(57)【要約】  本発明は、一般にプロテオースペプトン画分（ＰＰｆ）を含む組成物に関する。特に本発明は、β−ラクトグロブリンが減少しており、ＰＰｆに富む、ミネラル除去されたタンパク質画分を含む抽出物の生産のための方法及びこれらの抽出物の、例えば食品、栄養補助食品、栄養組成物、医薬組成物及び／又は化粧品組成物における使用、例えば、乳化剤又は起泡剤としての使用に関する。本発明のＰＰｆ画分は、天然タンパク質分散水溶液のｐＨを約５．６〜８．４、又は約３．５〜５．０に調整し、天然タンパク質分散水溶液を約１０秒間〜６０分間加熱して約７０〜９５℃とし、加熱後に、タンパク質分散水溶液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する形成された固形高分子量凝集体の少なくとも一部を除去し、分散水溶液の残りの液体画分を回収することによって得ることができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオースペプトン画分（ＰＰｆ）に富む抽出物の製造のための方法であって、
ミネラル除去された天然タンパク質分散水溶液のｐＨを約５．６〜８．４、又は約３．５〜５．０に調整するステップと、
前記天然タンパク質分散水溶液を約１０秒間〜６０分間加熱して約７０〜９５℃とするステップと、
加熱後に、前記タンパク質分散水溶液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する形成された固形高分子量凝集体の少なくとも一部を除去するステップと、
前記分散水溶液の残りの液体画分を回収するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ミネラル除去された天然タンパク質分散水溶液がミネラル除去されたホエイタンパク質画分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
加熱後に、前記タンパク質分散水溶液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する前記固形高分子量凝集体の少なくとも９０％、好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９９％を除去する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｐＨを約３．５〜５．０、又は
約５．６〜６．４、好ましくは約５．８〜６．０、又は
約７．５〜８．４、好ましくは約７．６〜８．０、又は
約６．４〜７．４、好ましくは約６．６〜７．２
に調整する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記天然タンパク質分散水溶液が本質的に塩を含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質分散水溶液中にタンパク質が、前記分散水溶液の全重量基準で約０．１重量％〜１２重量％、好ましくは約０．１重量％〜８重量％、より好ましくは約０．２重量％〜７重量％、さらにより好ましくは約１重量％〜５重量％の量で存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質分散水溶液が、二価カチオンを、全乾燥質量で２．５重量％未満、より好ましくは２重量％未満含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分散水溶液の残りの液体部分を乾燥させて、含水量を全組成物の重量に対して１０重量％未満、好ましくは５重量％未満、より好ましくは２重量％未満に減少させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法によって得られるホエイＰＰｆを含む組成物。
【請求項１０】
全アミノ酸組成に対する百分率で、約６〜９％のＡＳＰ、約４〜７％のＴＨＲ、約４〜７％のＳＥＲ、約２２〜２５％のＧＬＵ、約９〜１２％のＰＲＯ、約０〜３％のＧＬＹ、約１．５〜４．５％のＡＬＡ、約４〜７％のＶＡＬ、約０〜２％のＣＹＳ、約１〜４％のＭＥＴ、約４〜７％のＩＬＥ、約７．５〜１０．５％のＬＥＵ、約０〜３％のＴＹＲ、約６．７〜９．７％のＬＹＳ、約１．５〜４．５％のＨＩＳ、約１〜４％のＡＲＧのアミノ酸組成を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
タンパク質溶液、特にＰＰｆから２５０μｇタンパク質当量を、最終濃度がそれぞれ７Ｍ、２Ｍ、６５ｍＭ、２０ｍＭ、６５ｍＭ、０．４％（ｗ／ｖ）で使用される尿素、チオ尿素、ＣＨＡＰＳ、トリス、ＤＴＴ、アンフォライトと、染色のためのブロモフェノールブルーとからなる変性溶液３４０μｌに溶解し、
１．５Ｍトリス緩衝液で調製された９〜１６％アクリルアミドゲル上のｐＨ３〜ｐＨ１０のｐＨ勾配のイモビライン（ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ）ストリップにこの試料を載せ、
イモビラインストリップゲルに３００ボルトの電圧を１１．６時間印加し、その後５０００ボルトの電圧を１２．４時間印加して、電荷でタンパク質を分離し、
２５ｍＭトリス／１９２ｍＭグリシン／０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、ｐＨ８．３の緩衝液中でアクリルアミドが９〜１６％の範囲にあるアクリルアミド勾配ゲル上にイモビラインストリップゲルを配置し、
前記ゲルに４０ｍＡの電流を一晩流して、事前にイモビラインストリップゲル上で分離したタンパク質をアクリルアミド・マトリックスに流して、さらに大きさによりタンパク質を分離し、
