(57)【要約】  ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する新規な酵素が、環境試料から単離される細菌株から、炭素源として１−ブタノールを含有する培地中での集積後、同定された。酵素は、ブチルアルデヒドを１−ブタノールに、イソブチルアルデヒドをイソブタノールに、ならびに２−ブタノンを２−ブタノールに変換することが可能であり、それゆえにこれらの基質を生成する組換え微生物宿主内でのブタノールの生合成にとって有用である。ｓａｄＢと称されるコード遺伝子が、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）の単離物として同定された株から単離された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示される配列を有するポリペプチドと比較した場合、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアラインメント法に基づいて少なくとも約７０％の同一性を有する少なくとも約２５０個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を含み、ここで上述の酵素はブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する、孤立核酸分子。
【請求項２】
ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする孤立核酸分子、
ｂ）次のハイブリダイゼーション条件；０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する条件下で（ａ）とハイブリダイズする、孤立核酸分子；または
（ａ）または（ｂ）に対して相補的な孤立核酸分子
からなる群から選択されるブタノールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする孤立核酸分子。
【請求項３】
配列番号１および配列番号３からなる群から選択される配列を有する請求項１または２に記載の孤立核酸分子。
【請求項４】
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項５】
適した調節配列に作動可能に連結される請求項１または２に記載の孤立核酸分子を含むキメラ遺伝子。
【請求項６】
請求項１または２に記載の核酸分子を含む形質転換宿主細胞。
【請求項７】
宿主細胞は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌および酵母からなる群から選択される、請求項６に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項８】
宿主細胞は、クロストリジウム、ザイモモナス、エシェリキア、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、乳酸桿菌、腸球菌、アルガリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ピキア、カンジダ、ハンゼヌラ、クリベロミセスおよびサッカロミセスからなる群から選択される属のメンバーである、請求項７に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項９】
２−ブタノールを生産するための方法であって、
ａ）ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする請求項１または２に記載の孤立核酸分子および２−ブタノン源を含む組換え微生物生産宿主細胞を備えるステップと、
ｂ）孤立核酸分子が発現され、かつ２−ブタノンが２−ブタノールに変換される条件下で、（ａ）の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、
ｃ）場合により、２−ブタノールを回収するステップと、
を含む、上記方法。
【請求項１０】
イソブタノールを生産するための方法であって、
ａ）ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の孤立核酸分子およびイソブチルアルデヒド源を含む組換え微生物生産宿主細胞を備えるステップと、
ｂ）孤立核酸分子が発現され、かつイソブチルアルデヒドがイソブタノールに変換される条件下で、（ａ）の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、
ｃ）場合により、イソブタノールを回収するステップと、
を含む、上記方法。
【請求項１１】
１−ブタノールを生成するための方法であって、
ａ）ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１または２に記載の孤立核酸分子およびブチルアルデヒド源を含む組換え微生物生産宿主細胞を備えるステップと、
ｂ）孤立核酸分子が発現され、かつブチルアルデヒドが１−ブタノールに変換される条件下で、（ａ）の微生物宿主細胞を増殖させるステップと、
ｃ）場合により、１−ブタノールを回収するステップと、
を含む、上記方法。
【請求項１２】
（ａ）の組換え微生物宿主細胞は、細菌、シアノバクテリア、糸状菌および酵母からなる群から選択される、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
組換え微生物宿主細胞は、クロストリジウム、ザイモモナス、エシェリキア、サルモネラ、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、乳酸桿菌、腸球菌、アルガリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ピキア、カンジダ、ハンゼヌラ、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓ）およびサッカロミセスからなる群から選択される属のメンバーである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および微生物学の分野に関する。より詳細には、この分野は、微生物におけるブタノールの生成に有用なブタノールデヒドロゲナーゼ酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック産業における化学物質原料として、さらに食品および香料産業における食品等級の抽出剤として有用な重要な産業化学物質である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段により生産され、この汎用化学製品に対する需要は高まる可能性が高い。
【０００３】
微生物は、ブタノールの生成に対する生合成経路の発現のために改変されうる。共同所有および同時係属中の特許文献１は、イソブタノール（２−メチルプロパン−１−オール）の生成のために組換え微生物を改変することについて開示する。共同所有および同時係属中の特許文献２は、１−ブタノールの生成のために組換え微生物を改変することについて開示する。共同所有および同時係属中の特許文献３および４は、２−ブタノールの生成のために組換え微生物を改変することについて開示する。イソブタノールおよび２−ブタノールの生合成のための複数の経路が記載されている。３つのすべての産物に対する記載されたすべての経路における最終ステップは、ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素による、アルコール部分に対するより酸化された部分の還元である。これらの変換を行うことが可能な公知のアルコールデヒドロゲナーゼが存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００８０１８２３０８Ａ１号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００７０２５９４１０Ａ１号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００７０２９２９２７Ａ１号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するさらなる酵素が、ブタノール生合成経路が改変された組換え宿主微生物内でのブタノールの生成にとって望ましい。出願人は、環境細菌単離物内でブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素を発見し、酵素を単離し、同定されたアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）単離物からコード核酸配列を判定することによってこの課題を解決している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する新規な酵素、およびそれをコードする単離核酸分子が本明細書中に記載される。
【０００７】
本発明は、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアラインメント法に基づくと、配列番号２で示される配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体を含む第２のヌクレオチド配列を有するポリペプチドに対して少なくとも約７０％の同一性を有する少なくとも約２５０個のアミノ酸のポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供し、ここで前記酵素はブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、
ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードする単離核酸分子；
ｂ）次のハイブリダイゼーション条件、すなわち０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の下で（ａ）とハイブリダイズし、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄される単離核酸分子；あるいは
（ａ）または（ｂ）に対して相補的な単離核酸分子
からなる群から選択されるブタノールデヒドロゲナーゼ酵素をコードする単離核酸分子を提供する。
【０００９】
さらに本発明は、記載の核酸分子によってコードされるポリペプチド、ならびに少なくとも１つの調節因子に作動可能に連結される記載の核酸分子を含むキメラ遺伝子、および記載の核酸分子を有する形質転換宿主細胞を提供する。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、２−ブタノールを生成するための方法であって、
ａ）ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明の単離核酸分子および２−ブタノンの供給源を含む組換え微生物生成宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）単離核酸分子が発現され、かつ２−ブタノンが２−ブタノールに変換される条件下で、（ａ）の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
ｃ）場合によって２−ブタノールを回収するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、イソブタノールを生成するための方法であって、
ａ）ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明の単離核酸分子およびイソブチルアルデヒドの供給源を含む組換え微生物生成宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）単離核酸分子が発現され、かつイソブチルアルデヒドがイソブタノールに変換される条件下で、（ａ）の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
ｃ）場合によってイソブタノールを回収するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、１−ブタノールを生成するための方法であって、
ａ）ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明の単離核酸分子およびブチルアルデヒドの供給源を含む組換え微生物生成宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）単離核酸分子が発現され、かつブチルアルデヒドが１−ブタノールに変換される条件下で、（ａ）の微生物宿主細胞を成長させるステップと、
ｃ）場合によって１−ブタノールを回収するステップと、
を含む、方法を提供する。
【００１３】
配列記述
本発明は、本願の一部を形成する、以下の詳細な説明、図面、および添付の配列記述からより十分に理解可能である。
【００１４】
以下の配列は、米国特許施行規則第１．８２１−１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を有する特許出願の要件−配列の規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＷＩＰＯ）基準ＳＴ．２５（１９９８年）、ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表の要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、ならびに実施細則の第２０８節および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データにおいて用いられる記号および形式は、米国特許施行規則第１．８２２条に示される規則に従う。
【００１５】
配列番号１は、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のブタノールデヒドロゲナーゼにおいて同定されたコード領域（ｓａｄＢ）である。
【００１６】
配列番号２は、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のブタノールデヒドロゲナーゼにおいて同定されたタンパク質配列である。
【００１７】
配列番号３は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためにコドン最適化されたアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼにおけるコード領域である。
【００１８】
配列番号４および５は、株ＢＵＴＣＯＮ−５  １６Ｓ  ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅のためのプライマーである。
【００１９】
配列番号６は、株ＢＵＴＣＯＮ−５における１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列である。
【００２０】
配列番号７は、Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼのＮ末端ペプチド配列である。
【００２１】
配列番号８は、変性プライマーＮ３３１である。
【００２２】
配列番号９〜２６は、Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼコード領域における配列決定プライマーである。配列番号２７および２８は、ギャップ修復クローニングのために伸長されたｓａｄＢコード領域のＰＣＲ増幅のためのプライマーである。
【００２３】
配列番号２９は、酵母ＧＰＭプロモーターである。
【００２４】
配列番号３０は、酵母ＡＤＨ１ターミネーターである。
【００２５】
配列番号３１は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ｋｉｖＤコード領域である。
【００２６】
配列番号３２および３３は、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢを確認するための配列決定プライマーである。
【００２７】
配列番号３４および３５は、ＮｈｅＩ部位付加のための部位特異的突然変異誘発プライマーである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）として同定された細菌の環境単離物から単離される新規なブタノールデヒドロゲナーゼ酵素が本明細書中に記載される。本発明では、少なくとも約７０％のアミノ酸の同一性を有し、かつブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有するこの１種以上のタンパク質のアミノ酸配列が提供される。さらに、微生物内でブタノールデヒドロゲナーゼ酵素を発現するようにキメラ遺伝子内で使用されうる、これらのタンパク質をコードする単離核酸分子が提供される。アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼ酵素、および関連配列の酵素は、これらの基質のうち１つの供給源を有する組換え微生物内で、２−ブタノンから２−ブタノール、イソブチルアルデヒドからイソブタノール、またはブチルアルデヒドから１−ブタノールを生成するため、使用することが可能である。
