(57)【要約】本願明細書は、抗−血管新生治療を改善する腫瘍及び転移腫瘍を治療するための方法及び組成物である。生物システムのこれらの作用機序を抗−血管新生組成物と組み合わせた抗−ベータ１インテグリン組成物を用いて阻害することによって、腫瘍及び転移腫瘍から十分な血液供給を欠乏させて、腫瘍細胞に腫瘍細胞の死を含む増殖の停止及び可能ならば退行を生じさせる。本発明の組成物は、薬学的組成物又は組成物中に、抗−ＶＥＧＦ薬剤と組み合わせた抗−ベータ１インテグリン薬剤を含む。治療及びイメージングの方法も記載される。
2014523398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の阻害剤である第一薬剤と、
ベータ−１インテグリンの結合を遮断する第二薬剤と、
の組み合わせを含み、
ここで、前記組み合わせは、腫瘍細胞の増殖を、前記第一薬剤又は前記第二薬剤のいずれか別々の場合よりも大きい程度まで腫瘍細胞の増殖を阻害する、
腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＶＥＧＦの阻害剤はＶＥＧＦに結合する抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗体はヒト化マウス抗体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第二薬剤はベータ−１インテグリンに対して結合するポリペプチドである、請求項１、２、又は３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、あらゆるアルファサブユニットに関連するベータ−１インテグリンに対して結合し、腫瘍細胞の細胞外基質に対する結合を阻害する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドはベータ−１インテグリンに特異的な抗体である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記ベータ−１インテグリンに特異的な抗体は、キメラ、一本鎖、又はヒト化抗体である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗体はＡＩＩＢ２、ＢＩＥ１１又はＡＩＩＢ若しくはＢＩＥ１１に由来するヒト化抗体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記第一薬剤及び前記第二薬剤は、ＶＥＧＦを認識する１つの結合部位、及びベータ１インテグリンを認識する１つの結合部位を有する２価抗体により提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
腫瘍を有する被験者に対して、
抗血管新生薬である第一薬剤と；ベータ−１インテグリンにより仲介される腫瘍細胞の結合を遮断する第二薬剤と
の組み合わせを投与するステップを含み、
ここで、腫瘍細胞の増殖は、前記第一薬剤又は前記第二薬剤のいずれか単独の場合よりも大きい程度で阻害される、
腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項１１】
前記抗血管新生薬はＶＥＧＦに結合する抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗血管新生薬は、ヒト化マウスモノクローナル抗体及び完全ヒト化抗体からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第二薬剤はベータ−１インテグリンに結合するポリペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは、あらゆるアルファサブユニットに関連するベータ−１インテグリンに対して結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドはベータ−１インテグリンに特異的な抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体は、キメラ、一本鎖、又はヒト化抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体はＡＩＩＢ２、ＢＩＥ１１又はそのヒト化誘導体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍は、神経膠芽腫、大腸、肺、肝臓、腎臓、結腸、メラノーマ、及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
腫瘍をベータ−１インテグリンの結合の阻害剤と接触させるステップを含む、神経上皮組織の腫瘍を治療する方法。
【請求項２０】
前記阻害剤はあらゆるアルファサブユニットに関連するベータ−１インテグリンに対して結合する抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍を有する被験者に対して、
ＶＥＧＦに対して結合する第一薬剤と；ベータ−１インテグリンにより仲介される腫瘍細胞の結合を遮断する第二薬剤と
の組み合わせを投与するステップを含み、
ここで、前記第一薬剤又は前記第二薬剤の１つ又は両方はラベル化されている、
腫瘍をイメージングする方法。
【請求項２２】
前記第二薬剤は、キメラ、一本鎖、又はベータ−１インテグリンに対して結合するヒト化抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍は、神経膠芽腫、大腸、肺、腎臓、肝臓、卵巣、及び乳房からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞にベータ−１インテグリンをコード化する遺伝子の発現を妨げる拡散コンストラクトを送達するステップを含む、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２５】
前記コンストラクトは、ベータ−１インテグリンｍＲＮＡに対して結合して、ベータ−１インテグリン遺伝子発現を発現停止するｓｈＲＮＡをコード化するレンチウイルスベクターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
被験者に抗−インテグリン薬剤を投与するステップを含み、前記被験者は抗−ＶＥＧＦ抗体による治療に失敗している、
腫瘍を有する被験者を治療する方法。
【請求項２７】
（ａ）腫瘍内、切除による空洞内、又は硬膜下に配置するためのカテーテルと；
（ｂ）前記カテーテルを通して、対流強化送達法（ＣＥＤ）装置により、臨床的に意義のある用量及び速度で、投与するために製剤化された、阻害性の抗−ベータ１インテグリン組成物と
を含む、再発性の多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ）を有する被験者を治療するためのキット。
【請求項２８】
腫瘍を有する被験者に対して、
抗血管新生薬である低用量の第一薬剤と；ベータ−１インテグリンにより仲介される腫瘍細胞の結合を遮断する第二薬剤と、
の組み合わせを投与するステップを含み、
ここで腫瘍細胞の増殖は、より高い用量の第一薬剤により生じる量と同じ量まで阻害される、
腫瘍細胞の増殖を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年３月２３日に出願された米国仮出願第６１／４６６７９１号の利益を主張するものであり、その全開示を参照により本願明細書に援用する。
【０００２】
（政府支援についての記載）
なし
【０００３】
（配列表、コンピュータプログラム、又はコンパクトディスクの参照）
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全開示を参照により本願明細書に援用する。２０１２年１月３１日に作成されたこのＡＳＣＩＩの複製は、「４７９−１００配列表．ｔｘｔ」と名付けられ、５２８７バイトのサイズがある。
【０００４】
本発明は、治療用組成物、及び転移性癌を含む癌の治療、特に、腫瘍の血管新生を標的とした治療に関する。
【背景技術】
【０００５】
（先行技術）
本発明の特定の態様についての背景的情報を下記に記載する。これらは、詳細な説明において言及されるが、必ずしも詳細に記載されない技術的特徴に関連し得る。すなわち、本発明に用いられる個々の部材又は方法は、以下に記載の文献においてより詳細に記載され得る。これらの文献は、請求項に記載される本発明の特定の態様を実施又は使用するための更なる助言を当業者に提供する。以下の記載は、本願のあらゆる請求項について重要な情報であること、又は、下記の文献の先行技術の効果に関する自白として解釈されるべきではない。
【０００６】
多くの分子が、抗血管新生の特性を有すると同定されている。しかしながら、今日最高とされているのは、血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）である。これは、薬のベバシズマブの標的であり（ａ．ｋ．ａ．，  Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、南サンフランシスコ、カリフォルニア州）、結腸及び直腸（Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５０：２３３５−２３４２  （２００４））、乳房（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５７：２６６６−２６７６  （２００７））、肺（Ｓａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５５：２５４２−２５５０  （２００６））、腎臓（Ｅｓｃｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３７０：２１０３−２１１１  （２００７））、及び脳（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ｄｏｉ：  １０．１２００／ＪＣＯ．２００８．１９．８７２１  （２００９））を含む様々な末期癌を有する患者において、臨床応用の可能性を示す。ＶＥＧＦ−Ａ受容体に対してデザインされた薬も、ＶＥＧＦ−Ａそのものと反対に、最近の臨床試験において同様の可能性を示してきた。
【０００７】
ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ）も組換え型ヒト化抗−ＶＥＧＦ抗体である。ラニビズマブは複数のＶＥＧＦ−Ａアイソフォームに対して結合する。抗体断片として、ラニビズマブは分子量４８ｋＤを有する小分子としてデザインされる。これは、静脈内又は腫瘍内の用途よりもむしろ、硝子体内の用途のためにパッケージ化される。
【０００８】
ＶＥＧＦ−Ａは最も特性評価され、おそらく最も可能性がある、血管増殖因子のファミリーである（Ｆｅｒｒａｒａ  ａｎｄ  Ｇｅｒｂｅｒ，  Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  １０６：  １４８−１５６  （２００２））。最近では、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ−Ｆ、及びＰＩＧＦを含む。これらの因子は、少なくとも３つの公知の受容体チロシンキナーゼ：ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びＶＥＧＦＲ３を通してシグナルを送る。
【０００９】
不運なことに、今日までの抗血管新生の仮説による予測は、臨床において現実化されてきていない（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：  １３４７−１３５６  （２００９））。最高でも、化学療法と組み合わせたベバシズマブ治療が、生存の延長を平均４．７月だけに留めただけである（Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５０：２３３５−２３４２  （２００４））。患者は、究極的には継続した癌の増殖に屈する。この耐性の作用機序は、議論されており、血管新生の仮説の無効、又は腫瘍細胞の代わりの血管源を得る能力のいずれかを反映してよい。
