(57)【要約】本開示は、ＰＴＫ７を対象とする抗体−パートナー分子複合体に関する。抗体−パートナー分子複合体を用いた、ＰＴＫ７を発現する腫瘍細胞の増殖の特徴を有する疾患の治療または予防方法もまた記載される。
2011505146.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＴＫ−７を特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合部分、およびパートナー分子を含む抗体−パートナー分子複合体であって、その中で、該パートナー分子は、式（ｍ）、式（ｎ）、式（ｏ）、式（ｐ）、および式（ｑ）からなる群から選択される複合体。
【請求項２】
該抗体またはその抗原結合部分が、対照抗体によって認識されるＰＴＫ−７上のエピトープに結合し、該対照抗体が、配列番号：４および１０、配列番号：１および５、配列番号：１および６、配列番号：２および７、配列番号：３および８、配列番号：３および９、配列番号：８４および８５、または配列番号：８４および８６にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む、請求項１の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項３】
該抗体またはその抗原結合部分が、配列番号：４および１０、配列番号：１および５、配列番号：１および６、配列番号：２および７、配列番号：３および８、配列番号：３および９、配列番号：８４および８５、または配列番号：８４および８６にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項１もしくは２の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項４】
該抗体またはその抗原結合部分が、
ａ）配列番号：１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｂ）配列番号：１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
ｃ）配列番号：２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
ｄ）配列番号：２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
ｅ）配列番号：３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
ｆ）配列番号：４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む、請求項１もしくは２の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項５】
ＰＴＫ−７を特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合部分、およびパートナー分子を含む抗体−パートナー分子複合体であって、その中で、該抗体は、配列番号：４および１０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、並びに該パートナー分子は式（ｍ）（図２８）である複合体。
【請求項６】
抗体またはその抗原結合部分を含む抗体−パートナー分子複合体であって、その中で、該抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：４および１０にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む複合体。
【請求項７】
該抗体−パートナー分子複合体が、チオールリンカー、ペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカー、およびジスルフィドリンカーからなる群から選択されるリンカーによって該抗体に結合する、先の請求項のいずれかの抗体−パートナー分子複合体。
【請求項８】
先の請求項のいずれかの抗体−パートナー分子複合体および医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項９】
請求項２、３もしくは４の抗体またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子。
【請求項１０】
請求項１０の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１１の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれかの抗体−パートナー分子複合体を、ＰＴＫ７を発現する腫瘍細胞の増殖を特徴とする疾患を治療または予防するのに有効な量で患者に投与することを特徴とする、該疾患の治療または予防方法。
【請求項１３】
該疾患が癌である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
該癌が、大腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、メラノーマ、急性骨髄性白血病、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、および上皮細胞癌からなる群から選択される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
該癌が膵臓癌である、請求項１４の方法。
【請求項１６】
該癌が乳癌である、請求項１４の方法。
【請求項１７】
該癌が肺癌である、請求項１４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、細胞外環境から細胞の内部に生物学的シグナルを伝達する膜貫通シグナルタンパク質である。ＲＴＫシグナルの制御は、細胞増殖、分化、軸索伸長、上皮成長、発生、接着、遊走、およびアポトーシスの制御に重要である（Prenzel et al. (2001) Endocr. Relat. Cancer 8:11-31; Hubbard  and Till (2000) Annu. Rev. Biochem. 69:373-98）。ＲＴＫは、いくつかの形態の癌の発生および進行に関与していることが知られている。ＲＴＫ関連癌の大部分において、遺伝子の変異よりも受容体タンパク質の増幅が存在している（Kobus and Fleming (2005) Biochemistry 44:1464-70）。
【０００２】
タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）は、受容体タンパク質チロシンキナーゼファミリーのメンバーであり、最初に標準ヒトメラニン細胞から単離され、ＲＴ−ＰＣＲによってクローン化された（Lee et al., (1993) Oncogene 8:3403-10; Park et al., (1996) J. Biochem 119:235-9）。別々に、該遺伝子は、ヒト大腸癌由来細胞株からクローン化され、大腸癌キナーゼ４（ＣＣＫ４）と命名された（Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84）。ＰＴＫ７は、検出可能な触媒チロシンキナーゼ活性を欠くが、シグナル伝達活性を保持するＲＴＫのサブセットに属し、細胞接着分子として機能する可能性があると考えられる。
【０００３】
ＰＴＫ７についてのｍＲＮＡは、大腸癌由来細胞株に可変的に発現していることが分かったが、ヒト成人大腸組織に発現していることは分からなかった（Mossie et al., 上記）。ＰＴＫ７発現はまた、いくつかのメラノーマ細胞株およびメラノーマ生検にも見られた（Easty, et al. (1997) Int. J. Cancer 71:1061-5）。選択的スプライシング型が、肝細胞腫および大腸癌細胞に発現していることが分かった（Jung et al. (2002) Biochim Biophys Acta 1579: 153-63）。また、ＰＴＫ７は、急性骨髄性白血病試料に非常に過剰発現していることが分かった（Muller-Tidow et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:1241-9）。ＰＣＴ公開ＷＯ ０４／１７９９２に記載されるように、免疫組織化学によって、乳癌、大腸癌、肺癌、膵癌、腎癌および膀胱癌においてＰＴＫ７の腫瘍特異的染色が観察された。
したがって、ＰＴＫ７を認識する薬剤、およびかかる薬剤の使用方法が望まれている。
【０００４】
（発明の概要）
本発明は、ＰＴＫ７に結合し、多数の望ましい特性を示す単離したモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。これらの特性には、ヒトＰＴＫ７への高親和性結合およびウィルムス腫瘍細胞への高親和性結合が含まれる。本発明の抗体および組成物を用いた様々なＰＴＫ７を介した疾患の治療方法もまた提供される。一つの態様において、本発明は、単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関するものであり、その中で、抗体は：
（ａ）ヒトＰＴＫ７に特異的に結合し；および
（ｂ）ウィルムス腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４４１）に結合する。
【０００５】
別の態様において、抗体は、マウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体でありうるが、好ましくは、該抗体はヒト抗体である。
より好ましい態様において、抗体は、４.０ｎＭ以下のＥＣ50でウィルムス腫瘍細胞に結合するか、または３.５ｎＭ以下のＥＣ50でウィルムス腫瘍細胞に結合する。
別の態様において、抗体は、Ａ−４３１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５５５）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−８５）、ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−７７）、ＰＣ３（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４３５）、ＤＭＳ１１４（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−２０６６）、ＡＣＨＮ（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１６１１）、ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１７４０）、ＤＵ １４５（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−８１）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ受入番号ＣＣＬ−２２９）およびＭＩＡ ＰａＣａ−２（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４２０）細胞株からなる群から選択される癌細胞株に結合する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その中で、抗体は、対照抗体によって認識されるＰＴＫ７上のエピトープへの結合についてクロス競合し、対照抗体は：
（ａ）ヒトＰＴＫ７に特異的に結合し；および
（ｂ）ウィルムス腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４４１）に結合する。
【０００７】
様々な態様において、対照抗体には：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれ；または
対照抗体には：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれ；または
対照抗体には：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれ；または
対照抗体には：
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれ；または
対照抗体には：
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれ；または
対照抗体には：
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。
【０００８】
一つの態様において、本発明は、ヒトＶH ３−３０.３遺伝子の産物またはそれに由来する産物である重鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関するものであり、その中で、抗体はＰＴＫ７に特異的に結合する。本発明はまた、ヒトＶH ＤＰ４４遺伝子の産物またはそれに由来する産物である重鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７に特異的に結合する。本発明はまた、ヒトＶH ３−３３遺伝子の産物またはそれに由来する産物である重鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分も提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７に特異的に結合する。本発明は、ヒトＶK Ｌ１５遺伝子の産物またはそれに由来する産物である軽鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７に特異的に結合する。本発明は、ヒトＶK Ａ１０遺伝子の産物またはそれに由来する産物である軽鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７に特異的に結合する。本発明は、ヒトＶK Ａ２７遺伝子の産物またはそれに由来する産物である軽鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７に特異的に結合する。本発明は、ヒトＶK Ｌ６遺伝子の産物またはそれに由来する産物である軽鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７に特異的に結合する。
【０００９】
好ましい組み合わせには：
（ａ）配列番号：１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３が含まれる。
【００１０】
別の好ましい組み合わせには：
（ａ）配列番号：１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３が含まれる。
【００１１】
別の好ましい組み合わせには：
（ａ）配列番号：１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３が含まれる。
【００１２】
別の好ましい組み合わせには：
（ａ）配列番号：１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３が含まれる。
【００１３】
別の好ましい組み合わせには：
（ａ）配列番号：１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３が含まれる。
【００１４】
別の好ましい組み合わせには：
（ａ）配列番号：１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３が含まれる。
【００１５】
本発明の他の好ましい抗体またはその抗原結合部分には：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。
別の好ましい組み合わせには：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。
【００１６】
別の好ましい組み合わせには：
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。
別の好ましい組み合わせには：
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。
【００１７】
別の好ましい組み合わせには：
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。
別の好ましい組み合わせには：
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。
【００１８】
本発明の抗体は、例えば、完全長抗体、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの完全長抗体でありうる。あるいは、抗体は、抗体断片、例えばＦａｂまたはＦａｂ’２断片、または単鎖抗体でありうる。
本発明はまた、細胞毒素または放射性同位元素のような治療剤に結合した本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む抗体−パートナー分子複合体も提供する。特に好ましい態様において、本発明は、化合物Ｎ（図２８）に結合した（例えば、チオール結合によって）本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む抗体−パートナー分子複合体を提供する。例えば、様々な態様において、本発明は、以下の好ましい抗体−パートナー分子複合体を提供する：
【００１９】
（ｉ）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合部分を含む抗体−パートナー分子複合体であって、ここで、抗体またはその抗原結合部分は化合物Ｎ（図２８）に結合する複合体（その全体が本明細書に引用される米国特許出願第６０／８８２，４６１に詳細に議論されている）；
【００２０】
（ｉｉ）化合物Ｎ（図２８）に結合した、
（ａ）配列番号：１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含む抗体またはその抗原結合部分を含む抗体−パートナー分子複合体。
【００２１】
特定の態様において、抗体−パートナー分子複合体の抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：４および１０、配列番号：１および５、配列番号：１および６、配列番号：２および７、配列番号：３および８、または配列番号：３および９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を有している。
【００２２】
抗体が、本発明の抗体のいずれかによって結合される同一のまたは重複するエピトープに結合する、抗体−パートナー分子複合体もまた本発明によって提供される。例えば、一つの態様において、抗体−パートナー分子複合体の抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：４および１０、配列番号：１および５、配列番号：１および６、配列番号：２および７、配列番号：３および８、または配列番号：３および９にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有する対照抗体（例えばクロス競合）によって認識されるＰＴＫ−７上のエピトープに結合する。
【００２３】
本発明の抗体−パートナー分子複合体は、様々なリンカー、例えば本願を通して記載されたもの、並びに当該技術分野で知られているものによって結合されうる。一つの態様において、パートナー分子は、化学リンカー（すなわち、チオールリンカー、ペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカーまたはジスルフィドリンカー）によって抗体に結合する。
さらに別の態様において、本発明は、上述の本発明の抗体−パートナー分子複合体の抗体（またはその抗原結合部分）をコードする単離した核酸、並びに発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。
【００２４】
本願を通して議論されるように、本発明の抗体−パートナー分子複合体は、様々な診断的および治療的な適用に用いられうる。例えば、本発明の抗体−パートナー分子複合体は、ＰＴＫ７を発現する腫瘍細胞の増殖の特徴を有する疾患（例えば、癌）を治療または予防するのに有効な量で患者に投与されうる。治療または予防されうる癌には、これらに限らないが、大腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、メラノーマ、急性骨髄性白血病、腎癌、膀胱癌、卵巣癌および前立腺癌が含まれる。
【００２５】
本発明はまた、前記抗体またはその抗原結合部分と異なる結合特異性を有する第２の機能的部位(functional moiety)に結合した本発明の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子も提供する。
抗体もしくはその抗原結合部分、または本発明の免疫複合体もしくは二重特異性分子、並びに医薬的に許容される担体を含む組成物もまた提供される。
【００２６】
本開示はまた、高親和性でＰＴＫ７に特異的に結合する単離した抗ＰＴＫ７抗体−パートナー分子複合体、特にヒトモノクローナル抗体を含むものも提供する。特定のこのような抗体−パートナー分子複合体は、ＰＴＫ７を発現する細胞に内部移行されることができ、抗原依存性細胞傷害活性を媒介することができる。この開示はまた、本明細書に開示した抗ＰＴＫ７抗体−パートナー分子複合体を用いた、癌、例えば、中皮腫、大腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、メラノーマ、急性骨髄性白血病、腎癌、膀胱癌、卵巣癌および前立腺癌の治療方法も提供する。
【００２７】
本開示のパートナー分子に結合した抗体またはその抗原結合部分を含む組成物もまた提供される。本明細書に開示した抗体−パートナー分子複合体における抗体に有利に結合しうるパートナー分子には、これらに限らないが、薬物としての分子、毒素、マーカー分子（例えば、放射性同位元素）、タンパク質および治療剤が含まれる。抗体−パートナー分子複合体、および医薬的に許容される担体を含む組成物もまた本明細書に開示される。
【００２８】
一つの態様において、このような抗体−パートナー分子複合体は、化学リンカーによって結合する。いくつかの態様において、リンカーはペプチジルリンカーであり、（Ｌ4）p−Ｆ−（Ｌ1）mとして本明細書に描かれる。他のリンカーには、ヒドラジンおよびジスルフィドリンカーが含まれ、それぞれ、（Ｌ4）p−Ｈ−（Ｌ1）mまたは（Ｌ4）p−Ｊ−（Ｌ1）mとして本明細書に描かれる。パートナーに結合するリンカーに加えて、本発明はまた、本質的にいずれの分子種への結合にも適した開裂可能なリンカーアームも提供する。
【００２９】
本発明の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、並びにこのような核酸を含む発現ベクターおよびこのような発現ベクターを含む宿主細胞もまた本発明に含まれる。さらに、本発明は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖導入遺伝子を含む遺伝子組換えマウスを提供し、その中で、マウスは本発明の抗体、並びにこのようなマウスから作成したハイブリドーマを発現し、ハイブリドーマは本発明の抗体を産生する。
【００３０】
さらに別の態様において、本発明は、ＰＴＫ７を発現する腫瘍細胞の増殖を特徴とする疾患を治療または予防するのに有効な量で、本発明の抗体またはその抗原結合部分を患者に投与することを特徴とする、該疾患の治療もしくは予防方法を提供する。疾患は、例えば、癌、例えば、結腸癌（例えば小腸癌）、肺癌、乳癌、膵臓癌、メラノーマ（例えば、転移性悪性メラノーマ）、急性骨髄性白血病、腎癌、膀胱癌、卵巣癌および前立腺癌でありうる。
【００３１】
好ましい態様において、本発明は、抗ＰＴＫ７抗体を用いた、インビボの癌の治療方法を提供する。抗ＰＴＫ７抗体は、マウス、キメラ、ヒト化またはヒト抗体でありうる。本発明の方法を用いて治療されうる他の癌の例には、腎癌（例えば、腎細胞癌）、神経膠芽腫、脳腫瘍、慢性もしくは急性白血病、例えば急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み核細胞リンパ腫(nodular small cleaved-cell lymphoma)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、中心芽細胞性(entroblastic)／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫癌、びまん性大細胞性Ｂ細胞性リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）のようなＴ細胞リンパ腫およびＨＩＶ関連体腔に基づくリンパ腫）、胚性癌、上咽腔の未分化癌（例えば、シュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症および他のＢ細胞リンパ腫、上咽頭癌、骨癌、皮膚癌、頭頚癌、皮膚もしくは眼球内悪性メラノーマ、子宮癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓もしくは尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳ）、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮癌、扁平上皮癌、環境誘発性癌、例えばアスベストによって誘発されるもの（例えば、中皮腫）、並びに前記癌の組合せが含まれる。
【００３２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および実施例から明らかであるが、限定するものと解釈されるべきではない。本願を通して引用されるすべての引用文献、ジェンバンクのエントリー、特許および公開特許出願の内容は、本明細書に明確に引用される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】図１Ａは、３Ｇ８および３Ｇ８ａヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：４１）およびアミノ酸配列（配列番号：１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１１）、ＣＤＲ２（配列番号：１５）およびＣＤＲ３（配列番号：１９）領域が描かれており、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列誘導体(germline derivation)が示される。
【００３４】
【図１Ｂ】図１Ｂは、３Ｇ８ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：４５）およびアミノ酸配列（配列番号：５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：２３）、ＣＤＲ２（配列番号：２９）およびＣＤＲ３（配列番号：３５）領域が描かれており、ＶおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図１Ｃ】図１Ｃは、３Ｇ８ａヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：４６）およびアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：２４）、ＣＤＲ２（配列番号：３０）およびＣＤＲ３（配列番号：３６）領域が描かれており、ＶおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【００３５】
【図２Ａ】図２Ａは、４Ｄ５ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：４２）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１２）、ＣＤＲ２（配列番号：１６）およびＣＤＲ３（配列番号：２０）領域が描かれており、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図２Ｂ】図２Ｂは、４Ｄ５ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：４７）およびアミノ酸配列（配列番号：７）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：２５）、ＣＤＲ２（配列番号：３１）およびＣＤＲ３（配列番号：３７）領域が描かれており、ＶおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【００３６】
【図３Ａ】図３Ａは、１２Ｃ６ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：４３）およびアミノ酸配列（配列番号：３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１３）、ＣＤＲ２（配列番号：１７）およびＣＤＲ３（配列番号：２１）領域が描かれており、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図３Ｂ】図３Ｂは、１２Ｃ６ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：４８）およびアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：２６）、ＣＤＲ２（配列番号：３２）およびＣＤＲ３（配列番号：３８）領域が描かれており、ＶおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【００３７】
【図３Ｃ】図３Ｃは、１２Ｃ６ａヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：４９）およびアミノ酸配列（配列番号：９）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：２７）、ＣＤＲ２（配列番号：３３）およびＣＤＲ３（配列番号：３９）領域が描かれており、ＶおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図４Ａ】図４Ａは、７Ｃ８ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：４４）およびアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：１４）、ＣＤＲ２（配列番号：１８）およびＣＤＲ３（配列番号：２２）領域が描かれており、Ｖ、ＤおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【００３８】
【図４Ｂ】図４Ｂは、７Ｃ８ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号：５０）およびアミノ酸配列（配列番号：１０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号：２８）、ＣＤＲ２（配列番号：３４）およびＣＤＲ３（配列番号：４０）領域が描かれており、ＶおよびＪ生殖系列誘導体が示される。
【図５】図５は、３Ｇ８（配列番号：１）および３Ｇ８ａ（配列番号：１）の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列ＶH ３−３０.３アミノ酸配列（配列番号：５１）（配列番号：５９として開示したＪＨ４ｂ生殖系列）とのアラインメントを示す。
【００３９】
【図６】図６は、４Ｄ５（配列番号：２）の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列ＶH ３−３０.３アミノ酸配列（配列番号：５１）（配列番号：６０として開示したＪＨ４ｂ生殖系列）とのアラインメントを示す。
【図７】図７は、１２Ｃ６（配列番号：３）および１２Ｃ６ａ（配列番号：２）の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列ＶH ＤＰ４４アミノ酸配列（配列番号：５２）（それぞれ配列番号６１〜６３として開示された３−７、３−２３、およびＪＨ４ｂ生殖系列）とのアラインメントを示す。
【００４０】
【図８】図８は、７Ｃ８（配列番号：４）の重鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列ＶH ３−３３アミノ酸配列（配列番号：５３）（配列番号：６４として開示したＪＨ６ｂ生殖系列）とのアラインメントを示す。
【図９】図９は、３Ｇ８（配列番号：５）および３Ｇ８ａ（配列番号：６）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列Ｖk Ｌ１５アミノ酸配列（配列番号：５４）（配列番号：６５として開示したＪＫ１生殖系列）とのアラインメントを示す。
【００４１】
【図１０】図１０は、４Ｄ５（配列番号：７）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列Ｖk Ａ１０アミノ酸配列（配列番号：５５）（配列番号：６６として開示したＪＫ５生殖系列）とのアラインメントを示す。
【図１１】図１１は、１２Ｃ６（配列番号：８）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列Ｖk Ａ２７アミノ酸配列（配列番号：５６）（配列番号：６７として開示したＪＫ２生殖系列）とのアラインメントを示す。
【００４２】
【図１２】図１２は、１２Ｃ６ａ（配列番号：９）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列Ｖk Ｌ１５アミノ酸配列（配列番号：５４）（配列番号：６８として開示したＪＫ２生殖系列）とのアラインメントを示す。
【図１３】図１３は、７Ｃ８（配列番号：１０）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列と、ヒト生殖系列Ｖk Ｌ６アミノ酸配列（配列番号：５７）（配列番号：６９として開示したＪＫ３生殖系列）とのアラインメントを示す。
【００４３】
【図１４】図１４は、ヒトモノクローナル抗体７Ｃ８（ヒトＰＴＫ７に対する抗体）が、完全長ヒトＰＴＫ７を形質移入されたＨＥＫ３細胞の細胞表面に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１５】図１５は、ヒトＰＴＫ７に対するヒトモノクローナル抗体がＰＴＫ７に特異的に結合することを示すＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【００４４】
【図１６】図１６は、ヒトＰＴＫ７に対する抗体がウィルムス腫瘍細胞の細胞表面に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１７】図１７は、ヒトＰＴＫ７に対する抗体が様々な癌細胞株の細胞表面に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【００４５】
【図１８】図１８は、ヒトＰＴＫ７に対する抗体が樹状細胞の細胞表面に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図１９】図１９は、ヒトＰＴＫ７に対する抗体がＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ−リンパ球に結合するが、Ｂ−リンパ球には結合しないことを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。
【００４６】
【図２０】図２０は、ヒトＰＴＫ７に対するヒトモノクローナル抗体がＰＴＫ７＋細胞の内部に取り入れられうることを示すＨｕｍ−Ｚａｐ内部移行実験の結果を示す。  （Ａ）ヒト抗体３Ｇ８、４Ｄ５および７Ｃ８のウィルムス腫瘍細胞への内部移行。  （Ｂ）ヒト抗体１２Ｃ６のウィルムス腫瘍細胞への内部移行。  （Ｃ）ヒト抗体７Ｃ８および１２Ｃ６のＡ−４３１腫瘍細胞への内部移行。  （Ｄ）ヒト抗体７Ｃ８および１２Ｃ６のＰＣ３腫瘍細胞への内部移行。
【００４７】
【図２１】図２１は、毒素結合ヒトモノクローナル抗ＰＴＫ７抗体がヒト腎癌細胞株を死滅させることを示す細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図２２】図２２は、毒素結合ヒトモノクローナル抗ＰＴＫ７抗体が低〜高濃度のＰＴＫ７を発現する細胞株を死滅させることを示す細胞増殖アッセイの結果を示す。
【００４８】
【図２３】図２３は、抗ＰＴＫ７抗体が、細胞表面上にＰＴＫ７を発現する細胞の浸潤移動(invasion mobility)を阻害することを示す浸潤アッセイの結果を示す。
【図２４】図２４は、毒素に結合した抗ＰＴＫ７抗体がインビボ異種移植モデルにおいて膵腫瘍の進行を遅らせたことを示す。
【図２５】図２５は、毒素に結合した抗ＰＴＫ７抗体がインビボ異種移植モデルにおいて乳癌の進行を遅らせたことを示す。
【００４９】
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂは、上皮由来Ａ４３１および小細胞肺由来ＤＭＳ７９腫瘍が、７Ｃ８−式（ｍ）複合体を用いたインビボモデルにおいて縮小されることを示すグラフである。図２６Ａにおいて、ベヒクルのみ、無修飾アイソタイプ適合対照抗体、アイソタイプ適合式（ｍ）複合体、および７Ｃ８−式（ｍ）で処置したマウスにおいて腫瘍量のメジアンを測定した。図２６Ｂは、７Ｃ８−式（ｍ）による処置がＳＣＩＤマウスにおけるＤＭＳ７９小細胞肺癌腫瘍の完全な退縮を引き起こしたことを示す。
【００５０】
【図２７】図２７は、７Ｃ８−式（ｍ）複合体がインビボＳＣＩＤ異種移植マウスモデルにおける有意な体重減少を引き起こさないことを示すグラフである。
【図２８】図２８は、式（ｍ）の化学構造の図である。
【００５１】
（発明の詳細な説明）
一つの態様において、本発明は、ＰＴＫ７に特異的に結合する単離したモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体に関する。ある態様において、本発明の抗体は、一つ以上の望ましい機能特性、例えばＰＴＫ７への高親和性結合および／または腫瘍細胞増殖のインビトロもしくはインビボの阻害能を示す。ある態様において、本発明の抗体は、特定の重鎖および軽鎖生殖系列配列から生じ、および／または特定の構造の特徴、例えば特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域を含む。本発明は、単離した抗体；かかる抗体、かかる抗体を含む免疫複合体および二重特異性分子の製造方法；並びに本発明の抗体、免疫複合体または二重特異性分子を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、抗体の使用方法、例えば癌のような疾患の治療に関する。
【００５２】
本発明がより容易に理解され得るように、いくつかの用語をまず定義する。さらなる定義は詳細な説明を通して記載する。
用語「PTK7」および「CCK4」は互換的に用いられ、それには、ヒトPTK7の変異体、アイソフォームおよび相同種（species homolog）が含まれる。従って、ある特定の場合、本発明のヒト抗体はヒト以外の種からのPTK7と交差反応し得る。ある特定の実施態様において、該抗体は、１つ以上のヒトPTK7に対して完全に特異的であってもよく、非ヒト交差反応性の種または他のタイプを示さなくてもよい。典型的なヒトPTK7の完全アミノ酸配列は、ジェンバンク受入番号NM_002821(配列番号:58)を有している。
【００５３】
用語「免疫応答」とは、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または、自己免疫もしくは病的炎症の場合における正常なヒト細胞もしくは組織に対する選択的損傷、それらの破壊、またはそれらの人体からの排除をもたらす、例えば、上記の細胞または肝臓により産生されるリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および可溶性高分子(抗体、サイトカイン、および補体が含まれる)の作用をいう。
【００５４】
「シグナル伝達経路」とは、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達を担う、様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。本明細書で用いられるように、用語「細胞表面受容体」には、例えば、シグナルの受け取りおよび細胞の原形質膜を通過するようなシグナルの伝達が可能な分子および分子の複合体が含まれる。本発明の「細胞表面受容体」の例は、PTK7受容体である。
【００５５】
本明細書で呼ばれる用語「抗体」には、全抗体およびいずれの抗原結合フラグメント(すなわち、「抗原結合部分」)またはその単鎖も含まれる。「抗体」とは、ジスルフィド結合により相互に結合した少なくとも２つの重(H)鎖および２つの軽(L)鎖、またはその抗原結合部分を含有する糖タンパク質をいう。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書でVHと略記)および重鎖定常領域を含有する。該重鎖定常領域は、３つのドメイン、CH1、CH2およびCH3を含有する。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書でVLと略記)および軽鎖定常領域を含有する。該軽鎖定常領域は、１つのドメイン、CLを含有する。該VHおよびVL領域は、超可変領域（相補性決定領域(CDR)と称される）にさらに細分され、より高度に保存される領域（フレームワーク領域(FR)と称される）が組み入れられ得る。各VHおよびVLは３つのCDRおよび４つのFRから成り、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配列されている: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、宿主組織または因子（免疫系の様々な細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Clq)が含まれる）への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００５６】
本明細書で用いられる抗体(または単に「抗体部分」)の「抗原結合部分」という用語は、抗原(例えばPTK7)に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上のフラグメントをいう。全長抗体のフラグメントによって抗体の抗原結合機能が果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の中に含まれる結合フラグメントの例としては、(i) VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる１価のフラグメントであるFabフラグメント; (ii) ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２つのFabフラグメントを含有する２価のフラグメントであるF(ab')2フラグメント; (iii) 本質的にヒンジ領域を有するFabであるFab'フラグメント(FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993)を参照); (iv) VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント; (v) 抗体の単一の腕のVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント; (vi) VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vii) 単離された相補性決定領域(CDR); および(viii) １つの可変ドメインと２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域であるナノボディ(nanobody)が挙げられる。さらに、Fvフラグメントの２つのドメイン、VLおよびVH、は別個の遺伝子によりコードされるけれども、組換え方法を用いて、合成リンカーによりそれらを結合して単一のタンパク質鎖とすることができ、その中でVLおよびVH領域は対をなして１価の分子を形成する(単鎖Fv(scFv)として知られる;例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; および、Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照)。そのような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されると意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている通常の技術を用いて得られ、該フラグメントは、インタクトな抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【００５７】
本明細書で用いられる「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいうものと意図される(例えば、特異的にPTK7を結合する単離された抗体は、PTK7以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかしながら、PTK7を特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原（例えば他の種由来のPTK7分子）に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および/または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、単一の分子組成の抗体分子の調製物（preparation）をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「ヒト抗体」には、フレームワークおよびCDR領域の両方ともがヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体が含まれるものと意図される。さらに、該抗体が定常領域を含む場合、該定常領域もまたヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってか、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異)を含み得る。しかしながら、本明細書で用いられる該用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖系列由来のCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植(graft)されている抗体を意図しない。
【００６０】
用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、フレームワークおよびCDR領域の両方ともがヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する、単一の結合特異性を提示する抗体をいう。一実施態様において、該ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含有するゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）から得たB細胞を含む、ハイブリドーマにより産生される。
【００６１】
