(57)【要約】  本発明は、黄色ブドウ球菌細菌の増殖、検出、同定および／または測定のための特異的培養培地であって、それがホスホリパーゼＣの少なくとも１つの蛍光性、発色性または発光性基質を含むことを特徴とする、培地に本質的に関する。該培地は、黄色ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌との区別を可能にする。【選択図】図１
2011530303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌細菌の増殖、検出、同定および／または測定のための特異的培養培地であって、ホスホリパーゼＣの少なくとも１つの蛍光性、発色性、または発光性基質を含むことを特徴とする、培地。
【請求項２】
ホスホリパーゼＣの基質がホスファチジルイノシトール・ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）の基質であることを特徴とする、請求項１に記載の培養培地。
【請求項３】
ＰＩＰＬＣの基質の濃度が０.０１〜１ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項２に記載の培養培地。
【請求項４】
ＰＩＰＬＣの基質が、４-ニトロフェニル・ミヨ-イノシトール-１-リン酸、４-メチルウンベリフェリル・ミオ−イノシトール-１-リン酸、３-クロロ-７-ヒドロキシ-４-メチルクマリン・ミオ-イノシトール-１-リン酸、３-エトキシカルボニル-４-メチルクマリン・ミオ-イノシトール-１-リン酸、３-シアノ-４-メチルクマリン・ミオ-イノシトール-１-リン酸を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項２または３に記載の培養培地。
【請求項５】
ホスホリパーゼＣの基質がホスファチジルコリン・ホスホリパーゼＣ（ＰＣＰＬＣ）の基質であることを特徴とする、請求項１に記載の培養培地。
【請求項６】
ＰＣＰＬＣの基質の濃度が０.０１〜１ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項５に記載の培養培地。
【請求項７】
ＰＣＰＬＣの基質が、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドキシル・コリンリン酸、３-インドキシル・コリンリン酸、４-メチルウンベリフェリル・コリンリン酸を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項５または６に記載の培養培地。
【請求項８】
コアグラーゼ陰性ブドウ球菌から黄色ブドウ球菌細菌を区別するためのホスホリパーゼＣの少なくとも１つの基質の使用。
【請求項９】
黄色ブドウ球菌細菌の増殖、検出、同定および／または測定用の特異的培養培地を調製するためのホスホリパーゼＣの少なくとも１つの発色性、蛍光性、または発光性基質の使用。
【請求項１０】
複合試料中の黄色ブドウ球菌細菌を検出および／または同定および／または測定するための、請求項１から７の何れか一項に記載の培養培地の使用。
【請求項１１】
黄色ブドウ球菌細菌を増殖、検出、同定および／または測定する方法であって、
ａ）請求項１から７の何れか一項に記載の培養培地に、黄色ブドウ球菌細菌を含有する可能性がある試料を播種する工程、及び
ｂ）前記培養培地中の黄色ブドウ球菌細菌の増殖に対応する、前記培養培地中の蛍光、発光または着色のレベルの変化を測定する工程を
を含む、方法。
【請求項１２】
前記播種がされた培養培地を、前記細菌の増殖を可能にするために好適な条件下に置くことからなる中間工程ａ’）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
黄色ブドウ球菌を測定する補足的工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
生物学的試料が、臨床試料、食品試料または環境試料であることを特徴とする、請求項１１から１３の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、微生物学的分析の分野に関する。特に、本発明は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）をコアグラーゼ陰性ブドウ球菌と区別することを可能にする、ブドウ球菌の増殖、検出、同定および／または測定のための選択培養培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌、すなわちブドウ球菌は、多くの院内感染の原因であり、病院における相当な問題である。これらの細菌はグラム陽性球菌であり、グラム陽性球菌は、血漿の凝固を誘発するタンパク質である、コアグラーゼの産生によって区別される２つの主な群に分類することができる。