(57)【要約】  本発明は、立体選択性アルコール脱水素酵素およびその補助因子を用いて酸化反応と還元反応との組合せによって第２アルコールのエナンチオマー混合物を酵素的に脱ラセミ化するための方法であって、この場合には、形式的に光学活性の第２アルコールのエナンチオマーは、選択的に相応するケトンに酸化され、引続きケトンは、選択的に光学的対掌体に還元され、他方、補助因子の還元された形は、添加酵素により還元反応に使用される、上記に脱ラセミ化法に関し、この方法は、  相反する立体選択性および異なる補助因子選択性を有する２つのアルコール脱水素酵素ならびに２つの属する異なる補助因子が、酸化反応または還元反応に使用され、酸化された補助因子および還元された補助因子が、同時に進行する、添加酵素を用いる酵素反応で互いに変換され、この場合２つのエナンチオマーの１つへの脱ラセミ化の方向は、２つのアルコール脱水素酵素の選択によって制御可能であるか、または２つの補助因子のための添加酵素の選択性の差につき制御可能であることによって特徴付けられる。
2011516053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
立体選択性アルコール脱水素酵素およびその補助因子を用いて酸化反応と還元反応との組合せによって第２アルコールのエナンチオマー混合物を酵素的に脱ラセミ化するための方法であって、この場合には、形式的に光学活性の第２アルコールのエナンチオマーは、選択的に相応するケトンに酸化され、引続きケトンは、選択的に光学的対掌体に還元され、他方、補助因子の還元された形は、添加酵素により還元反応に使用される、上記の脱ラセミ化法において、相反する立体選択性および異なる補助因子選択性を有する２つのアルコール脱水素酵素ならびに２つの属する異なる補助因子が、酸化反応または還元反応に使用され、酸化された補助因子および還元された補助因子が、同時に進行する、添加酵素を用いる酵素反応で互いに変換され、この場合２つのエナンチオマーの１つへの脱ラセミ化の方向は、２つのアルコール脱水素酵素の選択によって制御可能であるか、または２つの補助因子のための添加酵素の選択性の差につき制御可能であることを特徴とする、上記の脱ラセミ化法。
【請求項２】
アルコール脱水素酵素として細菌由来のアルコール脱水素酵素を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アルコール脱水素酵素としてバシラス属（Bacillus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、乳酸菌（Lactobacillus）および／またはサーモアナエロビウム（Thermoanaerobium）に由来するアルコール脱水素酵素を使用する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
アルコール脱水素酵素として酵母菌株に由来する酵素を使用する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
アルコール脱水素酵素としてアスペルギルス（Aspergillus）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）またはサッカロミケス（Saccharomyces）に由来するアルコール脱水素酵素を使用する、請求項４記載の方法。
【請求項６】
２つのアルコール脱水素酵素を１：１の活性比で使用する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
２つのアルコール脱水素酵素を１  ＩＥの全体量で使用する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ラセミ化合物の第２アルコールを少なくとも２ｍｍｏｌ／ｌの濃度で使用する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
添加酵素としてグルコース脱水素酵素、グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素、ホルミエート脱水素酵素またはヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼを使用する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
添加酵素を２  ＩＥの量で使用する、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
添加酵素の基質を第２アルコール１モル当たり少なくとも０．３モルの量で使用する、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
補助因子を触媒量で使用する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
