(57)【要約】  悪液質を有する対象の血液、血漿、若しくは血清中に存在するマクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）を除去又は不活性化することを含む、悪液質の治療方法を開示する。一実施形態において前記方法は、ＭＩＣ−１を結合させる適切な基質（例えば、ＭＩＣ−１結合分子を備えた基質）を用意するステップ、前記血液、血漿、又は血清と前記基質とを接触させて、かかる血液、血漿、又は血清中に存在するＭＩＣ−１を前記基質に結合させることにより、対象から除去した血液、血漿又は血清を処理するステップ、前記処理した血液、血漿又は血清を基質から分離するステップ、及びその後、前記処理した血液、血清又は血漿を対象に戻すステップを含む。本発明はさらに、対象中に存在するＭＩＣ−１の量を判定するステップを含む、悪液質の診断方法又は予知方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪液質を示す、又は悪液質の傾向を示す対象の血液、血漿、若しくは血清をエクスビボにて処理することにより、前記血液、血漿若しくは血清中に存在するマクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）を除去又は不活性化するステップ、及びその後、前記処理した血液、血漿若しくは血清を前記対象に戻すステップを含む、悪液質の治療又は予防方法。
【請求項２】
対象が、がん、慢性腎不全、又は慢性炎症性疾患の患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象が、３．７〜５０ｎｇ／ｍｌ以上という上昇した血清ＭＩＣ−１レベルを示す、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
以下のステップを含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法：
（ｉ）ＭＩＣ−１を結合させる適切な基質を用意するステップ、
（ii）対象から除去した血液、血漿、又は血清と前記基質とをエクスビボで接触させて、前記血液、血漿、又は血清中に存在するＭＩＣ−１を前記基質に結合させることにより、前記血液、血漿又は血清を処理するステップ、
（iii）前記血液、血漿、又は血清を前記基質から分離するステップ、及びその後
（iv）前記処理した血液、血漿、又は血清を前記対象に戻すステップ。
【請求項５】
血液、血漿若しくは血清中に存在するＭＩＣ−１が、ＭＩＣ−１結合分子を用いて除去又は不活性化される、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
以下のステップを含む請求項５に記載の方法：
（ｉ）適切な基質に結合したＭＩＣ−１結合分子を用意するステップ、
（ii）対象から除去した血液、血漿、又は血清と前記基質に結合したＭＩＣ−１結合分子とをエクスビボで接触させて、前記血液、血漿、又は血清中に存在するＭＩＣ−１を、前記ＭＩＣ−１結合分子を介して前記基質に結合させることにより、前記血液、血漿、又は血清を処理するステップ、
（iii）前記処理した血液、血漿又は血清を前記基質から分離するステップ、及びその後、
（iv）前記処理した血液、血清又は血漿を前記対象に戻すステップ。
【請求項７】
ＭＩＣ−１結合分子が、抗ＭＩＣ−１抗体又はその機能的断片である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
ＭＩＣ−１結合分子が、フェチュイン又はそのＭＩＣ−１結合断片である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法であって、対象が慢性腎不全に罹患しており、前記方法が前記対象のための血液透析療法に組み込まれている方法。
【請求項１０】
対象中に存在するＭＩＣ−１の量を判定するステップを含む、対象の悪液質の診断又は予知方法。
【請求項１１】
対象が、３．７〜５０ｎｇ／ｍｌ以上という、上昇した血清ＭＩＣ−１レベルを示すかどうか判定するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法により又はＭＩＣ−１阻害剤を対象に投与することにより治療可能／予防可能な、前記対象の悪液質を特定する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪液質の治療方法に関する。より具体的には本発明は、悪液質患者の血液、血漿、又は血清中に存在するマクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）を除去又は不活性化することを含む、悪液質の治療方法に関する。
【０００２】
（参照による組込み）
本特許出願は、以下の優先権を主張する：
−出願日２００７年１０月９日、名称「悪液質の治療方法」（A method of treating cachexia）の豪州特許出願第２００７９０５５２４号明細書。この出願の全内容は、参照により本明細書に援用される。
本明細書中ではさらに、以下の明細書に言及する。
−国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２００５／０００５２５（ＷＯ２００５／０９９７４６号）。この明細書の全内容は、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
健康と幸せのためには、正常な体重の管理が重要である。特に肥満は、対象の罹病率及び死亡率を大きく上昇させる場合があるが、平均体重より軽い場合もまた問題がある。悪液質として知られる病態は典型的には、体重減少、筋萎縮、疲労、食欲減退又は顕著な食欲喪失によって特徴づけられるが、一部の慢性疾患（例えばがん、慢性腎疾患、慢性炎症性疾患、及び神経性食欲不振症として知られる摂食障害）の患者の病的状態の大きな原因となっている。悪液質は例えば、がんの末期によく見られ（最も末期症状のがん患者に起きる）、がんに関連する死亡の約４分の１が、悪液質に起因する。
【０００４】
体重の制御は複雑なプロセスであり、現在でも完全には解明されていない。しかし上記プロセスは多因子性であり、特に食欲、食物摂取、食物のエネルギーへの変換、エネルギー利用、及びエネルギー消費に影響されることが知られている。さらにレプチン、グレリン、メラノコルチン、アグーチ関連ペプチド、及び神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）等のホルモン及びサイトカインをはじめとして、上記プロセスの様々な側面の制御に関与する、多くの可溶性の伝達物質（mediator）が存在することが認識されている。体内では通常、マクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）として知られるヒトＴＧＦ−βスーパーファミリーサイトカインの発現レベル（特許文献１及び２、並びに非特許文献１〜５）は低いが、このレベルが上皮性悪性腫瘍、炎症、及び傷害において著しく上昇し（非特許文献５〜９）、その結果血清ＭＩＣ−１レベルが上昇することを、本発明に至る研究で本出願人は見い出した。
【０００５】
本出願人は、例えば末期上皮性がん又は慢性腎疾患の患者では、血清中のＭＩＣ−１レベルが上昇し、これが、ＭＩＣ−１を過剰発現して顕著な体重減少を示すトランスジェニックマウスで観察される血清中レベルと相関することを見い出した。したがって、ＭＩＣ−１の発現増大を伴う慢性疾患患者における悪液質の理由は、ＭＩＣ−１の過剰発現又は除去の低下であり、前記患者の血液、血漿、又は血清中に含まれるＭＩＣ−１を（例えば抗ＭＩＣ−１抗体を用いることにより）除去又は不活性化することにより、体重減少の重症度を反転（reverse）又は軽減させることを提唱した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】Breit SN & MR Bootcov, "Novel TGF-beta like cytokine", International Patent Application No PCT/AU96/00386 (WO 97/00958).
【特許文献２】Breit SN et al., "Diagnostic assay and method of treatment involving macrophage inhibitory cytokine-1 (MIC-1)", International Patent Application No PCT/AU01/00456 (WO 01/81928).
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bootcov MR et al., MIC-1, a novel macrophage inhibitory cytokine, is a divergent member of the TGF-b superfamily cluster.  Proc Natl Acad Sci USA 1997 94:11514-11519.
【非特許文献２】Fairlie WD et al., Expression of a TGF-b superfamily protein, Macrophage Inhibitory Cytokine-1, in the yeast Pichia pastoris. Gene 2000 254:67-76.
【非特許文献３】Moore AG et al., TGF-b superfamily cytokine MIC-1 is present in high concentrations in the serum of pregnant women. J Clin Endocrinol Metab 2000 85:4781-4788.