したがって、区別は、その主な代表が表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）である、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌と、その主な代表が、その毒性で有名な、黄色ブドウ球菌である、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌との間で行なわれる。ブドウ球菌は、環境、ヒトおよび動物の皮膚および粘膜において広く発生する。これらの宿主からの定期的に落屑することにより、自然界（水、土壌、大気、食料、物体）に、および衛生の厳格な対策と患者の隔離とが表皮性菌株の拡大を制限するために必要とされる病院環境に広く拡散される。したがって、臨床現場で分離されるブドウ球菌の８０〜９０％に相当する黄色ブドウ球菌は、特に、院内肺炎、手術創の感染症、火傷の感染症、異物（心臓弁、人工股関節、クランプなど）の感染症、およびしばしば血管内カテーテルの使用が原因であるか、または別の感染の部位からの細菌の伝播が原因である全身感染症または敗血症などの、病院環境における多くの感染症の原因となる主なヒト病原菌である。
【０００３】
ブドウ球菌、および特に黄色ブドウ球菌は、食品の分野においても相当な危険性をもたらす。実際、黄色ブドウ球菌の特定の株は腸毒素を産生することができ、消費者によるその摂取は中毒をもたらし、吐き気、腹痛および特に、しばしば下痢を伴う、激しい、反復嘔吐を引き起こす。
【０００４】
ブドウ球菌食中毒は、したがって、細菌由来の食中毒の主な形態の１つに相当する。
【０００５】
拡散は、通常、病気または健康な保菌者である動物およびヒトにより、生乳（乳腺炎）により、食品や健康または感染保菌者と接触している大気および汚染表面または機器により生じる。
【０００６】
食品中のブドウ球菌のおよび特に黄色ブドウ球菌の検出および同定は、それゆえ、主な公衆衛生課題を構成する。
【０００７】
ブドウ球菌属の細菌の検出、同定および測定に使用される培養培地の中で、区別は、コロンビア培地またはトリプチケース−ソイ寒天などの非選択培地とチャップマン寒天およびベアド−パーカー寒天などの、選択培地との間で行なわれる。黄色ブドウ球菌は、その形態学的特徴およびその溶血プロファイルによっては、血液寒天上で検出することもできるが、この方法は、感度および特異性があまり高くなく、仮にそうであるとしても、食品業界ではほとんど使用されない。心臓−脳培養液も通常ブドウ球菌の調査に使用される。
【０００８】
特定の細菌学的培養培地は特定の微生物の増殖を促進し、その他の増殖を制限する。それらは、標的病原菌以外の微生物の少なくとも１つの阻害剤を含有する。対象の微生物が、生産される食品調製物中で損傷されることがあるので、阻害剤の効果は、前記対象の微生物に限定されたままでなければならない。チャップマン寒天は、その発酵がｐＨ指示薬によって検出される、マンニトールを基質として用いた、普通の栄養基剤上の高塩培地に対応する。前記ｐＨ指示薬は、着色指示薬または蛍光指示薬であることができる。ベアド−パーカー培地は、黄色ブドウ球菌を増殖させるのによく用いられる選択剤である、添加されたテルル酸カリウムおよび塩化リチウムを含む富栄養基剤に対応する。塩化リチウムは腸球菌の阻害剤である。他の化学薬品、すなわち、硫酸アンモニウム、ソルビン酸、グリシン、ポリミキシンＢを、テルル酸カリウムおよび塩化ナトリウムまたは塩化リチウムと組み合わせることができる。
【０００９】
とはいえ、潜在的に毒素原性のブドウ球菌についての食品マトリックスの分析は、臨床実施のために開発された方法の実践的な使用を制限する、特殊な問題を提起する。実際、よく提案される培地は、食品汚染の媒介物とみなされない、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の増殖および、要求される表現型特徴によっては、検出も可能にする。
【００１０】
ＩＳＯ６８８８−１および６８８８−２標準に従う参照培地である、ベアド−パーカー＋ＲＰＦ（ウサギ血漿＋ウシフィブリノーゲン）培地の場合、いくらかの欠点が一般に観察される。
【００１１】
第１に、読取りおよび感度における問題がある。黄色ブドウ球菌の特定の株が、この培地上で発育しないか、またはコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の存在を示唆する、非常に弱くかつ遅延したコアグラーゼを示すという事実のために、偽陰性が潜在的に現れる可能性がある。さらに、偽陰性結果は、マトリックスからの干渉のために観察される可能性もある。実際、黄色ブドウ球菌による低レベルの汚染を測定するために、試料の最低限の希釈が行なわれ（１／１０）、これは、マトリックス化合物の存在のために、ハローを読み取るときの困難をもたらす（例えば、乳および／または乳製品の試料：カゼインの白色がコアグラーゼを明らかにするハローを隠す）。
【００１２】
ベアド−パーカー＋ＲＰＦ培地は、トロンビンの源とプラスミノーゲンの源を組み合わせることを必要とする。後者は、動物の血液から得られるが、このことは、供給の信頼性（品質、量など）の問題を提起する。
