(57)【要約】  複数のタンパク質結晶化溶液を同時にスクリーニングするため、及び蒸気拡散環境において回折高品質タンパク質結晶を生成するための、高密度ハイスループットマイクロプレート及び方法が開示されている。マイクロプレートは、等しいサイズの画定された並設対チャンバを有し、並設対チャンバは約８μｌの最大容積を有し、かつ対チャンバは並設対チャンバ間の蒸気交換を提供する蒸気チャネルを有する。マイクロプレートは、マイクロプレートの表面を密閉するための膜を更に具備する。マイクロプレートは、並設対チャンバの一方中に結晶化溶液を受容し、並設対チャンバの他方中にタンパク質溶液を受容するようになされており、タンパク質溶液及び結晶化溶液は蒸気拡散プロセスを介して相互作用し、これによりタンパク質溶液を収容するチャンバ内でのタンパク質結晶の形成が可能となる。
2011502151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
等しいサイズの画定された併設対チャンバ（side-by-side paired chambers）を有する複数のウェルを備えるフレームを具備するマイクロプレートであって、該並設対チャンバは約８μｌの最大容積を有し、かつ該並設対チャンバは該並設対チャンバ間の蒸気交換を提供する蒸気チャネルを有する、マイクロプレート。
【請求項２】
前記フレームが、ロボット式ハンドリングシステムによって容易に取り扱いできるフットプリントを有する、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項３】
前記並設対チャンバが、同一平面内に配列される底部を有する、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項４】
前記並設対チャンバが、平坦な、円錐形の、又は凹んだ底部を有する、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項５】
前記蒸気チャネルは、所定量の第１の結晶化溶液及び第２の結晶化溶液が最適に平衡化するのを可能にするような所定の深さ及び幅を有する、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項６】
前記蒸気チャネルが、前記並設対チャンバ間の壁における開口と、前記複数のウェルを覆って位置決めされる膜とによって形成される、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項７】
液体ハンドリングシステムが結晶化溶液を前記並設対チャンバの一方中に自動的に堆積でき、タンパク質溶液を前記並設対チャンバの他方中に自動的に堆積できるように、各ウェルが前記フレーム上に位置決めされる、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項８】
前記マイクロプレートが７６８の機能ウェルを有する、請求項１に記載のマイクロプレート。
【請求項９】
液体ハンドリングシステムが結晶化溶液を前記並設対チャンバの一方中に自動的に堆積でき、タンパク質溶液を前記並設対チャンバの他方中に自動的に堆積できるように、各ウェルが前記フレーム上に位置決めされる、請求項８に記載のマイクロプレート。
【請求項１０】
結晶化溶液を第１の並設対チャンバ中に自動的に堆積し、タンパク質溶液を第２の並設対チャンバ中に自動的に堆積するための液体ハンドリングシステムを採用することを備える、マイクロプレートを使用する方法であって、該並設対チャンバはそれぞれ約８μｌの最大容積を有し、該結晶化溶液及び該タンパク質溶液は蒸気拡散を介して相互作用し、かつタンパク質結晶が、該タンパク質溶液を収容するチャンバ内で形成される、方法。
【請求項１１】
前記結晶化溶液は表２に示された溶液から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
堆積される結晶化溶液の量は約６μｌであり、堆積されるタンパク質溶液の量は約１μｌである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
堆積される結晶化溶液の量は約４μｌ〜約８μｌの範囲であり、堆積されるタンパク質溶液の量は０．５μｌを超え約２μｌまでの範囲である、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年１０月３１日に出願された出願第６０／９８３，９６０号に対する優先権を主張し、その出願の全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は一般に、バイオテクノロジーの分野に関し、詳細には、複数のタンパク質結晶化溶液を同時にスクリーニングし、高密度ハイスループットフォーマットにおいて蒸気拡散環境中で回折高品質タンパク質結晶を生成するためのマイクロプレート及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書を通して、特許、公開された出願、技術論文、及び学術論文を包含し得る種々の出版物は括弧内に引用され、各々の完全な引用は本明細書の末尾に見出され得る。それらの引用された各出版物はその全体が、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００４】
実験技術における革新的な技術及び進歩により、研究者が、新規に同定される遺伝子の数及び生物学的巨大分子の三次元構造の数の両方を急速に増やすことが可能となってきた。遺伝子発現、タンパク質精製、結晶化、及び構造決定の一連のプロセスに顕著な改善がなされてきたが、依然として結晶化が結晶構造決定における主要なボトルネックの１つである。この課題に対処するために、多くの様々なハイスループットタンパク質結晶化法が提案されており、多くの自動化された結晶化システムが開発されてきた（スチーブンス（Stevens）２０００年、スガハラ（Sugahara）及びミヤノ（Miyano）２００２年、スルゼンベイチャー（Sulzenbacher）ら２００２年、ワタナベ（Watanabe）ら２００２年、ホスフィールド（Hosfield）ら２００３年、ホイ（Hui）及びエドワーズ（Edwards）２００３年、ストヤノフ（Stojanoff）２００４年、ヒラキ（Hiraki）ら２００６年）。例えば、オリックス（Oryx）６（ダグラス・インストルメンツ（Douglas Instruments, Ltd.）、英国バークシャー（Berkshire））は、シッティングドロップ蒸気拡散のために１２分に９６ウェルをセットアップすることが可能であり、またシリックス（Syrrx）システムは、蒸気拡散のために１時間あたり２８８０ドロップをセットアップすることが可能である（ホスフィールド（Hosfield）ら２００３年、ヒラキ（Hiraki）ら２００６年）。
【０００５】
