(57)【要約】本発明は、ヒータ及びリアクションチャンバを含むＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップを備えたハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置である。それは、また、温度センサから受け取った入力値に基づいてヒータを制御するためのヒータ制御手段を備える。それは、さらに、試料からの蛍光シグナルを検出するための光ファイバを有する光学システム、並びに、他の装置と通信するための少なくとも一の通信インターフェースをを有する。【選択図】図１
2011509070.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒータ、及び試料を装填するリアクションチャンバを含むＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップ、
ｂ）温度センサから受け取った入力情報に基づいて、該ヒータを制御するためのヒータ制御手段、
ｃ）該試料からの蛍光シグナルを検出するための光学検知システム、並びに
ｄ）他の装置と通信するための少なくとも一の通信インターフェース
を含むハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置。
【請求項２】
該ヒータと該リアクションチャンバとの間に少なくとも一のコンダクタ層が設けられる、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
該リアクションチャンバは、コンダクタリングによって囲まれている、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
該コンダクタリングは、該コンダクタ層にポストで結合されている、請求項２及び３に記載の装置。
【請求項５】
該コンダクタは、金、銀、白金及びパラジウム又はこれらの合金を含む群から選択される材料でできている、請求項２、３及び４に記載の装置。
【請求項６】
該温度センサは、チップの温度を測定するために該チップの外部に置かれている、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
該温度センサは、該チップの少なくとも一の層の中に埋設されている、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
該温度センサは、サーミスタである、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
該温度センサは、ブリッジ回路の一のアームに結合されている、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
該ブリッジ回路出力は、ヒータを制御するためのヒータ制御手段に供給される前に増幅される、請求項１及び９に記載の装置。
【請求項１１】
該チップは、該リアクションチャンバにカバーをするための透明シーリングキャップを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
該チップは、ディスポーザブルである、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
該光学検知システムは、ビームスプリッタ光学検知システム、ハイブリッド光学検知システム及び分岐光学検知システムを含む群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
該光学システムは、光源、及び、該試料からの蛍光シグナルを検出するための光検出器を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
該検出シグナルをロックインアンプが増幅する、請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
該分岐光学システムは、光ファイバの一つの分岐端（６０５ａ）に置かれた光源、及び、該光ファイバのもう一つの端（６０５ａ）に置かれた光検出器を有する分岐光ファイバを使用する、請求項１３及び１４に記載の装置。
【請求項１７】
該分岐光ファイバの共通端（６０５ｂ）が、該試料に向いている、請求項１及び１６に記載の装置。
【請求項１８】
該ハイブリッド光学検知システムは、該試料上に光を向けるために光ファイバを使用する、請求項１及び１３に記載の装置。
【請求項１９】
該ハイブリッド光学検知システムは、該試料からの散乱ビームを焦点に合わせるためのレンズを使用する、請求項１及び１３に記載の装置。
【請求項２０】
該通信インターフェースは、シリアルインターフェース、ＵＳＢ、ブルートゥース又はこれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項２１】
他の装置は、ハンドヘルド装置からチップ温度及び増幅したシグナルを収集する、請求項１及び１５に記載の装置。
【請求項２２】
他の装置は、スマートフォン、ＰＤＡ及びプログラマブルデバイスを含む群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項２３】
ハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置をモニタ及び制御する方法であって、
ａ）ハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置と他の装置との間の通信を、通信インターフェースを介して確立し、
ｂ）  ＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップを制御するために他の装置から受け取った熱プロファイル値に基づいて熱サイクリング工程を開始し、
並びに
ｃ）光学システムによって検知された光シグナルを他の装置へ送る
工程を含む前記方法。
【請求項２４】
該熱プロファイル値を他の装置へユーザによってユーザーインターフェースを介して供給する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該熱プロファイルを、ユーザーインターフェースを介して生成、修正又は削除する、請求項２３及び２４に記載の方法。
【請求項２６】
他の装置は、ユーザの認証を備える、請求項２３及び２５に記載の方法。
【請求項２７】
他の装置は、複数の熱プロファイルを記憶する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
該熱プロファイルは、セットポイント値及びサイクル数を提供する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
セットポイント値により決められた温度と時間にチップを維持する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
熱サイクリング工程をストップすることによって、マイクロＰＣＲチップ温度を室温までもってゆく、請求項２３及び２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
熱サイクルをポーズするとき、マイクロＰＣＲチップの温度を一定に維持する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
モバイルブルートゥースシリアルポートプロファイルスタックを用いて他の装置と通信する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
熱及び光学データを他の装置の表示装置上にプロットする、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ディスポーザブルの低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）マイクロＰＣＲチップを持ったポータブルリアルタイムＰＣＲシステムに関する。本発明は、さらに、マイクロＰＣＲを制御及び監視する方法、並びにＰＣＲに関連する装置に言及する。