クーマシーブルー染色法で前記ゲルのタンパク質スポットを視覚化する
手順を適用した後に、図１に示されたゲルに似たゲルを得る、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
食品、栄養補助食品、栄養組成物、医薬組成物及び／又は化粧品組成物の調製のための、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
乳化剤として、起泡剤として及び／又は低脂肪製品のための、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
クリーマー、特に、コーヒークリーマー、カプチーノのような起泡性飲料、カフェラテ、チョコレート、ヨーグルト、パスチャライズドＵＨＴミルク、加糖コンデンスミルク、発酵乳、ミルクベースの発酵製品、ミルクチョコレート、ムース、泡剤、乳剤、アイスクリーム、酸性飲料、炭酸飲料、フルーツジュース、飲料を調製する凝集粉末、ミルクベースの粉末、乳児用調整乳、栄養強化食、ペットフード、錠剤、乾燥経口サプリメント、液状経口サプリメント、ヘルスケア栄養調整物、化粧品の調製のための、請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
植物、果物、生体組織又は体液、発酵製品、細胞培養物、細菌、酵母等の生体物質由来の、生理活性物質、酸化防止剤又は色素等の疎水性又は脂溶性の構成成分の抽出及び／又は安定化のための、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にプロテオースペプトン画分（ＰＰｆ）を含む組成物に関する。特に本発明は、β−ラクトグロブリンが減少しており、ＰＰｆに富む、ミネラル除去されたタンパク質画分を含む抽出物の製造のための方法、及びこの抽出物の使用に関する。
【０００２】
起泡はミルクタンパク質の典型的な特徴であるという事実にもかかわらず、ミルクには、カゼイン、α−ラクトアルブミン、及びβ−ラクトグロブリンを除去した後にもかなりの界面活性があることが知られている（Ｒ．Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．１４（１９４５）、３１６〜３２８）。残りの画分には、界面活性成分のかなりの量を占めるプロテオースペプトン画分（ＰＰｆ）が含まれている。
【０００３】
ＰＰｆは、詳しい特徴が明らかでない多種のタンパク質性化合物の混合物を表し、Ｇｉｒａｒｄｅｔら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．６３（１９９６）、３３３〜３５０のこの主題に対する総論に概説されている。これを本明細書に引用して援用する。
【０００４】
β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、及びβ−カゼイン、αｓ１−カゼイン、並びに血清アルブミン等、ＰＰｆ中のいくつものタンパク質が報告されている。２つの糖タンパク質、ｐｐ１６ｋとｐｐ２０ｋは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のエンテロトキシンへの結合親和性を有し、それぞれα−ラクトアルブミンとβ−ラクトグロブリンのグリコシル化した形態として同定された。大型タンパク質では、６０ｋＤａの酸性リン酸化糖タンパク質オステオポンチン、及び８８ｋＤａのラクトフェリンが、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって検出された。
【０００５】
構成成分３、５及び８（ＰＰ３、ＰＰ５、ＰＰ８）と呼ばれるミルク試料の主要なＰＰｆ構成成分の量は、そのプラスミン活性と関連している。β−カゼインに対するプラスミン活性により、ＰＰ５すなわちβ−ＣＮ−５Ｐ  ｆ（１〜１０５／７、β−カゼインのＮ末端ペプチド１〜１０５と１〜１０７）、ＰＰ８−ｆａｓｔすなわちβ−ＣＮ−４Ｐ  ｆ（１〜２８、β−カゼインのＮ末端ペプチド１〜２８）の構成成分が生じる。構成成分であるＰＰ８−ｓｌｏｗとβ−ＣＮ−１Ｐ  ｆ（２９〜１０５／７、β−カゼインのＮ末端ペプチド２９〜１０５と２９〜１０７）は別個の要素であるが、電気泳動度によって区別するのが難しい。
【０００６】
ＰＰ３構成成分の多種の分子構造を下記の観察により説明する。ＰＰ３リン酸化糖タンパク質は、５Ｍ−グアニジンを使用して、４０ｋＤａの見かけの分子量を有するサブユニットに分離できる１６３ｋＤａ（ｐＨ８．６で超遠心により計測）の大きさを有する複合体を形成する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥが、ジスルフィド結合還元薬２−メルカプトエタノールの存在下で実施され、それぞれ２４．６〜３３．４ｋＤａと１７〜２０．９ｋＤａの２つの主要な糖タンパク質構成成分の存在が明らかとなった。２８ｋＤａと１８ｋＤａの見かけの分子量を有する主要な糖タンパク質が、実質的に常に観察され、１１ｋＤａのバンドを伴うことが見出された。それらは、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（２Ｄ−ＰＡＧＥ）によって分離されると、それぞれ、４つ及び２つのスポットとして現われ、ｐＨ４．９〜６．１の範囲の見かけの等電点を有する。複合体は、２８ｋＤａ、１８ｋＤａ、及び１１ｋＤａの分子量を有する糖タンパク質から構成されており、約７ｋＤａの分子量を有する非グリコシル化ポリペプチドを伴う。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）を有するレクチンアフィニティークロマトグラフィーで分離することにより、１１、１８及び２８ｋＤａの糖タンパク質の複雑な挙動が明らかとなる。１１ｋＤａの糖タンパク質がＣｏｎＡに結合しない一方、より大型の１８と２８ｋＤａの糖タンパク質は、非結合画分（糖タンパク質ｐｐ１８−とｐｐ２８−と呼ばれる）と結合画分（糖タンパク質ｐｐ１８＋とｐｐ２８＋と呼ばれる）とに分離した。
