(57)【要約】【課題】  少なくとも１種のＰＳ脂質を含む脂質粒子を含む組成物を、薬物送達が必要な宿主に投与することを含む、薬物送達の方法を提供する。【解決手段】  細胞のＥＲ膜と融合することができるリポソームのような脂質粒子を含む組成物が提供される。脂質粒子はさらに、細胞のＥＲ内腔の内側の粒子の内側に被包された、治療薬またはイメージング剤のようなカーゴを送達することができる。組成物はＨＩＶおよびＨＣＶ感染を含むウイルス感染のような、ウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスに関連する疾患または状態を治療する、および／または予防することに有用でありうる。【選択図】  図１。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のＰＳ脂質を含む脂質粒子を含む組成物を、薬物送達が必要な宿主に投与することを含む、薬物送達の方法。
【請求項２】
脂質粒子がリポソームである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脂質粒子がＰＥ、ＣＨＥＭＳ、ＰＩまたはＳＰ脂質の中の少なくとも１種をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
脂質粒子がＰＥ脂質を含み、そしてＰＥ脂質とＰＳ脂質間のモル比が０．５：１から２０：１まで変動する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
脂質粒子中のＰＥ脂質とＰＳ脂質間のモル比が１：１から１０：１まで変動する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＰＥ脂質がＤＯＰＥ脂質およびＰＥＧ−ＰＥ脂質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
脂質粒子がＰＥ、ＰＩおよびＰＣ脂質を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
ウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスに関連した疾患または状態を治療するか、または予防するために適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
疾患または状態がウイルス感染である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与がウイルスに感染した細胞の小胞体膜への、脂質粒子の中の１種以上の脂質の組み込みに帰着する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスがフラビウイルス科に属する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
感染がＣ型肝炎感染である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与がＣ型肝炎ウイルスに感染した細胞における脂肪滴の産生を低減させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与が脂肪滴とＣ型肝炎ウイルスのコア蛋白質との相互作用を阻止する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与がＣ型肝炎ウイルスの感染力を低減させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ウイルスがレトロウイルス科に属する、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
ウイルスがＨＩＶ−１ウイルスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
組成物が脂質粒子に被包された少なくとも１種の活性薬をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記投与が、感染を引き起こすウイルスに感染した細胞の小胞体膜への少なくとも１種の活性薬の送達に帰着する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１種の活性薬がイミノ糖を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１種の活性薬がアルファグルコシダーゼ阻害剤を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１種の活性薬がイオンチャンネル阻害剤を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１種の活性薬がＮ−置換デオキシノジリマイシンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１種の活性薬がＮ−ブチルデオキシノジリマイシンを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１種の活性薬が少なくとも１種の抗−ＨＩＶ薬を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１種の活性薬が少なくとも１種の抗−肝炎薬を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１種の活性薬が免疫刺激薬または免疫調節薬およびヌクレオチドまたはヌクレオシド抗ウイルス薬の中の少なくとも１種を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
組成物が抗ウイルス蛋白質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
抗ウイルス蛋白質が脂質粒子の脂質単層または二重層の中に挿入されるか、または脂質粒子とコンジュゲートする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
組成物が脂質粒子とコンジュゲートするか、または脂質粒子の脂質単層または二重層の中に挿入されるターゲッティング部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
ターゲッティング部分がｇｐ１２０／ｇｐ４１ターゲッティング部分を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ターゲッティング部分がｓＣＤ４分子を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ターゲッティング部分がモノクローナル抗体を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ターゲッティング部分がＥＩまたはＥ２ターゲッティング部分を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
宿主がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
ＰＳ脂質またはＰＩ脂質の中の少なくとも１種を含む脂質粒子を含む組成物を、薬物送達が必要な宿主に投与することを含む、ＨＩＶ感染を治療するか、予防する方法であって、前記脂質粒子がＣＨＥＭＳ脂質を含まない、前記方法。
【請求項３７】
脂質粒子がリポソームである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
脂質粒子がさらにＰＥ脂質を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ＰＥ脂質がＤＯＰＥ脂質またはＰＥＧ−ＰＥ脂質の中の少なくとも１種を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
脂質粒子がＰＣ脂質をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
組成物が脂質粒子中に被包された少なくとも１種の抗−ＨＩＶ薬を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１種の抗−ＨＩＶ薬がイミノ糖を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１種の抗−ＨＩＶ薬がアルファグルコシダーゼ阻害剤を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１種の抗−ＨＩＶ薬がＮ−置換デオキシノジリマイシンを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも１種の抗−ＨＩＶ薬がＮ−ブチルデオキシノジリマイシンを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
組成物が脂質粒子とコンジュゲートするか、または脂質粒子の脂質単層または二重層の中に挿入されるターゲッティング部分をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
ターゲッティング部分がｇｐ１２０／ｇｐ４１ターゲッティング部分を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ターゲッティング部分がｓＣＤ４分子を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
ターゲッティング部分がモノクローナル抗体を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも１種の多価不飽和脂質を含む脂質粒子を含む組成物を、薬物送達が必要な対象に投与することを含む、薬物送達の方法。
【請求項５１】
脂質粒子がリポソームである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
脂質粒子が多価不飽和ＰＥ脂質および多価不飽和ＰＣ脂質の中の少なくとも１種を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
脂質粒子が多価不飽和ＰＥ脂質および多価不飽和ＰＣ脂質を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
脂質粒子が多価不飽和２２：６ＰＥ脂質を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
脂質粒子が多価不飽和２２：６ＰＣ脂質を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
脂質粒子が多価不飽和２２：６ＰＣ脂質および多価不飽和２２：６ＰＥ脂質を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
ウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスに関連した疾患または状態を治療するか、または予防するために適用される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
ウイルスがフラビウイルス科に属する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
疾患または状態がＣ型肝炎感染である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記投与がＨＣＶ  ＲＮＡ複製を低減させる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ウイルスがＥＲ−出芽ウイルスである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
ウイルスが糖蛋白質含有ウイルスである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
組成物が脂質粒子に被包された少なくとも１種の活性薬をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも１種の活性薬がイミノ糖を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
少なくとも１種の活性薬がアルファ−グルコシダーゼ阻害剤を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
少なくとも１種の活性薬がイオンチャンネル阻害剤を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
少なくとも１種の活性薬がＮ−置換デオキシノジリマイシンを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
少なくとも１種の活性薬がＮ−ブチルデオキシノジリマイシンを含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
少なくとも１種の活性薬が少なくとも１種の抗−肝炎薬である、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
組成物が抗ウイルス蛋白質をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
脂質粒子とコンジュゲートするか、または脂質粒子の脂質単層または二重層の中に挿入されるターゲッティング部分を組成物が含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
対象がヒトである、請求項５０に記載の方法。
【請求項７３】
ＰＳ脂質を含む脂質粒子を含む組成物。
【請求項７４】
脂質粒子がリポソームである、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７５】
脂質粒子がＰＥ、ＣＨＥＭＳ、ＰＩ、ＰＣまたはＳＰ脂質の中の少なくとも１種をさらに含む、請求項７３に記載の組成物。
【請求項７６】
脂質粒子がＰＥ脂質を含み、そしてＰＥ脂質とＰＳ脂質間のモル比が０．５：１から２０：１まで変動する、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７７】
脂質粒子中のＰＥ脂質とＰＳ脂質間のモル比が１：１から１０：１まで変動する、請求項７６に記載の組成物。
【請求項７８】
ＰＥ脂質がＤＯＰＥ脂質およびＰＥＧ−ＰＥ脂質を含む、請求項７５に記載の組成物。
【請求項７９】
脂質粒子がＰＥ、ＰＩおよびＰＣ脂質を含む、請求項７５に記載の組成物。
【請求項８０】
脂質粒子中のＰＳ脂質のモル濃度が少なくとも１０％である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項８１】
脂質粒子中のＰＳのモル濃度が少なくとも２０％である、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
脂質粒子がＰＩ脂質をさらに含み、そして脂質粒子中のＰＳ脂質とＰＩ脂質の合わせたモル濃度が少なくとも１０％である、請求項７３に記載の組成物。
【請求項８３】
脂質粒子中のＰＳ脂質とＰＩ脂質の合わせたモル濃度が少なくとも２０％である、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
少なくとも１種の多価不飽和脂質を含む脂質粒子を含む組成物。
【請求項８５】
脂質粒子がリポソームである、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
脂質粒子が多価不飽和ＰＥ脂質または多価不飽和ＰＣ脂質の中の少なくとも１種を含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８７】
脂質粒子が多価不飽和ＰＥ脂質および多価不飽和ＰＣ脂質を含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８８】
脂質粒子が多価不飽和２２：６ＰＥ脂質を含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８９】
脂質粒子が多価不飽和２２：６ＰＣ脂質を含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９０】
脂質粒子が多価不飽和２２：６ＰＣ脂質および多価不飽和２２：６ＰＥ脂質を含む、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９１】
脂質粒子中の多価不飽和脂質のモル濃度が少なくとも２０％である、請求項８４に記載の組成物。
【請求項９２】
細胞と、ａ）ＰＩ脂質またはＰＳ脂質の中の少なくとも１種、およびｂ）少なくとも１種のラベルを含む少なくとも１種の標識脂質を含む脂質粒子を接触させることを含む方法。
【請求項９３】
脂質粒子がリポソームである、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
脂質粒子がＰＥおよびＣＨＥＭＳ脂質の中の少なくとも１種をさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９５】
脂質粒子がＰＥ脂質を含み、そしてＰＥ脂質とＰＳ脂質間のモル比が０．５：１から２０：１まで変動する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
脂質粒子中のＰＥ脂質とＰＳ脂質間のモル比が１：１から１０：１まで変動する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
ＰＥ脂質がＤＯＰＥ脂質およびＰＥＧ−ＰＥ脂質を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
脂質粒子がＰＳ、ＰＥ、ＰＩおよびＰＣ脂質を含む、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９９】
ウイルスがＥＲ−出芽ウイルスである、請求項９２に記載の方法。
【請求項１００】
ウイルスがＨＣＶウイルスまたはＨＢＶウイルスである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
少なくとも１種の標識脂質がフルオロフォア−脂質コンジュゲートを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０２】
少なくとも１種の標識脂質がビオチン−脂質コンジュゲートを含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０３】
前記の接触が細胞のＥＲ膜をラベルで標識することに帰着する、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０４】
細胞がＥＲ出芽ウイルスに感染した細胞であり、前記の接触が細胞から出芽するウイルス粒子のラベルによる標識に帰着する、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０５】
標識ウイルス粒子を精製することをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
標識したウイルス粒子を画像処理することをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願
本出願は、２００８年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／０３９，６３８号に対する優先権を主張し、それはそのまま参照として本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本出願は一般に活性薬、たとえば治療薬および／またはイメージング剤を送達するための方法および組成物、さらにとりわけ、リポソームのような脂質粒子を利用する活性薬を送達するための方法および組成物に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一態様は、少なくとも１種のＰＳ脂質を含む脂質粒子を含む組成物を、薬物送達が必要な宿主に投与することを含む、薬物送達の方法を提供する。
【０００４】
別の態様は、ＰＳ脂質またはＰＩ脂質の中の少なくとも１種を含み、ＣＨＥＭＳ脂質を含まない脂質粒子を含む組成物を、薬物送達が必要な宿主に投与することを含む、ＨＩＶ感染を治療するか、または予防する方法を提供する。
【０００５】
さらに別の態様は、少なくとも１種の多価不飽和脂質を含む脂質粒子を含む組成物を、薬物送達が必要な対象に投与することを含む、薬物送達の方法を提供する。
【０００６】
そしてさらに別の態様はＰＳ脂質を含む脂質粒子を含む組成物を提供する。
【０００７】
そしてさらに別の態様は少なくとも１種の多価不飽和脂質を含む脂質粒子を含む組成物を提供する。
【０００８】
そしてさらに別の態様は、ウイルスに感染した細胞を、ａ）ＰＩまたはＰＳ脂質の中の少なくとも１種、およびｂ）少なくとも１種のラベルを含む少なくとも１種の標識脂質を含む脂質粒子と接触させることを含む、ウイルスを標識する方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１（Ａ）〜（Ｇ）は以下の脂質の化学構造を表す：（Ａ）ＤＯＰＥ；（Ｂ）ＤＯＰＣ；（Ｃ）ＣＨＥＭＳ；（Ｄ）ＰＩ；（Ｅ）ＰＳ；（Ｆ）Ｒｈｏ−ＰＥおよび（Ｇ）ｂ−ＰＥ。
【図２−１】図２（Ａ）〜（Ｃ）はＨｕｈ７．５細胞における以下のリポソームとＥＲ膜蛋白質ＥＤＥＭとの共局在を研究した共焦点顕微鏡画像を提示する：（Ａ）ＰＥ：ＣＨ（モル比３：２）リポソーム；（Ｂ）ＰＥ：ＰＣ（３：２）リポソーム；（Ｃ）ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ（３：１：１）リポソーム。
【図２−２】図２（Ｄ）〜（Ｆ）はＨｕｈ７．５細胞における以下のリポソームとＥＲ膜蛋白質ＥＤＥＭとの共局在を研究した共焦点顕微鏡画像を提示する：（Ａ）ＰＥ：ＣＨ（モル比３：２）リポソーム；（Ｂ）ＰＥ：ＰＣ（３：２）リポソーム；（Ｃ）ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ（３：１：１）リポソーム；（Ｄ）ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ（２：２：１）リポソーム；（Ｅ）ＰＥ：ＣＨ：ＰＳ（３：１：１）リポソーム；（Ｆ）ＰＥ：ＰＣ：ＰＳ（２：２：１）リポソーム；（Ｇ）ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ：ＰＳ（３：１：０．５：０．５）リポソーム；（Ｈ）ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ（１．５：１．５：１：１）リポソーム。
【図２−３】図２（Ｇ）〜（Ｈ）はＨｕｈ７．５細胞における以下のリポソームとＥＲ膜蛋白質ＥＤＥＭとの共局在を研究した共焦点顕微鏡画像を提示する：（Ｇ）ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ：ＰＳ（３：１：０．５：０．５）リポソーム；（Ｈ）ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ（１．５：１．５：１：１）リポソーム。
【図３】図３はリポソームにより送達されたｒｈ−ＤＯＰＥとＥＤＥＭ抗体の計算された共局在を提示する。
【図４】図４は、リポソーム中のｂ−ＰＥのモル百分率の関数として、同じ試料内の分泌されたビリオンの総量（１００％）に関するストレプトアビジンにより捕獲されたタグ付きウイルス粒子の百分率を示す。
【図５】図５は、ナイーブＨｕｈ７．５細胞と一緒に１時間インキュベーションされたＲｈ−ＰＥ−タグ付きＪＣ−１ＨＣＶｃｃ（赤色、底部―左パネル）（ＭＯＩ＝０．１）の共焦点顕微鏡画像を示し、その後細胞は洗浄され、新鮮な培地中でさらに０、６、または２４時間インキュベーションされた。それぞれのインキュベーション期間後、細胞は固定され、抗−ＨＣＶコア抗体（緑色、上部−右パネル）およびＤＡＰＩ（青色、上部−左パネル）で染色され、その後顕微鏡スライドにマウントされ、共焦点顕微鏡イメージングが行われた。統合画像は底部−右パネルに示される。それぞれのインキュベーション期間の代表的な画像が示される。それぞれの画像の解像度バーは１０μｍである。
【図６】図６（Ａ）〜（Ｃ）は、モル比３：２のＰＥ：ＣＨリポソーム（Ａ）；ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ（３：１：１）リポソーム（Ｂ）およびＰＥ：ＣＨ：ＰＳ（３：１：１）リポソーム（Ｃ）の細胞膜への組み込みを研究した蛍光顕微鏡画像を提示する。
【図７】図７はＨｕｈ７．５細胞内側のＥＲ−ターゲッティングリポソームの増大した細胞内取り込みおよび脂質保持を実証するプロットを示す。データは、３回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値と標準偏差（ＳＤ）を表す。グラフはＥＲリポソーム（黒色線）およびｐＨ−感受性リポソーム（赤色線）両方に対する細胞増殖（点線）およびｒｈ−ＰＥ−リポソーム取り込み（実線）の２組のデータを表す。Ｙ軸は１００％に標準化した２組のデータの最大値を表す。１００％細胞増殖の最大値は２．４ｘ１０ｅ６細胞／ｍｌ（ＥＲリポソームに関して７２時間読み取り）であり、ｒｈ−ＰＥ蛍光の最大値は１．５ｘ１０ｅ−３任意単位（ＡＵ）／細胞（ＥＲリポソームに関して９６時間読み取り）である。
