(57)【要約】疼痛を防止するかまたは処置するための方法が提供される。このような方法は、ＬＰＡを結合する抗体または抗体断片を被験体（例えば、ヒト被験体）に投与することを包含する。抗体は、ヒト化モノクローナル抗体であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疼痛の処置または防止方法であって、リゾホスファチジン酸を結合し、中和する抗体または抗体断片を、疼痛を有するかまたは疼痛を有する危険があると思われる被験体に投与し、それにより疼痛の処置または防止を実行することを包含する方法。
【請求項２】
前記抗体または抗体断片がモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗体または抗体断片がヒト化モノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体の抗体断片である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記被験体がヒト被験体である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記疼痛が、神経障害性疼痛、中枢または末梢神経系に対する損傷、外傷または損害のための疼痛、あるいは炎症、関節炎、薬剤曝露、糖尿病、ウイルス性疾患、代謝疾患、虚血性傷害、栄養欠乏、毒素曝露、癌または癌処置のための疼痛である、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リゾホスファチジン（ＬＰＡ）およびその変異体を結合する作用物質に、特に、具体的には生理学的条件下でＬＰＡと反応性であるモノクローナル抗体、抗体断片および抗体誘導体に関する。このような作用物質は、このような作用物質を含有する薬学的組成物の送達により種々の疾患または傷害の処置および／または防止に用いられ得る。
【０００２】
ＬＰＡは、種々の細胞型において多細胞応答、例えば増殖、分化、血管形成、運動性およびアポトーシスからの防御を媒介する生理活性脂質である。
【０００３】
ＬＰＡは、前増殖性腫瘍微小環境を提供し、血管形成を促進することにより、癌の確立および進行に関与する。さらに、ＬＰＡは、繊維症、眼性疾患、例えば黄斑変性、および疼痛関連障害と関連づけられてきた。したがって、ＬＰＡの中和への抗体ベースのアプローチは、これらの適応症のための最新療法の集積を増大する可能性を提供する。
【０００４】
本譲渡人は、ＬＰＡに対する高親和性の特定のモノクローナル抗体の一ファミリーを発明した。そのうちの１つは、Ｌｐａｔｈｏｍａｂとして既知である。癌、繊維症および眼性障害の種々の動物モデルにおけるＬｐａｔｈｏｍａｂの効力は、例えば悪性腫瘍、血管形成および繊維症関連障害の処置において、このクラスの抗ＬＰＡ抗体（およびそれらに由来する分子）の有用性を際立たせる。
【背景技術】
【０００５】
１．  序論
以下の記述は、本発明を理解するに際して有用であり得る情報を包含する。それは、本明細書中で提供される情報のいずれかが、または本明細書中で具体的にまたは無条件に参照される任意の出版物が特許請求される本発明に対する従来技術であるか、あるいは特に関連している、ということを容認するものではない。
２．  背景
Ａ．  生理活性シグナル伝達脂質
【０００６】
単なる構造的素子としてではなく、あるいは酸化、解糖またはその他の代謝過程のためのエネルギー源としてではなく、医学的研究のための重要な標的として、ある種の脂質およびそれらの誘導体が目下認識されている。特に、ある種の脂質は、動物およびヒト疾患において重要なシグナル伝達媒介物質として機能する。形質膜の脂質の大半は専ら構造的な役割を果たすが、しかしそれらの小部分は細胞中への細胞外刺激を中継するのに関与している。これらの脂質は、「生理活性脂質」または代替的には「生理活性シグナル伝達脂質」と呼ばれる。「脂質シグナル伝達」は、二次メッセンジャーとして細胞膜脂質を使用する多数の細胞シグナル伝達経路のいずれかを指し、ならびに脂質シグナル伝達分子とそれ自体の特定の受容体との直接的相互作用を指す。脂質シグナル伝達経路は、成長因子から炎症性サイトカインまでの範囲の種々の細胞外刺激により活性化され、アポトーシス、分化および増殖のような細胞運命決定を調節する。益々、生理活性脂質は同定され、それらの作用は特性化されているので、生理活性脂質シグナル伝達の探求は熱心な科学的研究の一領域である。
【０００７】
生理活性脂質の例としては、エイコサノイド（例えば、カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸およびイソエイコサノイド）、非エイコサノイド・カンナビノイド媒介物質、リン脂質およびそれらの誘導体、例えばホスファチジン酸（ＰＡ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、血小板活性因子（ＰＡＦ）およびカルジオリピン、ならびにリゾリン脂質、例えばリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および種々のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が挙げられる。生理活性脂質としては、スフィンゴ脂質、例えばスフィンゴミエリン、セラミド、セラミド−１−ホスフェート、スフィンゴシン、スフィンゴシルホスホリルコリン、スフィンガニン、スフィンガニン−１−ホスフェート（ジヒドロ−Ｓ１Ｐ）およびスフィンゴシン−１−ホスフェートも挙げられる。スフィンゴ脂質およびそれらの誘導体は、重要な細胞過程に及ぼす多面的作用を有する細胞外および細胞内シグナル伝達分子の一群を表す。生理活性シグナル伝達脂質の他の例としては、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ジアシルグリセリド（ＤＧ）、スルファチド、ガングリオシドおよびセレブロシドが挙げられる。
１．  リゾ脂質
【０００８】
リゾ脂質としても既知であるリゾホスホ脂質（ＬＰＬ）は、単一炭化水素主鎖およびリン酸基を含有する極性頭部基を含有する低分子量（典型的には約５００ダルトン未満）脂質である。いくつかのリゾ脂質は、生理活性シグナル伝達脂質である。医学的に重要な生理活性リゾ脂質の２つの特定例は、ＬＰＡ（グリセロール主鎖）およびＳ１Ｐ（スフィンゴイド主鎖）である。選定ＬＰＡ、Ｓ１ＰおよびジヒドロＳ１Ｐの構造を以下に提示する。
【化１】
2014523439.tif 000002
【０００９】
ＬＰＡの構造主鎖は、グリセロールベースのリン脂質、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）またはホスファチジン酸（ＰＡ）に由来する。リゾスフィンゴ脂質、例えばＳ１Ｐの場合、セラミド主鎖の脂肪酸は失われている。Ｓ１Ｐ、ジヒドロＳ１Ｐ（ＤＨＳ１Ｐ）およびスフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）の構造主鎖はスフィンゴシンを基礎にしており、これは、スフィンゴミエリンに由来する。
【００１０】
ＬＰＡおよびＳ１Ｐは、複数の膜貫通ドメインＧタンパク質結合（ＧＰＣＲ）受容体の同一クラスと結合することにより、種々の細胞質なる伝達経路を調節する。Ｓ１Ｐ受容体は、Ｓ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、Ｓ１Ｐ４およびＳ１Ｐ５（以前は、ＥＤＧ−１、ＥＤＧ−５／ＡＧＲ１６、ＥＤＧ−３、ＥＤＧ−６およびＥＤＧ−８）とよばれ、
ＬＰＡ受容体は、ＬＰＡ１、ＬＰＡ２、ＬＰＡ３（以前は、ＥＤＧ−２、ＥＤＧ−４およびＥＤＧ−７）と呼ばれる。このファミリーの第四のＬＰＡ受容体は、ＬＰＡ（ＬＰＡ４）に関して同定されており、これらのリゾホスホ脂質に関する他の推定受容体も報告されている。
【００１１】
ＬＰＡおよびＳ１Ｐは、Ｔ−およびＢ−リンパ球のような免疫関連細胞の調整を通して免疫応答において一役を果たすことが示されている。これらの脂質は、免疫応答の部位へのＴ細胞移動を促し、Ｔ細胞の増殖ならびに種々のサイトカインの分泌を調節する。特に、Ｓ１Ｐは、末梢循環へのリンパ球の脱出を制御すると考えられる。したがって、ＬＰＡおよびＳ１Ｐを結合する作用物質は、望ましくない過剰なまたは異常な免疫応答を減少させるための、そしてリンパ球の望ましくない、過剰なまたは異常な関与に関連した疾患および症状、例えばある種の血液学的癌および自己免疫疾患および／または異常な免疫応答を処置するための方法において有用であると考えられる。
ａ．  リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）
【００１２】
リゾホスファチジン酸（モノ−アシルグリセロール−３−ホスフェート、＜５００ダルトン）は、単一炭化水素主鎖およびリン酸基を含有する極性頭部基からなる。ＬＰＡは、単一分子存在物ではないが、しかし、種々の長さおよび飽和度の脂肪酸を伴う内因性構造変異体の集合である。したがって、本明細書中で用いられる場合、「ＬＰＡ」は、別記しない限り、生理活性ＬＰＡ変異体組を指す。ＬＰＡの生物学的関連変異体は、１８：２、１８：１、１８：０、１６：０および２０：４を含む。飽和脂肪酸（１６：０および１８：０）ならびに不飽和脂肪酸（１６：１、１８：１、１８：２および２０：４）を有するＬＰＡ種が、血清および血漿中で検出されている。１６：０、１８：１、１８：２および２０：４  ＬＰＡアイソフォームは、血中の優勢種である。有意レベル（＞１μΜ）の聖地活性ＬＰＡが、種々の体液中、例えば血清、唾液、濾胞液および悪性滲出液中で検出可能である。
【００１３】
本発明は、その態様の中で、以下でさらに詳細に記載されるように、過剰増殖性障害および種々のその他の障害を処置または防止するために有用である抗ＬＰＡ薬を提供する。特に、本発明のある実施形態は、ＬＰＡ、例えばＬＰＡの１８：２、１８：１、１８：０、１６：０および２０：４変異体（これらに限定されない）に対して標的にされる抗体にひきつけられる。
【００１４】
ＬＰＡは、真核生物および原核生物細胞の両方におけるリン脂質生合成の前駆体として長い間知られてきたが、しかしＬＰＡは、活性化細胞、特に血小板により迅速に産生され、放出されて、特定細胞表面受容体に作用することにより標的細胞に影響を及ぼすシグナル伝達分子として、近年出現したに過ぎない。小胞体中で合成され、より複雑なリン脂質二加工処理されることに加えて、ＬＰＡは、細胞活性化後に先在するリン脂質の加水分解により生成され得る；例えば、ｓｎ−２位置は、一般に、脱アシル化のために脂肪酸残基を失って、脂肪酸にエステル化されるｓｎ−３ヒドロキシルのみを残す。さらに、ＬＰＡの産生における重要な酵素であるオートタキシン（リゾＰＬＤ／ＮＰＰ２）は、多数の腫瘍型がａｕｔｏｔｏｘｉｎを上方調節するので、癌遺伝子の生成物であり得る。高感度および特定ＬＣ／ＭＣ手法を用いてなされた決定を含めて、ヒト血漿および血清中のＬＰＡの濃度が報告されている。例えば、２５℃で１時間放置した新たに調製されたヒト血清では、ＬＰＡ濃度は約１．２ｍＭと概算されており、ＬＰＡ類似体  １６：０、１８：１、１８：２および２０：４が優勢種である。同様に、２５℃で１時間放置した新たに調製されたヒト血漿では、ＬＰＡ濃度は約０．７ｍＭであると概算されており、１８：１および１８：２  ＬＰＡが優勢種である。
【００１５】
ＬＰＡは、主に、複数の膜貫通Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）の一クラスと結合することにより、その生物学的機能を調整する。５つのＬＰＡ特異的ＧＰＣＲｓ（ＬＰＡ１〜５と呼ばれる）が、今日までに同定されている；それらは、重複するおよび異なるシグナル伝達特性ならびに組織発現をともに示す。ＬＰＡ１〜３受容体は、いわゆるＧＰＣＲのＥＤＧサブファミリー（ＥＧＤ２／ＬＰＡ１、ＥＤＧ４／ＬＰＡ２およびＥＤＧ７／ＬＰＡ３）に属し、互いに５０％の配列類似性を有する。それらの最も近い類縁物は、カンナビノイドＣＢ１受容体で、これは、生理活性脂質  ２−アラキドノイル−グリセロール（２−ＡＧ）およびアラキドノイル−エタノールアミンを結合する。２つの新たに同定されたＬＰＡ受容体（ＬＰＡ４（以前は、ＧＰＲ２３／ｐ２ｙ９）およびＬＰＡ５（以前は、ＧＰＲ９２）と呼ばれる）は、Ｐ２Ｙヌクレオチド受容体とより緊密に関連している。さらに、ＬＰＡは、細胞内受容体  ＰＰＲｇａｍｍａを認識する。
【００１６】
ＬＰＡ１は、広範囲の組織および器官において発現されるが、一方、ＬＰＡ２およびＬＰＡ３は、より限定された発現プロフィールを示す。しかしながら、ＬＰＡ２およびＬＰＡ３発現は、卵巣および結腸癌、ならびに炎症において増大されることが示されており、これは、ＬＰＡ２およびＬＰＡ３の主な役割が病理生理学的症状におけるものであることを示唆している。
【００１７】
これらの受容体の役割は、一部は、マウスにおける受容体ノックアウト試験により解明されてきた。ＬＰＡ１欠損マウスは、嗅覚障害に起因する哺乳血管のため、部分的出生後致死を示す。ＬＰＡ１欠損マウスは、さらにまた、ブレオマイシン誘導性肺損傷に応答して肺繊維症から防御される。さらに、ＬＰＡ１受容体遺伝子を欠くマウスは、神経損傷誘導性神経障害性疼痛行動および現象を損失する。
【００１８】
これに対比して、ＬＰＡ２受容体を欠くマウスは、正常であるように見える。ＬＰＡ３受容体ノックアウトマウスは、胚盤胞着床遅延および胚間隔配置変更のため、サイズをほとんど低減せず、ＬＰＡ３欠損子宮は、低減されたシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）発現およびプロスタグランジン合成を示す；一方、ＬＰＡ３欠損雌マウスへのＰＧＥ２の外因性投与は、着床欠陥を救助することが報告されている。
【００１９】
ＬＰＡは、広範囲の生物学的応答、例えば細胞増殖の誘導、細胞移動および神経突起退縮の刺激、ギャップ結合閉鎖に、ならびに粘菌走化性にさえ影響を及ぼす。ＬＰＡ応答性に関して細胞形は益々試験されているので、ＬＰＡの生物学についての関連情報の主要部分は引き続き発展している。ＬＰＡの主な生理学的および病理生理学的作用としては、例えば以下のものが挙げられる：
創傷治癒：細胞成長および増殖を刺激するほかに、ＬＰＡは細胞張力および細胞表面フィブロネクチン結合を促すことが目下既知であり、これは、創傷修復および再生において重要な事象である。
アポトーシス：近年、抗アポトーシス活性もＬＰＡに帰せられてきており、ペルオキシソーム増殖受容体ガンマがＬＰＡに関する受容体／標的である、ということが近年報告されている。
血管成熟：オートタキシン（ＬＰＡ産生に関与する分泌リゾホスホリパーゼＤ）は、発生中の血管形成に不可欠である。さらに、不飽和ＬＰＡは、血管平滑筋細胞分化の誘導への主要誘因であると同定された。
水腫および血管透過性：ＬＰＡは、マウスにおける血漿滲出およびヒスタミン放出を誘導する。
炎症：ＬＰＡは、ヒト角膜上皮細胞における炎症媒介物質として作用する。ＬＰＡは、角膜創傷治癒に参加し、水晶体におけるＲＯＳの放出を刺激する。ＬＰＡは、ウサギ角膜におけるＨＳＶ−１を再活性化することもできる。
【００２０】
毒蜘蛛Loxosceles reclusa（ドクイトグモ）に噛まれると、重篤な、長期間持続する組織損害を引き起こし得る壊死性潰瘍を生じ、時として死に至ることもある。この蜘蛛に噛まれたことにより生じる創傷の病態は、ＡＡおよびプロスタグランジンにより媒介される強烈な炎症応答からなる。L. reclusa（ドクイトグモ）毒の主要構成成分は、ホスホリパーゼＤ酵素（しばしば、スフィンゴミエリナーゼＤ（ＳＭアーゼＤ）と呼ばれる）であって、これは、スフィンゴミエリンを加水分解して、Ｃ１Ｐを産生する。しかしながら、種々の頭部基を有するリゾホスホ脂質は、L. reclusa（ドクイトグモ）酵素により加水分解されてＬＰＡを放出する、ということが判明している。抗ＬＰＡ薬、例えば本発明のものは、種々の型の炎症、例えばL. reclusa（ドクイトグモ）毒注入に起因する炎症（これに限定されない）を低減するかまたは処置するのに有用である、と考えられる。
【００２１】
繊維症および瘢痕形成：ＬＰＡは、皮膚繊維芽細胞におけるＥＲＫ依存性経路を介して、Ｉ型コラーゲンｍＲＮＡ安定性のＴＧＦ媒介性刺激を抑制する。さらに、ＬＰＡは、コラーゲン遺伝子発現および繊維芽細胞の増殖を刺激することによるいくつかの直接的繊維形成作用を有する。
【００２２】
免疫応答：ＬＰＡは、Ｓ１Ｐ同様、免疫関連細胞の調整により免疫応答において一役を果たすことが示されている。これらの脂質は、免疫の部位へのＴ細胞移動を促進し、Ｔ細胞の増殖ならびに種々のサイトカインの分泌を調節する。
【００２３】
神経変性：血液脳関門を損害する事象後、ＬＰＡ活性は脳脊髄液内で増大され、ＣＮＳ内のＬＰＡのレベルは１０μＭまで増大すると仮定される。普通は検出不可能な，ｅｌｕＰＡ産生酵素オートタキシンのレベルは、成体脳の損傷に隣接する星状細胞中で増大して、ＣＮＳ損傷応答におけるＬＰＡに関する役割を支持する。マウス脳へのＬＰＡ注射は、損傷の部位での星状細胞反応性を誘導するが、一方、脊髄では、ＬＰＡは神経障害性疼痛および脱髄を誘導する。ＬＰＡは星状細胞増殖を刺激し得るが、その濃度によって、それは、アポトーシスによるまたは壊死による海馬ニューロンの死を促進し得る。さらに、ＬＰＡは小神経膠活性化を媒介し、神経微小血管内皮に対して細胞傷害性である。さらに、ＬＰＡは、神経幹細胞／始原細胞（ＮＳ／ＰＣ）の死を誘導し、ニューロンへのそれらの分化（他の炎症性分子の付加により抑圧されない作用）を抑制する。さらに、ＬＰＡは、神経膠細胞への神経幹細胞分化を保持し、それゆえ、神経膠新生および炎症に関与する。ＬＰＡは、外傷性脳損傷、脊髄損傷および神経変性障害、例えばパーキンソン病、アルツハイマー病および多発性硬化症、を含めた神経損害および／または損傷後の修復の結果に重要な作用を及ぼすということを、他のデータが文献とともに強く示唆している。
【００２４】
疼痛：ＬＰＡが神経障害性疼痛において調節不全にされ得るという、そしてＬＰＡが疼痛応答において原因となり得るが、同時発生的ではないということを強力に示唆する多数の科学研究が漸増している。その結果として、ＬＰＡそれ自体またはＬＰＡ経路を標的２−スルホ−９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＳ）薬剤は、神経障害性疼痛を緩和する能力を有し得る。ＬＰＡは、成長円錐および過程退縮、ならびに細胞の生存、移動、接着および増殖といったような過程に影響を及ぼす神経系における重要な媒介物質であることが示されている。神経障害性疼痛の発症におけるＬＰＡの有意の役割は、種々の薬理学的および遺伝学的アプローチを用いて確立されている。したがって、拮抗性ＬＰＡは、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、化学療法誘導性疼痛、ならびに神経損傷または外傷に起因する疼痛の処置に有益である。
【００２５】
したがって、ＬＰＡの有効濃度を低減する作用物質、例えばLpathの抗ＬＰＡモノクローナル抗体は、創傷治癒および繊維症、アポトーシス、血管形成および新血管新生、血管透過性および炎症といったような疾患および症状を処置するための方法に有用であると考えられる。異常レベルのＬＰＡに関連した疾患は、ＬＰＡを結合し、中和する抗体による処置に特に適していると考えられる。
【００２６】
天然ＬＰＡに対するポリクローナル抗体が文献で報告されている（Chen, et al. (2000), Bioorg Med Chem Lett., Aug 7; 10(15): 1691-3）が、しかしモノクローナル抗体は、ＬＰＡに対するいくつかのモノクローナル抗体、例えばヒト化モノクローナル抗体を本出願人等が開発するまで、記載されたことはなかった。例えば米国特許出願公開第２０１０００３４８１４号（これは当該出願と権利者が共通で、その記載内容は参照により本明細書中で援用される）を参照。これらの抗ＬＰＡ抗体は、種々のＬＰＡと結合し、中和し得るし、その生物学的および薬理学的作用を緩和し得る。したがって、抗ＬＰＡ抗体は、過剰な、望ましくない、または異常レベルのＬＰＡに関連した種々の疾患および症状の防止および／または処置に有用であると考えられる。
【００２７】
ＬＰＡを検出する迅速且つ具体的方法も、所望されている。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）とその後のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）および／または質量分光分析（ＭＳ）といったような技法を用いて、ＬＰＡのようなリン脂質を分離し、半定量的に測定するための方法が既知である。例えば、脂質は、体液の試験試料から抽出され得る。代替的には、薄層クロマトグラフィーを用いて、種々のリン脂質を分離し得る。リン脂質およびリゾリン脂質は、次に、例えば紫外線を用いてプレート上に可視化され得る。代替的には、リゾリン脂質濃度は、リン脂質からの、またはリン脂質の一部としての単離後に、ＮＭＲまたはＨＰＬＣにより同定され得る。ＬＰＡレベルは、さらにまた、培養中の真核生物細胞に及ぼすリゾＰＡ特異的作用に依っている検定を用いて、卵巣癌患者からの腹水中で確定されている。しかしながら、これらの従来の手法は、時間を要し、費用が掛かり、可変的で、そして典型的には半定量的であるに過ぎない。生物学的流体中のＬＰＡのようなリゾリン脂質を検出するための、ならびにリゾリン脂質のレベル変更に関連した症状と相関させ、検出するための酵素的方法も既知であり、例えば米国特許第６，２５５，０６３号および第６，２４８，５５３号に開示されている。ここに開示される抗体は、ＬＰＡの検出のための高感度且つ具体的方法のための基礎を提供する。
３．  定義
【００２８】
本発明を詳細に記述する前に、本発明の状況で用いられるいくつかの用語を定義する。これらの用語に加えて、他の用語は、必要に応じて本明細書中の他の箇所で定義される。本明細書中で別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語は、それらの当該技術分野で認識された意味を有する。
【００２９】
「異常な」という用語は、例えば細胞標的、例えばタンパク質または生理活性脂質のレベルまたは有効濃度に関して、過剰なまたは望ましくないことを意味する。
【００３０】
「抗体」（「Ａｂ」）または「免疫グロブリン」（「Ｉｇ」）という用語は、抗原またはエピトープを結合し得る免疫グロブリン遺伝子またはその断片に由来するか、その後に形作られるかまたはそれによりコードされる任意の型のペプチド、ポリペプチを指す。例えば、Immunobiology, Fifth Edition, C.A. Janeway, P. Travers, M., Walport, M.J. Shlomchiked., Garland Publishing (2001)を参照。「抗体」という用語は、最も広い意味で本明細書中で用いられ、モノクローナル、ポリクローナルまたは多特異的抗体、ミニボディ、ヘテロ共役体、ジアボディ、トリアボディ、キメラ、抗体、合成抗体、抗体断片、ならびに親抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を用いる結合作用物質（または抗原結合活性を保有するその変異体）を包含する。所望の活性としては、抗原を特異的に結合する能力、in vitroで増殖を抑制する能力、in vivoで血管形成を抑制する能力、およびin vitroでサイトカインプロフィール（単数または複数）を変更する能力が挙げられる。本明細書中で、抗体および抗体断片、変異体および誘導体も「免疫誘導部分」として言及され得る。すなわち、このような分子または少なくともその抗原結合部分（単数または複数）は、抗ＬＰＡ抗体に由来する。