【００１０】
従来技術における治療戦略は、血管新生に基づく腫瘍の血管新生という１つの概念に過度に依存してきた。抗−血管新生の治療に対する臨床的な耐性は、脈管構造を得るための川氏の方法を用いる腫瘍細胞による可能性が極めて高い。血管拡張、血管リモデリング、血管吸収、血管隔壁形成、血管膠芽腫形成、疑似血管形成、及び循環血管内皮前駆細胞を含む、様々なタイプの腫瘍の血管新生のプロセスが以下に記載される（Ｄｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １７０：  １−１５  （２００７））。
【００１１】
従来技術における幾つかの戦略は、腫瘍の血管新生の阻害のための治療戦略の組み合わせを提案してきた。しかしながら、これらの戦略は腫瘍の血管新生の血管新生の側面のみを標的とするか、又は、新たな腫瘍の血管の血管破裂を標的とすることを提案する。現在のところ、先行技術における治療戦略は、血管成長のシグナリング及び接着に基づく吸収のシグナリングの両方の組み合わせを標的とした化合物を生物システムに対して投与することによって、腫瘍及び／又は転移の血管新生の完全な阻害を提供する。
【００１２】
（特定の特許及び文献）
Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第７，６１８，６２７号、２００９年１１月１７日発行、“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｏｎｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ”）は、腫瘍細胞のアポトーシスを増加させるためのイオン照射と組み合わせて、抗−ベータ１インテグリン抗体ＡＩＩＢ２を用いた。
Ｔｈｅｏｄｏｒｅ  Ｙｅｄｎｏｃｋ（米国特許第６，０３３，６６５号（２０００年））“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．”。これは、臨床用にＦＤＡ承認された抗−インテグリン治療薬（複数の硬化症の治療用のアルファ−４−ベータ−１に対するＴｙｓａｂｒｉ（登録商標）、Ｅｌａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．）を生じさせた最初の特許の１つである。
Ｆｒｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許出願公開第００５０３８５  Ａ１号（２００８年））は、共に血管新生に関連する増殖因子を標的とする、抗−ＶＥＧＦ抗体及び抗−ＨＥＲ２抗体による組み合わせ治療を提案した。
Ｓｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第６，５９６，２７６号（２００３年））は、ＶＥＧＦを介する血管新生の下流にあるエフェクターを標的とする、アルファ−１及び／又はアルファ−２インテグリンサブユニットに対する阻害抗体の投与を提案した。
Ｂｉｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，８４６，５３６号（１９９８年）及び米国特許第６，１２３，９４１号（２０００年））は、有効量の、ベータ１インテグリン機能−遮断抗体、又は、かかる治療を必要とする組織のベータ１受容体に対するインテグリンの機能のペプチド阻害剤を投与することによって、組織中の悪性の表現型を逆転させる方法を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第７，６１８，６２７号
【特許文献２】米国特許第６，０３３，６６５号
【特許文献３】米国特許出願公開第００５０３８５  Ａ１号
【特許文献４】米国特許第６，５９６，２７６号
【特許文献５】米国特許第５，８４６，５３６号
【特許文献６】米国特許第６，１２３，９４１号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５０：２３３５−２３４２  （２００４）
【非特許文献２】Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５７：２６６６−２６７６  （２００７）
【非特許文献３】Ｓａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５５：２５４２−２５５０  （２００６）
【非特許文献４】Ｅｓｃｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３７０：２１０３−２１１１  （２００７）
【非特許文献５】Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ｄｏｉ：  １０．１２００／ＪＣＯ．２００８．１９．８７２１  （２００９）
【非特許文献６】Ｆｅｒｒａｒａ  ａｎｄ  Ｇｅｒｂｅｒ，  Ａｃｔａ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  １０６：  １４８−１５６  （２００２）
【非特許文献７】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：  １３４７−１３５６  （２００９）
【非特許文献８】Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５０：２３３５−２３４２  （２００４）
【非特許文献９】Ｄｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １７０：  １−１５  （２００７）
【発明の概要】
【００１５】
下記の概要は本発明の全ての特徴及び態様を含むことを意図するものではなく、本発明がこの概要に記載される全ての特徴及び態様を含まなければならないことを示唆するものでもない。
【００１６】
本発明は概して、腫瘍細胞の増殖を阻害するための薬学的組成物に関し、該薬学的組成物は、ＶＥＧＦシグナリング及び／又はＶＥＧＦ受容体に対する結合等のＶＥＧＦの活性の阻害剤である第一薬剤と；ベータ−１インテグリンを遮断する第二薬剤とを含む。ベータ−１インテグリンの遮断は、細胞接着の遮断、細胞接着後に生じるベータインテグリン細胞内シグナリングの遮断、又はその両方とし得る。用いられ得る薬剤はペプチド又は小分子等の要素の組成物である。これらは、抗体又は抗体様分子としてもよい。薬剤の組み合わせは相乗効果を有する、すなわち、いずれかの薬剤別々の場合よりもより効果がある。薬剤は１種の組成物又は組成物のマッチしたペアに含めてよい。
【００１７】
特定の態様では、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法に関する。概して、本発明の方法は、腫瘍を有する被験者に対して、抗血管新生薬である第一薬剤と；；ベータ−１インテグリンにより仲介される腫瘍細胞の細胞外マトリックスとの相互作用、及びベータ１インテグリンシグナリングを遮断する第二薬剤との組み合わせを投与するステップを含み、ここで、腫瘍細胞の増殖は、第一薬剤又は第二薬剤のいずれか単独の場合よりも大きい程度で阻害される、すなわち、相乗効果的である。好適には、対照は癌を有するヒト対象である。
【００１８】
一実施形態では、本発明の方法は、投与量の、アンタゴニストである、抗−ＶＥＧＦ受容体、抗−ＶＥＧＦ（例えば、抗−ＶＥＧＦ−Ａ）抗体と組み合わせたベータ−１インテグリン抗体の投与を含む。様々な抗−ＶＥＧＦ及び抗−インテグリン薬剤を以下に詳細に記載する。組み合わせの抗体の患者への送達方法は、臨床的な腫瘍学の分野における、通常の医学、看護学、又は医療関連学の技術を有する者に周知であろう。本発明の組成物は、あらゆる臨床的手法、特に、非経口又は腫瘍内注射により投与することができる。本発明の組成物は、外科的な摘出後の腫瘍床を含む生体内における実際の又は生じ得る空洞に、直接的に適用することができる。血管透過性を増大させる薬剤も臨床的に適切な間隔で投与することができる。これらは中枢神経系（ＣＮＳ）等の中枢器官における治療薬の送達を高めることができる。加えて、術後補助（アジュバンド）療法計画も、放射線及び化学療法を含む治療の前、最中、又は後に行うこともできる。実施形態の繰り返しの投与も所望の臨床的効果を達成するために提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃは、それぞれ、急性低酸素症に対する、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞（１Ａ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞（１Ｂ）、及びＳＷ１０８０結腸直腸癌細胞（１）のベータ−１インテグリン（ＭＦＩ）の増加を示す３つの棒グラフである。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、ベバシズマブ治療による治療を行った場合（Ａ）又は行わなかった（Ｂ）場合の、神経膠腫腫瘍の異種移植片の、インテグリンベータ−１の発現についての染色を示す１対の写真である。
【図３】図３Ａは、異なる増殖条件におけるＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞でのインテグリンベータ−１の発現を示す棒グラフであり、図３Ｂは、インテグリンベータ−１の発現と増殖との間の相関関係を示す散布図である。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、通常の脈管構造（４Ａ）の箇所、及び血管新生の膠芽腫血管（４Ｂ）について、インテグリンベータ−１の発現について染色した細胞を示す、多形膠芽細胞腫の患者の試料の１対の写真である。
【図５】図５は、一次性膠芽腫、及び抗血管新生ｅｖａｓｉｖｅ神経膠芽腫の場合におけるインテグリンベータ１発現をプロットする棒グラフである。
【図６】図６は、一次性膠芽腫細胞株に対する異なる投与量のＡＩＩＢ２による細胞増殖阻害、及びＡＩＩＢ２を低酸素（１％酸素、４８時間）と組み合わせた場合の相乗的な増殖阻害を示す棒グラフである。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、３つの異なるノックダウン細胞株のインテグリンベータ−１の発現（７Ａ）と増殖（７Ｂ）とを示す１対の棒グラフであり、インテグリンベータ−１ノックダウンが、実質的により小さい発現及び増殖を示した。
【図８】図８は、抗血管新生耐性の神経膠腫細胞の細胞株における、異なるＡＩＩＢ２の濃度のアネキシン及びＫｉ６７アポトーシスマーカーの発現を示す棒グラフである。
【図９】図９は、異なる濃度のＡＩＩＢ２抗体での一次ＧＢＭ細胞株の細胞増殖を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、マウス腫瘍モデルにおける、異なる抗体による治療下での腫瘍の大きさの変化を示す。「ｃｏｍｂｏ」とラベルされたプロットは、ＡＩＩＢ２及びベバシツマブの組み合わせである。矢印は治療の開始を示す。
【図１１】図１１は、異なる濃度のＡＩＩＢ２により２日間治療した、増殖相及びコンフルエント（増殖停止）の培養物におけるＧＢＭ細胞の細胞増殖の時間経過を示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、２日間の低酸素、その後の酸素正常状態での成長、に曝されたＧＢＭ細胞の細胞増殖の時間経過を示す棒グラフである。
【図１３】図１３は、コントロールＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）（ダイヤモンド）、ベバシツマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）（四角）、又は低用量のベバシツマブ（１ｍｇ／ｋｇ）及びＡＩＩＢ２（１ｍｇ／ｋｇ）の交互の組み合わせによる治療（丸）を用いて、１週間おきに測定した、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫腫瘍についての腫瘍増殖の時間経過を示す線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
