(57)【要約】生物学的試料において血小板集団、好ましくは未成熟な網状血小板の集団を同定するための方法であって、生物学的試料を、血小板上のエピトープまたは抗原に結合する少なくとも１つの標識リガンドまたは標識モノクローナル抗体と、核酸色素と共にインキュベートするステップを含む方法。この試料は分析され、インキュベートされた試料がフローサイトメーターを通過することによって１つまたは複数の血小板集団が同定または定量される。インキュベートされた試料はレーザー光源を用いて照射され、標識リガンドおよび核酸色素の蛍光は、少なくとも１つのさらなるパラメーター、たとえば光散乱、直流、軸方向光損失、不透明度、および高周波と共に測定される。これらのパラメーターは、試料における血小板集団を定性的または定量的に同定するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料において血小板集団を同定するための方法であって、
（ａ）該生物学的試料を、核酸色素と、血小板上のエピトープに結合する少なくとも１つの標識抗血小板リガンドと共に５分未満の間インキュベートするステップ、
（ｂ）該インキュベートされた試料がフローサイトメーターの感知領域を通過するようにし、該インキュベートされた試料はレーザー光源を用いて照射され、該リガンドおよび該核酸色素からの蛍光と、光散乱、直流、軸方向光損失、不透明度、および高周波からなる群より独立して選択される少なくとも１つのさらなるパラメーターとを測定するステップ、ならびに
（ｃ）該試料における血小板集団を識別または同定するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
同定される前記血小板集団は、未成熟な網状血小板の集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｄ）前記試料における１つまたは複数の血小板集団を定量または計数するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
同定される前記血小板集団は、成熟血小板、未成熟な網状血小板、巨大血小板、血小板凝集塊、血小板サテライト、活性化血小板、非活性化血小板、その組み合わせ、および総血小板集団からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンドは、血小板集団上で専ら発現されるが、赤血球、白血球、上皮細胞、または内皮細胞上で発現されないエピトープまたは抗原に特異的に結合する血小板特異的リガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドは、血小板集団上で示差的に発現されるエピトープに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドは、血小板集団上で、ならびに赤血球、白血球、上皮細胞、および内皮細胞からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる集団上で発現されるエピトープまたは抗原に特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記リガンドは、血小板集団上で、ならびに赤血球、白血球、上皮細胞、および内皮細胞からなる群より選択される少なくとも１つのさらなる集団上で示差的に発現されるエピトープまたは抗原に特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記インキュベーション時間は、５秒間、１０秒間、１５秒間、２０秒間、３０秒間、４０秒間、５０秒間、１分間、１．５分間、２分間、２．５分間、３分間、３．５分間、４分間、４．５分間および５分間、ならびにその間の任意の小数部分からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標識リガンドは抗血小板蛍光性リガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識は、蛍光性標識、蛍光性または非蛍光性ビーズ、蛍光性または非蛍光性コロイド粒子、量子ドット、および蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）標識である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記識別ステップは、１つまたは複数の血小板集団を、白血球、網状赤血球、未成熟な網赤血球、細胞破片、および非細胞凝集物からなる群より選択される１つまたは複数の集団を有する混合物から区別することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
抗血小板蛍光を検出することによって、血小板集団を、他の血球、細胞破片、および非細胞凝集物と識別するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸色素の散乱光および蛍光のパラメーターを使用して前記血小板集団を分析することによって、未成熟な網状血小板を成熟血小板と区別するステップをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
リガンドの濃度を増加させると、前記試料とのインキュベーション時間が短縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料中の核酸色素の濃度は、約０．３〜約２．０μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料は、成熟赤血球および白血球をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料は、全血、末梢血、血漿、および血小板が豊富な血漿からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料は、（ａ）前記核酸色素に対して浸透性のある細胞、または（ｂ）該核酸色素と接触させる前もしくはその間に、球状化剤との接触によって該色素に対して浸透性となる、該試料中の細胞を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料は、溶解された細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料を、前記核酸色素と接触させる前またはその間に、該試料中に存在する無核赤血球を示差的に溶解し、前記血小板および有核細胞集団を維持する少なくとも１つの細胞溶解試薬と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸色素が、メタクロマジー性色素、非メタクロマジー性色素、青色励起性色素、緑色励起性色素、赤色励起性色素、細胞浸透性色素、および細胞非浸透性色素からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸色素が、メタクロマジー性色素を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記血小板特異的リガンドは、（ａ）前記核酸色素と区別可能な発光スペクトルを有するか、または（ｂ）該核酸色素と区別可能であるが、重複する発光スペクトルを有する蛍光性標識で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸色素はアクリジンオレンジであり、前記リガンド上の前記蛍光性色素はフィコエリトリン−シアニン−７（ＰＥＣｙ−７）またはＰＥ−Ａｌｅｘａ７５０である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料において総血小板集団を定量するステップをさらに含み、該総血小板集団は、成熟血小板、未成熟な網状血小板、巨大血小板、血小板凝集塊、および血小板サテライトを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記リガンドは、モノクローナル抗体またはその断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
物理的な洗浄または細胞分離の他の方法を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１の方法を実行するのに有用なキット。
【請求項３０】
生物学的試料において血小板の集団を同定するための方法であって、
（ａ）該生物学的試料を、核酸色素と、血小板上のエピトープに結合する少なくとも１つの標識抗血小板リガンドと共に５分未満の間インキュベートするステップであって、該リガンド上の標識および核酸色素は蛍光を放つ、ステップ、
（ｂ）該インキュベートされた試料がフローサイトメーターの感知領域を通過するようにし、該インキュベートされた試料はレーザー光源を用いて照射され、該標識リガンドの蛍光と該核酸色素の蛍光と、光散乱、直流、軸方向光損失、不透明度、および高周波からなる群より独立して選択される少なくとも１つの他のパラメーターとを測定するステップ、ならびに
（ｃ）該標識リガンドの蛍光およびさらなるパラメーターを使用して血小板の集団を同定し、該核酸色素の蛍光およびさらなるパラメーターを使用して同定された該血小板集団をゲーティングすることにより、該試料において未成熟な網状血小板集団を識別または同定するステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
血小板は、止血に一定の役割を果たすが、３つの一般的なタイプ：巨核球、巨核球の断片化に続いて末梢血に放出される網状（つまり未成熟）血小板、および成熟血小板がある。しかしながら、血小板の他の部分集団が、血液中に存在し、これらは、共通して、典型的な臨床的分析において数えられないか、または数え間違われる。そのような「部分集団」は、巨大血小板（つまり異常に大きな血小板）、血小板凝集塊（つまり多数の血小板が組み合わさったもの）、および血小板サテライト（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）（つまり白血球または他の細胞への血小板の付着）を含む。
【０００２】
患者の末梢血におけるこれらの様々なタイプの血球および血小板の識別および計数、その比率、ならびにそのある種のパラメーターまたは特徴の決定は、多種多様の血液障害または血液疾患の診断を可能にするのに必要である。異なるタイプの血小板の絶対数、濃度、および相対的パーセンテージは、ある種の疾患状態の存在もしくは不在および／または段階を大いに示す。たとえば、血小板タイプの測定および計数は、成熟化の様々な段階での血小板の異常な存在および／または数によって特徴づけられる多種多様の障害の診断およびモニタリングにとって重要である。たとえば、血小板集団の個々の同定および測定、その比率、ならびにすべての部分集団を含む総血小板数の精密な測定は、血小板新生および血小板代謝回転をモニターするための重要な臨床的有用性を有する。
【０００３】
典型的には、成熟細胞のみが、末梢血において検出可能な量で存在する。血小板数が、低く、疑わしげであり、そして／または自動化血球計数器が、警告を示す場合、手作業の血液塗抹標本は、典型的には、十分な血小板が存在するかどうかを決定するためのならびに巨大血小板および／または血小板凝集塊の存在を検証するための唯一の方法である。手作業の計数は、細胞を核酸特異的非メタクロマジー性色素（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）または核酸特異的メタクロマジー性色素（非特許文献４ならびに特許文献１）と接触させることを含む。メタクロマジー性色素は、広範囲の波長にわたって蛍光を放ち、未成熟な網状血小板を染色するのに特に有用であり、これらは、網状質として圧縮されたＲＮＡを含有する。たとえば、新規なメチレンブルーを用いる組織化学的染色において、未成熟な血小板の網状質は、斑状の紫がかった青色のエリアとして現われる。染色されたら、血小板はすべて、顕微鏡視野において計数され、網状質を含有する血小板を総血小板のパーセンテージとして表し、網状血小板のパーセンテージとしてそれらを表す（Ｉｎｇｒａｍ，Ｍ．およびＣｏｏｐｅｒｓｍｉｔｈ，Ａ．１９６９年Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ１７巻：２２５〜２２８頁）。この手作業の計数手順は手間がかかり、面倒で、ヒトの計数誤差を起こしやすい。
【０００４】
血小板分析の他の方法は、フローサイトメトリー技術を用いるものであり、これは、より速く、より信頼できる。そのような技術は、一般に、オキサジンと共に、非メタクロマジー性色素、チアゾールオレンジ（ＴＯ）、オーラミンＯ、およびポリメチンを用いる（Ｌｅｅ，Ｌ．Ｇ．ら、１９８６年Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ７巻：５０８〜５１７頁、Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ら、１９９５年Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ５４巻：１６３〜１７１頁、Ｂｒｉｇｇｓ，Ｃ．ら、２００４年Ｂｒｉｔ  Ｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １２６巻：９３〜９９頁）。メタクロマジー性色素であるアクリジンオレンジ（ＡＯ）もまた使用される（Ｓｅｌｉｇｍａｎ，Ｐ．Ａ．ら、１９８３年Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ１４巻：５７〜６６頁、特許文献１）。これらの方法は、成熟血小板および網状血小板を測定するのに有用であるが、ある種の弱点を欠点として持つ。これらの方法は、残りの血液成分から血小板を同定し、分離するためにサイズ（ログ前方散乱）および粒度（ログ側方散乱）を使用する。メタクロマジー性色素の蛍光発光の幅広い性質は、血小板を同定するための蛍光色素結合体化抗体の使用を妨げた。
【０００５】
健常なボランティアからの血液試料において、サイズおよび粒度の使用は、測定において血小板のみを含むのに十分である。しかしながら、ある種の疾患を有する患者からの試料は、血小板集団内にある、混入した赤血球断片を有し、血小板エリアにおいて血小板の数が見かけ上、増加し、そのため、網状血小板のパーセンテージがより低くなる。さらに、巨大血小板、血小板凝集塊、または血小板サテライトが、血小板関連性の欠乏または異常により存在する場合、結果として生じる同定または集団または定量は、フローサイトメーターによって誤って決定され得る。
【０００６】
