(57)【要約】  本明細書に開示の実施形態は、血管周囲薬用細胞（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｅｌｌｓ：ＰＶＭＣｓ）およびＰＶＭＣｓを単離する方法およびそれらの使用方法を対象とする。本明細書における一部の実施形態は、薬用能力を有するＰＶＭＣｓの組成物を記載する。一部の実施形態は、ＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離する方法を記載する。一部の実施形態は、ＰＶＭＣｓを骨から単離する方法を対象とする。一部の実施形態は、強化された自己骨移植片を作製する方法を記載する。一部の実施形態は、骨再生を刺激する方法であって、治療有効量の骨由来ＰＶＭＣｓを投与する段階を有する方法を記載する。本明細書に開示の実施形態は、細胞機能に影響を及ぼす疾患を処置する方法を対象とする。本明細書中の一部の実施形態は、部位依存性栄養因子を分泌することができるＰＶＭＣｓを記載する。一部の実施形態は、骨組織を再建する方法を記載する。  【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＰＶＭＣ。
【請求項２】
請求項１（ＰＶＭＣが骨に由来する）の単離されたＰＶＭＣ。
【請求項３】
骨が骨チップ、小柱骨腔、骨髄、骨腔洗浄またはそれらの組み合わせを具える、請求項２に記載の単離されたＰＶＭＣ。
【請求項４】
請求項１（ＰＶＭＣがアンビリカル・コード血管に由来する）のＰＶＭＣ。
【請求項５】
骨断片をグラインダまたは骨工場に通すことから成る骨チップを生産する方法。
【請求項６】
請求項５（骨断片が低温的に凍る）の方法
【請求項７】
骨形成細胞をリン酸カルシウム基板（高い親和性が骨形成細胞の存在を示す）に細胞の決定吸着を準備に含んでいるＰＶＭＣ調合剤から分離する方法。
【請求項８】
骨移植として使用される骨組織、そして濃縮ＰＶＭＣｓの人口で骨移植を補充している（ｉｉ）の第１部分を対象物から引き抜いている（ｉ）から成る強化された、自家組織の骨移植をする方法。
【請求項９】
強化された、自家組織の骨移植をする方法は、以下を含む：
a. 酵素、機械の力またはそれらの組み合わせを有する主題から細胞サスペンションを骨組織の第１部分から引き抜くこと、
b. 濃縮骨から派生したＰＶＭＣｓの人口を得るために浮く密度堆積、濾過または遠心分離によって、細胞中止の細胞に集中すること、そして、c. 強化された、自家組織の骨移植をするために、濃縮骨から派生したＰＶＭＣｓの人口を有する主題からの骨移植として使用される骨組織の第２部分を補充すること。
【請求項１０】
請求項９（骨組織の第１部分が大腿骨、大腿骨の末端領域またはそれらの組み合わせの近位領域から生じる）の方法。
【請求項１１】
請求項９（骨組織の第２部分が腸骨頂上、大腿骨、膝蓋骨、脛骨、上腕骨、鎖骨、肋骨、肩甲骨またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つから成る人間の骨から生じる）の方法。
【請求項１２】
更に成り立っていて、新しい自家骨髄、被処理自家骨髄、冷凍された自家骨髄、新しい自家骨、被処理自家骨、冷凍された自家骨またはそれらの組み合わせで強化された、自家組織の骨移植を補充している請求項９の方法。
【請求項１３】
複数の単離されたＰＶＭＣｓおよび薬学的に受け入れられるキャリアの治療上有効量から成る医薬品組成物。
【請求項１４】
複数のＰＶＭＣｓが骨、アンビリカル・コード血管、解剖的なソースを含んでいるＰＶＭＣｓまたはそれらの組み合わせに由来するＰＶＭＣｓを具える、請求項１３に記載の医薬品組成物。
【請求項１５】
骨が骨チップ、小柱骨腔、骨髄、骨腔洗浄またはそれらの組み合わせを具える、請求項１４に記載の医薬品組成物。
【請求項１６】
骨髄細胞から更に成っている請求項１３の医薬品組成物。
【請求項１７】
足場材料から更に成っている請求項１３の医薬品組成物。
【請求項１８】
足場材料が骨チップ、セラミック系骨移植代理、リン酸カルシウム・セラミック、硫酸カルシウム・セラミック、生体ガラス、ポリマー・ベースの骨移植代理、分解可能なおよび非分解性ポリマー、被処理同種移植骨材料、鉱化された被処理同種移植、ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄされた被処理同種移植、コラーゲン・スポンジまたはそれらの組み合わせを具える、請求項１７に記載の医薬品組成物。
【請求項１９】
その必要の主題にＰＶＭＣｓの治療上有効量から成る組成物を与えることから成るアポトーシスを調整する方法。
【請求項２０】
その必要の主題にＰＶＭＣｓの治療上有効量から成る組成物を与えることから成る有糸分裂を調整する方法。
【請求項２１】
その必要の主題にＰＶＭＣｓの治療上有効量から成る組成物を与えることから成る脈管形成を調整する方法。
【請求項２２】
その必要の主題にＰＶＭＣｓの治療上有効量から成る組成物を与えることから成る骨形成を調整する方法。
【請求項２３】
請求項２２（血管周囲医薬の細胞が骨芽細胞を形成する能力を有する）の方法。
【請求項２４】
その必要の主題にＰＶＭＣｓの治療上有効量から成る組成物を与えることから成る免疫調節の方法。
【請求項２５】
複数のＰＶＭＣｓおよび受け入れられるキャリアから成る組成物。
【請求項２６】
複数のＰＶＭＣｓが骨、アンビリカル・コード血管またはそれらの組み合わせに由来するＰＶＭＣｓを具える、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
２６（骨が骨チップ、骨髄組織および他の組織から成る）が骨（インター髄運河、骨チップ、小柱骨腔、骨腔洗浄またはそれらの組み合わせからの骨髄）を圧縮するというクレームの組成物。
【請求項２８】
骨髄細胞から更に成っている請求項２５の組成物。
【請求項２９】
足場材料から更に成っている請求項２５の組成物。
【請求項３０】
足場材料が骨チップ、セラミック系骨移植代理、リン酸カルシウム・セラミック、硫酸カルシウム・セラミック、生体ガラス、ポリマー・ベースの骨移植代理、分解可能なおよび非分解性ポリマー、被処理同種移植骨材料、鉱化された被処理同種移植、ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄされた被処理同種移植、コラーゲン・スポンジまたはそれらの組み合わせを具える、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ＰＶＭＣｓを分離すること間の方法は、方法に骨を入れる：主題から骨組織の検体を提供している（ｉ）、ＰＶＭＣｓを骨から抽出している（ｉｉ）、そして、抽出されたＰＶＭＣｓに集中している（ｉｉｉ）。
【請求項３２】
方法クレーム３１（骨組織を磨くことを更に含む）。
【請求項３３】
請求項３１（ＰＶＭＣｓを抽出することが成り立つ）の方法：酵素の消化、機械の力またはそれらの組み合わせによって、細胞サスペンションを骨組織から引き抜いている（ｉ）、そして、浮く密度堆積、濾過、遠心分離またはそれらの組み合わせによって、ＰＶＭＣｓの人口を細胞中止から切り離している（ｉｉ）。
【請求項３４】
請求項３３（酵素の消化がＰＶＭＣの付属品を小さい血管の基底膜から隔離する一つ以上の酵素を使用する）の方法。
【請求項３５】
請求項３１の方法、抽出されたＰＶＭＣｓに集中することが、成り立っている方法によって、成し遂げられる使用するＰＶＭＣ．上の細胞表面抗原に、親和性を有する抗体を含んでいる磁気ビーズの
【請求項３６】
請求項３５（抗体が反ＣＤ１４６、反ＣＤ１０５、反ＣＤ１６６、反ＣＤ２７１またはそれらの組み合わせから選択される）の方法。
【請求項３７】
その必要の主題にＰＶＭＣｓの治療上有効量から成る組成物を与えることから成る細胞機能に影響を及ぼす疾患を治療する方法。
【請求項３８】
請求項３７（ＰＶＭＣｓがサイトに依存する栄養に関する要因を隠すことができる）の方法。
【請求項３９】
請求項３８（サイトに依存する栄養に関する要因がプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）から選択される）の中で方法、間質細胞は、要因―１を引き出した（ＳＤＦ―１Ｖａｓｃｕｌａｒ内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ＶＥＧＦ１６５、インターロイキン―１β（ＩＬ―β）インターロイキン６（ＩＬ―６）インターロイキン７（ＩＬ―７）インターロイキン８（ＩＬ―８）インターロイキン１２（ＩＬ―１２）インターロイキン―１６（ＩＬ―１６）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ―β）塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）顆粒白血球―大食細胞コロニー刺激因子（ＧＭ―ＣＳＦ）インシュリン様成長因子１（ＩＧＦ―１）インドールアミン２，３―ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）インターロイキン１０（ＩＬ―１０）ヒト白血球抗原Ｇ（ＨＬＡ―Ｇ）白血病抑制因子（ＬＩＦ）クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ｅｏｔａｘｉｎ、顆粒白血球、起動、表されて、分泌される（ＲＡＮＴＥＳ）通常のＴ細胞、ＩＬ―１受容体アンタゴニスト（ＩＬ―１ｒａ）腫瘍壊死ｆａｃｔｏｒ―α、ＴＮＦ―α、腫瘍壊死ｆａｃｔｏｒ―β（ＴＮＦ―β）上皮の好中球を起動させているタンパク質７８（ＥＮＡ―７８）に調整されて、コロニー刺激因子（Ｇ―ｃｓｆ）ｅｏｔａｘｉｎ、単球化学遊走物質タンパク質１（ＭＣＰ―１）単球化学遊走物質タンパク質３（ＭＣＰ―３）大食細胞炎症性のタンパク質―１α（ＭＩＰ―１α）大食細胞炎症性のタンパク質―３α（ＭＩＰ―３α）大食細胞炎症性のタンパク質―１β（ＭＩＰ―１β）細胞接着分子―１（ＩＣＡＭ―１）ＶＣＡＭ―１、顆粒白血球コロニー刺激因子（Ｇ―ＣＳＦ）成長ホルモン、幹細胞要因（ＳＣＦ）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）ｅｏｔａｘｉｎ―３、フラクタルキン、上皮の好中球を起動させているタンパク質７８（ＥＮＡ―７８）Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ誘導可能なＴ細胞α化学遊走物質（ｉ―ＴＡＣ）成長調整された発ガン遺伝子―α（ＧＲＯα）発展調整された発ガン遺伝子―β（ＧＲＯβ）Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ誘導可能なタンパク質―１０（ＩＰ―１０）ＣＤ１４６、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４４、ＣＤ２７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ１０またはそれらの組み合わせ。
【請求項４０】
疾患が虚血性心疾患、燃焼、ストローク、炎症性腸疾患、クローン病、慢性関節リウマチ、狼瘡、筋萎縮性側索硬化症、脊髄の損傷、ポリ外傷、骨骨折、糖尿病またはそれらの組み合わせである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
その必要の主題にＰＶＭＣｓの治療上有効量から成る組成物を与えることから成る骨組織を再建する方法。
【請求項４２】
その必要の主題にＰＶＭＣｓの治療上有効量から成る組成物を与えることから成る骨の範囲内で金属装置を固定する方法。
【請求項４３】
請求項４２（金属装置が頭蓋顔面骨、頭蓋、下顎骨、ｃｌａｖｉｃｕｌｅ、肩甲骨、胸骨、肋骨、上腕骨、尺骨、半径、心皮、指骨、掌骨、膝蓋骨、腓骨、大腿骨、脛骨、足根骨、中足骨、仙骨、股関節または腰椎から選択される骨において、固定される）の方法。
【請求項４４】
ＰＶＭＣｓをアンビリカル・コード血管から分離する方法は、以下を含む：臍帯血容器を消耗させること、ＰＶＭＣを分離するために第１の酵素混合物をアンビリカル・コード血管に加えること、媒体を加えること、そして、媒体を加えた後に洗浄溶離剤を集めて。そこにおいて、洗浄溶離剤は、内皮、内皮細胞下細胞およびそれらの組み合わせから選択される細胞の細胞懸濁液から成る。
【請求項４５】
アンビリカル・コード血管が静脈または動脈である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第１の酵素の混合物がコラゲナーゼから選択される酵素、中性であるか酸性プロテアーゼ、ＧＡＧａｓｅｓ、メタロプロテアーゼｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システイン・プロテアーゼおよびそれらの組み合わせを具える、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
請求項４４に記載の方法において、第１の酵素混合物が、さらに、媒体、抗生物質およびそれらの組み合わせから選択される第２の薬品を含む方法。
【請求項４８】
請求項４７（媒体がタイロードの溶液、泌乳されたリンゲルの解決手段、ａｃｅｔａｔｅｄされたリンガー溶液、ＴＲＩＳを緩衝された食塩水（ＴＢＳ）ハンクのバランスのよい食塩水（ＨＢＳＳ）アールのバランスのよい食塩水（ＥＢＳＳ）スタンダード塩性のクエン酸塩（ＳＳＣ）ＨＥＰＥＳを緩衝された食塩水（ＨＢＳ）Ｇｅｙのバランスのよい食塩水（ＧＢＳＳ）最小限の必須の中程度のイーグルα変更態様（α―ＭＥＭ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびそれらの組み合わせから選択される）の方法。
【請求項４９】
請求項４７（抗生物質がストレプトマイシン、ゲンタマイシン、菌ゾーン、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎＧ、アンホテリシンＢおよびそれらの組み合わせから選択される）の方法。
【請求項５０】
臍帯血容器を消耗させることがアンビリカル・コード血管に針を中に嵌入して、媒体を有するアンビリカル・コード血管を洗浄することを具える、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
請求項４４（媒体がタイロードの溶液、泌乳されたリンゲルの解決手段、ａｃｅｔａｔｅｄされたリンガー溶液、ＴＲＩＳを緩衝された食塩水（ＴＢＳ）ハンクのバランスのよい食塩水（ＨＢＳＳ）アールのバランスのよい食塩水（ＥＢＳＳ）スタンダード塩性のクエン酸塩（ＳＳＣ）ＨＥＰＥＳを緩衝された食塩水（ＨＢＳ）Ｇｅｙのバランスのよい食塩水（ＧＢＳＳ）最小限の必須の中程度のイーグルα変更態様（α―ＭＥＭ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびそれらの組み合わせから選択される）の方法。
【請求項５２】
請求項４４の方法（約１５の？Ｃから約３８の？Ｃ．にわたっている温度で第１の酵素混合物を有するアンビリカル・コード血管を暖めることを更に含む）
【請求項５３】
請求項５２（アンビリカル・コード血管が約１５〜約６０分間の第１の酵素混合物によって、暖められてもよい）の方法。
【請求項５４】
更に成り立っていて、酵素を不活性化している請求項５２の方法。
【請求項５５】
そこにおいて、請求項４４の中で方法、媒体は、タイロードの溶液、泌乳されたリンゲルの解決手段、ａｃｅｔａｔｅｄされたリンガー溶液、ＴＲＩＳを緩衝された食塩水（ＴＢＳ）ハンクのバランスのよい食塩水（ＨＢＳＳ）アールのバランスのよい食塩水（ＥＢＳＳ）クエン酸（ＳＳＣ）スタンダード食塩水、ＨＥＰＥＳを緩衝された食塩水（ＨＢＳ）Ｇｅｙのバランスのよい食塩水（ＧＢＳＳ）最小限の必須の中程度のイーグルα変更態様（α―ＭＥＭ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはそれらの組み合わせから選択される。
【請求項５６】
請求項４４の方法（第２の酵素混合物をアンビリカル・コード血管に加えることを更に含む）。
【請求項５７】
そこにおいて、請求項５６の中で方法、第２の酵素混合物は、コラゲナーゼ、中性であるか酸性プロテアーゼ、ＧＡＧａｓｅｓ、メタロプロテアーゼｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システイン・プロテアーゼまたはそれらの組み合わせから選択される酵素から成る。
【請求項５８】
請求項５６に記載の方法において、第２の酵素混合物が、さらに、媒体、抗生物質およびそれらの組み合わせから選択される第２の薬品を含む方法。
【請求項５９】
請求項５６（媒体がタイロードの溶液、泌乳されたリンゲルの解決手段、ａｃｅｔａｔｅｄされたリンガー溶液、ＴＲＩＳを緩衝された食塩水（ＴＢＳ）ハンクのバランスのよい食塩水（ＨＢＳＳ）アールのバランスのよい食塩水（ＥＢＳＳ）スタンダード塩性のクエン酸塩（ＳＳＣ）ＨＥＰＥＳを緩衝された食塩水（ＨＢＳ）Ｇｅｙのバランスのよい食塩水（ＧＢＳＳ）最小限の必須の中程度のイーグルα変更態様（α―ＭＥＭ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはそれらの組み合わせから選択される）の方法。
【請求項６０】
請求項５６（抗生物質がストレプトマイシン、ゲンタマイシン、菌ゾーン、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎＧ、アンホテリシンＢまたはそれらの組み合わせから選択される）の方法。
【請求項６１】
請求項５６の方法（約１５の？Ｃから約３８の？Ｃ．にわたっている温度で第２の酵素混合物を有するアンビリカル・コード血管を暖めることを更に含む）
【請求項６２】
請求項６１（アンビリカル・コード血管が約１５〜約６０分間の第２の酵素混合物によって、暖められる）の方法。
【請求項６３】
更に成り立っていて、酵素を不活性化している請求項６１の方法。
【請求項６４】
請求項５６の方法（第２の酵素混合物を有するアンビリカル・コード血管を暖めた後に第２の媒体をアンビリカル・コード血管に加えることを更に含む）。
【請求項６５】
請求項６４（第２の媒体がタイロードの溶液、泌乳されたリンガー溶液、ａｃｅｔａｔｅｄされたリンガー溶液、ＴＲＩＳを緩衝された食塩水（ＴＢＳ）ハンクのバランスのよい食塩水（ＨＢＳＳ）アールのバランスのよい食塩水（ＥＢＳＳ）スタンダード塩性のクエン酸塩（ＳＳＣ）ＨＥＰＥＳを緩衝された食塩水（ＨＢＳ）Ｇｅｙのバランスのよい食塩水（ＧＢＳＳ）最小限の必須の中程度のイーグルα変更態様（α―ＭＥＭ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはそれらの組み合わせから選択される）の方法。
【請求項６６】
請求項６４の方法（媒体を加えた後に第２の洗浄溶離剤を集めることを更に含む）。
【請求項６７】
第２の洗浄溶離剤が内皮、内皮細胞下細胞およびそれらの組み合わせから選択される細胞の細胞懸濁液を具える、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
請求項６６の方法（媒体を有する第２の溶離剤を洗うことを更に含む）。
【請求項６９】
そこにおいて、請求項６８の中で方法、媒体は、タイロードの溶液、泌乳されたリンガー溶液、ａｃｅｔａｔｅｄされたリンガー溶液、ＴＲＩＳを緩衝された食塩水（ＴＢＳ）ハンクのバランスのよい食塩水（ＨＢＳＳ）アールのバランスのよい食塩水（ＥＢＳＳ）クエン酸（ＳＳＣ）スタンダード食塩水、ＨＥＰＥＳを緩衝された食塩水（ＨＢＳ）Ｇｅｙのバランスのよい食塩水（ＧＢＳＳ）最小限の必須の中程度のイーグルα変更態様（α―ＭＥＭ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはそれらの組み合わせから選択されてもよい。
【請求項７０】
請求項６７（細胞中止がＰＶＭＣｓから成ってもよい）の方法。
【請求項７１】
請求項６７の方法（細胞中止を細胞培養培地で培養することを更に含む）。
【請求項７２】
請求項７１（細胞中止がＰＶＭＣｓおよびそこにおいて、ＰＶＭＣｓが細胞培養皿に付着できることを成ってもよい）の方法。
【請求項７３】
請求項７０の方法（濃縮分解されたＰＶＭＣｓの人口を得るためにＰＶＭＣｓに集中することを更に含む）。
【請求項７４】
請求項６７の方法（ＰＶＭＣｓを中止が細胞培養培地で培養した細胞から分離することを更に含む）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年８月２９日付で出願された米国特許仮出願第６１／５２８，５５６号、２０１１年８月２９日付で出願された米国特許仮出願第６１／５２８，５６３号、および２０１１年８月２９日付で出願された米国特許仮出願第６１／５２８，５６７号の恩典を主張するものであり、これらの各々は、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
本明細書中の実施形態は、血管周囲薬用細胞（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｅｌｌｓ：「ＰＶＭＣｓ」）を単離するための方法を対象とする。一部の実施形態は、ＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離するための方法を対象とする。一部の実施形態は、ＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離するための方法であって、前記臍帯血管から排出する工程と；第１の酵素混合物を前記臍帯血管に添加してＰＶＭＣを解離させる工程と；培地を添加する工程と；前記培地の添加後に洗浄溶出液を採取する工程とを有する方法を対象とし、ここで前記洗浄溶出液は、内皮細胞、内皮下細胞、およびそれらの組合せから選択される細胞の細胞浮遊液を有する。一部の実施形態において、前記臍帯血管は、静脈または動脈である。
【０００３】
一部の実施形態において、前記第１の酵素混合物は、コラゲナーゼ、中性または酸性プロテアーゼ、ＧＡＧアーゼ、メタロプロテアーゼ  クロストリパイン、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、およびそれらの組合せから選択される酵素を有する。一部の実施形態において、前記第１の酵素混合物は、培地、抗生物質、およびそれらの組合せから選択される第２の薬剤をさらに有する。一部の実施形態において、前記培地は、タイロード液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、最小必須培地イーグルアルファ変性（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：α−ＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、およびそれらの組合せから選択される。一部の実施形態において、前記抗生物質は、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ファンギゾン、ペニシリンＧ、アンホテリシンＢ、およびそれらの組合せから選択される。
【０００４】
前記方法の一部の実施形態は、前記臍帯血管を前記第１の酵素混合物とともに約１５℃から約３８℃の範囲の温度で恒温放置する工程をさらに有する。一部の実施形態では、前記臍帯血管は前記第１の酵素混合物とともに約１５から約６０分間恒温放置されることがある。一部の実施形態において、前記方法は、前記酵素を不活性化する工程をさらに有する。
【０００５】
前記方法の一部の実施形態において、前記培地は、タイロード液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、最小必須培地イーグルアルファ変性（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：α−ＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、またはそれらの組合せから選択される。
【０００６】
前記方法の一部の実施形態は、第２の酵素混合物を前記臍帯血管に添加する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記第２の酵素混合物は、コラゲナーゼ、中性もしくは酸性プロテアーゼ、ＧＡＧアーゼ、メタロプロテアーゼ  クロストリパイン、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、またはそれらの組合せから選択される酵素を有する。一部の実施形態において、前記第２の酵素混合物は、培地、抗生物質、およびそれらの組合せから選択される第２の薬剤をさらに有する。一部の実施形態において、前記培地は、タイロード液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、最小必須培地イーグルアルファ変性（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：α−ＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、またはそれらの組合せから選択される。一部の実施形態において、前記抗生物質は、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ファンギゾン、ペニシリンＧ、アンホテリシンＢ、またはそれらの組合せから選択される。
【０００７】
前記方法の一部実施形態は、前記臍帯血管を前記第２の酵素混合物とともに約１５℃から約３８℃の範囲の温度で恒温放置する工程をさらに有する。一部の実施形態では、前記臍帯血管は前記第２の酵素混合物とともに約１５から約６０分間恒温放置される。一部の実施形態において、前記方法は、前記酵素を不活性化する工程をさらに有する。
【０００８】
前記方法の一部実施形態は、前記臍帯血管を前記第２の酵素混合物とともに恒温放置した後に該臍帯血管に第２の培地を添加する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記第２の培地は、タイロード液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、最小必須培地イーグルアルファ変性（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：α−ＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、またはそれらの組合せから選択される。
【０００９】
前記方法の一部の実施形態は、前記培地を添加した後に第２の洗浄溶出液を採取する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記第２の洗浄溶出液は、内皮細胞、内皮下細胞、およびそれらの組合せから選択される細胞の細胞浮遊液を有する。
【００１０】
前記方法の一部の実施形態は、前記第２の溶出液を培地で洗浄する工程をさらに有する。一部の実施形態では、前記培地は、タイロード液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、最小必須培地イーグルアルファ変性（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：α−ＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、またはそれらの組合せから選択され得る。前記方法の一部の実施形態において、前記細胞浮遊液は、ＰＶＭＣｓを有することがある。
【００１１】
前記方法の一部の実施形態は、細胞培養培地中で前記細胞浮遊液を培養する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記細胞浮遊液は、ＰＶＭＣｓを有することがあり、ここで前記ＰＶＭＣｓは、細胞培養皿への接着が可能である。前記方法の一部の実施形態は、前記ＰＶＭＣｓを濃縮して、濃縮された脱凝集ＰＶＭＣｓの集団を得る工程をさらに有する。
【００１２】
前記方法の一部の実施形態は、前記ＰＶＭＣｓを細胞培養培地中で培養された前記細胞浮遊液から単離する工程をさらに有する。
【００１３】
一部の実施形態は、ＰＶＭＣｓを骨から単離するための方法を対象とする。一部の実施形態は、ＰＶＭＣｓを骨から単離するための方法であって、（ｉ）被検者からの骨組織の試料を提供する工程と；（ｉｉ）前記ＰＶＭＣｓを前記骨から抽出する工程と；（ｉｉｉ）前記抽出されたＰＶＭＣｓを濃縮する工程とを有する方法を対象とする。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓを抽出する工程は、（ｉ）細胞浮遊液を前記骨組織から酵素消化、機械力、またはそれらの組合せによって抽出する段階と；（ｉｉ）ＰＶＭＣｓの集団を前記細胞浮遊液から浮遊密度沈降、濾過、遠心分離、またはそれらの組合せによって分離する段階とを有する。一部の実施形態は、前記骨組織を破砕する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記酵素消化は、小血管の基底膜からＰＶＭＣの付着を切断する１若しくはそれ以上の酵素を使用する。一部の実施形態では、前記抽出されたＰＶＭＣｓを濃縮する工程は、前記ＰＶＭＣ上の細胞表面抗原に対して親和性を有する抗体を含有する磁性ビーズの使用を有する方法によって果たされる。一部の実施形態において、前記抗体は、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１６６、抗ＣＤ２７１、またはそれらの組合せから選択される。
【００１４】
一部の実施形態は、ＰＶＭＣｓを有する組成物を対象とする。一部の実施形態は、複数のＰＶＭＣｓと許容され得る担体とを有する組成物である。前記組成物の一部の実施形態において、前記複数のＰＶＭＣｓは、骨、臍帯血管、またはそれらの組合せに由来するＰＶＭＣｓを有する。前記組成物の一部の実施形態において、前記骨は、骨細片、骨髄組織および他の組織、緻密骨、髄間管（ｉｎｔｅｒｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｃａｎａｌ）からの骨髄、骨細片、骨梁骨小腔、骨小腔洗浄、またはそれらの組合せを有する。前記組成物の一部の実施形態は、骨髄細胞をさらに有する。前記組成物の一部の実施形態は、足場材料をさらに有する。前記組成物の一部の実施形態において、前記足場材料は、骨細片、セラミック系代用骨移植片、リン酸カルシウムセラミックス、硫酸カルシウムセラミックス、バイオガラス、ポリマー系代用骨移植片、分解性および非分解性ポリマー、加工同種骨移植材料、石灰化加工同種移植片、脱灰加工同種移植片、コラーゲンスポンジ、またはそれらの組合せを有する。
【００１５】
一部の実施形態は、ＰＶＭＣを対象とする。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣは、骨に由来する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣは、臍帯血管に由来する。一部の実施形態において、前記骨は、骨細片、骨梁骨小腔、骨髄、骨小腔洗浄、またはそれらの組合せを有する。
【００１６】
一部の実施形態は、ＰＶＭＣｓを有する医薬組成物を対象とする。一部の実施形態は、治療有効量の複数の単離されたＰＶＭＣｓと医薬的に許容され得る担体とを有する医薬組成物を対象とする。一部の実施形態において、前記複数のＰＶＭＣｓは、骨、臍帯血管、ＰＶＭＣｓを含有する解剖学的源、またはそれらの組合せに由来するＰＶＭＣｓを有する。一部の実施形態において、前記骨は、骨細片、骨梁骨小腔、骨髄、骨小腔洗浄、またはそれらの組合せを有する。前記医薬組成物の一部の実施形態は、骨髄細胞をさらに有する。前記医薬組成物の一部の実施形態は、足場材料をさらに有する。一部の実施形態において、前記足場材料は、骨細片、セラミック系代用骨移植片、リン酸カルシウムセラミックス、硫酸カルシウムセラミックス、バイオガラス、ポリマー系代用骨移植片、分解性および非分解性ポリマー、加工同種骨移植材料、石灰化加工同種移植片、脱灰加工同種移植片、コラーゲンスポンジ、またはそれらの組合せを有する。
【００１７】
一部の実施形態は、強化された自家骨移植片を作製する方法であって、（ｉ）骨移植片として使用される骨組織の第１の部分を被検者から抽出する工程、その後（ｉｉ）前記骨移植片に濃縮されたＰＶＭＣｓの集団を補充する工程を有する方法を対象とする。
【００１８】
一部の実施形態は、強化された自家骨移植片を作製するための方法であって、
ａ．細胞浮遊液を被検者からの骨組織の第１の部分から酵素、機械力、またはそれらの組合せで抽出する工程と；
ｂ．前記細胞浮遊液中の細胞を浮遊密度沈降、濾過、または遠心分離によって濃縮して、濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの集団を獲得する工程と；
ｃ．前記被検者からの骨移植片として使用するための骨組織の第２の部分に濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの前記集団を補充して、前記強化された自家骨移植片を作製する工程と
を有する方法を対象とする。
【００１９】
一部の実施形態において、骨組織の前記第１の部分は、大腿骨の近位領域、大腿骨の遠位領域、またはそれらの組合せが起源である。一部の実施形態において、骨組織の前記第２の部分は、腸骨稜、大腿骨、膝蓋骨、脛骨、上腕骨、鎖骨、肋骨、肩甲骨、またはそれらの組合せのうちの少なくとも１つを有する人骨が起源である。一部の実施形態は、前記強化された自家骨移植片に新鮮な自家骨髄、加工自家骨髄、冷凍自家骨髄、新鮮な自家骨、加工自家骨、冷凍自家骨、またはそれらの組合せを補充する工程をさらに有する。
【００２０】
