(57)【要約】  本発明は、幹細胞または体細胞の胚芽細胞への分化をイン・ビトロで誘導するための方法であって、次の工程：前記幹細胞または体細胞を、それらの分化を可能にする培地で培養する工程、および前記培養培地から胚芽細胞を回収する工程を含み、前記細胞が、少なくともＶａｓａ遺伝子を含んでなる外因性遺伝的構造で形質転換された細胞である方法に関する。このようにして得られた胚芽細胞およびキメラ動物も本発明の目的である。
2011505853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞または体細胞の胚芽細胞への分化をイン・ビトロで誘導するための方法であって、次の工程：
前記幹細胞または体細胞を、それらの分化を可能にする培地で培養する工程、および
前記培養培地から胚芽細胞を回収する工程
を含んでなり、
前記幹細胞または体細胞が、少なくともＶａｓａ遺伝子を含んでなる外因性遺伝的構造で形質転換された細胞である、方法。
【請求項２】
前記幹細胞または体細胞が、ニワトリ胚幹細胞（ｃＥＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞または体細胞が、前原始線条期（ステージＩＸ−ＸＩＩ）胚盤葉細胞のイン・ビトロ培養物から生じたニワトリ胚幹細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞または体細胞が、非ヒト哺乳類胚幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞または体細胞が、体細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞または体細胞が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３４ｃを含んでなる遺伝的構造で形質転換される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞または体細胞が、少なくとも１つの目的の外因性遺伝子で形質転換される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記目的遺伝子が、胚芽細胞において機能する組織特異的プロモーターの制御下で発現される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
適当な培養培地が、分化誘導因子を含有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分化誘導因子が、ＢＭＰファミリーに属する因子、ＴＧＦβファミリーに属する因子、受容体ｃ−Ｒｅｔのリガンド、ＢＤＮＦ、ＮＴ３およびＮＴ４からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって得られる胚芽細胞。
【請求項１２】
少なくとも１つの目的の外因性遺伝子によってコードされる産物を発現する、請求項７または請求項８に記載の方法によって得られる胚芽細胞。
【請求項１３】
少なくとも１つのＶａｓａ遺伝子を含んでなる外因性遺伝的構造で形質転換された、非哺乳類胚幹細胞。
【請求項１４】
少なくとも１つのＶａｓａ遺伝子と少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−３４ｃとを含んでなる外因性遺伝的構造で形質転換された、非ヒト哺乳類胚または成体幹細胞。
【請求項１５】
少なくとも１つのＶａｓａ遺伝子と少なくとも１つのｍｉＲＮＡ−３４ｃとを含んでなる外因性遺伝的構造で形質転換された、体細胞。
【請求項１６】
キメラ非ヒト動物を得るための方法であって、請求項１１もしくは請求項１２に記載の、または請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の細胞の分化後に得られる胚芽細胞が、胚に注入される、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法によって得られるキメラ非ヒト動物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法によって得られるキメラ非ヒト動物であって、前記キメラ動物の少なくとも１種の細胞が、少なくとも１つの目的の外因性遺伝子によってコードされる少なくとも１つの産物を発現する、キメラ非ヒト動物。
【請求項１９】
前記動物の少なくとも１種の細胞が、ｖａｓａ遺伝子またはｖａｓａ遺伝子とｍｉＲＮＡ−３４ｃとを含んでなり、かつ／または少なくとも１つの目的の外因性遺伝子によってコードされる産物を発現する、請求項１７または１８に記載のキメラ動物の子孫。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
緒論
本発明は、幹細胞または体細胞から胚芽細胞（germinal cells）をイン・ビトロで産生するための方法に関する。本発明はまた、得られるような胚芽細胞にも関する。優先的には、これらの細胞は目的の導入遺伝子を発現する。これらの胚芽細胞の受容体胚への注入により前記胚の生殖腺の定着が起こり、そのため、それらの胚芽細胞への目的の導入遺伝子を発現するキメラ動物を作製することが可能である。よって、そのようなキメラ動物はそれらの子孫にその導入遺伝子を伝えることができる。
【０００２】
背景技術
Ｖａｓａ遺伝子発現は、生殖細胞（germ cells）の最も特異的なマーカーの１つであると確認された(Tanaka et al., 2000; Extavour and Akam, 2003)。この遺伝子は、キイロショウジョウバエ属(Drosophila)で最初に同定され、転写因子ｅＩＦ４の相同体であるＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ活性を有するＤＥＡＤボックスＲＮＡ結合タンパク質をコードする(Lasko et al., 1988)。この遺伝子はＤＤＸ４と呼ばれることもある。
