(57)【要約】  本発明は、アンチトロンビンＩＩＩの阻害物質、並びに出血の治療又は予防におけるその医学的使用に関する。阻害物質は、後天性若しくは遺伝性出血性障害（例えば血友病）に罹患している対象又は過度の出血により特徴づけられる臨床状態（例えば、手術、外傷、内出血）を有する対象において好ましく使用される。アンチトロンビンＩＩＩの阻害物質は、例えば、アンチトロンビンＩＩＩに特異的に結合して阻害するペプチド、アプタマー、抗体又は抗体断片であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための、アンチトロンビンＩＩＩの阻害物質。
【請求項２】
後天性若しくは遺伝性の出血性障害（凝固性低下）に罹患している対象又は過度の出血により特徴づけられる臨床状態を有する対象における出血の治療及び予防に使用するための、アンチトロンビンＩＩＩの阻害物質。
【請求項３】
阻害物質は、健常人由来のプール血漿に添加された場合に、トロンビン及び第Ｘａ因子及び第ＩＸａ因子のうちの少なくとも１つに添加された際の血漿によるトロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性の低下を、阻害物質なしの同じ血漿によるトロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性の低下と比較して２０％を超えて抑制し、好ましくは、トロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性は、発色基質を用いるアッセイで測定される、請求項２に記載の阻害物質。
【請求項４】
出血性障害は血友病であり、好ましくは、対象は第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子に対する中和抗体を有する血友病患者である、請求項２又は３に記載の阻害物質。
【請求項５】
阻害物質は、予防的な第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子バイパス療法として使用される、請求項４に記載の阻害物質。
【請求項６】
過度の出血により特徴づけられる臨床状態は手術、外傷及び内出血のうちの１つ又は複数である、請求項２又は３に記載の阻害物質。
【請求項７】
ａ）アンチトロンビンＩＩＩの中央のβシートへ挿入可能な化合物、
ｂ）アンチトロンビンＩＩＩに特異的に結合し、アンチトロンビンＩＩＩの中央のβシートへのＲＳＬループの挿入を抑制又は遅延するアプタマー、及び
ｃ）ＡＴに特異的に結合する抗体又は抗体断片
からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の阻害物質。
【請求項８】
ａ）の化合物は、ＲＳＬ残基Ｐ１−Ｐ１４のアミノ酸配列を模倣するペプチド又はペプチド模倣体である、請求項７に記載の阻害物質。
【請求項９】
抗体又は抗体断片は、アンチトロンビンＩＩＩのＲＳＬ配列中のエピトープに特異的に結合し、好ましくは、アンチトロンビンＩＩＩの中央のβシートへのＲＳＬの挿入を阻害する、請求項７に記載の阻害物質。
【請求項１０】
アンチトロンビンＩＩＩのＲＳＬ配列中のエピトープはＲＳＬ残基Ｐ１−Ｐ１４のうちの１つ又は複数を含み、好ましくは、エピトープは、ＲＳＬ残基Ｐ１０周辺、ＲＳＬ残基Ｐ５−Ｐ１０、又はＲＳＬ残基Ｐ３−Ｐ８を含む、請求項９に記載の阻害物質。
【請求項１１】
出血性障害に罹患している対象又は過度の出血により特徴づけられる臨床状態を有する対象の出血の治療又はリスク低下のための方法であって、対象に有効量のアンチトロンビンＩＩＩの阻害物質を投与するステップを含む方法。
【請求項１２】
阻害物質は請求項３〜７のいずれか一項に記載の阻害物質であり、及び／又は治療は請求項８〜１０のいずれか一項に記載の治療である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
化合物をアンチトロンビンＩＩＩの阻害物質として同定する方法であって、
ａ）化合物を健常人由来のプール血漿に添加するステップと、
ｂ）ａ）で得られた化合物含有プール血漿を単離トロンビン及び単離第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つと混合するステップと、
ｃ）ｂ）で得られた混合物中のトロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性を決定し、化合物を含む混合物中の活性を、化合物を含まない同じ血漿と混合されたトロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性と比較するステップであって、好ましくは、トロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性は、発色基質を用いるアッセイで測定される、ステップと、
ｄ）血漿中のトロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性の低下を、化合物を含まない同じ血漿に比べて抑制する化合物を、アンチトロンビンＩＩＩの阻害物質として同定するステップであって、好ましくは、化合物はトロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性の低下を２０％を超えて抑制する、ステップと、
を含む方法。
【請求項１４】
ステップａ）の前に、化合物は、アンチトロンビンＩＩＩに特異的に結合する化合物として選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
化合物は、アンチトロンビンＩＩＩに特異的に結合するものとして選択されたペプチド、アプタマー、抗体又は抗体断片であり、好ましくは、アンチトロンビンＩＩＩのＲＳＬ配列中のエピトープに特異的に結合するものとして選択されたペプチド、アプタマー、抗体又は抗体断片である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野に関し、特に血液凝固因子、その阻害物質、及び止血のためのその使用に関する。より詳細には、トロンビン活性を促進して血液凝固を刺激するための方法を開示する。本発明は、例えば、出血性障害（例えば血友病）による、又は手術若しくは外傷による、又は抗凝固薬の使用による過度の出血を治療又は予防するために、或いは内出血を止めるために使用することができる。
【発明の背景】
【０００２】
血液凝固は、血管が損傷すると直ちにスイッチが入り、血管系が無傷のときはスイッチがオフになっている繊細なプロセスである。このプロセスが不正確に制御されると病変が生じる。出血性障害又は過度の出血は、血液凝固のスイッチの入り方が遅すぎるか弱すぎるときに起こり、血栓性疾患は、血液凝固のスイッチの入り方が早すぎるか強すぎるときに生じる。本発明は、血液凝固を刺激する新規な方法を開示するものであり、したがって、（過度の）出血により特徴づけられる疾患又は臨床状態に適用され得る。そのような状態としては、血友病Ａ又はＢ、手術又は外傷に起因する出血、内出血（例えば、脳出血、胃腸出血）、又は抗凝固薬（例えば、ワルファリン、ヘパリン）の使用に基づく出血が挙げられる。
【０００３】
血液の凝固は体液性応答及び細胞性応答を含む。前者は可溶性フィブリノーゲンの不溶性フィブリンへの変換を導き、後者は血小板血栓の形成を導く。これらの応答は絡み合っている。例えば、体液性応答の間に形成された酵素トロンビンは血小板の強力な活性化因子であり、一方、活性化血小板の膜は、凝固因子複合体（これは効率的な凝固プロセスの要である。）を組み立てる役割を果たす。活性化された血小板血栓、フィブリンスレッド、並びに組み込まれた赤血球及び白血球が一緒になって血餅を構成する。本願は、血液凝固の体液性応答を促進するための新規の方法を扱う。そこで、まず体液性凝血応答について議論する。
【０００４】
体液性凝血応答は、不活性な補因子及び酵素前駆体として循環している一連のタンパク質である凝固因子によって媒介される。これらの因子は一緒になって血液凝固系を形成している。血液凝固の活性化は、不活性な酵素前駆体及び補因子がカスケード様の形式で連続的に活性化されることからなるプロセスを含む。各ステップでは、新たに形成された凝固プロテアーゼが次の因子の活性化を触媒する。活性化は、血液と膜タンパク質組織因子（ＴＦ）との接触により始まる。ＴＦは通常、内皮細胞で発現されていないが、平滑筋細胞のような内皮下の細胞に豊富に存在している。それ故、内皮細胞層が破壊されると、血液がこの構成的に発現されたＴＦに曝露され、これが血液凝固を引き起こす。血液凝固系の活性化中にいくつかの酵素−補因子複合体が形成され、この複合体は、細胞、特に内皮細胞及び活性化血小板の細胞膜に集まる。これらの酵素−補因子複合体の１つがＴＦと活性化第ＶＩＩ因子との複合体（ＴＦ−ＦＶＩＩａ）であり、この複合体では、ＦＶＩＩａがタンパク質分解活性を有し、第Ｘ因子及び第ＩＸ因子（ＦＸ及びＦＩＸ）を活性化することができる。活性化ＦＸ（ＦＸａ）は活性化第Ｖ因子（ＦＶａ）と一緒になってプロトロンビナーゼ複合体を形成し、この複合体は次いでプロトロンビンを活性化して、活性プロテアーゼであるトロンビンにする。ＴＦ−ＦＶＩＩａは第ＩＸ因子をＦＩＸａに変換することもでき、このＦＩＸａは活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）と一緒になってＦＶＩＩＩａ−ＦＸＩａ複合体を生成する。この複合体中の活性プロテアーゼはＦＩＸａであり、これはＦＶＩＩａと同様にＦＸを活性化することができる。
【０００５】
適切な刺激（例えばＴＦ）との接触があると、血液凝固系の活性化がＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体により開始され、ＦＶＩＩＩａ−ＦＩＸａ複合体の作用によって伝播し、ＦＸＩの活性化により増幅される（図１参照）。
【０００６】
生理学的条件下において、多くの止血応答は、ＦＸの十分な活性化（さらにはトロンビン生成）を確実にするために、このＦＩＸ−及びＦＶＩＩＩ依存性の増幅を必要とする。このＦＶＩＩＩ及びＩＸの必要性は、これらのタンパク質の遺伝性欠乏症である血友病Ａ又はＢ（重度の出血性障害であり、それぞれＦＶＩＩＩ又はＦＩＸの欠乏に起因する。）の臨床症状により顕著に示される。
【０００７】
血友病はＸ連鎖先天性出血性障害であり、概して、凝固ＦＶＩＩＩの欠乏（血友病Ａ）又はＦＩＸの欠乏（血友病Ｂ）に起因して生じる（Ｍａｎｎｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００１；３４４：１７７３−１７７９）。この疾患の発生頻度は１０，０００人の男性の出生当たり約１人である。血友病Ａの罹患率は、同じＸ連鎖遺伝性欠乏症である血友病Ｂの罹患率の約５〜６倍である。臨床的に、血友病は、出血症状の重症度に応じて軽度、中等度、重度の血友病に分類される。重度の血友病患者は、幼児期の容易な打撲、（特に関節及び軟組織への）自発的出血、及び外傷若しくは手術後の過度の出血という病歴を有していることが多い。軽度の血友病患者は自発的出血エピソードを患ったことはほとんどないが、大概は、外傷又は手術に起因する過度の出血を経験している。適切な凝固試験により診断が確実となり、患者が血友病Ａ又はＢのいずれに罹患しているかが明らかとなる。重度の血友病Ａは、機能性ＦＶＩＩＩレベルが非常に低いかゼロ（正常レベルの＜１％）であることによって特徴づけられ、一方、軽度の血友病では機能性ＦＶＩＩＩのレベルが正常レベルの５〜１５％である。
【０００８】
血友病患者のオンデマンド及び予防的治療法は典型的には補充療法からなる。補充療法とは、患者の不完全な血液凝固系において、不足している血液凝固因子を補充することに基づくものである。したがって、血友病Ａ及びＢ患者には、出血エピソードを治療又は予防するために、それぞれＦＶＩＩＩ及びＦＩＸ濃縮物が注入される。しかし、欠乏因子の調製物で処置された血友病患者は、その欠失因子に対する中和抗体（阻害物質）が発生するリスクがある。欠失している凝固因子は、これらの患者にとって内在性のものではなく、その結果、免疫系がそれらの因子に対して寛容でなくなる。中和抗体の形成は、重度の血友病Ａ患者の１５〜３０％で起こり（Ｇｏｕｄｅｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６；  １０７：４６−５１；Ｇｏｕｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．  ２００７；１０９：４６９３−４６９７）、血友病Ｂ患者の１〜３％で起こる。特にＦＶＩＩＩ血漿レベルが正常レベルの＜１％に至る重度の遺伝子欠損、例えば、遺伝子欠失又は逆位、ナンセンス及びフレームシフト変異を有する患者は、免疫系がＦＶＩＩＩに寛容でないため、阻害物質を生じる場合がある。阻害物質の循環レベルが高いとき、患者は阻害物質の中和効果を解消するために大量の欠乏因子を必要とする。そのような高用量のＦＶＩＩＩ療法は非常に費用がかかる。代替手段としてＦＶＩＩＩバイパス療法が開発された。この療法の根底にある原理は、ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ複合体の欠乏がＦＶＩＩ、ＩＸ及びＸの活性化形態の使用によりバイパスされることである。そのようなＦＶＩＩＩバイパス療法の例は活性化プロトロンビン−複合体濃縮物及び組換えＦＶＩＩａである（Ｊ  Ａｓｔｅｒｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００７；１０９：５４６−５５１；ＨＲ  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４：３８５８−３８６４；ＷＫ  Ｈｏｏｔｓ，Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１０９：３９５−３９６）。これらのＦＶＩＩＩ−バイパス療法の欠点は、オンデマンド療法にしか適用できないことである。