【図８−１】図８（Ａ）は、インキュベーション期間の終了時に、リポソーム膜を破壊するためのＴｒｉｔｏｎＸ−１００の添加により確定される最大蛍光に関して、リポソームから遊離されたカルセインの百分率をＰＥ：ＣＨおよびＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームに対する時間の関数として表すプロットである。
【図８−２】図８（Ｂ）は、１０％ウシ血清（ＦＢＳ）；１０％ヒト血清のいずれかの存在下において、または無血清培地において、Ｈｕｈ７．５細胞と一緒に２４時間インキュベーションされたＲｈ−標識リポソーム（５０μｍ脂質濃度）に関する実験の結果を提示する。インキュベーション期間後、細胞は採取され、計数され、そして蛍光はλｅｘ＝５５０ｍｍ、λｅｘｍ＝５９０ｎｍにおいて測定された。結果はそれぞれの試料の細胞毎に測定された平均蛍光として提示される。すべてのデータは３回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値と標準偏差を表す。
【図９】図９は１ｘＰＢＳを被包する異なるリポソーム製剤と一緒に５日間インキュベーション後のＨｕｈ７．５細胞の生存能力を示す。培地中の最終脂質濃度は０〜５００μＭまで変動した。結果は３回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。
【図１０】図１０は１ｘＰＢＳを被包する異なるリポソーム製剤と一緒に５日間インキュベーションした後のＰＢＭＣの生存能力を実証する。培地中の最終脂質濃度は０〜５００μＭまで変動した。結果は３回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。
【図１１】図１１は５日間のリポソームによる処置の間の感染ＰＢＭＣからのＨＩＶの分泌を表す。
【図１２】図１２はリポソーム−処置ＨＩＶ−感染ＰＢＭＣから分泌されたＨＩＶビリオンの感染力を表す。
【図１３】図１３は完全ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で４５分間Ｈｕｈ７．５細胞と一緒にインキュベーションされた、自己−消光カルセイン−負荷、ｒｈ−ＰＥ−標識、リポソーム（最終脂質濃度５０μＭ）に関する実験の結果を表す。インキュベーション後のリポソームに由来するカルセインの細胞内消光はλｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍで測定され、同じインキュベーション期間中の総リポソーム取り込みはλｅｘ＝５５０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍにおける蛍光測定により確定された。アッセイは３７℃および４℃の両方で実施され、エンドサイトーシスしないリポソーム結合に関して修正するために、すべての４℃の値は３７℃の値から差し引かれた。Ｈｕｈ７．５細胞内側に被包されたカルセインを送達するためのリポソームの能力は、インキュベーション後に、処置された細胞におけるカルセイン脱消光とｒｈ−ＰＥ蛍光の比を計算することによって測定された。データは３回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値とＳＤを表す。
【図１４】図１４は、１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪによる５日間処置の間の、感染したＰＢＭＣからのＨＩＶの分泌を表す：フリー対リポソーム−媒介送達。
【図１５】図１５はＮＢ−ＤＮＪ−リポソームまたはフリーＮＢ−ＤＮＪによって処置されたＨＩＶ−感染ＰＢＭＣから分泌されたＨＩＶビリオンの感染力を示す。
【図１６】図１６は１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包する異なるリポソーム製剤と一緒に５日間インキュベーション後のＰＢＭＣの生存能力を実証する。
【図１７】図１７はリポソームによる５日間処置後の急性感染および慢性感染両方のＨｕｈ７．５細胞からのＨＣＶの分泌を表す。
【図１８】図１８は、急性感染および慢性感染両方の、リポソーム−処置ＨＣＶ−感染Ｈｕｈ７．５細胞から分泌されたＨＣＶビリオンの感染力を表す。
【図１９】図１９は、１６時間インキュベーション後にＬＤを可視化するためにＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３（緑色）で探査された、無処置Ｈｕｈ７．５細胞（左パネル）およびＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソーム処置−Ｈｕｈ７．５細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。
【図２０】図２０は、ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームで２時間処置され、ＬＤ染料（緑色）で探査されたＨｕｈ７．５細胞（左パネル）の共焦点顕微鏡画像を示す。ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームは最終脂質濃度５０μＭになるまで細胞培養培地に添加された。ＤＡＰＩ（青色）は核染料として使用される。底部−右パネルは統合画像である。黄色は細胞内の共局在領域を同定する。
【図２１−１】図２１Ａは、１６時間インキュベーションされ、抗−ＨＣＶコア抗体（赤色）およびＬＤ染料（緑色）により探査された、無処置Ｈｕｈ７．５細胞（左パネル）およびＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソーム処置−Ｈｕｈ７．５細胞（右パネル）の共焦点顕微鏡画像を示す。
【図２１−２】図２１Ｂは無処置細胞（左）およびＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ細胞（右）両方に関する統合画像（図９Ａの白四角）の拡大を示す。
【図２１−３】図２１ＣはＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームの存在下（右）および非存在下（左）におけるＨＣＶコア蛋白質／ＬＤ相互作用の概念図である。
【図２２】図２２Ａ〜Ｄは代表的な多価不飽和脂質：２２：６ＰＥ（Ａ）；２０：４ＰＥ（Ｂ）；２２：６ＰＣ（Ｃ）および２０：４ＰＣ（Ｄ）の化学構造を表す。
【図２３】図２３Ａ〜Ｂはそれぞれ以下のことを示す：（２３Ａ）種々のＥＲリポソーム製剤の存在下において４日間インキュベーションの間の感染したＨｕｈ７．５細胞（ＭＯＩ＝０．５）からのＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ分泌は細胞上清５００μｌから定量された。分泌は定量ＰＣＲによる上清内のＪＣ−１  ＨＣＶｃｃＲＮＡの定量により測定される。（２３Ｂ）リポソーム−処置、ＪＣ−１−感染Ｈｕｈ７．５細胞から分泌されたＪＣ−１  ＨＣＶｃｃの感染力。分泌されたＨＣＶｃｃの感染力はナイーブＨｕｈ７．５細胞の１時間の感染、その後の４８時間のインキュベーションにより確定され、その時点で細胞は固定され、感染した細胞の数を定量するために抗−ＨＣＶコア抗体により、そしてすべての細胞を可視化するためにＤＡＰＩにより染色された。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
用語の定義
特記しない限り、“ａ”または“ａｎ”は“１以上”を意味する。
【００１１】
本明細書で使用する“ウイルス感染”という用語は罹病状態を表すことができ、そのような状態においてウイルスは健康な細胞に侵入し、細胞の再生装置を使用して増殖するか、または複製し、最終的に細胞を溶解して細胞死、ウイルス粒子の遊離および新規に産生された子孫ウイルスによる他の細胞の感染に帰着する。ある種のウイルスによる潜伏感染もウイルス感染の可能性のある結果である。
【００１２】
本明細書で使用する“ウイルス感染を治療するか、または予防する”という言い方は特有のウイルスの複製を阻止する、ウイルス伝播を阻止する、またはウイルスの宿主中にウイルスが定着することを予防する、およびウイルス感染によって引き起こされる疾患の症状を改善するか、または緩和することを意味しうる。治療がウイルス負荷の低減、死亡率および／または罹病率の減少に帰着する場合、そのような治療は治療効果があると見なすことができる
“治療薬”という用語は、ウイルス感染またはそれによって引き起こされる疾患のような生理的状態を治療することに役立ちうる、分子または化合物のような薬剤を表す。
【００１３】
“リポソーム”という用語は、通常球状二重層製剤である二重層製剤において脂質を含む粒子として定義することができる。本明細書で論じられるリポソームは以下の略語によって表される１以上の脂質を含んでいてもよい：
ＣＨＥＭＳはコレステリルヘミスクシネート脂質を意味する。
【００１４】
ＤＯＰＥはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン脂質を意味する。
【００１５】
ＤＯＰＣはジオレオイルホスファチジルコリン脂質を意味する。
【００１６】
ＰＥはホスファチジルエタノールアミン脂質またはその誘導体を意味する。
【００１７】
ＰＥＧ−ＰＥはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートしたＰＥ脂質を意味する。ＰＥＧ−ＰＥの一例としてはポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン脂質を挙げることができる。ＰＥＧのＰＥＧ成分の分子量は変化しうる。
【００１８】
Ｒｈ−ＰＥはリサミンローダミンＢ−ホスファチジルエタノールアミン脂質を意味する。
【００１９】
ＭＣＣ−ＰＥは、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−カルボキサミド］脂質を意味する。
【００２０】
ＰＩはホスファチジルイノシトール脂質を意味する。
【００２１】
ＰＳはホスファチジルセリンを意味する。
【００２２】
“細胞内送達”という用語は、リポソームからいずれかの細胞内コンパートメントへの被包された物質の送達を表すことができる。
【００２３】
ＩＣ５０またはＩＣ９０（５０％阻害濃度または９０％阻害濃度）はそれぞれ、ウイルス感染の５０％または９０％低減を達成するために使用される治療薬の濃度を表すことができる。
【００２４】
ＰＢＭＣは末梢血単核細胞を意味する。
【００２５】
ｓＣＤ４は可溶性ＣＤ４分子を意味する。“可溶性ＣＤ４”または“ｓＣＤ４”または“Ｄ１Ｄ２”はＣＤ４分子、またはそのフラグメントを意味し、当業者によって理解されるように、それは水性溶液の中にあり、ＨＩＶ  Ｅｎｖのコンホメーションを変更することにより生来の膜−係留ＣＤ４の機能を模倣することができる。可溶性ＣＤ４の一例としては、例えばＳａｌｚｗｅｄｅｌらのＪ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３２６  ３３３，２０００に記載の２−ドメイン可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４またはＤ１Ｄ２）が挙げられる。
【００２６】
ＭＡｂはモノクローナル抗体を意味する。
【００２７】
ＤＮＪはデオキシノジリマイシンを意味する。
【００２８】
ＮＢ−ＤＮＪはＮ−ブチルデオキシノジリマイシンを意味する。
【００２９】
ＮＮ−ＤＮＪはＮ−ノニルデオキシノジリマイシンを意味する。
【００３０】
ＢＶＤＶはウシウイルス性下痢症ウイルスを意味する。
【００３１】
ＨＢＶはＢ型肝炎ウイルスを意味する。
【００３２】
ＨＣＶはＣ型肝炎ウイルスを意味する。
【００３３】
ＨＩＶはヒト免疫不全症ウイルスを意味する。
【００３４】
Ｎｃｐは非細胞変性を意味する。
【００３５】
Ｃｐは細胞変性を意味する。
【００３６】
ＥＲは小胞体を意味する。
【００３７】
ＣＨＯはチャイニーズハムスター卵巣細胞を意味する。
【００３８】
ＭＤＢＫはＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓細胞を意味する。
【００３９】
ＰＣＲはポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００４０】
ＦＯＳは遊離オリゴサッカライドを意味する。
【００４１】
ＨＰＬＣは高速液体クロマトグラフィーを意味する。
【００４２】
ＰＨＡはフィトヘマグルチニンを意味する。
【００４３】
ＦＢＳはウシ胎児血清を意味する。
【００４４】
ＴＣＩＤ５０は５０％組織培養感染量を意味する。
【００４５】
ＥＬＩＳＡは酵素結合免疫吸着法を意味する。
【００４６】
ＩｇＧはイムノグロブリンを意味する。
【００４７】
ＤＡＰＩは４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを意味する。
【００４８】
ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水を意味する。
【００４９】
ＬＤは脂肪滴を意味する。
【００５０】
ＮＳは非構造を意味する。
【００５１】
“ＭＯＩ”は感染多重度を意味する。
【００５２】
関連する出願
本開示は米国特許出願公開第２００８−０１３８３５１号をそのまま参照として援用する。
【００５３】
Ｃ型肝炎
世界でおよそ１億７千万人、すなわち世界人口の３％（たとえばＷＨＯ，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．Ｈｅｐａｔ．１９９９；６：３５−４７を参照されたい）および米国のおよそ４百万人がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ、ＨｅｐＣ）に感染している。ＨＣＶに急性感染した人の約８０％は慢性感染になる。それゆえ、ＨＣＶは慢性肝炎の主要な原因である。一旦慢性的に感染すると、ウイルスは治療なしではほとんど取り除けない。まれな症例では、ＨＣＶ感染は臨床的に急性の疾患および肝不全さえ引き起こす。慢性ＨＣＶ感染は個人間で劇的に変化することが可能で、ある人は臨床的に重要でないか、あるいは極めて軽度の肝臓疾患に罹患し、決して合併症を発症しないが、他の人は臨床的に明らかな慢性肝炎に罹患し、肝硬変発症に進行する可能性がある。ＨＣＶに罹患し、肝硬変を発症する人の約２０％は末期肝臓疾患を発症し、そして原発性肝臓癌を発症するリスクが増大することになる。
【００５４】
単独の、またはリバビリンとの組み合わせにおける抗ウイルス薬、たとえばインターフェロンは、患者の８０％に至るまで有効である（Ｄｉ  Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅ，Ａ．Ｍ，ａｎｄ  Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ，Ｊ．Ｈ．２００２，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３６，Ｓ１２１−Ｓ１２７）が、多くの患者はこの組み合わせ療法の形態に耐えられない。
【００５５】
脂肪滴
脂肪滴（ＬＤ）は中性脂質貯蔵のために使用されうるオルガネラでありうる。ＬＤは細胞質の中を活発に動き、ＥＲを含む他のオルガネラと相互作用することができる。これらの相互作用は他のオルガネラへの脂質および蛋白質の輸送を促進すると考えられる。ＨＣＶキャプシド蛋白質（コア）は細胞内ＬＤと会合し、感染性ウイルス粒子産生のために非構造（ＮＳ）蛋白質および複製複合体をＬＤ−会合膜に能動的に動員することができる。ＨＣＶ粒子はＬＤのすぐそばで観察されていて、ウイルスアセンブリーのいくつかのステップがＬＤ周辺で起こりうることを示している（Ｍｉｙａｎａｒｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９（２００７）ｐｐ．１０８９−１０９７）。
【００５６】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ＨＩＶは後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および関連する障害の原因因子である。少なくとも２種の別個のＨＩＶの型：ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２がある。さらに、これらの型のそれぞれの集団内に大量の遺伝的異質性が存在する。ＡＩＤＳ流行の開始以来、約２千万人が死亡し、概算では４千万を超える人々がＨＩＶ−１／ＡＩＤＳに罹患しながら生存し、世界中で毎日１万４千人が感染している。
【００５７】
非常に多くの抗ウイルス治療薬および診断能力が開発されていて、少なくとも利用できる人々にとっては、そのことが命の長さおよび生活の質の両方を大きく改善してきた。これらの薬物の大部分は、ウイルス蛋白質または逆転写のようなプロセスおよびプロテアーゼ活性を妨害する。残念なことに、これらの治療は感染を排除せず、多くの療法の好ましくない効果は過酷であり、そして現在使用されているすべての型の抗ウイルス薬に対してＨＩＶの薬剤耐性株が存在する。
【００５８】
Ｎ−ブチル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール
Ｎ−ブチル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトールとしても公知のＮＢ−ＤＮＪはＥＲグルコシダーゼＩおよびＩＩによるプロセッシングを阻止することができ、そしてとりわけ、ＨＩＶおよびＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のような肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）の糖蛋白質のミスフォールディングおよび／またはＥＲ−保持を引き起こすことによる有効な抗ウイルス薬であることが示されている。ＮＢ−ＤＮＪおよび他のＮ−置換デオキシノジリマイシン誘導体を合成する方法は、たとえば米国特許第５，６２２，９７２号、第４，２４６，３４５号、第４，２６６，０２５号、第４，４０５，７１４号および第４，８０６，６５０号に記載される。ＮＢ−ＤＮＪの抗ウイルス効果は、たとえば肝炎ウイルスに関しては米国特許第６，４６５，４８７号；第６，５４５，０２１号；第６，６８９，７５９号；第６，８０９，０８３号に、そしてＨＩＶウイルスに関しては米国特許第４，８４９，４３０号において論じられる。
【００５９】
ＮＢ−ＤＮＪのようなグルコシダーゼ阻害剤は細胞培養物およびウッドチャック動物モデルを使用することの両方におけるＨＢＶ感染の治療に有効であることが示されている。たとえば、Ｔ．Ｂｌｏｃｋ，Ｘ．Ｌｕ，Ａ．Ｓ．Ｍｅｈｔａ，Ｂ．Ｓ．Ｂｌｕｍｂｅｒｇ，Ｂ．Ｔｅｎｎａｎｔ，Ｍ．Ｅｂｌｉｎｇ，Ｂ．Ｋｏｒｂａ，Ｄ．Ｍ．Ｌａｎｓｋｙ，Ｇ．Ｓ．Ｊａｃｏｂ  ＆  Ｒ．Ａ．Ｄｗｅｋ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９８  Ｍａｙ；４（５）：６１０−４を参照されたい。ＮＢ−ＤＮＪはＨＢＶ粒子の分泌を抑制し、ＨＢＶ  ＤＮＡの細胞内保持を引き起こす。
【００６０】
ＮＢ−ＤＮＪは、ＨＣＶの細胞培養物モデルであるＢＶＤＶに対する強い抗ウイルス薬であることが示されている。たとえば、Ｂｒａｎｚａ−Ｎｉｃｈｉｔａ  Ｎ，Ｄｕｒａｎｔｅｌ  Ｄ，Ｃａｒｒｏｕｅｅ−Ｄｕｒａｎｔｅｌ  Ｓ，Ｄｗｅｋ  ＲＡ，Ｚｉｔｚｍａｎｎ  Ｎ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００１  Ａｐｒ；７５（８）：３５２７−３６；Ｄｕｒａｎｔｅｌ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，２００１，７５，８９８７−８９９８；Ｎ．Ｚｉｔｚｍａｎｎら，ＰＮＡＳ，１９９９，９６，１１８７８−１１８８２を参照されたい。ＮＢ−ＤＮＪによる治療は、ウイルス子孫の感染力減少を導くが、分泌されたウイルスの実際の数に対する効果は少ない。
【００６１】
ＮＢ−ＤＮＪはＨＩＶに対する抗ウイルス性があることが示されている；処置はＨＩＶ−感染細胞から遊離されたウイルス粒子の数に対しては比較的効果が小さいが、遊離された感染性ウイルスの量は非常に低減される。たとえば、Ｐ．Ｂ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｃｏｌｌｉｎら（１９９５），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６９（９）：５７９１−７；Ｐ．Ｂ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｇ．Ｂ．Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｔ．Ｂｕｔｔｅｒｓ，Ｒ．Ｄｗｅｋ  ａｎｄ  Ｆ．Ｐｌａｔｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６ａ），ｐｐ．７１４３-７１５２、Ｐ．Ｂ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｇ．Ｂ．Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．Ｄｗｅｋ  ａｎｄ  Ｆ．Ｐｌａｔｔ，．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（１９９６ｂ），ｐｐ．７１５３-７１６０を参照されたい。ＮＢ−ＤＮＪを含む臨床試験はＨＩＶ−１感染患者において実施され、結果は抗ウイルス活性に必要な濃度が非常に高く、患者に重篤な副作用を生じることを実証した。たとえば、Ｆｉｓｃｈｌ  Ｍ．Ａ．，Ｒｅｓｎｉｃｋ  Ｌ．，Ｃｏｏｍｂｓ  Ｒ．，Ｋｒｅｍｅｒ  Ａ．Ｂ．，Ｐｏｔｔａｇｅ  Ｊ．Ｃ．Ｊｒ，Ｆａｓｓ  Ｒ．Ｊ．，Ｆｉｆｅ  Ｋ．Ｈ．，Ｐｏｗｄｅｒｌｙ  Ｗ．Ｇ．，Ｃｏｌｌｉｅｒ  Ａ．Ｃ．，Ａｓｐｉｎａｌｌ  Ｒ．Ｌ．ら，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ．Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．１９９４  Ｆｅｂ；７（２）：１３９−４７を参照されたい。現在、ＮＢ−ＤＮＪ処置に対して耐性のある突然変異ＨＩＶ株は存在しない。
【００６２】
ＥＲ蛋白質フォールディングおよびグルコシダーゼＩおよびＩＩ
グルコシダーゼ阻害によって実証される抗ウイルス効果は、主にカルネキシン／カルレテキュリンサイクルに入ることを遮断することによる、ＥＲ内のウイルス糖蛋白質のミスフォールディングまたは保持の結果であると考えられている。伸長しているポリペプチド鎖におけるトリグルコシル化オリゴサッカライド（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサス配列への転移後、成熟炭水化物ユニットへのそれ以上のプロセッシングが起こりうる前に３つのα‐結合グルコース残基が遊離されることが必要である。さらに、適切なフォールディングのためにカルネキシン／カルレテキュリンサイクルに入ることを可能にするために２つの外側のグルコース残基が取り除かれなければならない。たとえば、Ｂｅｒｇｅｒｏｎ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９４，１９，１２４−１２８；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１９９５，６，１１７３−１１８４を参照されたい。初期のプロセッシングは、ＥＲに位置し、α１−２結合グルコース残基を特に開裂し、内腔に配向した触媒ドメイン（グルコシダーゼＩ）を持つ膜内在性酵素に影響を受け；その後α１−３結合グルコース成分の両方を遊離するグルコシダーゼＩＩの作用を受ける。
【００６３】
リポソーム
