(57)【要約】  本発明は、細菌細胞を非特異的に分離するための組成物、方法、装置、及びキットに関する。それら組成物は、炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている固体支持体と、１）その炭水化物とそのタンパク質とのその組み合わせに非特異的に結合された複数の細菌細胞と、又は２）ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体とを含む。それら方法、装置及びキットは、これらの組成物の少なくとも１種類を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、前記タンパク質は、前記炭水化物に共有結合的に結合されており、かつ前記タンパク質は、前記炭水化物を経由して前記固体支持体に連結されている、固体支持体と、
前記炭水化物とタンパク質との組み合わせに非特異的に結合されている複数の細菌細胞と、を含む、組成物。
【請求項２】
炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、前記タンパク質は、前記炭水化物に共有結合的に結合されており、かつ前記タンパク質は、前記炭水化物を経由して前記固体支持体に連結されている、固体支持体と、
ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体と、を含む、組成物。
【請求項３】
前記炭水化物とタンパク質との組み合わせに非特異的に結合された複数の細菌細胞を更に含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記複数の細菌細胞が、２種類以上の異なる種類の細菌を包含する、請求項１又は３に記載の組成物。
【請求項５】
前記細菌が、バチルス属、ボルデテラ属、ボレリア属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、ヘリコバクター属、レジオネラ属、リステリア菌、マイコバクテリア属、ナイセリア属、シュードモナス属、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、ビブリオ属、及びエルシニア属からなる群から選択される、請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記のステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体が、サポニンである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の又は請求項３に従属する請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ビオチン結合タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン及び選択的にニトロ化されたアビジンからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記炭水化物が、単糖、オリゴ糖、多糖及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記炭水化物が、少なくとも１つのカルボキシ基を含有し、かつ前記ビオチン結合タンパク質が、前記タンパク質と前記炭水化物の少なくとも１つのカルボキシ基との反応生成物である連結基を介して、前記炭水化物に共有結合的に結合されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記固体支持体が、ビーズ、ゲル、フィルム、シート、粒子、濾過材、膜、プレート、ストリップ、チューブ、ウェル、繊維、毛細管、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記固体支持体が、磁性粒子である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記磁性粒子が、約０．０２〜約５マイクロメートルの直径を有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
細菌細胞を分離する方法であって、
炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体を提供する工程であって、前記タンパク質は、前記炭水化物に共有結合的に結合されており、かつ前記タンパク質は、前記炭水化物を経由して前記固体支持体に連結されている、固体支持体を提供する工程と、
複数の細菌細胞を有する疑いのある試料を提供する工程と、
前記炭水化物と前記ビオチン結合タンパク質との前記組み合わせを有する前記表面を持つ前記固体支持体を、前記試料と接触させる工程であって、前記試料由来の前記複数の細菌細胞の少なくとも一部分が、前記固体支持体の前記表面に非特異的に結合される、固体支持体を試料に接触させる工程と、
前記試料由来の前記複数の細菌細胞の前記少なくとも一部分が、前記固体支持体の前記表面に非特異的に結合された後、前記固体支持体を、前記試料の残部から分離する工程と、を含む、方法。
【請求項１４】
前記複数の細菌細胞の前記少なくとも一部分を検出する工程を更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出工程が、生物発光によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）検出、ポリジアセチレン（ＰＤＡ）比色検出、核酸検出、免疫学的検出、増殖に基づく検出、及び表面弾性波検出からなる群から選択される検出方法によって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記固体支持体を前記試料と接触させる工程が、ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体の存在下で行われる、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体が、サポニンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ビオチン結合タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、及び選択的にニトロ化されたアビジンからなる群から選択される、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記炭水化物が、単糖、オリゴ糖、多糖及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記炭水化物が、少なくとも１つのカルボキシ基を含有し、かつ前記ビオチン結合タンパク質が、前記タンパク質と前記炭水化物の少なくとも１つのカルボキシ基との反応生成物である連結基を介して、前記炭水化物に共有結合的に結合されている、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記固体支持体が、ビーズ、ゲル、フィルム、シート、粒子、濾過材、膜、プレート、ストリップ、チューブ、ウェル、繊維、毛細管、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記固体支持体が、磁性粒子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記磁性粒子が、約０．０２〜約５マイクロメートルの直径を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の細菌細胞が、２種類以上の異なる種類の細菌を包含する、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記細菌が、バチルス属、ボルデテラ属、ボレリア属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、ヘリコバクター属、レジオネラ菌、リステリア菌、マイコバクテリア属、ナイセリア属、シュードモナス属、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、ビブリオ属、及びエルシニア属からなる群から選択される、請求項１３から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
細菌細胞を検出するための装置であって、
炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、前記タンパク質は、前記炭水化物に共有結合的に結合されており、かつ前記タンパク質は、前記炭水化物を経由して前記固体支持体に連結されている、固体支持体、及び
前記炭水化物と前記タンパク質との前記組み合わせに非特異的に結合されている複数の細菌細胞、を含む組成物と、
前記複数の細菌細胞を検出するための手段と、を備えた装置。
【請求項２７】
細菌細胞を検出するための装置であって、
炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、前記タンパク質は、前記炭水化物に共有結合的に結合されており、かつ前記タンパク質は、前記炭水化物を経由して前記固体支持体に連結されている、固体支持体、及び
ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体、を含む、組成物と、
前記複数の細菌細胞を検出するための手段と、を備えた装置。
【請求項２８】
前記組成物が、前記炭水化物と前記タンパク質との前記組み合わせに非特異的に結合された複数の細菌細胞を更に含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
前記複数の細菌細胞が、２種類以上の異なる種類の細菌を包含する、請求項２６又は２８に記載の装置。
【請求項３０】
前記細菌が、バチルス属、ボルデテラ属、ボレリア属、カンピロバクター菌、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、ヘリコバクター属、レジオネラ菌、リステリア菌、マイコバクテリア属、ナイセリア属、シュードモナス属、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、ビブリオ属、及びエルシニア属からなる群から選択される、請求項２６、２８又は２９に記載の装置。
【請求項３１】
前記細菌細胞を検出するための前記手段が、生物発光によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を検出するための試薬、ＰＤＡ比色センサー、核酸検出用試薬、免疫学的検出用試薬、細菌細胞を平板培養しかつ数えるための培地、及び表面弾性波センサーからなる群から選択される、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３２】