【０００７】
当技術分野では、スキムミルクからＰＰｆを得る。
【０００８】
しかしながら、スキムミルクからＰＰｆを単離するには、カゼインと変性ホエイタンパク質を沈殿／遠心分離によって除去するため、ミルクの熱処理（例えば９０℃で１０分間）と酸性化が必要となる。この従来の方法は大変コストが高く、工業規模では適用できない。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、工業的に適用可能な、ＰＰｆを得るための方法を有する技術を提供することであった。本発明のさらなる目的は、ミルクから単離されたＰＰｆとは異なるタンパク質組成を示し、優れた特性とさらなる利点を提供するＰＰｆに富む抽出物をもたらす技術を提供することであった。
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに、これらの目的が、独立請求項の主題によって成し遂げられることを見出した。
【００１１】
本発明者らは、スキムミルクに対して、ミネラル除去されたタンパク質画分、例えばミネラル除去された球状タンパク質画分、特にホエイタンパク質濃縮物（ＷＰＣ）又はホエイタンパク質単離物（ＷＰＩ）から、ＰＰｆに富む抽出物が産生される場合、本発明の方法を適用すると、本発明の目的が達成されることを見出した。
【００１２】
本発明の非常に特殊な方法により、際立って有益な特性を有する抽出物の生産が可能となる。
【００１３】
得られた抽出物は、例えば、熱安定性で、酸可溶性及び酸不溶性のタンパク質を含んでいる。
【００１４】
そのうえ、ホエイは、例えば、チーズの生産において通常廃棄物である安価な原料である。チーズを作る工程は、ミルクを凝固するタンパク質分解酵素であるレンネットの添加を要し、カード（後にチーズとなる）と可溶性ホエイ画分とを分離する。
【００１５】
これとは対照的に、ミルクは高価な原料である。
【００１６】
さらに、ＷＰＩには脂肪がほとんどないので、我々の発明によるＰＰｆの生産では、脂肪除去は不必要となり、工程が単純化され、さらにＰＰｆのコンタミネーションを防ぐことができる。
【００１７】
したがって、本発明の一実施形態は、
ミネラル除去された天然タンパク質分散水溶液のｐＨを約５．６〜８．４、又は約３．５〜５．０に調整するステップと、
天然タンパク質分散水溶液を約１０秒間〜６０分間加熱して約７０〜９５℃とするステップと、
加熱後に、タンパク質分散水溶液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する形成された固形高分子量凝集体の少なくとも一部を除去するステップと、
分散水溶液の残りの液体画分を回収するステップと
を含む、抽出物の生産のための方法である。
【００１８】
得られた抽出物は、β−ラクトグロブリンが減少したタンパク質画分を含み、ＰＰｆに富む。得られた抽出物はミネラル除去もされている。
【００１９】
本発明の目的において「ミネラル除去された」とは、ミネラルの含有量を、スイートホエイ又は酸ホエイと比較して、少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％減少させたことを意味する。スイートホエイ又は酸ホエイの乾燥物質は平均で、０．９％のカルシウム、０．８％のナトリウム、２．２％のカリウム、０．１％のマグネシウム、０．７％のリン及び２．０％の塩化物を含む、８．８％のミネラルを含有している。
【００２０】
本発明の文脈において、「β−ラクトグロブリンが減少した」とは、抽出物中のタンパク質の全重量に対するβ−ラクトグロブリンの含有重量が、天然球状タンパク質溶液中のタンパク質の全重量に対するβ−ラクトグロブリンの含有重量と比較して、多くても７０％、好ましくは多くても５０％、より好ましくは多くても２０％であることを意味する。
【００２１】
したがって、β−ラクトグロブリンが減少した抽出物は、天然球状タンパク質溶液中に存在するβ−ラクトグロブリンの含量の多くても７０重量％、好ましくは多くても５０重量％、より好ましくは多くても２０重量％を含む。
【００２２】
「ＰＰｆに富む」とは、抽出物中のタンパク質の全重量に対するＰＰｆの含有重量が、天然球状タンパク質分散液中のタンパク質の全重量に対するＰＰｆの含有重量と比較して、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、さらにより好ましくは少なくとも１０倍増加していることを意味する。
【００２３】
本発明の抽出物はまた、α−ラクトアルブミンに富んでいてもよい。α−ラクトアルブミンに富むとは、抽出物中のタンパク質の全重量に対するα−ラクトアルブミンの含有重量が、最初の天然球状タンパク質分散液中のタンパク質の全重量に対するα−ラクトアルブミンの含有重量と比較して、少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍、さらにより好ましくは少なくとも２倍増加していることを意味する。
【００２４】
本発明の抽出物は、好ましくはミネラル除去された球状タンパク質分散液、特にホエイから調製される。ミネラル除去されたタンパク質画分は、好ましくはミネラル除去された球状タンパク質画分、特にホエイタンパク質画分である。
