(57)【要約】  本出願は、標的細胞で細胞内のカルシウム放出をおこし、これによって初代培養した内皮細胞で増殖、移動および毛細血管類似（ｃａｐｉｌｌａｒｙ−ｌｉｋｅ）管形成を誘導する血管新生ペプチドに関する。前記血管新生ペプチドは、特に患者の傷の治癒、足および脚の潰瘍の治療などのような血管新生が関連する状態の予防および／または治療に使用され得る。また、前記血管新生ペプチドは、例えば、シワ抑制および皮膚美白のような老化した皮膚のための化粧品の成分として使用され得る。【選択図】図１Ａ
2011519835.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸の長さが６〜１５個であり、必須部分としてＸ1ＦＸ2ＬＲＸ3のアミノ酸配列を含むペプチドからなる群より選択される血管新生ペプチド配列：
Ｘ1ＦＸ2ＬＲＸ3
（前記Ｘ1は、セリンまたはスレオニンであり；
Ｘ2は、リシン、アルギニン、またはイソロイシンであり；
Ｘ3は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アルギニン、またはヒスチジンである。）。
【請求項２】
前記血管新生ペプチドが、Ｘ1ＦＸ2ＬＲＸ3のＣ末端に結合した１〜９個のアミノ酸で構成される連結ペプチドを含むものである、請求項１に記載の血管新生ペプチド。
【請求項３】
前記血管新生ペプチドが、前記Ｃ末端のカルボキシル基を−ＮＨ2で置換することによって修飾されたものである、請求項１または２に記載の血管新生ペプチド。
【請求項４】
前記血管新生ペプチドが、配列番号ｌ、２、８、１２、１４または１５〜２４のアミノ酸配列である、請求項１に記載の血管新生ペプチド。
【請求項５】
前記血管新生ペプチドが、細胞移動、血管新生、またはコラーゲン合成の増進活性、またはメラニン形成の抑制活性を有するものである、請求項１に記載の血管新生ペプチド。
【請求項６】
前記血管新生ペプチドの血管新生活性が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の上向調節により媒介されるものである、請求項１に記載の血管新生ペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の血管新生ペプチドを含む、傷の治癒、コラーゲン合成の増進またはメラニン合成の抑制のための組成物。
【請求項８】
前記組成物が、細胞移動、血管新生またはコラーゲン合成を増進させるものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、活性成分として請求項１〜６のいずれか一項に記載の血管新生ペプチド、および薬学的に許容可能な担体を含む傷の治癒のための薬学的組成物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、活性成分として請求項１〜６のいずれか一項に記載の血管新生ペプチド、および化粧用として許容可能な担体を含む老化した皮膚の状態改善のための化粧料組成物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記化粧料組成物が、シワ抑制および皮膚美白活性があるものである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の血管新生ペプチドを有効量、必要とする対象に投与することを含む、哺乳動物における血管新生を増進させる方法。
【請求項１３】
前記対象が、上皮の傷の治癒のために血管新生を必要とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が、コラーゲン合成誘導のために血管新生を必要とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドが、局部的に、全身的に、経口でまたは非経口で投与されるものである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞で細胞内のカルシウム放出をおこし、これによって初代培養した内皮細胞で増殖、移動および毛細血管類似（ｃａｐｉｌｌａｒｙ−ｌｉｋｅ）管形成を誘導する血管新生ペプチドに関する。また、前記血管新生ペプチドは、特に患者の傷の治癒、足および脚の潰瘍の治療などのような血管新生が関連する状態の予防および／または治療に使用され得る。また、前記血管新生ペプチドは、例えば、シワ抑制および皮膚美白のような老化した皮膚のための化粧品の成分として使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
血管新生、つまり、既存の脈管構造から新生血管の成長は、傷の治癒、胚発生、慢性炎症、ならびに癌の進行および転移を含む多様な生理学的および病理学的状態において基本的な過程である（Ｊ．Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１（１９９５）、ｐｐ．２７〜３１；Ｗ．Ｒｉｓａｕ，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６（１９９７）、ｐｐ．６７１〜６７４）。血管新生の間、細胞外基質の分解、増殖、移動、および管形成のための内皮細胞の形態的分化を含む複雑な細胞過程が起こる。このような全体の過程は新血管形成を調節する局所的因子により組織化され（Ｆ．Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２２（１９９７）、ｐｐ．２５１〜２５６）、血管新生バランスの変化は「脈管新生スイッチ」を媒介しうる。脈管新生スイッチの混乱は血管内で深刻な問題を誘発し得る。
【０００３】
カルシウムは、多様な細胞外刺激により喚起されたシグナル伝達事象および多様な細胞機能において、重要な役割を果たす（ＭＪ．Ｂｅｒｒｉｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６１（１９９３）、ｐｐ．３１５〜３２５；Ｋ．Ｋｉｓｅｌｙｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １５（２００３）、ｐｐ．２４３〜２５３）。増加した細胞内Ｃａ2+は、生体におけるヒト内皮細胞の接着、コラーゲン溶解活性、移動および増殖ならびに毛細血管成長に必須である（Ｅ．Ｃ．Ｋｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（１９９５）、ｐｐ．１３０７〜１３１）。実際に、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）リガンド、およびスフィンゴシン−１−燐酸塩（Ｓ１Ｐ）、Ｇ−蛋白共役型受容体（ＧＰＣＲ）リガンドは、細胞内Ｃａ2+レベルを調節することにより新血管形成を誘導する（Ｍ．Ｆａｅｈｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１６（２００２）、ｐｐ．１８０５〜１８０７；Ｍ．Ｇｕｉｄｏｂｏｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５（２００５）、ｐｐ．５８７〜５９５）。したがって、内皮細胞でのＣａ2+動員特性を調査することは、血管新生と関連した生理学的過程の包括的理解のために重要な情報を提供するだろう。
【０００４】
合成ペプチドコンビナトリアルライブラリーの位置スキャニング戦略（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ−ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ、ＰＳ−ＳＰＣＬ）は、血管新生活性を有するペプチドを分離するために使用されてきた（Ｒ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３５４（１９９１）、ｐｐ．８４〜８６）。また、前記ＰＳ−ＳＰＣＬ法は、多様な生物学的過程と関連した有用なペプチドをふるいわけするのに好適に適用されてきており、その結果、インターロイキン−８−特異的アンタゴニスト（Ｓ．Ｈａｙａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（１９９５）、ｐｐ．８１４〜８２４）、活性化Ｔ細胞の核内因子に対する抑制剤（Ｊ．Ａｒａｍｂｕｒｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５（１９９９）、ｐｐ．２１２９〜２１３３）、および免疫調節ペプチド（Ｙ．Ｓ．Ｂａｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９７（２００１）、ｐｐ．２８５４〜２８６２）のような幾つかのペプチドが同定された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
内皮細胞に作用する生物学的に活性な合成ペプチドを獲得するために、合成ペプチドライブラリーのスクリーニングを行い、そして本発明者らは、試験管内および生体外で血管新生活性を強く誘導する新規なペプチドを同定した。また、本発明者らは、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ２の血管新生活性が、内皮細胞でＶＥＧＦ−Ａの誘導により媒介されることを証明する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一具体的態様は、細胞移動、血管新生、またはコラーゲン合成の増進活性、またはメラニン形成の抑制活性がある、６〜１５アミノ酸の長さで選択される血管新生ペプチド配列を提供する。前記血管新生ペプチドは、必須のヘキサペプチドおよび１〜９個のアミノ酸で構成される連結ペプチドを含む。任意に、前記血管新生ペプチドは、Ｃ末端のカルボキシル基を−ＮＨ２で置換することによって修飾される。前記血管新生ペプチドの血管新生活性は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の上向調節により媒介される。
【０００７】
本発明の他の一具体的態様は、前記血管新生ペプチドを含む、傷の治癒、コラーゲン合成の増進またはメラニン合成の抑制のための組成物を提供する。前記組成物は、活性成分として前記血管新生ペプチドを含み、また薬学的に許容可能な担体を含む傷の治癒のための薬学的組成物である。前記組成物は、活性成分として前記血管新生ペプチドを含み、また化粧用として許容可能な担体を含む老化した皮膚の状態改善のための化粧料組成物である。前記化粧料組成物は、シワ抑制および皮膚美白の活性がある。
【０００８】
また他の一具体的態様は、有効量の血管新生ペプチドを必要とする対象に投与することを含む、哺乳動物における血管新生を増進させる方法を提供する。
【０００９】
さらに他の一具体的態様は、傷の治癒に有効な量の血管新生ペプチドまたはその類似体（ｍｉｍｉｃ）を、必要とする対象に提供するステップを含む、対象における傷を治療する方法を提供する。
【００１０】
また他の態様で本発明は、有効量の前記血管新生ペプチドまたはその類似体（ｍｉｍｉｃ）を、必要とする対象に投与することを含むシワ改善方法に関する。
【００１１】
さらに他の態様で本発明は、有効量の前記血管新生ペプチドまたはその類似体（ｍｉｍｉｃ）を、必要とする対象に投与して皮膚色素沈着（ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を弱化させる方法に関する。
【００１２】
さらに他の様態で本発明は、内皮細胞を提供する段階；前記細胞を候補アンタゴニスト化合物と接触させる段階；および、前記候補が前述のペプチドまたはその類似体の血管新生活性を抑制したときには、前記候補アンタゴニスト化合物をアンタゴニスト化合物と同定する段階を含む、血管新生抑制分子の同定方法に関する。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の目的は、発明の説明、本明細書に参考として添付された図面および請求項からより深く理解されるであろう。
【００１４】
本発明は、本明細書の以下に記載された詳細な説明および添付図面からより深く理解されるが、前記添付図面は単に説明のためのものに過ぎず、本発明を制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａ〜図１Ｆは、ＭＳ−１細胞において細胞内カルシウムを増加させるペプチドのＰＳ−ＳＰＣＬｓ初期スクリーニングを示しており、それぞれの棒（ｐａｎｅｌ）は、ヘキサペプチドの６個の位置ごとにそれぞれ公知のアミノ酸を有するペプチドプール（ｐｏｏｌｓ）を使用して得られた結果を示す。前記６個の位置は、１９個のＬ−アミノ酸のうちのいずれか一つでそれぞれ定義（例えば、Ｏ１、Ｏ２）される。残りの５個の位置は、１９個のＬ−アミノ酸（システイン以外）の混合配列（Ｘ）（ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｘ））で構成される。ライブラリーは、１１４ペプチドプールで構成される；前記ＰＳ−ＳＰＣＬは、総４７，０４５，８８１個の異なるペプチドから構成される。［Ｃａ2+］ｉ増加は、材料および方法の部分に記載されたように、Ｆｕｒａ−２／ＡＭを使用して蛍光定量的に測定した。その結果は、３つの独立した実験のうちの一つを示す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）がＨＵＶＥＣｓにおいて増殖、移動、および管形成を誘導することを示す。細胞をそれぞれ異なる濃度のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（０．１〜１０μＭ）で処理した。４８時間培養後、ＤＮＡ合成活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。バーは３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。＊Ｐ＜０．０５。（Ｂ）ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の異なる用量によるＨＵＶＥＣｓの移動性。創傷後、ＨＵＶＥＣｓを示された濃度のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（０．１〜１０μＭ）で１６時間培養した後、基準線をこえて移動したＨＵＶＥＣｓを計数した。数値は２回行われた３つの独立した実験の代表値である（平均±Ｓ．Ｄ．）。＊Ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＨＵＶＥＣｓの管形成に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果。ＨＵＶＥＣｓを成長因子量を減少させたマトリゲルに播種して、比較のためにＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１μＭ）、ＦＹＳＲＬＫ−ＮＨ2（１０μＭ）、およびＳ１Ｐ（１００ｎＭ）で処理した。２４時間培養後、管類似構造を撮影し、管形成の長さを測定した。数値は２回行われた３つの独立した実験の代表値である（平均±Ｓ．Ｄ．）。＊Ｐ＜０．０５。