補助因子を第２アルコールに対して２〜３モル％の量で使用する、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
水、水と１つ以上の有機溶剤とからなる単相または多相の混合物ならびにイオン性液体から選択された溶剤を使用する、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
溶剤として水性緩衝系を使用する、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、酵素系を使用しながらエナンチオマー混合物を脱ラセミ化する方法に関する。
【０００２】
先行技術
最近、立体異性体の分野でラセミ化、即ちラセミ混合物を得るために光学異性体の鏡像異性体への変換および脱ラセミ化の場合ならびに前記プロセスの正確な逆のプロセスの場合にめざましい進歩が達成された。ラセミ化は、立体的に不安定な化合物、例えばシアンヒドリン、半（チオ）アセタールα−置換カルボニル化合物およびα−置換ヒダントインの場合に、簡単な保護的な酸触媒反応または塩基触媒反応によって達成可能であり、一方で、立体的に安定な化合物、例えば第２アルコールおよびキラールアミンは、ラセミ化がはるかに困難である。
【０００３】
最後のキラールアミンは、例えば遷移金属錯体触媒を用いて反応されるレドックス法により達成され、この場合キラリティー中心で必然的にｓｐ3−ハイブリダイズされているエナンチオマーは、プロキラールなｓｐ2ハイブリダイズされた中間生成物を経て別のエナンチオマーに変換される。例えば、O. PamiesおよびJ.- E. Baeckvall, Trends Biotechnol. 22, 130-135 (2004)およびChem. Rev. 103. 3247-3261 (2003); H. Pellissier, Tetrahedron 59, 8291-8327 (2003); M. J. Kim, Y. AhnおよびJ. Park, Curr. Opin. Biotechnol. 13, 578-587 (2002); V. Zimmermann, M. BellerおよびU. Kragi, Org. Process Res. Dev. 10, 622-627 (2006); Y. AsanoおよびS. Yamaguchi, J. Am. Chem. Soc. 127, 7696-7697 (2005)の論文参照。
【０００４】
固有の高特異的な生合成の分野で、僅かな「真性」ラセミ体だけが公知であり、それというのも、工業界とは異なり、天然ではラセミ化は、殆んど必要とされていないからである。即ち、例えばα−ヒドロキシカルボン酸（例えば、マンデル酸誘導体）、α−アミノ酸およびヒダントインのラセミ化を促進するための特殊な酵素は、ほんの二三が公知である（例えば、B. Schnell, K. FaberおよびW. Kroutil, Adv. Synth. Catal. 345, 653-666 (2003)）。第２アルコールおよび第１アミンをラセミ化するために、実際に定義された酵素は、久しく公知ではなかった。
【０００５】
Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１３，８２７１−８２７６に開示された、新しいラセミ化戦略の本発明者らの論文類は、動力学的考察形式の代わりに進行する反応の熱力学的考察形式を基礎とするものである。２つのエナンチオマーＲおよびＳならびにプロキラールな中間生成物Ｐからなる反応系においては、２つの光学対掌体のそれぞれは、中間生成物と一緒に化学的平衡および熱力学的平衡、即ちＰ⇔ＳおよびＲ⇔Ｐが存在する。同一の補助因子、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ（ニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチドまたは−ホスフェート）を利用する、２つの相反するエナンチオ選択性のアルコール脱水素酵素（以下、略してＡＤＨｓと呼称される）からなる多数の組合せを使用しながら、アシロインを含めて種々の光学活性の第２アルコールのラセミ化が達成される。アルコール／ケトンの平衡は、補助因子の酸化された形と還元された形の量および比、即ちＮＡＤ+：ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰ+：ＮＡＤＰＨをアルコール側で適当に選択することによって維持される。詳細は図１参照。
【０００６】
ＮＡＤ（Ｐ）+の割合を最小に設定した場合には、純粋な（Ｓ）異性体から出発して数時間の反応時間後に望ましいラセミ体が生じた。ケトン中間生成物の量は、１０％未満に減少させることができ、一部分は、１％未満に減少させることができた。これとは異なり、高い選択性のＡＤＨだけを用いる比較試験は、多くの場合に試験されたＡＨＤｓにとって不成功に終わった。単に、１つの場合には、１４日の反応時間後、８２％ｅｅの収率（"enantiomeric excess"、エナンチオマーの過剰量、即ち光学的収率）は、達成される。
