈｉｏｗｉｔｚほか、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．  ３５，ｐ．７５５−７７４（１９８８年）に記載されている、薬物送達用ミクロスフェアを作製するために開発された方法のいずれかを用いて調製することができる。
【０１０１】
上記デバイスは、埋設もしくは注入−通常、全身の処置のための投与量よりもはるかに少ない投与量を送達する−領域を処置するための局所放出用、又は全身性送達用に調合物化することができる。これらは皮下、筋肉内、脂肪内に埋設又は注入し、又は飲み込むことができる。
【０１０２】
ＩＶ．製造方法
上記のように、ポリペプチドｓＨ４、ｓＨ４をコードする核酸構築物又はこれらの改変体及びＢ７−Ｈ４及びＢ７−Ｈ４受容体に特異的な阻害核酸は当該分野で公知の標準的な分子生物学プロトコルを用いて製造することができる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ編、第３版）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１年）を参照されたい。或いは、ｓＨ４又はその改変体は通常の生化学的技法を用いてこれらを発現する宿主から単離及び精製することができる。
【０１０３】
Ａ．ポリペプチドの製造方法
単離ポリペプチドは、例えば、化学合成又は宿主細胞における組換え産生によって得ることができる。共刺激ポリペプチドを組換え技術によって製造するために、このポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する核酸を用いて細菌又は真核生物宿主細胞（例えば、昆虫、酵母又は哺乳動物細胞）を形質転換、形質導入又は形質移入することができる。一般に、核酸構築物には共刺激ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に動作可能なように連結した調節配列を含める。通常、調節配列（本明細書では発現制御配列とも称する）は遺伝子産物をコードするのではなく、これが動作可能なように連結している核酸配列の発現に影響を与える。
【０１０４】
ポリペプチドを発現、産生する有用な原核生物及び真核生物系については、当該分野で周知であり、例えば、ＢＬ−２１などの大腸菌株及びＣＨＯ細胞などの培養哺乳動物細胞が挙げられる。
【０１０５】
真核生物宿主細胞では、ポリペプチドを発現させるためにウイルスをベースとする多くの発現系を利用することができる。ウイルスをベースとした発現系については当該分野で周知であり、バキュロウイルス、ＳＶ４０、レトロウイルス又はワクシニアをベースとするウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０６】
共刺激ポリペプチド改変体を安定的に発現する哺乳動物細胞株は適切なコントロールエレメント及び選択可能なマーカを有する発現ベクターを用いて作製することができる。例えば、真核生物細胞発現ベクターｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びｐ９１０２３（Ｂ）（Ｗｏｎｇほか、（１９８５年）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：ｐ．８１０−８１５参照）は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ヒト胎児性腎臓２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＭＤＣＫ細胞及びヒト培養血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：ｈｕｍａｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）において共刺激ポリペプチド改変体を発現するのに適している。電気穿孔法、リポ移入法、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥデキストラン法又は他の適切な形質移入法により発現ベクターを導入した後に、安定な細胞株を（例えば、Ｇ４１８、カナマイシンもしくはハイグロマイシンに対する抗生物質耐性によって）選択することができる。形質移入した細胞は目的のポリペプチドが発現されるように培養することができ、このポリペプチドは、例えば、細胞培養上清又は溶解細胞から回収することができる。或いは、ポリペプチドは、（ａ）ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの哺乳動物発現ベクター内に増幅配列を結合させ、（ｂ）小麦胚芽抽出物又はウサギ網状赤血球溶血液を用いてインビトロで転写及び翻訳を行うことにより作製することができる。
【０１０７】
ポリペプチドは、例えば、ＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどのクロマトグラフ法を用いて単離することができる。例えば、細胞培養上清又は細胞質抽出物中のポリペプチドはプロテインＧカラムを用いて単離することができる。一部の実施態様において、ポリペプチドは、アフィニティーマトリックス上へのこのポリペプチドの捕捉を可能にするアミノ酸配列を含有するように「設計（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」することができる。例えば、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素、ポリヒスチジン又はＦｌａｇＴＭ（Ｋｏｄａｋ）のようなタグはポリペプチド精製を支援するために用いることができる。このようなタグは、カルボキシ又はアミノ末端のいずれかの位置を含む、そのポリペプチド内のどこにでも挿入することができる。有用であり得る他の融合では、アルカリ性ホスファターゼなどの、そのポリペプチドの検出に役立つ酵素を含むことができる。免疫アフィニティクロマトグラフィーもまたポリペプチドを精製するために用いることができる。
【０１０８】
Ｂ．単離核酸分子の製造方法
単離核酸分子は、標準的な技術によって製造することができる。このような技術としては通常の分子クローニング法及び化学的核酸合成法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて共刺激ポリペプチド改変体をコードする単離核酸を得ることができる。ＰＣＲは標的核酸を酵素的に増幅する技術である。通常、目的の領域の両端またはそれを越えたところからの配列情報を用いて、増幅すべき鋳型の向かい合った鎖に対して配列が同一であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。ＰＣＲを用いることによって、全ゲノムＤＮＡ又は全細胞ＲＮＡからの配列を含むＤＮＡ及びＲＮＡからの特定の配列を増幅することができる。プライマーは、通常は長さが１４乃至４０ヌクレオチドであるが、１０ヌクレオチドから数百ヌクレオチドの範囲の長さとすることもできる。一般的なＰＣＲ技術については、例えば、「ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ及びＤｖｅｋｓｌｅｒ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５年に記載されている。ＲＮＡを鋳型の供給源として用いる場合、逆転写酵素を用いることにより相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することができる。リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己維持的配列複製又は核酸配列ベース増幅の方法を用いることによって単離核酸を得ることもできる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２年）  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ  １２：ｐ．１；Ｇｕａｔｅｌｌｉほか（１９９０年）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：ｐ．１８７４−１８７８；及びＷｅｉｓｓ  １９９１年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：ｐ．１２９２−１２９３を参照されたい。
【０１０９】
単離核酸は、（例えば、３’から５’方向への自動ＤＮＡ合成のためのホスホラミダイト技術を用いて）単一核酸分子として、又は一連のオリゴヌクレオチドとして化学的に合成することができる。例えば、各オリゴヌクレオチド対がアニーリングしたときに二本鎖を形成するように、短鎖の相補性部分（例えば、約１５ヌクレオチド）を含む各々の対を用いて、所望の配列を含む１つ以上の長鎖オリゴヌクレオチド（例えば、＞１００ヌクレオチド長）対を合成することができる。ＤＮＡポリメラーゼを用いることによってこれらのオリゴヌクレオチドを延長させることができ、その結果、オリゴヌクレオチド対当たり単一の二本鎖核酸分子が得られ、次いで、これをベクターに結合させることができる。単離核酸は変異誘発によっても得ることができる。核酸は、ＰＣＲによるオリゴヌクレオチド特異的変異誘発及び／又は部位特異的変異誘発を含む標準的な技術を用いて改変させることができる。「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  」第８章、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ａｕｓｕｂｅｌほか編、１９９２年を参照されたい。改変することができるアミノ酸の位置の例としては、本明細書に記載したものが挙げられる。
【０１１０】
Ｃ．抗体の製造方法
基本的な抗体構造単位はサブユニットの四量体を含むことが知られている。各四量体はポリペプチド鎖の２つの同一対からなり、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（約５０乃至７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に関与するアミノ酸約１００乃至１１０個以上の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能に関与する定常領域を定めている。
【０１１１】
軽鎖はカッパ又はラムダのいずれかに分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ又はイプシロンに分類され、それぞれ抗体のアイソタイプＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを規定する。軽及び重鎖内では、上記可変及び定常領域がアミノ酸約１２個以上の「Ｊ」領域によって結合されており、重鎖はアミノ酸がさらに約１０個の「Ｄ」領域をも含んでいる。（通例、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．第２版  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年、第７章参照）。
【０１１２】
各軽／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。従って、完全な状態の抗体には結合部位が２箇所ある。二価又は二重特異性抗体の場合を除き、これら２箇所の結合部位は同じである。これらの鎖は全て、相補性決定領域もしくはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域により結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という同じ一般的構造を示す。各対の２本の鎖からのＣＤＲはフレームワーク領域によって整列化され、これによって特定のエピトープへの結合が可能となる。Ｎ末端からＣ末端までに、軽鎖及び重鎖のいずれもドメインＦＲｌ、ＣＤＲｌ、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。