【００２９】
ブタノールは、種々の用途を有する重要な産業用商品の化学物質であり、その場合、燃料または燃料添加剤としてのその可能性は特に有意である。ブタノールは、４炭素アルコールにすぎなくても、ガソリンの含量に類似のエネルギー含量を有し、任意の化石燃料と混和されうる。ブタノールは、標準の内燃エンジン内で燃焼される場合にＣＯ２のみを生成し、ＳＯＸまたはＮＯＸをほとんど生成しないことから燃料または燃料添加剤として好まれる。さらにブタノールは、今日まで最も好ましい燃料添加剤であるエタノールよりも腐食性が少ない。
【００３０】
ブタノールは、生物燃料または燃料添加剤としてのその有用性に加え、新興の燃料電池産業における水素配給の問題に影響を与える可能性を有する。今日、燃料電池では水素の輸送および配給に関連した安全性の懸念が悩みの種となっている。ブタノールは、その水素含量において容易に改善可能であり、かつ、既存のガソリンスタンドによる、車両内の燃料電池または燃焼機関のいずれかで要求される純度での配給が可能である。
【００３１】
次の略語および定義は、本明細書および特許請求の範囲を解釈するために使用されることになる。
【００３２】
本明細書で使用される用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｓ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」または「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」、または任意の他のこれらの変形は、非排他的な包含（ｎｏｎ−ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）を網羅するように意図される。たとえば、要素のリストを含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されないが、明示的に列挙されないかまたはかかる組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素を含みうる。さらに、相反する明示的な記載がない限り、「または」は、「包含的なまたは（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ  ｏｒ）」を示し、「限定的なまたは（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｏｒ）」を示さない。たとえば、条件ＡまたはＢは、Ａは真であり（または存在し）かつＢは偽である（存在しない）、Ａは偽であり（存在せず）かつＢは真である（または存在する）、およびＡとＢの双方が真である（または存在する）のいずれか１つによって満足される。
【００３３】
また、本発明の要素または成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、要素または成分の事例（すなわち出現）の数について非制限的であることが意図される。したがって、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むように解釈されるべきであり、要素または成分の単数の語形はまた、数が明らかに単数であることを意味しない限り、複数を含む。
【００３４】
本明細書で用いられる「発明（ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」または「本発明（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は非限定的用語であり、特定の発明の任意の単一の実施形態を示すように意図されていないが、明細書および特許請求の範囲に記載の考えられるあらゆる実施形態を包含する。
【００３５】
用いられる本発明の成分または反応物の量を修飾する、本明細書で使用される用語「約」は、たとえば、実地での濃縮物の作製または溶液の使用に用いられる典型的な測定および液体処理方法を通じて；これらの方法における不測の誤りを通じて；組成物を作製するかまたはこれらの方法を実施するために使用される成分の製造、供給源、または純度における差異を通じて生じうる数量における変動を示す。用語「約」はまた、特定の初期混合物から生じる組成物に対する、異なる平衡条件によって異なる量を包含する。用語「約」によって修飾されるか否かに無関係に、特許請求の範囲は、量に対する等価物を含む。一実施形態では、用語「約」は、報告される数値の１０％以内、好ましくは報告される数値の５％以内を意味する。
【００３６】
用語「ブタノール」は、本明細書で使用される場合、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブタノール、またはこれらの混合物を示す。
【００３７】
用語「ブタノール生合成経路」は、１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールを精製するための酵素経路を示す。
【００３８】
用語「１−ブタノール生合成経路」は、アセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）から１−ブタノールを生成するための酵素経路を示す。
【００３９】
用語「２−ブタノール生合成経路」は、ピルビン酸塩から２−ブタノールを生成するための酵素経路を示す。
【００４０】
用語「イソブタノール生合成経路」は、ピルビン酸塩からイソブタノールを生成するための酵素経路を示す。
【００４１】
「通性嫌気性生物」という用語は、好気性および嫌気性環境の双方で成長しうる微生物を示す。
【００４２】
「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝可能な炭素源ならびに特に単糖、オリゴ糖、多糖、およびそれらの１炭素基質または混合物からなる群から選択される炭素源を示す。
【００４３】
「遺伝子」という用語は、場合によりコード配列の上流（５’非コード配列）および下流（３’非コード配列）の調節配列を含む、特定のタンパク質として発現可能な核酸断片を示す。「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子でない任意の遺伝子を示し、天然に見出されることのない調節およびコード配列を含む。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列または同じ供給源に由来する調節配列およびコード配列を含みうるが、天然に見出されるものとは異なる様式で配列されている。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内のその天然の位置における天然遺伝子を示す。「外来」または「異種」遺伝子は、通常は宿主生物内に見出されることはないが宿主生物に遺伝子導入によって導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然の生物に導入される天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含みうる。「トランス遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入されている遺伝子である。
【００４４】
本明細書で用いられる「単離核酸断片」または「単離核酸分子」は同義に用いられ、かつ一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡの高分子を意味し、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を有することになる。ＤＮＡの高分子の形態の単離核酸断片については、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡのうちの１つもしくは複数のセグメントから構成されうる。
【００４５】
核酸断片については、ある一本鎖形態の核酸断片が温度および溶液のイオン強度の適切な条件下で他方の核酸断片にアニール可能である場合、別の核酸断片、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子に対して「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件については周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）、特に第１１章およびその中の表１１．１（全体として参照により本明細書中に援用される）に例示されている。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似の断片（遠縁の生物由来の相同配列など）から高度に類似の断片（近縁の生物由来の機能酵素を複製する遺伝子など）にかけてスクリーニングするように調整されうる。ハイブリダイゼーション後の洗浄がストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件のセットでは、室温で１５分間の６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳの場合から開始し、次いで４５℃で３０分間の２×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳの場合を繰り返し、次いで５０℃で３０分間の０．２×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳの場合を２回繰り返すという一連の洗浄が用いられる。より好ましいストリンジェントな条件のセットではより高温が用いられ、ここでの洗浄は終わりの２回の０．２×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳにおける３０分の洗浄で温度が６０℃に高められた点を除いて上記の洗浄と同一である。別の好ましい高度にストリンジェントな条件のセットでは、６５℃での０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳにおける２回の最終の洗浄が用いられる。さらなるストリンジェントな条件のセットでは、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーションおよび２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳとそれに続く０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの場合での洗浄が含まれる。
【００４６】
ハイブリダイゼーションでは、塩基間の不一致がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによりありうるとしても２つの核酸が相補配列を有することが必要である。核酸をハイブリダイズするのに適するストリンジェンシーは、当該技術分野での周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存している。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きくなると、それらの配列を有する核酸のハイブリッドにおけるＴｍの値が増加する。核酸ハイブリダイゼーションの（より高いＴｍに対応する）相対的安定性は、以下の順、すなわちＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡで低下する。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドにおいては、Ｔｍを計算するための方程式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、９．５０〜９．５１を参照）。より短い核酸すなわちオリゴヌクレオチドの場合のハイブリダイゼーションにおいては、不一致の位置がより重要になり、オリゴヌクレオチド長がその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、１１．７〜１１．８を参照）。一実施形態では、ハイブリダイズ可能な核酸における長さは少なくとも約１０ヌクレオチド長である。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸における最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチド長、および最も好ましくは長さは少なくとも約３０ヌクレオチド長である。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液の塩濃度がプローブ長などの要素による必要性に応じて調整可能であることを理解するであろう。
【００４７】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係性を記述するのに用いられる。例えばＤＮＡに関しては、アデノシンがチミンに対して相補的でありかつシトシンがグアニンに対して相補的である。
【００４８】
当該技術分野で既知のように、「同一性（％）」という用語は、配列の比較による判定からの、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係性である。当該技術分野では、「同一性」は、場合によっては、かかる配列の文字列の間の一致による判定からの、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列の関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、限定はされないが、１．）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ  Ａ．Ｍ．編）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８年）；２．）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ  Ｄ．Ｗ．編）  Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３年）；３．）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ  Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ  Ｈ．Ｇ．編）  Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４年）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ  Ｇ．編）  Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７年）；ならびに５．）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ．編）  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１年）に記載の方法を含む既知の方法により容易に計算されうる。
【００４９】