【背景技術】
【０００２】
過去５年間にわたって、ラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）技術に基づいた臨床診断システムの研究開発が非常に増加している。そのようなシステムは、臨床診断への多大な期待を抱えている。それらは、極めて小容積内で試料材料及び試薬を消費する。個々の微小チップは、安価でディスポーザブルであり得る。サンプリングから結果までの時間が極めて短くなる傾向にある。最も進化したチップの設計では、全ての分析機能−サンプリング、試料前処理；分離、希釈混合工程；化学反応；並びに検出−を単一の集積マイクロ流体回路内で実行することができる。ラボオンチップシステムでは、設計者が、微小、ポータブル、過酷、安価、かつ利用し易い診断器具を作製することができ、それは高レベルの能力及び多用途性を提供する。マイクロ流体（流体がマイクロチャンネルを流れる）は、大きなスケールでは機能しないであろう分析装置及び測定フォーマットの設計を可能にする。
【０００３】
ラボオンチップ技術は、マイクロ加工構造内の試料上で行われるであろう実験手順をエミュレートすることを企図する。最も成功した装置は、流動体試料上で作動するものであった。大多数の化学処理、精製、及び反応手順が、これらの装置で実証されている。化学プロセスのある程度のモノリシック集積化が、完全な化学測定手順を実行する装置を作るのに実証されている。これらの装置は、認められた分析実験手順をベースとし、したがって、汎用の化学的検出よりも複雑な試料マトリックスに適応できる。
【０００４】
分子及び細胞生物学の大部分での最近の進歩は、迅速かつ効率的な分析技術に発達の結果としてなされている。小型化及び多重化のために、遺伝子チップやバイオチップのような技術では、単一実験構成で全ゲノムの特徴付けを可能である。ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション）は、核酸分子のｉｎ−ｖｉｖｏ増幅のための分子生物学方法である。法医学、環境、臨床及び工業試料中の生物学的種及び病原体の同定について、ＰＣＲ技術は、時間を要し感度の低い他の技術と迅速に置き換わっている。バイオ技術の中でも、ＰＣＲは、大多数の分子及び臨床診断の際にライフサイエンス研究室内の最も重要な分析工程となっている。リアルタイムＰＣＲのようなＰＣＲ技術でなされた重要な発展は、従来方法と比べて迅速な反応工程を導いてきた。ここ数年の間に、微細加工テクノロジーが、分析時間と試薬の消費のさらなる削減の意図をもってＰＣＲ分析のような反応及び分析システムの小型化を拡張している。
【０００５】
現在入手可能なほとんどのＰＣＲでは、試料、容器及びサイクルラーの熱容量のために瞬時の温度変更ができず、その結果、２〜６時間という長期の増幅時間になる。試料温度が一の温度から別の温度へ移る間に、無関係で不所望な反応が生じ、貴重な試薬を消費し、かつ不所望な妨害化合物を生成する。
【０００６】
ＬＴＣＣは、半導体素子のパッケージングに使用されている。このシステムでは、電気的及び構造的な機能の集積が可能である。ＬＴＣＣ製作過程での各層毎（ｌａｙｅｒ  ｂｙ  ｌａｙｅｒ）の製作シーケンスでは、電気的素子を集積した３次元構造の作製が容易である。さらに、加工がシリコン加工と比べてより安価である。ＬＴＣＣ（低温同時焼成セラミクス）のようなセラミクス基板上にチップが製作されることで、機械的及び電気的素子の集積を簡単かつ容易にできる。
【０００７】
ＰＤＡのようなポータブル計算プラットフォームの使用により、エレクトロニクスを制御し、そしてデータをディスプレイする豊富で簡単なユーザーインターフェースを提供するための十分な計算力のシステムが提供される。それは、また、全システムをモジュール化し、したがって、ユーザに対して最小コストでシステムを簡単にアップグレードすることを可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の主要な目的は、ハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置を開発することである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、ハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置をモニタ及び制御する方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明は、ヒータ、試料を装填するリアクションチャンバを含むＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップ、温度センサから受け取った入力情報に基づいて該ヒータを制御するためのヒータ制御手段、該試料からの蛍光シグナルを検出するため光学検知システム、並びに他の装置と通信するための少なくとも一の通信インターフェースを含むハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置；並びに、ハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置をモニタ及び制御する方法であって、ハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置と他の装置との間の通信を、通信インターフェースを介して確立し、ＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップを制御するために他の装置から受け取った熱プロファイル値に基づいて熱サイクリング工程を開始し、並びに、光学システムによって検知された光シグナルを他の装置へ送る工程を含む前記方法を提供する。
【００１１】
以下に、添付の図面を参照して本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明に従う一実施態様のＬＴＣＣマイクロＰＣＲ装置の概略を示す。
【図２】一実施態様のＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップの正投影図を示す。
【図３】一実施態様のＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップの断面図を示す。
【図４】一実施態様のＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップの各層毎の設計を示す。
【図５】製作されたチップリアクションチャンバ設計の一モデルを示す。
【図６】分岐光ファイバを用いた分岐光学検知システム示す。
【図７】ヒータ及び温度センサを制御する回路のブロック図を示す。
【図８】ハンドヘルドユニットによって制御された集積ヒータ／サーミスタを用いたチップ上のλ−６３６ＤＮＡ断片の熔解を示す。
【図９】チップ上のλ−３１１ＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅であって、（ａ）チップからのリアルタイム蛍光シグナル；（ｂ）増幅産物を識別するゲル写真を示す。
【図１０】処理された血液及び血漿（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ）のサルモネラ菌の１６ＳリボソームユニットについてのＰＣＲ増幅のゲル写真を示す。
【図１１】全血（ｄｉｒｅｃｔ  ｂｌｏｏｄ）のサルモネラ菌の１６Ｓリボソーム単位についてのＰＣＲ増幅のゲル写真を示す。
【図１２】直接血漿（ｄｉｒｅｃｔ  ｐｌａｓｍａ）のサルモネラ菌の１６ＳリボソームユニットについてのＰＣＲ増幅のゲル写真を示す。
【図１３】マイクロチップを用いたサルモネラ菌遺伝子のＰＣＲ増幅であって；（ａ）チップからのリアルタイム蛍光シグナル、（ｂ）増幅産物を識別するゲル写真を示す。
【図１４】ＬＴＣＣチップを用いてＢ型肝炎ウイルスＤＮＡを増幅するのにかかった時間を示す。
【図１５】ハンドヘルドユニットと通信する携帯情報端末（ＰＤＡ）アプリケーションの概略を示す。
