(57)【要約】  本開示は、Ｆｎ１４に結合する抗体抗原結合性ドメインを含むタンパク質及びその使用を提供する。本開示はまた、消耗性障害（例えば悪液質）を処置する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質であって、抗原結合性ドメインはＦｎ１４に特異的に結合し、該タンパク質は、Ｆｎ１４を発現する細胞におけるＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達を低減させ、該タンパク質は、Ｔｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４を発現する細胞と接触した場合にＮＦκＢシグナル伝達を検出可能には誘導しない、Ｆｎ１４結合性タンパク質。
【請求項２】
抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質であって、抗原結合性ドメインはＦｎ１４に特異的に結合し、該タンパク質は、Ｆｎ１４を発現する細胞におけるＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達を低減させ、該タンパク質は、Ｔｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４を発現する細胞と接触した場合にＮＦκＢシグナル伝達を検出可能には誘導しない、Ｆｎ１４結合性タンパク質。
【請求項３】
配列番号３４の配列内に含有される残基を含むＦｎ１４中のエピトープに特異的に結合する、請求項１又は２に記載のＦｎ１４結合性タンパク質。
【請求項４】
下記特徴（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）及び／又は（ｖｉｉｉ）のうちの１つ又は複数を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＦｎ１４結合性タンパク質。
（ｉ）Ｆｎ１４の領域を含むポリペプチドであって、前記領域が配列番号３１又は４４の配列からなるポリペプチドには検出可能に結合しない。
（ｉｉ）Ｆｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５６位においてアルギニンがプロリン又はアラニンに置換されているＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。
（ｉｉｉ）Ｆｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５８位においてアルギニンがアラニンに置換されているＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。
（ｉｖ）Ｆｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の６０位においてヒスチジンがアラニンに置換されているＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。
（ｖ）Ｆｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号４８の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。
（ｖｉ）Ｆｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の４２位においてトリプトファンがアラニンに置換されているＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。
（ｖｉｉ）次のアミノ酸置換（配列番号１に対する番号付け）：Ｔ３３Ｎ、Ａ３４Ｓ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ５６Ｐ、Ｌ７７Ｍ、Ｒ５６Ａ、Ｒ５６Ｋ、Ｒ５８Ａ、Ｗ４２Ａ、Ｌ４６Ａ、Ｄ５１Ａ、Ｓ５４Ａ、Ａ５７Ｇ、Ｐ５９Ａ、Ｈ６０Ａ、Ｓ６１Ａ、Ｄ６２Ａ、Ｆ６３Ａ、Ｌ６５Ａ又はＨ６０Ｋのうち１つを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。一例において、結合のレベルは、Ｆｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルである。
（ｖｉｉｉ）酵素結合免疫吸着検定法によって測定し、Ｆｎ１４結合性タンパク質を約２μｇ／ｍｌの濃度でアッセイした場合に、配列番号１９の配列を含むＶＨ及び配列番号２６の配列を含むＶＬを含む抗体による結合の量の７５％以内の量で、配列番号３５の配列からなるペプチドに結合する。
【請求項５】
Ｆｎ１４中の立体構造エピトープに結合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＦｎ１４結合性タンパク質。
【請求項６】
Ｆｎ１４結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域に融合したＦｎ１４の細胞外ドメインを含むポリペプチドに検出可能には結合せず、前記ポリペプチドは還元されているか又は還元及びアルキル化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＦｎ１４結合性タンパク質。
【請求項７】
Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｆｎ１４及び／又は配列番号２若しくは３４の配列を含むポリペプチドに対する下記抗体（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つの抗体の結合を競合的に阻害するか、或いは下記抗体（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ又は複数の抗体と同じＦｎ１４中のエピトープに結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＦｎ１４結合性タンパク質。
（ｉ）配列番号１５の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２２の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体
（ｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨ及び配列番号２３の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｉｉｉ）配列番号１７の配列を含むＶＨ及び配列番号２４の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｉｖ）配列番号１８の配列を含むＶＨ及び配列番号２５の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｖ）配列番号１９の配列を含むＶＨ及び配列番号２６の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｖｉ）配列番号２０の配列を含むＶＨ及び配列番号２７の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｖｉｉ）配列番号２１の配列を含むＶＨ及び配列番号２８の配列を含むＶＬを含む抗体
【請求項８】
抗原結合性ドメインは、
（ｉ）配列番号１３若しくは１５〜２１のいずれか１つの配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）又はそのヒト化、キメラ、シンヒト化若しくは脱免疫化版、及び／又は
（ｉｉ）配列番号１４若しくは２２〜２８のいずれか１つの配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）又はそのヒト化、キメラ、シンヒト化若しくは脱免疫化版
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＦｎ１４結合性タンパク質。
【請求項９】
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を少なくとも含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＦｎ１４結合性タンパク質であって、ＶＨ及びＶＬが結合して、抗原結合性ドメインを含むＦｖを形成し、Ｆｖは下記（ｉ）〜（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つを含む、Ｆｎ１４結合性タンパク質。
（ｉ）配列番号１５の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２２の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ
（ｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２３の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ
（ｉｉｉ）配列番号１７の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２４の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ
（ｉｖ）配列番号１８の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２５の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ
（ｖ）配列番号１９の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２５の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ
（ｖｉ）配列番号２０の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２５の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ
（ｖｉｉ）配列番号２１の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２６の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ
【請求項１０】
ＶＨ及びＶＬが単一のポリペプチド鎖中に存在し、Ｆｎ１４結合性タンパク質が、
（ｉ）単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、
（ｉｉｉ）重鎖定常領域又はＦｃ又は重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された、（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のうち少なくとも１つ、又は
（ｉｖ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結された、（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のうち少なくとも１つ
であるか、或いは
ＶＨ及びＶＬが別々のポリペプチド鎖中に存在し、Ｆｎ１４結合性タンパク質が、
（ｉ）ダイアボディ、
（ｉｉ）トライアボディ、
（ｉｉｉ）テトラボディ、
（ｉｖ）Ｆａｂ、
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２、
（ｖｉ）Ｆｖ、
（ｖｉｉ）重鎖定常領域又はＦｃ又は重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された、（ｉ）〜（ｖｉ）のうち少なくとも１つ、
（ｖｉｉｉ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結された、（ｉ）〜（ｖｉ）のうち少なくとも１つ、又は
（ｉｘ）抗体
である、
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のＦｎ１４結合性タンパク質。
【請求項１１】
非抗体抗原結合性ドメイン、アドネクチン、アフィボディ、アトリマー、エバシン、アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）又はアンチカリンからなる群より選択される、請求項１に記載のＦｎ１４結合性タンパク質。
【請求項１２】
下記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のうちのいずれか１つを含む抗Ｆｎ１４抗体。
（ｉ）配列番号１３の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号１４の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｉｉ）配列番号１５の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２２の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｉｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２３の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｉｖ）配列番号１７の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２４の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｖ）配列番号１８の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２５の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｖｉ）配列番号１９の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２６の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｖｉｉ）配列番号２０の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２７の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｖｉｉｉ）配列番号２１の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２８の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項１２に記載の抗体と、適切な担体と、を含む組成物。
【請求項１４】
対象におけるＦｎ１４媒介性の状態を処置又は予防する方法であって、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタンパク質若しくは請求項１２に記載の抗体又は請求項１３に記載の組成物を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
Ｆｎ１４媒介性の状態は、癌、転移、過剰な血管新生若しくは血管形成、自己免疫疾患、炎症性疾患、神経変性疾患、消耗性障害、心血管疾患又は虚血である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記状態は癌であり、前記方法は、対象の組織中への癌の浸潤を低減若しくは予防するか、又は癌の転移を低減若しくは予防する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
状態に関連する消耗性障害を処置又は予防する方法であって、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質を対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１８】
消耗性障害は悪液質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
消耗性障害は、癌又は糖尿病に関連する悪液質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記状態は癌悪液質であり、前記方法は、癌悪液質に罹患している対象を選択するステップをさらに含み、対象は、Ｆｎ１４を発現する癌に罹患している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
Ｆｎ１４結合性タンパク質は、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＦｎ１４結合性タンパク質若しくは請求項１２に記載の抗体又は請求項１３に記載の組成物である、請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
Ｆｎ１４結合性タンパク質は下記特徴（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）及び／又は（ｖ）のうちの１つ又は複数を有する、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）１ｎＭ以下のＫＤで組換えヒトＦｎ１４に結合する。
（ｉｉ）約８×１０−４ｓ−１以下のＫｄで組換えヒトＦｎ１４に結合する。
（ｉｉｉ）Ｆｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５６位においてアルギニンがプロリン又はアラニンに置換されているＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。
（ｉｖ）Ｆｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５８位においてアルギニンがアラニンに置換されているＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。
（ｖ）Ｆｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の６０位においてヒスチジンがアラニンに置換されているＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。
【請求項２３】
Ｆｎ１４結合性タンパク質は、下記（ｉ）又は（ｉｉ）のうちの１つ又は複数を含む抗体である、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）配列番号１５の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２２の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２３の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
【発明の詳細な説明】
【関連出願データ】
【０００１】
本出願は、２０１１年８月２３日出願の米国特許出願第６１／５２６，５９９号、表題「Ｆｎ１４  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」の優先権を主張するものであり、この言及により、その内容全体が本明細書に組み入れられる。
【配列表の組入れ】
【０００２】
本出願は、電子的形態の配列表と共に出願されるものである。この言及により、配列表の全内容が本明細書に組み入れられる。
【分野】
【０００３】
本開示は、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質及びその使用、並びに消耗性障害（例えば悪液質）を含む種々の状態を処置、予防、診断又は予後判定する方法に関する。
【背景】
【０００４】
線維芽細胞増殖因子誘導１４（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  １４）：
繊維芽細胞増殖因子誘導１４（Ｆｎ１４）（ＴＮＦ様アポトーシス弱誘導因子受容体（ＴＮＦ−ｌｉｋｅ  ｗｅａｋ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）［Ｔｗｅａｋ−Ｒ］又はＴＮＦＲＳＦ１２Ａとしても知られている。）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの一員である。Ｆｎ１４の発現は、組織損傷、再生及び炎症に応答して、増殖因子によってｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで上方調節される。Ｆｎ１４の名称の１つが示唆するように、このタンパク質は、Ｔｗｅａｋと称されるタンパク質の受容体である。Ｆｎ１４に対するＴｗｅａｋの結合、又は構成的なＦｎ１４の過剰発現は、ＮＦκＢシグナル伝達経路を活性化し、この経路は、免疫及び炎症プロセス、発癌並びに癌治療抵抗性において重要な役割を果たすことが知られている。この相互作用は、増殖、移動、分化、アポトーシス、血管新生及び炎症を含む多くの細胞活性もまた制御する。Ｔｗｅａｋ及びＦｎ１４は、組織修復並びに免疫機能及び腫瘍成長の調節にも関与する。したがって、Ｆｎ１４媒介性のシグナル伝達は、ヒト疾患において重要な役割を果たす経路に関与している。Ｆｎ１４媒介性のシグナル伝達は、癌、転移、免疫学的障害（例えば、自己免疫疾患、移植片拒絶及び移植片対宿主病、慢性及び急性の神経学的状態（例えば脳卒中））を含む多数の疾患において役割を果たすことが示唆されている。
【０００５】
Ｆｎ１４は、多数の非リンパ系細胞型（上皮細胞、間葉系細胞、内皮細胞及びニューロン）によって、また、間葉系のすべての前駆細胞を含む多数の組織前駆細胞によって発現される。このタンパク質は、組織損傷及び／又は組織再構築の部位においてｉｎ  ｖｉｖｏで遭遇する、例えば血清中の増殖因子によって高度に誘導性である。結果として、Ｆｎ１４発現はほとんどの健康な組織において比較的低いが、損傷組織及び／又は罹患組織においては増加する。
【０００６】
上述の説明に基づいて、当業者は、Ｆｎ１４に結合する化合物が望ましいことに気付くであろう。これらの化合物は、Ｆｎ１４媒介性の状態を処置、予防、診断又は予後判定するために使用され得る。さらに、種々の生物学的状態及び疾患におけるＦｎ１４の役割を同定し、さらに理解することが望まれる。特に、消耗性障害におけるＦｎ１４の役割はこれまで実証されていない。
【０００７】
消耗性障害：
消耗性障害は、１つ又は複数の組織、例えば筋肉及び／又は脂肪の進行性の喪失を特徴とする障害のクラスである。消耗性障害は次の２つの型に分類できる。（ｉ）喪失される組織が障害の部位であるもの（例えば筋ジストロフィー）、及び（ｉｉ）他の状態に関連する又は他の状態によって引き起こされる消耗性障害。この後者の型は、運動ニューロン疾患、脱神経及び加齢を含む種々の状態に関連し得る。他の障害に関連する消耗性障害には、悪液質として公知の消耗性障害のサブクラスも含まれる。
【０００８】
悪液質は、基礎をなす病気（すなわち状態）に関連する、脂肪重量の喪失有り又は無しの、体重の喪失及び筋肉の喪失を特徴とする代謝障害である。悪液質は一般に、基礎疾患によるタンパク質異化の増加に関連する。悪液質の発症への寄与因子は、食欲不振及び代謝的変更（例えば、増加した炎症状態、増加した筋肉タンパク質分解、並びに炭水化物、タンパク質及び脂質代謝不良）である。悪液質に関連する状態には、癌、特定の感染性疾患（例えば、結核、ＡＩＤＳ）、ある種の自己免疫障害（糖尿病性神経障害性悪液質及びリウマチ性悪液質が含まれる）、又はアンフェタミン若しくはコカインなどの薬物に対する嗜癖、慢性アルコール中毒及び肝臓の硬変症が含まれる（これらに限定されない）。悪液質は、食欲の喪失、無力症及び貧血から生じる不動の状態にまで患者を肉体的に衰弱させ、標準的な処置に対する応答は通常乏しい。悪液質は通常は癌に関連して見られ、この文脈では「癌悪液質」と呼ばれる。例えば、腎疾患、うっ血性心不全、慢性閉塞性肺疾患、糖尿病等の障害に罹患している患者において観察される悪液質症候群もまた存在し、統合失調症のいくつかの重症例が、この障害を呈し得、この場合、障害はヴェサニック（ｖｅｓａｎｉｃ）悪液質と称される。
【０００９】
悪液質の一般的な形態は、癌に関連する。これに関して、悪液質は癌の最も一般的な所見の１つであり、乳房、肺、結腸、前立腺、膵臓及び胃腸管の癌（これらに限定されない。）を含む進行癌を有する患者の最大８０％において存在する。悪液質は、癌の進行の初期においても存在し、例えば、胃腸癌を有する患者の８５％、膵臓癌を有する患者の８３％、及び肺癌を有する患者の６０％が診断の際に悪液質を呈する。悪液質は、すべての癌関連の死の２０％超を占め、罹患者にとって生活の質における全体的な低減を導く、低減した可動性、手術における合併症の増加した危険性、化学療法／放射線療法に対する応答不良、減少した生存時間、及び増加した心理学的苦痛を伴う。現在、癌悪液質の唯一の決定的な処置は原因腫瘍の除去である。この目的（悪液質のために患者が癌処置に対する耐容性を示せないことによってしばしば損なわれる。）は達成には至っておらず、悪液質を寛解させるために種々の手段が取られているが、成功は限定的である。種々の薬剤が、癌患者における進行性悪液質を遅延させる又は停止するための試みにおいて投与されてきた。これらの薬剤には、食欲促進剤（食欲刺激因子）、コルチコステロイド、カンナビノイド、セロトニンアンタゴニスト、消化管運動改善剤、アンドロゲン及びタンパク質同化剤、抗サイトカイン剤、非ステロイド性抗炎症薬物、並びに概日リズムの調節因子が含まれる。
【００１０】
医療的処置及び診断的処置のための、改善されたＦｎ１４結合性タンパク質の同定が有用であることが、上記から当業者に明らかである。さらに、悪液質などの消耗性障害の処置は、満たされていない重要な医療上の要求である。したがって、１つ若しくは複数の障害に関連する、意図しない体重喪失、悪液質、筋肉及び／又は脂肪の消耗、脱力感及び／又は疲労が含まれる消耗性障害を寛解させる、遅延させる又は予防することができる治療の必要性が当分野に存在する。かかる治療は、死亡率を低減し、及び／又は患者の生活の質を増強及び／又は延長させることが望ましく、このことが、例えば消耗性障害を引き起こす又は消耗性障害に関連する状態を処置する治療方法及び／又は予防方法を補助し得る。
【概要】
【００１１】
本発明者らは、Ｆｎ１４に特異的に結合し、Ｆｎ１４を発現する細胞においてＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達を低減するあるクラスの抗体を生成した。したがって、これらの抗体は、Ｆｎ１４を介したＴｗｅａｋ媒介性の活性のアンタゴニストである。本発明者らが同定した抗体は、いくつかのＴｗｅａｋ媒介性の活性（例えば、ＮＦκＢシグナル伝達及び／又はＴｗｅａｋ誘導性のＫｙｍ１細胞死）をアンタゴナイズ又は低減することが可能である。本発明者らが同定した抗体は、例えば、Ｔｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４に結合した場合にはＮＦκＢシグナル伝達を誘導せず、このことは、これらの抗体が、Ｆｎ１４に対する抗体を使用したＴｗｅａｋ媒介性の状態の処置が望ましい状況において、望ましくない副作用を回避できることを意味する。この機能的差異は、実務上の利益を提供するだけでなく、本発明者らが生成した抗体を、望ましくない副作用に悩まされることがあるいくつかの公知の抗Ｆｎ１４抗体（例えば、ＩＴＥＭ−１、ＩＴＥＭ−２及びＩＴＥＭ−３並びにそれらの誘導体）から識別する。
【００１２】
本発明者らが同定したいくつかの抗体は、サイトカイン分泌（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−８分泌）などのいくつかのＴｗｅａｋ媒介性の活性を誘導又はアゴナイズすることが可能である。
【００１３】
本発明者らは、これらの抗体が、Ｆｎ１４の細胞外ドメインの共通領域内に含有される、立体構造エピトープなどのエピトープに結合することもまた明らかにした。さらに、本発明者らは、このエピトープ内の異なる残基が、異なるサブクラスの抗体の結合に関与することを見出した。これらの分析を実施するにあたり、本発明者らは、これらの分析が、抗体結合に関与するエピトープ内のアミノ酸残基に基づいて、無効又は有効性が低い抗体から、消耗性状態（後述）を処置する際に特に有効な抗体を識別できることを明らかにした。
【００１４】
本発明者らが生成した抗体を特徴付けるための動物モデルを開発するにあたり、本発明者らは、Ｆｎ１４を異所的に発現する腫瘍原性細胞を投与したマウスが重症悪液質を発症したことを驚くべきことに見出した。本発明者らは、Ｆｎ１４活性を調整した抗体のクラスが、悪液質の進行後に対象において体重増加を誘導することを含めて、悪液質を処置することが可能であることもまた明らかにした。この知見のさらなる特徴付けの際に、本発明者らは、これらの抗体が、腫瘍細胞上のＦｎ１４に結合し、Ｆｎ１４シグナル伝達を調整することによって治療効果を発揮していることを明らかにした。したがって、本発明者らは、腫瘍上のＦｎ１４シグナル伝達を調整することによって骨格筋などの異なる組織において正の効果を誘導していた。
【００１５】
本発明者らは、本発明者らが生成した抗Ｆｎ１４抗体が、結腸癌マウスモデルにおいて悪液質を予防又は遅延させることが可能であることを示すために、これらの研究を拡張した。本発明者らが試験した抗体はマウスにおいて腫瘍のサイズを低減することもできた。
【００１６】
本発明者らは、あるクラスの抗体が、癌及び／又は悪液質に罹患している対象の寿命を延長することが可能であることをさらに実証した。
【００１７】
本発明者らはまた、本発明者らが生成した抗体が、筋肉などの組織に浸潤する癌の能力を予防することを示し、このことは、癌の組織浸潤又は転移の予防における有用性を示している。
【００１８】
本発明者らは、これらの抗体が糖尿病誘導性の消耗／悪液質のマウスモデルにおいて筋肉消耗を低減又は予防し得ることを示すことによって抗体の研究をさらに拡張した。これらのデータは、本発明者らが、種々の消耗性障害の処置又は予防に有用な抗体を生成したことを示している。
【００１９】
抗体を用いて糖尿病に罹患しているマウスを処置する場合、本発明者らは、これらのマウスが、非処置の糖尿病マウスと比較して水摂取量及び血中グルコースレベルの低減を示すことを観察した。
【００２０】
したがって、本開示は、悪液質などの消耗性状態を含むＦｎ１４媒介性の状態を診断／予後判定／処置／予防するための種々の試薬を提供する。本開示は、消耗性状態（例えば悪液質）又は癌の組織浸潤若しくは転移を処置又は予防する方法もまた提供する。
【００２１】
一例において、本開示は、抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質であって、抗原結合性ドメインはＦｎ１４に特異的に結合し、タンパク質は、少なくとも１つのＴｗｅａｋ媒介性のＦｎ１４シグナル伝達効果をアンタゴナイズし、タンパク質は、Ｔｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４を発現する細胞と接触した場合にはＴｗｅａｋ媒介性のＦｎ１４シグナル伝達効果を検出可能には誘導しない、Ｆｎ１４結合性タンパク質を提供する。一例において、抗原結合性ドメインは、非抗体Ｆｎ１４結合性タンパク質由来又は非抗体Ｆｎ１４結合性タンパク質から誘導される。
【００２２】
一例において、本開示は、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質であって、抗原結合性ドメインはＦｎ１４に特異的に結合し、タンパク質は、少なくとも１つのＴｗｅａｋ媒介性のＦｎ１４シグナル伝達効果をアンタゴナイズし、タンパク質は、Ｔｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４を発現する細胞と接触した場合にはＴｗｅａｋ媒介性のＦｎ１４シグナル伝達効果を検出可能には誘導しない、Ｆｎ１４結合性タンパク質を提供する。
【００２３】
一例において、Ｔｗｅａｋ媒介性の活性は、細胞におけるＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達及び／又はＫｙｍ１細胞のＴｗｅａｋ誘導性の死である。
【００２４】
一例において、本開示は、抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質であって、抗原結合性ドメインはＦｎ１４に特異的に結合し、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｆｎ１４を発現する細胞におけるＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達を低減させ、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｔｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４を発現する細胞と接触した場合にはＮＦκＢシグナル伝達を検出可能には誘導しない、Ｆｎ１４結合性タンパク質を提供する。
【００２５】
一例において、本開示は、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質であって、抗原結合性ドメインはＦｎ１４に特異的に結合し、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｆｎ１４を発現する細胞におけるＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達を低減させ、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｔｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４を発現する細胞と接触した場合にはＮＦκＢシグナル伝達を検出可能には誘導しない、Ｆｎ１４結合性タンパク質を提供する。
【００２６】
例えば、ＮＦκＢシグナル伝達は、ＮＦκＢ結合の結果として遺伝子発現を促進するプロモーターに作動可能に連結された、蛍光タンパク質をコードする核酸を含む細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）において検出される。例えば、ＮＦκＢシグナル伝達は、蛍光活性化セルソーティングを用いて検出される。Ｔｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達は、タンパク質の存在下又は非存在下のいずれかで、細胞をＴｗｅａｋ（例えば、約１００ｎｇ又は２００ｎｇのＴｗｅａｋ）と接触させることによって誘導され得る。一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、１００ｎｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌの濃度で、Ｔｗｅａｋ誘導性の（例えば、１００ｎｇ又は２００ｎｇのＴｗｅａｋによって誘導される）ＮＦκＢシグナル伝達を低減又は予防する。
【００２７】
例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号３４の配列内に含有される残基を含むＦｎ１４中のエピトープに特異的に結合する。
【００２８】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｆｎ１４の領域を含むポリペプチドには検出可能に結合せず、この領域は配列番号３３又は４６の配列からなる。例えば、このポリペプチドはファージの表面上にディスプレイされる。
【００２９】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号３３又は４６の配列からなるペプチドには検出可能に結合しない。
【００３０】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号１の５６位においてアルギニンを置換したプロリン又はアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５６位においてアルギニンを置換したプロリン又はアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、例えばこのＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号５２又は５４の配列からなり、一端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号５２又は５４の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号５２又は５４の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【００３１】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号１の５８位においてアルギニンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５８位においてアルギニンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、例えばこのＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号５６の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって、又はファージの表面上にペプチドを発現させ、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質にファージを接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号５６の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号５６の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【００３２】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号１の６０位においてヒスチジンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の６０位においてヒスチジンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、例えばこのＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号６３の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号６３の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号６３の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【００３３】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号４８の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号４８の配列（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）からなるペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号４８の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号４８の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【００３４】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号１の４２位においてトリプトファンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の４２位においてトリプトファンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、例えばこのＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号５７の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００４と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００４と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００４と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号５７の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号５７の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００４と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【００３５】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、以下のアミノ酸置換（配列番号１に対する番号付け）Ｔ３３Ｎ、Ａ３４Ｓ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ５６Ｐ、Ｌ７７Ｍ、Ｒ５６Ａ、Ｒ５６Ｋ、Ｒ５８Ａ、Ｗ４２Ａ、Ｌ４６Ａ、Ｄ５１Ａ、Ｓ５４Ａ、Ａ５７Ｇ、Ｐ５９Ａ、Ｈ６０Ａ、Ｓ６１Ａ、Ｄ６２Ａ、Ｆ６３Ａ、Ｌ６５Ａ又はＨ６０Ｋのうち１つを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。一例において、結合のレベルは、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルである。
【００３６】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、（配列番号１に対する番号付け）Ｔ３３Ｎ、Ａ３４Ｓ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ５６Ｐ、Ｌ７７Ｍ、Ｒ５６Ａ、Ｒ５６Ｋ、Ｒ５８Ａ、Ｗ４２Ａ、Ｌ４６Ａ、Ｄ５１Ａ、Ｓ５４Ａ、Ａ５７Ｇ、Ｐ５９Ａ、Ｈ６０Ａ、Ｓ６１Ａ、Ｄ６２Ａ、Ｆ６３Ａ、Ｌ６５Ａ又はＨ６０Ｋからなる群より個々に又は集合的に選択される１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。一例において、結合のレベルは、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルである。
【００３７】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号４９〜６８のいずれか１つの配列からなり、末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有するペプチドに結合することが可能である。
【００３８】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、一連のペプチドに結合することが可能であり、この連は、配列番号４９〜６８のいずれか１つの配列のすべてを有し、末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有するペプチドを含む。
【００３９】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号４７の配列からなり、末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有するペプチドに結合することが可能である。
【００４０】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号４８の配列からなり、末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有するペプチドに結合することが可能である。
【００４１】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号１９の配列を含むＶＨ及び配列番号２６の配列を含むＶＬを含む抗体による結合の量の７５％以内の量で、配列番号３５の配列からなるペプチドに結合する。一例において、結合したタンパク質又は抗体の量は、配列番号３５の配列からなるペプチドにＦｎ１４結合性タンパク質を接触させ、ある量（例えば２μｇ／ｍｌ）のＦｎ１４結合性タンパク質をこのペプチドと接触させることによって評価される。次いで、ペプチドに結合したＦｎ１４結合性タンパク質の量が決定され、このペプチドに結合した、配列番号１９の配列を含むＶＨ及び配列番号２６の配列を含むＶＬを含む抗体の量と比較される。一例において、ペプチドに結合したＦｎ１４結合性タンパク質の量は、結合した抗体の量の約７３％又は６０％又は４５％以内である。
【００４２】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号１５の配列を含むＶＨ及び配列番号２２の配列を含むＶＬを含む抗体又は配列番号１６の配列を含むＶＨ及び配列番号２３の配列を含むＶＬを含む抗体による結合の量の８０％以内の量で、配列番号３４の配列からなるペプチドに結合する。一例において、結合したタンパク質又は抗体の量は、配列番号３４の配列からなるペプチドにＦｎ１４結合性タンパク質を接触させ、ある量（例えば５ｎｇ／ｍｌ）のＦｎ１４結合性タンパク質をこのペプチドと接触させることによって評価される。次いで、ペプチドに結合したＦｎ１４結合性タンパク質の量が決定され、このペプチドに結合した抗体の量と比較される。一例において、ペプチドに結合したＦｎ１４結合性タンパク質の量は、結合した抗体の量の約５０％又は４８％又は４５％又は４０％以内である。
【００４３】
本開示はまた、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質であって、抗原結合性ドメインは、本発明者らが同定した抗体が結合するエピトープの残基を含むペプチドに特異的に結合する、Ｆｎ１４結合性タンパク質を提供する。例えば、本開示は、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質であって、抗原結合性ドメインはＦｎ１４に特異的に結合し、抗原結合性ドメインは、配列番号３４の配列内に含有される残基を含むＦｎ１４中のエピトープに結合する、Ｆｎ１４結合性タンパク質を提供する。
【００４４】
例えば、抗原結合性ドメインは、配列番号３〜９又は３４に記載の１つ又は複数の配列内に含有される残基を含むＦｎ１４中のエピトープに特異的に結合する。
【００４５】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｆｎ１４中の立体構造エピトープに結合する。例えば、この立体構造エピトープは、Ｆｎ１４内でのジスルフィド結合の形成に依存する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質が結合する立体構造エピトープは、ジスルフィド結合を欠くＦｎ１４タンパク質、例えば還元形態のＦｎ１４中には存在しない。
【００４６】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、還元形態又は還元及びアルキル化された形態のＦｎ１４には、実質的に結合しない。一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域に融合したＦｎ１４の細胞外ドメインを含むポリペプチドには実質的に結合せず、このポリペプチドは、還元されている又は還元及びアルキル化されている。例えば、結合は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を実施して、固定化されたポリペプチドに対するＦｎ１４結合性タンパク質の結合を検出することによって検出される。
【００４７】
例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、還元形態又は還元及びアルキル化された形態のＦｎ１４には、検出可能に結合しない。一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域に融合したＦｎ１４の細胞外ドメインを含むポリペプチドには検出可能に結合せず、このポリペプチドは、還元されている又は還元及びアルキル化されている。
【００４８】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ａ３７５ヒト黒色腫細胞などの細胞（すなわち、ＩＬ−８分泌アンタゴニスト活性を有する細胞）からのＴｗｅａｋ誘導性のインターロイキン−８（ＩＬ−８）分泌を低減する。一例において、（例えば約１０μｇ／ｍｌの濃度の）Ｆｎ１４結合性タンパク質は、（例えば約３００ｎｇ／ｍｌの濃度の）抗体のＦｃ領域に融合したＴｗｅａｋと接触させたＡ３７５黒色腫細胞（例えば約１×１０４細胞）によるＩＬ−８分泌を低減する。かかる活性を有する例示的な抗体は、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００５及びＣＲＣＢＴ−０６−００７からなる群より選択される抗体の可変領域又はＣＤＲ、或いはそれらのＣＤＲを含む抗体を含む。
【００４９】
ＣＲＣＢＴ−０６−００５の場合、この抗体は、例えば、マウスＩｇＧ２ｂ（ヒトＩｇＧ３の等価物）である。これに関して、本発明者らは、ＣＲＣＢＴ−０６−００５及びＣＲＣＢＴ−０６−００６が、非常に類似したＶ領域を有するが、アイソタイプ及び活性が異なることを示している（例えば、ＣＲＣＢＴ−０６−００６［マウスＩｇＧ２ａ、ヒトＩｇＧ１の等価物］はＴｗｅａｋ誘導性のＩＬ−８分泌のアゴニストである）。
【００５０】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、式：（ｂ−ｄ）／（ｂ−ａ）［式中：ａ＝１０μｇ／ｍｌの抗体の存在下で分泌されたＩＬ−８の量；ｂ＝３００ｎｇ／ｍｌのＴｗｅａｋ−Ｆｃの存在下で分泌されたＩＬ−８の量；ｃ＝抗体又はＴｗｅａｋ−Ｆｃのいずれかの非存在下で細胞から分泌されたＩＬ−８の量；ｄ＝１０μｇ／ｍｌの抗体及び３００ｎｇ／ｍｌのＴｗｅａｋ−Ｆｃの存在下で分泌されたＩＬ−８の量］を用いて評価した場合に少なくとも約８０％又は９０％又は１００％のアンタゴニズムのレベルを有する。
【００５１】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、細胞をＴｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４結合性タンパク質と接触させた場合に、Ａ３７５ヒト黒色腫細胞などの細胞（すなわち、ＩＬ−８分泌アゴニスト活性を有する細胞）からのＴｗｅａｋ誘導性のインターロイキン−８（ＩＬ−８）分泌を誘導する。一例において、（例えば約１０、１、０．１又は０．０１μｇ／ｍｌの濃度の）Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｔｗｅａｋの非存在下でＡ３７５黒色腫細胞（例えば約１×１０４細胞）によるＩＬ−８分泌を誘導する。かかる活性を有する例示的な抗体は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００６からなる群より選択される抗体の可変領域又はＣＤＲを含む。
【００５２】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、式：（ａ−ｃ）／（ｂ−ｃ）［式中：ａ＝１０μｇ／ｍｌの抗体の存在下で分泌されたＩＬ−８の量；ｂ＝３００ｎｇ／ｍｌのＴｗｅａｋ−Ｆｃの存在下で分泌されたＩＬ−８の量；ｃ＝抗体又はＴｗｅａｋ−Ｆｃのいずれかの非存在下で細胞から分泌されたＩＬ−８の量；ｄ＝１０μｇ／ｍｌの抗体及び３００ｎｇ／ｍｌのＴｗｅａｋ−Ｆｃの存在下で分泌されたＩＬ−８の量］を用いて評価した場合に少なくとも約８０％又は９０％のアゴニズムのレベルを有する。
【００５３】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、癌若しくは癌悪液質又は糖尿病若しくは糖尿病誘導性の悪液質に罹患している対象への投与の際に体重喪失を遅延又は予防する。
【００５４】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、２ｎＭ以下、例えば１．５ｎＭ以下、例えば１ｎＭ以下の親和性解離定数（ＫＤ）で、抗体のＦｃ領域に融合したＦｎ１４の細胞外ドメインを含むタンパク質に結合する。一例において、ＫＤは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する、Ｆｃに融合したＦｎ１４の細胞外領域の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００５５】
一例において、ＫＤは、約０．０１ｎＭ〜約２ｎＭの間、例えば約０．０５ｎＭ〜約１ｎＭの間、例えば、約０．１ｎＭ〜約１ｎＭの間、例えば、約０．５ｎＭ〜約１ｎＭの間である。一例において、ＫＤは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する、Ｆｃに融合したＦｎ１４の細胞外領域の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００５６】
本開示の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域に融合したＦｎ１４の細胞外ドメインを含むタンパク質に対して、約０．９ｎＭ（例えば＋／−０．１ｎＭ）のＫＤを有する。本開示の別の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域に融合したＦｎ１４の細胞外ドメインを含むタンパク質に対して約０．７ｎＭ（例えば＋／−０．１ｎＭ）のＫＤを有する。
【００５７】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は０．６ｎＭ以下のＫＤで組換えヒトＦｎ１４に結合する。
【００５８】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、１ｎＭ以下、例えば０．９ｎＭ以下、例えば０．８ｎＭ以下、例えば０．７ｎＭ以下、例えば０．６ｎＭ以下のＫＤで組換えヒトＦｎ１４に結合する。一例において、ＫＤは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対するヒト組換えＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００５９】
一例において、ＫＤは、約０．０１ｎＭと１ｎＭとの間、例えば約０．０５ｎＭと０．９ｎＭとの間、例えば約０．０９ｎＭと０．７ｎＭとの間、例えば約０．１ｎＭと０．６ｎＭとの間である。
【００６０】
本開示の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、組換えヒトＦｎ１４に対して約０．５ｎＭ（例えば＋／−０．１ｎＭ）のＫＤを有する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、又はその抗原結合性ドメイン、可変領域若しくはＣＤＲを含む抗体である。
【００６１】
本開示の別の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、組換えヒトＦｎ１４に対して約０．２ｎＭ（例えば＋／−０．１ｎＭ）のＫＤを有する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、又はその抗原結合性ドメイン、可変領域若しくはＣＤＲを含む抗体である。
【００６２】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、５×１０３Ｍ−１ｓ−１以上、例えば約２×１０３Ｍ−１ｓ−１以上、例えば約１．５×１０４Ｍ−１ｓ−１以上のオンレート（Ｋａ）で、抗体のＦｃ領域に融合したＦｎ１４の細胞外ドメインを含むタンパク質に結合する。一例において、Ｋａは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する、Ｆｃに融合したＦｎ１４の細胞外領域の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００６３】
例えば、Ｋａは、約５×１０３Ｍ−１ｓ−１〜約５×１０５Ｍ−１ｓ−１の間、例えば約１×１０４Ｍ−１ｓ−１〜約４×１０５Ｍ−１ｓ−１の間、例えば約２×１０４Ｍ−１ｓ−１〜約４×１０５Ｍ−１ｓ−１の間である。一例において、Ｋａは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する、Ｆｃに融合したＦｎ１４の細胞外領域の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００６４】
本開示の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、約２．２×１０４Ｍ−１ｓ−１のＫａを有する。本開示のさらなる例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、約３．９×１０５Ｍ−１ｓ−１のＫａを有する。一例において、Ｋａは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する、Ｆｃに融合したＦｎ１４の細胞外領域の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００６５】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、１×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、例えば約１．２×１０５Ｍ−１ｓ−１以上、例えば約１．３×１０５Ｍ−１ｓ−１以上のＫａで組換えヒトＦｎ１４に結合する。一例において、Ｋａは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する組換えヒトＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００６６】
例えば、Ｋａは、約１×１０５Ｍ−１ｓ−１〜約３．５×１０５Ｍ−１ｓ−１の間である。一例において、Ｋａは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する組換えヒトＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００６７】
本開示の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、組換えヒトＦｎ１４に対して約１．８×１０５Ｍ−１ｓ−１のＫａを有する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、又はその抗原結合性ドメイン、可変領域若しくはＣＤＲを含む抗体である。一例において、Ｋａは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する組換えヒトＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００６８】
本開示のさらなる例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、組換えヒトＦｎ１４に対して約１．３×１０５Ｍ−１ｓ−１のＫａを有する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、又はその抗原結合性ドメイン、可変領域若しくはＣＤＲを含む抗体である。一例において、Ｋａは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する組換えヒトＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００６９】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、９×１０−５ｓ−１以下、例えば７×１０−５ｓ−１以下、例えば６×１０−５ｓ−１以下、例えば５．５×１０−５ｓ−１以下のオフレート（Ｋｄ）で、抗体のＦｃ領域に融合したＦｎ１４の細胞外ドメインを含むタンパク質に結合する。一例において、Ｋｄは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する、Ｆｃに融合したＦｎ１４の細胞外領域の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００７０】
例えば、Ｋｄは、約１×１０−４ｓ−１〜約１×１０−５ｓ−１、例えば約６×１０−５ｓ−１〜約１×１０−５ｓ−１の間、例えば約５．５×１０−５ｓ−１〜約１．４×１０−５ｓ−１の間、例えば約２×１０−５ｓ−１〜約１．４×１０−５ｓ−１の間である。一例において、Ｋｄは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する、Ｆｃに融合したＦｎ１４の細胞外領域の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００７１】
本開示の例示的なタンパク質は、約１．８５×１０−５ｓ−１のＫｄを有する。本開示のさらなる例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、約１．４５×１０−５ｓ−１のＫｄを有する。一例において、Ｋｄは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する、Ｆｃに融合したＦｎ１４の細胞外領域の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００７２】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は３×１０−３ｓ−１以下のＫｄで組換えヒトＦｎ１４に結合する。
