(57)【要約】【課題】組織から循環系に再循環させられる血中マクロファージによって組織から細胞内に吸収される分子マーカーを特徴づける、特に定量化するための方法を提供する。【解決手段】本発明は、組織から循環系に再循環させられる血中マクロファージによって組織から細胞内に吸収される分子マーカーを特徴づける、特に定量化するための方法であって、下記の工程：全血の凝固および／または凝集を阻害する薬剤の全血への適用；全血からの血中マクロファージまたは血中マクロファージ含有白血球集団の選択および／または濃縮および／または分離；選択された血中マクロファージまたは血中マクロファージ含有白血球集団の穿孔および／または溶解、必要な場合には、事前に行われるそれらの透過性化の後で行う；血中マクロファージまたは血中マクロファージ含有白血球集団の事前に行われた穿孔および／または溶解の後、非血中マクロファージマーカー、すなわち、組織から生じる分子マーカーの定性的および定量的な測定、が行われる方法、および本方法を行うための装置に関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織から循環系に再循環させられる血中マクロファージによって組織から細胞内に吸収される分子マーカーを特徴づける、特に定量化するための方法であって、下記の工程：
・全血の凝固および／または凝集を阻害する薬剤を全血に適用する工程；
・全血からの血中マクロファージまたは血中マクロファージ含有白血球集団の選択および／または濃縮および／または分離を行う工程；
・選択された血中マクロファージまたは血中マクロファージ含有白血球集団の穿孔および／または溶解を、必要な場合には、事前に行われる必要に応じた選択された血中マクロファージまたは血中マクロファージ含有白血球集団の透過性化の後で行う工程；
・貪食された非血中マクロファージマーカー、すなわち、組織から生じる分子マーカーに由来する貪食された非血中マクロファージマーカーの定性的および定量的な測定を、血中マクロファージまたは血中マクロファージ含有白血球集団の事前に行われた穿孔および／または溶解の後で行う工程
によって特徴づけられる方法。
【請求項２】
前記血中マクロファージの前記選択および／または濃縮および／または分離が、表面マーカーＣＤ１６に対する抗体を使用する正の選択によって行われることにおいて特徴づけられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
好ましくは、表面マーカーＣＤ１６に対する抗体を使用する前記正の選択の後で、または、場合によってはその前に、表面マーカーＣＤ１４に対する抗体を使用する正の選択が行われることにおいて特徴づけられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
表面マーカーＣＤ５６および／または表面マーカーＣＤ５７および／または表面マーカーＣＤ１６１を有する細胞を除くための負の選択が、ＣＤ５６および／または表面マーカーＣＤ５７および／または表面マーカーＣＤ１６１に対する抗体を使用して行われることにおいて特徴づけられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
正の選択または負の選択が、好ましくは可逆的に結合され得る磁気ビーズを使用して行われることにおいて特徴づけられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
正の選択または負の選択が、ＥＬＩＳＡプレートに結合される抗体を使用して行われることにおいて特徴づけられる、前記請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
単核白血球集団の定量的測定がＥｌｉｓａプレートで行われ、好ましくは、Ｅｌｉｓａプレートリーダーによる乳酸デヒドロゲナーゼ活性の測定によって行われ、特に好ましくは、分子マーカー、特に、非血中マクロファージ抗原の定性的および定量的な測定が行われる同じＥｌｉｓａプレートで行われることにおいて特徴づけられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
組織から生じる貪食された非血中マクロファージ分子マーカーの現在量の定量的測定の実施がＥｌｉｓａプレートリーダーおよび／または化学発光測定デバイスによって行われることにおいて特徴づけられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記分子マーカーとして、特に、組織マーカーおよび／または血清学的マーカーとして、
・異常なＤＮＡメチル化；
・ＡＦＰ（α−１−フェトプロテイン）；
・ＡＨＣＹ（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ）；
・ＡＭＹ２（膵臓アミラーゼ）；
・ＣＡ１５−３（異名：ＭＵＣ１、ＥＭＡ、ＣＤ２２７）；
・ＣＡ１９−９；
・ＣＡ５０；
・ＣＡ７２−４（異名：ＴＡＧ７２）；
・ＣＡ１２５（異名：ＭＵＣ１６）；
・カルシトニン；
・カルプロテクチン；
・ＣＣＳＡ−２（結腸ガン特異的抗原−２）；
・ＣＣＳＰ−２（結腸ガン分泌タンパク質−２）；
・ＣＥＡ（ガン胎児性抗原）；
・ＣＹＰ２４Ａ１；
・サイトケラチン（ＣＫ）８およびそのフラグメント；
・ＣＫ１８およびそのフラグメント；
・ＣＫ１９およびそのフラグメント；
・ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）；
・シスタチンＢ；
・ＤＤＨ（ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ）；
・ＤＫＫ−１（Ｄｉｋｋｏｐｆ−１）；
・ＧＰ７３（ゴルジタンパク質−７３）（異名：ＧＯＬＰＨ２）；
・ＨＥ４（ヒト精巣上体タンパク質４）；
・ＨＥＲ２／ｎｅｕ；
・ＨＳＰ（熱ショックタンパク質）−２７；
・Ｍａｃ−２ＢＰ（Ｍａｃ−２結合タンパク質）；
・マンマグロビンＡ；
・マンマグロビンＢ；
・ＭＩＡ（メラノーマ阻害活性）；
・ＭｎＳＯＤ（マンガンスーパーオキシドディスムターゼ）；
・ＰＡＲＫ７（異名：ＤＪ−１）；
・ＰｒｏＧＲＰ（プロガストリン放出ペプチド）；
・ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）；
・汎サイトケラチン；
・Ｐｒｏ−ＭＭＰ（プロマトリックスメタロプロテイナーゼ）−７；
・ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）；
・Ｓ１００Ａ８；
・Ｓ１００Ａ９；
・Ｓ−１００β；
・ＳＣＣＡ１（扁平上皮ガン抗原１）；
・ＳＣＣＡ２（扁平上皮ガン抗原２）；
・チログロブリン；
・ＵＨＲＦ１（ＰＨＤドメインおよびリングフィンガードメインを有する／含有するユビキチン様１）；
・ＵＲＧ４（アップレギュレーションされた遺伝子４）；および
・ＹＫＬ−４０（異名：ＣＨＩ３−Ｌ１）
が使用され、また、同様に組合せでも使用されることにおいて特徴づけられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ヘパリンまたは別の好適な抗凝固剤が、凝固および／または凝集に対する薬剤として使用されることにおいて特徴づけられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記マクロファージまたは前記マクロファージ含有白血球集団の前記穿孔または溶解がサポニン処理またはトリトン溶液による処理によって行われることにおいて特徴づけられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
非血中マクロファージ抗原を測定するために、ビオチン、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）または発光性色素と必要な場合にはコンジュゲート化される抗体、特に、免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ）の抗体、および、ＦａｂフラグメントもしくはＦ（ａｂ）２フラグメント、および／または、アプタマーが、特に下記の抗体：
・抗マウスＩｇＧ（ポリクローナル）；
・抗ウサギＩｇＧ（ポリクローナル）；
・抗ヤギＩｇＧ（ポリクローナル）；
・抗ラットＩｇＧ（ポリクローナル）；
・抗ロバＩｇＧ（ポリクローナル）；
・抗ＡＦＰ（クローンＡＦＰ−０１）；
・抗ＡＦＰ（クローンＡＦＰ−１１）；
・抗ＡＦＰ（クローン４Ａ３）；
・抗ＡＦＰ（クローン５Ｈ７）；
・抗ＡＦＰ（クローンＭ８０３２０９）；
・抗ＡＦＰ（クローンＭ０１５１６１１）；
・抗ＡＦＰ（クローンＭ０１５１６０８）；
・抗ＡＦＰ（ポリクローナル）；
・抗ＡＨＣＹ（クローン１Ｅ１１−１Ａ７）；
・抗ＡＨＣＹ（クローン２Ｆ１１−１Ｄ１０）；
・抗ＡＨＣＹ（クローン４Ｈ２）；
・抗ＡＨＣＹ（クローンＭ１）；
・抗ＡＨＣＹ（クローンＭ２）；
・抗ＡＨＣＹ（ポリクローナル）；
・抗ＡＭＹ２（クローン６Ａ９／１）；
・抗ＡＭＹ２（クローン５０１）；
・抗ＡＭＹ２（クローン５０３）；
・抗ＡＭＹ２（クローン１０−１０２．５）；
・抗ＡＭＹ２（ポリクローナル）；
・抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ２Ｃ５）；
・抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ９Ｅ７）；
・抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ４Ｈ２）；
・抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ８Ｃ９）；
・抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ１０Ｇ４）；
・抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ１０Ｈ６）；
・抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ３Ａ１０６）；
・抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＣ５９５（ＮＣＲＣ４８））；
・抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＥ２９）；
・抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（ポリクローナル）；
・抗ＣＡ１９−９（クローン１２１ＳＬＥ）；
・抗ＣＡ１９−９（ポリクローナル）；
・抗ＣＡ５０（クローンＭ９９１１４９）；
・抗ＣＡ５０（クローン９３）；
・抗ＣＡ５０（ポリクローナル）；
・抗ＣＡ７２−４／ＴＡＧ７２（クローンＳＰＭ１４８）；
・抗ＣＡ７２−４／ＴＡＧ７２（ポリクローナル）；
・抗ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６（クローン２Ｆ１）；
・抗ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６（クローン１０Ｇ１２）；
・抗ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６（クローンＸ７５）；
・抗ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６（クローンＸ３２５）；
・抗ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６（ポリクローナル）；
・抗カルシトニン（クローンＳＰ１７）；
・抗カルシトニン（クローン１３Ｂ９）；
・抗カルシトニン（クローン１３ｆ２）；
・抗カルシトニン（クローン２４Ｂ２）；
・抗カルシトニン（ポリクローナル）；
・抗カルプロテクチン（クローン２７Ｅ１０）；
・抗カルプロテクチン（ポリクローナル）；
・抗ＣＣＳＡ−２（ポリクローナル）；
・抗ＣＣＳＰ−２（ポリクローナル）；
・抗ＣＥＡ（クローンＣｏｌ−１）；
・抗ＣＥＡ（クローン１Ｃ７）；
・抗ＣＥＡ（クローン１Ｃ１０）；
・抗ＣＥＡ（クローン１Ｃ１１）；
・抗ＣＥＡ（ポリクローナル）；
・抗ＣＹＰ２４Ａ１（クローン１Ｅ１）；
・抗ＣＹＰ２４Ａ１（クローン１Ｆ８）；
・抗ＣＹＰ２４Ａ１（ポリクローナル）；
・抗ＣＫ８（クローン２４）；
・抗ＣＫ８（クローンＬＰ３Ｋ）；
・抗ＣＫ８（ポリクローナル）；
・抗ＣＫ１８（クローンＤＣ−１０）；
・抗ＣＫ１８（クローンＤＡ−７）；
・抗ＣＫ１８（クローンＬＤＫ１８）；
・抗ＣＫ１８（ポリクローナル）；
・抗ＣＫ１９（クローンＡ５３−Ｂ／Ａ２）；
・抗ＣＫ１９（クローンＢＡ１７）；
・抗ＣＫ１９（クローン２３６−１１２２１）；
・抗ＣＫ１９（ポリクローナル）；
・抗ＣＲＰ（クローン２３２００７）；
・抗ＣＲＰ（クローン２３２０２４）；
・抗ＣＲＰ（クローンＣ２）；
・抗ＣＲＰ（クローンＣ４）；
・抗ＣＲＰ（クローンＣ５）；
・抗ＣＲＰ（クローンＣ６）；
・抗ＣＲＰ（クローンＣ７）；
・抗ＣＲＰ（ポリクローナル）；
・抗シスタチンＢ（クローン２Ｆ１）；
・抗シスタチンＢ（クローン８ｋ２７５）；
・抗シスタチンＢ（クローンＢ−０２）；
・抗シスタチンＢ（クローンＲＪＭＷ−２Ｅ７）；
・抗シスタチンＢ（ポリクローナル）；
・抗ＤＤＨ（クローンＴ１０１）；
・抗ＤＤＨ（ポリクローナル）；
・抗ＤＫＫ−１（クローン１４１１３５）；
・抗ＤＫＫ−１（ポリクローナル）；
・抗ＧＰ７３／ＧＯＬＰＨ２（クローンＹＡ−１４）；
・抗ＧＰ７３／ＧＯＬＰＨ２（クローン５Ｂ１０）；
・抗ＧＰ７３／ＧＯＬＰＨ２（ポリクローナル）；
・抗ＨＥ４（クローンＣ−１２）；
・抗ＨＥ４（ポリクローナル）；
・抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（クローン１０Ｃ７）；
・抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（クローン１９１９２４）；
・抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（クローンＮ３／Ｄ１０）；
・抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ポリクローナル）；
・抗ＨＳＰ−２７（クローンＧ３．１）；
・抗ＨＳＰ−２７（クローンＡＦ５Ｅ５）；
・抗ＨＳＰ−２７（クローンＦ−４）；
・抗ＨＳＰ−２７（クローン２Ａ５）；
・抗ＨＳＰ−２７（ポリクローナル）；
・抗Ｍａｃ−２ＢＰ（クローンＳＰ−２）；
・抗Ｍａｃ−２ＢＰ（ポリクローナル）；
・抗マンマグロビンＡ（クローン１Ｇ８Ｄ６、異名：２Ｅ７Ｇ９）；
・抗マンマグロビンＡ（クローン３０４−１Ａ５）；
・抗マンマグロビンＡ（ポリクローナル）；
・抗マンマグロビンＢ（クローンＥ−１７）；
・抗マンマグロビンＢ（ポリクローナル）；
・抗ＭＩＡ（クローン３Ａ６）；
・抗ＭＩＡ（ポリクローナル）；
・抗ＭＭＰ−７（クローン６Ａ４）；
・抗ＭＭＰ−７（クローン１７６−５Ｆ１２）；
・抗ＭＭＰ−７（クローン１４１−７Ｂ２）；
・抗ＭＭＰ−７（クローン３７７３１３）；
・抗ＭＭＰ−７（ポリクローナル）；
・抗ＭｎＳＯＤ（クローン１ＡＥ）；
・抗ＭｎＳＯＤ（クローン２Ａ１）；
・抗ＭｎＳＯＤ（クローン４Ｆ１０）；
・抗ＭｎＳＯＤ（クローン２３Ｇ５）；
・抗ＭｎＳＯＤ（クローン３７ＣＴ１２７．５．１１．６）；
・抗ＭｎＳＯＤ（ポリクローナル）；
・抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローン１Ｂ１１）；
・抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローン１Ｄ７）；
・抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローン６Ａ６５）；
・抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローン３０５５）；
・抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローンＡ−９）；
・抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローンＤ−４）；
・抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローンＥ２）；
・抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（ポリクローナル）；
・抗ｐｒｏＧＲＰ（クローンｐＧＲＰ５）；
・抗ｐｒｏＧＲＰ（クローンＥ１４６）；
・抗ｐｒｏＧＲＰ（クローンＥ１７２）；
・抗ＧＲＰ（クローン７６−Ｅ６）；
・抗ｐｒｏＧＲＰ（ポリクローナル）；
・抗ＧＲＰ（ポリクローナル）；
・抗ＮＳＥ（クローン１Ｃ１）；
・抗ＮＳＥ（クローン５Ａ４）；
・抗ＮＳＥ（クローン５Ｅ２）；
・抗ＮＳＥ（クローン５Ｇ１０）；
・抗ＮＳＥ（ポリクローナル）；
・抗汎サイトケラチン（クローン７Ｈ８Ｃ４）；
・抗汎サイトケラチン（クローンＢ３１１．１）；
・抗汎サイトケラチン（クローンＣ１１）；
・抗汎サイトケラチン（クローンＤ−１２）；
・抗汎サイトケラチン（ポリクローナル）；
・抗ＰＳＡ（クローンＥＲ−ＰＲ８）；
・抗ＰＳＡ（クローン１８１８２３）；
・抗ＰＳＡ（ポリクローナル）；
・抗Ｓ１００Ａ８（クローン１Ｂ３）；
・抗Ｓ１００Ａ８（クローン２Ｃ５／４）；
・抗Ｓ１００Ａ８（クローン２Ｈ２）；
・抗Ｓ１００Ａ８（クローン２Ｑ３９６Ａ）；
・抗Ｓ１００Ａ８（クローン６Ａ６１４）；
・抗Ｓ１００Ａ８（クローン８Ｌ６２７）；
・抗Ｓ１００Ａ８（クローン８−５Ｃ２）；
・抗Ｓ１００Ａ８（クローンＣＦ−１４５）；
・抗Ｓ１００Ａ８（クローンＭＲＰ８  ７Ｃ１２／４）；
・抗Ｓ１００Ａ８（クローンＳ１３．６７）；
・抗Ｓ１００Ａ８（ポリクローナル）；
・抗Ｓ１００Ａ９（クローン１Ｃ１０）；
・抗Ｓ１００Ａ９（クローン２Ｑ３９６Ｂ）；
・抗Ｓ１００Ａ９（クローン４Ｇ９）；
・抗Ｓ１００Ａ９（クローンＮＯ．１９）；
・抗Ｓ１００Ａ９（クローンＮＯ．１３４）；
・抗Ｓ１００Ａ９（クローンＳ３２．２）；
・抗Ｓ１００Ａ９（クローンＳ３６．４８）；
・抗Ｓ１００Ａ９（ポリクローナル）；
・抗Ｓ−１００β（クローンＳＢ６）；
