(57)【要約】  例えば、血液または尿などの臨床液体試料中の検体を検出および定量するための使い捨て紙基材アッセイデバイスを本明細書に記載する。本デバイスは、医療インフラストラクチャーが存在しない世界の領域で使用するのに特に好適となり得る。検査デバイスは、様々な検体の検出に適するように構成することができるため、汎用性がある。本デバイスは、使用や解釈も容易である。典型的には、試料を１滴、デバイス上の表示された位置に塗布するだけで、アッセイを行うことができる。デバイスは、典型的には比色法によるものであり、肉眼で読み取り可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物液体試料中の検体を定量するための検査デバイスであって、
液体試料注入領域；
比色検査読み取り領域；
前記試料を吸収すると所定の色を維持または表示する陰性対照領域；
陽性対照領域、ならびに
前記注入領域への液体試料の塗布に応答して、液体を前記注入領域と前記読み取り領域および対照領域との間で輸送する液体流路；
を含む複数の機能領域を画定する多孔質親水性シート；
を備えるデバイスであり、
前記デバイス内に、前記試料中の検体の濃度に応じて前記読み取り領域に色のシェードまたはパターンを生じさせるように構成されている少なくとも１種の乾燥発色試薬が配置されており；
前記デバイス内に、前記陽性対照領域で反応して発色する乾燥発色試薬が配置されており；
検査の有効性が前記陽性対照領域の変色および前記陰性対照領域における所定の色の維持または表示により示されるデバイス。
【請求項２】
生物液体試料中の検体を定量するための検査デバイスであって：
液体試料注入領域；
読み取り領域の背景となる色の領域を含む比色検査読み取り領域であって、前記背景となる色が前記読み取り領域で呈される色と光学的に相互作用して、塗布された試料中の異なる検体濃度の視覚的識別を改善する比色検査読み取り領域；
比色対照領域；
前記注入領域と、前記読み取り領域と対照領域の両方との間で液体を輸送する液体流路；
を含む複数の機能領域を画定する多孔質親水性シート
を備えるデバイスであり、
前記デバイス内に、前記注入領域への液体試料の塗布に応答して、運ばれ、前記試料中に検体が存在する場合、検体と反応し、試料中の検体の濃度に応じて前記読み取り領域に色のシェードを生じさせる乾燥発色試薬が配置されているデバイス。
【請求項３】
互いに平行に配置された複数のシートを備え、その少なくとも２枚が前記シート間の液体流動連通を可能にする開口部を画定する液体不透過性バリア層により分離されている、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記読み取り領域の背景となる色の領域を備え、前記背景となる色が前記読み取り領域で呈される色と光学的に相互作用して、塗布された試料中の異なる検体濃度の視覚的識別を改善する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
前記発色試薬が肝臓酵素と反応する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記試料が、高濃度のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、またはこれらの混合物を含有すると思われる血液試料である、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
湿潤時に乾燥時とは異なる外観を有する、前記シートに塗布された有色領域を備える陰性対照領域を備える、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記読み取り領域が、前記発色試薬により生成する有色種を捕捉する固定化バインダを備える前記シートの一領域を備え、前記試料中の検体の濃度が前記注入領域への液体の塗布に応答して呈色する前記領域の部分により示される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記領域が連続的であり、前記試料中の検体の濃度が前記連続領域内の直線状の呈色範囲により示される、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記領域が複数の別個の領域を備え、前記試料中の検体の濃度が呈色する領域に数により示される、請求項８に記載のデバイス。
【請求項１１】
試料の塗布後、所定の時間間隔にわたり液体が供給され、リザーバが充填されてデバイスを読み取る準備が整っているという表示を備える、前記注入領域と液体連通している前記デバイス内に配置されたリザーバを備えるタイマーを画定する領域をさらに備える、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
前記タイマーは、液体が前記リザーバに到達し、前記表示を作動させるのに所要する、時間の長さを決定する所定の寸法のチャネルを備える、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記表示は、デバイスを読み取る準備が整っているときに視認可能な、印刷されたメッセージである、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記タイマーが陽性比色対照領域としても機能する、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記リザーバが前記読み取り領域の下流に配置されている、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記試料注入領域の下流に配置されたフィルタをさらに備える、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記発色試薬の下流且つ前記比色検査読み取り領域の上流に、前記検体と前記発色試薬との混合物を輸送する滞留領域をさらに備え、前記滞留領域は流動を妨げる疎水性表面を含む多数のマイクロ流路を備え、前記マイクロ流路の数および寸法は、前記混合物が通過する時、インキュベーション時間を所定の時間間隔内に設定する役割を果たす、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記滞留領域に、液体が前記滞留領域を通過する速度を遅らせる疎水性材料が含浸されている、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記シートの表面に疎水性材料を印刷し、前記疎水性材料が前記シートの細孔に吸収されるように加熱することにより前記滞留領域を形成する、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
インキュベーション中、前記滞留領域で形成された複合体を捕捉するために、前記比色検査読み取り領域に固定化バインダをさらに備える、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記流路に沿って液体を吸引し、前記滞留領域および比色検査読み取り領域を通過させ、それにより前記比色検査読み取り領域から未結合の有色種を除去するために、前記比色検査読み取り領域の下流に吸着性リザーバをさらに備える、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記滞留領域を画定する平行に配置されたシートと流体連通している前記乾燥発色試薬を保持するシートをさらに備える、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記デバイスの次の要素：乾燥発色試薬を保持する領域；試料注入領域；比色検査読み取り領域；滞留領域；および吸着性リザーバ；の少なくとも２つが単一の前記多孔質親水性シート上に画定されている、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記シート間の液体流動連通を可能にする開口部を画定する前記バリア層を備えるパターニングされた接着剤層を備える、請求項３に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記試料注入領域と前記読み取り領域が異なる前記シート上に配置されている、請求項３に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記読み取り領域と前記乾燥発色試薬が異なる前記シート上に配置されている、請求項３に記載のデバイス。
【請求項２７】
前記読み取り領域の色を検体濃度に関連付けるカラーチャートをさらに備える、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記カラーチャートが前記シートと一体化されている、請求項２７に記載のデバイス。
【請求項２９】
それぞれの異なる乾燥発色試薬を使用する複数の読み取り領域を備える、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項３０】
前記流路が、液体流動の輸送方向を定め、前記親水性シートの厚みに実質的に浸透する液体不透過性境界により画定されている１本の親水性チャネルまたは親水性チャネルのパターンを備える、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項３１】
前記注入領域と液体流動連通している１つまたは複数の電極を備える電極アセンブリをさらに備える、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項３２】
生物液体試料中の１種または複数種の検体を測定するための検査デバイスの製造方法であって：
ａ．吸収性流動輸送を支持する第１の多孔質親水性シートを提供する工程；
ｂ．前記多孔質シートの厚みに浸透し各要素を画定する疎水性バリアのパターンをそれぞれ備える検査デバイス要素の配列を前記シートに印刷する工程であって、そのそれぞれが：
液体流路；および
比色検査読み取り領域；
を含む複数の機能領域を備える工程；
ｃ．前記第１のシートに第２の多孔質親水性シートをラミネートして、ラミネートを形成する工程；および
ｄ．前記ラミネートを打ち抜いて個々の前記要素に分離し、多数の機能性検査デバイスを形成する工程；
を含む方法。
【請求項３３】
工程ｄの前に、前記検査デバイス要素のそれぞれに試薬をロボットでピペッティングする工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の多孔質親水性シートに試薬を付着させる工程をさらに含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記シート間の流体流動連通が実現するように構造部材を見当合わせするため、工程ｃの前に前記第１のシートと前記第２のシートを位置合わせする、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
フィルタ要素の配列を画定する第３のシートを提供する追加の工程、および、前記第３のシートを前記第１および第２のシートにラミネートして、前記検査デバイス要素の関係する前記液体流路と流体連通しているフィルタ要素を位置決めする追加の工程をさらに含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