【００７３】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、約８×１０−４ｓ−１以下、例えば５×１０−４ｓ−１以下、例えば４×１０−４ｓ−１以下、例えば２×１０−４ｓ−１以下のＫｄで、組換えヒトＦｎ１４に結合する。一例において、Ｋｄは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する組換えヒトＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００７４】
例えば、Ｋｄは、約９×１０−４ｓ−１〜約１×１０−５ｓ−１の間、例えば約５×１０−４ｓ−１〜約１×１０−５ｓ−１の間、例えば約２×１０−４ｓ−１〜約２×１０−５ｓ−１の間である。一例において、Ｋｄは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する組換えヒトＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００７５】
本開示の例示的なタンパク質は、組換えヒトＦｎ１４に対して約１．０２×１０−４ｓ−１のＫｄを有する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、又はその抗原結合性ドメイン、可変領域若しくはＣＤＲを含む抗体である。一例において、Ｋｄは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する組換えヒトＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００７６】
本開示のさらなる例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、組換えヒトＦｎ１４に対して約１．４５×１０−５ｓ−１のＫｄを有する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、又はその抗原結合性ドメイン、可変領域若しくはＣＤＲを含む抗体である。一例において、Ｋｄは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する組換えヒトＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【００７７】
一例において、配列番号２９〜３２のいずれか１つの配列を含むポリペプチドに対する、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質の結合のレベルは、配列番号２の配列を含むポリペプチドに対する結合のレベルと類似している。
【００７８】
一例において、本開示のＦｎ１４結合は、以下の配列のうちの１つ又は複数を含むペプチドには検出可能に結合しない。
（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列であって、このペプチドは、配列番号１のアミノ酸１〜６１を含まない、アミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列；及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列
【００７９】
一例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質はヒトＦｎ１４及びマウスＦｎ１４に結合する。一例において、タンパク質の結合は、組換えＦｎ１４細胞外ドメインを使用するＥＬＩＳＡによって評価される。
【００８０】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｆｎ１４及び／又はヒトＦｎ１４及び／又は配列番号１、２若しくは３４の配列を含むポリペプチドに対する、下記抗体のうちのいずれか１つの抗体の結合を競合的に阻害する。
（ｉ）配列番号１５の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２２の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体
（ｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨ及び配列番号２３の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｉｉｉ）配列番号１７の配列を含むＶＨ及び配列番号２４の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｉｖ）配列番号１８の配列を含むＶＨ及び配列番号２５の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｖ）配列番号１９の配列を含むＶＨ及び配列番号２６の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｖｉ）配列番号２０の配列を含むＶＨ及び配列番号２７の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｖｉｉ）配列番号２１の配列を含むＶＨ及び配列番号２８の配列を含むＶＬを含む抗体
【００８１】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｆｎ１４中の同じエピトープ、或いは下記抗体のうちのいずれか１つ又は複数の抗体が結合するエピトープと重複するＦｎ１４中のエピトープに結合する。
（ｉ）配列番号１５の配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）及び配列番号２２の配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体
（ｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨ及び配列番号２３の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｉｉｉ）配列番号１７の配列を含むＶＨ及び配列番号２４の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｉｖ）配列番号１８の配列を含むＶＨ及び配列番号２５の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｖ）配列番号１９の配列を含むＶＨ及び配列番号２６の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｖｉ）配列番号２０の配列を含むＶＨ及び配列番号２７の配列を含むＶＬを含む抗体
（ｖｉｉ）配列番号２１の配列を含むＶＨ及び配列番号２８の配列を含むＶＬを含む抗体
【００８２】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｆｎ１４を発現する細胞においてＴｗｅａｋ活性を中和する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質はＴｗｅａｋ媒介性のＫｙｍ１細胞死を阻害又は低減する。
【００８３】
例えば、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、約５０ｎｇ／ｍｌの抗体のＦｃ領域に融合したＴｗｅａｋを含むタンパク質によって誘導される細胞死を低減することが可能である。一例において、細胞死の低減は、同じ濃度の抗体のＦｃ領域に融合したＴｗｅａｋを含むタンパク質の存在下及びＦｎ１４結合性タンパク質の非存在下での細胞死のレベルと比較して、約１／１．５の低減又は１／２の低減である。
【００８４】
例えば、約１μｇ／ｍｌの濃度で、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、約２００ｎｇ／ｍｌの抗体のＦｃ領域に融合したＴｗｅａｋを含むタンパク質によって誘導される細胞死を低減することが可能である。一例において、細胞死の低減は、同じ濃度の抗体のＦｃ領域に融合したＴｗｅａｋを含むタンパク質の存在下及びＦｎ１４結合性タンパク質の非存在下での細胞死のレベルと比較して、約１／１．２の低減又は１／１．５の低減又は１／２の低減又は１／３の低減である。
【００８５】
あるいは又はさらに、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ｖ１２Ｈｒａｓ及びｈＦｎ１４を発現するように遺伝子改変された線維芽細胞などの腫瘍細胞による、Ｆｎ１４（例えば、ｈＦｎ１４）媒介性のサイトカイン産生、例えば、ＩＬ−６の産生を低減又は予防する。一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、約０．５μｇ／ｍｌの濃度で細胞と接触した場合に、少なくとも１／１．５又は少なくとも１／２に、ｖ１２Ｈｒａｓ及びｈＦｎ１４を発現するように遺伝子改変された線維芽細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）によるＦｎ１４（例えばｈＦｎ１４）媒介性のＩＬ−６産生を低減する。
【００８６】
あるいは又はさらに、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、例えば本明細書に記載されるような、Ｆｎ１４（例えばｈＦｎ１４）を発現する細胞においてＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達を低減又は阻害する。
【００８７】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、１つ又は複数のＩｇフォールドを含む、抗体から誘導されたものではないＦｎ１４結合性タンパク質（例えば、免疫グロブリン、例えばＴ細胞受容体又はＶドメイン又はＩｇＮＡＲ）、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アトリマー（ａｔｒｉｍｅｒ）、エバシン（ｅｖａｓｉｎ）、アンキリンリピートタンパク質（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＤＡＲＰｉｎ）又はアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）などの非抗体抗原結合性ドメインを含む。
【００８８】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は抗体抗原結合性ドメインを含む。
【００８９】
一例において、抗原結合性ドメインは、
（ｉ）配列番号１３若しくは１５〜２１のいずれか１つの配列を含むＶＨ、又はそのヒト化、キメラ若しくは脱免疫化版；及び／又は
（ｉｉ）配列番号１４若しくは２２〜２８のいずれか１つの配列を含むＶＬ、又はそのヒト化、キメラ若しくは脱免疫化版
を含む。
【００９０】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＶＨ及びＶＬが結合して、抗原結合性ドメインを含むＦｖを形成する、ＶＨ及びＶＬを含む。例えば、このＦｖは、
（ｉ）配列番号１３の配列を含むＶＨの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶＨであって、配列番号１３の残基１０１に対応する位置のアミノ酸がチミジンである場合には、配列番号１３の１０７位の残基はヒスチジンであり、及び／又は配列番号１３の５３位の残基はセリンである、ＶＨ；及び
（ｉｉ）配列番号１４の配列を含むＶＬの３つのＣＤＲを含むＶＬ
を含む。
【００９１】
一例において、Ｆｖは、
（ｉ）配列番号１５の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２２の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２３の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号１７の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２４の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号１８の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２５の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号１９の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２６の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号２０の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２７の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ；及び
（ｖｉｉ）配列番号２１の配列を含むＶＨのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＨ並びに配列番号２８の配列を含むＶＬのＣＤＲ１、２及び３を含むＶＬ
を含む。
【００９２】
一例において、これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって規定され、Ｆｉｇｕｒｅ  １１Ａ〜１１Ｄ中に太字文字列で示される。
【００９３】
一例において、これらのＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによって規定され、Ｆｉｇｕｒｅ  １１Ａ〜１１Ｄ中に下線付き文字列で示される。
【００９４】
一例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、ドメイン抗体（例えば、ＶＨのみ又はＶＬのみ、例えば、１つ又は複数の定常ドメイン又は定常領域又はＦｃなどの別の部分に作動可能に連結されたＶＨのみを含む）である。これに関して、本発明者らは、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴ−０６−００４を生成したが、これらの抗体はフレームシフト変異を含有するＶＬドメインを有し、このことは、ＣＤＲ２及び３が容易に同定可能でないことを意味する。したがって、これらのタンパク質の結合の少なくとも大部分は、ＶＨから生じると予測される。ＶＨドメインの配列は、本開示の他の例示的なタンパク質のＶＨ配列と非常に類似している。
【００９５】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質の一例において、ＶＨ及びＶＬは単一のポリペプチド鎖中に存在する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、
（ｉ）単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）重鎖定常領域又はＦｃ又は重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された、（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のうち少なくとも１つ；又は
（ｉｖ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結された、（ｉ）及び／又は（ｉｉ）のうち少なくとも１つ
である。
【００９６】
本開示の別の例において、ＶＬ及びＶＨは別々のポリペプチド鎖中に存在する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トライアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ’）２；
（ｖｉ）Ｆｖ；又は
（ｖｉｉ）重鎖定常領域又はＦｃ又は重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／又はＣＨ３に連結された、（ｉ）〜（ｖｉ）のうち少なくとも１つ、
（ｖｉｉｉ）免疫エフェクター細胞に結合するタンパク質に連結された、（ｉ）〜（ｖｉ）のうち少なくとも１つ
である。
【００９７】
本開示の１つの例示的な形態において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は抗体である。
【００９８】
本開示は、下記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のうちのいずれか１つを含む抗Ｆｎ１４抗体をさらに提供する。
（ｉ）配列番号１３の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号１４の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｉｉ）配列番号１５の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２２の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｉｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２３の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｉｖ）配列番号１７の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２４の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｖ）配列番号１８の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２５の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｖｉ）配列番号１９の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２６の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｖｉｉ）配列番号２０の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２７の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
（ｖｉｉｉ）配列番号２１の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２８の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
【００９９】
本開示は、配列番号１５の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２２の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版を含む抗Ｆｎ１４抗体をさらに提供する。
【０１００】
本開示は、配列番号１６の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２３の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版を含む抗Ｆｎ１４抗体をさらに提供する。
【０１０１】
本開示はまた、上述（例えば上記表中）のＶＨ及びＶＬを含むキメラ抗体であって、ＶＨはヒト重鎖定常領域に連結され、ＶＬはヒト軽鎖定常領域に連結されている、キメラ抗体を提供する。
【０１０２】
本明細書の開示に基づいて、当業者には、本開示がヒト、ヒト化、シンヒト化、キメラ及び霊長類化タンパク質を包含することが明らかとなる。
【０１０３】
本開示は、モノクローナル抗体もまた包含する。例えば、本開示は抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体であって、下記（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）のうちのいずれか１つを含む抗体を提供する。
（ｉ）配列番号１３の配列を含むＶＨ及び配列番号１４の配列を含むＶＬ
（ｉｉ）配列番号１５の配列を含むＶＨ及び配列番号２２の配列を含むＶＬ
（ｉｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨ及び配列番号２３の配列を含むＶＬ
（ｉｖ）配列番号１７の配列を含むＶＨ及び配列番号２４の配列を含むＶＬ
（ｖ）配列番号１８の配列を含むＶＨ及び配列番号２５の配列を含むＶＬ
（ｖｉ）配列番号１９の配列を含むＶＨ及び配列番号２６の配列を含むＶＬ
（ｖｉｉ）配列番号２０の配列を含むＶＨ及び配列番号２７の配列を含むＶＬ
（ｖｉｉｉ）配列番号２１の配列を含むＶＨ及び配列番号２８の配列を含むＶＬ
【０１０４】
一例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体は、化合物にコンジュゲート化される。例えば、この化合物は、放射性同位体、検出可能な標識、治療的化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象におけるＦｎ１４結合性タンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群より選択される。
【０１０５】
本開示はまた、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体をコードする単離された又は組換え核酸を提供する。
【０１０６】
本開示は、プロモーターに作動可能に連結された本開示の核酸を含む発現コンストラクトをさらに提供する。
【０１０７】
かかる発現コンストラクトはベクター（例えばプラスミド）中に存在し得る。
【０１０８】
単一ポリペプチドのＦｎ１４結合性タンパク質に関する開示の例において、発現コンストラクトは、ポリペプチド鎖をコードする核酸に連結されたプロモーターを含み得る。
【０１０９】
Ｆｎ１４結合性タンパク質を形成する複数のポリペプチドに関する例において、本開示の発現コンストラクトは、プロモーターに作動可能に連結されたポリペプチド（例えば、ＶＨを含む）のうち１つをコードする核酸と、別のプロモーターに作動可能に連結された別のポリペプチド（例えば、ＶＬを含む）をコードする核酸と、を含む。
【０１１０】
別の例において、発現コンストラクトは、例えば以下の作動可能に連結された構成要素を５’から３’の方向で含むバイシストロニックな発現コンストラクトである。
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）第１のポリペプチドをコードする核酸；
（ｉｉｉ）内部リボソーム進入部位；及び
（ｉｖ）第２のポリペプチドをコードする核酸
【０１１１】
例えば、第１のポリペプチドはＶＨを含み、第２のポリペプチドはＶＬを含むか、あるいは第１のポリペプチドはＶＬを含み、第２のポリペプチドはＶＨを含む。
【０１１２】
本開示ではまた、１つの発現コンストラクトは第１のポリペプチド（例えば、ＶＨを含む）をコードし、別の発現コンストラクトは第２のポリペプチド（例えば、ＶＬを含む）をコードする、別々の発現コンストラクトが企図されている。例えば、本開示は、
（ｉ）ポリペプチドをコードする核酸（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたＶＨを含む）を含む第１の発現コンストラクト；及び
（ｉｉ）ポリペプチドをコードする核酸（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたＶＬを含む）を含む第２の発現コンストラクト
を含む組成物であって、第１及び第２のポリペプチドが会合して、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質を形成する組成物を提供する。
【０１１３】
本開示は、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体を発現する単離された細胞、或いは本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体を発現するように遺伝子改変された組換え細胞をさらに提供する。一例において、この細胞は単離されたハイブリドーマである。別の例において、この細胞は、本開示の核酸又は本開示の発現コンストラクト、或いは
（ｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ポリペプチド（例えば、ＶＨを含む）をコードする核酸を含む第１の発現コンストラクト、及び
（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結された、ポリペプチド（例えば、ＶＬを含む）をコードする核酸を含む第２の発現コンストラクト
であって、第１及び第２のポリペプチドが会合して本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体を形成する、第１及び第２の発現コンストラクトを含む。
【０１１４】
本開示は、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体又は核酸又は発現コンストラクト又は細胞と、適切な担体と、を含む組成物をさらに提供する。一例において、この組成物は本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体を含む。
【０１１５】
一例において、上記担体は薬学的に許容可能である。
【０１１６】
本開示は、対象におけるＦｎ１４媒介性の状態を処置又は予防する方法であって、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体又は核酸又は発現コンストラクト又は細胞又は組成物を対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
【０１１７】
一例において、Ｆｎ１４媒介性の状態は、癌、転移、癌による組織浸潤、過剰な血管新生若しくは血管形成、自己免疫疾患、炎症性疾患、神経変性疾患、消耗性障害、ケロイド瘢痕、移植片対宿主病、移植片拒絶又は虚血である。
【０１１８】
一例において、Ｆｎ１４媒介性の状態は炎症性疾患又は自己免疫疾患である。一例において、この状態は、結合組織疾患（関節リウマチ、乾癬性関節炎、反応性関節炎又は痛風などの炎症性関節炎を含む）、ループス（全身性エリテマトーデスを含む）、１型糖尿病、多発性硬化症、血管炎（ウェゲナー肉芽腫症及びヘノッホ・シェーンライン症候群を含む）、腎炎（糸球体腎炎及び間質性肺炎を含む）、アテローム動脈硬化症又は目の炎症（ぶどう膜炎を含む）である。
【０１１９】
一例において、状態は心血管疾患である。
【０１２０】
一例において、Ｆｎ１４媒介性の状態は、移植片対宿主病、移植心冠動脈病変、心筋内梗塞、虚血再灌流損傷、結合組織疾患（例えば関節リウマチ）又は強皮症から選択される。
【０１２１】
本明細書中で示されるように、本発明者らは、本明細書に開示されるＦｎ１４結合性タンパク質が、対象の組織中への癌の浸潤を低減若しくは予防するのに有用であることを実証した。かかる浸潤は、癌の進行又は転移の構成要素である。したがって、一例において、Ｆｎ１４媒介性の状態は組織中への癌の浸潤である。
【０１２２】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、１ｎＭ以下、例えば０．９ｎＭ以下、例えば０．８ｎＭ以下、例えば０．７ｎＭ以下、例えば０．６ｎＭ以下のＫＤで、組換えヒトＦｎ１４に結合する。一例において、ＫＤは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する組換えヒトＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【０１２３】
一例において、ＫＤは、約０．０１ｎＭと１ｎＭとの間、例えば約０．０５ｎＭと０．９ｎＭとの間、例えば約０．０９ｎＭと０．７ｎＭとの間、例えば約０．１ｎＭと０．６ｎＭとの間である。
【０１２４】
本開示の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、組換えヒトＦｎ１４に対して、約０．５ｎＭ（例えば＋／−０．１ｎＭ）のＫＤを有する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、又はその抗原結合性ドメイン、可変領域若しくはＣＤＲを含む抗体である。
【０１２５】
本開示の別の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、組換えヒトＦｎ１４に対して、約０．２ｎＭ（例えば＋／−０．１ｎＭ）のＫＤを有する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、又はその抗原結合性ドメイン、可変領域若しくはＣＤＲを含む抗体である。
【０１２６】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５６位においてアルギニンを置換したプロリン又はアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号５２又は５４の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号５２又は５４の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号５２又は５４の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【０１２７】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５８位においてアルギニンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号５６の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって、又はファージの表面上にペプチドを発現させ、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質にファージを接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号５６の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号５６の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【０１２８】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の６０位においてヒスチジンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号６３の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号６３の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号６３の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【０１２９】
一例において、上記方法は、
（ｉ）配列番号１５の配列を含むＶＨ又はそのヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２２の配列を含むＶＬ又はそのヒト化若しくは脱免疫化版；又は
（ｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨ又はそのヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２３の配列を含むＶＬ又はそのヒト化若しくは脱免疫化版
のうちの１つ又は複数を含む抗体を投与するステップを含む。
【０１３０】
一例において、上記方法は、腫瘍を取り囲む組織中への腫瘍の浸潤を低減する。一例において、この方法は骨格筋中への腫瘍の浸潤を低減する。
【０１３１】
Ｆｎ１４結合性タンパク質が組織浸潤を低減する能力を考慮すると、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、腫瘍転移を低減又は予防するためにも有用である。したがって、本開示は、癌に罹患している対象における転移を予防する又は転移の危険性を低減する方法であって、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体又は核酸又は発現コンストラクト又は細胞又は組成物を対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
【０１３２】
本明細書中で示されるように、本発明者らは、本明細書に開示されるＦｎ１４結合性タンパク質が、対象における癌（例えば結腸癌）を処置するために有用であることを実証した。
【０１３３】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、０．４ｎｍ、例えば０．３ｎＭ以下、例えば０．２５ｎＭ以下のＫＤで、組換えヒトＦｎ１４に結合する。一例において、ＫＤは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対するヒト組換えＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。
【０１３４】
一例において、ＫＤは、約０．０１ｎＭと０．３ｎＭとの間、例えば約０．０５ｎＭと０．２５ｎＭとの間である。
【０１３５】
本開示の別の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、組換えヒトＦｎ１４に対して、約０．２ｎＭ（例えば＋／−０．１ｎＭ）のＫＤを有する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、又はその抗原結合性ドメイン、可変領域若しくはＣＤＲを含む抗体である。
【０１３６】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５６位においてアルギニンを置換したプロリン又はアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号５２又は５４の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号５２又は５４の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号５２又は５４の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【０１３７】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５８位においてアルギニンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号５６の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって、又はファージの表面上にペプチドを発現させ、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質にファージを接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号５６の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号５６の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【０１３８】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の６０位においてヒスチジンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号６３の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号６３の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号６３の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【０１３９】
一例において、上記方法は、
（ｉ）配列番号１５の配列を含むＶＨ又はそのヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２２の配列を含むＶＬ又はそのヒト化若しくは脱免疫化版；又は
（ｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨ又はそのヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２３の配列を含むＶＬ又はそのヒト化若しくは脱免疫化版
のうちの１つ又は複数を含む抗体を投与するステップを含む。
【０１４０】
本開示は、医薬において使用するための本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体又は核酸又は発現コンストラクト又は細胞又は組成物をさらに提供する。
【０１４１】
本開示は、Ｆｎ１４媒介性の状態の処置又は予防において使用するための、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体又は核酸又は発現コンストラクト又は細胞又は組成物をさらに提供する。一例において、Ｆｎ１４媒介性の状態は癌転移又は腫瘍浸潤である。
【０１４２】
本開示は、医薬における本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体又は核酸又は発現コンストラクト又は細胞又は組成物の使用をさらに提供する。
【０１４３】
本開示は、Ｆｎ１４媒介性の状態の処置又は予防のための医薬品の製造における、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体又は核酸又は発現コンストラクト又は細胞の使用をさらに提供する。一例において、Ｆｎ１４媒介性の状態は癌転移又は腫瘍浸潤である。
【０１４４】
本開示は、サンプル中のＦｎ１４を検出する方法であって、抗原−タンパク質複合体が形成するように、サンプルを本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体と接触させるステップ、及び複合体を検出するステップを含み、複合体の検出はサンプル中のＦｎ１４を示す、方法をさらに提供する。一例において、サンプルはＦｎ１４媒介性の状態に罹患している対象由来である。
【０１４５】
本開示は、対象においてＦｎ１４媒介性の状態を診断する方法であって、対象由来のサンプル中のＦｎ１４を検出するために本明細書に記載の方法を実施するステップを含み、サンプル中でのＦｎ１４の検出は該状態を示す、方法をさらに提供する。
【０１４６】
一例において、上記方法は、サンプル中のＦｎ１４のレベルを決定するステップを含み、コントロールサンプルと比較したサンプル中の増加又は減少したレベルのＦｎ１４は該状態を示す。
【０１４７】
本開示は、Ｆｎ１４媒介性の状態を限局化及び／又は検出及び／又は診断及び／又は予後判定する方法であって、存在する場合にはＦｎ１４に結合した本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで検出するステップを含み、Ｆｎ１４結合性タンパク質又は抗体は検出可能なタグにコンジュゲート化されている、方法をさらに提供する。
【０１４８】
一例において、上記方法は、結合性分子を対象に投与するステップをさらに含む。
【０１４９】
本明細書に記載される処置／予防／診断／予後判定の任意の方法の一例において、Ｆｎ１４媒介性の状態は、癌、転移、過剰な血管新生若しくは血管形成、自己免疫疾患、炎症性疾患、神経変性疾患、消耗性障害又は虚血である。
【０１５０】
本明細書中で説明されるように、本発明者らは、Ｆｎ１４に結合するＦｎ１４結合性タンパク質を用いて、状態に関連する消耗性障害を処置又は予防できることもまた明らかにした。したがって、本開示は、状態に関連する消耗性障害を処置又は予防する方法であって、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質を対象に投与するステップを含む方法をさらに提供する。
【０１５１】
一例において、消耗性障害は、意図しない体重喪失、悪液質、前悪液質、筋肉消耗及び脂肪消耗からなる群より選択される。例えば、消耗性障害は悪液質である。
【０１５２】
一例において、消耗性障害は、癌、代謝性アシドーシス、感染性疾患、糖尿病、自己免疫性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、自己免疫障害、薬物に対する嗜癖、肝臓の硬変症、慢性炎症障害、食欲不振、慢性心不全、慢性腎疾患、骨粗鬆症、骨格筋疾患、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、筋萎縮症及び神経変性疾患からなる群より選択される状態に関連する。
【０１５３】
一例において、消耗性障害は悪液質、前悪液質又は筋肉減少症（例えば、加齢に関連する筋肉消耗）である。
【０１５４】
一例において、消耗性障害は悪液質である。
【０１５５】
一例において、悪液質は、癌、感染性疾患（例えば、結核又はハンセン病）、ＡＩＤＳ、自己免疫疾患（関節リウマチ又は１型糖尿病を含む）、嚢胞性線維症、薬物嗜癖、アルコール中毒又は肝硬変症に関連する。
【０１５６】
一例において、悪液質は、関節リウマチ、糖尿病、心疾患、慢性腎疾患、慢性肺炎症、小腸炎症、炎症性腸疾患、加齢、敗血症又はＡＩＤＳから選択される状態に関連する。
【０１５７】
本開示の１つの例示的な形態において、消耗性障害は癌に関連する悪液質である。固形腫瘍、細胞腫、神経腫、黒色腫、白血病、リンパ腫、肉腫、線維腫、甲状腺癌、膀胱癌、肺癌、芽腫、骨癌、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、神経上皮腫瘍、子宮内膜癌、子宮内膜子宮癌、卵管癌、腎臓癌、口腔癌、骨髄腫、新生物、神経鞘腫、神経芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌又は腎細胞癌を含む多数の型の癌が悪液質に関連する。さらなる癌が本明細書に記載される。
【０１５８】
本開示の１つの例示的な形態において、消耗性障害は糖尿病に関連する悪液質である。
【０１５９】
本明細書中で説明されるように、本発明者らは、消耗性障害に関連する状態によって影響される組織上のＦｎ１４を接触させることによって消耗性障害（例えば筋肉消耗（例えば悪液質））を処置できることもまた明らかにした。例えば、本発明者らは、癌上のＦｎ１４を接触させることによって筋肉消耗を処置できることを見出した。したがって、いくつかの例において、本開示の方法は、消耗性疾患に関連する状態によって影響される組織中のＦｎ１４に結合するのに有効な量のＦｎ１４結合性タンパク質を投与するステップであって、前記組織は筋肉組織ではない、ステップを含む。癌に関連する悪液質の場合、この方法は、癌細胞上のＦｎ１４に結合するのに有効な量のＦｎ１４結合性タンパク質を投与するステップを含む。
【０１６０】
いくつかの例において、本開示の方法は、消耗性疾患に関連する状態によって影響される組織中のＦｎ１４に結合するのに有効な時間にわたり及び有効な条件下でＦｎ１４結合性タンパク質を投与するステップであって、前記組織は筋肉組織ではない、ステップを含む。癌に関連する悪液質の場合、この方法は、癌細胞上のＦｎ１４に結合するのに有効な時間にわたり及び有効な条件下でＦｎ１４結合性タンパク質を投与するステップを含む。
【０１６１】
一例において、本開示の方法は、消耗性障害に関連する状態に罹患している対象にＦｎ１４結合性タンパク質を投与するステップであって、前記状態は、Ｆｎ１４を発現する細胞に関連している又はＦｎ１４を発現する細胞によって引き起こされる、ステップを含む。例えば、この方法は、癌悪液質に罹患している対象にＦｎ１４結合性タンパク質を投与するステップであって、対象はＦｎ１４を発現する癌に罹患している、ステップを含む。
【０１６２】
一例において、本開示の方法は、Ｆｎ１４を発現する細胞に関連する又はＦｎ１４を発現する細胞によって引き起こされる状態に関連する消耗性障害に罹患している対象を選択するステップをさらに含む。例えば、この方法は、癌悪液質に罹患している対象を選択するステップであって、対象はＦｎ１４を発現する癌に罹患している、ステップをさらに含む。
【０１６３】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質はＴｗｅａｋ媒介性のＦｎ１４シグナル伝達を調整する。
【０１６４】
例えば、本発明者らは、Ｔｗｅａｋ媒介性のＮＦκＢシグナル伝達をアンタゴナイズする抗体が本開示の方法において有用であることを示した。一例において、上記Ｆｎ１４結合性タンパク質は本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体である。
【０１６５】
本発明者らは、Ｔｗｅａｋ媒介性のＩＬ−８分泌をアンタゴナイズ又はアゴナイズする抗体が、本開示の方法において有用であることもまた示した。本発明者らは、遅いオフレート及び高い親和性解離定数を有する抗体が、本開示の方法において有用であることを示した。かかる抗体は他の抗Ｆｎ４抗体と比較して優れた効果を提供することが本明細書中で示されている。
【０１６６】
例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、１ｎＭ以下、例えば０．９ｎＭ以下、例えば０．８ｎＭ以下、例えば０．７ｎＭ以下、例えば０．６ｎＭ以下のＫＤで、組換えヒトＦｎ１４に結合する。一例において、ＫＤは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対するヒト組換えＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。さらなる例示的なＫＤ値が本明細書に記載され、このＫＤ値は、本開示のこの例に対して変更すべき変更を適用すると解釈すべきである。
【０１６７】
別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、約８×１０−４ｓ−１以下、例えば５×１０−４ｓ−１以下、例えば４×１０−４ｓ−１以下、例えば２×１０−４ｓ−１以下のＫｄで、組換えヒトＦｎ１４に結合する。一例において、Ｋｄは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対する組換えヒトＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。さらなる例示的なＫｄ値が本明細書に記載され、このＫｄ値は、本開示のこの例に対して変更すべき変更を適用すると解釈すべきである。
【０１６８】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５６位においてアルギニンを置換したプロリン又はアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号５２又は５４の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号５２又は５４の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号５２又は５４の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【０１６９】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５８位においてアルギニンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号５６の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって、又はファージの表面上にペプチドを発現させ、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質にファージを接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号５６の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号５６の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【０１７０】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の６０位においてヒスチジンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号６３の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号６３の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号６３の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【０１７１】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、
（ｉ）配列番号１５の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２２の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版；又は
（ｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２３の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
のうちの１つ又は複数を含む抗体である。
【０１７２】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号１５の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２２の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版を含む抗体である。
【０１７３】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号１６の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２３の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版を含む抗体である。
【０１７４】
一例において、対象の体重及び／又は総体的健康は、Ｆｎ１４結合性タンパク質の投与の少なくとも１週間以内に増加する。
【０１７５】
一例において、対象の体重及び／又は総体的健康は、Ｆｎ１４結合性タンパク質の投与の少なくとも１日又は２日又は３日又は４日又は５日又は６日以内に増加する。
【０１７６】
一例において、対象の体重及び／又は総体的健康は、Ｆｎ１４結合性タンパク質の投与の少なくとも１週間又は２週間又は３週間又は４週間又は５週間又は６週間以内に増加する。
【０１７７】
別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質が投与される対象は、Ｆｎ１４結合性タンパク質が投与されない消耗性障害に罹患している対象よりも体重喪失が少ない。
【０１７８】
さらなる例において、対象の体重は、Ｆｎ１４結合性タンパク質の投与後少なくとも７日間にわたり、検出可能に増加したままである。
【０１７９】
なおさらなる例において、対象の体重は、Ｆｎ１４結合性タンパク質の投与の少なくとも約７日後の時点で、Ｆｎ１４結合性タンパク質の投与前の体重を顕著に下回るレベルまでは低減されない。
【０１８０】
別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質の投与は、Ｆｎ１４結合性タンパク質が投与されていない消耗性障害に罹患している対象又は対象の集団と比較して、対象の寿命を延長する。これに関して、対象の集団と比較した場合、寿命の延長は、その集団についての寿命の平均又は中央値の期間と比較され得る。
【０１８１】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質の投与は、Ｆｎ１４結合性タンパク質が投与されていない消耗性障害に罹患している対象又は対象の集団と比較して、Ｆｎ１４結合性タンパク質が投与される対象又は対象の集団の寿命を顕著に延長する。
【０１８２】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質の投与は、Ｆｎ１４結合性タンパク質が投与されていない消耗性障害に罹患している対象又は対象の集団と比較して、消耗に関連する障害に対する１つ又は複数のさらなる処置を許容するのに十分な時間にわたってＦｎ１４結合性タンパク質が投与される対象の寿命を延長する。
【０１８３】
一例において、対象の寿命は、少なくとも約１か月又は６か月又は２４か月延長される。
【０１８４】
一例において、対象の寿命は、対象が本明細書に記載の処置を受けている間に延長される。
【０１８５】
別の例において、対象の寿命は、Ｆｎ１４結合性タンパク質が投与されていない消耗性障害に罹患している対象又は対象の集団の寿命の期間の１％又は５％又は１０％又は２０％又は４０％分延長される。
【０１８６】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与される。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、１ｍｇ／ｋｇと１５ｍｇ／ｋｇとの間、例えば２ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇとの間の用量で投与される。
【０１８７】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は少なくとも約２ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ又は４ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇ又は６ｍｇ／ｋｇ又は７ｍｇ／ｋｇ又は８ｍｇ／ｋｇ又は９ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、２ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間、例えば３ｍｇ／ｋｇと１５ｍｇ／ｋｇとの間、例えば５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇとの間（包含的）の用量で投与される。一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１８８】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は複数の用量で投与される。
【０１８９】
例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、少なくとも２週間又は３週間又は４週間にわたり、週に２回投与される。
【０１９０】
別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、各々が少なくとも約７日間又は１４日間又は２１日間又は２８日間又は丸１か月離れた複数の用量で投与される。
【０１９１】
さらなる例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は負荷用量及び維持用量で投与される。例えば、この負荷用量は約０．５ｍｇ／ｋｇと２ｍｇ／ｋｇとの間（例えば、０．５ｍｇ／ｋｇと１ｍｇ／ｋｇとの間）であり、維持用量は約２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約３ｍｇ／ｋｇと約１５ｍｇ／ｋｇとの間、例えば約５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇとの間（包含的））である。一例において、この負荷用量は約０．５ｍｇ／ｋｇ又は１ｍｇ／ｋｇの用量であり、維持用量は約５ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇである。この投与計画はステップアップ投与計画とも呼ばれる。
【０１９２】
一例において、維持用量は、負荷用量の投与の約５日後又は６日後又は７日後又は８日後に投与される。例えば、維持用量は負荷用量の投与の約７日後に投与される。
【０１９３】
一例において、処置の方法は、Ｆｎ１４結合性タンパク質を投与するステップの前に対象の体重を測定するステップと、約３０日以内に約５％より多く対象の体重が減退した場合にＦｎ１４結合性タンパク質を投与するステップと、をさらに含む。
【０１９４】
別の例において、上記方法は、Ｆｎ１４結合性タンパク質の用量を投与するステップの前に対象の体重を測定するステップと、Ｆｎ１４結合性タンパク質の以前の用量の投与以来およそ１％より多く対象の体重が減退した場合にＦｎ１４結合性タンパク質を投与するステップと、をさらに含む。
【０１９５】
なおさらなる例において、上記方法は、対象の悪液質を評価するステップをさらに含む。例えば、対象の悪液質は、対象の総体重、除脂肪体重及び／又は肥満度指数を測定することによって評価される。一例において、対象の総体重、除脂肪体重及び／又は肥満度指数の測定値は、対象の腫瘍の推定重量及び／又は血管外液収集物を含まない。
【０１９６】
一例において、上記方法は、消耗性障害に関連する障害を処置するステップをさらに含む。
【０１９７】
一例において、上記方法は、悪液質に関連する癌などの癌を処置するステップをさらに含む。例えば、この処置は抗癌薬物又は放射線治療の投与を含む。
【０１９８】
一例において、消耗性障害に関連する癌又は障害に対する処置は、Ｆｎ１４結合性タンパク質を投与するのと同時に又はＦｎ１４結合性タンパク質を投与した後に、実施又は投与される。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質が少なくとも１回投与され、対象の体重を、消耗性障害に関連する癌又は障害に対する処置を実施又は投与する前に増加させる。
【０１９９】
本開示は、状態に関連する消耗性障害を処置又は予防する際に使用するための、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質もまた提供する。
【０２００】
本開示は、状態に関連する消耗性障害を処置又は予防するための医薬品の製造における、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質の使用もまた提供する。
【０２０１】
本発明者らは、本明細書に開示されるＦｎ１４結合性タンパク質が、対象の筋肉中への腫瘍の浸潤を低減又は予防するのに有用であることを示した。したがって、本開示の１つの特定の例は、癌に罹患している対象の筋肉中への腫瘍浸潤を低減又は予防する方法であって、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質を対象に投与するステップを含み、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｆｎ１４を発現する細胞においてＴｗｅａｋ活性を中和する、方法を提供する。
【０２０２】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｆｎ１４を発現する細胞においてＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達を低減する。
【０２０３】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｆｎ１４を発現する細胞においてＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達を低減し、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｔｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４を発現する細胞と接触した場合にはＮＦκＢシグナル伝達を検出可能には誘導しない。
【０２０４】
一例において、上記方法は、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体を投与するステップを含む。一例において、上記方法は、
（ｉ）配列番号１５の配列を含むＶＨ又はそのヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２２の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版；又は
（ｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨ又はそのヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２３の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
のうちの１つ又は複数を含む抗体を投与するステップを含む。
【０２０５】
一例において、上記方法は、腫瘍を取り囲む組織中への腫瘍の浸潤を低減する。一例において、上記方法は骨格筋中への腫瘍の浸潤を低減する。