マイクロバッチ及びハンギングドロップ法に比べると、シッティングドロップ蒸気拡散法及びマイクロプレートは、ハイスループットな結晶化用途のための利点を有する。利点としては、結晶化ドロップの観察が容易であること、ドロップからの結晶の収穫が容易であること、及び標準的なロボット工学及び液体ハンドリング装置によるマイクロプレートの取り扱いが容易であることが挙げられる（ヒラキ（Hiraki）ら２００６年）。多数のシッティングドロップマイクロプレートが、ハンプトン・リサーチ（Hampton Research）、グレイナー（Greiner）、及びコーニング（Corning）が挙げられる多くの様々なベンダーから低コストで市販されている。エメラルド・バイオストラクチャーズ社（Emerald Biostructures Inc.）、ストラクチュラル・ジェノミクス（Structural Genomics Inc.）、及びＵＡＢリサーチ・ファンデーション（UAB Research Foundation）などの他のベンダーはカスタムアプリケーションに向けた彼ら独自のマイクロプレート又はマイクロアレイを設計してきた（米国特許第６，０３９，８０４号、同第６，６５６，２６７号、及び同第７，２１４，５４０号）。シッティングドロップタンパク質結晶学的マイクロプレート又はマイクロアレイのいくつかの例を、以下に簡単に説明する。
【０００６】
図１は、ハンプトン・リサーチ（ハンプトン・リサーチ（Hampton Research）、カリフォルニア州アリソビエホ（Aliso Viejo））からのクリスケム（Cryschem）（商標）プレートの斜視図（１Ａ）及び断面側面図（１Ｂ）である。クリスケム（Cryschem）（商標）プレートは、２４ウェル（１０２）のアレイを備える２４ウェルシッティングドロップマイクロプレートであり、ウェルのそれぞれが評価すべきタンパク質溶液の試料を受容し得る。ハンプトン・リサーチマイクロプレートは、ウェルを支持するフレーム（１０４）を備える。フレームは矩形形状であり、外壁（１０６）及び外壁とウェルとの間に延在する上部平坦面（１０８）を備えている。ウェルは上部平坦面と平行な平面において円形の断面を有する。フレームの外側周囲を画定する外壁は、ウェルよりも低いところに延在する底縁部を有する。したがって、ハンプトン・リサーチマイクロプレートが支持面上に配置されるとき、マイクロプレートは、ウェルを支持面よりも持ち上げている底縁部（１１０）によって支持され、ウェルを破損から保護する。図示されているように、外壁はまた、マイクロプレートカバー（図示せず）の裾を受けるためのリム（１１２）も有している。
【０００７】
図１Ｂは、各ウェル（１０２）が外側壁（１１４）、底部（１１６）、及び支柱（１１８）を備えることを示している。ウェルの中央に配置された支柱は、タンパク質溶液及び試薬溶液が入れられる凹んだリザーバ（１２０）を備える。ウェルの中の支柱周辺の領域部分は、凹んだリザーバ内のタンパク質及び試薬溶液混合物よりも高い濃度を有する試薬溶液を受容する。そしてウェルの形状が、凹んだリザーバ内のタンパク質溶液及び試薬溶液が支柱の周りの試薬溶液と蒸気拡散プロセスを介して相互作用することを可能にし、これにより凹んだリザーバ内でのタンパク質結晶の形成が可能となる。試薬溶液についての典型的な充填体積は、ウェルの総容量が１．５ｍＬのとき、５００μｌ〜１，０００μｌである。支柱上の最大ドロップ体積は４０μｌである。ハンプトン・リサーチはまた、各ウェルの一方の側のシェルフ上に５０ナノリットル〜４マイクロリットルのタンパク質溶液が分配されることができ、ウェル中に５０〜１００マイクロリットルの結晶化試薬を入れることのできる、９６ウェルクリスタルクリア・ストリップス（96-well CrystalClear Strips）（商標）マイクロプレート（図示せず）をも有することに注目すべきである。
【０００８】
図２は、グレイナー（グレイナー・バイオワン・ノースアメリカ社（Greiner Bio-One North America Inc.）、米国ノースカロライナ州）からのクリスタルクイック（CrystalQuick）（商標）マイクロプレートの斜視図（２Ａ）、部分上面図（２Ｂ）、及び断面側面図（２Ｃ）を示している。グレイナーマイクロプレートは、各ウェル（２０２）が調査すべきタンパク質溶液の試料を３つまで受容し得る９６ウェルシッティングドロップマイクロプレートである。斜視図から分かるように、グレイナーマイクロプレートは、ウェルを支持するフレーム（２０４）を備えている。矩形形状のフレームは、フレームの周囲を画定する外壁（２０６）及び外壁とウェルとの間に延在する上部平坦面（２０８）を備える。図示されているウェルは上部平坦面に平行な平面において矩形の断面を有する。
【０００９】
図２Ｂ及び図２Ｃは、各ウェル（２０２）が相対的に大きなリザーバ（２１４）及び３つの相対的に小さなリザーバ（２１６）を備えることを示している。各小リザーバは、タンパク質溶液及び試薬溶液を堆積させることのできる、平坦な底部（２１８）を備える。小リザーバの隣に配置される大リザーバは典型的に、小リザーバ内の試薬溶液よりも高い濃度を有する試薬溶液を受容する。そしてウェルの形状は、各小リザーバ内のタンパク質溶液及び試薬溶液が大リザーバ内の試薬溶液と蒸気拡散プロセスを介して相互作用することを可能にする。これが各小リザーバ内でのタンパク質結晶の形成を可能にする。
【００１０】
図３は、米国特許第６，９１３，７３２号に記載された、コーニングマイクロプレートの斜視図（３Ａ）、切り欠き部分斜視図（３Ｂ）、及び断面側面図（３Ｃ）を示している。図示されているように、このマイクロプレートは、９６の機能ウェル（３０２）のアレイを備え、そのそれぞれがタンパク質溶液のサンプルを受容できる、９６ウェルハイスループット結晶学的マイクロプレートである。マイクロプレートは、ウェルを支持するフレーム（３０４）を備える。矩形形状のフレームは、外壁（３０６）及び外壁とウェルとの間に延在する上部平坦面（３０８）を備えている。図示されているように、外壁はフレームの外部周囲を画定し、ウェルよりも低いところに延在する底縁部（３１０）を有する。マイクロプレートが支持面上に配置されるとき、マイクロプレートは、ウェルが支持面よりも持ち上げられた状態で底縁部により支持される。外壁はまた、マイクロプレートカバー（図示せず）の裾を受けるためのリムも有している。
【００１１】
図３Ｂ及び図３Ｃは、各機能ウェル（３０２）が２つの重なり合う円形ウェル（３０２ａ、３０２ｂ）から構成され、両方が上部平坦面（３０８）に平行な平面内に配置されていることを示している。詳細には、第１の重複ウェルはタンパク質溶液及び試薬溶液を受容できる相対的に小さな凹んだリザーバ（３１４）を有し、第２の重複ウェルは第１のウェル中に堆積させる試薬溶液よりも高い濃度を有する試薬溶液を受容できる相対的に大きなリザーバ（３１６）を有する。タンパク質溶液及び試薬溶液をウェル中に堆積させた後、溶液の過剰な蒸発を防ぐためにウェルの開口を接着性シール又はヒートシールなどのシールによって覆うことができる。第１及び第２の重複ウェルの形状及び配置の結果として、タンパク質溶液及び試薬溶液が蒸気拡散プロセスを介して相互作用でき、これにより、タンパク質溶液を収容する第１のウェル内におけるタンパク質結晶の形成が可能となる。
【００１２】
図４は、米国特許第６，９１３，７３２号に記載された第２のマイクロプレート設計の斜視図（４Ａ）、部分上面図（４Ｂ）、及び断面側面図（４Ｃ）を示している。図４に示されたマイクロプレートは、ウェルの第１部分（４０２ａ）及びウェルの第２部分（４０２ｂ）が互いに隣接しており、そして図３に示されたマイクロプレートのウェルのようには重なり合っていない、９６の機能ウェルを有する。
【００１３】