リポソームは、分子障壁としての役割を果たす細胞膜を回避することによって、水溶性化合物を細胞の内側に直接送達することができる。ｐＨ感受性リポソーム製剤は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）またはその誘導体、たとえばＤＯＰＥと、中性ｐＨにおいて安定化剤としての役割を果たす酸性基を含む化合物の組み合わせを含むことができる。コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて他の両親媒性安定化剤に比較してそのコレステロール基がＰＥ含有小胞に高い安定性を与えるため、優れた安定化分子でありうる。リポソーム−媒介送達のｉｎ  ｖｉｖｏでの効力は、それらの薬物動態および生体内分布に影響を与える血清成分（オプソニン）との相互作用に強く依存しうる。ｐＨ−感受性リポソームは、血液循環から速やかに除去され、肝臓および腎臓に蓄積するが、共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を持つ脂質の包含は、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳリポソームの正味の負電荷を安定化し、長期の循環時間を導くことにより、細網内皮系（ＲＥＳ）によるクリアランスに打ち勝つことができる。ＤＯＰＥ−ＣＨＥＭＳおよびＤＯＰＥ−ＣＨＥＭＳ−ＰＥＧ−ＰＥリポソームならびにそれらの調製の方法は、たとえばＶ．Ａ．Ｓｌｅｐｕｓｈｋｉｎ，Ｓ．Ｓｉｍｏｅｓ，Ｐ．Ｄａｚｉｎ，Ｍ．Ｓ．Ｎｅｗｍａｎ，Ｌ．Ｓ．Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．Ｐ．ｄｅ  Ｌｉｍａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７）２３８２−２３８８；およびＳ．Ｓｉｍｏｅｓ，Ｖ．Ｓｌｅｐｕｓｈｋｉｎ，Ｎ．Ｄｕｚｇｕｎｅｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｃ．Ｐｅｄｒｏｓｏ  ｄｅ  Ｌｉｍａ，Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １５１５（２００１）２３−３７に記載され、それらは共にそのまま参照として本明細書に援用される。
【００６４】
ＤＯＰＥ−ＣＨＥＭＳ（モル比６：４）に被包されたＮＢ−ＤＮＪの送達は米国特許出願第ＵＳ２００３／０１２４１６０号に開示される。
【００６５】
開示
発明者らはＰＩまたはＰＳ脂質（図１を参照されたい）の中の少なくとも１種を含む、リポソームまたはミセルのような脂質粒子は細胞により効率的に取り込まれ、そしてその細胞のＥＲ膜と融合してもよいと考える。発明者らはまた、ＰＩまたはＰＳ脂質の中の少なくとも１種を含む脂質粒子は、血液または血清のような血液成分中で高い安定性を有しうることを発見した。たとえば、ＰＩまたはＰＳ脂質の中の少なくとも１種を含むリポソームは、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソーム（モル比６：３）またはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ＰＥＧ−ＰＥ（モル比６：３：０．１）リポソームより、血清中で高い安定性を有しうる。
【００６６】
ある態様では、脂質粒子は少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または３％から６０％、または５％から５０％、または１０％から３０％のモル濃度でＰＩおよび／またはＰＳ脂質を含むことができる。ある態様では、脂質粒子中のＰＳ脂質のモル濃度は、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または３％から６０％、または５％から５０％、または１０％から３０％でありうる。ある態様では、脂質粒子中のＰＩ脂質のモル濃度は、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または３％から６０％、または５％から５０％、または１０％から３０％でありうる。ある態様では、脂質粒子中のＰＩとＰＳ脂質を組み合わせた濃度は、少なくとも５％または少なくとも１０％または少なくとも１５％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または３％から６０％、または５％から５０％、または１０％から３０％でありうる。
【００６７】
脂質粒子はさらに１種以上のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）脂質またはその誘導体、たとえばＤＯＰＥを含んでいてもよい。ある態様では、ＰＥ脂質はラベルとコンジュゲートしたＰＥ脂質を含んでいてもよく、該ラベルはたとえば、フルオロフォアラベル、ビオチンラベル、または放射性ラベルでありうる。図１Ａ、１Ｆおよび１Ｇは、ＤＯＰＥ脂質、フルオロフォアとコンジュゲートしたＰＥ脂質の例であるＲｈｏ−ＰＥ脂質、およびビオチンラベルとコンジュゲートしたＰＥ脂質の例であるｂ−ＰＥ脂質を提示する。
【００６８】
ある態様では、脂質粒子はＰＣまたはＣＨＥＭＳリポソームの中の少なくとも１種をさらに含んでいてもよい。さらにある他の態様では、脂質粒子はＰＣおよび／またはＣＨＥＭＳ脂質を含まないような粒子であってもよい。
【００６９】
ある態様では、ＰＥ、ＰＣ、ＰＩおよびＰＳ脂質を含む脂質粒子が好ましくてもよい。そのような脂質粒子は、細胞内ＬＤを妨害してもよく、そのことがこれらの脂質粒子によって処置されたＨＣＶ―感染細胞から分泌されたＨＣＶ粒子の感染力の著しい低減を導いてもよい。ＰＥ、ＰＣ、ＰＩおよびＰＳ脂質を含む脂質粒子はＨＣＶ−感染細胞への脂質の導入に使用されて、ＬＤ／ＨＣＶコア蛋白質相互作用を妨害してもよい。さらに、ＰＥ、ＰＣ、ＰＩおよびＰＳ脂質を含む脂質粒子はＨＣＶと同じ細胞受容体を競い、その結果、ウイルスの細胞への侵入を妨げ、ウイルス感染力を低減させてもよい。
【００７０】
ウイルス感染
脂質粒子は対象においてウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスに関連した疾患または状態を治療する、予防するおよび／またはモニターするために使用することができ、そのような対象は多くの場合哺乳類または鳥類のような温血動物でありうる。多くの場合、対象はヒトでありうる。多くの場合、該疾患または状態はウイルス感染でありうる。
【００７１】
ある態様では、ＰＩまたはＰＳ脂質の中の少なくとも１種を含む脂質粒子は、フラビウイルス科に属するウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスに関連した疾患または状態を治療する、予防するおよび／またはモニターするために使用することができる。フラビウイルス科にはフラビウイルス属；ヘパシウイルス属およびペスティウイルス属が挙げられる。
【００７２】
フラビウイルス属には、ガジェッツガリー（Ｇａｄｇｅｔｓ  Ｇｕｌｌｙ）ウイルス（ＧＧＹＶ）、カダム（Ｋａｄａｍ）ウイルス（ＫＡＤＶ）；キャサヌール森林病（Ｋｙａｓａｎｕｒ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス（ＫＦＤＶ）；ランガット（Ｌａｎｇａｔ）ウイルス（ＬＧＴＶ）；オムスク出血熱（Ｏｍｓｋ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ）ウイルス（ＯＨＦＶ）；ポーワッサン（Ｐｏｗａｓｓａｎ）ウイルス（ＰＯＷＶ）；ロイヤルファーム（Ｒｏｙａｌ  Ｆａｒｍ）ウイルス（ＲＦＶ）；ダニ−媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）；跳躍病ウイルス（ＬＩＶ）；メアバン（Ｍｅａｂａｎ）ウイルス（ＭＥＡＶ）；サウマレッツリーフ（Ｓａｕｍａｒｅｚ  Ｒｅｅｆ）ウイルス（ＳＲＥＶ）；チュレニー（Ｔｙｕｌｅｎｉｙ）ウイルス（ＴＹＵＶ）；アロア（Ａｒｏａ）ウイルス（ＡＲＯＡＶ）；デング（Ｄｅｎｇｕｅ）ウイルス（ＤＥＮＶ）１−４；ケドゴウ（Ｋｅｄｏｕｇｏｕ）ウイルス（ＫＥＤＶ）；カシパコア（Ｃａｃｉｐａｃｏｒｅ）ウイルス（ＣＰＣＶ）；コウタンゴ（Ｋｏｕｔａｎｇｏ）ウイルス（ＫＯＵＶ）；日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）；マレー渓谷脳炎（Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス（ＭＶＥＶ）；セントルイス脳炎（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス（ＳＬＥＶ）；ウスツ（Ｕｓｕｔｕ）ウイルス（ＵＳＵＶ）；西ナイル（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ）ウイルス（ＷＮＶ）；ヤオウンド（Ｙａｏｕｎｄｅ）ウイルス（ＹＡＯＶ）；ココベラ（Ｋｏｋｏｂｅｒａ）ウイルス（ＫＯＫＶ）；バガザ（Ｂａｇａｚａ）ウイルス（ＢＡＧＶ）；イレウス（Ｉｌｈｅｕｓ）ウイルス（ＩＬＨＶ）；イスラエルトルコ脳膜脳脊髄炎（Ｉｓｒａｅｌ  ｔｕｒｋｅｙ  ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）ウイルス（ＩＴＶ）；ンタヤ（Ｎｔａｙａ）ウイルス（ＮＴＡＶ）；テンブス（Ｔｅｍｂｕｓｕ）（ＴＭＵＶ）；ジカ（Ｚｉｋａ）ウイルス（ＺＩＫＶ）；バンジ（Ｂａｎｚｉ）ウイルス（ＢＡＮＶ）；ボウボウイ（Ｂｏｕｂｏｕｉ）ウイルス（ＢＯＵＶ）；エッジヒル（Ｅｄｇｅ  Ｈｉｌｌ）ウイルス（ＥＨＶ）；ジュグラ（Ｊｕｇｒａ）ウイルス（ＪＵＧＶ）；サボヤ（Ｓａｂｏｙａ）ウイルス（ＳＡＢＶ）；セピク（Ｓｅｐｉｋ）ウイルス（ＳＥＰＶ）；ウガンダＳ（Ｕｇａｎｄａ  Ｓ）ウイルス（ＵＧＳＶ）；ベッセルスブロン（Ｗｅｓｓｅｌｓｂｒｏｎ）ウイルス（ＷＥＳＳＶ）；黄熱病（Ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ）ウイルス（ＹＦＶ）；エンテベコウモリ（Ｅｎｔｅｂｂｅ  ｂａｔ）ウイルス（ＥＮＴＶ）；ヨコセ（Ｙｏｋｏｓｅ）ウイルス（ＹＯＫＶ）；アポイ（Ａｐｏｉ）ウイルス（ＡＰＯＩＶ）；カウボーンリッジ（Ｃｏｗｂｏｎｅ  Ｒｉｄｇｅ）ウイルス（ＣＲＶ）；ジュチアパ（Ｊｕｔｉａｐａ）ウイルス（ＪＵＴＶ）；モドク（Ｍｏｄｏｃ）ウイルス（ＭＯＤＶ）；サルビエヤ（Ｓａｌ  Ｖｉｅｊａ）ウイルス（ＳＶＶ）；サンパーリタ（Ｓａｎ  Ｐｅｒｌｉｔａ）ウイルス（ＳＰＶ）；ブカラサコウモリ（Ｂｕｋａｌａｓａ  ｂａｔ）ウイルス（ＢＢＶ）；カーレー島（Ｃａｒｅｙ  Ｉｓｌａｎｄ）ウイルス（ＣＩＶ）；ダカーコウモリ（Ｄａｋａｒ  ｂａｔ）ウイルス（ＤＢＶ）；モンタナミオチス白��脳炎（Ｍｏｎｔａｎａ  ｍｙｏｔｉｓ  ｌｅｕｋｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス（ＭＭＬＶ）；フノンペンコウモリ（Ｐｈｎｏｍ  Ｐｅｎｈ  ｂａｔ）ウイルス（ＰＰＢＶ）；リオブラボ（Ｒｉｏ  Ｂｒａｖｏ）ウイルス（ＲＢＶ）が挙げられる。ヘパシウイルス属には、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ、Ｈｅｐ  Ｃ）が挙げられる。ペスティウイルス属には、ボーダー病（Ｂｏｒｄｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルス、ウシ下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）；および豚コレラ（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）ウイルスが挙げられる。フラビウイルスによって引き起こされるか、またはそれらに関連した疾患には、デング熱；日本脳炎；キャサヌール森林病（Ｋｙａｓａｎｕｒ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）；マレー渓谷脳炎（Ｍｕｒｒａｙ  Ｖａｌｌｅｙ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）；セントルイス脳炎（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）；チックボーン脳炎（Ｔｉｃｋ−ｂｏｒｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）；西ナイル脳炎（Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）および黄熱病が挙げられる。ヘパシウイルスによって引き起こされるか、またはそれらに関連した疾患にはＣ型肝炎ウイルス感染が挙げられる。ペスティウイルスによって引き起こされるか、またはそれらに関連した疾患には、豚コレラ（Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）（ＣＳＦ）およびウシウイルス性下痢（ＢＶＤ）またはウシウイルス性下痢／粘膜病（ＢＶＤ／ＭＤ）が挙げられる。
【００７３】
ある態様では、脂質粒子はヘパドナウイルス科に属するウイルスよって引き起こされるか、またはそれらに関連した疾患または状態を治療する、予防するおよび／またはモニターするために使用されうる。ヘパドナウイルス科には、Ｂ型肝炎ウイルスを含むオルトヘパドナウイルス属、およびアヒルＢ型肝炎ウイルスを含むアビヘパドナウイルス属が挙げられる。ヘパドナウイルスによって引き起こされるか、またはそれらに関連した疾患にはＢ型肝炎ウイルス感染が挙げられる。
【００７４】
ある態様では、脂質粒子はレトロウイルス科に属するウイルスよって引き起こされるか、またはそれらに関連した疾患または状態を治療する、予防するおよび／またはモニターするために使用されうる。レトロウイルス科には、トリ白血病ウイルスを含むアルファレトロウイルス属；マウス乳癌ウイルスを含むベータレトロウイルス属；マウス白血病ウイルスおよびネコ白血病ウイルスを含むガンマレトロウイルス属；ウシ白血病ウイルスおよびヒトＴ−リンパ球向性ウイルスを含むデルタレトロウイルス属；ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス（Ｗａｌｌｅｙｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）を含むイプシロンレトロウイルス属；ヒト免疫不全ウイルスＩ、サル免疫不全ウイルスおよびネコ免疫不全ウイルスを含むレンチウイルス属；チンパンジー泡沫状ウイルスを含むスプーマウイルス属が挙げられる。レトロウイルス科に属するウイルスによって引き起こされるか、またはそれらに関連した疾患および状態にはＨＩＶ  Ｉ感染が挙げられる。
【００７５】
ある態様では、脂質粒子は糖蛋白質含有ウイルスよって引き起こされるか、またはそれらに関連した疾患または状態を治療する、予防するおよび／またはモニターするために使用されうる。脂質粒子は、対象、たとえばヒトに組成物の一部として投与される場合、感染、たとえばウイルス感染の治療および予防のために使用されてもよい。ある態様では、そのような感染は糖蛋白質含有ウイルス、すなわち少なくとも１種の糖蛋白質を含むウイルスによって引き起こされるか、またはそれに関連した感染であってもよい。さらにある態様では、そのような感染は、肝炎感染、たとえばＨＣＶ感染またはＨＢＶ感染であってもよい。さらにある態様では、そのような感染はレトロウイルス感染、たとえばＨＩＶであってもよい。さらにある態様では、感染はフラビウイルス感染、たとえばＨＣＶであってもよい。
【００７６】
脂質粒子がＨＩＶ感染を治療するために使用される場合、それがＨＩＶ感染細胞から分泌されたＨＩＶ粒子の感染力を低減させてもよい。
【００７７】
脂質粒子がＨＣＶ感染を治療するために使用される場合、それが細胞内ＬＤを妨害し、ＨＣＶ感染細胞から分泌されたＨＣＶ粒子の感染力を低減させてもよい。ＰＥ、ＰＣ、ＰＩおよびＰＳ脂質を含む脂質粒子がそのような場合に好ましくてもよい。
【００７８】
本発明はそれらの操作理論によって限定されるが、発明者らは、ＰＥ、ＰＣ、ＰＩおよびＰＳ脂質を含む脂質粒子がＨＣＶと同じ細胞受容体を競い、その結果ウイルスの細胞への侵入を妨げ、ウイルス感染力を低減させると考えている。
【００７９】
活性薬
ある態様では、少なくとも１種の薬剤、たとえば治療薬またはイメージング剤は脂質粒子内側に被包されてもよい。そのような薬剤は、たとえば、水溶性分子、ペプチドまたはアミノ酸であってもよい。被包された活性薬と一緒に脂質粒子を含む組成物は、活性薬が有効であることが公知の疾患または状態を治療する、予防する、またはモニターするために使用することができる。該疾患または状態は、活性薬の細胞内送達が有益であってもよい任意の疾患または状態であってもよい。
【００８０】
ＰＩおよび／ＰＳ脂質を含む脂質粒子の使用は、細胞のＥＲ内腔への被包された物質の送達を考慮してもよい。
【００８１】
ある態様では、脂質粒子の内側に被包された薬剤は、α−グルコシダーゼ阻害剤でありうる。ある態様では、α−グルコシダーゼ阻害剤はＥＲα−グルコシダーゼ阻害剤であってよく、そしてそれはＥＲα−グルコシダーゼＩ阻害剤またはＥＲα−グルコシダーゼＩＩ阻害剤であってもよい。一般に、ウイルスエンベロップ糖蛋白質の適切なフォールディングをカルネキシンおよび／またはカルレティキュリンとの相互作用に頼る任意のウイルスがＥＲα−グルコシダーゼ阻害剤の目標にされうる。
【００８２】
アルファグルコシダーゼ阻害剤は、宿主のアルファ−グルコシダーゼ酵素活性を、薬剤の非存在下におけるアルファ−グルコシダーゼの酵素活性に比較して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、またはそれより多く阻止する薬剤でありうる。“アルファ−グルコシダーゼ阻害剤”という用語は、宿主のアルファ−グルコシダーゼ活性を阻止する、天然に存在する薬剤および合成薬剤の両方を包含する。適切なアルファ−グルコシダーゼ阻害剤には、限定するものではないがデオキシノジリマイシンおよびＮ−置換デオキシノジリマイシン、たとえば式Ｉの化合物：
【００８３】
【化１】
2011518124.tif 000002
【００８４】
および薬剤的に受容可能なその塩を挙げることができ、式中、Ｒ１は分枝鎖または直鎖アルキル基でありうる置換、または非置換アルキル基；置換、または非置換シクロアルキル基；置換、または非置換アリール基、置換、または非置換オキサアルキル基、置換、または非置換アリールアルキル、シクロアルキルアルキルから選択され、そしてＷ、Ｘ、Ｙ、およびＺはそれぞれ独立して水素、アルカノイル基、アロイル基、およびハロアルカノイル基から選択される。
【００８５】
ある態様では、Ｒ１はＣ１〜Ｃ２０アルキル基またはＣ３〜Ｃ１２アルキル基から選択されうる。ある態様では、Ｒ１はエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、ｎ−ヘキシル、へプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニルおよびｎ−デシルから選択されうる。ある態様では、Ｒ１はブチルまたはノニルでありうる。
【００８６】
ある態様では、Ｒ１はＣ１〜Ｃ２０アルキル基またはＣ３〜Ｃ１２アルキル基であってよく、さらに１から５、または１から３、または１から２個の酸素原子を含むことができるオキサルキルでありうる。オキサルキル基の例としては、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）５ＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）６ＣＨ３、-（ＣＨ２）６ＯＣＨ２ＣＨ３、および−（ＣＨ２）２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３が挙げられる。
【００８７】
ある態様では、Ｒ１はアリールアルキル基でありうる。アリールアルキル基の例としてはＣ１〜Ｃ１２−Ｐｈ基、たとえばＣ３−Ｐｈ、Ｃ４−Ｐｈ、Ｃ５−Ｐｈ、Ｃ６−ＰｈおよびＣ７−Ｐｈが挙げられる。
【００８８】
ある態様では、式Ｉの化合物は以下の化合物から選択されるが、それらに限定されない：Ｎ−（ｎ−ヘキシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−ヘプチル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−オクチル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−オクチル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール、テトラブチレート；Ｎ−（ｎ−ノニル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（ｎ−デシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（ｎ−ウンデシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（ｎ−ノニル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−デシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−ウンデシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−ドデシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（２−エチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（４−エチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（５−メチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（３−プロピルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（１−ペンチルペンチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（１−ブチルブチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（７−メチルオクチル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（８−メチルノニル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（９−メチルデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（１０−メチルウンデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（６−シクロヘキシルヘキシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（４−シクロヘキシルブチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（２−シクロヘキシルエチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（１−シクロヘキシルメチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（１−フェニルメチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（３−フェニルプロピル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（３−（４−メチル）−フェニルプロピル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（６−フェニルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール；Ｎ−（ｎ−ノニル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（ｎ−デシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（ｎ−ウンデシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（ｎ−ドデシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（２−エチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（４−エチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（５−メチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（３−プロピルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（１−ペンチルペンチルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（１−ブチルブチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（７−メチルオクチル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（８−メチルノニル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（９−メチルデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（１０−メチルウンデシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（６−シクロヘキシルヘキシル−）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（４−シクロヘキシルブチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（２−シクロヘキシルエチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（１−シクロヘキシルメチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（１−フェニルメチル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（３−フェニルプロピル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（３−（４−メチル）−フェニルプロピル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；Ｎ−（６−フェニルヘキシル）−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−グルシトール，テトラブチレート；薬剤的に受容可能なその塩；およびそのいずれか２種以上の混合物。