【００２５】
本発明の一実施形態において、ミネラル除去された天然タンパク質分散水溶液は、ミネラル除去されたホエイ、又はミネラル除去されたホエイタンパク質画分である。
【００２６】
原理的に、加熱後に、当技術分野において知られる任意の方法により、ホエイタンパク質分散水溶液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する、形成された固形高分子量凝集体を除去することができる。しかしながら、好ましくは、沈殿、遠心分離、濾過、精密濾過、又はこれらの方法の組み合わせによって高分子量凝集体を除去することができる。この除去ステップに、ｐＨ調整をさらに加えてもよい。
【００２７】
沈殿には、必要な実験装置が最小で、最低限のエネルギー入力で実行することができるという長所がある。
【００２８】
遠心分離はエネルギー入力が必要となるが高速の方法である。連続遠心分離は、例えば白チーズ製造の工場において既に使用されている工程である。
【００２９】
濾過と精密濾過は、大規模生産にはよく応用されており、高分子量凝集体の除去において非常に信頼性が高い。
【００３０】
これらの方法をいくつか併用することでそれぞれの利点を兼ね備えることができるであろう。
【００３１】
例えば、最後のステップに精密濾過の工程を適用することで、少なくとも１００ｎｍの直径を有する高分子量凝集体を実質的に完全に除去することができる。
【００３２】
加熱後に、ホエイタンパク質分散水溶液から、少なくとも１００ｎｍの直径を有する固形高分子量凝集体の好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９９％、理想的には１００％を除去する。
【００３３】
本発明の方法は、限外濾過及び／又は蒸発ステップをさらに含むこともできる。
【００３４】
限外濾過は、静水圧を利用して、半透膜に液体を通す膜濾過技術である。水と低分子量の溶質が膜を通過する一方、懸濁固体と高分子量の溶質が残る。この分離工程は、高分子量の分子（１０３〜１０６Ｄａ）、特にタンパク質を含む溶液の精製及び濃縮のため、産業及び研究において使用される。限外濾過は、産業環境において定評があるという長所があり、高分子量のタンパク質を効率的でありながら穏やかに分離でき、ストレス誘発性のタンパク質変性を防ぐ。
【００３５】
蒸発は、タンパク質溶液を濃縮できる穏やかな方法である。例えば、少なくとも４０℃に、又は好ましくは少なくとも６０℃に加熱することで蒸発を起こしてもよい。例えば、ＰＰｆを含む組成物を乾燥させて、含水量を全組成物の重量に対して１０重量％未満、好ましくは５重量％未満、より好ましくは２重量％未満に減少させてもよい。この乾燥ステップには、得られたＰＰｆに富む抽出物を、その完全な活性を維持しつつ組成物の重量を減らし高濃度で貯蔵できるという長所がある。また、蒸発により水分活性が低くなったため、製品の安定性は増す。
【００３６】
本発明の方法では、天然ホエイタンパク質分散水溶液を約１５分間加熱して約８５℃とすることが好ましい。ｐＨを約３．５〜５．０、又は約５．６〜６．４、好ましくは約５．８〜６．０、又は約７．５〜８．４、好ましくは約７．６〜８．０、又は約６．４〜７．４、好ましくは約６．６〜７．２に調整することが好ましい。
【００３７】
本発明に至る長い実験の過程で、本発明者らは、驚くべきことに、熱処理前にｐＨの値を厳密（±０．１ｐＨ単位）に調整すると、１μｍ未満の直径を有する、ホエイタンパク質凝集体の球状微粒子が得られることを見出した。最適ｐＨ値は出発物質、例えばＷＰＩの濃度と組成に依存することが見出された。この方法には、例えば剪断などの、いかなる機械的ストレスもない状態で、ホエイタンパク質微粒子を生成するという長所がある。得られた粒子により、本発明のＰＰｆ含有抽出物からこれら微粒子を形成する化合物を容易に除去できるという長所がもたらされる。
【００３８】
これらの発見により、ｐＨとイオン強度が本発明の方法にとって２つの大切な要素であることが明らかとなった。それゆえ、十分に透析して、Ｃａ＋＋、Ｋ＋、Ｎａ＋、Ｍｇ＋＋等の遊離のカチオンを激減させた試料では、上記の熱処理を適用した後、５．４未満のｐＨではカードが生成し、６．８を超えるｐＨでは可溶性ホエイタンパク質凝集体が生成する傾向がある。したがって、ｐＨ値の範囲がかなり狭い場合でのみ、ＰＰｆ抽出物の調製に必要なタイプの固形ホエイタンパク質微粒子が得られる。類似したホエイタンパク質微粒子は、ホエイの等電ｐＨ未満の対称的なｐＨ値、すなわち３．５〜５．０までを使用することで産生される。
【００３９】
低濃度（最初のホエイタンパク質粉末１００ｇに対して０．２ｇ未満）の二価カチオンに対して、ｐＨが５．６〜６．４、より好ましくは５．８〜６．０のｐＨ範囲に調整される場合、負に帯電した粒子が得られる。ｐＨは、ホエイタンパク質源（例えばＷＰＣ又はＷＰＩ）のミネラルの含有量によって、８．４まで高くしてもよい。特に、大量の遊離ミネラルの存在下で負に帯電した粒子を得るためには、ｐＨを７．５〜８．４、好ましくは７．６〜８．０に調整してもよい。中程度の濃度の遊離ミネラルの存在下で負に帯電した粒子を得るためには、ｐＨを６．４〜７．４、好ましくは６．６〜７．２に調整してもよい。
【００４０】
もちろん、微粒子の帯電は、本発明のＰＰｆを含むホエイ抽出物からこれらの微粒子を分ける手段として、さらに使用することができる。
【００４１】
