(57)【要約】  式Ｉ 2011530497.tif 000031（式中、ｎ、Ｒ１およびＲ２の意味は明細書中に示した通り）のニコチン由来ハプテンまたはその塩もしくは溶媒和物の調製方法。ニコチン由来ハプテンは禁煙ワクチンの一部を形成する。
2011530497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉのニコチン由来ハプテンまたはその塩もしくは溶媒和物の調製方法であって、
【化２２】
2011530497.tif 000024
（式中、ｎは０〜５の整数であり、Ｒ１およびＲ２は一緒になって、１〜４個の環窒素原子と必要に応じて酸素および硫黄からなる群より選択される１〜４個の他のヘテロ原子とを含有するＮ−結合５〜１０員ヘテロ環基を形成し、ここで当該ヘテロ環基は、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、アミノカルボニル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシまたはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルで１、２、３または４箇所置換されていてもよい）、以下の工程を含む、前記方法：
（ａ）下記式ＩＩの化合物またはその塩もしくは溶媒和物を
【化２３】
2011530497.tif 000025
（式中、ｎは０〜５の整数である）
下記式ＩＩＩの化合物またはその塩
【化２４】
2011530497.tif 000026
（式中、Ｒ１およびＲ２は一緒になって、１〜４個の環窒素原子と必要に応じて酸素および硫黄からなる群より選択される１〜４個の他のヘテロ原子とを含有するＮ−結合５〜１０員ヘテロ環基を形成し、ここで当該ヘテロ環基は、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、アミノカルボニル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシまたはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルで１、２、３または４箇所置換されていてもよい）
および、ポリマー担持カップリング剤と反応させ、
（ｂ）工程（ａ）の生成物を濾過して、式Ｉの化合物を遊離体、塩または溶媒和物の形態で得る（式中、ｎは０〜５の整数であり、Ｒ１およびＲ２は一緒になって、１〜４個の環窒素原子と必要に応じて酸素および硫黄からなる群より選択される１〜４個の他のヘテロ原子とを含有するＮ−結合５〜１０員ヘテロ環基を形成し、ここで当該ヘテロ環基は、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、アミノカルボニル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシまたはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルで１、２、３または４箇所置換されていてもよい）。
【請求項２】
上記式ＩＩの化合物のｎが１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記式ＩＩＩの化合物のＲ１およびＲ２が一緒になって、１または２個の環窒素原子と必要に応じて酸素および硫黄からなる群より選択される１または２個の他のヘテロ原子とを含有するＮ−結合５〜６員ヘテロ環基を形成し、ここで当該ヘテロ環基は、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、アミノカルボニル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシまたはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルで１または２箇所置換されていてもよい、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記式ＩＩＩの化合物のＲ１およびＲ２が一緒になって、２位および５位がオキソで置換されたピロリジン基を形成する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記ポリマー担持カップリング剤が下記式ＩＶの化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法：
【化２５】
2011530497.tif 000027
（式中、Ｗは表示のメチレン基に化学的に結合した固相支持体を表し、Ｒ３はＣ１−Ｃ５−アルキルまたはＣ３−Ｃ８−シクロアルキルである）。
【請求項６】
上記式ＩＶの化合物のＲ３がエチル、イソプロピルまたはシクロヘキシルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記工程（ａ）を４０℃〜６０℃の温度で行う、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