【０１１３】
１．ポリクロナール抗体の製造
ポリクロナール抗体はウサギ、ヤギ、齧歯動物などの免疫化動物からの血清として得られ、さらに処理することなく直接使用することができ、又は硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーなどの通常の富化又は精製方法にかけることができる。
【０１１４】
２．モノクロナール抗体の製造
モノクロナール抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：ｐ．４９５−９７（１９７５年））により導入された手順及びその変法（上記文献参照）などの従来のハイブリドーマ技術を用いて製造することができる。動物、好ましくはマウスに上記のような免疫原で免疫することにより開始してこの特発された動物に所望の抗体反応を惹起させる。特発された動物のリンパ節、脾臓又は末梢血からのＢリンパ球を、一般にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの融合促進剤の存在下に骨髄腫細胞と融合させる。いく種かのマウス骨髄腫細胞、即ち、Ｐ３−ＮＳ１／ｌ−Ａｇ４−ｌ、Ｐ３−ｘ６３−ｋ０Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇｌ４又はＨＬ１−６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．から入手可能）のいずれもそのような用途に利用できる。その後の工程には、未融合の親骨髄腫細胞及びドナーのリンパ球細胞は最終的に死滅するが、ハイブリドーマ細胞のみが生残するように選択培地で増殖させることが含まれる。生残した細胞をクローニングし、増殖させ、その上清を所望の特異性を有する抗体の存在について、例えば免疫測定技術によりスクリーニングする。陽性のクローンは、例えば限界希釈法によりサブクローニングし、モノクロナール抗体を単離する。
【０１１５】
こうした方法によって作製したハイブリドーマは当該分野で公知の技術（通例、Ｆｉｎｋほか、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、９：ｐ．１２１−３３（１９８４年）参照）を用いてインビトロ又はインビボ（腹水中）で増殖させることができる。一般には、個々の細胞株を培養で増殖させ、高濃度の単一モノクロナール抗体を含有する培養培地をデカンテーション、濾過又は遠心分離によって採集することができる。
【０１１６】
ａ．キメラ及びヒト化モノクロナール抗体の製造
キメラ及びヒト化抗体は、キメラ又はヒト化抗体構築の出発原料となるマウス又は他の非ヒト抗体と同一又は同様の結合特異性及び親和性を有する。キメラ抗体は、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子部分から、通常遺伝子操作によってその軽及び重鎖遺伝子が構築されている抗体である。例えば、マウスモノクロナール抗体からの遺伝子の可変（Ｖ）部分をＩｇＧ１、ＩｇＧ４などのヒト定常（Ｃ）部分に結合させることができる。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が好ましい。一部の方法では、この抗体のアイソタイプはヒトＩｇＧ１である。一部の方法では、ＩｇＭ抗体を用いることもできる。従って、代表的なキメラ抗体はマウス抗体からのＶ、即ち、抗原結合ドメイン及びヒト抗体からのＣ、即ち、エフェクタードメインからなるハイブリッド蛋白である。
【０１１７】
ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（アクセプタ抗体と称する）からの可変領域フレームワーク残基及び実質的にマウス抗体（ドナー免疫グロブリンと称する）からの相補性決定領域を有する。Ｑｕｅｅｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：ｐ．１００２９−１００３３（１９８９年）、国際公開第９０／０７８６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，５３０，１０１号及びＷｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい。定常領域も、存在する場合、実質的又は完全にヒト免疫グロブリン由来である。通常、ヒト可変ドメインは、フレームワーク配列が上記ＣＤＲが由来するマウス可変領域ドメインと高度の配列一致性を示すヒト抗体から選ばれる。重及び軽鎖可変領域フレームワーク残基は同一又は異なるヒト抗体配列由来でよい。ヒト抗体配列は、天然のヒト抗体の配列とすることができ、又はいく種かのヒト抗体のコンセンサス配列とすることができる。ＣＤＲの高次構造及び／又は抗原への結合に及ぼし得る影響に基づいて、置換のために、上記ヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸を選択する。このような影響の可能性の検討は、モデリング、特定位置のアミノ酸の特性調査又は特定アミノ酸の置換もしくは変異誘発の影響の経験的観察により行う。
【０１１８】
例えば、マウス可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基との間でアミノ酸が異なる場合、このアミノ酸が
（１）抗原と直接非共有結合し、
（２）ＣＤＲ領域に隣接し、
（３）そうでない場合は、ＣＤＲ領域と相互作用し（例えば、ＣＤＲ領域の約６Ａ内にある）、又は
（４）ＶＬ−ＶＨインターフェースに関与する
ことが合理的に予想されるのであれば、このヒトフレームワークアミノ酸は、通常、マウス抗体からの等価のフレームワークアミノ酸によって置換すべきである。
【０１１９】
置換のための他の候補は、その位置でヒト免疫グロブリンの場合には異常であるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。こうしたアミノ酸は、マウスドナー抗体の等価な位置又はより代表的なヒト免疫グロブリンの等価な位置からのアミノ酸で置換することができる。置換のための他の候補は、その位置でヒト免疫グロブリンにおいて異常であるアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。ヒト化免疫グロブリンの可変領域フレームワークは、通常、ヒト可変領域フレームワーク配列又はそのような配列のコンセンサスに対して少なくとも８５％の配列同一性を示す。
【０１２０】
ｂ．ヒトモノクロナール抗体の製造
Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に対するヒト抗体は、下記の各種の技術によって提供される。一部のヒト抗体は、競合的結合実験により選択するか、そうでない場合は、特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するように選択する。ヒト抗体はアイソタイプ特異性ヒトＩｇＧ１を有することが好ましい。
【０１２１】
ヒトモノクロナール抗体を製造する１つの方法はトリオーマ法である。この基本的方法及びこの方法に用いる例示的な細胞融合パートナーＳＰＡＺ−４についてはＯｅｓｔｂｅｒｇほか、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：ｐ．３６１−３６７（１９８３年）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ、米国特許第４，６３４，６６４号；及びＥｎｇｌｅｍａｎほか、米国特許第４，６３４，６６６号に記載されている）。この方法によって得られる抗体産生細胞株は、３種の細胞−２種のヒト及び１種のマウス細胞−に由来するので、トリオーマと呼ばれる。最初に、マウス骨髄腫細胞株をヒトＢリンパ球と融合させて、ＳＰＡＺ−４細胞株などの非抗体産生異種ハイブリッド細胞を得る。次いで、この異種細胞を免疫されたヒトＢリンパ球と融合させて抗体産生トリオーマ細胞株を得る。トリオーマはヒト細胞から作製される通常のハイブリドーマよりも安定的に抗体を産生することが見出されている。
【０１２２】
免疫されたそのＢリンパ球はヒトドナーの血液、脾臓、リンパ節又は骨髄から得られる。特定の抗原又はエピトープに対する抗体を所望する場合には、免疫化のためにその抗原又はそのエピトープを用いることが好ましい。免疫化はインビボ又はインビトロとすることができる。インビボ免疫化の場合、通常、Ｂ細胞はＢ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体で免疫したヒトから単離する。一部の方法では、Ｂ細胞は、最終的に抗体治療を施行されることになる同じ患者から単離する。インビトロ免疫化の場合、通常、Ｂリンパ球は、１０％ヒト血漿を補充したＲＰＭＩ−１６４０などの培地中、７乃至１４日間抗原に曝露させる。
【０１２３】
免疫されたＢリンパ球は、周知の方法によってＳＰＡＺ−４などの異種ハイブリッド細胞と融合させる。例えば、これらの細胞を約３７℃で約５乃至１０分間４０乃至５０％のＭＷ１，０００乃至４，０００のポリエチレングリコールで処理する。その融合混液から細胞を分離し、これを所望のハイブリッドの選択培地（例えば、ＨＡＴ又はＡＨ）中で増殖させる。このトリオーマ培養培地をＢ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体への結合能について測定することにより必要な結合特異性を有する抗体を分泌するクローンを同定する。所望の特異性を有するヒト抗体を産生するトリオーマを限界希釈法によりサブクローニングし、培養培地中インビトロで増殖させる。次いで、得られたトリオーマ細胞株をＢ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体への結合能について試験する。
【０１２４】
トリオーマは遺伝的に安定であるが、余り高レベルで抗体を産生しない。トリオーマからの抗体遺伝子を１種以上の発現ベクター中にクローニングし、このベクターを標準的な哺乳動物、細菌又は酵母細胞株中に形質転換することによって発現レベルを上昇させることができる。
【０１２５】
Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に対するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも一部分をコードする導入遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック哺乳動物から産生させることもできる。通常、このようなトランスジェニック哺乳動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座は機能的に不活性化される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座の部分は重及び軽鎖成分の再配列されていない配列を含むことが好ましい。内因性免疫グロブリン遺伝子の不活性化及び外因性免疫グロブリン遺伝子の導入はいずれも標的相同組換え又はＹＡＣ染色体の導入によって達成することができる。この工程から得られるトランスジェニック動物は、免疫グロブリン成分の配列を機能的に再配列し、内因性免疫グロブリン遺伝子を発現することなく、ヒト
免疫グロブリン遺伝子によりコードされている各種アイソタイプの抗体レパートリを発現することができる。こうした特性を有する哺乳動物の作製及び性質については、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇほか、国際公開第９３／１２２２号、米国特許第５，８７７，３９７号、米国特許第５，８７４，２９９号、米国特許第５，８１４，３１８号、米国特許第５，７８９，６５０号、米国特許第５，７７０，４２９号、米国特許第５，６６１，０１６、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，５４５，８０６号、Ｎａｔｕｒｅ  １４８：ｐ．１５４７−１５５３（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：ｐ．８２６（１９９６年）、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ、国際公開第９１／１０７４１号に詳細に記載されている。
