(57)【要約】本発明は、一般に金ナノクラスタ、および特に蛍光金ナノクラスタに関する。本金ナノクラスタは、例えばタンパク質または安定剤で、安定させることができる。場合により、本金ナノクラスタは、サンプル中の第二水銀イオンの存在、不在、および／または濃度を判定するための方法または物品に使用することができる。一部の実施形態において、本発明は、組成物を提供する。第一の実施形態において、組成物は、複数の金ナノクラスタと、タンパク質または安定剤とを含み、この場合の金ナノクラスタは、少なくとも１％の量子収率で約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で蛍光を放出することができる。
2011530699.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の金ナノクラスタと、
タンパク質または安定剤と
を含む組成物であって、
前記金ナノクラスタが、少なくとも１％の量子収率で約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で蛍光を放出することができる、組成物。
【請求項２】
複数の金ナノクラスタを形成するための方法であって、
金原子前駆体の複数の分子とタンパク質の複数の分子とを含む反応混合物を形成する工程（この場合、金原子前駆体の分子のタンパク質の分子に対する比率は、少なくとも約５：１である）；
前記反応混合物のｐＨを約１１より大きくなるように調整する工程；および
前記反応混合物を適する温度で十分な期間にわたって維持して、少なくとも１つのタンパク質分子によって安定化された複数の金ナノクラスタを形成する工程
を含み、
前記金ナノクラスタが、約２ｎｍ未満の平均直径を有する、方法。
【請求項３】
第二水銀イオンを検出する方法であって、
複数の金ナノクラスタとタンパク質または安定剤とを含む組成物を生じさせる工程；
第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルに前記組成物を曝露する工程；および
前記サンプルが第二水銀イオンを含むかどうかを判定する工程
を含む方法。
【請求項４】
第二水銀イオンを検出する方法であって、
複数の金ナノクラスタ（該金ナノクラスタは、少なくとも１％の量子収率で約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で第一の蛍光強度を有する）を生じさせる工程；
第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルを前記ナノクラスタに曝露し、前記蛍光強度の変化を判定する工程；および
前記サンプルが第二水銀イオンを含有するかどうかを前記蛍光強度の変化に基づいて判定する工程
を含む方法。
【請求項５】
第二水銀イオンを検出する方法であって、
式Ａｕ２５を有する複数の安定化金ナノクラスタを含む組成物を生じさせる工程；
第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルに前記組成物を曝露する工程；および
前記サンプルが第二水銀イオンを含むかどうかを判定する工程
を含む方法。
【請求項６】
サンプル中の第二水銀イオンの存在または不在を判定するための物品であって、
基質と、
前記基質と会合している組成物（この場合、該組成物は、金ナノクラスタとタンパク質または安定剤とを含む）と
を含む物品。
【請求項７】
金ナノクラスタが、約２５個の金原子を含む、前記いずれかの請求項に記載の組成物、方法または物品。
【請求項８】
前記タンパク質が、ウシ血清アルブミンである、前記いずれかの請求項に記載の組成物、方法または物品。
【請求項９】
前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、前記いずれかの請求項に記載の組成物、方法または物品。
【請求項１０】
前記タンパク質が、リゾチームである、前記いずれかの請求項に記載の組成物、方法または物品。
【請求項１１】
前記金ナノクラスタが、約２ｎｍ未満の平均直径を有する、前記いずれかの請求項に記載の組成物、方法または物品。
【請求項１２】
前記金ナノクラスタが、約１ｎｍ未満の平均直径を有する、前記いずれかの請求項に記載の組成物、方法または物品。
【請求項１３】
前記金ナノクラスタが、実質的に単分散である、前記いずれかの請求項に記載の組成物、方法または物品。
【請求項１４】
前記金ナノクラスタが、約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で蛍光を放出することができる、前記いずれかの請求項に記載の組成物、方法または物品。
【請求項１６】
前記金ナノクラスタが、少なくとも１％の量子収率で蛍光を放出することができる、前記いずれかの請求項に記載の組成物、方法または物品。
【請求項１７】
前記金ナノクラスタが、少なくとも３％の量子収率で蛍光を放出することができる、前記いずれかの請求項に記載の組成物、方法または物品。
【請求項１８】
前記金ナノクラスタが、約６％の量子収率で蛍光を放出することができる、前記いずれかの請求項に記載の組成物、方法または物品。
【請求項１９】
少なくとも３０℃で少なくとも２時間、前記反応混合物を加熱することを含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２０】
約３７℃で少なくとも約８時間、前記反応混合物を加熱することを含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２１】
前記金ナノクラスタを安定させる少なくとも１つのタンパク質分子のうちの１つ以上を安定剤で置き換える工程をさらに含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２２】
前記安定剤が、システインまたはグルタチオンである、前記いずれかの請求項に記載の組成物、方法または物品。
【請求項２３】
第二水銀イオンの検出限界が、約５ｎＭ未満である、前記いずれかの請求項に記載の方法または物品。
【請求項２４】
第二水銀イオンの検出限界が、約１ｎＭ未満である、前記いずれかの請求項に記載の方法または物品。
【請求項２５】
第二水銀イオンの検出限界が、約０．５ｎＭ未満である、前記いずれかの請求項に記載の方法または物品。
【請求項２６】
サンプルが第二水銀イオンを含むかどうかを判定する工程が、前記組成物または金ナノクラスタの蛍光の変化を判定する工程を含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２７】
Ａｇ＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｄ２＋、Ｐｔ４＋、Ｐｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｐｂ２＋、またはＣａ２＋から成る群より選択される金属イオンのうちの少なくとも１つへの曝露に基づく前記金ナノクラスタまたは組成物の蛍光強度の変化が、２０％未満である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプル中の第二水銀イオンの濃度の測定を判定することをさらに含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２９】
前記サンプル中の第二水銀イオンの濃度の測度が、前記組成物または金ナノクラスタの蛍光の変化に基づいて判定される、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプルが、環境源から採取される、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項３１】
前記基質が、ニトロセルロースを含む、前記いずれかの請求項に記載の物品。
【請求項３２】
前記反応混合物のｐＨが、約１２より大きくなるように調整される、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項３３】
前記反応混合物のｐＨが、その反応混合物に塩基を供給することによって調整される、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項３４】
前記塩基が、ＮａＯＨである、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、同時係属中の２００８年８月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１２９，９９４号に対して、米国特許法§１１９（ｅ）の下で、優先権の主張をする。この仮特許出願の内容は本明細書に参照として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に金ナノクラスタ、および特に蛍光金ナノクラスタに関する。本金ナノクラスタは、例えばタンパク質または安定剤で、安定させることができる。場合により、本金ナノクラスタは、サンプル中の第二水銀イオンの存在、不在、および／または濃度を判定するための方法または物品に使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
貴金属ナノクラスタ（ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒ：ＮＣ）は、概して、数個から数十個の金属原子から成り、一般に１ｎｍ未満のサイズである。金属ナノクラスタ中の自由電子の空間拘束によって、個別のおよびサイズを合せることができる電子遷移を生じさせることができ、その結果、発光および固有荷電特性などの分子様特性をもたらすことができる。寸法が大きく（例えば、おおよそ３から１００ｎｍ）、毒性金属種（例えば、カドミウム、鉛）を含有することがある半導体量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ：ＱＤｓ）とは対照的に、貴金属ナノクラスタは、それらの超微細サイズおよび非毒性のため、様々な用途（例えば、センシング）にとって魅力的である。多くの用途で、例えば第二水銀イオンの検出に、使用することができるだろう、赤外線または近赤外線を放出する蛍光金ナノクラスタを合成する方法および技術の開発は、興味深い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
第二水銀イオン（Ｈｇ２＋）の日常的検出は、環境および人間の健康に対するその有害作用のため、水生生態系での環境モニタリングに重要である。過去数年間に、第二水銀イオンの検出用の幾つかの光学センサシステムが、小有機分子（発蛍光団または発色団）、生体分子（タンパク質、抗体、オレゴヌクレオチド、ＤＮＡ酵素など）、および様々な材料（高分子材料または無機材料）に基づいて開発された。しかし、これらのシステムの多くは、単純性、感度、選択性に関して制約があり、および／または実際の用途が限定される（例えば、水生生態系に不適合）。
【０００５】
従って、改善された方法および材料が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
一部の実施形態において、本発明は、組成物を提供する。第一の実施形態において、組成物は、複数の金ナノクラスタと、タンパク質または安定剤とを含み、この場合の金ナノクラスタは、少なくとも１％の量子収率で約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で蛍光を放出することができる。
【０００７】
一部の実施形態において、本発明は、方法を提供する。第一の実施形態によると、複数の金ナノクラスタを形成するための方法は、金原子前駆体の複数の分子とタンパク質の複数の分子とを含む反応混合物を形成する工程（この場合、金原子前駆体の分子のタンパク質の分子に対する比率は、少なくとも約５：１である）、前記反応混合物のｐＨを約１１より大きくなるように調整する工程、および前記反応混合物を適する温度で十分な時間維持して、少なくとも１つのタンパク質分子によって安定化された複数の金ナノクラスタを形成する工程を含み、この場合の金ナノクラスタは、約２ｎｍ未満の平均直径を有する。
【０００８】
もう１つの実施形態において、第二水銀イオンを検出する方法は、複数の金ナノクラスタとタンパク質または安定剤とを含む組成物を生じさせる工程、第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルに前記組成物を曝露する工程、および前記サンプルが第二水銀イオンを含むかどうかを判定する工程を含む。さらにもう１つの実施形態において、第二水銀イオンを検出する方法は、複数の金ナノクラスタ（該金ナノクラスタは、少なくとも１％の量子収率で約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で第一の蛍光強度を有する）を生じさせる工程、第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルを前記ナノクラスタに曝露し、蛍光強度の変化を判定する工程、および前記サンプルが第二水銀イオンを含有するかどうかを前記蛍光強度の変化に基づいて判定する工程を含む。
【０００９】
場合により、第二水銀イオンを検出する方法は、式Ａｕ２５を有する複数の安定化金ナノクラスタを含む組成物を生じさせる工程、第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルに前記組成物を曝露する工程、および前記サンプルが第二水銀イオンを含むかどうかを判定する工程を含む。
【００１０】
一部の実施形態において、本発明は、物品を提供する。場合により、サンプル中の第二水銀イオンの存在または不在を判定するための物品は、基質と、該基質と会合している組成物とを含み、この場合の組成物は、金ナノクラスタとタンパク質または安定剤とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の非限定的実施形態による、ウシ血清アルブミンと会合している金ナノクラスタ（ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ）の形成の略図を示すものである。