さらに、ハローの読取りは、ブロス（液体培地）中では不可能であり、かつハローと培地のコントラストが低下する可能性がある。最後に、コンフルエントなコロニーの場合、ハローを産生するものとそれを産生しないものとを区別するのは困難である。
【００１３】
第２に、特異性の問題もあり得る。豊富な付随的細菌叢（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属）の存在下で、この種の培地を用いると偽陽性結果が現れることがある。これは、例えば、スタフィロコッカス・キシローサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ）をスターターとして用いる特定の肉原料製品（ドライソーセージ）および乳製品（マンステールタイプのチーズ）中の黄色ブドウ球菌を測定する場合に当てはまる。したがって、ハローによって囲まれた黒いコロニー、すなわち、通常はこの培地上の黄色ブドウ球菌の特徴を示すものであるが、実際はスタフィロコッカス・キシローサスの株（ハローのない黒いコロニーを産生する）と、寒天上でハローと認定され得る、濁りを生じさせるバチルスの特定の株との近接した増殖によって生じるコロニーが、ベアドパーカー＋ＲＰＦ培地上に出現する。
【００１４】
コアグラーゼ陽性ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の類似性がより大きいために、発色性培地などの、代替法の中に、これら２つの群を極めて特異的に識別することを可能にする培地はない。実際、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌をコアグラーゼ陰性ブドウ球菌と区別する目的でこの種の培地において利用される区別という概念（すなわち、阻害剤系と組み合わされる、多かれ少なかれ特異的である基質および／または糖）は、非常に多くの場合、複雑であり、特に多様でかつ豊富な微生物叢を含有する食品試料に対する優れた識別を提供しない。
【００１５】
コアグラーゼ陽性ブドウ球菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（または他の細菌種さえも）の区別のための特異的基質または糖の不在は、偽陰性結果が得られることを潜在的にもたらす、黄色ブドウ球菌の問題となる増殖または酵素活性を変化させ得るかまたは阻害し得る、「積極的な」選択／阻害系を使用することを意味する。
【００１６】
マトリックス相互作用を避けるために必要とされる希釈のために、少しの汚染の場合の偽陰性結果が、特定の培地を用いると得られることもある。例えば、３Ｍ（商標）ペトリフィルム（商標）Ｓｔａｐｈエクスプレス測定プレートを用いると、乳製品に存在する高レベルのホスファターゼによってピンク色の着色が生じる。
【００１７】
逆に、黄色ブドウ球菌に対する特異性が低い基質の分解または糖の発酵に基づく培地は、十分には選択的でない阻害系と更に組合わせられると、偽陽性結果が得られることになる。
【００１８】
最後に、特定の培地は、黄色ブドウ球菌と他のブドウ球菌および細菌種の最適な区別を確実にするために、２つの基質の使用に基づいている。そのような概念の適用は、特に、食品から得られる試料の場合、十分な特異性を提供することなく、培地の費用を増加させる。
【００１９】
ホスホリパーゼＣタイプの酵素が知られており、多くの微生物中に存在するものとして文献に記載されている。
【００２０】
ホスホリパーゼＣの中で、黄色ブドウ球菌由来のホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）が精製され、かつ特徴解析されている（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，１９８１−Ｖｏｌ．７１）。
【００２１】
この酵素はまた、黄色ブドウ球菌の考えられる毒性因子であると記載されている（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｎｏｖ．１９８９，ｐ．２４５１−２４５４−Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１１およびＩＮＦＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＩＴＹ，Ｄｅｃ．１９９３，ｐ．５０７８−５０８９−Ｖｏｌ．６１，Ｎｏ．１２）。さらに、黄色ブドウ球菌における活性のあるＰＩＰＬＣの最大産生を可能にするインビトロでの条件を評価するための研究も発表されている（Ｍａｒｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．；Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ａｃｉｄｉｃ  Ｍｅｄｉａ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ  ｂｙ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  Ｖｏｌ．２５（１９９２），ｐｐ．１２５−１２８）。