【０１２６】
トランスジェニックマウスが特に適している。抗Ｂ７−Ｈ４及び抗Ｂ７−Ｈ４受容体抗体は、完全長のＢ７−Ｈ４に相当するポリペプチドもしくはＢ７−Ｈ４受容体ポリペプチド又はこれらの免疫原性断片でトランスジェニック非ヒト哺乳動物を免疫することによって得られる。モノクロナール抗体は、例えば、そのような哺乳動物からのＢ細胞を通常のＫｏｈｌｅｒ−Ｍｉｌｓｔｅｉｎ技術を用いて適切な骨髄腫細胞株と融合させることによって調製する。また、ヒトポリクロナール抗体は、免疫原作用物質で免疫したヒトからの血清として供給することができる。任意選択的に、このようなポリクロナール抗体は、Ｂ７−Ｈ４もしくはＢ７−Ｈ４受容体ポリペプチド又はこれらの断片を親和性試薬として用いる親和性精製によって濃縮することができる。
【０１２７】
ヒト抗Ｂ７−Ｈ４及び抗Ｂ７−Ｈ４受容体抗体を得る別の方法は、Ｈｕｓｅほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：ｐ．１２７５−１２８１  （１９８９年）に概説されている一般的プロトコルに従ってヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリをスクリーニングすることである。トリオーマ法の場合に記載したように、そのようなＢ細胞は完全長Ｂ７−Ｈ４もしくはＢ７−Ｈ４受容体ポリペプチド又はこれらの免疫原性断片で免疫したヒトから得ることができる。任意選択的に、そのようなＢ細胞は最終的に抗体処置を受けることになる患者から得る。Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ４受容体又はこれらの断片に結合する抗体を選択する。次いで、このような抗体（又は結合断片）をコードする配列をクローニングし、増幅させる。Ｈｕｓｅにより記載されたプロトコルは、ファージ−ディスプレイ技術との組合せでより効率的なものにされている。例えば、Ｄｏｗｅｒほかの国際公開第９１／１７２７１号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙほかの国際公開第９２／０１０４７号、米国特許第５，８７７，２１８号、米国特許第５，８７１，９０７号、米国特許第５，８５８，６５７号、米国特許第５，８３７，２４２号、米国特許第５，７３３，７４３号及び米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい。これらの方法では、メンバーがその外表面に種々の抗体を表示するファージのライブラリを作製する。通常、抗体はＦｖ又はＦａｂ断片として表示される。Ｂ７−Ｈ４もしくはＢ７−Ｈ４受容体ポリペプチド又はこれらの断片に対する親和性富化によって所望の特異性を有する抗体を表示するファージを選択する。
【０１２８】
上記ファージ−ディスプレイ法の変法では、選択したマウス抗体の結合特異性を有するヒト抗体を作製することができる（Ｗｉｎｔｅｒの国際公開第９２／２０７９１号）。この方法では、上記選択したマウス抗体の重又は軽鎖可変領域を出発原料として用いる。例えば、軽鎖可変領域を出発原料として選択する場合は、メンバーが同じ軽鎖可変領域（即ち、上記マウス出発原料）及び異なる重鎖可変領域を表示するファージライブラリを構築する。こうした重鎖可変領域は再配列したヒト重鎖可変領域のライブラリから得られる。αＳｙｎに対する強い特異結合（例えば、少なくとも１０８、好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１）を示すファージを選択する。次いで、このファージからのヒト重鎖可変領域をさらなるファージライブラリを構築するための出発原料とする。このライブラリでは、各ファージは同じ重鎖可変領域（即ち、第１のディスプレイライブラリから確認された領域）及び異なる軽鎖可変領域を表示する。こうした軽鎖可変領域は再配列したヒト軽鎖可変領域のライブラリから得られる。この場合も、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に対する強い特異結合を示すファージを選択する。こうしたファージは完全にヒトの抗Ｂ７−Ｈ４もしくは抗Ｂ７−Ｈ４受容体抗体の可変領域を表示する。通常、これらの抗体は上記マウス出発原料と同一又は同様のエピトープ特異性を有する。
【０１２９】
キメラ、ヒト化又はヒト抗体の重及び軽鎖可変領域はヒト定常領域の少なくとも一部分に連結させることができる。定常領域の選択は、抗体依存性補体及び／又は細胞媒介性毒性が所望されるかどうかにある程度依存している。例えば、アイソタイプＩｇＧ１及びＩｇＧ３は補体活性を有するが、アイソタイプＩｇＧ２及びＩｇＧ４は有しない。また、アイソタイプの選択は抗体の脳内への通過に影響し得る。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が好ましい。軽鎖定常領域はラムダ又はカッパとすることができる。抗体は、２本の軽鎖及び２本の重鎖を含有する四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖとして、又は重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサを介して連結されている単一鎖抗体として、発現させることができる。
【０１３０】
３．組換え抗体の発現
キメラ、ヒト化及びヒト抗体は、通常、組換え発現によって製造する。通常、組換えポリヌクレオチド構築体は、天然で結合されているまたは異種のプロモータ領域を含む、抗体鎖のコーディング配列に動作可能なように連結した発現制御配列を含む。この発現制御配列は真核生物宿主細胞を形質転換又は形質移入することができるベクター中の真核生物生物プロモータ系であることが好ましい。一旦このベクターを適切な宿主に取り込ませると、この宿主を上記ヌクレオチド配列の高レベル発現並びに上記交差反応抗体の収集及び精製に適した条件下に維持する。通常、こうした発現ベクターは、エピソーム又は宿主染色体ＤＮＡの構成要素の一部として宿主有機体中で複製可能である。通例、発現ベクターには所望のＤＮＡ配列で形質転換した細胞の検出が可能となるように選択マーカ、例えばアンピシリン抵抗性又はハイグロマイシン抵抗性マーカを含有させる。
【０１３１】
Ｅ．ｃｏｌｉは、ＤＮＡ配列をクローニングするのに特に有用な原核生物宿主の１種である。酵母などの微生物も発現に有用である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、所望通り発現制御配列、複製起点、終止配列などを有する好適なベクターを含有する好ましい酵母宿主である。代表的なプロモータとしては３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の糖分解酵素が挙げられる。誘導可能な酵母プロモータとしては、特に、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素からのプロモータが挙げられる。
【０１３２】
哺乳動物細胞は免疫グロブリン又はその断片をコードするヌクレオチド部分を発現するための好ましい宿主である（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ＮＹ，１９８７年）。無傷の異種蛋白を分泌することができる多くの適切な宿主細胞株が当該分野で開発されており、このようなものとしてはＣＨＯ細胞株、各種ＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ヒト胎児性腎臓細胞及び骨髄腫細胞株が挙げられる。こうした細胞は非ヒトであることが好ましい。これらの細胞のための発現ベクターには複製起点、プロモータ、エンハンサ（Ｑｕｅｅｎほか、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．  ８９：ｐ．４９（１９８６年））などの発現制御配列及びリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列などの必要なプロセッシング情報部位を含めることができる。好ましい発現制御配列はサイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスを含む内因性遺伝子由来のプロモータである（Ｃｏほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：ｐ．１１４９（１９９２年））。
【０１３３】
或いは、抗体をコードする配列を導入遺伝子に組み込み、トランスジェニック動物のゲノム中に導入した後、このトランスジェニック動物のミルクにおいて発現させることができる（例えば、米国特許第５，７４１，９５７号、米国特許第５，３０４，４８９号、米国特許第５，８４９，９９２号参照）。導入遺伝子には、カゼインもしくはベータラクトグロブリンなどの乳腺特異的な遺伝子からのプロモータ及びエンハンサと動作可能なように連結した軽及び／又は重鎖のコーディング配列を含ませるのが適切である。
【０１３４】
目的のＤＮＡ部分を含有するベクターは、宿主細胞の種類に応じて周知の方法を用い、宿主細胞中に移入させることができる。例えば、原核生物細胞では塩化カルシウムトランスフェクション法が一般に利用されるのに対し、他の細胞宿主ではリン酸カルシウム処理法、電気穿孔法、リポフェクション法、微粒子銃法又はウイルス利用トランスフェクション法を用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するのに用いられる他の方法としては、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔及び微量注入の使用が挙げられる（通例、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、上掲）。トランスジェニック動物を作製する場合、導入遺伝子を受精卵母細胞中に微量注入するか、胚性幹細胞のゲノム中に取り込ませることができ、そのような細胞の核を除核卵母細胞に移入させる。
【０１３５】
一旦発現させれば、抗体を、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む、当該分野の標準的な方法に従って精製することができる（通例、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ、１９８２年）参照）。
【０１３６】
本明細書に開示したポリペプチド免疫原は、適切な担体分子と連結させて免疫応答の惹起を助ける結合体を形成させることができる。好適な担体としては血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイドもしくはジフテリア、Ｅ．ｃｏｌｉ、ｃｈｏｌｅｒａ、又はＨ．ｐｙｌｏｒｉなどの他の病原体からのトキソイド又は弱毒化毒素誘導体が挙げられる。Ｔ細胞エピトープも好適な担体分子である。結合体によっては、作用物質を免疫促進性ポリマー分子（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリンシステイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、マンナン（マンノースポリマー）もしくはグルカン（ベータ１→２ポリマー）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ及びベータペプチド、ＩＬ−２、ガンマ−ＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ）並びにケモカイン（例えば、ＭＩＰ１アルファ及びベータ、及びＲＡＮＴＥＳ））に連結させることによって形成させることができるものもある。また、免疫原作用物質は、Ｏ’Ｍａｈｏｎｙの国際公開第９７／１７６１３号及び国際公開第９７／１７６１４号に記載されているような、組織を通過する輸送を増強するペプチドに連結することもできる。免疫原は、スペーサアミノ酸（例えば、ｇｌｙ−ｇｌｙ）を有し、又は有しない担体に連結させることができる。