上記工程（ａ）を、２−ブタノンを溶剤としてその中で行う請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
式Ｉのニコチン由来ハプテンが下記式Ｉｂの化合物またはその塩もしくは溶媒和物である場合の請求項１に記載の調製方法であって、
【化２６】
2011530497.tif 000028
以下の工程を含む、前記方法：
（ａ）下記式ＩＩａの化合物またはその塩もしくは溶媒和物を
【化２７】
2011530497.tif 000029
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドまたはその塩、および、下記式ＩＶのポリマー担持カップリング剤
【化２８】
2011530497.tif 000030
（式中、Ｗは表示のメチレン基に化学的に結合した固相支持体を表し、Ｒ３はＣ１−Ｃ５−アルキルまたはＣ３−Ｃ８−シクロアルキルである）と反応させ、
（ｂ）工程（ｂ）
の生成物を濾過して、式Ｉｂの化合物を遊離体、塩または溶媒和物の形態で得る。
【請求項１０】
ニコチン由来ハプテン−担体コンジュゲートの調製方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によって得られる式Ｉのニコチン由来ハプテンを、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の１以上の外被タンパク質へ共有結合的にカップリングさせることを含む、前記方法。
【請求項１１】
上記ＶＬＰがＲＮＡファージの外被タンパク質を含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[1]  本発明は、禁煙ワクチンの有用な成分であるニコチン由来ハプテンの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[2]  タバコは世界中で最も広く利用されている嗜癖性薬物である。タバコの主な嗜癖性成分はニコチンであり、タバコの葉に由来するアルカロイドである。紙巻きタバコでの喫煙は、米国や他の多くの国において予防が可能な死因の第一位である。肺癌、冠動脈性心疾患、慢性肺疾患や卒中が喫煙によって引き起こされることを多くの喫煙者が承知している一方で、禁煙を試みた紙巻きタバコ喫煙者の大多数が失敗に終わっている。
【０００３】
[3]  ニコチン置換療法（例えば、ニコチンガムや経皮パッチの利用）や抗うつ薬治療（例えば、ブプロピオンの利用）といった様々な行動療法や薬物療法が、喫煙者の禁煙を助けるのに有効である。しかしながら、結果は明らかに様々である。これらの療法は、望ましくない副作用を引き起こしかねないものであり、また、喫煙者が禁煙の意思を持ち続けることに大きく依存している。
【０００４】
[4]  特許文献１には、禁煙のための治療用ワクチンが開示されている。ワクチンを投与すると、血液中のニコチンに結合するニコチン特異的抗体が高レベルで産生される。ニコチンと抗体との結合複合体は、血液脳関門を通過するには大き過ぎるため、ニコチンの脳への取り込みと、それに続く脳でのニコチン感知性ニューロンの刺激が有意に軽減または予防されると考えられる。このように、嗜癖を誘発し満足をもたらすニコチンの刺激を最小限に抑える。
【０００５】
[5]  特許文献１のワクチンは、大腸菌で産生されたphagusＱβ組換えウイルス様粒子の表面に化学的架橋を介して結合したニコチン由来ハプテンからなる。ニコチン由来ハプテンは既知のニコチン誘導体、即ち、１−（トランス−３’−ヒドロキシメチル−ニコチニル）−６−ヒドロキシ−スクシンイミジル−スクシネート（Ｃ１９Ｈ２３Ｎ３Ｏ６）である。このハプテンは、Langoneら（非特許文献１）に開示された手順に基づき、トランス−３’−ヒドロキシメチルニコチンと無水コハク酸とを反応させて、スクシニル化ヒドロキシメチル−ニコチンであるＯ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチンを生成することで合成する。次いで、この化合物を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）と混合して、Ｏ−スクシニル−３’−ヒドロキシメチル−ニコチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、即ち、前述の１−（トランス−３’−ヒドロキシメチル−ニコチニル）−６−ヒドロキシスクシンイミジル−スクシネートを得る。
【０００６】
[6]  特許文献１に開示の方法は、当該方法によって調製されるハプテンに毒性かつ突然変異誘発性のＥＤＣが残存量含まれる可能性があるため、工業生産には望ましくない。また、ハプテンは元来不安定な分子でもある。このため、ハプテンの取り扱いおよび調製を困難にしている。従って、これらの問題を回避するか、または、少なくとも最小限に抑えるハプテンの調製方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】US6,932,971