本明細書で用いられる用語「組換えヒト抗体」には、組換え手法により作製、発現、創出もしくは単離された全てのヒト抗体、例えば(a) ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックもしくは導入染色体（transchromosomal）である動物（例えばマウス）、またはそれから作製されたハイブリドーマから単離された抗体(以下にさらに記載)、(b) ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞（例えばトランスフェクトーマ（transfectoma））から単離された抗体、(c) 組換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、および(d) いずれか他の手法（他のDNA配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む）により作製、発現、創出もしくは単離された抗体が含まれる。そのような組換えヒト抗体は、フレームワークおよびCDR領域がヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する。しかしながら、ある特定の実施態様において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発(または、ヒトIg配列のトランスジェニック動物が用いられる場合、インビボ体細胞変異誘発)処理することができ、それ故、組換え抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列VHおよびVL配列由来であってそれに関連する一方、インビボにおいてヒト抗体の生殖系列レパートリー内に天然に存在していなくてもよい配列である。
【００６２】
本明細書で用いる「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えば、IgMまたはIgGl)をいう。
「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という語句は、本明細書において「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に用いられる。
【００６３】
用語「ヒト抗体誘導体」とは、いずれの修飾型ヒト抗体、例えば該抗体と別の薬剤または抗体との複合体をいう。
用語「ヒト化抗体」とは、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖系列由来のCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体をいうものと意図される。さらなるフレームワーク領域修飾がヒトフレームワーク配列内でなされ得る。
【００６４】
用語「キメラ抗体」とは、可変領域配列はある１種に由来し、定常領域配列は別の種に由来している抗体（例えば、可変領域配列はマウス抗体に由来し、定常領域配列はヒト抗体に由来している抗体）をいうものと意図される。
【００６５】
用語「抗体模倣体」とは、抗体（しかし天然の抗体構造に限定されない）の持つ抗原を結合する能力を模倣することが可能な分子をいうものと意図される。そのような抗体模倣体の例としては、限定はされないが、アフィボディ、DARPin、アンチカリン(Anticalin)、アビマー、およびベルサボディが挙げられ、それらは伝統的な抗体結合を模倣しているが、それらすべて異なる機構によって生じ、かつ機能する結合構造を用いている。
【００６６】
本明細書で用いられるように、用語「パートナー分子」とは、抗体-パートナー分子複合体中の抗体に結合しているものをいう。パートナー分子の例としては、薬剤、毒素、マーカー分子(限定はされないが、ペプチドおよび小分子マーカー（例えば蛍光色素マーカー）、ならびに単一原子マーカー（例えば放射性同位元素）が含まれる)、タンパク質および治療薬が挙げられる。
【００６７】
本明細書で用いるられるように、「ヒトPTK7に特異的に結合する」抗体とは、1 x 10-7 M以下、より好ましくは5 x 10-8 M以下、より好ましくは1 x 10-8 M以下、より好ましくは5 x 10-9 M以下のKDでヒトPTK7に結合する抗体をいうものと意図される。
本明細書で用いるられるように、タンパク質または細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質または細胞に結合しないか、または高親和性で結合しない、すなわち、1 x 10-6 M以上、より好ましくは1 x 10-5 M以上、より好ましくは1 x 10-4 M以上、より好ましくは1 x 10-3 M以上、さらにより好ましくは1 x 10-2 M以上のKDでタンパク質または細胞に結合することを意味する。
【００６８】
本明細書で用いる用語「Kassoc」または「Ka」は、特定の抗体-抗原相互作用の結合速度を示すように意図され、一方、本明細書で用いる用語「Kdis」または「Kd」は、特定の抗体-抗原相互作用の解離速度を示すように意図されている。本明細書で用いる用語「KD」は、解離定数を示すように意図され、それはKaに対するKdの比(すなわちKd/Ka)から得られ、モル濃度(M)で表される。抗体についてのKD値は、当分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のKDを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、好ましくはバイオセンサーシステム（例えばBiacore（登録商標）システム）を用いることによるものである。
【００６９】
本明細書に用いられるように、IgG抗体についての用語「高親和性」とは、標的抗原に対して、10-8 M以下、より好ましくは10-9 M以下、およびさらにより好ましくは10-10 M以下のKDを有する抗体をいう。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに応じて変化し得る。例えば、IgMアイソタイプに対する「高親和性」結合は、10-7 M以下、より好ましくは10-8 M以下、さらにより好ましくは10-9 M以下のKDを有する抗体をいう。
【００７０】
本明細書で用いる用語「対象」には、いずれのヒトまたは非ヒト動物も含まれる。該用語「非ヒト動物」には、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、は虫類などが含まれる。
記号「−」は、結合として利用されようと結合に対して垂直に表示されようと、表示された部位が分子の残りの部分、固体支持体(solid support)などに結合する点を示す。
【００７１】
単独または別の置換基の一部としての用語「アルキル」は、他に明記しない限り、直鎖もしくは分枝鎖、または環状炭化水素基、あるいはそれらの組み合わせを意味し、それは完全飽和、モノ不飽和もしくはポリ不飽和であってよく、示された数の炭素原子(すなわち、C1-C10は１から１０個の炭素を意味する)を有する二価基および多価基を含むことができる。飽和炭化水素基の例としては、限定はされないが、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、シクロヘキシル、(シクロヘキシル)メチル、シクロプロピルメチル、例えば、n-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチルの相同体および異性体などの化学基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、限定はされないが、ビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-(ブタジエニル)、2,4-ペンタジエニル、3-(1,4-ペンタジエニル)、エチニル、1-および3-プロピニル、3-ブチニル、ならびにより高級な相同体および異性体が挙げられる。該用語「アルキル」にはまた、他に断りのない限り、以下（例えば「ヘテロアルキル」）により詳細に記載のアルキルの誘導体も含まれるものと意図される。炭化水素基に限定されているアルキル基は、「ホモアルキル」と称する。
【００７２】
単独または別の置換基の一部としての用語「アルキレン」は、アルカン由来の二価基を意味し、限定はされないが、-CH2CH2CH2CH2-により例示され、以下の「ヘテロアルキレン」に記載の基をさらに含む。典型的には、アルキル(またはアルキレン)基は1から24個の炭素原子を有していてもよく、本発明においては10個以下の炭素原子を有する基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有するより短い鎖のアルキルまたはアルキレン基である。
【００７３】
単独または別の用語と組み合わされた用語「ヘテロアルキル」は、他に明記しない限り、安定な直鎖もしくは分枝鎖、または環状炭化水素基、あるいはそれらの組み合わせを意味し、規定数の炭素原子ならびにO、N、Si、およびSからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子から成り、ここで、該窒素、炭素および硫黄原子は適宜酸化されていてもよく、該窒素ヘテロ原子は適宜四級化されていてもよい。該ヘテロ原子O、N、S、およびSiは、ヘテロアルキル基のいずれの内部位置、またはアルキル基が分子の残りの部分に結合している位置に配置され得る。例としては、限定はされないが、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3、および-CH=CH-N(CH3)-CH3が挙げられる。例えば、-CH2-NH-OCH3および-CH2-O-Si(CH3)3のように、最大２個のヘテロ原子が連続し得る。同様に、単独または別の置換基の一部としての用語「ヘテロアルキレン」は、ヘテロアルキル由来の二価基を意味し、限定はされないが、-CH2-CH2-S-CH2-CH2-および-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-として例示される。ヘテロアルキレン基において、ヘテロ原子は鎖末端の一方または両方を占有し得る(例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど)。該用語「ヘテロアルキル」および「ヘテロアルキレン」は、ポリ(エチレングリコール)およびその誘導体を包含する(例えば、Shearwater Polymers Catalog, 2001を参照)。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基において、記載された連結基の式の方向は連結基の配向を意味していない。例えば、式-C(O)2R'-は-C(O)2R'-および-R'C(O)2-の両方を表す。
【００７４】
用語「アルキル」または「ヘテロアルキル」と組み合わせた用語「低級」とは、1から6個の炭素原子を有する部分をいう。
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、「アルキルスルホニル」、および「アルキルチオ」(またはチオアルコキシ)は、それらの通常の意味で用いられ、各々、酸素原子、アミノ基、SO2基または硫黄原子を介して分子の残りに結合したアルキル基をいう。用語「アリールスルホニル」とはSO2基を介して分子の残りに結合したアリール基をいい、用語「スルフヒドリル」とはSH基をいう。
【００７５】
一般に、「アシル置換基」はまた、上記の基からも選択される。本明細書で用いられるように、用語「アシル置換基」とは、本発明の化合物の多環式の核に直接的または間接的に結合したカルボニル炭素に結合し、その原子価を満たしている基をいう。
【００７６】
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、単独でまたは他の用語と組み合わせて、他に明記しない限り、各々、置換もしくは無置換「アルキル」および置換もしくは無置換「ヘテロアルキル」の環状体を表す。加えて、ヘテロシクロアルキルにおいて、ヘテロ原子は、ヘテロ環が分子の残りに結合している位置を占有することができる。シクロアルキルの例としては、限定はされないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、1-シクロヘキセニル、3-シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、限定はされないが、1-(1,2,5,6-テトラヒドロピリジル)、1-ピペリジニル、2-ピペリジニル、3-ピペリジニル、4-モルホリニル、3-モルホリニル、テトラヒドロフラン-2-イル、テトラヒドロフラン-3-イル、テトラヒドロチエン-2-イル、テトラヒドロチエン-3-イル、1-ピペラジニル、2-ピペラジニルなどが挙げられる。環状構造のヘテロ原子および炭素原子は適宜酸化されている。
【００７７】
単独または別の置換基の一部としての用語「ハロ」または「ハロゲン」は、特に断りがなければ、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。加えて、「ハロアルキル」といった用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むものと意図される。例えば、用語「ハロ(C1-C4)アルキル」には、これらに限らないが、トリフルオロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、4-クロロブチル、3-ブロモプロピルなどが含まれるものと意図される。
【００７８】
用語「アリール」は、他に明記しない限り、置換または無置換のポリ不飽和の芳香族の炭化水素置換基を意味し、それは単環または多環(好ましくは1から3環)であることができ、共に縮合しているかまたは共有結合している。用語「ヘテロアリール」とは、N、O、またはSから選択される１から４個のヘテロ原子を有するアリール基(または環)をいい、ここで該窒素、炭素および硫黄原子は適宜酸化されており、該窒素原子は適宜四級化されている。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りに結合することができる。アリールおよびヘテロアリール基の非限定的な例として、フェニル、1-ナフチル、2-ナフチル、4-ビフェニル、1-ピロリル、2-ピロリル、3-ピロリル、3-ピラゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、ピラジニル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、2-フェニル-4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、3-イソオキサゾリル、4-イソオキサゾリル、5-イソオキサゾリル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-ピリミジル、4-ピリミジル、5-ベンゾチアゾリル、プリニル、2-ベンズイミダゾリル、5-インドリル、1-イソキノリル、5-イソキノリル、2-キノキサリニル、5-キノキサリニル、3-キノリル、および6-キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系の各々に対する置換基は、下記の許容される置換基の群から選択される。「アリール」および「ヘテロアリール」はまた、１つ以上の非芳香族環系がアリールもしくはヘテロアリール系に縮合しているかまたは結合している環系を包含する。
【００７９】
簡潔にするため、他の用語と組み合わせて用いる場合(例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル)、用語「アリール」は、上記のアリールおよびヘテロアリール環の両方を含む。従って、用語「アリールアルキル」は、アリール基が、炭素原子 (例えばメチレン基)が、例えば酸素原子(例えば、フェノキシメチル、2-ピリジルオキシメチル、3-(1-ナフチルオキシ)プロピルなど)により置換されているアルキル基を含むアルキル基(例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど)に結合している基を含むことを意図している。
【００８０】
上記の用語(例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」)の各々には、示した基の置換および無置換形態の両方が含まれる。各タイプの基に対して好ましい置換基を以下に提示する。
【００８１】
アルキル、およびヘテロアルキル基(アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニルおよびヘテロシクロアルケニルとしばしば称される基が含まれる)に対する置換基は、概して、各々、「アルキル置換基」および「ヘテロアルキル置換基」と称され、それらは、限定はされないが、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2R'、-NR-C(NR'R''R''')=NR''''、-NR-C(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-NRSO2R'、-CNおよび-NO2から、0から(2m'+1)（ここで、m'はかかる化学基中の炭素原子の総数である）の範囲の数で選択される、１つ以上の様々な基であり得る。R'、R''、R'''およびR''''は、各々好ましくは独立して、水素、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、置換もしくは無置換アリール、例えば、1-3個のハロゲンで置換されたアリール、置換もしくは無置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を示す。本発明の化合物が２つ以上のR基を含む場合、例えば、R基の各々は、各R'、R''、R'''およびR''''基として、これらの基のうちの２つ以上が存在する場合に独立して選択される。R'およびR''が同一の窒素原子に結合している場合、それらは該窒素原子と合わさって、5、6、または7員環を形成することができる。例えば、-NR'R''は、限定はされないが、1-ピロリジニルおよび4-モルホリニルを含むことを意図している。置換基についての上記考察から、当業者であれば、用語「アルキル」が、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基（例えば、ハロアルキル(例えば、-CF3および-CH2CF3)およびアシル(例えば、-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3など)）を含むことを意図していることを理解するであろう。
【００８２】
アルキル基について記載された置換基と同様に、アリール置換基およびヘテロアリール置換基は、一般的に、各々、「アリール置換基」および「ヘテロアリール置換基」と称され、多様であり、例えば、ハロゲン、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R''、-OC(O)NR'R''、-NR''C(O)R'、-NR'-C(O)NR''R'''、-NR''C(O)2R'、-NR-C(NR'R'')=NR'''、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R''、-NRSO2R'、-CNおよび-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、フルオロ(C1-C4)アルコキシ、およびフルオロ(C1-C4)アルキルから、0から芳香族環構造の開放原子価（open valence）の総数の範囲の数で選択され;ここで、R'、R''、R'''およびR''''は、好ましくは独立して、水素、(C1-C8)アルキルおよびヘテロアルキル、無置換アリールおよびヘテロアリール、(無置換アリール)-(C1-C4)アルキル、あるいは(無置換アリール)オキシ-(C1-C4)アルキルから選択される。本発明の化合物が一つより多くのR基を含む場合、例えば、R基は各々独立して、各R'、R''、R'''およびR''''基として選択される（２つ以上のこれらの基が存在している場合）。
【００８３】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の２つのアリール置換基は、適宜、式-T-C(O)-(CRR')q-U-の置換基で置換されていてもよく、ここで、TおよびUは独立して、-NR-、-O-、-CRR'-または単結合であり、qは0から3の整数である。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の２つの置換基は、適宜、式-A-(CH2)r-B-の置換基で置換されていてもよく、ここで、AおよびBは独立して、-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-または単結合であり、rは1から4の整数である。このように形成された新しい環の単結合の１つは、適宜、二重結合で置換されていてもよい。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の２つの置換基は、適宜、式-(CRR')s-X-(CR''R''')d-の置換基で置換されていてもよく、ここで、sおよびdは独立して、0から3の整数であり、Xは-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、または-S(O)2NR'-である。該置換基R、R'、R''およびR'''は、好ましくは独立して、水素、または置換もしくは無置換(C1-C6)アルキルから選択される。
【００８４】
本明細書で用いる用語「二リン酸エステル」には、限定はされないが、２つのリン酸基を有するリン酸のエステルが含まれる。用語「三リン酸エステル」には、限定はされないが、３つのリン酸基を有するリン酸のエステルが含まれる。例えば、二リン酸エステルまたは三リン酸エステルを有する特定の薬物には：
【化１】
2011505146.tif 000003
が含まれる。
【００８５】
本明細書で用いる用語「ヘテロ原子」は、酸素(O)、窒素(N)、硫黄(S)およびケイ素(Si)を含む。
記号「R」は、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換ヘテロアリール、または置換もしくは無置換ヘテロシクリル基から選択される置換基を表す一般的な略語である。
本発明の様々な態様を、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載する。
【００８６】
抗PTK7抗体
本発明の抗体は、特定の機能的特徴または抗体の特性によって特徴付けられる。例えば、抗体はＰＴＫ７に特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体は、高親和性で、例えば１×１０-7Ｍ以下のＫDでＰＴＫ７に結合する。本発明の抗ＰＴＫ７抗体は、好ましくは一つ以上の以下の特徴を示す：
（ａ）ヒトＰＴＫ７に特異的に結合し；または
（ｂ）ウィルムス腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４４１）に結合する。
【００８７】
好ましくは、抗体は５×１０-8Ｍ以下のＫDでヒトＰＴＫ７に結合し、１×１０-8Ｍ以下のＫDでヒトＰＴＫ７に結合し、５×１０-9Ｍ以下のＫDでヒトＰＴＫ７に結合し、または１×１０-8Ｍと１×１０-10Ｍの間またはそれ未満のＫDでヒトＰＴＫ７に結合する。好ましくは、抗体は４.０ｎＭ以下のＥＣ50でウィルムス腫瘍細胞に結合し、または３.５ｎＭ以下のＥＣ50でウィルムス腫瘍細胞に結合する。ＰＴＫ７に対する抗体の結合能力を評価する標準アッセイは当該技術分野で知られており、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡが含まれる。抗体の結合速度論（例えば、結合親和性）はまた、当該技術分野で知られている標準アッセイによって、例えばＥＬＩＳＡ、スキャッチャードおよびビアコア分析によって評価されうる。別の例として、本発明の抗体は、腎癌腫瘍細胞株、例えば、ウィルムス腫瘍細胞株に結合しうる。いずれの上記の特徴を評価するのにも適したアッセイは、実施例に詳細に記載されている。
【００８８】
モノクローナル抗体３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８
本発明の好ましい抗体は、実施例１および２に記載されているように単離および構造評価された、ヒトモノクローナル抗体３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８である。抗体３Ｇ８および３Ｇ８ａ、並びに抗体１２Ｃ６および１２Ｃ６ａは同一の重鎖配列を有しているが、それらの軽鎖配列が異なっていることを当業者は認識している。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８のＶHアミノ酸配列は、配列番号：１（３Ｇ８および３Ｇ８ａ）、２（４Ｄ５）、３（１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ）並びに４（７Ｃ８）に示されている。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａ、および７Ｃ８のＶLアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：５、６、７、８、９および１０に示されている。
【００８９】
これらの抗体の各々がＰＴＫ７に結合しうるのであれば、ＶHおよびＶL配列は「混合および適合」して、本発明の他の抗ＰＴＫ７結合分子を生成しうる。このように「混合および適合」した抗体のＰＴＫ７結合は、上記および実施例に記載した結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて試験されうる。好ましくは、ＶHおよびＶL鎖が混合および適合される場合、特定のＶH／ＶL対からのＶH配列は構造上類似するＶH配列に置き換えられる。同様に、好ましくは特定のＶH／ＶL対からのＶL配列は構造上類似するＶL配列と置き換えられる。
【００９０】
したがって、一つの態様において、本発明は：
（ａ）配列番号：１、２、３および４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；並びに
（ｂ）配列番号：５、６、７、８、９および１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７、好ましくはヒトＰＴＫ７に特異的に結合する。
【００９１】
好ましい重鎖および軽鎖の組合せには：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ａ）配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または
（ａ）配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および（ｂ）配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域が含まれる。
【００９２】
別の態様において、本発明は、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８、またはその組合せの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体を提供する。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８のＶH ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号：１１（３Ｇ８および３Ｇ８ａ）、１２（４Ｄ５）、１３（１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ）並びに１４（７Ｃ８）に示されている。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８のＶH ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号：１５（３Ｇ８および３Ｇ８ａ）、１６（４Ｄ５）、１７（１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ）並びに１８（７Ｃ８）に示されている。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８のＶH ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号：１９（３Ｇ８および３Ｇ８ａ）、２０（４Ｄ５）、２１（１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ）並びに２２（７Ｃ８）に示されている。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８のＶk ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：２３、２４、２５、２６、２７および２８に示されている。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８のＶk ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：２９、３０、３１、３２、３３および３４に示されている。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８のＶk ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：３５、３６、３７、３８、３９および４０に示されている。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）を用いて描写される。
【００９３】
これらの抗体の各々がＰＴＫ７に結合しうる場合であって、かつ抗原結合特異性が、主としてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域によって与えられる場合、ＶH ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列と、Ｖk ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とは、「混合および適合」（すなわち、各抗体は、ＶH ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、並びにＶk ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含んでいなければならないが、異なる抗体からのＣＤＲは混合および適合しうる）して、本発明の他の抗ＰＴＫ７結合分子を生成しうる。このような「混合および適合」した抗体のＰＴＫ７結合は、上記および実施例に記載した結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ビアコア分析）を用いて試験されうる。好ましくは、ＶH ＣＤＲ配列が混合および適合する場合、特定のＶH配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造上類似するＣＤＲ配列と置き換えられる。同様に、Ｖk ＣＤＲ配列が混合および適合する場合、特定のＶk配列からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造上類似するＣＤＲ配列と置き換えられる。一つ以上のＶHおよび／またはＶLＣＤＲ領域配列を、モノクローナル抗体である抗体３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８について本明細書に開示したＣＤＲ配列からの構造上類似する配列と置き換えることによって、新規のＶHおよびＶL配列が生成されうることは、当業者にとって容易に理解される。
【００９４】
したがって、別の態様において、本発明は：
（ａ）配列番号：１１、１２、１３および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１５、１６、１７および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１９、２０、２１および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２３、２４、２５、２６、２７および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２９、３０、３１、３２、３３および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；並びに
（ｆ）配列番号：３５、３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、
その中で、抗体はＰＴＫ７、好ましくはヒトＰＴＫ７に特異的に結合する。
【００９５】
好ましい態様において、抗体は：
（ａ）配列番号：１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：２９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００９６】
別の好ましい態様において、抗体は：
（ａ）配列番号：１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００９７】
別の好ましい態様において、抗体は：
（ａ）配列番号：１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００９８】
別の好ましい態様において、抗体は：
（ａ）配列番号：１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【００９９】
別の好ましい態様において、抗体は：
（ａ）配列番号：１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１００】
別の好ましい態様において、抗体は：
（ａ）配列番号：１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号：１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号：２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号：３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号：４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３を含む。
【０１０１】
ＣＤＲ３ドメインが、ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインから独立して、単独で同種抗原についての抗体の結合特異性を決定することができ、共通のＣＤＲ３配列に基づいて同一の結合特異性を有する多重抗体が予想どおりに生成されうることは、当該技術分野でよく知られている。例えば、Klimkaら, British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)（マウス抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ−４の重鎖可変領域ＣＤＲ３のみを用いたヒト化抗ＣＤ３０抗体の生成を記載）；Beiboerら, J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000)（親マウスＭＯＣ−３１ 抗ＥＧＰ−２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを用いた組換え上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）抗体を記載）；Raderら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998)（マウス抗インテグリンαvβ3抗体ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ３ドメインを用いたヒト化抗インテグリンαvβ3抗体のパネルを記載し、その中で、各メンバーの抗体は、ＣＤＲ３ドメインの外側に固有の配列を含み、親マウス抗体と同じかそれよりも高い親和性で、親マウス抗体と同じエピトープを結合することができる）；Barbasら, J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994)（ＣＤＲ３ドメインが、抗原結合に最も重要な寄与を与えることを開示）；Barbasら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995)（ヒト胎盤ＤＮＡに対する３つのＦａｂ（ＳＩ−１、ＳＩ−４０、およびＳＩ−３２）の重鎖ＣＤＲ３配列を、抗破傷風トキソイドＦａｂの重鎖へ移植し、それによって存在している重鎖ＣＤＲ３を置き換えたことを記載し、ＣＤＲ３ドメインのみが結合特異性を与えたことを示す）；およびDitzelら, J. Immunol. 157:739-749 (1996)（親Ｆａｂの結合特異性を保持するのには、、親多特異性Ｆａｂ ＬＮＡ３の重鎖ＣＤＲ３のみを、単一特異性ＩｇＧ破傷風トキソイド結合Ｆａｂ ｐ３１３抗体の重鎖へ移せば十分であったという移植試験を記載）；Berezovら, BIAjournal 8:Scientific Review 8 (2001)（抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体のＣＤＲ３に基づくペプチド模倣薬を記載）；Igarashiら, J. Biochem (Tokyo) 117:452-7 (1995)（抗ホスファチジルセリン抗体のＣＤＲ３ドメインに対応の１２アミノ酸合成ポリペプチドを記載）；Bourgeoisら, J. Virol 72:807-10 (1998)（抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗体の重鎖ＣＤＲ３ドメインから生じる単一ペプチドが、インビトロでウイルスを中和することができたことを示す）；Leviら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4374-8 (1993)（マウス抗ＨＩＶ抗体の重鎖ＣＤＲ３ドメインに基づくペプチドを記載）；Polymenis and Stoller, J. Immunol. 152:5218-5329 (1994)（Ｚ−ＤＮＡ結合抗体の重鎖ＣＤＲ３領域を移植することによって、ｓｃＦｖの結合が可能になることを記載）およびXu and Davis, Immunity 13:37-45 (2000)（様々なハプテンとタンパク質抗原との間を他の同一のＩｇＭ分子に識別させるのに、重鎖ＣＤＲ３での多様性が十分であることを記載）を参照。単一ＣＤＲドメインによって規定される特許された抗体を記載する、米国特許第６，９５１，６４６；６，９１４，１２８；６，０９０，３８２；６，８１８，２１６；６，１５６，３１３；６，８２７，９２５；５，８３３，９４３；５，７６２，９０５および５，７６０，１８５もまた参照。これらの参考文献の各々は、その全体が本明細書に引用される。
【０１０２】
したがって、本発明は、ヒトまたは非ヒト動物から生じる抗体からの一つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、その中で、モノクローナル抗体はＰＴＫ７に特異的に結合しうる。特定の態様の中で、本発明は、非ヒト抗体、例えばマウスまたはラット抗体からの一つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、その中で、モノクローナル抗体はＰＴＫ７に特異的に結合しうる。いくつかの態様の中で、非ヒト抗体からの一つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むこのような本発明の抗体は、
（ａ）結合について競合することができ；
（ｂ）機能特性を保持し；
（ｃ）同じエピトープに結合し；および／または
（ｄ）対応の親非ヒト抗体に類似する結合親和性を有する。
【０１０３】
他の態様の中で、本発明は、ヒト抗体、例えば、非ヒト動物から得られるヒト抗体からの一つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、その中で、ヒト抗体はＰＴＫ７に特異的に結合しうる。他の態様の中で、本発明は、第１ヒト抗体、例えば、非ヒト動物から得られるヒト抗体からの一つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、その中で、第１ヒト抗体はＰＴＫ７に特異的に結合することができ、第１ヒト抗体からのＣＤＲ３ドメインは、ＰＴＫ７への結合特異性がないヒト抗体におけるＣＤＲ３ドメインに取って代わり、ＰＴＫ７に特異的に結合しうる第２ヒト抗体を生成する。いくつかの態様の中で、第１ヒト抗体からの一つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むこのような本発明の抗体は、
（ａ）結合について競合することができ；
（ｂ）機能特性を保持し；
（ｃ）同じエピトープに結合し；および／または
（ｄ）対応の親の第１ヒト抗体に類似する結合親和性を有する。好ましい態様において、第１ヒト抗体は、３Ｇ８、＃ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａまたは７Ｃ８である。
【０１０４】
特定の生殖系列配列を有する抗体
ある態様において、本発明の抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域および／または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。
【０１０５】
例えば、好ましい態様において、本発明は、ヒトＶH ３−３０.３遺伝子の産物またはそれに由来する産物である重鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７、好ましくはヒトＰＴＫ７特異的に結合する。別の好ましい態様において、本発明は、ヒトＶH ＤＰ４４遺伝子の産物またはそれに由来する産物である重鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７、好ましくはヒトＰＴＫ７特異的に結合する。別の好ましい態様において、本発明は、ヒトＶH ３−３３遺伝子の産物またはそれに由来する産物である重鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７、好ましくはヒトＰＴＫ７特異的に結合する。さらに別の好ましい態様において、本発明は、ヒトＶK Ｌ１５遺伝子の産物またはそれに由来する産物である軽鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７、好ましくはヒトＰＴＫ７特異的に結合する。さらに別の好ましい態様において、本発明は、ヒトＶK Ａ１０遺伝子の産物またはそれに由来する産物である軽鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７、好ましくはヒトＰＴＫ７特異的に結合する。さらに別の好ましい態様において、本発明は、ヒトＶK Ａ２７遺伝子の産物またはそれに由来する産物である軽鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７、好ましくはヒトＰＴＫ７特異的に結合する。さらに別の好ましい態様において、本発明は、ヒトＶK Ｌ６遺伝子の産物またはそれに由来する産物である軽鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その中で、抗体はＰＴＫ７、好ましくはヒトＰＴＫ７特異的に結合する。
【０１０６】
さらに別の好ましい態様において、本発明は、単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その中で、抗体は、
（ａ）ヒトＶH ３−３０.３、ＤＰ４４または３−３３遺伝子（該遺伝子は、それぞれ、配列番号：５１、５２または５３に示されるアミノ酸配列をコードする）の産物またはそれに由来する産物である重鎖可変領域を含み；
（ｂ）ヒトＶK Ｌ１５、Ａ１０、Ａ２７またはＬ６遺伝子（該遺伝子は、それぞれ、配列番号：５４、５５、５６または５７に示されるアミノ酸配列をコードする）の産物またはそれに由来する産物である軽鎖可変領域を含み；並びに
（ｃ）ＰＴＫ７に特異的に結合する。
【０１０７】
それぞれ、ＶH３−３０.３およびＶk Ｌ１５のＶHおよびＶkを有する抗体の例は、３Ｇ８および３Ｇ８ａである。それぞれ、ＶH３−３０.３およびＶk Ａ１０のＶHおよびＶkを有する抗体の例は、４Ｄ５である。それぞれ、ＶHＤＰ４４およびＶk Ａ２７のＶHおよびＶkを有する抗体の例は、１２Ｃ６である。それぞれ、ＶHＤＰ４４およびＶk Ｌ１５のＶHおよびＶkを有する抗体の例は、１２Ｃ６ａである。それぞれ、ＶH３−３３およびＶk Ｌ６のＶHおよびＶkを有する抗体の例は、７Ｃ８である。
【０１０８】
本明細書において、該抗体の可変領域がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、ヒト抗体は、特定の生殖系列配列「の産生物」または「由来」である、重鎖または軽鎖可変領域を含有する。そのような系には、目的の抗原を用いてヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫化すること、あるいはファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリを目的の抗原を用いてスクリーニングすることが含まれる。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産生物」または「由来」であるヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列に最も近い(すなわち、最大の％同一性)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって、それ自体同定されうる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産生物」または「由来」であるヒト抗体は、例えば、天然の体細胞変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因する、生殖系列配列とのアミノ酸配列の差違を有し得る。しかしながら、選択されたヒト抗体は典型的にはヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比べた場合にヒトであるとしてヒト抗体を同定するアミノ酸残基を有する。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも95％、またはさらには少なくとも96％、97％、98％、もしくは99％同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖系列配列由来のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とは10アミノ酸以下の差違を示すであろう。特定の場合において、該ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とは、5以下、またはさらには4、3、2、もしくは1アミノ酸以下の差違を示し得る。
【０１０９】
相同抗体
さらに別の実施態様において、本発明の抗体は、本明細書に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を含有する重鎖および軽鎖可変領域を有し、ここで、該抗体は本発明の抗PTK7抗体の目的の機能特性を保持する。
【０１１０】
例えば、本発明は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで:
(a)重鎖可変領域は、配列番号:1、2、3および4からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を含有し;
(b)軽鎖可変領域は、配列番号:5、6、7、8、9および10からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を含有し;並びに、