【０００９】
認可されている唯一の組換えＦＶＩＩＩバイパス療法は組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ；ノボセブン（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ）（登録商標），ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）である。ｒＦＶＩＩａは、直接に又は組織因子と複合体を形成して、活性化血小板の表面上に露出した負に荷電したリン脂質に結合し、それにより損傷部位に対するＦＸの活性化を標的とすることによって止血を刺激する。あるいは、その効果は、ＦＶＩＩに対するＦＶＩＩａの比率の増加によるものであり得る。ｒＦＶＩＩａは、阻害物質を有する患者の７０〜７５％の出血を止める。このｒＦＶＩＩａ又は活性化プロトロンビン複合体を用いたＦＶＩＩＩバイパス療法の限界は、費用が高いことと、半減期が２〜３時間と短いために予防的療法として利用できないことである。しかし、血友病の予防的処置を行えば、血友病性関節症が予防され、生活の質が改善する（Ｍａｎｃｏ−Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００７；；３５７：５３５−４４）。このように、ＦＶＩＩＩ阻害物質を有する血友病患者への予防的ＦＶＩＩＩバイパス療法に対する、実現されていない医学的要求が存在している。本発明の目的は、そのような治療法を提供することである。
【００１０】
いくつかの他の臨床状態は、過度の又は望まない出血、例えば、手術により誘発される出血、戦争又は交通事故による出血、内出血（例えば、脳出血、胃腸出血）、及び抗凝固剤（例えばワルファリン）の使用に関連する出血を伴う。これらの状態は、局所的に適用される止血剤（例えばフィブリンシーラント）又は全身的に投与されるｒＦＶＩＩａによって治療し得る。しかし、ｒＦＶＩＩａを用いたこれらの状態の治療は、血栓−塞栓プロセスを引き起こして重篤な副作用をもたらすリスクがある（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ．２００６；２９５：２９３−２９８；Ｌｅｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１０；３６３：１７９１−１８００）。この血栓−塞栓リスクは、おそらくｒＦＶＩＩａが活性な凝固プロテアーゼであることと関係がある。循環血液にｒＦＶＩＩａを注入すると、循環血液のいたるところで活性な凝固プロテアーゼが存在することになる。さらに、ｒＦＶＩＩａは、その薬力学的効果をモニターする簡単なアッセイ法がないために用量設定が難しい。
【００１１】
本発明の目的は、手術、事故及び他の状態による過度の出血の治療及び予防のための新規の化合物及び方法を提供する。ｒＦＶＩＩａを用いる治療とは対照的に、本発明の新規の化合物及び方法は、オンデマンド療法だけでなく予防的治療法としても使用することができ、治療上必要な用量は、簡単かつ便利な臨床アッセイ法を用いて決定及びモニターすることができる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、過度の出血の治療及び予防のための方法であって、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ）の阻害物質を出血患者又は出血のリスクのある患者に投与して機能的ＡＴのレベルを低下させることを含む方法を提供する。ＡＴ阻害物質が、患者の出血を治療又は予防するための方法として記述されたことはないので、この方法は驚くべきかつ新規なものである。本発明は、血友病、手術、外傷、又は過度の出血が生じる他の状態（例えば、抗凝固剤の使用）において、また、内出血（例えば、脳出血、胃腸出血（例えば、静脈瘤による食道出血））の場合において適用し得る。また、本発明により開示される方法は、出血のリスクのある患者の出血を予防するために使用することができ、例えば、血友病患者において、血友病患者の関節、筋肉及び／又は軟組織における出血を予防するために使用することができる。ＡＴ阻害物質での処置によって、そのような患者において出血を予防することができる。
【００１３】
ある実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＡＴに結合して、ＡＴの機能を阻害し又はヒト又は動物におけるＡＴのクリアランスを増加させる分子である。本発明の他の実施形態において、結合分子は、ペプチド、タンパク質、又は抗体若しくは抗体断片である。また、ＡＴに結合してその機能を阻害する他の分子（例えば化合物）も本発明の範囲内にある。
【００１４】
本発明のある実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＡＴに結合してＡＴの活性を阻害する、ヒト、ヒト化又は動物種由来のモノクローナル抗体又はその断片である。
【００１５】
本発明の他の実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＡＴに結合してヒト又は動物におけるＡＴのレベルを低下させる、ヒト、ヒト化又は動物種由来のモノクローナル抗体又はその断片である。
【００１６】
本発明の他の実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＡＴの活性を阻害するポリクローナル抗体又はその断片である。
【００１７】
本発明の他の実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＡＴに結合してヒト又は動物におけるＡＴのレベルを低下させる、ヒト、ヒト化又は動物種由来のポリクローナル抗体又はその断片である。
【００１８】
本発明の他の実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＡＴに結合してＡＴの活性を阻害する非抗体分子（例えば、アプタマー、タンパク質、ペプチド、化合物）である。
【００１９】
本発明の他の実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＡＴに結合してヒト又は動物におけるＡＴのレベルを低下させる非抗体分子（例えば、アプタマー、タンパク質、ペプチド、化合物）である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＡＴとその標的プロテアーゼとの相互作用に関与するＡＴ上の部位に結合してそれを遮断する。本発明の他の実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＡＴ上の部位に結合し、それによって、ヘパリン又は他のグリコサミノグリカンによるＡＴの機能的活性の増加を抑制する。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＡＴの中央のβシートへのＡＴの反応部位ループの挿入を抑制し、その標的プロテアーゼによるＡＴのタンパク質分解的不活性化を引き起こす。
【００２２】
本発明の別の実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＦＶＩＩＩが欠乏している血友病患者（ＦＶＩＩＩに対する中和抗体を有していても有していなくてもよい。）における出血を治療又は予防するために投与される。他の実施形態において、血友病患者は、ＦＩＸ活性を欠乏している患者（ＦＩＸに対する中和抗体を有しても有していなくてもよい。）である。
【００２３】
本発明の別の実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＦＸＩが欠乏している血友病患者における出血を治療又は予防するために投与される。別の実施形態において、ＡＴ阻害物質は、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ又はＦＸＩ以外の凝固因子が欠乏している患者の出血を治療又は予防するために投与される。
【００２４】
本発明はまた、血友病Ａ患者においてＦＶＩＩＩに対する阻害物質が生成する可能性を低減又は予防するための方法であって、ＡＴ阻害物質を投与して、ＦＶＩＩＩの必要性を低下させることを含む方法を提供する。さらに、本発明は、血友病Ｂ患者においてＦＩＸに対する阻害物質が生成する可能性を低減又は予防するための方法であって、ＡＴ阻害物質を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、非血友病患者の出血を治療又は予防する方法であって、（過度に）出血している患者にＡＴ阻害物質を投与することを含む方法を提供する。すなわち、一実施形態において、本発明は、過度の出血により特徴づけられる臨床状態（例えば、手術、外傷、内出血）の予防又は治療に使用するためのＡＴ阻害物質に関する。
【００２６】
上述の本発明の実施形態によれば、ＡＴ阻害物質の止血量が患者に投与される。前記止血量は好ましくは有効止血量である。
【００２７】
ある実施形態において、血友病患者に投与されるべきＡＴ阻害物質の用量は、血漿中で欠乏した凝固因子を補うことのできるＡＴ阻害物質の濃度を確定するために使用されるインビトロアッセイであって、次のステップａ）〜ｄ）を含むアッセイから計算される。ａ）血友病患者由来の血漿に、組織因子及びＣａ２＋の希釈液を複数の濃度で添加するステップであって、凝固時間は、血漿中で欠乏した凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ）の添加に依存する、ステップ；ｂ）前記凝固因子の不存在下で血友病血漿におけるフィブリン生成又はトロンビン生成を測定するステップ；ｃ）０．０１〜１Ｕ／ｍｌ（１Ｕ／ｍｌは、正常ヒトプール血漿中に存在する因子の量である。）の濃度を達成するように添加された欠乏凝固因子の存在下で、血友病血漿におけるフィブリン生成又はトロンビン生成を測定するステップ；ｄ）前記凝固因子の不存在下かつ種々の濃度のＡＴ阻害物質の存在下で、血友病血漿におけるフィブリン生成又はトロンビン生成（並びにＡＴレベル）を測定するステップ。ＡＴ阻害物質の投与によって達成される機能性ＡＴの所望のレベルは、種々のＡＴ阻害物質レベルでのトロンビン生成及びフィブリン形成を、種々の欠乏因子レベルで観察されるトロンビン生成及びフィブリン形成と比較することによって推定することができる。
【００２８】
別の実施形態において、阻害物質を有する血友病患者に投与されるＡＴ阻害物質の用量は、血漿中で欠乏した凝固因子を補うことのできるＡＴ阻害物質の濃度を確定するために使用されるインビトロアッセイであって、次のステップａ）〜ｃ）を含むアッセイから計算される。ａ）ＦＶＩＩＩ又はＩＸの阻害物質を有する血友病患者由来の血漿に、組織因子及びＣａ２＋の希釈液を複数の濃度で添加するステップであって、凝固時間は、阻害物質を有する血友病患者由来の血漿中の前記凝固因子（例えば、ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸ）の添加に依存する、ステップ；ｂ）阻害物質を有する血友病血漿におけるフィブリン生成又はトロンビン生成を測定するステップ；ｃ）正常プール血漿におけるフィブリン生成又はトロンビン生成を測定するステップ。トロンビン生成及びフィブリン形成を正常化するＡＴ阻害物質の用量は、生体内投与の標的レベルに応じて選択することができる。その後、生体内で使用されるＡＴ阻害物質の用量は、ＡＴ阻害物質を患者に投与し、循環血液中の機能性ＡＴレベルを測定することによってモニターされる。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は、手術、外傷、抗凝固剤の使用又は他の理由により出血している非血友病患者由来の血漿におけるフィブリン形成及びトロンビン生成並びに活性を刺激するＡＴ阻害物質の能力を推定するための方法であって、ａ）患者の血漿に組織因子の希釈液を供給するステップと、ｂ）前記血漿におけるフィブリン生成又はトロンビン生成を測定するステップと、ｃ）０〜１Ｕ／ｍｌ（正常レベルの０〜１００％）のＡＴ活性の低下を引き起こす用量のＡＴ阻害物質の存在下でフィブリン生成又はトロンビン生成を測定するステップと、ｄ）ＡＴ阻害物質の非存在下又は存在下で前記血漿におけるフィブリン生成又はトロンビン生成を測定して、前記血漿におけるフィブリン形成又はトロンビン生成を増加させるＡＴ阻害物質の能力を確定するステップと、を含む方法を提供する。