【００２２】
文書ＥＰ−０  ９７０  ２３９  Ｂ１は、様々な微生物によって分泌される、ＰＩＰＬＣの検出を可能にする新規の発色性基質を記載している。示された実施例は、一方で、言及された様々な基質の調製を記載し、他方で、この方法の使用のための最適条件（例えば、基質／酵素濃度、推奨される誘導因子など）を示している。しかしながら、ブドウ球菌の検出を可能にする培養培地はこの文書に記載されていない。
【００２３】
文書ＥＰ−１  ５０６  ３０９  Ｂ１は、ＰＩＰＬＣを産生することができる微生物の検出のための培養培地であって、それらがＰＩＰＬＣと接触したときに、それぞれ、蛍光と着色を発生させることができる、少なくとも１つの蛍光性化合物と少なくとも１つの発色性化合物の組合せを含有する培養培地を記載している。この培養培地は、阻害剤を添加することなく、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、黄色ブドウ球菌、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）の種、およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種などの、様々な細菌種の検出を可能にするものとして記載されている。しかしながら、黄色ブドウ球菌を検出することを目的とした、そのようなものと同様の培養培地は、この文書に記載されていない。記載されている培養培地は、リステリア・モノサイトゲネスおよびバチルスのセレウス群の検出に関するもののみである。さらに、記載されている全ての培養培地上で、ブドウ球菌の種、および特に黄色ブドウ球菌は増殖しないように思われる。
【００２４】
文書ＥＰ−０  ９４９  ２６６  Ｂ１は、特にリステリア属の細菌活性の指示薬としての、ＰＩＰＬＣに特異的な基質を記載している。該基質は、色または蛍光を生じさせることができる少なくとも１つの化合物を含有する。記載されている培養培地は、リステリア・モノサイトゲネスの検出に関するもののみである。さらに、記載されている全ての培養培地上で、ブドウ球菌の種および特に黄色ブドウ球菌は、それらの阻害のために、増殖しないように思われる。
【００２５】
他のホスホリパーゼＣと同様に、ホスファチジルコリンホスホリパーゼＣ（ＰＣＰＬＣ）も、黄色ブドウ球菌を含む、様々な細菌に存在するものとして記載されている（Ｊ．Ｇ．Ｓｏｎｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５，Ｎｕｍｂｅｒ  ４，Ａｐｒｉｌ  １９９７，ｐｐ．１５６−１６１（６））。
【００２６】
文書ＥＰ−１  ２１９  ６２８は、微生物の検出および同定のための新規の発色基質を記載している。これらの基質は、ＰＣＰＬＣに特異的な基質である。とはいえ、この文書は、黄色ブドウ球菌の検出および同定のための基質も、特異的培養培地も記載していない。
【００２７】
このように、２５年よりも前に黄色ブドウ球菌由来のＰＩＰＬＣの特徴解析およびこの細菌種の毒性における潜在的な役割が同定されているにも関わらず、発色性、蛍光性または発光性の、ＰＩＰＬＣに特異的な少なくとも１つの基質の使用に基づく、黄色ブドウ球菌の検出および／または測定に特異的であり、かつブドウ球菌のこの種とその他の種の識別を可能にする培養培地はこれまで記載されていないようなので、記載の培地における黄色ブドウ球菌の株の阻害はそもそも不可能である。さらに、黄色ブドウ球菌を検出または測定するための特異的培養培地における、ＰＣＰＬＣに特異的な発色性、蛍光性または発光性基質の使用、ブドウ球菌のこの種とその他の種の識別を可能にする該基質の使用を記載した文書はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
上で考慮された当該技術分野の状況によって提起される問題を念頭に置くと、本発明の本質的な目的の１つは、それらを検出するおよび／またはそれらを同定するおよび／またはそれらを測定する、ならびに黄色ブドウ球菌とその他のブドウ球菌の種との識別を可能にする目的のために、ブドウ球菌の増殖を促進する培養培地を供給することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、特にコアグラーゼ陰性ブドウ球菌による、偽陽性結果の生成を制限する培養培地を供給することである。
【００３０】
本発明の別の目的は、特に低レベルの汚染の場合に、減らされた阻害系の使用によって、標的細菌のよりカバーできる培養培地を供給することである。
【００３１】
本発明の別の目的は、単一の特異的基質の使用によって、簡単な読取りおよび解釈を可能にする培養培地を供給することである。
【００３２】
本発明の別の目的は、読取りの自動化を可能にする培養培地を供給することである。
【００３３】