【０００３】
この遺伝子およびその特異性は、後生動物において高度に保存され(Mochizuki et al., 2001)、ヒト(Castrillon et al., 2000)、マウス(Fujiwara et al., 1994)、ツメガエル属(Xenopus)(Komiya et al., 1994)、ゼブラフィッシュ(Yoon et al., 1997; Brat et al;, 2000)でも、腕足類(Sagawa et al;, 2005)、カキ(Fabioux et al., 2004)、プラナリア(Shibata et al., 1999)、ヒドラ(Mochizuki et al., 2001)、polyaechetes Platynereisおよびエレガンス線虫(C. elegans)(Shisa et al., 2001)でも見られる。
【０００４】
ニワトリＶａｓａ相同体（Ｃｖｈ）は２０００年に同定され、クローニングされた(Tsunekawa et al., 2000)。
【０００５】
ニワトリの生殖細胞は発生のごく初期に予め決定され、特異的マーカーであるＶａｓａを特徴とする(Tsukenawa et al., 2000; Extavour and Akam, 2002)。これらの細胞は始原生殖細胞と呼ばれ、単離し、イン・ビトロで培養することができる(van de Lavoir, Nature, 2006)。また、これらの細胞は体細胞に分化させることもできる。
ニワトリでは、Ｃｖｈ陽性細胞は第１卵割には早くも検出され、産まれたての卵で通常観察されるステージＸ（ＥＧ＆Ｋ）胚ではおよそ３０個の細胞が存在する。後のステージ２−３（Ｈ＆Ｈ）では胚盤葉下層において約４５〜６０個の陽性細胞が同定され、ステージ４（Ｈ＆Ｈ）では形態形成運動の結果として生殖三日月環の前方に２００〜２５０個の陽性細胞が位置していた(Tsunekawa et al., 2000)。
【０００６】
始原生殖細胞は、胚クレスト(germinal crests)から誘導することができ、集まって胚形態になる。これらの細胞はイン・ビトロで維持することができるが；これらの細胞は胚幹細胞の後成的状態が異なる(Shiota et al., 2001; Reik et al., 2001)。
【０００７】
ニワトリにおける胚形成時のマーカー特異的発現のパターンに関するより詳細な情報は、ニワトリ胚細胞の性質を確認するのに有用な分子マーカーの組合せに関するＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５２５７４に開示されている。
【０００８】
哺乳類においても同じような機構が観察される。マウスの胚芽細胞は、胚形成初期に準備される始原生殖細胞の創始集団から誘導される。始原生殖細胞は、胚卵黄嚢の最初の血液系統にも寄与する初期マウス胚領域である近位胚盤葉上層から発生する。
【０００９】
ニワトリ胚幹細胞（ｃＥＳＣ）は、前原始線条期(pre-primitive streak)（ステージＩＸ−ＸＩＩ）胚盤葉細胞のイン・ビトロ培養物から発生した。ニワトリ胚幹細胞は、典型的なＥＳＣマーカー（例えばアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ））の存在、テロメラーゼ活性およびＥＣＭＡ−７、ＳＳＥＡ−ＩおよびＳＳＥＡ−３を含む種々の特異的抗体に対する反応性を特徴とした(Pain et al., 1996; ＦＲ  ９４／１２５９８; Pettite et al., 2004)。それらの哺乳類対応物の場合、これらの細胞は多能性であり、イン・ビトロでもイン・ビボでも３つの胚葉から分化した誘導体を生み出すことができる(Pain et al., 1996; Van de Lavoir et al., 2005)。
【００１０】
しかしながら、イン・ビトロでは細胞維持後すぐに胚の挙動はなくなってしまう。
【００１１】
イン・ビボでは、レシピエント胚へ注入すると、ＥＳ細胞は体細胞キメラを形成することができるが、宿主胚の生殖腺に効果的に定着することはできない。
【００１２】
その一方、培養していない胚盤葉細胞や長期培養したニワトリ始原生殖細胞はそれらの生殖細胞系能力を維持する。イン・ビトロでのＰＧＣの単離は、Ｖａｓａマーカーを発現する細胞の細胞スクリーニングに基づいて行われて成功している。
【００１３】
キメラ動物およびトランスジェニック動物の産生は、イン・ビトロで操作することができる細胞を得ることから始まる。しかしながら、始原生殖細胞は、ＥＳ細胞ほど容易に外因性ＤＮＡで形質転換させることができない。特に、リポフェクション系薬剤（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００、(Invitrogen R)、Ｆｕｇｅｎｅ(Roche)、ＰＥＩ...）を用いたトランスフェクションの効率は、ＥＳ細胞のトランスフェクションにおいて得られる効率と比べてむしろ低い。さらに、ネオマイシン(Neomycine)（Ｇ４１８）、ハイグロマイシン(Hygroycine)、ピューロマイシン(puromycine)などの選択薬の使用は、ＰＧＣよりもＥＳ細胞において効果が高く、これは前記ＰＧＣの増殖がＥＳ細胞よりも遅いためである。イン・ビトロでは、安定なクローンはＰＧＣからよりもむしろＥＳ細胞から得る方が容易であった。
【００１４】
そのため、トランスジェニック胚芽細胞の作出は、形質転換させることができ、かつ、イン・ビトロで胚芽細胞に分化することができるＥＳ細胞を培養し単離することから始まる。これらのトランスジェニック胚芽細胞は、レシピエント胚に生殖腺を定着させるために用いられ、このレシピエント胚はキメラ動物において発達し、子孫にまで伝わり得る遺伝子改変を有する。
【００１５】
マウスおよび他の哺乳類では、この問題は全く同じではない。