・抗Ｓ−１００β（クローンＳＨ−Ｂ１）；
・抗Ｓ−１００β（クローンＳＨ−Ｂ４）；
・抗Ｓ−１００β（ポリクローナル）；
・抗ＳＣＣＡ１（クローン８Ｈ１１）；
・抗ＳＣＣＡ１（ポリクローナル）；
・抗ＳＣＣＡ２（クローン１０Ｃ１２）；
・抗ＳＣＣＡ２（ポリクローナル）；
・抗ＳＣＣＡ１／２（クローンＢ−９）；
・抗ＳＣＣＡ１／２（ポリクローナル）；
・抗チログロブリン（クローン５Ｅ６）；
・抗チログロブリン（クローン５Ｆ９）；
・抗チログロブリン（クローン５Ｇ４）；
・抗チログロブリン（クローン１１Ａ１６）；
・抗チログロブリン（クローンＰＢ２）；
・抗チログロブリン（クローンＰＢ３）；
・抗チログロブリン（ポリクローナル）；
・抗ＵＨＲＦ１（クローン１ＲＣ１Ｃ−１０）；
・抗ＵＨＲＦ１（クローン３Ａ１１）；
・抗ＵＨＲＦ１（ポリクローナル）；
・抗ＵＲＧ４（ポリクローナル）；
・抗ＹＫＬ−４０／ＣＨＩ３−Ｌ１（クローン２０１１）；
・抗ＹＫＬ−４０／ＣＨＩ３−Ｌ１（クローン３２１８０６）；
・抗ＹＫＬ−４０／ＣＨＩ３−Ｌ１（ポリクローナル）
から選択されることにおいて特徴づけられる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
血液の単核白血球、特に、血中マクロファージを単離および特徴づけるためのアセンブリーであって、下記のデバイス：
・全血の凝固および／または凝集を阻害する薬剤を加えるためのデバイス；
・全血からの単核白血球、特に、血中マクロファージの予備選択および濃縮を密度勾配遠心分離によって行うためのデバイス；
・ＣＤ１４＋細胞の選択および濃縮を、磁気ビーズまたはＥｌｉｓａプレートに必要な場合には可逆的に結合される、ＣＤ１４に対する抗体によって行うためのデバイス；
・ＣＤ１６＋細胞の選択および濃縮を、磁気ビーズまたはＥｌｉｓａプレートに必要な場合には可逆的に結合される、ＣＤ１６に対する抗体によって行うためのデバイス；
・単核白血球集団、特に、血中マクロファージの穿孔および／または溶解をサポニン溶液またはトリトン溶液によって行うためのデバイス；
・単核白血球集団、特に、血中マクロファージの定量的測定を、ＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）の活性を、Ｅｌｉｓａプレートで、すなわち、分子マーカーの定性的および定量的な測定が行われる同じＥｌｉｓａプレートで求めるためのアッセイを使用して行うためのデバイス；
・血液の単核白血球、特に、マクロファージの事前に行われる穿孔または溶解の後における、血中マクロファージによって貪食された分子内分子マーカーの定性的および定量的な測定をＥｌｉｓａプレートリーダーおよび／または化学発光測定デバイスによって行うためのデバイス
を含むアセンブリー。
【請求項１４】
細胞表面マーカーＣＤ５６または細胞表面マーカーＣＤ５７または細胞表面マーカーＣＤ１６１を有するＮＫ細胞（ナチュラルキラー細胞）を、磁気ビーズに結合される、ＣＤ５６またはＣＤ５７またはＣＤ１６１に対する抗体を使用して単核白血球、特に、ＣＤ１６＋白血球の集団から除くためのデバイス
によって特徴づけられる、請求項１３に記載のアセンブリー。
【請求項１５】
細胞溶解前に細胞内で貪食された分子マーカーに対する抗体を細胞内で結合させるために、好ましくは血中マクロファージまたは血中マクロファージ含有白血球集団の選択および／または濃縮および／または分離の前に、場合によってはその後に、単核白血球を溶解前に固定処理および透過性化するためのデバイスによって特徴づけられる、前記請求項１３または１４のいずれか一項に記載のアセンブリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１の前文に従う、血液の単核白血球（特に、血中マクロファージ）の貪食された細胞内分子マーカーを特徴づける（具体的に定量化する）ための方法、ならびに、請求項１３の前文に従う、本方法を行うための分析アセンブリーに関連する。
【背景技術】
【０００２】
全血において、ＣＤ１４およびＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）の両方のタンパク質をその表面に発現する細胞が検出可能である。ＣＤ１４は細胞表面タンパク質であり、このタンパク質は典型的には単球およびマクロファージによって発現される。細胞表面タンパク質ＣＤ１６は、ＩｇＧ抗体の定常（Ｆｃ）領域が細胞に結合することを可能にしており、ＣＤ１６は、２つのイソ型で、すなわち、ＮＫ細胞、マクロファージおよびいわゆる活性化単球の表面におけるＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）として、また、好中性顆粒球におけるＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩＢ）として存在する。
【０００３】
古典的学説によれば、組織におけるマクロファージ、および、血液のいわゆる「活性化単球」のみが、それぞれＣＤ１４およびＣＤ１６の両方を発現する。以前の学説では、血液のＣＤ１４／ＣＤ１６陽性（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋）細胞が「活性化単球」と単に見なされたが、この「活性化単球」は、例えば、炎症、感染または腫瘍の場所において、組織の中に（未だ）遊走していない（Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ，Ｌ．、２００７、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋血中単球：感染および炎症におけるその役割、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．８１、５８４〜５９２）。
【０００４】
しかしながら、近年の様々な知見により、活性化単球が、循環系において組織から再循環させられるマクロファージであって、例えば、炎症場所または腫瘍場所に起源を有するものであるが、組織の一部（例えば、上皮タンパク質）をその細胞内食胞に含むマクロファージであることが示唆される（Ｈｅｒｗｉｇ，Ｒ．、Ｈｏｒｎｉｎｇｅｒ，Ｗ．、Ｒｅｈｄｅｒ，Ｐ．他、２００５、ＰＳＡ陽性の循環マクロファージの前立腺ガン検出能、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、６２、２９０〜２９８；Ｌｅｅｒｓ，Ｍ．Ｐ．Ｇ．、Ｎａｐ，Ｍ．、Ｈｅｒｗｉｇ，Ｒ．他、２００８、前立腺ガンを検出するための可能な標的としての循環しているＰＳＡ含有マクロファージ：末梢血サンプルに対する３色／５パラメーターのフローサイトメトリー研究、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、１２９、６４９〜６５６）。
【０００５】
生来的なＣＤ１４陽性かつＣＤ１６陰性（ＣＤ１４＋ＣＤ１６−）単球集団とは対照的に、これらの細胞は、組織の十分に分化したマクロファージの形態学的特徴を有しており、それらによって封入される（貪食された）分子が単球において見出されない（Ｌｅｅｒｓ，Ｍ．Ｐ．Ｇ．、Ｎａｐ，Ｍ．、Ｈｅｒｗｉｇ，Ｒ．他、２００８、前立腺ガンを検出するための可能な標的としての循環しているＰＳＡ含有マクロファージ：末梢血サンプルに対する３色／５パラメーターのフローサイトメトリー研究、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、１２９、６４９〜６５６）。
【０００６】
系統的には、血液のＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞を分析的に検出し単離し、濃縮するために、例えば、ＣＤ１６＋細胞を、ＣＤ１４＋細胞のすべてからなる部分集団として見なし、かつ、ＣＤ１４＋細胞を、ＣＤ１６＋細胞のすべてからなるサブセットとして見なすことが考えられ得る。
【０００７】
その上、活性化単球および血中マクロファージはそれぞれ、ＣＤ１４の部分的に弱い発現を有すること（Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ，Ｌ．、２００７、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋血中単球：感染および炎症におけるその役割、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．、８１、５８４〜５９２）、または、ＣＤ１４の完全な喪失を受けること（ＢａｚｉｌおよびＳｔｒｏｍｉｎｇｅｒ、１９９１、刺激されたヒト単球におけるＣＤ１４の下方調節機構の解明、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７、１５６７〜１５７４）が知られている。
【０００８】
例えば、マーカータンパク質ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）をその食胞において細胞内に含有する血中マクロファージのフローサイトメトリーによる検出（この場合、このマーカーは以降、ｉｍＰＳＡ（細胞内マクロファージＰＳＡ）として示される）は、前立腺疾患の病期を極めて特異的かつ高感度な様式で明らかにすることができ、その点で、血液の血清におけるＰＳＡの古典的検出よりも優れている（Ｈｅｒｗｉｇ，Ｒ．、Ｍｉｔｔｅｒｅｇｇｅｒ，Ｄ．、Ｄｊａｖａｎ，Ｂ．他、２００８、細胞内マクロファージ前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）による前立腺ガンの検出：従来の血清総ＰＳＡよりも特異的かつ高感度なマーカー、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、３８、４３０〜４３７）。
【０００９】
フローサイトメトリーによる細胞の特徴づけの基礎は、検出対象の標的分子（「抗原」）に蛍光色素標識された抗体により標識を付けることである。分析のために、懸濁されている細胞が、流体力学的集束によって、好適な波長の集束レーザービームを通過させられる。それにより、蛍光色素が励起されて、エネルギーを光子の形で放射し、この光子が検出器によって記録される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ，Ｌ．、２００７、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋血中単球：感染および炎症におけるその役割、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．８１、５８４〜５９２
【非特許文献２】Ｈｅｒｗｉｇ，Ｒ．、Ｈｏｒｎｉｎｇｅｒ，Ｗ．、Ｒｅｈｄｅｒ，Ｐ．他、２００５、ＰＳＡ陽性の循環マクロファージの前立腺ガン検出能、Ｐｒｏｓｔａｔｅ、６２、２９０〜２９８
【非特許文献３】Ｌｅｅｒｓ，Ｍ．Ｐ．Ｇ．、Ｎａｐ，Ｍ．、Ｈｅｒｗｉｇ，Ｒ．他、２００８、前立腺ガンを検出するための可能な標的としての循環しているＰＳＡ含有マクロファージ：末梢血サンプルに対する３色／５パラメーターのフローサイトメトリー研究、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、１２９、６４９〜６５６
【非特許文献４】ＢａｚｉｌおよびＳｔｒｏｍｉｎｇｅｒ、１９９１、刺激されたヒト単球におけるＣＤ１４の下方調節機構の解明、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７、１５６７〜１５７４
【非特許文献５】Ｈｅｒｗｉｇ，Ｒ．、Ｍｉｔｔｅｒｅｇｇｅｒ，Ｄ．、Ｄｊａｖａｎ，Ｂ．他、２００８、細胞内マクロファージ前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）による前立腺ガンの検出：従来の血清総ＰＳＡよりも特異的かつ高感度なマーカー、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、３８、４３０〜４３７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、この方法の欠点が、結合した抗体の量を定量化することができないことにあり、従って、検出された抗原の量に関する情報がないことにある。さらなる欠点が、フローサイトメーターの運用により生じる装置経費および財政的経費が少なくないことである。
【００１２】
本発明の目的は、組織に由来するその貪食された分子マーカーなどの血液、特に血中マクロファージの特徴づけを、特に細胞数あたりの質量単位で表すことによって定量化できることにより、改善、単純化された安価な方法のほか、分析アセンブリーを具体的に述べることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、この目的が、請求項１による方法によって、同様にまた、請求項１３による装置によって解決される。
【００１４】
具体的には、その目的は、組織から循環系に再循環させられる血中マクロファージによって組織から細胞内に吸収される分子マーカーを特徴づける（具体的には定量化する）ための方法であって、下記の工程：
・全血の凝固および／または凝集を阻害する薬剤を全血に適用する工程；
・全血からの血中マクロファージまたは血中マクロファージ含有白血球集団の選択および／または濃縮および／または分離を行う工程；
・選択された血中マクロファージまたは血中マクロファージ含有白血球集団の透過性化および／または穿孔および／または溶解を行う工程；
・非血中マクロファージマーカー、すなわち、組織から生じる分子マーカーに由来する非血中マクロファージマーカーの定性的および定量的な測定を、血中マクロファージまたは血中マクロファージ含有白血球集団の事前に行われた穿孔および／または溶解の後で行う工程
が行われる方法によって解決される。
【００１５】
本発明の主たる検討事項が、分子マーカー（例えば、上皮タンパク質）を循環系の貪食された単核細胞において、すなわち、血中マクロファージにおいて検出することにあり、この場合、本発明による方法に基づいて、直接的かつ特異的に、同様にまた、定量的に検出できることが好ましい。
【００１６】
従って、血中マクロファージにおける分子マーカーの検出を可能にするために、全血からの血中マクロファージの選択および／または濃縮および／または分離を最初に行うことが本発明に従って提供される（以降、用語「活性化単球」および用語「マクロファージ」は、「血中マクロファージ」と同一であると解釈すること）。さらに、本発明の範囲内で処理され、かつ、検出対象であるマーカーおよびマーカーフラグメントのすべてがそれぞれ、組織におけるマクロファージによって吸収される少なくとも部分的に貪食された分子であって、血中マクロファージにおいて細胞内で検出される分子であることが指摘される。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記血中マクロファージの前記選択および／または濃縮および／または分離が、表面マーカーＣＤ１６に対する抗体を使用する正の選択によって行われる
【００１８】
従って、本発明によれば、すべてのＣＤ１６発現細胞の検討が、確実にすべての活性化単球／マクロファージを検出するために行われる。
【００１９】
必要であれば、本発明によれば、好ましくは、表面マーカーＣＤ１６に対する抗体を使用する前記正の選択の後で、または、代替的にはその前にも、表面マーカーＣＤ１４に対する抗体を使用する正の選択が行われる。表面マーカーＣＤ１６に対する抗体を使用する正のＣＤ１６＋選択を正のＣＤ１４＋選択の前に事前に行うことにより、未分化単球のＣＤ１４＋集団（これは、ＣＤ１６＋集団に関して多く存在し、ＣＤ１６表面マーカーを有しておらず、かつ、組織から循環系に再循環させられる血中マクロファージによって組織から細胞内に吸収される分子マーカーを特徴づける（具体的には定量化する）ための本発明による方法の主題ではない）が第１の工程において既に除かれるという本発明による利点が提供される。
【００２０】
この方法に関しては、ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞のみを確実に選択することが好ましい（この場合、正のＣＤ１４＋選択の後における正のＣＤ１６＋選択もまた本発明に従って可能であることが述べられる）。
【００２１】
細胞表面タンパク質ＣＤ１６を有する他の細胞集団（特に、ＮＫ細胞）が、後に実施する細胞内の食胞に含有され、組織から生じる分子マーカーの分析における妨げと見なされるならば、ＣＤ１６＋単核細胞下でＮＫ細胞のみによって発現される表面タンパク質ＣＤ５６または表面タンパク質ＣＤ５７または表面タンパク質ＣＤ１６１に基づく、負の選択をその後で行うことができる。
【００２２】
この理由のため、本発明によれば、表面マーカーＣＤ５６および／または表面マーカーＣＤ５７および／または表面マーカーＣＤ１６１を有する細胞を除くための負の選択が、ＣＤ５６および／または表面マーカーＣＤ５７および／または表面マーカーＣＤ１６１に対する抗体を使用して行われる。そのような負の選択を別個の選択工程として行うことができ、または、さらなる好都合な実施形態に従って、代わりに、下記において例示的に説明されるように、ＣＤ１６＋細胞の正の選択と同時に行うことができる。
【００２３】
さらに、本発明によれば、それぞれ選択された細胞を極めて簡便な様式で好適な磁石によって分離するために、正の選択または負の選択が、好ましくは可逆的に結合され得る磁気ビーズを使用して行われることが提供される。
【００２４】
代わりに、あるいは、事前に行われる選択工程または続いて行われる選択工程において、本発明によれば、一方ではサンプル処理量を増大させるために、また、他方では、ある容器から別の容器への被試験液体の不必要な移送、および、それに伴う被試験細胞の実質的な喪失を本発明の好都合な様式で避けるために、正の選択または負の選択が、ＥＬＩＳＡプレートに結合される抗体を使用して行われる。
【００２５】
さらに、本発明による、さらに好ましい実施形態によると、単核白血球集団の定量的測定がＥｌｉｓａプレートで行われ、好ましくは、Ｅｌｉｓａプレートリーダーによる乳酸デヒドロゲナーゼ活性の測定によって行われ、特に好ましくは、分子マーカー（特に、非血中マクロファージ抗原）の定性的および定量的な測定が行われる同じＥｌｉｓａプレートで行われる。
【００２６】