【０１３７】
結合体によっては、作用物質を少なくとも１つのＴ細胞エピトープに連結させることによって形成させることができるものもある。一部のＴ細胞エピトープは乱交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）であるが、他のＴ細胞エピトープは万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）である。乱交雑Ｔ細胞エピトープは種々のＨＬＡ型を表示する多種多様な被検体においてＴ細胞免疫の誘導を増強することができる。乱交雑Ｔ細胞エピトープとは対照的に、万能Ｔ細胞エピトープは、種々のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子によりコードされる各種ＨＬＡ分子を表示する大きな割合（例えば、少なくとも７５％）の被検体においてＴ細胞免疫の誘導を増強することができる。
【０１３８】
天然のＴ細胞エピトープには、破傷風トキソイド（例えば、Ｐ２及びＰ３０エピトープ）、Ｂ型肝炎表面抗原、百日咳、トキソイド、麻疹ウイルスＦ蛋白、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍｉｔｉｓ主要外膜蛋白、ジフテリアトキソイド、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイト周囲蛋白Ｔ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ＣＳ抗原、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉトリオースリン酸イソメラーゼ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴｒａＴ、およびインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）など多数存在する。また、上記免疫原性ペプチドをＳｉｎｉｇａｇｌｉａ  Ｆ．ほか、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：ｐ．７７８−７８０（１９８８年）；Ｃｈｉｃｚ  Ｒ．Ｍ．ほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７８：ｐ．２７−４７（１９９３年）；Ｈａｍｍｅｒ  Ｊ．ほか、Ｃｅｌｌ  ７４：ｐ．１９７−２０３（１９９３年）；Ｆａｌｋ  Ｋ．ほか、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９：ｐ．２３０−２４２（１９９４年）；国際公開第９８／２３６３５号；及びＳｏｕｔｈｗｏｏｄ  Ｓ．ほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６０：ｐ．３３６３−３３７３（１９９８年）に記載されているＴ細胞エピトープと結合体を形成させることもできる。
【０１３９】
或いは、上記結合体は、汎ＤＲエピトープ（「ＰＡＤＲＥ」）のような、ＭＨＣクラスＩＩ分子の大部分と結合することができる人工Ｔ細胞エピトープの少なくとも１種に作用物質を連結させることによって形成させることができる。ＰＡＤＲＥについては米国特許第５，７３６，１４２号、国際公開第９５／０７７０７号及びＡｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｊほか、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１：ｐ．７５１−７６１（１９９４年）に記載されている。好ましいＰＡＤＲＥペプチドはＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（配列番号１）であり、Ｘは好ましくはシクロヘキシルアラニン、チロシン又はフェニルアラニンであり、最も好ましくはシクロヘキシルアラニンである。
【０１４０】
免疫原作用物質は、化学的架橋によって担体に連結させることができる。免疫原を担体に連結させる技術としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル−チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いてジスルフィド結合を形成させる（ペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合は、シンテイン残基の添加によってこれを供給することができる）ことが挙げられる。これらの試薬はそれら自身と１種のタンパク質上のペプチドシステイン残基との間にジスルフィド結合を、および、リシン上のイプシロン−アミノ若しくは他のアミノ酸中の他の遊離アミノ基によりアミド結合を創出する。多様なこうしたジスルフィド／アミド形成剤がＩｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．６２：ｐ．１８５（１９８２年）に記載されている。他の二官能性カップリング剤はジスルフィド結合ではなく、チオエーテルを形成する。これらのチオエーテル形成剤の多くは市販されており、６−マレイミドカプロン酸、２−ブロモ酢酸および２−ヨード酢酸、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸の反応性エステルが挙げられる。カルボキシル基は、スクシンイミド若しくは１−ヒドロキシ−２−ニトロ−４−スルホン酸ナトリウム塩と組合せることにより活性化することができる。
【０１４１】
免疫原性は、Ｔｈエピトープと上記ペプチド免疫原との間にスペーサ残基（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）を付加することにより向上させることができる。上記Ｂ細胞エピトープ（即ち、ペプチド免疫原）から上記Ｔｈエピトープを物理的に分離することに加え、これらのグリシン残基は、上記ペプチド免疫原との上記Ｔｈエピトープの結合により創出されるいかなる人工的二次構造も阻害することにより、Ｔ及び／又はＢ細胞応答間の干渉をなくすことができる。上記のヘルパーエピトープと抗体誘導ドメインとを立体構造的に分離させることによって、提示された免疫原と該当するＴｈ及びＢ細胞とのより効率的な相互作用が可能となる。
【０１４２】
多様なＨＬＡ型を表示する被検体の大きな割合において開示の作用物質に対するＴ細胞免疫の誘導を増強するために、種々のＴｈ細胞エピトープとの結合体の混合物を調製することができる。この混合物には、種々のＴｈ細胞エピトープとの少なくとも２種の結合体の混合物、種々のＴｈ細胞エピトープとの少なくとも３種の結合体の混合物、又は種々のＴｈ細胞エピトープとの少なくとも４種の結合体の混合物を含有させることができる。この混合物は、アジュバントと共に投与することができる。
【０１４３】
免疫原性ペプチドは、担体（即ち、異種ペプチド）との融合蛋白として発現させることもできる。この免疫原性ペプチドは、そのアミノ末端もしくはそのカルボキシ末端又はこれらの両者において担体と連結させることができる。任意選択的に、この融合蛋白中にこの免疫原性ペプチドの多重反復を存在させることができる。任意選択的に、免疫原性ペプチドを異種ペプチドの複数のコピーに、例えばこのペプチドのＮ及びＣ末端で連結させることができる。担体ペプチドによっては、この担体ペプチドに対するヘルパーＴ細胞応答を誘導する働きをするものもある。誘導されたヘルパーＴ細胞は上記担体ペプチドに連結した免疫原性ペプチドに対するＢ細胞応答を誘導する。
【０１４４】
本発明は、以下の限定されない実施例を参照することによってさらに理解されよう。
【実施例】
【０１４５】
（実施例１）
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスの作製
マウス
６乃至８週令のＣ５７ＢＬ１６（Ｂ６）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。ＲＡＧ−１  ＫＯマウスはＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓから購入した。実験には雌雄マウスとも使用した。全てのマウスは、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて施設内動物管理使用委員会により承認された全てのプロトコルを用いて特定病原体感染防止条件下で飼育した。相同組換えによって遺伝子ＫＯマウスを作製する一般的な方法については、以前に記載された（Ｄｏｎｇ，  Ｈ．ほか、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０：ｐ．３２７−３３６  （２００４年）；Ｔａｍａｄａ，  Ｋ．ほか、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６８：ｐ．４８３２−４８３５  （２００２年））。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスを作製するために、１２９ＳｖＪ細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からマウスＢ７−Ｈ４ゲノムＤＮＡのＩｇＶドメイン（エクソン３）の上流の５．０９ｋｂＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、ｐＫＯスクランブラーベクターＮＴＫＶ−１９０７（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の５’アーム位中にクローニングした。同じライブラリからＢ７−Ｈ４ゲノムＤＮＡのＩｇＣドメイン（エクソン４）の下流の５．５７ｋｂＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、同じベクターの３’アーム位中にクローニングしてＢ７−Ｈ４遺伝子からのＩｇＶ及びＩｇＣドメインの除去をもたらす標的プラスミドを作製した（図１Ａ）。Ｂ７−Ｈ４遺伝子の５’アーム及び３’アーム配列、ポジティブ選択マーカＮＥＯ及びネガティブ選択マーカＴＫを含有する標的断片を１２９ＳｖＩＥ胚幹（ＥＳ）細胞中に形質移入した。ＥＳ細胞形質移入体をネオマイシン薬剤選択にかけた。標的とするクローンは、３’外部プローブを用いるサザンブロット分析によって同定した。Ｂ６宿主の胚盤胞中に標的ＥＳ細胞を注入することによりキメラマウスを作製した。キメラマウスをＢ６マウスと交配してヘテロ接合体Ｂ７−Ｈ４（＋Ｉ−）マウスを得た。野生型及びＢ７−Ｈ４対立遺伝子欠失を識別するためにＰＣＲ分析を行った。３種のＰＣＲプライマーの配列は以下の通りとした。
【０１４６】
【化１】
2011502954.tif 000003
１０世代超の間Ｂ６へ戻し交配することによりホモ接合体マウスを作製した後、更なる分析に用いた。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスとＲＡＧ−１ＫＯマウスとを戻し交配することによりＢ７−Ｈ４ＫＯ／ＲＡＧ−１ＫＯマウスを得た。
【０１４７】
Ｂ７−Ｈ４遺伝子のＩｇＶ及びＩｇＣ領域全体を欠損させてその潜在的な受容体とのこれらの相互作用を完全になくすことで１２９ＥＳ細胞における相同組換えを行ってＢ７−Ｈ４ＫＯマウスを作製した。Ｂ７−Ｈ４遺伝子のＩｇＶ及びＩｇＣドメインをコードするエクソンはＮｅｏ遺伝子カセットで置換した（図１）。ＥＳ細胞の標的組換えはサザンブロット分析によって確認し、４つの独立したＥＳクローンからのデータを図に示した。
【０１４８】