前記ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体が、サポニンである、請求項２７、請求項２８、請求項２８に従属する請求項２９、請求項２８に従属する請求項３０、又は請求項２８に従属する請求項２９、及び請求項２７に従属する請求項３１、請求項２８、請求項２８に従属する請求項２９、又は請求項２８に従属する請求項３０、請求項２８に従属する請求項２９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３３】
前記ビオチン結合タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、及び選択的にニトロ化されたアビジンからなる群から選択されている、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３４】
前記炭水化物が、単糖、オリゴ糖、多糖及びそれらの組み合わせからなる群から選択されている、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３５】
前記炭水化物が、少なくとも１つのカルボキシ基を含有し、かつ前記ビオチン結合タンパク質が、前記タンパク質と前記炭水化物の前記少なくとも１つのカルボキシ基との反応生成物である連結基を介して、前記炭水化物に共有結合的に結合されている、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３６】
前記固体支持体が、ビーズ、ゲル、フィルム、シート、粒子、濾過材、膜、プレート、ストリップ、チューブ、ウェル、繊維、毛細管、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３７】
前記固体支持体が、磁性粒子である、請求項３６に記載の装置。
【請求項３８】
前記磁性粒子が、約０．０２〜約５マイクロメートルの直径を有する、請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
キットであって、
炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、前記タンパク質は、前記炭水化物に共有結合的に結合されており、かつ前記タンパク質は、前記炭水化物を経由して前記固体支持体に連結されている、固体支持体と、
ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体と、を有するキット。
【請求項４０】
細菌細胞を検出するための手段を更に有する、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記細菌細胞を検出するための手段が、生物発光によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を検出するための試薬、ＰＤＡ比色センサー、核酸検出用試薬、免疫学的検出用試薬、細菌細胞を平板培養しかつ数えるための培地、及び表面弾性波センサーからなる群から選択される、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体が、サポニンである、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４３】
前記ビオチン結合タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、及び選択的にニトロ化されたアビジンからなる群から選択されている、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４４】
前記炭水化物は、単糖、オリゴ糖、多糖及びそれらの組み合わせからなる群から選択されている、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４５】
前記炭水化物が、少なくとも１つのカルボキシ基を含有し、かつ前記タンパク質が、前記タンパク質と前記炭水化物の前記少なくとも１つのカルボキシ基との反応生成物である連結基を介して、前記炭水化物に共有結合的に結合されている、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４６】
前記固体支持体が、ビーズ、ゲル、フィルム、シート、粒子、濾過材、膜、プレート、ストリップ、チューブ、ウェル、繊維、毛細管、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されている、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４７】
前記固体支持体が、磁性粒子である、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記磁性粒子が、約０．０２〜約５マイクロメートルの直径を有する、請求項４７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本発明は、参考として本明細書に組み込まれる２００７年１２月３１日に出願された米国仮出願シリアル第６１／０１８０１１号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（政府の権利）
米国政府は、米国国防総省によって付与された協定第ＤＡＡＤ−１３−０３−Ｃ−００４７号（プログラム第２６４０号）及びＷ８１ＸＷＨ−０７−０１−０３５４（プログラム第２７５０号）の条件の下、本発明に関するいくつかの権利を有することができる。
【背景技術】
【０００３】
食品試料、臨床試料、環境試料及び実験試料を包含する様々な試料の中に、微生物が存在することを決定するための分析は、重要性が増大している。そのような分析は、微生物負荷の表示、及び／又は存在する微生物の同定を提供することができる。
【０００４】
微生物の存在を定性的にかつ定量的に決定する最新技術には、典型的には、病原体のような特異的微生物を同定することが包含される。試料中の細菌のような特定の微生物の存在の検出の成功性は、試料中の細菌の濃度によって決まる。一般に、細菌試料は、培養されて、生存度が評価され、かつ試料中の細菌数を増大して、検出のための十分な濃度が確保される。培養工程はかなりの時間を必要とし、そのことによって、検出結果を得るのが遅れる。
【０００５】
試料中の細菌を濃縮することによって、より短い培養工程を用いて、又は培養工程を用いなくても、検出を実施することができる。細菌株に特異的な抗体を用いることによって特異な細菌株を分離し、そうすることによって濃縮する方法が開発された。
【０００６】
菌株非特異性である他の濃縮方法であって、存在微生物のより一般的な試料採集を提供すると思われる方法が提案されてきた。菌株混合物内の１種類以上の特異的菌株は、ひとたび分離されると直ちに、既知の検出方法（例えば、核酸増幅方法を包含するもの）を用いて、同定及び／又は定量が行われ得る。
【０００７】
炭水化物とレクチンタンパク質との相互作用を用いた、微生物の非特異的分離が提案されている。細菌の表面に存在するレクチンは、ポリアクリルアミドに付着したある種の炭水化物に対する捕捉標的として提案された。微生物のための栄養素として役立つ物質であって、微生物を非特異的に捕捉するための配位子として用いられる物質もまた、提案されている。そのような栄養素配位子には、炭水化物、ビタミン、鉄キレート化合物及びシデロホア（sidorophores）が包含された。微生物をより容易にかつより迅速に分析するのを可能にする非菌株特異的なやり方で、微生物を濃縮するためのキトサン支持体も提案された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
微生物を分離するためのいくつかの方法が記述されてきたが、微生物を分離するための改善された材料及び方法への関心と、それら材料及び方法に対する必要性とは、存在し続けている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
炭水化物を経由して固体支持体に付着したビオチン結合タンパク質の組み合わせは、細菌細胞を非特異的に結合するのに有効であることが、今回見出だされた。固体支持体上に炭水化物を有するが、ビオチン結合タンパク質を有さない組成物は、細菌細胞を非特異的に結合するのにはあまり有効でないことが見出だされた。更に、固体支持体上にビオチン結合タンパク質を含有するが、炭水化物を有さない組成物もまた、細菌細胞を非特異的に結合するのにはあまり有効でないことが見出だされた。いくつかの実施形態において、炭水化物を経由して固体支持体に付着したビオチン結合タンパク質は、ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体の存在下では、細菌細胞を非特異的に結合するのに、なおさら効果的である。
【００１０】
したがって、本発明は、細菌細胞を非特異的に結合するための新規組成物を提供する。
【００１１】
１つの実施形態において、炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている固体支持体と、１）その炭水化物とそのタンパク質とのその組み合わせに非特異的に結合された複数の細菌細胞、又は２）ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体と、を含む、組成物が提供される。
【００１２】
別の実施形態では、
炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている、固体支持体と、
その炭水化物とそのタンパク質とのその組み合わせに非特異的に結合されている複数の細菌細胞と、を含む、組成物が提供される。
【００１３】
別の実施形態では、炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている固体支持体と、ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体と、を含む、組成物が提供される。
【００１４】
別の態様では、細菌細胞を分離する方法であって、
炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体を提供する工程であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている、固体支持体を提供する工程と、
複数の細菌細胞を有する疑いのある試料を提供する工程と、
その炭水化物とそのビオチン結合タンパク質とのその組み合わせを有するその表面を持つその固体支持体を、その試料と接触させる工程であって、その試料由来の複数の細菌細胞の少なくとも一部分が、その固体支持体のその表面に非特異的に結合される、固体支持体を試料に接触させる工程と、
その試料由来のその複数の細菌細胞のその少なくとも一部分が、その固体支持体のその表面に非特異的に結合された後、その固体支持体を、その試料の残部から分離する工程と、を含む、方法が提供される。