【０００７】
本発明者らの最初に短時間で発行された論文（C.V. Voss, C.C. GruberおよびW. Kroutil, Angew. Chem. Int. Ed. 47, 741-745 (2008)）には、第２アルコールのラセミ化合物を、中間生成物としてのプロキラールなケトンを経てエナンチオ選択性の細菌酵素に由来するタンデム系を使用しながらアルコール酸化のために補助因子としての立体選択性ＡＤＨおよびＮＡＤの形で脱ラセミ化することが開示されている。補助因子は、いわば「再生され」、即ち同時に「添加酵素」または「補助酵素」としてのグルコース脱水素酵素（以下、ＧＨＤと略記する）を用いて促進される、グルコースからグルコノラクトンまたはグルコン酸への酸化を進行させることにより、酸化された形から還元された形へ戻された。
【０００８】
親液性化されたアルカリ糞便菌細胞を使用しながらの最初の試験の場合には、意外なことに、脱ラセミ化が確認されるのではなく、むしろ、出発基質としてのエナンチオマー純粋のアルコールのラセミ化が確認され、このことは、親液性化による細胞透過性の上昇に帰因した。損傷を受けていない細胞膜を有する、新たに収穫された細胞を使用し、したがって酸化および還元は、空間的に互いに別々に進行し、種々の第２アルコールのラセミ化合物は、選択的に９９％ｅｅを上廻る収率で望ましいエナンチオマーに変換されることができた。
【０００９】
しかし、この公知技術水準は、多数の欠点を有する。一方で、酵素混合物を酸化のために準備するアルカリ糞便菌系は、正確には定義不可能であり、したがって反応の進行の著しい変化をまねく可能性があり、ひいては再現可能性は、殆んど無い。他方、全ての従来法の場合、異性体化されたアルコール１モル当たり酸化のために酸素１モルが使用され、および補助因子の再生のためにグルコースが化学量論的に１モル使用され、その上、この場合には、グルコン酸またはグルコノラクトン１モルが副生成物として生じる。
【００１０】
従って、本発明の課題は、上記の欠点を回避する、改善された脱ラセミ化法を準備することであった。
【００１１】
発明の詳細な説明
意外なことに、立体選択性アルコール脱水素酵素およびその補助因子を用いて酸化反応と還元反応との組合せによって第２アルコールのエナンチオマー混合物を酵素的に脱ラセミ化するための改善された方法は、前記課題を解決することが見出され、この場合には、形式的に光学活性の第２アルコールのエナンチオマーは、選択的に相応するケトンに酸化され、引続きケトンは、選択的に光学的対掌体に還元され、他方、補助因子の還元された形は、添加酵素により還元反応に使用される。本発明による方法は、相反する立体選択性および異なる補助因子選択性を有する２つのアルコール脱水素酵素ならびに２つの属する異なる補助因子が、酸化反応または還元反応に使用され、酸化された補助因子および還元された補助因子が、同時に進行する、添加酵素を用いる酵素反応で互いに変換され、この場合２つのエナンチオマーの１つへの脱ラセミ化の方向は、２つのアルコール脱水素酵素の選択によって制御可能であるか、または２つの補助因子のための添加酵素の選択性の差につき制御可能であることによって特徴付けられる。
【００１２】
本発明による方法によって、脱ラセミ化は、実際に定量的な光学的収率、即ち９９％ｅｅ超で達成可能であり、この場合には、後になお詳説されているように、前記系が安定した平衡を達成すると直ちに、試薬が同時の反応の経過中に化学量論的に使用されることはない。更に、正確に定義された純粋な酵素（２つのＡＤＨｓおよび添加酵素）は、触媒反応に使用され、このことから専ら可逆的な反応が前記方法で生じ、ならびに顕著な再生可能性が生じる。最終的に、前記方法は、簡単な一槽反応法で実施されることができ、この場合個々の部分反応間での時間的または空間的な分離は、不要である。
【００１３】
アルコール脱水素酵素として、特に市場で入手可能または簡単に入手可能なアルコール脱水素酵素、例えばバシラス属（Bacillus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、乳酸菌（Lactobacillus）および／またはサーモアナエロビウム（Thermoanaerobium）に由来する細菌酵素、例えばロドコッカス・ルベル（Rhodococcus ruber）、ラクトバシラス・ケフィル（Lactobacillus kefir）またはサーモアナエロビウム・ブロキイ（Thermoanaerobium brockii）に由来する細菌酵素または酵母、例えばアスペルギルス（Aspergillus）、カンジダ（Candida）、ピキア（Pichia）またはサッカロミケス（Saccharomyces）に由来する酵素が使用され、それというのも、前記酵素は、エナンチオマー過剰量および反応速度に関連して特に良好な結果を生じるからである。しかし、適したＡＨＤ対の選択にとって決定的なことは、なかんずく２つのＡＤＨｓが相反する立体選択性および異なる補助因子選択性を有しなければならないという要件にある。補助因子は、ＡＤＨｓのそれぞれの選択から相応してもたらされ、通常は、ＮＡＤおよびＮＡＤＰであり、有利には、単に触媒量で使用される。