抗体は以下の特性の一つ以上を示す:
(c)抗体は、1×10-7 M以下のKDでヒトPTK7に特異的に結合し;
(d)抗体は、ウィルムス腫瘍細胞株に結合する。
【０１１１】
他の実施態様において、該VHおよび/またはVLアミノ酸配列は、上記の配列に対して、85％、90％、95％、96％、97％、98％もしくは99％相同であり得る。上記の配列のVHおよびVL領域に対して高い(すなわち、80％以上)相同性を有するVHおよびVL領域を有する抗体は、配列番号:41、42、43、44、45、46、47、48、49および50をコードする核酸分子の変異誘発(例えば、部位特異的またはPCR媒介変異誘発)の後、保持機能(すなわち、上記の(c)および(d)に示される機能)について、コードされた変異抗体を本明細書に記載の機能アッセイを用いて試験することによって、得ることができる。
【０１１２】
本明細書で用いられるように、２つのアミノ酸配列間のパーセント相同性は２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性に相当する。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列により共有される同一ポジションの数の関数(すなわち、％相同性 ＝ 同一ポジションの数/ポジションの総数 × 100)であり、２つの配列の最適アラインメントにおいて導入される必要がある。２つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、以下の非限定的実施例に記載のとおり、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。
【０１１３】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に導入されているE. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))により、PAM120重み残基表（weight residue table）、12のギャップ長ペナルティおよび4のギャップペナルティを用いて、決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラム(www.gcg.comで入手可能)に導入されているNeedlemanおよびWunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))アルゴリズムにより、Blosum62マトリックスもしくはPAM250マトリックスのいずれか、ならびに、16、14、12、10、8、6もしくは4のギャップ荷重（gap weight）および1、2、3、4、5もしくは6の長さ荷重（length weight）を用いて、決定することができる。
【０１１４】
さらにまたは別法として、例えば関連配列を同定するために、本発明のタンパク質配列を「クエリ配列」としてさらに用いて、公開データベースに対して検索を実施することができる。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のXBLASTプログラム(バージョン2.0)を用いて実施することができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア = 50、ワード長 = 3を用いて実施し、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較するためのギャップアラインメントを得るため、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のとおりGapped BLASTを用いることができる。BLASTおよびGapped BLASTプログラムを用いる場合、各プログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータを用いることができる。（www.ncbi.nlm.nih.govを参照）。
【０１１５】
保存的修飾(conservative modification)を有する抗体
ある態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、その中で、これらのＣＤＲ配列の一つ以上は、本明細書に記載した好ましい抗体（例えば、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａまたは７Ｃ８）に基づく特定のアミノ酸配列、またはその保存的修飾を含み、並びに抗体は、本発明の抗ＰＴＫ７抗体の目的の機能特性を保持している。抗原結合を取り除かない特定の保存的配列修飾がなされうることが、当該技術分野で理解されている。例えば、Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8（サルモネラ菌に特異的な抗体のＣＤＲ３重鎖ドメインにおける変異分析を記載）；de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41（抗ＵＡ１抗体における変異研究を記載）；Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870（破壊または減少された親和性をもたらすＨＣＤＲ３の中央における変異を示す）；Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12（ＣＤＲ３領域における単一アミノ酸変化が結合活性を破壊したことを記載）；Kelley and O'Connell (1993) Biochem. 32:6862-35（抗原結合におけるＴｙｒ残基の寄与を記載）；Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6（結合における疎水性の効果を記載）並びにBeers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43（ＨＣＤＲ３アミノ酸変異体を記載）を参照。
【０１１６】
したがって、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域並びにＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その中で：
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号：１９、２０、２１および２２のアミノ酸配列、並びにその保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
（ｂ）軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、配列番号：３５、３６、３７、３８、３９および４０のアミノ酸配列、およびその保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；並びに
抗体は、一つ以上の以下の特性の一つ以上を示す：
（ｃ）ヒトＰＴＫ７に特異的に結合し；および
（ｄ）ウィルムス腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４４１）に結合する。
【０１１７】
好ましい態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号：１５、１６、１７および１８のアミノ酸配列、並びにその保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号：２９、３０、３１、３２、３３および３４のアミノ酸配列、並びにその保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号：１１、１２、１３および１４のアミノ酸配列、並びにその保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、配列番号：２３、２４、２５、２６、２７および２８のアミノ酸配列、並びにその保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１１８】
様々な態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
本明細書で用いられるように、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合の特徴に有意に影響を及ぼさないまたはそれを変えないアミノ酸修飾をいうものと意図される。このような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。修飾は、当該技術分野で知られている標準的な技術、例えば部位特異的変異誘発およびＰＣＲを介した変異誘発によって本発明の抗体に導入されうる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換である。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域の中の一つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置き換えられてもよく、改変した抗体は、本明細書に記載した機能アッセイを用いて、保持された機能（すなわち、上記の（ｃ）および（ｄ）に示した機能）について試験されてもよい。
【０１１９】
本発明の抗ＰＴＫ７抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の態様において、本発明は、いずれの本発明のＰＴＫ７モノクローナル抗体によっても認識されるヒトＰＴＫ７上のエピトープを結合する抗体（すなわち、ＰＴＫ７への結合について、いずれの本発明のモノクローナル抗体ともクロス競合する能力を有する抗体）を提供する。好ましい態様において、クロス競合試験のための対照抗体は、モノクローナル抗体３Ｇ８（配列番号：１および５にそれぞれ示されるＶHおよびＶL配列を有する）、またはモノクローナル抗体３Ｇ８ａ（配列番号：１および６にそれぞれ示されるＶHおよびＶL配列を有する）、またはモノクローナル抗体４Ｄ５（配列番号：２および７にそれぞれ示されるＶHおよびＶL配列を有する）、またはモノクローナル抗体１２Ｃ６（配列番号：３および８にそれぞれ示されるＶHおよびＶL配列を有する）、またはモノクローナル抗体１２Ｃ６ａ（配列番号：３および９にそれぞれ示されるＶHおよびＶL配列を有する）、またはモノクローナル抗体７Ｃ８（配列番号：４および１０にそれぞれ示されるＶHおよびＶL配列を有する）でありうる。
【０１２０】
このようなクロス競合抗体は、標準ＰＴＫ７結合アッセイにおいて、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａまたは７Ｃ８とクロス競合するその能力に基づいて同定されうる。例えば、ビアコア分析、ＥＬＩＳＡアッセイまたはフローサイトメトリーは、本発明の抗体とのクロス競合を示すために用いられうる。例えば、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａまたは７Ｃ８のヒトＰＴＫ７への結合を阻害する試験抗体の能力によって、ヒトＰＴＫ７への結合について、試験抗体が３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａまたは７Ｃ８と競合し、そのため３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａまたは７Ｃ８と同じヒトＰＴＫ７上のエピトープに結合しうることが示される。好ましい態様において、ヒトＰＴＫ７上の同じエピトープに結合する抗体は、３Ｇ８（配列番号：１および５にそれぞれ示されるＶHおよびＶL配列を有する）、３Ｇ８ａ（配列番号：１および６にそれぞれ示されるＶHおよびＶL配列を有する）、４Ｄ５（配列番号：２および７にそれぞれ示されるＶHおよびＶL配列を有する）、１２Ｃ６（配列番号：３および８にそれぞれ示されるＶHおよびＶL配列を有する）、１２Ｃ６ａ（配列番号：３および９にそれぞれ示されるＶHおよびＶL配列を有する）または７Ｃ８（配列番号：４および１０にそれぞれ示されるＶHおよびＶL配列を有する）によって認識される。好ましい態様において、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａまたは７Ｃ８によって認識されるように、ヒトＰＴＫ７上の同じエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、実施例に記載されるように製造および単離されうる。
【０１２１】
改変および修飾された抗体
本発明の抗体はさらに、修飾された抗体を設計するために出発物質として本明細書に開示した一つ以上のＶHおよび／またはＶL配列を有する抗体を用いて製造されてもよく、その修飾された抗体は出発の抗体から変更した特性を有していてもよい。一つもしくは両方の可変領域（すなわち、ＶHおよび／またはＶL）の中の、例えば一つ以上のＣＤＲ領域の中の、および／または一つ以上のフレームワーク領域の中の、一つ以上の残基を変えることによって、抗体を設計してもよい。さらにまたは別法として、定常領域の中の残基を変えることによって、例えば抗体のエフェクター機能を変えることによって抗体を設計してもよい。
【０１２２】
遂行されうる可変領域操作の一つの型は、ＣＤＲ移植法(CDR grafting)である。抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置しているアミノ酸残基を通して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲの中のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外部の配列よりも、個々の抗体間でより多様化している。ＣＤＲ配列はたいていの抗体−抗原相互作用に関与しているので、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列上に移植された特定の天然に存在する抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体の特性を模倣した組換え抗体を発現することは可能である（例えば、Riechmann, L.ら (1998) Nature 332:323-327; Jones, P.ら (1986) Nature 321:522-525; Queen, C.ら (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、並びにＱｕｅｅｎらの米国特許第５，５３０，１０１号; 第５，５８５，０８９号; 第５，６９３，７６２号および第６，１８０，３７０号を参照）。
【０１２３】
したがって、本発明の別の態様は、配列番号：１１、１２、１３および１４、配列番号：１５、１６、１７および１８、並びに配列番号：１９、２０、２１および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域；並びに
配列番号：２３、２４、２５、２６、２７および２８、配列番号：２９、３０、３１、３２、３３および３４、並びに配列番号：３５、３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域；
を含む単離したモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、このような抗体は、モノクローナル抗体３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａまたは７Ｃ８のＶHおよびＶLＣＤＲ配列を含むが、これらの抗体と異なるフレームワーク配列を含んでいてもよい。
【０１２４】
そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的DNAデータベースまたは公開文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列DNA配列は、「VBase」ヒト生殖系列配列データベース(インターネット上のwww.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseで利用可能)、ならびにKabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) 「The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops」 J. Mol. Biol. 227:776-798; および、Cox, J. P. L. et al. (1994) 「A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」 Eur. J. Immunol. 24:827-836;（その各々の内容は引用により本明細書に明確に援用される）に見いだすことができる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列DNA配列はGenbankデータベースに見いだすことができる。例えば、HCo7 HuMAbマウスで見いだされる以下の重鎖生殖系列配列は、付随のGenbank受入番号: 1-69 (NG_0010109、NT_024637およびBC070333)、3-33 (NG_0010109およびNT_024637)ならびに3-7 (NG_0010109およびNT_024637)で入手可能である。別の例として、HCo12 HuMAbマウスで見いだされる以下の重鎖生殖系列配列は、付随のGenbank受入番号: 1-69 (NG_0010109、NT_024637およびBC070333)、5-51 (NG_0010109およびNT_024637)、4-34 (NG_0010109およびNT_024637)、3-30.3 (CAJ556644)ならびに3-23 (AJ406678)で入手可能である。他のヒト生殖系列配列データベース、例えばIMGT (http://imgt.cines.fr)から利用可能であるものは、上記のVBASEと同様に検索されうる。
【０１２５】
抗体タンパク質配列を、Gapped BLASTと呼ばれる配列類似性検索方法(Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402)のうちの一つを用いて、コンパイルされたタンパク質配列データベースと比較し、それは当業者によく知られている。抗体配列とデータベース配列との間での統計的に有意なアラインメントはアラインメントされたワードの高スコアセグメント対（high-scoring segment pair）(HSP)を有する傾向が強い点で、BLASTはヒューリスティックアルゴリズムである。伸長またはトリミングによりスコアを改善することができないセグメント対をヒット（hit）と呼ぶ。簡単に言うと、VBASE由来のヌクレオチド配列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)が翻訳され、FR1からFR3フレームワーク領域間の領域および同領域を含む領域が保持される。該データベース配列は、平均98残基長を有する。タンパク質の全長にわたって厳密に一致する重複配列が除去される。デフォルトでのblastpプログラム、低複雑性フィルタ（オフにしている）以外の標準パラメータ、およびBLOSUM62の置換マトリックスを用いたタンパク質についてのBLAST検索によって、配列の一致をもたらす上位5つのヒットにフィルタがかけられる。該ヌクレオチド配列は全６つのフレーム中で翻訳され、データベース配列の一致するセグメント中に停止コドンを有さないフレームはヒットの可能性があると考えられる。同様に、BLASTプログラムtblastxを用いてこのことを確認する（全６つのフレーム中で抗体配列を翻訳し、それら翻訳を全６つのフレーム中で動的に翻訳されたVBASEヌクレオチド配列と比較する）。他のヒト生殖系列配列データベース、例えばIMGT (http://imgt.cines.fr)から利用可能であるものは、上記のVBASEと同様に検索されうる。
【０１２６】
同一性は、抗体配列と配列の全長にわたるタンパク質データベースとの間の正確なアミノ酸の一致である。ポジティブ（positive）(同一性+置換の一致)は、同一ではなく、BLOSUM62置換マトリックスによって導かれるアミノ酸置換である。抗体配列が、データベース配列のうちの２つと同じ同一性で一致する場合、ほとんどのポジティブを有するヒットが一致する配列ヒットであると決定され得る。
【０１２７】
本発明の抗体に使用するのに好ましいフレームワーク配列は、本発明の選択された抗体に用いられるフレームワーク配列に構造上類似するもの、例えば、本発明の好ましいモノクローナル抗体に用いられる、ＶH３−３０.３フレームワーク配列（配列番号：５１）および／またはＶHＤＰ４４フレームワーク配列（配列番号：５２）および／またはＶH３−３３フレームワーク配列（配列番号：５３）および／またはＶk Ｌ１５フレームワーク配列（配列番号：５４）および／またはＶk Ａ１０フレームワーク配列（配列番号：５５）および／またはＶk Ｌ１５フレームワーク配列（配列番号：５４）および／またはＶk Ａ２７フレームワーク配列（配列番号：５６）および／またはＶk Ｌ１５フレームワーク配列（配列番号：５４）および／またはＶk Ｌ６フレームワーク配列（配列番号：５７）に類似するものである。VH CDR1、CDR2、およびCDR3配列、ならびにVK CDR1、CDR2、およびCDR3配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子中に見いだされるのと同一の配列を有するフレームワーク領域上に導入され得るか、あるいは、該CDR配列は、生殖系列配列と比べて１つ以上の変異を含むフレームワーク領域上に導入され得る。例えば、特定の場合において、フレームワーク領域内の残基を変異させて抗体の抗原結合親和性を維持もしくは増強させることが有益であることが見いだされている(例えば、Queen et al.の米国特許第5,530,101号; 第5,585,089号; 第5,693,762号および第6,180,370号を参照)。
【０１２８】
別のタイプの可変領域修飾は、VHおよび/またはVKの、CDR1、CDR2および/またはCDR3領域内のアミノ酸残基を変異させて、それによって目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば親和性）を改善するものである。部位特異的変異誘発またはPCR媒介変異誘発を実施して変異を導入することができ、抗体結合における効果または他の目的の機能特性を、本明細書に記載し、かつ実施例に与えられるインビトロもしくはインビボアッセイで評価することができる。保存的修飾（上記で議論したもの）が導入されるのが好ましい。該変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失であってよいが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、CDR領域内の１、２、３、４または５以下の残基を変異させる。
【０１２９】
したがって、別の態様において、本発明は、以下を含む重鎖可変領域を含む単離した抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する：
（ａ）配列番号：１１、１２、１３および１４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１１、１２、１３および１４と比較して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶH ＣＤＲ１領域；
（ｂ）配列番号：１５、１６、１７および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１５、１６、１７および１８と比較して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶH ＣＤＲ２領域；
（ｃ）配列番号：１９、２０、２１および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：１９、２０、２１および２２と比較して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶH ＣＤＲ３領域；
（ｄ）配列番号：２３、２４、２５、２６、２７および２８からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：２３、２４、２５、２６、２７および２８と比較して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶk ＣＤＲ１領域；
（ｅ）配列番号：２９、３０、３１、３２、３３および３４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：２９、３０、３１、３２、３３および３４と比較して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶk ＣＤＲ２領域；および
（ｆ）配列番号：３５、３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列、または配列番号：３５、３６、３７、３８、３９および４０と比較して１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶk ＣＤＲ３領域。
【０１３０】
本発明の改変抗体には、修飾がＶHおよび／またはＶKの中のフレームワーク残基になされているもの、例えば抗体の特性を改善するものが含まれる。典型的には、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるためになされる。例えば、一つのアプローチは、一つ以上のフレームワーク残基を対応の生殖系列配列に「逆変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を受けている抗体は、該抗体が生じる生殖系列配列と異なるフレームワーク残基を含みうる。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、該抗体が生じる生殖系列配列と比較することによって同定されうる。
【０１３１】
例えば、３Ｇ８（および３Ｇ８ａ）について、ＶHのアミノ酸残基＃２８（ＦＲ１の中で）はイソロイシンであるが、対応のＶH３−３０.３生殖系列配列におけるこの残基はスレオニンである。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列配置に戻すために、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲを介した変異誘発によって、体細胞変異は生殖系列配列に「逆変異(backmutated)」されうる（例えば、３Ｇ８（および３Ｇ８ａ）のＶHのＦＲ１の残基＃２８は、イソロイシンからスレオニンに「逆変異」されうる）。
【０１３２】
別の例として、１２Ｃ６（および１２Ｃ６ａ）について、ＶHのアミノ酸残基＃４４（ＦＲ２の中で）はスレオニンであるが、対応のＶH ＤＰ４４生殖系列配列におけるこの残基はグリシンである。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列配置に戻すために、例えば、１２Ｃ６（および１２Ｃ６ａ）のＶHの残基＃４４（ＦＲ２の残基＃９）は、スレオニンからグリシンに「逆変異」されうる。このような「逆変異」抗体もまた、本発明に含まれるものと意図される。
【０１３３】
別のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内またはさらには１つ以上のCDR領域内での、１つ以上の残基の変異に関与して、T細胞エピトープを除去し、それによって抗体の潜在的な免疫原性を低下させる。このアプローチはまた、「脱免疫化（deimmunization）」とも称され、Carr et alによる米国特許公開第20030153043号にさらに詳細に記載されている。
【０１３４】
フレームワーク領域またはCDR領域の中でなされる修飾に加えてまたはその代わりに、本発明の抗体は、Fc領域内に修飾を含むように改変され、典型的には、例えば、血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、および/または抗原依存性の細胞傷害性といった、抗体の一つ以上の機能特性が変化され得る。さらに、本発明の抗体を化学的に修飾してもよい(例えば、１つ以上の化学的部分が抗体に結合され得る)か、あるいはそのグリコシル化を変化させて、抗体の１つ以上の機能特性を再び変化させてもよい。これらの実施態様の各々を、以下にさらに詳細に記載する。Fc領域における残基のナンバリングは、KabatのEUインデックスのものである。
【０１３５】
一実施態様においては、CH1のヒンジ領域が修飾されて、該ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変化される（例えば、増加または減少される）。このアプローチはさらに、Bodmer et alによる米国特許第5,677,425号に記載されている。CH1のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖および重鎖の構築を促進させるように、あるいは抗体の安定性を増大または低下させるように、変えられる。
【０１３６】
別の実施態様において、抗体のFcヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を低下させる。より具体的には、該抗体が天然のFc-ヒンジドメインSpA結合と比べて低下したブドウ球菌プロテイン(SpA)結合を有するように、１つ以上のアミノ酸変異がFc-ヒンジフラグメントのCH2-CH3ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、Ward et alによる米国特許第6,165,745号により詳細に記載されている。
【０１３７】
別の実施態様において、該抗体は、その生物学的半減期を増大させるように修飾される。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardの米国特許第6,277,375号に記載のとおり、以下の変異のうちの１つ以上を導入することができる: T252L、T254S、T256F。別法として、生物学的半減期を増大させるために、Presta et al.による米国特許第5,869,046号および第6,121,022号に記載のとおり、該抗体を、IgGのFc領域のCH2ドメインの２つのループからのサルベージ（salvage）受容体結合エピトープを含むように、CH1またはCL領域内で変化させることができる。
【０１３８】
さらに他の実施態様において、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによってFc領域を変異させて、抗体のエフェクター機能を変化させる。例えば、アミノ酸残基234、235、236、237、297、318、320、または322から選択される１つ以上のアミノ酸を、抗体がエフェクターリガンドに対して親和性が変化されているが親抗体の抗原-結合親和性を保持しているように、異なるアミノ酸残基で置換することができる。親和性が変化されるエフェクターリガンドは、例えば、Fc受容体または補体のC1成分であり得る。このアプローチは、Winter et al.による米国特許第5,624,821号および第5,648,260号にさらに詳細に記載されている。
【０１３９】
別の実施例において、アミノ酸残基329、331または322から選択される１つ以上のアミノ酸を、抗体が、変化したC1q結合および/または低下もしくは消滅した補体依存性細胞傷害性(CDC)を有するように、異なるアミノ酸残基で置換することができる。このアプローチは、Idusogie et al.による米国特許第6,194,551号にさらに詳細に記載されている。
別の実施例において、アミノ酸位置231および239内の１つ以上のアミノ酸残基が変化されることによって、抗体の補体を結合する能力を変化させる。このアプローチは、Bodmer et al.によるPCT公開WO 94/29351にさらに詳細に記載されている。
【０１４０】
さらに別の実施例において、Fc領域は、以下の位置で１つ以上のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を媒介する抗体の能力を増大させ、および／またはFcγ受容体に対する抗体の親和性を増大させるように修飾される: 238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438または439。このアプローチは、PrestaによるPCT公開WO 00/42072にさらに詳細に記載されている。さらに、FcγR1、FcγRII、FcγRIIIおよびFcRnに対するヒトIgG1上の結合部位がマッピングされており、結合が改善された変異体が記載されている(Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604を参照)。位置256、290、298、333、334および339での特異的変異がFcγRIIIに対する結合を改善することが示された。さらに、以下の組み合わせ変異体がFcγRIII結合を改善することが示された: T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224AおよびS298A/E333A/K334A。
【０１４１】
さらに別の実施態様において、本発明の抗体のC末端は、米国仮出願第60/957,271号に記載（引用によりその全般が本明細書に援用される）されているように、システイン残基の導入によって修飾される。そのような修飾としては、限定はされないが、全長重鎖配列のC末端もしくはその付近に存在するアミノ酸残基の置換、ならびに全長重鎖配列のC末端へのシステイン-含有伸長の導入、が挙げられる。好ましい実施態様において、システイン-含有伸長は、配列アラニン-アラニン-システイン(N末端からC末端)を含む。
【０１４２】
好ましい態様において、このようなC末端システイン修飾の存在によって、パートナー分子、例えば治療剤またはマーカー分子が結合するための位置が与えられる。特に、反応性チオール基の存在は、C末端システイン修飾のため、以下に詳細に記載されるジスルフィドリンカーを用いてパートナー分子を結合するのに用いられうる。このように抗体がパートナー分子に結合することで、特異的な結合部位についての制御が高められ得る。さらに、C末端またはその付近に結合部位を導入することによって結合を最適化することができ、それにより、抗体の機能特性の妨害を低減または除去し、複合体製剤の分析および品質管理の簡易化を可能にする。
【０１４３】
さらに別の態様において、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が製造されうる（すなわち、抗体はグリコシル化されていない）。グリコシル化は、例えば、抗体の抗原に対する親和性を増大させるように変化されうる。このような糖修飾は、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変化させることにより達成されうる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらす１つ以上のアミノ酸置換を行い、それによって該部位でのグリコシル化を除去しうる。このようなグリコシル化は、抗体の抗原に対する親和性を増大させうる。このようなアプローチは、Ｃｏらの米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。グリコシル化を変化させる別のアプローチは、Ｈａｎａｉらの米国特許第７，２１４，７７５号、Ｐｒｅｓｔａの米国特許第６，７３７，０５６号、Ｐｒｅｓｔａの米国公開第２００７００２０２６０号、ＤｉｃｋｅｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００７／０８４９２６、ＺｈｕらのＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００６／０８９２９４、およびＲａｖｅｔｃｈらのＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００７／０５５９１６にさらに詳細に記載されており、その各々はその全体が本明細書に引用されている。
【０１４４】
加えてまたは別法として、改変型のグリコシル化を有する抗体、例えば、フコシル残基の量が低下した低フコシル化（hypofucosylated）抗体または分岐（bisecting）GlcNac構造が増加した抗体を作製することができる。そのような改変グリコシル化パターンは抗体のADCC能力を増大させることが示されている。そのような糖修飾は、例えば、改変グリコシル化機構を有する宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成することができる。改変グリコシル化機構を有する細胞は当分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現することにより改変グリコシル化を有する抗体を産生する宿主細胞として用いることができる。例えば、細胞株Ms704、Ms705、およびMs709は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8(α (1,6) フコシルトランスフェラーゼ)が欠如しており、それにより、Ms704、Ms705、およびMs709の細胞株で発現する抗体はその糖においてフコースを欠いている。Ms704、Ms705、およびMs709 FUT8-/- 細胞株は、２つの置換ベクターを用いてCHO/DG44細胞中のFUT8遺伝子を標的破壊することにより創り出すことができた(Yamane et al.による米国特許公開第20040110704号およびYamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22を参照)。別の実施例として、Hanai et al.によるEP 1,176,195は機能的に破壊されたFUT8遺伝子を有する細胞株を記載しており、それはフコシルトランスフェラーゼをコードし、それにより、そのような細胞株で発現する抗体は、α 1,6 結合-関連酵素の低減もしくは除去による低フコシル化を示す。Hanai et al.はまた、抗体のFc領域に結合するN-アセチルグルコサミンにフコースを付加するための酵素活性が低いか、あるいは酵素活性をもたない細胞株、例えばラットミエローマ細胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)も記載している。PrestaによるPCT公開WO 03/035835は、Asn(297)-連結糖（carbohydrate）にフコースを結合させる能力が低下したCHO細胞変異株であるLec13細胞（これもまた該宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化をもたらす）を記載している(また、Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740を参照)。UmanaらによるPCT公開WO 99/54342は、改変された細胞株中で発現する抗体が分岐GlcNac構造の増大を示すように糖タンパク質-修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII (GnTIII))を発現するように改変され、結果として抗体のADCC活性の増大をもたらす細胞株を記載している(Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180もまた参照)。別法としては、抗体のフコース残基がフコシダーゼ酵素を用いて切断され得る。例えば、フコシダーゼ α-L-フコシダーゼはフコシル残基を抗体から除去する(Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23)。
【０１４５】
さらにまたは別法として、改変型のグリコシル化を有する抗体が製造されてもよく、その中で、該改変は抗体のシアリル化のレベルに関する。かかる改変は、ＤｉｃｋｅｙらのＰＣＴ公開番号ＷＯ ２００７／０８４９２６、およびＲａｖｅｔｃｈらのＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００７／０５５９１６に記載されており、その両方ともその全体が引用される。例えば、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafacens）シアリダーゼなどのシアリダーゼとの酵素反応を用いてもよい。そのような反応の条件は、概して、米国特許第5,831,077号に記載されており、引用によりその全般が本明細書に援用される。適切な酵素の他の非限定的な例は、ノイラミニダーゼおよびN-グリコシダーゼFであり、各々、Schloemer et al . , J. Virology, 15(4), 882-893 (1975)およびLeibiger et al., Biochem J., 338, 529-538 (1999)に記載されている。脱シアリル化抗体を、アフィニティークロマトグラフィを用いることによりさらに精製してもよい。別法として、例えばシアリルトランスフェラーゼ（sialytransferase）酵素を用いることにより、シアリル化（sialyation）のレベルを増大させる方法を用いてもよい。そのような反応の条件は、概して、Basset et al., Scandinavian Journal of Immunology, 51(3), 307−311 (2000)に記載されている。
【０１４６】
本発明によって意図される本明細書の抗体の別の修飾はペグ化である。例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を増大させるために、抗体をペグ化してもよい。抗体をペグ化するために、典型的には、１つ以上のPEG基が抗体または抗体フラグメントに結合した状態になる条件下において、該抗体またはそのフラグメントをポリエチレングリコール(PEG)（例えば、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させる。好ましくは、該ペグ化は、反応性PEG分子(または類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。本明細書で用いるように、用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質を誘導体化するのに用いられているPEGのいずれの形態、例えば、モノ(C1-C10)アルコキシ-もしくはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール-マレイミドを包含するものと意図される。ある特定の実施態様において、ペグ化される抗体はアグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法が当分野において公知であり、本発明の抗体に適用されうる。例えば、NishimuraらによるEP 0 154 316、およびIshikawaらによるEP 0 401 384を参照。
【０１４７】
抗体フラグメントおよび抗体模倣体
本明細書で開示された発明は、抗原結合成分としての従来の抗体に限定されず、抗体フラグメントおよび抗体模倣体の使用を通して実用可能である。様々な抗体フラグメントおよび抗体模倣技術が開発され、当分野で広く知られている。
【０１４８】
ドメイン抗体(dAb)は、抗体の最小の機能的結合ユニット（functional binding unit）-分子量約13 kDa-であり、抗体の重鎖(VH)または軽鎖(VL)のいずれかの可変領域に対応する。ドメイン抗体およびその製造方法についてのさらなる詳細は、US 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; および6,696,245; US 2004/0110941; EP 1433846、0368684および0616640; WO 2005/035572、2004/101790、2004/081026、2004/058821、2004/003019および2003/002609に記載されており、その各々は引用によりその全般が本明細書に援用される。
【０１４９】
ナノボディは、天然の重鎖抗体の特有の構造特性および機能特性を有する抗体由来のタンパク質である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン(VHH)および２つの定常ドメイン(CH2およびCH3)を有する。重要なことには、クローニングされて単離されたVHHドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能力を有する安定なポリペプチドである。ナノボディはヒト抗体のVHドメインと高い相同性を有し、活性のいずれの損失も伴うことなくさらにヒト化され得る。重要なことには、ナノボディは低い免疫原性を有する。
【０１５０】
ナノボディは、従来の抗体の利点と小分子薬剤の重要な特徴とを組み合わせる。従来の抗体と同様に、ナノボディは、高い標的特異性および高い親和性ならびに低い固有の毒性を示す。さらに、ナノボディは極めて安定であり、注入以外の方法により投与することができ(例えば、WO 2004/041867を参照)、製造が容易である。ナノボディの他の利点としては、その小さいサイズに起因する稀であるかまたは隠れたエピトープの認識、それら特有の3-次元の薬剤形態の柔軟性に起因するタンパク質標的の空洞または活性部位への高親和性および選択的な結合、半減期の調整、ならびに薬剤発見の容易さおよび速度が挙げられる。
【０１５１】
ナノボディは単一の遺伝子によってコードされており、ほとんど全ての原核生物宿主および真核生物宿主、例えば、大腸菌(例えば、引用によりその全般が本明細書に援用されるUS 6,765,087を参照)、カビ(例えば、アスペルギルスまたはトリコデルマ)および酵母(例えば、サッカロマイセス、クリベロマイセス、ハンゼヌラまたはピキア)(例えば、引用によりその全般が本明細書に援用されるUS 6,838,254を参照)において効率的に産生される。
ナノクローン(Nanoclone)法(例えば、引用によりその全般が本明細書に援用されるWO 06/079372を参照)により、B-細胞の自動化ハイスループット選別に基づいて、目的の標的に対するナノボディが得られ、本発明に関連して用いられ得る。
【０１５２】
ユニボディ(UniBody)は、IgG4抗体のヒンジ領域の除去に基づく、別の抗体フラグメント技術である。ヒンジ領域の除去により、従来のIgG4抗体の本質的に半分のサイズであって、２価の結合領域よりむしろ１価の結合領域を有する分子が得られる。さらに、ユニボディはおおよそより小さいので、より大きな固形腫瘍全体によりよく分布し、有利な効果の可能性を示し得る。ユニボディに関するさらなる詳細はWO 2007/059782を参照することにより得られ、それは引用によりその全般が援用される。
【０１５３】
アフィボディ(Affibody)分子は、ブドウ球菌プロテインAの３つのへリックスバンドルIgG-結合ドメイン由来の58-アミノ酸残基タンパク質ドメインに基づく親和性タンパク質である。このドメインはコンビナトリアルファージミドライブラリーの構築のための骨格として用いられており、そこからファージディスプレイ技術を用いて目的の分子を標的にするアフィボディ変異体が選択され得る(Nord et al., Nat Biotechnol 1997;15:772-7; Ronmark et al., Eur J Biochem 2002;269:2647-55)。アフィボディ分子は、その単純で強固な構造および低い分子量(6 kDa)によって、様々な用途（例えば検出試薬および受容体相互作用の阻害剤）に適している。アフィボディに関するさらなる詳細はUS 5,831,012に記載されており、それは引用によりその全般が援用される。標識アフィボディはまた、アイソフォームの存在量の決定のためのイメージング用途においても有用である。
【０１５４】