核酸色素を使用する従来のフローサイトメトリー測定法における他の悪化させる問題は、何人かの患者から得られる血液試料における少ない血小板数である。１つの例は、特発性血小板減少性紫斑病と呼ばれる障害であり、患者自身の血小板は、自己抗体で覆われ、単核食細胞系によって除去される。この疾患における統計的に根拠のある網状血小板パーセンテージに十分な血小板を数えるために、大部分の数が依然として赤血球の数となる莫大なデータファイルを取得しなければならない。
【０００７】
そのような自動化フローサイトメトリー法はまた、網状血小板を測定する目的のために、非メタクロマジー性核酸色素と同時に血小板特異的抗体をも用いた。たとえば、Ｂｏｎａｎら１９９３年Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１４巻：６９０〜６９４頁、Ｍａｔｉｃら１９９８年Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、３４巻：２２９〜２３４頁、Ｒｉｎｄｅｒら１９９８年、Ｂｌｏｏｄ、９１巻：１２８８〜１２９４頁、非特許文献３、Ｂａｌｄｕｉｎｉ，Ｃ．Ｌ．ら、１９９９年Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ１０６巻：２０２〜２０７頁、Ｓｔｏｈｌａｗｅｔｚ，Ｐ．ら、１９９９年Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ８１巻：６１３〜６１７頁、Ｓａｘｏｎｈｏｕｓｅ，Ｍ．Ａ．ら、２００４年Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ：２６巻、７９７〜８０２頁、Ｃｈａｏｕｉ，Ｄ．ら、２００５年Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ：４５巻、７６６〜７７２頁を参照されたい）。例として、５６０ｎｍを超えるピーク発光を有する蛍光色素結合体化抗体は、４８８ｎｍレーザーを用いる励起に基づいてＲＮＡに結合し、適切な光学フィルターを使用し、蛍光補正（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）を適用することによって５００〜５６０ｎｍの検出可能な発光を有する色素チアゾールオレンジ（ＴＯ）と共に使用される（Ｓａｘｏｎｈｏｕｓｅら２００４年、上記に引用）。しかしながら、他の色素は、この方法において作用しない。たとえば、メタクロマジー性色素ＡＯは、ＲＮＡに結合する場合、約６３０〜６７０ｎｍのピークを有する、５００ｎｍ〜７００ｎｍの、幅広い重複する発光を有する。そのため、たとえ蛍光補正も使用したとしても、その範囲に及ぶ発光スペクトルを有する蛍光色素結合体化抗体と共にＡＯを使用するのは困難である（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、第４版、ＨＭ  Ｓｈａｐｉｒｏ（編）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、３０６〜３２６頁のＳｈａｐｉｒｏ，Ｈ．Ｍ．２００３年Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ．）。
【０００８】
一般に、そのようなフローサイトメトリー法は、長いインキュベーション時間を含み、したがって、そのような方法は、ハイスループット血液学的システムに基づいた使用に適用できない。これは、ＴＯおよび血小板特異的抗体を用いる、全血中の網状血小板の測定において例示される。抗ＣＤ４１血小板特異的抗体は、１５分間のインキュベーション時間を使用するある刊行物において報告された（Ｃｈａｏｕｉら２００５年、上記に引用）。同じ試薬は、他の方法において使用されたが、それぞれ３０および４５分間の異なるインキュベーション時間が用いられた（Ｓｔｏｈｌａｗｅｔｚら１９９９年およびＳａｘｏｎｈｏｕｓｅら、２００４年、共に上記に引用）。ＴＯおよび蛍光色素結合体化抗血小板抗体を使用するさらなる刊行物は、抗体が血小板に結合するための１０〜４５分間の範囲のインキュベーション時間を使用する（Ｂｏｎａｎら１９９３年、Ｍａｔｉｃら１９９８年、Ｒｉｎｄｅｒら１９９８年、非特許文献３、Ｂａｌｄｕｉｎｉら１９９９年、すべて上記に引用）。これらの長いインキュベーション時間は、これらのアッセイを、ハイスループット血液学的システムにとって役に立たないものとする。
【０００９】
同様に、広範囲の核酸色素結合および血小板以外の血液成分の抗体を用いる表面染色において、インキュベーション時間は、同様に長く、たとえば３０分間（特許文献２）および１５分間（特許文献３）であり、したがって、自動化細胞分析に適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，０６０，３２２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，０４７，３２１号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２８７，７９１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｉｅｎａｓｔ，Ｊ．およびＳｃｈｍｉｔｚ，Ｇ．、Ｂｌｏｏｄ（１９９０年）７５巻：１１６〜１２１頁
【非特許文献２】Ａｕｌｔ，Ｋ．Ａ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９２年）９８巻：６３７〜６４６頁
【非特許文献３】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．Ｃ．ら、Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ（１９９８年）１００巻：３５１〜３５７頁
【非特許文献４】Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｆ．Ｊ．およびＷｅｒｎｅｒ，Ｅ．、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９８６年）７巻：４３９〜４４４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
低い血小板数または干渉条件が、測定の不正確さをもたらし得る臨床的状況における血小板および網状血小板の特異的な同定を増強する迅速な分析方法のための当技術分野における必要性が残っている。機器のスループットを損なわずに、自動化血液学的分析器における実行に適しているような方法の必要性もまた残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本明細書において記載される方法は、血小板の実質的に同時の染色および抗体結合のための５分間未満の短いインキュベーション時間を含む迅速な分析を可能にする、血小板に結合する標識抗体および／または核酸色素の特有の組み合わせを使用する血小板血液学的分析のための方法の様々な実施形態を提供することによって、当技術分野における必要性に対応する。一実施形態において、迅速な方法は、１分間未満で実行されてもよいインキュベーションおよび染色手順を含む。他の実施形態において、そのプロセスは、３０秒間未満で実行される。
【００１４】
一態様として、生物学的試料において血小板集団を同定するための方法は、生物学的試料を、血小板集団上のエピトープおよび抗原に結合する少なくとも１つの標識リガンドと、核酸色素と共に、試料中の細胞が色素に対して浸透性である条件下で５分未満の間インキュベートするステップを含む。インキュベートされた試料がフローサイトメーターの感知領域を通過するようにし、このインキュベートされた試料はレーザー光源を用いて照射される。一実施形態において、少なくとも２つのパラメーター、たとえば光散乱、直流、軸方向光損失、不透明度、高周波、および蛍光を測定する。これらの測定によって生成されるデータを２つのパラメーターの使用によって一般に分析し、試料中の１つまたは複数の血小板集団を他の細胞と区別する。
【００１５】
なおさらなる態様または実施形態において、生物学的試料において未成熟な網状血小板の集団を同定するための方法は、生物学的試料を、核酸色素と、血小板上のエピトープに結合する少なくとも１つの標識抗血小板リガンドと共に５分未満の間インキュベートするステップを含み、リガンド上の標識および核酸色素は、蛍光を放つ。インキュベートされた試料がフローサイトメーターの感知領域を通過するようにし、上述のインキュベートされた試料はレーザー光源を用いて照射され、標識リガンドの蛍光および核酸色素の蛍光と、任意選択で、光散乱、直流、軸方向光損失、不透明度、高周波、および蛍光からなる群より独立して選択される少なくとも１つの他のパラメーターとを測定する。上述の試料における血小板集団は、標識リガンドの蛍光およびさらなるパラメーターの測定によって生成されるデータを使用して血小板の集団を同定することによって識別または同定される。その同定された集団をゲーティングし、その後、核酸色素の蛍光およびさらなるパラメーターを使用して生成される測定値を分析することにより、未成熟な網状血小板集団の同定または定量が可能となる。
【００１６】
他の態様または実施形態において、上記アッセイを使用する方法は、哺乳動物被験体からの生物学的試料においてある種の血小板集団を同定または測定することにより、血小板関連性の疾患の進行の診断およびモニタリングが可能となる。
【００１７】
他の態様および特許請求の範囲の様々な実施形態の利点は、その以下の詳細な説明において開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｆは、本明細書に記載のように、血液標本が核酸色素のアクリジンオレンジを用い、抗体を用いないで染色することによる分析のために調製された（１Ａ、１Ｃおよび１Ｅ）、または血液標本が、抗血小板抗体およびＡＯ（１Ｂ、１Ｄおよび１Ｆ）と混合し、インキュベートすることによって調製された、健康な患者由来の試料の２パラメーターのヒストグラムの図である。図１Ａは、血小板を同定し、計数するための従来技術のゲーティング戦略である、サイズ／前方散乱（ＦＳ）対粒度／側方散乱（ＳＳ）を使用したヒストグラムである。この試料中の細胞を、メタクロマジー性色素のアクリジンオレンジ（ＡＯ）を用い、抗血小板抗体は用いずに染色した。このヒストグラムは、サイズ（ＦＳ）および粒度（ＳＳ）に基づく血小板（Ｐ）、赤血球（ＲＢＣ）および白血球（ＷＢＣ）の分離を示す。血小板は、横長の形の最も下にある集団である（Ｐ）。図１Ｂは、ＰＥＣｙ７蛍光標識抗ＣＤ４１抗血小板抗体およびＡＯを用いた、本明細書に記載の迅速抗体染色法を使用して調製された試料に用いた、同じＦＳ対ＳＳ光散乱のゲーティング戦略を表す図である。サイズ（ＦＳ）および粒度（ＳＳ）に基づく血小板（Ｐ）、赤血球（ＲＢＣ）および白血球（ＷＢＣ）の分離は、図１Ａの試料と同様に示された。
【図１−２】図１Ａ〜１Ｆは、本明細書に記載のように、血液標本が核酸色素のアクリジンオレンジを用い、抗体を用いないで染色することによる分析のために調製された（１Ａ、１Ｃおよび１Ｅ）、または血液標本が、抗血小板抗体およびＡＯ（１Ｂ、１Ｄおよび１Ｆ）と混合し、インキュベートすることによって調製された、健康な患者由来の試料の２パラメーターのヒストグラムの図である。図１Ｃは、蛍光性抗血小板抗体を使用しない図１Ａの試料由来の血小板集団の、サイズ（ＦＳ）および抗血小板蛍光（ＰＣ７）を表す図である。この場合、血小板は抗血小板抗体で染色されず、したがって輪郭領域（Ｓ）は何ら血小板も存在しない、すなわち、蛍光は検出されない。図１Ｄは、図１Ｃに示されたものと同様のＦＳ対抗血小板蛍光分析を表す図であるが、この試料は図１Ｂのために調製された同じ標本であった。この標本において、７６０〜８２０ｎｍの範囲において放射するＰＥＣｙ７蛍光標識抗ＣＤ４１抗血小板抗体およびＡＯを使用して、迅速抗体染色法を用いた。このヒストグラムは、血小板がＣＤ４１−ＰＥＣｙ７抗血小板抗体と結合した血小板集団の、サイズおよび蛍光を表す。このヒストグラムの血小板は、異なる蛍光性集団（Ｓ）と思われる。血小板ではない粒子は、非蛍光性であり、Ｙ−軸に沿った事象として蛍光性血小板の左の、すなわち破片（Ｄ）と思われる。
【図１−３】図１Ａ〜１Ｆは、本明細書に記載のように、血液標本が核酸色素のアクリジンオレンジを用い、抗体を用いないで染色することによる分析のために調製された（１Ａ、１Ｃおよび１Ｅ）、または血液標本が、抗血小板抗体およびＡＯ（１Ｂ、１Ｄおよび１Ｆ）と混合し、インキュベートすることによって調製された、健康な患者由来の試料の２パラメーターのヒストグラムの図である。図１Ｅは、図１Ａおよび１Ｃに記載の同じ血液標本の、ＦＳ対核酸色素の蛍光を表す図である。このヒストグラムは、赤血球、白血球および網状血小板を含む血小板のサイズおよび蛍光を示す。血小板は円弧のように見え、残りの細胞から十分分離されている。赤血球は、血小板より蛍光が低い。ＤＮＡを有する白血球は、測定限界外であり、ヒストグラムの右上角に縦線（ＷＢＣ）のように見える。示されているように網状血小板は、血小板集団の中でより明るい蛍光性集団である。図１Ｆは、図１Ｄのヒストグラムにおいて同定された血小板集団の、ＦＳ対核酸色素の蛍光を表す図である。このヒストグラムは、破片および抗血小板抗体染色により同定され、分割された他の細胞（図１Ｄ）がない血小板の純粋集団をゲーティングするので、血小板および網状血小板の正確な計数を可能にする。未成熟な血小板である網状血小板は、前方散乱により実証されるようにサイズがより大きく、血小板の網状組織または顆粒の存在のためにＡＯ蛍光がより明るい。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、血液標本が、本明細書に記載の迅速染色法を使用して、抗血小板抗体（抗ＣＤ４１−ＰＥＣｙ７）およびＡＯと混合し、共にインキュベートすることによって分析するために調製された、健康な患者由来の試料の、２パラメーターのヒストグラムである。図２Ａは、光散乱のみ、すなわち前方散乱（ＦＳ）対側方散乱（ＳＳ）を使用して試料を分析したヒストグラムである。血小板を、Ｐと名付けた領域に同定した。図２Ｂは、ＦＳ対抗血小板抗体蛍光を使用して、同じ試料を分析したヒストグラムである。このヒストグラムは、染色された血小板（Ｓ）と、破片（Ｄ）および抗ＣＤ４１  ＰＥＣｙ７蛍光を有する他の細胞との分離を実証する。図２Ｃは、血小板集団を、ＦＳ対ＡＯ蛍光を使用して、図２Ａにおいて同定された血小板集団についてのゲーティングにより分析した図である。この得られたヒストグラムは破片（Ｄ）領域を示す。図２Ａのような、サイズ（ＦＳ）および粒度（ＳＳ）の使用により破片が含まれ、計算において網状血小板のパーセントがより低く、すなわち１６．６％になり、これは、血小板集団の分析のための光散乱のみの使用の限界である。図２Ｄは、ＦＳ対ＡＯ蛍光を使用した、図２Ｂのヒストグラムにおいて「Ｓ」としてすでに同定された破片を除いた、純粋な血小板集団を分析した図である。図２ＢのＦＳおよび抗血小板の蛍光領域は、破片（Ｄ）を排除する。したがって、図２Ｄのヒストグラムは、血小板の改善された分割および網状血小板のより高いパーセント、すなわち２２．６％を提供する。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、血液標本が、本明細書に記載の迅速染色法（抗血小板抗体および核酸色素との混合およびインキュベーション）に従って分析するために調製された、別の健康な患者由来の試料の、図２Ａ〜２Ｄに示すヒストグラムと同様の２パラメーターのヒストグラムである。図３Ａは、前方散乱（ＦＳ）対側方散乱（ＳＳ）を表し、光散乱パラメーターのみの使用による血小板およびＲＢＣの分離を示すヒストグラムである。図３Ｂは、図３Ａにおいて使用した同じ患者の試料に関する血小板集団の、ＦＳ対抗血小板抗体の蛍光を表す図である。図３Ｂにおける血小板は、抗ＣＤ４１  ＰＥＣｙ７と結合した。このヒストグラムは、血小板と、破片および抗ＣＤ４１  ＰＥＣｙ７蛍光を有する他の細胞との分離を実証する。図３Ｃは、光散乱のみにより図３Ａにおいて同定された血小板集団の、ＦＳ対ＡＯ蛍光分析を表し、２３．０％の網状血小板集団の評価をもたらす図である。図３Ｄは、図３Ｃとは対照的に、抗体染色により図３Ｂにおいて同定された、染色された血小板の純粋集団の、ＦＳ対ＡＯ蛍光を表す図である。ＦＳ対ＡＯ蛍光により評価された図３Ｂの集団は、同じ患者の試料に関して、より正確でより高いパーセントの網状血小板、すなわち２５．４％を提供する