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Radioimunno-assay of nicotine, cotine and γ-(3-pyridyl)-γ-oxo-N-methylbutyramide, Methods Enzymol. 84, pages 628-640, Academic Press 1982
【発明の概要】
【０００９】
[7]  第一の態様では、本発明は、下記式Ｉのニコチン由来ハプテンまたはその塩もしくは溶媒和物の調製方法に関する：
【００１０】
【化１】
2011530497.tif 000003
【００１１】
[8]  （式中、ｎは０〜５の整数であり、Ｒ１およびＲ２は一緒になって、１〜４個の環窒素原子と必要に応じて酸素および硫黄からなる群より選択される１〜４個の他のヘテロ原子とを含有するＮ−結合５〜１０員ヘテロ環基を形成し、ここで当該ヘテロ環基は、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、アミノカルボニル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシまたはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルで１、２、３または４箇所置換されていてもよい）。当該方法は、以下の工程を含むものである：
[9]  （ａ）下記式ＩＩの化合物またはその塩もしくは溶媒和物を
【００１２】
【化２】
2011530497.tif 000004
（式中、ｎは０〜５の整数である）
[10]  下記式ＩＩＩの化合物またはその塩
【００１３】
【化３】
2011530497.tif 000005
【００１４】
[11]  （式中、Ｒ１およびＲ２は上記で定義した通り）
[12]  および、ポリマー担持カップリング剤と反応させ、
[13]  （ｂ）工程（ａ）の生成物を濾過して、式Ｉ（上記で定義した通り）の化合物を遊離体、塩または溶媒和物の形態で得る。
【００１５】
[14]  第二の態様では、本発明は、上述した式Ｉのニコチン由来ハプテンの調製方法によって得られる、または、得られた式Ｉ（上記で定義した通り）のニコチン由来ハプテンに関する。好ましくは、１Ｈ ＮＭＲ等で測定した際にハプテンが８０％、８５％または９０％を超える純度である組成物としてハプテンを提供する。
【００１６】
[15]  第三の態様では、本発明は、ハプテン−担体コンジュゲートの調製方法を提供する。当該方法は、本発明の第一の態様の方法で得られた、または、得られる式Ｉのニコチン由来ハプテンを、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の１以上の外被タンパク質へ共有結合的にカップリングさせることを含む。一実施態様では、ＶＬＰがＲＮＡファージの外被タンパク質、好ましくはファージＱβの外被タンパク質を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[16]  本明細書中で使用する用語は、以下の意味を有する。
【００１８】
[17]  本明細書中「置換されていてもよい」とは、以下に挙げる基のいずれか一つ、または、それらの任意の組み合わせによって１箇所以上置換可能な基を意味する。
【００１９】
[18]  本明細書中「ハロ」または「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素であってよい。ハロは、適切には（suitably）塩素である。
【００２０】
[19]  本明細書中「Ｃ１−Ｃ５−アルキル」とは、１〜５個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖アルキルを意味する。Ｃ１−Ｃ５−アルキルは、適切にはメチルまたはエチルである。
【００２１】
[20]  本明細書中「Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキル」とは、３〜８個の環炭素原子を有するシクロアルキルを意味し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルもしくはシクロオクチル等の単環基、または、ビシクロヘプチルもしくはビシクロオクチル等の二環基を意味する。Ｃ３−Ｃ８−シクロアルキルは、適切にはＣ５−Ｃ６−シクロアルキル、特にシクロヘキシルである。
【００２２】
[21]  本明細書中「１〜４個の環窒素原子と必要に応じて酸素および硫黄からなる群より選択される１〜４個の他のヘテロ原子とを含有するＮ−結合５〜１０員ヘテロ環基」とは、５、６、７、８、９または１０個の環原子を含むヘテロ環基であり、環原子のうちの一つが窒素であって、式Ｉの化合物のニコチニル部分に対して遠位のエステル基の酸素原子に結合しており、必要に応じて残りの環原子の１、２または３個が窒素原子であり、また、必要に応じて残りの環原子の１、２、３または４個が酸素および硫黄から選択可能である。Ｎ−結合５〜１０員ヘテロ環基は、例えば、飽和または不飽和の単環式または二環式ヘテロ環基であってよい。Ｎ−結合５〜１０員ヘテロ環基は、適切には、１〜４個の環窒素原子を含有するＮ−結合５または６員ヘテロ環基、特にＮ−結合ピロリジニルである。