工程ｃが前記第１のシートと前記第２のシートとの間に液体不透過性層を設ける工程を含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記液体不透過性層が前記シートに粘着する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記液体不透過性層を設ける工程が、接着剤をある一定のパターンでシートに塗布する工程を含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
シートの表面の一領域に所定の濃度のインクを印刷することにより塗布し、前記インクを前記シートに浸透させ、前記インクを硬化させて、前記インクにより画定された流動を妨げる疎水性表面を含む多数のマイクロ流路を備える滞留領域を形成する工程をさらに含み、前記マイクロ流路の数および寸法は液体試料が前記滞留領域を通過する所定の時間間隔を設定する役割を果たす、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記シートの表面に比較的高密度の前記インクを印刷することにより塗布して、流路の境界を画定し、前記インクを前記シートに浸透させ、インクを硬化させて、前記滞留領域と流体連通する液体流路を画定する液体不透過性バリアを形成する追加の工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記シートを、吸収性流動輸送を支持し、少なくとも一部が前記シートと液体連通している少なくとも１枚の追加の多孔質親水性シートにラミネートし、前記追加のシートが流路；比色検査読み取り領域；複合体を捕捉するための検査部位の固定化バインダ；第２の滞留領域；液体試料入口；対照部位；乾燥発色試薬リザーバ；吸着性リザーバ；および試料分割層からなる群から選択される少なくとも１つの要素を画定する追加の工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記シートの表面に比較的高密度の前記インクを印刷することにより塗布し、流路；比色検査読み取り領域；複合体を捕捉するための検査部位の固定化バインダ；第２の滞留領域；液体試料入口；対照部位；乾燥発色試薬リザーバ；吸着性リザーバ；および前記シートと液体連通している試料分割層からなる群から選択される少なくとも１つの要素の境界を画定し、前記インクを前記シートに浸透させ、前記インクを硬化させて、前記要素の境界を画定する液体不透過性バリアを形成する追加の工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記滞留領域と流体流動連通しているフィルタまたは発色試薬リザーバを設ける追加の工程を含む、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記シートの表面の複数の領域に所定の濃度のインクをある特定の配列で印刷することにより塗布し、前記滞留領域の配列を形成し、前記シートを、吸収性流動輸送を支持し、少なくとも一部が前記シートと液体連通している少なくとも１枚の追加の多孔質親水性シートにラミネートし、前記追加のシートが流路；比色検査読み取り領域；複合体を捕捉するための検査部位の固定化バインダ；第２の滞留領域；液体試料入口；対照部位；乾燥発色試薬リザーバ；吸着性リザーバ；および試料分割層からなる群から選択される少なくとも１つの要素の対応する配列を画定する工程を含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１１年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／５３９，７１４号明細書、および２０１１年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６１／５５５，９７７号明細書の利益および優先権を主張し、これらの内容はそれぞれ参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
患者から採取した試料中の検体濃度を監視するための血液検査は広く利用可能である。一例としては、現在先進国において標準的な医療の一部となっている、肝臓の状態の診断を行うためのデバイス、特に、基礎肝疾患を有するまたは肝毒性（薬物により誘発される肝障害、即ち、ＤＩＬＩ）を引き起こし得る医薬を服用している個人のためのデバイスがある。ＤＩＬＩおよびその後の血清トランスアミナーゼ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルの上昇を招くおそれがある医薬としては、スタチン類、アセトアミノフェン、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、フェニルブタゾン、抗てんかん薬、抗生物質、および抗うつ剤が挙げられる。さらに、Ａ型またはＢ型急性ウイルス性肝炎、アルコール中毒、薬物耽溺、肝臓癌、ショック、肝臓脂肪症、即ち脂肪肝、肥満、糖尿病、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、α１−アンチトリプシン欠乏症、環境毒素暴露、およびクローン病などの疾患はトランスアミナーゼの増加と相関し、頻繁な監視を必要とする。
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または結核（ＴＢ）の治療を受けている患者には、ＤＩＬＩが頻発する特殊な症例が発生する。従って、米国ガイドラインは、ＴＢおよび／またはＨＩＶの標準的な療法中のリスクのある個人の血清トランスアミナーゼのベースラインおよび連続的監視を要求している。ＴＢ療法中の臨床上重大な肝毒性（典型的には、イソニアジド、リファンピン、および／またはピラジナミドなどの医薬による）の全発生率は２〜３３％の範囲であり、異常なベースライントランスアミナーゼ、加齢、既存の肝臓疾患（例えば、Ｂ型および／またはＣ型肝炎）、飲酒、妊娠、および栄養失調症などの複数の要因により、リスクが増加する可能性がある。
【０００４】
最新の設備や計測機器へのアクセスが限られている状況と広く定義される、資源が限られている状況における血液検査または尿検査による、健康に関連するパラメータ、例えば、肝臓の健康状態を示す検体の監視は、相対的費用ならびに物流的（ｌｏｇｉｓｔｉｃａｌ）および実際的問題により妨げられることが多い。これらの状況では、検査は中央集中型の実験室または地域の実験室で行われることが多く、その結果、結果を入手し、それに基づいて行為を行うのが著しく遅れることが多い。これらの障害のため、資源が限られている多くの状況では、患者は最低限の監視しか受けられないまたは全く監視を受けられない。臨床上重要な検体用の低コストで低侵襲性のポイント・オブ・ケア検査デバイスは、発展途上諸国と先進諸国の両方で患者の治療に劇的な影響を及ぼすであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
臨床液体試料、例えば、血液または尿中の検体を検出および定量するための使い捨てアッセイデバイスの効率的且つ極めて安価な製造を可能にする一連の方法および構造的改善が開発された。本検査デバイスは、様々な検体の検出に適するように構成することができるため、汎用性がある。使用時、それらは使い易く、自己作動型であり：典型的には、デバイス上の表示された位置に試料を１滴塗布するだけでアッセイを行うことができる。さらに、それらは解釈が容易であり：典型的には比色法によるものであり、肉眼で読み取ることができる。さらに、それらは少なくとも半定量的である。これらの方法および改善を、肝機能用の使い捨て紙基材検査の設計に関して、より詳細に後述するが、それらを医療インフラストラクチャーが存在しない世界の地域で使用するのに好適な比色臨床アッセイデバイス群の開発に応用することができる。
【０００６】
広範な一態様では、本発明は、生物液体試料中の検体を定量するための検査デバイスを提供する。本デバイスは、液体試料注入領域；比色検査読み取り領域；試料を吸収すると所定の色を維持または表示する陰性対照領域；陽性対照領域、ならびに、注入領域への液体試料の塗布に応答して、注入領域と、読み取り領域および対照領域の両方との間で液体を輸送する液体流路；を含む複数の機能領域を画定する、多孔質親水性シート、例えば、吸着性の紙またはニトロセルロースを備える。試料中の検体の濃度に応じて、読み取り領域に色のシェードまたはパターンを生じさせるように構成された少なくとも１種類の乾燥発色試薬が、デバイス内に、例えば、注入領域に隣接してもしくは検査領域内に、または液体流路と流体連通している試薬リザーバ内に配置されている。陽性対照領域で反応して発色する乾燥発色試薬もデバイス内に配置されている。本発明のデバイスのこれらの実施形態では、陽性対照領域が変色し、且つ陰性対照領域で所定の色が維持または表示されているかどうかだけで検査の有効性が示される。
【０００７】
別の態様では、本発明は、前段落に記載の実施形態と共通の要素を有する生物液体試料中の検体を定量するための検査デバイス群を提供するが、比色検査読み取り領域は読み取り領域の背景となる色の領域、例えば、印刷された色の領域を含み、背景となる色は読み取り領域で呈される色と光学的に相互作用して、塗布された試料中の異なる検体濃度の視覚的識別を改善する。従って、このタイプのデバイスは、液体試料注入領域；読み取り領域の背景となる色の領域を含む比色検査読み取り領域であって、背景となる色が読み取り領域で呈される色と光学的に相互作用して、塗布された試料中の異なる検体濃度の視覚的識別を改善する読み取り領域；比色対照領域；ならびに、注入領域と、読み取り領域および対照領域の両方との間で液体を輸送する液体流路；を含む複数の機能領域を画定する多孔質親水性シートを備える。ここでも、注入領域への液体試料の塗布に応答して、運ばれ、塗布された試料中に検体が存在する場合、検体と反応し、試料中の検体の濃度に応じて、読み取り領域に視覚的に検出可能な色の変化（単色の強度とは対照的）を生じさせる乾燥発色試薬がデバイス内に配置されている。
【０００８】
好ましい実施形態では、デバイスは、互いに平行に配置された、例えば、積層されたまたはラミネートされた複数のシートを備え、その少なくとも２枚は、シート間の液体流動連通を可能にする開口部を画定する液体不透過性バリア層により分離されている。発色試薬は、任意の検体と反応することができ、１つの好ましい実施形態では、１種または複数種の肝臓酵素と反応して、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、またはこれらの混合物のレベルまたは濃度の上昇などの病的な肝機能を検出する。陰性対照領域は、湿潤時に乾燥時とは異なる外観を有する、シートに塗布された有色領域を備えてもよい。読み取り領域は発色試薬により生じる有色種を捕捉する固定化バインダを備えるシートの領域を備えてもよい。これは、前記注入領域への液体の塗布に応答して呈色する領域の一部として、試料中の検体の濃度の表示または読み取りを可能にする。前記試料中の検体の濃度が、水銀温度計のように、領域内の直線状の呈色範囲で示されるように、この領域は連続的であってもよい。あるいは、この領域は複数の別個の領域を備え、試料中の検体の濃度の濃度は呈色する領域の数で示される。
【０００９】
本発明のさらに他の形態および実施形態では、デバイスは、試料の塗布後、所定の時間間隔にわたり試料から液体を受け入れ、リザーバが充填されてデバイスを読み取る準備が整っているという表示を備える、入口と液体連通しているデバイス内に配置されたリザーバを備えるタイマーを画定する領域をさらに備える。タイマーは、例えば、液体がリザーバに到達し、表示を作動させるのに所要する時間の長さを決定する所定の寸法のチャネルを備えてもよく、表示は、デバイスを読み取る準備が整っているときに視認可能な、印刷されたメッセージを含んでもよい。タイマーはまた陽性比色対照領域としても機能することができる。多くの場合、タイマーは読み取り領域の下流に配置される。本発明のデバイスの多くは、例えば、赤血球またはヘモグロビンなどの有色成分をデバイスの流動構造を通る輸送から排除し、妨げのない比色読み取りを可能にするために、入口の上流に配置されるフィルタを備える。
