(57)【要約】  本発明は、全般的に、医薬の分野、とりわけ、上皮傷害、特に、虚血、低酸素症、外傷、化学溶解剤又は放射線曝露によるもの、を治療するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮傷害を治療することを必要とする対象に、カルシウム模倣化合物の治療的有効量を投与することを含む、上皮傷害を治療するための方法。
【請求項２】
上皮傷害が胃腸上皮傷害である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上皮傷害が皮膚損傷である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上皮傷害が、低酸素症又は虚血により誘発される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上皮傷害が、化学溶解剤（ｃｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）により誘発される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上皮傷害が化学療法誘発性細胞毒性である、請求項７に記載の方法。
【請求項７】
上皮傷害が、放射線により誘発される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上皮傷害が、毒素、感染性因子又は化学物質により誘発される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上皮傷害が、外傷により誘発される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上皮傷害を緩和することを必要とする対象にカルシウム模倣化合物の治療的有効量を投与することを含む前治療計画によって、上皮傷害を緩和するための方法。
【請求項１１】
前治療計画が、それを必要とする対象に、上皮傷害の前３日以内に、カルシウム模倣化合物の治療的有効量を投与することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
治療後処置計画をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
カルシウム模倣化合物が、式Ｉの化合物：
【化１】
2011516424.tif 000014
（式中、Ｘ１及びＸ２（これらは同一であるか又は異なり得る。）は、それぞれ、ＣＨ３、ＣＨ３Ｏ、ＣＨ３ＣＨ２Ｏ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＦ３Ｏ、ＣＨ３Ｓ、ＯＨ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＨ３ＣＨ２、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、アセトキシ及びアセチル基から選択される基であるか又はＸ１の２つが、縮合環式脂肪族環、縮合芳香環及びメチレンジオキシ基から選択される部分を一緒に形成し得るか又はＸ２の２つが、縮合環式脂肪族環、縮合芳香環及びメチレンジオキシ基から選択される部分を一緒に形成し得；ただし、Ｘ２は３−ｔ−ブチル基ではなく；
ｎは、０から５の範囲であり；
ｍは、１から５の範囲であり；
アルキル基はＣ１−Ｃ３アルキル基から選択され、このアルキル基は、場合によっては、飽和及び不飽和、線状、分岐型及び環状Ｃ１−Ｃ９アルキル基、ジヒドロインドリル及びチオジヒドロインドリル基及び２−、３−及び４−ピペリジニル基から選択される少なくとも１つの基で置換される。）；
又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
カルシウム模倣化合物が、Ｎ−（３−［２−クロロフェニル］−プロピル）−Ｒ−α−メチル−３−メトキシベンジルアミン又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
カルシウム模倣化合物がシナカルセトＨＣｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
カルシウム模倣化合物が、式ＩＩの化合物：
【化２】
2011516424.tif 000015
（式中、Ｒ１は、アリール、置換アリール、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり；
Ｒ２は、アルキル又はハロアルキルであり；
Ｒ３は、Ｈ、アルキル又はハロアルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル又はハロアルキルであり；
存在する各Ｒ５は、独立して、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロゲン、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＲｄＳ（＝Ｏ）ｍＲｄ、−ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＮＲｄＲｄ、−ＮＲｄＳ（＝Ｏ）ｍＮＲｄＲｄ又は−ＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒｄからなる群から選択され；
Ｒ６は、アリール、置換アリール、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり；
各Ｒａは、独立に、Ｈ、アルキル又はハロアルキルであり；
各Ｒｂは、独立に、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルであり、これらのそれぞれは、未置換であるか又はアルキル、ハロゲン、ハロアルキル、アルコキシ、シアノ及びニトロからなる群から選択される３個以下の置換基により置換され得；
各Ｒｃは、独立に、アルキル、ハロアルキル、フェニル又はベンジルであり、これらのそれぞれは、置換され得るか又は未置換であり得；
各Ｒｄは、独立に、Ｈ、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルであり、このアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル及びヘテロシクリルアルキルは、アルキル、ハロゲン、ハロアルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロ、Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＯＲｂ、−ＮＲａＲａ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｎＲｃ及び−Ｓ（＝Ｏ）ｎＮＲａＲａから選択される０、１、２、３又は４個の置換基により置換され；
ｍは、１又は２であり；
ｎは、０、１又は２であり；
ｐは、０、１、２、３又は４であり；
ただし、Ｒ２がメチルであり、ｐが０であり、Ｒ６が未置換フェニルであるならば、Ｒ１は、２，４−ジハロフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，４−ジエチルフェニル、２，４，６−トリハロフェニル又は２，３，４−トリハロフェニルではない。）
又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
カルシウム模倣化合物が、（１Ｒ）−Ｎ−（（６−（メチルオキシ）−４’−（トリフルオロメチル）−３−ビフェニルイル）メチル）−１−フェニルエタンアミン又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
カルシウム模倣化合物が、（１Ｒ）−Ｎ−（（６−クロロ−３’−フルオロ−３−ビフェニルイル）メチル）−１−（３−クロロフェニル）エタンアミン又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
カルシウム模倣化合物が、（１Ｒ）−１−（６−（メチルオキシ）−４’−（トリフルオロメチル）−３−ビフェニルイル）−Ｎ−（（１Ｒ）−１−フェニルエチル）エタンアミン又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
カルシウム模倣化合物が、式ＩＩＩの化合物：
【化３】
2011516424.tif 000016
及び医薬的に許容可能なその塩（式中、
【化４】
2011516424.tif 000017
は、二重又は単結合を表し；
Ｒ１はＲｂであり；
Ｒ２は、Ｃ１−８アルキル又はＣ１−４ハロアルキルであり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−４ハロアルキル又はＣ１−８アルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４ハロアルキル又はＣ１−４アルキルであり；
Ｒ５は、独立に、各例で、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＣ１−６アルキル、−ＮＲａＲｄ又はＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒｄであり；
Ｘは、−ＣＲｄ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＲｄ−、Ｏ、Ｓ又は−ＮＲｄ−であり；
【化５】
2011516424.tif 000018
が二重結合である場合、Ｙは＝ＣＲ６−又は＝Ｎ−であり、Ｚは−ＣＲ７＝又は−Ｎ＝であり；
【化６】
2011516424.tif 000019
が単結合である場合、Ｙは−ＣＲａＲ６−又は−ＮＲｄ−であり、Ｚは−ＣＲａＲ７−又は−ＮＲｄ−であり；
Ｒ６は、Ｒｄ、Ｃ１−４ハロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＯＣ１−６アルキル、−ＯＲｂ、−ＮＲａＲａ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、シアノ、ニトロ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｍＲｃ又は−Ｓ（＝Ｏ）ｍＮＲａＲａであり；
Ｒ７は、Ｒｄ、Ｃ１−４ハロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＯＣ１−６アルキル、−ＯＲｂ、−ＮＲａＲａ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、シアノ、ニトロ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｍＲｃ又は−Ｓ（＝Ｏ）ｍＮＲａＲａであるか；又はＲ６及びＲ７は、一緒に、０、１、２又は３個のＮ原子及び０、１又は２個のＳ及びＯから選択される原子を含有する３から６個の原子の飽和又は不飽和架橋を形成し、この場合、この架橋は、Ｒ５から選択される０、１又は２個の置換基により置換され；Ｒ６及びＲ７がベンゾ架橋を形成する場合、このベンゾ架橋は、Ｎ及びＯから選択される１又は２個の原子を含有する３又は４個の原子の架橋（この架橋は、Ｃ１−４アルキルから選択される０又は１個の置換基により置換される。）によりさらに置換され得；
Ｒａは、独立に、各例で、Ｈ、Ｃ１−４ハロアルキル又はＣ１−６アルキルであり；
Ｒｂは、独立に、各例で、フェニル、ベンジル、ナフチル又は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の原子（Ｏ及びＳから選択される原子は２個以下）を含有する飽和もしくは不飽和の５もしくは６員環の複素環（このフェニル、ベンジル又は複素環は、Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、−ＯＣ１−６アルキル、シアノ及びニトロから選択される０、１、２又は３個の置換基により置換される。）であり；
Ｒｃは、独立に、各例で、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、フェニル又はベンジルであり；
Ｒｄは、独立に、各例で、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、フェニル、ベンジル又は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の原子（Ｏ及びＳから選択される原子は２個以下）を含有する、飽和もしくは不飽和の５もしくは６員環の複素環（このＣ１−６アルキル、フェニル、ベンジル、ナフチル及び複素環は、Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、−ＯＣ１−６アルキル、シアノ及びニトロから選択される０、１、２、３又は４個の置換基により置換される。）、Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＯＲｂ、−ＮＲａＲａ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｍＲｃ及び−Ｓ（＝Ｏ）ｍＮＲａＲａであり；
ｍは、１又は２である。）
又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
カルシウム模倣化合物が、式ＩＶの化合物：
【化７】
2011516424.tif 000020
（式中、Ｒ１及びＲ’１（これらは同じであるか又は異なり得る。）は、アリール基、ヘテロアリール基、１以上のハロゲン原子により、１以上のヒドロキシ基により、１から５個の炭素原子を含有する１以上の線状又は分岐状アルキル又はアルコキシ基により、１以上のトリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、−ＣＮ、−ＮＯ２、アセチル、カルボキシル、カルボアルコキシ又はチオアルキル基及び酸化スルホキシド又はそのスルホン型、チオフルオロアルコキシ基により置換される、アリール又はヘテロアリール基を表すか、
又は、Ｒ１及びＲ’１は、それらが連結される炭素原子と一緒に、式：
【化８】
2011516424.tif 000021
の環（式中、Ａは、単結合、−ＣＨ２−基、酸素、窒素又は硫黄原子である。）を形成し、
Ｒ２及びＲ’２は、それらが連結される窒素原子と一緒に、１から５個の炭素原子を含有する１以上の線状又は分岐状アルキル基により場合によっては置換される４又は５個の炭素原子を含有する飽和複素環を形成するか（この複素環は、場合によってはさらなるヘテロ原子を含有し、それ自身、基Ｒ５により場合によっては置換される（Ｒ５は、水素原子、アルコキシ又はアシルオキシ基により場合によっては置換される１から５個の炭素原子を含有する線状又は分岐状アルキル基を表す。）。）、
又はＲ２及びＲ’２は（これらは同じであるか又は異なり得る。）、水素原子、１から５個の炭素原子を含有するヒドロキシ又はアルコキシ基により場合によっては置換される、１から５個の炭素原子を含有する線状又は分岐状アルキル基を表し、
Ｒ３は、式：
【化９】
2011516424.tif 000022
（式中、Ｂは、酸素原子又は硫黄原子を表し、Ｒ及びＲ’（これらは同じであるか又は異なり得る。）は、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、アルキル、アルコキシ、アルコキシカルボニル又はアルキルチオ基及び、酸化スルホキシド及びそのスルホン型、１から５個の炭素原子を含有する線状又は分岐状、アリール又はヘテロアリール基、ハロゲン原子、１から５個の炭素原子を含有する線状又は分岐状アルキル基、トリフルオロメチル基、トリフルオロメトキシ基、−ＣＮ基、アミノ、ジアルキルアミノ及び−ＮＨ−ＣＯ−アルキル基、アルキルチオ基及び酸化スルホキシド及びそのスルホン型、アルキルスルホンアミド−ＮＨ−ＳＯ２−アルキル基から選択される１以上の基によるか又はモルホリノ基により置換される、アリール又はヘテロアリール基を表すか、