同一性を判定するための好ましい方法が試験される配列間に最適な一致を与えるように設計される。同一性および類似性を判定するため方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラム内にコード化される。配列アラインメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて行われうる。配列の複数のアラインメントが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖと称されるアラインメント法に対応する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」を含む数種類のアルゴリズムを包含する「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法」を用いて行われ（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、８：１８９−１９１頁（１９９２年）で記載）、かつＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）において見出される。複数のアラインメントにおいては、デフォルト値はギャップペナルティ＝１０およびギャップ長ペナルティ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いる、タンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性パーセントの計算におけるデフォルトパラメータが、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ギャップペナルティ＝３、ウインドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズセイブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ）＝５である。核酸においては、これらのパラメータはＫＴＵＰＬＥ＝２、ギャップペナルティ＝５、ウインドウ＝４およびダイアゴナルズセイブド＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを用いての配列のアラインメント後、同じプログラム内の「配列距離（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｉｓｔａｎｃｅｓ）」表を見ることにより「同一性パーセント」を得ることが可能である。さらに、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗのアラインメント法」が利用可能あり、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗと称されるアラインメント法に対応し（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１頁（１９９２年）で記載）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）において見出される。複数のアラインメントにおけるデフォルトパラメータ（ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、ディレイ・ディバージェン配列（Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ）（％）＝３０、ＤＮＡトランジション・ウェイト（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５、タンパク質重み行列（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ）＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ（Ｓｅｒｉｅｓ）、ＤＮＡ重み行列（Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ）＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いての配列のアラインメント後、同じプログラム内の「配列距離」表を見ることにより「同一性パーセン���」を得ることが可能である。
【００５０】
配列同一性の多数のレベルが、同一または類似の機能または活性を有するポリペプチドを他の種から同定するのに有用であることが当業者により十分に理解されている。パーセント同一性の有用な例として、限定はされないが、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％があげられるか、または７０％〜１００％の任意の整数の百分率、たとえば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％は、本発明の記載において有用でありうる。好適な核酸断片は、上記の同一性を有するポリペプチドをコードし、典型的には、少なくとも約２５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも３００個のアミノ酸、および最も好ましくは少なくとも約３４８個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００５１】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析にとって有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを示す。「配列分析ソフトウェア」は商業的に利用可能であるかまたは個別に開発される場合がある。典型的な配列分析ソフトウェアは、限定はされないが、１．）プログラムのＧＣＧスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅバージョン９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０頁（１９９０年））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；４．）Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）；および５．）Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、会合日１９９２年、１１１−２０頁．Ｓｕｈａｉ編、Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を組み入れたＦＡＳＴＡプログラムを含むことになる。本願における文脈の中で、配列分析ソフトウェアが分析に用いられる場合、分析の結果が、他に規定がない限り、参照されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されるであろう。本明細書で用いられる「デフォルト値」は、最初に初期化される際に最初にソフトウェアが読み込む任意の値またはパラメータのセットを意味することになる。
【００５２】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「大部分」は、ポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を、当業者による配列の人手による評価、またはＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ら、、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを使用するコンピュータで自動化された配列比較および同定のいずれかにより、ポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定する程度に十分に含む部分である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列を公知のタンパク質または遺伝子に対して相同なものとして推定的に同定するため、１０個以上の隣接アミノ酸または３０個以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、２０〜３０個の隣接ヌクレオチドを含む遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、遺伝子同定（たとえば、サザンハイブリダイゼーション）および単離（たとえば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチュハイブリダイゼーション）の配列に依存した方法において使用することが可能である。さらに、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドは、プライマーを含む特定の核酸断片を得るため、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして使用することが可能である。したがって、ヌクレオチド配列の「大部分」は、配列を、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離する程度に十分に含む。本明細書は、特定のアルコールデヒドロゲナーゼタンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列について教示する。本明細書で報告されるような配列の利点を有する当業者は、当業者に公知の目的のため、開示される配列のすべてまたは大部分をここで使用することができる。したがって、本発明は、添付の配列表において報告されるような完全な配列、ならびに上で定義されるような配列の大部分を含む。
【００５３】
アミノ酸配列内またはコード領域内での改変（ここでは化学的に等価なアミノ酸が所与の部位で置換されても、コードタンパク質の機能的特性に影響を与えない）が一般に認められることは当該技術分野で周知であることから、本発明は、特定の例示的な配列以上のものを包含する。本発明の目的においては、置換は、次の５つの群、すなわち、
１．小さい脂肪族、非極性またはわずかに極性のある残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）；
２．極性のある負に帯電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
３．極性のある正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
４．大きい脂肪族、非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）；および５．大きい芳香族性残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
のうち１つの範囲内での交換として定義される。
【００５４】
したがって、アミノ酸のアラニン、疎水性アミノ酸におけるコドンは、別のより疎水性の低い残基（グリシンなど）またはより疎水性の高い残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換されうる。同様に、ある負に帯電した残基と別の残基（アスパラギン酸とグルタミン酸など）またはある正に帯電した残基と別の残基（リジンとアルギニンなど）の置換をもたらす変化はまた、機能的に等価な産物を生成することが想定されうる。多くの場合、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分の改変をもたらすヌクレオチド変化であれば、タンパク質の活性を改変することも想定されないことになる。したがって、記載されるコドン変化を伴うコード領域、および記載されるアミノ酸変化を伴うタンパク質は、本発明に包含される。
【００５５】
本明細書で用いられる「コード配列」または「ＣＤＳ」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「適切な調節配列」は、上流（５’非コード配列）またはコード配列の下流（３’非コード配列）内に位置するヌクレオチド配列を示し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡのプロセシングまたは安定性あるいは翻訳に作用する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含みうる。
【００５６】
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御可能なＤＮＡ配列を示す。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、その全体として天然遺伝子に由来するか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されるか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含む場合がある。異なるプロモーターが異なる組織または細胞種における、あるいは発生の異なる段階で、あるいは異なる環境または生理的状態に応答して遺伝子の発現を誘導可能であることが当業者により理解されている。遺伝子における大部分の細胞種内でほぼ常に発現を誘導するプロモーターが一般に「構成プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に規定されていないことから、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有しうると理解されている。
【００５７】
「作動可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響を受けるような核酸配列の単一の核酸断片上への結合を示す。例えば、プロモーターが、そのコード配列の発現に効果を及ぼすことが可能である（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、コード配列に作動可能に連結されている。コード配列は調節配列にセンスまたはアンチセンス方向に作動可能に連結されうる。
【００５８】
本明細書で用いられる「発現」という用語は、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を示す。発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も示しうる。
【００５９】
本明細書で用いられる「形質転換」という用語は、核酸断片の宿主生物への転移を示し、遺伝的に安定な遺伝的形質をもたらす。形質転換された核酸断片を有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換された」生物と称される。
【００６０】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中央代謝の一部でない、遺伝子を保有することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である余分な染色体要素を示す。かかる要素は、任意の供給源に由来する線状または環状の一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡにおける自己複製配列、ゲノム結合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）配列、ファージまたはヌクレオチド配列である場合があり、ここでは多数のヌクレオチド配列が適切な３’未翻訳配列を有する選択された遺伝子産物におけるプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入可能な固有の作成物に連結されるかまたは組換えられている。「形質転換ベクター」は、外来遺伝子を有し、かつ特定の宿主細胞の形質転換を促進する、外来遺伝子に加わる要素を有する特定のベクターを示す。
【００６１】
本明細書で用いられる「コドン縮重」という用語は、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に作用することなくヌクレオチド配列の変異を可能にする遺伝子コードにおける性質を示す。当業者は、所定のアミノ酸を特定するための、ヌクレオチドコドンの使用時に特定の宿主細胞により示される「コドンバイアス」について十分に理解している。したがって、宿主細胞内での改善された発現のために遺伝子を合成する場合、遺伝子をそのコドン使用の頻度が宿主細胞での好ましいコドンの使用の頻度に近づくように設計することが望ましい。
【００６２】
「コドンが最適化された」という用語は、様々な宿主の形質転換における核酸分子の遺伝子またはコード領域を示すとき、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドンの使用を反映するための核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を示す。
【００６３】
ここで用いられる標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（以後Ｍａｎｉａｔｉｓ）；Ｓｉｌｈａｖｙ  Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ  Ｍ．Ｌ．、およびＥｎｑｕｉｓｔ  Ｌ．Ｗ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行（１９８７年）に記載されている。ここで用いられるさらなる方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １９４，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ、２００４年、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  ＧｕｔｈｒｉｅおよびＧｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ））に記載されている。