【００８９】
Ｎ−置換デオキシノジリマイシンが有効でありうる疾患および状態は以下の米国特許に開示される：第４，８４９，４３０号；第４，８７６，２６８号；第５，４１１，９７０号；第５，４７２，９６９号；第５，６４３，８８８号；第６，２２５，３２５号；第６，４６５，４８７号；第６，４６５，４８８号；第６，５１５，０２８号；第６，６８９，７５９号；第６，８０９，０８３号；第６，５８３，１５８号；第６５８９，９６４号；第６，５９９，９１９号；第６，９１６，８２９号；第７，１４１，５８２号。Ｎ−置換デオキシノジリマイシンが有効でありうる疾患および状態には以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：ＨＩＶ感染；Ｃ型肝炎感染およびＢ型肝炎感染を含む肝炎感染；テイサックス病、ゴーシェ病、クラッベ病およびファブリー病を含むリソソーム脂質蓄積症；ならびに嚢胞性線維症。
【００９０】
ある態様では、α−グルコシダーゼ阻害剤は、Ｎ−オキサアルキル化デオキシノジリマイシンまたはＮ−アルキルオキシデオキシノジリマイシン、たとえば米国特許第４，６３９，４３６号に記載のＮ−ヒドロキシエチルＤＮＪ（ミグリトール（Ｍｉｇｌｉｔｏｌ）またはグリセット（Ｇｌｙｓｅｔ）（登録商標））でありうる。
【００９１】
ある態様では、α−グルコシダーゼ阻害剤はカスタノスペルミンおよび／またはカスタノスペルミン誘導体、たとえば、６−Ｏ−ブタノイルカスタノスペルミン（セルゴシビル（ｃｅｌｇｏｓｉｖｉｒ））を含む米国特許出願第２００６／０１９４８３５号に開示された式（Ｉ）の化合物および薬剤的に受容可能なその塩、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ０１０５４６９２号に開示された式ＩＩの化合物または薬剤的に受容可能なその塩でありうる。
【００９２】
カスタノスペルミンおよびその誘導体が有効でありうる疾患および状態は、米国特許第
４，７９２，５５８号；第４，８３７，２３７号；第４，９２５，７９６号；第４，９５２，５８５号；第５，００４，７４６号；第５，２１４，０５０号；第５，２６４，３５６号；第５，３８５，９１１号；第５，６４３，８８８号；第５，６９１，３４６号；第５，７５０，６４８号；第５，８３７，７０９号；第５，９０８，８６７号；第６，１３６，８２０号；第６，５８３，１５８号；第６，５８９，９６４号；第６，６５６，９１２号および米国特許公報２００２０００６９０９；２００２０１８８０１１；２００６００９３５７７；２００６０１９４８３５；２００８０１３１３９８に開示される。カスタノスペルミンおよびその誘導体が有効でありうる疾患および状態には、ＨＩＶ感染を含むレトロウイルス感染；脳性マラリア；Ｂ型肝炎感染およびＣ型肝炎感染を含む肝炎感染；糖尿病ならびにリソソーム蓄積障害が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９３】
ある態様では、アルファ−グルコシダーゼ阻害剤はアカルボース（Ｏ−４，６−ジデオキシ−４−［［（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４，５，６−トリヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−２−シクロヘキセン−１−イル］アミノ］−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｏ−→−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコース）、またはプレコース（Ｐｒｅｃｏｓｅ）（登録商標）でありうる。アカルボースは米国特許第４，９０４，７６９号に開示される。ある態様では、アルファグルコシダーゼ阻害剤はアカルボースの高度に精製された形状（米国特許第４，９０４，７６９号を参照されたい）でありうる。
【００９４】
ある態様では、リポソーム内側に被包された薬剤はイオンチャンネル阻害剤でありうる。ある態様では、イオンチャンネル阻害剤はＨＣＶｐ７蛋白質の活性を阻止する薬剤でありうる。イオンチャンネル阻害剤およびそれらを同定する方法は米国特許公開第２００４／０１１０７９５号に詳述される。適切なイオンチャンネル阻害剤には、Ｎ−（７−オキサ−ノニル）−１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−７−オキサ−ノニル６−ＭｅＤＧＪまたはＵＴ２３１Ｂ）およびＮ−１０−オキサウンデクル−６−ＭｅＤＧＪを含む式Ｉの化合物および薬剤的に受容可能なその塩が挙げられる。適切なイオンチャンネル阻害剤にはさらに、Ｎ−ノニルデオキシノジリマイシン、Ｎ−ノニルデオキシガラクトノジリマイシンおよびＮ−オキサノニルデオキシガラクトノジリマイシンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００９５】
ある態様では、リポソーム内に被包された薬剤はイミノ糖でありうる。適切なイミノ糖には、天然に存在するイミノ糖および合成イミノ糖の両方が挙げられる。
【００９６】
ある態様では、イミノ糖はデオキシノジリマイシンまたはＮ−置換デオキシノジリマイシン誘導体でありうる。適切なＮ−置換デオキシノジリマイシン誘導体の例としては、本出願の式ＩＩの化合物、米国特許第６，５４５，０２１号に記載の式Ｉの化合物およびＮ−オキサアルキル化デオキシノジリマイシン、たとえば米国特許第４，６３９，４３６号に記載のＮ−ヒドロキシエチルＤＮＪ（ミグリトールまたはグリセット（登録商標））が挙げられる。
【００９７】
ある態様では、イミノ糖はカスタノスペルミンまたはカスタノスペルミン誘導体でありうる。適切なカスタノスペルミン誘導体には、米国特許出願第２００６／０１９４８３５号に開示された式Ｉの化合物および薬剤的に受容可能なその塩ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ０１０５４６９２号に開示された式ＩＩの化合物および薬剤的に受容可能なその塩が挙げられるが、それらに限定されない。
【００９８】
ある態様では、イミノ糖は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／２４４０１号および第ＷＯ０１／１０４２９号に開示されたもののような、デオキシガラクトノジリマイシンまたはそのＮ−置換誘導体でありうる。適切なＮ−置換デオキシガラクトノジリマイシン誘導体の例としては、Ｎ−アルキル化デオキシガラクトノジリマイシン（Ｎ−アルキル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール）、たとえばＮ−ノニルデオキシガラクトノジリマイシン、およびＮ−オキサ−アルキル化デオキシガラクトノジリマイシン（Ｎ−オキサ−アルキル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール）、たとえばＮ−７−オキサノニルデオキシガラクトノジリマイシンが挙げられるが、それらに限定されない。
【００９９】
ある態様では、イミノ糖は式ＩＩの化合物：
【０１００】
【化２】
2011518124.tif 000003
【０１０１】
（式中、Ｒは置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換シクロアルキル基、置換もしくは非置換ヘテロシクリル基、または置換もしくは非置換オキサアルキル基から選択される）を含むＮ−置換１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−置換ＭｅＤＧＪ）でありうるが、それらに限定されない。ある態様では、置換もしくは非置換アルキル基および／または置換もしくは非置換オキサアルキル基は１から１６個の炭素原子、または４から１２個の炭素原子または８から１０個の炭素原子を含む。ある態様では、置換もしくは非置換アルキル基および／または置換もしくは非置換オキサアルキル基は１から４個の酸素原子、そして他の態様では１から２個の酸素原子を含む。他の態様では、置換もしくは非置換アルキル基および／または置換もしくは非置換オキサアルキル基は１から１６個の炭素原子および１から４個の酸素原子を含む。従って、ある態様では、Ｒは−（ＣＨ２）６ＯＣＨ３、−（ＣＨ２）６ＯＣＨ２ＣＨ３、−（ＣＨ２）６Ｏ（ＣＨ２）２ＣＨ３、−（ＣＨ２）６Ｏ（ＣＨ２）３ＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）５ＣＨ３、−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）６ＣＨ３、および−（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択されるが、それらに限定されない。Ｎ−置換ＭｅＤＧＪは、たとえばＰＣＴ公開第ＷＯ０１／１０４２９号に開示される。
【０１０２】
ある態様では、リポソーム内側に被包された薬剤は式ＩＩＩを有する窒素含有化合物：
【０１０３】
【化３】
2011518124.tif 000004
【０１０４】
または薬剤的に受容可能なその塩を挙げることができ、式中、Ｒ１２はＣ１〜Ｃ２０、またはＣ１〜Ｃ６またはＣ７〜Ｃ１２またはＣ８〜Ｃ１６のようなアルキルであり、さらに１から５または１から３または１から２個の酸素を含むことができ、Ｒ１２はオキサ−置換アルキル誘導体でありうる。オキサ−置換アルキル誘導体の例としては３−オキサノニル、３−オキサデシル、７−オキサノニルおよび７−オキサデシルが挙げられる。
【０１０５】
Ｒ２は水素であり、Ｒ３はカルボキシもしくはＣ１〜Ｃ４アルコキシカルボニルであるか、またはＲ２とＲ３は一緒に：
【０１０６】
【化４】
2011518124.tif 000005
【０１０７】
であり、式中、ｎは３または４であり、それぞれのＸは独立して水素、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アシルオキシ、またはアロイルオキシであり、そしてそれぞれのＹは独立して水素、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜Ｃ６アシルオキシ、アロイルオキシであるか、または除去され（すなわち、存在しない）；
Ｒ４は水素であるか、または除去され（すなわち、存在しない）；そして
Ｒ５は水素、ヒドロキシ、アミノ、置換されたアミノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキル、アリール、アラルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アシルオキシ、もしくはアロイルオキシであるか、またはＲ３とＲ５は一緒にフェニルを形成し、そしてＲ４は除去される（すなわち、存在しない）。
【０１０８】
ある態様では、窒素含有化合物は式：
【０１０９】
【化５】
2011518124.tif 000006
【０１１０】
を有し、式中Ｒ６〜Ｒ１０のそれぞれは独立して、水素、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキルカルボキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜Ｃ４アシルオキシ、およびアロイルオキシからなる群から選択され；そしてＲ１１は水素またはＣ１〜Ｃ６アルキルである。
【０１１１】
窒素含有化合物はＮ−アルキル化ピペリジン、Ｎ−オキサ−アルキル化ピペリジン、Ｎ−アルキル化ピロリジン、Ｎ−オキサ−アルキル化ピロリジン、Ｎ−アルキル化フェニルアミン、Ｎ−オキサ−アルキル化フェニルアミン、Ｎ−アルキル化ピリジン、Ｎ−オキサ−アルキル化ピリジン、Ｎ−アルキル化ピロール、Ｎ−オキサ−アルキル化ピロール、Ｎ−アルキル化アミノ酸、またはＮ−オキサ−アルキル化アミノ酸でありうる。ある態様では、Ｎ−アルキル化ピペリジン、Ｎ−オキサ−アルキル化ピペリジン、Ｎ−アルキル化ピロリジン、またはＮ−オキサ−アルキル化ピロリジン化合物はイミノ糖でありうる。たとえば、ある態様では、窒素含有化合物は式：
【０１１２】
【化６】
2011518124.tif 000007
【０１１３】
を有する、Ｎ−アルキル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−アルキル−ＤＧＪ）もしくはＮ−オキサ−アルキル−１，５−ジデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−オキサ−アルキル−ＤＧＪ）、または式：
【０１１４】
【化７】
2011518124.tif 000008
【０１１５】
を有するＮ−アルキル−１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−アルキル−ＭｅＤＧＪ）もしくはＮ−オキサ−アルキル−１，５，６−トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｄ−ガラクチトール（Ｎ−オキサ−アルキル−ＭｅＤＧＪ）でありうる。
【０１１６】
本明細書で使用する基は、炭素原子の数が別に特定されない限り、以下の特徴を有する。アルキル基は１から２０個の炭素原子を有し、線状であるか、または分枝し、置換されるか、または置換されない。アルコキシ基は１から１６個の炭素原子を有し、線状であるか、または分枝し、置換されるか、または置換されない。アルコキシカルボニル基は２から１６個の炭素原子を有するエステル基である。アルケニルオキシ基は２から１６個の炭素原子、１から６個の二重結合を有し、線状であるか、または分枝し、置換されるか、または置換されない。アルキニルオキシ基は２から１６個の炭素原子、１から３個の三重結合を有し、線状であるか、または分枝し、置換されるか、または置換されない。アリール基は６から１４個の炭素原子（たとえば、フェニル基）を有し、そして置換されるか、または置換されない。アラルキルオキシ（たとえば、ベンジルオキシ）およびアロイルオキシ（たとえば、ベンゾイルオキシ）基は、７から１５個の炭素原子を有し、そして置換されるか、または置換されない。アミノ基は、第１、第２、第３、または第４アミノ基（すなわち、置換されたアミノ基）でありうる。アミノカルボニル基は、１から３２個の炭素原子を有するアミド基（たとえば、置換されたアミド基）である。置換された基は、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ１−１０アシル、またはＣ１−１０アルコキシからなる群から選択される置換基を含むことができる。
【０１１７】
Ｎ−アルキル化アミノ酸は、Ｎ−アルキル化ａ−アミノ酸のような、Ｎ−アルキル化された天然に存在するアミノ酸でありうる。天然に存在するアミノ酸は、２０個の一般的α−アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｃｙｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、およびＰｒｏ）、ならびに天然の産物、たとえばノルロイシン、エチルグリシン、オルニチン、メチルブテニル−メチルトレオニンおよびフェニルグリシンであるその他のアミノ酸の中の１種である。アミノ酸側鎖（たとえばＲ５）の例としては、Ｈ（グリシン）、メチル（アラニン）、−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２（アスパラギン）、−ＣＨ２−ＳＨ（システイン）、および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３（トレオニン）が挙げられる。
【０１１８】
Ｎ−アルキル化化合物はアミノ（またはイミノ）化合物の還元アルキル化によって調製されうる。たとえば、アミノまたはイミノ化合物は、アミンをＮ−アルキル化するために還元剤（たとえば、シアノ水素化ほう素ナトリウム）と一緒にアルデヒドに暴露されうる。同様に、Ｎ−オキサ−アルキル化化合物はアミノ（またはイミノ）化合物の還元アルキル化によって調製されうる。たとえば、アミノまたはイミノ化合物はアミンをＮ−オキサ−アルキル化するために還元剤（たとえば、シアノ水素化ほう素ナトリウム）と一緒にオキサ−アルデヒドに暴露されうる。
【０１１９】
窒素含有化合物は１以上の保護基を含むことができる。種々の保護基が公知である。一般に、保護基が化合物の他の位置でのいずれか次の反応の条件に対して安定であり、分子の残余部分に有害な影響を与えずに適切な時点で除去されうるならば、保護基の種類は重要ではない。その上、保護基は実質的な合成変換が完了した後、別のものに置換されてもよい。明らかに、ある化合物が、本明細書に開示された化合物の１以上の保護基が異なる保護基によって置換されているという点においてだけ開示された化合物と異なる場合、その化合物は本発明の範囲内にある。別の例および条件はＧｒｅｅｎｅ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（１版，１９８１，Ｇｒｅｅｎｅ  ＆  Ｗｕｔｓ、２版，１９９１）に見出される。
【０１２０】
窒素含有化合物は、たとえば結晶化またはクロマトグラフィー法によって精製することができる。該化合物は出発物質として立体特異的アミノまたはイミノ化合物を使用することにより立体特異的に調製することができる。
【０１２１】
長鎖Ｎ−アルキル化化合物の調製において出発物質として使用されるアミノおよびイミノ化合物は市販のもの（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ；Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を入手するか、または公知の合成法によって調製することができる。。たとえば、該化合物はＮ−アルキル化イミノ糖化合物またはそのオキサ−置換誘導体でありうる。イミノ糖は、たとえばデオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）、１−メチル−デオキシガラクトノジリマイシン（ＭｅＤＧＪ）、デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、アルトロスタチン、２Ｒ，５Ｒ−ジヒドロキシメチル−３Ｒ，４Ｒ−ジヒドロキシピロリジン（ＤＭＤＰ）、またはその誘導体、エナンチオマー、もしくは立体異性体でありうる。
【０１２２】
ある態様では、脂質粒子内側に被包された薬剤は式ＩＶまたはＶの化合物：
【０１２３】
【化８】
2011518124.tif 000009
【０１２４】
（式中、Ｒは：
【０１２５】
【化９】
2011518124.tif 000010
【０１２６】
であり、Ｒ′は：
【０１２７】
【化１０】
2011518124.tif 000011
【０１２８】
であり、Ｒ１は置換もしくは非置換アルキル基であり；Ｒ２は置換もしくは非置換アルキル基であり；Ｗ１〜４は水素、置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ハロアルキル基、置換もしくは非置換アルカノイル基、置換もしくは非置換アロイル基、または置換もしくは非置換ハロアルカノイル基から独立して選択され；Ｘ１〜５はＨ、ＮＯ２、Ｎ３、またはＮＨ２から独立して選択され；Ｙは存在しないか、またはカルボニル以外の置換もしくは非置換Ｃ１−アルキル基であり；ＺはボンドまたはＮＨから選択され；Ｚがボンドである場合、Ｙは存在せず、そしてＺがＮＨである場合、Ｙはカルボニル以外の置換または非置換Ｃ１−アルキル基であり；そしてＺ’はボンドまたはＮＨである。式ＩＶおよびＶの化合物ならびにそれらの合成方法は、たとえば、米国公開公報第ＵＳ２００７／０２７５９９８号に開示される。式ＩＶおよびＶの化合物の限定的でない例としては、Ｎ−（Ｎ′−｛４′アジド−２′−ニトロフェニル）−６−アミノヘキシル）−デオキシノジリマイシン（ＮＡＰ−ＤＮＪ）およびＮ−（Ｎ′−｛２，４−ジニトロフェニル）−６−アミノヘキシル）−デオキシノジリマイシン（ＮＤＰ−ＤＮＪ）が挙げられる。
【０１２９】
多様なイミノ糖化合物の合成は記載されている。たとえば、米国特許第５，６２２，９７２号、第５，４０１，６４５号、第５，２００，５２３号、第５，０４３，２７３号、第４，９９４，５７２号、第４，２４６，３４５号、第４，２６６，０２５号、第４，４０５，７１４号、および第４，８０６，６５０号が挙げられる。他のイミノ糖誘導体を合成する方法は公知であり、たとえば米国特許第４，８６１，８９２号、第４，８９４，３８８号、第４，９１０，３１０号、第４，９９６，３２９号、第５，０１１，９２９号、第５，０１３，８４２号、第５，０１７，７０４号、第５，５８０，８８４号、第５，２８６，８７７号、および第５，１００，７９７号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ  ０１／１０４２９号に記載される。２Ｒ，５Ｒ−ジヒドロキシメチル−３Ｒ，４Ｒ−ジヒドロキシピロリジン（ＤＭＤＰ）のエナンチオ特異的合成はＦｌｅｅｔ  ＆  Ｓｍｉｔｈ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２６：１４６９−１４７２，１９８５）によって記載される。
【０１３０】
イメージング剤は、タグ付きもしくは蛍光水性物質、たとえばカルセイン、または蛍光標識分子、たとえばｓｉＲＮＡ、抗体、または他の低分子阻害剤でありうる。また、タグ付き脂溶性物質、たとえば細胞においてリポソームを可視化するために使用されるｒｈ−ＰＥ脂質、および可視化または精製のためにタグを付けた他の類似の脂質は、細胞の膜への組み込みのために脂質粒子に組み込まれうる。また、これには可視化または精製のための蛍光部分または他のタグを付けたタグ付き脂溶性蛋白質または薬物を挙げることができる。
【０１３１】
ターゲッティング部分
ある態様では、脂質粒子を含む組成物は、脂質粒子とコンジュゲートするか、または粒子の脂質単層もしくは脂質二重層に挿入されうる、少なくとも１つのターゲッティング部分を含んでいてもよい。ある態様では、ターゲッティング部分はウイルスのエンベロップ蛋白質のリガンドであってもよいリガンド、またはウイルスのエンベロップ蛋白質に対する抗体であってもよい抗体であってもよい。そのような部分はウイルスに感染した細胞を粒子の目標にするために使用されてもよい。そのようなターゲッティング部分はまた、ウイルスに関連するか、またはウイルスによって引き起こされるウイルス感染に対する排除（ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ）免疫を獲得するために使用されてもよい。
【０１３２】
ある態様では、ターゲッティング部分はｇｐ１２０／ｇｐ４１ターゲッティング部分を含んでいてもよい。そのような場合、脂質粒子を含む組成物がＨＩＶ−１感染を治療する、および／または予防するために好ましくてもよい。ｇｐ１２０／ｇｐ４１ターゲッティング部分は、ｓＣＤ４分子またはモノクローナル抗体、たとえばＩｇＧ２Ｆ５もしくはＩｇＧｂ１２抗体を含むことができる。
【０１３３】
ある態様では、ターゲッティング部分はＥ１またはＥ２ターゲッティング部分、たとえばＨＣＶに由来するＥ１またはＥ２蛋白質を含むことができる。そのような場合、脂質粒子を含む組成物がＨＣＶ感染を治療する、および／または予防するために好ましくてもよい。ある場合には、ターゲッティング部分はＥ１および／またはＥ２蛋白質を目標にすることができる分子、たとえばこれらの蛋白質に対する特定の抗体、および細胞受容体の可溶性部分、たとえば可溶性ＣＤ８１またはＳＲ−Ｂ１分子であってもよい。
【０１３４】
挿入部分
ある態様では、脂質粒子はその脂質単層、または二重層に挿入された１以上の部分を含んでいてもよい。挿入部分の例としては、膜貫通蛋白質、蛋白質脂質コンジュゲート、標識脂質、脂溶性化合物またはいずれかその組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３５】
ある態様では、挿入部分は脂質−ＰＥＧコンジュゲートを含んでいてもよい。そのようなコンジュゲートは脂質粒子のｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増してもよく、および／またはその循環時間を増してもよい。