さらに、組織から生じる非血中マクロファージ分子マーカーの現在量の定量的測定の実施がＥｌｉｓａプレートリーダーおよび／または化学発光測定デバイスによって行われる。その中で、本発明によれば、分子マーカーとして、特に、組織マーカーおよび／または血清学的マーカーとして、異常なＤＮＡメチル化、ＡＦＰ（α−１−フェトプロテイン）、ＡＨＣＹ（Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ）、ＡＭＹ２（膵臓アミラーゼ）、ＣＡ１５−３（異名：ＭＵＣ１、ＥＭＡ、ＣＤ２２７）、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ７２−４（異名：ＴＡＧ７２）、ＣＡ１２５（異名：ＭＵＣ１６）、カルシトニン、カルプロテクチン、ＣＣＳＡ−２（結腸ガン特異的抗原−２）、ＣＣＳＰ−２（結腸ガン分泌タンパク質−２）、ＣＥＡ（ガン胎児性抗原）、ＣＹＰ２４Ａ１、サイトケラチン（ＣＫ）８およびそのフラグメント、ＣＫ１８およびそのフラグメント、ＣＫ１９およびそのフラグメント、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）、シスタチンＢ、ＤＤＨ（ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ）、ＤＫＫ−１（Ｄｉｋｋｏｐｆ−１）、ＧＰ７３（ゴルジタンパク質−７３）（異名：ＧＯＬＰＨ２）、ＨＥ４（ヒト精巣上体タンパク質４）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＳＰ（熱ショックタンパク質）−２７、Ｍａｃ−２ＢＰ（Ｍａｃ−２結合タンパク質）、マンマグロビンＡ、マンマグロビンＢ、ＭＩＡ（メラノーマ阻害活性）、ＭｎＳＯＤ（マンガンスーパーオキシドディスムターゼ）、ＰＡＲＫ７（異名：ＤＪ−１）、ＰｒｏＧＲＰ（プロガストリン放出ペプチド）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、汎サイトケラチン、Ｐｒｏ−ＭＭＰ（プロマトリックスメタロプロテイナーゼ）−７、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、Ｓ−１００β、ＳＣＣＡ１（扁平上皮ガン抗原１）、ＳＣＣＡ２（扁平上皮ガン抗原２）、チログロブリン、ＵＨＲＦ１（ＰＨＤドメインおよびリングフィンガードメインを有する／含有するユビキチン様１）、ＵＲＧ４（アップレギュレーションされた遺伝子４）、並びにＹＫＬ−４０（異名：ＣＨＩ３−Ｌ１）が使用され、また、同様に組合せでも使用される。
【００２７】
本発明によれば、その方法を行う目的で、全血が始めに、凝固および／または凝集に対する薬剤、例えばヘパリンまたは別の好適な抗凝固剤（例えばクエン酸塩溶液）と混合される。
【００２８】
本発明によれば、前記マクロファージまたは前記マクロファージ含有白血球集団の穿孔または溶解がサポニン処理またはトリトン溶液による処理によってさらに行われる。
【００２９】
さらに、本発明によれば、非血中マクロファージ抗原を測定するために、ビオチン、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）、ＡＰ（アルカリホスファターゼ）または発光性色素と必要な場合にはコンジュゲート化される抗体（特に、免疫グロブリンクラス（ＩｇＧ）の抗体）、および、ＦａｂフラグメントもしくはＦ（ａｂ）２フラグメント、および／または、アプタマーが、特に下記の抗体：抗マウスＩｇＧ（ポリクローナル）、抗ウサギＩｇＧ（ポリクローナル）、抗ヤギＩｇＧ（ポリクローナル）、抗ラットＩｇＧ（ポリクローナル）、抗ロバＩｇＧ（ポリクローナル）、抗ＡＦＰ（クローンＡＦＰ−０１）、抗ＡＦＰ（クローンＡＦＰ−１１）、抗ＡＦＰ（クローン４Ａ３）、抗ＡＦＰ（クローン５Ｈ７）、抗ＡＦＰ（クローンＭ８０３２０９）、抗ＡＦＰ（クローンＭ０１５１６１１）、抗ＡＦＰ（クローンＭ０１５１６０８）、抗ＡＦＰ（ポリクローナル）、抗ＡＨＣＹ（クローン１Ｅ１１−１Ａ７）、抗ＡＨＣＹ（クローン２Ｆ１１−１Ｄ１０）、抗ＡＨＣＹ（クローン４Ｈ２）、抗ＡＨＣＹ（クローンＭ１）、抗ＡＨＣＹ（クローンＭ２）、抗ＡＨＣＹ（ポリクローナル）、抗ＡＭＹ２（クローン６Ａ９／１）、抗ＡＭＹ２（クローン５０１）、抗ＡＭＹ２（クローン５０３）、抗ＡＭＹ２（クローン１０−１０２．５）、抗ＡＭＹ２（ポリクローナル）、抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ２Ｃ５）、抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ９Ｅ７）、抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ４Ｈ２）、抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ８Ｃ９）、抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ１０Ｇ４）、抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ１０Ｈ６）、抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＭ３Ａ１０６）、抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＣ５９５（ＮＣＲＣ４８））、抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（クローンＥ２９）、抗ＣＡ１５−３／ＭＵＣ１（ポリクローナル）、抗ＣＡ１９−９（クローン１２１ＳＬＥ）、抗ＣＡ１９−９（ポリクローナル）、抗ＣＡ５０（クローンＭ９９１１４９）、抗ＣＡ５０（クローン９３）、抗ＣＡ５０（ポリクローナル）、抗ＣＡ７２−４／ＴＡＧ７２（クローンＳＰＭ１４８）、抗ＣＡ７２−４／ＴＡＧ７２（ポリクローナル）、抗ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６（クローン２Ｆ１）、抗ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６（クローン１０Ｇ１２）、抗ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６（クローンＸ７５）、抗ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６（クローンＸ３２５）、抗ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６（ポリクローナル）、抗カルシトニン（クローンＳＰ１７）、抗カルシトニン（クローン１３Ｂ９）、抗カルシトニン（クローン１３ｆ２）、抗カルシトニン（クローン２４Ｂ２）、抗カルシトニン（ポリクローナル）、抗カルプロテクチン（クローン２７Ｅ１０）、抗カルプロテクチン（ポリクローナル）、抗ＣＣＳＡ−２（ポリクローナル）、抗ＣＣＳＰ−２（ポリクローナル）、抗ＣＥＡ（クローンＣｏｌ−１）、抗ＣＥＡ（クローン１Ｃ７）、抗ＣＥＡ（クローン１Ｃ１０）、抗ＣＥＡ（クローン１Ｃ１１）、抗ＣＥＡ（ポリクローナル）、抗ＣＹＰ２４Ａ１（クローン１Ｅ１）、抗ＣＹＰ２４Ａ１（クローン１Ｆ８）、抗ＣＹＰ２４Ａ１（ポリクローナル）、抗ＣＫ８（クローン２４）、抗ＣＫ８（クローンＬＰ３Ｋ）、抗ＣＫ８（ポリクローナル）、抗ＣＫ１８（クローンＤＣ−１０）、抗ＣＫ１８（クローンＤＡ−７）、抗ＣＫ１８（クローンＬＤＫ１８）、抗ＣＫ１８（ポリクローナル）、抗ＣＫ１９（クローンＡ５３−Ｂ／Ａ２）、抗ＣＫ１９（クローンＢＡ１７）、抗ＣＫ１９（クローン２３６−１１２２１）、抗ＣＫ１９（ポリクローナル）、抗ＣＲＰ（クローン２３２００７）、抗ＣＲＰ（クローン２３２０２４）、抗ＣＲＰ（クローンＣ２）、抗ＣＲＰ（クローンＣ４）、抗ＣＲＰ（クローンＣ５）、抗ＣＲＰ（クローンＣ６）、抗ＣＲＰ（クローンＣ７）、抗ＣＲＰ（ポリクローナル）、抗シスタチンＢ（クローン２Ｆ１）、抗シスタチンＢ（クローン８ｋ２７５）、抗シスタチンＢ（クローンＢ−０２）、抗シスタチンＢ（クローンＲＪＭＷ−２Ｅ７）、抗シスタチンＢ（ポリクローナル）、抗ＤＤＨ（クローンＴ１０１）、抗ＤＤＨ（ポリクローナル）、抗ＤＫＫ−１（クローン１４１１３５）、抗ＤＫＫ−１（ポリクローナル）、抗ＧＰ７３／ＧＯＬＰＨ２（クローンＹＡ−１４）、抗ＧＰ７３／ＧＯＬＰＨ２（クローン５Ｂ１０）、抗ＧＰ７３／ＧＯＬＰＨ２（ポリクローナル）、抗ＨＥ４（クローンＣ−１２）、抗ＨＥ４（ポリクローナル）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（クローン１０Ｃ７）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（クローン１９１９２４）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（クローンＮ３／Ｄ１０）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ポリクローナル）、抗ＨＳＰ−２７（クローンＧ３．１）、抗ＨＳＰ−２７（クローンＡＦ５Ｅ５）、抗ＨＳＰ−２７（クローンＦ−４）、抗ＨＳＰ−２７（クローン２Ａ５）、抗ＨＳＰ−２７（ポリクローナル）、抗Ｍａｃ−２ＢＰ（クローンＳＰ−２）、抗Ｍａｃ−２ＢＰ（ポリクローナル）、抗マンマグロビンＡ（クローン１Ｇ８Ｄ６、異名：２Ｅ７Ｇ９）、抗マンマグロビンＡ（クローン３０４−１Ａ５）、抗マンマグロビンＡ（ポリクローナル）、抗マンマグロビンＢ（クローンＥ−１７）、抗マンマグロビンＢ（ポリクローナル）、抗ＭＩＡ（クローン３Ａ６）、抗ＭＩＡ（ポリクローナル）、抗ＭＭＰ−７（クローン６Ａ４）、抗ＭＭＰ−７（クローン１７６−５Ｆ１２）、抗ＭＭＰ−７（クローン１４１−７Ｂ２）、抗ＭＭＰ−７（クローン３７７３１３）、抗ＭＭＰ−７（ポリクローナル）、抗ＭｎＳＯＤ（クローン１ＡＥ）、抗ＭｎＳＯＤ（クローン２Ａ１）、抗ＭｎＳＯＤ（クローン４Ｆ１０）、抗ＭｎＳＯＤ（クローン２３Ｇ５）、抗ＭｎＳＯＤ（クローン３７ＣＴ１２７．５．１１．６）、抗ＭｎＳＯＤ（ポリクローナル）、抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローン１Ｂ１１）、抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローン１Ｄ７）、抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローン６Ａ６５）、抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローン３０５５）、抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローンＡ−９）、抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローンＤ−４）、抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（クローンＥ２）、抗ＰＡＲＫ７／ＤＪ−１（ポリクローナル）、抗ｐｒｏＧＲＰ（クローンｐＧＲＰ５）、抗ｐｒｏＧＲＰ（クローンＥ１４６）、抗ｐｒｏＧＲＰ（クローンＥ１７２）、抗ＧＲＰ（クローン７６−Ｅ６）、抗ｐｒｏＧＲＰ（ポリクローナル）、抗ＧＲＰ（ポリクローナル）、抗ＮＳＥ（クローン１Ｃ１）、抗ＮＳＥ（クローン５Ａ４）、抗ＮＳＥ（クローン５Ｅ２）、抗ＮＳＥ（クローン５Ｇ１０）、抗ＮＳＥ（ポリクローナル）、抗汎サイトケラチン（クローン７Ｈ８Ｃ４）、抗汎サイトケラチン（クローンＢ３１１．１）、抗汎サイトケラチン（クローンＣ１１）、抗汎サイトケラチン（クローンＤ−１２）、抗汎サイトケラチン（ポリクローナル）、抗ＰＳＡ（クローンＥＲ−ＰＲ８）、抗ＰＳＡ（クローン１８１８２３）、抗ＰＳＡ（ポリクローナル）、抗Ｓ１００Ａ８（クローン１Ｂ３）、抗Ｓ１００Ａ８（クローン２Ｃ５／４）、抗Ｓ１００Ａ８（クローン２Ｈ２）、抗Ｓ１００Ａ８（クローン２Ｑ３９６Ａ）、抗Ｓ１００Ａ８（クローン６Ａ６１４）、抗Ｓ１００Ａ８（クローン８Ｌ６２７）、抗Ｓ１００Ａ８（クローン８−５Ｃ２）、抗Ｓ１００Ａ８（クローンＣＦ−１４５）、抗Ｓ１００Ａ８（クローンＭＲＰ８  ７Ｃ１２／４）、抗Ｓ１００Ａ８（クローンＳ１３．６７）、抗Ｓ１００Ａ８（ポリクローナル）、抗Ｓ１００Ａ９（クローン１Ｃ１０）、抗Ｓ１００Ａ９（クローン２Ｑ３９６Ｂ）、抗Ｓ１００Ａ９（クローン４Ｇ９）、抗Ｓ１００Ａ９（クローンＮＯ．１９）、抗Ｓ１００Ａ９（クローンＮＯ．１３４）、抗Ｓ１００Ａ９（クローンＳ３２．２）、抗Ｓ１００Ａ９（クローンＳ３６．４８）、抗Ｓ１００Ａ９（ポリクローナル）、抗Ｓ−１００β（クローンＳＢ６）、抗Ｓ−１００β（クローンＳＨ−Ｂ１）、抗Ｓ−１００β（クローンＳＨ−Ｂ４）、抗Ｓ−１００β（ポリクローナル）、抗ＳＣＣＡ１（クローン８Ｈ１１）、抗ＳＣＣＡ１（ポリクローナル）、抗ＳＣＣＡ２（クローン１０Ｃ１２）、抗ＳＣＣＡ２（ポリクローナル）、抗ＳＣＣＡ１／２（クローンＢ−９）、抗ＳＣＣＡ１／２（ポリクローナル）、抗チログロブリン（クローン５Ｅ６）、抗チログロブリン（クローン５Ｆ９）、抗チログロブリン（クローン５Ｇ４）、抗チログロブリン（クローン１１Ａ１６）、抗チログロブリン（クローンＰＢ２）、抗チログロブリン（クローンＰＢ３）、抗チログロブリン（ポリクローナル）、抗ＵＨＲＦ１（クローン１ＲＣ１Ｃ−１０）、抗ＵＨＲＦ１（クローン３Ａ１１）、抗ＵＨＲＦ１（ポリクローナル）、抗ＵＲＧ４（ポリクローナル）、抗ＹＫＬ−４０／ＣＨＩ３−Ｌ１（クローン２０１１）、抗ＹＫＬ−４０／ＣＨＩ３−Ｌ１（クローン３２１８０６）、抗ＹＫＬ−４０／ＣＨＩ３−Ｌ１（ポリクローナル）から選択される。
【００３０】
従って、まとめると、最初に、単核細胞のすべてが、ＣＤ１６陽性の好中性顆粒球をそれにより除く密度勾配遠心分離によって取り出されると述べることができる。表面タンパク質ＣＤ１４を有する細胞、または、表面タンパク質ＣＤ１６を有する細胞のどちらかの正の選択および濃縮がそれに続く。代替として、表面タンパク質ＣＤ５６または表面タンパク質ＣＤ５７または表面タンパク質ＣＤ１６１を有する細胞の負の選択を代わりに行うことができる。
【００３１】
本発明によれば、表面タンパク質ＣＤ１４および表面タンパク質ＣＤ１６を有する単核細胞の正の選択および濃縮と、表面タンパク質ＣＤ５６または表面タンパク質ＣＤ５７または表面タンパク質ＣＤ１６１を有する単核細胞の負の選択との両方が、表面タンパク質のＣＤ１４またはＣＤ１６またはＣＤ５６またはＣＤ５７またはＣＤ１６１に対する、磁気ビーズに結合された抗体を用いて行われる。
【００３２】
ＣＤ１４＋細胞に対する正の選択、または、負の選択の場合には、磁気ビーズに結合されるか、または、Ｅｌｉｓａプレートに被覆されるかのどちらかである、細胞表面タンパク質ＣＤ１６に対する抗体を使用する細胞の正の選択によって特徴づけられるさらなる分離工程が続く。最初のＣＤ１６＋細胞に対する正の選択の場合には、磁気ビーズに結合されるか、または、Ｅｌｉｓａプレートに被覆されるかのどちらかである抗体を用いたＣＤ１４＋細胞に対する細胞のさらなる正の選択が続くか、あるいは、細胞表面タンパク質ＣＤ５６または細胞表面タンパク質ＣＤ５７または細胞表面タンパク質ＣＤ１６１に対する磁気抗体を使用する、ＣＤ５６＋またはＣＤ５７＋またはＣＤ１６１＋のＮＫ細胞に対する負の選択が続く。代替として、ＣＤ１６＋細胞に対する正の選択と、ＣＤ５６＋またはＣＤ５７＋またはＣＤ１６１＋のＮＫ細胞に対する負の選択とを１つの方法工程において同時に行うことができる。ＣＤ１６＋細胞に対する正の選択では、その代替として、さらなる選択工程を省略することができる。
【００３３】
さらに連続して、分離および単離されたばかりの単核白血球が、穿孔溶液および／または細胞溶解試薬による処理によって破壊される。１つの方法変法によれば、事前に、すなわち、細胞の溶解直前または密度勾配遠心分離の直後のどちらかで、抗体（１つまたは複数）を、細胞の透過性化とともに、検出対象の分子マーカーに加えることができる。従って、細胞溶解後の工程の１つにおいて、細胞に含有される分子マーカーの定量化が可能である。
【００３４】
さらに、付着した細胞数を求めるという目的のために、溶解物における酵素（乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ））の活性がＥｌｉｓａプレートで求められる。この場合、存在する単核白血球の量を標準物により計算することができる。指示薬基質を加えることによって、酵素活性によって誘導される着色反応をＥｌｉｓａリーダーによって読み取ることができ、従って、定量化することができる。
【００３５】
最後に、それぞれの分子マーカーに対して特異的に向けられる抗体（１つまたは複数）によって、および／または、それぞれの分子抗体（１つまたは複数）に対する抗体（１つまたは複数）によって、好ましくは、細胞の定量化が、ＬＤＨ活性を測定することによって達成されている同じＥｌｉｓａプレートにおいて、酵素着色反応または化学発光シグナルが、試験されたマーカーの量に比例して誘導される。Ｅｌｉｓａプレートリーダーまたは化学発光検出器によって、それぞれの分子マーカーを標準物により定量化することができる。結果の最終的な表示が、「細胞数あたりの細胞内分子マーカーに基づく量または質量の単位」として行われる。
【００３６】
本発明による目的がさらに、本発明の方法を請求項１３に従って行うための分析アセンブリーによって解決される。
【００３７】
本発明によれば、上記方法を行うための分析アセンブリーは、下記のデバイス：
・全血の凝固および／または凝集を阻害する薬剤を加えるためのデバイス（例えば、ヘパリン、クエン酸塩溶液、または別の好適な抗凝固剤）；
・全血サンプルにおける全単核白血球（特に、血中マクロファージ）の予備選択または選択および濃縮を密度勾配遠心分離によって行うためのデバイス；
・ＣＤ１４＋細胞の選択および濃縮を、磁気ビーズまたはＥｌｉｓａプレートに必要な場合には可逆的に結合される、ＣＤ１４に対する抗体を用いて行うためのデバイス；
・ＣＤ１６＋細胞の選択および濃縮を、磁気ビーズまたはＥｌｉｓａプレートに必要な場合には可逆的に結合される、ＣＤ１６に対する抗体を用いて行うためのデバイス；
・必要な場合には、細胞表面マーカーＣＤ５６または細胞表面マーカーＣＤ５７または細胞表面マーカーＣＤ１６１を有するＮＫ細胞を、磁気ビーズに結合される、ＣＤ５６またはＣＤ５７またはＣＤ１６１に対する抗体を使用して単核白血球の集団から除くためのデバイス；