【００２３】
[22]  本明細書中「ニコチン由来ハプテン（nicotine-based hapten）」とは、担体に直接または架橋基を介して結合可能なように誘導体化されているニコチンのことであり、エナンチオマー的に純粋なＳもしくはＲ体、または、これらの混合物のいずれであってもよい。
【００２４】
[23]  本明細書中「ワクチン」とは、担体に結合した本発明のニコチン由来ハプテンを含有する製剤であって、動物へ投与可能な形態の製剤のことである。典型的には、ワクチンには、従来慣用の生理食塩水または緩衝化水溶液媒体（例えば、アルミニウム塩溶液）にニコチン由来ハプテン−担体コンジュゲートを懸濁または溶解したものが含まれる。この形態であれば、病態の予防、改善あるいは治療にワクチンを簡便に利用できる。宿主に導入されると、ワクチンは免疫応答を誘発することができ、免疫応答としては、抗体および／またはサイトカインの産生、および／または、細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞（例えば、免疫グロブリン）、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞の活性化、および／または、その他の細胞応答が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
[24]  本明細書および特許請求の範囲を通して、文脈上他に必要としない限り、用語「含む」とは、記載した整数または工程（単数であっても複数であっても）を包含するが、その以外の整数または工程（単数であっても複数であっても）は排除しないものと理解されたい。
【００２６】
[25]  本発明は、禁煙ワクチンの有用な成分であるニコチン由来ハプテンの調製方法に関する。
【００２７】
[26]  ニコチン由来ハプテンを含有する禁煙ワクチンは、ＵＳ６，９３２，９７１（Cytos）、ＵＳ６，２３２，０８２（Nabi）およびＵＳ６，６５６，４６９（IPAB）に開示されており、ハプテンが化学的架橋を介して、大腸菌で産生されるphagusＱβ組換えウイルス様粒子、組換え緑膿菌エキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）および破傷風トキソイドにそれぞれ結合している。
【００２８】
[27]  ニコチンは以下の化学構造を有する。
【００２９】
【化４】
2011530497.tif 000006
【００３０】
[28]  ニコチンは、ヒトでは免疫学的応答を誘発しない。しかしながら、ニコチンを誘導体化して適切な担体に結合させたハプテンを形成することで、ヒトにおいてもニコチン特異的抗体を生成することが可能である。
【００３１】
[29]  本発明は、遊離体、塩または溶媒和物の形態である、下記式Ｉのニコチン由来ハプテンの調製方法に関する：
【００３２】
【化５】
2011530497.tif 000007
【００３３】
（式中、ｎは０〜５の整数であり、Ｒ１およびＲ２は一緒になって、１〜４個の環窒素原子と必要に応じて酸素および硫黄からなる群より選択される１〜４個の他のヘテロ原子とを含有するＮ−結合５〜１０員ヘテロ環基を形成し、ここで当該ヘテロ環基は、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、アミノカルボニル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシまたはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルで１、２、３または４箇所置換されていてもよい）。
【００３４】
[30]  以下に記載する本発明の適切な、好適な、より好適な、または、最も好適な態様は、別々に、一括して、または、任意の組み合わせで含まれていてもよい。
【００３５】
[31]  ｎは、適切には０〜５の整数、例えば０、１、２、３、４または５であり、特に１である。
【００３６】
[32]  Ｒ１およびＲ２は、適切には、一緒になって１または２個の環窒素原子と必要に応じて酸素および硫黄からなる群より選択される１または２個の他のヘテロ原子とを含有するＮ−結合５〜６員ヘテロ環基を形成し、ここで当該ヘテロ環基は、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、アミノカルボニル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４−アルキル、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシまたはＣ３−Ｃ６−シクロアルキルで１または２箇所置換されていてもよく、特にオキソで置換されていてもよい。例えば、Ｒ１およびＲ２は一緒になって２位および５位がオキソで置換されたピロリジン基、即ち、スクシンイミジルを形成する。