Ｂ７−Ｈ４＋対立遺伝子は１２．２５ｋｂ  Ｓｐｅ１断片を有し、Ｂ７−Ｈ４−対立遺伝子は８．９ｋｂ  Ｓｐｅ１断片を有すると予測される。両断片を有するクローン（２及び３）は組換えが生じたことを示す。これらのＥＳクローンから標準的な手順によりキメラ雄性マウスを得た。こうしたマウスをＣ５７ＢＬ１６（Ｂ６）雌へ戻し交配し、２つの独立した標的ＥＳクローンからヘテロ接合体改変マウスを確立した。次いで、Ｂ７−Ｈ４改変マウスがヘテロ接合体であるかホモ接合体であるかについて、尾部生検試料から単離したゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析により確認した。サザンブロット分析によってゲノムＤＮＡが置換されていることを確認した。ＲＴ−ＰＣＲ分析によってＢ７−Ｈ４欠損マウスの肝臓ではＢ７−Ｈ４ｍＲＮＡが発現されていないことが明らかとなった。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは正常に成長し、正常な同腹仔数が得られた。こうしたマウスを１０世代の間、Ｂ６バックグラウンドへ戻し交配した後、下記の実験に用いた。
（実施例２）
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおけるリステリア菌感染に対する顆粒球媒介抵抗性の増強
抗体、組換え蛋白及びフローサイトメトリー分析
ＦＩＴＣ、ＰＥ又はＡＰＣと直接結合体を形成する、マウスＧｒ−１及びＣＤ１１ｂに対する一次及び二次抗体はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。結合体を形成していない一次抗体をハイブリドーマ培養上清から精製した。Ｂ７−Ｈ４Ｉｇ融合蛋白はＳｉｃａ，Ｇ．Ｌ．ほか、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１８：ｐ．８４９−８６１（２００３年）に記載されているのと同様にして調製した。細胞は全て標準的なプロトコルを用いて染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーで分析した（同上文献）。そのデータはＳｏｆｔｗａｒｅ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  （ＢＤ）又はＦｌｏｗＪｏ  （Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて解析した。インビボ実験の場合、ｍＡｂは、以前に記載された様に（同上文献）調製し、精製した。抗ＮＫ１．１ハイブリドーマ（ＰＫｌ３６）及び抗ＩＦＮ−γハイブリドーマ（Ｒ４−６Ａ２）はＡＴＣＣから購入した。抗Ｇｒ−１ハイブリドーマ（ＲＢ６−８Ｃ５）はシカゴ大学のＨａｎｓ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ博士から親切な提供を受けた。対照マウスＩｇＧ、ラットＩｇＧ及びハムスターＩｇＧはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、さらに、以前に記載された様に（同上文献）精製した。カラゲナンはＳｉｇｍａから購入した。全ての細胞培養培地及び抗体はＣｅｌｌｇｒｏ（Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）から購入した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）はＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）  から購入した。
【０１４９】
リステリア菌感染及びコロニー計数
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０５６はＣｅｒｕｓ  Ｃｏｒｐ．のＴｈｏｍａｓ  Ｗ．Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  Ｊｒ．博士から親切な提供を受けた。リステリア菌のストックを調製するため、リステリア菌細胞をＤｌＦＣＯ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）中、ＯＤ６００ｎｍで０．８乃至１となるまで増殖させた。培養物を遠心分離により採集しＰＢＳで２度洗浄した。次いで、ペレットをストック用溶液（１５乃至２０％グリセロール含有ＰＢＳ）に再懸濁し、マイクロチューブ当たり２００μｌのアリコートにして−８０℃で貯蔵した。リステリア菌ストックのコロニー形成単位（ＣＦＵ）は、ＢＢＬ  ＣＨＲＯＭａｇａｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）上で増殖する上記アリコートの希釈系列液のコロニーを計測することにより求めた。感染させる前に、リステリア菌ストックを解凍してＰＢＳで適切なＣＦＵ／ｍｌ濃度に希釈し、示したようにしてマウス又は細胞に適用した。６乃至８週令のマウスに対して、示したＣＦＵのリステリア菌を腹腔内（ｉ．ｐ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）注射して感染させた。感染後の示した時点で、マウスの肝臓又は膵臓の一片を切り取り、重量を計ってＰＢＳ中ですり潰した。得られた肝臓懸濁液はＢＢＬ  ＣＨＲＯＭａｇａｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａプレート又はＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈの寒天プレート上で平板培養した。平板培養後２日にコロニーを計数し、肝臓又は脾臓のＣＦＵＩｇに調整した。
【０１５０】
インビトロにおける顆粒球のリステリア菌感染
顆粒球は、Ｃｈｅｎ，  Ｌ．  Ｙ．ほか、Ｈｕｍ．  ＭｏＬ．  Ｇｅｎｅｔ、１２：ｐ．２５４７−２５５８  （２００３年）に記載の方法と同様にして単離した。つまり、マウスに３％チオグリコレート培地をｉ．ｐ．注射した。注射後４乃至５時間に、各マウスの腹膜腔を５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、遠心分離により細胞を収集した。この方法では、採集細胞の＞９０％がＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋顆粒球であった。１×１０６個の顆粒球を１×１０８ＣＦＵのＬＭと３７℃で１０分間インキュベートした。培養は、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）の添加によって終結した。次いで、遠心分離によって細胞を収集し、これを９６穴プレートで平板培養した。プレートを３７℃でインキュベートし、示した時点で採集した。細胞は、１ｍｌの滅菌水中に再懸濁して直ちに溶解させた。細胞溶解液又は希釈細胞溶解液をＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈの寒天プレート上に平板培養してコロニーを計数した。
【０１５１】
顆粒球の呼吸バースト及び貪食
Ｒａｄｓａｋ，Ｍ．Ｐ．ほか、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７２：ｐ．４９５６−４９６３  （２００４年）；Ｒａｄｓａｋ，Ｍ．Ｐ．ほか、Ｂｌｏｏｄ、１０１：ｐ．２８１０−２８１５（２００３年）に記載の方法と同様にして、顆粒球の貪食活性及び酸化的バースト活性を測定した。つまり、１×１０６個の顆粒球を５×１０７個の赤色蛍光マイクロビーズ（Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ  Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍａｔｉｃ  Ｒｅｄ  １．０  Ｍｉｃｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）及び２５μＭのＤＣＦＨ−ＤＡ（２’，７’−ジヒドロクロロフルオレセイン二酢酸、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に３７℃で３０乃至６０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で２度洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した。分析はフローサイトメトリーによって行った。
【０１５２】
病理学
組織の処理及び染色の方法についてはＤｏｎｇ，Ｈ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ８：ｐ．７９３−８００（２００２年）に記載されている。簡単に言えば、６乃至８週令のマウスの脾臓試料をＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で包埋し、−８０℃で凍結した。凍結組織はスライスにし、固定して５μｇ／ｍｌのＧｒ−１−ビオチン抗体で染色した。次いで、ＡＢＣペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）及びＤＡＢペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をメーカーのプロトコルに従ってスライドに適用した。最後に、ヘマトキシリン液を用いてＧｒ−１ネガティブ細胞を染色した。
【０１５３】
結果
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは正常な数及び率のＴ、Ｂ、ＮＫ、ＮＫＴ細胞及びマクロファージを示す。さらに、ＣＤ３架橋による精製Ｔ細胞のインビトロ増殖、同種抗原刺激又は同種抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の応答により判断して、Ｔ細胞応答に明白な変化は認められない。これらの結果から、抗原に対する多クローン性Ｔ細胞の応答はＢ７−Ｈ４ＫＯマウスでは損なわれないことが示される。こうしたインビトロの知見と符合して、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスはＣｏｎ−Ａ誘導肝炎（Ｄｏｎｇ，Ｈ．ほか、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０３２７−３３６（２００４年））、ハプテン誘導過敏症（Ｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｆ．ほか、Ｅｕｒ．Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３３：ｐ．２７７３−２７８２（２００３年））及びＯＶＡ誘導気道炎症（Ｋａｍａｔａ，Ｔ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、１１１：ｐ．１０９−１１９（２００３年））に対して正常な応答を示すことも見出した。また、Ｂ７−Ｈ４欠損マウスはＯＶＡ蛋白に対するＯＴ−Ｉ及びＯＴ−ＩＩ細胞の増殖（Ｓｉｃａ，Ｇ．Ｌ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１８８４９−８６１（２００３年））、超抗原に対するＣＤ４−Ｖβ８．１１８．２Ｔ細胞の増殖（Ｔａｍａｄａ，Ｋ．ほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６８：ｐ．４８３２−４８３５（２００２年））並びにインビボにおける同種抗原に対するＣＴＬ活性（Ｔａｍａｄａ，Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、６：ｐ．２８３−２８９（２０００年））において野生型マウスと同等であることも見出した。また、正常なＢ細胞応答がＴＮＰ−ＫＬＨによる免疫化（Ｔａｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ９７：ｐ．１８０９−１８１６（２００１年））後に認められた。最後に、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは、ＳＰＦ条件で最長１．５年、自然発生の自己免疫疾患を発症しない。
【０１５４】