DARPin(設計アンキリン反復タンパク質（Designed Ankyrin Repeat Protein）)は、非抗体ポリペプチドの結合能を開発利用するDRP(設計反復タンパク質（Designed Repeat Protein）)抗体模倣技術の具体例である。反復タンパク質、例えばアンキリンおよびロイシン-リッチな反復タンパク質は、抗体とは異なり、細胞内および細胞外で生じる偏在性の結合分子である。それらの特有のモジュール構造は、共に積み重なって可変性を示す伸長された反復ドメインおよびモジュール標的結合表面を形成する、構造単位を繰り返すこと(反復)を特徴とする。このモジュール性に基づいて、高度に多様化された結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリが形成され得る。この方策には、可変表面残基および反復ドメインへのそのランダムなアセンブリーを提示する自家和合性反復の共通設計が含まれる。DARPinおよび他のDRP技術に関するさらなる情報は、US 2004/0132028およびWO 02/20565中に見いだすことができ、その両方とも引用により援用される。
【０１５５】
アンチカリンは別の抗体模倣技術である。この場合、結合特異性はヒト組織および体液において天然に豊富に発現される低分子量タンパク質のファミリーであるリポカリン由来である。リポカリンは、インビボにおいて、生理学的輸送および化学的感受性もしくは不溶性の化合物の保存に関連する様々な機能を果たすように進化してきた。リポカリンは、タンパク質の一末端で４つのループを支持する高度に保存されたβ-バレルを含有する、強固な固有の構造を有する。これらのループが結合ポケットへの入り口を形成し、分子のこの部分における立体構造上の差違が個々のリポカリン間の結合特異性におけるバリエーションを決定づけている。
【０１５６】
保存されたβ-シートフレームワークにより支持された高頻度可変ループの全体構造はイムノグロブリンを連想させるが、リポカリンはサイズに関して抗体とは大きく異なっていて、160-180のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖からなっており、それは単一の免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きい。
【０１５７】
リポカリンをクローニングし、それらのループを改変してアンチカリンを作り出すことができる。構造的に多様なアンチカリンのライブラリが作製されており、アンチカリンの提示は、結合機能の選択およびスクリーニング、それに続く原核生物系もしくは真核生物系におけるさらなる分析のための可溶性タンパク質の発現および産生を可能にする。研究により、実質的にいずれのヒト標的タンパク質に特異的なアンチカリンを開発することができ、ナノモル以上の範囲の結合親和性が得られることが証明されている。アンチカリンに関するさらなる情報はUS 7,250,297およびWO 99/16873に見いだすことができ、その両方とも引用によりその全般が本明細書に援用される。
【０１５８】
アビマー(Avimer)は、本発明と関連して有用な別のタイプの抗体模倣技術である。アビマーは、エクソンシャッフリングおよびファージディスプレイにより、大きなヒト細胞外受容体ドメインファミリーから得られ、結合特性および阻害特性を有する多ドメインタンパク質を生成する。複数の独立した結合ドメインの連結により、結合活性が生み出され、それにより従来の単一エピトープ結合タンパク質に比べて改善された親和性および特異性がもたらされることが示されている。他の潜在的な利点としては、大腸菌における多標的特異的分子の単純で効率的な産生、改善された熱安定性およびプロテアーゼに対する耐性が挙げられる。ナノモル以下の親和性を有するアビマーが、様々な標的に対して得られている。アビマーに関するさらなる情報はUS 2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756に見いだすことができ、それら全ては引用によりその全般が本明細書に援用される。
【０１５９】
ベルサボディ（Versabody）は、本発明に関連して有いることができる別の抗体模倣技術である。ベルサボディは、＞15％のシステインを有する3-5 kDaの小さなタンパク質であり、典型的なタンパク質が有する疎水性コアに置き換わる高いジスルフィド密度の骨格を形成する。より小さく、より親水性であり(すなわち、凝集および非特異的結合をする傾向が低い)、プロテアーゼおよび熱に対してより耐性があり、MHC提示に最も貢献する残基が疎水性であることからT-細胞エピトープの密度がより低いタンパク質が、この置換によりもたらされる。これらの特性は免疫原性に影響することがよく知られており、それらはともに免疫原性の大幅な低下をもたらすと予期される。
【０１６０】
ベルサボディの構造を考慮すると、これらの抗体模倣体は、多価、多重特異性、多様な半減期メカニズム、組織ターゲティングモジュールおよび抗体Fc領域の欠損を含む、多用途形式を提示する。さらに、ベルサボディは大腸菌において高収率で製造され、ベルサボディは親水性でサイズが小さいことからそれらは高溶解性であり、高濃度で製剤化され得る。ベルサボディは非常に熱安定であり、有効期間を伸ばす。ベルサボディに関するさらなる情報はUS 2007/0191272に見いだすことができ、それは引用によりその全般が本明細書に援用される。
【０１６１】
抗体フラグメントおよび模倣技術の上述の記載は包括的であることを意図しない。代替ポリペプチドに基づく技術（例えば、Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007)に概説される相補性決定領域の融合）、ならびに核酸に基づく技術（例えば、US 5,789,157; 5,864,026; 5,712,375; 5,763,566; 6,013,443; 6,376,474; 6,613,526; 6,114,120; 6,261,774; および6,387,620;（その全ては引用により本明細書に援用される）に記載のRNAアプタマー技術を含む、様々なさらなる技術が本発明に関連して用いられ得る。
【０１６２】
抗体の物理的特性
本発明で用いられる抗体は、様々な物理的特性によりキャラクタライズされ得る。
該抗体は、VLまたはVHのいずれかにおいて１つ以上のグリコシル化部位を有し得て、それによって免疫原性の増大またはpKの変化がもたらされ得る(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706)。グリコシル化はN-X-S/T配列を有するモチーフで生じることが知られている。可変領域のグリコシル化は、抗体を切断してFabを作製した後に過ヨウ素酸酸化およびシッフ塩基形成を測定するアッセイを用いてグリコシル化を試験する、グライコブロット（Glycoblot）アッセイを用いて試験され得る。別法として、可変領域のグリコシル化は、Fabから糖を切断して単糖にして個々の単糖含量を分析する、ダイオネクス液体クロマトグラフィ（Dionex light chromatography）(Dionex-LC)を用いて試験され得る。場合によっては、可変領域のグリコシル化を含まない抗抗体を有することが好ましい。このことは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択することによってか、あるいは標準的な技法を用いてグリコシル化モチーフ内の塩基を変異させることによって、達成することができる。
【０１６３】
好ましい実施態様において、本発明の抗体はアスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミドはN-GまたはD-G配列上で生じ得て、イソアスパラギン酸残基の産生をもたらし、ポリペプチド鎖によじれを導入してその安定性を低下させる(イソアスパラギン酸効力)。イソアスパラギン酸の存在は、逆相HPLC試験(iso-quantアッセイ)を用いて測定することができる。
【０１６４】
各抗体は、特有の等電点(pI)を有するであろう（一般的には6〜9.5のpH範囲に収まる）。IgG1抗体のpIは典型的には7〜9.5のpH範囲内に収まり、IgG4抗体のpIは典型的には6〜8のpH範囲内に収まる。正常範囲外のpIを有する抗体は、インビボ条件下においていくらかのアンフォールディングおよび不安定性を有し得ることが推測される。従って、正常範囲に収まるpI値を有する抗PTK7抗体を有することが好ましい。このことは、正常範囲のpIを有する抗体を選択することによってか、あるいは荷電した表面残基を変異させることによって達成することができる。
【０１６５】
各抗体は特有の融解温度を有するであろう（より高い融解温度はインビボにおいてより高い全体的安定性を示す）(Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。一般的には、TM1(初期アンフォールディングの温度)は、60℃以上、好ましくは65℃以上、さらにより好ましくは70℃以上であることが好ましい。抗体の融点は示差走査熱量測定(Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52)、または円偏光二色性(Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)を用いて測定することができる。
【０１６６】
好ましい実施態様において、急速に分解しない抗体が選択される。抗体の断片化は、当分野で十分に理解されているような、キャピラリー電気泳動(CE)およびMALDI-MSを用いて測定され得る(Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32)。
【０１６７】
別の好ましい実施態様において、最小の凝集効果を有する抗体が選択され、それは望ましくない免疫応答および/または変化されたかもしくは好ましくない薬物動態学的特性の引き金を導き得る。一般的に、抗体は、25％以下、好ましくは20％以下、さらにより好ましくは15％以下、さらにより好ましくは10％以下、およびさらにより好ましくは5％以下の凝集で許容される。凝集は、サイズ排除カラム(SEC)、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)、および光散乱を含む、いくつかの技法により測定できる。
【０１６８】
抗体の改変方法
上記で議論したように、本明細書に開示したVHおよびVK配列を有する抗PTK7抗体を用いて、VHおよび/またはVK配列、またはそれに結合する定常領域を修飾することにより、新しい抗PTK7抗体を作り出すことができる。従って、本発明の別の態様において、本発明の抗PTK7抗体、例えば3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6aまたは7C8の構造的特徴を用いて、本発明の抗体の少なくとも１つの機能特性（例えば、ヒトPTK7への結合）を保持する、構造的に関連した抗PTK7抗体が作り出される。例えば、上述のとおり、3G8、3G8a、4D5、12C6、12C6aもしくは7C8の１つ以上のCDR領域またはその変異体を、公知のフレームワーク領域および/または他のCDRと組み替えで合わせて、さらなる、組み替えで改変した本発明の抗PTK7抗体を作り出すことができる。他のタイプの修飾としては、前項に記載のものが挙げられる。改変方法のための出発物質は、本明細書に記載のVHおよび/またはVK配列の１つ以上、またはそれらのCDR領域の１つ以上である。改変抗体を作出するために、本明細書に与えられるVHおよび/またはVK配列の１つ以上、またはそれらのCDR領域の１つ以上を有する抗体を実際に調製する(すなわち、タンパク質として発現させる)必要はない。むしろ、配列に含まれる情報を出発物質として用いて、元の配列由来の「第二世代」配列を作り出し、次いで該「第二世代」配列をタンパク質として調製および発現させる。
【０１６９】
したがって、別の態様において、本発明は：
（ａ）
（ｉ）配列番号：１１、１２、１３および１４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号：１５、１６、１７および１８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号：１９、２０、２１および２２からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；および／または
（ｉｉ）配列番号：２３、２４、２５、２６、２７および２８からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号：２９、３０、３１、３２、３３および３４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号：３５、３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列；
を提供し；
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列の中で少なくとも一つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも一つの改変抗体配列を作成し；並びに
（ｃ）改変抗体配列をタンパク質として発現すること
を特徴とする、抗ＰＴＫ７抗体の製造方法を提供する。
【０１７０】
標準分子生物学の技術を用いて、改変抗体配列を製造および発現してもよい。
好ましくは、改変抗体配列によってコードされる抗体は、本明細書に記載した抗ＰＴＫ７抗体の機能特性のうちの一つ、いくつか、またはすべてを保持するものであり、その機能特性には、これらに限らないが、以下が含まれる：
（ａ）抗体は１×１０-7Ｍ以下のＫDでヒトＰＴＫ７に結合し；
（ｂ）抗体はウィルムス腫瘍細胞株を結合する。
【０１７１】
改変抗体の機能特性は、当該技術分野で利用可能な標準アッセイ、および／または本明細書に記載した標準アッセイ、例えば実施例に示したもの（例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ）を用いて評価されうる。
【０１７２】
本発明の抗体の改変方法の特定の態様において、変異は、ランダムもしくは選択的に、全てもしくは一部の抗PTK7抗体コード配列を導入することができ、得られた修飾抗PTK7抗体は、結合活性および/または本明細書に記載の他の機能特性についてスクリーニングされ得る。変異方法は当分野で記載されている。例えば、ShortによるPCT公開WO 02/092780は、飽和変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー（synthetic ligation assembly）、またはその組み合わせを用いた、抗体変異の作出およびスクリーニング方法を記載する。別法として、Lazar et al.によるPCT公開WO 03/074679は、コンピューターによるスクリーニング方法を用いて抗体の生理化学的特性を最適化する方法を記載している。
【０１７３】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。該核酸は、ホールセルで、細胞溶解物で、または部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分もしくは他の夾雑物（例えば、他の細胞核酸もしくはタンパク質）から、標準的な技法（アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動およびその他当分野において周知のものが含まれる）によって精製されて、「単離される」か、または「実質的に純粋にされる」。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照。本発明の核酸は、例えば、DNAまたはRNAであることができ、イントロン配列を有しても有さなくてもよい。好ましい実施態様において、該核酸はcDNA分子である。
【０１７４】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ(例えば、さらに以下に記載の、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製したハイブリドーマ)により発現される抗体について、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするcDNAは、標準的なPCR増幅もしくはcDNAクローニング技法により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから得られる抗体(例えば、ファージディスプレイ技法を用いて)について、抗体をコードする核酸は該ライブラリから回収することができる。
【０１７５】
好ましい本発明の核酸分子は、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａまたは７Ｃ８モノクローナル抗体のＶHおよびＶL配列をコードするものである。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８のＶH配列をコードするＤＮＡ配列は、配列番号：４１（３Ｇ８および３Ｇ８ａ）、４２（４Ｄ５）、４３（１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ）並びに４４（７Ｃ８）に示される。３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８のＶL配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号：４５、４６、４７、４８、４９および５０に示される。
【０１７６】
VHおよびVLセグメントをコードするDNAフラグメントが得られたところで、これらのDNAフラグメントを標準的な組換えDNA技法によりさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を、全長抗体鎖遺伝子、Fabフラグメント遺伝子、またはscFv遺伝子に変換することができる。これらの操作において、VL-もしくはVH-コードDNAフラグメントは、別のタンパク質（例えば抗体定常領域または可動性リンカー）をコードする別のDNAフラグメントに作動可能に連結される。この文脈で用いられる用語「作動可能に連結した」とは、２つのDNAフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのDNAフラグメントが結合していることを意味するものと意図される。
【０１７７】
VH-コードDNAを、重鎖定常領域（CH1、CH2およびCH3）をコードする別のDNA分子に作動可能に連結することにより、VH領域をコードする単離されたDNAを全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で公知であり(例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域を包含するDNAフラグメントは標準PCR増幅により得ることができる。該重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgMまたはIgD定常領域であることができるが、最も好ましくはIgG1またはIgG4定常領域である。Fabフラグメント重鎖遺伝子について、該VH-コードDNAは、重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子に作動可能に連結することができる。
【０１７８】
VL-コードDNAを、軽鎖定常領域CLをコードする別のDNA分子に作動可能に連結することにより、VL領域をコードする単離されたDNAを全長軽鎖遺伝子(ならびにFab軽鎖遺伝子)に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で公知であり(例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照)、これらの領域を包含するDNAフラグメントは標準PCR増幅により得ることができる。該軽鎖定常領域はκまたはλ定常領域であり得るが、最も好ましいのはκ定常領域である。
【０１７９】
scFv遺伝子の作製のため、VH-およびVL-コードDNAフラグメントを、可動性リンカーをコードする別のフラグメント、例えばアミノ酸配列(Gly4-Ser)3をコードする別のフラグメントに作動可能に連結させることにより、VHおよびVL配列は、可動性リンカーにより結合されたVLおよびVH領域を有する、近接する１本鎖タンパク質として発現され得る(例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554を参照)。
【０１８０】
本発明のモノクローナル抗体の産生
本発明のモノクローナル抗体(mAb)は、様々な技法（従来のモノクローナル抗体方法、例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495の標準体細胞ハイブリダイゼーション法が含まれる）により製造することができる。体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいけれども、原理上はモノクローナル抗体を製造する他の技法、例えば、Bリンパ球のウイルス性形質転換もしくは癌化を用いることができる。
【０１８１】
ハイブリドーマの調製に好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの産生は極めて十分に確立された方法である。融合用の免疫化脾細胞を単離するための免疫化方法および技法が当分野において公知である。融合パートナー(例えば、マウスミエローマ細胞)および融合方法もまた公知である。
【０１８２】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のとおり調製されたマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製され得る。重鎖および軽鎖イムノグロブリンをコードするDNAは、目的のマウスハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学的技法を用いて、非-マウス(例えば、ヒト)免疫グロブリン配列を含むように改変され得る。例えば、キメラ抗体を作製するために、当分野で公知の方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域に連結することができる(例えば、Cabilly et al.の米国特許第4,816,567号を参照)。ヒト化抗体を作製するために、当分野で公知の方法を用いて、マウスCDR領域をヒトフレームワークに挿入することができる(例えば、Winterの米国特許第5,225,539号、ならびにQueen et al.の米国特許第5,530,101号; 第5,585,089号; 第5,693,762号および第6,180,370号を参照)。
【０１８３】
好ましい態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。PTK7に対するヒトモノクローナル抗体は、マウス免疫系よりむしろヒト免疫系の各部を保有するトランスジェニックもしくはトランス染色体（transchromosomic）マウスを用いて、得ることができる。これらのトランスジェニックおよびトランス染色体マウスには、本明細書において、各々、HuMAbマウスおよびKMマウス（登録商標）と称されるマウスが含まれ、本明細書においてはまとめて「ヒトIgマウス」と称する。
【０１８４】
HuMAbマウス（登録商標）(Medarex, Inc.)は、再配列していないヒト重鎖(μおよびγ)およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を、内在性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異とともに有する(例えば、Lonberg et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照)。従って、該マウスは、マウスIgMまたはκの発現低下を示し、免疫化に反応して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチおよび体細胞変異を経て高親和性ヒトIgGκモノクローナルを産生する(Lonberg, N. et al. (1994), 上記; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93、およびHarding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546に概説)。HuMAbマウスの作製および使用、ならびにそのようなマウスが保有するゲノム修飾は、Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; および、Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851にさらに記載されており、その全ての内容はその全般が引用により本明細書に具体的に援用される。さらに、Lonberg and Kayの米国特許第5,545,806号; 第5,569,825号; 第5,625,126号; 第5,633,425号; 第5,789,650号; 第5,877,397号; 第5,661,016号; 第5,814,318号; 第5,874,299号; および第5,770,429号; Surani et al.の米国特許第5,545,807号; Lonberg and KayのPCT公開番号WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884およびWO 99/45962; ならびにKorman et alのPCT公開番号WO 01/14424を参照。
【０１８５】
別の実施態様において、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子およびトランス染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス（例えば、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖トランス染色体を保有するマウス）を用いて産生することができる。そのようなマウスは本明細書において「KMマウス（登録商標）」と称され、Ishida et al.のPCT公開WO 02/43478に詳述されている。
【０１８６】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物系が当分野で利用可能であり、それを用いて本発明の抗PTK7抗体を産生させることができる。例えば、Xenomouse(Abgenix, Inc.)と称される別のトランスジェニック系を用いることができる; そのようなマウスは、例えば、Kucherlapati et al.の米国特許第5,939,598号; 第6,075,181号; 第6,114,598号; 第6,150,584号および第6,162,963号に記載されている。
【０１８７】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランス染色体動物系が当分野において利用可能であり、それを用いて本発明の抗PTK7抗体を産生させることができる。例えば、「TCマウス」と称される、ヒト重鎖トランス染色体およびヒト軽鎖トランス染色体の両方を保有するマウスを用いることができ; そのようなマウスはTomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランス染色体を保有するウシが、当分野(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894)に記載されており、それを用いて本発明の抗PTK7抗体を産生することができる。
【０１８８】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いて製造することができる。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、当該技術分野で確立されている。例えば: Ladner et al.の米国特許第5,223,409号; 第5,403,484号; および第5,571,698号; Dower et al.の米国特許第5,427,908号および第5,580,717号; McCafferty et al.の米国特許第5,969,108号および第6,172,197号;ならびにGriffiths et al.の米国特許第5,885,793号; 第6,521,404号; 第6,544,731号; 第6,555,313号; 第6,582,915号および第6,593,081号を参照。
【０１８９】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、免疫するとヒト抗体反応を生じることができるようにヒト免疫細胞を再構成したSCIDマウスを用いて製造することができる。そのようなマウスは、例えば、Wilson et al.の米国特許第5,476,996号および第5,698,767号に記載されている。
【０１９０】
別の態様において、Ｂｕｅｃｈｌｅｒらによる米国特許第６，７９４，１３２号に記載されているように、ヒト抗ＰＴＫ７抗体は、ヒトＩｇマウスおよびファージディスプレイ法の組合せを用いて製造される。より具体的には、該方法は、最初にマウスを一つ以上のＰＴＫ７抗原で免疫化することによって、ヒトＩｇマウス（例えば、上記のＨｕＭａｂマウスまたはＫＭマウス）における抗ＰＴＫ７抗体応答を上昇させることを必要とし、その後、マウスのリンパ細胞からヒト抗体鎖をコードする核酸を単離し、これらの核酸をディスプレイベクター（例えば、ファージ）の中に導入して、ディスプレイパッケージのライブラリを提供する。したがって、各ライブラリのメンバーはヒト抗体鎖をコードする核酸を含み、各抗体鎖はディスプレイパッケージから掲示される。次いでライブラリをＰＴＫ７タンパク質でスクリーニングして、ＰＴＫ７に特異的に結合するライブラリメンバーを単離する。次いで選択したライブラリメンバーの核酸挿入物を標準的な方法で単離および配列決定して、選択されたＰＴＫ７結合物(PTK7 binder)の軽鎖および重鎖可変配列を決定する。ＶH領域がＣH領域と動作可能に結び付き、ＶL領域がＣL領域と動作可能に結び付くように、標準組換えＤＮＡ法、例えばヒト重鎖および軽鎖定常領域を保有する発現ベクターへの可変領域のクローニングによって、可変領域を完全長抗体鎖に変換してもよい。
【０１９１】
ヒトIgマウスの免疫化
ヒトIgマウスを用いて本発明のヒト抗体を産生させる場合、Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; ならびにPCT公開 WO 98/24884およびWO 01/14424に記載のとおり、精製もしくは濃縮したPTK7抗原および/または組換えPTK7調製物か、またはPTK7融合タンパク質を用いて、このようなマウスを免疫化することができる。好ましくは、初回注入時に6-16週齢でありうる。例えば、精製もしくは組換えPTK7抗原調製物(5-50 μg)を用いて、ヒトIgマウスに、腹腔内に免疫することができる。
【０１９２】
PTK7への完全ヒトモノクローナル抗体を生成する詳細な手順は、以下の実施例１に記載されている。様々な抗原を用いた累積実験により、トランスジェニックマウスは、最初に完全フロイントアジュバント中の抗原を用いて腹腔内に(IP)免疫し、その後不完全フロイントアジュバント中の抗原を用いて隔週でIP免疫(計6まで)した場合に、応答することが示されている。しかしながら、フロイント以外のアジュバントもまた有効であることが分かっている。加えて、アジュバント非存在下のホールセルは高い免疫原性であることが分かっている。該免疫応答は、後眼窩採血によって得た血漿サンプルを用いる一連の免疫化プロトコールを通してモニターすることができる。血漿はELISA（下記）によりスクリーニングすることができ、十分な力価の抗PTK7ヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合に用いることができる。マウスは、屠殺および脾臓摘出の3日前に抗原を静脈内に追加免疫され得る。各免疫化に対して2-3融合が行われる必要がありうると予想される。典型的には、各抗原について6から24匹のマウスを免疫化する。通常はHCo7とHCo12系統の両方を用いる。さらに、HCo7とHCo12導入遺伝子の両方を一緒に、２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子(HCo7/HCo12)を有する単一のマウスに育種することができる。別法としてまたはさらに、実施例１に記載されるように、KMマウス（登録商標）系統を用いることができる。
【０１９３】
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫化マウスからの脾細胞および/またはリンパ節細胞を単離し、適当な不死化細胞株（例えばマウスミエローマ細胞株）に融合することができる。得られたハイブリドーマを抗原-特異的抗体の産生についてスクリーニングすることができる。例えば、免疫化マウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、P3X63-Ag8.653非分泌性マウスミエローマ細胞(ATCC, CRL 1580)の数の６分の１に、50％ PEGを用いて融合させることができる。別法として、免疫化マウスからの脾臓のリンパ球の単一細胞懸濁液を、CytoPulse大型チャンバー細胞融合エレクトロポレーター(CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland)を用いて、電界に基づく電気融合法により、融合することができる。細胞を、約2 x 105で、平底マイクロタイタープレートに蒔いた後、20％のfetal Clone血清、18％の“653”条件培地、5％のorigen(IGEN)、4 mMのL-グルタミン、1 mMのピルビン酸ナトリウム、5mMのHEPES、0.055 mMの2-メルカプトエタノール、50 単位/mlのペニシリン、50 mg/mlのストレプトマイシン、50 mg/mlのゲンタマイシンおよび1X HAT(Sigma; 該HATは融合の24時間後に添加する)を含有する選択培地中において、２週間培養した。約２週間後、細胞はHATがHTで置換されている培地中で培養され得る。その後、個々のウェルを、ヒトモノクローナルIgMおよびIgG抗体について、ELISAによりスクリーニングすることができる。大規模なハイブリドーマ増殖が生じた後、通常10-14日後に、培地が観察され得る。抗体分泌性ハイブリドーマを再播種し、再度スクリーニングし、ヒトIgGについて依然として陽性である場合、該モノクローナル抗体を少なくとも２回、限界希釈によりサブクローニングすることができる。次いで、キャラクタライズのため、安定なサブクローンをインビトロで培養して組織培地中に少量の抗体を産生させることができる。
【０１９４】
ヒトモノクローナル抗体の精製のため、選択したハイブリドーマはモノクローナル抗体精製用の２Lのスピナーフラスコ中で増殖され得る。上清を濾過して濃縮した後、プロテインA-セファロース(Pharmacia, Piscataway, N.J.)を用いたアフィニティークロマトグラフィで処理することができる。溶離されたIgGは、ゲル電気泳動法および高速液体クロマトグラフィによって検査することにより純度を確かめることができる。該緩衝液をPBSに交換し、1.43の吸光係数を用いてOD280により、濃度を決定することができる。該抗体は、アリコートにして-80℃で保存することができる。
【０１９５】
本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製 
本発明の抗体はまた、例えば、当該技術分野でよく知られているように、組換えDNA技法と遺伝子導入方法の組み合わせを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにおいても産生され得る(例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
【０１９６】
例えば、抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、部分または全長の軽鎖および重鎖をコードするDNAを、標準的な分子生物学の技法(例えば、目的の抗体を発現するハイブリドーマを用いたPCR増幅またはcDNAクローニング)により得ることができ、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、該DNAを発現ベクターに挿入してもよい。この文脈において、用語「作動可能に連結した」とは、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を制御するそれらの所望の機能に役立つように、抗体遺伝子がベクターに連結されていることを意味するものと意図される。該発現ベクターおよび発現制御配列は、用いる発現宿主細胞に適合するように選択される。該抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別個のベクターに挿入され得るか、または、より典型的には、両方の遺伝子は同一の発現ベクターに挿入される。該抗体遺伝子は、標準的な方法(例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または、制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション)によって、発現ベクターに挿入される。本明細書に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用いて、VHセグメントがベクター内のCHセグメントに作動可能に連結され、VKセグメントがベクター内のCLセグメントに作動可能に連結されるように、それらを目的のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域をすでにコードする発現ベクターに挿入することによって、いずれの抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子をも作製することができる。さらにまたは別法として、該組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。該抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。該シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド(すなわち、非-免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド)であり得る。
【０１９７】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を保有する。用語「制御配列」は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子(例えば、ポリアルデニル化シグナル)を含むことを意図する。そのような制御配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))に記載されている。発現ベクターの設計（制御配列の選択を含む）は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの要素に依存しうることが、当業者には理解されるであろう。哺乳動物の宿主細胞発現の好ましい制御配列には、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス性要素、例えばサイトメガロウイルス(CMV)、サルウイルス40(SV40)、アデノウイルス由来のプロモーターおよび/またはエンハンサー (例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター(AdMLP)）ならびにポリオーマが含まれる。別法として、非ウイルス性制御配列、例えばユビキチンプロモーターまたはβ-グロビンプロモーター、を用いてもよい。さらに、制御要素は異なる源（例えばSRαプロモーター系）由来の配列から成り、それはSV40初期プロモーターおよびヒトT細胞白血病ウイルス１型の末端反復配列からの配列を含む(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472)。
【０１９８】
本発明の組換え発現ベクターは、抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、さらなる配列、例えば宿主細胞においてベクターの複製を制御する配列(例えば、複製開始点)、および選択マーカー遺伝子を保有し得る。該選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する(例えば、米国特許第4,399,216号、第4,634,665号および第5,179,017号（全てAxel et al.による）を参照)。例えば典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に、薬剤（例えばG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート）に対する耐性を与える。好ましい選択マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子(メトトレキサート選択/増幅によるdhfr- 宿主細胞における使用のため)およびネオ遺伝子(G418選択のため)が含まれる。
【０１９９】
軽鎖および重鎖の発現のため、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、標準的な技法によって宿主細胞にトランスフェクトする。様々な形態の用語「トランスフェクション」は、原核もしくは真核宿主細胞への外因性DNAの導入に共通して用いられる様々な技法（例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクションなど）を包含することを意図する。原核もしくは真核宿主細胞のいずれかにおいて本発明の抗体を発現させることは論理的には可能であるけれども、真核細胞（とりわけ哺乳動物細胞）は、正確に折りたたまれており免疫学的に活性な抗体の構築および分泌する可能性が高いので、真核細胞（最も好ましくは哺乳動物宿主細胞）における抗体の発現が最も好ましい。抗体遺伝子の原核生物での発現は活性抗体の高収率の産生に効果がないことが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13)。
【０２００】
本発明の組換え抗体の発現のための好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(DHFR選択マーカー、例えばR. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621に記載のものと共に用いる、Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載のdhfr- CHO細胞が含まれる)、NSOミエローマ細胞、COS細胞およびSP2細胞が挙げられる。特に、NSOミエローマ細胞とともに用いる場合、別の好ましい発現系はWO 87/04462、WO 89/01036およびEP 338,841に開示されたGS遺伝子発現系である。抗体遺伝子を発現する組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、該抗体は、宿主細胞中で抗体が発現されるのに十分な時間、より好ましくは宿主細胞が増殖している培地へ抗体が分泌されるのに十分な時間、培養することによって産生される。標準的なタンパク質精製方法を用いて、培地から抗体を回収することができる。
【０２０１】
抗原に結合する抗体のキャラクタライズ
例えば、標準的なELISAにより、PTK7への結合について本発明の抗体を試験することができる。手短に説明すると、マイクロタイタープレートを、PBS中に0.25μg/mlの精製PTK7を用いてコーティングし、次いで、5％ウシ血清アルブミン／PBSでブロッキングする。抗体の希釈物(例えば、PTK7免疫化マウス由来の血漿の希釈物)を各ウェルに添加し、1-2時間、37℃でインキュベートする。該プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、アルカリホスファターゼに結合した二次試薬(例えば、ヒト抗体に対しては、ヤギ-抗-ヒトIgG Fc-特異的ポリクローナル試薬)とともに、37℃で1時間インキュベートする。洗浄後、該プレートをpNPP基質(1 mg/ml)で発色させ、OD 405-650で分析する。好ましくは、最も高い力価を産生するマウスが融合に用いられ得る。
【０２０２】
上記のELISAアッセイを用いて、PTK7免疫原と陽性の反応性を示すハイブリドーマについてスクリーニングすることもできる。高い結合活性でPTK7に結合するハイブリドーマをサブクローニングしてさらにキャラクタライズする。親細胞の反応性を保持する(ELISAによる)各ハイブリドーマから１クローンを、-140 ℃で保存される5-10の細胞バンクの作製、および抗体精製のために選択することができる。
【０２０３】
抗PTK7抗体の精製のため、選択されたハイブリドーマはモノクローナル抗体精製用の２Lのスピナーフラスコ中で増殖され得る。上清を濾過して濃縮した後、プロテインA-セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィで処理することができる(Pharmacia, Piscataway, NJ)。溶離されたIgGは、ゲル電気泳動法および高速液体クロマトグラフィによって検査することにより、純度を確かめることができる。該緩衝液をPBSに交換し、吸光係数1.43を用いてOD280により、濃度を決定することができる。モノクローナル抗体は、アリコートにして、-80 ℃で保存することができる。
【０２０４】
選択された抗PTK7モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかどうかを決定するため、市販の試薬を用いて各抗体をビオチン化することができる(Pierce, Rockford, IL)。上記のPTK7コート-ELISAプレートを用いて、未標識のモノクローナル抗体とビオチン化モノクローナル抗体を用いた競合試験を実施することができる。ビオチン化mAbの結合は、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼプローブを用いて検出することができる。
【０２０５】
特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を用いてアイソタイプELISAを実施し、精製抗体のアイソタイプを決定することができる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、1 μg/mlの抗-ヒト免疫グロブリンを用いて4 ℃で終夜、マイクロタイタープレートのウェルをコーティングすることができる。1％ BSAでブロッキングした後、周囲温度で１から２時間、該プレートを1 μg /ml以下の試験モノクローナル抗体または精製アイソタイプコントロールと反応させる。その後、該ウェルをヒトIgG1またはヒトIgM-特異的アルカリホスファターゼ-結合プローブのいずれかと反応させることができる。プレートを上記の通り発色させて分析する。
【０２０６】
抗PTK7ヒトIgGを、ウエスタンブロットにより、PTK7抗原との反応性についてさらに試験することができる。手短に説明すると、PTK7を調製してドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法に付してもよい。電気泳動法の後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、10％ウシ胎仔血清でブロッキングし、試験するモノクローナル抗体でプローブする。ヒトIgGの結合は、抗-ヒトIgGアルカリホスファターゼを用いて検出し、BCIP/NBT基質錠剤を用いて発色させることができる(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.)。
【０２０７】
二重特異性分子