【非特許文献４】Fairlie WD et al., Epitope mapping of the Transforming Growth Factor-β superfamily protein, MIC-1: Identification of at least five distinct epitope specificities. Biochemistry 2001 40:65-73.
【非特許文献５】Fairlie WD et al., MIC-1 is a novel TGF-b superfamily cytokine associated with macrophage activation. J Leukocyte Biol 1999 65:2-5.
【非特許文献６】Koniaris LG, Induction of MIC-1/growth differentiation factor-15 following bile duct injury. J Gastrointest Surg 2003 7(7):901-905.
【非特許文献７】Welsh JB et al., Analysis of Gene Expression Identifies Candidate Markers and Pharmacological Targets in Prostate Cancer.  Cancer Res 2001 61:5974-5978.
【非特許文献８】Buckhaults P et al., Secreted and cell surface genes expressed in benign and malignant colorectal tumors. Cancer Res 2001 61:6996-7001.
【非特許文献９】Welsh JB et al., Large-Scale Delineation of Secreted Protein Biomarkers Overexpressed in Cancer Tissue and Serum.  Proc Natl Acad Sci USA 2003 100:3410-3415.
【発明の概要】
【発明の効果】
【０００８】
したがって第１の態様において本発明は、悪液質を示す、又は悪液質の傾向を示す対象の血液（例えば全血）、血漿、若しくは血清をエクスビボにて処理することにより、前記血液、血漿若しくは血清中に存在するマクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）を除去又は不活性化するステップ、及びその後、前記処理した血液、血漿若しくは血清を前記対象に戻すステップを含む、悪液質の治療方法又は予防方法を提供する。
好適な実施形態において本発明は、以下のステップを含む悪液質の治療方法又は予防方法を提供する。
（ｉ）ＭＩＣ−１を結合させる適切な基質を用意するステップ、
（ii）対象から除去した血液、血漿、又は血清と前記基質とをエクスビボで接触させて、かかる血液、血漿、又は血清中に存在するＭＩＣ−１を前記基質に結合させることにより、前記血液、血漿、又は血清を処理するステップ、
（iii）前記血液、血漿、又は血清を前記基質から分離するステップ、及びその後
（iv）前記処理した血液、血漿、又は血清を前記対象に戻すステップ
第２の態様において本発明は、対象中に存在するＭＩＣ−１の量（特に血清ＭＩＣ−１レベル）を判定するステップを含む、対象の悪液質の診断方法又は予知方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＭＩＣ−１前駆体から、１１２個のアミノ酸を含む成熟形態へのプロセシングを示す概略図である。成熟領域からプロペプチドを切断する箇所は、アルギニン１９６である。
【図２】ヌードマウスの体重と、マウスの腫瘍の最大直径が約１ｃｍになったときに採取した血液における血清ヒトＭＩＣ−１レベルとの関係を示す図である。以下の（ｉ）〜（iv）のいずれかを過剰発現するように操作されたヒトＤＵ１４５細胞を、ヌードマウスに異種移植した。（ｉ）完全長ヒトＭＩＣ−１（プロペプチドを含む）（シリーズ３）、（ii）成熟ヒトＭＩＣ−１（プロペプチドを含まない）（シリーズ１）、（iii）プロペプチドを含むが、フリン様プロコンバターゼ部位が欠失している（ＦＵＲＩＮ ＤＥＬ）ヒトＭＩＣ−１（シリーズ２）、及び（iv）ベクターのみのネガティブ・コントロール（シリーズ４）
【図３】ヌードマウスの体重減少率（実験開始時点の体重と比較した）と、マウスの腫瘍の最大直径が約１ｃｍになったときに採取した血液における血清ヒトＭＩＣ−１レベルとの関係を示す図である。以下の（ｉ）〜（iv）のいずれかを過剰発現するように操作されたヒトＤＵ１４５細胞を、ヌードマウスに異種移植した。（ｉ）完全長ヒトＭＩＣ−１（プロペプチドを含む）（シリーズ３）、（ii）成熟ヒトＭＩＣ−１（プロペプチドを含まない）（シリーズ１）、（iii）プロペプチドを含むが、フリン様プロコンバターゼ部位が欠失している（ＦＵＲＩＮ ＤＥＬ）ヒトＭＩＣ−１（シリーズ２）、及び（iv）ベクターのみのネガティブ・コントロール（シリーズ４）
【図４】マウスの体重（ｇ）に対する、ヒツジ抗ヒトＭＩＣ−１抗体の作用に関する結果を示す図である。（Ａ）２７日目に、高度に精製された組換えＭＩＣ−１で免疫したヒツジ由来の精製ＩｇＧ１０ｍｇを２匹のマウス（腹腔内）に投与し、ヒトＭＩＣ−１に対する、高力価の抗体をつくらせた。（Ｂ）２７日目に、正常ヒツジ血清由来の精製ＩｇＧ１０ｍｇを対照として、２匹のマウス（腹腔内）に投与した。グラフＡ及びＢは、２つのグループのマウスのうち、各々１匹由来の代表的データを示す。
【図５】ＭＩＣ−１を過剰発現するトランスジェニック（ＴＧ）マウス株ｍｉｎ２８を用いた体重減少の評価の結果を示す。雄及び雌の両方のｍｉｎ２８マウスでは、コンジェニックな野生型同腹子（５９〜６１日齢の３組の同腹子）と比較して、体重が有意に減少していた（Ｐ ＜０．００１）。
【図６】ＭＩＣ−１を過剰発現するトランスジェニック（ＴＧ）マウス株ｍｉｎ７５を用いた体重減少の評価の結果を示す。雄及び雌の両方のｍｉｎ７５マウスでは、コンジェニックな野生型（ＷＴ）同腹子（５９〜６１日齢の３組の同腹子）と比較して、体重が有意に減少していた（Ｐ ＜０．００１）。
【図７】７組の同腹子で、野生型マウス（黒塗り、ＷＴ）及びヘテロ型トランスジェニック同腹子マウス（ＴＧ、白抜き）の体重（ｇ）の比較を示す。数字は各同腹における、ヘテロ型マウスとその野生型同腹子の平均体重を示す。新生仔ＷＴマウスと新生仔ＴＧマウス（４８時間齢未満のマウス）とでは、体重に有意差がなかった。
【図８−１】ヒトＭＩＣ−１に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ２６）を投与すると、成熟ヒトＭＩＣ−１構築物（プロペプチドを含まない）を用いた形質導入によりＭＩＣ−１を過剰発現するヒトＤＵ１４５細胞を異種移植したヌードマウスにおいて、体重の減少を反転させられることを示す図である。ＭＩＣ−１を過剰発現するＤＵ１４５細胞を注射したマウスの体重は、急速に減少し始めた。１１日目に０．１〜１ｍｇ量のＭＡｂ２６を単回投与すると体重が増加し、ＭＡｂ２６の量を増加させると、体重の増加の程度及び期間も増大した（Ａ〜Ｃ）。ＭＡｂ２６は、腫瘍の増殖には影響しなかった（Ｄ〜Ｆ）。未処理マウス（Ｇ）及びＰＢＳ緩衝液のみで処理したマウス（Ｈ）の体重は、実験期間中、急速かつ持続的に減少した。縦軸は体重（ｇ）を示す。