【００３０】
別の実施形態では、生体内で使用されるＡＴ阻害物質の用量は、ＡＴ阻害物質を患者に投与し、循環血液中の機能的ＡＴレベルを測定することによってモニターされる。
【００３１】
一態様において、本発明は、出血患者又は出血のリスクのある患者を治療する方法であって、患者にＡＴ阻害物質を投与して、正常レベルの８０％未満、好ましくは２０〜８０％、好ましくは正常レベルの２０〜６０％、より好ましくは正常レベルの４０〜６０％、さらに好ましくは正常レベルの約５０％の機能性ＡＴの血漿濃度を得ることを含む方法を提供する。すなわち、好ましくは、阻害物質は、ＡＴの機能的活性を正常なＡＴレベルの少なくとも９０、８０、５０、２０、１０、５、１、０．５、０．２、０．１％に低下させる量で投与される。本明細書において、正常なＡＴは、好ましくは健常人由来のプール血漿におけるレベルと理解される。
【００３２】
ある実施形態において、本発明は、出血エピソードを有する非血友病患者を治療する方法であって、患者にＡＴ阻害物質を投与して、正常レベルの８０％未満、好ましくは２０〜８０％、好ましくは正常レベルの２０〜６０％、より好ましくは正常レベルの４０〜６０％、さらに好ましくは正常レベルの約５０％の機能的ＡＴの血漿濃度を得ることを含む方法を提供する。ある実施形態において、投与されるＡＴ阻害物質の用量は、機能的ＡＴの血漿レベルについてのアッセイを用いてモニターする。
【００３３】
別の態様において、本発明は、ＦＶＩＩＩ欠乏を有する患者を治療する方法であって、最適止血レベル未満のＦＶＩＩＩがＡＴ阻害物質と組み合わせて患者に投与されて、有効止血量の混合物を生成させる方法を提供する。ある実施形態において、ＦＶＩＩＩは、ＡＴ阻害物質と組み合わせて、ＦＶＩＩＩに対する免疫応答が患者において惹起されない十分に低いレベルで投与される。
【発明の詳細な説明】
【００３４】
生体内での血液凝固の過剰な活性化はいくつかの阻害物質によって制御されている。主たる阻害物質はアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ）である。ＡＴは、セリンプロテイナーゼ阻害物質、すなわちセルピンのタンパク質ファミリーに属する。これまで、ＡＴの阻害が、血液凝固を促進するための治療的アプローチを構成することを提示又は示唆した者はいなかった。本発明は、ＡＴの阻害が、血友病又は他の出血性障害を有する患者への治療的選択肢を構成するという意外な知見を開示する。ＡＴの阻害物質（例えば阻害抗体）を出血患者又は出血のリスクのある患者に投与することにより、ＡＴレベルが低下し、より多くのトロンビンの生成とトロンビン活性の延長が可能となり、より多くのフィブリンの生成とより効率的な血餅形成がもたらされる。
【００３５】
発明の原理：
ＡＴは、いくつかの凝固プロテイナーゼ、特に、トロンビン及びＦＸａ、並びにＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ及びＦＸＩａも阻害する。生体内で生成されるトロンビンの量の約８０％がＡＴにより中和されると推定されている。機能性ＡＴのレベル低下（例えば、遺伝的ヘテロ接合性欠損によるもの）により、トロンビン、ＦＸａ、ＦＩＸａ、ＦＸＩａ及びＦＶＩＩａの阻害が少なくなり、より多くのフィブリンが生成する。注目すべきことに、ＡＴレベルの低下の際に、トロンビン活性の半減期が延長されるだけでなく、より多くのトロンビン分子が生成されることとなるが、その理由は、プロトロンビンからトロンビンを生成する凝固プロテアーゼであるＦＸａの半減期も延長されるためである。ＦＸＡ活性の延長により、ＦＸａ１分子当たりのプロトロンビン分子からトロンビンへの変換数が増加する。したがって、ＡＴレベルを低下させることによる凝固促進効果は、トロンビンの半減期の延長と、生成されるトロンビン量の増加によるものである。これは、ｒＦＶＩＩａを用いる治療法のような他のすべてのＦＶＩＩＩバイパス形式がトロンビンの生成を増加させるにすぎず、トロンビンの半減期への効果はなかったことと対照的である。出血患者又は出血のリスクのある患者におけるＡＴ阻害は、文献に記述されたことのなかった新たな治療原理を構成するものである。
【００３６】
血友病の主な欠点は、ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸループを介するトロンビン生成の増幅がないことである（図１参照）。但し、一部のトロンビンは、ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸループが存在しなくても生成する。その理由は、ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体によるＦＸの直接活性化経路は無傷であるためである。血漿において、トロンビンはＡＴにより６０〜９０％阻害される。さらに、ＦＸａ及びＦＩＸａの活性もＡＴにより阻害される。本発明の一実施形態は、ＦＸａ及びトロンビンのＡＴによる阻害を低下させるために治療有効量のＡＴ阻害物質を投与することである。結果として、両方のプロテアーゼの半減期が延長され、ＦＸａ１分子当たりのプロトロンビン分子からトロンビンに変換される数がより大きくなり、トロンビン１分子のフィブリノーゲン分子からフィブリンに変換される数がより大きくなる。このように、機能的ＡＴレベルを低下させることによって、より多くのトロンビンが生成され、トロンビン活性の半減期が延長される。これは、ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸループの機能低下の結果血友病で生じるトロンビンの生成低下を補うものである。注目すべきことに、このＡＴ阻害による二重の効果、すなわち生成されるトロンビン分子数の増加とトロンビン活性の延長という効果は、ＡＴ阻害のコンセプトに特有のものであり、他のＦＶＩＩＩバイパス法のいずれとも共通しない。これにより、ＡＴ阻害は、原理的には最も有効なＦＶＩＩＩバイパスアプローチとなる。
【００３７】
血液凝固の活性化は活性プロテアーゼを必要とすることから、ＡＴの阻害自体は血液凝固の活性化を引き起こすものではない。ＴＦとＦＶＩＩ（ａ）との相互作用、及び続くＦＩＸ及びＦＸの活性化により、ＴＦの発現部位において活性プロテアーゼが生成する（図１参照）。したがって、ＡＴ阻害物質の存在下では機能的ＡＴレベルの低下により凝固が生じ易くなるが、この凝固形成は、主として（完全とまではいかないが）、ＴＦが血液に曝露された身体の場所（例えば、損傷した血管壁）に限定されるであろう。これは、活性プロテアーゼとして投与された組換えＦＶＩＩａが循環系全体にわたって適用されることとなる、組換えＦＶＩＩａでの処置とは対照的である。
【００３８】
発明の態様：
すなわち、第１の態様において、本発明は、医薬として使用するためのＡＴ阻害物質に関する。阻害物質は好ましくは後述のＡＴ阻害物質である。
【００３９】
第２の態様において、本発明は、後天性若しくは遺伝性の出血性障害（凝固性低下）に罹患している対象又は過度の出血により特徴づけられる臨床状態を有する対象における出血の治療及び予防に使用するためのＡＴ阻害物質に関する。あるいは、この態様において、本発明は、後天性若しくは遺伝性の出血性障害（凝固性低下）に罹患している対象又は過度の出血により特徴づけられる臨床状態を有する対象における出血の治療及び予防用の医薬の製造のためのＡＴ阻害物質の使用に関する。この態様において、ＡＴ阻害物質は好ましくは後述の阻害物質である。同様に、後天性若しくは遺伝性の出血性障害（凝固性低下）に罹患している対象又は過度の出血により特徴づけられる臨床状態を有する対象の出血の治療又は予防は好ましくは後述の通りである。
【００４０】
さらなる態様において、本発明は、後天性また遺伝性の出血性障害（凝固性低下）に罹患している対象又は過度の出血により特徴づけられる臨床状態を有する対象の出血の治療又はリスク低下のための方法であって、対象に有効量のＡＴ阻害物質を投与するステップを含む方法に関する。ＡＴ阻害物質は好ましくは後述の阻害物質である。同様に、後天性若しくは遺伝性の出血性障害（凝固性低下）及び過度の出血により特徴づけられる臨床状態は好ましくは後述の通りである。
【００４１】
別の態様において、本発明は、化合物を後述のＡＴ阻害物質として同定するための方法に関する。
【００４２】
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ）の阻害物質：
アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ）は、セルピン（セリンプロテアーゼ阻害物質）のタンパク質ファミリーに属する５８ｋＤａの糖タンパク質である。成熟したタンパク質は４３２個のアミノ酸からなり、４つの糖鎖付加部位を有する。ＡＴは肝臓の実質細胞で産生される。その血漿濃度は約０．１〜０．１５ｍｇ／ｍｌ又は３．５μＭである。ＡＴは、２〜３日の明確な半減期で循環血液から消失する。抗原性及び活性レベルは、正常なレベルに対する割合（％）として又はＵ／ｍｌ［１Ｕはヒトプール血漿における量である。］で表される。ＡＴはα−形態及びβ−形態の両方で発現される。α−ＡＴはＡＴの９０％を構成し、４つすべての位置で糖鎖付加されている。β−ＡＴはＡＴの１０％を構成するにすぎないが、ヘパリンに対する高い親和性を有し、１つの位置（Ｎ１３５）で糖鎖付加されておらず、α−ＡＴより全体的に高い抗凝固効果を示す。
【００４３】
ＡＴは血液凝固経路の最も強力な生理学的阻害物質である。その名称から示唆される通り、ＡＴはトロンビンを阻害する。さらに、ＡＴは、すべての他のタンパク質分解性血液凝固因子（例えば、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ）を阻害する能力を有する。しかし、その主要な抗血液凝固活性はＦＸａ、ＦＩＸａ及びトロンビンの制御による。ＡＴは、生体内でトロンビンに対して５０〜８０％又は最大８０％の阻害効果を示すと推定される。
【００４４】
ＡＴの作用は、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸塩）によって増強され、ＡＴの機能的活性は２〜３ｌｏｇ増加し得る。ヘパリンは、いくつかの硫酸化二糖類を有するタンパク質骨格で構成される。粗調製物は、３〜４０ｋＤａの範囲の分子量を有するヘパリン分子を含有する。ヘパリン中の特有の五糖配列が、ＡＴに高い親和性で結合するために重要である。生体内では、内皮上のヘパラン硫酸塩、及び内皮関連マスト細胞小粒から放出されるヘパリンがおそらくＡＴの補因子の主な供給源である。
【００４５】
ヘパリンは、ＡＴによるプロテアーゼ阻害を加速するために２つの異なるメカニズムを用いる。１つのメカニズムは、反応部位ループ（ＲＳＬ；図２では、このループは反応中心ループ（ＲＣＬ）と呼ばれる（図２参照）。）を標的プロテアーゼにアクセスし易くすることであり、このメカニズムはＦＩＸａ及びＦＸａに対する阻害活性の増強に寄与する。もう一つのメカニズムは、ヘパリンが、ＡＴ及びその標的プロテアーゼ、特にトロンビンに鋳型を提供することである。抗血液凝固活性に加えて、ＡＴは抗炎症及び抗血管形成機能を同様に有する。これらはここでは議論しない。
【００４６】
ＡＴの生理学的重要性は、完全にＡＴを欠損させたノックアウトマウスで示されてきた。これらのマウスは血栓症及び出血により子宮内で死に至る（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０００；１０６：８７３−８７８）。また、ヒトにおいても、ＡＴの完全な欠損は致命的な影響を与えるものと推測される。その理由は、ヘテロ接合性の欠損が２，０００〜５，０００人に１人の割合で生じるのに対し、ＡＴの完全な欠損はヒトにおいて記録されたことがないためである。ヘテロ接合性のＡＴ欠損者では血栓−塞栓障害のリスクが増加している（ＰＳ  ＭｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ  ２００７；６７：１４２９−１４４０）。
【００４７】
ＡＴによる凝固プロテアーゼの阻害効果が、精製タンパク質を正常血漿濃度で有する系で検討されてきた（ｖａｎ‘ｔ  Ｖｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２：４３６７−４３７７）。ＡＴの正常レベルでの存在は、ＦＶＩＩａ／ＴＦを用いて反応を開始させる際のトロンビン生成の開始段階に影響を与えず、また、ＦＶ活性化にも影響を与えなかった。ＡＴが存在する場合のトロンビン形成速度は、阻害されていない反応における速度の３０％に低下し、形成されたトロンビンの量はその生成後に急速に減少した。本発明は、ＡＴレベルの低下が、重度の出血があるか又はそのリスクのある患者の治療原理として使用可能であることを開示する。
【００４８】