ｐＨは一般に、好ましくは食品等級の酸、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、グルコン酸又は乳酸、の添加によって調整する。ミネラル含有量が高い場合は、ｐＨは一般に、好ましくは食品等級のアルカリ性溶液、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化アンモニウムの添加によって調整する。
【００４２】
本発明の方法には、本質的に塩を含まない天然ホエイタンパク質分散水溶液が好ましい。「本質的に塩を含まない」とは、約４重量％のタンパク質濃度に対して塩の含有量が１ｇ／ｌ以下であることを意味する。例えば、ホエイタンパク質水溶液は二価カチオンを、全乾燥質量で２．５重量％未満、より好ましくは２重量％未満含んでもよい。
【００４３】
天然タンパク質分散水溶液中に天然タンパク質、好ましくは天然球状タンパク質、さらにより好ましくはホエイタンパク質が、溶液の全重量に対して約０．１重量％〜１２重量％、好ましくは約０．１重量％〜８重量％、より好ましくは約０．２重量％〜７重量％、さらにより好ましくは約１重量％〜５重量％で存在する。
【００４４】
ホエイタンパク質分散水溶液は、ウシ、若しくはスイギュウ、若しくはヒツジ、若しくはヤギ、若しくはウマ、若しくはラクダの原料、又はそれらの混合物のいずれかのホエイを含んでもよい。
【００４５】
本発明の一実施形態は、ＰＰｆ、特に本発明の方法によって入手可能なホエイＰＰｆを含む組成物である。
【００４６】
本発明の方法により得られたホエイＰＰｆは、本発明においてホエイが出発物質として使用され、また、特定の方法が使用されるという事実のため、従来技術において入手可能なＰＰｆ、特にミルクから入手可能なＰＰｆとは異なる。
【００４７】
本発明の方法により得られたホエイＰＰｆは、全アミノ酸組成に対する百分率として、下記のようなアミノ酸組成を有する：約６〜９％のＡＳＰ、約４〜７％のＴＨＲ、約４〜７％のＳＥＲ、約２２〜２５％のＧＬＵ、約９〜１２％のＰＲＯ、約０〜３％のＧＬＹ、約１．５〜４．５％のＡＬＡ、約４〜７％のＶＡＬ、約０〜２のＣＹＳ、約１〜４％のＭＥＴ、約４〜７％のＩＬＥ、約７．５〜１０．５％のＬＥＵ、約０〜３％のＴＹＲ、約６．７〜９．７％のＬＹＳ、約１．５〜４．５％のＨＩＳ、約１〜４％のＡＲＧ。
【００４８】
この組成は、従来の方法によって得られたＰＰｆの典型的な組成とは異なる。表１には、従来の方法（試料１）とホエイＰＰｆ（本発明、試料２）に対応する典型的なＰＰｆ−アミノ酸プロフィールが示され、両者を比較することができる。
【００４９】
試料１は、以下に示す従来の方法を使用して同じＷＰＩから調製した。
【００５０】
基本的には、Ｐａｑｕｅｔ，Ｄ．Ｎｅｊｊａｒ，Ｙ．、及びＬｉｎｄｅｎ，Ｇ．（１９８８）；Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｏｓｅ−ｐｅｐｔｏｎｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、７１、１４６４〜１４７１）に提案された方法によって、従来のＰＰｆを調製した。
【００５１】
プロラクタ（Ｐｒｏｌａｃｔａ）９０を出発物質として使用した。プロラクタ９０（４２８ｇ）をＭｉｌｌｉ−ＱグレードＨ２Ｏ５Ｌでもどした（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ）。この溶液を計測するとｐＨ６．４３であったが、その後、１ＮのＮａＯＨを約１５ｍｌ添加しｐＨ７．００に調整した。この溶液の体積を、６Ｌ（最終タンパク質濃度は６％（ｗ／ｗ）であった）とし、６つの１Ｌビンに等分し、９３℃に設定したウォーターバスに３０分間置き、タンパク質を変性させた。２０分のインキュベーションの後、ビンの内側の温度は９０℃となった。インキュベーションの終わりに、ビンを氷浴に入れ、２０℃まで冷やした。ｐＨを４．６に調整して、タンパク質性化合物の等電沈殿を実施した。実際には、１Ｌビン３本の内容物を一緒にし（ｐＨ７．１７）、１ＮのＨＣｌ約８８ｍｌを使用してｐＨを４．６に調整した。他の１Ｌビン３本も同様に処理した。得られる２つの酸性化された溶液を一緒にして４℃で１８時間貯蔵し、１Ｌプラスチックボトル６本に等分した。ビンを遠心分離後（６℃、５０００ｒｐｍ／７２００ｇで６０分、Ｈ６０００Ａローターを備えたＳｏｒｖａｌ  ＲＣ３Ｃ  Ｐｌｕｓ）、ＰＰｆを含有する上清を回収した。その後、ＰＰｆの硫酸アンモニウム沈殿法を、半飽和（３１３ｇ／Ｌ）で２時間実施した。沈殿物を、遠心分離（Ｓｏｒｖａｌ  ＲＣ３Ｃ  Ｐｌｕｓを使用して６℃、５０００ｒｐｍで６０分）後に回収し、一緒にして、Ｍｉｌｌｉ−ＱグレードＨ２Ｏ３５０ｍｌ内に再度分散した。濁った懸濁液／溶液を、分子量（ＭＷ）１０００のカットオフのＳｐｅｃｔｒａｐｏｒ膜チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｉｎｃ．）を使用して、２２ＬのＭｉｌｌｉ−Ｑグレード水に対し４回透析した。透析後、ＰＰｆを含む抽出物を遠心分離し（６℃、５０００ｒｐｍで６０分）、上清を濾過し（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製０．２２μｍフィルター、ＧＰステリカップ（ＧＰ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐ）（登録商標）エクスプレスプラス（Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｐｌｕｓ）（商標））、フリーズドライした。ＰＰｆの収量はホエイタンパク質全荷重３６０ｇから６ｇ（１．６％）だった。
【００５２】
例えば、２つのＰＰｆを区別するには、アミノ酸プロフィール（表１）と２Ｄ−ＰＡＧＥによって決定されるタンパク質プロフィール（図１と２）の２つの基準を使用できる。