又はチアゾリル又はオキサゾリル基上のＲ及びＲ’は、１以上の場合によっては置換されるヘテロ原子を含むか又は含まない、飽和もしくは不飽和の環を形成し得る。）
のチアゾリル、オキサゾリル、ベンゾチアゾリル又はベンゾオキサゾリル基を表す。）
又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
カルシウム模倣化合物が、３−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−１−（３，３−ジフェニルプロピル）−１−（２−（４−モルホリニル）エチル）尿素又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
カルシウム模倣化合物が、Ｎ−（４−（２−（（（（３，３−ジフェニルプロピル）（２−（４−モルホリニル）エチル）アミノ）カルボニル）アミノ）−１，３−チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミド又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
カルシウム模倣化合物が、式Ｖの化合物：
【化１０】
2011516424.tif 000023
（式中、
Ｒ１は、フェニル、ベンジル、ナフチル又は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の原子（Ｏ及びＳから選択される原子は２個以下）を含有する飽和もしくは不飽和の５もしくは６員の複素環であり、このフェニル、ベンジル、ナフチル又は複素環は、Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、−ＯＣ１−６アルキル、シアノ及びニトロから選択される０、１、２又は３個の置換基により置換され；
Ｒ２は、Ｃ１−８アルキル又はＣ１−４ハロアルキルであり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−４ハロアルキル又はＣ１−８アルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４ハロアルキル又はＣ１−８アルキルであり；
Ｒ５は、独立に、各例で、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＣ１−６アルキル、−ＮＲａＲｄ、ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｄ、置換もしくは未置換ピロリジニル、置換もしくは未置換アゼチジニル又は置換もしくは未置換ピペリジルであり、この場合、この置換基は、ハロゲン、−ＯＲｂ、−ＮＲａＲｄ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｄ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、シアノ、ニトロ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｎＲｃ又は−Ｓ（＝Ｏ）ｎＮＲａＲｄから選択され得；
Ｌは、−Ｏ−、−ＯＣ１−６アルキル−、−Ｃ１−６アルキルＯ−、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｄ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｄＣ１−６アルキル−、−Ｃ１−６アルキル−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｄ−、−ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＮＲｄ−、−ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＮＲｄＣ１−６アルキル−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲｃ−、−ＯＣ１−６アルキル−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＲｄＣ１−６アルキル−、−Ｃ１−６アルキルＮＲｄ−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）ｎ−、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｎ又は−Ｓ（＝Ｏ）ｎＮ（Ｒａ）−であり；
Ｃｙは、部分もしくは完全飽和又は不飽和の５−８員単環式、６−１２員二環式又は７−１４員三環式の環系であり、この環系は、単環式の場合は１から３個のヘテロ原子、二環式の場合は１から６個のヘテロ原子又は三環式の場合は１から９個のヘテロ原子を場合によっては含む炭素原子から形成され、この環系の各環は、場合によっては、独立に、Ｒ６、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、−ＯＣ１−６アルキル、−ＮＲａＲｄ、ＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒｄ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｄ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｍＲｃ又は−Ｓ（＝Ｏ）ｍＮＲａＲｄの１以上の置換基により置換され；
Ｒ６は、部分もしくは完全飽和又は不飽和の５−８員単環式、６−１２員二環式又は７−１４員三環式の環系であり、この環系は、単環式の場合は１から３個のヘテロ原子、二環式の場合は１から６個のヘテロ原子又は三環式の場合は１から９個のヘテロ原子を場合によっては含む炭素原子から形成され、この環系の各環は、場合によっては、独立に、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、−ＯＣ１−６アルキル、−ＮＲａＲｄ、ＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒｄ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｄ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｍＲｃ又は−Ｓ（＝Ｏ）ｍＮＲａＲｄの１以上の置換基により置換され；
Ｒａは、独立に、各例で、Ｈ、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルケニル、Ｃ１−６アルキルアリール又はアリールＣ１−６アルキルであり；
Ｒｂは、独立に、各例で、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、フェニル、ベンジル、ナフチル又は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の原子（Ｏ及びＳから選択される原子は２個以下）を含有する、飽和もしくは不飽和の５もしくは６員の複素環であり、このフェニル、ベンジル、ナフチル又は複素環は、Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、−ＯＣ１−６アルキル、シアノ及びニトロから選択される０、１、２又は３個の置換基により置換され；
Ｒｃは、独立に、各例で、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、フェニル又はベンジルであり；
Ｒｄは、独立に、各例で、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルケニル、フェニル、ベンジル、ナフチル又は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の原子（Ｏ及びＳから選択される原子は２個以下）を含有する飽和もしくは不飽和の５もしくは６員の複素環であり、このＣ１−６アルキル、フェニル、ベンジル、ナフチル及び複素環は、Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、−ＯＣ１−６アルキル、シアノ及びニトロ、Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＯＲｂ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｍＲｃ及び−Ｓ（＝Ｏ）ｍＮＲａＲａから選択される０、１、２、３又は４個の置換基により置換され；
ｍは、１又は２であり；
ｎは１又は２であり；
ただし、Ｌが、−Ｏ−又は−ＯＣ１−６アルキル−であるならば、Ｃｙはフェニルではない。）
又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
カルシウム模倣化合物が、Ｎ−（２−クロロ−５−（（（（１Ｒ）−１−フェニルエチル）アミノ）メチル）フェニル）−５−メチル−３−イソキサゾールカルボキサミド又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
カルシウム模倣化合物が、Ｎ−（２−クロロ−５−（（（（１Ｒ）−１−フェニルエチル）アミノ）メチル）フェニル）−２−ピリジンカルボキサミド又は医薬的に許容可能なその塩である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
対象が哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に、医薬の分野、とりわけ、上皮傷害、特に、虚血、低酸素症、外傷、化学溶解剤又は放射線曝露によるもの、を治療又は予防するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急速に分裂する腸上皮は、虚血、化学療法又は放射線被爆による損傷に対して非常に感受性が高い。その結果起こる上皮傷害により、様々な腸細胞において、最終的に細胞破壊及び細胞死を引き起こし得る重要な代謝及び構造の変化が起こる。虚血に関連する細胞傷害の進行を制限するために血流の回復が必要であるにもかかわらず、虚血の腸への血流及び酸素供給の回復の結果、矛盾して組織傷害が促進され得る（再潅流傷害）。化学療法剤は、いくつかの異なる機構を介して、急速に増殖する細胞においてそれらの細胞崩壊性の作用を発揮し、これにより、究極的には細胞周期が停止し及び／又は細胞アポトーシスが引き起こされる。化学溶解剤／化学療法剤の細胞毒性作用は腫瘍特異的ではない。化学溶解剤投与後の胃腸毒性は、重篤な粘膜炎、体重減少及び全身性感染症を特徴とする。胃腸（ＧＩ）毒性による化学溶解剤の用量及び治療の制限により、感受性が高い患者において化学療法の有効性が損なわれる。
【０００３】
放射線を含む多様な治療の使用は、多くの悪性腫瘍を治療する上でごく一般的なものとなっており、癌患者の約半数がその治療の一部として放射線療法を受けている。放射線療法の断層撮影法での局所化及び細分化に対する現在の技術により、放射線療法の結果起こる短期及び長期の胃腸病的状態が顕著に減少した。それにもかかわらず、殆どの患者が、下痢、腹部疼痛、鼓張、裏急後重及び出血などの、急性の放射線療法に伴うＧＩ症状を経験する。放射線野が上部ＧＩ管を含む場合、胸部疼痛、嚥下困難及び嚥下痛が見られ得る。通常、これらの症状は、放射線療法終了後すぐに消失する。しかし、放射線療法を受けている患者の最大で４分の１は、治療完了後３ヶ月を超えて呈する症状として定義されるある形態の慢性傷害も発現する。症状は、通常、治療開始後の最初の２年以内で顕著である。しかし、患者の中には、何年にも又は数十年にわたり症状を発現しない者もいる。
【０００４】
紫外線（ＵＶ）光に対する皮膚の曝露により、急速かつ長期にわたる影響が生じ得る。ＵＶ光への曝露の主要な急性の影響には、日焼け及びビタミンＤ合成が含まれる。ＵＶ光に対する慢性的曝露により、皺、しみ、毛細管拡張症及び粗く日焼けした外観を呈する光損傷を受けた皮膚となり得、メラノーマ又は非メラノーマ皮膚癌の発症というより深刻な結果にもなり得る。皮膚癌のリスクはＵＶ光への曝露の累積と大して相関はないが、皮膚癌は、一般に、ＵＶ光への曝露の長期続発症と考えられる。
【０００５】
皮膚創傷は完全修復に１２から１８ヶ月を要し得、瘢痕は、適正な創傷治癒を妨害する過度の治癒反応を引き起こす傷害の結果である。瘢痕は、創傷、火傷、手術、事故の結果であり得、細菌及び座瘡などの皮膚状態により起こり得る。
【０００６】
上皮傷害に関連する細胞死を抑制すること及び細胞の生存を促進することにおいて、有効な治療計画を提供する治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、上皮傷害を治療又は予防することを必要とする対象に、カルシウム模倣化合物及び医薬的に許容可能な希釈剤又は担体を含む医薬組成物の治療的に許容される用量を投与することを含む、上皮傷害を治療又は予防するための方法を提供する。ある態様において、上皮傷害は腸の傷害である。別の態様において、上皮傷害は皮膚の傷害である。
【０００８】
ある態様において、上皮傷害は、低酸素症又は虚血により誘発され得る。別の態様において、上皮傷害は、化学溶解剤によるものであり得る。さらなる態様において、上皮傷害は、化学療法誘発性細胞毒性であり得る。別の態様において、上皮傷害は、放射線により誘発され得る。別の態様において、上皮傷害は、毒素、感染性因子又は化学物質により誘発され得る。
【０００９】
本発明は、上皮傷害を改善することを必要とする対象に、カルシウム模倣化合物の治療的有効量を投与することを含む前治療計画により上皮傷害を改善するための方法を包含する。ある態様において、前治療計画は、それを必要とする対象に、上皮傷害前の３日以内に、カルシウム模倣化合物の治療的有効量を投与することを含む。別の態様において、本発明の方法は、治療後処置計画をさらに含み得る。
【００１０】
本発明の方法は、発明を実施するための形態において詳述する。
【００１１】
本発明の方法において有用なカルシウム模倣化合物は、下記の発明を実施するための形態において詳述する。
【００１２】
ある態様において、対象は哺乳動物であり得る。ある態様において、対象はヒトであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ラットからの単離回腸絨毛における虚血性傷害からの保護におけるカルシウム模倣化合物Ａの効果を示す。パネルＡは、１００％Ｎ２（虚血性傷害）への曝露後の細胞内カルシウムの変化に対する経時変化を示す。パネルＢは、Ｎ２曝露後の回腸絨毛における細胞内カルシウムの変化のまとめである。パネルＣは、カルシウム模倣物（１００ｎＭ  化合物Ａ）への５分間曝露の保護効果が、１００％Ｎ２の存在下でカルシウム上昇を示さないことを示す。パネルＤは、虚血性傷害に曝露された絨毛におけるカルシウム模倣物（１００ｎＭ  化合物Ａ）の保護効果のまとめである。
【図２】カルシウム模倣化合物がラット結腸陰窩での虚血に対する保護効果を示すことを示す。パネルＡは、１００％Ｎ２（虚血性傷害）への曝露後の、結腸陰窩における細胞内カルシウムの変化に対する経時変化を示す。パネルＢは、Ｎ２曝露後の細胞内カルシウムの変化のまとめである。パネルＣは、カルシウム模倣物（１００ｎＭ  化合物Ａ）への５分間曝露の保護効果により、１００％Ｎ２の存在下でカルシウム上昇が見られないことを示す。パネルＤは、虚血性傷害に曝露された結腸陰窩におけるカルシウム模倣物（１００ｎＭ  化合物Ａ）の保護効果のまとめである。
【図３】トリパンブルー色素排除による、カルシウム模倣物への短時間曝露後のラット回腸絨毛における細胞傷害に対する保護効果を示す。
【図４】傷害後第１日及び第３日での、全層創傷後の正常皮膚及び損傷皮膚におけるＣａＳＲ  ＲＮＡ発現を示す。カルシウム感知受容体ＲＮＡは、傷害後第１日（Ｄ１）及び第３日（Ｄ３）での、カルシウム模倣物（化合物Ｂ）処置動物における対照に対する％として表す（ｎ＝４−５）。