最後に、本発明の最後の目的は、黄色ブドウ球菌の増殖を促進する減らされた選択性のために、結果を返す時間を減らすことを可能にする培養培地を供給することである。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
これらの目的はとりわけ、本発明によって達成され、本発明は、第１に、黄色ブドウ球菌細菌の増殖、検出、同定および／または測定のための特異的培養培地であって、それがホスホリパーゼＣの少なくとも１つの発色性、蛍光性、または発光性基質を含むことを特徴とする培地に関する。
【００３５】
「基質」は、微生物の酵素または代謝活性により、直接的にまたは間接的に、検出可能なシグナルを生じさせることができる任意の分子を意味する。
【００３６】
基質は、特に酵素基質、すなわち、酵素によって微生物の直接的または間接的な検出を可能にする産物に代謝されることができる基質であることができる。
【００３７】
この基質は、特に、検出される酵素活性に特異的な第１の部分と、以下、マーカー部分と呼ばれる、マーカーとしての役割を果たす第２の部分とを含む。このマーカー部分は、発色性、蛍光性、発光性である。好ましくは、本発明において使用される基質は、蛍光性である。本発明者らは、クマリンの誘導体および特にウンベリフェロン、ナフトール、レゾルフィン、フルオレセインについて言及する場合がある。
【００３８】
本発明の意味において、この基質は、ホスファチジルイノシトールホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）の基質であることができる。この場合、培地中のＰＩＰＬＣ基質の濃度は、０．０１〜１ｇ／ｌである。
【００３９】
好ましくは、ＰＩＰＬＣの基質は、４−ニトロフェニルミオ−イノシトール１−リン酸、４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール１−リン酸、３−クロロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンミオ−イノシトール１−リン酸、３−エトキシカルボニル−４−メチルクマリンミオ−イノシトール１−リン酸、３−シアノ−４−メチルクマリンミオ−イノシトール１−リン酸を含む群から選ばれる。
【００４０】
代わりの方法によれば、基質は、ホスファチジルコリンホスホリパーゼＣ（ＰＣＰＬＣ）の基質であることができる。この場合、培地中のＰＣＰＬＣ基質の濃度は、０．０１〜１ｇ／ｌである。
【００４１】
好ましくは、ＰＣＰＬＣの基質は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルコリンリン酸、３−インドキシルコリンリン酸、４−メチルウンベリフェリルコリン−リン酸を含む群から選ばれる。
【００４２】
好ましい実施形態では、本発明による培養培地は液体形態である。実際、この形態は、該試料中に潜在的に存在する微生物の放出を可能にするために、培養培地中での固体試料の混合の段階を必要とし得る、食品の微生物学的分析に特に好適である。
【００４３】
それでもなお、培養培地は、固体形態（例えば、寒天ベースの培地）であることもできる。液体培地と同じように、ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣまたはＰＣＰＬＣ）の基質がこれらの固体培地中に存在し、黄色ブドウ球菌の検出、同定、または測定すら可能にすることができる。
【００４４】
あるいは、本発明による培養培地は、エステラーゼ（特に、リパーゼまたはホスファターゼ）、コアグラーゼまたはα−グルコシダーゼ活性などの、ホスホリパーゼＣ活性とは異なる、標的微生物の酵素または代謝活性を検出するのを可能にする基質をさらに含むことができる。直接的な検出のために、この基質を、蛍光または発色性の、マーカーとしての役割を果たす部分に結合させることができる。間接的な検出のために、本発明による培養培地は、基質の消費によって誘導されるｐＨ変化に感受性がありかつ標的微生物の増殖を明らかにする、ｐＨ指示薬をさらに含むことができる。該ｐＨ指示薬は、発色団または蛍光団であることができる。
【００４５】
第１の実施形態によれば、本発明による選択培地は、食品の微生物学的検査において使用される。好ましくは、それは、乳製品中で黄色ブドウ球菌を増殖させて、測定するために使用される。
【００４６】
第２の実施形態によれば、本発明による選択培地は、環境の微生物学的モニタリングにおいて使用される。「環境」は、大気の試料、水の試料、または表面からの試料を意味する。表面からの試料の中では、本発明の目的は、院内感染の原因となるコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の中で、病院環境における黄色ブドウ球菌の検出に特定の用途を見出すことができる。
【００４７】
最後の実施形態によれば、本発明による選択培地は、黄色ブドウ球菌を検出するおよび／または同定するおよび／または測定するための臨床解析において使用される。
【００４８】
有利には、本発明による選択培地は、例えば、黄色ブドウ球菌の株のメチシリンに対する耐性の検査の範囲内で、耐性のマーカーをさらに含むことができる。