【００１５】
別の態様では、細菌細胞を検出するための装置であって、
炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている、固体支持体と、
その炭水化物とそのタンパク質とのその組み合わせに非特異的に結合されている複数の細菌細胞と、を含む組成物と、
それらの細菌細胞を検出するための手段と、を備えた装置が提供される。
【００１６】
別の態様では、細菌細胞を検出するための装置であって、
炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている、固体支持体と、
ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体と、を含む、組成物と、
それらの細菌細胞を検出するための手段と、を備えた装置が提供される。
【００１７】
別の態様では、キットであって、
炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている、固体支持体と、
ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体と、を含む、組成物が提供される。
【００１８】
定義
用語「ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体」は、グリコシド結合によって糖質に接合されたステロイド又はトリテルペンを指し、結果として得られる材料は、両親媒性（即ち、界面活性剤特性）を有し、その材料は、親水性と親油性との両方である。
【００１９】
用語「ビオチン結合タンパク質」は、高い親和性とビオチンを結合するための選択性とを有するタンパク質を指す。本明細書で用いられるとき、「ビオチン結合タンパク質」は、結合ビオチンを包含しない。
【００２０】
用語「磁性粒子」は、強磁性粒子、常磁性粒子若しくは超常磁性粒子を含有する粒子、粒子集合体、又はビーズを意味し、ポリマービーズ中におけるそれら粒子の分散系を包含する。
【００２１】
本明細書で用いられるとき、「１つの（a）」、「１つの（an）」、「その（the）」、「少なくとも１つの（at least one）」、及び「１つ以上の（one or more）」は、互いに交換できるように用いられる。
【００２２】
用語「含む（comprises）」及びこの変形は、説明及び請求項において、これらの用語が現れる箇所で制限する意味を持たない。
【００２３】
本発明の上記の「課題を解決するための手段」は、本発明が開示するそれぞれの実施形態又は全ての実施例を説明することを意図したものではない。以下の説明は、例示的な実施形態をより詳細に例示する。以下の説明の全体にわたるいくつかの箇所において、複数の実施例の一覧表を通して、ガイダンスが提供されており、それら実施例は、様々な組み合わせで用いられ得る。それぞれの事例において、列挙された一覧表は、代表的な群としてのみ役立ち、排他的な一覧表と解釈されるべきでない。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、細菌細胞を非特異的に結合するための新規組成物を提供する。細菌細胞を「非特異的に結合する」は、結合することが、いずれのタイプの細菌細胞にも特異的でないことを意味する。したがって、試料中の全ての細菌は、例えば、細菌の１つの菌株を標的にするのではなく、その試料中の他の構成成分から分離され得る。グラム陽性細菌とグラム陰性細菌との両方が、結合され得る。結果として得られた分離済み細菌には、次いで、細菌負荷検出のような既知の検出方法が適用され得る。
【００２５】
１つの実施形態において、炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている、固体支持体と、その炭水化物とそのタンパク質とのその組み合わせに非特異的に結合されている複数の細菌細胞と、を含む、組成物が提供される。
【００２６】
別の実施形態において、炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている、固体支持体と、ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体と、を含む、組成物が提供される。ある実施形態に関し、本組成物は、その炭水化物とそのビオチン結合タンパク質とのその組み合わせに非特異的に結合された複数の細菌細胞を更に含む。
【００２７】
それら組成物は、上述の炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する固体支持体を、複数の細菌細胞の少なくとも１種類と、又はステロイド若しくはトリテルペンの両親媒性配糖体と組み合わせることによって調製され得る。炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する固体支持体は、下述のように提供され得る。固体支持体を細菌細胞及び／又は両親媒性配糖体と組み合わせる工程は、固体支持体を緩衝液に懸濁させるか又は浸漬し、次いで、緩衝液に懸濁されている細菌細胞、及び／又は緩衝液に溶解されている両親媒性配糖体を添加することによって都合よく実施することができる。両親媒性配糖体の緩衝溶液は、好ましくは両親媒性配糖体を約０．２〜約１０重量／容量％（％ｗ／ｖ）、より好ましくは約０．５〜約５％ｗ／ｖ含有する。
【００２８】
別の実施形態において、細菌細胞を分離する方法であって、炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体を提供する工程であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている工程と、複数の細菌細胞を有する疑いのある試料を提供する工程と、その炭水化物とそのビオチン結合タンパク質とのその組み合わせを有するその表面を持つその固体支持体を、その試料と接触させる工程であって、その試料由来の複数の細菌細胞の少なくとも一部分が、その固体支持体のその表面に非特異的に結合される工程と、その試料由来の複数の細菌細胞の少なくとも一部分が、その固体支持体のその表面に非特異的に結合された後、その固体支持体を、その試料の残部から分離する工程と、を含む、方法が提供される。
【００２９】
複数の細菌細胞を有する疑いのある試料は、既知の方法を用いて、様々な供給源から提供され得る。供給源の例には、生理的流体（例えば、血液、唾液、眼用レンズ液、滑液、脳脊髄液、膿、汗、滲出液、尿、粘液）、粘膜組織（例えば、頬、歯肉、鼻粘膜、眼球膜、気管膜、気管支膜、胃腸膜、直腸膜、尿道膜、尿管膜、膣膜、頸管膜及び子宮粘膜）、泌乳、等が包含される。試料供給源の更なる例には、身体部位（例えば、創傷、皮膚、鼻咽頭腔、鼻孔、前部鼻前庭、頭皮、爪、外耳、中耳、口、直腸、又は他の部位）から得られるものが包含される。試料供給源の追加的例には、プロセス流、水、食品、土壌、植物、空気（例えば、汚染空気）、表面（例えば、食品調理用表面）、等が包含される。
【００３０】
既知の試料採集法を用いて、供給源から試料を集めることができる。例えば、供給源から多量の液体試料を取り出すことができるか、又は綿棒若しくはワイプを用いて、生理学的表面若しくは環境表面から試料を採取することができる。様々な綿棒又は他の試料採集手段が市販されている。
【００３１】
上記方法で用いられる試料は、例えば水溶液の場合、試料採集手段によってそのまま直接提供され得る。代替的に、試料は、例えば、水、生理食塩水、ｐＨ緩衝液、又は他のあらゆる溶液若しくは諸溶液の組み合わせであって、試料採集手段から試料を取り除くことができ、かつその試料を懸濁液にすることのできるものを用いて、試料採集手段からその試料を溶出するか、放出するか、又は洗浄することによって提供され得る。溶出用緩衝液の例は、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、又はポリ（オキシエチレン−コ−オキシプロピレン）ブロック共重合体）と組み合わせて用いることのできるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。他の抽出溶液は、試料採集部位から試料分析部位まで輸送する間、標本の安定性を保持する働きをすることができる。これらのタイプの抽出溶液の例には、アミーズ及びスチュアートの輸送媒体（Amies' and Stuart's transport media.）が包含される。
【００３２】
その試料は、固体支持体と接触する前に、例えば、粘液の希釈、天然要素の濃縮、濾過、蒸留、透析、希釈、不活性化、試薬の添加、化学処理等の処理が行われてもよい。
【００３３】
炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つその固体支持体を、複数種類の細菌細胞を含有する疑いのある試料と接触させる工程は、緩衝液に固体支持体を懸濁させるか又は浸漬し、次いで、緩衝液に懸濁させることもできる試料を添加することによって、都合よく実施され得る。適切な緩衝液には、ＰＢＳ及び非イオン性界面活性剤を含有するＰＢＳが包含される。その混合物は、それら細菌細胞が、固体支持体上の炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせに結合されるのを可能にするのに十分な時間の間、攪拌され得る。その結合工程は、室温で都合よく実施され得る。
【００３４】
試料の残部から固体支持体を分離する工程は、周知の方法を用いて実施され得る。例えば、試料の残部は、固体支持体の排出が行われるか、デカンテーションが行われるか、汲み出されるか、遠心分離機で分離されるか、ピペットで取られるか、かつ／又は濾過して取り除かれるかすることが可能である。固体支持体が磁性粒子である場合、その固体支持体は、試料の残部を、例えば、デカンテーションを行うか、ピペットで取るか、又は圧力差若しくは重力を用いて懸濁物を容器から強制的に外に出すことによって、都合よく除去するための磁石を備えた容器の１つの領域にまとめられてもよい。加えて、固体支持体は、例えば緩衝液で洗浄されて、残存するあらゆる非結合試料物質を除去することができる。
【００３５】
ある実施形態に関し、細菌細胞を分離するための方法は、複数の細菌細胞の少なくとも一部分を検出する工程を更に含むことができる。これらの実施形態のいくつかに関し、検出工程は、生物発光によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）検出、ポリジアセチレン（ＰＤＡ）比色検出、核酸検出、免疫学的検出、増殖に基づく検出、及び表面弾性波検出、等からなる群から選択された検出方法によって行われる。
【００３６】
ＡＴＰ検出は、細菌負荷の非特異的表示として用いられ得る。細菌細胞が非特異的に結合されている固体支持体を、（過剰の細胞ＡＴＰのような妨害要素を含有することのある）試料の残部から分離した後、それらの細胞を溶解し、ルシフェリン及びルシフェラーゼと接触させる。次いで、結果として得られる生物発光であって、捕捉された細菌細胞の数に比例する強度のものである生物発光は、例えば照度計を用いて、測定される。