ＡＴは、動物、植物、細菌及びウイルスにおいて天然に存在するｆ／ｅで広く見出されるセルピン（セリンプロテアーゼ阻害物質）のタンパク質スーパーファミリーに属する（概観についてはＲｕｂｙ  ＨＰ  Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６；７：２１６．１−２１６．１１を参照のこと）。多くのセルピンが、良く知られた名称を有しており、その名称の多くが、発見につながった機能に言及している。ＡＴなどのいくつかのセルピンでは、従来の名称が、多かれ少なかれ、それらの主な生物学的機能を包含しているが、他のいくつかのセルピンでは、この点で従来の名称が誤解を招きやすいものとなっている。例えば、α１−抗トリプシン及びα１−抗キモトリプシンは、それぞれ消化酵素トリプシン及びキモトリプシンを阻害する能力により発見されたが、その生体内での主要な機能は、それぞれ好中球プロテアーゼ（エラスターゼ、プロテアーゼ３）及びカテプシンＧを阻害することである。セルピンは１６のクレード（Ａ−Ｐ）に分類される。各セルピンの組織的名称はセルピンＸｙであり、ここで、Ｘはクレード、ｙはクレード内の数を表す。この分類によれば、ＡＴはセルピンＣ１である。ヒトの遺伝子は３６種のセルピンをコードしている。多くのセルピンはプロテアーゼ阻害物質として作用するが、一部のセルピンは異なる機能を有する。
【００４９】
セルピンの基本構造は約４００個のアミノ酸で構成され、一部のセルピンは、大きなＮ末端、Ｃ末端、又は内部挿入ループを有する。多くのセルピンは、それらの機能を変化させる翻訳後修飾（例えば、糖鎖付加、硫酸化、リン酸化、酸化）を受ける。セルピンは、９個のα−へリックス（Ａ−Ｉ）及び３つのβシート（Ａ−Ｃ）で構成されるβ−サンドウィッチの束を含む高度に保存された３−Ｄ構造を共通して有する（図２参照）。セルピンのもう一つの典型的な特徴は反応部位ループ（ＲＳＬ）であり、ＲＳＬはタンパク質の本体部分から突き出て、ある種の餌のようにプロテアーゼに提示される。ＲＳＬは、典型的には、Ｎ末端のＰ１７からＣ末端のＰ３’にわたる２０個のアミノ酸で構成される（この命名法に従えば、Ｐ１−Ｐ１’が切断可能な結合（プロテアーゼで切断され得る。）を構成する）。セルピンの通常の天然状態では、βシートＡ、すなわち中央のβシートは５つのストランドで構成されており、ＲＳＬ（ストランド５ＡのＣ末端からストランド１ＣのＮ末端に架橋）が露出されている。注目すべきことに、この立体構造の熱力学的安定性は最適ではなく、中央のβシートへのＲＳＬの組み込みによってより安定な構造が生じる。この安定な立体構造は、（非標的）プロテアーゼによるＲＳＬのタンパク質分解の際に生ずる（この場合、プロテアーゼは、中央のβシートへのＲＳＬの挿入が完了する前にセルピンから放出される。）か、あるいは標的プロテアーゼとの複合体形成の際に生じる（この場合、挿入が終了する時点で、プロテアーゼは、Ｐ１位置のアミノ酸残基に依然として共有結合的に結び付けられている）。この挿入の結果として、活性部位セリンは、プロテアーゼの活性部位における位置からわずかに引き抜かれ、プロテアーゼがＰ１残基から離れる可能性が防がれる。後者の場合、立体構造的に変化したセルピンとその標的プロテアーゼとの間で共有結合的に連結した複合体が残る。
【００５０】
セルピンと標的プロテアーゼとの相互作用は化学量論的である。この反応は次のように記述することができる。
Ｐ＋Ｓ←→ＰＳ→ＰＳ＊→Ｐ＋Ｓ＊
［Ｐ＝プロテアーゼ；Ｓ＝セルピン；Ｓ＊＝変化した安定な立体構造を有するセルピン］
【００５１】
プロテアーゼによる基質としてＲＳＬ（図３のＲＣＬ）の配列が認識されると、セルピンの立体構造が依然として天然の状態（Ｓ）である可逆的な複合体（ミカエリス複合体としても知られる。）が形成される。次の段階において、プロテアーゼは、アミノ酸残基Ｐ１位置とＰ１’位置との間のペプチジル結合の切断を開始し（非標的プロテアーゼの場合、ＲＳＬにおける他のペプチジル結合も同様に切断され得る）、エネルギー的に最も低い立体構造が生じるように、ＲＳＬのＮ末端部分がセルピンの中央のβシートに挿入される。プロテアーゼがＰ１から離れる前に挿入が完了する場合、プロテアーゼの活性部位が歪められ、プロテアーゼのタンパク質分解反応はすぐに中断される（図３の立体構造ｃ）。
【００５２】
これにより、プロテアーゼの活性部位がセルピンのＲＳＬに共有結合的に捕えられ、セルピンが安定な立体構造（Ｓ＊）をとる安定な複合体が生じる。プロテアーゼが加水分解反応を終えた時点で挿入がまだ完了していない場合、プロテアーゼは活性な酵素として離れ、不活性なセルピンでは、切断されたＲＳＬが中央のβシートに挿入される（図３の立体構造ｄ）。必須となるＲＳＬ−活性部位の接触がミカエリス複合体の形成に大きく寄与するが、分子の他の部位もまた関与する。
【００５３】
ＡＴの場合、セルピンと、プロテアーゼであるトロンビン、ＦＸａ及びＦＩＸａと、の間で共有結合複合体が形成され、ある程度、ＦＸＩａ及びＦＸＩＩａも形成され得る。これらのプロテアーゼの阻害効率は、速度定数、特に二次速度定数で記述することができる。これらの定数を表１に示す。
【００５４】
【表１】
2014529606.tif 000002
【００５５】
表１から明らかなように、ＡＴの阻害活性はグリコサミノグリカン（例えばヘパリン）又は合成五糖の存在によって増強される。ヘパリン存在下のＡＴによるプロテアーゼの阻害増強は２つの異なるメカニズムによりもたらされる。１つは中央のβシートＡからのＲＳＬのＮ末端の放出である。このＲＳＬの「解放」はＦＩＸａとＦＸａの阻害増強を説明するが、トロンビンの阻害増強は説明しない。トロンビン阻害増強はいわゆる鋳型メカニズムに起因するもので、このメカニズムは、ヘパリンが鋳型として作用し、トロンビンとＡＴの両方に最適位置で結合し、ＡＴによるトロンビンの最大阻害が可能になることを意味する。
【００５６】
原則として、薬学的に許容されるＡＴ阻害物質はいずれも本発明で使用可能である。本発明での使用に適したＡＴ阻害物質は、血漿（好ましくはヒト血漿、より好ましくは健常人由来のプール血漿）に添加されたときに、（好ましくは、第Ｘａ因子、トロンビン、又はＡＴと相互作用する任意の他のプロテアーゼ（例えば第ＩＸａ因子）を用いて測定される）ＡＴの活性低下を引き起こす阻害物質であることが好ましい。阻害物質は、ＡＴの活性を、正常なＡＴレベルの少なくとも９０、８０、５０、２０、１０、５、１、０．５、０．２、０．１％まで低下させることが好ましい。本明細書において、正常なＡＴは、健常人由来のプール血漿におけるレベルと理解される。あるいは、阻害物質は、ＡＴの活性を、阻害物質添加前のＡＴレベルの少なくとも９０、８０、５０、２０、１０、５、１、０．５、０．２、０．１％まで低下させる。
【００５７】
ＡＴの阻害は、好ましくは、ＡＴによって通常阻害されるタンパク質分解酵素（例えば、ヒト又はウシ由来のトロンビン、第Ｘａ因子又は第ＩＸａ因子）に添加した際の血漿におけるＡＴの効果を阻害物質ありと阻害物質なしとで比較することによって測定される。すなわち、好ましくは、阻害物質は、血漿（好ましくはヒト血漿、より好ましくは健常人由来のプール血漿）に添加された場合に、（単離）トロンビン、（単離）第Ｘａ因子及び（単離）第ＩＩａ因子のうちの少なくとも１つに添加された際の血漿によるトロンビン、第Ｘａ因子及び第ＩＩａ因子のうちの少なくとも１つの活性の低下を、阻害物質なしの同じ血漿によるトロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性の低下と比較して１０、２０、５０、８０、９０、９５、９９、９９．５、９９．８、９９．９％を超えて抑制する。好ましくは、トロンビン及び／又は第Ｘａ因子の活性は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒａｃｔｉｃａｌ−ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ．ｃｏｍ／Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ％２０Ｔｅｓｔｓ／ａｔ＿ａｓｓａｙｓ．ｈｔｍｌ又はＢｅｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ２０００；１１：１２７−３５に記載の発色基質を用いるアッセイで測定される。第Ｘａ因子に対する適切な発色基質は、例えば、下記式を有するＳ−２７６５，Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．２ＨＣｌである。
【化１】
2014529606.tif 000003
【００５８】
ＡＴ活性に関するアッセイは、本明細書において、「ＡＴの阻害を評価するための機能的ＡＴレベルの決定」の項でさらに記述される。
【００５９】
本発明で使用するために好ましいＡＴ阻害物質は、ａ）アンチトロンビンＩＩＩの中央のβシートへ挿入可能な化合物、ｂ）アンチトロンビンＩＩＩに特異的に結合し、アンチトロンビンＩＩＩの中央のβシートへのＲＳＬループの挿入を抑制又は遅延するアプタマー、ｃ）ＡＴに特異的に結合する抗体又は抗体断片、からなる群から選択される阻害物質である。そのような阻害物質については以下でさらに説明される。
【００６０】
ＡＴのペプチド阻害物質：
本発明の一実施形態において、例えば出血している患者のトロンビン形成及びトロンビン活性を増強するために使用可能なＡＴ阻害物質の一クラスは、ＲＳＬ残基Ｐ１−Ｐ１４の配列を模倣するペプチドがＡＴの中央のβシートに挿入できるという観察に基づくものである。中央のβシートへのペプチドの挿入は分子自体のＲＳＬの挿入を抑制する。中央のβシートへのＲＳＬの挿入はセルピンの阻害機能に不可欠であり（図２及び３参照）、ＲＳＬペプチドとインキュベートされるＡＴは標的プロテアーゼ（例えばトロンビン）に対する基質に変換される。言い換えると、ＡＴとのインキュベーションにおいて、ＡＴのＲＳＬアミノ酸配列を模倣したペプチドがＡＴの中央のβシートに結合して挿入し、ＡＴを標的プロテアーゼの基質に変換する（図４参照）。ＡＴのＲＳＬのＰ１−Ｐ１４の配列を模倣するペプチドの効果は、Ｉ  Ｂｊｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：１９７６−１９８２に記述されている。したがって、この実施形態に従う好ましいＡＴ阻害物質は、ＲＳＬ残基Ｐ１−Ｐ１４のアミノ酸配列を模倣するペプチド又はペプチド模倣体である。
【００６１】
このペプチドの好ましい配列は次の通りである。
ＮＨ２−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＣＯＯＨ
【００６２】
注目すべきことに、過度の出血を有する患者の治療法として、ＡＴのＲＳＬ配列を模倣するペプチドを治療的に使用することは、これまで誰からも主張又は示唆されなかった。そのようなペプチドは、上記配列を有するペプチド、又は同じ配列を有するが、薬物動態特性を改善するために他のタンパク質配列、１若しくは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子又は他の分子に結合しているペプチドであり得る。さらに上記配列の変化形でＡＴに結合可能なペプチドも本発明の範囲内にあるものとする。
【００６３】
さらに、ＡＴに結合し、ＲＳＬループの挿入を抑制又は遅延してＡＴを不活性化し、それにより、トロンビン及び他の凝固プロテアーゼに対する阻害活性を低下させる化学物質又は他の化合物（例えばアプタマー）も本特許の範囲内にあるものとする。
【００６４】
ＡＴの抗体阻害物質：
別の実施形態では、本発明で使用するＡＴ阻害物質は、ＡＴに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体（ヒト、マウス、ヒト化マウス、ラクダ科などの他の動物種由来）又はそれらの断片を含む。本明細書における特定の実施例では、ヒトＡＴに対するポリクローナル抗体が、血漿に添加された場合に血漿におけるＡＴ活性を完全に遮断することを実証する。
【００６５】
Ｃ１阻害物質（セルピンの１種でもあり、ＡＴと構造的な相同性を有し、後天性のＣ１阻害物質欠乏症の原因となる。）を中和し、不活性化するモノクローナル自己抗体の研究により、これらの抗体が、Ｐ１０’周辺のＲＳＬ配列の近くに位置するエピトープを認識することが明らかにされた（Ｓ  Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９９６；１５４：  ２００９−２０１３）。これらの抗体は、おそらくは中央のβシートへのＣ１阻害物質のＲＳＬの挿入を妨げる（図４の右側パネルも参照）ことによってＣ１阻害物質を標的プロテアーゼの基質とする（Ｓ  Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１１９−１２８，１９９８）。ＡＴの相同配列に対する抗体又はその断片は、標的プロテアーゼとの相互作用の際にＡＴを不活性化するために使用される。Ｐ１０周辺のＡＴのＲＳＬ配列に対する抗体又はその断片はまた、標的プロテアーゼと相互作用すると、中央のβシートへのＲＳＬの挿入を阻害してセルピンを基質にする。実際、ＡＴのＲＳＬのＰ３−Ｐ８位のアミノ酸を含むエピトープを認識するある抗体は、トロンビンとインキュベートさせるとＡＴを基質にすることが示されている（Ｓ  Ａｓａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９０；２６５：５１３５−６）。さらに、ＡＴを阻害するが、阻害のメカニズムは明らかになっていない他のモノクローナル抗体も文献に記載されている（Ｐ  Ｈｅｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １９８５；６５：１２０１−７；Ｓ  Ｋｎｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈ  １９８９；１８０：３１９−２７）。しかし、出血の治療又は予防に対するそのような抗体の治療的能力は検討されてこなかった。本発明は、そのような抗体が、血友病患者又は他の理由による出血エピソードを有する患者の出血を阻止又は予防するために使用し得ることを開示する。ＡＴの中央のβシートへのＲＳＬの挿入を妨げることによってＡＴを阻害するすべての抗体（完全ヒト抗体、ヒト化抗体、動物種由来の抗体、脱免疫された若しくはされていない抗体）又はその断片が本発明の範囲内に入る。