【図１６】λ−３１１ＤＮＡ溶解のための蛍光シグナルの微分（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）について、ＬＴＣＣチップを用いて得られた溶解曲線を示す。
【図１７】ＰＤＡ内で実行されるサーマルサイクリングプログラムのフローチャートを示す。
【図１８】マイクロチップを用いて増幅されたＨＢＶ  ＤＮＡのリアルタイム蛍光シグナルを示す。
【図１９】ビームスプリッタを用いたビームスプリッタ光学検知システムを示す。
【図２０】ハイブリッド光学検知システムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、
ａ）ヒータ、及び試料を装填するリアクションチャンバを含むＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップ、
ｂ）温度センサから受け取った入力情報に基づいて、該ヒータを制御するためのヒータ制御手段、
ｃ）該試料からの蛍光シグナルを検出するための光学検知システム、並びに
ｄ）他の装置と通信するための少なくとも一の通信インターフェース
を含むハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置に関する。
【００１４】
本発明の一実施態様では、該ヒータと該リアクションチャンバとの間に少なくとも一のコンダクタ層（ｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｌａｙｅｒ）が設けられる。
【００１５】
本発明の一実施態様では、該リアクションチャンバは、コンダクタリング（ｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｒｉｎｇｓ）によって囲まれている。
【００１６】
本発明の一実施態様では、該コンダクタリングは、該コンダクタ層にポスト（ｐｏｓｔｓ）で結合されている。
【００１７】
本発明の一実施態様では、該コンダクタは、金、銀、白金及びパラジウム又はこれらの合金を含む群から選択される材料でできている。
【００１８】
本発明の一実施態様では、該温度センサは、チップの温度を測定するために該チップの外部に置かれている。
【００１９】
本発明の一実施態様では、該温度センサは、該チップの少なくとも一の層の中に埋設されている。
【００２０】
本発明の一実施態様では、該温度センサは、サーミスタである。
【００２１】
本発明の一実施態様では、該温度センサは、ブリッジ回路の一のアームに結合されている。
【００２２】
本発明の一実施態様では、該ブリッジ回路出力は、ヒータを制御するためのヒータ制御手段に供給される前に増幅される。
【００２３】
本発明の一実施態様では、該チップは、リアクションチャンバにカバーをするための透明シーリングキャップを含む。
【００２４】
本発明の一実施態様では、該チップは、ディスポーザブルである。
【００２５】
本発明の一実施態様では、該光学検知システムは、ビームスプリッタ光学検知システム、ハイブリッド光学検知システム及び分岐光学検知システムを含む群から選択される。
【００２６】
本発明の一実施態様では、該光学システムは、光源、及び、該試料からの蛍光シグナルを検出するための光検出器を含む。
【００２７】
本発明の一実施態様では、ロックインアンプが、該検出シグナルを増幅する。
【００２８】
本発明の一実施態様では、該分岐光学システムは、光ファイバの一つの分岐端（６０５ａ）に置かれた光源を、及び、該光ファイバのもう一つの端（６０５ａ）に置かれた光検出器を有する分岐光ファイバを使用する。
【００２９】
本発明の一実施態様では、該分岐光ファイバの共通端（６０５ｂ）が、該試料に向いている。
【００３０】
本発明の一実施態様では、該ハイブリッド光学検知システムは、該試料上に光を向けるために光ファイバを使用する。
【００３１】
本発明の一実施態様では、該ハイブリッド光学検知システムは、該試料から放出されたビームを焦点に合わせるためのレンズを使用する。
【００３２】
本発明の一実施態様では、該通信インターフェースは、シリアルインターフェース、ＵＳＢ、ブルートゥース又はこれらの組み合わせを含む群から選択される。
【００３３】
本発明の一実施態様では、他の装置は、ハンドヘルド装置からチップ温度及び増幅シグナルを収集する。
【００３４】
本発明の一実施態様では、他の装置は、スマートフォン、ＰＤＡ及びプログラマブルデバイスを含む群から選択される。
【００３５】
本発明は、また、ハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置をモニタ及び制御する方法であって、
ａ）ハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置と他の装置との間の通信を、通信インターフェースを介して確立し、
ｂ）ＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップを制御するために他の装置から受け取った熱プロファイル値に基づいて熱サイクリング工程を開始し、
並びに
ｃ）光学システムによって検知された光シグナルを他の装置へ送る
工程を含む前記方法に関する。
【００３６】
本発明の一実施態様では、該熱プロファイル値を、他の装置へユーザによってユーザーインターフェースを介して供給する。
【００３７】
本発明の一実施態様では、該熱プロファイルを、ユーザーインターフェースを介して生成、修正又は削除する。
【００３８】
本発明の一実施態様では、前記他の装置は、ユーザ認証を備える。
【００３９】
本発明の一実施態様では、前記他の装置は、複数の熱プロファイルを記憶する。
【００４０】
本発明の一実施態様では、該熱プロファイルは、セットポイント値及びサイクル数を提供する。
【００４１】
本発明の一実施態様では、セットポイント値により決められた温度と時間にチップを維持する。
【００４２】
本発明の一実施態様では、熱サイクリング工程を止めることによって、マイクロＰＣＲチップ温度を室温までもってゆく。
【００４３】
本発明の一実施態様では、熱サイクルをポーズ（ｐｅｕｓｉｎｇ）するとき、マイクロＰＣＲチップの温度を一定に維持する。
【００４４】
本発明の一実施態様では、モバイルブルートゥースシリアルポートプロファイルスタックを用いて前記他の装置と通信する。
【００４５】
本発明の一実施態様では、熱及び光学データを、前記他の装置の表示装置上にプロットする。
【００４６】
他の装置（１０１）は、例えば有線（ＲＳ２３２シリアルポート、ＵＳＢ）又は無線（シリアルポートプロファイルを実行するブルートゥース）などのようなすべての標準通信インターフェース（１０７）を介してハンドヘルド装置と通信できるものである。
【００４７】
ＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップは、ＬＴＣＣ  層でできたＰＣＲチップである。このチップは、ハンドヘルドユニットに簡便に脱着可能である。
【００４８】
熱プロファイルは、セットポイント値である温度及び時間と熱サイクル工程を完了するためのサイクル数のカウントを有する。
【００４９】
ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）は、テンプレートから特定ＤＮＡ断片の多重コピーを合成するために開発された技術である。初期のＰＣＲ法は、Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素（Ｔａｑ）に基づき、これは、４つのＤＮＡ塩基及びターゲット配列の側面に配置する二つのプライマ断片を含む混合物中で所定のＤＮＡストランドと相補なストランドを合成することができる。該混合物を加熱して該ターゲット配列を含有する二重鎖ＤＮＡストランドを分離し、次いで、冷却して、プライマが分離ストランド上でその相補配列を見つけて結合できるようにし、Ｔａｑポリメラーゼがプライマに新しい相補ストランドを伸長させる。繰り返される加熱及び冷却サイクルは、新しい二重ストランドのそれぞれが分離してさらなる合成のための二個のテンプレートになるため、ターゲットＤＮＡを指数関数的に増殖させる。