【００３７】
比色センサーを細菌に接触させることによって、特異的細菌又は細菌のスペクトルを検出するために、ＰＤＡ比色検出を利用することができる。比色センサーは、受容体と、ジアセチレン化合物又はポリジアセチレンを含有する重合組成物とを含む。細菌細胞が受容体によって結合されるとき、結果として得られる、比色センサーに対する構造変化は、測定可能な色変化を引き起こす。色変化は、例えば、視覚に、又は比色計を用いて測定され得る。受容体に結合し得るプローブを用いて、細菌細胞を間接的に検出することもまた、利用することができる。そのような比色センサーを用いるＰＤＡ比色検出は既知であり、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１３４７９６Ａ１号、国際公開第ＷＯ２００４／０５７３３１Ａ１号、及びＷＯ２００７／０１６６３３Ａ１号、並びに譲受人の同時係属米国特許出願シリアル番号第６０／９８９２９８号に記述されている。
【００３８】
ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する核酸を検出する方法は、しばしば、それら核酸を増幅する工程、又はそれら核酸のハイブリッド形成を行う工程を含む。捕捉された細菌細胞は、溶解されて、検出に使用可能である細胞核酸を作る。溶解工程は、酵素的に、化学的に及び／又は機械的に実施され得る。分解に用いられる酵素には、例えば、リゾスタフィン、リゾチーム、ムタノリジン（mutanolysin）、等が包含される。化学的溶解は、界面活性剤、アルカリ、加熱、又は他の手段を用いて実施され得る。溶解のためにアルカリが用いられるとき、中和剤を用いて、溶解後の溶液又は混合物を中和することができる。機械的溶解は、例えばビーズ若しくはマイクロビーズの固体粒子又は微小粒子を用いた混合工程又は剪断工程によって達成され得る。溶解のためには、音波処理をも用いることができる。溶解用試薬には、必要に応じて緩衝される界面活性剤又は洗剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、ＴＲＩＴＯＮ系、ＴＷＥＥＮ系、ＢＲＩＪ系、ＮＰ系、ＣＨＡＰＳ、Ｎ−メチル−Ｎ−（１−オキソドデシル）グリシン、ナトリウム塩等）、カオトロープ（例えば、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアナート、ヨウ化ナトリウム、等）、溶解酵素（例えば、リゾチーム、リゾスタフィン、ムタノリジン（mutanolysin）、プロテイナーゼ、プロナーゼ、セルラーゼ、市販の他の分解酵素のあらゆるもの）、アルカリ溶解試薬、固体粒子（例えば、ビーズ）、又はそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００３９】
増幅方法の例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、標的ポリヌクレチド増幅法（例えば、自家持続配列複製法（self-sustained sequence replication）（３ＳＲ））及びストランド転移増幅（strand-displacement amplification）（ＳＤＡ））、標的ポリヌクレオチドに付着したシグナルの増幅に基づく方法（例えば、「枝分れ鎖」ＤＮＡ増幅）、プローブＤＮＡの増幅に基づく方法（例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）及びＱＢレプリカーゼ増幅法（ＱＢＲ））、転写ベース法（transcription-based methods）（例えば、結紮活性化転写（ligation activated transcription）（ＬＡＴ）、核酸配列ベース増幅（nucleic acid sequence-based amplification）（ＮＡＳＢＡ）、商標名ＩＮＶＡＤＥＲという名称での増幅法、及び転写媒介増幅法（transcription-mediated amplification）（ＴＭＡ））、並びに他の様々な増幅方法（例えば、修復連鎖反応（repair chain reaction）（ＲＣＲ）及びサイクリングプローブ反応（cycling probe reaction）（ＣＰＲ））が包含される。
【００４０】
細菌のスペクトルから、核酸をハイブリダイズすることのできるプライマーを選択することによって、細菌のスペクトルを都合よく検出するために、プライマー指向性（primer-directed）核酸増幅法であって、例えば、熱サイクル法（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ及びＳＤＡ）を包含する増幅法を用いることができる。
【００４１】
核酸ハイブリッド形成検出方法もまた、周知である。ここに、一本鎖核酸プローブは、それら細菌細胞由来の１種類以上の一本鎖核酸にハイブリッド形成されて、プローブ鎖を含む二本鎖核酸を提供する。後で定量され、次いで検出され得る核酸プローブ（プローブの標識）（蛍光標識、化学発光標識及び放射性標識のようなもの）が、既知である。更に、種特異性プローブ、又は種特異性プローブの組み合わせを用いて、特異性細菌又は多数種類の異なる細菌を検出することができる。
【００４２】
免疫学的検出には、例えばタンパク質、プロテオグリカン、又は抗原活性を有し、細菌の表面でマーカーとして作用する他の物質などの生体分子の検出が包含される。抗原物質の検出は、典型的には、抗体か、ファージ提示法のようなプロセスから選択されるポリペプチドか、又はスクリーニングプロセスからのアプタマーによる。免疫学的検出法が既知であり、それら検出法の例には、免疫沈降分析、及び酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が包含される。抗体結合は、一次抗体又は二次抗体を、蛍光色素で、量子ドットで、又は化学発光若しくは色変化を生じ得る酵素で標識化することによる方法を包含するいくつかの方法で検出され得る。プレートリーダー及び側方流動装置を用いて、結合事象を検出し定量化した。
【００４３】
増殖に基づく検出法が周知であり、一般に、細菌を平板培養する工程と、細菌を培養して、一定条件下でそれら細菌細胞の数を増大させる工程と、それら細菌細胞を数える工程と、を包含する。この目的について、ＰＥＴＲＩＦＩＬＭ  Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅｓ（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）を用いることができる。
【００４４】
細菌細胞を検出するための表面弾性波検出（surface acoustic wave detection）、例えば、国際公開第ＷＯ２００５／０７１４１６号に記述されるものも知られている。例えば、バルク音波インピーダンスセンサーを用いて、固体培地表面の細菌細胞の増殖及び数が検出されている。この方法によって検出し得る細菌の濃度範囲は、３．４×１０２〜６．７×１０６細胞／ｍＬであった。ＬｅＤｅｎｇ等，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２６，Ｉｓｓ．１０〜２，１９７〜２０３（１９９７）を参照されたい。
【００４５】
細菌細胞を分離するための方法の上記諸実施形態のいずれか１つを包含するある実施形態に関し、固体支持体を試料と接触させる工程は、ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体の存在下で行われる。
【００４６】
前述のとおり、固体支持体を試料に接触させる工程は、細菌細胞を固体支持体に効果的に結合させるのに適した培地を提供し得る緩衝液の存在下でも行うことができる。固体支持体に接触させる前、固体支持体に接触させるのと同時に又は固体支持体に接触させた後に、適切な分量、オスモル濃度、又は他の特性の緩衝液を、試料に添加することができる。ＰＢＳ及びＰＢＳ−Ｌ６４緩衝液は、そのような細胞結合性緩衝液の例である。
【００４７】
別の実施形態において、細菌細胞を検出するための装置であって、炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている、固体支持体及びその炭水化物とそのタンパク質とのその組み合わせに非特異的に結合されている複数の細菌細胞、を含む組成物と、それら複数の細菌細胞を検出するための手段と、を備えた装置が提供される。
【００４８】
別の実施形態では、細菌細胞を検出するための装置であって、炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている、固体支持体及びステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体、を含む、組成物と、それら複数の細菌細胞を検出するための手段と、を備えた装置が提供される。いくつかの実施形態に関し、その組成物は、その炭水化物とそのタンパク質とのその組み合わせに非特異的に結合された複数の細菌細胞を更に含む。
【００４９】
本装置は、組成物と、細菌細胞を検出するための手段とを含む１つ以上の構造的特徴を有することがある。本装置は、固体支持体によって細菌細胞を捕捉し、残部試料を固体支持体から分離し、次いで、細菌細胞を検出するための１つ以上の場所と条件とを提供することができる。試料は、１つ以上の場所又は容器の中に置くことができる。本装置は、それらの場所又は容器の均一かつ精確な温度制御を提供することができる。本装置は、例えば、細菌細胞の結合が、１つ以上の場所又は容器の中で起こり、かつ細菌細胞の検出が、１つ以上の他の場所又は容器の中で行われ得るような具合に、場所又は容器の間にチャネルを提供することができる。細菌細胞を検出するための装置を含む、上述の諸実施形態のいずれか１つを包含するいくつかの実施形態に関し、その装置は、側方流動装置、垂直流動装置、又はそれらの組み合わせである。そのような装置のいくつかの例は、譲受人の同時継続米国特許出願シリアル第６０／９８９２９１号に記述されている。いくつかの実施形態に関し、本装置は、マイクロ流体デバイスである。マイクロ流体デバイスのいくつかの例は、米国特許出願公開第２００２／００６４８８５号（Ｂｅｄｉｎｇｈａｍ等）、米国特許出願公開第２００２／００４８５３３（Ｂｅｄｉｎｇｈａｍ等）、米国特許出願公開第２００２／００４７００３号（Ｂｅｄｉｎｇｈａｍ等）、及び米国特許出願公開第２００３／１３８７７９号（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ等）、米国特許第６，６２７，１５９号、同第６，７２０，１８７号、同第６，７３４，４０１号、同第６，８１４，９３５号、同第６，９８７，２５３号、同第７，０２６，１６８号、及び同第７，１６４，１０７号、及び国際公開ＷＯ２００５／０６１０８４Ａ１号（Ｂｅｄｉｎｇｈａｍ等）に記述されている。
