(57)【要約】  血管疾患の患者の血管を修復して再生するために、組織工学による血管を使用する組成物及び方法を開示する。
2011519616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（ｐ−ジオキサノン）を含む足場、並びに細胞、細胞シート、細胞溶解物及び細切組織のうち１つ以上を含む、組織工学による血管用の管状の作製物。
【請求項２】
前記足場が更にコラーゲンを含む、請求項１に記載の管状の作製物。
【請求項３】
前記細胞が、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、ヒト臍帯由来細胞及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の管状の作製物。
【請求項４】
ａ．ポリ（ｐ−ジオキサノン）を含む管状に形成された足場を提供する工程と、
ｂ．前記足場に、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞及びヒト臍帯由来細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞を播種する工程と、
ｃ．前記細胞を播種した足場をバイオリアクターで培養する工程と、を含む、組織工学による血管を作製する方法。
【請求項５】
ａ．ポリ（ｐ−ジオキサノン）を含む管状に形成された足場を提供する工程と、
ｂ．前記足場をヒト臍帯由来細胞シートで包む工程と、
ｃ．前記細胞シートで包まれた足場をバイオリアクターで培養する工程と、を含む、組織工学による血管を作製する方法。
【請求項６】
ａ．ポリ（ｐ−ジオキサノン）を含む管状に形成された足場を提供する工程と、
ｂ．前記足場を細切筋組織と細切内皮組織とに当てる工程と、
ｃ．前記細切組織足場をバイオリアクターで培養する工程と、を含む、組織工学による血管を作製する方法。
【請求項７】
ａ．ポリ（ｐ−ジオキサノン）を含む管状に形成された足場を提供する工程と、
ｂ．前記足場を細胞溶解物に当てる工程と、次に、
ｃ．前記足場を凍結乾燥する工程と、を含む、組織工学による血管を作製する方法。
【請求項８】
ａ．細胞及び細切組織のうち１つ以上を前記細胞溶解物足場に当てる工程と、
ｂ．細胞及び細切組織のうち１つ以上を有する前記細胞溶解物足場をバイオリアクターで培養する工程と、を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ａ．ポリ（ｐ−ジオキサノン）を含む足場を提供する工程と、
ｂ．前記足場シートに細胞を播種する工程と、
ｃ．前記播種したシートを巻いて管にする工程と、
ｄ．前記管をバイオリアクターで培養する工程と、を含む、組織工学による血管を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願第６１／０４９０６７号の非仮出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、血管疾患の治療用の組織工学による血管に関する。特に、本発明は、損傷を受けた又は病的な生体血管を修復する又は置換するために、足場、及び細胞、細胞シート、細胞溶解物、細切組織のうち１つ以上、及びバイオリアクタープロセスから調製された組織工学による血管を提供する。
【背景技術】
【０００３】
心血管系疾患は、先進国で１つの主な死亡原因である。米国だけで、心血管死が３４秒に１人の割合で起こっており、心血管疾患に関連するコストは、およそ２５００億ドルにもなる。現行の血管疾患治療の方法には、化学療法のレジメン、血管形成、ステント挿入、再建術、バイパス移植、罹患組織の切除、又は切断が挙げられる。残念ながら、多くの患者にとって、そのようなインターベンションは限られた成功しか収めておらず、多くの患者で、状態又は症状が悪化している。
【０００４】
これらの疾患は、しばしば血管の再建及び置換を必要とする。現在、血管置換で最も普及している源は、自家移植の動脈及び静脈である。しかしながら、そのような自家移植血管は、不足しているか、又は特に血管疾患を患ったことがある患者、若しくは以前に手術を受けたことがある患者には適していない。
【０００５】
ＰＴＦＥ及びダクロン等の材料で作られた人工移植片は、血管の代用品として一般的である。それらが一般的であるにもかかわらず、合成材料は、小径の移植片には適さないか、又は低血流量の領域では適さない。狭窄、血栓塞栓、石灰沈着、及び感染等の材料に関連する問題も実証されている。
【０００６】
ゆえに、病的な又は損傷を受けた組織を修復／再生するために、組織への浸潤を促進する生体適合性、及び生分解性の構造マトリックスの臨床的必要性がある。一般に、損傷を受けた又は病的な血管組織を修復する臨床的なアプローチは、実質的にそれらの組織の本来の機能を回復させない。したがって、現在の臨床的アプローチに関連した共通の問題を回避する、組織の修復／再生のための代替アプローチの必要性が依然として存在する。
【０００７】
組織工学の出現によって、損傷を受けた／病的な組織を修復及び再生するための代替アプローチが提供され得る。究極的には組織の機能を回復させること又は改善することができる生物学的な代用品を開発するために、組織工学の戦略は、細胞、成長因子、生物活性プロセス、及びバイオリアクタープロセスと組み合わせた生体材料の使用を探求してきた。コロニー形成及び再構築が可能な足場材料の使用は、組織の鋳型、導管、バリア、及びレザバーとして広く研究されている。特に、発泡体の形の合成材料及び天然材料、並びに繊維は、生体組織を再建する／再生するために、及び組織の増殖を誘発するために、インビトロ又はインビボで使用されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そのような組織工学による血管（ＴＥＢＶ）は、インビトロでの作製に成功しており、動物モデルで使用されている。しかしながら、臨床的な成功は非常に限られている。
【０００９】
足場の組成物及び標的組織にかかわらず、鋳型は、いくつかの基本的な特性を持っていなければならない。足場は、生体適合性があり、手術時に加えられた物理的力に耐えるために十分な機械的特性を持ち、細胞が浸潤できる又は増殖できるだけ十分に多孔性があり、滅菌が容易で、浸潤する組織によって再構築が可能で、新しい組織が形成されるにつれて分解可能でなければならない。更に、足場は、機械的な方法、固定機器、又は接着剤によって、周囲の組織に固定されてもよい。今までのところ、従来の材料は、単独で又は組み合わせで、上述の基準のうち１つ以上を欠いている。したがって、従来の材料の潜在的な落とし穴を解決することができる足場の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、生体適合性、生体吸収性のある足場、及び細胞、細胞シート、細胞溶解物、細切組織のうち１つ以上からなり、バイオリアクタープロセスで又はバイオリアクタープロセスなしで培養された、組織工学による血管（ＴＥＢＶ）である。そのような組織工学による血管は、損傷を受けた又は病的な生体血管を修復する又は置換するために使用されてもよい。一実施形態では、組織工学による血管は、生体適合性、生体吸収性のある足場及び細胞からなる。別の実施形態では、組織工学による血管は、生体適合性、生体吸収性のある足場及び細胞シートからなる。別の実施形態では、組織工学による血管は、生体適合性、生体吸収性のある足場及び細胞溶解物からなる。更に別の実施形態では、組織工学による血管は、生体適合性、生体吸収性のある足場及び細切組織からなる。更に、細胞、細胞シート、細胞溶解物、及び細切組織の様々な組み合わせが、生体適合性、生体吸収性のある足場と組み合わされて、組織工学による血管を形成する。これらの組織工学による血管は、バイオリアクタープロセスで又はバイオリアクタープロセスなしで培養されてもよい。一実施形態では、組織工学による血管は、生物活性剤と組み合わせることによって強化される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】培養３日後及び７日後の血管移植片生体材料上のヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）の付着及び増殖。Ａ：３日後のＰＤＯ−ＥＳＳ足場、Ｂ：７日後のＰＤＯ−ＥＳＳ足場、Ｃ：３日後のＰＤＯ／コラーゲン−ＥＳＳ足場、Ｄ：７日後のＰＤＯ／コラーゲン−ＥＳＳ足場。画像はすべて４０倍率で撮影。
【図２】培養３日後及び７日後の血管移植片生体材料上の平滑筋細胞（ＵＡＳＭＣ）の細胞の付着及び増殖の代表例。Ａ：３日後の１００ｍｇ／ｍＬのＰＤＯ−ＥＳＳ足場、Ｂ：７日後の１００ｍｇ／ｍＬのＰＤＯ−ＥＳＳ足場、Ｃ：３日後の１４０ｍｇ／ｍＬのＰＤＯ−ＥＳＳ足場、Ｄ：７日後の１４０ｍｇ／ｍＬのＰＤＯ−ＥＳＳ足場。画像はすべて４０倍率で撮影。
【図３】培養３日後及び７日後の血管移植片生体材料上の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の細胞の付着及び増殖の代表例。Ａ：３日後の１００ｍｇ／ｍＬのＰＤＯ−ＥＳＳ足場、Ｂ：７日後の１００ｍｇ／ｍＬのＰＤＯ−ＥＳＳ足場、Ｃ：３日後の１４０ｍｇ／ｍＬのＰＤＯ−ＥＳＳ足場、Ｄ：７日後の１４０ｍｇ／ｍＬのＰＤＯ−ＥＳＳ足場。画像はすべて４０倍率で撮影。
【図４】溶解物で増強した（lysate-augmented）ＰＤＯ−ＥＳＳ足場への細胞の付着。ＰＤＯ−ＥＳＳ足場を、２つの異なる濃度のｈＵＴＣ細胞溶解物を添加して凍結乾燥した。次に、細胞（５０，０００個／足場）を足場に播種して、生／死染色する前に３日間及び７日間培養した。（Ａ）３日後の対照足場（Ｂ）７日後の対照足場（Ｃ）３日後の１８ｍｇ／ｍＬの溶解物で増強した足場（Ｄ）７日後の１８ｍｇ／ｍＬの溶解物で増強した足場（Ｅ）３日後の５．２ｍｇ／ｍＬの溶解物で増強した足場（Ｆ）７日後の５．２ｍｇ／ｍＬの溶解物で増強した足場。画像はすべて４０倍率で撮影。
【図５】溶解物で増強したＰＤＯ−ＥＳＳ足場上に培養した細胞のＤＮＡ含量。ＰＤＯ−ＥＳＳ足場を、２つの異なる濃度（低＝５．２ｍｇ／ｍＬ、高＝１８ｍｇ／ｍＬ）のｈＵＴＣ細胞溶解物を添加して凍結乾燥した。次に、細胞（５０，０００個／足場）を足場に播種して、細胞のＤＮＡ含量を分析する前に３日間培養した。試料を洗浄して、パパインで消化させて、ＣｙＱｕａｎｔ  ＮＦアッセイキットを使用してＤＮＡ定量化した。
【図６】２４時間ラットＳＭＣで培養したＰＢＳ又はｈＵＴＣ溶解物でコーティングした管状足場は、生／死及びＨ＆Ｅの画像から、溶解物をコーティングした足場の方がより多くの細胞の付着が示されたことを示した。
【図７】播種後１１日間培養した後の、あらかじめｈＵＴＣ溶解物をコーティングしたｈＵＴＣを播種したＰＤＯシートのＨ＆Ｅ染色。細胞を片側面上のみ播種したが、細胞は移動して、足場上の一面に浸透した。箱？
【図８】巻いた管を描いた図は、生−死染色実験用の試料採取位置を示す。静置培養中、位置１ｃ２は管の底面で、ａ及びｂは管の側面で、１ｄ２は管の上面である。
【図９】ｒＳＭＣを播種したシート（厚さ５０マイクロメートル）から巻いたＰＤＯ管のＨ＆Ｅ染色。
【図１０】ｈＵＴＣを２ｍｍの管状足場上に播種する。ＰＤＯ−ＥＳＳ（Ａ）及びラットテールタイプＩコラーゲンでコーティングしたＰＤＯ−ＥＳＳ（Ｂ）の直径２ｍｍの管状足場をＬｕｍｅＧｅｎバイオリアクターチャンバに固定して、内腔に５．５×１０５個細胞／ｍＬの細胞懸濁液を充填することで播種した。次に、チャンバを０．４ｒｐｍで一晩回転させて、生／死染色によって分析した。画像はすべて１００倍率で撮影。
【図１１】ラット大動脈平滑筋細胞を管状足場上に播種する。ＰＤＯ−ＥＳＳ（Ａ）及びＰＤＯ／コラーゲン−ＥＳＳ（Ｂ）の管状足場を、ＬｕｍｅＧｅｎバイオリアクターチャンバに固定して、内腔に２×１０６個細胞／ｍＬの細胞懸濁液を充填することで播種した。次に、チャンバを０．４ｒｐｍで一晩回転させて、生／死染色によって分析した。画像はすべて１００倍率で撮影。
【図１２】管状足場上のラット大動脈平滑筋細胞を流体流れに曝す、又は７日間の静置培養。長さ〜５ｃｍのＰＤＯ−ＥＳＳの管状足場を、ＬｕｍｅＧｅｎバイオリアクターチャンバに固定して、内腔に２×１０６個細胞／ｍＬの細胞懸濁液を充填することで播種した。次に、チャンバを０．４ｒｐｍで一晩回転させた。翌日、管状足場をＬｕｍｅＧｅｎバイオリアクターに接続して、２時間１０ｍＬ／分の流速に曝した。次に、１つの管状足場を生／死染色で分析した。（Ａ）管の左側。（Ｂ）管の右側。もう１つの管状足場を７日間静置培養して、次に生／死染色で分析した。（Ｃ）管の左側。（Ｄ）管の右側。画像はすべて１００倍率で撮影。
【図１３】管状足場上のラット大動脈平滑筋細胞を動的培養又は静置培養の条件に曝す。長さ〜５ｃｍのＰＤＯ−ＥＳＳの管状足場を、ＬｕｍｅＧｅｎバイオリアクターチャンバに固定して、内腔に２×１０６個細胞／ｍＬの細胞懸濁液を充填することで播種した。次に、チャンバを０．４ｒｐｍで一晩回転させた。翌日、管状足場をＬｕｍｅＧｅｎバイオリアクターに接続して、３日間２０ｍＬ／分の流速及び１Ｈｚの周波数で１５．９〜１０．７ｋＰａ（１２０〜８０ｍｍＨｇ）の範囲の拍動性圧力に曝した。別の管状足場を、同じ期間静的条件下で培養した。次に、両方の管を生／死染色によって分析した。（Ａ）静的に培養した管の左側。（Ｂ）静的に培養した管の右側。（Ｃ）動的条件下で培養した管の左側。（Ｄ）動的条件下で培養した管の右側。画像はすべて１００倍率で撮影。
【図１４】画像は、ラットの細切筋組織が異なる量で管状の作製物上に均一に分配されたのを示す。
【図１５】培養７２時間後に、画像は、細切組織がまだ管状足場に付着していたのを示す。
【図１６】ＰＤＯ管上で４日間播種（静的）して、続いて１０日間バイオリアクターに入れた（Ｈ＆Ｅ染色）ラット平滑筋細胞。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、生体適合性、生体吸収性のある足場、及び細胞、細胞シート、細胞溶解物、細切組織のうち１つ以上からなり、バイオリアクタープロセスで又はバイオリアクタープロセスなしで培養された、組織工学による血管（ＴＥＢＶ）である。そのような組織工学による血管は、損傷を受けた又は病的な生体血管を修復する又は置換するために使用されてもよい。組織工学において、生体によって足場が再吸収される速度は、好ましくは、組織によって足場が置換される速度に近似する。すなわち、組織によって足場が置換される速度に対する足場が再吸収される速度は、足場に要求される強度等の構造上の完全性が要求される期間、保持されるものでなければならない。足場が分解され、足場がそこに増殖している組織によって置換されるより容認できないほど速く吸収される場合は、足場は、強度の損失を示す可能性があり、機器の故障が生じる可能性がある。機能不全の足場を取り除き、損傷を受けた組織を修復するために、追加の手術が更に必要となる可能性がある。したがって、本発明の機器は、それぞれ組織再生又は組織修復に望ましい、有用である、又は必要である、生物分解性、再吸収、経時的な構造上の完全性、及び組織の内成長を促進する能力の特性の平衡を有利に保つ。そのような機器は、従来の技術の機器に比べて相乗的な改善を提供する。
【００１３】
一般に、足場の調製に適した生分解性ポリマーは、望ましくは、意図する適用に適した機械的特性を有し、組織が内成長し治癒するまで、十分に完全性を維持し、最小の炎症性反応又は毒性反応も引き起こさず、材料に破損なしで、長期的な血行力学的な応力に耐えることができ、血栓症及び感染の両方に耐久性があり、目的を満たした後に体内で代謝され、形成される所望の最終製品に容易に加工され、許容できる有効期間を実証し、容易に滅菌されるように構成されている。
【００１４】
生体適合性、生分解性の足場は、ホモポリマー、コポリマー、及びブロックポリマー、直鎖若しくは分枝鎖、セグメント化若しくはランダム、並びにこれらの組み合わせを含む天然ポリマー、改質天然ポリマー、又は合成生分解性ポリマーから構成されてもよい。非常に適した合成生分解性ポリマーは、脂肪族のポリエステルであり、ラクチドのホモポリマー及びコポリマー（乳酸Ｄ−、Ｌ−及びメソラクチドを含む）、グリコリド（グリコール酸を含む）、イプシロン−カプロラクトン、ｐ−ジオキサノン（１，４−ジオキサン−２−オン）、及び炭酸トリメチレン（１，３−ジオキサン−２−オン）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ポリマーは、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＡ／ＰＧＡ）コポリマー（９５／５、８５／１５、１０／９０モル−モル％）、及びポリ（グリコリド−コ−カプロラクトン（caprolatone））（ＰＧＡ／ＰＣＬ）６５／３５コポリマー、及びポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン（caprolatone））（ＰＬＡ／ＰＣＬ）（６０／４０モル−モル％）コポリマーである。
【００１５】
適した天然ポリマーには、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスティック、フィブリン、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、天然ポリマーはコラーゲンである。更に別の実施形態では、天然ポリマーの混合物は、細胞を含まない網マトリックスである。
【００１６】
足場は、所望の範囲を反映する寸法を有しており、細胞、細胞シート、細胞溶解物、細切組織のうち１つ以上、及びバイオリアクタープロセスと組み合わせて、損傷を受けた又は病的な小径の静脈血管又は動脈血管を置換する。所望の寸法は、内径（好ましくは３〜７ｍｍ、最も好ましくは４〜６ｍｍ）、壁厚（好ましくは０．１〜１ｍｍ、最も好ましくは０．２〜０．７ｍｍ）、及び長さ（好ましくは１〜２０ｃｍ、最も好ましくは２〜１０ｃｍ）を含むが、これらに限定されない。下表は、本発明者らのＰＤＯ作製物の特性が、生体血管の特性といかに合致するかを示す。
【表１】
2011519616.tif 000003
【００１７】
足場は、所望の範囲を反映する物質的特性を有しており、細胞、細胞シート、細胞溶解物、細切組織のうち１つ以上、及びバイオリアクタープロセスと共に、損傷を受けた又は病的な小径の静脈血管又は動脈血管を置換する。所望の物質的特性は、コンプライアンス（好ましくは０．２〜１０％、最も好ましくは０．７〜７％）、縫合糸保持強度（好ましくは１００ｇｍ〜４Ｋｇ、最も好ましくは１００〜３００ｇｍ）、破裂強さ／圧力（好ましくは１３３．３〜６００．０ｋＰａ（１０００〜４５００ｍｍ  Ｈｇ）、最も好ましくは２００．０〜６００．０ｋＰａ（１５００〜４５００ｍｍ  Ｈｇ）、バイオリアクタープロセス中は１００ｍｍ  Ｈｇ以上）、キンク耐性（プロセスの全ての段階−細胞播種、バイオリアクター、移植、患者の生存期間の間ハンドリング中にキンクに対して抵抗する）、及びインビトロの強度（細胞及びＥＣＭの増殖が、足場の物質的性質の損失を克服するまで、１日〜１年、十分な強さを保持する。バイオリアクターの「フロー」の条件下で好ましくは１日〜３ヶ月）を含むが、これらに限定されない。足場は更に、弾性率（ＭＰａ）が、長軸方向／軸方向（好ましくは１〜２００、最も好ましくは５〜１００）、直交／径方向（好ましくは０．１〜１００、最も好ましくは０．５〜５０）、ランダム（好ましくは０．１〜１００、最も好ましくは０．５〜５０）、及び湿潤／長軸方向（好ましくは５〜１００、好ましくは２５〜７５）、ピーク応力（ＭＰａ）は、長軸方向／軸方向（好ましくは１〜３０、最も好ましくは２〜２０）、直交／径方向（好ましくは０．５〜１５ｎ、最も好ましくは１〜１０）、ランダム（好ましくは０．５〜１５、最も好ましくは１〜１０）、及び湿潤／長手（好ましくは１〜３０、最も好ましくは２〜２０）、破壊ひずみ（％）が、長軸方向／軸方向（好ましくは１〜２００、最も好ましくは５〜７５）、直交／径方向（好ましくは５〜４００、最も好ましくは１０〜３００）、ランダム（好ましくは５〜４００、最も好ましくは１０〜３００）、及び湿潤／長手（好ましくは１〜２００、最も好ましくは２０〜１００）を含むがこれらに限定されない、所望の引張特性（径方向及び軸方向）を有するべきである。