一部の実施形態は、細胞機能に影響を及ぼす疾患を処置する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、部位依存性栄養因子を分泌することができる。一部の実施形態において、前記部位依存性栄養因子は、プロスタグランジンＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２：ＰＧＥ２）、間質細胞由来因子−１（ｓｔｒｏｍａｌ−ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＳＤＦ−１  血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ１６５、インターロイキン−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β：ＩＬ−β）、インターロイキン−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６：ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−７：ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８：ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２：ＩＬ−１２）、インターロイキン−１６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１６：ＩＬ−１６）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ：ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １：ＩＧＦ−１）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ：ＩＤＯ）、インターロイキン−１０（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０：ＩＬ−１０）、ヒト白血球抗原Ｇ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｇ：ＨＬＡ−Ｇ）、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体（ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）、エオタキシン、顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、活性化により調節される、発現され分泌された正常Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ：ＲＡＮＴＥＳ）、ＩＬ−１受容体アゴニスト（ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ：ＩＬ−１ｒａ）、腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）、ＴＮＦ−α、腫瘍壊死因子−β（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−β：ＴＮＦ−β）、上皮好中球活性化タンパク質７８（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７８：ＥＮＡ−７８）、エオタキシン、単球走化性タンパク質１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔ��ｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：ＭＣＰ−１）、単球走化性タンパク質３（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３：ＭＣＰ−３）、マクロファージ炎症性タンパク質−１  α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  α：ＭＩＰ−１  α）、マクロファージ炎症性タンパク質−３  α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３  α：ＭＩＰ−３  α）、マクロファージ炎症性タンパク質−１  β（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  β：ＭＩＰ−１  β）、細胞間接着分子−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：ＩＣＡＭ−１）、ＶＣＡＭ−１、顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、成長ホルモン、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ：ＳＣＦ）、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ＴＳＨ）、ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド、胎盤成長因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰｌＧＦ）、エオタキシン−３、フラクタルカイン、上皮好中球活性化タンパク質７８（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７８：ＥＮＡ−７８）、インターフェロン誘導性Ｔ細胞アルファ化学誘引物質（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｌｐｈａ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ：ｉ−ＴＡＣ）、成長調節癌遺伝子−アルファ（ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ−ａｌｐｈａ：ＧＲＯα）、成長調節癌遺伝子−ベータ（ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ−ｂｅｔａ：ＧＲＯβ）、インターフェロン誘導性タンパク質−１０（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１０：ＩＰ−１０）、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４４、ＣＤ２７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０、またはそれらの組合せから選択される。一部の実施形態において、前記疾患は、虚血性心疾患、熱傷、脳卒中、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、狼瘡、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、多発外傷、骨折、糖尿病、またはそれらの組合せである。
【００２１】
一部の実施形態は、骨組織を再建する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。
【００２２】
一部の実施形態は、金属デバイスを骨の中に固定する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。一部の実施形態では、前記金属デバイスは、頭蓋顔面骨、頭蓋骨、下顎骨、鎖骨、肩甲骨、胸骨、肋骨、上腕骨、尺骨、橈骨、心皮、指節骨、中手骨、膝蓋骨、腓骨、大腿骨、脛骨、足根骨、中足骨、仙骨、寛骨、または腰椎から選択される骨内に固定される。
【００２３】
一部の実施形態は、アポトーシスを修飾する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。
【００２４】
一部の実施形態は、有糸分裂を修飾する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。
【００２５】
一部の実施形態は、血管新生を修飾する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。
【００２６】
一部の実施形態は、骨形成を修飾する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。一部の実施形態において、前記血管周囲薬用細胞は、骨芽細胞を形成する能力を有する。
【００２７】
一部の実施形態は、免疫修飾方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。
【００２８】
一部の実施形態は、骨細片を製造する方法であって、骨断片を破砕機またはボーンミルに通す工程を有する方法を対象とする。一部の実施形態では、前記骨断片は極低温冷凍される。
【００２９】
一部の実施形態は、骨形成原細胞をＰＶＭＣ調製物から分離する方法であって、リン酸カルシウム基材への前記調製物中の細胞の吸着を判定する工程を有する方法であって、高い親和性は、骨形成原細胞の存在を示す方法を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本明細書に記載の実施形態に従ってＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離するための例示的工程を図示するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
一部の実施形態は、一般に、細胞、ヒト組織に関し、より詳細には、ヒト組織由来ＰＶＭＣｓ、ヒト組織由来ＰＶＭＣｓを使用する方法、骨由来および臍帯血管由来ＰＶＭＣｓを含有する組成物、ならびに骨由来および臍帯血管由来ＰＶＭＣｓを調製および使用するためのシステムに関する。
【００３２】
間葉幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣｓ）の周皮細胞としての同定は、骨形成、再生、および修復のプロセスに新しい意味を持たせた。成長因子およびシグナル伝達分子がＭＳＣｓと一緒にこれらのプロセスにおいて重要な役割を果たす。
【００３３】
新たな血管系の形成もまた、骨成長、再生、および修復において、前記プロセスを駆動する点でも、骨形成を方向づける点でも、重大な役割を果たす。血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）などのシグナル伝達分子は、骨への骨芽細胞分化を刺激する機能があると考えられる。生理的には、ＰＤＧＦｓは、周皮細胞をそれらの反管腔側の在所から損傷部位に動員すること、前記細胞集団の増殖を誘発すること、ならびに骨芽細胞の成長および分化を制御することができ、新たな血管形成を促進することもできる。
【００３４】
収率、一貫性、および／または純度が増した活性ＰＶＭＣｓの集団を迅速かつ確実に調製することができ、それによって前記細胞の抽出後操作の必要を低減または排除することができる、交代のアプローチが必要とされている。理想的には、この細胞集団は、レシピエントへのそれらの直接配置に適している手法で獲得されることになる。
【００３５】
インビトロで、周皮細胞、すなわち血管周囲細胞は、骨原性、軟骨原性、脂肪原性、および筋原性系列への多分化能があり、それらの細胞表面発現プロファイル（ＣＤ１４６＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５、およびＣＤ４６−）の点でＭＳＣｓに類似している。
【００３６】
局在血管周囲細胞は、生理的骨治癒（すなわち、仮骨形成）に一定の役割を果たすことができる。さらに、血管系による軟骨の軟骨内置換は、血管周囲細胞を損傷部位にもたらす。これらの血管周囲細胞は、同所性および異所性位置両方で血管によって駆動される骨における分化が可能であり得る。
【００３７】
骨損傷、例えば、限定ではないが骨折は、以前には連結していた２つの骨片間の分離を特徴とし得る。前記２つの骨片間に作られる間隙は、間葉前駆細胞で満たされ、間葉前駆細胞が、軟骨に分化する（機械的に不安定な骨折箇所）、または血管を前記骨折箇所にまたがらせる（機械的に安定した骨折箇所）。これらの空間を満たす細胞が前記間隙にまたがり、結合組織を形成する骨折端間の接続を提供する。骨損傷後の前記接続空間全体にわたる前記骨折箇所外での骨形成の駆動因子は血管であり、該血管は、前記前駆細胞を骨形成性骨芽細胞になるように方向づけ、これらの骨芽細胞は、それらの基底外側が該血管に対向するように方向づけられ、協調して、それらの先端側部からそれらは類骨を分泌し、類骨が最終的に石灰化されて体重支持骨を形成する。一部の実施形態では、本明細書における実施形態の前記ＰＶＭＣｓを使用して、間葉前駆細胞の役割を果たすことができる。
【００３８】
自家骨移植は、例えば、限定ではないが骨損傷後、局所的骨欠損が存在する場合、および偽関節の際、骨原性再生を誘導するための有効なツールであり得る。理論により拘束されることを望まないが、骨髄穿刺濃縮物（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＢＭＡＣ）を用いる自家骨移植は、間葉幹細胞を含有することができ、間葉幹細胞は、免疫細胞増殖、分化、および表現型の調節に一役割を果たすことができ、炎症および損傷を和らげることができ、組織再生を駆動するエフェクター分子を生産することができると考えられる。
【００３９】
本発明の組成物および方法を記載する前に、記載された特定のプロセス、組成物、または方法論は変わることがあるので、本発明はこれらに限定されないことを理解されたい。説明の中で用いる専門用語は、特定のバージョンまたは実施形態を記載するためのものにすぎず、本発明の範囲を限定するためのものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになることも理解されたい。別段の定義がない限り、本明細書において用いるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験の際に使用することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料を今から記載する。本明細書において言及するすべての出版物は、この参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。先行発明によるそのような開示より前に生じたものとする権利が本発明にないことを認めるものと見なすべきものは、本明細書にはない。
【００４０】
本明細書においておよび添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明確な指図がない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「血管周囲薬用細胞」（ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｅｌｌ：ＰＶＭＣ）への言及は、１若しくはそれ以上のＰＶＭＣｓおよび当業者に公知のそれらの等価物などへの言及である。
【００４１】
本明細書において用いる場合、用語「約」は、それを用いている数の数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。したがって、約５０％は、４５％〜５５％の範囲内を意味する。
【００４２】
用語「血管周囲薬用細胞」または「ＰＶＭＣ」は、本明細書において用いる場合、単核細胞、内皮細胞、内皮下細胞、血管周囲細胞、または骨形成原細胞を指す。ＰＶＭＣ単核細胞は、ＣＤ１４６＋、ＣＤ２７１＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ２９＋、ＳＳＥＡ４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ３１−、ｖＷＦ−、およびＣＤ１４−、またはそれらの組合せから選択される分化抗原群（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ＣＤ）マーカーの１つ、一部、またはすべての発現によって特徴づけられる。ＰＶＭＣ内皮または内皮下細胞は、Ｓｙｔｏ１６＋、ＣＤ４５−、ＣＤ３１＋、ＣＤ１５６＋、またはそれらの組合せの１つ、一部、またはすべての発現によって特徴づけられる。ＰＶＭＣ骨形成原細胞は、アルカリホスファターゼ、オステオポンチン、オステオカルシン、またはそれらの組合せの１つ、一部、またはすべての発現によって特徴づけられる。ＰＶＭＣｓは、ＭＨＣクラスＩについて陰性であることもあるが、ＭＨＣクラスＩＩを発現することもある。単離されたＰＶＭＣｓを、細胞表面ポリペプチドなどのマーカーの存在に基づいて、他の細胞タイプと区別することができる。これらのマーカーの検出は、免疫細胞化学、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＲＴ−ＰＣＲ）などを用いて行うことができる。ＰＶＭＣｓの同定に有用なマーカーとしては、これに限定されるものではないが、成長因子受容体：ＣＤ１２１（ＩＬ−１Ｒ）、ＣＤ２５（ＩＬ−２Ｒ）、ＣＤ１２３（ＩＬ−３Ｒ）、ＣＤ７１（トランスフェリン受容体）、ＣＤＩ１７（ＳＣＦ−Ｒ）、ＣＤ１１４（（３−ＣＳＦ−Ｒ）、ＰＤＧＦ−Ｒ、およびＥＧＦ−Ｒ；造血系マーカー：ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３；接着受容体：ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ１０２（ＩＣＡＭ−２）、ＣＤ５０（ＩＣＡＭ−３）、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ６２ｅ（Ｅ−セレクチン）、ＣＤ３Ｉ（ＰＥＣＡＭ）、ＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体）；インテグリン：ＣＤ４９ａ（ＶＬＡα）、ＣＤ４９ｂ（ＶＬＡα２）、ＣＤ４９ｃ（ＶＬＡ−α３）、ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ−α４）、ＣＤ４９ｅ（ＶＬＡα５）、ＣＤ２９（ＶＬＡ−β）、ＣＤ１０４（β４−インテグリン）；ならびに他の多種多様なマーカー：Ｄ９０（Ｔｈｙ１）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、およびＣＤ８（Ｂ７−２）を含むことができる。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、ＣＤ１４６＋、ＣＤ２７１＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１６６＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ２９＋、ＳＳＥＡ４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ３１−、ｖＷＦ−、ＣＤ１４−、またはそれらの組合せを発現する、臍帯血管に由来する細胞を含むことができる。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、臍帯血管、内皮細胞、骨形成原細胞、またはそれらの組合せに由来する細胞を含むことができる。一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓは、ＰＶＭＣｓを含有することができる任意の解剖学的源に由来することができる。細胞学的源の例は、これに限定されるものではないが、血管（これに限定されるものではないが、静脈および動脈を含む）、骨膜、骨梁骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、膵臓、肺、肝臓、羊水、胎盤、および血液を含む。ＰＶＭＣｓは、これに限定されるものではないが、細胞表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３  ＣＤ１４６、およびＣＤ１６６を発現することができる。一部の実施形態において、ＰＶＭＣ調製物は、抗原発現および生存力の点においてかつＣＤ７３＋／ＣＤ１０５＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ２９＋／ＳＳＥＡ４＋／ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ｖＷＦ−／ＣＤ１４−の表現型を発現するように９０％超純粋であることができる。これらのＰＶＭＣｓは、ＭＨＣクラスＩについて陰性であることもあるが、ＭＨＣクラスＩＩを発現することもある。一部の実施形態において、ＰＶＭＣ調製物は、９０％未満純粋、８０％未満純粋、７０％未満純粋、６０％未満純粋、または５０％未満純粋であると予想される。
【００４３】
ＰＶＭＣ細胞表面マーカーは、ヒトＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｖＷＦ、およびＣＤ１４に対するものを含む様々な抗体で標識した後、ＦＡＣＳによって特徴づけることができる。一部の実施形態では、その後、フルオレシンと結合させた二次抗体を使用することができる。
【００４４】
本明細書において用いる場合、用語「単離されたＰＶＭＣ」は、ＰＶＭＣｓが生物から単離された、ＰＶＭＣ、ＰＶＭＣ集団、またはＰＶＭＣ調製物を指す。一部の実施形態において、前記生物は、哺乳動物である。一部の実施形態において、前記哺乳動物は、妊娠哺乳動物である。一部の実施形態において、前記妊娠哺乳動物は、ヒトである。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣは、骨膜、骨梁骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、膵臓、肺、肝臓、羊水、胎盤、血液、および臍帯血管、またはそれらの組合せから単離されたＰＶＭＣである。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣは、骨に由来するＰＶＭＣである。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣは、臍帯血管に由来するＰＶＭＣである。
【００４５】
一部の実施形態では、ＰＶＭＣ複合体を単離することができる。一部の実施形態において、ＰＶＭＣ複合体は、細胞の群を有する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣ複合体は、骨形成原細胞、単核細胞、内皮細胞  内皮下細胞、間葉幹細胞、またはこれらの組合せを含むことができる。自家移植片を使用または作製する実施形態において、前記ＰＶＭＣは、ＰＶＭＣ複合体であることがあり、または精製されたＰＶＭＣであることもある。
【００４６】
ＰＶＭＣｓは、分化、栄養媒介因子の生産、および宿主環境との相互作用において広範な多様性を呈示する。一部の実施形態において、本発明の前記ＰＶＭＣｓは、自家性であることもあり、同種異系であることもあり、または異種源からのものであることもある。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣは、自家使用を意図したものである。ＰＶＭＣｓを単離することができ、これらの細胞を、それらが育てられた患者に投与して戻すことができる。この自家移植技術は、免疫抑制プロトコルの必要がないようにする。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、胚性である場合もあり、または出生後の源からのものである場合もある。骨髄を、腸骨稜、大腿骨、脛骨、肋骨、もしくは他の骨髄腔、またはそれらの組合せから獲得することができる。他のＰＶＭＣｓ源としては、脂肪、骨膜、皮膚、および骨格筋、肝臓、胎盤、血液、および臍帯血管、またはそれらの組合せを含む。
【００４７】
本明細書において用いる場合、用語「薬用能力（ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ）」は、特定の生理環境で前記ＰＶＭＣによって分泌される分子の範囲を指す。ＰＶＭＣｓは、免疫修飾機能の一因となり損傷部位で再生環境を提供することによっていわゆる「栄養効果」を別個にもたらす膨大な一連の生物活性分子から、それらの薬用特性を引き出す。
【００４８】
本明細書において用いる場合、用語「栄養効果」は、部位に依存して前記ＰＶＭＣにより分泌される分子の範囲を指す。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓの栄養効果は、前記ＰＶＭＣの身体位置に非常に依存して変化することになる。例えば、一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓによる生物活性分子の分泌および生成は、抗原提示およびＴ細胞前駆体増殖に影響を及ぼすことによりＴ細胞阻害をもたらして、免疫監視機構から損傷部位を保護することができ、傷害を受けた組織に対する自己免疫感作を未然に防ぐことができる。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、虚血組織において抗アポトーシス効果を有することができる。ＰＶＭＣｓによって分泌される分子は、正常レベルの酸素または栄養素を損傷した組織に侵入させない破断または機能不全血管に起因する細胞死から保護することが可能であり得る。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、抗瘢痕化または抗線維化効果を有することができる。ＰＶＭＣｓによって分泌される分子は、創傷部位における筋線維芽細胞の侵入または機能を阻害し、その結果、高濃度コラゲナーゼ瘢痕組織の形成を阻害することができる。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、血管新生効果を有することができる。ＰＶＭＣｓによって分泌される分子は、損傷部位への内皮細胞またはそれらの前駆体の動員を惹起することが可能であり得、その損傷部位でそれらは分裂し、原始血管を形成することができる。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣは、それ自体が周皮細胞に成長して、新たに形成された血管に付着し、発生期血管に安定性を提供することができる。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、組織固有前駆体に分裂および分化するように影響を及ぼす分裂促進因子を分泌し、損傷部位の組織を再生することができる。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、様々な修復およびヘルパー細胞を損傷部位に動員することができる強力な化学誘引物質を分泌し、組織再生を促進することができる。
【００４９】
ＰＶＭＣｓは、消化された細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ：ＥＣＭ）にも他の走化性刺激にも応答して、損傷部位に移動することが可能であり得る。ＰＶＭＣｓによる生物活性分子の分泌または生成は、抗原提示およびＴ細胞前駆体増殖に影響を及ぼすことによりＴ細胞阻害をもたらして、免疫監視機構から損傷部位を保護することができ、傷害を受けた組織に対する自己免疫感作を未然に防ぐことができる。
【００５０】
それを必要とする被検者へのＰＶＭＣｓの投与は、損傷部位に存在するＰＶＭＣｓの数の増加のためＰＶＭＣの生理および治療効果を増強する結果となる。一部の実施形態において、それを必要とする被検者へのＰＶＭＣｓの投与は、該被検者体内のＰＶＭＣｓの数を増加させる結果となる。一部の実施形態において、ＰＶＭＣ投与の前記生理および治療効果は、損傷部位に存在するＰＭＶＣｓの数と正の相関関係がある。
【００５１】
本明細書において用いる場合、用語「細胞培地（単数）」または「細胞培地（複数）」を用いて、単核細胞および／または神経細胞が成長する細胞成長培地を記載する。細胞培地は、当該技術分野において周知であり、少なくとも最小必須培地に加えて任意選択の薬剤、例えば、成長因子、グルコース、非必須アミノ酸、インスリン、トランスフェリン、および当該技術分野において周知の他の薬剤を有する。
【００５２】
本明細書において用いる場合、用語「非接着細胞」を用いて、培養期間の終了時に組織培養フラスコ内に浮遊状態で残存する細胞を記載する。
【００５３】
用語「接着細胞」を用いて、組織培養プラスチックに付着しており、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬからの酵素不含細胞解離バッファーの添加によりまたはトリプシン−ＥＤＴＡの添加によりフラスコから剥離される細胞を記載する。
【００５４】
本明細書において用いる場合、用語「単核細胞」を用いて、骨髄または臍帯血管または血液から単離された単一の核を含有する細胞を記載する。単核細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）またはＰＥＲＣＯＬＬ（商標）の密度勾配を用いて単離することができる。単核細胞を骨髄または臍帯血管または血液から獲得し、ＰＶＭＣｓ源として使用する。
【００５５】
本明細書において用いる場合、用語「骨」は、骨髄組織および他の骨関連組織、緻密骨（これに限定されるものではないが、骨細片、骨断片、骨粉、または骨セグメントなどを含む）、髄間管からの骨髄、またはそれらの組合せを指す。一部の実施形態において、用語「骨」は、骨髄を含む。
【００５６】
本明細書において用いる場合、用語「骨由来」は、限定ではいが、骨、骨細片、骨粉、骨セグメント、骨断片、骨髄、または骨小腔洗浄から単離された材料を指す。骨小腔洗浄は、骨小腔からの骨髄の物理的除去後に行われる。
【００５７】
本明細書において用いる場合、用語「骨組織」は、これに限定されるものではないが、骨、骨細片、骨粉末、骨セグメント、骨断片、骨髄スクープ、または骨小腔洗浄からの組織を指す。
【００５８】
用語「骨髄細胞」は、線維芽細胞（網様結合組織）、マクロファージ、脂肪細胞、骨芽細胞、破骨細胞、洞様毛細血管を形成する内皮細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、周皮細胞、ＰＶＭＣｓ、組織ヘルパー細胞、またはそれらの組合せを指す。
【００５９】
本明細書において用いる場合、用語「解離させる」は、血管を包囲する基底膜からＰＶＭＣｓを、それらを血管組織から分離することができるように、放出させるプロセスを指す。一部の実施形態において、前記血管は、臍帯血管である。ＰＶＭＣの解離は、前記ＰＶＭＣｓを臍帯内の小血管の基底膜に連結する結合の酵素消化によって果たされる。一部の実施形態において、酵素消化は、前記ＰＶＭＣｓが別個に会合している分離した会合分子を収容している前記基底膜の結合を切断する。例えば、前記基底膜中のヘパリンに結合するＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢは次いで、ＰＤＧＦ受容体を発現するＰＶＭＣｓへの結合が可能であり得る。一部の実施形態において、前記酵素消化は、コラゲナーゼ、中性もしくは酸性プロテアーゼ、ＧＡＧアーゼ、またはメタロプロテアーゼ、クロストリパイン、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、あるいはそれらの組合せから選択される１若しくはそれ以上の酵素を使用することにより果たすことができる。前記１若しくはそれ以上の酵素は、これに限定されるものではないが、動物、植物、細菌、もしくは真菌、またはそれらの組合せからのものであってよい。一部の実施形態において、前記酵素消化は、小血管の基底膜からＰＶＭＣの付着を切断する１若しくはそれ以上の酵素を使用する。一部の実施形態において、酵素消化は、それら自体が前記基底膜に結合することができる分子に前記ＰＶＭＣを連結する結合を切断するための酵素消化も含む。例えば、前記基底膜中のヘパリンに結合するＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢは次いで、ＰＤＧＦ受容体を発現するＰＶＭＣｓへの結合が可能であり得る。
【００６０】
本明細書において用いる場合、用語「フラッシュ」は、クランプされた血管などの腔を液体で満たすおよび空にするプロセスを指す。一部の実施形態では、満たす前記プロセスの直後に空にすることが続く。一部の実施形態では、満たすおよび空にする前記プロセスを恒温放置期間によって隔てる。一部の実施形態では、前記液体をさらなる使用のために保持する。一部の実施形態では、前記液体を廃棄する。
【００６１】
ＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離するための方法
一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓを骨膜、骨梁骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、膵臓、肺、肝臓、羊水、胎盤、血液、および臍帯血管から単離することができる。一部の実施形態において、臍帯血管血および臍帯血管は、それらの入手可能性、非侵襲性、および自家細胞ベースの療法の可能性のため、特に有利なＰＶＭＣｓ源であり得る。前記臍帯血管は、ワルトン膠様質として公知の粘液様結合組織によって包囲された、２本の動脈および１本の静脈を含有する。一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓを前記臍帯動脈および静脈の血管周囲領域から単離することができる。
【００６２】
満期産新生児における前記臍帯血管は、約５０センチメートル長、および直径約２センチメートルであり得る。一部の実施形態において、本明細書における実施形態の前記臍帯血管は、約２５ｃｍから約６０ｃｍ、約３０ｃｍから約６０ｃｍ、約３５ｃｍから約６０ｃｍ、約４０ｃｍから約６０ｃｍ、約４５ｃｍから約６０ｃｍ、約３０ｃｍから約５５ｃｍ、約３５ｃｍから約５５ｃｍ、約４０ｃｍから約５５ｃｍ、約４５から約５５ｃｍ、約５０から約５５ｃｍ、約４０ｃｍ、約４５ｃｍ、約５０ｃｍ、約５５ｃｍ、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲の長さを有することがある。
【００６３】
一部の実施形態では、満期分娩からの臍帯血管血の単離を、満期正常分娩または帝王切開後に娩出したての胎盤から子宮外で行うことができる。一部の実施形態において、臍帯血管血の単離は、胎盤を懸架する工程と、静脈にカニューレを挿入する工程と、特別設計の採取バッグまたは容器に重力によって血液を排出させる工程とを有することがある。子宮外単離中に母体または乳児に危険はないが、臍帯血管血の微生物汚染の危険性は高い。
【００６４】
一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離する方法は、前記臍帯血管に酵素または酵素混合物を添加して、前記ＰＶＭＣｓを該臍帯動脈または静脈から解離させる工程を有する。一部の実施形態は、前記酵素または酵素混合物を添加する前に前記臍帯血管から排出する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記単離プロセスは、無菌である。一部の実施形態では、前記臍帯血管を任意の胎盤哺乳動物から単離することができる。一部の実施形態において、前記臍帯血管は、ヒトであってもよく、または非ヒト胎盤哺乳動物、例えば、限定ではないが野生動物、飼い馴らされた動物、または家畜からのものであってもよい。
【００６５】
一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離する前記方法は、（ｉ）臍帯血管の内容物を排出し、該臍帯血管に針を挿入する工程と、（ｉｉ）前記臍帯血管を滅菌リン酸緩衝生理食塩水でフラッシュする工程と、（ｉｉｉ）前記内容物を採取する工程とを有する。一部の実施形態において、前記臍帯血管の内容物を排出する前記プロセスは、ストッパーを有する２本の針を１本は臍帯血管の頂部に、もう１本は臍帯血管の底部に挿入する工程と、前記血管を空にする工程と、前記洗浄溶出液を採取する工程とを有する。一部の実施形態において、前記血管は、静脈であってもよく、または動脈であってもよい。一部の実施形態において、前記血管を空にする工程は、重力で前記血管を空にさせる段階を有する。
【００６６】
一部の実施形態では、酵素混合物を前記臍帯血管内で恒温放置する。一部の実施形態では、前記酵素混合物を前記臍帯血管内で、該臍帯血管の内容物の排出、フラッシュおよび採取後に恒温放置する。一部の実施形態において、前記酵素混合物は、コラゲナーゼ、中性もしくは酸性プロテアーゼ、ＧＡＧアーゼ、メタロプロテアーゼ  クロストリパイン、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態において、前記酵素は、これに限定されるものではないが、動物、植物、細菌、もしくは真菌、またはそれらの組合せからのものであってよい。コラゲナーゼは、コラーゲン中のペプチド結合を壊す酵素である。コラーゲンは、結合組織の主成分であり、哺乳動物において最も豊富なタンパク質であり、また動物の細胞外基質の重要な成分である。タンパク質分解酵素としても公知のプロテアーゼは、タンパク質を形成するペプチド鎖内のアミノ酸を互いに連結するペプチド結合の加水分解によってタンパク質異化を果たすことができる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、およびグルタミン酸プロテアーゼを含む酵素の多数の広範な群を有する。プロテアーゼは、それらが最も良く機能する最適ｐＨによってさらに分類される。タンパク質中の特定のペプチド結合を壊すことができるプロテアーゼもあり、その一方で、タンパク質の個々のアミノ酸への完全消化ができるプロテアーゼもある。哺乳動物のプロテアーゼに加えて、多数の細菌、真菌、および植物プロテアーゼも存在する。プロテアーゼは、アミノ酸残基を連結するペプチド結合を分断することにより、長いタンパク質鎖を短い断片に消化することができる。末端アミノ酸をタンパク質鎖から引き離すことができるプロテアーゼ（エキソペプチダーゼ、例えば、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡなど）もあり、その一方で、タンパク質の内部ペプチド結合を攻撃するプロテアーゼ（エンドペプチダーゼ、例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、エラスターゼなど）もある。ペプチダーゼは、それらの触媒活性部位の特徴および作用条件に従って４つの主要グループに分けられる：セリンプロテイナーゼ、システイン（チオール）プロテイナーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ、およびメタロプロテイナーゼ。プロテアーゼの一定の基への結合は、当該触媒部位の構造、およびその活性に不可欠なアミノ酸（構成成分の１つとして）に依存する。ＧＡＧアーゼは、二糖繰り返し単位から成る長い分岐多糖である、グリコサミノグリカン（Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ：ＧＡＧｓ）またはムコ多糖を加水分解することができる酵素である。前記繰り返し単位は、ヘキサソミン（窒素を含有する６炭素糖）に連結した、ヘキソース（６炭素糖）またはヘキスロン酸から成る。これらの分子は、結合組織の重要な成分である。ＧＡＧ鎖をタンパク質に共有結合させて、結合組織、軟骨、および腱において見つけることができるプロテオグリカン、例えばコンドロイチンを形成することができる。メタロプロテイナーゼ（またはメタロプロテアーゼ）は、その触媒活���が亜鉛またはコバルト依存性であるタンパク質分解酵素である。メタロプロテイナーゼ中で見つけられる亜鉛またはコバルトイオンは、３つの配位子によってタンパク質に配位されている。前記金属イオンに配位する配位子は、ヒスチジン、グルタメート、アスパルテート、リシン、およびアルギニンで異なり得る。第４の配位位置は、不安定な水分子が占めている。メタロプロテイナーゼおよびエキソペプチダーゼの２つのサブグループがあり、メタロエキソペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ、およびメタロエンドペプチダーゼもそうである。メタロエンドペプチダーゼは、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼを含む。エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃとしても公知のクロストリパインは、アルギニンのカルボキシルペプチド結合上のタンパク質を切断するプロテイナーゼである。それは、クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）から単離されたものであり、約７．４から約７．８のｐＨで最適に機能する。