【図８−２】ヒトＭＩＣ−１に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ２６）を投与すると、成熟ヒトＭＩＣ−１構築物（プロペプチドを含まない）を用いた形質導入によりＭＩＣ−１を過剰発現するヒトＤＵ１４５細胞を異種移植したヌードマウスにおいて、体重の減少を反転させられることを示す図である。ＭＩＣ−１を過剰発現するＤＵ１４５細胞を注射したマウスの体重は、急速に減少し始めた。１１日目に０．１〜１ｍｇ量のＭＡｂ２６を単回投与すると体重が増加し、ＭＡｂ２６の量を増加させると、体重の増加の程度及び期間も増大した（Ａ〜Ｃ）。ＭＡｂ２６は、腫瘍の増殖には影響しなかった（Ｄ〜Ｆ）。未処理マウス（Ｇ）及びＰＢＳ緩衝液のみで処理したマウス（Ｈ）の体重は、実験期間中、急速かつ持続的に減少した。縦軸は体重（ｇ）を示す。
【図８−３】ヒトＭＩＣ−１に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ２６）を投与すると、成熟ヒトＭＩＣ−１構築物（プロペプチドを含まない）を用いた形質導入によりＭＩＣ−１を過剰発現するヒトＤＵ１４５細胞を異種移植したヌードマウスにおいて、体重の減少を反転させられることを示す図である。ＭＩＣ−１を過剰発現するＤＵ１４５細胞を注射したマウスの体重は、急速に減少し始めた。１１日目に０．１〜１ｍｇ量のＭＡｂ２６を単回投与すると体重が増加し、ＭＡｂ２６の量を増加させると、体重の増加の程度及び期間も増大した（Ａ〜Ｃ）。ＭＡｂ２６は、腫瘍の増殖には影響しなかった（Ｄ〜Ｆ）。未処理マウス（Ｇ）及びＰＢＳ緩衝液のみで処理したマウス（Ｈ）の体重は、実験期間中、急速かつ持続的に減少した。縦軸は体重（ｇ）を示す。
【図９】成熟ヒトＭＩＣ−１構築物（プロペプチドを含まない）を用いた形質導入によりＭＩＣ−１を過剰発現するヒトＤＵ１４５細胞を異種移植したヌードマウスと、対照構築物で形質導入したＤＵ１４５細胞を投与した対照マウスとの、１日の食物摂取に関する比較を３日連続で示す図である。
【図１０】成熟ヒトＭＩＣ−１構築物（プロペプチドを含まない）を用いた形質導入によりＭＩＣ−１を過剰発現するヒトＤＵ１４５細胞を異種移植したヌードマウスと、対照構築物で形質導入したＤＵ１４５細胞を投与した対照マウスとの、脂肪体重量及び筋肉重量の比較を示す図である。ＭＩＣ−１を有するＤＵ１４５（MIC-1 bearing DU145）を発現する腫瘍を有するマウスを実線で示し、対照腫瘍を有するマウスを白抜き棒で示す。Ｔ検定を用いて統計的比較を実施した。星印の数は、統計的有意性の増大、ｐ＝０．００３〜ｐ＜０．０００１を示す。鼠径部脂肪、精巣上体脂肪、後腹膜脂肪における体脂肪の重量が顕著に減少した。筋肉重量については、２つのマウス群の間に有意差はなかった。ＮＳ＝有意差なし、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１である。
【図１１】食物摂取について、ＭＩＣ−１トランスジェニックマウスと野生型対照マウスとの比較を示す図である。野生型マウス（ＷＴ）５匹及びトランスジェニックマウス（ＴＧ）６匹を１匹ずつケージに収容し、単独飼育に適応させるために４８時間放置した。時間ゼロの時点で、ホッパ（hopper）内に配置した食物を計量した。２４時間ごとに、ホッパに入れた食物の重量から残余及びこぼれた量を差し引くことにより、食物の消費を推定した。２４時間ごとの周期で４回にわたり、食物摂取を計量した。マウス１匹の１日当りの食物摂取量は、ＷＴ動物のほうが多く、有意差があった（ｐ＜０．０４）（Ａ）。しかしマウスの体重に関して食物摂取を補正すると、その差は解消した（Ｂ）。
【図１２】ＭＩＣ−１トランスジェニック（ＴＧ）マウス由来の臓器及び野生型（ＷＴ）マウス由来の臓器の重量を示す図である。略記は以下を示す。ｍ＝雄、ｆ＝雌、epid＝精巣上体、ut＝子宮、retroperit＝後腹膜、＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１。
【図１３】フェチュインに結合するＭＩＣ−１に関するアッセイの結果である。フェチュインでコーティングしたアガロースビーズと共に、精製した組換えＭＩＣ−１（０．１％ＢＳＡ中）をインキュベートした。次にビーズを洗浄し、結合した物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び、その後の抗ＭＩＣ−１抗体を用いたウェスタンブロット法により解析した。レーン１は精製した組換えＭＩＣ−１、レーン２はフェチュインビーズに結合したＭＩＣ−１、レーン３はフェチュインビーズのみ、及びレーン４はアガロースビーズのみと共にインキュベートしたＭＩＣ−１である。矢印はＭＩＣ−１のバンドを示す。
【図１４】成体マウスの脳の視床下部領域の断面を示す図である。第三脳室（Ｖ３）を切断し、（Ａ）３５Ｓ標識化ＲＮＡプローブを用いてＭＩＣ−１のインサイチュハイブリダイゼーションを行い、オートラジオグラフィーで分析し、（Ｂ）組換えマウスＭＩＣ−１に対するアフィニティー精製ポリクローナル抗体を用いて、免疫組織化学法を実施した。これらの断面は、弓状核（ＡＮ）領域並びに脳室周辺部において、ＭＩＣ−１のｍＲＮＡ及びＭＩＣ−１タンパク質が発現していることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
多くのがん、特に上皮性がんがＭＩＣ−１を過剰発現し、これらのがん患者の血清ＭＩＣ−１レベルが、病気の段階と広がりに比例して上昇することが既に見い出されている。特にがん末期では、血清レベルが３．７〜５０ｎｇ／ｍｌ以上に達することがあり、マウスの場合、このレベルになると顕著な体重減少を伴う。がん患者又は悪液質を示す若しくは悪液質の傾向があり得るその他の患者におけるＭＩＣ−１レベル或いはＭＩＣ−１の活性を低下させることにより、体重減少並びにそれに引き続く、患者の幸福及び尊厳に対する悪影響を反転又は軽減させることができると期待されている。これにより、慢性基礎疾患（例えばがん又は慢性腎疾患）に対する患者の治療可能性、及びかかる治療に対して患者が有効反応（positively respond）を示すよう支援することができ、このため罹病率及び死亡率を低減させることができる。
【００１１】
したがって第１の態様において本発明は、悪液質を示す、又は悪液質の傾向を示す対象の血液（例えば全血）、血漿、若しくは血清をエクスビボにて処理することにより、前記血液、血漿若しくは血清中に存在するマクロファージ阻害性サイトカイン（ＭＩＣ−１）を除去又は不活性化するステップ、及びその後、前記処理した血液、血漿若しくは血清を前記対象に戻すステップを含む、悪液質の治療方法又は予防方法を提供する。
【００１２】