特に断りのない限り、本願明細書に用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野における当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本願明細書に記載されるものに類似又はそれと同等のあらゆる方法及び材料を、本発明の実施又は試験において用いることができるが、好適な方法及び材料を記載する。一般的に、細胞生物学及び科学の技術に関する命名は、周知であり、且つ当該技術分野で一般的に用いられるものである。特定の実験技術は、具体的に記載しないが、当該技術分野において周知であり、且つ本願明細書を通して引用及び言及される様々な一般的な及びより具体的な文献に記載される、従来的な方法に従って行われる。わかりやすさの目的で、下記の単語を以下に定義する。
【００２１】
「ＶＥＧＦ」という用語は、血管内皮増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を指し、血管内皮増殖因子（ｖａｓｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）をも指し、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＡＡ３５７８９の、更には、Ｌｅｕｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  “Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｔｏｇｅｎ，”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６  （４９３５），  １３０６−１３０９  （１９８９）に記載される、例示的なアミノ酸配列を有する。ＶＥＧＦは、二量体であり、ジスルフィド結合した４６ｋＤａの、血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）に関連する糖タンパク質である。これは、正常細胞株及び腫瘍細胞株により生産され；内皮細胞選択的な分裂促進因子であり；インビボ試験系（例えば、ウサギ角膜）において血管新生の活性を示し；内皮細胞及び単球に対して走化性であり；内皮細胞中でプラスミノーゲン活性化因子を誘導して、毛細管の形成中に細胞外マトリックスのタンパク質分解に関与する。多数のＶＥＧＦのアイソフォームが知られており、それらは同等の生物活性を示すものの、それらを分泌する細胞のタイプ、及びそれらのヘパリン結合能力において異なる。ＶＥＧＦｓの細胞の需要遺体（ＶＥＧＦＲｓ）は、膜貫通受容体チロシンキナーゼである。これらは、７つの免疫グロブリン様領域を有する細胞該領域、及び細胞内チロシンキナーゼ領域を特徴とする。ＶＥＧＦＲ−１（ｆｌｔ−１としても知られている）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ３としても知られている）、及びＶＥＧＦＲ−３を含む、様々なタイプのＶＥＧＦ受容体が特性評価されている。大多数のヒトの腫瘍、特に、神経膠腫及び細胞腫、は高レベルのＶＥＧＦ及びＶＥＧＦＲｓを発現する。これは、腫瘍細胞により放出されるＶＥＧＦが、パラクリンのように、血管の毛細管の成長、及び腫瘍内皮の増殖を刺激し、血液供給の向上を通して、腫瘍の増殖を加速するという仮説を導いた。
【００２２】
「ＶＥＧＦ阻害剤」という用語は、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ経路によるシグナリングを減少する物質又は方法を指す。ＶＥＧＦ阻害剤は、例えば、小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質としてよく、より具体的には、抗体を含み、抗−ＶＥＧＦ抗体、抗−ＶＥＧＦＲ抗体、イントラボディ（細胞内抗体）、マキシボディ、ミニボディ、ダイアボディ、ペプチボディ、リセプチボディ、溶解性ＶＥＧＦ受容体タンパク質及びその断片等のＦｃ融合タンパク質、並びに他の様々なものを含む。今日好適なＶＥＧＦ阻害剤はペプチドであり、例えば、阻害剤に基づく抗体等である。多くのＶＥＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体に対して結合することによって、機能する。他は、ＶＥＧＦ若しくはＶＥＧＦ受容体に対して結合する因子、又はＶＥＧＦシグナリング経路の他の要素に対して結合することによって、より間接的に機能する。また他のＶＥＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦシグナリング経路を調節する翻訳後修飾の制御を変更することによって、作用する。本発明に従うＶＥＧＦ阻害剤は、より間接的な作用机上により作用してもよい。関わる作用機序が何であれ、本願明細書に用いられるように、ＶＥＧＦ阻害剤は、阻害剤の非存在下での同じ状況におけるものよりも、所与の状況におけるＶＥＧＦシグナリング経路の効果活性を減少させる。別のＶＥＧＦ阻害剤は、下記の通り、ＲＮＡｉを用いる、核酸に基づくものである。
【００２３】
「ヒト化」という用語は、非ヒト免疫グロブリン由来の配列を最小限含むキメラ抗体である、非ヒト（例えば、齧歯類）形式の抗体を指す。大部分では、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類等の非ヒトの種（ドナーの抗体）の超可変領域由来の残基により置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエントの抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、対応する非ヒトの残基により置換されている。更には、非ヒト抗体は、レシピエントの抗体又はドナーの抗体に見られない残基を含んでよい。これらの変性は抗体の働きを更に高めるためになされる。一般的に、ヒト化抗体は、実質的に全てにおいて、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域を含み、全て又は実質的に全ての超可変ループは非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、且つ全て又は実質的に全てのＦＲｓは非ヒト免疫グロブリンの配列である。ヒト化抗体は、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれをも含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；  及びＰｒｅｓｔａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２：５９３−５９６  （１９９２）  を参照のこと。
【００２４】
「対流強化送達法（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」という用語は、血液脳関門を回避して嚢に薬物送達する方法を指す。対流強化送達法は、最初に、Ｒ．  Ｈｕｎｔ  Ｂｏｂｏ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （Ｍａｒｃｈ  １９９４，  Ｖｏｌ  ９１，  ｐａｇｅｓ  ２０７６−２０８０；  “Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ”）  により記載された。対流強化送達法は、脳実質への幾つかのカテーテルの頭蓋の穴による定位固定、及びマイクロインフュージョンポンプによる治療用薬剤のその後の注入を含む。脳への大部分の薬の局所送達の標準的な方法は、静脈内注射及び脳関門の通過又は脳室内注射のいずれかにより、分散に依存するものであり、大部分の薬剤の不均一分布を生じる。脳に対する薬物の静脈内投与は、血液脳関門により妨害され、第分子の通過を妨げる。血液脳関門は、血管内皮細胞間の狭い接合部を特徴とし、様々な天然及び合成の物質（抗癌薬物を含む）が脳に侵入することを妨げる又は遅らせる。分散に依存する技術とは対照的に、対流強化送達法は、細胞外空間に薬物を押し出すために、注入カテーテルの先端で実現される圧力勾配を用いる。目的は薬物をより均等に、より高濃度で、分散のみにより投与された場合よりも広い領域に亘って、分散させることである。治療用薬剤の対流強化送達は、腫瘍摘出を伴う開頭術の後で行ってよい。薬物の対流強化送達は、Ｙａｅｌ  Ｍａｒｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （Ａｕｇｕｓｔ  ２００５，  ｖｏｌ  ６５，  ｐａｇｅｓ  ６８５８−６８６３；  “ｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ”  に詳細に記載される。
【００２５】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、非ヒト（例えば、マウス）配列を実質的に含まない抗体を指す。これは、当該技術分野に知られるように、Ｆｖ部分又はＣＤＲ領域のいずれかの、抗体の結合領域を保存するマウス配列の除去により、完全ヒト又はヒト化させてよい。
【００２６】
「抗体」という用語は、Ｆｖ断片、軽鎖及び重鎖可変領域のみを含むＦｖ断片、ジスルフィド結合により結合したＦｖ断片（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：  ５４７−５５１  （１９９３））、可変領域及び定常領域の部分を含むＦａｂ又は（Ｆａｂ）’２断片、一本鎖抗体（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：  ４２４−４２６  （１９８８）；  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：  ５８７９−５８８３  （１９８８））等の様々な形式の変性又は変形された抗体、並びにその同等物を更に含む。抗体は、原始的に動物（特にマウス又はラット）又はヒトを起源とするものとしてよく、又はキメラのものとしてもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：  ６８５１−６８５５  （１９８４））。これは、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：  ５２２−５２５  （１９８６）、及び英国特許出願公開第８７０７２５２号に記載されるようにヒト化してもよい。
【００２７】
「細胞外基質」という用語は、細胞の結合のための物質を指し、脈管構造（血管内皮細胞）、又は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、すなわち、様々な他の重要な機能を発揮することに加えて、通常、動物細胞に構造的な支持を与える、動物組織の細胞外部分等の両方の組織を含んでよい：これは、線維性タンパク質及びグリコサミノグリカンの連結メッシュを含む。
【００２８】
「ｓｈＲＮＡ」という用語は、ショートヘアピンＲＮＡを指す。
【００２９】