・単核白血球集団の穿孔および／または溶解を行うためのデバイス；
・単核白血球集団の定量的測定を、Ｅｌｉｓａプレートで、（例えば乳酸デヒドロゲナーゼの測定を、Ｅｌｉｓａプレートで、）すなわち、分子マーカーの定性的および定量的な測定が行われる同じＥｌｉｓａプレートで行うためのデバイス；
・事前に行われる血液細胞の穿孔または溶解の後における、血中マクロファージによって貪食された分子内分子マーカーの定性的および定量的な測定を（Ｅｌｉｓａプレートリーダー、化学発光測定デバイスなどによって）行うためのデバイス、を含む。
【００３８】
さらに、本発明によれば、細胞溶解前に細胞内で貪食された分子マーカーに対する抗体を細胞内で結合させることを有利に行うために、好ましくは血中マクロファージまたは血中マクロファージ含有白血球集団の選択および／または濃縮および／または分離の前に、場合によってはその後に、単核白血球を溶解前に固定処理および透過性化するためのデバイスが提供され得る。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
下記において、本発明がいくつかの実施形態としてより詳細に説明される：
【実施例１】
【００４０】
第１の実施形態：
磁気ビーズを用いたＣＤ１４＋単球の正の選択；ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋集団の正の選択、細胞数測定、および、Ｅｌｉｓａプレートでの分子マーカー（ここではｉｍＰＳＡ）の定量。
【００４１】
本実施形態が６ｍｌの全血により開始される。この場合、６ｍｌの全血が、ポリエステルゲルおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液を含有するチューブに採取される。血液の遠心分離（例えば、１８００ｘｇ、２０分間）によって、単核白血球のすべてがゲル上方に血小板と一緒に単離される。
【００４２】
単離された細胞が、血小板を除くために、０．１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）をさらに含有し得るＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）溶液（ｐＨ７．４）により２回洗浄される。
【００４３】
単離された単核白血球が、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。アリコートを採取し、２℃〜８℃で貯蔵することができる。懸濁物が、細胞表面抗原ＣＤ１４に対する抗体を直接にその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、２５０μｌにおいて１０８個のビーズ）と混合される。その代替として、懸濁物を、振とうまたは揺動とともに２℃〜８℃で１０分間、細胞表面抗原ＣＤ１４に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体の１０μｇとインキュベーションすることができ、その後、懸濁物は遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、上清を廃棄した後、細胞が、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に再懸濁される。ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、３００μｌにおいて１０８個のビーズ）が加えられる。
【００４４】
単核白血球および磁気ビーズの懸濁物が、２℃〜８℃で２０分間、振とうまたは揺動された後、磁気ビーズに結合したばかりの細胞が、好適な磁石を用いて分離され、この場合、上清が廃棄される。ビーズが、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄される。細胞表面抗原ＣＤ１４に対する抗体をその表面に有する磁気ビーズを使用するとき、ビーズは、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。その代替として、細胞表面抗原ＣＤ１４に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体と、ストレプトアビジンをその表面に有する磁気ビーズとを使用するとき、ビーズは、修飾ビオチンを含有する細胞放出緩衝液に再懸濁することができる。懸濁物が室温で１０分間振とうまたは揺動され、その後、ビーズおよび上清の磁気分離が行われる。上清が除去され、遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。
【００４５】
均質化された懸濁物の規定量（最大で１００μｌ）が９６ウエルのＭａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートにウエルあたりピペット注入される。この場合、プレートは、細胞表面抗原ＣＤ１６に対するマウス抗体（例えば、クローン３Ｇ８の５μｇ／ｍｌ）と、ＰＳＡに対するマウス抗体（例えば、クローンＥＲ−ＰＲ８の１μｇ／ｍｌ）との両方で被覆され、そして、（例えば、５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）溶液により）ブロッキング処理されている。懸濁物の希釈系列を作製することができる。懸濁物のアリコートは２℃〜８℃で保たれなければならない。プレートが（例えば、クリングフィルムまたはアルミニウムホイルにより）密封され、室温で１時間インキュベーションされるか、または、２℃〜８℃で冷蔵庫において一晩インキュベーションされる。
【００４６】
プレートが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により５回洗浄される。続いて、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する５０μｌの細胞溶解液がそれぞれのウエルにピペット注入される。加えて、全単核白血球の保存された懸濁物のアリコート、または、すべての細胞が抗原ＣＤ１４をその表面に有するビーズのアリコートが、任意の数のウエルに、例えば、それぞれ２つのウエルにピペット注入され、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する５０μｌ不足量の細胞溶解液と混合される。さらに、組換えＰＳＡの希釈系列（例えば、５０ｐｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌの間）が標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。次に、プレートは２℃〜８℃に５分間置かれ、続いて、超音波浴において５分間処理される（プレートの底だけが水浴に浸かるだけであり、水面のわずかに下側に置かれたケージが支持体として役立つ）。
【００４７】
プレートを密封し、室温（１時間）または２℃〜８℃（一晩）でインキュベーションした後、細胞溶解液における校正されたＬＤＨ陽性コントロールの希釈系列（例えば、１／２５００の希釈度から開始する）が標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。続いて、５０μｌのＬＤＨ基質溶液がプレートのそれぞれのインキュベーションされたウエルに加えられ、プレートがアルミニウムホイルにより遮光して密封され、室温で３０分間放置される。その後、インキュベーションされたウエルのすべてがそれぞれ５０μｌの停止液（１ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ）と混合され、大きい気泡のすべてがニードルで穿刺され、すべてのウエルの光吸収が４９２ｎｍにおいてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定される。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができる細胞数に比例している。
【００４８】
次に、ウエルのすべてが、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。その後すぐに、ウエルが、ＰＳＡに対するヤギのポリクローナル検出抗体と、例えば、ＰＢＳにおける０．５μｇ／ｍｌの濃度で、室温で１時間インキュベーションされる。
【００４９】
次に、ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。検出抗体に対する、酵素ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲート化された二次抗体（例えば、マウスまたはウサギの二次抗体）が、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における２μｇ／ｍｌの濃度で加えられる。この時の室温におけるインキュベーション時間も１時間である。
【００５０】
ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄された後、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を含有する１００μｌの基質溶液がウエルあたり加えられる。インキュベーション時間が室温で１５分であり、その後、５０μｌの停止液（例えば、１ＭのＨ２ＳＯ４）がそれぞれのウエルにピペット注入される。最後に、ウエルの光吸収が４５０ｎｍの波長においてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定され、５７０ｎｍにおける吸収が引かれる。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができるｉｍＰＳＡの量に比例している。
【００５１】
結果の表示が、例えば、ｐｇ（ｉｍＰＳＡ）／細胞数（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞、または、代わりに、ＣＤ１４＋細胞、または、代わりに、単核白血球）として行われる。
【実施例２】
【００５２】
第２の実施形態：
磁気ビーズを用いたＣＤ１６＋単球の正の選択；ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋集団の正の選択、細胞数測定、および、Ｅｌｉｓａプレートでの分子マーカー（ここではｉｍＰＳＡ）の定量。
【００５３】
本実施形態が６ｍｌの全血により開始される。この場合、６ｍｌの全血が、ポリエステルゲルおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液を含有するチューブに採取される。血液の遠心分離（例えば、１８００ｘｇ、２０分間）によって、単核白血球のすべてがゲル上方に血小板と一緒に単離される。
【００５４】
単離された細胞が、血小板を除くために、０．１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）をさらに含有し得るＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）溶液（ｐＨ７．４）により２回洗浄される。
【００５５】
単離された単核白血球が、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。アリコートを取り、２℃〜８℃で貯蔵することができる。懸濁物が、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する抗体を直接にその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、２５０μｌにおいて１０８個のビーズ）と混合される。その代替として、懸濁物を、振とうまたは揺動とともに２℃〜８℃で１０分間、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体の１０μｇとインキュベーションすることができ、その後、懸濁物は遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、上清を捨てた後、細胞が、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に再懸濁される。ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、３００μｌにおいて１０８個のビーズ）が加えられる。
【００５６】
単核白血球および磁気ビーズの懸濁物が、２℃〜８℃で２０分間、振とうまたは揺動された後、磁気ビーズに結合したばかりの細胞が、好適な磁石を用いて分離され、この場合、上清が廃棄される。ビーズが、０．１％のＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄される。細胞表面抗原ＣＤ１６に対する抗体をその表面に有する磁気ビーズを使用するとき、ビーズは、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。その代替として、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体と、ストレプトアビジンをその表面に有する磁気ビーズとを使用するとき、ビーズは、修飾ビオチンを含有する細胞放出緩衝液に再懸濁することができる。懸濁物が室温で１０分間振とうまたは揺動され、その後、ビーズおよび上清の磁気分離が行われる。上清が除去され、遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。
【００５７】
均質化された懸濁物の規定量（最大で１００μｌ）が９６ウエルのＭａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートにウエルあたりピペット注入される。この場合、プレートは、細胞表面抗原ＣＤ１４に対するマウス抗体（例えば、クローンＭφＰ９の５μｇ／ｍｌ）と、ＰＳＡに対するマウス抗体（例えば、クローンＥＲ−ＰＲ８の１μｇ／ｍｌ）との両方で被覆され、そして、（例えば、５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）溶液により）ブロッキング処理されている。懸濁物の希釈系列を作製することができる。懸濁物のアリコートは２℃〜８℃で保たれなければならない。プレートが（例えば、クリングフィルムまたはアルミニウムホイルにより）密封され、室温で１時間インキュベーションされるか、または、２℃〜８℃で冷蔵庫において一晩インキュベーションされる。
【００５８】
プレートが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により５回洗浄される。続いて、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する５０μｌの細胞溶解液がそれぞれのウエルにピペット注入される。加えて、全単核白血球の保存された懸濁物のアリコート、または、すべての細胞が抗原ＣＤ１６をその表面に有するビーズのアリコートが、任意の数のウエルに、例えば、それぞれ２つのウエルにピペット注入され、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する５０μｌ不足量の細胞溶解液と混合される。さらに、組換えＰＳＡの希釈系列（例えば、５０ｐｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌの間）が標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。次に、プレートは２℃〜８℃に５分間置かれ、続いて、超音波浴において５分間処理される（プレートの底だけが水浴に浸かるだけであり、水面のわずかに下側に置かれたケージが支持体として役立つ）。
【００５９】
プレートを密封し、室温（１時間）または２℃〜８℃（一晩）でインキュベーションした後、細胞溶解液における校正されたＬＤＨ陽性コントロールの希釈系列（例えば、１／２５００の希釈度から開始する）が標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。続いて、５０μｌのＬＤＨ基質溶液がプレートのそれぞれのインキュベーションされたウエルに加えられ、プレートがアルミニウムホイルにより遮光して密封され、室温で３０分間放置される。その後、インキュベーションされたウエルのすべてがそれぞれ５０μｌの停止液（１ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ）と混合され、大きい気泡のすべてがニードルで穿刺され、すべてのウエルの光吸収が４９２ｎｍにおいてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定される。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができる細胞数に比例している。
【００６０】
次に、ウエルのすべてが、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。その後すぐに、ウエルが、ＰＳＡに対するヤギのポリクローナル検出抗体と、例えば、ＰＢＳにおける０．５μｇ／ｍｌの濃度で、室温で１時間インキュベーションされる。
【００６１】
次に、ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。検出抗体に対する、酵素ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲート化された二次抗体（例えば、マウスまたはウサギの二次抗体）が、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における２μｇ／ｍｌの濃度で加えられる。この時の室温におけるインキュベーション時間も１時間である。
【００６２】
ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄された後、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を含有する１００μｌの基質溶液がウエルあたり加えられる。インキュベーション時間が室温で１５分であり、その後、５０μｌの停止液（例えば、１ＭのＨ２ＳＯ４）がそれぞれのウエルにピペット注入される。最後に、ウエルの光吸収が４５０ｎｍの波長においてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定され、５７０ｎｍにおける吸収が引かれる。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができるｉｍＰＳＡの量に比例している。
【００６３】
結果の表示が、例えば、ｐｇ（ｉｍＰＳＡ）／細胞数（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞、または、代わりに、ＣＤ１６＋細胞、または、代わりに、単核白血球）として行われる。
【実施例３】
【００６４】
第３の実施形態：
磁気ビーズの助けを借りた、最初にＣＤ１４＋単球、続いてＣＤ１４＋ＣＤ１６＋集団の両方の正の選択；細胞数測定、および、Ｅｌｉｓａプレートでの分子マーカー（ここではｉｍＰＳＡ）の定量。
【００６５】
本実施形態が６ｍｌの全血により開始される。この場合、６ｍｌの全血が、ポリエステルゲルおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液を含有するチューブに採取される。血液の遠心分離（例えば、１８００ｘｇ、２０分間）によって、単核白血球のすべてがゲル上方に血小板と一緒に単離される。
【００６６】
単離された細胞が、血小板を除去するために、０．１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）をさらに含有し得るＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）溶液（ｐＨ７．４）により２回洗浄される。
【００６７】
単離された単核白血球が、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。アリコートを採取し、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解し、２℃〜８℃で貯蔵することができる。懸濁物が、振とうまたは揺動とともに２℃〜８℃で１０分間、細胞表面抗原ＣＤ１４に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体の１０μｇとインキュベーションされる。
【００６８】
細胞が遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、上清を廃棄した後、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に再懸濁される。ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、３００μｌにおいて１０８個のビーズ）が加えられる。
【００６９】
その後、単核白血球および磁気ビーズの懸濁物が、２℃〜８℃で２０分間、振とうまたは揺動される。その場合、ストレプトアビジンにより標識されたビーズが、ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体に結合し、これにより、ビーズが、細胞表面抗原ＣＤ１４を有する細胞に結合する。
【００７０】
好適な磁石を用いた、磁気ビーズに結合した細胞の分離がその後に続き、この場合、上清が廃棄される。ビーズが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄され、続いて、修飾ビオチンを含有する細胞放出緩衝液に再懸濁される。懸濁物が室温で１０分間振とうまたは揺動され、その後、ビーズおよび上清の磁気分離が行われる。上清が除去され、遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。懸濁物のアリコートが取り出され、遠心分離され、ペレットが、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解され、２℃〜８℃で保たれる。
【００７１】
次に、細胞懸濁物が、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する抗体をその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、１００μｌにおいて４×１０７個のビーズ）と混合され、２℃〜８℃で２０分間振とうまたは揺動される。好適な磁石を用いた、磁気ビーズに結合した細胞の分離が続き、この場合、上清が廃棄される。細胞を有するビーズが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄される。その後で、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液が加えられる。溶解物が、少なくとも５分間、２℃〜８℃に置かれる。
【００７２】
次に、細胞溶解物のすべてが超音波浴において５分間処理され、好適な磁石が、対応する溶解物からビーズを除くために使用され、溶解物が再度遠心分離される（１４０００ｘｇ、１０分間）。規定量の上清（最大で１００μｌ）が９６ウエルのＭａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートにウエルあたりピペット注入される。この場合、プレートは、ＰＳＡに対するマウス抗体（例えば、クローンＥＲ−ＰＲ８の１μｇ／ｍｌ）で被覆され、そして、（例えば、５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）溶液により）ブロッキング処理されている。組換えＰＳＡの希釈系列（例えば、５０ｐｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌの間）がＰＳＡ標準物として調製され、標準物の各濃度の規定量がそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。さらに、細胞溶解液における校正されたＬＤＨ陽性コントロールの希釈系列（例えば、１／２５００の希釈度から開始する）が細胞数の標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。プレートが（例えば、クリングフィルムまたはアルミニウムホイルにより）密封され、室温で１時間インキュベーションされる。
【００７３】
続いて、５０μｌのＬＤＨ基質溶液がプレートのそれぞれのインキュベーションされたウエルに加えられ、プレートがアルミニウムホイルにより遮光して密封され、室温で３０分間放置される。その後、インキュベーションされたウエルのすべてがそれぞれ５０μｌの停止液（１ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ）と混合され、大きい気泡のすべてがニードルで穿刺され、すべてのウエルの光吸収が４９２ｎｍにおいてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定される。測定された吸収の強度が、細胞数の標準物に基づいて求めることができる細胞数に比例している。
【００７４】
次に、ウエルのすべてが、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。その後すぐに、ウエルが、ＰＳＡに対するヤギのポリクローナル検出抗体と、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における０．５μｇ／ｍｌの濃度で、室温で１時間インキュベーションされる。
【００７５】
次に、ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。検出抗体に対する、酵素ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲート化された二次抗体（例えば、マウスまたはウサギの二次抗体）が、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における２μｇ／ｍｌの濃度で加えられる。この時の室温におけるインキュベーション時間も１時間である。
【００７６】
ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄された後、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を含有する１００μｌの基質溶液がウエルあたり加えられる。インキュベーション時間が室温で１５分であり、その後、５０μｌの停止液（例えば、１ＭのＨ２ＳＯ４）がそれぞれのウエルにピペット注入される。最後に、ウエルの光吸収が４５０ｎｍの波長においてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定され、５７０ｎｍにおける吸収が引かれる。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができるｉｍＰＳＡの量に比例している。
【００７７】
結果の表示が、例えば、ｐｇ（ｉｍＰＳＡ）／細胞数（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞、または、代わりに、ＣＤ１４＋細胞、または、代わりに、単核白血球）として行われる。
【実施例４】
【００７８】
第４の実施形態：
磁気ビーズを用いた、最初にＣＤ１６＋集団、続いてＣＤ１４＋ＣＤ１６＋集団の両方の正の選択；細胞数測定、および、Ｅｌｉｓａプレートでの分子マーカー（ここではｉｍＰＳＡ）の定量。
【００７９】
本実施形態が６ｍｌの全血により開始される。この場合、６ｍｌの全血が、ポリエステルゲルおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液を含有するチューブに採取される。血液の遠心分離（例えば、１８００ｘｇ、２０分間）によって、単核白血球のすべてがゲル上方に血小板と一緒に単離される。
【００８０】
単離された細胞が、血小板を除去するために、０．１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）をさらに含有し得るＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）溶液（ｐＨ７．４）により２回洗浄される。
【００８１】
単離された単核白血球が、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。アリコートを採取し、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解し、２℃〜８℃で貯蔵することができる。懸濁物が、振とうまたは揺動とともに２℃〜８℃で１０分間、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体の５μｇとインキュベーションされる。
【００８２】
細胞が遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、上清を廃棄した後、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に再懸濁される。ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおいて２×１０７個のビーズ）が加えられる。
【００８３】
その後、単核白血球および磁気ビーズの懸濁物が、２℃〜８℃で２０分間、振とうまたは揺動される。その場合、ストレプトアビジンにより標識されたビーズが、ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体に結合し、これにより、ビーズが、細胞表面抗原ＣＤ１６を有する細胞に結合する。
【００８４】
好適な磁石を用いた、磁気ビーズに結合した細胞の分離がその後に続き、この場合、上清が廃棄される。ビーズが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄され、続いて、修飾ビオチンを含有する細胞放出緩衝液に再懸濁される。懸濁物が室温で１０分間振とうまたは揺動され、その後、ビーズおよび上清の磁気分離が行われる。上清が除去され、遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。懸濁物の規定量が懸濁物から取り出され、遠心分離され、ペレットが、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解され、２℃〜８℃で保たれる。
【００８５】
次に、細胞懸濁物が、細胞表面抗原ＣＤ１４に対する抗体をその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおいて２×１０７個のビーズ）と混合され、２℃〜８℃で２０分間振とうまたは揺動される。好適な磁石を用いた、磁気ビーズに結合した細胞の分離が続き、この場合、上清が廃棄される。細胞を有するビーズが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄される。その後で、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液が加えられる。溶解物が、少なくとも５分間、２℃〜８℃に置かれる。
【００８６】
次に、細胞溶解物のすべてが超音波浴において５分間処理され、好適な磁石が、対応する溶解物からビーズを除去するために使用され、溶解物が再度遠心分離される（１４０００ｘｇ、１０分間）。規定量の上清（最大で１００μｌ）が９６ウエルのＭａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートにウエルあたりピペット注入される。この場合、プレートは、ＰＳＡに対するマウス抗体（例えば、クローンＥＲ−ＰＲ８の１μｇ／ｍｌ）で被覆され、そして、（例えば、５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）溶液により）ブロッキング処理されている。組換えＰＳＡの希釈系列（例えば、５０ｐｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌの間）がＰＳＡ標準物として調製され、標準物の各濃度の規定量がそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。さらに、細胞溶解液における校正されたＬＤＨ陽性コントロールの希釈系列（例えば、１／２５００の希釈度から開始する）が細胞数の標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。プレートが（例えば、クリングフィルムまたはアルミニウムホイルにより）密封され、室温で１時間インキュベーションされる。
【００８７】
続いて、５０μｌのＬＤＨ基質溶液がプレートのそれぞれのインキュベーションされたウエルに加えられ、プレートがアルミニウムホイルにより遮光して密封され、室温で３０分間放置される。その後、インキュベーションされたウエルのすべてがそれぞれ５０μｌの停止液（１ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ）と混合され、大きい気泡のすべてがニードルで穿刺され、すべてのウエルの光吸収が４９２ｎｍにおいてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定される。測定された吸収の強度が、細胞数の標準物に基づいて求めることができる細胞数に比例している。
【００８８】
次に、ウエルのすべてが、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。その後すぐに、ウエルが、ＰＳＡに対するヤギのポリクローナル検出抗体と、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における０．５μｇ／ｍｌの濃度で、室温で１時間インキュベーションされる。
【００８９】
次に、ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。検出抗体に対する、酵素ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲート化された二次抗体（例えば、マウスまたはウサギの二次抗体）が、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における２μｇ／ｍｌの濃度で加えられる。この時の室温におけるインキュベーション時間も１時間である。
【００９０】
ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄された後、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を含有する１００μｌの基質溶液がウエルあたり加えられる。インキュベーション時間が室温で１５分であり、その後、５０μｌの停止液（例えば、１ＭのＨ２ＳＯ４）がそれぞれのウエルにピペット注入される。最後に、ウエルの光吸収が４５０ｎｍの波長においてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定され、５７０ｎｍにおける吸収が引かれる。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができるｉｍＰＳＡの量に比例している。
【００９１】
結果の表示が、例えば、ｐｇ（ｉｍＰＳＡ）／細胞数（ＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞、または、代わりに、ＣＤ１６＋細胞、または、代わりに、単核白血球）として行われる。
【実施例５】
【００９２】
第５の実施形態：
磁気ビーズを用いたＣＤ１６＋集団の正の選択；細胞数測定、および、Ｅｌｉｓａプレートでの分子マーカー（ここではｉｍＰＳＡ）の定量。
【００９３】
本実施形態が６ｍｌの全血により開始される。この場合、６ｍｌの全血が、ポリエステルゲルおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液を含有するチューブに採取される。血液の遠心分離（例えば、１８００ｘｇ、２０分間）によって、単核白血球のすべてがゲル上方に血小板と一緒に単離される。