【図４】図４Ａ〜４Ｆは、血液標本が、他の従来技術の方法に従って、または抗血小板抗体および核酸色素を使用した本明細書に記載の迅速染色法を使用して分析するために調製された、同じ健康な患者由来の試料の２パラメーターのヒストグラムである。これらのヒストグラムは、健康なボランティアの試料中の血小板集団（Ｐ）に存在するいずれの破片からも血小板を同定し、分割し、計数するための、抗血小板抗体を用いた迅速抗体染色法を例示し、従来技術の方法による結果と比較する。図４Ａは、血小板の分割および計数のために、いずれの抗体も用いずに調製した試料に関する前方散乱（ＦＳ）対側方散乱（ＳＳ）を表す図である。健康なボランティアの試料における血小板（Ｐ）、赤血球（ＲＢＣ）および白血球（ＷＢＣ）の分離を、サイズ（ＦＳ）および粒度（ＳＳ）に基づき示す。血小板は、横長の形の最も下にある集団（Ｐ）である。図４Ｂは、血小板に対して特異性を有さない蛍光性抗体を試料と混合した試料に関するＦＳ対ＰＣ７蛍光を表す図である。血小板は染色されなかったので、輪郭領域（Ｓ）にはいずれの血小板も存在しない。２パラメーターの使用では、血小板集団は同定されなかった。図４Ｃは、７６０〜８２０ｎｍの範囲で放射するＰＥＣｙ７蛍光標識抗ＣＤ４１抗血小板抗体およびＡＯを用いた迅速染色法を使用して調製された試料についてのＦＳ対抗血小板（ＰＣ７）蛍光を表す図である。このヒストグラム中の血小板は、異なる蛍光性集団のように思われる。血小板ではない粒子は非蛍光性であり、Ｙ軸に沿った事象として蛍光性血小板の左に見える（Ｄ）。この領域は、抗体を用いて染色された患者試料を測定した場合の事象において増加する。図４Ｄは、試料がＡＯで染色され、抗体で染色されなかった被験体の血小板集団のＦＳ対ＡＯ蛍光を例示する図である。この血小板集団を、図４Ａにおいて光散乱のみにより同定した。血小板は円弧のように見え、残りの細胞から十分分離されている。プロットは図４Ａからの血小板集団に基づいて（ゲーティングされて）いるので、赤血球および白血球は見ることができなかった。示されているように、網状血小板は、血小板集団の中でより明るい蛍光である。図４Ｅは、試料が非特異的抗体により染色されない、図４Ｂの試料の血小板集団の、ＦＳ対ＡＯ蛍光分析を表す図である。したがって、図４Ｂのヒストグラムが、血小板集団を同定しなかったので、図４ＥのヒストグラムはＡＯ蛍光を示さない。図４Ｆは、ＰＥＣｙ７蛍光標識抗ＣＤ４１抗血小板抗体およびＡＯを用いて染色され、図４Ｃに記載のように単離された試料のＦＳ対ＡＯ蛍光を表す図である。血小板集団は、図４Ｃにおいて抗血小板抗体染色によって同定され、分割されたので、純粋血小板集団と関連付けることによって網状血小板の正確な計数が可能である。抗血小板特異的抗体の不在下で測定した網状血小板（１６．４％、図４Ｄ）および抗血小板特異的抗体の存在下で測定した網状血小板（２２．１％、図４Ｆ）は、健康なボランティアの試料において同様である。しかし、この集団は図４Ｄの集団より正確に同定され、より高い。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、軽度の血小板減少症を有する患者から得た試料に由来する、２パラメーターのヒストグラムである。すべての試料は、迅速染色法に従って、少なくとも１種の抗血小板抗体（抗ＣＤ４１および／または抗ＣＤ６１）および核酸色素ＡＯを用いて調製した。図５Ａは、ＰＥＣｙ７蛍光標識抗ＣＤ４１抗血小板抗体およびＡＯを用いて染色された試料の、前方散乱（ＦＳ）対抗血小板蛍光のパラメーターを表す図である。図５Ｂは、ＰＥＣｙ７蛍光標識抗ＣＤ６１抗血小板抗体およびＡＯを用いて染色された試料である以外は同様の分析の図である。図５Ｃは、ＰＥＣｙ７蛍光標識抗ＣＤ４１抗血小板抗体およびＰＥＣｙ７蛍光標識抗ＣＤ６１抗血小板抗体およびＡＯを用いて染色された試料である以外は同様の分析の図である。図５Ｄは、図５Ａにおいて同定された血小板集団についてゲーティングし、２１．５％の網状血小板を示す、ＦＳ対ＡＯ蛍光のパラメーターを表すヒストグラムである。図５Ｅは、図５Ｂにおいて同定され、２１．９％の網状血小板を示す血小板集団の、ＦＳ対ＡＯ蛍光分析を表す図である。図５Ｆは、図５Ｃの２種の抗血小板抗体を使用して同定され、２３．５％の網状血小板を示す血小板集団の、ＦＳ対ＡＯ蛍光分析を表す図である。
【図６】正常なボランティアおよび患者における網状血小板値の分布を例示するグラフである。各記号は１個人を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書において記載される方法は、生物学的試料における１つまたは複数の血小板集団の自動で迅速な分析および同定を可能にする。この方法は、低い血小板数または干渉条件のいずれかが、測定の不正確さをもたらし得る臨床的状況において総血小板集団および血小板のサブセットの特異的な同定および／または定量を増強する。さらに、このアッセイ方法は、機器のスループットを損なわずに、自動化血液学的分析器へのこの方法の組み込みを可能にする迅速な染色を用いる。この方法は、試料中の血小板および他の細胞の迅速な染色を可能にする標識抗血小板リガンドおよび核酸色素の組み合わせを通して、当技術分野における現在の血小板同定アッセイに対するその利点を達成する。この方法は、最小数のアッセイ成分を使用しながら、血小板集団の最大数を同定し、および／または他の細胞からの血小板集団のより正確な分離を可能にする血液学的分析のために設計される。一実施形態において、この方法は、試料中の未成熟な網状血小板の集団の迅速で精密な同定を可能にする。
【００２０】
本明細書において使用されるように、「血小板集団」は、成熟血小板集団、未成熟な網状血小板集団、巨大血小板集団、血小板凝集塊の集団、および血小板サテライトの集団などのような個々の血小板部分集団を含む。活性化血小板および休止（非活性化）血小板を含む総成熟血小板は同定される。一実施形態において、上記の血小板部分集団のすべてから成る総血小板集団は、同定されるおよび／または測定される。方法はまた、上記に示される血小板部分集団の２つ以上の集団を同定するために用いられてもよい。
【００２１】
このアッセイ方法は、試料中の細胞が色素に対して浸透性である条件下での、少なくとも１つの標識抗血小板リガンドまたは血小板特異的リガンドおよび核酸色素との生物学的試料の迅速なインキュベーションを含む。結果として生じるインキュベートされた試料は、レーザー光に曝露され、パラメーターデータは収集される。その後は、血小板集団の識別は、たとえば抗血小板蛍光および核酸の蛍光を含むパラメーター測定値の組み合わせおよび評価に基づく。
【００２２】
Ａ．迅速なインキュベーション
１．生物学的試料
「生物学的試料」は、血小板を含有する任意の哺乳動物細胞含有懸濁液を含む。そのような標本または試料は、血液細胞および非血液細胞を含むことができる。例示的な試料は、全血、末梢血、血漿、および血小板が豊富な血漿を含む。そのような試料は、限定を伴うことなく、全血、末梢血、血漿、血小板が豊富な血漿、骨髄吸引液、リンパ節組織、脾臓組織、脳脊髄液、皮膚組織、粘膜組織、胸腔穿刺液、胸膜液、および脊髄液を含む。しかしながら、分析のための血小板集団を含有する任意の懸濁液、組織、または体液は、このアッセイにおいて用いられてもよい。血液学的な（つまり血液）細胞集団は、成熟したおよび未成熟な変異体および異型の白血球および赤血球、網状赤血球、有核赤血球、様々な血小板集団、網状血小板、ならびに巨核球を含む。血液において、異型細胞は、骨髄球、未成熟な顆粒球、杆状球、芽細胞、異型リンパ球、変異リンパ球、有核赤血球、巨大血小板、血小板凝集塊、および血小板サテライトなどの様々な形態を含む。一実施形態において、有核細胞集団は、有核赤血球および有核白血球を含む。非血液細胞は、とりわけ、上皮細胞および内皮細胞を含む。試料はまた、任意選択で、細胞破片および非細胞凝集物を含有していてもよい。
【００２３】
好ましくは、生物学的試料は、正常であるまたは疾患、有害な環境刺激、たとえば発癌物質に対する反応により、もしくは治療処置の結果として異型細胞集団を含有するヒト全血もしくは末梢血または血漿もしくは血漿が豊富な試料である。本明細書において記載される方法はまた、限定を伴うことなく、イヌおよびネコなどのような家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｉｍａｌ）ならびに農場動物（ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）またはとりわけウマなどのような、より大きな哺乳動物を含む他の哺乳動物からの試料の分析において用いられてもよい。
【００２４】
一実施形態において、試料は、方法において使用される核酸色素に対して自然に浸透性のある細胞を含有する。あるいは、方法の実行のために、試料中の細胞は、下記に記載されるように、アッセイの実行に先行して、試料調製の間に色素に対して浸透性となる。他の実施形態において、試料は、溶解された細胞を含有する。
【００２５】
一実施形態において、試料はまた、緩衝液などのような他の成分を含有してもよい。適した緩衝液は、約６〜約９の範囲に、インキュベーションおよびパラメーター測定の間に試料のｐＨを維持するものを含む。望ましくは、約７〜約７．５の範囲のｐＨは、試料において維持される。さらに、そのような緩衝液はまた、方法の１つまたは複数のリガンドまたは色素成分の濃度を調節するために使用されてもよい。本明細書において記載される方法において利用することができる緩衝液の例は、限定を伴うことなく、ＩＳＯＴＯＮ  ＩＩ、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬまたはその他同種のものなどのようなリン酸緩衝生理食塩水または等張生理食塩水を含む。米国特許第３，９６２，１２５号を参照されたい。これは、参考として本明細書によって援用される。適切な緩衝液の選択は、迅速な染色法を限定しない。
【００２６】
この迅速な染色法における使用のために、生物学的試料容量は、システムの必要量に適合させるために変更することができるが、好ましくは、約１０μＬ〜約１５０μＬの範囲とする。特に、試料容量は、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、または１４０μＬとすることができる。
【００２７】
２．リガンド
本明細書において使用されるような用語「リガンド」は、血小板集団上に存在する、指定される標的、たとえばエピトープ、抗原、または受容体に結合するタンパク質、ペプチド、または核酸配列を一般に指す。ある実施形態において、リガンドは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの高度に特異的なポリクローナル、モノクローナル、合成、または組換え抗体、抗体の２つのタイプまたは種の組み合わせによって形成されるキメラ抗体、ならびにヒト抗体バックボーン内に他の種の抗体可変領域を含有するヒト化抗体である。すべてのそのような抗体は、血小板上に発現されるエピトープまたは抗原または細胞表面受容体に向けられる。他の実施形態において、このアッセイにおいて有用なリガンドはまた、上記のタイプの抗体のうちの１つのＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｆｄ断片、またはＦｃ抗体断片などのような抗体断片とすることもできる。他の実施形態において、リガンドは、単鎖可変抗体断片である。他の適したリガンドは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む組換え構築物または血小板集団上に発現される標的エピトープもしくは標的抗原に結合する抗体の機能的に等価な結合特徴を保持するのに十分なＣＤＲを共有する構築物である。
【００２８】
一実施形態におけるこのアッセイにおいて使用される用語「血小板特異的リガンド」は、血小板集団上で専ら発現され、または異なる血小板集団上で示差的に発現されるエピトープ、抗原、または受容体に特異的に結合するリガンドである。血小板上で専ら発現されるエピトープ、抗原、または受容体は、赤血球、白血球、上皮細胞、または内皮細胞上で発現されない。たとえば、専ら血小板で発現されるエピトープまたは抗原または受容体の中には、ＣＤ４１（ＧＰＩＩｂ）、ＣＤ６１（ＧＰＩＩＩａ）、ＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂ）、ＣＤ４２ａ（ＧＰＩＸ）、ＣＤ４２ｄ（ＧＰＶ）、ＣＤ４２ｂＣＤ４２ａ（ＧＰ１ｂＩＸ）、ＣＤ４２ｂＣＤ４２ａＣＤ４２ｄ（ＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖ）、ＣＤ４１ＣＤ６１（ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ）、およびＣＤ６２ｐ（Ｐ−セレクチン／ＧＭＰ−１４０）と命名されるタンパク質があり、これらは、血小板集団のみを特徴づけることが公知である。したがって、このタイプの血小板特異的リガンドの例は、抗ＧＰＩｂモノクローナル抗体、抗ＧＰＩＸモノクローナル抗体、抗ＧＰ１ｂＩＸモノクローナル抗体、抗ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａモノクローナル抗体、抗ＧＰＩＶモノクローナル抗体、もしくは抗ＧＭＰ−１４０モノクローナル抗体またはその部分である。血小板特異的エピトープまたは抗原はまた、上記に同定された抗原の断片をも含む。上記に定義されるような血小板特異的エピトープまたは抗原はまた、血小板のある種のサブセット上でのみ発現され、または血小板のある種のサブセット上で示差的に発現されるそれらの抗原をも含む。たとえば、ＣＤ６２ｐは、休止血小板上でよりも活性化血小板上で高い密度で発現される受容体であり、したがって、抗ＣＤ６２ｐは、本明細書において記載される方法において血小板のこれらの２つのサブセットを区別するために用いられてもよい。