【００５０】
複数の細菌細胞を含む組成物、方法又は装置にかかる上記実施形態のいずれか１つを包含するいくつかの実施形態に関し、それら複数の細菌細胞は、２種類以上の異なる種類の細菌を含む。１つの種類の細菌、又は１つの種類の細菌細胞は、細菌又は細菌細胞の菌株、種類、属、族、目、又は部分である。
【００５１】
複数の細菌細胞を含む組成物、方法又は装置にかかる上記実施形態のいずれか１つを包含するいくつかの実施形態に関し、それら細菌は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌からなる群から選択される。これらの実施形態のいくつかに関し、それら細菌は、バチルス属、ボルデテラ属、ボレリア属、カンピロバクター属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、ヘリコバクター属、レジオネラ属、リステリア菌、マイコバクテリア属、ナイセリア属、シュードモナス属、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、ビブリオ属、及びエルシニア属からなる群から選択される。いくつかの実施形態に関し、それら細菌は、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、表皮ブドウ球菌、大腸レンサ球菌、ストレプトコッカスアガラクチア（Strep agalatiae）、ストレプトコッカスジスガラクチア（Strep dysgalatiae）、大腸菌、サルモネラ菌、及びＢ群レンサ球菌からなる群から選択される。
【００５２】
別の実施形態では、炭水化物とビオチン結合タンパク質との組み合わせを有する表面を持つ固体支持体であって、そのタンパク質は、その炭水化物に共有結合的に結合されており、かつそのタンパク質は、その炭水化物を経由してその固体支持体に連結されている、固体支持体と、ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体と、を有する、キットが提供される。これらの実施形態のいくつかに関し、キットは、細菌細胞を検出するための手段を更に有する。
【００５３】
装置又はキットにかかる上記の諸実施形態のいずれか１つを包含するいくつかの実施形態に関し、細菌細胞を検出するための手段は、生物発光によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を検出するための試薬、ＰＤＡ比色センサー、核酸検出用試薬、免疫学的検出用試薬、細菌細胞を平板培養しかつ数えるための培地、表面弾性波センサー、等からなる群から選択される。
【００５４】
ＡＴＰを検出するための試薬には、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及び所望により溶解剤が包含される。核酸検出用試薬には、例えば、プライマー、プローブ、プライマーを伸長するための酵素、又はそれらの組み合わせが包含される。免疫学的検出用試薬には、例えば、少なくとも１種類の抗体が包含される。
【００５５】
ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体を含む組成物、方法、装置又はキットにかかる上記諸実施形態のいずれか１つを包含するいくつかの実施形態に関し、ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体は、サポニンである。サポニンは、グリコシド結合によって糖質に接合されている２７個の炭素原子のステロイド、又は３０個の炭素原子のトリテルペンである。いくつかの実施形態に関し、その糖質は、ヘキソース、ペントース、糖酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。サポニンは、中性洗剤として、及び赤血球を溶解するために用いられてきた。しかし、意外にも、この種の物質は、細菌細胞を非特異的に結合するための有効性を損失することなく、ビオチン結合タンパク質と、炭水化物を経由して固体支持体に付着しているその炭水化物との組み合わせと一緒に存在し得ることが今回見出だされた。更に、いくつかの実施形態に関し、ビオチン結合タンパク質と、炭水化物を経由して固体支持体に付着したその炭水化物との組み合わせであって、ステロイド又はトリテルペンの両親媒性配糖体と組み合わされたもの、又は上述のそれらの実施形態は、細菌細胞を非特異的に結合することに対して更にいっそう効果的である。
【００５６】
組成物、方法、装置又はキットにかかる上記諸実施形態のいずれか１つを包含するいくつかの実施形態に関し、ビオチン結合タンパク質は、ビオチンがそのタンパク質と一緒に存在する場合、１個のタンパク質分子当り４個のビオチン分子を結合するタンパク質である。本発明のそれら実施形態は、ビオチン結合タンパク質を含むが、そのビオチン結合タンパク質は、ビオチン（又は、別の物質に付着されたビオチン）がそのビオチン結合タンパク質に結合されることなく含まれる。これらの実施形態のいくつかでは、ビオチン結合タンパク質は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、及び選択的にニトロ化されたアビジンからなる群から選択される。アビジンは、約６６ｋＤａの質量と、１０〜１０．５の等電点とを有する糖タンパク質である。アビジンの全質量の約１０％は、炭水化物である。アビジンは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。ストレプトアビジンは、約６０ｋＤａの質量と、約５の等電点とを有する四量体タンパク質である。アビジンに見出だされる炭水化物成分を欠いているストレプトアビジンは、例えば、Ｐｉｅｒｃｅより市販されている。脱グリコシル化されたアビジンであるニュートラアビジンは、約６０ｋＤａの質量と約６．３の等電点とを有する。ニュートラアビジンは、Ｐｉｅｒｃｅより市販されている。選択的にニトロ化されたアビジンは、ＣＡＰＴＡＶＩＤＩＮという商標名でＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．より入手でき、ニトロ化されたアビジンの４つのビオチン結合部位にチロシン残基を有する。いくつかの実施形態に関し、ビオチン結合タンパク質は、ストレプトアビジンである。
【００５７】
組成物、方法、装置又はキットにかかる上記諸実施形態のいずれか１つを包含するいくつかの実施形態に関し、炭水化物は、単糖、オリゴ糖、多糖及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。適切な単糖には、例えば、マンノース、ガラクトース、ブドウ糖、フルクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ラムノース、ガラクトサミン、グルコサミン、ガラクツロン酸、グルクロン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、メチルＤ−マンノピラノシド、α−メチルグルコシド、ガラクトシド、リボース、キシロース、アラビノース、サッカラート、マニトール、ソルビトール、イノシトール、グリセロール、これらの単糖のいずれか１種類の誘導体、及びそれらの組み合わせが包含される。適切なオリゴ糖には、同一種類又は異なる種類であってもよい、２〜１２個の単糖単位を有するものが包含される。例には、２〜６個の単位を有するオリゴマンノース、麦芽糖、スクロース、トレハロース、セロビオース、サリシン、これらのオリゴ糖のいすれか１種類の誘導体、及びそれらの組み合わせが包含される。適切な多糖には、同一種類又は異なる種類であってもよい、１２個以上の単糖単位を有するものが包含される。例には、多糖（例えば、アラビアゴム（アカシアゴム））であって、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、並びにカルシウム塩、マグネシウム塩、及びカリウム塩としてのグルクロン酸の分枝ポリマーであると思われるものと、ガラクトマンナン多糖（ローカストビーンガム）であって、マンノースの直鎖ポリマー、及びマンノース４つ毎の上の１つのガラクトース枝であると思われるものと、グアーガムであって、ガラクトース、ラムノース及びグルクロン酸の部分的にアセチル化されてたポリマーを含むと思われるものと、が包含される。これらの実施形態のいくつかに関し、炭水化物には少なくとも１種類のカルボキシ基が包含される。少なくとも１種類のカルボキシ基を含有する、上述の単糖、オリゴ糖、多糖、及びそれらの組み合わせのいずれか１種類を用いてもよい。更に、上述の単糖、オリゴ糖、多糖、及びそれらの組み合わせのいずれか１種類であって、少なくとも１つのカルボキシ基を含むように誘導されるものを用いることができる。これらの実施形態のいくつかに関し、炭水化物は、多糖である。
【００５８】
これらの実施形態のいくつかに関し、炭水化物はアラビン酸を含有する。
【００５９】
ビオチン結合タンパク質は、ビオチン結合タンパク質上の官能基と炭水化物上の官能基との間の１種類以上の反応によって、その炭水化物に共有結合的に結合され得る。組成物、方法、装置又はキットにかかる上記諸実施形態のいずれか１つを包含するいくつかの実施形態に関し、炭水化物は少なくとも１つのカルボキシ基を含み、かつビオチン結合タンパク質は、そのタンパク質とその炭水化物の少なくとも１つのカルボキシ基との反応生成物である連結基によって、その炭水化物に非特異的に結合される。ビオチン結合タンパク質は、周知の相互作用によって、炭水化物に非特異的に結合される。例えば、ビオチン結合タンパク質のアミノ基は、炭水化物のカルボキシ基と反応して、連結基（この場合、アミド基）を提供する。別の実施例において、ビオチン結合タンパク質のヒドロキシ基は、炭水化物のカルボキシ基と反応して、連結基（この場合、エステル基）を提供する。これらの連結基の一方又は両方は、タンパク質と炭水化物との間に化学結合を提供することができるが、他の既知の結合経路及び連結基が、追加的に又は代替的に用いられることもある。
【００６０】
固体支持体は、部分的に又は完全に炭水化物で構成されることがある。固体支持体は、炭水化物がビオチン結合タンパク質と反応するのに利用できるような具合に、固体支持体の表面でその炭水化物と構造化される。ビオチン結合タンパク質は、その後、炭水化物に結合され、引き続いて、固体支持体に付着されるか、又は固体支持体になる。
【００６１】
固体支持体は、現在、分離又は固定化のために用いられている既知の支持体又はマトリックスである。組成物、方法、装置又はキットにかかる上記諸実施形態のいずれか１つを包含するいくつかの実施形態に関し、固体支持体は、ビーズ、ゲル、フィルム、シート、粒子、濾過材、膜、プレート、ストリップ、チューブ、ウェル、繊維、毛細管、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。固体支持体は、ガラス、シリカ、セラミックス、金属、ポリマー、又はそれらの組み合わせを含有することができる。適切なポリマーには、例えば、ラテックス、セルロース、多糖、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びポリ（４−メチルブテン））、ポリオレフィン共重合体、ポリオレフィンアイオノマー、ポリオレフィン配合物、ポリスチレン、ポリアミド（例えば、ナイロン）、ポリ（ビニルブチラート）、ポリエステル（例えば、ポリ（エチレンテレフタレート））、ポリ塩化ビニル、ポリ（ビニルアルコール）、並びにポリカーボネートが包含される。いくつかの実施形態に関し、固体支持体は、多糖を含有する。