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、ＢＡＰＴＡ、Ｕ７３１２２およびＰＴＸがＭＳ−１細胞において、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2に誘導された［Ｃａ2+］ｉの増加を抑制したことを示す。細胞内カルシウムのキレート剤であるＢＡＰＴＡ−ＡＭ（Ａ）、ＰＬＣ抑制剤であるＵ７３１２２およびその不活性類似体であるＵ７３４３３、ならびにＰＴＸ（Ｂ）の存在または非存在下で、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で誘導された細胞内Ｃａ2+動員活性を測定した。（Ａ）前記細胞を１０μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭを含むＤＭＥＭ内でＦｌｕｏ−４／ＡＭと３０分間３７℃で前培養した。細胞は０．２ｍＭのＥＧＴＡを含むＣａ2+フリーのロッケ溶液に懸濁し、示された濃度のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で処理した。蛍光強度の変化を励起４８８ｎｍおよび放出５２０ｎｍにて測定した。（Ｂ）細胞をＵ７３１２２（１０μＭ）、Ｕ７３４３３（１０μＭ）の存在または非存在下で３０分間、およびＰＴＸ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在または非存在下で２時間、それぞれＦｕｒａ−２と共に前培養した。その後、Ｆｕｒａ−２を添加された細胞をＣａ2+フリーのロッケ溶液に懸濁し、１μＭのＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で処理した。データはそれぞれ３回行われた平均±（３つの独立した実験）を示す。＊Ｐ＜０．０５。
【図４】図４は、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）が生体外で血管出芽（ｖｅｓｓｅｌ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）を誘導することを示す。マトリゲル内でラット大動脈外植片を、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１μＭ）、ＦＹＳＲＬＫ−ＮＨ2（１μＭ）、Ｓ１Ｐ（１０ｎＭ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｕ７３１２２（１０μＭ）もしくはＰＴＸ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含むＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１μＭ）、または１０％のＦＢＳを含有するＭ−１９９で培養し、７日間培養後に撮影した。その後、３つの独立した実験をそれぞれ２回ずつ行った。
【図５】図５Ａ〜図５Ｂは、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）によるＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−１  ｍＲＮＡの上向調節を示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で処理された初代培養ＨＵＶＥＣｓから単離されたｍＲＮＡに対して行った。表示されたデータは３つの独立した実験の代表的なものである。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１０μＭ）をＨＵＶＥＣｓで０、１、２、３、４、８、または１２時間（Ａ）、そして０、０．０１、０．１、または１０μＭで２時間処理し（Ｂ）、ＶＥＧＦ−Ａを、その特異的なプライマーを使用して増幅した。ＧＡＰＤＨは対照遺伝子として使用された。
【図６】図６Ａ〜図６Ｂは、ＨＵＶＥＣｓにおいて、抗ＶＥＧＦ抗体がＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で誘導された管形成を阻害することを示す。細胞を、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１０μＭ）またはＶＥＧＦ−Ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）と抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体（０．１、１、または１０μｇ／ｍＬ）とを含む培地で２４時間培養した。２４時間培養後、管類似構造を撮影し、管形成の長さを測定した。データは二つの独立的実験のうちの一つから代表され、数値は二つの独立した実験の平均である。＊Ｐ＜０．０５：溶媒処理と比較して。
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、１４日目における創傷治癒組織の組織像を示す。（Ａ）モック処理された（Ｍｏｃｋ−ｔｒｅａｔｅｄ）傷は、深刻な浮腫および組織崩壊した微小構造を示している。（Ｂ）正常にまでほとんど完全に復元された微小構造が、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１０μＭ）処理により観測された。
【図８】図８は、Ｉ型コラーゲンに対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果を示す。ヒト繊維芽細胞をＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（０．１、１、１０μＭ）で処理した。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、Ｂｌ６メラノーマ細胞内のメラニン含量に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
内皮細胞で［Ｃａ2+］ｉ増加を誘導する一連の新規なペプチドが、合成ペプチドコンビナトリアルライブラリーの位置スキャニング方法（ＰＳ−ＳＰＣＬ）を適応させること（accommodating）により明らかになった。前記ペプチドのうち、プロトタイプペプチドであるＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）が、内皮細胞においてＰＴＸ感受性Ｇ蛋白質／ＰＬＣ−媒介性［Ｃａ2+］ｉ増加を通じてＤＮＡ合成、移動、および管形成を誘導するということが証明されたが、これらは血管新生のための必須段階である。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の同定は、小さいペプチドとして血管新生の研究において注目すべきである。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）は、試験管内および生体外で血管新生活性を示したばかりか、ラットモデルで劇的な創傷治癒活性も示した。また、前記ペプチドの処理は、皮膚繊維芽細胞においてコラーゲンの合成を促進し、メラニン合成を抑制した。
【００１７】
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するプロトタイプペプチドおよび保存的変異体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｖａｒｉａｎｔ）またはこれらの機能的フラグメントに関するものである。前記血管新生ペプチドは、６〜１５、６〜１０、６〜７、または６個のアミノ酸長であり得、必須的な部分としてＸ1ＦＸ2ＬＲＸ3のアミノ酸配列を含み、Ｘ1ＦＸ2ＬＲＸ3のＣ末端に連結された１〜９個のアミノ酸で構成されるペプチドを含む。前記血管新生ペプチドは、前記末端のカルボキシル基を−ＮＨ2で置換することによって修飾されていてもよい。前記血管新生ペプチドの例としては、配列番号ｌ、２、８、１２、１４または１５〜２４からなるペプチドが挙げられる。
【００１８】
本明細書で使用される前記血管新生ペプチドは、化学式Ｉのアミノ酸配列を有するヘキサペプチドを含み、約６〜約１５のアミノ酸長であり得るオリゴペプチドを意味する。また、前記ペプチドは［Ｃａ2+］ｉ増加を刺激し、これによって内皮細胞で毛細血管類似管形成を誘導する化合物である。
【００１９】
Ｘ1ＦＸ2ＬＲＸ3
前記Ｘ1は、セリンまたはスレオニンであり；
Ｘ2は、リシン、アルギニン、またはイソロイシンであり；
Ｘ3は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アルギニン、またはヒスチジンである。
【００２０】
各位置で最も活性であるアミノ酸は：１番目の位置ではＳｅｒ（Ｓ）およびＴｈｒ（Ｔ）；２番目の位置ではＰｈｅ（Ｆ）；３番目の位置ではＩｌｅ（Ｉ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、およびＡｒｇ（Ｒ）；４番目の位置ではＬｅｕ（Ｌ）；５番目の位置ではＡｒｇ（Ｒ）；そして６番目の位置ではＡｒｇ（Ｒ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＨｉｓ（Ｈ）であった。
【００２１】
本明細書で使用される「血管新生」という用語は、新たな血管の成長、または「新血管形成」を意味し、内皮細胞で構成された比較的小口径の新たな血管の成長を含む。血管新生は、癌細胞増殖固形腫瘍の形成、炎症、傷の治癒、損傷された虚血組織の回復、心筋の血管再生および再構築、卵胞成熟、月経周期、および胎児発生を含む多くの重要な生物学的過程において、必須の部分である。新たな血管形成は、正常なものでも病的なものでも新たな組織の発達のために必要とされ、したがって正常組織および「正常」血管新生の成長を助長する治療的機会のみならず、多くの疾病状態調節において有望な管理点である。
【００２２】
血管新生に関する完全なメカニズムが全て知られているわけではないが、次のようにして毛細血管の内皮細胞が関連していることが知られている：
（１）おそらくプロテアーゼおよびグリコシダーゼにより媒介されて、内皮細胞および周辺細胞外基質（ＥＣＭ）の間の接着が変化し、それにより微細血管の内皮細胞を囲む基底膜が破壊され、その結果内皮細胞が化学走性因子の方向に細胞質芽（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｂｕｄｓ）を拡張することができる；
（２）血管新生化されるべき組織に向かって内皮細胞が移動する「化学走性過程」がある；そして
（３）「有糸分裂誘発過程」（例えば、新たな管のために追加の細胞を提供するための内皮細胞の増殖）がある。これらそれぞれの血管新生活動は、試験管内の内皮細胞培養を活用して独立的に測定できる。
【００２３】
傷は構造の正常な連続性を妨害する、体内または体外の身体損傷または病変であって、機械的、化学的、細菌的、または熱的手段のような物理的手段により引き起こされる。このような身体損傷には、皮膚が損傷しない傷である挫傷、皮膚が切断手段により損傷された切開、および皮膚が鈍器により損傷された裂創が含まれる。傷は事故または外科手術の過程により生じ得る。
【００２４】
傷の治癒は、損傷された組織を回復させ、固有の組織を再生させ、新たな組織を再組織させる一連の過程からなる。傷の治癒は、一般に３段階に分けられる：炎症段階、増殖段階、再構成段階。フィブロネクチンは、特に浸潤細胞が付着し得る足場を作ることで、傷の治癒過程の各段階に関連していることが知られている。初期に、フィブロネクチンおよびフィブリノゲンのような多くのメディエーターが、傷部位に放出される。その後、血管新生および再上皮化が起こる（ＵＳ特許第５，６４１，４８３号）。虚血に起因した損傷組織の回復は、広範囲な再構成および再血管新生を要する傷の治癒の一形態である。梗塞は、定義によれば、そして局所血液循環の閉塞による組織虚血性壊死領域である。その結果できる壊死性病変は、患部組織を酸素と栄養分が取り去られた状態にする。心臓では、特に冠状動脈循環の妨害が、心筋梗塞を招く。虚血性心筋は急速に酸素欠乏になるため、影響を受けた心筋の低酸素性微細環境は、再血管新生を試みるために血管新生因子の合成を誘導する。例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は梗塞が発生した心筋の部位で酸性されることが知られている（Ｒｅｆ）。