【００１０】
本発明のさらに他の形態および実施形態では、デバイスは、発色試薬の下流且つ比色検査読み取り領域の上流に、試料からの検体と発色試薬との混合物を輸送する滞留領域をさらに備え、滞留領域は、流動を妨げる疎水性表面を含む多数のマイクロ流路を備え、マイクロ流路の数および寸法は、混合物が通過する時、インキュベーション時間を所定の時間間隔内に設定する役割を果たす。滞留領域には、例えば、液体が滞留領域を通過する速度を遅らせる疎水性材料（例えば、ワックス）が含浸されていてもよい。場合により、滞留領域は、疎水性材料をシートの表面に印刷し、疎水性材料がシートの細孔に吸収されるように加熱することにより形成される。
【００１１】
幾つかの実施形態では、デバイスは、液体を流路に沿って吸引し、滞留領域および比色検査読み取り領域を通過させ、それにより比色検査読み取り領域から未結合の有色種が除去されるように、比色検査読み取り領域の下流に吸着性リザーバを備えてもよい。デバイスは、場合により、滞留領域でインキュベーション中に形成される複合体を捕捉するために、比色検査読み取り領域に固定化バインダ（例えば、抗体）を備えてもよい。デバイスは、滞留領域を画定する平行に配置されたシートと流体連通している乾燥発色試薬を保持するシートを含んでもよい。ある特定の実施形態では、次のデバイス要素：乾燥発色試薬を保持する領域；試料注入領域；比色検査読み取り領域；滞留領域；および吸着性リザーバ；の少なくとも２つが単一の前記吸着性シート上に画定されている。
【００１２】
本発明の三次元実施形態では、デバイスは、隣接する吸着性または吸収性シート間にバリア層を構成し、シート間の液体流動連通を可能にする開口部を画定するパターニングされた接着剤層を備えてもよい。これにより柔軟性および制御、ならびに単一のデバイス上での検査路の多重化が提供される。例えば、入口と読み取り領域は異なるシート上に配置されてもよく、または読み取り領域と発色試薬は異なるシート上に配置されてもよい
【００１３】
本発明のデバイスは、読み取り領域の色を検体濃度に関連付けるカラーチャートをさらに備えてもよく、これは任意選択によりシートと一体化されていてもよい。もちろん、それぞれの異なる乾燥発色試薬を使用する複数の読み取り領域は、本明細書の開示により可能となる。デバイス内の流路は、典型的には、液体流動の輸送方向を定め、親水性シートの厚みに実質的に浸透している液体不透過性境界により画定されている、１本の親水性チャネルまたは親水性チャネルのパターンを備える。デバイスは、任意選択により、注入領域と液体流動連通している１つまたは複数の電極を備える電極アセンブリ、および／または流路と連通している熱伝導性材料または電気伝導性材料を含んでもよく、これは、例えば、弁として流量を制御するまたは流体を蒸発させる役割を果たすことができる。例えば、国際公開第２００９／１２１０４１号パンフレットおよび米国特許出願第１３／２５４，９６７号明細書（これらの開示内容は参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、任意の１種類の検体または検体の組み合わせの定量または半定量臨床アッセイ用に設計された高信頼性で極めて安価な検査デバイスの大量生産を可能にする、生物液体試料中の１種または複数種の検体を測定するための検査デバイスの製造方法を提供する。本方法は、ａ）吸収性または吸着性流動輸送を支持する第１の多孔質親水性シートを提供する工程；ｂ）多孔質シートの厚みに浸透して各要素を画定する疎水性バリアのパターンをそれぞれ備える検査デバイス要素の配列をシートに印刷する工程であって、そのそれぞれが液体流路および比色検査読み取り領域を含む複数の機能領域を備える工程；ｃ）第１のシートに第２の多孔質親水性シートを接着してラミネートを形成する工程；およびｄ）そのラミネートを打ち抜いて個々の要素に分離し、多数の機能性検査デバイスを形成する工程；を含む。好ましい実施形態では、工程ｄ）の前に１種または複数種の試薬を、例えば、ロボットでピペッティングすることにより、各検査デバイス要素に塗布する。試薬を第１もしくは第２の多孔質親水性シートに、または注入領域に塗布される液体試料と接触するように配置される試薬リザーバの役割を果たす別個の構造に付着させてもよい。シート間の流体流動連通が実現するように構造部材を見当合わせするため、工程ｃの前に第１のシートと第２のシートを位置合わせする。また、本方法は、他の構造、例えば、フィルタ要素の配列を画定する第３のシートまたは追加の複数のシートを提供する追加の工程、および、第３のシートまたは追加のシートを第１および第２のシートにラミネートして、各検査デバイス要素の関係する（ｒｅｓｐｅｃｔｅｄ）液体流路と流体連通しているフィルタ要素などの機能性構造を位置決めする追加の工程を含んでもよい。工程ｃは、第１のシートと第２のシートとの間に、それ自体接着剤層の役割を果たし得る液体不透過性層を設ける工程を含むことが多い。これは、シート間の液体流動連通を可能にするように位置決めされた１つまたは複数の画定された穴以外、各シート上の液体の流れが遮断されるように設計された両面接着シート材料を貼付することにより行われてもよい。好ましくは、液体不透過性層は、接着剤をある一定のパターンでシートに塗布することにより形成される。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、製造方法は、シートの表面の一領域に所定の濃度のインクを印刷することにより塗布し、インクをシートに浸透させ、インクを硬化させて、インクにより画定された流動を妨げる疎水性表面を含む多数のマイクロ流路を備える滞留領域を形成する工程をさらに含み、マイクロ流路の数および寸法は、液体試料が滞留領域を通過する所定の時間間隔を設定する役割を果たす。本方法は、シートの表面に比較的高濃度のインクを印刷することにより塗布して、流路の境界を画定し、インクをシートに浸透させ、インクを硬化させて、滞留領域と流体連通している液体流路を画定する液体不透過性バリアを形成する追加の工程をさらに含んでもよい。また、本方法は、そのシートを、吸収性流動輸送を支持し、少なくとも一部がそのシートと液体連通している少なくとも１枚の追加の多孔質親水性シートにラミネートする追加の工程を含んでもよく、追加のシートは流路；比色検査読み取り領域；複合体を捕捉するための検査領域の固定化バインダ；第２の滞留領域；液体試料入口；対照部位；乾燥発色試薬リザーバ、吸着性リザーバ、および試料分割層からなる群から選択される少なくとも１つの要素を画定する。試料分割層は、例えば、複数のアッセイを並行して実施できるように、試料を分割することを可能にする。
【００１６】
本方法は、シートの表面に比較的高濃度のインクを印刷することにより塗布し、流路；比色検査読み取り領域；複合体を捕捉するための検査領域の固定化バインダ；第２の滞留領域；液体試料入口；対照部位；乾燥発色試薬リザーバ；吸着性リザーバ；およびシートと液体連通している試料分割層からなる群から選択される少なくとも１つの要素の境界を画定し、インクをシートに浸透させ、インクを硬化させて、要素の境界を画定する液体不透過性バリアを形成するさらに別の追加の工程を含んでもよい。幾つかの実施形態では、方法は、滞留領域と流体流動連通しているフィルタまたは発色試薬リザーバを設ける工程を含んでもよい。本方法は、シートの表面の複数の領域に、ある一定の配列で所定の濃度のインクを印刷することにより塗布して滞留領域の配列を形成し、そのシートを、吸収性流動輸送を支持し、少なくとも一部がそのシートと液体連通している少なくとも１枚の追加の多孔質親水性シートにラミネートする工程を含んでもよく、追加のシートは流路；比色検査読み取り領域；複合体を捕捉するための検査領域の固定化バインダ；第２の滞留領域；液体試料入口；対照部位；乾燥発色試薬リザーバ；吸着性リザーバ；および試料分割層からなる群から選択される少なくとも１つの要素の対応する配列を画定する。
【００１７】
本明細書では添付の図面を参照して本発明を説明するが、それは例示に過ぎず、図面中、寸法は縮尺通りではなく、検討される様々なデバイスの構造および動作を説明する手段として選択されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】一実施形態による、平行に配置された複数のシートを備えるデバイスの組立分解斜視図（パネルａ）、デバイスを使用してアッセイを行う方法を示す概略図（パネルｂ）、およびアッセイの結果を定量するための読み取りガイドの図（パネルｃ）である。
【図２】一実施形態による、２つの検査領域と３つの対照領域とを含む肝臓酵素検査デバイスおよび例示的な結果出力を示す図である。
【図３】一実施形態による、湿潤時に白色から黄色に変色するデバイスの対照領域を示す図である。
【図４】白色背景（上パネル）と黄色背景（下パネル）での色読み取りの比較を示し、黄色背景ではコントラストが改善されていることを示す図である。
【図５Ａ】有用な例示的なＡＳＴアッセイ化学を示す図である。
【図５Ｂ】例示的なＡＬＴアッセイ化学を示す図である。
【図６】様々な実施形態による、多重化デバイスの設計を示す図である。
【図７】一実施形態による、複数のデバイスの製造方法を説明するのに有用な図である。
【図８】一実施形態による、時間調整要素を組み込むデバイスを示す図である。
【図９】一実施形態による、デバイス製造方法における血漿分離膜フィルタ取り付けプロセスを示す図である。
【図１０】一実施形態による、定量比色読み取り用に構成されたデバイスの組立分解図（左パネル）および例示的なアッセイ読み取りを示す図（右パネル）である。
【図１１】定量比色読み取り用に構成されたデバイスを示す図であり；塗りつぶされた円が多いほど、検体濃度が高いことを意味する。
【図１２】自動較正用のカラーチャートを含む定量比色読み取り用デバイスの平面図および斜視図である。
【図１３Ａ】本発明を具体化する肝臓酵素検査デバイスの底面図である。
【図１３Ｂ】本発明を具体化する肝臓酵素検査デバイスの上面図である。
【図１４】ＡＬＴアッセイでのＡＬＴ濃度の増加に応じた黄色から赤色への色の諧調、およびＡＳＴアッセイにおけるＡＳＴ濃度の増加に応じた暗青色からピンク色への色の諧調を表示するデバイスを示す図である。
【図１５】肝機能検査（ＬＦＴ）の出力信号対ＡＳＴ濃度（左パネル）またはＡＬＴ濃度（右パネル）（各濃度につきＮ＝７）の較正プロットを示す図である。
【図１６】一実施形態による、ＡＬＴ検査に関して作成されたＡＬＴ濃度に対する検量線（左パネル）、およびＡＳＴ検査に関して作成されたＡＳＴ濃度に対する検量線（右パネル）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