【００６６】
すなわち、本発明の好ましい阻害物質は、ＡＴのＲＳＬ配列中のエピトープに特異的に結合し、好ましくはＡＴの中央のβシートへのＲＳＬの挿入を阻害する抗体又は抗体断片である。より好ましくは、ＡＴのＲＳＬ配列中のエピトープはＲＳＬ残基Ｐ１−Ｐ１４のうちの１つ又は複数を含み、好ましくは、前記エピトープは、ＲＳＬ残基Ｐ１０周辺、ＲＳＬ残基Ｐ５−Ｐ１０、又はＲＳＬ残基Ｐ３−Ｐ８を含む。
【００６７】
上述のＲＳＬペプチドの配列に対する抗体は、これらの配列を含むペプチド（キャリアタンパク質に結合していても結合していなくてもよい。）で免疫を行うことによって作製される。キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）を結合させたペプチドが、ペプチド配列に対する抗体を生成するための抗原として一般的に使用されている。しかし、他のキャリアタンパク質、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）も使用可能である。さらに、上記ペプチド配列の変異体も、得られる抗体がＡＴに結合する限り免疫に使用できる。
【００６８】
ＡＴ阻害抗体を作製するための好ましい戦略は、ＡＴのＲＳＬのアミノ酸配列を有するペプチドが結合したＫＬＨを用いて適切な宿主を免疫することである。ペプチドは、商業的又は非商業的な提供者から入手してもよく、又は当技術分野で周知の手順に従って作製してもよい。また、市販のペプチド合成装置もこの目的のために使用できる。ペプチドは、よく確立された方法（例えば、配列のＣ末端システインの導入による方法）を介してＫＬＨに結合される。別の方法では、結合試薬としてグルタルアルデヒドを使用する。いくつかの営利的企業は、ＫＬＨ−ペプチド結合体の作製を顧客へのサービスとして提供している。そのようなＫＬＨ−ペプチド結合体は適切な宿主の免疫に使用できる。
【００６９】
好ましい実施形態において、ＫＬＨはキャリアタンパク質として使用され、ＲＳＬ配列（上記参照）を含むペプチド又はＡＴのＲＳＬの配列Ｐ５’−Ｐ１０を含むペプチドは、Ｃ末端での付加的なシステイン残基の導入を介してＫＬＨに結合される。
【００７０】
種々の免疫プロトコルを使用することができ、例えば、静脈内、皮下又は腹腔内の注射と、その後の１又は複数回の追加免疫が挙げられる。適切なアジュバントはフロイントアジュバントである。適切な免疫手順は、ＫＬＨ−ペプチド（濃度は、宿主動物に応じて１０〜５００マイクログラムの範囲であり得る。）を完全フロイントアジュバントと混合して用いて過免疫を行うことである。混合物は皮下注射する。注射は、不完全フロイントアジュバントと混合させた同じＫＬＨ−ペプチド調製物を用いて２〜５回繰り返す。血液サンプルを、３回目、４回目、５回目の注射後１週間の動物から採取し、ＡＴに対する抗体の存在についてスクリーニングする。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態において、ＡＴに対するモノクローナルマウス抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて作製される。モノクローナル抗体は、当業者によく理解されている技術を用いて他の種々の方法で製造することができる。これらの技術の詳細は、（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．７２６，１９８８）において、又は（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．Ｍ．“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，”  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４）若しくは（Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：１−２１，１９８０）に記載されている。
【００７２】
ヒトＡＴに対する抗体を分泌するハイブリドーマは、抗体の存在について培養上清などを分析することによって同定することができる。好ましいスクリーニング法は次の２つの連続するステップを含む。第１のステップは、ＡＴに対するｍＡｂを分泌するハイブリドーマの同定であり、第２のステップは、ＡＴの機能的活性を阻害するｍＡｂの能力の測定である。
【００７３】
抗ＡＴモノクローナル抗体の存在についてハイブリドーマ上清をスクリーニングするにはＥＬＩＳＡが使用される。ＥＬＩＳＡは以下のように実施することができる。精製したヒト血漿ＡＴ（又は組換えヒトＡＴ）をコーティングに使用する（リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）［ＰＢＳ］中２μｇ／ｍｌ；１００μｌ／ウェル）。次いで、残余の非特異的結合部位を、ＰＢＳ／０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）に０．２％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含有させたもの（ＰＢＳ−ＴＧ）を用いて、室温で３０分間インキュベートして遮断する。その後、洗浄（ＰＢＳ−Ｔを用いて５回）の後、プレートを、８０μｌのＰＢＳ−ＴＧと共に２０μｌのハイブリドーマ上清で、３７℃で６０分間インキュベートする。最後に、結合したマウス抗体を、ペルオキシダーゼ結合ポリクローナルヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体での３７℃、１２０分間のインキュベーションによって検出する。最後に、プレートを蒸留水で洗浄し（５回）、３，５，３’，５’−テトラメチルベンジジンで発色させる。
【００７４】
あるいは、抗ＡＴ抗体は放射免疫アッセイで測定される。例えば、抗Ｃ３抗体の検出に関してＨａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８８；１４１：１６０２−９に記載されている方法と同様の方法を用いて測定される。
【００７５】
ＡＴに対する抗体の、ＡＴの機能的活性への効果を評価するために、陽性ハイブリドーマを限界希釈法によりサブクローニングして増殖させる。次いで、抗体を、ハイブリドーマ培養上清からプロテインＧ−アフィニティクロマトグラフィによって精製する。次いで、精製した抗体を精製ＡＴ又はヒト血漿と共にインキュベートし、その後、ＡＴの機能的活性を後述の発色アッセイで測定する。
【００７６】
ＲＳＬ挿入の干渉とは異なるメカニズムを介してＡＴを阻害する抗体又はその断片も本発明の範囲内にあるものとする。これらの抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、脱免疫モノクローナル抗体、ラクダなどの他の動物種由来の抗体、若しくは合成抗体、又はその断片であり得る。本発明の範囲内にある抗体又は抗体断片の主要な特徴は、ＡＴに結合し、ＡＴの機能的活性を阻害することである。これらの抗体は、ＡＴにおける機能的に重要な部位の１つ又は複数を遮断し、その結果、ＡＴの機能的活性を低下させる。
【００７７】
ＡＴを阻害する抗体は、一般に、機能的ＡＴを用いて動物を免疫することによって得ることができる。次いで、抗体（血漿の回収及びＡＴ−抗体の精製によるポリクローナル抗体、又は天然のＡＴを抗原として用いるハイブリドーマ技術を介して作製したモノクローナル抗体）を、ＡＴを抗原として使用するアッセイを用いてスクリーニングする。すべての陽性抗体を、精製ＡＴと共にインキュベートすることによってＡＴに対する阻害活性について試験し、ＡＴの機能的活性を、後述の発色アッセイを用いて試験する。あるいは、抗体を血漿に添加して、その血漿を凝固アッセイ（例えば、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化プロトロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ））で試験することによってスクリーニングすることもできる。さらに、抗体を正常なヒト血漿に添加して、その後、ＡＴの機能的活性を後述の発色アッセイで測定してもよい。これらのアッセイでは、抗体による阻害によりＡＴの機能的活性が低下する。
【００７８】
さらに、ＡＴに結合し、ＡＴのクリアランスの増強によって生体内のＡＴ減少を引き起こすか、又は他のメカニズムによって生体内のＡＴ活性を低下させる抗体又はその断片も本発明の範囲内にあるものとする。
【００７９】
他のＡＴ阻害物質：
ＡＴに結合し、中央のβシートへのＲＳＬの挿入の干渉とは異なるメカニズムによってＡＴを阻害するペプチド、抗体及び他の分子も本発明の範囲内にある。例えば、これらのペプチド又は化合物（例えばアプタマー）は、ＡＴ上の他の機能的部位、例えば、標的プロテアーゼとの相互作用に関与する部位に結合してもよい。ＡＴの機能的活性を好ましくは生体内で阻害することができるいかなる分子も本発明の範囲内にあるものとする。同様に、ＡＴの機能的活性を好ましくは生体内で低下させることができるいかなる分子も本発明の範囲内にあるものとする。
【００８０】
ＡＴの阻害を評価するための機能的ＡＴレベルの決定：
血漿中のＡＴ阻害物質の効果は、血漿又は他の（生体）液中のＡＴの機能的活性を測定するアッセイを用いて評価することができる。ＡＴの機能的活性は、トロンビンに対する阻害活性に基づいて評価することができる。そのようなアッセイは商業的に利用可能である（ｆ／ｅ  Ａｃｔｉｃｈｒｏｍｅ  ＡＴＩＩＩ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ，ＵＳＡ；  ＳＴＡ  Ｓｔａｃｈｒｏｍｅ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  Ｉｎｃ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）。これらのアッセイの基礎は、トロンビンが適切な発色基質を変換し得ることにある（ｆ／ｅ  Ｓ−２２３８，Ｈａｅｍｏｃｈｒｏｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ，Ｍｏｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）。発色基質は、色が生成する条件下でタンパク質分解酵素と反応するペプチドである。それらはいくつかの企業で合成的に製造されており、酵素に対して天然の基質の選択性に類似した選択性を保有するように設計されている。発色基質のペプチド部分に結合しているのは化学基ｐ−ニトロアニリドであり、酵素による切断後に放出されて、黄色を生じさせる。色の変化は分光測定法で追跡することができ、タンパク質分解活性に比例している。ＡＴ測定の場合、ステップ１において、所与の量のトロンビンを血漿とインキュベートし、このステップ中に、機能性ＡＴがトロンビンの一部に結合してこれを不活性化する。次いで、アッセイのステップ２において、残存トロンビン活性を、発色基質を用いて測定する。残存トロンビン活性はＡＴ濃度に反比例する。最適な定量を確実に行うために、トロンビンの血漿とのインキュベーションは、ＡＴの活性を最適化するヘパリンの存在下で行う。さらに、ウシトロンビンを、アッセイの特異性をさらに高めるために使用することが多い。この理由は、ウシトロンビンは、ヒトトロンビンと対照的に、別の血漿阻害物質であるヘパリン補因子ＩＩとほとんど反応しないためである。また、発色基質と組み合わせたヒト又はウシＦＸａをＡＴ活性レベルの測定に使用することもできる。
【００８１】
この発色アッセイを用いて、ＡＴ阻害物質によるＡＴ阻害のレベルをインビトロ及びインビトロの両方で容易に測定することができる。インビトロでは、一定量（例えばＸｍｌ）の血漿を、例えば０．１Ｘｍｌの食塩水又は緩衝液に溶解した一定量のＡＴ阻害物質と共にインキュベートすることによって達成される。この混合物を３７℃でインキュベートし、その後、混合物中のＡＴ活性を、上述のようなＡＴについての発色アッセイで測定する。次いで、得られた値を、血漿に代えてトロンビンと食塩水を含むサンプルで得られた値（機能性ＡＴの１００％阻害に等しい）、並びにＡＴ阻害物質が加えられていない血漿を用いたサンプルで得られた値（０％阻害と等しい。）と比較する。次いで、ＡＴ阻害物質と共にインキュベートした血漿サンプル中のＡＴ阻害量を０％及び１００％阻害対照と比較してＡＴの阻害％で表す。ＡＴ阻害物質と共にインキュベートされる血漿サンプルは、正常血漿、又は出血患者若しくは出血のリスクのある患者（例えば血友病患者）由来の血漿であり得る。患者に投与されたＡＴ阻害物質によるＡＴの生体内での阻害は、ＡＴ阻害物質を投与した際の循環ＡＴレベルを、この段落に記載の発色アッセイを用いて測定することによって評価することができる。