図５は、米国特許第６，９１３，７３２号に記載された第３のマイクロプレート設計の斜視図（５Ａ）、部分上面図（５Ｂ）、及び断面側面図（５Ｃ）を示している。図５に示されたマイクロプレートは、チャネル（５０４）によって互いに連結された第１のウェル（５０２ａ）及び第２のウェル（５０２ｂ）から構成された４８の機能ウェルを有する。第１のウェル（５０２ａ）は相対的に小さなリザーバを備え、第２のウェル（５０２ｂ）は相対的に大きなリザーバを備える。
【００１４】
米国特許第７，２１４，５４０号には、約０．００１ｎｌ〜約２５０ｎｌの容積を有するマイクロチャンバを用いたタンパク質結晶成長条件のスクリーニング法が開示されている。図６に示されているような複数のウェル又はリザーバを有するマイクロアレイを使用する方法もまた開示されている。マイクロアレイ（１０）は、タンパク質溶液ウェル（１２）と沈殿溶液ウェル（１４）とを連結するマイクロチャネル（１６）によって連結された２つのウェル（１２、１４）を備える。これらのウェルは、約０．００１ｎｌ〜約５００ｎｌ、好ましくは約０．０１ｎｌ〜約２０ｎｌの所望の体積を保持又は保有するのに十分であることが更に開示されている。異なるチャンバ内でのタンパク質結晶成長は、結晶成長を自動的に検出する高解像度若しくはその他の光学的手段により、又は高解像度顕微鏡法若しくは電子顕微鏡法を用いる手作業の検査により監視される。あるサンプルにおいて望ましい結晶成長が観察された場合には、更なる分析のためのタンパク質結晶を生成するために、そのサンプルのタンパク質結晶成長条件をマクロスケールで再現することができるということが開示されている。開示されたスクリーニング法の非常に小さな体積では、スクリーニング中の大きな回折高品質結晶の成長は支持されない。
【００１５】
本発明のマイクロプレートは、他の利用可能な結晶学的マイクロプレートを上回る利点を有する。本発明のマイクロプレートは、７６８の機能ウェルを有する高密度の１５３６ウェルフォーマットにおけるものであり、したがってシッティングドロップ蒸気拡散法を用いる、真に高密度でハイスループットなスクリーニングを可能にする。標準的な１５３６ウェルフォーマットは、マイクロプレートの容易なロボットによる取り扱い及び広範囲の液体ハンドリングシステムとの適合性を可能にする。更に、ウェルの底部で同一平面内に配列された底部を有する等しいサイズのウェルを使用することで、倒立光学顕微鏡による容易な画像取得が可能となると同時に、上からの結晶の操作及び収穫が可能となる。ウェルの底部が平坦である好ましい実施形態では、ウェルの底部が単一の焦点面中にあるため、ウェルの顕微鏡画像が非常に迅速にスクリーニングできる。高密度ハイスループットフォーマットのリザーバ対液滴の体積比（reservoir to droplet ratio volumes）を減少させたことにより、他の利用可能な結晶学的マイクロプレート（サンタルシエロ（Santarsiero）ら２００２年）を使用するのと比較して、より早い平衡化速度並びにより迅速なタンパク質の核生成及び結晶成長をもたらはずであることにも注目すべきである。
【００１６】
本発明のマイクロプレート及び方法は、米国特許第７，２１４，５４０号に記載されたマイクロアレイ及び方法を上回る利点も有する。８μｌの最大容積を有する本発明のマイクロプレートを使用することにより、約１μｌのタンパク質溶液体積又は２μｌもの体積を使用することが可能となり、したがって本発明の方法は、高密度ハイスループットスクリーニング中の回折高品質結晶の成長を可能にする。スクリーンから直接得られる結晶は、Ｘ線による分析に適しており、したがって分析されるのに適したタンパク質結晶を生成するためにマクロスケールで結晶を再生成する必要がなくなる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、複数のタンパク質結晶化溶液を同時にスクリーニングし、高密度ハイスループットフォーマットにおいて蒸気拡散環境で回折高品質タンパク質結晶を生成するための、マイクロプレート及び方法を包含する。
【００１８】
本発明の第１の態様によれば、等しいサイズの画定された並設対チャンバ（side-by-side paired chambers）を有する複数のウェルを備えるフレームを具備するマイクロプレートであって、並設対チャンバは約８μｌの最大体積を有し、かつ並設対チャンバは並設対チャンバ間の蒸気交換を提供する蒸気チャネルを有する、マイクロプレートが提供される。
【００１９】
本発明の第２の態様によれば、ロボット式ハンドリングシステムによって簡単に取り扱いできるフットプリントを有するフレームを具備するマイクロプレートが提供される。
【００２０】
本発明の第３の態様によれば、並設対チャンバの底部が同一平面内に配列されているマイクロプレートが提供される。
【００２１】
本発明の第４の態様によれば、並設対チャンバの底部が平坦な、円錐形の、又は凹んだマイクロプレートが提供される。
【００２２】
本発明の第５の態様によれば、所定量の第１及び第２の結晶化溶液が最適に平衡化するのを可能にするように、蒸気チャネルが所定の深さ及び幅を有するマイクロプレートが提供される。
【００２３】
本発明の第６の態様によれば、蒸気チャネルが、並設対チャンバ間の壁の一部における所定の開口と、並設対チャンバを覆って位置決めされる透明な接着性膜とによって形成される、マイクロプレートが提供される。
【００２４】
本発明の第７の態様によれば、液体ハンドリングシステムが、配合された結晶化溶液を並設対チャンバの一方中に自動的に堆積でき、タンパク質溶液を並設対チャンバの他方中に自動的に堆積できるように、各ウェルが前記フレーム上に位置決めされる、マイクロプレートが提供される。
【００２５】
本発明の第８の態様によれば、高密度ハイスループットシッティングドロップ蒸気拡散タンパク質結晶学的マイクロプレートが、７６８の機能ウェルを有する、マイクロプレートが提供される。
【００２６】
本発明の第９の態様によれば、液体ハンドリングシステムが、配合された結晶化溶液を並設対チャンバの一方中に自動的に堆積でき、タンパク質溶液を並設対チャンバの他方中に自動的に堆積できるように、各ウェルが前記フレーム上に位置決めされる、マイクロプレートが提供される。
【００２７】
本発明の第１０の態様によれば、液体ハンドリングシステムが、配合された結晶化溶液を本発明のマイクロプレートの並設対チャンバの一方中に自動的に堆積でき、タンパク質溶液を本発明のマイクロプレートの並設対チャンバの他方中に自動的に堆積でき、一方の並設対チャンバ中のタンパク質溶液及び第２の並設対チャンバ内の結晶化溶液が蒸気拡散プロセスを介して相互作用し、これによりタンパク質溶液を収容するチャンバ内におけるタンパク質結晶の形成が可能となる、方法が提供される。
【００２８】
本発明の第１１の態様によれば、配合された結晶化溶液が表２に示された溶液から選択される、方法が提供される。
【００２９】
本発明の第１２の態様によれば、堆積される配合された結晶化溶液の量は約６μｌであり、堆積されるタンパク質溶液の量は約１μｌである、方法が提供される。
【００３０】
本発明の第１３の態様によれば、堆積される配合された結晶化溶液の量が約４μｌ〜約８μｌの範囲であり、堆積されるタンパク質溶液の量が０．５μｌを超え約２μｌまでの範囲である、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