ここで図１を参照すると、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）／アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）検査デバイスの非限定的な組立分解図および例示的なアッセイプロトコルが示されている。検査デバイスは、図１のパネルＡに示すように、互いに平行に配置された（例えば、積層された構成となるように）複数のシート（即ち、層）を備えてもよい。デバイスは、最上ラミネートおよび最下ラミネートなどの疎水性シートの間に配置され得る複数の多孔質親水性シートを含んでもよい。最上ラミネートは、最上ラミネートの開口部により画定された試料入口を含む。デバイスは、幾つかの実施形態では、最上ラミネートと多孔質親水性シートとの間に位置決めされ得るフィルタ（例えば、血漿分離膜）をさらに含んでもよい。図１に示すように、多孔質親水性シートには、１つまたは複数の機能領域（例えば、試料注入領域、検査読み取り領域、陽性対照領域、陰性対照領域、および流路等）を形成するように疎水性バリア（例えば、ワックス）がパターニングされていてもよい。パネルＡに示す例示的検査デバイスでは、機能領域は２つの検査領域と３つの対照領域を画定する。１種または複数種の試薬が、多孔質親水性シートの一方または両方に付着されていてもよい。層は、例えば、接着剤を使用しておよび／または積層された層をラミネートすることにより互いに固定されていてもよい。
【００２０】
ここで図１のパネルＢを参照すると、生物流体（例えば、血液）を１滴、検査デバイスの試料入口に塗布することができる。生物流体中の細胞（例えば、赤血球および白血球）は、デバイス内のフィルタにより分離され、得られた血漿は毛細管現象により移動し機能領域を通過する。一定時間（例えば、約１５分）後、検査領域を対応する色見本（図１、パネルＣ）と比較して、アッセイの結果を定量する。幾つかの実施形態では、結果を、例えば、正常値上限（ＵＬＮ、この実施例では４０Ｕ／Ｌと定義される）の約３倍未満（＜３Ｘ）、正常値上限の約３倍〜約５倍（３−５Ｘ）、または正常値上限の５倍超（＞５Ｘ）などの値の範囲に入るものと解釈することができる。
【００２１】
図２は、肝機能検査デバイスの使用についてさらに説明し、様々な読み取り可能性を示している。図の中心に、検査領域と対照領域の概略図を示す。この例示的デバイスでは、ＡＳＴ検査領域、ＡＳＴ陽性対照領域、ＡＳＴ陰性対照領域、ＡＬＴ検査領域、およびＡＬＴ陰性対照領域が設けられている。パネルＡに示すように、ＡＳＴ検査領域は、ＡＳＴ正常値（例えば、＜８０単位／リットル（Ｕ／Ｌ））の場合、暗青色（「低ＡＳＴ」）となるが、高ＡＳＴ値（例えば、＞２００Ｕ／Ｌ）の場合、明ピンク色（「高ＡＳＴ」）となる。ＡＬＴ検査領域（パネルＢに示す）は、ＡＬＴ正常値（例えば、＜６０単位／リットル（Ｕ／Ｌ））の場合、黄色（「低ＡＬＴ）となるが、高ＡＬＴ値（例えば、＞２００Ｕ／Ｌ）の場合、濃赤色となる（「高ＡＬＴ」）。パネルＣ、ＤおよびＥは、検査デバイス内の対照領域の動作を示す。ＡＬＴ陰性対照領域（パネルＣ）では、この領域が濡れると白色から黄色への変化が起こり、デバイスが適切に作動し、溶血が本質的に起こっていないことを示し（「作動している−溶血なしのとき、黄色」）、試料に溶血が起こっている場合、領域は橙色／赤色になり、デバイスは「無効」と読み取られる（「試料が溶血している（無効）とき、橙色／赤色」）。ＡＳＴ陰性対照領域（パネルＤ）では、色素化学が適切に機能している場合、ベースライン青色は不変である（「青色＝試薬が機能している」）が、非特異的色素反応が起こった場合、対照領域は明ピンク色になり（「ピンク色＝試薬が失効している（無効）」）、デバイスは「無効」と読み取られる。ＡＳＴ陽性対照領域（パネルＥ）では、ＡＳＴ試薬が適切に機能している場合、領域は青色からピンク色に変化する（「青色＝試薬は作用していない（無効）」）が、試薬が機能していない場合またはゾーンが作動していない場合、暗青色のままであり（「ピンク色＝試薬が機能している」）、デバイスは「無効」と読み取られる。
【００２２】
図２、パネルＣに示すように、対照領域は濡れると変色し、例えば、デバイスの作動を示すことができる。幾つかの実施形態では、この効果は、検査デバイスの層に付着した顔料を使用して達成することができる。例えば、顔料は、デバイスが乾燥状態のとき、顔料が印刷されている側の反対側から視認不可能となり得る。理論に拘泥することを望むものではないが、デバイスが乾燥状態のとき、多孔質親水性シート中の繊維（例えば、セルロース）による光の散乱および繊維と空気との屈折率の差のため、顔料は本質的に視認不可能であると考えられる。流体が多孔質親水性シートに導入されると、屈折率差が小さくなって、多孔質親水性シートは半透明になり、このようにして裏側の有色顔料が現れる。この単純な効果をさらに図３に示し、これは２つの重要な機能を果たすことができる。第１に、白色から白色以外の色、例えば、黄色または別の背景色への変色が観察された場合、それは十分量の流体試料がデバイスに塗布され、毛細管現象により適切な領域に移動したことを使用者に示すことができる。第２に、色は、所与の比色反応にコントラストを加えるための背景色の役割を果たすことができる。コントラストを加える色の一例を図４に示し、赤色／紫色の色素が生成するＡＬＴアッセイは、白色背景（上パネル）で行われるとき、ＡＬＴ濃度の増加に伴い赤色／紫色のシェードを経て進行するが、黄色背景（下パネル）に対して行われるとき、この同じ反応は黄色から橙色に、そして赤色に進行し、従って、濃度の変化に伴って異なる色が生じ、これは、濃度の変化に伴って同じ色のシェードが変わるのとは対照的である。有利には、この効果は、使用者が比色データを解釈できる大きな助けとなり得る。同様に有利には、機能性領域が乾燥すると色は白色に戻り、それによりデバイスは窓部が読み取り可能な時間を過ぎ、有効な結果が得られたことを使用者に示すことができる。
【００２３】
幾つかの実施形態では、デバイス内に２層以上のパターニングされた紙を有することが特に有用である。例えば、２層以上を有する場合、さもなければ混合時に迅速に反応するであろう試薬の分離を達成することができる。例えば、デバイスの陽性対照領域内で、第１層の紙は乾燥酵素（例えば、ＡＳＴまたはＡＬＴ）を含有することができ、第２層は酵素と反応する試薬（例えば、基質）を含有することができる。この構成は次のように動作し得る。試料をデバイスに添加することができ、試料からの流体が毛細管現象により第１層の中に移動し、乾燥酵素を放出した後、第２層に到達し、そこで酵素は試薬（例えば、反応性化学）と混合することができる。対照的に、場合により、酵素が反応性化学と同じ層に付着されたならば、それが尚早に反応し、望ましくない結果をもたらすおそれがある。試薬を異なる層に分離することにより、別個の配合化学を使用して特定の試薬を安定化することが可能になる。例えば、１つの層では糖で酵素を安定化させ、別の層では水溶性ポリマーで色素分子を安定化させることができる。さらに、多層デバイスは色素または他の試薬の移動の防止を助けることができるが、そのような移動は、流動が横方向でしか起こらない場合に見られることが多い。
【００２４】
好ましい実施形態では、肝臓トランスアミナーゼ検査は６つの検査ゾーンを含んでもよい。この設計は、別個の陽性対照領域および陰性対照領域を有するＡＬＴ用の検査ゾーンと、別個の陽性対照領域および陰性対照領域を有するＡＳＴ用の検査ゾーンとを提供する。これらのゾーンには様々な設計およびレイアウトが考えられる。図６は、６ゾーン検査の幾つかの可能な非限定的設計を示す。
【００２５】
血液試料中のＡＳＴおよびＡＬＴの測定に特に有用な本実施形態の化学を図５に示す。ＡＳＴアッセイ化学は、試料中に存在するＡＳＴを利用して、システインスルフィン酸およびα−ケトグルタル酸をＬ−グルタミン酸およびβ−スルフィニルピルビン酸に変換する。β−スルフィニルピルビン酸は水と反応して遊離ＳＯ３−２を生成し、これがさらに青色色素であるメチルグリーンと反応して無色化合物を生成する。この反応は、ローダミンＢを紙に点着することによっても生じる、ピンク色のコントラスト色素に対して行われる。反応が進行するにつれ、色素は透明な化合物に変換され、ピンク色の背景がさらに現れる。ＡＳＴが存在する場合、検出ゾーンに暗青色から明ピンク色への変化が見られる。
【００２６】
血液試料中のＡＳＴの測定に有用な本実施形態のさらに別の化学は、（オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ）を使用する。試料中に存在するＡＳＴは、Ｌ−アスパラギン酸をオキサロ酢酸に変換する。オキサロ酢酸はオキサロ酢酸デカルボキシラーゼと反応して、ピルビン酸を生成し、その後、これがピルビン酸オキシダーゼにより酸化されて、アセチルリン酸および過酸化水素を生成し、遊離された過酸化水素がホースラディッシュペルオキシダーゼにより使用され、４−アミノアンチピリンとＮ，Ｎ−ジメチルアミノ安息香酸とのカップリングにより、赤色色素である４−Ｎ−（１−イミノ−３−カルボキシ−５−Ｎ，Ｎジメチルアミノ−１，２−シクロヘキサンジエン）を生成する。
【００２７】
ＡＬＴアッセイ化学は、ＡＬＴによりＬ−アラニンおよびα−ケトグルタル酸をピルビン酸およびＬ−グルタミン酸に変換し、その後、ピルビン酸オキシダーゼによりピルビン酸を酸化してアセチルリン酸および過酸化水素を生成し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により遊離過酸化水素を利用し、４−アミノアンチピリンとＮ，Ｎ−ジメチルアミノ安息香酸とのカップリングにより、赤色色素である４−Ｎ−（１−イミノ−３−カルボキシ−５−Ｎ，Ｎジメチルアミノ−１，２−シクロヘキサンジエン）を生成することに基づく。他の実施形態では、ＡＳＴ化学で生成したピルビン酸を、米国特許第５，５０８，１７３号明細書に記載のＡＬＴアッセイと同じ反応カスケードに使用することができる。
【００２８】
Ｈｕａｎｇらは、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ２００６；６（７）：７５６−７８２に、幾つかのトランスアミナーゼ検出方法を記載しており、参照によりその内容全体が本明細書に援用される。さらに、Ａｎｏｎらは、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９７４；３３（４）：２９１−３０６に、ＡＳＴおよびＡＬＴの検出方法を記載しており、参照によりその内容全体が本明細書に援用される。
【００２９】
他の実施形態では、検査デバイスにその他のゾーンを追加してさらに多くのアッセイを収容し得ることが考えられる。本発明の概念的な実施形態では、検査は、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ビリルビン、ＡＬＰ、ＧＧＴ、およびアルブミンの検出ゾーンならびに検査の一部または全部の陽性対照領域および陰性対照領域を含む。さらに他の実施形態では、ＡＳＴアッセイおよびＡＬＴアッセイを、腎臓機能を監視するためのクレアチニンなどのその他のアッセイまたはさらには肝炎の検出に使用されるものなどのイムノアッセイと多重化してもよい。
【００３０】
検査デバイスの様々な態様を肝機能検査に関して例示してきたが、検査デバイスは肝機能検査に限定されるものではないことを理解されたい。本明細書に記載の検査デバイスを使用して、任意の好適な生物学的アッセイを行うことができる。例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、ペプチド、ホルモン、小分子、ウイルス、細胞および微生物等の生物流体の成分の定量に生物学的アッセイを使用することができる。また、生物流体中の活性（例えば、血液凝固、ＡＬＴ、ＡＳＴ、アミラーゼ、クレアチンキナーゼ等）の定量に生物学的アッセイを使用することもできる。
【００３１】