【００１６】
ネズミ胚幹細胞は、胚盤胞期胚の内細胞塊から１９８１年に初めて単離された。ネズミ胚幹細胞は、イン・ビトロでの培養下で何継代にもわたって維持することができる。
【００１７】
胚に注入されると、ＥＳＣは、３つ総ての胚葉から誘導される組織および生殖細胞系をもたらすことができる。研究により、ＥＳＣは体細胞培養系を自然発生的に形成させることにより胚発生特性を繰り返すことができることを示すことに成功した。
【００１８】
ｍＥＳＣからのマウス始原生殖細胞の発生は無添加培地での７日の培養後に観察された(Hubner et al, Science, 2003; Geijsen, Nature, 2004)。この自然発生的分化はヒトＥＳＣでも観察された。
【００１９】
また、マウスＥＳＣは、減数分裂を受け、雌雄両方の配偶子を形成することができる培養始原生殖細胞を生み出すことができることも示されている。
【００２０】
しかしながら、これらのＥＳ由来生殖細胞および配偶子の十分な潜在能力はまだ証明されていない。
【００２１】
さらに、このようなイン・ビトロで得られる胚芽細胞の割合は低いため、血清濃度が低く、サイトカインおよび増殖因子を含まない特異的分化培地での分化プロトコールに供する前に、細胞を選別し、その後濃縮して増殖培地でイン・ビトロで増殖させる必要がある。
【００２２】
最終的な生殖細胞表現型を誘導するために、トランスフェクトし、選別したＥＳ細胞を増殖させ分化させるという連続的段階を用いることが最も重要である。
【００２３】
従って、非胚芽細胞から胚芽細胞をイン・ビトロで得るための簡単で効率的な方法は先行技術には存在しないと思われる。
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、幹細胞または体細胞の胚芽細胞への分化をイン・ビトロで誘導するための方法であって、これらの細胞を遺伝学的に改変すること、およびその形質転換細胞を適当な培地で培養することによる方法に関する。幹細胞は、成体幹細胞など、胚幹細胞であっても非胚幹細胞であってもよい。
【００２５】
本発明者らは、イン・ビトロで培養したニワトリＥＳ細胞の、これらの細胞への外因性遺伝子「Ｖａｓａ」の導入からなる単一遺伝子改変により、胚芽細胞への分化を誘導することができることを見出した。
【００２６】
哺乳類胚幹細胞も、これらの細胞への外因性遺伝子「Ｖａｓａ」と特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡの導入からなる遺伝子改変により、胚芽細胞への分化を誘導することができる。
【００２７】
さらに、本発明は、ニワトリまたは哺乳類由来の体細胞の、胚芽細胞への分化を誘導するための方法であって、遺伝子「Ｖａｓａ」と特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡの両方を含んでなる遺伝的構造で前記細胞を形質転換することによる方法を提供する。
【００２８】
本発明の方法を用いて得られる胚芽細胞は、胚芽細胞特異的マーカーに特有の発現パターンを示す；特にニワトリ細胞は、ＰＣＴ／  ＥＰ２００７／０５２５７４に記載されるような特異的マーカーの発現によって特徴付けられる。
【００２９】
本発明の方法を用いて得られる胚芽細胞は、胚芽細胞を胚に注入するとそれらの胚芽細胞は生殖腺に定着することができるという事実によっても特徴付けられる。
【００３０】
この方法は、トランスジェニック胚芽細胞、および子孫に遺伝子改変を伝えることができるキメラ動物を作出するのに特に有用である。
【発明の具体的説明】
【００３１】
本発明は、幹細胞または体細胞の胚芽細胞への分化をイン・ビトロで誘導するための方法であって、次の工程：
前記幹細胞または体細胞を、それらの分化を可能にする培地で培養する工程、および
前記培養培地から胚芽細胞を回収する工程
を含んでなり、
前記幹細胞または体細胞が、少なくともＶａｓａ遺伝子を含んでなる外因性遺伝的構造で形質転換された細胞である方法に関する。
【００３２】
細胞分化を可能にする培地での細胞の培養は当技術分野で公知である。当業者は適当な培地および／または適当な増殖条件を選択することができる。
【００３３】
適当な培地は、特に、血清が低率（特に血清が１０％未満）である増殖培地である。当業者であれば、特定のサイトカイン、増殖因子などを添加または排除することによって、細胞の分化を好適にする(favorize)方法を知っている。
【００３４】
ニワトリ胚細胞の分化の促進に適した特定の培地は以下の実施例において示す。
【００３５】
分化した胚芽細胞を回収する工程は当業者に周知であり、ＦＡＣＳ細胞選別などのいくつかの方法によって実施することができる。
【００３６】
「形質転換された」または「形質転換」とは、外因性核酸の細胞への組込みを意味し、この新規遺伝子獲得は一時的であるか（遺伝子を有するベクターが取り除かれる場合）または永久的である（外因性ＤＮＡが染色体に組み込まれる場合）。これらの用語は、「トランスフェクトされた」および「トランスフェクション」とは区別されずに用いられる。形質転換されている細胞は「宿主細胞」とも呼ばれる。
【００３７】
細胞の形質転換は種々の技術によって実施することができる。当業者であれば、形質転換する必要がある細胞についてより適当な技術を選択する方法を知っている。
【００３８】
特に、ニワトリＥＳ細胞は、Pain et al., 1996およびPain et al., 1999に記載されている方法に従ってトランスフェクトすることができる。
【００３９】
ネズミＥＳ細胞は、Robertson et al., 1987に従っておよびエレクトロポレーションまたはリポフェクションのいずれかを用いるいくつかの独立プロトコールに記載されているようにトランスフェクトすることができる。
【００４０】