【図５】回腸の機能における放射線傷害の影響を示す。パネルＡは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、マウス回腸絨毛細胞の完全性におけるＵＶＡ及びＵＶＢ放射線の影響の合成サマリープロットである。パネルＢは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、ＣａＳＲノックアウトマウス細胞の完全性におけるＵＶＡ及びＵＶＢ放射線の影響の合成サマリープロットである。
【図６】結腸機能における放射線傷害の影響を示す。パネルＡは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、マウス結腸陰窩細胞の完全性におけるＵＶＡ及びＵＶＢ放射線の影響の合成サマリープロットである。パネルＢは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、ＣａＳＲノックアウトマウス細胞の完全性におけるＵＶＡ及びＵＶＢ放射線の影響の合成サマリープロットである。
【図７】回腸機能における放射線傷害の影響を示す。パネルＡは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、マウス回腸絨毛細胞の完全性におけるＵＶＡ及びＵＶＢ放射線の影響の合成サマリープロットである。パネルＢは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、ＣａＳＲノックアウトマウス細胞の完全性におけるＵＶＡ及びＵＶＢ放射線の影響の合成サマリープロットである。
【図８】回腸機能における化学的傷害の影響を示す。まとめのグラフは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、回腸切片における５０ｍＭ  ソルビトールからの化学的傷害の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
Ｉ．定義
本明細書中で使用される場合、「対象」という用語は、治療を必要とする、ヒト又は動物を意味するものとする。この対象は、例えば、虚血、低酸素症、化学溶解剤又は放射線曝露による上皮傷害を有し得るか又は発現するリスクがあり得る。
【００１５】
疾患の「治療する」又は「治療」には、（１）疾患を阻害する、即ち疾患もしくはその臨床兆候の何れかの発現を阻止するかもしくは軽減するか又は（２）疾患を予防する、即ち、ある疾患もしくはその疾患を引き起こし得る状態であり得るか又はそれに曝露されているか又はその疾患に罹患しやすくなっているが疾患兆候をまだ発現していないか又は示さない対象において、疾患の臨床兆候を発現しないようにするか、（３）ある疾患を緩和する、即ち、ある疾患又はその臨床兆候の何れかの軽減を引き起こすことが含まれる。
【００１６】
１以上のさらなる治療薬と「組み合わせて」又は「一緒に」投与（すること）には、同時又は並行投与及びあらゆる順序での連続投与が含まれる。
【００１７】
「治療的有効量」という用語は、疾患の重症度及び発症頻度における改善の目的を達成する本発明の化合物の量である。疾患の重症度の改善には、疾患の好転ならびに疾患の進行の遅延が含まれる。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「カルシウム感知受容体」又は「ＣａＳＲ」は、細胞外カルシウム及び／又はマグネシウムレベルの変化に反応するＧタンパク質共役型受容体を指す。ＣａＳＲの活性化により、タプシガルジン−感受性細胞内貯蔵からカルシウムを移動させることによって、及び細胞膜における電圧に無反応のカルシウムチャネルを通じてカルシウム流入を増加させることによって、細胞質カルシウム濃度が急速に一過性に上昇する（Ｂｒｏｗｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６６：５７５−５８０、１９９３；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ａｄｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４７：２０９−２５３、２０００）。
【００１９】
「上皮傷害」という用語は、本明細書中で使用される場合、虚血、低酸素症、化学療法、放射線又は外傷による細胞性傷害を包含する。
【００２０】
「放射線」という用語は、放射線のイオン化及び非イオン化型の両方を包含し、赤外線、紫外線、α、β、γ及びＸ放射線を含む。
【００２１】
「紫外線」又は「ＵＶ光」は、本明細書中で使用される場合、約１０から４００ｎｍの間の波長を有する電磁エネルギーを意味する。紫外線スペクトルは、３つの主要なセグメント、約３２０から４００ｎｍの波長のＵＶ−Ａ光、２９０から３２０ｎｍの波長のＵＶ−Ｂ光及び約１０から２９０ｎｍの波長のＵＶ−Ｃ光に適宜に分けられる。ＵＶスペクトルのＵＶ−Ｂ部は、主に日焼けの発赤又は紅斑の発生に関与し、一方でＵＶ−Ａ光は、皮膚の充血又は日焼けを引き起こす効率はおよそ数千倍低い。太陽からのＵＶ−Ｃ光は成層圏オゾンにより吸収される。
【００２２】
「化学溶解剤（ｃｈｅｍｏｌｙｔｉｃｓ又はｃｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）」という用語は、本明細書中で使用される場合、化学療法で使用される何らかの薬剤を意味する。化学溶解剤の例にはアルキル化薬（例えばシクロホスファミド）（このタイプの薬物は、ＤＮＡをアルキル化する。）；ＤＮＡの産生を妨害し、細胞が増大及び増殖しないようにする代謝拮抗剤（例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；真菌から調製される抗腫瘍抗生物質（例えばドキソルビシン及びブレオマイシン）；正常な細胞分裂を妨害する植物アルカロイド（例えばビンブラスチン及びビンクリスチン）；及びホルモン依存性の癌で主に使用されるステロイドホルモン（例えばタモキシフェン）が含まれる。化学溶解剤又は化学療法剤のその他の例は当技術分野で周知である。
【００２３】
ＩＩ．カルシウム模倣化合物及びそれらを含む医薬組成物、投与及び投薬
Ａ．カルシウム模倣化合物、定義
本明細書中で使用される場合、「カルシウム模倣化合物」又は「カルシウム模倣物」という用語は、カルシウム感知受容体に結合し、内因性リガンドＣａ２＋によりカルシウム感知受容体活性化に対する閾値を低下させる構造変化を誘導する化合物を指す。これらのカルシウム模倣化合物はまた、カルシウム受容体のアロステリック調節因子とも見なされ得る。
【００２４】
ある態様において、カルシウム模倣物は、次の活性の１以上を有し得る：３０秒未満の持続時間の内部カルシウムの一過性の上昇を喚起する活性（例えば内部カルシウムを移動させることによる。）；３０秒以内に起こる［Ｃａ２＋ｉ］の急速な上昇を喚起、；［Ｃａ２＋ｉ］の持続性の上昇（３０秒より長い。）を喚起する活性（例えば、外部カルシウムの流入を引き起こすことによる。）；通常は６０秒未満以内の、イノシトール−１，４，５−３リン酸又はジアシルグリセロールレベルの上昇を喚起する活性；及びドーパミン−又はイソプロテレノール刺激性の環状ＡＭＰ形成を阻害する活性。ある態様において、［Ｃａ２＋ｉ］の一過性の上昇は、１０ｍＭフッ化ナトリウムで又はホスホリパーゼＣの阻害剤で１０分間細胞を前処理することにより阻止され得るか、又はタンパク質キナーゼＣの活性化因子、例えば、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、メゼレイン又は（−）インドラクタムＶでの細胞の短時間の前処理（１０分以下）によって一過性の上昇が縮小される。ある態様において、カルシウム模倣化合物は小分子であり得る。別の態様において、カルシウム模倣物は、ＣａＳＲに対するアゴニスト性抗体であり得る。
【００２５】
本発明において有用なカルシウム模倣化合物には、例えば、欧州特許第６３７，２３７号、同第６５７，０２９号、同第７２４，５６１号、同第７８７，１２２号、同第９０７，６３１号、同第９３３，３５４号、同第１，２０３，７６１号、同第１，２３５，７９７号、同第１，２５８，４７１号、同第１，２７５，６３５号、同第１，２８１，７０２号、同第１，２８４，９６３号、同第１，２９６，１４２号、同第１，３０８，４３６号、同第１，５０９，４９７号、同第１，５０９，５１８号、同第１，５５３，０７８号；国際公開ＷＯ９３／０４３７３、ＷＯ９４／１８９５９、ＷＯ９５／１１２２１、ＷＯ９６／１２６９７、ＷＯ９７／４１０９０、ＷＯ０１／３４５６２、ＷＯ０１／９００６９、ＷＯ０２／１４２５９、ＷＯ０２／０５９１０２、ＷＯ０３／０９９７７６、ＷＯ０３／０９９８１４、ＷＯ０４／０１７９０８；ＷＯ０４／０９４３６２、ＷＯ０４／１０６２８０、ＷＯ０６／１１７２１１；ＷＯ０６／１２３７２５；米国特許第５，６８８，９３８号、同第５，７６３，５６９号、同第５，９６２，３１４号、同第５，９８１，５９９号、同第６，００１，８８４号、同第６，０１１，０６８号、同第６，０３１，００３号、同第６、１７２，０９１号、同第６，２１１，２４４号、同第６，３１３，１４６号、同第６，３４２，５３２号、同第６，３６２，２３１号、同第６，４３２，６５６号、同第６，７１０，０８８号、同第６，７５０，２５５号、同第６，９０８，９３５号、同第７，１５７，４９８号、同第７，１７６，３２２号及び米国特許出願公開第２００２／０１０７４０６号、同第２００３／０００８８７６号、同第２００３／０１４４５２６号、同第２００３／０１７６４８５号、同第２００３／０１９９４９７号、同第２００４／０００６１３０号、同第２００４／００７７６１９号、同第２００５／００３２７９６号、同第２００５／０１０７４４８号、同第２００５／０１４３４２６号、欧州特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００４１６６、仏国特許出願第０５１１９４０号に記載のものが含まれる。
【００２６】
ある種の実施形態において、カルシウム模倣化合物は、式Ｉの化合物及び医薬的に許容可能なその塩から選択される：
【００２７】
【化１】
2011516424.tif 000002
（式中、Ｘ１及びＸ２（これらは同一であるか又は異なり得る。）は、それぞれ、ＣＨ３、ＣＨ３Ｏ、ＣＨ３ＣＨ２Ｏ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＦ３、ＣＨＦ２、ＣＨ２Ｆ、ＣＦ３Ｏ、ＣＨ３Ｓ、ＯＨ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＨ３ＣＨ２、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、アセトキシ及びアセチル基から選択される基であるか又はＸ１の２つが、縮合環式脂肪族環、縮合芳香環及びメチレンジオキシ基から選択される部分を一緒に形成し得るか又はＸ２の２つが、縮合環式脂肪族環、縮合芳香環及びメチレンジオキシ基から選択される部分を一緒に形成し得；ただしＸ２は３−ｔ−ブチル基ではなく；
ｎは、０から５の範囲であり；
ｍは、１から５の範囲であり；
アルキル基はＣ１−Ｃ３アルキル基から選択され、このアルキル基は、場合によっては、飽和及び不飽和、線状、分岐型及び環状Ｃ１−Ｃ９アルキル基、ジヒドロインドリル及びチオジヒドロインドリル基及び２−、３−及び４−ピペリジニル基から選択される少なくとも１つの基で置換される。）。
【００２８】
本カルシウム模倣化合物はまた、式ＩＩの化合物：
【００２９】
【化２】
2011516424.tif 000003
及び医薬的に許容可能なその塩からも選択され得る（式中、
Ｒ１は、アリール、置換アリール、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり；
Ｒ２は、アルキル又はハロアルキルであり；
Ｒ３は、Ｈ、アルキル又はハロアルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル又はハロアルキルであり；
存在する各Ｒ５は、独立して、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロゲン、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＲｄＳ（＝Ｏ）ｍＲｄ、−ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＮＲｄＲｄ、−ＮＲｄＳ（＝Ｏ）ｍＮＲｄＲｄ又は−ＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒｄからなる群から選択され；
Ｒ６は、アリール、置換アリール、ヘテロシクリル、置換ヘテロシクリル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり；
各Ｒａは、独立に、Ｈ、アルキル又はハロアルキルであり；
各Ｒｂは、独立に、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルであり、これらのそれぞれは、未置換であるか又はアルキル、ハロゲン、ハロアルキル、アルコキシ、シアノ及びニトロからなる群から選択される３個以下の置換基により置換され得；
各Ｒｃは、独立に、アルキル、ハロアルキル、フェニル又はベンジルであり、これらのそれぞれは、置換され得るか又は未置換であり得；
各Ｒｄは、独立に、Ｈ、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル又はヘテロシクリルアルキルであり、このアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル及びヘテロシクリルアルキルは、アルキル、ハロゲン、ハロアルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロ、Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＯＲｂ、−ＮＲａＲａ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｎＲｃ及び−Ｓ（＝Ｏ）ｎＮＲａＲａから選択される０、１、２、３又は４個の置換基により置換され；
ｍは、１又は２であり；
ｎは、０、１又は２であり；
ｐは、０、１、２、３又は４であり；
ただし、Ｒ２がメチルであり、ｐが０であり、Ｒ６が未置換フェニルであるならば、Ｒ１は、２，４−ジハロフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，４−ジエチルフェニル、２，４，６−トリハロフェニル又は２，３，４−トリハロフェニルではない。）。これらの化合物は、米国特許出願第２００４００８２６２５号で詳述されている。
【００３０】
ある態様において、本カルシウム模倣化合物は、Ｎ−（（６−（メチルオキシ）−４’−（トリフルオロメチル）−１，１’−ビフェニルイル−３−イル）メチル）−１−フェニルエタンアミン又は医薬的に許容可能なその塩であり得る。別の態様において、本カルシウム模倣化合物は、（１Ｒ）−Ｎ−（（６−クロロ−３’−フルオロ−３−ビフェニルイル）メチル）−１−（３−クロロフェニル）エタンアミン又は医薬的に許容可能なその塩であり得る。さらなる態様において、本カルシウム模倣化合物は、（１Ｒ）−１−（６−（メチルオキシ）−４’−（トリフルオロメチル）−３−ビフェニルイル）−Ｎ−（（１Ｒ）−１−フェニルエチル）エタンアミン）又は医薬的に許容可能なその塩であり得る。
【００３１】
本発明のある種の実施形態において、カルシウム模倣化合物は、式ＩＩＩの化合物：
【００３２】
【化３】
2011516424.tif 000004
又は医薬的に許容可能なその塩から選択され得る（式中、
【００３３】
【化４】
2011516424.tif 000005
は、二重又は単結合を表し；
Ｒ１はＲｂであり；
Ｒ２は、Ｃ１−８アルキル又はＣ１−４ハロアルキルであり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−４ハロアルキル又はＣ１−８アルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４ハロアルキル又はＣ１−４アルキルであり；