これらのデータからＢ７−Ｈ４はアッセイにおける抗原駆動Ｔ及びＢ細胞応答に最小の関与であることが分かるが、これらの応答は、活動性感染の非存在下に行われたものであり、活動性感染が存在すれば、通常、自然免疫と適応免疫との精巧な協調を必要とする。この可能性を検証するために、Ｂ７−Ｈ４を除いた場合の影響をＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  （ＬＭ）に感染させたマウスで評価してＢ７−Ｈ４が感染に対する免疫に寄与するかどうかを調べた。マウスに、致死性を誘導するのに十分な腹腔内（ｉ．ｐ．）用量（２×１０６ＣＦＵ）のＬＭを感染させた。次に、こうしたマウスの生残について評価した。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスはＬＭ感染に対して有意により抵抗性であった。即ち、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは野生型（ＷＴ）同腹仔よりもはるかに長く生残し、マウスの最大４０％が細菌を除去し、いつまでも生存したのに対して、全ての同腹仔は９日目前後で死亡した（図２ａ）。この効果は、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスの脾臓（図２ｂ）及び肝臓中のリステリア菌数の減少と相関性がある。興味深いことに、大部分のマウスは、適応免疫が通常まだ発達していない時点である３乃至４日以内に死んでいた。従って、これらの結果から、Ｂ７−Ｈ４は自然免疫応答の状況を変えることに関与することが示唆される。
【０１５５】
この抵抗性のメカニズムに取り組むために、自然免疫及び適応免疫の細胞組成を調べた。マウスをリステリア菌に感染させ、末梢血及びリンパ系器官中のＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ及び顆粒球を特異的ｍＡｂによって調べた。ＬＭ感染後最初の３日以内ではＮＫ、マクロファージ、Ｔ細胞及びＢ細胞に有意な差違は見られなかったが、脾臓中の顆粒球は、感染３日目で、同一に感染させたＷＴ同腹仔よりもＬＭ感染Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスから有意により多く見出された（図２ｃ）。同様な結果は、感染後の肝臓から単離される顆粒球及び末梢血の顆粒球においても得られた。しかしながら、未感染のＢ７−Ｈ４ＫＯマウスでは、顆粒球数はＷＴ対照の正常範囲内にあった。これらの結果から、Ｂ７−Ｈ４の役割はＬＭ感染時の顆粒球応答を阻害することにあることが分かる。
【０１５６】
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおけるＬＭ感染の抵抗性に顆粒球が必要とされるかどうかを明らかにするために、Ｇｒ−１ｍＡｂを接種することにより顆粒球を枯渇させた。Ｇｒ−ＩｍＡｂを注射すると、２日目の脾臓において顆粒球が検出不可能なレベルにまで急速に減少した。Ｇｒ−Ｉ＋顆粒球を枯渇させると、ＰＢＳ又はアイソタイプ適合対照ｍＡｂで処置したマウスと比較して、Ｂ７−ＫＯマウスからの肝臓におけるＬＭ負荷は有意に増大した（図２ｄ）。ＮＫ細胞をＮＫＩ．ＩｍＡｂによって枯渇させても肝臓におけるＬＭのコロニー形成に影響を及ぼさなかったが、マクロファージをカラゲナンにより枯渇させると、ＬＭコロニーは中等度に増殖したが、Ｇｒ−Ｉ細胞枯渇の場合に比し、より重要性の低いレベルであった。従って、これらの結果は、Ｇｒ−Ｉ＋顆粒球がＢ７−Ｈ４非存在下におけるＬＭ感染に対する抵抗性に重要な役割を果たしているという概念を支持するものである。
【０１５７】
Ｂ７−Ｈ４欠乏顆粒球では機能性が改変されているかどうかについて精製顆粒球とＬＭとの共培養により明らかにした。Ｂ７−Ｈ４欠乏顆粒球は培養系中のＬＭの正常な取り込み及び増殖阻害を示した（図３）。さらに、Ｂ７−Ｈ４ＫＯ顆粒球による呼吸バースト及び貪食も正常であり、Ｂ７−Ｈ４ＫＯ顆粒球はＷＴ顆粒球と機能的に異ならないことが示された。従って、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおいてＬＭ感染に対する抵抗性が増大するのは、顆粒球の機能的能力の増大によるのでなく、顆粒球数の増加による可能性が高い。
（実施例３）
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスの顆粒球媒介自然抵抗性は適応免疫と無関係である。
【０１５８】
活性化及び記憶Ｔ細胞はＬＭに対する免疫における重要な構成要素である（Ｎａｔｈａｎ，Ｃ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．ＩｍｍｕｎｏＬ、６：ｐ．１７３−１８２（２００６年））。データはＬＭ感染に対するＢ７−Ｈ４ＫＯマウスの抵抗性が顆粒球を必要とすることを支持しているが、適応免疫もこの抵抗性に寄与しているかどうかは不明である。ＬＭ感染後の顆粒球数の増加はＢ７−Ｈ４ＫＯマウスに見出される主要な表現型であるので、ＬＭ感染に対するＢ７−Ｈ４ＫＯマウスの反応を適応免疫の非存在下に調べた。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは、ＲＡＧ−１ＫＯバックグラウンドへ戻し交配してＴ及びＢ細胞を除去した。
【０１５９】
結果
小さな脾臓を有するＲＡＧ−１ＫＯ（ＲＫＯ）マウスと異なって、Ｂ７−Ｈ４／ＲＡＧ−１二重ＫＯ（ＤＫＯ）マウスは脾臓の拡大を呈する。ＤＫＯマウスの脾臓サイズはＢ６バックグラウンドにおけるＷＴ及びＢ７−Ｈ４ＫＯマウスと同様である。脾臓、末梢血、肝臓及び骨髄の細胞成分をさらに分析すると、Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋顆粒球が劇的に増加することが明らかとなった。
【０１６０】
ＲＫＯ及びＤＫＯマウスに対して致死量のＬＭを投与して感染させ、これらの自然抵抗性を検討した。ＬＭによりＲＫＯマウスを感染させることによって肝臓のＬＭは指数関数的に増殖し、４日目には死亡率１００％となった（図４）。これとは際立って対照的に、ＤＫＯマウスは２日目の肝臓における細菌負荷が有意に少なく、大部分のマウスはＬＭ感染後１０日を超えて生残することができた（図４）。脾臓を含む他の器官でも同様なＬＭの指数関数的増殖が認められ、ＬＭ感染の播種が示された。感染Ｂ６バックグラウンドＢ７−Ｈ４ＫＯマウスのかなりの割合が長期間生残した（図２ａ）のとは対照的に、ＤＫＯマウスは全て最終的に１５日目に感染死し、適応免疫の重要な役割を確認した（図４）。ＬＭが２日目という早期にＤＫＯマウスの肝臓その他の器官から速やかに除去されたことと相俟って、以上の結果から、Ｂ７−Ｈ４の欠乏によってＬＭ感染に対する自然免疫が増強され、これは主として顆粒球の増加によって媒介されることが示唆される。
（実施例４）
Ｂ７−Ｈ４は顆粒球の増殖を直接阻害する。
【０１６１】
骨髄細胞の培養並びに顆粒球の増殖及び阻害試験
骨髄細胞を吸引し、Ｗｉｌｃｏｘ，Ｒ．Ａ．ほか、Ｂｌｏｏｄ、１０３：ｐ．１７７−１８４（２００４年）に記載されている方法と同様にして調製した。Ｂ７−Ｈ４媒介増殖阻害の場合、９６穴プレート中でＢ７−Ｈ４Ｉｇ又は対照マウスＩｇを一夜コーティングした。十分洗浄した後、組換えマウスＧ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を示した濃度で含み、又は含まない２４穴プレート中でＢＭ細胞を２×１０６個／穴平板培養した。示した時点で細胞を採集し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）で細胞数を計数した。細胞増殖を調べるために、２×１０５／穴のＢＭ細胞をＧ−ＣＳＦを含む９６穴プレート中で平板培養した。３ＨＴｄＲでパルスした後、細胞を３ＨＴｄＲパルス後１６時間にＦｉｌｔｅｒＭａｔｅセルハーベスタ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、ＣＴ）で収集した。取り込まれた３ＨＴｄＲはＴｒｉｌｕｘ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ及びＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）によって検出した。細胞分裂試験の場合、まず、ＢＭ細胞を２μＭのカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ｃａｒｂｏｘｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で標識し、次いで９６穴又は２４穴プレートに添加し、培養した。示した時点で細胞を収集し、ｍＡｂ  Ｇｒ−１及びＣＤ１１ｂで染色し、種々の時点のＣＦＳＥ含量（２）についてフローサイトメトリー分析を行った。
【０１６２】
結果
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおいて顆粒球が増加したことから、Ｂ７−Ｈ４は顆粒球に増殖阻害シグナルを送達することに関与していることが分かる。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスからの顆粒球について、これがＷＴ顆粒球よりも増殖能に優れているかどうかを明らかにするための検討を行った。これを行うために、多数の顆粒球前駆体を含有する骨髄（ＢＭ）細胞をＷＴ又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウスから調製し、Ｇ−ＣＳＦの存在又は非存在下に３日間培養して顆粒球／好中球の分化を促進した。次いで、ＢＭ細胞の増殖を  ３ＨＴｄＲの取り込みにより測定した。図５ａに示したように、ＢＭ細胞は用量依存性に増殖することでＧ−ＣＳＦに反応するが、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスからのＢＭ細胞の増殖はＷＴ細胞からの場合よりも有意に高かった。培養の最後においてＧ−ＣＳＦに反応するＢＭ細胞のフローサイトメトリー分析を行った結果から、生残細胞の９５％超はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋顆粒球であることを示している。
【０１６３】
このデータは顆粒球におけるＢ７−Ｈ４の阻害効果と一致しているが、ＢＭ細胞中の他の細胞成分が増殖に寄与することも考えられる。この可能性を明確に排除するために、ＢＭ細胞をＣＦＳＥで標識し、Ｇ−ＣＳＦで３日間刺激した後、この細胞を抗Ｇｒ−１＋／ＣＤ１１ｂ＋ｍＡｂで染色することにより細胞分裂に関して顆粒球を観察した。図５ｂは、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウス（Ｂ６）からの７０％のＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋顆粒球が少なくとも１回分裂するのに対し、ＷＴＢ６マウスからのわずか５６％の顆粒球がＣＳＦＥの希釈を示した。同様ではあるがより大きな有意差がＲＡＧ−１ＫＯバックグラウンドを有するマウスで見出された。即ち、ＤＫＯマウスの８６％の顆粒球が分裂を始めたのに対し、ＲＫＯマウスからのわずか６４．８％の顆粒球がＣＳＦＥの希釈を示した。従って、これらの結果から、ＢＭ細胞においてＢ７−Ｈ４が欠乏すると、ＢＭ由来顆粒球の増殖が増大することが示唆される。
【０１６４】
Ｂ７−Ｈ４の欠乏がＢＭ由来顆粒球の増殖増大をもたらし得ることを考慮して、Ｂ７−Ｈ４がその増殖を直接阻害することができるかどうかを調べた。これを検証するために、組換えＢ７−Ｈ４Ｉｇ融合蛋白の存在下にＷＴ  ＢＭ由来顆粒球を培養し、顆粒球の増殖について調べた。ＷＴ  ＢＭ細胞の増殖は、Ｂ７−Ｈ４の細胞外部分と免疫グロブリンＦｃとの融合蛋白であるＢ７−Ｈ４Ｉｇによって有意に阻害された。この阻害は培養３日目で明らかであり、４及び５日目でより著しくなった（図６ａ）。培養液に０．１ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを添加すると、ＢＭ細胞の増殖が中等度に増大したにもかかわらず、Ｂ７−Ｈ４Ｉｇ媒介の抑制は有意には覆されなかった（図６ｂ）。しかしながら、培養液中のＧ−ＣＳＦを１ｎｇ／ｍｌに増加させると、ＢＭ細胞のＢ７−Ｈ４Ｉｇ媒介増殖阻害を大きく回復させることができた（図６ｃ）。同様な阻害はＢ７−Ｈ４欠乏顆粒球でも認められた。集約すると、これらの結果から、さらに、Ｂ７−Ｈ４は顆粒球の増殖に対して阻害的であるが、これをＧ−ＣＳＦが逆転させ得るという証拠が得られる。