ここで本発明の好ましい実施形態を、添付の図面を参照し、例示のみの目的で説明する。
【図１】ハンプトン・リサーチ社（Hampton Research Inc.）からのクリスケム（Cryschem）（商標）プレートの斜視図（１Ａ）及び断面側面図（１Ｂ）を示す図。
【図２】グレイナー・バイオワン・ノースアメリカ社（Greiner Bio-One North America Inc.）によるクリスタルクイック（CrystalQuick）（商標）マイクロプレートの斜視図（２Ａ）、部分上面図（２Ｂ）、及び断面側面図（２Ｃ）を示す図。
【図３】米国特許第６，９１３，７３２号に開示された、第１のマイクロプレートの斜視図（３Ａ）、切り欠き部分斜視図（３Ｂ）、及び断面側面図（３Ｃ）を示す図。
【図４】米国特許第６，９１３，７３２号に開示された第２のマイクロプレートの斜視図（４Ａ）、部分上面図（４Ｂ）、及び断面側面図（４Ｃ）を示す図。
【図５】米国特許第６，９１３，７３２号に開示された第３のマイクロプレートの斜視図（５Ａ）、部分上面図（５Ｂ）、及び断面側面図（５Ｃ）を示す図。
【図６】米国特許第７，２１４，５４０号に開示されたマイクロアレイを示す図。
【図７】７６８の機能ウェルを有する修正された１５３６ウェル透明ポリスチレンアッセイプレートの平面図（７Ａ）を示しており、カラム１及び続く各奇数カラムは結晶化溶液用（Ｗ）となされ、カラム２及び続く各偶数カラムはタンパク質液滴用（Ｐ）となされている図。透明な接着性膜で密閉された場合、より短く粉砕された壁が２つの並設対チャンバ、Ｗ及びＰを連結する蒸気チャネルを作り、こうして結晶化のための単一の環境が形成される（７Ｂ）。
【図８】本発明の結晶学的マイクロプレートの４つの機能ウェルを示す図。８Ａは、４つの機能ウェルの中央を通った側面図であり、カラム１及び続く各奇数カラムは、結晶化溶液用（Ｗ）となされ、カラム２及び続く各偶数カラムはタンパク質液滴用（Ｐ）となされる。８Ｂは、８Ａの側面図を９０度回転された状態で示している。８Ｃは、本発明の高密度ハイスループット７６８機能ウェル・マイクロプレートの４つの機能ウェルの平面図を示しており、Ｗには６μｌの結晶化溶液、Ｐには１μｌのタンパク質溶液が入れられている。
【図９】各結晶化実験を採点するために使用される画像及び関連の厳密な採点ガイドラインを示す図。１〜１０までのスコアは、各溶液構成成分と対照してタンパク質の閾値を特定する臨界指標（critical markers）である。評点１０は、塩であると決定されるまで、最初はタンパク質リードと共にグループ化される。１１〜２０のスコアは、更なる結晶化及び回折分析のために結晶を再生成するための最適化実験のためにフラグが付けられる。
【００３２】
表１：１０００溶液結晶化スクリーンのためのストック構成成分：１０００溶液結晶化スクリーンを作製するために使用されるストック溶液試薬セットの表が示される。ストック溶液は、ＣＲＣ化学ハンドブック（CRC Handbook of Chemistry）において提供される溶解度情報に基づく濃度で調製されたか、又はハンプトン・リサーチ社（Hampton Research,Inc.）から購入されたかのいずれかである。
【００３３】
表２：１０００溶液の完全なリスト：高密度ハイスループットスクリーンにおいて使用される１０００の溶液すべての組成を列挙する表が示される。
【００３４】
定義
次のように説明される意味を有する特定の用語が、本明細書で使用される。
【００３５】
用語「具備する（comprising）」は「主として備えるが、必ずしも単独で備えるのではない」ことを意味する。更に、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」等の、単語「具備する（comprising）」の変化形はそれに応じて変化した意味を有する。
【００３６】
次の省略形が、本明細書中で、及び本明細書を通して使用される。
ｎｌ：ナノリットル、
μｌ：マイクロリットル、
ｍＬ：ミリリットル、
ｍｍ：ミリメートル、
ｍｇ／ｍＬ：ミリメートル当たりのミリグラム、
℃：度（摂氏）
【発明を実施するための形態】
【００３７】
ここで、本発明を更に、より詳細に説明する。本明細書において与えられる図及び実施例は例示のためのものであり、本発明及びその種々の実施形態を限定しないものであるということが最初に理解されるべきである。
【００３８】
ハイスループット結晶化のための試薬開発
ハイスループット結晶化法の開発中、市販の結晶化スクリーンの量が限られていたため、溶液の多様な希薄マトリックススクリーンが設計された。大部分のタンパク質に対する結晶化成功率が２％以上であるという一般化に基づき、セゲルケ（Segelke）は、１つのタンパク質に対する完全なスクリーンはおよそ２８８の結晶化溶液からなるべきであるということを提唱した（セゲルケ（Segelke）２００１年）。本発明の高密度ハイスループット方法及びマイクロプレートの少量のタンパク質及びリザーバ要件の低さをかんがみて、欠落したパラメータスペースの量を少なくし、単一スクリーンにおいて結晶を生成する機会を改善するために、溶液スクリーンを拡張することが決定された。セゲルケ（Segelke）によって議論された推奨サイズのおよそ４倍の結晶化パラメータスペースをカバーするために、１０００溶液スクリーンが開発された。好ましい実施形態では、回折高品質結晶は単一の１０００溶液スクリーンから直接生成されるが、最初のスクリーンの間に回折高品質結晶が生成されなかった場合、１０００溶液スクリーンがタンパク質の溶解性のデータ及び条件の更なる最適化のための情報を提供するようにも設計された。
【００３９】
結晶を生ずる最大尤度で独自の１０００溶液スクリーンを設計するために理想的な構成成分が選択された。情報は、最適な溶解度スクリーニング品目、ＮＩＳＴ／ＣＡＲＢ生物学的巨大分子結晶化データベース（the NIST/CARB Biological Macromolecule Crystallization Database）、ＰＤＢ（ブルックヘブン・プロテイン・データバンク（Brookhaven Protein Data Bank））結晶化パラメーター、ホフメイスターシリーズ（the Hofmeister series）、並びにハンプトン・リサーチ（Hampton Research）及びエメラルド・バイオシステムズ（Emerald Biosystems）からの既存の結晶化スクリーン（ジャンカリク（Jancarik）及びキム（Kim）１９９１年、サリダキス（Saridakis）及びチェイエン（Chayen）２０００年）から収集された。選択された化学物質は、５０の沈殿剤、交替するｐＨ値を有する１２の緩衝剤、５１の添加剤、及び８の界面活性剤（detergent）からなる（表１）。これらの化学物質は相互に関連付けされてクリスツール（CRYStool）（商標）プログラム（イエナ・バイオサイエンス（Jena Bioscience GmbH）、ドイツ）に入れられ、ランダムに１０００の独自の溶液を生ずる。クリスツール（CRYStool）（商標）プログラムは、ランダムサンプリングに基づきスクリーンを生成する能力を有するが故に選択された（セゲルケ（Segelke）２００１年）。この試薬セットはスプレッドシートへと移されてストック試薬濃度を計算するために使用された。選択された構成成分は、表２に列挙された１０００溶液スクリーンを含む各独自の結晶化溶液を作製するように手作業で組み合わされた。１０００溶液の完全なセットは、様々なｐＨ、緩衝剤、塩、ポリマー、アルコール、界面活性剤、及び他の添加剤を有する溶液の実に多様なセットである。溶液の全ては、５０ｍＬの円錐管中で調製され、４℃で貯蔵するためにマトリックス９６ウェル・ディープウェル貯蔵ブロック（Matrix 96-well deep-well storage blocks）（カタログ＃４２１１、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、米国、ニューハンプシャー（New Hampshire））中に移された。ディープウェルブロック中の溶液は、およそ１年の貯蔵寿命を有する。