Ｒ５は、独立に、各例で、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＣ１−６アルキル、−ＮＲａＲｄ又はＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒｄであり；
Ｘは、−ＣＲｄ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＲｄ−、Ｏ、Ｓ又は−ＮＲｄ−であり；
【００３４】
【化５】
2011516424.tif 000006
が二重結合である場合、Ｙは＝ＣＲ６−又は＝Ｎ−であり、Ｚは−ＣＲ７＝又は−Ｎ＝であり；
【００３５】
【化６】
2011516424.tif 000007
が単結合である場合、Ｙは−ＣＲａＲ６−又は−ＮＲｄ−であり、Ｚは−ＣＲａＲ７−又は−ＮＲｄ−であり；
Ｒ６は、Ｒｄ、Ｃ１−４ハロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＯＣ１−６アルキル、−ＯＲｂ、−ＮＲａＲａ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、シアノ、ニトロ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｍＲｃ又は−Ｓ（＝Ｏ）ｍＮＲａＲａであり；
Ｒ７は、Ｒｄ、Ｃ１−４ハロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＯＣ１−６アルキル、−ＯＲｂ、−ＮＲａＲａ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、シアノ、ニトロ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｍＲｃ又は−Ｓ（＝Ｏ）ｍＮＲａＲａであるか；又は
Ｒ６及びＲ７は、一緒に、０、１、２又は３個のＮ原子及び０、１又は２個のＳ及びＯから選択される原子を含有する３から６個の原子の飽和又は不飽和架橋を形成し、この場合、この架橋は、Ｒ５から選択される０、１又は２個の置換基により置換され；Ｒ６及びＲ７がベンゾ架橋を形成する場合、このベンゾ架橋は、Ｎ及びＯから選択される１又は２個の原子を含有する３又は４個の原子の架橋（この架橋は、Ｃ１−４アルキルから選択される０又は１個の置換基により置換される。）によりさらに置換され得；
Ｒａは、独立に、各例で、Ｈ、Ｃ１−４ハロアルキル又はＣ１−６アルキルであり；
Ｒｂは、独立に、各例で、フェニル、ベンジル、ナフチル又は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の原子（Ｏ及びＳから選択される原子は２個以下）を含有する飽和もしくは不飽和の５もしくは６員環の複素環（このフェニル、ベンジル又は複素環は、Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、−ＯＣ１−６アルキル、シアノ及びニトロから選択される０、１、２又は３個の置換基により置換される。）であり；
Ｒｃは、独立に、各例で、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、フェニル又はベンジルであり；
Ｒｄは、独立に、各例で、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、フェニル、ベンジル又は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の原子（Ｏ及びＳから選択される原子は２個以下）を含有する、飽和もしくは不飽和の５もしくは６員環の複素環（このＣ１−６アルキル、フェニル、ベンジル、ナフチル及び複素環は、Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、−ＯＣ１−６アルキル、シアノ及びニトロから選択される０、１、２、３又は４個の置換基により置換される。）、Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＯＲｂ、−ＮＲａＲａ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｍＲｃ及び−Ｓ（＝Ｏ）ｍＮＲａＲａであり；
ｍは、１又は２である。）。
【００３６】
式ＩＩＩの化合物は、米国特許出願第２００４００７７６１９号（参照により本明細書中に組み込まれる。）で詳述される。
【００３７】
ある態様において、カルシウム模倣化合物は、Ｎ−（３−［２−クロロフェニル］−プロピル）−Ｒ−α−メチル−３−メトキシベンジルアミンＨＣｌ（化合物Ａ）である。別の態様において、カルシウム模倣化合物は、Ｎ−（（６−（メチルオキシ）−４’−（トリフルオロメチル）−１，１’−ビフェニル−３−イル）メチル）−１−フェニルエタンアミン（化合物Ｂ）である。
【００３８】
ある態様において、本発明のカルシウム模倣化合物は、式ＩＶの化合物から選択される：
【００３９】
【化７】
2011516424.tif 000008
（式中、
Ｙは、酸素又は硫黄であり；
Ｒ１及びＲ’１は、同じであるか又は異なり、それぞれがアリール基、ヘテロアリール基を表すか又はＲ１及びＲ’１は、それらが連結される炭素原子と一緒に、式：
【００４０】
【化８】
2011516424.tif 000009
の縮合環構造を形成し（式中、Ａは、単結合、メチレン基、ジメチレン基、酸素、窒素又は硫黄（この硫黄は、場合によってはスルホキシド又はスルホン型であり得る。）を表す。）、Ｒ１及びＲ’１のそれぞれ又はそれらにより形成されるこの縮合環構造は、場合によっては、群ｃから選択される少なくとも１つの置換基により置換され、
この群ｃは、ハロゲン原子、ヒドロキシル、カルボキシル、線状及び分岐状アルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アルキルチオ、アルケニル及びアルキニル基；線状及び分岐状アルコキシル基；線状及び分岐状チオアルキル基；ヒドロキシカルボニルアルキル；アルキルカルボニル；アルコキシカルボニルアルキル；アルコキシカルボニル；トリフルオロメチル；トリフルオロメトキシル；−ＣＮ；−ＮＯ２；アルキルスルホニル基（場合によってはスルホキシド又はスルホン型である。）からなり；この場合、何れのアルキル成分も１から６個の炭素原子を有し、何れのアルケニル又はアルキニル成分も２から６個の炭素原子を有し、
複数の置換基がある場合、この各置換基は同じであるか又は異なり、
Ｒ２及びＲ’２（これらは同じであるか又は異なり得る。）は、それぞれ、水素原子；１から６個の炭素原子を含有し、少なくとも１つのハロゲン原子、ヒドロキシ又は、１から６個の炭素原子を含有するアルコキシ基により場合によっては置換される、線状又は分岐状アルキル基；アルキルアミノアルキル又はジアルキルアミノアルキル基（ここで各アルキル基は１から６個の炭素原子を含有する。）を表すか、
又はＲ２及びＲ’２は、それらが連結される窒素原子と一緒に、０、１又は２個のさらなるヘテロ原子を含有し、５、６又は７環原子を有する、飽和もしくは不飽和の複素環を形成し（この複素環は、上記で定義された群「ｃ」から選択される少なくとも１つの置換基により場合によっては置換され、複数の置換基がある場合、この置換基は同じであるか又は異なる。）、
Ｒ３は、式：
【００４１】
【化９】
2011516424.tif 000010
の基：
（式中、Ｂは酸素原子又は硫黄原子を表し、ｘは、０、１又は２であり、ｙ及びｙ’は同じであるか又は異なり、それぞれが０又は１であり、Ａｒ及びＡｒ’は同じであるか又は異なり、それぞれが、アリール又はヘテロアリール基を表し、ｎ及びｎ’は同じであるか又は異なり、それが連結されるｙ又はｙ’が０である場合、それぞれが１であるか、又はこのｙ又はｙ’が１である場合、連結されるＡｒ又はＡｒ’上で置換され得る位置の数と等しく、Ｎｘを含有する縮合環は５又は６員のヘテロアリール環であり、ここで、Ｒ及びＲ’（これらは同じであるか又は異なり得る。）は、それぞれが水素原子又は群ａから選択される置換基を表し、
この群ａは、ハロゲン原子；ヒドロキシル；カルボキシル；アルデヒド基；線状及び分岐状アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ハロアルキル、ハロアルケニル及びハロアルキニル基；線状及び分岐状アルコキシル基；線状及び分岐状チオアルキル基；アラルコキシ基；アリールオキシ基；アルコキシカルボニル；アラルコキシカルボニル；アリールオキシカルボニル；ヒドロキシカルボニルアルキル；アルコキシカルボニルアルキル；アラルコキシカルボニルアルキル；アリールオキシカルボニルアルキル；パーフルオロアルキル；パーフルオロアルコキシ；−ＣＮ；アシル；アミノ、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキルアミノ、ジアラルキルアミノ、ジアリールアミノ、アシルアミノ及びジアシルアミノ基；アルコキシカルボニルアミノ、アラルコキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノ及びアリールカルボニルアミノ基；アルキルアミノカルボニルオキシ、アラルキルアミノカルボニルオキシ及びアリールアミノカルボニルオキシ基；
アミノ、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキルアミノ、ジアラルキルアミノ、ジアリールアミノ、アシルアミノ、トリフルオロメチルカルボニル−アミノ、フルオロアルキルカルボニルアミノ又はジアシルアミノ基で置換されるアルキル基；ＣＯＮＨ２；アルキル−、アラルキル−及びアリール−アミド基；アルキルチオ、アリールチオ及びアラルキルチオ及び酸化スルホキシド及びそのスルホン型；スルホニル、アルキルスルホニル、ハロアルキルスルホニル、アリールスルホニル及びアラルキルスルホニル基；スルホンアミド、アルキルスルホンアミド、ハロアルキルスルホンアミド、ジ（アルキルスルホニル）アミノ、アラルキルスルホンアミド、ジ（アラルキルスルホニル）アミノ、アリールスルホンアミド及びジ（アリールスルホニル）アミノ；及び飽和及び不飽和ヘテロシクリル基からなり、ここで、このヘテロシクリル基は、単環式又は二環式であり、群ｂから選択される１以上の置換基（これらは同じであるか又は異なり得る。）により場合によっては置換され、
この群ｂは、ハロゲン原子；ヒドロキシル；カルボキシル；アルデヒド基；線状及び分岐状アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ハロアルキル、ハロアルケニル及びハロアルキニル基；線状及び分岐状アルコキシル基；線状及び分岐状チオアルキル基；アルコキシカルボニル；ヒドロキシカルボニルアルキル；アルコキシカルボニルアルキル；パーフルオロアルキル；パーフルオロアルコキシ；−ＣＮ；アシル；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ及びジアシルアミノ基；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ又はジアシルアミノ基により置換されるアルキル基；ＣＯＮＨ２；アルキルアミド基；アルキルチオ及び酸化スルホキシド及びそのスルホン型；スルホニル、アルキルスルホニル基；及びスルホンアミド、アルキルスルホンアミド及びジ（アルキルスルホニル）アミノ基からなり、
群ａ及びｂにおいて、何れのアルキル成分も１から６個の炭素原子を含有し、何れのアルケニル又はアルキニル成分も２から６個の炭素原子を含有し、少なくとも１つのハロゲン原子又はヒドロキシ基により場合によっては置換され、ここで何れのアリール成分も場合によってはヘテロアリール基である。）を表す。）。
【００４２】
ある態様において、本カルシウム模倣化合物は、３−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）−１−（３，３−ジフェニルプロピル）−１−（２−（４−モルホリニル）エチル）尿素又は医薬的に許容可能なその塩であり得る。別の態様において、本カルシウム模倣化合物は、Ｎ−（４−（２−（（（（３，３−ジフェニルプロピル）（２−（４−モルホリニル）エチル）アミノ）カルボニル）アミノ）−１，３−チアゾール−４−イル）フェニル）メタンスルホンアミド又は医薬的に許容可能なその塩であり得る。
【００４３】
ある態様において、本発明のカルシウム模倣化合物は、式Ｖの化合物から選択され得る：
【００４４】
【化１０】
2011516424.tif 000011
（式中、
Ｒ１は、フェニル、ベンジル、ナフチル又は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の原子（Ｏ及びＳから選択される原子は２個以下）を含有する飽和もしくは不飽和の５もしくは６員の複素環であり、このフェニル、ベンジル、ナフチル又は複素環は、Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、−ＯＣ１−６アルキル、シアノ及びニトロから選択される０、１、２又は３個の置換基により置換され；
Ｒ２は、Ｃ１−８アルキル又はＣ１−４ハロアルキルであり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１−４ハロアルキル又はＣ１−８アルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ、Ｃ１−４ハロアルキル又はＣ１−８アルキルであり；
Ｒ５は、独立に、各例で、Ｈ、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＣ１−６アルキル、−ＮＲａＲｄ、ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｄ、置換もしくは未置換ピロリジニル、置換もしくは未置換アゼチジニル又は置換もしくは未置換ピペリジルであり、この場合、この置換基は、ハロゲン、−ＯＲｂ、−ＮＲａＲｄ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｄ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、シアノ、ニトロ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｎＲｃ又は−Ｓ（＝Ｏ）ｎＮＲａＲｄから選択され得；
Ｌは、−Ｏ−、−ＯＣ１−６アルキル−、−Ｃ１−６アルキルＯ−、−Ｎ（Ｒａ）（Ｒｄ）−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｄＣ１−６アルキル−、−Ｃ１−６アルキル−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｄ−、−ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＮＲｄ−、−ＮＲｄＣ（＝Ｏ）ＮＲｄＣ１−６アルキル−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ−、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＯＲｃ−、−ＯＣ１−６アルキル−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＲｄＣ１−６アルキル−、−Ｃ１−６アルキルＮＲｄ−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）ｎ−、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｎ又は−Ｓ（＝Ｏ）ｎＮ（Ｒａ）−であり；