「ＲＮＡｉ」という用語は、ＲＮＡ干渉を指す。ＲＮＡｉは、二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）をｄｓＲＮＡと同じ配列を含むメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解するために用いる、転写後の標的とした遺伝子のサイレンシング技術である（Ｓｈａｒｐ，  Ｐ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｚａｍｏｒｅ，  Ｐ．  Ｄ．  ２８７，  ２４３１−２４３２  （２０００）；Ｚａｍｏｒｅ，  Ｐ．  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  １０１，  ２５−３３  （２０００）；Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １３，  ３１９１−３１９７  （１９９９）；Ｃｏｔｔｒｅｌｌ  Ｔ  Ｒ，  ａｎｄ  Ｄｏｅｒｉｎｇ  Ｔ  Ｌ．  ２００３．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １１：３７−４３；  Ｂｕｓｈｍａｎ  Ｆ．  ２００３；Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ．  ７：９−１０；  ＭｃＭａｎｕｓ  Ｍ  Ｔ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  Ｐ  Ａ．  ２００２．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．  ３：７３７−４７）。このプロセスは、内在性のリボヌクレアーゼが長いｄｓＲＮＡを短く切断する、例えば、２１又は２２ヌクレオチド長のＲＮＡｓとされ、低分子干渉ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡと名付けられる、ときに生じる。低分子干渉ＲＮＡ部分はその後標的のｍＲＮＡの分解を仲介する。ＲＮＡｉの合成用キットは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社又はＡｍｂｉｏｎ社から市販されている。一実施形態では、アンチセンスＲＮＡにおいて用いるための本願明細書に記載される１つ又は複数の化学をＲＮＡｉを仲介する分子において用いることができる。
【００３０】
「薬学的組成物」という用語は、「薬学的に許容可能な」希釈剤、安定化剤、賦形剤等と組み合わせて、特定の量で、列挙する治療用薬剤を含む、製品又は製品のペアを指す。「薬学的に許容可能」という用語は、本発明の薬学的組成物、薬物、又は医薬の製剤中に用いるための、十分な純度及び品質を有し、また、動物又はヒトに対して適切に投与したときに、副作用、アレルギー、又は他の有害反応を生み出すことのない、分子の集合及び組成物を指す。ヒトへの使用及び動物への使用の両方が、本発明の範囲に同等にふくまれるため、薬学的に許容可能な製剤は、ヒト又は動物用の、薬学的組成物、薬物、又は医薬を含む。
【００３１】
方法に関する本発明の特定の態様では、薬学的組成物は、１種の薬剤を含んでよいが、この方法によれば、他の薬剤と共に、治療の流れの中で投与されてもよい。
【００３２】
（方法及び材料一般）
本願明細書に記載されるのは、１）血管の新たな成長又はリモデリング（すなわち、血管新生）と、２）直接的な接着性の相互作用（すなわち、吸収）による既存の血管の使用とによる腫瘍の血管新生という２つの作用機序が認められる、腫瘍及び転移腫瘍、を治療するための改良した方法及び組成物である。生物システム中の両作用機序を組み合わせて阻害することによって、腫瘍及び転移腫瘍は、十分な血液供給を取り除くことができ、腫瘍細胞の死を含む腫瘍細胞の成長停止及び可能ならば退行を生じさせることができる。この方法は、血管新生が疾患、特に癌のプロセスにおいて寄与する因子となる、科学研究及び医療において様々な用途を有する。別の実施形態では、組織の修復又は交換のための血管新生の増強を、血管新生及び接着性の血管吸収の両方を同時に又は連続的に促進することによって達成することができる。
【００３３】
現在のＶＥＧＦ経路を標的とする血管新生治療は、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ’ｓ  Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシツマブ）により指導される、２００９年の総売上高が６１億ドルであった、急成長中の市場である。しかしながら、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）は、中程度の臨床的成功しか示さなかった。最高でも、それは、脳癌（多形の神経膠芽腫、ＧＢＭ）において４．２月の未成長の生存、及び結腸癌において４．７月の全体的な生存を高めただけである。更に残念なことに、ＦＤＡは、既に英国において起きているように、転移性乳癌におけるＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）の使用についての承認を覆すことを検討している。
【００３４】
Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）は、新たな血管形成（血管新生）を妨げ、腫瘍細胞のグルコース及び酸素を欠乏させる。特に、ベータ１インテグリンは、腫瘍細胞において酸素欠乏（別名、低酸素）中に上方制御される。Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）治療に不成功であった患者から採取したＧＢＭ細胞では、この標的は、未処理の一次性ＧＢＭ細胞と比較して、５０〜２００×に上方制御される。興味深いことに、腫瘍細胞の増殖の過程中、及び有糸分裂及び細胞生存における二元的役割を与えるガンマ線照射後にも上方制御される。この標的の阻害は、ＥＣＭスキャフォールド（間質及び血管基底膜）上の腫瘍細胞のインテグリン依存的な浸入を防ぐこともできる。
【００３５】
本発明の態様は、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシツマブ）等の抗−ＶＥＧＦ抗体の治療が不成功であった患者においてベータ１インテグリンを阻害する薬剤の使用に関する。これは、下記の通りインビトロで、及びインビボで示される。「抗−ＶＥＧＦ抗体の治療が不成功」という記載は、臨床的意味で本願明細書で用いられる。ベバシツマブの不成功の臨床的定義は：１）（通常７０％の患者において）開始から反応がないこと、及び２）初期反応の後治療前に疾患の進行があること、である。進行に関する客観的な、しかしながら最も頻繁に用いられる（また、特にベバシツマブの臨床試験において用いられる）診断基準は、マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）診断基準である。そのため、抗−ベータ−１組成物は、ベバシツマブが不成功であった３ＬのＧＢＭに対する単剤治療としてよい。
【００３６】
（血管吸収）
Ｈｏｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９；  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：  １９９４−１９９８  “ｅｓｓｅｌ  ｃｏ−ｏｐｔｉｏｎ，  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎｓ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ”）は、腫瘍のサブセットが既存の宿主の血管を吸収することによって初めに成長することを、ラット神経膠腫モデルにおいて実証した。この吸収された宿主の脈管構造は、やがてＶＥＧＦ及び血管新生の上方制御を示した。脳転移腫瘍についての発明者の研究は、血管吸収又は既存の血管の使用が、実験用の脳転移腫瘍の確立の初期における腫瘍細胞による、及び疾患の初期を示すヒト臨床用試料中において用いられる、血管の主要な形態であることを示した。この発見は、ミクロコロニー形成前のデノボ血管新生の要件を除外する。ＣＮＳ実質は、内皮及び癌細胞の接着及び生存に必要である非血管性の間質の基底膜要素を大きく欠いている。そのため、血管吸収は、そうでなければ神経網で広く用いられていない、非神経系の癌細胞の悪性の増殖に関係する物質を供給する。転移性腫瘍細胞による増殖は、インビトロで、基底膜の基層に対する接着により大きく促進され、ＭＥＫを阻害することによって減衰される。組織培養における実験と一致して、インビボでのコロニー形成の初期段階中、微小転移の圧倒的多数は、既存の脳血管のＶＢＭと直接的に接触することが見出され、これらの細胞の多くは増殖していた。このように、血管基底膜（ＶＢＭ）は、脳における腫瘍細胞増殖のための活性物質とし示唆される。ＶＢＭは接着及び悪性細胞の浸入を促進し、血管新生のあらゆる兆候の前の腫瘍増殖に十分であった。
【００３７】
（血管吸収におけるベータ−１インテグリンの役割）
血管の血管基底膜にチアする腫瘍細胞の接着は、ベータ−１インテグリンにより仲介されることが見出されている。腫瘍細胞におけるベータ−１インテグリンサブユニットの遮断又は喪失は、血管基底膜に対する接着を妨げ、ビボでの転移腫瘍の確立及び増殖を減衰させた。脳における転移中の接着及び浸入における脈管構造のための転移性癌細胞の要件は、膵島の発達中のＶＢＭについての要件により類似したものとしてよい。島細胞はＶＢＭに適合するためのベータ１インテグリンを用い、この相互作用は増殖及び内分泌機能に必要となる。Ｎｉｋｏｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．は、この基底膜の微小環境を、「血管ニッチ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｎｉｃｈｅ）」と称した（Ｎｉｋｏｌｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １０：  ３９７−４０５；  “ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ：  ａ  ｎｉｃｈｅ  ｆｏｒ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ”）。同様に、血管の壁細胞は、血管に対する適切な接着及び血管安定性を維持するために、ベータ１インテグリンサブユニットを必要とする。同様に、その後、癌細胞は、脳の転移中に必須の機能を求めて、脳のＶＢＭをハイジャックすると思われる。興味深いことに、限局性の安定確立されたＣＮＳメラノーマ転移において血管新生を阻害することにより、血管吸収による増殖への転換が生じる。これは、治療的活用のための生物標的を表し得る腫瘍細胞による血管に使用するための連続体を与える。
【００３８】
腫瘍細胞と血管との間の相互作用は、ベータ１インテグリンに仲介される腫瘍細胞の血管の血管基底膜に対する接着に依存する。この相互作用は、脳における腫瘍細胞の、迅速な増殖及び微小転移巣の確立を促進するのに十分である。この欠陥栄養の作用機序は、ＣＮＳの細胞癌（足場依存性細胞）及びリンパ腫（足場非依存性細胞）の両方に普遍的である。ベータ１インテグリンは、通常の細胞生物学の多くの場面において支配的な役割を演じ、癌の開始、成長、及び転移で関与している。コラーゲン及びラミニン等の多様なリガンドに対する可変的な交雑性の接着性受容体として機能する、少なくとも１０個のベータ１インテグリンヘテロダイマーがある。我々のデータは、ベータ１インテグリンサブユニットのみのアンタゴニズム（拮抗作用）は、脳への転移に関するウ治療戦略において有用となり得ることを示す。実際、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  は、抗−ベータ１インテグリンサブユニット抗体の阻害剤は、乳癌細胞においてアポトーシスを誘導したが、単層で成長した細胞ではそうはならなかったことを見出した（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６；  “β１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｇｒｏｗｔｈ，  ａｎｄ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｆｒｏｍ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６６：  １５２６−１５３５）。  同じ抗体で細胞株由来の乳癌異種移植を有するマウスを治療したところ、腫瘍の体積の減少を導いた。インビトロで記載されるアポトーシスの作用機序に加えて、血管吸収の阻害も増殖を減衰させ得る。ベータ１インテグリンの役割を評価する代わりの戦略は、腫瘍を乳癌のＭＭＴＶ／ＰｙＭＴ転移モデルで分析することである。腫瘍形成の誘導後のベータ１インテグリンの条件的な欠乏は、腫瘍増殖についての足場依存的なシグナリングへの依存に一致して、ＦＡＫリン酸化及び増殖の障害を生じる。