【０１３６】
ある態様では、挿入部分は長いアルキル鎖イミノ糖、たとえばＣ７〜Ｃ１６アルキルもしくはオキサアルキル置換Ｎ−デオキシノジリマイシン（ＤＮＪ）、またはＣ７〜Ｃ１６アルキルもしくはオキサアルキル置換Ｎ−デオキシガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）を含んでいてもよい。長いアルキル鎖イミノ糖の限定的でない例としては、Ｎ−ノニルＤＮＪおよびＮ−ノニルＤＧＪが挙げられる。
【０１３７】
ある態様では、挿入部分はフルオロフォア−脂質コンジュゲートを含んでいてもよく、そしてそれは脂質二重層粒子と接触する細胞のＥＲ膜を標識するために使用されてもよい。そのような標識は真核細胞におけるライブおよび／または固定−細胞イメージングに有用であってもよい。
【０１３８】
ＰＩおよび／またはＰＳ脂質を含む脂質粒子の使用が細胞のＥＲ膜への挿入部分の送達に帰着してもよい。
【０１３９】
多価不飽和脂質粒子
本発明者らはまた、少なくとも１種の多価不飽和脂質を含む脂質粒子、たとえばリポソームが、対象、たとえばヒトにおける、感染、たとえばウイルス感染を治療するおよび／または予防することにおいて有効であってもよいと考えている。
【０１４０】
ある態様では、多価不飽和脂質は、脂質粒子中の総脂質のモルで少なくとも５％、モルで少なくとも１０％、モルで少なくとも１５％、モルで少なくとも２０％、モルで少なくとも２５％、モルで少なくとも３０％、モルで少なくとも３５％、モルで少なくとも４０％、モルで少なくとも４５％、モルで少なくとも５０％、モルで少なくとも５５％、モルで少なくとも６０％、モルで少なくとも６５％、モルで少なくとも７０％、モルで少なくとも７５％、モルで少なくとも８０％、モルで少なくとも８５％、モルで少なくとも９０％、またはモルで少なくとも９５％を構成してもよい。
【０１４１】
本明細書で使用する“多価不飽和脂質”という用語は、その疎水性尾部に、１より多い不飽和化学結合、たとえば二重結合または三重結合を含む脂質を表す。
【０１４２】
ある態様では、多価不飽和脂質はその疎水性尾部に、２から８個、または３から７個または４から６個の二重結合を有することができる。
【０１４３】
本明細書で使用する“多価不飽和脂質粒子”という用語は、少なくとも１種の多価不飽和脂質を含む脂質粒子を表す。
【０１４４】
ある態様では、脂質粒子は１種以上の多価不飽和脂質を含んでいてもよい。
【０１４５】
好ましくは、多価不飽和脂質粒子は多価不飽和ＰＥまたは多価不飽和ＰＣ脂質の中の少なくとも１種を含む。図２２Ａ〜Ｄは代表的な多価不飽和ＰＥおよびＰＣ脂質の化学構造を提供する。
【０１４６】
脂質粒子は、１種以上の付加的な脂質、たとえばＰＩ、ＰＳ、またはＣＨＥＭＳをさらに含んでいてもよい。
【０１４７】
多価不飽和ＰＥまたは多価不飽和ＰＣ脂質の中の少なくとも１種を含む多価不飽和脂質は、先に開示した疾患または状態のような、ウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスに関連した疾患または状態を治療する、予防する、モニターするために使用されてもよい。多くの態様では、そのような疾患および状態はウイルス感染でありうる。ある態様では、そのような感染は肝炎感染、たとえばＨＣＶ感染またはＨＢＶ感染であってもよい。さらにある態様では、そのような感染はレトロウイルス感染、たとえばＨＩＶであってもよい。さらにある態様では、該感染はフラビウイルス感染、たとえばＨＣＶ感染であってもよい。
【０１４８】
ある態様では、多価不飽和脂質粒子は、少なくとも１種の活性薬、たとえば先に開示した薬剤を被包していてもよい。
【０１４９】
ある態様では、多価不飽和脂質粒子は粒子の脂質単層または二重層に挿入される少なくとも１種の部分を含んでいてもよく、該部分は先に開示した挿入部分のいずれであってもよい。
【０１５０】
ある態様では、脂質粒子を含む組成物は粒子に結合したターゲッティング部分を含んでいてもよく、しかも該部分は先に開示したターゲッティング部分のいずれであってもよい。
【０１５１】
ある態様では、ＰＥ、ＰＣ、ＰＩおよびＰＳ脂質を含み、それらの中の少なくとも１種は不飽和である多価不飽和脂質粒子が、ＨＣＶ感染の治療または予防に好ましくてもよい。本発明はそれらの操作理論に限定されないが、発明者らはＰＥ、ＰＣ、ＰＩおよびＰＳ脂質を含む多価不飽和脂質粒子はＨＣＶ−感染細胞からのＨＣＶビリオンの分泌を顕著に減少させうると考えている。なぜなら、ＥＲ膜であるＨＣＶ複製部位への多価不飽和脂質の送達はＨＣＶ  ＲＮＡ複製、その後のＨＣＶ分泌を低減しうるからである。
【０１５２】
投与
ある態様では、脂質粒子を含む組成物は細胞に投与されうる。細胞はウイルスに感染した細胞でありうる。多くの場合、接触した細胞は哺乳動物または鳥のような温血動物に由来する細胞でありうる。ある態様では、接触した細胞はヒトに由来する細胞でありうる。
【０１５３】
ある態様では、脂質粒子を含む組成物は個体に投与されうる。対象は哺乳動物または鳥のような温血動物でありうる。多くの場合、対象はヒトでありうる。ある態様では、脂質粒子を含む組成物は静脈内注射によって投与されうる。さらにある態様では、脂質粒子を含む組成物は静脈内注射以外の非経口経路、たとえば腹腔内、皮下、皮内、上皮内、筋肉内または経皮経路を介して投与されうる。さらにある態様では、脂質粒子を含む組成物は粘膜表面、たとえば眼球、鼻腔内、肺、腸、直腸、および尿路表面を介して投与されうる。
【０１５４】
脂質含有組成物、たとえばリポソーム組成物の投与経路は、たとえばＡ．Ｓ．Ｕｌｒｉｃｈ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ａｓ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅｓ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２２巻，２号，Ａｐｒ  ２００２，１２９-１５０に開示される。
【０１５５】
脂質粒子を介した治療薬、たとえばＮＢ−ＤＮＪのＥＲ内腔への送達は、非リポソーム法に比較してＥＲ−グルコシダーゼの阻害に必要な治療薬の有効量を減らすことができる。たとえば、ＮＢ−ＤＮＪの場合、ＩＣ９０は少なくとも１００、または少なくとも５００、または少なくとも１０００、または少なくとも５０００、または少なくとも１００００、または少なくとも５００００、または少なくとも１０００００低減されうる。そのようなＮＢ−ＤＮＪの有効な抗ウイルス量の低減によって、投与されるＮＢ−ＤＮＪの最終濃度は哺乳動物、とりわけヒトにおける毒性レベルより１桁以上低い濃度に帰着しうる。
【０１５６】
ある態様では、治療薬、たとえばＮＢ−ＤＮＪを含む脂質粒子を含む組成物は１以上の付加的な治療薬、たとえば抗ウイルス薬と組み合わせて感染した細胞と接触することができる。ある場合には、そのような付加的な治療薬はＮＢ−ＤＮＪと一緒に脂質粒子の中に共に被包されうる。さらにある場合には、感染した細胞をそのような付加的な治療薬と接触させることは、細胞を含む対象への付加的な治療薬の投与の結果でありうる。付加的な治療薬の投与は、組成物に治療薬を添加することによって実行することができる。さらにある場合には、付加的な治療薬の投与はＮＢ−ＤＮＪを含む脂質粒子を含む組成物を投与することとは別個に行うことができる。そのような別個の投与は、脂質粒子を含む組成物に使用される投与経路と同じでありうるか、または異なりうる投与経路を介して行うことができる。
【０１５７】
組み合わせ療法は、抗ウイルス活性に必要な薬剤の有効投薬量を低減し、それによってその毒性を低減するだけでなく、複数の機序を通してウイルスを攻撃する結果として純粋な抗ウイルス効果を改善してもよい。
【０１５８】
その上、組み合わせ療法はウイルス耐性の発生のチャンスを妨げるか、または減少させるための手段を提供することができる。
【０１５９】
ＮＢ−ＤＮＪを含むリポソームと組み合わせて使用することができる特有の付加的な治療薬は、処置されることになる疾患または状態に依存しうる。たとえば、ＨＢＶ、ＨＣＶまたはＢＶＤＶ感染のような肝炎感染の場合、そのような治療薬はヌクレオシドまたはヌクレオチド抗ウイルス薬および／または免疫賦活／免疫修飾薬でありうる。肝炎処置のためにＮＢ−ＤＮＪと組み合わせて使用することができる種々のヌクレオシド薬、ヌクレオチド薬および免疫賦活／免疫修飾薬は、２００４年２月１０日に発行されたＪａｃｏｂらの米国特許第６，６８９，７５９号に例示される。たとえば、Ｃ型肝炎処置の場合、ＮＢ−ＤＮＪはヌクレオシド薬としての１−ｂ−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド（リバビリン）、および免疫賦活／免疫修飾薬としてのインターフェロン、たとえばインターフェロンアルファと組み合わせてリポソーム中に被包されうる。リバビリンおよび／またはインターフェロンによる肝炎感染の処置は、たとえば米国特許第６，１７２，０４６号；第６，１７７，０７４号；第６，２９９，８７２号；第６，３８７，３６５号；第６，４７２，３７３号；第６，５２４，５７０号および第６，８２４，７６８号で論じられる。
【０１６０】
ＨＩＶ感染を治療する場合、ＮＢ−ＤＮＪを含むリポソームと組み合わせて使用することができる治療薬は抗−ＨＩＶ薬であってよく、それらはたとえば、ヌクレオシド逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤、たとえば（−）−２′−デオキシ−３′−チオシチジン−５′−トリフォスフェート（３ＴＣ）；（−）−ｃｉｓ−５−フルオロ−１−［２−（ヒドロキシ−メチル）−［１，３−オキサチオラン−５−イル］シトシン（ＦＴＣ）；３′−アジド−３′−デオキシチミジン（ＡＺＴ）およびジデオキシ−イノシン（ｄｄＩ）；非ヌクレオシドＲＴ阻害剤、たとえばＮ１１−シクロプロピル−４−メチル−５，１１−ジヒドロ−６Ｈ−ジピリド［３，２−ｂ：２′３′−ｅ］−［１，４］ジアゼピン−６−オン（ネビパリン（Ｎｅｖｉｐａｒｉｎｅ））、プロテアーゼ阻害剤またはその組み合わせでありうる。抗ＨＩＶ治療薬は、ＡＺＴ、ＤＤＩ、およびネビラピン組み合わせのように、二重または三重の組み合わせで使用することができる。
【０１６１】
ある態様では、脂質粒子内側に被包される薬剤は、たとえば米国特許出願第１１／８３２，８９１号の１４〜２０ページに開示された薬剤であってもよく、該開示はそのまま参照として本明細書に援用される。脂質粒子はＥＲ膜と脂質粒子の中の脂質との融合時にＥＲの内腔に被包された薬剤を送達してもよい。
【０１６２】
標識脂質
ある態様では、脂質粒子は放射性ラベル、フルオロフォアラベルまたはビオチンラベルのような少なくとも１種のラベルにより標識される少なくとも１種の標識脂質を含み、それゆえ粒子自体を標識してもよい。
【０１６３】
標識脂質粒子は、後に画像処理されうる細胞のＥＲ膜の特定の標識のために使用されてもよい。この技術によって画像処理することができる細胞の型は特に限定されない。イメージングは、たとえばライブ（ｌｉｖｅ）または固定（ｆｉｘｅｄ）イメージングによって行われてもよい。固定イメージングは、パラホルムアルデヒドのような固定液で固定されていてもよい死細胞のイメージングを表すことができる。細胞は、マウンティングおよびイメージングの前に、特定の蛋白質またはラベルを検出するために透過化され、抗体で探査されうる。ライブセル顕微鏡検査の場合、イメージングが行われている間、細胞は培地中で依然として生きた状態のままでありうる。
【０１６４】
標識粒子はウイルスを標識するために使用されてもよい。そのような研究方法を使用して標識されてもよいウイルスの例としては、ＥＲ−出芽ウイルス、たとえばＢＶＤＶおよびＨＣＶが挙げられる。ラベルがフルオロフォアラベルの場合、標識された脂質二重層粒子は標識されたウイルスのイメージングのために使用されてもよく、そして該イメージングはライブおよび／または固定イメージングでありうる。
【０１６５】
ラベルがビオチンラベルである場合、標識された脂質粒子は標識されたウイルス粒子の精製のために使用されてもよい。ある場合には、そのような精製はストレプトアビジンを使用して行うことができる。ストレプトアビジンはビオチン−標識物質のバッチ精製のためのセファロースビーズに連結することができる。
【０１６６】
本発明はさらに以下の実施例によって説明されるが、決してそれらに限定されない。
【実施例】
【０１６７】
１．リポソーム調製
リポソームは記載されたすべてのアッセイに対して新たに調製された。脂質のクロロホルム溶液はガラス試験管に入れられ、溶媒は窒素ガス流下で留去された。特記しない限り、脂質フィルムは１ｘＰＢＳバッファー中ボルテックスで攪拌することにより、最終脂質濃度５ｍＭに水和された。生じたマルチラメラ小胞はＭｉｎｉ−Ｅｘｔｒｕｄｅｒ装置を使用し、ポア直径１００ｎｍのポリカーボネートフィルターを１１回通して押し出された。リポソームは０．２２μｍフィルターユニットを使用して濾過滅菌された。図１（Ａ）〜（Ｅ）はこれらの研究で使用された脂質を提示する：Ａ．ＤＯＰＥ；Ｂ．ＤＯＰＣ；Ｃ．ＣＨＥＭＳ；Ｄ．ＰＩ；Ｅ．ＰＳ。実験で使用されたＰＥＧ−ＰＥはＰＥＧ（ＭＷ−２０００）−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンであった。コレステリルヘミスクシネートを除くすべての脂質は、リポソームの調製のためのすべての物質と同じように、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（ＵＳＡ）から購入した。コレステリルヘミスクシネートはＳｉｇｍａ（ＵＫ）から購入した。
【０１６８】
２．ＰＩおよび／またはＰＳを含むリポソームはＥＲに局在する
この実験の目的は、ＰＩおよび／またはＰＳ脂質と一緒に、またはそれらを含まずにＰＥおよびＰＣまたはＣＨＥＭＳを含むリポソームでＨｕｈ７．５細胞（ヒト肝臓細胞）を処置し、それらのＥＲ膜との共局在を確定することであった。リポソームはすべてのリポソームへのローダミン−タグ付きＰＥ（Ｒｈ−ＰＥ）の組み込みによって標識された。Ｈｕｈ７．５細胞のＥＲ膜は抗−ＥＤＥＭ抗体を使用して標識された。ＥＤＥＭ抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＵＳＡ）から購入した。共局在は共焦点顕微鏡によって確定された。顕著な共局在は、Ｈｕｈ７．５細胞のＥＲ膜と融合するリポソームの証拠として役立ちうる
２．１．リポソーム処置Ｈｕｈ７．５細胞のＥＲ膜とリポソームとの共局在を可視化するための特定の方法論：
脂質組成ＰＥ：ＣＨ、ＰＥ：ＰＣ、ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ、ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ、ＰＥ：ＣＨ：ＰＳ、ＰＥ：ＰＣ：ＰＳ、ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ：ＰＳ、およびＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳを持つリポソームは先に記載のように調製され、可視化のためにＲｈ−ＰＥを１％（総モル）含んだ。Ｈｕｈ７．５細胞は番号１．５のガラスカバースライドに一晩接着させ、その後培地が交換され、最終脂質濃度５０μＭになるまで添加されたリポソームを含む新鮮な培地と取り替えられた。３７℃／５％ＣＯ２で５分間インキュベーション後、リポソームを含む培地は除去され、細胞は１ｘＰＢＳで２回洗浄され、付加的に３０分間新鮮な培地中でインキュベーションされ、１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で希釈された４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定され、１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄された。その後細胞は４μｇ／ｍｌ抗−ＥＤＥＭ抗体を含む１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で１時間インキュベーションされ、１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄され、４μｇ／ｍｌＦＩＴＣ−標識二次抗体を含む１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で１時間インキュベーションされ、さらに２回洗浄された。細胞はＤＡＰＩで染色され、その後顕微鏡スライドにマウントされた。Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ顕微鏡を使用して共焦点画像が撮られ、画像解析はＬＳＭソフトウェアｖ５．１０．を使用して行われた。図１Ｆはこれらのアッセイで使用されたＲｈ−ＰＥ脂質の構造を示す。
【０１６９】
２．２．Ｈｕｈ７．５細胞における異なるリポソームとＥＲマーカーＥＤＥＭとの共局在：
図２（Ａ）〜（Ｆ）は、脂質ＰＩおよび／またはＰＳを含むリポソームがＥＲ−膜蛋白質ＥＤＥＭと共局在したことを実証する。リポソームは５分間Ｈｕｈ７．５細胞と一緒にインキュベーションされ、その後培地は交換され、細胞はリポソームを含まない培地でインキュベーションされた。細胞は固定され、３０分間インキュベーション後、抗−ＥＤＥＭ抗体（緑色、上部右画像）で探査され、リポソームに由来するＲｈ−ＰＥ脂質との共局在（赤色、底部左画像）は共焦点顕微鏡により確定された。ＤＡＰＩ（青色、上部左画像）は核染料として使用される。共局在は統合画像（底部、右）内の黄色の存在によって測定された。実験は３回反復され、代表的な画像が示される。図２Ａ．ＰＥ：ＣＨ（モル比３：２）リポソーム；図２Ｂ．ＰＥ：ＰＣ（３：２）リポソーム；図２Ｃ．ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ（３：１：１）リポソーム；図２Ｄ．ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ（２：２：１）リポソーム；図２Ｅ．ＰＥ：ＣＨ：ＰＳ（３：１：１）リポソーム；図２Ｆ．ＰＥ：ＰＣ：ＰＳ（２：２：１）リポソーム；図２Ｇ．ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ：ＰＳ（３：１：０．５：０．５）リポソーム；図２Ｈ．ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ（１．５：１．５：１：１）リポソーム。
【０１７０】
リポソームとＥＲ膜マーカー（ＥＤＥＭ）との共局在は先に記載のように、得られた画像を使用して定量された。
【０１７１】
２．３．画像共局在の定量のための方法論：
ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（ｖ．７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用してパーセンテージ共局在が測定された。画像はメディアンフィルターセットを使用して３ｘ３ピクセルにフィルター処理され、２つの画像（ｒｈ−ＰＥ／赤色画像およびＥＤＥＭ／緑色画像）間の統合した共局在を確定するために使用される閾値は、それぞれに対して平均濃度プラス１標準偏差（ＳＤ）に設定された。報告された値は３０細胞の平均値±ＳＤを表す。
２．４．リポソームとＥＲマーカー（ＥＤＥＭ）のパーセント共局在解析の結果：
画像共局在の定量の結果は、ＤＯＰＥ：ＣＨまたはＤＯＰＥ：ＤＯＰＣリポソームへの２０％ＰＩまたは２０％ＰＳの組み込みがＥＲ膜との共局在を著しく増すことを示唆しうる。ＤＯＰＥ：ＣＨ：ＰＩおよびＤＯＰＥ：ＣＨ：ＰＳからなるリポソームは、ＤＯＰＥ：ＣＨだけの場合の１３％（ＳＤ＝６．６％）と比較して、それぞれ５２％（ＳＤ＝８．０％）および４６％（ＳＤ＝８．１％）の共局在を実証した。同様に、ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩとＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＳの組成物は、ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣリポソームの場合の１２％（ＳＤ＝４．７％）と比較して、それぞれ６４％（ＳＤ＝８．１％）および４８％（ＳＤ＝７．６％）の共局在を実証した。ＤＯＰＥ：ＣＨおよびＤＯＰＥ：ＤＯＰＣリポソーム内の２０％ＰＩと２０％ＰＳの組み合わせはさらにＥＲ膜への共局在を増し、その結果ＤＯＰＥ：ＣＨ：ＰＩ：ＰＳリポソームは７６％（ＳＤ＝８．７％）のＥＲ膜共局在を実証し、８８％（ＳＤ＝３．５％）共局在がＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームにより観察された。
【０１７２】
図３は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを使用して、リポソーム調製物毎に３０の別個の細胞を分析することにより、リポソーム−送達ｒｈ−ＤＯＰＥとＥＤＥＭ抗体の計算された共局在が確定されたことを示し、ここでは％共局在を確定するために使用される閾値は、それぞれの画像に対して平均濃度プラス１ＳＤに設定された。示された結果は３０細胞の平均共局在とＳＤを表す。
【０１７３】
これらの結果は、Ｈｕｈ７．５細胞において、ＰＥと組み合わせて脂質ＰＩおよび／またはＰＳを含むリポソームだけが、リポソームによる５分間パルス（ｐｕｌｓｅ）および３０分間追跡（ｃｈａｓｅ）後のＥＲマーカーとの増加した共局在を示すことを実証することができる。ＥＲリポソーム、すなわちＰＩおよび／またはＰＳ脂質を含むリポソームはＥＲマーカーとの顕著な共局在を実証するため、蛍光−標識ＥＲリポソームが真核細胞のＥＲ膜を標識するための迅速で安価な技術として使用されてもよい。
【０１７４】
３．ＥＲリポソームを介して送達される脂質は、アセンブルし、ＥＲ膜から出芽することが公知のウイルスのエンベロップに組み込まれる
以下の実験の目的は、共焦点顕微鏡によって、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）に感染したＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞およびＨＣＶ細胞培養物（ＨＣＶｃｃ）−感染Ｈｕｈ７．５細胞を、ＥＲ膜と共局在することが示されたリポソームにより処置し、そして分泌されたウイルス粒子内へのタグ付きリポソーム脂質の組み込みを調べることであった。ＢＶＤＶおよびＨＣＶは両方ともアセンブルし、ＥＲ膜から出芽するウイルスであり；従って分泌されたウイルス粒子へのリポソームを介して送達されるタグ付き脂質の組み込みは、これらの細胞のＥＲ膜とリポソームの融合を示唆する。ＨＩＶ−１感染末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、細胞膜から出芽するウイルスへの脂質の組み込みを検出するための対照として使用される。
【０１７５】
３．１．ビオチン化ＰＥ脂質を使用して分泌されたウイルス粒子へのリポソーム脂質の組み込みをモニターするための特定の方法論：
ＢＶＤＶ細胞培養物：Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞は完全ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中、６ウェルプレートのウェル毎に３ｘ１０５細胞で播種され、０．１の感染多重度（ＭＯＩ）でｎｃｐＢＶＤＶ株Ｐｅ５１５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に感染し、３日毎に１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清を含む新鮮なＲＰＭＩ１６４０培地２ｍｌに１：８希釈で継代された。分泌されたＢＶＤＶ粒子を定量するためのＲＴ−ＰＣＲによって確定される安定な感染が達成された後、リポソーム処置が開始された。定量ＰＣＲは取り扱い説明書に従って、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡ精製キット（ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して上清５００μｌに対して行われた。リアルタイムＰＣＲは、ＳｙＢｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ）およびｎｃｐＢＶＤＶ  ＲＮＡに対して設計されたプライマー（フォワード：ＴＡＧ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＣＣＡ  ＴＣＴ  ＧＧＡ  ＡＧ、リバースプライマー：ＡＣＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＣＡ）を使用して行われた。
【０１７６】