【００１４】
図３は、本発明に方法における反応経過を説明し、この場合ＨＴＳは、「Hydrid-Transfer-System水素化物移送系」を表わし、この中で「Ａｕｘ」で示された添加酵素によって促進される副反応は、補助因子の「再生」、即ち酸化された形と還元された形の互いの変換のために行なわれる。ｋ1〜ｋ4は、水素化物移送系の第１の順序の反応の形式的な速度定数を表わす。
【００１５】
図３Ａに図示されているように、第２のアルコールエナンチオマーの酸化反応および還元反応は、２つの相反する立体選択性ＡＤＨｓ（図示されていない）によって促進される。（Ｓ）エナンチオマーから（Ｒ）エナンチオマーへの反応が進行する場合には、ＮＡＤに対して補助因子の選択を有する、（Ｓ）選択性ＡＤＨの（Ｓ）異性体の酸化の際に、水素化物イオンは、アルコールから分離され、補助因子、ＮＡＤ+、の酸化物の形に移行され、それによってこの補助因子は、還元された形、ＮＡＤＨ、に移行される。本質的に同時に添加酵素Ａｕｘは、ＮＡＤＨの前記水素化物イオンを受け取り（このことは、「Ａｕｘ−Ｈ」を生じる）、引続き酸化された形、ＮＡＤＰ+の形で第２の補助因子に移行され、それによって第２の補助因子の還元された形のＮＡＤＰＨは、準備される。前記の第２の補助因子から再び水素化物は、ＮＡＤＰの選択性を有する第２の（Ｒ）選択性ＡＤＨによってケトン中間生成物Ｐに移行され、それによってこのケトン中間生成物Ｐは、（Ｒ）エナンチオマーに還元される。逆の方向に、即ち（Ｒ）異性体が（Ｓ）形に変換される際に、逆反応は、当然に同様に行なわれる。
【００１６】
平衡で存在する酵素／補助因子系から出発する場合には、同一の水素化物イオンは、上記に説明した反応を経て、最終的に再び今や立体化学が逆転されたアルコール分子上に到達する。
【００１７】
添加酵素がヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼである場合には、水素化物イオンは、添加酵素によって１つの補助因子から別の補助因子へ、上記の簡単な形で移行する。この場合、図３Ｂ中のＡｕｘ−Ｈは、酵素と水素化物イオンとの複合体を表わす。しかし、試験されたヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼは、満足させる結果を生じないので、本発明者らは、試験の際に他の選択可能な方法により、水素化物を直接に移行するヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼの代わりにもう１つの脱水素酵素／基質系もその役を引き受けうることが見い出された。この場合、Ａｕｘ−Ｈは、添加酵素に相当する基質の還元された形を表わす。
【００１８】
この種の添加酵素として、原理的に全ての補助因子に依存するオキシド還元酵素がこれに該当し、このオキシド還元酵素は、脱ラセミ化する第２アルコールの酸化反応および還元反応を損なわない。脱水素酵素、有利にグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素（Ｇ６ＰＤＨ）およびホルミエート脱水素酵素（ＦＤＨ）は、極めて良好な結果をもたらし、したがって好ましい添加酵素である。
【００１９】
最初の２つの場合には、基質への水素化物の移行によって、グルコン酸またはグルコノラクトン、またはこれらの−６−ホスフェートは、グルコースまたは−６−ホスフェートへ還元され（このことは、"Ａｕｘ−Ｈ"を生じる）、直ちに再び酸化される。同様のことは、第３の場合にもＣＯ2で行なわれ、このＣＯ2は、Ａｕｘ−Ｈとしてのホルミエートで平衡状態になる。実際にホルミエートからＣＯ2への酸化の反応平衡は、二酸化炭素側に遙かに広がるが、しかし、反応の原理的な可逆性は、正しいことが確認された。本発明においては、添加酵素は、全く使用されず（または殆んど使用されず）、したがって、微少量だけが必要とされるので、ホルミエート脱水素酵素／ホルミエート／ＣＯ2系は、本発明の目的に十分に好適であり、例えばこのことは、下記の実施例に示されている。
【００２０】
上記したように、本発明による方法において、平衡状態が達成されると直ちに試薬の化学量論的使用は、全く生じない。この平衡状態は、特殊な酵素／基質の組合せおよびその選択性に依存するので、予想または予めの調整は、不可能である。それによって、実際には、この平衡は、脱ラセミ化法の開始時に生じる。前記の通常数分間継続する段階において、微少量の添加基質、即ちグルコースまたはグルコン酸、ホルミエートまたはＣＯ2は、実際に使用される。