【図２】図２Ａは、１つの実施形態による、（上部）可視光および（下部）ＵＶ線のもとでのＢＳＡ（１）粉末および（２）水溶液、ならびにＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ（３）水溶液および（４）粉末の写真を示すものである。図２Ｂは、（ｉ）ＢＳＡおよび（ｉｉ）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの水溶液の光学吸収（断続線）および光電子放出（実線、λｅｘ＝４７０ｎｍ）スペクトルを示すものである。挿入図は、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣについての約４８０ｎｍでの弱い吸収ピークを示すものである。
【図３】図３は、非限定的実施形態による、３７℃でのＨＡｕＣｌ４およびＢＳＡを含む反応混合物についての光電子放出スペクトル（λｅｘ＝４７０ｎｍ）の時間発展を示すものである。
【図４】図４Ａは、（ｉｉｉ）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ中のＡｕ  ４ｆのＸＰＳスペクトル、ならびに図４Ｂは、（ｉｖ）ＢＳＡおよび（ｖ）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示すものである。図４Ｃは、非限定的実施形態による、空気中でのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ粉末のＴＧＡ分析を示すものである。
【図５】図５は、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの代表ＴＥＭ画像を示すものである。
【図６】図６は、非限定的実施形態による、（ｉ、または黒色）ＢＳＡおよび（ｉｉ、または灰色）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの（Ａ）ＤＬＳヒストグラム、（Ｂ）フーリエ変換赤外（Ｆｏｕｒｉｅｒ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｉｎｆｒａｒｅｄ：ＦＴＩＲ）スペクトル、（Ｃ）ゼータ電位の結果、ならびに（Ｄ）遠ＵＶ円偏光二色性（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ：ＣＤ）スペクトルを示すものである。（Ａ）中の挿入図は、（ｉｉ）ＢＳＡ（ＦＩＴＣ色素で標識したもの）および（ｉ）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの（ＵＶ線下での）電気泳動データを示すものである。
【図７】図７は、（０）ＢＳＡ、（１）最適化条件下で合成したＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ、（２）ＮａＢＨ４を用いて合成したＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ、（３）ＮａＯＨなしで合成したＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ、（４）１００℃で合成したＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ、および（５）低ＢＳＡ濃度で合成したＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣについての（Ａ）可視光および（Ｂ）紫外線のもとでの写真、（Ｃ）光学吸収スペクトル、ならびに（Ｄ）光電子放出スペクトル（λｅｘ＝４７０ｎｍ）を示すものである。
【図８】図８は、ＮａＯＨなしで合成したＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの代表ＴＥＭ画像を示すものである。
【図９】図９は、（Ａ）光電子放出スペクトル（λｅｘ＝４７０ｎｍ）、ならびに（Ｂ）Ｈｇ２＋イオン（５０ｍＭ）の（１）不在および（２）存在下でのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ（２０ｍＭ）についてのＵＶ線のもとでの写真、ならびに（Ｃ）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの蛍光消光に基づくＨｇ２＋センシングの略図を示すものである。
【図１０】図１０は、（Ａ）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣにより封鎖されたＨｇイオンおよび（Ｂ）ＮａＢＨ４によって還元された封鎖ＨｇイオンについてのＸＰＳ  Ｈｇ  ４ｆスペクトルを示すものである。
【図１１】図１１は、Ｈｇ２＋イオンの存在下でのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの代表ＴＥＭ画像を示すものである。
【図１２】図１２は、（Ａ）ポリスチレンビーズに結合させたＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの略図、および（Ｂ）ポリスチレンビーズに結合させたＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの代表蛍光画像を示すものである。
【図１３】図１３は、５０ｍＭの様々な金属イオンの存在下でのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ水溶液（２０ｍＭ）についての（Ａ）ＵＶ線のもとでの写真、および（Ｂ）λｅｘ＝４７０ｎｍでの相対蛍光（Ｉ／Ｉ０）を示すものである。
【図１４】図１４Ａは、異なるＨｇ２＋濃度の存在下でのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ（２０ｎＭ）の光電子放出スペクトル（λｅｘ＝４７０ｎｍ）、および図１４Ａは、Ｈｇ２＋濃度の関数としてのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの相対蛍光（Ｉ／Ｉ０）を示すものである。図１４Ｃは、１〜２０ｎＭのＨｇ２＋についての線形検出範囲を示すものである。
【図１５】図１５Ａは、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣを有するテストストリップの、該テストストリップを５０ｍＭの様々な金属イオンの溶液に浸漬した後の、ＵＶ線のもとでの写真を示すものである。図１５Ｂは、Ｈｇ２＋の溶液に浸漬したテストストリップの（ＵＶ線のもとでの）写真を示すものである。
【図１６】図１６は、（ｉ）ＢＳＡ、（ｉｉ）ヒト血清アルブミンおよび（ｉｉｉ）リゾチームを使用して合成したＡｕ−ＮＣの水溶液の光電子放出（λｅｘ＝４７０ｎｍ）スペクトルを示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
これらの添付の図面に関連して考えれば、以下の詳細な説明から本発明の他の態様、実施形態および特徴が明らかになるであろう。これらの添付の図は、略図であり、正確な尺度で描くことを意図したものではない。当業者が本発明を理解できるようにするために図示が必要でない場合には、わかりやすさのために、すべての図においてすべての成分の名を表示しておらず、本発明の各実施形態のすべての成分の名を表示してもいない。参照により本明細書に援用されているすべての特許出願および特許は、それら全体が参照により援用されている。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が支配することとなる。
【００１３】
本発明は、一般に、金ナノクラスタを含む方法、組成物および物品に関する。場合により、本金ナノクラスタは、蛍光性であり、および高い量子収率で赤色エネルギーを放出する。本金ナノクラスタは、例えば本明細書に記載するようなタンパク質または安定剤によって、安定させることができる。本発明の一部の態様は、例えば水銀の検出のための、本金ナノクラスタを含む用途に関する。
【００１４】
一部の実施形態において、金ナノクラスタは、複数の金原子を含む。用語「ナノクラスタ」は、本明細書において用いられる場合、当該技術分野におけるその通常の意味が与えられたものであり、数個から数十個の金属原子を含むクラスタを指す。場合により、ナノクラスタは、ほぼ約２個と約３０個の間の会合した金原子を含むことがある。特別な場合、ナノクラスタは、約２５個の金原子を含む。当業者は、ナノクラスタが含む金属原子の近似数を決定する方法（例えば、質量分光法）を知っているであろう。場合により、ナノクラスタは、ゼロより高い酸化状態の金原子（例えば、Ａｕ＋、Ａｕ＋３）を少なくとも１個含むことがある。このゼロより高い酸化状態の少なくとも１個の金原子の存在は、本明細書に記載するような第二水銀イオンの検出のための金ナノクラスタの用途において、重要な特徴であり得る。
【００１５】
一部の実施形態において、本発明の金ナノクラスタは、発光性であり得る。発光材料は、特定量の電磁放射線を吸収して、その材料に励起状態構造を実現させるおよび場合により放射線を放出させることができる材料を指す。放出される放射線が、発光であり得、この場合、「発光」は、紫外線または可視放射の放出と定義する。発光の特定のタイプとして、可視放射の吸収と放出の間の時間間隔が１０−１２から１０−７秒にわたる「蛍光」が挙げられる。場合により、光源への露光により、本発明の金ナノクラスタは蛍光エネルギーを放出することができる。当業者に公知の方法を用いてその放出蛍光エネルギーを検出することができる。場合により、その放出蛍光エネルギーの強度および／または波長がサンプルについての情報を与え、それを、本明細書において説明するように分析することができる。
【００１６】
一部の実施形態において、金ナノクラスタは、約７００ｎｍと約６３０ｎｍの間、約６８０ｎｍと約６４０ｎｍの間、約６７５ｎｍと約６５０ｎｍの間、または約６４０ｎｍ、約６５０ｎｍ、約６６０ｎｍ、約６７０ｎｍ、約６８０ｎｍ、約６９０ｎｍもしくは日光の波長で、光を放出するおよび／またはλｍａｘ放出（例えば、最大放出の波長）を有することがある。すなわち、一部の実施形態において、前記金ナノクラスタは、ＵＶ線のもとで赤色エネルギーを放出するおよび／または赤色に見えることがある。しかし、場合により、前記ナノクラスタは、近ＩＲ領域（例えば、約７００ｎｍと約１４００ｎｍの間）または他の可視光波長領域（例えば、約４００ｎｍと約６３０ｎｍの間）で光を放出するおよび／またはλｍａｘ放出を有することがある。当業者は、複数の金ナノクラスタの放出光および／またはλｍａｘ放出を判定するための方法および技術を知っているであろう。例えば、蛍光分光法を用いて、金ナノクラスタを分析することができる。そのような分析では、金ナノクラスタを光源（例えば、紫外線）に露光し、この光が一定の分子内の電子を励起させ、その結果、より低いエネルギーの光（例えば、可視光）が放出される。
【００１７】
一部の実施形態では、金ナノクラスタを含む組成物の量子収率を決定することができる。量子収率は、その組成物によって吸収される光子の、その組成物によって蛍光により放出される光子に対する比率である。一部の実施形態において、金ナノクラスタを含む組成物は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、またはそれ以上の量子収率で、エネルギーを放出するおよび／またはλｍａｘ放出を有することがある。場合により、量子収率は、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、または約３％と約１０％の間、約４％と約９％の間、もしくは約５％と約８％の間である。当業者は、組成物の量子収率を決定する方法を知っているであろう。一部の実施形態において、前記金ナノクラスタは、少なくとも１％の量子収率で約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で、または本明細書に記載する値の任意の他の組み合わせで、蛍光を放出する（またはλｍａｘ放出を有する）ことがある。
【００１８】
場合により、ナノクラスタは、約０．１ｎｍと約２ｎｍの間、約０．１ｎｍと約１ｎｍの間、約０．１ｎｍと約０．５ｎｍの間、約０．５ｎｍと約１ｎｍの間、またはこれらに類するｎｍの平均直径を有することがある。一部の事例では、前記ナノクラスタは、約２ｎｍ未満、約１．５ｎｍ未満、約１ｎｍ未満、約０．５ｎｍ未満、約０．１ｎｍ未満、またはこれらに類するｎｍの平均直径を有することがある。ナノクラスタ集団の「平均直径」は、本明細書において用いられる場合、そのナノクラスタの直径の算術平均である。当業者は、ナノクラスタ集団の平均直径を決定する方法および技術、例えばレーザー光散乱、動的光散乱（または光子相関分光法）、透過電子顕微検査（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：ＴＥＭ）などの使用、を知っているであろう。
【００１９】
一部の実施形態において、前記ナノクラスタは、多分散であることもあり、実質的に単分散であることもあり、または単分散である（例えば、直径の均一な分布を有する）こともある。複数のナノクラスタは、該ナノクラスタが、それらの小滴の約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、またはそれ以下より多くが該ナノクラスタ全部についての平均直径の約２０％、約３０％、約５０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、またはそれ以上より大きいまたは小さい直径を有さないような直径の分布を有する場合、実質的に単分散である。一部の実施形態において、前記ナノクラスタは、実質的に球形である。しかし、他の実施形態において、前記ナノクラスタは、球形、三角柱、立方体、板（例えば、三角形、正方形、円形、長方形の板）、またはこれらに類するものをはじめとする様々な形状を含むことがある。
【００２０】