【００２９】
用語「抗血小板リガンド」は、血小板上でおよび少なくとも１つのさらなる細胞集団上で発現され、または示差的に発現されるエピトープ、抗原、または受容体に結合するリガンドを指す。ある種のエピトープは、血小板上で示差的に発現されてもよく、また、２つ以上のさらなる細胞集団上で示差的に発現されてもよく、そのようなエピトープに結合するリガンドは、下記に記載されるように同定のための様々なパラメーターを使用して多数の細胞タイプを同定するために使用されてもよい。たとえば、さらなる細胞集団は、赤血球、白血球、上皮細胞、または内皮細胞から選択することができる。一実施形態において、血小板および赤血球上で発現され、または示差的に発現されるエピトープまたは抗原は、限定を伴うことなく、以下のエピトープ、抗原、またはその断片を含む：ＣＤ３６、ＣＤ４７、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ９９、ＣＤ１１１、およびＣＤ１４７。したがって、方法における使用のためのこのタイプの適した抗血小板リガンドは、とりわけ抗ＣＤ３６抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＤ５５抗体、抗ＣＤ５８抗体、抗ＣＤ９９抗体、抗ＣＤ１１１抗体、および抗ＣＤ１４７抗体またはその部分を含む。
【００３０】
他の実施形態において、血小板および白血球上で発現されるエピトープまたは抗原は、限定を伴うことなく、以下のエピトープ、抗原、またはその断片を含む：ＣＤ９、ＣＤ１７、ＣＤ３１、ＣＤｗ３２、ＣＤ３６、ＣＤ４９、ＣＤ５１、ＣＤｗ６０、ＣＤ８４、ＣＤ１１４、およびＣＤ１５１。したがって、このタイプの示差的に発現される抗血小板リガンドは、たとえば抗ＣＤ８４抗体、抗ＣＤｗ３２抗体、もしくは抗ＣＤ４９抗体またはその部分である。
【００３１】
他の実施形態において、血小板および上皮細胞上で発現されるエピトープまたは抗原は、限定を伴うことなく、以下のエピトープ、抗原、またはその断片を含む：ＣＤ９、ＣＤｗ１７、ＣＤ２９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ５５、ＣＤ６０ｂ、ＣＤ８２、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１５１、およびＣＤ１６５。したがって、このタイプの示差的に発現される抗血小板リガンドは、たとえば抗ＣＤｗ１７抗体、抗ＣＤ１１２抗体、もしくは抗ＣＤ４９ｂ抗体またはその部分である。
【００３２】
他の実施形態において、血小板および内皮細胞上で発現されるエピトープまたは抗原は、限定を伴うことなく、以下のエピトープ、抗原、またはその断片を含む：ＣＤ３１、ＣＤ１１４、ＣＤ１５１、およびＰＥＣＡＭ−１。したがって、このタイプの示差的に発現される抗血小板リガンドは、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体、抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ１１４抗体、もしくは抗ＣＤ１５１抗体またはその部分である。
【００３３】
一実施形態において、方法は、１つの血小板特異的リガンドまたは１つの抗血小板リガンドを用いる。他の実施形態において、方法は、２つ以上の異なる血小板特異的リガンドを用いる。他の実施形態において、方法は、２つ以上の異なる抗血小板リガンドを用いる。他の実施形態において、方法は、血小板上の異なる決定基に結合する血小板特異的リガンドおよび抗血小板リガンドを用いる。他の実施形態において、そのようなリガンド（またはリガンドの組み合わせ）は、血小板上の抗原決定基の異なる発現に基づいて成熟した血小板および未成熟な血小板を、それらが成熟し、老化すると共に識別することができる。互いに関連する個々のリガンド／抗体特異性およびさらなる測定されるパラメーターは、単一の分析において最大の情報を提供することができる。血小板上のみのまたは血小板および他の血球上の抗原決定基に結合するこれらのリガンド／抗体の様々な組み合わせの使用は、正常および異型細胞タイプの中のさらなる同定および区別を可能にする。
【００３４】
この方法の様々な実施形態における使用のために選択されるリガンドは、下記に定義されるように、検出可能な標識を用いて典型的には標識される。方法において使用されるリガンド／抗体の最適濃度は、選択される標識、所望の染色強度、反応速度論、および１つのみまたは２つの蛍光色素標識を有する多数の抗体を使用する場合の、蛍光チャンネルの間の蛍光キャリーオーバーに基づいて定義される。そのような濃度は、本発明の教示を考慮して、当業者によって決定することもできる。
【００３５】
望ましくは、リガンド／抗体は、生物学的試料を有する単一反応混合物への混合のために設計される。
【００３６】
３．標識
この迅速な染色法において使用されるそれぞれのリガンドまたは抗体は、選択される検出可能な標識と結合または連結される。一実施形態において、標識は、蛍光性標識である。他の実施形態において、標識は、非蛍光性標識である。多数の標識リガンドが使用される実施形態において、蛍光性および非蛍光性標識の両方の組み合わせが用いられる。そのような標識は、限定を伴うことなく、蛍光色素、蛍光性および非蛍光性ビーズ、蛍光性または非蛍光性コロイド粒子、量子ドット、ならびに蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）標識を含む。
【００３７】
一実施形態において、検出可能な標識は、蛍光性標識、つまり診断アッセイにおいて共通して使用される蛍光色素である。リガンド／抗体を標識するのに有用な共通して使用される蛍光色素は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ４８８、フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ−シアニン−５（ＰＣ５）、ＰＥ−シアニン−７（ＰＣ７）、ＰＥ−テキサスレッド（ＥＣＤ）、およびペリジニン−クロロフィル−タンパク質（ＰｅｒＣＰ）などのような青色励起性蛍光色素ならびにアロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ａｌｅｘａ６４７、およびＡＰＣ−Ｃｙ７などのような赤色励起性蛍光色素を含む。他の有用な蛍光色素は、タンデム色素、たとえばＰＥ−シアニン−５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ａｌｅｘａ７５０、およびローダミンを含む。Ａｌｅｘａ色素もまた、タンデム色素ではないが、有用である。とりわけテキサスレッドおよびローダミン、ＦＩＴＣ＋ＰＥ、ＦＩＴＣ＋ＰＥＣｙ５、ならびにＰＥ＋ＰＥＣｙ７などのような、そのような標識の組み合わせは、フローサイトメトリー装置において用いられるレーザーのタイプに依存して使用されてもよい。他の蛍光色素は、方法において用いられてもよく、赤字、青色、紫色、もしくは緑色の波長またはその組み合わせの照射によって励起性となるものを含んでいてもよい。多数の蛍光色素は、入手可能な蛍光色素から独立して選択されてもよい。
【００３８】
あるいは、ビオチン−アビジンまたは一次および二次標識抗体などのような間接的な標識方法は、同様の効果を達成するのに有用である。
【００３９】
これらの蛍光性標識はすべて、市販で入手可能であり、それらの使用は、当技術分野で公知である。他の蛍光性標識は、他の供給源から入手可能であってもよく、今後開発されてもよい。そのような蛍光性色素または蛍光色素は、下記の実施例の例示的な蛍光性標識と同じ様式の方法において有用であることが予想される。
【００４０】
それぞれの蛍光色素は、特徴的な「発光スペクトル」を有し、この部分は、特徴的な「ピーク発光スペクトル」となる。本明細書において使用されるように、用語「発光スペクトル」は、励起された場合に蛍光色素が放つ、それぞれの周波数の電磁放射の量を一般に意味する。一般に、発光スペクトルは、ナノメートルで普通測定される、ある種の周波数のバンドによって形成される範囲またはプロファイルである（つまり波長）。本明細書において使用されるように、用語「ピーク発光スペクトル」は、ナノメートルで最大波長として普通測定される、発光スペクトルの最も強い部分を意味する。任意の所与の蛍光色素の（および狭い発光スペクトルを有するほとんどの核酸色素の）ピーク発光スペクトルは、公知であり、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、１９９６年；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、１９９４年／１９９５年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓおよび他の同様のテキストまたは対応するウェブサイトなどのような、当業者らに公知であり、参考として本明細書に援用されるそのような蛍光色素を記載する刊行物から容易に得られる。任意の所与の蛍光色素のピーク発光スペクトルはまた、分光光度計を使用してスペクトル走査を実行することによって得られてもよい。したがって、ある実施形態において、この方法において使用されるリガンド上の標識は、方法において使用される他の蛍光色素標識および／または核酸色素と重複ピーク発光スペクトルを有していてもよい。
【００４１】
リガンド、たとえば抗体と標識を連結または結合するための方法は、同様に、従来のものであり、当業者らに公知である。標識結合の公知の方法は、記載されている（たとえば、とりわけＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６版、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、１９９６年、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、１９９４年／１９９５年）、米国特許第６，６９２，９６８号、および第５，１６４，３１１号を参照されたい。したがって、連結方法の選択は、本発明を限定しない。
【００４２】
方法の様々な実施形態によれば、１つの蛍光色素は、用いられる単一のリガンドを標識するために使用される。あるいは、同じまたは異なる蛍光色素は、方法において使用される多数のリガンド（たとえば１つまたは複数の抗体）を標識するために用いられる。標識として選択される蛍光色素の正体は、組成物における２つ以上の抗体を標識するために同じ蛍光色素または異なる蛍光色素が使用されるかどうかに依存する。同じ蛍光色素が、１つを超える抗体を標識するために使用される場合、それぞれの抗体は、「重複ピーク発光スペクトル」を有するであろう。同一の蛍光色素の間のそのような重複は、補正不可能であるまたは分離不可能である。２つ以上の蛍光色素が使用される場合、それぞれ異なるピーク発光スペクトルを有する、異なる蛍光色素が選択されてもよく、これらは、任意選択で、重複ピーク発光スペクトルであってもよい。一実施形態において、方法における１つの抗体上の蛍光色素標識のピーク発光スペクトルは、他の抗体を標識するために使用される蛍光色素のピーク発光スペクトルと重複して、補正不可能なスペクトル発光を形成してもよい。
【００４３】
重複発光スペクトルによって形成されるスペクトルパターンに適用されるような語句「補正不可能な」、「分解不可能な」、または「分離不可能な」は、２つの抗体を標識する蛍光色素のピーク発光スペクトルの重複によって形成されるスペクトルパターンが、成分のピーク発光スペクトルに分離することができない、または分解することができないことを意味する。一実施形態において、重複スペクトルパターンは、現在の光学または色補正法（光学もしくは電子）によって分離可能ではない。したがって、結果として生じる補正不可能なスペクトルパターンは、その成分の蛍光色素ピーク発光スペクトルのいずれかと異なり、異なる血小板または他の血球サブセットもしくは集団を同定するヒストグラムを作成するために、組成物において使用される抗体および／または色素の異なる細胞特異性を用いる分析法において用いることができる。補正不可能な重複スペクトル発光パターンを形成する適したペアの蛍光色素は、限定を伴うことなく、青色励起性ペア：ＦＩＴＣおよびＡｌｅｘａ４８８、ＰＥおよびＣｙ３、ＰＣ５およびＰｅＣｙ５、ＰＣ５およびＰｅｒＣＰ、ＰｅＣｙ５およびＰｅｒＣＰ、ＰＣ７およびＰｅＣｙ７ならびに赤色励起性ペア：ＡＰＣおよびＡｌｅｘａ６４７を含む。異なる色の２つのレーザーが蛍光性分析において使用される場合、適した蛍光色素ペアは、限定を伴うことなく、ＰＣ７およびＡＰＣ−Ｃｙ７ならびにＰｅＣｙ７およびＡＰＣ−Ｃｙ７を含む。
【００４４】
あるいは、重複ピーク発光スペクトルを有していない異なる蛍光色素ペアを使用してもよい（以後、「非重複」蛍光色素と呼ぶ）。たとえば、使用のための選択される、連結される蛍光色素（１つまたは２つのレーザーを使用）は、ＰＥ（ピーク発光スペクトル約５７５ｎｍ）＋ＰＥＣｙ５（ピーク発光スペクトル約６７０ｎｍ）、ＰＥ＋ＡＰＣ（ピーク発光スペクトル約６６０ｎｍ）、ＦＩＴＣ（ピーク発光スペクトル約５２０ｎｍ）＋ＰＥ、ＡＰＣ＋ＰＥＣｙ７（ピーク発光スペクトル約７７０ｎｍ）、およびＰＥ＋ＰＥＣｙ７を含む。これらのペアの蛍光色素はすべて、非重複ピーク発光スペクトルを有する。補正不可能な重複発光スペクトルもしくは補正可能な重複発光スペクトルまたは重複しない発光スペクトルを有する蛍光色素ペアのこれらのリストは、代表的なもののみであり、網羅的なリストを含むことを企図しない。当業者は、本明細書のさらなる教示を考慮して、本明細書において記載される方法における使用のための適切な蛍光色素の組み合わせを容易に選択することができるはずである。
【００４５】