【００２１】
第２アルコールの異性体化がどの方向に進行するかにより、実際には最初に２つのＡＤＨｓの立体選択性および補助因子選択性に依存するが、しかし、他の結果においては、２つの補助因子のための添加酵素の異なる選択性にも依存する。ＮＡＤＰの選択性を有する（Ｓ）選択性ＡＤＨおよびＮＡＤＰの選択性を有する（Ｒ）選択性ＡＤＨから出発する、上記に示された例には、実際に添加酵素の補助因子選択性による脱ラセミ化の方向を規定することができ、そのために、これは、十分に「制御系」とも呼称されてよい。添加系の酸化法または還元法における補助因子選択性は、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ+がＮＡＤ+およびＮＡＤＰＨ（図３Ｂで：ｋ1＋ｋ3＞ｋ2＋ｋ4）へ変換されることを導くか、またはＮＡＤ+およびＮＡＤＰＨがＮＡＤＨおよびＮＡＤＰ+（図３Ｂで：ｋ1＋ｋ3＞ｋ2＋ｋ4）へ変換されることを導き、このことは、第１の場合には、（Ｒ）エナンチオマーの形成を導き、別の場合には、（Ｓ）エナンチオマーの形成を導く。制御酵素またはその基質が省略されるか、または制御酵素が２つの補助因子の１つに対する選択性を有する（勿論、このことは、全くありそうもないことである）場合には、全く脱ラセミ化だけを観察することができるのではなく、光学的に純粋なアルコールから出発して、むしろ、逆反応、即ちラセミ化を観察することができ、例えば、これは、図４からも明らかである：図４Ａおよび４Ｂは、それぞれ逆の補助因子選択性を有するホルミエート脱水素酵素に対して第２アルコールとしての２−オクタノールを用いた反応経過を示し、図４ｃは、ＦＤＨなしの系のための反応経過を示す。
【００２２】
しかし、脱ラセミ化の方向は、逆に反対される立体選択性または補助因子選択性を有するＡＤＨ対を選択することによって逆転される可能性もある。例えば、上記の記載において、同じ添加酵素の際にＮＡＤＰの選択性を有する（Ｓ）選択性ＡＤＨおよびＮＡＤＰの選択性を有する（Ｒ）選択性ＡＤＨを使用する場合には、ラセミ化合物から選択的に（Ｒ）エナンチオマーの代わりに光学的に純粋な（Ｓ）エナンチオマーが形成される。
【００２３】
本発明による方法は、通常、水、水と１つ以上の有機溶剤とからなる単相または多相の混合物およびイオン性液体を含む群から選択された溶剤中で実施され、この場合費用および安定性の理由から特に従来の水性緩衝系が使用される。
【００２４】
水性緩衝系は、溶剤をｐＨ値に対して非敏感性にする物質、例えば塩を含有する水性溶剤である。公知の水性緩衝系は、例えば炭酸／重炭酸塩系、炭酸−珪酸塩緩衝液、酢酸／酢酸塩緩衝液、燐酸塩緩衝液、ミハエリス（Michaelis）によるベロナール／酢酸塩緩衝液、アンモニア緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）およびＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、プロキラールなケトンを経て２つの特殊なＡＤＨｓを用いて酵素触媒反応によりラセミ化を行なう原理を示す略図である。
【図２】図２は、定義された菌株の背景を用いるラセミ化合物の分解および引続く補助因子の再生を示す略図である。
【図３】図３のＡは、補助因子の再生のために２つの特異性ＡＤＨｓおよび特異性補助酵素（水素化物移行系：ＨＴＳ）を用いて本発明による酵素触媒反応により脱ラセミ化を行なう原理を示す略図であり、図３のＢは、水素化物移行系の原理を示す略図である。
【図４】図４のＡは、ホルミエート脱水素酵素（ＦＤＨ００２）を用いる１−フェニルエタノールのラセミ混合物の移動を示す略図であり、図４のＢは、ホルミエート脱水素酵素（ＦＤＨ００１）を用いる１−フェニルエタノールのラセミ混合物の移動を示す略図であり、図４のＣは、ホルミエート脱水素酵素（ＦＤＨ）なしの１−フェニルエタノールのラセミ混合物の移動を示す略図である。
【図５】図５は、ＮＡＤまたはＮＡＤＰ特異性ホルミエート脱水素酵素（ＦＤＨ）を用いるラセミ混合物の移動を示す略図である。
【図６】図６は、反応平衡に対する種々の反応パラメーターの変更の影響を示す略図である。
【図７】図７は、ラセミ化平衡の調節に対する添加基質のグルコースの種々の濃度の影響を示し、図７のＡは、種々のグルコース濃度についての時間的経過を示す略図であり、図７のＢは、６時間の反応時間後のそれぞれのグルコース濃度への相関関係ｅｅ［％］を示す略図である。
【実施例】
【００２６】
例：
次に、本発明を代表的な制限されていない実施例につき詳細に記載する。
【００２７】
材料、関連資料および方法
酵素
ＡＤＨ−Ａ：ロドコッカス・ルベル（Rhodococcus ruber）のアルコール脱水素酵素（BioCatalytics Inc.,社から市場で入手可能、今やCodexis社, Pasadens在, USAから市場で入手可能）。