【００１８】
足場は、所望の範囲を反映する形態を有しており、細胞、細胞シート、細胞溶解物、細切組織のうち１つ以上、及びバイオリアクタープロセスと共に、損傷を受けた又は病的な小径の静脈血管又は動脈血管を置換する。所望の形態は、孔径（好ましくは１〜２００μｍ、最も好ましくは１００μｍ未満）、多孔性（好ましくは４０〜９８％、最も好ましくは６０〜９５％）、表面積／体積（好ましくは０．１〜７ｍ２／ｃｍ３、最も好ましくは０．３〜５．５ｍ２／ｃｍ３）、透水性（好ましくは８０〜１２０ｍｍ  Ｈｇで１〜１０ｍＬｃｍ２／分、最も好ましくは１２０ｍｍ  Ｈｇで＜５ｍＬｃｍ２／分未満）、及びポリマー／ファイバーの配向（適切な細胞の播種、固着、増殖、及びＥＣＭ形成を可能にする）を含むが、これらに限定されない。ポリマー／ファイバーの配向は更に、適切な細胞移動を可能にするであろうが、これは、細胞が細切組織から移動して足場に集合するので、細切組織片にとっても重要であろう。
【００１９】
足場は、足場にとって所望の特性を反映する生体適合性を有しており、細胞、細胞シート、細胞溶解物、細切組織のうち１つ以上、及びバイオリアクタープロセスと共に、損傷を受けた又は病的な小径の静脈血管又は動脈血管を置換する。所望の生体適合性は、吸収（足場の最大体積が細胞及びＥＣＭで占有されることを可能にするために、１週間〜４年間が好ましく、４週間〜３０週間が最も好ましい）、組織反応（最小）、細胞の適合性（固着、生存能、増殖、移動、及び足場によって負の影響を受けない分化）、残留紡糸性（最小）、残留ＥｔＯ（最小）、及び血液適合性（非血栓形成性）を含むが、これらに限定されない。
【００２０】
足場は、足場にとって所望の特性を反映する他の因子を有しており、細胞、細胞シート、細胞溶解物、細切組織、組織のうち１つ以上、及びバイオリアクタープロセスと共に、損傷を受けた又は病的な小径の静脈血管又は動脈血管を置換する。所望の因子は、表面エネルギー（適切な細胞の播種、固着、増殖、移動、及びＥＣＭ形成を可能にする）、表面化学（酸素、表面の粗さ等の因子の追加）、局所解剖学（細胞の付着、及び他の細胞機能に影響を与えるために用いられ得る）、表面のナノスケール特徴は、１０〜１２００ナノメートルの範囲の径が好ましく、２５〜９００ナノメートルがより好ましい（優先的な内皮細胞の付着を可能にする）、ＮＯ、フリーラジカルスカベンジャーは、適切な細胞の播種、固着、増殖、及びＥＣＭ形成を可能にする、細胞のメディエーター（マトリックスタンパク質等の因子を追加することにより、適切な細胞の播種、付着、増殖、移動、及びＥＣＭ形成を可能にする）、疎水性／親水性（適切な平衡の疎水性／親水性は、適切な細胞の播種、固着、増殖、及びＥＣＭ形成を可能にする）を含むが、これらに限定されない。他の表面改質には、ガルバーニ電気的な材料で表面をコーティングする形式で電気的な微小電流を提供することが挙げられる。特に、亜鉛、及び銅（０．０１マイクロメートル〜０．１マイクロメートル）は、電流源として作用することができ、内皮及び平滑筋細胞の付着及び増殖を増強する。
【００２１】
本発明で使用されてもよい足場の非限定的な例には、フェルト、織物、編物、組みひも、メッシュ、不織布、ねじり編物等の繊維構造、多孔性の泡、並びに半多孔性の泡を含む発泡体、有孔フィルム若しくはシート、パターン化したフィルム、シート、又はファイバー、及びこれらの混合物が挙げられる。ここで使用される用語「不織布」は、紡ぐ、織る、又は編む以外のプロセスで製造された、接着された布、形成された布、又は工学による布を含むが、これらに限定されない。具体的に、用語「不織布」は、通常フラットシートの形状で、主として又は完全にステープルファイバからなり、ウェブ、シート、又はバット（batt）に組み立てられた多孔性の繊維のような材料のことを言う。ファイバーの径は、１０ｎｍ〜１００μｍが好ましく、２５ｎｍ〜１０μｍがより好ましい。一実施形態で、足場は繊維、発泡体、及びこれらの組み合わせである。
【００２２】
別の実施例では、足場は、静電紡糸法、押し出し、射出成型、及び任意の前処理、又は後処理（例えば、押出チューブに注入を形成するためのレーザー切断）で調製されたファイバーからなる繊維である。一実施形態では、足場は、静電紡糸法によって調製された繊維である。静電紡糸法による足場プロセスでは、電気力がポリマー溶液に加えられ、溶液の表面張力を克服して、帯電した噴流を形成する。静電紡糸法によるファイバーからなる、シート、チューブ、又は他の作製物を形成するために、溶液のこの噴流が放出され、乾燥され、基材上に凝固される。ポリマー溶液の紡糸性は、濃度（ポリマー／溶媒の溶液が紡がれ、適切な足場（１〜５０ｗ／ｖ％が好ましい）を形成するファイバーが産生されることを可能にする濃度）、溶媒（特定の濃度の範囲でポリマーを溶かす溶媒、ＨＦＩＰが好ましい）、溶液粘度（好ましくは１０〜３００ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは２５〜２５０ｍｇ／ｍＬ（５０〜３０００センチポアズ））を含むが、これらに限定されない、いくつかのパラメータによってコントロールされる。紡糸の条件をコントロールすることによって、産生されるファイバーは、約０．１μｍ〜約１０μｍに及ぶことができ、好ましくは０．３μｍ〜５．０μｍに及ぶことができる。
【００２３】
静電紡糸法の重要である他のプロセスパラメータは、電位差（好ましくは１０〜１００ｋＶ、最も好ましくは１５〜３０ｋＶ）、流量（好ましくは０．１〜２０ｍＬ／時、最も好ましくは１〜１５ｍＬ／時）、間隙／先端の距離（好ましくは１〜３５ｃｍ、最も好ましくは２．５〜２５ｃｍ）、回転／マンドレルの割合／速度（好ましくは１０〜５，０００ｒｐｍ、最も好ましくは５０〜３０００ｒｐｍ）を含むが、これらに限定されない。ファイバーはまた、融解物から紡ぐことができる。
【００２４】
所望により、静電紡糸法による足場（ＥＳＳＣ）の強度は、前述の作製物のファイバーの接合により高められてもよい。ファイバーの接合は、ＥＳＳＣをＰＣＬ等の低融点材料、及び低分子ＰＬＧＡコポリマーでコーティングするによって行われてもよい。足場のコーティング後、熱プレスを用いて後処理を実施してもよい。その処理は、強化繊維のコーティング層を融解する。静電紡糸したファイバー間の溶解したコーティングは、圧縮され室温まで冷却されると、ファイバーを一緒に融合させる。あるいは、静電紡糸のプロセス中に、静電紡糸したファイバーは、溶媒の蒸気に曝される。硬化されると、ファイバーが一緒に融合され、それによって、足場が強化される。
【００２５】
一実施形態では、繊維、及びＥＳＳＣの足場は、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＡ／ＰＧＡ）コポリマー（９５／５、８５／１５、１０／９０モル−モル％）、及びコラーゲンを含むが、これらに限定されない、ポリマーから調製される。
【００２６】
別の実施形態では、足場は発泡体である。一実施形態では、発泡体の足場は、エラストマーコポリマーから調製される。適した生体吸収性、生体適合性のエラストマーコポリマーは、イプシロン−カプロラクトンとグリコリドとのコポリマー（好ましくは、イプシロン−カプロラクトン対グリコリドのモル比が、約３０：７０〜約７０：３０、好ましくは３５：６５〜約６５：３５、最も好ましくは４５：５５〜３５：６５）；イプシロン−カプロラクトンとラクチド（Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、これらの配合物、又は乳酸コポリマーを含む）とのエラストマーコポリマー（好ましくは、イプシロン−カプロラクトン対ラクチドのモル比が、約３５：６５〜約６５：３５、より好ましくは４５：５５〜３０：７０；）ｐ−ジオキサノン（１，４−ジオキサン−２−オン）とラクチド（Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、及び乳酸を含む）とのエラストマーコポリマー（好ましくは、ｐ−ジオキサノン対ラクチドのモル比が、約４０：６０〜約６０：４０）；イプシロン−カプロラクトンとｐ−ジオキサノンとのエラストマーコポリマー（好ましくは、イプシロン−カプロラクトン対ｐ−ジオキサノンのモル比が、約３０：７０〜約７０：３０）；ｐ−ジオキサノンと炭酸トリメチレンとのエラストマーコポリマー（好ましくは、ｐ−ジオキサノン対炭酸トリメチレンのモル比が、約３０：７０〜約７０：３０）；炭酸トリメチレンとグリコリドとのエラストマーコポリマー（好ましくは、炭酸トリメチレン対グリコリドのモル比が、約３０：７０〜約７０：３０）；炭酸トリメチレンとラクチド（Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、これらの配合物、又は乳酸コポリマーを含む）とのエラストマーコポリマー（好ましくは、炭酸トリメチレン対ラクチドのモル比が、約３０：７０〜約７０：３０）及びこれらの配合物を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、エラストマーコポリマーは、ポリ（グリコリド−コ−カプロラクトン（caprolatone））（ＰＧＡ／ＰＣＬ）６５／３５コポリマー、又はポリ（ラクチド−コ−カプロラクトン（caprolatone））（ＰＬＡ／ＰＣＬ）（６０／−４０モル−モル％）コポリマーである。
【００２７】
発泡体足場は、凍結乾燥、超臨界溶媒発泡法（つまりＥＰ  ４６４，１６３  Ｂ１に記載されているとおり）、ガス注入射出、ガス注入成形、又は抽出材料を使った鋳造等の、従来のプロセスによって調製されてもよい。一実施形態では、発泡体は、凍結乾燥によって調製される。発泡体を形成するために、６５／３５ＰＧＡ／ＰＣＬ等のエラストマーポリマーを凍結乾燥するために適した方法は、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃに譲渡された米国特許第６，３５５，６９９号「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｆｏａｍｓ」の例で説明され、参照によりその全体がこの開示に完全に組み込まれる。
【００２８】
別の実施例では、孔を形成する追加の方法として、浸出性物質を足場へ導入することができる。適した浸出性固体には、塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酒石酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等）、生体適合性のモノ、及び二糖類（例えば、グルコース、フルクトース、デキストロース、マルトース、ラクトース、及びスクロース）、多糖類（例えば、デンプン、アルギナート、キトサン）、水溶性タンパク質（例えば、ゼラチン、及びアガロース）、等の無毒性の浸出性材料が挙げられる。
【００２９】
発泡体は、組織工学に適した微細構造を有する。そのような発泡体の特徴は、凍結乾燥中に発泡体を形成する適切な条件を選ぶことによって、所望の適用に合うようにコントロールすることができる。吸収性のあるポリマーのこれらの特徴は、足場が典型的に等方性構造、又はランダム構造である従来の技術よりも明確な利点を有する。しかしながら、組織工学（すなわち、修復又は再生）で使用される発泡体は、正常組織の解剖学的、生体力学的、及び生化学的な特徴を有する細胞の組織化、及び組織の再生を促進する鋳型を提供する組織化を、微細構造のレベルで提供する構造体を有することが好ましい。これらの発泡体は、家畜動物、霊長類、及びヒト等の動物で、組織（器官を含む）を修復する又は再生するために使用することができる。
【００３０】
そのような発泡体の特徴は、（１）細胞の内成長及び栄養素拡散のための経路を供給する、約１０〜約２００μｍ（又はそれ以上）の範囲の径の孔の相互連結、（２）約２０％〜約９８％の範囲、及び好ましくは約５０％〜約９５％の範囲の様々な多孔度、（３）優先的な細胞培養のために一方向の端から端までの孔径の勾配、（４）細胞浸潤、血管化、及び栄養素拡散の向上のために発泡体を通り抜けるチャネル、（５）細胞組織化のための表面の孔のマイクロパターニング、（６）孔形状の調整可能性（tailorability）及び／又は配向（例えば、実質的に球状、楕円体、円柱状）、（７）異方性の機械的特性、（８）異なる材料に対する異なる細胞反応の利点を引き出す又は利用するために、ポリマーの組成勾配を備えた複合発泡体、（９）異なる割合で分解されるであろう部分を有する構造体を作製するための異なるポリマー組成物の配合物、（１０）薬剤的に活性な化合物で、共に凍結乾燥した発泡体、並びに（１１）好ましい微細構造で、３次元の形状、及び機器を作る能力のうち１つ以上の特性を得るために凍結乾燥用に適切な条件を選ぶことによって、所望の適用に合うようにコントロールすることができる。足場の内層又は内腔層は、表面の多孔性をコントロールすること及び表面処理の可能な追加によって、内皮化のために最適化されてもよい。足場の最外層又は外膜層は、平滑筋細胞の増殖を支援するために、再度、多孔性の最適化（多孔性の割合、孔径、孔形状、及び孔径の配分、）及び生理活性因子、医薬品、又は細胞を取り込むことによって調整されてもよい。強度を高めて漏出を減少させるために、これら２つの多孔質層間に配置された低多孔性を有するバリア層があってもなくてもよい。本明細書で説明する足場のそのような構造上の特徴はまた、本明細書で説明する静電紡糸法による足場及び他の足場等の繊維に見ることができる。
【００３１】
一実施形態では、足場は、発泡体と繊維との混合物である。繊維には、足場の補強の役割をする、織物構造体、編物構造体、ねじり編物構造体（つまり、レース状）、不織布構造体、及び組みひも構造体が挙げられる。補強は、縫合を可能にするために十分な密度を有するべきであるが、この密度は、発泡体と繊維との間の適切な接合を妨げるほど大きくあるべきでない。補強材料はまた、組織の内成長を可能にする穿孔を有する薄い、穿孔含有のエラストマーシートから形成されてもよい。
【００３２】
例えば、本発明は更に、繊維層の第１の層、及び生体適合性の発泡体又はＥＳＳＣの第２の層を含む複合足場を提供する。この複合構造体は、ユニークな機械的特性を有する構造体の作製を可能にする。一実施形態では、繊維層は、複合体を適所に保持する縫合糸、ステープル、又は種々の固定機器の使用を可能にする。一般に、繊維は、１マイクロメートル〜約５００マイクロメートルの範囲の厚さを有する。繊維層は、設計、異なる生体吸収性のプロファイル、及び細胞の浸潤及び播種のための異なる微環境に応じて、複合体が可変の機械的強度を有することを可能にし、それは様々な医療応用において有利である。繊維層は、好ましくは生体吸収性である、様々な生体適合性のポリマー及び生体適合性のポリマーの配合物から作製されてもよい。生体適合性の発泡体又はＥＳＳＣは、勾配又はチャネルのどちらかを含有してもよい。勾配のある構造体は、組成物、剛直性、柔軟性、生体吸収率、孔構築、及び／又は微細構造からなる群から選択される、少なくとも１つの特性に実質的に連続的な遷移を有する。勾配のある構造体は、１つのポリマー材料からもう１つのポリマー材料まで、組成的に勾配のある遷移を形成する、吸収性のあるポリマーの配合物から作製することができる。単一化学組成物が応用に十分な状況で、本発明は、組織の解剖学的特徴を模倣してもよい、１つ以上の寸法全体にわたって構造体の微細構造の変動を有してもよい、複合体を提供する。チャネル付きの構造体は、構造体全体にわたって、細胞の移動及び栄養素の流れを促進するために、発泡体を通って延びるチャネルを提供する。
【００３３】
別の実施形態では、発泡体又はＥＳＳＣは、上面又は底面に融合させた繊維を有してもよい。この方法によって、多孔性、浸透性、分解率、及び機械的特性等の構造体の表面特性をコントロールすることができる。繊維は本明細書で説明する従来の技術によって製造することができ、それによって繊維を凍結乾燥した発泡体の表面に構築することができる。繊維は、凍結乾燥した発泡体表面にＥＳＳＣを構築することができる、静電紡糸法プロセスによって製造することができる。
【００３４】
足場は、発泡体又はＥＳＳＣのそれぞれのうち１つ以上の層及び補強成分を含んでもよい。好ましくは、発泡体又はＥＳＳＣの隣接層は更に、隣接層で孔を形成するウェブ又は壁の少なくとも部分的な噛み合わせによって集積される。
【００３５】
一実施形態では、足場は、細胞の適合性を増強するために天然ポリマーでコーティングされてもよい。適する天然ポリマーには、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸、フィブリン、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、天然ポリマーはコラーゲンである。更に別の実施形態では、天然ポリマーの混合物は、細胞を含まない網マトリックスである。
【００３６】
一実施形態では、組織工学による血管は、生体適合性、生体吸収性のある足場及び細胞からなる。足場は、本明細書で上述したとおりである。足場と組み合わせてもよい適した細胞には、多能性幹細胞又は万能性幹細胞等の幹細胞、平滑筋前駆細胞及び脈管内皮前駆細胞等の前駆細胞、胚性幹細胞、胎盤組織由来細胞及び臍帯組織由来細胞等の分娩後組織由来細胞、血管内皮細胞等の内皮細胞、血管平滑筋細胞等の平滑筋細胞、脂肪組織由来前駆細胞、並びに橈骨動脈由来細胞、及び内胸動脈としても知られる左右の内乳動脈（ＩＭＡ）等の動脈細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
一実施形態では、ＴＥＢＶは、本明細書で上述した足場、及びヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）からなる。ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）（臍帯由来細胞（ＵＤＣ）とも呼ばれる）を分離及び採取する方法は、同時係属米国特許出願第１０／８７７，０１２号に記述されており、参照により全体が本明細書に組み込まれる。別の実施例では、ＴＥＢＶは、本明細書で上述した足場、ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）、及び１つ以上の他の細胞からなる。１つ以上の他の細胞には、血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）、血管平滑筋前駆細胞、血管内皮細胞（ＥＣ）、又は脈管内皮前駆細胞、及び／又は他の多能性幹細胞、若しくは万能性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。ｈＵＴＣを足場上で１つ以上の他の細胞と組み合わせることは、足場上のＥＣ及びＳＭＣ等の播種、付着、及び増殖を増強する可能性がある。ｈＵＴＣは更に、足場作製物中のＥＣ、ＳＭＣ、又は前駆細胞の分化を促進する可能性がある。これは、インビトロ培養中のＴＥＢＶの成熟、並びにインビボ移植中の生着を促進する可能性がある。ｈＵＴＣは、栄養の補助を提供する可能性があり、又はＥＣＭタンパク質の発現を提供及び増強する可能性がある。ｈＵＴＣを含めて細胞の栄養作用は、患者の血管平滑筋又は脈管内皮の増殖につながる可能性がある。ｈＵＴＣを含めて細胞の栄養作用は、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞、骨格筋前駆細胞、血管平滑筋前駆細胞、又は脈管内皮前駆細胞の再生された血管の部位（単数又は複数）への移動を誘発する可能性がある。