迅速な染色法の一実施形態において、上記に示される（１つまたは複数の）リガンドと結合体化する標識は、方法において用いられる核酸色素と区別可能である発光スペクトルを有する蛍光性標識である。他の実施形態において、血小板特異的または抗血小板リガンドは、核酸色素と重複発光スペクトルを有する蛍光性標識で標識される。後者の実施形態において、そのような重複発光スペクトルは、方法において使用される蛍光性標識または核酸色素の少なくとも１つのピーク発光スペクトルで補正可能であってもよいもしくは分解可能であってもよいまたは補正可能でなくてもよいもしくは分解可能でなくてもよい。
【００４６】
他の非蛍光性標識は、この迅速な染色法において用いられてもよい。たとえば、抗体は、たとえば放射性化合物、化学発光標識、ビオチンなどのようなタンパク質、酵素、ＦＬＡＧなどのような分子標識などを用いて標識されてもよい。たとえば、Ｃｈｕｂｅｔ  ＲＧ、Ｂｒｉｚｚａｒｄ  ＢＬ．１９９６年Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２０巻（１号）：１３６〜１４１頁およびＫｎａｐｐｉｋ  Ａ、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．１９９４年Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９９４年；１７巻（４号）：７５４〜７６１頁を参照されたい。検出可能な標識の他の要素は、他の成分との相互作用に際してシグナルを生成するのに有用な基質、たとえばストレプトアビジンおよびホースラディシュペルオキシダーゼ系を含む。適した標識は、幅広い、慣習的に用いられる検出可能な診断標識の中から選択される。
【００４７】
望ましい一実施形態において、本明細書において記載される方法において使用される蛍光色素は、ＰＥ−Ｃｙ７である。
【００４８】
４．核酸色素
本明細書において記載される迅速な染色法は、下記に定義されるように、試料中の細胞に浸透することができ、核酸を迅速に染色することができる核酸色素を利用する。核酸特異的色素は、それらのＲＮＡまたはＤＮＡ結合能力に基づいてある種の波長の蛍光を放つ（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ、第２版、ＭＲ  Ｍｅｌａｍｅｄ、Ｔ  Ｌｉｎｄｍｏ、およびＭＬ  Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ（編）、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２９１〜３１４頁のＤａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，ＺおよびＫａｐｕｓｃｉｎｓｋｉ  Ｊ  １９９０年  「Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ：Ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｐｒｏｂｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ．」）。
【００４９】
本発明において有用な蛍光性色素に関して、用語「発光スペクトル」は、上記の蛍光色素について定義されるのと同じように定義される。いくつかの色素は、２００ｎｍを超えてわたる幅広い「ピーク」と共に幅広い発光スペクトルを有する。他の色素は、狭いピーク発光スペクトルを有する。そのような色素の発光スペクトルはまた、当技術分野においても公知であり、多種多様の周知のテキストにおいて公開されている。たとえばＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ、第２版、ＭＲ  Ｍｅｌａｍｅｄら（編）、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２９１〜３１４頁のＤａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，ＺおよびＫａｐｕｓｃｉｎｓｋｉ  Ｊ（１９９０年）Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ：Ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｐｒｏｂｅ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ、Ｓｈａｐｉｒｏ、Ｈｏｗａｒｄ  Ｍ．（２００３年）  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  第４版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ  ２９６〜２９７頁、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎウェブサイト：ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ．を参照されたい。
【００５０】
蛍光性色素は、一実施形態において、核酸色素である。他の実施形態において、蛍光性色素は、細胞親和性色素である。一実施形態において、核酸または色素は、細胞浸透性色素である。色素は、メタクロマジー性もしくは非メタクロマジー性、または細胞浸透性もしくは非細胞浸透性であってもよい。用語「細胞浸透性」は、組成物または反応混合物中の透過剤のさらなる存在を必要とすることなく、細胞膜に容易に浸透し、細胞の成分を染色する色素を表すものとする。典型的には、細胞浸透性色素は、生きている細胞または溶解されていない細胞の成分を染色するために利用される。
【００５１】
他の実施形態において、蛍光性色素は、赤色、緑色、紫色または青色励起波長領域内の細胞非浸透性色素などの細胞非浸透性色素である。方法の実施形態におけるこの色素の使用は、下記に提供されるように、細胞を溶解するための、試料の前処理が一般に伴う。
【００５２】
さらなる実施形態において、蛍光性色素は、挿入色素および／またはメタクロマジー性色素である。たとえば、Ｕｒｂａｎら、２０００年  Ａｃｔａ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．１０２巻：２５９〜２７２頁において示されるメタクロマジー性色素を参照されたい。
【００５３】
さらなる実施形態において、蛍光性色素は、非メタクロマジー性色素である。用語「非メタクロマジー性色素」は、所定の波長で照射された場合に励起および／または発光の単一の波長を提供する蛍光性色素を表すものとする。
【００５４】
様々な態様において有用な蛍光性色素は、上記の特徴の組み合わせを共有していてもよい。たとえば、この方法の一実施形態において、核酸色素は、メタクロマジー性、細胞浸透性である青色励起性核酸色素のアクリジンオレンジである。他の有用な色素は、非メタクロマジー性、非細胞浸透性である青色励起性核酸色素のヨウ化プロピジウムである。他の有用な色素は、青色の約４８８ｎｍ波長において励起する、非メタクロマジー性細胞浸透性核酸色素のチアゾールオレンジである。フルオレセインジアセテートは、核酸色素ではないが、非メタクロマジー性細胞浸透性の酵素基質色素である、他の青色励起性色素である。ローダミン１２３は、方法のある種の実施形態において有用な青色励起性の非メタクロマジー性細胞浸透性ミトコンドリア色素である。赤色励起性ＳＹＴＯ６１色素は、約６３３ｎｍで励起する非メタクロマジー性細胞浸透性核酸色素である。同様に、赤色励起性色素ＴＯ−ＰＲＯ−３は、迅速な染色法のある種の実施形態において有用な非メタクロマジー性非細胞浸透性核酸色素である。
【００５５】
本明細書において記載される方法の様々な実施形態において利用されてもよい他の蛍光性色素の例は、限定を伴うことなく、ピロニンＹ色素、アクリジン色素、ノニルアクリジンオレンジ色素（３，６−ビス−（ジメチルアミノ）−１０−ノニルアクリジニウムブロミド、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、およびアクリジン赤色色素（ピロニンＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯとしても市販で入手可能）；チアゾールオレンジ色素（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）；ヨウ化プロピジウム（３，８−ジアミノ−５−（３−ジエチルアミノプロピル）−６−フェニル−二ヨウ化フェナントリジニウム、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；ヨウ化ヘキシジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；ジヒドロエチジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）；エチジウムモノアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、トルイジンブルー色素（２−アミノ−７−ジメチルアミノ−３−塩化メチルフェノチアジニウム、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；ＴＯＰＲＯ−３色素；ＹＯＰＲＯ−１色素；ＳＹＴＯ（商標）１７色素およびＳＹＴＯ（商標）５９色素〜ＳＹＴＯ（商標）６４色素などのようなＳＹＴＯ（商標）色素；ＴＯＴＯ−１色素およびＴＯＴＯ−３色素などのようなＴＯＴＯ（商標）色素；ＰＯ−ＰＲＯ−３色素；ＹＯＹＯ−１色素などのようなＹＯＹＯ（商標）色素；ＢＯＢＯ（商標）色素；ＰＯＰＯ−３色素などのようなＰＯＰＯ（商標）色素；キサンテン色素；カルボシアニン色素；Ａｓｔｒａ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＦＲを含むポリメチン色素；チオフラビンＴ；プソイドイソシアニン（ｐｓｕｄｏｉｓｏｃｙａｎｉｎｅ）；オキサカルボシアニン色素；アジン色素；ジフェニルメタン色素；メチン色素；オキサジン色素；シアニン色素；スチリル色素；およびヒドロシスチルバミジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を含む。これらの色素の多くおよび本明細書において記載される方法において利用することができる他のものは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）から市販で入手可能である。米国特許第５，５６３，０７０号を参照されたい。これは、参考として本明細書によって援用される。
【００５６】
非メタクロマジー性色素の例は、限定を伴うことなく、とりわけ、ニュートラルレッド色素（３−アミノ−７−ジメチルアミノ−２−メチルフェナジン塩酸塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｂａｓｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ（商標）２１色素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＤｉＯＣ色素（１，１’−ジメチルオキサカルボシアニン、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、Ｐｙｒｏｎｉｎ（商標）Ｙ色素（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）、Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｂｌｕｅ（商標）色素（３−ビス−（ジメチルアミノ）−フェノチアジン−５−イウムクロリド、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、Ａｕｒａｍｉｎｅ（商標）Ｏ色素（４，４’−（イミドカルボニル）−ビス−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）一塩酸塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＬＤＳ（商標）７５１色素（キノリンイウム，６−（ジメチルアミノ）−２−［４−［４−（ジメチルアミノ）フェニル）−１，３−ブタジエニル）−２−エチル過塩素酸塩、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、赤色系列色素、およびその組み合わせを含む。たとえば、様々なＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒカタログ；Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第６版、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲを参照されたい。ある種の色素は、いくつかの状況においてメタクロマジー性色素とすることができ、他の状況において非メタクロマジー性色素とすることができることに注目されたい。
【００５７】
本明細書において記載された方法および組成物において利用することができるメタクロマジー性色素の例は、限定を伴うことなく、とりわけキサンテン色素、カルボシアニン色素、Ａｓｔｒａ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＦＲを含むポリメチン色素、チオフラビンＴ、プソイドイソシアニン、オキサカルボシアニン色素、アクリジン色素、アジン色素、ジフェニルメタン色素、メタン色素、オキサジン色素、シアニン色素、およびスチリル色素を含む。たとえば、Ｕｒｂａｎら、２０００年  Ａｃｔａ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．１０２巻：２５９〜２７２頁において示されるメタクロマジー性色素を参照されたい。
【００５８】
７５０ｎｍを超えるピーク発光波長を有する（１つまたは複数の）蛍光色素の新しいタンデム色素の最近の生産により、蛍光色素結合体化リガンドとのメタクロマジー性色素の使用が可能になる。たとえば、下記の実施例において実証されるように、抗血小板リガンドまたは血小板特異的リガンドと結合体化するそのタンデム蛍光色素ＰＥ−Ｃｙ７との核酸色素ＡＯの使用は、この方法におけるインキュベーションの間の迅速な染色を可能にする。この組み合わせの使用は、７５０ｎｍを超える、著しく過剰なＡＯ結合ＤＮＡ発光を引き起こす血小板ＤＮＡがない血小板活動領域において適合する。
【００５９】