前記対象は、がん（特に乳がん、前立腺がん、結腸がん、直腸がん、膀胱がん、及び膵臓がん等の上皮性がん）、慢性腎疾患、慢性炎症性疾患（例えば関節リウマチ及びクローン病）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の慢性疾患、鬱血性心不全等の心疾患、神経性食欲不振症として知られる摂食障害、又は結核、後天的免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及びマラリア等の特定の感染症の患者であってよい。これらの疾患及び障害は一般的に悪液質を伴うため、前記対象は既に悪液質を示すか、又は悪液質の傾向を示している場合がある。前記対象の血液、血漿、又は血清におけるＭＩＣ−１レベルは典型的には上昇しているか（例えば血清レベル３．７（Kempf, T et al., Prognostic utility of growth differentiation factor-15 in patients with chronic heart failure. J Am Coll Cardiol 2007 50(11):1054-1060）〜５０ｎｇ／ｍｌ又は５〜５０ｎｇ／ｍｌ。しかし疾患によっては、１００〜２００ｎｇ／ｍｌという高い血清ＭＩＣ−１レベルが観察される）、又は少なくとも血清ＭＩＣ−１レベルが常に、通常の血清ＭＩＣ−１レベル０．２〜１．１５ｎｇ／ｍｌの上限にある（Brown, DA et al., MIC-1 serum level and genotype: associations with progress and prognosis of colorectal carcinoma. Clin Cancer Res 2003 9:2642-2650）。必要であれば、ＭＩＣ−１用アッセイ（例えばＭＩＣ−１ ＥＬＩＳＡ（非特許文献３））を用いてＭＩＣ−１レベルの上昇を（例えば血液、血漿、又は血清試料から）検知することにより、前記対象を選択することができる。
【００１３】
本発明の方法は、先に記載した疾患及び障害に罹患した対象の治療に加え、ＭＩＣ−１が過剰発現している若しくはＭＩＣ−１の排除が減少している病態又は治療（例えば負傷、ストレス並びに放射線治療及び化学療法）に関連する悪液質の治療或いは予防にも適している。
【００１４】
前記対象の血液、血漿、若しくは血清をエクスビボにて処理することにより、ＭＩＣ−１を除去又は不活性化した後、前記処理した血液、血漿又は血清を前記対象に戻すことによって血清ＭＩＣ−１レベルを効果的に低下させることができ、これが、前記対象の食欲の増進及び／若しくは体重の増加、又は少なくとも体重減少を軽減させることにつながる可能性がある。前記対象の血液、血漿又は血清は望ましくは、血清ＭＩＣ−１レベルが、通常範囲の血清ＭＩＣ−１レベル０．２〜１．１５ｎｇ／ｍｌの下限になるように処理される。または、血液若しくは血漿ＭＩＣ−１レベルの場合は、前記通常範囲の血清ＭＩＣ−１レベル０．２〜１．１５ｎｇ／ｍｌの下限の量に相当するように処理される（血漿においては、前記相当する量は実質的に同等量である。なぜなら血漿の主成分は血清であり、相違としては、フィブリノゲン及び他の凝固因子のみであるからである。一方、血液ついては、前記相当する量は血清における量の約２倍である）。低下したＭＩＣ−１レベルを維持して所望の結果（例えば食欲増進）を達成するためには、前記対象の血液、血漿又は血清を定期的に処理する必要がある場合がある。
【００１５】
血液、血漿又は血清中に存在するＭＩＣ−１を、例えばＭＩＣ−１に結合する分子及び／若しくは基質を用いて除去又は不活性化することができる。
【００１６】
ＭＩＣ−１に結合する適切な分子は、ＭＩＣ−１受容体及びその断片（例えばＭＩＣ−１受容体の、細胞質外可溶性受容体ドメイン）並びに成熟ＭＩＣ−１に結合する可溶性分子又はマトリクス結合タンパク質を有する。本発明において有用な、成熟ＭＩＣ−１に結合する可溶性分子の特定の例としては、フェチュインが挙げられる。フェチュイン（Demetriou, M et al., Fetuin/α2-HS glycoprotein is a transforming growth factor-β type II receptor mimic and cytokine antagonist. J Biol Chem 1996 271(22):12755-12761）は、胎児の血液に豊富に含まれている糖タンパク質である。フェチュインは胎児の血液において、様々な物質の輸送に関与している。ＭＩＣ−１に結合するフェチュイン断片もまた、本発明における使用に適している。
【００１７】
血液、血漿又は血清中に存在するＭＩＣ−１の除去又は不活性化に用いることができる適切な基質としては、例えば、成熟ＭＩＣ−１に結合する天然物質若しくは合成物質が挙げられ、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）様物質であってよい。かかる基質は、ビーズ、繊維、膜、又は血液、血漿若しくは血清と容易に接触させてＭＩＣ−１を「捕捉」する（すなわちＭＩＣ−１を基質に結合させる）ことができるその他の表面（surface）の形態で用意することができる。これにより処理した血液、血漿又は血清由来のＭＩＣ−１を除去することができる。
【００１８】
好ましくは前記血液、血漿又は血清のエクスビボの処理には、ＭＩＣ−１に特異的に結合する抗体（すなわち抗ＭＩＣ−１抗体若しくはその断片）又はその機能的断片（例えばＦａｂ断片若しくは組換えｓｃＦｖ断片（Pluckthun A, Antibody engineering: advances from the use of Escherichia coli expression systems. Bio/Technology 1991 9:545-551））の使用を伴う。本発明による抗ＭＩＣ−１抗体又はその断片（及びＭＩＣ−１受容体若しくはその断片等の、ＭＩＣ−１に結合する他の分子）の使用は好ましくは、前記ＭＩＣ−１結合分子を適切な基質の表面に備えることを含み、かかる基質を血液、血漿又は血清と容易に接触させてＭＩＣ−１を「捕捉」させる（すなわち前記ＭＩＣ−１結合分子を介してＭＩＣ−１を基質に結合させる）ことができ、これにより、処理した血液、血漿、又は血清由来のＭＩＣ−１を除去することができる。この場合、前記基質としては、不活性ビーズ（例えばポリスチレンビーズ若しくはアガロースビーズ）、繊維、膜（例えばポリアクリロニトリル膜若しくはポリスルホン膜等の高流速型膜（high flux membrane））、又はその他の表面が挙げられる。前記ＭＩＣ−１結合分子は好ましくは、共有結合により前記基質の表面に結合される。しかしその他の結合形態（例えば静電結合）も適している。ＭＩＣ−１結合分子を前記基質の表面に結合させる通常の方法は、当業者に周知である。
【００１９】
好適な実施形態において本発明は、以下のステップを含む悪液質の治療方法又は予防方法である。
（ｉ）ＭＩＣ−１を結合させる適切な基質（例えばＭＩＣ−１結合分子を備えた基質）を用意するステップ、
（ii）対象から除去した血液、血漿、又は血清と前記基質とをエクスビボで接触させて、かかる血液、血漿、又は血清中に存在するＭＩＣ−１を前記基質に結合させることにより、前記血液、血漿又は血清を処理するステップ、
（iii）前記処理した血液、血漿又は血清を基質から分離するステップ、及びその後、
（iv）前記処理した血液、血清又は血漿を前記対象に戻すステップ（例えば注入による）。
【００２０】
好適な実施形態において本方法は、血液、血漿若しくは血清の体外処理のための、任意の１又複数の通常の方法（例えば血液透析法、血液フェレーシス法、アフェレーシス法、及び血漿フェレーシス法）の使用又は改変を含むことがある。したがって例えば、対象が慢性腎疾患患者で血液透析（例えば、持続的動静脈血液ろ過法（ＣＡＶＨ）、持続的静脈−静脈血液濾過法（ＣＶＶＨ）、又は緩徐持続的限外濾過法（ＳＣＵＦ）を使用）が必要な場合、かかる血液透析法が、前記本方法の好適な実施形態を含むように適宜改変することができる（すなわち対象に血液を戻す前にさらに前記基質と接触させて、かかる基質にＭＩＣ−１を結合させることにより、血液中に存在するＭＩＣ−１を除去する）。