一部の実施形態では、金ナノクラスタを、例えば、タンパク質および／または安定剤と会合させ、それによって金ナノクラスタとタンパク質および／または安定剤とを含む組成物を形成することにより、安定させることができる。場合により、前記タンパク質は、本明細書において説明するように、金ナノクラスタの形成を助長することもある。前記会合は、例えば、金ナノクラスタとタンパク質または安定剤との（例えば、タンパク質の残基と金原子またはイオンとの）少なくとも１つの相互作用の形成を含むことがある。場合により、前記相互作用は、イオン結合、共有結合（例えば、炭素−炭素、炭素−酸素、酸素−ケイ素、硫黄−硫黄、リン−窒素、炭素−窒素、金属−酸素、または他の共有結合）、水素結合（例えば、ヒドロキシル、アミン、カルボキシル、チオール、および／または同様の官能基間の水素結合）、供与結合（例えば、金属イオンと単座または多座配位子との錯化またはキレート化）、ファンデルワールス相互作用、ならびにこれらに類するものであり得る。一部の実施形態において、前記相互作用は、共有結合ではない。安定化金ナノクラスタを合成するための方法および適するタンパク質または安定剤を決定するための方法を本明細書において説明する。
【００２１】
一部の実施形態において、本発明は、金ナノクラスタを合成するための方法を提供する。場合により、方法は、タンパク質と金原子前駆体とを含む反応混合物を形成する工程、その後、その反応混合物のｐＨを調整する工程を含む。前記反応混合物を、本明細書において説明するように、適する温度で十分な期間にわたって維持して複数の金ナノクラスタを形成することができる。形成された金ナノクラスタを、本明細書に記載するような１つ以上の特性（放出される蛍光の波長、量子収率、平均直径など）によって特性づけすることができる。
【００２２】
理論により拘束されることを望まないが、タンパク質の存在が金ナノクラスタの形成を助長することもある。一例として、あるタンパク質分子は、複数の金イオンを（例えば、金イオンとチロシンなどのタンパク質に含まれる残基との会合により）封鎖し、その結果、そのタンパク質の中に複数の金イオンを捕捉することができる。このとき、そのタンパク質がそれらの金イオンを分子の金原子に還元する場合があり、および（例えば、金原子はタンパク質の中に捕捉されているため）金原子の互いの近接が金ナノクラスタを形成させる場合がある。一部の事例では、それぞれのタンパク質が、同数の金イオンと会合する可能性が高いだろうという理由で、形成される複数の金ナノクラスタは、実質的に単分散、または単分散であり得る。一部の実施形態において、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つなど）のタンパク質分子は、金ナノクラスタの形成後にその金ナノクラスタと会合したままである（例えば、それによって、安定化金ナノクラスタを形成する）ことがある。場合により、少なくとも１つのタンパク質の少なくとも一部を、本明細書に記載するような安定剤で置き換えることができる。
【００２３】
特定の例では、金原子前駆体を含む（例えば、Ａｕ（ＩＩＩ）イオンを含む）溶液を、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）を含む溶液に添加して、反応混合物を形成することがある。この実施形態において、ＢＳＡ分子は、金イオンを封鎖し、それらを捕捉することができる（例えば、図１参照）。反応混合物のｐＨを１１より高くなるように調整することにより、ＢＳＡ分子の還元能力を活性化することができる。捕捉された金イオンを還元して金ナノクラスタを形成することができ、この場合の金ナノクラスタは、ＢＳＡ分子によって安定化されている。
【００２４】
場合により、タンパク質と金原子前駆体とを含む反応混合物を形成することがある。タンパク質の溶液を、金原子前駆体の溶液に添加することもあり、または金原子前駆体の溶液をタンパク質の溶液に添加することもある。場合により、タンパク質と金原子前駆体を固体として混合し、その後、溶剤を添加することがある。反応に干渉しない任意の適する溶剤（例えば、水）で溶液を形成することができる。前記溶液は、約０．１Ｍと約１０Ｍの間、約０．５Ｍと約５Ｍの間、約０．５Ｍと約２Ｍの間、または約１Ｍ、約２Ｍ、約３Ｍ、約４Ｍ、もしくはこれらに類するＭのモル濃度を有することがある。
【００２５】
一部の実施形態において、金原子前駆体の分子のタンパク質の分子に対する比率は、ナノ粒子と比較してナノクラスタの形成を可能にする方法の重要な特徴である。理論により拘束されることを望まないが、この比率は、タンパク質分子に対する金原子前駆体分子の数および凝集に影響するため、重要な特徴であるとみなされる（例えば、表１に示す結果を参照のこと）。
【００２６】
さて、金原子前駆体の分子のタンパク質の分子に対する適切な比率を決定する方法を、さらに詳細に説明しよう。一部の実施形態において、金原子前駆体分子のタンパク質の分子に対する適切な比率は、そのタンパク質中のシステインおよびチロシン残基の比率を決定することによって、決定することができる。一部の実施形態において、タンパク質に含まれるシステインおよびチロシン残基の金原子前駆体の数に対する比率は、約１：１と約５０：１の間、約１：１と約２５：１の間、約５：１と約１５：１の間、またはそれらの中の任意の範囲である。特定の実施形態において、前記比率は、約１０：１である。システインおよびチロシン残基の比率から、金原子前駆体の分子のタンパク質の分子に対する比率を決定することができる。例えば、システインおよびチロシン残基の金原子前駆体に対する比率が１０：１になるように選択し、そのタンパク質が５０個のシステインおよびチロシン残基を含む場合、金原子前駆体のタンパク質に対する分子の比率は、約５：１である。場合により、金原子前駆体の分子のタンパク質の分子に対する比率は、少なくとも約３：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約１２：１、少なくとも約１５：１、少なくとも約２０：１またはそれ以上である。場合により、前記比率は、約５：１と約２０：１の間、約８：１と約１５：１の間、およびこれらに類するものである。
【００２７】
本発明での使用に適するタンパク質としては、複数（例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０など）のシステインおよび／またはチロシン残基を含むタンパク質が挙げられる。タンパク質の非限定的な例としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン、リゾチーム、およびこれらに類するものが挙げられる。
【００２８】
本明細書において用いられる場合の金原子前駆体は、ゼロより高い酸化状態の金（例えば、Ａｕ＋、Ａｕ＋３）を含む、および（例えば、そのタンパク質によって）還元されて金原子を形成することができる、前駆物質を指す。当業者は、適切な金原子前駆体、例えばＨＡｕＣｌ４、ＡｕＣｌ３およびＡｕＢｒ３、を知っているであろう。場合により、金原子前駆体は、水和されている（例えば、水を含む）ことがある。
【００２９】
金原子前駆体とタンパク質とを含む反応混合物を形成した後、その反応混合物のｐＨを、例えばその反応混合物への塩基の添加によって、調整することができる。前記塩基は、前記反応混合物の形成の直後、または約１分、約２分、約３分、約５分、約１０分、もしくはこれらに類する時間の後、添加することができる。前記塩基は、任意の適する塩基（例えば、ＮａＯＨ）であってよく、ならびに前記塩基を任意の適切なモル濃度（例えば、約０．１Ｍ、約０．５Ｍ、約１Ｍ、約２Ｍ）および量で添加して、望みどおりにｐＨを調整することができる。場合により、添加する塩基の量は、前記反応混合物のｐＨが少なくとも約１０．５、少なくとも約１１、少なくとも約１１．５、少なくとも約１２、少なくとも約１３、またはそれ以上になるように調整されるような量であり得る。場合により、前記反応混合物のｐＨは、約１１と約１４の間、約１２と約１４の間、またはこれらに類するものであり得る。理論により拘束されることを望まないが、一部の実施形態において、前記反応混合物のｐＨは、本発明の重要な特徴であり得る。前記反応混合物のｐＨは、タンパク質に含まれる残基（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基中のカルボキシル基、システイン中のチオール基、リシン中のアミン基、など）のプロトン化または脱プロトン化に影響を及ぼし、その結果、そのタンパク質の構造および反応性に影響を及ぼすからである（例えば、表１に示す結果を参照のこと）。
【００３０】
選択したレベルに前記反応混合物のｐＨを調整した後、その反応混合物を適する温度で十分な期間にわたって維持して、複数の金ナノクラスタを形成することができる。前記反応混合物をこの期間の間、かき混ぜる（例えば、攪拌する、振盪する）こともある。当業者は、適切な反応温度および反応時間を決めることができるであろう。例えば、タンパク質の分解または失活が起こらないように、その温度を選択することができる。もう１つの例として、妥当な時間量の範囲内で（例えば、約４８時間未満、約２４時間未満、約１２時間未満など）反応が進行するように、反応の温度を選択することができる。場合により、制限反応物の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、またはそれ以上が消費されるまで、反応を行うことができる。当業者に公知の方法および／または技術（例えば、光電子放出スペクトル、核磁気共鳴など）を用いて、その反応の進行を判定することができる。
【００３１】
一部の実施形態では、前記反応混合物を周囲温度で、周囲温度より上で、または周囲温度より下で維持することがある。場合により、前記反応は、周囲温度より高い温度、例えば、約３０℃で、約３５℃で、約３７℃で、約４０℃で、約５０℃で、約６０℃で、約８０℃で、約１００℃で、またはそれ以上で維持することがある。場合により、前記反応を約３０℃と約４０℃の間、約２５℃と約４０℃の間、約２５℃と約５０℃の間、約３０℃と約１００℃の間、またはこれらに類する温度で行うことがある。
【００３２】
前記反応混合物を適する温度で、約０時間と４８時間の間、約２時間と約２４時間の間、約４時間と約１８時間の間、約８時間と約１２時間の間、または約１時間、約２時間、約４時間、約８時間、約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３６時間、または約４８時間、またはそれ以上維持することがある。
【００３３】
一部の実施形態において、少なくとも１つのタンパク質分子と会合している金ナノクラスタの形成後、前記少なくとも１つのタンパク質分子のうちの１つ以上を安定剤で置き換えることができる。場合により、前記タンパク質分子の本質的にすべてを安定剤によって置き換えることができる。一部の実施形態では、安定剤の複数の分子を、タンパク質安定化金ナノクラスタを含む溶液に供給することがあり、この場合、前記安定剤は、前記タンパク質と比較して前記金ナノクラスタに対するほうが大きな親和性を有する。それ故、それぞれの金ナノクラスタと会合しているタンパク質分子の少なくとも一部分を、少なくとも１つの安定剤の分子によって置き換えることができる。場合により、前記少なくとも１つの安定剤は、タンパク質の置換後、金ナノクラスタと会合したままであることがある。例えば、一部の実施形態では、システインまたはグルタチオンなどの化学的キャッピング剤を使用して、タンパク質分子を抽出することができる。安定剤と金ナノクラスタの会合後、安定剤によって安定している金ナノクラスタからタンパク質分子を、例えば濾過、洗浄および／または遠心分離によって、分離することができる。
【００３４】
前記ナノクラスタを任意の期間保管することができ、または本明細書において論じる用途のうちの１つに直ちに使用することができる。前記ナノクラスタは、保管１ヶ月につき１０％以下の機能喪失、または保管１ヶ月につき５％以下、またはさらに２％、の機能喪失で、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約５日、少なくとも約１０日、少なくとも約１ヶ月、少なくとも約３ヶ月、少なくとも約６ヶ月、または少なくとも約１年間、保管することができる。本明細書に記載するようなナノクラスタは、様々な条件下で保管することができる。一部の事例において、前記ナノクラスタは、周囲条件で、および／または空気雰囲気下で保管されることがある。他の事例において、前記ナノクラスタは、真空下で保管されることがある。さらに他の事例において、前記ナノクラスタは、凍結乾燥されることがある。
【００３５】
本明細書に記載するような金ナノクラスタは、様々なシステム／装置に含めることができ、および／または特定用途のための様々な方法に使用することができる。例えば、ターゲット環境中の化学種を定性的におよび／または定量的に判定するために使用することができる電気または化学センシング装置において前記金ナノクラスタを使用することができる。すなわち、前記金ナノクラスタは、前記化学種と相互作用できるので、それらの金ナノクラスタの特性の変化を判定して、サンプル中に存在する種の存在、不在および／または量を判定することができる。もう１つの例として、前記金ナノクラスタを触媒におよび／または生物学的用途において用いることもできる。
【００３６】
一部の実施形態において、本発明は、サンプル中の第二水銀イオン（Ｈｇ＋２）を定性的におよび／または定量的に判定するための方法および／またはシステムを提供する。水銀は、広範囲に及ぶ汚染物質であり、Ｈｇ＋２は、高い細胞毒性を有する腐食性および発癌性物質である。Ｈｇ＋２の検出方法は、環境サンプルの分析に特に有用である。場合により、第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルへの曝露前および後に、複数の金ナノクラスタの特性（例えば、蛍光）を判定することがある。その特性の変化を判定し、それによって、その分析物がそのサンプル中に存在するかどうかを定量的に（例えば、校正曲線との比較により）または定性的に（例えば、その特性の増加もしくは減少により）判定することができる。
【００３７】
一部の実施形態では、水銀イオン（Ｈｇ＋２）の存在を、複数の金ナノクラスタの特性のオン／オフ分析により定量的に判定することができる。場合により、前記検出メカニズムは、水銀イオンが不在である場合に複数の金ナノクラスタが蛍光放出（または他の測定可能な特性）を生じさせることができる、「ターンオフ」検出メカニズムであることもある。第二水銀イオンが存在する場合、複数の金ナノクラスタは、少なくとも１つの第二水銀イオンと相互作用することができるので、実質的に低減された蛍光放出（もしくは他の測定可能な特性）が観察されるまたは蛍光放出（もしくは他の測定可能な特性）が観察されない消光状態すなわち暗い状態が発生し得る。