【００３７】
[33]  上述のＮ−結合５〜６員ヘテロ環基がＣ１−Ｃ４−アルキルで置換されている場合には、Ｃ１−Ｃ４−アルキルは適切にはメチルまたはエチルである。
【００３８】
[34]  上述のＮ−結合５〜６員ヘテロ環基がＣ１−Ｃ４−アルコキシで置換されている場合には、Ｃ１−Ｃ４−アルコキシは適切にはメトキシまたはエトキシである。
【００３９】
[35]  上述のＮ−結合５〜６員ヘテロ環基がＣ３−Ｃ６−シクロアルキルで置換されている場合には、Ｃ３−Ｃ６−シクロアルキルは適切にはペンチルまたはヘキシルである。
【００４０】
[36]  ハプテンには少なくとも一つの不斉炭素原子が含まれ、そのため、個々の異性体の形態、または、その混合物（例えば、ラセミ混合物やジアステレオマー混合物）として存在している。本発明には、各立体中心の個々の異性体の全て（例えば、ＳＳ、ＳＲ、ＲＳおよびＲＲ異性体）並びにその混合物（例えば、ラセミ混合物（例えば、２種類の異性体の５０：５０混合物や４種類全ての異性体の２５：２５：２５：２５混合物）またはジアステレオマー混合物）を調製することが包含される。
【００４１】
[37]  式Ｉのニコチン由来ハプテンは、適切には式Ｉａ
【００４２】
【化６】
2011530497.tif 000008
【００４３】
のニコチン由来ハプテンであって、遊離体、塩または溶媒和物の形態であり、トランスエナンチオマーのラセミ混合物である。
【００４４】
[38]  特に好ましい実施態様では、式Ｉのニコチン由来ハプテンは式Ｉｂ
【００４５】
【化７】
2011530497.tif 000009
【００４６】
のニコチン由来ハプテンであって、遊離体、塩または溶媒和物の形態であり、トランス−４−ニコチンメチレンモノ−スクシネートエステルスクシンイミジルエステル（トランスコハク酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル１−メチル−２−ピリジン−３−イル−ピロリジン−３−イルメチルエステル（Ｃ１９Ｈ２３Ｎ３Ｏ６）としても知られる）のラセミ体である。
【００４７】
[39]  式Ｉのニコチン由来ハプテンの調製方法には２つの工程（ａ）および（ｂ）が含まれ、標準的な反応器（好ましくは、ポリマー構造を損傷しないよう緩やかに攪拌しながら）と、標準的なユニットでの濾過とで行うことができる。
【００４８】
[40]  工程（ａ）では、式ＩＩ
【００４９】
【化８】
2011530497.tif 000010
【００５０】
[41]  （式中、ｎは０〜５の整数である）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を、式ＩＩＩ
【００５１】
【化９】
2011530497.tif 000011
【００５２】
[42]  （式中、Ｒ１およびＲ２は上記で定義した通り）の化合物またはその塩、
[43]  および、ポリマー担持カップリング剤と反応させる。
【００５３】
[44]  好ましい実施態様では、式ＩＩの化合物は下記式ＩＩａの化合物であり、遊離体、塩または溶媒和物の形態である。
【００５４】
【化１０】
2011530497.tif 000012
【００５５】
[45]  ポリマー担持カップリング剤は、適切には、アミド結合やエステルを形成する際の活性酸種を調製するためのポリマー担持型溶液相合成試薬である。
【００５６】
[46]  好ましい実施態様では、ポリマー担持カップリング剤は式ＩＶ
【００５７】
【化１１】
2011530497.tif 000013
【００５８】
（式中、Ｗは表示のメチレン基に化学的に結合した固相支持体を表し、Ｒ３はＣ１−Ｃ５−アルキルまたはＣ３−Ｃ８−シクロアルキルである）の化合物である。
【００５９】
[47]  Ｒ３がＣ１−Ｃ５−アルキルである場合、適切にはエチルまたはイソプロピルである。
【００６０】
[48]  Ｒ３がＣ３−Ｃ８−シクロアルキルである場合、適切にはシクロヘキシルである。
【００６１】
[49]  特に好ましい実施態様では、式ＩＶの化合物は、適切には、Varian IncからStratoSpheresTM PL-DCC resinとして市販されているシクロヘキシルカルボジイミド樹脂である。
【００６２】
[50]  ポリマー担持カップリング剤を用いることの利点は、毒性の副生物が高分子担体に結合したままであって、その結果、水性抽出や固形副生物（ジシクロヘキシル尿素）の除去の必要性を回避できるため、後処理の手順が大幅に簡略化されることである。未反応の酸またはアミン種はいずれも、適当なスカベンジャー樹脂を添加することで除去可能である。
【００６３】
[51]  式ＩＩおよびＩＩＩの化合物は、ポリマー担持カップリング剤と接触させる前に混合しておくのが好ましい。なお、式ＩＩＩの化合物と混合する前に式ＩＩの化合物をポリマー担持カップリング剤と混合すると、式Ｉのニコチン由来ハプテンの収率が低下し、さらには別の生成物が形成されるおそれがある。