【００６７】
酵素消化は、前記ＰＶＭＳｃを小血管の基底膜に連結する結合を特異的に切断する。より具体的には、酵素消化は、小血管の基底膜からＰＶＭＣの付着を切断する。一部の実施形態において、酵素消化は、それら自体が前記基底膜に結合することができる分子に前記ＰＶＭＣを連結する結合を切断するための酵素消化も含む。例えば、前記基底膜中のヘパリンに結合するＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢは次いで、ＰＤＧＦ受容体を発現するＰＶＭＣｓへの結合が可能であり得る。一部の実施形態において、酵素消化は、糖とペプチドまたは糖と別の糖を伴う、特異的ペプチド結合、エステル結合、またはそれらの組合せを切断する結果となる。一部の実施形態において、酵素消化は、脂肪酸の複合脂質または単純エステルへの結合を特異的に切断することができる。さらなる実施形態において、酵素消化は、前記結合がベンゼン環を伴うコレステロールまたは分子への結合を切断することができる。一部の実施形態では、１つの結合の切断が結果的に他の結合を不安定にして、その結果、ＰＶＭＣと会合することができる分子の配座変化を生じさせる場合がある。
【００６８】
一部の実施形態において、前記酵素混合物は、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ファンギゾン、ペニシリンＧ、アンホテリシンＢ、またはそれらの組合せから選択される抗生物質をさらに有する。一部の実施形態において、前記抗生物質は、前記酵素混合物の約２０％を構成する。一部の実施形態において、前記酵素は、タイロード液、乳酸リンゲル液、最小必須培地イーグルアルファ変性（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：α−ＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、またはそれらの組合せから選択される培地をさらに有する。一部の実施形態において、前記酵素混合物中の前記抗生物質は、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ファンギゾン、ペニシリンＧ、アンホテリシンＢ、またはそれらの組合せから選択される抗生物質を有することができる。
【００６９】
一部の実施形態では、前記酵素混合物を約１から約１０分間、約１０から約２０分間、約２０から約６０分間、約２０から約３０分間、約３０から約４０分間、約４０から約５０分間、約５０から約６０分間、約６０から約１２０分間、恒温放置する。一部の実施形態では、前記酵素混合物を約１５℃から約３８℃、約１５℃から約２０℃、約２０℃から約２５℃、約２５℃から約３０℃、約３０℃から約３５℃、または約３５℃から約３８℃の範囲の温度で恒温放置する。一部の実施形態では、前記臍帯血管をリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）でフラッシュすることにより前記解離酵素混合物を不活性化し、前記酵素混合物およびＰＢＳを採取する。
【００７０】
一部の実施形態では、第２の酵素混合物との第２の恒温放置を行うことがある。一部の実施形態では、酵素混合物との多回恒温放置を行うことがある。驚くべきことに、酵素との２回恒温放置を行うと、前記第２の恒温放置は、結果としてＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離させられる。理論により拘束されることを望まないが、前記第１の酵素混合物との第１の恒温放置が結果として内皮細胞を解離させ、それにより前記基底膜が露出された状態になると考えられる。前記第２の酵素混合物との第２の恒温放置において、前記基底膜に結合している前記ＰＶＭＣＳを該基底膜から解離させることができ、それを採取することができると考えられる。
【００７１】
一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離する前記方法は、細胞浮遊液中のＰＶＭＣｓを濃縮する工程をさらに有する。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓを濃縮する工程は、濃縮され、解離された血管周囲薬用細胞の集団を獲得するための浮遊密度沈降、濾過、または遠心分離の使用を有する。
【００７２】
一部の実施形態では、前記濃縮された臍帯血管由来ＰＶＭＣｓの調製に、前記ＰＶＭＣｓの濃縮後に前記濃縮されたＰＶＭＣｓを培養して、濃縮された臍帯血管由来ＰＶＭＣｓの前記集団を選択的に増殖させる工程を追加することができる。一部の実施形態では、臍帯血管から単離されたＰＶＭＣｓを、約１から２０％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）で補足されたダルベッコ変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）で希釈することができる。一部の実施形態では、前記ＤＭＥＭ混合物を激しくボルテックスして前記組織を機械的に分散させ、続いてベンチトップ遠心機で濃縮することができ、その後、当該上清を除去することができる。一部の実施形態では、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）、続いて、インタクトＰｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配を保証するための破壊を伴わない第２ラウンドの遠心分離を用いることにより、残存細胞ペレットを分別して成核細胞を採取することになる。その後、前記勾配の上部画分を新しい試験管に移し、ＤＭＥＭで補足し、その後、遠心分離することができる。遠心分離後、前記ペレットを乱すことなく当該上清を除去することができる。一部の実施形態では、その後、前記ペレットをＤＭＥＭに再浮遊させ、ＤＭＥＭを使用して遠心分離により数回洗浄することができる。得られるＰＶＭＣ細胞浮遊液は、その結果、増殖または濃縮の準備が整った状態であり得る。
【００７３】
一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓの集団を臍帯血管から濃縮する工程を、前記ＰＶＭＣ上の細胞表面抗原に対して親和性を有する抗体を有する磁性ビーズの使用によって果たすことができる。さらに他の実施形態では、ＰＶＭＣｓの濃縮を増殖した細胞集団に対して行うことができる。ＰＶＭＣｓは限られた回数しか継代されず、その後増殖および分化能力の低減を経験することがあると予想される。さらに、ＰＶＭＣ調製物の成長特性および細胞収率は、ドナーの年齢に依存し、個体間で様々である。さらに他の実施形態では、ＰＶＭＣ集団の前記濃縮を該細胞集団の事前増殖なしで行うことができる。
【００７４】
一部の実施形態では、濃縮された臍帯血管由来ＰＶＭＣｓの前記集団を培養しない。一部の実施形態では、臍帯血管から獲得されたＰＶＭＣｓを培地中で培養して増殖させる。
【００７５】
一部の実施形態では、臍帯血管からのＰＶＭＣｓを細胞培養で増殖させることができる。一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓの一次培養物を１００ｍｍ培養皿１つにつき約１０７細胞で播種し、約１０％ウシ胎仔血清と、約２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、約１００単位／ｍＬペニシリンと、約１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ培養培地中で増殖させることができる。ＰＶＭＣｓは、前記負に帯電した培養皿に接着する。一部の実施形態において、前記方法は、前記培養培地に接着する細胞を選択する工程をさらに有することがある。一部の実施形態において、前記方法は、ＤＭＥＭですすぐ工程と接着細胞の前記選択を反復する工程とをさらに有することがある。接着細胞の選択後、ＰＶＭＣ集団をさらに二次培養してもよい。
【００７６】
一部の実施形態において、臍帯血管からのＰＶＭＣｓは、細胞表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１４６、およびＣＤ１６６を発現するが、造血系および内皮細胞マーカーを発現しない。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣ集団は、抗原発現および生存力の点で９０％超純粋であり、ならびにＣＤ７３＋／ＣＤ１０５＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ２９＋／ＳＳＥＡ４＋／ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ｖＷＦ−／ＣＤ１４−の表現型を発現する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、ＭＨＣクライスＩに対して陰性であるが、ＭＨＣクラスＩＩを発現する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣ集団は、９０％未満純粋、８０％未満純粋、７０％未満純粋、６０％未満純粋、または５０％未満純粋であることがある。一部の実施形態では、精製されたまたは不純な細胞集団を任意の適切な培地に採取することができる。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、前記精製された細胞集団の約３０％またはそれ以上、好ましくは前記精製された細胞集団の約５０％またはそれ以上、さらに好ましくは前記精製された細胞集団の約９０％またはそれ以上、および最も好ましくは前記精製された細胞集団の約９５％またはそれ以上（実質的に純粋）になる。
【００７７】
細胞表面マーカーを、ヒトＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｖＷＦ、およびＣＤ１４に対するものを含む様々な抗体で標識した後、フローサイトメトリーによって特徴づけることができる。その後、フルオレシンと結合させた二次抗体を使用する。
【００７８】
一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓを臍帯血管からＦＡＣＳ選別によって単離することができる。ＰＶＭＣｓを単離するための細胞表面抗原、例えば、限定ではないがＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、およびＣＤ７３の使用は、ＰＶＭＣ集団の陽性免疫選択のための手段を提供し、ＰＶＭＣ細胞集団の表現型分析、例えばフローサイトメトリーのための手段も提供する。ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、およびＣＤ７３抗原の発現について選択された細胞を、他の幹細胞および前駆細胞マーカー（これに限定されるものではないが、ＳＳＡＥ４ヒト胚性幹期特異的マーカー（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｓｔａｇｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ）を含む）についての選択により、さらに精製することができる。
【００７９】
一部の実施形態において、臍帯血管からの実質的に純粋なＰＶＭＣｓの前記調製物、臍帯血管由来ＰＶＭＣｓサブセットを、当該技術分野において公知の他の表面マーカーに基づいて他の細胞から分離することができる。
【００８０】
分離のための手順としては、これに限定されるものではないが、抗体被覆磁性ビーズを使用する磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、および固体マトリックス、例えばプレートに付着した抗体での「パンニング」、または他の好都合な技法を含むことができる。正確な分離を提供する技法としては、これに限定されるものではないが、様々な洗練度、例えば、多色チャンネル、低角および鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなどを有することができる蛍光活性化細胞選別機を含む。死滅細胞は、死滅細胞に会合している色素（ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｕ  ｉｏｄｉｄｅ：ＰＩ）、ＬＤＳ）での選択によって排除することができる。前記選択された細胞の生存力に過度に有害でない任意の技法を利用することができる。
【００８１】
抗体被覆磁性ビーズを使用する一部の実施形態では、該抗体を、特定の細胞タイプの分離の容易さを可能にする標識、例えば磁性ビーズ；アビジンまたはストレプトアビジンに高い親和性で結合するビオチン；蛍光活性化細胞選別機（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ：ＦＡＣＳ）で使用することができる蛍光色素；およびハプテンなどと結合させることができる。多色分析を前記ＦＡＣＳとともにまたは免疫磁気分離とフローサイトメトリーとの組合せで利用することもできる。多色分析は、多数の表面抗原、例えばＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ２９＋、とＳＳＡＥ４細胞マーカーを認識する抗体とに基づく細胞の分離にとって興味深いものである。多色分析に使用されている蛍光色素としては、これに限定されるものではないが、フィコビリタンパク質、例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン；フルオレシン；ならびにテキサスレッドを含む。陰性表示は、染色レベルが、アイソタイプ適合陰性対照の輝度またはそれ以下であることを示すことができる。ｄｉｍ表示は、染色レベルが陰性染色レベルの近いことがあるが、アイソタイプ適合対照より明るいこともあるということを示すことができる。
【００８２】
一部の実施形態では、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｖＷＦ、およびＣＤ１４抗体を超常磁性微粒子（微粒子）などの磁性試薬に直接または間接的に結合させる。磁性粒子への直接結合は、当該技術分野において公知であるように、様々な化学的連結基の使用によって果たすことができる。前記抗体を側鎖アミノまたはスルフヒドリル基およびヘテロ官能性架橋試薬によって前記微粒子にカップリングさせることができる。多数のヘテロ官能性化合物がエンティティへの連結に利用可能である。一部の実施形態において、前記連結基は、３−（２−ｐｙｒｉｄｙｉジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）と前記抗体上の反応性スルフヒドリル基および前記磁性粒子上の反応性アミノ基である。
【００８３】
一部の実施形態では、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｖＷＦ、およびＣＤ１４抗体を前記磁性粒子に間接的にカップリングさせる。一部の実施形態では、前記抗体をハプテンに直接接合させ、ハプテン特異的第２ステージ抗体は前記粒子に結合させる。一部の実施形態において、適するハプテンとしては、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、ジニトロフェニル、ニトロフェニル、アビジン、ビオチンなどを含む。前記ハプテンのタンパク質への接合方法は、当該技術分野において公知であり、かかる接合のためのキットは、市販されている。
【００８４】
一部の実施形態では、特定の細胞サブセットを結合するために必要な抗体の量を、試験分離および分析を行うことによって経験的に決定する。一部の実施形態では、前記細胞および抗体を、複合体の形成に十分な期間、恒温放置する。一部の実施形態において、前記期間は、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、約３０分まで、または約６０分までであることがある。
【００８５】
一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣｓ上に存在するまたは不在であることが公知の細胞表面マーカーに特異的な抗体または結合分子とともに前記細胞をさらに恒温放置することができる。例えば、一部の実施形態では、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｖＷＦ、またはＣＤ１４マーカーを発現する細胞を陰性選択することができる。
【００８６】
一部の実施形態では、前記標識された細胞を前記特異的抗体調製物に従って分離する。一部の実施形態において、蛍光色素標識抗体は、ＦＡＣＳ分離、免疫磁気選択用の磁性粒子、および特に高勾配磁気選択（ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＨＧＭＳ）などに有用である。例示的磁気分離デバイスは、国際公開第９０／０７３７０号パンフレット、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／００９５３号、および欧州特許出願公開第４３８，５２０号明細書に記載されており、これらの各々はこの参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００８７】
一部の実施形態では、臍帯血管からの前記ＰＶＭＣ細胞集団を適切な培地に採取することができる。ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＨＳＡ）などで多くの場合補足された、ダルベッコ変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）、ハンクス塩基性塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：；ｄＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、イスコフ変性ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ：ＩＭＤＭ）、５ｍＭ  ＥＤＴＡを伴うリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）などを含む様々な培地が市販されており、それらを使用することができる。好ましい培養培地としては、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｍ１９９、およびＲＰＭＩを含む。
【００８８】
一部の実施形態において、臍帯血管からの前記ＰＶＭＣｓは、前記細胞集団の約３０％もしくはそれ以上、前記細胞集団の約５０％もしくはそれ以上、前記細胞集団の約９０％もしくはそれ以上、または前記細胞集団の約９５％もしくはそれ以上を構成することがある。
【００８９】
一部の実施形態では、臍帯血管からの単離されたＰＶＭＣｓを、約１０％ウシ胎仔血清と、約２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、約１００単位／ｍＬペニシリンと、約１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ培養培地中で増殖させることができる。一部の実施形態では、前記臍帯血管由来ＰＶＭＣｓをＴ７５フラスコに入れ、ＤＭＥＭ培養培地で希釈する。一部の実施形態では、この混合物を、約５％ＣＯ２を有する約３７℃での恒温器の中で３日間保管する。前記恒温放置時間の後、前記ＰＶＭＣｓは、前記フラスコの表面に接着し、骨髄の残存成分をＰＢＳでの洗浄によって除去することができる。
【００９０】
一部の実施形態では、基礎培地および低グルコースを約１０〜２０％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）とともに用いて、臍帯血管からのＰＶＭＣｓを増殖させることができる。一部の実施形態では、血小板溶解産物などの他のタンパク質源を使用することができる。一部の実施形態では、組換えヒト線維芽細胞増殖因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｒｈＦＧＦ）などのさらなる因子を、増殖能力を強化するための培養補足物として使用することができる。一部の実施形態では、約１０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＦＧＦ−２を使用して、ＰＶＭＣ細胞集団の集団倍加時間を短縮する。
【００９１】
一部の実施形態において、臍帯血管からの単離されたＰＶＭＣｓを、５％ＣＯ２を有する３７℃恒温器において、約１０％ウシ胎仔血清と、約１０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞成長因子と、約２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、約１００Ｕ／Ｌペニシリン−ストレプトマイシンとで補足されたイスコフ変性ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ：ＩＭＤＭ）中で増殖させ、単離前に約１０から２０回継代することができる。
【００９２】
ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）は、病原体を宿していることがあり、ＰＶＭＣレシピエントは、抗ＦＢＳ抗体を発生させることがあり、そのため場合によっては無血清培地の使用を要する。一部の実施形態では、ＦＧＦと、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）と、トランスフォーミング成長因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β：ＴＧＦ−β）とで補足された無血清培地中でＰＶＭＣｓを成長させることができる。一部の実施形態では、高血小板血漿をＦＢＳの有効な代用品として使用することができる。
【００９３】
一部の実施形態は、ＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離する方法であって、前記臍帯血管の内容物を排出して細胞浮遊液を作製する工程と、酵素混合物を使用して前記細胞浮遊液から前記ＰＭＶＣｓを解離させる工程とを有する方法を記載する。一部の実施形態において、前記臍帯血管の前記内容物を排出する前記プロセスは、前記臍帯血管に針を挿入する工程と、溶液でフラッシュする工程とを有する。一部の実施形態において、前記方法は、前記細胞浮遊液を採取する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸含有生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、またはそれらの組合せである。
【００９４】
一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣｓを解離させる工程をインタクト臍帯血管に対して行う。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離する方法は、前記臍帯血管を洗浄液で洗浄する工程と、酵素混合物を添加する工程とを有する。一部の実施形態では、前記臍帯血管の内部のみを洗浄液または前記酵素混合物に曝露する。
【００９５】
一部の実施形態では、前記酵素混合物を前記臍帯血管内で恒温放置する。一部の実施形態では、前記酵素混合物は、コラゲナーゼ、中性もしくは酸性プロテアーゼ、ＧＡＧアーゼ、メタロプロテアーゼ  クロストリパイン、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、またはそれらの組合せを有する。前記酵素は、これに限定されるものではないが、動物、植物、細菌、もしくは真菌、またはそれらの組合せからのものであってよい。
【００９６】
一部の実施形態は、ＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離する方法であって、前記臍帯血管に酵素を添加して、前記ＰＶＭＣｓを該臍帯血管から解離させる工程を有する方法である。一部の実施形態は、前記臍帯血管から排出する工程と、前記臍帯血管に酵素を添加して前記ＰＶＭＣｓを該臍帯血管から解離させる工程とをさらに有する。一部の実施形態において、前記臍帯血管の内容物を排出する前記プロセスは、前記臍帯血管を生理食塩水でフラッシュする工程を有する。一部の実施形態において、前記臍帯血管から排出する工程は、前記臍帯血管に針を挿入する段階と、前記臍帯血管を生理食塩水でフラッシュする段階とを有する。一部の実施形態において、前記生理食塩水は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）である。
【００９７】
一部の実施形態において、前記酵素は、コラゲナーゼ、中性もしくは酸性プロテアーゼ、ＧＡＧアーゼ、メタロプロテアーゼ  クロストリパイン、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、またはそれらの組合せから選択される。前記酵素は、これに限定されるものではないが、動物、植物、細菌、もしくは真菌、またはそれらの組合せからのものであってよい。
【００９８】
一部の実施形態において、前記酵素混合物は、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ファンギゾン、ペニシリンＧ、アンホテリシンＢ、またはそれらの組合せから選択される抗生物質をさらに有する。一部の実施形態において、前記抗生物質は、前記酵素混合物の約２０％を構成する。一部の実施形態において、前記酵素混合物は、タイロード液、乳酸リンゲル液、最小必須培地イーグルアルファ変性（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：α−ＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、またはそれらの組合せから選択される培地をさらに有する。一部の実施形態において、前記酵素混合物中の前記抗生物質は、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ファンギゾン、ペニシリンＧ、アンホテリシンＢ、またはそれらの組合せから選択される抗生物質を有することができる。
【００９９】
一部の実施形態は、前記酵素を前記臍帯血管とともに恒温放置する工程を有する。一部の実施形態では、前記酵素を約２０から約６０分間、恒温放置する。一部の実施形態では、前記酵素を約１５℃から約３５℃の範囲の温度で恒温放置する。
【０１００】
一部の実施形態は、前記酵素を不活性化する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記酵素を不活性化する工程は、前記臍帯血管を溶液でフラッシュする段階を有する。一部の実施形態では、前記溶液はリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、血清含有培地、ＥＤＴＡ、ジイソプロピルフルオロリン酸（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＤＦＰ）、エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：ＥＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ：ＥＧＴＡ）、システイン、ヒスチジン、ジチオトレイトール（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ：ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ｏ−フェナントロリン、Ｈｇ２＋、Ｐｂ２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、α２−マクログロブリン、１，１０−フェナントロリン、トシルリシルクロロメチルケトン（Ｔｏｓｙｌ  Ｌｙｓｙｌ  Ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  Ｋｅｔｏｎｅ：ＴＬＣＫ）、重金属イオン、クエン酸アニオン、ホウ酸アニオン、およびＴｒｉｓアニオン、アルファ１−アンチトリプシン、Ｃ１−阻害因子、アンチトロンビン、アルファ１−アンチキモトリプシン、プラスミノゲン活性化因子阻害因子−１、ニューロセルピン、アプロチニン、べスタチン、Ｅ６４、ロイペプチン、組織メタロプロテイナーゼ阻害因子（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ：ＴＩＭＰｓ）１〜４、またはそれらの組合せから選択され得る。
【０１０１】
一部の実施形態は、前記臍帯血管を酵素混合物とともに２度目に、恒温放置する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記酵素混合物は、前記第１の恒温放置において使用したのと同じ酵素であってよい。
【０１０２】
一部の実施形態では、臍帯血管からのＰＶＭＣｓの単離を無菌環境で行う。
【０１０３】
一部の実施形態は、血管周囲薬用細胞の集団を濃縮する工程をさらに有する。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓの集団を濃縮する工程は、浮遊密度沈降、濾過、遠心分離、またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓの前記集団を濃縮する工程によって、濃縮された脱凝集血管周囲薬用細胞の集団を得る。
【０１０４】
一部の実施形態は、多数の臍帯血管由来調製物を併せる、ＰＶＭＣｓの単離方法である。一部の実施形態では、多数の臍帯血管由来調製物を、血管周囲薬用細胞の集団を濃縮する前記工程後に併せることができる。一部の実施形態では、多数の臍帯血管由来調製物を、第２の酵素との第２の恒温放置を行う前記工程後に併せることができる。
【０１０５】
一部の実施形態は、ＰＶＭＣｓを臍帯血管から単離する方法であって、酵素混合物を前記血管に添加して、前記血管周囲薬用細胞を解離させる工程を有する方法である。一部の実施形態において、前記臍帯血管は、長さ約２ｃｍから約１０ｍであり得る。一部の実施形態において、前記血管は、静脈または動脈である。一部の実施形態において、前記酵素混合物は、タイロード液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、最小必須培地イーグルアルファ変性（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：α−ＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、またはそれらの組合せから選択される培地を有する。一部の実施形態において、前記酵素混合物中の前記抗生物質は、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ファンギゾン、ペニシリンＧ、アンホテリシンＢ、またはそれらの組合せから選択される抗生物質を有することができる。一部の実施形態において、前記抗生物質は、前記酵素混合物の約２０％を構成する。一部の実施形態において、前記酵素混合物は、コラゲナーゼ、中性もしくは酸性プロテアーゼ、ＧＡＧアーゼ、メタロプロテアーゼ  クロストリパイン、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、またはそれらの組合せを有する。前記酵素は、これに限定されるものではないが、動物、植物、細菌、もしくは真菌、またはそれらの組合せからのものであってよい。一部の実施形態において、前記酵素混合物は、ＩＶ型コラゲナーゼを有する。
【０１０６】
一部の実施形態では、前記臍帯血管を、培地、抗生物質、またはそれらの混合物を有する前記酵素混合物の添加前に、浸漬培地に浸漬する。一部の実施形態において、前記浸漬培地は、タイロード液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、最小必須培地イーグルアルファ変性（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：α−ＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態では、前記抗生物質はストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ファンギゾン、ペニシリンＧ、アンホテリシンＢ、またはそれらの組合せから選択され得る。一部の実施形態において、前記抗生物質は、前記浸漬培地の約２０％を構成することができる。
【０１０７】
一部の実施形態では、前記臍帯血管にカニューレを挿入することができる。一部の実施形態は、前記カニューレが挿入された血管をヘパリン培地で洗浄する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記ヘパリン培地は、タイロード液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、最小必須培地イーグルアルファ変性（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：α−ＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、またはそれらの組合せであってよい。一部の実施形態において、前記ヘパリン培地は、ヘパリンを約５０から約２００単位／ｍＬの量で有する。
【０１０８】
一部の実施形態は、前記臍帯血管の第１の端部を、該血管に前記酵素混合物を添加する前にクランプする工程をさらに有する。一部の実施形態は、前記臍帯血管の第２の端部を、該血管に前記酵素混合物を添加した後にクランプして、クランプされた臍帯血管を作製する工程をさらに有する。一部の実施形態は、クランプされた臍帯血管を作製する工程の後、前記クランプされた臍帯血管を約１５℃から約３８℃の範囲の温度で恒温放置する工程をさらに有する。一部の実施形態では、前記クランプされた臍帯血管を約１５から約６０分間、恒温放置することがある。