【００３８】
細胞は、（組織修復する手術の前又は手術中に）患者から収集することができ、この細胞は、特定の細胞型を用意するために滅菌状態の下で処理することができる。当業者は、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２００７，Ｆｅｂ；１５（２）：２２６〜３１等に記載されるような上述の細胞を収集して用意するための従来の方法を知っており、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００３９】
細胞を、短期間、例えば、移植の直前に１日未満、本発明の足場上に播種でき、又はより長い期間、例えば、移植の前に、播種した足場内に細胞の増殖及び細胞外マトリックス合成を可能にするために１日以上、培養することができる。一実施形態では、単一の細胞型を足場上に播種する。別の実施例では、１つ以上の細胞型を足場上に播種する。様々な細胞戦略（つまり、自家細胞、同種細胞、異種細胞等）を、これらの足場と一緒に使用することができるであろう。
【００４０】
別の実施形態では、細胞は、血管形成促進活性、抗炎症活性、細胞生存性、細胞の増殖性、又は分化若しくは免疫修飾（immunemodulation）に関与するターゲットの遺伝子を発現させるために、遺伝子的に改変される。
【００４１】
別の実施形態では、組織工学による血管は、生体適合性、生体吸収性のある足場、及び細胞シートからなる。細胞シートは、ｈＵＴＣ又は他の細胞型で作製されてもよい。細胞シートの作製方法は、同時係属中米国特許出願第１１／３０４０９１号で記述されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。細胞シートは、温度の低下と共に無傷細胞シートの収集を可能にする熱応答性ポリマーがコーティングされた皿を使用して生成される。あるいは、細胞シートを作製する他の方法には、ポリマーフィルム上に細胞シートの形で細胞を生成することが含まれるが、これらに限定されない。選択された細胞は、ガラス、セラミックス、又は表面処理された合成ポリマー上で培養されてもよい。例えば、γ線照射、又はシリコンコーティングのような表面処理を受けたポリスチレンを、細胞培養の表面として使用してもよい。８５％以上コンフルエントに増殖した細胞は、細胞増殖支援機器上に細胞シート層を形成する。細胞シート層は、トリプシン又はディスパーゼ等のタンパク質分解酵素を使用して、細胞増殖支援機器から分離されてもよい。更に非酵素の細胞解離を使用することができる。非限定的な例としては、酵素処理に関連する損傷のリスクを低減すると同時に、培養中の固着細胞を穏やかに取り外すように設計されている非酵素の細胞解離溶液である、ＣＥＬＬＳＴＲＩＰＰＥＲ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．）の商品名で販売されているキレート化剤の混合物が挙げられる。
【００４２】
あるいは、培養細胞が採取される細胞増殖支援機器の表面は、細胞がタンパク質分解酵素又は化学材料なしで分離する材料で作製された床であってもよい。床の材料は、その上にサポート及びコーティングを含んでもよく、コーティングは、水に対する臨界溶解温度０℃〜８０℃の範囲を有するポリマー又はコポリマーから形成される。
【００４３】
一実施形態では、１つ以上の細胞シートは、細胞シート（単数又は複数）を足場の回りに巻き付けることで、本明細書で上述した足場と結合される。１つ以上の細胞シートは、本明細書で上述したように、同じ細胞型又は異なる細胞型であってもよい。一実施形態では、頑強な脈管の作製物を形成するために、多数の細胞シートを組み合わせることができる。例えば、内皮細胞及び平滑筋細胞で作製された細胞シートを、ＴＥＢＶを形成するために足場と結合することができる。あるいは、ｈＵＴＣ細胞シート等の他の細胞型を、ＴＥＢＶを形成するために内皮細胞シート及び足場と結合することができる。更に、作製物の成熟を支援する栄養の因子を供給するために、ｈＵＴＣで作製された細胞シートを、足場、ＥＣ、及びＳＭＣからなるあらかじめ形成されたＴＥＢＶの回りに巻き付けることができる。
【００４４】
細胞シートは、細胞シートに補強及び機械的特性を提供するために、足場上で増殖させてもよい。強化された細胞シートは、支援機器に細胞を播種する前に、支援機器の底部に生分解性補強材料又は非生分解性補強部材を置くことによって形成することができる。補強部材は、本明細書で上述したとおりである。細胞シート層は、結果として細胞シート層に付加的な強度を提供する補強足場を組み込むことになり、バッキング層を必要としないで操作することができる。好ましい補強足場は、ポリ（ジオキサノン）からなるメッシュである。メッシュは、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ａｔｔａｃｈｅｍｅｎｔ皿の底部に置くことができる。次に、細胞間の相互作用を形成することになると同時に、メッシュと相互作用する時にメッシュと結合することになるように、細胞を皿に播種することができる。これによって、より良好な強度及びハンドリング特性を備えた強化された細胞シートを生じさせるであろう。そのように強化された細胞シートは、巻いてＴＥＢＶにしてもよく、又は強化された細胞シート層は足場上に配置されてもよい（上述のとおり）。
【００４５】
別の実施例では、細胞シートは、遺伝子操作されている。遺伝子操作された細胞シートは細胞集団を含んでおり、細胞集団の少なくとも１つの細胞は、外因性ポリヌクレオチドが組織の治癒、置換、維持、及び診断を助けるための明確な診断上の及び／又は治療上の生成物（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を発現するように、外因性ポリヌクレオチドで形質移入されている。本明細書で用いられてもよい「ターゲットのタンパク質」（及びそれをコードする遺伝子）の例には、サイトカイン、成長因子、ケモカイン、化学走性ペプチド、メタロプロテイナーゼの組織阻害物質、ホルモン、刺激性、又は抑制性の血管新生調節薬、免疫調節性タンパク質、神経防護的タンパク質、神経再生的なタンパク質及びアポトーシス阻害物質が含まれるが、これらに限定されない。具体的に、好ましいタンパク質には、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＫＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−δ、ＭＳＨ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＢＤＮＦ、ＧＤＦ−５、ＢＭＰ−７、及びＩＬ−６が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
別の実施形態では、組織工学による血管は、生体適合性、生体吸収性のある足場、及び細胞溶解物からなる。細胞溶解物は、多能性幹細胞又は万能性幹細胞等の幹細胞、平滑筋前駆細胞及び脈管内皮前駆細胞等の前駆細胞、胚性幹細胞、胎盤組織由来細胞及び臍帯組織由来細胞等の分娩後組織由来細胞、血管内皮細胞等の内皮細胞、血管平滑筋細胞等の平滑筋細胞、脂肪組織由来前駆細胞、橈骨動脈由来細胞及び内胸動脈としても知られる左右の内乳動脈（ＩＭＡ）等の動脈細胞が含まれるが、これらに限定されない細胞から得られてもよい。細胞溶解物、及び細胞の可溶性画分は、血管平滑筋又は脈管内皮経路に沿って、分化するために刺激されてもよい。そのような溶解物及びその画分は、多くの有用性を有する。インビボで溶解物の可溶性画分を使用する（つまり、実質的に膜がない）ことは、例えば、拒絶又は他の有害な免疫反応を引き起こす可能性が高い相当量の細胞表面タンパク質を導入することなく、有益な細胞内の環境を患者に同種で使用することを可能にする。細胞を溶解する方法は、当該技術分野において周知であり、機械的破壊、酵素破壊、化学的破壊、又はこれらの組み合わせの様々な手段を含む。そのような細胞溶解物は、増殖培地中の細胞から直接、したがって、分泌された増殖因子等を含有した状態で調製されてもよく、又は例えば、ＰＢＳ若しくは他の溶液で、培地なしに洗浄した細胞から調製されてもよい。
【００４７】
更に別の実施形態では、組織工学による血管は、生体適合性、生体吸収性のある足場及び細切組織からなる。細切組織は、組織片から足場に移動することができる少なくとも１つの生存可能な細胞を有する。更に好ましくは、細切組織は、組織片から移動して足場に集合し始めることができる有効量の細胞を含有する。細切組織は、１つ以上の組織源から得られてもよく、又は１つの源から得られてもよい。細切組織源には、骨格筋組織及び平滑筋組織等の筋組織、静脈組織及び動脈組織等の血管組織、内皮組織等の皮膚組織、並びに脂肪組織が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
細切組織は、最初に収集用の適切なツールを使用してドナーから組織試料（自家、同種、又は異種）を取得することにより調製される。組織試料を次に、組織が採取される時に細かく刻み、小断片に分割するか、又は代替的に、体外で採取され収集した後で刻むこともできる。組織の収集後に組織試料が刻まれる実施形態では、組織試料は、リン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄することができる。組織は次に、リン酸緩衝生理食塩水等の生理的緩衝液、又はＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地液中の０．２％コラゲナーゼ等のマトリックス消化酵素が、例えば、約１ｍＬの少量が存在する状態で、小断片に刻むことができる。組織は、およそ０．１〜１ｍｍ３のサイズの断片に刻まれる。組織を細切にすることは、種々の方法により達成できる。一実施形態では、平行及び対向する方向に切断する２つの滅菌メスを用いて刻むか、又は別の実施形態では、組織を自動的に所望の大きさの粒子に分割する加工用具により組織を刻むことができる。１つの実施形態では、細切組織は、例えば、篩い分け、沈降又は遠心分離のような当業者に既知の種々の方法を用いて生理液から分離し、濃縮することができる。細切組織を濾過及び濃縮する実施形態では、細切組織の懸濁液は、好ましくは、懸濁液中に少量の流体を保持して組織が乾燥することを防ぐ。
【００４９】
刻まれた生組織の懸濁液は、組織及び足場が結合するように、生組織の懸濁液を生体適合性の足場上に沈着させることによって、本発明によるＴＥＢＶを作製するために使用することができる。好ましくは、組織は、足場の少なくとも一部分に結合している。ＴＥＢＶは、対象に直ちに移植することができる。又は代替的に、作製物は、組織試料の生存能を保持するのに有効である滅菌状態の下で、培養することができる。
【００５０】
本発明の別の態様では、細切組織は、２つの異なる細切組織源の利用からなることができる（例えば、１つの表面には刻んだ内皮組織を載せ、別の表面には、刻んだ平滑筋組織を載せることができる）。
【００５１】
一実施形態では、足場、及び細胞、細胞シート、細胞溶解物、細切組織のうち１つ以上からなる組織工学による血管は、生物活性剤と組み合わせることにより増強される。適した生物活性剤には、抗血栓薬、抗炎症薬、免疫抑制剤、免疫調節薬、血管形成促進、抗アポトーシス剤、酸化防止剤、成長因子、血管形成因子、筋再生的な又は筋防護的な薬、培養上清、コラーゲン、アテロコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、インテグリン、グリコサミノグリカン（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸等）、エラスチン、及びフィブリン等の細胞外マトリックスタンパク質、血管内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子、上皮成長因子、繊維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様成長因子、及び形質転換増殖因子等の成長因子及び／又はサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で前述した、細胞からの培養上清は、拒絶又は他の有害な免疫反応を引き起こす可能性がある無傷細胞を導入することなく、細胞によって分泌された有益な栄養の因子を、同種で患者に使用することを可能にする。培養上清は、培地に細胞を培養して、次に培地から細胞を取り除くことによって調製される。ｈＵＴＣを含む細胞集合から調製された培養上清は、そのまま使用する、限外ろ過、凍結乾燥、若しくは更に乾燥すること等によって更に濃縮する、部分的に精製する、製薬上許容できるキャリア、若しくは周知技術の希釈剤と組み合わせてもよく、又は他の生物活性剤と組み合わせてもよい。培養上清は、インビトロ又はインビボで、単独で、又は例えば、自家生細胞又は同種生細胞と組み合わせて、使用してもよい。インビボで導入する場合、培養上清は、治療部位で局所的に導入してもよく、又は患者に必要な細胞の増殖、若しくは栄養の因子を供給するために遠隔で導入してもよい。この同培地は更に、ＴＥＢＶの成熟に使用されてもよい。あるいは、ｈＵＴＣ又は他の細胞の培養上清はまた、ＥＣ及びＳＭＣの両方で播種する前に、足場上に凍結乾燥されてもよい。
【００５３】
製造の観点から、ｈＵＴＣ、他の細胞、又は培養上清は、ＴＥＢＶのインビトロ培養又は作製に要する時間が短縮される可能性がある。これは更に、ＥＣ及びＳＭＣの自家源を作る開始細胞をより少なく使用することになり、より実行可能な選択肢となるであろう。
【００５４】
一実施形態では、足場、及び細胞、細胞シート、細胞溶解物、細切組織のうち１つ以上からなる組織工学による血管は、生物活性剤と組み合わせることにより増強される。これらの組織工学による血管は、バイオリアクタープロセスで又はバイオリアクタープロセスなしで培養されてもよい。ＴＥＢＶ足場は、スピナーフラスコ、回転壁容器（ＲＷＶ）バイオリアクター、灌流ベースのバイオリアクター、又はこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない、様々な細胞培養バイオリアクターを使用して培養されてもよい。一実施形態では、細胞培養バイオリアクターは、回転壁容器（ＲＷＶ）バイオリアクター又は灌流ベースのバイオリアクターである。灌流ベースのバイオリアクターは、ＴＥＢＶ足場を固定する機器からなり、培地が足場の内腔を通って流れることができるようにするであろう。更に足場の内側表面（内腔）と外側表面との両方の上で細胞が播種及び培養できるようにしてもよい。灌流バイオリアクターは更に、移植の前に、細胞播種した足場を条件付けするために拍動流及び様々な圧力を生成する能力を持っていてもよい。バイオリアクタープロセス中の拍動流の圧力（好ましくは１日〜１年間にわたって０．１〜２．５Ｐａ（１〜２５ダイン／ｃｍ２）、より好ましくは２〜４週間にわたって０．１〜２．５Ｐａ（１〜２５ダイン／ｃｍ２）の緩やかな上昇）。
【００５５】
細胞、細胞シート、細胞溶解物、又は細切組織、及び任意に生物活性剤を有する足場は、移植の前に、足場内の細胞の増殖及びマトリックス合成ができるように、より長い期間、例えば１日以上、培養されてもよい。本明細書で上述したように、足場を細胞、細胞シート、細胞溶解物、又は細切組織に当てて、より長期間培養するためにバイオリアクターに移されるか、又はより好ましくは、バイオリアクター内で播種され培養される。更に、１つのバイオリアクターを細胞の初期の播種用に、別のバイオリアクターを長期培養用にするなど、多数のバイオリアクターを順次使用してもよい。
【００５６】
バイオリアクターを使用して、足場で細胞を播種及び培養するプロセスは、多数の細胞型で、平滑筋細胞を一定期間、播種及び培養して、次に内皮細胞を播種及び培養する等の順次に又は同時に（外側表面上で平滑筋細胞及び足場の内側表面（内腔）上で内皮細胞等）繰り返されてもよい。作製物は、成熟を促進するために、一定期間培養されても、培養されなくてもよい。バイオリアクターの条件を、作製物の適切な成熟が促進されるようにコントロールすることができる。培養期間に続いて、作製物は取り外されて、動物又はヒトの脈管部位に移植することができる。
【００５７】
細胞培養の一般的条件は、温度３７℃及び５％ＣＯ２を含む。細胞を播種した作製物は、生理的ｐＨで又はその近傍で保持された緩衝生理食塩溶液で培養される。培地は、代謝性呼吸を支援するために酸素で補充することができる。培地は、標準処方又は作製物中の細胞増殖及び成熟を最適に支援するために変更されたものであってもよい。培地は、緩衝剤、塩類、アミノ酸、グルコース、ビタミン、及び他の細胞の栄養素を含有してもよい。培地は更に、作製物内に内皮細胞及び平滑筋細胞を確立するために選択された成長因子を含有してもよい。それらの例として、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、アンジオスタチン、エンドスタチン、トロンビン、及びアンギオテンシンＩＩが挙げられる。培地は更に、作製物の成熟を促進するために作製物内で灌流されてもよい。これには、作製物が移植されると曝される可能性がある値又は近傍の値の圧力及び流速にて内腔内の流れが含まれてもよい。
【００５８】
培地は、培養される細胞型に特異的である（つまり、内皮細胞には内皮培地、ＳＭＣには平滑筋細胞培地）。特に灌流バイオリアクター用に、ずれ応力（流速に関連した）、酸素分圧、及び圧力等に限定されないが、考慮すべき他の検討事項がある。
【００５９】
ＴＥＢＶは更に、異なる細胞型の付着又は増殖を増強するために、電気的に刺激され得る。電気刺激は、細胞の培養及び増殖中に、ＴＥＢＶの作製の前に、ＴＥＢＶの成熟過程中に、又は移植中に、実施することができる。ｈＵＴＣを含む細胞も、培養上清の生成中に電気的に刺激されてもよい。
【００６０】
本発明は更に、修復を必要とする血管上の位置で上述のＴＥＢＶを挿入することで組織を修復又は再生するための方法を提供する。それらのＴＥＢＶ構造体は特に、２つ以上の異なる種類の組織間での組織の再生に有用である。最も単純な場合の多細胞系には、１つの細胞型を足場の片側に存在させて、もう１つの細胞型をその反対側に存在させることができる。そのような再生の例としては、（ａ）血管の構造体を再生するために、外側に平滑筋を備え、内側に内皮細胞を備えた血管組織があり得る。
【００６１】