【００９４】
単離された細胞が、血小板を除去するために、０．１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）をさらに含有し得るＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）溶液（ｐＨ７．４）により２回洗浄される。
【００９５】
単離された単核白血球が、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。アリコートを採取し、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解し、２℃〜８℃で貯蔵することができる。懸濁物が、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する抗体をその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおいて２×１０７個のビーズ）と混合される。代替として、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体の５μｇを、振とうまたは揺動とともに２℃〜８℃で１０分間インキュベーションすることができ、その時、ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおける２×１０７個のビーズ）の添加が続く。
【００９６】
その後、単核白血球および磁気ビーズの懸濁物が、２℃〜８℃で２０分間、振とうまたは揺動される。その場合、抗体に結合されたビーズ、または、ストレプトアビジンにより標識されたビーズが、抗原ＣＤ１６をその表面に有する細胞に、または、ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体に結合し、これにより、ビーズが、表面抗原ＣＤ１６を有する細胞に結合する。
【００９７】
好適な磁石の助けを借りた、磁気ビーズに結合した細胞の分離がその後に続き、この場合、上清が廃棄される。ビーズが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄され、続いて、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解され、２℃〜８℃で保たれる。
【００９８】
次に、細胞溶解物のすべてが超音波浴において５分間処理され、好適な磁石が、対応する溶解物からビーズを除去するために使用され、溶解物がもう一度遠心分離される（１４０００ｘｇ、１０分間）。規定量の上清（最大で１００μｌ）が９６ウエルのＭａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートにウエルあたりピペット注入される。この場合、プレートは、ＰＳＡに対するマウス抗体（例えば、クローンＥＲ−ＰＲ８の１μｇ／ｍｌ）で被覆され、そして、（例えば、５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）溶液により）ブロッキング処理されている。組換えＰＳＡの希釈系列（例えば、５０ｐｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌの間）がＰＳＡ標準物として調製され、標準物の各濃度の規定量がそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。さらに、細胞溶解液における校正されたＬＤＨ陽性コントロールの希釈系列（例えば、１／２５００の希釈度から開始する）が細胞数の標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。プレートが（例えば、クリングフィルムまたはアルミニウムホイルにより）密封され、室温で１時間インキュベーションされる。
【００９９】
続いて、５０μｌのＬＤＨ基質溶液がプレートのそれぞれのインキュベーションされたウエルに加えられ、プレートがアルミニウムホイルにより遮光して密封され、室温で３０分間放置される。その後、インキュベーションされたウエルのすべてがそれぞれ５０μｌの停止液（１ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ）と混合され、大きい気泡のすべてがニードルで穿刺され、すべてのウエルの光吸収が４９２ｎｍにおいてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定される。測定された吸収の強度が、細胞数の標準物に基づいて求めることができる細胞数に比例している。
【０１００】
次に、ウエルのすべてが、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。その後すぐに、ウエルが、ＰＳＡに対するヤギのポリクローナル検出抗体と、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における０．５μｇ／ｍｌの濃度で、室温で１時間インキュベーションされる。
【０１０１】
次に、ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。検出抗体に対する、酵素ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲート化された二次抗体（例えば、マウスまたはウサギの二次抗体）が、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における２μｇ／ｍｌの濃度で加えられる。この時の室温におけるインキュベーション時間も１時間である。
【０１０２】
ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄された後、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を含有する１００μｌの基質溶液がウエルあたり加えられる。インキュベーション時間が室温で１５分であり、その後、５０μｌの停止液（例えば、１ＭのＨ２ＳＯ４）がそれぞれのウエルにピペット注入される。最後に、ウエルの光吸収が４５０ｎｍの波長においてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定され、５７０ｎｍにおける吸収が引かれる。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができるｉｍＰＳＡの量に比例している。
【０１０３】
結果の表示が、例えば、ｐｇ（ｉｍＰＳＡ）／細胞数（ＣＤ１６＋細胞、または、代わりに、単核白血球）として行われる。
【実施例６】
【０１０４】
第６の実施形態：
磁気ビーズを用いた、ＣＤ１６＋集団の正の選択、続いてＣＤ１６＋ＣＤ５６−集団またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−集団またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−集団の負の選択；細胞数測定、および、Ｅｌｉｓａプレートでの分子マーカー（ここではｉｍＰＳＡ）の定量。
【０１０５】
本実施形態が６ｍｌの全血により開始される。この場合、６ｍｌの全血が、ポリエステルゲルおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液を含有するチューブに採取される。血液の遠心分離（例えば、１８００ｘｇ、２０分間）によって、単核白血球のすべてがゲル上方に血小板と一緒に単離される。
【０１０６】
単離された細胞が、血小板を除去するために、０．１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）をさらに含有し得るＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）溶液（ｐＨ７．４）により２回洗浄される。
【０１０７】
単離された単核白血球が、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。アリコートを採取し、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解し、２℃〜８℃で貯蔵することができる。懸濁物が、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する抗体をその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおいて２×１０７個のビーズ）と混合される。代替として、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体の５μｇを、振とうまたは揺動とともに２℃〜８℃で１０分間インキュベーションすることができ、その時、ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおける２×１０７個のビーズ）の添加が続く。
【０１０８】
その後、単核白血球および磁気ビーズの懸濁物が、２℃〜８℃で２０分間、振とうまたは揺動される。その場合、抗体に結合されたビーズ、または、ストレプトアビジンにより標識されたビーズが、抗原ＣＤ１６をその表面に有する細胞に、または、ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体に結合し、これにより、ビーズが、表面抗原ＣＤ１６を有する細胞に結合する。
【０１０９】
好適な磁石を用いた、磁気ビーズに結合した細胞の分離がその後に続き、この場合、上清が廃棄される。ビーズが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄され、続いて、修飾ビオチンを含有する細胞放出緩衝液に再懸濁される。懸濁物が室温で１０分間振とうまたは揺動され、その後、ビーズおよび上清の磁気分離が行われる。上清が除去され、遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。懸濁物の規定量が懸濁物から取り出され、遠心分離され、ペレットが、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解され、２℃〜８℃で保たれる。
【０１１０】
次に、細胞懸濁物が、細胞表面抗原ＣＤ５６または細胞表面抗原ＣＤ５７または細胞表面抗原ＣＤ１６１に対する抗体をその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおいて２×１０７個のビーズ）と混合される。代替として、細胞表面抗原ＣＤ５６または細胞表面抗原ＣＤ５７または細胞表面抗原ＣＤ１６１に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体の５μｇを、振とうまたは揺動とともに２℃〜８℃で１０分間インキュベーションすることができ、その時、ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおける２×１０７個のビーズ）の添加が続く。
【０１１１】
２℃〜８℃での２０分間の振とうまたは揺動の後、好適な磁石を用いた、磁気ビーズに結合した細胞の分離が続き、この場合、上清が残される。細胞を有するビーズが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄される。洗浄液が上清に加えられ、同様に残され、ビーズが廃棄される。上清溶液が遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液が細胞ペレットに加えられる。溶解物が、少なくとも５分間、２℃〜８℃に置かれる。
【０１１２】
次に、細胞溶解物のすべてが超音波浴において５分間処理され、再度遠心分離される（１４０００ｘｇ、１０分間）。規定量の上清（最大で１００μｌ）が９６ウエルのＭａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートにウエルあたりピペット注入される。この場合、プレートは、ＰＳＡに対するマウス抗体（例えば、クローンＥＲ−ＰＲ８の１μｇ／ｍｌ）で被覆され、そして、（例えば、５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）溶液により）ブロッキング処理されている。組換えＰＳＡの希釈系列（例えば、５０ｐｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌの間）がＰＳＡ標準物として調製され、標準物の各濃度の規定量がそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。さらに、細胞溶解液における校正されたＬＤＨ陽性コントロールの希釈系列（例えば、１／２５００の希釈度から開始する）が細胞数の標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。プレートが（例えば、クリングフィルムまたはアルミニウムホイルにより）密封され、室温で１時間インキュベーションされる。
【０１１３】
続いて、５０μｌのＬＤＨ基質溶液がプレートのそれぞれのインキュベーションされたウエルに加えられ、プレートがアルミニウムホイルにより遮光して密封され、室温で３０分間放置される。その後、インキュベーションされたウエルのすべてがそれぞれ５０μｌの停止液（１ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ）と混合され、大きい気泡のすべてがニードルで穿刺され、すべてのウエルの光吸収が４９２ｎｍにおいてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定される。測定された吸収の強度が、細胞数の標準物に基づいて求めることができる細胞数に比例している。
【０１１４】
次に、ウエルのすべてが、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。その後すぐに、ウエルが、ＰＳＡに対するヤギのポリクローナル検出抗体と、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における０．５μｇ／ｍｌの濃度で、室温で１時間インキュベーションされる。
【０１１５】
次に、ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。検出抗体に対する、酵素ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲート化された二次抗体（例えば、マウスまたはウサギの二次抗体）が、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における２μｇ／ｍｌの濃度で加えられる。この時の室温におけるインキュベーション時間も１時間である。
【０１１６】
ウエルのすべてが再び、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄された後、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を含有する１００μｌの基質溶液がウエルあたり加えられる。インキュベーション時間が室温で１５分であり、その後、５０μｌの停止液（例えば、１ＭのＨ２ＳＯ４）がそれぞれのウエルにピペット注入される。最後に、ウエルの光吸収が４５０ｎｍの波長においてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定され、５７０ｎｍにおける吸収が引かれる。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができるｉｍＰＳＡの量に比例している。
【０１１７】
結果の表示が、例えば、ｐｇ（ｉｍＰＳＡ）／細胞数（ＣＤ１６＋ＣＤ５６−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−細胞、あるいは、代わりに、ＣＤ１６＋、あるいは、代わりに、単核白血球）として行われる。
【実施例７】
【０１１８】
第７の実施形態：
磁気ビーズを用いた、ＣＤ５６−集団またはＣＤ５７−集団またはＣＤ１６１−集団の負の選択、続いてＣＤ１６＋ＣＤ５６−集団またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−集団またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−集団の正の選択；細胞数測定、および、Ｅｌｉｓａプレートでの分子マーカー（ここではｉｍＰＳＡ）の定量。
【０１１９】
本実施形態が６ｍｌの全血により開始される。この場合、６ｍｌの全血が、ポリエステルゲルおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液を含有するチューブに採取される。血液の遠心分離（例えば、１８００ｘｇ、２０分間）によって、単核白血球のすべてがゲル上方に血小板と一緒に単離される。
【０１２０】
単離された細胞が、血小板を除去するために、０．１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）をさらに含有し得るＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）溶液（ｐＨ７．４）により２回洗浄される。
【０１２１】
単離された単核白血球が、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。アリコートを採取し、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解し、２℃〜８℃で貯蔵することができる。懸濁物が、細胞表面抗原ＣＤ５６または細胞表面抗原ＣＤ５７または細胞表面抗原ＣＤ１６１に対する抗体をその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおいて２×１０７個のビーズ）と混合される。代替として、細胞表面抗原ＣＤ５６または細胞表面抗原ＣＤ５７または細胞表面抗原ＣＤ１６１に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体の５μｇを、振とうまたは揺動とともに２℃〜８℃で１０分間インキュベーションすることができ、その時、ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおける２×１０７個のビーズ）の添加が続く。