【０１０９】
一部の実施形態は、前記臍帯血管の第１の端部のクランプを外す工程と、前記臍帯血管にタイロード液を添加する工程とをさらに有する。一部の実施形態は、タイロード液を添加する工程の後、前記臍帯血管の前記第１の端部を再びクランプする工程と、前記臍帯血管をマッサージする工程とをさらに有する。一部の実施形態は、タイロード液を添加する工程の後、洗浄溶出液を採取する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記洗浄溶出液は、内皮および内皮下細胞の細胞浮遊液を有する。一部の実施形態は、前記溶出液を培地で洗浄する工程をさらに有する。一部の実施形態では、前記培地はタイロード液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、最小必須培地イーグルアルファ変性（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：α−ＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、またはそれらの組合せから選択され得る。
【０１１０】
一部の実施形態は、第２の酵素混合物を前記臍帯血管に添加する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記酵素混合物は、酵素、培地、抗生物質、またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態では、前記培地はタイロード液、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、最小必須培地イーグルアルファ変性（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ  ａｌｐｈａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：α−ＭＥＭ）、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、またはそれらの組合せから選択され得る。
【０１１１】
一部の実施形態では、前記抗生物質はストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ファンギゾン、ペニシリンＧ、アンホテリシンＢ、またはそれらの組合せから選択され得る。一部の実施形態において、前記抗生物質は、前記酵素混合物の約２０％を構成する。一部の実施形態では、前記酵素はコラゲナーゼ、中性もしくは酸性プロテアーゼ、ＧＡＧアーゼ、メタロプロテアーゼ  クロストリパイン、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、またはそれらの組合せから選択され得る。前記酵素は、これに限定されるものではないが、動物、植物、細菌、もしくは真菌、またはそれらの組合せからのものであってよい。一部の実施形態において、前記酵素は、ＩＶ型コラゲナーゼを有する。
【０１１２】
一部の実施形態は、前記臍帯血管の第１の端部を、前記酵素混合物を添加する前にクランプする工程をさらに有する。一部の実施形態は、前記臍帯血管の第２の端部を、該血管に前記酵素混合物を添加した後にクランプして、クランプされた臍帯血管を作製する工程をさらに有する。一部の実施形態は、クランプされた臍帯血管を作製する工程の後、前記クランプされた臍帯血管を約１５℃から約３８℃の範囲の温度で恒温放置する工程をさらに含む。一部の実施形態では、前記クランプされた臍帯血管を約１５から約６０分間、恒温放置することがある。
【０１１３】
一部の実施形態は、前記臍帯血管の第１の端部のクランプを外す工程と、前記臍帯血管にタイロード液を添加する工程とをさらに有する。一部の実施形態は、タイロード液を添加する工程の後、前記臍帯血管の前記第１の端部を再びクランプする工程と、前記臍帯血管をマッサージする工程とをさらに有する。一部の実施形態は、タイロード液を添加する工程の後、洗浄溶出液を採取する工程をさらに有する。
【０１１４】
一部の実施形態は、臍帯血管から単離されたＰＶＭＣｓを有する組成物を対象とする。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、薬用能力を有する。
【０１１５】
ＰＶＭＣｓを骨から単離するための方法
一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓを骨から単離する方法は、細胞浮遊液を前記骨から抽出する工程と、ＰＶＭＣｓの集団を前記細胞浮遊液から分離する工程とを有する。一部の実施形態において、抽出工程は、酵素消化、機械力、またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態において、前記方法は、ＰＶＭＣｓの前記集団を濃縮する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記方法は、前記濃縮されたＰＶＭＣｓの集団を選択的に増殖させる工程をさらに有する。
【０１１６】
一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓを骨細片から単離することができる。一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓを骨髄スクープ、骨髄スコープ、または骨小腔洗浄から単離することができる。
【０１１７】
一部の実施形態において、骨からのＰＶＭＣｓの単離は、（ｉ）細胞浮遊液を前記骨から酵素消化、機械力、またはそれらの組合せによって抽出する工程と；ｉｉ）ＰＶＭＣｓの集団を前記細胞浮遊液から浮遊密度沈降、濾過、遠心分離、またはそれらの組合せによって分離する工程とを有する。
【０１１８】
一部の実施形態において、細胞浮遊液を前記骨から抽出する工程は、前記ＰＶＭＣｓを前記骨中の小血管の基底膜に連結する結合を特異的に切断するための酵素消化を有する。より具体的には、酵素消化は、前記基底膜の一部分であり得る分子を切断することができ、結果としてＰＶＭＣ結合ドメインを放出する。
【０１１９】
一部の実施形態において、前記方法は、前記細胞浮遊液を抽出する工程の前に前記骨を破砕する工程をさらに有する。一部の実施形態において、破砕工程は、前記骨を清浄化して外来軟組織を除去する段階と、前記骨を破砕する段階とを有する。一部の実施形態において、粒径は、約１から約５０ｍｍ３の範囲である。一部の実施形態において、前記骨の酵素消化は、コラゲナーゼ  中性もしくは酸性プロテアーゼ、ＧＡＧアーゼ、メタロプロテアーゼ、クロストリパイン（Ｃ．ヒストリチクムからのシステインプロテアーゼ）、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、またはそれらの組合せから選択される酵素で前記骨を処理する段階を有することがある。前記酵素は、これに限定されるものではないが、動物、植物、細菌、もしくは真菌、またはそれらの組合せからのものであってよい。一部の実施形態において、前記酵素消化は、前記ＰＶＭＣｓを前記骨断片の中の小血管の前記基底膜に連結する結合を特異的に切断する。一部の実施形態において、酵素消化は、前記ＰＶＭＣｓが別々に会合している分離した会合分子、例えば、前記基底膜中のヘパリンに結合するＰＤＧＦ−ＢＢを収容している前記基底膜の結合を切断し、ＰＤＧＦ−ＢＢは次いで、ＰＤＧＦ受容体を発現するＰＶＭＣｓに結合することが可能であり得る。一部の実施形態では、骨断片の前記酵素消化を骨の機械的破壊後でも、インタクト骨断片でも行うことができる。
【０１２０】
一部の実施形態において、前記細胞浮遊液を骨から抽出する工程は、密度勾配遠心分離を有することがある。一部の実施形態では、密度勾配遠心分離を、一連の遠心分離工程によって遂行することができる。一部の実施形態では、遠心分離を約５００×ｇから約２，５００×ｇで行うことができる。一部の実施形態において、これらの調製物は、整形外科的および歯科的用途での直接使用に適し得る。一部の実施形態では、前記骨を密度勾配遠心分離の前に酵素消化に付すことがある。
【０１２１】
一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣｓを骨から抽出する工程は、骨髄試料をリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）で希釈することによって果たすことができる。ＰＢＳなどの適する媒体での希釈は、酵素消化の前記プロセスに適する環境を提供する。一部の実施形態では、ＰＢＳでの希釈の後に、１若しくはそれ以上の酵素、例えば、コラゲナーゼ  中性もしくは酸性プロテアーゼ、ＧＡＧアーゼ、メタロプロテアーゼ、クロストリパイン（Ｃ．ヒストリチクムからのシステインプロテアーゼ）、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、またはそれらの組合せを使用する酵素消化の前記工程が続くことがある。前記１若しくはそれ以上の酵素は、これに限定されるものではないが、動物、植物、細菌、もしくは真菌、またはそれらの組合せからのものであってよい。一部の実施形態において、前記酵素消化は、小血管または洞様毛細血管の基底膜からＰＶＭＣの付着を切断する酵素を使用することがある。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓの骨髄からの前記抽出は、酵素消化の工程を含まない。一部の実施形態では、その後、前記希釈されたまたは酵素的に消化された試料を、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）を使用する密度勾配分離に付して単核細胞を獲得することができる。前記単核画分をＰＶＭＣｓの増殖のためのダルベッコ変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）内の細胞培養カセットにプレーティングすることができる。一部の実施形態において、前記方法は、ＰＶＭＣｓの集団を前記細胞浮遊液から浮遊密度沈降、濾過、遠心分離、免疫ビーズ選択、またはそれらの組合せによって分離する工程をさらに有する。
【０１２２】
一部の実施形態において、前記方法は、前記濃縮されたＰＶＭＣｓを培養して、濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの集団を選択的に増殖させる工程をさらに有することがある。
【０１２３】
一部の実施形態では、骨組織を有する骨細片または粉砕された骨試料を、１から２０％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）で補足されたＤＭＥＭで希釈することができる。一部の実施形態では、前記骨−ＤＭＥＭ混合物を激しくボルテックスして、前記組織を機械的に分散させ、それを前記骨から分離し、続いてベンチトップ遠心機で遠心分離することができ、その後、当該上清を除去することができる。一部の実施形態では、Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）、続いて、インタクトＰｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配を保証するための破壊を伴わない第２ラウンドの遠心分離を用いることにより、残存細胞ペレットを分別して成核細胞を採取することになる。その後、前記勾配の上部画分を新しい試験管に移し、ＤＭＥＭで補足し、その後、遠心分離することができる。遠心分離後、前記ペレットを乱すことなく当該上清を除去することができる。一部の実施形態では、その後、前記ペレットをＤＭＥＭに再浮遊させ、ＤＭＥＭを使用して遠心分離により数回洗浄することができる。得られるＰＶＭＣ細胞浮遊液は、その結果、増殖または濃縮の準備が整った状態であり得、または治療的に使用され得る。一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣ細胞浮遊液を骨と併用することができる。一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣ細胞浮遊液を、それを必要とする被検者に全身送達または直接注入することができる。
【０１２４】
一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓの前記集団を濃縮する工程は、前記ＰＶＭＣ上の細胞表面抗原に対して親和性を有する抗体を有する磁性ビーズの使用を有する。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓを濃縮する工程は、増殖させた細胞集団を濃縮する段階を有することがある。理論により拘束されることを望まないが、ＰＶＭＣｓは限られた回数しか継代されず、その後増殖および分化能力の低減を経験することがあると考えられる。さらに、ＰＶＭＣ調製物の成長特性および細胞収率は、ドナーの年齢に依存することがあり、個体間で様々であることがあると考えられる。一部の実施形態では、ＰＶＭＣ集団の前記濃縮を該細胞集団の事前増殖なしで行うことができる。
【０１２５】
一部の実施形態では、濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの前記集団を培養しないことがある。一部の実施形態では、ヒト骨髄から獲得されたＰＶＭＣｓを培地中で培養して増殖させることがある。
【０１２６】
一部の実施形態では、骨由来ＰＶＭＣｓを細胞培養で増殖させることがある。ＰＶＭＣｓの一次培養物を１００ｍｍ培養皿１つにつき約１０５から約１０９細胞で播種し、約１から２０％ウシ胎仔血清と、約１〜３ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、約５〜２００単位／ｍＬペニシリンと、約５〜２００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ培養培地中で増殖させることができる。ＰＶＭＣｓは、前記負に帯電した培養皿に接着することができ、その結果、反復継代およびＤＭＥＭでのすすぎ後、接着細胞のみの選択が可能である。一部の実施形態では、ＰＶＭＣ集団を接着細胞の選択後にさらに二次培養することができる。一部の実施形態では、ヒトフィブロネクチンで培養皿をプレコートすることにより、ＰＶＭＣｓを選択することができる。一部の実施形態では、ヒトフィブロネクチンを前記培養培地に添加することができる。一部の実施形態では、接着ＰＶＭＣｓを培養皿からトリプシンでの処理によって除去することができる。一部の実施形態において、かかる選択的培養は、造血機能の細胞を除去する。なぜならこれらの細胞は、非接着性でありまたはあまり付着しないからである。一部の実施形態において、造血細胞は、前記培養培地に接着し、トリプシンでの処理によって剥離しない。
【０１２７】
骨由来ＰＶＭＣｓは、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、またはそれらの任意の組合せから選択される細胞表面マーカーを発現することができる。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、造血系および内皮細胞マーカーを発現することができない。一部の実施形態において、本明細書における実施形態の単離されたＰＶＭＣ集団は、約９０％超純粋であることができる。一部の実施形態において、本明細書における実施形態のＰＶＭＣ集団は、約５０％超純粋、６０％純粋、７０％純粋、または８０％純粋であることができる。一部の実施形態において、用語「純粋な」は、抗原発現、生存力、ＣＤ７３＋／ＣＤ１０５＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ２９＋／ＳＳＥＡ４＋／ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ｖＷＦ−／ＣＤ１４−の表現型を発現する能力、またはそれらの任意の組合せを指す。一部の実施形態において、本明細書における実施形態の単離されたＰＶＭＣ集団は、約９０％まで純粋、約８０％まで純粋、約７０％まで純粋、約６０％まで純粋、または約５０％まで純粋であることができる。一部の実施形態において、骨由来ＰＶＭＣ集団は、不純である。
【０１２８】
細胞表面マーカーを、ヒトＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｖＷＦ、およびＣＤ１４に対するものを含む様々な抗体で標識した後、フローサイトメトリーによって特徴づけることができる。その後、フルオレシンと結合させた二次抗体を使用することができる。
【０１２９】
一部の実施形態では、骨由来ＰＶＭＣｓを異種骨由来細胞調製物からまたはＦＡＣＳ選別によって抽出および濃縮することができる。ＰＶＭＣｓに対する細胞表面抗原、例えばＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３の使用は、ＰＶＭＣ集団の陽性免疫選択のための手段を提供し、ＰＶＭＣ細胞集団の表現型分析、例えばフローサイトメトリーのための手段も提供する。ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、およびＣＤ７３抗原の発現について選択された細胞を他の幹細胞および前駆細胞マーカー（これに限定されるものではないが、ＳＳＡＥ４ヒト胚性幹期特異的マーカーを含む）についての選択により、さらに精製することができる。
【０１３０】
一部の実施形態において、前記細胞浮遊液から骨由来ＰＶＭＣｓの集団を濃縮する工程は、前記ＰＶＭＣｓの表面マーカーを使用して前記ＰＶＭＣｓを前記異種細胞浮遊液から分離する段階を有する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓを分離するために使用する前記表面マーカーとしては、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＳＳＥＡ４、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。
【０１３１】
一部の実施形態において、骨由来ＰＶＭＣｓを抽出および濃縮するための手順としては、抗体被覆磁性ビーズを使用する磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、および固体マトリックス、例えばプレートに付着した抗体での「パンニング」、または当該技術分野において公知の他の好都合な技法を含むことができる。正確な分離を提供する技法としては、様々な洗練度、例えば、多色チャンネル、低角および鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなどを有することができる蛍光活性化細胞選別機を含む。死滅細胞は、死滅細胞に会合している色素、例えば、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｕ  ｉｏｄｉｄｅ：ＰＩ）またはＬＤＳでの選択によって排除することができる。前記選択された細胞の生存力に過度に有害でない任意の技法を利用することができる。
【０１３２】
一部の実施形態において、抗体被覆磁性ビーズは、特定の細胞タイプの分離の容易さを可能にする標識、例えば、磁性ビーズ；アビジンまたはストレプトアビジンに高い親和性で結合するビオチン；蛍光活性化細胞選別機（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ：ＦＡＣＳ）で使用することができる蛍光色素；またはハプテンなどと結合させた抗体を有することができる。多色分析を前記ＦＡＣＳとともにまたは免疫磁気分離とフローサイトメトリーとの組合せで利用することもできる。多色分析は、多数の表面抗原、例えばＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ２９＋、とＳＳＡＥ４細胞マーカーを認識する抗体とに基づく細胞の分離にとって興味深いものであり得る。多色分析に使用されている蛍光色素としては、これに限定されるものではないが、フィコビリタンパク質、例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン；フルオレセイン、ならびにテキサスレッドを含むことができる。一部の実施形態において、陰性表示は、染色レベルが、アイソタイプ適合陰性対照の輝度またはそれ以下であることを示す。一部の実施形態において、ｄｉｍ表示は、染色レベルが陰性染色レベルに近いことがあるが、アイソタイプ適合対照より明るいこともあるということを示す。
【０１３３】
一部の実施形態では、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｖＷＦ、およびＣＤ１４抗体を超常磁性微粒子などの磁性試薬に直接または間接的に結合させることができる。磁性粒子への直接結合は、様々な化学的連結基の使用によって果たすことができる。一部の実施形態では、抗体を側鎖アミノまたはスルフヒドリル基およびヘテロ官能性架橋試薬によって前記微粒子にカップリングさせることができる。多数のヘテロ官能性化合物がエンティティへの連結に利用可能である。一部の実施形態において、前記連結基としては、これに限定されるものではないが、３−（２−ｐｙｒｉｄｙｉジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）と前記抗体上の反応性スルフヒドリル基および前記磁性粒子上の反応性アミノ基を含むことができる。
【０１３４】
一部の実施形態では、抗ＣＤ２９、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ７３、抗ＳＳＥＡ４、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３１、抗ｖＷＦ、および抗ＣＤ１４抗体を前記磁性粒子に間接的にカップリングさせることができる。前記抗体をハプテンに直接接合させることができ、ハプテン特異的第２ステージ抗体を前記粒子に結合させることができる。適するハプテンとしては、これに限定されるものではないが、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、ジニトロフェニル、ニトロフェニル、アビジン、ビオチンなどを含む。前記ハプテンのタンパク質への接合方法は、当該技術分野において公知であり、かかる接合のためのキットは、市販されている。
【０１３５】
一部の実施形態では、特定の細胞サブセットを結合するために必要な抗体の量を、試験分離および分析を行うことによって経験的に決定することができる。一部の実施形態では、前記細胞および抗体を、複合体の形成に十分な期間、例えば、これに限定されるものではないが、少なくとも約５分、少なくとも約１０分、または約３０分もしくはそれ以下、または約６０分もしくはそれ以下、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲の期間、恒温放置することができる。
【０１３６】
一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣｓ上に存在するまたは不在であることが公知の細胞表面マーカーに特異的な抗体または結合分子とともに前記細胞をさらに恒温放置することができる。例えば、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｖＷＦ、またはＣＤ１４マーカーを発現する細胞を陰性選択することができる。
【０１３７】
一部の実施形態では、前記標識された細胞を前記特異的抗体調製物に従って分離することができる。蛍光色素標識抗体は、ＦＡＣＳ分離、免疫磁気選択用の磁性粒子、特に高勾配磁気選択（ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＨＧＭＳ）などに有用であり得る。ＰＶＭＣｓを分離および単離するための手順が抗体を用いる実施形態において、一部の実施形態では、かかる抗体が、細胞培養および増殖中の自然な細胞プロセスによって消費され得るので、強化された自家骨移植片に使用され得る前記ＰＶＭＣ調製物中に検出可能な抗体がないことになることに留意されたい。
【０１３８】
一部の実施形態では、精製されたまたは不純な細胞集団を任意の適切な培地に採取することができる。一部の実施形態では、これに限定されるものではないが、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＨＳＡ）、またはそれらの組合せで多くの場合補足された、ダルベッコ変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）、ハンクス塩基性塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：；ｄＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、イスコフ変性ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ：ＩＭＤＭ）、約５ｍＭ  ＥＤＴＡを伴うリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）などを含む任意の市販培地を使用することができる。一部の実施形態において、前記培地は、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｍ１９９、ＲＰＭＩ、またはそれらの任意の組合せであってよい。
【０１３９】
一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、前記精製された細胞集団の約３０％またはそれ以上、好ましくは前記精製された細胞集団の５０％またはそれ以上、さらに好ましくは前記精製された細胞集団の９０％またはそれ以上、および最も好ましくは前記精製された細胞集団の約９５％またはそれ以上（実質的に純粋）であることになる。
【０１４０】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを、約１０％ウシ胎仔血清と、約２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、約１００単位／ｍＬペニシリンと、約１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ培養培地中で増殖させることができる。前記骨髄をＴ７５フラスコに入れ、ＤＭＥＭ培養培地で希釈することができる。この混合物を、約５％ＣＯ２を有する約３７℃での恒温器の中で約３日間保管することができる。前記恒温放置時間の後、前記ＰＶＭＣｓは、前記フラスコの表面に接着していることがあり、骨髄の残存成分をＰＢＳでの洗浄によって除去することができる。
【０１４１】
一部の実施形態では、基礎培地および低グルコースを約１〜２０％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）とともに用いて、ＰＶＭＣｓを増殖させることができる。一部の実施形態では、血小板溶解産物などの他のタンパク質源を使用することができる。一部の実施形態では、増殖能力を強化するための培養補足物としてのさらなる因子、例えば、限定ではないが組換えヒト線維芽細胞増殖因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｒｈＦＧＦ）を使用することができる。一部の実施形態では、１０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＦＧＦ−２は、ＰＶＭＣ細胞集団の集団倍加時間を短縮することができる。
【０１４２】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓを、約５％ＣＯ２を有する３７℃恒温器において、約１〜２００％ウシ胎仔血清と、約１〜２０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞成長因子と、約１〜３ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、約１〜２００Ｕ／Ｌペニシリン−ストレプトマイシンとで補足されたイスコフ変性ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ：ＩＭＤＭ）中で増殖させ、単離前に約５〜３０回継代することができる。
【０１４３】
ウシ胎仔血清は、病原体を宿していることがあり、ＰＶＭＣレシピエントは、抗ＦＢＳ抗体を発生させることがあり、そのため場合によっては無血清培地の使用を要する。一部の実施形態では、ＦＧＦと、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）と、トランスフォーミング成長因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β：ＴＧＦ−β）とで補足された無血清培地中でＰＶＭＣｓを成長させることができる。さらなる実施形態では、高血小板血漿もまたＦＢＳの有効な代用品であると思われる。自家血清もまた実行可能な代替品となるが、前記培地を補足するために必要な大容量により制限される。加えて、幾つかの無血清被定義培地が間葉幹細胞の増殖用に市販されており、それらもまたＰＶＭＣｓの増殖に適用可能となる。一部の実施形態では、自家血清を使用して無血清培地を補足することができる。一部の実施形態では、自家血清を無血清培地に添加して、約５から約２５％の最終濃度を達成する。一部の実施形態において、前記自家血清は、自家ヒト血清であってもよい。かかる化学的に定義された培地の使用は、それらを特定のＰＶＭＣ源のためにおよび場合によってはＰＶＭＣｓの特定の治療的使用のために最適化することを要する。
【０１４４】
一部の実施形態は、骨から獲得されたＰＶＭＣｓを単離する方法であって、（ｉ）被検者からの骨または骨組織の試料を提供する工程と；（ｉｉ）前記ＰＶＭＣｓを前記骨または骨組織から抽出する工程と；（ｉｉｉ）前記抽出されたＰＶＭＣｓを濃縮する工程とを有する方法を対象とする。
【０１４５】
一部の実施形態では、骨または骨組織を破砕機に通すことによって加工して、骨細片を製造することができる。骨細片は、骨と骨髄組織との両方を有することがある。一部の実施形態において、骨細片は、緻密骨、骨髄、髄管からの組織、海綿骨組織、またはそれらの組合せを有することがある。一部の実施形態では、骨の断片をＮｏｖｉｏｍａｇｕｓ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｌｌなどのボーンミルに通すことによって骨細片に粉砕する。一部の実施形態では、骨断片を粉砕前に冷凍する。一部の実施形態において、骨断片は、粉砕前は新鮮である。一部の実施形態において、前記粉砕された骨細片は、インタクト骨梁構造を有する。一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓを培養してＰＶＭＣ集団を選択的に増殖させることができる。一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓを培養しないことがある。一部の実施形態において、前記培養されたＰＶＭＣｓは、細胞培養表面に接着性であり得る。
【０１４６】
一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓを抽出する工程は、（ｉ）細胞浮遊液を前記骨から、酵素消化、機械力、またはそれらの組合せによって抽出する段階と；（ｉｉ）ＰＶＭＣｓの集団を前記細胞浮遊液から浮遊密度沈降、濾過、遠心分離、またはそれらの組合せによって分離する段階とを有する。
【０１４７】
一部の実施形態において、細胞浮遊液の前記骨からの形成は、前記ＰＶＭＣｓを前記骨中の小血管の基底膜に連結する結合を特異的に切断するための酵素消化を有する。一部の実施形態において、酵素消化は、小血管を包囲する基底膜からのＰＶＭＣｓの切断を有する。一部の実施形態において、酵素消化は、前記ＰＶＭＣｓが別々に会合している分離した会合分子、例えば、前記基底膜中のヘパリンに結合するＰＤＧＦ−ＢＢを収容している前記基底膜の結合を切断し、ＰＤＧＦ−ＢＢは次いで、ＰＤＧＦ受容体を発現するＰＶＭＣｓに結合することが可能であり得る。
【０１４８】
一部の実施形態では、前記酵素消化を、コラゲナーゼ  中性もしくは酸性プロテアーゼ、ＧＡＧアーゼ、もしくはメタロプロテアーゼ、クロストリパイン、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、またはそれらの組合せから選択される１若しくはそれ以上の酵素を使用することによって果たすことができる。前記１若しくはそれ以上の酵素は、これに限定されるものではないが、動物、植物、細菌、もしくは真、またはそれらの組合せからのものであってよい。一部の実施形態において、前記酵素消化は、小血管の基底膜からＰＶＭＣの付着を切断する１若しくはそれ以上の酵素を使用する。一部の実施形態において、酵素消化は、分子であって、それら自体が前記基底膜に結合することができるものである分子に前記ＰＶＭＣを連結する結合を切断するための酵素消化も含む。例えば、前記基底膜中のヘパリンに結合するＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢは次いで、ＰＤＧＦ受容体を発現するＰＶＭＣｓへの結合が可能であり得る。
【０１４９】
一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓを単離する前記方法は、ＰＶＭＣｓの集団を濃縮する工程をさらに有する。一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓの集団を濃縮する工程は、前記ＰＶＭＣ上の細胞表面抗原に対して親和性を有する抗体を有する磁性ビーズの使用によって果たすことができる。一部の実施形態において、抗体は、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１６６、抗ＣＤ２７１、またはそれらの組合せから選択される。一部の実施形態では、親和性を有する抗体またはＣＤ４５、ＣＤ３４、またはそれらの組合せを使用して、ＣＤ４５、ＣＤ３４、またはそれらの組合せを発現する細胞をＰＶＭＣｓの前記集団から除去することができる。一部の実施形態では、抗体アフィニティーカラムを使用することができ、抗体アフィニティーカラムにＰＶＭＣ調製物を通し、その後、溶離してより濃縮されたＰＶＭＣ調製物を生じさせることができる。
【０１５０】
一部の実施形態において、前記濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの調製は、前記ＰＶＭＣｓを濃縮する工程の後、前記濃縮されたＰＶＭＣｓを培養して、濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの前記集団を選択的に増殖させる工程をさらに有する。一部の実施形態では、濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの前記集団を培養しない。
【０１５１】
一部の実施形態において、前記細胞浮遊液中の細胞を濃縮する工程は、遠心分離によるものであってもよい。
【０１５２】
単離されたＰＶＭＣｓを濃縮および増殖させるための方法
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓの前記集団の濃縮は、前記単離されたＰＶＭＣ上の細胞表面抗原に対して親和性を有する抗体を有する磁性ビーズの使用を含む。一部の実施形態において、前記単離されたＰＶＭＣｓの濃縮は、増殖した細胞集団を濃縮する工程を有することがある。理論により拘束されることを望まないが、単離されたＰＶＭＣｓは限られた回数しか継代されず、その後増殖および分化能力の低減を経験することがあると考えられる。さらに、単離されたＰＶＭＣ調製物の成長特性および細胞収率は、ドナーの年齢に依存することがあり、個体間で様々であることがあると考えられる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ集団の前記濃縮を前記細胞集団の事前増殖なしで行うことができる。