【００２１】
本発明の方法は、他の悪液質治療法又は例えば経腸栄養法及び非経口的栄養法等の予防的治療法と組み合わせて、悪液質の治療又は予防に用いることができる。非経口的栄養法は適宜、血液、血漿又は血清に対する適切な栄養物質とエクスビボで混合して、本方法によるＭＩＣ−１の除去若しくは不活性化の前、最中、又は後に前記対象に投与することができる。
【００２２】
第２の態様において本発明は、対象中に存在するＭＩＣ−１の量（特に血清ＭＩＣ−１レベル）を判定するステップを含む、対象の悪液質の診断方法又は予知方法を提供する。
【００２３】
前記第２の態様による方法は、例えば、体重減少の観察及び／又は測定、悪液質マーカー（例えば血液、血漿若しくは血清における、悪液質に関連するＩＬ−６又はグレリンのレベル）の検出を含む、他の悪液質アッセイと組み合わせて用いることができる。
【００２４】
前記方法は好ましくは、悪液質に関連するＭＩＣ−１レベルの上昇を対象が示しているかどうか（例えば、血清レベル３．７〜５０ｎｇ／ｍｌ以上、又は少なくとも血清ＭＩＣ−１レベルが常に、通常範囲の血清ＭＩＣ−１レベル０．２〜１．２ｎｇ／ｍｌの上限にあること）、判定することを含む。かかる判定は、ＭＩＣ−１用アッセイ（例えばＭＩＣ−１ ＥＬＩＳＡ（非特許文献３））を用いて実施することができる。また、前記ＭＩＣ−１レベルの上昇の判定により、特定の患者の悪液質が、本発明の第１の態様の方法を用いることにより治療可能／予防可能であるか、又は例えば本出願人による同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ２００５／０００５２５（ＷＯ２００５／０９９７４６）に記載された薬剤及び方法によるＭＩＣ−１阻害剤を対象に投与することにより治療可能／予防可能であるかが示される。好適なＭＩＣ−１阻害剤は、上記ＭＩＣ−１結合分子を含む。
【００２５】
本発明の性質のより明確な理解のために、以下の非限定的な実施例を参照して本発明の好適な形態を記載する。
［実施例］
【実施例１】
【００２６】
血清ＭＩＣ−１レベルの調節
ＭＩＣ−１は他のＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質のメンバーと同様、Ｎ末端プロペプチド及びＣ末端成熟ＭＩＣ−１ドメインを含む前駆体として合成される。かかる前駆体は、小胞体（ＥＲ）においてジスルフィド結合を介して二量化される。二量化されるとＥＲを出てゴルジ体に向かい、かかるゴルジ体において、保存ＲＸＸＲ部位（アミノ酸１９６）（配列番号１）でフリン様転換酵素により切断される。この切断により前記プロペプチドが、成熟Ｃ末端ドメインから除去され、したがってＭＩＣ−１が、成熟した、アミノ酸数１１２のポリペプチドであって、ジスルフィド結合を介した２４．５ｋＤの二量体（非特許文献１）として放出される（図１）。
【００２７】
かなりの量のＭＩＣ−１が通常、プロセシングされていない形態で分泌されることが見い出されている。例えば、プロセシングされていない内因性プロＭＩＣ−１は、トロホブラスト細胞株ＢｅＷｏ（非特許文献３）、前立腺がん細胞株ＬｎＣＡＰ及びＰＣ３、膵臓細胞株Ｐａｎｃ１及び単球様細胞株Ｕ９３７をはじめとする各種の細胞から分泌されることが見い出されている。前立腺腺がん株ＬｎＣＡＰでは、プロセシングされていないプロＭＩＣ−１は細胞外マトリクス（ＥＣＭ）に結合しているが、成熟ＭＩＣ−１は馴化培地に見い出される（locate to）（Bauskin AR et al., The propeptide mediates formation of stromal stores of PROMIC-1: role in determining prostate cancer outcome. Cancer Res 2005 65(6):2330-2336）ことがわかっている。形質転換されたメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を用いた、いくつかの準備研究では、ＥＣＭとの結合は、プロペプチドのＣ末端領域アミノ酸１４４〜１９５の位置によっても仲介されることが示された。さらに、精製された組換えプロペプチド及びプロＭＩＣ−１の両方が、前記プロペプチドの同じＣ末端領域を介して、ヘパリンと相互作用する。
【００２８】
前記プロＭＩＣ−１とＥＣＭとの結合は、かかるＥＣＭ結合により潜在的ＭＩＣ−１が局所的に保存（local storage）できる可能性があること、及びかかる貯蔵されたプロＭＩＣ−１のプロセシングが、成熟ＭＩＣ−１（成熟ＭＩＣ−１はＥＣＭに対する親和性がほとんどない）の血流中への急速な放出を招くことを示唆している。この概念について試験するため、ヌードマウスの腫瘍異種移植モデル（Brown DA et al., An antibody based approach to high volume genotyping for MIC-1 polymorphism. Biotechniques 2002 33(1):118-120, 122, 124 passim）を作製した。
【００２９】
（材料及び方法）
ＤＵ１４５ヒト前立腺がん株（Liu T et al., MIC-1 reduces cell adhesion and induces apoptosis in prostate cancer cells. Cancer Res 2003 63:5034-5040）は内因性ＭＩＣ−１を生じない（主な理由としては、機能的ｐ５３を産生しないため）ので、各種のヒトＭＩＣ−１構築物を発現させるためのビヒクルとして有用であり、これを用いて永久的に形質転換された、サブクローンＤＵ１４５細胞株を調製した。形質導入には、以下のいずれかをコードする配列を含む真核細胞発現ベクター（IRES II EGFPベクター、Clontech Laboratories, Inc、米国、カルフォルニア州、マウンテンビュー）を用いた。
（ｉ）完全長ヒトプロＭＩＣ−１（但し天然のリーダーペプチドではなく、ＦＳＨリーダーペプチドを使用）（非特許文献１）、
（ii）成熟ヒトＭＩＣ−１（プロペプチドを有さないが、ＦＳＨリーダーを有する）、
（iii）フリン様プロ転換酵素部位（太字で示す）を含むアミノ酸配列RGRRRAR（配列番号２）を欠失したヒトプロＭＩＣ−１（ＦＳＨリーダーを有する）。これにより、プロペプチドから成熟ＭＩＣ−１へのプロセシング及びその後の放出が妨げられる、並びに
（iv）ベクターのみの負の対照（非特許文献４）。
【００３０】