【００４０】
修正マイクロプレート設計
１０００溶液スクリーンを素早くセットアップして使用するためのマイクロプレート及び方法が必要であった。利用可能な代替の方法も存在するが、全結晶化実験の９５％ほどが蒸気拡散環境下でセットアップされる。２０年を超える長期にわたり日常的に使用されている伝統的な蒸気拡散法は、２４ウェル・ディープウェルリンブロプレート（24-well deep-well Linbro plate）及びガラスカバースリップ上の懸濁された２μｌのタンパク質液滴を使用するものである。タンパク質液滴は典型的に１：１の比率のタンパク質と結晶化溶液で構成され、液滴は１ｍＬの結晶化溶液上に懸濁される。蒸気拡散法は、水が液滴から抜き出されて、タンパク質液滴が結晶化溶液と平衡化するのを可能にする。平衡化の間に水が抜き出されると、液滴中でタンパク質及び沈殿剤の濃度がゆっくりと上昇し、それにより状態が広範囲にわたって変化して核生成及び／又は結晶成長を促進する。不都合なことに、２４ウェル・ディープウェルリンブロプレート及びガラスカバースリップ上の懸濁された２μｌのタンパク質液滴を使用する伝統的なハンギングドロップ法は、極めて労力のいる面倒なプロセスである。加えて、１０００溶液スクリーンを行うために従来の２４ウェルリンブロプレートを使用するなら、およそ０．０５７立方メートル（２立方フィート）のインキュベータ空間を占有し、１ウェルあたり１ｍＬの各結晶化溶液を使用することにより１リットルの結晶化溶液を消費し、実験のセットアップのためにおよそ１６時間かかる、４２のプレートが必要となったであろう。９６ウェル結晶化プレートの手法ならば、プレートの数を１１まで減少させ、１ウェルあたり８０μｌの各結晶化溶液を使用することによって結晶化溶液の合計体積を８０ｍＬまで減少させ、かつ１０００の溶液スクリーンをセットアップするための時間をおよそ３時間まで短縮させたであろう。
【００４１】
本発明は、７６８の機能ウェルを有する修正された１５３６ウェルのハイベース・クリア・ポリスチレン・フラットボトム・マイクロプレートにおいてシッティングドロップ蒸気拡散実験を行うためのマイクロプレート及び方法を提供する（図７及び図８）。この方法及びマイクロプレートは、プレート貯蔵容量を増大し、１ウェルあたり６μｌだけを使用することで７ｍＬをわずかに下回るまで結晶化溶液の総消費を減少させ、１０００溶液スクリーンを完全にセットアップするための時間をわずか約２０分まで短縮させた。更に、リザーバ対液滴体積比（ratio volumes）が減少されることにより、より早い平衡化速度と、より迅速なタンパク質核生成及び結晶成長がもたらされることが期待された（サンタルシェロ（Santarsiero）ら２００２年）。未修正の１５３６ウェルハイベース・クリア・ポリスチレン・フラットボトム・マイクロプレートは、グレイナーから購入された（グレイナー・アメリカ（Greiner America, Inc）、カタログ＃７８２１０１）。修正されたマイクロプレートは、２つの並設ウェルの間の壁の頂部からの高さの約１／４を粉砕し、こうして７６８の並設対チャンバからなる７６８の機能ウェルを有するマイクロプレートを作り出すことにより作製した。粉砕後、各チャンバは約８μｌの最大容積を有する。並設対チャンバの間の短く粉砕された壁は、マイクロプレートが透明な接着性膜で密閉されたときに、蒸気チャネルとなる（図７及び図８）。
【００４２】
マイクロプレートの左側から出発して、カラム１及び続く各奇数カラムがウェル溶液用（Ｗ）となされる（図７及び図８）。カラム２及び続く各偶数カラムがタンパク質液滴用（Ｐ）となされる（図７及び図８）。透明な接着性膜で密閉された場合、短く粉砕された壁が２つの並設対チャンバ、Ｗ及びＰを連結する蒸気チャネルを作り、こうして結晶化のための単一の環境を形成する。例えば、１つの実験は、Ｗ1中に１０００溶液からの第１の選択及びＰ2中にタンパク質液滴を包含しうる。第２の実験は、Ｗ3中に１０００溶液からの第２の選択及びＰ4中にタンパク質液滴を包含しうる。第３の実験は、Ｗ5中に１０００溶液からの第３の選択及びＰ6中にタンパク質液滴を包含しうる。各タンパク質液滴は、約０．５μｌのストックタンパク質溶液及び０．５μｌの１０００結晶化溶液の１つを各タンパク質ウェル中にピペット分取することにより作製された、１：１の比率のストックタンパク質溶液及び１０００結晶化溶液の１つである。各タンパク質液滴ウェル（Ｐ）中で１：１の比率で使用される結晶化溶液は、各並設対結晶化溶液ウェル（Ｗ）中で使用される対応する結晶化溶液と同じである。この手順を、７６８結晶化実験の完全なマイクロプレートをセットアップするために修正マイクロプレート全体にわたって続ける。
【００４３】
修正マイクロプレートの利用
１０００の結晶化溶液を、マトリックス９６ウェル・ディープウェル貯蔵ブロック（カタログ＃４２１１、サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、米国ニューハンプシャー（New Hampshire））から、ギルソン（Gilson）Ｃ２５０ロボット（ギルソン（Gilson, Inc.）、米国ウィスコンシン州ミッドレトン（Middleton））を用いて３枚の３８４ウェルドータープレート（グレイナー・アメリカ（Greiner America, Inc.）、カタログ＃７８１２０１）へと移す。各ドータープレートは、１ウェルあたり８０μｌの１０００結晶化溶液の１つを収容するように作製される。各ドータープレートは、再分配が必要となる前に、１２のタンパク質のハイスループットスクリーニングサイクルに適応させることが可能である。ドータープレートを使用して、結晶化溶液をスクリーニングマイクロプレートへと分配する。１０００溶液の完全なスクリーンを実行するためには、７６８の機能ウェルを有する修正された１５３６ウェル修正マイクロプレートが２枚必要である。７６８の機能ウェルに７６８の実験を収容するように、第１のマイクロプレートが作製される。２３２機能ウェル中に残りの２３２の実験を収容するように第２のマイクロプレートが作製され、追加の５３６の機能ウェルはより多くの溶液が所望された場合に将来的にスクリーンを拡張するためのものとされる。
【００４４】