【０１５３】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを細胞培養で増殖させることができる。単離されたＰＶＭＣｓの一次培養物を１００ｍｍ培養皿１つにつき約１０５から約１０９細胞で播種し、約１から２０％ウシ胎仔血清と、約１〜３ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、約５〜２００単位／ｍＬペニシリンと、約５〜２００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ培養培地中で増殖させることができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、前記負に帯電した培養皿に接着することができ、その結果、反復継代およびＤＭＥＭでのすすぎ後、接着細胞のみの選択が可能である。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ集団を、接着細胞の選択後にさらに二次培養することができる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを、ヒトフィブロネクチンで培養皿をプレコートすることにより選択することができる。一部の実施形態では、ヒトフィブロネクチンを前記培養培地に添加することができる。一部の実施形態では、単離された接着ＰＶＭＣｓを培養皿からトリプシンでの処理によって除去することができる。一部の実施形態では、かかる選択的培養は、造血機能の細胞を除去する。なぜならこれらの細胞は、非接着性であり、またはあまり付着しないからである。一部の実施形態において、造血細胞は、前記培養培地に接着し、トリプシンでの処理によって剥離しない。
【０１５４】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１４６、ＣＤ１６６、またはそれらの任意の組合せから選択される細胞表面マーカーを発現することができる。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、造血系および内皮細胞マーカーを発現することができない。一部の実施形態において、本明細書における実施形態の単離されたＰＶＭＣ集団は、約９０％超純粋であることができる。一部の実施形態において、本明細書における実施形態のＰＶＭＣ集団は、約５０％超純粋、６０％純粋、７０％純粋、または８０％純粋であることができる。一部の実施形態において、用語「純粋な」は、抗原発現、生存力、ＣＤ７３＋／ＣＤ１０５＋／ＣＤ４４＋／ＣＤ２９＋／ＳＳＥＡ４＋／ＣＤ４５−／ＣＤ３１−／ｖＷＦ−／ＣＤ１４−の表現型を発現する能力、またはそれらの任意の組合せを指す。一部の実施形態において、本明細書における実施形態の単離されたＰＶＭＣ集団は、約９０％まで純粋、約８０％まで純粋、約７０％まで純粋、約６０％まで純粋、または約５０％まで純粋であることができる。一部の実施形態において、骨由来ＰＶＭＣ集団は、不純である。
【０１５５】
細胞表面マーカーを、ヒトＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｖＷＦ、およびＣＤ１４に対するものを含む様々な抗体で標識した後、フローサイトメトリーによって特徴づけることができる。その後、フルオレシンと結合させた二次抗体を使用することができる。
【０１５６】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを異種骨由来細胞調製物からまたはＦＡＣＳ選別によって抽出および濃縮することができる。ＰＶＭＣｓに対する細胞表面抗原、例えばＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３の使用は、ＰＶＭＣ集団の陽性免疫選択のための手段を提供し、ＰＶＭＣ細胞集団の表現型分析、例えばフローサイトメトリーのための手段も提供する。ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、およびＣＤ７３抗原の発現について選択された細胞を他の幹細胞および前駆細胞マーカー（これに限定されるものではないが、ＳＳＡＥ４ヒト胚性幹期特異的マーカーを含む）についての選択により、さらに精製することができる。
【０１５７】
一部の実施形態において、前記細胞浮遊液から単離されたＰＶＭＣｓの集団を濃縮する工程は、前記ＰＶＭＣｓの表面マーカーを使用して前記ＰＶＭＣｓを前記異種細胞浮遊液から分離する工程を有する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓを分離するために使用する前記表面マーカーとしては、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＳＳＥＡ４、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。
【０１５８】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓを抽出および濃縮するための手順としては、抗体被覆磁性ビーズを使用する磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、および固体マトリックス、例えばプレートに付着した抗体での「パンニング」、または当該技術分野において公知の他の好都合な技法を含むことができる。正確な分離を提供する技法としては、様々な洗練度、例えば、多色チャンネル、低角および鈍角光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなどを有することができる蛍光活性化細胞選別機を含む。死滅細胞は、死滅細胞に会合している色素、例えば、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｕ  ｉｏｄｉｄｅ：ＰＩ）またはＬＤＳでの選択によって排除することができる。前記選択された細胞の生存力に過度に有害でない任意の技法を利用することができる。
【０１５９】
一部の実施形態において、抗体被覆磁性ビーズは、特定の細胞タイプの分離の容易さを可能にする標識、例えば、磁性ビーズ；アビジンまたはストレプトアビジンに高い親和性で結合するビオチン；蛍光活性化細胞選別機（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ：ＦＡＣＳ）で使用することができる蛍光色素；またはハプテンなどと結合させた抗体を有することができる。多色分析を前記ＦＡＣＳとともにまたは免疫磁気分離とフローサイトメトリーとの組合せで利用することもできる。多色分析は、多数の表面抗原、例えばＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ２９＋、とＳＳＡＥ４細胞マーカーを認識する抗体とに基づく細胞の分離にとって興味深いものであり得る。多色分析に使用されている蛍光色素としては、これに限定されるものではないが、フィコビリタンパク質、例えば、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン；フルオレセイン、ならびにテキサスレッドを含むことができる。一部の実施形態において、陰性表示は、染色レベルが、アイソタイプ適合陰性対照の輝度またはそれ以下であることを示す。一部の実施形態において、ｄｉｍ表示は、染色レベルが陰性染色レベルに近いことがあるが、アイソタイプ適合対照より明るいこともあるということを示す。
【０１６０】
一部の実施形態では、ＣＤ２９、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＳＳＥＡ４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｖＷＦ、およびＣＤ１４抗体を超常磁性微粒子などの磁性試薬に直接または間接的に結合させることができる。磁性粒子への直接結合は、様々な化学的連結基の使用によって果たすことができる。一部の実施形態では、抗体を側鎖アミノまたはスルフヒドリル基およびヘテロ官能性架橋試薬によって前記微粒子にカップリングさせることができる。多数のヘテロ官能性化合物がエンティティへの連結に利用可能である。一部の実施形態において、前記連結基としては、これに限定されるものではないが、３−（２−ｐｙｒｉｄｙｉジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）または４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）と前記抗体上の反応性スルフヒドリル基および前記磁性粒子上の反応性アミノ基を含むことができる。
【０１６１】
一部の実施形態では、抗ＣＤ２９、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ７３、抗ＳＳＥＡ４、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３１、抗ｖＷＦ、および抗ＣＤ１４抗体を前記磁性粒子に間接的にカップリングさせることができる。前記抗体をハプテンに直接接合させることができ、ハプテン特異的第２ステージ抗体を前記粒子に結合させることができる。適するハプテンとしては、これに限定されるものではないが、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、ＦＩＴＣ、ジニトロフェニル、ニトロフェニル、アビジン、ビオチンなどを含む。前記ハプテンのタンパク質への接合方法は、当該技術分野において公知であり、かかる接合のためのキットは、市販されている。
【０１６２】
一部の実施形態では、特定の細胞サブセットを結合するために必要な抗体の量を、試験分離および分析を行うことによって経験的に決定することができる。一部の実施形態では、前記細胞および抗体を、複合体の形成に十分な期間、例えば、限定ではないが少なくとも約５分、少なくとも約１０分、または約、約３０分もしくはそれ以下、または約６０分もしくはそれ以下、またはこれらの値のいずれか２つ間の範囲の期間、恒温放置することができる。
【０１６３】
一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣｓ上に存在するまたは不在であることが公知の細胞表面マーカーに特異的な抗体または結合分子とともに前記細胞をさらに恒温放置することができる。例えば、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ｖＷＦ、またはＣＤ１４マーカーを発現する細胞を陰性選択することができる。
【０１６４】
一部の実施形態では、前記標識された細胞を前記特異的抗体調製物に従って分離することができる。蛍光色素標識抗体は、ＦＡＣＳ分離、免疫磁気選択用の磁性粒子、特に高勾配磁気選択（ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ＨＧＭＳ）などに有用であり得る。ＰＶＭＣｓを分離および単離するための手順が抗体を用いる実施形態において、一部の実施形態では、かかる抗体が、細胞培養および増殖中の自然な細胞プロセスによって消費され得るので、強化された自家骨移植片に使用され得る前記ＰＶＭＣ調製物中で検出可能な抗体がないことになることに留意されたい。
【０１６５】
一部の実施形態では、精製されたまたは不純な細胞集団を任意の適切な培地に採取することができる。一部の実施形態では、これに限定されるものではないが、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＨＳＡ）、またはそれらの組合せで多くの場合補足された、ダルベッコ変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）、ハンクス塩基性塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：；ｄＰＢＳ）、ＲＰＭＩ、イスコフ変性ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ：ＩＭＤＭ）、約５ｍＭ  ＥＤＴＡを伴うリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）などを含む任意の市販培地を使用することができる。一部の実施形態において、前記培地は、ＤＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｍ１９９、ＲＰＭＩ、またはそれらの任意の組合せであってよい。
【０１６６】
一部の実施形態において、前記単離されたＰＶＭＣｓは、前記精製された細胞集団の約３０％またはそれ以上、好ましくは前記精製された細胞集団の約５０％またはそれ以上、さらに好ましくは前記精製された細胞集団の約９０％またはそれ以上、および最も好ましくは前記精製された細胞集団の約９５％またはそれ以上（実質的に純粋）であることになる。
【０１６７】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを、約１０％ウシ胎仔血清と、約２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、約１００単位／ｍＬペニシリンと、約１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンとを含有するＤＭＥＭ培養培地中で増殖させることができる。前記骨髄をＴ７５フラスコに入れ、ＤＭＥＭ培養培地で希釈することができる。この混合物を、約５％ＣＯ２を有する約３７℃での恒温器の中で約３日間保管することができる。前記恒温放置時間の後、前記ＰＶＭＣｓは、前記フラスコの表面に接着していることがあり、骨髄の残存成分をＰＢＳでの洗浄によって除去することができる。
【０１６８】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを、基礎培地および低グルコースを約１〜２０％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）とともに用いて増殖させることができる。一部の実施形態では、血小板溶解産物などの他のタンパク質源を使用することができる。一部の実施形態では、増殖能力を強化するための培養補足物としてのさらなる因子、例えば、限定ではないが組換えヒト線維芽細胞増殖因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｒｈＦＧＦ）を使用することができる。一部の実施形態では、１０ｎｇ／ｍＬ  ｒｈＦＧＦ−２は、ＰＶＭＣ細胞集団の集団倍加時間を短縮することができる。
【０１６９】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを、約５％ＣＯ２を有する３７℃恒温器において、約１〜２００％ウシ胎仔血清と、約１〜２０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞成長因子と、約１〜３ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、約１〜２００Ｕ／Ｌペニシリン−ストレプトマイシンとで補足されたイスコフ変性ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ：ＩＭＤＭ）中で増殖させ、単離前に約５〜３０回継代することができる。
【０１７０】
ウシ胎仔血清は、病原体を宿していることがあり、単離されたＰＶＭＣレシピエントは、抗ＦＢＳ抗体を発生させることがあり、そのため場合によっては無血清培地の使用を要する。一部の実施形態では、ＦＧＦと、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）と、トランスフォーミング成長因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β：ＴＧＦ−β）とで補足された無血清培地中でＰＶＭＣｓを成長させることができる。さらなる実施形態では、高血小板血漿もまたＦＢＳの有効な代用品であると思われる。自家血清もまた実行可能な代替品となるが、前記培地を補足するために必要な大容量により制限される。加えて、幾つかの無血清被定義培地が間葉幹細胞の増殖用に市販されており、それらもまたＰＶＭＣｓの増殖に適用可能となる。一部の実施形態では、自家血清を使用して無血清培地を補足することができる。一部の実施形態では、自家血清を無血清培地に添加して、約５から約２５％の最終濃度を達成する。一部の実施形態において、前記自家血清は、自家ヒト血清であってもよい。かかる化学的に定義された培地の使用は、それらを特定のＰＶＭＣ源のためにおよび場合によってはＰＶＭＣｓの特定の治療的使用のために最適化することを要する。
【０１７１】
脱灰骨を調製するための方法
一部の実施形態では、ＰＶＭＣ調製物を、脱灰骨を使用して調製することができる。一部の実施形態において、脱灰骨を調製する方法は、酸を骨材料と混合して脱灰骨粉を作製する工程を有する。一部の実施形態において、脱灰骨としては、完全脱灰骨または部分脱灰骨を含むことができる。一部の実施形態において、骨材料としては、骨細片、骨粉、またはそれらの組合せを含むことができる。一部の実施形態では、骨細片と骨粉との混合物を使用して脱灰骨を作製することができる。一部の実施形態では、骨細片を使用して脱灰骨を作製することができる。一部の実施形態において、前記方法は、骨を破砕して骨細片を作製する工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記方法は、骨細片を粉砕して骨粉を作製する工程をさらに有する。一部の実施形態において、酸は、強無機酸であり得る。本明細書において用いる場合、骨細片は、骨断片、骨セグメント、骨片、または骨裂片などを指すことができる。一部の実施形態では、前記酸は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、ホウ酸、フッ化水素酸、または臭化水素酸から選択され得る。一部の実施形態において、前記骨粉を前記酸と混合する工程は、約６時間から約４８時間の期間であることがある。一部の実施形態において、前記骨粉を前記酸と混合する前記期間は、約６から約３６時間、約６から約２４時間、約１２から約４８時間、約１２から約３６時間、約１２から約２４時間、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲であることがある。
【０１７２】
一部の実施形態において、前記方法は、骨材料をエタノールの中に浸す工程をさらに有する。一部の実施形態において、前記エタノールは、７０％ＥｔＯＨである。一部の実施形態では、別の滅菌  抗菌または抗真菌剤を使用することができる。一部の実施形態において、前記方法は、前記骨を破砕して骨細片を作製する工程を有することがある。一部の実施形態において、前記細片は、約５ｍｍまでの縁部寸法を有する不規則形状多面体の形態であることがある。一部の実施形態において、細片は、約１０ｍｍまでの縁部寸法を有する不規則形状多面体の形態であることがある。一部の実施形態において、前記方法は、前記骨細片を粉砕する工程と、前記細片をふるいにかけてその前記粉砕された骨を約１００〜８００ミクロンのサイズにして骨粉を作製する工程とをさらに有する。一部の実施形態では、近位脛骨からの骨細片を粉砕して、サイズが約３．６ｍｍから約８．０ｍｍの範囲の粒子を形成することができる。一部の実施形態では、遠位大腿骨からの骨細片を粉砕して、サイズが約２．０ｍｍから約８．０ｍｍの範囲の粒子を形成することができる。一部の実施形態では、大腿骨骨頭からの骨細片を粉砕して、サイズが約２．０ｍｍから約５．０ｍｍの範囲の粒子を形成することができる。粉砕された骨細片のサイズをその最大軸周りで測定することができる。一部の実施形態では、前記粉砕された骨材料を混合容器に入れ、過酸化水素で清浄化し、撹拌することができる。一部の実施形態では、前記骨細片を、前記骨を粉砕することなく、すすぎに付すことができる。一部の実施形態では、その後、前記骨材料を除去し、滅菌水ですすぐことができる。さらなる実施形態では、前記すすいだ骨材料を、前記清浄化した混合容器に戻し入れることができ、エタノールまたは別の滅菌、抗菌、もしくは抗真菌剤を添加することができ、前記溶液を混合することができる。一部の実施形態では、前記骨材料をふるいに移し入れ、開放減圧を前記ふるいの底部に適用することができ、前記骨粉を乾燥させることができる。一部の実施形態では、前記乾燥させた骨材料を部分脱灰プロセスに移すことができ、そこでそれを計量することができる。さらなる実施形態では、前記骨材料を酸と混合することができる。一部の実施形態では、前記骨材料を前記酸と接触させておく時間が長いほど、前記骨粉の脱灰度は大きくなる。
【０１７３】
一部の実施形態では、前記骨材料を約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、または約１０：１の３％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）水溶液対骨の比率で清浄化し約５から３０分間撹拌することができる。一部の実施形態では、その後、前記骨材料を取り出し、滅菌水ですすぐことができる。エタノールまたは他の滅菌、抗菌、もしくは抗真菌剤を前記すすいだ骨材料に添加して溶液を作製することができる。一部の実施形態では、前記溶液を約１０から約６０分間、混合することができる。一部の実施形態において、前記方法は、前記溶液を乾燥させて、乾燥させた骨材料を形成する工程をさらに有する。一部の実施形態では、前記骨粉をＮｏ．７０ふるいに移し入れ、開放減圧を前記ふるいの底部に適用することができ、前記骨粉を約１０から約６０分間、乾燥させることができる。一部の実施形態では、前記乾燥させた骨材料を計量することができ、グラムでの骨重量を、適用される酸の体積を決定するチャートと比較することができる。一部の実施形態において、添加する酸の量は、骨１グラムごとに約１６ｍＬであり得る。一部の実施形態では、前記骨材料を強無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、ホウ酸、フッ化水素酸、または臭化水素酸と約１から約１２時間混合して前記塩酸による部分的な骨の表面への係合を果たして、部分脱灰骨を作製することができる。さらなる実施形態では、前記骨材料を強無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、ホウ酸、フッ化水素酸、または臭化水素酸と約１２から約２４時間混合して前記塩酸による最大骨表面係合を果たして、灰分の大部分を除去することができる。一部の実施形態では、前記骨材料を強無機酸とより長期間混合して、前記骨を完全に脱灰することができる。
【０１７４】
一部の実施形態では、部分的に脱灰された骨細片または完全に脱灰された骨細片を単離されたＰＶＭＣｓと併用して、骨再生を促進し組織再生および修復のための再生環境を作ることに有用であり得る治療用調製物を形成することができる。
【０１７５】
骨細片を作製するための方法
一部の実施形態は、骨細片を製造する方法であって、骨断片を破砕機またはボーンミルに通す工程を有する方法である。一部の実施形態において、骨細片は、骨組織、骨髄、またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態において、骨細片は、緻密骨、骨髄、髄管からの組織、海綿骨組織、またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態では、骨の断片を粉砕して骨細片を形成する。一部の実施形態では、骨の前記断片をボーンミルまたは破砕機に通すことによって粉砕する。
【０１７６】
一部の実施形態において、前記骨断片は、大腿骨、腸骨梁、膝蓋骨、脛骨、上腕骨、鎖骨、肋骨、または肩甲骨を有する人骨が起源である。
【０１７７】
一部の実施形態において、前記骨断片は、近位大腿骨、遠位大腿骨、またはそれらの組合せが起源である。一部の実施形態において、前記骨断片は、新鮮である。一部の実施形態では、前記骨断片は極低温冷凍される。一部の実施形態において、前記骨細片は、インタクト骨梁構造を有する。一部の実施形態において、前記骨細片は、ＰＶＭＣｓを有する。一部の実施形態において、骨細片は、骨髄組織および他の組織が付着している骨断片を有する。
【０１７８】
骨細片は、それらの起源に依存してサイズが様々であり得る。一部の実施形態では、骨断片を粉砕して、サイズが３．６ｍｍから８．０ｍｍの範囲の骨細片を形成する。一部の実施形態では、遠位大腿骨が起源である骨断片を粉砕して、サイズが約２．９ｍｍから約７．１ｍｍの範囲の骨細片を形成する。一部の実施形態では、大腿骨骨頭からの骨断片起点を粉砕して、サイズが約２．２ｍｍから約３．４ｍｍの範囲の粒子を形成することができる。一部の実施形態では、粉砕された骨細片のサイズをその最大軸周りで測定する。
【０１７９】
一部の実施形態において、骨細片を製造する方法は、骨断片を破砕機またはボーンミルに通す工程を有し、骨細片を極低温保存する工程をさらに有する。
【０１８０】
一部の実施形態において、骨細片を製造する方法は、骨断片を破砕機またはボーンミルに通す工程を有し、それを必要とする患者への治療的投与をさらに有する。
【０１８１】
骨形成原細胞を単離するための方法
一部の実施形態では、骨形成原細胞をＰＶＭＣ調製物、骨細片、骨粉、またはそれらの組合せと混合することができ、骨形成原細胞は、骨の再生微小環境を作ることに寄与することができる。
【０１８２】
一部の実施形態では、骨形成原細胞をＰＶＭＣ調製物から単離することができる。骨形成原細胞は、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＡＰ）の高い発現レベルのため、ＰＶＭＣｓの集団の中で同定することができる。ＡＰに対する抗体は市販されており、それらを蛍光タグに結合させて高レベルのＡＰを発現する細胞（ＡＰ−Ｈｉｇｈ細胞）の選別を可能にすることができる。
【０１８３】
一部の実施形態では、ＰＶＭＣ調製物と骨髄細胞との組合せを、約１ｎＭから約１００ｎＭの最終濃度のデキサメチルソーム（ｄｅｘａｍｅｔｈｙｌｓｏｍｅ）と、アスコルビン酸塩またはアスコルビン酸−２−リン酸とを有する培地中で５から１０日の期間、培養することができる。一部の実施形態では、細胞を７日間培養する。さらなる実施形態において、使用する前記培地は、骨形成原細胞の成長のための誘導培地として役立つ。ＰＶＭＣｓは、接着細胞であり、トリプシンおよびコラゲナーゼ消化後に脱凝集され、培養皿から放出され得る。その後、脱凝集された細胞をＡＰ発現レベルにより選別することができ、それによってＡＰ−Ｈｉｇｈ細胞の単離が可能になる。前記ＡＰ−Ｈｉｇｈ細胞を隔離することができ、該細胞は、新鮮な調製物中の固有骨形成原細胞に対する標準物質としての役割を果たすことができる。さらに、前記ＡＰ−Ｈｉｇｈ細胞を使用して、骨形成原細胞をインビボおよびインビトロで染色することができる。
【０１８４】
一部の実施形態は、骨形成原細胞をＰＶＭＣ調製物から分離するための方法であって、前記ＰＶＭＣ調製物と高特異的活性アルカリホスファターゼに対して親和性を有する抗体とを混合する工程を有する方法を対象とする。
【０１８５】
一部の実施形態は、骨形成原細胞をＰＶＭＣ調製物から分離するための方法であって、リン酸カルシウム基材への前記調製物中の細胞の吸着を判定する工程を有する方法を対象とし、ここで、高い親和性は、前記骨形成原細胞の存在を示す。
【０１８６】
一部の実施形態は、骨形成原細胞をＰＶＭＣ調製物から分離する方法であって、前記ＰＶＭＣ調製物を被覆ペトリ皿にプレーティングする工程と、骨形成原細胞を該細胞の差次的付着に基づいて単離する工程とを有する方法を対象とする。一部の実施形態では、前記被覆ペトリ皿をフィブロネクチン、ラミニン、他の細胞外基質分子、またはそれらの組合せで被覆する。
【０１８７】
強化された自家骨移植片を作製するための方法
一部の実施形態は、強化された自家骨移植片を作製する方法であって、
ａ．細胞浮遊液を被検者からの骨組織の第１の部分から酵素、機械力、またはそれらの組合せで抽出する工程と；
ｂ．前記細胞浮遊液中の細胞を浮遊密度沈降、濾過、または遠心分離によって濃縮して、濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの集団を獲得する工程と；
ｃ．前記被検者からの骨移植片として使用される骨組織または代用骨の第２の部分に濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの前記集団を補充して、前記強化された自家骨移植片を作製する工程と
を有する方法を対象とし得る。
【０１８８】
一部の実施形態において、強化された自家骨移植片を作製する方法は、骨由来ＰＶＭＣｓを被検者から単離する工程と、骨移片として使用される前記被検者からの骨部分に前記骨由来ＰＶＭＣｓを補充する工程とを有する。一部の実施形態において、強化された自家骨移植片を作製する方法は、骨由来ＰＶＭＣｓを被検者の骨組織の第１の部分から単離する工程と、骨移植片として使用される前記被検者からの骨組織の第２の部分を抽出する工程と、前記骨移植片に前記骨由来ＰＶＭＣｓを補充する工程とを有する。
【０１８９】
一部の実施形態において、細胞浮遊液を骨組織の第１の部分から抽出する工程は、前記血管周囲細胞を前記骨中の小血管の基底膜に連結する結合を特異的に切断するための酵素消化を有する。より具体的には、酵素消化は、前記基底膜の一部分であり得る分子を切断し、結果としてＰＶＭＣ結合ドメインを放出させることができる。
【０１９０】
一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓを含有する強化された自家骨移植片は、骨移植片として使用される骨組織の第１の部分を被検者から抽出し、その後、濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの集団（ここで、該濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓは、該ＰＶＭＣｓを前記被検者からの骨組織の第２の部分から抽出および濃縮することによって調製することができる）を前記骨移植片に補充して、該強化された自家骨移植片を作製することによって、製造することができる。
【０１９１】
一部の実施形態において、骨組織の第１の部分は、骨が起源である。一部の実施形態において、骨組織の第２の部分は、骨、骨細片、骨髄、骨小腔洗浄から組織、またはそれらの組合せが起源である。一部の実施形態において、骨組織の第１の部分は、骨髄を有し、骨組織の第２の部分は、骨細片を有する。
【０１９２】
一部の実施形態において、骨組織の前記第１の部分は、腸骨梁、大腿骨、膝蓋骨、脛骨、上腕骨、鎖骨、肋骨、もしくは肩甲骨、またはそれらの組合せを有する人骨が起源である。一部の実施形態では、この組織を患者に対する外科手術後の廃棄組織として獲得し、自家使用のために準備することができる。一部の実施形態において、骨は、大腿骨、腸骨梁、膝蓋骨、脛骨、上腕骨、鎖骨、肋骨、肩甲骨、またはそれらの組合せの近位および遠位領域が起源であり得る。
【０１９３】
もう１つの実施形態において、骨組織の前記第２の部分は、腸骨梁、大腿骨、膝蓋骨、脛骨、上腕骨、鎖骨、肋骨、もしくは肩甲骨、またはそれらの組合せを有する人骨が起源である。
【０１９４】
一部の実施形態では、前記強化された自家骨移植片に骨から単離されたＰＶＭＣｓを補充することができる。一部の実施形態では、非脱灰、脱灰骨細片、または部分脱灰骨細片を骨粉とまたは骨由来ＰＶＭＣｓと併用して、強化された自家骨移植片調製物を作製することができる。
【０１９５】
一部の実施形態において、強化された自家骨移植片を作製する前記方法は、強化された自家骨移植片に新鮮な自家骨髄、加工自家骨髄、冷凍自家骨髄、またはそれらの組合せを補充する工程を含むことができる。
【０１９６】
一部の実施形態において、強化された自家骨移植片を作製する前記方法は、強化された自家骨移植片に１若しくはそれ以上の合成代用骨を追加して補充する工程を有し、ここで前記合成代用骨は、リン酸カルシウム系代用骨、カルシウムアパタイト、β−リン酸三カルシウム、天然および合成ポリマー、セラミックス、Ａｌｌｏｇｒｏ、Ｏｐｔｅｆｏｒｍ、Ｇｒａｆｔｏｎ、ＯｒｔｈｏＢｌａｓｔ、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、バイオガラス、ＯｓｔｅｏＧｒａｆｔ、Ｎｏｒｉａｎ  ＳＲＳ、ＰｒｏＯｓｔｅｏｎ、Ｏｓｔｅｏｓｅｔ、ポリマー系代用骨移植片、分解性および非分解性ポリマー、Ｃｏｒｔｏｓｓ、開孔性（ｏｐｅｎ  ｐｏｒｏｓｉｔｙ）ポリ乳酸ポリマー  Ｉｍｍｉｘ、またはそれらの組合せを有する。
【０１９７】
一部の実施形態において、強化された自家骨移植片を作製する前記方法は、石灰化加工同種移植片、最小脱灰加工同種移植片、部分脱灰加工同種移植片、脱灰加工同種移植片、またはそれらの組合せを追加する工程を有することができる。
【０１９８】
一部の実施形態において、強化された自家骨移植片を作製する前記方法は、コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ−２含有コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ−７含有コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７含有スポンジ、またはそれらの組合せの追加を有する。一部の実施形態において、強化された自家骨移植片を作製する前記方法は、ＰＤＧＦ−ＢＢの添加を含むことができる。一部の実施形態において、強化された自家骨移植片を作製する前記方法は、ＰＤＧＦ−ＢＢをコラーゲンスポンジまたは別の適するビヒクルに添加する工程を有する。一部の実施形態において、強化された自家骨移植片を作製する前記方法は、ＰＤＧＦ−ＢＢ含有コラーゲンスポンジの追加を有する。
【０１９９】
一部の実施形態において、前記自己骨移植片は、単離された骨芽細胞、全骨髄、未精製の、精製された、もしくは増殖させたＰＶＭＣｓ、単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せと併用されるリン酸カルシウム系代用骨を有することができる。一部の実施形態では、自家骨断片を他の代用骨、例えば、ヒドロキシアパタイト、カルシウムアパタイト、およびβ−リン酸三カルシウムと併用することができる。一部の実施形態において、前記自家骨移植片は、単離された骨芽細胞、全骨髄、未精製の、精製された、もしくは増殖させたＰＶＭＣｓ、単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを有することに加えて、天然および合成ポリマー、セラミックス、もしくは他の骨代用材料、またはそれらの組合せを有する。さらなる実施形態において、前記骨は、ルート関節形成術（ｒｏｕｔｅ  ａｒｔｈｒｏｐｌａｓｔｙ）中に獲得される廃棄膝関節または股関節骨／骨髄からのものであり得る。
【０２００】
一部の実施形態において、自家骨移植片は、骨膜、骨梁骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、膵臓、肺、肝臓、羊水、胎盤、血液、および臍帯血管、またはそれらの組合せから単離されたＰＶＭＣを有することができる。一部の実施形態において、自家骨移植片は、臍帯血管から単離されたＰＶＭＣを有することができる。
【０２０１】
一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣｓを前記骨の骨梁骨小腔から獲得することができる。一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓを大腿骨骨頭、遠位大腿骨、または近位脛骨から獲得することができる。一部の実施形態において、前記骨は、骨髄組織および他の組織、緻密骨、髄管からの骨髄、またはそれらの組合せを有する。
【０２０２】
さらなる実施形態では、自家代用骨移植片を単独で使用してもよく、または他の材料（例えば、Ａｌｌｏｇｒｏ、Ｏｐｔｅｆｏｒｍ、Ｇｒａｆｔｏｎ、またはＯｒｔｈｏＢｌａｓｔ）と併用してもよい。一部の実施形態では、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、およびバイオガラスを含むセラミック系代用骨移植片を単独で使用してもよく、または併用してもよい（例えば、ＯｓｔｅｏＧｒａｆｔ、Ｎｏｒｉａｎ  ＳＲＳ、ＰｒｏＯｓｔｅｏｎ、またはＯｓｔｅｏｓｅｔ）。一部の実施形態では、ポリマー系代用骨移植片、分解性および非分解性ポリマーを単独で使用してもよく、または他の材料（例えば、Ｃｏｒｔｏｓｓ、開孔性ポリ乳酸ポリマー、またはＩｍｍｉｘ）と併用してもよい。