【００３１】
ネイティブ抗体（ネイティブ免疫グロブリン）は、通常は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であって、典型的には、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の長（Ｈ）鎖からなる。各軽鎖は、典型的には、１つの共有ジスルフィド結合により長鎖と連結され、一方、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの長鎖間で変化する。各長鎖および軽鎖は、調節的に間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各長鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）（可変ドメインとしても言及される）を有し、その後に、多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、およびその他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと一列に並べられ、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一列に並べられる。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメイン間の界面を形成する。「可変ドメイン」および「可変領域」という用語は、互換的に用いられる。「定常ドメイン」および「定常領域」という用語も、互いに交換可能である。
【００３２】
ＶＨおよびＶＬ領域の各々における３つの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとしても既知）は、分子の独特の抗原結合部位を形成する。抗体分子中のアミノ酸配列変異のほとんどがＣＤＲ内にある、その抗原に対するその特異性を抗体に与える。
【００３３】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、それらの定常ドメインの朝配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明らかに異なる型のうちの１つに割り当てられ得る。
【００３４】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには以下の５つの主なクラスが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ。これらのうちのいくつかは、さらに以下のサブクラス（アイソタイプ）に分けられる：例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する長鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は、周知である。
【００３５】
「抗体誘導体」は、免疫誘導部分、すなわち抗体に由来する分子である。これは、例えば抗体変異体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、多価抗体、抗体共役体等を包含し、これらは抗原に関する所望レベルの結合活性を保持する。
【００３６】
本明細書中で用いる場合、「抗体断片」は、無傷抗体の抗原結合部位または可変ドメインを含む無傷抗体の一部分を指し、この場合、当該部分は無傷抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）を含有し得ない。代替的には、定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）は、「抗体断片」中に含まれ得ない。抗体断片は抗原結合を保持し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖ断片；ジアボディ；トリアボディ；一本鎖抗体分子（ｓｃ−Ｆｖ）；ミニボディ、ナノボディおよび多特異性抗体（抗体断片から形成される）を包含する。抗体のパパイン消化は、２つの同一抗原結合断片（「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々が単一抗原結合部位を有する）を生じ、残りの「Ｆｃ」断片は、この名前が示すように容易に結晶化し得る。ペプシン処置は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋し得るＦ（ａｂ’）２断片を産生する。例として、Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。「Ｆｖ」は、完全抗原認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。この領域は、密な非共有的関係の１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。それは、各可変ドメインの３つの超可変領域がＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を限定するよう相互作用する、というこの立体配置で存在する。集合的に、６つの超可変領域が抗体に特異的に抗原結合を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有するが、しかし完全結合部位より低い親和性で有する。「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含むが、この場合、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖに抗原結合のための所望の構造を形成させるＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの再検討のためには、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag,  New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。
【００３７】
Ｆａｂ断片も、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステイン（単数または複数）を含めて重鎖ＣＨ１のカルボキシル末端に少数の残基を付加することにより、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨはＦａｂ’に関する本明細書中での呼称であって、この場合、定常ドメインのシステイン残基（単数または複数）は遊離チオール基を保有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元来、Ｆａｂ’断片の対として産生され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片のその他のキメラカップリングも既知である。
【００３８】
「抗体変異体」（この場合、抗ＬＰＡ抗体変異体）は、本明細書中では、抗体配列中の１つ以上のアミノ酸残基（単数または複数）の付加、欠失および／または置換に基づいてネイティブ抗ＬＰＡ抗体アミノ酸配列とアミノ酸配列が異なる、そして親抗結合抗体の少なくとも１つの所望の活性を保持する分子を指す。所望の活性としては、抗原を特異的に結合する能力、in vitroで増殖を抑制する能力、in vivoで血管形成を抑制する能力、およびin vitroでサイトカインプロフィールを変更する能力が挙げられる。抗体変異体におけるアミノ酸変化（単数または複数）は、軽鎖および／または重鎖の可変ドメインまたは定常領域内に、例えばＦｃ領域、Ｆａｂ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびヒンジ領域において存在し得る。一実施形態では、変異体は、親抗体の１つ以上の超可変領域（単数または複数）における１つ以上のアミノ酸置換（単数または複数）を含む。例えば、変異体は、親抗体の１つ以上の超可変領域における少なくとも１つの、例えば約１〜約１０、好ましくは約２〜約５つの置換を含み得る。普通は、変異体は、親抗体重鎖または軽鎖可変ドメイン配列と少なくとも６５％の、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの状況においては、少なくとも５０％の配列同一性が好ましく、この場合、当該分子の他の特質は、例えば結合および特異性といったような所望の属性を伝える。この配列に関する同一性または相同性は、必要な場合、最大配列同一性パーセントを達成するために、配列を一列に並べ、ギャップを導入した後の、親抗体残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして、本明細書中で定義される。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端または内部の伸長、欠失または挿入はどれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼすとは考えられない。変異体は、ＬＰＡを結合する能力を保持し、好ましくは、親抗体のものより優れた所望の活性を有する。例えば変異体は、より強い結合親和性、血管形成を低減するおよび／または腫瘍進行を停止する能力増強を示す。このような所望の特性（例えば、低免疫原性、より長い半減期、増強された安定性、増強された効力）を分析するためには、例えば抗スフィンゴ脂質抗体のフォーマットが本明細書中で開示される生物学的活性検定におけるその活性に影響を及ぼすということが判明しているため、変異体のＦａｂ型を親抗体のＦａｂ型と、あるいは変異体の全長型を親抗体の全長型と比較すべきである。本明細書中の特定の当該変異体交代は、少なくとも１つの所望の活性の少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約％５、２５、５９またはそれ以上を示すものであり得る。好ましい変異体は、in vitroで測定した場合に優れた生物物理学的特性を有するか、あるいは親抗体と比較した場合に、in vitroまたはin vivoで測定して生物学的である優れた活性を有するものである。
【００３９】
「抗ＬＰＡ薬」は、ＬＰＡを結合する任意の治療薬を指し、ＬＰＡおよびその変異体を結合する抗体、抗体変異体、抗体由来分子または非抗体由来部分を包含する。
【００４０】
「生理活性脂質」は、脂質シグナル伝達分子を指す。生理活性脂質は、それらが細胞外および／または細胞内シグナル伝達を媒介し、したがって分化、移動、増殖、分泌、生存およびその他の過程を調整することにより多数の型の細胞の機能を制御するのに関与するという点で、構造脂質（例えば膜結合リン脂質）とは区別される。in vivoでは、生理活性脂質は細胞外流体中に見出され得るが、この場合、それらは他の分子と、例えば血清タンパク質、例えばアルブミンおよびリポタンパク質と複合体を形成され得るし、あるいは「遊離」形態で、すなわち別の分子種と複合体を形成しない。細胞外媒介物質として、いくつかの生理活性脂質は、膜結合イオンチャンネル、またはＧＰＣＲまたは酵素または因子を活性化し、これが順次、複合シグナル伝達系を活性化して、細胞機能または生存における変化を生じることにより、細胞シグナル伝達を変更する。細胞内媒介物質として、生理活性脂質は、細胞内構成成分、例えば酵素、イオンチャンネルまたは構造素子、例えばアクチンと直接的に相互作用することにより、それらの働きを発揮し得る。
【００４１】
生理活性脂質の例としては、スフィンゴ脂質、例えばセラミド、セラミド−１−ホスフェート（Ｃ１Ｐ）、スフィンゴシン、スフィンガニン、スフィンゴシルホスホリルコリン（ＳＰＣ）およびスフィンゴシン−１−ホスフェートが挙げられる。スフィンゴ脂質ならびにそれらの誘導体および代謝物質は、スフィンゴイド主鎖（スフィンゴミエリン由来）により特性化される。スフィンゴ脂質ならびにそれらの誘導体および代謝物質は、重要な細胞過程に及ぼす多面的作用を有する細胞外および細胞内シグナル伝達分子の一群を表す。それらは、スルファチド、ガングリオシドおよびセレブロシドを包含する。その他の生理活性脂質は、グリセロールベースの主鎖により特性化される；例えば、リゾリン脂質、例えばリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）および種々のリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ならびにホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＡ）、ホスファチジン酸、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびジアシルグリセリド（ＤＧ）が挙げられる。さらに別の生理活性脂質は、アラキドン酸に由来する；これらの例としては、エイコサノイド（例えば、エイコサノイド代謝物質、例えばＨＥＴＥ、カンナビノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン、リポキシン、エポキシエイコサトリエン酸およびイソエイコサノイド）、非エイコサノイド・カンナビノイド媒介物質が挙げられる。その他の生理活性脂質、例えばその他のリン脂質およびそれらの誘導体も、本発明に従って用いられ得る。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態では、スフィンゴシンベースの生理活性脂質（スフィンゴイド主鎖を有するもの、例えばスフィンゴシンおよびＳ１Ｐ）に対比するものとして、抗体産生のためにグリセロールベースの生理活性脂質（グリセロール油ファイの主鎖を有するもの、例えばＬＰＡ）を標的にすることが選択可能であり得る。他の実施形態では、抗体生成のためにアラキドン酸由来の生理活性脂質を標的にすることが所望され得るし、他の実施形態では、アラキドン酸由来およびグリセロール由来の生理活性脂質が好ましいが、しかしスフィンゴイド由来の生理活性脂質は選択されない。アラキドン酸由来およびグリセロール由来の生理活性脂質はともに、「非スフィンゴイド生理活性脂質」と本明細書中で言及され得る。
【００４３】
具体的には、本発明による生理活性脂質のクラスから除外されるのは、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルセリン、ならびに細胞膜の内部および／または外部小葉の構造成員として主に機能するそれらの代謝物質および誘導体である。
【００４４】
「生物学的に活性な」という用語は、抗体あるいは抗体断片または変異体の状況では、所望のエピトープと結合し得る、そしてなんらかの方法で生物学的作用を発揮する抗体あるいは抗体断片または抗体変異体を指す。生物学的作用としては、成長シグナルの調整、抗アポトーシスシグナルの調整、アポトーシスシグナルの調整、エフェクター機能カスケードの調整およびその他のリガンド相互作用の調整が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
「バイオマーカー」は、身体における特定の生化学物質であって、これは、疾患の進行または処置の効果を測定するためにそれを有用にする特別な分子特徴を有する。例えば、Ｓ１Ｐは、ある種の過剰増殖性および／または心臓血管性症状に関するバイオマーカーである。
【００４６】
「心臓血管療法」は、心臓療法（心筋虚血および心不全の処置）ならびに心臓血管系に関連したその他の疾患、例えば心臓疾患の防止および／または処置を包含する。「心臓疾患」という用語は、心臓または心筋組織に関与する任意の型の疾患、障害、外傷または外科的処置を包含する。特に興味深いのは、組織リモデリングに関連した症状である。「心臓治療薬」という用語は、心臓により引き起こされるかまたは心臓に関連した疾患、ならびに心筋性の疾患および障害に対して治療性である作用物質を指す。
【００４７】
「担体」は、ハプテンとの共役のために適合され、それによりハプテンを免疫原性にする部分を指す。代表的担体としては、タンパク質、例えばアルブミン、カギアナカサガイヘモシアニン、ヘマグルタニン、破傷風およびジフテリア毒素が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に従って用いるのに適したその他のクラスの担体の例が、当該技術分野で既知である。これらの、ならびに後に発見されるかまたは発明された天然または合成担体は、本発明に従った用途のために適合され得る。
【００４８】
本明細書中で用いる場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」という表現は互換的に用いられ、このような呼称はすべて、子孫を包含する。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、移入の回数にかかわらず、一次対象細胞およびそれに由来する培養を包含する。意図的な、または故意ではない突然変異のため、すべての子孫がＤＮＡ含量が精確に等しいというわけではない、とも理解される。元の形質転換化細胞でスクリーニングした場合と同一の機能または生物学的活性を有する突然変異化子孫が包含される。別個の呼称が意図される場合、それは状況から明らかである。
【００４９】
「化学療法薬」という用語は、抗癌薬およびその他の抗過剰増殖薬を意味する。したがって、化学療法薬は、概して治療薬の一亜組である。化学療法薬としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＤＮＡ損傷剤およびＤＮＡ合成を抑制する作用物質：アントラサイクリン（ドキソルビシン、ドノルビシン、エピルビシン）、アルキル化剤（ベンダムスチン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、イフォスファミド、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、ミトタン、マイトマイシン、ピポブロマン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、チオテパおよびトリエチレンメラミン）、プラチナ誘導体（シスプラチン、カルボプラチン、シスジアミン−ジクロロプラチナ）およびトポイソメラーゼ阻害薬（カンプトサル）；抗代謝物質、例えばカペシタビン、クロロデオキシアデノシン、シタラビン（およびその活性化形態、アラ−ＣＭＰ）、シトシンアラビノシド、ダカバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、５−ＤＦＵＲ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ペントスタチン、トリメトレキサート、６−チオグアニン）；抗血管形成薬（ベバシズマブ、サリドマイド、スニチニブ、レナリドミド、ＴＮＰ−４７０、２−メトキシエストラジオール、ラニビズマブ、ソラフェニブ、エルロチニブ、ボルテゾミブ、ペガプタニブ、エンドスタチン）；血管崩壊剤（フラボノイド／フラボン、ＤＭＸＡＡ、コンブレタスタチン誘導体、例えばＣＡ４ＤＰ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２Ａ等）；生物学的製剤、例えば抗体（ヘルセプチン、アバスチン、パノレクス、リツキシン、ゼバリン、ミロタルグ、カムパス、ベキサール、エルビタックス）；内分泌療法：アロマターゼ阻害薬（４−ヒドロアンドロステンジオン、エクセメスタン、アミノグルテチミド、アナストラゾール、レトゾール）、抗エストロゲン薬（タモキシフェン、トレミフィン、ラオキシフェン、ファスロデックス）、ステロイド、例えばデキサメタゾン、；免疫調節薬：サイトカイン、例えばＩＦＮ−ベータおよびＩＬ２）、インテグリン、その他の接着タンパク質およびマトリックスメタロプロテイナーゼに対する阻害薬）；ヒストンデアセチラーゼ阻害薬、例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸；シグナル伝達の阻害薬、例えばチロシンキナーゼの阻害薬、例えばイマチニブ（グリーベック）；ヒートショックタンパク質の阻害薬、例えば１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン；レチノイド、例えばすべてのトランスレチノイン酸；成長因子受容体の阻害薬または成長因子それ自体；抗有糸分裂化合物および／またはチューブリン−脱重合剤、例えばタキソイド（パクリタキセル、ドセタキセル、タキソテレ、ＢＡＹ  ５９−８８６２）、ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシンおよびビノレルビン；抗炎症薬、例えばＣＯＸ阻害薬および細胞周期調節薬、例えばチェックポイント調節薬およびテロメラーゼ阻害薬。
【００５０】
「キメラ」抗体（または免疫グロブリン）という用語は、特定の種に由来するかまたは特定抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同である重鎖および／または軽鎖を含む分子をさすが、一方、鎖（単数または複数）の残りのものは、それらが所望の生物学的活性を示す限り、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスまたはサブクラス、ならびにこのような抗体の断片における対応する配列と同一であるかまたは相同である（Cabilly, et al., infra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 81 :6851 (1984)）。キメラ抗体の一例は、ネズミ可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）およびヒト定常ドメインを含有する抗体である。しかしながら、抗体配列は、脊椎動物または無脊椎動物起源であり、例えば哺乳類、鳥類または魚類、例えば軟骨魚類、齧歯類、イヌ、ネコ、有蹄動物および霊長類からであり得る。
【００５１】
「併用療法」という用語は、指示された治療効果を達成するために少なくとも２つの異なる療法の提供を包含する治療レジメンを指す。例えば、併用療法は、２つ以上の化学的に異なる活性成分、例えば迅速作用性化学療法薬および抗脂質抗体の投与を包含し得る。代替的には、併用療法は、抗脂質抗体および／または１つ以上の化学療法薬を、単独で、または別の処置、例えば放射線療法および／または外科手術と一緒に投与することを包含し得る。２つ以上の化学的に異なる活性成分の投与の状況では、活性成分は同一組成物の一部として、または異なる組成物として投与され得る、と理解される。別個の組成物として投与される場合、異なる活性成分を含む組成物は、特別な状況が必要とするように、および担当医により決定されるように、同一のまたは異なる用量投与レジメンを用いて、同一のまたは異なる経路により、同時にまたは異なる時点で投与され得る。同様に、１つ以上の抗脂質抗体種、例えば抗ＬＰＡ抗体が、単独でまたは１つ以上の化学療法薬と一緒に、例えば放射線および／または外科手術と併用される場合、薬剤（単数または複数）は外科手術または放射線処置の前または後に送達され得る。
【００５２】
「制御配列」という表現は、特定の宿主生物体における操作可能的に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列としては、例えばプロモーター、任意にオペレーター配列およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが既知である。
【００５３】