本発明は更に、本明細書で説明する方法によって調製されたＴＥＢＶを使用して組織を処置する方法に関する。ＴＥＢＶは、動静脈移植術、冠状動脈移植術、又は抹消動脈移植術で使用することができる。例えば、末期腎不全患者の治療に使用される典型的なＡＶ（動静脈）の外科的処置において、外科医は、前腕の皮膚及び筋肉を介して切開する。動脈及び静脈（通常、橈骨動脈及び腕頭静脈）が選択されて、それぞれが切開される。次に、動脈及び静脈の端部を吻合するのにＴＥＢＶが使用される。それから、筋肉及び皮膚が閉じられる。移植片が適切に治癒した後（４〜６週間）、患者の血液を治療するために、順調にバイパス術を使用することができる。
【００６２】
冠状動脈バイパス（ＣＡＢＧ）処置において、動脈壁が厚くなり、弾力性を失い、石灰化することによって特徴づけられる一般的な動脈障害である動脈硬化症を患う患者に、ＴＥＢＶが使用される。この疾患は、心臓の損傷、脳卒中、心臓発作につながる可能性がある血液供給の減少を引き起こす。典型的なＣＡＢＧ処置では、外科医は胸骨切開術によって開胸を行う。心臓の機能を心肺装置が代行する。病的な動脈を見つけ、ＴＥＢＶの一端を塞栓部を越えた冠動脈に縫いつけ、もう一端を大動脈に取り付ける。心臓が再開されて、胸骨がワイヤーでつなぎ合わされて、切開部が縫合して閉じられる。数週間内に、成功したバイパス処置は完全に治癒し、患者は正常に機能する。
【００６３】
下記の実施例は本発明の原理及び実践の説明のためであり、これらに限定されるものではない。本発明の範囲及び趣旨内の多くの追加の実施形態は、ひとたびこの開示の利益を得ると、当業者に明らかになるであろう。
【実施例】
【００６４】
実施例１．静電紡糸プロセスで作製された生体吸収性ポリマーの管状足場。
ＰＤＯの静電紡糸管
１）高濃度（１４０ｍｇ／ｍＬ）から
１４０ｍｇ／ｍＬのポリ（ｐ−ジオキサノン）（ＰＤＯ）（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）の溶液を、１，１，１，３，３，３−ヘキサフロロ−２−プロパノール（ＨＦＰ，ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）の溶媒で作製した。確実にＰＤＯがすべて溶解して均一溶液を形成するように、溶液を箱（暗室環境）に入れて、攪拌プレート上で一晩放置した。次に、４ｍＬのポリマー溶液を、プラスチック注射器（５ｍＬ）（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に取り込んで、８ｍＬ／時の速度で分注するように、注射器ポンプ（ＫＤ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｏｄｅｌ  １００，Ｈｏｌｌｉｓｏｎ，ＭＡ）に取り付けた。高電圧電源（Ｓｐｅｌｌｍａｎ  ＣＺＥ１０００Ｒ，Ｓｐｅｌｌｍａｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ、ＮＹ）を使用して、溶液を含有する注射器に固定された先端が丸い１８ゲージ針に、＋２５ｋＶの電圧を印加した。針先から２０．３ｃｍ（８インチ）離して配置され、〜４００ｒｐｍの速度で回転する５ｍｍ直径の円筒形の接地したマンドレル上で、溶液を静電紡糸して、ランダム配向したファイバーの足場を作製した。マンドレルの長さに沿って均一の被覆度を確実にするために、１８ｃｍ／秒の平行移動速度で、マンドレルの平行移動距離は１８ｃｍであった。静電紡糸直後に、マンドレル及び足場を、エタノール浴に素早く浸漬させて、足場をマンドレルから注意深くスライドさせて外した。次に、管（内径５ｍｍ、厚さ〜５００マイクロメートル、長さ１０ｃｍ）を、３０分間ドラフトチャンバに入れ、任意の残余のエタノールを蒸発させた。
【００６５】
２）中濃度（１００ｍｇ／ｍＬ）から
１００ｍｇ／ｍＬのＰＤＯの溶液は、ポリマーをＨＦＰの溶媒に入れて、確実にＰＤＯがすべて溶解して均一溶液を形成するように、溶液を暗所で、攪拌プレート上で一晩放置することで作製した。次に、所望量のポリマー溶液を、プラスチック製のＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ注射器に取り込んで、１０ｍＬ／時の速度で分注するように、注射器ポンプに取り付けた。２つの高電圧電源を使用した。１つの高電圧電源は、溶液を含有する注射器に固定された先端が丸い１８ゲージ針に、＋２０ｋＶの電圧を印加するために使用され、もう１つの高電圧電源は、接地したマンドレル（直径２ｍｍ又は５ｍｍ）の後方１５．２ｃｍ（６インチ）に配置された直径１２．７ｃｍ（５インチ）の平たい金属製対象物に−８ｋＶを供給する。接地したマンドレルを、針先から２０．３ｃｍ（８インチ）離して〜４００ｒｐｍの速度で回転させて配置し、ランダム配向したファイバーの足場を作製した。１８ｃｍ／秒の平行移動速度で、マンドレルの平行移動距離は１８ｃｍであった。管状の作製物用に、静電紡糸直後に、マンドレル及び足場をエタノール浴に素早く浸漬させ、管をマンドレルからスライドさせて外し易くした。次に、管を３０分間ドラフトチャンバに入れ、任意の残余のエタノールを蒸発させた。
【００６６】
３）低濃度（６０ｍｇ／ｍＬ）から
６０ｍｇ／ｍＬのＰＤＯの溶液をＨＦＰの溶媒で作製した。確実にＰＤＯがすべて溶解して均一溶液を形成するように、溶液を箱（暗室環境）に入れて、攪拌プレート上で一晩放置した。次に、１５ｍＬのポリマー溶液を、プラスチック製のＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ注射器（３０ｍＬ）に取り込んで、１２ｍＬ／時の速度で分注するように、注射器ポンプに取り付けた。２つの高電圧電源を使用した。１つの高電圧電源は、溶液を含有する注射器に固定された先端が丸い１８ゲージ針に＋２２ｋＶの電圧を印加するために使用され、もう１つの高電圧電源は、接地したマンドレルの後方１５．２ｃｍ（６インチ）に配置された平たい金属製対象物に−１０ｋＶを供給した。ランダム配向したファイバーの足場を作製するために、針先から３０．５ｃｍ（１２インチ）離して配置され、〜４００ｒｐｍの速度で回転する５ｍｍ直径の円筒形の接地したマンドレル上で、溶液を静電紡糸した。１８ｃｍ／秒の平行移動速度で、マンドレルの平行移動距離は１８ｃｍであった。静電紡糸直後に、マンドレル及び足場を、エタノール浴に素早く浸して、足場をマンドレルから注意深くスライドさせて外した。次に、管（内径５ｍｍ、厚さ〜５００マイクロメートル、長さ１０ｃｍ）を、３０分間ドラフトチャンバに入れ、任意の残余のエタノールを蒸発させた。
【００６７】
８５／１５  ＰＬＧＡの静電紡糸管
１）高濃度（１２０ｍｇ／ｍＬ）から
８５／１５のラクチド対グリコリドのモルパーセント比を有する１２０ｍｇ／ｍＬのポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（Ｐｕｒａｃ，Ｌｉｎｏｌｎｓｈｉｒｅ，ＩＬ）の溶液（８５／１５  ＰＬＧＡ）をＨＦＰの溶媒で作製した。確実に８５／１５  ＰＬＧＡがすべて溶解して均一溶液を形成するように、溶液を箱（暗室環境）に入れて、攪拌プレート上で一晩放置した。次に、１５ｍＬのポリマー溶液を、プラスチック製のＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ注射器（５ｍＬ）に取り込んで、８ｍＬ／時の速度で分注するように、注射器ポンプに取り付けた。２つの高電圧電源を使用した。１つの高電圧電源は、溶液を含有する注射器に固定された先端が丸い１８ゲージ針に、＋２２ｋＶの電圧を印加するために使用され、もう１つの高電圧電源は、接地したマンドレルの後方１５．２ｃｍ（６インチ）に配置された平たい金属製対象物に−１０ｋＶを供給した。針先から２０．３ｃｍ（８インチ）離して配置され、〜４００ｒｐｍの速度で回転する５ｍｍ直径の円筒形の接地したマンドレル上で、溶液を静電紡糸して、ランダム配向したファイバーの足場を作製した。１８ｃｍ／秒の平行移動速度で、マンドレルの平行移動距離は１８ｃｍであった。静電紡糸の前に、マンドレルを、アルミホイルの小切片で包み、管を取り出し易くした。静電紡糸が完了次第、アルミホイルのライナーをマンドレルからスライドさせて外し、管（内径５ｍｍ、厚さ〜５００マイクロメートル、長さ１０ｃｍ）の内部から注意深く取り出した。
【００６８】
２）低濃度（５０ｍｇ／ｍＬ）から
８５／１５ＰＬＧＡの５０ｍｇ／ｍＬの溶液をＨＦＰの溶媒で作製した。確実に８５／１５ＰＬＧＡがすべて溶解して均一溶液を形成するように、溶液を箱（暗室環境）に入れて、攪拌プレート上で一晩放置した。次に、１５ｍＬのポリマー溶液を、プラスチック製のＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ注射器（３０ｍＬ）に取り込んで、注射器ポンプに取り付け、１２ｍＬ／時の速度で分注した。２つの高電圧電源を使用した。１つの高電圧電源は、溶液を含有する注射器に固定された先端が丸い１８ゲージ針に、＋２２ｋＶの電圧を印加するために使用され、もう１つの高電圧電源は、接地したマンドレルの後方１５．２ｃｍ（６インチ）に配置された平たい金属製対象物に−５ｋＶを供給した。針先から２０．３ｃｍ（８インチ）離して配置され、〜４００ｒｐｍの速度で回転する５ｍｍ直径の円筒形の接地したマンドレル上で、溶液を静電紡糸して、ランダム配向したファイバーの足場を作製した。マンドレルの平行移動速度を１８ｃｍ／秒に設定した。静電紡糸の前に、マンドレルをアルミホイルの小切片で包み、管を取り出し易くした。静電紡糸が完了次第、アルミホイルのライナーをマンドレルからスライドさせて外し、管（内径５ｍｍ、厚さ〜５００マイクロメートル、長さ１０ｃｍ）の内部から注意深く取り出した。
【００６９】
実施例２．静電紡糸プロセスで作製された生体吸収性ポリマー及びコラーゲンの管状足場
１）コラーゲン静電紡糸管
コラーゲン（牛コラーゲンタイプＩ、Ｋｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）をＨＦＰで１２０ｍｇ／ｍＬの濃度で静電紡糸した。確実にコラーゲンがすべて溶解するように、コラーゲンの溶液を混ぜて、攪拌プレート上に置いた暗箱の中に一晩静置した。コラーゲン管用に、少量（マンドレル径に応じて０．２〜０．５ｍＬ）のコラーゲン溶液を１ｍＬのＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ注射器に取り込んで、管が取り外し易いように回転するマンドレル上で静電紡糸した。このコラーゲンの予備的なコーティングは、３ｍＬ／時の速度で、尖っていない１８ゲージの注射針を通して分注した。２つの高電圧電源が、針先、及びマンドレル（直径２又は５ｍｍ）の１５．２（６インチ）後方に配置された直径１２．７（５インチ）の後部対象物に接続されて、それぞれ＋２５ｋｖ及び−１０ｋｖに設定される。接地したマンドレルを、荷電した針先から２０．３ｃｍ（８インチ）離して〜４００ｒｐｍの速度で回転させて配置し、ランダム配向したファイバーの足場を作製した。１８ｃｍ／秒の平行移動速度で、マンドレルの平行移動距離は１８ｃｍであった。コラーゲンの予備的な犠牲層が完成次第、最初の注射器を処分して、所望量のコラーゲン溶液を含有する新しい注射器を注射器ポンプに取り付けた。この溶液を、犠牲層と同じパラメータを使用して静電紡糸した。静電紡糸プロセスが完了次第、マンドレルを静電紡糸チャンバから取り出して、移植片を、マンドレルから注意深くスライドさせて外した。このプロセス中に、まだマンドレル上にあるコラーゲンの薄層を残したまま、最初の層が移植片から引きはがされる。
【００７０】
２）ＰＤＯ及びコラーゲンの静電紡糸管
５０：５０のＰＤＯ：コラーゲンの足場は、５０：５０の容量比の１００ｍｇ／ｍＬのＰＤＯ及び１２０ｍｇ／ｍＬのコラーゲン（牛コラーゲンタイプＩ、Ｋｅｎｓｅｙ  Ｎａｓｈ，Ｅｘｔｏｎ，ＰＡ）溶液からなる足場である。ＨＦＰ溶液に入ったポリマーを攪拌プレート上に置いた暗箱の中に一晩入れておくことで、ポリマーを個別に静電紡糸した条件と同じ条件下で、２つのポリマー溶液を、別々のシンチレーションバイアルに作製した。ポリマーが完全に溶解した時点で、等量の２つの溶液を、新しい１本のシンチレーションバイアルに混ぜ合わせて、３０秒間ボルテックスして、攪拌器に置いた。２つの溶液を混合している間、純粋なコラーゲン管を静電紡糸するために、上述のプロトコルと同一のプロセスを用いて、少量の純粋コラーゲン溶液を、犠牲層として機能するように、接地したマンドレル上で静電紡糸した。コラーゲンの予備層が静電紡糸した時点で、所望する量の混合したＰＤＯ：コラーゲンの溶液を、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ注射器に取り込んで、管が取り外し易いように回転するマンドレル（直径２又は５ｍｍ）上で静電紡糸した。コラーゲンの予備的な犠牲層が完成次第、最初の注射器を処分して、所望量のコラーゲン溶液を含有する新しい注射器を注射器ポンプに取り付けた。この溶液を、実施例２のパート１で説明するように、犠牲層と同じパラメータを使用して静電紡糸した。
【００７１】
３）コラーゲン及びＰＤＯ：コラーゲンのＥＳＳ管を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）で架橋させる
純粋なコラーゲンの足場、並びに実施例２のパート２及び３で調製されたＰＤＯ及びコラーゲンの配合物を、純粋なエタノール中で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を使用して、架橋させた。試料を４０ｍＭ（ＨＦＰ中のコラーゲンのモル濃度の５０倍）のＥＤＣ溶液をエタノール中に１８時間浸漬し、続いて、未反応のＯ−イソアシルウレア（isoacylurea）中間体を加水分解するために、２時間０．１Ｍのリン酸二ナトリウム溶液で濯いだ。架橋させた後に、試料を脱イオン水で濯いで、冷凍し、一晩凍結乾燥して、任意の残留水分を取り除いた。
【００７２】
実施例３．静電紡糸プロセスによって作製した生体吸収性ポリマーのＰＤＯシート足場
１００ｍｇ／ｍＬのＰＤＯの溶液を、ポリマーをＨＦＰの溶媒に入れ、確実にＰＤＯがすべて溶解して均一溶液を形成するように、溶液を暗箱に入れて、攪拌プレート上で一晩放置することで作製した。次に、所望量のポリマー溶液を、プラスチック製のＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ注射器に取り込んで、１０ｍＬ／時の速度で分注するように、注射器ポンプに取り付けた。２つの高電圧電源を使用した。１つの高電圧電源は、溶液を含有する注射器に固定された先端が丸い１８ゲージ針に、＋２０ｋＶの電圧を印加するために使用され、もう１つの高電圧電源は、接地したマンドレル（直径２．５ｃｍ）の後方１５．２ｃｍ（６インチ）に配置された金属製対象物に−８ｋＶを供給する。接地したマンドレルを、針先から２０．３ｃｍ（８インチ）離して〜４００ｒｐｍの速度で回転させて配置し、ランダム配向したファイバーの足場を作製した。１８ｃｍ／秒の平行移動速度で、マンドレルの平行移動距離は１８ｃｍであった。静電紡糸直後に、マンドレル及び足場をエタノール浴に素早く浸し、管をマンドレルからスライドさせて外し易くした。シートを形成するために管を切断し、次に３０分間ドラフトチャンバに入れて、任意の残余のエタノールを蒸発させた。
【００７３】
実施例４．静電紡糸プロセスによって作製された生体吸収性ポリマー及びコラーゲンの５０：５０のＰＤＯ：コラーゲンシートの足場
５０：５０のＰＤＯ：コラーゲンの足場は、５０：５０の容量比の１００ｍｇ／ｍＬのＰＤＯ及び１２０ｍｇ／ｍＬのコラーゲン溶液からなる足場であり、実施例３で説明するプロセスで作製された。
【００７４】
５０：５０  ＰＤＳ：コラーゲンシートを、次に純粋なエタノール中で１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を使用して架橋させた。試料を４０ｍＭ（ＨＦＰ中のコラーゲンのモル濃度の５０倍）のＥＤＣ溶液をエタノール中に１８時間浸漬して、続いて、０．１Ｍのリン酸二ナトリウム溶液で２時間濯ぎ、未反応のＯ−イソアシルウレア（isoacylurea）中間体を加水分解した。架橋させた後に、試料を脱イオン水で濯いで冷凍し、一晩凍結乾燥して、任意の残留水分を取り除いた。
【００７５】
実施例５．凍結乾燥プロセスで作製された生体吸収性ポリマーの管状足場
１）３５／６５ポリ（カプロラクトン−コ−グリコリド）（３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡ）凍結乾燥した管（１，４−ジオキサンに１０重量％溶液）
この実施例は、栄養素の輸送及び組織再生誘導法の経路を提供することになる多孔構造を含有する管の作製を説明する。したがって、１０％重量／重量のポリマー溶液を、１部の３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡ（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を、９部の１，４−ジオキサン溶媒で溶解することで調製した。溶液を、磁気撹拌棒を用いてフラスコ内で調製した。コポリマーを完全に溶解するために、混合液を、穏やかに６０℃まで加熱して、一晩連続的に撹拌した。次に、超荒目のフィルター（商標Ｐｙｒｅｘのフリットディスク付き抽出円筒ろ紙）で溶液をろ過することで、透明の均一溶液を得た。
【００７６】
次に、ポリマー溶液から管を形成するために、凍結乾燥器（ＤＵＲＡ−ＳＴＯＰ，ＦＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｏｎｅ  Ｒｉｄｇｅ，ＮＹ）を使用した。凍結乾燥器を起動させて、棚チャンバをおよそ３０分間−１７℃に保持した。棚の温度をモニターするための熱電対を取り付けてモニターした。工程Ａで調製した均一ポリマー溶液を、１ｍＬのＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）注射器の筒と１ｍＬのＢＤ注射器のピストン棒との間の隙間に注ぐことで、注射器を管形成の金型として使用した。金型を−１７℃に保持した凍結乾燥器に入れた（予冷却）。凍結乾燥サイクルを開始して、棚の温度を１５分間−１７℃に維持し、次に１２０分間−１５℃に維持した。昇華によってジオキサンの乾燥を起こさせるために減圧した。棚の温度を−５℃に上げて、６０分間その温度を維持した。棚の温度を５℃に上げて、６０分維持した。棚の温度を、再び２０℃に上げて、６０分にその温度を維持した。第２の乾燥工程を開始して、棚の温度を２０℃で更に１２０分間維持した。第２の工程の終了時に、凍結乾燥器を室温及び気圧に戻した。薄い足場を、注射器のピストン棒から取り外した。
【００７７】
２）３５／６５ポリ（カプロラクトン−コ−グリコリド）（３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡ）凍結乾燥した管（１，４−ジオキサンに５重量％溶液）
この実施例は、栄養素の輸送及び組織再生誘導法の経路を提供することになる多孔構造を含有する管の作製を説明する。したがって、５％重量／重量のポリマー溶液を、１部の３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡを、９部の１，４−ジオキサンで溶解することで調製した。溶液を、磁気撹拌棒を用いてフラスコ内で調製した。コポリマーを完全に溶解するために、混合液を穏やかに６０℃まで加熱して、一晩連続的に撹拌した。次に、超荒目のフィルター（商標Ｐｙｒｅｘのフリットディスク付き抽出円筒ろ紙）で溶液をろ過することで、透明の均一溶液を得た。
【００７８】