したがって、迅速な染色法の一実施形態において、蛍光性色素は、アクリジンオレンジまたはノニルアクリジンオレンジである。他の実施形態において、色素は、チアゾールオレンジである。他の実施形態において、色素は、ヨウ化プロピジウムである。他の実施形態において、色素は、アクリジンレッドまたはトルイジンブルー色素である。
【００６０】
一実施形態において、蛍光性色素の発光スペクトルは、方法において使用される１つまたは複数の蛍光色素標識の１つまたは複数のピーク発光スペクトルと重複する。他の実施形態において、核酸色素およびリガンド上の標識の発光スペクトルは、非重複である。
【００６１】
本明細書において記載される方法の一実施形態において、使用される核酸色素は、アクリジンオレンジであり、蛍光色素は、ＰＥＣｙ７である。色素および蛍光色素の様々な組み合わせは、以下の実施例において使用されるアクリジンオレンジおよびＰＥＣｙ７について記載されるのと同じ様式において、迅速な染色法において使用されてもよい。
【００６２】
５．インキュベーション条件
試料、リガンド、および色素の間の接触のためのインキュベーション時間が、一実施形態において、約５分間未満であることはこの方法の利点である。一実施形態において、試料およびリガンドおよび色素の間のアッセイインキュベーション時間は、約１分間である。他の実施形態において、インキュベーション時間は、３０秒間未満である。この方法はまた、少なくとも５秒間、１０秒間、１５秒間、２０秒間、３０秒間、４０秒間、５０秒間、１分間、１．５分間、２分間、２．５分間、３分間、３．５分間、４分間、４．５分間、または４．９分間以内のインキュベーション時間を使用して実行されてもよい。同様に、インキュベーション時間は、分および５秒間以内の秒で表される時間の任意の小数部分とすることができる。
【００６３】
個々の抗体および試薬の濃度を調節して、処方物に球状化剤（ｓｐｈｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の使用を組み込み、混合を最適化する場合、約１分間の反応混合物の反応時間が達成される。この種の迅速な反応時間は、研究所において実証されており、自動化ハイスループットシステムに必要とされる。
【００６４】
反応混合物の成分は、室温でインキュベートすることによって反応させる。温度は問題とならないが、一般に周囲の温度が用いられる。他の実施形態において、温度は、約３７℃まで変動してもよいが、但し、試料における細胞の生存能に十分なものとする。
【００６５】
本明細書において記載されるアッセイのインキュベーションステップの他の条件は、方法において使用されるリガンドおよび核酸色素の試薬の濃度を含む。一実施形態において、リガンド／抗体の濃度を増加させると、試料とのインキュベーション時間が短縮される（または反応速度が増大する）。したがって、リガンドの濃度が高くなるほど、インキュベーション時間は短くなる、つまり、より迅速なアッセイとなる。一実施形態において、約１０〜約２００μＬの試料に対して、約０．１〜約２μｇのそれぞれのリガンド／抗体が添加される。他の実施形態において、リガンドは、約０．１〜約２μｇ／１００μＬ試料の間の濃度で存在する。
【００６６】
核酸色素の濃度および性質は、インキュベーション時間の迅速性に影響を与え得る。たとえば、色素が細胞浸透性である場合、アッセイ時間は縮小される。典型的には、このアッセイにおいて試料中の核酸色素の濃度は、約０．３〜約２．０μｇ／ｍｌである。他の実施形態において、試料中の核酸色素の濃度は、約０．６μｇ／ｍｌである。核酸色素は、反応混合物中に導入される。抗体濃度、血液容量、インキュベーション時間および／または混合時間を適切に調節すると、それよりも低い濃度または高い濃度が可能である。この方法において用いられるリガンドの種類および数もこの方法の迅速性に影響を与え得る。
【００６７】
迅速な染色法の一実施形態において、試料中の細胞を、アッセイ試薬、特に核酸色素に透過性になるように、試料を球状化剤と接触させる。この接触は、核酸色素および抗血小板リガンドまたは血小板特異的リガンドとインキュベートする前またはその間に行われる。球状化剤は、当業者によって容易に選択することができる。望ましくは、球状化試薬は、赤血球および網赤血球を等容性で（ｉｓｏｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）球状化し、透過性を増加させる両性イオン性界面活性剤である。そのような試薬はまた、界面活性剤としても作用することができる。球状化剤の例は、リン酸緩衝生理食塩水などのような緩衝液を有する溶液中に適当に存在する非イオン性界面活性剤ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、アルキルアミドベタインもしくはラウロアミドプロピルベタイン、ココアミドプロピルベタイン、およびココアミドスルホベタインなどのようなアルキルベタインなどのような両性イオン性作用物質、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、またはＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを含む。米国特許第５，６３３，１６７号および第５，４３８，００３号を参照されたい。これらは、参考として本明細書によって援用される。血液試料内の細胞を等容性で球状化するために、試料における球状化試薬の濃度は、最も好ましくは、約３μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、ｍＯｓｍは、約２００〜約４００ｍＯｓｍ、好ましくは約２５０ｍＯｓｍ〜約３５０ｍＯｓｍの範囲である。しかしながら、当業者は、選択される界面活性剤を考慮に入れて、細胞を等容性で球状化するために必要とされ、または所望されるように、この濃度および容量オスモル濃度を容易に調節してもよい。
【００６８】
細胞をも透過性にするいくつかの界面活性剤および洗浄剤もまた、インキュベーションに先立ってまたはその間に、試料との混合のために用いられてもよい。界面活性剤の例は、限定を伴うことなく、陰イオン性界面活性剤アンモニウムペルフルオロアルキルカルボキシレート（Ｆｌｕｏｒａｄ（登録商標）ＦＣ−１４３（３Ｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）として市販で入手可能）、ナトリウムラウロイルミリストイルラクチレート（Ｐａｔｉｏｎｉｃ（登録商標）１３８Ｃ（Ｒ．Ｉ．Ｔ．Ａ．Ｃｏｒｐ、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）として市販で入手可能）または非イオン性界面活性剤ドデシル−α−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス［３−Ｄ−グルコン−アミドプロピル）コールアミド、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレン−ブロック共重合体、Ｎ−テトラデシル−α−Ｄ−マルトシド、ダコニール−Ｎ−メチル−グルカミド、ｎ−ドデシル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−デシル−α−Ｄ−グルコピラノシド、ステアリン酸のポリエチレングリコールエステル、エトキシ化ココモノグリセリド、オクチフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール、エトキシ化オクチルフェノール、および直鎖アルコールまたは陽イオン性界面活性剤ココヒドロキシエチルイミダゾリン、塩化ラウリルトリメチルアンモニウム、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、オクチルトリメチルアンモニウムブロミドまたは両性イオン性界面活性剤ラウルアミドプロピルベタイン、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ココアミドプロピルベタイン、ココアミドスルホベタイン、Ｎ−ドデシルＮ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを含む。洗浄剤の例は、限定を伴うことなく、非イオン性洗浄剤を含む。
【００６９】
他の細胞透過剤もまた、細胞非浸透性色素が細胞膜に浸透することを可能にするために、方法の様々な実施形態において含むことができる。望ましくは、これらの成分は、全組成の約０〜約１％の間の濃度で使用される。
【００７０】
迅速な染色法の代替の実施形態において、（１つまたは複数の）リガンドおよび色素に対して透過性ではない細胞を含有する試料について、試料は、試料中に存在する無核細胞を示差的に溶解し、血小板および有核細胞集団を維持する少なくとも１つの細胞溶解試薬と、リガンドおよび色素とのインキュベーションに先立ってまたはその間に接触させられる。有核細胞集団は、有核赤血球および白血球を含む。有核細胞、特に血小板の内因性または外因性の特性を変化させることを伴わない試料／反応混合物中の無核細胞の異なる溶解および溶解反応の随意のクエンチングは、色素および（１つまたは複数の）リガンドとの試料のインキュベーションの前にまたはその一部として行われてもよい。
【００７１】
細胞溶解系は、典型的には、核酸色素が非浸透性色素である場合に用いられる。いくつかの実施形態において、細胞溶解系は、単一の細胞溶解試薬を含むことができる。他の実施形態において、細胞溶解系は、細胞溶解剤およびクエンチ試薬などのような２つの試薬を含む。いくつかの実施形態において、細胞溶解系は、３つの試薬、細胞溶解剤、クエンチ試薬、および固定試薬を含むことができる。
【００７２】
（１つまたは複数の）細胞溶解試薬は、ＥＲＹＴＨＲＯＬＹＳＥ  ＩＩ試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、試薬を同定する目的のために参考として援用される米国特許第５，８８２，９３３号において開示される溶解試薬を含むが、これらに限定されない。本明細書において記載される方法において有用な細胞溶解系は、第２の試薬、たとえば、方法の残りのステップの間に、たとえば、試料が、トランスデューサーモジュールの開口部を流れている間に、細胞溶解試薬の影響をクエンチまたは阻止するものを含むことができる。有用な細胞溶解阻止剤は、溶解剤に依存して選択されてもよく、速度が問題である場合のみ、おそらく用いられてもよい。そのような細胞溶解阻止剤の例は、Ｓｔａｂｉｌｙｓｅ（商標）試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）である。細胞溶解阻止試薬は、変えることができるが、但し、細胞溶解反応のクエンチングの主要な条件ならびに興味のある細胞の抗原決定基ならびに所望される電気的および光学的特性の維持が達成されるものとする。他の細胞溶解系は、市販されており、Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｐ（商標）系（米国特許第５，０３０，５５４号；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、Ｖｅｒｓａｌｙｓｅ（商標）系、Ｆａｃｓｌｙｓｅ（商標）系（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、または塩化アンモニウム系を含む。これらの系は、本明細書において記載される方法において有用である。
【００７３】
一実施形態において、インキュベーションは、溶解／クエンチ反応を含み、これは、約４〜１０秒間の間、上記に定義されるように、細胞溶解系または細胞溶解試薬と試料／抗体混合物の一部を接触させることを含む。数秒間の後、細胞溶解系の効果は、その後、記載されるようなクエンチング試薬を用いて阻止されるかまたはクエンチされ、ＲＢＣは溶解する。試料が、サイトメトリ／血液学的分析器の開口部を流れている間、クエンチング試薬は、一般に、試料に接している。この第２の試薬は、したがって、少なくとも数秒間、混合物に接している。従来の固定試薬はまた、細胞溶解試薬の選択または方法の好ましい実行に依存して用いられてもよい。細胞溶解試薬、クエンチ試薬、および固定試薬の容量は、所望の場合、使用される細胞溶解系の正体に依存して当業者によって容易に選択することができる。
【００７４】
迅速な染色およびインキュベーションのための他の条件の中には、試料への試薬の追加の順序がある。一実施形態において、（１つまたは複数の）リガンド／抗体は、最初に試料に追加され、その後、核酸色素、その後、他の成分が追加される。その後、単一反応混合物は、試料中に存在する無核赤血球を示差的に溶解し、試料中の血小板集団を維持する随意の細胞溶解試薬とおよび／または球状化試薬と接触させられる。最後に、随意のクエンチングまたは固定性試薬は、追加されてもよい。あるいは、他の実施形態において、細胞溶解試薬または球状化試薬は、（１つまたは複数の）リガンドおよび色素の追加に先立って試料に最初に追加される。他の実施形態において、すべての試薬は、同時に追加される。迅速な染色の迅速性により、すべての試薬を実質的に同時に追加する後者のプロセスは好ましい。
【００７５】
反応混合物のインキュベーションならびに細胞溶解サイクルおよびクエンチサイクル（リガンド／色素試薬とのインキュベーションの前にまたはその間に行われてもよい）は、好ましくは、完全に自動化される。
【００７６】
Ｂ．パラメーター測定および分析
生物学的試料における正常および異型の両方の血小板集団、特に未成熟な網状血小板の迅速な同定および分析のための方法は、上記に定義される迅速に染色される試料／色素／（１つまたは複数の）リガンド反応混合物および以下のステップを使用して実行される。必要であれば、いくつかのステップは手動で実行されてもよいが、好ましくは、方法は、完全に自動化される。
【００７７】
迅速な染色およびインキュベーションに続いて、結果として生じる試料／リガンド／色素反応混合物は、細胞分析器、多パラメーターハイスループットフロー血液学的分析器またはフローサイトメーターのたとえばトランスデューサーの単一フロー開口部中の感知領域を通過する。トランスデューサーは、単一の分析ステップにおいて、細胞について、それらが、トランスデューサーモジュールの単一の開口部を通過する時に、多数の関連する測定（電気的、蛍光性、および光学的）を行うことができる。サイトメーターは、多数のパラメーターを測定する。試料は、これらの測定によって生成されるデータを使用して分析される。一般に、少なくとも２つのパラメーターの測定によって生成されるデータは、抗血小板リガンド上の標識、たとえば、選択されるリガンドと結合体化または結合する標識の蛍光の検出または定量的検出および核酸色素によって放たれるシグナル、たとえば蛍光の検出を可能にする。さらなるパラメーターは、上記に言及される２つのパラメーターと組み合わせて測定され、分析されてもよい。一実施形態において、通過ステップは、多数の（少なくとも２つの）異なるパラメーターについて混合物を測定する単一のステップである。フローサイトメーターの感知領域は、レーザー光源を用いて、インキュベートされた試料を照射する。パラメーターは、同じでも異なっていてもよく、リガンド上の標識の正体および色素によって放たれるシグナルに依存して、蛍光の１つもしくは複数のチャンネル、１つもしくは複数の光学的パラメーター、１つもしくは複数の電気的パラメーター、またはその組み合わせを含む。その後は、それぞれの細胞集団は、同定され、光散乱、直流、軸方向光損失、不透明度、高周波、または蛍光であるこれらのパラメーターのうちの少なくとも２つを使用して計数され、試料について測定される。