【００６２】
固体支持体は、炭水化物（例えば、上述の諸炭水化物の１種類以上）で被覆されることがある。被覆された炭水化物は、既知の結合方法及び構造体によって、固体支持体に結合され得る。例えば、固体支持体の表面は、イソシアネート基で官能基化され、次いで、炭水化物で被覆されることがある。炭水化物上のヒドロキシ基（及び、存在すれば、アミノ基）は、イソシアネート基と反応して、炭水化物を固体支持体に結合させる。
【００６３】
組成物、方法、装置又はキットにかかる上記諸実施形態のいずれか１つを包含するいくつかの実施形態に関し、固体支持体は、磁性粒子である。例えば、ポリ（ビニルアルコール）を主成分とするポリマー粒子であって、その中に磁性コロイドがカプセル化されているポリマー粒子（Ｃｈｅｍａｇｅｎ  ＡＧ，ドイツ）と、マグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）とマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）との混合物の分散系を含むポリスチレン球体と、ポリスチレンシェル（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＳＡ，Ｏｓｌｏ，ノルウェー）、多糖マトリックスを有する磁性粒子（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，ドイツ）、及び多糖コアを有する磁性粒子であって、ストレプトアビジンデバイス被覆されている磁性粒子（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ）とを包含する様々な磁性粒子が市販されている。それらの磁性ビーズ又は磁性粒子であって、ビオチン結合タンパク質と結合するために利用可能な炭水化物を含まないものは、例えば、上述のように変性されて、ビオチン結合タンパク質が後で結合され得る炭水化物を付着させることができる。多糖コア又はマトリックスを含有する磁性粒子は、ビオチン結合タンパク質と反応して、上述の、炭水化物とタンパク質との組み合わせを提供することができる。多糖コア又はマトリックスを含有する磁性粒子であって、ストレプトアビジンで既に被覆されたものは、変性なしで用いられ得る。
【００６４】
磁性のビーズ又は粒子を含む上記諸実施形態のいずれか１つを包含するいくつかの実施形態に関し、それら磁性のビーズ又は粒子は、約０．０２〜約５μｍの直径を有する。球形でないビーズ又は粒子に関し、この直径はビーズ又は粒子の少なくとも１つの寸法である。この直径範囲によって、細菌細胞の効果的な非特異的捕捉を行うための適切な表面積が提供される。
【００６５】
本発明の目的及び利点は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらの実施例において列挙された特定の材料及びその量は、他の諸条件及び詳細と同様に本発明を過度に制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６６】
特段の指摘がない限り、実施例における部、百分率、比、等は、全てモルによる。供給者が指定されていない溶媒及び試薬は全て、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから購入された。水は、Ｕ−Ｖ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ浄水器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）を用いて精製され、抵抗率は１８．２Ｍオーム／ｃｍであった。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
調製の実施例１−ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ６４（ＰＢＳ−Ｌ６４緩衝液）を含有するリン酸緩衝生理食塩水の調製
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液は、１０ｘ  ＰＢＳ原液（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を１０倍希釈することによって、調製された。このことによって、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウムの塩組成を有するＰＢＳ緩衝溶液が得られた。ＰＢＳ緩衝溶液は、２５℃で７．５のｐＨを有した。ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ６４界面活性剤が、０．２％（ｗ／ｖ）の量で、ＰＢＳ緩衝溶液に添加されて、２５℃で７．５のｐＨを有する、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ６４（ＰＢＳ−Ｌ６４緩衝液）を含有するリン酸緩衝生理食塩水が提供された。
【００６９】
調製の実施例２−抗体官能基化された磁性ビーズの調製
製造者の指示によって、抗体製剤は全て、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬからの製造番号２１３３０）でビオチン化された。ストレプトアビジンで被覆された磁性粒子（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，ドイツからの１００ｎｍ  ＦＬＵＩＤＭＡＧビーズ）を用いた。特段の記述がない限り、反応及び洗浄は全て、ＰＢＳ  Ｌ−６４緩衝液中で行われた。洗浄工程は、他に規定されない限り、３回の連続洗浄を含んだ。洗浄プロセスは、磁石に近位の管側に、粒子を引き込むための管に隣接して磁石を設置する工程と、隣接した磁石で管から液体を除去する工程と、除去された液体を交換するために等量の新しい緩衝液を添加する工程からなる。磁石を取り外して、それら粒子の再懸濁及び混合を可能にした。
【００７０】
２．５ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍＬ）の濃度の、ストレプトアビジンで被覆された磁性粒子は、５００μｌ  ＰＢＳ  Ｌ−６４緩衝液に入れたビオチン化抗体製剤と混合された。結合のための抗体対粒子の質量比は、抗体４０μｇ／粒子１ｍｇであった。得られた混合物は、３７℃で１時間（ｈｒ）の間、培養された。続いて、それら粒子は、ＰＢＳ  Ｌ−６４緩衝液中で洗浄し、結合しなかった抗体を除去した。最終洗浄の後、それら粒子は、２．５ｍｇ／ｍＬの粒子濃度まで再懸濁された。
【００７１】
調製の実施例３−表面にカルボキシル官能基を有する多糖ビーズ又はポリスチレンビーズへのストレプトアビジン又はニュートラアビジンの付着
ストレプトアビジンの原液は、先ず、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）５ｍｇを水０．５ｍＬに溶解し（最終溶液濃度は１０ｍｇ／ｍＬ）、その後、結果として得られる溶液７５μｌを、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝液４２５μｌに添加して、１．５ｍｇ／ｍＬの最終ストレプトアビジン溶液濃度を得ることによって調製された。
【００７２】
ニュートラアビジンの原液は、先ず、ニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）１０ｍｇを、水１．０ｍＬに溶解し（最終溶液濃度は１０ｍｇ／ｍＬ）、その後、結果として得られる溶液７５μｌを、ＭＥＳ緩衝液４２５μｌに添加して、１．５ｍｇ／ｍＬの最終ニュートラアビジン溶液濃度を得ることによって調製された。
【００７３】
ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）の原液は、それらビーズを官能基化する直前に、ＥＤＣ  ２０ｍｇをＭＥＳ緩衝液０．５ｍＬに添加して、４０ｍｇ／ｍＬの最終ＥＤＣ溶液濃度を生じさせることによって調製された。
【００７４】
（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから１００ｎｍの）ＦＬＵＩＤＭＡＧ  ＡＲＡビーズは、次の手順を用いて、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンで官能基化された。
【００７５】
１．ストックビーズ溶液１００μｌを、ＭＥＳ緩衝液１ｍＬで２回洗浄し、次いで、上澄みを除去した。
【００７６】
２．それらビーズを、上記で調製されたＥＤＣ溶液０．２ｍＬに再懸濁した。
【００７７】
３．懸濁液を、室温で１０分間混合した。
【００７８】
４．それらビーズを、ＭＥＳ緩衝液１ｍＬで２回洗浄した。
【００７９】
５．それらビーズを、上記で調製されたストレプトアビジン又はニュートラアビジンの原液を含有するＭＥＳ緩衝液０．２ｍＬに再懸濁し、次いで、結果として得られた混合物を、室温で撹拌しながら２時間の間定温放置した。
【００８０】
６．結果として得られたビーズを、ＰＢＳ  Ｌ−６４緩衝液中で３回洗浄した。
【００８１】
７．それらビーズを、ＰＢＳ  Ｌ−６４緩衝液１．２ｍＬに再懸濁し、２．５ｍｇ／ｍＬの最終ビーズ溶液濃度を提供した。
【００８２】
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡからの）ＤＹＮＡＬ  Ｃ１ビーズは、上記のように１００μｌではなくビーズ原液３００μｌで開始したことを除き、上記に概説された手順と同一の手順を用いて、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンで官能基化された。
【００８３】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ，ＡＴＣＣＣ  ２５９２３）細胞及び緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，ＡＴＣＣＣ  １０６６２）細胞のための捕捉手順並びに検出手順