次に、凍結乾燥器（ＤＵＲＡ−ＳＴＯＰ，ＦＴＳ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔｏｎｅ  Ｒｉｄｇｅ，ＮＹ）を使用し、ポリマー溶液から管を形成した。凍結乾燥器を起動させて、棚チャンバをおよそ３０分間−１７℃に保持した。棚の温度をモニターするための熱電対を取り付けてモニターした。工程Ａで調製した均一ポリマー溶液を、１ｍＬのＢＤ注射器の筒と１ｍＬのＢＤ注射器のピストン棒との間の隙間に注ぐことで、注射器を管形成の金型として使用した。金型を−１７℃に保持した凍結乾燥器に入れた（予冷却）。凍結乾燥サイクルを開始して、棚の温度を１５分間−１７℃に維持し、次に１２０分間−１５℃に維持した。昇華によってジオキサンの乾燥を起こさせるために減圧した。棚の温度を−５℃に上げて、６０分間その温度を維持した。棚の温度を５℃に上げて、６０分間維持した。棚の温度を、再び２０℃に上げて、６０分間その温度を維持した。第２の乾燥工程を開始して、棚の温度を更に１２０分間２０℃に維持した。第２の工程の終了時に、凍結乾燥器を室温及び気圧に戻した。薄い足場を、注射器のピストン棒から取り外した。
【００７９】
実施例６．ポリ（ラクチド）及びポリ（グリコリド）不織布管の調製
長さおよそ５０ｍｍ、内径およそ４ｍｍ、壁厚およそ０．５〜１．０ｍｍの不織布管を、様々な生体再吸収性フィラメントから作製した。具体的には、フィラメントは、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＧＡ）及び９０：１０（９０／１０  ＰＧＡ／ＰＬＡ）のモル比でＰＧＡとＰＬＡとのコポリマーからなる。これらの試料は、乾燥不織布の一般技術を使用し、まず直径およそ２０マイクロメートル、及び長さおよそ５０ｍｍのフィラメントから不織布のバットを製造することで作製した。次に、このバットをマンドレルを使用して、ニードルパンチ技法で統合した。
【００８０】
実施例７．コラーゲンをコーティングした吸収性のある合成の組織工学による管状足場の調整
高純度アテロコラーゲン（Ｃｏｌｂａｒ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｃｏ．，Ｉｓｒａｅｌ）を組織工学による管状足場をコーティングするために使用して、実施例１〜６及び８〜１１で説明するように調製した。組織工学による管状足場（実施例１、パート２）をマンドレル上に置いて、１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを含有する１０ｍＭのＨＣｌ溶液に浸した。組織工学による管状足場を、室温で３０分間コラーゲン溶液に浸漬した。組織工学による管状足場を溶液から取り出して、８時間室温で乾燥した。
【００８１】
実施例８．細胞を含まない網マトリックスがコーティングされた組織工学による管状足場の調製
ブタの網を収集後に、０．９％の生理食塩水に入れた。血液及び他の外来の細塵を洗い流すために、生理食塩水で３回濯いだ後、網を３０分間７０％エタノールに入れる。７０％エタノールによる処理の後、新しいエタノールに２回交換しながら３０分間１００％エタノールで組織を脱水した。次に、組織を、６０分ごとに新鮮なアセトン溶液を使用しながら、１８０分間アセトン溶液に移した。続いて、脂質を取り除くために、組織を６０分間５０：５０アセトン−ヘキサン混合液に入れた後、２４〜４８時間２０：８０アセトン−ヘキサン混合液に入れた（新しい溶液に３回交換）。次に、組織を、３０分間１００％エタノールに移し、続いて、脱細胞化プロセスを開始するまで４℃で保存が可能な場合は、必要に応じて、７０％エタノールに移す。次に、組織を、３０分間ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（１％ｗ／Ｖ；非イオン性界面活性剤）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＮＪ）及び５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）に溶解したＭｇＣｌ２（１％）を含む脱細胞化緩衝液に浸した。続いて、脱細胞化緩衝液で混合したエンドヌクレアーゼ（ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ；４１．８Ｕ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＮＪ）を含む酵素溶液で処理する。組織を２０時間この溶液中で回転する。次に、組織を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１％（Ｗ／Ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含む溶液で、２回（それぞれ２時間）洗浄する。次に、組織を、１時間１ＭのＮａＣｌ、２０ｍｍのＥＤＴＡ、０．２％（Ｗ／Ｖ）のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００ｐＨ７．０を含む細胞抽出溶液に入れてから、超純水で洗浄する（４回、それぞれ５分間）。組織を、水で洗浄（４回、それぞれ２０分）した後、１時間、０．１５％の過酢酸（又は酢酸）の入った８０：２０水：エタノール（標準強度２００）を含む消毒液に移して、組織を４℃の７０％アルコールで保存する。
【００８２】
細胞を含まない網を空気乾燥させて、次に極低温で粉末に粉砕する。次に、粉末を５ｍｇ／ｍＬの濃度で１０ｍＭのＨＣｌに散布する。実施例１〜６及び９〜１１で説明する組織工学による管状足場を、マンドレル上に置いて細胞を含まない網の懸濁液に浸して、２４時間−２０℃で凍結乾燥によって乾燥させる。含浸させた組織工学による管状足場上の網マトリックスは、次に、一晩真空下１２０℃で加熱脱水によって架橋させる。
【００８３】
実施例９．ＰＣＬ／ＰＧＡフィルム上の細胞シートの生成
この実施例は、フィルム上でヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）からなる細胞シートの生成を説明する。これらのシートを次に、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のみからなるＴＥＢＶにつながる管状構造体に作製することができる。細胞シートを得るために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＰＣＬ／ＰＧＡフィルム上に播種した。これを行うために、２．５ｍＬのポリマー溶液（ジオキサンに４５／５５のＰＣＬ／ＰＧＡ  １０％（ｗ／ｗ）、又はジオキサンに３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡ  １０％（ｗ／ｗ））を６０ｍｍの培養皿上に加えることで、フィルムをキャストした。キャストした後、フィルムをエタノールで洗浄して滅菌し、空気乾燥させた。ＨＵＶＥＣはトリプシン処理によって収集され、Ｇｕａｖａ製装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を使用して計数した。細胞を、５０００個細胞／ｃｍ２の密度（１４１，３５０個細胞／６０ｍｍの皿）でフィルム上に播種させて、次に９日間３７℃のインキュベーターに入れた。細胞を、顕微鏡で又はカルセイン染色によって視覚化した。ＨＵＶＥＣ細胞を、細胞シートを提供するポリ（カプロラクトン−コ−グリコリド３５／６５モル−モル％）（３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡ）フィルム、又はポリ（カプロラクトン−コ−グリコリド４５／５５モル−モル％）（４５／５５のＰＣＬ／ＰＧＡ）フィルム上でコンフルエントな層に達するまで増殖させた。顕微鏡画像で、細胞のコンフルエントな単層が確認された。カルセイン染色は、細胞が９日目に、死細胞がほとんど又はまったく認められずに、付着して増殖したことを示した。
【００８４】
シートは巻いて管にして作製物を形成し、単独で組織工学による血管として使用する、又は実施例１〜８若しくは１１で説明する足場等の機械的なストラットと組み合わせて使用することができる。同様の方法（実施例１８及び１９を参照）によって、細胞シートは、直接管に形成することができる。
【００８５】
実施例１０．ＰＣＬ／ＰＧＡフィルム上の細胞シートの生成
この実施例は、フィルム上でヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）からなる細胞シートの生成を説明する。ヒト臍帯組織由来細胞は、米国特許第７５１０８７３号で説明される方法によって得られ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらのシートを、ｈＵＴＣのみからなるＴＥＢＶにつながる管状構造体に作製する。細胞シートを得るために、ｈＵＴＣをＰＣＬ／ＰＧＡフィルム上に播種する。これを行うために、２．５ｍＬのポリマー溶液を６０ｍｍの培養皿上に加えることで、フィルムをキャストする。キャストした後、フィルムをエタノールで洗浄して滅菌し、空気乾燥させる。ｈＵＴＣをトリプシン処理によって収集し、Ｇｕａｖａ製装置を使用して計数する。細胞を、５０００個細胞／ｃｍ２の密度（１４１，３５０個細胞／６０ｍｍの皿）でフィルム上に播種させて、次に３７℃のインキュベーターに入れる。細胞は、顕微鏡で又はカルセイン染色によって視覚化される。ｈＵＴＣ及びポリ（カプロラクトン−コ−グリコリド３５／６５モル−モル％）（３５／６５のＰＣＬ／ＰＧＡ）フィルム、又はポリ（カプロラクトン−コ−グリコリド４５／５５モル−モル％）（４５／５５のＰＣＬ／ＰＧＡ）フィルムからなる細胞シートが調製される。
【００８６】
シートは巻いて管にして作製物を形成し、単独で組織工学による血管として使用する、又は実施例１〜８若しくは１１で説明する足場等の機械的なストラットと組み合わせて使用することができる。同様の方法（実施例１８及び１９を参照）によって、細胞シートは、直接管に形成することができる。
【００８７】
実施例１１．凍結乾燥、脱細胞化した細胞シート
この実施例は、ＴＥＢＶを作製するために、凍結乾燥又は脱細胞化した細胞シートの使用に関する。細胞シートはインビトロで生成され、次に凍結乾燥又は脱細胞化される。必要に応じて、必要な型の細胞シートが解凍され、次に管状構造体に形成されてＴＥＢＶを作製することができる。一方で脱細胞化した細胞シートは、栄養の因子の支援又は細胞外マトリックスタンパク質を供給することによってＴＥＢＶの構成体を増強するために、他の細胞シートの回りに巻くことができる。
【００８８】
細胞シートは、実施例９、１０及び１７のとおりに生成される。細胞シートを得る代わりの方法には、脱細胞化した網上に細胞を培養する（実施例８）、組織培養したプラスチック上に細胞を培養する、又は熱応答性皿上に細胞を培養する（ＣｅｌｌＳｅｅｄ，Ｉｎｃ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）が挙げられるであろう。細胞シートを得るために使用する細胞型には、内皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、又はｈＵＴＣが挙げられるであろう。単層が達成されるまで、細胞は培養を保持される。得られた細胞シートは、次に低温保存、及び続いて凍結乾燥（Ｃｏｒｅ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ，ＮＹ）することによって冷凍保存法用に処理される。
【００８９】
実施例１２．ＰＤＯのＥＳＳ足場上のヒト臍帯組織由来細胞の付着及び増殖
この実施例は、組織工学による血管（ＴＥＢＶ）を作製するための、ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）の使用に関する。ＴＥＢＶは、ヒト臍帯組織由来細胞で血管移植片又は足場材料を播種することによって生成することができる。ＴＥＢＶ上にｈＵＴＣを播種することは、インビトロで播種した時、又は移植後の血管移植片上で播種した時、内皮（endothelian）細胞（ＥＣ）、及び平滑筋細胞（ＳＭＣ）の播種、付着、増殖が増強されるであろうことが想定される。ｈＵＴＣは更に、浸潤、及びそれに続くＥＣ又はＳＭＣの前駆細胞の移植片作製物への分化を促進する可能性がある。これは、栄養の支援を提供すること又はＥＣＭタンパク質の発現を提供することによって、インビボに移植中に、ＴＥＢＶの成熟及び生着を促進する可能性がある。
【００９０】
ＰＤＯ及びＰＤＯ／コラーゲン（５０／５０、架橋した）（実施例１及び２）ＥＳＳ足場上のｈＵＴＣの付着及び増殖が評価された。足場材料から直径５ｍｍのパンチ生検を行い、完全増殖培地中であらかじめ湿らせておいた。ｈＵＴＣを、次にトリプシン処理して、計数し、２００，０００個細胞／ｍＬの濃度で完全増殖培地に再懸濁させた。足場パンチを９６ウェルの低クラスタープレートに入れて、１００マイクロリットルの細胞懸濁液（２０，０００個細胞／パンチ）で播種した。細胞を３時間３７℃で付着させて、次に足場を１ｍＬの完全増殖培地を含有する２４ウェルの超低クラスタープレートに移した。足場は、３日後に中程度の変更があり、７日間培養させた。
【００９１】
播種後３日目及び７日目に、足場を１ｍＬの無血清ＤＭＥＭを含有する新しい低クラスターの２４ウェル皿に移した。次に、足場を追加の１ｍＬの無血清ＤＭＥＭで洗浄した。２ミクロモルのカルセインＡＭ及び４ミクロモルのエチジウム（ethidum）ホモ二量体を含有する生／死染色原液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を調製して、０．５ｍＬをそれぞれのウェルに加えた。室温で５分間インキュベートした後、細胞の付着及び細胞の生存能を蛍光顕微鏡で評価した。
【００９２】
結果：ＴＥＢＶの足場上にｈＵＴＣは付着して増殖していた。ＰＤＯ／コラーゲンのＥＳＳ足場は、ＰＤＯ−ＥＳＳ足場と比較して、３日目〜７日目に細胞数により著しい増加を示した（図１）。
【００９３】
実施例１３．ＰＤＯのＥＳＳ足場上のヒト臍帯動脈平滑筋細胞（ＵＡＳＭＣ）及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の付着及び増殖
ＰＤＯのＥＳＳ足場（１００ｍｇ／ｍＬ及び１４０ｍｇ／ｍＬ、実施例１）上の、ヒト臍帯動脈平滑筋細胞（ＵＡＳＭＣ）及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の付着及び増殖を評価した。ＵＡＳＭＣ（Ｌｏｎｚａ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）、及びＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ  Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）をＰＤＯのＥＳＳ足場上に播種させて、特定の時点（３日目及び７日目）に、それぞれの表面上の細胞の増殖を、生／死染色によって生存能について評価した。
【００９４】
滅菌済みのＰＤＯ足場（５ｍｍの生検パンチ）を空の低クラスターの９６ウェル皿に入れて、ＰＢＳで洗浄し、次に細胞をトリプシン処理する間、適切な培地（ＨＵＶＥＣにはＥＧＭ−２、及びＵＡＳＭＣにはＳｍＧＭ）に浸漬した。ＵＡＳＭＣ及びＨＵＶＥＣは、トリプシン処理によって収集され、計数されて、５×１０５個細胞／ｍＬの最終濃度にＳｍＧＭ培地（ＵＡＳＭＣ）又はＥＧＭ−２培地（ＨＵＶＥＣ）に再懸濁させた。１００マイクロリットル（５０，０００個細胞）のこの原液細胞懸濁液を足場上に分注して、細胞を３時間３７℃のインキュベーターで付着させた。次に足場を、該当する培地１ｍＬを含有する２４ウェル皿に移して、３日間及び７日間培養した。
【００９５】
足場を、１ｍＬの無血清ＤＭＥＭを含有する新しい低クラスターの２４ウェル皿に移した。次に、移植片材料を追加の１ｍＬ無血清ＤＭＥＭで洗浄した。２ミクロモルのカルセインＡＭ及び４ミクロモルのエチジウム（ethidum）ホモ二量体を含有する生／死染色の原液を無血清ＤＭＥＭ調製して、０．５ｍＬをそれぞれのウェルに加えた。室温で５分間インキュベートした後、細胞の付着及び細胞の生存能を蛍光顕微鏡で評価した。
【００９６】
結果：試料はすべて、７日の培養期間にわたって細胞の付着及び増殖を示した（図２及び３）。内皮細胞は、足場の表面上に完全な単層を形成した。１００ｍｇ／ｍＬのＰＤＯ足場が、３日目に付着した細胞の高い数、及び７日目に細胞数の増加があり、最も良好な結果を示した。１４０ｍｇ／ｍＬのＰＤＯ足場は、３日目に付着した細胞の高い数を示したが、７日目までの細胞の増加は、１００ｍｇ／ｍＬの足場ほど著しくなかった。
【００９７】
実施例１４．ＨＵＶＥＣの増殖及び移動に対するｈＵＴＣの影響
この実施例は、組織工学による血管移植片（ＴＥＢＶ）を作製するための、ヒト臍帯組織由来細胞（ｈＵＴＣ）の使用に関する。ＴＥＢＶは、ヒト内皮細胞（ＥＣ）及びヒト平滑筋細胞（ＳＭＣ）で血管移植片又は足場材料を播種することによって生成することができる。ｈＵＴＣは、血管移植片上のＥＣ及びＳＭＣの播種、付着、増殖が増強されるであろうことが想定される。ｈＵＴＣは更に、移植片作製物中のＥＣ、ＳＭＣ又は前駆細胞の分化を促進する可能性がある。これは、インビトロ培養中のＴＥＢＶの成熟、並びにインビボ移植中の生着を促進する可能性がある。ｈＵＴＣは、栄養の補助を提供する可能性、又はＥＣＭタンパク質の発現を提供及び増強する可能性がある。
【００９８】
原理の証拠として、ＨＵＶＥＣの増殖及び移動に対するｈＵＴＣの影響をインビトロで評価する。増殖に関する試験として、ｈＵＴＣ（ロット番号１２０３０４）の影響の試験を行い、キラー細胞として異なる血管床からの３種類の内皮細胞を使用した（ヒト臍帯静脈内皮細胞［ＨＵＶＥＣ］ヒト冠状動脈内皮細胞［ＨＣＡＥＣ］、ヒト腸骨動脈内皮細胞［ＨＩＡＥＣ］）。ｈＵＴＣでの共培養は、内皮細胞の増殖の増強が見られた。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）又は繊維芽細胞での共培養は、培地対照に匹敵する細胞数が見られた（表１）。
【００９９】
移動は、トランスウエルの下側にある細胞数を計数することで定量化した。ＨＵＶＥＣ及びＨＣＡＥＣの両方をキラー細胞として使用した。増殖に関する試験とは異なり、これらの細胞の移動反応はわずかに異なる。ＨＵＴＣ（ロット番号１２０３０４）は、ＨＵＶＥＣ及びＨＣＡＥＣの両方の移動を誘発した。ＭＳＣは、ＨＵＶＥＣの移動を誘発せず、ｈＵＴＣに対するこの反応の特異性を示唆している（表２）。
【表２】
2011519616.tif 000004
【０１００】
表１内皮細胞の増殖に対するｈＵＴＣ（ロット番号１２０３０４）、ＭＳＣ、及び繊維芽細胞の影響共培養の培地（Ｈａｙｆｌｉｃｋ  ８０％及びＥＧＭ−２ＭＶ  ２０％又はＨａｙｆｌｉｃｋ  ５０％及びＥＧＭ−２ＭＶ  ５０％）に、内皮細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞、ヒト腸骨動脈内皮細胞、ヒト冠状動脈内皮細胞）は、５０００個細胞／ｃｍ２（１０，０００個細胞／ウェル）の密度で２４ウェルの組織培養皿の底部に播種させて、ｈＵＴＣ（ロット番号１２０３０４）、ＭＳＣ、又は繊維芽細胞は、５０００個細胞／ｃｍ２（１，６５０個細胞／インサート）の密度で、トランスウエルインサートの内側に播種させた。７日間の共培養の後、細胞を収集して、Ｇｕａｖａ製装置を使用して計数した。更に内皮細胞を陽性対照として、ＥＧＭ−２ＭＶ培地中に保持した。