別の態様において、本発明は、本発明の抗PTK7抗体またはそのフラグメントを含む二重特異性分子の特徴を有する。本発明の抗体またはその抗原結合部分を誘導体化するか、または別の機能分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質(例えば、別の抗体もしくは受容体に対するリガンド)に連結して、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を作製することができる。実際のところ本発明の抗体を誘導体化するかまたは２つ以上の他の機能分子に連結させて、３つ以上の異なる結合部位および/または標的分子に結合する多重特異的分子を作製してもよく; そのような多重特異的分子はまた、本明細書で用いられる用語「二重特異性分子」によって包含されると意図される。本発明の二重特異性分子を作出するために、本発明の抗体を、１つ以上の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドもしくは結合模倣体に、二重特異性分子が得られるように機能的に連結させる(例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合もしくはその他により)ことができる。
【０２０８】
したがって、本発明には、少なくとも１つのPTK7に対する第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子が含まれる。本発明の特定の態様において、第２の標的エピトープは、Fc受容体（例えば、ヒトFcγRI(CD64)またはヒトFcα受容体(CD89)）である。そのため、本発明には、FcγRもしくはFcαR発現エフェクター細胞(例えば、単球、マクロファージまたは多形核細胞(PMN))およびPTK7を発現する標的細胞の両方に結合することができる二重特異性分子が含まれる。これらの二重特異性分子は、エフェクター細胞に対するPTK7発現細胞を標的とし、Fc受容体-媒介エフェクター細胞活性（例えば、PTK7発現細胞の食作用、抗体依存性細胞-媒介細胞傷害性(ADCC)、サイトカイン放出、またはスーパーオキシドアニオンの生成）を誘発する。
【０２０９】
二重特異性分子が多重特異的である本発明の態様において、該分子は、抗Fc結合特異性および抗PTK7結合特異性に加えて、第３の結合特異性をさらに含むことができる。一実施態様において、該第３の結合特異性は、抗増強因子（enhancement factor）(EF)部分、例えば、細胞傷害活性に関与する表面タンパク質に結合することによって標的細胞に対する免疫応答を増大させる分子である。該「抗増強因子部分」は、所定の分子（例えば、抗原または受容体）に結合してそれによりFc受容体または標的細胞抗原に対する結合決定因子の効力を高める、抗体、機能的抗体フラグメントまたはリガンドであり得る。「抗増強因子部分」は、Fc受容体または標的細胞抗原に結合することができる。あるいは、抗増強因子部分は、第１および第２の結合特異性が結合するものとは異なるものに結合することができる。例えば、該抗増強因子部分は、細胞傷害性T-細胞(例えば、標的細胞に対する免疫応答を増大させるCD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1または他の免疫細胞を介して)を結合することができる。
【０２１０】
一実施態様において、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１つの抗体またはその抗体フラグメント（例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、または単鎖Fvが含まれる）を含有する。該抗体はまた、軽鎖もしくは重鎖二量体、またはそのいずれの最小フラグメント（例えば、Ladner et al. 米国特許第4,946,778号（その内容は引用により明示的に援用される）に記載のFvもしくは単鎖コンストラクト）であってもよい。
【０２１１】
一実施態様において、Fcγ受容体についての結合特異性はモノクローナル抗体により得られ、その結合はヒト免疫グロブリンG(IgG)によって遮断されない。本明細書で用いる用語「IgG受容体」とは、染色体1上に位置する８つのγ-鎖遺伝子のうちのいずれかを言う。これらの遺伝子は、３つのFcγ受容体クラス: FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、およびFcγRIII(CD16)にグループ化される、計１２の膜貫通または可溶性受容体アイソフォームをコードする。１つの好ましい実施態様において、該Fcγ受容体はヒト高親和性FcγRIである。該ヒトFcγRIは72 kDaの分子であり、単量体IgGに対する高親和性を示す(108 - 109 M-1)。
【０２１２】
特定の好ましい抗Fcγモノクローナル抗体の産生および評価は、PCT公開WO 88/00052および米国特許第4,954,617号においてFangerらによって記載されており、その記載は本明細書に十分に引用される。これらの抗体は、受容体のFcγ結合部位とは異なる部位で、FcγRI、FcγRIIまたはFcγRIIIのエピトープに結合し、それ故に、それらの結合は生理学的濃度のIgGにより実質的には遮断されない。本発明において有用な具体的な抗FcγRI抗体は、mAb22、mAb32、mAb44、mAb62およびmAb197である。mAb32を産生するハイブリドーマは、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手可能で、ATCC寄託番号 HB9469である。他の実施態様において、該抗Fcγ受容体抗体はモノクローナル抗体22(H22)のヒト化形態である。H22抗体の産生および評価は、Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002およびPCT公開WO 94/10332に記載されている。H22抗体産生細胞株はHA022CL1の称号の下でアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関に寄託されており、寄託番号 CRL 11177を有する。
【０２１３】
さらに他の好ましい実施態様において、Fc受容体に対する結合特異性は、ヒトIgA受容体、例えば、Fc-α受容体(FcαRI (CD89))に結合する抗体により得られ、その結合は好ましくはヒト免疫グロブリンA(IgA)によって遮断されない。用語「IgA受容体」は、染色体19上に位置する１つのα-遺伝子(FcαRI)の遺伝子産物を含むことを意図する。この遺伝子は、55から110 kDaのいくつかの、選択的スプライスによる（alternatively spliced）膜貫通アイソフォームをコードすると知られている。FcαRI(CD89)は、非-エフェクター細胞集団上では発現されないが、単球/マクロファージ、好酸性および好中性の顆粒球上では恒常的に発現される。FcαRIは、IgA1とIgA2の両方に対して中程度の親和性(≒5 × 107 M-1)を有し、それはサイトカイン（例えばG-CSFまたはGM-CSF）に曝露すると増大される (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440)。IgAリガンド結合ドメインの外部のFcαRIを結合する、A3、A59、A62およびA77として同定された４つのFcαRI-特異的モノクローナル抗体が記載されている(Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764)。
【０２１４】
FcαRIおよびFcγRIは、(1)主に、免疫エフェクター細胞、例えば、単球、PMN、マクロファージおよび樹状細胞上で発現され; (2)高レベル(例えば、5,000-100,000／細胞)で発現され; (3)細胞傷害活性(例えば、ADCC、食作用)のメディエーターであり; (4)それらを標的とする抗原（自己抗原を含む）の抗原提示の増強を媒介することから、本発明の二重特異性分子において用いるために好ましい誘発受容体（trigger receptor）である。
【０２１５】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、一方で、他の抗体を本発明の二重特異性分子において用いることができ、それは、マウスの、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
【０２１６】
当分野で公知の方法を用いて、構成成分の結合特異性（例えば、抗FcRおよび抗PTK7結合特異性）を結合させることにより、本発明の二重特異性分子を調製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を別々に得た後で、それらを互いに結合させることができる。該結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリング剤または架橋結合剤を共有結合に用いることができる。架橋結合剤の例としては、プロテインA、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、o-フェニレンジマレイミド(oPDM)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、およびスルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル) シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sulfo-SMCC)が挙げられる(例えば、Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照)。他の方法としては、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83、およびGlennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375に記載のものが挙げられる。好ましい結合剤（conjugating agent）はSATAおよびsulfo-SMCCであり、両方ともPierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手できる。
【０２１７】
該結合特異性が抗体である場合、２つの重鎖のC末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して、それらを結合させることができる。とりわけ好ましい実施態様において、該ヒンジ領域は、奇数の数のスルフヒドリル残基（好ましくは１つ）を含むように修飾され、その後、結合される。
【０２１８】
別法として、両方の結合特異性を、同一のベクター中でコードし、同一の宿主細胞中で発現および構築することができる。この方法は、二重特異性分子がmAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2、またはリガンド x Fab 融合タンパク質である場合においてとりわけ有用である。本発明の二重特異性分子は、１つの単鎖抗体および結合決定因子を含有する単鎖分子、または２つの結合決定因子を含有する単鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は少なくとも２つの単鎖分子を含有してよい。二重特異性分子の調製方法は、例えば、米国特許第5,260,203号; 米国特許第5,455,030号; 米国特許第4,881,175号; 米国特許第5,132,405号; 米国特許第5,091,513号; 米国特許第5,476,786号; 米国特許第5,013,653号; 米国特許第5,258,498号; および米国特許第5,482,858号に記載されている。
【０２１９】
二重特異性分子の特異的な標的に対するその結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、FACS分析、バイオアッセイ(例えば、増殖阻害)、またはウエスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらのアッセイの各々は通常、目的の複合体に対して特異的な標識試薬(例えば、抗体)を用いることによって、特定の目的のタンパク質-抗体複合体の存在を検出する。例えばFcR-抗体複合体は、例えば、抗体-FcR複合体を認識して特異的に結合する酵素-結合抗体もしくは抗体フラグメントを用いて、検出され得る。別法として、様々な他のイムノアッセイのいずれかを用いて該複合体を検出することができる。例えば、該抗体を放射活性物質で標識し、ラジオイムノアッセイ(RIA)に用いることができる(例えば、参照により本明細書に援用されるWeintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照)。該放射性同位元素は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用といった方法、またはオートラジオグラフィーにより検出され得る。
【０２２０】
複合体
本発明の複合体において、パートナー分子は、化学リンカー(本明細書ではしばしば単に「リンカー」と言う)によって抗体に結合している。該パートナー分子は、治療薬またはマーカーであり得る。該治療薬は、例えば、細胞毒素、非細胞傷害性薬物(例えば、免疫抑制剤)、放射性薬剤、別の抗体、または酵素であり得る。好ましくは、該パートナー分子は細胞毒素である。該マーカーは、検出可能なシグナルを生じるいずれの標識（例えば、放射性標識、蛍光標識、または基質への検出可能な修飾を触媒する酵素）であり得る。該抗体はターゲティング機能を果たす: その抗原が認められる標的組織または細胞に結合することにより、該抗体は該複合体を標的組織または細胞に誘導する。そこで、該リンカーが切断され、パートナー分子が放出され、その目的の生物学的機能を果たす。
【０２２１】
抗体に結合されたパートナー分子の比は、結合反応の間に用いるパートナー分子の量などの因子および実験条件に応じて、変化させることができる。好ましくは、抗体に対するパートナー分子の比は、1〜3、より好ましくは1〜1.5である。抗体Zの個々の分子は整数の数のパートナー分子に結合されるけれども、複合体の調製物はパートナー分子対抗体の整数でない比（統計的平均を示す）について分析され得ることを、当業者であれば理解するであろう。
【０２２２】
リンカー
いくつかの態様において、リンカーは、（Ｌ4）p−Ｆ−（Ｌ1）mとして本明細書に描写されるペプチジルリンカーである。他のリンカーには、それぞれ、（Ｌ4）p−Ｈ−（Ｌ1）mおよび（Ｌ4）p−Ｊ−（Ｌ1）mとして本明細書に描写されるヒドラジンおよびジスルフィドリンカーが含まれる。Ｆ、Ｈ、およびＪは、それぞれ、ペプチジル、ヒドラジン、およびジスルフィド基であり、それらは抗体からパートナー分子を放出するために開裂可能であるが、一方、Ｌ1およびＬ4はリンカー基である。Ｆ、Ｈ、Ｊ、Ｌ1、およびＬ4は、下付き文字ｐおよびｍとともに、下記でより十分に定義される。これらおよび他のリンカーの製造および使用は、ＷＯ ２００５／１１２９１９に記載されており、その開示は本明細書に引用される。
【０２２３】
抗体−パートナー複合体におけるペプチジルおよび他のリンカーの使用は、ＵＳ ２００６／０００４０８１；２００６／００２４３１７；２００６／０２４７２９５；６，９８９，４５２；７，０８７，６００；および７，１２９，２６１；ＷＯ ２００７／０５１０８１；２００７／０３８６５８；２００７／０５９４０４；および２００７／０８９１００に記載されており；そのすべては本明細書に引用される。
【０２２４】
別のリンカーは、ＵＳ ６，２１４，３４５；２００３／００９６７４３；および２００３／０１３０１８９；de Groot et al., J. Med. Chem. 42, 5277 (1999)；de Groot et al. J. Org. Chem. 43, 3093 (2000)；de Groot et al., J. Med. Chem. 66, 8815, (2001)；ＷＯ ０２／０８３１８０；Carl et al., J. Med. Chem. Lett. 24, 479, (1981)；Dubowchik et al., Bioorg & Med. Chem. Lett. 8, 3347 (1998)に記載されており、その開示は本明細書に引用される。
【０２２５】
抗体およびパートナー分子の連結に加えて、リンカーは、パートナー分子に安定性を与え、そのインビボ毒性を減少させ、またはその薬物動態、バイオアベイラビリティおよび／または薬力学に有利に影響を及ぼしうる。いったん複合体がその作用部位に送達されると、リンカーが開裂し、パートナー分子を放出するのが一般に好ましい。また、いったん開裂されるとリンカーの存在の跡が残らないように、リンカーは痕跡がないのが好ましい。
【０２２６】
別の態様において、リンカーは、標的細胞内の部位またはその近くの部位で、例えば治療作用部位またはパートナー分子のマーカー活性部位で開裂される能力を特徴とする。このような開裂は、本質的には酵素的でありうる。この特徴は、パートナー分子の全身活性を減少させ、毒性および全身性副作用を減少させるのに役立つ。酵素的開裂に好ましい開裂可能な化学基には、ペプチド結合、エステル結合、およびジスルフィド結合、例えば上述のＦ、Ｈ、およびＪ基が含まれる。他の態様において、リンカーはｐＨに感受性があり、ｐＨにおける変化を通して開裂される。
【０２２７】
重要な態様は、リンカーが開裂するスピードを調節する能力である。多くの場合、すばやく開裂するリンカーが望ましい。しかしながら、いくつかの態様において、よりゆっくりと開裂するリンカーが好ましい。例えば、徐放性製剤において、またはすばやく放出する成分およびゆっくり放出する成分を有する製剤において、よりゆっくりと開裂するリンカーを提供することは有用でありうる。上記で引用したＷＯ ２００５／１１２９１９は、非常に速いものから非常に遅いものまでのスピードの範囲で開裂するように設計されうるヒドラジンリンカーを開示する。
【０２２８】
リンカーはまた、標的組織または細胞に達する前に、複合体が循環している間の分解に対してパートナー分子を安定化するのにも役立ちうる。パートナー分子の循環半減期を延長するので、これは大きな利益である。複合体が循環している間は比較的穏和であるが、目的の作用部位で活性化した後は、パートナー分子が目的の効果−例えば細胞傷害性を有するように、リンカーはまた、パートナー分子の活性を減弱するのにも役立つ。治療剤複合体について、リンカーのこの特徴は、薬剤の治療係数を改善するのに役立つ。
【０２２９】
それぞれ開裂可能なペプチド、ヒドラジン、またはジスルフィド基である、Ｆ、Ｈ、またはＪに加えて、場合により、一つ以上のリンカー基Ｌ1が、パートナー分子とＦ、Ｈ、またはＪとの間で適宜導入されてもよい。これらのリンカー基Ｌ1はまた、スペーサー基としても記載され、少なくとも２つの官能基を含みうる。下付き文字ｍの値（すなわち、存在しているＬ1基の数）および特定のＬ1基の位置に応じて、Ｌ1基の化学官能基は、パートナー分子の化学官能基、Ｆ、ＨもしくはＪの化学官能基（場合により）、または別のリンカー基Ｌ1の化学官能基（一つより多くのＬ1が存在している場合）に結合しうる。スペーサー基Ｌ1に適した化学官能基の例には、ヒドロキシ、メルカプト、カルボニル、カルボキシ、アミノ、ケトン、アルデヒド、およびメルカプト基が含まれる。
【０２３０】
リンカーＬ1は、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換ヘテロアリール、または置換もしくは無置換ヘテロアルキル基でありうる。一つの態様において、アルキルもしくはアリール基は、１〜２０個の炭素原子を含みうる。これらはまた、ポリエチレングリコール基も含みうる。
【０２３１】
Ｌ1基の例には、例えば、６−アミノヘキサノール、６−メルカプトヘキサノール、１０−ヒドロキシデカン酸、グリシンおよび他のアミノ酸類、１，６−ヘキサンジオール、β−アラニン、２−アミノエタノール、システアミン（２−アミノエタンチオール）、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、３−マレイミド安息香酸、フタリド、α−置換フタリド類、カルボニル基、アミナールエステル類、核酸類、ペプチド類などが含まれる。
【０２３２】
Ｌ1基の一つの機能は、パートナー分子がＦ、Ｈ、またはＪでの開裂の化学を妨害（例えば、立体的または電子的効果によって）しないように、Ｆ、ＨまたはＪ（場合により）とパートナー分子の間の空間的隔離を提供することである。Ｌ1基はまた、複合体に追加の分子量および化学官能基を導入するのにも役立ちうる。一般に、追加の質量および官能基は、複合体の血清半減期および他の特性に影響を及ぼす。したがって、スペーサー基の注意深い選択を通して、様々な血清半減期を有する複合体が製造されうる。適宜、一つ以上のリンカーＬ1は、下記のように、自壊的(self-immolative)化学基であってもよい。
【０２３３】
下付き文字ｍは、０、１、２、３、４、５、および６から選択される整数である。複数のＬ1基が存在する場合、これらは同じかまたは異なっていてもよい。
Ｆ、Ｈ、またはＪが抗体による抗原結合を妨害しないように、または抗体がＦ、Ｈ、またはＪでの開裂の化学を妨害しないように、Ｌ4は、Ｆ、Ｈ、またはＪ（場合により）と抗体の間の空間的隔離を提供するリンカー基である。好ましくは、Ｌ4は、該化学基を含むリンカーか、または複合体の加水分解速度を変更するリンカーを利用して、複合体に増加した溶解度または減少した凝集特性を与える。Ｌ1の場合のように、Ｌ4は適宜、自壊的化学基であってもよい。一つの態様において、Ｌ4は、置換アルキル、無置換アルキル、置換アリール、無置換アリール、置換ヘテロアルキル、または無置換ヘテロアルキルであり、そのいずれも直鎖、分枝鎖、または環状であってもよい。置換は、例えば、低級（Ｃ1−Ｃ6）アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノでありうる。ある態様において、Ｌ4は非環状基を含む。別の態様において、Ｌ4は、正もしくは負に荷電したアミノ酸ポリマー、例えばポリリジンまたはポリアルギニンを含む。Ｌ4は、ポリエチレングリコール基のようなポリマーを含みうる。また、Ｌ4は、例えば、ポリマー成分および小分子成分を含みうる。
【０２３４】
好ましい態様において、Ｌ4はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基を含む。Ｌ4のＰＥＧ部分は、１〜５０単位の長さでありうる。好ましくは、ＰＥＧは、１〜１２個の反復単位、より好ましくは３〜１２個の反復単位、より好ましくは２〜６個の反復単位、もしくはさらにより好ましくは３〜５個の反復単位および最も好ましくは４個の反復単位を有する。Ｌ4はＰＥＧ基のみからなるか、または追加の置換もしくは無置換アルキルもしくはヘテロアルキルを含んでいてもよい。Ｌ4基の一部としてＰＥＧを混合して、複合体の水溶解度を増強することは有用である。また、ＰＥＧ基は、薬物の抗体への結合の間に起こりうる凝集度を減少させる。
【０２３５】
下付き文字ｐは、０または１であり；すなわち、Ｌ4の存在は任意である。存在する場合、Ｌ4は少なくとも２つの官能基を有しており、一方の官能基はＦ、Ｈ、またはＪにおける化学官能基に結合し（場合により）、他方の官能基は抗体に結合する。Ｌ4基の適当な化学官能基の例には、ヒドロキシ、メルカプト、カルボニル、カルボキシ、アミノ、ケトン、アルデヒド、およびメルカプト基が含まれる。抗体は、典型的には、スルフヒドリル基（例えば、酸化されていないシステイン残基、イミノチオランを用いたリジン残基へのスルフヒドリル含有伸長の付加、またはジスルフィド架橋の還元由来）、アミノ基（例えば、リジン残基由来）、アルデヒド基（例えば、グリコシド側鎖の酸化由来）、またはヒドロキシル基（例えば、セリン残基由来）によって結合するので、抗体への結合に好ましい化学官能基は、前述の化学基と反応するもの、例えば、マレイミド、スルフヒドリル、アルデヒド、ヒドラジン、セミカルバジド、およびカルボキシル基である。
抗体におけるスルフヒドリル基とＬ4におけるマレイミド基の組合せが好ましい。
【０２３６】
いくつかの態様において、Ｌ4は、（ＡＡ1）cのＮ末端に直結した
【化２】
2011505146.tif 000004
を含む。Ｒ20は、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。Ｒ25、Ｒ25'、Ｒ26、およびＲ26'は各々独立して、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換ヘテロアリール、および置換もしくは無置換ヘテロシクロアルキルから選択され；並びにｓおよびｔは独立して、１〜６の整数である。好ましくは、Ｒ20、Ｒ25、Ｒ25'、Ｒ26およびＲ26'は疎水性である。いくつかの態様において、Ｒ20は、Ｈまたはアルキル（好ましくは、無置換低級アルキル）である。いくつかの態様において、Ｒ25、Ｒ25'、Ｒ26およびＲ26'は独立して、Ｈまたはアルキル（好ましくは、無置換Ｃ1〜Ｃ4アルキル）である。いくつかの態様において、Ｒ25、Ｒ25'、Ｒ26およびＲ26'は、すべてＨである。いくつかの態様において、ｔは１であり、ｓは１または２である。
【０２３７】
ペプチドリンカー（Ｆ）
上記で議論したように、本発明のペプチジルリンカーは、一般式：（Ｌ4）p−Ｆ−（Ｌ1）m（式中、Ｆはペプチジル基を含む部分を表す）によって表されうる。一つの態様において、Ｆ部分は、任意の追加の自壊的リンカーＬ2およびカルボニル基を含み、式（ａ）：
【化３】
2011505146.tif 000005
の複合体に対応する。この態様において、Ｌ1、Ｌ4、ｐ、およびｍは、上記と同義である。Ｘ4は抗体であり、Ｄはパートナー分子である。下付き文字ｏは、０または１であり、Ｌ2（存在している場合）は、自壊的リンカーを表す。ＡＡ1は、一つ以上の天然アミノ酸、および／または非天然α−アミノ酸を表し；ｃは、１〜２０の整数である。いくつかの態様において、ｃは２〜５の範囲にあるか、またはｃは２もしくは３である。
【０２３８】
式（ａ）において、ＡＡ1は、そのアミノ末端で、Ｌ4に直結するか、またはＬ4が不存在の場合は、Ｘ4に直結する。いくつかの態様において、Ｌ4が存在している場合、Ｌ4は、（ＡＡ1）cのＮ末端に直結したカルボン酸アシル基を含まない。
別の態様において、Ｆ部分はアミノ基および任意のスペーサー基Ｌ3を含み、Ｌ1は不存在であり（すなわち、ｍは０である）、式（ｂ）：
【化４】
2011505146.tif 000006
の複合体に対応する。
【０２３９】
この態様において、Ｘ4、Ｄ、Ｌ4、ＡＡ1、ｃ、およびｐは、上記と同義である。下付き文字ｏは、０または１である。Ｌ3（存在している場合）は、一級もしくは二級アミンまたはカルボキシル官能基を含むスペーサー基であり、Ｌ3のアミンは、Ｄのペンダントカルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはＬ3のカルボキシルは、Ｄのペンダントアミン官能基とアミド結合を形成する。
【０２４０】
自壊的リンカー
自壊的リンカーは、間隔を空けた２つの化学基とともに、通常は安定したトリパーテート(tripartate)分子へと共有結合することができる二官能性化学基であり、前記の間隔を空けた化学基のうちの一つを、酵素的開裂によってトリパーテート分子から放出し；前記酵素的開裂の後、分子の残りから自発的に開裂して、前記の間隔を空けた化学基の他方を放出する。本発明に従って、自壊的スペーサーは、その末端の一方でペプチド基に共有結合し、その他方の末端で、薬物成分（その誘導体化が薬理活性を阻害する）の化学反応部位に共有結合して、ペプチド基および薬物成分とともに、トリパーテート分子（これは、標的酵素の不存在下で安定かつ薬理学的に不活性であるが、スペーサー基およびペプチド基を共有結合する結合上で、このような標的酵素によって酵素的に開裂され、それによってトリパーテート分子からのペプチド基の放出を行いうる）へと間隔を空けて共有結合する。このような酵素的開裂は、同様に、スペーサー基の自壊的特徴を活性化し、スペーサー基を薬物成分に共有結合する結合の自発的な開裂を開始し、それによって薬理活性型の薬物の放出を行う。例えば、Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981)；Carl et al., WO 81/01145 (1981)；Toki et al., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002)；Boyd et al., ＷＯ ２００５／１１２９１９；およびBoyd et al., ＷＯ ２００７／０３８６５８（その開示は本明細書に引用される）を参照。
【０２４１】
一つの特に好ましい自壊的スペーサーは、式（ｃ）：
【化５】
2011505146.tif 000007
によって表されうる。
アミノベンジル基の芳香環は、一つ以上の「Ｋ」基で置換されうる。「Ｋ」基は、環構造の一部である４つの無置換炭素のうちの一つに結合した水素をそれ以外のものに置き換える芳香環上の置換基である。「Ｋ」基は、単一原子、例えばハロゲンであってもよく、または多原子基、例えば、アルキル、ヘテロアルキル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、およびシアノであってもよい。各Ｋは独立して、置換アルキル、無置換アルキル、置換ヘテロアルキル、無置換ヘテロアルキル、置換アリール、無置換アリール、置換ヘテロアリール、無置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、無置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ2、ＮＲ21Ｒ22、ＮＲ21ＣＯＲ22、ＯＣＯＮＲ21Ｒ22、ＯＣＯＲ21、およびＯＲ21からなる群から選択され、その中で、Ｒ21およびＲ22は独立して、Ｈ、置換アルキル、無置換アルキル、置換ヘテロアルキル、無置換ヘテロアルキル、置換アリール、無置換アリール、置換ヘテロアリール、無置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキルおよび無置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。Ｋ置換基の例には、これらに限らないが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ2、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＮＨＣＯＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2、ＮＨＣＯＣＦ3およびメチルが含まれる。「Ｋi」について、ｉは、０、１、２、３、または４の整数である。一つの好ましい態様において、ｉは０である。
【０２４２】
上記の構造のエーテル酸素原子は、カルボニル基に結合している（示されていない）。ＮＲ24官能基から芳香環への線は、該環を形成しかつ−ＣＨ2−Ｏ−基によって置換されていないいずれの５つの炭素にも、アミン官能基が結合しうることを示す。好ましくは、ＸのＮＲ24官能基は、−ＣＨ2−Ｏ−基に対してパラ位で芳香環に共有結合する。Ｒ24は、Ｈ、置換アルキル、無置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および無置換ヘテロアルキルからなる群から選択されるメンバーである。特定の態様において、Ｒ24は水素である。
【０２４３】
一つの態様において、本発明は、上記の式（ａ）のペプチドリンカーを提供し、その中で、Ｆは、構造：
【化６】
2011505146.tif 000008
［式中、Ｒ24、ＡＡ1、Ｋ、ｉ、およびｃは、上記と同義である］
を含む。
【０２４４】
別の態様において、上記の式（ａ）のペプチドリンカーは、構造：
【化７】
2011505146.tif 000009
［式中、Ｒ24、ＡＡ1、Ｋ、ｉ、およびｃは、上記と同義である］
を含む−Ｆ−（Ｌ1）m−を含む。
【０２４５】
いくつかの態様において、自壊的スペーサーＬ1またはＬ2には、
【化８】
2011505146.tif 000010
［式中、
Ｒ17、Ｒ18、およびＲ19は各々独立して、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは無置換アリールから選択され、
ｗは、０〜４の整数である］
が含まれる。いくつかの態様において、Ｒ17およびＲ18は独立して、Ｈまたはアルキル（好ましくは、無置換Ｃ1−Ｃ4アルキル）である。好ましくは、Ｒ17およびＲ18はＣ1-4アルキル、例えばメチルまたはエチルである。いくつかの態様において、ｗは０である。この特定の自壊的スペーサーは、比較的迅速に環化することが経験的に分かっている。
【０２４６】
いくつかの態様において、Ｌ1またはＬ2には、
【化９】
2011505146.tif 000011
［式中、Ｒ17、Ｒ18、Ｒ19、Ｒ24、およびＫは、上記と同義である］
が含まれる。
【０２４７】
スペーサー基
スペーサー基Ｌ3は、一級もしくは二級アミンまたはカルボキシル官能基を含むことを特徴とし、Ｌ3のアミンは、Ｄのペンダントカルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはＬ3のカルボキシルは、Ｄのペンダントアミン官能基とアミド結合を形成する。Ｌ3は、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換ヘテロアリール、または置換もしくは無置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択されうる。好ましい態様において、Ｌ3には芳香族基が含まれる。より好ましくは、Ｌ3には、安息香酸基、アニリン基またはインドール基が含まれる。−Ｌ3−ＮＨ−スペーサーとして役立ちうる構造の例には、これらに限らないが、以下の構造：
【化１０】
2011505146.tif 000012
［式中、
Ｚは、Ｏ、ＳおよびＮＲ23から選択されるメンバーであり、
Ｒ23は、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである］
が含まれる。
【０２４８】
Ｌ3を含む本発明のリンカーの開裂後、Ｌ3基は薬物Ｄに結合したままである。したがって、Ｌ3基は、Ｄへのその結合がＤの活性を有意に変えないように選択される。別の態様において、薬物Ｄそれ自体の一部、Ｌ3スペーサーとして機能する。例えば、一つの態様において、薬物Ｄは、薬物の一部がＬ3スペーサーとして機能するデュオカルマイシン誘導体である。このような態様の例には、これらに限らないが、ＮＨ2−（Ｌ3）−Ｄが：
【化１１−１】
2011505146.tif 000013
【化１１−２】
2011505146.tif 000014
［式中、
Ｚは、Ｏ、ＳまたはＮＲ23であり、
Ｒ23は、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、またはアシルであり；並びに
各構造におけるＮＨ2基は、（ＡＡ1）cと反応して、−（ＡＡ1）c−ＮＨ−を形成する］
からなる群から選択される構造を有するものが含まれる。
【０２４９】
ペプチド配列（ＡＡ1）c
ＡＡ1基は、単一のアミノ酸、またはアミド結合によって結合した複数のアミノ酸を表す。アミノ酸は、天然アミノ酸および／または非天然α−アミノ酸でありうる。これらは、ＬまたはＤ配置でありうる。一つの態様において、少なくとも３つの異なるアミノ酸が用いられる。別の態様において、２つのアミノ酸のみが用いられる。
【０２５０】
用語「アミノ酸」とは、天然アミノ酸および合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類縁体および模倣アミノ酸(amino acid mimetic)をいう。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、並びに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類縁体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムをいう。このような類縁体は、修飾したＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾したペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。特に用いられうる一つのアミノ酸はシトルリンであり、それはアルギニンの前駆体であって、肝臓における尿素の形成に関与する。模倣アミノ酸とは、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の様式で機能する化合物をいう。用語「非天然アミノ酸」は、上記の２０個の天然アミノ酸の「Ｄ」立体化学形態を表すものと意図される。用語「非天然アミノ酸」には、天然アミノ酸の相同体、および天然アミノ酸の合成的に修飾された形態が含まれることがさらに理解される。合成的に修飾された形態には、これらに限らないが、２つの炭素原子まで短くするかまたは長くしたアルキレン鎖を有するアミノ酸、適宜置換してもよいアリール基を含むアミノ酸、並びにハロゲン化基、好ましくはハロゲン化アルキルおよびアリール基を含むアミノ酸が含まれる。本発明のリンカーまたは複合体に結合する場合、アミノ酸は「アミノ酸側鎖」の形態であり、ここで、アミノ酸のカルボン酸基はケト（Ｃ（Ｏ））基で置換されている。したがって、例えば、アラニン側鎖は、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＨ3などである。
【０２５１】
ペプチド配列（ＡＡ1）cは、機能的には、単一のアミノ酸（ｃ＝１である場合）、またはアミド結合によって結合した複数のアミノ酸のアミド化残基である。ペプチド配列（ＡＡ1）cは、好ましくは、生物システムにおける興味深い位置での酵素による酵素触媒開裂のために選択される。例えば、標的とされるが、細胞によって内部移行されない複合体については、ペプチドが細胞外で開裂されるように、細胞外マトリックス中のプロテアーゼ、例えば、近くの死細胞によって放出されたプロテアーゼ、または腫瘍関連プロテアーゼによって開裂されるペプチドが選択される。細胞によって内部移行されるようにデザインされた複合体については、配列（ＡＡ1）cは、好ましくは、エンドソームもしくはリソソームプロテアーゼによって開裂されるように選択される。ペプチド中のアミノ酸数は、１〜２０個の範囲でありうるが；より好ましくは、（ＡＡ1）cを含む１〜８個のアミノ酸、１〜６個のアミノ酸、または１、２、３もしくは４個のアミノ酸が存在する。特定の酵素または酵素クラスによって開裂されやすいペプチド配列は、当該技術分野でよく知られている。
【０２５２】
好ましくは、（ＡＡ1）cは、プロテアーゼによる開裂部位であるアミノ酸配列（「開裂認識配列」）を含む。多くのプロテアーゼ開裂配列は、当該技術分野で知られている。例えば、Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); Bouvier et al. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995), Hardy et al., in Amyloid Protein Precursor in Development, Aging, and Alzheimer's Disease, ed. Masters et al. pp. 190-198 (1994)を参照。
【０２５３】
ペプチドは、典型的には、３〜１２個（またはそれ以上）のアミノ酸を含む。特定のアミノ酸の選択は、少なくとも部分的には、ペプチドを開裂するのに用いられる酵素、並びにインビボでのペプチドの安定性に依存する。適当な開裂可能なペプチドの一つの例は、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：２７）である。これは、安定化基と結合して、スクシニル−β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：３０）を形成しうる。適当な開裂可能ペプチドの他の例は、下記の引用文献に与えられる。あるいは、ＷＯ ２００８／１０３６９３（その開示は本明細書に引用される）に開示されるように、単一のアミノ酸残基を含むリンカーが用いられてもよい。
【０２５４】
好ましい態様において、ペプチド配列（ＡＡ1）cは、リソソームプロテアーゼによって開裂されるその能力に基づいて選択され、その例には、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、ＬおよびＳが含まれる。好ましくは、ペプチド配列（ＡＡ1）cは、インビトロでカテプシンＢによって開裂されうる。カテプシンＢはリソソームプロテアーゼであるが、その特定の濃度は、腫瘍組織の周囲の細胞外マトリックスに見られると考えられている。
【０２５５】
別の態様において、ペプチド配列（ＡＡ1）cは、腫瘍関連プロテアーゼ、例えば腫瘍細胞の近くの細胞外で見られるプロテアーゼによって開裂されるその能力に基づいて選択され、その例には、サイメット(thimet)オリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）およびＣＤ１０が含まれる。あるいは、配列（ＡＡ1）cは、ウロキナーゼまたはトリプターゼによる選択的開裂がなされるようにデザインされる。
【０２５６】
一つの実例として、ＣＤ１０（ネプリライシンとしても知られている）、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）、および急性リンパ芽球性白血病共通抗原（ＣＡＬＬＡ）は、ＩＩ型細胞表面亜鉛依存性メタロプロテアーゼである。ＣＤ１０とともに使用するのに適した開裂可能な基質には、Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＬｅｕおよびＩｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕが含まれる。
【０２５７】
別の実例は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に基づいている。おそらく、最もよく特徴が分かっている腫瘍関連のタンパク質分解酵素であり、腫瘍微小環境の中でＭＭＰの活性の明らかな相関がある。特に、可溶性マトリックス酵素ＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）およびＭＭＰ９（ゼラチナーゼＢ）が集中的に研究されており、腫瘍増殖を含む組織再構築の間に選択的に活性化されることが示されている。ＭＭＰ２およびＭＭＰ９によって開裂されるようにデザインされたペプチド配列は、デキストランおよびメトトレキセート（Chau et al., Bioconjugate Chem. 15:931-941 (2004)）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）およびドキソルビシン（Bae et al., Drugs Exp. Clin. Res. 29:15-23 (2004)）；並びにアルブミンおよびドキソルビシン（Kratz et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2001-2006 (2001)）の複合体についてデザインおよび試験されている。ＭＭＰとともに使用するのに適した配列の例には、これらに限らないが、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：２１）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：２２）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：２３）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：２４）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：２５）、およびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：２６）が含まれる。（例えば、先に引用した参考文献、並びにKline et al., Mol. Pharmaceut. 1:9-22 (2004) および Liu et al., Cancer Res. 60:6061-6067 (2000)を参照）。
【０２５８】
さらに別の例は、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼである。この酵素群には、例えば、ヘプシン、テスチシン(testisin)、およびＴＭＰＲＳＳ４が含まれる。Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｒｇは、マトリプターゼ／ＭＴ−ＳＰ１（乳癌および卵巣癌で過剰発現される）を用いて有効である一つの基質配列であり、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇは、ヘプシン（前立腺癌およびいくつかの他の腫瘍型において過剰発現される）を用いて有効である。（例えば、Lee et.al., J. Biol. Chem. 275:36720-36725 および Kurachi and Yamamoto, Handbook of Proeolytic Enzymes Vol. 2, 2nd edition (Barrett AJ, Rawlings ND & Woessner JF, eds) pp. 1699-1702 (2004)を参照）。
【０２５９】
これらに限らないが、本発明の複合体に使用するのに適したペプチド配列の適当な例には、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ9−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ9−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：２７）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：２８）、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：２９）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ、およびＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌが含まれる。好ましいペプチド配列は、Ｖａｌ−ＣｉｔおよびＶａｌ−Ｌｙｓである。
【０２６０】
別の態様において、薬物成分に最も近い位置にあるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｉｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択される。さらに別の態様において、薬物成分に最も近い位置にあるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択される。
【０２６１】
当業者は、過度の実験を用いることなく、ペプチド配列のアレイを容易に評価して、本発明におけるその有用性を決定しうる。例えば、Zimmerman, M., et al., (1977) Analytical Biochemistry 78:47-51; Lee, D., et al., (1999) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9:1667-72; および Rano, T.A., et al., (1997) Chemistry and Biology 4:149-55を参照。
【０２６２】
本発明の複合体は、２つ以上のリンカーを適宜含みうる。これらのリンカーは、同じであるかまたは異なっていてもよい。例えば、ペプチジルリンカーを用いて薬物をリガンドに結合してもよく、第２のペプチジルリンカーは、診断薬を複合体に結合しうる。追加のリンカーについての他の使用には、結合分析剤(linking analytical agent)、生体分子、標的薬剤、および抗体−パートナー複合体への検出可能な標識が含まれる。
【０２６３】
ヒドラジンリンカー（Ｈ）