【００３８】
一部の実施形態において、第二水銀イオンを検出する方法は、複数の金ナノクラスタを（例えば、本明細書に記載するように）生じさせる工程、および第一の蛍光強度（または他の測定可能な特性）を判定する工程を含む。その後、前記複数の金ナノクラスタを、第二水銀イオンを含有するまたは含有する疑いのあるサンプルに曝露することができ、第二の蛍光強度を判定することができる。そのサンプル中の第二水銀イオンの存在、不在、および／または濃度を、第一と第二の蛍光（または他の測定可能な特性）間の差を判定することによって、判定することができる。一部の実施形態では、第一と第二の蛍光強度間の差を相対蛍光（例えば、第一の蛍光強度で割った第二の蛍光強度）として判定することができる。その相対蛍光を校正曲線と比較して、サンプル中の第二水銀イオンの濃度を決定することができる。
【００３９】
当業者は、材料（例えば、金ナノクラスタを含む組成物）の蛍光を判定するための方法および技術を知っているであろう。一部の実施形態では、第一の波長の光によって材料を励起させることができ、その材料は、より低いエネルギーの第二の波長（例えば、より長い波長）のエネルギーを放出することができる。場合により、本明細書に記載するような材料および組成物を、約３００ｎｍ未満、約３００ｎｍと約５００ｎｍの間、約４００ｎｍと約５００ｎｍの間、または約４２０ｎｍ、約４３０ｎｍ、約４４０ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４６０ｎｍ、約４７０ｎｍ、約４８０ｎｍ、約４９０ｎｍ、またはこれらに類するｎｍの波長を有する光に露光することがある。特定の実施形態において、前記光は、約４７０ｎｍの波長を有する。前記組成物は、本明細書に記載するような（例えば、約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の）波長を有するエネルギーを放出することができる。
【００４０】
場合により、前記方法は、複数の金ナノクラスタとタンパク質および／または安定剤とを含む組成物を生じさせる工程、第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルに前記組成物を曝露する工程、および前記サンプルが第二水銀イオンを含むかどうかを（例えば、前記組成物の少なくとも１つの特性の変化を判定することにより）判定する工程を含むことがある。
【００４１】
本発明の方法は、低濃度レベルでのサンプル中の第二水銀イオンの検出を可能にすることができる。最近の理論研究は、閉殻金属原子間の分散力が特異的であり、強力であり、および特に、これらの相互作用がＨｇ２＋（４ｆ１４５ｄ１０）およびＡｕ＋（４ｆ１４５ｄ１０）などの重イオンを伴うとき、相対論的効果によって大いに拡大されることを示唆している。理論により拘束されることを望まないが、本明細書に記載するようなＡｕ−ＮＣの表面は少量のＡｕ＋を含み、それがＨｇ２＋との強い特異的な相互作用を可能にし、その結果、低い検出限界をもたらすと考えられる。一部の実施形態において、本明細書に記載する方法は、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．１ｎＭ未満、または約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．１ｎＭ、もしくはこれらに類するｎＭの、サンプル中の第二水銀イオンの検出限界を有することができる。
【００４２】
場合により、第二水銀イオンを検出するための方法および物品は、第二水銀イオンに特異的であることがある。すなわち、前記方法および物品は、他の金属イオン、例えば、Ａｇ＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｄ２＋、Ｐｔ４＋、Ｐｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｐｂ２＋、およびＣａ２＋イオンより第二水銀イオンを特異的に検出することができる。この特異性は、サンプルを環境源から採取する場合（例えば、サンプルが他の金属イオンを含有する可能性が高い場合）、有利である。場合により、Ｈｇ＋２以外の少なくとも金属イオンへの曝露に基づく前記金ナノクラスタまたは組成物の蛍光強度（または他の特性）の変化は、約３０％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約３％未満、約１％未満などである。加えて、第二水銀イオンを検出するための方法および物品は、サンプル中に含有されることがある様々なアニオン（例えば、Ｃｌ−、ＮＯ３−、ＳＯ４２−、ＰＯ４３−、および緩衝剤（例えば、２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル）エタンスルホン酸））に対して強いだろう。
【００４３】
一部の実施形態では、サンプル中の第二水銀イオンの存在、不在、および／または濃度を判定するための物品を提供することができる。場合により、前記物品は、基質および組成物を含むことがあり、前記組成物は前記基質と会合している。前記組成物は、金ナノクラスタと、タンパク質または安定剤（例えば、本明細書に記載するようなもの）とを含むことがある。
【００４４】
一部の実施形態において、前記物品は、第二水銀イオンを含む疑いのある溶液に曝露することができるテストストリップである場合がある。前記テストストリップは、第二水銀イオンへの曝露に基づき蛍光放出（または他の特性）の変化を有することができる組成物（例えば、金ナノクラスタとタンパク質または安定剤とを含むもの）を含むことができる。一部の実施形態において、前記蛍光放出（または他の特性）の変化によって、第二水銀イオンがサンプル（例えば、本明細書に記載するもの）中に存在するかどうかを定量的におよび／または定性的に判定することができる。前記テストストリップは、任意の適するサイズおよび／または形状（例えば、正方形、長方形、円形など）であり得る。場合により、前記テストストリップのサイズは、一般に使用される実験用ガラス器具（例えば、試験管）の口にうまく入れることができるようなサイズだろう。
【００４５】
場合により、サンプル中の第二水銀イオンの存在、不在および／または濃度を判定するための少なくとも１つのテストストリップとカラー（または他の特性）リファレンスとを含むキットを提供することができる。場合により、第二水銀イオンを含有する疑いのあるまたは含有するサンプルへの曝露後にテストストリップの色を比較するために、そのカラーリファレンス上に与えられている色を用いることがある。場合により、テストストリップの蛍光色（例えば、ＵＶ線のもとで観察されるテストストリップの色）を比較するために、そのカラーリファレンスの色を用いることがある。第二水銀イオンを含有するまたは含有する疑いのあるサンプルにテストストリップを曝露した後、そのテストストリップの色をカラーリファレンスと比較して、第二水銀イオンの存在もしくは不在を判定することができ、および／またはサンプル中の第二水銀イオンの近似的濃度を判定することができる。例えば、テストストリップが定性的に機能する事例では、カラーリファレンスは、第二水銀イオンを含まないサンプルへの曝露に基づき、テストストリップの色を示すことがある。従って、サンプルへの曝露後にそのテストストリップが、カラーリファレンスとは異なる色を有する場合、そのサンプルは水銀を含む。テストストリップが定量的に機能する事例では、カラーリファレンスは、それぞれの色がサンプル中の第二水銀イオンの近似的濃度と符合する、複数の色を示すことがある。従って、サンプルへの曝露後、テストストリップの色を比較し、カラーリファレンス上の最も近い色と照合し、それによってサンプル中の第二水銀イオンの近似的濃度を示すことができる。当業者は、カラーリファレンスの適切な色（単数または複数）を決定する方法および技術（例えば、第二水銀を含むサンプルの様々な既知濃度にテストストリップを曝露することによる）を知っているであろう。前記キットは、使用のための説示をさらに含むことがある。カラーリファレンスは、テストストリップから完全に独立して提示されることもあり、またはテストストリップに付随することもある。
【００４６】
前記組成物を任意の適する基質と会合させて、本発明によるテストストリップを生じさせることができる。一部の実施形態において、前記基質材料は、前記金ナノクラスタと会合しているまたは前記組成物に含まれているタンパク質または安定剤と会合することができる材料を含むことがある。基質の非限定的な例としては、セルロース系および非セルロース系材料、例えば、ニトロセルロース；紙；綿、レーヨン、麻、ジュートなどの材料から製造された天然または合成繊維、糸およびヤーン；竹繊維；酢酸セルロース；カルボキシメチル化溶剤紡糸セルロース繊維；またはこれらの組み合わせなどが挙げられる。一部の実施形態において、前記基質は、ポリマー、例えばポリエステル、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリアセテートなど、またはそれらの組み合わせを含むことがある。前記基質は、多孔質である場合もあり、または無孔質である場合もある。例えば、前記組成物を前記基質の表面にコーティングすることができ、またはそれに含浸させることができる。前記基質は、軟質である場合があり、および／または硬質である場合がある。
【００４７】
本発明のテストストリップを作製する際、当業者に公知の技術を用いて適する基質に組成物を塗布することができる。本発明の実施形態において、テストストリップの作製は、基質に塗布することができるコーティング可能な液体組成物を調製する工程を含む。一般に、前記液体組成物は、複数のＢＳＡ会合金ナノクラスタを溶剤に添加することによって調製する。その基質を使用前に（例えば、周囲温度で、高温で、真空下で）乾燥させることができる。一部の実施形態では、追加の成分（例えば、界面活性剤、結合剤など）が存在することがある。
【００４８】
任意の適する源からサンプルを採取することができる。一部の実施形態において、前記サンプルとしては、化学的サンプル、水サンプル、抽出物、環境サンプル（例えば、環境源からのもの）、食品などを挙げることができる。一部の実施形態において、前記サンプルは、第二水銀イオンを含有するまたは含有する疑いがある場合がある。前記サンプルをその源から採取したそのままで使用することもあり、またはそのサンプルの少なくとも１つの特性を変性するように前処理することもある。前処理方法は、濾過、蒸留、濃縮、緩衝成分の不活性化、および／または試薬の添加を含む場合がある。一部の実施形態では、前記サンプルを（例えば、第二水銀イオンの濃度が高すぎて、校正曲線またはカラーリファレンスとの単純比較によって判定できない場合）希釈することもあり、または濃縮することもある。
【００４９】
次の参考文献は、参照により本明細書に援用されている：Ｙｉｎｇらによる「Ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｅｔａｌ  ｎａｎｏｃｌｕｓｔｅｒｓ」と題する２００８年８月５日出願の米国特許仮出願番号６１／１２９，９９４。
【００５０】
本発明のこのおよび他の態様は、後続の実施例を考慮することによってさらに正しく理解されることであろう。この後続の実施例は、本発明のある特定の実施形態を例証するためのものであり、特許請求の範囲によって定義する本発明の範囲を制限するためのものではない。
【実施例】
【００５１】
（実施例１）
以下の実施例は、本発明の一部の実施形態に従って、金ナノクラスタの合成および特性を説明するものである。
【００５２】
具体的には、この実施例は、生理温度（３７℃）で赤色発光（λｅｍｍａｘ＝６４０ｎｍ、量子収率（ｑｕａｎｔｕｍ  ｙｉｅｌｄ：ＱＹ）約６％）を有するＡｕ−ＮＣの調製のための、一般的な市販タンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のバイオミネラリゼーション能力に基づく、単純でワンポットの「環境にやさしい（ｇｒｅｅｎ）」合成経路を説明するものである。この実施例では、Ａｕ（ＩＩＩ）イオンをＢＳＡ水溶液に添加する。ＢＳＡ分子は、場合により、Ａｕイオンを封鎖し、それらを捕捉した（図１）。反応混合物のｐＨを約１２に調整することにより、ＢＳＡ分子の還元能力を活性化した；捕捉されたイオンが漸進的に還元されてＢＳＡ結合金ナノクラスタ（ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ）をインサイチューで形成した。調製したそのままのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣは、（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析から明らかなように）約２５個の金原子から成り、およびＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣとしてＢＳＡ分子内で安定化されていた（図１）。この実施形態において、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣは、水溶性であり、緩衝剤安定性であり、強酸／塩基および濃塩（１Ｍ  ＮａＣｌ）などの過酷な条件の溶液中でさえ安定であった。この合成法は、良好なバッチ間再現性で容易にグラム量に規模拡大することができ、調製したそのままのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣを凍結乾燥後に粉末として保管することができた。この方法論の良好な生体適合性および多大な環境的／費用的優位性に加えて、Ａｕ−ＮＣ上のＢＳＡコーティング層は機能的配位子での合成後表面改質も助長した。
【００５３】