【０２０３】
一部の実施形態において、強化された自家移植片はまた、加工同種骨移植材料、例えば、石灰化加工同種移植片、最小脱灰加工同種移植片、部分脱灰加工同種移植片、または脱灰加工同種移植片を有することができる。一部の実施形態において、強化された自家移植片はまた、コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ−２含有コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ−７含有コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７含有スポンジ、またはそれらの組合せを有することができる。
【０２０４】
一部の実施形態は、強化された自家骨移植片を作製する方法であって、骨移植片として使用される骨組織の第１の部分を被検者から抽出し、その後、濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの集団（ここで、該濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓは、該ＰＶＭＣｓを前記被検者からの同じ自家骨組織の第２の部分から抽出および濃縮することによって調製することができる）を前記骨移植片に補充して、該強化された自家骨移植片を作製する工程を有する方法を有する。
【０２０５】
一部の実施形態において、強化された自己骨移植片を作製する前記方法は、リン酸カルシウム系代用骨、単離された骨芽細胞、全骨髄、未精製の、精製された、もしくは増殖させたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを添加する工程を含むことができる。一部の実施形態において、強化された自己骨移植片を作製する前記方法は、自家骨断片、代用骨、例えば、これに限定されるものではないが、ヒドロキシアパタイト、カルシウムアパタイト、β−リン酸三カルシウム、またはそれらの組合せを追加する工程を含むことができる。一部の実施形態において、前記自家骨移植片は、単離された骨芽細胞、全骨髄、未精製の、精製された、また増殖させたＰＶＭＣｓを有することに加えて、天然および合成ポリマー、セラミックス、もしくは他の骨代用材料、またはそれらの組合せを有する。
【０２０６】
一部の実施形態において、強化された自己骨移植片を作製する前記方法は、自家代用骨移植片を単独でまたは他の材料（例えば、Ａｌｌｏｇｒｏ、Ｏｐｔｅｆｏｒｍ、Ｇｒａｆｔｏｎ、またはＯｒｔｈｏＢｌａｓｔ）と併用で追加する工程を含むことができる。一部の実施形態では、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、およびバイオガラスを含むセラミック系代用骨移植片を単独で使用してもよく、または併用してもよい（例えば、ＯｓｔｅｏＧｒａｆｔ、Ｎｏｒｉａｎ  ＳＲＳ、ＰｒｏＯｓｔｅｏｎ、またはＯｓｔｅｏｓｅｔ）。一部の実施形態では、ポリマー系代用骨移植片、分解性および非分解性ポリマーを単独で追加してもよく、または他の材料（例えば、Ｃｏｒｔｏｓｓ、開孔性ポリ乳酸ポリマー、またはＩｍｍｉｘ）と併用してもよい。
【０２０７】
一部の実施形態において、強化された自家移植片を作製する方法はまた、加工同種骨移植材料、例えば、石灰化加工同種移植片、最小脱灰加工同種移植片、部分脱灰加工同種移植片、または脱灰加工同種移植片を追加する工程を有することができる。一部の実施形態において、強化された自家移植片を作製する方法はまた、コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ−２含有コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ−７含有コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−７含有スポンジ、またはそれらの組合せを追加する工程を有することができる。
【０２０８】
もう１つの実施形態において、強化された自家骨移植片を作製する方法は、前記濃縮されたＰＶＭＣｓを工程（ｃ）の前に培養して、濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの前記集団の前記ＰＶＭＣ部分の前記部分を選択的に増殖させる工程をさらに有する。もう１つの実施形態では、濃縮された骨由来ＰＶＭＣの前記集団を培養しないことがある。
【０２０９】
一部の実施形態では、ＰＶＭＣ調製物、およびＰＶＭＣｓを含有する自家骨移植片を使用して、骨髄を有するまたは有さない治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物をヒト患者の胴、頭または肢に投与することにより、骨再生を刺激することができる。一部の実施形態において、前記投与された周皮細胞は、分泌骨芽細胞に直接分化すること、および／または骨形成のための再生微小環境を提供することが可能であり得る。
【０２１０】
ＰＶＭＣ調製物および投与
一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、自家使用のためのものであってよい。一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓを被検者から単離することができ、これらの細胞を、それらが育てられた前記被検者に投与して戻すことができる。一部の実施形態において、自家移植は、免疫抑制プロトコルの必要がないようにすることができる。
【０２１１】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを治療的に利用することができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、同種輸液（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｉｎｆｕｓａｔｅ）の一部を形成することができる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを単離された骨芽細胞、全骨髄、未精製の、精製された、もしくは増殖させたＰＶＭＣｓと併用して、輸液を形成することができる。一部の実施形態において、輸液はまた、リン酸緩衝生理食塩水、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、またはそれらの組合せを有する平衡塩類溶液を含むことができる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを組織に直接注入することができる。例えば、単離されたＰＶＭＣｓの調製物をカテーテルによって心臓に直接注入することができる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを治療的投与前に足場に包み込むことができる。適する足場の例としては、既製支柱および酵素または触媒により架橋がインビボで起こるように活性化される架橋性複合体を含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物をヒト被検者の胴、頭、または肢に投与することができ、該調製物は、骨再生のための再生微小環境を提供することが可能であり得る。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓの固有分泌活性は、傷害を受ける組織損傷部位で再生微小環境を確立することができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、瘢痕化を阻害する、アポトーシスを阻害する、血管新生を刺激する、ならびに有糸分裂および組織固有幹または前駆細胞を刺激する生物活性因子を分泌することができ、細菌が損傷部位、例えば開放創に存在するとき抗生物質タンパク質を分泌することもできる。単離されたＰＶＭＣｓの前記多面的効果を「栄養活性」と呼ぶことができる。
【０２１３】
一部の実施形態では、前記単離されたＰＶＭＣｓの薬用能力を、具体的な異なる解剖学的位置によって決定されるような特定の生理環境で該ＰＶＭＣｓによって分泌される分子の範囲によって定義することができる。一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣｓの薬用能力を、該ＰＶＭＣによって分泌される分子の範囲によって定義する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣによって分泌される分子の範囲は、部位依存性である。
【０２１４】
一部の実施形態では、ヒト骨組織から単離されたＰＶＭＣｓを自己移植片に使用することができ、該ＰＶＭＣｓは、プロスタグランジンＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２：ＰＧＥ２）、間質細胞由来因子−１（ｓｔｒｏｍａｌ−ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＳＤＦ−１）、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、インターロイキン−７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−７：ＩＬ−７）、およびインターロイキン−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８：ＩＬ−８）の分泌によって再生環境を提供することができる。
【０２１５】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）  トランスフォーミング成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ：ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １：ＩＧＦ−１）、内皮細胞成長および生存を増進する因子の分泌によって抗アポトーシス微小環境を提供することができる。
【０２１６】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、αβＴ細胞の増殖の阻害、γδＴ細胞の抑制、Ｂ細胞増殖の阻害および促進、ＮＫ細胞活性化の抑制、樹状細胞およびマクロファージのサイトカイン分泌プロファイルの修飾、ならびに形質細胞による免疫グロブリン生産の抑制によって、免疫修飾特性を有することができる。プロスタグランジンＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２：ＰＧＥ−２）は、免疫細胞に対するＰＶＭＣｓの多数の効果におけるならびに樹状細胞およびマクロファージの分泌プロファイルの修飾における中心的な媒介因子であり得る。ＰＶＭＣｓによって分泌されるＴＧＦ−β１およびＨＧＦは、免疫修飾の役割を有することができる。ＰＶＭＣｓはまた、Ｔ細胞増殖を停止させることができるインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ：ＩＤＯ）を発現することができる。ＰＶＭＣｓの免疫修飾効果を媒介する他の分子としては、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ：ＩＬ）−１０、ヒト白血球抗原Ｇ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｇ：ＨＬＡ−Ｇ）、および白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）を含むことができ、後者は、Ｔ細胞増殖の抑制にばかりでなく、調節Ｔ細胞の産生および維持にも重要な役割を果たす。さらにもう１つの実施形態において、ＰＶＭＣｓは、炎症誘発性サイトカインインターロイキン−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β：ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２：ＩＬ−２）  インターロイキン−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ：ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α：ＴＮＦ−α）、およびインターロイキン−１α（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１α：ＩＬ−１α）を阻害することが可能であり得る。さらにもう１つの実施形態において、ＰＶＭＣｓは、低用量のＩＦＮ−γの影響下、クラスＩＩ主要組織適合性複合体（ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）分子を発現し、抗原提示細胞として挙動することができる。
【０２１７】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓはまた、組織修復中に一役割を果たすことができる。ＰＶＭＣｓは、一斉に作用して病変を回復させる種々の生物活性分子を分泌することが可能であり得る。理論により拘束されることを望まないが、前記プロセスの初期段階に、ＰＶＭＣｓは、炎症性細胞に対する化学誘引物質であり得る炎症誘発性分子、すなわち、エオタキシン、顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、およびＩＬ−８、ならびに活性化により調節される、発現され分泌された正常Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ：ＲＡＮＴＥＳ）の発現によって免疫細胞に対して支持的効果を提供することができる可能性が高い。ＰＶＭＣｓのＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βへの曝露は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ：ＩＬ−１ｒａ）、ＴＮＦ−α、腫瘍壊死因子−β（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−β：ＴＮＦ−β）、上皮好中球活性化タンパク質７８（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７８：ＥＮＡ−７８）、エオタキシン、ＩＬ−８、単球走化性タンパク質１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質−１  α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  α：ＭＩＰ−１  α）、ＭＩＰ−１  β、ＲＡＮＴＥＳ、細胞間接着分子−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：ＩＣＡＭ−１）、ＶＣＡＭ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ：ＳＣＦ）、ＶＥＧＦ１６５、ｂＦＧＦ、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ＴＳＨ）、ＣＤ４０、およびＣＤ４０リガンドを含む走化性および刺激性分子の発現を増加させることができる。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、創傷治癒の早期に炎症性細胞に応答することおよび後続の免疫応答段階のための生理的支持を提供することが可能であり得る。しかし、局所環境は、治癒過程で変化を受けるので、ＰＶＭＣｓの発現プロファイルは経時的に変化し、したがって、損傷部位の免疫監視の阻害、および防止（自己免疫事象の開始）をもたらす結果となることがある。
【０２１８】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、大規模な線維化の確立が生ずる前に抗線維化効果を有することができる。ＨＧＦおよびｂＦＧＦは、ＰＶＭＣｓによる線維化の防止に関与することができる。組織損傷の状況で、ＰＶＭＣｓは、増殖性になり、ＨＧＦを分泌することができ、ＨＧＦが次いで抗線維化効果および免疫修飾効果を媒介する。したがって、一部の実施形態では、線維化を防止するためのＰＶＭＣｓの投与を、線維化を回避すべき症例においてＨＧＦ（およびおそらく他の抗瘢痕化因子）の局所生産を増加させる方法と見なすことができる。
【０２１９】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、インビトロで造血を支持することが可能であり得、この能力は、可溶性因子、例えばＳＣＦ、ＬＩＦ、ＩＬ−６、およびマクロファージコロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｍ−ＣＳＦ）の構成的分泌を伴うことがある。加えて、造血の支持は、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−１α誘導分泌によってさらに増強される場合がある。
【０２２０】
理論により拘束されることを望まないが、血液供給の確立は、傷害を受けた組織の回復の基本であると考えられる。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、胎盤成長因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰｌＧＦ）、およびＭＣＰ−１、ならびに低酸素条件下で培養された内皮細胞の死滅を阻害しインビトロアッセイにおいて毛細血管様構造の形成を促進する血管新生および抗アポトーシス因子、例えばＩＬ−６、ＶＥＧＦ、およびＭＣＰ−１の分泌によって、血管新生促進効果を有することができる。ＰＶＭＣｓはまた、内皮細胞の基質として役立つ細胞外基質成分を提供することによって血管新生に寄与することが可能であり得る。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、周皮細胞に転移し、新たに形成された血管系を安定させることができる。
【０２２１】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＸ３ＣＬ１（フラクタルカイン）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）、ＣＸＣＬ１１（ｉ−ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯα）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯβ）、およびＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）を含む様々な走化性分子を分泌することができる。これらの走化性分子の標的細胞としては、単球、好酸球、好中球、好塩基球、記憶およびナイーブＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、ならびに造血および内皮前駆細胞を含む。一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓによるケモカイン発現を他の細胞タイプ、特に免疫細胞への曝露によって修飾することができる。
【０２２２】
一部の実施形態において、純粋な、実質的に純粋な、または不純な単離されたＰＶＭＣｓを有する組成物は、薬用能力を有する。さらなる実施形態において、これらの組成物の前記ＰＶＭＣｓは、薬用能力を有する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、またはそれらの組合せを発現することが可能であり得る。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、ＣＤ４５陰性であることがある。一部の実施形態において、組成物は、骨および骨髄細胞から単離されたＰＶＭＣｓを有する。
【０２２３】
一部の実施形態では、純粋な、実質的に純粋な、または不純なＰＶＭＣ調製物をヒト患者の胴、頭または肢に投与することができる。さらにもう１つの実施形態において、ＰＶＭＣｓは、再生微小環境を提供することが可能であり得る。
【０２２４】
一部の実施形態では、純粋な、実質的に純粋な、または不純なＰＶＭＣ調製物を骨細片、完全脱灰骨細片、または部分脱灰骨細片と併用することができる。
【０２２５】
一部の実施形態は、治療有効量の複数の単離されたＰＶＭＣｓと医薬的に許容され得る担体とを有する医薬組成物を対象とする。一部の実施形態において、前記複数のＰＶＭＣｓは、骨、臍帯血管、ＰＶＭＣｓを含有する解剖学的源、またはそれらの組合せに由来するＰＶＭＣｓを有する。一部の実施形態において、前記骨は、骨細片、骨梁骨小腔、骨髄、骨小腔洗浄、またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、ＰＶＭＣｓを含有することができるいずれの解剖学的源に由来してもよい。解剖学的源の例は、これに限定されるものではないが、血管（静脈および動脈を含むが、これに限定される）、骨膜、骨梁骨、脂肪組織、滑膜、骨格筋、乳歯、膵臓、肺、肝臓、羊水、胎盤、および血液を含む。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣは、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、またはそれらの組合せから選択されるＣＤを発現する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣは、ＣＤ４５を発現しない。一部の実施形態は、骨髄細胞をさらに有する。一部の実施形態は、足場材料をさらに有する。一部の実施形態において、前記足場材料は、前記足場材料は、骨細片、セラミック系代用骨移植片、リン酸カルシウムセラミックス、硫酸カルシウムセラミックス、バイオガラス、ポリマー系代用骨移植片、分解性および非分解性ポリマー、加工同種骨移植材料、石灰化加工同種移植片、脱灰加工同種移植片、コラーゲンスポンジ、またはそれらの組合せを有する。
【０２２６】
一部の実施形態は、単離されたＰＶＭＣを対象とする。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣは、骨に由来する。一部の実施形態において、前記骨は、骨細片、骨梁骨小腔、骨髄、骨小腔洗浄、またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣは、臍帯血管に由来する。
【０２２７】
一部の実施形態は、複数のＰＶＭＣｓと許容され得る担体とを有する組成物を対象とする。一部の実施形態において、前記複数のＰＶＭＣｓは、骨、臍帯血管、またはそれらの組合せに由来するＰＶＭＣｓを有する。一部の実施形態において、前記骨は、骨細片、骨髄組織および他の組織、緻密骨、髄間管からの骨髄、骨細片、骨梁骨小腔、骨小腔洗浄、またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣは、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびそれらの組合せから選択されるＣＤを発現する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣは、ＣＤ４５を発現しない。一部の実施形態は、骨髄細胞をさらに有する。一部の実施形態は、足場材料をさらに有する。一部の実施形態において、前記足場材料は、前記足場材料は、骨細片、セラミック系代用骨移植片、リン酸カルシウムセラミックス、硫酸カルシウムセラミックス、バイオガラス、ポリマー系代用骨移植片、分解性および非分解性ポリマー、加工同種骨移植材料、石灰化加工同種移植片、脱灰加工同種移植片、コラーゲンスポンジ、またはそれらの組合せを有する。
【０２２８】
医薬組成物はまた、医薬的に許容され得る担体を含有することがある。用語「医薬的に許容され得る担体」は、治療薬、例えば抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療薬の投与のための担体を指す。前記用語は、前記組成物を受ける個体に有害な抗体の生産をそれ自体が誘導せず過度の毒性なく投与することができる任意の医薬的担体を指す。適する担体は、大きい、ゆっくりと代謝される高分子、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体、および不活性ウイルス粒子であり得る。かかる担体は、当業者に周知である。治療組成物中の医薬的に許容され得る担体としては、液体、例えば、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールを含むことができる。補助物質、例えば、湿潤または乳化剤およびｐＨ緩衝物質なども、かかるビヒクル中に存在することがある。
【０２２９】
典型的には、前記治療組成物を注射剤として、溶液または懸濁液のいずれかとして調製する；注射前の液体ビヒクルへの溶解または懸濁に適する固体形態を調製することもできる。リポソームは、医薬的に許容され得る担体の定義に含まれる。医薬的に許容され得る塩、例えば、無機酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩など；ならびに有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、および安息香酸塩なども、前記医薬組成物中に存在することがある。医薬的に許容され得る賦形剤の詳細な論考は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９９５）Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，&  Ｗｉｌｋｉｎｓにおいて入手することができ、これは、この参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２３０】
ＰＶＭＣｓの治療的使用
本明細書において用いる場合の用語「治療有効量」は、所望の疾患もしくは病態を処置、改善もしくは予防するための、または検出可能な治療もしくは予防効果を呈示するための治療薬の量を指す。前記効果を、例えば、化学的マーカーまたは抗原レベルによって検出することができる。治療効果は、身体症状の低減、例えば体温低下も含む。
【０２３１】
被検者のための的確な有効量は、前記被検者のサイズおよび健康状態、前記病態の性質および程度、ならびに投与に選択された治療または治療の組合せに依存することになる。したがって、正確な有効量を前以て特定することは有用でない。しかし、所与の状況のための有効量は、常例的実験によって決定され、臨床家の判断の範囲内である。
【０２３２】
一部の実施形態は、同種輸液を投与する段階を含む、それを必要とする患者を処置する方法を対象とする。一部の実施形態において、前記輸液は、平衡塩類溶液、単離されたＰＶＭＣＳ、またはそれらの組合せを有する。
【０２３３】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを治療的に利用することができる。一部の実施形態において、臍帯血管から単離されたＰＶＭＣｓは、同種輸液の一部を形成することができる。一部の実施形態において、骨から単離されたＰＶＭＣｓは、同種輸液の一部を形成することができる。一部の実施形態において、単離された単離されたＰＶＭＣｓを単離された骨芽細胞、全骨髄、未精製の、精製された、または増殖させたＰＶＭＣｓと併用して、輸液を形成することができる。一部の実施形態において、輸液はまた、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸含有生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、またはそれらの組合せを有する平衡塩類溶液を含むことができる。一部の実施形態では、臍帯血管から単離されたＰＶＭＣｓを組織に直接注入することができる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを治療的投与前に足場に包み込むことができる。適する足場の例としては、既製支柱および酵素または触媒により架橋がインビボで起こるように活性化される架橋性複合体を含む。
【０２３４】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物をヒト患者の胴、頭、または肢に投与することができ、該調製物は、組織再生のための再生微小環境を提供することが可能であり得る。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓの固有分泌活性は、傷害を受ける組織損傷部位で再生微小環境を確立する。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、瘢痕化を阻害する、アポトーシスを阻害する、血管新生を刺激する、ならびに有糸分裂および組織固有幹または前駆細胞を刺激する生物活性因子を分泌することができ、細菌が損傷部位、例えば開放創に存在するとき抗生物質タンパク質を分泌することができる。本明細書において用いる場合、ＰＶＭＣｓの前記多面的効果を「栄養活性」と呼ぶことができる。
【０２３５】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを同種移植片に使用することができ、該ＰＶＭＣｓは、プロスタグランジンＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２：ＰＧＥ２）、間質細胞由来因子−１（ｓｔｒｏｍａｌ−ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＳＤＦ−１）、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、インターロイキン−７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−７：ＩＬ−７）、およびインターロイキン−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８：ＩＬ−８）の分泌によって再生環境を提供すると予想される。
【０２３６】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ：ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １：ＩＧＦ−１）、内皮細胞成長および生存を増進する因子の分泌によって抗アポトーシス微小環境を提供する。
【０２３７】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、αβＴ細胞の増殖の阻害、γδＴ細胞の抑制、Ｂ細胞増殖の阻害および促進、ＮＫ細胞活性化の抑制、樹状細胞およびマクロファージのサイトカイン分泌プロファイルの修飾、ならびに形質細胞による免疫グロブリン生産の抑制によって、免疫修飾特性を有することができる。プロスタグランジンＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２：ＰＧＥ−２）は、免疫細胞に対するＰＶＭＣｓの多数の効果におけるならびに樹状細胞およびマクロファージの分泌プロファイルの修飾における中心的な媒介因子であり得る。ＰＶＭＣｓによって分泌されるＴＧＦ−β１およびＨＧＦはまた、免疫修飾の役割を有すると予想される。ＰＶＭＣｓは、Ｔ細胞増殖を停止させることが示されているインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ：ＩＤＯ）を発現することができる。ＰＶＭＣｓの免疫修飾効果を媒介する他の分子としては、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ：ＩＬ）−１０、ヒト白血球抗原Ｇ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｇ：ＨＬＡ−Ｇ）、および白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）を含むことができ、後者は、Ｔ細胞増殖の抑制にばかりでなく、調節Ｔ細胞の産生および維持にも重要な役割を果たす。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、炎症誘発性サイトカインインターロイキン−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β：ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２：ＩＬ−２）  インターロイキン−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ：ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α：ＴＮＦ−α）、およびインターロイキン−１α（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１α：ＩＬ−１α）を阻害することができる。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、低用量のＩＦＮ−γの影響下、クラスＩＩ主要組織適合性複合体（ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）分子を発現し、抗原提示細胞として挙動する。
【０２３８】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓはまた、組織修復中に一役割を果たすことができる。ＰＶＭＣｓは、一斉に作用して病変を回復させる種々の生物活性分子を分泌することが可能であり得る。一部の実施形態において、前記プロセスの初期段階の間、ＰＶＭＣｓは、炎症性細胞に対する化学誘引物質であり得る炎症誘発性分子、すなわち、エオタキシン、顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、およびＩＬ−８、ならびに活性化により調節される、発現され分泌された正常Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ：ＲＡＮＴＥＳ）の発現によって免疫細胞に対して支持的効果を提供することができる。ＰＶＭＣｓのＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βへの曝露は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ：ＩＬ−１ｒａ）、ＴＮＦ−α、腫瘍壊死因子−β（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−β：ＴＮＦ−β）、上皮好中球活性化タンパク質７８（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７８：ＥＮＡ−７８）、エオタキシン、ＩＬ−８、単球走化性タンパク質１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質−１  α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  α：ＭＩＰ−１  α）、ＭＩＰ−１  β、ＲＡＮＴＥＳ、細胞間接着分子−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：ＩＣＡＭ−１）、ＶＣＡＭ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ：ＳＣＦ）、ＶＥＧＦ１６５、ｂＦＧＦ、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ＴＳＨ）、ＣＤ４０、およびＣＤ４０リガンドを含む走化性および刺激性分子の発現増加を生じさせる結果となり得る。ＰＶＭＣｓは、創傷治癒の早期に炎症性細胞に応答することおよび後続の免疫応答段階のための生理的支持を提供することが可能であり得る。しかし、局所環境は、治癒過程で変化するので、ＰＶＭＣｓの発現プロファイルは経時的に変化し、結果として損傷部位の免疫監視の阻害をもたらすことができ、自己免疫事象の開始を防止することができる。