幾つかの実施形態では、検査デバイスの複数の層を接着剤で結合することができる。任意の好適な接着剤を使用することができる。例えば、場合により、疎水性ポリマー接着剤を使用することができる。他の実施形態では、スクリーン印刷、フレキソ印刷、グラビア印刷、転写印刷、およびインクジェット印刷を含む印刷法により接着剤をパターニングすることができるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態は、スクリーン印刷による接着剤のパターニングである。Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓらは、レーザーカッターで切断した両面テープを使用して、複数のパターニングされた紙の層を互いに接着する方法を報告している（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １０５：１９６０６−１９６１１、参照によりその内容全体が本明細書に援用される）。切断された両面テープを使用すると、テープの厚みにより生じる間隙が残り、パターニングされた紙の親水性領域間の接触が防止される。ｚ方向の流動（即ち、デバイスを通るタンジェンシャルフロー）を可能にするために、この間隙にセルロース粉末を充填しなければならない。この方法と比較して、接着剤のスクリーン印刷には、幾つかの利点がある。例えば、パターニングされた接着剤層は、典型的には、非常に小さい厚み（例えば、約１〜約５００ミクロン、約１〜約１００ミクロン、約１〜約５０ミクロン、および約５０〜１００ミクロン）で塗布することができ、これにより、パターニングされた紙の親水性領域間の密接が可能となり、セルロース粉末充填剤を使用する必要がなくなる。スクリーン印刷はまた両面テープよりも必要とする材料が少なくて済み、それにより、デバイスの原料費用が削減される。さらに、スクリーン印刷は低コストで、拡大縮小が容易なパターニング法であり、検査デバイスの安価な大量生産に有利である。紙の肝臓トランスアミナーゼ検査の特定の実施形態では、印刷された接着剤は紙を接触した状態に保持すると共に、接着により血漿分離フィルタへの接触を確保する。好ましい実施形態では、接着剤は感圧接着剤であってもよい。他の好ましい実施形態では、接着剤は、Ｈｅｎｋｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより販売されているＵｎｉｔａｋ  １３１である。
【００３２】
検査デバイスの製造単位操作を一連の工程に分離することができる。例えば、幾つかの実施形態では、製造操作は、次の工程：紙基材に疎水性バリアをパターニングする工程、スクリーン印刷により接着剤をパターニングする工程、生物学的／化学試薬を付着させる工程、層を位置合わせして組み立てる工程、血漿分離膜を取り付ける工程、および／またはラミネートして包装する工程、の一部または全部を含むことができる。
【００３３】
検査デバイスに使用される紙をパターニングする好ましい方法はワックス印刷であるが、多孔質親水性シート上に疎水性バリアを形成する任意の好適な方法を使用することができる。ワックス印刷は、ＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓらによりＡｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ８１：７０９１−７０９５に、および国際公開第２０１０／１０２２９４号パンフレットに詳細に記載されており、これらは共に参照によりその内容全体が本明細書に援用される。デバイスはコンピュータ上で設計されてもよく、固形インク法を用いる市販のプリンタを使用して（例えば、Ｘｅｒｏｘ  Ｐｈａｓｅｒプリンタを使用して）、紙のシートにマイクロ流体チャネルの疎水性壁を印刷してもよい。プリンタは、一般に、ワックスベースの固形インクを溶融し、紙の上にインクを付着させることにより動作する。次いで、そのシートをワックスの融点より高温に加熱して、ワックスを紙の厚み全体にわたり浸透させ、それにより紙の厚み全体にわたり疎水性バリアを形成する。場合により、加熱工程中にワックスの展延が起こり得るが、この展延は、使用する紙の種類および印刷される線の厚みに基づき再現可能であり、設計に組み込むことができる。理論に拘泥することを望むものではないが、紙にパターニングされたチャネルは、毛細管作用によりマイクロリットルの量の流体を移送し、流体を検査ゾーンに分配し、そこで独立したアッセイを行うことができると考えられる。
【００３４】
他の方法実施形態は、フォトレジストに浸漬された紙を使用することができ、その後、これに、所望のパターンを有するフォトマスクを通してＵＶ光を露光させる。その後、未露光領域を好適な溶媒で洗い流すと、紙の厚み全体にわたり浸透する架橋された水性領域が後に残る。この方法を使用して、１００μｍの小さい部材サイズが実証された。このパターニング方法の例は、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００７，４６，１３１８−１３２０の先行技術および国際公開第２００８／０４９０８３号パンフレットに記載されており、参照によりその内容全体が本明細書に援用される。他の実施形態では、検査デバイスの要件を満たすように紙に疎水性バリアを付着させるのに使用することができる他の多くの大規模印刷およびパターニング方法がある。これらの方法としては：スクリーン印刷、グラビア印刷、コンタクトプリンティング、フレキソ印刷、熱エンボス、インクジェット印刷、および蝋染め印刷（ｂａｔｉｋ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明の幾つかの実施形態では、流体が毛細管現象により次の紙層への入口点までｚ方向に（即ち、接線方向に）移動し得るように、層を互いに接着してもよい。これを達成する方法の１つは、流体が流通し得る所望のパターンに打ち抜かれた穴を有する両面接着テープを使用する方法である。この方法は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００８，１０５，１９６０６に、より詳細に記載されており、参照によりその内容全体が本明細書に援用される。この特定の方法では、親水性粉末（即ち、セルロース）を、テープの厚みにより形成される紙層間の打ち抜き孔に添加してもよい。３−Ｄデバイスの好ましい組み立て方法は、簡単且つ拡大縮尺可能なスクリーン印刷法を使用して、非常に薄い接着剤層を紙に所望のパターンで付着させる方法である。このようにして、疎水性感圧接着剤（例えば、Ｈｅｎｋｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより販売されているＵｎｉｔａｋ  １３１）を紙に塗布することができる。接着剤を塗布した後、例えば、ラベルおよびテープなどの他の接着製品に一般的に見られるように、接着剤側を非接着剥離層にラミネートすることにより、予め製造されたシートを保存することができる。他の実施形態では、ステンシルを製造し、ある特定の部材が被覆されるように、パターニングされた紙のシートに押し当てることができる。次いで、エアゾールスプレーから残りの露出領域に接着剤を付着させることができる。
【００３６】
好ましい実施形態では、化学および／または生物学的アッセイ試薬をデバイスの領域に付着させることが必要である。試薬は体液中に存在する検体と反応し、それにより特定の検体の濃度を示すことができる応答（即ち、比色または電気化学的）が得られる。幾つかの実施形態では、乾燥後に機能を維持するように、試薬を適切な安定剤（例えば、糖類）と配合することが必要な場合が多い。試作品製作および小規模製造（例えば、１日当たり数百個のデバイス）に有用な一実施形態では、試薬の付着は、マイクロピペットおよびリピートピペッタ（ｒｅｐｅａｔ  ｐｉｐｅｔｔｅｒｓ）を使用して手動で行われる。典型的な付着量は０．５〜５μＬである。比較的大規模な製造に好ましい実施形態では、精密液体付着装置を使用することができる。このような器具を２例挙げると、ＢｉｏＤｏｔ，Ｉｎｃ．から入手可能なＡＤ３４００および富士フイルム株式会社から入手可能なＤｉａｍａｔｉｘ  ＤＭＰ−２８００インクジェットプリンタがある。これらの装置は共に、ｎＬの量まで正確な量の流体をプログラムされたパターンで迅速に分注する（非接触型）ことができる。さらに、このような装置は、連続製造ラインを大規模製造に適するように構成することができる。
【００３７】
好ましい製造方法では、デバイスは、例えば、図７に示すように、シート全体で組み立てることができる。これを行うためには、層間での必要な流体接続を可能にするように、パターニングされた領域を正確に位置合わせすることが不可欠である。これを達成する簡単且つ拡大縮尺可能な方法は、シートがペグボード上に摺動できるように、紙層に正確な穴を打ち抜くことである。次いで、部材の適正な位置合わせが迅速に行われるように、各層をペグボードに貼付することができる。事前に塗布された接着剤は、接触後、シートを所定の位置に固定する役割を果たす。連続的製造では、Ｄｏｔ−Ｍａｔｒｉｘ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇに使用されるものなどのペグを含むリール上で、類似の方法を使用することができる。あるいは、ラミネートする前に、レーザーウェブガイドを使用してシートを正確に位置合わせすることができる。シートを位置合わせするその他の方法は当業者に公知である。
【００３８】
図１に示すように、血漿分離膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をデバイスの入口点に配置してもよい。膜は、生物流体（例えば、血滴）を回収し、重要なことには生物流体から細胞（例えば、赤血球）を濾別して、流体（例えば、血漿）が毛細管現象によりデバイスゾーンに移動することを可能にするリザーバの役割を果たすことができる。従って、本発明の実施形態は、次の工程（図９に示す）からなる「ピック・アンド・プレイス」法を使用する：
【００３９】
（ｉ）レーザーカッターまたはダイカッターを使用して、１枚のＰａｌｌ膜シートを密集した直径１ｃｍの円に打ち抜くことができる。打ち抜かれたシートを、低タックラミネートシートまたはゴムシートなどの低接着性の表面にラミネートすることができる。好ましい実施形態では、打ち抜かれた膜シートを、ＰＤＭＳでコーティングされたＰＥＴフィルムに接着させる。
【００４０】
（ｉｉ）シートがフィルタ／デバイスへの入口点（図７の最上層）の役割を果たす孔を含むように、１枚の接着ラミネートシートをナイフプロッター、レーザーカッター、またはダイカッター等を使用して打ち抜くことができる。ラミネートシートの穴は、直径約０．１ｃｍ〜約１．５ｃｍ、または直径約０．５ｃｍ〜１．０ｃｍであってもよい。好ましい実施形態では、穴は直径約０．７５ｃｍである。
【００４１】
（ｉｉｉ）フィルタより大きい孔を有するように、非接着性マスキング層を、例えば、蝋引きのカード用紙または低接着性の他の材料からある一定のパターンで打ち抜いてもよい。例えば、幾つかの実施形態では、非接着性マスキング層の穴の直径は、膜の穴の直径より約０．２ｃｍ超、約０．３ｃｍ超、約０．４ｃｍ超、または約０．５ｃｍ超大きくてもよい。好ましい実施形態では、マスキング層の穴は、直径約１．１３ｃｍである。
【００４２】
（ｉｖ）予め打ち抜かれた０．７５ｃｍの穴を含むラミネートとマスキング層とを、ラミネートの孔が阻止層の孔の中央に位置するように、互いに接着することができる。
【００４３】
（ｖ）打ち抜かれたラミネートシートと位置が合っているフィルタ膜ディスクだけが選抜されるように、積層体を、高密度に打ち抜かれた膜シート上に配置することができる。他の膜ディスクは、マスキング層で阻止される。
【００４４】
（ｖｉ）次いで、積層体をラミネートして、接着ラミネート層を剥離することができ、離時に、ラミネートシート上の各ラミネート孔を覆うようにフィルタを接着させると共に、他のものが次の組のデバイスのために後に残るようにする。