【０１２２】
その後、単核白血球および磁気ビーズの懸濁物が、２℃〜８℃で２０分間、振とうまたは揺動される。その場合、抗体に結合されたビーズ、または、ストレプトアビジンにより標識されたビーズが、抗原ＣＤ５６または抗原ＣＤ５７または抗原ＣＤ１６１をその表面に有する細胞に、または、ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体に結合し、これにより、ビーズが、細胞表面抗原ＣＤ５６または細胞表面抗原ＣＤ５７または細胞表面抗原ＣＤ１６１を有する細胞に結合する。
【０１２３】
好適な磁石を用いた、磁気ビーズに結合した細胞の分離がその後に続き、この場合、上清が残される。ビーズが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄される。洗浄液が上清に加えられ、同様に残され、ビーズが廃棄される。上清溶液が遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。懸濁物の規定量が懸濁物から取り出され、遠心分離され、ペレットが、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解され、２℃〜８℃で保たれる。
【０１２４】
次に、細胞懸濁物が、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する抗体をその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおいて２×１０７個のビーズ）と混合される。代替として、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体の５μｇを、振とうまたは揺動とともに２℃〜８℃で１０分間インキュベーションすることができ、そのとき、ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおける２×１０７個のビーズ）の添加が続く。
【０１２５】
２℃〜８℃での２０分間の振とうまたは揺動の後、好適な磁石を用いた、磁気ビーズに結合した細胞の分離が続き、この場合、上清が廃棄される。細胞を有するビーズが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄され、続いて、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解され、少なくとも５分間、２℃〜８℃に置かれる。
【０１２６】
次に、細胞溶解物のすべてが超音波浴において５分間処理され、再度遠心分離される（１４０００ｘｇ、１０分間）。規定量の上清（最大で１００μｌ）が９６ウエルのＭａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートにウエルあたりピペット注入される。この場合、プレートは、ＰＳＡに対するマウス抗体（例えば、クローンＥＲ−ＰＲ８の１μｇ／ｍｌ）で被覆され、そして、（例えば、５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）溶液により）ブロッキング処理されている。組換えＰＳＡの希釈系列（例えば、５０ｐｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌの間）がＰＳＡ標準物として調製され、標準物の各濃度の規定量がそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。さらに、細胞溶解液における校正されたＬＤＨ陽性コントロールの希釈系列（例えば、１／２５００の希釈度から開始する）が細胞数の標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。プレートが（例えば、クリングフィルムまたはアルミニウムホイルにより）密封され、室温で１時間インキュベーションされる。
【０１２７】
続いて、５０μｌのＬＤＨ基質溶液がプレートのそれぞれのインキュベーションされたウエルに加えられ、プレートがアルミニウムホイルにより遮光して密封され、室温で３０分間放置される。その後、インキュベーションされたウエルのすべてがそれぞれ５０μｌの停止液（１ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ）と混合され、大きい気泡のすべてがニードルで穿刺され、すべてのウエルの光吸収が４９２ｎｍにおいてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定される。測定された吸収の強度が、細胞数の標準物に基づいて求めることができる細胞数に比例している。
【０１２８】
次に、ウエルのすべてが、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。その後すぐに、ウエルが、ＰＳＡに対するヤギのポリクローナル検出抗体と、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における０．５μｇ／ｍｌの濃度で、室温で１時間インキュベーションされる。
【０１２９】
次に、ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。検出抗体に対する、酵素ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲート化された二次抗体（例えば、マウスまたはウサギの二次抗体）が、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における２μｇ／ｍｌの濃度で加えられる。この時の室温におけるインキュベーション時間も１時間である。
【０１３０】
ウエルのすべてが再び、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄された後、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を含有する１００μｌの基質溶液がウエルあたり加えられる。インキュベーション時間が室温で１５分であり、その後、５０μｌの停止液（例えば、１ＭのＨ２ＳＯ４）がそれぞれのウエルにピペット注入される。最後に、ウエルの光吸収が４５０ｎｍの波長においてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定され、５７０ｎｍにおける吸収が引かれる。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができるｉｍＰＳＡの量に比例している。
【０１３１】
結果の表示が、例えば、ｐｇ（ｉｍＰＳＡ）／細胞数（ＣＤ１６＋ＣＤ５６−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−細胞、あるいは、代わりに、ＣＤ５６−細胞またはＣＤ５７−細胞またはＣＤ１６１−細胞、あるいは、代わりに、単核白血球）として行われる。
【実施例８】
【０１３２】
第８の実施形態：
磁気ビーズを用いた、ＣＤ５６−集団またはＣＤ５７−集団またはＣＤ１６１−集団の負の選択；ＣＤ１６＋ＣＤ５６−集団またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−集団またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−集団の正の選択；細胞数測定、および、Ｅｌｉｓａプレートでの分子マーカー（ここではｉｍＰＳＡ）の定量。
【０１３３】
本実施形態が６ｍｌの全血により開始される。この場合、６ｍｌの全血が、ポリエステルゲルおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液を含有するチューブに採取される。血液の遠心分離（例えば、１８００ｘｇ、２０分間）によって、単核白血球のすべてがゲル上方に血小板と一緒に単離される。
【０１３４】
単離された細胞が、血小板を除去するために、０．１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）をさらに含有し得るＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）溶液（ｐＨ７．４）により２回洗浄される。
【０１３５】
単離された単核白血球が、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。アリコートを採取し、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解し、２℃〜８℃で貯蔵することができる。懸濁物が、表面抗原ＣＤ５６または表面抗原ＣＤ５７または表面抗原ＣＤ１６１に対する抗体をその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおいて２×１０７個のビーズ）と混合される。代替として、細胞表面抗原ＣＤ５６または細胞表面抗原ＣＤ５７または細胞表面抗原ＣＤ１６１に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体の５μｇを、振とうまたは揺動とともに２℃〜８℃で１０分間インキュベーションすることができ、その時、ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおける２×１０７個のビーズ）の添加が続く。
【０１３６】
その後、単核白血球および磁気ビーズの懸濁物が、２℃〜８℃で２０分間、振とうまたは揺動される。その場合、抗体に結合されたビーズ、または、ストレプトアビジンにより標識されたビーズが、抗原ＣＤ５６または抗原ＣＤ５７または抗原ＣＤ１６１をその表面に有する細胞に、または、ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体に結合し、これにより、ビーズが、細胞表面抗原ＣＤ５６または細胞表面抗原ＣＤ５７または細胞表面抗原ＣＤ１６１を有する細胞に結合する。
【０１３７】
好適な磁石を用いた、磁気ビーズに結合した細胞の分離がその後に続き、この場合、上清が残される。ビーズが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄される。洗浄液が上清に加えられ、同様に残され、ビーズが廃棄される。上清溶液が遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、ペレットが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。
【０１３８】
細胞懸濁物の規定量（最大で１００μｌ）が９６ウエルのＭａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートにウエルあたりピペット注入される。この場合、プレートは、細胞表面抗原ＣＤ１６に対するマウス抗体（例えば、クローン３Ｇ８の５μｇ／ｍｌ）と、ＰＳＡに対するマウス抗体（例えば、クローンＥＲ−ＰＲ８の１μｇ／ｍｌ）との両方で被覆され、そして、（例えば、５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）溶液により）ブロッキング処理されている。懸濁物の希釈系列を調製することができる。残留した懸濁物は残しておく必要があるが、その際凍結させてはならない。
プレートが（例えば、クリングフィルムまたはアルミニウムホイルにより）密封され、室温で１時間インキュベーションされるか、または、２℃〜８℃で冷蔵庫において一晩インキュベーションされる。
【０１３９】
プレートが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により５回洗浄される。続いて、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する５０μｌの細胞溶解液がそれぞれのウエルにピペット注入される。加えて、抗原ＣＤ５６または抗原ＣＤ５７または抗原ＣＤ１６１をその表面に有しないすべての細胞の保存された懸濁物の２５μｌが、任意の数のウエルに、例えば、それぞれ２つのウエルにピペット注入され、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する同じ体積の細胞溶解液と混合される。さらに、組換えＰＳＡの希釈系列（例えば、５０ｐｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌの間）が標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。次に、プレートが２℃〜８℃に５分間置かれ、続いて、超音波浴において５分間処理される（プレートの底だけが水浴に浸かるだけであり、水面のわずかに下側に置かれたケージが支持体として役立つ）。
【０１４０】
プレートを密封し、室温（１時間）または２℃〜８℃（一晩）でインキュベーションした後、細胞溶解液における校正されたＬＤＨ陽性コントロールの希釈系列（例えば、１／２５００の希釈度から開始する）が標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。続いて、５０μｌのＬＤＨ基質溶液がプレートのそれぞれのインキュベーションされたウエルに加えられ、プレートがアルミニウムホイルにより遮光して密封され、室温で３０分間放置される。その後、インキュベーションされたウエルのすべてがそれぞれ５０μｌの停止液（１ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ）と混合され、大きい気泡のすべてがニードルで穿刺され、すべてのウエルの光吸収が４９２ｎｍにおいてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定される。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができる細胞数に比例している。
【０１４１】
次に、ウエルのすべてが、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。その後すぐに、ウエルが、ＰＳＡに対するヤギのポリクローナル検出抗体と、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における０．５μｇ／ｍｌの濃度で、室温で１時間インキュベーションされる。
【０１４２】
次に、ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。検出抗体に対する、酵素ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲート化された二次抗体（例えば、マウスまたはウサギの二次抗体）が、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における２μｇ／ｍｌの濃度で加えられる。この時の室温におけるインキュベーション時間も１時間である。
【０１４３】
ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄された後、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を含有する１００μｌの基質溶液がウエルあたり加えられる。インキュベーション時間が室温で１５分であり、その後、５０μｌの停止液（例えば、１ＭのＨ２ＳＯ４）がそれぞれのウエルにピペット注入される。最後に、ウエルの光吸収が４５０ｎｍの波長においてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定され、５７０ｎｍにおける吸収が引かれる。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができるｉｍＰＳＡの量に比例している。
【０１４４】
結果の表示が、例えば、ｐｇ（ｉｍＰＳＡ）／細胞数（ＣＤ１６＋ＣＤ５６−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−細胞、あるいは、代わりに、ＣＤ５６−細胞またはＣＤ５７−細胞またはＣＤ１６１−細胞、あるいは、代わりに、単核白血球）として行われる。
【実施例９】
【０１４５】
第９の実施形態：
磁気ビーズを１回用いたＣＤ１６＋ＣＤ５６−集団またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−集団またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−集団の正の選択；細胞数測定、および、Ｅｌｉｓａプレートでの分子マーカー（ここではｉｍＰＳＡ）の定量。
【０１４６】
本実施形態が６ｍｌの全血により開始される。この場合、６ｍｌの全血が、ポリエステルゲルおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液を含有するチューブに採取される。血液の遠心分離（例えば、１８００ｘｇ、２０分間）によって、単核白血球のすべてがゲル上方に血小板と一緒に単離される。
【０１４７】
単離された細胞が、血小板を除くために、０．１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）をさらに含有し得るＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）溶液（ｐＨ７．４）により２回洗浄される。
【０１４８】
単離された単核白血球が、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される。アリコートを採取し、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解し、２℃〜８℃で貯蔵することができる。懸濁物が、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体の５μｇ、および、細胞表面抗原ＣＤ５６または細胞表面抗原ＣＤ５７または細胞表面抗原ＣＤ１６１に対する、ビオチンとコンジュゲート化された抗体の同じ量（５μｇ）と混合される。懸濁物が、振とうまたは揺動とともに２℃〜８℃で１０分間インキュベーションされ、そのとき、ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおける２×１０７個のビーズ）の添加が続く。