周知の体細胞性ヒト細胞系統である体細胞性ヒトＨｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）も当業者に周知の技術（リン酸カルシウム沈殿法または様々な企業（Roche、Invitrogen、BioRadなど）から提供されている様々なリポフェクション剤を用いたリポフェクションなど）に従って形質転換することができる。
【００４１】
本発明による外因性遺伝的構造は、５’から３’への方向に、少なくとも：
形質転換細胞において機能する発現プロモーター、
Ｖａｓａ遺伝子（コード配列の総てまたは一部を含み、総ての場合において、細胞の胚芽細胞への分化が得られるように機能する）、
形質転換細胞において機能する終結配列
を含んでなるカセットを意味する。
【００４２】
遺伝的構造を達成するために用いられる総ての分子生物学的技術は、Sambrook, Fritsch and ManiatisによるMolecular cloning: a laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に十分に記載されている。
【００４３】
本発明において用いる、用語「Ｖａｓａ遺伝子」は、Ｖａｓａファミリーの遺伝子をコードする、あらゆる種由来のいかなる遺伝子またはコード配列をも意味する。Ｖａｓａファミリーの系統樹を図１に示す。より特には、Ｖａｓａ遺伝子は以下：
ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｄ１４８５９のマウスのＶａｓａ遺伝子「ＤＤＸ４」(Fujiwara et al., 1994)；
ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＢ００４８３６のニワトリの遺伝子「Ｃｖｈ」(Tsunekawa et al., 2000)；
ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｓ７５２７５のラットのＶａｓａ遺伝子(Komoya and Tanigawa, 1995)；
ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｓ６９５３４のツメガエル属のＶａｓａ遺伝子(Komiya et al., 1994)；
ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＢ００５１４７のゼブラフィッシュのＶａｓａ遺伝子(Yoon et al., 1997)
のいずれかを意味する。
【００４４】
本発明によれば、カセットに含まれるＶａｓａ遺伝子は、宿主細胞と同じ種のものであってもよいし、宿主細胞と異なる種のものであってもよい。
【００４５】
特に、幹細胞または体細胞は、
ニワトリ、マウス、ヒト、または任意の種の任意のＶａｓａ遺伝子、特に図１の系統樹に示された遺伝子（しかし、Ｖａｓａファミリーに属する本明細書には示されていない任意の遺伝子も含まれる）、あるいは
Ｖａｓａ遺伝子のＤＮＡ配列と少なくとも５０％の相同性を有する任意の変異体、またはＶａｓａによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも３０％の同一性を有するタンパク質をコードする変異体：
を含んでなる構造で形質転換することができる。
【００４６】
実施例では本発明をニワトリＶａｓａ遺伝子に関して記載する。しかしながら、これは本発明によるより一般的な意味を有し、他の種の対応する遺伝子を含む。当業者は、Ｖａｓａ遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ参照配列を用いて、他の種における等価の遺伝子を決定することができる。
【００４７】
相同配列およびそれらの相同性率の同定手段は当業者に周知であり、特に、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上でそのウェブサイト上に示されたデフォルトパラメーターを用いて利用することができるＢＬＡＳＴプログラムが挙げられる。得られた配列は、例えばプログラムＣＬＵＳＴＡＬＷ(http ://www.ebi.ac.uk/clustalw/)を利用し、これらのウェブサイト上に示されたデフォルトパラメーターを用いて、活用する（アラインさせる）ことができる。
【００４８】
ＰＦＡＭデータベース(protein families database of alignments and hidden Markov models http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)は、タンパク質配列のアライメントの多数のコレクションである。各ＰＦＡＭは、マルチプルアライメントを視覚化し、タンパク質ドメインを考察し、生物間の分布を評価し、他のデータベースにアクセスし、既知のタンパク質構造を視覚化することを可能にする。
【００４９】
分化した胚芽細胞を得るためのこの方法は、イン・ビトロで培養した種々の細胞型に適用することができる。
【００５０】
特に、この方法は、ニワトリ胚幹細胞（ｃＥＳＣ）、優先的には、前原始線条期（ステージＩＸ−ＸＩＩ）胚盤葉細胞のイン・ビトロ培養物から生じた細胞に適用することができる。これらの細胞は、Pain et al., 1996およびPain et al., 1999に記載されている技術に従って得ることができる。
【００５１】
哺乳類の胚または成体幹細胞も、本発明による方法を用いることによって胚芽細胞へと分化させることができる。これらの細胞は、優先的には非ヒト細胞である。これらの細胞は、優先的には胚幹細胞であり、より優先的にはネズミ胚幹細胞である。ネズミＥＳ細胞は科学文献において詳しく記載されている。
【００５２】