細菌懸濁液は、トリプシン大豆ブロス中で３７℃で一晩培養して調製された。それら培養液は、細胞を接種するために遠心分離機にかけ、次いで、細胞ペレットを、無菌のリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁して、約５×１０８ｃｆｕ／ｍＬの最終濃度にした。実験を行う前、細菌は、ＰＢＳ  Ｌ−６４緩衝液中で３回洗浄し、約５×１０３〜５×１０６ｃｆｕ／ｍＬに希釈した。次いで、所望により、その溶液にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加して、タンパク質の目標濃度（典型的には、３００μｇ／ｍＬ）を得た。ストレプトアビジンで被覆された粒子の懸濁液の所望量（１０ｍｇ／ｍＬ）（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，ＧｅｒｍａｎｙからのＦＬＵＩＤＭＡＧビーズ）を、細菌の懸濁液と混合して、２ｍＬ入りポリプロピレンバイアル瓶の中で５００マイクロリットル（μｌ）の全容量にした。バイアル瓶は、手動で３０秒間振盪し、細菌とそれら粒子とを混合し、次いで、振盪台（約０．３サイクル／秒に設定された（Ｒｅｃｉｐｒｏｃａｔｉｎｇ  ＢＡＲＮＳＴＥＡＤ／ＴＨＥＲＭＯＬＹＮＥ  ＶＡＲＩＭＩＸ（Ｄｕｂｕｑｕｅ，Ｉｏｗａ）））上で１５分間撹拌した。それら粒子は、５分間磁石を用いてバイアル瓶の片側に引き出した。それら粒子によって吸着されなかった細菌細胞を含有する上澄み液を、取り除いて、無菌のＰＢＳ  Ｌ−６４緩衝液で１０倍に希釈した。次いで、磁石からバイアル瓶を取り外し、５００μｌの無菌ＰＢＳ  Ｌ−６４緩衝液を添加し、次いで、バイアル瓶を手動で３０秒間撹拌して、それら粒子を再懸濁させることによって、任意的洗浄工程を行った。バイアル瓶は、５分間磁石に隣接して配置し、次いで、洗浄溶液を吸引し、ＰＢＳ  Ｌ−６４緩衝液で１０倍に希釈した。バイアル瓶を磁石から取り外し、５００μｌの緩衝液を添加し、次いで、バイアル瓶を、手動で３０秒間撹拌して、粒子を再懸濁した。
【００８４】
各々の溶液（上澄み液、洗浄液、及び再懸濁された粒子）の各々の生菌の数は、各々の懸濁液の階段希釈物をＰＥＴＲＩＦＩＬＭ  Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｃｏｕｎｔ  Ｐｌａｔｅｓ（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）で平板培養することによって決定した。
【００８５】
（実施例１）
黄色ぶどう球菌（S. aureus）（ＡＴＣＣＣ  ２５９２３）の捕捉
（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙからの１００ｎｍ）ＦＬＵＩＤＭＡＧ粒子であって、多糖コアを有し、かつストレプトアビジンで官能基化された粒子を用い、上記のＣａｐｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅを用いて、黄色ぶどう球菌を非特異的に捕捉した。粒子１０μｌを、約５×１０３ｃｆｕ／ｍＬの細菌４９０μｌと組み合わせた。洗浄工程は、本実験に含まれた。
【００８６】
それら粒子は、細菌の高捕捉％を実証した。同一粒子が、細胞表面に存在するいかなる抗原にも特異的ではない抗体（調製の実施例２によって調製されたような）で被覆され、かつ同一実験が繰り返された場合、捕捉率は乏しかった。このように、抗体の存在は、非特異的細菌の捕捉率を著しく低下させた。結果を表１に示す。
【００８７】
【表２】
2011509083.tif 000003
【００８８】
ＰＢＰ２Ａ抗体に関し、譲受人の同時係属米国特許出願シリアル第６０／８６７０８９号を参照されたい。
【００８９】
（実施例２）
ストレプトアビジンで官能基化されたビーズと、ストレプトアビジンを含有しない、カルボキシ基で官能基化されたビーズとの間の比較
多糖コアを有するＦＬＵＩＤＭＡＧ磁性粒子であって、ストレプトアビジンで官能基化された磁性粒子（１００ｎｍ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ）を用いて、上記の捕捉及び検出の手順に従って、細菌を非特異的に捕捉した。加えて、多糖コアと表面のカルボキシ表面基とを有するＦＬＵＩＤＭＡＧ  ＡＲＡ磁性粒子（１００ｎｍ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ）もまた、試験された。緑膿菌（ＡＴＣＣＣ  １０６６２）（表２）と黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣＣ  ２５９２３）（表３）との両方について、捕捉を行った。ヒト血清アルブミン３００μｇ／ｍＬが存在する場合と、存在しない場合との捕捉を試験した。実験の全てについて、粒子（３０μｌ）を、約５×１０６ｃｆｕ／ｍＬの細菌４７０μｌと組み合わせた（粒子濃度０．６ｍｇ／ｍＬ）。表２及び表３に、結果を示す。
【００９０】
【表３】
2011509083.tif 000004
【００９１】
表２に示されるように、ストレプトアビジンビーズは、血清アルブミンの存在下で、僅かにより低い捕捉率で緑膿菌を捕捉した。しかし、カルボキシル基ビーズは、特に、血清アルブミンの存在下で、著しくより低い捕捉率を示した。両方の粒子が、同一の多糖コアの化学的性質を有したとしても、ストレプトアビジンを有する粒子は、カルボキシル基で官能基化されているがストレプトアビジンを含有しない粒子表面と比較して、遥かに優れた捕捉率を実証した。
【００９２】
【表４】
2011509083.tif 000005
【００９３】
表３に示されるように、ストレプトアビジン／多糖のビーズは、血清アルブミンの存在下と非存在下との両方において、黄色ブドウ球菌の優れた捕捉率を示した。しかし、ストレプトアビジンを含有しないカルボキシルビーズは、両方の場合で乏しい捕捉率を示した。両方の粒子が、同一の多糖コアを有したとしても、表面上にストレプトアビジンを有する粒子は、著しく良好に作動した。
【００９４】
（実施例３）
赤血球及びタンパク質の存在下での多糖上のストレプトアビジンによる捕捉
多糖コアを有するＦＬＵＩＤＭＡＧ磁性粒子（１００ｎｍ、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ）であって、ストレプトアビジンで官能基化された磁性粒子を用いて、上記の捕捉及び検出の手順に従って、細菌を非特異的に捕捉した。緑膿菌（ＡＴＣＣＣ  １０６６２）（表４）と黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣＣ  ２５９２３）（表５）との両方について捕捉を行った。試料中に血液が様々な濃度（全血液の１：１０００、１：１００００及び１：１０００００の希釈）で存在する状態で、捕捉を行った。血液を含有しない対照試料をも試験した。それら実験の全てについて、粒子（３０μｌ）を、約５×１０６ｃｆｕ／ｍＬの細菌（０．６ｍｇ／ｍＬの粒子濃度）４７０μｌと結合させた。表４及び表５に、それらの結果を示す。
【００９５】
【表５】
2011509083.tif 000006
【００９６】
対照試料において、緑膿菌の優れた捕捉率が見られた。血液濃度が増加するにつれて、捕捉率は減少したが、試験された血液の最大濃度（１：１０００希釈）でさえ、捕捉レベルは満足できるものであった。
【００９７】
【表６】
2011509083.tif 000007
【００９８】
黄色ブドウ球菌に関し、対照試料に、優れた捕捉率が見られた。血液濃度が増加するにつれて、捕捉率は減少したが、試験された血液の最大濃度（１：１０００希釈）でさえ、捕捉レベルは満足できるものであった。
【００９９】
（実施例４）
ポリスチレン−カルボキシル基のビーズ上のストレプトアビジンによる黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣＣ  ２５９２３）捕捉と比較した、多糖ビーズ上のストレプトアビジンによる黄色ブドウ球菌の捕捉
調製の実施例３のように、ポリスチレン−カルボキシル基のビーズ（ＤＹＮＡＬ  Ｃ１）、及び多糖−カルボキシル基のビーズ（ＦＬＵＩＤＭＡＧ  ＡＲＡ，Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にストレプトアビジンが付着され、次いで、上記の捕捉と検出の手順に従って、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣＣ  ２５９２３）が捕捉された（調製の実施例３で調製されたストックビーズ溶液の３２μｌを、細菌のストック試料４６８μｌに添加して、０．１６ｍｇ／ｍＬの最終ビーズ溶液濃度を得た）。加えて、非変性のポリスチレン−カルボキシル基（ＤＹＮＡＬ  Ｃ１）ビーズ及び多糖−カルボキシル基（ＦＬＵＩＤＭＡＧ  ＡＲＡ）ビーズを用いて、捕捉実験を行った。結果を表６に示す。
【０１００】
【表７】
2011509083.tif 000008
【０１０１】
表６に関し、ストレプトアビジンで官能基化されたポリスチレンビーズの捕捉効率は、非変性のポリスチレンビーズよりも約５倍低かった。一方、ストレプトアビジンで変性された多糖ビーズの捕捉効率は、非変性多糖ビーズ、又はストレプトアビジンで官能基化されたポリスチレンビーズのいずれよりも、約１０倍優れた。
【０１０２】
（実施例５）
ポリスチレン−カルボキシルビーズ上のストレプトアビジンによる緑膿菌（ＡＴＣＣＣ  ３５０３２）の捕捉と比較した、多糖ビーズ上のストレプトアビジンによる緑膿菌（ＡＴＣＣＣ  ３５０３２）の捕捉
黄色ブドウ球菌に代えて緑膿菌（ＡＴＣＣＣ  ３５０３２）を用いて、実施例４を実質的に繰り返し、結果は、下の表７にまとめられた。全体的に見て、ストレプトアビジンで変性された多糖ビーズは、最良の非特異的細菌捕捉性能を提供した。
【０１０３】
【表８】
2011509083.tif 000009
【０１０４】
（実施例６）
ポリスチレン−カルボキシルビーズ上のニュートラアビジンによる黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣＣ  ２５９２３）の捕捉と比較した、多糖ビーズ上のニュートラアビジンによる黄色ブドウ球菌の捕捉
調製の実施例３のように、ポリスチレン−カルボキシル基（ＤＹＮＡＬ  Ｃ１）ビーズ、及び多糖−カルボキシル基（ＦＬＵＩＤＭＡＧ  ＡＲＡ，Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ）ビーズにニュートラアビジンを付着し、次いで、上記の捕捉及び検出の手順に従って、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣＣ  ２５９２３）を捕捉した（調製の実施例３で調製されたストックビーズ溶液の３２μｌを、細菌のストック試料４６８μｌに添加して、０．１６ｍｇ／ｍＬの最終ビーズ溶液濃度を得た）。結果は、表８に示される。
【０１０５】
【表９】
2011509083.tif 000010
【０１０６】
表８に関し、ニュートラアビジンで変性された多糖ビーズは、ニュートラアビジンで官能基化されたポリスチレンビーズに比べて１０倍の捕捉効率を示した。
【０１０７】
（実施例７）