【００８２】
本発明の臨床応用：
ＡＴ阻害物質は出血性障害の予防的又はオンデマンド療法のために適用され得る。すなわち、一実施形態において、本発明は、出血性障害（凝固性低下）に罹患している対象の出血を治療又は予防するために使用するＡＴ阻害物質に関する。出血性障害は後天性又は遺伝性の出血性障害であり得る。好ましい実施形態において、出血性障害は血友病（例えば、血友病Ａ又はＢ）である。より好ましくは、ＡＴ阻害物質は、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子に対する中和抗体と共に血友病対象の処置に使用される。そのような場合において、阻害物質は、好ましくは予防的な第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子バイパス療法として使用される。
【００８３】
本発明の１つの適用は、阻害物質（ＩＸのＦＶＩＩＩに対する中和抗体）を用いて血友病患者の緊急又は予防的処置を行うことである。血友病における出血症状の重症度は概して凝固因子のレベルと相関する。重度の血友病患者は、ＦＶＩＩＩが無視できる量（正常レベルの＜１％）しかなく、多くの部位で自発的に出血する場合がある。しかし、最も頻度の高い部位は関節（７０％〜８０％）（特に膝及び肘）、及び筋肉／軟組織（１０％〜２０％）である。他に大量出血（５％〜１０％）、ときには中枢神経系の出血（＜５％）も生じる。さらに、血友病患者では、手術又はその他の外傷後に過度の出血が生じ得る。血友病における凝固因子の予防的な補充は、欠乏因子の循環レベルを常時１％超に維持して関節及び軟組織における自発的出血を予防することを目的とするが、オンデマンド療法とは対照的に血友病性関節症を大きく予防する（ＭＪ  Ｍａｎｃｏ−Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００７；３５７：５３５−４４）。特に、ＦＶＩＩＩが非常に少ないか全くない患者は、外因性のＦＶＩＩＩで処置された場合、自身の免疫系が、投与されたＦＶＩＩＩを外来抗原とみなして寛容しないため、中和抗体が発生するリスクがある。実際に、重度の血友病患者の２０〜３０％にそのような中和抗体が発生しており（Ｊ  Ｇｏｕｄｅｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００６；１０７：４６−５１；  ＳＣ  Ｇｏｕｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２００７；１０９：４６９３−４６９７）、このような中和抗体は、投与されたＦＶＩＩＩの効力を阻害することからＦＶＩＩＩ阻害物質としばしば称される。現在のところ、血友病患者に適用し得る唯一の予防的治療法は欠乏因子の補充療法である。しかし、ＦＶＩＩＩに対する阻害物質を有する患者の場合には、投与されたＦＶＩＩＩが阻害物質により中和されるか、抗体がＦＶＩＩＩに結合することによって循環血液から急速に取り除かれるため、予防的療法は事実上成り立たない。本発明によれば、これらの患者の血液凝固におけるフィブリン形成の欠陥を、循環ＡＴの機能的活性を低下させるＡＴ阻害物質の一定量を投与し、第Ｘａ因子の阻害の減少及びトロンビン活性の延長によりフィブリン形成を増加させることによって回復させることができる。要求されるＡＴ阻害の程度は、ＡＴ阻害物質を血友病患者に投与した際の機能的ＡＴの生体内レベルを測定することによってモニターすることができる。一方、効果的な止血のために要求される阻害の程度は、種々の量のＡＴ阻害物質の存在下で血友病血漿中の低濃度ＴＦによってトロンビン生成を誘導するインビトロの実験に基づいて推定することができる。
【００８４】
別の実施形態において、本発明は、過度の出血により特徴づけられる臨床状態の予防又は治療に使用するためのＡＴ阻害物質に関する。過度の出血により特徴づけられる臨床状態は、例えば、手術、外傷及び内出血のうちの１つ又は複数であり得る。すなわち、本発明はさらに、外傷のある患者又は戦争犠牲者における失血を低減又は予防するための方法であって、ＡＴ阻害物質を患者に投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、手術（例えば、冠状動脈バイパス又は他の血管系手術）を受けている患者における失血を低減又は予防するための方法であって、ＡＴ阻害物質を患者に投与することを含む方法を提供する。本発明はさらに、脳内出血が生じている患者における脳損傷を低減又は予防するための方法であって、ＡＴ阻害物質を患者に投与することを含む方法を提供する。また本発明は、内出血（例えば、食道静脈瘤からの出血、非ステロイド抗炎症剤の使用による出血）を有する患者における失血を低減又は予防するための方法であって、ＡＴ阻害物質を患者に投与することを含む方法を提供する。また、本発明は、抗凝固剤の使用により出血している患者の失血を低減又は予防するための方法を提供する。本発明は、手術、外傷、過度の出血が生じる他の状態（例えば、抗凝固剤の使用）において、また、内出血（例えば、脳出血、胃腸出血（例えば、食道静脈瘤からの出血））の場合において適用し得る。また、本発明により開示される方法は、出血のリスクのある患者の出血を予防するために使用可能であり、例えば、血友病患者において、血友病患者の関節、筋肉及び／又は軟組織における出血を予防するために使用可能である。
【００８５】
本発明に従って、後天性又は遺伝性の出血性障害（凝固性低下）を有する対象又は過度の出血により特徴づけられる臨床状態を有する対象における出血の治療及び予防に使用する場合、アンチトロンビンＩＩＩの阻害物質は、ＡＴの活性を、正常なＡＴレベルの少なくとも９０、８０、５０、２０、１０、５、１、０．５、０．２、０．１％に低下させる用量（ここで、正常なＡＴレベルは上述の通りである。）で使用することが好ましい。
【００８６】
生体内で使用するＡＴ阻害物質の用量の手引きとなる機能的なＡＴレベルの評価：
血漿中のＡＴ阻害物質の効果は、上述の血漿中のＡＴの機能的活性を測定するアッセイを用いて評価することができる。生体内で達成されるべきＡＴ阻害のレベルは、出血性障害を有する患者由来の血漿サンプルを用いてインビトロで評価し得る。血友病血漿の場合、種々の濃度のＡＴ阻害物質で補充した血漿はＦＶＩＩＩ−免疫枯渇血漿（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又は血友病患者由来の血漿であり得る。次いで、これらの血漿サンプル中のトロンビン形成がＴＦの添加により開始される（例えば、Ｉｎｎｏｖｉｎ，Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｂ４２１２−５０）。ＴＦ濃度をまず選択して、このＦＶＩＩＩ枯渇血漿又は血友病血漿中でＦＶＩＩＩ依存性トロンビン生成又はフィブリン形成を生じさせる。これは、正常レベルの０．１％（０．００１Ｕ／ｍｌ）〜２５％（０．２５Ｕ／ｍｌ）の範囲の種々の濃度のＦＶＩＩＩ（重度〜軽度の血友病状態を模倣する。）の存在下で、血漿サンプルを１：１０００〜１：８００００希釈のＩｎｎｏｖｉｎとインキュベートすることによって達成される。フィブリン生成は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロタイタープレートリーダー及びＳｏｆｔｍａｘ  ｐｒｏソフトウェアの使用により適時に測定することができる。あるいは、トロンビン生成は、色素形成又は蛍光形成基質（ｆ／ｅ、ＤｉａＰｈａｒｍａより提供されるＴｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＴＧＡ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて評価される。次いで、この系においてＦＶＩＩＩ用量依存性トロンビン−又はフィブリン生成を誘導するＴＦ濃度を選択する。
【００８７】
フィブリン形成又はトロンビン生成へのＡＴ阻害物質の効果を評価するために、血友病患者由来又はＦＶＩＩＩ欠乏血漿サンプルを種々の量のＡＴ阻害物質とインキュベートして、（上記の手順で評価される）機能的ＡＴレベルを２０、４０、６０、８０又は１００％低下させる。コントロールとして、血漿サンプルに、種々の濃度のＦＶＩＩＩ（ｆ／ｅ  Ｂａｘｔｅｒ｛リコンビネート［Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ］（登録商標）｝又はＢａｙｅｒ｛コゲネート［Ｋｏｇｅｎａｔｅ］（登録商標）｝の組換えＦＶＩＩＩ）を補充する。混合後、サンプルを、ＦＶＩＩＩ依存性トロンビン生成及びフィブリン形成を生ずるように（前述のように）選択した濃度でＴＦを添加した際のフィブリン生成又はトロンビン生成について評価する。次いで、このトロンビン生成及び／又はフィブリン形成を上述のように測定する。機能性ＡＴレベルの低下（ＡＴ阻害の増加）した血漿サンプルで観察される増強した（促進された）フィブリン生成及び／又はトロンビン生成を、ＦＶＩＩＩを用いて得られた結果と比較することができる。ＦＶＩＩＩの不足を補うＡＴ阻害の所望のレベルは、中等度の血友病、軽度の血友病、又は血友病でない状態を模倣するように選択することができる。次いで、血漿中で達成すべきＡＴ阻害物質の対応レベルを計算することができる。
【００８８】
ＡＴ阻害物質とＦＶＩＩＩとの同時投与も考慮することができる。そのような同時投与はＦＶＩＩＩの必要性を低下させ、免疫原性の危険及び阻害物質発生の機会を減少させることができる。患者において、第ＶＩＩＩ因子の投与は、十分に低いレベル、例えば患者にＦＶＩＩＩに対する免疫応答が発生しない程度に十分低いレベルに低減することができる。例えば、血友病患者に、０．００１〜０．０５Ｕ／ｍｌ（例えば０．０１Ｕ／ｍｌ）の血漿濃度を達成させるＦＶＩＩＩの量を投与することができ、同時に、本発明に従ってＡＴ阻害物質を用いて患者を処置することもできる。
【００８９】
血友病だけでなく他の多くの医学的障害においても、従来の治療法を損なわせる出血がごく普通に生じ得る。現在のところ、適応外使用でのｒＦＶＩＩａがこれらの状態の唯一の治療法である。これらの状態としては、頭蓋内出血、肝臓病、手術（例えば、心肺バイパス手術、脊柱手術、前立腺手術、同所性肝移植）の後の出血、外傷に関連した出血、抗血液凝固剤（例えばワルファリン）の使用に関連した出血、及び他のものが挙げられる。
【００９０】
脳内出血は、卒中の最も障害性の高い形態の一つである。この障害を有する患者の３分の１以上が発病後１か月以内に死亡し、大多数が重度に衰弱し、機能的な独立を回復するのは２０％のみである。現在、脳内出血に対する有効な治療法はないが、組換えＦＶＩＩａの投与による血液凝固の刺激が有望な結果を示している（ＳＡ  Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００５；３５２：７７７−８５）。血腫の体積は、脳内出血後の死亡率及び機能的帰結の重大な決定要素であり、初期の血腫の成長は神経学的悪化の重要な原因である。ｒＦＶＩＩａによりこの体積の増加が縮小されることが示された。フェーズ３試験において、梗塞のサイズに対するｒＦＶＩＩａの好ましい効果が再び示され、臨床的には、ｒＦＶＩＩａは血腫の成長を縮小させたが、脳内出血後の生存率又は機能的帰結は改善しなかった（ＳＡ  Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００８；３５８：２１２７−３７）。
【００９１】
アルコール性若しくは肝炎後肝硬変又は他の疾患による肝臓病を有する患者は、凝固因子の循環レベルの低下をもたらす肝臓による凝固因子の合成低下、並びに食道及び胃の静脈瘤の存在による重度の出血が生じるリスクがある。これらの患者は、現在、凝固因子濃縮物又はｒＦＶＩＩａの注入により処置されている。重度の出血は、種々の凝固因子の循環レベルの低下により、肝移植、及び非硬変患者の部分的肝切除の間に生じる場合もある。過度の出血は、心臓手術を受けている患者にも生じ得る。この出血リスクの増加は、体外酸素供給器用のプライミング流体の使用の結果としての血液希釈、抗血液凝固剤の使用、及び代用血管の機械的な問題による凝固因子の血漿レベルの低下によるものである。
【００９２】
抗血液凝固剤は、心房細動、深部静脈血栓症、心筋梗塞及び他のものを含む多くの血栓−塞栓疾患に使用されている。経口の抗血液凝固剤で処置された患者は、機能的なビタミンＫ依存性血液凝固タンパク質のレベルが低下し、出血性合併症のリスクがある。出血の発生率は、治療の国際標準比（ＩＮＲ）で１か月当たり約０．６〜０．７％であり、大量出血イベントの発生率も相当にある。したがって、抗ビタミンＫ効果を逆行させる能力が重要となる。緊急の場合、血漿又はプロトロンビンの複合濃縮物、及び組換えＦＶＩＩａが使用される。代替手段として本発明を使用することができる。本発明の利点は、ＡＴ阻害物質を受けている患者の機能的ＡＴレベルを測定することによって血液凝固促進効果を決定できるということである。