【００６４】
[52]  当該反応は、カルボン酸をアミノ化合物およびポリマー担持カップリング剤（例えば、支持体に結合させたカルボジイミド誘導体）と反応させる既知の方法を用いて行うことができ、また同様に、例えば、実施例に後述する方法で行うことができる。反応は、簡便には有機溶剤、例えば、２−ブタノン（エチルメチルケトンまたはブタン−２−オンとしても知られる）を用いて行い、即ち、式ＩＩおよびＩＩＩの化合物を第一の容器中で溶剤に溶解し、ポリマー担持カップリング剤を第二の容器中で同じ溶剤で膨潤させる。第一および第二の容器の内容物を合わせることで、式ＩＩおよびＩＩＩの化合物がポリマー担持カップリング剤の中間体と反応する。適切な反応温度は２０℃〜７０℃、好ましくは４０℃〜６０℃であるが、特に約５０℃である。
【００６５】
[53]  反応の温度を上昇させると、ほぼ間違いなく反応速度が上昇するものの、副産物の量と数が増えてしまう傾向がある。温度が高いほど、スクシンイミジル基の求核開環と転位が起こりやすい。
【００６６】
[54]  工程（ｂ）では、工程（ａ）の生成物を濾過して式Ｉのニコチン由来ハプテンを溶液状態で得る。
【００６７】
[55]  濾過は、当該技術分野で公知の任意の手段で行うことができる。
【００６８】
[56]  最終生成物は、特にＵＳ６，９３２，９７１に記載の実験室規模の方法と比べて純度が高いものである。このことは、ハプテンをワクチンの臨床試験用に調製する場合に特に重要である。ニコチン由来ハプテンの精製は、加水分解による分解が起こりやすいため、困難であることが多い。ニコチンハプテンの純度は、１Ｈ ＮＭＲ等で測定した際に８０％、８５％または９０％を超えることが好ましい。
【００６９】
[57]  必要であれば、得られた固体を適切な有機溶剤（例えば、２−ブタノン）に溶解し、輸送や保存の際には適切には温度を下げて、即ち−１００℃〜２０℃、例えば約−８０℃とする。
【００７０】
[58]  式ＩＩの化合物は市販されており、また、式Ｖ
【００７１】
【化１２】
2011530497.tif 000014
【００７２】
[59]  の化合物を、式ＶＩ
【００７３】
【化１３】
2011530497.tif 000015
【００７４】
（式中、ｎは０〜５の整数である）の化合物と反応させることで調製することも可能である。当該反応は、ジヒドロ−フラン−２，５−ジオンまたは類似体をアルコールと反応させる既知の方法を用いて行うことができ、また同様に、例えば、実施例に後述する方法で行うことができる。
【００７５】
[60]  式ＩＩＩの化合物は、市販のものでも、または、ヒドロキシル化Ｎ−ヘテロ環式化合物を調製する既知の手順で取得してもよい。
【００７６】
[61]  式ＩＶの化合物は市販されている。
【００７７】
[62]  式Ｖの化合物は、式ＶＩＩ
【００７８】
【化１４】
2011530497.tif 000016
【００７９】
の化合物、即ち、１−メチル−５−オキソ−２−ピリジン−３−イル−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルを還元することで得られる。当該反応は、エステルを還元する既知の方法を用いて行うことができ、好ましくは水素化アルミニウムリチウム等の還元剤を用いて行うことができ、また同様に、例えば、実施例に後述する方法で行うことができる。
【００８０】
[63]  式ＶＩの化合物は市販されている。
【００８１】
[64]  式ＶＩＩの化合物は、式ＶＩＩＩ
【００８２】
【化１５】
2011530497.tif 000017
【００８３】
の化合物、即ち、１−メチル−５−オキソ−２−ピリジン−３−イル−ピロリジン−３−カルボン酸をエステル化することで得られる。当該反応は、カルボン酸をアルコールでエステル化してエステルを形成する既知の方法を用いて行うことができ、好ましくは、塩化チオニル（ＳＯＣｌ２）等の脱水剤を用いて行うことができ、また同様に、例えば、実施例に後述する方法で行うことができる。
【００８４】
[65]  好ましい実施態様では、本発明は、下記式Ｉｂのニコチン由来ハプテンまたはその塩もしくは溶媒和物の調製方法であって、
【００８５】
【化１６】
2011530497.tif 000018
【００８６】
当該方法は、以下の工程を含むものである：
[66]  （ａ）下記式ＩＩａの化合物を
【００８７】
【化１７】
2011530497.tif 000019
【００８８】
[67]  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、および、下記式ＩＶのポリマー担持カップリング剤
【００８９】
【化１８】
2011530497.tif 000020
【００９０】
（式中、Ｗは表示のメチレン基に化学的に結合した固相支持体を表し、Ｒ３はＣ１−Ｃ５−アルキルまたはＣ３−Ｃ８−シクロアルキルである）と反応させ、
[68]  （ｂ）工程（ａ）の生成物を濾過して、式Ｉｂの化合物を遊離体、塩または溶媒和物の形態で得る。
【００９１】