【００３９】
本発明の方法は、ベータ１インテグリン受容体、特に、神経膠芽腫、未分化星状細胞腫、乳／乳房の癌、肺癌、メラノーマ、結腸及び直腸癌、膀胱癌、子宮内膜癌、卵巣癌、腎癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵癌、前立腺癌、及び甲状腺癌を有する、あらゆるタイプの内皮又は非内皮の哺乳動物の腫瘍の治療に適用することができる。
【００４０】
このように、この態様の利点は、血管新生及び接着性の血管吸収を含む腫瘍の血管新生の作用機序の両方を標的とすることである。下記の通り、ベータ−１インテグリンの阻害の利点は腫瘍により用いられる血管の吸収を遮断することのみならず、直接的に腫瘍の増殖を阻害すること及び低酸素により活性化される生存シグナリングの経路を妨害することも含む。これにより、抗−血管新生薬のみに頼っていた先行技術の戦略において同定された治療への耐性を回避することができる。腫瘍の休止及び退行を含む治療の構造の評価方法は、当業者に周知であろう。これらは、ＭＲＩ、ＣＴ，ＰＥＴ、及びＳＰＥＣＴ、並びに物理的サイズ測定等の医療のイメージング技術、及び患者の臨床的状態の使用を含むであろう。
【００４１】
本発笑みの方法の実施に有用な、インテグリンに対する抗体、特に、ベータ１インテグリンは、当技術分野において知られている。抗−ベータ１インテグリン抗体ＡＩＩＢ２の応用により、癌細胞中の悪性の表現型を戻すことの記載について、Ｂｉｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  の米国特許第６１２３９４１号参照。ＣＤ−２９エピトープに対する抗−ベータ−１インテグリンは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，フランドル、ニュージャージー州から入手可能である。別の抗−ベータ１インテグリン抗体はＣＳＡＴであり、アイオワ大学ハイブリドーマバンクから入手可能である。別の市販の抗−ベータ１インテグリン抗体は４Ｂ７Ｒ、マウスＩｇＧカッパ抗体は、Ａｎｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手可能である。
【００４２】
ＡＩＩＢ２は、元来ヒト絨毛癌ハイブリドーマから単離され、ベータ１インテグリン細胞外領域の全てのヘテロダイマーに対して非特異的に結合した抗−ベータ１インテグリン抗体として同定された、ラットモノクローナルＩｇＧ１である。酵素処理されたＡＩＩＢ２Ｆ（ａｂ）’断片を用いた実験は、抗体のエピトープ結合部分は活性であり、ベータ１インテグリンに仲介されるシグナリング及び下流のシグナリング中間体の下方制御を生じさせることを示した。ベータ１インテグリンの生物学に関する更なる詳細は、主として細胞質ドメインに関して異なる５つの公知のスプライスバリアントにより、より複雑となり、抗−ベータ１インテグリン抗体の調製における免疫様のポリペプチドに関連して以下に更に記載される。ＡＩＩＢ２は、細胞外ドメインにより全ての変異体を認識することが見出されている。Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌら（２００９年１１月１７日発行の米国特許第７６１８６２７号、”Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｏｎｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ”）は、腫瘍細胞のアポトーシスを増加させるために、ＡＩＩＢ２抗体をイオン照射と組み合わせて用いた。
【００４３】
Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  の“Ｔｈｅ  ａｌｐｈａ  １／ｂｅｔａ  １  ａｎｄ  ａｌｐｈａ  ６／ｂｅｔａ  −１  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  Ｌａｍｉｎｉｎ，”  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １１０：２１７５−２１８４  （１９９０）”  に報告されるように、抗−インテグリン抗体ＡＩＩＢ２を下記の通り調製した：ルイスラットに、Ｒｉｂｉアジュバンドと１：１で混合した、１０７個のＥＤＴＡ−培養したＪＡＲ絨毛癌細胞で、２週間隔で２回の腹腔内注射を与えた。２週間後、２回の追加的な脾臓内注射をアジュバンド非存在下で２週間隔で与えた。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、２月間隔で４回の、５×１０６個の第１期ヒト栄養膜細胞層の腹腔内注射を与えた。最後の注射の４日後、各脾臓を、Ｗｈｅｅｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）により修正されるＫｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）の方法により、Ｓｐ２／０形質細胞腫細胞と融合させた。ハイブリドーマの上澄みは、上記の接着性アッセイを用いて、ＦＮ、ＬＮ、又はＣｏｌＩＶに対するＪＡＲヒト絨毛癌の細胞接着を阻害するそれらの能力について調べられた。２つのラットハイブリドーマの上澄みは、ＦＮのみ（ＢＩＥ５及びＢＩＩＧ２）に対する接着を阻害する一方、他の２つはＬＮ、ＦＮ、及びＣｏｌＩＶ（ＡＩＩＢ２及びＢＩＥｌｌ）に対する接着を阻害することが見出された。１つのマウスハイブリドーマの上澄みは、ＪＡＲ細胞のＣｏｌＩＶのみ（Ｓ２Ｇ３）に対する接着を阻害した。これらのハイブリドーマは、限界希釈によりクローン化された。ラット抗体は、培養物の上澄みからヤギ抗−ラットアガロースを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。マウスの上澄み、Ｓ２Ｇ３、ＩｇＭは、４℃での５０％飽和硫酸アンモニウムを用いた沈殿により１０倍濃縮した。これらの抗体を、更なる使用の前に、ＦＮ、ＬＮ、及びＣｏｌＩＶで被覆された基材に対する接着阻害活性について再試験した。
【００４４】
本発明の方法及び組成物と共に用いるのに適した抗−インテグリン抗体は、Ｗｅｒｂ，  Ｚ．，  Ｔｒｅｍｂｌｅ，  Ｐ．，  Ｂｅｒｅｎｓｔｅｎ，  Ｏ．，  Ｃｒｏｗｌｅｙ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｄａｍｓｋｙ，  Ｃ．  Ｈ．  （１９８９）  に記載される方法と同様の方法により生産することができる。フィブロネクチン受容体を介するシグナル伝達は、コラゲナーゼの発現を誘導する。Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０９，  ８７７−８９０；  ａｎｄ  Ｄａｍｓｋｙ，  Ｃ．  Ｈ．，  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｓ．  Ｊ．  （１９９２）。この文献は、能力ある抗体についてのスクリーニングアッセイを提供する。用いられる免疫原は、前ヒトＪＡＲ絨毛癌細胞であった。抗体は、Ｆｎ、Ｃｏｌ−Ｉ、ＩＶ及びＬＮに対する細胞接着を遮断するため、これらの方法で更なる特性評価をされることが可能となる。
【００４５】
低酸素と組み合わせられたラットモノクローナル抗体ＡＩＩＢ２を用いたベータ１インテグリンの阻害は、インビトロで相乗的にＧＢＭ細胞の増殖を低減した。ＡＩＩＢ２は、インビトロで、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）ｅｖａｓｉｖｅＧＢＭ細胞の増殖をも直接的に低減した。かかる組成物は、インビボでの腫瘍イメージングに、又は細胞増殖又は細胞侵襲（例えば、低酸素又はイオン照射）に対する応答についてのバイオマーカーとして、用いることもできる。未治療のＧＢＭの血管新生におけるベータ−１インテグリンの著しい上方制御も観察された。そのため、それは、インビボでの血管新生のプロセスを直接的に阻害する及び／又はイメージングするために用いることもできる。
【００４６】
上記の通り、様々なＶＥＧＦ阻害剤を、本発明の方法及び組成物に用いることができる。Ｏｌｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  米国特許出願公開第２００９／０３０４６９４  Ａ１号、２００９年１２月１０日公開、タイトル“ＡＮＧ２  ＡＮＤ  ＶＥＧＦ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲ  ＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮＳ”  に記載の通り、本願発明の方法に用いられる適切なＶＥＧＦ阻害剤は、（ａ）参照により本願明細書にその全体、特に４ＴＢＰＰＡＰＣを開示する部分を援用される米国特許出願公開第２００３／０１２５３３９号又は米国特許第６９９５１６２号、に記載される４ＴＢＰＰＡＰＣ、（ｂ）参照により本願明細書にその全体、特にＡＭＧ７０６を開示する部分を援用される米国特許出願公開第２００３／０１２５３３９号又は米国特許第６９９５１６２号、に記載されるＡＭＧ７０６、（ｃ）Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、（ｄ）参照により本願明細書にその全体、特にＮｅｘａｖｅｒ（登録商標）を開示する部分を援用される国際公開第００／４２０１２号、国際公開第００／４１６９８号、米国特許出願公開第２００５／００３８０８０Ａ１号、米国特許出願公開第２００３／０１２５３５９Ａ１号、米国特許出願公開第２００２／０１６５３９４Ａ１号、米国特許出願公開第２００１／００３４４７Ａ１号、米国特許出願公開第２００１／００１６６５９Ａ１号、及び米国特許出願公開第２００２／０１３７７４Ａ１号に記載されるＮｅｘａｖｅｒ（登録商標）、（ｅ）ＰＴＫ／ＺＫ；（ｆ）Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）、並びに（ｇ）米国特許出願公開第２００６／０２４１１１５号に記載される式ＩＶのＶＥＧＦ阻害剤、を含む。この点、今日の好適なＶＥＧＦ阻害剤はＡＭＧ７０６である。
【００４７】
ヒト化した抗−ＶＥＧＦ又は抗インテグリン抗体は、幾つかの方法により調製することができる。Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第６９４９２４５号、２００５年９月２７日発送、タイトル、”Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＥｒｂＢ２  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ＥｒｂＢ２  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”は、本願開示に従って用いることができる抗体のヒト化の方法を記載した。本願明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する、抗体中の相当する配列と同一か又は相同であり、鎖の残りが、別の種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する、抗体中の相当する配列と同一か又は相同である、「キメラ」抗体、並びに、これらが所望の生物活性を示す限りにおいてかかる抗体の断片、を含む（米国特許第４８１６５６７号；  及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：６８５１−６８５５  （１９８４））。本願明細書における興味のキメラ抗体は、非ヒトの霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）由来の可変領域抗原結合配列、並びにヒトの定常領域配列を含む「霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」された抗体を含む。