【００６４】
アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼ活性
１−ブタノールを含有する培地上での連続培養による環境汚泥試料の集積を通じ、出願人は、１−ブタノールを単一の炭素源として使用する能力がある微生物を単離することができた。１つの単離物が、細菌種アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に属するものとして、その１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列によって同定された。出願人は、この単離物中に、ブチルアルデヒドと１−ブタノールを相互変換するブタノールデヒドロゲナーゼ酵素活性を見出した。出願人はまた、このブタノールデヒドロゲナーゼ酵素活性がまた、イソブチルアルデヒドとイソブタノールの相互変換、ならびに２−ブタノンと２−ブタノールの相互変換を触媒することを見出した。意外なことに、この酵素は、集積培地中で使用される１−ブタノール基質の場合に匹敵するかまたはより優れた代替基質における動的定数を有した。これらの結果は、このアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼが、１−ブタノール、イソブタノール、または２−ブタノールを、それぞれブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒドまたは２−ブタノン基質の供給源を有する組換え微生物宿主細胞内で生成するために使用可能であることを示した。
【００６５】
ブタノールデヒドロゲナーゼタンパク質およびコード配列
ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）内で同定されたヌクレオチド配列（ｓａｄＢと称す）は、配列番号１として与えられる。完全タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２として与えられる。このアミノ酸配列と公的データベース内の配列との比較によると、このタンパク質が公知のアルコールデヒドロゲナーゼに対して驚異的に低い類似性を有することが示された。最も類似した公知の配列は、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、１０の期待値カットオフおよびワードサイズ３を伴うＢＬＡＳＴを使用し、配列番号２のアミノ酸配列に対してその３４８個のアミノ酸長にわたって６７％同一であった。１１のギャップオープニングペナルティおよび１のギャップエクステンションが使用された。見出された最高の類似性は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８のＺｎ含有アルコールデヒドロゲナーゼ（登録番号ＡＡＦ４１７５９．１）に対する６７％のアミノ酸の同一性およびマイコプラズマ・ガラクチアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）のＺｎ含有アルコールデヒドロゲナーゼ（登録番号Ａ５ＩＹ６３）に対する６７％のアミノ酸の同一性であった。本明細書で同定され、単離される、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼ（配列番号２）の配列に対して６７％超の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質は、本発明のタンパク質である。本発明のタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも約７０％〜７５％、約７５％〜８０％、約８０％〜８５％、もしくは約８５％〜９０％同一なアミノ酸配列を有し、ここでは約９０％〜９５％がより好ましい。配列番号２に対して少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列が最も好ましい。
【００６６】
アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼをコードする核酸配列（配列番号１）は、デフォルトパラメータを伴うＢＬＡＳＴを用い、公開配列（ｐｕｂｌｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）と比較し、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８のＺｎ含有アルコールデヒドロゲナーゼ（登録番号ＮＣ００３１１２）をコードする配列に対して約６５％の最高の同一性を有する。本発明の核酸分子は、配列番号２に対して少なくとも約７０％の同一性を有し、ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する、少なくとも約２５０個のアミノ酸のポリペプチドをコードするものである。核酸分子は、少なくとも約３００個のアミノ酸、または約３４８個のアミノ酸のポリペプチドをコードしうる。核酸分子は、配列番号２に対して少なくとも約７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、もしくは９５％〜１００％の同一性を有するポリペプチドをコードしうる。
【００６７】
本発明のさらなる核酸分子は、配列番号２のブタノールデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子に対する、次の条件、すなわち０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃の下でのハイブリダイゼーションによって同定し、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄することが可能である。本発明の態様では、上記の核酸分子のいずれかに対して相補的な核酸分子がさらに含められる。配列番号２のポリペプチドをコードする核酸分子は最も好適であり、その例が配列番号１および３である。当業者に周知のように、遺伝子コードの縮重により、複数の核酸配列が、配列番号２のポリペプチドをコードしうる。たとえば、コード配列は、特定の宿主内で最大の発現のためにコドン最適化され、たとえば、配列番号３である配列は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内で発現のためにコドン最適化されうる。
【００６８】
相同体の単離
アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子、たとえば配列番号１を使用し、この核酸断片に対して少なくとも７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、もしくは９５％〜１００％の配列同一性を有する、相同タンパク質をコードする核酸分子を、同じまたは他の微生物種から単離することが可能である。コード相同タンパク質は、下記のように、ブタノールデヒドロゲナーゼ活性について評価することが可能である。配列依存性プロトコルを用いる相同体の単離は、当該技術分野で周知である。配列依存性プロトコルの例は、限定はされないが、核酸ハイブリダイゼーションの方法、ならびに、核酸増幅技術（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ  Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、１０７４（１９８５年）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：３９２頁（１９９２年））のさまざまな使用によって例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法を含む。
【００６９】
たとえば、本発明の核酸断片は、当業者に周知の方法を用い、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１の核酸断片の全部または一部を使用し、任意の所望される細菌からライブラリをスクリーニングすることによって直接単離することが可能である。配列番号１に基づく特異的なオリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野で公知の方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ、上記）によって設計し、合成することが可能である。さらに、配列を直接使用し、ＤＮＡプローブを、ランダムプライマーＤＮＡラベリング、ニックトランスレーション、または末端標識技術などの当業者に公知の方法により、またはＲＮＡプローブを、利用可能なインビトロ転写系を使用し、合成することが可能である。さらに、特異的なプライマーを設計し、使用し、配列番号１の相同体の一部または完全長を増幅することが可能である。得られる増幅産物は、増幅反応の間に直接標識するかまたは増幅反応後に標識し、プローブとして使用し、完全長ＤＮＡ断片を好適なストリンジェントな条件下で単離することが可能である。
【００７０】
典型的には、ＰＣＲタイプ増幅技術においては、プライマーは、異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望される試験条件に依存し、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するように設計される必要がある。ＰＣＲプライマー設計の方法は、一般的であり、当該技術分野で周知である（ＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ、“Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ”，ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編（１９８６年）、３３−５０頁、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ））；Ｒｙｃｈｌｉｋ  Ｗ．（１９９３年）、Ｉｎ  Ｗｈｉｔｅ  Ｂ．Ａ．（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１５巻、３１−３９頁、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｈｕｍａｎｉａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ））。
【００７１】
一般に、本核酸配列の２つの短いセグメントを使用し、ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおける使用を意図したプライマーを設計し、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同コード領域をコードするより長い核酸断片を増幅することが可能である。ＰＣＲは、鋳型として配列番号１に相同な核酸配列を有する任意のＤＮＡ、たとえば鋳型としてゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを使用して実施してもよい。クローン化ｃＤＮＡのライブラリを使用する場合、一方のプライマーの配列は配列番号１に由来し、他方のプライマーの配列は微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端でのポリアデニル酸トラクト（ｔｒａｃｔｓ）の存在を利用する。あるいは、第２のプライマー配列は、クローン化ベクターに由来する配列に基づく場合がある。たとえば、当業者は、鋳型としてｍＲＮＡを使用するＲＡＣＥプロトコルに従い（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８９９８頁（１９８８年））、ＰＣＲを用いてｃＤＮＡを生成し、転写産物における単一点（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｉｎｔ）と３’または５’末端の間の領域のコピーを増幅することができる。３’および５’方向に方向づけられるプライマーは、本核酸配列から設計することが可能である。市販の３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））を使用し、特異的な３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離することが可能である（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５６７３頁（１９８９年）；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７頁（１９８９年））。
【００７２】
あるいは、配列番号１の核酸分子またはその相補体は、相同体の同定用のハイブリダイゼーション試薬として使用してもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的要素は、プローブ、目的の遺伝子または遺伝子断片を含有すると思われる試料、および特異的ハイブリダイゼーション法を含む。本発明のプローブは、典型的には、検出されるべき核酸配列に対して相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出されるべき核酸配列に対して「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は、５塩基から数万塩基まで可変であり、実施されるべき特定の試験に依存することになる。典型的には、約１５塩基〜約３０塩基のプローブ長が好適である。検出されるべき核酸配列に対して相補的である必要があるプローブ分子はほんの一部に限られる。さらに、プローブと標的配列の間の相補性は完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは、相補性が不完全な分子間では生じず、その結果として、ハイブリダイズされる領域内の塩基の特定の画分は適切な相補的塩基と対合しない。
【００７３】
ハイブリダイゼーション方法は十分に確立されている。典型的には、プローブおよび試料は、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなければならない。これは、適切な濃度および温度条件下、無機または有機塩の存在下で、プローブと試料を接触させることを含む。プローブと試料核酸は、プローブと試料核酸の間の任意の可能なハイブリダイゼーションが生じうるような十分に長い期間接触状態でなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度によって、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間が決まることになる。プローブまたは標的濃度が高まると、必要とされるハイブリダイゼーションのインキュベーション時間が短くなる。場合によって、カオトロピック剤を加えてもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することにより、核酸を安定化する。さらに、カオトロピック剤は、室温での短いオリゴヌクレオチドプローブの高感度かつストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（Ｖａｎ  ＮｅｓｓおよびＣｈｅｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５１４３−５１５１頁（１９９１年））。好適なカオトロピック剤は、特に、塩化グアニジン、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、およびトリフルオロ酢酸セシウムを含む。典型的には、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在することになる。必要に応じて、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを、典型的には３０〜５０％（ｖ／ｖ）加えてもよい。
【００７４】