「誘導体化生理活性脂質」は、極性頭部基および少なくとも１つの炭化水素鎖を有する生理活性脂質、例えばＬＰＡであって、この場合、炭化水素鎖内の炭素原子は、保護されることもされないこともあるペンダント反応基（例えば、スルフヒドリル（チオール）基、カルボン酸基、シアノ基、エステル、ヒドロキシル基、アルケン、アルキン、酸塩化物基またはハロゲン原子）で誘導体化される。この誘導体化は、分子との反応のために、例えば担体との共役のために生理活性脂質を活性化するのに役立つ。
【００５４】
「誘導体化生理活性脂質共役体」は、担体と共有的に共役される誘導体化生理活性脂質を指す。担体は、タンパク質分子であり得るし、あるいはポリエチレングリコール、コロイド金、アジュバントまたはシリコーンビーズのような部分であり得る。誘導体化生理活性脂質共役体は、本発明による抗体応答を生じさせるための免疫原として用いられ得るし、同一のまたは異なる生理活性脂質共役体は、このように産生された抗体を検出するための検出試薬として用いられ得る。いくつかの実施形態では、誘導体化生理活性脂質共役体は、検出のために用いられる場合、固体支持体と結合される。
【００５５】
「ジアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する小抗体断片を指し、この断片は、同一ポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と連結される重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。同一鎖上の２つのドメイン間で対合させるには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合されて、２つの抗原結合部位を作る。ジアボディは、例えばＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；およびHollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)でさらに詳細に記載されている。
【００５６】
「有効濃度」は、例えばある望ましくない生理活性脂質の絶対、相対的、および／または利用可能な濃度および／または活性を指す。言い換えれば、生理活性脂質の有効濃度は、利用可能な、そしてその生物学的機能を実施し得る脂質の量である。本発明において、免疫誘導部分、例えば生理活性脂質（例えばＣ１Ｐ）に向けられるモノクローナル抗体は、脂質と結合し、それがその生物学的機能を実施できなくさせることにより、脂質の有効濃度を低減し得る。この例では、脂質それ自体は依然として存在する（言い換えれば、それは抗体により分解されない）が、しかしもはやその受容体または他の標的を結合して、下流作用を生じることができず、そこで、絶対濃度よりむしろ「有効濃度」が、適切な測定値である。生理活性脂質の有効濃度を下げることは、標的脂質またはその望ましくない作用、例えば下流作用を「中和する」としても言及される。生理活性脂質の有効濃度を直接的および／または間接的に測定するための方法および検定が存在する。
【００５７】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体に由来する抗体抗原結合部分と反応する抗原の当該部分を指す。
【００５８】
「発現カセット」という用語は、このような配列と互換性のある宿主中の構造遺伝子（すなわち、タンパク質コード配列、例えば本発明の抗体）の発現に影響を及ぼし得るヌクレオチド分子を指す。発現カセットは、少なくとも、ポリペプチドコード配列と、そして任意に他の配列、例えば転写終結シグナルと操作可能的に連結されるプロモーターを包含する。発現を実行するのに必要なまたは役に立つ付加的調節素子、例えばエンハンサーも用いられ得る。したがって、発現カセットは、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え「裸ＤＮＡ」ベクター等を包含する。
【００５９】
「完全ヒト抗体」は、適切な免疫原を与えられると、ＣＤＲグラフティングを必ずしも必要とせずにヒト抗体を産生し得る遺伝子工学処理（すなわちトランスジェニック）動物、典型的には哺乳動物、通常はマウス（例えばMedarexから入手され得る）において、産生される抗体を表し得る。これらの抗体は、非ヒト抗体遺伝子が取り替えられるかまたは抑圧されて、ヒト免疫グロブリン遺伝子のいくつかまたはすべてと取り替えられる動物（例えばトランスジェニックマウス）からそれらが生じるという点で、完全に「ヒト」である。言い換えれば、本発明の抗体は、関連ＣＤＲに関するヒトフレームワークを産生するよう遺伝子工学処理されたマウスまたは他の動物に免疫原形態で与えられる場合に、生理活性脂質、具体的にはＬＰＡに対して生成されるものを包含する。
【００６０】
「ハプテン」は、非免疫原性であるが、しかし抗体または抗体由来の抗原結合部分と反応し得る物質である。言い換えれば、ハプテンは、抗原性の特性を有するが、しかし免疫原性ではない。ハプテンは、一般に、ほとんどの環境下で、担体、例えばタンパク質、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、コロイド金、シリコーンビーズ等と結合される場合にのみ、免疫応答を引き出し得る（すなわち、抗原として作用する）小分子である。担体は、それ自体、免疫応答を引き出さないものであり得る。
【００６１】
「ヘテロ接合型抗体」は、２つの共有的に連結された抗体を示し得る。このような抗体は、合成タンパク質化学における既知の方法を用いて、例えば架橋剤を用いて調製され得る。本明細書中で用いる場合、「接合体」という用語は、１つ以上の抗体断片（単数または複数）または結合部分と１つ以上のポリマー分子（単数または複数）との共有結合により形成される分子を指す。
【００６２】
「ヒト化」型の非ヒト（例えば、ネズミ）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小量の配列を含有するキメラ抗体である。あるいは、別の点に注目すると、ヒト化抗体は、ヒト配列の代わりに非ヒト（例えば、ネズミ）抗体からの選択配列も含有するヒト抗体である。ヒト化抗体は、その結合および／または生物学的活性を有意に変更しない同一のまたは異なる種からの保存的アミノ酸置換または非天然残基を含み得る。このような抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小量の配列を含有するキメラ抗体である。大部分、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、所望の特性を有する非ヒト種のＣＤＲ（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ラクダ、ウシ、ヤギまたはウサギからの残基により取り替えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に取り替えられる。
【００６３】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中にも移入ＣＤＲまたはフレームワーク配列中にも見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練し、最大化する。したがって、概して、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、そして一態様では２つの、可変ドメインをすべて含むが、この場合、すべてのまたは超可変ループのうちのすべてが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、すべてのまたは実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、またはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分も含む。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号（Cabilly等）;欧州特許第０，１２５，０２３  Ｂ１号（Cabilly等）;米国特許第４，８１６，３９７号（Boss等）;欧州特許第０，１２０，６９４  Ｂ１号（Boss等）;ＷＯ  ８６／０１５３３（Neuberger等）;欧州特許第０，１９４，２７６  Ｂ１号（Neuberger等）;米国特許第５，２２５，５３９号（Winter）;欧州特許第０，２３９，４００  Ｂ１号（Winter）;欧州特許出願第０，５１９，５９６  Ａ１号（Padlan等）; Queen, et al. (1989), Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, vol. 86:10029-10033)を参照されたい。さらなる詳細に関しては、Jones, et al., Nature 321 :522-525 (1986); Reichmann, et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、ならびにＷＯ２００６１０５０６２（Hansen）を参照。
【００６４】
「過剰増殖性障害」という用語は、細胞の非制御化増殖、例えば癌および良性腫瘍を生じる器官および組織細胞の非制御化成長（これらに限定されない）に関連した疾患および障害を指す。内皮細胞に関連した過剰増殖性障害は、血管形成の疾患、例えば血管腫、子宮内膜症、肥満症、加齢性黄斑変性および種々の網膜疾患、ならびにアテローム硬化症の処置におけるステントの結果として再狭窄を引き起こす内皮細胞および平滑筋細胞の増殖を生じ得る。繊維芽細胞に関与する過剰増殖性障害（すなわち、繊維形成）としては、過剰瘢痕の障害（すなわち繊維症）、例えば、加齢性黄斑変性、心臓リモデリングおよび心筋梗塞に関連した不全、ならびに例えば外科手術または損傷、ケロイドおよび類繊維腫およびステントの結果として一般に生じるような過剰創傷治癒が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
「免疫原」は、特異的免疫応答、特に免疫原が投与された動物における抗体応答を誘導し得る分子である。本発明において、免疫原は、担体と共役される誘導体化生理活性脂質、すなわち「誘導体化生理活性脂質共役体」である。免疫原として用いられる誘導体化生理活性脂質共役体は、免疫原に応答して生成される抗体の検出のための捕捉物質として用いられ得る。したがって、免疫原は、検出試薬としても用いられ得る。代替的には、捕捉物質として用いられる誘導体化生理活性脂質共役体は、免疫原におけるものとは異なるリンカーおよび／または担体部分を有し得る。
【００６６】
「抑制する」ことは、生物学的現象の状況では、減少させる、抑圧するまたは遅延することを意味する。例えば、「腫瘍形成の抑制」を生じる処置は、腫瘍が全く生じないか、あるいはそれらが非処置対照より遅く生じるか、または数が少ない、ということを意味する。
【００６７】
「単離」組成物は、その天然環境の一構成成分から同定され、分離され、および／または回収されたものである。その天然環境の夾雑構成成分は、抗体に関する診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質様または非タンパク質様溶質を包含する。好ましい実施形態では、組成物は抗体であり、（１）ローリー法により確定した場合に９５重量％より高い、最も好ましくは９９重量％より高い抗体に、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用により、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、あるいは（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いて還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質に、精製される。単離抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないため、組換え細胞内でin situに抗体を含む。しかしながら、普通は、単離抗体は少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
【００６８】
「標識」という語は、本明細書中で用いられる場合、検出可能な化合物または組成物、例えば抗体と直接または間接的に共役されるものを指す。標識は、それ自体、検出可能であり得るし（例えば放射性同位体標識または蛍光標識）、あるいは酵素標識の場合には、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒し得る。
【００６９】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質および／または哺乳動物への薬剤（例えば、本明細書中に開示される抗スフィンゴ脂質抗体、および任意に化学療法薬）の送達のために有用である界面活性剤からなる小胞である。リポソームの構成成分は、生物学的膜の脂質配列と同様に、二重層形成で一般に整列される。「単離」核酸分子は、それが通常は抗体核酸の天然源と会合される少なくとも１つの夾雑核酸分子から同定され、分離される核酸分子である。単離核酸分子は、それが実際に見出される形態または設定以外である。したがって、単離核酸分子は、それが天然細胞中に存在するような核酸分子から区別される。しかしながら、単離核酸分子は、通常、抗体を発現する細胞中に含有される核酸分子を包含するが、この場合例えば核酸分子は、非工学処理細胞のものとは異なる染色体位置にある。
【００７０】
本発明の状況では、「液体組成物」は、最終ユーザー（例えば、医者または看護士）のためにメーカーから提供されるようなその充填および完成形態で、固体に対比して液体または溶液であるものを指す。ここで、「固体」は、液体または溶液でない組成物を指す。例えば、固体は、凍結乾燥、フリーズドライ、沈澱および同様の手法により調製される乾燥組成物を包含する。
【００７１】
「線状抗体」という表現は、本出願全体を通して用いられる場合、Zapata, et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を指す。要するに、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は、二重特異性または単一特異性であり得る。
【００７２】
「代謝物質」という用語は、ＬＰＡがそれから作られる化合物、ならびにＬＰＡの分解に起因するもの；すなわち、リゾリン脂質代謝経路に関与する化合物を指す。「代謝前駆体」という用語は、スフィンゴ脂質がそれから作られる化合物に言及するために用いられ得る。
【００７３】
「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、本明細書中で用いる場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体、あるいは前記抗体集団を指す。当該集団を構成する個々の抗体は本質的に同一であるが、但し、少量で存在し得る天然突然変異が考えられる。モノクローナル抗体は非常に特異的で、単一抗原部位に対して向けられる。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して向けられることなる抗体を包含する慣用的（ポリクローナル）抗体調製物に対比して、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して向けられる。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られるもののような抗体の特質を指し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするよう意図されない。例えば、本発明に従って用いられるべきモノクローナル抗体は、Kohler, et al., Nature 256: 495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作製され得るか、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）により作製され得る。「モノクローナル抗体」はさらにまた、例えばClackson, et al., Nature 352:624-628 (1991)およびMarks, et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載された技法を用いて、あるいは当該技術分野で既知の他の方法により、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。モノクローナル抗体は、本明細書中では具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同であり、一方、鎖（単数または複数）の残りは別の種に由来するかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびに所望の生物学的活性を有する限りはこのような抗体の断片中の対応する配列と同一であるかまたは相同であるキメラ抗体を包含する（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984)）。
【００７４】
「単一療法」は、経時的に単一回用量投与でも、または数回用量として投与される場合であっても、１つの治療的に有効な化合物の送達を基礎にした処置レジメンを指す。
【００７５】
「多重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なるエピトープに関する結合特性を有する抗体またはモノクローナル抗体を示し得る。一実施形態では、エピトープは同一抗原からである。別の実施形態では、エピトープは２つ以上の異なる抗原からである。多重特異性抗体の作製方法は、当該技術分野で既知である。多重特異性抗体としては、二重特異性抗体（２つのエピトープに関する結合特性を有する）、三重特異性抗体（３つのエピトープ）等が挙げられる。例えば、多重特異性抗体は、２つ以上の免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を用いて組換え的に産生され得る。代替的には、多重特異性抗体は、化学結合を用いて調製され得る。当業者は、これらのまたは当該技術分野で既知であり得るような他の方法を用いて多重特異性抗体を産生し得る。多重特異性抗体としては、多重特異性抗体断片を包含する。本発明により理解される多重特異性（この場合、二重特異性）抗体の一例は、Ｓ１ＰエピトープおよびＣ１Ｐエピトープに関する結合特性を有する抗体であり、したがってこれはＳ１ＰおよびＣ１Ｐの両方を認識し、結合し得る。本発明により理解される二重特異性抗体の別の例は、生理活性脂質からのエピトープおよび細胞表面抗原からのエピトープに関する結合特性を有する抗体である。したがって、抗体は、生理活性脂質を認識して、結合し得るし、例えばターゲッティング目的のために細胞を認識し、結合し得る。
【００７６】
「新生物形成」または「癌」は、異常な且つ非制御化細胞成長を指す。「新生物」または腫瘍または癌は、細胞成長の異常な、非調節化および非組織化増殖であり、一般的に、癌として言及される。新生物は、良性または悪性であり得る。新生物は、破壊的成長、侵襲性および転移の特性を有する場合、悪性であるかまたは癌性である。侵襲性は、周囲組織の浸潤または破壊による、典型的には、組織の境界を限定する基底板を通して破壊死、それによりしばしば身体の循環系に進入することによる新生物の局所的拡散を指す。転移は、典型的には、リンパ管または血管による腫瘍細胞の伝播を指す。転移は、漿液腔またはくも膜下腔またはその他の間隙を通した直接的拡張による腫瘍細胞の移動も指す。転移の過程を通して、身体の他の領域への腫瘍細胞移動は、最初の出現部位から離れた領域における新生物を確立する。
【００７７】
「神経障害性疼痛」は、神経系における病理的変化により引き起こされる慢性疼痛状態である。
【００７８】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「操作可能的に連結」される。例えば、前駆配列または分泌リーダー配列に関するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに関するＤＮＡと操作可能的に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列と操作可能的に連結される；あるいはリボソーム結合部位は、翻訳を促すために配置される場合、コード配列と操作可能的に連結される。一般的に、「操作可能的に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列が連続的であり、分泌リーダー配列の場合、連続的で且つ読み取り相である、ということを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的である必要はない。連結は、好都合な制限部位での結紮により成し遂げられる。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、慣用的実行に従って用いられる。
【００７９】
「親」抗体は、本明細書中では、変異体の調製のために用いられるアミノ酸配列によりコードされるものである。親抗体は、ネイティブ抗体であり得るし、または既に変異体、例えばキメラ抗体であり得る。例えば、親抗体は、ヒト化またはヒト抗体であり得る。
【００８０】
本発明による製造の「特許可能な」組成物、方法、機械または製品は、分析が実施される時点で、対象物が特許可能性に関する全ての法定要件を満たしている、ということを意味する。例えば、新規性、非自明性等に関して、１つ以上の請求項が新規性、非自明性等を否定する１つ以上の実施形態を包含することを後の発明が明示する場合には、特許請求（単数または複数）は「特許可能な」実施形態に対する定義に限定され、具体的には非特許可能な実施形態（単数または複数）を除外する。さらにまた、本明細書に添付される特許請求の範囲は、最も広い合理的範囲を提供し、ならびにそれらの有効性を保持すると解釈されるべきものである。さらに、特許請求の範囲は、（１）その有効性を保持する、および（２）特許可能性に関する法定要件のうちの１つ以上が修正される場合には、またはこの出願が提出されるかまたは特許として発行する時点から、添付の特許請求の範囲のうちの１つ以上の有効性が問題にされる時点まで、特許可能性に関する特定の法定要件が満たされているか否かを査定するために標準が変わる場合には、当該環境下で最も広い合理的解釈を提供する、という点で解釈されるべきものである。
【００８１】
「製薬上許容可能な塩」という用語は、本発明の作用物質および化合物の生物学的有効性および特性を保持する、そして生物学的にまたは別の状況で望ましくないものである、処方に際して用いられるような塩を指す。多くの場合、本発明の作用物質および化合物は、荷電基、例えば荷電アミノおよび／またはカルボキシル基、またはそれと同様の基の存在に基づいて、酸および／または塩基塩を形成し得る。製薬上許容可能な酸付加塩は、無機および有機酸から調製され、一方、製薬上許容可能な塩基付加塩は無機および有機塩基から調製され得る。製薬上許容可能な塩の再検討のためには、Berge, et al. (1977), J. Pharm. Sci., vol. 66, 1-19を参照されたい。
【００８２】
「複数」は、１つより多いことを意味する。
【００８３】