ＪＣ−１  ＨＣＶ細胞培養物（ＨＣＶｃｃ）：Ｈｕｈ７．５細胞（Ａｐａｔｈ，ＬＬＣ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む完全ＤＭＥＭ（１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１ｘＭＥＭ）中で培養された。すべてのインキュベーションは３７℃／５％ＣＯ２で行われた。細胞はＭＯＩ＝０．５で１時間感染し、ＨＣＶコア蛋白質免疫蛍光による確定の結果、５０％を超える細胞がＨＣＶｃｃ感染に陽性と評価された場合、リポソーム処置が開始された。上清に由来するウイルスＲＮＡの定量、ならびに分泌された粒子の感染力は、それぞれ定量ＰＣＲおよびコア蛋白質免疫蛍光によって確定された。
【０１７７】
ＨＩＶ細胞培養物：４人の非感染ドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度勾配遠心法（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）を使用して分離され、プールされ、完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩプラス１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミン）中で、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、５μｇ／ｍｌ）により４８時間、その後インターロイキン−２（ＩＬ２、４０Ｕ／ｍｌ）により７２時間刺激された後、実験が開始された。特記しない限り、すべてのインキュベーションは３７℃／５％ＣＯ２で行われた。細胞を感染させるために、４ｘ１０６ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣおよび初代分離株ストックの１００ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）は、６−ウェルプレートのウェル毎に、２ｍｌ完全ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ中で一緒にインキュベーションされた。細胞は１６時間感染し、完全ＲＰＭＩ培地で３回洗浄され、その後リポソームとのインキュベーションが開始された。
【０１７８】
分泌されたビオチン−標識粒子の精製：ウイルス感染細胞は７５ｃｍ２フラスコで培養され、培地は５０μＭ  ｂ−ＰＥ−標識２２：６ＥＲリポソームを含む培地と取り替えられ、そのまま４８時間インキュベーションされた。その後細胞はＰＢＳで２回洗浄され、リポソームを含まない新鮮な培地中でさらに２４時間インキュベーションされた。
【０１７９】
分泌された粒子を含む上清は採取され、細胞はトリパンブルー染色を使用して計数され、そして上清はＰＢＳを使用して試料細胞数に標準化された。分泌されたＨＣＶｃｃおよびＢＶＤＶは定量ＰＣＲにより力価を測定され、分泌されたビリオンの感染力が確定された。ＨＩＶ−１はｐ２４捕獲ＥＬＩＳＡ（ｃａｐｔｕｒｅ  ＥＬＩＳＡ）により定量された。ビオチン化粒子捕獲のために高性能ストレプトアビジンセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が使用された。セファロースビーズはＰＢＳで１：５０（ｖｏｌ：ｖｏｌ）に希釈することにより２回洗浄され、室温で５分間穏やかに混合され、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離することによりペレット化された。セファロースは再懸濁されて５０％スラリーを形成し、培養上清（培養上清１０ｍｌ毎に５０％スラリー２００μｌ）に添加された。セファロースおよび上清はそのまま穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベーションされ、その後セファロースビーズは先に記載のようにＰＢＳで５回洗浄された。ｂ−ＰＥ−標識ビリオンの量を定量するために１ｍｌの培養上清は取りおかれ、その中の５００μｌが総ウイルス定量のために使用され、そして５００μｌがストレプトアビジンセファロース上に捕獲され、ＰＢＳで５回洗浄され、そしてＨＣＶｃｃおよびＢＶＤＶ  ＲＴ−ＰＣＲ解析用にウイルスＲＮＡ溶解バッファー（ＱＩＡＧＥＮ）と一緒にビーズをインキュベーションすることにより、またはｐ２４  ＨＩＶ  ＥＬＩＳＡアッセイ用に１％エンピゲン（ｅｍｐｉｇｅｎ）中でインキュベーションすることにより、ＲＮＡ定量に直接使用された。
【０１８０】
３．２．分泌されたウイルス粒子へのｂ−ＰＥ脂質の組み込み：
図１Ｇは使用されるビオチン化ＰＥ脂質（ｂ−ＰＥ）の構造を示す。ビオチン−標識ＰＥ（ｂ−ＰＥ）は、ＥＲリポソーム、すなわちＰＩおよび／またはＰＳ脂質を含むリポソームに０．１、０．５、１、５、または１０モル％で組み込まれ、分泌されたＨＣＶおよびＢＶＤＶ（２種のＥＲ−出芽ウイルス）にタグを付けるための至適濃度は１％であると確定され、該濃度はそれぞれ分泌されたビリオンの総数の９０％（ＳＤ＝３．６％）および９１％（ＳＤ＝１．５％）を捕獲する（図４）。ＨＩＶ−１の初代分離株（ＬＡＩ）に感染したＰＢＭＣは同様にｂ−ＥＲリポソームによって処置され、分泌されたＨＩＶ−１粒子はいずれも検出可能な量のタグ付き脂質を含まなかった（図４）。この結果は、生産的ＨＩＶ−１アセンブリーは細胞膜で発生するため、脂質をＥＲおよびＥＲ−結合膜に送達するためのこのシステムの特異性を強調することができる。
【０１８１】
図４はＪＣ−１−感染Ｈｕｈ７．５細胞、ＢＶＤＶ−感染ＭＤＢＫ、またはＨＩＶ−１−感染ＰＢＭＣと４８時間インキュベーションしたｂ−ＰＥ脂質を含むＥＲリポソーム（最終脂質濃度５０μＭ）に関する実験の結果を示す。感染細胞は洗浄され、リポソームの非存在下でその後の２４時間のインキュベーション期間中に分泌されたｂ−ＰＥ−標識ウイルス粒子はストレプトアビジン−セファロースレジンを使用して捕獲された。結果は、同じ試料内で分泌されたビリオンの総量（１００％）に関するストレプトアビジンによって捕獲された標識ウイルス粒子の百分率として表示される。
【０１８２】
図４の結果は、ＥＲ−局在リポソーム（ＰＩおよび／またはＰＳと組み合わせてＰＥを含むリポソーム）を介してＢＶＤＶ−感染ＭＤＢＫ細胞およびＨＣＶｃｃ−感染Ｈｕｈ７．５細胞に送達される脂質は、リポソーム処置中に分泌されるＢＶＤＶおよびＨＣＶｃｃウイルスエンベロップの大部分に存在するが、ＨＩＶエンベロップには存在しないことを実証する。ＢＶＤＶおよびＨＣＶはアセンブルし、ＥＲ膜から出芽することが公知であるが、ＨＩＶは細胞膜においてアセンブルし、そこから出芽するため、このことは、ＰＩおよび／またはＰＳ脂質を含むリポソームは細胞のＥＲ膜との融合が可能であるというさらなる証拠である。
【０１８３】
ＥＲリポソームによる処置後のＥＲ−出芽ウイルスへのタグ付き脂質の組み込みはビオチン化脂質に限定されず、蛍光顕微鏡観察による可視化のための蛍光脂質を含むビリオンを産生するために、蛍光脂質が同じように使用されてもよい。
【０１８４】
３．３．共焦点顕微鏡を使用してｒｈ−ＰＥリポソーム処置後のｒｈ−ＰＥ−タグ付きＨＣＶｃｃを画像処理するための方法論：
Ｈｕｈ７．５細胞は７５ｃｍ２フラスコ中で十分にコンフルエントになるまで培養され、その後培地は５０μＭのｒｈ−ＰＥ−標識２２：６ＥＲリポソームを含む培地に取り替えられた。細胞はそのまま４８時間インキュベーションされ、ＰＢＳで２回洗浄され、リポソームを含まない新鮮な培地中で２４時間インキュベーションされた。分泌された粒子を含む上清が採取された。分泌されたＨＣＶｃｃは定量ＰＣＲによって力価を測定され、分泌されたビリオンの感染力は先に記載のように確定された。共焦点顕微鏡によるｒｈ−ＨＣＶｃｃの可視化のために、ナイーブＨｕｈ７．５細胞は完全ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中で番号１．５のガラスカバースライドに一晩接着させ、その後、培地はｒｈ−ＨＣＶｃｃウイルスストックと取り替えられ、１時間インキュベーションされた。感染後、細胞はＰＢＳで２回洗浄され、新鮮な培地は種々のインキュベーション期間に対して取り替えられ、１ｘＰＢＳで２回洗浄され、メタノール：アセトン（１：１、ｖｏｌ：ｖｏｌ）で１０分間固定され、そして最後に１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄された。その後細胞は初代抗体を含む１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で１時間インキュベーションされ、１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄され、蛍光−標識二次抗体を含む１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で１時間インキュベーションされ、さらに４回洗浄された。細胞はＤＡＰＩで染色され、顕微鏡スライドにマウントされた。共焦点画像はＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ顕微鏡を使用して撮られ、画像解析はＬＳＭソフトウェアｖ５．１０．を使用して行われた。
【０１８５】
３．４．共焦点顕微鏡によるｒｈ−タグ付きＨＣＶｃｃの可視化：
我々は１％ｒｈ−ＥＲリポソームおよび固定―細胞共焦点顕微鏡観察を使用して、Ｈｕｈ７．５細胞におけるＨＣＶｃｃ感染を可視化している（図５）。Ｒｈ−タグ付きＨＣＶｃｃは１％ｒｈ−ＥＲリポソームの存在下で４８時間インキュベーション後２４時間集められ、ＭＯＩ＝０．１でナイーブ細胞を１時間感染させるために使用された。固定共焦点画像は１時間感染後、ならびに６時間および２４時間感染後ただちに撮られ、透過化された細胞は確かにＨＣＶｃｃ粒子を同定するために、抗−ＨＣＶコア抗体により探査された。これらの画像において、コア−陽性粒子は感染後１時間まで細胞表面上で直径およそ１μｍの単一クラスターとして出現し、その時点でこのクラスターはエンドサイトーシスされるように見え、そしておよそ５μｍのクラスターに広がる。この大きなクラスターは細胞の核に向かって移動し、感染した細胞の核の特徴的なくぼみを形成し（図５）、その時点でクラスターは消失し、ｒｈ−タグ付き脂質はＨＣＶコア蛋白質から分離し始める。増大したコア蛋白質レベルが感染後およそ２４時間目に細胞で観察されて、樹立された感染および新規なコア蛋白質合成を表してもよい。
【０１８６】
図５は、ナイーブＨｕｈ７．５細胞と一緒に１時間インキュベーションされ、その後洗浄され、さらに０、６、または２４時間、新鮮な培地中でインキュベーションされた、Ｒｈ−ＰＥ−タグ付きＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ（赤色、底部−左パネル）に関する実験の結果を示す。それぞれのインキュベーション期間後、細胞は固定され、抗−ＨＣＶコア抗体（緑色、上部−右パネル）およびＤＡＰＩ（青色、上部−左パネル）で染色され、その後顕微鏡スライドへのマウント、共焦点顕微鏡によるイメージングが行われた。統合画像は底部−右パネルに示される。それぞれのインキュベーション期間の代表的な画像が示される。固定された細胞の共焦点顕微鏡観察がこれらの解析において使用されるが、この技術は、ライブ−セル顕微鏡観察により追跡するための多様な脂質−フルオロフォアコンジュゲートによりビリオンを標識するための方法を提案する。他の脂質コンジュゲートまたは膜貫通蛋白質も細胞のＥＲ膜への特定の送達のためにＥＲリポソームへ取り込まれうるため、この型の組み込み技術はビオチンまたは蛍光タグ付き脂質に限定されない。
【０１８７】
４．ＥＲリポソームを介して送達される脂質はｐＨ−感受性リポソームに比較して細胞中でより長い寿命を有する
この実験の目的は、ＭＤＢＫ細胞を蛍光−標識リポソームで処置し、期間全体にわたってそれらの細胞膜への取り込みおよび組み込みをモニターすることであった。ｐＨ−感受性リポソーム、すなわち、ＰＩおよびＰＳ脂質を含まないＤＯＰＥ−ＣＨＥＭＳまたはＤＯＰＥ−ＣＨＥＭＳ−ＰＥＧ−ＰＥリポソームは細胞に入ると考えてよく、そしてエンドソームにおけるリポソーム膜の破壊後、脂質はリソソームへのエンドソーム経路に沿って留まると考えられる。ＰＩおよび／またはＰＳ脂質を含むリポソームが細胞内の他の膜と融合することが可能であるならば、それらはｐＨ−感受性リポソームに比較してより長い寿命を有するべきである。リポソームを介して細胞に送達されたＲｈｏ−ＰＥ脂質は５分間処置後、ＭＤＢＫ細胞と一緒に４８時間にわたり蛍光顕微鏡により可視化された。
【０１８８】
４．１．細胞膜へのリポソーム組み込みをモニターするための特定の方法論：
ＰＥ：ＣＨ、ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ、およびＰＥ：ＣＨ：ＰＳリポソームは先に記載のように調製され、可視化のために１％（総モル）のＲｈ−ＰＥを含んだ。ＭＤＢＫ細胞は５０％のコンフルエンシーで６ウェルプレートに播種され、そのまま一晩接着させた。細胞は１ｘＰＢＳで２回洗浄され，その後、２ｍｌの完全ＲＰＭＩに最終脂質濃度５０μＭになるまで添加されたＲｈ−標識リポソームにより、５分間、３７℃、５％ＣＯ２で処置された。５分間インキュベーション後、細胞は１ｘＰＢＳで２回洗浄され、新鮮な完全ＲＰＭＩ培地２ｍｌがそれぞれのウェルに添加され、そしてプレートはそのまま１、１０、２４、および４８時間インキュベーションされた。それぞれのインキュベーション期間終了時に、細胞は２回洗浄され、１ｘＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で希釈された４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定され、１ｘＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄された。細胞はイメージング前にＤＡＰＩで染色された。蛍光画像はＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ顕微鏡により撮られ、画像解析はＮｉｋｏｎ  ＡＣＴ−１ソフトウェアｖ２．７０を使用して行われた。
【０１８９】
４．２．細胞膜へのリポソームの組み込み：
図６（Ａ）〜（Ｃ）は、脂質ＰＩまたはＰＳと組み合わせたＰＥからなるリポソームの蛍光顕微鏡画像がｐＨ−感受性リポソームに比較して細胞膜への増大した組み込みを実証することを示す。ＭＤＢＫ細胞はＲｈ−ＰＥ標識リポソームにより５分間処置され、その後細胞は洗浄され、そのまま培地中で１、１０、２４、および４８時間だけインキュベーションされた。それぞれのインキュベーション期間後、細胞は固定され、Ｒｈ−ＰＥ脂質（赤色）は蛍光顕微鏡下で可視化される。ＤＡＰＩ（青色）は核染料として使用される。実験は２回反復され、１回の実験に由来する代表的な画像が示される。図Ａ．ＰＥ：ＣＨ（モル比３：２）リポソーム。図６Ｂ．ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ（モル比３：１：１）リポソーム。図６Ｃ．ＰＥ：ＣＨ：ＰＳ（モル比３：１：１）リポソーム。
【０１９０】
図６の結果は、ＰＩまたはＰＳと組み合わせたＰＥからなるリポソームはＭＤＢＫ細胞の膜への組み込みが可能であることを示す。ＰＥ：ＣＨ脂質を介して細胞に送達されたＲｈ−ＰＥ脂質は細胞培地からのリポソーム除去後２４時間でほとんど消失するが、ＰＥ：ＣＨ：ＰＩおよびＰＥ：ＣＨ：ＰＳを介して送達された脂質は４８時間にわたって依然として細胞に存在し、膜へのより多い組み込みを示唆する。
【０１９１】
４．３．処置された細胞におけるリポソーム取り込みおよび脂質保持の定量：
４日間のインキュベーション期間にわたりＨｕｈ７．５細胞におけるリポソーム取り込み速度をモニターするために、細胞は培地中において最終脂質濃度５０μＭの、１％ｒｈ−ＰＥを含むＤＯＰＥ：ＣＨおよびＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームと一緒にインキュベーションされた。細胞は低密度で播種され、リポソーム取り込みは細胞増殖に関して測定された。４日間インキュベーション後、処置されたＨｕｈ７．５細胞は洗浄され、いずれのリポソームも含まない培地に戻され、ＤＯＰＥ：ＣＨおよびＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームを介して送達されるｒｈ−ＤＯＰＥ脂質の半減期がモニターされた。
【０１９２】
４．４．処置された細胞におけるリポソーム取り込みおよび脂質保持を定量するための方法論：
リポソームは先に記載のように調製され、細胞におけるそれらの取り込みをモニターするために１％（総モル）のｒｈ−ＰＥを含んだ。長期（４日間）リポソーム取り込みアッセイのために、Ｈｕｈ７．５細胞は２ｍｌの完全ＤＭＥＭ培地／１０％ＦＢＳのウェル毎に１０５細胞で６ウェルプレートに播種された。Ｒｈ−ＰＥ−標識リポソームは最終リン脂質濃度５０μＭになるまで細胞に添加され、３７ｏＣ／５％  ＣＯ２で２、２４、４８、７２、および９６時間、そのままインキュベーションされた。インキュベーション期間後、細胞は採取され、分析された。分析のために、細胞は１ｘＰＢＳで２回洗浄され、計数され、２００μｌの１ｘＰＢＳ／０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に再懸濁され、そして９６ウェルプレートに移されて、λｅｘ＝５５０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍにおいて分光蛍光光度計で読み取られた。先に記載のように９６時間インキュベーション後の、Ｈｕｈ７．５細胞内側のｒｈ−ＰＥ脂質の保持を測定するために、細胞は１ｘＰＢＳで３回洗浄され、培地は新鮮なＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳと取り替えられ、そして細胞はそのままさらに８、２４、３０、および４８時間インキュベーションされた。インキュベーション期間後、細胞は採取され、先に記載のように解析された。
【０１９３】
４．５．Ｈｕｈ７．５細胞におけるリポソーム取り込みおよび脂質保持アッセイの結果：
図７に示すように、活発に分裂するＨｕｈ７．５細胞は４日間のインキュベーション期間にわたり、ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームの継続した取り込みを実証した。４日目に、ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳ−処置細胞は、１．５ｘ１０−３ＡＵ／細胞（ＳＤ＝３．４ｘ１０−４ＡＵ／細胞）の蛍光を実証し、それはＤＯＰＥ：ＣＨリポソーム処置（２．５ｘ１０−４ＡＵ／細胞（ＳＤ＝５．５ｘ１０−５ＡＵ／細胞））で観察された値より６倍大きかった。実際、ＤＯＰＥ：ＣＨ−処置細胞で観察された最大蛍光（５．０ｘ１０−４ＡＵ／細胞（ＳＤ＝１．１ｘ１０−４））はたった２４時間処置期間後に到達し、その後細胞に関連した蛍光はゆっくり減少し、減少したリポソーム取り込みもしくは増大したｒｈ−ＰＥ脂質エフラックスのいずれか、または両方を示唆する。
【０１９４】
これらの実験に基づいて、ＤＯＰＥ：ＣＨリポソームに由来するｒｈ−ＤＯＰＥ脂質は、培地からのリポソームの除去後細胞におけるおよそ７時間の半減期を実証した。ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームで処置された細胞の場合、ｒｈ−ＤＯＰＥ半減期はおよそ２９時間に延び、処置された細胞の膜へのこれらのリポソームのより多い組み込みを示唆した。
【０１９５】
図７は、Ｈｕｈ７．５細胞内側の増大した取り込みおよび脂質保持を実証するＥＲ−ターゲッティングリポソームの実験の結果を示す。Ｒｈ−標識リポソーム（最終脂質濃度５０μＭ）はＨｕｈ７．５細胞と一緒に４日間（９６時間）インキュベーションされた。細胞へのリポソーム取り込みは、インキュベーション期間を通してモニターされ、最大値（１．５ｘ１０−３ＡＵ／細胞、ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソーム、９６時間読み取り）に関して、細胞毎に観察されるＤＯＰＥ：ＣＨリポソーム（赤色、実線）およびＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソーム（黒色、実線）の両方の蛍光として提示される。蛍光はλｅｘ＝５５０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍにおいて測定された。９６時間インキュベーション後、細胞は洗浄され、新鮮な培地（リポソームを含まない）に入れられ、さらに４８時間にわたって細胞内のｒｈ−ＤＯＰＥ脂質の保持をモニターされた。インキュベーション期間中の細胞増殖は、最大値（２．４ｘ１０６細胞／ｍｌ、ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソーム、７２時間読み取り）に関して、ＤＯＰＥ：ＣＨ（赤色、点線）およびＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳ（黒色、点線）の両方に対して提示された。データは３回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値とＳＤを表す。
【０１９６】
５．ＥＲリポソームは血清存在下における増大した安定性および細胞取り込みを実証する：
薬物送達システムとしてのリポソームの一般的使用はいくつかの問題によって妨げられてきた。血清蛋白質に媒介されるリポソーム内容物の漏出はこれらの問題の１つである。カルセイン−被包リポソームを使用して、１０％ＦＢＳを含む無細胞培地におけるリポソームの安定性を４日間にわたりモニターした。カルセインはリポソーム内側に被包されている場合は消光した状態である、水溶性、自己−消光フルオロフォアである；しかし、リポソーム不安定化が漏出およびその後のフルオロフォアの脱消光を誘発することになる。
【０１９７】
５．１．ＦＢＳにおけるリポソーム安定性および細胞取り込みを定量するための方法論：
１０％ＦＢＳ存在下でのリポソームの安定性をモニターするために、カルセイン−負荷リポソームが調製され、サイズ−排除クロマトグラフィーにより被包されていないカルセインから分離され、細胞の非存在下で、最終リン脂質濃度５０μＭになるまで完全ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳに添加された。リポソームはそのまま４日間インキュベーションされ、２４時間毎にリポソーム−含有培地の試料が採取され、リポソーム不安定化および周囲培地へのカルセインの漏出の結果としてのカルセイン脱消光をλｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍにおいてモニターした。蛍光スケールを較正するために、４日間インキュベーション後、最終濃度１％になるまでのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加はリポソーム膜を破壊し、１００％カルセイン脱消光を達成した：％漏出＝（（Ｉｎ−Ｉ０）／（Ｉ１００−Ｉ０））ｘ１００、式中Ｉ０は０時での蛍光であり、Ｉｎはｎ時での蛍光であり、そしてＩ１００はＴｒｉｔｏｎ添加後に完全に脱消光したカルセイン蛍光である。
【０１９８】
細胞取り込みアッセイの場合、リポソームは先に記載のように調製され、細胞におけるそれらの取り込みをモニターするために１％（総モル）のｒｈ−ＰＥを含んだ。血清存在下、または血清非存在下における短期間リポソーム取り込みアッセイの場合、無血清完全ＤＭＥＭ、または１０％ＦＢＳもしくは１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）を補足した完全ＤＭＥＭのいずれかの６−ウェルプレートでコンフルエントになるまで培養されたＨｕｈ７．５細胞に、ｒｈ−ＰＥ−標識リポソームは最終リン脂質濃度５０μＭになるまで添加され、そのまま２４時間インキュベーションされた。インキュベーション後、細胞は１ｘＰＢＳで２回洗浄され、計数され、２００μｌの１ｘＰＢＳ／０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に再懸濁され、９６ウェルプレートに移されて、分光蛍光光度計でλｅｘ＝５５０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍにおいて読み取られた。
【０１９９】
５．２．１０％血清の存在下におけるリポソーム安定性および細胞取り込みを定量するためのアッセイの結果：
図８ＡはｐＨ−感受性ＤＯＰＥ：ＣＨおよびＥＲ−ターゲッティングＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソーム内からのカルセイン遊離の割合を実証する。４日間インキュベーション後に、ＤＯＰＥ：ＰＥリポソームからは５８％（ＳＤ＝１２．６％）のカルセインが遊離されていたが、ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームからは３２％（ＳＤ＝９．２％）だけしかカルセインは遊離されず、血清の存在におけるより高い安定性を示唆した。
【０２００】