結晶化溶液及びタンパク質溶液を高密度ハイスループット７６８機能ウェル・スクリーニングマイクロプレートへと添加するために、固定３８４シリンジヘッド（ベロシティー１１（Velocity 11）社、米国カリフォルニア）を有するＶＰｒｅｐ（登録商標）自動化液体ハンドリングシステムを用いる高度に再現可能な結晶化ルーチンが開発された。典型的な高密度ハイスループットスクリーンでは、（Ｗ）ウェルは３８４ウェルドータープレートから６μｌの１０００結晶化溶液の１つを受容し、（Ｐ）ウェルは、最終体積が１μｌとなるように０．５μｌのストックタンパク質溶液及び０．５μｌの１０００結晶化溶液の１つを受容する。各タンパク質液滴ウェル（Ｐ）中で１：１の比率で使用される結晶化溶液は、各並設対結晶化溶液ウェル（Ｗ）中で使用される対応する結晶化溶液と同じである。スクリーニングマイクロプレートをセットアップした後、各ウェルの溶液（Ｗ）には、その結晶化溶液の本質的に半分の濃度でタンパク質液滴（Ｐ）が隣接されている（図７及び図８）。マイクロプレートを、次いで透明な接着性膜で密閉し、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離してタンパク質液滴が確実にタンパク質ウェルの底にくるようにする。プレートはその後、画像分析の列に入れられるまで４℃又は２２℃のいずれかで貯蔵される。透明な接着性膜で密閉されると、この膜が７６８の対チャンバ間の粉砕壁から蒸気チャネルを形成し、各タンパク質液滴は、タンパク質溶液がウェル溶液と同濃度に到達するまで、各ウェル溶液と平衡化する。平衡化のプロセスは、タンパク質が過飽和状態に向かって濃縮されるままにする（permitting）ことにより核生成を促進する。
【００４５】
視覚化及び画像分析
高密度ハイスループット７６８機能ウェル・マイクロプレートにおける実験を評価するのに必要なスループット及び正確性の両方を向上させるために、自動化ニコン（Nikon）Ｍ３倒立顕微鏡、フェーズ３イメージングＸＹステージ（Phase 3 Imaging XY stage）、及びエボリューションＭＰ５．１メガピクセルＣＣＤカラーカメラ（Evolution MP 5.1 Mega-pixel CCD color camera）を組み合わせて画像を取り込み記録する。第一の焦点は、収穫及びＸ線回折による分析のために結晶を特定すること、又はデータ分析のため、及び更には結晶品質を向上させるべく最適化するために結晶化リードを特定することである。取り込まれた各画像、フレームあたり１００ＫＢは、視覚化のための独自の図の配列を作り出すために、日時を刻印して適切なフォルダー中に入れられる。完全な１０００ウェル実験セットを撮像するのにおよそ１時間半かかる。
【００４６】
１０００の画像の各セットは、ディスクスペースのおよそ１００ＭＢを使用し、比較試験のためにアクセスされる内部データベースに格納される。社内で設計された結晶評価者ブラウザを使用して、画像のセットを読み込み、各画像を視覚化する。内部制御設定は精密な採点を補助するためのズームイン／アウト及び光度フィルターを備える。採点プロセスは現在は手作業で行われているが、画像認識ソフトウェアが更に自動化されれば、自動化プロセスに容易に適応させることができる。各画像を２０の序数評点スキーマに対して手作業で採点し、タンパク質結晶化液滴の視覚特性を定義する（図９）。各評点の厳密な解釈が、各溶液構成成分がタンパク質の挙動にどのように影響を与えるかについての関連付けを支援する。≧１０の評点を有するあらゆる液滴が初期リードとしてフラグ付けされ、その後再現性及びタンパク質検証の研究のための待ち行列に入れられる。評点はまた、０及び１のバイナリフォーマットへと変換される。１〜１０と観測されたあらゆる結果は０として記録され、一方１１〜２０の結果は１として記録される。結果は、観測者ごとに主観的である傾向があるが、評点リストは、結晶化実験において典型的に観測される大多数の観測を最下位から最上位まで具体的に定義するように作成された。１１〜２０までの評点は、タンパク質結晶を生成する溶液を特定するが故に最も重要である。否定的なものを含む全ての結果が序数及びバイナリの両方の表を包含するようにデータベースに記録され、溶液ごとのタンパク質結晶化における傾向を検討するためのデータを提供する。リードの品質は更なる結晶化のために取られる経路を指示する。Ｘ線調査用の十分に大きい結晶は高密度ハイスループット７６８機能ウェル・マイクロプレートから直接収穫され、予め処方された凍結防止剤に入れられて−１７３℃にて凍結され、タンパク質回折のためにスクリーニングされる。結晶がＸ線には小さすぎる場合には、クーマシー（Coomassie）溶液で染色して吸収を観測するか、砕いてタンパク質かどうか確認するか、又は結晶再生成におけるシードストックとして使用される。最適化実験は≧８Åの回折により特定されたリードにおいて行われる。構造研究に好適な改善された結晶を生成するための伝統的な方法としては、変動可能なｐＨ及び沈殿剤濃度、添加剤スクリーニング、緩衝剤／沈殿剤の置換、及び播種による実験が挙げられる。
【００４７】
結果
１０００溶液セット及び高密度ハイスループット７６８機能ウェル・マイクロプレートフォーマット及び方法は、最初に１５ｍｇ／ｍＬリゾチームストック溶液を用いて試験された。試験は、リゾチームを結晶化するためのリードとして１７５の独自の溶液を特定することにより１７．５％のヒット率を示した。そのヒットは、結晶シャワーから０．５ｍｍよりも大きな結晶の範囲に渡っていた。０．０５ｍｍから０．５ｍｍを超える範囲の結晶が、１０００溶液の１４％を構成し、０．２５ｍｍよりも大きいものが２％であった。結果は、１０００溶液セット及び高密度ハイスループット７６８機能ウェル・マイクロプレートフォーマット及び方法が、スクリーンにおけるタンパク質結晶の生成のため、及び更なる最適化及び結晶生成のためのリードを特定するために好適であるということを確証した。
【００４８】
１０００溶液セット及び高密度ハイスループット７６８機能ウェル・マイクロプレートフォーマット及び方法は、タンパク質を迅速にスクリーニングしてリードを特定し、構造に基づいた医薬品設計のために好適な結晶を生ずるプロセスのために極めて重要なものとなってきている。過去３年の間に、このプロセスは、６８４のリードを特定し、結果として調査された４６の治療標的のうちの、３３のタンパク質又は１３の阻害剤複合体の構造決定につながった。未知のタンパク質のための最適な結晶化条件の計算及び予測のためのレポジトリを構築するために、全ての治療領域からのタンパク質について１０００溶液の各々に対する表面応答データを、現在収集中である。
【００４９】
【表１】
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【００５０】
【表２−１】
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【００５１】
【表２−２】
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【００５２】
【表２−３】
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【００５３】
【表２−４】
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【００５４】
【表２−５】
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【００５５】
【表２−６】
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【００５６】