【００４８】
上記の米国特許第６９４９２４４５号に更に記載されるように、ヒト化抗体は、非ヒトのソースから導入される１つ又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と称され、一般的には「インポート（ｉｍｐｏｒｔ）」の可変領域から取り出される。ヒト化は基本的に、Ｗｉｎｔｅｒら（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３−３２７  （１９８８）；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９：  １５３４−１５３６  （１９８８））  の方法に沿って、超可変領域の配列をヒト抗体の相当する配列に置換することによって、行うことができる。従って、かかる「ヒト化」抗体は、実質的に未変形のヒトの可変領域が非ヒトの種に由来する相当する配列により置換されている、キメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際、ヒト化抗体は、一般的に、幾つかの超可変領域の残基、及び可能ならばいくつかのＦＲ残基が、齧歯類の抗体中の類似の部位に由来する残基により置換されている、ヒト抗体である。
【００４９】
例えば、かかる組成物の調製に有用な方法を記載する目的で、参照により本願明細書に援用される、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ  の米国特許第５８４０３００号、タイトル「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」に記載される通り、一本鎖組換え型抗体も用いることができる。手短に言えば、組換えＰＣＲ、すなわち、オーバーラップエクステンション（ＳＯＥ）ＰＣＲ法によるスプライシングを用いて、カッパ、重鎖、及びラムダの免疫グロブリン鎖を、別々に増幅し、後に１本鎖として結合し、ここで、一本鎖は重鎖とカッパ鎖、又は重鎖とラムダ鎖を含む。柔軟性のある直鎖のリンカーペプチドをプライマーに用いられ、このプライマーはＶＬをＶＨに結合させるために用いられるリンカーを含み、軽鎖及び重鎖を一本鎖として含むインテグリン結合可変領域を含む新規の組換え型Ｆｖ断片を形成する。Ｆｖ断片はベータ１インテグリンサブユニットに対するＦｖ断片のライブラリーとして開発することができる。
【００５０】
適切な抗体は、ヒト抗体を発現するようにデザインされた遺伝子組み換えされたマウス中で調製することもできる。マウスは、ヒトベータ１インテグリンの断片、及び適切なミエローマ細胞株と融合させた活性なＢ細胞を含むマウスの脾細胞を含む抗原で免疫することができる。ヒトＩｇレパートリーを有するマウスは市販されている。Ｈｅｍａｃｈａｎｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｇａｂａｓｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｌｏｃｉ  Ａｒｅ  Ｏｐｓｏｎｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｆａｔａｌ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ｓｅｐｓｉｓ，”  ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＩＴＹ，  Ａｐｒ．  ２００１，  ｐ．  ２２２３−２２２９  Ｖｏｌ．  ６９，  Ｎｏ．  ４  を参照。
【００５１】
本願発明の抗体を調製する別の技術である、ファージディスプレイによるコンビナトリアルライブラリー技術は、抗−インテグリン活性についてスクリーンすることができるヒトＭａｂｓの大きなライブラリーを作るための有用な方法を提供する。リンパ球ｍＲＮＡから作られたライブラリーは、モノクローナルＦａｂレパートリーの最大１０８の組換え体からなるものとし得る。繊維状ファージ表面にライブラリーを提示し、モデルエピトープ（下記のベータ１インテグリン断片）に対してパニングすることによって、モノクローナルＦａｂ抗体はその免疫的特性及び生物的特性（インテグリン阻害）について選択し、分析することができる。Ｆａｂｓは、安価に大量に生産することができ、元来非−免疫原性であるため、治療的及び診断的方法の両方における使用に理想的である。この技術の記載については、参照により本願明細書に援用される、Ｗｉｔｚｕｍ  ｅｔ  ａｌ．  米国特許第６７１６４１０号を参照。
【００５２】
Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．により記載される通り、ヒト一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、ベータ１抗原に結合する非−免疫性のファージディスプレイから単離することができる。選択された抗体のＣＤＲ３の軽鎖（Ｖ（Ｌ））及び重鎖（Ｖ（Ｈ））可変領域は、その後変異導入され、変異導入されたｓｃＦｖはファージ上に提示され、抗原上でより高い親和性を有する変異体が選択される。Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｉｃｏｍｏｌａｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉ−ｃ−ｅｒｂＢ−２  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ，”  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９６  Ｎｏｖ．  ８；  ２６３（４）：５５１−６７を参照。
【００５３】
他の抗原とクロスリンクする二重特異性抗体（例えば、ダイアボディ）はも用いることができる。他の二重特異性のものに似ず、ダイアボディはバクテリア（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は酵母（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）からの分泌により機能ある形態で生産することができる。詳細はプロトコールは、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｉ．  ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．  （２０００）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｄ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  ３２６，  ４６１−４７９；  及びＨｏｌｌｉｇｅｒ，  Ｐ．  （２００１）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ．  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  に見出すことができる。二量体の抗体断片、又はミニボディを様々な公知の方法で作製することができる。これらは、被共有結合又は共有結合のダイマー（ｓｃ（ＦＶ）２）を生産する。本発明の抗体組成物は、当該技術分野において公知であり、参照により本願明細書に援用される米国特許第６１６５４６７号における凍結乾燥したモノクローナル抗体の記載に例示されるように、公知の安定化剤及び賦形剤と共に、無菌の粉体又は液体の形式で、静脈内注射用に、精製済みの薬学的組成物として調製することができる。
【００５４】
「相乗的」という用語は、本願明細書において、従来的な意味で用いられ、その組み合わせの活性が、その組み合わせの各構成要素の個々の活性を加えたものよりも大きくなるような構成要素の組み合わせを指す。
【００５５】
ＶＥＧＦ活性の他の阻害剤も本願発明の方法及び組成物に用いることができる。例えば、Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ（ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、ＡＶＥ−０００５）は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）の第２のＩｇ領域、及び血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）の第３のＩｇ領域を含む完全ヒト組換え型融合タンパク質である。Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔは、全てのＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム、及び胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）と結合し、これらの因子が血管新生を刺激するのを妨げる。Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔは、４ｍｇ／ｋｇで化学療法と組み合わせて２週間に１回、点滴静注により投与される。
【００５６】
ヌママムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ）の毒液に由来する、ＶＥＧＦ受容体結合タンパク質、ＫＤＲ−ｂｐ（ＫＤＲ結合タンパク質）と名付けられる、は、触媒的に不活性なＰＬＡ２ホモログであるＬｙｓ４９ＰＬＡ２であり、これは、Ｆｕｊｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２  ｖｉａ  ａ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌｏｏｐ  ｒｅｇｉｏｎ，”  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  （２００８）  ４１１，  ５１５−５２２．  に記載される通り、強い筋毒性を有し、ＶＥＧＦ受容体をアンタゴナイズすることが見出された外来性分子である。
【００５７】
特定の態様では、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を含み、該方法は、腫瘍を有する被験者に対して、抗血管新生薬である第一薬剤と；ベータ−１インテグリンにより仲介される腫瘍細胞の結合を遮断する第二薬剤との組み合わせを投与するステップを含み、ここで、腫瘍細胞の増殖は、より高い臨床的用量での第一薬剤により生じる阻害と同等の程度で阻害される。低用量の第一薬剤は、例えば、製品のラベル及び説明書に示される最小用量で投与されるＶＥＧＦ阻害剤としてよい。本発明によれば、腫瘍増殖は、ＶＥＧＦ阻害剤が承認される最高の用量で与えられた場合と少なくとも同程度阻害されるであろう。例えば、直腸又は結腸癌を治療する場合のベバシツマブの推奨用量は、１４日毎のＩＶによる投与で、１ｋｇ当たり５ｍｇ又は１０ｍｇのいずれか（１ポンド当たり約２．３ｍｇから４．５ｍｇ）である。推奨用量は、与えられる化学療法のタイプに基づいて変動する（ｋｇ当たり５又は１０ｍｇのいずれか）であろう。
【００５８】
（ＶＥＧＦの阻害剤である薬剤とインテグリンを遮断する薬剤との治療上の組み合わせ）
接着性の血管吸収及び血管新生を制御する薬剤は、一緒に又は処方時間のインターバルの後に連続的に投与してよい。一緒に投与される場合、これらは許容可能な生体適合性の送達のプラットフォームにより送達してよい。代わりに、薬剤は互いに直接的に融合されてよい。加えて、複数の血管新生の及び／又は接着性の血管吸収を制御する薬剤が、同時又は連続的のいずれかで投与されてよい。最後に、いかなる実施形態も、照射、化学療法、及び／又は血管透過性を増大させる薬剤等のアジュバンド療法と組み合わせてよい。