ポリスチレン−カルボキシルビーズ上のニュートラアビジンによる緑膿菌（ＡＴＣＣＣ  ３５０３２）の捕捉と比較した、多糖ビーズ上のニュートラアビジンによる緑膿菌の捕捉
黄色ブドウ球菌に代えて緑膿菌（ＡＴＣＣＣ  ３５０３２）を用いて、実施例６を本質的に繰り返した。結果は、下の表９にまとめられる。ニュートラアビジンを有する多糖ビーズは、ニュートラアビジンを有するポリスチレンビーズに比べて、著しくより大きい非特異的細菌捕捉率を提供した。
【０１０８】
【表１０】
2011509083.tif 000011
【０１０９】
（実施例８）
ストレプトアビジンで官能基化された多糖ビーズを用いた、様々な細菌の非特異的捕捉
調製の実施例３のように、多糖−カルボキシルビーズ（ＦＬＵＩＤＭＡＧ  ＡＲＡ，Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ）にストレプトアビジンを付着させた。次いで、上記の捕捉及び検出の手順に従って、（臨床分離株由来の）様々な細菌株を捕捉した（調製の実施例３で調製されたストックビーズ溶液の３２μｌを、細菌のストック試料４６８μｌに添加して、０．１６ｍｇ／ｍＬの最終ビーズ溶液濃度を得た）。結果は、下の表１０にまとめられる。
【０１１０】
【表１１】
2011509083.tif 000012
【０１１１】
表１０の結果は、多糖−ストレプトアビジンビーズを用いて、様々な微生物を非特異的に捕捉することができることを示す。
【０１１２】
（実施例９）
ストレプトアビジンで官能基化された多糖ビーズを用いた、連鎖球菌株の非特異的捕捉
多糖コアを有するＦＬＵＩＤＭＡＧ磁性粒子（１００ｎｍ，Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ）であって、ストレプトアビジンで官能基化された磁性粒子を用いて、ストレプトコッカスアガラクチア（Strep agalatiae）３９Ｂと、ストレプトコッカスジスガラクチア１Ｅ（臨床分離株）とを非特異的に捕捉した。０．６ｍｇ／ｍｌのビーズ溶液濃度を用いて、上記の捕捉及び検出の手順に従った。（表１１に示される）結果は、ストレプトコッカスアガラクチアとストレプトコッカスジスガラクチアとの両方が効率的に捕捉されることを実証する。
【０１１３】
【表１２】
2011509083.tif 000013
【０１１４】
（実施例１０）
ストレプトアビジンで官能基化された多糖ビーズを用いた、細菌の非特異的捕捉に及ぼすサポニンの影響
大腸菌、サルモネラ菌、及びＢ群レンサ球菌の溶液は、これらの細菌を、血液寒天プレート上で一晩増殖させることによって調製された。次いで、細菌の懸濁液は、約１×１０８ｃｆｕ／ｍＬの濃度に対するマクファーランド濁度基準（MacFarland turbidity standards）によって、ＰＢＳ  Ｌ−６４緩衝液で調製された。それら懸濁液は、ＰＢＳ  Ｌ−６４緩衝液で、約１×１０６ｃｆｕ／ｍＬの作業濃度まで希釈された。
【０１１５】
（調製の実施例３におけるＦＬＵＩＤＭＡＧ  ＡＲＡビーズを用いて作られた）ストレプトアビジンで官能基化された多糖−カルボキシルビーズ（２．５ｍｇ／ｍＬ）３２μｌを、細菌試料の２３４μｌに添加することによって、捕捉の実験を行った。ＰＢＳ緩衝液に入れたサポニン（製品番号４７０３６，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の２％原液を調製した。サポニンの存在下での捕捉実験に関し、サポニンの原液２３４μｌを、ビーズ−細菌の混合物に添加し、結果として、捕捉の間のサポニン濃度は０．９％になった。サポニンを用いない捕捉実験に関し、ＰＢＳ  Ｌ−６４緩衝液２３４μｌを、ビーズ−細菌の混合物に添加した。ビーズ濃度は、捕捉実験の間０．１６ｍｇ／ｍｌであった。捕捉実験は、上記の捕捉及び検出の手順に記述されるように、この点から前方に実施された。表１２に示される結果は、サポニンの存在が、試験された細菌全てに対して細菌の捕捉率を増大させたことを示す。
【０１１６】
【表１３】
2011509083.tif 000014
【０１１７】
（実施例１１〜２２及び比較実施例１〜４）
細菌の捕捉及びＡＴＰ検出
多糖コアを有する（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙからの１００ｎｍ）ＦＬＵＩＤＭＡＧ  ＡＲＡビーズであって、（調製の実施例３のように調製された）ストレプトアビジン又はニュートラアビジンで官能基化されたビーズを用い、上記の捕捉及び検出の手順を用いて、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ  ２５９２３）及び大腸菌（ＡＴＣＣ  ２５９２２）を非特異的に捕捉した。各々の実施例に関し、ビーズ懸濁液の１０μｌは、（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡから入手可能な）ポリプロピレン微小遠心管を用いて、約１×１０６ｃｆｕ／ｍｌ及び約１×１０５ｃｆｕ／ｍｌの２つの濃度の細菌懸濁液４９０μｌと組み合わされた。上記の捕捉及び検出の手順を用いて、０ｃｆｕ／ｍｌを有する試料、及び（細菌は、１×１０６ｃｆｕ／ｍｌ又は１×１０５ｃｆｕ／ｍｌであり、いかなる捕捉用ビーズをも用いない）陽性対照試料をも調製した。
【０１１８】
次いで、それらビーズは、分離され、次いで、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能な）ＤＹＮＡＬ磁性の材料固定具の中に微小遠心管を少なくとも５分間配置することによって濃縮された。上澄み液は、凝塊形成したビーズを崩壊させることなく、マイクロピペットを用いて廃棄された。
【０１１９】
次いで、それらビーズは、微小遠心管にＰＢＳ−Ｌ６４緩衝液を０．５ｍＬ添加し、次いで、５分間、揺動運動を用いることによって洗浄された。それらビーズは、次いで、再び分離され、次いで、ＤＹＮＡＬ磁性の材料固定具の中に微小遠心管を少なくとも５分間配置することによって、濃縮された。洗浄溶液は、凝塊形成したビーズを崩壊させることなく、マイクロピペットを用いて廃棄された。この洗浄工程は、２回繰り返された。
【０１２０】
ＤＥＰＣ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ  ＷＩから入手できるピロ炭酸ジエチル）処理水１００μｌと、（Ｂｉｏｔｒａｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡから入手可能な）抽出溶剤ＸＭの１００μｌとを、それらビーズに添加した。バイアル瓶は、磁性の材料固定具から取り外され、次いで、手動で撹拌されて、それら粒子を再懸濁させた。それら粒子が、可視のいかなる凝集をも生じることなく確実に懸濁するように、渦動（vortexing）をも用いられた。それら懸濁粒子は、ＤＥＰＣ処理水及び抽出溶剤ＸＭと一緒に、少なくとも６０秒間培養された。
【０１２１】
次いで、それらビーズは、再び分離され、次いで、ＤＹＮＡＬ磁性の材料固定具の中に微小遠心管を少なくとも５分間配置することによって濃縮された。次いで、スワブと、ペレット化した形態の溶解剤の入っている、ホイルで密封された室とを取り外した後、上澄み液は、マイクロピペットで吸い上げられて（Ｂｉｏｔｒａｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡから入手できる）Ｂｉｏｔｒａｃｅ  ＡＱＵＡ−ＴＲＡＣＥ試験装置の底部室に放出された。Ｂｉｏｔｒａｃｅ装置の底部室には、ルシフェラーゼ生物発光によってＡＴＰの存在を決定するのに必要な乾燥試薬の全てが入った。試料は、１０秒間渦動され、次いで、Ｂｉｏｔｒａｃｅ  ＡＱＵＡ−ＴＲＡＣＥ試験装置の底部室に上澄み液を添加した後、３０秒以内に、（Ｂｉｏｔｒａｃｅ照度計（Ｂｉｏｔｒａｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡから入手できる）ＵＮＩ−ＬＩＴＥ  ＮＧ）の中に配置された。各々の試料からの生物発光応答は、相対発光量（ＲＬＵｓ）で表１３に記載される。３回繰り返しによる平均ＲＬＵｓは、表１３に記載される。記載されたＲＬＵｓ値に基づく１σ標準偏差も、表１３に示される。
【０１２２】
【表１４】
2011509083.tif 000015
【０１２３】
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、及びＣ４は、比較例１、２、３、４である。
【０１２４】
黄色ブドウ球菌は、試験された両方の濃度で検出されたが、大腸菌は、試験された最大濃度でのみ検出された。陽性対照のシグナル強度（Ｃ１〜Ｃ４）を、常磁性ビーズを用いて捕捉された試料のそれと比較した場合、捕捉された試料に対して見出だされたより低い強度は、試料配合物の１００％未満の捕捉効率から生じたが、分析の間、ビーズ上の抽出されたＡＴＰの非特異的結合に起因する、試料のＡＴＰの損失もまたそうである。
【０１２５】
（実施例２３〜２７）
溶解血液細胞の存在下での黄色ブドウ球菌及び大腸菌の捕捉、並びにＡＴＰ検出
細菌を検出するための分析は、０、１×１０５、又は１×１０６ｃｆｕ／ｍｌの細菌を含有するＰＢＳ緩衝液２３４μｌ、及び、（１００ｎｍ，ドイツ国ベルリン、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ  ＧｍｂＨからの）ＦＬＵＩＤＭＡＧ粒子であって、多糖コアを有し、かつ、ストレプトアビジンで官能基化されている粒子３２μｌと一緒に、（ＰＢＳ緩衝液を用いて）１：１０，０００に希釈され、かつ、（０．９％サポニン生成物＃４７０３６，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈを用いて）溶解されたヒト全血試料２３４μｌを含有する初期の試料組成物は別にして、実施例１１〜２２に記述されるように、厳密に繰り返しされた。各々の試料からの生物発光反応は、相対発光量（ＲＬＵｓ）で表１４に記載される。３回繰り返しによる平均ＲＬＵｓは、表１４に記載される。記載されるＲＬＵｓ値の１σ標準偏差も、表１４に示される。表１４に示されるデータは、両方の細菌の検出が、試験された両方の濃度で観察されたことを実証する。
【０１２６】
【表１５】
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【０１２７】
本明細書中に引用される特許、特許文献、及び刊行物の完全な開示は、それぞれが個々に組み込まれたかのように、その全体が参照により組み込まれる。本発明の範囲及び趣旨から逸脱しない本発明の様々な変更や改変は、当業者には明らかとなるであろう。本発明は、本明細書で述べる例示的な実施形態及び実施例によって不当に限定されるものではないこと、また、こうした実施例及び実施形態は、本明細書において以下に記述する特許請求の範囲によってのみ限定されると意図する本発明の範囲に関する例示のためにのみ提示されることを理解すべきである。
【国際調査報告】
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