別の態様において、本発明の複合体にはヒドラジン自壊的リンカーが含まれ、その中で、該複合体は、構造：
【化１２】
2011505146.tif 000015
［式中、
Ｄ、Ｌ1、Ｌ4、ｐ、ｍ、およびＸ4は上記と同義であり、かつ本明細書にさらに記載されており、並びに
Ｈは、構造：
【化１３】
2011505146.tif 000016
を含むリンカーであり、
ｎ1は、１〜１０の整数であり；
ｎ2は、０、１、または２であり；
各Ｒ24は、Ｈ、置換アルキル、無置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および無置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーであり；並びに
Ｉは、結合（すなわち、骨格炭素と隣接窒素の間の結合）または：
【化１４】
2011505146.tif 000017
であり、
ｎ3は、０または１であるが、但し、ｎ3が０である場合、ｎ2は０ではなく；並びに
ｎ4は、１、２、または３である］
を有している。
【０２６４】
一つの態様において、フェニル環上の置換はパラ置換である。好ましい態様において、ｎ1は、２、３、もしくは４であるか、またはｎ1は３である。好ましい態様において、ｎ2は１である。好ましい態様において、Ｉは結合（すなわち、骨格炭素と隣接窒素の間の結合）である。一つの態様において、例えば、ｎ3が０であり、かつｎ4が２である場合、ヒドラジンリンカーＨは、開裂して、６員自壊的リンカーを形成しうる。別の態様において、ヒドラジンリンカーＨは、開裂して、２つの５員自壊的リンカーを形成しうる。さらに他の態様において、開裂して、Ｈは５員自壊的リンカーを形成し、Ｈは７員自壊的リンカーを形成し、またはＨは５員自壊的リンカーおよび６員自壊的リンカーを形成する。開裂速度は、開裂後に形成した環の大きさの影響を受ける。したがって、望ましい開裂速度に応じて、開裂後に形成される適当な大きさの環が選択されうる。
【０２６５】
別のヒドラジン構造Ｈは、式：
【化１５】
2011505146.tif 000018
［式中、
ｑは、０、１、２、３、４、５、または６であり；並びに
各Ｒ24は、Ｈ、置換アルキル、無置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および無置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーである］
を有する。このヒドラジン構造はまた、５、６、もしくは７員環を形成してもよく、追加の構成要素を付加して多環を形成してもよい。
様々なヒドラジンリンカーの製造、開裂の化学および環化の速度論は、ＷＯ ２００５／１１２９１９に開示されており、その開示は本明細書に引用される。
【０２６６】
ジスルフィドリンカー（Ｊ）
さらに別の態様において、リンカーには、酵素的に開裂可能なジスルフィド基が含まれる。一つの態様において、本発明は、式（ｄ）：
【化１６】
2011505146.tif 000019
［式中、
Ｄ、Ｌ1、Ｌ4、ｐ、ｍ、およびＸ4は上記と同義であり、かつ本明細書にさらに記載されており、並びに
Ｊは、構造：
【化１７】
2011505146.tif 000020
を有する化学基を含むジスルフィドリンカーであり、
各Ｒ24は、Ｈ、置換アルキル、無置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および無置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーであり；
各Ｋは、置換アルキル、無置換アルキル、置換ヘテロアルキル、無置換ヘテロアルキル、置換されたアリール、無置換アリール、置換ヘテロアリール、無置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、無置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ2、ＮＲ21Ｒ22、ＮＲ21ＣＯＲ22、ＯＣＯＮＲ21Ｒ22、ＯＣＯＲ21、およびＯＲ21からなる群から独立して選択されるメンバーであり、
Ｒ21およびＲ22は、Ｈ、置換アルキル、無置換アルキル、置換ヘテロアルキル、無置換ヘテロアルキル、置換されたアリール、無置換アリール、置換ヘテロアリール、無置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキルおよび無置換ヘテロシクロアルキルからなる群から独立して選択され；
ｉは、０、１、２、３、または４の整数であり；並びに
ｄは、０、１、２、３、４、５、または６の整数である］
の構造を有する細胞傷害性抗体−パートナー化合物を提供する。
【０２６７】
ジスルフィドリンカーの芳香環は、一つ以上の「Ｋ」基で置換されうる。「Ｋ」基は、環構造の一部である４つの無置換炭素のうちの一つに結合した水素を他のものに置き換えた置換基である。「Ｋ」基は、単一原子、例えばハロゲンであってもよく、または多原子基、例えば、アルキル、ヘテロアルキル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、およびシアノであってもよい。Ｋ置換基の例には、これらに限らないが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ2、ＯＨ、ＯＣＨ3、ＮＨＣＯＣＨ3、Ｎ（ＣＨ3）2、ＮＨＣＯＣＦ3およびメチルが含まれる。「Ｋi」について、ｉは、０、１、２、３、または４の整数である。特定の態様において、ｉは０である。
【０２６８】
好ましい態様において、リンカーには、下式：
【化１８】
2011505146.tif 000021
［式中、
Ｌ4、Ｘ4、p、およびＲ24は上記と同義であり、並びに
ｄは、０、１、２、３、４、５、または６である］
の酵素的に開裂可能なジスルフィド基が含まれる。特定の態様において、ｄは、１または２である。
【０２６９】
より具体的なジスルフィドリンカーは、下式：
【化１９】
2011505146.tif 000022
に示される。好ましくは、ｄは１または２であり、各ＫはＨである。
【０２７０】
別のジスルフィドリンカーは、下式：
【化２０】
2011505146.tif 000023
に示される。好ましくは、ｄは１または２であり、各ＫはＨである。
【０２７１】
様々な態様において、ジスルフィドは、アミンに対してオルトである。別の具体的な態様において、ａは０である。好ましい態様において、Ｒ24は、ＨおよびＣＨ3から独立して選択される。
上記のようなジスルフィドリンカーの製造および使用は、ＷＯ ２００５／１１２９１９に開示されており、その開示は本明細書に引用される。
【０２７２】
抗体への治療剤の細胞毒素、リンカーおよび複合体の型のさらなる議論については、ＵＳ ７，０８７，６００；ＵＳ ６，９８９，４５２；ＵＳ ７，１２９，２６１；ＵＳ ２００６／０００４０８１；ＵＳ ２００６／０２４７２９５；ＷＯ ０２／０９６９１０；ＷＯ ２００７／０５１０８１；ＷＯ ２００５／１１２９１９；ＷＯ ２００７／０５９４０４；ＷＯ ２００８／０８３３１２；ＷＯ ２００８／１０３６９３；Saito et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan and Kreitman (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter and Springer (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264（各々は本明細書に引用される）もまた参照。
【０２７３】
パートナー分子としての細胞毒素
一つの態様において、本発明は、パートナー分子、例えば細胞毒素、薬物（例えば、免疫抑制剤）または放射性毒素に結合した抗体を特徴とする。このような複合体はまた、「免疫毒素」とも呼ばれる。細胞毒素または細胞傷害性薬剤には、細胞に有害な（例えば、死滅させる）いずれの薬剤も含まれる。本明細書で、「細胞毒素」には、プロドラッグ型であって、インビボで実際の有毒種に変換される化合物が含まれる。
【０２７４】
本発明のパートナー分子の例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド(tenoposide)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン(dihydroxy anthracin dione)、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、並びにその類縁体または相同体が含まれる。パートナー分子の例には、例えば、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン(5-fluorouracil decarbazine)）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロランブシル(thioepa chlorambucil)、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ツブリシン(tubulysin)、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）もまた含まれる。本発明の抗体に結合しうるパートナー分子の他の好ましい例には、カリチアマイシン(calicheamicin)類、メイタンシン類およびオーリスタチン(auristatin)類、並びにその誘導体が含まれる。
【０２７５】
パートナー分子の好ましい例は、ＣＣ−１０６５および構造に関係があるデュオカルマイシン類の類縁体および誘導体である。ＣＣ−１０６５は実験動物において遅発性死亡を引き起こすため、その強力かつ広範な抗腫瘍活性にもかかわらず、ヒトに用いることができず、より良い治療係数を有する類縁体または誘導体の探索が促されている。
【０２７６】
ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシン類の多くの類縁体および誘導体が当該技術分野で知られている。多くの化合物の構造、合成および特性への研究が概説されている。例えば、Boger et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35: 1438 (1996); および Boger et al., Chem. Rev. 97: 787 (1997)を参照。ＣＣ−１０６５類縁体または誘導体に関する他の開示には：ＵＳ ５，１０１、０３８；ＵＳ ５，６４１，７８０；ＵＳ ５，１８７，１８６；ＵＳ ５，０７０，０９２；ＵＳ ５，７０３，０８０；ＵＳ ５，０７０，０９２；ＵＳ ５，６４１，７８０；ＵＳ ５，１０１，０３８；ＵＳ ５，０８４，４６８；ＵＳ ５，７３９，３５０；ＵＳ ４，９７８，７５７、ＵＳ ５，３３２、８３７およびＵＳ ４，９１２，２２７；ＷＯ ９６／１０４０５；並びにＥＰ ０，５３７，５７５ Ａ１が含まれる。
【０２７７】
特に好ましい態様において、パートナー分子は、以下の式（ｅ）：
【化２１】
2011505146.tif 000024
［式中、環構造Ａは、置換もしくは無置換アリール 置換もしくは無置換ヘテロアリールおよび置換もしくは無置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーである］
の構造を有するＣＣ−１０６５／デュオカルマイシン類縁体である。環構造Ａの例には、フェニルおよびピロールが含まれる。
【０２７８】
記号ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるか、またはＥおよびＧは、適宜一緒になって、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換ヘテロアリールおよび置換もしくは無置換ヘテロシクロアルキルから選択される環構造を形成しうる。
【０２７９】
記号Ｘは、Ｏ、ＳおよびＮＲ23から選択されるメンバーを表す。Ｒ23は、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
【０２８０】
記号Ｒ3は、（＝Ｏ）、ＳＲ11、ＮＨＲ11およびＯＲ11から選択されるメンバーを表し、その中で、Ｒ11は、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、一リン酸エステル、二リン酸エステル、三リン酸エステル、スルホン酸エステル、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ12Ｒ13、Ｃ（Ｏ）ＯＲ12、Ｃ（Ｏ）ＮＲ12Ｒ13、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ12）2、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ12Ｒ13、ＳＲ12またはＳｉＲ12Ｒ13Ｒ14である。記号Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は独立して、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは無置換アリールを表し、ここで、Ｒ12およびＲ13は、それらに結合する窒素もしくは炭素原子とともに、適宜一緒になって、２つ以上のヘテロ原子を適宜含んでいてもよい４〜６員の置換もしくは無置換ヘテロシクロアルキル環構造を形成しうる。
【０２８１】
Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ5およびＲ5'は、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換ヘテロアリール、置換もしくは無置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ2、ＮＲ15Ｒ16、ＮＣ（Ｏ）Ｒ15、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ15Ｒ16、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ15、Ｃ（Ｏ）Ｒ15、ＳＲ15、ＯＲ15、ＣＲ15＝ＮＲ16、およびＯ（ＣＨ2）nＮ（ＣＨ3）2から独立して選択されるメンバーであり、ここで、ｎは１〜２０の整数であるか、またはＲ4、Ｒ4'、Ｒ5およびＲ5'のいずれの隣接ペアも、それらに結合する炭素原子とともに、一緒になって、４〜６員の置換もしくは無置換シクロアルキルもしくはヘテロシクロアルキル環構造を形成する。Ｒ15およびＲ16は独立して、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換ヘテロアリール、置換もしくは無置換ヘテロシクロアルキルおよび置換もしくは無置換ペプチジルを表し、ここで、Ｒ15およびＲ16は、それらに結合する窒素原子とともに、適宜一緒になって、２つ以上のヘテロ原子を適宜含んでいてもよい４〜６員の置換もしくは無置換ヘテロシクロアルキル環構造を形成しうる。一つの例示的な構造はアニリンである。
【０２８２】
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ5、およびＲ5'のうちの一つは、本明細書に記載したように、細胞毒素を本発明のリンカーまたは酵素開裂可能な基質、例えばＬ1またはＬ3（存在している場合）に結合させるか、またはＦ、Ｈ、もしくはＪに結合させる。
【０２８３】
Ｒ6は、存在しても存在しなくてもよい単結合である。Ｒ6が存在している場合、Ｒ6およびＲ7は一緒になって、シクロプロピル環を形成する。Ｒ7は、ＣＨ2−Ｘ1または−ＣＨ2−である。Ｒ7が−ＣＨ2−である場合、それはシクロプロパン環の構成要素である。記号Ｘ1は、ハロゲン、例えばＣｌ、ＢｒまたはＦのような脱離基を表す。Ｒ6とＲ7の組合せは、化学原子価の原理に反しない方法で解釈される。
【０２８４】
Ｘ1はいずれの脱離基であってもよい。有用な脱離基には、これらに限らないが、ハロゲン類、アジ化物類、スルホン酸エステル類（例えば、アルキルスルホニル、アリールスルホニル）、オキソニウムイオン類、アルキル過塩素酸エステル類、アンモニオアルカンスルホン酸エステル類、アルキルフルオロスルホン酸エステル類およびフッ素化化合物類（例えば、トリルレート類、ノナフレート(nonaflate)類、トレシレート(tresylate)類）などが含まれる。脱離基として有用な特定のハロゲン類は、Ｆ、ＣｌおよびＢｒである。
【０２８５】
６員環の中の曲線は、該環が一つ以上の不飽和度を有していてもよく、それが芳香族でありうることを示す。したがって、以下に示されるような環構造、および関連構造は、式（ｆ）：
【化２２】
2011505146.tif 000025
（ｆ）
の範囲にある。
【０２８６】
一つの態様において、Ｒ11には、自己環化(self-cyclize)せず、薬物をＬ1またはＬ3（存在している場合）に連結するか、またはＦ、Ｈ、もしくはＪに連結するＸ5基が含まれる。Ｘ5基は、好ましくは酵素を用いて開裂可能であり、開裂されると活性薬物を与える。例として、Ｒ11は、以下の構造（右側が薬物の残りの部分にカップリングしている）：
【化２３】
2011505146.tif 000026
を有していてもよい。
【０２８７】
いくつかの態様において、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ5、およびＲ5'の少なくとも一つは、前記薬物をＬ1（存在している場合）に連結するか、またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ2に連結し、Ｒ3は、ＳＲ11、ＮＨＲ11およびＯＲ11から選択される。Ｒ11は、−ＳＯ（ＯＨ）2、−ＰＯ（ＯＨ）2、−ＡＡn、−Ｓｉ（ＣＨ3）2Ｃ（ＣＨ3）3、−Ｃ（Ｏ）ＯＰｈＮＨ（ＡＡ）m、
【化２４】
2011505146.tif 000027
、並びにその医薬的に許容される塩から選択され、ここで、ｎは、１〜１０の範囲の任意の整数であり、ｍは、１〜４の範囲の任意の整数であり、ｐは、１〜６の範囲の任意の整数であり、並びにＡＡは、任意の天然または非天然アミノ酸である。式（ｅ）の化合物が、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ5、またはＲ6を通して結合する場合、Ｒ3は、好ましくは開裂可能な遮断基(blocking group)を含み、その存在は、化合物の細胞傷害活性を遮断するが、細胞毒素を抗体に結合させるリンカーの開裂についてのメカニズムと異なるメカニズムによって、意図される作用部位で見られる条件下で開裂可能である。このようにして、血漿中の複合体の偶発的開裂がある場合、該遮断基は、放出された細胞毒素の細胞傷害性を減弱する。例えば、複合体がヒドラゾンまたはジスルフィドリンカーを有する場合、該遮断基は酵素的に開裂可能なアミドでありうる。あるいは、リンカーが、プロテアーゼによって開裂可能なペプチジルリンカーである場合、該遮断基はカルボキシエステラーゼによって開裂可能なエステルまたはカルバメートでありうる。
【０２８８】
例えば、好ましい態様において、Ｄは、構造（ｊ）：
【化２５】
2011505146.tif 000028
（ｊ）
を有する細胞毒素である。
【０２８９】
この構造において、Ｒ3、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ5、Ｒ5'およびＸは、式（ｅ）について上記に記載したものである。Ｚは、Ｏ、ＳおよびＮＲ23から選択されるメンバーであり、ここで、Ｒ23は、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
Ｒ1は、Ｈ、置換もしくは無置換低級アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ8、またはＣＯ2Ｒ8であり、その中で、Ｒ8は、ＮＲ9Ｒ10およびＯＲ9から選択されるメンバーであり、Ｒ9およびＲ10は、Ｈ、置換もしくは無置換アルキルおよび置換もしくは無置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
【０２９０】
Ｒ1'は、Ｈ、置換もしくは無置換低級アルキル、またはＣ（Ｏ）Ｒ8であり、その中で、Ｒ8は、ＮＲ9Ｒ10およびＯＲ9から選択されるメンバーであり、Ｒ9およびＲ10は、Ｈ、置換もしくは無置換アルキルおよび置換もしくは無置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
Ｒ2は、Ｈ、または置換もしくは無置換低級アルキルまたは無置換ヘテロアルキルまたはシアノまたはアルコキシであり；並びにＲ2'は、Ｈ、または置換もしくは無置換低級アルキルまたは無置換ヘテロアルキルである。
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ5、またはＲ5'のうちの一つは、細胞毒素をＬ1またはＬ3（存在している場合）に連結するか、またはＦ、Ｈ、もしくはＪに連結する。
【０２９１】
さらなる態様は、式：
【化２６】
2011505146.tif 000029
を有する。この構造において、Ａ、Ｒ6、Ｒ7、Ｘ、Ｒ4、Ｒ4'、Ｒ5、およびＲ5'は、式（ｅ）について上記に記載したものである。Ｚは、Ｏ、ＳおよびＮＲ23から選択されるメンバーであり、ここで、Ｒ23は、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；
Ｒ34は、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ33またはＣ1−Ｃ6アルキルであり、ここで、Ｒ33は、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換ヘテロアリール、置換もしくは無置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ2、ＮＲ15Ｒ16、ＮＣ（Ｏ）Ｒ15、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ15Ｒ16、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ15、Ｃ（Ｏ）Ｒ15、ＳＲ15、ＯＲ15、ＣＲ15＝ＮＲ16、およびＯ（ＣＨ2）nＮ（ＣＨ3）2から選択され、ｎは１〜２０の整数である。Ｒ15およびＲ16は独立して、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換ヘテロアルキル、置換もしくは無置換アリール、置換もしくは無置換ヘテロアリール、置換もしくは無置換ヘテロシクロアルキルおよび置換もしくは無置換ペプチジルを表し、ここで、Ｒ15およびＲ16は、それらに結合する窒素原子とともに、適宜一緒になって、２つ以上のヘテロ原子を適宜含んでいてもよい４〜６員の置換もしくは無置換ヘテロシクロアルキル環構造を形成しうる。
【０２９２】
好ましくは、Ａは、置換もしくは無置換フェニルまたは置換もしくは無置換ピロールである。さらに、Ｒ11について本明細書に記載したいずれの置換基の選択もまた、Ｒ33に適用可能である。
【０２９３】
好ましいパートナー分子は、式（Ｉ）
【化２７】
2011505146.tif 000030
によって表される構造を有する。
【０２９４】
式（Ｉ）において、ＰＤは、プロドラッグ化基(prodrugging group)（時折、保護基とも呼ばれる）を表す。化合物（Ｉ）は、インサイチュー(in situ)で（好ましくは酵素的に）加水分解されて、式（ＩＩ）の化合物を放出する。当業者が認識するように、化合物（ＩＩ）は、ＣＢＩ化合物として知られている化合物群に属する（Boger et al., J. Org. Chem. 2001, 66, 6654-6661 および Boger et al., ＵＳ ２００５／００１４７００ Ａ１（２００５）。ＣＢＩ化合物は、インサイチュー（または、患者に投与される場合、インビボ）でそのシクロプロピル誘導体、例えば化合物（ＩＩＩ）に変換され、ＤＮＡの副溝に結合し、次いで実際のアルキル化種であると考えられるシクロプロピル誘導体を用いて、アデニン基上でＤＮＡをアルキル化する。
【化２８】
2011505146.tif 000031
【０２９５】
適当なプロドラッグ化基ＰＤの例には、これらに限らないが、以下：
【化２９】
2011505146.tif 000032
に例示されるエステル類、カルバミン酸エステル類、リン酸エステル類、およびグリコシド類が含まれる。
【０２９６】
好ましいプロドラッグ化基ＰＤは、カルバミン酸エステル類（上記の最初の５つの構造によって例示され、カルボキシエステラーゼ類によって加水分解される）；リン酸エステル類（上記の６番目の構造であり、アルカリホスファターゼによって加水分解される）、およびβ−グルクロン酸誘導体類（β−グルクロニダーゼによって加水分解される）である。特定の好ましいパートナー分子は、式（ＩＶ）：
【化３０】
2011505146.tif 000033
によって表されるカルバミン酸エステルのプロドラッグ化物である。
【０２９７】
パートナー分子としてのマーカー
パートナー分子がマーカーである場合、それは、検出可能な物理的または化学的特性を有するかまたは生じるいずれの部分であってもよく、それによって、特定の組織または細胞におけるその存在が示される。マーカー（時折、レポーター基とも呼ばれる）は、イムノアッセイ、生物医学研究、および医療診断の領域において十分に開発されている。マーカーは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出されうる。例には、磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射標識（例えば、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または32Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡによく用いられる他のもの）、並びに比色分析標識、例えばコロイド金または色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）が含まれる。
【０２９８】
マーカーは、好ましくは、放射性同位元素、蛍光剤、蛍光剤前駆体、発色団、酵素およびその組合せからなる群から選択されるメンバーである。適当な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼである。蛍光剤には、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが含まれる。化学発光化合物には、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、例えば、ルミノールが含まれる。用いられうる様々な標識またはシグナル生成システムの概説については、ＵＳ ４，３９１，９０４を参照。
【０２９９】
マーカーは間接的手段によって結合されうる：リガンド分子（例えば、ビオチン）は抗体に共有結合する。次いでリガンドは、別の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合し、それはもともと検出可能であるか、またはシグナルシステム、例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物に共有結合する。
【０３００】
複合体の例
本発明の抗体への結合に適したパートナー分子−リンカーの組合せの具体例は、以下に示される：
【化３１−１】
2011505146.tif 000034
【化３１−２】
2011505146.tif 000035
【０３０１】
式（ｏ）は、以下に示される：
【化３２−１】
2011505146.tif 000036
【化３２−２】
2011505146.tif 000037
【化３２−３】
2011505146.tif 000038
【０３０２】
式（ｐ）は、以下に示される：
【化３３−１】
2011505146.tif 000039
【化３３−２】
2011505146.tif 000040
【化３３−３】
2011505146.tif 000041
【０３０３】
前述の化合物において、下付き文字ｒが式中に存在している場合、それは０〜２４の範囲の整数である。どこに現れる場合でも、Ｒは、
【化３４】
2011505146.tif 000042
である。
前述の化合物の各々はマレイミド基を有しており、抗体上のスルフヒドリル基を通して抗体に結合できる状態にある。
【０３０４】
医薬組成物
別の態様において、本発明は、医薬的に許容される担体、および適宜、他の活性もしくは不活性成分とともに製剤化した本発明の複合体を含む医薬組成物を提供する。
【０３０５】
本発明の医薬組成物はまた、他の薬剤との併用療法で投与されてもよい。例えば、併用療法には、少なくとも一つの他の抗炎症または免疫抑制剤と混合した本発明の複合体が含まれうる。併用療法に用いられうる治療剤の例は、以下でより詳細に記載される。
【０３０６】
本明細書で用いられるように、「医薬的に許容される担体」には、生理学的に適合性である任意かつすべての溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤(absorption delaying agent)などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮の投与（例えば、注射または注入によって）に適している。投与経路に応じて、活性化合物を物質でコーティングして、化合物を不活性化しうる酸の作用および他の自然条件から化合物を保護してもよい。
【０３０７】
本発明の医薬化合物には、一つ以上の医薬的に許容される塩が含まれうる。「医薬的に許容される塩」とは、親化合物の目的の生物活性を保持し、いずれの望ましくない毒性効果も与えない塩をいう（例えば、Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照）。このような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、無毒性無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などから生じるもの、並びに無毒性有機酸、例えば脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などから生じるものが含まれる。塩基付加塩には、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどから生じるもの、並びに無毒性有機アミン、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから生じるものが含まれる。
【０３０８】
本発明の医薬組成物には、医薬的に許容される抗酸化剤もまた含まれうる。医薬的に許容される抗酸化剤の例には：
（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；
（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および
（３）金属キレート化剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
【０３０９】
適当な担体の例には、水、エタノール、ポリオール類（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその混合物、植物油（例えばオリーブ油）、並びに注射用有機エステル類（例えばオレイン酸エチル）が含まれる。適当な流動性は、コーティング剤、例えばレシチンの使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されうる。
【０３１０】
組成物には、添加剤、例えば防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤もまた含まれうる。殺菌によって、かつ抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの含有によって、微生物の存在の阻止が保証されうる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを組成物の中に入れることもまた望ましい。また、注射用医薬形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを入れることによってもたらされうる。
【０３１１】
医薬的に許容される担体には、無菌注射液もしくは分散液の即時調製(extemporaneous preparation)のための無菌水溶液もしくは分散液および無菌散剤が含まれる。医薬的に活性な基質のためのこのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において知られている。いずれの通常の媒質または薬剤も活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用は意図される。また補助的な活性化合物を組み入れてもよい。
【０３１２】
治療組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の秩序構造として製剤化されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、並びにその適当な混合物を含む溶媒または分散媒でありうる。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散の場合に必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されうる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムが組成物中に含まれるのが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に入れることによってもたらされうる。
【０３１３】
無菌注射液は、必要に応じて、適当な溶媒中、活性化合物の必要量を上記で列挙される成分の１つもしくはその組合せと混合し、続いて無菌精密濾過(filtered sterilization)することによって製造されうる。一般に、分散剤は、活性化合物を、基本分散媒質、および上記で列挙したものからの必要な他の成分を含む無菌ベヒクルに組み入れることによって製造される。無菌注射液の製造用無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、それによって、活性成分に、そのあらかじめ無菌濾過した溶液からのいずれの追加の目的成分も加えた粉末が生じる。
【０３１４】
単一製剤を製造するために担体と混合されうる活性成分の量は、治療している患者および特定の投与方法に応じて変化し、それは一般に、治療効果を生じる組成物の中の活性成分の量である。一般に、１００％中、この量は、医薬的に許容される担体と組み合わせた約０.０１％〜約９９％の活性成分、好ましくは約０.１％〜約７０％、最も好ましくは約１％〜約３０％の活性成分の範囲にわたる。
【０３１５】
投与計画は、最適な望ましい応答（例えば、治療応答）を得るために調整される。例えば、単回ボーラス投与を行ってもよく、時間をかけて何回かに分けて投与してもよく、または治療状況の緊急性に示されるように、用量を比例的に減少または増加させてもよい。投与を簡単にし、用量を均一にするためには、単位製剤において非経口組成物を製剤化するのが特に有利である。本明細書で用いられる単位製剤とは、治療される患者についての単位投与量(unitary dosage)として適した物理的に分離した単位をいい；各単位は、必要な医薬担体と共同して目的の治療効果を生ずるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位製剤についての詳細は、
（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、並びに
（ｂ）個体における治療感受性(treatment of sensitivity)のためにこのような活性化合物を配合する技術分野に内在する限界
によって決定され、かつそれらに直接依存する。
【０３１６】
複合体の投与について、投与量は、ホストの体重あたり、約０.０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般には０.０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲にわたる。例えば投与量は、０.３ｍｇ／ｋｇ 体重、１ｍｇ／ｋｇ 体重、３ｍｇ／ｋｇ 体重、５ｍｇ／ｋｇ 体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ 体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。例示的な治療計画は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月に１回、３月に１回または３〜６月に１回の投与を必要とする。本発明の複合体に好ましい投与計画には、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ 体重または３ｍｇ／ｋｇ 体重が含まれ、以下：
（ｉ）６回の投与量について４週間毎、次いで３月毎；
（ｉｉ）３週間毎；
（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ 体重を１回、続いて３週間毎に１ｍｇ／ｋｇ 体重
の投与計画のうちの一つを用いて複合体が与えられる。いくつかの方法において約１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿複合体濃度を達成し、いくつかの方法において約２５〜３００μｇ／ｍｌを達成するように投与量が調整される。
【０３１７】
あるいは、抗体は徐放性製剤として投与されてもよく、その場合、投与回数を少なくする必要がある。用量および回数は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト抗体は最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体と続く。投与量および投与回数は、処置が予防的であるかまたは治療的であるかに応じて変化しうる。予防的適用においては、比較的低い用量が比較的少ない間隔で長期にわたって投与される。患者の中には生涯治療を受け続けるものもいる。治療的適用においては、疾患の進行が低下または終結するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的高用量が比較的短い間隔で必要となる場合がある。その後、患者は予防レジメを投与されうる。
【０３１８】
異常な細胞増殖に関する疾患の予防および／または治療に使用するために、約０.００１μＭ〜２０μＭの投与化合物の血中濃度が好ましく、約０.０１μＭ〜５μＭが好ましい。
【０３１９】
本明細書に記載した化合物の経口投与についての患者の用量は、典型的には約１ｍｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／日、より典型的には約１０ｍｇ／日〜約１，０００ｍｇ／日、最も典型的には約５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲にわたる。患者の体重の観点で述べると、典型的な用量は、約０.０１〜約１５０ｍｇ／ｋｇ／日、より典型的には約０.１〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日、最も典型的には約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日（例えば５ｍｇ／ｋｇ／日または３ｍｇ／ｋｇ／日）の範囲にわたる。
【０３２０】
いくつかの態様において、腫瘍増殖を遅延させるかまたは阻害する患者の用量は、１μｍｏｌ／ｋｇ／日以下でありうる。例えば、患者の用量は、０.９、０.６、０.５、０.４５、０.３、０.２、０.１５、または０.１μｍｏｌ／ｋｇ／日以下でありうる（薬物のモルに関して）。好ましくは、抗体−薬物複合体は、少なくとも５日間にわたって毎日の投与量で投与された場合、腫瘍増殖を遅延させる。少なくともいくつかの態様において、腫瘍はＳＣＩＤマウスにおけるヒト型腫瘍である。例として、ＳＣＩＤマウスはＣＢ１７.ＳＣＩＤマウス（タコニック、ジャーマンタウン、ＮＹから入手可能）でありうる。
【０３２１】
患者への毒性なしに、特定の患者、組成物、および投与方法についての目的の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量が得られるように、実際の投与量レベルを変えてもよい。選択された投与量レベルは、様々な薬物動態学的要因、例えば用いられる特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、排出速度、治療期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物および／または物質、年齢、性別、体重、症状、全体的な健康、並びに患者の前病歴などの要因に依存する。
【０３２２】
本発明の複合体の「治療上有効な用量」は、好ましくは疾患症状の重症度の減少、疾患症状がない期間の回数および持続時間の増加、および／または疾患の苦痛に起因する障害(impairment, disability)の予防をもたらす。例えば、腫瘍の治療について、「治療上有効な用量」は、好ましくは、無治療の患者と比べて、少なくとも約２０％まで、より好ましくは少なくとも約４０％まで、さらにより好ましくは少なくとも約６０％まで、さらにより好ましくは少なくとも約８０％まで細胞増殖または腫瘍増殖を阻害する。腫瘍増殖を阻害する複合体の能力は、ヒト腫瘍における有効性の予測となる動物モデルシステムにおいて評価されうる。あるいは、組成物のこの特性は、細胞増殖を阻害するその能力を試験することによって評価されてもよく、このような能力は、当業者に知られているアッセイによってインビトロで測定可能である。治療化合物の治療有効量は、腫瘍の大きさを減少させるか、または患者における症状を改善しうる。当業者は、患者の大きさ、症状の重症度、および選択された特定の組成物もしくは投与経路のような要因に基づいて、かかる量を決定しうる。
【０３２３】
本発明の複合体は、当該技術分野で知られている一つ以上の様々な方法を用いて、一つ以上の投与経路によって投与されうる。当業者によって認識されているように、投与経路および／または投与方法は目的の結果に依存して変化する。本発明の抗体に好ましい投与経路には、例えば注射もしくは注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路が含まれる。本明細書で用いられる用語「非経口投与」は、通常は注射による、腸内投与および局所投与以外の投与方法を意味し、これらに限らないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入が含まれる。あるいは、本発明の組成物は、非経口でない経路、例えば局所的、表皮または粘膜の投与経路によって、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的に投与されうる。
【０３２４】
活性化合物は、早発放出(premature release)、例えば、放出制御製剤、移植(implant)、経皮貼付、およびマイクロカプセル化送達システムからそれを保護する担体とともに製造されうる。生分解性の生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類、およびポリ乳酸が用いられうる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照。
【０３２５】
治療組成物は、当該技術分野で知られている医療機器を用いて投与されうる。例えば、好ましい態様において、本発明の治療組成物は、無針皮下注射器具(needleless hypodermic injection device)、例えばＵＳ ５，３９９，１６３；５，３８３，８５１；５，３１２，３３５；５，０６４，４１３；４，９４１，８８０；４，７９０，８２４；または４，５９６，５５６に開示されているものを用いて投与されうる。他の適当な器具の例には：ＵＳ ４，４８７，６０３；ＵＳ ４，４８６，１９４；ＵＳ ４，４４７，２３３；ＵＳ ４，４４７，２２４；ＵＳ ４，４３９，１９６；およびＵＳ ４，４７５，１９６に開示されているものが含まれる。これらの特許は本明細書に引用される。
【０３２６】
ある態様において、本発明の複合体は、インビボでの適当な分布が確保されるように製剤化されうる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの親水性の高い化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを超えるようにするために（必要であれば）、これらは例えば、リポソーム中で製剤化されうる。リポソームの製造方法については、例えば、ＵＳ ４，５２２，８１１；５，３７４，５４８；および５，３９９，３３１を参照。リポソームには、特異的な細胞または器官に選択的に輸送される一つ以上の部分が含まれていてもよく、このようにして標的薬物送達が亢進される（例えば、V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照）。標的部位の例には、葉酸またはビオチン（例えば、ＬｏｗらのＵＳ ５，４１６，０１６を参照）；マンノシド類（Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038）；抗体（P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180）；界面活性剤タンパク質Ａ受容体（Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134）；ｐ１２０（Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）が含まれ；K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273もまた参照。
【０３２７】
本発明の使用および方法
本発明の抗体、抗体組成物および方法は、ＰＴＫ７を介した障害の診断および治療に関する多くのインビトロおよびインビボ診断的および治療的有用性を有する。好ましい態様において、本発明の抗体はヒト抗体である。例えば、これらの分子は、インビトロまたはエキソビボで培養細胞に投与されてもよく、または様々な障害を治療、予防および診断するために、ヒトの患者に、例えば、インビボで投与されてもよい。本明細書で用いられるように、用語「患者」は、ヒトおよび非ヒト動物を含むものと意図される。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類が含まれる。好ましい患者には、ＰＴＫ７活性を介した障害を有するヒトの患者が含まれる。該方法は、異常なＰＴＫ７発現を伴う障害を有するヒトの患者を治療するのに特に適している。ＰＴＫ７への抗体が別の薬剤とともに投与される場合、その２つは順番にまたは同時に投与されうる。
【０３２８】
本発明の抗体のＰＴＫ７に対する特異的結合を考慮して、本発明の抗体は、細胞表面上のＰＴＫ７発現を特異的に検出するのに用いられてもよく、さらに、イムノアフィニティー精製によってＰＴＫ７を精製するのに用いられてもよい。
【０３２９】
本発明は、抗体またはその部分とヒトＰＴＫ７との間の複合体形成を可能にする条件下で、該試料、および対照試料を、ヒトＰＴＫ７に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と反応させることを特徴とする、試料中のヒトＰＴＫ７抗原の存在を検出する方法、またはヒトＰＴＫ７抗原の量を測定する方法をさらに提供する。次いで複合体形成を検出し、その中で、該試料と対照試料の間の複合体形成の違いによって、試料中のヒトＰＴＫ７抗原の存在が示される。
【０３３０】