【００５０】
ポリメラーゼチェインリアクションの典型的な温度プロファイルは、以下のとおりである：
１．９３℃、１５〜３０秒間での変性
２．５５℃、１５〜３０秒間でのプライマのアニーリング
３．７２℃、３０〜６０秒間でのプライマの伸長
【００５１】
一例として、最初の工程において、溶液を９０〜９５℃に加熱して、二重ストランドのテンプレートを溶解（”変性”）して二個の単一ストランドを形成するようにする。次の工程では、それを５０〜５５℃へ冷却して、特別に合成した短いＤＮＡ断片（”プライマ”）がテンプレートの適切な相補部位と結合するようにする（”アニーリング”）。最後に、溶液を７２℃に加熱し、その時、特別な酵素（”ＤＮＡポリメラーゼ”）が、溶液からの相補塩基を結合させることでプライマを伸長させる。こうして、二個の同一の二重ストランドが、単一の二重ストランドから合成される。
【００５２】
数百塩基よりも長い産物を生成させるために、プライマ伸長工程を概ね６０秒／ｋｂａｓｅまで増大しなけければならない。上記は、典型的な装置時間であり、実際、変性及びアニーリング工程は、ほとんど瞬時に起きる。しかし、メタルブロック又は水が温度平衡に用いられ、試料がプラスチック製微量遠心チューブに入れられる場合、市販装置の温度速度は、通常、１℃／秒以下である。
【００５３】
断熱低質量ＰＣＲチャンバをマイクロ加工することにより、もっと速く、エネルギー効率的で特殊なＰＣＲ装置を量産することが可能である。さらに、一の温度から別の温度への迅速な遷移によれば、試料が不所望な中間温度に費やす時間が最小になり、その結果、増幅したＤＮＡは最良の忠実度及び純度を有するようになる。
【００５４】
低温同時焼成セラミクス（ＬＴＣＣ）は、自動車、防衛、航空機及び通信業界の電気部品のパッケージングに使用される厚膜テクノロジーの最新版である。それは、アルミナをベースとするガラスセラミクス材料であり、化学的安定、生体適合性、熱安定性（＞６００℃）であり、低い熱伝導度（＜３Ｗ／ｍＫ）、良好な機械強度を有し、かつ良好なエルミート性（ｈｅｒｍｉｔｉｃｉｔｙ）を有する。それは、従来、チップレベルの電気素子のパッケージングに使用され、そこで、構造及び電気機能の両方を担う。本発明者らの認識では、ＬＴＣＣの適合性はマイクロＰＣＲチップ用途に使用されるべきであり、そして、本発明者らの最高の知識では、ＬＴＣＣはそのような目的には使用されていなかった。ＬＴＣＣテクノロジーでの基礎の基板（ｂａｓｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）は、好ましくは、ポリマー結合材の付いたガラスセラミクス材料の未焼成（グリーン）層である。これらの層をカッティング／パンチング／ドリリングして多層に積み重ねることにより、構造的特徴が形成される。各層毎の工程により、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）にとって重要な３次元構造を作製することができる。５０ミクロンを下回る特徴がＬＴＣＣ上に容易に作り上げられる。電気回路は、各層上に導電及び抵抗ペーストをスクリーン印刷することにより製作される。多層は、ビアの穴あけを行って（ｐｕｎｃｈｉｎｇ  ｖｉａｓ）、そこに導電ペーストを充填することにより相互に連結される。これらの層が積み重ねられ、加圧され、そして焼成される。最高８０層の積み重ね工程が、文献で報告されている。焼成された材料は、緻密かつ、良好な機械強度を有する。
【００５５】
図１に、さまざまな部品及びそれらの機能を示す一実施態様のマイクロＰＣＲ装置の概略を示す。この装置は、ディスポーザブルＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップ（１０３）を含み、これは、試料を保持するためのリアクションチャンバを、サーマルサイクリングのための埋設ヒータ及び埋設温度センサとともに有する。温度センサは、サーミスタである。温度センサは、また、チップ内部に埋め込まれる代わりにチップの外部に置くこともできる。温度センサは、温度を測定可能ないかなるセンサでもよい。ＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップ（１０３）は、温度センサ値に基づいてヒータを制御するヒータ制御手段及びドライバ回路を有する制御回路構成（１０２）を含むハンドヘルドエレクトロニクスユニット（１０９）に接続される。温度センサ値は、温度センサ回路（１０７）を介して前記ヒータ制御手段へ供給される。ヒータ制御手段はチップ温度を設定し、マイクロコントローラ（１０６）によりセットポイント値として設けられた期間、その温度を維持する。ハンドヘルド装置（１０９）のすべての部品は、バッテリーパック（１０８）によって動力が供給される。
【００５６】
ハンドヘルド装置（１０９）は、また、マイクロＰＣＲチップ（１０３）からの蛍光シグナルを検出する光学システム（１０４）を収容する。これは、光源、光源を制御する回路、試料からの放出光を検出するための検出器、（試料からの）シグナルを増幅するための回路を含む。ハンドヘルド装置（１０９）は、ＵＳＢ／ブルートゥースのような他の処理装置（１０１）でデータ取得及び制御のためのスマートフォン／ＰＤＡやあらゆる処理装置と接続され得る。
【００５７】
バッテリは、外部源から再充電するために設けられたポートを有する再充電可能なバッテリであり得る。例えば、バッテリは、１Ａを越えるピークカレントを供給可能なニッケルカドミウム、リチウムイオンや、ポリマーであり得る。
【００５８】
ハンドヘルド装置は、また、他の装置（１０１）と通信するための少なくとも一の通信インターフェース（１０７）を含む。通信インターフェース（１０７）は、有線をベースとするもの（ＲＳ２３２シリアルポート、ＵＳＢ）や無線（シリアルポートプロファイルを実行するブルートゥース）であり得る。典型的には、シリアルポートプロファイルが、そのスピードと実行し易さのために通信用に使用される。インターフェースは、他の装置（１０１）とマイクロコントローラ（１０６）との間のデータ及び指令を伝達する。
【００５９】
他の装置（１０１）は、本明細書では、ハンドヘルド装置を制御及びモニタすることの可能なものである。例えば、他の装置は、ＰＤＡ、スマートフォン、コンピュータ、マイクロコントローラや、ハンドヘルド装置と通信可能なあらゆる処理装置である。他の装置は、また、ユーザによってデータをインプットし、視るためのユーザーインターフェースを提供する。他の装置は、本明細書では、ハンドヘルド装置（１０９）と通信、制御及びモニタするために適当なソフトウエアを実行する能力を有する意味である。
【００６０】
マイクロコントローラ（１０６）は、ハンドヘルド装置（１０９）上のエレクトロニクスを制御し、インターフェースを介して他の装置（１０１）と通信する。マイクロコントローラは、他のアナログ回路、すなわち、制御回路（１０２）、温度センサ回路（１０７）及び光学回路（１０５）と通信するためのアナログ／デジタル及びデジタル／アナログコンバータを有する。マイクロコントローラ（１０６）は、他の装置からセットポイント値を収集し、それを制御回路（１０２）へ提供する。マイクロコントローラは、また、温度センサ回路（１０７）で検知した温度及び光学回路（１０５）により供給された光学データを他の装置へ提供する。光学データは、本明細書では、光学システム（１０５）によって検知されたシグナルである。
【００６１】
図２に、リアクションチャンバ（２０１）又はウエルを示す一実施態様のマイクロＰＣＲチップの正投影図を示す。図は、ＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップ内部のヒータ（２０１）及び温度センササーミスタ（２０３）のアセンブリを示している。ヒータコンダクタライン（２０５）及びサーミスタコンダクタライン（２０４）もまた示す。これらのコンダクタラインは、ヒップ（ｈｉｐ）内に埋設されたヒータ及びサーミスタと外部回路構成とを連結するのを助ける。
【００６２】