驚くべきことに、本発明による方法は、非胚の体細胞にも適用することができる。体細胞には、生殖細胞系細胞を除く、体を作るいかなる細胞をも含まれる。「体細胞」とは、イン・ビトロでの培養のために体から採取された分化非生殖細胞、さらに培養下で維持された不死化非生殖細胞系統も含む。体細胞は、あらゆる種の細胞であってもよい（特にヒト細胞、ネズミ細胞、またはニワトリ細胞）。不死化ヒト細胞の例は、「ＨｅＬａ」と呼ばれる細胞系統（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）である。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、細胞、特に体細胞および哺乳類幹細胞は、ヒトｍｉｃｒｏＲＮＡ−３４ｃ、もしくは成熟ｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ−３４ｃと少なくとも９０％の相同性を示すそのようなｍｉｃｒｏＲＮＡの相同配列、またはそのようなｍｉＲＮＡもしくは相同体をコードするＤＮＡ配列を含んでなる遺伝的構造で形質転換される。
【００５４】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は約２１〜２３ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子であり、遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写されるがタンパク質へは翻訳されない遺伝子によってコードされる、すなわち非コードＲＮＡであり；その代わりとしてそれらの遺伝子はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物からｐｒｅ−ｍｉＲＮＡと呼ばれるショートステムループ構造へ、そして最終的には機能的ｍｉＲＮＡへとプロセッシングを受ける。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１以上のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と部分的に相補的であり、それらの主な機能は、遺伝子発現をダウンレギュレートすることである。
【００５５】
ｍｉｃｒｏＲＮＡは、エレガンス線虫(Caenorhabditis elegans)において発生タイミングのレギュレーターとして初めて同定された(Lee et al. 1993; Bartel 2004)が、ｍｉｃｒｏＲＮＡとの用語は、２００１年に一連の３つの科学論文において採用された（２００１年１０月２６日）。これらのＲＮＡは多様な動物で同定されており、一部は線虫(C. elegans)からキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)を通じてホモ・サピエンス(Homo sapiens)まで保存されている(Pasquinelli et al. 2000; Lagos-Quintana et al. 2001; Lau et al. 2001; Lee and Ambros 2001)。
【００５６】
ヒトｍｉｃｒｏＲＮＡ−３４ｃは、組織特異的に発現されるｍｉｃｒｏＲＮＡを同定するための、２００種のｍｉＲＮＡのパネル（ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ  ｐｒｏｂｅ  ｓｅｔ、Ambion社製）を用いた通常のスクリーニングから単離された(Baskerville & Bartel, 2005)。異なる分化ステージの種々のヒト組織が試験された。総ての低分子量ＲＮＡは、Ambion社によって提供されているＦｌａｓｈＰａｇｅ  ｋｉｔ（参照番号１３１０００）およびQiagen社製Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（参照番号７４１０４）などのプロトコールを用いて得られた。低分子量ＲＮＡは、一度単離されると、標識され、製造業者に従ってスライドのハイブリダイゼーションに用いられた。
【００５７】
このスクリーニングから単離されたｍｉＲＮＡのうち、ｍｉＲＮＡ  ｍｉｒ−１６、ｍｉｒ  １５ｂ、ｍｉｒ−１０６ａ、ｍｉｒ−１７−５ｐは胚芽細胞において発現されることが確認されたが、普遍的発現も示した。
【００５８】
ｍｉＲ３４ｃだけが胚芽細胞に限定された発現を示すと思われる。この結果はノーザンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ解析の両方によって確認された。
【００５９】
ヒトｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３４ｃの配列および成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３４ｃの配列を本願明細書ではそれぞれ、配列番号１および配列番号２として示す。優先的には、相同配列は、配列番号２と少なくとも９０％の相同性を有するものである。
【００６０】
ニワトリおよび哺乳類幹細胞、またはニワトリおよび哺乳類体細胞を胚芽細胞へと分化させるために、Ｖａｓａ遺伝子およびｍｉｃｒｏ−ＲＮＡ  ３４ｃ、または前記ｍｉｃｒｏＲＮＡをコードするＤＮＡ配列の連続発現を可能にする二段階法を使用することは、Ｖａｓａ遺伝子単独の発現に比べて最良の結果をもたらす。これはニワトリＥＳＣの分化についてもいえる（実施例３参照）。
【００６１】
本発明の目的においてはあらゆる種のいかなるｍｉＲＮＡ−３４ｃをも用いることができる。ｍｉＲＮＡ−３４ｃは宿主細胞と同じ種のものであってもよいし、宿主細胞と異なる種のものであってもよい。
【００６２】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３４ｃをコードするＤＮＡ配列はＶａｓａ遺伝子を含んでなる同じ遺伝的構造に組み込まれていてよく、またはもう１つの遺伝的構造の一部であってもよい。特に、前記コード配列は、独自のプロモーター配列および終結配列を有することが好ましい。
【００６３】