【００５３】
表１：従来のＰＰｆ（試料１）とホエイタンパク質ＰＰｆ（試料２）のアミノ酸組成を、１００ｇ粉末当たり各アミノ酸のｇで、及び全アミノ酸組成に対する割合で表した。
【００５４】
【表１】
2011516406.tif 000002
【００５５】
２Ｄ−ＰＡＧＥは複合タンパク質混合物を分析し比較する強力な方法である。この方法では、一次元目ではタンパク質の電荷によって、二次元目では分子量によってタンパク質を分離する。
【００５６】
本発明者らは、この２Ｄ−ＰＡＧＥを使用して、従来の方法を使用して得られたＰＰｆと本発明を使用して得られたＰＰｆと間にある差異を分析した。同じＷＰＩを使用して従来の方法によって調製されたＰＰｆと本発明によって調製されたＰＰｆの両方を産生した。Ｐａｑｕｅｔ，Ｄ．Ｎｅｊｊａｒ，Ｙ．、及びＬｉｎｄｅｎ，Ｇ．（１９８８）；Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｏｓｅ−ｐｅｐｔｏｎｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、７１、１４６４〜１４７１）に記載された方法によって、従来のＰＰｆを調製した。図１は、本発明によって得られたＰＰｆの２Ｄ−ＰＡＧＥタンパク質プロフィールを示す。図１の２Ｄゲルの標識されたタンパク質スポットはすべて、従来の方法で調製されたＰＰｆによって生成された２Ｄゲルのタンパク質スポットとは質的及び／又は量的に異なる。図２は、観察された差異の定量化を示す。
【００５７】
したがって、本発明の一実施形態は、本発明の方法によって入手可能な天然ホエイタンパク質分散液からのＰＰｆを含む組成物である。
【００５８】
ＰＰｆに富む抽出物を、下記の手順により分析した：
タンパク質溶液、特にＰＰｆから２５０μｇタンパク質当量を、最終濃度がそれぞれ７Ｍ、２Ｍ、６５ｍＭ、２０ｍＭ、６５ｍＭ、０．４％（ｗ／ｖ）で使用される尿素、チオ尿素、ＣＨＡＰＳ、トリス、ＤＴＴ、アンフォライトと、染色のためのブロモフェノールブルーとからなる変性溶液３４０μｌに溶解し、
１．５Ｍトリス緩衝液で調製された９〜１６％アクリルアミドゲル上のｐＨ３〜ｐＨ１０のｐＨ勾配のイモビライン（ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ）ストリップにこの試料を載せ、
イモビラインストリップゲルに３００ボルトの電圧を１１．６時間印加し、その後５０００ボルトの電圧を１２．４時間印加して、電荷でタンパク質を分離し、
２５ｍＭトリス／１９２ｍＭグリシン／０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、ｐＨ８．３の緩衝液中でアクリルアミドが９〜１６％の範囲にあるアクリルアミド勾配ゲル上にイモビラインストリップゲルを配置し、
ゲルに４０ｍＡの電流を一晩流して、事前にｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅストリップゲル上で分離したタンパク質をアクリルアミド・マトリックスに流して、さらに大きさによりタンパク質を分離し、
クーマシーブルー染色法でタンパク質スポットを視覚化する。
この手順により、図１に示されるようなゲルが得られた。
【００５９】
本発明の組成物は数々の異なった目的に使用されてもよい。しかしながら、得られた組成物は、食品等級の組成物であるため、食品、栄養補助食品、栄養組成物及び／又は医薬組成物の調製に特に有効である。
【００６０】
本発明の組成物を、特に出発物質としてウシのミルク又はホエイを使用して調製した場合、脂肪を実質的に含んでいないため、低脂肪の製品の生産に大変有効である。
【００６１】
本発明の組成物を、例えば、乳化剤又は起泡剤として使用してもよい。
【００６２】
本発明の組成物の典型的な応用例は、さらにクリーマー、特に、コーヒークリーマー、カプチーノのような起泡性飲料、カフェラテ、チョコレート、ヨーグルト、パスチャライズドＵＨＴミルク、加糖コンデンスミルク、発酵乳、ミルクベースの発酵製品、ミルクチョコレート、ムース、泡剤、乳剤、アイスクリーム、酸性飲料、炭酸飲料、フルーツジュース、飲料を調製する凝集粉末、ミルクベースの粉末、乳児用調整乳、栄養強化食、ペットフード、錠剤、乾燥経口サプリメント、液状経口サプリメント、ヘルスケア栄養調整物、及び化粧品等の製品の調製のための組成物の利用である。
【００６３】
本発明の組成物をまた、植物、果物、生体組織又は体液、発酵製品、細胞培養物、細菌、酵母等の生体物質由来の、生理活性物質、酸化防止剤又は色素等の疎水性又は脂溶性の構成成分の抽出及び／又は安定化に使用してもよい。
【００６４】
本発明の組成物を含む製品も、本発明に含まれ、この製品は、好ましくは食品、栄養補助食品、栄養組成物及び／又は医薬組成物、又は化粧品組成物、並びに好ましくはクリーマー、特に、コーヒークリーマー、カプチーノのような起泡性飲料、カフェラテ、チョコレート、ヨーグルト、パスチャライズドＵＨＴミルク、加糖コンデンスミルク、発酵乳、ミルクベースの発酵製品、ミルクチョコレート、ムース、泡剤、乳剤、アイスクリーム、酸性飲料、炭酸飲料、フルーツジュース、飲料を調製する凝集粉、ミルクベースの粉末、乳児用調整乳、栄養強化食、ペットフード、錠剤、乾燥経口サプリメント、液状経口サプリメント、又はヘルスケア栄養調整物である。
【００６５】
本明細書の開示から逸脱することなく、本明細書に開示されたすべての特徴を自由に組み合わせ得ることは、当業者には明白であろう。本発明のさらなる利点及び特徴が、下記の実施例と図から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、本発明のＰＰｆの２Ｄ−ＰＡＧＥである。