【００２５】
一具体的態様において、本発明は［Ｃａ2+］ｉ増加を刺激して内皮細胞における毛細血管類似管形成を誘導するポリペプチド、ペプチド類似体、または化学的化合物のような化合物のスクリーニングに関するものである。前記化合物は、糖尿病または傷に伴う足と脚の潰瘍および網膜症を含む、血液供給が障害されることにより誘発される疾患を患っている人々を治療することと期待される。
【００２６】
ファージディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）または化学的ライブラリーを含む多様なライブラリーが、内皮細胞で［Ｃａ2+］ｉ増加を刺激する化合物をスクリーニングするのに使用され得る。他の方法は、糖尿病または傷に伴う足と脚の潰瘍および網膜症を含む、血液供給が障害されることにより誘発される疾患を治療することを含む、対象における血管形成を誘導する化合物を同定するためにツーハイブリッドシステム（例えば、酵母または哺乳類のツーハイブリッドシステム）を使用する。これら多くの方法はハイスループット分析に適用可能である。また、追加の血管新生化合物の同定およびひいては足と脚の潰瘍、網膜病症、および傷を治療および／または予防する方法が提供される。一つの方法は、理論的薬物設計技術の使用を含む。すなわち、同定された化合物と類似する分子、およびこのような分子のフラグメントまたは誘導体が、コンピュータを使用した相同性分析、蛋白質モデリングおよび組み合わせ化学を使用してデザインされ、作られる。例えば、Ｘ1ＦＸ2ＬＲＸ3ペプチド、またはそのフラグメントもしくは誘導体に対応する核酸または蛋白質配列を含むデータベースが、類似のリガンドを同定するために、前記配列を公的にまたは商業的に利用可能なデータベースの他の配列と比較する検索プログラムによりアクセスされる。他の合理的方法によって、蛋白質モデリング技術（例えば、ｘ−線結晶学、ＮＭＲ、およびコンピュータモデリング）が前記化合物のモデルを構築するために使用される。これらモデルから、理論的薬物設計が可能である。一旦候補化合物がデザインされ、作られると、好ましくはそれらについて、内皮細胞において［Ｃａ2+］ｉ増加を刺激する能力を評価する。候補の前記能力およびその結果として発生する血管形成の誘導を評価する方法は、マトリゲルアッセイ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ａｓｓａｙ）のような多様なアッセイを使用して行なわれ得る。
【００２７】
［変異および突然変異ポリペプチド］
ポリペプチドの特性を向上または変化させるために、アミノ酸工学が使用されてもよい。新規な突然変異ポリペプチドを作るために、単一または多重アミノ酸置換、欠失、付加、または融合蛋白質を含む、当該分野で熟練した技術を有する者に知られた組み換えＤＮＡ技術が使用できる。特に短いペプチドにおいて、類似する突然変異ポリペプチドが化学的合成によっても製造できる。このように修飾されたポリペプチドは、例えば、増加した／減少した活性または増加した／減少した安定性を示しうる。また、これらは少なくとも一定の精製および保管条件下で、対応する天然ポリペプチドに比べて高収率で精製され得、また、より優れた溶解度を示しうる。
【００２８】
Ｘ1ＦＸ2ＬＲＸ3ペプチド、およびこれらの分子のフラグメントまたは誘導体と類似する化合物（例えば、Ｘ1ＦＸ2ＬＲＸ3ペプチド類似体）には、一次アミノ酸配列として血管新生ペプチド、およびこれらの分子のフラグメントまたは誘導体のアミノ酸配列の全部または一部を含む天然分子のみならず、結果的にサイレント変化となる範囲の残基によって、機能的に同等なアミノ酸残基が置換された変更配列も含まれる。したがって、血管新生ペプチド、およびこれらの分子のフラグメントまたは誘導体の配列内の一つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、機能的等価物として作用してサイレント変化を招く、他の類似する極性のアミノ酸で置換されてもよい。配列内アミノ酸の置換は、前記アミノ酸が属している群の他の構成アミノ酸より選択されてもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む。非荷電極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正電荷を帯びた（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む。負電荷を帯びた（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンを含む。本発明の他の態様において、翻訳途中または以降に、例えば、燐酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、蛋白質切断、抗体分子、膜分子、もしくは他のリガンドに対する連結により異なった様式で修飾された、Ｘ1ＦＸ2ＬＲＸ3ペプチド、およびこれらの分子のフラグメントまたは誘導体である。したがって、Ｘ1ＦＸ2ＬＲＸ3ペプチド、およびこれらの分子のフラグメントまたは誘導体に対応する前記蛋白質配列が、公知の配列と比較可能である。Ｘ1ＦＸ2ＬＲＸ3ペプチドと同等かあるいはそれ以上である前記候補化合物が同定され、その後にカルシウム動員アッセイを使用して分析される。
【００２９】
［類似体（Ｍｉｍｅｔｉｃｓ）］
本発明の態様で使用されるペプチドもまた修飾されてもよい。例えば、前記ペプチドは、ペプチドで通常見られない置換基を有してもよく、またペプチドで通常見られるが通常とは異なったペプチドの領域に置換基が導入されてもよい。本発明の態様で使用されるペプチドは、例えば、アセチル化、アシル化、またはアミノ化されてもよい。前記ペプチドを修飾するために該ペプチドに含まれ得る置換基は、Ｈ、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、芳香族、エーテル、エステル、非置換もしくは置換されたアミン、アミド、ハロゲン、または非置換もしくは置換されたスルホニル、または５もしくは６員環の脂肪族もしくは芳香族環を含むが、これに制限されない。「ＳＦＫＬＲＹペプチド類似体」は、ＳＦＫＬＲＹペプチドと類似する化合物である。ＳＦＫＬＲＹペプチド類似体は、ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）、ペプチド、修飾ペプチド、および誘導体化されたペプチドでありうる。
【００３０】
追加的な化合物誘導体は、関心があるポリペプチドと類似するペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）を含む。ペプチドの生物学的製造で使用される自然発生アミノ酸は全てＬ配置である。合成ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または２種類の異なる立体配置のアミノ酸の多様な組み合わせを活用して、従来の合成法で製造可能である。例えば、オリゴペプチドのような特定ペプチドの立体配置および好ましい特性は模倣するが、例えば柔軟性（立体配置の喪失）および結合分解のような好ましくない特性は避ける合成化合物、かつてそのようなペプチドが発見されていて、それは「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」として知られている。
【００３１】
一般に、ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）のデザインおよび合成は先ず、ペプチドの配列および所望のペプチド（例えば、最も可能性あるシミュレーション上のペプチド）の立体配置データ（例えば、結合長および結合角のような幾何学的データ）で始まり、ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）のデザインに取り入れられるべき幾何学的構造を決定するために、かかるデータを利用することを含む。このようなステップを遂行するための多くの方法と技術が当該分野に知られており、如何なるものも使用可能である。
【００３２】
ペプチド類似体の定義が類似体を非ペプチドリガンドと特徴づける一方、天然アミノ酸で構成された真性ペプチドとペプチド類似体との間のどこかに多くの構造が存在する。何がペプチド類似体を構成するのかについての論争が依然として続いているが、当該分野で熟練した技術を有する者は類似体とペプチドを区別することができる。ペプチド類似体は一般にペプチドの改良体とみなすことができる。ペプチド結合の還元のようなペプチド上の化学修飾は、その酵素的安定性を増加させることができる。また、非天然アミノ酸を導入すると、ペプチドの活性および選択性の両方を向上させることができる。ペプチドが構造的および／または化学的に変わるほど、それはより真性ペプチド類似体となる。ペプチド類似体には、ペプチド、蛋白質、およびこれらの誘導体、例えば、非ペプチド有機残基を含むペプチド、ペプチドリガンドの構造的および機能的特性は維持しながらアミノ酸および／またはペプチド結合を含んでも含まなくてもよい合成ペプチド、およびＳｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７（１９９２）に記載されたもののようなＮ−置換グリシンを含む分子であるペプトイドおよびオリゴペプトイド；および抗イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ）抗体などの抗体が含まれる。
【００３３】
本発明の他の態様において、本発明の前記発明された化合物は足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）のような多様な任意の化合物、ターン模倣体（ｔｕｒｎ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、およびペプチド結合置換を導入して合成的に作られてもよい。ペプチド骨格の代わりに多様な線形および複素環式足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）を使用したアミノ酸合成を採用しうる。化学的工程および方法には、向上した血液−脳浸透のために中性プロドラッグとして電荷を帯びたペプチドを一時的に保護すること、および複素環、オレフィンおよびフルオロオレフィン、およびケトメチレンのような群でペプチド結合を置換することが含まれる。
【００３４】
本発明の一具体的態様において、前記類似体はその標的に高度に特異的であり、毒性が低く、傷の治癒を向上させるために皮膚障壁を通過するペプチド類似体に関するものである。したがって、皮膚障壁を通過することができるように修飾された化合物は、本発明に包含される。
【００３５】
［薬学的組成物］
本明細書で使用される「担体」は、細胞または哺乳動物が適用される用量および濃度でこれらにさらされたときに無毒である、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を含む。前記薬学的に許容可能な担体は、たいていｐＨ緩衝水溶液である。薬学的に許容可能な担体の例は、これに限定されるわけではないが、燐酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白質；ポリビニルピロリドンのような親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；および／またはＴＷＥＥＮTR、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳTRのような非イオン性界面活性剤を含む。
【００３６】
本明細書で使用される「有効量」は、有利な効果または所望の臨床的もしくは生化学的結果を得るに十分な量を意味する。有効量は１回またはそれ以上の回数で投与されてもよい。本発明の目的のために、抑制剤化合物の有効量は疾病状態の緩和、寛解、安定、復帰、緩慢化または進行を遅延させるのに十分な量を意味する。本発明の好ましい一具体的態様において、前記「有効量」は、所定の一連の実験で応答を誘発することができる化合物の量と定義される。
【００３７】
本明細書で使用される「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは人間である。
【００３８】
本明細書で使用される「治療」という用語は、有利なまたは所望の臨床的結果を得るための方法をいう。本発明の目的のために、有利なまたは所望の臨床的結果には、感知できるか否かを問わずに、症状の軽減、疾病の規模の縮小、疾病状態の安定化（つまり、悪化しない）、疾病進行の遅延または減速、疾病状態の寛解または緩和、および鎮静（部分的であるか全的であるかを問わずに）が含まれるが、これに制限されない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想されるのに比べて生存期間を延長させることも意味する。「治療」は、治療的処置および予防的措置の両方を意味する。治療を要する対象には、前記異常が予防されている者のみならず、既に異常がある者も含まれる。疾病の「緩和」は、治療がない状況に比べ、疾病状態の規模および／または好ましくない臨床症状が減少することおよび／または進行の時間経過が遅延されたり延長されることを意味する。
【００３９】