【００７８】
たとえば、一実施形態において、細胞の蛍光は、好ましくは、個別の多数の波長の範囲内で測定され、これらは、試料中の血小板および他の細胞に結合する抗体を標識するために使用される色素または蛍光色素のそれぞれの蛍光発光スペクトルによって決定される。したがって、蛍光分析は、細胞が、細胞集団を同定するためにトランスデューサーを通過する時に個々の細胞についてなされる、少なくとも１つの同時に測定される電気的または光学的測定と組み合わせられる。このように、血小板集団は、試料中に存在する場合、溶解および非溶解画分のさらなる分離ならびに異なるトランスデューサーの試料中の異なる細胞についてなされる異なる測定の相互関係の必要性を伴わないで得られる。
【００７９】
一実施形態において、蛍光分析は、試料において、蛍光標識血小板特異的抗体が結合した血小板の非血小板からの同定を可能にし、少なくとも１つの血小板集団の同定を可能にする。他の実施形態において、核酸色素の蛍光の測定は、未成熟な血小板の同定を可能にする。血小板集団の、より精密な測定の利点は、抗血小板抗体蛍光が、他の破片から血小板の純粋な集団を単離し、同定するために実行され、その後、純粋な血小板集団中の未成熟な血小板集団を同定するための核酸色素の蛍光が使用される場合に、見出される。これは、本明細書において記載される図において理解することができる。
【００８０】
さらなるパラメーターは、光学的パラメーター、たとえば一般に１つの散乱光、たとえば側方散乱または前方散乱を含む。しかしながら、散乱光がある種の血小板集団の測定においてそれほど精密ではないので、散乱光のみを使用する測定は、好ましくない（図を参照されたい）。単一の蛍光色素のみが用いられる場合、散乱光の１つを超える角度が、使用されてもよい。散乱光の角度は、約１０〜７０度の間の散乱光、つまり中程度の角度の散乱光（ＭＡＬＳ）；約１０〜２０度の間の散乱光、つまりより低い中程度の角度の散乱光（ＬＭＡＬＳ）；約２０および約７０度の間、つまりより高い中程度の角度の散乱光（ＵＭＡＬＳ）、または約８０〜１００度の間の散乱光、名目上直角の、つまり側方散乱（ＳＳ）、約２〜１８度の間の低角度の前方散乱および軸方向光損失または吸光度から選択されてもよい。
【００８１】
電気的パラメーターは、一般に、直流電気的インピーダンス測定の容量である（ＤＣ）。あるいは、電気的パラメーターは、不透明度とすることができ、これは、ＤＣ容量にわたる細胞の高周波として計算される。これらのパラメーターは、同一出願人による米国特許第５，１２５，７３７号において詳細に議論され、定義されており、これは、参考として本明細書に援用される。
【００８２】
上記のフローサイトメトリーのステップは、手動で、部分的に手動で実行されてもよく、部分的に自動化されてもよいまたは完全に自動化されてもよい。あるそのような自動化フローサイトメトリー機器は、参考として本明細書に援用される米国特許第６，２２８，６５２号において記載され、これは、前述の細胞特徴、つまりＤＣ容量、ＲＦ伝導性（不透明度）、散乱光、および蛍光特徴をすべて同時に決定することができ、それによって、個別のトランスデューサーから集められるデータを関連させるためのあらゆる必要性を回避する自動化機器を開示する。電気的測定は、ＤＣ（直流容量／インピーダンス）およびＲＦ（高周波）から成る。光学的測定は、光散乱および蛍光を含む。散乱光測定は、低い、中程度の、および高い前方の角度の測定ならびに直角（９０度／側方散乱）の測定を含むように、それぞれの細胞について収集される散乱の多数の角度から成ってもよい。蛍光測定は、２つまたは３つの光電子増倍管または検出器（ＰＭＴ）での蛍光発光の収集によってなされる。
【００８３】
望ましくは、様々な実施形態の分析を実行するのに有用であるのは、電気的、光学的、および蛍光パラメーターを測定する血液学的機器である。たとえば、参考として本明細書に援用される米国特許第６，２２８，５３２号において記載される機器を参照されたい。例示的な実施形態において、５３２ｎｍ緑色ダイオードレーザーは、有用なフロー血液学的システムにおいて照明源として使用される。しかしながら、当業者にとって、代替の輝線を有するレーザー、たとえば６３３ｎｍもしくは６４７ｎｍレーザーなどのような赤色レーザー、４８８ｎｍレーザーなどのような青色レーザー、または４０５ｎｍレーザーなどのような紫色レーザーを、代用することができ、蛍光色素は、適切に調節される。色素は、レーザーシステムに適合させてもよい。
【００８４】
結果として生じるデータは、上記に同定される血小板集団または部分集団の１つまたは複数を同定し、任意選択で定量するために必要とされる情報を提供する。他の非血小板細胞もまた同定されてもよい。この方法によれば、それぞれの細胞集団は、単一反応混合物における蛍光の蛍光分析において検出可能な発現の異なるパターンを利用して、少なくとも２つのパラメーターによって同定される。たとえば、２つのパラメーターは、抗血小板リガンド蛍光を同定する蛍光のチャンネルおよび側方散乱などのような光学的パラメーターであってもよい。細胞集団を同定するために使用されてもよい他の２つのパラメーターは、蛍光の２つのチャンネルであってもよい。細胞集団を同定するために使用されてもよい他の２つのパラメーターは、蛍光のチャンネルおよび電気的パラメーター、たとえばＤＣであってもよい。細胞集団を同定するために使用されてもよい他の２つのパラメーターは、光学的パラメーター、たとえばＳＳおよび電気的パラメーター、たとえばＤＣであってもよい。単一反応混合物についてなされる測定のさらなる組み合わせは、この方法において使用される特定の蛍光色素、色素、抗体、光学的、および電気的パラメーターに依存して、当業者にとって明白である。これらの分析ステップは、望ましくは、自動化プロセスにおけるアルゴリズムの中に組み込まれる。
【００８５】
Ｃ．集団識別
このアッセイ方法によれば、未成熟な網状血小板などのような血小板集団は、白血球、網状赤血球、未成熟な網赤血球、細胞破片、および非細胞凝集物を含む、試料中に存在していてもよい１つまたは複数の集団を有する混合物から区別される。同様に、アッセイ方法は、１つを超える血小板集団が同定されることを可能にする。試料中のこれらの血小板集団は、他のパラメーターに対してあるパラメーターをプロットする、測定されたデータから生成されるヒストグラムの検討に際して同定される。
【００８６】
一実施形態において、血小板集団は、抗血小板蛍光によって、他の血球、細胞破片、および非細胞凝集物と識別される。他の実施形態において、成熟血小板は、散乱光および抗血小板蛍光のパラメーターによって測定されるように、サイズおよび粒度によって未成熟な血小板と区別される。他の実施形態において、網状血小板は、核酸色素の蛍光を測定することによって成熟血小板と区別される。他の実施形態において、抗血小板蛍光は、血小板集団を同定するために用いられ、その後、その集団は、未成熟な血小板集団を精密に測定し、同定するために、それ自体、核酸色素の蛍光を使用してさらに分析される。
【００８７】
一実施形態において、この評価に使用されるパラメーターは、前方および側方散乱ならびに最低限の少なくとも２つの蛍光のチャンネルを含む。収集されたチャンネルのそれぞれの蛍光発光パターンは、反応混合物における、色素のみ、蛍光色素結合体化モノクローナル抗体のみ、または色素および少なくとも１つの蛍光色素結合体化モノクローナル抗体のスペクトルの追加の代表的なものである。しかしながら、方法はまた、散乱光および蛍光の測定と共に、インピーダンス（ＤＣ）および伝導性（ＲＦ）のＶＣＳパラメーターを用いてもよい。上記に示されるように、多くの適したレーザーは、蛍光を励起するために用いられてもよく、４８８ｎｍ青色アルゴンレーザー、緑色５３２ｎｍレーザー、または色素が赤色励起性蛍光色素と結合体化した抗体と組み合わせて使用される赤色励起性色素である場合、赤色レーザー（６３３ｎｍ、６３５ｎｍ、６４０ｎｍ、もしくは６４４ｎｍ）を含む。
【００８８】
混合物における少なくとも１つの抗体／リガンド上の少なくとも１つの蛍光色素標識のピーク発光スペクトルが、色素発光スペクトルと重複して、補正不可能な新しいスペクトルパターンを形成する場合、検出系の任意のチャンネルにおいて検出された、結果として生じる蛍光シグナルは、色素のみ、（１つもしくは複数の）蛍光色素結合体化抗体のみ、または色素および少なくとも１つの蛍光色素結合体化抗体の付加的な蛍光の補正不可能な産物の蛍光発光の特徴となる。
【００８９】
以下の表Ｉは、方法を使用して、互いに、以下の血小板集団および部分集団を同定し、区別するためにゲーティング手順において使用されてもよいパラメーターを示す。選択されるパラメーターは、リガンドおよびその標識の正体ならびに特定の核酸色素ならびに分析器において用いられるレーザーに関係する。標識リガンドおよび核酸色素ならびにレーザーの選択とのパラメーターの関係は、当業者に公知であり、本明細書において提供される教示を考慮して容易に選択される。表Ｉにおいて示されるように、２つのパラメーターのセットは、核酸色素、たとえばＡＯおよび選択されるリガンドを標識する所望の蛍光色素、たとえばＰＥ−Ｃｙ７を用いる本発明の方法においてある種の細胞または血小板サブセットを同定するために使用されてもよい。一実施形態において、表Ｉは、本明細書において記載される方法において示される細胞タイプのうちの任意の２つを区別またはゲーティングするために用いることができるパラメーターのそれらのペアを同定するのに有用である。２つの細胞タイプの間で共通したパラメーターのセットが使用されるであろう。たとえば、本明細書において記載される方法の一実施形態において、同定のために、成熟血小板および血小板サテライトの細胞タイプを選択した場合、表において明示されるように、２つの細胞タイプの間で共通したパラメーターのセット、たとえば前方散乱および蛍光のセットを使用することができる。
【００９０】
【表１】
2011502264.tif 000002
【００９１】
この方法は、試料中の血小板集団を定量ならびに同定することをさらに含む。一実施形態において、成熟血小板、未成熟な網状血小板、巨大血小板、血小板凝集塊、および血小板サテライトを含む、試料中の総血小板集団は、他の公知の血小板測定アッセイを使用して達成することができるよりも正確に定量される。
【００９２】
一実施形態において、方法は、約１〜１００μＬのヒト血漿試料に、シアニン７に連結されたフィコエリトリン（ＰＥ−Ｃｙ７）を用いて標識された抗血小板抗体および核酸色素アクリジンオレンジを追加することを含む。ＰＥ−Ｃｙ７は、メタクロマジー性アクリジンオレンジを超える発光バンド幅を有する。これらの発光スペクトルは、この方法における同時の使用のための色素および標識の選択を可能にする。さらに、血小板中のＤＮＡの不在は、色素の幅広い発光の強度を低下させ、抗体染色の蛍光シグナル対ノイズ比を結果的に増加させる。標識リガンドは、使用される抗体に依存し、従来の滴定によって当業者によって決定される濃度で１〜５０μｌの容量で追加される。核酸色素は、約０．５〜２．０ｍｌの容量で０．１〜１．０μｇ／ｍｌの濃度で球状化または他の緩衝液中で一般に追加される。インキュベーションは、試料への試薬の追加に続いて、随意の球状化剤の存在下において、６０秒間以下の時間、室温で実行される。血小板の表面への抗体の結合時間は、細胞の抗体染色に通常付随する通常の１０分間から１０秒間以内に縮小される。球状化剤の存在下におけるメタクロマジー性色素の３０秒間未満の速い結合と組み合わせて（たとえば米国特許第６，０６０，３２２号を参照されたい）、この迅速な抗体染色法は、メタクロマジー性色素を用いる血小板集団の測定に対する特有のアプローチである。このインキュベーションに続いて、混合物は、電気的、光学的、および蛍光測定値が得られる、フロー／血液学的分析器の感知領域を通過する。結果として生じるデータは、とりわけ成熟血小板数、網状血小板数、および未成熟な血小板画分を決定するために使用される。方法のこの実施形態は、物理的な洗浄または物理的な細胞分離の他のステップを欠く。方法が、そのようなさらなるステップを用いないので、それは、他の方法よりも、自動化システムの迅速な実行に、より適している。
【００９３】
血小板特異的抗体がリガンドとして用いられる方法の実施形態において、リガンドは、血小板に特異的であり（またはそれが、血小板集団に示差的に結合する場合、抗体の集団に）、他の血液成分を染色しない。この特徴は、単に、染色された血小板から蛍光シグナルを取得し、その後、この集団の色素蛍光を測定することによって、血球または破片の残りから血小板を同定し、分離するために使用することができる。この方法は、測定時間を短縮し、スループットを増加させ、獲得したファイルのサイズを最小限にする。
【００９４】
なお別の実施形態において、方法は、全血における網状血小板測定に有用である。全血中の血小板成分が、血小板の活性化または損失のあらゆる可能性を最小限にするその自然環境において存在しているので、全血は、使用のための最適な試料である。網状血小板測定は、状態が、血小板の骨髄機能不全または血管破壊のうちの１つであるかどうかを決定するために、低い血小板数を有する患者においてより必要となるので、低い血小板数を有する試料は、統計的に意味のある結果に十分な計数を得るためにより長い測定時間を必要とするであろう。全血が使用される場合、測定は、血小板と共に存在する赤血球の莫大な数に影響される。これは、網状血小板値を低下させるであろう、血小板との赤血球の同時の計数を予防するために血液試料の高度な希釈を必要とする。さらに、獲得したデータファイルは、多くの赤血球の包含により巨大となる。そのため、先行技術の方法における、低い血小板数を有する全血試料は、より長い測定時間によりスループットを損なうであろう。
【００９５】