「プロモーター」という用語は、細胞におけるコード配列の転写を駆動し得るすべての配列を包含する。したがって、本発明の構築物において用いられるプロモーターは、遺伝子の転写の時機および／または割合を調節するかまたは変調することに関与するシス作用性転写制御因子および調節配列を包含する。例えば、プロモーターは、シス作用性転写制御因子、例えばエンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組込み配列、５’および３’非翻訳領域、またはイントロン配列（転写調節に関与）であり得る。本発明において用いるのに適した転写調節領域としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、大腸菌ｌａｃまたはｔｒｐプロモーター、ならびに原核生物または真核生物細胞またはそれらのウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが既知のその他のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
「組換えＤＮＡ」という用語は、人により工学処理され、作成され、または修飾された核酸およびそれから発現される遺伝子産物を指す。「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、所望のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性ＤＮＡ構築物により形質転換される細胞から、組換えＤＮＡ技術により産生されるポリペプチドまたはタンパク質である。「合成」ポリペプチドまたはタンパク質は、化学合成により調製されるものである。
【００８５】
「分離される」、「精製される」、「単離される」等の用語は、試料保持容器中に含有される試料の１つ以上の構成成分が、容器中に存在する１つ以上の他の構成成分から物理的に除去される（されている）か、または他の構成成分の存在中に希釈される（されている）、ということを意味する。分離または精製ステップ中に除去されるかまたは希釈され得る試料構成成分としては、化学反応生成物、非反応化学物質、タンパク質、炭水化物、脂質および非結合分子が挙げられる。
【００８６】
「固相」とは、非水性マトリックス、例えば本発明の抗体が接着され得るものを意味する。本明細書中に包含される固相の例としては、ガラス（例えば、多孔性ガラス）、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルあるこるおよびシリコーンから、部分的にまたは全体的に形成されるものが挙げられる。ある実施形態では、状況によって、固相は検定プレートのウェルを含み得る；他の場合には、それは精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語は、例えば米国特許第４，２７５，１４９号に記載されているような離散粒子の不連続固相も包含する。
【００８７】
「種」という用語は、種々の状況で本明細書中で用いられ、例えば、化学療法薬の特定の種である。各状況において、当該用語は、特定の状況で言及される部類の化学的に明瞭に区別できない分子の集団を指す。
【００８８】
「特異的」または「特異性」という用語は、抗体−抗原相互作用の状況では、抗体とその標的エピトープとの間の選択適非無作為相互作用を指す。ここでは、「抗原」という用語は、抗体分子または他の免疫誘導性部分により認識され、結合される分子を指す。抗体により結合される抗原の特異的部分は、「エピトープ」と呼ばれる。この相互作用は、分子間の適切な化学的または分子的相互作用を可能にする構造的、疎水性／親水性、および／または静電特徴の存在によって決まる。したがって、抗体は、その標的抗原のエピトープと、「結合する（または「特異的に結合する」）」、または「反応する（または「特異的に反応する」）」、または等価的に、エピトープに「対して反応性である（または「特異的に反応性である」）」、と一般に言われている。抗体は、抗原と結合する抗体に関する略記としてそれらの抗原に「対抗する」または「対する」ものである、と当該技術分野で一般に記載される。したがって、「Ｃ１Ｐを結合する抗体」、「Ｃ１Ｐに対して反応性である抗体」、「Ｃ１Ｐと反応性である抗体」、「Ｃ１Ｐに対する抗体」および「抗Ｃ１Ｐ抗体」はすべて、当該技術分野で同じ意味を有する。抗体分子は、所望の抗原との結合を、所定組の条件下で非関連抗原または類似型抗原または抗原混合物との結合と比較することにより、結合の特異性に関して試験され得る。好ましくは、本発明による抗体は、非関連抗原との有意の結合を、または標的抗原の類似物との有意の結合さえ、欠いている。
【００８９】
本明細書中では、「安定な」とは、所望の目的または操作のために分子が保持され得るよう、十分に安定である２つの分子（例えば、ペプチドとＴＬＲ分子）間の相互作用を指す。例えば、ペプチドとＴＬＲ分子との間の「安定な」相互作用は、所望の作用を達成するのに十分な期間、ペプチドがＴＬＲ分子と関連するようになり且つ保持するものを指す。
【００９０】
「被験体」または「患者」は、本発明の分子により実行され得る処置を必要とする動物を指す。本発明に従って処置され得る動物としては脊椎動物が挙げられるが、哺乳動物、例えばウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタおよび霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類）動物が特に好ましい例である。
【００９１】
「代理マーカー」は、疾患状態に及ぼす処置の影響を間接的に示す身体内の生物学的活性の実験室測定値を指す。過剰増殖性および／または心臓血管性症状に関する代理マーカーの例としては、ＳＰＨＫおよび／またはＳ１ＰＲが挙げられる。
【００９２】
「治療薬」は、治療効果を提供するよう意図される薬剤または化合物を指し、例としては、抗炎症薬、例えばＣＯＸ阻害薬およびその他のＮＳＡＩＤ、抗血管形成薬、上記のような化学療法薬、心臓血管薬、免疫調節薬、神経変性障害を処置するために用いられる作用物質、眼用薬等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
「治療的有効量」（または「有効量」）は、このような処置を必要とする被験体に投与される場合、処置を実行するのに十分な、活性成分、例えば本発明による作用物質の量を指す。したがって、本発明による治療的有効量の組成物を構成するものは、当業者により容易に決定され得る。癌療法の状況では、「治療的有効量」は、癌細胞の生存または代謝に関連した１つ以上のパラメーター、例えば特定の癌と相関する１つ以上の遺伝子の発現における増大または減少、腫瘍負荷の低減、癌細胞溶解、生物学的試料における１つ以上の癌細胞死マーカーの検出（例えば、生検、および体液、例えば全血、血漿、血清尿等のアリコート）、アポトーシスまたはその他の細胞死経路の誘導等における客観的に測定される変化を生じるものである。もちろん、治療的有効量は、特定の被験体および処置されている症状、被験体の体重および年齢、疾患症状の重症度、選択される特定の化合物、追跡調査される用量投与レジメン、投与の時機、投与方式等によって代わり、これらはすべて、当業者により容易に決定され得る。併用療法の状況では、治療的有効量の特定の活性成分は、単一療法（すなわち、活性成分として１つだけの化学的存在物を用いる治療レジメン）として投与される場合の治療的有効量の活性成分を構成するものとは異なり得る、と理解される。
【００９４】
本発明の組成物は、生理活性脂質ベースの療法の方法で用いられる。本明細書中で用いる場合、「治療」および「治療的」という用語は、疾患、障害または身体的外傷のための防止および／または処置の全範囲を包含する。本発明の「治療」薬は、危険に直面していると同定され得る標的個体に対して意図される手法を組入れるものを含めて、予防的または防止的である方式で（薬理遺伝学）；あるいは事実上改善的または治癒的である方式で作用し得るし；あるいは処置されている疾患または障害の少なくとも１つの症候の進行の速度または程度を遅らせるよう作用し得るし；あるいは必要とされる時間、任意の不快または疼痛の出現または程度、あるいは疾患、障害または身体的外傷からの回復に関連した身体的制限を最小限にするよう作用し得るし；あるいは他の療法および処置に対するアジュバントとして用いられ得る。
【００９５】
「処置」または「処置すること」という用語は、疾患または障害の任意の処置、例えば疾患または障害を防止または防御すること（すなわち、臨床症候を発症させないこと）；疾患または障害を抑制すること（すなわち、臨床症候の発症を休止、遅延または抑止すること）；および／または疾患または障害を軽減すること（すなわち、臨床症候の退行を生じること）を意味する。理解されるように、単数または複数の最終的誘導事象は未知であるかまたは潜在性であるため、疾患または障害を「防止すること」と「抑止すること」の間を区別することはいつも可能であるというわけではない。「処置を必要とする」者は、既に障害を有する者、ならびに障害が防止されるべきである者を包含する。したがって、「予防」という用語は、「防止すること」および「抑止すること」の両方を包含する「処置」の一型を構成すると理解される。したがって、「防御」という用語は、「予防」を包含する。
【００９６】
「治療レジメン」という用語は、化学療法薬および細胞傷害薬、放射線療法、外科手術、遺伝子療法、ＤＮＡワクチンおよび療法、ｓｉＲＮＡ療法、抗血管形成療法、免疫療法、骨髄移植、アプタマーおよびその他の生物製剤、例えば抗体および抗体変異体、受容体デコイ、ならびにその他のタンパク質ベースの治療薬を用いる疾患または障害の任意の処置を意味する。
【００９７】
抗体の「可変」領域は、フレームワークおよび相補性決定領域（ＣＤＲ、別の状況では超可変領域として既知）を含む。変異性は、抗体の可変ドメイン全体を通して均一に分布されるわけではない。可変ドメインのより高度に保存される部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブ重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、主にβシート形状を取る４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、これがループ連結を形成し、いくつかの場合には、βシート構造の部分を形成する。「超可変領域」という用語は、本明細書中で用いられる場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）; Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）、および／または「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義されるような超可変領域以外の可変ドメイン残基である。
【００９８】
各鎖中の超可変領域は、ＦＲにより密に近接して一緒に保持され、他の鎖からの超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), pages 647-669参照）。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接的に関与しないが、しかし抗体依存性細胞毒性における抗体の関与といったような種々のエフェクター機能を示す。
【００９９】
「ベクター」または「プラスミド」または「発現ベクター」は、細胞中に一時的にまたは安定的に保持されて、１つ以上の組換え遺伝子の発現を実行し得る核酸を指す。ベクターは、核酸を、単独でまたは他の化合物と複合されて含み得る。ベクターは、任意に、ウイルスまたは細菌核酸および／またはタンパク質、および／または膜を含む。ベクターとしては、ＤＮＡの断片が結合され、複製されるようになり得るレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、ベクターとしては、ＲＮＡ、自律的自己複製性環状または線状ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されないし、発現および非発現プラスミドも包含する。プラスミドは、市販されているし、制限なしに公的に利用可能であり、あるいは発表済みプロトコールで報告されているように利用可能なプラスミドから構築され得る。さらに、発現ベクターは、真核生物細胞培養のためのジヒドロフォレートレダクターゼまたはネオマイシン抵抗性といったような、あるいは大腸菌におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン抵抗性といったような形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を提供するための遺伝子も含有し得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０１００】
本出願は、疼痛を処置するかまたは防止するための方法を記載する。本発明の実行は、疼痛を有するかまたは疼痛を有する危険があると考えられる被験体、例えばヒト被験体に、ＬＰＡを結合し、中和する抗体または抗体断片を投与することを包含する。抗体は、ＬＰＡ結合活性を保持するポリクローナルまたはモノクローナル抗体、あるいは抗体断片であり得る。好ましいのは、ＬＰＡを結合するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体またはその断片である。
【０１０１】
本発明の方法に従って処置される疼痛は、急性または慢性疼痛であり得る。当該方法は、神経障害性疼痛、ならびに中枢または末梢神経系への損傷、外傷または損害、炎症、薬剤曝露、糖尿病、ウイルス性疾患、代謝疾患、虚血性傷害、栄養欠乏、毒素曝露、癌または癌処置のための疼痛（神経障害性疼痛を含む）といったような疼痛を処置するかまたは防止するために特に有用である。
【０１０２】
前記のおよびその他の本発明の態様は、以下の詳細な記述、添付の図面ならびに特許請求の範囲からさらに明らかになる。別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が関連する当該技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似のまたは等価の方法および物質は本発明の実行または試験に用いられ得るが、しかし適切な方法および物質が以下で記載される。本明細書中で言及される出版物、特許出願、特許およびその他の参考文献はすべて、その記載内容が参照により本明細書中で援用される。相容れない場合は、本発明の明細書（定義を含む）が支配する。さらに、当該物質、方法および実施例は例証のために過ぎず、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
図面の各々の簡単な要約を、以下に示す。
【図１】３部からなる：図１ａ、１ｂおよび１ｃは、ＥＬＩＳＡベースの競合結合検定で測定した場合の、それぞれヒト化抗ＬＰＡ抗体、ＬＴ３０１５、ＬＴ３１１４およびネズミｍＡｂ、Ｂ３の結合特異性を示す線グラフである。
【図２】３部からなる：図２ａ、２ｂおよび２ｃは、ＥＬＩＳＡベースの競合結合検定で測定した場合の、それぞれヒト化抗ＬＰＡ抗体、ＬＴ３０１５、ＬＴ３１１４およびネズミ抗ＬＰＡ  ｍＡｂ、Ｂ３の結合親和性を示す線グラフである。
【図３】対照または糖尿病ラットに関する脚引っ込め閾値（ＰＷＴ）を示す棒グラフである。対照ラットは、ビヒクル（Ｖｅｈ）の髄腔内および静脈内注射を受けた。糖尿病（Ｄ）ラットは、以下の群に無作為化された：Ｖｅｈ＋Ｄ、  ビヒクルの髄腔内および静脈内注射；低用量＋Ｄ、静脈内注射抗ＬＰＡ−ｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋髄腔内注射抗ＬＰＡ−ｍＡｂ（２ｕｇ／１０μＬ）、ならびに高用量＋Ｄ、  静脈内注射抗ＬＰＡ−ｍＡｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）＋髄腔内注射抗ＬＰＡ−ｍＡｂ（１０ｕｇ／１０μＬ）。
【図４】糖尿病ラットにおける介入試験での疼痛の測定値である脚引っ込め潜伏時間に及ぼす抗ＬＰＡ抗体の作用を示す２部図面である。図４Ａは、疼痛の測定値である脚引っ込め潜伏時間（ＰＷＬ）に及ぼす抗ＬＰＡ抗体処置の作用を示す時間経過の線グラフである。図４Ｂは、脚引っ込め閾値に関する曲線下面積を示す棒グラフである。ガバペンチンは、陽性対照として用いられている。
【図５】疼痛の測定値である脚引っ込め潜伏時間に及ぼす抗ＬＰＡ抗体の作用を示す２部図面である。図５Ａは、疼痛の測定値である脚引っ込め潜伏時間（ＰＷＬ）に及ぼす予防的抗ＬＰＡ抗体処置の作用を示す時間線である。図５Ｂは、ＰＷＬに及ぼす介入的抗ＬＰＡ抗体処置の作用を示す棒グラフである。予防的および介入的処置は、このモデルにおいては疼痛を減少した。
【図６】経時的な疼痛の２つの測定値に及ぼす抗ＬＰＡ抗体の作用を示す２部線グラフである。図６ａは、１４日間に亘る熱性疼痛引っ込め（ハーグリーブス検定）に及ぼす３つの用量の抗ＬＰＡ抗体の作用を示す。図６ｂは、１４日間に亘る脚圧に及ぼす３つの用量の抗ＬＰＡ抗体の作用を示す。
【図７】ヒト化抗ＬＰＡ抗体ＬＴ３０１５で処置した後の関節炎ラットにおける疼痛発生の抑制を示す棒グラフである。この予備試験では、抗体を３つの用量（１．６、８および４０ｍｇ／ｋｇ）で投与した。２つの高用量は、陽性対照であるナプロキセン処置後に観察されるレベルに疼痛発生を減少した。最低用量（１．６ｍｇ／ｋｇ）は中間作用を有し、非特異的抗体は疼痛発生に最小度の影響を及ぼした。
【図８】パクリタキセル誘導性神経障害性疼痛に及ぼすネズミ抗ＬＰＡ抗体Ｂ３（５０４Ｂ３としてこのグラフで示されている）およびＬＴ１０１５の作用を示す線グラフである。ビヒクル群（□）と比較した場合、パクリタキセル（●）の投与は機械的異痛症の時間依存的発症をもたらしたが、これは、５０４Ｂ３（▲）の静脈内送達により１６時間で有意に減衰されたが、しかしＬＴ１０１５（▼）によっては弱められなかった。結果を、平均±ＳＥＭで表す。パクリタキセル群とのボンフェロニ・ポストホック比較とともに両側二方向ＡＮＯＶを用いて、３動物に関する行動データを分析した（この場合、パクリタキセル体ビヒクルに関しては、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊Ｐ＜０．００１、ならびにパクリタキセル＋５０４Ｂ３対パクリタキセルに関しては†Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
本発明の詳細な説明
抗ＬＰＡ薬（抗ＬＰＡ抗体を含む）
１．  序論
種々の疾患および障害のための治療的処置としてのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用は、それらが安全且つ有効な治療薬であることが示されているため、休息に増大しつつある。認可された治療用モノクローナル抗体としては、アバスチン（商標）、エルビタックス（商標）およびリツキサン（商標）が挙げられる。付加的モノクローナル抗体は、種々の疾患のための臨床的開発の種々の段階にあり、大多数が種々の型の癌を標的にしている。概して、モノクローナル抗体は、非ヒト哺乳動物において生成される。ネズミモノクローナル抗体の治療的有用性は、非ヒト哺乳動物抗体のキメラ化またはヒト化で改善され得る。ヒト化は、投与される治療用モノクローナル抗体に対する免疫応答の発現を大いに減少し、それによりこのような応答に及ぼす半減期および治療効果結果の低減を回避する。大体において、ヒト化過程は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）にネズミ相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフトすることからなる。最初のグラフト化構築物で失われている親和性を改善するかまたは再獲得するためには、ＦＲにおける選択残基のネズミアミノ酸残基への逆変異がしばしば必要とされる。
【０１０５】
モノクローナル抗体の製造は、免疫グロブリンタンパク質それ自体の変異性に由来する複雑な過程である。二者択一的ジスルフィド対合の形成、脱アミド化およびイソアスパルチル残基の形成、メチオニンおよびシステイン酸化、Ｎ末端グルタミン残基のピログルタメートへの環化、および哺乳動物カルボキシペプチダーゼによるＣ末端リシンの部分的酵素的開裂は、不均質性に起因する。工学処理は、一般に、抗体分子に適用して、それらの特性、例えば増強された安定性、プロテアーゼに対する抵抗性、凝集行動を改善し、異種系における発現レベルを増強する。
２．  ＬＰＡの疾患関連性および抗ＬＰＡ薬の治療的使用
【０１０６】
ＬＰＡは、多数の疾患および障害と関連づけられており、その多くは、異常レベルのＬＰＡと関連する。再検討のためには、Gardell, et al., (2006)Trends ol Med. 12(2):65-75, and Chun J. and Rosen, H., (2006) Curr. Pharma. Design 12:161-171を参照。これらは、自己免疫障害、例えば糖尿病、多発性硬化症および強皮症；過剰増殖性障害、例えば癌；疼痛、血管形成および新血管新生に関連した障害；肥満症；神経変性疾患、例えばアルツハイマー病；精神分裂病、免疫関連障害、例えば移植片拒絶および移植片対宿主病等を包含する。多数の疾患および障害におけるＬＰＡの役割は、例えば米国特許出願公開第２０１０００３４８１４号（一般に当該出願で所有され、この記載内容および全目的に関して本明細書中で援用される）にさらに記載されている。
ａ．  疼痛
【０１０７】
米国では、疼痛は医者を訪れず最も一般的な理由であり、広範囲の疾患、障害および症状の一部として存在する。疼痛は、急性または慢性であり得るし、身体における位置により、および／または病因により分類され得るが、しかし多くの場合、疼痛の病因は分からないか、またはいくつかの考え得る原因（重複することがある）のためであり得る。疼痛は、例えば異痛症（疼痛の異常知覚認知）または痛覚過敏症（誇張疼痛感覚）のように定性的にも記載され得る。
【０１０８】
神経障害性疼痛は、神経系の損害または機能不全に関連した複雑な、しばしば慢性型の疼痛である。手短に言えば、神経障害性疼痛は神経系における病理学的変化により引き起こされる慢性疼痛状態である（Myers, et al (2006) Drug Disc. Today 11: 8-20）。急性および／または慢性神経障害性疼痛の原因としては、中枢または末梢神経系に対する損傷、外傷または損害（脊髄損傷、椎間板ヘルニア、多発性硬化症、あるいはその他の変性または神経変性疾患）、炎症、薬剤曝露（例えば、細胞傷害、例えばパクリタキセル（タキソール）、シスプラチンおよびその他の化学療法薬）、糖尿病、ウイルス性疾患（例えば、ＨＩＶおよび帯状疱疹）、代謝疾患、重症虚血性傷害、栄養欠乏、毒素曝露および癌が挙げられるが、これらに限定されない。癌神経障害性疼痛は、直接的に腫瘍に起因死、神経に影響を及ぼすか、あるいは間接的に、例えば放射線、外科手術または薬剤処置に起因し得る。神経障害性疼痛は、初期傷害に対する炎症性応答により制御される神経炎症機序により媒介され、神経系組織に影響を及ぼす（Myers, et al (2006) Drug Disc. Today 11: 8-20）。多数の炎症媒介物質、例えばＴＮＦが、神経障害性疼痛において極めて重要であることが判明している（Leung L, Cahill CM. (2010) J Neuroinflamm., 7:27）。神経障害性疼痛は、大部分の一般的な鎮痛薬に対して非応答性である。
【０１０９】