【００４５】
（ｖｉｉ）各孔の下にフィルタ膜が接着されているラミネート層を、スクリーン印刷された接着剤で互いに接着されていてもよい２層のパターニングされた紙からなる積層体に接着させることができる。
【００４６】
このようにして、膜材料の面積を最大限、デバイスに使用可能な濾過ディスクに変換することができる。ダイ打ち抜き法および簡単なラミネータを使用して、このプロセスを大規模製造に容易に自動化することができる。
【００４７】
代替の方法では、後述のダイ打ち抜き法を使用してフィルタ膜の打ち抜きおよび配置を達成する：
【００４８】
（ｉ）ダイカッターを使用して、１枚のＰａｌｌ膜シートを密集した直径１ｃｍの円に打ち抜くことができる。打ち抜きに使用されるダイは、打ち抜き後、フィルタが所定の位置に留まるように設計されている。これは、各部材内に埋め込まれたゴム栓の存在により達成される。
【００４９】
（ｉｉ）シートがフィルタ／デバイスへの入口点の役割を果たす孔を含むように、１枚の接着ラミネートシートをナイフプロッター、レーザーカッター、またはダイカッター等を使用して打ち抜くことができる。ラミネートシートの穴は、直径約０．１ｃｍ〜約１．５ｃｍ、または約０．５ｃｍ〜１．０ｃｍであってもよい。好ましい実施形態では、穴は直径約０．７５ｃｍである。
【００５０】
（ｉｉｉ）フィルタより大きい孔を有するように、非接着性マスキング層を、例えば、蝋引きのカード用紙または低接着性の他の材料からある一定のパターンで打ち抜いてもよい。例えば、幾つかの実施形態では、非接着性マスキング層の穴の直径は、膜の穴の直径より約０．２ｃｍ超、約０．３ｃｍ超、約０．４ｃｍ超、または約０．５ｃｍ超大きくてもよい。好ましい実施形態では、マスキング層の穴は、直径約１．１３ｃｍである。
【００５１】
（ｉｖ）予め打ち抜かれた０．７５ｃｍの穴を含むラミネートとマスキング層とを、ラミネートの孔が阻止層の孔の中央に位置するように、互いに接着することができる。
【００５２】
（ｖ）打ち抜かれたラミネートシートと位置が合っているフィルタ膜ディスクだけが選抜されるように、積層体を、予め打ち抜かれたフィルタディスク（ダイプレート上で見当合わせされている）上に配置することができる。
【００５３】
（ｖｉ）接着ラミネート層を剥離し、剥離時に、ラミネートシート上の各ラミネート孔を覆うようにフィルタを接着させる。
【００５４】
（ｖｉｉ）各孔の下にフィルタ膜が接着されているラミネート層を、スクリーン印刷された接着剤で互いに接着されていてもよい２層のパターニングされた紙からなる積層体に接着させることができる。このようにして、膜材料の面積を最大限、デバイスに使用可能な濾過ディスクに変換することができる。ダイ打ち抜き法および簡単なラミネータを使用して、このプロセスを大規模製造に容易に自動化することができる。
【００５５】
上記工程を行った後、パターニングされた紙（および、必要に応じて、フィルタ等）の積層体をラミネートすることができる。幾つかの実施形態では、一方の面に接着剤を有するＰＥＴフィルムからなる「コールドラミネーション」シートを使用してもよい。フィルムはデバイスを保護し、パターニングされたゾーンに外側疎水性層を提供する。次いで、デバイス要素を別個のデバイスに分離する（例えば、別個のデバイスに切断する）ことができる。幾つかの実施形態では、箔でライニングされたバッグにデバイスを入れ、ヒートシールしてもよく、ここで、好ましくはバッグには乾燥剤が入っている。
【００５６】
本発明の幾つかの実施形態では、ある特定の試料取り扱い部材がデバイス自体に内蔵されていることが有用である。例えば、このような部材の１つには、試料入口孔を保護する簡単なプラスチックカバーがある。生物流体を１滴、入口孔を通してデバイスに導入し、フィルタ膜に入った後、プラスチックカバーで孔を密封し、デバイス内での流体の蒸発および乾燥速度を遅くすることができる。
【００５７】
別の概念的な実施形態では、小滴と接触させるだけで、正確な量の血液をデバイス内に吸入することができる内蔵式キャピラリーを有することが望ましい場合がある。このような部材により使用者の操作を最小限に抑えることができ、デバイスに導入される試料の量の再現性が確保される。
【００５８】
さらに別の概念的な実施形態では、検査デバイスは内蔵式ランセットを含んでもよく、これは使用後にデバイスと共に廃棄される。
【００５９】
幾つかの実施形態では、デバイスは、ガラス製またはプラスチック製キャピラリーチューブを含むキットの一部として使用されてもよく、好ましい実施形態では、チューブは、Ｓａｆｅ−Ｔｅｃ（登録商標）から入手可能なＭｉｃｒｏＳａｆｔｅ  Ｔｕｂｅなどのプラスチックであってもよい。幾つかの実施形態では、キットはランセットを含んでもよく、好ましい実施形態では、ランセットは、Ｓｕｒｇｉｌａｎｃｅ（商標）から入手可能なものなどのばね式の（ｓｐｒｉｎｇ−ｌｏａｄｅｄ）ランセットである。さらに他の実施形態では、キットは、パターニングされた紙のデバイス、ランセット、キャピラリーチューブ、絆創膏、アルコール消毒綿、ゴム手袋、および結果を解釈するための比色読み取りガイドを含む。
【００６０】
前述のように、幾つかの実施形態では、血漿を分離するために血球（および、汚れ、繊維等）を濾別する役割を果たすフィルタをデバイスに組み込んでもよく、その後、血漿は毛細管現象によりデバイスの中に移動する。好ましい実施形態では、フィルタは、Ｐａｌｌ社から入手可能なＶｉｖｄ（商標）膜である。他の実施形態では、膜はガラス繊維膜、またはさらには紙フィルタであってもよい。他の実施形態では、血球の捕捉を容易にするために、抗血球抗体が膜に結合されていてもよい。他の実施形態では、反応化学に干渉し得る物質を捕捉することができるフィルタ膜または紙チャネルに「スクラブ剤」が添加されていてもよい。
【００６１】
ほぼどのような多孔質材料でも開示される本方法でパターニングすることができる。従って、本発明による肝機能検査を製造するために、多くの材料をパターニングすることができる。材料としては：紙、クロマトグラフィー紙、ニトロセルロース、不織ポリマー材料、ラボワイプ（ｌａｂ  ｗｉｐｅｓ）、Ｐａｌｌ（登録商標）社により販売されているＩｍｍｕｎｏｄｙｎｅ（登録商標）膜などのナイロン膜が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に好ましい材料は、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）ｎｏ  １．クロマトグラフィー紙である。
【００６２】
本発明の幾つかの実施形態では、紙に点着される酵素をさらに安定化させるために、試薬ゾーンに安定剤を添加してもよい。他の実施形態では、安定剤としては：トレハロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、デキストラン、マンノース、ショ糖、ブドウ糖、アルブミン、ポリエチレンイミン、絹、およびアラビノガラクタンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。幾つかの実施形態では、ＭｇＣｌ２またはＺｎＣｌ２などの色素安定剤をアッセイに添加してもよい。
【００６３】
好ましい実施形態では、安定剤は糖類である。酵素および他のタンパク質を安定化させるのに特に有用な方法である真空泡沫乾燥法がＢｒｏｎｓｈｔｅｉｎらにより、米国特許第６，５０９，１４６号明細書に記載されており、参照によりその内容全体が本明細書に援用される。
【００６４】
幾つかの実施形態では、デバイスを読み取るべき時間を操作者に示す役割を果たすタイマーをデバイスに組み込んでもよい。このようなタイマーはＰｈｉｌｌｉｐｓらにより、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ，２０１０，８２，８０７１−８０７８に記載されており、参照によりその内容全体が本明細書に援用される。他の実施形態では、タイマーは、流体がチャネルの端部まで移動するのに所要する時間が予測可能となるように、所定の長さおよび幅を有するチャネルを含む多層デバイスの形態を取る。試料をデバイスに添加すると、流体は直ぐに毛細管現象により所定の紙チャネルを下流に移動し始める。流体はチャネルを濡らすため、紙が濡れて透明になる時、紙の裏側の印刷されたメッセージが出現し得る。この概念を図８に示す。幾つかの実施形態では、入口の後に分割層を組み込むことにより、このタイプのタイマーを検査デバイスに組み込むことができ、入口の後、流体は検査ゾーンとタイマーチャネルの両方に同時に移動する。
【００６５】
ある特定の実施形態では、陽性対照領域が完全に呈色されているときに、デバイスを読み取ることができるため、陽性対照領域は検査のタイマーの役割を果たすことができる。他の実施形態では、熱または湿度によりアッセイ速度が速くなるまたは遅くなるように、アッセイは感熱性または感湿性であってもよい。この状況では、陽性対照領域は、それが同じ加速または減速効果を示すように形成されてもよい。このようにして、陽性対照領域が呈色されているとき、依然としてデバイスを読み取ることができる。
【００６６】
幾つかの実施形態では、デバイスは、デバイス内の特定の箇所で溶液に所定のインキュベーション時間を提供する役割を果たす滞留領域を含んでもよい。例えば、捕捉抗体と接触する前に、抗体コンジュゲートおよび試料中に存在する抗原をインキュベートするのに有用な場合がある。滞留領域は、親水性多孔質ゾーンに流体のウィッキング速度を低下させるように設計された疎水性材料が含まれる、パターニングされたゾーンの形態を取ってもよい。好ましい実施形態では、疎水性材料はワックスである。疎水性バリアの形成に使用されるのと同じプリンタ（例えば、Ｘｅｒｏｘ  Ｐｈａｓｅｒ  ８５６０）を使用して、滞留領域にワックスを印刷することができる。場合により、グラフィックデザインプログラムに黒色を使用して、バリアを印刷することができる。例えば、Ａｄｏｂｅ（登録商標）Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒなどのコンピュータイラストレーションプログラムで利用可能なグレースケール機能を使用することにより、様々な量のワックスを滞留領域に印刷することができる。幾つかの実施形態では、プリンタは、単に白色の紙背景に対して様々なパーセンテージの黒色ワックスインクを印刷することにより灰色を作成する。従って、例えば、約１％〜約９９％黒色の範囲とすることができる特定のシェードの灰色を選択するだけで、特定ゾーンに付着させるワックスの量を制御することができる。このようにして、滞留領域におけるグレースケールの強度を増加することにより、流体が滞留領域を通過するのに所要する時間を変えることができる。遅延時間は数秒から数時間まで様々となり得る。例えば、遅延時間は、約１秒〜約５秒、約２秒〜約１０秒、約５秒〜約１５秒、約１０秒〜約３０秒、約１５秒〜約１分、約３０秒〜約２分、約１分〜約５分、約２分〜約１０分、約５分〜約２０分、約１０分〜約３０分、約２０分〜約１時間、約３０分〜約２時間、約１時間〜約３時間、および約２時間〜約４時間等であってもよい。
【００６７】
さらに他の実施形態では、様々な量の疎水性材料を含有する溶液を付着させることにより、滞留領域を形成することができる。好ましい実施形態では、これらの溶液は、ポリスチレンなどのポリマーまたはパラフィンなどのワックスを含有する。幾つかの実施形態では、溶液は、疎水性材料約０．００１％〜約０．０１％、疎水性材料約０．０１％〜約０．１％、疎水性材料約０．１％〜約１％、疎水性材料約１％〜約１０％、疎水性材料約１０％〜約５０％、または疎水性材料約５０％〜約１００％を含有してもよい。任意の好適な溶媒を使用して溶液を作製することができる。