さまざまなハイブリダイゼーション溶液を使用してもよい。典型的には、これらは、約２０〜６０％容量、好ましくは３０％の極性有機溶媒を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液では、約３０〜５０％  ｖ／ｖのホルムアミド、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液、たとえばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（約６〜９のｐＨ範囲）、約０．０５〜０．２％の洗剤、たとえばドデシル硫酸ナトリウム、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ＦＩＣＯＬＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）（約３００〜５００キロダルトン（ｋＤ））、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋＤ）、および血清アルブミンが使用される。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液中に、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識キャリア核酸、断片化核ＤＮＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ＤＮＡ）、たとえば仔ウシ胸腺またはサケ精液ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ、および場合によって約０．５〜２％  ｗｔ．／ｖｏｌ．のグリシンが含まれることになる。また、他の添加剤、たとえば体積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）を含めてもよく、それは、種々の極性水溶性剤または膨潤剤（ｓｗｅｌｌａｂｌｅ  ａｇｅｎｔ）、たとえばポリエチレングリコール、ポリアクリル酸塩またはポリアクリル酸メチルなどのアニオンポリマー、およびアニオンサッカライドポリマー（ａｎｉｏｎｉｃ  ｓａｃｃｈａｒｉｄｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ）、たとえば硫酸デキストランを含む。
【００７５】
核酸ハイブリダイゼーションは、種々のアッセイフォーマットに適合可能である。最も好適なものの１つが、サンドイッチアッセイフォーマットである。サンドイッチアッセイは、特に、非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合可能である。サンドイッチ型アッセイの主要素が固体支持体である。固体支持体は、それに吸着しているか、またはそれに未標識でかつ配列の一部に相補的である固定化核酸プローブを共有結合させている。
【００７６】
さらに、微生物ゲノムの配列が急速に公的に入手可能になりつつあることから、相同体は、当業者に周知であるバイオインフォマティクスアプローチのみを用いて同定することが可能である。
【００７７】
ブタノールデヒドロゲナーゼ活性
本発明のタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも約７０％以上のアミノ酸同一性を有し、かつブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する。本発明の核酸分子は、ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を有する配列番号２に対して少なくとも約７０％以上のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする。当業者は、タンパク質におけるブタノールデヒドロゲナーゼ活性を容易に評価することができる。タンパク質は、下記のように微生物細胞内で発現され、細胞抽出物、粗酵素調製物、または精製酵素調製物中でのブタノールデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイされる。たとえば、精製酵素および粗酵素調製物のアッセイは、本明細書中、実施例１で説明される。１−ブタノールデヒドロゲナーゼ活性についてのアッセイでは、５０ｍＭのブチルアルデヒドおよび０．２ｍＭのＮＡＤＨを含有する５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２、３５℃）中の酵素を適量で使用し、ＮＡＤＨからＮＡＤ＋への酸化が３４０ｎｍで分光測定的にモニタリングされる。アルコール基質を用いる代替アッセイが、３ｍＭのＮＡＤ＋およびさまざまな濃度のアルコールを含有するトリス緩衝液（ｐＨ８．５）において３５℃で実施されるか、あるいはケトンまたはアルデヒド基質を用いる場合は、２００μＭのＮＡＤＨおよびさまざまな濃度のケトンまたはアルデヒドを含有する５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）において３５℃で実施される。これらまたは他の容易に実施可能なアッセイによると、ブタノールデヒドロゲナーゼの機能は、単離核酸分子によってコードされる同定されたタンパク質の構造に関連性がある（そのいずれもが同定された配列を有する）。
【００７８】
組換え発現
本発明の核酸断片は、微生物宿主細胞、たとえば細菌、シアノバクテリア、糸状真菌および酵母において発現され、コードされたブタノールデヒドロゲナーゼの発現がもたらされうる。宿主株の例として、限定はされないが、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、アルガリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およびサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）があげられる。
【００７９】
外来タンパク質の高レベル発現を誘導する調節配列を有する微生物発現系および発現ベクターは、当業者に周知である。これらのいずれかを使用し、本発明の核酸分子によってコードされるタンパク質を生成するためのキメラ遺伝子を作成することが可能である。次いで、これらのキメラ遺伝子を、形質転換を介して好適な微生物に導入し、酵素の高レベル発現を提供することが可能である。
【００８０】
種々の宿主細胞の形質転換にとって有用なベクターについては一般的であり、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）などの企業から市販されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクターは、酵母発現のためのキメラ遺伝子のクローニングにとって有用である。典型的には、ベクターは、選択可能マーカーおよび所望の宿主内での自己複製または染色体組込みを可能にする配列を有する。さらに、適切なベクターは転写開始制御を内在するプロモーター領域および転写終結制御領域を含み、それらの間にコード領域のＤＮＡ断片が挿入されることで挿入されたコード領域の発現がもたらされうる。両方の制御領域は形質転換された宿主細胞に対して相同な遺伝子から誘導されうるが、かかる制御領域が生成宿主として選択される特定の種に対して天然でない遺伝子からも誘導されることが理解されるべきである。
【００８１】
所望される宿主細胞内での本ブタノールデヒドロゲナーゼコード領域の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは極めて多く、当業者に周知である。好適なプロモーターは、限定はされないが、次の遺伝子に由来するプロモーター、すなわち、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ、ＣＵＰ１、ＦＢＡ、ＧＰＤ、およびＧＰＭ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現にとって有用）；ＡＯＸ１（ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現にとって有用）；ならびに、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃプロモーター（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アルガリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）における発現にとって有用）；枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）における発現にとって有用なａｍｙ、ａｐｒ、およびｎｐｒプロモーター、ならびにさまざまなファージプロモーター；ｎｉｓＡ（グラム陽性細菌における発現にとって有用、Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（８）：２７６３−２７６９頁（１９９８年））；ならびに合成Ｐ１１プロモーター（ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現にとって有用（Ｒｕｄら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５２：１０１１−１０１９頁（２００６年）））を含む。
【００８２】
終結制御領域についても好ましい宿主に対して天然の様々な遺伝子から誘導されうる。場合により終結部位は不要でありうるが、含められる場合が最も好ましい。
【００８３】
特定のベクターが広範囲の宿主細菌内で複製可能であり、かつ複合により導入可能である。ｐＲＫ４０４および３つの関連ベクター：ｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、およびｐＲＫ４４２（Ｈ）の完全でかつアノテートされた配列が利用可能である。これらの誘導体はグラム陰性菌における遺伝子操作にとって有用なツールであることが判明している（スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら、Ｐｌａｓｍｉｄ  ５０（１）：７４−７９頁（２００３年））。広範な宿主範囲のＩｎｃ  Ｐ４プラスミドＲＳＦ１０１０における数種のプラスミド誘導体についても、グラム陰性菌の範囲内で機能しうるプロモーターとともに利用可能である。プラスミドｐＡＹＣ３６およびｐＡＹＣ３７が複数のクローニング部位とともに活性プロモーターを有し、グラム陰性菌内での異種の遺伝子発現が可能である。
【００８４】
グラム陽性細菌に適したベクターのいくつかの例として、ｐＡＭβ１およびその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔら、Ｇｅｎｅ  １８３：１７５−１８２頁（１９９６年）；およびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｇｅｎｅ  １３７：２２７−２３１頁（１９９３年））；ｐＭＢＢ１およびｐＨＷ８００、ｐＭＢＢ１の誘導体（Ｗｙｃｋｏｆｆら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１４８１−１４８６頁（１９９６年））；接合プラスミドｐＭＧ１（Ｔａｎｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５８００−５８０４頁（２００２年））；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：４５８１−４５８４頁（１９９７年））；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：１２６２−１２６７頁（２００１年））；およびｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３８：１８９９−１９０３頁（１９９４年））があげられる。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のいくつかのプラスミドもまた報告されている（ｖａｎ  Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１（３）：１２２３−１２３０頁（２００５年））。
【００８５】
酵母内での遺伝子発現のための方法は、当該技術分野で公知である（たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１９４巻、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ  Ａ、２００４年、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  ＧｕｔｈｒｉｅおよびＧｅｒａｌｄ  Ｒ．Ｆｉｎｋ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を参照）。酵母内で典型的に使用されるプラスミドは、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、およびｐＲＳ４２６であり（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））、それらは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点（たとえばｐＭＢ１）、酵母２μ複製起点、および栄養選択のためのマーカーを有する。これら４つのベクターにおける選択マーカーは、Ｈｉｓ３（ベクターｐＲＳ４２３）、Ｔｒｐ１（ベクターｐＲＳ４２４）、Ｌｅｕ２（ベクターｐＲＳ４２５）およびＵｒａ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。本発明のブタノールデヒドロゲナーゼをコードするキメラ遺伝子を有する発現ベクターの作成は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における標準の分子クローニング技術または酵母におけるギャップ修復組換え法（ｇａｐ  ｒｅｐａｉｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）のいずれかによって行うことが可能である。これらのベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および酵母株の双方において株の増殖を可能にする。
【００８６】
本発明のキメラ遺伝子は、安定な複製プラスミドから発現させるか、または宿主ゲノムに組み込んでもよい。ＤＮＡ組み込み用プラスミドは、トランスポゾン、宿主ゲノムにおける組み込み標的位置に対して相同な核酸配列の領域、または組み込みを支持する他の配列を含みうる。ベクターのさらなるタイプは、たとえばＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）から市販されている系を使用して生成されるトランスポゾンでありうる。所望される標的宿主および所望される機能に適したベクターの選択の仕方は周知である。さらに、本発明のブタノールデヒドロゲナーゼをコードする核酸分子は、宿主ゲノムにおいて、内因性プロモーターに隣接して、作動可能に連結される様式で組み込まれうる。
【００８７】
ブタノール微生物生成宿主
本発明の単離核酸分子の発現は、標的の形質転換された組換え微生物宿主細胞に、ブタノールデヒドロゲナーゼ活性を提供し、ここでブタノールは、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、または２−ブタノンの存在下で生成される。これらの各基質は、宿主細胞内で天然に生成されうるか、または宿主細胞内で改変された生合成経路の産物として生成されうる。イソブタノール、２−ブタノール、または１−ブタノールの生成を目的とした、微生物において改変されうる生合成経路は、米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７０２５９４１０Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２００７０２９２９２７Ａ１号明細書、および米国特許出願公開第２００８０１８２３０８Ａ１号明細書（これらはすべて、参照により本明細書中に援用される）に記載されている。記載された各経路における最終ステップを排除すると、産物は、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、または２−ブタノンである。したがって、最終ステップが欠如したこれらの記載された経路のうち１つが改変された組換え微生物宿主細胞は、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、または２−ブタノンの供給源を有する。本発明の単離核酸分子の細胞内でのさらなる発現が、ブチルアルデヒドを１−ブタノール、イソブチルアルデヒドをイソブタノール、または２−ブタノンを２−ブタノールに変換するためのブタノールデヒドロゲナーゼ活性の存在をもたらす。
【００８８】
ブタノール生成のための成長