ＬＫ−ＡＤＨ：乳酸桿菌属ケフィル（Lactobacillus kefir）のアルコール脱水素酵素（Sigma-Aldrich社, Wien在、から市場で入手可能、＃０５６４３、０．４  ＩＥ／ｍｇ）。
ＲＥ−ＡＤＨ：ロドコッカス・エリトロポリス（Rhodococcus erythropolis）のアルコール脱水素酵素（Sigma-Aldrich社から市場で入手可能、＃６８４８２、２０  ＩＥ／ｍｌ）。
ＬＢ−ＡＤＨ：アルコール脱水素酵素００２（Juelich Chiral Solutions社から市場で入手可能、今やCodexis社から市場で入手可能、＃０５．１１）。
ＡＤＨ−Ｔ：アルコール脱水素酵素００５（Juelich Chiral Solutions社から市場で入手可能、今やCodexis社から市場で入手可能、＃２６．１０）。
ＡＤＨ−ＰＲ２：アルコール脱水素酵素００７（Juelich Chiral Solutions社から市場で入手可能、今やCodexis社から市場で入手可能、＃４２．１０）。
ＴＢ−ＡＤＨ：テルモアナエロビウム・ブロキイ（Thermoanaerobium brockii）のアルコール脱水素酵素（Sigma-Aldrich社から市場で入手可能、＃Ａ９２８７，３０−９０  ＩＥ／ｍｇ）。
Ｇ６ＰＤＨ：パン酵母のグルコース−６−ホスフェート脱水素酵素（Sigma-Aldrich社から市場で入手可能、＃４９２７１，２４０  ＩＥ／ｍｇ）。
ＧＬＹ−ＤＨ：ゲオトリクム・カンディドゥム（Geotrichum candidum）のグリセリン脱水素酵素（Sigma-Aldrich社から市場で入手可能、＃４９８６０，３０  ＩＥ／ｍｇ）。
ＬＤＨ−ＳＣ：スラフィロコッキ（Sraphylococci）のＤ−ラクテート脱水素酵素（Sigma-Aldrich社から市場で入手可能、＃１７８４７，１２０  ＩＥ／ｍｇ）。
ＬＤＨ−ＬＳ：ラクトバシラス・スプ（Lactobacillus sp.）のＤ−ラクテート脱水素酵素（Sigma-Aldrich社から市場で入手可能、＃５９０２３，４００  ＩＥ／ｍｇ）。
ＬＤＨ−ＲＭ：イエウサギの筋肉に由来するＬ−ラクテート脱水素酵素（Sigma-Aldrich社から市場で入手可能、＃６１３１１，５００  ＩＥ／ｍｇ）。
ＦＤＨＩ：ＮＡＤＰ特異性ホルミエート脱水素酵素００１（Juelich Chiral Solutions社から市場で入手可能、今やCodexis社, Pasadena在, USAから市場で入手可能、＃２５．１０，４７  ＩＥ/ｍｌ）。
ＦＤＨＩ：ＮＡＤＰ特異性ホルミエート脱水素酵素００１（Juelich Chiral Solutions社から市場で入手可能、今やCodexis社, Pasadena在, USAから市場で入手可能、＃２５．１０，４７  ＩＥ/ｍｌ）。
ＦＤＨ３：ＮＡＤ特異性ホルミエート脱水素酵素００１（Juelich Chiral Solutions社から市場で入手可能、今やCodexis社から市場で入手可能、＃０９．１１，２００  ＩＥ/ｍｌ）。
ＦＤＨ４：酵母のホルミエート脱水素酵素（Boehringer Mannheim GmbH社から市場で入手可能、＃２０４２２６，０．５  ＩＥ/ｍｇ）。
ＦＤＨ５：カンディダ・ボイジニイ（Candida boidinii）のホルマール脱水素酵素（Martina Pohl、デュッセルドルフ大学、ドイツ連邦共和国、からの寄贈品）。
ＧＤＨ−ＢＭ：Ｄ−グルコース脱水素酵素００１（Juelich Chiral Solutions社から市場で入手可能、今やCodexis社から市場で入手可能、＃２２．１０，３０  ＩＥ/ｍｇ）。
ＧＤＨ−ＢＳ：Ｄ−グルコース脱水素酵素００２（Juelich Chiral Solutions社から市場で入手可能、今やCodexis社から市場で入手可能、＃２９．１０，５００  ＩＥ/ｍｌ）。
【００２８】
酵素の性質
【表１】
2011516053.tif 000003
【００２９】
【表２】
2011516053.tif 000004
【００３０】
化学薬品
ｒａｃ−２−オクタノール（＃０４５０４、ＭＧ  １３０．２３ｇ／mol）、（Ｒ）−２−オクタノール（＃７４８６４、ＭＧ  １３０．２３ｇ／mol）、（Ｓ）−２−オクタノール（＃７４８６３、ＭＧ  １３０．２３ｇ／mol）、２−オクタノン（＃５３２２０、ＭＧ  １２８．２１ｇ／mol）、アンモニウムホルミエート（＃０９７３９、６３．９６ｇ／mol）、ナトリウムホルミエート（＃３９９６−１５−４、６９．０２ｇ／mol）およびカリウム塩としての蟻酸（＃５７４４４−８１−２、ＭＧ  ８５．１３ｇ／mol）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｗｉｅｎ在、から購入した。抽出および後処理のための化学薬品：