Ｃｙは、部分もしくは完全飽和又は不飽和の５−８員単環式、６−１２員二環式又は７−１４員三環式の環系であり、この環系は、単環式の場合は１から３個のヘテロ原子、二環式の場合は１から６個のヘテロ原子又は三環式の場合は１から９個のヘテロ原子を場合によっては含む炭素原子から形成され、この環系の各環は、場合によっては、独立に、Ｒ６、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、−ＯＣ１−６アルキル、−ＮＲａＲｄ、ＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒｄ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｄ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｍＲｃ又は−Ｓ（＝Ｏ）ｍＮＲａＲｄの１以上の置換基により置換され；
Ｒ６は、部分もしくは完全飽和又は不飽和の５−８員単環式、６−１２員二環式又は７−１４員三環式の環系であり、この環系は、単環式の場合は１から３個のヘテロ原子、二環式の場合は１から６個のヘテロ原子又は三環式の場合は１から９個のヘテロ原子を場合によっては含む炭素原子から形成され、この環系の各環は、場合によっては、独立に、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、−ＯＣ１−６アルキル、−ＮＲａＲｄ、ＮＲｄＣ（＝Ｏ）Ｒｄ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｄ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｍＲｃ又は−Ｓ（＝Ｏ）ｍＮＲａＲｄの１以上の置換基により置換され；
Ｒａは、独立に、各例で、Ｈ、Ｃ１−４ハロアルキル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルケニル、Ｃ１−６アルキルアリール又はアリールＣ１−６アルキルであり；
Ｒｂは、独立に、各例で、Ｃ１−８アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、フェニル、ベンジル、ナフチル又は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の原子（Ｏ及びＳから選択される原子は２個以下）を含有する、飽和もしくは不飽和の５もしくは６員複素環であり、このフェニル、ベンジル、ナフチル又は複素環は、Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、−ＯＣ１−６アルキル、シアノ及びニトロから選択される０、１、２又は３個の置換基により置換され；
Ｒｃは、独立に、各例で、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−４ハロアルキル、フェニル又はベンジルであり；
Ｒｄは、独立に、各例で、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルケニル、フェニル、ベンジル、ナフチル又は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２又は３個の原子（Ｏ及びＳから選択される原子は２個以下）を含有する飽和もしくは不飽和の５もしくは６員複素環であり、このＣ１−６アルキル、フェニル、ベンジル、ナフチル及び複素環は、Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、Ｃ１−４ハロアルキル、−ＯＣ１−６アルキル、シアノ及びニトロ、Ｒｂ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＯＲｂ、−ＮＲａＲｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａＲｂ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｒｃ、−ＮＲａＳ（＝Ｏ）ｍＲｃ及び−Ｓ（＝Ｏ）ｍＮＲａＲａから選択される０、１、２、３又は４個の置換基により置換され；
ｍは、１又は２であり；
ｎは１又は２であり；
ただし、Ｌが、−Ｏ−又は−ＯＣ１−６アルキル−である場合、Ｃｙはフェニルではない。）。
【００４５】
ある態様において、本カルシウム模倣化合物は、Ｎ−（２−クロロ−５−（（（（１Ｒ）−１−フェニルエチル）アミノ）メチル）フェニル）−５−メチル−３−イソキサゾールカルボキサミド又は医薬的に許容可能なその塩であり得る。別の態様において、本カルシウム模倣化合物は、Ｎ−（２−クロロ−５−（（（（１Ｒ）−１−フェニルエチル）アミノ）メチル）フェニル）−２−ピリジンカルボキサミド又は医薬的に許容可能なその塩であり得る。
【００４６】
本発明の方法で有用なカルシウム模倣化合物には、上述のカルシウム模倣化合物ならびにそれらの立体異性体、鏡像異性体、多形体、水和物及び前述のものの何れかの医薬的に許容可能な塩が含まれる。
【００４７】
Ｂ．カルシウム模倣活性を評価する方法
ある態様において、ＣａＳＲ活性調節部位に結合する化合物は、例えば、競合的結合アッセイ形式でこの部位に結合する標識した化合物を用いて同定され得る。
【００４８】
化合物のカルシウム模倣活性は、国際公開ＷＯ９３／０４３７３、ＷＯ９４／１８９５９及びＷＯ９５／１１２１１に記載のものなどの技術を用いて決定され得る。
【００４９】
化合物カルシウム模倣活性を評価するために使用され得るその他の方法は下記で述べる。
【００５０】
ＨＥＫ２９３細胞アッセイ
ヒト副甲状腺ＣａＳＲを発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３４．０−７）は、以前に詳述されている（Ｎｅｍｅｔｈ  ＥＦら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４０４０−４０４５）。このクローン細胞株は、
ＣａＳＲのアゴニスト、アロステリック調節物質及びアンタゴニストに対してスクリーニングするために広く使用されてきた（Ｎｅｍｅｔｈ  ＥＦら（２００１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９９：３２３−３３１）。
【００５１】
細胞質カルシウム濃度の測定のために、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．０２％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で短時間処理することによって組織培養フラスコから細胞を回収し、次いで洗浄し、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−グルコースが添加された緩衝液Ａ（１２６ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．７ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ  Ｎａ−Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）中で再懸濁する。緩衝液Ａ及び２μＭ  ｆｕｒａ−２アセトキシメチルエステル中で３７℃で３０分間温置することによって、ｆｕｒａ−２を細胞に負荷する。この細胞を緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂは、硫酸塩及びリン酸塩を含まず、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する、０．５％ＢＳＡ及び１ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−グルコースが添加された緩衝液Ａ）で洗浄し、４から５ｘ１０６個（細胞）／ｍＬの密度になるように室温で再懸濁する。蛍光シグナルを記録するために、持続的に撹拌しながら、予め温められた（３７℃）緩衝液Ｂで細胞を５倍希釈する。励起及び発光波長はそれぞれ３４０及び５１０ｎｍである。蛍光シグナルは、ストリップチャート記録装置を用いてリアルタイムで記録する。
【００５２】
蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）分析のために、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でＨＥＫ２９３細胞を維持する。分析２４時間前に、細胞をトリプシン処理し、側面が黒色で底部が透明で、コラーゲン１で被覆された９６ウェルプレートに、１．２ｘ１０５個（細胞）／ウェルになるように上記培地中でプレーティングする。このプレートを１，０００ｒｐｍで２分間遠心し、５％ＣＯ２下、３７℃で一晩温置する。次に、室温で６０分間、６μＭ  フルオ−３アセトキシメチルエステルを細胞に負荷する。１．０ｍｇ／ｍＬ  Ｄ−グルコース及び１．０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡフラクションＩＶ（ｐＨ７．４）を添加した、１２６ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｎａ−Ｈｅｐｅｓを含有する緩衝液中で全てのアッセイを行う。
【００５３】
ある態様において、１ｍＭ  Ｃａ２＋の存在下でＣａＳＲ活性化合物に対するＥＣ５０を決定することができる。０．５ｍＭの細胞外Ｃａ２＋レベルで出発して、細胞質カルシウム濃度に対するＥＣ５０を決定することができる。０．８Ｗのレーザー設定及び０．４秒ＣＣＤカメラシャッタースピードを用いて、ＦＬＩＰＲ実験を行う。カルシウム、ＣａＳＲ活性化合物又はビヒクル（２０μＬ）を細胞に添加し、５０秒間にわたり、１秒間隔で蛍光を監視する。次に、カルシウム、ＣａＳＲ活性化合物又はビヒクルの第二の添加（５０μＬ）を行い、蛍光シグナルを監視することができる。同じ時間内の反応のピーク高として蛍光シグナルを測定する。次に、％最大蛍光を調べるために、プレート中で観察される最大ピークに対して各反応を正規化する。
【００５４】
ウシ副甲状腺細胞
単離されたウシ副甲状腺細胞の初代培養物を用いて、ＰＴＨ分泌のＣａＳＲ依存性制御におけるカルシウム模倣化合物の効果を評価することができる。コラゲナーゼ消化により単離細胞を得て、プールし、次いでＰｅｒｃｏｌｌ精製緩衝液中で再懸濁し、４℃で２０分間、１４，５００ｘｇで遠心することにより精製することができる。単離副甲状腺細胞を取り出し、０．５％ＢＳＡ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び２０μｇ／ｍＬゲンタマイシンが添加されたＨａｍ’ｓＦ−１２及びＤＭＥＭの１：１混合液（Ｆ−１２／ＤＭＥＭ）中で洗浄する。最終的に、１０Ｕ／ｍＬペニシリン、１０μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び４μｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有するＦ−１２／ＤＭＥＭ中で細胞を再懸濁し、ＩＴＳ＋（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸、ＢＳＡ及びリノール酸；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）によりＢＳＡを置き換える。大気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で、３７℃でＴ−７５フラスコ中で細胞を温置する。
【００５５】
一晩培養した後、傾斜法により細胞をフラスコから取り出し、０．１％ＢＳＡ及び０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する副甲状腺細胞緩衝液（１２６ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．７ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ  Ｎａ−Ｈｅｐｅｓ、２０；ｐＨ７．４５及び規定どおりのＣａＣｌ２の可変量）で洗浄する。この同じ緩衝液中で細胞を再懸濁し、適切な対照、ＣａＳＲ活性化合物及び／又はＣａＣｌ２の様々な濃度を含有するポリスチレンチューブに一部（０．３ｍＬ）を添加する。各３本ずつ、各実験条件を実施する。３７℃での温置は２０分間であり、チューブを氷上に置くことにより停止させ得る。遠心（４℃で５分間、１５００ｘｇ）により細胞を沈殿させ、上清０．１ｍＬをすぐにアッセイする。温置時間中、細胞の一部を氷上に置いたままにし、次いでその他の試料とともに平行して処理する。氷上で維持されたチューブからの上清中のＰＴＨの量は、「基底放出」として定義され、その他の試料から差し引かれる。ラットＰＴＨ−（１−３４）免疫放射定量アッセイキット（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｐｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ、ＣＡ）を用いて、製造者の説明書に従い、ＰＴＨを測定する。
【００５６】
ＭＴＣ６−２３細胞カルシトニン放出
増殖培地（カルシウム／１５％ＨＩＨＳが添加されたＤＭＥＭ高グルコース）中で、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入されるラットＭＴＣ６−２３細胞（クローン６）を維持し、この培地を３から４日ごとに交換する。１：４の分割比で週に１回培養物を継代する。処方された増殖培地中のカルシウム濃度を計算し、３．２ｍＭとなる。３７℃で９０％Ｏ２／１０％ＣＯ２の雰囲気中で細胞を温置する。実験前に、コンフルエントに近い培養物からの細胞を吸引し、トリプシン溶液で１回リンスする。フラスコを再び吸引し、細胞を剥離するために、新鮮なトリプシン溶液とともに室温で５−１０分間温置する。増殖培地中３．０ｘ１０５個（細胞）／ｍＬの密度で、剥離細胞を縣濁し、コラーゲン被覆４８ウェルプレート（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）中に１．５ｘ１０５個（細胞）／ウェル（０．５ｍＬ細胞縣濁液）の密度で播種する。播種後５６時間、細胞を付着させ、その後、増殖培地を吸引し、アッセイ培地（ＤＭＥＭ高グルコース、２％ＦＢＳなし）の０．５ｍＬで置き換えた。次に、カルシウム刺激されたカルシトニン放出の測定前に、細胞を１６時間温置する。この培地中の実際のカルシウム濃度を計算し、０．０７ｍＭ未満となる。カルシトニン放出を測定するために、アッセイ培地中の試験薬剤０．３５ｍＬを各ウェルに添加し、培地中のカルシトニン含量測定前に４時間温置する。ラットカルシトニン免疫放射定量アッセイキット（Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ、ＣＡ）を用いて、製造者の説明書に従い、カルシトニンレベルを定量する。
【００５７】
イノシトールリン酸アッセイ
ラット脳からのクローン化ＣａＳＲを含有する発現ベクターを遺伝子移入したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞［ＣＨＯ（ＣａＳＲ）］又は遺伝子移入していない［ＣＨＯ（ＷＴ）］で行われる生化学的アッセイにおいて、化合物のカルシウム模倣特性を評価することもできる（Ｒｕａｔ  Ｍ．、Ｓｎｏｗｍａｎ  ＡＭ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７１、１９９６、ｐ５９７２）。ＣＨＯ（ＣａＳＲ）は、Ｃａ２＋及びその他の二価陽イオンによる及びＮＰＳ５６８によるＣａＳＲの活性化時に、トリチウム化イノシトールリン酸（［３Ｈ］ＩＰ）蓄積を刺激することが示されている（Ｒｕａｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７１、１９９６）。このようにして、２ｍＭ細胞外カルシウム存在下での各ＣａＳＲ活性化合物１０μＭにより生じる［３Ｈ］ＩＰ蓄積を測定し、１０ｍＭ細胞外カルシウム（最大ＣａＳＲ活性化を誘発する濃度）により生じる効果と比較することができる（Ｄａｕｂａｎ  Ｐ．ら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１０、２０００、ｐ２００１）。