典型的な合成では、ＨＡｕＣｌ４水溶液（５ｍＬ、１０ｍＭ、３７℃）をＢＳＡ溶液（５ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、３７℃）に激しく攪拌しながら添加した。２分経過した後、ＮａＯＨ溶液（０．５ｍＬ、１Ｍ）を導入し、その混合物を３７℃で１２時間インキュベートした。その溶液の色が淡黄色から淡褐色に、そしてその後、濃褐色に変化した（図２Ａ）。具体的には、図２Ａは、（上部）可視光および（下部）ＵＶ線のものでのＢＳＡ（１）粉末および（２）水溶液、ならびにＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ（３）水溶液および（４）粉末の写真を示すものである。図２Ｂは、（ｉ）ＢＳＡおよび（ｉｉ）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの水溶液の光学吸収（断続線）および光電子放出（実線、λｅｘ＝４７０ｎｍ）スペクトルを示すものである。図２Ｂ中の挿入図は、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣについての約４８０ｎｍでの弱い吸収ピークを示すものである。この反応は、蛍光発生の経時的測定によって確認したところ、約１２時間で完了した（図３）。具体的には、図３は、３７℃でのＨＡｕＣｌ４およびＢＳＡを含む反応混合物についての光電子放出スペクトル（λｅｘ＝４７０ｎｍ）の時間発展を示すものである。
【００５４】
ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの濃褐色溶液は、ＵＶ線（約３６５ｎｍ）のもとで強い赤色蛍光を放出した（図２Ａ、下部、３）。対照的に、対照ＢＳＡ溶液は、可視光のもとでの色が薄黄色であり（図２Ａ、上部、２）、ＵＶ線のもとで、アミノ酸残基（トリプトファン、チロシン（Ｔｙｒ）およびフェニルアラニン）中の芳香族基に特有であるピークブルー蛍光を放出した（図２Ａ、下部、２）。蛍光Ａｕ−ＮＣは、約４８０ｎｍおよび約６４０ｎｍで、それぞれ、吸収および放出ピークを示した（図２Ｂ）。そのフォトルミネッセンス量子収率（ＱＹ）は、約６％であった（４７０ｎｍレーザーを使用してフルオレセインで校正）。
【００５５】
ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの酸化状態を、Ｘ線光電子分光法（Ｘ−ｒａｙ  ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：ＸＰＳ）によって判定した。Ａｕ  ４ｆ７／２スペクトルにデコンボリューション処理を施して、８４．０ｅＶおよび８５．１ｅＶの結合エネルギーで中心に配置された２つの別個の成分（図４Ｂにおける、それぞれ、線ｉｉおよび線ｉ）にした。これらは、それぞれＡｕ（０）およびＡｕ（Ｉ）に割り当てることができるものであった。具体的には、図４は、（Ａ）（ｉｉｉ）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ中のＡｕ  ４ｆのＸＰＳスペクトル、ならびに（Ｂ）（ｉｖ）ＢＳＡおよび（ｖ）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示すものである。
【００５６】
チオール保護ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣについて前の構造研究で説明したように、Ａｕコアの表面に存在する少量のＡｕ（Ｉ）（約１７％）は、ナノクラスタの安定化を助長した。調製したそのままのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣは、ＢＳＡモノマー中の（３５個のシステイン（Ｃｙｓ）残基からの）３５個のチオール基の存在を考えると、同様の構造を有するだろう。ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣは、約６４０ｎｍでの光電子放出ピークを有し、これは、球形ジェリウムモデルに基づくＡｕ２５クラスタの存在を示す。調製したそのままのＡｕ−ＮＣのサイズをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法によってさらに確認した。その明確なタンパク質構造が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法での封入ナノクラスタサイズの分析を可能にした。ＡｕＣｌ４―を伴わないＢＳＡのスペクトルは、ＢＳＡ分子量に対応するｍ／ｚ約６６ｋＤａに１つのピークを示した（図４Ｂ）。調製したそのままのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣは、約５ｋＤａのピークシフトを示し、Ａｕ−ＮＣの２５個の金原子がこの一因になると考えられた。ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの熱重量（ＴＧＡ）分析によっても裏付けとなる証拠が得られた（図４Ｃ）。具体的には、図４Ｃは、空気中でのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ粉末のＴＧＡ分析を示すものである。２５個の原子を有するＡｕ−ＮＣは、非常に安定であると報告されており、それは、閉殻と幾何学的寄与の両方を伴う最も一般的な磁性クラスタサイズに相当した。
【００５７】
広いｐＨ範囲（３〜１２）の溶液中、および様々な緩衝溶液（例えば、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６５））中、および高濃度の塩（例えば、１ＭのＮａＣｌ）を有する溶液中のＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣについて、蛍光特性の明らかな差は観察されなかった。溶剤を凍結乾燥によって除去することができ、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣを少なくとも２か月間、固体状態（図２Ａ、４）で保管し、必要に応じて再分散させることができた。タンパク質との（例えば、ＢＳＡ中の３５個のＣｙｓ残基による）Ａｕ−Ｓ結合とタンパク質の嵩高さに起因する立体保護作用との組み合わせによって、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣを安定させることができた可能性もある。ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの高い安定性は、インビトロおよびインビボバイオイメージング用途でのそれらの使用を大いに容易にできる。ＢＳＡ分子へのＡｕ−ＮＣ（約０．８ｎｍ）の封入（図５における代表ＴＥＭ画像参照）は、ＢＳＡ足場構造に対して殆ど影響を及ぼさない（図６参照）。具体的には、図６は、（ｉ、または黒色）ＢＳＡおよび（ｉｉ、または灰色）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの（Ａ）ＤＬＳヒストグラム、（Ｂ）フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトル、（Ｃ）ゼータ電位の結果、ならびに（Ｄ）遠ＵＶ円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを示すものである。（Ａ）中の挿入図は、（ｉｉ）ＢＳＡ（ＦＩＴＣ色素で標識したもの）および（ｉ）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの（ＵＶ線下での）電気泳動データを示すものである。
【００５８】
分子レベルでＢＳＡ分子がどのようにして蛍光Ａｕ−ＮＣを「バイオミネラライズする」のか明らかではなかったが、幾つかの啓示的実験観察があった。理論により拘束されることを望まないが、タンパク質の担当残基による封入Ａｕイオンのインサイチュー還元とＮａＯＨの添加の両方が、一部の実施形態では、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの形成にとって重要であった。外来還元剤、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、を前記ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ合成と同じ反応溶液に添加することによって、対照実験を行った。結果として生ずるＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣは、非常に弱い赤色蛍光を放出した（ＱＹ約０．１％、表１および図７）。具体的には、図７は、（０）ＢＳＡ、（１）最適化条件下で合成したＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ、（２）ＮａＢＨ４を用いて合成したＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ、（３）ＮａＯＨなしで合成したＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ、（４）１００℃で合成したＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ、および（５）低ＢＳＡ濃度（２．５ｍｇ／ｍＬ）で合成したＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣについての（Ａ）可視光および（Ｂ）紫外線のもとでの写真、（Ｃ）光学吸収スペクトル、ならびに（Ｄ）光電子放出スペクトル（λｅｘ＝４７０ｎｍ）を示すものである。最近の研究により、ＴｙｒまたはＴｙｒ残基を含有する特注ペプチドが、そのフェノール基によりＡｕ（ＩＩＩ）またはＡｇ（Ｉ）イオンを還元できることは証明されており；それらの還元能力を、その反応ｐＨをＴｙｒのｐＫａ（約１０）より上に調整することによって大きく向上させることができる。ＮａＯＨの添加も必要であり、これが無いと、不規則または板様形態を有する大きなナノ粒子（＞２０ｎｍ）しか得られず（ＮａＯＨなしで合成したＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの代表ＴＥＭ画像を示す図８を参照のこと）、これらのナノ粒子は、蛍光を示さなかった。反応温度は、高いＱＹを有する蛍光Ａｕ−ＮＣの合成における重要な考慮事項であった。異なる温度（２５、３７および１００℃）で反応を行い、２５℃ではＡｕ−ＮＣが非常にゆっくりと形成され；１２時間の反応後でさえクラスタは検出されなかった。生理温度（３７℃）での反応は、妥当な還元動態を示した。反応は１２時間以内に完了し、高いＱＹ（約６％）を有するＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣが得られた。反応温度を１００℃に上昇させると、反応速度は急上昇した。反応は数分以内に完了したが、調製したそのままのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣは、比較的低いＱＹ（約０．５％、表１および図７参照）を有した。ＢＳＡ濃度のＡｕ前駆体に対する比率は重要であった。固定Ａｕ前駆体濃度（５ｍＭ）で、高いＢＳＡ濃度（１０〜２５ｍｇ／ｍＬ）（約２０から５０ｍＭのアミノ酸残基の濃度を伴う）がＡｕ−ＮＣの有効な保護に必要とされた。Ａｕ前駆体濃度を一定（５ｍＭ）に保ちながらＢＳＡ濃度を２．５ｍｇ／ｍＬに低下させると、蛍光を有さない大きなナノ粒子が生じた（表１および図７）。
【００５９】
【表１】
2011530699.tif 000003
表１において、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣのＱＹは、４７０ｎｍ励起下でＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣおよびリファレンス（塩基性エタノール中のフルオレセイン溶液、ＱＹ＝９７％）の積分蛍光強度を測定することによって決定した。スペクトル測定のためにＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣを脱イオン水で希釈して、４７０ｎｍで約０．１の吸収を生じさせた。
【００６０】
要約すると、この実施例は、一般的なタンパク質を使用してＡｕ前駆体をインサイチューで封鎖して還元することによる、赤色発光を有するＡｕ−ＮＣの新規調製方法を例証するものである。調製したそのままのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣは、溶液（水溶液または緩衝液）中でも、固体形態でも安定であった。この発光Ａｕ−ＮＣは、約２５個の金原子（Ａｕ２５）から成るものであった。高いＱＹを有するＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣを誘導するように実験条件を最適化した。プロトコルおよび生成物は、蛍光ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの単純で「環境にやさしい」生産方法を提供するためばかりでなく、タンパク質／ペプチドとＡｕイオンの相互作用（バイオミネラリゼーションまたは生物模倣型鉱物形成（ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ））をタンパク質−Ａｕ−ＮＣの生成に向けて用いることができることを具現するためにも、重要である。
【００６１】
（実施例２）
以下の実施例は、実施例１において調製し、使用した金ナノクラスタに関する追加の実験情報を説明するものである。
【００６２】
すべての化学薬品は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったそのままで使用した。Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｗａｔｅｒ（１８．２Ｍ）を使用した。
【００６３】
赤色蛍光Ａｕ−ＮＣの合成。すべてのガラス器具を王水（ＨＣｌ：ＨＮＯ３  体積比＝３：１）で洗浄し、エタノールおよび超純水ですすいだ。典型的な実験では、ＨＡｕＣｌ４水溶液（５ｍＬ、１０ｍＭ、３７℃）をＢＳＡ溶液（５ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、３７℃）に激しく攪拌しながら添加した。２分後、ＮａＯＨ溶液（０．５ｍＬ、１Ｍ）を導入し、激しく攪拌しながら３７℃で１２時間、反応を進行させた。