幾つかの新規な血管新生ペプチドの発見が本開示で提供される。このような薬品は、経皮、局所、非経口、胃腸、経気管支、および経肺胞を含むあらゆる公知の経路を通じて送達され得るが、これらに制限されない。本発明の具体的態様はまた、糖尿病に伴う足と脚の潰瘍および網膜症、傷、および皮膚老化を研究、治療、および／または予防するための、生命工学的ツール、予防法、治療法および前述したものの使用方法を含む。
【００４０】
治療的化合物の剤型は、当該分野に一般に知られており、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．，ＵＳＡが好適に参照できる。例えば、一日に約０．０５μｇ／Ｋｇ（体重）〜約２０ｍｇ／Ｋｇ（体重）が投与されてもよい。用量計画は最適の治療的応答が得られるように調整されうる。例えば、毎日数回の分割量で投与されたりまたは治療状態の緊急事態の兆候に応じて比例して減少させてもよい。活性化合物は、経口、静脈注射（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内または座薬経路または植え込み（例えば、腹腔内経路により、又は試験管内で感作され、受容者に養子導入される単核球または樹状突起細胞のような細胞を利用することにより、徐放性分子を利用する）のような公知の方法で投与されうる。投与経路に応じて前記ペプチドは、成分を不活性化しうる酵素、酸および他の自然状態の作用から保護するために、ある材料でコーティングして包む必要があるかもしれない。
【００４１】
例えば、親油性の低いペプチドは、胃腸管内ではペプチド結合を開裂することができる酵素により、胃内では酸加水分解により破壊されるだろう。ペプチドを非経口投与でない方法で投与するために、ペプチドは不活性化を防止するための材料でコーティングされるか、またはこれと共に投与されうる。例えば、ペプチドは補助剤内に入った状態で、酵素阻害剤剤と共に、またはリポソームに入れた状態で投与されてもよい。本明細書で意図される補助剤は、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤を含む。酵素阻害剤は、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロ燐酸（ＤＥＰ）およびトラジロールを含む。リポソームは、公知のリポソームのみならず、水中油中水ＣＧＦエマルジョンを含む。
【００４２】
前記活性化合物はまた、非経口で、または腹腔内に投与されてもよい。また分散液が、グリセロール液体ポリエチレングリコール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｌｉｑｕｉｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌｓ）、およびこれらの混合物およびオイル内で調製可能である。通常の保管および使用条件下で、このような製剤は微生物の成長を防止するために保存剤を含む。
【００４３】
注入用として適した前記薬品の形態は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注入溶液または分散液の即時調製に使用される滅菌粉末を含む。全ての場合において前記形態は滅菌されたものでなければならず、また容易な注射能力（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が実現するほどの流体でなければならない。前記形態は製造および保管条件下で安定していなければならず、バクテリアおよび菌類のような微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適した混合物および植物油を含む溶剤または分散媒でありうる。例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には要求される粒子径の維持により、および界面活性剤（ｓｕｐｅｒｆａｃｔａｎｔｓ）の使用により適切な流動性が維持できる。微生物作用の防止は、例えば、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサール（ｔｈｅｏｍｅｒｓａｌ）など多様な抗菌および抗真菌剤により実施可能である。多くの場合で、例えば、糖類または塩化ナトリウムのような等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）を含むことが好ましいだろう。例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンのような吸収遅延剤を組成物内に含めて使用することにより、注入可能な組成物の吸収を遅延させることができる。
【００４４】
前記ペプチドが適切に保護された場合、前記活性化合物は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と共に経口で投与されたり、あるいは硬いかまたは柔らかい皮のゼラチンカプセルに封入されたり、または圧縮して錠剤にされたり、または食事の食品に直接混合されてもよい。経口治療的投与において、前記活性化合物は賦形剤と混合され、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、オブラートなどの形態で使用されてもよい。このような組成物および製剤は少なくとも１重量の活性化合物を含む。前記組成物および製剤の比率は、もちろん変更されてもよい。このような治療的に有用な組成物内の活性化合物の量は、適した用量になる量である。本発明における好ましい組成物または製剤は、活性化合物を約０．１μｇ〜２０００ｍｇ含む経口用量単位形態で製造される。
【００４５】
前記錠剤、丸剤、カプセルなどはまた、次のものを含んでもよい：トラガカントガム、アカシアガム、とうもろこしデンプンまたはゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；とうもろこしデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などのような崩壊剤；マグネシウムステアレートのような滑沢剤；およびスクロース、ラクトースまたはサッカリンのような甘味剤が追加されたり、ペパーミント、冬緑油（ｏｉｌ  ｏｆ  ｗｉｎｔｅｒｇｒｅｅｎ）、またはチェリー香料のような香味料である。前記用量単位形態がカプセルである場合、前述の種類の物質に加えて、液体担体を含んでもよい。多様な他の物質がコーティングとして、また他の場合には前記用量単位形態の物理的形態を修飾するために存在しうる。例えば、錠剤、丸剤またはカプセルは、シェラック、糖類またはこれら両方によりコーティングされていてもよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてスクロース、保存剤としてメチルおよびプロピルパラベン、色素およびチェリーまたはオレンジ香料のような香料を含んでもよい。もちろん、用量単位形態の製造で使用されたあらゆる物質は、使用される量で薬学的に純粋で実質的に無毒性であればよい。また、前記活性化合物は、徐放性製剤および剤型内に導入されてもよい。
【００４６】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体および／または希釈剤」は、あらゆる全ての溶剤、分散媒、コーティング抗菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性である物質として、このような媒体および物質を使用することは当該分野によく知られている。如何なる公知の媒体または物質が、前記活性成分と不適合性である場合でない限り、治療的組成物内におけるこれらの使用が意図される。追加の活性成分もまた、前記組成物に導入可能である。
【００４７】
例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内への導入、受容体媒介性エンドサイトーシスのような多様な送達システムが知られており、本発明の化合物を投与するに際して使用することができる。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が挙げられるが、これらに制限されない。前記化合物または組成物は、例えば、注入またはボーラス投与により、上皮または皮膚粘膜内壁（ｍｕｃｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｉｎｉｎｇｓ）（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収といった、あらゆる公知の経路により通じて投与され得、また他の生物学的活性薬剤と共に投与されてもよい。投与は全身的または局所的であってもよい。また、前記本発明の薬学的化合物または組成物を脳室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）およびクモ膜下腔内注射を含む、あらゆる適切な経路によって中枢神経系に導入することが好適であろう；脳室内注射は、例えば、オマヤ槽のようなリザーバに付着された脳室内カテーテルにより容易化されるかもしれない。肺の投与もまた、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアゾール製剤の使用により可能である。
【００４８】
［化粧料組成物］
本明細書に使用される「化粧用として許容可能な」は、記載された成分が過度な毒性、非適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応などなしに組織（例えば、皮膚または毛髪）と接触して使用するのに適することを意味する。
【００４９】
本明細書に使用される「有効量」は、シワおよび黒化のような人間の老化した皮膚を改善するのに十分であるが、深刻な副作用を避けられる程度の少ない量を意味する。前記組成物の安全且つ効果的な量は、治療部位、最終消費者の年齢および皮膚のタイプ、治療の期間および性質、使用される特定の成分または組成物、使用される化粧用として許容可能な特定の担体などの因子により変わり得る。
【００５０】
一具体的態様において、前記局所組成物は、重合体に加えてさらに他の化粧用活性成分を含む。「化粧用活性成分」は、皮膚または毛髪に化粧的または治療的効果を有する化合物（例えば、合成化合物または天然資源もしくは天然抽出物から分離された化合物）であり、例えば、抗にきび剤、光沢制御剤（ｓｈｉｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｇｅｎｔｓ）、抗菌剤、抗炎症剤、日焼け止め、光防護剤（ｐｈｏｔｏｐｒｏｔｅｃｔｏｒｓ）、抗酸化剤、角質溶解剤、洗浄剤／界面活性剤、保湿剤、栄養剤、ビタミン、エネルギー増強剤（ｅｎｅｒｇｙ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ）、制汗剤、収斂剤、消臭剤、安定剤、たこ抑制剤（ａｎｔｉ−ｃａｌｌｏｕｓ  ａｇｅｎｔｓ）、および毛髪および／または皮膚コンディショニング剤が挙げられるが、これらに制限されない。
【実施例】
【００５１】
本発明は、以下の実施例を参照してより詳しく説明される。しかしながら、本実施例は如何なる意味においても本発明の範囲を制限すると解釈されない。
【００５２】
［実施例１］
ＦＰＲＬｌ拮抗剤（Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）ペプチドの特性評価のための物質および方法
１．１．物質
フラ−２（Ｆｕｒａ−２）ペンタアセトキシメチルエステル（Ｆｕｒａ−２−ＡＭ）およびｌ，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラアセトキシメチルエステル（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から、百日咳毒素（ＰＴＸ）、Ｕ７３１２２およびＵ７３４３３はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から、マトリゲルは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）から、組み換えヒトＶＥＧＦおよび抗−ＶＥＧＦ中和抗体は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。ペプチドは、Ｐｅｐｔｒｏｎ  Ｉｎｃ．（韓国）により合成された。ＰＳ−ＳＰＣＬｓは、以前Ｓ．Ｈ．Ｂａｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１（１９９６）、ｐｐ．８１７０〜８１７５；Ｒ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４（１９９１）、ｐｐ．８４〜８６）に記載されたようにして、浦項工科大学（韓国）ペプチドライブラリー支援施設で準備した。
【００５３】
１．２．細胞培養
ＭＳ−１細胞およびＢ１６Ｆｌマウスメラノーマ細胞を、１０％ＦＢＳを含んでいるＤＭＥＭ内で、３７℃、９５％の空気および５％のＣＯ2が供給された加湿インキュベータで成長させた。ＨＵＶＥＣｓは、以前Ｅ．Ａ．Ｊａｆｆｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ５２（１９７３）、ｐｐ．２７４５〜２７５６）に記載されたようにして、新鮮なヒト臍帯からコラゲナーゼ消化により調製し、２０％ＦＢＳ含有Ｍ１９９培地で維持した。本研究に使用した全てのＨＵＶＥＣｓは５継代（ｐａｓｓａｇｅ）以下である。ヒトの通常の繊維芽細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入した。前記細胞は、１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質を含有しているＤＭＥＭ内で、３７℃、５％ＣＯ2の加湿雰囲気で培養した。その後前記細胞は、２日または３日毎に新鮮な培地に交換した後、０．０５％トリプシン−０．５３ｍＭのＥＤＴＡで継代培養した。