両方のコード配列が２つの異なるカセットの一部である場合、両方のカセットは宿主細胞に同時にまたは別々に、任意の順序で導入することができる。
【００６４】
これまでに明記したとおり、本発明による外因性遺伝的構造は、宿主細胞において機能する発現プロモーターを含んでなる。このプロモーターは、普遍的プロモーターおよび組織特異的プロモーターの中から選択することができる。
【００６５】
普遍的プロモーターは、いかなるタイプの細胞においても機能するものであり、例えば、遺伝子ＣＭＶ、ＴＫ、ＳＶ４０、β−アクチン、ＰＧＫ、Ｅ２Ｆａ等のプロモーターである。
組織特異的プロモーターは、以下：
胚幹細胞において特異的に機能するプロモーター：
−Ｏｃｔ４（哺乳類）、１Ｐ０６（ニワトリ）、Ｎａｎｏｇ、Ｒｅｘ１、Ｕｔｆ１
−Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｎｅｓｔｉｎ
−Ｇｃｎｆ、Ｅｏｍｅｓ
−Ｅｎｓ１
体細胞において特異的に機能するプロモーター
の中から選択することができる。
【００６６】
優先的には、プロモーターは誘導可能であり、増殖培地に誘導因子を添加することにより容易に誘導することができる。これらのプロモーターは当技術分野で周知であり、それらの配列を使って一般的なＮＣＢＩまたはＥＭＢＬ遺伝子データベースで検索することができ、これらのプロモーターは引用することにより本明細書の一部とされる。例えば、誘導プロモーターは、テトラサイクリン誘導プロモーターである。
【００６７】
本発明の特定の目的は、少なくとも１つの目的の外因性遺伝子を発現するトランスジェニック胚芽細胞を得ることである。
【００６８】
よって、本発明の好ましい実施形態によれば、前記幹細胞または体細胞は、少なくとも１つの目的の外因性遺伝子で形質転換される。
【００６９】
本発明の第１の態様において、Ｖａｓａ遺伝子および目的遺伝子は、同じ遺伝的構造に含まれる。
【００７０】
本発明のもう１つの態様において、Ｖａｓａ遺伝子および目的遺伝子は、２以上の異なる遺伝的構造の一部である。それらのカセットは、宿主細胞に同時にまたは別々に導入することができる。
【００７１】
前記細胞の形質転換は、当業者に公知のいずれの技術によっても実施することができ、形質転換すべき細胞型に従ってより適当な技術を用いることに留意する。
【００７２】
本発明の好ましい態様によれば、前記細胞の形質転換は、胚芽細胞への分化を起こさせる培養工程の前に行われる。
【００７３】
目的遺伝子は、当業者によって発現が望まれる任意の遺伝子である。目的遺伝子によって発現される遺伝子産物は、翻訳または非翻訳遺伝子産物例えばタンパク質、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイムであり得る。本発明の本目的において、好ましい目的遺伝子は、タンパク質、特には生殖ホルモン、成長ホルモン、抗体もしくはそのフラグメント、増殖因子、膜受容体、またはウイルス受容体をコードする遺伝子の中から選択される。
【００７４】
前記目的遺伝子はプロモーターの制御下で発現される。前記プロモーターは普遍的であってもよいし組織特異的であってもよく、場合によって誘導可能である。
【００７５】
本発明の好ましい態様において、目的遺伝子の発現を制御するプロモーターは、胚芽細胞において特異的に機能する。胚芽細胞特異的プロモーターは例えば：
Ｖａｓａ遺伝子のプロモーター
遺伝子Ｎａｎｏｚ、Ｄａｚｌ、Ｐｕｍｉｌｉｏ、Ｓｔａｕｆｅｎ、Ｔｕｄｏｒ等のプロモーター
遺伝子Ｓｔｅｌｌａ、Ｆｒａｇｉｌｉｓ等のプロモーター
Ｂｌｉｍｐ１のプロモーター（このプロモーターは別の発生ステージではあるがリンパ球Ｂにおいても特異的に機能する）
である。
【００７６】
適当な培地は形質転換細胞の細胞型の機能により決定される。胚芽細胞への分化を可能にする適当な培地は、血清濃度が低く、増殖因子を含まないことを特徴とするが、この増殖因子は増殖培地には存在する。
【００７７】
この定義された条件において、最も高い生殖細胞分化率は、前記細胞の適当な培地へのペーシング(pacing)の２〜５日後に得られる。ＢＮＤＦ、ＢＭＰなどの特定の増殖因子をさらに添加することにより、このような胚芽細胞分化動態および効率を改善することができた。
【００７８】
優先的には、適当な培養培地は分化誘導因子を含有する。このような分化誘導因子の例は：
ＢＭＰファミリーに属する因子、例えば、ＢＭＰ４、ＢＭＰ８、ＢＭＰ７、ＢＭＰ２、ＢＭＰ１５等
ＴＧＦβファミリーに属する因子、例えば、ＴＧＦβ、ｎｏｄａｌ、アクチビン(activine)、ＧＤＦ９等
受容体ｃ−Ｒｅｔのリガンド、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、ＮＴ４（ニューロトロフィン−３、−４）等
である。
【００７９】
当業者ならば、これらの因子の濃度を決定するのは容易である。
【００８０】
もう１つの態様において、本発明は、得ることができる単離された胚芽細胞、および本発明による方法によって得られる単離された胚芽細胞に関する。
【００８１】
分化誘導を受ける始原幹細胞または体細胞に応じて、これらの胚芽細胞は、あらゆる種、特にニワトリまたは哺乳類のものである。
【００８２】
これらの細胞は、特異的マーカーの発現および／または胚に注入されると生殖腺に定着する能力によって特徴付けることができる。
【００８３】
本発明の好ましい態様において、本発明によって得ることができるような胚芽細胞は、少なくとも１つの目的の外因性遺伝子によってコードされる産物を発現する。特に前記遺伝子産物は目的のタンパク質である。
【００８４】
本発明はまた、少なくとも１つのＶａｓａ遺伝子を含んでなる外因性遺伝的構造で形質転換された非哺乳類胚幹細胞に関する。
【００８５】
もう１つの態様において、本発明は、少なくとも１つのＶａｓａ遺伝子と１つのｍｉＲＮＡ−３４ｃを含んでなる外因性遺伝的構造で形質転換された哺乳類の胚または成体幹細胞に関する。優先的には、哺乳類細胞は非ヒト細胞であり、より優先的にはネズミ細胞である。優先的には、幹細胞は胚起源のものであり、より優先的にはネズミＥＳ細胞である。