【表３】
2011519616.tif 000005
【０１０１】
表２内皮細胞の移動に対するｈＵＴＣ及びＭＳＣの影響共培養の培地（Ｈａｙｆｌｉｃｋ  ５０％及びＥＧＭ−２ＭＶ  ５０％）に、ＨＵＶＥＣ又はＨＣＡＥＣは、５０００個細胞／ｃｍ２（２３，０００個細胞／インサート）の密度でトランスウエルインサートの内側に播種させて、ｈＵＴＣ（ロット番号１２０３０４）又はＭＳＣは、６ウェルの組織培養皿の底部に、５０００個細胞／ｃｍ２（４８，０００個細胞／ウェル）の密度で、播種させた。７日間の共培養の後、トランスウエルインサートの下側にあった細胞を収集して、Ｇｕａｖａ製装置を使用して計数した。更に内皮細胞を、対照としてＥＧＭ−２ＭＶ培地中に保持した。
【０１０２】
実施例１５．細胞溶解物で増強した生検パンチの調製
この実施例で、ｈＵＴＣを、凍結解凍サイクルを繰り返すことにより、拡大培養し、収集し、溶解して、実施例１〜１１の生体吸収性足場に適用して、凍結乾燥した。細胞溶解物で増強した足場は、それ自体で、細胞を播種させて（実施例１６及び１７のとおり）、又は細切組織（実施例２５）として、移植することができ、組織工学による血管を作製するために培養することができる。
【０１０３】
臍帯分娩後細胞ｈＵＴＣ（継代１１、ロット１２０３０４）をＴ２２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（ＣＯＲＮＩＮＧ、カタログ番号４３１０８２、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中に、５，０００個細胞／平方センチメートルで、ＤＭＥＭ−低グルコース（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１１０５４  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１５％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ  カタログ番号ＳＨ３００７０−０３  Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５０７０）の完全増殖培地で培養した。細胞をおよそ２５，０００個細胞／ｃｍ２に拡大した後に、細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（ＧＩＢＣＯ  ｃａｔ  Ｎｏ１２５６３）で収集し、５０ｍＬの円錐管に採取して、５分間３００ｒｃｆで遠心分離機にかけて、上澄みを取り除いた。細胞ペレットをＰＢＳで３回洗浄して、次に全容積１４ｍＬを１×１０７細胞／ｍＬでＰＢＳに再懸濁させた。この溶液を液体窒素で急速冷凍して、３７℃の水浴中で解凍し、細胞の残屑を除去するために遠心分離機にかけて、得られた上澄み（１０ｍＬ）を移して保存した。残りの材料もまた、上述のように、急速冷凍、解凍、及び遠心分離機にかけた。上澄み（２ｍＬ）を移して保存した。２つの上澄みのタンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ＰＢＳ中に希釈された試料を測定することにより判定した。第１の溶解物上澄み（ロット番号０８２９０８）の濃度は、５．２ｍｇ／ｍＬ（ロット番号０８２９０８低）、及び第２の溶解物上澄みは１８ｍｇ／ｍＬ（ロット番号０８２９０８高）であった。
【０１０４】
直径５ｍｍの生検パンチを、ＰＤＯ−ＥＳＳ足場シート（実施例３）から得た。これらの足場を９６ウェルの超低クラスタープレート（ＣＯＳＴＡＲ、カタログ番号３４７４、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に入れて、２５マイクロリットルの細胞溶解物を、５．２ｍｇ／ｍＬ（低）又は１８ｍｇ／ｍＬ（高）のタンパク質濃度で、それぞれのディスクに添加した。次に、足場パンチは水分を取り除くために、４８時間凍結乾燥した。
【０１０５】
細胞の付着：溶解物で増強した足場を、９６ウェルの低クラスタープレートに入れて、２５マイクロリットルのＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で再水和させた。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をトリプシン処理（tyrpisinized）して、計数し、５００，０００個細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。それぞれの足場を、１００マイクロリットルのこの細胞懸濁液（５０，０００個細胞）で播種して、細胞を３時間３７℃で付着させた。この付着期間の後、足場を１ｍＬのＥＧＭ−２培地を含有する２４ウェルの低クラスタープレートに移した。足場を３及び７日間培養した。
【０１０６】
播種後３日目と７日目に、足場を、生／死染色を使用して細胞の付着の分析を行い、細胞ＤＮＡを測定するために、ＣｙＱｕａｎｔアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞数の分析を行った。生／死染色用に、足場を、１ｍＬの無血清ＤＭＥＭを含有する新しい低クラスターの２４ウェル皿に移した。次に、足場を追加の１ｍＬの無血清ＤＭＥＭで洗浄した。２ミクロモルのカルセインＡＭ及び４ミクロモルのエチジウム（ethidum）ホモ二量体を含有する生／死染色原液を調製して、０．５ｍＬをそれぞれのウェルに加えた。室温で５分間インキュベートした後、細胞の付着及び細胞の生存能を蛍光顕微鏡で評価した。
【０１０７】
細胞ＤＮＡの測定用に、足場をＰＢＳで洗浄して、次に微量遠心チューブで１５０マイクロリットルのＰＢＳ中に冷凍した。次に、足場を凍結乾燥で乾燥させて、１５０マイクロリットルのパパイン消化液に再懸濁させた。次に、試料を６０℃で一晩消化させた。翌日、１０マイクロリットルを、ＣｙＱｕａｎｔ  ＮＦアッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＤＮＡ含量のアッセイに使用した。
【０１０８】
結果：細胞数の増加が、播種後３日目及び７日目の両方で、試験した溶解物の両方の濃度に観察された。生／死染色は、多数の細胞を示し、両方の検査時点で、足場表面のより多くが覆われていた（図４）。３日後に、対照足場と比較しておよそ４倍の細胞ＤＮＡの増加があった（図５）。
【０１０９】
実施例１６．管足場上の細胞溶解物の調製
ＰＤＯの管状足場（実施例１、パート２）を、５．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度（ロット番号０８２９０８低）で５分間、ｈＵＴＣ溶解物溶液（実施例１５）に浸漬被覆し、次に凍結乾燥器（ＤＵＲＡ−ＳＴＯＰ，ＦＴＳ  ｓｙｔｅｍ）を使用して、２４時間凍結乾燥した。凍結乾燥器を起動させて、棚チャンバをおよそ１５分間−４０℃に保持した。棚の温度をモニターするための熱電対を取り付けてモニターした。足場管を−４０℃に保持した凍結乾燥器に入れた（予冷却）。凍結乾燥サイクルを開始して、棚の温度を１５分間−４０℃に維持して、次に６０分間−３７℃に維持した。減圧した。棚の温度を−４０℃に保持して、１８０分間この温度に維持した。棚の温度を−２５℃に上げて、５００分間維持した。棚の温度を−１５℃に上げて、１８０分間維持した。棚の温度を−５℃に上げて、１８０分間維持した。棚の温度を５℃に上げて、１２０分間維持した。棚の温度を１２０分間２０℃に維持した。棚の温度を１２０分間−２０℃に維持した。凍結乾燥の後、管状足場を細胞の付着について評価した。
【０１１０】
個別の管状足場を、１００ｍｍの無処理のプレート（Ｃｏｒｎｉｇ、カタログ番号４３０５９１）に入れた。ラット平滑筋細胞を、５×１０６／足場の播種密度で、ｈＵＴＣ溶解物又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（対照として）でコーティングした管状足場上に静置播種した。細胞を播種した足場を、１５ミリリットルの平滑筋増殖培地で皿を再播種する前に、３７℃の湿空気で１時間インキュベートした。足場を２４時間培養した。２４時間後に、足場を生／死キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｌ３２２４）で評価した。ＰＢＳ又はｈＵＴＣの溶解物でコーティングして、ラットＳＭＣで２４時間培養した管状足場上の生／死染色は、溶解物をコーティングした足場に比べて、より多くの細胞を示した（図６）。
【０１１１】
実施例１７．溶解物処理したＰＤＯシート上の細胞シートの生成
この実施例は、溶解物処理したＰＤＯシート上に播種したｈＵＴＣは、足場に付着、移動及び浸透することができることを実証するためである。これらのシートを、インビボで損傷した血管部位に直ちに移植するために、又はバイオリアクターで培養することで更に成熟させるために、ｈＵＴＣのみからなるＴＥＢＶ（次の実施例を参照）につながる管状構造体に作製することができる。ＰＤＯシート（２．０ｃｍ×２．０ｃｍ×０．０１μＭ）（ロット番号３９０４−７８）（実施例３）を、４０μＬの溶解物（合計５．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有、ロット番号０８２９０８）で浸漬して、続いて一晩４℃で空気乾燥した。次に、処理した足場を、ｈＵＴＣで播種して、培養し、実施例１５で説明するように、１．７５×１０５個細胞／ｃｍ２の密度で得た。次に、細胞を播種した足場を、実施例１５で説明する細胞と同じ条件で培養した。播種後１１及び１４日目に、細胞シートをＨ＆Ｅ染色のために固定した。示されるように、細胞を片側のみに播種したが、細胞が表面一面及び足場の内部に広がり、ｈＵＴＣが溶解物処理したＰＤＯの足場内で、付着し、移動し、増殖しているのが示されている（図７）。
【０１１２】
実施例１８．ｈＵＴＣ細胞及びｈＵＴＣ細胞溶解物でＥＳＳシートを巻いた組織工学による移植片
２枚のＰＤＯシート（２×５×０．０５ｃｍ、ロット番号５−６−０８−２シート３９０４−５０−３）を実施例３で説明するように、７００μＬのＰＢＳ又はｈＵＴＣ溶解物（合計５．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有、ロット番号０８２９０８低）で添加して、３日間−２０℃に保存することで乾燥させた。それぞれのシートを、３５０μＬの増殖培地（ＤＭＥＭ中に１５％のＦＢＳ）で水和した。実施例１５で説明するように、３５０μＬのｈＵＴＣ（５×１０６個細胞／ｍＬ）を得て、１．７５×１０５／ｃｍ２の密度（細胞ロット番号１２０３０４、Ｐ．９）で添加した。細胞を加えたシートを増殖培地で培養した。４日目に、それぞれのシートを２つに切断した（２×２．５×０．０５ｃｍ）。１組を、巻いて直径５ｍｍ及び長さ２．５ｃｍの単層管にして、もう１つの組を、シートの形状のままにした。
【０１１３】
巻いたＰＤＯのＥＳＳシートの端部に、フィブリンシーラント（０．５ｍＬ）（Ｏｍｒｉｘ，Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｅｓ  ＬＴＤ，Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｉｓｒａｅｌ）を適用し、続いてトロンビン（０．５ｍＬ）（Ｏｍｒｉｘ，Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｅｓ  ＬＴＤ，Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｉｓｒａｅｌ）を適用して、足場の末端を足場自体に接着し、足場を管状に維持した。接着して巻いた管をマンドレルから取り外した。２番目のシートは、シートのままにしておいた。管及びシートはすべて、引き続き３７℃で培養した。管及びシートのｈＵＴＣの生存能、付着及び増殖を、培養後に１及び４日目に評価した。結果は、溶解物の有無にかかわらず、ｈＵＴＣはＰＤＯシート上で付着してコンフルエントに増殖していることが示された。細胞の付着は、溶解物処理したＰＤＯシートでより強い。巻いている間ＰＤＯシート上に形成した細胞層が妨害されるが、管の形成後１日目の評価時に、細胞の密度は低く、ｈＵＴＣは管の管腔表面全体に均一に高密度に分配しており、ｈＵＴＣ溶解物で処理したＰＤＯ材料により多くの増殖が見られた（図８）。
【０１１４】
実施例１９．ｒＳＭＣ細胞及びｈＵＴＣ細胞溶解物でＥＳＳシートを巻いた組織工学による移植片
実施例３で説明するように、ＰＤＯシート（２×２．５×０．００５ｃｍ、ロット番号３９０４−７２−２３）に、６０μＬのｈＵＴＣ溶解物を添加した（合計５．２ｍｇ／ｍＬのタンパク質を含有、ロット番号０８２９０８低）。およそ２５０μＬのｒＳＭＣｓ（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を３．７５×１０６個細胞／ｍＬで、ＰＤＯシート上に１．７５×１０５個細胞／ｃｍ２の密度で播種した。３７℃で２時間後に、播種した材料をＳＭＣ増殖培地（ＧＭ）に浸した。５日間の培養の後に、シートをマンドレルのまわりに巻いて管（〜４層）にした（φ＝２ｍｍ）。
【０１１５】
ＥＳＳシートを巻いて組織工学による血管を開発するために使用することができる移植片にするために、ラボスケールの装置を組み立てた。装置はチャックを有しており、それにマンドレルは接続され、シートが巻かれて管になるようにマンドレルが回転した。細胞培養したＰＤＯのＥＳＳシートをマンドレルに置いた（直径５ｍｍ又は直径２ｍｍ）。マンドレルを、５層の細胞を含有する足場を形成するためにゆっくりと回転させた。管を、実施例１７で説明するように、フィブリンシーラントで密閉した。作製物を５日間ＧＭで培養して、更に４日間ＳＭＣ分化培地（ＤＭ）に切り替えた。作製物を２つの断片に切断して、１つは生−死染色用に、もう１つはＨ＆Ｅ用に１０％緩衝ホルマリンで固定した。
【０１１６】
結果は、ｒＳＭＣ細胞が足場の両側から足場に浸透しており、材料の厚さ全体にわたって、足場内で良好に付着及び増殖していることを示している。いくつかの領域（右パネル）で、２層の統合を示している（図９）。
【０１１７】
実施例２０．直径２ｍｍの組織工学による血管足場上のｈＵＴＣの播種
この実施例は、異なる内径のＰＤＯ−ＥＳＳ管に、ヒト臍帯細胞（ｈＵＴＣ）を均一に播種し、続いて細胞を増殖させてマトリックスを生成させるように培養することに関する。この増殖には、静置培養、あるいは圧力を伴った若しくは伴わない管腔の流れ及び／又は拍動流等の、バイオリアクターで生理的条件下での培養を含むことができる。ＰＤＯ−ＥＳＳ管は、最初にタイプＩコラーゲン、又は他の細胞外マトリックス成分でコーティングすることができる。
【０１１８】
長さおよそ３．５ｃｍ及び内径２ｍｍのＰＤＯ−ＥＳＳ管（１００ｍｇ／ｍＬ、実施例１、部品２）を、５０マイクログラム／ｍＬのラットテールタイプＩコラーゲン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の溶液に浸漬させて、コラーゲンでコーティングした。コラーゲンでコーティングした管及びコーティングしていない対照を、絹製縫合糸を使用してＬｕｍｅＧｅｎバイオリアクターチャンバ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ  ＭＮ）内のバーブに固定して、チャンバを密閉した。管状足場を培地に浴する外側のチャンバを、完全増殖培地で充填した。ｈＵＴＣを、トリプシン処理して、計数し、５．５×１０５個細胞／ｍＬの濃度に完全増殖培地に再懸濁させた。次に、播種リングを、ＬｕｍｅＧｅｎチャンバに取り付けた。これらのリングは、標準型組織培養ボトルローラーに配置されると、チャンバの回転を可能にする。気泡をすべて除去する方法で注射器を使用して、細胞懸濁液をＰＤＯ−ＥＳＳ管の内腔に注入した。管腔チャンバの両端を密閉して、チャンバをボトルローラーに置いて、一晩およそ０．４ｒｐｍの回転速度で、３７℃でインキュベートした。このように一晩インキュベートした後に、管を切断して開き、５ｍｍの生検パンチを採取して、ＴＥＢＶ足場内の細胞の分配を調べた。足場の生検を、１ｍＬのＰＢＳを含有する新しい低クラスターの２４ウェル皿に移した。２ミクロモルのカルセインＡＭ及び４ミクロモルのエチジウムホモ二量体を含有する生／死染色原液を調製して、０．５ｍＬを個別のウェルに加えた。次に、足場パンチを生／死溶液を含有するウェルに移した。室温で５分間インキュベートした後、細胞の付着及び細胞の生存能を蛍光顕微鏡で評価した。
【０１１９】
結果：ｈＵＴＣで播種したすべてのＰＤＯ−ＥＳＳ管に、大量の細胞の付着が観察された。コーティングされていないＰＤＯ−ＥＳＳ管と比較して、コラーゲンをコーティングしたＰＤＯ−ＥＳＳ管に付着した細胞の数に著しい増加があった。どちらの試料においても死細胞はほとんど観察されなかった（図１０）。
【０１２０】
実施例２１．組織工学による血管開発のためのバイオリアクタープロセス（静置培養）
この実施例は、異なる内径のＰＤＯ−ＥＳＳ管に、平滑筋細胞を均一に播種し、続いて細胞を増殖させてマトリックスを生成させるように培養することに関する。この増殖には、静置培養、あるいは圧力を伴った若しくは伴わない管腔の流れ及び／又は拍動流等の、バイオリアクターで生理的条件下での培養を含むことができる。
【０１２１】
長さおよそ５ｃｍのＰＤＯ−ＥＳＳ管（１００ｍｇ／ｍＬ）、又はＰＤＯ／コラーゲン−ＥＳＳ管（実施例１、パート２及び実施例２、パート２）を、絹製縫合糸を使用してＬｕｍｅＧｅｎバイオリアクターチャンバ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ  ＭＮ）内のバーブに固定した。チャンバを密閉した後、管状足場を浴する外側のチャンバを、平滑筋細胞増殖培地で充填した（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。ラット大動脈平滑筋細胞（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を、トリプシン処理して、計数し、２×１０６個細胞／ｍＬの濃度に増殖培地に再懸濁させた。次に、播種リングを、ＬｕｍｅＧｅｎチャンバに取り付けた。これらのリングは、標準型組織培養ボトルローラーに配置されると、チャンバの回転を可能にする。注射器を使用して、細胞懸濁液をＰＤＯ−ＥＳＳ管の内腔に注入した。管腔チャンバの両端を密閉して、チャンバをボトルローラーに置いて、一晩およそ０．４ｒｐｍの回転で３７℃でインキュベートした。このように一晩インキュベートした後に、いくらかの管を切断して開いて、５ｍｍの生検パンチを採取し、ＴＥＢＶ足場内の細胞の分配を調べた。足場の生検を、１ｍＬの無血清ＤＭＥＭを含有する新しい低クラスターの２４ウェル皿に移した。次に、足場を追加の１ｍＬの無血清ＤＭＥＭで洗浄した。２ミクロモルのカルセインＡＭ及び４ミクロモルのエチジウム（ethidum）ホモ二量体を含有する生／死染色原液を調製して、０．５ｍＬをそれぞれのウェルに加えた。室温で５分間インキュベートした後、細胞の付着及び細胞の生存能を蛍光顕微鏡で評価した。
【０１２２】