本発明の単離核酸分子を含み、かつブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、または２−ブタノンを有する組換え微生物生成宿主が、好適な炭素基質を含有する発酵培地中で成長する。適切な基質が、限定はされないが、グルコースおよびフルクトースなどの単糖、乳糖またはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンまたはセルロースなどの多糖、あるいはそれらの混合物、ならびに乳清透過液、コーンスティープリカー（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ  ｌｉｑｕｏｒ）、砂糖液（ｓｕｇａｒ  ｂｅｅｔ  ｍｏｌａｓｓｅｓ）、および大麦モルト（ｂａｒｌｅｙ  ｍａｌｔ）などの再生可能な原料由来の未精製混合物を含みうる。さらに、炭素基質はまた二酸化炭素または主要な生化学的中間体への代謝変換が実証されているメタノールなどの１炭素基質でありうる。メチロトローフ（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ）生物が、メチルアミン、グルコサミンおよび代謝活性における種々のアミノ酸などの化合物を含有する他の多数の炭素を用いることでも知られている。例えば、メチロトローフ酵母がメチルアミン由来の炭素を用いてトレハロースまたはグリセロールを形成することで知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎら、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃ１  Ｃｏｍｐｄ．、［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］、７ｔｈ（１９９３年）、４１５−３２頁、Ｍｕｒｒｅｌｌ  Ｊ．Ｃｏｌｌｉｎ；Ｋｅｌｌｙ，Ｄｏｎ  Ｐ．編、Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ発行）。同様に、カンジダの様々な種がアラニンまたはオレイン酸を代謝することになる（Ｓｕｌｔｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １５３：４８５−４８９頁（１９９０年））。それ故、本発明で用いられる炭素源が基質を有する多種多様な炭素を包含する場合があり、生物の選択によってのみ限定されうると考えられる。
【００８９】
上記の炭素基質およびその混合物のすべてが本発明において好適であると考えられるが、好ましい炭素基質は、グルコース、フルクトース、およびスクロースである。スクロースは、サトウキビ、サトウダイコン、キャッサバ、サトウモロコシ、およびこれらの混合物などの再生可能な糖供給源に由来しうる。グルコースおよびデキストロースは、トウモロコシ、小麦、ライ麦、大麦、オート麦、およびこれらの混合物などの穀物を含むデンプンに基づく供給原料の糖化を通じて、再生可能な穀物供給源に由来しうる。さらに、発酵性糖は、たとえば共同所有および同時係属中の米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書（参照によって本明細書中に援用される）中に記載のように、前処理および糖化のプロセスを通じて、再生可能なセルロース系またはリグノセルロース系バイオマスに由来しうる。バイオマスは、任意のセルロース系またはリグノセルロース系の原料を示し、セルロースを含有し、かつ場合により、ヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖および／または単糖をさらに含有する原料を含む。バイオマスは、追加成分、例えばタンパク質および／または脂質も含有しうる。バイオマスは単一の供給源から誘導されうるか、またはバイオマスは２つ以上の供給源から誘導される混合物を含有しうる。バイオマスは、例えばトウモロコシ穂軸（ｃｏｒｎ  ｃｏｂ）およびコーンストーバーの混合物または草および葉の混合物を含有しうる。バイオマスは、限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、地方自治体の固体廃棄物、産業固体廃棄物、製紙から排出される汚泥、庭ごみ、廃材および林業廃棄物を含む。バイオマスの例として、限定はされないが、トウモロコシ粒、トウモロコシ穂軸、トウモロコシの皮などのトウモロコシ残渣、コーンストーバー、草、小麦、麦かん（ｗｈｅａｔ  ｓｔｒａｗ）、大麦、麦かん（ｂａｒｌｅｙ  ｓｔｒａｗ）、干し草、稲わら、スイッチグラス、紙くず、サトウキビバガス、サトウモロコシ、大豆、穀物、木、枝、根、葉、木片、おがくず、シュラブおよびブッシュのミリングから得られる成分、野菜、果物、花、家畜糞尿ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【００９０】
発酵培地は、適切な炭素源に加え、２−ブタノンの生成に必要な培養物の成長および酵素経路の促進に適する、当業者に既知の、適切なミネラル、塩、共同因子、緩衝液および他の成分を含有する必要がある。
【００９１】
培養条件
典型的には細胞が、適切な培地内、約２０℃〜約４０℃の範囲内の温度で成長される。本発明において好適な成長培地は、ルリアベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロス、酵母培地（ＹＭ）ブロス、または（炭素／エネルギー源として）酵母窒素塩基、硫酸アンモニウム、およびデキストロースを含むブロスなどの一般的な商業的に調製された培地、あるいは、大部分のサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を成長させるための、ペプトン、酵母抽出物、およびデキストロースの最適な割合での混合物であるＹＰＤ培地である。他の限定または合成された成長培地が用いられる場合があり、かつ特定の微生物の成長に適した培地について微生物学または発酵科学に関する当業者は知っているであろう。異化代謝産物抑制を直接的または間接的に調節することで知られる作用物質、例えば環状アデノシン２’：３’一リン酸の使用についても発酵培地内に取り込まれうる。
【００９２】
酵母の発酵に適するｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、初期条件としてはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が好ましい。他の微生物の発酵における好適なｐＨ範囲はｐＨ３．０〜ｐＨ７．５であり、ここでｐＨ４．５〜ｐＨ６．５が初期条件として好ましい。
【００９３】
発酵は好気性または嫌気性条件下で実施可能であり、嫌気性または微好気性条件が好ましい。
【００９４】
工業用バッチおよび連続発酵
発酵は、発酵のバッチ方法でありうる。従来のバッチ発酵は、培地の組成物が発酵開始時に設定され、発酵の間に人工的な改変が施されることがない閉鎖系である。したがって、発酵開始時に培地に望ましい生物が接種され、系に何も添加しなくても発酵の生成が可能である。しかし、典型的には「バッチ」発酵は炭素源の添加に関連したバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの要素を制御する試みがなされることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物およびバイオマス組成物は、最大で発酵が停止する時間まで常時変化する。バッチ培養物内では、細胞が、変化のない誘導期（ｌａｇ  ｐｈａｓｅ）から高成長の対数期（ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ）、最終的に成長率が減少または停止する定常期（ｓｔａｔｉｏｎａｙ  ｐｈａｓｅ）にかけて抑制される。定常期における細胞が、未処理の場合、最終的に死滅することになる。対数期における細胞が、一般に最終生成物または中間体の生成の大部分に関与する。
【００９５】
標準のバッチシステムに対する変形がフェドバッチシステムである。フェドバッチ発酵プロセスは本発明においても適切であり、基質が発酵プロセスごとに添加されること以外では典型的なバッチシステムを含む。フェドバッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある場合や培地内に限られた量の基質を有することが望ましい場合に有用である。フェドバッチシステム内での実際の基質濃度の測定は困難であることから、それはｐＨ、溶解酸素およびＣＯ２などの排ガスの分圧などの測定可能な要素の変化に基づいて評価される。バッチおよびフェドバッチ発酵は一般的で、当該技術分野で周知であり、例がＴｈｏｍａｓ  Ｄ．、Ｂｒｏｃｋｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９年）  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡまたはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６：２２７頁（１９９２年）（参照により本明細書中に援用される）において見出されうる。
【００９６】
発酵培地は、連続発酵方法に適合可能でありうる。連続発酵は、限定された発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加されかつ等量の条件培地が処理と同時に除去される場合の開放系である。連続発酵では、一般に一定の高密度で培養物が維持される。
【００９７】
連続発酵では、細胞成長または最終生成物濃度に作用する１つの要素またはいくつかの要素の調節が可能になる。例えば、１つの方法では、炭素源などの限られた栄養素または一定速度での窒素レベルが維持され、あらゆる他のパラメータの抑制が可能になる。他のシステムでは、培地の濁度により測定される細胞濃度が一定に保持される間、成長に作用する多数の要素を連続的に改変することが可能である。連続システムでは、恒常的成長条件を維持するように試みることで、培地の除去（ｄｒａｗｎ  ｏｆｆ）に起因する細胞欠損を発酵における細胞成長率に対して均衡させなければならない。連続発酵プロセス用の栄養素および成長因子を調節する方法ならびに生成物形成の速度を最大化するための技術については産業微生物学における当該技術分野で周知であり、かつ種々の方法がＢｒｏｃｋ、上記で詳述されている。
【００９８】
バッチ、フェドバッチ、連続プロセス、または発酵の任意の公知のモードが、記載の組換え微生物宿主細胞の成長にとって好適であると考えられる。さらに、細胞が、全細胞触媒としての基質上に固定化され、２−ブタノール生成のための発酵条件に従うものと考えられる。
【００９９】
発酵培地からブタノールを単離するための方法
生物学的に生成されたブタノールは、ＡＢＥ発酵におけるものなどの当該技術分野で既知の方法を用いて発酵培地から単離されうる（例えば、Ｄｕｒｒｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４９：６３９−６４８頁（１９９８年）、Ｇｒｏｏｔら、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：６１−７５頁（１９９２年）、およびその中の参考文献を参照）。例えば、固体が遠心分離、濾過、デカンテーション、または同様のものにより発酵培地から除去されうる。次いで、２−ブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液体−液体抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、または浸透気化法などの方法を用いて発酵培地から単離されうる。
【０１００】
ブタノールが水と低い沸点の共沸混合物を形成することから、蒸留を用い、混合物をその共沸組成物まで分離してもよい。蒸留を、別の分離方法と併用し、共沸混合物についての分離を得ることが可能である。ブタノールを単離し、精製するための、蒸留と併用可能な方法は、限定はされないが、デカンテーション、液体−液体抽出、吸着、および膜に基づく技術を含む。さらに、ブタノールは、エントレーナを使用する共沸蒸留を用いて単離してもよい（たとえば、ＤｏｈｅｒｔｙおよびＭａｌｏｎｅ、Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、２００１年を参照）。
【０１０１】
ブタノール−水混合物は異種共沸混合物を形成し、それから蒸留をデカンテーションと併用し、ブタノールを単離し、精製してもよい。この方法では、ブタノールを含有する発酵ブロスは蒸留され、共沸組成物に接近する。次いで、共沸混合物は濃縮され、ブタノールはデカンテーションによって発酵培地から分離される。デカントされた水相は、還流としての第１の蒸留カラムに戻してもよい。ブタノールに富むデカントされた有機相は、第２の蒸留カラム内で、蒸留によってさらに精製してもよい。
【０１０２】
ブタノールはまた、蒸留と併用し、液体−液体抽出を用いて発酵培地から単離してもよい。この方法では、ブタノールは、好適な溶媒による液体−液体抽出を用い、発酵ブロスから抽出される。次いで、ブタノールを含有する有機相は蒸留され、ブタノールは溶媒から分離される。
【０１０３】
また、吸着と組み合わせた蒸留を用い、ブタノールを発酵培地から単離してもよい。この方法では、ブタノールを含有する発酵ブロスは蒸留され、共沸組成物に接近し、次いで残留水は、吸着剤、たとえば分子ふるいの使用によって除去される（Ａｄｅｎら、Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ｔｏ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｏ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｌｕｔｅ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｎ  Ｓｔｏｖｅｒ」、Ｒｅｐｏｒｔ  ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−３２４３８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、２００２年６月）。
【０１０４】
さらに、パーベーパレイションと組み合わせた蒸留を用い、ブタノールを発酵培地から単離し、精製してもよい。この方法では、ブタノールを含有する発酵ブロスは蒸留され、共沸組成物に接近し、次いで残留水は、親水性膜を通したパーベーパレイションによって除去される（Ｇｕｏら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｓｃｉ．２４５、１９９−２１０頁（２００４年））。
【実施例】
【０１０５】
本発明はさらに以下の実施例にて定義される。これらの実施例が本発明の好ましい実施形態を示す一方であくまで例示目的で与えられることは理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴により、その趣旨および範囲から逸脱することなく本発明に対して様々な変更および改良を行うことで、本発明の様々な利用および条件への適合が可能であることが確認できる。
【０１０６】
一般的方法
実施例において記載される標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）およびＴ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）（１９８４年）およびＡｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．およびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ発行（１９８７年）およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）において記載されている。
【０１０７】
細菌培養物の維持および成長に適する材料および方法については当該技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適する技術が、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ
Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．（１９９４年））またはＴｈｏｍａｓ  Ｄ．、Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）に示されるように見出されうる。細菌細胞の成長および維持について使用されるすべての試薬、制限酵素および材料は、他に特に規定がなければ、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
【０１０８】
微生物株は、特に断りのない限り、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得られた。
【０１０９】