【００６４】
材料特性づけ。吸収および光電子放出スペクトルは、それぞれ、Ａｇｉｌｅｎｔ  ８４５３  ＵＶ−可視分光計およびＪｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｈｏｒｉｂａ  Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ蛍光分光計を用いて得た。ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ水溶液およびＢＳＡ水溶液のＤＬＳ分析は、ＢＩ−２００ＳＭレーザー光散乱システム（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて行った。元素分析は、ＥＬＡＮ  ９０００／ＤＲＣ  ＩＣＰ−ＭＳシステムを用いて行った。ＢＳＡおよびＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの分子量は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦシステムでのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法を用いて分析した。透過電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）およびＸＰＳは、それぞれ、２００ｋＶでＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  ＴＦ−２０電界放出型高解像度透過電子顕微鏡を用いて、およびＶＧ  ＥＳＣＡＬＡＢ  ＭＫＩＩ分光計を用いて行った。外来炭素を使用してＸＰＳＰＥＡＫソフトウェア（バージョン４．１）によりＡｕ  ４ｆコアレベルのナロー・スキャンＸＰＳスペクトルにデコンボリューション処理を施して、Ｃ１ｓ（２８４．５ｅＶ）の結合エネルギーを校正した。
【００６５】
（実施例３）
以下の実施例は、本発明の非限定的実施形態による、金ナノクラスタを使用する第二水銀イオン（Ｈｇ＋２）の検出を説明するものである。第二水銀イオン（Ｈｇ２＋）の日常的検出は、環境および人間の健康に対するその有害作用のため、水生生態系における環境モニタリングの重要な側面である。
【００６６】
理論により拘束されることを望まないが、最近の理論研究は、閉殻金属原子間の分散力が非常に特異的であり、強力であり、および特に、これらの相互作用がＨｇ２＋（４ｆ１４５ｄ１０）およびＡｕ＋（４ｆ１４５ｄ１０）などの重イオンを伴うとき相対論的効果によって大いに拡大されることを示唆している。従って、Ｈｇ２＋−Ａｕ＋相互作用の利用は、Ｈｇ２＋検出における無標識アプローチにとって魅力的である。実施例１において説明したように、タンパク質をテンプレートにする方法を用いて金ナノクラスタ（ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ）を合成した。調製したそのままのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣは、約２５個の金原子（Ａｕ２５）から成り、強い赤色蛍光（λｅｍｍａｘ＝６４０ｎｍ）を放出した。このクラスタコアの表面は、Ｈｇ２＋と強い特異的な相互作用を有することができる、少量（約１７％）のＡｕ＋によって安定化されている。この実施例では、図９に示すような、好金属性Ｈｇ２＋−Ａｕ＋相互作用に依存してＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの蛍光を消光するＨｇ２＋の検出技術を提供する。図９は、（Ｃ）高親和性好金属性Ｈｇ２＋−Ａｕ＋結合の結果として生ずるＡｕ−ＮＣの蛍光消光に基づくＨｇ２＋センシングの略図、ならびにＨｇ２＋イオン（５０ｍＭ）の（１）不在および（２）存在下でのＡｕ−ＮＣ（２０ｍＭ）についてのＵＶ線のもとでの（Ａ）光電子放出スペクトル（λｅｘ＝４７０ｎｍ）および（Ｂ）写真を示すものである。この一段法は、単純であり、迅速であり、ならびに高い選択性および感度を有する。さらに、それをペーパー・テスト・ストリップとして（下に示すように）用いて、日常的なＨｇ２＋モニタリングを助長することができる。
【００６７】
実施例４において説明する手順に従って、蛍光ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣを合成し、精製した。Ｈｇ２＋イオン（５０ｍＭ）をＡｕ−ＮＣ水溶液（約２０ｍＭ）に添加すると、光電子放出スペクトル（図９Ａ）においても明らかであるように、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの赤色蛍光（図９Ｂ、１）は、数秒以内に完全に消光した（図９Ｂ、２）。このＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの蛍光消光は、Ｈｇ２＋とＡｕ＋の相互作用のためであった。Ｈｇ２＋イオンの存在下でＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ溶液に強い還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）を添加することにより、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの赤色蛍光を一部回復することができた（図９Ａおよび９Ｂ、３）。理論により拘束されることを望まないが、水素化ホウ素ナトリウムは、Ｈｇ２＋をＨｇ０に還元すると考えられ、および後者Ｈｇ０は、Ａｕ＋とのより弱い結合エネルギーを有するので、従って、蛍光Ａｕ−ＮＣに対するより低い消光効率を有すると考えられる。Ｈｇの酸化状態を、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって確認した（図１０）。具体的には、図１０は、（Ａ）ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣにより封鎖されたＨｇイオンおよび（Ｂ）ＮａＢＨ４によって還元された封鎖ＨｇイオンについてのＸＰＳ  Ｈｇ  ４ｆスペクトルを示すものである。
【００６８】
ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ溶液へのＨｇ２＋イオンの添加は、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣのサイズに対して殆ど影響を有さず（図１１）、これにより、蛍光消光に対するＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ凝集の影響は排除された。図１１は、約０．８ｎｍのクラスタサイズを示す、Ｈｇ２＋イオンの存在下でのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの代表ＴＥＭ画像を示すものである。さらに、調製したそのままのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの凝集は、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの蛍光に対して殆ど影響を及ぼさない（図１２）。図１２は、（Ａ）１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）法によりポリスチレンビーズ（１ｍｍ）に結合させたＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの略図、および（Ｂ）ポリスチレン−ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの代表蛍光画像を示すものである。
【００６９】
Ｈｇ２＋−Ａｕ＋相互作用の高い特異性が、他の環境関連金属イオンよりＨｇ２＋の検出に対するこの方法の優れた選択性をもたらした。図１３Ａは、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの蛍光が、５０ＭのＡｇ＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｄ２＋、Ｐｔ４＋、Ｐｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｐｂ２＋およびＣａ２＋イオンによって消光されなかったことを示すものである。Ｈｇ２＋イオンだけが、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ蛍光のほぼ１００％消光をもたらした（図１３Ｂ）。この検出選択性を裸眼で見えるようにすることができた（図１３Ｂ）。具体的には、図１３は、５０ｍＭの様々な金属イオンの存在下でのＡｕ−ＮＣ水溶液（２０ｍＭ）についての（Ａ）ＵＶ線のもとでの写真、および（Ｂ）λｅｘ＝４７０ｎｍでの相対蛍光（Ｉ／Ｉ０）を示すものである。
【００７０】
加えて、調製したそのままのＡｕ−ＮＣは、様々なアニオン（例えば、Ｃｌ−、ＮＯ３−、ＳＯ４２−、およびＰＯ４３−）および緩衝剤（例えば、２−（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル）エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ））に対して強く、そのため、この方法は様々な環境からのサンプルの試験に適する。Ｈｇ２＋とＡｕ＋の強い結合エネルギーのため、この方法は高感度でもある。理論的には、ＮＣ表面の１個のＡｕ＋イオンとの相互作用により１個のＨｇ２＋によってＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの蛍光を消光することができるだろう。このアッセイの感度を評価するために、異なる濃度（０．０５〜１００ｎＭ）のＨｇ２＋を、２０ｎＭのＡｕ−ＮＣを含有する一連の溶液に添加した。図１４に示すように、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの蛍光は、Ｈｇ２＋濃度の上昇に伴って低下された。Ｈｇ２＋に対するＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの蛍光強度は、１〜２０ｎＭのＨｇ２＋濃度範囲にわたって直線的に低下した。具体的には、図１４は、（Ａ）異なるＨｇ２＋濃度の存在下でのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣ（２０ｎＭ）の光電子放出スペクトル（λｅｘ＝４７０ｎｍ）、および（Ｂ）Ｈｇ２＋濃度の関数としてのＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの相対蛍光（Ｉ／Ｉ０）を示すものである。図１４Ｃは、１〜２０ｎＭのＨｇ２＋についての線形検出範囲を示すものである。３のシグナル対ノイズ比でのＨｇ２＋についての検出限界（ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＬＯＤ）は、０．５ｎＭ（０．１ｐｐｂ）と推定され、これは、アメリカ合衆国環境保護庁（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ：ＥＰＡ）によって認可された飲料水中の水銀の最大レベル（２．０ｐｐｂ）よりはるかに低かった。
【００７１】
金ナノクラスタを使用するＨｇ＋２の検出をペーパー・テスト・ストリップ・システムに拡大した。ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣをニトロセルロースストリップ上に分散させた。それらはＢＳＡ足場によって封入され、ニトロセルロース膜に捕捉されるだろう。結合していないＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣは水ですすぎ落した。Ｈｇ２＋検出に対するこのペーパー・テスト・ストリップ・システムの選択性を、５０ｍＭの濃度の様々な金属イオンの溶液にそれらのテストストリップを浸漬することによって評価した。Ｈｇ２＋イオン溶液に浸漬したテストストリップだけは、ＵＶ線のもとでの色が（ニトロセルロース膜のバックグラウンドカラーである）弱い緑色であった（図１５Ａ）。具体的には、図１５Ａは、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣを有するテストストリップの、それらのテストストリップを５０ｍＭの様々な金属イオンの溶液に浸漬した後の、ＵＶ線のもとでの写真を示すものである。すべての他のテストストリップは、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣに付随する強い赤色蛍光を放出した。前記テストストリップは、図１５Ｂに示すように、様々な濃度のＨｇ２＋イオン溶液に浸漬した後、異なる色（緑色から紫色まで）も示した（２ｍＭ（濃緑色）、２００ｎＭ（紫色）、２０ｎＭ（紫−桃色）、および２ｎＭ（桃色））。具体的には、図１５Ｂは、Ｈｇ２＋の溶液に浸漬したテストストリップの（ＵＶ線のもとでの）写真を示すものである。このように、それらを使用して、視覚的にＨｇ２＋イオン濃度を迅速に推定することができた。
【００７２】
この実施例は、非限定的な実施形態に従って、水性媒質中の蛍光ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣを使用して非常に高い選択性および感度でＨｇ２＋イオンを検出する新規の簡単な方法を例証するものである。このセンシングメカニズムは、ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣの蛍光を有効に消光する高親和性好金属性Ｈｇ２＋−Ａｕ＋相互作用に基づくものであった。ＢＳＡ−Ａｕ−ＮＣは、他の金属イオンよりＨｇ２＋に対する著しく高い選択性を示し、０．５ｎＭほども低い濃度のＨｇ２＋を検出した。このプロセスは、グリーンケミストリーを伴うので注目に値し、そしてそれをＨｇ２＋イオンの迅速な日常的モニタリングのための単純なペーパー・テスト・ストリップ・システムとして開発することができた。
【００７３】
（実施例４）