炎症媒介物質は、疼痛の発生、持続性および重症度に関与する。ＩＬ−６は、強力な疼痛発生性炎症媒介物質である。ＩＬ−６は、末梢神経損傷後のラット脊髄で産生され、ＩＬ−６レベルは、異痛症の強度と直接相関する（Arruda, et al. (2000), Brain Res. 879: 216-25）。ＩＬ−６レベルは、ストレスまたは炎症中に増大し、関節リウマチが滑液中のＩＬ−６レベル増大と関連している（Matsumoto, et al (2006), Rheumatol. Int. 26:1096-1100; Desgeorges, et al. (1997), J. Rheumatol. 24:1510-1516）。神経障害性疼痛は、ＩＬ−６マウスにおいて防止される（Xu, et al (1997), Cytokine 9:1028-1033）。
【０１１０】
ＩＬ−８は、疼痛発生性炎症媒介物質である。疱疹性神経痛後の薬剤処置は、ＩＬ−８濃度の５０％減を示し、この減少は疼痛軽減と相関した（Kotani, et al. (2000), New Engl. J. Med. 343:1514-1519）。
【０１１１】
ＴＮＦは、末梢神経繊維における軸索損害、マクロファージ動員および異所性活性を誘導し、痛覚過敏症の発生に一役を果たす。ＴＮＦは、末梢神経損傷の部位で、ならびに神経障害性疼痛患者において上方調節される。ＴＮＦ産生の選択的遮断薬であるサリドマイドは、神経障害性疼痛（慢性絞扼損傷）の動物モデルにおいて痛覚過敏症を低減する（George, et al. (2000), Pain 88:267-275）。
【０１１２】
生理活性脂質は、神経障害性疼痛および化学療法に関連した疼痛を含めた疼痛の病因に重要な役割を果たすと考えられる。神経障害性疼痛の発症におけるＬＰＡの有意の役割が、種々の薬理学的および遺伝学的アプローチを用いて確立された。ＬＰＡは、長期持続性機械的異痛症および熱性痛覚過敏症、ならびにＬＰＡ１受容体による脱髄および疼痛関連タンパク質の上方調節に関与する。さらに、ＬＰＡの髄腔内注射は、行動的、形態学的および生化学的変化、例えば神経結紮後に観察されるものと同様の、背根の脱髄に伴う疼痛刺激に対する感受性延長を誘導する（Fujita, R., Kiguchi, N. & Ueda, H. (2007), Neurochem Int 50, 351-5）。神経損傷を有する野生型動物は、行動的異痛症および痛覚過敏症を発症し、背根における脱髄、ならびに脊髄背角内のプロテインキナーゼＣアイソフォームおよび背根神経膠における２１カルシウムチャンネルサブユニットの両方の発現増大を伴う。ＬＰＡ１受容体遺伝子（ｌｐａ１−／−マウス）を欠いているマウスは神経損傷誘導性神経障害性疼痛行動および現象を喪失する、ということが実証されている（Inoue, et al. (2004), Nat Med 10, 712-8）。オートタキシン遺伝子に関するヘテロ接合性突然変異体マウス（ａｔｘ＋／−）は、神経損傷誘導性神経障害性疼痛の約５０％回復を示した。痛覚過敏症は、ｌｐａ１−／−およびａｔｘ＋／−マウスの両方において完全に無くされた。さらに、ＲｈｏおよびＲｈｏキナーゼシグナル伝達経路の阻害薬も、神経障害性疼痛を防止した（Mueller, B.K., Mack, H. & Teusch, N. (2005), Nat Rev Drug Discov A, 387-98）。したがって、ＬＰＡ生合成および／またはＬＰＡ１受容体をターゲッティングすることにより、神経損傷誘導性神経障害性疼痛を緩和するための新規の特許可能なアプローチが示される。
【０１１３】
化学療法に関連した疼痛は、多数の小分子化学療法薬の主要な用量限定毒性である。実際、化学療法誘導性疼痛の多くの症例が報告されている。例えば、イチイ（Pacific yew tree、学名Taxus brevifolia）由来のパクリタキセル（タキソール）は、種々の癌、例えば卵巣癌、乳癌および非小細胞肺癌を処置するために用いられる。しかしながら、パクリタキセルの有効性は、重症疼痛性末梢神経障害、例えば知覚麻痺および灼熱痛の非常に偶発的な発症に限定される。このような疼痛と相関する生理活性脂質、例えばＬＰＡに対する抗体（またはその脂質結合部分を含有するこのような抗体の誘導体）は、化学療法薬に関連した疼痛を低減するために、パクリタキセルと組合せて投与され得る。この用量限定性毒性を改善することの結果として、投与されるべきパクリタキセルの量は、このようなモノクローナル抗体または抗体誘導体と組合せて用いられる場合、さらに高くなり得る（したがって、さらに有効になる）。いくつかの実施形態では、化学療法薬（または他の薬剤）は、例えば、小分子化学療法薬を抗体と共有的に連結することにより、モノクローナル抗体または標的生理活性脂質に対して特異的に反応性であるモノクローナル抗体由来の少なくとも１つの生理活性脂質結合ドメインとも連結される多価足場と小分子化学療法薬を連結することによる等により、抗体または抗体誘導体と共役されるか、そうでなければ会合され得る。ヒトおよび動物モデルの両方において、１型および２型糖尿病における糖尿病性神経障害は、末梢神経系のすべての構成成分（感覚、運動および自律神経）における病理生理学的変化により特性化される。主な求心性神経の変化のほかに、中枢性感作は、持続性疼痛、例えば神経障害性および炎症性疼痛の基礎を成す重要な機序であると考えられる（G. Baranauskas, A. Nistri (1998) Prog Neurobiol 54, 349; T. J. Coderre, R. Melzack (1992) J Neurosci 12, 3665; R. Dubner, M. A. Ruda (1992) Trends Neurosci 15, 96; M. J. Millan (1999) Prog Neurobiol 57, 1 ; C. J. Woolf, S. W. Thompson, (1991) Pain 44, 293）。
【０１１４】
近年、ＬＰＡに関する役割が、持続性疼痛における中枢感作で提唱されてきた。具体的には、主要な求心性神経繊維の刺激が脊髄におけるＬＰＡの産生を引き起こす、ということが実証された（M. Inoue et al. (2008) J Neurochem 107, 1556）。ＡＴＸによるＬＰＡへのＬＰＣの転化は、神経障害性疼痛に関与するＣＮＳにおけるＬＰＡの主な供給源であることが提唱されている（L. Ma et al. (2010) J Pharmacol Exp Ther 333, 540）。
【０１１５】
細胞レベルで、ＬＰＡはニューロンおよび神経膠細胞における形態学的変化の強力な誘導物質である（Kingsbury, et al. (2003), Nat Neurosci 6, 1292-9; Jalink, et al. (1993), Cell Growth Differ 4, 247-55; Tigyi, G. & Miledi, R. (1992), J Biol Chem 267, 21360-7 (1992); Fukushima, et al. (2000), Dev Biol 228, 6-18; Yuan, X.B. et al. (2003) Nat Cell Biol 5, 38-45; Fukushima, et al. (2007), Neurochem Int 50, 302-7）。
【０１１６】
一次星状細胞において、ならびに神経膠由来細胞株において、ＬＰＡは、活性ＲｈｏＡにより指図され、局所接着タンパク質の再構築および活性化を伴う過程である突起成長（「星形化」）の逆転を引き起こす（Ramakers, G.J. & Moolenaar, W.H. (1998), Exp Cell Res, 245: 252-62）。髄鞘形成におけるＬＰＡの役割も、ＬＰＡが細胞−細胞接着およびシュワン細胞における生存を促す、という知見により示唆されている（Weiner, et al. (2001), J Neurosci. 21 :7069-78; Ramer, et al (2004), J Neurosci. 24:10796-805）。
３．  抗体生成および特性化
【０１１７】
本発明は、疼痛の処置における抗ＬＰＡ抗体および抗体断片の使用に関する。ＬＰＡに対するネズミおよびヒト化モノクローナル抗体（およびそのＬＰＡ結合断片）の生成および特性化は、いくつかの特許出願、例えば米国特許出願公開第２０１０００３４８１４号（これは本出願と権利者が共通で、この記載内容は本明細書中で援用される）に記載されている。
４．  薬学的処方物、用量投与および投与経路
【０１１８】
患者における望ましくないＬＰＡの量を制御するための一方法は、１つ以上のＬＰＡを結合するために１つ以上の抗ＬＰＡ抗体または抗体断片を含む組成物を提供し、それにより遊離の望ましくないＬＰＡのレベルを低減する治療用「スポンジ」として作用することによる。化合物が「遊離」であると記述される場合、化合物は、それがその望ましくない作用を発揮する単数または複数の部位に到達することを、如何なる点でも制限されない。遊離化合物は、化合物を望ましくない化合物に転化する任意の酵素により作用されるべく利用可能でもあり得る。
【０１１９】
抗ＬＰＡ抗体および抗体断片は、種々の目的、例えば疾患、障害または身体的外傷の処置のために有用である薬学的組成物中に処方され得る。生理活性脂質に対する抗体（またはその断片）に適した薬学的組成物は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１０００９８７００号（当該出願と共通して譲渡され、本明細書中で援用される）に開示されている。
【０１２０】
本発明の１つ以上の抗ＬＰＡ抗体および抗体断片を含む薬学的組成物は、このような処置のためのキットおよび医療用具に組み入れられ得る。医療用具は、それを必要とする患者に本発明の薬学的組成物を投与するために用いられ得るし、本発明の一実施形態によれば、このような用具を含むキットが提供される。このような用具およびキットは、本発明の薬学的組成物の慣例的投与、例えば自己投与のために設計され得る。このような用具およびキットは、緊急的使用のために、例えば救急車または救急処置室において、あるいは外科手術中に、あるいは損傷が考えられるがしかし十分な治療が直ちに用意されていない場合（例えば、ハイキングおよびキャンプ、または実線状況）の活動においても意図され得る。
【０１２１】
抗体の治療用処方物は、凍結乾燥処方物または水溶液の形態で、所望純度を有する抗体または抗体断片を任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤または安定化剤と混合することにより、貯蔵のために調製される（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）。許容可能な担体、賦形剤または安定化剤は、用いられる投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンズエトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルあるこる；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン；単糖、二糖およびその他の炭水化物、例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート化剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばトゥイーン（商標）、プルロニック（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。
【０１２２】
本明細書中の処方物は、処置されている特定の適応症のために必要な場合、１つより多い活性化合物、好ましくは互いに悪作用を及ぼさない相補的活性を有するものも含有し得る。このような分子は、意図される目的のために有効である量で、組合せて適切に存在する。
【０１２３】
活性成分は、さらにまた、例えば、コロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマイクロエマルション中に、コアセルベーション技術により、または界面重合、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、調製されるマイクロカプセル中に閉じ込められ得る。このような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０１２４】
in vivo投与のために用いられるべき処方物は、滅菌性でなければならない。これは、例えば滅菌濾過膜を通した濾過により容易に成し遂げられる。
【０１２５】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられるが、このマトリックスは、造形品、例えば皮膜またはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ．ＴＭ．（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロイドからなる注射用マイクロスフェア）およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。ポリマー、例えばエチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸は１００日間に亘って分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルは、タンパク質をより短い期間放出する。封入抗体が身体中に長時間残存する場合、それらは３７℃で水分に曝露された結果として変性または凝集して、生物学的活性の損失ならびに免疫原性において起こり得る変化を生じ得る。関与する機序によって、安定化のために合理的戦略が考案され得る。例えば、凝集機序がチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、含水量を制御し、適切な添加物を用いて、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより、達成され得る。
【０１２６】
治療用適用に関しては、本発明の抗ＬＰＡ薬、例えば抗体および／または抗体断片は、上記のもののような製薬上許容可能な剤形で、例えば非経口的に（例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入）、あるいは頭蓋内、髄腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液内、経口、局所、気管内または吸入経路によりヒトに投与され得る剤形で、哺乳動物に、好ましくはヒトに投与される。
【０１２７】
疾患の防止または処置に関しては、抗体（または抗体断片）の適切な投与量は、上記のような処置されるべき疾患の型、疾患の重症度および経過（抗体（またはその断片）防止目的であれ、治療目的であれ、投与される場合）、患者の臨床歴および抗体または抗体断片に対する応答、ならびに担当医の判断によって決まる。抗ＬＰＡ抗体または抗体断片を含有する組成物は、一度にまたは一連の処置に亘って、患者に適切に投与される。
【０１２８】
例えば、１回以上の別個の投与であっても、連続注入による投与であっても、疾患の型および重症度によって、約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者に投与される初期候補投与量である。典型的１日または１週投与量は、上記の因子によって、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり得る。数日間またはそれ以上に亘る反復投与に関しては、症状によって、疾患症候の所望の抑止が起きるまで、処置は反復される。しかしながら、その他の投与量レジメンが有用なこともある。この両方の進行は、慣用的技法および検定、例えば放射線画像処理により、容易にモニタリングされる。治療用抗体への患者の曝露を最適にするために、体液または組織中のＬＰＡレベルを測定するために抗体を用いる検出方法が用いられ得る。
【０１２９】
本発明の別の実施形態によれば、ＬＰＡ活性を妨げる作用物質、例えばｍＡｂまたはＦａｂを含む組成物は、単一両方として投与されるが、一方、他の好ましい実施形態では、ＬＰＡ活性を妨げる作用物質を含む組成物は、併用療法の一部として投与される。いくつかの場合、疾患を防止または処置するに際しての抗体の有効性は、逐次的に、または癌の処置のための化学療法薬または慣用的鎮痛薬のようなその目的のために有効である別の作用物質と組合せて、抗体を投与することにより改善され得る。
【０１３０】
このようなその他の作用物質は、投与されている組成物中に存在し得るし、または別々に投与され得る。さらにまた、抗体は、逐次的に、または他の作用物質または他の使用方法と組合せて適切に投与される。
５．  キットおよび製品
【０１３１】
本発明の別の態様では、疼痛の処置のために有用な物質を含有する製品が提供される。製品またはキットは、容器およびラベルを含む。適切な容器としては、例えば瓶、バイアル、注射器および試験管が挙げられる。容器は、種々の材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成され得る。容器は、当該症状を処置するために有効である組成物を保持し、滅菌性アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液袋または皮下注射針により突き刺し可能な栓を有するバイアルであり得る）。組成物中の活性作用物質は、抗ＬＰＡ抗体である。容器上のまたは容器に添えられるラベルは、組成物が当該症状を処置するために用いられる、ということを示す。製品は、製薬上許容可能な緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む二次容器をさらに包含する。それはさらに、商業的およびユーザー視点から望ましい他の物質、例えば他の緩衝剤、希釈剤、充填剤、針、注射器および使用説明書を伴う包装挿入物を包含し得る。
【０１３２】
本発明は、以下の実施例を参照することによりさらに良好に理解されるが、これは、本発明を実施するために今日既知の最良の方式を単に例証するものである。本発明の範囲はそれらに限定されるものではない。
実施例
【０１３３】
以下の詳細な実施例により、本発明をさらに記載する。これらの実施例は、如何なる点でも本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：  ＬＰＡに対するモノクローナル抗体
【０１３４】
米国特許出願公開第２０１０００３４８１４号（本出願と権利者が共通で、記載内容および全目的に関して、本明細書中で援用される）に記載されているように、ＬＰＡに対するネズミモノクローナル抗体を作製した。その優れた生化学的および生物学的特性に基づいた特性化のために、６つのハイブリドーマクローンを選択した。マウスハイブリドーマ細胞株５０４Ｂ３−６Ｃ２、５０４Ｂ７．１、５０４Ｂ５８／３Ｆ８、５０４Ａ６３．１および５０４Ｂ３Ａ６（それぞれ、本明細書中でＢ３、Ｂ７、Ｂ５８、Ａ６３およびＢ３Ａ６として言及されるクローンに対応する）を、LPath Inc.に代わって、特許寄託のために、２００７年５月８日に、アメリカ培養細胞コレクション（ＡＴＣＣ  Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110）が受け取り、それぞれ寄託番号ＰＴＡ−８４１７、ＰＴＡ−８４２０、ＰＴＡ−８４１８、ＰＴＡ−８４１９およびＰＴＡ−８４１６を交付された。本明細書中で言及される抗ＬＰＡ抗体およびその部分はすべて、これらの細胞株に由来した。
直接結合動態
【０１３５】
６つの抗ＬＰＡ  ｍＡｂｓ（Ｂ３、Ｂ７、Ｂ５８、Ａ６３、Ｂ３Ａ６、Ｄ２２）と１２：０および１８：１  ＬＰＡ（０．１  ｕＭ）との結合を、ＥＬＩＳＡにより測定した。６つの漸増濃度の精製ｍＡｂ（０〜０．４  ｕｇ／ｍｌ）を用いて、滴定曲線からＥＣ５０値を算定した。ＥＣ５０は、５０％の最大結合を有する有効抗体濃度を表す。Ｍａｘは、最大結合を意味する（ＯＤ４５０として表される）。結果を、以下の表に示す。
【表１】
2014523439.tif 000003
【０１３６】
ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００バイオセンサー機器を用いて、６つの最有力候補に関して、動態パラメーターｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）およびＫＤ（会合平衡定数）を決定した。この試験では、ＬＰＡをセンサー表面に固定して、抗ＬＰＡ  ｍＡｂを当該表面全体に及ぶ溶液中で流動させた。示したように、６つのｍＡｂは、０．３４〜３．８ｐＭの範囲の同様のＫＤ値および同様の動態パラメーターで、ＬＰＡを結合した。
抗ＬＰＡネズミｍＡｂはＬＰＡに対して高親和性を示す
【０１３７】
ＬＰＡを、１５０共鳴単位の範囲の密度でセンサーチップ上に固定した。各ｍＡｂの希釈液を固定化ＬＰＡ上に通して、会合／解離相の非線形回帰により動態定数を得た。二重反復実験で少なくとも３つの測定を用いて、誤差を標準偏差として示す。結果を、以下の表２に示す。見掛けの親和性を、ＫＤ＝ｋａ／ｋｄにより決定した。
【表２】
2014523439.tif 000004
６つの抗ＬＰＡ  ｍＡｂの特異性プロフィール
【０１３８】
ＬＰＡの多数のアイソフォームは生物学的に活性であると同定されたが、ｍＡｂが、治療的関連性を有すべき程度にそれらのすべてを認識する、ということが好ましい。競合体脂質を抗体固定化脂質混合物に付加した競合検定を利用して、抗ＬＰＡ  ｍＡｂの特異性を評価した。
【０１３９】
競合ＥＬＩＳＡ検定を、抗ＬＰＡ  ｍＡｂを用いて実施して、それらの特異性を査定した。１８：１  ＬＰＡを、ＥＬＩＳＡプレート上に捕捉した。各競合体脂質（１０ｕＭまで）を、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）−ＰＢＳ中で連続希釈し、次いで、ｍＡｂ（３ｎＭ）とともにインキュベートした。混合物を、次に、ＬＰＡ被覆ウェルに移し、結合抗体の量を二次抗体で測定した。データを最大シグナル（Ａ４５０）に正規化し、抑制パーセントとして表わす。検定を、三重反復実験で実施した。ＩＣ５０：半最大抑制濃度；Ｍｌ：最大抑制（阻害薬の非存在下での結合の％）；---：弱抑制のため、概算されなかった。高抑制結果は、抗体による競合体脂質の認識を示す。以下で表３に示すように、抗ＬＰＡ  ｍＡｂはすべて、異なるＬＰＡアイソフォームを認識した。
【表３】
2014523439.tif 000005
【０１４０】
興味深いことに、抗ＬＰＡ  ｍＡｂは、  ｔｏ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  １２：０（ラウロイル）、１４：０（ミリストイル）、１６：０（パルミトイル）、１８：１（オレオイル）、１８：２（リノレオイル）および２０：４（アラキドノイル）ＬＰＡｓを識別し得た。最終的薬剤開発のための望ましいＥＣ５０順位は、不飽和脂質に関しては１８：２＞１８：１＞２０：４であり、飽和脂質に関しては１４：０＞１６：０＞１８：０で、高特異性を伴った。抗ＬＰＡ  ｍＡｂの特異性を、ＬＰＡ関連生体脂質、例えばジステアロイル−ホスファチジン酸、リゾホスファチジルコリン、Ｓ１Ｐ、セラミドおよびセラミド−１−ホスフェートとのそれらの結合に関して査定した。抗体の何れもが、ＬＰＡの即時型代謝前駆体であるジステアロイルＰＡおよびＬＰＣとの交差反応性を実証しなかった。
実施例２：  ネズミ抗ＬＰＡ抗体のクローニング  −  大要
【０１４１】
ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ領域を有するハイブリドーマからの３つのネズミ抗体のうちの１つの活性ＬＰＡ結合領域を含有する可変ドメイン（Ｆｖ）を用いて、ＬＰＡに対するキメラ抗体を生成した。当業者が理解するように、「ヒト化」抗体は、ヒト抗体フレームワーク領域（例えば、Ｆｒ１、Ｆｒ４等）例えば、ＩｇＧ１のフレームワーク領域を有するネズミ抗ＬＰＡ  ｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ、例えばＣＤＲ１〜４）をグラフトすることにより生成され得る。
【０１４２】
ＬＰＡに対するネズミｍＡｂのクローニングのための全体的戦略は、各抗体からの軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方のネズミ可変ドメインをクローニングすることからなる。遺伝子のコンセンサス配列は、定常領域断片はガンマアイソタイプと一致し、軽鎖はカッパアイソタイプと一致する、ということを示す。ネズミ可変ドメインを、ヒト抗体軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）と、ならびにヒト重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）と一緒にクローン化して、キメラ抗体構築物を生じた。この過程およびその結果生じたキメラ抗体は、米国特許出願公開第２０１０００３４８１４号（これは本出願と権利者が共通で、この記載内容は本明細書中で援用される）でさらに詳細に記載されている。
実施例３：  ネズミ抗体Ｂ７
【０１４３】
ネズミ抗体クローンＢ７は、シグナル伝達脂質ＬＰＡに関する高親和性を有する（Ｂｉａｃｏｒｅ検定において、ならびに直接結合ＥＬＩＳＡ検定において、表面プラズモン共鳴により実証されるように、１〜５０ｐＭのＫＤ）；さらに、Ｂ７は、ＬＰＡに関する高特異性を実証し、そのうちのいくつかが構造的にＬＰＡと同様である２０を上回る整理活性脂質を含めた１００より多くの異なる生理活性脂質およびタンパク質に関する結合親和性を示していない。ネズミ抗体は、１５５．５ｋＤａの総分子量を有する２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖からなる全長ＩｇＧ１ｋアイソタイプ抗体である。生物物理学的特性を、以下の表４に要約する。
【表４】
2014523439.tif 000006
【０１４４】
Ｂ７は、サイトカイン放出、移動および侵襲のような予備細胞ベースの検定において、生物学的活性も示した；これらを、ＬＰＡアイソフォームおよびその他の生理活性脂質に関するＢ７の特異性、ならびにin vitro生物学的作用を示すデータとともに、以下の表５に要約する。
【表５】
2014523439.tif 000007
【０１４５】
ＬＰＡとのＢ７／ＬＴ３０００の強力且つ特異的な結合は、潜在的治療効果を有する細胞外ＬＰＡの利用可能性低減（ＬＰＡの有効濃度における減少）を生じる。
【０１４６】
二次ネズミ抗ＬＰＡ抗体、Ｂ３も、以下の表６に示すように結合分析に付した。
【表６】
2014523439.tif 000008
実施例４：  Ｌｐａｔｈｏｍａｂ（Ｂ７、ＬＴ３０００）のヒト化
【０１４７】
ＬＰＡに関する高親和性、特異性および結合能力を保持する抗体を産生するという目標を有して、米国特許出願公開第２０１０００３４８１４号および米国特許出願第１２／７６１，５８４号および海外等価物  ＰＣＴ／ＵＳ１０／３１３３９（これらは一般に当該出願とともに譲渡され、その記載内容は本明細書中で援用される）で詳細に記載されているように、ヒトフレームワーク領域（ＦＲ）にネズミＣＤＲをグラフトすることにより、ネズミ抗ＬＰＡモノクローナル抗体Ｂ７の可変ドメインをヒト化した。
ヒト化変異体の工学処理
【０１４８】
ＬＴ３０００  ＶＨおよびＶＬからのＫａｂａｔ  ＣＤＲをアクセプターヒトフレームワークにグラフトすることにより、ネズミ抗ＬＰＡ抗体をヒト化した。７つのヒト化変異体を、無血清条件中でＨＥＫ２９３細胞中で一時的に発現させ、精製し、次いで、検定のパネルで特性化した。各々の軽鎖および重鎖の配列を含有するプラスミドを、産生のために哺乳動物細胞中にトランスフェクトした。５日間培養後、ｍＡｂ力価を定量的ＥＬＩＳＡを用いて測定した。重鎖および軽鎖の全組合せが、細胞培養１ｍｌ当たり２〜１２ｕｇの抗体を生じた。
【０１４９】
ヒト化ＶＬおよびＶＨ配列を含有する三次元（３Ｄ）モデルを構築して、ＣＤＲを構成する残基と並列されるＦＲ残基を同定した。これらのＦＲ残基は、ＣＤＲループ構造、ならびに抗原に関する高親和性および特異性を保持する抗体の能力に潜在的に影響を及ぼす。この分析に基づいて、ＡＪ００２７７３における６残基およびＤＱ１８７６７９における３残基を同定したが、ＬＴ３０００とは有意に異なると思われ、ネズミ配列への復帰突然変異が考えられた。ＤａｔａＭａｂｓ（LLP, Radlett, Hertfordshire, UK）により、フレームワーク選択および復帰突然変異同定を実行した。ＬＰＡ結合、熱安定性およびサイトカイン放出に及ぼすこれらの復帰突然変異の役割を調べて、完全ヒト化抗ＬＰＡモノクローナル抗体の開発のための最有力候補を同定した。
ヒト化変異体の発現
【０１５０】
ヒト化変異体を、無血清条件中でＨＥＫ２９３細胞中で一時的に発現させ、精製し、次いで、検定のパネルで特性化した。各々の軽鎖（ｐＡＴＨ５００シリーズ）および重鎖（ｐＡＴＨ６００シリーズ）の配列を含有するプラスミドを、産生のために哺乳動物細胞中にトランスフェクトした。５日間培養後、ｍＡｂ力価を定量的ＥＬＩＳＡを用いて測定した。重鎖および軽鎖の全組合せが、細胞培養１ｍｌ当たり２〜１２ｕｇの抗体を生じた。還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、高純度（＞９８％）で２５ｋＤａおよび５０ｋＤａでの２つの帯域を明示したが、これは軽鎖および重鎖の予測質量と一致した。単一帯域を、〜１５０ｋＤａの予測質量で非還元条件下で観察した。
ヒト化変異体の特性化
【０１５１】
ヒト化変異体の生物物理学的特性を、それらの結合親和性、結合能力、収率、効力および安定性に関して特性化した。全ヒト化抗ＬＰＡ  ｍＡｂ変異体が、キメラ抗ＬＰＡ抗体（ＬＴ３０１０としても既知）およびネズミ抗体（ＬＴ３０００）と同様に低ピコモル範囲での結合親和性を示した。ヒト化変異体のすべてが、ＬＴ３０００と同様のまたはそれより高いＴＭを示し、ほとんどが、約７１℃のＴｍを有した。特異性に関しては、ヒト化変異体は、ＬＴ３０００と同様の特異性プロフィールを実証した。例えば、ＬＴ３０００は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、リゾホスファチジン酸の種々のアイソフォーム（１４：０および１８：１  ＬＰＡ）、環状ホスファチジン酸（ｃＰＡ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）に対する交差反応性を実証しなかった。
哺乳動物細胞における抗体発現および産生
【０１５２】
ネズミ抗体遺伝子を、ハイブリドーマからクローン化した。ヒトフレームワーク配列およびネズミＣＤＲを含有する合成遺伝子を、合成オリゴヌクレオチドから構築して、平滑制限部位を用いてｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ中にクローン化した。シーケンシングし、１００％配列一致度を観察後、重鎖および軽鎖をクローン化して、重鎖遺伝子に関するｐＣｏｎガンマベクターおよび掲載電子に関するｐＣｏｎカッパベクター（Lonza Biologics, Portsmouth NH）を用いて全長ＩｇＧ１キメラ抗体として発現させた。これらの遺伝子の各々に関する発現カセットは、プロモーター、コザック配列およびターミネーターを含有した。これらのプラスミドを大腸菌中で形質転換して（ワンショットトップ１０化学的コンピテント大腸菌細胞、Invitrogen, カタログ番号Ｃ４０４０−１０）、ＬＢ培地中で増殖させて、グリセロール中にストックした。メーカーの記載どおりに、大規模プラスミドＤＮＡを調製した（Qiagen、無内毒素ＭＡＸＩＰＲＥＰ（商標）キット、カタログ番号１２３６２）。２９３フェクチンを用いて、ならびに培養のために２９３Ｆ−ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地を用いて、プラスミドをヒト胚性腎細胞株２９３Ｆ中にトランスフェクトした。トランスフェクト化細胞は、約２〜１２ｍｇ／Ｌのヒト化抗体を発現した。
抗体精製
【０１５３】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて、培養上清からモノクローナル抗体を精製した。０．５ｍｌのＰｒｏＳｅｐ−ｖＡ−Ｕｌｔｒａ樹脂（Millipore、カタログ番号１１５１１５８２７）を含有するアリコートを、重力流使い捨て仕様カラム（Pierce、カタログ番号２９９２４）に付加し、１０〜１５ｍｌの結合緩衝液（Pierce、カタログ番号２１００１）と平衡させた。一過性発現ヒト化抗体を含有する培養上清を、結合緩衝液で１：１希釈して、樹脂上を通過させた。カラム上に保持される抗体を１５ｍｌの結合緩衝液で洗浄し、低ｐＨ緩衝液（Pierce、カタログ番号２１００４）で溶離し、１００ｕｌの結合緩衝液を含有する１ｍｌ分画中に収集して、ｐＨを中和した。吸光度（２８０ｎｍ）＞０．１を有する分画を、１リットルのＰＢＳ緩衝液（Cellgro、カタログ番号０２１−０３０）に対して一晩透析した（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット、３５００  ＭＷＣＯ、Pierce、カタログ番号６６３８２）。透析試料を、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−ＹＭ５０（Amicon、カタログ番号４２２５）濃縮器を用いて濃縮し、０．２２ｕＭ酢酸セルロース膜（Costar、カタログ番号８１６０）を通して濾過した。各調製物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて査定した。
定量的ＥＬＩＳＡ
【０１５４】
定量的ＥＬＩＳＡを用いて、抗体力価を決定した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ８０−１０４Ａ、１ｍｇ／ｍｌ）を炭酸塩緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３３．６ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．５）中で１：１００希釈した。１００ｕｌ／ウェルのコーティング溶液を、３７°Ｃで１時間、インキュベートすることにより、プレートを被覆した。プレートをＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭトリス、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％トゥイーン−２０、ｐＨ８．０）で４回洗浄し、２００ｕｌ／ウェルのＴＢＳ／ＢＳＡ（５０ｍＭトリス、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、ｐＨ８．０）で、３７℃で１時間、遮断した。試料および標準を、非結合プレート上で、十分な容積で調製して、二重反復実験で実行した。ＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ（５０ｍＭトリス、０．１４  ＮａＣｌ、１％ＢＳＡ、０．０５％トゥイーン２０、ｐＨ８．０）中にヒト参照血清（Ｂｅｔｈｙｌ  ＲＳ１０−１１０；４ｍｇ／ｍｌ）を希釈して以下の濃度にすることにより、標準を調製した：５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．２５ｎｇ／ｍｌ、１５．６２５ｎｇ／ｍｌ、７．８１２５ｎｇ／ｍｌおよび０．０ｎｇ／ｍｌ。ＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ中に適切な希釈液を作製することにより試料を調製して、試料の光学密度（ＯＤ）が標準の範囲内になるようにした；ほとんどの線状範囲が１２５ｎｇ／ｍｌ〜１５．６２５ｎｇ／ｍｌである。プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄後、１００ｕｌの標準／試料調製物を各ウェルに付加し、３７°Ｃで１時間、インキュベートした。次に、プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄して、ＴＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ中に１：１５０，０００希釈した１００ｕｌ／ウェルＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ａ８０−１０４Ｐ、１ｍｇ／ｍｌ）とともに、３７℃で１時間、インキュベートした。プレートをＴＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００ｕｌ／ウェルのＴＭＢ基質（４°Ｃに冷却）を用いて展開させた。７分後、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（１００ｕｌ／ウェル）で反応を停止させた。ＯＤを４５０ｎｍで測定し、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｚｍソフトウェアを用いてデータを解析した。４つのパラメーター方程式を用いて標準曲線を適合させて、試料中のヒトＩｇＧ含量を算定するために用いた。
直接結合ＥＬＩＳＡ
【０１５５】
ヒト化抗体のＬＰＡ結合親和性を、直接結合ＥＬＩＳＡ検定を用いて確定した。微量滴定ＥＬＩＳＡプレート（Costar）を、０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）中で３７°Ｃで１時間希釈されたＩｍｊｅｃｔマレイミド活性化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Pierce Co.）と共役された１．０ｕｇ／ｍｌのＣ１２：０  ＬＰＡで、一晩被覆した。プレートを、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１０．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）で洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ／トゥイーン２０で、室温で１時間、または４℃で一晩、遮断した。初回インキュベーション（室温で１時間）のために、抗ＬＰＡ抗体の希釈液シリーズ（０．４ｕｇ／ｍＬ、０．２ｕｇ／ｍＬ、０．１ｕｇ／ｍＬ、０．０５ｕｇ／ｍＬ、０．０１２５ｕｇ／ｍＬおよび０ｕｇ／ｍＬ）をマイクロプレート（１００ｍｌ／ウェル）に付加した。プレートを洗浄し、１００ｕｌ／ウェルのＨＲＰ共役ヤギ抗ヒト（Ｈ＋Ｌ）（１：２０，０００希釈）（Jackson、カタログ番号１０９−０３５−００３）とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、テトラメチルベンジジン基質（Sigma、カタログ番号Ｔ０４４０）でペルオキシダーゼを展開させて、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を付加することにより停止させた。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて、光学密度（ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｚｍソフトウェアを用いて、４つのパラメーター方程式で用量応答曲線の最小二乗適合により、ＥＣ５０（半最大結合濃度）を確定した。
【０１５６】
ヒト化抗体ＬＴ３０１５のＥＣ５０は７５．６ｎｇ／ｍＬと確定されたが、これと比較して、ネズミ抗体ＬＴ３０００は６５．３ｎｇ／ｍＬのＥＣ５０を有した。
ＬＰＡ競合ＥＬＩＳＡ
【０１５７】
ヒト化抗体の特異性を、競合ＥＬＩＳＡにより確定した。Ｃ１８：０  ＬＰＡ個鎮撫物質を、炭酸塩緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３３．６ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．５）で０．３３ｕｇ／ｍｌに希釈した。プレートを、１００ｕｌ／ウェルのコーティング溶液で被覆して、３７°Ｃで１時間インキュベートした。プレートを、ＰＢＳ（１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２７ｍＭ  ＫＣｌ、１．３７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で４回洗浄し、１５０ｕｌ／ウェルのＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％トゥイーン２０で、室温で１時間遮断した。ヒト化抗ＬＰＡ抗体を、脂質競合体（１４：０  ＬＰＡ（Avanti、カタログ番号８５７１２０）、１８：１  ＬＰＡ（Avanti、カタログ番号８５７１３０）、１８：１  ＬＰＣ（Avanti、カタログ番号８４５８７５）、ｃＬＰＡ（Avanti、カタログ番号８５７３２８）、１８：１  ＰＡ（Avanti、カタログ番号８４０８７５）、ＰＣ（Avanti、カタログ番号８５０４５４）に対して、５ｕＭ、２．５ｕＭ、１．２５ｕＭ、０．６２５ｕＭおよび０．０ｕＭで試験した。抗体をＰＢＳ、０．１％トゥイーン２０中に希釈して０．５ｕｇ／ｍｌとして、非結合プレート上で１：３の比の抗体対試料で脂質試料と組み合わせた。プレートをＰＢＳで４回洗浄し、１００ｕｌ／ウェルの一次抗体／脂質複合体とともに、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％トゥイーン２０中に１：２０，０００希釈した１００ｕｌ／ウェルのＨＲＰ−共役ヤギ抗ヒト抗体とともに室温で１時間インキュベートした。再び、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、ＴＭＢ基質（１００ｕｌ／ウェル）を４°Ｃで用いて展開させた。８分後、１００ｕｌ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。光学密度（ＯＤ）を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸを用いて４５０ｎｍで測定した。生データを、解析のためにＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアに移した。
【０１５８】
ヒト化ｍＡｂに関するＩＣ５０は０．０８ｕＭであると確定されたが、一方、対応するネズミ抗体（ＬＴ３０００）に関するＩＣ５０は０．２８ｕＭであった。
熱安定性
【０１５９】
ヒト化抗体の熱安定性を、直接結合ＥＬＩＳＡを用いて加熱後のそのＬＰＡ結合親和性（ＥＣ５０）を測定することにより試験した。ＰＢＳ中に溶解した抗体（Cellgo、カタログ番号０２１−０４０）を、２５ｕｇ／ｍｌに希釈し、６０°Ｃ、６５°Ｃ、７０°Ｃ、７５°Ｃおよび８０°Ｃで１０分間、インキュベートした。温度を上げる前に、１０ｕｌの各試料を取り出して、９０ｕｌのＰＢＳで希釈し、氷上に保存した。次に、試料を手短に掻き混ぜて、不溶性物質を、１３，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離により除去した。上清の結合活性を、直接ＬＰＡ結合ＥＬＩＳＡにより確定して対照（加熱処理をしていない同一試料からなる）と比較した。
【０１６０】
ヒト化抗体ＬＴ３０１５に関するＴｍは７１．５℃であると確定されたが、これは、ネズミ親抗体ＬＴ３０００の６７℃より高かった。
表面プラズモン共鳴
【０１６１】
全結合データを、ＰｒｏｔｅＯｎ光学バイオセンサー（BioRad, Hercules CA）上に収集した。１２：０  ＬＰＡ−チオールおよび１８：０  ＬＰＡ−チオールを、マレイミド修飾ＧＬＣセンサーチップ（カタログ番号１７６−５０１１）と連結させた。先ず、ＧＬＣチップをスルホ−ＮＨＳ／ＥＤＣの等混合物で７分間活性化して、その後、エチルジアミンで７分間遮断した。次に、スルホ−ＭＢＳ（Pierce Co.、カタログ番号２２３１２）を、ＨＢＳ流動緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％トゥイーン２０、ｐＨ７．４）中０．５ｍＭの濃度で表面全体に通した。ＬＰＡ−チオールをＨＢＳ流動緩衝液中に希釈して、１０、１および０．１ｕＭの濃度にして７分間注射して、  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ３つの異なる密度のＬＰＡ表面（〜１００、〜３００および〜１４００ＲＵ）を生じた。次に、ヒト化抗体に関する結合データを、最高濃度として２５ｎＭで出発して、３倍希釈シリーズを用いて収集した（元のストックを、各々、１〜１００倍希釈した）。１００ｍＭ  ＨＣｌの１００秒パルスで、表面を再生した。データはすべて、２５°Ｃで収集した。参照表面、ならびにブランク注射を用いて、対照を加工処理した。各表面からの応答データは、複雑な結合行動を示したが、これは種々の多価結合度により引き起こされると思われる。結合定数の概算値を引き出すために、種々の抗体濃度からのデータを、１部位および２部位モデルを用いて、全体的に適合させた。これにより、二価（部位１）および一価部位（部位２）に関する親和性の概算値を得た。
ＬＰＡモル結合能力
【０１６２】
置換式検定を用いて、ＬＰＡ：ｍＡｂのモル比を確定した。ボロシリケート管（Fisherbrand、カタログ番号１４−９６１−２６）を、ドライ窒素流を用いて、５ナノモルのビオチニル化ＬＰＡ（５０ｕｇの脂質（Echelon Bioscienes、カタログ番号Ｌ−０１２Ｂ、ロット番号Ｆ−６６−１３６を７０５ｕｌの１：１  クロロホルム：メタノール中に懸濁して、１００ｕＭ溶液を得る）で被覆した。被覆試験管を、７５ｕｌ（１２５ｐｍｏｌｅｓ）の抗体（ＰＢＳ中に溶解、Cellgro、カタログ番号０２１−０３０)とともに室温でインキュベートした。３時間インキュベーション後、タンパク質脱塩カラム（Pierce、カタログ番号８９８４９）を用いて、ＬＰＡ：ｍＡｂ複合体を遊離脂質から分離し、メーカーの仕様説明書に従ってＨＡＢＡ／アビジン置換検定（Pierce、カタログ番号２８０１０）を用いて、結合ビオチニル化ＬＰＡのモル濃度を確定した。
ＳＫＯＶ３細胞におけるＬＰＡ誘導性ＩＬ−６およびＩＬ−８放出の測定
【０１６３】