一実施態様のＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップの断面図である図３を参照すると、２０６ａ及び２０６ｂは、ヒータ（２０２）のためのコンタクトパッド（ｃｏｎｔａｃｔ  ｐａｄ）を示し、２０７ａ及び２０７ｂは、サーミスタ（２０３）のためのコンタクトパッドを示す。
【００６３】
一実施態様のＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップの各層毎の設計を示す図４を参照すると、チップは１２層のＬＴＣＣテープからなる。２個のベース層（４０１）、ヒータ層（４０２）、コンダクタ層（４０３）及びサーミスタ（４０４）を有する層を有する３個のミッド層が存在し、一方、４０５がリアクションチャンバ（２０１）へのインターフェース層を形成する。リアクションチャンバ層は、図示のとおり、６層の４０６からなる。また、コンダクタ層（４０３）が、ヒータ層とサーミスタ層との間に設けられる。ヒータコンダクタライン（２０５）及びサーミスタコンダクタライン（２０４）もまた示す。図では、コンダクタライン（２０４）がサーミスタ層（４０４）のいずれかの側に置かれる。ヒータデザインは、”梯子”、”蛇行（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）”、”線”、”板”などのようなあらゆる形状でよく、サイズは、０．２ｍｍ  ｘ  ３ｍｍ〜２ｍｍ  ｘ  ２ｍｍの間で変更される。ヒータのサイズ及び形状は、要求に基づいて選択され得る。その要求は、リアクションチャンバ、試験される試料やコンダクタ層として使用される材料の大きさに依存する。
【００６４】
ＬＴＣＣチップは、１〜２５μｌのウエル容積を有する。ヒータは、汎用のＬＴＣＣパッケージに採用される厚膜抵抗素子をベースとする。アルミナを用いたサーミスタ系が、埋設される温度センサの製作のために使用される。チップのＴＣＲ測定値は、１〜２Ω／℃の間であった。チップは、デュポン９５１グリーンシステム上に作製された。サーミスタ層は、チップ内のどこに置いてもよく、温度センサは、チップ内部のサーミスタの代わりにチップ外部に置かれ得る。
【００６５】
チップ内部の温度プロファイルの均一性を測定した後、ＰＣＲ反応をこれらのチップ上で行った。λＤＮＡ断片、サルモネラ菌ＤＮＡ及びＢ型肝炎ＤＮＡは、これらのチップを用いて上首尾に増幅される。図５に、ヒータ、コンダクタリング、サーミスタ、及びコンダクタリング（５０２）との様々な結合を示す三次元表示のマイクロチップを示す。それは、また、コンダクタリング（５０２）をコンダクタプレート（４０３）へ結合するポスト（５０１）を示す。
【００６６】
埋設されたヒータは、ＬＴＣＣと適合するデュポン製ＣＦシリーズのような抵抗ペースト（ｒｅｓｉｓｔｏｒ  ｐａｓｔｅ）でできている。デュポン９５、ＥＳＬ（４１ＸＸＸシリーズ）、Ｆｅｒｒｏ（Ａ６システム）やＨａｒａｅｕｓのようなあらゆるグリーンセラミクステープ系を使用可能である。埋設された温度センサは、アルミナ基板のたためのＰＴＣ（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）抵抗サーミスタペースト（例えば５０９Ｘ  Ｄは、ＥＳＬエレクトロサイエンス製のＥＳＬ２６１２である）を用いて作製されたサーミスタである。ＮＴＣ４９９３（ＥＭＣＡ  Ｒｅｍｅｘ製）のような抵抗ペーストのＮＴＣ（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）もまた使用可能である。
【００６７】
透明（波長３００〜１０００ｎｍ）なシーリングキャップは、試料のリアクションチャンバからの蒸発を防ぐためにあり、ポリマー材料でできている。
【００６８】
光学検知システム（１０４，１０５）
光学（蛍光）検知システムは、照明源（典型的にはＬＥＤ）、適合な波長の光を選択するためのフィルタ、試料から光を回収し運ぶための光学部品、及び光センサ（光ダイオード、光電子増倍管、光トランジスタ、イメージセンサなど）を含む。それは、また、光源を駆動し、光センサからのシグナルを検出する回路構成（１０５）を含む。ポータブル用途では、低消費電力（＜１ミリＷ）のために光ダイオードや光トランジスタあるいはイメージセンサが好ましい。ＰＣＲ産物のリアルタイム検知には蛍光技術を採用し、ここで、ＰＣＲ混合物内に存在する感光性染料（ＳＹＢＲグリーンのようなフルオロフォア）が一定波長の光を吸収し、高波長を放出する（ＳＹＢＲグリーンの場合、４７０ｎｍ及び５２０ｎｍ）。典型的には、放出光強度は、ＰＣＲの上首尾な進行とともに徐々に増減する。放出強度の変化のモニタリングは、ＰＣＲ装置のリアルタイム検知能力を与える。ＰＣＲ試料からの光のカップリング及び採集は、いろいろな方法で達成することができる。以下の方法が、本システムに採用可能である：
【００６９】
・分岐端部（６０５ａ）及び共通端部（６０５ｂ）を有する分岐光ファイバ（６０５）（マルチモードプラスチック又はシリカファイバもしくはファイバ束）を用いた分岐の光学検知システム。一の分岐端部（６０５ａ）は、ＬＥＤ（６０１）からの光を試料上へ入射し、他の端部が光を光学検知器（６０２）へ入射するためにある。共通端部（６０５ｂ）は、光を試料上へ指し向ける。この方法は、波長選択のためのフィルタに加えて、光をファイバへ向けて、あるいは光をファイバからカップリングするための光学部品を採用する。
【００７０】
・ビームスプリッタ、レンズ、及び、光を試料に焦点を合わせ検出するためのフィルタを用いたビームスプリッタ光学検知システム。図１９
・焦点レンズ、フィルタ及び検知器を用いた照明及び検知用光ファイバを採用したハイブリッド光学検知システム。図２０
【００７１】
図６に、本発明に従うＰＣＲ装置の好ましい一実施態様の光学システムを示す。図は、分岐端部（６０５ａ）の一端にＬＥＤ（６０１）の励起源、及び、もう一つの分岐端部（６０５ａ）に光学検知器（６０２）によって検出された蛍光を含む分岐光ファイバ（６０５）を持った配置を示す。ＬＥＤ（６０１）及び光学検知器（６０２）は、光ファイバの分岐端部（６０５ａ）及び、ＬＴＣＣチップ（２００）のリアクションチャンバ（２０１）を覗き込む共通端部（６０５ｂ）と結合する。図は、また、カプラ（６０３ａ及び６０３ｂ）で、それぞれ、ＬＥＤ（６０１）に結合したフィルタ（６０４ａ）及び光学検知器（６０２）に結合したフィルタ（６０４ｂ）を示す。
【００７２】
検出器（６０２）からの出力シグナルは、ヒータコントローラに送られる前に、図７に示すような増幅器回路（７０１）を用いて増幅される（光電子増倍管、アバランシェ光ダイオードにおけるｉｎ−ｓｉｔｕ）。増幅器回路の一例は、位相ロックループ（ＰＬＬ）回路（ロックインアンプ）である。この回路では、照明は、所定波長（典型的には１０Ｈｚ〜５００ｋＨｚのレンジ内）でパルスされる。出力シグナル（蛍光シグナル）を処理する回路が同一波長をロックオンし、及び、増幅され電圧に変換されさらにマイクロコントローラ（１０６）へ送られる比例した直流（ＤＣ）を生成する。この回路は、シグナルのＳＮ比を高め、シグナル中のノイズに関連する波長を消去する。ロックイン回路は、平衡変調器／復調器（例えばＡＤ６３０ＪＮ（Ａｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製））に基づく。
【００７３】
図７は、ヒータ及びサーミスタを制御する回路のブロック図を示し、ここで、ＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップ（２００）内のサーミスタが、ブリッジ回路（７０６）のアームの一つとして作用する。温度センサがチップの外部に置かれた場合でも、それは、ブリッジ回路のアームの一つに結合することができる。ブリッジ増幅器（７０１）からのブリッジの増幅出力は、ＰＩＤコントローラ（７０３）への入力として与えられ、ここで、デジタル化され、そして、ＰＩＤアルゴリズムは、制御されたデジタル出力を与える。出力は、再び、アナログ電圧に再変換され、そして、これが、ヒータドライバ（７０４）内に在るパワートランジスタを用いたヒータを駆動する。
【００７４】