以下の実施例は、実施例３において調製し、使用した金ナノクラスタに関する追加の実験情報を説明するものである。
【００７４】
すべての化学薬品は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったそのままで使用した。Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｗａｔｅｒ（１８．２ＭＷ）を使用した。
【００７５】
赤色蛍光Ａｕ−ＮＣの合成。すべてのガラス器具を王水（ＨＣｌ／ＨＮＯ３  体積比＝３：１）で洗浄し、エタノールおよび超純水ですすいだ。典型的な実験では、ＨＡｕＣｌ４水溶液（５ｍＬ、１０ｍＭ、３７℃）をＢＳＡ溶液（５ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、３７℃）に激しく攪拌しながら添加した。２分後、ＮａＯＨ溶液（０．５ｍＬ、１Ｍ）を導入し、激しく攪拌しながら３７℃で１２時間、反応を進行させた。
【００７６】
（実施例５）
実施例４において説明した手順を用いて、ＢＳＡの代わりにヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＨＳＡ）またはリゾチーム（ＬＹＳ）を使用してＡｕ−ＮＣを合成した。（ｉ）ＢＳＡ、（ｉｉ）ＨＳＡ、または（ｉｉｉ）ＬＹＳを使用して合成したＡｕ−ＮＣの水溶液の光電子放出（λｅｘ＝４７０ｎｍ）スペクトルを図１６に示す。
【００７７】
本発明の幾つかの実施形態を本明細書において説明し、例証したが、当業者は、本明細書に記載する機能を果たすための、ならびに／または本明細書に記載する結果および／もしくは１つ以上の利点の得るための、様々な他の手段および／または構造を容易に思い浮かべることができるであろう。そのような変形および／または変更のそれぞれが、本発明の範囲内であると考える。より一般的に、本明細書に記載するすべてのパラメータ、寸法、材料および立体配置が、例示を意図したものであること、ならびに実際のパラメータ、寸法、材料および／または立体配置が、本発明の教示（単数または複数）を用いる特定の用途（単数または複数）に依存するであろうということは、当業者には容易に理解されるであろう。当業者は、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態の多くの等価物がわかるであろうし、または常用の実験以上のものを用いることなくそれを突き止めることができるであろう。従って、上述の実施形態を単に例として提供すること、ならびに添付の特許請求の範囲およびそれらと等価のものの範囲内で、本発明を、具体的に記載するおよび特許請求の範囲に記載するものとは別様に実施できることは、理解されるはずである。本発明は、本明細書に記載する個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法それぞれに関する。加えて、２つ以上のそのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせは、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾しない場合、本発明の範囲に含まれる。
【００７８】
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および本特許請求の範囲において用いられる場合、相反する明確な指示がない限り、「少なくとも１つ」を意味すると解釈すべきである。
【００７９】
「および／または」という句は、本明細書および本特許請求の範囲において用いられる場合、そのように連接されている要素、すなわち、ある場合は接続的に存在し、および他の場合は離接的に存在する要素、の「いずれかまたは両方」を意味すると解釈すべきである。相反する明確な指示がない限り、「および／または」節によって具体的に特定される要素以外の他の要素が、それらの具体的に特定される要素に関係のあるものであろうと、関係ないものであろうと、場合によっては存在することがある。従って、非限定的例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む」などの状況に応じて変更可能な言葉と共に用いられるとき、１つの実施形態ではＢなしのＡ（場合によってはＢ以外の他の要素を含む）；別の実施形態ではＡなしのＢ（場合によってはＡ以外の他の要素を含む）；さらに別の実施形態ではＡとＢの両方（場合によっては他の要素を含む）、などを指すことがある。
【００８０】
ここで本明細書においておよび本特許請求の範囲において用いられる場合、「または」は、上で定義した「および／または」と同じ意味を有すると解釈すべきである。例えば、リスト内の項目を分けるとき、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち、多数の要素または要素のリストのうちの、１つより多くも含むが、少なくとも１つ、および、場合によっては、リストにない追加の項目の包含、と解釈するものとする。「の１つだけ」もしくは「の正確に１つ」または特許請求の範囲で用いられるときの「から成る」などの、そうでないと明確に示す用語だけが、多数の要素または要素のリストのうちの正確に１つの要素の包含を指すだろう。一般に、ここで用いられる場合の用語「または」は、排他性の用語、例えば「いずれか」、「の１つ」、「の１つだけ」、または「の正確に１つ」が先行するとき、排他的選択肢（すなわち、「両方ではなく、一方または他方」）を示すともっぱら解釈するものとする。特許請求の範囲において用いられているときの「から本質的に成る」は、特許法の分野で用いられているような、その通常の意味を有するものとする。
【００８１】
ここで本明細書においておよび本特許請求の範囲において用いられる場合、１つ以上の要素のリストに関しての、「少なくとも１つの」という句は、その要素リスト内の任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、その要素リスト内に具体的にリストされているそれぞれのおよびすべての要素の少なくとも１つを含むとは限らず、およびその要素リスト内の要素の任意の組み合わせを除外しないと解釈すべきである。この定義は、「少なくとも１つの」という句が指す要素のリスト内の具体的に特定される要素以外の要素が、それらの具体的に特定される要素に関係のあるものであろうと、関係ないものであろうと、場合によっては存在することがあることも許容する。従って、非限定的例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（言い換えると、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、言い換えると「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態では、Ｂが存在しない、場合によっては「１つより多くの」を含む少なくとも１つのＡ（および場合によってはＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ａが存在しない、場合によっては「１つより多くの」を含む少なくとも１つのＢ（および場合によっては、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、場合によっては「１つより多くの」を含む少なくとも１つのＡおよび、場合によっては「１つより多くの」を含む少なくとも１つのＢ（および場合によっては、他の要素を含む）、などを指すことがある。
【００８２】
本特許請求の範囲において、ならびに上の本明細書において、すべての移行句、例えば、「含む」、「挙げられる」、「担持する」、「有する」、「含有する」、「伴う」、「保持する」、およびこれらに類するものは、状況に応じて変更可能である、すなわち、含むがそれらに限定されないことを意味すると解釈すべきである。「から成る」および「から本質的に成る」という移行句だけは、それぞれ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２１１１．０３に示されているように、排他的または半排他的移行句であるものとする。
【図５】
2011530699.tif 000004
【図８】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年4月11日(2011.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の金ナノクラスタであって、それぞれ約２５個の金原子を含む、複数の金ナノクラスタと、
タンパク質または安定剤と
を含む組成物であって、
前記金ナノクラスタが、少なくとも１％の量子収率で約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の最大放出の波長で蛍光を放出することができ、前記蛍光は、水銀の存在下で少なくとも部分的に消光される、組成物。
【請求項２】
複数の金ナノクラスタを形成するための方法であって、
金原子前駆体の複数の分子とタンパク質の複数の分子とを含む反応混合物を形成する工程（この場合、金原子前駆体の分子のタンパク質の分子に対する比率は、少なくとも約５：１である）；
前記反応混合物のｐＨを約１１より大きくなるように調整する工程；および
前記反応混合物を適する温度で十分な期間にわたって維持して、少なくとも１つのタンパク質分子によって安定化された複数の金ナノクラスタを形成する工程
を含み、
前記金ナノクラスタが、約２ｎｍ未満の平均直径を有する、方法。
【請求項３】
第二水銀イオンを検出する方法であって、
複数の金ナノクラスタとタンパク質とを含む組成物を生じさせる工程であって、前記ナノクラスタが、約２ｎｍ未満の平均直径を有する、工程；
第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルに前記組成物を曝露する工程；および
前記サンプルが第二水銀イオンを含むかどうかを判定する工程
を含む方法。
【請求項４】
第二水銀イオンを検出する方法であって、
複数の金ナノクラスタ（該金ナノクラスタは、少なくとも１％の量子収率で約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で第一の蛍光強度を有する）を生じさせる工程；
第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルを前記ナノクラスタに曝露し、前記蛍光強度の変化を判定する工程；および
前記サンプルが第二水銀イオンを含有するかどうかを、約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長での前記蛍光強度の変化に基づいて判定する工程
を含む方法。
【請求項５】
第二水銀イオンを検出する方法であって、
複数の安定化金ナノクラスタを含む組成物を生じさせる工程であって、前記金ナノクラスタが、約２５個の金原子を含む、工程；
第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルに前記組成物を曝露する工程；および
前記サンプルが第二水銀イオンを含むかどうかを判定する工程
を含む方法。
【請求項６】
サンプル中の第二水銀イオンの存在または不在を判定するためのキットであって、
基質と、
前記基質と会合している組成物（この場合、該組成物は、金ナノクラスタとタンパク質または安定剤とを含み、前記金ナノクラスタが、約２５個の金原子を含む）と、
カラーまたは他の特性リファレンスと
を含むテストストリップを含むキット。
【請求項７】
金ナノクラスタが、約２５個の金原子を含む、請求項１または６のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項８】
前記タンパク質が、ウシ血清アルブミンである、請求項１、６または７のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項９】
前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、請求項１、６または７のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項１０】
前記タンパク質が、リゾチームである、請求項１、６または７のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項１１】
前記金ナノクラスタが、約２ｎｍ未満の平均直径を有する、請求項１または６〜１０のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項１２】
前記金ナノクラスタが、約１ｎｍ未満の平均直径を有する、請求項１または６〜１０のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項１３】
前記金ナノクラスタが、実質的に単分散である、請求項１または６〜１２のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項１４】
前記金ナノクラスタが、約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で蛍光を放出することができる、請求項１または６〜１３のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項１５】
前記金ナノクラスタが、少なくとも１％の量子収率で蛍光を放出することができる、請求項１または６〜１４のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項１６】
前記金ナノクラスタが、少なくとも３％の量子収率で蛍光を放出することができる、請求項１または６〜１４のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項１７】
前記金ナノクラスタが、約６％の量子収率で蛍光を放出することができる、請求項１または６〜１４のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項１８】