【００５９】
下流のシグナリング、又は細胞外受容体（ＶＥＧＦＲ−ｌ／Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ−２／Ｆｌｋ−ｌ）に対して結合する能力のいずれかにおいて、ＶＥＧＦ−Ａに対する阻害効果を有する、血管新生のシグナリングの側面を阻害する実施形態が用いられてよい。他の血管新生のメディエーターも標的としてよく、他のＶＥＧＦファミリーメンバー（ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、及びＰＩＧＦ）並びにその受容体（ＶＥＧＦＲ−１／Ｆｌｔ−１、ＶＥＧＦＲ２／Ｆｌｋ−１、ＶＥＧＦＲ−３／Ｆｌｔ−４）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１及びＦＧＦ−２）並びにその受容体（ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ４）、内皮増殖因子メンバー（ＥＧＦ及びＨＢ−ＥＧＦ）並びにその受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＥＡＣＡＭ−ｌ／ＣＤ−６６ａ、オーファン受容体ＨＥＲ−２、アンジオポエチン（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３、及びＡｎｇ４）並びにその受容体（Ｔｉｅ−１及びＴｉｅ２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）並びにその受容体（ＰＤＧＦＲ型アルファ及びＰＤＧＦＲ型ベータ）、トランスフォーミング増殖因子ベータファミリーメンバー（ＴＧＦ−ベータ−１、ＴＧＦベータ２、ＴＧＦ−ベータ３）並びにその受容体（ＴＧＦＢＲ２）、デルタ様リガンド４並びにその受容体（Ｎｏｔｃｈ）、並びに、アンジオスタチン及びタムスタチン等の天然の抗血管新生薬の既存の構造タンパク質の断片を含む。
【００６０】
下流のシグナリング、又は細胞外受容体に対して結合する能力のいずれかにおいて、ベータ−１インテグリンに対する阻害効果を有する、接着性の血管吸収のシグナリングの側面を標的とする実施形態が用いられてよい。これらは、ディスインテグリン、細胞外マトリックスの構成要素／断片、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、ＦＡＫ関連非キナーゼ、並びに細胞外シグナル関連キナーゼ（ＥＲＫ／ＭＡＰＫ）を含んでよい。
【００６１】
抗−血管新生の組成物は、ヒトモノクローナル抗体若しくは抗体断片、ヒト化抗体若しくは抗体断片、阻害ペプチド、キナーゼ阻害剤、内在性阻害剤、小分子阻害剤、ナノボディ、ＲＮＡｉ、アプタマー、アンチセンス、又は薬学的に許容可能なベクター若しくはキャリアと組み合わせたこれらの薬剤のいずれかを含んでよい。
【００６２】
抗−接着性の血管吸収の組成物は、ヒトモノクローナル抗体若しくは抗体断片、ヒト化抗体若しくは抗体断片、阻害ペプチド、キナーゼ阻害剤、内在性阻害剤、小分子阻害剤、ナノボディ、ＲＮＡｉ、アプタマー、アンチセンス、又は薬学的に許容可能なベクター若しくはキャリアと組み合わせたこれらの薬剤のいずれかを含んでよい。
【００６３】
現在のところ好適な実施形態では、再発した多形性膠芽腫（ＧＢＭ）を有する患者には、１つ又は複数の、腫瘍内、切除による空洞内、又は硬膜下に配置するためのカテーテルの移植を行う。患者は、承認された臨床的な用量及び間隔で、標準的な静脈内のベバシツマブ治療を与えられる。ベバシツマブ注射の少なくとも２４時間又は理想的には４８〜１２０時間後、阻害性の抗−ベータ−１インテグリン組成物は、前記カテーテルを通して、対流強化送達法（ＣＥＤ）装置により、臨床的に意義のある用量及び速度で、投与される。
【００６４】
別の実施形態では、上記処方計画は、イオン照射及び／又は化学療法等の追加的なアジュバンド療法と組み合わせられる。別の実施形態では、上記処方計画は新たに診断されたＧＢＭに対して与えられる。別の実施形態では、抗血管新生の組成物及び阻害性の抗−ベータ−１インテグリン組成物の両方がＣＥＤにより投与される。別の実施形態では、抗血管新生の組成物及び阻害性の抗−ベータ１−インテグリン組成物の両方が非経口で投与される。別の実施形態では、１つ又は複数の組成物が、可溶性の生体劇合成ポリマー等の不活性なキャリア中で、腫瘍床に直接的に投与される。別の実施形態では、両方の組成物が２価の抗体として同時に投与される。別の実施形態では、阻害性の抗−ベータ−１インテグリン組成物は、単独で、抗血管新生治療を受けていない患者に対して投与される。別の実施形態では、抗−ベータ−１インテグリン組成物は、それに結合したラジオアイソトープ、特に、ベータ線を発する元素を更に含む。
【００６５】
低酸素を誘導するための代わりの薬剤は、抗−血管新生治療に加えて、血管塞栓のための血管内技術（超選択的塞栓術／標的塞栓術）を用いることである。この手法は、病変部を収縮して、外科的な摘出のためにより好ましい状況を提供するために、髄膜腫及びＡＶＭｓ等の極めて血管の多い脳の病変部に使用するものとして知られている。
【００６６】
この標的を阻害することは、乳房、肺、肝臓、腎臓、結腸、メラノーマ、及びリンパ腫等のほとんどの内皮及び非内皮の腫瘍を含むＧＢＭを越えて、ベータ１インテグリンを発現する幾つかの癌に対して効果的とし得る。加齢に関連した滲出型黄斑変性等の主要性疾患における血管新生を阻害するための抗−ベータ１組成物への追加的な使用もあり得る。最後に、ベータ１−インテグリンシグナリングは接着及び増殖を含む幾つかの免疫細胞の機能にとって重要であるため、抗−炎症性指示のための抗−ベータ−１組成物への使用もあり得る。
【００６７】
代わりの実施形態は、再生医療戦略として生物システムにおいて血管新生を促進させることに関する。かかる実施形態では、血管新生の及び接着の血管吸収の両方の選択的制御が組織修復又は再生の向上を生じさせる。
【００６８】
本発明の更なる実施形態は、腫瘍細胞中でベータ−１インテグリン遺伝子発現をノックダウンするためのｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）の使用を含む。これは、下記の実施形態で実施され、腫瘍細胞増殖における相当の低減が抗−ＶＥＧＦ抗体に対して耐性を有する細胞株において示された。実施例では、ｓｈＲＮＡｓは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の強力なメディエーターである短鎖の干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）の前駆体である。ＲＮＡｉでは、ｓｉＲＮＡに配列で相同な遺伝子が、転写後の段階でサイレンス（発現制御）される。効果的なｓｉＲＮＡｓを生じ得る様々な異なるヘアピン構造がある。レンチウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、脳の分化したニューロンを含む非分裂性細胞に感染することができる。短鎖のへあぴんＲＮＡｓは、レンチウイルスから発現することができ、様々な細胞型の高効率のトランスフェクションを可能にする。効果的なＲＮＡヘアピンコンストラクトは、サイレンスされる遺伝子の配列に基づいてデザインしてよい。インテグリンベータ−１は、ヒトにおいて、ＩＴＧＢ１遺伝子によりコード化されるタンパク質である。インテグリンベータ−１サブユニットについての全ヒトｍＲＮＡは、Ｇｅｎｂａｎｋ  ｌｏｃｕｓ  Ｘ０７９７９、アクセッション番号ＢＣ０２００５７に記載される。３６５６ヌクレオチド（配列番号：１）の、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０５  （３），  １１８３−１１９０  （１９８７）にも記載されるこの配列は、簡潔さのために本願明細書では繰り返さないが、特に参照により本願明細書に援用される。この公知の配列は、実施されたｓｈＲＮＡ等の干渉核酸コンストラクトをデザインするために用いてよい。
【００６９】
全てのヘアピンコンストラクトが効果的なＲＮＡｉ応答を生み出すわけではないものの、良好なコンストラクトについて富化させる法則が開発された。これらの法則は、多数の効果的なコンストラクトの実験、マイクロＲＮＡｓ及び効果的なｓｉＲＮＡｓの熱力学的解析に基づく。法則は、例えば、Ａｍｂｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃５０６に公開され、オンラインで入手可能である。
【００７０】
ＤＮＡベクター由来のコンピテントなウイルスの調製は、コンストラクトの細胞株中へのパッケージングに関わる。ＲＮＡｉレンチウイルスのパッケージングは、ｃＤＮＡを運搬するレンチウイルスをパッケージングすることと本質的に同様である。基本的に、ＤＮＡベクターは、ヒト２９３細胞等のパッケージング細胞株中に一過的にトランスフェクトされ、２−３日後に上澄みがウイルスを含むようになる。
【００７１】
大概、レンチウイルスベクターの生産システムは、「スプリット（ｓｐｌｉｔ）」システムに基づき、天然のウイルスゲノムが個々のヘルパープラスミドコンストラクトに分離されている。異なるウイルス要素を３つ又は４つの別々のベクターに分離することにより、レンチウイルスゲノムの偶発的な組換えにより複製可能なウイルスが作られるリスクを減少させる。
【００７２】
本発明に従ってベータインテグリンノックダウンを生産するためのレンチウイルスの生産システムを選択する場合、宿主の範囲が制限されている（すなわち、齧歯類のみに感染することができるウイルス）ウイルスか、又は宿主の範囲が広い（マウス、トリ、ヒト等に感染することができるウイルス）ウイルスか、を調製してよい。大概、ウイルス表面の被覆タンパク質は、種の特異性を決定する。レンチウイルスの生産システムはスプリットであるため、この被覆タンパク質が、例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ／Ｇ）糖タンパク質（広い宿主指向性の範囲を示す）か、狭宿主性のマルトース結合表面の糖タンパク質（限定された特異性を示す）かを用いることによって、変えることができる。
【００７３】
Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋ  ＳｉＲＮＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ｓｉｒｎａ／ｓｈｒｎａｉ．ａｓｐ）  を用いて、例えば、配列ＴＴＣＴＧＧＡＴＴＧＧＡＣＴＧＡＴＣＡＧＴＴＣ（配列番号：２）を含む、４８３のｓｈＲＮＡ配列をヒトベータ−１インテグリンのｍＲＮＡと同定した。
【００７４】
本願明細書において言及される薬剤はそれを必要とする、本願明細書に記載される腫瘍を患っている患者に、ヒトへの投与に適した薬学的組成物の形式で、送達されることが好ましい。この組成物は、当該技術分野で知られているように、例えば、安定化剤、緩衝剤、賦形剤等が混ぜ合わされ、単離され且つ実質的にピュアな形であり、外来性の薬剤を含むことのない、抗体又は核酸を含む。
【００７５】
下記の実施例は、本願明細書に記載される特定の発明の概念の例示である。
【実施例】
【００７６】
（実施例１：ベータ−１インテグリンの高発現に関係する低酸素）
高速増殖の癌の確立及び抗血管新生治療後における別の一般的な細胞ストレスである、低酸素が、患者の多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ）の試料におけるベータ１の高発現に関係することを示す。この作用機序を直接的に確認するために、我々は、神経膠腫細胞を６〜４８時間、１％酸素に曝して、微小環境の低酸素刺激を行った。我々は、インビトロで神経膠腫細胞においてベータ１インテグリン発現に大きな増加を観察した。これは、迅速で可逆の細胞の応答であり、乳癌及び結腸直腸癌細胞においても実証された。抗−血管新生治療がインビボで増殖中の腫瘍においてベータ１の発現を急激に増加させることを証明するために、我々は、最後にベバシツマブ治療を行った日のうちに採取したマウス由来の神経膠腫を染色した。コントロールと比較して特記すべきベータ１の増加が、治療された腫瘍、特に、低酸素の腫瘍コアにおいて観察された（図２）。