略語の意味は以下の通りである。「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｐｓｉ」はポンド毎平方インチ意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学密度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロ塩基対を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容量パーセントを意味し、「％ｖ／ｖ」は容量／容量パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味する。「モル選択性」という用語は、消費される糖基質の１モル当たりに生成される生成物のモル数であり、パーセントとして報告される。
【０１１０】
「Ｋｍ」は、酵素の所与の濃度での酵素反応において、Ｖｍａｘの半分に等しい生成物生成の速度をもたらす基質の濃度である。
【０１１１】
「Ｖｍａｘ」は、酵素の所与の濃度での酵素反応における生成物生成の最大速度である。一般的単位は、反応時間１分あたりの生成物のマイクロモルである。
【０１１２】
実施例１
アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）の環境単離物からのブタノールデヒドロゲナーゼの単離および特徴づけ
集積プロセスを使用し、単一の炭素源として環境廃水汚泥試料由来の１−ブタノールを利用可能な微生物を単離することが可能であるか否かを判定した。集積培養を、１２５ｍＬのエルレンマイヤーフラスコ内で、１ｍＬの活性化汚泥を、酵母抽出物（０．００１％の最終濃度）および０．１％（ｗ／ｖ）の１−ブタノールを含有する１０ｍＬのＳ１２培地（０．０１Ｍ硫酸アンモニウム、０．０５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．０、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．７ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０μＭ  ＭｎＣｌ２、１μＭ  ＦｅＣｌ３、１μＭ  ＺｎＣｌ２、１．７２μＭ  ＣｕＳＯ４、２．５３μＭ  ＣｏＣｌ２、２．４２μＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、２μＭ塩酸チアミン）に接種することによって確立した。活性化汚泥は、ＤｕＰｏｎｔの廃水処理施設から得られた。集積培養物を、往復振とうしながら、３７℃でインキュベートした。最初に、培養物を、９ｍＬの培養物を同容量の培地と取り替えることにより、１〜２日ごとに希釈した。次いで、０．１〜０．４％（ｗ／ｖ）の初期１−ブタノール濃度を含有する同じ培地へのより高い希釈により、約０．５５／時間での成長速度（３４℃、２５０ｒｐｍ）が得られた。
【０１１３】
試料（１０μＬ）の集積培養物を、ＬＢ寒天またはトリプチカーゼ大豆寒天上に広げ、３５℃で約２０時間インキュベートした。代表的コロニーを、同じ培地上にストリークし、培養物を３５℃でインキュベートすることによって精製した。単離物を、さらなる試験のために選択した。１つの単離物をＢＵＴＣＯＮ−５と称した。ＢＵＴＣＯＮ−５株の同一性を、ｒＲＮＡの特徴づけによって分析した。
【０１１４】
株ＢＵＴＣＯＮ−５の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を、ＰＣＲによって増幅し、次のように分析した。株ＢＵＴＣＯＮ−５を、ＬＢ中で振とうしながら、３７℃で１６時間成長させた。Ｕｌｔｒａｃｌｅａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＭｏＢｉｏ、部品番号１２２２４）を製造業者の使用説明書に従って使用し、ＤＮＡを株ＢＵＴＣＯＮ−５から抽出した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を、プライマーＪＣＲ１４（ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ；配列番号４）およびＪＣＲ１５（ＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡ；配列番号５）とともに、市販キットを製造業者の使用説明書に従って使用することにより（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ））、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ９６００で実施した。試料を、９４℃で２分間インキュベートし、次いで９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間、３０回循環させ、７２℃で５分間保持した。増幅された１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列断片を、市販キットを製造業者の使用説明書に従って使用して精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ））、自動ＡＢＩシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））で配列決定した。配列決定反応を、プライマーＪＣＲ１４（配列番号４）およびＪＣＲ１５（配列番号５）を用いて開始した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列を、類似配列を対象とする、ＧｅｎＢａｎｋにおける利用可能な配列のＢＬＡＳＴ探索（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２頁（１９９７年））におけるクエリー配列として使用した。株ＢＵＴＣＯＮ−５由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列（配列番号６）は、種アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に属する細菌のいくつかの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対して高い配列同一性を有した。ＢＵＴＣＯＮ−５配列は、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）株ＮＦＲＩ−Ａ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ１６１６９１）から単離される１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対して最高の同一性（９９％）を有した。
【０１１５】
Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）からのブタノールデヒドロゲナーゼ活性の精製
アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ＢＵＴＣＯＮ−５株からのブタノールデヒドロゲナーゼの精製を、上記の培地中で成長させた株の５００ｍＬの一晩培養物から行った。細胞を、ペレット状にし（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ、Ｆ１０ローター、６０００ＲＰＭ、２０分、１０℃）、２５ｍＬの２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０で２回洗浄した。洗浄したペレットを、３０ｍＬの２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０に再懸濁し、氷上で冷却した。細胞を、超音波処理によって溶解した（Ｈｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ、Ｃｅｌｌ  ＤｉｓｒｕｐｔｅｒモデルＷ３７５、出力レベル５０、パルスモード、７０％のデューティサイクル、５分）。無細胞抽出物を、溶解物を遠心分離することによって調製した（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｂ、ＳＳ３４ローター、１８０００ＲＰＭ、２０分、１０℃）。上清を、一定分量、−８０℃で保存した。２アリコート（９．１２ｍＬ）を解凍し、結合させ、硫酸プロタミン沈殿を施した。５０ｍｇ／ｍＬの硫酸プロタミン溶液の各々の１００μＬの４滴添加を、１５分間にわたり行った（タンパク質に対して全部で１５％ｗ／ｗ）。沈殿物を、遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ製冷凍微量遠心分離機、２０，０００ＲＣＦ、４℃、１０分）によって除去した。
【０１１６】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘプレップ２００カラムを、２０ｍＭリン酸カリウム、２０ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化した。硫酸プロタミン沈殿物からの上清を、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ濃縮器で約１．３ｍＬに濃縮し、カラム上に装填し、同じ緩衝液で、１．００ｍＬ／分の均一濃度で溶出した。画分を回収し、１−ブタノールデヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。アッセイでは、５０ｍＭのブチルアルデヒドおよび０．２ｍＭのＮＡＤＨを含有する５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２、３５℃）中の酵素を適量で使用し、ＮＡＤＨからＮＡＤ＋への酸化を３４０ｎｍで分光測定的にモニタリングした。高い比活性を有する画分を、プールし、濃縮し、１９μｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質の比活性を有する高度に精製された画分を得た。
【０１１７】
Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）から単離されたブタノールデヒドロゲナーゼの活性株
精製酵素および分子量標準物に、非変性ポリアクリルアミドゲル（８〜１６％トリス−グリシン勾配ゲル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して電気泳動を施した。電気泳動後、ゲルを除去し、タンパク質について染色するか（Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｐｏｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、または、メディエーターとしてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）を使用し、１−ブタノール＋ＮＡＤ＋のブチルアルデヒド＋ＮＡＤＨへの変換を３［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）の深色化したホルマザンへの変換と組み合わせることにより、活性について染色した（Ｔａｎｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４０、１８２頁（１９９７年））。活性溶液は、２５ｍＬの全容量中に、０．５ｍｇのＰＭＳ、５ｍｇのＭＴＴ、２０ｍｇのＮＡＤ＋および１ｍＬの１−ブタノールを含有した。得られた活性染色は、Ｂ−フィコエリトリン（２４２ｋダルトン）および乳酸デヒドロゲナーゼ（１４６ｋダルトン）タンパク質標準物の間の中間バンド（ｂａｎｄ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）で泳動された。その後、（２−ブタノンを生成する）２−ブタノールまたは（イソブチルアルデヒドを生成する）イソブタノールを使用する活性染色により、同一の分子量を有するバンドが生成され、それにより同じタンパク質がこれらのブタノール異性体に対して活性があることが示された。
【０１１８】
Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来のブタノールデヒドロゲナーゼの動的特徴づけ
Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼの動的パラメータを、還元（ケトンおよびアルデヒド）または酸化（アルコール）における基質として１−ブタノール、２−ブタノール、ブチルアルデヒド、２−ブタノン（メチルエチルケトン）、およびイソブチルアルデヒドを使用して測定した。アルコール基質での反応を、３ｍＭ  ＮＡＤ＋およびさまざまな濃度のアルコールを含有するトリス緩衝液（ｐＨ８．５）中、３５℃で行った。ケトンまたはアルデヒド基質での反応を、５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）、２００μＭ  ＮＡＤＨおよびさまざまな濃度のケトンまたはアルデヒドの場合に３５℃で行った。Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）または組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｍａｃｈ１／ｐＴｒｃ９９ａ：：ｓａｄＢ（下記の実施例３で記載）のいずれかから得られた粗酵素調製物を使用した。各基質におけるＶｍａｘおよびＫｍを結果から計算し、これらを表１に示す。
【０１１９】
【表１】
2011518575.tif 000002
【０１２０】
実施例２
アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼにおけるコード配列の入手
好適な分子量のＡ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼに対応するバンドを、実施例１に記載のように調製したゲルから切り出し、タンパク質を単離し、Ｎ末端配列を、標準的方法を用いて判定した。配列は、ＭＫＡＬＶＹＨＧＤＨＫＩＳＬＧＤＫＰＫＰ（配列番号７）であると判定された。
【０１２１】
配列決定プライマーを、このペプチドをコードする計画されたＤＮＡ配列から設計した。変性プライマーＮ３３１（配列番号８）は、次の実験において第１の配列情報を提供することができた。ゲノムＤＮＡを、グラム陰性生物における推奨プロトコルに従い、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）；カタログ番号Ｄ−５５００Ａ）を使用し、アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）株ＢＵＴＣＯＮ−５から調製した。最初に、精製ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）から配列決定するために改良されたプロトコルを用い、コード領域の５’末端から３’末端に向けて染色体沿いに移動した。各配列決定プライマー反応においては、２０μｌの精製ｇＤＮＡ（約２００ｎｇ／μｌ）を、１６μｌのＢｉｇＤｙｅ  ｖ３．１  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３３７４５７）、３μｌの１０μＭプライマー、および１μｌのＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ８４１８）に加えた。次いで、配列決定反応における熱サイクルを、９６℃で３分間、次いで２００サイクル（９５℃で３０秒間＋５５℃で２０秒間＋６０℃で２分間）行い、次いで４℃で保存した。取り込まれなかったｄｄＮＴＰを、配列決定前、Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ２０８７７，ＵＳＡ）製クリーンアッププレート（ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｐｌａｔｅｓ）を使用して除去した。各配列決定反応においては、４０μｌ全体を、予め回転された（ｐｒｅ−ｓｐｕｎ）９６ウェルクリーンアッププレートの１つのウェルにピペッティングした。次いで、プレートを、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＴ−７冷凍遠心分離機で、５，０００×ｇで５分間回転させた。次いで、クリーンアップ反応物を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０  ＤＮＡシーケンサー上に直接セットし、自動ベースコーリング（ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｂａｓｅ  ｃａｌｌｉｎｇ）で配列決定した。