次に、ＬｕｍｅＧｅｎチャンバ内の細胞を播種したＰＤＯ−ＥＳＳ足場を、生理的な流速、拍動流及び圧力を生成可能なＬｕｍｅＧｅｎバイオリアクターに接続した。拍動流は、部分的には蠕動ポンプから生じ、一方で圧力及びパルスは、内腔又はチャンバのいずれかからの培地の出口流の管をクリンプすることによって調節することができる。更に、パルスは、所望により拍動的な方法で移植片を圧縮するメカニズムによって加えることができる。これは、コンピュータインターフェースを経由してコントロールされる。流れを開始して、細胞を１０ｍＬ／分の流速に２時間曝した。この流れの期間の後、１つのＴＥＢＶ足場を、チャンバから取り外して（removed form）、上述のように生／死染色を使用することで分析した（analyzied）。次に、別の細胞を播種したＰＤＯ−ＥＳＳ足場を、７日間ＬｕｍｅＧｅｎチャンバ内で静置培養し、続いて上述のように生／死染で分析した。
【０１２３】
結果：生／死染色の結果から、ＬｕｍｅＧｅｎチャンバ内での回転播種方法は、足場の全長にわたって細胞が均一的に分配すると共に、ＰＤＯ−ＥＳＳ足場上に付着して広がることを可能にすることを示している。（図１１）。その上、細胞を１０ｍＬ／分の流れに曝すことで、細胞は足場の管腔表面から（form）ずれなかった。播種した足場を、流れに続いて７日間インキュベートすることは、細胞の生存能に影響を与えずに、細胞数の増加をもたらした（図１２）。
【０１２４】
実施例２２．組織工学による血管開発のためのバイオリアクタープロセス（拍動流の生理的条件−短期培養）
この実施例は、異なる内径のＰＤＯ−ＥＳＳ管に、平滑筋細胞を均一に播種し、続いて細胞を増殖させてマトリックスを生成させるように動的条件で培養することに関する。これらの動的条件には、圧力を伴った若しくは伴わない管腔の流れ、及び／又は拍動流等の、バイオリアクターで生理学的又は非生理学的条件下での培養を含むことができる。更に、流れは外側のチャンバに導入することができるが、これは組織工学による血管作製物の外側を培地に浴させる。
【０１２５】
長さおよそ５ｃｍ及び直径４ｍｍのＰＤＯ−ＥＳＳ管（１００ｍｇ／ｍＬ、実施例１、パート２）を、絹製縫合糸を使用してＬｕｍｅＧｅｎバイオリアクターチャンバ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ  ＭＮ）内のバーブに固定して、チャンパを密閉した。管状足場を培地に浴する外側のチャンバを、平滑筋増殖培地（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）で充填した。ラット大動脈平滑筋細胞（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を、トリプシン処理して、計数し、２×１０６個細胞／ｍＬの濃度に増殖培地に再懸濁させた。次に、播種リングを、ＬｕｍｅＧｅｎチャンバに取り付けた。これらのリングは、標準型組織培養ボトルローラーに配置されると、チャンバの回転を可能にする。注射器を使用して、細胞懸濁液をＰＤＯ−ＥＳＳ管の内腔に注入した。管腔チャンバの両端を密閉して、チャンバをボトルローラーに置いて、一晩およそ０．４ｒｐｍの回転で３７℃でインキュベートした。
【０１２６】
次に、ＬｕｍｅＧｅｎチャンバ内のうち１つの細胞を播種したＰＤＯ−ＥＳＳ足場を、拍動流及び圧力を含む生理的流速条件を生成することが可能なＬｕｍｅＧｅｎバイオリアクターに接続した。拍動流は、部分的には蠕動ポンプから生じ、一方で圧力及びパルスは、内腔又はチャンバのいずれかからの培地の出口流の管をクリンプすることによって調節することができる。更に、パルスは、拍動的な方法で移植片を圧縮するメカニズムによって加えることができる。これは、コンピュータインターフェースを経由してコントロールされる。流れを開始して、管状足場上の播種された細胞を、２０ｍＬ／分の流速、及び１Ｈｚの周波数で１５．９〜１０．７ｋＰａ（１２０〜８０ｍｍ  Ｈｇ）の拍動性圧力に曝した。対照として、バイオリアクターチャンバ内の細胞を播種した別の管を、２４時間後に管腔の培地を変えて静置培養した。
【０１２７】
３日間の培養後、管状足場をチャンバから取り出して、切断して開き、５ｍｍの生検パンチを採取して、ＴＥＢＶ足場内の細胞数、分配、及び形態を調べた。生検パンチを、１ｍＬのＰＢＳを含有する新しい低クラスターの２４ウェル皿に移した。２ミクロモルのカルセインＡＭ及び４ミクロモルのエチジウムホモ二量体を含有する生／死染色原液を調製して、０．５ｍＬを個別のウェルに加えた。次に、足場パンチを生／死溶液を含有するウェルに移した。室温で５分間インキュベートした後、細胞の付着及び細胞の生存能を蛍光顕微鏡で評価した。
【０１２８】
結果：生／死染色の結果から、ＬｕｍｅＧｅｎチャンバ内での回転播種方法は、足場の全長にわたって細胞が均一的に分配すると共に、ＰＤＯ−ＥＳＳ足場上に付着して広がることを可能にすることを示している。その上（Futhermore）、２０ｍＬ／分の流れ及び生理的な１５．９〜１０．７ｋＰａ（１２０〜８０ｍｍ  Ｈｇ）拍動性圧力に細胞を曝すことは、足場の表面上の細胞数に著しい増加をもたらした。更に、細胞の形態が、流れの方向に整合するように変化した（図１３）。
【０１２９】
実施例２３．細胞を播種した細胞組織工学による血管開発のためのバイオリアクタープロセス（拍動流の生理的条件（Conditions）−長期培養）
実施例１〜１１で説明するように、回転壁容器灌流バイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）で、細胞（臍帯動脈平滑筋細胞−ＵＡＳＭＣ）を足場上に播種した。バイオリアクターは、足場が接続されることになるバーブを備えた中央回転芯を有する。核は、外面が培地に浴されている間、培地が足場の内腔を通して灌流されることを可能にする。組み立て品全体が、上述のように水平に回転するので、この場合もずれ応力が最小限に抑えられる。足場の管腔表面上に細胞を播種するために、細胞懸濁液（１０６個細胞／ｍＬ）を足場の内腔に注入した。流れを止めて、回転を継続させる。バイオリアクターが回転するにつれて、細胞が均一な方法で、回転する内腔の表面に付着する。付着させるために２〜４時間インキュベートした後に、残留した付着していない細胞を内腔から排出させて、増殖培地が内腔を通して灌流された。この培養期間は〜１４日間継続され、細胞が増殖して足場の孔に移動することを可能にする（培養の実時間は経験的に判定されるであろう）。
【０１３０】
足場への細胞の増殖は、カルセイン染色に続いて共焦点顕微鏡検査によって、又はローダミンファロイジンを使用して、アクチン染色で調べられる。同様の技術が、細胞の増殖の深さ、及び／又は足場生体材料への移動を測定するために使用される。横断面画像が調べられ、細胞内成長の深さが画像解析ツールを使用して測定される。
【０１３１】
細胞を播種した他の足場を、生理的な流速、拍動流及び圧力を生成することができる第２のバイオリアクター（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移すことができる。拍動流は部分的には蠕動ポンプから生じ、一方で圧力及びパルスは、内腔又はチャンバのいずれかからの培地の出口流の管をクリンプすることによって調節することができる。更にパルスは、拍動的な方法で移植片を圧縮するメカニズムによって加えることができる。これは、コンピュータインターフェースを経由してコントロールされる。バイオリアクターは、内蔵の圧力センサ、及び移植片の外径を測定するレーザーマイクロメートルを有する。流速、圧力、及び移植片の外径が、リアルタイムでコンピュータ上に図示される。これによって、ユーザーは移植片に生理的な圧力及び拍動性波を加えることが可能で、任意の方法でそれらを変更することができる。
【０１３２】
細胞を播種した移植片は、所望する物理的及び生物学的特性次第で、追加の期間、このバイオリアクターで培養される。第１の期間中、圧力及び流速を、最終的に所望の生理的なレベルに達するまで、ゆっくりと上昇させる。最終パラメータは、足場の最終的な位置によって異なる。これらのレベルを、最終段階の間保持する。毎日１時間、バイオリアクターチャンバ内の圧力の変動、流速、及び足場の外径の変動の測定値が記録されることになる。培養期間の終了時に、作製物の破裂強さを測定するために、移植片が破裂するまで圧力を上昇させてもよい。
【０１３３】
実施例２４．細胞シート組織工学による血管開発のためのバイオリアクタープロセス
実施例１７〜１８で説明するように巻いて管にした細胞シートは、バイオリアクタープロセスを使用して、組織工学による血管を形成するために、更にバイオプロセスすることができる。細胞シートは、回転壁容器灌流バイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ，Ｉｎｃ．）で、ｈＵＴＣ又はＩＭＡ等の細胞を播種されることになる。バイオリアクターは、足場が接続されることになるバーブを備えた中央回転芯を有する。核は、外面が培地に浴されている間、培地が足場の内腔を通して灌流されることを可能にする。組み立て品全体が、上述のように水平に回転するので、この場合もずれ応力が最小限に抑えられる。細胞シートの管腔表面上に細胞を播種するために、細胞懸濁液（１０６個細胞／ｍＬ）を足場の内腔に注入した。流れを止めて、回転を継続させる。バイオリアクターが回転するにつれて、細胞が均一な方法で、回転する内腔の表面に付着する。付着させるために２〜４時間インキュベートした後に、残留する付着していない細胞を内腔から排出させて、増殖培地を内腔を通して灌流した。この培養期間は〜１４日間継続され、細胞が増殖して足場の孔に移動することを可能にする（培養の実時間は経験的に判定されるであろう）。
【０１３４】
足場への細胞の増殖は、カルセイン染色に続いて共焦点顕微鏡検査によって、及び又はローダミンファロイジンを使用してアクチン染色で調べられることになる。同様の技術が、細胞の増殖の深さ及び／又は足場生体材料への移動を測定するために使用される。横断面画像が調べられて、細胞内成長の深さが画像解析ツールを使用して測定される。
【０１３５】
細胞を播種した足場を、生理的な流速、拍動流及び圧力を生成することができる第２のバイオリアクター（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移すことができる。拍動流は部分的には蠕動ポンプから生じ、一方で圧力及びパルスは、内腔又はチャンバのいずれかからの培地の出口流の管をクリンプすることによって調節することができる。更にパルスは、拍動的な方法で移植片を圧縮するメカニズムによって加えることができる。これは、コンピュータインターフェースを経由してコントロールされる。バイオリアクターは、内蔵の圧力センサ、並びに移植片の外径を測定するレーザーマイクロメートルを有する。流速、圧力及び移植片の外径が、リアルタイムでコンピュータ上に図示される。これによって、ユーザーは移植片に生理的な圧力及び拍動性波を加えることが可能で、任意の方法でそれらを変更することができる。
【０１３６】
細胞を播種した移植片は、所望する物理的及び生物学的特性次第で、追加の期間、このバイオリアクターで培養される。第１の期間中、圧力及び流速を、最終的に所望の生理的なレベルに達するまで、ゆっくりと上昇させる。最終パラメータは、足場の最終的な位置によって異なる。これらのレベルを、最終段階の間保持する。毎日１時間、バイオリアクターチャンバ内の圧力の変動、流速、及び足場の外径の変動の測定値が記録されることになる。培養期間の終了時に、作製物の破裂強さを測定するために、移植片が破裂するまで圧力を上昇させてもよい。
【０１３７】
実施例２５．管状の作製物上の細切組織の調製
生検組織の２小片を、５ｍｍの直径生検パンチ（Ｍｉｌｔｅｘ、参照番号３３〜３５）で、ラット筋肉（Ｈａｒｌａｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮからのＬｅｗｉｓ  ｒａｔ）から収集した。それぞれの生検は、約５０〜６０ｍｇの重量があり、標準濃度（１００Ｕ／ｍＬ）でペニシリンを補充したＰＢＳに入れられた。組織を、ＰＢＳで３回洗浄して、細切に刻んだ。細切組織を計量して、２５ｍｇ及び５０ｍｇに分割して、次に、それぞれの管状の作製物の外側表面に均等に伸ばした（図１４）。フィブリン接着剤（ＥＶＩＣＥＬ、カタログ番号３９０５、Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を使用して、組織片を足場上に維持した。管状の作製物に、細切組織を添加して、３７℃で２時間及び７２時間インキュベーターに入れた（図１５）。
【０１３８】
実施例２６．２つの細切組織源で細切組織を播種したＴＥＢＶ作製物の調製
この実施例は、細胞源として細切した自家組織で播種された生体吸収性足場から作成された、組織工学による血管の調製を説明する。実施例１〜１１で概説する寸法で、管状又は平たい生体再吸収性足場を調製する。例えば、中空器官（消化管、食道の下部、胃及び腸、膀胱壁、子宮、様々な腺管、並びに血管壁等）の壁の筋肉層の組織源から、平滑筋細胞を含有する組織の小さい生検を得る。生検組織を、標準濃度（１００Ｕ／ｍＬ）でペニシリンを補充したＰＢＳに入れる。組織をＰＢＳで３回洗浄し、次に細切組織を得るためにメスを用いて刻んだ。次に組織を、管状又は平たい作製物の外側表面に均等に分配した。別の組織生検を血管の内膜等の内皮組織源から得る。組織を標準濃度（１００Ｕ／ｍＬ）でペニシリンを補充したＰＢＳに入れる。組織を刻んで、管状の作製物の内側表面又は水平な作製物の内側表面に分配した。組織片は、両方の場合で、フィブリン接着剤等の細胞にやさしい接着剤を使用して、足場上に維持することができる。平たい足場作製物は、ここで管状の作製物に縫合することができる。次に、作製物をペニシリン／ストレプトマイシン及び１５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを含有する培地に、低細胞付着皿で４〜８週間培養することができ、その間、平滑筋細胞及び内皮細胞は、細切組織から足場上に移動する。次に、実施例２７で説明するように、工学による血管を、２０％  ＦＢＳ、ペニシリンＧ（１００Ｕ／ｍＬ）、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、アスコルビン酸（０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ＣｕＳＯ４（（３ナノグラム／ｍＬ）、プロリン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アラニン（０．０３ｍｇ／ｍＬ）、及びグリシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）を補充したＤＭＥＭ中で、３７℃の温度で、１０％ＣＯ２の雰囲気中で、数週間又は数ヶ月間、バイオリアクターで更に培養することができる。
【０１３９】
実施例２７．単一源の細切組織で細切組織を播種したＴＥＢＶ作製物の調製
別の実施例では、細切組織を播種した作製物は、実施例２５で概説するように、調製することができる。しかしながら、細切組織源は、単一の組織源が平滑筋細胞及び内皮細胞の両方を含有するような単一源であることが可能で、同じ細切組織断片が、足場の内側表面及び外側表面に当てられる。
【０１４０】
実施例２８．細胞溶解物又は細切組織の組織工学による血管開発のためのバイオリアクタープロセス
実施例１〜１１、２４〜２６で説明するように、細切組織又は細胞溶解物を含有する作製物及び足場は更に、バイオリアクタープロセスを使用して、組織工学による血管を形成するためにバイオリアクター処理をすることができる。細切組織及び足場を含有する作製物は、回転壁容器灌流バイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ，Ｉｎｃ．Ｈｏｕｓｔｏｎ  ＴＸ）内で、ｈＵＴＣ又はＩＭＡ等の細胞を播種されることになる。バイオリアクターは、足場が接続されることになるバーブを備えた中央回転芯を有する。核は、外面が培地に浴されている間、培地が足場の内腔を通して灌流されることを可能にする。組み立て品全体が、上述のように水平に回転するので、この場合もずれ応力が最小限に抑えられる。細切組織及び足場を含有する作製物の管腔表面上に細胞を播種するために、細胞懸濁液（１０６個細胞／ｍＬ）を作製物の内腔に注入した。流れを止めて、回転を継続させる。バイオリアクターが回転するにつれて、細胞が均一な方法で、回転する内腔の表面に付着する。付着させるために２〜４時間インキュベートした後に、残留する付着していない細胞を内腔から排出させて、増殖培地を内腔を通して灌流した。この培養期間は〜１４日間継続され、細胞が増殖して足場の孔に移動することを可能にする（培養の実時間は経験的に判定されるであろう）。
【０１４１】
足場への細胞の増殖は、カルセイン染色に続いて共焦点顕微鏡検査によって、及び又はローダミンファロイジンを使用してアクチン染色で調べられるであろう。同様の技術が、細胞の増殖の深さ及び／又は足場生体材料への移動を測定するために使用されるであろう。横断面画像が調べられて、細胞内成長の深さが画像解析ツールを使用して測定されるであろう。
【０１４２】
Ｔ細胞を播種した足場を、生理的な流速、拍動流及び圧力を生成することができるもう１つのバイオリアクター（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に移すことができる。拍動流は部分的には蠕動ポンプから生じ、一方で圧力及びパルスは、内腔又はチャンバのいずれかからの培地の出口流の管をクリンプすることによって調節することができる。更にパルスは、拍動的な方法で移植片を圧縮するメカニズムによって加えることができる。これは、コンピュータインターフェースを経由してコントロールされる。バイオリアクターは、内蔵の圧力センサ、並びに移植片の外径を測定するレーザーマイクロメートルを有する。流速、圧力及び移植片の外径が、リアルタイムでコンピュータ上に図示される。これによって、ユーザーは移植片に生理的な圧力及び拍動性波を加えることが可能で、任意の方法でそれらを変更することができる。
【０１４３】
細胞を播種した移植片は、更に７日間、このバイオリアクター内で培養される。最初の３日間中、圧力及び流速を、最終的に所望の生理的なレベルに達するまで、ゆっくりと上昇させる。最終パラメータは、足場の最終的な位置によって異なる。これらのレベルを、最後の４日間保持する。毎日１時間、バイオリアクターチャンバ内の圧力の変動、流速、及び足場の外径の変動の測定値が記録されることになる。培養期間の終了時に、作製物の破裂強さを測定するために、移植片が破裂するまで圧力を上昇させてもよい。
【０１４４】
実施例２９．ＴＥＢＶのインビボ有効性に関する研究
ＴＥＢＶを、１４匹の成熟したイヌの大腿動脈に外科的に移植した。生体血管の５〜１０ｍｍの切片を切除して、標準手術手技を用いて、実験用のＴＥＢＶと置換した。標準的な縫合手技を用いて吻合した。血管内腔を、標準ヘパリン溶液で洗浄した。筋肉及び皮膚を、標準手技で閉じる。手術後に、開存性を標準超音波でモニターする。
【０１４５】
ＴＥＢＶを４週間後に外植して、開存性を直接視診で評価する。開存性は、ＴＥＢＶを切除して、内腔を組織学的に評価することにより確認される。
【０１４６】
実施例３０．冠動脈性心疾患の患者の治療でのＴＥＢＶの使用
冠動脈バイパス（ＣＡＢＧ）処置で、ＴＥＢＶは、動脈壁が厚くなり（塞栓）、弾力性を失い、石灰化することによって特徴づけられる一般的な動脈障害である、動脈硬化症を患う患者に使用されるであろう。この疾患は、心臓の損傷、脳卒中及び心臓発作につながる可能性がある血液供給の減少を引き起こす。