【００６８】
さらに他の実施形態では、滞留領域は所定の長さのチャネルの形態を取ることができる。チャネルの長さは、流体がチャネルの距離を移動するのに所要する時間に比例し得る。従って、例えば、デバイスに導入され、コンジュゲート抗体と混合される抗原を含有する流体試料は、チャネルの長さに対応するインキュベーション時間を有し得る。このチャネルの端部に到達すると、流体は、捕捉ゾーンまで垂直に移動して、完全（ｆｕｌｌ）免疫複合体を形成することができる。幾つかの実施形態では、ウィッキング速度をさらに低下させるため、このチャネルが疎水性材料も含有することが有用となり得る。これらの材料を前述したのと同様にワックスプリンタまたは溶液を使用して付着させることができる。他の実施形態では、チャネルの幅で滞留時間に影響を及ぼすことができる。例えば、チャネルは、始めは幅広で、その後、一部狭くなった後、幅が広くなり、その結果、チャネルの幅広部分と比較してチャネルの狭小部分では流量が低くなる。幾つかの実施形態では、チャネルの流路で滞留時間に影響を及ぼすことができる。例えば、チャネルは、蛇行流路を有してもよく、この場合、例えば、流路の湾曲（ｔｕｒｎｓ）の数および／または湾曲の長さを調節して滞留時間を制御することができる。
【００６９】
本発明の概念的な実施形態では、パターニングされた紙から形成される多層デバイスを図１０に示す。この特定の設計により、定量比色読み取りが可能となる。デバイスは、試薬の貯蔵に使用される領域（即ち、ゾーン）を備える１層以上のパターニングされた紙に接着された血漿分離膜を備え、試薬は流体試料と接触すると放出するように配合されている。ＡＬＴゾーンは、Ｌ−アラニン、α−ケトグルタル酸、ピルビン酸オキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノ安息香酸を含有してもよい。ＡＳＴゾーンは、システインスルホン酸、α−ケトグルタル酸およびメチルグリーン色素を含有してもよい。パターニングされた紙の層を、パターニングされたチャネルからなる最下層に接着してもよい。この設計のチャネルは、チャネルを形成する紙繊維に固定化された抗ＡＬＴ抗体および抗ＡＳＴ抗体を有してもよい。このようにして、血液試料はフィルタ膜に導入され、毛細管現象により下流の２つの試薬ゾーンまで移動することができ、そこで各アッセイ用の試薬が紙から放出された後、毛細管現象により対応するチャネルまで下流に移動し始める。試料（この時点では試薬を含有している）が毛細管現象によりチャネルを下流に移動する時、ＡＳＴまたはＡＬＴは抗体により捕捉され得る。試料中に存在するＡＬＴまたはＡＳＴが多いほど、捕捉時にチャネルのさらに下流に存在することになる。このようにして、比色反応はＡＬＴまたはＡＳＴの存在下でしか進行しないため、「温度計」型の読み取り領域が得られ、それによりＡＬＴまたはＡＳＴの量が多いほど、チャネルのさらに下流が呈色する。正常レベル、高レベル、および非常に高レベルのＡＳＴおよびＡＬＴに関する理論的結果を図１０に示す。
【００７０】
本発明の別の概念的な実施形態では、検査デバイスは、複数の出力ゾーンを備える。各ゾーンに同じ反応化学を点着することができるが、但し、濃度が徐々に高くなるようにする。各ゾーンで変色が起こるためには検体のレベルが漸次高くなっている必要があるように、濃度を選択することができる。従って、「作動した」ゾーンの数は、所与の試料中の検体の量に相関することになり、その結果、定量読み取り領域が得られる。この実施形態の図を図１１に示す。例えば、６ゾーン読み取り領域は、正常濃度を有する試料では色を表示するゾーがなく（図１１、パネルＡ）；高濃度ではゾーン１〜３が色を示し（図１１、パネルＢ）；非常に高濃度では６つのゾーン全部が色を示す（図１１、パネルＣ）。
【００７１】
本発明の幾つかの実施形態では、携帯電話を使用して、デバイスの比色出力を読み取り、解釈することができる。肝機能検査は、肉眼で読み取られる場合、高い有用性を有するが、色強度解析ソフトウェアを使用して結果を解釈することにより、自動法の解像度にまで近付く、極めて高い解像度を達成することが可能となる。さらに、この方法による比色データの解釈には、電子医療記録に結果を自動記入すること、および医学的意思決定を行うための容易な伝達を促進することなどのその他の利点もある。遠隔医療用途により、色盲の使用者に関する問題も未然に防止されるであろう。本発明の別の実施形態は、次の要件：（ｉ）システムは基本的なカメラ付き携帯電話（発展途上諸国に共通するものなど）で機能しなければならない；（ｉｉ）カメラで収集したデータはカメラアングル、照明、またはレンズからの距離に敏感なものであってはならない；を満たす携帯電話および添付のソフトウェアの使用である。好ましい実施形態では、紙デバイスは、自動較正のために電話のソフトウェアが使用できるカラーチャートを含む（図１２）；および（ｉｉｉ）使用者の負担を最小限に抑えるために、システムはデバイスの検査ゾーンのパターンを自動認識することができなければならない。他の実施形態では、画像の記録に使用されるデバイスは、携帯電話ではなく、反射率に基づく測定および伝達が可能な任意のデバイスである。
【００７２】
本明細書全体を通して、組成物およびキットは特定の構成要素を有する、含む、もしくは備えるものとして記載されている、またはプロセスおよび方法は特定の工程を有する、含む、もしくは備えるものとして記載されているが、さらに、前述の構成要素から本質的になるまたは前述の構成要素からなる本発明の組成物およびキットが存在すること、および前述の処理工程から本質的になるまたは前述の処理工程からなる本発明のプロセスおよび方法が存在することも考えられる。
【００７３】
「ＰＥＧ」という略称はポリエチレングリコールを指す。「ＥＤＴＡ」という略称は、エチレンジアミン四酢酸を指す。「ＰＶＡ」という略称は、ポリビニルアルコールを指す。「ＰＢＳ」という略称は、リン酸緩衝生理食塩水を指す。「ＢＳＡ」という略称はウシ血清アルブミンを指す。
【実施例】
【００７４】
本発明を概略的に説明したが、本発明は以下の実施例を参照することによりさらに容易に理解され、それらは本発明のある特定の態様および実施形態を説明する目的で記載されるに過ぎず、本発明を限定しようとするものではない。
【００７５】
実施例１：５ゾーンデバイスの製造
材料
ＡＬＴアッセイ：
アラニン溶液：１Ｍ  Ｌ−アラニン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、３０ｍＭ  α−ケトグルタル酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２ｍＭチアミンピロリン酸（ＭＰ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、２ｍＭ  ４−アミノアンチピリン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および２５Ｕ／ｍＬ（０．１ｍｇ／ｍＬ）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する溶液は、２００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ＝７．４）に溶解して調製した。
【００７６】
ＤＡＢＡ溶液：１０ｗｔ％ＰＥＧ（ＭＷ＝３５，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０ｍＭジメチルアミノ安息香酸を含有する溶液は、ＤＩ水に溶解して調製した。
【００７７】
ピルビン酸オキシダーゼ：１００Ｕ／ｍＬピルビン酸オキシダーゼ（ＭＰ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＥＭＤ）を含有する溶液は、２００ｍＭトリス緩衝液ｐＨ＝７．４に溶解して調製した。
【００７８】
ＰＥＧ溶液：５ｗｔ％ＰＥＧ（ＭＷ＝３５，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する溶液は、ＤＩ水に溶解して調製した。
【００７９】
ＡＳＴアッセイ：
ＰＶＡ溶液：２ｗｔ％ＰＶＡ（８７〜９０％加水分解、ＭＷ＝１３，０００〜２３，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する溶液は、ＤＩ水に溶解して調製した。
【００８０】
トリス緩衝液（４００ｍＭ）：トリス塩基（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）４．８４５６ｇをＤＩ  Ｈ２Ｏ１００ｍＬに溶解した溶液（ｐＨ＝８．０）を調製した。
【００８１】
ＥＤＴＡ：４００ｍＭトリス緩衝液中にＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）０．７５ｇを含有する溶液１０ｍＬ、ｐＨを８．０に調節した。
【００８２】
リン酸緩衝液（４０ｍＭ）：ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）０．０３８ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｇ、およびＮａＣｌ０．３８７ｇを含有する溶液１００ｍＬを調製し、ｐＨを８．０に調節した。
【００８３】
メチルグリーン溶液：メチルグリーン０．６ｇをＰＶＡ溶液（上記で調製）５０ｍＬに溶解することにより、１．２％メチルグリーン溶液を調製した。
【００８４】
ローダミンＢ溶液：ローダミンＢ０．６ｇをＰＶＡ溶液（上記で調製）５０ｍＬに溶解することにより、１．２％ローダミンＢ溶液を調製した。
【００８５】
ＡＳＴ色素溶液：メチルグリーン溶液６００μＬをローダミンＢ溶液１００μＬおよび１％ＰＶ溶液５００μＬと混合することにより、１％ＰＶＡ中に０．６％メチルグリーンおよび０．０５％ローダミンＢを含有する溶液を調製した。
【００８６】
ＣＳＡ溶液：ＣＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１７１．１ｍｇ、α−ケトグルタル酸１４．６ｍｇおよび２００ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１０μＬを４０ｍＭリン酸緩衝液１ｍＬ中で調製し、ｐＨを８．０に調節した。
【００８７】
ＡＳＴ陽性対照溶液（２００ＫＵ／Ｌ  ＡＳＴ溶液、５ｗｔ％ＰＥＧ、１Ｘ  ＰＢＳ中）：１Ｘ  ＰＢＳ中に５ｗｔ％ＰＥＧ（ＭＷ＝３５，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する溶液を調製し、ＡＳＴ（５１７７Ｕ／ｍＬ、ＭＰ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）６．１７μＬを添加して２００ＫＵ／Ｌ  ＡＳＴ溶液を作製した。この工程は、デバイス製造の直前に行った。
【００８８】
方法
デバイス製造
デバイスのパターンは、Ａｄｏｂｅ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒ  ＣＳ３を使用して設計した。１枚のＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１クロマトグラフィー紙シート（８．５×１１”）をレーザープリンタ（ＨＰ  Ｃｏｌｏｒ  Ｌａｓｅｒｊｅｔ  ４５２０）に供給し、ＡＬＴゾーンと位置が合うように、シートの背面に黄色ストライプを印刷した。黄色ストライプの反対側にワックスが印刷されるように、このシートにデバイスの最上層（デバイスが読み取られる層）のワックスパターンを、Ｘｅｒｏｘ  ８５６０ＤＮプリンタを使用して印刷した。ワックスが確実に紙の厚み全体にわたって移動するように、シートを１５０℃のオーブンで３０秒間加熱した。Ｘｅｒｏｘ  ８５６０ＤＮプリンタを使用して、デバイスの最下層（フィルタが接着される層）のワックスパターンをＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１クロマトグラフィー紙に印刷した。ワックスが確実に紙の厚み全体にわたって移動するように、このシートも１５０℃のオーブンで３０秒間加熱した。