ＰＴＫ７は大腸癌由来細胞株において発現されるが、ヒト成人大腸組織において発現されることは分かっていない（Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84）。ＰＴＫ７発現はまた、いくつかのメラノーマ細胞株およびメラノーマ生検にも見られた（Easty, et al. (1997) Int. J. Cancer 71:1061-5）。また、ＰＴＫ７は急性骨髄性白血病試料において非常に過剰発現されることが分かった（Muller-Tidow et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:1241-9）。抗ＰＴＫ７抗体は癌性腫瘍の増殖を阻害するのに単独で用いられうる。あるいは、抗ＰＴＫ７抗体は、下記の他の免疫原(immunogenic agent)、標準的な癌治療または他の抗体と併用されうる。
【０３３１】
好ましい癌（その増殖が本発明の抗体を用いて阻害されうるもの）には、免疫療法に典型的に応答する癌が含まれる。これらに限らないが、治療するのに好ましい癌の例には、大腸癌（例えば小腸癌）、肺癌、乳癌、膵臓癌、メラノーマ（例えば、転移性悪性メラノーマ）、急性骨髄性白血病、腎癌、膀胱癌、卵巣癌および前立腺癌が含まれる。本発明の方法を用いて治療されうる他の癌の例には、腎癌（例えば、腎細胞癌）、神経膠芽腫、脳腫瘍、慢性もしくは急性白血病、例えば急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み核細胞リンパ腫(nodular small cleaved-cell lymphoma)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、中心芽細胞性(entroblastic)／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫癌、びまん性大細胞性Ｂ細胞性リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）のようなＴ細胞リンパ腫およびＨＩＶ関連体腔に基づくリンパ腫）、胚性癌、上咽腔の未分化癌（例えば、シュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症および他のＢ細胞リンパ腫、上咽頭癌、骨癌、皮膚癌、頭頚癌、皮膚もしくは眼球内悪性メラノーマ、子宮癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓もしくは尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳ）、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮癌、扁平上皮癌、環境誘発性癌、例えばアスベストによって誘発されるもの（例えば、中皮腫）、並びに前記癌の組合せが含まれる。
【０３３２】
さらに、様々な腫瘍細胞におけるＰＴＫ７の発現を考慮して、本発明のヒト抗体、抗体組成物および方法は、腫瘍形成障害、例えば、ＰＴＫ７を発現する腫瘍細胞の存在を特徴とする障害、例えば、大腸癌（例えば小腸癌）、メラノーマ（例えば、転移性悪性メラノーマ）、急性骨髄性白血病、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌を有する患者を治療するのに用いられうる。腫瘍形成障害を有する他の患者の例には、腎癌（例えば、腎細胞癌）、神経膠芽腫、脳腫瘍、慢性もしくは急性白血病、例えば急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ腫（例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み核細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、中心芽細胞性／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫癌、びまん性大細胞性Ｂ細胞性リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）のようなＴ細胞リンパ腫およびＨＩＶ関連体腔に基づくリンパ腫）、胚性癌、上咽腔の未分化癌（例えば、シュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症および他のＢ細胞リンパ腫、上咽頭癌、骨癌、皮膚癌、頭頚癌、皮膚もしくは眼球内悪性メラノーマ、子宮癌、直腸癌、肛門癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頚癌、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、膀胱癌、腎臓もしくは尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系腫瘍（ＣＮＳ）、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、類表皮癌、扁平上皮癌、環境誘発性癌、例えばアスベストによって誘発されるもの（例えば、中皮腫）、並びに前記癌の組合せを有する患者が含まれる。
【０３３３】
したがって、一つの態様において、本発明は、治療有効量の抗ＰＴＫ７抗体またはその抗原結合部分を患者に投与することを特徴とする、患者における腫瘍細胞の増殖の阻害方法を提供する。好ましくは、抗体はヒト抗ＰＴＫ７抗体（例えば本明細書に記載したいずれのヒト 抗ヒトＰＴＫ７抗体）である。さらにまたは別法として、抗体はキメラまたはヒト化抗ＰＴＫ７抗体でありうる。
【０３３４】
一つの態様において、本発明の抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子並びに組成物）は、ＰＴＫ７のレベルまたはその膜表面上にＰＴＫ７を含む細胞のレベルを検出するために用いられてもよく、次いでそのレベルを特定の疾患症状に連結してもよい。あるいは、同様に、特定の疾患症状の予防または寛解につながりうるＰＴＫ７の機能を阻害または遮断するのに抗体を用いて、それによってＰＴＫ７を疾患のメディエーターとして結びつけてもよい。これは、抗体とＰＴＫ７の間の複合体を形成させる条件下で、実験試料および対照試料を抗ＰＴＫ７抗体と反応させることによって達成されうる。抗体とＰＴＫ７の間で形成されるいずれの複合体も、実験試料および対照において検出および比較される。
【０３３５】
別の態様において、本発明の抗体（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子並びに組成物）は、最初に、インビトロでの治療的使用または診断的使用と関連する結合活性について試験されうる。例えば、本発明の組成物は、以下の実施例に記載したフローサイトメトリーアッセイを用いて試験されうる。
【０３３６】
本発明の抗体（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子、免疫複合体および組成物）は、ＰＴＫ７関連疾患の治療および診断においてさらなる有用性を有する。例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性または二重特異性分子並びに免疫複合体は、以下の生物活性の一つ以上をインビボまたはインビトロで引き出すのに用いられうる：ＰＴＫ７を発現する細胞の増殖を阻害および／または死滅させること；ヒトエフェクター細胞の存在下、ＰＴＫ７を発現する細胞の食作用またはＡＤＣＣを仲介すること；またはＰＴＫ７へのＰＴＫ７リガンド結合を遮断すること。
【０３３７】
特定の態様において、抗体（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子並びに組成物）は、様々なＰＴＫ７関連疾患を治療、予防または診断するのにインビボで用いられる。ＰＴＫ７関連疾患の例には、とりわけ、大腸癌（例えば小腸癌）、メラノーマ （例えば、転移性 悪性メラノーマ）、急性骨髄性白血病、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌および前立腺癌が含まれる。
【０３３８】
インビボおよびインビトロでの本発明の抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子並びに免疫複合体）の適当な投与経路は当該技術分野でよく知られており、当業者に選択されうる。例えば、抗体組成物は注射（例えば、静脈内または皮下）で投与されうる。用いられる分子の適当な投薬量は、患者の年齢および体重、並びに抗体組成物の濃度および／または製剤に依存する。
【０３３９】
先に記載したように、本発明のヒト抗ＰＴＫ７抗体は、他の一つ以上の治療剤、例えば、細胞傷害性薬剤、放射性毒性薬剤(radiotoxic agent)または免疫抑制剤と同時に投与されうる。抗体は薬剤に連結されてもよく（免疫複合体として）、または薬剤から分離して投与されてもよい。後者の場合（分離投与）、抗体は、薬剤より前、後、もしくはそれと同時に投与されてもよく、または他の公知の治療法、例えば抗癌治療（例えば照射）と同時に投与されてもよい。このような治療剤には、とりわけ、抗悪性腫瘍薬、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロランブシルおよびシクロホスファミドヒドロキシ尿素が含まれ、それらは、単独では、患者に対して毒性または準毒性がある濃度でのみ有効である。シスプラチンは、４週間に一度、１００ｍｇ／用量として静脈内投与され、アドリアマイシンは、２１日に一度、６０〜７５ｍｇ／ｍｌの用量として静脈内投与される。本発明のヒト抗ＰＴＫ７抗体またはその抗原結合断片を化学療法剤と同時に投与することによって、ヒト腫瘍細胞に細胞傷害効果をもたらす異なる機構によって作用する２つの抗癌剤が提供される。このような同時投与によって、薬物に対する耐性の発生または腫瘍細胞の抗原性における変化（それによってこれらが抗体に反応しなくなる）に起因する問題が解決されうる。
【０３４０】
異常な細胞増殖に関する疾患の予防および／または治療に使用するために本発明の抗体−パートナー分子複合体を投与する場合、約０.００１μＭ〜２０μＭの投与化合物の血中濃度が好ましく、約０.０１μＭ〜５μＭが好ましい。
【０３４１】
本明細書に記載した化合物の経口投与についての患者の用量は、典型的には約１ｍｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／日、より典型的には約１０ｍｇ／日〜約１，０００ｍｇ／日、最も典型的には約５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲にわたる。患者の体重の観点から述べると、典型的な投薬量は、約０.０１〜約１５０ｍｇ／ｋｇ／日、より典型的には約０.１〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日、最も典型的には約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば５ｍｇ／ｋｇ／日または３ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にわたる。
【０３４２】
少なくともいくつかの態様において、腫瘍増殖を遅延させ、または阻害する患者の用量は、１μｍｏｌ／ｋｇ／日以下でありうる。例えば、患者の用量は、０.９、０.６、０.５、０.４５、０.３、０.２、０.１５、または０.１μｍｏｌ／ｋｇ／日以下でありうる（薬物のモルに関して）。好ましくは、抗体−薬物複合体は、少なくとも５日間にわたって毎日の投与量を投与された場合、腫瘍の増殖を遅延させる。少なくともいくつかの態様において、腫瘍はＳＣＩＤマウスにおけるヒト型腫瘍である。例として、ＳＣＩＤマウスは、ＣＢ１７.ＳＣＩＤマウス（タコニック、ジャーマンタウン、ＮＹから入手可能）でありうる。
【０３４３】
一つの態様において、本発明の免疫複合体は、化合物（例えば、治療剤、標識、細胞毒素、放射性毒素 免疫抑制剤など）を抗体に連結することによって、このような化合物に、ＰＴＫ７細胞表面受容体を有する細胞を標的とさせるのに用いられうる。例えば、抗ＰＴＫ７抗体は、その全体が本明細書に引用される、米国特許第６，２８１，３５４号および第６，５４８，５３０号、米国特許公開第２００３００５０３３１、２００３００６４９８４、２００３００７３８５２および２００４００８７４９７に記載され、またはＷＯ ０３／０２２８０６に公開されたいずれの毒素化合物にも結合されうる。したがって、本発明はまた、ＰＴＫ７を発現するエクスビボまたはインビボ細胞を局在化させる方法も提供する（例えば、検出可能な標識、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子を用いる）。あるいは、免疫複合体は、細胞毒素または放射性毒素にＰＴＫ７を標的とさせることによって、ＰＴＫ７細胞表面受容体を有する細胞を死滅させるのに用いられうる。
【０３４４】
標的特異的エフェクター細胞、例えば、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）に連結したエフェクター細胞もまた、治療剤として用いられうる。ターゲティングのためのエフェクター細胞は、ヒト白血球、例えばマクロファージ、好中球または単球でありうる。他の細胞には、好酸球、ナチュラルキラー細胞および他のＩｇＧもしくはＩｇＡ受容体を有する細胞が含まれる。必要であれば、エフェクター細胞は治療されるべき患者から得てもよい。標的特異的エフェクター細胞は、生理学的に許容される溶液中で細胞懸濁液として投与されうる。投与される細胞の数は１０8〜１０9のオーダーでありうるが、治療目的に応じて変化する。一般に、量は、標的細胞、例えば、ＰＴＫ７を発現する腫瘍細胞での局在性を得るのに十分であり、かつ例えば、食作用によって細胞を死滅させるのに十分である。投与経路もまた変化しうる。
【０３４５】
標的特異的エフェクター細胞による治療は、標的細胞を取り除くための他の技術と併せて遂行されうる。例えば、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）および／またはこれらの組成物を有しているエフェクター細胞を用いた抗腫瘍治療は、化学療法と併用されうる。また、組合せ免疫療法を用いて、２つの異なる細胞傷害性エフェクター集団を腫瘍細胞の拒絶に向けてもよい。例えば、抗Ｆｃ−γ ＲＩまたは抗ＣＤ３に連結した抗ＰＴＫ７抗体は、ＩｇＧもしくはＩｇＡ受容体に特異的な結合剤と併せて用いられうる。
【０３４６】
本発明の二重特異性および多重特異性分子はまた、例えば細胞表面上の受容体のキャッピングおよび除去によって、エフェクター細胞におけるＦｃγＲまたはＦｃγＲ濃度を調節するのにも用いられうる。抗Ｆｃ受容体の混合物もまた、この目的に用いられうる。
【０３４７】
補体結合部位、例えば補体(complement)を結合するＩｇＧ１、−２もしくは−３またはＩｇＭからの部分を有する本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子並びに免疫複合体）もまた、補体の存在下で用いられうる。一つの態様において、本発明の結合剤を有する標的細胞および適当なエフェクター細胞を含む細胞集団のエキソビボ処置は、補体または血清含有補体を加えることによって補われうる。本発明の結合剤でコーティングした標的細胞の食作用は、補体タンパク質の結合によって改善されうる。別の態様において、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）でコーティングした標的細胞はまた、補体によって溶解してもよい。さらに別の態様において、本発明の組成物は補体を活性化しない。
【０３４８】
本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子並びに免疫複合体）はまた、補体とともに投与してもよい。したがって、ヒト抗体、多重特異性もしくは二重特異性分子および血清もしくは補体を含む組成物は、本発明の範囲内である。これらの組成物は、補体が、ヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子にごく接近して位置しているという点で有利である。あるいは、本発明のヒト抗体、多重特異性もしくは二重特異性分子および補体もしくは血清は、別々に投与されうる。
【０３４９】
したがって、本発明の抗体組成物で治療した患者は、ヒト抗体の治療効果を亢進または増大する別の治療剤、例えば細胞傷害性薬剤または放射性毒性薬剤を追加的に投与（本発明のヒト抗体の投与前、投与と同時、または投与後に）されうる。
【０３５０】
他の態様において、例えば、サイトカインで患者を治療することによって、患者は、ＦｃγまたはＦｃγ受容体の発現または活性を調節、例えば、増強または阻害する薬剤で追加的に治療されうる。多重特異性分子による治療中の投与に好ましいサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。
【０３５１】
本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）はまた、ＦｃγＲまたはＰＴＫ７を発現する細胞を標的とするため、例えばこのような細胞を標識するために用いてもよい。このような使用のために、検出されうる分子に結合剤が連結されうる。したがって、本発明は、Ｆｃ受容体、例えばＦｃγＲまたはＰＴＫ７を発現するエキソビボまたはインビトロ細胞を局在化させる方法を提供する。検出可能な標識は、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子でありうる。
【０３５２】
本発明の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性もしくは多重特異性分子、または免疫複合体）を含むキットおよび使用説明書もまた、本発明の範囲内である。キットは、一つ以上の追加の試薬、例えば免疫抑制剤、細胞傷害性薬剤もしくは放射性毒性薬剤または一つ以上の追加の本発明のヒト抗体（例えば、第１ヒト抗体と異なる、ＰＴＫ７抗原中のエピトープに結合する相補活性(complementary activity)を有するヒト抗体）をさらに含みうる。キットは、典型的には、キットの内容の意図される使用を示す標識を含む。用語「標識」には、キットにおいてもしくはキットとともに供給されるいずれの書き込み物(writing material)もしくは記録物(recorded material)、またはキットに付随するものが含まれる。
【０３５３】
本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、それはさらに限定するものと解釈されるべきではない。本願を通して引用されるすべての図およびすべての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、その全体が本明細書に明確に引用される。
【０３５４】
（実施例）
実施例１：ＰＴＫ７に対するヒトモノクローナル抗体の生成
抗原
免疫化プロトコールは、
（ｉ）ｍｙｃおよびｈｉｓタグを有するＰＴＫ７の細胞外部分を含む組換え融合タンパク質、および
（ｉｉ）膜結合型完全長ＰＴＫ７
を抗原として利用した。両方の抗原を、ＣＨＯ細胞株における組換え形質移入法によって生成した。
【０３５５】
遺伝子組換えＨｕＭａｂおよびＫＭマウス（登録商標）
ＨｕＭａｂ遺伝子組換えマウスのＨＣｏ７およびＨＣｏ１２株、並びに遺伝子組換え染色体導入マウス(transgenic transchromosomic mice)のＫＭ株（その各々はヒト抗体遺伝子を発現する）を用いて、ＰＴＫ７に対する完全ヒトモノクローナル抗体を製造した。これらのマウス株の各々において、内在性マウスκ軽鎖遺伝子は、Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820に記載されているようにホモ接合的に破壊されており、内在性マウス重鎖遺伝子は、ＰＣＴ公開ＷＯ ０１／０９１８７の実施例１に記載されているようにホモ接合的に破壊されている。これらのマウス株の各々は、Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851に記載されているように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子，ＫＣｏ５を保有する。米国特許第５，７７０，４２９号；第５，５４５，８０６号；第５，６２５，８２５号；および第５，５４５，８０７号に記載されているように、ＨＣｏ７株はＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を保有する。ＷＯ ０１／０９１８７の実施例２またはＷＯ ０１／１４４２４の実施例２に記載されているように、ＨＣｏ１２株はＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を保有する。ＫＭ株には、ＰＣＴ公開ＷＯ ０２／４３４７８に記載されているように、ＳＣ２０トランス染色体が含まれる。
【０３５６】
ＨｕＭａｂおよびＫＭ免疫化：
ＰＴＫ７に対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成するために、精製した組換えＰＴＫ７融合タンパク質およびＰＴＫ７形質移入ＣＨＯ細胞を抗原として用いて、ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウス（登録商標）を免疫化した。ＨｕＭａｂマウスについての一般的な免疫化スキームは、Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびＰＣＴ公開ＷＯ ９８／２４８８４に記載されている。マウスは、抗原の最初の注入後、生後６〜１６週間であった。ＰＴＫ７融合タンパク質抗原および５〜１０×１０6細胞の精製した組換え調製物（５〜５０μｇ）を用いて、ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウス（登録商標）を、腹腔内に、皮下（Ｓｃ）に、または足蹠注射(footpad injection)によって、免疫化した。
【０３５７】
遺伝子組換えマウスを、完全フロイントアジュバントまたはＲｉｂｉアジュバントＩＰ中、抗原で２回免疫化し、その後、不完全フロイントアジュバントまたはＲｉｂｉアジュバント中、抗原で３〜２１日 ＩＰ（合計１１の免疫化まで）を行った。免疫応答を眼窩後方からの採血(retroorbital bleed)によってモニターした。血漿をＥＬＩＳＡ（下記）によってスクリーニングし、十分な力価の抗ＰＴＫ７ヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合に用いた。マウスを静脈内に抗原で追加免疫し、３日後に屠殺および脾摘した。典型的には、各抗原について１０〜３５の融合を行った。各抗原について数ダースのマウスを免疫化した。
【０３５８】
抗ＰＴＫ７抗体を産生するＨｕＭａｂまたはＫＭマウス（登録商標）の選択：
ＰＴＫ７を結合する抗体を産生するＨｕＭａｂまたはＫＭマウス（登録商標）を選択するために、Fishwild, D. et al. (1996)に記載されているように、免疫化マウスからの血清をＥＬＩＳＡで試験した。簡単に言えば、４℃で終夜インキュベートし、次いで２００μｌ／ウェルの５％ ウシ胎児血清のＰＢＳ／ツイーン溶液（０.０５％）で遮断したＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）中、１〜２μｇ／ｍｌで、マイクロタイタープレートを、形質移入ＣＨＯ細胞から精製した組換えＰＴＫ７融合タンパク質でコーティングした。ＰＴＫ７免疫化マウスからの血清の希釈液を各ウェルに加え、周囲温度で１〜２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／ツイーンで洗浄し、次いで室温で１時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体とインキュベートした。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（シグマ、Ａ−１８８８、０.２２ｍｇ／ｍｌ）を用いて展開し、ＯＤ ４１５−４９５で分光光度計によって分析した。最も高い力価の抗ＰＴＫ７抗体を発生させたマウスを融合に用いた。下記のように融合を行い、ＥＬＩＳＡによって、抗ＰＴＫ７活性についてハイブリドーマ上清を試験した。
【０３５９】
ＰＴＫ７に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成：
標準プロトコールに基づいて、ＨｕＭａｂマウスから単離したマウス脾細胞を、ＰＥＧでマウス骨髄腫細胞株に融合した。次いで抗原特異的抗体の生成のために、生じたハイブリドーマをスクリーニングした。免疫化マウスからの脾細胞の単一細胞懸濁液を、５０％ ＰＥＧ（シグマ）とともに、４分の１の数のＳＰ２／０ 非分泌型マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ １５８１）に融合した。平底マイクロタイタープレートにおいて、約１×１０5／ウェルで細胞を蒔き、続いて１０％ ウシ胎児血清、１０％ Ｐ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ ＴＩＢ−６３）馴化培地、３〜５％ ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）のＤＭＥＭ溶液（メディアテック、ＣＲＬ １００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含む）、並びに５ｍＭ ヘペス、０.０５５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍｌ ゲンタマイシンおよび１× ＨＡＴ（シグマ、ＣＲＬ Ｐ−７１８５）を含む選択培地中で約２週間インキュベーションを行った。１〜２週間後、細胞を、ＨＡＴをＨＴと置き換えた培地中で培養した。次いで個々のウェルを、ヒト抗ＰＴＫ７モノクローナルＩｇＧ抗体についてＥＬＩＳＡ（上記）でスクリーニングした。一旦、広範なハイブリドーマの増殖が生じたら、通常１０〜１４日後に培地をモニターした。抗体を分泌するハイブリドーマを再び蒔き、再度スクリーニングし、ヒトＩｇＧに対してまだ陽性である場合には、希釈を制限することによって、抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体を少なくとも２回サブクローニングした。次いで安定なサブクローンをインビトロで培養して、さらなる評価のために、組織培地中で少量の抗体を生成した。
ハイブリドーマクローン３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８をさらなる分析のために選択した。
【０３６０】
実施例２：ヒトモノクローナル抗体３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８の構造評価
標準ＰＣＲ法を用いて、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を、それぞれ、３Ｇ８、３Ｇ８ａ、４Ｄ５、１２Ｃ６、１２Ｃ６ａおよび７Ｃ８ハイブリドーマから得て、標準ＤＮＡ配列決定法を用いて配列決定した。
【０３６１】
３Ｇ８の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図１Ａ並びに配列番号：４１および１に示す。
３Ｇ８の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図１Ｂ並びに配列番号：４５および５に示す。
【０３６２】
３Ｇ８重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することによって、３Ｇ８重鎖が、ヒト生殖系列ＶＨ ３−３０.３からのＶＨセグメント、未決定のＤセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ ４ｂからのＪＨセグメントを利用していることが説明された。生殖系列ＶＨ ３−３０.３配列に対する３Ｇ８ ＶＨ配列のアラインメントを図５に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いた３Ｇ８ ＶＨ配列のさらなる解析によって、それぞれ、図１Ａおよび５、並びに配列番号：１１、１５および１９に示されるように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写がもたらされた。
【０３６３】
３Ｇ８軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することによって、３Ｇ８軽鎖が、ヒト生殖系列ＶＫ Ｌ１５からのＶLセグメントおよびヒト生殖系列ＪＫ１からのＪＫセグメントを利用していることが説明された。生殖系列ＶＫ Ｌ１５配列に対する３Ｇ８ ＶＬ配列のアラインメントを図９に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いた３Ｇ８ ＶＬ配列のさらなる解析によって、それぞれ、図１Ｂおよび９、並びに配列番号：２３、２９および３５に示されるように、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写がもたらされた。
【０３６４】
３Ｇ８の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図１Ａ並びに配列番号：４１および１に示す。
３Ｇ８の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図１Ｃ並びに配列番号：４６および６に示す。
【０３６５】
３Ｇ８重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することによって、３Ｇ８重鎖が、ヒト生殖系列ＶＨ ３−３０.３からのＶＨセグメント、未決定のＤセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ ４ｂからのＪＨセグメントを利用していることが説明された。生殖系列ＶＨ ３−３０.３配列に対する３Ｇ８ａ ＶＨ配列のアラインメントを図５に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いた３Ｇ８ａ ＶＨ配列のさらなる解析によって、それぞれ、図１Ａおよび５、並びに配列番号：１１、１５および１９に示されるように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写がもたらされた。
【０３６６】
３Ｇ８軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することによって、３Ｇ８軽鎖が、ヒト生殖系列ＶＫ Ｌ１５からのＶＬセグメントおよびヒト生殖系列ＪＫ３からのＪＫセグメントを利用していることが説明された。生殖系列ＶＫ Ｌ１５配列に対する３Ｇ８ａ ＶＬ配列のアラインメントを図９に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いた３Ｇ８ａ ＶＬ配列のさらなる解析によって、それぞれ、図１Ｃおよび９、並びに配列番号：２４、３０および３６に示されるように、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写がもたらされた。
【０３６７】
４Ｄ５の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図２Ａ並びに配列番号：４２および２に示す。
４Ｄ５の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図２Ｂ並びに配列番号：４７および７に示す。
【０３６８】
４Ｄ５重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することによって、４Ｄ５重鎖が、ヒト生殖系列ＶＨ ３−３０.３からのＶＨセグメント、未決定のＤセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ ４ｂからのＪＨセグメントを利用していることが説明された。生殖系列ＶＨ ３−３０.３配列に対する４Ｄ５ ＶＨ配列のアラインメントを図６に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いた４Ｄ５ ＶＨ配列のさらなる解析によって、それぞれ、図２Ａおよび６、並びに配列番号：１２、１６および２０に示されるように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写がもたらされた。
【０３６９】
４Ｄ５軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することによって、４Ｄ５軽鎖が、ヒト生殖系列ＶＫ Ａ１０からのＶＬセグメントおよびヒト生殖系列ＪＫ５からのＪＫセグメントを利用していることが説明された。生殖系列ＶＫ Ａ１０配列に対する４Ｄ５ ＶＬ配列のアラインメントを図１０に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いた４Ｄ５ ＶＬ配列のさらなる解析によって、それぞれ、図２Ｂおよび１０、並びに配列番号：２５、３１および３７に示されるように、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写がもたらされた。
【０３７０】
１２Ｃ６の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図３Ａ並びに配列番号：４３および３に示す。
１２Ｃ６の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図３Ｂ並びに配列番号：４８および８に示す。
【０３７１】
１２Ｃ６重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することによって、１２Ｃ６重鎖が、ヒト生殖系列ＶＨ ＤＰ４４からのＶＨセグメント、未決定のＤセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ ４ｂからのＪＨセグメントを利用していることが説明された。生殖系列ＶＨ ＤＰ４４配列に対する１２Ｃ６ ＶＨ配列のアラインメントを図７に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いた１２Ｃ６ ＶＨ配列のさらなる解析によって、それぞれ、図３Ａおよび７、並びに配列番号：１３、１７および２１に示されるように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写がもたらされた。
【０３７２】
１２Ｃ６軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することによって、１２Ｃ６軽鎖が、ヒト生殖系列ＶＫ Ａ２７からのＶＬセグメントおよびヒト生殖系列ＪＫ２からのＪＫセグメントを利用していることが説明された。生殖系列ＶＫ Ａ２７配列に対する１２Ｃ６ ＶＬ配列のアラインメントを図１１に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いた１２Ｃ６ ＶＬ配列のさらなる解析によって、それぞれ、図３Ｂおよび１１、並びに配列番号：２６、３２および３８に示されるように、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写がもたらされた。
【０３７３】
１２Ｃ６の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図３Ａ並びに配列番号：４３および３に示す。
１２Ｃ６の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図３Ｃ並びに配列番号：４９および９に示す。
１２Ｃ６重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することによって、１２Ｃ６重鎖が、ヒト生殖系列ＶＨ ＤＰ４４からのＶＨセグメント、未決定のＤセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ ４ｂからのＪＨセグメントを利用していることが説明された。生殖系列ＶＨ ＤＰ４４配列に対する１２Ｃ６ ＶＨ配列のアラインメントを図７に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いた１２Ｃ６ａ ＶＨ配列のさらなる解析によって、それぞれ、図３Ａおよび７、並びに配列番号：１３、１７および２１に示されるように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写がもたらされた。
【０３７４】
１２Ｃ６軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することによって、１２Ｃ６軽鎖が、ヒト生殖系列ＶＫ Ｌ１５からのＶＬセグメントおよびヒト生殖系列ＪＫ２からのＪＫセグメントを利用していることが説明された。生殖系列ＶＫ Ｌ１５配列に対する１２Ｃ６ａ ＶＬ配列のアラインメントを図１２に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いた１２Ｃ６ａ ＶＬ配列のさらなる解析によって、それぞれ、図３Ｃおよび１２、並びに配列番号：２７、３３および３９に示されるように、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写がもたらされた。
【０３７５】
７Ｃ８の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図４Ａ並びに配列番号：４４および４に示す。
７Ｃ８の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ、図４Ｂ並びに配列番号：５０および１０に示す。
【０３７６】
７Ｃ８重鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン重鎖配列と比較することによって、７Ｃ８重鎖が、ヒト生殖系列ＶＨ ３−３３からのＶＨセグメント、ヒト生殖系列３−１０からのＤセグメント、およびヒト生殖系列ＪＨ ６ｂからのＪＨセグメントを利用していることが説明された。生殖系列ＶＨ ３−３３配列に対する７Ｃ８ ＶＨ配列のアラインメントを図８に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いた７Ｃ８ ＶＨ配列のさらなる解析によって、それぞれ、図４Ａおよび８、並びに配列番号：１４、１８および２２に示されるように、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写がもたらされた。
【０３７７】
７Ｃ８軽鎖免疫グロブリン配列を公知のヒト生殖系列免疫グロブリン軽鎖配列と比較することによって、７Ｃ８軽鎖が、ヒト生殖系列ＶＫ Ｌ６からのＶＬセグメントおよびヒト生殖系列ＪＫ３からのＪＫセグメントを利用していることが説明された。生殖系列ＶＫ Ｌ６配列に対する７Ｃ８ ＶＬ配列のアラインメントを図１３に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いた７Ｃ８ ＶＬ配列のさらなる解析によって、それぞれ、図４Ｂおよび１３、並びに配列番号：２８、３４および４０に示されるように、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３領域の描写がもたらされた。
【０３７８】
実施例３：ｍＡｂ １２Ｃ６の変異および別の生殖系列の使用
上記の実施例２で議論されるように、モノクローナル抗体１２Ｃ６および１２Ｃ６ａは、ＨｕＭａｂマウス（登録商標）系統のＨＣｏ７導入遺伝子に存在しているヒトＤＰ−４４生殖系列配列から生じる重鎖可変領域を利用している。ＤＰ−４４は天然のヒト免疫グロブリンレパートリーに利用される生殖系列配列ではないので、１２Ｃ６および１２Ｃ６ａのＶＨ配列を変異させて、潜在的な免疫原生を減少させることは有利でありうる。好ましくは、１２Ｃ６または１２Ｃ６ａ ＶＨ配列の一つ以上のフレームワーク残基は、天然のヒト免疫グロブリンレパートリーに利用される構造上関連のあるＶＨ生殖系列配列のフレームワークに存在している残基に変異される。例えば、図７は、１２Ｃ６および１２Ｃ６ａ ＶＨ配列とＤＰ４４生殖系列配列とのアラインメントを示し、また、２つの構造上関連のあるヒト生殖系列配列，ＶＨ ３−２３およびＶＨ ３−７とのアラインメントも示す。これらの配列の関連性が与えられると、ヒトＰＴＫ７に特異的に結合し、かつＶＨ ３−２３またはＶＨ ３−７生殖系列配列から生じるＶＨ領域を利用するヒト抗体が選択できることが予測されうる。さらに、比較可能な位置でＶＨ ３−２３またはＶＨ ３−７配列中の残基と異なる１２Ｃ６または１２Ｃ６ａ ＶＨ配列中の一つ以上の残基を、ＶＨ ３−２３またはＶＨ ３−７に存在している残基に、またはその保存された置換アミノ酸に変異させることができる。
【０３７９】
実施例４：抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体の結合特異性および結合速度論の評価
この例において、抗ＰＴＫ７抗体の結合親和性および結合速度論をビアコア分析によって試験した。結合特異性、およびクロス競合をフローサイトメトリーによって試験した。
【０３８０】
フローサイトメトリーによる結合特異性
細胞表面で組換えヒトＰＴＫ７を発現するＨＥＫ３細胞株を開発し、フローサイトメトリーでＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体の特異性を測定するのに用いた。膜貫通型ＰＴＫ７をコードする完全長ｃＤＮＡを含む発現プラスミドをＨＥＫ３細胞に形質移入した。１０μｇ／ｍｌの濃度で抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体を形質移入した細胞をインキュベートすることによって、７Ｃ８抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体の結合を評価した。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ Ａｂを用いて結合を検出した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン、サンノゼ、ＣＡ）を用いて、フローサイトメトリー分析を行った。結果を図１４に描く。抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体７Ｃ８は、ＰＴＫ７を形質移入したＨＥＫ３細胞に結合したが、ヒトＰＴＫ７を形質移入していなかったＨＥＫ３細胞には結合しなかった。このデータは、ＰＴＫ７についての抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体の特異性を示す。
【０３８１】
ＥＬＩＳＡによる結合特異性
抗ＰＴＫ７抗体の結合を標準ＥＬＩＳＡによってもまた評価して、ＰＴＫ７についての結合の特異性を試験した。
ＰＴＫ７の組換え細胞外ドメインを、異なる濃度での抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６および１２Ｃ６ａに対する結合について試験した。標準ＥＬＩＳＡの手順を行った。抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体を出発濃度１０μｇ／ｍｌで加え、１：２の希釈で段階希釈した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ（κ鎖特異的）ポリクローナル抗体を二次抗体として用いた。結果を図１５に示す。抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６および１２Ｃ６ａの各々は、ＰＴＫ７に結合した。このデータは、ＰＴＫ７についての抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体の特異性を示す。
【０３８２】
抗ＰＴＫ７抗体のエピトープマッピング
フローサイトメトリーを用いて、抗ＰＴＫ７ＨｕＭａｂのエピトープ分類を決定した。ウィルムス腫瘍細胞Ｇ−４０１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４４１）に、膜貫通型ＰＴＫ７をコードする完全長ｃＤＮＡを含む発現プラスミドを形質移入した。１０μｇ／ｍｌの冷たい抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体を形質移入した細胞（１×１０5）をインキュベートすることによって、各抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体のエピトープ結合を評価し、洗浄し、続いて１０μｇ／ｍｌの蛍光結合抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体を加えた。ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ Ａｂを用いて結合を検出した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン、サンノゼ、ＣＡ）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。データを分析して、抗ＰＴＫ７抗体を、３つのエピトープ群−Ａ群（７Ｄ１１を含む）、Ｂ群（３Ｇ８および３Ｇ８ａを含む）並びにＣ群（７Ｃ８、１２Ｃ６および１２Ｃ６ａを含む）に分類した。
【０３８３】
実施例５：ヒト癌細胞の表面上に発現したＰＴＫ７への抗ＰＴＫ７抗体結合の評価
腎芽腫ウィルムス腫瘍細胞株Ｇ−４０１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４４１）を、異なる濃度でのＨｕＭａｂ抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体１２Ｃ６および７Ｃ８の結合について試験した。出発濃度３０μｇ／ｍｌでの抗体を有する細胞（１×１０5）をインキュベートし、１：１０の希釈で抗体を段階希釈することによって、抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体の結合を評価した。細胞を洗浄し、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ Ａｂを用いて結合を検出した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン、サンノゼ、ＣＡ）を用いて、フローサイトメトリー分析を行った。結果を図１６に示す。染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されるように、濃度依存的様式で、抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体１２Ｃ６および７Ｃ８は腎芽腫ウィルムス腫瘍細胞株に結合した。抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体１２Ｃ６および７Ｃ８についてのＥＣ50値は、それぞれ、４.０ｎＭおよび３.４ｎＭであった。
これらのデータは、抗ＰＴＫ７ ＨｕＭａｂが腎癌細胞株に結合することを示す。
【０３８４】
実施例６：ヒト抗ＰＴＫ７抗体の癌細胞株への結合
フローサイトメトリーによって、様々な癌細胞株への結合について抗ＰＴＫ７抗体を試験した。