【０１４７】
したがって、実施例１で説明する静電紡糸プロセスによって作製したＰＤＯ管状足場は、次に実施例１０で説明するように、細胞を播種されてバイオリアクタープロセスにかけられて、ＴＥＢＶを形成し、それから滅菌され、パッケージ化されて、オペ室に運ばれる。典型的なＣＡＢＧ処置では、外科医は胸骨切開術によって開胸を行う。心臓の機能を心肺装置が代行する。病的な動脈を見つけ、ＴＥＢＶの一端を塞栓部を越えた冠動脈に縫いつけ、もう一端を大動脈に取り付ける。心臓が再開されて、胸骨がワイヤーでつなぎ合わされて、切開部が縫合して閉じられる。数週間内に、成功したバイパス処置は完全に治癒し、患者は正常に機能する。
【０１４８】
上記の説明は単に例示的なものであり、設計及び材料配向の最適化に関して、決定する際のすべての検討事項を網羅すると解釈されるべきでない。ここで図示及び説明した実施形態は、最も実用的で好適な実施形態と考えられるが、当業者であれば、ここに図示及び開示した特定の設計及び方法からの変更はそれ自体当業者にとって自明であり、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく使用できることは明らかであろう。本発明は、説明及び図示した特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に含まれ得るすべての改変と一貫すると解釈されるべきである。
【０１４９】
実施例３１．胸動脈由来細胞：隔離及び特性化
胸動脈由来細胞の隔離
内胸動脈（ＩＭＡ）を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡ）から入手する。血液及び残屑を除去するために、動脈をトリミングして、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−低グルコース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄する。次に、動脈を、細胞が微細のパルプ状に刻まれるまで、組織培養プレートの中で機械的に分離する。次に、組織を５０ミリリットルの円錐管に移す。次に、組織を、０．２５ユニット／ミリリットルのコラゲナーゼ（Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２．５ユニット／ミリリットルのディスパーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ）、及び１ユニット／ミリリットルのヒアルロニダーゼ（Ｖｉｔｒａｓｅ，ＩＳＴＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を含有する酵素混合物で消化させる。次に、酵素混合物を、１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する増殖培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）及びストレプトマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ））と混合する。組織、培地及び消化酵素を含有する円錐管を、２２５ｒｐｍで２時間、軌道攪拌器に３７℃でインキュベートする。
【０１５０】
消化物を１５０×ｇで５分間遠心分離機にかけて、次に、上澄みを吸引する。次に、ペレットを２０ミリリットルの培地で再懸濁させる。次に、細胞懸濁液を、４０マイクロメートルナイロンのＢＤ  ＦＡＬＣＯＮセルストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でろ過する。次に濾液を、培地（全容積５０ミリリットル）に再懸濁させて、１５０×ｇで５分間遠心分離機にかける。次に、上澄みを吸引して、細胞を、別の５０ミリリットルの新しい培地に再懸濁させる。この洗浄処置を更に２回繰り返す。
【０１５１】
最終の遠心分離の後に、細胞を、１％  ＦＢＳ又は１０％  ＦＢＳのいずれかを含有する増殖培地にプレーティングして、３７℃及び５％  ＣＯ２で培養する。ＩＭＡの断片を更に、コーティングした又はコーティングしていない組織培養フラスコに外植片として培養する。組織片から移動する細胞を、培地選択の下で、トリプシン又は他の非酵素の方法を使用して収集する。
【０１５２】
核型分析用に、継代４及び継代１０の胸動脈由来細胞を、Ｔ２５フラスコにプレーティングして、一晩付着させる。次に、フラスコをＲＥＧＭで充填して、核型分析のために、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙに送る。
【０１５３】
増殖能力の分析
ＩＭＡ由来細胞は、５０００個細胞／ｃｍ２でＴ７５フラスコに増殖培地でプレーティングして、５％二酸化炭素中で、３７℃で培養されることになる。細胞を３〜５日ごとに継代する。それぞれの継代で、細胞を計数して、Ｇｕａｖａ製の装置（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を使用して、生存能を測定する。次に、細胞分裂［ｌｎ（最終的に得られた細胞／プレーティングした初代細胞数）／ｌｎ２］を計算する。
【０１５４】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析が、ＩＭＡ由来細胞について実施される。細胞を、３７℃及び５％の二酸化炭素でＴ２２５フラスコの増殖培地で、継代４及び１０に拡大する。粘着細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）ではがす。細胞を収集して、遠心分離機にかけ、１×１０７個細胞／ｍＬの濃度で、ＰＢＳに３％（ｖ／ｖ）のＦＢＳに再懸濁させる。特定の抗体を、１００マイクロリットルの細胞懸濁液に加え、混合液を４℃で３０〜４５分間暗所でインキュベートする。インキュベートした後、細胞をＰＢＳで洗浄して、超過の抗体を除去するために遠心分離機にかける。細胞を、５００マイクロリットルのＰＢＳに再懸濁させて、フローサイトメトリーによって分析する。フローサイトメトリー分析は、Ｇｕａｖａ製の装置で実施される。使用する抗体を表３に示す。
【表４】
2011519616.tif 000006
【０１５５】
総ＲＮＡの隔離
ＲＮＡをＩＭＡ由来細胞から抽出する。（ＲＮｅａｓｙミニキット、Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）ＲＮＡを、５０μＬのＤＥＰＣ処理水で溶出して、−８０℃で保存する。
【０１５６】
逆転写
ＲＮＡを、ランダムヘキサマーを用いて、ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で、１０分間２５℃で、６０分間３７℃で、及び１０分間９５℃で逆転写する。試料を−２０℃で保存する。選択した遺伝子（下表を参照）を、従来のＰＣＲを使用して調べる。
【０１５７】
ＰＣＲ
ＰＣＲ反応（ＧＡＰＤＨを除く−以下のチャートを参照）を、ＲＴ２  ＰＣＲプライマーセット（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  ＭＤ）を使用して、ｃＤＮＡ試料上で実施される。以下に示すプライマーはすべて、シーケンスが確認される。
【表５】
2011519616.tif 000007
【０１５８】
プライマーを、１μＬのｃＤＮＡと２倍のＲｅａｃｔｉｏｎＲｅａｄｙ（商標）ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスター（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とで製造業者の指示に従って混合し、ＰＣＲを、ＡＢＩプリズム７０００システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して実施する。熱サイクル条件は、初期は、２分間５０℃及び１０分間９５℃、その後１５秒間９５℃の３４サイクル及び１分間６０℃とする。ＧＡＰＤＨ用には、ＰＣＲを、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＧＡＰＤＨプライマー（カタログ番号４０２８６９）、１μＬのｃＤＮＡ溶液、及び製造業者のプロトコルに従って１倍のＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄユニバーサルミックスＰＣＲ反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して実施する。最終のＰＣＲ反応でのプライマー濃度は、順方向プライマー及び逆方向プライマーの両方用に０．５μＭであり、ＴａｑＭａｎプローブは加えられない。試料は、２％（ｗ／ｖ）のアガロースゲル上で実行され、エチジウムブロミド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色される。画像を、焦点距離ポラロイド（商標）カメラ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）を用いて、６６７ユニバーサルツインパックフィルム（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）を使用して撮影する。
【０１５９】
ＥＬＩＳＡ
ＩＭＡ由来細胞を、継代４及び継代１０で解凍し、それぞれ１５ミリリットルの増殖培地を含有する５０００個細胞／ｃｍ２でＴ７５フラスコ上に播種する。細胞を、５％の二酸化炭素及び大気中酸素で、３７℃で２４時間培養する。培地を、無血清培地（ＤＭＥＭ−低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン（５０ユニット／ミリリットル）、及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ、Ｇｉｂｃｏ））に変えて、更に８時間培養する。次に、条件付けをした無血清培地を、インキュベーションの終わりに５分間１４，０００×ｇで遠心分離機にかけて採取して、−２０℃で保存する。
【０１６０】
それぞれのフラスコ中の細胞数を推定するために、細胞をＰＢＳで洗浄し、２ミリリットルのトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用してはがし、Ｇｕａｖａ製（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）の装置で計数する。次に、試料を、メタロプロテイナーゼ１組織阻害剤（ＴＩＭＰ１）、メタロプロテイナーゼ２組織阻害剤（ＴＩＭＰ２）、血小板由来増殖因子ｂｂ（ＰＤＧＦｂｂ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、単球走化性タンパク質１、（ＭＣＰ１）インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン８（ＩＬ８）、形質転換増殖因子α（ＴＧＦａ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、間質由来因子１Ｂ（ＳＤＦ１Ｂ）、繊毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、基礎的な神経成長因子（ｂＮＧＦ）、Ｓｅａｒｃｈｌｉｇｈｔ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ａｒｒａｙｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）でニューロトロフィン３（ＮＴ３）の因子について分析する。
【０１６１】
実施例３２．ラット平滑筋細胞Ｒ３５４−０５をＰＤＯ足場に播種する
この実施例は、ラット平滑筋細胞Ｒ３５４−０５（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）をＰＤＯ−ＥＳＳ管（実施例１、パート２）に、均一に静置播種することに関する。細胞を増殖させてマトリックスを生成させるために、細胞を培養する。この増殖には、静置培養、あるいは圧力を伴った若しくは伴わない管腔の流れ及び／又は拍動流等の、バイオリアクター中で生理的条件下での培養を含むことができる。
【０１６２】
ＰＤＯ管を長さ２ｃｍに切断し、６０ｍｍの組織培養皿に入れた。ラット大動脈平滑筋細胞（Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）を、トリプシン処理して、計数し、２×１０６個細胞／ｍＬの濃度でラット平滑筋増殖培地に再懸濁させた。２００μｌのピペットチップを使用して、細胞をＰＤＯ管上にそっと滴下した。細胞を含有するＰＤＯ管を１時間室温に放置してから、４日間３７℃の加湿環境に置いた。
【０１６３】
４日間の静置培養後、ＰＤＯ管を回転型細胞培養装置（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ）に７．０ｒｐｍで１０日間入れて、細胞を増殖させ、マトリックスを生成させた。培養１４日目に、細胞の分配及び形態を評価する。ＰＤＯ管を６０ｍｍの組織培養皿に移した。５ｍｍの生検パンチを収集して、ＰＢＳを含有する２４ウェルプレートに入れた。細胞の生存能を調べるために、生／死アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を実施した。２ミクロモルのカルセインＡＭ及び４ミクロモルのエチジウム（ethidum）ホモ二量体を含有する１０ｍＬのＰＢＳを調製した。１ｍＬの生／死染色を生検に加えた。室温で５分間インキュベートした後、細胞の付着及び細胞の生存能を蛍光顕微鏡で評価した。同様の生検パンチを、１０％中性緩衝ホルマリンに固定して、パラフィンに包埋して、切断し、細胞の形態学（図１６）を評価するためにＨ＆Ｅで染色、及び細胞外マトリックスの形成に特異的であるマッソントリクローム染色で染色した。
【０１６４】
結果：ラット平滑筋細胞は、細胞の生存能を支援するＰＤＯ管で、培養期間を通して生存可能である。４日間のラット平滑筋細胞の静置播種は、均一の細胞分配につながる。細胞は足場の両側に付着している。足場への細胞の浸潤が観察される。
【０１６５】
〔実施の態様〕
（１）  ポリ（ｐ−ジオキサノン）を含む足場、並びに細胞、細胞シート、細胞溶解物及び細切組織のうち１つ以上を含む、組織工学による血管用の管状の作製物。
（２）  前記足場が更にコラーゲンを含む、実施態様１に記載の管状の作製物。
（３）  前記細胞が、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞（fibrobasts）、ヒト臍帯由来細胞及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、実施態様１に記載の管状の作製物。
（４）  ａ．ポリ（ｐ−ジオキサノン）を含む管状に形成された足場を提供する工程と、
ｂ．前記足場に、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞及びヒト臍帯由来細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞を播種する工程と、
ｃ．前記細胞を播種した足場をバイオリアクターで培養する工程と、を含む、組織工学による血管を作製する方法。
（５）  ａ．ポリ（ｐ−ジオキサノン）を含む管状に形成された足場を提供する工程と、
ｂ．前記足場をヒト臍帯由来細胞シートで包む工程と、
ｃ．前記細胞シートで包まれた足場をバイオリアクターで培養する工程と、を含む、組織工学による血管を作製する方法。
（６）  ａ．ポリ（ｐ−ジオキサノン）を含む管状に形成された足場を提供する工程と、
ｂ．前記足場を細切筋組織と細切内皮組織とに当てる工程と、
ｃ．前記細切組織足場をバイオリアクターで培養する工程と、を含む、組織工学による血管を作製する方法。
（７）  ａ．ポリ（ｐ−ジオキサノン）を含む管状に形成された足場を提供する工程と、
ｂ．前記足場を細胞溶解物に当てる工程と、次に、
ｃ．前記足場を凍結乾燥する工程と、を含む、組織工学による血管を作製する方法。
（８）  ａ．細胞及び細切組織のうち１つ以上を前記細胞溶解物足場に当てる工程と、
ｂ．細胞及び細切組織のうち１つ以上を有する前記細胞溶解物足場をバイオリアクターで培養する工程と、を更に含む、実施態様７に記載の方法。
（９）  ａ．ポリ（ｐ−ジオキサノン）を含む足場を提供する工程と、
ｂ．前記足場シートに細胞を播種する工程と、
ｃ．前記播種したシートを巻いて管にする工程と、
ｄ．前記管をバイオリアクターで培養する工程と、を含む、組織工学による血管を作製する方法。
【図１Ａ】
2011519616.tif 000008
【図１Ｂ】
2011519616.tif 000009
【図１Ｃ】
2011519616.tif 000010
【図１Ｄ】
2011519616.tif 000011
【図２Ａ】
2011519616.tif 000012
【図２Ｂ】
2011519616.tif 000013
【図２Ｃ】
2011519616.tif 000014
【図２Ｄ】
2011519616.tif 000015
【図３Ａ】
2011519616.tif 000016
【図３Ｂ】
2011519616.tif 000017
【図３Ｃ】
2011519616.tif 000018
【図３Ｄ】
2011519616.tif 000019
【図４Ａ】
2011519616.tif 000020
【図４Ｂ】
2011519616.tif 000021
【図４Ｃ】
2011519616.tif 000022
【図４Ｄ】
2011519616.tif 000023
【図４Ｅ】
2011519616.tif 000024
【図４Ｆ】
2011519616.tif 000025
【図５】
2011519616.tif 000026
【図６】
2011519616.tif 000027
【図７】
2011519616.tif 000028
【図８】
2011519616.tif 000029
【図９】
2011519616.tif 000030
【図１０Ａ】
2011519616.tif 000031
【図１０Ｂ】
2011519616.tif 000032
【図１１Ａ】
2011519616.tif 000033
【図１１Ｂ】
2011519616.tif 000034
【図１２Ａ】
2011519616.tif 000035
【図１２Ｂ】
2011519616.tif 000036
【図１２Ｃ】
2011519616.tif 000037
【図１２Ｄ】
2011519616.tif 000038
【図１３Ａ】
2011519616.tif 000039
【図１３Ｂ】
2011519616.tif 000040
【図１３Ｃ】
2011519616.tif 000041
【図１３Ｄ】
2011519616.tif 000042
【図１４】
2011519616.tif 000043
【図１５】
2011519616.tif 000044
【図１６】
2011519616.tif 000045
【国際調査報告】
2011519616.tif 000046
2011519616.tif 000047
2011519616.tif 000048