【０２０６】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、腫瘍の処置と同時又は腫瘍の処置の前に投与される。かかる処置は、腫瘍の処置により誘導され得る又は腫瘍の処置に関連し得る転移を低減するのに有用である。
【０２０７】
本開示は、筋肉中への腫瘍浸潤を処置又は予防する際に使用するための、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質もまた提供する。
【０２０８】
本開示は、筋肉中への腫瘍浸潤を処置又は予防するための医薬品の製造における、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質の使用もまた提供する。
【０２０９】
本発明者らはまた、Ｔｗｅａｋ媒介性のＮＦκＢシグナル伝達をアンタゴナイズする抗体が、グルコース代謝障害（例えば、１型糖尿病などの糖尿病）を処置又は予防するのに有用であることを示した。一例において、上記Ｆｎ１４結合性タンパク質は本開示のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体である。
【０２１０】
本発明者らは、Ｔｗｅａｋ媒介性のＩＬ−８分泌をアンタゴナイズ又はアゴナイズする抗体が、本開示の方法において有用であることもまた示した。本発明者らは、遅いオフレート及び高い親和性解離定数を有する抗体が、本開示の方法において有用であることを示した。かかる抗体は他の抗Ｆｎ４抗体と比較して優れた効果を提供することが本明細書中で示されている。
【０２１１】
例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、１ｎＭ以下、例えば０．９ｎＭ以下、例えば０．８ｎＭ以下、例えば０．７ｎＭ以下、例えば０．６ｎＭ以下又は０．３ｎＭ以下又は０．２５ｎＭ以下のＫＤで、組換えヒトＦｎ１４に結合する。一例において、ＫＤは、Ｆｎ１４結合性タンパク質（例えば、Ｆａｂ又は抗体）を固定化し、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に対するヒト組換えＦｎ１４の結合を、表面プラズモン共鳴を用いて評価することによって評価される。さらなる例示的なＫＤ値が本明細書に記載され、このＫＤ値は、本開示のこの例に対して変更すべき変更を適用すると解釈すべきである。
【０２１２】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５６位においてアルギニンを置換したプロリン又はアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号５２又は５４の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号５２又は５４の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号５２又は５４の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【０２１３】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の５８位においてアルギニンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号５６の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって、又はファージの表面上にペプチドを発現させ、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質にファージを接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号５６の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号５６の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＣＲＣＢＴ−０６−００５と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【０２１４】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号１の６０位においてヒスチジンを置換したアラニンを含むＦｎ１４の細胞外ドメインに結合する。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、このＦｎ１４結合性タンパク質が（例えば、配列番号２の配列を含む）Ｆｎ１４の細胞外ドメインに結合するのと類似又は実質的に同じレベルで、配列番号６３の配列からなり、末端に６つのヒスチジン残基を任意選択でさらに含むペプチドに結合する。一例において、結合のレベルは、ペプチドを固定化し、このペプチドをＦｎ１４結合性タンパク質と接触させることによって評価される。かかる結合特徴を有する本明細書に記載の例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体の可変領域及び／又はＣＤＲを含む。したがって、一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体と類似又は実質的に同じレベル或いはＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体と類似又は実質的に同じ親和性で、配列番号６３の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに結合する。別の例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号６３の配列からなる（末端にさらなる６つのヒスチジン残基を任意選択で有する）ペプチドに対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２と称される抗体の結合を競合的に阻害する。
【０２１５】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、
（ｉ）配列番号１５の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２２の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版、又は
（ｉｉ）配列番号１６の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２３の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版
のうちの１つ又は複数を含む抗体である。
【０２１６】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号１５の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２２の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版を含む抗体である。
【０２１７】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、配列番号１６の配列を含むＶＨ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版及び配列番号２３の配列を含むＶＬ又はそのヒト化、シンヒト化若しくは脱免疫化版を含む抗体である。
【０２１８】
本発明者らはまた、癌悪液質などの消耗性障害のモデルを生成した。したがって、本開示はまた、腫瘍細胞を含む非ヒト哺乳動物であって、腫瘍細胞は組換えヒトＦｎ１４を異所的に発現することが可能であり、非ヒト哺乳動物は消耗性障害を発症する、動物を提供する。本開示はまた、組換えヒトＦｎ１４を異所的に発現することが可能な腫瘍細胞を提供する。
【０２１９】
本開示はまた、消耗性障害の非ヒト動物モデルを生成する方法であって、Ｆｎ１４が発現され、消耗性障害が発症するのに十分な条件下で、組換えヒトＦｎ１４を発現する腫瘍細胞を非ヒト哺乳動物に投与するステップを含む方法を提供する。
【０２２０】
一例において、Ｆｎ１４は誘導的に発現される。例えば、Ｆｎ１４をコードする核酸は、４−ヒドロキシタモキシフェンによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
【０２２１】
一例において、Ｆｎ１４は構成的に発現される。
【０２２２】
一例において、腫瘍細胞は、ｖ１２Ｈｒａｓを発現するように遺伝子改変された線維芽細胞である。
【０２２３】
本発明者らは、癌悪液質などの消耗性状態における化合物の影響を評価するための実験においてコントロールとして有用なＦｎ１４の非シグナル伝達形態もまた生成した。非シグナル伝達融合タンパク質を発現する腫瘍細胞が投与された動物は癌を発症するが、消耗性状態は発症しない。
【０２２４】
一例において、本開示は、Ｆｎ１４の細胞外領域及び受容体のグリコシル−ホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩ）領域を含むが、受容体の細胞質ゾル領域を欠く融合タンパク質を提供する。例えば、この融合タンパク質は、細胞において発現される場合にはＴｗｅａｋシグナル伝達を媒介しない。
【０２２５】
本開示はまた、Ｆｎ１４の細胞外領域及び受容体のグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩ）領域を含むが、受容体の細胞質ゾル領域を欠く融合タンパク質を発現する組換え細胞であって、融合タンパク質は該細胞においてＴｗｅａｋシグナル伝達を媒介しない、組換え細胞を提供する。
【０２２６】
一例において、Ｆｎ１４の細胞外領域はヒトＦｎ１４の細胞外領域である。
【０２２７】
一例において、このＧＰＩ領域はＴｒａｉｌ受容体３由来である。
【０２２８】
例えば、この融合タンパク質は配列番号３６の配列又は配列番号３６の残基２８〜１２６の間の配列を含む。
【０２２９】
本開示はまた、消耗性障害の処置のための化合物を同定する方法であって、
（ｉ）この化合物を、本明細書に記載される消耗性障害の非ヒト哺乳動物モデルに投与し、Ｆｎ１４の発現を誘導し（必要な場合）、消耗性障害のレベルを決定するステップ、及び
（ｉｉ）（ｉ）における消耗性障害のレベルを、Ｆｎ１４の細胞外領域及び受容体のグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩ）領域を含むが、受容体の細胞質ゾル領域を欠く融合タンパク質を発現する細胞が投与された非ヒト哺乳動物における消耗性障害のレベルと比較し、消耗性障害のレベルを決定するステップ
を含み、（ｉｉ）と比較した（ｉ）における消耗性障害の類似のレベルは、この化合物が消耗性障害を処置するのに有用であることを示す、方法を提供する。
【０２３０】
本開示はまた、消耗性障害の処置のための化合物を同定する方法であって、
（ｉ）この化合物を、本明細書に記載される消耗性障害の非ヒト哺乳動物モデルに投与し、Ｆｎ１４の発現を誘導し（必要な場合）、消耗性障害のレベルを決定するステップ、及び
（ｉｉ）非ヒト哺乳動物に、Ｆｎ１４の細胞外領域及びグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩ）領域を含む融合タンパク質を発現する細胞を投与し、消耗性障害のレベルを決定するステップ
を含み、（ｉｉ）と比較した（ｉ）における消耗性障害の類似のレベルは、この化合物が消耗性障害を処置するのに有用であることを示す、方法を提供する。
【０２３１】
一例において、Ｆｎ１４の細胞外領域及びグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩ）領域を含む融合タンパク質を発現し、消耗性障害のレベルを決定する非ヒト哺乳動物にも上記化合物が投与される。
【０２３２】
一例において、上記方法は、化合物を単離するステップ又は化合物の構造を提供するステップをさらに含む。
【０２３３】
一例において、上記化合物は、抗Ｆｎ１４抗体の抗原結合性ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１】Ｆｉｇｕｒｅ  １は、ｈＦｎ１４の細胞外ドメインを含む組換えタンパク質で免疫したマウス由来の血清のスクリーニングの結果を示す一連のグラフである。パネルＡは、ヒトＦｎ１４を発現する生きたＭＥＦｖ１２Ｈｒａｓ細胞（＋／−  ４−ＯＨＴ誘導）を免疫マウス由来の血清で染色し、引き続いてフローサイトメトリーで分析したアッセイの結果を示す。ヒストグラムトレース：点線のトレースは、誘導していない細胞に対する染色を示し、実線のトレースは、誘導された細胞に対する染色を示す。パネルＡ  ｉは、すべてのサンプルの分析のために側方散乱及び前方散乱でゲートをかけた細胞集団を示す。パネルＡ  ｉｉは未染色の細胞を示し、パネルＡ  ｉｉｉ及びｉｖは、２匹の非免疫マウス由来の血清で染色した細胞を示し、パネルＡ  ｖ及びｖｉは、それぞれＰＢＳ又はアジュバント中の無関係の抗原で免疫した２匹のマウス由来の血清を示す。パネルＡ  ｖｉｉは抗ｈＦｎ１４陽性コントロールを示す。パネルＢは、図に示されるようにＰＢＳ又はアジュバント中に懸濁した細胞で免疫したマウス由来の血清を使用した結果を示し（マウス＃１３１８〜１３２３）、点線の四角は、ｈＦｎ１４に対する陽性の免疫応答を示すマウス由来の血清を示す。すべての血清サンプルを、染色のために１：５０希釈で使用した。
【図２】Ｆｉｇｕｒｅ  ２は、ヒトＤ６４５細胞に対する、組換えＦｎ１４−Ｆｃで免疫したマウス由来の血清のスクリーニングの結果を示す一連のグラフである。パネルＡは、マウス血清又はコントロールで染色した生きたＤ６４５ヒト神経膠腫細胞を用い、フローサイトメトリーで分析したスクリーニングの結果を示す。点線のヒストグラムトレースは染色されていない細胞を示し、実線のトレースは染色された細胞を示す。パネルＡ  ｉは、すべてのサンプルの分析のためにゲートをかけた細胞集団を示し、パネルｉｉは未染色の細胞を示し、パネルｉｉｉは抗ｈＦｎ１４陽性コントロールを示す。パネルｉｖ及びｖは、２匹の非免疫マウス由来の血清で染色した細胞を示す。パネルｖｉ及びｖｉｉは、それぞれアジュバント又はＰＢＳ中の無関係の抗原で免疫した２匹のマウス由来の血清を示す。パネルＢは、図に示されるようにアジュバント又はＰＢＳ中のｈＦｎ１４の細胞外ドメインを含む組換えタンパク質で免疫したマウス由来の血清を示し（マウス＃１３１８〜１３２３）、点線の四角は、陽性の免疫応答を有するマウスを示す。すべての血清サンプルを、染色のために１：５０希釈で使用した。
【図３】Ｆｉｇｕｒｅ  ３は、ヒトＦｎ１４を発現した細胞表面を特異的に認識するモノクローナル抗体の検出を示す一連のグラフである。ヒトＦｎ１４誘導性ＭＥＦｖ１２Ｈｒａｓ細胞（図に示されるように＋／−  ４−ＯＨＴ）を、コントロール抗体（パネルＡ）、又はハイブリドーマの選択のためにハイブリドーマ上清（パネルＢ）、又はクローンＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴ−０６−００４由来のハイブリドーマ上清（パネルＣ）で染色した。実線のトレースは細胞の上清染色を示し、点線のトレースは、コントロールとして二次抗体単独染色のオーバーレイを示す（パネルＡから）。
【図４】Ｆｉｇｕｒｅ  ４は、ＮＦκＢ活性化に対する抗ｈＦｎ１４陽性モノクローナル抗体の影響を示す一連のグラフである。ＧＦＰレポーターに作動可能に連結されたＮＦκＢ応答性プロモーターを保有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃ（図に示された濃度）、及びコントロール抗体（パネルＡ）又は親ハイブリドーマクローン由来の上清（パネルＢ）又は変動する濃度の精製されたモノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１（パネルＣ）のいずれかの存在／非存在下で２４時間インキュベートした。細胞を収集し、ＧＦＰ蛍光をフローサイトメトリーによって評価した。すべての上清を、このアッセイのために１：１０希釈した。比較のために、点線のトレースオーバーレイは、細胞単独又は各濃度におけるＴｗｅａｋ−Ｆｃのみの存在下を示す。Ｓｐｎ／ｔ：上清。
【図５】Ｆｉｇｕｒｅ  ５は、ｈＦｎ１４を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で免疫したマウス由来の血清のスクリーニングからの結果を示す一連のグラフである。ヒトＦｎ１４を発現する生きたＭＥＦｖ１２Ｈｒａｓ細胞（＋／−  ４−ＯＨＴ誘導）を、１：１の比率で混合し、コントロール（パネルＡ）又は免疫マウス（パネルＢ）由来の血清を用いて染色した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。点線のヒストグラムトレースは、比較のために、無関係の抗原を発現する細胞で免疫したマウス由来の血清による細胞の染色を示す。パネルＡ  ｉ及びｉｉは、他の無関係のヒトタンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で免疫したマウス由来の血清による細胞の染色を示し、パネルＡ  ｉｉｉは抗ｈＦｎ１４陽性コントロールを示し、パネルＡ  ｉｖは二次抗体単独で染色した細胞を示す。パネルＢ：図に示されるようにＰＢＳ又はアジュバント中に懸濁されたｈＦｎ１４を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞で免疫したマウス由来の血清（マウス＃３１〜３６）；二重ピークの出現に基づいて評価した陽性応答（点線の四角によって示される）。
【図６Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ａは、Ｔｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢ活性化に対する精製されたＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴ−０６−００４の影響を示す一連のグラフである。ＧＦＰレポーターに作動可能に連結されたＮＦκＢ応答性プロモーターを保有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃ（図に示された濃度）及び精製された抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３又はＣＲＣＢＴ−０６−００４の存在／非存在下で２４時間インキュベートした。細胞を収集し、ＧＦＰ蛍光をフローサイトメトリーによって評価した。すべての上清を、このアッセイのために１：５０希釈した。比較のために、点線のトレースオーバーレイは、（Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ｃ  パネルｉに示される）細胞単独又はＴｗｅａｋ−Ｆｃのみの存在下を示す。
【図６Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ｂは、Ｔｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢ活性化に対する精製された陰性コントロール抗体の影響を示す一連のグラフである。ＧＦＰレポーターに作動可能に連結されたＮＦκＢ応答性プロモーターを保有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃ（図に示された濃度）及び精製されたコントロール抗体の存在／非存在下で２４時間インキュベートした。細胞を収集し、ＧＦＰ蛍光をフローサイトメトリーによって評価した。比較のために、点線のトレースオーバーレイは、（Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ｃ  パネルｉに示される）細胞単独又はＴｗｅａｋ−Ｆｃのみの存在下を示す。
【図６Ｃ】Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ｃは、Ｔｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢ活性化に対する（図に示された）コントロールの影響を示す一連のグラフである。ＧＦＰレポーターに作動可能に連結されたＮＦκＢ応答性プロモーターを保有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃ（図に示された濃度）及びコントロールの存在／非存在下で２４時間インキュベートした。細胞を収集し、ＧＦＰ蛍光をフローサイトメトリーによって評価した。すべての上清を、このアッセイのために１：５０希釈した。比較のために、点線のトレースオーバーレイは、（パネルｉに示される）細胞単独又はＴｗｅａｋ−Ｆｃのみの存在下を示す。
【図７Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  ７Ａは、Ｔｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢ活性化に対する精製されたＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６、ＣＲＣＢＴ−０６−００７、ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−２の影響を示す一連のグラフである。ＧＦＰレポーターに作動可能に連結されたＮＦκＢ応答性プロモーターを保有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ又は２００ｎｇ／ｍｌ）、及び細胞単独、アイソタイプコントロールＩｇＧ２ｂ（破線のトレース）、精製されたＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６又はＣＲＣＢＴ−０６−００７（実線のトレース；示された濃度）のいずれかの存在／非存在下で２４時間インキュベートした。細胞を収集し、ＧＦＰ蛍光をフローサイトメトリーによって評価した。
【図７Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  ７Ｂは、Ｔｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢ活性化に対する精製されたＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−２の影響を示す一連のグラフである。ＧＦＰレポーターに作動可能に連結されたＮＦκＢ応答性プロモーターを保有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ又は２００ｎｇ／ｍｌ）、及び細胞単独（抗体グラフについての下敷きとしての破線のトレース）、精製されたＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＩＴＥＭ−１又はＩＴＥＭ−２（実線のトレース；示された濃度）のいずれかの存在／非存在下で２４時間インキュベートした。細胞を収集し、ＧＦＰ蛍光をフローサイトメトリーによって評価した。
【図８】Ｆｉｇｕｒｅ  ８は、Ｔｗｅａｋ誘導性のＫｙｍ１細胞死を遮断する精製されたＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴ−０６−００４の能力を決定するためのアッセイの結果を示すグラフである。Ｋｙｍ１細胞を、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃ（図に示された濃度）及び精製された抗体（図に示された濃度）又は陽性コントロールとしてのＴｗｅａｋＲ−Ｆｃの存在／非存在下で２４時間インキュベートした。全細胞を回収し、ヨウ化プロピジウムと共にインキュベートした。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、各サンプル中の細胞死のパーセンテージとしてグラフ化した。
【図９】Ｆｉｇｕｒｅ  ９は、抗体のアゴニスト特性を評価するためのＩＬ−８分泌アッセイの結果を示すグラフである。Ａ３７５細胞を、抗体（１０、１、０．１又は０．０１μｇ／ｍｌ）の存在下で２４時間インキュベートした。細胞培養上清をＩＬ−８の量について評価した。３回の独立したバイオロジカルレプリケートで実験を実施し、結果を平均し、ＳＥＭを示すエラーバーと共にＩＬ−８（ｐｇ／ｍｌ）としてグラフ化した。
【図１０】Ｆｉｇｕｒｅ  １０は、抗体の抗体アンタゴニスト特性の決定のためのＩＬ−８分泌アッセイを示すグラフである。Ａ３７５細胞を、抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃ（３００ｎｇ／ｍｌ）の存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。細胞培養上清をＩＬ−８の量について評価した。３回の独立したバイオロジカルレプリケートで実験を実施し、結果を平均し、ＳＥＭを示すエラーバーと共にＩＬ−８（ｐｇ／ｍｌ）としてグラフ化した。
【図１１Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  １１Ａは、モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６及びＣＲＣＢＴ−０６−００７（それぞれ、００１、００２、００３、００４、００５、００６及び００７と表示する）の軽鎖可変領域の配列を示す図である。配列はアラインされている。ＣＤＲ１〜３及びフレームワーク領域１〜４が示される。Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従うＣＤＲは太字文字列で示される。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに従うＣＤＲは下線付き文字列で示される。
【図１１Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  １１Ｂは、Ｆｉｇｕｒｅ  １１Ａに示されるモノクローナル抗体（００１、００２、００．３、００４、００５及び００６と表示する）の高度に関連する軽鎖可変領域のクラスの配列を示す図である。配列はアラインされている。ＣＤＲ１〜３及び隣接領域１〜４が示される。Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従うＣＤＲは太字文字列で示される。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに従うＣＤＲは下線付き文字列で示される。コンセンサス配列もまた示され、この配列中、「Ｘ」はバリエーションの部位を示す。「Ｘ」の下には、分析された配列中のその部位に存在するすべてのアミノ酸を示す。
【図１１Ｃ】Ｆｉｇｕｒｅ  １１Ｃは、モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６及びＣＲＣＢＴ−０６−００７（それぞれ、００１、００２、００３、００４、００５、００６及び００７と表示する）の重鎖可変領域の配列を示す図である。配列はアラインされている。ＣＤＲ１〜３及び隣接領域１〜４が示される。Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従うＣＤＲは太字文字列で示される。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに従うＣＤＲは下線付き文字列で示される。
【図１１Ｄ】Ｆｉｇｕｒｅ  １１Ｄは、Ｆｉｇｕｒｅ  １１Ｃに示されるモノクローナル抗体（００１、００２、００５、００６及び００７と表示する）の高度に関連する重鎖可変領域のクラスの配列を示す図である。配列はアラインされている。ＣＤＲ１〜３及び隣接領域１〜４（Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って規定される）が示される。Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従うＣＤＲは太字文字列で示される。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに従うＣＤＲは下線付き文字列で示される。コンセンサス配列もまた示され、この配列中、「Ｘ」はバリエーションの部位を示す。「Ｘ」の下には、分析された配列中のその部位に存在するすべてのアミノ酸を示す。
【図１２Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  １２Ａは、抗Ｆｎ１４抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１が立体構造エピトープを認識することを示す一連のグラフである。パネルＡ  ｉは、ＥＬＩＳＡにより、ＣＲＣＢＴ−０６−００１がネイティブＦｎ１４に結合するが、還元及びアルキル化された（Ｒ＋Ａ）Ｆｎ１４（四角）には結合しないことを示す。パネルＡ  ｉｉは、ネイティブＦｎ１４及びＲ＋Ａ  Ｆｎ１４が抗Ｆｃ抗体に対する結合を保持していることを示し、このことは、Ｒ＋Ａ  Ｆｎ１４の完全性が保持されていることを示している。◆＝ネイティブＦｎ１４；■＝Ｒ＋Ａ  Ｆｎ１４；▲＝ブランク。
【図１２Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  １２Ｂは、Ｆｎ１４及びＲ＋Ａ  Ｆｎ１４のウエスタンブロット分析の結果を示す写真のコピーであり、Ｒ＋Ａ  Ｆｎ１４はＣＲＣＢＴ−０６−００１によって検出されないが、ネイティブＦｎ１４は強く検出されることを示す。レーン１及び２：Ｆｎ１４−Ｆｃ調製物１：レーン１＝ネイティブＦｎ１４−Ｆｃ；レーン２＝Ｒ＋Ａ  Ｆｎ１４。レーン３及び４：Ｆｎ１４−Ｆｃ調製物２：レーン３＝ネイティブＦｎ１４−Ｆｃ；レーン４＝Ｒ＋Ａ  Ｆｎ１４−Ｆｃ。Ｍ＝分子量マーカー。α−Ｆｃ＝抗Ｆｃ抗体を使用する検出。αＦｎ１４＝ＣＲＣＢＴ−０６−００１を使用する検出。
【図１２Ｃ】Ｆｉｇｕｒｅ  １２Ｃは、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６及びＣＲＣＢＴ−０６−００７が立体構造エピトープを認識することを示すグラフである。ネイティブＦｎ１４−Ｆｃ及び還元及びアルキル化されたＦｎ１４−Ｆｃに対する結合について、抗体をＥＬＩＳＡによってアッセイした。抗原を２μｇ／ｍｌでプレート上に被覆し、抗体を１μｇ／ｍｌでアッセイした。抗ヒトＦｃはＦｎ１４のＦｃ部分を認識し、このことは、Ｒ＋Ａ  Ｆｎ１４の完全性が保持されていることを示している。無関係な抗体（５Ｇ８）及び二次抗体単独（抗マウスＨＲＰ）を陰性コントロールとして使用した。
【図１３】Ｆｉｇｕｒｅ  １３は一連の図である。パネルＡは、ＣＲＣＢＴ−０６−００１に対する結合について試験したクローンの選択の配列を示す。ファージディスプレイライブラリーをパニングすることによって同定された最も短い断片（ＲＷ１２９）を、太字で強調する。パネルＢは、ＣＲＣＢＴ−０６−００１に対する、パネルＡに列挙した断片の結合を示すグラフである。
【図１４Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  １４Ａは、ファージ上でのディスプレイのためのｈＦｎ１４細胞外ドメインコンストラクトを示す一連のグラフである。パネルＡは、ファージ上にディスプレイされた次のｈＦｎ１４コンストラクトのアラインメントを示す。ｈＦｎ１４の全長細胞外ドメイン；Ｄ４５Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｍ５０Ａ及びＤ６２Ｅ変異体（すべて天然のリガンドＴｗｅａｋに対する低減された親和性を有することが知られている）；及びサブドメイン１〜３。
【図１４Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  １４Ｂは、ヒトＦｎ１４細胞外ドメイン構造のＮＭＲによって解明された溶液構造のｐｙｍｏｌ画像である（Ｈｅら、２００９から適合させた）。サブドメイン１及び２（それぞれＳＤ１及びＳＤ２）が示され、また、残基Ｋ４８、Ｄ４５、Ｍ５０及びＤ６２（これらは、Ｔｗｅａｋ結合に重要であることが知られている。）が示されている。
【図１５】Ｆｉｇｕｒｅ  １５は、ｈＦｎ１４細胞外ドメインコンストラクトが組換えＴｗｅａｋ−Ｆｃに差示的に結合することを示す一連のグラフである。パネルＡは、各正規化されたｈＦｎ１４コンストラクトのＭＡｂ  ９Ｅ１０との反応性を比較するＥＬＩＳＡの結果を示す。各ファージ調製物を１０倍段階希釈し、固相に付着したＭＡｂ  ９Ｅ１０に添加した。パネルＢは、最も高い濃度のファージの、ＭＡｂ  ９Ｅ１０及びＭＡｂ  ５Ｇ８との結合を比較する、パネルＡと同じＥＬＩＳＡの結果を示す。パネルＣは、各正規化されたファージディスプレイされたｈＦｎ１４コンストラクトの組換えＴｗｅａｋ−Ｆｃとの反応性を比較するＥＬＩＳＡの結果を示す。パネルＤは、最も高い濃度の各ファージ調製物の、組換えＴｗｅａｋ−Ｆｃ及び組換えＦｃ単独との結合を比較する、パネルＣと同じＥＬＩＳＡの結果を示す。ＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージポリクローナルＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは多重アッセイの標準偏差を示す。この図において、「ＦＮ１４外部ドメイン」又は「ＷＴ」とはｈＦｎ１４の細胞外ドメインを指す。ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピングに従う方法（方法１）。
【図１６Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  １６Ａは、ファージディスプレイされたｈＦｎ１４コンストラクトが抗Ｆｎ１４  ＭＡｂに結合することを示す一連のグラフである。ｈＦｎ１４ファージコンストラクトのレパートリーの、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴ−０６−００４との反応性を示すＥＬＩＳＡ。ＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージポリクローナルＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは多重アッセイの標準偏差を示す。この図において、「ＦＮ１４外部ドメイン」とはｈＦｎ１４の細胞外ドメインを指す。ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピングに従う方法（方法１）。
【図１６Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  １６Ｂは、ファージディスプレイされたｈＦｎ１４細胞外ドメインコンストラクトが抗Ｆｎ１４ＭＡｂに特異的に結合することを示す一連のグラフである。図に示された結果は、ｈＦｎ１４ファージコンストラクトのレパートリーの、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴ−０６−００４並びにＭＡｂ  ５Ｇ８との反応性を比較する、Ｆｉｇｕｒｅ  １６Ａと同じＥＬＩＳＡからの結果である。ＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージポリクローナルＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは多重アッセイの標準偏差を示す。この図において、「ＷＴ」とはｈＦｎ１４の細胞外ドメインを指す。
【図１７】Ｆｉｇｕｒｅ  １７は、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＩＴＥＭ−１が、４つすべてのＴｗｅａｋ変異体に良好に結合することを示す一連のグラフである。パネルＡは、ｈＦｎ１４ファージコンストラクトのレパートリーの、ＭＡｂ  ９Ｅ１０並びに抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＩＴＥＭ−１との反応性を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。ＭＡｂ  ９Ｅ１０とのおよそ等しい反応性を与えるように各ファージ調製物の濃度を調節して、各ファージ調製物中のディスプレイされたｈＦｎ１４の量を正規化した。各正規化された調製物を１０倍段階希釈し、固相に付着したＭＡｂに溶液中で添加した。ここに示されるすべてのＥＬＩＳＡは、ファージの同じ調製物を用いて同時に実施した。ＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージポリクローナルＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは多重アッセイの標準偏差を示す。パネルＢは、ファージディスプレイされたｈＦｎ１４コンストラクトのいずれも、陰性コントロールＭＡｂ  ５Ｇ８に有意に結合しないことを示す、パネルＡと同じＥＬＩＳＡの結果を示す。この図において、「ＦＮ１４」とはｈＦｎ１４の細胞外ドメインを指す。ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピングに従う方法（方法１）。
【図１８Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  １８Ａは、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体が、ｈＦｎ１４細胞外ドメインのサブドメイン２に特異的に結合することを示す一連のグラフである。ファージディスプレイされたｈＦｎ１４細胞外ドメイン、サブドメイン１（ＳＤ１）及びサブドメイン２（ＳＤ２）の、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６、ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−２との反応性を示すＥＬＩＳＡの結果が示される。ＭＡｂ  ９Ｅ１０とのおよそ等しい反応性を与えるように各ファージ調製物の濃度を調節して、各ファージ調製物中のディスプレイされたｈＦｎ１４の量を正規化した。各正規化された調製物を１０倍段階希釈し、固相に付着したＭＡｂに溶液中で添加した。ここに示されるすべてのＥＬＩＳＡは、ファージの同じ調製物を用いて同時に実施した。ＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージポリクローナルＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは多重アッセイの標準偏差を示す。この図において、「ＦＮ１４  Ｅｃｔｏ」とはｈＦｎ１４の細胞外ドメインを指す。ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピングに従う方法（方法１）。
【図１８Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  １８Ｂは、Ｆｉｇｕｒｅ  １８Ａと同じファージコンストラクトを使用するＥＬＩＳＡの結果を示す一連のグラフであり、ファージディスプレイされたｈＦｎ１４コンストラクトのいずれも陰性コントロールＭＡｂ  ５Ｇ８に有意に結合しないことを示している。Ｆｉｇｕｒｅ  １６Ａに記載された条件と類似の条件下でＥＬＩＳＡを実施した。この図において、「ＦＮ１４  Ｅｃｔｏ」とはｈＦｎ１４の細胞外ドメインを指す。
【図１９】Ｆｉｇｕｒｅ  １９は、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００７がｈＦｎ１４細胞外ドメインのサブドメイン２に特異的に結合することを示す一連のグラフである。パネルＡ：ファージディスプレイされたｈＦｎ１４細胞外ドメイン（Ｆｎ１４  Ｅｃｔｏ）、サブドメイン１（ＳＤ１）及びサブドメイン２（ＳＤ２）の、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００７との反応性を示すＥＬＩＳＡの結果が示される。ＭＡｂ  ９Ｅ１０とのおよそ等しい反応性を与えるように各ファージ調製物の濃度を調節して、各ファージ調製物中のディスプレイされたｈＦｎ１４の量を正規化した。各正規化された調製物を１０倍段階希釈し、固相に付着したＭＡｂに溶液中で添加した。ここに示されるＥＬＩＳＡは、ファージの同じ調製物を用いて同時に実施した。ＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージポリクローナルＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは多重アッセイの標準偏差を示す。パネルＢは、図のパネルＡと同じファージコンストラクトを使用するＥＬＩＳＡの結果を示し、ファージディスプレイされたｈＦｎ１４コンストラクトのいずれも、陰性コントロールＭＡｂ  ５Ｇ８に有意に結合しないことを示す。パネルＡに記載された条件と類似の条件下でＥＬＩＳＡを実施した。ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピングに従う方法（方法１）。
【図２０】Ｆｉｇｕｒｅ  ２０は一連の図である。パネルＡはＦｎ１４細胞外ドメインを示し、パネルＢはＦｎ１４サブドメイン１ｐ（ファージ上に発現されたサブドメイン１のより長い形態）を示し、パネルＣはＦｎ１４サブドメイン２を示し、パネルＤはＦｎ１４サブドメイン３を示す。パネルＥは、Ｆｎ１４  ＥＣＤ中のジスルフィド結合を形成する３番目及び６番目のシステイン残基がセリンに変異したＦｎ１４サブドメイン２（本明細書において「サブドメイン２  Ｃｙｓ  ３＆６  ΔＳ」という。）を示す。パネルＦは、Ｆｎ１４  ＥＣＤ中のジスルフィド結合を形成する４番目及び５番目のシステイン残基がセリンに変異したＦｎ１４サブドメイン２（本明細書において「サブドメイン２  Ｃｙｓ  ４＆５  ΔＳ」という。）を示す。すべてのパネルは、溶液構造に従うジスルフィド結合性を示す（Ｈｅら、２００９）。太字の大きい文字「Ｓ」は、天然に存在するシステイン残基に替わって置換されたセリン残基を示す。
【図２１Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  ２１Ａは、抗Ｆｎ１４  ｍＡｂの特異性を示すグラフである。抗Ｆｎ１４  ｍＡｂ  ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６及びＣＲＣＢＴ−０６−００７は、サブドメイン２及び３と反応性であるが、サブドメイン１とは反応性でない。コントロールペプチドに対する非常に低い反応性がすべての抗Ｆｎ１４  ｍＡｂについて観察された。このコントロールペプチドはその同族（アイソタイプコントロール）抗体とも反応性であった。
【図２１Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  ２１Ｂは、抗Ｆｎ１４  ｍＡｂ  ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６、ＣＲＣＢＴ−０６−００７及びＩＴＥＭ−１の、Ｆｎ１４のサブドメイン２を示す合成ペプチドとの反応性を示すグラフである。プレートをサブドメイン２ペプチドで被覆し、種々の希釈の抗体を結合させ、結合した抗体を、抗マウスＨＲＰ及びＴＭＢ基質を用いて検出した。重複読み取りの平均をプロットし、エラーバーは標準偏差を示す。ＥＬＩＳＡを繰り返して、一貫した結果を保証した。曲線の直線部分内の５ｎｇ／ｍｌにおける垂直線は、各ｍＡｂの反応性の比較を分析した時点である。
【図２１Ｃ】Ｆｉｇｕｒｅ  ２１Ｃは、抗Ｆｎ１４  ｍＡｂ  ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６、ＣＲＣＢＴ−０６−００７及びＩＴＥＭ−１の、Ｆｎ１４のサブドメイン３を示す合成ペプチドとの反応性を示すグラフである。プレートをサブドメイン３ペプチドで被覆し、種々の希釈の抗体を結合させ、結合した抗体を、抗マウスＨＲＰ及びＴＭＢ基質を用いて検出した。重複読み取りの平均をプロットし、エラーバーは標準偏差を示す。ＥＬＩＳＡを繰り返して、一貫した結果を保証した。
【図２２】Ｆｉｇｕｒｅ  ２２は、ファージディスプレイされたＦｎ１４の断片及びその変異体に対する、ｈＦｎ１４ファージコンストラクトの、ｍＡｂ  ９Ｅ１０コントロール（パネルｉ）、ＣＲＣＢＴ−０６−００２（パネルｉｉ）及びＩＴＥＭ−１（パネルｉｉｉ）との反応性を示すグラフである。ＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージ抗体及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは重複値の範囲を示す。ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピングに従う方法（方法１）。
【図２３−１】Ｆｉｇｕｒｅ  ２３Ａは、ＥＬＩＳＡを用いて決定された、ｈＦｎ１４の（図に示された）抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体との反応性を示すグラフである。ＨＲＰコンジュゲート化抗マウスＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。抗体濃度はμｇ／ｍｌ。
【図２３−２】Ｆｉｇｕｒｅ  ２３Ｂ及びＣは、Ｆｉｇｕｒｅ  ２３Ａと同様であるが、（図に示された）抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体に対してマウスＦｎ１４を使用するＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。抗体濃度はμｇ／ｍｌ。抗体ＣＲＣＢＴ−の結合を示す一連のグラフを含む。
【図２４−１】Ｆｉｇｕｒｅ  ２４Ａ〜Ｅは、ｈＦｎ１４変異体Ｒ５６Ｐ、Ｒ５６Ａ及びＲ５６Ｋの、抗Ｆｎ１４抗体に対する結合を示すグラフである。Ｆｉｇｕｒｅ  ２４Ａ及びＢは、ｈＦｎ１４変異体Ｒ５６Ｐの、（図に示された）抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体との反応性を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。ＨＲＰコンジュゲート化抗マウスＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。Ｆｉｇｕｒｅ  ２４Ｃ及びＤは、（図に示された）抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体に対するｈＦｎ１４変異体Ｒ５６Ａの結合を比較して実施されたＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｆｉｇｕｒｅ  ２４Ｅ及びＦは、（図に示された）抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体に対するｈＦｎ１４変異体Ｒ５６Ｋの結合を比較して実施されたＥＬＩＳＡの結果を示す。抗体濃度はμｇ／ｍｌ。
【図２４−２】Ｆｉｇｕｒｅ  ２４Ａ〜Ｅは、ｈＦｎ１４変異体Ｒ５６Ｐ、Ｒ５６Ａ及びＲ５６Ｋの、抗Ｆｎ１４抗体に対する結合を示すグラフである。Ｆｉｇｕｒｅ  ２４Ａ及びＢは、ｈＦｎ１４変異体Ｒ５６Ｐの、（図に示された）抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体との反応性を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。ＨＲＰコンジュゲート化抗マウスＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。Ｆｉｇｕｒｅ  ２４Ｃ及びＤは、（図に示された）抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体に対するｈＦｎ１４変異体Ｒ５６Ａの結合を比較して実施されたＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｆｉｇｕｒｅ  ２４Ｅ及びＦは、（図に示された）抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体に対するｈＦｎ１４変異体Ｒ５６Ｋの結合を比較して実施されたＥＬＩＳＡの結果を示す。抗体濃度はμｇ／ｍｌ。
【図２５】Ｆｉｇｕｒｅ  ２５Ａ及びＢは、（図に示された）抗Ｆｎ１４抗体に対する精製されたｈＦｎ１４変異体Ｒ５８Ａの結合を示すグラフである。ＨＲＰコンジュゲート化抗マウスＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。抗体濃度はμｇ／ｍｌ。
【図２６】Ｆｉｇｕｒｅ  ２６は、ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−４と比較した、Ｒ５８Ａ変異を含む変異体ｈＦｎ１４ファージコンストラクトの、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００４との反応性を試験するＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。ビオチンコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージモノクローナル抗体とその後のＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジン、及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは多重アッセイの標準偏差を示す。Ｘ軸＝ファージの希釈。ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピングに従う方法（方法２）。
【図２７−１】Ｆｉｇｕｒｅ  ２７は、抗Ｆｎ１４  ｍＡｂに対するファージディスプレイされた変異体ｈＦｎ１４コンストラクトの結合を示す一連のグラフである。ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−４と、場合によってはＩＴＥＭ−２と比較した、変異体ｈＦｎ１４ファージコンストラクトの、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００４との反応性を試験するＥＬＩＳＡの結果を示す。変異体Ｐ５９Ａ及びＦ６３Ａについて、ＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージポリクローナルＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。すべての他の変異体について、ビオチンコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージモノクローナル抗体とその後のＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジン、及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは多重アッセイの標準偏差を示す。Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ａ：野生型Ｆｎ１４；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｂ：Ｗ４２Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｃ：Ｓ５４Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｄ：Ａ５７Ｇ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｅ：Ｐ５９Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｆ：Ｓ６１Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｇ：Ｆ６３Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｈ：Ｌ６５Ａ。すべての場合において、エラーバーは標準偏差を示す。Ｘ軸＝ファージの希釈。ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピングに従う方法（方法２）。
【図２７−２】Ｆｉｇｕｒｅ  ２７は、抗Ｆｎ１４  ｍＡｂに対するファージディスプレイされた変異体ｈＦｎ１４コンストラクトの結合を示す一連のグラフである。ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−４と、場合によってはＩＴＥＭ−２と比較した、変異体ｈＦｎ１４ファージコンストラクトの、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００４との反応性を試験するＥＬＩＳＡの結果を示す。変異体Ｐ５９Ａ及びＦ６３Ａについて、ＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージポリクローナルＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。すべての他の変異体について、ビオチンコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージモノクローナル抗体とその後のＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジン、及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは多重アッセイの標準偏差を示す。Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ａ：野生型Ｆｎ１４；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｂ：Ｗ４２Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｃ：Ｓ５４Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｄ：Ａ５７Ｇ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｅ：Ｐ５９Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｆ：Ｓ６１Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｇ：Ｆ６３Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｈ：Ｌ６５Ａ。すべての場合において、エラーバーは標準偏差を示す。Ｘ軸＝ファージの希釈。ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピングに従う方法（方法２）。
【図２７−３】Ｆｉｇｕｒｅ  ２７は、抗Ｆｎ１４  ｍＡｂに対するファージディスプレイされた変異体ｈＦｎ１４コンストラクトの結合を示す一連のグラフである。ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−４と、場合によってはＩＴＥＭ−２と比較した、変異体ｈＦｎ１４ファージコンストラクトの、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００４との反応性を試験するＥＬＩＳＡの結果を示す。変異体Ｐ５９Ａ及びＦ６３Ａについて、ＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージポリクローナルＩｇＧ及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。すべての他の変異体について、ビオチンコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージモノクローナル抗体とその後のＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジン、及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは多重アッセイの標準偏差を示す。Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ａ：野生型Ｆｎ１４；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｂ：Ｗ４２Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｃ：Ｓ５４Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｄ：Ａ５７Ｇ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｅ：Ｐ５９Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｆ：Ｓ６１Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｇ：Ｆ６３Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｈ：Ｌ６５Ａ。すべての場合において、エラーバーは標準偏差を示す。Ｘ軸＝ファージの希釈。ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピングに従う方法（方法２）。
【図２８】Ｆｉｇｕｒｅ  ２８は、抗Ｆｎ１４  ｍＡｂに対するファージディスプレイされた変異体ｈＦｎ１４コンストラクトの結合を示す一連のグラフである。ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−４と比較した、変異体ｈＦｎ１４ファージコンストラクトの、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００４との反応性を示すＥＬＩＳＡ。ビオチンコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージモノクローナル抗体とその後のＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジン、及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは多重アッセイの標準偏差を示す。Ｆｉｇｕｒｅ  ２８Ａ：Ｌ４６Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２８Ｂ：Ｄ５１Ａ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２８Ｃ：Ｄ６２Ａ。すべての場合において、エラーバーは標準偏差を示す。Ｘ軸＝ファージの希釈。ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピングに従う方法（方法２）。
【図２９】Ｆｉｇｕｒｅ  ２９Ａ及びＢは、抗Ｆｎ１４  ｍＡｂに対するファージディスプレイされた変異体ｈＦｎ１４コンストラクトの結合を示すグラフである。ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−４と比較した、変異体Ｈ６０Ａ及びＨ６０Ｋ  ｈＦｎ１４ファージコンストラクトの、抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００４との反応性を示すＥＬＩＳＡ。ＩＴＥＭ−２はＨ６０Ｋに対して評価した。ビオチンコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージモノクローナル抗体とその後のＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジン、及びＴＭＢ基質を用いて結合を検出した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ分光光度計を用いて４５０ｎｍにおける光学密度を定量した。各希釈についてのエラーバーは多重アッセイの標準偏差を示す。Ｘ軸＝ファージの希釈。ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピングに従う方法（方法２）。
【図３０】Ｆｉｇｕｒｅ  ３０Ａ及びＢは、ジスルフィド結合変異体ペプチドに対する抗Ｆｎ１４抗体の結合を示すグラフである。Ｆｉｇｕｒｅ  ３０Ａは、抗Ｆｎ１４抗体の力価を決定し（０．１〜０．０００１μｇ／ｍｌ）、サブドメイン２  ｃｙｓ３＆６ΔＳ変異体に対する結合を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｆｉｇｕｒｅ  ３０ＢはＦｉｇｕｒｅ  ２７Ａと類似しているが、サブドメイン２  ｃｙｓ４＆５ΔＳ変異体に対する結合を評価した（１〜０．０００１μｇ／ｍｌ）。
【図３１】Ｆｉｇｕｒｅ  ３１は、Ｆｎ１４発現レベルについての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された細胞の染色を示す一連のグラフである。１００ｎＭ  ４−ＯＨＴの存在下又は非存在下で２４時間にわたり細胞を培養した（パネルＡはＭＥＦ  ＳＶ４０ｖ１２Ｈｒａｓ  Ｆｎ１４についての結果を示し、パネルＢはＭＥＦ  ＳＶ４０についての結果を示し、パネルＣはルイス肺癌細胞についての結果を示す）。細胞を収集し、市販の抗Ｆｎ１４抗体を用い、その後フローサイトメトリーによる検出のための抗マウスＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−６４７抗体を用いて、ｈＦｎ１４発現について染色した。抗Ｆｎ１４による染色は実線のトレースで示され、二次抗体コントロール染色は細切れトレースで示され、未染色の細胞は点線のトレースで示される。