ＥＧＦＰの発現に基づき、高発現サブクローンを選択した。これらの細胞を、免疫不全ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕヌードマウスの側腹に皮下注射した。マウスを定期的に観察し、２〜３日ごとに前記マウスの体重を測定した。注射の約２ヶ月後か、又は腫瘍の直径が１．１ｃｍに達したときにマウスを殺処理した。殺処理の直前、これらのマウスから血清を得、ＥＬＩＳＡによりヒトＭＩＣ−１レベルを評価した（非特許文献３、Brown DA et al., An antibody based approach to high volume genotyping for MIC-1 polymorphism. Biotechniques 2002 33(1):118-120, 122, 124 passim、Koopmann J et al., Serum macrophage inhibitory cytokine 1 as a marker of pancreatic and other periampullary cancers. Clin Cancer Res 2004 10(7):2386-2392）。ヒトＭＩＣ−１用のこのＥＬＩＳＡは、マウスＭＩＣ−１と交差反応を起こさず、これまでも、マウスにおけるヒト腫瘍ＭＩＣ−１レベルのみを、良好に測定するために用いられてきた（Brown DA et al., An antibody based approach to high volume genotyping for MIC-1 polymorphism. Biotechniques 2002 33(1):118-120, 122, 124 passim）。
【００３１】
（結果）
結果を図２及び３に示す。成熟ＭＩＣ−１を発現する腫瘍マウスでは、血清ＭＩＣ−１レベルが著しく上昇していた。一方、ＭＩＣ−１変異体FURIN DELを発現する腫瘍マウスは、正常にプロセシングを行うことができないためプロペプチドを有しており、血清ＭＩＣ−１レベルは著しく低かった。インビトロ及びインビボのデータから推定すると、この結果は、FURIN DEL変異体がＥＣＭと強固に結合しているためとみられる。
【００３２】
（考察）
この実施例で得られた結果により、組織と血液との間のＭＩＣ−１分布（distribution）の調節に、ＭＩＣ−１プロペプチドが重要であることが示された。したがって、ＭＩＣ−１プロペプチドに結合する任意の物質（例えばヘパリン及びヘパラン硫酸）又は、かかるプロペプチド上のマトリクス結合部位に対抗する（compete with）任意の物質（例えば組換え精製プロペプチド自体）は、血流中のＭＩＣ−１レベルを上昇させると予測される。その結果、血清ＭＩＣ−１によって仲介される機能が調節される。
【実施例２】
【００３３】
ＭＩＣ−１による食欲の調節
実施例１に記載した実験の過程で、異種移植マウスモデルのうち、ＭＩＣ−１を過剰発現する腫瘍を有するマウスは、体重が減少したか、又は対照マウスほどには体重が増加しなかった。したがって観察された、マウスの体重に対する影響の程度及び理由を判定するため、検討を行った。
【００３４】
（材料及び方法）
殺処分の直前にマウスの体重を計量し、測定した血清ＭＩＣ−１レベル（例えば実施例１に記載のＥＬＩＳＡによって測定）に対し、体重／体重減少％を比較した。
【００３５】
観察された体重減少について、血清ＭＩＣ−１レベルが原因であるかどうかを評価するために、第２の検討を行った。この検討においては、（最も高い血清ＭＩＣ−１レベルと関連性があるとされている）成熟ヒトＭＩＣ−１を過剰発現するＤＵ１４５クローンをヌードマウスに皮下注射した。マウスの体重が相当減少した後、２７日目に、対照として精製ヒツジＩｇＧ若しくは、組換えヒトＭＩＣ−１で免疫し、ヒトＭＩＣ−１に対して高力価の抗体を有するヒツジの血清から精製したＩｇＧ １ｍｇ又は１０ｍｇを腹腔内注射した。このヒツジ抗ヒトＭＩＣ−１ ＩｇＧは、ヒトＭＩＣ−１と高い親和性で反応し、既にＭＩＣ−１ ＥＬＩＳＡに使用されているものである。
【００３６】
観察された体重減少が、腫瘍由来の別の産物ではなく、ＭＩＣ−１によって仲介されたことをさらに実証するため、マクロファージ特異的なｃ−ｆｍｓプロモーターの制御下にマウスＭＩＣ−１を過剰発現する２つのトランスジェニックマウス系統（ｍｉｎ ２８及びｍｉｎ ７５、共にＣ５７Ｂｌ６マウスで作製）について、体重減少の評価を行った。
【００３７】
（結果）
ヒツジ抗ヒトＭＩＣ−１ ＩｇＧを用いて実施した検討において、ヒツジ抗ヒトＭＩＣ−１ ＩｇＧは、１ｍｇではマウスの体重に何ら差異をもたらさなかった（データは示さず）が、抗ＭＩＣ−１ ＩｇＧ １０ｍｇ（図４Ａを参照）では、腫瘍を有する各ヌードマウスにおいて急速な体重増加を誘導した（図４Ｂに示す１０ｍｇの対照ＩｇＧでの結果と比較）ことがわかった。この体重増加は抗体の投与の５〜６日後にピークに達し、その後７〜１０日間にわたって、マウスの体重が徐々に減少し始めた。
【００３８】
トランスジェニックマウス系統ｍｉｎ ２８及びｍｉｎ ７５の体重減少の評価結果を図５〜７に示す。これらの結果により、これらのマウスが、その野生型のコンジェニック同腹子より大幅に小型であることも示された。これらのマウスの出生時体重は同等であり、体重の差異は最初の数週齢を過ぎた後に現れ始めた。
【００３９】
（考察）
観察された体重減少は、一部のマウスでは非常に急速であり、これが血清における腫瘍由来ヒトＭＩＣ−１レベルと関連していることが見い出された。成熟ヒトＭＩＣ−１を過剰発現しているＤＵ１４５クローンを形質導入したマウスは、血清ＭＩＣ−１レベルが圧倒的に高く、これらのマウスの体重減少は急速であった。動物行動の観察により、体重減少の主な原因は、これらのマウスによる食物摂取の急速な減少にあることが示された。ヒツジ抗ＭＩＣ−１ ＩｇＧの投与によって、体重減少を反転させられる（対照ＩｇＧではできない）という新たな知見により、この体重減少がＭＩＣ−１によるものであることが実証された。このことは、前記トランスジェニックマウス系統ｍｉｎ ２８及びｍｉｎ ７５を用いた体重減少の評価によって裏付けられた。これらのマウスでは、ＭＩＣ−１発現がマクロファージ特異的であるにもかかわらず、血清ＭＩＣ−１レベルが著しく上昇しており、野生型のコンジェニックマウスと比較して、体重の有意差が観察された。この体重減少効果は出生後に起きたものである。なぜなら前記トランスジェニックマウス系統及びそれらのコンジェニックな野生型同腹子はいずれも、出生時体重（すなわち、出生の２４時間後に測定された体重）が同じであったからである。
【実施例３】
【００４０】
ＭＩＣ−１を分泌する腫瘍が関与する体重減少は、抗ＭＩＣ−１モノクローナル抗体の投与によって反転する
（結果及び考察）
成熟ＭＩＣ−１を過剰発現するように遺伝子操作したいずれかの（either）ＤＵ１４５細胞をヌードマウスの側腹に注射し、異種移植マウスモデルを（上述のように）確立した。ＭＩＣ−１を過剰発現するＤＵ１４５細胞を注射したマウスの体重は、急速に減少し始めた。１１日目に０．１〜１ｍｇの量でＭＩＣ−１に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ２６）を注射で単回投与したところ、体重が増加した。ＭＡｂ２６の量を増加させると、体重増加の程度及び期間が増大した（図８Ａ〜Ｃ）。最も高い用量は約１ｍｇであったが、マウスの体重は異種移植前のレベルにまで上昇し、最初に抗体を投与したときと同じ体重にまで再び減少するのに約１７日かかった。ＭＡｂ２６は、腫瘍の増殖には影響しなかった（図８Ｄ〜Ｆ）。また、未処理のマウス（図８Ｇ）、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のみで処理したマウス（図８Ｈ）では、実験期間中、急速かつ継続的に体重が減少した。
【実施例４】
【００４１】
異種移植マウスモデルの食物摂取への影響