【００７７】
（実施例２：腫瘍細胞増殖中に観察されるベータ１インテグリンの発現の増加）
インビトロでの腫瘍細胞におけるベータ１の発現の更なる増加が、腫瘍細胞の増殖そのものの中で観察された。Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞において、インビトロでの細胞コンフルエントとベータ１のレベルとの間には負の相関がある（図３）。加えて、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫細胞において、増殖マーカーであるＫｉ−６７は、ＦＡＣＳによる実験の通り、ベータ１の発現と正の相関がある。これは、他の研究者が乳癌細胞において観察した結果と一致している。第一に、我々は、一次性ＧＢＭ由来のヒトの外科的試料中の血管新生の血管におけるベータ１インテグリンの発現において相当な減少を視覚的に観察した（図４）。このベータ１インテグリンの発現の増加は、上記の通り、神経膠腫細胞において観察された細胞の増殖へのベータ１の集合に関連すると考えられる。このように、血管の浸入及び増殖に加えて、ベータ１インテグリンは、腫瘍細胞の増殖、低酸素及びＩＲ青の生存シグナリング、及び血管新生のプロセス中の血管内皮細胞に、密接に関係すると思われる。これらの複数の特徴は、ベータ１インテグリンを、直接的に腫瘍の増殖を阻害することができる、また、抗−血管新生薬への耐性の発達を減衰させる抗−血管新生薬を用いた併用療法として、非常に魅力的な標的とする。
【００７８】
（実施例３：腫瘍細胞における抗−ＶＥＧＦ抗体耐性へのベータ１インテグリンの関与）
ベータ１インテグリンがベバシツマブ耐性に関与し得るという仮説を実証するために、我々は、ベバシツマブ治療の前、及び獲得したベバシツマブ耐性の発達後に採取した、一対の患者のＧＢＭの試料において、ベータ１インテグリンに対する免疫蛍光化学を用いた。未治療の試料と比較して、ベバシツマブ後のＧＢＭ組織において、１２対中９対で明らかな増加が見られた（７５％、図５）。
【００７９】
ベバシツマブ耐性を獲得した後の腫瘍細胞におけるベータ１インテグリンの発現の増加を直接的に証明するために、一次性ＧＢＭｓ（位階目の手術）由来の、及び抗血管新生治療に対する耐性の発達後少なくとも３０日で単離された組織由来の細胞株を分析した。実際、ベータ１インテグリン発現は、前者グループと比較して後者のグループに由来する細胞において平均で１３倍高かった（図６）。
【００８０】
観察したベータ１インテグリンの上方制御が機能的なものであったことを証明するために、我々は、活性化された焦点接着キナーゼ（リン酸化−ＦＡＫｔｙｒ３９７）に隣接する患者の腫瘍部位を染色した。リン酸化−ＦＡＫｔｙｒ３９７染色は、治療前に採取した患者の試料と比較して、ベバシツマブ耐性を獲得した後に採取した試料において相当高かった。
【００８１】
このように、ベータ１インテグリンは、獲得したベバシツマブ耐性の発達後に採取された臨床的な患者の試料において機能的に上方制御される。
【００８２】
（実施例４：ベータ１インテグリンの阻害後の抗−ＶＥＧＦ抗体耐性細胞株における病原力の減少）
レンチウイルス粒子中のインテグリンベータ１ｓｈＲＮＡは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，カタログ番号ｓｃ−３５６７５から購入した。４つの異なるｓｈＲＮＡ配列の混合物を与えた。この試薬は、ベバシツマブ治療に不成功であった患者に由来する、ＳＦ８１０６−Ａｘ１及びＳＦ７７９６−Ａｘ３（それぞれ、ＢＲＧ３及びＢＲＧ２として知られている）細胞株を形質転換するために用いられる。我々は、レンチウイルスベクターを用いてベータ１及びベータ３インテグリンの安定ノックダウン細胞株を作製した。我々は、ＢＲＧ３細胞において、一週間後に、ＧＦＰベクターコントロール細胞株又はベータ３ノックダウン細胞株のいずれかと比較して、７０％のベータ１のノックダウンと、それに相当する６０％の細胞増殖の減少を実証した（図８）。これらの細胞をより詳細に研究するために、我々は、９０％超のベータ１がノックダウンされたＢＲＧ３ノックダウン細胞株を単離して、接着性、細胞伸展、細胞移動、及び細胞増殖を含む腫瘍細胞の病原力の増加を示す機能を評価した。これらのノックダウン細胞株は、ベクターコントロール細胞株と比較して、４つの機能全てにおいて相当に損なわれた。
【００８３】
インビボでの上記発見を実証するために、我々は、３つの上記ＢＲＧ３ベータ１インテグリンノックダウン細胞株を同時にヌードマウスに移植して、６か月間腫瘍を追跡した。ベクターコントロールの腫瘍細胞は正常に増殖する一方、我々は、研究の全期間において、ノックダウン細胞株のいずれについても全く増殖を観察しなかった（図１０）。実際、１５中１３（８７％）のノックダウン腫瘍が完全に消失した。この発見がベータ１ノックダウンの直接的な結果であることを証明するために、我々は、ＢＲＧ２及びＢＲＧ３由来のポリクローナルノックダウン細胞株を移植して、インビボでの増殖を同様にモニターした。これらの細胞株は平均７０％のベータ１ノックダウンを実証した。予測の通り、これらの細胞株は、ベクターコントロール細胞株よりも遅く増殖した。しかしながら、９０％ノックダウン細胞株とは対照的に、数週間後、両細胞株はインビボで潜伏性の増殖を示し、増殖とベータ１インテグリンのレベルとの用量依存的な関係を示唆する。
【００８４】
このように、ベバシツマブ耐性の神経膠腫細胞株におけるベータ１の９０％超のノックダウンは、インビトロで病原性の表現型を減衰させ、インビボでの異種移植モデルでの増殖を完全に妨害する。
【００８５】
（実施例５：抗−ＶＥＧＦ抗体耐性細胞株の抗−ベータ１インテグリン抗体治療）
臨床的に意義のあるモードのベータ１阻害を伴う上記結果を証明するために、我々は、よく特性評価されたＡＩＩＢ２阻害性のラットモノクローナル抗−ベータ１インテグリン抗体をインビトロでの阻害実験で用いた。アイソタイプがマッチしたＩｇＧをコントロールとして用いた。ベバシツマブ耐性神経膠腫細胞株は、１０μｇ／ｍＬで、接着性（データ未公表）及び移動（動的な映像分析、未公表）の低減を含むベータ１のノックダウンとしての同様な機能の阻害を示した。細胞増殖に対する効果は、アポトーシス／細胞死（アネキシンＶ）又は増殖（Ｋｉ−６７抗原）のいずれかについての免疫蛍光染色を用いて実証された。染色後、細胞をフローサイトメトリー／蛍光励起セルソーティング（ＦＡＣＳ）によりソートした。この分析は、ＡＩＩＢ２で治療されたＧＢＭ細胞におけるＫｉ−６７における相当な減少を示したが、アネキシンＶの免疫反応性に関して全く効果を示さず、細胞分裂停止の効果と一致した（データ未公表）。
【００８６】
このＡＩＩＢ２での治療を、細胞増殖が増殖状態により影響され得るかどうかを理解するために、インビトロで一次性ＧＢＭ細胞株を用いて繰り返した。コンフルエントな培養物（増殖停止）中のものでなく、サブコンフルエントな培養物（増殖フェーズ）中の細胞は、２日間のＡＩＩＢ２治療により相当に増殖阻害された（図１１）。
【００８７】
最後に、週２回の最大５ｍｇ／ｋｇｍでの用量でのＡＩＩＢ２でのインビボでの治療は、皮下の異種移植モデルにおけるＢＲＧ３ベバシツマブ耐性細胞株（データ未公表）の増殖を相当に阻害した。アポトーシスターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ＵＴＰ末端標識（ＴＵＮＥＬ）は、ＢＲＧ３細胞株におけるＡＩＩＢ２治療された腫瘍でのアポトーシスの増加を明らかにした（データ未公表）。
【００８８】
このように、ＡＩＩＢ２等の機能遮断する抗体を用いたベータ１インテグリン阻害は、ベータ１ノックダウンと同様なインビトロでの病原性の表現型を減衰させる。加えて、ＡＩＩＢ２の非経口投与は、インビボでの、標準の及びベバシツマブ耐性の神経膠腫の異種移植の腫瘍増殖を阻害するのに効果的である。
【００８９】
（実施例６：ベータ１の阻害が上皮間葉移行（ＥＭＴ）及び幹様表現型を逆行させる）
スフェロイドの培養物中の腫瘍細胞の増殖が、幹様表現型の代替物となり、低酸素及び酸性のｐＨ等のストレス要因により促進／富化され得る。標準的な神経膠腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ）及びＢＲＧ３ベバシツマブ耐性細胞株の両方におけるベータ１のノックダウンは、スフェロイドの形成を相当に悪化させる（データ未公表）。ＡＩＩＢ２は、４８時間の低酸素により誘導されたＵ８７ＭＧ神経膠腫細胞のスフェロイド増殖をも阻害した。
【００９０】
スフェロイド増殖の悪化に加えて、ベータ１インテグリンの阻害は、腫瘍細胞領域の相当な増加により示されるＥＭＴの逆行、及び間葉系受容体ｃ−ｍｅｔの５０％の減少を促進する（データ未公表）。
【００９１】
（実施例７：ベータ１インテグリンでの抗血管新生治療の相乗効果）
抗血管新生治療の効果のインビトロのモデルとして、我々は、増殖フェーズにある一次性ＧＢＭ細胞を、低酸素で２時間、その後酸素正常で２日間曝した。低酸素は、ベバシツマブ等の抗−血管新生治療のインビトロでの代替物として用いた。２日の回復期間のＡＩＩＢ２抗体の追加により、低酸素又はＡＩＩＢ２治療のみのいずれかの場合と比較して、腫瘍細胞の増殖の更なる低減が生じた（図１２）。このように、ベータ１インテグリンと抗血管新生薬との組み合わせは、治療効果の相乗効果を予見させる。
【００９２】
インビトロの上記結果を証明するために、我々は、皮下のＵ８７ＭＧ神経膠腫を有するマウスを、コントロールＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）、ベバシツマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、又は低用量の交互のベバシツマブ（１ｍｇ／ｋｇ）及びＡＩＩＢ２（１ｍｇ／ｋｇ）の併用療法で、週２回、治療した。治療の数週間後、低用量の交互の併用療法は、標準的な用量のベバシツマブのみの場合と同じくらい腫瘍増殖の阻害に効果的であることを示した（図１３）。このように、要約すれば、ベータ１インテグリンの阻害は、１）血管吸収及び血管周囲の浸入（又はあらゆる標準的なＥＣＭ基質への浸入）を妨げること、２）ＩＲ，及び低酸素等の侵襲後に腫瘍細胞の生存率を低減する、可能ならばアポトーシスを促進すること、３）腫瘍細胞の増殖を直接的に阻害すること、４）内皮細胞が増殖すること及び移動することを標的とすることによって血管新生を直接的に阻害すること、５）上皮間葉移行（ＥＭＴ）を含む病原性の幹様の表現型を逆行させることによって、腫瘍の増殖を阻害し得ることが示された。重要なことに、レンチウイルスのノックダウン又はＡＩＩＢ２の使用のいずれかによりベータ１受容体をアンタゴナイズすることは、インビボで、ベバシツマブ耐性の神経膠腫の異種移植の増殖を相当に減衰させることができる。更に、ＡＩＩＢ２治療は、神経膠腫の異種移植モデルにおいて少なくとも２０×だけ必要なベバシツマブの用量を低減することができる。
【００９３】
（結論）
上記特定の記載は、本発明の例示説明を意味し、添付の請求項に記述の同等の本発明の範囲により定義される本発明の範囲を限定すると解されるべきではない。この明細書に記載されるあらゆる特許又は文献は、明示的に説明されないが、当業者により理解されうる、本発明の特定の実施形態を実施する際に有用な方法及び材料の詳細を説明することを目的とする。かかる特許又は文献は、それぞれが具体的に個別に本願明細書に参照され含まれる場合と同様に、言及される方法又は材料を記載する及び実施可能とする目的で必要に応じて、参照により本願明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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