【０１６５】
Ｂ７−Ｈ４がリステリア菌感染に対する自然免疫を負に調節し得ることを思いがけなく発見した。Ｂ７−Ｈ４の効果は顆粒球の増殖抑制によって媒介されると考えられる。末梢組織におけるＢ７−Ｈ４の広範な発現パターンとの関連で、これまでに記載したＴ細胞応答の阻害におけるＢ７−Ｈ４の役割の他に、Ｂ７−Ｈ４が末梢組織の自然免疫の制御において重要な調節分子であることをデータは裏付けている。
【０１６６】
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスでは、Ｂ７−Ｈ４蛋白の細胞外部分の大部分が欠損することにより内因性Ｂ７−Ｈ４とその推定上の受容体との相互作用が完全に排除される。しかしながら、この遺伝子を除去すると、インビトロにおける多クローン性及び異種抗原刺激に対するＴ細胞応答に強い影響はない。最近の研究でも同様な観察がなされている（Ｓｕｈ，Ｗ．Ｋ．ほか、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２６：ｐ．６４０３−６４１１（２００６年））。これらの知見からＢ７−Ｈ４はＣＤ３架橋又は異種抗原に対する強い多クローン性Ｔ細胞応答の阻害に実質的には影響を及ぼさないことが示唆されるが、Ｂ７−Ｈ４がＴ細胞応答のカスケードにおけるより選択的な段階に影響する可能性がある。例えば、最近の研究では、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは数種の気道炎症反応並びにＬＣＭＶ及びインフルエンザ感染に対して正常に反応するが、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ感染に対してはこのマウスはＴ細胞免疫応答の軽度の増強を示すことが分かっている。しかしながら、このノックアウト系では顆粒球の応答については検討されていない。今回の実験から、リステリア菌感染におけるＢ７−Ｈ４の主要な役割は顆粒球媒介自然免疫を抑制することであり、この効果は適応免疫系の非存在下のＲＡＧ−１  ＫＯマウスでも認め得ることが示唆される。従って、これまでに報告されたＴ細胞免疫の阻害の他に、Ｂ７−Ｈ４は細菌感染に対する自然免疫の負の調節に重要な役割を果たし得る。
【０１６７】
Ｂ６１Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスの脾臓では顆粒球が軽度に増加するが、ＬＭ感染時には顆粒球は劇的に増加する（図２）。しかしながら、この増加は、単にＬＭ誘導性炎症による動員の増大によるものではない。Ｂ６バックグラウンドのＢ７−Ｈ４ＫＯマウスは感染のない血液、骨髄及び脾臓において顆粒球のわずかな増加を示す。ＲＡＧ−１  ＫＯバックグラウンドではより劇的な顆粒球増加が認められる。さらに、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスからの骨髄細胞はＧ−ＣＳＦ刺激存在下により多くの顆粒球を産生する。最後に、培養液にＢ７−Ｈ４蛋白を含めると骨髄由来顆粒球の増殖が有意に阻害される。興味深いことに、顆粒球の阻害におけるＢ７−Ｈ４の役割は、培養液により高濃度のＧ−ＣＳＦを添加することで少なくともある程度逆転し得る。Ｇ−ＣＳＦはインビボにおける顆粒球の増殖及び恒常性のための重要な因子である。この結果から、Ｂ７−Ｈ４はインビボにおけるＧ−ＣＳＦの役割に拮抗する負の調節因子として働き得ることが示唆される。集約すると、これらの結果から、Ｂ７−Ｈ４は、顆粒球の第一位の増殖因子であるＧ−ＣＳＦに対する顆粒球の反応性の阻害シグナルを供給することにより、顆粒球の恒常性を調節できることが確認される。
【０１６８】
顆粒球のＢ７−Ｈ４媒介増殖阻害のメカニズムについてはまだ明らかにされていない。Ｂ７−Ｈ４は、その推定上の受容体に結合すると、Ｔ細胞の細胞周期の進行を阻害することが示されている（Ｓｉｃａ，Ｇ．Ｌ．ほか、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：ｐ．８４９−８６１（２００３年）；Ｋｒｙｃｚｅｋ，Ｉ．、Ｊ．Ｅｉｃｐ．Ｍｅｄ．、２０３：ｐ．８７１−８８１（２００６年））。この細胞培養系では、ＣＦＳＥの希釈及び３ＨＴｄＲの取り込みが明らかに阻害される（図６ａ）。骨髄細胞は、顆粒球の重要な増殖因子であるＧ−ＣＳＦを外因的に供給しなくても増殖（図６ａ）及び細胞分裂（図５ｇ）が観察された。内因性Ｇ−ＣＳＦが骨髄細胞によって産生され、インビトロにおける基底レベルの増殖を維持している可能性がある。この抑制はＧ−ＣＳＦを添加することで大きく逆転し得た（図６ｃ）。培養中、細胞アポトーシスの有意な増加は最長５日間認められなかった。従って、Ｂ７−Ｈ４結合による顆粒球において増殖阻害が主要なメカニズムであり得る。Ｂ７−Ｈ４ｍＲＮＡは種々の細胞によって広く発現されるが、その細胞表面発現は、卵巣癌及び浸潤性マクロファージにおいて観察されたように（Ｋｒｙｃｚｅｋ，Ｉ．ほか、Ｊ．Ｅｉｃｐ．Ｍｅｄ．、２０３：ｐ．８７１−８８１（２００６年））、大部分は細胞質内に含み得る。Ｂ７−Ｈ４の表面発現が骨髄微小環境内のサイトカインによって調節されて顆粒球の増殖を阻害し得る。
【０１６９】
好中球を含む顆粒球は感染部位に最も早期に達する細胞の一つであり、貪食能を介した宿主の感染防御の最前線である（Ｎａｔｈａｎ，Ｃ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：ｐ．１７３−１８２（２００６年））。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおいてリステリア菌感染に対する抵抗性が増大することを示す上記知見は、リステリア菌及び恐らく他の病原体による感染に対する自然免疫を増強する新たなアプローチを包含する。また、ＲＡＧ−１バックグラウンドのＢ７−Ｈ４ＫＯマウスが、Ｂ６バックグラウンドのＢ７−Ｈ４ＫＯマウスと比較して顆粒球数のより顕著な増加を示し、初期相のＬＭ感染に対してより抵抗性であることも興味深い。こうしたデータは、顆粒球の恒常性及びリステリア菌感染に対する応答におけるＴ及びＢ細胞を含む適応免疫の構成要素の抑制的な役割の可能性を包含している。従って、アンタゴニスト活性を有する中和ｍＡｂ又は適切に設計されたＢ７−Ｈ４蛋白のような、Ｂ７−Ｈ４発現を選択的に遮断する方法は、顆粒球を増加させ、病原体感染に対する自然免疫を増強する新しいアプローチを示し得る。
【０１７０】
当業者は、本明細書に記載されている特定の実施態様に対する多くの均等物を、通常の実験作業を超えることなくして、認識し、確認できる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものである。
【図１】
2011502954.tif 000004
【図２ａ】
2011502954.tif 000005
【図２ｂ】
2011502954.tif 000006
【図２ｃ】
2011502954.tif 000007
【図２ｄ】
2011502954.tif 000008
【図３】
2011502954.tif 000009
【図４】
2011502954.tif 000010
【図５ａ】
2011502954.tif 000011
【図５ｂ】
2011502954.tif 000012
【図６】
2011502954.tif 000013
【配列表】
2011502954000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成21年8月31日(2009.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
別の実施態様では、Ｂ７−Ｈ４アンタゴニスト、好ましくはｓＨ４を含むワクチン組成物を提供する。このワクチンは抗原供給源をも含む。この抗原供給源はウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原又は原生動物抗原を供給することができる。好ましい実施態様では、この抗原は腫瘍特異的抗原である。上記ワクチン組成物は任意選択的にアジュバントを含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
医薬組成物投与単位であって、これを必要とする個体においてＢ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニスト及び医薬用として許容可能な担体を含む医薬組成物投与単位。
（項目２）
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストがｓＨ４又はその改変体である項目１に記載の医薬組成物。
（項目３）
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｂ７−Ｈ４受容体抗体、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体抗体に特異的な阻害核酸、ｓＨ４をコードする核酸及びこれらの組合せからなる群から選択される項目１に記載の医薬組成物。
（項目４）
前記阻害核酸がアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びミクロＲＮＡからなる群から選択される項目３に記載の医薬組成物。
（項目５）
前記Ｂ７−Ｈ４活性が細胞表面受容体へのＢ７−Ｈ４の結合である項目１に記載の医薬組成物。
（項目６）
前記細胞表面受容体がＴ細胞上の受容体である項目５に記載の医薬組成物。
（項目７）
前記Ｂ７−Ｈ４活性がＴ細胞活性の阻害である項目１に記載の医薬組成物。
（項目８）
第２の治療剤をさらに含む項目１に記載の医薬組成物。
（項目９）
前記第２の治療剤が成長因子受容体又は腫瘍特異抗原に特異的な抗体又はその抗原結合断片、サイトカイン、ケモカイン、増殖阻害剤及び細胞毒性剤からなる群から選択される項目８に記載の医薬組成物。
（項目１０）
個体において免疫応答を刺激又は増強する方法であって、
該個体においてＢ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストを該個体に投与する工程を含む方法。
（項目１１）
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストがｓＨ４又はその改変体である項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｂ７−Ｈ４受容体抗体、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に特異的な阻害核酸、ｓＨ４をコードする核酸及びこれらの組合せからなる群から選択される項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記阻害核酸がアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びミクロＲＮＡからなる群から選択される項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記Ｂ７−Ｈ４活性が細胞表面受容体へのＢ７−Ｈ４の結合である項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞表面受容体がＴ細胞上の受容体である項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記Ｂ７−Ｈ４活性がＴ細胞活性の阻害である項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記方法が前記個体において感染又は癌を処置するために用いられる項目１０に記載の方法。
（項目１８）