【００９３】
前述の臨床状態において、並びに出血リスクの増加又は進行中の出血がある他の疾患において出血を予防又は阻止することが医学的に必要である。出血を止めるには、組換えＦＶＩＩａ又は血漿由来活性化プロトロンビン複合体（例えばＦＥＩＢＡ）が唯一利用可能である（Ｊ  Ａｓｔｅｒｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１０９：５４６−５５１；ＨＲ  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４：３８５８−３８６４）。これらのいずれも出血の予防には使用できない。さらに、これらの薬剤の効力又は副作用を予測する良好なインビトロアッセイがない。本発明は、処置の効果が測定及びモニター可能であり、また、予防的にだけでなくオンデマンド療法にも使用し得る点で、上記血液凝固促進剤に対する選択肢を提供するものである。本発明は、ＡＴ阻害物質を、出血のリスクのある患者又は出血している患者に投与することで構成される。投与されるＡＴ阻害物質の量の薬理学的制御は、機能的ＡＴの血漿レベルを測定することによって達成し得る。
【００９４】
トロンビン形成を促進するＡＴ阻害物質の有効濃度の評価：
上述のように、生体内でのＡＴ阻害の標的レベルは、出血性障害を有する患者由来の血漿サンプルを用いてインビトロで評価し得る。血液凝固を導くＴＦの添加の際、フィブリン生成は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロタイタープレートリーダー及びＳｏｆｔｍａｘ  ｐｒｏソフトウェアの使用によって適時に測定することができ、トロンビン生成は発色基質又は蛍光発生基質（ｆ／ｅ  ＤｉａＰｈａｒｍａ製のＴｅｃｈｎｏｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＴＧＡ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて評価することができる。
【００９５】
種々の量のＡＴ阻害物質を含む患者由来の血漿サンプルにおけるトロンビン生成及びフィブリン形成の結果を、正常な対照由来の血漿サンプルで得られた結果と比較する。次いで、正常対照由来の血漿サンプルで観察される範囲にトロンビン生成及びフィブリン形成を回復させることのできるＡＴ阻害物質の量、並びに生物学的利用能及び薬物動態特性に基づいて、投与すべきＡＴ阻害物質の量を計算する。投与すべき用量は、上述のアッセイを用いて、患者にＡＴ阻害物質を投与する際の循環ＡＴ活性レベルを測定することによって確認する。
【００９６】
ＡＴ阻害物質の医薬組成物：
ヒトへの投与について、本発明は、ＡＴ阻害物質と、薬学的に許容される担体若しくは賦形剤と、を含む医薬組成物を使用し得る。本発明において、「薬学的に許容される」とは、担体又は賦形剤が、利用される用量及び濃度で、それらが投与される患者に何ら不要又は有害な効果を引き起こさないことを意味する。そのような薬学的に許容される担体及び賦形剤は当分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  ［２０００］；及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  ［２０００］参照）。本発明のＡＴ阻害物質は、滅菌溶液として製剤化及び投与されることが好ましいが、凍結乾燥調製物を利用することも本発明の範囲内にある。滅菌溶液は、滅菌濾過、又は当技術分野で公知の他の方法によって調製される。次いで、溶液を凍結乾燥し、薬学的投与容器に充填する。溶液のｐＨは、概してｐＨ３．０〜９．５、例えばｐＨ５．０〜７．５である。タンパク質又はペプチドは、典型的には、適切な薬学的に許容される緩衝液を有する溶液に含有され、また、タンパク質の溶液は塩を含んでもよい。ある実施形態では洗浄剤が添加される。本発明で使用するために、ＡＴ阻害物質は注射用製剤に製剤化してもよい。非経口製剤は、本発明での使用に適しており、好ましくは静脈投与のために適している。これらの製剤は、治療有効量のＡＴ阻害物質を含有しており、滅菌液体溶液、液体懸濁液、又は凍結乾燥形態であり、任意選択で安定剤又は賦形剤を含有する。典型的には、凍結乾燥組成物は、適切な希釈液（例えば、注射用滅菌水、滅菌生理食塩水）で再構成される。
【００９７】
ＡＴ阻害物質を用いた出血性障害を有する患者の処置：
ＡＴ阻害物質は、静脈注射により投与されてもよく、他の投与経路及び／又は部位に投与されてもよい。必要とされる用量は特に臨床状態に依存する。
【００９８】
本発明者らは、血友病血漿におけるトロンビン及びフィブリン生成に対するＡＴ阻害の種々の程度の効果を、ある用量範囲のＦＶＩＩＩの効果と比較して評価する方法を上述した。ＡＴ阻害物質を用いる予防的処置の場合、先の「生体内で使用するＡＴ阻害物質の用量の手引きとなる機能的なＡＴレベルの評価」の項に記述される約０．３ＵのＦＶＩＩＩの補充に相当する阻害の程度と等価である、類似の程度のＡＴ阻害が望ましい。ＡＴ阻害物質の薬物動態特性を考慮すると、インビトロの実験と同程度に生体内でのＡＴの阻害を生じさせる用量を推定し得る。ＡＴ阻害物質投与後、患者における機能的ＡＴレベルをモニターすることによって、ＡＴ阻害の所望のレベルが実際に患者で生じているかがチェックされる。
【００９９】
急性出血エピソードの場合、ＡＴ阻害物質は、用量を少し増やし、出血が停止するまでＡＴの機能的レベルの指標を得ながら投与してもよい。血友病以外の他の原因による出血エピソードを有する患者の治療も、同様の戦略を用いて行うことができる。出血が止まるまでＡＴ阻害物質を投与してＡＴの機能的レベルをゆっくり低下させる。ＡＴ阻害物質投与後の機能的ＡＴレベルのモニタリングは上述のアッセイを用いて行う。
【０１００】
化合物をＡＴ阻害物質として同定する方法：
さらなる態様において、本発明は、化合物をＡＴ阻害物質として同定する方法に関する。好ましくは、この方法は、（ａ）化合物を健常人由来のプール血漿に添加するステップと、（ｂ）ａ）で得られた化合物含有プール血漿を単離トロンビン及び単離第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つと混合するステップと、（ｃ）ｂ）で得られた混合物中のトロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性を決定し、化合物を含む混合物中の活性を、化合物を含まない同じ血漿に混合されたトロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性と比較するステップであって、好ましくは、トロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性は、発色基質を用いるアッセイで測定される、ステップと、（ｄ）血漿中のトロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性の低下を、化合物を含まない同じ血漿に比べて抑制する化合物を、ＡＴの阻害物質として同定するステップであって、好ましくは、化合物はトロンビン及び第Ｘａ因子のうちの少なくとも１つの活性の低下を５０％を超えて阻害する、ステップと、を含む。この方法の好ましい実施形態において、化合物は、ステップ（ａ）の前に、ＡＴに特異的に結合する化合物として選択される。この方法において、化合物は、ＡＴに特異的に結合するように選択されたペプチド、アプタマー、抗体又は抗体断片であることが好ましく、より好ましくは、ペプチド、アプタマー、抗体又は抗体断片は、ＡＴのＲＳＬ配列中のエピトープに特異的に結合するように選択されたものである。
【０１０１】
本明細書及び特許請求の範囲において、動詞“ｃｏｍｐｒｉｓｅ”（「含む」）及びその変化形は、非限定的な意味でその動詞の後に続く項目を含むことを意味するために使用され、特に言及されていない項目を排除するものではない。さらに、不定冠詞“ａ”又は“ａｎ”による要素への言及は、文脈により明らかに要素が一つであること及び要素の一つだけであることが要求されない限り、複数の要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞“ａ”又は“ａｎ”は、通常「少なくとも一つ」を意味する。
【０１０２】
本明細書で引用されるすべての特許及び参考文献は、言及されることによりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０１０３】
以下の実施例は例示目的でのみ提供され、いかなる様式でも本発明の範囲の限定を意図するものでない。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】単純化した血液凝固スキームを示す。活性化は、組織因子（ＴＦ）への血液の曝露に始まり、ＴＦは血漿ＦＶＩＩ（ａ）と複合体を形成する。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体はＦＸを活性化してＦＸａとし、次いでＦＸａはＦＶと複合体を形成する。ＦＸａ／ＦＶａ複合体は、酵素前駆体プロトロンビンを、血液凝固の中心的酵素であるトロンビンに変換する。この経路は血液凝固の基礎経路と考えられる。この基礎経路は、２つの経路、すなわち１つはＦＩＸとＦＶＩＩＩとで構成される経路、もう一つはＦＸＩで構成される経路で増幅される。ＦＩＸ／ＦＶＩＩＩ経路はＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体により活性化され、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体はＦＩＸをＦＩＸａに活性化する。ＦＩＸａ／ＦＶＩＩＩａ複合体中のＦＩＸａはタンパク質分解活性を有し、ＦＸをＦＸａに活性化できる。別の増幅ループは、トロンビンによる活性化の際にＦＩＸも活性化し得るＦＸＩからなる。図には示されていないが、ＡＴ及びリン脂質補因子を含む種々の凝固阻害物質がある。
【図２】セルピンＡ１の構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）ｃｏｄｅ  １ＱＬＰ；ＰＲ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １９９６；３：６７６−６８１）を示す。反応中心ループ（ＲＣＬ）は分子の頂部にある。点で描かれた矢印は、反応中心ループが挿入される中央のβシートの「溝」を示す。
【図３】プロテアーゼを有するセルピンの阻害作用の構造的メカニズムを示す。示されている構造は、ＳＥＲＰＩＮＡ１  Ｐｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）コード１ＱＬＰの構造である。経路ｂ→ｃ：プロテアーゼ−セルピン相互作用は、プロテアーゼの活性部位セリンが、セルピンの反応部位ループ（＝反応中心ループ，ＲＣＬ）のＰ１残基に結合している安定な共有結合複合体をもたらす。結果として、プロテアーゼは、歪められた不活性な状態で分子の底部に掛かっている。経路ｂ→ｄ：セルピン−プロテアーゼ複合体は、中央のβシートへのＲＳＬの挿入が完了する前に分離され、セリンプロテアーゼの活性部位の立体構造的変化が誘導される。結果として活性プロテアーゼが放出され、安定な立体構造を有する不活性なセルピンが残る。この状況において、セルピンはプロテアーゼの基質のように作用し、立体構造的なトラップを回避する。参考文献：ＰＲ  Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １９９６；３：６７６−６８１；Ａ  Ｄｅｍｅｎｔｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３；２７８：３７８８１−３７８８７；ＪＡ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２０００；４０７：９２３−９２６；Ｈ  Ｌｏｅｂｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １９８４；１７７：５３１−５５７。
【図４】いくつかのＡＴ阻害物質のメカニズムを描いた略画である。ＡＴの中央のβシートに挿入されるペプチド、又は中央のβシートへのＲＳＬの挿入を抑制するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の効果が示されている。略画の左側の部分は通常の状況を示しており、ＲＳＬが標的プロテアーゼによって切断されると、切断されたＲＳＬ（残基Ｐ１−Ｐ１４）が中央のβシートに挿入され、これによりプロテアーゼの活性部位の３Ｄ構造が歪められ、プロテアーゼを不活性にする。右側では、ＲＳＬのＰ１−Ｐ１４配列を模倣するペプチドが中央のβシートに挿入され、これによりＡＴのＲＳＬ挿入が抑制される。ＡＴの代替的阻害物質として、ＲＳＬのＰ４−Ｐ１４配列に結合するｍＡｂは中央のβシートへのＲＳＬの挿入を抑制し、ＡＴを標的プロテアーゼの基質にする。