【００４９】
本発明の別の目的は、黄色ブドウ球菌細菌とコアグラーゼ陰性ブドウ球菌との区別のためのホスホリパーゼＣの少なくとも１つの発色性、蛍光性、または発光性基質の使用に関する。
【００５０】
該使用は、培養培地の製造に限定されない。実際には、ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣまたはＰＣＰＬＣ）の１以上の基質を有しかつ黄色ブドウ球菌の同定を可能にする同定試薬を作製することが完全に想定される。該試薬を、ＶＩＴＥＫ（登録商標）カード、ＡＰＩ（登録商標）またはＲＡＰｉＤＥＣ（登録商標）生化学検査キットなどの、本出願人により市販されている製品において使用することができる。
【００５１】
本発明の別の目的は、黄色ブドウ球菌細菌の増殖、検出、同定および／または測定のための特異的培養培地を調製するためのホスホリパーゼＣの少なくとも１つの基質の使用に関する。
【００５２】
本発明の別の目的は、複合試料中の黄色ブドウ球菌細菌を検出するおよび／または同定するおよび／または測定するための、本発明による培養培地の使用に関する。
【００５３】
最後に、本発明の最後の目的は、黄色ブドウ球菌細菌の検出および／または同定の方法であって、
ａ）本発明による培養培地に、黄色ブドウ球菌細菌を含有し得る試料を播種すること；及び
ｂ）該培養培地中の黄色ブドウ球菌細菌の増殖に対応する、培養培地中の蛍光、発光または着色の変化を測定すること
からなる工程を含む、方法に関する。 
【００５４】
有利には、本発明による方法は、上に述べたように播種された培養培地を、黄色ブドウ球菌細菌の増殖を可能にするのに好適な条件に置くことからなる中間工程ａ’）を含む。
【００５５】
特定の実施形態によれば、本発明による方法は、標的微生物を測定する補足的工程を含むことができる。該測定段階は、好ましくは最確数（ＭＰＮ）の方法に従って行なわれる。この方法は、本出願人の名における特許ＥＰ  １  １０５  ４５７において説明されている。
【００５６】
好ましくは、生物学的試料は、臨床試料、食品試料または環境試料である。
【００５７】
本発明による目的の適用は、単一タイプの支持体に限定されるものではないことが最後に留意されるべきである。実際には、インビトロ診断の分野において使用される全てのタイプの支持体、すなわち、マイクロプレート、マイクロチューブ、マイクロカプセル、キャピラリーなどが、使用に好適である。
【００５８】
以下の実施例は、図１と併せて、例示の目的のために示されており、決して限定するものではない。これらは本発明を理解することをより容易にするであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】２株の黄色ブドウ球菌のＰＣ−ＰＬＣ（レシチナーゼ）酵素活性を反映する、経時的な蛍光の測定を示す。
【実施例】
【００６０】
実施例１：黄色ブドウ球菌におけるＰＩＰＬＣ活性とコアグラーゼの存在との間の相関関係の調査−ＴＥＭＰＯ（登録商標）システム／ベアド−パーカー＋ＲＰＦ（ＢＰ＋ＲＰＦ）培地の比較
４３株の黄色ブドウ球菌および２０株のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を、本出願人により市販されているＴＥＭＰＯ（登録商標）システムとともに使用される、ベアド−パーカー＋ＲＰＦ培地（ビオメリュー  Ｒｅｆ．：４４００３）及びオッタビアーニ・アゴスティ寒天培地（ＯＡＡ）から得られた液体培地に播種することにより検査した。
【００６１】
ＯＡＡから得られた培地：
使用された培地は以下の組成からなる。
2011530303.tif 000003
−  ０．１ＭのＭＯＰＳバッファー  ｐＨ６．７０（６Ｎ  ＨＣｌを用いて調整した）
−  基質：４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−リン酸、Ｎ−メチル−モルフォリン塩、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ、Ｒｅｆ．Ｍ−５７１７  バッチ２００７８／１）
上記の培養培地は４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール−１−リン酸を含有しており、増殖と同時に、蛍光の出現による黄色ブドウ球菌の検出を可能にするための栄養基剤と組み合わされる。
【００６２】
ＴＥＭＰＯ（登録商標）カードの播種およびインキュベーション：
１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの初期濃度の、検査される株を、１０３ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度を得るように、トリプトン塩ブロス中に希釈する。
５０μｌのこの細菌懸濁液を４ｍｌの培養培地に添加する。細菌の量が５０ＣＦＵ／カードとなるように、全部をＴＥＭＰＯ（登録商標）カードに充填する。