【００５８】
Ｃ．医薬組成物及び投与
無機又は有機酸由来の医薬的に許容可能な塩の形態で、本発明において有用なカルシウム模倣化合物を使用することができる。この塩には、以下に限定されないが、次のもの：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファスルホン酸塩、ジグルコン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチネート（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、過硫酸塩、２−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、メシル酸塩及びウンデカン酸塩が含まれる。本発明の化合物がカルボキシ基などの酸性官能基を含む場合、カルボキシ基に対する適切な医薬的に許容可能な塩は、当業者にとって周知であり、例えば、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム、第４級アンモニウム陽イオンなどが含まれる。「薬理学的に許容可能な塩」のさらなる例については、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１、１９７７を参照のこと。本発明のある種の実施形態において、塩酸塩及びメタンスルホン酸塩を使用することができる。
【００５９】
本発明のある態様において、シナカルセト、即ち、Ｎ−（１−（Ｒ）−（１−ナフチル）エチル］−３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−１−アミノプロパン、シナカルセトＨＣｌ及びシナカルセトメタンスルホン酸塩から、カルシウム受容体活性化合物を選択することができる。シナカルセトＨＣｌ及びシナカルセトメタンスルホン酸塩などのカルシウム模倣化合物は、非晶質粉末、結晶性粉末及びそれらの混合物などの様々な形態であり得る。結晶性粉末は、多形、偽多形、晶癖、粉体（ｍｉｃｒｏｍｅｒｅｔｉｃｓ）及び粒子形態を含む形態であり得る。
【００６０】
投与のために、本発明において有用な化合物は、通常、指示された投与経路に適切な１以上のアジュバントと組み合わせられる。本化合物は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸及び硫酸のナトリウム及びカルシウム塩、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリジン及び／又はポリビニルアルコールと混合することができ、従来の投与の場合、錠剤化又はカプセル化することができる。あるいは、本発明で有用な化合物は、食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、ゴマ油、トラガカントゴム及び／又は様々な緩衝液に溶解させ得る。その他のアジュバント及び投与形式が医薬分野で周知である。担体又は希釈剤は、モノステアリン酸グリセリン、ジステアリン酸グリセリンなどの遅延材料を、単独で、又はワックスもしくは当技術分野で周知のその他の材料と一緒に、含み得る。
【００６１】
本医薬組成物は、（顆粒剤、散剤又は坐剤を含む）固体剤形又は液体剤形（例えば、溶液、懸濁液又はエマルジョン）で構成され得る。本医薬組成物は、滅菌などの従来の製薬操作に供し得、及び／又は保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などの従来のアジュバントを含有し得る。
【００６２】
経口投与用の固体剤形には、カプセル、錠剤、丸剤、散剤、坐剤及び顆粒剤が含まれ得る。このような固体剤形において、本活性化合物をスクロース、ラクトース又はデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合し得る。このような剤形は、通常実施されるように、不活性希釈剤以外のさらなる物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含むこともできる。カプセル、錠剤及び丸剤の場合、緩衝剤も本剤形に含まれ得る。さらに、錠剤及び丸剤は、腸溶コーティングとともに調製され得る。
【００６３】
経口投与用の液体剤形には、水などの当技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含有する、医薬的に許容可能な、エマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、エリキシル剤などが挙げられる。このような組成物は、湿潤剤、甘味料、香味料、芳香剤などのアジュバントも含み得る。
【００６４】
本発明で有用な組成物中のカルシウム受容体活性化合物の治療的有効量は、対象１人あたりカルシウム模倣化合物約０．１ｍｇから約１８０ｍｇ、例えば、約５ｍｇから約１８０ｍｇ、又は約１ｍｇから約１００ｍｇの範囲であり得る。ある態様において、組成物中のカルシウム受容体活性化合物の治療的有効量は、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、５ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７５ｍｇ、約９０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１８０ｍｇから選択され得る。
【００６５】
カルシウム受容体活性化合物を対象に単独で投与し得る一方で、投与される化合物は、通常、医薬組成物中の活性成分として存在する。従って、本発明の医薬組成物は、少なくとも１種類のカルシウム模倣化合物の治療的有効量又は少なくとも１種類のカルシウム模倣化合物の有効投与量を含み得る。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、「有効投与量」は、単回投与、複数回投与又は部分投与として投与した場合に、カルシウム受容体活性化合物の治療的有効量を与える量である。従って、本発明のカルシウム受容体活性化合物の有効投与量は、化合物の有効量未満の量、有効量と同量、有効量を超える量を含み、例えば、錠剤、カプセルなどの２以上の単位投与量（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ）が化合物の有効量を投与するために必要とされる医薬組成物、又は、あるいは、組成物の一部を投与することによってカルシウム模倣化合物の有効量が投与される、散剤、液剤などの複数回投与医薬組成物を含む。
【００６７】
あるいは、錠剤、カプセルなどの２種類以上の単位製剤がカルシウム受容体活性化合物の有効量を投与するために必要とされる医薬組成物は、例えば、個々の対象に対する有効量を確認するために、潜在的副作用に対して個々の対象の敏感性を減じるために、個々の対象に投与する１以上のその他の治療薬の有効な投薬再調整又は減少を可能にするためになど、有効量未満で１期間以上（例えば、１日１回投与及び１日２回投与）投与し得る。
【００６８】
本発明において有用である医薬組成物の有効投与量は、単位剤形から約１ｍｇから約３６０ｍｇ、例えば、単位剤形から約５ｍｇ、約１５ｍｇ、約３０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７５ｍｇ、約９０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約３００ｍｇ又は約３６０ｍｇの範囲であり得る。
【００６９】
本発明のある態様において、本明細書中で開示される組成物は、上皮傷害の治療又は予防のためのカルシウム受容体活性化合物の治療的有効量を含む。例えば、ある種の実施形態において、シナカルセトＨＣｌなどのカルシウム模倣化合物は、組成物の総重量に対する重量比で約１％から約７０％、例えば約５％から約４０％、約１０％から約３０％又は約１５％から約２０％の範囲の量で存在し得る。
【００７０】
本発明において有用な組成物は、本カルシウム感知受容体活性化合物に加えて、１以上の活性成分を含有し得る。さらなる活性成分は、別のカルシウム模倣化合物であり得るか又は異なる治療活性を有する活性成分であり得る。併用薬として投与される場合、本治療薬は、同時にもしくは異なる時間に投与される個別の組成物として処方され得るか、又は本治療薬は単一組成物として投与され得る。
【００７１】
ある態様において、本発明の方法に対して有用な医薬組成物には、下記でより詳細に記載されるようなさらなる化合物が含まれ得る。
【００７２】
別の態様において、本発明の方法を実施するために使用される化合物は、上部胃腸管、例えば胃及び腸へ実質的に放出せず、結腸において生物活性成分を放出する経口投与のために処方され得る。結腸への薬物の経口送達により、上部ＧＩ管での薬物放出のために起こる副作用又は不要な全身性吸収を最小限に抑えながら、局所的な高濃度を達成することができるようになり得る。薬物の結腸送達の長所は、吸収性に乏しい薬物吸収のバイオアベイラビリティーが高くなり得るという事実によるものであり得、結腸は、胃及び小腸よりも活性の多様性及び強度が低い、幾分厳しさが低い環境であり、結腸は、より長い保持時間を有し、吸収性に乏しい薬物の吸収を促進する薬剤に対して高い反応性があると思われる。Ｃｈｏｕｒａｓｉａ、Ｍ．ら（２００３）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ  ６（１）：３３−６６。結腸を標的とする薬物送達系の開発のために使用され得るいくつかの製薬学的アプローチを表１でまとめる。
【００７３】
【表１】
2011516424.tif 000012
【００７４】
別の例において、ペクチン及びガラクトマナン（両者とも結腸細菌酵素により分解可能な多糖類）を含む薬物担体とともに、本発明の医薬組成物を使用することができる（米国特許第６，４１３，４９４号）。薬物担体として単独で使用される場合、ペクチン又はガラクトマナンは模擬胃液及び模擬腸液中で容易に溶解されるが、一方で、約７のｐＨ以上で調製されるこれらの２種類の多糖類の混合物は、模擬胃液及び腸液中で溶解されないか又は分解されない、強く、弾性があり不溶性であるゲルを生じ、従って、この混合物で被覆された薬物は、上部ＧＩ管で放出されないよう保護される。ペクチン及びガラクトマナンの混合物が結腸に到達すると、結腸細菌酵素の相乗作用によってこれが迅速に分解される。さらに別の態様において、本発明の組成物は、結腸酵素により分解可能である、ゼラチン及び陰イオン性多糖類（例えば、ペクチネート（ｐｅｃｔｉｎａｔｅ）、ペクテート（ｐｅｃｔａｔｅ）、アルギン酸塩、コンドロイチン硫酸、ポリガラクツロン酸、トラガントゴム、アラビアゴム及びそれらの混合物）の複合体の医薬マトリクスとともに使用され得る（米国特許第６，３１９，５１８号）。
【００７５】
本発明の化合物の別の送達経路において、全身循環系における化合物の治療レベルを達成するために、ならびに、より局所的な薬物の内部投薬のために、経皮投与を使用することができる。標的内部組織での化合物の治療レベルを達成するために薬物の十分な経皮浸透をもたらすため、皮膚浸透性促進ビヒクルを含有する組成物を提供することが必要であることが多い。米国特許第４，４８５，０３３号；同第４，５３７，７７６号；同第４，６３７，９３０号；同第４，６９５，４６５号を含め、多くの皮膚浸透性促進ビヒクルが開示されている。
【００７６】
上皮傷害の治療のための本発明の化合物及び組成物の送達の別の例は、局所送達、例えばオイル及びローションの形態のものである。局所送達組成物は当技術分野で周知であり、例えば米国特許第５，６１４，１７８号；同第７，２４１，４５６号；及び同第５，７２０，９４８号に記載されている。
【００７７】
ＩＩＩ．治療の方法
ある態様において、本発明は、虚血、化学療法、放射線又は機械的傷害による腸上皮損傷又は傷害を克服するために有用な方法を提供する。本発明は、アポトーシス及び／又は壊死を阻害し、上皮傷害がある対象における細胞生存を促進するためのカルシウム模倣物の使用に関する。本発明の方法が目論まれる上皮組織は、一例を挙げると、単層上皮である。別の例において、それは重層上皮である。さらなる例において、それは偽重層上皮である。ある態様において、上皮傷害は、腸上皮傷害であり得る。別の態様において、それは皮膚傷害であり得る。さらなる態様において、それは、例えば口腔、食道及び直腸の一部の上皮など、重層扁平上皮に対する傷害であり得る。別の態様において、これは、扁平、円柱又は偽重層上皮細胞に対する傷害であり得る。
【００７８】
ある態様において、本発明は、化学療法、放射線療法又は手術が行われようとしている対象を治療するための方法に関する。この態様において、対象は、化学療法、放射線療法又は手術を行う前に、本発明のカルシウム模倣化合物で前治療され得る。前治療プロトコールの例は下記に記載する。
【００７９】
本発明の別の態様は、ＧＩ管における悪影響を引き起こす殺生物剤（例えば抗ウイルス剤、抗真菌剤及び抗菌剤）などの細胞毒性剤を投与される対象に対する治療の方法に関する。本発明のさらなる態様は、疾患、例えば浸透圧性下痢により引き起こされる上皮傷害を取り扱う。
【００８０】
本発明のある態様は、化学的傷害による悪影響を軽減するために適用され得る。適用例には、上皮傷害誘発性の腸粘膜炎の発現の阻害又は予防、感染の発生率及び重症度の低下、白血球細胞枯渇の抑制及び大腸に対する損傷耐性が含まれる。
【００８１】
本発明の別の態様は、小腸の機能における上皮傷害の悪影響を改善すること、例えば、腸の長さの短縮及び機能の低下につながる、吸収不良、潰瘍形成、出血、感染、下痢、線維症及び狭窄形成の発生率を改善することである。
【００８２】
本発明に従う対象の前治療での使用のために、上皮傷害前に予め定められた期間にわたり、日常的に対象に本発明のカルシウム模倣化合物を投与し得る。適切な前治療期間は、傷害後のこれらの評価項目の何れか１つ：生存上昇、小腸又は大腸の健康又は機能の向上、白血球数上昇、感染発生率又は細菌数低下及び粘膜炎の発生率に関して、カルシウム模倣化合物で前治療されない対象と比較して、ある一定の利益を対象に与えるものとして特定される。ある態様において、前治療期間は、１日から７日間からなる。一例において、前治療期間は、上記の用量でのカルシウム模倣組成物での前治療の３連続日からなる。
【００８３】
本発明は、機械的ストレス、例えば創傷治癒、皮膚移植又は手術による上皮傷害を治療するための方法をさらに提供する。上皮傷害の全てのタイプは、本発明のこの態様において治療されることがもくろまれる。本発明のある態様において、本発明の化合物及び組成物は、治癒を加速させるために、植皮片を処置又は前処置するために使用され得る。本発明の化合物は、治癒を向上させ、細胞死を防ぐために、手術前、手術中又は手術後に使用され得る。
【００８４】
上皮傷害の様々なマーカーが当技術分野で公知である。臨床兆候は、治療中及び治療後の代用評価項目として最も一般的に使用される。皮膚傷害のタイプには、切り傷、擦り傷、打撲が含まれ得る。ＵＶ損傷マーカーは、乾燥皮膚、日焼け又は光線角化症である。腸上皮傷害の症状には、食欲不振、嘔気、嘔吐、粘膜傷害、腹部けいれん及び下痢が含まれる。これらの症状は、傷害後すぐに起こり得る。しばしば、これらは、傷害（例えば、化学療法後又は放射線療法中）から２又は２週間後に顕著になり、傷害後２−６週間続く。粘膜輸送及びバリア機能の評価は、試験マーカーの吸収を測定すること又は栄養吸収不良に対する試験を通じて行われ得る。Ｌｕｔｇｅｎｓ  Ｌ．ら（２００７）Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１３（２２）：３０３３−３０４２参照。腸上皮傷害のその他のバイオマーカーには、例えば虚血性小腸傷害を測定するための血漿ジアミンオキシダーゼ（ＤＡＯ）活性、脂肪酸結合タンパク質、カルプロテクチン及びシトルリンが含まれる。上皮傷害のさらなるバイオマーカーは、下記の実施例でさらに詳細に記載される。