前記癌が膀胱、脳、乳腺、頸部、結腸−直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣及び精巣の癌からなる群から選択される項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記感染がウイルス、細菌、真菌及び原生動物によるものである感染を処置するための項目１７に記載の方法。
（項目２０）
ワクチン組成物であって、
抗原及び個体においてＢ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストを含む組成物。
（項目２１）
前記抗原が該抗原をコードする発現ベクターである項目２０に記載のワクチン組成物。
（項目２２）
前記抗原が抗原性ポリペプチドを含む項目２０に記載のワクチン組成物。
（項目２３）
前記抗原性ポリペプチドがウイルス性、真菌性、細菌性又は原生動物性である項目２２に記載のワクチン組成物。
（項目２４）
前記抗原性ポリペプチドが腫瘍特異抗原を含む項目２２に記載のワクチン組成物。
（項目２５）
癌を処置する方法であって、
腫瘍細胞上のＢ７−Ｈ４分子に結合するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストを被検体に投与して該Ｂ７−Ｈ４分子が免疫細胞上のＢ７−Ｈ４受容体に結合するのを阻害する工程を含む方法。
（項目２６）
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが抗体又はその抗原結合断片及びｓＨ４からなる群から選択される項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記被検体に第２の治療剤を投与する工程をさらに含む項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記第２の治療剤が成長因子受容体又は腫瘍特異抗原に特異的な抗体又はその抗原結合断片、サイトカイン、ケモカイン、増殖阻害剤及び細胞毒性剤からなる群から選択される項目２７に記載の方法。
（項目２９）
有効量の放射線を投与する工程をさらに含む項目２５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物投与単位であって、これを必要とする個体においてＢ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニスト及び医薬用として許容可能な担体を含む医薬組成物投与単位。
【請求項２】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストがｓＨ４又はその改変体である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｂ７−Ｈ４受容体抗体、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体抗体に特異的な阻害核酸、ｓＨ４をコードする核酸及びこれらの組合せからなる群から選択される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記阻害核酸がアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びミクロＲＮＡからなる群から選択される請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記Ｂ７−Ｈ４活性が細胞表面受容体へのＢ７−Ｈ４の結合である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記細胞表面受容体がＴ細胞上の受容体である請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記Ｂ７−Ｈ４活性がＴ細胞活性の阻害である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
第２の治療剤をさらに含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記第２の治療剤が成長因子受容体又は腫瘍特異抗原に特異的な抗体又はその抗原結合断片、サイトカイン、ケモカイン、増殖阻害剤及び細胞毒性剤からなる群から選択される請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
個体において免疫応答を刺激又は増強するための組成物であって、Ｂ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストを含む、組成物。
【請求項１１】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストがｓＨ４又はその改変体である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｂ７−Ｈ４受容体抗体、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に特異的な阻害核酸、ｓＨ４をコードする核酸及びこれらの組合せからなる群から選択される請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記阻害核酸がアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びミクロＲＮＡからなる群から選択される請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記Ｂ７−Ｈ４活性が細胞表面受容体へのＢ７−Ｈ４の結合である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞表面受容体がＴ細胞上の受容体である請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｂ７−Ｈ４活性がＴ細胞活性の阻害である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が前記個体において感染又は癌を処置するために用いられる請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
前記癌が膀胱、脳、乳腺、頸部、結腸−直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣及び精巣の癌からなる群から選択される請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記感染がウイルス、細菌、真菌及び原生動物によるものである感染を処置するための請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
ワクチン組成物であって、
抗原及び個体においてＢ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストを含む組成物。
【請求項２１】
前記抗原が該抗原をコードする発現ベクターである請求項２０に記載のワクチン組成物。
【請求項２２】
前記抗原が抗原性ポリペプチドを含む請求項２０に記載のワクチン組成物。
【請求項２３】
前記抗原性ポリペプチドがウイルス性、真菌性、細菌性又は原生動物性である請求項２２に記載のワクチン組成物。
【請求項２４】
前記抗原性ポリペプチドが腫瘍特異抗原を含む請求項２２に記載のワクチン組成物。
【請求項２５】
癌を処置するための組成物であって、
腫瘍細胞上のＢ７−Ｈ４分子に結合するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストを含み、該Ｂ７−Ｈ４分子が免疫細胞上のＢ７−Ｈ４受容体に結合するのを阻害する、組成物。
【請求項２６】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが抗体又はその抗原結合断片及びｓＨ４からなる群から選択される請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、第２の治療剤とともに投与されることで特徴づけられる、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記第２の治療剤が成長因子受容体又は腫瘍特異抗原に特異的な抗体又はその抗原結合断片、サイトカイン、ケモカイン、増殖阻害剤及び細胞毒性剤からなる群から選択される請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物が、有効量の放射線とともに投与されることで特徴づけられる、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３０】
個体において免疫応答を刺激又は増強するための医薬の製造における、Ｂ７−Ｈ４活性を阻害するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストの使用。
【請求項３１】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストがｓＨ４又はその改変体である請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｂ７−Ｈ４受容体抗体、Ｂ７−Ｈ４又はＢ７−Ｈ４受容体に特異的な阻害核酸、ｓＨ４をコードする核酸及びこれらの組合せからなる群から選択される請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
前記阻害核酸がアンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びミクロＲＮＡからなる群から選択される請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記Ｂ７−Ｈ４活性が細胞表面受容体へのＢ７−Ｈ４の結合である請求項３０に記載の使用。
【請求項３５】
前記細胞表面受容体がＴ細胞上の受容体である請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記Ｂ７−Ｈ４活性がＴ細胞活性の阻害である請求項３０に記載の使用。
【請求項３７】
前記医薬が、前記個体において感染又は癌を処置するためのものである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３８】
前記癌が膀胱、脳、乳腺、頸部、結腸−直腸、食道、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、膵臓、前立腺、皮膚、胃、子宮、卵巣及び精巣の癌からなる群から選択される請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記感染がウイルス、細菌、真菌及び原生動物によるものである感染を処置するための請求項３７に記載の使用。
【請求項４０】
癌を処置するための医薬の製造における、
腫瘍細胞上のＢ７−Ｈ４分子に結合するのに有効な量のＢ７−Ｈ４アンタゴニストの使用であって、該Ｂ７−Ｈ４分子が免疫細胞上のＢ７−Ｈ４受容体に結合するのを阻害する、使用。
【請求項４１】
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが抗体又はその抗原結合断片及びｓＨ４からなる群から選択される請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記医薬が、第２の治療剤とともに投与されることで特徴づけられる、請求項４０に記載の使用。
【請求項４３】
前記第２の治療剤が成長因子受容体又は腫瘍特異抗原に特異的な抗体又はその抗原結合断片、サイトカイン、ケモカイン、増殖阻害剤及び細胞毒性剤からなる群から選択される請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
前記医薬が、有効量の放射線とともに投与されることで特徴づけられる、請求項４０に記載の使用。
【国際調査報告】
2011502954.tif 000014
2011502954.tif 000015
2011502954.tif 000016
2011502954.tif 000017
2011502954.tif 000018