抽出のためのエチルアセテート（＃４４１９７７）は、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  ＣＥＥ  ＧｍｂＨ社、Ｏｒｔ在、から購入され、新たに蒸留に使用された。アセチル化のためのＤＭＡＰ（＃２９２２４、ＭＧ  １２２．１７ｇ／mol）および無水酢酸（＃４５８３０、ＭＧ  １０２．０９ｇ／mol）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｗｉｅｎ在、から購入した。
【００３１】
一般的なプロセス
光学的組成物のシフトのためのモデル的方法：市販の酵素の活性は、一般に国際単位（ＩＥ）で記載されている。しかし、この単位は、全体でここで使用されたものとは別の基質に対するそれぞれの酵素の活性を示す。従って、使用された酵素の活性は、適した"再生"系での２−オクタノンの還元の際に測定された（一般に、アンモニウムホルミエートを有するＦＤＨ、５当量）。全ての試験のためには、例えばＡＤＨｓの１  ＩＥ2-オクタノールが使用された。
【００３２】
系１：ＡＤＨ−Ａ、ＬＫ−ＡＤＨ、ＮＡＤＰ特異性ＦＤＨ（２  ＩＥ）、アンモニウムホルムエート（基質濃度に対して３当量）、ＮＡＤ+およびＮＡＤＰ+（基質３モル％）は、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ７．５、全容量０．５ｍｌ）中に懸濁された。反応は、ラセミ体の２−オクタノールの添加によって開始された（０．５μｌ、８ｍｍｏｌ／ｍｌ、ｅｅ＜３％）。３０℃で３時間の振盪（１３０ｒｐｍ）後、混合物は、ＥｔＯＡｃ（５００μｌ）で抽出され、遠心分離され、相分離が生じた。
【００３３】
系２：ＮＡＤ特異性ＦＤＨ（２  ＩＥ）の使用まで系１と同様。
【００３４】
系３：ＧＤＨ−ＢＳ（２  ＩＥ）およびα−Ｄ−グルコース（１当量、８ｍｍｏｌ／Ｌ）の使用まで系１と同様。
【００３５】
系４：ＡＤＨ−ＴおよびＡＤＨ−ＰＲ２の使用まで系１と同様。
【００３６】
系５：ＡＤＨ−Ｔ、ＡＤＨ−ＰＲ２およびＮＡＤ特異性ＦＤＨの使用まで系１と同様。
【００３７】
系６：ＲＥ−ＡＤＨおよびテルモアナエロビウム・ブロキイ（Thermoanaerobium brockii）のＡＯＲの使用まで系１と同様。
【００３８】
分析法
キラルなＧＣ−ＦＩＤ分析：
アルコールは、無水酢酸（１００ｍｌ）およびＤＭＡＰ（０．５ｍｇ）の添加によって３０℃で２時間でアセチル化された。後処理後、生成物は、ＧＣ−ＦＩＤおよびＧＣ−ＭＳＤを用いてキラルな固定相で分析された。
【００３９】
キラルなＧＣ−ＦＩＤ分析は、バリアン（Varian）−３９００−ガスクロマトグラフィーでＦＩＤ検出器を用いてクロムパック−キラシル−ＤＥＸ−ＣＢ−カラム（Chrompack-Chirasil-DEX-CB-Saeule）（Varian社、２５ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５ｍｍ、１．０バール  Ｈ2）を使用して、検出器温度２５０℃、分配比９０：１で行なわれた。
【００４０】
キラルなＧＣ−ＭＳＤ分析：
キラルなＧＣ−ＭＳＤ分析は、アギレント（Agilent）−７８９０Ａ−ＧＣシステムでＦＩＤ検出器を用いてクロムパック−キラシル−ＤＥＸ−ＣＢ−カラム（Chrompack-Chirasil-DEX-CB-Saeule）（Varian社、２５ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５ｍｍ、１．０バール  Ｈ2）を使用して、検出器温度２５０℃、分配比９０：１で行なわれた。
【００４１】
キラルなＨＰＬＣ分析：
ＨＰＬＣ分析は、ＤＧＵ−２０Ａ５脱ガス装置、ＬＣ−２０ＡＤ液体クロマトグラフ、ＳＩＬ−２０ＡＣ自動サンプラー、ＣＢＭ−２０Ａコミュニケーションバスモジュール（Kommunikationsbusmodul）、ＳＰＤ−Ｍ２０Ａダイオードアレー検出器およびＣＴＯ−２０ＡＣカラム炉を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ−ＨＰＬＣシステムでｎ−ヘプタン／イソプロパノール＝９０：１０、０．５ｍｌ／分、１８℃を有するＣｈｉｒａｌｐａｋ−ＡＤカラム（Daicel, 0.46×25cm）を使用して行なわれた。
【００４２】
実施例１〜１３、比較例１〜４
脱ラセミ化を、第２アルコールとしての２−オクタノールとの種々のＡＨＤ／添加酵素組合せ物を使用して次の条件下で実施した：基質濃度８ｍｍｏｌ／ｌ、反応時間３〜１２時間、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、５０ｍＭ）または燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．５、５０ｍＭ）中で３０℃、１３０ｒｐｍでの振盪。ＡＤＨｓからそれぞれ約１  ＩＥ（基質としての２−オクタノールのため）；触媒量（約３モル％）中のＮＡＤ+およびＮＡＤＰ+。添加酵素：２  ＩＥ（そのために、製造業者によって記載されたような天然基質）。添加基質（ホルミエート、グルコース、グルコース−６−ホスフェート、ラクテートおよびグリセリン）：１６ｍｍｏｌ／Ｌ。この組成および結果は、次の第３表中に記載されている。