【００８５】
本発明の方法によりもくろまれるような治療の進行は、臨床兆候又は評価項目を観察することにより、又は、カルシウム模倣化合物及び本発明の組成物での治療前、治療中及び治療後に、傷害の各個々のタイプに対する適切なバイオマーカーを評価することにより、測定され得る。
【００８６】
次の実施例は、本発明をより完全に説明するために与えられるものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００８７】
この実施例は、カルシウム模倣化合物が虚血性傷害から回腸絨毛を保護することを示す。
【００８８】
動物
実験前に、体重２２−２７グラムの雄（Ｃａｓｒ＋／＋；Ｇｃｍ２−／−）又はＣａＳＲノックアウト（Ｃａｓｒ−／−；Ｇｃｍ２−／−）マウス（上パネル）又は体重２２０−２７５グラムの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（下パネル）を自由摂餌及び摂水にした。イソフルオランの過剰量に動物を曝露し、回腸を取り出した。次に、この回腸を４ｃｍの長さの切片に切り分け、個々の絨毛を単離するために３７℃で２０分間、各切片をＥＤＴＡ（２０ｍＭ）中に入れた。この消化時間後、１００％Ｏ２を泡立てて通気したＨＥＰＥＳ−リンガー溶液中に絨毛を入れ、使用まで４℃でこの溶液中で保存した。全てのマウスは、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで繁殖コロニーから作製した。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを購入した。Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの標準プロトコールに従い、全ての動物を取り扱った。
【００８９】
化学試薬
ＨＥＰＥＳ−リンガー溶液は、（ｍｍｏｌ／Ｌで）ＮａＣｌ  １２５；ＫＣｌ  ５；ＭｇＣｌ２  ０．５；ＨＥＰＥＳ  ２２、ＣａＣｌ２  ０．１又は１．６；グルコース  １０、ｐＨ＝７．４を含有した。この溶液に１００％Ｏ２を泡立てて通気した。
【００９０】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）からのＦＬＵＯ−４及び保存溶液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製した。
【００９１】
ＤＭＳＯを用いて、カルシウム模倣物溶液（化合物Ａ、３−（２−クロロフェニル）−Ｎ−（（１Ｒ）−１−（３−（メチルオキシ）フェニル）エチル）−１−プロパンアミン）及び化合物Ｂ、Ｎ−（（６−（メチルオキシ）−４’−（トリフルオロメチル）−１，１'−ビフェニル−３−イル）メチル）−１−フェニルエタンアミンを処方した。ＤＭＳＯの最終濃度は、０．１％（ｖ／ｖ）を超えなかった。予備実験から、ビヒクルは、何れの細胞傷害パラメーターも変化させなかったか又は生存に影響しなかったことが示された。
【００９２】
虚血性傷害及びカルシウム測定
単離後、個々の絨毛をカバースリップ上に置き、カルシウム指示色素ＦＬＵＯ４−ＡＭ（１０μＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｏｒｅｇｏｎ  ＵＳＡ）を１５分間負荷した。
【００９３】
負荷後、絨毛を倒立顕微鏡のステージに移し、そこで、１００％Ｏ２を泡立てて通気した３７℃ＨＥＰＥＳリンガー溶液でそれらを潅流した。５分間の平衡時間後、脱エステル化色素を除去するために、１００％Ｎ２を泡立てて通気したＨＥＰＥＳリンガー溶液に絨毛を曝露し、一方で、５３５ｎｍ励起及び４９０ｎｍ発光で１５秒ごとに画像を回収した。冷却ＣＣＤカメラ及びＭｅｔａｍｏｒｐｈ画像収集及び分析ソフトウェア付きの６０ｘ倍率のＤＩＣオプティクスを用いて、２０−３０分間、画像を記録した。
【００９４】
虚血性傷害及びトリパンブルー
個々の絨毛を倒立顕微鏡のステージに移し、そこで、１００％Ｏ２を泡立てて通気した３７℃ＨＥＰＥＳリンガー溶液でそれらを潅流した。５分間の平衡時間後、１００％Ｎ２を泡立てて通気したＨＥＰＥＳリンガー溶液に絨毛を曝露した。一連のトリパンブルーにおいて、膜の完全性の評価のために使用される非膜浸透色素を槽に添加した（０．１ｍＭトリパンブルー濃縮液を槽溶液に直接溶解、１００％Ｏ２又は１００％Ｎ２の何れか）。次に、連続した時間点で、冷却ＣＣＤカメラ及びＭｅｔａｆｌｕｏｒ画像収集及び分析ソフトウェアを用いた６０ｘ倍率のＤＩＣオプティクスを用いて、画像を記録した。全ての群に対して潅流開始から３０分で最終データを収集した。トリパンブルー陽性細胞の数を数え、各条件下で各絨毛に対して数を記録した。
【００９５】
統計学的分析
カルシウム測定及び虚血性傷害
任意蛍光単位（ＡＦＵ）として細胞内Ｃａ＋の上昇をプロットするが、ＡＦＵの数値が高いことは細胞内Ｃａ２＋の上昇を示す。次に、絨毛１本あたり最少で７個の細胞を有する各絨毛に対するデータをプールし、記録した。次に、各絨毛から及び各動物からの全ての細胞データの合計に対して、数値的平均を与えた。与えられる研究に対して、絨毛１本あたり７個の細胞、動物１匹あたり５本の絨毛及び各群において５匹の動物があった。
【００９６】
トリパンブルー測定及び虚血性傷害
各実験溶液に３０分間曝露した後、盲検下にある観察者から、トリパンブルー陽性細胞の数を記録した。各絨毛に対する陽性細胞の最終的な数を記録した。絨毛１本あたり最少で７個の細胞を有する各絨毛に対するデータをプールし、記録した。次に、各絨毛から及び各動物からの全ての細胞データの合計に対して数値的平均を与えた。与えられる実験に対して、絨毛１本あたり７個の細胞、動物１匹あたり５本の絨毛及び各群において５匹の動物があった。
【００９７】
図１で結果をまとめるが、これは、ラット由来の単離回腸絨毛での虚血性傷害からの保護におけるカルシウム模倣化合物Ａの効果を示す。パネルＡは、前出の１００％Ｎ２（虚血性傷害）への曝露後の、細胞内カルシウムの変化（ビデオ蛍光画像システム及びカルシウム感受性蛍光指示薬ＦＬＵＯ−４により測定した場合：細胞内カルシウムの上昇はより大きい蛍光強度により示される。）に対する経時変化を示す。パネルＢは、Ｎ２曝露後の回腸絨毛における細胞内カルシウムの変化のまとめである。細胞傷害及び結果として起こる細胞死の兆候であった、最初の値の２００％を超えるカルシウムの持続的上昇があった。パネルＣは、カルシウム模倣物（１００ｎＭ  化合物Ａ）への５分間曝露の保護効果を示し、このカルシウム模倣物では、１００％Ｎ２の存在下でカルシウム上昇は示されず、それにより、虚血がなかったことが示唆される。パネルＤは、虚血性傷害に曝露された絨毛におけるカルシウム模倣物（１００ｎＭ  化合物Ａ）の保護効果のまとめである。
【実施例２】
【００９８】
この実施例は、カルシウム模倣化合物が虚血から結腸陰窩を保護することを示す。
【００９９】
動物
実験前に、体重２２−２７グラムの雄（Ｃａｓｒ＋／＋；Ｇｃｍ２−／−）又はＣａＳＲノックアウト（Ｃａｓｒ−／−；Ｇｃｍ２−／−）マウス又は体重２２０−２７５グラムの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを自由摂餌及び摂水にした。イソフルオランの過剰量に動物を曝露し、結腸を取り出した。次に、この結腸を４ｃｍの長さの切片に切り分け、個々の陰窩を単離するために３７℃で２０分間、各切片をＥＤＴＡ（２０ｍＭ）中に入れた。この消化時間後、１００％Ｏ２を泡立てて通気したＨＥＰＥＳ−リンガー溶液中に陰窩を入れ、使用まで４℃でこの溶液中で保存した。全てのマウスは、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで繁殖コロニーから作製した。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを購入した。Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの標準プロトコールに従い、全ての動物を取り扱った。
【０１００】
化学試薬、虚血性傷害及びカルシウム測定、虚血性傷害及びトリパンブルー、統計学的分析−実施例１参照。
【０１０１】
結果を図２でまとめるが、これは、カルシウム模倣化合物がラット結腸陰窩での虚血に対して保護効果を示すことを示す。パネルＡは、１００％Ｎ２（虚血性傷害）への曝露後の結腸陰窩における細胞内カルシウムの変化に対する経時変化を示す。パネルＢは、Ｎ２曝露後の細胞内カルシウムの変化のまとめである。パネルＣは、カルシウム模倣物（１００ｎＭ  化合物Ａ）への５分間曝露の保護効果を示し、このカルシウム模倣物では、１００％Ｎ２の存在下でカルシウム上昇は示されなかった。パネルＤは、虚血性傷害に曝露された結腸陰窩におけるカルシウム模倣物（１００ｎＭ  化合物Ａ）の保護効果のまとめである。化合物Ａ１００ｎＭでの５分間のプレパルスにより、結腸陰窩における細胞内カルシウムの上昇が阻止され、従って、酸素なしの環境での陰窩の生存能が高まり、細胞膜の変化（アポトーシス）が阻止された。
【実施例３】
【０１０２】
この実施例は、カルシウム模倣物が虚血による細胞死を阻止できることを示す。
【０１０３】
図３は、カルシウム模倣物への短時間の曝露後のラット回腸絨毛における細胞損傷に対する保護効果を示す。細胞損傷及び膜完全性の崩壊をアッセイするために使用される、トリパンブルー、ジアゾ色素生細胞染色に組織を曝露した。生細胞又は膜損傷のない細胞は染色されなかった。カルシウム模倣物の非存在下で、虚血性状態（１００％Ｎ２）に３０分間曝露した結果、６０％を超えるトリパンブルーの細胞取り込みが起こった。カルシウム模倣物１００ｎＭに僅か５分間曝露することにより、回腸絨毛へのトリパンブルー取り込みが阻止され、このことから、虚血性傷害の予防におけるカルシウム模倣物（１００ｎＭ  化合物Ａ）の保護効果が示される。
【実施例４】
【０１０４】
この実施例は、創傷傷害及び修復におけるカルシウム模倣物治療の効果を示し、創傷傷害、炎症及び修復に関与する９６種類の遺伝子における化合物Ｂの影響をマウス全層皮膚創傷傷害モデルにおいて評価した。Ｚｏｏｇ  ＳＪら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ．（２００９）３月；７５（３）：１８９−９８参照。遺伝子ｍＲＮＡバイオマーカーにおけるカルシウム模倣物治療の影響を定量的ＰＣＲにより評価した。
【０１０５】
創傷傷害に対するＲＮＡバイオマーカー
創傷傷害ＲＮＡバイオマーカー探索のために、雌ｂａｌｂ／ｃマウスを無作為に分け、皮膚創傷の前日及び皮膚創傷後、実験終了まで毎日、化合物Ｂ（３ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝５）又はビヒクル（水中２０％カプチゾール（Ｃａｐｔｉｓｏｌ）、ｎ＝５）で処置した。第０日に、全てのマウスに３ｍｍ直径の全層穿孔創傷を与えた。傷害後、第１日及び第３日に、元の３ｍｍの創傷を覆う６ｍｍ直径の皮膚生検を行い、創傷組織をＲＮＡ分析のために回収した。製造者の説明書に従い、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＮＡを単離した。１ｘＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）Ｔａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ混合液中の１０μＬの最終体積で１個のウェルにトータルＲＮＡ１０ｎｇを添加し、ＡＢＩ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステムにおいて運転した。データ分析のために、ＡＢＩ  ＳＤＳ２．１ソフトウェアを用いて、対照遺伝子、Ｈｐｒｔ１を基にして、各試料の遺伝子発現プロファイルを最初に調べた。さらにＡｃｔｂ、Ｇａｐｄｈ、Ｈｐｒｔ１及びＲｐｌ２７で各試料のシグナルを正規化した。第１日及び３日にビヒクルとカルシウム模倣物（化合物Ｂ）処置群との間で差異を示す遺伝子を表２でまとめる。
【０１０６】
カルシウム模倣物処置マウスは、一連の試験期間にわたり、２０−３６ｎｇ／ｍＬの平均血漿レベルを示し、ビヒクル処置動物での１０．２−１０．９ｍｇ／ｄＬの総カルシウムレベルと比較して、７．２１−７．９ｍｇ／ｄＬの血清総カルシウムレベルという、対応する低下を示した。これらの結果から、カルシウム模倣化合物が、皮膚創傷傷害、炎症及び修復反応に影響を与え得る血清カルシウムにおいて薬力学的な効果を有したことが示唆される。
【０１０７】
バイオマーカー遺伝子ＲＮＡ分析から、正常な皮膚において、及び化合物Ｂで処置した動物の傷害後第１日及び第３日の損傷皮膚において、ＣａＳＲが発現されることが示された（図４）。このことから、創傷組織においてＣａＳＲが発現され、故にカルシウム模倣物により調節され得ることが示唆される（図４）。
【０１０８】
ビヒクル対照と比較して、第１日及び第３日に化合物Ｂにより動的に影響を受けた創傷傷害、炎症及び修復のバイオマーカーを表２で示す。カルシウム模倣化合物Ｂは、炎症性遺伝子及びリモデリング及び修復に関与する遺伝子に影響を及ぼした。具体的に、細胞死を促進し得るＩＬ−１ａ及びＴＮＦなどのキーとなる炎症性サイトカイは、化合物Ｂにより影響を受けた。影響を受けた、炎症及び修復に関与する遺伝子には、トリプターゼ、ＴＩＭＰ−３及びＭＭＰ１３が含まれた。細胞生存の促進に関与する遺伝子には、ＶＥＧＦａ、ＴＧＦｂ１、ｅＮＯＳ及びＰＤＧＦＲｂが含まれた。免疫細胞関連遺伝子には、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＬＲ−７及びＣＤ３が含まれた。その他の関連遺伝子には、ＩＴＧＡ３及びＰＲＧ−１が含まれた。従って、カルシウム模倣物は、皮膚創傷傷害モデルにおいて創傷バイオマーカー遺伝子発現に影響を与える薬力学的活性を示した。表２は、ＰＣＲ分析により測定した場合の、ビヒクルを上回る、遺伝子の薬物誘導性の量的変化の増加（倍）を示す（各薬物又はビヒクル処置コホートにおいてｎ＝５）。
【０１０９】
【表２】
2011516424.tif 000013
【実施例５】
【０１１０】
この実施例は、回腸での放射線傷害におけるカルシウム模倣化合物の保護効果を示す。
【０１１１】
動物
実験前に、体重２２−２７グラムの雄（Ｃａｓｒ＋／＋；Ｇｃｍ２−／−）又はＣａＳＲノックアウト（Ｃａｓｒ−／−；Ｇｃｍ２−／−）マウス又は体重２２０−２７５グラムの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを自由摂餌及び摂水にした。イソフルオランの過剰量に動物を曝露し、回腸を取り出した。次に、この回腸を４ｃｍの長さの切片に切り分け、個々の絨毛を単離するために３７℃で２０分間、各切片をＥＤＴＡ（２０ｍＭ）中に入れた。この消化時間後、１００％Ｏ２を泡立てて通気したＨＥＰＥＳ−リンガー溶液中に絨毛を入れ、使用まで４℃でこの溶液中で保存した。全てのマウスは、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで繁殖コロニーから作製した。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを購入した。Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの標準プロトコールに従い、全ての動物を取り扱った。
【０１１２】
化学試薬
ＨＥＰＥＳ−リンガー溶液は、（ｍｍｏｌ／Ｌで）ＮａＣｌ  １２５；ＫＣｌ  ５；ＭｇＣｌ２  ０．５；ＨＥＰＥＳ  ２２、ＣａＣｌ２  ０．１又は１．６；グルコース  １０、ｐＨ＝７．４を含有した。この溶液に１００％Ｏ２を泡立てて通気した。
【０１１３】
生死アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＯＲ）