【図５】ＡＴに対するアフィニティ精製ヤギポリクローナル抗体（抗ＡＴ）が、トロンビンを用いて測定される新鮮なヒト血漿中のＡＴの活性を完全に阻害することを示す。アフィニティ精製ヤギ抗ＡＴ抗体（２５μｌ中、２０μｇ）を、２５μｌの１：１０希釈した新鮮なヒト血漿に添加し、１５分間、室温でインキュベートした。次いで、５０μｌの混合物をトロンビン（５０μｌ）と共にインキュベートし、残存するトロンビン活性を、５０μｌの発色基質エチル−マロニル−Ｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．ＡｃＯＨ（２ｍｇ／ｍｌ）の溶液に添加して測定した。次いで、混合物を４０５ｎｍで毎分測定した。ＯＤ値をＹ−軸に示し、時間（分単位）をＸ−軸に示した。種々の濃度の血漿を試験して用量応答曲線を作成した。１００％血漿により、添加されたトロンビンの活性が強力に阻害されること、及びＡＴに対する抗体の追加（１００％血漿＋抗ＡＴ）により、この血漿の効果が完全に阻害されることに留意されたい。
【図６】ＡＴに対するアフィニティ精製ヤギポリクローナル抗体（抗ＡＴ）が、ウシＦＸａを用いて測定される新鮮なヒト血漿中のＡＴの活性を完全に阻害することを示す。アフィニティ精製ヤギ抗ＡＴ抗体（７．５μｌ中、６μｇ）を、７．５μｌの１：５希釈した新鮮なヒト血漿に添加し、１５分間、室温でインキュベートした。次いで、１５μｌのヘパリン（２．５Ｕ／ｍｌ）を添加し、混合物を３０分間、３７℃でインキュベートした。次いで、７５μｌの発色基質ＭＡＰＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（８．４ｕｍｏｌ／ｍｌ）を添加し、混合物をさらに３０分間インキュベートした。最後に、ウシＦＸａ（７５μｌ）を添加し、残余のＦＸａ活性を４０５ｎｍで毎分測定した。ＯＤ値をＹ−軸に示し、時間（分単位）をＸ−軸に示した。種々の濃度の血漿を試験して用量応答曲線を作成した。１００％血漿により、添加されたＦＸａの活性が強力に阻害されること、及びＡＴに対する抗体の追加（１００％血漿＋抗ＡＴ）により、用量依存的にこの血漿の効果が阻害されることに留意されたい。
【図７】ＡＴに対するアフィニティ精製ヤギポリクローナル抗体が新鮮なヒト血漿中のトロンビン生成を促進することを示す。精製ヤギ抗−アンチトロンビンＩＩＩ抗体（ａ−ＡＴ）を新鮮なヒト血漿に添加した。次いで、混合物を組織因子と共にインキュベートして血液凝固系の活性化を誘導した。混合物中のトロンビン生成を、リアルタイムで発色基質を用いて測定し、標準物質を参照としてｎＭで表した。同量のＴＦの添加の際に生成されるトロンビンの量が２倍を超えて増加することに留意されたい。
【図８】ＡＴに対するアフィニティ精製ヤギポリクローナル抗体が、ＦＶＩＩＩ欠乏血漿中のトロンビン生成を促進することを示す。精製ヤギ抗−アンチトロンビンＩＩＩ抗体（抗ＡＴ）を血漿試料に添加した。次いで、混合物を組織因子と共にインキュベートして血液凝固系の活性化を誘導した。混合物中のトロンビンを、発色基質を用いて測定した。ＡＴを完全に阻害（２５０μｇ／ｍｌ）した際にサンプル中で生成されるトロンビンの量が２倍を超えて増加することに留意されたい。
【実施例】
【０１０５】
実施例１（ＡＴに対するポリクローナル抗体を用いた血漿中のＡＴ活性の阻害）：
抗体がヒト血漿中のＡＴ活性を確かに阻害し得ることを示す例として、ポリクローナル抗体を、ヒトＡＴで免疫したヤギの血清から精製した（Ｂｉｏｃｏｎｎｅｃｔ，Ｈｕｉｓｓｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｒ：ＡＨＰ１７５０）。精製ＡＴ（Ｋｙｂｅｒｎｉｎ  Ｐ，ＣＳＬ−Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ，Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｒ：８３１６７１１１Ａ）を、製造者の指示に従ってＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｉｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に結合させた（１グラムのＣＮＢｒ活性化セファロースに対して約２５ｍｇのＡＴ）。ビーズを洗浄し、次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）で１：２希釈した２．５ｍｌのヒトＡＴに対するヤギ抗血清と共に、室温で２時間インキュベートした。このビーズを再度洗浄した後、０．１Ｍのグリシン、０．１５  ＮａＣｌ（ｐＨ２．５）で抽出した。ビーズを、１３００ｇで１分間、遠心分離によって沈降させ、上清を取り出し、直ちに１Ｍトリス（ｐＨ８．５）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。得られた調製物を、純度についてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、非還元条件下ではＭｒが約１６００００の１つのバンドからなること、還元条件下ではＭｒが約５００００と約２５０００の２つのバンドからなることが分かった。
【０１０６】
機能的ＡＴ活性に関する２つのアッセイを用いて、血漿中の機能的ＡＴに対する抗体の効果を評価した。最初のアッセイ（ＳＴＡ  ＡＴＩＩＩ  ｋｉｔ，Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｒ：１２１４５１０３１４０；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｌｍｅｒｅ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は、トロンビンを標的プロテアーゼとして使用する発色アッセイである。このアッセイの原理は、標準量のトロンビンをヘパリンの存在下で血漿に添加し、次いで、血漿について、発色基質エチル−マロニル−Ｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．ＡｃＯＨ（２ｍｇ／ｍｌ）を用いて残余のトロンビン活性を検査することである。このアッセイにおいて、５０μＬの１：２０希釈（アッセイで提供される希釈液中）血漿試料を試験する。血漿中のＡＴ機能に対する効果を評価するために、２５μＬ中の２０μｇの精製抗ＡＴ抗体を２５μＬの１：１０希釈正常血漿に添加した。次いで、混合物をアッセイにおいて試験した。結果は、トロンビン活性に対する血漿の阻害効果が、精製抗ＡＴ抗体の添加により中和されたことを明確に示した（図５において、「１００％血漿」を「１００％血漿＋抗ＡＴ」及び「０％血漿」と比較されたい）。
【０１０７】
ＡＴは、血漿におけるトロンビンの主要な阻害物質であるが、血漿中の他の阻害物質（例えばヘパリン補因子ＩＩ）もトロンビンの阻害に寄与し得る。対照的に、ＦＸａは血漿中でＡＴにより完全に阻害される。したがって、抗ＡＴ抗体を用いる結果を、別のアッセイ（ＳＴＡ  Ｒｏｔａｃｈｒｏｍ  Ｈｅｐａｒｉｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  ｎｒ：１１５５６９５９１４０；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で確認した。このアッセイは、ウシＦＸａをプロテアーゼとして、また、エチル−マロニル−Ｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．ＡｃＯＨを発色基質（２ｍｇ／ｍｌで）として使用したこと以外は、上述のトロンビンを用いたアッセイと同様である。さらに、１５μＬの１：１０希釈（アッセイで提供される希釈液中）血漿試料を試験する。６μｇのアフィニティ精製抗ＡＴ抗体（７．５μＬ中）と７．５μＬの１：５希釈正常血漿との混合物を作製し、アッセイで試験した。アフィニティ精製抗体を新鮮なヒト血漿へ添加すると、用量依存的にＦＸａに対する血漿の阻害効果が破棄された（図６において、「１００％血漿」を「１００％血漿＋抗ＡＴ」及び「０％血漿」と比較されたい）。
【０１０８】
図５及び図６に示される結果は、血漿におけるＡＴ活性の完全な阻害が、ＡＴに対するポリクローナル抗体によって達成可能であることを示している。アフィニティ精製ＡＴ抗体の効果がいくつかの他の血漿サンプルでも確認された。試験したすべての血漿サンプルで、ＡＴに対するアフィニティ精製ポリクローナル抗体の添加によるＡＴ活性の完全な阻害が確認された。
【０１０９】
実施例２（正常及びＦＶＩＩＩ欠乏血漿におけるトロンビン生成に対するＡＴ阻害物質の効果）：
次の実験のセットにおいて、アフィニティ精製抗ＡＴ抗体の追加によるＡＴの阻害が、正常な血漿及び血友病血漿中のＴＦによって引き起こされるトロンビン生成に影響し得るかを確認した。
【０１１０】
トロンビンは血液凝固系の重要な酵素であり、インビトロで血漿にＴＦを添加すると適時にトロンビンが生成されることは、血液凝固に関する優れた生体外モデルと考えられる。血友病血漿における低ＴＦ濃度でのトロンビン生成は著しく低下している。血友病患者の出血を止めるために効果があることが示されている治療的介在物、すなわちＦＶＩＩＩ調製物、ｒＦＶＩＩａ、及び活性化プロトロンビン複合体（例えばＦＥＩＢＡ）（Ｊ  Ａｓｔｅｒｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００７；１０９：５４６−５５１；  ＨＲ  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ２００４；１０４：３８５８−３８６４）はすべて、トロンビン生成をある程度回復させることが示されている（Ｋ  Ｖａｒａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００３；１：２３７４−８０；  ＮＭ  Ａｌｊａｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ２００９；１５：１３１８−２６）。そこで、本発明者らは、ＡＴ阻害物質の効果を評価するためにこの生体外モデルを選択した。
【０１１１】
モデルとなる較正済み自動化トロンボグラム（ｔｈｒｏｍｂｏｇｒａｍ）アッセイは、実質的に、Ｈｅｍｋｅｒら（Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈａｅｍｏｓｔ  Ｔｈｒｏｍｂ  ２００２；３２：２４９−２）、及びＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ（Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により提供されるマニュアルに記載されているように行った。血液凝固は、１又は５ｐＭの組換えヒト組織因子、４μＭの凝血原リン脂質、及び４１７μＭの蛍光発生基質Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣの存在下でのカルシウム再沈着により開始させた。蛍光を、フルオロメータ（Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ，ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いてモニターし、内因性トロンビン電位（ＥＴＰ）を、トロンビノスコープ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）（登録商標）ソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）を用いて計算した。血小板が不十分又は豊富な血漿中で得られた「トロンボグラム」は、凝固性低下（例えば、血友病、抗血液凝固剤の使用）だけでなく凝固亢進（例えばＡＴ欠乏）の尺度ともなる。図７に示されるように、精製抗ＡＴ抗体の添加は、凝固亢進状態の存在と一致する正常血漿中のトロンビン生成の増加を誘導し、このことは、血漿中でＡＴが阻害されることと合致する。
【０１１２】
正常プール血漿に代えてＦＶＩＩＩ欠乏血漿を使用すること以外は同様の実験を行った。血友病患者は、第ＶＩＩＩ因子（又は第ＩＸ因子）が欠乏しており、低ＴＦ濃度でのトロンビン生成が健常者よりもかなり低いことを示している。図８から分かるように、トロンビン生成は、予想されたように血友病血漿において実際に低下しており、ピークレベルは約２０ｎＭであって、血漿の凝固性低下と合致する。ＡＴに対するアフィニティ精製ヤギポリクローナル抗体の添加は、用量依存的にＦＶＩＩＩ欠乏血漿におけるトロンビン生成を促進した。最も高い濃度（２５０μｇ／ｍｌ）で添加した場合にほぼ２倍のトロンビン生成の増加が観察された。血漿中のトロンビン生成は生体内でのトロンビン生成能力の優れた指標と考えられ、これらのデータは、ＡＴの阻害が、ＦＶＩＩＩをバイパスすることによってトロンビン生成低下を回復させる、血友病に対する治療的アプローチを構成するものであることを強く支持している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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