ヒータ制御手段（７０３）のために実行されるアナログ回路は、Ｐ又はＰＩ又はＰＤ又はＰＩＤ（Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を採用し、あるいは、サーミスタからの出力に基づいた簡単なオン／オフ制御であり得る。温度センサは、温度変化を検知する回路の一部である。この図では、サーミスタの一例が、温度センサのために考慮され、ここで、これは、ホイートストンブリッジ回路（７０６）の一部でできている。加熱又は冷却によるサーミスタ抵抗の変化が、回路からの限界出力電圧（ｆｉｎｉｔｅ  ｏｕｔｐｕｔ  ｖｏｌｔａｇｅ）を生じる。この電圧は、ＬＴＣＣチップ上のウエルの温度と関係する。測定された電圧は、ヒータをオンオフするかどうかを決定するのに使用される。ヒータは、（ＬＴＣＣチップ上）のウエル内で達成される最高温度によって決定される事前設定のパワーで供給される。ヒータ及びサーミスタ内の抵抗変動を考慮に入れて（最適なチップの〜２０％）、自己較正回路が開発されており、ハンドヘルド内に具備されている。この回路は、外気に曝された市販のサーミスタ（ＰＴ１００）を用いたことによる抵抗変化を補償する。
【００７５】
ヒータ制御回路は、マイクロコントローラによって管理される。マイクロコントローラは、所望の熱プロファイルを、通信インターフェースを介して実行するようにプログラムされる。プログラムは、ＬＴＣＣチップ上の所望のプロファイルを実行するようにヒータ制御回路（１０２）を制御する。ブルートゥースインターフェイスが、ＰＤＡを動かすソフトウエアを用いたマイクロコントローラを制御するために試験されている（ｉＰａｑが動くＷｉｎｃｏｗｓＣＥ）。ブルートゥース通信用ソフトウエアの進歩及びＧＵＩ（Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｕｓｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）の進歩が、ハンドヘルド装置（１０９）内に具備される。ここに開示したヒータを制御し、そして温度センサ値を読み取る方法は、ほんの一例である。これを、コントローラや限定への唯一の方法ととらえるべきではない。ヒータを制御し、そしてサーミスタ値を読み取るための他の手段や方法は、本開示に十分に適用可能である。
【００７６】
他の装置は、ユーザがＰＣＲ用熱プロファイルをＧＵＩ（Ｇｒａｐｈｉｃａｌ  Ｕｓｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を介して作成することを可能にする。熱プロファイルは、マイクロコントローラへ通信インターフェース（１０７）を介して伝達される。熱プロファイルは、セットポイント値（温度及び時間）並びにサイクル数を含む。マイクロコントローラからの温度センサデータ及び光学検知データが、他の装置に送られ、そしてそこに表示される。コンピュータは、また、データを評価し、そして、反応の結果を表示する。ポータブルコンピュータは、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＣＥ／Ｍｏｂｉｌｅ、Ｐａｌｍ  ＯＳ、Ｓｙｍｂｉａｎ、Ｌｉｎｕｘのようなオペレーティングシステムを実行する。別の実施態様では、セットポイント値のみをハンドヘルド装置へ送り、そして、サイクル数を他の装置でモニタすることが可能である。マイクロコントローラは、他の装置によって熱プロファイルから送られたセットポイント値を達成する。
【００７７】
ＰＣＲ産物は、典型的には、ゲル電気泳動を用いて分析される。この技術では、ＰＣＲ後のＤＮＡ断片が電場内で分離され、蛍光染料で着色することにより観測される。より適したスキームは、二重ストランドＤＮＡに特異的に結合して反応を継続的にモニタする蛍光染料を使用することである（リアルタイムＰＣＲ）。そのような染料の例は、４９０ｎｍの青色光によって励起し、ＤＮＡと結合したときに５２０ｎｍの緑色光を放出するＳＹＢＲグリーンである。蛍光強度は、ＰＣＲ中に形成された二重ストランド産物の量に比例するので、サイクル数とともに増大する。
【００７８】
以下の実施例は、ハンドヘルド装置（１０９）を他の装置とともに用いて達成できる別の可能性を説明する。この実施例で検討される他の装置は、ＰＤＡ／スマートフォンである。
【００７９】
ターゲットのＰＤＡ／スマートフォンアプリケーションは、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ｍｏｂｉｌｅ  ５プラットフォーム上で実行される。それは、ウインドウズモバイルブルートゥースシリアルポートプロファイル（ＳＰＰ）スタックを、ハンドヘルドユニットと通信するのに使用する。ハンドヘルドユニットは、マイクロコントローラとデータ通信用ＵＡＲＴ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ａｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ  ｒｅｃｅｉｖｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｍｉｔ）ポートを介してインターフェースするブルートゥースモジュールを含む。アプリケーションのコア機能は、ハンドヘルドユニットの熱サイクリング工程をさまざまな記憶された熱プロファイルを介して制御及びモニタすることである。それは、また、２レベルアクセス制御；データプロッティング、熱プロファイル作成などのような機能を有する。図１５は、をアプリケーションとハンドヘルド装置との間の通信方法を示している。
【００８０】
ＰＤＡアプリケーション
ＰＤＡアプリケーションプログラムは、セットポイント値（温度及び時間）並びにサイクル数を含むインプットデータを許可する。セットポイント値は、ハンドヘルドユニットへブルートゥースコネクションを介して伝達され、そして、ハンドヘルドユニットの応答を待つ。セットポイント値に達すると、ハンドヘルドユニットは、同じものをＰＤＡへ通信し、ＰＤＡは次のインストラクションセットを送る（図１７）。ＰＤＡは、また、ハンドヘルドからデータ（温度及び光学データ）を受け取り、それを表示する。ＰＤＡによって送られるインストラクションを通信し、そして実行するため、ハンドヘルドは、ブルートゥース通信及びアナログ回路の制御を可能にする埋め込まれたプログラムを持つマイクロコントローラを有する。さらに、マイクロコントローラ上のプログラムは、継続的に温度及び光学データをＰＤＡへ送る。ＰＤＡアプリケーションは、４つのモジュールを有する：
１．アクセス制御
２．ＧＵＩ
３．データ処理及び通信
【００８１】
アクセス制御：
１．このモジュールは、ユーザにアプリケーションへのログインを許可する
２．それは、ユーザネーム及びパスワードを持ったログインスクリーンを有する
３．二つのレベルのアクセス制御を有する
ａ．管理
ｂ．ユーザ  
４．管理者は、以下の権限を有する：  
ａ．ユーザ及びユーザフォルダを作成する
ｂ．熱プロファイルを作成する
ｃ．ハンドヘルド装置（１０９）を結合／変更する
５．ユーザネーム及びパスワードで一度ログインしたユーザは、アプリケーションを実行し、セッションに関係するデータを見、記憶する権限を有する。
【００８２】
ＧＵＩ
１．ＧＵＩモジュールは、以下のためのスクリーンを提供する：
ａ．管理者が、異なるセットポイント値（温度及び時間）を入力し、及び熱プロファイルを作成／削除／修正する
ｂ．ユーザ及びユーザフォルダを作成／削除する
ｃ．ハンドヘルド装置を変更する
ｉ．アプリケーションは、レンジ内のブルートゥース装置検出するためにブルートゥーススタックを使用する。検出後、それは、レンジ内のすべての使用可能な装置を表示する。管理者は、ハンドヘルド装置を選択し、アプリケーションがブルートゥーススタックにハンドヘルド装置（１０９）との提携（ｐａｉｒ）を要求する。提携後、提携装置情報を将来の使用のために記憶する
ｄ．アプリケーションのスタート、ストップ、リスタート及びポーズ
ｅ．伝達され及びアプリケーションによって受け取られたデータを示すログウインドウ