【００８９】
感圧接着剤（ＵＮＩＴＡＫ  １３１、Ｈｅｎｋｅｌ）をスクリーン印刷により最上層の背面に塗布した。印刷スクリーンは、接着剤がデバイスの５つの作動ゾーンには付着しないが残りの領域には付着するように、光硬化型エマルション（Ａｔｌａｓ  Ｓｃｒｅｅｎ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｓｕｐｐｌｙ）を用いる既知の方法を使用してパターニングした。層を７０℃に設定したオーブンに１５分間入れて接着剤から水を除去し、ゾーン全体に「穴」を有するパターニングされた粘着性の接着剤層が後に残るようにした。このスクリーン印刷プロセスを最下層の背面で繰り返した。次いで、試薬を点着するために、シートをプラスチック枠にテープで貼付した。
【００９０】
図１３Ａおよび図１３Ｂに従いマイクロピペットを使用して、ゾーンに点着した。複数のスポットが必要な場合、最初のスポットを完全に乾燥（室温で風乾）させた後、２番目のスポットを塗布した。
【００９１】
穴あけ器を使用して両方のデバイス層に位置合わせ穴（各シートの角部に予め印刷されている）をあけた。予めあけた穴を位置合わせすることにより、デバイス層を位置合わせした。次いで、位置合わせされた層を２枚の蝋引きした非接着性シート間に挟持し、２ｆｔ／分の速度でラミネータを通過させた。次いで、コールドラミネーション（Ｆｅｌｌｏｗｅｓ粘着ラミネートシート）をデバイスのシートの前面に載置した。第２のＦｅｌｌｏｗｓラミネートシートを７ｍｍの穴を有するように打ち抜きまたは穴あけし、接着剤側を上にして作業台に載置した。次いで、予め打ち抜かれたＰａｌｌ  Ｖｉｖｉｄ  ＧＸ血漿分離膜の１ｃｍディスクを、膜の粗面側が接着剤と接触するようにしてラミネートシートの穴を覆うように心合わせした。各デバイスが対応するフィルタを有するまで、このプロセスを繰り返した。次いで、各フィルタがデバイスの５ゾーン全部を被覆するように、打ち抜かれてフィルタが接着されたラミネートをデバイスシート積層体の背面に位置合わせして、ラミネートした。最後に、積層体全体を合計８回（各側を上向きにして４回ずつ）ラミネートし、十分な接触を確保した。次いで、個々のデバイスを手動で切断し、箔ライニングされヒートシールされたバッグ内にデバイス１０個／袋で、シリカ乾燥剤１袋を入れて貯蔵した。
【００９２】
実施例２：緩衝液での検査
８４％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、４％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３、２％（ｗ／ｖ）ＫＣｌ、２％（ｗ／ｖ）Ｎａ２ＨＰＯ４３Ｈ２Ｏ、３％（ｗ／ｖ）ＭｇＣｌ２６Ｈ２Ｏ、３％（ｗ／ｖ）ＣａＣｌ２、１％（ｗ／ｖ）Ｎａ２ＳＯ４、および７％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有する人工血漿緩衝液は、ＤＩ水に溶解して調製し、ｐＨを７．４に調節した。ＡＬＴとＡＳＴの両方の０Ｕ／Ｌ、４０Ｕ／Ｌ、１２０Ｕ／Ｌ、２００Ｕ／Ｌ、および４００Ｕ／Ｌ含有保存溶液は、人工血漿緩衝液に溶解して調製した。これらの溶液各３０μＬを５つの個々のデバイスに添加した。デバイスを１５分間反応させ、デスクトップスキャナ（Ｃａｎｏｎ）を使用して走査した。得られた画像（図１４）は、ＡＬＴアッセイではＡＬＴの増加に伴い黄色から赤色への色の諧調を示し、ＡＳＴアッセイではＡＳＴの増加に伴い暗青色からピンク色への色の諧調を示した。
【００９３】
実施例３：検出限界
標準的な統計的手法を使用して、ＡＳＴおよびＡＬＴのアッセイに関する検出限界（ＬＯＤ）曲線を作成した。画像をデジタル化するデスクトップスキャナおよび値を得るための解析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ）を使用することにより、各ゾーンの色強度を定量化した。ＬＦＴの出力信号対緩衝液試料（各濃度につきＮ＝７）中のＡＳＴまたはＡＬＴの濃度の較正プロットを図１５に示す。ＡＳＴに関して、実線はヒルの式：Ｉ＝Ｉｍａｘ［Ｌ］ｎ／（［Ｌ］ｎ＋［Ｌ５０］ｎ）｛式中、Ｉｍａｘ＝１０５．７、［Ｌ５０］＝２６０．９Ｕ／Ｌ、ｎ＝１．７２、およびＲ２＝０．９９｝の非線形回帰を表す。エラーバーは１標準偏差（σ）を表す。ＡＬＴに関して、実線はヒルの式：Ｉ＝Ｉｍａｘ［Ｌ］ｎ／（［Ｌ］ｎ＋［Ｌ５０］ｎ）｛式中、Ｉｍａｘ＝１２６．５、［Ｌ５０］＝３３１．３３Ｕ／Ｌ、ｎ＝１．０４、およびＲ２＝０．９６｝の非線形回帰を表す。エラーバーは１標準偏差（σ）を表す。これらのアッセイでは両方とも、シグモイド曲線の直線部分がほぼ４０〜２００Ｕ／Ｌの濃度範囲に入る。算出されたＬＯＤは、ＡＬＴアッセイでは５３Ｕ／Ｌ、ＡＳＴアッセイでは８４Ｕ／Ｌであった。これらの値は、正常レベルと比較したとき、視認可能な変色を生じさせたＡＬＴおよびＡＳＴの最低濃度とよく一致した。
【００９４】
実施例４：再現性
紙基材のトランスアミナーゼ検査の再現性を評価するために、正常レベルおよび高レベルのＡＳＴおよびＡＬＴを含有する試料で色強度を測定した（スキャナ／ＩｍａｇｅＪ解析）。合計１０個のデバイスを使用して、各試料を測定した。各試料に関して、標準偏差を平均値で割ったものと定義される変動係数（％ＣＶ）から変動を調べた。結果（表１）から、ＡＳＴ検査とＡＬＴ検査の両方とも、検査した４つの状態（高い／正常な血清および血液）全てにおいてＣＶが１０％未満であったことが分かる。
【００９５】
【表１】
2014529083.tif 000002
【００９６】
実施例５：全血での線形性試験
検査の線形性は、既知の量（０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、３００、および４００Ｕ／Ｌ）の精製されたＡＬＴおよびＡＳＴを新鮮な全血（静脈穿刺により入手）に添加し、ピペットで血液３０μＬをデバイスに移し、１５分後に観察された色反応をデスクトップスキャナを使用してデジタル化することにより、評価した（図１７）。画像解析ソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ）を使用して各走査ゾーンで得られた色強度を定量値に翻訳した。これらの値を実際の濃度に対してプロットし、検量線（図１６）を得た。両アッセイに関して、臨床上重要な範囲（４０〜２００Ｕ／Ｌ）で強い線形性が認められた。ＡＬＴプロットおよびＡＳＴプロットに関してそれぞれ、Ｒの二乗値０．９５および０．９８が測定された（各データ点につきＮ＝３、エラーバーは＋／−１の標準偏差を表す）。
【００９７】
実施例６：臨床標本検査
所与の試料で測定された値を適切なビン（＜３ｘ×ＵＬＮ（０〜１１９Ｕ／Ｌ）、３〜５ｘ×ＵＬＮ（１２０〜２００Ｕ／Ｌ）、または＞５ｘ×ＵＬＮ（＞２００Ｕ／Ｌ）に適正に分類する読み取り装置の能力に関する紙基材のトランスアミナーゼ検査の確度を評価するために、１組の臨床標本の検査を行った。これらの実験では、通常の臨床検査のために事前の５時間以内に患者から同時に（それぞれ、標準ＥＤＴＡ含有および血清分離器管に）採血された、対の全血標本と血清標本を３０μＬずつ検査したが、それに関して、血清標本の自動トランスアミナーゼ検査（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ）の結果が入手可能であった（注目すべきことには、以前の検査からＥＤＴＡは紙基材でのアッセイに干渉しないことが分かった）。各紙アッセイは１５分後に、自動検査の結果に盲目である３人の独立した読み取り者により目視で読み取られ；それぞれ独立して検査ゾーンの色を、読み取りガイドに記載の最も近い色／値に一致させ、結果をＵ／Ｌで記録した（最も近い１０Ｕ／Ｌに丸めた）。
【００９８】
ビン分類確度は、各データ点が、次の評価基準：ｉ）紙トランスアミナーゼ検査で測定された値が自動検査の（真の）値により決定された適正なビン内にある、またはｉｉ）紙検査で測定された値が真の値の４０Ｕ／Ｌ内にある；の少なくとも１つを満たすかどうかを調べることにより評価した。＜４０Ｕ／Ｌの変動は、患者の臨床状態の差を反映する可能性がないことから、臨床上許容されることが認められたため、第２の評価基準はビンの境界に近い値となる。ビン分類確度データの要約を表２に示す。デバイスの全体的確度は、血清と全血の両方で、ＡＳＴとＡＬＴの両方とも９０％を上回った。さらに、各ビン内の適正にビン化された試料の数をそのビン内の試料の総数で割ることにより、「ビン当たりの」確度を算出した。データから、血清の方が全血より、特に３−５ＸビンではＡＬＴ確度が高かった（それぞれ９２％対５７％）ことが判明している。この不一致は、検査時点での全血の経過時間（２〜５時間、即ち、患者から２〜５時間前に採血した）により説明することができる。事前の実験（データ示さず）において、全血試料では、採血時間から＞３時間経過した後、不自然に高いＡＬＴ値が得られることが判明した。これは、経時的に、赤血球（ＲＢＣ）が乳酸を放出し、これがピルビン酸に変換され；ピルビン酸によりＡＬＴアッセイが作動し、そのため不正に高い読み取り値が得られるという理由によるものと考えられる。血清の場合、ＲＢＣは採血直後に血清から分離され、血清中でのピルビン酸の蓄積が防止される。従って、本試験において、新鮮な全血から（即ち、フィンガースティック法から）得られた確度は、血清結果を反映するものと予想される。
【００９９】
【表２】
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【０１００】
実施例７：フィンガースティック法での検査
フィンガースティック法で得られた全血でのデバイスの性能を観察するために、実験を行った。小規模試験で、１０人の健常被験者がそれぞれランセット（ＳｕｒｇｉＬａｎｃｅ（商標）ＳＬＮ３００）を使用して指から血液の小滴（約３０μＬ）を得、それをデバイス（例えば、図１に示す）に導入した。１０／１０のデバイスが十分に作動する、即ち、全てのゾーンが血漿で濡れ、全ての対照領域が適切に機能することが判明した。予想通り、この群では、ＡＳＴレベルおよびＡＬＴレベルは正常範囲（＜６０Ｕ／Ｌ）内であることが判明した。
【０１０１】
参照による援用
本明細書で参照する特許文献および科学論文はそれぞれ、その開示内容全体があらゆる目的で参照により援用される。
【０１０２】
均等物
本発明の精神またはその本質的特徴から逸脱することなく他の特定の形態でも本発明を具体化することができる。従って、前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明に限定するものではなく、あらゆる点で本発明を説明するものと見なされるべきである。従って、本発明の範囲は、前述の詳細な説明ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等物の意味および範囲に入る全ての変更は本明細書に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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