Ｈｕｈ７．５細胞へのリポソーム取り込みに対するＦＢＳとヒト血清両方の効果をモニターするために、膜内に１％ｒｈ−ＰＥを含むＤＯＰＥ：ＣＨおよびＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームが調製され、無血清培地または１０％ＦＣＳもしくは１０％ヒト血清を含む培地の存在下で、Ｈｕｈ７．５細胞と一緒に２４時間インキュベーションされた（最終リポソーム濃度５０μＭ）。細胞におけるリポソーム取り込みは２４時間インキュベーション期間後の細胞毎の蛍光の量（任意単位、ＡＵ）として表現される。ＦＢＳの存在下におけるＤＯＰＥ：ＣＨリポソーム取り込みは無血清培地に比較して有意に減少することが観察された（それぞれ５．０ｘ１０−４ＡＵ／細胞（ＳＤ＝７．０ｘ１０−５ＡＵ／細胞）対８．２ｘ１０−４ＡＵ／細胞（ＳＤ＝２．１ｘ１０−４ＡＵ／細胞）、Ｐ＝０．０２、図８Ｂ）。ヒト血清の存在では有意な差は見られなかった。対照的に、ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームでは、ＦＢＳの存在下における取り込みは無血清培地に比較して有意な増大を実証した（それぞれ６．６ｘ１０−４ＡＵ／細胞（ＳＤ＝８．４ｘ１０−５ＡＵ／細胞）対３．１ｘ１０−４ＡＵ／細胞（ＳＤ＝１．２ｘ１０−４ＡＵ／細胞）、Ｐ＝０．００３、図８ｂ）。さらに、ヒト血清の存在は、Ｈｕｈ７．５細胞におけるＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソーム取り込みの効率をＦＢＳに比較して有意に増大させた（１．４ｘ１０−３ＡＵ／細胞（ＳＤ＝１．８ｘ１０−４ＡＵ／細胞）、Ｐ＝０．００１、図８Ｂ）。
【０２０１】
図１０Ａ〜ＢはＥＲ−ターゲッティングリポソームが血清の存在下で安定性および細胞取り込みが増大したことを実証する実験の結果を提示する。（Ａ）自己−消光カルセイン−負荷リポソーム（最終脂質濃度５０μＭ）は完全ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中でインキュベーションされ、そのまま４日間３７℃でインキュベーションされた。
【０２０２】
２４時間毎に培養物の試料を使用してλｅｘ＝４８５ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍでのカルセイン脱消光を測定した。結果は、インキュベーション期間終了時にリポソーム膜を破壊するためのＴｒｉｔｏｎＸ−１００添加により確定される最大蛍光に関して、リポソームから遊離されるカルセインの百分率として提示される。（Ｂ）Ｒｈ−標識リポソーム（脂質濃度５０μＭ）は１０％ウシ血清（ＦＢＳ）、１０％ヒト血清のいずれかの存在下において、または無血清培地において２４時間Ｈｕｈ７．５細胞と一緒にインキュベーションされた。インキュベーション期間後、細胞は採取され、計数され、そしてλｅｘ＝５５０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍにおいて蛍光が測定された。結果はそれぞれの試料の細胞毎に測定された平均蛍光として提示される。すべてのデータは３回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値とＳＤを表す。
【０２０３】
ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームを使用するこれらの研究は、このリン脂質の組み合わせが、ＤＯＰＥ：ＣＨリポソームと比較して、細胞および血清両方とのいっそう好ましい相互作用を実証しうることを示唆することができる。１０％ＦＢＳの存在下において、ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームは、４日間インキュベーション後ＤＯＰＥ：ＣＨリポソームと比較して被包されたカーゴの４５％少ない漏出を表す。ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームはまた、ＦＢＳの存在下においてＨｕｈ７．５細胞への増大した取り込みを実証し、取り込みはまた、ヒト血清の存在下でさらに増大した。対照的に、ＤＯＰＥ：ＣＨリポソーム取り込みは無血清培地に比較して、ＦＢＳの存在下で阻止されるように見えた。本発明はそれらの操作理論によって限定されないが、これらの結果はＥＲを目標とするリポソーム、すなわちＰＩおよび／またはＰＳ脂質を含むリポソームは、ＤＯＰＥ：ＣＨリポソームによって使用されるものと異なる細胞受容体によってエンドサイトーシスされ、そしてこの機序を介したエンドサイトーシスは血清の存在によって高められうることを示唆しうる。
【０２０４】
６．Ｈｕｈ７．５細胞およびＰＢＭＣにおけるＥＲリポソームの細胞毒性
これらの実験の目的は、Ｈｕｈ７．５細胞およびＰＢＭＣ両方の１ラウンド処置（５日間）にわたる細胞生存能力に対するリポソームの効果を確定することであった。
【０２０５】
６．１．Ｈｕｈ７．５細胞およびＰＢＭＣにおける細胞毒性の確定のための特定の方法論：
脂質組成ＰＨ：ＣＨ（３：２）、ＰＥ：ＰＣ（３：２）、ＰＥ：ＰＩ（３：２）、ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ（３：１：１）、ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ（１．５：１．５：２）、ＰＥ：ＰＳ（３：２）、ＰＥ：ＣＨ：ＰＳ（３：１：１）、ＰＥ：ＰＣ：ＰＳ（１．５：１．５：２）、ＰＥ：ＰＩ：ＰＳ（３：１：１）、ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ：ＰＳ（３：１：０．５：０．５）およびＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ（１．５：１．５：１：１）を持つリポソームは先に記載のように調製された。Ｈｕｈ７．５細胞およびＰＢＭＣはそれぞれ２００μｌの完全ＤＭＥＭおよびＲＰＭＩ＋ＩＬ２培地中５ｘ１０４細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種され、０〜５００μＭの範囲の最終脂質濃度を持つ１ｘＰＢＳを被包したリポソームの存在下でインキュベーションされた。５日間のインキュベーション後、細胞生存能力は取扱説明書に従ってＭＴＳを基礎にした細胞増殖アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）により確定された。
【０２０６】
６．２．ＰＢＳリポソームで５日間処置した場合のＨｕｈ７．５細胞およびＰＢＭＣにおける細胞毒性：
図９は、１ｘＰＢＳを被包した異なるリポソーム製剤と一緒に５日間インキュベーション後のＨｕｈ７．５細胞の生存能力を示す。培地における最終脂質濃度は０〜５００μＭまで変動した。結果は、３回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。
【０２０７】
図１０は、１ｘＰＢＳを被包した異なるリポソーム製剤と一緒に５日間インキュベーション後のＰＢＭＣの生存能力を示す。培地における最終脂質濃度は０〜５００μＭまで変動した。結果は、３回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。
【０２０８】
図９および１０の結果は、脂質ＣＨＥＭＳを含むリポソームだけが６０μＭより高い濃度で細胞に添加された場合、Ｈｕｈ７．５細胞およびＰＢＭＣにおいて細胞毒性であることを実証することができる。この脂質を含まないＥＲリポソームは、たとえあったとしても、ｐＨ−感受性リポソームに比較してほとんど細胞毒性を示さず、従って、ｉｎ  ｖｉｖｏの使用に好ましい。
【０２０９】
７．ＥＲリポソームで処置された感染ＰＢＭＣからのＨＩＶ−１の分泌
これらの実験の目的は異なるリポソーム組成物で処置されたＨＩＶ−１−感染ＰＢＭＣからのＨＩＶ−１分泌レベルの変化をモニターすることであった。
【０２１０】
７．１．１ラウンドＨＩＶ分泌アッセイのための特定の方法論：
脂質組成ＰＨ：ＣＨ（３：２）、ＰＥ：ＰＣ（３：２）、ＰＥ：ＰＩ（３：２）、ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ（３：１：１）、ＰＥ：ＰＳ（３：２）、ＰＥ：ＣＨ：ＰＳ（３：１：１）、ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ：ＰＳ（３：１：０．５：０．５）およびＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ（１．５：１．５：１：１）を持つリポソームは先に記載のように調製された。薬物処置細胞から分泌されたビリオンによる感染の結果としてのＨＩＶの分泌の変化は、指標細胞としての刺激されたＰＢＭＣ、およびエンドポイントとしてのｐ２４抗原産生の確定を使用して評価された。４人の正常（非感染）ドナーに由来するＰＢＭＣはＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度勾配遠心法（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｕ．Ｋ．）を使用して分離され、プールされ、そして完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩプラス１０％熱―不活性化ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン）中で４８時間フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、５μｇ／ｍｌ）、続いて７２時間インターロイキン−２（ＩＬ２、４０Ｕ／ｍｌ）により刺激された。特記しない限り、すべての実験は９６ウェルマイクロタイタープレートで行われ、すべてのインキュベーションは３７ｏＣ／５％ＣＯ２で行われた。細胞を感染させるために、４ｘ１０５ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣおよび初代分離株ストックの１００ＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染量）がそれぞれのウェルに添加された。１６時間の夜通しのインキュベーション後、細胞は完全ＲＰＭＩ培地で３回洗浄され、適切な遊離薬物またはリポソーム処置剤（最終脂質濃度５０μＭ）を含む完全ＲＰＭＩ／ＩＬ２に再懸濁された。５日目に、薬物―処置細胞から分泌されたＨＩＶビリオンを含む上清は集められ、ｐ２４濃度はｐ２４捕獲ＥＬＩＳＡによってそれぞれに対して定量される。
【０２１１】
７．２．１ラウンドＨＩＶ分泌アッセイの結果：
図１１は、５日間リポソーム処置した感染ＰＢＭＣからのＨＩＶの分泌を実証する。すべてのリポソームは１ｘＰＢＳ溶液を被包していて、最終脂質濃度５０μＭで細胞培養培地に添加されている。ウイルス分泌は、捕獲ＥＬＩＳＡによる処置および無処置ＰＢＭＣ上清内のＨＩＶコア蛋白質ｐ２４の定量後に計算された。結果は無処置対照に関したＨＩＶ分泌の百分率として提示され、２回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。アッセイはＬＡＩ（クレードＢ）、９３ＵＧ０６７（クレードＤ）および９３ＲＷ０２４（クレードＡ）を含む、３種の遺伝的に多様なＨＩＶ−１分離株に対して実施された。
【０２１２】
図１１の結果は、脂質ＰＩを含むＥＲリポソームが、無処置対照に比較してＰＢＭＣからのＨＩＶ分泌をおよそ２０％減少させることが可能であることを実証することができる。非−ＥＲターゲッティングリポソーム（ＰＥ：ＣＨおよびＰＥ：ＰＣ）およびＰＩ脂質を含まないＥＲリポソームは、ＨＩＶ感染に対して全く効果がない。
【０２１３】
８．ＥＲリポソームで処置された感染ＰＢＭＣから分泌されたＨＩＶ−１の感染力
これらの実験の目的は、異なるリポソーム組成物で処置されたＨＩＶ−１−感染ＰＢＭＣから分泌されたＨＩＶ−１ビリオンの感染力の変化をモニターすることであった。
【０２１４】
８．１．１ラウンドＨＩＶ感染力アッセイのための特定の方法論：
リポソームで処置された感染ＰＢＭＣから分泌されたＨＩＶ−１ビリオンの感染力は、先の段落に記載のように、リポソーム−処置細胞から分泌されたＨＩＶビリオンを含む上清を使用して確定された。すべての上清は完全ＲＰＭＩ／ＩＬ２中最終ｐ２４濃度１０ｎｇ／ｍｌに希釈され、１００μｌは最終ｐ２４濃度５ｎｇ／ｍｌとなるようにやはり１００μｌの培地中の４ｘ１０５ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣに添加され、そのまま一晩インキュベーションされた。翌日、細胞は記載のように洗浄され、２００μｌの新鮮なＲＰＭＩ／ＩＬ２に再懸濁され、そのまま４日間インキュベーションされた後、上清が集められ、捕獲ＥＬＩＳＡによってｐ２４含量がアッセイされた。
【０２１５】
８．２．１ラウンドＨＩＶ感染力アッセイの結果：
図１２はリポソーム−処置ＨＩＶ−感染ＰＢＭＣから分泌されたＨＩＶビリオンの感染力を示す。分泌されたウイルス粒子はナイーブＰＢＭＣを感染させるために使用され、そして細胞を感染させる能力は、上清が除去され、細胞が５日間無処置のままでおかれた後にウイルス分泌を測定することによって確定された。結果は無処置対照に関したＨＩＶ感染力の百分率として提示され、２回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。アッセイは、ＬＡＩ（クレードＢ）、９３ＵＧ０６７（クレードＤ）および９３ＲＷ０２４（クレードＡ）を含む、３種の遺伝的に多様なＨＩＶ−１分離株に対して実施された。
【０２１６】
図１２の結果は、ある種のＥＲリポソームが処置されたＰＢＭＣから分泌されたウイルス粒子の感染力を低減させることが可能でありうることを実証することができる。最も強い抗ウイルス活性は、ＰＩおよび／またはＰＳと組み合わせた脂質ＣＨＥＭＳからなるＥＲリポソームに見られ、ここではウイルス粒子の感染力は無処置ビリオンの２０％未満である。非ＥＲリポソーム（ＰＥ：ＣＨおよびＰＥ：ＰＣ）およびＥＲリポソームＰＥ：ＰＳはウイルス感染力に対して全く効果が見られなかった。
【０２１７】
９．ＥＲリポソームはｐＨ−感受性リポソームに比較してより効率的な細胞内カーゴ遊離を実証する：
これらの実験では、自己−消光濃度の蛍光分子、カルセインを被包するローダミン−標識リポソームが調製され、Ｈｕｈ７．５細胞の存在下でインキュベーションされた。カルセインは細胞内空間に遊離されて脱消光するため、細胞内側への被包されたカーゴの送達は蛍光の増大によってモニターされた。
【０２１８】
９．１．Ｈｕｈ７．５細胞におけるリポソームの細胞内送達を測定するための特定の方法論：
蛍光測定アッセイのために、５ｘ１０６Ｈｕｈ７．５細胞は完全ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを含む２５ｃｍ２フラスコに播種され、そのまま一晩置かれた。翌日、１％ｒｈ−ＰＥを含むカルセイン−負荷リポソームが培地に添加され（最終リン脂質濃度５０μＭ）、３７℃または４℃でそのまま３０分間インキュベーションされた。インキュベーション後、細胞は１ｘＰＢＳで２回洗浄され、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で剥がされ、さらに２回洗浄され、そして６００μｌＰＢＳに再懸濁された。２００μｌのアリコート３つを使用して蛍光が測定され、平均が求められた。カルセイン脱消光はλｅｘ＝４８５ｎｍおよびλｅｍ＝５２０ｎｍで測定され、そしてローダミン蛍光はλｅｘ＝５５０ｎｍおよびλｅｍ＝５９０ｎｍで測定された。エンドサイトーシスしない状態で細胞に結合したリポソームの初期のカルセイン蛍光対ローダミン蛍光の比は、リポソームを４℃で細胞と一緒にインキュベーションすることによって得られ、そして３７℃での値を調整するために使用される。
【０２１９】
９．２．Ｈｕｈ７．５細胞におけるリポソームからの被包されたカルセインの細胞内遊離：
リポソームとの４５分間インキュベーション後のＨｕｈ７．５細胞における平均ｒｈ−ＤＯＰＥ蛍光はリポソームの取り込みを反映し、そして平均カルセイン蛍光は細胞内脱消光、従って蛍光色素の遊離を示す。計算されたカルセイン蛍光対ローダミン蛍光の比は、細胞に結合したリポソーム毎に細胞内に遊離された水性マーカーの量の尺度として見なされる。ＤＯＰＥ：ＣＨリポソームに対するカルセイン／ローダミン比は１０．３（ＳＤ＝２．６）であると計算されたが、ＤＯＰＥ：ＤＯＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームに対する比は１５．７（ＳＤ＝２．４）であり、１５２％（Ｐ＝０．０２、図１３）の増大であった。
【０２２０】
図１３は、完全ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中Ｈｕｈ７．５細胞と一緒に４５分間インキュベーションされた、自己−消光カルセイン−負荷、ｒｈ−ＰＥ−標識リポソームに関する実験の結果を提示する。インキュベーション後のリポソームに由来するカルセインの細胞内脱消光はλｅｘ＝４９０ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍで測定され、同じインキュベーション期間の総リポソーム取り込みはλｅｘ＝５５０ｎｍ、λｅｍ＝５９０ｎｍでの蛍光測定によって確定された。アッセイは３７℃および４℃の両方で実施され、エンドサイトーシスしないリポソーム結合に対して修正するために、すべての４℃の値は３７℃の値から差し引かれた。Ｈｕｈ７．５細胞内側の被包されたカルセインを送達するためのリポソームの能力はインキュベーション後の処置された細胞におけるカルセイン脱消光とｒｈ−ＰＥ蛍光の比を計算することによって測定された。データは３回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値とＳＤを表す。
【０２２１】
図１３に提示された結果は、ＰＥとＰＩおよび／またはＰＳとの組み合わせからなるリポソームは、被包された化合物の効率的な細胞内送達のために特に設計されたリポソーム組成物であるＰＥ：ＣＨリポソームに比較して、リポソーム毎の細胞内カルセイン遊離の増大したレベルを有していることを示唆することができる。これらのアッセイでは、ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームはＰＥ：ＣＨリポソームに比較して、１．５倍多いカルセイン遊離を実証する。
【０２２２】
１０．１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包するリポソームによって処置されたＰＢＭＣからのＨＩＶ−１の分泌
これらの実験の目的は、被包されたイミノ糖（すなわち、ＮＢ−ＤＮＪ）をＨＩＶ−感染ＰＢＭＣに送達するリポソームの能力を確定することであった。脂質ＰＩおよびＰＳを含むリポソームはｐＨ−感受性リポソーム（ＰＥ：ＣＨ）およびｐＨ−非感受性リポソーム（ＰＥ：ＰＣ）に比較された。
【０２２３】
１０．１．１ラウンドＨＩＶ分泌アッセイのための特定の方法論；
脂質組成ＰＨ：ＣＨ（３：２）、ＰＥ：ＰＣ（３：２）、ＰＥ：ＰＩ（３：２）、ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ（３：１：１）、ＰＥ：ＰＳ（３：２）、ＰＥ：ＰＩ：ＰＳ（３：１：１）、ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ：ＰＳ（３：１：０．５：０．５）およびＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ（１．５：１．５：１：１）を持つリポソームは、すべてのリポソームが１ｘＰＢＳ中の１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包すること以外は先に記載のように調製された。ＨＩＶ分泌アッセイは先に記載のように実行された。サイズ−排除クロマトグラフィーによってリポソームは被包されないＮＢ−ＤＮＪから精製された。リポソームに関する結果は細胞培養培地に１ｍＭの最終濃度で添加されたＮＢ−ＤＮＪに関する結果と比較される。
【０２２４】
１０．２．１ラウンドＨＩＶ分泌アッセイの結果：
図１４は１ｍＭのフリーＮＢ−ＤＮＪ対リポソームに媒介されて送達されたＮＢ−ＤＮＪによる５日間処置の間の感染ＰＢＭＣからのＨＩＶ分泌を示す。リポソームは１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包していて、最終脂質濃度５０μＭで細胞培養培地に添加されている。ウイルス分泌は先に記載のように計算された。結果は無処置対照に関したＨＩＶ分泌の百分率として提示され、２つの独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。アッセイはＬＡＩ（クレードＢ）、９３ＵＧ０６７（クレードＤ）および９３ＲＷ０２４（クレードＡ）を含む、３種の遺伝的に多様なＨＩＶ−１分離株に対して実施された。
【０２２５】
図１４の結果は、脂質ＰＩまたはＰＳを含むリポソームは、ＰＥ：ＣＨリポソームに比較してより高くはないとしても、同様のＨＩＶ分泌の減少によって確定される抗ウイルス活性を達成するために、ＨＩＶ−感染ＰＢＭＣに抗ウイルスＮＢ−ＤＮＪを送達することが可能でありうることを実証することができる。
【０２２６】
１１．１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包するリポソームによって処置された感染ＰＢＭＣから分泌されたＨＩＶ−１の感染力。
【０２２７】
これらの実験の目的は、被包されたイミノ糖（すなわち、ＮＢ−ＤＮＪ）をＨＩＶ−感染ＰＢＭＣに送達するリポソームの能力を確定することであった。脂質ＰＩおよびＰＳを含むリポソームはｐＨ−感受性リポソーム（ＰＥ：ＣＨ）およびｐＨ−非感受性リポソーム（ＰＥ：ＰＣ）と比較された。
【０２２８】
１１．１．１ラウンドＨＩＶ感染力アッセイのための特定の方法論：
リポソームによって処置されたＰＢＭＣから分泌されたＨＩＶビリオンの感染力は、すべてのリポソームが１ｘＰＢＳ中１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包していること以外は先に記載のように確定された。リポソーム−処置細胞から分泌されたビリオンに関する結果はフリーＮＢ−ＤＮＪ−処置細胞および無処置細胞から分泌されたものと比較される。
【０２２９】
１１．２．１ラウンドＨＩＶ感染力アッセイの結果：
図１５はＮＢ−ＤＮＪ−リポソームまたはフリーＮＢ−ＤＮＪ−処置ＨＩＶ−感染ＰＢＭＣから分泌されたＨＩＶビリオンの感染力を示す。分泌されたウイルス粒子はナイーブＰＢＭＣを感染させるために使用され、そして細胞を感染させる能力は先に記載のように確定された。結果は無処置対照に関するＨＩＶ感染力の百分率として提示され、２回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。アッセイはＡＩ（クレードＢ）、９３ＵＧ０６７（クレードＤ）および９３ＲＷ０２４（クレードＡ）を含む、３種の遺伝的に多様なＨＩＶ−１分離株に対して実施された。
【０２３０】
図１５の結果は、１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包するＥＲリポソームによるＨＩＶ−感染ＰＢＭＣの処置は無処置対照に比較してＨＩＶの分泌および感染力を減少させることを実証することができる。ＰＩおよびＰＳ脂質を含まないリポソームであるｐＨ−感受性リポソームと脂質ＰＩおよびＰＳを含むリポソーム間の結果の比較は、１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包している場合、抗ウイルス活性に有意な差は見られないことを明らかにする。
【０２３１】
抗ウイルス活性は、ｇｐ１２０／ｇｐ４１ターゲッティング分子、たとえばＣＤ４の可溶性型を薬物被包リポソームの外側表面に化学的に連結することによってさらに高めることができる。ターゲッティング分子は、感染を予防するためにフリーウイルス粒子を中和することに加え、受容体−媒介エンドサイトーシスを介してＨＩＶ−感染細胞への薬物−負荷リポソームの取り込み増大を導くべきである。
【０２３２】
１２．ＰＢＭＣにおける１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包するＥＲ−リポソームの細胞毒性：
これらの実験の目的は、ＰＢＭＣの細胞生存能力に対する１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包するリポソーム１ラウンド処置（５日間）の効果を確定することであった。
【０２３３】
１２．１．ＰＢＭＣにおける細胞毒性の確定のための特定の方法論：
脂質組成ＰＨ：ＣＨ（３：２）、ＰＥ：ＰＣ（３：２）、ＰＥ：ＰＩ（３：２）、ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ（３：１：１）、ＰＥ：ＰＳ（３：２）、ＰＥ：ＣＨ：ＰＳ（３：１：１）、ＰＥ：ＣＨ：ＰＩ：ＰＳ（３：１：０．５：０．５）およびＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ（１．５：１．５：１：１）を持つリポソームは、すべてのリポソームが１ｘＰＢＳ中の１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包する以外は、先に記載のように調製された。１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包するリポソームとの５日間インキュベーション後の細胞生存能力は先に記載のように確定された。