（材料及び方法）
成熟ＭＩＣ−１を過剰発現するように、又は対照プラスミドを有するように遺伝子操作した、いずれかのＤＵ１４５細胞をヌードマウスの側腹に注射し、異種移植モデルを（上述のように）確立した。ＭＩＣ−１を過剰発現するＤＵ１４５細胞の注射後８日目の腫瘍体積の平均は５６ｍｍ３、体重減少の平均は７％であり、食物摂取を２４時間ごとに３回連続測定した。マウスは、１ケージ当たり５匹のグループで飼育した。時間ゼロの時点の、ホッパに配置した食物の重量及び同腹子の体重を測定した。２４時間後、ホッパに配置した食物から残余及びこぼれた量を差し引くことにより、消費された食物を推定した。同一の方法により、対照マウスの食物摂取を、腫瘍注射後２１日目に腫瘍体積の平均が７０ｍｍ３に達したときに測定した。
【００４２】
（結果）
ＭＩＣ−１を過剰発現するＤＵ１４５を注射したマウスの食物摂取は、１、２、及び３日目に、対照マウスより有意に少なかった（約３０％）（ｐ＝０．０１、０．０００１、及び０．０２）（図９）。これらのマウスの脂肪量を直接測定したところ、精巣上体部、鼠径部、及び後腹膜部の脂肪量の著しい減少にＭＩＣ−１の過剰発現が関連していたことが示された。２種の代表的な筋肉の量（mass）は減少しなかった（図１０）。
【実施例５】
【００４３】
異種移植マウスモデルにおける血清代謝マーカーの測定
（材料及び方法）
ＭＩＣ−１を過剰発現するように遺伝子操作したＤＵ１４５細胞又は対照ＤＵ１４５細胞のいずれかをヌードマウスの側腹に注射し、異種移植モデルを（上述のように）確立した。ＭＩＣ−１を過剰発現するＤＵ１４５腫瘍細胞の注射後１１〜１６日目、及び対照腫瘍の注射後２１〜３０日目、腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３に達したか、及び／又はマウスの体重が約１８％減少したときに、マウスを殺処理した。先の実験から、血清における腫瘍由来ヒトＭＩＣ−１レベルが１５〜５８ｎｇ／ｍｌであることがわかっていた。心臓穿刺によって血清を採取し、市販のイムノアッセイを用いて代謝マーカーについてアッセイした。スチューデントＴ検定を用いて統計的比較を実施した。
【００４４】
（結果及び考察）
マウスにおける様々な代謝マーカーの測定により、ＭＩＣ−１を過剰発現する腫瘍マウスにおいて、トリグリセリド及び遊離脂肪酸並びにグルカゴン及びＩＧＦ−１の有意な低下が、統計的に示された（データは示さず）。脂肪量の低下に合致した、レプチンレベルの低下も見られた。これは、ＭＩＣ−１により減少した食物摂取が、ＭＩＣ−１によるレプチンの刺激に仲介されたものである可能性が極めて低いことを示すものである。グルコースに関する差異はｐ＝０．０５３であり、統計的有意性にわずかに及ばなかった。これらの知見の大部分は、飢餓状態及び脂肪量の減少に合致する。
【実施例６】
【００４５】
異種移植マウスモデルにおける脂肪体及び筋肉重量（muscle weight）の測定
（材料及び方法）
ＭＩＣ−１を過剰発現するように遺伝子操作したＤＵ１４５細胞を２０匹のマウスの側腹に、対照プラスミドで形質導入したＤＵ１４５細胞を２０匹のマウスに注射し、ヌードマウスで異種移植モデルを（上述のように）確立した。ＭＩＣ−１を過剰発現するＤＵ１４５腫瘍細胞の注射後１１〜１６日目及び対照腫瘍の注射後２１〜３０日目に、腫瘍体積が１００〜２００ｍｍ３に達したか、及び／又はマウスの体重が約１８％減少したときに、前記マウスを殺処理した。肩甲骨間褐色脂肪組織脂肪、鼠径部脂肪、精巣上体脂肪、及び後腹膜脂肪、並びに脛骨筋及び腓腹筋を慎重に切断し、摘出して重量を測定し、かかる重量の体重補正値を求めた。
【００４６】
（結果及び考察）
褐色脂肪は減少しなかったが、鼠径部脂肪、精巣上体脂肪、及び後腹膜脂肪における体脂肪（すなわち、白色脂肪）の重量は顕著に減少した（図１０）。これらの２つのマウスのグループ間では、筋肉重量の有意差がなかった（図１０）。しかし、PIXImus撮像装置（GE Lunar社製）を使用した、より高感度の総除脂肪体重分析を用いたところ、除脂肪体重の全体的な減少があったことが示された。また、総脂肪量及び腹部脂肪量の減少が、はるかに大きいことも確認された。
【実施例７】
【００４７】
ＭＩＣ−１トランスジェニックマウス
（結果及び考察）
ｃ−ｆｍｓプロモーターの制御下に、単球様細胞からＭＩＣ−１を過剰発現するように遺伝子操作したトランスジェニックマウスを作製した。これらのマウスは全身的にＭＩＣ−１レベルが高かったが、外見は健康で正常に繁殖した。これらのマウスは野生型マウスと区別できなかったが、３週齢頃から発育遅延が顕著になり、成体期になるまで続いた（図５〜７）。この効果は、ｍｉｎ７５及びｍｉｎ２８の２つの独立したトランスジェニック系統で観察された。
【００４８】
腫瘍異種移植マウスと同様に、ＭＩＣ−１を過剰発現するトランスジェニックマウスの食物摂取は、それらに対応する野生型マウスより有意に少なかった。しかし、食物摂取をマウスの体重に関して補正するとこの差異は消失した（図１１）。出生時からＭＩＣ−１レベルが高ければ、食物摂取が少なく、その結果体格が小さくなり、かかる体格が、少ない食物摂取に対して適切である平衡に達すると考えられる。前記トランスジェニック動物で、腫瘍異種移植マウスと同じ代謝マーカー類の測定を行ったところ、ＩＧＦ−１レベルでのみ有意差があった。これらの値はＭＩＣ−１トランスジェニックマウスでは低かった。
【００４９】
前記過剰発現トランスジェニックマウスで脂肪量を測定したところ、鼠径部、精巣上体／子宮、及び後腹膜の部分で脂肪量が低く、かかる低下は、雄マウスと比較して雌の方が顕著であった（図１２）。脾臓が小さいこと及び胸腺が大きいことに加え、分析した３種類の脂肪体すべてが小型であった。絶対的には（in absolute terms）、ＷＴ対ＴＧで胸腺の重量に差がなかった。
【実施例８】
【００５０】
フェチュインによる血清ＭＩＣ−１レベルの制御
血清ＭＩＣ−１の全対象中の平均濃度が４５０ｐｇ／ｍｌであることは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する他のサイトカインの一部と同様に、ＭＩＣ−１が１種又は複数種の血中調節因子（circulating modulator）に結合する可能性があることを示唆している。糖タンパク質であるフェチュインは、細胞及び組織で広く発現し、血清中に存在する。ＭＩＣ−１がこの糖タンパク質と相互作用するかどうかを判定するために以下の検討を行った。
【００５１】
（材料及び方法）
精製された組換え成熟ＭＩＣ−１（０．１％ＢＳＡ中）を、フェチュインでコーティングしたアガロースビーズと共にインキュベートした。その後ビーズを洗浄し、結合した物質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、その後の抗ＭＩＣ−１抗体を用いたウェスタンブロット法とによって分析した。レーン１は、精製組換えＭＩＣ−１、レーン２は、フェチュインビーズに結合したＭＩＣ−１、レーン３は、フェチュインビーズのみ、レーン４は、アガロースビーズのみとインキュベートしたＭＩＣ−１であった。
【００５２】
（結果及び考察）
結果を図１３に示す。図１３は、成熟ＭＩＣ−１がフェチュインと相互作用し、フェチュインに結合することを明確に示している。したがってフェチュインは、体重制御の調節を目的とした、患者の血液からＭＩＣ−１を除去するための抗ＭＩＣ−１抗体の使用に替わる選択肢を提供する。