【図２】図２は、図１のゲルにおいて標識されたタンパク質の定量化である。
【図３】図３は、クーマシーブルー染色法を使用して、変性させ還元させた状態で実施された本発明のＰＰｆのＮＵ−ＰＡＧＥである。レーン１は市販のＷＰＩ（天然タンパク質プロラクタ９０（Ｌａｃｔａｌｉｓ））である。レーン２はＷＰＡ濃縮物である。レーン３はＷＰＡ精密濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ＭＦ）透過液である。レーン４はｐＨ４．６での遠心分離後のＷＰＡのＭＦ透過液の上清である。レーン５はｐＨ４．６での遠心分離後のＷＰＡのＭＦ透過液の沈殿物である。
【図４】図４は、ＷＰＩ（プロラクタ９０（Ｌａｃｔａｌｉｓ、Ｒｅｔｉｅｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ））、ＷＰＡ精密濾過透過液及びＷＰＡ精密濾過／限外濾過透過液の０．５重量％タンパク質分散液の、２５℃での、ｐＨ７．０における乳化活性指数（ＥＡＩ）を示す。
【図５】図５は、ＷＰＩ（プロラクタ（登録商標）９０（Ｌａｃｔａｌｉｓ、Ｒｅｔｉｅｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ））、又は本発明の、ＰＰｆに富む抽出物のＭＦ透過液の０．１重量％タンパク質分散液のｐＨ６．３での、２５℃における起泡容量を示す。
【図６】図６は、８５℃、１５分間の熱処理後の、ＷＰＩ（プロラクタ９０（Ｌａｃｔａｌｉｓ、Ｒｅｔｉｅｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ））、本発明ＭＦの抽出物、及び本発明ＭＦ／ＵＦの抽出物、の０．１重量％タンパク質分散液の、ｐＨ４．０での、２５℃における泡の体積安定性を示す。
【００６７】
実施例１  本発明に対応するＰＰｆに富む画分の抽出
６８ｋｇのプロラクタ９０（ロット５００６５８、Ｌａｃｔａｌｉｓ、Ｒｅｔｉｅｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を、１３３２ｋｇの軟水（Ｎａ＋を１６０ｍｇ．Ｌ−１含む）に１５℃で分散させた。これを、ｐＨプローブを装備した２０００Ｌ水槽内で一定の撹拌と再循環の下で１時間維持した。結果、タンパク質分散液のｐＨは６．６８となり、全固形物含有量（ＴＳ）は４．５％となった。その後、約１３ｋｇの１ＭのＨＣｌを添加しｐＨを５．９０±０．０５に調整した。この特定のｐＨ値は、実験室規模の環境において軟水を使用したＷＰＡの形成に最適であることが見出された（ＷＰＡの平均直径は２５０ｎｍ、５００ｎｍの濁度＞７０）。最適ｐＨ値がこれらの処理条件下で非常に安定であることが見出された。その後、プロラクタ９０分散液を１０００Ｌ．ｈ−１の流速で汲み出し、５５℃の予熱温度で平板熱交換器を使用して熱処理し、続いて、８５℃で加熱し、１５分間保持し、４℃に冷却した。結果として生じたＷＰＡ含有ホエイ分散液（ＴＳは４．５％）を、４℃で貯蔵した。
【００６８】
その後、全表面積が６．８ｍ２のＣａｒｂｏｓｅｐ  Ｍ１４セラミック／カーボン膜（孔径０．１４ミクロン）２つを使用して、精密濾過（ＭＦ）により、５００ｋｇのＷＰＡ含有ホエイ分散液からＷＰＡを取り除いた。測定基準（ｍｏｄｕｌｅ）の温度は、８〜１１℃の間に、圧力は２．３バールに設定した。透過液の流速は３時間の精密濾過後に１８０ｌ．ｈ−１から７０ｌ．ｈ−１に減少した。主にＷＰＡを含む、廃棄されることとなる保持液の最終全固形物（ＴＳ）は２０％だった。本発明のＰＰｆに対応する精密濾過透過液には全固形物含有量が約０．２８％あり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに分析した（図３、レーン３）。この分析法により、このＰＰｆがα−ラクトアルブミン、カゼイン、及びプロテオースペプトンの混合物を含むことが示された（図３）。天然のプロラクタ９０のタンパク質プロフィールと捨てられたＷＰＡを詳細に調査したが、大きな違いは見られなかった（図３、レーン１〜２）。しかしながら、本発明の抽出物の組成物がα−ラクトアルブミン、ＰＰｆ及びカゼインに富むことが示された（レーン３）。ｐＨ４．６で遠心分離後、上清と沈殿物とを調査し、ＰＰｆが存在することが確認された（レーン４〜５）。ｐＨ４．６で沈殿するカゼインとα−ラクトアルブミンが沈殿物において見出された一方、ＰＰｆは上清で溶解したままであった。追加の濃縮工程で、精密濾過透過液をさらに限外濾過工程にかけ、抽出物の乾燥量基準で、ＴＳを０．２８から２０％に、窒素含有量を６２から８４．５％に増加させた。
【００６９】
実施例２  乳化性
Ｋ．Ｎ．Ｐｅａｒｃｅ及びＪ．Ｅ．Ｋｉｎｓｅｌｌａ、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２６（１９７８），７１６〜７２３に記述された方法により、本発明のＰＰｆの乳化性を中性ｐＨで評価した。基準試料を取得した（プロラクタ９０、ロット５００６５８、Ｒｅｔｉｅｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ）。加えて、本発明の２つの抽出物をテストした。第一の抽出物（ＰＰｆ）は、実験例１に記述された６２％のタンパク含有量を有するＭＦ透過液とした。第二の抽出物（ＰＰｆ）は、８４．５％のタンパク含有量によって特徴づけられた、実験例１において次に記述されたＵＦ抽出物とした。ひまわり油を使用して乳濁液（オイル相）を生成し、タンパク含有量は水相の０．