【図３２】Ｆｉｇｕｒｅ  ３２は、ＭＥＦ腫瘍細胞株によるサイトカイン分泌の分析を示す一連のグラフである。Ｆｎ１４又はＦｎ１４−ＧＰＩを含むＭＥＦ腫瘍細胞株を４−ＯＨＴで誘導したか又は誘導しなかった。通常の成長条件下での４８時間の後、細胞由来の培地を収集し、ＩＬ−６のレベルを、ＢＤ  ＣＢＡ  Ｍｏｕｓｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、及びＦＣＡＰ  Ａｒｒａｙソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施される定量分析を用いて評価した。
【図３３】Ｆｉｇｕｒｅ  ３３は、Ｆｎ１４  ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルの創出を示す一連の図である。雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１日目に腫瘍細胞を注射した。パネルＡは、腫瘍が形成した時に行った測定の結果を示すグラフであり、各マウスについての腫瘍体積を計算し（［長さ＊幅２］／２）、群平均をグラフ化した。パネルＢは、各マウスについての体重を毎日評価し、１日目の体重１００に対して標準化した分析の結果を示すグラフである。各群についての平均を計算し、グラフ化した。群は、野生型ｈＦｎ１４（ｖ１２Ｈｒａｓ  Ｆｎ１４；◎；ｎ＝６）又は親腫瘍細胞株（ｖ１２Ｈｒａｓ；■；ｎ＝６）を含む腫瘍を含む。実験を多数回再現性よく繰り返し、１回の実験からのデータを示した。エラーバーはＳＥＭを示す。注：パネルＢにおいてＹ軸は０から始まらない。
【図３４Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  ３４Ａは、ｈＦｎ１４−ＧＰＩを創出するための、ＴｒａｉｌＲ３のＧＰＩアンカーコード領域（イタリック）に融合したヒトＦｎ１４の細胞外領域（太字）の配列を示す図である。予測されたＧＰＩ付着セリン残基は矢印と共に太字文字列で示される。下線付きの領域はＦｎ１４シグナル配列を示す。
【図３４Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  ３４Ｂは、ｈＦｎ１４発現腫瘍又は非シグナル伝達ｈＦｎ１４発現腫瘍をマウス中に導入することの結果を示す２つのグラフである。雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１日目に腫瘍細胞を注射した。群は、野生型Ｆｎ１４（◆；ｎ＝１４）又はＦｎ１４−ＧＰＩ腫瘍（■；ｎ＝１４）を含む腫瘍を含む。パネルｉは、腫瘍が形成した時に実施した分析の結果を示し、測定を行い、各マウスについての腫瘍体積を計算した（［長さ＊幅２］／２）。パネルｉｉは、各マウスについての体重の分析の結果を示す。群平均を計算し、経時的にグラフ化した。注：パネルｉｉにおいてＹ軸は０から始まらない。データを群平均としてグラフ化した。実験を多数回再現性よく繰り返し、１回の代表的実験からのデータを示した。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図３５】Ｆｉｇｕｒｅ  ３５は、ヒトＦｎ１４を構成的に発現する腫瘍の影響を示す２つのグラフである。雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１日目に腫瘍細胞を注射した。群は、脚注の傍に示されたように、低レベルのＦｎ１４（ｎ＝３；マウス１３７〜１３９）及び構成的発現Ｆｎ１４（ｎ＝６；マウス１４９〜１５４）を含む腫瘍を含む。パネルＡは、各マウスについての体重が毎日評価され経時的にグラフ化された分析の結果を示す。注：パネルＡにおいてＹ軸は０から始まらない。パネルＢは腫瘍体積の測定の結果を示す。測定を行い、各マウスについての腫瘍体積を計算し（［長さ＊幅２］／２）、個々に経時的にグラフ化した。
【図３６】Ｆｉｇｕｒｅ  ３６は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１によるｈＦｎ１４腫瘍の処置の結果を示すグラフである。雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１日目にｈＦｎ１４又はｈＦｎ１４−ＧＰＩ腫瘍細胞のいずれかを注射した。６日目に、各群を均等に分離し、半分を、合計４週間にわたりＣＲＣＢＴ−０６−００１（１０ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射で１週間に２回処置した。群のもう半分は処置を受けなかった。体重を毎日測定し、開始時の体重１００に対して標準化し、群平均をグラフ化した。■＝Ｆｎ１４抗体処置；◆＝Ｆｎ１４非処置；●＝Ｆｎ１４−ＧＰＩ抗体処置；▲＝Ｆｎ１４−ＧＰＩ非処置。処置日は黒の下向き矢印（↓）によって示される。上向きに指す矢印は、マウスを安楽死させたことを示し、その下の記号はどの群からかを示す。各群ｎ＝３であり、エラーバーはＳＥＭを示す。注：Ｙ軸は０から始まらない。
【図３７Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  ３７Ａは、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００４又はＩＴＥＭ−１によるｈＦｎ１４腫瘍マウスの処置の結果を示すグラフである。雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１日目にＦｎ１４腫瘍細胞を注射した。７日目に、マウスの群（ｎ＝６）に、精製された抗体（５ｍｇ／ｋｇ）の単回のＩＰ注射を与えたか、又は処置を与えなかった。体重を毎日測定し、開始時の体重１００％に対して標準化された体重としてグラフ化し、群平均としてグラフ化した。処置日は黒の下向き矢印（↓）によって示される。エラーバーはＳＥＭを示す。注：Ｙ軸は０で交差しない。
【図３７Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  ３７Ｂは、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００４又はＩＴＥＭ−１によるｈＦｎ１４腫瘍マウスの生存を示す２つのグラフである。左側のパネルは、各マウスを殺処分した日及び群平均生存日を示す。注：  ＊は、実験の終了時（２７日目）において体重喪失を有さない健康なマウスを示すデータポイントを示す。細切れ線（−−）は抗体処置を示す（７日目）。右側のパネルは、生存率を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線である。
【図３８】Ｆｉｇｕｒｅ  ３８は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１用量反応並びに体重喪失及び病気からのマウスのレスキューを示すグラフである。１日目に、雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにｈＦｎ１４腫瘍細胞を注射した。６日目に、群をＣＲＣＢＴ−０６−００１（０〜１０ｍｇ／ｋｇ）の単回のＩＰ注射で処置した。非処置マウスはビヒクル注射（ＰＢＳ）を受けた。図に示されるように、９日目又は１０日目に、明らかな体重喪失を示すマウスを１０ｍｇ／ｋｇのＣＲＣＢＴ−０６−００１の単回のＩＰ注射で処置した。体重を毎日測定し、開始時の体重（１日目）１００に対して標準化し、群平均をグラフ化した。各群について標準化された体重を群平均としてグラフ化した。エラーバーはＳＥＭを示す。抗体用量処置日は黒の下向き矢印によって示される。各群ｎ＝３。記号は、マウスを、その記号が示す群から安楽死させたことを示す。注：Ｙ軸は０から始まらない。
【図３９Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  ３９Ａは、ＭＥＦ  Ｆｎ１４細胞を注射したマウスにおける体重に対するＣＲＣＢＴ−０６−００１の影響を示すグラフである。１日目に、雌性１１週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＥＦ  Ｆｎ１４又は親細胞株（Ｈｒａｓ）の単回皮下注射を与えた。６日目に、マウスにＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロール抗体（Ｈｒａｓ＋ＩｇＧ２ｂ；ＭＥＦ  Ｆｎ１４＋ＩｇＧ２ｂ；ｎ＝８／群）又はＣＲＣＢＴ−０６−００１（ＭＥＦ  Ｆｎ１４＋００１；ｎ＝８）の単回腹腔内注射を与えた。体重を１日目及び１１日目に測定した。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０１対Ｈｒａｓ＋ＩｇＧ２ｂ；†Ｐ＜０．０５対ＭＥＦＦｎ１４＋ＩｇＧ２ｂ。
【図３９Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  ３９Ｂは、ＭＥＦ  Ｆｎ１４細胞を注射したマウスにおける除腫瘍体重に対するＣＲＣＢＴ−０６−００１の影響を示すグラフである。１１日目に、Ｆｉｇｕｒｅ  ２８Ａに関連して記載されたマウス由来の腫瘍を外科的に切除し、計量して、接種前からの除腫瘍体重の変化率の計算を可能にした。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０１対Ｈｒａｓ＋ＩｇＧ２ｂ；†Ｐ＜０．０５対ＭＥＦＦｎ１４＋ＩｇＧ２ｂ。
【図４０Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  ４０Ａは、ＭＥＦ  Ｆｎ１４細胞を注射したマウスにおける腫瘍重量に対するＣＲＣＢＴ−０６−００１の影響を示すグラフである。１１日目に、Ｆｉｇｕｒｅ  ３９Ａに関連して記載されたマウス由来の腫瘍を外科的に切除し、計量して、腫瘍重量の変化率の計算を可能にした。
【図４０Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  ４０Ｂは、ＭＥＦ  Ｆｎ１４細胞を注射したマウスにおける腫瘍体積に対するＣＲＣＢＴ−０６−００１の影響を示すグラフである。１１日目に、Ｆｉｇｕｒｅ  ３９Ａに関連して記載されたマウス由来の腫瘍を外科的に切除し、腫瘍体積を計算した。
【図４１Ａ】Ｆｉｇｕｒｅ  ４１Ａ及びＢは、ＭＥＦ  Ｆｎ１４細胞を注射したマウスにおける筋肉量に対するＣＲＣＢＴ−０６−００１の影響を示す一連のグラフである。１１日目に、（Ｆｉｇｕｒｅ  ４１Ａに示された）選択された後肢筋肉並びに（Ｆｉｇｕｒｅ  ４２Ｂに示された）精巣上体脂肪及び心臓を切除し、化学天秤で計量した。ＥＤＬ：長指伸筋；Ｐｌａｎｔ：足底筋；ＴＡ：前脛骨筋；Ｇａｓｔｒｏｃ：腓腹筋；Ｑｕａｄ：四頭筋。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５対Ｈｒａｓ＋ＩｇＧ２ｂ；†Ｐ＜０．０５対ＭＥＦ  Ｆｎ１４＋ＩｇＧ２ｂ。
【図４１Ｂ】Ｆｉｇｕｒｅ  ４１Ａ及びＢは、ＭＥＦ  Ｆｎ１４細胞を注射したマウスにおける筋肉量に対するＣＲＣＢＴ−０６−００１の影響を示す一連のグラフである。１１日目に、（Ｆｉｇｕｒｅ  ４１Ａに示された）選択された後肢筋肉並びに（Ｆｉｇｕｒｅ  ４２Ｂに示された）精巣上体脂肪及び心臓を切除し、化学天秤で計量した。ＥＤＬ：長指伸筋；Ｐｌａｎｔ：足底筋；ＴＡ：前脛骨筋；Ｇａｓｔｒｏｃ：腓腹筋；Ｑｕａｄ：四頭筋。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５対Ｈｒａｓ＋ＩｇＧ２ｂ；†Ｐ＜０．０５対ＭＥＦ  Ｆｎ１４＋ＩｇＧ２ｂ。
【図４２】Ｆｉｇｕｒｅ  ４２Ａ及びＢは、ＭＥＦ  Ｆｎ１４細胞を注射したマウスにおける全身強度に対するＣＲＣＢＴ−０６−００１の影響を示すグラフである。１１日目に、全身強度を、握力メーターを用いて評価し、絶対値として表し（Ｆｉｇｕｒｅ  ４２Ａ）、体重に対して正規化した（Ｆｉｇｕｒｅ  ４２Ｂ）。データは平均±ＳＥＭである。
【図４３】Ｆｉｇｕｒｅ  ４３Ａ〜Ｄは、ＭＥＦＦｎ１４細胞を注射したマウスにおけるｉｎ  ｓｉｔｕでの前脛骨筋（ＴＡ）筋肉の機能的特性に対するＣＲＣＢＴ−０６−００１影響の影響を示すグラフである。１１日目に、ピーク単収縮力（Ｆｉｇｕｒｅ  ４３Ａ）、ピーク強縮力（Ｆｉｇｕｒｅ  ４３Ｂ）、頻度−力関係（Ｆｉｇｕｒｅ  ４３Ｃ）、並びに疲労間欠刺激の間及び４分間の疲労間欠刺激後の力発生（Ｆｉｇｕｒｅ  ４３Ｄ）をＴＡ筋肉においてｉｎ  ｓｉｔｕで評価した。データは平均±ＳＥＭである。ａＰ＜０．０５  主効果  Ｈｒａｓ＋ＩｇＧ２ｂ対ＭＥＦ  Ｆｎ１４＋ＩｇＧ２ｂ。
【図４４】Ｆｉｇｕｒｅ  ４４は、ＭＥＦ  Ｆｎ１４細胞を注射したマウス由来の前脛骨筋（ＴＡ）筋肉における線維サイズ、線維型組成及び線維酸化酵素能に対するＣＲＣＢＴ−０６−００１の影響を示す一連のグラフである。１１日目に、ＴＡ筋肉を切除し、引き続く組織学的分析のために凍結した。反応強度に基づくラミニン、Ｎ２．２６１及びＳＤＨの定量は、ＩＩａ型及びＩＩｘ／ｂ型線維（非Ｎ２．２６１反応性線維）の割合（左パネル）、ＩＩａ型及びＩＩｘ／ｂ型線維の面積（中央パネル）、並びにＩＩａ型及びＩＩｘ／ｂ型線維の反応強度に基づくＳＤＨ活性（右パネル）の決定を容易にした。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５対Ｈｒａｓ＋ＩｇＧ２ｂ；†Ｐ＜０．０５対ＭＥＦ  Ｆｎ１４＋ＩｇＧ２ｂ。
【図４５】Ｆｉｇｕｒｅ  ４５Ａ及びＢは、癌悪液質に関するＣｏｌｏｎ−２６モデルに対するＣＲＣＢＴ−０６−００２影響の影響を示すグラフである。１日目に、雄性１１週齢ＣＤ２Ｆ１マウスにおいて、脇腹に１×１０６細胞をｓ／ｃ接種し、固形腫瘍を形成させた。群は、Ｃｏｌｏｎ−２６非処置（ｎ＝５）、Ｃｏｌｏｎ−２６＋ＣＲＣＢＴ−０６−００２処置（ｎ＝５）、ペアフィード（ｎ＝４）及び非腫瘍非処置コントロール（ｎ＝３）を含む。５日目、１２日目、１５日目及び２０日目に、マウスを１０ｍｇ／ｋｇのＣＲＣＢＴ−０６−００２のＩＰ注射で処置した（↓）。非処置マウスは処置を受けなかった。Ｆｉｇｕｒｅ  ４５Ａに関しては、体重を毎日測定し、開始時の体重（１日目）１００％に対して標準化された群平均体重としてグラフ化した。Ｆｉｇｕｒｅ  ４５Ｂに関しては、抗体処置の開始（５日目）後の毎日の生存率をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線としてグラフ化した。注：２匹の抗体処置したマウスは最大腫瘍体積エンドポイントのために殺処分したので、このグラフには含まれない。
【図４６】Ｆｉｇｕｒｅ  ４６Ａ及びＢは、癌悪液質に関するＣｏｌｏｎ−２６モデルにおける腫瘍に対するＣＲＣＢＴ−０６−００２影響の影響を示すグラフである。Ｆｉｇｕｒｅ  ４６Ａに関しては、腫瘍が形成した時に測定を行い、各マウスについて腫瘍体積を計算した（［長さ＊幅２］／２）。データはグラフ化した群平均である。エラーバーはＳＥＭを示す。２０日目での腫瘍体積における（約１２００ｍｍ３から４００ｍｍ３への）見かけの急落は、最大許容腫瘍サイズに達した多数のマウスの殺処分による群数の減少を反映している。２１日目における生存マウスは約４００ｍｍ３の平均腫瘍体積を有した。Ｆｉｇｕｒｅ  ４６Ｂに関しては、１日目に、雌性９〜１０週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、脇腹に１×１０６細胞をｓ／ｃ接種し、固形腫瘍を形成させた。群には、非処置（ｎ＝５）及びＣＲＣＢＴ−０６−００２処置（ｎ＝５）が含まれる。８日目、１２日目、１５日目、１９日目及び２２日目に、マウスを、図に示されるように１０ｍｇ／ｋｇのＣＲＣＢＴ−０６−００２のＩＰ注射で処置した。腫瘍が形成した時に測定を行い、各マウスについて腫瘍体積を計算した。データを群平均についてグラフ化する。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図４７】Ｆｉｇｕｒｅ  ４７Ａ〜Ｃは、Ｃｏｌｏｎ−２６細胞を投与したＣＤ２Ｆ１マウスに対するＣＲＣＢＴ−０６−００１の影響を示すグラフである。１日目に、雄性１２週齢ＣＤ２Ｆ１マウスにおいて、脇腹に１×１０６細胞をｓ／ｃ接種し、固形腫瘍を形成させた。群は、非処置（ｎ＝５；マウス＃１〜５）及びＣＲＣＢＴ−０６−００１処置（ｎ＝５；マウス＃６〜１０）を含む。１６日目及び２０日目に、マウスを１０ｍｇ／ｋｇのＣＲＣＢＴ−０６−００のＩＰ注射で処置した。抗体処置日は↓で示す。群平均について開始時の体重１００％に対して標準化されたデータをグラフ化した（Ｆｉｇｕｒｅ  ４７Ａに示す）。エラーバーはＳＥＭを示す。Ｆｉｇｕｒｅ  ４７Ｂは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線としてグラフ化した生存率を示す。Ｆｉｇｕｒｅ  ４７Ｃは腫瘍体積の群平均を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図４８】Ｆｉｇｕｒｅ  ４８Ａ〜Ｃは、癌悪液質のＣｏｌｏｎ−２６モデルにおける体重に対するＣＲＣＢＴ−０６−００２の影響を示すグラフである。１日目に、雄性１１週齢ＣＤ２Ｆ１マウスにおいて、脇腹に１×１０６細胞をｓ／ｃ接種し、固形腫瘍を形成させた。群は、非処置（ｎ＝９）、ＩｇＧ処置ペアフィード（ｎ＝１０）及びＣＲＣＢＴ−０６−００２処置ペアフィード（ｎ＝１０）を含む。８日目、１２日目及び１６日目に、マウスを１０ｍｇ／ｋｇのＩｇＧ又は１０ｍｇ／ｋｇのＣＲＣＢＴ−０６−００２のＩＰ注射で処置した（↓）。体重を毎日測定し、絶対体重（Ｆｉｇｕｒｅ  ４８Ａに示される。）、及び開始時の体重１００に対して正規化した体重として表した。注：Ｙ軸は０から始まらない（Ｆｉｇｕｒｅ  ４８Ｂ）。２２日目に、腫瘍を外科的に切除し、計量して、接種前からの除腫瘍体重の変化率の計算を可能にした（Ｆｉｇｕｒｅ  ４８Ｃ）。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５対Ｃ−２６；†Ｐ＜０．０５対Ｃ−２６＋ＩｇＧ。
【図４９】Ｆｉｇｕｒｅ  ４９Ａ〜Ｃは、癌悪液質のＣｏｌｏｎ−２６モデルにおける腫瘍サイズに対するＣＲＣＢＴ−０６−００２の影響を示すグラフである。腫瘍サイズを、デジタルノギスを用いて毎日測定した（Ｆｉｇｕｒｅ  ４９Ａに示される結果）。２２日目に、腫瘍を外科的に切除し、計量し（Ｆｉｇｕｒｅ  ４９Ｂに示される結果）、総体重に対して正規化した（Ｆｉｇｕｒｅ  ４９Ｃに示される）。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５対Ｃ−２６；†Ｐ＜０．０５対Ｃ−２６＋ＩｇＧ。
【図５０】Ｆｉｇｕｒｅ  ５０Ａ及びＢは、癌悪液質のＣｏｌｏｎ−２６モデルにおける筋肉量に対するＣＲＣＢＴ−０６−００２の影響を示すグラフである。２２日目に、選択された後肢筋肉（Ｆｉｇｕｒｅ  ５０Ａ）、精巣上体脂肪及び心臓（Ｆｉｇｕｒｅ  ５０Ｂ）を切除し、化学天秤で計量した。ＥＤＬ：長指伸筋；Ｐｌａｎｔ：足底筋；ＴＡ：前脛骨筋；Ｇａｓｔｒｏｃ：腓腹筋；Ｑｕａｄ：四頭筋。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５対Ｃ−２６；†Ｐ＜０．０５対Ｃ−２６＋ＩｇＧ。
【図５１】Ｆｉｇｕｒｅ  ５１Ａ及びＢは、癌悪液質のＣｏｌｏｎ−２６モデルにおける全身強度及び可動性に対するＣＲＣＢＴ−０６−００２の影響を示すグラフである。２１日目に、全身強度を、握力メーターを用いて評価し（Ｆｉｇｕｒｅ  ５１Ａ）、全身可動性を、ロータロッド試験における落下潜時を介して評価した（Ｆｉｇｕｒｅ  ５１Ｂ）。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５対Ｃ−２６；†Ｐ＜０．０５対Ｃ−２６＋ＩｇＧ。
【図５２】Ｆｉｇｕｒｅ  ５２Ａ〜Ｄは、癌悪液質のＣｏｌｏｎ−２６モデルにおけるｉｎ  ｓｉｔｕの前脛骨筋（ＴＡ）筋肉の機能的特性に対するＣＲＣＢＴ−０６−００２影響の影響を示すグラフである。２２日目に、ピーク単収縮力（Ｆｉｇｕｒｅ  ５２Ａ）、ピーク強縮力（Ｆｉｇｕｒｅ  ５２Ｂ）、頻度−力関係（Ｆｉｇｕｒｅ  ５２Ｃ）、並びに疲労間欠刺激の間及び４分間の疲労間欠刺激後の力発生（Ｆｉｇｕｒｅ  ５２Ｄ）をＴＡ筋肉においてｉｎ  ｓｉｔｕで評価した。データは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０１対Ｃ−２６；†Ｐ＜０．０５対Ｃ−２６＋ＩｇＧ；ｃＰ＜０．０３  主効果  Ｃ−２６＋００２がＣ−２６＋ＩｇＧより高い。
【図５３】Ｆｉｇｕｒｅ  ５２Ａ〜Ｃは、癌悪液質のＣｏｌｏｎ−２６モデル由来の前脛骨筋（ＴＡ）筋肉における筋肉線維構造、線維サイズ、線維型組成及び線維酸化酵素能に対するＣＲＣＢＴ−０６−００２の影響を示すグラフである。２２日目に、ＴＡ筋肉を切除し、引き続く分析のために凍結した。ラミニン及びＮ２．２６１反応の定量により、ＩＩａ型及びＩＩｘ／ｂ型線維の断面積（ＣＳＡ）並びに平均筋肉線維ＣＳＡの評価が可能になった（Ｆｉｇｕｒｅ  ５３Ａ）。かかる定量により、ＩＩａ型及びＩＩｘ／ｂ型筋肉線維の割合の評価もまた可能になった（Ｆｉｇｕｒｅ  ５３Ｂ）。ＳＤＨ及びＮ２．２６１の定量により、ＩＩａ型及びＩＩｘ／ｂ型線維の酸化酵素能並びに平均筋肉線維酸化酵素能の評価が可能になった（Ｆｉｇｕｒｅ  ５３Ｃ）。＊Ｐ＜０．０５対Ｃ−２６；†Ｐ＜０．０５対Ｃ−２６＋ＩｇＧ。
【図５４】Ｆｉｇｕｒｅ  ５４は、糖尿病発症後の抗Ｆｎ１４抗体の投与が、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導された糖尿病に関連する体重喪失を部分的に予防することを示すグラフである。複数回の低用量ＳＴＺ投与によって、雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて糖尿病を誘導した。群は、ＳＴＺ、ビヒクル、ペアフィード及び２０ｍｇ／ｋｇのＣＲＣＢＴ−０６−００２を含む。↓＝抗体処置日。毎日の体重測定を、開始時の体重（１日目）１００％に対して標準化し、群平均をグラフ化した。ｎ＝８；エラーバーはＳＥを示す。注：Ｙ軸は０で交差しない。
【図５５】Ｆｉｇｕｒｅ  ５５は、Ｆｉｇｕｒｅ  ５４に示されるマウスにおける累積水摂取量を示すグラフである。水摂取量を各群（ｎ＝８）について毎日測定し、累積水摂取量としてグラフ化した。
【図５６】Ｆｉｇｕｒｅ  ５６は、Ｆｉｇｕｒｅ  ５４に関して記載されたように処置したマウスの血中グルコース分析を示すグラフである。血中グルコースを、Ａｃｃｕ−ｃｈｅｃｋ血中グルコースモニターを用いて実験の最終日に非絶食マウスにおいて評価し、群平均としてグラフ化した。エラーバーはＳＥＭを示す。範囲を超える読み取りが検出された場合、６００ｍｇ／ｄｌの最大の起こりうる読み取りを割り当てた。１群当たりｎ＝８。
【図５７】Ｆｉｇｕｒｅ  ５７は、糖尿病発症後の抗Ｆｎ１４抗体投与が、ＳＴＺ誘導された糖尿病に関連する筋肉消耗を減弱することを示す一連のグラフである。Ｆｉｇｕｒｅ  ５４と同様に、複数回の低用量ＳＴＺ投与によって雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて糖尿病を誘導した。群は、ＳＴＺ、ビヒクル、ペアフィード及び２０ｍｇ／ｋｇのＣＲＣＢＴ−０６−００２抗体処置を含む。抗体処置を７日目に投与した。パネルＡは、計算されグラフ化された群平均組織重量を示す。組織重量を最終体重（パネルＢ）及び開始時の体重（パネルＣ）に対して標準化し、群平均としてグラフ化した。パネルＢ及びＣはそれぞれ、ｉ：四頭筋；ｉｉ：心臓；ｉｉｉ：前脛骨筋；ｉｖ：精巣上体脂肪の重量を示す。エラーバーはＳＥＭを示す。ｎ＝８。注：いくつかのＹ軸は０において交差しない。
【配列表の説明】
【０２３５】
配列番号１：ヒトＦｎ１４のアミノ酸配列
配列番号２：Ｆｎ１４細胞外ドメインのアミノ酸配列
配列番号３：Ｆｎ１４遺伝子断片ＲＷ１２９のアミノ酸配列
配列番号４：Ｆｎ１４遺伝子断片ＲＷ１３１のアミノ酸配列
配列番号５：Ｆｎ１４遺伝子断片ＲＷ１２７のアミノ酸配列
配列番号６：Ｆｎ１４遺伝子断片ＲＷ１２５のアミノ酸配列
配列番号７：Ｆｎ１４遺伝子断片ＲＷ１２０のアミノ酸配列
配列番号８：Ｆｎ１４遺伝子断片ＲＷ１１８のアミノ酸配列
配列番号９：Ｆｎ１４遺伝子断片ＲＷ１１４のアミノ酸配列
配列番号１０：Ｆｎ１４遺伝子断片ＲＷ９８のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｆｎ１４遺伝子断片ＲＷ９５のアミノ酸配列
配列番号１２：Ｆｎ１４遺伝子断片ＲＷ９１のアミノ酸配列
配列番号１３：ＶＨのコンセンサス配列のアミノ酸配列
配列番号１４：ＶＬのコンセンサス配列のアミノ酸配列
配列番号１５：ＣＲＣＢＴ−０６−００１のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１６：ＣＲＣＢＴ−０６−００２のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１７：ＣＲＣＢＴ−０６−００３のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１８：ＣＲＣＢＴ−０６−００４のＶＨのアミノ酸配列
配列番号１９：ＣＲＣＢＴ−０６−００５のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２０：ＣＲＣＢＴ−０６−００６のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２１：ＣＲＣＢＴ−０６−００７のＶＨのアミノ酸配列
配列番号２２：ＣＲＣＢＴ−０６−００１のＶＬのアミノ酸配列
配列番号２３：ＣＲＣＢＴ−０６−００２のＶＬのアミノ酸配列
配列番号２４：ＣＲＣＢＴ−０６−００３のＶＬのアミノ酸配列
配列番号２５：ＣＲＣＢＴ−０６−００４のＶＬのアミノ酸配列
配列番号２６：ＣＲＣＢＴ−０６−００５のＶＬのアミノ酸配列
配列番号２７：ＣＲＣＢＴ−０６−００６のＶＬのアミノ酸配列
配列番号２８：ＣＲＣＢＴ−０６−００７のＶＬのアミノ酸配列
配列番号２９：ｈＦｎ１４細胞外ドメイン変異体コンストラクトＤ４５Ａのアミノ酸配列
配列番号３０：ｈＦｎ１４細胞外ドメイン変異体コンストラクトＫ４８Ａのアミノ酸配列
配列番号３１：ｈＦｎ１４細胞外ドメイン変異体コンストラクトＭ５０Ａのアミノ酸配列
配列番号３２：ｈＦｎ１４細胞外ドメイン変異体コンストラクトＤ６２Ｅのアミノ酸配列
配列番号３３：ｈＦｎ１４サブドメイン１のアミノ酸配列
配列番号３４：ｈＦｎ１４サブドメイン２のアミノ酸配列
配列番号３５：ｈＦｎ１４サブドメイン３のアミノ酸配列
配列番号３６：Ｆｎ１４−ＧＰＩコントロールのアミノ酸配列
配列番号３７：Ｆｎ１４の細胞外ドメインをコードする核酸を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列
配列番号３８：Ｆｎ１４の細胞外ドメインをコードする核酸を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列
配列番号３９：Ｔｒａｉｌ  Ｒ３  ＧＰＩアンカーコード領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列
配列番号４０：Ｔｒａｉｌ  Ｒ３  ＧＰＩアンカーコード領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列
配列番号４１：抗体の軽鎖可変領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列
配列番号４２：抗体の軽鎖可変領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列
配列番号４３：抗体の重鎖可変領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列
配列番号４４：抗体の重鎖可変領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列
配列番号４５：抗体の重鎖可変領域を増幅するためのプライマーのヌクレオチド配列
配列番号４６：サブドメイン１ｐのアミノ酸配列
配列番号４７：Ｆｎ１４  ＥＣＤ中のジスルフィド結合を形成する３番目及び６番目のシステイン残基がセリンに変異したＦｎ１４サブドメイン２（本明細書において「サブドメイン２  Ｃｙｓ  ３＆６  ΔＳ」という。）
配列番号４８：Ｆｎ１４  ＥＣＤ中のジスルフィド結合を形成する４番目及び５番目のシステイン残基がセリンに変異したＦｎ１４サブドメイン２（本明細書において「サブドメイン２  Ｃｙｓ  ４＆５  ΔＳ」という。）
配列番号４９：Ｆｎ１４  Ｔ３３Ｎ変異体
配列番号５０：Ｆｎ１４  Ａ３４Ｓ変異体
配列番号５１：Ｆｎ１４  Ｒ３８Ｓ変異体
配列番号５２：Ｆｎ１４  Ｒ５６Ｐ変異体
配列番号５３：Ｆｎ１４  Ｌ７７Ｍ変異体
配列番号５４：Ｆｎ１４  Ｒ５６Ａ変異体
配列番号５５：Ｆｎ１４  Ｒ５６Ｋ変異体
配列番号５６：Ｆｎ１４  Ｒ５８Ａ変異体
配列番号５７：Ｆｎ１４  Ｗ４２Ａ変異体
配列番号５８：Ｆｎ１４  Ｌ４６Ａ変異体
配列番号５９：Ｆｎ１４  Ｄ５１Ａ変異体
配列番号６０：Ｆｎ１４  Ｓ５４Ａ変異体
配列番号６１：Ｆｎ１４  Ａ５７Ｇ変異体
配列番号６２：Ｆｎ１４  Ｐ５９Ａ変異体
配列番号６３：Ｆｎ１４  Ｈ６０Ａ変異体
配列番号６４：Ｆｎ１４  Ｓ６１Ａ変異体
配列番号６５：Ｆｎ１４  Ｄ６２Ａ変異体
配列番号６６：Ｆｎ１４  Ｆ６３Ａ変異体
配列番号６７：Ｆｎ１４  Ｌ６５Ａ変異体
配列番号６８：Ｆｎ１４  Ｈ６０Ｋ変異体
配列番号６９：抗体軽鎖を増幅するためのプライマー
配列番号７０：抗体軽鎖を増幅するためのプライマー
【詳細な説明】
【０２３６】
概要：
具体的に他を述べないか、又は文脈が他を要求しない限り、本明細書を通じて、単一のステップ、問題の組成物、ステップの群又は問題の組成物の群に言及される場合、１つ及び複数の（すなわち１つ又は複数の）これらのステップ、問題の組成物、ステップの群又は問題の組成物の群を包含するものと解釈すべきである。
【０２３７】
当業者は、本開示が、具体的に記載されたもの以外のバリエーション及び改変を受け入れる余地があることを理解するであろう。本開示がすべてのかかるバリエーション及び改変を含むことを理解すべきである。本開示は、本明細書中で個々に又は集合的に言及される又は示されるステップ、特徴、組成物及び化合物のすべて、並びにこれらのステップ又は特徴の任意の及びすべての組み合わせ又はいずれか２つ以上もまた含む。
【０２３８】
本開示は、もっぱら例示目的であることが意図される本明細書に記載の特定の例によってはその範囲を限定されない。機能的に等価な生成物、組成物及び方法が本開示の範囲内であることは明らかである。
【０２３９】
本明細書の開示の任意の例は、特に断らない限り、本開示の任意の他の例に対して変更すべき変更を適用すると解釈すべきである。
【０２４０】
特に断らない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学及び生化学における）当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有すると解釈すべきである。
【０２４１】
特に断らない限り、本開示において利用される組換えタンパク質、細胞培養及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的な手順である。かかる技術は、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、Ｂｒｏｗｎ（１９９１）、Ｇｌｏｖｅｒ及びＨａｍｅｓ（１９９５及び１９９６）、並びにＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８８、現在までのすべての更新を含む）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、（１９８８）、Ｃｏｌｉｇａｎら、（現在までのすべての更新を含む）並びにＺｏｌａ（１９８７）などの供給源における文献中で、記載され説明されている。
【０２４２】
可変領域及びその一部、免疫グロブリン、抗体及びその断片についての本明細書中の記載及び定義は、Ｋａｂａｔ、１９８７及び／又は１９９１、Ｂｏｒｋら、１９９４及び／又はＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、１９８７及び／又は１９８９又はＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、１９９７における議論によってさらに明確にすることができる。
【０２４３】
「及び／又は」とは、例えば「Ｘ及び／又はＹ」であれば、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味すると理解すべきであり、両方の意味又はいずれかの意味に対する明確な根拠をもたらすものと解釈すべきである。
【０２４４】
本明細書を通じて、「含む」及びそのバリエーションは、述べられた要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を含むことを含意するが、任意の他の要素、整数若しくはステップ、又は要素、整数若しくはステップの群を排除しないことを含意するものと理解される。
【０２４５】
本明細書において、「から誘導される」は、特定された整数が、特定の供給源から直接由来する必要はないが、その供給源から得られたものであってもよいことを示すものと解釈すべきである。
【０２４６】
本開示の一例において、１０３位のＸはグリシンである。本開示の一例において、１０３位のＸはグルタメート又はグルタミン酸である。
【０２４７】
選択された定義：
本明細書において、「Ｆｎ１４」は、すべての哺乳動物由来、例えばヒト由来及びげっ歯動物由来のＦｎ１４を集合的に指す。「ｈＦｎ１４」又は「ヒトＦｎ１４」はヒト由来のＦｎ１４を指す。命名目的（限定的なものではない。）でｈＦｎ１４のアミノ酸配列を配列番号１に記載する。
【０２４８】
本開示において、「抗体」という語には、Ｆｖのおかげで１個又は数個の密に関連した抗原（例えば、Ｆｎ１４）に特異的に結合することが可能なタンパク質が含まれる。この用語には、四鎖抗体（例えば、２つの軽鎖及び２つの重鎖）、組換え抗体又は改変抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体及び半抗体、二重特異的抗体）が含まれる。抗体は一般に定常ドメイン（定常領域又は定常断片又は結晶化可能断片（Ｆｃ）に分類され得る。）を含む。抗体の例示的な形態は、その基礎単位として四鎖構造を含む。全長抗体は、共有結合した２つの重鎖（約５０〜７０ｋＤａ）、及び２つの軽鎖（それぞれ約２３ｋＤａ）を含む。軽鎖は一般に可変領域及び定常ドメインを含み、哺乳動物ではκ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかである。重鎖は一般に、１つの可変領域及びヒンジ領域によってさらなる定常ドメインに連結された１つ又は２つの定常ドメインを含む。哺乳動物の重鎖は、以下の型α、δ、ε、γ又はμのうち１つの重鎖である。各軽鎖はまた、これらの重鎖のうち１つと共有結合している。例えば、２つの重鎖並びに重鎖及び軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合及び非共有相互作用によって一緒にされる。鎖間ジスルフィド結合の数は異なる型の抗体間で変動し得る。各鎖は、１つのＮ末端可変領域（それぞれ約１１０アミノ酸長であるＶＨ又はＶＬ）及びＣ末端の１つ又は複数の定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメイン（約１１０アミノ酸長であるＣＬ）は重鎖の第１の定常ドメイン（約３３０〜４４０アミノ酸長であるＣＨ）とアラインされ、ジスルフィド結合される。軽鎖可変領域は重鎖の可変領域とアラインされる。抗体重鎖は２つ以上のさらなるＣＨドメイン（例えば、ＣＨ２、ＣＨ３）を含み得、ＣＨ１定常ドメインとＣＨ２定常ドメインとの間に同定され得るヒンジ領域を含み得る。抗体は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及、ＩｇＡ２）又はサブクラスの抗体であり得る。一例において、この抗体は、ネズミ（マウス又はラット）抗体若しくはそのヒト化形態、又は霊長類（例えばヒト）抗体である。
【０２４９】
「全長抗体」、「インタクト抗体」又は「抗体全体」という語は、相互交換可能に使用され、抗体の抗原結合性断片とは対照的に実質的にインタクトな形態の抗体を指す。具体的には、抗体全体には、定常領域を含む重鎖及び軽鎖を有する抗体が含まれる。この定常領域は、野生型配列の定常領域（例えば、ヒト野生型配列の定常領域）又はそのアミノ酸配列バリアントであり得る。
【０２５０】
「Ｆｎ１４結合性タンパク質」という語は、単一のポリペプチド鎖（すなわち、ペプチド結合によって連結された一連の連続アミノ酸）、或いは本明細書に記載され、及び／又は特許請求された様式でＦｎ１４に結合することが可能な、互いに共有結合又は非共有結合により連結された一連のポリペプチド鎖（すなわちポリペプチド複合体）を含むと解釈すべきである。例えば、この一連のポリペプチド鎖は、適切な化学結合又はジスルフィド結合を用いて共有結合され得る。非共有結合の例には、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力及び疎水性相互作用が含まれる。本開示により企図される非共有結合は、例えばダイアボディ又はトライアボディ又はテトラボディ又はＦｖのいくつかの形態におけるＶＨ及びＶＬの間の相互作用である。
【０２５１】
「ポリペプチド鎖」とは、以上より、ペプチド結合によって連結された一連の連続アミノ酸を意味すると理解される。
【０２５２】
「抗Ｆｎ１４抗体」とは、用語が示唆するように、Ｆｎ１４に特異的に結合する抗体を意味する。
【０２５３】
本明細書において抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１という場合、配列番号１５の配列を含むＶＨ及び配列番号２２の配列を含むＶＬを含む抗体を指す。
【０２５４】
本明細書において抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００２という場合、配列番号１６の配列を含むＶＨ及び配列番号２３の配列を含むＶＬを含む抗体を指す。
【０２５５】
本明細書において抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００３という場合、配列番号１７の配列を含むＶＨ及び配列番号２４の配列を含むＶＬを含む抗体を指す。
【０２５６】
本明細書において抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００４という場合、配列番号１８の配列を含むＶＨ及び配列番号２５の配列を含むＶＬを含む抗体を指す。
【０２５７】
本明細書において抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００５という場合、配列番号１９の配列を含むＶＨ及び配列番号２６の配列を含むＶＬを含む抗体を指す。
【０２５８】
本明細書において抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００６という場合、配列番号２０の配列を含むＶＨ及び配列番号２７の配列を含むＶＬを含む抗体を指す。
【０２５９】
本明細書において抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００７という場合、配列番号２１の配列を含むＶＨ及び配列番号２８の配列を含むＶＬを含む抗体を指す。
【０２６０】
本明細書において、「可変領域」は、抗原に特異的に結合することが可能であり、ＣＤＲ；すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びにＦＲのアミノ酸配列を含む、本明細書中で定義される抗体の軽鎖及び／又は重鎖の一部を指す。例えば、可変領域は、３つのＣＤＲと共に、３つ又は４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び任意選択でＦＲ４）を含む。ＶＨは重鎖の可変領域を表す。ＶＬは軽鎖の可変領域を表す。
【０２６１】
本明細書において、「相補性決定領域」（同義語ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は抗体可変領域のアミノ酸残基を指し、その存在は、特異的抗原結合に対する主要な寄与因子である。各可変領域は、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と特定される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔら、（１９８７及び／又は１９９１）に規定されるような「相補性決定領域」由来のアミノ酸残基を含み得る。例えば、重鎖可変領域において、ＣＤＲＨ１は残基３１〜３５の間であり、ＣＤＲＨ２は残基５０〜６５の間であり、ＣＤＲＨ３は残基９５〜１０２の間である。軽鎖において、ＣＤＲＬ１は残基２４〜３４の間であり、ＣＤＲＬ２は残基５０〜５６の間であり、ＣＤＲＬ３は残基８９〜９７の間である。これらのＣＤＲは、例えばＫａｂａｔ（１９８７及び／又は１９９１）に記載されるように、多数の挿入もまた含み得る。本開示は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって規定されたＦＲ及びＣＤＲに限定されず、正準の番号付けシステム又はＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）の番号付けシステム；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）；及び／又はＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、（１９９７）；Ｈｏｎｎｅｇｈｅｒ及びＰｌｕｋｔｈｕｎ（２００１）の番号付けシステム；Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉら、（１９９７）に記載のＩＭＧＴシステム；或いはＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  Ｓｃｈｅｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｍｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を含むすべての番号付けシステムが含まれる。一例において、ＣＤＲ及び／又はＦＲは、例えばＦｉｇｕｒｅ  １１Ａ〜１１Ｄ中に太字文字列で示されるように、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って規定される。任意選択で、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う重鎖ＣＤＲ２は本明細書に記載の５つのＣ末端アミノ酸を含まないか、あるいはこれらのアミノ酸のうちのいずれか１つ又は複数は別の天然に存在するアミノ酸で置換されている。さらなる又は代替的な選択肢で、軽鎖ＣＤＲ１は本明細書に記載の４つのＮ末端アミノ酸を含まないか、あるいはこれらのアミノ酸のうちのいずれか１つ又は複数は別の天然に存在するアミノ酸で置換されている。これに関して、Ｐａｄｌａｎら、１９９５は、重鎖ＣＤＲ２の５つのＣ末端アミノ酸及び／又は軽鎖ＣＤＲ１の４つのＮ末端アミノ酸が抗原結合には一般に関与しないことを確立した。一例において、ＣＤＲ及び／又はＦＲは、例えばＦｉｇｕｒｅ  ９Ａ〜９Ｄ中に下線付き文字列で示されるように、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに従って規定される。
【０２６２】
本明細書において、「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」は、Ｋａｂａｔら、（１９８７及び／又は１９９１）に示される、抗体可変領域を番号付けし、ＣＤＲ（超可変領域）を同定するためのスキームを指す。
【０２６３】
本明細書において、「Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステム」とは、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）又はＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、（１９９７）に示される、抗体可変領域を番号付けし、ＣＤＲ（構造的ループ）を同定するためのスキームを指す。
【０２６４】
「フレームワーク領域」（以下ＦＲ）はＣＤＲ残基以外の可変領域残基である。
【０２６５】
本明細書において、「Ｆｖ」とは、複数のポリペプチドから構成されるにしろ単一のポリペプチドから構成されるにしろ、ＶＬ及びＶＨが会合して、抗原結合性ドメインを有する、すなわち抗原（例えば、Ｆｎ１４）に特異的に結合することが可能な複合体を形成する、任意のタンパク質を意味するものと解釈すべきである。抗原結合性ドメインを形成するＶＨ及びＶＬは単一のポリペプチド鎖又は異なるポリペプチド鎖中に存在し得る。さらに、本開示のＦｖ（並びに本開示の任意のタンパク質）は、同じ抗原に結合してもしなくてもよい複数の抗原結合部位を有し得る。この用語は、抗体から直接誘導された断片並びに組換え手段を用いて生成されたタンパク質を包含するものと理解すべきである。いくつかの例において、ドメイン抗体のように、ＶＨは重鎖定常ドメインＣＨ１に連結されず、及び／又はＶＬは軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に連結されない。例示的なＦｖ含有ポリペプチド又はタンパク質には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ又はより高次の複合体、或いはその定常領域又はＣＨ２又はＣＨ３ドメインなどのドメインに連結された上述のもののいずれか、例えば、ミニボディが含まれる。「Ｆａｂ断片」は免疫グロブリンの一価結合性断片からなり、これは、インタクトな軽鎖及び重鎖の一部からなる断片を生じるための酵素パパインによる抗体全体の消化によって生成され得るか、又は組換え手段を用いて生成され得る。抗体の「Ｆａｂ’断片」は、抗体全体をペプシンで処理し、次いで還元することによって得ることができ、インタクトな軽鎖並びにＶＨ及び単一の定常ドメインを含む重鎖の一部からなる分子を生じる。この様式で処理された抗体１つ当たり２つのＦａｂ’断片が得られる。Ｆａｂ’断片は組換え手段によっても生成され得る。抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つのジスルフィド結合によって一緒にされた２つのＦａｂ’断片の二量体からなり、引き続く還元なしに酵素ペプシンで抗体全体分子を処理することによって得られる。「Ｆａｂ２」断片は、例えばロイシンジッパー又はＣＨ３ドメインを用いて連結された２つのＦａｂ断片を含む組換え断片である。「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が適切な可撓性ポリペプチドリンカーによって共有結合連結された抗体の可変領域断片（Ｆｖ）を含む組換え分子である。この用語の範囲に入る例示的なＦｖ含有タンパク質については以下で説明される。
【０２６６】
本明細書において、「抗原結合性ドメイン」とは、抗原に特異的に結合することが可能な抗体の領域、すなわち、本明細書中で規定されるＶＨ又はＶＬ又はＦｖ又は可変領域を意味するものと解釈すべきである。抗原結合性ドメインは、抗体全体の一部として存在している必要はなく、例えば、単離形態（例えばドメイン抗体）又は別の形態（例えば、ｓｃＦｖなどの本明細書に記載の形態）であり得る。
【０２６７】
本明細書において、「定常領域」（同義語ＣＲ）は、定常ドメインを含む抗体の一部を指し、これは、一般に（必ずではないが）グリコシル化され、１つ又は複数のＦｃ受容体及び／又は補体カスケードの構成要素（例えば、エフェクター機能を付与する。）に結合する。重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ又はμのいずれかから選択され得る。さらに、種々のサブクラスの重鎖（例えば、ＩｇＧサブクラスの重鎖）は異なるエフェクター機能を担い、したがって、所望の重鎖定常領域を選択することによって、所望のエフェクター機能を有するタンパク質が生成され得る。例示的な重鎖定常領域はγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）及びγ３（ＩｇＧ３）である。
【０２６８】
「定常ドメイン」は抗体中のドメインであり、その配列は、ＩｇＧ又はＩｇＭ又はＩｇＥなどの同じ型の抗体（単数／複数）において高度に類似している。抗体の定常領域は一般に複数の定常ドメインを含む。例えば、γ、α及びδ重鎖の定常領域は３つの定常ドメインを含み、γ、α及びδ重鎖のＦｃは２つの定常ドメインを含む。μ及びε重鎖の定常領域は４つの定常ドメインを含み、Ｆｃ領域は２つの定常ドメインを含む。
【０２６９】
本明細書において、タンパク質又はその抗原結合性ドメインと抗原との相互作用に関する「結合する」という語は、この相互作用が抗原上の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、タンパク質一般ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に結合する場合、エピトープ「Ａ」（又は遊離の未標識の「Ａ」）を含む分子の存在は、標識された「Ａ」及び抗体を含む反応において、抗体に結合する標識された「Ａ」の量を低減させる。
【０２７０】
本明細書において、「特異的に結合する」とは、本開示のタンパク質が代替的な抗原又は細胞と反応又は会合するよりも、本開示のタンパク質が、特定の抗原（単数又は複数）又はかかる抗原を発現する細胞と、より高い頻度で、より迅速に、より長い持続時間で、及び／又はより大きい親和性で反応又は会合することを意味するものと解釈すべきである。例えば、抗原に特異的に結合するタンパク質は、このタンパク質が他の抗原、例えば他のＴＮＦスーパーファミリー受容体又は多反応性の天然抗体（すなわち、ヒトにおいて天然に見出される種々の抗原に結合することが公知の天然に存在する抗体）によって共通して認識される抗原に結合するよりも大きい親和性（例えば、２０倍又は４０倍又は６０倍又は８０倍〜１００倍又は１５０倍又は２００倍より大きい親和性）、結合力で、より容易に、及び／又はより長い持続時間でその抗原に結合する。この定義を読むことにより、例えば、第１の抗原に特異的に結合するタンパク質は第２の抗原に特異的に結合してもしなくてもよいことが理解される。かかる「特異的結合」は、排他的な結合又は別の抗原の検出不能な結合を必ずしも必要としないので、これは「選択的結合」という語でも表現される。
【０２７１】
本明細書において、「類似の」レベルの結合という場合、抗体が別の抗原に結合するレベルの約３０％又は２５％又は２０％以内のレベルで、その抗体が抗原に結合することを意味するものと理解される。この用語はまた、別の抗体が同じ抗原に結合するレベルの約３０％又は２５％又は２０％以内のレベルで１つの抗体がその抗原に結合することを意味し得る。
【０２７２】
本明細書において、「実質的に同じレベル」の結合という場合、抗体が別の抗原に結合するレベルの約１５％又は１０％又は５％以内のレベルで、その抗体が抗原に結合することを意味するものと理解される。この用語はまた、別の抗体が同じ抗原に結合するレベルの約５％又は４％又は３％以内のレベルで、１つの抗体がその抗原に結合することを意味し得る。
【０２７３】
本明細書において、「エピトープ」（同義語「抗原決定基」）とは、ＣＲＣＢＴ−０６−００１及び／又はＣＲＣＢＴ−０６−００２及び／又はＣＲＣＢＴ−０６−００３及び／又はＣＲＣＢＴ−０６−００４及び／又はＣＲＣＢＴ−０６−００５及び／又はＣＲＣＢＴ−０６−００６及び／又はＣＲＣＢＴ−０６−００７と称される抗体が結合するＦｎ１４の領域を意味するものと理解すべきである。この用語は、抗体が接触する特定の残基又は構造に必ずしも限定されない。例えば、この用語は、抗体及び／又はこの領域の外側の５〜１０若しくは２〜５若しくは１〜３アミノ酸によって接触されるアミノ酸にわたる領域を含む。いくつかの例において、このエピトープは、Ｆｎ１４由来の一連の連続アミノ酸である。しかし、エピトープは、Ｆｎ１４が折り畳まれた場合に互いに近接して位置付けられる一連の非連続アミノ酸、すなわち「立体構造エピトープ」もまた含み得る。これに関して、「エピトープ」は、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質に結合するのに十分な一連の非連続アミノ酸のいくらか又はすべてを含む単一ポリペプチドを包含し得、及び／又はこの一連のアミノ酸を含む一連のペプチドを含み得る。当業者は、「エピトープ」がペプチド又はポリペプチドに限定されないこともまた認識するであろう。例えば、抗体は、他のエピトープのなかでも、炭水化物又はグリコシル化ペプチド若しくはグリコシル化ポリペプチド、ホスフェートペプチド若しくはポリペプチド又はホスホ−ペプチド若しくはポリペプチドに結合することが可能である。エピトープ又はエピトープを含むペプチド若しくはポリペプチドは、該エピトープに対する抗体を生成するために動物に投与され得る。
【０２７４】
「単離された」とは、そのタンパク質が天然に存在する環境から実質的に取り出されていること、例えば異種環境中に存在すること、及び／又は汚染因子を実質的に含まないこと、例えば汚染因子を少なくとも約７０％又は７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％含まないことを意味する。
【０２７５】
「競合的に阻害する」とは、本開示のタンパク質が、Ｆｎ１４又はその断片に対して生成された列挙された抗体の結合を低減又は防止することを意味するものと理解すべきである。タンパク質は、抗体の結合を完全に阻害する必要はなく、統計的に有意な量、例えば少なくとも約１０％又は２０％又は３０％又は４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は９５％、結合を低減すればよいことは上述から明らかである。結合の競合的阻害を決定する方法は当分野で知られており、及び／又は本明細書に記載されている。例えば、抗体は、タンパク質の存在下又は非存在下のいずれかでＦｎ１４又はその断片に曝露される。タンパク質の存在下で結合する抗体がタンパク質の非存在下で結合する抗体よりも少ない場合、タンパク質はその抗体の結合を競合的に阻害するとみなされる。一例において、タンパク質及び抗体はＦｎ１４に実質的に同時に曝露される。結合の競合的阻害を決定するためのさらなる方法は当業者に知られており、及び／又は本明細書に記載されている。一例において、タンパク質の抗原結合性ドメインが抗体の結合を競合的に阻害する。
【０２７６】
本明細書において、列挙された配列「内に含まれる残基を含むエピトープ」という場合、タンパク質が結合するエピトープ（立体構造エピトープであり得る。）が、列挙された配列内の残基を含むが、さらなる残基を含んでいてもよいことを意味するものと理解される。この配列内に含まれる残基は、任意の例に従う本明細書に記載のタンパク質にこの配列が結合することを許容するのに十分である。
【０２７７】
２つのエピトープに関して、「重複する」とは、１つのエピトープに結合する抗体が、他のエピトープに結合する抗体の結合を競合的に阻害することを許容するのに十分な数のアミノ酸残基を、これら２つのエピトープが共有することを意味するものと解釈すべきである。例えば、これらのエピトープは、少なくとも１つ又は２つ又は３つ又は４つ又は５つ又は６つ又は７つ又は８つ又は９つ又は１０個のアミノ酸を共有する。
【０２７８】
本明細書において、「検出可能に結合しない」とは、抗体などのタンパク質が、バックグラウンドを１０％未満、又は８％又は６％又は５％上回るレベルで候補抗原に結合することを意味するものと理解すべきである。このバックグラウンドは、タンパク質の非存在下及び／又は陰性コントロールタンパク質（例えばアイソタイプコントロール抗体）の存在下で検出された結合シグナルのレベルであり得、及び／又は陰性コントロール抗原の存在下で検出された結合のレベルであり得る。結合のレベルは、タンパク質が固定化されて抗原と接触されるバイオセンサー分析（例えばＢｉａｃｏｒｅ）を用いて検出される。
【０２７９】
本明細書において、Ｆｎ１４又はその変異体形態の領域を含むペプチドに対するＦｎ１４結合性タンパク質の結合に関して「低減された結合」又は「より低いレベルの結合」に言及される場合、コントロールエピトープ又は抗原（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含むＦｎ１４又はペプチド）の少なくとも約１／２又は１／５又は１／１０又は１／２０又は１／４０又は１／６０の親和性でタンパク質がペプチドに結合することを意味するものと理解される。
【０２８０】
本明細書において、Ｆｎ１４結合性タンパク質に関する「類似のレベル」とは、本開示のタンパク質が２つの抗原（例えば、配列番号２の配列を含むＦｎ１４又はペプチド、及び配列番号２９〜３２、３４又は４９〜６８のいずれか１つの配列を含むペプチド）に互いの２倍以下以内、例えば互いの約１倍以内、例えば互いの約０．５倍以内の親和性で結合すること、或いは結合のレベルが実質的に同一であることを意味するものと理解される。
【０２８１】
「個々に」とは、本開示が、列挙された抗原又は抗原の群に別々に結合するＦｎ１４結合性タンパク質を包含すること、及びそれにもかかわらず、個々の抗原又は抗原の群が本明細書中に別々に列挙されていなくてもよく、添付の特許請求の範囲がかかる抗原又は抗原の群を互いから別々にかつ分けて規定してもよいことを意味する。
【０２８２】
「集合的に」とは、本発明が、列挙された抗原又は抗原の群の任意の数又は組み合わせを包含すること、及びそれにもかかわらず、抗原又は抗原の群のかかる数又は組み合わせが、本明細書中に具体的に列挙されていなくてもよく、添付の特許請求の範囲がかかる組み合わせ又は下位組み合わせを抗原又は抗原の群の任意の他の組み合わせから別々にかつ分けて規定してもよいことを意味する。
【０２８３】
「Ｔｗｅａｋ媒介性のＦｎ１４シグナル伝達効果」とは、細胞におけるＦｎ１４を介したＴｗｅａｋシグナル伝達によってもたらされる表現型のいずれか１つ又は群を意味するものと理解される。かかる効果には、遺伝子発現の変化、ＮＦκＢシグナル伝達、アポトーシス若しくは壊死の誘導若しくは阻害、血管新生の誘導若しくは阻害、又はサイトカイン分泌の誘導若しくは阻害が含まれる。Ｔｗｅａｋ媒介性のＦｎ１４シグナル伝達効果を決定するのに適した方法は本明細書に記載されている。
【０２８４】
本明細書において、「Ｔｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達」とは、Ｆｎ１４に対するＴｗｅａｋ結合の結果としてＮＦκＢを介して生じ、Ｆｎ１４を発現する細胞内で生じるシグナル伝達を意味するものと理解される。かかるシグナル伝達を決定する方法は当分野で知られており、及び／又は本明細書に記載されている。例えば、ＮＦκＢ結合部位を含み、ＮＦκＢ結合の結果として遺伝子発現を促進するプロモーターがレポーター遺伝子に作動可能に連結される。次いで、Ｔｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達は、レポーター遺伝子の発現を検出すること、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて蛍光レポーター遺伝子を検出することによって決定される。Ｔｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達は、ＮＦκＢによって誘導される遺伝子の発現のレベルを例えばｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで検出することによっても決定され得る。
【０２８５】
本明細書において、Ｔｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４を発現する細胞と接触させたタンパク質に関する「ＮＦκＢシグナル伝達を検出可能には誘導しない」とは、そのタンパク質が、コントロールタンパク質、例えば、アイソタイプコントロール抗体よりも有意に高いレベルまでＮＦκＢシグナル伝達を誘導することがないことを意味するものと解釈すべきである。いくつかの例において、シグナル伝達の誘導は、コントロールタンパク質によるシグナル伝達の誘導と比較して１．５倍以下又は１．４倍以下又は１．３倍以下又は１．２倍以下又は１．１倍以下である。ＮＦκＢシグナル伝達を決定する方法は本明細書に記載されている。
【０２８６】
本明細書において、「中和する」とは、Ｆｎ１４を介した細胞における任意の１つ又は複数のＴｗｅａｋ媒介性のシグナル伝達効果をタンパク質が遮断、低減又は防止することが可能であることを意味するものと解釈すべきである。中和を決定する方法は当分野で知られており、及び／又は本明細書に記載されている。
【０２８７】
「Ｆｎ１４媒介性の状態」は、例えば対象の血清中の、Ｆｎ１４を発現する過剰な数の細胞及び／又は細胞によるＦｎ１４の過剰発現及び／又はＦｎ１４の過剰な活性及び／又は過剰なレベルのＴｗｅａｋによって引き起こされる又はこれらに関連する任意の疾患又は障害を包含するものと解釈すべきである。例示的なＦｎ１４媒介性の状態は、癌、転移、過剰な血管新生若しくは血管形成、自己免疫疾患、炎症性疾患、神経変性疾患、ケロイド瘢痕、移植片対宿主病、移植片拒絶、心血管疾患及び虚血（脳卒中を含む）である。
【０２８８】
本明細書において、「消耗性障害」は、積極的に体重を減らそうとしていない人における障害であって、体重の喪失、筋萎縮症、疲労、脱力感に関与するか、少なくとも一部においてはそれらの結果として生じるか、或いはそれらを含む障害を指す。消耗性障害は、筋肉及び／又は脂肪の不注意な及び／又は制御されていない（医療的介入の非存在下での）喪失を一般に特徴とする。この用語は、悪液質又は他の形態の消耗、例えば、脱神経誘導性の消耗を包含する。
【０２８９】
「別の状態に関連する消耗性障害」とは、ある状態に罹患している対象において観察される消耗、すなわち、この消耗が、その状態によって引き起こされた変化（例えば代謝的変化）の結果であり得ることを意味するものと理解される。一例において、この状態はＦｎ１４媒介性の状態である。一例において、この状態は、筋肉以外の細胞（又はＦｎ１４を発現する細胞）におけるＦｎ１４発現によって引き起こされる又はかかるＦｎ１４発現に関連する。