ＴＥＭＰＯ（登録商標）カードを３７℃で２４時間インキュベートする。
【００６３】
ベアド−パーカー＋ＲＰＦ培地の播種およびインキュベーション：
１０３ＣＦＵ／ｍｌの細菌懸濁液は、５０μｌの割合でベアド−パーカー＋ＲＰＦ培地に播種するためにも使用する。
この培地を３７℃で２４時間インキュベートする。
【００６４】
結果：
ＴＥＭＰＯ（登録商標）カードを用いて得られた結果を、最確数（ＭＰＮ）の方法に従って、ＴＥＭＰＯ（登録商標）システムにより解析する。蛍光の出現は、蛍光４−メチルウンベリフェロンの放出を導くＰＩＰＬＣの４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール１−リン酸に対する触媒活性に直接関連する。
ベアド−パーカー＋ＲＰＦ培地上で得られたコロニーを従来通りに測定する。
【００６５】
以下に示す表１および２は、２つの方法により得られた結果をまとめている。
表１：黄色ブドウ球菌におけるＰＩＰＬＣ活性とコアグラーゼの存在との間の相関関係および各々の方法と関連する数（２４ｈ）
2011530303.tif 000004
2011530303.tif 000005
表２：ブドウ球菌属におけるＰＩＰＬＣ活性とコアグラーゼの不在の間の相関関係および各々の方法と関連する数（４０ｈ）
2011530303.tif 000006
【００６６】
−  検査された黄色ブドウ球菌の全ての株がインキュベーションの２４時間後にベアド−パーカー＋ＲＰＦ培地上で発育した。それらは全て、コアグラーゼを有している。
−  非黄色ブドウ球菌の中で、Ｓ４６という株だけが、コアグラーゼの存在を示す。この株に対してＡＰＩキットを用いて行なわれた検査は、それが実際には黄色ブドウ球菌であることを示した。
−  Ｓ４５株は、ベアド−パーカー＋ＲＰＦ上では、コアグラーゼ表現型を有するが、ＴＥＭＰＯを用いると、陽性シグナルが観察される。ディッシュからの単離は、バチルス属による試料の汚染を示した。
−  ２４時間で、２株の黄色ブドウ球菌（Ｓ１およびＳ１５）は、陽性シグナルとバックグラウンドノイズの間にわずかな変化を示す。これは、ベアド−パーカー＋ＲＰＦ上のこれらのコロニーの周辺の明るくなったハローの小さい直径と一致する。長期のインキュベーション（４０時間）は、シグナル対ノイズ比が正しいことを裏付けた。
−  ＰＩＰＬＣ活性を、ベアド−パーカー＋ＲＰＦ上でコアグラーゼが陽性である株の各々について検出する。コアグラーゼ陰性株は、Ｓ４５を除いて、ＰＩＰＬＣ活性の陽性シグナルを誘導しない。
こうして得られた結果は、それゆえ、黄色ブドウ球菌のコアグラーゼ活性とＰＩＰＬＣ活性との間の相関関係をはっきりと示す。
【００６７】
実施例２：２つの異なるＰＩＰＬＣ基質を用いたマイクロプレート中の黄色ブドウ球菌におけるＰＩＰＬＣ活性の解析
１９株のＡＴＣＣの黄色ブドウ球菌をマイクロプレート中のそれらのＰＩＰＬＣ活性について検査する。これらの検査を、実施例１に記載のＯＡＡ培地から得られる培地の成分に様々な濃度で添加される、ＰＩＰＬＣの２つの異なる蛍光性基質：４−メチルウンベリフェリル−ミオ−イノシトール１−リン酸および３−クロロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンミオ−イノシトールリン酸を用いて行なう。
2011530303.tif 000007
−  ４−メチルウンベリフェリルミオ−イノシトール１−リン酸、Ｎ−メチル−モルフォリン塩、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ（Ｒｅｆ．Ｍ−５７１７  ロット２００７８／１）
−  ３−クロロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンミオ−イノシトール１−リン酸（ＰＭ４５８．３６）
【００６８】
３−クロロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンミオ−イノシトール１−リン酸の合成
まず、保護されたミオ−イノシトール中間体を、A.V.Rukavishnikov et al.,Chem.Phys.Lipids,89(1997),153-157に従って合成する。
次に、この中間体を、調製された第２の中間体、すなわち、３−クロロ−７−ヒドロキシ−４−メチル−クマリン−ジイソプロピルホスホロアミダイトとカップリングした。所望の産物は、ヨウ化リチウムの存在下におけるカップリング産物の脱メチル化の反応、次のイノシトール部分の脱保護によって得られた（Ｔ．Ｏ．Ｚａｉｋｏｖａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１２（２００１），３０７−３１３）。
2011530303.tif 000008
最終産物のおよび中間体の分子構造をＮＭＲにより解析した。
【００６９】
マイクロプレートの播種およびインキュベーション：