【００５４】
１．３．ＭＳ−１細胞における［Ｃａ2+］ｉ動員アッセイを利用したＰＳ−ＳＰＣＬｓの反復スクリーニング
細胞を４μＭ  Ｆｕｒａ−２ＡＭおよび２５０μＭ  スルフィンピラゾンと共に無血清ＤＭＥＭ培地内で、継続して撹拌しながら３０分間３７℃で培養した。その後、前記細胞をロッケ溶液（Ｍ．Ｆａｅｈｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １６（２００２）、ｐｐ．１８０５〜１８０７）で洗浄し、２ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように希釈した。分量５０μＬの細胞懸濁液を９６−ウェルプレートのそれぞれのウェルに添加し、ペプチドの添加後３４０および３８０ｎｍの二重励起波長と５００ｎｍの放出波長で、蛍光比の変化を測定した。ペプチドプールの添加後プレートを直ちに測定し、その結果、ペプチド添加とＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）による検出との間の時間遅延はほぼ５秒であった。全てのサンプルが同等の条件にさらされたことを保証するために、陰性および陽性対照をテストサンプルと同時に測定した。Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ  ２６０（１９８５）、ｐｐ．３４４０〜３４５０に従って、［Ｃａ2+］ｉについての蛍光比の較正を行った。
【００５５】
１．４．［3Ｈ］−チミジン取り込みアッセイ
ＨＵＶＥＣｓを２４−ウェル培養皿に２ｘ１０4細胞／ウェルの密度でまいて、一晩付着させた。１２時間の血清除去後、前記細胞を指定の濃度のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で、またはそれなしで４８時間処理した。細胞をアッセイ前に４時間［3Ｈ］−チミジン（２５ｍＣｉ／ｍｍｏｌ；Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ、英国）で標識した（Ｍ．Ｇｕｉｄｏｂｏｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５（２００５）、ｐｐ．５８７〜５９５）。取り込まれなかった［3Ｈ］−チミジンは１０％トリクロロ酢酸で洗浄して除去し、その後取り込まれた［3Ｈ］−チミジンを、０．２ＭのＮａＯＨおよび０．１％のＳＤＳで、３７℃で１時間抽出した。細胞内放射能は、液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）で計数した。
【００５６】
１．５．管形成アッセイ
以前Ｍ．Ｓ．Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７（２００６）、ｐｐ．５５８５〜５５９４に記載されたようにして、ＨＵＶＥＣｓを、予め重合されたマトリゲル層上に、ＶＥＧＦ中和抗体の存在または非存在下で、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）、その組み換え配列ＦＹＳＲＬＫ−ＮＨ2、Ｓ１ＰまたはＶＥＧＦと共にまいた。２４時間培養後、細胞形態変化を位相差顕微鏡を通して観察し撮影した。毛細血管網の形成を測定するために、場所（ｆｉｅｌｄ）当りの合計管長さを、４０倍拡大スケールで測定した。三つの異なる場所を、１ウェル毎に分析した。
【００５７】
１．６．傷移動検査
ＨＵＶＥＣの移動に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果を測定するために、以前Ｍ．Ｓ．Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７（２００６）、ｐｐ．５５８５〜５５９４に記載されたようにして、試験管内において傷の治癒の回復アッセイを行った。簡単に言えば、３５−ｍｍ培養皿に９０％コンフルエンスでＨＵＶＥＣｓをまき、２ｍｍ幅のかみそりの刃で傷をつけ、その傷の線に印を付けた。傷をつけた後に、前記細胞を無血清培地にて洗浄し、１％血清および／または示された量のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）を含有するＭ１９９でさらに培養した。ＨＵＶＥＣｓを１６時間移動させ、無血清培地でリンスし、無水メタノール（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｍｅｔｈａｎｏｌ）で固定し、ギムザで染色した。傷の線を越えて移動した細胞数を計数することで、移動を定量した。
【００５８】
１．７．大動脈輪アッセイ
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２６（１９９０）、ｐｐ．１１９〜１２８でＮｉｃｏｓｉａおよびＯｔｔｉｎｅｔｔｉにより開発された方法を一部変更して使用した。大動脈を６週齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットから採取した。周辺の繊維脂肪組織を除去した後、輪を培養皿のウェル内マトリゲルに漬けた。大動脈輪を、ＰＴＸもしくはＵ７３１２２の存在または非存在下で、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）、Ｓ１Ｐ、ＦＹＳＲＬＫ−ＮＨ2もしくはＶＥＧＦを含有する無血清Ｍｌ９９内で培養した（５％ＣＯ2、３７℃）。７日目に、大動脈移植片からの出芽を測定した。
【００５９】
１．８．ＲＴ−ＰＣＲ分析
ｅａｓｙ−ＢＬＵＥTM全ＲＮＡ抽出キット（Ｉｎｔｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．）を使用し、製造会社の説明書に基いてＨＵＶＥＣｓから全ＲＮＡを分離した。３μｇのＤＮＡフリー全ＲＮＡおよびオリゴ（ｄＴ）15プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、モロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）により、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。使用されたプライマ−の配列は次の通りである。ヒトＶＥＧＦ（１５０−ｂｐ産物）：フォワード、５’−ＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＣＧ−３’（配列番号２５）；リバース、５’−ＡＴＣＧＣＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号２６）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで染色して可視化した。
【００６０】
１．９．培養上清およびＥＬＩＳＡ
培養上清を次の通り作製した。６−ウェル皿において８０％コンフルエントのＨＵＶＥＣｓに、皿当り２ｍｌの無血清Ｍ１９９を供給し、示された時間培養した。残余細胞を除去するために、回収した培地を遠心分離し、−８０℃で凍結させた。ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）用の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、製造会社の説明書に基づいて行った。
【００６１】
１．１０．統計分析
データは平均±Ｓ．Ｄ．で示す。グループ間の統計的比較は、シグマプロット（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）を使用して行い、続けてスチューデントｔ−検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ）を行うことにより実施した。
【００６２】
［実施例２］
２．１．ＭＳ−１細胞において［Ｃａ2+］ｉ増加を誘導するペプチドの同定
マウスの内皮細胞（ＭＳ−１細胞）で細胞内カルシウム動員を刺激するペプチドを同定するために、本発明者らはＣ末端アミド化された合成ヘキサペプチドの１１４プールをスクリーニングした。ＭＳ−１細胞におけるペプチドライブラリーの初期スクリーニング結果を図１Ａ〜１Ｆに示した。
【００６３】
図１Ａ〜１Ｆは、ＭＳ−１細胞における細胞内カルシウムを増加させるペプチドを探すためのＰＳ−ＳＰＣＬｓの初期スクリーニングを示している。それぞれの棒は、ヘキサペプチドの６個のそれぞれの位置に公知のアミノ酸を有するペプチドプールを使用して得られた結果を示す。前記６個の位置は、１９個のＬ−アミノ酸のうちのいずれか一つで個別に定義（例えば、Ｏ１、Ｏ２）される。残りの５個の位置は、１９個のＬ−アミノ酸（システインを除く）の混合配列（Ｘ）（ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｘ））で構成される。ライブラリーは１１４ペプチドプールで構成される；前記ＰＳ−ＳＰＣＬは、合計で４７，０４５，８８１個の異なるペプチドで構成される。［Ｃａ2+］ｉ増加は、実施例１に記載されたＦｕｒａ−２／ＡＭを使用して蛍光定量的に測定した。本結果は、３つの独立した実験のうちの一つを示す。
【００６４】
各位置で最も活性のあるアミノ酸は：一番目の位置でＳｅｒ（Ｓ）およびＴｈｒ（Ｔ）；２番目の位置でＰｈｅ（Ｆ）；３番目の位置でＩｌｅ（Ｉ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、およびＡｒｇ（Ｒ）；４番目の位置でＬｅｕ（Ｌ）；５番目の位置でＡｒｇ（Ｒ）；そして６番目の位置でＡｒｇ（Ｒ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、およびＨｉｓ（Ｈ）であった。
【００６５】
ペプチドライブラリーの初期スクリーニングから得られた結果に基づき、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）を選択し、さらなる分析のためのプロトタイプペプチドとして合成した。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）のＣ末端アミド化体は、カルボキシル化されたペプチド（ＳＦＫＬＲＹ−ＣＯＯＨ）よりも強い活性を示し、一番目のアミノ末端残基を修飾（欠失またはＤ−型アミノ酸置換）すると、細胞内カルシウム動員活性が完全に消失した、これは、細胞内カルシウム動員活性が配列特異的であり、また、アミノ末端残基はＣ末端残基よりも活性においてより重要であるということを示唆している。また、他のヘキサペプチドの結果もまた、初期スクリーニング結果と相関していた（表１）。多くのペプチドリガンドがＣ末端アミド化形態で存在し、このような修飾は、幾つかの場合においては活性の発現に重要である（Ｙ．Ｉｎ、Ｍ．Ｆｕｊｉｉ，ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｂ  ５７（２００１）、ｐｐ．７２〜８１）；したがって、我々のペプチドは細胞内の特定の受容体に対するリガンドとしての特性を共有している。
【００６６】
【表１】
2011519835.tif 000003
【００６７】
２．２．ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）は、ＨＵＶＥＣｓにおける［Ｃａ2+］ｉの増加、増殖、移動、および管類似（ｔｕｂｕｌａｒ−ｌｉｋｅ）構造の形成を誘導する
ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）がヒト内皮細胞で［Ｃａ2+］ｉ増加を誘導するかを確認するために、初代培養したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）における細胞内Ｃａ2+動員を測定した。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）処理は、ＨＵＶＥＣｓにおける［Ｃａ2+］ｉ増加を、１．４±０．１５μＭで最大の半分の効果で誘導したが（データは示さず）、組み換えた配列であるＦＹＳＲＬＫ−ＮＨ2（１０μＭ）は、ＨＵＶＥＣｓにおいてＣａ2+動員を引き起こさなかった。ペプチドにより引き起こされた、Ｃａ2+放出についての用量−反応曲線は、マウス内皮細胞株で観察されたものと非常に類似していた（図２Ａ〜２Ｃ）。
【００６８】