【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【００５９】
【表２−１０】
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【００６０】
【表２−１１】
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【００６１】
【表２−１２】
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【００６２】
【表２−１３】
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【００６３】
【表２−１４】
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【００６４】
【表２−１５】
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【００６６】
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【表２−２０】
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【００７０】
【表２−２１】
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【表２−２２】
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【表２−２３】
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【００７３】
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【００７８】
【表２−２９】
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【００７９】
【表２−３０】
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【００８０】
【表２−３１】
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【００８１】
【表２−３２】
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【００８２】
【表２−３３】
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【００８３】
【表２−３４】
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【００８４】
【表２−３５】
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【００８５】
【表２−３６】
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【００８６】
【表２−３７】
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【００８７】
【表２−３８】
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【００８８】
【表２−３９】
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【００８９】
【表２−４０】
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【００９０】
【表２−４１】
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【００９１】
【表２−４２】
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【００９２】
【表２−４３】
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【００９３】
【表２−４４】
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【００９４】
【表２−４５】
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【表２−４６】
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【００９６】
【表２−４７】
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【００９７】
【表２−４８】
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【００９８】
【表２−４９】
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【００９９】
【表２−５０】
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【０１００】
【表２−５１】
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【０１０１】
【表２−５２】
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【０１０２】
【表２−５３】
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【０１０３】
【表２−５４】
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【０１０４】
【表２−５５】
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【０１０５】
【表２−５６】
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【０１０６】
【表２−５７】
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【０１０７】
【表２−５８】
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【０１０８】
【表２−５９】
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【０１０９】
【表２−６０】
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【０１１０】
【表２−６１】
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【０１１１】
【表２−６２】
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【０１１２】
【表２−６３】
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【０１１３】