【００８６】
もう１つの態様において、本発明は、少なくとも１つのＶａｓａ遺伝子と１つのｍｉＲＮＡ−３４ｃを含んでなる外因性遺伝的構造で形質転換された体細胞、すなわち非幹、非胚芽細胞に関する。
【００８７】
体細胞は、あらゆる種の細胞であってもよい（特にヒト細胞、ネズミ細胞、ニワトリ細胞）。体性不死化ヒト細胞の例はＨｅｌａ細胞である。
【００８８】
本発明はまた、キメラ非ヒト動物を得るための方法であって、
本発明の方法を用いて得られる胚芽細胞、または
本発明による形質転換幹細胞または体細胞の分化後に得られる胚芽細胞
が胚に注入される方法にも関する。
【００８９】
キメラ動物またはキメラは、遺伝学的に異なる細胞の２種以上の異なる集団を含む動物である；ここで、体細胞は、イン・ビトロで得られた胚芽細胞が注入された胚から生じ、これらの細胞は、受容体胚の細胞とは遺伝学的に異なっている。優先的には、胚に注入される胚芽細胞は受容体胚と同じ種のものである。
【００９０】
キメラ動物の産生は、この２０年の間に開発された周知の技術である。
【００９１】
本発明のもう１つの目的は、本発明による方法によって得られるキメラ非ヒト動物である。
【００９２】
本発明の特定の態様において、本発明による方法によって得られるキメラ非ヒト動物は、少なくとも１つの目的の外因性遺伝子によってコードされる少なくとも１つの遺伝子産物を発現する。
【００９３】
本発明のもう１つの目的は、本発明によるキメラ動物の子孫であって、前記動物の少なくとも１種の細胞は、ｖａｓａ遺伝子またはｖａｓａ遺伝子とｍｉＲＮＡ−３４ｃを含んでなり、かつ／または少なくとも１つの目的の外因性遺伝子によってコードされる産物を発現するキメラ動物子孫である。
【実施例】
【００９４】
実施例１：ニワトリＶａｓａ遺伝子を含んでなる遺伝的構造でのニワトリ胚幹細胞の形質転換および胚芽細胞への細胞の分化
白色レグホーン(White Leghorn)およびRed-Naked neck雌鶏の受精卵を地元の畜産家から購入し、加湿インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートした。
【００９５】
ｃＥＳＣ細胞を維持し、Pain et al., 1996;、Pain et al, 1999に記載のとおり、増殖培地（ＰＭ）でトランスフェクトした。ネオマイシンを２００μｇ／ｍＬで８日間毎日添加した後、安定なクローンを得た。
【００９６】
ａ）Ｃｖｈの外因性発現は生殖細胞関連遺伝子発現を誘導し、多能性関連遺伝子発現を喪失させた
融合ＧＦＰ：：Ｃｖｈ構築物をｃＥＳＣに導入した。トランスフェクションおよび薬剤選択後、クローンを得、プールし、細胞をＦＡＣＳにより分類した（レーザーＣＯＨＥＲＥＮＴ（登録商標）Ｅｎｔｒｅｐｒｉｓｅ（商標）ＩＩＣ（４８８ｎｍおよびＵＶ３５１〜３６４ｎｍ）を装備したＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（商標）ＳＥオプションＤｉｖａ）。およそ０．５％の細胞は高度にＧＦＰ陽性であった。
【００９７】
ＧＦＰ：：Ｃｖｈ高ｃＥＳＣ亜集団とＧＦＰ：：Ｃｖｈ陰性ｃＥＳＣ亜集団の間には大きな形態的相違は見られない。
ＧＦＰ：：Ｃｖｈ陽性細胞は、イン・ビトロで増殖条件下で増殖させることができ、さらに濃縮するためにこの場合も容易に分類することができる。
【００９８】
図２は、３つの分類細胞集団において定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した遺伝子発現レベル示す：
ＧＦＰ：：Ｃｖｈ高細胞
ＧＦＰ：：Ｃｖｈ中位細胞
ＧＦＰ：：Ｃｖｈ陰性細胞
【００９９】
ｃＰｏｕＶ（１Ｐ０６とも呼ばれる；この配列は、ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５２５７２において配列番号１として開示されている）の発現は、Ｃｖｈを発現するｃＥＳＣにおいて用量依存的に強くダウンレギュレートされる（ＧＦＰ：：Ｃｖｈ高ｃＥＳＣではＧＦＰ：：Ｃｖｈ陰性ｃＥＳＣと比べて最大６０％低下）ようである。
【０１００】
このダウンレギュレーションは、ＡＰ、Ｓｔｒａｔ８などのいくつかの特異的生殖細胞マーカーの誘導と、さらに内因性Ｃｖｈ発現と同時に観察される。
【０１０１】
しかしながら、これらの条件では、生殖細胞の極めて特異的なマーカーであるｃＤａｚｌの発現は、総てのＧＦＰ：：Ｃｖｈ亜集団において検出されない。
【０１０２】
結論として、Ｃｖｈの高い外因性発現は、ｃＥＳＣによって支えられており、遺伝子発現変化、特に多能性関連遺伝子の強いダウンレギュレーションをもたらす。
【０１０３】
ｂ）Ｃｖｈを過剰発現するｃＥＳＣは、Ｄａｚｌを発現する生殖細胞へと分化することができる
ＧＦＰ：：Ｃｖｈ高ｃＥＳＣおよびＧＦＰ：：Ｃｖｈ陰性ｃＥＳＣを、低血清濃度（５％）の増殖因子およびサイトカインを含まない適当な分化培地に播種した。
【０１０４】
これらの条件下では、ｃＰｏｕＶ、ｃＮａｎｏｇおよびｃＳｏｘ２などの多能性関連遺伝子の発現低下によって観察されるように、ＧＦＰ：：Ｃｖｈ陰性細胞は通常分化する。生殖細胞マーカーの発現の中等度の増加も観察され、ｃＤａｚｌ発現は検出されず、Ｃｖｈの生体内レベルのままである。これは図３に示されている。
【０１０５】
同じ条件で播種したとき、図３に示されるように、ＧＦＰ：：Ｃｖｈ高ｃＥＳＣは発現パターンにおいて様々な変化を示す：
多能性関連遺伝子は発現されたままである
生殖細胞特異的マーカーは劇的に誘導される（ｃＤａｚｌおよび内因性Ｃｖｈを含む）
Ｓｔｒａｔ８およびＳｃｙｐ３などの減数分裂前期の発現マーカーの強く著しい誘導がもたらされる
興味深いことに、ヒナＰＧＣ誘導に関与することが分かっているＳｄｆｌの発現も強く誘導される。
【０１０６】