２．ＧＵＩモジュールは、ハンドヘルドユニットから収集した熱及び光学的データをプロットするスクリーンを有する。
【００８３】
データ処理モジュール
データ処理モジュールは、以下の機能を有する：
１．データ変換
２．通信アルゴリズム
【００８４】
データ変換：
１．データは、ユーザにより選択された熱プロファイルから収集する。
２．以下は典型的な熱プロファイルである：  
【００８５】
【数１】
2011509070.tif 000003
【００８６】
３．セットポイント値が温度及び時間を含むので、温度値は、次いで、下式を用いて電圧値に変換される：
【数２】
2011509070.tif 000004
ここで、Ｖは電圧、ｔは温度、ｘ及びｙは、予め決められた定数である。
【００８７】
４．こうして得られた電圧値は、下式を用いて１０ビット１６進数値（ベース１６）に変換される：
【数３】
2011509070.tif 000005
ここで、Ｖは電圧である。
【００８８】
５．時間値（秒）は、１６進数（ｈｅｘ）に変換される。
６．ハンドヘルドユニットから収集した熱データは、下式を用いて１６進数値からプロット用電圧に変換される。
【数４】
2011509070.tif 000006
【００８９】
７．電圧は再び、温度に逆変換される。
【数５】
2011509070.tif 000007
【００９０】
８．収集された光学データは、電圧に変換され、プロッティングへ直接送られる。
【００９１】
データ通信：
データ通信モジュールは、ウインドウズモバイルブルートゥーススタックと通話する。以下のプロトコルが通信の間、フォローされる：
【００９２】
スタート：
アプリケーションプログラムによって設けられたスタートボタンが熱サイクリング工程を開始する。アプリケーションは、ブルートゥーススタックにハンドヘルドユニットとの無線シリアルポートコネクションを確立するよう要求する。認識を受けとった後、ＰＤＡは、ハンドヘルドユニットとの通信を開始する。
【００９３】
スタート／ポーズ／続行
ストップコマンドは、サーマルサイクリングをストップし、ハンドヘルドユニットにチップ温度を室温へ下げるよう指示する−この工程は、再スタートされない。ポーズは、チップ温度を現在のランニング温度に維持する。これは、続行コマンドにより取り消すことができる。
【００９４】
ＰＤＡのようなポータブル計算プラットフォームを使用することで、システムに電子機器を制御し、そしてデータを表示するために豊富だがシンプルなユーザーインターフェースを提供するための十分な計算力が与えられる。それは、また、全体のシステムモジュラーを作り、最小コストでユーザにシステムのアップグレードが可能になる。
【００９５】
本発明は、特定の診断用途のための市場性のあるハンドヘルドＰＣＲ装置を提供する。他の装置上で実行するプログラムは、リアルタイム検出とソフトウエア制御をもった完全なハンドヘルドＰＣＲシステムを提供する。
【００９６】
本装置を用いて熱容積を減少し、加熱／冷却速度を改善することにより、５〜２５μｌの適度な試料容積の場合でも３０〜４０サイクルの反応を終了するためにかかる２〜３時間の時間を、３０分以下に削減した。図１４は、本発明のＬＴＣＣチップを用いてＢ型肝炎ウイルス性ＤＮＡを増幅するのにかかる時間を示す。図１４の（１）に示すように、ＰＣＲを４５サイクル実行し、そして、４５分以内に増幅を達成できた。さらに、増幅は、ＰＣＲを２０分（２）及び１５分（３）で４５サイクル行った場合にも観測された。ＨＢＶ（４５サイクル）のための汎用のＰＣＲ期間は、約２時間要する。
【００９７】
ミニチュア化では、より小さい試料サイズでの正確な読み取りと、コスト高な試薬のより小容積の消費が可能になる。マイクロシステムの小さい熱容積及び小さい試料サイズによれば、迅速で低出力の熱サイクルが可能で、マイクロＰＣＲを介するＤＮＡ複製のような多くのプロセスのスピードをアップする。さらに、マイクロスケールでの利用可能な表面対容積比の増大により、表面化学に依存する化学プロセスを大いに高める。マイクロ流体の利点が、化学分析のための集積マイクロシステムの開発の要望を促している。
【００９８】
ハンドヘルド装置（１０９）内に移されたマイクロチップは、これにより、高度な研究室からＰＣＲ機械装置を除去し、それによりこの極めて強力な技術の範囲を増大させ、臨床診断、食品検査、血液バンクでの血液スクリーニング、他の用途分野でのホスト（ｈｏｓｔ）のためなる。
【００９９】
多数のリアクションチャンバを有する既存のＰＣＲ装置は、すべてが同一のサーマルプロトコルを実行し、したがって時間的に非能率的な多数のＤＮＡ実験サイトを提供する。反応時間及び試料容積の摂取量を最小化する必要がでてくる。
【０１００】
本ＰＣＲは、将来設計されるが、極めて迅速な熱応答を持つ装置のアレイを有し得、そして、多重反応を異なるサーマルプロトコロルを最小の混信をもって効率的かつ独立に実行し得るように隣接するＰＣＲチップと高度に孤立している。
【０１０１】
ＰＣＲ産物の分析又は定量化は、リアルタイム蛍光検出システムの実用的集積化によって実現する。このシステムは、また、Ｂ型肝炎（図１２）、ＡＩＤＳ、結核などのような疾患を検出するための定量化及びセンサシステムを用いて集積化される。他の市場には、食品モニタリング、ＤＮＡ分析、法科学及び環境モニタリングが含まれる。
【０１０２】
図８は、集積化ヒータ及びサーミスタを用いたチップ上のλ−６３６ＤＮＡ断片の溶解の比較プロットを示す。
【０１０３】
図９は、λ−３１１ＤＮＡの増幅に伴う蛍光シグナルの増大を示す。熱プロファイルは、ハンドヘルドユニットにより制御され、反応は、チップ上（３μｌの反応混合物及び６μｌのオイル）で行われた。蛍光を汎用のロックインアンプを用いてモニタした。
【０１０４】
本発明は、また、診断システムを提供する。診断システムを開発するために採用された手順は、初期には、二三の問題のためにサーマルプロトコルを規格化し、そして同一物をチップ上で機能化させるべきものであった。１６ＳリボソームＤＮＡのために設計されたプライマは、Ｅ．ｃｏｌｉ及びサルモネラ菌から〜３００−４００ｂｐ断片を増幅し、一方、サチライシン遺伝子（ｓｔｎ  ｇｅｎｅ）についてのプライマは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉから〜２００ｂｐ断片を増幅した。得られた産物を、ＳＹＢＲグリーン蛍光検出とアガロースゲル電気泳動で確認した。図９及び１３に、マイクロチップを用いて増幅したλ−３１１ＤＮＡ及びサルモネラ菌遺伝子のゲル写真を示す。
【０１０５】
λ−３１１ＤＮＡ増幅のための熱プロファイル：
変性：９４℃（９０秒）  
９４℃（３０秒）  −  ５０℃（３０秒）  −  ７２℃（４５秒）
伸長：７２℃（１２０秒）
【０１０６】
サルモネラ菌遺伝子増幅のための熱プロファイル：
変性：９４℃（９０秒）  
９４℃（３０秒）  −  ５５℃（３０秒）  −  ７２℃（３０秒）
伸長：７２℃（３００秒）
【０１０７】
処理血液及び血漿を用いたＰＣＲ
血液又は血漿を、試料から主要なＰＣＲ阻害物質を沈殿させることのできる沈殿剤で処理した。透明な上清を、テンプレートとして用いた。このプロトコルを用いて、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉから〜２００ｂｐ断片の増幅を得た（図１０）。図１０に、ゲル電気泳動写真を示す。
１．コントロール反応、
２．ＰＣＲ産物−血液（未処理）、
３．ＰＣＲ産物−処理血液、
４．ＰＣＲ産物−処理血漿
【０１０８】
血液直接ＰＣＲバッファ
血液又は血漿試料を用いた直接ＰＣＲのためにユニークバッファを配合した。このユニークバッファシステムを用いて、血液及び血漿を用いた直接ＰＣＲ増幅を達成した。本発明のＬＴＣＣチップを用いてこのバッファシステムを用いると、最高５０％の血液、及び４０％の血漿で増幅が達成された（図１１及び１２参照）。
図１１にゲル電気泳動写真を示す。
１．ＰＣＲ産物−２０％血液、
２．ＰＣＲ産物−３０％血液、
３．ＰＣＲ産物−４０％血液、  
４．ＰＣＲ産物−５０％血液、及び  
図１２にゲル電気泳動写真を示す。
１．ＰＣＲ産物−２０％血漿、