【０１２２】
変性プライマーＮ３３１で得られる配列を、公的に入手可能な配列のＢＬＡＳＴＸ探索によって分析し、それは髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＺｎ依存性アルコールデヒドロゲナーゼに対して６５％のコードアミノ酸の類似性および他の生物に由来する関連活性を有するタンパク質に対してより少ない程度の類似性を有することが判明した。さらなるプライマーをプライマーＮ３３１で得られる配列から調製し、２回目の配列決定を行った。プライマーＮ４０１（フォワード；配列番号９）、Ｎ４０２（リバース；配列番号１０）およびＮ４０６（フォワード；配列番号１１）から得られた結果は、出発コドンおよび推定上の亜鉛結合ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−ｃｙｓモチーフを示した。さらなるフォワードおよびリバース配列決定プライマーを、新規に得られた配列から設計した。プライマーＮ４１２（配列番号１２）、Ｎ４２１（配列番号１３）およびＮ４２２（配列番号１４）からの配列決定結果は、プライマーＮ３３１およびＮ４０２から得られた結果と重複し、それは４２６ｎｔコンティグの構築を可能にした。
【０１２３】
次いで、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２５−６６００−０１）を使用し、ｇＤＮＡを増幅し、配列決定のリード長を次のように改善した。精製ｇＤＮＡの１ｎｇを９μｌの試料緩衝液に加え、９５℃で３分間加熱し、次いで４℃まで冷却した。９μｌの反応緩衝液＋１μｌの酵素から構成される１０μｌの酵素ミックスを各冷却試料に加え、混合物を３０℃で１８時間インキュベートした。次いで、酵素を、６５℃まで１０分間加熱することによって不活性化した。試料を、配列決定まで４℃で保存した。各配列決定プライマー反応においては、８μｌの増幅ＤＮＡを、８μｌのＢｉｇＤｙｅ  ｖ３．１  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３３７４５７）、４μの５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，４３３６６９９）、３μｌの１０μＭプライマー、および１６μｌの分子生物学グレード（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｇｒａｄｅ）水（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、および１μｌのＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｄ８４１８）に加えた。
【０１２４】
プライマーＮ４６２（配列番号１７）、Ｎ４６４（配列番号１９）およびＮ４６５（配列番号２０）（すべては４２６ｎｔのコンティグ配列から調製された）で増幅されたＤＮＡの配列決定により、コード領域の３’末端が完了し、１０４７ｎｔのオープンリーディングフレームを構築することができた。最終確認においては、フォワードおよびリバースプライマーＮ４７３（配列番号２４）とＮ４６９（配列番号２３）のそれぞれを、「大まかな（ｒｏｕｇｈ）」コンティグ構築から設計し、ハイフィディリティＰｈｕｓｉｏｎ（商標）増幅キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｆ−５３１Ｓ）を使用し、精製ｇＤＮＡから全コード配列をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲ４  ＢＬＵＮＴにクローン化されたＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｋ２８３５−２０）であり、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢを生成し、製造業者のプロトコルに従い、それを（キット中に提供される）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ−１細胞に形質転換した。次いで、プラスミドを４つのクローンから単離し、インサートを、フランキングベクターに特異的なプライマー（Ｍ１３フォワードおよびリバース；配列番号２５、２６）と、プライマーＮ４５６（配列番号１５）、Ｎ４５７（配列番号１６）、Ｎ４６２（配列番号１７）、Ｎ４６３（配列番号１８）、Ｎ４６５（配列番号２０）、Ｎ４６６（配列番号２１）、およびＮ４６７（配列番号２２）（これらはインサートに特異的なコード配列である）を用いて配列決定した。少なくとも４倍の範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）が達成され、それにより１０４７ｎｔのコード領域配列（配列番号１）を確認した。
【０１２５】
Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）の同定されたブタノールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を、二次アルコールデヒドロゲナーゼ−２−ブタノール（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−２−ｂｕｔａｎｏｌ）に対してｓａｄＢと称した。酵素は、実施例１に示される１−ブタノールおよびイソブタノールを含む２−ブタノール二次アルコールより広範な基質を有し、ブタノールデヒドロゲナーゼになることが示された。最終の１０４７ｎｔのコード配列から翻訳されたタンパク質（配列番号２）を、デフォルトパラメータを使用する、公的に入手可能な配列のＢＬＡＳＴＰクエリーにおいて使用した。それは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来の推定上のＺｎ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＦ４１７５９）に最も類似することが判明し、それはｓａｄＢアミノ酸配列に対して６７％同一である。アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼにおけるＤＮＡコード配列は、公的に入手可能な配列のＢＬＡＳＴ分析により、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８のＺｎ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ００３１１２）のコード配列に対して６４．５％の同一性を有することが見出された。
【０１２６】
実施例３
２−ブタノンの２−ブタノールへの変換のためのアクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のアルコールデヒドロゲナーゼの発現用大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンストラクト
アクロモバクター・キシロスオキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来の二次アルコールデヒドロゲナーゼ（ｓａｄＢ）をベクターｐＴｒｃ９９ａにクローン化した（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ  ６９（２）：３０１−３１５頁（１９８８年））。コード領域（配列番号１）を、標準条件を用い、Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ゲノムＤＮＡから増幅し、フォワードおよびリバースプライマーのＮ４７３およびＮ４６９（配列番号２４および２３）を使用するグラム陰性生物用の推奨プロトコルに従い、Ｇｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅキット（Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）；カタログ番号Ｄ−５５００Ａ）を使用して調製した。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲ４  ＢＬＵＮＴにクローン化されたＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）であり、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢを生成し、それを使用し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ−１細胞を形質転換した。次いで、プラスミドＤＮＡを４つのクローンから単離し、配列を確認した。次いで、プラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、ｓａｄＢ断片を放出し、それをＥｃｏＲＩで消化されたｐＴｒｃ９９ａとライゲートし、ｐＴｒｃ９９ａ：：ｓａｄＢを生成した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｍａｃｈ１細胞を、プラスミドで形質転換し、得られた形質転換体をＭａｃｈ１／ｐＴｒｃ９９ａ：：ｓａｄＢと称した。これらの細胞内でｓａｄＢ遺伝子から発現された酵素の活性をアッセイし、結果を実施例１における表１に示した。
【０１２７】
実施例４
ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢのｓａｄＢコンストラクトによってコードされるブタノールデヒドロゲナーゼを発現する酵母
ｓａｄＢ遺伝子コード領域を、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ：：ｓａｄＢからＰＣＲ増幅した。ＰＣＲプライマーＮ５８３およびＮ５８４（配列番号２７および２８）は、酵母ＧＰＭプロモーター（配列番号２９）およびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号３０）と重複する追加的な５’配列を有した。次いで、ＰＣＲ産物を、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における「ギャップ修復」法（Ｍａら、上記）を用い、酵母−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルベクターｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ：：ｋｉｖＤ：：ＡＤＨに次のようにクローン化した。このベクターは、（ｐＲＳ４００シリーズ：Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎら、Ｇｅｎｅ  １１０：１１９−１２２頁（１９９２年）からの）ｐＲＳ４２５ベクター内に、酵母ＧＰＭプロモーター（配列番号２９）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ｋｉｖＤコード領域（配列番号３１）、およびＡＤＨ１ターミネーター（配列番号３０）を含むキメラ遺伝子を有し、共同所有および同時係属中の米国特許出願公開第２００７００９２９５７Ａ１号明細書、実施例１７に記載されたものである。ベクターを、ＢｂｖＣＩおよびＰａｃＩ制限酵素で消化し、ｋｉｖＤコード領域を放出した。約１μｇの残存するベクター断片を使用し、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＢＹ４７４１を１μｇのｓａｄＢ  ＰＣＲ産物とともに形質転換した。形質転換体を、ロイシンを含まない合成完全培地上で選択した。ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢを生成する適切な組換え事象を、プライマーＮ１４２およびＮ４５９（配列番号３２および３３）を使用するＰＣＲによって確認した。
【０１２８】
３つのクローンを、ロイシンを含まない合成完全培地中で培養し、アッセイ用の細胞を生成した。無細胞抽出物を、１ｍｌの０．５ｍｍビーズおよび１．５ｍｌの酵母細胞懸濁液を使用する標準のビードビーティング（ｂｅａｄ  ｂｅａｔｉｎｇ）法によって調製した。ＭＥＫレダクターゼ活性としてアッセイされる活性を次のように測定した。酵母細胞を含まない抽出物（表２に示されるように５０μｌと１００μｌの１つの試料）を、９２０もしくは８７０μｌの５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）、１０μｌの２０ｍＭ  ＮＡＤＨ、および１０μｌの１００ｍＭ  ＤＴＴを含有するクオーツ製キュベットに加えた。１０μｌの５００ｍＭ  ２−ブタノンを反応物に加える前、３４０ｎｍでの吸光度を１分間モニタリングし、バックグラウンド速度を得た。３４０ｎｍでの吸光度をさらに２分間モニタリングし、反応速度を得た。表２に報告される（μモル／分／ｍｇでの）活性によって示されるように、３つのクローンすべてが、ベクター−単独対照（ＢＹ４７４１／ｐＲＳ４２６）に対して有意なＭＥＫ還元活性を有した。
【０１２９】
【表２】
2011518575.tif 000003
【０１３０】
実施例５
Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるコドン最適化されたｓａｄＢの発現
Ａ．キシロスオキシダンス（Ａ．ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）のブタノールデヒドロゲナーゼをコードする配列は、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のため、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）により、Ｋａｚｕｓａ  ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（日本）によって維持されるＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅにおいて報告される標準のコドン使用情報を使用してコドン最適化された。ｓａｄＢｙ（配列番号３）と称される最適化されたコード領域を有するクローン化ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ２．０から得た。ＧＰＭプロモーター−ｓａｄＢｙコード領域−ＡＤＨ１ターミネーターを有するキメラ遺伝子を次のように作成した。
【０１３１】
プライマーＯＴ１０７４およびＯＴ１０７５（配列番号３４および３５）による部位特異的突然変異誘発を用い、実施例４に記載のｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢにおけるｓａｄＢコード領域のＡＴＧコドンの上流にＮｈｅＩ制限部位を生成し、ベクターｐＲＳ４２５：：ＧＰＭｐ−ｓａｄＢ（ＮｈｅＩ）−ＡＤＨ１ｔを作成した。コドン最適化されたｓａｄＢｙ断片を、ＮｈｅＩおよびＰａｃＩ制限部位を使用してｐＲＳ４２５：：ＧＰＭｐ−ｓａｄＢ（ＮｈｅＩ）−ＡＤＨ１ｔにサブクローン化し、元のｓａｄＢコード領域と取り替えた。得られたプラスミドをｐＲＳ４２５：：ＧＰＭｐ−ｓａｄＢｙ−ＡＤＨ１ｔと称した。
【０１３２】
Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４１（ＡＴＣＣ番号２０１３８８）を、標準の遺伝子技術（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）、２０１−２０２頁）を用い、プラスミドｐＲＳ４２５−ＧＰＭｐ−ｓａｄＢｙ−ＡＤＨ１ｔで形質転換し、形質転換体を、ロイシンを含まず、２％グルコースを補充した合成完全培地上で、３０℃で選択した。ＢＹ４７４１ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭｐ−ｓａｄＢｙ−ＡＤＨ１ｔを、ロイシンを含まず、２％グルコースを補充した合成完全培地中で、３０℃で一晩成長させ、２００ｍｌの同じ培地に、最終ＯＤ６００が０．２になるまで接種した。培養物を、０．８〜１．０のＯＤ６００で遠心分離によって回収されるまで２２０ｒｐｍで振とうしながら３０℃でインキュベートし、−８０℃で保存した。
【０１３３】
酵母抽出物を、実施例４における上記のように調製した。２−ブタノン還元についての活性アッセイを、実施例４における上記のように実施した。個々のアッセイから得られる特異的活性（μモル／分／ｍｇ）を表３に示す。
【０１３４】
【表３】
2011518575.tif 000004
【配列表】
2011518575000001.app
【国際調査報告】
2011518575.tif 000005
2011518575.tif 000006
2011518575.tif 000007
2011518575.tif 000008