図２Ａ〜２Ｃは、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）が、ＨＵＶＥＣｓにおいて増殖、移動、および管形成を誘導することを示している。（Ａ）ＨＵＶＥＣｓの増殖に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2の影響。細胞を異なる濃度のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（０．１−１０μＭ）で処理した。４８時間培養後、ＤＮＡ合成活性を液体シンチレーションカウンターで計数した。バーは３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。＊Ｐ＜０．０５。（Ｂ）異なった用量のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）によるＨＵＶＥＣｓの移動性。傷をつけた後に、ＨＵＶＥＣｓを示された濃度のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（０．１〜１０μＭ）で１６時間培養した後、基準線を越えて移動したＨＵＶＥＣｓを計数した。数値は２回行われた３つの独立した実験の代表値である（平均±Ｓ．Ｄ．）。＊Ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＨＵＶＥＣｓの管形成に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果。ＨＵＶＥＣｓを、成長因子が減量されたマトリゲルにまき、比較のためにＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１μＭ）、ＦＹＳＲＬＫ−ＮＨ2（１０μＭ）、およびＳ１Ｐ（１００ｎＭ）で処理した。２４時間培養後、管類似構造を撮影して、管形成の長さを測定した。数値は２回行われた３つの独立した実験の代表値である（平均±Ｓ．Ｄ．）。＊Ｐ＜０．０５。
【００６９】
血管新生過程は複雑であり、細胞外基質分解、増殖、移動、および管形成のための内皮細胞の形態的分化を含む、幾つかの区別可能な段階を含む（Ｆ．Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２２（１９９７）、ｐｐ．２５１〜２５６）。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）が血管新生を誘導するかを決定するために、血管新生刺激剤としてのＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の能力を、試験管内血管新生モデルで評価した。本発明者らは先ず血管新生カスケードの面：すなわちＨＵＶＥＣｓにおける増殖に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果を評価した。
【００７０】
ＨＵＶＥＣｓのＤＮＡ合成に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果を、［3Ｈ］−チミジン取り込みアッセイを用いて評価した時、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）はＨＵＶＥＣｓの増殖活性を用量依存的に増進させ、ＨＵＶＥＣｓのＤＮＡ合成を１μＭで約２．５倍増加させた。１０μＭのペプチドの増殖活性は、１０％ＦＢＳの増殖活性と類似していた（図２Ａ）。
【００７１】
血管新生は、内皮細胞の運動性に高度に依存的であるため、本発明者らは、次に試験管内傷移動アッセイでＨＵＶＥＣ移動に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果を評価した。図２Ｂに示されているように、ＨＵＶＥＣｓの移動活性は、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の添加により用量依存的に増進され、１０μＭで最大活性に近づいた。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）１０μＭにおける移動活性は、対照群（溶媒または未処理）より１．６倍増加し、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果は、ＨＵＶＥＣ移動の刺激剤として知られている１０％ＦＢＳと類似していた。
【００７２】
内皮細胞におけるＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の機能的役割に対する追加の証拠を提供するために、ＨＵＶＥＣｓにおける形態的分化に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果を、試験管内管形成アッセイで評価した（図２Ｃ）。対照群細胞が凝集して塊を形成したのに対し、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１０μＭ）で処理したＨＵＶＥＣｓは、ネットワーク（ｎｅｔｗｏｒｋ）形成へと至る伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）および内壁化（ｌｉｎｉｎｇ）といった形態的変化を示した。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の管形成活性（２０．２５±１．３１）は、対照群細胞（９．４±０．６７）の２倍以上であり、１０μＭのＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の活性は、１００ｎＭのＳ１Ｐの活性（１９．６９±０．３２）と類似する反面、組み換えた配列の１０μＭのＦＹＳＲＬＫ−ＮＨ2（８．９６±１．１４）はＨＵＶＥＣｓの形態的変化に対して効果がなかった（図２Ｃ）。このような結果は、試験管内でのヒト内皮細胞培養系における新血管形成に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の配列特異的な性質を裏付ける。
【００７３】
２．３．ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導［Ｃａ2+］ｉ増加は、ＰＴＸ感受性Ｇ蛋白質−ＰＬＣシグナル伝達経路により媒介される
内皮細胞におけるＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）媒介性シグナル伝達経路を描写するために、本発明者らは細胞内Ｃａ2+増加と関連した上流シグナル伝達メカニズムを検討した。ＰＬＣは、細胞内Ｃａ2+動員を活性化させるＩＰ３およびジアシルグリセロールを生産することが知られている（ＭＪ．Ｂｅｒｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２（１９８４）、ｐｐ．３１５〜３２１；Ｐ．Ｗ．  Ｍａｊｅｒｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６８（２０００）、ｐｐ．４７〜５３；およびＹ．Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８（１９９２）、ｐｐ．６０７〜６１４）。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導Ｃａ2+シグナル伝達において、ＰＬＣ媒介性シグナル伝達経路が関係する可能性を調べるために、ペプチド誘導性細胞内カルシウム動員に対するＰＬＣ抑制剤、Ｕ７３１２２およびその不活性アナログＵ７３４３３の効果を検討した。
【００７４】
図３Ａ〜３Ｂは、ＢＡＰＴＡ、Ｕ７３１２２およびＰＴＸがＭＳ−１細胞におけるＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2誘導［Ｃａ2+］ｉ増加を抑制したことを示している。細胞内カルシウムキレート化剤、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（Ａ）、ＰＬＣ抑制剤Ｕ７３１２２およびその不活性アナログであるＵ７３４３３、およびＰＴＸ（Ｂ）の存在または非存在下で、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導細胞内Ｃａ2+動員活性を測定した。（Ａ）前記細胞を１０μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭを含むＤＭＥＭ内でＦｌｕｏ−４／ＡＭと共に３０分間、３７℃で前培養した。細胞は０．２ｍＭのＥＧＴＡを含むＣａ2+フリーのロッケ溶液に懸濁し、示された濃度のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で処理した。蛍光強度の変化を、励起４８８ｎｍおよび放出５２０ｎｍで測定した。（Ｂ）細胞を、Ｕ７３１２２（１０μＭ）、Ｕ７３４３３（１０μＭ）の存在または非存在下で３０分間、およびＰＴＸ（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在または非存在下でＦｕｒａ−２と共に２時間、それぞれ前培養した。その後、Ｆｕｒａ−２を添加された細胞をＣａ2+フリーのロッケ溶液に懸濁し、１μＭのＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で処理した。データはそれぞれ３回行われた平均±３（独立した実験）を示す。＊Ｐ＜０．０５。
【００７５】
Ｕ７３１２２（１０μＭ）はペプチド誘導細胞内カルシウム動員を完全になくしたが、Ｕ７３４３３（１０μＭ）は抑制効果がほとんどなかった（図３Ｂ）。ＨＵＶＥＣｓのＧｉ−共役受容体−ＰＬＣ−細胞内Ｃａ2+シグナル伝達経路を通じた血管新生活性の誘導は、（Ｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５８２（２００２）、ｐｐ．２２８〜２３９；Ｏ．Ｈ．Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６８（２０００）、ｐｐ．４７〜５３；Ｆ．Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（１９９９）、ｐｐ．３５３４３〜３５３５０）によく記載されているため、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導細胞内Ｃａ2+動員におけるＧ−蛋白質の関連を評価した。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で処理する２時間前にＭＳ−１細胞を百日咳毒素（ＰＴＸ）（１００ｎｇ／ｍＬ）で処理した時、ペプチド依存性細胞内Ｃａ2+動員は、図３Ｂに示されているように、ＰＴＸ前処理により顕著に弱化された、これは、応答がＰＴＸ感受性Ｇ−蛋白質により大部分引き起こされることを示す。一般に、［Ｃａ2+］ｉの上昇は内部のストアからのＣａ2+放出または外部環境からの流入により達成される。
【００７６】
Ｃａ2+プールの源を確認するために、０．２ｍＭのＥＧＴＡを含むＣａ2+フリーのロッケ溶液中にて、ＭＳ−１細胞におけるペプチド誘導［Ｃａ2+］ｉ増加を測定した。ＢＡＰＴＡ−ＡＭの非存在下では、細胞内Ｃａ2+濃度の上昇は用量依存的な様式であることが示された反面（図３Ａ）、細胞内Ｃａ2+キレート化剤ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（１０μＭ）をＭＳ−１細胞に予め添加することにより細胞内Ｃａ2+を枯渇させると、最大効果のペプチド濃度で処理した細胞ですら［Ｃａ2+］ｉ増加が完全になくなった（図３Ａ）。このような結果は、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）が細胞内Ｃａ2+ストアからの［Ｃａ2+］ｉ増加を引き起こすことができ、ＰＴＸ−感受性Ｇ−蛋白質は、ＭＳ−１細胞におけるＰＬＣ−媒介性細胞内カルシウム動員と関連があるかもしれないことを示している。
【００７７】
もし、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）が膜受容体に結合し、細胞内Ｃａ2+生産を誘導することができるなら、関連したシグナル伝達メカニズムを知らなければならない。αサブユニットのＡＤＰ−リボシル化によりＧ蛋白質を抑制するＰＴＸは、細胞内Ｃａ2+増加を大きく弱化させ（図３Ｂ）、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）によるラット大動脈輪における血管移植片からの内皮細胞の成長活性を顕著になくした（図４）。したがって、我々のデータは、ＰＴＸ−感受性Ｇ蛋白質の媒介が、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導性血管新生の作用において重要なシグナルであることを示唆する。シグナル伝達の後Ｇ蛋白質は、ホスホリパーゼＣの活性化を含む多様な細胞反応を導く、その酵素はＰＩＰ2を加水分解してＤＡＧおよびＩＰ3を形成し、これらは細胞内Ｃａ2+ストアからの細胞内カルシウムの放出を媒介する。多様なホルモン、成長因子、および多様な神経伝達物質がこのようなシグナル伝達経路を使用する（ＭＪ．Ｂｅｒｒｉｄｇｅ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２（１９８４）、ｐｐ．３１５〜３２１；Ｐ．Ｗ．Ｍａｊｅｒｕｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６３（１９９０）、ｐｐ．４５９〜４６５；Ｙ．Ｎｉｓｈｉｚｕｋａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８（１９９２）、ｐｐ．６０７〜６１４）。ホスホリパーゼＣ抑制剤、Ｕ７３１２２は、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）により開始された細胞内カルシウム動員をなくした（図３Ｂ）、従って［Ｃａ2+］ｉ増加がＰＬＣの活性化に依存することが示される。このような結果に基づき、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）がＰＴＸ感受性Ｇ−蛋白質共役細胞表面受容体の活性化を通じてその応答を引き起こし、続けて内部のストアからＰＬＣ−媒介性細胞内カルシウム動員が起こることと思われる （図３Ａ）。
【００７８】