強い蛍光性のカルセインへの実質的に非蛍光の細胞浸透性カルセインＡＭの酵素変換により調べられる、ユビキタスな細胞内エステラーゼ活性の有無により、生きている細胞を区別する。ポリアニオン系色素カルセインは、生細胞中でよく維持され、生細胞において強い均一な緑色蛍光を発した（励起／発光〜４９５ｎｍ／〜５１５ｎｍ）。ＥｔｈＤ−１は膜損傷のある細胞に侵入し、核酸へ結合すると４０倍の蛍光増強が起こり、それにより、死細胞において明るい赤色蛍光が生じた（励起／発光〜４９５ｎｍ／〜６３５ｎｍ）。ＥｔｈＤ−１は、生細胞の無傷の原形質膜により排除された。細胞生存能の判定は、細胞のこれらの物理学的及び生化学的特性に依存する。バックグラウンド蛍光レベルは、このアッセイ技術では生来的に低かったが、これは、色素が細胞との相互作用前に実質的に非蛍光であったからである。
【０１１４】
放射線傷害及び生死アッセイ測定
単離後、個々の絨毛をカバースリップ上に置き、倒立顕微鏡のステージに移し、そこで１００％Ｏ２を泡立てて通気した３７℃ＨＥＰＥＳリンガー溶液でそれらを潅流した。５分間の平衡時間後、３００Ｗ  Ｘｅｎｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅから送達されるＵＶ  Ａ及びＵＶ  Ｂ放射線に絨毛を曝露した。１００％Ｏ２を泡立てて通気したＨＥＰＥＳリンガー溶液が入ったチャンバーを連続的に潅流しながら、２０分間の曝露時間にわたり、個々の絨毛に放射線を集束させた。１つのシリーズでのこの時間の終了時に、Ｍｅｔａｆｌｕｏｒ画像収集プログラム及び分析ソフトウェアを用いて、画像を記録した。独立観察者が絨毛１本あたりの死細胞数を数えた。各動物に対してこのプロセスを繰り返し、次に統計学的分析のために数値をプールした。
【０１１５】
放射線傷害及びトリパンブルー
個々の絨毛を倒立顕微鏡のステージに移し、そこで、１００％Ｏ２を泡立てて通気した３７℃ＨＥＰＥＳリンガー溶液でそれらを潅流した。５分間の平衡時間後、３００Ｗ  Ｘｅｎｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅから送達されるＵＶ  Ａ及びＵＶ  Ｂ放射線に絨毛を曝露した。１００％Ｏ２を泡立てて通気したＨＥＰＥＳリンガー溶液が入ったチャンバーを連続的に潅流しながら、２０分間の曝露時間にわたり、個々の絨毛に放射線を集束させた。１つのシリーズのトリパンブルーにおいて、膜の完全性の評価のために使用される非膜浸透色素を槽に添加した（０．１ｍＭトリパンブルー濃縮液を槽溶液に直接溶解させた。）。次に、連続的な時間点で、冷却ＣＣＤカメラ及びＭｅｔａｆｌｕｏｒ画像収集及び分析ソフトウェアを用いた６０ｘ倍率のＤＩＣオプティクスを用いて、画像を記録した。全ての群に対して潅流開始から３０分で最終データを収集した。トリパンブルー陽性細胞の数を数え、各条件下で各絨毛に対して数を記録した。
【０１１６】
統計学的分析
生死測定及び放射線傷害
死滅アッセイエチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ-１）に対する陽性染色細胞の増加を死細胞としてプロットした。次に、絨毛１本あたり最少で７個の細胞を有する各絨毛に対するデータをプールし、記録した。次に、各絨毛から及び各動物からの全ての細胞データの合計に対して数値的平均を与えた。与えられる研究に対して、絨毛１本あたり７個の細胞、動物１匹あたり５本の絨毛及び各群において５匹の動物があった。
【０１１７】
トリパンブルー測定及び放射線傷害
各実験溶液に３０分間曝露した後、盲検下にある観察者から、トリパンブルー陽性細胞の数を記録した。各絨毛に対する陽性細胞の最終的な数を記録した。次に、絨毛１本あたり最少で７個の細胞を有する各絨毛に対するデータをプールし、記録した。次に、各絨毛から及び各動物からの全ての細胞データの合計に対して数値的平均を与えた。与えられる実験に対して、絨毛１本あたり７個の細胞、動物１匹あたり５本の絨毛及び各群において５匹の動物があった。
【０１１８】
結果は図５で与えるが、これは、回腸機能における放射線傷害の影響をまとめる。パネルＡは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、マウス回腸絨毛細胞の完全性におけるＵＶＡ及びＵＶＢ放射線の影響の合成サマリープロットである。本カルシウム模倣物はトリパンブルー取り込みを阻止し、それにより細胞の健全性が向上したことが示される。パネルＢは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、ＣａＳＲノックアウトマウス細胞の完全性におけるＵＶＡ及びＵＶＢ放射線の影響の合成サマリープロットである。本カルシウム模倣物は、トリパンブルー取り込みの阻止には影響がなく、これにより、本カルシウム模倣物の保護効果が回腸における機能的カルシウム感知受容体と関連することが示される。
【実施例６】
【０１１９】
この実施例は、回腸での放射線傷害における本カルシウム模倣化合物の保護効果を示す。
【０１２０】
動物
実験前に、体重２２−２７グラムの雄（Ｃａｓｒ＋／＋；Ｇｃｍ２−／−）又はＣａＳＲノックアウト（Ｃａｓｒ−／−；Ｇｃｍ２−／−）マウス又は体重２２０−２７５グラムの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを自由摂餌及び摂水にした。イソフルオランの過剰量に動物を曝露し、回腸を取り出した。次に、結腸を４ｃｍの長さの切片に切り分け、個々の陰窩を単離するために３７℃で２０分間、各切片をＥＤＴＡ（２０ｍＭ）中に入れた。この消化時間後、１００％Ｏ２を泡立てて通気したＨＥＰＥＳ−リンガー溶液中に陰窩を入れ、使用まで４℃でこの溶液中で保存した。全てのマウスは、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで繁殖コロニーから作製した。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを購入した。Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの標準プロトコールに従い、全ての動物を取り扱った。
【０１２１】
化学試薬
ＨＥＰＥＳ−リンガー溶液は、（ｍｍｏｌ／Ｌで）ＮａＣｌ  １２５；ＫＣｌ  ５；ＭｇＣｌ２  ０．５；ＨＥＰＥＳ  ２２、ＣａＣｌ２  ０．１又は１．６；グルコース  １０、ｐＨ＝７．４を含有した。この溶液に対して１００％Ｏ２を泡立てて通気した。
【０１２２】
生死アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＯＲ）
実質的に非蛍光の細胞浸透性カルセインＡＭの、強い蛍光性のカルセインへの酵素変換により調べられる、ユビキタスな細胞内エステラーゼ活性の有無により、生細胞を区別する。ポリアニオン系色素カルセインは、生細胞中でよく維持され、生細胞において強い均一な緑色蛍光を発した（励起／発光〜４９５ｎｍ／〜５１５ｎｍ）。ＥｔｈＤ−１は膜損傷のある細胞に侵入し、核酸への結合の際に４０倍の蛍光増強が起こり、それにより、死細胞において明るい赤色蛍光が生じた（励起／発光〜４９５ｎｍ／〜６３５ｎｍ）。ＥｔｈＤ−１は、生細胞の無傷の原形質膜により排除された。細胞生存能の判定は、細胞のこれらの物理学的及び生化学的特性に依存する。バックグラウンド蛍光レベルは、このアッセイ技術では生来的に低かったが、これは、この色素が細胞との相互作用前に実質的に非蛍光であったからである。
【０１２３】
放射線傷害及び生死アッセイ測定
単離後、個々の陰窩をカバースリップ上に置き、倒立顕微鏡のステージに移し、そこで、１００％Ｏ２を泡立てて通気した３７℃ＨＥＰＥＳリンガー溶液でそれらを潅流した。５分間の平衡時間後、３００Ｗ  Ｘｅｎｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅから送達されるＵＶ  Ａ及びＵＶ  Ｂ放射線に陰窩を曝露した。１００％Ｏ２を泡立てて通気したＨＥＰＥＳリンガー溶液が入ったチャンバーを連続的に潅流しながら、２０分間の曝露時間にわたり、個々の陰窩に放射線を集束させた。１つのシリーズのこの時間の終了時に、Ｍｅｔａｆｌｕｏｒ画像収集プログラム及び分析ソフトウェアを用いて、画像を記録した。独立観察者が陰窩１個あたりの死細胞数を数えた。各動物に対してこのプロセスを繰り返し、次に統計学的分析のために数値をプールした。
【０１２４】
放射線傷害及びトリパンブルー
個々の陰窩を倒立顕微鏡のステージに移し、そこで、１００％Ｏ２を泡立てて通気した３７℃ＨＥＰＥＳリンガー溶液でそれらを潅流した。５分間の平衡時間後、３００Ｗ  Ｘｅｎｏｎ  Ｓｏｕｒｃｗｅから送達されるＵＶ  Ａ及びＵＶ  Ｂ放射線に陰窩を曝露した。１００％Ｏ２を泡立てて通気したＨＥＰＥＳリンガー溶液が入ったチャンバーを連続的に潅流しながら、２０分間の曝露時間にわたり、個々の陰窩に放射線を集束させた。一連のトリパンブルーにおいて、膜の完全性の評価のために使用される非膜浸透色素を槽に添加した（０．１ｍＭトリパンブルー濃縮液を槽溶液に直接溶解させた。）。次に、連続的な時間点で、冷却ＣＣＤカメラ及びＭｅｔａｆｌｕｏｒ画像収集及び分析ソフトウェアを用いた６０ｘ倍率のＤＩＣオプティクスを用いて、画像を記録した。全ての群に対して潅流開始から３０分で最終データを収集した。トリパンブルー陽性細胞の数を数え、各条件下で各絨毛に対して数を記録した。
【０１２５】
統計学的分析
生死測定及び放射線傷害
死滅アッセイエチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ-１）に対して陽性の細胞染色の増加を死細胞としてプロットした。次に、絨毛１本あたり最少で７個の細胞を有する各陰窩に対するデータをプールし、記録した。次に、各陰窩から及び各動物からの全ての細胞データの合計に対して数値的平均を与えた。与えられる研究に対して、陰窩１個あたり７個の細胞、動物１匹あたり５個の陰窩及び各群で５匹の動物があった。
【０１２６】
トリパンブルー測定及び放射線傷害
各実験溶液に３０分間曝露した後、盲検下にある観察者から、トリパンブルー陽性細胞の数を記録した。次に、各陰窩に対する陽性細胞の最終的な数を記録した。陰窩１個あたり最少で７個の細胞を有する各陰窩に対するデータをプールし、記録した。次に、各陰窩から及び各動物からの全ての細胞データの合計に対して数値的平均を与えた。与えられる実験に対して、陰窩１個あたり７個の細胞、動物１匹あたり５個の陰窩、各群５匹及び各群で５匹の動物があった。
【０１２７】
結果を図６でまとめるが、これは、結腸機能における放射線傷害の効果を示す。パネルＡは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、マウス結腸陰窩細胞の完全性におけるＵＶＡ及びＵＶＢ放射線の影響の合成サマリープロットである。本カルシウム模倣物は、トリパンブルー取り込みを阻止し、それにより、細胞の健全性が向上したことが示される。パネルＢは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、ＣａＳＲノックアウトマウス細胞の完全性におけるＵＶＡ及びＵＶＢ放射線の影響の合成サマリープロットである。本カルシウム模倣物は、トリパンブルー取り込みの阻止には影響がなく、これにより、本カルシウム模倣物の保護効果が結腸における機能的カルシウム感知受容体と関連することが示される。
【実施例７】
【０１２８】
この実施例は、カルシウム模倣化合物が回腸での放射線傷害に対する保護効果を示すことを示す。
【０１２９】
動物
実験前に、体重２２−２７グラムの雄（Ｃａｓｒ＋／＋；Ｇｃｍ２−／−）又はＣａＳＲノックアウト（Ｃａｓｒ−／−；Ｇｃｍ２−／−）マウス又は体重２２０−２７５グラムの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを自由摂餌及び摂水にした。イソフルオランの過剰量に動物を曝露し、回腸を取り出した。次に、この回腸を４ｃｍの長さの切片に切り分け、個々の絨毛を単離するために３７℃で２０分間、各切片をＥＤＴＡ（２０ｍＭ）中に入れた。この消化時間後、１００％Ｏ２を泡立てて通気したＨＥＰＥＳ−リンガー溶液中に絨毛を入れ、使用まで４℃でこの溶液中で保存した。全てのマウスは、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙで繁殖コロニーから作製した。Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを購入した。Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの標準プロトコールに従い、全ての動物を取り扱った。
【０１３０】
化学的傷害及び細胞体積変化
単離後、個々の絨毛をカバースリップ上に置き、倒立顕微鏡のステージに移し、そこで、１００％Ｏ２を泡立てて通気した３７℃ＨＥＰＥＳリンガー溶液でそれらを潅流した。５分間の平衡時間後、標準的ＨＥＰＥＳ−リンガー溶液＋５０ｍＭソルビトールに絨毛を曝露した。ソルビトールへの曝露後、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像収集プログラム及び分析ソフトウェアを用いて１５秒ごとに画像を記録した。開始時と、全部で１５分間にわたり、以降の各時間周期の間、独立観察者が絨毛直径を測定した。各動物に対してこのプロセスを繰り返し、次に統計学的分析のために数値をプールした。
【０１３１】
統計学的分析
細胞体積測定及び化学的傷害：死滅アッセイエチジウムホモ二量体（ＥｔｈＤ-１）に対して陽性の細胞染色の増加を死細胞としてプロットした。各絨毛に対するデータを記録した。次に、各絨毛から及び各動物からの全ての絨毛体積データの合計に対して数値的平均を与えた。与えられる研究に対して、動物１匹あたり５本の絨毛、各群で５匹の動物があった。
【０１３２】
結果を図７で与えるが、これは、回腸機能における放射線傷害の影響を示す。パネルＡは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、マウス回腸絨毛細胞の完全性におけるＵＶＡ及びＵＶＢ放射線の影響の合成サマリープロットである。本カルシウム模倣物は、エチジウムホモ二量体の取り込みの上昇を阻止し、これにより、細胞の健全性が向上することが示される。パネルＢは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、ＣａＳＲノックアウトマウス細胞の完全性におけるＵＶＡ及びＵＶＢ放射線の影響の合成サマリープロットである。本カルシウム模倣物は、エチジウムホモ二量体の取り込みをを阻止することにおいて影響がなく、これにより、本カルシウム模倣物の保護効果が回腸における機能的カルシウム感知受容体と関連することが示される。
【実施例８】
【０１３３】
この実施例は、カルシウム模倣化合物が結腸における化学的傷害に対して保護効果を示すことを示す。
【０１３４】
この結果は、回腸機能における化学的傷害の影響をまとめる図８で示す。まとめのグラフは、カルシウム模倣物の存在下及び非存在下での、回腸切片における５０ｍＭソルビトールからの化学的傷害の影響を示す。ソルビトールへの曝露によって、傷害により組織重量が増加する。カルシウム模倣物の存在下で、重量は変化しないが、これは、化学的傷害からの保護を示す。
【０１３５】
本願で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、各個々の刊行物又は特許出願が具体的に及び個別に参照により組み込まれることが示されるように、参照により本明細書中に組み込まれる。前述の発明は、理解を明確にするために説明及び実施例によりある程度詳細に記載したが、当業者にとって当然のことながら、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明に対してある程度の変更及び改変が行われ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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