１０μｇ／ｍｌの濃度で抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体を有する癌細胞株をインキュベートすることによって、癌細胞株のパネルへの３Ｇ８、１２Ｃ６ａ、４Ｄ５および１２Ｃ６抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体の結合を評価した。試験された癌細胞株は、Ａ−４３１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５５５）、ウィルムス腫瘍細胞Ｇ−４０１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４４１）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−８５）、ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−７７）、ＰＣ３（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４３５）、ＤＭＳ１１４（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−２０６６）、ＡＣＨＮ（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１６１１）、ＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１７４０）、ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−８１）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ受入番号ＣＣＬ−２２９）およびＭＩＡ ＰａＣａ−２（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４２０）であった。アイソタイプ対照抗体を負の対照として用いた。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ Ａｂを用いて結合を検出した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン、サンノゼ、ＣＡ）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。結果を図１７に示す。染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されるように、抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体３Ｇ８、１２Ｃ６ａ、４Ｄ５および１２Ｃ６は、癌細胞株Ａ−４３１、ウィルムス腫瘍細胞Ｇ−４０１、Ｓａｏｓ−２、ＳＫＯＶ−３、ＰＣ３、ＤＭＳ１１４、ＡＣＨＮ、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５、ＬｏＶｏおよびＭＩＡ ＰａＣａ−２に結合した。これらのデータは、抗ＰＴＫ７ ＨｕＭａｂが、細胞表面ＰＴＫ７を発現する様々な癌細胞に結合することを示す。
【０３８５】
実施例７：ヒトＴ、Ｂおよび樹状細胞への抗ＰＴＫ７の結合
フローサイトメトリーによって、その細胞表面上にＰＴＫ７を発現するＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ１９＋ Ｂ細胞およびヒト血液骨髄樹状細胞への結合について、抗ＰＴＫ７抗体を試験した。
【０３８６】
ヒトＴ細胞を抗ＣＤ３抗体によって活性化して、Ｔ細胞においてＰＴＫ７発現を誘導し、次いでヒト抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体と結合させた。１０μｇ／ｍｌの濃度で抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体を用いて細胞をインキュベートすることによって、７ｃ８抗ＰＴＫ７ヒトモノクローナル抗体の結合を評価した。いくつかの実験において、ＴおよびＢ細胞特異的マーカーを結合する公知の抗体を正の対照として用いた。細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ Ａｂを用いて結合を検出した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン、サンノゼ、ＣＡ）を用いてフローサイトメトリー分析を行った。結果を図１８（活性化ヒトＴ細胞およびＢ細胞）および１９（樹状細胞）に示す。染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されるように、抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体７Ｃ８は、活性化ヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞および樹状細胞に結合したが、Ｂ細胞には結合しなかった。これらのデータは、抗ＰＴＫ７ ＨｕＭａｂがヒトＴ細胞および樹状細胞に結合することを示す。
【０３８７】
実施例８：抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体の内部移行
Ｈｕｍ−Ｚａｐ内部移行アッセイを用いて、ＰＴＫ７発現細胞株の中に内部移行する能力について、抗ＰＴＫ７ ＨｕＭａｂを試験した。Ｈｕｍ−Ｚａｐアッセイは、細胞毒素のサポリンに結合したヒトＩｇＧに対する親和性を有する二次抗体の結合を通して、一次ヒト抗体の内部移行について試験する。
【０３８８】
１００μｌウェルにおいて、１×１０4細胞／ウェルで、ＰＴＫ７発現癌細胞株ウィルムス腫瘍Ｇ−４０１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４４１）、Ａ−４３１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１５５５）およびＰＣ３（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４３５）を直接蒔いた(seeded)。抗ＰＴＫ７ ＨｕＭａｂ抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６または７Ｃ８を出発濃度３０ｎＭでウェルに加え、１：３の段階希釈で滴下した(titrated down)。ＰＴＫ７に対して非特異的なアイソタイプ対照抗体を負の対照として用いた。Ｈｕｍ−Ｚａｐ（アドバンスド・ターゲティング・システムズ、サンディエゴ、ＣＡ、ＩＴ−２２−２５）を１１ｎＭの濃度で加え、プレートを７２時間インキュベートした。次いでプレートに１.０μＣｉの3Ｈ−チミジンを２４時間適用し、収集し、トップカウント シンチレーションカウンター（パッカード・インスツルメンツ、メリデン、ＣＴ）において読み取った。結果を図２０Ａ−Ｄに示す。抗ＰＴＫ７抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６および７Ｃ８は、ＰＴＫ７発現ウィルムス腫瘍癌細胞株における3Ｈ−チミジン取込みの抗体濃度依存的な減少を示した。抗ＰＴＫ７抗体１２Ｃ６および７Ｃ８は、ＰＴＫ７発現癌細胞株Ａ−４３１およびＰＣ３における3Ｈ−チミジン取込みの抗体濃度依存的な減少を示した。ウィルムス腫瘍細胞における抗ＰＴＫ７抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６および７Ｃ８についてのＥＣ50値は、それぞれ、０.６ｎＭ、０.３ｎＭ、０.２ｎＭおよび０.２ｎＭであった。Ａ−４３１細胞における抗ＰＴＫ７抗体１２Ｃ６および７Ｃ８についてのＥＣ50値は、それぞれ、０.２ｎＭおよび０.２ｎＭであった。ＰＣ３腫瘍細胞における抗ＰＴＫ７抗体１２Ｃ６および７Ｃ８についてのＥＣ50値は、それぞれ、０.３ｎＭおよび０.３ｎＭであった。このデータは、抗ＰＴＫ７抗体３Ｇ８、４Ｄ５、１２Ｃ６および７Ｃ８が癌細胞に内部移行することを示す。
【０３８９】
実施例９：ヒト癌細胞株における細胞毒素結合抗ＰＴＫ７抗体の細胞死滅の評価
この例において、細胞毒素に結合した抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体が、細胞増殖アッセイにおいて、ＰＴＫ７＋ヒト癌細胞株を死滅させることが示された。抗ＰＴＫ７抗体は、リンカー、例えばペプチジル、ヒドラゾンまたはジスルフィドリンカーによって細胞毒素に結合しうる。本発明の抗体並びにリンカーに結合しうる細胞毒素化合物の例は、本明細書および２００５年９月２６日に出願された米国特許出願第６０／７２０，４９９（その全体が本明細書に引用される）に記載されている。
【０３９０】
抗ＰＴＫ７抗体１Ｆ１２（配列番号：８４−９８）を本明細書に開示した式（ｑ）に結合して、１Ｆ１２−式（ｑ）を生成した。結合を以下のように行った：Ｎａ−リン酸（１００ｍＭ）、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＤＴＰＡ（２ｍＭ）、ｐＨ ８.０中、約５ｍｇ／ｍｌでの抗体を、混合し続けながら、室温で１時間、１５倍モル過剰の２−イミノチオランでチオール化した。チオール化の後、チオール化１Ｆ１２を、ＰＤ１０カラム（セファデックス Ｇ−２５）によって、結合緩衝液（５０ｍＭ ヘペス、５ｍＭ グリシン、３％ グリセロール、ｐＨ ６.０）に緩衝液交換した。チオール化抗体の濃度およびチオール濃度を測定した。式（ｑ）のＤＭＳＯ溶液のストック（５ｍＭ）を、抗体のチオールあたり３倍モル過剰で加え、室温で９０分間混合した。結合した抗体を０.２μｍフィルターに通して濾過した。５０ｍＭ ヘペス、５ｍＭ グリシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７.２中で実行したセファクリル−２００サイズ排除カラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィによって、生じた複合体を精製した。単量体の抗体複合体を含む画分をプールし、限外濾過によって濃縮した。２８０および３４０ｎｍで吸光度を測定することによって、抗体複合体濃度および置換比(substitution ratio)を決定した。
【０３９１】
ＰＴＫ７発現ウィルムス腫瘍ヒト腎癌細胞株Ｇ−４０１（ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４４１）を、１００μｌ ウェルにおいて１０4細胞／ウェルで３時間蒔いた。１Ｆ１２−式（ｐ）を出発濃度１００ｎＭでウェルに加え、１：３の段階希釈で滴下した。プレートを４８時間インキュベートした。次いでプレートに１μＣｉの3Ｈ−チミジンを２４時間適用し、次いで培養を終了し、収集し、トップカウント シンチレーションカウンター（パッカード・インスツルメンツ、メリデン、ＣＴ）において読み取った。図２１は、１Ｆ１２−式（ｑ）の濃度の増加に伴う、ＰＴＫ７発現ウィルムス腫瘍ヒト腎癌細胞株への3Ｈ−チミジン取込みの減少を示す。これらのデータは、細胞毒素に結合した抗ＰＴＫ７抗体がヒト腎癌細胞に対する特異的な細胞傷害性を示すことを説明している。
【０３９２】
実施例１０：ヒト腫瘍細胞株における細胞毒素結合抗ＰＴＫ７抗体の細胞死滅の評価
この例において、細胞毒素に結合した抗ＰＴＫ７モノクローナル抗体が、細胞増殖アッセイにおける細胞表面でＰＴＫ７を低発現、中発現または高発現するＰＴＫ７+ヒト腫瘍細胞株を死滅させることが示された。
【０３９３】
抗ＰＴＫ７ ＨｕＭａｂ抗体１２Ｃ６ａを式（ｐ）に結合し、本明細書で１２Ｃ６ａ−式（ｐ）と呼ばれる抗体複合体を得た。１２Ｃ６ａの式（ｐ）への結合を以下のように行った：１００ｍＭ Ｎａ−リン酸、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＰＡ、ｐＨ ８.０中の１２Ｃ６ａ（約５ｍｇ／ｍｌ）を、１５倍モル過剰の２−イミノチオランでチオール化した。混合し続けながら、室温で１時間、チオール化反応を進行させた。チオール化の後、抗体を、ＰＤ１０カラム（セファデックスＧ−２５）によって、結合緩衝液（５０ｍＭ ヘペス、５ｍＭ グリシン、３％ グリセロール、ｐＨ ６.０）に緩衝液交換した。チオール化抗体の濃度およびチオール濃度を測定した。
【０３９４】
次いで式（ｑ）のＤＭＳＯ溶液の５ｍＭストックを、抗体のチオールあたり３倍モル過剰で加え、室温で９０分間混合した。結合した抗体を０.２μｍフィルターに通して濾過した。５０ｍＭ ヘペス、５ｍＭ グリシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７.２中で実行したセファクリル−２００サイズ排除カラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィによって、生じた複合体を精製した。単量体の抗体複合体を含む画分をプールし、限外濾過によって濃縮した。２８０および３４０ｎｍで吸光度を測定することによって、抗体複合体濃度および置換比を決定した。
【０３９５】
ＰＴＫ７発現ヒト腫瘍癌細胞株Ａ−４３１、ＳＫＯＶ３、およびＬｏＶｏを、１００μｌ ウェルにおいて１０4細胞／ウェルで蒔いた。標準ＦＡＣＳアッセイでＰＴＫ７の細胞表面発現について、細胞株をあらかじめ試験した。Ａ−４３１細胞株は最も高いレベルのＰＴＫ７細胞表面発現をし、ＬｏＶｏ細胞株は最も低いレベルのＰＴＫ７細胞表面発現をした。１２Ｃ６ａ−式（ｐ）を出発濃度２０ｎＭでウェルに加え、１：２の段階希釈で滴下した。アイソタイプ対照抗体を負の対照として用いた。プレートを３時間インキュベートし、非結合の（遊離）抗体−細胞毒素複合体を洗い出した。プレートを９６時間インキュベートし続け、細胞死滅活性（ＦＵ、蛍光単位(fluorescent unit)）を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光アッセイ（プロメガ、ＷＩ、ＵＳＡ、技術告示(Technical bulletin) Ｎｏ．２８８）およびＢＩＯ−ＴＥＫリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋインスツルメンツ社、ＶＴ、USA）を用いて測定した。結果を図２２に示す。１２Ｃ６ａ−式（ｐ）は、すべての３つの細胞株で、生細胞において濃度依存的な減少を示し、このことは、細胞毒素に結合した抗ＰＴＫ７抗体が様々なヒト癌細胞に対して特異的な細胞傷害性を示すことを説明している。
【０３９６】
実施例１１：３Ｇ８、１２Ｃ６ａ、２Ｅ１１および７Ｃ８を用いた免疫組織化学
抗ＰＴＫ７ ＨｕＭａｂ ３Ｇ８、１２Ｃ６ａ、２Ｅ１１および７Ｃ８が免疫組織化学によりＰＴＫ７を認識する能力を、肺癌、乳癌、腎癌、膀胱癌、膵臓癌、大腸癌、卵巣癌、小腸癌、前立腺癌、メラノーマ、および頭頚癌からの臨床生検を用いて試験した。
【０３９７】
免疫組織化学について、５μｍ 凍結切片を用いた（アーデイス(Ardais)社、ＵＳＡ）。３０分間乾燥した後、切片をアセトンで固定し（室温で１０分間）、５分間風乾した。スライドをＰＢＳですすぎ、次いで２０分間、１０％ 標準ヤギ血清のＰＢＳ溶液とプレインキュベートし、続いて、室温で３０分間、１０％ 標準ヤギ血清を含む１０μｇ／ｍｌ ｆｉｔｃ標識した(fitcylated)３Ｇ８、１２Ｃ６ａまたは２Ｅ１１抗体のＰＢＳ溶液とインキュベートした。次に、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、室温で３０分間、マウス抗ＦＩＴＣ（１０μｇ／ｍｌ ＤＡＫＯ）とインキュベートした。スライドをＰＢＳで再度洗浄し、室温で３０分間、ヤギ抗マウスＨＲＰ複合体（ＤＡＫＯ）とインキュベートした。スライドをＰＢＳで再度（３×）洗浄した。ジアミノベンジジン（シグマ）を基質として用い、茶色染色がもたらされた。蒸留水で洗浄した後、スライドをヘマトキシリンで１時間対比染色した。続いて、蒸留水を流してスライドを１０秒間洗浄し、グリセルゲル（ＤＡＫＯ）に取り付けた。臨床生検免疫組織化学染色によって、肺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、大腸癌、卵巣癌、小腸癌および前立腺癌切片においてポジティブ染色が示された。標準組織は通常、ＰＴＫ７染色に対して陰性であったが、悪性組織の中で、癌活性化線維芽細胞および癌性上皮細胞はＰＴＫ７染色に対して陽性であることが観察された。線維芽細胞活性化タンパク質抗体（ＦＡＰ、アレクシスバイオケミカルズ(Alexis Biochemicals)、サンディエゴ、ＵＳＡ）を用いた染色によって、膀胱癌および乳癌の切片で癌活性化線維芽細胞の同一性が確認された。ＦＡＰは、癌活性化線維芽細胞の公知のマーカーである（Hofheinz et al. (2003) Oncologie 26:44-48）。
【０３９８】
７Ｃ８の最終濃度が５μｇ／ｍｌとなるように、７Ｃ８をＦｉｔｃ標識ヤギ抗ヒトＦａｂ（ジャクソン ＃ １０９−０９７−００３）とあらかじめ結合させた。次いでこの複合体を標準ＩＨＣ法とともに用いて、結合を決定した。７Ｃ８は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌（小細胞および非小細胞）、メラノーマ、腎癌、大腸癌、乳癌、膀胱癌および頭頚癌に結合した。
【０３９９】
実施例１２：浸潤アッセイ
この例において、ＰＴＫ７を形質移入したＣＨＯ細胞株において細胞浸潤する能力について、ＰＴＫ７に対する抗体を試験した。プロトコールに従って、ＨＴＳ ９６マルチウェルインサートシステム（Ｃａｔ＃ ３５１１６２、ＢＤバイオサイエンス、ＣＡ）を用いてアッセイを行った。細胞を挿入ウェル(insert)の中に加える前に、ＣＨＯ親細胞株、完全長ＰＴＫ７を形質移入したＣＨＯ細胞、または対照ＨＥＫ２９３細胞株を、抗ＰＴＫ７ ＨｕＭａｂのプールまたはアイソタイプ対照抗体と混合した。混合物（細胞＋Ａｂプール）を、浸潤プレートにおける挿入ウェル(insert well)の中に加えた。３７℃で２４時間、５％ ＣＯ2とインキュベートした後、蛍光色素を用いて細胞を標識し、膜の底に浸潤した細胞を、蛍光プレートリーダーを用いて定量化した。結果を図２３に示す。このデータは、抗ＰＴＫ７抗体が、細胞表面上のＰＴＫ７を発現する細胞の浸潤移動を阻害することを示す。
【０４００】
実施例１３：無修飾および細胞毒素結合抗ＰＴＫ７抗体を用いたインビボ膵臓癌細胞異種移植モデルの処置
この実施例は、細胞毒素結合抗ＰＴＫ７抗体が、膵臓細胞癌腫瘍を埋め込んだマウスにおける腫瘍増殖を阻害することを示す。本発明の抗体に結合されうる細胞毒素化合物の例は、係属中の米国特許出願第１１／１３４，８２６号（その全体が本明細書に引用される）に記載された。本明細書に記載した２つのＨｕＭａｂ 抗ＰＴＫ７抗体−毒素複合体を試験した：７Ｃ８−式（ｏ）および７Ｃ８−式（ｐ）。
【０４０１】
上記の実施例１０に記載したプロトコールを用いて、式（ｐ）を７Ｃ８に結合した。以下のように、式（ｏ）を７Ｃ８に結合した：１００ｍＭ Ｎａ−リン酸、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＰＡ、ｐＨ ８.０中の７Ｃ８（約５ｍｇ／ｍｌ）を、混合し続けながら、室温で１時間、１５倍モル過剰の２−イミノチオランでチオール化した。次いで抗体を、ＰＤ１０カラム（セファデックス Ｇ−２５）によって、結合緩衝液（５０ｍＭ ヘペス、５ｍＭ グリシン、０.５％ ポビドン （１０Ｋ） ２ｍＭ ＤＴＰＡ、ｐＨ ５.５）に緩衝液交換した。チオール化抗体の濃度およびチオール濃度を測定した。式（ｏ）（ｒ＝４）のＤＭＳＯ溶液のストック（５ｍＭ）を、抗体のチオールあたり３倍モル過剰で加え、室温で９０分間混合した。結合した抗体を０.２μｍフィルターに通して濾過した。結合した後、１００ｍＭ Ｎ−エチルマレイミドのＤＭＳＯ溶液を、抗体あたり１０倍モル過剰のチオールで加え、いずれの未反応のチオールもクエンチした。混合し続けながら、このクエンチ反応を室温で１時間行った。ＮＥＭの存在下でインキュベートした後、生じた複合体を、セファクリル−２００ サイズ排除カラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィ（５０ｍＭ ヘペス、５ｍＭ グリシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ６.０において実行）によって精製した。単量体の抗体複合体を含む画分をプールし、限外濾過によって濃縮した。２８０および３４０ｎｍで吸光度を測定することによって、抗体複合体濃度および置換比を決定した。
【０４０２】
多くの膵臓癌細胞型が、抗ＰＴＫ７抗体−毒素複合体が腫瘍を阻害することを示すのに用いられうる。この例において、ＨＰＡＣ（ヒト膵臓腺癌、ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−２１１９）を選択し、標準検査法を用いてインビトロに拡張した。生後６〜８週間のオスＮｃｒ無胸腺ヌードマウス（タコニック、ハドソン、ＮＹ）に、マウスあたり２.５×１０6ＨＰＡＣ細胞のＰＢＳ／マトリゲル（１：１、０.２ｍＬ）溶液を右脇腹の皮下に埋め込んだ。埋め込み後、週２回、マウスを秤量し、電子測径器を用いて三次元的に腫瘍を測定した。腫瘍の容積を、高さ×幅×長さ／２として計算した。平均９０ｍｍ3のＨＰＡＣ腫瘍を有するマウスを、治療群にランダム化した。図２４に示されるように、０日目に、マウスに、指示された投薬量（μｍｏｌ／ｋｇ）で、ＰＢＳベヒクル、無修飾抗ＰＴＫ７抗体、７Ｃ８−式（ｏ）、または７Ｃ８−式（ｐ）を単回静脈内投与した。投与後６１日間、腫瘍増殖についてマウスをモニターした。腫瘍が腫瘍終点（２０００ｍｍ3）に達するか、または潰瘍化した場合、マウスを安楽死させた。７Ｃ８抗体は腫瘍増殖の進行を阻害し、７Ｃ８複合体によって示される阻害が有意に増大した（図２４）。７Ｃ８複合体の抗腫瘍効果は用量依存的であり、０.３μｍｏｌ／ｋｇの用量で最大の効果が見られた。抗体複合体による処置は良好な耐容性を示し、患者は一度も５％超の体重中央値の減少を経験しなかった（データは示されていない）。したがって、抗ＰＴＫ７抗体−細胞毒素複合体による処置は、膵臓癌腫瘍の増殖において、直接のインビボ阻害効果を有する。
【０４０３】
実施例１４：無修飾および細胞毒素結合抗ＰＴＫ７抗体を用いたインビボ乳癌細胞異種移植モデルの処置
この実施例は、抗ＰＴＫ７抗体複合体が乳癌腫瘍の増殖をインビボで阻害することを示す。標準検査法を用いて、ＭＣＦ７−ａｄｒ細胞（アドリアマイシンに対して抵抗性があるヒト乳癌細胞）をインビトロに拡張した。生後６〜８週間のメスＣＢ１７.ＳＣＩＤマウス（タコニック、ハドソン、ＮＹ）に、１.７ｍｇの９０日放出エストロゲンペレット，３.０ｍｍサイズ（イノベイティブ・リサーチ・オブ・アメリカ(Innovative Research of America)、サラソタ、ＦＬ）を皮下に埋め込んだ。マウスあたり１０×１０6ＭＣＦ７−Ａｄｒ細胞のＰＢＳ／マトリゲル（１：１、０.２ｍＬ）溶液を右脇腹の皮下に埋め込む１日前に、エストロゲンを頚部に投与した。埋め込み後、週２回、マウスを秤量し、電子測径器を用いて三次元的に腫瘍を測定した。腫瘍の容積を、高さ×幅×長さ／２として計算した。平均１６０ｍｍ3のＭＣＦ７−ａｄｒ腫瘍を有するマウスを、治療群にランダム化した。０日目に、マウスに、０.１μｍｏｌ／ｋｇで、ＰＢＳベヒクル、無修飾７Ｃ８または７Ｃ８−式（ｏ）を単回静脈内投与した。投与後６３日間、腫瘍増殖についてマウスをモニターした。腫瘍が潰瘍化した場合、マウスを安楽死させた。結果を図２５に示す。７Ｃ８−式（ｏ）は腫瘍増殖を阻害した。したがって、抗ＰＴＫ７抗体−細胞毒素複合体による処置は、乳癌腫瘍の増殖において、直接のインビボ阻害効果を有する。
【０４０４】
実施例１５：７Ｃ８毒素複合体によるインビボでの腫瘍阻害
この例において、毒素が結合した７Ｃ８が、インビボＳＣＩＤマウスモデルにおいて上皮細胞および肺の腫瘍増殖を阻害することが示された。この例において、７Ｃ８は式（ｍ）に結合した。式（ｍ）の構造を図２８に示す。式（ｍ）、およびその製造は、２００６年１２月２８日に出願された米国特許出願第６０／８８２，４６１号（その全内容は本明細書に具体的に引用される）にさらに記載されている。７Ｃ８−式（ｍ）複合体を以下のように製造した：
【０４０５】
抗ＰＴＫ７抗体７Ｃ８を約５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、リン酸緩衝液（１００ｍＭ）、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＤＴＰＡ（２ｍＭ） ｐＨ ８.０に緩衝液交換し、室温で６０分間、８〜１０倍モル過剰の２−イミノチオランを加えることによってチオール化した。チオール化の後、抗体を、グリシン（３００ｍＭ）、ＤＴＰＡ（２ｍＭ）、およびポビドン（０.５％、１０Ｋ） ｐＨ ５.５を含むヘペス緩衝液（５０ｍＭ）に緩衝液交換した。３２４ｎＭでのチオピリジン放出を測定することによって、４，４”−ジチオジピリジンを用いてチオール化を定量化した。３：１のモル比の薬物対チオール類で、式（ｍ）を含むマレイミドを加えることによって、結合を達成した。室温で６０分間インキュベートし、続いて１０：１のモル比のＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）対チオール類を反応混合物に加えて、いずれの未反応のチオール類もクエンチした。混合し続けながら、このクエンチ反応を室温で１時間行った。
【０４０６】
次いで抗体薬物複合体を０.２μｍ濾過し、次いで陽イオン交換クロマトグラフィ精製を行った。５ＣＶ（カラム容積）のヘペス（５０ｍＭ）、グリシン（５ｍＭ）、ＮａＣｌ（１Ｍ）、ｐＨ ５.５を用いて、ＳＰセファロース高性能陽イオン交換カラム（ＣＥＸ）を再生した。再生後、３ＣＶの平衡化緩衝液（５０ｍＭ ヘペス、５ｍＭ グリシン、ｐＨ ５.５）を用いてカラムを平衡化した。７Ｃ８−式（ｍ）複合体をロードし、カラムを平衡化緩衝液で１回洗浄した。ヘペス（５０ｍＭ）、グリシン（５ｍＭ）、ＮａＣｌ（２３０ｍＭ）、ｐＨ ５.５で複合体を溶離した。溶離液を画分で集めた。次いでヘペス（５０ｍＭ）、グリシン（５ｍＭ）、ＮａＣｌ（１Ｍ）、ｐＨ ５.５を用いてカラムを再生して、タンパク質凝集物およびいずれの未反応の式（ｍ）も除去した。溶離液画分の貯蔵(Pooling)は、凝集レベルおよび置換比（ＳＲ）、すなわち、薬物のモル 対 抗体のモルに基づいて行った。貯蔵基準は、１〜２のＳＲ範囲を用いてＳＥＣ−ＨＰＬＣによって決定された≧９５％ モノマーであった。ＰＥＳ膜を有する１０ＮＭＷＣＯ フラットシートＴＦＦカセット(flat-sheet TFF cassette)において、精製したＣＥＸ溶離液プールをバルクダイアフィルトレーション緩衝液(bulk diafiltration buffer)（３０ｍｇ／ｍｌ ショ糖、１０ｍｇ／ｍｌ グリシン、ｐＨ ６.０）に緩衝液交換した。５ｍｇ／ｍｌへのタンパク質濃度の希釈によって、および最終濃度１０ｍｇ／ｍｌまでデキストラン４０をダイアフィルターした複合体溶液に加えることによって、バルクの製剤化を完了した。製剤化バルクを、ＰＥＳフィルター（０.２μｍ）を通して無菌ＰＥＴＧボトルに濾過し、２℃〜８℃で保存した。
【０４０７】
次いでインビボマウスモデルにおいて、Ａ４３１異種移植腫瘍の増殖における７Ｃ８および７Ｃ８−式（ｍ）の効果を試験した。Ａ４３１はＰＴＫ−７発現する上皮細胞株であり、そのため、ＰＴＫ−７タンパク質を発現する上皮癌、例えば乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、腎癌、頭頚癌、膀胱癌、前立腺癌、および膵臓癌の代表である。さらに、７Ｃ８が、これらの疾患を示す細胞株および癌を結合することが、ＦＡＣＳおよびＩＨＣによって示されている。ＰＴＫ７はまた、上皮癌の活性化ストロマ(activated stroma)においても時折発現する。７Ｃ８−式（ｍ）のような抗ＰＴＫ７抗体薬物複合体は、これらの癌において抗癌活性を有する。これは抗ＲＧ１毒素複合体の活性に類似している。ＲＧ−１はまた、細胞ストロマにおいても発現される。前立腺癌の異種移植モデルにおける抗ＲＧ−１抗体薬物複合体の抗癌活性は、米国特許出願第６０／９９１，６９０号に記載されている。
【０４０８】
Ａ４３１異種移植モデルにおいて、ＳＣＩＤマウス（ＣＢ１７ ＳＣＩＤ、タコニック社、ジャーマンタウン、ＮＹ）にＡ４３１細胞を移植し、腫瘍が約９０ｍｍ3に達するまで増殖させた。次いでマウスをランダム化し、ベヒクル単独、式（ｍ）に連結したアイソタイプ適合ヒトＩｇＧ抗体（０.３μモル／ｋｇ、イソ−式（ｍ））、無修飾７Ｃ８、または７Ｃ８−式（ｍ）複合体（０.３μモル／ｋｇ）の単回投与により腹腔内処置した。３５日を超えて、一定の間隔を置いて、腫瘍容積を測定した（図２６）。
【０４０９】
図２６Ａに図示されるように、無修飾７Ｃ８抗体またはアイソタイプ適合式（ｍ）抗体による処置は、Ａ４３１腫瘍細胞容積における効果を示さなかった（すなわち、腫瘍増殖を阻害しなかった）が、７Ｃ８−式（ｍ）複合体による処置は、腫瘍増殖を有意に阻害した。また、体重によって測定されるように、７Ｃ８−式（ｍ）複合体がマウスに投与された際に毒性を伴わなかった（図２７）。
【０４１０】
第２セットの分析において、７Ｃ８−式（ｍ）複合体はマウス異種移植モデルにおける小細胞肺癌由来ＤＭＳ７９細胞の増殖を阻害した。異種移植モデルにおいて、ＳＣＩＤマウスに、マウスあたり５×１０6ＤＭＳ７９細胞を埋め込み、平均腫瘍溶液が約２００ｍｍ3になるまで増殖させた。次いでマウスをランダム化し、７Ｃ８−式（ｍ）複合体（０.３μｍｏｌ／ｋｇ）で腹腔内処置した。図２７Ｃに示されるように、７Ｃ８−式（ｍ）複合体による処置によって、８１日を通してすべてのマウスにおいて完全な腫瘍退縮が引き起こされた。
要約すれば、抗ＰＴＫ７抗体毒素複合体は、インビボで上皮および肺の腫瘍増殖を有意に阻害し、マウスにおける有意な毒性を示さなかった。
【０４１１】
実施例１６：カニクイザルにおける７Ｃ８−式（ｍ）の毒性の評価
カニクイザルおよびヒトは、ＰＴＫ７発現の類似するパターンを示す。７Ｃ８がヒトにおいて結合するように、カニクイザルにおいて同じ組織に結合することが、免疫組織化学分析によって示される。したがって、カニクイザルは７Ｃ８−式（ｍ）の標的毒性について評価するのに適している。
【０４１２】
７Ｃ８−式（ｍ）を２匹のオスおよび２匹のメスのカニクイザルに静脈内投与した。１日目および１５日目に、０.４μｍｏｌ／ｋｇを２回投与した。行動の変化、毒性兆候について動物を観察し、分析のために採血した。行動の変化は認められなかった。血液細胞および化学分析によって、薬物関連の変化は示されなかった。ＰＴＫ７を発現することが知られている組織（例えば卵巣線維芽細胞）の病理学検査によって、７Ｃ８−式（ｍ）に誘導される毒性の証拠は示されなかった。したがって、７Ｃ８−式（ｍ）の毒性は、カニクイザルにおいて検出されなかった。
【表１】
2011505146.tif 000043
2011505146.tif 000044
【図１Ａ】
2011505146.tif 000045
【図１Ｂ】
2011505146.tif 000046
【図１Ｃ】
2011505146.tif 000047
【図２Ａ】
2011505146.tif 000048
【図２Ｂ】
2011505146.tif 000049
【図３Ａ】
2011505146.tif 000050
【図３Ｂ】
2011505146.tif 000051
【図３Ｃ】
2011505146.tif 000052
【図４Ａ】
2011505146.tif 000053
【図４Ｂ】
2011505146.tif 000054
【図５】
2011505146.tif 000055
【図６】
2011505146.tif 000056
【図７】
2011505146.tif 000057
【図８】
2011505146.tif 000058
【図９】
2011505146.tif 000059
【図１０】
2011505146.tif 000060
【図１１】
2011505146.tif 000061
【図１２】
2011505146.tif 000062
【図１３】
2011505146.tif 000063
【図１４】
2011505146.tif 000064
【図１５】
2011505146.tif 000065
【図１６】
2011505146.tif 000066
【図１７】
2011505146.tif 000067
【図１８】
2011505146.tif 000068
【図１９】
2011505146.tif 000069
【図２０Ａ】
2011505146.tif 000070
【図２０Ｂ】
2011505146.tif 000071
【図２０Ｃ】
2011505146.tif 000072
【図２０Ｄ】
2011505146.tif 000073
【図２１】
2011505146.tif 000074
【図２２】
2011505146.tif 000075
【図２３】
2011505146.tif 000076
【図２４】
2011505146.tif 000077
【図２５】
2011505146.tif 000078
【図２６】
2011505146.tif 000079
【図２７】
2011505146.tif 000080
【図２８】
2011505146.tif 000081
【配列表】
2011505146000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成22年7月14日(2010.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2011505146000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月9日(2010.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＴＫ−７を特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合部分、およびパートナー分子を含む抗体−パートナー分子複合体であって、その中で、該パートナー分子は、式（ｍ）、式（ｎ）、式（ｏ）、式（ｐ）、および式（ｑ）からなる群から選択される複合体。
【請求項２】
該抗体またはその抗原結合部分が、ＰＴＫ−７への結合について、配列番号：２および７、配列番号：４および１０、配列番号：１および５、配列番号：１および６、配列番号：３および８、配列番号：３および９、配列番号：８４および８５、または配列番号：８４および８６にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む抗体と競合する、請求項１の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項３】
該抗体またはその抗原結合部分が、配列番号：２および７、配列番号：４および１０、配列番号：１および５、配列番号：１および６、配列番号：３および８、配列番号：３および９、配列番号：８４および８５、または配列番号：８４および８６にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む抗体によって認識されるＰＴＫ−７上のエピトープに結合する、請求項１の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項４】
該抗体またはその抗原結合部分が、配列番号：２および７、配列番号：４および１０、配列番号：１および５、配列番号：１および６、配列番号：３および８、配列番号：３および９、配列番号：８４および８５、または配列番号：８４および８６にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、請求項１の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項５】
該抗体またはその抗原結合部分が、
（ａ）配列番号：１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号：１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号：２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号：２５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号：３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｂ）配列番号：１４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号：１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号：２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号：２８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号：３４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｃ）配列番号：１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号：１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号：１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号：２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号：２９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：３５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号：１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号：１５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号：１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号：２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号：３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：３６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｅ）配列番号：１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号：１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号：２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号：２６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号：３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；または
（ｆ）配列番号：１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号：１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、配列番号：２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、配列番号：２７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、配列番号：３３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および配列番号：３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
を含む、請求項１の抗体−パートナー分子複合体。
【請求項６】
ＰＴＫ−７を特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合部分、およびパートナー分子を含む抗体−パートナー分子複合体であって、その中で、該抗体は、配列番号：２および７にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、並びに該パートナー分子は式（ｍ）（図２８）である複合体。
【請求項７】
抗体またはその抗原結合部分を含む抗体−パートナー分子複合体であって、その中で、該抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：２および７にそれぞれ示されるアミノ酸配列を含む複合体。
【請求項８】
該抗体−パートナー分子複合体が、チオールリンカー、ペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカー、およびジスルフィドリンカーからなる群から選択されるリンカーによって該抗体に結合する、先の請求項のいずれかの抗体−パートナー分子複合体。
【請求項９】
先の請求項のいずれかの抗体−パートナー分子複合体および医薬的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１０】
請求項３、４もしくは５の抗体またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれかの抗体−パートナー分子複合体を、ＰＴＫ７を発現する腫瘍細胞の増殖を特徴とする疾患を治療または予防するのに有効な量で患者に投与することを特徴とする、該疾患の治療または予防方法。
【請求項１４】
該疾患が癌である、請求項１３の方法。
【請求項１５】
該癌が、大腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、メラノーマ、急性骨髄性白血病、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、および上皮細胞癌からなる群から選択される、請求項１４の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５３】
ペプチドは、典型的には、３〜１２個（またはそれ以上）のアミノ酸を含む。特定のアミノ酸の選択は、少なくとも部分的には、ペプチドを開裂するのに用いられる酵素、並びにインビボでのペプチドの安定性に依存する。適当な開裂可能なペプチドの一つの例は、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：７０）である。これは、安定化基と結合して、スクシニル−β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：７１）を形成しうる。適当な開裂可能ペプチドの他の例は、下記の引用文献に与えられる。あるいは、ＷＯ ２００８／１０３６９３（その開示は本明細書に引用される）に開示されるように、単一のアミノ酸残基を含むリンカーが用いられてもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
別の実例は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に基づいている。おそらく、最もよく特徴が分かっている腫瘍関連のタンパク質分解酵素であり、腫瘍微小環境の中でＭＭＰの活性の明らかな相関がある。特に、可溶性マトリックス酵素ＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）およびＭＭＰ９（ゼラチナーゼＢ）が集中的に研究されており、腫瘍増殖を含む組織再構築の間に選択的に活性化されることが示されている。ＭＭＰ２およびＭＭＰ９によって開裂されるようにデザインされたペプチド配列は、デキストランおよびメトトレキセート（Chau et al., Bioconjugate Chem. 15:931-941 (2004)）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）およびドキソルビシン（Bae et al., Drugs Exp. Clin. Res. 29:15-23 (2004)）；並びにアルブミンおよびドキソルビシン（Kratz et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:2001-2006 (2001)）の複合体についてデザインおよび試験されている。ＭＭＰとともに使用するのに適した配列の例には、これらに限らないが、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：７２）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：７３）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：７４）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：７５）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：７６）、およびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：７７）が含まれる。（例えば、先に引用した参考文献、並びにKline et al., Mol. Pharmaceut. 1:9-22 (2004) および Liu et al., Cancer Res. 60:6061-6067 (2000)を参照）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５９】
これらに限らないが、本発明の複合体に使用するのに適したペプチド配列の適当な例には、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ9−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ9−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：７８）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号：７０）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ. ＩＤ ＮＯ：７９）、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号：８０）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ、およびＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌが含まれる。好ましいペプチド配列は、Ｖａｌ−ＣｉｔおよびＶａｌ−Ｌｙｓである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９０】
抗ＰＴＫ７抗体１Ｆ１２を本明細書に開示した式（ｑ）に結合して、１Ｆ１２−式（ｑ）を生成した。結合を以下のように行った：Ｎａ−リン酸（１００ｍＭ）、ＮａＣｌ（５０ｍＭ）、ＤＴＰＡ（２ｍＭ）、ｐＨ ８.０中、約５ｍｇ／ｍｌでの抗体を、混合し続けながら、室温で１時間、１５倍モル過剰の２−イミノチオランでチオール化した。チオール化の後、チオール化１Ｆ１２を、ＰＤ１０カラム（セファデックス Ｇ−２５）によって、結合緩衝液（５０ｍＭ ヘペス、５ｍＭ グリシン、３％ グリセロール、ｐＨ ６.０）に緩衝液交換した。チオール化抗体の濃度およびチオール濃度を測定した。式（ｑ）のＤＭＳＯ溶液のストック（５ｍＭ）を、抗体のチオールあたり３倍モル過剰で加え、室温で９０分間混合した。結合した抗体を０.２μｍフィルターに通して濾過した。５０ｍＭ ヘペス、５ｍＭ グリシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７.２中で実行したセファクリル−２００サイズ排除カラムにおけるサイズ排除クロマトグラフィによって、生じた複合体を精製した。単量体の抗体複合体を含む画分をプールし、限外濾過によって濃縮した。２８０および３４０ｎｍで吸光度を測定することによって、抗体複合体濃度および置換比(substitution ratio)を決定した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１２】
７Ｃ８−式（ｍ）を２匹のオスおよび２匹のメスのカニクイザルに静脈内投与した。１日目および１５日目に、０.４μｍｏｌ／ｋｇを２回投与した。行動の変化、毒性兆候について動物を観察し、分析のために採血した。行動の変化は認められなかった。血液細胞および化学分析によって、薬物関連の変化は示されなかった。ＰＴＫ７を発現することが知られている組織（例えば卵巣線維芽細胞）の病理学検査によって、７Ｃ８−式（ｍ）に誘導される毒性の証拠は示されなかった。したがって、７Ｃ８−式（ｍ）の毒性は、カニクイザルにおいて検出されなかった。
【表１】
2011505146.tif 000105
2011505146.tif 000106
【手続補正書】
【提出日】平成22年8月9日(2010.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2011505146000001.app
【国際調査報告】
2011505146.tif 000107
2011505146.tif 000108
2011505146.tif 000109