抗ＬＰＡ抗体は、ＳＫＯＶ３卵巣細胞の状態調節培地中のヒトＣＸＣＬ８／ＩＬ−８のＬＰＡ依存性放出を抑制するが、このことは、これらの抗体が生物学的に活性であることをしめしている。ＳＫＯＶ３細胞（ロット番号４２５５５５８、１４継代）を、２ｍｌの１×トリプシンＥＤＴＡ（Mediatech Inc、カタログ番号２５−０５３−ＣＶ）で収穫して、８ｍｌの完全培地（１０％ＦＢＳ、Mediatech Inc.、カタログ番号３５−０１１−ＣＶ）中に再懸濁した。細胞を５分間（１１，０００ｒｐｍ）遠心分離して、５ｍｌの完全培地中に再懸濁した。細胞を、血球計を用いて０．４％トリパンブルー（１０ｕｌの細胞＋９０ｕｌのトリパンブルー、Invitrogen、カタログ番号１５２５０−０６１）で、二重反復実験で計数した。９６−ウェルプレート中に、１×１０５個の細胞／ウェルを植えつけた（最終容積１００ｕｌ／ウェル）。３７℃で一晩インキュベートすることにより、細胞を付着させて、集密単一層を形成させた。翌日、最小培地（Ｌ−グルタミンを有するマッコイ培地中１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、Mediatech、カタログ番号１０−０５０−ＣＶ）で２回、細胞を静かに洗浄した。培地を調整して、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Mediatech、カタログ番号３０−００２  ＣＩ）および２．２ｇ／Ｌ  重炭酸ナトリウム（Mediatech、カタログ番号２５−０３５−ＣＩ）とした。次いで、これは、ヒト化ＬＰＡ抗体  ＬＴ３０１５（１５０、３００または６００ｕｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下で１時間、予備インキュベートされた細胞を、３７°Ｃで正確に２４時間、血清枯渇状態にして、その後、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ／ＰＢＳ（Calbiochem、カタログ番号１２６５７５）中に溶解した１ｕＭ  Ｃ１８：１  ＬＰＡ（Avanti、カタログ番号８５７１３０）を用いてサイトカイン刺激した。次いで、細胞に処理を加えた。２２時間のサイトカイン刺激後、細胞を５分間（１３，５００ｒｐｍ）、４°Ｃで遠心分離して、上清（細胞状態調節培地）を収集した。各上清中のＣＸＣＬ８／ＩＬ−８レベルを、売主の使用説明書（R&D Systems、Minneapolis MN、カタログ番号Ｄ８０００Ｃ）に従って、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＣＸＣＬ８／ＩＬ−８ＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＩＬ−６イムノアッセイキット（R&D systems、カタログ番号Ｄ６０５０）を用いて、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−６レベルを測定した。一方向ＡＮＯＶＡと、その後のボンフェロニ後試験によりデータを解析し、ヒトＩＬ−８またはヒトＩＬ−６の倍増として表した。データを、以下の表７および表８に示す。
【表７】
2014523439.tif 000009
【表８】
2014523439.tif 000010
疾患モデルにおけるＬＴ３０１５の活性：
【０１６４】
ＬＴ３０１５は、掻爬検定において卵巣腫瘍細胞移動を防止することが示されており、さらに、マウスの生物学的流体中の卵巣腫瘍ＳＫＯＶ３進行および循環サイトカインを低減することが示されている。さらなる詳細に関しては、米国特許出願第１２／７６１，５８４号（２０１０年４月１６日出願（代理人生理番号  ＬＰＴ−３２１０−ＵＴ））（これは本発明と権利者が共通で、その記載内容は参照により本明細書中で援用される）を参照。
実施例５：  細胞株開発のためのベクターｐＡＴＨ３０１５の作製
【０１６５】
ＬＴ３０１５は、生理活性脂質リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）と高親和性で結合する組換えヒト化モノクローナル抗体である。ＬＴ３０１５は、２つの同一軽鎖および２つの同一重鎖からなる全長ＩｇＧｌｋアイソタイプ抗体であって、そう分子量は１５０ｋＤａである。重鎖は、Ｎ−結合型グリコシル化部位を含有する。２つの重鎖は、ヒトＩｇＧ１の構造と一致する２つの分子間ジスルフィド結合を介して互いに共有的に結合される。
【０１６６】
ＬＴ３０１５は、最初は、ＬＰＡで免疫化されたマウスから生成されたハイブリドーマを用いて産生されたネズミモノクローナル抗体から得られた。ネズミ抗体のヒト化は、ネズミ親抗体とのその構造的類似性のために選択されるヒト抗体フレームワークのものの代わりに、６つのネズミ相補性決定領域（ＣＤＲ）の挿入を伴った。ヒト化抗体を工学処理するために、フレームワークにおいて一連の置換がなされた。これらの置換は、復帰突然変異と呼ばれ、抗原との相互作用に関与するネズミ残基とヒト残基を取り替える。最終的ヒトバージョンは、重鎖の可変ドメインのヒトフレームワークにおける６つのネズミ復帰突然変異（ｐＡＴＨ６０２）および軽鎖の可変ドメインのヒトフレームワークにおける３つのネズミ復帰突然変異（ｐＡＴＨ５０２）を含有する。
【０１６７】
ヒト化抗ＬＰＡモノクローナル抗体の可変ドメインをLonza BiologiesのＧＳ遺伝子発現系のベクターＩｇＧｌｋ中でクローン化して、ベクターｐＡＴＨ３０１５を生成した。この発現系は、抗体遺伝子の定常ドメインおよび選択可能マーカーグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）を保有する発現ベクターからなる。ＧＳは、グルタミン酸塩およびアンモニアからのグルタミンの生合成に関与する酵素である。抗体遺伝子および選択可能マーカーの両方を保有するベクターを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯＫ１  ＳＶ）細胞株中にトランスフェクトして、外因性グルタミンなしで細胞が生存するために十分なグルタミンを提供する。さらに、ベクターにより提供されるＧＳ活性を有する細胞株のみが生き残り得るよう、特異的ＧＳ阻害薬であるメチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を培地中に補足して、内因性ＧＳ活性を抑制した。ＭＳＸの存在下で無グルタミン培地中で増殖するそれらの能力に関して、トランスフェクト化細胞を選択した。
【０１６８】
ｐＡＴＨ３０１５を生成するためのLonza BiologicのＧＳ遺伝子発現系の二重遺伝子ベクターＩｇＧ１ｋ中でのヒト化抗ＬＰＡモノクローナル抗体の可変ドメインのクローニングステップのさらなる詳細は、米国特許出願第１２／７６１，５８４（２０１０年４月１６日出願（代理人生理番号  ＬＰＴ−３２１０−ＵＴ））（これは本発明と権利者が共通で、その記載内容は参照により本明細書中で援用される）見出され得る。
【０１６９】
ｐＡＴＨ３０１５を、電気穿孔により、Lonza所有のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯＫ１ＳＶ）宿主細胞株（無血清培地中での増殖のために適合）中に導入した。このトランスフェクトから得られる細胞株はＬＨ２と呼ばれ、薬剤物質を産生するために用いられる。発現薬剤ＬＴ３０１５は、以下の特質を有する：
【表９】
2014523439.tif 000011
実施例６：  ヒト化抗ＬＰＡ可変領域配列
【０１７０】
ネズミ抗体Ｂ７およびネズミ抗体Ｂ３重鎖の、ならびにＢ３重鎖の付加的ヒト化抗ＬＰＡ変異体を、上記のように生成した。
【０１７１】
ｐＡＴＨ３０１６を、ｐＡＴＨ３０１５と同様に生成した。上記のように、ｐＡＴＨ３０１５および３０１６の重鎖は同一である（ｐＡＴＨ６０２由来。６つの復帰突然変異を有する）が、しかしｐＡＴＨ３０１６軽鎖（ｐＡＴＨ５０６由来）は、より少ない復帰突然変異を含有する。ｐＡＴＨ３０１６から産生されるヒト化モノクローナル抗体は、ＬＴ３０１６である。ｐＡＴＨ３０１５およびｐＡＴＨ３０１６はともに、アメリカ培養細胞コレクション（Manassas VA）に寄託され、ＡＴＣＣ特許寄託呼称  ＰＴＡ−９２１９およびＰＴＡ−９２２０をそれぞれ有する。
ヒト化変異体の活性
【０１７２】
５つのヒト化変異体（ＬＴ３０１１、ＬＴ３０１３、ＬＴ３０１４、ＬＴ３０１５およびＬＴ３０１６）を、in vitro細胞検定でさらに査定した。ＬＰＡは、癌細胞からのインターロイキン−８（ＩＬ−８）の放出を引き出すに際して重要な役割を果たすことが既知である。ＬＴ３０００は、濃度依存的方式で、卵巣癌細胞からのＩＬ−８放出を低減した。ヒト化変異体は、ＬＴ３０００と比較して、ＩＬ−８放出の同様の低減を示した。
【０１７３】
新血管新生に関するマトリゲル管形成検定において、いくつかのヒト化変異体を、微小血管密度（ＭＶＤ）に及ぼすそれらの作用に関しても試験した。ともに、ＭＶＤ形成を減少させることが示された。
【表１０】
2014523439.tif 000012
【０１７４】
ヒト化抗ＬＰＡ抗体  ＬＴ３０１５（「Ｌｐａｔｈｏｍａｂ」とも呼ばれる）を、さらなる特性化のために選択した。ヒト化ｍＡｂは、ネズミ親抗体Ｂ７の結合特異性および熱安定性を保持する。
【０１７５】
別のヒト化抗ＬＰＡ変異体  ＬＴ３１１４も、さらなる特性化およびＬＴ３０１５との比較のために選択した。ネズミモノクローナル抗体Ｂ３を基礎にして、ＬＴ３１１４をヒト化した。
【０１７６】
便宜上、Ｂ７の変異体（軽鎖および重鎖ならびにその組合せ）の比較を、表１１に示し、Ｂ３の変異体の比較を表１２に示す。
【表１１】
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【表１２】
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ＬＴ３１１４およびＬＴ３０１５の開発および特性化
【０１７７】
ＬＰＡを結合するために高親和性および特異性を保持するヒト化抗体を産生することを目標にして、Ｌｐａｔｈｏｍａｂをヒト化した。選択されたヒト抗体フレームワークのＩｇＧｋｌ重鎖および軽鎖可変ドメインの６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をネズミ抗ＬＰＡ  ｍＡｂ  Ｌｐａｔｈｏｍａｂからのカバト限定ＣＤＲｓに取り替えることにより、ネズミ抗体のヒト化を達成した。ヒト化抗体と抗原の相互作用を最大にするために、フレームワーク中に一連の復帰突然変異を作製した。いくつかのヒト化変異体を工学処理し、哺乳動物細胞中で発現させると、ネズミＬｐａｔｈｏｍａｂと非常によく似たＬＰＡとの結合を示した。ＬＰＡに関するそれらの結合親和性ならびに関連脂質に対するそれらの交差反応性に関して、ヒト化変異体を特性化した。ヒト化抗ＬＰＡ抗体  ＬＴ３０１５、ＬＴ３１１４およびネズミｍＡｂ、Ｂ３の特異性を、ＥＬＩＳＡベースの競合結合検定で測定した。要するに、ヤギ抗ヒトまたはマウスＩｇＧで予め被覆したＥＬＩＳＡプレート上に、抗体を捕捉した。競合脂質の一連の希釈液を、一定量のビオチン標識１８：０  ＬＰＡの存在下で結合させた。次に、結合標識化ＬＰＡを、ホースラディッシュペルオキシダーゼと共役されたストレプトアビジンを用いて検出した。
【０１７８】
特異性に関して、ヒト化変異体は、Ｌｐａｔｈｏｍａｂと同様の特異性プロフィール、例えばＬＰＣ、ＰＡ、ＰＣ、血小板活性化因子（ＰＡＦ）またはリゾ−ＰＡＦに対する無交差反応性、ならびに環状ＬＰＡ（ｃＬＰＡ）との最小交差反応性を、競合ＥＬＩＳＡにより実証した（図１）。
【０１７９】
異なるアイソフォームのＬＰＡに関する異なる抗体の親和性をひかくするためにも、競合結合ＥＬＩＳＡを用いた。ネイティブ１８：１および１８：２  ＬＰＡに関する抗体の親和性を、ＥＬＩＳＡベースの競合結合検定で測定した。要するに、ヤギ抗ヒトまたはマウスＩｇＧで予め被覆したＥＬＩＳＡプレート上に、抗体を捕捉した。ネイティブ脂質の一連の希釈液を、一定量のビオチン標識１８：０  ＬＰＡの存在下で結合させた。次に、結合標識化ＬＰＡを、ホースラディッシュペルオキシダーゼと共役されたストレプトアビジンを用いて検出した。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍソフトウェアでChengおよびPrusoffの式を用いて競合結合データを適合することにより、ネイティブ脂質と結合する各抗体に関するＫｉを確定し、そしてビオチン標識化ＬＰＡに関する各抗体のＫｄを、別個の飽和結合ＥＬＩＳＡ実験で確定した。２つのヒト化抗体候補  ＬＴ３１１４およびＬＴ３０１５に関する代表的データ、ならびに最初のネズミ抗ＬＰＡ抗体（Ｂ３と呼ばれる）を、図２に示す。これらのデータは、１８：１および１８：２  ＬＰＡに関する競合結合曲線を示す。ヒト化抗体変異体  ＬＴ３１１４およびネズミ抗体  Ｂ３（これからＬＴ３１１４  ＣＤＲが得られる）を得たが、これらは、ネイティブ脂質に関して本質的に同一の結合特質を有し、Ｋｉは、１８：２  ＬＰＡに関しては１５ｎＭおよび１８：１  ＬＰＡに関しては３６０ｎＭである。２つのＬＰＡアイソフォームに関するＬＴ３０１５ヒト化抗体変異体のＫｉは、１８：２に関しては２００ｎＭおよび１８：１  ＬＰＡに関しては６００ｎＭで多少低い。１６：０、１８：０および２０：４  ＬＰＡアイソフォームとの結合も調べた。各々の場合、ヒト化抗体ＬＴ３１１４による結合は、元のネズミＢ３抗体を用いて得られるものと同一であった。
２．ヒト化抗ＬＰＡ抗体  ＬＴ３１１４およびＬＴ３０１５はＬＰＡの生物学的活性を抑制する
【０１８０】
Ｌｐａｔｈｏｍａｂは、ＬＰＡ１受容体とのＬＰＡの結合を遮断し、細胞活性化を防止し得る、ということが実証されている。ＬＰＡ１過剰発現細胞におけるＬＰＡによる刺激を遮断するヒト化ｍＡｂｓ、ＬＴ３１１４およびＬＴ３０１５の能力を試験した。漸増濃度（０〜１，５００ｇ／ｍＬ）のネズミ抗体Ｂ３およびヒト化抗体ＬＴ３１１４およびＬＴ３０１５を、１８：０、１８：１、１８：２または２０：４  ＬＰＡと一緒にＬＰＡ１受容体トランスフェクト化細胞に付加し、受容体シグナル伝達を遮断するそれらの能力に関して試験した。３つの抗体はすべて、試験した各脂質に応答して、ＬＰＡ１受容体シグナル伝達を有効に抑制した。
実施例７：  Ｌｐａｔｈｏｍａｂの予備的動物薬物動態
【０１８１】
Ｌｐａｔｈｏｍａｂを用いて、予備ＰＫ試験を実行した。ＩＶ用量投与群に関しては、単一３０ｍｇ／ｋｇ用量をマウスに注射し、１５日までの時点で屠殺した。抗体も腹腔内投与により与えて、最初の２４時間の間に動物を屠殺し、異なる送達経路に関して個の期間中、血中のｍＡｂのレベルを比較した。薬物動態パラメーターを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎにより査定した。３匹のマウスを各時点で屠殺して、血漿試料を収集して、ＥＬＩＳＡによりｍＡｂレベルに関して分析した。マウスにおけるＬｐａｔｈｏｍａｂの半減期は、静脈内投与により１０２時間（４．２５日）であると確定された。さらに、腹腔内投与した場合、抗体は６〜１２日以内に血液に完全に分布し、これは腹腔内投与が適切であることを示唆している。
【表１３】
2014523439.tif 000015
実施例８：  抗ＬＰＡ  ｍＡｂはＬＰＡ誘導性ＩＬ−６放出を抑制する
【０１８２】
ＩＬ−６は、強力な疼痛発生性炎症媒介物質である。ＩＬ−６は、末梢神経損傷後のラット脊髄中に産生され、ＩＬ−６レベルは異痛症の強度と直接的に相関する（Arruda, et al.(2000), Brain Res. 879:216-25）。ＩＬ−６レベルはストレスまたは炎症中に増大し、関節リウマチは、滑液中のＩＬ−６のレベル増大に関連する（Matsumoto, et al (2006), Rheumatol. Int. 26:1096-1100; Desgeorges, et al. (1997), J. Rheumatol.24:1510-1516）。神経障害性疼痛は、ＩＬ−６ノックアウトマウスにおいて防止される（Xu, et al (1997) Cytokine 9:1028-1033）。一次星状細胞では、ＬＰＡ（１ｕＭ）による処置は、ＩＬ−６放出を引き起こす。一次星状細胞におけるＩＬ−６放出に及ぼす抗ＬＰＡ抗体の作用を評価するために、実験を実行した。
【０１８３】
ラット一次星状細胞をCambrex (Charles City, IA)から購入し、売主の使用説明書に従って培養した。ＩＬ−６放出検定のために、細胞を１×１０４細胞／ウェルで９６−ウェルプレート中に植えつけて、２４時間血清ナシで、培地中の血清を枯渇させた。血清枯渇後、一次星状細胞を、１ｍＭ  ＬＰＡ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬの脂肪酸無含有ＢＳＡ中に溶解）（ネズミ抗ＬＰＡモノクローナル抗体Ｂ３の存在下または非存在下で予めインキュベート（１５０または３００ｍｇ／ｍＬ抗体（１：１または１：２のモル比のｍＡｂ：ＬＰＡ；５％ＣＯ２保湿インキュベータ中で３７℃で１時間））で処理した。２４時間後、状態調節培地を収集し、売主の使用説明書に従ってヒトＩＬ−６ＥＬＩＳＡ（ラットＩＬ−６  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット、 R&D systems, Minneapolis MN)により試験した。ＩＬ−６値（ｐｇ／ｍｌ）を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア(La Jolla CA)を用いて算定した。 
【０１８４】
ヒト一次星状細胞からの細胞状態調節培地を、Ｂ３抗体のモル比濃度（１：１または１：２  ｍＡｂ：ＬＰＡ）の存在下または非存在下で１ｍＭ  ＬＰＡとともに２４時間インキュベーション後のＩＬ−６レベルに関して試験した。２：１の比でのＬＰＡ＋ＬＰＡに対する抗体（ネズミ抗体  Ｂ３）による処理は、ＩＬ−６放出を遮断しただけでなく、ＩＬ−６レベルを対照レベルの約半分に下げた。ＬＰＡ＋抗体（１：１）は、ＩＬ−６レベルのほぼ同じ大きさの低減を生じた。したがって、抗ＬＰＡ抗体は、ＬＰＡによる星状細胞処理に応答して起こるＩＬ−６の放出を遮断する。
実施例９：  ＬＰＡに対する抗体は糖尿病誘導性神経障害性疼痛モデルにおける異痛症を低減する
【０１８５】
糖尿病誘導性神経障害性疼痛の行動指数としてのホルマリン試験中の触覚性異痛症および痛覚過敏症を用いて、ストレプトゾトシン誘導性１型（インスリン欠乏性）糖尿病のラットモデルで、試験を実施した。実験手順はすべて、公表されている（Calcutt NA, Freshwater JD, O'Brien JS (2000), Anesthesiology 93:1271-1278; Jolivalt CG, Ramos KM, Herbetsson K, Esch FS, Calcutt NA (2006), Pain 121 :14-21）。
【０１８６】
各々体重２２５〜２５０ｇの雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット(Harlan Industries, San Diego CA)を、６５〜８２°Ｆの室温で、３０〜７０％の相対湿度で保持した。蛍光灯による１２時間点灯／１２時間消灯周期で、部屋を照明した。動物はすべて、２匹／ケージで保持し、乾燥食餌および自治体の水を自由に摂らせた。
【０１８７】
０．９％滅菌生理食塩水中に溶解したストレプトゾトシン（５５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により、一晩絶食後にインスリン欠乏性糖尿病を誘導した。高血糖症が、４日後に、そして行動試験前にも、ストリップ操作式反射率計を用いて、尾に突き刺すことで得た血液試料において、確証された。全動物を毎日観察し、試験期間中、定期的に計量した。
【０１８８】
触覚性応答閾値：  金網底を有する試験ケージにラットを移し、馴化させた。フォンフライ式フィラメント(Stoelting, Wood Dale IL)を用いて、脚引っ込めに関する５０％機械的閾値を確定した。一連のフィラメントを、２．０ｇのバックル重量を保有するもので開始して、フィラメントをゆがませる圧力で右後肢の足裏表面に次々に適用した。脚の持ち上げを陽性応答として記録し、次に最も軽いフィラメントを次の測定のために選択した。５秒後に応答がなければ、漸増重量の次のフィラメントの使用を促した。行動の初期変化後４回の測定がなされるまで、あるいは５連続陰性（１５ｇのスコアを与える）または４つの陽性（０．２５ｇのスコア）スコアが生じるまで、このパラダイムを継続した。その結果生じた陽性および陰性スコア列を用いて、５０％応答閾値を内挿した。６ｇより低い５０％触覚性応答閾値を有するラットだけが異痛症とみなされ、薬剤試験のために提示された。
【０１８９】
ホルマリン試験：  ラットを手で抑えて、ホルマリン（０．２％または０．５％溶液を５０μｌ）を後肢背側の皮下に注射した。次にラットを観察小室に入れて、１時間の間に５分毎に１分遮断で、しり込み行動を計数した。
【０１９０】
組織採取：ストリップ操作式反射率計を用いて、糖尿病ラットにおける高血糖症を確証するために、尾に突き刺すことで拘束ラットから血液を取り出した。血液（０．３〜０．５ｍｌ／試料）を、氷上のヘパリン被覆試験管中にも抜き取って、遠心分離し（１５００ｇ、２℃、１０分）、血漿を損後の検定のために−７０℃で保存した。ＣＳＦ（２０〜５０μｌ）を採取し、−７０℃で保存した。末梢脳脊髄軸および脊髄を固定液中に取り出して、その後の検定のために剖検時に−７０℃で保存した。
実験計画
【０１９１】
４群の糖尿病ラットおよび１群の対照ラットを確立し、１週間の高血糖症後の異痛症に関して試験した。ラットにＩＴカテーテルを埋め込み、ＩＶ（尾静脈）およびＩＴ注射の両方により処置した。ラットは、２および３週目の間に、各経路による週２回処置を受けた（ＩＴ：月／木、ＩＶ：火／金）。４週目の開始時に（最終処置後３〜４日目）、次いで、触覚性異痛症が処置ラットに認められる場合には、ＩＴ（月）およびＩＶ（火）処置後１、３および６時間目に、触覚性異痛症を試験した。別の状況では、非処置糖尿病ラットは、ガバペンチンによる単一処置を受け、その後、投薬後１，３および６時間目に触覚性異痛症を測定して、陽性処置対照として役立てた。試験終了時に、全ラットに抗ＬＰＡ抗体の最終注射を施し（ＩＶおよび／またはＩＴ経路：触覚試験データに基づいて決定）、あるいはしり込み惹起を伴う脚ホルマリン注射（０．２％）前の選定時間にガバペンチンを与えて、１時間までの追跡調査をした。ホルマリン試験終了時に動物に麻酔して、上記のような保存のために組織を採取した。
パイロット試験（予備的結果）
【０１９２】
４週間の糖尿病後にネズミ抗ＬＰＡ抗体で２週間処置するパイロット試験を実行して、疼痛引っ込め閾値を確定した。非糖尿病マウスを対照として用いた。この予備試験では、抗ＬＰＡ抗体Ｂ３は糖尿病ラットにおける脚引っ込め閾値を増大したが、これは、糖尿病誘導性神経障害性疼痛を有するラットにおける異痛症の低減を示している。これらの好ましい結果に基づいて、糖尿病性神経障害防止試験を計画し、下記のように実行した。
糖尿病性神経障害防止試験：  糖尿病誘導性神経障害性疼痛の発症を防止するに際してのネズミ抗体Ｂ３の効力を調べるために、３群の糖尿病ラットをＳＴＺでの処置により確立した。糖尿病開始の２週間後に、しかし触覚性異痛症の症状発現前に開始して、動物に静脈内および髄腔内の両方で用量投与して、末梢および中枢神経系区画の両方に抗体が確実に届くようにした（文献はこれに関しては不明であり、あるいは両区画はＬＰＡレベルの調節不全を示すので）。処置群に関する用量投与レジメンは、以下の通りであった：２群の試験動物に、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与抗体を週２回投与した。静脈内投与抗体のほかに、髄腔内カテーテルを介して週２回、動物に抗体を投与した。１群の動物（「低用量＋Ｄ」）には、２μｇの抗体を与え、１群の動物（「高用量＋Ｄ」）には１０μｇの抗体を髄腔内投与した。１群の糖尿病動物は、ビヒクルのみ（「Ｖｅｈ＋Ｄ」）を摂取した。非糖尿病ラットを対照として用いた（「Ｖｅｈ＋Ｃ」）。３週目の開始時、最終処置後４日目に、触覚性応答閾値を測定した。結果を図３に示す。抗ＬＰＡ抗体Ｂ３は、糖尿病ラット２置いて、非糖尿病ラットで観察されたレベルと同様のレベルに脚引っ込め閾値（ＰＷＴ）を増大したが、これは、糖尿病誘導性神経障害性疼痛を有するラットにおける異痛症の顕著な低減を示している。