本発明の方法によれば、赤血球の影響を減らすために、全血試料は、赤血球を除去するために溶解されるかまたは血球成分の残りから血小板を取り出すために物理的に分離され、それによって、試料における血小板の割合を増加させる。両方の調製用の方法は、網状血小板の測定のための方法のこの実施形態に随意の追加のステップを導入する。溶解方法について、抗血小板抗体および核酸色素は、全血試料に追加され、その後、網状血小板への色素結合を促進するために、溶解ステップおよび球状化緩衝液における再懸濁が続く。方法は、その後、成熟血小板と共に網赤血球（未成熟な赤血球）を同時に同定するために、前方散乱、側方散乱、直流、および蛍光の選択されるパラメーターを使用して、上記に記載されるように実行される。表Ｉを参照されたい。
【００９６】
核酸色素と組み合わせた、蛍光色素結合体化抗血小板特異的抗体との血小板の結合を用いることによる、本明細書において記載され、下記の実施例において示される方法は、非血小板集団からの血小板の分離および同定の改善をもたらす。この方法は、一般に間違った結果をもたらす、血小板集団内にある混入した赤血球断片によって特徴づけられる特発性血小板減少性紫斑病または他の疾患などのような疾患について、より一貫した、より信頼できる網状血小板値を可能にする。したがって、このアッセイは、総血小板集団の精密な定量に基づいて障害を診断するのに有用である。
【００９７】
他の実施形態において、上記に記載される方法の様々な成分は、自動化機器での、この方法の即座の実行のためにキットにおいて組み合わせられてもよい。したがって、使用のために組み合わされたことがない色素、リガンド、および標識の組み合わせは、これらの方法の実行において有用な組成物を形成してもよい。
【実施例】
【００９８】
以下の実施例は、生物学的試料中の血小板集団の同定および定量化のための、迅速染色法の様々な態様を例示する。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲により定義される範囲を限定するものではない。
【００９９】
（実施例１）
網状血小板を同定および染色する方法。
【０１００】
Ａ．試料の調製
ｉ．迅速染色調製物
本明細書において述べられ、図において例示される研究それぞれに関して、蛍光色素結合体化抗血小板抗体、たとえば抗ＣＤ４１（０．５μｇ／ｍＬ）または抗ＣＤ６１（０．５μｇ／ｍＬ）を、ヒト全血液のアリコート（約２５μＬ）に加えた。各抗体リガンドに結合体化された標識は、蛍光色素のフィコエリトリン−シアニン７（ＰｅＣｙ−７）であった。結合体化は従来の方法によった。各抗体／試料の混合物を、周囲温度において１０秒を超えない間インキュベートした。
【０１０１】
以下および図面に記載の試料に適切な場合、その後、抗体により染色された試料のアリコート（約２μＬ）を、球状化緩衝液（０．５から２．０ｍＬ）中のメタクロマジー性核酸色素のアクリジンオレンジ（０．１〜１．０μｇ／ｍＬ）に加え、混合し、速やかに測定した。抗体結合から核酸染色までの全反応を、６０秒未満で完了した。
【０１０２】
ｉｉ．比較試料の調製
実験に使用する他の試料は、抗血小板抗体と混合しない、または同様の方法で非特異的抗体（同じ蛍光色素と結合体化したアイソタイプ抗体）と混合する、あるいは上記の比率でＡＯのみと混合するかのいずれかであった。このような試料を、記載の迅速法により調製された試料との比較のために使用した。
【０１０３】
Ｂ．分析
１つの分析の実施のために、血液標本を、核酸色素のアクリジンオレンジを用い、抗体なしで染色することによって、健康な被験体由来の試料から調製した。「試験」標本は、上記のパートＡに記載の同じ被験体から調製した。
【０１０４】
各試料のアリコート（約１〜２ｍｌ）を、Ｆ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）に導入し、複数の蛍光性、光学的および電気的パラメーターを測定した。その結果得たデータを分析し、図において同定したヒストグラムを作成した。２パラメーターの評価によって血小板集団を同定するヒストグラムにおいて、記載のように、その血小板集団を別の２パラメーターを使用してさらに評価し、血小板のサブセットを同定した。
【０１０５】
図のヒストグラムは、健康なボランティアの試料および血小板減少症の臨床試料の双方において血小板集団（Ｐ）に存在するあらゆる破片からも、血小板を同定し、分割し、計数するための、抗血小板抗体を用いた迅速抗体染色法を例示する。本明細書において報告されたヒストグラム（すべて２パラメーター）は、光散乱のみの評価、または血小板を同定するための他の組み合わせを使用する従来技術の結果と比較する。
【０１０６】
第１の実験において、健康な被験体の試料を、上記の試料の調製に従って、メタクロマジー性色素のアクリジンオレンジ（ＡＯ）を用い、抗血小板抗体は用いずに染色した。血小板を同定し、計数する従来のゲーティング戦略は、細胞集団を同定するために、光散乱パラメーター、たとえばサイズ／前方散乱（ＦＳ）対粒度／側方散乱（ＳＳ）を用いた。得られたヒストグラム（図１Ａ）は、サイズ（ＦＳ）および粒度（ＳＳ）に基づく、血小板（Ｐ）、赤血球（ＲＢＣ）および白血球（ＷＢＣ）の分離を示した。血小板は、楕円形の最も下にある集団（Ｐ）であった。同じ試料調製物をＦＳおよびＰＥＣｙ７蛍光のパラメーターを使用して評価した場合、血小板は抗血小板抗体で染色されず、したがって、得られたヒストグラム（図１Ｃ）にどのような血小板もない、すなわち蛍光は検出されなかった。同じ試料調製物を、ＦＳ対核酸色素の蛍光のパラメーターを使用して評価した場合、得られたヒストグラムは、赤血球、白血球および網状血小板を含む血小板のサイズおよび蛍光を示した。血小板は円弧のように見え、残りの細胞から十分分離されている。赤血球は、血小板より蛍光が低かった。ＤＮＡを有する白血球は、測定限界外であり、図１Ｅのヒストグラムの右上角に縦線（ＷＢＣ）のように見える。示されているように網状血小板は、血小板集団の中でより明るい蛍光性集団である。
【０１０７】
同じ被験体の血液試料を、上記のパートＡの方法に従って、迅速染色法においてＰＥＣｙ７蛍光性標識抗ＣＤ４１抗血小板抗体およびＡＯを使用して調製した場合、サイズ（ＦＳ）および粒度（ＳＳ）に基づく血小板（Ｐ）、ＲＢＣおよびＷＢＣの同様の分離を検出する（図１Ｂ）。ＦＳ対抗血小板蛍光のパラメーターを、７６０〜８２０ｎｍの範囲で放射するＰＥＣｙ７蛍光性標識抗ＣＤ４１抗血小板抗体およびＡＯを使用して迅速抗体染色法に供したこの試料に用いた場合、得られたヒストグラムは異なる結果を表した。図１Ｄは、血小板集団のサイズおよび蛍光を表し、血小板はＣＤ４１−ＰＥＣｙ７抗血小板抗体と結合していた。このヒストグラム中の血小板は、異なる蛍光性集団（Ｓ）として現れた。血小板ではない粒子は非蛍光性であり、破片として血小板集団とは分離されているようだった。この後者の領域は、血小板が少ない特定の疾患状態の患者において増加し、血小板と非血小板事象とを特異的に識別するこの方法の重要性を例示する。
【０１０８】
図１Ｄのヒストグラムにおいて同定された、同定血小板集団の次の分析を、ＦＳ対核酸色素の蛍光のパラメーターにより実施した。図１Ｆのヒストグラムは、破片および抗血小板抗体染色によって同定され、分割された他の細胞がない、血小板の純粋な集団についてゲーティングしたので、血小板および網状血小板のより正確な計数が得られた。未成熟な血小板である網状血小板は、前方散乱により実証されるようにサイズがより大きく、血小板の網状組織または顆粒の存在のためにＡＯ蛍光がより明るい。
【０１０９】
第２の実験において、健康な患者由来の血液試料を、上記の迅速染色法を使用して、抗血小板抗体（抗ＣＤ４１−ＰＥＣｙ７）およびＡＯと混合し、共にインキュベートすることによって分析するために調製した。光散乱のみ、すなわち前方散乱（ＦＳ）対側方散乱（ＳＳ）を使用したサイトメトリ評価は、血小板集団を同定するヒストグラム（図２Ａ）を提供した。ＦＳ対ＡＯ蛍光を使用して図２Ａにおいて同定された血小板集団についてゲーティングする次の分析（図２Ｃ）により、総血小板集団の約１６．６％に測定された網状血小板（未成熟）を示すヒストグラムが作成された。
【０１１０】
ＦＳ対抗血小板抗体の蛍光のパラメーターを使用した同じ試料の分析により、破片および他の細胞から、染色された血小板の分離を表すヒストグラム（図２Ｂ）を得た。したがって、図２Ｂのヒストグラムにおいて「Ｓ」としてすでに同定された、破片を除いた純粋な血小板集団についてゲーティングする次の分析は、ＦＳ対ＡＯ蛍光のパラメーターを使用した。この場合、破片の排除により、図２Ｄのヒストグラムのパラメーターが血小板の改善された分割を提供することが可能になった。図２Ｃにより得られた１６．６％とは対照的に、より高いパーセントの網状血小板、すなわち２２．６％が得られた。サイズ（ＦＳ）および粒度（ＳＳ）パラメーターの使用によりその計算に破片が含まれ、抗血小板蛍光と核酸蛍光とを使用する分析と一体となった迅速染色法の使用により提供された網状血小板のパーセントより、同定された網状血小板のパーセントが低くなった。したがって、これらのヒストグラムは、本明細書に記載の方法の利点である、精度の改善を実証する。
【０１１１】
第３の実験において、別の健康な被験体由来の血液試料を、上記のパートＡに記載の迅速染色法（抗血小板抗体および核酸色素との混合およびインキュベーション）に従って調製した。試料を、前方散乱（ＦＳ）対側方散乱（ＳＳ）（図３Ａ）を使用して分析し、その後、それによって同定された血小板集団を、ＦＳ対ＡＯ蛍光（図３Ｃ）を使用して分析した。この分析により、網状血小板集団が２３．０％であると推定された。
【０１１２】
同じ試料を、ＦＳ対抗血小板抗体の蛍光を使用して分析した場合、染色された血小板の純粋な集団が、破片およびヒストグラムの他の細胞から分離された（図３Ｂ）。ＦＳおよびＡＯ蛍光を使用したこの血小板集団についての続くゲーティング（図３Ｄ）は、より正確で、より高いパーセントの網状血小板、すなわち２５．４％を、同じ患者の試料に関して提供した。この実験は、血小板集団を、蛍光性結合体化抗血小板抗体および核酸色素を用いて迅速染色法で分割し、本発明に従って評価した場合、血小板および網状血小板の改善された同定および計数を例示する。
【０１１３】
第４の実験において、試料を別の健康な被験体から調製した。各試料を、上記のパートＡに記載の迅速染色法を使用して、抗血小板抗体および核酸色素を使用して分析するために、または代替的に以下に記載のように、のいずれかで調製した。得られたヒストグラムは、抗血小板抗体およびその後の蛍光分析を用いた迅速抗体染色法が、試料中に存在する破片からの、血小板集団の同定、分割および数え上げ、したがってより正確な血小板集団の測定を可能することを例示した。いずれの抗体も用いず、ＡＯを用いて調製した１種の試料を、前方散乱（ＦＳ）対側方散乱（ＳＳ）をプロットすることによって評価し、そのヒストグラムは、血小板、赤血球および白血球の分離を示した。血小板は、横長の形の最も下にある集団（Ｐ）であった（図４Ａ）。ＦＳおよびＡＯ蛍光による血小板集団について得られたゲーティングは、約１６．４％の網状血小板集団を提供した（図４Ｄ）。
【０１１４】
第２の試料を、血小板に対して特異性を持たない蛍光性抗体を用いて調製した。ＦＳおよびＰＣ７蛍光のパラメーターにより得られた評価は、血小板集団を同定しないヒストグラムを作成した（図４Ｂ）。ゲーティングするために、ヒストグラムには同定された集団がなかったので、ＦＳおよびＡＯ蛍光を用いた続くゲーティングを示すヒストグラムは、同様に空白であった（図４Ｅ）。
【０１１５】
対照的に、７６０〜８２０ｎｍの範囲で放射するＰＥＣｙ７蛍光性標識抗ＣＤ４１抗血小板抗体およびＡＯを用いた、上記のパートＡに記載の迅速染色法を使用して調製した試料を、その後、サイトメトリ分析器にかけた。ＦＳ対抗血小板（ＰＣ７）蛍光を表すヒストグラム（図４Ｃ）は、試料中の血小板ではない粒子と異なる血小板集団を明らかにした。したがって、非血小板または破片の領域は、抗体で染色された患者試料を測定した場合の事象において増加した。純粋血小板集団についての続くゲーティングは、ＦＳ対ＡＯ（図４Ｆ）を使用して達成され、分析された。血小板集団は、図４Ｃにおいて抗血小板抗体染色により同定され、分割されたので、純粋血小板集団と関連付けることにより、網状血小板の正確な計数が可能であった。抗血小板特異的抗体の不在下で測定した網状血小板（１６．４％、図４Ｄ）および抗血小板特異的抗体の存在下で測定した網状血小板（２２．１％、図４Ｆ）は、健康なボランティアの試料において同様である。しかし、この集団は図４Ｄの集団より正確に同定され、より高い。
【０１１６】
第５の実験は、軽度の血小板減少症を有する患者から得た血液試料を使用した。すべての試料は、上記のパートＡに記載の迅速染色法に従って、以下のように、１種の抗血小板抗体（抗ＣＤ４１または抗ＣＤ６１）および核酸色素のＡＯあるいは双方の抗血小板抗体およびＡＯを用いて調製した。得られた図５Ａおよび５Ｂは、ＰＥＣｙ７蛍光性標識抗ＣＤ４１または抗ＣＤ６１抗血小板抗体およびＡＯを用いて染色された試料の、前方散乱（ＦＳ）対抗血小板の蛍光のパラメーターを使用した分析が、血小板の同様の集団を提供したことを明らかにした。ＦＳおよびＡＯ蛍光を使用したそれらの血小板集団についての続くゲーティングは、比較的同様のパーセントの網状血小板、すなわち、それぞれ２１．５％および２１．９％（図５Ｄおよび５Ｅ）を提供した。双方の抗血小板抗体を用いて調製した試料について実施された同じ評価（図５Ｃおよび５Ｆ）は、２３．５％の網状血小板を明らかにした。図５Ｄおよび５Ｅ中の同じ被験体由来の試料中の血小板集団を同定するための、単一の異なる抗血小板抗体の使用は、試料中の血小板の同様のパーセントを実証するが、図５Ｄおよび５Ｆの比較により、迅速抗体染色法が２種の抗血小板抗体を使用する場合、単一の抗血小板抗体よりも網状血小板値が増加することを示す。
【０１１７】
（実施例２）
網状血小板の測定
正常なボランティアおよび患者における網状血小板の比較値：正常なボランティアおよび血小板数の低い患者により、予備研究を実施した。ＰＥ−Ｃｙ７標識抗ＣＤ４１およびアクリジンオレンジと、全血液試料とを使用した実施例１の方法を使用すると、正常なボランティアおよび患者の網状血小板値のパーセントの分布は、図６に示すように明らかに異なる。患者集団には広範囲にわたる値があった。
【０１１８】
上に引用されたすべての出版文献、特許および特許出願ならびに優先権文献の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法および組成物の、多くの従来の改善および変形は、上に同定された明細書に含まれ、当業者には明らかであることが期待される。本発明の様々な実施形態に対するこのような改善および改変は、本明細書に添付の特許請求の範囲に包含されると考えられる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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