金ナノクラスタが、約２５個の金原子を含む、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質が、ウシ血清アルブミンである、請求項２〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、請求項２〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質が、リゾチームである、請求項２〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記金ナノクラスタが、約２ｎｍ未満の平均直径を有する、請求項２〜５または１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記金ナノクラスタが、約１ｎｍ未満の平均直径を有する、請求項２〜５または１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記金ナノクラスタが、実質的に単分散である、請求項２〜５または１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記金ナノクラスタが、約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で蛍光を放出することができる、請求項２〜５または１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記金ナノクラスタが、少なくとも１％の量子収率で蛍光を放出することができる、請求項２〜５または１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記金ナノクラスタが、少なくとも３％の量子収率で蛍光を放出することができる、請求項２〜５または１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記金ナノクラスタが、約６％の量子収率で蛍光を放出することができる、請求項２〜５または１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも３０℃で少なくとも２時間、前記反応混合物を加熱することを含む、請求項２〜５または１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
約３７℃で少なくとも約８時間、前記反応混合物を加熱することを含む、請求項２〜５または１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記金ナノクラスタを安定させる少なくとも１つのタンパク質分子のうちの１つ以上を安定剤で置き換える工程をさらに含む、請求項２〜５または１８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記安定剤が、システインまたはグルタチオンである、請求項１、６〜１７のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項３３】
第二水銀イオンの検出限界が、約５ｎＭ未満である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
第二水銀イオンの検出限界が、約１ｎＭ未満である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
第二水銀イオンの検出限界が、約０．５ｎＭ未満である、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記安定剤が、システインまたはグルタチオンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
第二水銀イオンの検出限界が、約５ｎＭ未満である、請求項６に記載のキット。
【請求項３８】
第二水銀イオンの検出限界が、約１ｎＭ未満である、請求項６に記載のキット。
【請求項３９】
第二水銀イオンの検出限界が、約０．５ｎＭ未満である、請求項６に記載のキット。
【請求項４０】
サンプルが第二水銀イオンを含むかどうかを判定する工程が、前記組成物または金ナノクラスタの蛍光強度の変化を判定する工程を含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
Ａｇ＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｄ２＋、Ｐｔ４＋、Ｐｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｐｂ２＋、またはＣａ２＋から成る群より選択される金属イオンのうちの少なくとも１つへの曝露に基づく前記金ナノクラスタまたは組成物の蛍光強度の変化が、２０％未満である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記サンプル中の第二水銀イオンの濃度の測度を判定することをさらに含む、請求項２〜５、１８〜３１、３３〜３６または４０〜４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記サンプル中の第二水銀イオンの濃度の測度が、前記組成物または金ナノクラスタの蛍光の変化に基づいて判定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記サンプルが、環境源から採取される、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記基質が、ニトロセルロースを含む、請求項６、３７〜３９に記載のキット。
【請求項４６】
前記反応混合物のｐＨが、約１２より大きくなるように調整される、請求項２、７〜３１、３６、４２または４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記反応混合物のｐＨが、その反応混合物に塩基を供給することによって調整される、請求項２、７〜３１、３６、４２または４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記塩基が、ＮａＯＨである、請求項３２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
一部の実施形態において、本発明は、物品を提供する。場合により、サンプル中の第二水銀イオンの存在または不在を判定するための物品は、基質と、該基質と会合している組成物とを含み、この場合の組成物は、金ナノクラスタとタンパク質または安定剤とを含む。
例えば、本発明は以下を提供する。
（項目１）
複数の金ナノクラスタと、
タンパク質または安定剤と
を含む組成物であって、
前記金ナノクラスタが、少なくとも１％の量子収率で約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で蛍光を放出することができる、組成物。
（項目２）
複数の金ナノクラスタを形成するための方法であって、
金原子前駆体の複数の分子とタンパク質の複数の分子とを含む反応混合物を形成する工程（この場合、金原子前駆体の分子のタンパク質の分子に対する比率は、少なくとも約５：１である）；
前記反応混合物のｐＨを約１１より大きくなるように調整する工程；および
前記反応混合物を適する温度で十分な期間にわたって維持して、少なくとも１つのタンパク質分子によって安定化された複数の金ナノクラスタを形成する工程
を含み、
前記金ナノクラスタが、約２ｎｍ未満の平均直径を有する、方法。
（項目３）
第二水銀イオンを検出する方法であって、
複数の金ナノクラスタとタンパク質または安定剤とを含む組成物を生じさせる工程；
第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルに前記組成物を曝露する工程；および
前記サンプルが第二水銀イオンを含むかどうかを判定する工程
を含む方法。
（項目４）
第二水銀イオンを検出する方法であって、
複数の金ナノクラスタ（該金ナノクラスタは、少なくとも１％の量子収率で約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で第一の蛍光強度を有する）を生じさせる工程；
第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルを前記ナノクラスタに曝露し、前記蛍光強度の変化を判定する工程；および
前記サンプルが第二水銀イオンを含有するかどうかを前記蛍光強度の変化に基づいて判定する工程
を含む方法。
（項目５）
第二水銀イオンを検出する方法であって、
式Ａｕ２５を有する複数の安定化金ナノクラスタを含む組成物を生じさせる工程；
第二水銀イオンを含有する疑いのあるサンプルに前記組成物を曝露する工程；および
前記サンプルが第二水銀イオンを含むかどうかを判定する工程
を含む方法。
（項目６）
サンプル中の第二水銀イオンの存在または不在を判定するための物品であって、
基質と、
前記基質と会合している組成物（この場合、該組成物は、金ナノクラスタとタンパク質または安定剤とを含む）と
を含む物品。
（項目７）
金ナノクラスタが、約２５個の金原子を含む、前記いずれかの項目に記載の組成物、方法または物品。
（項目８）
前記タンパク質が、ウシ血清アルブミンである、前記いずれかの項目に記載の組成物、方法または物品。
（項目９）
前記タンパク質が、ヒト血清アルブミンである、前記いずれかの項目に記載の組成物、方法または物品。
（項目１０）
前記タンパク質が、リゾチームである、前記いずれかの項目に記載の組成物、方法または物品。
（項目１１）
前記金ナノクラスタが、約２ｎｍ未満の平均直径を有する、前記いずれかの項目に記載の組成物、方法または物品。
（項目１２）
前記金ナノクラスタが、約１ｎｍ未満の平均直径を有する、前記いずれかの項目に記載の組成物、方法または物品。
（項目１３）
前記金ナノクラスタが、実質的に単分散である、前記いずれかの項目に記載の組成物、方法または物品。
（項目１４）
前記金ナノクラスタが、約６３０ｎｍと約７００ｎｍの間の波長で蛍光を放出することができる、前記いずれかの項目に記載の組成物、方法または物品。
（項目１６）
前記金ナノクラスタが、少なくとも１％の量子収率で蛍光を放出することができる、前記いずれかの項目に記載の組成物、方法または物品。
（項目１７）
前記金ナノクラスタが、少なくとも３％の量子収率で蛍光を放出することができる、前記いずれかの項目に記載の組成物、方法または物品。
（項目１８）
前記金ナノクラスタが、約６％の量子収率で蛍光を放出することができる、前記いずれかの項目に記載の組成物、方法または物品。
（項目１９）
少なくとも３０℃で少なくとも２時間、前記反応混合物を加熱することを含む、前記いずれかの項目に記載の方法。
（項目２０）
約３７℃で少なくとも約８時間、前記反応混合物を加熱することを含む、前記いずれかの項目に記載の方法。
（項目２１）
前記金ナノクラスタを安定させる少なくとも１つのタンパク質分子のうちの１つ以上を安定剤で置き換える工程をさらに含む、前記いずれかの項目に記載の方法。
（項目２２）
前記安定剤が、システインまたはグルタチオンである、前記いずれかの項目に記載の組成物、方法または物品。
（項目２３）
第二水銀イオンの検出限界が、約５ｎＭ未満である、前記いずれかの項目に記載の方法または物品。
（項目２４）
第二水銀イオンの検出限界が、約１ｎＭ未満である、前記いずれかの項目に記載の方法または物品。
（項目２５）
第二水銀イオンの検出限界が、約０．５ｎＭ未満である、前記いずれかの項目に記載の方法または物品。
（項目２６）
サンプルが第二水銀イオンを含むかどうかを判定する工程が、前記組成物または金ナノクラスタの蛍光の変化を判定する工程を含む、前記いずれかの項目に記載の方法。
（項目２７）
Ａｇ＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｎｉ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｄ２＋、Ｐｔ４＋、Ｐｄ２＋、Ｃｏ２＋、Ｐｂ２＋、またはＣａ２＋から成る群より選択される金属イオンのうちの少なくとも１つへの曝露に基づく前記金ナノクラスタまたは組成物の蛍光強度の変化が、２０％未満である、前記いずれかの項目に記載の方法。
（項目２８）
前記サンプル中の第二水銀イオンの濃度の測定を判定することをさらに含む、前記いずれかの項目に記載の方法。
（項目２９）
前記サンプル中の第二水銀イオンの濃度の測度が、前記組成物または金ナノクラスタの蛍光の変化に基づいて判定される、前記いずれかの項目に記載の方法。
（項目３０）
前記サンプルが、環境源から採取される、前記いずれかの項目に記載の方法。
（項目３１）
前記基質が、ニトロセルロースを含む、前記いずれかの項目に記載の物品。
（項目３２）
前記反応混合物のｐＨが、約１２より大きくなるように調整される、前記いずれかの項目に記載の方法。
（項目３３）
前記反応混合物のｐＨが、その反応混合物に塩基を供給することによって調整される、前記いずれかの項目に記載の方法。
（項目３４）
前記塩基が、ＮａＯＨである、項目３３に記載の方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2011530699.tif 000020
【図２】
2011530699.tif 000021
【図３】
2011530699.tif 000022
【図４】
2011530699.tif 000023
【図５】
2011530699.tif 000024
【図６】
2011530699.tif 000025
【図７】
2011530699.tif 000026
【図８】
2011530699.tif 000027
【図９】
2011530699.tif 000028
【図１０】
2011530699.tif 000029
【図１１】
2011530699.tif 000030
【図１２】
2011530699.tif 000031
【図１３】
2011530699.tif 000032
【図１４】
2011530699.tif 000033
【図１５】
2011530699.tif 000034
【図１６】
2011530699.tif 000035
【国際調査報告】
2011530699.tif 000036
2011530699.tif 000037
2011530699.tif 000038