糖尿病性神経障害介入試験：
【０１９３】
防止試験における励みになる結果に基づいて、次に、それからの対照糖尿病ラット９匹を用いて、既に確立された糖尿病誘導性神経障害性疼痛の可逆性を査定し、そして抗ＬＰＡ抗体Ｂ３の静脈内および髄腔内投与間を識別した。ラットは、種々の日の処置後に、以下のものを摂取した：１日目に対照作用物質としてガバペンチン（腹腔内）、３日目にＬｐａｔｈｏｍａｂ（ｉ．ｔ．）、６日目にＬｐａｔｈｏｍａｂ（ｉ．ｖ．）、および１２日目に併用（ｉ．ｔ．＋ｉ．ｖ．）。各用量投与後、１、３および６時間目の触覚性異痛症のその後の測定（ＰＷＴ応答）を、防止試験に関して上記したように記録した。試験終了時に全動物に麻酔をして、組織を採取し、その後の分析のために保存した。
【０１９４】
この試験の結果を、図４に示す。脚引っ込め閾値に関する時間経過グラフ（図４ａ）および曲線下面積（ＡＵＣ）グラフ（図４ｂ）を提示する。この予備介入試験は、単一用量の抗体は、確立された糖尿病誘導性神経障害性疼痛を改善するに際してガバペンチンと同様に有効であった、ということを実証している。静脈内抗体投与および髄腔内投与はともに、ビヒクルと比較して有効であった。静脈内用量投与後の効力は、一般的に、末梢神経系機序の関与を実証すると考えられるが、一方、ｉ．ｔ．用量投与後に観察された応答は、中枢神経系関与を示唆している。両投与経路による疼痛応答を緩和するＬｐａｔｈｏｍａｂの能力は、ＬＰＡが疼痛伝達の末梢および中枢機序の両方を媒介する、ということを示唆している。これは、動物に両投与経路を組合せてＬｐａｔｈｏｍａｂを用量投与した場合に観察された付加的効果により支持される。
実施例１０：  神経障害性疼痛の坐骨神経損傷モデルにおける抗ＬＰＡ抗体
【０１９５】
リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）は、  ｉｓ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  多数の細胞性応答、例えば増殖、分化、血管形成、およびアポトーシスからの防御を媒介する内因性生理活性脂質である。ＬＰＡは、神経障害性疼痛、ならびに部分的坐骨神経損傷を有するマウスにおけるＬＰＡ１受容体シグナル伝達による根元的機序を生じる（Ueda at al., Nature Med, 10(7):712-8 2004）。実際、ＬＰＡ１−零マウスは、種々の神経損傷誘導性神経傷害性疼痛ならびにその根元的機序、例えば脱髄、ミエリンタンパク質の下方調節、Ｃａｖ  α２δ−１および脊髄ＰＫＣγの上方調節を示さない。坐骨神経損傷誘導性脱髄は、坐骨神経（ＳＣＮ）および背根（ＤＲ）で観察されたが、しかし脊髄神経（ＳＮ）では観察されず、脱髄はＤＲでは終わっていたが、しかしＬＰＡ１受容体ノックアウトマウスのＳＣＮでは終わっていなかった。脊髄薄片をサブスタンスＰ＋ＮＭＤＡで刺激した場合（いずれか一方では刺激されない）、ＬＰＡのレベルの顕著な時間依存性増大が認められたが、これは、オートタキシンの作用により新規に産生されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）から転化された（Inoue, M. et al. (2008) J Neurochem, 107(6):1556-65）。したがって、感覚遷移の強い刺激がＬＰＡ産生をもたらし、これが順次、背根遷移の脱髄をもたらす、ということは明らかである。末梢神経傷害性疼痛の坐骨神経損傷誘導性モデルのほかに、脊髄損傷誘導性中枢性神経傷害性疼痛および中枢性ストレス誘導性慢性疼痛モデルが開発されている。
【０１９６】
抗ＬＰＡ抗体を、末梢神経傷害性疼痛の坐骨神経損傷誘導性モデルで査定し（Seltzer, et al. (1990), Pain, 43(2), 205-218)、そして脊髄損傷誘導性中枢神経障害性疼痛および中枢性ストレス誘導性慢性疼痛のモデルにおいても査定し得た。この試験は、長崎大学のDr. Hiroshi Uedaの研究室で実行された。
in vivo試験
【０１９７】
６週齢雄および雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（体重８〜２２ｇ）を用いた。これらのマウスを、２４±２°Ｃで、湿度６０±５％に維持した部屋に、個別に保持し、標準実験室餌および水道水を自由に摂らせた後、用いた。
１）部分坐骨神経損傷（ＰＳＮＩ）モデル
【０１９８】
５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで、マウスを深く麻酔した。右（または左）後足の総坐骨神経を、小切開により高大腿部のレベルで曝露し、神経厚の背側半分を絹縫合糸でしっかり結紮した。
２）脊髄損傷（ＳＣＩ）モデル
【０１９９】
ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）麻酔下で、第九胸椎での椎弓切除術後に、硬膜の背側表面を曝露する。市販のＳＣＩ装置（４０ｋｄｙｎ、不定水平インパクター使用。Precision Systems & Instrumentation, Fairfax Station VA）を用いて、Ｔ９の脊髄セグメントに脊髄損傷を生成する。
３）間欠性寒冷ストレス（ＩＣＳ）モデル
【０２００】
マウス２匹／群を、４±２°Ｃの寒冷室に、１日目の４：３０ｐ．ｍ．に入れて、餌と水の代わりに寒天を与える。マウスをステンレススチール製の網の上に載せて、プレキシガラスケージで覆う。翌朝１０：００  ａ．ｍ．に、マウスを、２４±２°Ｃの通常温度室に移す。通常温度に３０分置いた後、再び、寒冷室に３０分間置く。これらの過程を４：３０  ｐ．ｍ．まで繰り返す。次に、マウスを寒冷室に一晩入れる。翌日に同一処置をした後、最後に、１０：００  ａ．ｍ．にマウスを寒冷室から取り出す。
【０２０１】
１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、３．８ｍＭ  ＫＣｌ、２．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３および１０ｍＭ  Ｄ−グルコースを含む人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）（ｐＨ７．４）中に希釈した０．２ｐｇ／ｐＬの最小濃度での抗ＬＰＡ抗体（Ｂ３）を供給した。
１）ＰＳＮＩモデル
【０２０２】
抗ＬＰＡ抗体注射：  抗ＬＰＡ抗体の髄腔内（ｉ．ｃ．ｖ．またはｉ．ｔ．）注射を、第５および第６腰椎セグメント間で自由裁量で実施した。ｉ．ｃ．ｖ．またはｉ．ｔ．注射を、５μｌ（１ｇ）の容積で投与した。
【０２０３】
痛覚試験：  デジタルフォンフライ装置試験（触覚計、 IITC Inc., Woodland Hills, USA）を用いて、脚圧試験を実行した。この実験では、マウスの脚引っ込め行動を引き起こす所定の圧力の閾値（グラム）を、評価した。熱性脚引っ込め試験［Hargreaves, et al. (1988), Pain 32:77-88］を、熱刺激を用いて実行した（IITC Inc., Woodland Hills, CA, USA）。これらの行動実験を、結紮後１、３、７および１４日目のマウスにおいて実行した。
【０２０４】
プロテインキナーゼＣｙおよびＣａα２δ１に関する免疫組織化学：痛覚試験後（１４日目）、マウスをｉ．ｐ．ペントバルビタールで深く麻酔して、Ｋ＋無含有ＰＢＳで、その後、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて、経心臓還流した。背根神経節（ＤＲＧ）および第４腰椎〜第５腰痛セグメント間の脊髄を取り出し、４％ＰＦＡ中で後固定する。プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）およびＣａ２１のアイソフォームの免疫染色のために、次に切片をウサギポリクローナル抗体と反応させる。次に切片を、ＦＩＴＣ−共役抗ウサギＩｇＧとともにインキュベートする。
【０２０５】
脱髄のためのトルイジンブルー染色および投下型電子顕微鏡
ＤＲ繊維を２．５％グルタルアルデヒドで固定する。固定ＤＲ繊維を、２％四酸化オスミウムで後固定して、段階的アルコールシリーズ中で脱水し、エポン８１２中に包埋する。薄切片（１  ｍ）を各ブロックから切断し、アルカリ性トルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で検査する。超薄切片（８０ｎｍ厚）を、Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｓ（Leica, Austria）で切り出し、次いで酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛でそれぞれ染色する。染色切片を、電子顕微鏡（ＪＥＭ−１２００ＥＸ；JEOL, Tokyo, Japan）下で観察する。
２）ＳＣＩモデル
【０２０６】
抗ＬＰＡ抗体注射：  抗ＬＰＡ抗体の脳室内（ｉ．ｃ．ｖ．またはｉ．ｔ．）注射を、マウスの右外側脳室中に実行する。ｉ．ｃ．ｖ．またはｉ．ｔ．注射を、５μｌ（１μｇ）の容積で１〜５回、投与する。
【０２０７】
痛覚試験：  脚圧試験および熱性脚引っ込め試験を、ＳＣＩ後２、４、８および１２週目に実行する。
３）ＩＣＳモデル
【０２０８】
抗ＬＰＡ抗体注射：  抗ＬＰＡ抗体のｉ．ｃ．ｖ．またはｉ．ｔ．注射を、５μｌ（１μｇ）の容積で１〜５回投与する。
【０２０９】
痛覚試験：  脚圧試験および熱性脚引っ込め試験を、ＩＣＳ後１、３、５、１２および１９日目に実行する。
【０２１０】
予備ＰＳＮＩ実験の結果を、図５に示す。
【０２１１】
１．  予防実験（図５Ａ）：  ＬＰＡに対する抗体（Ｂ３）（１  ｕｇ、髄腔内）を部分坐骨神経損傷の１時間前にマウスに注射したが、これは、末梢性神経障害性疼痛を誘導する［Seltzer, et al. (1990), Pain, 43(2), 205-218］。一方のみの後足／動物で損傷を実施し、疼痛応答を、損傷（同側）および非注射（反対側）側で疼痛応答を測定した。熱性脚引っ込め潜伏期（ＰＷＬ）試験（Hargreaves, et al., 1988）を用いて、疼痛応答を定量した。要するに、ガラス表面に置いたマウスの後足の足裏に、熱線を集中させ、引っ込め応答潜伏期を測定した（秒）。したがって、より高い（長時間）応答は低疼痛を、そしてより低い(短時間）応答はより大きい疼痛を示している。
【０２１２】
図５Ａは、部分坐骨神経損傷が、抗体処置の非存在下で、非損傷部位（「反対側」）と比較して、損傷側（「同側」）で疼痛応答の劇的増大（ＰＷＬ時間短縮）を生じる（白色バー比較）、ということを示している。この作用は、抗ＬＰＡ抗体（Ｂ３）での処置により防止される（黒色バー）。
【０２１３】
２．  介入実験（図５Ｂ）：  部分坐骨神経損傷（同上）の３時間後に、ＬＰＡに対する抗体（Ｂ３）（３ｕｇ、髄腔内）をマウスに注射した。図５Ｂは、上記と同様に、部分坐骨神経損傷が、抗体処置の非存在下で、非損傷部位（「反対側」）と比較して、損傷側（「同側」）で疼痛応答の劇的増大（ＰＷＬ時間短縮）を生じる（白色バー比較）、ということを示している。この作用は、抗ＬＰＡ抗体（Ｂ３）での損傷後処置により少なくとも部分的に逆転される（黒色バー）。
【０２１４】
これらの実験は、神経損傷誘導性神経障害性疼痛に関する標的としてＬＰＡを確証し、ＬＰＡの有効濃度を低減する抗体のようなＬＰＡの阻害薬が、神経障害性疼痛の軽減に治療的に有用である、ということを示唆している。
【０２１５】
後続時間経過実験では、５０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールでマウスを深く麻酔した。右（または左）後足の総坐骨神経を、小切開により高大腿部のレベルで曝露し、神経厚の背側半分を絹縫合糸でしっかり結紮した。損傷の１時間前に抗ＬＰＡ抗体の髄腔内（ｉ．ｔ．）注射を投与し、第５および第６腰椎セグメント間で自由裁量で実施した。ｉ．ｔ．注射を、５μｌの容積で投与した。痛覚行動に関する熱性脚引っ込め（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ）および脚圧試験を、結紮後１４日まで実行した。Ｌｐａｔｈｏｍａｂは、坐骨神経損傷誘導性末梢神経障害において、１週間以上、神経障害性疼痛を低減することが判明した（図６）。
実施例１１：  アジュバント誘導性関節炎（ＡＩＡ）のラットモデルにおける抗ＬＰＡ抗体の作用
【０２１６】
雌Ｌｅｗｉｓラット（１５０〜２００ｇ）において、炎症を確立した。１０匹／用量群の尾に、０日目に、パラフィン油中に懸濁した加熱処理マイコバクテリウム属のMycobacterium buytricum  ３ｍｇ（３ｍｇ／０．１５０ｍｌ）を皮下注射した。対照動物には、パラフィン油のみを注射した。ラットを割り当てて、数および体重を各週に追跡調査した。９〜１０日目までに、ラットは疾患の徴候を発現したので、脚容量測定装置で脚浮腫（容積）を測定することにより、ベースラインを得た。罹患ラットでは、試験に含めるためには、対照ラット（１．２ｍｌ）における脚容積より０．２００ｍｌ大きい足容積が必要であった。脚浮腫に基づいて動物を無作為化し、次いで、ビヒクル、アイソタイプ対照またはヒト化抗ＬＰＡ抗体  ＬＴ３０１５を投与した。脚容積を、抗体用量投与後７日および１１日に測定した。ＥＤ５０およびＥＤ８０データを、用量投与後１１日からのデータに基づいて算定した。疼痛の測定値としての発声を、試験最終日に試験ラットで評価した。終末血液採取を実施した。血漿試料を、抗体濃度に関して分析した。血漿および脚流体試料を、サイトカイン、エイコサノイドまたはその他の当該炎症媒介物質に関して分析した。考え得る組織学的評価のために、終了時に足を収集した。
【０２１７】
用量投与：  疾患症状が一旦発現したら、ｄ１１〜２５に用量投与が開始した。用量投与は３日毎で、約５用量に関して腹腔内投与であった。
群：４群  ＝  以下のような合計３２匹のラット：
１．  陰性対照−  パラフィン油のみ−  ビヒクル
２．  陽性対照−  ナプロキセン  １０ｍｇ／ｋｇ毎日、経口
３．  アイソタイプ対照−  ４０ｍｇ／ｋｇの非関連抗体、３日毎
４．  抗ＬＰＡ抗体  ＬＴ３０１５−  ４０ｍｇ／ｋｇ、３日毎
５．  抗ＬＰＡ抗体  ＬＴ３０１５  −  ８ｍｇ／ｋｇ、３日毎
６．  抗ＬＰＡ抗体  ＬＴ３０１５−１．６ｍｇ／ｋｇ、３日毎。
【０２１８】
この試験では、ヒト化抗ＬＰＡ抗体（ＬＴ３０１５）による処置は、関節炎のラットＡＩＡモデルにおける疼痛音声化応答を逆転することが判明した。これを、図７に示す。バーは、音声化の低減を示す。ビヒクル単独およびアイソフォーム対照は、音声化を減少しなかった；中等度（８ｍｇ／ｋｇ）および高（４０ｍｇ／ｋｇ）用量の抗ＬＰＡ抗体は、陽性対照ナプロキセンと同様に、音声化を７０〜７５％低減した。低用量（１．６ｍｇ／ｋｇ）のＬＴ３０１５は、音声化を約３０％低減したが、これは，用量依存性作用を示す。
実施例１２：  パクリタキセル誘導性神経障害性疼痛における抗ＬＰＡ抗体の評価
【０２１９】
神経障害性疼痛は、癌のためのパクリタキセル（タキソール）の問題の多い且つしばしば用量限定性の副作用である。パクリタキセル誘導性神経障害性疼痛におけるＬＰＡの役割、ならびにこの疼痛を緩和する抗ＬＰＡ抗体Ｂ３の能力を評価した。この試験は、Dr Daniela Salvemni, St. Louis University School of Medicineの実験室で実行された。
材料および方法
【０２２０】
実験動物：  Harlan (Indianapolis, IN)からの雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜２１０ｇの開始体重）を、制御環境（１２時間点灯／消灯周期）下で、３〜４匹／ケージで収容して、餌および水を自由に摂取させた。実験はすべて、International Association for the Study of Pain and the National Institutes of Health guidelines on laboratory animal welfare and the recommendations by Saint Louis University Institutional Animal Care and Use Committeeに従って実施した。処置条件を知らされない実験者によって、全実験が実行された。
【０２２１】
パクリタキセル誘導性神経障害性疼痛および薬剤投与：  これは、ベネットにより開発された良好に特性化されたラットモデルであって、低用量のパクリタキセルの反復腹腔内（ｉ．ｐ）注射が、神経障害性疼痛（機械的異痛症）を誘導して、症候性毒性または運動障害をほとんど伴わない。行動的応答は数週間〜数ヶ月持続し、したがって、患者における疼痛性神経障害をモデル化する（Flatters, S.J. & Bennett, G.J. (2006). Pain 122, 245-257; Jin, H.W., et al. (2008) Exp Neurol 210, 229-237; Polomano, R.C., et al. (2001) Pain 94, 293-304）。パクリタキセルまたはそのビヒクル（クレモホール  ＥＬおよび９５％脱水エタノール  １：１の比）を、４日おきに、すなわち０、２、４および６日目（Ｄ）に、１ｍｇ／ｋｇで、最終累積用量  ４ｍｇ／ｋｇで、ラットに腹腔内投与した。１〜３  以下の実験用試験物質を用いた：  ネズミ抗ＬＰＡ抗体  Ｂ３およびアイソタイプ対照抗体  ＬＴ１０１５；これらを生理食塩水中に溶解し、個々のバイアル中でLpathにより提供された。実験用試験物質を、以下のように（そして、パワーポイントフォーマットにおける実験計画、模式図を参照）、Lpathにより意図された用量レジメンに従って、２５ｍｇ／ｋｇで静脈内（ｉ．ｖ）投与した。実験用試験物質を、パクリタキセルの初回注射の１日前（Ｄ−１）に、その後、パクリタキセルの初回注射後のＤ２、Ｄ５、Ｄ８、Ｄ１１およびＤ１４に投与した。試験物質を溶解するために用いられるビヒクル（生理食塩水）を、同一用量投与パラダイムに従って、パクリタキセル処置群またはそのそれぞれのビヒクル群に注射した。実験用試験物質の注射がパクリタキセルの注射と同時的である場合（すなわちＤ２）、実験用試験物質をパクリタキセルの１５分前に送達した。機械的引っ込め閾値を、フォンフライ試験（動的足裏知覚計、モデル３７４５０； Ugo Basile、Milan、Italy）の電子バージョンで、実験的試験物質注射の１日前  Ｄ−１、パクリタキセルの初回ｉ．ｐ．注射の後（ＤＯ）および前、ならびにその後、Ｄ１２およびＤ１６に、査定した。この終了まで、各ラットをプレキシガラス小室（２８×４０×３５−ｃｍ、金網床）中に入れて、１５分間馴化させた。馴化後、サーボ制御機械的刺激（先の尖った金属フィラメント）を足裏面に適用し、これが、漸増性断続圧を発揮して、１０秒以内に５０ｇまで到達する。明瞭な自発的後足引っ込め反応を惹起する圧力を自動的に記録し、機械的閾値指数を得た。各時点で３回機械的閾値を査定して、平均値を得て、これを平均絶対閾値（グラム、ｇ）として報告する。パクリタキセル処置前（基線）に引っ込め応答を引き出すことができない力での機械的平均絶対脚引っ込め閾値（グラム、ｇ）における有意の（Ｐ＜０．０５）低減により、機械的異痛症の発症を立証した。パクリタキセル処置は両側異痛症を生じ。閾値は任意の群において任意の時点で左および右後足間で異ならなかったため、両脚からの値を、さらなる分析およびデータ提示のために平均した。４つの群全体を、ｎ＝３ラット／群で用いた。
群１：  パクリタキセル＋生理食塩水の代わりのビヒクル
群２：  パクリタキセル＋生理食塩水
群３：  パクリタキセル＋５０４Ｂ３
群４：  パクリタキセル＋ＬＴ１０１５。
【０２２２】
（Ｄ−１）および実験用試験物質またはそれらのビヒクル（生理食塩水）のｉ．ｖ．注射前における脚引っ込め閾値（ｇ）は、（平均＋／ｓ．ｅｍ）：それぞれ、４３．６±０．２９６、４３．３±０．３７６、４２．８±０．１２０および４２．７±０．２０３であった。
【０２２３】
統計学的解析：  データは、３匹／群に関して、平均±ＳＥＭとして表され、両側二方向ＡＮＯＶＡにより、パクリタキセル群に対するボンフェロニ・ポストホック比較を用いて解析される。
パクリタキセル群とのボンフェロニ・ポストホック比較とともに両側二方向ＡＮＯＶを用いて、３動物／群に関するデータを分析した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１  パクリタキセル対ビヒクル群）。
結果
【０２２４】
パクリタキセル誘導性神経障害性疼痛に及ぼす抗ＬＰＡ抗体Ｂ３および対照抗体の作用：ビヒクル処置群と比較して、パクリタキセルの投与は、機械的異痛症の発症をもたらした（図８）。１６時間での機械的異痛症の発症は、抗ＬＰＡ抗体Ｂ３により有意に弱められたが、しかしアイソタイプ対照  ＬＴ１０１５によっては弱められなかった（図８）。
【０２２５】
本明細書中で記載され、特許請求される組成物および方法はすべて、本発明の開示にかんがみて、過度の実験を伴うことなく製造され、遂行され得る。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、種々の変更が組成物および方法に適用され得ることは、当業者には明らかである。当業者に明らかなこのような類似の置換物、修正はすべて、添付の特許請求の範囲により定義されるように本発明の精神および範囲内であると考えられる。
【０２２６】
本明細書中で記述される特許、特許出願および出版物はすべて、本発明が関連する当該技術分野の当業者のレベルを示している。特許、特許出願および出版物は、優先権または別の利益が主張されるものを含めて、すべて、各々の個々の出版物が具体的に且つ独立して参照により組入れられる場合と同程度に参照により本明細書中で援用される。
【０２２７】
本明細書中で例証的に記載される本発明は、本明細書中に具体的に開示されない任意の要素（単数または複数）の非存在下で実行され得る。したがって、例えば本明細書中の各々の場合に、「〜を含む」、「本質的に〜からなる」および「〜からなる」という用語は何れも、他の２つの用語のいずれかと取り替えられ得る。用いられてきた用語および表現は、記述のための用語として用いられ、限定的ではなく、このような用語および表現の使用に際しては、示され、記述された特徴の任意の等価物またはその部分を除外するということは意図されないが、しかし本発明の特許請求の範囲内であれば、種々の修正が可能であると認識される。したがって、好ましい実施形態および任意の特徴により本発明を具体的に開示してきたが、開示された本明細書中の概念の修正および変更が当業者によりなされ得るし、このような修正および変更は添付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の範囲内であるとみなされる、と理解されるべきである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
2014523439.tif 000025
【図５ｂ】
2014523439.tif 000026
【図６ａ】
2014523439.tif 000027
【図６ｂ】
2014523439.tif 000028
【図７】
2014523439.tif 000029
【図８】
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【国際調査報告】
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