形態学的には、分化培地に播種されたＧＦＰ：：Ｃｖｈ高ｃＥＳＣは、ＰＧＣの典型的な円形形態を示す。
【０１０７】
実施例２：ニワトリＥＳ細胞の分化後に得られる生殖細胞系細胞の特性評価
ａ）ステージＸ胚へのｃＥＳＣの注入
ＧＦＰ：：Ｃｖｈ高ｃＥＳＣのイン・ビボでの潜在能力を評価するために、増殖培地（ＰＭ）または分化培地（ＤＭ）のいずれかにおいて維持したこれらの細胞を、これまでに記載されている手順に従ってレシピエントステージＸ胚に注入した(Pain et al., 1996)。
【０１０８】
レシピエント胚に６Ｇｙで照射した（コバルト線源）。卵の外側部に小窓を作り、卵殻膜を取り除いた。１〜３μｌ中５００〜２０００個の細胞を、２０μｌホウケイ酸塩マイクロピペットを用いて胚下腔に注入した。二重の卵殻膜で窓を閉じ、Ｖｉｓｕｌｉｎ(Hartmann ＮＯ  ６８５７２１／３）１片で補強した。
卵を１２〜１５日間インキュベートした。
ｂ）ＧＦＰ：：Ｃｖｈ高ｃＥＳＣは高効率で胚生殖腺に定着することができる
胚を１３〜１５日間インキュベートし、異なる胚除去体細胞組織（心臓および腎臓および生殖腺など）でＧＦＰ：：Ｃｖｈ陽性細胞の存在をゲノムと発現の両方のレベルにおいて解析した。モック培地を注入した胚とこれらの細胞を注入した胚では生存率（およそ８％）は同じである。
【０１０９】
ゲノムＰＣＲ解析により、増殖培地条件および分化培地条件で維持したＧＦＰ：Ｃｖｈ高ｃＥＳＣを注入した胚それぞれの７０％および５０％においてＧＦＰ：Ｃｖｈシグナルの存在を検出した（図４）。
非注入対照胚は全くシグナルを示さない。
【０１１０】
３種類のキメラに識別される：
体細胞キメラ胚（ＳＣＥ）（前記シグナルが体細胞組織でのみ検出される場合）
混合キメラ胚（ＭＣＥ）（前記シグナルが体細胞組織と生殖腺の両方において検出される場合）
生殖細胞系キメラ胚（ＧＣＥ）（前記シグナルが注入された胚の生殖腺でのみ検出される場合）
ＧＦＰ：：Ｃｖｈ高ｃＥＳＣおよびＧＦＰ：：Ｃｖｈ陰性ｃＥＳＣを増殖培地（ＰＭ）または分化培地（ＤＭ）のいずれかにおいて５日間維持した後、レシピエントステージＸ胚に注入した。
以下の表１では、得られた各キメラ種：ＳＣＥ（体細胞キメラ胚）、ＧＣＥ（生殖細胞系キメラ胚）、ＭＣＥ（混合キメラ胚）の詳細な割合を示している。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
分化培地で培養したＧＦＰ：：Ｃｖｈ高ｃＥＳＣ細胞は強い生殖腺定着を示し、得られたのは生殖細胞キメラ胚６６，７％、体細胞キメラ胚はわずか１１，１％である（表１）。これらの細胞の「生殖細胞配向」が明らかに示されている。
【０１１３】
増殖培地で維持した同じ細胞ではＧＣＥ２０％、ＭＣＥ４０％およびＳＭＥ４０％にしかならない。
【０１１４】
この結果は、適当な条件で培養したＧＦＰ：：Ｃｖｈ高ｃＥＳＣの強い生殖細胞向性を明示している。
【０１１５】
このゲノム解析に加えて、ゲノム解析に用いなかった１つの残る生殖腺でin situハイブリダイゼーションを行った。このハイブリダイゼーションではｃＤＡｚｌ陽性生殖細胞の局在に対応した皮質領域におけるＧＦＰ陽性細胞の存在が明らかになった。
【０１１６】
結論として、これらの結果は、Ｃｖｈ改変ｃＥＳＣは生殖細胞に誘導され、イン・ビボで生殖腺に定着することができ、同時にそれらの体細胞分化可能性がなくなることを示している。
【０１１７】
実施例３：ニワトリＥＳＣにおけるｍｉＲ３４ｃおよびｖａｓａの同時過剰発現
ＧＦＰ：Ｃｖｈ細胞を、ｍｉＲ３４ｃまたは陰性対照として、ｐｍｉＲを発現する発現ベクターでトランスフェクトする。これらの細胞におけるｍｉＲ３４ｃの過剰発現により、生殖細胞マーカーのアップレギュレーションが分かる。
【０１１８】
これまでに示したように、ニワトリ胚幹細胞（ｃＥＳＣ）におけるＣｖｈ（ニワトリＶａｓａ相同体）の過剰発現は、これらの細胞において生殖細胞表現型を出現させる（上記参照）。
これらの細胞では、ｍｉＲ３４ｃの過剰発現後、次の特徴を観察することができる：
生殖細胞特異的マーカーのより強い発現（図５Ａ）、
多能性マーカーにおけるわずかな増加（ｃＰｏｕｖおよびＮａｎｏｇ）、
他の系統限定マーカーの変化なし、
生殖細胞マーカーの増加（図５Ｂ）。
【０１１９】
ｍｉＲ３４−ｃは、ｖａｓａ遺伝子でトランスフェクトしたｃＥＳＣの生殖細胞分化を増進することにより生殖細胞表現型に作用していると我々は結論付ける。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】異なる種のＶａｓａ遺伝子間の配列相同性率の表。
【図２】ＧＦＰ／Ｃｖｈ陰性ｃＥＳＣ、ＧＦＰ／Ｃｖｈ中位ｃＥＳＣおよびＧＦＰ／Ｃｖｈ高ｃＥＳＣの発現特性。異なる亜集団について定量ＲＴ−ＰＣＲによりレベルを評価した。対照ＧＦＰ／Ｃｖｈ陰性ｃＥＳＣ集団におけるレベルを任意に値１とした。各サンプルを二連で行った。５回の独立した試験では同じような結果を得た。
【図３】ＧＦＰ／Ｃｖｈ陰性ｃＥＳＣおよびＧＦＰ／Ｃｖｈ高ｃＥＳＣの分化動態。（Ａ）試験の模式図。（Ｂ−Ｃ）５日の分化過程中の発現レベル。０，５ｘ１０６細胞を１０ｃｍ皿に播種し、低血清濃度（５％）の増殖サイトカインを含まない分化培地で５日間培養した。胚芽関連遺伝子の発現レベルを定量ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。各遺伝子について、Ｔ０におけるレベルを値１とした。各サンプルを二連で行った。２回の独立した試験では同じ結果を得た。
【図４】宿主胚の定着可能性：試験の模式図。
【図５】ｍｉＲＮＡ−３４ｃをさらに発現するＧＦＰ／Ｃｖｈ細胞の発現特性。
【図１】
2011505853.tif 000004
【図２】
2011505853.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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