【０２９０】
本明細書において、「悪液質」は、基礎（又は別の）状態に関連する代謝状態を指すものと理解され、ここで、悪液質は、脂肪重量の喪失あり又はなしの、体重の喪失及び筋肉の喪失を特徴とする。悪液質は、基礎疾患によるタンパク質異化の増加に一般に関連する。悪液質の発症に対する寄与因子は、食欲不振及び代謝的変更（例えば、炎症状態の増加、筋肉タンパク質分解の増加、並びに炭水化物、タンパク質及び脂質代謝の不良）である。悪液質の顕著な臨床的特徴は、成人における体重喪失（任意選択で、体液貯留に関して補正されている。）又は小児における成長不全（内分泌障害を除く。）である。食欲不振、炎症、インスリン抵抗性及び増加した筋肉タンパク質分解は悪液質と高頻度で関連している。悪液質は、飢餓、原発性うつ病、吸収不良及び甲状腺機能亢進症とは区別され、罹患率の増加に関連する。悪液質は、癌、（タンパク質合成の減少及びタンパク質異化の増加からの）代謝性アシドーシス、特定の感染性疾患（例えば、結核、ＡＩＤＳを含む細菌感染）、ある種の自己免疫障害、アンフェタミン若しくはコカインなどの薬物に対する嗜癖、慢性アルコール中毒及び／又は肝臓の硬変症、慢性炎症障害、食欲不振、神経学的状態及び／又は神経変性疾患を含む種々の基礎障害に関連し得るか、又はかかる基礎障害の（直接的又は間接的な）結果であり得る。一例において、悪液質は癌悪液質（癌に関連する悪液質）である。他の例において、神経変性疾患、多発性硬化症、脊髄損傷などの種々の疾患に起因する神経学的状態、不動性又は可動性不良に関連する筋肉消耗及び／又は意図しない体重喪失がこの用語に含まれる。悪液質は、以下のうちの１つ又は複数に基づいて診断され得る。
６か月間の期間にわたる少なくとも５％の体重喪失（飢餓の非存在下）；
体重喪失と共にＢＭＩ＜２０；又は
体重喪失と共に筋肉減少症と一致する付属器官骨格筋指数（男性＜７．２６ｋｇ／ｍ２；女性＜５．４５ｋｇ／ｍ２）
【０２９１】
本明細書において、「前悪液質」とは、基礎状態（例えば慢性状態）に関連し、対象の体重の約５％未満の意図しない体重喪失；及び慢性又は再発性の全身炎症応答を特徴とする状態を意味するものと理解される。
【０２９２】
本明細書において、「意図しない体重喪失」は、対象が健康な体重を維持できない状態、又は体重を減らすことを実際に試みることなしに体重のかなりの量を喪失する状態を指す。例えば、１８．５未満の肥満度指数（又は専門医によって規定される任意の別のＢＭＩ範囲）は体重不足とみなされる。
【０２９３】
本開示において、「肥満度指数」は式：重量（ｋｇ）／身長（ｍ）２によって計算される。
【０２９４】
本開示において、「除脂肪体重」とは、対象における脂肪（例えば、白色脂肪組織）以外の組織の重量を意味するものと解釈すべきである。除脂肪体重は、（例えばノギスを用いて）対象の脂肪含量を概算し、対象の重量からこの量を差し引くこと、又は空気置換プレチスモグラフィー若しくは二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＥＸＡ）を使用することによって計算又は推定され得る。
【０２９５】
「総体重」とは対象の体重を意味するものと理解される。
【０２９６】
対象の「総体的健康」という場合、嗜眠若しくは疲労、呼吸数、姿勢、疼痛、又は対象の健康の他のスコア（例えば、当分野で知られているもの）のうちの１つ又は複数を含むことを当業者は本明細書の記載から理解するであろう。例えば、改善された総体的健康を生じる本開示のＦｎ１４結合性タンパク質による対象の処置は、ｎ１４結合性タンパク質が投与されていない関連の状態に罹患している対象と比較して、低減したレベルの嗜眠若しくは疲労、増加した呼吸数、より深い呼吸又は改善された姿勢のうちの１つ又は複数を生じる。
【０２９７】
本明細書において、「グルコース代謝障害」とは、対象が、１つ又は複数の形態の炭水化物を分解又は代謝又は摂取又は使用することができないか、或いは分解又は代謝又は摂取又は使用する減少した能力を有しており、対象の血流における増加したレベルのかかる炭水化物を一般に導く任意の障害を意味するものと解釈すべきである。例えば、炭水化物代謝障害は、炭水化物の分解に関与するホルモンの膵臓による低減した産生、例えばアミラーゼの産生に関連する又はかかる産生によって引き起こされる。一例において、この炭水化物代謝障害は、炭水化物の取り込みに関与するホルモンの膵臓による低下した産生、例えばインスリンの産生に関連する又はかかる産生によって引き起こされる。例示的な炭水化物代謝障害には、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、特発性Ｉ型糖尿病（Ｉｂ型）、早期発症ＩＩ型糖尿病（ＥＯＤ）、若年発症型非定型糖尿病（ＹＯＡＤ）、若年発症型成人発症型糖尿病（ＭＯＤＹ）、栄養不良関連糖尿病、妊娠糖尿病、耐糖能障害（ＩＧＴ）の状態、空腹時血漿グルコース不良の状態、代謝性アシドーシス、ケトーシス、シンドロームＸ、高血糖症、低インスリン血症、インスリン抵抗性、αマンノース症、βマンノース症、フルクトース不耐症、フコシド症、ガラクトース血症、リー病、ムコリピドーシス、ムコ多糖症、又は上述のいずれか１つ若しくは複数の合併症が含まれる。一例において、このグルコース代謝障害は糖尿病（例えばＩ型糖尿病）である。
【０２９８】
一例において、糖尿病に罹患している対象は、例えば下記の、臨床的に受容された糖尿病のマーカーを有する。
７ｍｍｏｌ／Ｌ又は１２６ｍｇ／ｄｌ以上の空腹時血漿グルコース；
糖尿病の症状を伴う、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ又は２００ｍｇ／ｄｌ以上の随時血糖（一日の任意の時点で取得する。）
【０２９９】
２時間間隔で測定された、１１．１ｍｍｏｌ／Ｌ又は２００ｍｇ／ｄｌ以上の経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）値。このＯＧＴＴは、２時間又は３時間の期間にわたって与えられる。
【０３００】
本明細書において、「予防すること」、「予防する」又は「予防」という語は、特定の疾患又は状態の少なくとも１つの症状の発症を停止又は妨げるのに十分な治療有効量の本開示のタンパク質を投与することを含む。
【０３０１】
本明細書において、「処置すること」、「処置する」又は「処置」という語は、特定の疾患又は状態の少なくとも１つの症状を低減又は排除するのに十分な治療有効量の本明細書に記載のタンパク質を投与することを含む。
【０３０２】
本明細書において、「対象」とは、哺乳動物を含む任意の動物を意味するものと解釈すべきである。例示的な対象にはヒト又は非ヒト霊長類が含まれる。一例において、この対象はヒトである。
【０３０３】
「サンプル」は、列挙されたサンプル（例えば、血液又は尿サンプル）及びその任意の画分（例えば、血漿、血清又はバフィーコート）若しくはそれらから誘導される細胞（例えば末梢血単核球）又はそれらの処理された形態を包含するものと解釈すべきである。
【０３０４】
「異所的に発現される」とは、細胞が列挙されたタンパク質を発現できるようにその細胞が遺伝子改変されていることを意味するものと理解される。例えば、Ｆｎ１４を異所的に発現する細胞は、Ｆｎ１４を発現できるように遺伝子改変されている。これに関して、遺伝子改変の前に内因性Ｆｎ１４を発現していてもしていなくてもよい。
【０３０５】
抗体ベースのＦｎ１４結合性タンパク質：
抗体：
抗体を生成する方法は当分野で知られており、及び／又はＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）若しくはＺｏｌａ（１９８７）に記載されている。一般に、かかる方法において、任意の適切な又は所望の担体、アジュバント又は薬学的に許容可能な賦形剤と共に任意選択で製剤化された、Ｆｎ１４タンパク質又はその免疫原性断片若しくはエピトープ、或いはこれら（すなわち免疫原）を発現及びディスプレイする細胞が、非ヒト動物対象、例えば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ又はブタに投与される。この免疫原は、鼻腔内、筋内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内又は他の公知の経路で投与され得る。
【０３０６】
ポリクローナル抗体の生成は、免疫化後の種々の時点で、免疫した動物の血液をサンプリングすることによってモニタリングされ得る。所望の抗体力価を達成することが必要な場合、１回又は複数回のさらなる免疫化が与えられ得る。追加免疫及び力価決定のプロセスが、適切な力価が達成されるまで繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られた場合、免疫した動物から出血させ、血清を単離して保存する、及び／又はこの動物を用いてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成する。
【０３０７】
モノクローナル抗体は、本開示によって企図される例示的な抗体である。「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」又は「ＭＡｂ」は、同じ抗原に、例えば抗原内の同じエピトープに結合することが可能な均質な抗体集団を指す。この用語は、抗体の供給源又はかかる抗体が製造される様式に関して限定されることを意図しない。
【０３０８】
ｍＡｂの生成のために、例えば米国特許第４，１９６，２６５号又はＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）又はＺｏｌａ（１９８７）中に例示される手順などの、多数の公知技術のうちのいずれか１つを使用することができる。
【０３０９】
例えば、抗体生成細胞を刺激するのに十分な条件下で、有効量の、タンパク質又はその免疫原性断片若しくはエピトープ或いはこれらを発現する細胞を用いて、適切な動物が免疫される。ウサギ、マウス及びラットなどのげっ歯動物が例示的な動物であり、マウスが最も一般的に使用される。（例えば国際公開第２００２／０６６６３０号パンフレットに記載されるように、）ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現し、ネズミ免疫グロブリンタンパク質を発現しないように遺伝子操作されたマウスもまた、本開示の抗体を生成するために使用され得る。
【０３１０】
免疫化後、抗体を生成する能力を有する体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）がＭＡｂ生成プロトコルにおける使用のために選択される。これらの細胞は、脾臓、扁桃腺若しくはリンパ節の生検から又は末梢血サンプルから得ることができる。次いで、免疫した動物由来のＢ細胞が、一般的にはこの免疫原で免疫された動物と同じ種から誘導された不死骨髄腫細胞の細胞と融合される。Ｂ細胞と不死細胞とを、細胞膜の融合を促進する因子（単数又は複数）（化学的又は電気的）の存在下で、これらの細胞型の混合物をインキュベートすることによって融合させる。センダイウイルスを使用する融合法は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５）並びにＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７６）に記載されている。３７％（ｖ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのＰＥＧを使用する方法はＧｅｆｔｅｒら、（１９７７）に記載されている。電気的に誘導される融合方法の使用もまた適切である。
【０３１１】
ハイブリッドは、組織培養培地中でのヌクレオチドのｄｅ  ｎｏｖｏ合成を遮断する薬剤を含む選択培地中での培養によって増幅される。例示的な薬剤はアミノプテリン、メトトレキサート及びアザセリンである。
【０３１２】
増幅されたハイブリドーマは、例えばフローサイトメトリー及び／又は免疫組織化学及び／又はイムノアッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドットイムノアッセイなど）などによる、抗体の特異性及び／又は力価についての機能的選択に供される。本開示はまた、本明細書に記載されるような抗体生成細胞のサブクローニングを企図する。
【０３１３】
あるいは、ＡＢＬ−ＭＹＣ技術（ＮｅｏＣｌｏｎｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ  ５３７１３、ＵＳＡ）が、（例えば、Ｋｕｍａｒら、１９９９に記載されるように）ＭＡｂを分泌する細胞株を生成するために使用される。
【０３１４】
抗体は、例えば、米国特許第６３０００６４号、欧州特許第０３６８６８４号及び／又は米国特許第５８８５７９３号に記載されるように、ファージディスプレイライブラリーなどのディスプレイライブラリーをスクリーニングすることによっても生成又は単離され得る。
【０３１５】
キメラ抗体及びタンパク質：
一例において、本開示の抗体又はＦｎ１４結合性タンパク質がキメラ抗体であるか、あるいはＦｎ１４結合性タンパク質がキメラタンパク質である。「キメラタンパク質」は、抗原結合性ドメインＶＨ又はＶＬが、特定の種（例えば、ネズミ、例えばマウス又はラット）から誘導された又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属するタンパク質における対応する配列と同一若しくは相同であるが、鎖タンパク質の残部が、別の種（例えば霊長類、例えばヒト）から誘導された又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属するタンパク質における対応する配列と同一若しくは相同であるタンパク質を指す。一例において、キメラタンパク質は、非ヒト抗体（例えばネズミ抗体）由来のＶＨ及びＶＬを含むキメラ抗体であり、この抗体の残部領域はヒト抗体由来である。かかるキメラタンパク質の生成は当分野で知られており、（例えば、米国特許第６３３１４１５号、米国特許第５８０７７１５号、米国特許第４８１６５６７号及び米国特許第４８１６３９７号に記載される）標準的な手段によって達成され得る。
【０３１６】
ヒト化及びヒト抗体／タンパク質：
本開示の抗体又はＦｎ１４結合性タンパク質はヒト化抗体／タンパク質であってもヒト抗体／タンパク質であってもよい。
【０３１７】
「ヒト化タンパク質」は、ヒト抗体由来のＦＲ上に移植された又はかかるＦＲ中に挿入された、非ヒト種由来の抗体由来のＣＤＲを含むヒト様可変領域を含むタンパク質を指すものと理解すべきである（この型の抗体は「ＣＤＲ移植抗体」とも呼ばれる）。ヒト化タンパク質には、ヒトタンパク質の１つ又は複数の残基が、１つ又は複数のアミノ酸置換によって改変されているタンパク質、及び／又はヒトタンパク質の１つ又は複数のＦＲ残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられているタンパク質もまた含まれる。ヒト化タンパク質はまた、ヒト抗体中又は非ヒト抗体中のいずれかにおいて見出される残基を含んでいてもよい。タンパク質の任意のさらなる領域（例えばＦｃ領域）は一般にヒトである。ヒト化は、米国特許第５２２５５３９号、米国特許第６０５４２９７号、米国特許第７５６６７７１号又は米国特許第５５８５０８９号などの、当分野で知られている方法を用いて実施され得る。「ヒト化タンパク質」はまた、例えば米国特許第７７３２５７８号に記載されるような超ヒト化タンパク質を包含する。
【０３１８】
一例において、ヒト化タンパク質は、本明細書に開示される軽鎖配列中の２７ｄと３４との間、５０と５５との間及び８９と９６との間の領域；並びに本明細書に開示される重鎖配列中の３１と３５ｂとの間、５０と５８との間及び９５と１０１との間の領域（Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う番号付け）を含む。これに関して、Ｐａｄｌａｎら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、９：１３３〜１３９、１９９５は、これらの領域が抗原と結合又は接触する可能性が最も高い領域であるという証拠を提示している。
【０３１９】
本明細書において、「ヒトタンパク質」は、ヒト、例えばヒト生殖系列細胞又は体細胞において見出される配列から誘導された又はかかる配列に対応する、可変抗体領域及び任意選択で定常抗体領域を有するタンパク質を指す。「ヒト」抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダム変異又は部位特異的変異によって導入された変異（特に、タンパク質の少数の残基、例えばそのタンパク質の残基のうち１つ、２つ、３つ、４つ又は５つにおける保存的置換又は変異を含む変異）を含み得る。これらの「ヒト抗体」は、ヒトの免疫応答の結果として実際に生成される必要はなく、これらのヒト抗体は、組換え手段（例えば、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング）を用いて、及び／又はヒト抗体の定常領域及び／又は可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物（例えばマウス）によって、及び／又は（例えば米国特許第５５６５３３２号に記載される）ガイドされた選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を用いて生成され得る。この用語は、かかる抗体の親和性成熟した形態もまた包含する。ヒトタンパク質はまた、例えば米国特許第６３０００６４号及び／又は米国特許第６２４８５１６号に記載されるような、ヒト抗体由来のＦＲ、又はヒトＦＲのコンセンサス配列由来の配列を含むＦＲを含み、１つ又は複数のＣＤＲがランダム又は半ランダムであるタンパク質を含むとみなされる。
【０３２０】
選択されたエピトープを認識するヒトタンパク質又は抗体は、「ガイドされた選択」と呼ばれる技術を用いても生成され得る。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体が、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドするために使用される（Ｊｅｓｐｅｒｓら、１９８８）。
【０３２１】
本開示のヒトＦｎ１４結合性タンパク質はヒト抗体の可変領域を含む。
【０３２２】
シンヒト化タンパク質及び霊長類化タンパク質：
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質はシンヒト化（ｓｙｎｈｕｍａｎｉｚｅｄ）タンパク質であり得る。「シンヒト化タンパク質」は、国際公開第２００７／０１９６２０号パンフレットに記載される方法によって調製されるタンパク質を指す。シンヒト化Ｆｎ１４結合性タンパク質は抗体の可変領域を含み、該可変領域は、新世界霊長類抗体可変領域由来のＦＲ及び非新世界霊長類抗体可変領域由来のＣＤＲを含む。例えば、シンヒト化Ｆｎ１４結合性タンパク質は抗体の可変領域を含み、該可変領域は、例えば本明細書に記載されるような、新世界霊長類抗体可変領域由来のＦＲ及びマウス抗体由来のＣＤＲを含む。一例において、シンヒト化Ｆｎ１４結合性タンパク質は、一方又は両方の可変領域がシンヒト化されたＦｎ１４結合性抗体である。
【０３２３】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は霊長類化タンパク質であり得る。「霊長類化タンパク質」は、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）の免疫化後に生成される抗体由来の可変領域を含む。任意選択で、非ヒト霊長類抗体の可変領域は、霊長類化抗体を生成するためにヒト定常領域に連結される。霊長類化抗体を生成するための例示的な方法は米国特許第６１１３８９８号に記載されている。
【０３２４】
脱免疫化抗体及びタンパク質：
本開示は、脱免疫化抗体又はＦｎ１４結合性タンパク質もまた包含する。脱免疫化抗体及びＦｎ１４結合性タンパク質は、１つ又は複数のエピトープ、例えば、Ｂ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープが除去（すなわち変異）されており、それにより、対象がこの抗体又はタンパク質に対する免疫応答を惹起する可能性を低減する。脱免疫化抗体及びタンパク質を生成する方法は当分野で知られており、例えば、国際公開第００／３４３１７号パンフレット、国際公開第２００４／１０８１５８号パンフレット及び国際公開第２００４／０６４７２４号パンフレットに記載されている。
【０３２５】
適切な変異を導入し、得られたタンパク質を発現及びアッセイする方法は本明細書の記載に基づいて当業者に明らかとなろう。
【０３２６】
抗体可変領域含有タンパク質：
単一ドメイン抗体：
いくつかの例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は単一ドメイン抗体（「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」という語と相互交換可能に使用される。）である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変領域の全部又は一部を含む単一のポリペプチド鎖である。特定の例において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６号；国際公開第９０／０５１４４号パンフレット及び／又は国際公開第２００４／０５８８２０号パンフレットを参照のこと）。
【０３２７】
ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ：
抗体抗原結合性ドメインを含む例示的なＦｎ１４結合性タンパク質は、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ及びより高次のタンパク質複合体、例えば国際公開第９８／０４４００１号パンフレット及び国際公開第９４／００７９２１号パンフレットに記載されたものである。
【０３２８】
例えば、ダイアボディは、各ポリペプチド鎖が構造ＶＬ−Ｘ−ＶＨ又はＶＨ−Ｘ−ＶＬ［構造中、ＶＬは抗体軽鎖可変領域であり、ＶＨは抗体重鎖可変領域であり、Ｘは、単一のポリペプチド鎖中のＶＨ及びＶＬが会合する（又はＦｖを形成する）のを可能にするのに不十分な残基を含むリンカーであるか又は存在せず、一方のポリペプチド鎖のＶＨは他方のポリペプチド鎖のＶＬに結合して抗原結合部位を形成する、すなわち、１つ又は複数の抗原に特異的に結合することが可能なＦｖ分子を形成する。］を含む２つの会合したポリペプチド鎖を含むタンパク質である。ＶＬ及びＶＨは各ポリペプチド鎖において同じであってもよく、あるいはＶＬ及びＶＨは、二重特異的ダイアボディ（すなわち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含む。）を形成するように各ポリペプチド鎖において異なっていてもよい。
【０３２９】
単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片：
当業者は、ｓｃＦｖが単一のポリペプチド鎖中にＶＨ領域及びＶＬ領域を含むことを認識するであろう。このポリペプチド鎖は、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成する（すなわち、単一のポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬが互いに会合してＦｖを形成する）のを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨとＶＬとの間にさらに含む。例えば、リンカーは１２個を超えるアミノ酸残基を含み、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３はｓｃＦｖのより好ましいリンカーの１つである。
【０３３０】
本開示ではまた、ジスルフィド安定化されたＦｖ（又はｄｉＦｖ又はｄｓＦｖ）が企図されており、ここでは、単一のシステイン残基がＶＨのＦＲ及びＶＬのＦＲ中に導入され、ジスルフィド結合によってこれらのシステイン残基が連結されて安定なＦｖを得る（例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、１９９３を参照のこと）。
【０３３１】
あるいは又はさらに、本開示は、二量体ｓｃＦｖ、すなわち、非共有結合又は共有結合、例えば、（例えばＦｏｓ又はＪｕｎから誘導される）ロイシンジッパードメインによって連結された２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質を提供する（例えば、Ｋｒｕｉｆ及びＬｏｇｔｅｎｂｅｒｇ、１９９６を参照のこと）。あるいは、２つのｓｃＦｖは、例えば米国特許出願公開第２００６０２６３３６７号に記載されるように、両方のｓｃＦｖを形成させ、抗原に結合させるのに十分な長さのペプチドリンカーによって連結される。
【０３３２】
ｓｃＦｖの総説についてはＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）を参照のこと。
【０３３３】
ミニボディ：
当業者は、ミニボディが、抗体のＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインに融合した抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むことを認識するであろう。任意選択で、このミニボディはＶＨとＶＬとの間にヒンジ領域を含み、この立体構造はＦｌｅｘ  Ｍｉｎｉｂｏｄｙと呼ばれる場合がある。ミニボディはＣＨ１もＣＬも含まない。一例において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは抗体のヒンジ領域及びＣＨ３ドメインに融合される。ミニボディの少なくとも１つの可変領域は本開示の様式でＦｎ１４に結合する。例示的なミニボディ及びその生成方法は例えば国際公開第９４／０９８１７号パンフレットに記載されている。
【０３３４】
他の抗体可変領域含有タンパク質：
本開示はまた、例えば下記のような他の可変領域含有Ｆｎ１４結合性タンパク質を包含する。
（ｉ）米国特許第５，７３１，１６８号に記載されるような、「鍵と鍵穴」二重特異的タンパク質；
（ｉｉ）例えば米国特許第４，６７６，９８０号に記載されるような、ヘテロコンジュゲートタンパク質；
（ｉｉｉ）例えば米国特許第４，６７６，号に記載されるような、化学的架橋剤を用いて生成されるヘテロコンジュゲートタンパク質；
（ｉｖ）例えばＳｈａｌａｂｙ（１９９２）号に記載されるような、Ｆａｂ’−ＳＨ断片；
（ｖ）単鎖Ｆａｂ；又は
（ｖｉ）Ｆａｂ３（例えば欧州出願公開第１９９３０３０２８９４号に記載のもの）
【０３３５】
非抗体ベースの抗原結合性ドメイン含有タンパク質：
免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片：
本開示の化合物の例は、免疫グロブリン、例えばＴ細胞受容体又は重鎖免疫グロブリン（例えば、ＩｇＮＡＲ、ラクダ科動物抗体）の可変領域を含むタンパク質である。
【０３３６】
「免疫グロブリン」という語は、免疫グロブリンドメインを含む任意の抗原結合性タンパク質を含むものと理解される。例示的な免疫グロブリンは抗体である。「免疫グロブリン」という語によって包含されるさらなるタンパク質には、ドメイン抗体、ラクダ科動物抗体及び軟骨魚由来抗体（すなわち免疫グロブリン新抗原受容体（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＩｇＮＡＲ））が含まれる。一般に、ラクダ科動物抗体及びＩｇＮＡＲはＶＨを含むがＶＬを欠き、しばしば重鎖免疫グロブリンと呼ばれる。他の「免疫グロブリン」にはＴ細胞受容体が含まれる。
【０３３７】
重鎖免疫グロブリン：
重鎖免疫グロブリンは、重鎖を含むが軽鎖を含まない限りにおいて、多数の他の形態の免疫グロブリン（例えば抗体）とは構造的に異なる。したがって、これらの免疫グロブリンは「重鎖のみの抗体」とも呼ばれる。重鎖免疫グロブリンは、例えば、ラクダ科動物及び軟骨魚（ＩｇＮＡＲとも呼ばれる）において見出される。
【０３３８】
天然に存在する重鎖免疫グロブリン中に存在する可変領域は、従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変領域（「ＶＨドメイン」と呼ばれる。）及び従来の４鎖抗体中に存在する軽鎖可変領域（「ＶＬドメイン」と呼ばれる。）と識別するために、ラクダ科動物Ｉｇ中の「ＶＨＨドメイン」及びＩｇＮＡＲ中のＶ−ＮＡＲと一般に呼ばれる。
【０３３９】
重鎖免疫グロブリンは、高い親和性及び高い特異性で関連の抗原に結合するために軽鎖の存在を必要とすることはない。これは、単一ドメイン結合性断片が重鎖免疫グロブリン（発現が容易であり、一般に安定で可溶性である。）から誘導され得ることを意味する。
【０３４０】
ラクダ科動物由来の重鎖免疫グロブリン及びその可変領域、並びにその生成及び／又は単離及び／又は使用の方法の一般的な記載は、とりわけ国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、国際公開第９７／４９８０５号パンフレット及び国際公開第９７／４９８０５号パンフレット中に見出される。
【０３４１】
軟骨魚由来の重鎖免疫グロブリン及びその可変領域、並びにその生成及び／又は単離及び／又は使用の方法の一般的な記載は、とりわけ国際公開第２００５／１１８６２９号パンフレット中に見出される。
【０３４２】
Ｖ様タンパク質：
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質の例はＴ細胞受容体である。Ｔ細胞受容体は、抗体のＦｖモジュールに類似した構造へと組み合わされる、２つのＶドメインを有する。Ｎｏｖｏｔｎｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：８６４６〜８６５０、１９９１は、Ｔ細胞受容体の２つのＶドメイン（α及びβと称される。）がどのように融合され単鎖ポリペプチドとしてどのように発現され得るか、及びさらに、表面残基を変更することが抗体ｓｃＦｖに直接類似した疎水性をどのように低減するかを記載している。２つのＶαドメイン及びＶβドメインを含む単鎖Ｔ細胞受容体又は多量体Ｔ細胞受容体の生成を記載する他の刊行物には、国際公開第１９９９／０４５１１０号パンフレット又は国際公開第２０１１／１０７５９５号パンフレットが含まれる。
【０３４３】
抗原結合性ドメインを含む他の非抗体タンパク質には、一般的には一量体であるＶ様ドメインを有するタンパク質が含まれる。かかるＶ様ドメインを含むタンパク質の例にはＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８及びＩＣＯＳが含まれる。かかるＶ様ドメインを含むタンパク質のさらなる開示は国際公開第１９９９／０４５１１０号パンフレット中に含まれている。
【０３４４】
アドネクチン：
一例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質はアドネクチンである。アドネクチンは、ループ領域が抗原結合を付与するために変更された、ヒトフィブロネクチンの１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインに基づく。例えば、１０Ｆｎ３ドメインのβサンドイッチの末端における３つのループは、アドネクチンが抗原を特異的に認識するのを可能にするように操作され得る。さらなる詳細については、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号又は国際公開第２００５／０５６７６４号パンフレットを参照のこと。
【０３４５】
アンチカリン：
さらなる例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、アンチカリンである。アンチカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの疎水性小分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである、リポカリンから誘導される。リポカリンは、抗原に結合するように操作され得る錐体構造の解放端において複数のループを有する強固なβシート二次構造を有する。かかる操作されたリポカリンはアンチカリンとして知られている。アンチカリンのさらなる記載については、米国特許第７２５０２９７号又は米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照のこと。
【０３４６】
アフィボディ：
さらなる例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、アフィボディである。アフィボディは、抗原に結合するように操作され得る、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡのＺドメイン（抗原結合性ドメイン）から誘導されたスキャフォールドである。このＺドメインは、およそ５８アミノ酸の３らせんバンドルからなる。表面残基のランダム化によってライブラリーが生成されている。さらなる詳細については欧州特許第１６４１８１８号を参照のこと。
【０３４７】
アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）：
さらなる例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、アビマーである。アビマーは、Ａドメインスキャフォールドファミリーから誘導されるマルチドメインタンパク質である。およそ３５アミノ酸のネイティブドメインは、規定されたジスルフィド結合した構造を取る。多様性は、Ａドメインのファミリーによって示される天然のバリエーションのシャッフリングによって生成される。さらなる詳細については、国際公開第２００２０８８１７１号パンフレットを参照のこと。
【０３４８】
ＤＡＲＰｉｎ：
さらなる例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質はアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）である。ＤＡＲＰｉｎは、内在性膜タンパク質の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンから誘導される。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックス及び１つのβシートからなる３３残基のモチーフである。ＤＡＲＰｉｎは、各リピートの第１のαヘリックス及びβシート中の残基をランダム化することによって、異なる標的抗原に結合するように操作され得る。ＤＡＲＰｉｎの結合界面は、モジュールの数を増加させること（親和性成熟の方法）によって増加され得る。さらなる詳細については、米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照のこと。
【０３４９】
他の非抗体ポリペプチド：
結合性ドメインを含む他の非抗体タンパク質には、ヒトγ−クリスタリン及びヒトユビキチン（アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ））、ヒトプロテアーゼインヒビターのクニッツ型ドメイン、Ｒａｓ結合性タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、サソリ毒素（カリブドトキシン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン（ｔｅｔｒａｎｅｃｔｉｎ））に基づくタンパク質が含まれる。
【０３５０】
定常領域：
本開示は、可変領域及び定常領域又はそれらのドメイン、例えば、Ｆｃ、ＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインを含むＦｎ１４結合性タンパク質を包含する。当業者は、本明細書の開示及び本明細書に記載される参考文献に基づいて定常領域及び定常ドメインという語の意味を知るであろう。
【０３５１】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質を生成するのに有用な定常領域配列は、多数の異なる供給源から得ることができる。いくつかの例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質の定常領域又はその一部はヒト抗体から誘導される。さらに、定常ドメイン又はその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む任意の抗体クラス、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意の抗体アイソタイプから誘導され得る。一例において、ヒトアイソタイプＩｇＧ１が使用される。
【０３５２】
種々の定常領域遺伝子配列は、公にアクセス可能な寄託物の形態で入手可能であるか、又はその配列は、公に利用可能なデータベースから入手可能である。特定のエフェクター機能を有する（又は特定のエフェクター機能を欠く）又は免疫原性を低減するための特定の改変を有する定常領域が選択され得る。
【０３５３】
一例において、本開示のタンパク質は、Ｆｎ１４を発現する細胞の少なくとも部分的な枯渇、実質的な枯渇又は排除を促進する又は可能にするエフェクター機能を有する又は示す。かかるエフェクター機能は、Ｆｃ受容体に対する増強された結合親和性、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）であり得る。
【０３５４】
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、増強されたレベルのエフェクター機能を誘導することが可能である。
【０３５５】
一例において、定常領域によって誘導されるエフェクター機能のレベルは、ＩｇＧ１抗体の野生型Ｆｃ領域又はＩｇＧ３抗体の野生型Ｆｃ領域と比較して増強されている。
【０３５６】
別の例において、定常領域は、改変なしの定常領域と比較して、この定常領域が誘導することが可能なエフェクター機能のレベルを増加させるために改変される。かかる改変は、アミノ酸レベル及び／又は二次構造レベル及び／又は三次構造レベルにおけるもの及び／又はＦｃ領域のグリコシル化に対するものであり得る。
【０３５７】
当業者は、より高いエフェクター機能が、例えばより高いレベルの効果、より持続性の効果、又はより速い速度の効果として、多数の方法のいずれかにおいて現れ得ることを認識するであろう。
【０３５８】
例示的な定常領域改変には、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けしたＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ又はＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けしたＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅなどのアミノ酸置換が含まれる。
【０３５９】
Ｆｃ領域がエフェクター機能を誘導する能力を増加させるさらなるアミノ酸置換は、当分野で知られており、及び／又は例えば米国特許第６７３７０５６号若しくは米国特許第７３１７０９１号に記載されている。
【０３６０】
一例において、定常領域のグリコシル化は、増強されたエフェクター機能を誘導するその能力を増加させるように変更される。いくつかの例において、本開示に従うＦｃ領域は、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付着したフコースを欠く炭水化物構造を含む、すなわち、このＦｃ領域は「アフコシル化」されている。かかるバリアントは、ＡＤＣＣを誘導する改善された能力を有し得る。アフコシル化抗体を生成する方法は、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を発現することが不可能な細胞株においてＦｎ１４結合性タンパク質を発現させることを含む（例えば、Ｙｕｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、２００４に記載されている通り）。他の方法には、増強されたエフェクター機能を誘導することが可能な抗体を生得的に生成する細胞株（例えば、ウイルスワクチンの生成のためのアヒル胚由来幹細胞、国際公開第２００８／１２９０５８号パンフレット；トリＥＢＸ（登録商標）細胞における組換えタンパク質生成、国際公開第２００８／１４２１２４号パンフレット）の使用が含まれる。
【０３６１】
Ｆｎ１４結合性タンパク質は、増強されたレベルのＣＤＣを誘導することが可能なＦｃ領域もまた含み得る。例えば、ＩｇＧ１とＩｇＧ３とのハイブリッドは、増強されたＣＤＣ活性を有する抗体を生成する（Ｎａｔｓｕｍｅら、２００８）。
【０３６２】
抗体又はその抗原結合性断片がエフェクター機能を誘導する能力を決定する方法は当分野で知られており、及び／又は本明細書に記載されている。
【０３６３】
別の例において、上記タンパク質は、Ｆｎ１４結合性タンパク質の半減期を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、新生児Ｆｃ領域（ＦｃＲｎ）に対する定常領域の親和性を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む定常領域を含む。例えば、この定常領域は、エンドソームにおけるＦｃ／ＦｃＲｎ結合を促進するために、より低いｐＨ、例えば約ｐＨ６．０で、ＦｃＲｎに対する増加した親和性を有する。一例において、この定常領域は、約ｐＨ７．４におけるその親和性と比較して、約ｐＨ６においてＦｃＲｎに対する増加した親和性を有し、細胞リサイクル後の血液中へのＦｃの再放出を促進する。これらのアミノ酸置換は、血液からのクリアランスを低減することによって、タンパク質の半減期を延長するのに有用である。
【０３６４】
例示的なアミノ酸置換には、ＥＵ番号付けシステムに従って、Ｔ２５０Ｑ及び／又はＭ４２８Ｌ若しくはＴ２５２Ａ、Ｔ２５４Ｓ及びＴ２６６Ｆ若しくはＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ若しくはＨ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆが含まれる。さらなる又は代替的なアミノ酸置換は、例えば米国特許出願公開第２００７０１３５６２０号又は米国特許第７０８３７８４号に記載されている。
【０３６５】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質を中和することは、ＩｇＧ４定常領域又は安定化されたＩｇＧ４定常領域を含み得る。「安定化されたＩｇＧ４定常領域」とは、Ｆａｂアーム交換、又はＦａｂアーム交換を受ける傾向、又は半抗体の形成、又は半抗体を形成する傾向を低減するように改変されたＩｇＧ４定常領域を意味するものと理解される。「Ｆａｂアーム交換」は、ＩｇＧ４重鎖及び付属の軽鎖（半分子）が、別のＩｇＧ４分子由来の重鎖−軽鎖対と交換されるヒトＩｇＧ４のタンパク質改変の１つの型を指す。したがって、ＩｇＧ４分子は、２つの別個の抗原を認識する２つの別個のＦａｂアームを獲得し得る（二重特異的分子を生じる）。Ｆａｂアーム交換は、ｉｎ  ｖｉｖｏで天然に発生し、精製された血液細胞又は還元型グルタチオンなどの還元剤によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導され得る。ＩｇＧ４抗体が解離して、それぞれが単一の重鎖及び単一の軽鎖を含む２つの分子を形成する場合に、「半抗体」が形成される。
【０３６６】
一例において、安定化されたＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔのシステムに従うヒンジ領域の２４１位においてプロリンを含む。この位置は、ＥＵ番号付けシステムに従うヒンジ領域の２２８位に対応する。ヒトＩｇＧ４では、この残基は一般にはセリンである。プロリンのセリンによる置換の後、このＩｇＧ４ヒンジ領域は配列ＣＰＰＣを含む。これに関して、当業者は、この「ヒンジ領域」が、抗体の２つのアームに可動性を付与する、Ｆｃ領域とＦａｂ領域とを連結する抗体重鎖定常領域のプロリンリッチ部分であることを認識するであろう。このヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド結合に関与するシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従って、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２２６からＰｒｏ２４３までのストレッチとして一般に規定される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置にある重鎖間ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成する第１のシステイン残基及び最後のシステイン残基を置き換えることによって、ＩｇＧ１配列とアラインされ得る（例えば、国際公開第２０１０／０８０５３８号パンフレットを参照のこと）。
【０３６７】
変異体タンパク質：
本開示は、本開示の配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、本明細書に記載され、又は特許請求されるのと同じ機能的特徴を有するＦｎ１４結合性タンパク質を提供する。
【０３６８】
一例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、本明細書に開示されるＶＬ配列に対して、少なくとも８０％又は８５％又は９０％又は９１％又は９２％又は９３％又は９４％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％の同一性を有する配列を含むが、この配列が配列番号１４の残基５７に対応する位置にセリンを含むことを条件とする。これに関して、本発明者らは、その全長にわたって少なくとも約９２％の同一性を共有するいくつかの抗体を同定した。
【０３６９】
別の例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、本明細書に記載された本開示のＶＨに対して、少なくとも７０％又は７５％又は８０％又は８５％又は９０％又は９１％又は９２％又は９３％又は９４％又は９５％又は９６％又は９７％又は９８％又は９９％の同一性を有する配列を含むが、この配列が、配列番号１３の３１位に対応する位置におけるトリプトファン、配列番号１３の５４位に対応する位置におけるグルタミン、配列番号１３の１０１位に対応する位置におけるアルギニン又はセリン、配列番号１３の１０７位に対応する位置におけるヒスチジン、或いは配列番号１３の１０８位に対応する位置におけるヒスチジンのうちの１つ又は複数を含むことを条件とする。これに関して、本発明者らは、その全長にわたって少なくとも約９２％の同一性を共有するいくつかの抗体を同定した。本発明者らは、その全長にわたって６０％の同一性を共有する、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う一連のＨＣＤＲ１もまた同定した。本発明者らは、その全長にわたって７４％の同一性を共有する、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う一連のＨＣＤＲ２もまた同定した。本発明者らは、その全長にわたって約６３％の同一性を共有する、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う一連のＨＣＤＲ３もまた同定した。
【０３７０】
上述のように、重鎖ＣＤＲ２の５つのＣ末端残基が保存的又は非保存的アミノ酸置換に変異され得る（残基の２６％）こともまた当分野で知られている（Ｐａｄｌａｎら、１９９５）。本発明者らによって同定された可変性の部位（５つ）との組み合わせは、本明細書中で説明されるように、（Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う）ＣＤＲ２の配列に対する最大５２％の変動（又は少なくとも４８％の同一性）を意味する。
【０３７１】
本開示は、上述のタンパク質をコードする核酸又は中程度から高いストリンジェンシーの条件下でそれにハイブリダイズする核酸もまた提供する。
【０３７２】
本開示は、遺伝暗号の縮重の結果として本明細書に記載の配列とは異なる、配列番号１３〜２８のいずれか１つの配列を含むタンパク質をコードする核酸もまた包含する。
【０３７３】
核酸又はポリペプチドの％同一性は、ギャップ創出ペナルティー（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝５及びギャップ伸長ペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．３で、ＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ．１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）によって決定される。問い合わせ配列は少なくとも５０残基長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０残基の領域にわたって２つの配列をアラインする。例えば、この問い合わせ配列は少なくとも１００残基長であり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００残基の領域にわたって２つの配列をアラインする。一例において、これら２つの配列はその全長にわたってアラインされる。
【０３７４】
本開示は、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質の変異体形態を企図する。例えば、かかる変異体Ｆｎ１４結合性タンパク質は、本明細書に記載の配列と比較して１つ又は複数の保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、１０個の或いはより少ない、例えば９つ又は８つ又は７つ又は６つ又は５つ又は４つ又は３つ又は２つ又は１つの保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖及び／又はハイドロパシー及び／又は親水性を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。
【０３７５】
塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当分野で規定されている。ハイドロパシー指標は例えばＫｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）に記載されており、親水性指標は例えば米国特許第４５５４１０１号に記載されている。
【０３７６】
本開示は、非保存的アミノ酸変化もまた企図する。例えば、荷電アミノ酸の別の荷電アミノ酸による置換、及び中性アミノ酸又は正に荷電したアミノ酸による置換が特に興味深い。いくつかの例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、１０個の或いはより少ない、例えば９つ又は８つ又は７つ又は６つ又は５つ又は４つ又は３つ又は２つ又は１つの非保存的アミノ酸置換を含む。
【０３７７】
任意の例に従う本明細書に記載のＦｎ１４結合性タンパク質の変異体形態はＦｎ１４に特異的に結合する能力を保持する。Ｆｎ１４に対する特異的結合を決定する方法は本明細書に記載されている。例えば、標識Ｆｎ１４結合性タンパク質を、固定化されたＦｎ１４と接触させる。洗浄後、結合した標識が検出される。標識Ｆｎ１４結合性タンパク質もまた、固定化されたＦｎ１４及び関連するタンパク質又はＦｎ１４の変異体形態又はＦｎ１４の断片と接触させられ、洗浄後、結合した標識が検出される。Ｆｎ１４に結合しているが、関連するタンパク質若しくは変異体タンパク質又はＦｎ１４の断片には結合していない標識の検出は、この変異体Ｆｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４に特異的に結合する能力を保持していることを示す。
【０３７８】
一例において、変異は本開示のＦｎ１４結合性タンパク質のＦＲ内に存在する。別の例において、変異は本開示のＦｎ１４結合性タンパク質のＣＤＲ内に存在する。
【０３７９】
親和性成熟：
さらなる例において、既存の本開示のＦｎ１４結合性タンパク質が、増加した親和性でＦｎ１４に結合することが可能な抗体を生成するために親和性成熟される。例えば、ＶＬ及び／又はＶＨをコードする配列が単離され、ＣＤＲコード領域（例えば、ＶＬ及び／又はＶＨのＣＤＲ３をコードする領域）が、１つ又は複数のアミノ酸置換が導入されるように変異される。次いで、得られた変異体Ｆｎ１４結合性タンパク質は、例えば競合アッセイにおいてＦｎ１４に対する結合についてスクリーニングされる。
【０３８０】
本開示に従うＦｎ１４結合性タンパク質は可溶性分泌タンパク質であってもよく、あるいは細胞の表面又は粒子（例えば、ファージ若しくは他のウイルス、リボソーム又は胞子）上の融合タンパク質として提示されてもよい。例示的なファージディスプレイ法は、例えば、米国特許第５８２１０４７号、米国特許第６２４８５１６号及び米国特許第６１９０９０８号に記載されている。次いで、これらの方法を用いて生成されたファージディスプレイ粒子をスクリーニングして、Ｆｎ１４などの標的抗原に対する結合に十分な立体構造を有するディスプレイされたＦｎ１４結合性タンパク質を同定する。
【０３８１】
タンパク質製造：
一例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、ハイブリドーマなどの細胞株を、例えば本明細書に記載されており、及び／又は当分野で知られている、タンパク質を生成するのに十分な条件下で培養することによって製造される。
【０３８２】
組換え発現：
組換えタンパク質の場合、かかる組換えタンパク質をコードする核酸は、宿主細胞、例えば、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞などの、ジスルフィド架橋又はジスルフィド結合を生成し得る細胞中に次いでトランスフェクトされる、発現ベクターなどの１つ又は複数の発現コンストラクト中に配置される。例示的な哺乳動物細胞には、他の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞が含まれる。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は当分野で知られており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ又はＳａｍｂｒｏｏｋに記載されている。種々のクローニング及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅の方法が組換え核酸の構築に適している。組換え抗体を製造する方法は当分野で知られている。米国特許第４８１６５６７号、米国特許第７９２３２２１号及び米国特許第７０２２５００号を参照のこと。
【０３８３】
単離後、本開示のタンパク質をコードする核酸は、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため又は無細胞系中若しくは細胞中での発現のために、発現コンストラクト又は複製可能なベクター中に挿入される。例えば、この核酸はプロモーターに作動可能に連結される。
【０３８４】
本明細書において、「プロモーター」という語はその最も広い文脈で解釈すべきであり、この用語には、例えば、発生及び／又は外部刺激に応答して、又は組織特異的様式で核酸の発現を変更するさらなる調節エレメント（例えば、上流の活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー）あり又はなしで、正確な転写開始に必要なＴＡＴＡボックス又はイニシエーターエレメントを含む、ゲノム遺伝子の転写調節配列が含まれる。本発明において、「プロモーター」という語は、作動可能に連結される核酸の発現を付与、活性化又は増強する、組換え核酸、合成核酸若しくは融合核酸又は誘導体を記述するためにも使用される。例示的なプロモーターは、その核酸の発現をさらに増強するため及び／又は空間的発現及び／又は時間的発現を変更するために、１つ又は複数の特異的調節エレメントのさらなるコピーを含み得る。
【０３８５】
本明細書において、「作動可能に連結される」とは、核酸の発現がプロモーターによって制御されるように核酸に対してプロモーターを位置付けることを意味する。
【０３８６】
無細胞発現系もまた本開示によって企図される。例えば、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質をコードする核酸は、Ｔ７プロモーターなどの適切なプロモーターに作動可能に連結され、得られた発現コンストラクトは転写及び翻訳に十分な条件に曝露される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現又は無細胞発現のための典型的な発現ベクターは記載されており、ＴＮＴ  Ｔ７系及びＴＮＴ  Ｔ３系（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＥＸＰ１−ＤＥＳＴ及びｐＥＸＰ２−ＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる（これらに限定されない）。
【０３８７】
細胞における発現のための多数のベクターが入手可能である。ベクター構成要素には一般に以下のうちの１つ又は複数が含まれる（これらに限定されない）。シグナル配列、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質をコードする配列（例えば、本明細書中で提供される情報から誘導される）、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列。当業者は、タンパク質の発現に適した配列を認識するであろう。例えば、例示的なシグナル配列には、原核生物分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダー又は酸ホスファターゼリーダー）又は哺乳動物分泌シグナル（例えば単純ヘルペスｇＤシグナル）が含まれる。
【０３８８】
例示的なプロモーターには、原核生物において活性なプロモーター（例えば、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター）が含まれる。
【０３８９】
哺乳動物細胞において活性な例示的なプロモーターには、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１）、核内低分子ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α−ミオシン重鎖プロモーター、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモーター、β−アクチンプロモーター；ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーターを含むハイブリッド調節エレメント又は免疫グロブリンプロモーター或いはそれらの活性断片が含まれる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＵＳＴＲＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓株（懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＵＳＴＲＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ  ＣＣＬ  １０）；又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。
【０３９０】
例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びサッカロマイセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）を含む群から選択される酵母細胞などの酵母細胞における発現に適した典型的なプロモーターには、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター又はＴＥＦ１プロモーターが含まれる（これらに限定されない）。
【０３９１】
単離された核酸分子又はかかる単離された核酸分子を含む遺伝子コンストラクトを細胞中に導入して発現させる手段は当業者に知られている。所与の細胞に使用される技術は、公知の有効な技術によって決まる。細胞中に組換えＤＮＡを導入する手段には、とりわけ、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェクション、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、ＵＳＡ）及び／又はセルフェクチン（ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、ＵＳＡ）などを使用することによる、リポソームにより媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧ媒介性のＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルスを使用する）並びにＤＮＡ被覆されたタングステン又は金粒子などを使用することによる、微粒子銃（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ  Ｉｎｃ．、ＷＩ、ＵＳＡ）が含まれる。
【０３９２】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質を生成するために使用される宿主細胞は、使用される細胞型に依存して、種々の培地中で培養され得る。市販の培地、例えばハムＦｌ０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）が、哺乳動物細胞を培養するのに適している。本明細書に記載される他の細胞型を培養するための培地は当分野で知られている。