１０８（ＣＦＵ）／ｍｌの初期濃度の、検査される株を、１０３ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度を得るように、トリプトン塩ブロス中に希釈する。
１０μｌのこの細菌懸濁液を２００μｌの培養培地に添加する。各々の株を、ＧＥＮｉｏｓ（商標）という名の下でＴＥＣＡＮ社により市販されているマイクロプレートリーダー中の培地の各々を用いて、３７℃で２４時間インキュベートした。
【００７０】
播種物の検証：
播種物を検証するために、１０ｍｌの１０３ＣＦＵ／ｍｌの各々の細菌懸濁液を、ベアド−パーカー＋ＲＰＦ培地（ビオメリュー  Ｒｅｆ．：４４００３）に播種するために使用する。
【００７１】
結果：
マイクロプレートにおいて得られた結果を下記の表３にまとめている。＋の表示は、バックグラウンドノイズの少なくとも２倍の蛍光の産生を可能にする株に対応する。−の表示は、培地により放出された、バックグラウンドノイズよりも小さいシグナルに対応する。
2011530303.tif 000009
【００７２】
検査された１９株のＡＴＣＣの黄色ブドウ球菌の中で、たった１つだけが、どんな基質を用いても、全くＰＩＰＬＣシグナルを生じさせなかった（ＡＴＣＣ４９７７５）。１７個が、４−メチルウンベリフェリル−ミオ−イノシトール１−リン酸の存在下でＰＩＰＬＣ活性を示し、１８個が、３−クロロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンミオ−イノシトール１−リン酸の存在下でＰＩＰＬＣ活性を示す。
従って、黄色ブドウ球菌におけるＰＩＰＬＣ活性は、適切に確認される。
【００７３】
さらに、ＰＩＰＬＣ活性の測定が、（ベアド−パーカー＋ＲＰＦ培地上でコアグラーゼ陽性であることが明らかになった）合計１０９株の黄色ブドウ球菌と、２６株のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌とに対して行なわれたことに留意すべきである。得られた結果は下記の表４にまとめられている。
2011530303.tif 000010
上で提示された結果は、ＰＩＰＬＣ活性の測定が黄色ブドウ球菌をコアグラーゼ陰性ブドウ球菌と区別するための非常に意義あるパラメータであることを裏付けている。
【００７４】
実施例３：マイクロプレート中の黄色ブドウ球菌のＰＣ−ＰＬＣ（レシチナーゼ）活性の解析（図１）
２株の黄色ブドウ球菌、ＡＴＣＣ３３５９２およびＡＴＣＣ７００６９９のＰＣ−ＰＬＣ活性の動力学を以下に示す培地の存在下においてマイクロプレート中で評価した。次に、マイクロプレートの様々なウェルの各々における蛍光の出現の読取りを動的条件下で行なった。
【００７５】
１．培地
使用された培地は、以下の組成、ｐＨ７．２からなる：
2011530303.tif 000011
４ＭＵ−ＣＰは、Ｍ−５５２８という参照番号の下で、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ社によって製造されている。
【００７６】
２．アッセイ
１０ＣＦＵの黄色ブドウ球菌、ＡＴＣＣ３３５９２およびＡＴＣＣ７００６９９を上記の培地の存在下においてマイクロプレートのウェル中に植菌した。次に、このマイクロプレートを、ＴＥＣＡＮリーダー中、３７℃でインキュベートし、この２株の黄色ブドウ球菌のＰＣ−ＰＬＣ活性を、４ＭＵ−ＣＰ基質の加水分解、すなわち、蛍光の出現の動態の形で評価した。
【００７７】
３．結果および解釈
４ＭＵ−ＣＰ基質の加水分解後の蛍光の出現の測定を、検査される２株の黄色ブドウ球菌（ＳＴＡ  ＡＴＣＣ３３５９２およびＳＴＡ  ＡＴＣＣ７００６９９）について、植菌されていない対照培地（ベースライン）と比べて、７２時間のインキュベーション時間にわたって行なった。
調査された２株の黄色ブドウ球菌のＰＣ−ＰＬＣ活性の動態は、図１に示すグラフ上に表示されている。
従って、ＰＣ−ＰＬＣの蛍光性基質、４ＭＵ−ＣＰの使用は、黄色ブドウ球菌の検出および識別を可能にする。
【図１】
2011530303.tif 000012
【国際調査報告】
2011530303.tif 000013
2011530303.tif 000014
2011530303.tif 000015
2011530303.tif 000016
2011530303.tif 000017
2011530303.tif 000018
2011530303.tif 000019
2011530303.tif 000020
2011530303.tif 000021
2011530303.tif 000022
2011530303.tif 000023
2011530303.tif 000024
2011530303.tif 000025
2011530303.tif 000026
2011530303.tif 000027
2011530303.tif 000028
2011530303.tif 000029
2011530303.tif 000030
2011530303.tif 000031
2011530303.tif 000032
2011530303.tif 000033