【０２３４】
１２．２．１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包するリポソームによる処置後のＰＢＭＣ生存能力：
図１６は、１ｍＭ  ＮＢ−ＤＮＪを被包する異なるリポソーム製剤との５日間インキュベーション後のＰＢＭＣ生存能力を示す。培地の最終脂質濃度は０から５００μＭまで変動した。結果は３回の独立した実験に由来するトリプリケート試料の平均値を表す。驚くべきことに、ある種のリポソーム内側のＮＢ−ＤＮＪの被包はモック−処置対照に比較して，細胞増殖を１６０％にまで増大させるように見える。
【０２３５】
１３．ＥＲリポソームで処置されたＨｕｈ７．５細胞からのＨＣＶの分泌
これらの実験の目的は、異なるリポソーム組成物によって処置されたＨＣＶ−感染Ｈｕｈ７．５細胞からのＨＣＶ−１−分泌レベルの変化をモニターすることであった。
【０２３６】
１３．１．１ラウンドＨＩＶ分泌アッセイのための方法：
アッセイは感染後８日目（急性）および感染後５０日目（慢性）の細胞に対して行われた。ＨＣＶ−感染Ｈｕｈ７．５細胞は６ウェルプレートにおいて７５％コンフルエンシーになるまで培養され、その後培地はウェル毎に総容量２ｍｌの完全ＤＭＥＭ＋５０μＭリポソームで取り替えられ、そのまま３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベーションされた。すべてのアッセイはトリプリケート試料により行われた。ウイルス分泌解析は、ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡ精製キットを使用し、取り扱い説明書に従って上清５００μｌから抽出されたウイルスＲＮＡに対する定量ＰＣＲによって行われた。分泌されたウイルスＲＮＡの定量は、初めに逆転写酵素反応を使用することによる分離されたＲＮＡからｃＤＮＡへの変換、続いてＳｙＢｒ  ＧｒｅｅｎミックスとＨＣＶ  ｃＤＮＡに対して設計されたプライマーを使用したリアル−タイムＰＣＲによって行われた。
【０２３７】
１３．２．１ラウンド分泌アッセイの結果：
図１７は、５日間のリポソーム処置後の、急性および慢性−感染両方の、感染Ｈｕｈ７．５細胞からのＨＣＶの分泌を示す。すべてのリポソームは１ｘＰＢＳ溶液を被包し、最終脂質濃度５０μＭで細胞培養培地に添加されている。ＨＣＶ分泌は定量ＰＣＲによる処置および無処置Ｈｕｈ７．５細胞の上清内のＲＮＡの定量後計算された。結果は無処置対照に関するＨＣＶ  ＲＮＡ分泌の百分率として提示され、トリプリケート試料の平均値を表す。
【０２３８】
１４．ＥＲリポソームにより処置されたＨｕｈ７．５細胞から分泌されたＨＣＶの感染力
この実験の目的は、異なるリポソーム組成物によって処置されたＨＣＶ−感染Ｈｕｈ７．５細胞から分泌されたＨＣＶビリオンの感染力の変化をモニターすることであった。
【０２３９】
１４．１．１ラウンドＨＩＶ感染力アッセイのための方法：
リポソームで処置されたＨｕｈ７．５細胞から分泌されたＨＣＶビリオンの感染力は、先の段落に記載のように、リポソーム−処置細胞から分泌されたＨＣＶビリオンを含む上清を使用して確定された。ナイーブＨｕｈ７．５細胞は４８−ウェルプレートにおいて７５％コンフルエンシーになるまで培養され、その後培地はリポソーム−処置細胞から分泌されたＨＣＶを含む上清２００μｌと取り替えられた。上清はそのまま１時間ナイーブＨｕｈ７．５細胞を感染させ、その後細胞は１ｘＰＢＳで２回洗浄され、完全ＤＭＥＭ５００μｌ中、２日間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーションされた。２日間のインキュベーション後、細胞は１ｘＰＢＳで２回洗浄され、メタノール／アセトン（１：１、ｖｏｌ：ｖｏｌ）で１０分間固定され、１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄された。細胞は４μｇ／ｍｌ抗−ＨＣＶコア抗体を含む１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で１時間インキュベーションされ、１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄され、４μｇ／ｍｌＦＩＴＣ−標識二次抗体を含む１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で１時間インキュベーションされ、さらに２回洗浄され、そしてＤＡＰＩで染色された。蛍光画像は、先に記載のようにＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｕ顕微鏡を使用して撮られた。感染した細胞の百分率は、ＨＣＶに感染した細胞の総数（抗−ＨＣＶ抗体によって検出される）を計数し、アッセイにおける（ＤＡＰＩ染色によって検出される）細胞の総数で割ることにより計算される。
【０２４０】
１４．２．１ラウンドＨＩＶ感染力アッセイの結果：
図１８は急性および慢性−感染両方の、リポソーム−処置ＨＣＶ−感染Ｈｕｈ７．５細胞から分泌されたＨＣＶビリオンの感染力を示す。分泌されたウイルス粒子はナイーブＨｕｈ７．５細胞を感染させるために使用され、細胞を感染させる能力は、一旦上清が除去され、細胞が２日間無処置のまま置かれた後にＨＣＶコア蛋白質の存在を測定することによって確定された。結果は、無処置対照に関するＨＣＶ感染力の百分率として提示され、トリプリケート試料の平均値を表す。
【０２４１】
選ばれたＥＲリポソームおよびｐＨ−感受性リポソーム（ＰＥ：ＣＨ）で処置されたＨＣＶ−感染Ｈｕｈ７．５細胞に由来する結果は、すべてのリポソームはウイルス粒子の分泌を増大させるが、分泌された粒子の感染力は無処置粒子に比較して有意に低減されることを示唆する。
【０２４２】
１５．ＥＲリポソームはＨｕｈ７．５細胞におけるＬＤの形成を減少させる
Ｈｕｈ７．５細胞はＥＲリポソームの存在下で一晩インキュベーションされ、細胞ＬＤに対するそれらの効果をモニターされた。ＬＤはリポソーム−処置細胞において共焦点顕微鏡により可視化された。
【０２４３】
１５．１．Ｈｕｈ７．５細胞内のＬＤを可視化するための方法：
ＥＲリポソームＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ（１．５：１．７：１．５：０．３）は先に記載のように調製された。Ｈｕｈ７．５細胞は番号１．５ガラスカバースライドに一晩接着させ、その後培地は交換され、最終脂質濃度５０μＭになるまで添加されたリポソームを含む新鮮な培地と取り替えられた。３７℃／５％ＣＯ２で１６時間インキュベーション後、リポソームを含む培地は除去され、細胞は１ｘＰＢＳで洗浄され、１ｘＰＢＳで希釈された４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定され、１ｘＰＢＳで２回洗浄された。その後細胞は２０μｇ／ｍｌのＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３を含む１ｘＰＢＳ中で１０分間インキュベーションされ、１ｘＰＢＳで２回洗浄された。ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３はＬＤのまわりの微小環境の詳細な分析に適する。細胞はＤＡＰＩで染色され、その後顕微鏡スライドにマウントされた。共焦点画像はＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ顕微鏡を使用して撮られ、画像解析はＬＳＭソフトウェアｖ５．１０を使用して行われた。
【０２４４】
１５．２．ＥＲリポソームによる１６時間処置後のＨｕｈ７．５細胞内側のＬＤを可視化した結果
図１９は、１６時間インキュベーション後にＬＤを可視化するためにＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３（緑色）で探査された、無処置Ｈｕｈ７．５細胞（左パネル）およびＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソーム−処置Ｈｕｈ７．５細胞（右パネル）の実験の結果を示す。ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームは最終脂質濃度５０μＭになるまで細胞培養培地に添加された。ＤＡＰＩ（青色）は核染料として、および画像濃度を標準化するために使用される。結果は、ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームによるＨｕｈ７．５細胞の処置はＬＤの形成を減少させることを示唆する。
【０２４５】
１６．ＥＲリポソームはＨｕｈ７．５細胞においてＬＤと共局在する
ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームはＨｕｈ７．５細胞においてＬＤ形成を妨害することが示されたため、これらのリポソームが細胞内ＬＤと直接相互作用するかどうかを確定するために以下の実験が行われた。共局在を確定するために、Ｒｈ−ＰＥ標識リポソームはＨｕｈ７．５細胞と２時間インキュベーションされ、その後Ｒｈ−ＰＥ脂質および細胞内ＬＤは共焦点顕微鏡によって可視化された。
【０２４６】
１６．１．ＬＤおよびリポソームの細胞内共局在を可視化するための方法：
ＥＲリポソームＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ（１．５：１．７：１．５：０．３）は先に記載のように調製され、可視化のために１％（総モル）のＲｈ−ＰＥを含んだ。Ｈｕｈ７．５細胞は番号１．５ガラスカバースライドに一晩接着させ、その後培地は交換され、最終脂質濃度５０μＭになるまで添加されたＲｈ−ＰＥ標識リポソームを含む新鮮な培地と取り替えられた。３７℃／５％ＣＯ２で２時間インキュベーション後、リポソームを含む培地は除去され、細胞は固定され、先に記載のようにＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３で染色された。細胞はＤＡＰＩで染色され、その後顕微鏡スライドにマウントされた。共焦点画像は先に記載のように撮られた。
【０２４７】
１６．２．２時間インキュベーション後のＨｕｈ７．５  ＬＤとリポソームの共局在：
図２０は、ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソーム（赤色）で２時間処置され、ＬＤ染料（緑色）で探査されたＨｕｈ７．５細胞の実験の結果を示す。ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームは最終脂質濃度５０μＭまで細胞培養培地に添加された。ＤＡＰＩ（青色）は核染料として使用される。底部−右パネルは統合画像である。黄色は細胞内の共局在領域を同定する。
【０２４８】
結果は、ＰＥ：ＰＩ：ＰＳ：ＰＣリポソームはたった２時間だけの処置後にＨｕｈ７．５細胞のＬＤと相互作用できることを示唆する。
【０２４９】
１７．ＥＲリポソームによるＨＣＶ−感染Ｈｕｈ７．５細胞の処置はＨＣＶコア蛋白質とＬＤとの会合を阻止する
ＨＣＶコア蛋白質と細胞内ＬＤ間の相互作用の妨害は、主としてＨＣＶ−感染細胞からの非−感染性ウイルス粒子の分泌を導くことができる。
【０２５０】
これらの実験の目的はリポソーム処置がＨｕｈ７．５細胞におけるＨＣＶコア蛋白質とＬＤの共局在を低減させるかどうかを確定することであった。
【０２５１】
１７．１．ＬＤとＨＣＶコア蛋白質の細胞内共局在を可視化するための方法：
ＥＲリポソームＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ（１．５：１．７：１．５：０．３）は先に記載のように調製された。ＨＣＶ遺伝子型ＪＦＨ１による感染後８日目にＨｕｈ７．５細胞は番号１．５ガラスカバースライドに一晩接着させ、その後培地は交換され、最終脂質濃度５０μＭになるまで添加されたリポソームを含む新鮮な培地と取り替えられた。３７℃／５％ＣＯ２で１６時間インキュベーション後、リポソームを含む培地は除去され、細胞は１ｘＰＢＳで２回洗浄され、メタノール／アセトン（１：１、ｖｏｌ：ｖｏｌ）で１０分間固定され、１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄された。次に細胞は３μｇ／ｍｌ抗−ＨＣＶコア抗体を含む１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で１時間インキュベーションされ、１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回洗浄され、４μｇ／ｍｌＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５０−標識二次抗体を含む１ｘＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で１時間インキュベーションされ、さらに２回洗浄された。細胞は２０μｇ／ｍｌのＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３を含む１ｘＰＢＳと一緒に１０分間インキュベーションされ、１ｘＰＢＳで２回洗浄され、その後ＤＡＰＩで染色され、そして先に記載のようにマウントされた。共焦点画像は先に記載のように撮られた。
【０２５２】
１７．２．ＥＲリポソームによる１６時間処置後のＨｕｈ７．５  ＬＤとＨＣＶコア蛋白質の共局在：
図２１Ａは、１６時間インキュベーションされ、抗−ＨＣＶ抗体（赤色）およびＬＤ染色（緑色）によって探査された、無処置Ｈｕｈ７．５細胞（左パネル）とＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソーム−処置Ｈｕｈ７．５細胞（右パネル）に関する実験の結果を示す。ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームは最終脂質濃度５０μＭになるまで細胞培養培地に添加された。ＤＡＰＩ（青色）は核染料として使用される。底部−右パネルは統合画像である。黄色は細胞内の共局在領域を同定する。図２１Ｂは無処置（左）およびＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソーム−処置（右）細胞両方の統合画像（白四角）の拡大を提示する。図２１ＣはＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソームの存在下（右）および非存在下（左）におけるＨＣＶコア蛋白質／ＬＤ相互作用の概念図である。
【０２５３】
大きなＬＤ／ＨＣＶコア小胞の存在が感染性ウイルス粒子の産生にとって必要であってもよい。これらの結果は、ＰＥ：ＰＣ：ＰＩ：ＰＳリポソーム−によるＨＣＶ−感染Ｈｕｈ７．５細胞の処置がＨＣＶコアと細胞内ＬＤとの会合を低減させうることを実証し、そのことはおそらくＥＲリポソーム−処置細胞から分泌されたＨＣＶ粒子の感染力の減少を説明しうる。
【０２５４】
１８．ＥＲリポソームを介して多価不飽和脂質をＨＣＶ−感染Ｈｕｈ７．５細胞に送達することによるＨＣＶ分泌および感染力の減少
ＨＣＶに対するＥＲリポソームの抗ウイルス活性を高めるために、ＰＥおよびＰＣ脂質（現在すべての実験において１８：１一価不飽和）は多価不飽和ＰＥおよびＰＣ脂質（２２：６および／または２０：４のいずれか）によって取り替えることができる。
【０２５５】
図２２Ａ〜Ｄは多価不飽和ＥＲリポソームに組み込まれることになる多価不飽和脂質の化学構造を示す。Ａ．２２：６ＰＥ。Ｂ．２０：４ＰＥ。Ｃ．２２：６ＰＣ。Ｄ．２０：４ＰＣ。
【０２５６】
ＨＣＶ抗ウイルス薬としてのＥＲリポソームの潜在的な役割を検討するために、ＪＣ−１−感染Ｈｕｈ７．５細胞は種々のリポソーム組成物で処置され、ＨＣＣｃｃ分泌および感染力に対するそれらの効果がモニターされた。ＨＣＶ複製に対する異なるリポソーム脂質飽和の効果をモニターするために、２２：６ＥＲリポソーム（２２：６ＰＥ：２２：６ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ、１．５：１．５：１：１）および２２：６ＰＥＧ−ＥＲリポソーム（３％ＰＥＧ−ＰＥ脂質を含む２２：６多価不飽和ＥＲリポソーム）に加え、２０：４ＥＲリポソーム（２０：４ＰＥ：２０：４ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ、１．５：１．５：１：１）および１８：１ＥＲリポソーム（１８：１ＰＥ：１８：１ＰＣ：ＰＩ：ＰＳ、１．５：１．５：１：１）が含まれた。
【０２５７】
１８．１．リポソーム処置後のＨＣＶｃｃ分泌および感染力をモニターするための方法論：
方法は、急性ＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ感染に関して先に１３＆１４節において記載のものと同じである。
【０２５８】
１８．２．リポソームによる４日間処置の間のＨＣＶｃｃ分泌：
図２３Ａで実証したように、１８：１および２０：４脂質は両方とも無処置対照に比較してＨＣＶｃｃ分泌の増大を導いた（それぞれ２１８％、ＳＤ＝３４．４％および１５９％、ＳＤ＝２１．６％）。２２：６ＥＲリポソームだけが５０μＭの濃度で有意に２７％（ＳＤ＝１１．３％）ＨＣＶ分泌を減少させることが示され；同様の減少が５０μＭの２２：６ＰＥＧ−ＥＲリポソーム処置（２３％、ＳＤ＝６．６％）により観察された。分泌されたウイルス粒子の感染力を測定するために、リポソーム−処置ＨＣＶｃｃに由来する上清を使用してナイーブＨｕｈ７．５細胞を感染させ、感染した細胞数は感染後４８時間目に定量された。図２３Ｂは、すべてのリポソーム処置による、それどころか増大したウイルス分泌を引き起こす１８：１および２０：４ＥＲリポソーム処置による、ＨＣＶ感染力の有意な減少を示す。５０μＭ２２：６ＥＲリポソームによる処置はＨＣＶ感染力を９１％（ＳＤ＝２．２％）減少させた。試験した最も低い２２：６ＥＲリポソームの濃度１μＭでさえ、感染力を５２％（ＳＤ＝５．３％）減少させ、２２：６多価不飽和（ｐｕ）ＥＲリポソームがウイルス感染の強力な阻害剤であることを示唆する。
【０２５９】
図２３Ａは、種々のＥＲリポソーム製剤の存在下における４日間インキュベーション中に、感染Ｈｕｈ７．５細胞（ＭＯＩ＝０．５）からのＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ分泌が５００μｌの細胞上清から定量されたことを示す。分泌は定量ＰＣＲによる上清内のＪＣ−１  ＨＣＶｃｃ  ＲＮＡの定量によって測定される。
【０２６０】
図２３Ｂはリポソーム−処置、ＪＣ−１感染Ｈｕｈ７．５細胞に由来する分泌されたＪＣ−１  ＨＣＶｃｃの感染力を示す。分泌されたＨＣＶｃｃの感染力は、ナイーブＨｕｈ７．５細胞の１時間の感染、続く４８時間のインキュベーションによって確定され、その時点で細胞は固定され、感染細胞の数を定量するための抗−ＨＣＶコア蛋白質、およびすべての細胞を可視化するためのＤＡＰＩにより染色された。
【０２６１】
図２３Ａ〜Ｂのデータは、脂質２２：６を含むＥＲリポソームが、先に記載のＥＲリポソーム（１８：１脂質）と同じように、分泌されたＨＣＶビリオンの感染力を有意に減少させうることを示唆することができる。２２：６多価不飽和脂質からなるＥＲリポソームは現在抗−ＨＣＶ療法開発にとって最も好ましいものである。
【０２６２】
前記の事項は特有の好ましい態様を表すが、本発明はそのように限定されないことは理解されるであろう。当業者は、開示された態様に対して種々の改変が行われてもよいこと、およびそのような改変は本発明の範囲内にあることが意図されることに気がつくであろう。
【０２６３】
本明細書に引用されたすべての刊行物、特許出願および特許はそのまま本明細書に参照として援用される。
【図１】
2011518124.tif 000012
【図２−１】
2011518124.tif 000013
【図２−２】
2011518124.tif 000014
【図２−３】
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【図３】
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【図４】
2011518124.tif 000017
【図５】
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【図６】
2011518124.tif 000019
【図７】
2011518124.tif 000020
【図８−１】
2011518124.tif 000021
【図８−２】
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【図９】
2011518124.tif 000023
【図１０】
2011518124.tif 000024
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2011518124.tif 000030
【図１７】
2011518124.tif 000031
【図１８】
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【図１９】
2011518124.tif 000033
【図２０】
2011518124.tif 000034
【図２１−１】
2011518124.tif 000035
【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２】
2011518124.tif 000038
【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年1月26日(2011.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質粒子中のＰＳ脂質のモル濃度が少なくとも１０％である、ＰＳ脂質を含む脂質粒子を含む組成物。
【請求項２】
脂質粒子がＰＥ、ＣＨＥＭＳ、ＰＩ、ＰＣまたはＳＰ脂質の中の少なくとも１種をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
脂質粒子がＰＥ脂質を含み、そしてＰＥ脂質とＰＳ脂質間のモル比が０．５：１から２０：１まで変動する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
脂質粒子が、ＰＥ、ＰＩおよびＰＣ脂質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
脂質粒子がＰＩ脂質をさらに含み、そして脂質粒子中のＰＳ脂質とＰＩ脂質を合わせたモル濃度が少なくとも１０％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスに関連した疾患または状態を処置するか、または予防するための請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
ウイルスがフラビウイルス科またはレトロウイルス科に属する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルスまたはＨＩＶ−１ウイルスである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
脂質粒子に被包された少なくとも１種の活性薬をさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記の少なくとも１種の活性薬が、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンのような、Ｎ−置換デオキシノジリマイシンを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
脂質粒子の脂質単層または二重層に挿入されるか、または脂質粒子とコンジュゲートする抗ウイルス蛋白質をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
組成物が脂質粒子とコンジュゲートするか、または脂質粒子の脂質単層または二重層に挿入されるターゲッティング部分をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
組成物が少なくとも１種のラベルを含む少なくとも１種の標識脂質をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
少なくとも１種の標識脂質がフルオロフォア−脂質コンジュゲートまたはビオチン−脂質コンジュゲートを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
脂質粒子がリポソームである、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【国際調査報告】
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2011518124.tif 000042
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