したがって、我々のデータは百日咳毒素感受性Ｇ蛋白質の媒介は、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導血管新生の作用において重要な信号であり、これはマストパランのような直接Ｇ蛋白質活性化剤よりはＧＰＣＲに分類される受容体を示唆する（Ｒ．Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６５（１９９０）、ｐｐ．１１０４４〜１１０４９）。マストパランは両親媒性ペプチドであり、免疫および神経細胞株を含む多様な細胞において細胞内Ｃａ2+動員活性を有する（Ｊ．Ｆ．Ｋｌｉｎｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０４（１９９４）、ｐｐ．３７７〜３８３；Ｔ．Ｍｕｒａｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６９（１９９６）、ｐｐ．４４８〜４５４）。しかしながら、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）は細胞膜を貫通し難い親水性ペプチドであり、細胞内カルシウム動員活性はＭＣ３Ｔ３−Ｅ１、Ｃ６ｂｕ１、ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＣ２Ｃ１２のような細胞内において観察されたが、ＰＣ１２およびＵ９３７のような神経または免疫細胞では観察されなかった（データは示さず）。しかしながら、他の細胞で同一レベルのカルシウム応答を達成するためには、１０倍以上の用量のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）が必要であった。我々の観察結果は、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の推定される受容体は間葉系統の細胞で広く発現しており、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の作用は内皮細胞でより特異的であることを示唆する。
【００７９】
最近、幾つかの報告で、血管新生過程の調節において、Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲｓ）の活性化に続けてＰＬＣ−Ｃａ2+シグナル伝達経路が活性化するとの示唆が記載された（Ｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５８２（２００２）、ｐｐ．２２８〜２３９；Ｄ．Ｓ．Ｇｅｌｉｎａｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３７（２００２）、ｐｐ．１０２１〜１０３０；Ｙ．Ｍ．Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７（２００２）、ｐｐ．６７９９〜６８０５；Ｆ．Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（１９９９）、ｐｐ．３５３４３〜３５３５０）。Ｇｉ共役受容体媒介性のＰＬＣ−Ｃａ2+シグナル伝達経路は、Ｓ１Ｐで刺激された内皮細胞の接着点形成および移動において重要であることが知られている（Ｏ．Ｈ．Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６８（２０００）、ｐｐ．４７〜５３；Ｆ．Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（１９９９）、ｐｐ．３５３４３〜３５３５０）。新血管形成の初期段階では、内皮細胞の発芽は細胞増殖、細胞移動および管形成を必要とする必須の段階である（Ｗ．Ｒｉｓａｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８６（１９９７）、ｐｐ．６７１〜６７４）。我々の結果は、ＨＵＶＥＣｓの細胞増殖、移動、および管形成がＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）処理により用量依存的に増強されることを示した（図２）。また、生体外でのラット大動脈輪からのＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）により刺激された内皮細胞の成長結果は、ＶＥＧＦ処理により得られた結果と類似している（図４）。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）による血管移植片からの内皮細胞の発芽は、ＰＴＸまたはＵ７３１２２の処理により、それら抑制剤のペプチド誘導［Ｃａ2+］ｉ動員に対する効果により、顕著に減少した。これらの結果は、ＰＴＸ感受性ＧＰＣＲ−ＰＬＣ−Ｃａ2+シグナル伝達経路がＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導内皮細胞発芽に必須であることを示唆する。
【００８０】
２．４．ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2による生体外における血管発芽の誘導
ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）が生体外において、血管内皮細胞の発芽で役割を果たすかについて取り組むために、１μＭのＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）、１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、１０ｎＭのＳ１Ｐ、および１０％のＦＢＳを含む多様な刺激の存在下に、大動脈輪を分析した。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１μＭ）は血管移植片からの内皮細胞の顕著な成長をおこし、血管発芽活性は１０ｎＭのＳ１Ｐおよび１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ処理の場合よりも高かった。図４は、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）が生体外において血管発芽を誘導することを示す。マトリゲル内でラット大動脈移植片をＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１μＭ）、ＦＹＳＲＬＫ−ＮＨ2（１μＭ）、Ｓ１Ｐ（１０ｎＭ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）またはＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１μＭ）を含むＭ−１９９、あるいはさらにＵ７３１２２（１０μＭ）またはＰＴＸ（５０ｎｇ／ｍＬ）を含むＭ−１９９、あるいは１０％のＦＢＳを有するＭ−１９９で培養し、７日間培養後に撮影した。そして３つの独立した実験をそれぞれ２回ずつ行った。
【００８１】
また、組み換え配列のＦＹＳＲＬＫ−ＮＨ2（１μＭ）は無視できる程度の活性を有していた。［Ｃａ2+］ｉ動員に対するＰＴＸおよびＵ７３１２２の影響により、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）により増進された血管発芽活性は、ＰＴＸ（５０ｎｇ／ｍＬ）またはＵ７３１２２（１０μＭ）との併用処理により顕著に弱化された（図４）。したがって、これらの発見はＰＴＸ感受性Ｇ蛋白質、ＰＬＣ−［Ｃａ2+］ｉシグナル伝達経路がペプチドによる管発芽増強に関連していることを示す。
【００８２】
２．５．ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）によるＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの上向調節
ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導血管新生過程におけるＶＥＧＦシグナル伝達経路の関連の可能性を明確にするために、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で処理したＨＵＶＥＣｓにおいて、血管新生因子の発現をＲＴ−ＰＣＲで測定した。図５Ａ〜５Ｂは、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）によるＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ−１  ｍＲＮＡの上向調節を示す。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で処理した初代培養ＨＵＶＥＣｓから分離されたｍＲＮＡに対して行った。表示されたデータは３つの独立した実験を代表するものである。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１０μＭ）は、ＨＵＶＥＣｓにおいて０、１、２、３、４、８、または１２時間（Ａ）、そして０、０．０１、０．１、または１０μＭで２時間処理し（Ｂ）、ＶＥＧＦ−Ａを、その特異的なプライマーを使用して増幅した。ＧＡＰＤＨを対照遺伝子として使用した。
【００８３】
図５Ａに示されているように、強力な血管新生因子のＶＥＧＦ−Ａの発現レベルは３．７７倍増加し、時間依存的な誘導を示し、２時間において発現が最大となった。
【００８４】
ＶＥＧＦ−Ａの誘導は８および４時間以上持続した。一方、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）刺激は、発現レベルｂＦＧＦ、およびＦＧＦＲ−２に影響を与えなかった（データは示されず）。前記ペプチドは、ＶＥＧＦ−Ａの誘導を用量依存的に誘発した（図５Ｂ）。これらのデータは、増強されたＶＥＧＦの発現が、ＨＵＶＥＣｓにおけるＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の血管新生作用と関連があるかもしれないということを示唆する。
【００８５】
２．６．ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）はＶＥＧＦの上向調節を通じて血管新生効果を誘導する
本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、蛋白質に対応するメッセンジャーの増加を評価することによって、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導血管新生におけるＶＥＧＦ上向調節の関連の可能性を示した（図５Ａおよび５Ｂ）。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導血管新生におけるＶＥＧＦ−Ａ誘導の役割の可能性をより裏付けるために、ペプチド誘導血管新生に対するＶＥＧＦ中和抗体の効果を管形成アッセイで評価した。
【００８６】
図６Ａ〜６Ｂは、ＨＵＶＥＣｓにおいて抗−ＶＥＧＦ抗体が、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導管形成を阻害することを示す。細胞を、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１０μＭ）またはＶＥＧＦ−Ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）と、抗ＶＥＧＦ−Ａ中和抗体（０．１、１、または１０μｇ／ｍＬ）とを含む培地で２４時間培養した。２４時間培養後、管類似構造を撮影し、管形成の長さを測定した。データは二つの独立した実験のうちの一つから代表され、数値は二つの独立した実験の平均である。＊Ｐ＜０．０５  溶媒処理と比較して。
【００８７】
ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導ＨＵＶＥＣｓ管形成（１８．２±０．７７）は、ＶＥＧＦ中和抗体の併用処理により統計的に有意な減少を示し、約１／２抑制された、これは対照群（ＶＥＧＦ＋ＶＥＧＦ中和抗体、１２．１±０．６３）と同様の水準である（図６Ａ）。また、ＥＬＩＳＡで測定した結果、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）刺激後のＶＥＧＦ−Ａ  ｍＲＮＡ発現の最大３．７７倍の増加には、ＨＵＶＥＣｓによるＶＥＧＦ−Ａ生産の劇的な増加が伴った（図６Ｂ）。これらの結果は、ＶＥＧＦの誘導がＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導血管新生と関連していることを示す。
【００８８】
ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）が他の血管新生因子を誘導することによって血管新生に影響を与えるか検討するために、血管新生と関連している、よく知られたシグナル伝達分子についてＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。本発明者らは、ＨＵＶＥＣｓにおいて、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で２時間の処理という早さでＶＥＧＦ−Ａ発現の増加を観測した（図５）、一方、ｂＦＧＦおよびＦＧＦＲ−２の発現レベルには変化がなかった（データは示さず）。また、ＶＥＧＦ−中和抗体はＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導ＨＵＶＥＣｓ管形成を高度に抑制した（図６Ａ）。培養培地内に分泌されたＶＥＧＦ−Ａ蛋白質をＥＬＩＳＡ分析でモニタリングしたところ、ＨＵＶＥＣｓにおけるＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）刺激の結果、ＶＥＧＦ蓄積が３倍増加したことがわかった（図６Ｂ）。これらの結果から我々は、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）誘導血管新生活性のメカニズムはＶＥＧＦ誘導により媒介されるまたはされ得ることを提案する、また、ＶＥＧＦ中和抗体を使用して得られた１／２−抑制の結果（図６Ａ）はまた、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）刺激による血管新生活性における、特徴づけられていないメディエーターを提案する。