【表２−６４】
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【０１１４】
参考文献
特許及び特許公報
米国特許第６，９１３，７３２号
米国特許第６，０３９，８０４号
米国特許第６，６５６，２６７号
米国特許第７，２１４，５４０号
【０１１５】
他の参考文献
ヒラキ（Hiraki）、Ｍ．、Ｒ．カトウ（Kato）ら（２００６年）。「ハイスループットタンパク質構造分析のための自動化大スケールタンパク質結晶化及びモニタリングシステムの開発（Development of an automated large-scale protein-crystallization and monitoring system for high-throughput protein-structure analyses）」。アクタクリスタログラフィカＤバイオロジカルクリスタログラフィ（Acta Crystallogr D Biol Crystallogr）６２（Ｐｔ９）、１０５８〜６５。
【０１１６】
ヒラキ（Hiraki）、Ｍ．、Ｒ．カトウ（Kato）ら（２００６年）。「ハイスループットタンパク質構造分析のための自動化大スケールタンパク質結晶化及びモニタリングシステムの開発（Development of an automated large-scale protein-crystallization and monitoring system for high-throughput protein-structure analyses）」。アクタクリスタログラフィカセクションＤ（Acta Crystallographica Section D）６２（９）、１０５８〜１０６５。
【０１１７】
ホスフィールド（Hosfield）、Ｄ．、Ｊ．パラン（Palan）ら（２００３年）。「小分子医薬品の発見のための完全に一体化されたタンパク質結晶化プラットフォーム（A fully integrated protein crystallization platform for small-molecule drug discovery）」。ジャーナルオブストラクチュラルバイオロジー（J Struct Biol）１４２（１）、２０７〜１７。
【０１１８】
ホイ（Hui）、Ｒ．及びＡ．エドワーズ（Edwards）（２００３年）。「ハイスループットタンパク質結晶化（High-throughput protein crystallization）」。ジャーナルオブストラクチュラルバイオロジー（J Struct Biol）１４２（１）、１５４〜６１。
【０１１９】
ジャンカリク（Jancarik）、Ｊ．及びＳ．Ｈ．キム（Kim）（１９９１年）。「希薄なマトリックスサンプリング：タンパク質の結晶化のためのスクリーニング法（Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins）」。ジャーナルオブアプライドクリスタログラフィ（J Appl Crystallogr）２４、４０９〜４１１。
【０１２０】
サンタルシェロ（Santarsiero）、Ｂ．Ｄ．、Ｄ．Ｔ．イエジアン（Yegian）ら（２００２年）。「ナノ液滴を用いた迅速なタンパク質結晶化へのアプローチ（An approach to rapid protein crystallization using nanodroplets）」。ジャーナルオブアプライドクリスタログラフィ（Journal of Applied Crystallography）３５（２）、２７８〜２８１。
【０１２１】
サリダキス（Saridakis）、Ｅ．及びＮ．Ｅ．チェイエン（Chayen）（２０００年）。「デカップリング核生成及び蒸気拡散における成長によるタンパク質結晶品質の改善（Improving protein crystal quality by decoupling nucleation and growth in vapor diffusion）」。プロテインサイエンス（Protein Sci）９（４）、７５５〜７。
【０１２２】
セゲルケ（Segelke）、Ｂ．Ｗ．（２００１年）。「タンパク質結晶化スクリーニングにおいて使用されるサンプリングプロトコルの効率分析（Efficiency analysis of sampling protocols used in protein crystallization screening）」ジャーナルオブクリスタルグロウス（Journal of Crystal Growth）２３２（１）、５５３〜５６２。
【０１２３】
スチーブンス（Stevens）、Ｒ．Ｃ．（２０００年）。「ハイスループットタンパク質結晶化（High-throughput protein crystallization）」。カレントオピニオンインストラクチュラルバイオロジー（Curr Opin Struct Biol）１０（５）、５５８〜６３。
【０１２４】
ストヤノフ（Stojanoff）、Ｖ．（２００４年）。「ハイスループットスクリーニングへの新規なアプローチ；構造ゲノム学のための溶液？（A novel approach to high-throughput screening; a solution for structural genomics?）」ストラクチャー（Structure）１２（７）、１１２７〜８。
【０１２５】
スガハラ（Sugahara）、Ｍ．及びＭ．ミヤノ（Miyano）（２００２年）。「［ハイスループット自動化タンパク質結晶化及び観察システムの開発（Development of high-throughput automatic protein crystallization and observation system）］」。蛋白質核酸酵素（Tanpakushitsu Kakusan Koso）４７（８Ｓｕｐｐｌ）、１０２６〜３２。
【０１２６】
スルゼンベイチャー（Sulzenbacher）、Ｇ．、Ａ．グルツ（Gruez）ら（２００２年）。「ミディアムスループット結晶化アプローチ（A medium-throughput crystallization approach）」。アクタクリスタログラフィカＤバイオロジカルクリスタログラフィ（Acta Crystallogr D Biol Crystallogr）５８（Ｐｔ１２）、２１０９〜１５。
【０１２７】
ワタナベ（Watanabe）、Ｎ．、Ｈ．ムライ（Murai）ら（２００２年）。「ドロップ中の結晶からのＸ線回折のその場観察を可能にする半自動タンパク質結晶化システム（Semi-automatic protein crystallization system that allows in situ observation of X-ray diffraction from crystals in the drop）」。アクタクリスタログラフィカＤバイオロジカルクリスタログラフィ（Acta Crystallogr D Biol Crystallogr）５８（Ｐｔ１０Ｐｔ１）、１５２７〜３０。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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