２．ＰＣＲ産物−３０％血漿、  
３．ＰＣＲ産物−４０％血漿、
４．ＰＣＲ産物−５０％血漿、
５．コントロール反応
【０１０９】
ユニークバッファは、バッファの塩、二価イオンを含有する塩化物又は硫酸塩、非イオン性界面活性剤、安定剤及び糖アルコールを含む。
【０１１０】
図１６は、λ−３１１ＤＮＡの溶解のための蛍光シグナルの微分のためのＬＴＣＣチップの溶解曲線を示す。図は、また、本発明（１６１）と汎用のＰＣＲ装置（１６２）との比較を提供する。
より鋭いピーク：ピーク値／幅（ｘ軸）＠ハーフピーク値＝１．２／４３
より浅いピーク：ピーク値／幅（ｘ軸）＠ハーフピーク値＝０．７／６３
【０１１１】
高い比率はより鋭いピークを示す。また、グラフにおいて、ｙ軸は、微分（溶解曲線の傾き）であり、より高い傾きは、より急峻な溶解を示す。
【０１１２】
図１９は、ハンドヘルド装置に採用し得るビームスプリッタ付き光学システムの一実施態様の説明を示す。蛍光検出システムは、ＬＥＤ光源（１９３）、光を焦点に合わせるレンズ（１９６）、特定波長の光を選択するためのバンドパスフィルタ（１９５）、ビームスプリッタ（１９１）、入射ビーム及びチップ（２００）上に投入された試料からのシグナルを集光するためのレンズ（１９８）、特定波長の光を選択するためのバンドパスフィルタ（１９４）、集光レンズ（１９７）及び光学検知器（１９２）を含む。
【０１１３】
図２０は、光ファイバ及びレンズを組み込んだハイブリッド光学システムの一実施態様の説明を示す。この蛍光検出システムは、図に記載されていないＬＥＤ光源を、光ファイバ（２１３）に結合した特定波長の光を選択するためのバンドパスフィルタを含む。光ファイバは、光を試料に指し向ける。光学的に好適なレンズは、光ファイバから出てくる光を試料上で焦点を合わせるために使用することができる。レンズ（２１２）は、チップ（２００）上に投入された試料からの放出ビームを阻害（ｃａｌｕｍｎｉａｔｅ）するのに使用することができる。放出光の特定波長を選択するためのバンドパスフィルタ（２１４）及びそれを光学検知器に焦点を合わせる集光レンズ（２１２）。
【図１】
2011509070.tif 000008
【図２】
2011509070.tif 000009
【図３】
2011509070.tif 000010
【図４】
2011509070.tif 000011
【図５】
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【図６】
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【図７】
2011509070.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2011509070.tif 000017
【図１１】
2011509070.tif 000018
【図１２】
2011509070.tif 000019
【図１３】
2011509070.tif 000020
【図１４】
2011509070.tif 000021
【図１５】
2011509070.tif 000022
【図１６】
2011509070.tif 000023
【図１７】
2011509070.tif 000024
【図１８】
2011509070.tif 000025
【図１９】
2011509070.tif 000026
【図２０】
2011509070.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月28日(2010.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ヒータ、及び試料を装填するリアクションチャンバを含むＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップ、
ｂ）温度センサから受け取った入力情報に基づいて、該ヒータを制御するためのヒータ制御手段、
ｃ）該試料からの蛍光シグナルを検出するための光学検知システム、並びに
ｄ）他の装置と通信するための少なくとも一の通信インターフェース
を含むハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置。
【請求項２】
該ヒータと該リアクションチャンバとの間に少なくとも一のコンダクタ層が設けられる、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
該リアクションチャンバは、コンダクタリングによって囲まれている、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
該コンダクタリングは、該コンダクタ層にポストで結合されている、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
該温度センサは、チップの温度を測定するために該チップの外部に置かれているか、あるいは該チップの少なくとも一の層の中に埋設されている、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
該温度センサは、ブリッジ回路の一のアームに結合され、該ブリッジ回路出力は、ヒータを制御するためのヒータ制御手段に供給される前に増幅される、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
該チップは、該リアクションチャンバにカバーをするための透明シーリングキャップを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
該光学検知システムは、光源及び光検出器を含み、ビームスプリッタ光学検知システム、ハイブリッド光学検知システム及び分岐光学検知システムを含む群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
該通信インターフェースは、シリアルインターフェース、ＵＳＢ、ブルートゥース又はこれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記他の装置は、ハンドヘルド装置からチップ温度及び増幅したシグナルを収集し、スマートフォン、ＰＤＡ及びプログラマブルデバイスを含む群から選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
ハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置をモニタ及び制御する方法であって、
ａ．ハンドヘルドマイクロＰＣＲ装置と他の装置との間の通信を、通信インターフェースを介して確立し、
ｂ．ＬＴＣＣマイクロＰＣＲチップを制御するために他の装置から受け取った熱プロファイル値に基づいて熱サイクリング工程を開始し、
並びに
ｃ．光学システムによって検知された光シグナルを他の装置へ送る
工程を含む前記方法。
【請求項１２】
該熱プロファイル値を他の装置へユーザによってユーザーインターフェースを介して供給し、生成、修正又は削除する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記他の装置は、ユーザの認証を備え、複数の熱プロファイルを記憶する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
該熱プロファイルは、セットポイント値及びサイクル数を提供し、セットポイント値により決められた温度と時間にチップを維持する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
熱サイクリング工程をストップすることによって、マイクロＰＣＲチップ温度を室温までもってゆき、そして熱サイクルをポーズするとき、マイクロＰＣＲチップの温度を一定に維持する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
熱及び光学データを他の装置の表示装置上にプロットする、請求項１１に記載の方法。
【国際調査報告】
2011509070.tif 000028