【０２３９】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、大規模な線維化の確立が生ずる前に抗線維化効果を有することができる。ｂＦＧＦおよびＨＧＦは、ＰＶＭＣｓによる線維化の防止に関与することができる。組織損傷の状況で、ＰＶＭＣｓは、増殖性になり、ＨＧＦを分泌することができ、ＨＧＦが次いで抗線維化効果および免疫修飾効果を媒介する。したがって、一部の実施形態では、線維化を防止するためのＰＶＭＣｓの投与を、線維化を回避すべき症例においてＨＧＦ（およびおそらく他の抗瘢痕化因子）の局所生産を増加させる方法と見なすことができる。
【０２４０】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、インビトロで造血を支持することが可能であり得、この能力は、可溶性因子、例えばＳＣＦ、ＬＩＦ、ＩＬ−６、およびマクロファージコロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｍ−ＣＳＦ）の構成的分泌を伴うことがある：加えて、造血の支持は、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−１α誘導分泌によってさらに増強される場合がある。
【０２４１】
血液供給の確立は、傷害を受けた組織の回復の基本であり得る。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、胎盤成長因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰｌＧＦ）、およびＭＣＰ−１、ならびに低酸素条件下で培養された内皮細胞の死滅を阻害しインビトロアッセイにおいて毛細血管様構造の形成を促進する血管新生および抗アポトーシス因子、例えばＩＬ−６、ＶＥＧＦ、およびＭＣＰ−１の分泌によって、血管新生促進効果を有することができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓはまた、内皮細胞の基質として役立つ細胞外基質成分を提供することによって血管新生に寄与することができると予想される。ＰＶＭＣｓが周皮細胞に転移し、新たに形成された血管系を安定させることができることも予想される。
【０２４２】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＸ３ＣＬ１（フラクタルカイン）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）、ＣＸＣＬ１１（ｉ−ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯα）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯβ）、およびＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）を含む様々な走化性分子を分泌することができる。これらの標的細胞としては、単球、好酸球、好中球、好塩基球、記憶およびナイーブＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、ならびに造血および内皮前駆細胞を含む。ＰＶＭＣｓによるケモカイン発現は、他の細胞タイプ、特に免疫細胞への曝露によって修飾されることになる可能性が高い。
【０２４３】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓ、ＰＶＭＣ調製物、またはそれらの組合せを使用して、治療有効量の単離されたＰＶＭＣｓを有する組成物を投与することにより骨再生を刺激することができる。一部の実施形態において、前記単離されたＰＶＭＣｓは、骨髄をさらに有することができる。一部の実施形態において、前記組成物の投与は、ヒト患者の胴、頭、または肢へのものである。前記投与された血管周囲細胞は、分泌骨芽細胞に直接分化すること、および／または骨形成のための再生微小環境を提供することが可能であり得る。
【０２４４】
単離されたＰＶＭＣ調製物をヒト患者の胴、頭、または肢に投与することができ、該調製物は、骨再生のための再生微小環境を提供することが可能であり得る。単離されたＰＶＭＣｓの固有分泌活性は、傷害を受ける組織損傷部位で再生微小環境を確立する。本明細書において用いる場合、用語「栄養活性」は、瘢痕化を阻害する、アポトーシスを阻害する、血管新生を刺激する、ならびに有糸分裂および組織固有幹または前駆細胞を刺激する生物活性因子を分泌し、かつ細菌が損傷部位、例えば開放創に存在するとき抗生物質タンパク質も分泌する、前記単離されたＰＶＭＣｓの能力を指す。
【０２４５】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓは、プロスタグランジンＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２：ＰＧＥ２）、間質細胞由来因子−１（ｓｔｒｏｍａｌ−ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＳＤＦ−１）、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、インターロイキン−７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−７：ＩＬ−７）、およびインターロイキン−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８：ＩＬ−８）の分泌によって再生環境を提供することができる。
【０２４６】
一部の実施形態において、前記単離されたＰＶＭＣｓは、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）  トランスフォーミング成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ：ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）およびインスリン様成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １：ＩＧＦ−１）、内皮細胞成長および生存を増進する因子の分泌によって抗アポトーシス微小環境を提供することができる。
【０２４７】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、虚血組織において抗アポトーシス効果を有することができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、傷害を受けた組織への酸素および栄養供給低減を生じさせる結果となる破断または機能不全血管に起因する細胞死から保護する分子を分泌することができる。
【０２４８】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、αβＴ細胞の増殖の阻害、γδＴ細胞の抑制、Ｂ細胞増殖の阻害および促進、ＮＫ細胞活性化の抑制、樹状細胞およびマクロファージのサイトカイン分泌プロファイルの修飾、ならびに形質細胞による免疫グロブリン生産の抑制によって、免疫修飾特性を有することができる。プロスタグランジンＥ２（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２：ＰＧＥ−２）は、免疫細胞に対するＰＶＭＣｓの多数の効果におけるならびに樹状細胞およびマクロファージの分泌プロファイルの修飾における中心的な媒介因子であり得る。ＰＶＭＣｓによって分泌されるＴＧＦ−β１およびＨＧＦは、免疫修飾の役割を有することができる。ＰＶＭＣｓは、Ｔ細胞増殖を停止させることが示されているインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ：ＩＤＯ）を発現することができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓの免疫修飾効果を媒介する他の分子としては、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ：ＩＬ）−１０、ヒト白血球抗原Ｇ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｇ：ＨＬＡ−Ｇ）、および白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）を含むことができ、後者は、Ｔ細胞増殖の抑制にばかりでなく、調節Ｔ細胞の産生および維持にも重要な役割を果たす。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、炎症誘発性サイトカインインターロイキン−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β：ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２：ＩＬ−２）  インターロイキン−γ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ：ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α：ＴＮＦ−α）、およびインターロイキン−１α（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１α：ＩＬ−１α）を阻害することが可能であり得る。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、低用量のＩＦＮ−γの影響下、クラスＩＩ主要組織適合性複合体（ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）分子を発現し、抗原提示細胞として挙動する。
【０２４９】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓはまた、組織修復中に一役割を果たすことができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、一斉に作用して病変を回復させる種々の生物活性分子を分泌することが可能であり得る。前記プロセスの初期段階において、ＰＶＭＣｓは、炎症性細胞に対する化学誘引物質であり得る炎症誘発性分子、すなわち、エオタキシン、顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ｃｓｆ）、およびＩＬ−８、ならびに活性化により調節される、発現され分泌された正常Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ：ＲＡＮＴＥＳ）の発現によって免疫細胞に対して支持的効果を提供する可能性が高い。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓのＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βへの曝露は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ：ＩＬ−１ｒａ）、ＴＮＦ−α、腫瘍壊死因子−β（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−β：ＴＮＦ−β）、上皮好中球活性化タンパク質７８（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７８：ＥＮＡ−７８）、エオタキシン、ＩＬ−８、単球走化性タンパク質１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：ＭＣＰ−１）、マクロファージ炎症性タンパク質−１  α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  α：ＭＩＰ−１  α）、ＭＩＰ−１  β、ＲＡＮＴＥＳ、細胞間接着分子−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：ＩＣＡＭ−１）、ＶＣＡＭ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、成長ホルモン、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ：ＳＣＦ）、ＶＥＧＦ１６５、ｂＦＧＦ、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ＴＳＨ）、ＣＤ４０、およびＣＤ４０リガンドを含む走化性および刺激性分子の発現増加を生じさせる結果となり得る。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、創傷治癒の早期に炎症性細胞に応答することおよび後続の免疫応答段階のための生理的支持を提供することが可能であり得る。一部の実施形態において、局所環境は、治癒過程で変化するので、単離されたＰＶＭＣｓの発現プロファイルは経時的に変化し、損傷部位の免疫監視の阻害、および防止（自己免疫事象の開始）をもたらす結果となる可能性が高い。
【０２５０】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、大規模な線維化の確立が生ずる前に抗線維化または抗瘢痕化効果を有することができる。ＨＧＦおよびｂＦＧＦは、単離されたＰＶＭＣｓによる線維化の防止に関与することができる。組織損傷の状況で、単離されたＰＶＭＣｓは、増殖性になり、ＨＧＦを分泌することができ、ＨＧＦが次いで抗線維化効果および免疫修飾効果を媒介する。したがって、一部の実施形態において、線維化を防止するための単離されたＰＶＭＣｓの投与を、線維化を回避すべき症例においてＨＧＦ（およびおそらく他の抗瘢痕化因子）の局所生産を増加させる方法と見なすことができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓの前記抗線維化または抗瘢痕化効果は、損傷部位に移動し通常は高濃度コラゲナーゼ瘢痕組織を生成する筋線維芽細胞の侵入および機能を阻害することができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、造血を支持することが可能であり得、この能力は、可溶性因子、例えばＳＣＦ、ＬＩＦ、ＩＬ−６、およびマクロファージコロニー刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｍ−ＣＳＦ）の構成的分泌を伴うことがある；加えて、造血の支持は、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−１α誘導分泌によってさらに増強される場合がある。
【０２５１】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、組織固有前駆体を分裂および分化するように刺激して損傷部位において組織の再生を生じさせる結果となる分裂促進因子を分泌することにより、分裂促進特性を有することができる。
【０２５２】
一部の実施形態において、それを必要とする被検者に投与される単離されたＰＶＭＣｓは、血管新生効果を有することができる。単離されたＰＶＭＣｓによって分泌される分子は、結果として損傷部位への血管内皮細胞またはそれらの前駆体の動員をもたらすことができる。前記損傷部位に動員されると、内皮細胞またはそれらの前駆体は、分裂し、原始血管を形成することが可能であり得る。血液供給の確立は、傷害を受けた組織の回復の基本である。ＰＶＭＣｓは、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、胎盤成長因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰｌＧＦ）、およびＭＣＰ−１、ならびに低酸素条件下で培養された内皮細胞の死滅を阻害しインビトロアッセイにおいて毛細血管様構造の形成を促進する血管新生および抗アポトーシス因子、例えばＩＬ−６、ＶＥＧＦ、およびＭＣＰ−１の分泌によって、血管新生促進効果を有することができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、内皮細胞の基質として役立つ細胞外基質成分を提供することによって血管新生に寄与することが可能であり得る。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、周皮細胞に転移し、新たに形成された血管系を安定させることができる。
【０２５３】
一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、様々な修復およびヘルパー細胞を再生中の組織ゾーンに動員することができる強力な化学誘引物質である分子を分泌することができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３α）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＸ３ＣＬ１（フラクタルカイン）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）、ＣＸＣＬ１１（ｉ−ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯα）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）、ＣＸＣＬ８（ＩＬ−８）、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯβ）、およびＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）を含む様々な走化性分子を分泌することができる。これら化学誘引物質の標的細胞としては、単球、好酸球、好中球、好塩基球、記憶およびナイーブＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、ならびに造血および内皮前駆細胞を含むことができる。単離されたＰＶＭＣｓによるケモカイン発現は、他の細胞タイプ、特に免疫細胞への曝露によって修飾されることになると考えられる。
【０２５４】
一部の実施形態において、前記単離されたＰＶＭＣｓは、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、またはそれらの組合せを発現することができる。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、ＣＤ４５陰性である。
【０２５５】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを治療的に利用することができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、同種輸液の一部を形成することができる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを単離された骨芽細胞、全骨髄、未精製の、精製された、もしくは増殖させたＰＶＭＣｓと併用して、輸液を形成することができる。一部の実施形態において、輸液はまた、リン酸緩衝生理食塩水、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、またはそれらの組合せを有する平衡塩類溶液を含むことができる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを組織に直接注入することができる。例えば、単離されたＰＶＭＣｓの調製物をカテーテルによって心臓に直接注入することができる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣｓを治療的投与前に足場に包み込むことができる。適する足場の例としては、既製支柱および酵素または触媒により架橋がインビボで起こるように活性化される架橋性複合体を含む。
【０２５６】
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物をヒト患者の胴、頭、または肢に投与することができ、該調製物は、骨再生のための再生微小環境を提供することが可能であり得る。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓの固有分泌活性は、組織損傷部位で再生微小環境を確立することができる。一部の実施形態において、単離されたＰＶＭＣｓは、瘢痕化を阻害する、アポトーシスを阻害する、血管新生を刺激する、ならびに有糸分裂および組織固有幹または前駆細胞を刺激する生物活性因子を分泌することができ、かつ細菌が損傷部位、例えば開放創に存在するとき抗生物質タンパク質を分泌することもできる。ＰＶＭＣｓの前記多面的効果を「栄養活性」と呼ぶことができる。
【０２５７】
一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣｓの薬用能力を、具体的な異なる解剖学的位置によって決定されるような特定の生理環境で該ＰＶＭＣｓによって分泌される分子の範囲によって定義する。
【０２５８】
一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣｓを前記骨の骨梁骨小腔から獲得する。一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓを大腿骨骨頭、遠位大腿骨、または近位脛骨から獲得する。
【０２５９】
一部の実施形態は、骨再生を刺激する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を投与する段階を有する方法を対象とする。一部の実施形態において、前記組成物は、骨髄をさらに有する。一部の実施形態では、ＰＶＭＣ調製物を骨芽細胞と併用する。
【０２６０】
一部の実施形態では、ＰＶＭＣ調製物をヒト患者の胴、頭、または肢に投与する。一部の実施形態において、ＰＶＭＣｓは、再生微小環境を提供することができる。
【０２６１】
一部の実施形態において、細胞機能に影響を及ぼす疾患を処置する方法は、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する。一部の実施形態において、前記疾患は、虚血性心疾患、熱傷、脳卒中、炎症性腸疾患、クローン病、関節リウマチ、狼瘡、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、多発外傷、骨折、糖尿病、またはそれらの組合せである。
【０２６２】
一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、部位依存性栄養因子を分泌することができる。一部の実施形態において、前記栄養因子の部位依存性効果は、アポトーシスの修飾；有糸分裂の修飾；血管新生の修飾；免疫修飾、瘢痕化および線維化の修飾、またはそれらの組合せから選択される。
【０２６３】
一部の実施形態において、前記部位依存性栄養因子は、プロスタグランジンＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２：ＰＧＥ２）、間質細胞由来因子−１（ｓｔｒｏｍａｌ−ｃｅｌｌ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１：ＳＤＦ−１）、血管内皮成長因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ１６５、インターロイキン−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β：ＩＬ−β）、インターロイキン−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６：ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−７：ＩＬ−７）、インターロイキン−８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８：ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２：ＩＬ−１２）、インターロイキン−１６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１６：ＩＬ−１６）、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ：ＴＧＦ−β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ｂＦＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン様成長因子１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １：ＩＧＦ−１）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ  ２，３−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ：ＩＤＯ）、インターロイキン−１０（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０：ＩＬ−１０）、ヒト白血球抗原Ｇ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｇ：ＨＬＡ−Ｇ）、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）、クラスＩＩ主要組織適合性複合体（ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＭＨＣ）、エオタキシン、顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ｃｓｆ）、活性化により調節される、発現され分泌された正常Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ：ＲＡＮＴＥＳ）、ＩＬ−１受容体アゴニスト（ＩＬ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ：ＩＬ−１ｒａ）、腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）、ＴＮＦ−α、腫瘍壊死因子−β（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−β：ＴＮＦ−β）、上皮好中球活性化タンパク質７８（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７８：ＥＮＡ−７８）、エオタキシン、単球走化性タンパク質１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １：ＭＣＰ−１）、単球走化性タンパク質３（ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３：ＭＣＰ−３）、マクロファージ炎症性タンパク質−１  α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  α：ＭＩＰ−１  α）、マクロファージ炎症性タンパク質−３  α（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３  α：ＭＩＰ−３  α）、マクロファージ炎症性タンパク質−１  β（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  β：ＭＩＰ−１  β）、細胞間接着分子−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：ＩＣＡＭ−１）、ＶＣＡＭ−１、顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：Ｇ−ＣＳＦ）、成長ホルモン、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ：ＳＣＦ）、甲状腺刺激ホルモン（ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ：ＴＳＨ）、ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド、胎盤成長因子（ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＰｌＧＦ）、エオタキシン−３、フラクタルカイン、上皮好中球活性化タンパク質７８（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ７８：ＥＮＡ−７８）、インターフェロン誘導性Ｔ細胞アルファ化学誘引物質（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｌｐｈａ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ：ｉ−ＴＡＣ）、成長調節癌遺伝子−アルファ（ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ−ａｌｐｈａ：ＧＲＯα）、成長調節癌遺伝子−ベータ（ｇｒｏｗｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ−ｂｅｔａ：ＧＲＯβ）、インターフェロン誘導性タンパク質−１０（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１０：ＩＰ−１０）、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ４４、ＣＤ２７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ１０、またはそれらの組合せから選択される。
【０２６４】
一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、ＣＤ２７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、またはそれらの組合せを発現する。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、ＣＤ１４６、ＣＤ１０５、ＣＤ４４、ＣＤ１０、またはそれらの組合せを発現する。一部の実施形態において、前記血管周囲細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、またはそれらの組合せを発現しない。
【０２６５】
一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣｓをヒトドナーから獲得する。一部の実施形態において、投与されるＰＶＭＣｓは、自家血管周囲薬用細胞である。一部の実施形態において、投与される前記ＰＶＭＣｓは、同種血管周囲薬用細胞である。
【０２６６】
一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓをヒト骨髄、ヒト組織、または非脱灰骨から獲得する。一部の実施形態において、前記ヒト組織は、脂肪、筋肉、皮膚、胎盤、臍帯組織、血管組織、またはそれらの組合せから選択される毛細血管含有組織である。
【０２６７】
一部の実施形態では、ＰＶＭＣｓを医薬的に許容され得る担体とともに投与する。一部の実施形態では、前記組成物を静脈内注射、腹腔内注射、直接組織注射によって、または必要に応じた領域への直接適用によって投与する。一部の実施形態では、前記組成物を熱傷または創傷に直接適用することができる。一部の実施形態では、前記組成物を静脈内投与する。一部の実施形態において、前記医薬的に許容され得る担体は、標準注入媒質を有する。一部の実施形態において、標準注入媒質は、増量剤、血液ベースの製品、代用血液、緩衝溶液、薬物、栄養素、またはそれらの組合せを有する。一部の実施形態において、増量剤は、これに限定されるものではないが、Ｄ５Ｗ、２／３Ｄ、１／３Ｓ、２分の１生理食塩水、正常生理食塩水、乳酸リンゲル液、およびＤ５ＮＳを含む。一部の実施形態において、血液ベースの製品は、これに限定されるものではないが、全血、赤血球、白血球、血漿、凝固因子、および血小板を含む。一部の実施形態において、代用血液は、これに限定されるものではないが、酸素運搬代用血液、ヘモグロビン系酸素運搬体（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃａｒｒｉｅｒｓ：ＨＢＯＣ）、およびパーフルオロカーボン系酸素運搬体（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ  ｃａｒｒｉｅｒｓ：ＰＦＢＯＣ）を含む。一部の実施形態において、緩衝溶液は、これに限定されるものではないが、乳酸リンゲル液および静脈内投与用重炭酸ナトリウムを含む。栄養素としては、これに限定されるものではないが、塩、グルコース、アミノ酸、脂質、およびビタミンを含む。薬物は、これに限定されるものではないが、通常は静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内経路によって投与されることになる薬物を含む。
【０２６８】
一部の実施形態は、アポトーシスを修飾する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、虚血細胞におけるアポトーシスを修飾することができる。
【０２６９】
一部の実施形態は、有糸分裂を修飾する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、固有組織前駆体における有糸分裂を修飾することができる。
【０２７０】
一部の実施形態は、血管新生を修飾する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、成長因子を分泌して血管新生を修飾することができる。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、血管周囲組織に局在され、新たに形成された血管を安定させる。
【０２７１】
一部の実施形態は、骨組織を再建する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。
【０２７２】
一部の実施形態は、金属デバイスを骨の中に固定する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。一部の実施形態では、前記金属デバイスは、頭蓋顔面骨、頭蓋骨、下顎骨、鎖骨、肩甲骨、胸骨、肋骨、上腕骨、尺骨、橈骨、心皮、指節骨、中手骨、膝蓋骨、腓骨、大腿骨、脛骨、足根骨、中足骨、仙骨、寛骨、または腰椎から選択される骨内に固定される。
【０２７３】
一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、血管周囲組織に局在することができる。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、新たに形成された血管を安定させる。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、血管新生分子、血管形成性分子、またはそれらの組合せを分泌する。一部の実施形態において、前記血管新生または血管形成性分子は、血管内皮細胞を誘引し、増加させる。一部の実施形態において、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する前記組成物の投与は、内皮細胞の動員および増殖を生じさせる結果となる。
【０２７４】