[69]  本発明の方法で調製されるハプテンは、遊離塩基または塩もしくは溶媒和物の形態で調製が可能である。必要であれば、ハプテンを各種塩の形態または溶媒和物（適切には、非アルコール性溶剤を使用）へ従来慣用の方法で変換してもよく、逆もまた同様である。エナンチオマーやジアステレオマーといった異性体は従来慣用の方法で、例えば、対応の不斉置換された（例えば、光学活性な）出発原料や光学活性な不斉触媒または光学活性な補助剤からの不斉合成によって得ることができる。
【００９２】
[70]  本発明の方法で調製されるハプテンは、禁煙ワクチンの有用な成分である。このようなワクチンを製造するには、ＷＯ０４／００９１１６に記載されているように、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）等の適切な担体、例えば、ＲＮＡファージ（好ましくはＲＮＡファージＱβ）の外被タンパク質に基づくＶＬＰへ、ハプテンを共有結合的にコンジュゲートさせる。適切な方法はＷＯ０４／００９１１６に記載されており、例えば、誘導体化したニコチンハプテンをウイルス様粒子外被タンパク質の表面に存在するリシン残基と反応させてアミド結合を形成する方法が挙げられる。ハプテン−担体コンジュゲートを次いで１種以上の薬学的に許容される製剤成分と組み合わせる。適切な製剤は、例えばＷＯ２００７／１３１９７２に記載されており、当該製剤には少なくとも１種類の非還元糖（例えば、スクロースまたはトレハロース）と少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤とが含まれ、好ましくは５．４〜６．６のｐＨとなっている。一実施態様では、このような製剤を凍結乾燥する。
【００９３】
[71]  本発明の一実施態様では、組成物にはさらにアジュバントが含まれ、好ましくはアルミニウム含有アジュバント、好ましくはアルミニウム塩、好ましくは水酸化アルミニウム、好ましくはアルミニウム含有ミネラルゲル、最も好ましくはアルハイドロゲルが含まれる。本発明の好ましい一実施態様では、組成物には１ｍｇ〜２ｍｇ、好ましくは１．２ｍｇ〜１．７ｍｇ、より好ましくは１．３ｍｇ〜１．５ｍｇのアルミニウム塩、好ましくは水酸化アルミニウムが含まれる。
【００９４】
[72]  ワクチンは、典型的には、禁煙支援を望むヒト患者へ注射する。適切な投与量および用法はＷＯ２００８／１２９０２０に記載されている。例えば、用法としては、組成物をヒトへ少なくとも１回、２回および３回投与してもよく、１回目の投与と２回目の投与の時間間隔、および、２回目の投与と３回目の投与の時間間隔が、最大で１８日である。好ましくは、１回目の投与と２回目の投与の時間間隔、および、２回目の投与と３回目の投与の時間間隔が、少なくとも３日、好ましくは少なくとも４日、より好ましくは少なくとも５日である。好ましい一実施態様では、１回目の投与と２回目の投与の時間間隔、および、２回目の投与と３回目の投与の時間間隔が、少なくとも５日かつ最大で１８日である。
【００９５】
[73]  好ましい一実施態様では、各投与時に少なくとも５０μｇ、好ましくは少なくとも１００μｇ、または、好ましくは少なくとも２００μｇ、または、少なくとも３００μｇの用量のハプテン−担体コンジュゲートを投与する。ハプテン−担体コンジュゲートの用量は、好ましくは５００μｇを超えず、好ましくは４００μｇを超えない。本発明の好ましい一実施態様では、各投与時に約１００μｇのハプテン−担体コンジュゲートを投与する。組成物は当該技術分野で公知の様々な方法で投与してもよいが、通常は注射、輸液、吸入、経口投与、または、他の適切な物理的方法によって投与する。組成物は、また、筋肉内投与、静脈内投与、経粘膜投与、経皮投与または皮下投与してもよい。非常に好ましい一実施態様では、組成物の投与は皮下投与である。投与用組成物の成分としては、滅菌された水性溶液（例えば、生理食塩水）または非水性溶液や懸濁液が挙げられる。非水性溶剤の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）、注射可能な有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。
【００９６】
[74]  ニコチンに対する抗体は、ハプテン−担体コンジュゲート粒子に対する生体の免疫反応によって誘導される。これらの抗体は、吸入されたニコチンに結合してニコチンが血液脳関門を通過するのを防ぐと考えられる。このように、ニコチンが脳の標的部位に結合せず、その結果、快楽／見返りの感覚をもたらすドーパミンの放出が起こらない。それゆえ、患者は禁煙の続行が容易になる。
【００９７】
[75]  以下、実施例を参照して本発明をさらに説明するが、実施例は例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００９８】
出発原料の調製
ラセミトランス−４−ニコチンメチレンアルコールの調製：