【０３９３】
タンパク質の単離：
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は単離又は精製され得る。
【０３９４】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質を精製する方法は当分野で知られており、及び／又は本明細書に記載されている。
【０３９５】
組換え技術を使用する場合、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、細胞内で、細胞膜周辺腔において生成され得、又は培地中に直接分泌され得る。タンパク質が細胞内で生成される場合、第１のステップとして、宿主細胞又は溶解された断片のいずれかの粒状残骸が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。タンパク質が培地中に分泌される場合、かかる発現系由来の上清が、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過単位を用いて最初に濃縮され得る。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼインヒビターが、タンパク質分解を阻害するために上述のステップのいずれか中に含まれていてもよく、抗生物質が、偶発的な汚染菌の成長を防止するために含まれていてもよい。
【０３９６】
細胞から調製されたタンパク質は、例えば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー又はプロテインＧクロマトグラフィー）又は上述の任意の組み合わせを用いて精製され得る。これらの方法は当分野で知られており、例えば、国際公開第９９／５７１３４号パンフレット又はＺｏｌａ（１９９７）に記載されている。
【０３９７】
当業者は、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質が、精製又は検出を容易にするためのタグ、例えば、ポリヒスチジンタグ、例えばヘキサヒスチジンタグ、又はインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、又はサルウイルス５（Ｖ５）タグ、又はＦＬＡＧタグ、又はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含むように改変され得ることも認識するであろう。例えば、このタグはヘキサｈｉｓタグである。次いで、得られたタンパク質は、親和性精製などの当分野で知られている方法を用いて精製される。例えば、ヘキサｈｉｓタグを含むタンパク質は、このタンパク質を含むサンプルを、固体又は半固体支持体上に固定化されたヘキサｈｉｓタグに特異的に結合するニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）と接触させ、このサンプルを洗浄して未結合のタンパク質を除去し、引き続いて結合したタンパク質を溶出させることによって、精製される。あるいは又はさらに、タグに結合するリガンド若しくは抗体が親和性精製法において使用される。
【０３９８】
コンジュゲート：
本開示は、任意の例に従う本明細書に記載のＦｎ１４結合性タンパク質のコンジュゲートもまた提供する。タンパク質がコンジュゲート化され得る化合物の例は、放射性同位体、検出可能な標識、治療的化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象におけるタンパク質の半減期を増加させる化合物及びそれらの混合物からなる群より選択される。例示的な治療剤には、抗血管新生剤、抗新血管形成剤及び／又は他の血管形成剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、化学療法剤又は治療的核酸が含まれる（これらに限定されない）。
【０３９９】
毒素には、細胞に対して有害な（例えば細胞を死滅させる）任意の薬剤が含まれる。当分野で知られているこれらのクラスの薬物及びその作用機構の説明については、Ｇｏｏｄｍａｎら、（１９９０）を参照のこと。免疫グロブリン−免疫毒素コンジュゲートの調製に適したさらなる技術は、例えば米国特許第５１９４５９４号中に提供されている。例示的な毒素には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、α−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、アレウリテス・フォーディー（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテシン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）が含まれる。例えば、国際公開第９３／２１２３２号パンフレットを参照のこと。
【０４００】
本開示のイムノコンジュゲートを形成するのに適した化学療法剤には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、クラドリビン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチン及び他の白金誘導体、例えばカルボプラチン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ））が含まれる。
【０４０１】
一例において、任意の例に従う本明細書に記載のＦｎ１４結合性タンパク質は、別の本開示のＦｎ１４結合性タンパク質、又は抗体可変領域を含むタンパク質、例えば、本明細書に記載されるような、抗体又は抗体から誘導されるタンパク質を含む別のタンパク質に、コンジュゲート化又は連結される。他のタンパク質は排除されない。さらなるタンパク質は当業者に明らかであり、例えばとりわけ、免疫調節剤又は半減期延長タンパク質又は血清アルブミンに結合するペプチド若しくは他のタンパク質が含まれる。
【０４０２】
血清アルブミン結合性のペプチド又はタンパク質の例は米国特許出願公開第２００６０２２８３６４号又は米国特許出願公開第２００８０２６０７５７号に記載されている。
【０４０３】
種々の放射性核種がラジオコンジュゲート化（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）タンパク質の生成に利用可能である。その例には、低エネルギー放射性核（例えば、診断目的に適したもの）、例えば１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、４３Ｋ、５２Ｆｅ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎなどが含まれる（これらに限定されない）。例えば、この放射性核種は、投与と画像化部位への局在化との間の経過時間後の活性及び検出を可能にするのに適した半減期を有する、γ、光子又はポジトロン放出放射性核種である。本開示は、高エネルギー放射性核（例えば、治療目的のため）、例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１０５Ｒｈ、１５３Ｓｍ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ及び１８８Ｒｅもまた包含する。これらの同位体は、短い路長を有する高エネルギーα粒子又はβ粒子を典型的に生成する。かかる放射性核種は、ごく接近する細胞、例えば、コンジュゲートが付着した又は進入した新生物細胞を死滅させる。これらの放射性核種は、非局在化細胞に対してほとんど又はまったく影響を有さず、本質的に非免疫原性である。あるいは、高エネルギー同位体は、例えばホウ素中性子捕捉療法（Ｇｕａｎら、１９９８）におけるように他の安定な同位体の熱照射によって生成され得る。
【０４０４】
別の例において、タンパク質は、細胞の事前標的化における利用のために「受容体」（例えばストレプトアビジン）にコンジュゲート化され、コンジュゲートは患者に投与され、その後、除去剤を用いた循環からの未結合コンジュゲートの除去、次いで、治療剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲート化された「リガンド」（例えばアビジン）の投与が続く。
【０４０５】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、当分野で知られていて容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むように改変され得る。例えば、タンパク質の誘導体化に適した部分は、生理学的に許容可能なポリマー、例えば水溶性ポリマーである。かかるポリマーは、安定性を増加させる及び／又は（例えば、腎臓による）クリアランスを低減する及び／又は本開示のＦｎ１４結合性タンパク質の免疫原性を低減するのに有用である。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）又はポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）が含まれる（これらに限定されない）。
【０４０６】
一例において、任意の例に従う本明細書に記載のＦｎ１４結合性タンパク質は、検出及び／又は単離を容易にするために１つ又は複数の検出可能なマーカーを含む。例えば、この化合物は、例えば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、並びにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７、フルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）などの蛍光標識を含む。これらの蛍光についての吸収最大及び発光最大はそれぞれ以下である：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ：６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）及びＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）。
【０４０７】
あるいは又はさらに、任意の例に従う本明細書に記載のＦｎ１４結合性タンパク質は、例えば、（例えば米国特許第６，３０６，６１０号に記載の方法で）蛍光半導体ナノ結晶で標識される。
【０４０８】
あるいは又はさらに、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、例えば、鉄、鋼、ニッケル、コバルト、希土類物質、ネオジム−鉄−ホウ素、第一鉄−クロム−コバルト、ニッケル−第一鉄、コバルト−白金又はストロンチウムフェライトなどの磁性化合物又は常磁性化合物で標識される。
【０４０９】
固定化されたタンパク質：
一例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、固体又は半固体マトリックス上に固定化される。「固定化」は、例えば国際公開第９９／５６１２６号パンフレット又は国際公開第０２／２６２９２号パンフレットに記載されるような、特定のマトリックス上にタンパク質を固定するための種々の方法及び技術を含むものと理解すべきである。例えば、固定化は、特に保存の間又は単一バッチでの使用において、生物学的、化学的又は物理的曝露によってタンパク質の活性が低減されることも有害に改変されることもないように、そのタンパク質を安定化するように機能し得る。
【０４１０】
本開示の意味において、３つの基本的な方法が固定化に使用され得る。
【０４１１】
マトリックス上にタンパク質を固定化するための種々の方法は当分野で知られており、架橋、タンパク質に対する結合、半透過性マトリックス内での保持が含まれる。
【０４１２】
例示的なマトリックスには、多孔質ゲル、酸化アルミニウム、ベントナイト、アガロース、デンプン、ナイロン又はポリアクリルアミドが含まれる。
【０４１３】
本開示のタンパク質の活性のアッセイ：
結合アッセイ：
かかるアッセイの１形態は、例えばＳｃｏｐｅｓ（１９９４）に記載されるような抗原結合アッセイである。かかる方法は一般に、Ｆｎ１４結合性タンパク質を標識するステップ、及びこの標識Ｆｎ１４結合性タンパク質を、固定化された抗原又はその断片、例えば、抗体のＦｃ領域に融合したＦｎ１４の細胞外ドメインを含むタンパク質と接触させるステップを含む。結合した非特異的タンパク質を除去するための洗浄の後、標識の量、及び結果として結合したタンパク質の量が検出される。当然、Ｆｎ１４結合性タンパク質は固定化され得、抗原が標識され得る。本明細書に記載されるようなパニング型アッセイもまた使用され得る。
【０４１４】
中和アッセイ：
１つ又は複数のＦｎ１４媒介性のＴｗｅａｋ活性を中和するＦｎ１４結合性タンパク質を同定するためのアッセイもまた当業者に明らかとなろう。
【０４１５】
例えば、中和アッセイは、Ｆｎ１４を発現する細胞におけるＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達を低減するＦｎ１４結合性タンパク質を決定することを含む。一例において、細胞中、例えば細胞のゲノム中に、レポーター遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを取り込んだＦｎ１４を発現する細胞が、生成又は取得され、このプロモーターは、ＮＦκＢによる結合に応答して、プロモーターの発現を誘導する。この細胞を、Ｆｎ１４結合性タンパク質の存在下又は非存在下で、Ｔｗｅａｋ（又は抗体のＦｃ領域に融合したＴｗｅａｋ）と接触させる。Ｆｎ１４結合性タンパク質の非存在下と比較して、Ｆｎ１４結合性タンパク質の存在下でのレポーター遺伝子の低減したレベルの発現は、Ｆｎ１４を発現する細胞におけるＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達の低減を示す。一例において、この細胞はまた、Ｔｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４結合性タンパク質と接触され、アゴニスト活性を有さないＦｎ１４結合性タンパク質の同定を可能にする、レポーター遺伝子発現のレベルが決定される。複数の濃度のＦｎ１４結合性タンパク質を試験することによって、ＩＣ５０、すなわち、ＮＦκＢシグナル伝達の最大阻害の５０％が生じる濃度が決定される。
【０４１６】
Ｆｎ１４を発現する細胞におけるＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢシグナル伝達の低減について試験するための別の手段は、ＮＦκＢによって発現が誘導される遺伝子の発現のレベルについて試験することである。かかる遺伝子発現変化は、核酸ベースの検出アッセイ（例えば定量ＲＴ−ＰＣＲ）又は（例えば、本明細書に記載される）タンパク質ベースのアッセイによって測定され得る。ＮＦκＢによって誘導される例示的な遺伝子には、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＢＣＬ２、ＶＥＧＦ及びＣＯＸ２が含まれる。
【０４１７】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４媒介性のＴｗｅａｋ活性を中和する能力を決定するための別の方法は受容体結合アッセイである。かかる方法において、Ｆｎ１４若しくはその可溶性形態又はそれらを発現する細胞が固定化される。次いで、標識されたＴｗｅａｋが、試験Ｆｎ１４結合性タンパク質の存在下又は非存在下で、固定化された受容体又は細胞に接触させられ、結合した標識の量が検出される。Ｆｎ１４結合性タンパク質の非存在下と比較した、Ｆｎ１４結合性タンパク質の存在下での結合した標識の量の減少は、このＦｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４に対するＴｗｅａｋの結合を低減又は防止することを示す。複数の濃度のＦｎ１４結合性タンパク質を試験することによって、ＩＣ５０、すなわち、Ｆｎ１４に対するＴｗｅａｋの結合の最大阻害の５０％が生じる濃度が決定される。
【０４１８】
Ｆｎ１４媒介性のＴｗｅａｋ活性の中和を決定するためのさらなる方法は、Ｆｎ１４結合性タンパク質がＴｗｅａｋの存在下でのＫｙｍ１細胞の死を低減する能力である。Ｋｙｍ１細胞を、Ｆｎ１４結合性タンパク質の存在下又は非存在下でＴｗｅａｋ（又は抗体のＦｃドメインに融合したＴｗｅａｋ）と接触させる。Ｆｎ１４結合性タンパク質の非存在下と比較して、Ｆｎ１４結合性タンパク質の存在下での低減したレベルの細胞死（例えば、ヨウ化プロピジウム取り込みによって評価される）は、このＦｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４媒介性のＴｗｅａｋ活性を中和することを示す。一例において、このＫｙｍ１細胞はまた、Ｔｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４結合性タンパク質と接触され、アゴニスト活性を有さないＦｎ１４結合性タンパク質の同定を可能にする、細胞死のレベルが決定される。複数の濃度のＦｎ１４結合性タンパク質を試験することによって、ＩＣ５０、すなわち、Ｋｙｍ１細胞死の最大阻害の５０％が生じる濃度が決定される。
【０４１９】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４媒介性のＴｗｅａｋ活性を中和する能力を決定するための別の方法は、Ｆｎ１４結合性タンパクの存在下又は非存在下で腫瘍細胞をＴｗｅａｋと接触させ、ＩＬ−６などのサイトカインの分泌を検出することである。Ｆｎ１４結合性タンパク質の非存在下と比較して、Ｆｎ１４結合性タンパク質の存在下でのより低いレベルのサイトカインは、このＦｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４媒介性のＴｗｅａｋ活性を中和することを示す。一例において、この細胞はまた、Ｔｗｅａｋの非存在下でＦｎ１４結合性タンパク質と接触され、アゴニスト活性を有さないＦｎ１４結合性タンパク質の同定を可能にする、サイトカイン分泌のレベルが決定される。複数の濃度のＦｎ１４結合性タンパク質を試験することによって、ＩＣ５０、すなわち、サイトカイン分泌の最大阻害の５０％が生じる濃度が決定される。
【０４２０】
Ｆｎ１４媒介性のＴｗｅａｋ活性の阻害を決定するための他のアッセイには、内皮細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ）による管形成の阻害及び／又はＡ３７５黒色腫細胞によるＴｗｅａｋ誘導性のＩＬ−８分泌の阻害が含まれる。
【０４２１】
サイトカイン分泌アッセイ：
別の例において、本開示のタンパク質の活性は、細胞を本開示のタンパク質と接触させ、その細胞によるサイトカイン（例えばＩＬ−８）の分泌を決定することによって決定される。ＩＬ−８分泌を決定する方法は当分野で知られている。
【０４２２】
細胞死滅アッセイ：
別の例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質（例えば、毒性化合物又は定常領域に連結されたもの）の能力は、細胞の死を誘導するその能力を決定することによって評価される。定常領域に連結されたＦｎ１４結合性タンパク質の場合、免疫エフェクター細胞及び／又は補体（例えば、ＡＤＣＣ／ＣＤＣを促進するため）の存在下でかかるアッセイを実施することが望ましい。
【０４２３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ治療効力アッセイ：
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏでも試験され得る。
【０４２４】
例えば、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、本明細書に記載されるような消耗性障害の動物モデルにおいて試験され得、例えば、このモデルでは、消耗性障害を発症させる条件下で、Ｆｎ１４を発現する腫瘍細胞が非ヒト哺乳動物に投与される。次いで、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質が投与され、消耗性障害に対する影響が、例えば体重変化をモニタリングすることによって評価される。体重の喪失を低減若しくは予防する又は体重増加を誘導するＦｎ１４結合性タンパク質が潜在的な治療剤として選択される。
【０４２５】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、腫瘍細胞の浸潤を低減又は予防するその能力に基づいて選択することもできる。例えば、腫瘍細胞が、対象中（例えば筋肉中）に移植され、この対象に試験Ｆｎ１４結合性タンパク質が投与される（又は、コントロールとして、Ｆｎ１４結合性タンパク質は投与されない）。Ｆｎ１４結合性タンパク質の非存在下と比較した、Ｆｎ１４結合性タンパク質の存在下での、腫瘍細胞を取り囲む組織の（例えば、病理組織検査を用いて評価される）浸潤の低減は、このＦｎ１４結合性タンパク質が腫瘍細胞の浸潤を低減又は予防することを示す。
【０４２６】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、異種移植モデルにおいて腫瘍の発症を遅延又は予防するその能力を決定することによっても治療効力について評価され得る。
【０４２７】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、異種移植モデル中の腫瘍における血管新生又は脈管形成の量を低減するその能力を決定することによっても治療効力について評価され得る。
【０４２８】
治療効力は、関節リウマチの動物モデル、例えば、ＳＫＧ系統のマウス（Ｓａｋａｇｕｃｈｉら）、ラットＩＩ型コラーゲン関節炎モデル、マウスＩＩ型コラーゲン関節炎モデル；ＧＶＨＤのマウスモデル（例えば、Ｔｒｅｎａｄｏ（２００２）に記載される通り）、又は虚血性脳卒中、例えば、大動脈／大静脈閉塞、外部頸部止血帯若しくはカフ、出血若しくは低血圧症、頭蓋内圧亢進症若しくは総頸動脈閉塞、二血管閉塞及び低血圧症、四血管閉塞、片側性総頸動脈閉塞（いくつかの種においてのみ）、エンドセリン−１誘導性の動脈及び静脈の狭窄、中大脳動脈閉塞、自発的脳梗塞（自発的に高血圧性のラットにおける）、マクロスフェア（ｍａｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）塞栓、血餅塞栓症若しくはミクロスフェア塞栓のモデルにおいても評価され得る。
【０４２９】
治療効力は、１型糖尿病などの糖尿病のモデルへのＦｎ１４結合性タンパク質の投与によっても決定され得る。例えば、試験対象は、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス（Ｉ型糖尿病のモデル）又はストレプトゾトシンが投与されたマウス若しくはラット（Ｉ型及び／又はＩＩ型糖尿病のモデル）である。
【０４３０】
競合的結合アッセイ：
本開示の抗体の結合を競合的に阻害するＦｎ１４結合性タンパク質を決定するためのアッセイは、当業者に明らかである。例えば、本開示の抗体は、蛍光標識又は放射性標識などの検出可能な標識にコンジュゲート化される。次いで、標識された抗体と試験Ｆｎ１４結合性タンパク質とが混合され、抗体のＦｃ領域に融合したＦｎ１４若しくはその細胞外ドメイン又はそのエピトープを含むペプチドと接触される。次いで、標識抗体のレベルが決定され、標識抗体をＦｎ１４結合性タンパク質の非存在下でＦｎ１４若しくはＦｎ１４−Ｆｃ融合物又はそのエピトープを含むペプチドと接触させた場合に決定されたレベルと比較される。Ｆｎ１４結合性タンパク質の非存在下と比較して、試験Ｆｎ１４結合性タンパク質の存在下で標識抗体のレベルが低減する場合、このＦｎ１４結合性タンパク質はこの抗体の結合を競合的に阻害する。
【０４３１】
任意選択で、この試験Ｆｎ１４結合性タンパク質は、抗体とは異なる標識にコンジュゲート化される。これにより、タンパク質又はエピトープに対する試験Ｆｎ１４結合性タンパク質の結合のレベルの検出が可能になる。
【０４３２】
別の例において、この試験Ｆｎ１４結合性タンパク質は、Ｆｎ１４若しくはＦｎ１４−Ｆｃ融合物又はそのエピトープを含むペプチドを本明細書に記載の抗体と接触させる前に、Ｆｎ１４若しくはＦｎ１４−Ｆｃ融合物又はそのエピトープを含むペプチドに結合させることができる。Ｆｎ１４結合性タンパク質の非存在下と比較した、Ｆｎ１４結合性タンパク質の存在下での結合した抗体の量の減少は、このＦｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４に対する抗体の結合を競合的に阻害することを示す。相互アッセイもまた、標識Ｆｎ１４結合性タンパク質を使用し、抗体をＦｎ１４若しくはＦｎ１４−Ｆｃ融合物又はそのエピトープを含むペプチドに最初に結合させて実施され得る。この場合、抗体の非存在下と比較して、抗体の存在下での、Ｆｎ１４若しくはＦｎ１４−Ｆｃ融合物又はそのエピトープを含むペプチドに結合した標識Ｆｎ１４結合性タンパク質の量の減少は、このＦｎ１４結合性タンパク質がＦｎ１４に対する抗体の結合を競合的に阻害することを示す。
【０４３３】
エピトープマッピングアッセイ：
別の例において、本明細書に記載のＦｎ１４結合性タンパク質によって結合されるエピトープがマッピングされる。エピトープマッピング法は当業者に明らかである。例えば、Ｆｎ１４配列又は目的のエピトープを含むその領域にわたって重複する一連のペプチド、例えば、１０〜１５アミノ酸を含むペプチドが生成される。次いで、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、各ペプチド又はそれらの組み合わせと接触させられ、Ｆｎ１４結合性タンパク質が結合するペプチドが決定される。これにより、Ｆｎ１４結合性タンパク質が結合するエピトープを含むペプチドの決定が可能になる。複数の非連続ペプチドがＦｎ１４結合性タンパク質によって結合される場合、このＦｎ１４結合性タンパク質は立体構造エピトープに結合し得る。
【０４３４】
一例において、Ｆｎ１４のランダム断片がファージの表面上に発現され、このファージが、Ｆｎ１４結合性タンパク質と接触される。次いで、抗体により結合されたファージが単離され得、発現されたペプチドのアミノ酸配列が、ファージ中に含まれるコーディング核酸によって推定される。重複するペプチドを有する一連のファージを単離することによって、エピトープ中に含まれる残基を含むＦｎ１４の領域を含むペプチドが同定される。
【０４３５】
あるいは又はさらに、Ｆｎ１４内のアミノ酸残基が、例えばアラニンスキャニング変異誘発によって変異され、Ｆｎ１４結合性タンパク質の結合を低減又は防止する変異が決定される。Ｆｎ１４結合性タンパク質の結合を低減又は防止する任意の変異は、このＦｎ１４結合性タンパク質によって結合されるエピトープ内に存在する可能性が高い。
【０４３６】
さらなる方法は、固定化された本開示のＦｎ１４結合性タンパク質にＦｎ１４又はその領域を結合させ、得られた複合体をプロテアーゼで消化することを含む。次いで、固定化されたＦｎ１４結合性タンパク質に結合したままのペプチドが単離され、例えば質量分析を用いて、その配列を決定するために分析され得る。
【０４３７】
さらなる方法は、Ｆｎ１４又はその領域中の水素を重陽子（ｄｅｕｔｒｏｎ）に変換し、得られたタンパク質を、固定化された本開示のＦｎ１４結合性タンパク質に結合させることを含む。次いで、重陽子は水素に戻し変換され、Ｆｎ１４又はその領域が単離され、酵素で消化され、例えば質量分析を用いて、本明細書に記載のＦｎ１４結合性タンパク質の結合により水素への変換から保護されていた重陽子を含む領域を同定するために分析される。
【０４３８】
以上において、Ｆｎ１４という場合、その細胞外ドメインを含めた組換えＦｎ１４を包含する。
【０４３９】
親和性アッセイ：
任意選択で、Ｆｎ１４又はそのエピトープ含有ペプチドに対するＦｎ１４結合性タンパク質の解離定数（Ｋｄ）又は会合定数（Ｋａ）又は結合定数（ＫＤ、すなわちＫａ／Ｋｄ）が決定される。Ｆｎ１４結合性タンパク質に関するこれらの定数は、一例において、放射性標識された又は蛍光標識されたＦｎ１４結合アッセイによって決定される。このアッセイは、一連の滴定の未標識Ｆｎ１４の存在下で、最小濃度の標識Ｆｎ１４を用いてＦｎ１４結合性タンパク質を平衡化する。未結合のＦｎ１４を除去するために洗浄した後、標識の量が決定される。別の例によれば、これらの定数は、固定化されたＦｎ１４又はその領域を用い、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって、例えばＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用することによって測定される。
【０４４０】
医薬組成物及び処置の方法：
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質（同義語活性成分）は、予防的処置又は治療的処置のために、非経口、外用、経口若しくは局所投与、エアロゾル投与、又は経皮投与のための医薬組成物への製剤化に有用である。この医薬組成物は、投与方法に依存して、種々の単位投与形態で投与され得る。例えば、経口投与に適した単位投与形態には、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤及びトローチ剤が含まれる。
【０４４１】
本開示の医薬組成物は、静脈内投与或いは皮下投与或いは体腔又は臓器若しくは関節の管腔中への投与などの非経口投与に有用である。投与のための組成物は、水性担体などの薬学的に許容可能な担体中に溶解された、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質の溶液を一般に含む。例えば緩衝化生理食塩水などの種々の水性担体が使用され得る。この組成物は、生理学的条件に近づけるのに必要な薬学的に許容可能な担体、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含んでいてもよい。これらの製剤中の本開示のＦｎ１４結合性タンパク質の濃度は広く変動し得、選択された特定の投与様式及び患者のニーズに従って、流体体積、粘度、体重などに主に基づいて選択される。例示的な担体には、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンが含まれる。混合油及びオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルもまた使用され得る。リポソームも担体として使用され得る。これらのビヒクルは、等張性及び化学的安定性を増強する微量の添加剤、例えば緩衝液及び防腐剤を含み得る。
【０４４２】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、非経口投与のために製剤化され得、例えば、蠕動投与及び腫瘍又は疾患部位中への直接的滴下（腔内投与）を含む、静脈内、筋内、皮下、経皮又は他のかかる経路を介した注射のために製剤化され得る。本開示の化合物を活性成分として含む水性組成物の調製は当業者に知られている。
【０４４３】
本開示に従う適切な医薬組成物は、意図した使用に依存して、ある範囲の終濃度を与えるために、無菌水溶液などの許容可能な医薬担体と混合したある量の本開示のＦｎ１４結合性タンパク質を一般に含む。調製の技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９８０によって例示されるように当分野で一般に知られている。
【０４４４】
製剤化に際して、本開示の化合物は、投与製剤と適合する様式で、治療的／予防的に有効な量で投与される。本開示の化合物の適切な投与量は、特定の化合物、処置される状態及び／又は処置されている対象に依存して変動する。例えば、最適以下の投与量で開始し、最適又は有用な投与量を決定するために投与量を漸増的に改変することによって適切な投与量を決定することは熟練の医師の能力の範囲内である。
【０４４５】
例示的な投与量及び投与のタイミングは本明細書の開示に基づいて当業者に明らかとなろう。
【０４４６】
いくつかの例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、癌などの状態に対する処置と共に又はかかる処置の前に又はかかる処置の後に投与される。例示的な処置には、放射線療法、化学療法（例えば、カボプラチン（ｃａｂｏｐｌａｔｉｎ）、シプラチン（ｓｉｐｌａｔｉｎ）、シクロホスファミド、ドセタキサル（ｄｏｃｅｔａｘａｌ）、ドキソルビシン、エルロチニブ、エトポシド、フルオロウラシル、イリノテカン、メトトレキサート、パクリタキセル、トポテカン、ビンクリスチン若しくはビンブラスチン）、又は状態を処置するための別の薬物の投与、例えば、リツキシマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、パニツムマブ若しくはセツキシマブなどの生物学的薬剤が含まれる。
【０４４７】
一例において、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、食欲刺激因子（例えば、メラノコルチン−４受容体アンタゴニスト、グレリン受容体アゴニスト、酢酸メゲストロール又はカンナビノイド）、炎症性サイトカインを標的化する薬物（例えば、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、エタネルセプト、アダリムマブ、ゴリムマブ、インフリキシマブ）、抗ＩＬ−６抗体（例えば、ＣＮＴＯ−３２８、ＡＬＤ−５１８）、β−アドレナリン受容体アンタゴニスト、タンパク質同化ステロイド、ミオスタチン、ＡＣＥインヒビター又はエイコサペンタエン酸）と共に投与される。
【０４４８】
診断／予後判定アッセイ：
Ｆｎ１４発現に関連する状態を診断／予後判定するための種々の方法が本開示により提供されることは本明細書の記載から明らかである。
【０４４９】
タンパク質検出アッセイ：
本開示の一例は、Ｆｎ１４又はＦｎ１４を発現する細胞の存在を検出する。タンパク質又は細胞の量、レベル又は存在は、当業者に公知の種々の技術のいずれか、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光、イムノブロット、ウエスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、質量分析（タンデム質量分析、例えば、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳが含まれる）、バイオセンサー技術、エバネッセント光ファイバー技術又はタンパク質チップ技術からなる群より選択される技術などを用いて決定される。
【０４５０】
一例において、タンパク質の量又はレベルを決定するために使用されるアッセイは半定量アッセイである。
【０４５１】
別の例において、タンパク質の量又はレベルを決定するために使用されるアッセイは定量アッセイである。
【０４５２】
例えば、タンパク質は、イムノアッセイ、例えば、免疫組織化学、免疫蛍光、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸着検定法（ＦＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、バイオセンサーアッセイ、タンパク質チップアッセイ及び免疫染色アッセイ（例えば、免疫蛍光）からなる群より選択されるアッセイを用いて検出される。
【０４５３】
標準的な固相ＥＬＩＳＡ又はＦＬＩＳＡ形式は、種々のサンプル由来のタンパク質の濃度を決定する際に特に有用である。
【０４５４】
１形態において、ＥＬＩＳＡ又はＦＬＩＳＡは、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質、又はＦｎ１４の異なるエピトープに結合するタンパク質を、例えばメンブレン、ポリスチレン若しくはポリカーボネートマイクロウェル、ポリスチレン若しくはポリカーボネート試験紙又はガラス支持体などの固相マトリックス上に固定化することから構成される。次いでサンプルが、固定化されたタンパク質と物理的に関連付けられ、Ｆｎ１４が結合又は「捕捉」される。次いで、結合したＦｎ１４が、Ｆｎ１４の異なるエピトープに結合する第２の標識化合物（例えば本開示のＦｎ１４結合性タンパク質）を用いて検出される。あるいは、第２の（検出）抗体に結合する第３の標識抗体が使用され得る。
【０４５５】
本明細書に記載されるアッセイ形式が、例えばスクリーニングプロセスの自動化のためなどのハイスループット形式、又はマイクロアレイ形式になじみやすいことは当業者に明らかである。さらに、上記アッセイのバリエーション（例えば競合的ＥＬＩＳＡ）は当業者に明らかである。
【０４５６】
代替的な例において、ポリペプチドは、例えば免疫組織化学又は免疫蛍光などの当分野で知られている方法を用いて細胞内又は細胞上で検出される。免疫蛍光を使用する方法は、かかる方法が定量的又は少なくとも半定量的である場合には例示的である。染色された細胞の蛍光の程度を定量する方法は当分野で知られており、例えばＣｕｅｌｌｏ、１９８４に記載されている。
【０４５７】
バイオセンサーデバイスは、アッセイ基材と組み合わせてデバイスへと統合される電流又はインピーダンス測定要素と組み合わせた電極表面を一般に使用する（例えば、米国特許第５５６７３０１号に記載されるもの）。本開示のＦｎ１４結合性タンパク質が、バイオセンサーデバイスの表面上に取り込まれ、生物学的サンプルがこのデバイスと接触される。バイオセンサーデバイスによって検出された電流又はインピーダンスにおける変化は、Ｆｎ１４結合性タンパク質に結合するタンパク質を示す。当分野で知られているいくつかの形態のバイオセンサーはまた、タンパク質相互作用を検出するために表面プラズモン共鳴に依存し、それにより、表面プラズモン共鳴の反射面における変化は、リガンド又は抗体に結合するタンパク質を示す（米国特許第５４８５２７７号及び米国特許第５４９２８４０号）。
【０４５８】
バイオセンサーは、マイクロスケール又はナノスケールまでかかるシステムを適合させることの容易さのためにハイスループット分析において特に使用される。さらに、かかるシステムは、いくつかの検出試薬を取り込んで、単一のバイオセンサー単位での診断試薬の多重化を可能にするように、簡便に適合される。これにより、少量の体液中のいくつかのタンパク質又はペプチドの同時検出が可能になる。
【０４５９】
画像化法：
上述から当業者に明らかなように、本開示は、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質を使用する画像化法もまた企図する。画像化のために、Ｆｎ１４結合性タンパク質は一般に、画像化によって研修可能なシグナルを放出できる任意の分子又は因子であり得る検出可能な標識にコンジュゲート化される。しかし、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質に特異的に結合する二次的な標識化合物もまた使用され得る。例示的な検出可能な標識には、タンパク質、放射性同位体、フルオロフォア、可視光発光フルオロフォア、赤外線発光フルオロフォア、金属、強磁性物質、電磁気放射物質、特定の磁気共鳴（ＭＲ）分光学的シグネチャーを有する物質、Ｘ線吸収物質若しくは反射物質、又は音変更物質が含まれる。
【０４６０】
本開示のＦｎ１４結合性タンパク質（及び使用される場合には標識二次化合物）は、画像化手順の前に、全身的に又は画像化される臓器若しくは組織（又は癌の場合には腫瘍）に局所的に投与され得る。一般に、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、腫瘍、組織又は臓器の所望の光学画像を達成するために有効な用量で投与される。かかる用量は、使用される特定のＦｎ１４結合性タンパク質、画像化される状態、画像化手順に供される組織又は臓器、使用される画像化装置などに依存して、後半に変動し得る。
【０４６１】
本開示のいくつかの例において、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、種々の生化学的適用において組織及び臓器のｉｎ  ｖｉｖｏの光学画像化剤として使用され、この適用には、腫瘍の画像化、臓器の断層撮影画像化、臓器機能のモニタリング、冠動脈造影、蛍光内視鏡検査、レーザー誘導手術、光音響及び音響蛍光（ｓｏｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）法などが含まれる（これらに限定されない）。
【０４６２】
画像化法の例には、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、ＭＲ分光法、Ｘ線撮影、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波、平面ガンマカメラ（ｐｌａｎａｒ  ｇａｍｍａ  ｃａｍｅｒａ）画像化、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、他の核医薬ベースの画像化、可視光を使用する光学画像化、ルシフェラーゼを使用する光学画像化、フルオロフォアを使用する光学画像化、他の光学画像化、近赤外線を使用する画像化、又は赤外線を使用する画像化が含まれる。
【０４６３】
いくつかの例において、画像化剤は、ヒトにおける使用の前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて、例えば本明細書に記載されるモデルを用いて試験される。
【０４６４】
サンプル：
ｉｎ  ｖｉｖｏベースのスクリーニングとは異なり、単離された組織サンプルに対して本開示の方法がｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される限りにおいて、「サンプル」とは、動物から誘導された生物学的材料の任意のサンプル、例えば、体液（例えば、血液又は滑液又は脳脊髄液）、細胞性材料（例えば組織吸引物）、組織生検検体又は外科的検体（これらに限定されない。）のことをいうものとして理解すべきである。
【０４６５】
本開示の方法に従って使用されるサンプルは直接使用されてもよく、又は使用前にいくつかの形態の処理を必要としてもよい。例えば、生検又は外科的サンプルは、使用前にホモジナイゼーション又は他の形態の細胞分散を必要とし得る。さらに、生物学的サンプルが液体形態（かかる形態が必要であるか又は望ましい場合）でない限りにおいて、サンプルを動員するために緩衝液などの試薬の添加を必要とし得る。
【０４６６】
上記の記載から明らかなように、かかるアッセイは、例えば定量のために、適切なコントロール、例えば正常若しくは健康な個体又は典型的な集団の使用を必要とし得る。
【０４６７】
本明細書において、「正常個体」とは、その対象が、異常な数のＦｎ１４発現細胞又は異常なレベルのＴｗｅａｋを有さないことに基づいて選択されることを意味するものと解釈すべきである。
【０４６８】
「健康な対象」は、Ｆｎ１４媒介性の状態などの状態に罹患していると診断されていない及び／又はその状態を発症する危険性がない対象である。
【０４６９】
あるいは又はさらに、適切なコントロールサンプルは、状態に罹患していないことが知られている対象の典型的な集団についての、アッセイされているマーカーの測定値を含むコントロールデータセットである。
【０４７０】
一例において、参照サンプルはアッセイに含まれない。その代り、適切な参照サンプルは、典型的な集団から既に生成・確立されているデータセットから誘導される。次いで、試験サンプルを処理、分析及び／又はアッセイすることから誘導されるデータが、サンプル集団について得られたデータと比較される。
【０４７１】
Ｆｎ１４媒介性の状態：
本開示は、任意のＦｎ１４媒介性の状態を処置するための、本明細書に記載のＦｎ１４結合性タンパク質又は抗体又は組成物の使用を包含する。例示的な状態には、癌、転移、過剰な血管新生若しくは血管形成、自己免疫疾患、炎症性疾患、神経変性疾患、ケロイド瘢痕、移植片対宿主病、移植片拒絶又は虚血が含まれる。
【０４７２】
一例において、Ｆｎ１４媒介性の状態は炎症性疾患又は自己免疫疾患である。一例において、状態は、結合組織疾患（関節リウマチ、乾癬性関節炎、反応性関節炎又は痛風などの炎症性関節炎を含む）、ループス（全身性エリテマトーデスを含む）、１型糖尿病、多発性硬化症、血管炎（ウェゲナー肉芽腫症及びヘノッホ・シェーンライン症候群を含む）、腎炎（糸球体腎炎及び間質性肺炎を含む）、アテローム動脈硬化症又は目の炎症（ぶどう膜炎を含む）である。
【０４７３】
一例において、自己免疫状態は、多発性硬化症、神経炎、多発性筋炎、乾癬、白斑、シェーグレン症候群、関節炎（例えば、関節リウマチ）、１型糖尿病、自己免疫膵炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、小児脂肪便症、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫甲状腺疾患、橋本病、グレーブス病、重症筋無力症、アジソン病、自己免疫網膜ぶどう膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血又は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。一例において、状態は関節リウマチ又はＳＬＥである。
【０４７４】
一例において、状態は結合組織疾患（例えば関節リウマチ）である。これに関して、Ｄｈａｒｍａｐａｔｎｉら、（２０１１）は、Ｔｗｅａｋ／Ｆｎ１４が関節リウマチにおいて役割を果たすことを示している。
【０４７５】
一例において、状態は強皮症（全身性強皮症を含む）である。
【０４７６】
別の例において、状態は、移植片拒絶（例えば同種移植片拒絶）又は移植片対宿主病（移植片対宿主病に関連する体重喪失を含む）である。これに関して、例えば、Ｚｈａｏら、（２００７）によって、Ｔｗｅａｋ／Ｆｎ１４は、移植片対宿主病の病理発生において役割を果たすことが示されている。
【０４７７】
別の例において、状態は移植心冠動脈病変である。
【０４７８】
一例において、状態は移植片拒絶関連の内膜肥厚である。
【０４７９】
別の例において、状態は心筋内梗塞又は虚血再灌流（ｒｅｐｕｒｆｕｓｉｏｎ）損傷である。これに関して、例えばＦｒａｕｅｎｋｎｅｃｈｔら、（２０１０）及びＩｎｔａら、（２００８）によって、Ｔｗｅａｋ／Ｆｎ１４は、虚血において役割を果たすことが示されている。
【０４８０】
別の例において、状態は、過剰な血管新生及び／又は新血管形成、例えば、癌（固形腫瘍、白血病、リンパ腫、黒色腫、神経膠腫、乳癌、結腸癌、胃癌、食道癌、腎細胞癌、卵巣癌、子宮頸癌、カルチノイド癌、精巣癌、前立腺癌、頭頸部癌及び肝細胞癌を含む）、癌転移、癌新血管形成、自己免疫疾患（乾癬を含む）、腎症、網膜症、妊娠高血圧腎症、肝炎、敗血症及び黄斑変性に関連する。
【０４８１】
一例において、状態は癌又はその転移である。「癌」とは、制御されない細胞の成長／増殖を典型的には特徴とする、哺乳動物における生理学的状態をいう。癌の例には、腺癌、有棘細胞癌、消化／胃腸癌、内分泌癌、眼癌、骨格筋癌、乳癌、神経癌、尿生殖器癌、胚細胞癌、頭頸部癌、血液学的／血液癌、呼吸器癌、皮膚癌、ＡＩＤＳ関連の悪性腫瘍又は婦人科（ｇｙｎｅｌｏｇｉｃ）癌が含まれる（これらに限定されない）。
【０４８２】
腺癌は、腺組織に起源する上皮の癌である。例示的な腺癌には、結腸直腸癌、肺癌、子宮頸癌、前立腺癌、尿膜管癌、外陰癌、乳癌、食道癌、膵臓癌及び胃癌の形態が含まれる。
【０４８３】
消化／胃腸癌には、肛門癌；胆管癌；肝外胆管癌；虫垂癌；カルチノイド腫瘍、胃腸癌；結腸癌；小児結腸直腸癌を含む結腸直腸癌；小児食道癌を含む食道癌；胆嚢癌；小児胃（胃）癌を含む胃（胃）癌；小児肝細胞（肝臓）癌を含む肝細胞（肝臓）癌；小児膵臓癌を含む膵臓癌；肉腫、横紋筋肉腫；直腸癌；及び小腸癌が含まれる。
【０４８４】
内分泌癌には、島細胞癌（内分泌膵臓）；小児副腎皮質癌を含む副腎皮質癌；胃腸カルチノイド腫瘍；副甲状腺癌；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；小児甲状腺癌を含む甲状腺癌；小児多発性内分泌腺腫症候群；及び小児カルチノイド腫瘍が含まれる。
【０４８５】
眼癌には、眼球内黒色腫；及び網膜芽細胞腫が含まれる。
【０４８６】
骨格筋癌には、ユーイングファミリーの腫瘍；骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫；小児横紋筋肉腫を含む横紋筋肉腫；小児軟組織肉腫を含む軟組織肉腫；腱鞘の明細胞肉腫；及び子宮肉腫が含まれる。
【０４８７】
神経癌には、小児脳幹神経膠腫；脳腫瘍；小児小脳星状細胞腫；小児大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫；小児上衣腫；小児髄芽腫；小児松果体及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍；小児視覚路及び視床下部神経膠腫；他の小児脳癌；副腎皮質癌；原発性中枢神経系リンパ腫；小児小脳星状細胞腫；神経芽腫；頭蓋咽頭腫；脊髄腫瘍；中枢神経系非定型奇形／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚性腫瘍；並びに小児及び下垂体腫瘍を含むテント上原始神経外胚葉性腫瘍が含まれる。
【０４８８】
尿生殖器癌には、小児膀胱癌を含む膀胱癌；腎細胞（腎臓）癌；小児卵巣癌を含む卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣の低悪性度の潜在的腫瘍；陰茎癌；前立腺癌；小児腎細胞癌を含む腎細胞癌；腎盂及び尿管の移行上皮癌；精巣癌；尿道癌；腟癌；外陰癌；子宮頸癌；ウィルムス腫瘍及び他の小児腎臓腫瘍；子宮内膜癌；並びに妊娠性絨毛性腫瘍が含まれる。
【０４８９】
胚細胞癌には、小児頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；卵巣胚細胞腫瘍；及び精巣癌が含まれる。
【０４９０】
頭頸部癌には、口唇及び口腔（ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ）の癌；小児口腔（ｏｒａｌ）癌；下咽頭癌；小児喉頭癌を含む喉頭癌；原発不明転移性扁平上皮性頸部癌；口腔（ｍｏｕｔｈ）癌；鼻腔及び副鼻腔の癌；小児上咽頭癌を含む上咽頭癌；中咽頭癌；副甲状腺癌；咽頭癌；小児唾液腺癌を含む唾液腺癌；咽喉癌；並びに甲状腺癌が含まれる。
【０４９１】
血液学的／血液細胞癌には、白血病（例えば、成人及び小児における急性リンパ芽球性白血病；例えば成人及び小児における急性骨髄球性白血病；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；及びヘアリーセル白血病）；リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；成人及び小児におけるホジキンリンパ腫を含むホジキンリンパ腫；妊娠中のホジキンリンパ腫；成人及び小児における非ホジキンリンパ腫を含む非ホジキンリンパ腫；妊娠中の非ホジキンリンパ腫；菌状息肉症；セザリー症候群；ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症；及び原発性中枢神経系リンパ腫）；及び他の血液学的癌（例えば、慢性骨髄増殖性障害；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；骨髄異形成症候群；並びに骨髄異形成／骨髄増殖性障害）が含まれる。
【０４９２】
呼吸器癌には、非小細胞肺癌；小細胞肺癌；成人及び小児における悪性中皮腫を含む悪性中皮腫；悪性胸腺腫；小児胸腺腫；胸腺癌；小児気管支アデノーマ／カルチノイドを含む気管支アデノーマ／カルチノイド；胸膜肺芽腫が含まれる。
【０４９３】
皮膚癌には、カポジ肉腫；メルケル細胞癌；黒色腫；基底細胞癌及び小児皮膚癌が含まれる。
【０４９４】
さらなる例において、状態は、本明細書により詳細に記載されるように、悪液質などの消耗性障害である。一例において、消耗性障害は、癌、代謝性アシドーシス、感染性疾患、糖尿病、自己免疫性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、自己免疫障害、薬物に対する嗜癖、肝臓の硬変症、慢性炎症障害、食欲不振、慢性心不全、慢性腎疾患、骨粗鬆症、骨格筋疾患、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、筋萎縮症及び神経変性疾患などの状態に関連する。
【０４９５】
一例において、消耗性障害は悪液質又は筋肉減少症（例えば、加齢に関連する消耗）である。
【０４９６】
一例において、消耗性障害は悪液質である。
【０４９７】
一例において、悪液質は、癌、感染性疾患（例えば、結核又はハンセン病）、ＡＩＤＳ、自己免疫疾患（関節リウマチ又は１型糖尿病を含む）、嚢胞性線維症、薬物嗜癖、アルコール中毒又は肝硬変症に関連する。
【０４９８】
一例において、悪液質は自己免疫疾患に関連する。一例において、悪液質は関節リウマチに関連する。一例において、悪液質は１型糖尿病に関連する。
【０４９９】
一例において、悪液質は心疾患に関連する。
【０５００】
一例において、悪液質は慢性腎疾患に関連する。
【０５０１】
一例において、悪液質は慢性肺炎症に関連する。
【０５０２】
一例において、悪液質は腸管炎症に関連する。
【０５０３】
一例において、悪液質は炎症性腸疾患に関連する。
【０５０４】
一例において、悪液質は加齢に関連する。
【０５０５】
一例において、悪液質は敗血症に関連する。
【０５０６】
一例において、悪液質はＡＩＤＳに関連する。
【０５０７】
本開示の１つの例示的な形態において、消耗性障害は癌に関連する悪液質である。癌の例は上述の通りである。
【０５０８】
一例において、方法は、悪液質に罹患している対象を同定するステップをさらに含む。かかる対象は、例えば、別の状態（例えば癌）の診断後の意図しない体重喪失の検出に基づいて同定され得る。例えば、この対象は、別の状態（例えば癌）の診断後又は先行する３０日間の間にその体重の少なくとも５％を喪失し得る。
【０５０９】
キット：
本開示は、本発明の検出／単離／診断／予後判定／処置／予防方法において使用するための、本開示の化合物を含む治療／予防／診断キットもまた提供する。かかるキットは、適切な容器手段中に、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質を一般に含む。これらのキットは、例えば、検出／単離／診断／画像化又は併用療法のための他の化合物もまた含み得る。例えば、かかるキットは、ある範囲の抗炎症薬物及び／又は化学療法薬物若しくは放射線療法薬物；抗血管新生剤；抗腫瘍細胞抗体；及び／又は抗腫瘍脈管構造若しくは抗腫瘍間質免疫毒素又はコアギュリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）若しくはワクチンのうちのいずれか１つ又は複数を含み得る。
【０５１０】
一例において、キットは、Ｆｎ１４を検出するためのものであり、検出を容易にするために試薬（検出可能な標識及び／又は検出可能な標識の基質）をさらに含む。かかるキットは陽性コントロールをさらに含んでいてもよい。
【０５１１】
別の例において、キットは、細胞又は細胞の集団を単離するためのものである。かかるキットにおいて、本開示のＦｎ１４結合性タンパク質は、ＦＡＣＳを容易にするために検出可能な標識で標識され得る。Ｆｎ１４結合性タンパク質はまた、ＭＡＣＳを容易にするために磁性粒子又は常磁性粒子で標識され得る。Ｆｎ１４結合性タンパク質はまた、単離を容易にするために固体又は半固体基材上に固定化され得る。
【０５１２】
さらなる例において、キットは状態の処置又は予防のためのものである。かかるキットにおいて、Ｆｎ１４結合性タンパク質は、溶液中で、又は任意選択で再懸濁のための溶液と共に、凍結乾燥形態で提供され得る。Ｆｎ１４結合性タンパク質は治療的化合物にコンジュゲート化され得るか、あるいはこのキットはコンジュゲート化のための治療的化合物を含み得る。上述のように、このキットはさらなる治療的化合物又は予防的化合物もまた含み得る。
【０５１３】
スクリーニングの方法：
本明細書の開示に基づいて当業者に明らかなように、本開示は、消耗性障害の処置のための化合物を同定する方法を提供する。これらの方法は、以下で説明されるようにさらなるステップを含み得る。
【０５１４】
本開示は、同定又は単離された化合物に関する情報の提供もまた包含する。したがって、スクリーニング方法は下記によってさらに改変される。
（ｉ）任意選択で、化合物の構造を決定するステップ；及び
（ｉｉ）例えば紙形態、機械可読形態又はコンピュータ可読形態などで、化合物又は化合物の名称若しくは構造を提供するステップ
【０５１５】
当然、知られている化合物については、たとえ本開示によって提供されるスクリーニングを用いてそれ以前にその機能が試験されていなくても、化合物の名称及び／又は構造の決定は暗黙的に行われる。これは、当業者が、スクリーニングを実施する時点において化合物の名称及び／又は構造を知るからである。
【０５１６】
本明細書において、「化合物を提供する」という語は、化合物を生成するための任意の化学的手段又は組換え合成手段、或いは任意の人又は手段によって以前に合成された化合物の提供を含むと解釈すべきである。ここに化合物の単離が含まれるのは明らかである。
【０５１７】
一例において、化合物又は化合物の名称若しくは構造は、例えば本明細書に記載のスクリーニングによって決定されるその用途に関する表示と共に提供される。
【０５１８】
スクリーニングアッセイは下記によってさらに改変され得る。
（ｉ）任意選択で、化合物の構造を決定するステップ；
（ｉｉ）任意選択で、例えば紙形態、機械可読形態又はコンピュータ可読形態などで、化合物又は化合物の名称若しくは構造を提供するステップ；及び
（ｉｉｉ）化合物を提供するステップ
【０５１９】
一例において、合成／生成された化合物又は化合物の名称若しくは構造は、例えば本明細書に記載のスクリーニングによって決定されるその用途に関する表示と共に提供される。
【０５２０】
一例において、化合物は、その各々又はサブセットが他のメンバーから分離され得る（すなわち、物理的に単離され得る）、化合物のライブラリー中で提供される。かかる場合において、化合物は、その同定によってライブラリーから単離され、これが次いで、例えばそのライブラリーの他のメンバーの非存在下で、当業者が単離においてその化合物を生成するのを可能にする。
【０５２１】
本開示は以下の非限定的な実施例を含む。
【０５２２】
実施例１（ヒトＦｎ１４に対するモノクローナル抗体の生成及び特徴付け）：
方法：
Ｆｎ１４を発現する腫瘍細胞及び非シグナル伝達Ｆｎ１４を発現する腫瘍細胞の生成：
腫瘍モデルのためのコンストラクトのクローニング（Ｆｎ１４及びＦｎ１４−ＧＰＩ）：
４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）誘導性レンチウイルス感染系（Ｖｉｎｃｅら、２００７）をすべてのコンストラクトについて使用した。ヒトＦｎ１４の全長野生型ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１６６３９）を、ＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩにおいて、レンチウイルスベクターｐＦ＿ＵＡＳ＿Ｎｅｏ中にクローニングした。ＴｒａｉｌＲ３  ＧＰＩアンカーコード領域（ＡＦ０２０５０２）に融合したヒトＦｎ１４の細胞外領域のｃＤＮＡ（フォワードＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＧＧＧＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣ（配列番号３７）リバースＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＧＣＡＧＧ（配列番号３８））を含有するコントロールコンストラクトを、オーバーラップＰＣＲ（フォワードプライマーＣＧＧＣＴＧＣＴＴＴＧＧＡＴＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＣＴＣＣＴ（配列番号３９）、リバースプライマーＣＧＣＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＡＣＡＡＴＣＡＧＡＡＧ（配列番号４０））によって創出して、Ｆｎ１４−ＧＰＩを創出した。コンストラクトをＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０５２３】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルのための細胞株の創出（Ｆｎ１４及びＦｎ１４−ＧＰＩ）：
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＳＶ４０不死化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を、レトロウイルス感染によってヒトｖ１２Ｈｒａｓで形質転換した。次いで、ｖ１２Ｈｒａｓ形質転換した細胞を、構成的発現ＧＥＶ１６、及び４−ヒドロキシタモキシフェン誘導性ｈＦｎ１４、誘導性ｈＦｎ１４−ＧＰＩ又は構成的発現ｈＦｎ１４のいずれかに関する、ＤＮＡコンストラクトを保有するレンチウイルスに感染させた。細胞を最低２週間にわたり適切な抗生物質で選択し、その後ＦＡＣＳスクリーニングを実施してタンパク質発現を確認した。タンパク質発現の誘導のために、４−ＯＨＴを、最低２４時間にわたり正常成長培地に添加して１００ｎＭの濃度にした。細胞を収集し、ヒトＦｎ１４に対する市販の抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ２１３５９）及びＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  １０３０−０９）にコンジュゲート化した抗マウス抗体又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ２１２３５）にコンジュゲート化した抗マウス抗体のいずれかを用いて生染色を実施した。最低１０，０００の事象を、評価した各サンプルについて記録し、引き続いてデータを分析した。
【０５２４】
マウスの免疫化：