【００８９】
最近の研究は、プラスミドまたはＶＥＧＦをコードするアデノウイルスＤＮＡの伝達が、動物モデルで心筋梗塞および十二指腸潰瘍の治療において好ましい効果を有する臨床的状況で、ＶＥＧＦ誘導の重要性を提案する（Ｘ．Ｄｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３１１（２００４）、ｐｐ．９８２〜９８８；Ｊ．Ｒｕｔａｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０９（２００４）、ｐｐ．１０２９〜１０３５；Ｙ．Ｓ．Ｙｏｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６４（２００４）、ｐｐ．６３〜７４）。ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）が生体内でＶＥＧＦ発現を誘導するかをテストすべきではあるが、標的器官に対する治療プラスミド遺伝子の送達は難しく、しばしば一時的なものであるため、ペプチド治療は遺伝子送達よりも有利な方法であろう。また、ＴＮＦ−α、トランスフォーミング増殖因子−β、インターロイキン−ｌβ、およびエンドセリンのような公知のＶＥＧＦ誘導剤のうちで（Ｆ．Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３１１（２００４）、ｐｐ．９８２〜９８８）、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）は最も小さいペプチドであって、合成が容易であり、蛋白質発現よりも費用が少なく、また発現システムが不要であるという点で他の蛋白質に対していくつかの利点を有している；本発明者らは単純に高純度のペプチドを得る。管再構成に対するこのようなＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の潜在的利点は、糖尿病または傷と関連した足と脚の潰瘍を含む、障害された血液供給により誘発される人間の疾病に、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）が使用できる可能性があることを提案する。
【００９０】
［実施例３］
動物モデルにおける傷の治療の増進
傷の治癒実験をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系（６週齢、雄、体重１４０−１６０グラム）を使用して行い、前記動物は任意に３グループに分けた。ゲロラン麻酔下で、背毛を剃り、皮膚を７０％エタノールで殺菌した。８−ｍｍ皮膚生検パンチで全層創傷を背の皮膚に作った。傷の部位をテガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）で覆った。本発明者らは対照群（ＨＢＳＳ）、ＳＦＫＬＲＹのｌ０ｕＭおよびｆｙｓｒｌｋのｌ０ｕＭを、１日１回で１４日間各グループに局所的に投与された。１４日後、ラットを屠殺し、その後創傷組織を除去した。これらのサンプルはその後別々に４％ホルムアルデヒドで固定され、段階的な一連のアルコール（ｇｒａｄｅｄ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｓｅｒｉｅｓ）で脱水し、キシレンで洗浄しパラフィンワックスで包埋した。４μｍの連続切片を切りとり、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００９１】
試験管内での創傷移動アッセイでのＨＵＶＥＣ移動に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の促進的効果に基づき、創傷に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果をラットモデルで評価した。１４日目における、生検創傷組織の組織像を図７Ａおよび７Ｂに示す。図７Ａ〜７Ｂは、１４日目における治癒しつつある創傷組織の組織像を示している。図７Ａにおいて、モック処理された創傷は深刻な浮腫および微小構造の崩壊（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅｄ  ｍｉｃｒｏａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ）を示している。図７Ｂでは、微小構造の通常の状態へのほとんど完璧な復元が、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（１０μＭ）処理により観測された。
【００９２】
対照（ＰＢＳ−処理）に比べ、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で処理するとほとんど完璧に創傷が復元された。
【００９３】
［実施例４］
コラーゲン合成の誘導
血管形成および皮膚老化の間に関連がありうることを想起し、抗シワ用化粧料の成分としてのＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の使用の可能性を検討した。Ｉ型コラーゲンの発現をウェスタンブロットで測定した。各グループから繊維芽細胞をペレット化して、氷冷細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で抽出した。細胞可溶化液を１５０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離し、各グループからの上清を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロース膜に転写した。ブロッキング溶液（５％脱脂乳）でインキュベートした後、膜を１次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と一晩４℃でインキュベートした。膜を１ｘＴＢＳＴ溶液で洗浄した後、２次抗体（１：５０００希釈、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）と２時間インキュベートした。膜をＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定し、蛋白質バンドの相対強度をＳｃａｎ−ｇｅｌ−ｉｔソフトウェアで分析した。
【００９４】
図８に示されているように、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）は１０μＭの濃度で最大反応を示し、Ｉ型コラーゲンの発現を有意に向上させた。図８は、Ｉ型コラーゲンの合成に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果を示す。ヒト繊維芽細胞をＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）（０．１、１、１０μＭ）で処理した。２４時間後、Ｉ型コラーゲンの発現をウェスタンブロットで測定した。実験は３回繰り返し、再現可能な結果が得られた。
【００９５】
［実施例５］
メラノーマ細胞におけるメラニン形成の抑制
メラニン形成に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果の可能性を調べるために、α−ＭＳＨで刺激したＢ１６メラノーマ細胞を、１、１０、または５０μＭの濃度のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の存在下に５日間培養した。Ｂ１６メラノーマ細胞は、与えられた濃度のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で処理され、続いてα−ＭＳＨ（１０ｎＭ）で５日間処理された。処理後、これらをトリプシン／ＥＤＴＡで短時間インキュベートして剥離した。沈澱後、細胞ペレットを撮影して、沸騰２Ｍ ＮａＯＨにて２０分間可溶化した。メラニン含量の分光光度分析を４０５ｎｍで行った。
【００９６】
図９Ａ〜９Ｂは、Ｂｌ６メラノーマ細胞内のメラニン含量に対するＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）の効果を示している。図９Ａにおいて、Ｂ１６メラノーマ細胞は、与えられた濃度のＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）で処理され、続けてα−ＭＳＨ（１０ｎＭ）で５日間処理された。処理後、これらをトリプシン／ＥＤＴＡで短時間インキュベートして剥離した。沈澱後、図９Ａにおいて細胞ペレットを撮影して、沸騰２Ｍ ＮａＯＨにて２０分間可溶化した。図９Ｂでは、メラニン含量の分光光度分析を４０５ｎｍで行った。実験結果は対照群（α−ＭＳＨ−処理）に対する比率として示されている。
【００９７】
図９Ａおよび９Ｂに示されているように、細胞ペレットは脱色され、ＳＦＫＬＲＹ−ＮＨ2（配列番号２）処理はメラニン形成に対する顕著な抑制効果（約６０％の抑制）を示し、１μＭで応答が飽和した。
【００９８】
本明細書で引用された全ての参考文献は全て参考として包含される。当該分野で熟練した技術を有する者は、本明細書に具体的に記載されている本発明の具体的な態様に対する多くの等価なものを、単に通常の実験をすることで認識するであろうし、また確認することができる。このような等価なものは本発明の特許請求の範囲に含まれるものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2011519835.tif 000005
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図６Ｂ】
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【図９Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年1月27日(2011.1.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸の長さが６〜１５個であり、必須部分としてＸ1ＦＸ2ＬＲＸ3のアミノ酸配列を含むペプチドからなる群より選択される血管新生ペプチド配列：
Ｘ1ＦＸ2ＬＲＸ3
（前記Ｘ1は、セリンまたはスレオニンであり；
Ｘ2は、リシン、アルギニン、またはイソロイシンであり；
Ｘ3は、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アルギニン、またはヒスチジンである。）。
【請求項２】
前記血管新生ペプチドが、Ｘ1ＦＸ2ＬＲＸ3のＣ末端に結合した１〜９個のアミノ酸で構成される連結ペプチドを含むものである、請求項１に記載の血管新生ペプチド。
【請求項３】
前記血管新生ペプチドが、前記Ｃ末端のカルボキシル基を−ＮＨ2で置換することによって修飾されたものである、請求項１または２に記載の血管新生ペプチド。
【請求項４】
前記血管新生ペプチドが、配列番号ｌ、２、８、１２、１４または１５〜２４のアミノ酸配列である、請求項１に記載の血管新生ペプチド。
【請求項５】
前記血管新生ペプチドが、細胞移動、血管新生、またはコラーゲン合成の増進活性、またはメラニン形成の抑制活性を有するものである、請求項１に記載の血管新生ペプチド。
【請求項６】
前記血管新生ペプチドの血管新生活性が、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の上向調節により媒介されるものである、請求項１に記載の血管新生ペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の血管新生ペプチドを含む、傷の治癒、コラーゲン合成の増進またはメラニン合成の抑制のための組成物。
【請求項８】
前記組成物が、細胞移動、血管新生またはコラーゲン合成を増進させるものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、活性成分として請求項１〜６のいずれか一項に記載の血管新生ペプチド、および薬学的に許容可能な担体を含む傷の治癒のための薬学的組成物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、活性成分として請求項１〜６のいずれか一項に記載の血管新生ペプチド、および化粧用として許容可能な担体を含む老化した皮膚の状態改善のための化粧料組成物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記化粧料組成物が、シワ抑制および皮膚美白活性があるものである、請求項１０に記載の組成物。
【国際調査報告】
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