[76]  ラセミトランス−４−コチニンカルボン酸（１．８ｋｇ）をメタノール（１７Ｌ）へ室温で添加し、懸濁液を３５℃（内部温度）へ加熱する（Buechiガラスを内張りした５０Ｌ容器）。次いで塩化チオニル（１．０７ｋｇ）を３５℃にて１時間以内で慎重に添加する。溶液をさらに１時間攪拌し、その際、工程内管理（ＨＰＬＣ転化率）を行って反応を完結させる。トルエン（１２Ｌ）を反応混合物へ添加し、−５℃（内部温度）へ冷却してから、溶液を水酸化ナトリウム水溶液（２．５ｋｇ、１０Ｎ）で慎重にクエンチする。ＮａＣｌを除去する濾過を行ってからケーク（cake）をメタノール（６．３Ｌ）で洗浄し、続いてトルエンからの蒸留を繰り返すことにより（全量トルエン：４８Ｌ）メタノールと水を共沸除去する。２回目の濾過（さらにＮａＣｌを除去）を行ってラセミトランス−メチルトランス−４−コチニンエステルをトルエン溶液（濃度範囲：９ｍ／ｍ％）として得る。溶液は自発的に結晶化するため、一定期間保存する。結晶は５０℃（外部温度）で１時間温めれば再溶解が可能である。
【００９９】
[77]  ラセミトランス−メチル−４−コチニンエステル溶液（トルエン溶液として１．９１ｋｇ）を室温で水素化アルミニウムリチウムのＴＨＦ溶液（７．７９ｋｇ、４．５ｍ／ｍ％、Chemetall）へ徐々に添加する（Buechiガラスを内張りした１００Ｌ容器）。反応混合物を４時間攪拌し、その際、cellflock（１．５ｋｇ）を添加して反応を水（０．５ｋｇ）で慎重にクエンチする。２時間さらに攪拌した後、不溶性のリチウム塩とアルミニウム塩を濾過により除去し、ケークをＴＨＦ（１３Ｌ）で洗浄する。ラセミトランス−４−ニコチンメチレンアルコールをＴＨＦ／トルエン溶液として得る（濃度範囲：４ｍ／ｍ％）。
【０１００】
【化１９】
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【０１０１】
ラセミトランス−４−ニコチンメチレンモノ−スクシネートエステルの調製：
[78]  ラセミトランス−４−ニコチンメチレンアルコールのＴＨＦ／トルエン溶液（１．２７ｋｇ、濃度範囲：４ｍ／ｍ％）を５５℃（内部温度）へ加熱し、蒸留とアセトニトリルの添加（全量：２１．６Ｌ）とを繰り返して当該アルコールのアセトニトリル溶液を得る（Buechiガラスを内張りした５０Ｌ容器）。次いで、ラセミトランス−４−ニコチンメチレンアルコールの溶液（１．２７ｋｇ、アセトニトリル溶液としての濃度範囲：１２ｍ／ｍ％）を７０℃（内部温度）へ加熱し、これに無水コハク酸（ＶＩ）のアセトニトリル溶液（６６８ｇ、２３ｍ／ｍ％）を徐々に添加する。工程内管理（ＨＰＬＣ転化率）によって生成物（ＩＩ）へ十分に転化したことが確認されるまで、反応混合物を７０℃で８時間攪拌する。溶剤を２−ブタノンへ切り替え、粗生成物をシリカ（１５ｋｇ）に対してクロマトグラフィーにかけ（濾過プレート装置、２０Ｌ）、生成物を２−ブタノン／メタノール混合液（１：１、１９２ｋｇ）で溶出する。純度を分析（ＨＰＬＣ）した後、選択した画分を次いで蒸留し、溶剤を１００％２−ブタノンへ戻す。
【０１０２】
【化２０】
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【０１０３】
[79]  実施例１：ラセミトランス−４−ニコチンメチレンモノ−スクシネートエステルスクシンイミジルエステルの調製
[80]  高分子シクロヘキシルカルボジイミド樹脂ＩＶ（StratoSpheresTMPL-DCC resin ex Varian Inc）を２−ブタノン（８．３Ｌ）中で一晩室温にて緩やかに攪拌しながら膨潤させておく（Buechiガラスを内張りした１００Ｌ容器）。
【０１０４】
[81]  トランス−４−ニコチンメチレンモノ−スクシネートエステル（５００ｇ、２−ブタノン溶液、濃度範囲：２５ｍ／ｍ％）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２０６ｇ）を、２−ブタノン（３．５Ｌ）と混合し、１時間攪拌しておく（Buechiガラスを内張りした５０Ｌ容器）。５０℃（内部温度）へ予め加熱しておいた膨潤ＰＬ−ＤＣＣ懸濁液を含む反応器へ、混合物を徐々に添加する。緩やかな攪拌を２時間続ける。
【０１０５】
[82]  工程内管理（ＨＰＬＣ転化率）を無事終了した後、懸濁液を濾過して高分子試薬と副生物を除去し、ケークを洗浄する。次いで、ロータリーエバポレーターを用いた蒸留によって２−ブタノンを完全にまたは一部除去する。完全に乾燥させると、ラセミトランス−４−ニコチンメチレンモノ−スクシネートエステルスクシンイミジルエステルが金色の油として形成される（質量：６７３ｇ）。
【０１０６】
[83]  最終生成物の純度を判定したところ、ＨＰＬＣアッセイ（アミノ化類似体との面積比較）では＞７０％、１Ｈ ＮＭＲでは＞９０％である。
【０１０７】
[84]  工程の概要を以下のスキームに示す。
【０１０８】
【化２１】
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【国際調査報告】
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