一部の実施形態は、骨形成を修飾する方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは骨芽細胞を形成する能力を有する。
【０２７５】
一部の実施形態は、免疫修飾方法であって、治療有効量のＰＶＭＣｓを有する組成物を、それを必要とする被検者に投与する段階を有する方法を対象とする。一部の実施形態において、前記免疫修飾は、サイトカイン、成長因子、またはそれらの組合せの少なくとも１つによって媒介される。一部の実施形態において、前記免疫修飾は、リンパまたはリンパ系におけるものである。
【０２７６】
一部の実施形態は、ＰＶＭＣｓと足場材料とを有する組成物を対象とする。一部の実施形態において、前記ＰＶＭＣｓは、冷凍保存されており、その後、解凍されている。一部の実施形態において、前記足場材料は、骨細片、セラミック系代用骨移植片、リン酸カルシウムセラミックス、硫酸カルシウムセラミックス、バイオガラス、ポリマー系代用骨移植片、分解性および非分解性ポリマー、加工同種骨移植材料、石灰化加工同種移植片、脱灰加工同種移植片、コラーゲンスポンジ、またはそれらの組合せを有する。
【０２７７】
一部の実施形態では、本開示に記載の前記ＰＶＭＣ調製物をヒト被検者に投与して、細胞機能に影響を及ぼす疾患を処置することができる。前記ＰＶＭＣｓを単独で使用してもよく、または他の治療薬と併用してもよい。単独で使用するとき、ＰＶＭＣ調製物を静脈内投与することができ、または損傷部位に投与することができる。治療レジメンは、時間経過を規定した多回注射から構成されることもあり、または単回注射で構成されることもある。細胞ベースの療法、例えば、本開示に記載の実施形態は、前記細胞が特定の病的微小環境に応答するので、病変内で様々な部位で何回も多数の治療効果を発揮する利点を有することができる。
【０２７８】
治療的投与のためのＰＶＭＣ調製物は、濃縮された骨または臍帯由来ＰＶＭＣｓの集団が補充された骨の第１の部分から調製された自家骨移植片を含むことができる。一部の実施形態では、前記濃縮された骨または臍帯由来ＰＶＭＣｓは、該ＰＶＭＣｓを前記被検者からの同じ自家骨組織の第２の部分から抽出および濃縮することによって調製して、前記強化された自家骨移植片を作製ことができる。
【０２７９】
一部の実施形態において、ＰＶＭＣ調製物は、同種輸液の一部を形成することができる。骨または臍帯由来ＰＶＭＣｓを単離された骨芽細胞、全骨髄、未精製の、精製された、または増殖させたＰＶＭＣｓと併用して輸液を形成することになる。一部の実施形態において、前記輸液はまた、平衡塩類溶液、例えば、限定ではないがリン酸緩衝生理食塩水、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、またはそれらの組合せを含むことができる。
【０２８０】
一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣ調製物を組織に直接注入することができる。例えば、骨由来ＰＶＭＣｓの調製物をカテーテルによって心臓に直接注入することができる。一部の実施形態において、疾患を処置する前記方法は、ＰＶＭＣ調製物を足場に包み込む段階を有することができる。ＰＶＭＣ調製物を治療的投与前に足場に包み込むことができる。適する足場の例としては、既製支柱および酵素または触媒により架橋がインビボで起こるように活性化される架橋性複合体を含む。
【０２８１】
一部の実施形態では、ＰＶＭＣの調製物を骨細片と併用して、創傷部位に直接適用することができるペーストを形成することができる。前記ペーストは、再生微小環境を提供することが可能であり得る。一部の実施形態において、前記ペーストは、抗アポトーシス特性を有することができる。
【０２８２】
ＰＶＭＣ調製物を、これに限定されないが合成代用骨を含む多種多様な追加の要素と共に投与することができ、前記合成代用骨は、リン酸カルシウム系代用骨、カルシウムアパタイト、β−リン酸三カルシウム、天然および合成ポリマー、セラミックス、Ａｌｌｏｇｒｏ、Ｏｐｔｅｆｏｒｍ、Ｇｒａｆｔｏｎ、ＯｒｔｈｏＢｌａｓｔ、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、バイオガラス、ＯｓｔｅｏＧｒａｆｔ、Ｎｏｒｉａｎ  ＳＲＳ、ＰｒｏＯｓｔｅｏｎ、Ｏｓｔｅｏｓｅｔ、ポリマー系代用骨移植片、分解性および非分解性ポリマー、Ｃｏｒｔｏｓｓ、開孔性ポリ乳酸ポリマー、Ｉｍｍｉｘ、またはそれらの組合せ；石灰化加工同種移植片、脱灰加工同種移植片、またはそれらの組合せ；コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ−２含有コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ−７含有コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ−２およびＢＰＭ−７含有コラーゲンスポンジ、またはそれらの組合せ；ＰＤＧＦ−ＢＢ；単離された骨芽細胞、全骨髄、未精製の、精製された、もしくは増殖させたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せと併用されるリン酸カルシウム系代用骨；単離された骨芽細胞、全骨髄、未精製の、精製された、または増殖させたＰＶＭＣｓを有することに加えて、代用骨、例えば、ヒドロキシアパタイト、カルシウムアパタイト、β−リン酸三カルシウム、天然および合成ポリマー、セラミックス、もしくは他の代用骨材料、またはそれらの組合せ；ルート関節形成術中に獲得される廃棄膝関節または股関節骨／骨髄を有する。一部の実施形態では、前記ＰＶＭＣｓを単独で使用してもよく、または骨もしくは他の足場、例えば自家骨移植片と併用してもよい。
【０２８３】
単離されたＰＶＭＣｓおよびＰＭＶＣ調製物を保管するための方法
一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを将来の使用のために保管することができる。単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せの保管は、−２０℃から−２５０℃の範囲の温度での極低温保存によって果たすことができる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せをプラズマライトおよびジメチルスルホキシドと混合し、その後、液体窒素または液体窒素蒸気中で保管することができる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを約０．５Ｍエチレングリコール、約１．０Ｍプロピレングリコール、および約１．５Ｍジメチルスルホキシドと培養培地の存在下で混合し、その後、液体窒素または液体窒素蒸気中で保管することができる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを培養培地および１０％ジメチルスルホキシドと混合物し、その後、液体窒素または液体窒素蒸気中で保管することができる。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを冷凍する前記プロセスを瞬間冷凍によって果たす。本明細書に記載する場合、瞬間冷凍は、ＰＶＭＣ調製物を液体窒素に浸漬し、その結果、前記単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せの急速冷凍を生じさせるプロセスを含む。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを冷凍する前記プロセスを、前記ＰＶＭＣ調製物の温度を該調製物の液体窒素蒸気への浸漬により徐々に低下させることによって果たす。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを、温度プローブに連結された冷凍庫に入れ、ここで当該温度を、所望の冷凍温度への漸進的降下を可能にするためのコンピュータ制御プロトコルによって低下させる。さらなる実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを所定の量のＰＶＭＣｓが入っているクリオバイアルに詰め、−８５℃機械的冷凍器内で２４時間のイソプロパノール浴中でのバイアルの浮遊、続いての−１９６℃での保管のための液体窒素への投入から成るダンプ・フリーズ法（ｄｕｍｐ−ｆｒｅｅｚｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いておおよそ−１℃／分で冷却する。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを保管場所から回収し、直ちに３７℃水浴で解凍し、続いて滅菌培地で注意深く洗浄して、１０分にわたる完全培地でのゆっくりとした希釈によって抗凍結剤を除去し、５００×ｇでの５分間の遠心分離、上清の吸引、および新たな完全培地での再浮遊が続く。
【０２８４】
一部の実施形態では、極低温冷凍の単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを、該調製物を約３５℃から４０℃の温度での予熱滅菌水浴に入れることによって解凍することができる。前記水浴に浸漬したら、前記単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを解凍するまで混合する。したがって、前記単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せは、細胞培養での増殖またはＰＶＭＣ生存力についての試験に適している。一部の実施形態では、単離されたＰＶＭＣ調製物、単離されたＰＶＭＣｓ、骨もしくは骨組織に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、臍帯血管に由来する単離されたＰＶＭＣｓ、またはそれらの組合せを、該調製物を液体窒素蒸気に約３０から４５分間浸漬することによって解凍することができる。その後、前記ＰＶＭＣ調製物を、細胞培養での増殖、試験、または治療的使用のために必要とされるまでドライアイス中で維持する。
【０２８５】
本発明ならびに用いる方法および材料を例示する実施形態を、以下の非限定的実施例への参照によりさらに理解することができる。
（実施例）
【実施例１】
【０２８６】
臍帯血管からのＰＶＭＣｓの単離
ＰＶＭＣｓを臍帯血管の静脈または動脈から多段プロセスによって単離することになる。臍帯血管の４〜５ｃｍ長部分を単離し、抗生物質（３００単位／ｍＬペニシリン、３００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、および１μｇ／ｍＬファンギゾンを含有するタイロード液に浸漬することになる、あるいは２０％抗生物質（１６７単位／ｍＬペニシリンＧ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、０．３μｇ／ｍＬアンホテリシン）を含有する８０％α−ＭＥＭに浸漬することになる。ＰＶＭＣｓを臍帯血管から、子宮外で臍帯血管組織を獲得してから６から１２時間以内に単離すべきである。
【０２８７】
第１工程では、前記臍帯血管にカニューレを挿入し、１００単位／ｍＬヘパリンを含有するタイロード液で洗浄することになり、前記洗浄溶液を廃棄する。
【０２８８】
第２工程では、前記臍帯血管の遠位端をクランプし、前記カニューレが挿入された臍帯血管または静脈を１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（ＩＶ型）を含有するα−ＭＥＭあるいは最適化酵素ミックスで満たす。代替工程では、コラゲナーゼ（ＩＶ型）の代わりにメタロプロテイナーゼを用いる。
【０２８９】
第３工程では、前記臍帯血管の近位端をクランプすることになり、コラゲナーゼあるいは前記最適化酵素混合物を含有する当該臍帯を２０〜３０分間、３７℃で恒温放置する。その後、前記臍帯血管をクランプから外し、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（ＩＶ型）を含有する前記α−ＭＥＭあるいは最適化酵素ミックスを前記静脈または動脈から排出する。
【０２９０】
第４工程では、前記臍帯血管を再びクランプし、タイロード液で洗浄し、その後、前記臍帯血管を穏やかにマッサージすることになる。結果として得られるタイロード溶液は、内皮および内皮下細胞の浮遊液を含有する。前記タイロード細胞浮遊液を採取し、当該細胞を洗浄し、その後、１０％ＦＥＢと、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、１００単位／ｍＬペニシリンと、１００単位／ｍＬストレプトマイシンとで補足されたＤＭＥＭ中、３７℃で、５％ＣＯ２で３日間培養する。このプロセスによって、主として内皮細胞を有する細胞の集団と小ＰＶＭＣ集団とを得ることになる。
【０２９１】
第５工程では、前記第２工程から第４工程を繰り返して第２のタイロード細胞浮遊液を得ることになり、第２のタイロード細胞浮遊液を、１０％ＦＢＳと、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、１００単位／ｍＬペニシリンと、１００単位／ｍＬストレプトマイシンとで補足されたＤＭＥＭ中、３７℃で、５％ＣＯ２で３日間培養することができる。この第２の細胞浮遊液は、ＰＶＭＣｓが富化されていると予想される。
【実施例２】
【０２９２】
臍帯血管からのＰＶＭＣｓの単離
ＰＶＭＣｓを、臍帯血管の静脈または動脈から、２回の別個の酵素恒温放置を含む多段プロセスによって単離することになる。第１工程では、臍帯血管の４〜５ｃｍ長部分を単離し、抗生物質（３００単位／ｍＬペニシリン、３００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、および１μｇ／ｍＬファンギゾンを含有するタイロード液に浸漬することになる、あるいは２０％抗生物質（１６７単位／ｍＬペニシリンＧ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、０．３μｇ／ｍＬアンホテリシン）を含有する８０％α−ＭＥＭに浸漬することになる。ＰＶＭＣｓを臍帯血管から、子宮外で臍帯血管組織を獲得してから６から１２時間以内に単離すべきである。
【０２９３】
第２工程では、臍帯の前記部分をリングスタンドに対して垂直位置に取り付けることになり、前記臍帯の頂部および底部をクランプする。これに続いて、前記血管の頂部および底部にカニューレを挿入し、前記懸架された臍帯血管の前記血管の前記頂部および底部に３方口を挿入し、ここで前記頂部の前記３方口は、前記血管への培地の送達を可能にすることができる。前記３方口により、培地の挿入、前記血管へのおよび血管からの空気の移動、ならびに前記血管に含有された培地を空にすることが可能になる。
【０２９４】
その後、第３工程では、前記臍帯血管を、１００単位／ｍＬヘパリンを含有するタイロード液で洗浄することになり、前記洗浄溶液を廃棄する。前記タイロードを、前記臍帯血管の前記底部に挿入された前記３方口に、前記血管が溶液で満たされるまで注入する。その後、同じ３方口を通して前記タイロード液を空にする。
【０２９５】
第４工程では、前記臍帯血管を、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（ＩＶ型）を含有するα−ＭＥＭあるいは最適化酵素ミックスで満たすことになる。代替工程では、コラゲナーゼ（ＩＶ型）の代わりにメタロプロテイナーゼを用いる。１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（ＩＶ型）を含有する前記α−ＭＥＭあるいは最適化酵素ミックスを、前記臍帯血管の前記底部に挿入された前記３方口に、前記血管が培地で満たされるまで注入する。その後、１ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ（ＩＶ型）を含有する前記α−ＭＥＭあるいは最適化酵素ミックスを、同じ３方口を通して空にする。
【０２９６】
第５工程では、１ｍｇ／ｍＬ  コラゲナーゼ（ＩＶ型）を含有するα−ＭＥＭあるいは最適化酵素ミックスを含有する前記臍帯血管を２０〜３０分間、３７℃で恒温放置する。前記臍帯血管の前記底部の前記３方口を通して前記臍帯血管を空にし、廃棄する。
【０２９７】
第６工程では、前記第２工程から第４工程を繰り返して第２のタイロード細胞浮遊液を得ることになり、第２のタイロード細胞浮遊液を、１０％ＦＢＳと、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、１００単位／ｍＬペニシリンと、１００単位／ｍＬストレプトマイシンとで補足されたＤＭＥＭ中、３７℃で、５％ＣＯ２で３日間培養することができる。この第２の細胞浮遊液は、ＰＶＭＣｓが富化されていると予想される。
【０２９８】
ＰＶＭＣｓを前記臍帯血管から単離する前記プロセスの間、前記臍帯を極低温保存することが可能である。前記単離プロセスの前記第１工程におけるタイロード液への浸漬後の極低温保存が企図される。単離プロセスの前記第３工程の後の、すなわち、前記臍帯血管をタイロード液で洗浄して、前記血管中に残存する残留血液をフラッシュした後の前記臍帯の極低温保存も企図される。前記血管を前記第２工程で記載したように洗浄したら、それを適する凍結保護溶液、例えば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはジメチルスルホキシドを含有する別のグリコールで満たす。その後、当該臍帯切片を瞬間凍結させて、氷結晶の形成、ならびに前記血管の中に含有されている組織および細胞に対する傷害を回避する。前記臍帯切片を、−７０℃での１から２４時間の初期冷凍、続いて液体窒素中−１９６℃での長期極低温保存によって段階的様式で冷凍することもできる。極低温保存された試料を前記単離プロトコルの完了のために解凍することができる。組織および細胞生存力を維持するために、極低温保存された試料を急速解凍すべきである。
【実施例３】
【０２９９】
ＰＶＭＣｓの培養
臍帯血管から単離されたＰＶＭＣｓを培養して、濃縮された臍帯血管由来ＰＶＭＣｓの集団を選択的に増殖させることができる。臍帯血管から単離された１若しくはそれ以上の細胞浮遊液を、１０％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）で補足されたＤＭＥＭで希釈することができる。前記ＤＭＥＭ混合物を激しくボルテックスして当該細胞を機械的に分散させ、続いて４８０×ｇで５分間、ベンチトップ遠心機において遠心分離することができ、その後、当該上清を除去する。Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）（密度１．０３〜１．１２ｇ／ｍＬ）、続いて、インタクトＰｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配を保証するための破壊を伴わない４８０×ｇでの１５分間の第２ラウンドの遠心分離を用いることにより、残存細胞ペレットを分別して成核細胞を採取することになる。その後、前記勾配の上部画分を新しい試験管に移し、ＤＭＥＭで補足し、続いて４８０×ｇで１５分間、遠心分離する。遠心分離後、前記ペレットを乱すことなく当該上清を除去する。その後、前記ペレットをＤＭＥＭに再浮遊させ、ＤＭＥＭを使用して遠心分離により数回洗浄する。得られるＰＶＭＣ細胞浮遊液は、その結果、増殖または濃縮の準備が整っている。
【実施例４】
【０３００】
大腿骨の大腿骨骨頭からのＰＶＭＣｓの単離
股関節置換手術からの廃棄骨断片または大腿骨骨頭を骨細片としても、ＰＶＭＣｓ源としても使用することができる。先ず、細胞浮遊液を前記骨から酵素消化および機械力によって抽出することよって；次に、前記抽出されたＰＶＭＣｓを濃縮し、ＰＶＭＣ集団を選択的に増殖させることによってＰＶＭＣｓを単離することができる。
【０３０１】
細胞浮遊液を大腿骨の大腿骨骨頭から抽出するために、前記骨を破砕してもよい。先ず、前記骨の外来軟組織を取って清浄化し、粉砕して、５ｍｍまでの縁部寸法を有する不規則形状多面体の形態の皮質／海綿質細片を獲得する。前記骨細片は、骨髄を有することもある。場合によっては、骨細片を大腿骨骨頭から獲得することになり、前記清浄化プロセスを省いて前記調製物中に骨髄組織を留めておく。骨を機械的に破壊することに加えて、前記骨断片の酵素消化を、次の酵素での一連の処理に前記骨を付すことによって果たすこともできる：コラゲナーゼ、プロテアーゼ、ＧＡＧアーゼ、およびメタロプロテアーゼ、クロストリパイン（Ｃ．ヒストリチクムからのシステインプロテアーゼ）、セリンプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、またはそれらの組合せ。理論により拘束されることを望まないが、酵素消化は、前記ＰＶＭＣｓを前記骨断片中の小血管の基底膜に連結する結合を特異的に切断すると考えられる。一部の実施形態では、骨断片の前記酵素消化を、骨の機械的破壊の後でも、インタクト骨断片でも行うことができる。
【０３０２】
酵素消化後、骨断片から獲得された前記細胞浮遊液を、Ｓｍａｒｔｐｒｅｐ２（商標）遠心機を２，５００ｒｐｍで３分間、続いて２，３００ｒｐｍで９分間使用する密度勾配遠心分離により清浄化および採取することができる。あるいは、重力により、粒子を採取管の底部に集めて細胞を回収することができる。
【０３０３】
その後、ＰＶＭＣ細胞浮遊液を、前記ＰＶＭＣ上の細胞表面抗原に対して親和性を有する抗体を有する磁性ビーズの使用により濃縮することができる。ＰＭＶＣの濃縮を、増殖させた細胞集団に対して行ってもよい。ＰＭＶＣ集団の濃縮を、前記細胞集団の事前の増殖なしに行ってもよい。ＰＭＶＣ調製物は自家様式で投与されてもよい。絶対細胞純度が要求されないこともある。理論により拘束されることを望まないが、内皮細胞または単球中の不純物は、骨形成事象に有益である場合があると考えられる。
【０３０４】
一部の実施形態では、その後、前記濃縮物を多孔質ヒドロキシアパタイト顆粒（Ｏｒｔｈｏｓｓ（登録商標）；９７ｍ２／ｇ、全孔隙率６０％、結晶間隙結晶サイズ１０〜６０ｍｍ、Ｃａ／Ｐ  ２．０３）と混合することができ、またはブタもしくはウシコラーゲンスポンジ（１００ｍｇゼラチン、インビボでの再吸収期間２〜３週間）に適用することができる。前記濃縮物を自己フィブリンクロットに包み込んでもよい。
【０３０５】
これらの調製物は、整形外科的、歯科、および頭蓋顔面再建用途での直接使用に適し得る。単離されたＰＶＭＣｓを−１９５℃での極低温保管によって将来の使用のために保管することができる。
【実施例５】
【０３０６】
骨再生のための再生微小環境を作るためのＰＶＭＣｓの投与
ＰＶＭＣ調製物、例えば実施例１からのものをヒト被検者に投与して、損傷後の骨の再生を促進することになる。これらの細胞を単独で使用してもよく、骨または他の足場、例えば自己骨移植片と併用してもよい。単独で使用するとき、ＰＶＭＣ調製物を静脈内注射することができ、または損傷部位に注射することができる。治療レジメンは、時間経過を規定した多回注射から構成されることもあり、または単回注射で構成されることもある。治療レジメンはまた、患者の静脈に前以て挿入されたカテーテルに接続された生理食塩水のバッグに注入口を介してＰＶＭＣ調製物を注入することによる点滴静注によって患者の静脈に注入することもできる。細胞ベースの療法、例えば、本出願に記載の実施形態は、前記細胞が特定の病的微小環境に応答するので、病変内で様々な部位で何回も多数の治療効果を発揮する利点を有することができる。
【０３０７】
ＰＶＭＣ調製物、例えば実施例１のものは、同種輸液の一部を形成することができる。骨由来ＰＶＭＣｓを単離された骨芽細胞、全骨髄、未精製の、精製された、または増殖させたＰＶＭＣｓと併用して、静脈内投与用の輸液を形成することができる。輸液はまた、リン酸緩衝生理食塩水、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、またはそれらの組合せを有する平衡塩類溶液を含むことができる。あるいは、骨由来ＰＶＭＣｓを組織に直接注入することができる。例えば、骨由来ＰＶＭＣｓの調製物をカテーテルによって心臓に直接注入することができる。さらに、骨由来ＰＶＭＣｓを損傷部位への直接的な治療的投与前に足場に包み込むことができる。例えば、骨細片と併用してペーストにした骨由来ＰＶＭＣｓを、外科的に露出させて準備した損傷した脊椎骨または他の骨上に直接配置することができる。適する足場の例としては、既製支柱および酵素または触媒により架橋がインビボで起こるように活性化される架橋性複合体を含む。
【実施例６】
【０３０８】
抜歯および歯科インプラントでの置換におけるＰＶＭＣと骨細片との複合材の使用
歯科インプラントは、通常はチタンで作製された「ルート」デバイスであり、欠如歯を置換するための歯または歯群に似ている修復を支持するために歯科学において使用されるデバイスである。事実上、今日配置されているすべての歯科インプラントは、歯根型骨内インプラントである、すなわち、それらは、実際の歯根に似ているように見え、したがって「歯根型」を有し、歯根が以前、抜歯前にあった骨小腔内に配置される。顎の骨は、チタンポストを受け入れ、チタンポストと骨結合する。骨結合は、インプラント表面と周囲骨の癒合を指す。
【０３０９】
骨結合インプラントの配置は、骨の燃焼または圧迫壊死を防止するような高度に調整された速度で手動骨刀または精密ドリルのいずれかを使用する骨への準備を必要とする。骨が前記インプラント表面上に成長すること（骨結合）を可能にするための可変量の時間の後、歯冠（単数または複数）を前記インプラント上に配置することになる。インプラントを配置するために要する時間量は、施術者の経験、骨の質および量、ならびに個々の状況の難しさに依存して変わり得る。
【０３１０】
ＰＶＭＣと骨細片との複合材を抜歯後に残存する空洞の填塞または前記インプラントの包囲に利用して、骨結合を促進することができる。前記ＰＶＭＣと骨細片との配合調製物を使用して、抜歯後に抜歯部位を充填することもできる。前記ＰＶＭＣと骨細片との調製物は、抜歯部位内での骨形成を刺激するために必要な再生微小環境を提供することができる。前記ＰＶＭＣと骨細片との複合材調製物を準備が整った抜歯部位に挿入する。前記準備が整った抜歯部位への前記ＰＶＭＣと骨細片との複合材調製物の挿入後、前記歯科インプラントを前記充填された抜歯部位に挿入し、その上に人工歯を取り付けることになる。前記ＰＶＭＣと骨細片との複合材調製物の存在によって作られる、結果として生ずる再生微小環境が、前記金属ポスト周囲で骨形成を生じさせる結果になる。
【実施例７】
【０３１１】
部分脱灰骨の調製
大腿骨骨頭からの骨を骨細片に破砕し、粉砕し、ふるいにかけて、約８００マイクロメートルのサイズを有する粉砕された骨を単離することになる。前記骨細片は、骨髄を含有することがある。前記粉砕された骨は、骨細片と骨粉との組合せを有することがある。前記粉砕された骨材料を混合容器に入れ、５：１比の３％過酸化水素で清浄化し、１５分間撹拌し、取り出し、最低３０００ｍＬの滅菌水ですすぐことになる。前記すすいだ骨材料を、前記清浄化した混合容器に戻し入れ、少なくとも１０００ｍｌの７０％ＥｔＯＨを添加し、前記溶液を３０分間混合することになる。前記骨材料をＮｏ．７０ふるいに移し入れることになり、前記ふるいの底部に開放減圧を適用し、前記骨粉を２０分間乾燥させる。前記乾燥させた骨材料を計量することになる。グラムでの骨重量を、適用される酸の体積を決定するチャートと比較することになり、ここでおおよそ１グラムの骨は、おおよそ１６ｍＬの酸を要することになる。前記骨材料を０．６Ｍ塩酸と約７時間混合して、灰分を部分的に除去することになる。前記骨材料を塩酸とより長時間（２４時間まで）混合して、より多くの灰分を除去することができる。
【実施例８】
【０３１２】
骨からの骨細片の獲得
骨からの骨細片の獲得は多段プロセスである。適する骨は、腸骨稜、大腿骨、膝蓋骨、脛骨、上腕骨、鎖骨、肋骨、もしくは肩甲骨、またはそれらの組合せを有する人骨が起源である。一部の実施形態では、この組織を患者に対する外科手術後に廃棄組織として獲得し、自家使用のために準備することができる。一部の実施形態において、骨は、大腿骨の近位および遠位領域、腸骨稜、膝蓋骨、脛骨、上腕骨、鎖骨、肋骨、または肩甲骨が起源である。
【０３１３】
第１工程では、適するボーンミル、例えば、Ｎｏｖｉｏｍａｇｕｓ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｌｌを平面上で製造業者の使用説明書に従って先ず組み立て、小サイズ骨粒子には「微粉砕」を用いる。その後、適するボールまたは採取容器を粉砕ドラム出口の下に配置する。
【０３１４】
第２工程では、骨の断片を獲得し、この断片を破砕プロセス前もしくは後に冷凍することができ、またはこの断片は新鮮である場合もある。前記単離された骨を粉砕に準備をするために、過剰な組織および関節軟骨をボーンカッタでトリミングする。
【０３１５】
第３工程では、骨の前記断片を前記ミルのハウジングに入れる。大腿骨骨頭からの骨を使用するとき、前記骨頭を通常は半分に切断し、骨梁骨表面を前記ミルの回転方向に対向させて骨頭のそれぞれの半分を別々に粉砕する。前記ミルのプッシュブロックに下向きに圧力を適用しながら前記ミルのハンドルを時計回りに回転させると、骨断片は骨細片に粉砕される。前記骨細片をボールまたは採取容器に採取する。また、過剰な骨細片を、前記粉砕プロセス中にそれらを保持することができる粉砕ドラムおよびハウジング内から、スパチュラで回収する。
【０３１６】
骨細片は、骨と骨髄との両方を有することがある。あるいは、骨細片は、緻密骨、骨髄、髄管からの組織、海綿骨組織、またはそれらの組合せを有することもある。この方法によって形成される骨細片のサイズは、前記骨の起源に依存して様々である。例えば、近位脛骨からの骨細片を粉砕して、サイズが約３．６ｍｍから約８．０ｍｍの範囲の粒子を形成することができ；遠位大腿骨からの骨細片を粉砕して、サイズが約２．９ｍｍから約７．１ｍｍの範囲の粒子を形成することができ；大腿骨骨頭からの細片を粉砕して、サイズが約２．２ｍｍから約３．４ｍｍの範囲の粒子を形成することができる。粉砕された骨細片のサイズをその最長軸周りで測定することができる
その後、骨を極低温保存してもよく、または直ちに治療的投与に使用してもよい。
【実施例９】
【０３１７】
部分脱灰骨細片の調製
大腿骨骨頭からの骨を、その最大軸周りの寸法が約３．０ｍｍである骨細片に破砕することになる。前記骨細片は、骨髄を含有することがある。前記骨細片を混合容器に入れ、５：１比の３％過酸化水素で清浄化し、１５分間撹拌し、取り出し、最低３０００ｍＬの滅菌水ですすぐことになる。前記すすいだ骨材料を、前記清浄化した混合容器に戻し入れ、少なくとも１０００ｍＬの７０％ＥｔＯＨを添加し、前記溶液を３０分間混合することになる。前記骨材料をふるいに移し入れることになり、前記ふるいの底部に開放減圧を適用し、前記骨細片を２０分間乾燥させる。前記乾燥させた骨材料を計量することになる。グラムでの骨重量を、適用される酸の体積を決定するチャートと比較することになり、ここでおおよそ１グラムの骨は、おおよそ１６ｍＬの酸を要することになる。前記骨細片を０．６Ｍ塩酸と約７時間混合して、灰分を部分的に除去することになる。前記骨細片を塩酸とより長時間（２４時間まで）混合して、より多くの灰分を除去することができる。
【実施例１０】
【０３１８】
骨細片からのＰＶＭＣｓの直接培養
ＰＶＭＣｓを骨細片から直接培養して、濃縮された骨由来ＰＶＭＣｓの集団を選択的に増殖させることができる。骨組織を含有する粉砕された骨試料を、１０％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）で補足されたＤＭＥＭで希釈する。前記骨−ＤＭＥＭ混合物を激しくボルテックスして、前記組織を機械的に分散させ、それを前記骨から分離し、続いてベンチトップ遠心機において４８０×ｇで５分間遠心分離することができ、その後、当該上清を除去する。Ｐｅｒｃｏｌｌ（商標）（密度１．０３〜１．１２ｇ／ｍＬ）、続いて、インタクトＰｅｒｃｏｌｌ（商標）勾配を保証するための破壊を伴わない４８０×ｇでの１５分間の第２ラウンドの遠心分離を用いることにより、残存細胞ペレットを分別して成核細胞を採取することになる。その後、前記勾配の上部画分を新しい試験管に移し、ＤＭＥＭで補足し、その後、４８０×ｇで１５分間遠心分離する。遠心分離後、前記ペレットを乱すことなく当該上清を除去する。その後、前記ペレットをＤＭＥＭに再浮遊させ、ＤＭＥＭを使用して遠心分離により数回洗浄する。得られるＰＶＭＣ細胞浮遊液は、その結果、増殖または濃縮の準備が整っている。
【０３１９】
本発明を、本発明の一定の好ましい実施形態を参照して相当詳細に記載したが、他のバージョンが可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲を、本明細書に収載されている説明および好ましいバージョンに限定すべきでない。
【実施例１１】
【０３２０】
骨再生のための再生微小環境を作るためのＰＶＭＣｓの投与
ＰＶＭＣ調製物をヒト被験者に投与して、損傷後の骨の再生を促進することになる。前記ＰＶＭＣ調製物は、骨髄を含む。前記ＰＶＭＣ調製物を骨粉と併用することになり、静脈内注射することができ、または損傷部位に注射することができる。治療レジメンは、時間経過を規定した多回注射から構成されることもあり、または単回注射で構成されることもある。治療レジメンはまた、患者の静脈に前以て挿入されたカテーテルに接続された生理食塩水のバッグに注入口を介してＰＶＭＣ調製物を注入することによって点滴静注により患者の静脈に注入することもできる。
【実施例１２】
【０３２１】
骨再生のための輸液中のＰＶＭＣｓの投与
ＰＶＭＣ調製物を、それを必要とする被検者に同種輸液として投与することになる。骨または臍帯由来ＰＶＭＣｓを単離された骨芽細胞、全骨髄、未精製の、精製された、または増殖させたＰＶＭＣｓと併用して、静脈内投与用の輸液を形成することになる。前記輸液はまた、平衡塩類溶液、例えば、限定ではないがリン酸緩衝生理食塩水、乳酸リンゲル液、酢酸リンゲル液、ＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＲＩＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＴＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）、アール平衡塩類溶液（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＥＢＳＳ）、標準クエン酸添加生理食塩水（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ：ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＥＰＥＳ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ：ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（Ｇｅｙ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：ＧＢＳＳ）、またはそれらの組合せを含むことができる。あるいは、骨または臍帯由来ＰＶＭＣｓを組織に直接注入することになる。例えば、骨由来ＰＶＭＣｓの調製物をカテーテルによって心臓に直接注入することになる。
【実施例１３】
【０３２２】
骨再生のためのＰＶＭＣｓの直接投与
骨または臍帯由来ＰＶＭＣｓを損傷部位への直接的な治療的投与の前に足場に包み込むことになる。骨細片と併用してペーストにした骨または臍帯由来ＰＶＭＣｓを、外科的に露出させて準備した損傷した脊椎骨または他の骨上に直接配置することができる。適する足場の他の例としては、これに限定されるものではないが、既製支柱および酵素または触媒により架橋がインビボで起こるように活性化される架橋性複合体を含む。
【０３２３】
本発明を、本発明の一定の好ましい実施形態を参照して相当詳細に記載したが、他のバージョンが可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲を、本明細書に収載されている説明および好ましいバージョンに限定すべきでない。
【図１】
2014529406.tif 000003
【国際調査報告】
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