【実施例９】
【００５３】
正常マウスの脳におけるＭＩＣ−１発現の分析
（結果及び考察）
食物摂取及び食欲は、様々な複雑な機構によって制御されており、かかる機構の多くは中枢神経系の内部に存在する。食欲や体温等の、基本的な身体機能の多くを制御する神経系内の部分は、視床下部領域中に局在する。食欲の場合、このプロセスを調節する複雑な因子の多くは、視床下部の弓状核に局在し、神経ペプチドＹ等の伝達物質及び伝達物質の受容体の多くがこの領域に局在する。また、この領域の血液脳関門は漏入が起きやすく（leaky）、全身性分子（systemic molecule）が血液脳関門を通過して、脳に直接作用する状況が存在する、非常に限られた脳領域の１つである。この機構によってＭＩＣ−１は、弓状核及び視床下部に直接的に作用を及ぼすことができると考えられている。しかしＭＩＣ−１は、正常マウスの脳でもこの領域内部に発現する（図１４）。これは、ＭＩＣ−１ のｍＲＮＡとＭＩＣ−１ タンパク質とが、弓状核領域、脳室周囲領域、及び視床下部傍脳室領域に共局在することを実証するインサイチュ（in situ）ハイブリダイゼーションによる検討で示した通り、血流中ＭＩＣ−１の拡散を示すものではない。正常な脳のこれらの領域においてＭＩＣ−１の局在がみられ、それが食欲の制御等の機能と強く関連しているということは、抹消循環由来ＭＩＣ−１と、脳内で内因的に産生されるＭＩＣ−１との両方が、この重要な機能を制御する役割を果たしているとの強力な論拠を提供する。
【実施例１０】
【００５４】
血清ＭＩＣ−１レベルは、進行した前立腺がん患者の体重減少の程度と相関性がある
（結果及び考察）
ＭＩＣ−１とヒトの悪液質との関連性を判定するため、進行した前立腺がん（ＰＣａ）患者の特徴を十分に有するコホート（cohort）に採用された患者の血清ＭＩＣ−１レベルを測定した。かかるコホートにおいて、悪液質は血清ＩＬ−６レベルと関連づけられていた（Pfitzenmaier, J et al., Elevation of cytokine levels in cachectic patients with prostate carcinoma. Cancer 2003 97:1211-1216）。悪液質を有する進行がん患者では、悪液質のない進行がん患者と比較して、血清ＭＩＣ−１レベルが有意に上昇していた（１２４１６±１０２３５ｐｇ／ｍｌ対３２６５±６３７０ｐｇ／ｍｌ（平均±ＳＤ）、ｐ＜０．０００１、マン・ホイットニーＵ検定）。悪液質患者では、血清ＩＬ−６が同様に上昇していた（３３．８±６４．２ｐｇ／ｍｌ対７．８±３．４ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００２、マン・ホイットニーＵ検定）。また血清ＭＩＣ−１はわずかではあるが、有意かつ確実に、血清ＩＬ−６レベルと相関していた（ｒ＝０．２９４９、ｐ、０．０４、線形回帰）。さらに、ロジスティックな単回帰及び多変量回帰では、血清ＭＩＣ−１レベル及び血清ＩＬ−６レベルの両方が、がん悪液質の存在に関する独立予測因子（independent predictors）であった（各々ｐ＝０．０００２、ｐ＜０．０００１、単変量ロジスティク回帰、各々ｐ＝０．００１７、ｐ＝０．０００５、多変量ロジスティック回帰）。しかし、悪液質に関する最も優れた客観的かつ定量化可能な尺度は体重減少である。血清ＭＩＣ−１レベルは、前立腺がんに関係する体重減少の程度と、有意な関連性があった（ｐ＝０．０００２、ｒ＝０．４８９９、線形回帰）が、ＩＬ−６についてはそのような関連性はなかった（ｐ＝０．６３０３、線形回帰）。
【実施例１１】
【００５５】
血清ＭＩＣ−１レベルは、慢性腎不全患者のＢＭＩと関連性がある
（結果及び考察）
進行がんと同様に、慢性腎不全は一般的に、体重減少及び悪液質を伴う。このプロセスのマーカー、例えば食欲不振、体重減少及びＢＭＩ等の、このプロセスのマーカーは、腎不全末期における有力な予後予測因子（predictor of mortality）である（Kovesdy, CP et al., Inverse association between lipid levels and mortality in men with chronic kidney disease who are not yet on dialysis: effects of case mix and the malnutrition-inflammation-cachexia syndrome. J Am Soc Nephrol 2007 18:304-311）。ＢＭＩは有力な予後予測因子であり、血清ＭＩＣ−１レベルの上昇は、動物における同様の変化と関連性があったため、末期腎不全患者の血清ＭＩＣ−１レベルとＢＭＩとの関連性を調べた。方法としては、悪液質又は他の代謝プロセスについて検討するために集められたのではない末期腎不全患者３８１名のコホートから得た血清試料を検査した（Apple, FS et al., Predictive value of cardiac troponin I and T for subsequent death in end-stage renal disease. Circulation 2002 106:2941-2945）。
【００５６】
検討期間中（最長３年）に死亡した患者のＢＭＩは、著しく低かった（２６．１７±５．６３、２６６（平均±ＳＤ；ｎ）、２３．１５±４．９２、１０４：ｐ＜０．０００１、対応のないｔ検定（unpaired t-test））。検討の開始時に透析前の血清試料を得て、血清ＭＩＣ−１レベルを判定した。血清ＭＩＣ−１レベルは、ＢＭＩと相関しており、血清ＭＩＣ−１レベルの上昇はＢＭＩの低下と関連性があった（ｐ＝０．０００３、ｒ＝０．１８９、線形回帰）。
【００５７】
本明細書全体にわたり、「含む」なる用語、又は「含んでいる」若しくは「含むこと」等の変形は、記述された要素、整数、若しくはステップ、又は要素群、整数群、若しくはステップ群の包含を意味するものであり、他の任意の要素、整数、若しくはステップ、又は要素群、整数群、若しくはステップ群の除外を意味するものではないことが理解される。
【００５８】
本明細書中で言及した全ての刊行物は、参照により本明細書に援用される。本明細書に含まれる文書、行為、材料、装置、又は物品等に関する考察は、いずれも本発明の状況（context）を提供することのみを目的としている。これらの事項の一部又は全部が、本出願の各々の請求項の優先日以前に豪州若しくは他国に存在していたとして、先行技術の裏づけの一部を形成するか、又は本発明に関連する分野における技術常識であったと認めるものと理解されるべきでない。
【００５９】
広い範囲で記載された本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、前記具体的な実施形態に示した本発明に対し、多数の変更及び／又は改変を加えることが可能であることを、当業者であれば理解する。したがって本明細書中の実施形態は、あらゆる点で例示的であり、限定的ではない。
【００６０】
［参考文献］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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