Ｆｎ１４細胞外ドメインを含む精製された組換えタンパク質を免疫化に使用した。抗Ｆｎ１４抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２の生成のために、雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを、一次免疫化のためにフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ｆ５８８１）中に、引き続く追加免疫のためにフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ｆ５５０６）中に１：１の比率で乳化した、ＰＢＳ中の抗原１５μｇで腹腔内（ＩＰ）免疫した。抗Ｆｎ１４抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００５〜ＣＲＣＢＴ−０６−００７の生成のために、マウスを、ＰＢＳ中に懸濁したＨＥＫ２９３Ｔ細胞で免疫し、引き続いてＰＢＳ中の細胞で追加免疫を実施したか、又は細胞を、一次免疫化のためにフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ｆ５８８１）中に、引き続く追加免疫のためにフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ｆ５５０６）中に１：１で混合した。すべてのマウスについて、追加免疫を１週間に４回実施し、脾臓を取り出し脾臓細胞を収集する３日前に、最終注射をＰＢＳ中に腹腔内で与えた。テストブリード（ｔｅｓｔ  ｂｌｅｅｄ）を追加免疫の５〜７日後に採取し、ｈＦｎ１４に対する免疫応答の存在についてのスクリーニングに使用した。マウスから収集した血液を４℃で一晩凝血させた。血餅を遠心分離によって除去し、血清を収集して−２０℃で保存した。
【０５２５】
モノクローナル抗体製造：
ハイブリドーマ融合を、製造業者の指示に本質的に従ってクローナセル（ＣｌｏｎａＣｅｌｌ）（登録商標）−ＨＹ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｋｉｔ  ＃０３８００、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用して実施した。簡潔に述べると、脾臓細胞を、マウス骨髄腫ＳＰ２／Ｏとの融合（１：５の比率）の前に、脾臓灌流によって単離した。選択及びクローニングのステップを、メチルセルロースベースの半固体上、９６ウェルプレート中で実施した。培養上清を、ＩｇＧ生成のためにＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、引き続いて特異性についてフローサイトメトリーによってスクリーニングした。
【０５２６】
ハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡスクリーニング：
上清を、ＩｇＧ生成のためにＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。簡潔に述べると、９６ウェルプレートを、０．０５％炭酸塩−炭酸水素塩被覆緩衝液中のマウスＩｇＧに対するポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃７１５−００６−１５０  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で４℃で一晩被覆し、その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に希釈した３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で室温（ＲＴ）で１時間インキュベートしてブロッキングした。標準及びサンプルを、ＲＴで６０分間添加した（ＰＢＳ中に１：５０希釈した１００μｌ／ウェル）。結合したモノクローナル抗体を、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ２５５５４  Ａｕｓｔｒａｌｉａ；１００μｌ／ウェル、１／５０，０００で使用）と共にＲＴで６０分間インキュベートし、その後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（１００μｌ／ウェル）と共にインキュベートして検出した。発色を２Ｍの硫酸で停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【０５２７】
ハイブリドーマ上清のフローサイトメトリースクリーニング：
１００ｎＭ  ４−ＯＨＴで誘導した１×１０５のＭＥＦ  ｖ１２Ｈｒａｓ  Ｆｎ１４＋／−（上記）を、染色の前に単一細胞又は混合細胞集団（１：１の比率）として使用した。細胞を、ＰＢＳ、２％  ＢＳＡ中で３０分間、サンプル又はコントロールと共に４℃でインキュベートした。細胞を洗浄し、暗中４℃で３０分間、二次抗体（１：１００  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃Ａ２１２３５、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）と共にインキュベートした。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩを用いて製造業者のプロトコルに従ってフローサイトメトリーを実施し、データ分析を実施した。実験は、少なくとも３回の独立した実験の代表であった。精製されたコントロール抗体は、ＩｇＧ２ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃４０１２１２）、ＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃４０１４０５）、ＩＴＥＭ−１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ  ＃３１４００６）及びＩＴＥＭ−２（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む。
【０５２８】
モノクローナル抗体精製／内毒素除去及び試験：
抗体の精製：
抗体１つにつきおよそ１リットルの無血清馴化培地を、ペニシリン−ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍｌ）を補充したハイブリドーマ無血清培地（１２０４５−０８４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａｕｓ）中で培養した４×Ｔｒｉｐｌｅ  Ｆｌａｓｋ  ５００ｃｍ２（ＮＵＮ１３２９１３  Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａｕｓ）のハイブリドーマから、４．５日間にわたって収集した。精製前に、０．４５μｍフィルターを通して培地を濾過した。５ｍｌカラムのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（２８−４０８２−６０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ａｕｓ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製した。このＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムを、０．０２Ｍリン酸ナトリウム、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．８５を含む緩衝液で平衡化し、抗体を、０．１Ｍグリシン／ＨＣｌ  ｐＨ３．０で溶出し、その後１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ９．０で中和した。中和した溶出物を濃縮し、ビバスピン（ｖｉｖａｓｐｉｎ）２０カラム（ＶＳ２０２１、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ａｕｓ）を用いて緩衝液をＰＢＳと交換した。内毒素を、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ（２０３３９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｕｓ）を用いてサンプルから除去し、Ｅ−トキセート（Ｅ−ｔｏｘａｔｅ）キット（ＥＴ０１００、Ｓｉｇｍａ、Ａｕｓ）を用いて又はエンドセーフ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ）（登録商標）−ＰＴＳ  Ｐｒｏｔａｂｌｅ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（５〜０．０５Ｅｕ／ｍｌの範囲のカートリッジ）を用いて測定し、いずれの方法も製造業者の指示に従って実施した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験に使用したすべての最終抗体調製物の内毒素レベルはアッセイの検出水準より低かった（０．０５ＥＵ／ｍｇ未満の抗体）。
【０５２９】
抗体アイソタイプ特定：
抗体を、製造業者の指示に本質的に従ってＢＤ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）Ｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（カタログ番号５５００２６）を使用してアイソタイプ特定した。
【０５３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性アッセイ：
ＨＥＫ２９３Ｔ  ＮＦκＢ  ＧＦＰアッセイ：
ＧＦＰオープンリーディングフレームが後に続く安定に組み込まれたＮＦκＢプロモーターを含有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、機能的に活性な抗体について試験した（Ｖｉｎｃｅら、２００７）。細胞を、５〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度の精製された組換えＴｗｅａｋ−Ｆｃの存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。さらに、ハイブリドーマ上清又はコントロールを、１：１０〜１：１００の最終希釈になるように添加した。細胞を収集し、ＧＦＰ蛍光を、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ、Ｄｉｖａソフトウェア）によって測定した。サンプル当たり最低１０，０００の事象を記録した。
【０５３１】
アイソタイプコントロールとして、ＩｇＧ２ｂ抗チトクロムＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ５５６４３３）抗体を等価な濃度で使用した。非抗体分泌ハイブリドーマ又は無関係なＩｇＧを生成するハイブリドーマ由来のハイブリドーマ上清をコントロールとして使用した。
【０５３２】
Ｋｙｍ１死アッセイ：
Ｋｙｍ１細胞死アッセイを、本質的にはＶｉｎｃｅら、（２００７）に記載されたように実施した。細胞を、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃ及びハイブリドーマ上清、精製された抗体又はコントロールの存在下又は非存在下で２４時間インキュベートした。全細胞を回収し、５０μｇ／ｍｌの濃度のヨウ化プロピジウム（ＰＩ；Ｓｉｇｍａ  Ｐ４１７０）の存在下でフローサイトメトリーによって分析した。データを細胞死のパーセンテージとしてグラフ化した。
【０５３３】
ＩＬ−８分泌アッセイ：
Ａ３７５ヒト黒色腫細胞を、１０％胎児ウシ血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、９６ウェル平底プレートにおいて１ウェル当たり１×１０４細胞で播種した。細胞を、５％ＣＯ２、３７℃の標準的な細胞培養条件下で一晩付着させた。
【０５３４】
細胞を、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃ（終濃度：３００ｎｇ／ｍｌ）又は１０、１、０．１若しくは０．０１μｇ／ｍｌの抗体のいずれかと共に、或いは終濃度がそれぞれ３００ｎｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌのＴｗｅａｋ−Ｆｃ及び抗体の両方と共にインキュベートした。
【０５３５】
試薬の添加後、細胞を標準的な組織培養条件下で２４時間インキュベートした。上清を収集し、７００ｇ、４℃で５分間遠心分離した。抗Ｔｗｅａｋ抗体（ＭＴＷ−１）、ラットＩｇＧ１、ＩＴＥＭ−１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入し、ＩＴＥＭ−４はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
【０５３６】
ＩＬ−８検出ＥＬＩＳＡ：
２４時間後、細胞培養上清を、本質的には製造業者の指示に従って、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によってＩＬ−８レベルについて評価した。簡潔に述べると、これらのサンプル及び供給された標準を室温で２時間インキュベートした。インキュベーション間の数回の徹底的な洗浄（供給された洗浄緩衝液中）後、ＩＬ−８コンジュゲート及び次の基質溶液をすべてのサンプルに添加し、室温でそれぞれ６０分間及び３０分間インキュベートした。吸光度を４５０ｎｍ及び５４０ｎｍで測定した。プレートのばらつきを説明するために５４０ｎｍでの読み取りを４５０ｎｍでの読み取りから差し引いた。
【０５３７】
抗体可変領域のＤＮＡ配列決定：
ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、７５１４４）を用いてｍＲＮＡをハイブリドーマ細胞から単離した。ＲＴ−ＰＣＲを、ワンステップＲＴ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、２１０２１２）を製造業者の指示に従って使用して実施した。簡潔に述べると、１μｇのｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成の鋳型として使用し、可変マウス軽鎖及び重鎖を、Ｗａｎｇら、２０００に記載されるように変性プライマーを用いて増幅した。
【０５３８】
軽鎖は、それぞれ１０ｐＭの５’−ＧＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＹ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＭＴＳ  ＡＣＭ  ＣＡＲ  ＷＣＴ  ＭＣＡ−３’（配列番号４１）フォワードプライマー及び５’−ＧＧＴ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＧＧＡ  ＴＡＣ  ＡＧＴ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＡＴＣ−３’（配列番号４２）リバースプライマーを用いて増幅した。重鎖は、１０ｐＭのフォワードプライマー（ＭＨ１：５’−ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＳＡＲ  ＧＴＮ  ＭＡＧ  ＣＴＧ  ＳＡＧ  ＳＡＧ  ＴＣ−３’（配列番号４３）又はＭＨ２：５’−ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＳＡＲ  ＧＴＮ  ＭＡＧ  ＣＴＧ  ＳＡＧ  ＳＡＧ  ＴＣＷ  ＧＧ−３’（配列番号４４））及び特異的リバースプライマー（ＩｇＧ１：５’−ｇｇａ  ａｇａ  ｔｃｔ  ＡＴＡ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＧＣ−３’（配列番号４５））を用いて増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で分離し、バンドを切り出し、ウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ及びＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ９２８２）を用いてＤＮＡを精製した。製造業者の指示に従って、精製された断片を、トポティーエークローニング（ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）（登録商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋ４５６０−４０）を用いてｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター中にサブクローニングし、ライゲーション産物を、ワンショット（Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ）（登録商標）トップテンエレクトロコンプ（ＴＯＰ１０  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐ）（商標）エシェリキア・コリ中に形質転換した。Ｘ−Ｇａｌ青−白スクリーニングにより、ウィザード（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ１４６０）を使用するＤＮＡ単離のための、培養した白色コロニーの選択が可能になった。各ｍＡｂについて、数個の独立したクローンを、ユニバーサルＭ１３プライマーを使用した配列決定に送った。
【０５３９】
ＣＲＣＢＴ−０６−００２の配列を確認するために、軽鎖を、１０ｐＭのフォワードプライマーＭＫＶＰ２  ５’−ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＷＣＡ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＹＴＡ  ＴＧＧ  Ｔ−３’（配列番号６９）及びリバースプライマー５’−ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＧＣ−３’（配列番号７０；Ｄｅｂａｔら、２００１から適合させた）を用いて増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で分離し、バンドを切り出し、ウィザード（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ及びＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ９２８２）を用いてＤＮＡを精製した。製造業者の指示に従って、精製された断片を、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ３６１０）を用いてｐＧＥＭ（登録商標）Ｔベクター中にサブクローニングし、ライゲーション産物を、エシェリキア・コリＪＭ１０９コンピテント細胞中に形質転換した。Ｘ−Ｇａｌ青−白スクリーニングにより、ウィザード（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ａ１４６０）を使用するＤＮＡ単離のための、培養した白色コロニーの選択が可能になった。数個の独立したクローンを、ユニバーサルプライマーＴ７及びＳＰ６を使用する配列決定に送った。
【０５４０】
質量分析的分析による抗体ＣＤＲ／ＦＲ配列の検証：
Ｆａｂ生成：
Ｆａｂ断片を、軽微な改変を伴って製造業者の指示に従ってＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号４４９８０）を使用してＣＲＣＢＴ−０６−００２から生成した。簡潔に述べると、４ｍｇの抗体を、およそｐＨ５．６の２５ｍＭシステイン中で、７５０μｌの固定化されたＦｉｃｉｎによって、一定に混合しながら３７℃で５時間消化した。インキュベーション後、固定化されたＦｉｃｉｎ樹脂を５，０００ｇで１分間遠心分離し、上清を氷上に維持した。固定化されたＦｉｃｉｎ樹脂を、０．５ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。消化した抗体に洗浄画分を添加し、透析カップ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号ＶＳＡ００５）と共にビバスピン２０濃縮器３０ＫＤカットオフ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号ＶＳ１５Ｔ２１）を用いて２０ｍｌのＰＢＳに対して透析し、０．５ｍｌに濃縮した。未消化のＩｇＧ及びＦｃ断片を、製造業者の指示に従ってプロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０６１８−０１）を使用してＦａｂ断片から除去した。
【０５４１】
ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６及びＣＲＣＢＴ−０６−００７由来のＦａｂを、軽微な改変を伴って製造業者の指示に従ってＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｆａｂ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号４４９８５）を使用して生成した。簡潔に述べると、５ｍｇの抗体を、およそｐＨ７の２０ｍＭシステイン中で、２５０μｌの固定化されたパパインによって、一定に混合しながら３７℃で３時間消化した。インキュベーション後、固定化されたパパインを５，０００ｇで１分間遠心分離し、上清を氷上に維持した。固定化されたパパインを、０．５ｍｌのＰＢＳで３回洗浄した。消化した抗体に洗浄画分を添加した。未消化のＩｇＧ及びＦｃ断片を、製造業者の指示に従ってプロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−０６１８−０１）を使用してＦａｂ断片から除去した。
【０５４２】
質量分析的配列分析のためのサンプル調製：
モノクローナル抗体から生成したＦａｂ断片を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中に溶解し、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ＲＴで一晩還元し、その後暗中ＲＴで３０分間、５０ｍＭ  ＩＡＡでアルキル化した。Ｆａｂの各サンプルを、４０℃で２時間、配列グレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はキモトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）のいずれかを０．５μｇ用いて消化した。さらに、各Ｆａｂを最初に消化し、次いで還元しアルキル化した。このペプチド混合物を、ＥＳＩ−ｍｉｃｒｏＴＯＦ−Ｑ−ＭＳ／ＭＳによる直接的分析の前にＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００）によって、又は引き続くＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ／ｔｏｆ−ＭＳ（両機器ともＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）分析のためにＭＡＬＤＩ−ＭＳ標的プレート上にスポットすることによって分離した。
【０５４３】
いずれかの機器によって得られたスペクトルを、ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓによってアノテートし、データをＢｉｏｔｏｏｌｓプログラムに移した（両プログラムとも：Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。Ｍａｓｃｏｔ検索エンジン（Ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）を用いてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに対してすべてのデータを検索し、抗体の定常部分及びアイソフォームを確認できた。ＣＤＲ領域の配列をＤＮＡ配列から誘導し、Ｂｉｏｔｏｏｌｓプログラムと共に利用可能な設備を用いてこれらの配列を質量分析データと一致させた。適用した質量精度は、ＭＳスペクトルについて５０ｐｐｍの質量ウインドウであり、０．８Ｄａの許容度をＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて使用した。
【０５４４】
Ｆｎ１４−Ｆｃを用いた、Ｆｎ１４に対する抗体の親和性の決定：
マウス抗Ｆｎ１４  ＩｇＧモノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２と組換えＦｎ１４−Ｆｃとの相互作用を、本質的にはＮａｈｓｈｏｌら、（２００８）に記載された通りにＢｉｏ−Ｒａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６を使用して測定した。簡潔に述べると、ＧＬＭ  ＰｒｏｔｅＯｎセンサーチップを、チップ上に０．２Ｍ  ＥＤＣと０．０５Ｍスルホ−ＮＨＳとの混合物を流すことによって（１５０μｌ、３０μｌ／分で５分間）、活性化した。次いで、ウサギ抗マウスＩｇＧ分子全体（Ｓｉｇｍａ  Ｍ−７０２３）を、１０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）中の５０μｇ／ｍｌ溶液１５０μｌを３０μｌ／分で流すことによって、垂直方向でチップにカップリングさせた。次いで、残ったカップリング部位を、１５０μｌの１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を３０μｌ／分で流すことによって不活性化した。次いで、マウス抗Ｆｎ１４  ＩｇＧモノクローナル抗体を、水平方向でセンサーチップの単一チャネル上に１００μｇ／ｍｌのＩｇＧを２５μｌ／分で１５０μｌ流すことによって、カップリングした抗マウスＩｇＧ抗体に結合させた。次いで、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．００５％）中に希釈した組換えＦｎ１４−Ｆｃを、以下の濃度で５つのチャネルにおいて垂直方向でＧＬＭセンサーチップ上を通過させた（１５０μｌ、４０μｌ／分、接触時間９０秒及び解離時間８００秒）：５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、６．２５ｎＭ及び３．１２５ｎＭ。ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．００５％）単独を、残りのチャネル上を通過させた。結合センサーグラムを収集し、Ｌａｎｇｍｕｉｒ又は二価アナライト動態モデルを用い、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ２．１  ＸＰＲ３６ソフトウェアを用いて分析し、データをフィットさせて親和性定数ＫＤを決定した。
【０５４５】
Ｆｎ１４を用いた、Ｆｎ１４に対する抗体の親和性の決定：
モノクローナル抗体の動態分析を、本質的にＮａｈｓｈｏｌら（２００８）からのプロトコルに従って、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６システム（ＢｉｏＲａｄ）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で実施した。ｈＦｎ１４に対するモノクローナル抗体（５０μｇ／ｍｌ）を、ＧＭＣチップに共有結合でカップリングさせた。アナライトは、細菌発現させ精製したヒスチジンタグ化ｈＦｎ１４の段階希釈物であった。結合センサーグラムを収集し、統合されたＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて処理・分析した。結合曲線を、１：１の結合化学量論を記述するＬａｎｇｍｕｉｒモデルを用いてフィットさせた。
【０５４６】
ＣＲＣＢＴ−０６−００１によって結合されるエピトープの性質の特徴付け：
Ｆｎ１４の還元及びアルキル化：
ＣＲＣＢＴ−０６−００１のエピトープが立体構造エピトープであるかどうかを決定するために、Ｆｎ１４−Ｆｃを、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ  ｐＨ８．０の存在下で１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて４５℃で４５分間還元し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０中５０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を用いて１時間アルキル化した。タンパク質を、ＰＢＳ中に広範に透析して、過剰のＤＴＴ及びＩＡＡを除去した。ネイティブＦｎ１４及びＲ＋Ａｎ  Ｆｎ１４でマイクロタイタープレートのウェルを被覆することによってＥＬＩＳＡを実施し、抗Ｆｎ１４抗体を結合させ、その後抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートを用いて検出した。基質ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ）を用い、マイクロタイタープレートリーダーを用いて吸光度を４５０ｎｍで検出した。還元及びアルキル化されたＦｎ１４−Ｆｃの完全性を確実にするために、融合タンパク質のＦｃ部分を、抗Ｆｃ−ＨＲＰを用いて検出した。
【０５４７】
ｍＡｂが結合するＦｎ１４の最小結合領域の決定：
ファージディスプレイアプローチを用いてヒトＦｎ１４遺伝子を消化し、バクテリオファージの表面上にその断片を発現させることによって、遺伝子断片ライブラリーを構築した。これは、立体構造エピトープ及び線状エピトープの両方のエピトープマッピングに頻繁に使用されている標準的な技術である。
【０５４８】
ヒトＦｎ１４遺伝子断片ライブラリーの調製及びパニング：
Ｃｏｌｅｙら２００１に記載される方法のバリエーションを用いて、Ｍ１３バクテリオファージ上に発現されたヒトＦｎ１４遺伝子断片ライブラリーを調製した。
【０５４９】
ファージミドベクターｐＨＥＮＨ６（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１）は、ファージ粒子の表面上のｐＩＩＩタンパク質をコードするＭ１３バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩを１コピー含有し、周辺質標的化配列と機能的遺伝子ＩＩＩ配列との間に複数のクローニング部位を含有する。このベクターを、ｐＩＩＩタンパク質との融合物としてのｈＦｎ１４断片の発現に使用した。簡潔に述べると、Ｆｎ１４のコード領域に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ｈＦｎ１４  ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによってオープンリーディングフレーム全体を増幅した。ＰＣＲ産物をＤＮａｓｅＩで消化し、断片を精製し、末端（複数）をＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した。ＰｓｔＩを用いてｐＨＥＮＨ６ファージミドベクターを消化し、引き続いて、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した。次いで、ランダム消化によって生成された平滑化されたＦｎ１４遺伝子断片を、調製したｐＨＥＮＨ６ベクター中にライゲーションした。ライゲーションした産物を精製し、エレクトロポレーションによってコンピテントエシェリキア・コリＴＧ−１細胞中に形質転換した。得られたライブラリーの分析により、ｈＦｎ１４配列のカバー範囲がランダムであることが示された。
【０５５０】
４ラウンドのパニングを、２μｇ／ｍｌのＣＲＣＢＴ−０６−００１で１０ウェルのマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ  ｍａｘｉｓｏｒｐ）を被覆することによって実施し、これらのウェルを、ＰＢＳ中５％のスキムミルク粉末でブロッキングし、ライブラリーを抗体に結合させた。１時間後、プレートを洗浄して未結合のファージを除去し、次いで接着ファージを０．１Ｍグリシン  ｐＨ２．２で溶出し、中和した。Ｃｏｌｅｙら２００１に記載されるように、溶出したファージを、ＴＧ１エシェリキア・コリ細胞において再感染させ、レスキューし、増幅し、次のラウンドのパニングのためにＰＥＧ沈殿させた。ＣＲＣＢＴ−０６−００１抗体に結合したＦｎ１４断片の正体を確立するために、ラウンド４由来のクローンについてＤＮＡ配列決定を行った。
【０５５１】
ファージ上に発現された遺伝子断片の調製：
Ｆｎ１４の溶液構造は、Ｈｅら、２００９によって最近記載されており、さらにＢｒｏｗｎら、２００６は、Ｔｗｅａｋリガンド相互作用に重要な残基を同定した。Ｆｎ１４の細胞外ドメインは６つのシステイン残基を含有し、ジスルフィドペアリングはＨｅら（２００９）に記載されている。Ｆｉｇｕｒｅ  １３に示されるＦｎ１４の断片を生成し、ファージ上で発現させ、ＣＲＣＢＴ−０６−００１によって結合されるエピトープを特徴付けるために使用した。
【０５５２】
Ｍ１３ファージ上でのディスプレイのためのｈＦｎ１４コンストラクトのクローニング：
ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限部位を有するように操作したオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、合成し（Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ）、ＰＣＲによってホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）Ｆｎ１４コード配列の全長細胞外ドメイン並びにサブドメイン１、２及び３を増幅するために使用し、その産物を、引き続いてＡテイル化し（Ａ−ｔａｉｌｅｄ）、ｐＧＥＭＴベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にライゲーションした。単一のｈＦｎ１４細胞外ドメイン／ＳＤ１／２／３−ｐＧＥＭＴクローン由来のプラスミドを調製し、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ制限酵素を用いて挿入物をベクター骨格から消化した。次いで、制限された挿入物を精製し、ファージミドベクターｐＨＥＮ−Ｈ６（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１）中にライゲーションした。ｈＦｎ１４変異体について、変異誘発を、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用し、鋳型としてｈＦｎ１４細胞外ドメイン−ｐＨＥＮ−Ｈ６プラスミドを使用して達成した。
【０５５３】
ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピング（方法１）：
ファージの発現・精製：
ファージミドコンストラクトで形質転換したＴＧ−１エシェリキア・コリのグリセロールストックを用いて、アンピシリンを含有するＹＴ培地１０ｍＬに接種した。開始培養物を対数期まで成長させ、その後Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加して細胞に感染させた。次いで、ヘルパーファージ感染した培養物を、アンピシリン及びカナマイシンを含有するＳＢ培地２００ｍｌに移した。培養物を、３０℃で一晩成長させた。引き続いて、エシェリキア・コリを遠心分離によって収集し、廃棄した。ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液をこの培養上清に添加し、ファージを沈澱させ、これを引き続いて遠心分離によって収集し、リン酸緩衝食塩水溶液中に再懸濁し、−８０℃で保存した。
【０５５４】
抗体に対するファージの結合を決定するための酵素結合免疫吸着検定法：
Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルを、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬの濃度の標的モノクローナル抗体又は組換えＴｗｅａｋ−Ｆｃで、４℃で一晩被覆した。ｍＡｂ  ５Ｇ８を、試験した抗体で被覆したＥＬＩＳＡプレートについての陰性コントロールとして使用した。組換えＦｃ単独を、組換えＴｗｅａｋ−Ｆｃで被覆したＥＬＩＳＡプレートについての陰性コントロールとして使用した。被覆されたＥＬＩＳＡプレートのウェルを、引き続いてＰＢＳ中１０％のスキムミルク溶液で２時間ブロッキングした。ファージの１０倍段階希釈物を、５％スキムミルク／ＰＢＳ溶液を用いて２ｍｌウェルのマイクロタイタープレート中で作成し、ファージ希釈物を、室温で激しく振盪しながら１時間、被覆してブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。引き続いてファージをウェルから除去し、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄した。次いで、ＰＢＳ中に希釈したＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージポリクローナルＩｇＧを、室温で激しく振盪しながら１時間、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。次いで、抗体溶液をウェルから除去し、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で５回洗浄した。ＴＭＢ基質を用いてＥＬＩＳＡを発色させ、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて反応を停止させた。４５０ｎｍにおける光学密度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ吸光度分光光度計を用いて定量した。
【０５５５】
ファージ発現されたＦｎ１４を使用するエピトープマッピング（方法２）：
ファージの発現・精製：
ファージミドコンストラクトで形質転換したＴＧ−１エシェリキア・コリの単一コロニーを用いて、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含む２ＹＴ培地１０ｍｌに接種した。開始培養物を対数期まで成長させ、その後Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加して、ファージ感染したエシェリキア・コリをレスキューした。ヘルパーファージ感染した培養物を、アンピシリン及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する２ＹＴ培地２００ｍｌ中で増幅した。培養物を、振盪インキュベータ中で３０℃で一晩成長させた。培養物を遠心分離し、ファージ（上清画分）をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿によって収集した。ファージを遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳ中に再懸濁し、−８０℃で保存した。
【０５５６】
ｍＡｂのＦｎ１４変異体との反応性を測定するための酵素結合免疫吸着検定法：
Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルを、ＰＢＳ中１．５μｇ／ｍｌの濃度の標的モノクローナル抗体又は組換えＴｗｅａｋ−Ｆｃで、４℃で一晩被覆した。ｍＡｂ  ５Ｇ８を、試験した抗体で被覆したＥＬＩＳＡプレートについての陰性コントロールとして使用した。被覆されたＥＬＩＳＡプレートのウェルを、引き続いてＰＢＳ中５％のスキムミルク溶液で２時間ブロッキングした。ファージの１０倍段階希釈物を、ＰＢＳ溶液を用いて作製し、ファージ希釈物を、室温で振盪しながら１時間、被覆してブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。引き続いてファージをウェルから除去し、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄した。
【０５５７】
ファージの検出：
ファージ変異体の結合を検出するために２つの方法を使用した。
【０５５８】
方法Ａ：次いで、ＰＢＳ中１／５０００希釈のＨＲＰコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、室温で振盪しながら１時間、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。次いで、抗体溶液をウェルから除去し、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄した。方法Ｂ：次いで、ＰＢＳ中に希釈したビオチンコンジュゲート化抗Ｍ１３ファージ抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、室温で振盪しながら１時間、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。次いで、抗体溶液をウェルから除去し、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ中に希釈したＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンを、室温で振盪しながら１時間、ＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。次いで、溶液をウェルから除去し、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄した。ＴＭＢ基質を用いてＥＬＩＳＡを発色させ、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて反応を停止させた。４５０ｎｍにおける光学密度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ吸光度分光光度計を用いて定量した。
【０５５９】
合成ペプチドを用いた抗体のエピトープマッピング：
ｈＦｎ１４のサブドメイン１ｐ、２及び３（Ｆｉｇｕｒｅ  ２０  パネルＢ及びＣ、並びにＦｉｇｕｒｅ  １４  パネルＡ）並びにジスルフィドペア変異体（Ｃｙｓ  ３＆６  ΔＳ及びＣｙｓ  ４＆５  ΔＳ；Ｆｉｇｕｒｅ  ２０  パネルＤ及びＥ）を提示するペプチドはＧＬＢｉｏｃｈｅｍ  Ｌｔｄ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）によって合成されたものであり、ジスルフィド結合のためのシステイン残基を、Ｈｅら、（２００９）による溶液構造に記載されるように選択した。ビオチン部分を付着させるため、及びニュートラアビジン被覆されたプレート（ブロッキング済み；Ｐｉｅｒｃｅ）にペプチドが結合するのを可能にするために、さらなるリジン残基をＣ末端に付加した。これらの実験のために、Ｃ末端にビオチンを有するコントロールペプチドを陰性コントロールとして使用し、アイソタイプコントロール抗体もまた使用した。
【０５６０】
ＥＬＩＳＡを、製造業者が推奨するプロトコル（Ｐｉｅｒｃｅ）に本質的に従って実施した。簡潔に述べると、ペプチドを室温で２時間、１〜１０μｇ／ｍｌでウェル（重複して）上に被覆した。ウェルを、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／０．１％  ＢＳＡで３回洗浄し、洗浄緩衝液中の各抗体の希釈物を、穏やかに撹拌しながら１時間添加した。もう３回の洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）にコンジュゲート化した抗マウスＨＲＰを、１時間振盪しながら１／１０００希釈で添加した。最後に、４回のさらなる洗浄後に、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてプレートを発色させ、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて反応を停止させた。４５０ｎＭにおける光学密度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ吸光度分光光度計を用いて定量した。
【０５６１】
組換えタンパク質を用いた抗体のエピトープマッピング：
細菌発現のためのｈＦｎ１４及びｍＦｎ１４コンストラクトのクローニング：
ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を有するように操作したオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、合成し（Ｇｅｎｅｗｏｒｋｓ）、ＰＣＲによってホモ・サピエンスＦｎ１４（ｈＦｎ１４）の全長細胞外ドメイン、マウスＦｎ１４（ｍＦｎ１４）細胞外ドメイン、及びｈＦｎ１４の変異体（Ｒ５６Ｐ、Ｒ５６Ａ、Ｒ５６Ｋ、Ｒ５８Ｋ）を増幅するために使用した。引き続く産物を、ＳｍａＩで切断したベクターｐＧＥＭ−４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にライゲーションした。単一クローン由来のプラスミドを調製し、挿入物をベクターから消化した。次いで、制限された挿入物を精製し、エシェリキア・コリ中での発現のためにｐＥＴ−１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に挿入した。
【０５６２】
（Ｈｉｓ）６−タンパク質の発現及び精製：
ｐＥＴ−１５ｂから誘導したベクターを、Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓエシェリキア・コリ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）中に形質転換した。１ｍＭ  ＩＰＴＧによって３０℃で４時間発現を誘導した。細菌溶解物を、溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．８］、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％［ｖ／ｖ］グリセロール、１８ｍＭイミダゾール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ完全プロテアーゼインヒビター）で平衡化した１ｍｌ  Ｎｉ２＋−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ２＋−ＮＴＡ）−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ）カラム上にロードした。このカラムを２０ｍｌの溶解緩衝液で最初に洗浄し、組換えタンパク質を３００ｍＭイミダゾールによって溶出した。組換えタンパク質を透析し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＹＭ−１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０５６３】
分析的ゲル濾過クロマトグラフィー：
（Ｈｉｓ）６−タンパク質をゲル濾過によってさらに精製した。タンパク質サンプル（１ｍｌ）を室温で、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードし、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で１．５ｍｌ／分の流速でクロマトグラフィーにかけた。溶出プロファイルを２８０ｎｍで検出し、１．５ｍｌ画分を収集した。
【０５６４】
精製された（Ｈｉｓ）６−タンパク質を用いたモノクローナル抗体のＥＬＩＳＡスクリーニング：
Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（Ｎｕｎｃ）のウェルを、精製されたヒスチジンタグ化タンパク質の２倍段階希釈物（０．５μｇ／ｍｌ〜４ｎｇ／ｍｌ）で、４℃で一晩被覆した。非特異的なタンパク質結合部位を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中１％のミルクで、３７℃で１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ［１０ｍＭリン酸Ｎａ及び１５０ｍＭ  ＮａＣｌ］、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄した。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ  ０．００５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）＋０．１％ミルク中に１μｇ／ｍｌに希釈したモノクローナル抗体を添加し、被覆されたプレートにおいて３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、０．１％ミルクを含有する、１：１５，０００希釈のペルオキシダーゼコンジュゲート化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｉｇｍａ）を３７℃で１時間添加した。ＴＭＢ基質を用いてＥＬＩＳＡを発色させ、２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて反応を停止させた。４５０ｎｍにおける光学密度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ吸光度分光光度計を用いて定量した。
【０５６５】
結果：
組換えタンパク質を用いた、マウスにおけるＦｎ１４特異的免疫応答の生成：
マウスを、アジュバントの存在下又は非存在下で、Ｆｎ１４細胞外ドメインを含む組換えタンパク質を用いて免疫し、引き続く追加免疫の後、少量のブリードを採取し、血清を単離した。生きたｈＦｎ１４誘導性マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ；Ｆｉｇｕｒｅ  １）上のｈＦｎ１４に特異的なＩｇＧ抗体の存在について、フローサイトメトリーによって血清サンプルをスクリーニングした。多数のマウスが、非誘導細胞の染色と比較した場合に陽性コントロールと類似の誘導細胞上の蛍光の増加によって示される、ｈＦｎ１４に対する良好な免疫応答を示した（パネルＢ）。
【０５６６】
この結果を確認するために、血清をヒト神経膠腫細胞株Ｄ６４５（血清の存在下で培養した場合にＦｎ１４を天然に発現する。）に対してもスクリーニングした（Ｆｉｇｕｒｅ  ２）。４−ＯＨＴ誘導ＭＥＦ細胞に対して陽性であった同じマウスがＤ６４５細胞に対しても陽性染色を示し、蛍光の全体的なシフトは陽性コントロールについてのシフトと匹敵し（パネルＢと比較してパネルＡ  ｉｉｉ）、僅かなバックグラウンド染色が、無関係の抗原で免疫したマウス由来の血清で細胞を染色した場合に見られた（パネルＡ  ｖｉ及びｖｉｉ）。
【０５６７】
アンタゴニスト抗Ｆｎ１４抗体を産生するマウスの同定：
免疫マウス由来の血清を、２つのアッセイ、ＮＦκＢ活性及びＫｙｍ１細胞死についての細胞ベースのレポーターアッセイを用いて、機能的に活性な抗体の存在についてアッセイした。
【０５６８】
ＮＦκＢ活性についての細胞ベースのレポーターアッセイの結果により、外因性Ｔｗｅａｋ−Ｆｃが強いＮＦκＢ活性化を誘導すること、及びＮＦκＢ活性化が、可溶性ＴｗｅａｋＲ、又は抗ｈＦｎ１４抗体の存在について陽性のマウス由来の血清によって遮断され得ることが示された。対照的に、無関係の抗原で免疫したマウス又は抗ｈＦｎ１４抗体について試験して陽性でないマウス由来の血清はＮＦκＢ活性化を遮断しなかった。
【０５６９】
数匹のマウス由来の血清は、ＮＦκＢ活性化を遮断することが可能であったので、これらの抗体がＴｗｅａｋ誘導性の細胞死を遮断する能力を、次に調査した。このアッセイの結果により、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃの存在下でＫｙｍ１細胞を培養することにより、細胞生存における劇的な低減が引き起こされたこと、及びこの効果が、可溶性ＴｗｅａｋＲ、又はＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢ活性化を低減したｈＦｎ１４免疫マウス由来の血清によって遮断され得ることが示され、これによりアンタゴニスト抗ｈＦｎ１４抗体の存在が確認された。
【０５７０】
モノクローナル抗体製造：
ヒトＦｎ１４特異的抗体の存在及びＴｗｅａｋを遮断する能力を示すマウス由来の脾臓をモノクローナル抗体製造に使用した。ハイブリドーマ融合を実施し、引き続くクローンを、ＩｇＧ分泌についてＥＬＩＳＡで最初にスクリーニングした。ＩｇＧを生成するクローン由来の上清を、生きた細胞を染色することによってさらに評価した（＋／−ｈＦｎ１４；Ｆｉｇｕｒｅ  ３）。ｈＦｎ１４陽性細胞に特異的に結合するが、ｈＦｎ１４を欠く細胞には特異的に結合しない多数のクローンを生成した。パネルＢは、Ｆｎ１４結合がないか、中程度の結合を示すか、又は高い結合を示す、スクリーニングされた多数のクローンの代表である。パネルＣは、細胞表面発現したｈＦｎ１４に対する高いレベルの結合を明らかに示す、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴ−０６−００４と称される４つの抗体を示す。
【０５７１】
機能的活性についてモノクローナル抗体を評価するためのＮＦκＢアッセイ：
次いで、抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２由来の上清を、上記ＮＦκＢアッセイにおいて機能的活性について評価した。実質的に増加したＧＦＰ蛍光は、可溶性Ｔｗｅａｋ−Ｆｃの存在下では明らかであるが、非ＩｇＧ分泌細胞株又は無関係のコントロールＩｇＧを分泌する細胞株のいずれか由来の上清の存在下では明らかでない（Ｆｉｇｕｒｅ  ４  パネルＡ）。ＣＲＣＢＴ−０６−００１を含有する上清及びＣＲＣＢＴ−０６−００２を含有する上清の存在下では、ＮＦκＢ活性化の強い阻害が明らかであるが、他の上清の存在下では活性化に対する目に見えた影響は見ることができない（パネルＢ）。
【０５７２】
ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２の特異性及び遮断能力を考慮して、抗体を生成するこれらのハイブリドーマを、さらなる特徴付けのために選択した。各ハイブリドーマ細胞株を少なくとも１回クローニングし、引き続いて細胞株を選択した。選択したすべてのサブクローンが、親細胞株と同じ結合及び機能的特徴を示した。
【０５７３】
モノクローナル抗体のアイソタイプ特定を実施した。抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２は、それぞれＩｇＧ２ｂκ及びＩｇＧ１であることが見出された。ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴ−０６−００４は共に、ＩｇＧ２ｂκであることが見出された。
【０５７４】
モノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１を精製し、質量分析によって評価して、高レベルの純度を確実にした。次いで、精製されたＣＲＣＢＴ−０６−００１を、ＮＦκＢアッセイにおいて検出可能な遮断のレベルについてアッセイした（Ｆｉｇｕｒｅ  ４  パネルＣ）。５０ｎｇ／ｍｌ以上では、ＣＲＣＢＴ−０６−００１は、ＮＦκＢ活性化に対する、５ｎｇ／ｍｌ又は５０ｎｇ／ｍｌのＴｗｅａｋ−Ｆｃの作用を遮断できる。ＣＲＣＢＴ−０６−００１によるＴｗｅａｋの完全な遮断は、１μｇ／ｍｌの濃度で見ることができる。Ｆｎ１４の小さいレベルの活性化が、より高い濃度のＣＲＣＢＴ−０６−００１で見られるが、これは一貫して見られたわけではなかった。しかし、精製されたＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロールは、１μｇ／ｍｌになるように添加した場合にはＴｗｅａｋの作用に対して影響を示さなかった（パネルＡ、下のシリーズ）。
【０５７５】
マウスの免疫化のための一過性トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞：
さらなるｈＦｎ１４抗体を生成するために、細胞ベースの免疫化戦略を使用した。ｈＦｎ１４過剰発現コンストラクトによるＨＥＫ２９３Ｔの一過性トランスフェクションを最適化した。マウスを、アジュバントの存在下又は非存在下で、一過性トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で免疫した。２回の引き続く追加免疫後、少量のブリードをスクリーニングのために採取した。これらのマウス由来の血清を用いて、ｈＦｎ１４に対する特異的免疫応答の存在についてＭＥＦ細胞（＋／−ｈＦｎ１４）を染色した（Ｆｉｇｕｒｅ  ５）。この実験において、Ｆｎ１４陰性及び陽性の細胞集団を、１：１の比率で混合し、その後染色し、フローサイトメトリーによって分析した。引き続く陰性結果は、陰性コントロールの蛍光ピークと重複する蛍光ピーク、又はピーク全体におけるシフトのいずれかの存在によって示される。二重ピークの出現は、陽性結果を示す（パネルＡ  ｉｉｉ中の陽性コントロールを参照のこと）。興味深いことに、ＰＢＳ中に懸濁した生きた細胞で免疫したマウスのみが、細胞表面発現されたｈＦｎ１４を認識する抗体について陽性であったが、アジュバント中の抗原で免疫したマウスは検出可能な応答を示さない（パネルＢ）。これらの抗ｈＦｎ１４陽性マウスのうちの２匹由来の脾臓をハイブリドーマ融合に使用して、モノクローナル抗体を生成した。この融合により、細胞表面発現されたｈＦｎ１４を認識する１５個のクローンが得られた。これらのクローンのうち３つ由来の抗体を精製し、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６及びＣＲＣＢＴ−０６−００７と命名した。これらのモノクローナル抗体のアイソタイプを評価したところ、ＣＲＣＢＴ−０６−００５及びＣＲＣＢＴ−０６−００７はＩｇＧ２ｂκであることが見いだされ、ＣＲＣＢＴ−０６−００６はＩｇＧ２ａであることが見いだされた。
【０５７６】
ヒトＦｎ１４に対するモノクローナル抗体の特徴付け：
Ｔｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢ遮断：
抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６及びＣＲＣＢＴ−０６−００７を精製し、機能的活性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。すべての精製抗体が、予測されたようにＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢ遮断活性を示した。ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２は、１００ｎｇ／ｍｌで活性化を完全に遮断できた（Ｆｉｇｕｒｅ  ６Ａ）。ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴ−０６−００４もまた良好な遮断能を実証した。ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６及びＣＲＣＢＴ−０６−００７は、１μｇ／ｍｌの濃度で添加した場合に、２００ｎｇ／ｍｌのＴｗｅａｋ−ＦｃによるＮＦκＢ活性化を効果的に遮断した（Ｆｉｇｕｒｅ  ７Ａ）。１００ｎｇ／ｍｌのより低い抗体濃度でも遮断が観察された。
【０５７７】
抗体ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−２もまた、レポーターアッセイにおいて、ＮＦκＢを活性化する能力又はＴｗｅａｋ誘導性のＮＦκＢを遮断する能力のいずれかについて評価した（Ｆｉｇｕｒｅ  ７Ａ及びＢ）。ＩＴＥＭ−１はＮＦκＢを活性化できなかった、すなわち、ＩＴＥＭ−１の存在下で培養した細胞は、細胞単独と比較して、ＮＦκＢ活性化において差異を示さない。ＩＴＥＭ−１は、Ｔｗｅａｋ−ＦｃによるＮＦκＢの活性化に対しても影響を有さなかった。ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６、ＣＲＣＢＴ−０６−００７及びＩＴＥＭ−１と比較して、ＩＴＥＭ−２は一貫したＮＦκＢ活性化を誘導した。
【０５７８】
Ｋｙｍ１細胞死アッセイにおけるＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２の機能的活性：
ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴ−０６−００４を、Ｋｙｍ１細胞のＴｗｅａｋ誘導性の細胞死を遮断する能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。細胞単独は低い程度の細胞死のみを示し、この割合は、増加するレベルのＴｗｅａｋ−Ｆｃの存在下で細胞を培養した場合に増加する（Ｆｉｇｕｒｅ  ８）。細胞をＴｗｅａｋＲ−Ｆｃの存在下で共培養した場合、Ｔｗｅａｋ誘導性の細胞死は遮断された。同様に、Ｔｗｅａｋの存在下で培養した細胞を、ＣＲＣＢＴ−０６−００１又はＣＲＣＢＴ−０６−００２（１μｇ／ｍｌ）の存在下で共培養した場合、細胞は生存したままであり、これは、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃ誘導性の細胞死の効率的な遮断を示す。より低い濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）の抗体では、Ｔｗｅａｋ誘導性の細胞死は、より低い濃度のＴｗｅａｋ−Ｆｃにおいて遮断された。ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴＧ−０６−００４もまた、Ｔｗｅａｋ誘導性のＫｙｍ１細胞死の良好な遮断を示すが、ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２と同じレベルではなかった。