【００４３】
【表３】
2011516053.tif 000005
【００４４】
２−オクタノールラセミ化合物からなる本発明の実施例１〜１３の試験された酵素組合せ物は、主に良好な一部分が実際に定量的なエナンチオマー過剰量およびエナンチオマーの１つの殆んど全て定量的な収量で供給されたことを確認することができる。同一のＡＤＨ対を使用した場合、添加酵素の補助因子特異性を逆にすることによって、脱ラセミ化の方向を制御することができた。実施例１／２＋３、８／９、１０／１１、１２／１３参照。また、実施例８および９の結果は、図５にグラフで図示されている。
【００４５】
これに対して、比較例１〜４においてラクテート脱水素酵素またはグリセリン脱水素酵素を使用した場合には、脱ラセミ化は、全く生じなかった。
【００４６】
実施例１４〜２２
これらの実施例において、実施例１からの酵素系を使用して、種々の反応パラメーターが変更され、反応経過に対して前記反応パラメーターの作用が試験された。実施例１４〜２１の結果は、図６Ａ〜Ｈにグラフで図示されており、実施例２２の結果は、図７Ａ〜Ｂに図示されている。
【００４７】
実施例１４
ここでは、反応時間を１〜６時間の間で変動させ、３時間後に既に定量的な変換が達成されることが見い出された。従って、前記群の他の実施例は、３時間に亘って実施された（図６Ａ）。
【００４８】
実施例１５
アルコール濃度を１〜２４３ｍ2／ｌの間で変動させ、この最適な結果は、６時間の所定の反応時間で２〜８ｍｍｏｌ／ｌを生じた。よりいっそう高い濃度の場合には、よりいっそう長い反応時間またはよりいっそう大量の酵素が必要不可欠であり、完全な変換が達成される（図６Ｂ）。
【００４９】
実施例１６
２つのＡＤＨｓの全体量を０．１〜３．４  ＩＥの間で変動させ、この場合には、１  ＩＥが最適な活性量であることが明らかになった（図６Ｃ）。
【００５０】
実施例１７
互いに２つのＡＤＨｓの活性比（ＩＥで）を０．０１〜１３．５の間で変動させ、約０．２〜約０．７の比は、最も効果的であることが判明したが、しかし、その際に、１：１の比の値は、欠いた（図６Ｄ）。
【００５１】
実施例１８および１９
２つのＡＤＨｓのそれぞれ一方の活性を０．１〜７．６  ＩＥの間で、または３．４  ＩＥで変動させ、その際に第２のＡＤＨの活性は、１  ＩＥであり、また、第２の酵素のための最適な活性量は１  ＩＥであり、したがって、２つのＡＤＨｓの最適な活性比は１：１であることが見い出された（図６Ｅ、６Ｆ）。
【００５２】
実施例２０
ＦＤＨの量を０．３〜６４．０  ＩＥの間で変動させ、２  ＩＥの量から既に定量的な変換が達成されることが判明した（図６Ｇ）。
【００５３】
実施例２１
補助因子ＮＡＤおよびＮＡＤＰの共通の濃度を０〜９６モル％の間で変動させ、この場合約２〜３モル％の濃度は、最も効果的であった（図６Ｈ）。
【００５４】
実施例２２
実施例５を繰り返したが、この場合添加基質、即ちグルコースの濃度は、図７Ａに示されているように、０．５〜１２時間の反応時間に亘ってアルコール濃度に対して０．１〜３当量の間で変動した。グルコース当量が０．１〜１の間で変動する際の６時間後のエナンチオマー過剰量ｅｅは、図７Ｂに示されている。この場合には、＞９９％が既に０．３当量から達成され、このことは、明らかに化学量論的不足量の添加基質でも十分であることを示す。
【００５５】
実施例２３〜３２
これらの実施例において、実施例１からの酵素系を使用して試験し、１０個の別の第２アルコールのラセミ化合物を脱ラセミ化した。前記アルコールを、２つの関連したＡＤＨｓのための専門書に記載された基質スペクトルを考慮して選択した。こうして、原理的には、本発明による方法により全ての基質が脱ラセミ化可能であり、この全ての基質は、２つのＡＤＨｓの基質スペクトル中に含まれている。前記実施例中で使用された第２アルコールの構造は、次の第４表中に記載されている。
【００５６】
【表４】
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【００５７】
ラセミ化の結果は、次の表中に記載されている。
【００５８】
【表５】
2011516053.tif 000007
【００５９】
この表から、全ての試験されたラセミ化合物は、本発明による方法により顕著な選択性で短時間で殆んど定量的に脱ラセミ化されうることが判明し、その際に他の官能基の存在は、本発明による方法の作用を削減しなかった。
【００６０】
本発明は、立体異性体化の分野の価値のある利益をもたらし、その理由から、本発明の産業上の利用可能性は、確実なことである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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