【０１４９】
その後、単核白血球および磁気ビーズの懸濁物が、２℃〜８℃で２０分間、振とうまたは揺動される。その場合、ストレプトアビジンにより標識されたビーズが、ビオチンとコンジュゲート化された抗体に、同様にまた、ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体に結合し、これにより、ビーズが、表面抗原ＣＤ５６または表面抗原ＣＤ５７または表面抗原ＣＤ１６１を有する細胞に、あるいは、表面抗原ＣＤ１６を有する細胞に結合する。
【０１５０】
好適な磁石を用いた、磁気ビーズに結合した細胞の分離がその後に続き、この場合、上清が廃棄される。ビーズが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄され、洗浄液が廃棄され、続いて、ビーズが、修飾ビオチンを含有する細胞放出緩衝液に再懸濁される。懸濁物が室温で１０分間振とうまたは揺動され、その後、ビーズおよび上清の磁気分離が行われる。ＣＤ１６＋ＣＤ５６−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−細胞のみを含有する上清が取り出され、遠心分離され（３５０ｘｇ、８分間）、ペレットが、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解され、少なくとも５分間、２℃〜８℃に置かれる。
【０１５１】
次に、細胞溶解物のすべてが超音波浴において５分間処理され、再度遠心分離される（１４０００ｘｇ、１０分間）。規定量の上清（最大で１００μｌ）が９６ウエルのＭａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートにウエルあたりピペット注入される。この場合、プレートは、ＰＳＡに対するマウス抗体（例えば、クローンＥＲ−ＰＲ８の１μｇ／ｍｌ）で被覆され、そして、（例えば、５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）溶液により）ブロッキング処理されている。組換えＰＳＡの希釈系列（例えば、５０ｐｇ／ｍｌ〜２ｎｇ／ｍｌの間）がＰＳＡ標準物として調製され、標準物の各濃度の規定量がそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。さらに、細胞溶解液における校正されたＬＤＨ陽性コントロールの希釈系列（例えば、１／２５００の希釈度から開始する）が細胞数の標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。プレートが（例えば、クリングフィルムまたはアルミニウムホイルにより）密封され、室温で１時間インキュベーションされる。
【０１５２】
続いて、５０μｌのＬＤＨ基質溶液がプレートのそれぞれのインキュベーションされたウエルに加えられ、プレートがアルミニウムホイルにより遮光して密封され、室温で３０分間放置される。その後、インキュベーションされたウエルのすべてがそれぞれ５０μｌの停止液（１ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ）と混合され、大きい気泡のすべてがニードルで穿刺され、すべてのウエルの光吸収が４９２ｎｍにおいてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定される。測定された吸収の強度が、細胞数の標準物に基づいて求めることができる細胞数に比例している。
【０１５３】
次に、ウエルのすべてが、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。その後すぐに、ウエルが、ＰＳＡに対するヤギのポリクローナル検出抗体と、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における０．５μｇ／ｍｌの濃度で、室温で１時間インキュベーションされる。
【０１５４】
次に、ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。検出抗体に対する、酵素ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）とコンジュゲート化される二次抗体（例えば、マウスまたはウサギの二次抗体）が、例えば、ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）における２μｇ／ｍｌの濃度で加えられる。この時の室温におけるインキュベーション時間も１時間である。
【０１５５】
ウエルのすべてが再度、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄された後、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を含有する１００μｌの基質溶液がウエルあたり加えられる。インキュベーション時間が室温で１５分であり、その後、５０μｌの停止液（例えば、１ＭのＨ２ＳＯ４）がそれぞれのウエルにピペット注入される。最後に、ウエルの光吸収が４５０ｎｍの波長においてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定され、５７０ｎｍにおける吸収が引かれる。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができるｉｍＰＳＡの量に比例している。
【０１５６】
結果の表示が、例えば、ｐｇ（ｉｍＰＳＡ）／細胞数（ＣＤ１６＋ＣＤ５６−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−細胞、あるいは、代わりに、単核白血球）として行われる。
【実施例１０】
【０１５７】
第１０の実施形態：
第３、第４、第５、第６、第７および第９の実施形態において記載されるような、磁気ビーズを用いたＣＤ１４＋ＣＤ１６＋細胞またはＣＤ１６＋細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ５６−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−細胞の単離；事前またはその後でのどちらであっても、細胞の透過性化を伴う分子マーカー（ここではｉｍＰＳＡ）に対する抗体の添加；細胞数測定、および、Ｅｌｉｓａプレートでの分子マーカー（ここではｉｍＰＳＡ）の定量。
【０１５８】
第９の実施形態に従ったＣＤ１６＋ＣＤ５６−集団またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−集団またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−集団の単離について記載される成績。
【０１５９】
本実施形態が６ｍｌの全血により開始される。この場合、６ｍｌの全血が、ポリエステルゲルおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウム溶液を含有するチューブに採取される。血液の遠心分離（例えば、１８００ｘｇ、２０分間）によって、単核白血球のすべてがゲル上方に血小板と一緒に単離される。
【０１６０】
単離された細胞が、血小板を除去するために、０．１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および２ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）をさらに含有し得るＰＢＳ（リン酸塩緩衝化生理的食塩水）溶液（ｐＨ７．４）により２回洗浄される。
【０１６１】
単離された単核白血球が、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁され、細胞表面抗原ＣＤ１６に対する、修飾ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体の５μｇ、および、細胞表面抗原ＣＤ５６または細胞表面抗原ＣＤ５７または細胞表面抗原ＣＤ１６１に対する、ビオチンとコンジュゲート化された抗体の同じ量（５μｇ）と混合される。懸濁物が、振とうまたは揺動とともに２℃〜８℃で１０分間インキュベーションされる。ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）による洗浄工程の後、細胞が０．５ｍｌの固定処理試薬（例えば、１％ホルマリン溶液）に懸濁され、１０分後にＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により洗浄され、その後、１００μｌの透過性化媒体に入れられ、ＰＳＡに対する、酵素ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチンとコンジュゲート化されたマウス抗体（例えば、クローンＥＲ−ＰＲ８の１μｇ／ｍｌ）と約２０分間インキュベーションされる。その後、細胞がＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により洗浄され、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しない０．５ｍｌのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）に懸濁される；アリコートを採取し、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解し、２℃〜８℃で貯蔵することができる。ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおける２×１０７個のビーズ）の添加がその後に続く。その代替として、固定処理試薬および透過性化媒体による細胞の処理をこのプロトコルのこの時点では省略することができ、ただし、この場合には、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解され、２℃〜８℃で貯蔵されるアリコートを取り出した後、細胞が直ちに、ストレプトアビジンをその表面に有する適量の磁気ビーズ（例えば、５０μｌにおける２×１０７個のビーズ）とインキュベーションされる。
【０１６２】
その後、単核白血球および磁気ビーズの懸濁物が、２℃〜８℃で２０分間、振とうまたは揺動される。その場合、ストレプトアビジンにより標識されたビーズが、ビオチンとコンジュゲート化された抗体に、同様にまた、ＤＳＢ−Ｘビオチンとコンジュゲート化された抗体に結合し、これにより、ビーズが、表面抗原ＣＤ５６または表面抗原ＣＤ５７または表面抗原ＣＤ１６１を有する細胞に、あるいは、表面抗原ＣＤ１６を有する細胞に結合する。
【０１６３】
好適な磁石を用いた、磁気ビーズに結合した細胞の分離がその後に続き、この場合、上清が廃棄される。ビーズが、０．１％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含有するが、Ｃａ２＋イオンまたはＭｇ２＋イオンを全く含有しないＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により数回洗浄され、洗浄液が廃棄され、続いて、ビーズが、修飾ビオチンを含有する細胞放出緩衝液に再懸濁される。懸濁物が室温で１０分間振とうまたは揺動され、その後、ビーズおよび上清の磁気分離が行われる。ＣＤ１６＋ＣＤ５６−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−細胞のみを含有する上清が取り出され、遠心分離される（３５０ｘｇ、８分間）。上清を廃棄した後、細胞の透過性化を伴う、ｉｍＰＳＡに対する抗体の添加が既に行われたならば、ペレットが、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解され、少なくとも５分間、２℃〜８℃に置かれる。そうでなければ、ペレットが、上清を廃棄した後で０．５ｍｌの固定処理試薬（例えば、１％ホルマリン懸濁物）に懸濁され、１０分後にＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により洗浄され、その後、１００μｌの透過性化媒体に入れられ、ＰＳＡに対する、酵素ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチンとコンジュゲート化されたマウス抗体（例えば、クローンＥＲ−ＰＲ８の１μｇ／ｍｌ）と約２０分間インキュベーションされる。その後、細胞がＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）により洗浄され、１％のトリトンおよび１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）を含有する規定量の細胞溶解液において溶解され、少なくとも５分間、２℃〜８℃に置かれる。
【０１６４】
次に、細胞溶解物のすべてが超音波浴において５分間処理され、再度遠心分離される（１４０００ｘｇ、１０分間）。規定量の上清（最大で１００μｌ）が９６ウエルのＭａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートにウエルあたりピペット注入される。この場合、プレートは、（ＨＲＰとコンジュゲート化される、ＰＳＡに対する抗体が使用される場合には）マウス免疫グロブリンに対するポリクローナル抗体により、例えば、２μｇ／ｍｌの濃度で被覆されるか、あるいは、（ビオチンとコンジュゲート化される、ＰＳＡに対する抗体が使用される場合には）アビジンまたはストレプトアビジンにより被覆され、そして、（例えば、５％のＦＣＳ（ウシ胎児血清）溶液により）ブロッキング処理されている。酵素ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはビオチンとコンジュゲート化されたマウス抗体クローンＥＲ−ＰＲ８の希釈系列が標準物として調製され、標準物の各濃度の規定量がそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。これから、結合したｉｍＰＳＡの量に逆算することができる。さらに、細胞溶解液における校正されたＬＤＨ陽性コントロールの希釈系列（例えば、１／２５００の希釈度から開始する）が細胞数の標準物として調製され、標準物の各濃度の５０μｌがそれぞれの少なくとも２つの未使用ウエルにピペット注入される。プレートが（例えば、クリングフィルムまたはアルミニウムホイルにより）密封され、室温で１時間インキュベーションされる。
【０１６５】
続いて、５０μｌのＬＤＨ基質溶液がプレートのそれぞれのインキュベーションされたウエルに加えられ、プレートがアルミニウムホイルにより遮光して密封され、室温で３０分間放置される。その後、インキュベーションされたウエルのすべてがそれぞれ５０μｌの停止液（１ＭのＣＨ３ＣＯＯＨ）と混合され、大きい気泡のすべてがニードルで穿刺され、すべてのウエルの光吸収が４９２ｎｍにおいてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定される。測定された吸収の強度が、細胞数の標準物に基づいて求めることができる細胞数に比例している。
【０１６６】
次に、ウエルのすべてが、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄され、そして、ＨＲＰとコンジュゲート化される、ＰＳＡに対する抗体が使用される場合には、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）を含有する１００μｌの基質溶液と混合される。ビオチンとコンジュゲート化される、ＰＳＡに対する抗体が使用される場合には事前に、ＨＲＰとコンジュゲート化される、マウス免疫グロブリンに対するポリクローナル抗体と、例えば、０．５μｇ／ｍｌの濃度で、１時間インキュベーションされ、その後、ウエルのすべてが、０．０５％または０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ溶液により５回洗浄される。ＴＭＢを含有する基質溶液とのインキュベーション時間が室温で１５分であり、その後、５０μｌの停止液（例えば、１ＭのＨ２ＳＯ４）がそれぞれのウエルにピペット注入される。最後に、ウエルの光吸収が４５０ｎｍの波長においてＥｌｉｓａプレートリーダーで測定され、５７０ｎｍにおける吸収が引かれる。測定された吸収の強度が、標準物に基づいて求めることができるｉｍＰＳＡの量に比例している。
【０１６７】
結果の表示が、例えば、ｐｇ（ｉｍＰＳＡ）／細胞数（ＣＤ１６＋ＣＤ５６−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ５７−細胞またはＣＤ１６＋ＣＤ１６１−細胞、あるいは、代わりに、単核白血球）として行われる。
【０１６８】
現時点では、上記実施形態のすべてが、ｉｍＰＳＡの定量化を例示的に明らかにするものであり、これらはまた、明白なことではあるが、上記で述べられる他の分子マーカー（特に、請求項９において述べられる分子マーカー）のすべての特徴づけにも適用され得ること、そして、これらのマーカーの定量化が、ｉｍＰＳＡの定量化と同様な様式で達成されることは言及されなければならない。さらに、それぞれの分子マーカーまたはそれぞれのそのエピトープを決定するために、これらのマーカーおよび／またはエピトープにそれぞれ関連する抗体が使用されることは指摘されなければならない。
【０１６９】
現時点では、上記で記載される部分のすべてはそれら自体が、また、各組合せにおいて、特に、図面において表される詳細は、本発明のために不可欠であるとして主張されることは指摘されなければならない。当業者は、本発明に対する改変を熟知している。
【国際調査報告】
2011530077.tif 000002
2011530077.tif 000003
2011530077.tif 000004
2011530077.tif 000005
2011530077.tif 000006
2011530077.tif 000007