５重量％に設定した。その後、１分間に１１，０００ｒｐｍで回転するＳ２５Ｎ−１０Ｇの分散ヘッド（ＩＫＡ−Ｗｅｒｋｅ、Ｓｔａｕｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を装備したウルトラタラックス（Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ）（登録商標）Ｔ２５を使用して、水相１２ｍｌに、ひまわり油４ｍｌを混合し、均質化した。その後、この乳濁液５０ｍｌに、０．１％のＳＤＳ溶液５ｍｌを混合し、経路長１ｃｍのキュベットを装備したＮｉｃｏｌｅｔ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  １００分光光度計（Ｄｉｇｉｔａｎａ、Ｙｖｅｒｄｏｎ−ｌｅｓ−Ｂａｉｎｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、この分散液の吸光度を５００ｎｍで計測した。ＥＡＩ（ｍ２．ｇ−１）をｐＨ４．０と７．０で、以下の式に従って算出した。
ＥＡＩ＝４．６０６Ａｄ／φＣｌ
ここで、Ａは５００ｎｍの吸光度、ｄは希釈係数、φは油の体積分率、Ｃはタンパク質濃度（ｇ．ｍ−３）、ｌはキュベットの経路長（ｍ）である。実験は２セット行った。
【００７０】
ＥＡＩ（乳化活性指数）を図４に示す。本発明のＰＰｆに富む抽出物が、出発物質（ＷＰＩ、プロラクタ９０）と同等の、乳化活性を示すことが明らかに認められる。これは、ホエイの主なタンパク質画分をすべて含有しているＷＰＩ（プロラクタ９０）同様、本発明のＰＰｆ含有抽出物で、同量のひまわり油を安定化することが可能であることを意味する。
【００７１】
実施例３  起泡特性
精密濾過（ＭＦ）、及び例１に記述された精密濾過／限外濾過（ＭＦ／ＵＦ）によって得られたＰＰｆ抽出物を、Ｃ．Ｇｕｉｌｌｅｒｍｅら、Ｊ．Ｔｅｘｔ．Ｓｔｕｄ．２４（１９９３）２８７〜３０２に記述された方法を使用して抽出物の起泡特性を決定するために使用した。多孔性の焼結ガラス円板（多孔度と気流を制御する）を通して気体を噴霧し（ｓｐａｒｇｉｎｇ）、ＷＰＭ分散液の定義された量を泡立たせるという原理である。生成された泡は円柱状のガラス柱に沿って上昇し、その容積をＣＣＤカメラを使用した画像解析によって追跡した。泡に組みこまれた液体の量と泡均質性を、液体を含むキュベット内及びコラムの異なった高さでのコンダクタンスを、電極を使い計測することで追跡した。ＰＰｆ抽出物の起泡特性を市販のフォームスキャン（Ｆｏａｍｓｃａｎ）（商標）装置（Ｔｅｃｌｉｓ−ＩＴＣｏｎｃｅｐｔ、Ｌｏｎｇｅｓｓａｉｇｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用し計測した。ＰＰｆに富む抽出物ＭＦとＭＦ／ＵＦの透過液を、タンパク質０．１重量％となるようにＭｉｌｌｉ−Ｑグレード水Ｈ２Ｏでもどし（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）、起泡容量及び泡の安定性をｐＨ６．３で測定し、対応するプロラクタ９０の起泡容量及び泡の安定性と同じタンパク質濃度で比較した。酸性の状態での熱処理後のＰＰｆ抽出物の起泡特性をさらにテストするために、起泡実験を行う前に、上記の分散液をｐＨ４．０に酸性化し、８５℃の熱処理を１５分間行った。
【００７２】
タンパク質分散液２０ｍｌをキュベットに注ぎ、８０ｍｌ．分−１で窒素を噴霧（ｓｐａｒｇｉｎｇ）した。この流速で、強い重力排液が生じる前に効率的な起泡が可能となることが見出された。これら起泡特性のテストに使用された焼結ガラス円板の多孔度により、１０〜１６μｍの直径を有する気泡の形成が可能となる。１１０ｃｍ３の泡が得られた後、通気を止めた。通気の終わりに、泡容量（ＦＣ＝泡の体積／注入された気体の体積）が算出された。加えて、泡の総体積が２５±２℃で経時的に追跡された。すべての実験を２セット行った。
【００７３】
起泡容量は、注入された気体の総体積で割られた、産生された泡の総体積と定義されるが、本発明のＰＰｆに富むＭＦ抽出物の起泡容量は、対応するプロラクタ９０の起泡容量よりもわずかに多く、ＰＰｆに富む抽出物が、すべての主なホエイタンパク質（図５）の組み合わせとして、界面活性として存在することが示された。
【００７４】
酸熱安定性に関して、従来技術の主なホエイミルク画分は、加熱し酸性化されるとその起泡特性を失うことが知られている（ＬＧ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓら，Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．５５（１９９０）、１１１６〜１１１９）。これが本発明のＰＰｆに富む抽出物では起こらなかった。０．１重量％で分散したＰＰｆに富む抽出物２つのＦＣ、１．１８±０．０３と比較して、０．１重量％タンパク質のプロラクタ９０分散液のＦＣは、１．０９±０．０１と著しく低かった。
【００７５】
８５℃、１５分間の熱処理とｐＨ４．０への調整後の、本発明の抽出物の０．１重量％タンパク質分散液で得られた泡の泡体積安定性はプロラクタ９０（図６）で得られた泡量安定性と同等か、さらに高く、再度、抽出物対主なホエイタンパク質画分の酸、熱安定性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図３】
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【国際調査報告】
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