【０５７９】
ＩＬ−８分泌アッセイ：
ＣＲＣＢＴ抗体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＩＬ−８分泌アッセイにおいて機能的活性について評価した。ＣＲＣＢＴ抗体の特性を、ＣＲＣＢＴ抗体がＩＬ−８分泌を誘発できるか否か（アゴニスト）又はＴｗｅａｋ−Ｆｃ誘導性のＩＬ−８分泌を阻害できるか否か（アンタゴニスト）のいずれかを決定することによって、Ａ３７５細胞に対して評価した。
【０５８０】
Ａ３７５細胞を、ある範囲の濃度（０、０．０１、０．１、１、１０μｇ／ｍｌ；Ｆｉｇｕｒｅ  ９）の抗体の存在下又は非存在下で培養した。細胞単独では、検出可能なバックグラウンドレベルのＩＬ−８が見られなかった。一連のアイソタイプコントロールを評価したところ、これらはＩＬ−８分泌を示さなかった。ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００６の存在下で高いＩＬ−８分泌が見られた。このＩＬ−８分泌は、そのレベルが抗体濃度依存的様式で増加するので、特異的であった。ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００７、ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−４の存在下では弱いＩＬ−８分泌が観察される（Ｆｉｇｕｒｅ  ９）。
【０５８１】
抗体（１０μｇ／ｍｌ）もまた３００ｎｇ／ｍｌのＴｗｅａｋ−Ｆｃの存在下で評価してアンタゴニスト特性を決定した（Ｆｉｇｕｒｅ  １０）。抗Ｔｗｅａｋ遮断抗体と匹敵する高いアンタゴニスト活性がＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００７、ＩＴＥＭ−４について見られた。抗Ｔｗｅａｋ遮断抗体と匹敵する弱いアンタゴニスト活性がＣＲＣＢＴ−０６−００４について見られる（Ｆｉｇｕｒｅ  １０）。
【０５８２】
式：（ａ−ｃ）／（ｂ−ｃ）を用いてアゴニスト活性のレベルを概算した。類似の式：（ｂ−ｄ）／（ｂ−ａ）を用いてアンタゴニスト活性の程度を概算した。式中：ａ＝１０μｇ／ｍｌの抗体の存在下で分泌されたＩＬ−８の量；ｂ＝３００ｎｇ／ｍｌのＴｗｅａｋ−Ｆｃの存在下で分泌されたＩＬ−８の量；ｃ＝抗体又はＴｗｅａｋ−Ｆｃのいずれかの非存在下で細胞から分泌されたＩＬ−８の量；ｄ＝１０μｇ／ｍｌの抗体及び３００ｎｇ／ｍｌのＴｗｅａｋ−Ｆｃの存在下で分泌されたＩＬ−８の量。表１は、試験したすべての抗体についてのこれらの計算をまとめているが、強いアゴニスト特性を有する抗体についてのアンタゴニスト活性は除かれている。これは、これらの例では計算が妥当でないからである。
【０５８３】
【表１】
2014529597.tif 000002
【０５８４】
したがって、ＮＦκＢシグナル伝達及び／又はｋｙｍ１細胞死を決定するためのアッセイからのデータと共に、これらのデータは、抗体がいくつかの機能的アッセイにおいてはアゴニスト活性を有し、他のアッセイにおいてはアンタゴニスト活性を有することを示す。
【０５８５】
Ｆｎ１４−Ｆｃを用いた抗体の親和性測定：
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６を用いて、組換えＦｎ１４−Ｆｃに対するマウスモノクローナル抗Ｆｎ１４抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２の親和性を決定した。試験した両方の抗体は高いオンレート及び低いオフレートを示すことが明らかである。ＰｒｏｔｅＯｎソフトウェアを用いて、数学モデルに基づいて曲線をセンサーグラムにフィットさせ、相互作用の動態（ｋａ、Ｋｄ及びＫＤ）の計算を可能にした。多数のモデルを用いて曲線をセンサーグラムにフィットさせることが可能であり、各センサーグラムに使用されるモデルは本質的に、残余について得られた低いχ２値によって明らかなように、そのモデルがベストフィットを提供した場合に使用した。結果を表２及び３に示す。
【０５８６】
【表２】
2014529597.tif 000003
【０５８７】
【表３】
2014529597.tif 000004
【０５８８】
Ｆｎ１４を用いた抗体の親和性測定：
抗Ｆｎ１４抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−４の結合動態を、本明細書に記載されるように評価した。結果を表４に示す。
【０５８９】
捕捉剤として同一の実験条件下で試験した抗Ｆｎ１４抗体の選択のうち、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−４は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２と比較してかなり速い解離を示した（表４）。
【０５９０】
【表４】
2014529597.tif 000005
【０５９１】
アンタゴニスト抗体の重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列決定：
ＮＦκＢシグナル伝達をアンタゴナイズしたすべての抗体について、軽鎖及び重鎖の配列決定を行った（Ｆｉｇｕｒｅ  １１）。抗体のサブセットは、多くの差異の存在を伴ってその重鎖及び軽鎖内で高い程度の相同性を有する。
【０５９２】
抗ｈＦｎ１４抗体は立体構造エピトープに結合する：
ＣＲＣＢＴ−０６−００１によって結合されるエピトープが立体構造エピトープであるかどうかを決定するために、Ｆｎ１４−Ｆｃ精製タンパク質を、還元及びアルキル化して（Ｒ＋Ａ）、ジスルフィド結合構造を破壊した。ＣＲＣＢＴ−０６−００１を使用したＥＬＩＳＡ結果は、抗原がネイティブの折り畳み状態である場合、抗体が用量依存的様式で結合したことを明らかに実証している。しかし、還元及びアルキル化の際に、この結合は破壊され（Ｆｉｇｕｒｅ  １２Ａｉ）、これは、ＣＲＣＢＴ−０６−００１に対する結合についての立体構造依存性を実証する。抗ヒトＦｃは、Ｆｎ１４のＦｃ部分を認識し、Ｒ＋Ａ  Ｆｎ１４の完全性が保持されていることを示す（Ｆｉｇｕｒｅ  １２Ａｉｉ）。ウエスタンブロット分析もまたこの知見を確認した（Ｆｉｇｕｒｅ  １２Ｂ）。
【０５９３】
ＥＬＩＳＡもまた用いて、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６及びＣＲＣＢＴ−０６−００７により結合されるエピトープが立体構造的に依存するかどうかを決定した。抗体を１μｇ／ｍｌで試験したところ、Ｆｉｇｕｒｅ  １２Ｃに示されるように、すべての結合がｈＦｎ１４のジスルフィド依存的立体構造に結合する。
【０５９４】
ランダムなＦｎ１４断片を発現するファージライブラリーの生成：
Ｆｎ１４のコード領域を増幅し、ＤＮａｓｅＩで消化した。５０ｂｐと４００ｂｐとの間の断片を生じた条件を用いて、Ｆｎ１４遺伝子断片の混合物を生成した。これらの断片をファージミドベクターｐＨＥＮＨ６中にクローニングして、約６×１０６のサイズの独立したクローンを有する遺伝子断片ライブラリーを創出した。多数のランダムに取り上げたクローンを評価したところ、このライブラリーの広いサイズ分布が実証された。
【０５９５】
ＣＲＣＢＴ−０６−００１を用いたＦｎ１４遺伝子断片ライブラリーのパニング：
４ラウンドのパニングを実施して、ＣＲＣＢＴ−０６−００１に結合したＦｎ１４の遺伝子断片を選択した。ＥＬＩＳＡを実施したところ、非常に高いシグナルが観察され、これにより、ラウンド１〜４における、ファージ上にディスプレイされた遺伝子断片の、ＣＲＣＢＴ−０６−００１に対する結合における富化が実証された。
【０５９６】
個々のクローンをラウンド４のパニングから選択し、ＰＣＲを実施し、得られたＤＮＡ断片について配列決定を行った。ラウンド４で選択したＦｎ１４遺伝子断片の配列同一性を、Ｆｉｇｕｒｅ  １３  パネルＡに示す。断片を、抗ｈＦｎ１４抗体結合能についてＥＬＩＳＡで再評価した（Ｆｉｇｕｒｅ  １３  パネルＢ）。結合した断片は、３つの既知のジスルフィド結合を形成する６つすべてのシステイン残基を含有するＦｎ１４の細胞外領域の一部を含んでいた（ＲＷ１１４〜ＲＷ１３１）。この領域を含有するが膜貫通ドメインの一部もまた含む断片は、この実験では特異的結合を示さないようであった。理論にも作用の様式にも拘束されずに、これらのデータは、膜貫通ドメインの一部の存在が、これらの断片（ＲＷ９５及びＲＷ９８）の構造又は折り畳みを変更することを示唆し得る。ファージライブラリーパニング実験において同定された、ＣＲＣＢＴ−０６−００１によって結合される最も短いＦｎ１４断片を太字で示す（ＲＷ１２９）。
【０５９７】
ファージ上で発現されるｈＦｎ１４細胞外ドメイン変異体及びサブドメインの構築：
抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体のエピトープをさらに特徴付けるために、ｈＦｎ１４コンストラクトのパネルを、ファージ上でディスプレイされるように設計した。これらは以下を含む：ホモ・サピエンスＦｎ１４（ｈＦｎ１４）細胞外ドメイン；天然リガンドＴｗｅａｋに対する減少した親和性を有することが公知の４つのｈＦｎ１４細胞外ドメイン変異体（Ｄ４５Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｍ５０Ａ及びＤ６２Ｅ）（Ｂｒｏｗｎら、２００６）；及びｈＦｎ１４細胞外ドメインのＮＭＲ溶液構造において解明されたジスルフィド結合によって記述される２つのサブドメイン（１及び２）（Ｈｅら、２００９）。ＣＲＣＢＴ−０６−００１に対してｈＦｎ１４遺伝子断片ライブラリーをパニングすることで、細胞外ドメインの７つのＣ末端残基を欠く断片が富化されたので、サブドメイン２はＣ末端で短縮されており、これらの残基が抗体結合について重要でないことを示唆している。クローニングしファージ上で発現させたコンストラクトをＦｉｇｕｒｅ  １２Ａに示す。Ｂｒｏｗｎら、（２００６）によって誘導されたｈＦｎ１４構造相同性モデルに関して示された変異体をＦｉｇｕｒｅ  １４Ｂに示す。
【０５９８】
ｈＦｎ１４細胞外ドメインコンストラクトはファージの表面上で良好に発現される：
ファージ上で発現された各ｈＦｎ１４コンストラクトの相対量を適切に評価するために、ｃ−ｍｙｃエピトープタグを、ファージのｐＩＩＩマイナーコートタンパク質とディスプレイされたｈＦｎ１４コンストラクトとの間で操作した。抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ１０（ＭＡｂ  ９Ｅ１０）の、野生型ｈＦｎ１４細胞外ドメイン及び変異体との強い反応性は、これらのコンストラクトがファージ上で良好に発現されたことを示した。同じＥＬＩＳＡにおいて同時に試験した場合、陰性コントロールＭＡｂ  ５Ｇ８に対するファージコンストラクトの顕著な結合は観察されず、これは、このファージ調製物がＭＡｂ  ９Ｅ１０に特異的に結合することを示している。
【０５９９】
ファージディスプレイされたヒト細胞外ドメイン変異体は組換えＴｗｅａｋ−Ｆｃに対する減少した結合を示す：
各ファージ調製物の濃度を調整して、ＭＡｂ  ９Ｅ１０とのおよそ等しい反応性を達成した。これを実施して、比較のために、各ファージ調製物中のディスプレイされたｈＦｎ１４の量を正規化した。ＥＬＩＳＡによって評価した場合、各ファージ調製物はＭＡｂ  ９Ｅ１０とのおよそ等しい反応性を有することが示され、この調製物がうまく正規化されたことを示す（Ｆｉｇｕｒｅ  １５  パネルＡ）。ＭＡｂ  ５Ｇ８に対する顕著な反応性は同じＥＬＩＳＡにおいて観察されず、これは、結合がＭＡｂ  ９Ｅ１０に対して特異的であることを示す（Ｆｉｇｕｒｅ  １５  パネルＢ）。組換えＴｗｅａｋ−Ｆｃとの各ｈＦｎ１４コンストラクトの相対的反応性を評価するために、正規化したファージ調製物を、リガンドに対する結合についてＥＬＩＳＡによって同時に試験した（Ｆｉｇｕｒｅ  １５  パネルＣ）。ＭＡｂ  ９Ｅ１０とは対照的に、Ｔｗｅａｋ−Ｆｃは野生型ｈＦｎ１４細胞外ドメインと最も反応性であり、４つの変異体とは反応性が低かった（Ｆｉｇｕｒｅ  １５  パネルＣ）。Ｔｗｅａｋ−Ｆｃに対するサブドメイン２の顕著な結合は観察されず、このことは、このコンストラクト中に存在しない細胞外ドメインの領域が、Ｔｗｅａｋ結合に重要な残基を含有することを示唆する。Ｔｗｅａｋ−Ｆｃに対するファージディスプレイされたｃ−ｍｙｃ単独の顕著な結合も組換えＦｃ単独に対するファージディスプレイされたｈＦｎ１４の顕著な結合も観察されず、このことは、これらのｈＦｎ１４コンストラクトがこれらのアッセイにおいてＴｗｅａｋに特異的に結合したことを示唆する（Ｆｉｇｕｒｅ  １５  パネルＤ）。
【０６００】
ファージディスプレイされたｈＦｎ１４細胞外ドメインコンストラクトのパネルは抗Ｆｎ１４ＭＡｂに結合する：
ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴ−０６−００４抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体に対する各ファージディスプレイされたｈＦｎ１４コンストラクトの相対的反応性もまた、並行して実施したＥＬＩＳＡによって評価した（Ｆｉｇｕｒｅ  １６Ａ）。組換えＴｗｅａｋ−Ｆｃで観察された反応性のパターンとは対照的に、すべてのｈＦｎ１４変異体コンストラクトが、抗Ｆｎ１４  ＭＡｂ  ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＣＲＣＢＴ−０６−００４に対して良好に結合した。以前のアッセイにおいて示されたように、ＭＡｂ  ５Ｇ８に対するファージディスプレイされたコンストラクトの顕著な結合は観察されず、このことは、これらのファージコンストラクトが抗Ｆｎ１４  ＭＡｂに特異的に結合していたことを示す（Ｆｉｇｕｒｅ  １６Ｂ）。さらに、任意の抗Ｆｎ１４  ＭＡｂに対するファージディスプレイされたｃ−ｍｙｃタグ単独の顕著な結合は観察されず、このことは、これらの抗体がディスプレイされたＦｎ１４に特異的に結合していたことを示唆する（Ｆｉｇｕｒｅ  １７）。４つの変異体に対するＩＴＥＭ−１の結合は野生型Ｆｎ１４細胞外ドメインに対する結合と匹敵していた（Ｆｉｇｕｒｅ  １７）。
【０６０１】
抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体は、ｈＦｎ１４細胞外ドメインのサブドメイン２に結合するが、サブドメイン１には結合しない：
抗Ｆｎ１４モノクローナル抗体によって結合されるエピトープをさらに特徴付けるために、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６、ＣＲＣＢＴ−０６−００７、ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−２を、ＥＬＩＳＡによって、ファージディスプレイされたｈＦｎ１４細胞外ドメイン、サブドメイン１及びサブドメイン２に対する結合について試験した（Ｆｉｇｕｒｅ  １８Ａ、Ｆｉｇｕｒｅ  １９  パネルＡ）。ファージを、並行してアッセイしたＭＡｂ  ９Ｅ１０との反応性のレベルに従って正規化した。以前のＥＬＩＳＡデータと一致して、ＣＲＣ−ＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２は、全長細胞外ドメイン及びサブドメイン２の両方と良好に反応した。さらに、ＣＲＣ−ＢＴ−０６−００３〜ＣＲＣＢＴ−０６−００７、ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−２は、これらのファージディスプレイされたｈＦｎ１４コンストラクトに良好に結合した。抗Ｆｎ１４  ＭＡｂはいずれも、ファージディスプレイされたサブドメイン１には結合しなかったが、このコンストラクトは、並行してアッセイした場合にＭＡｂ  ９Ｅ１０に良好に結合した。予測されるように、これらのファージコンストラクトはいずれも、陰性コントロール抗体ＭＡｂ  ５Ｇ８に結合しなかった（Ｆｉｇｕｒｅ  １８Ｂ、Ｆｉｇｕｒｅ  １９Ｂ）。
【０６０２】
Ｆｎ１４サブドメインに対する抗体の結合：
上記のように、抗ｈＦｎ１４  ｍＡｂ  ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６及びＣＲＣＢＴ−０６−００７のエピトープ中に含まれる残基は、ファージディスプレイを用いて、ｈＦｎ１４のサブドメイン２に結合することが示されているが、サブドメイン１に結合しないことが示されている。ｈＦｎ１４のサブドメイン１ｐ（ファージ上に発現されたサブドメイン１のより長い形態）及び２並びにさらなるより小さい領域（サブドメイン３と称される。）に対応する合成ペプチドを、これらの知見を確認するために生成した（Ｆｉｇｕｒｅ  ２０）。
【０６０３】
ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６、ＣＲＣＢＴ−０６−００７及びＩＴＥＭ−１は、アイソタイプコントロール抗体と比較して、Ｆｎ１４のサブドメイン１ｐには結合しなかったが（Ｆｉｇｕｒｅ  ２１Ａ）、サブドメイン２を示す合成ペプチドとは反応性であった（Ｆｉｇｕｒｅ  ２１Ａ）。最も強い反応性から最も弱い反応性までの順序は、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００７、ＩＴＥＭ−１及びＣＲＣＢＴ−０６−００６であった。ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２の反応性は類似であり、５ｎｇ／ｍｌであった（Ｆｉｇｕｒｅ  ２１Ｂ）。この点は各曲線の直線部分中に存在し、サブドメイン２に対する他のｍＡｂの結合の減少率を測定するために使用した。サブドメイン２に対するＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２の結合と比較して、ＣＲＣＢＴ−０６−００５の結合における４０％の減少、ＣＲＣＢＴ−０６−００７の結合における４８％の減少、ＩＴＥＭ−１の結合における６８％の減少、及びＣＲＣＢＴ−０６−００６の結合における７６％の減少が存在した。このことは、ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２の親和性が、このドメインに対してより高いこと、又はこのエピトープが、ＣＲＣＢＴ−０６−００７及びＩＴＥＭ−１と比較して、ＣＲＣＢＴ−０６−００５について僅かに変動し得ることのいずれかを示唆する。
【０６０４】
サブドメイン３との、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００６及びＣＲＣＢＴ−０６−００７の反応性は、サブドメイン２に対する反応性よりも低く、このことは、この領域が、これらの抗体に対する部分的エピトープであり得ることを示す。しかし、この領域に対する結合における差異は、ｈＦｎ１４に対する抗体の定常領域における微妙なバリエーションを明らかにし得る。最も強い結合から最も弱い結合までの順序は、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００６、ＣＲＣＢＴ−０６−００７及びＩＴＥＭ−１であった。曲線の直線領域中の単一の点におけるサブドメイン３に対する各個体の相対的結合が０．２μｇ／ｍｌで測定された（Ｆｉｇｕｒｅ  ２１Ｃ）。サブドメイン３に対する結合について、ＣＲＣＢＴ−０６−００５と比較して、ＣＲＣＢＴ−０６−００２の結合における４３％の減少、ＣＲＣＢＴ−０６−００５  ｍＡｂと比較して、サブドメイン３に対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００１について６０％の減少、ＣＲＣＢＴ−０６−００６及びＣＲＣＢＴ−０６−００７について７３％の減少、並びにＩＴＥＭ−１の結合における７６％の減少が存在した。これは、サブドメイン３中の表面露出した残基とのより弱い相互作用に基づいてＩＴＥＭ−１のエピトープがＣＲＣＢＴ抗体とは僅かに異なり得ることを示し得る。
【０６０５】
Ｆｎ１４ホモログ変異体は抗Ｆｎ１４  ｍＡｂに結合する：
マウス及び／又はラット等価物へとヒトＦｎ１４残基を変化させる単一のアミノ酸変異を示す一連の変異体を生成した。これらはファージ上での発現のために設計した。変異体は、Ｔ３３Ｎ（配列番号４９）、Ａ３４Ｓ（配列番号５０）、Ｒ３８Ｓ（配列番号５１）、Ｒ５６Ｐ（配列番号５２）及びＬ７７Ｍ（配列番号５３）を含む。抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００２及びＩＴＥＭ−１抗体に対する各ファージディスプレイされたＦｎ１４コンストラクトの相対的反応性をＥＬＩＳＡによって評価した。すべてのｈＦｎ１４コンストラクトがＣＲＣＢＴ−０６−００２に良好に結合した。Ｒ５６Ｐ変異体は、ＣＲＣＢＴ−０６−００２に対しては僅かに低減していたものの、ＩＴＥＭ−１に対する結合は示さなかった。さらに、任意の抗Ｆｎ１４  ｍＡｂに対するファージディスプレイされたｃ−ｍｙｃ単独の顕著な結合は観察されず、このことは、これらの抗体が、ファージディスプレイされたＦｎ１４に特異的に結合していたことを示唆する（Ｆｉｇｕｒｅ  ２２）。
【０６０６】
以前のアッセイで示されたように、コントロールｍＡｂ  ５Ｇ８に対するファージディスプレイされたコンストラクトの顕著な結合は観察されず（Ｆｉｇｕｒｅ  ２２）、このことは、これらのファージコンストラクトが、ＣＲＣＢＴ−０６−００２又はＩＴＥＭ−１に特異的に結合していたことを示す（Ｆｉｇｕｒｅ  ２２）。
【０６０７】
ヒト及びマウスＦｎ１４並びに変異体ヒトＦｎ１４に対する抗体結合の比較：
野生型ヒト及びマウスＦｎ１４細胞外領域を、細菌中での発現のために、Ｈｉｓタグ化融合コンストラクトとしてクローニングした。タンパク質を発現させ、精製して、折り畳まれた可溶性タンパク質を得た。ヒト及びマウスのＦｎ１４細胞外ドメインに結合する各抗体の能力の評価を、ＥＬＩＳＡによって評価した（Ｆｉｇｕｒｅ  ２３Ａ、Ｂ及びＣ）。このアッセイ形式において、すべての抗体が野生型ヒトＦｎ１４細胞外ドメインに良好に結合することが示された。マウスＦｎ１４に結合する抗体の能力により、抗体特異性における差異が明らかになった。抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００５、ＩＴＥＭ−２及びＩＴＥＭ−４はすべて、マウスＦｎ１４に良好に結合したが、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＩＴＥＭ−１は低減した結合を示した。
【０６０８】
ファージ上で発現させた場合、Ｒ５６Ｐ変異体はＩＴＥＭ−１に対する結合を示さなかったので（Ｆｉｇｕｒｅ  ２２）、この変異体を、市販の抗体ＩＴＥＭ−１、ＩＴＥＭ−２及びＩＴＥＭ−４と共に、一揃いのＣＲＣＢＴ抗体に対する結合についてさらに評価した。この残基の重要性を評価するために、多数のＲ５６変異体を生成した。Ｈｉｓタグ化融合タンパク質を、変異体ヒトＦｎ１４  Ｒ５６Ｐ、Ｒ５６Ａ（配列番号５４）及びＲ５６Ｋ（配列番号５５）の細胞外領域について生成した。これらを細菌中で発現させ、精製して、折り畳まれた可溶性タンパク質を得た。この一連の残基Ｒ５６変異体に各抗体が結合する能力の評価をＥＬＩＳＡによって評価した（結果はＦｉｇｕｒｅ  ２４に示す）。
【０６０９】
Ｒ５６Ｐ変異体に対する抗体の結合はすべての抗体について見られたが、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＩＴＥＭ−１については僅かに低減していた（Ｆｉｇｕｒｅ  ２４Ａ及びＢ）。プロリン残基の導入がタンパク質の折り畳み状態を変更するだけであったことを確実にするために、Ｒ５６がアラニンに変異している類似の変異体（Ｒ５６Ａ）を評価した。この変異体に対する抗体の結合は、Ｒ５６Ｐ変異体について得られた結合を映し出した（Ｆｉｇｕｒｅ  ２４Ｃ及びＤ）。野生型アルギニン残基の荷電した性質が、ＣＲＣＢＴ−０６−００３及びＩＴＥＭ−１が結合の低減を示す理由であるかどうかをさらに評価するために、Ｒ５６Ｋ変異体を生成した。ＣＲＣＢ−０６−００３及びＩＴＥＭ−１の結合は大部分が回復され、このことは、この電荷がこの残基における抗原−抗体相互作用に重要であることを示唆する（Ｆｉｇｕｒｅ  ２４Ｅ及びＦ）。
【０６１０】
組み合わせると、Ｒ５６変異体について生成されたデータは、この変異体に対するいくらかの低減した結合がＣＲＣＢＴ−０６−００３について存在するが、すべてのＣＲＣＢＴ抗体がＲ５６の変異体に対して良好に結合することを示し、したがって、Ｒ５６が、抗体−抗原相互作用における重要な残基ではないと結論付けることができる。
【０６１１】
変異Ｒ５８Ａについての組換えタンパク質（配列番号５６）もまた生成し、すべての抗体の結合を評価した。Ｈｉｓタグ化融合タンパク質を細菌中で発現させ、精製して、折り畳まれた可溶性タンパク質を得た。興味深いことに、この変異体は、抗体を２つの群、結合することが可能な抗体又は結合がない抗体に分けた（Ｆｉｇｕｒｅ  ２５）。ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００５及びＩＴＥＭ−２の結合は、この変異の存在によって影響を受けなかったが、ＣＲＣＢＴ−０６−００３、ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−４の結合は破壊される。
【０６１２】
Ｒ５８Ａ変異体のさらなる分析を、この変異体のファージ発現版を用いて実施した。抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２の結合はまたも影響を受けない。ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−４の結合は以前同様破壊され、ＣＲＣＢＴ−０６−００４はさらに結合できない（Ｆｉｇｕｒｅ  ２６）。
【０６１３】
サブドメイン２のアラニンスキャン：
各抗体の結合に重要なＦｎ１４エピトープ内の特異的残基を決定するために、アラニンスキャンを、ほとんどのサブドメイン２残基（この領域の外側の数個の残基の付加を伴う）にわたって実施した。一揃いのアラニン変異体を、ヒトＦｎ１４細胞外領域のファージ発現された変異体として生成した。
【０６１４】
評価した変異体は、Ｗ４２Ａ（配列番号５７）、Ｌ４６Ａ（配列番号５８）、Ｄ５１Ａ（配列番号５９）、Ｓ５４Ａ（配列番号６０）、Ａ５７Ｇ（配列番号６１）、Ｒ５８Ａ（配列番号５６）、Ｐ５９Ａ（配列番号６２）、Ｈ６０Ａ（配列番号６３）、Ｓ６１Ａ（配列番号６４）、Ｄ６２Ａ（配列番号６５）、Ｆ６３Ａ（配列番号６６）及びＬ６５Ａ（配列番号６７）を含む。アラニン残基がＦｎ１４中に存在する場合（Ａ５７の場合のように）、グリシン残基を用いてこの変異を生成した。ＩＴＥＭ−１、ＩＴＥＭ−４、及びある場合にはＩＴＥＭ−２と共に、ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２及びＣＲＣＢＴ−０６−００４の結合を、それぞれの変異体に対する結合について評価した（Ｆｉｇｕｒｅ  ２７及び２８）。予測されるように、すべての場合において、コントロール抗体５Ｇ８は、ファージ発現されたタンパク質に対する結合を全く示さなかった。評価したすべての抗Ｆｎ１４抗体は、野生型ヒトＦｎ１４に良好に結合した（Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ａ）。抗体結合は、変異体Ｗ４２Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｂ）、Ｓ５４Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｃ）、Ａ５７Ｇ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｄ）、Ｐ５９Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｅ）、Ｓ６１Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｆ）、Ｆ６３Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｇ）及びＬ６５Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２７Ｈ）に対していずれの抗体についてももたらされず、このことは、これらが抗体−抗原結合に重要な残基ではないことを示唆する。
【０６１５】
すべての抗体がＬ４６Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２８Ａ）、Ｄ５１Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２８Ｂ）及びＤ６２Ａ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２８Ｃ）変異体に結合したが、ＩＴＥＭ−４の結合は各場合において部分的に低減される。
【０６１６】
すべての抗体は、Ｈ６０Ａ変異体に結合できたが、僅かに低減した結合が、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＩＴＥＭ−１及びＩＴＥＭ−４について注目される（Ｆｉｇｕｒｅ  ２９Ａ）。変異をリジンで置き換えた場合には、この効果は、ＣＲＣＢＴ−０６−００４及びＩＴＥＭ−１については観察されなかったが、ＩＴＥＭ−４については結合が破壊された（Ｈ６０Ｋ；配列番号６８；Ｆｉｇｕｒｅ  ２９Ｂ）。Ｈ６０Ｋ変異体に対するＩＴＥＭ−２の結合は、国際公開第２００９／１４０１７７号パンフレット中のものから変動し、さらなる調査の理由を与え得る。
【０６１７】
個々のジスルフィド結合に依存する抗体結合の分析：
Ｆｎ１４細胞外領域は、３つのジスルフィド結合（１〜６と称するシステイン残基）を含有し、そのうち２つはサブドメイン２内に存在する（システイン残基３〜６；Ｆｉｇｕｒｅ  ２０  パネルＣ）。ペプチド結合アッセイに関して、すべてのＣＲＣＢＴ抗体がサブドメイン２に良好に結合したので、ジスルフィド結合の必要性を、一度に一対ずつ評価した。システイン残基３及び６を、ペプチドにおいてセリン残基に変異させ（Ｆｉｇｕｒｅ  ２０  パネルＥ）、抗Ｆｎ１４抗体の結合を評価した。このジスルフィド結合はなくてもよいことが証明され、すべての抗体が、試験したＦｎ１４に対する結合を示した（Ｆｉｇｕｒｅ  ３０Ａ）。第２のジスルフィド結合を創出するシステイン残基（４及び５）を、サブドメイン２のペプチドにおいてセリンに変異させた（Ｆｉｇｕｒｅ  ２０  パネルＦ）。このペプチドに対する反応性においては明確な差異が存在し、抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２及びＩＴＥＭ−４は良好な結合を示すが、ＣＲＣＢＴ−０６−００４、ＣＲＣＢＴ−０６−００５及びＩＴＥＭ−１については結合が破壊される（Ｆｉｇｕｒｅ  ３０Ｂ）。
【０６１８】
実施例２（抗Ｆｎ１４抗体を用いた癌媒介性の消耗性障害の処置）：
本実施例において使用した多くの方法は実施例１に既に記載されている。いくつかの新たな方法が実験の結果と共に以下に記載される。
【０６１９】
腫瘍形成に使用した細胞株におけるｈＦｎ１４発現の検出：
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍形成研究に使用した細胞株におけるｈＦｎ１４発現のレベルを評価するために、誘導された腫瘍細胞株及び誘導されていない腫瘍細胞株を、抗ｈＦｎ１４特異的抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーによって評価した。誘導性ｈＦｎ１４を含有する細胞は高いレベルの誘導性発現を示す（Ｆｉｇｕｒｅ  ３１  パネルＡ  ＋４−ＯＨＴ）。誘導されていない状態では、これらの細胞は標的タンパク質の発現を含まないはずであるが、低いレベルのｈＦｎ１４が明らかに見られる（矢印によって示される）。ｈＦｎ１４を含有しない評価した他の細胞株におけるこの低いレベルの染色の非存在により、抗体の特異性が確認され、したがって、誘導されていない細胞における発現が確認される（Ｆｉｇｕｒｅ  ３１  パネルＢ及びＣ）。
【０６２０】
腫瘍細胞株によるｉｎ  ｖｉｔｒｏのＩＬ−６分泌：
ｈＦｎ１４又はｈＦｎ１４−ＧＰＩを含有するＭＥＦ腫瘍細胞株（タンパク質発現のために誘導された又は誘導されていない）を、通常の成長条件下で４８時間培養し、細胞からの培地を収集し、ＩＬ−６のレベルを評価した（Ｆｉｇｕｒｅ  ３２）。分泌されたＩＬ−６のレベルは、４−ＯＨＴによる誘導の後、ｈＦｎ１４含有細胞において顕著に増加した（Ｆｉｇｕｒｅ  ３２）。
【０６２１】
マウスにおけるｈＦｎ１４腫瘍モデルの確立：
４−ＯＨＴ誘導性ｈＦｎ１４を含む、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルを創出した。腫瘍細胞株を創出するために、ＳＶ４０不死化ＭＥＦ細胞を、ヒトｖ１２Ｈｒａｓで形質転換し、次いで、実施例１の材料及び方法の節において記載された誘導性ｈＦｎ１４コンストラクトを安定に感染させた。
【０６２２】
マウスに細胞（＋／−誘導性ｈＦｎ１４）を皮下接種した。腫瘍が形成し始め、４日目までに測定可能となった（Ｆｉｇｕｒｅ  ３３Ａ  パネルＡ）。これらの腫瘍の成長速度はｈＦｎ１４とコントロールとの間で類似していたが、ｈＦｎ１４腫瘍はより遅い時点でより大きく成長した。同時に、８日目から、ｈＦｎ１４腫瘍を有するマウスは迅速に体重喪失を蒙り、その全体的な総体的健康は悪化し（Ｆｉｇｕｒｅ  ３３Ｂ）、マウスは悪液質を発症した。これらの症状の存在のために、この群中のすべてのマウスを１０日目までに安楽死させた。興味深いことに、これらのマウスにおける腫瘍はなおも誘導されていない状態にあり、このことは、この系における誘導性発現がしっかりと調節されていなかったことを示す。死後分析において、非ｈＦｎ１４コントロール腫瘍と比較して増加した脈管構造がｈＦｎ１４腫瘍において注目された。
【０６２３】
非シグナル伝達ｈＦｎ１４コントロール腫瘍の創出：
この系を用いた以前の実験で使用したコントロール腫瘍は、標的タンパク質の発現を単に欠いていたので、より適切なコントロールコンストラクトを、コントロールとしての使用のために創出した。「非シグナル伝達」ｈＦｎ１４を創出し、それにより、ｈＦｎ１４の細胞外領域を、ＴｒａｉｌＲ３由来のＣ末端グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩ）コード領域に融合させて、ｈＦｎ１４−ＧＰＩを創出した（Ｆｉｇｕｒｅ  ３４Ａ）。細胞上で発現させた場合、このタンパク質は、野生型ｈＦｎ１４と同じく細胞の外側に出るが、機能的シグナル伝達を単に欠く。４−ＯＨＴ誘導性ＧＰＩアンカー型ｈＦｎ１４を有する等価な腫瘍細胞株を、このｈＦｎ１４−ＧＰＩコンストラクトを用いて生成した。マウスに、実験の１日目に腫瘍細胞を注射し、実験を通じて、体重、腫瘍の出現及び総体的健康についてモニタリングした。腫瘍の出現は、４日目までにすべてのマウスにおいて明らかになった（Ｆｉｇｕｒｅ  ３４Ｂ  パネルｉ）。以前の実験における非ｈＦｎ１４腫瘍と同様、ｈＦｎ１４−ＧＰＩは、ｈＦｎ１４腫瘍と比較して過去８日間に僅かにより低い成長速度を有した。ｈＦｎ１４−ＧＰＩ腫瘍マウスにおいて、体重喪失も肉体的病気の他の徴候（すなわち悪液質）がないことが注目され、これらのマウスがより遅い時点で症状を単に発症するわけではないことを確認するために、マウスを最大３０日間観察した。ｈＦｎ１４−ＧＰＩ腫瘍は大きく成長し、ｈＦｎ１４腫瘍で見られたものと比較してマウスの全体的健康に対して影響を有さなかった（Ｆｉｇｕｒｅ  ３４Ｂ  パネルｉｉ）。死後評価の際に、ｈＦｎ１４−ＧＰＩコントロール腫瘍の血管形成は、以前の実験における非発現コントロールとかなり似ているようであった。
【０６２４】
構成的Ｆｎ１４発現腫瘍：
腫瘍におけるｈＦｎ１４のレベルが低く、したがって検出が困難であったために、またこのモデルの誘導性が使用されていないことを考慮して、脈管構造の増加及び肉体的症状の発症の原因が野生型ｈＦｎ１４にあることを実証するための別の方法を生成した。ｈＦｎ１４の構成的発現を有する独立した細胞株を生成した。これらの細胞株におけるｈＦｎ１４の発現を確認した。これらの構成的発現腫瘍細胞を以前のｈＦｎ１４腫瘍と比較する腫瘍実験を実施した（Ｆｉｇｕｒｅ  ３５）。腫瘍は両方の群において形成したが、構成的発現ｈＦｎ１４腫瘍は、（以前のｈＦｎ１４腫瘍について見られた）８〜１２日目頃の悪液質（すなわち、体重喪失及び肉体的病気）の徴候を全く示さなかった。これらのマウスを経時的に観察したところ、およそ１８日目から悪液質の症状を結局は示さなかった。この結果により、野生型ｈＦｎ１４が腫瘍中に存在する場合に見られた体重喪失及び健康の悪化におけるｈＦｎ１４の関与が間接的に確証された。
【０６２５】
ｈＦｎ１４腫瘍の抗体処置：
Ｆｎ１４に対する遮断抗体によるｈＦｎ１４腫瘍の処置を、低レベルのＦｎ１４発現を有する誘導性腫瘍モデルにおいて次に評価した。マウスに、ｈＦｎ１４又はｈＦｎ１４−ＧＰＩ腫瘍細胞を接種した。腫瘍のサイズ、マウスの体重及び全体的健康を毎日評価した。悪液質症状（すなわち、体重喪失及び減退する総体的健康）の発症及び重症度は、このモデルにおいて迅速であるので、マウスを、体重喪失の予測された発症の２日前に、遮断抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１（１０ｍｇ／ｋｇ）で最初に処置した（Ｆｉｇｕｒｅ  ３６）。この最初の抗体投与の前に、ｈＦｎ１４群及びｈＦｎ１４−ＧＰＩ群を、＋／−抗体処置群にランダムに分けた。処置を１週間に２回、合計４週間にわたり継続した。コントロールマウスは処置を受けなかった。ｈＦｎ１４−ＧＰＩ腫瘍群は、予測されたように、実験の過程を通じて健康なままであり、抗体処置群は良好な総体的健康を維持した。平均体重における小さい減少が抗体処置群において注目されたが、マウスは他の点では健康に見えた。予測されたように、非処置ｈＦｎ１４群は、８日目から体重喪失及び総体的健康の悪化を示した。すべてのマウスを１２日目までに安楽死させた。抗体処置を受けたｈＦｎ１４マウスは、処置の過程を通じて体重及び全体的健康を維持しただけでなく、非処置マウスよりも全体で１５〜２５日長く生存した。結果をＦｉｇｕｒｅ  ３６に示す。
【０６２６】
ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００４及びＩＴＥＭ−１の効力の評価及び比較：
抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１、ＣＲＣＢＴ−０６−００２、ＣＲＣＢＴ−０６−００４及びＩＴＥＭ−１を、ｉｎ  ｖｉｖｏの単一用量投与実験においた（Ｆｉｇｕｒｅ  ３７）。ｈＦｎ１４発現腫瘍をマウスにおいて形成させ、体重喪失の発症が平均して見られた７日目に、５ｍｇ／ｋｇ抗体の単一ＩＰ用量をマウスの群に投与した。ｈＦｎ１４腫瘍マウスの群は処置を受けなかった。予測されたように、ＣＲＣＢＴ−０６−００１は、この群において大部分のマウスをレスキューできた。ＣＲＣＢＴ−０６−００２はすべてのマウスをレスキューし、体重喪失の迅速な逆転が抗体投与の４８時間後に早くも明らかであった。抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２の投与は、それぞれ１７．９日間及び２２．３日間の増加した生存時間を導いた（Ｆｉｇｕｒｅ  ３７Ｂを参照のこと。ただし、両方の場合において、少なくとも１匹のマウスは２７日目の研究終了時において健康なままであり、体重を維持した。これは、示した日数が過小評価である可能性があることを意味する）。非処置マウスは病気の進行に対して影響を示さず、約１０．３日間の生存時間を実証した。ＩＴＥＭ−１又はＣＲＣＢＴ−０６−００４で処置したマウスはそれぞれ１１日間及び１０日間の平均生存時間を有した。これらのデータは、ＣＲＣＢＴ−０６−００１及びＣＲＣＢＴ−０６−００２が、このマウスモデルにおいて悪液質の症状を処置し、寿命を延長させることにおいて優れた利点を提供することを実証する。
【０６２７】
腫瘍の病理組織検査：
ｈＦｎ１４腫瘍又はｈＦｎ１４−ＧＰＩ腫瘍を有するマウス由来の腫瘍、並びに生存しているＣＲＣＢＴ−０６−００２抗体処置ｈＦｎ１４腫瘍保有マウス由来の腫瘍に対して病理組織検査を実施した。ｈＦｎ１４−ＧＰＩ発現腫瘍は、筋肉−腫瘍界面が明確に規定された別個の実体を形成した。対照的に、ｈＦｎ１４発現腫瘍細胞は、周囲の骨格筋を浸潤し、腫瘍細胞と筋肉との間の明確な境界は同定できなかった。抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００２で処置され、引き続いて３２日目まで生存した、ｈＦｎ１４発現腫瘍を有するマウスにおいて、腫瘍細胞による周囲の骨格筋の浸潤は見られず、明確な腫瘍−筋肉界面が、ｈＦｎ１４−ＧＰＩ腫瘍で見られる界面と匹敵して可視的であった。
【０６２８】
ＣＲＣＢＴ−０６−００１用量反応及びレスキュー処置：
高い用量のＣＲＣＢＴ−０６−００１による１週間に２回の処置は大変成功したので、マウスを次に、ある範囲の用量（０〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体の単回注射で処置して、効果を観察するのに必要な最小有効量の抗体を評価した（Ｆｉｇｕｒｅ  ３８）。非処置マウスは再び、予測された運命を蒙ったが、この場合、体重喪失（すなわち悪液質）の発症は７日目に始まった。１０ｍｇ／ｋｇ群のマウスは、非処置群と比較した全体的健康及び体重の維持における劇的増加を伴って、以前と同じパターンに従った。体重喪失の発症は、１４日目及び１６日目にこの群の２匹のマウスにおいて見られた。他のマウスは実験の終了時まで健康に生存した（２３日間）。５ｍｇ／ｋｇ処置群において、すべてのマウスは、実験の過程を通じて健康なままで体重を維持し、体重における小さい減少が２１〜２２日目頃に見られるようになり、このことは、抗体の身体からのクリアランスを示唆する。この用量は、１０ｍｇ／ｋｇのより高い用量よりも全体としてより有効であった。
【０６２９】
すべての他の抗体処置群（０．１、０．５及び１ｍｇ／ｋｇ）は、処置後にある程度の改善を示したが、これらのより低い用量は体重喪失（すなわち悪液質）の発症を２〜３日遅延させただけであり、体重における減退が８〜１０日目の間に見られた。これらの群のマウスについて、悪液質症状の発症が明らかになった時点で（９日目又は１０日目）、１０ｍｇ／ｋｇの単回抗体用量を投与して、さらなる減退からのこれらのマウスの起こり得るレスキューを評価した。０．５ｍｇ／ｋｇ群及び１ｍｇ／ｋｇ群はさらなる体重喪失から完全にレスキューされ、驚くべきことに、処置後およそ５日以内に体重喪失の完全な逆転を示した。この逆転は、実験の残りの期間（２３日目まで）を通じて維持された。
【０６３０】
実施例３（抗Ｆｎ１４抗体による癌媒介性の消耗性障害の処置）：
方法：
実験動物：
雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１１週齢）に、Ｆｎ１４で安定にトランスフェクトされたマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）（ＭＥＦ  Ｆｎ１４）又はトランスフェクトされていないＭＥＦ  Ｈｒａｓ細胞（Ｈｒａｓ）の単回皮下注射を与えた（実施例１の材料及び方法の節に記載される細胞株生成）。６日目に、マウスに、ＩｇＧ２ｂアイソタイプコントロール抗体（Ｈｒａｓ＋ＩｇＧ２ｂ、ＭＥＦ  Ｆｎ１４＋ＩｇＧ２ｂ、ｎ＝８／群）又はＣＲＣＢＴ−０６−００１（ＭＥＦ  Ｆｎ１４＋００１、ｎ＝８）の単回腹腔内注射を与えた。マウスを、１２：１２時間の明暗サイクル下で収容した。マウスを、総体的健康、体重、腫瘍サイズ、食物摂取量及び水摂取量について毎日評価した。
【０６３１】
握力試験：
全身強度を、本質的にＭｕｒｐｈｙら、２０１２に記載されたように、握力メーター（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）によって１１日目に評価した。
【０６３２】
前脛骨筋筋肉の機能的特性のｉｎ  ｓｉｔｕ評価：
１１日目に、マウスを腹腔内（ＩＰ）注射によってペントバルビタールナトリウム（Ｎｅｍｂｕｔａｌ；６０ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で麻酔した。マウス前脛骨筋（ＴＡ）筋肉の収縮特性のｉｎ  ｓｉｔｕ評価のための方法は文献に記載されている（Ｍｕｒｐｈｙら、２０１０）。ピーク強縮力を決定した後、筋肉を４分間の間欠刺激プロトコルに供して、筋肉疲労を誘導した。筋肉を、疲労プロトコルの持続時間にわたって４秒毎に１秒間にわたり最大刺激した。ピーク強縮力を、疲労刺激プロトコルの休止後５分及び１０分の時点で評価した。ｉｎ  ｓｉｔｕ収縮測定の終局において、ＴＡ、長指伸筋（ＥＤＬ）、ヒラメ筋、足底、腓腹筋及び四頭筋筋肉並びに精巣上体脂肪及び心臓を、注意深く切除し、濾紙上にブロットし、化学天秤で計量した。マウスを、深く麻酔したまま心臓切除を行って殺処分した。
【０６３３】
骨格筋組織学的検査：
連続切片（５μｍ）を、冷却（−２０°Ｃ）クリオスタット（ＣＴＩ  Ｃｒｙｏｓｔａｔ；ＩＥＣ、Ｎｅｅｄｈａｍ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＭＡ）を用いて、ＴＡ筋肉中を横断して切断した。切片を次のものと反応させた。平均筋線維断面積（ＣＳＡ）の決定のためのラミニン（＃Ｌ９３９３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；酸化酵素の活性を決定するためのコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）；及びミオシンＩＩａアイソフォームの割合を評価するためのＮ２．２６１（Ｈｅｌｅｎ  Ｍ．Ｂｌａｕ博士により開発された。ＮＩＣＨＤの援助の下で展開されたＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋから得られ、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ、ＩＡ、ＵＳＡによって維持される。）（Ｍｕｒｐｈｙら、２０１０）。マウスＴＡ筋肉はＩ型線維をほとんど欠くことが既に示されている（Ｍｕｒｐｈｙら、２０１１）ので、すべての非Ｎ２．２６１反応性線維はＩＩｘ／ｂ型線維と仮定した。Ｍｕｒｐｈｙら、２０１０に実質的に記載されるように、ＳＤＨの光学密度（ｏ．ｄ．）を、すべてのサンプルについて６分間の反応性の後で決定し、切片を、明視野光学顕微鏡を用いてフルカラーで捕捉し、分析した。デジタル画像を、カメラを備えた正立顕微鏡（Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｄ１、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｗｒｅｋ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて得て、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＡＣソフトウェア（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＡＣ  Ｒｅｌ．４．７．１、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）によって制御及び定量した。
【０６３４】
結果：
ＭＥＦ  Ｆｎ１４による注射は体重の喪失を引き起こし、ＩｇＧ２ｂ処置マウスは、コントロールマウスが約３％の体重だけを喪失したのと比較して、１１日間の実験期間の間に約２０％の体重を喪失した（Ｆｉｇｕｒｅ  ３９）。しかし、ＣＲＣＢＴ−０６−００１による処置は体重の喪失を減弱し、ＭＥＦ  Ｆｎ１４−００１処置マウスは約５．５％の体重だけを喪失した（Ｆｉｇｕｒｅ  ３９）。腫瘍重量及び腫瘍体積は群間で有意に異ならなかった（Ｆｉｇｕｒｅ  ４０）。
【０６３５】
ＭＥＦ  Ｆｎ１４注射は、筋肉及び脂肪の重量の喪失を引き起こし、コントロールマウスと比較して、足底及び前脛骨筋（ＴＡ）の筋肉の重量における１５〜２９％の減少、並びに肩甲下脂肪重量における６０％の減少を引き起こした（Ｆｉｇｕｒｅ  ４１）。ＭＥＦ  Ｆｎ１４注射したマウスにおける筋肉及び脂肪重量の喪失は、ＣＲＣＢＴ−０６−００１の単回注射によって完全に予防された（Ｆｉｇｕｒｅ  ４１Ｂ）。
【０６３６】
実験の短い持続時間を考慮すると、筋肉機能の評価において群間に差異は存在せず、類似の握力（Ｆｉｇｕｒｅ  ４２）並びにＴＡ筋肉のピーク単収縮力及び強縮力（Ｆｉｇｕｒｅ  ４３Ａ及びＢ）であった。ＴＡ筋肉強度を、ある範囲の刺激頻度にわたって試験した場合、コントロールと比較して、ＭＥＦ  Ｆｎ１４＋ＩｇＧ２ｂ処置マウスにおいて、より低い強縮力発生について主要な効果が存在した（Ｆｉｇｕｒｅ  ４３Ｃ）。４分間の間欠疲労刺激プロトコルの間、ＭＥＦ  Ｆｎ１４＋ＩｇＧ２ｂ処置マウス由来のＴＡ筋肉はコントロールよりも高い力を発生させた（Ｆｉｇｕｒｅ  ４３Ｄ）。
【０６３７】
ヘマトキシリン及びエオシンで染色したＴＡ筋肉切片並びに抗ラミニン抗体と反応させた切片により、ＭＥＦ  Ｆｎ１４注射が、ＩＩａ型線維（−２１％）及びＩＩｘ／ｂ型線維（−１３％）の断面積の減少、並びに平均断面積における１３％の減少を引き起こしたことが明らかになった。しかし、ＣＲＣＢＴ−０６−００１の単回注射は筋肉線維サイズの減少を完全に予防した。ＩＩａ型及びＩＩｘ／ｂ型線維の割合又は酸化酵素能においては群間で差異は存在しなかった（Ｆｉｇｕｒｅ  ４４）。
【０６３８】
実施例４（抗Ｆｎ１４抗体による結腸癌媒介性の消耗性障害の処置）：
方法：
雄性ＣＤ２Ｆ１（１１週齢）又は雌性Ｂａｌｂ／ｃ（９〜１０週齢）マウスに、１日目に１×１０６のＣｏｌｏｎ−２６細胞（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｇｅｒｍａｎｙ）を皮下（ｓ／ｃ）接種した。マウスを、総体的健康、体重、食物摂取量及び水摂取量について毎日評価した。腫瘍を毎日測定し、腫瘍体積を（ｌ＊ｗ２）／２に基づいて計算した。式中、ｌ＝長さ及びｗ＝幅である。ペアフィード群について、飼育を、２４時間毎に非処置腫瘍群の食物摂取をモニタリングし、次いでその後の２４時間の期間にわたって非腫瘍「ペアフィード」群にその量の食物を与えることによって行った。
【０６３９】
結果：
悪液質のＣｏｌｏｎ−２６マウス癌モデルにおける抗体の評価：
悪液質のＣｏｌｏｎ−２６癌モデルは悪液質の文献において知られている（Ｍｕｒｐｈｙら、２０１２）。ＣＤ２Ｆ１マウスにＣｏｌｏｎ−２６細胞を接種して、皮下固形腫瘍を形成した。これらの腫瘍は、骨格筋の消耗を含むマウスの進行性の体重喪失を導く。
【０６４０】
このモデルにおいて抗Ｆｎ１４抗体の影響を評価するために、Ｃｏｌｏｎ−２６保有マウスを体重喪失の発症前にＩＰ抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００２で処置した（Ｃｏｌｏｎ−２６＋ＣＲＣＢＴ−０６−００２）。複数回の投与を、Ｆｉｇｕｒｅ  ４５Ａ中に示されるように実験の過程を通じて実施した。ペアフィード非腫瘍群（ペアフィード）、非処置腫瘍群（Ｃｏｌｏｎ−２６非処置）及び非処置非腫瘍群（コントロール）をさらなるコントロール群とした。ＣＲＣＢＴ−０６−００２の効力を、非処置マウス（すべて１４〜１８日目までに（機関の動物倫理承認に基づく）最大許容体重喪失に達した。）と比較して実験を通じて体重及び良好な全体的健康を維持した処置マウスを用いて実証した（測定した最長時点は２７日目であった。）（Ｆｉｇｕｒｅ  ４５Ａ及びＢ）。注：５匹の抗体処置マウスのうち２匹を、（機関の動物倫理承認に基づく）最大腫瘍重量に到達したために２０日目に殺処分したが、体重喪失又は病気の他の徴候のために殺処分したのではない。
【０６４１】
Ｃｏｌｏｎ−２６腫瘍保有Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける抗体の評価：
Ｃｏｌｏｎ−２６腫瘍は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいても共通して形成され、ＣＤ２Ｆ１マウスにおいて注目されたＣＲＣＢＴ−０６−００２の効果を考慮すると、類似の処置スケジュールを、Ｃｏｌｏｎ−２６腫瘍を保有するＢａｌｂ／ｃマウスにおいて実施した。結果はＦｉｇｕｒｅ  ４６に示され、ＣＲＣＢＴ−０６−００２による処置が腫瘍サイズを低減することを示す。
【０６４２】
ＣＤ２Ｆ１マウス中のＣｏｌｏｎ−２６腫瘍における抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１の評価：
Ｃｏｌｏｎ−２６癌悪液質に対する、ＣＲＣＢＴ−０６−００２により実証された効力を考慮して、このモデルにおける悪液質に対するＣＲＣＢＴ−０６−００１の影響を、次に評価した。ＣＤ２Ｆ１マウスにＣｏｌｏｎ−２６細胞を接種し、マウスを、示されたように１６日目及び２０日目に、１０ｍｇ／ｋｇのＩＰ抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００１で処置した。非処置マウスには、Ｃｏｌｏｎ−２６細胞を注射したが、抗体処置は受けなかった。ＣＲＣＢＴ−０６−００１処置マウスは、非処置コントロールと比較して体重喪失の遅延した発症を示し、このことは、このモデルにおける悪液質進行に対するこの抗体の有効性を実証する（Ｆｉｇｕｒｅ  ４７Ａ）。これは、経時的な生存の評価についても見ることができる（Ｆｉｇｕｒｅ  ４７Ｂ）。体重喪失の予防における抗体の有効性にもかかわらず、腫瘍体積に対する有意な効果は有さないようであった（Ｆｉｇｕｒｅ  ４７Ｃ）。
【０６４３】
実施例５（抗Ｆｎ１４抗体による結腸癌媒介性の消耗性障害の処置）：
方法：
実験動物：
雄性ＣＤ２Ｆ１マウス（１２週齢）に、１００μｌの滅菌ＰＢＳ中に懸濁した５×１０５のＣｏｌｏｎ−２６（Ｃ−２６）細胞（Ｍａｒｔｈａ  Ｂｅｌｕｒｙ、Ｔｈｅ  Ｏｈｉｏ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨの厚意による提供）を皮下（ｓ／ｃ）接種した。マウスを、総体的健康、体重、食物摂取量及び水摂取量について毎日評価した。すべてのマウスは、Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｒｅ（Ｃａｎｎｉｎｇ  Ｖａｌｅ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から取得し、１２：１２時間の明暗サイクルの下で、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｅｌｂｏｕｒｎｅのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて収容した。水は自由に入手可能であり、水及び標準的な実験室固形飼料の両方を毎日与え、交換し、モニタリングした。ペアフィードを、２４時間毎に非処置群の食物摂取をモニタリングし、次いでその後の２４時間の期間にわたってペアフィード群にその量の食物を与えることによって行った。
【０６４４】
握力及びロータロッド試験：
全身強度及び全身可動性並びに協調を、握力メーター（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）及びロータロッド成績試験（Ｒｏｔａｍｅｘ−５、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって、本質的にＭｕｒｐｈｙら、２０１２に記載されたように、２１日目に評価した。
【０６４５】
前脛骨筋筋肉の機能的特性のｉｎ  ｓｉｔｕ評価：
２２日目に、マウスを腹腔内（ＩＰ）注射によってペントバルビタールナトリウム（Ｎｅｍｂｕｔａｌ；６０ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で麻酔した。マウス前脛骨筋（ＴＡ）筋肉の収縮特性のｉｎ  ｓｉｔｕ評価のための方法は文献に詳細に記載されている（Ｍｕｒｐｈｙら、２０１０）。ピーク強縮力を決定した後、筋肉を４分間の間欠刺激プロトコルに供して、筋肉疲労を誘導した。筋肉を、疲労プロトコルの持続時間にわたって４秒毎に１秒間にわたり最大刺激した。ピーク強縮力を、疲労刺激プロトコルの休止後５分及び１０分の時点で評価した。ｉｎ  ｓｉｔｕ収縮測定の終局において、ＴＡ、長指伸筋（ＥＤＬ）、ヒラメ筋、足底、腓腹筋及び四頭筋筋肉並びに精巣上体脂肪及び心臓を、注意深く切除し、濾紙上にブロットし、化学天秤で計量した。マウスを、深く麻酔したまま心臓切除を行って殺処分した。
【０６４６】
骨格筋組織学的検査：
骨格筋組織学的検査を、実質的に実施例３に記載されたように行った。
【０６４７】
結果（悪液質のＣｏｌｏｎ−２６マウス癌モデルにおける抗体の評価）：
Ｃｏｌｏｎ−２６モデルにおける抗Ｆｎ１４抗体の影響をさらに評価するために、マウスに、体重喪失の発症の前にＣｏｌｏｎ−２６細胞を接種し、抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００２で処置した（Ｃ−２６＋００２）。複数回の投与を、示されたように実験の過程を通じて実施した。コントロール群は、非処置腫瘍群（Ｃ−２６）及びＩｇＧ抗体を注射した腫瘍群（Ｃ−２６＋ＩｇＧ）を含む。非処置腫瘍群に対し、Ｃ−２６＋ＩｇＧ群及びＣ−２６＋００２群をペアフィードした。
【０６４８】
ＣＲＣＢＴ−０６−００２の明白な効力を、非処置マウス及びＩｇＧ処置マウスと比較して実験を通じて体重及び良好な全体的健康を維持した処置マウスを用いて実証した（測定した最長時点は２２日目であった。）（Ｆｉｇｕｒｅ  ４８Ａ及びＢ）。２２日間の期間にわたって、非処置マウス及びＩｇＧ処置腫瘍マウスは約２９％の除腫瘍体重を喪失したが、ＣＲＣＢＴ−０６−００２処置腫瘍マウスは約４％の除腫瘍体重だけを喪失した（Ｆｉｇｕｒｅ  ４８Ｃ）。腫瘍を経時的に測定し（Ｆｉｇｕｒｅ  ４９Ａ）、腫瘍体積を各群について計算してグラフ化した（Ｆｉｇｕｒｅ  ４９Ｂ及びＣ）。
【０６４９】
長指伸筋（ＥＤＬ）、足底、前脛骨筋（ＴＡ）、腓腹筋及び四頭筋筋肉の絶対重量は、非処置マウス及びＩｇＧ処置マウスと比較して、ＣＲＣＢＴ−０６−００２処置腫瘍マウスにおいて２３〜３４％高かった（Ｆｉｇｕｒｅ  ５０Ａ）。脂肪及び心臓の重量もまた、ＣＲＣＢＴ−０６−００２処置によってより高かった（Ｆｉｇｕｒｅ  ５０Ｂ）。
【０６５０】
ピーク握力は、それぞれ非処置マウス及びＩｇＧ処置マウスと比較して、ＣＲＣＢＴ−０６−００２処置腫瘍マウスにおいて３５％及び２６％高かったが（Ｆｉｇｕｒｅ  ５１Ａ）、ロータロッド試験における落下潜時は群間で有意に異ならなかった（Ｆｉｇｕｒｅ  ５１Ｂ）。
【０６５１】
ＣＲＣＢＴ−０６−００２処置腫瘍マウス由来のＴＡ筋肉は非処置マウス及びＩｇＧ処置マウスよりも強く、ある範囲の刺激頻度にわたって、より高いピーク単収縮力及び強縮力であった（Ｆｉｇｕｒｅ  ５２Ａ〜Ｃ）。４分間の間欠疲労刺激プロトコルの間、００２処置マウス由来のＴＡ筋肉は非処置マウス及びＩｇＧ処置腫瘍マウスよりも強かった（Ｆｉｇｕｒｅ  ５２Ｄ）。
【０６５２】
ヘマトキシリン及びエオシンで染色したＴＡ筋肉切片並びに抗ラミニン抗体と反応させた切片により、ＣＲＣＢＴ−０６−００２処置マウスが非処置マウス及びＩｇＧ処置マウスよりも大きい筋肉線維を有することが明らかになった。ＩＩａ型筋肉線維の割合は、群間で類似のように見えるが、ＩＩａ型線維の面積は、ＣＲＣＢＴ−０６−００２処置マウスにおいてより大きい。ＳＤＨ反応によって評価した筋肉線維の酸化能は群間で類似していた。
【０６５３】
ヘマトキシリン及びエオシンで染色したＴＡ筋肉切片並びに抗ラミニン抗体と反応させた切片の分析により、ＩＩａ型及びＩＩｘ／ｂ型線維の断面積（ＣＳＡ）並びに平均線維ＣＳＡは、非処置マウス及びＩｇＧ処置マウスよりもＣＲＣＢＴ−０６−００２処置マウスにおいてより大きかったことが明らかになった（Ｆｉｇｕｒｅ  ５３Ａ）。ＩＩａ型及びＩＩｘ／ｂ型筋肉線維の割合は群間で類似していた（Ｆｉｇｕｒｅ  ５３Ｂ）。ＳＤＨ反応によって評価した場合、ＩＩａ型及びＩＩｘ／ｂ型線維における酸化酵素能並びに平均線維酸化能が群間で類似していた（Ｆｉｇｕｒｅ  ５３Ｃ）。これらのデータは、ＣＲＣＢＴ−０６−００２処置は、コントロールと比較して筋肉繊維のサイズを増加させたが、筋肉の構成を変化させなかったことを示す。
【０６５４】
実施例６（抗Ｆｎ１４抗体による糖尿病及び糖尿病媒介性の消耗性障害の処置）：
方法：
糖尿病を、Ｃｈｅｎら、２００９及び／又はＭｏｔｙｌら、２００９に本質的に記載されたように、複数回の低用量ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を投与することによって、８週齢雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて誘導した。簡潔に述べると、マウスは、連続する５日間にわたり（１日目〜５日目）、４５ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ−０１３０）のＩＰ注射を受けた。コントロールマウスにはビヒクル（０．１Ｍの冷却クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５）を注射した。マウスを総体的健康、体重、食物摂取量及び水摂取量について毎日評価した。ペアフィード（ＰＦ）群をＳＴＺ注射群の毎日の摂取に従って飼育した。
【０６５５】
抗体処置のために、最後のストレプトゾトシン注射の２日後（７日目）に、マウスに単回ＩＰ２０ｍｇ／ｋｇ用量のＣＲＣＢＴ−０６−００２を投与した。２８日目に、すべてのマウスを屠殺し、血液、筋肉（前脛骨筋、四頭筋及び心臓）及び精巣上体脂肪を分析のために取り出した。非絶食血中グルコースレベルを、Ａｃｃｕ−ｃｈｅｃｋ血中グルコースモニターを用いて測定した。
【０６５６】
結果：
ＳＴＺ誘導された糖尿病マウスモデルを用いて、糖尿病関連の体重喪失に対する抗体ＣＲＣＢＴ−０６−００２の影響を評価した。７日目に、ＳＴＺ誘導された糖尿病マウスの群に抗体を投与した。体重を毎日評価し、開始時の体重１００％に対して標準化した。標準化された群平均をグラフ化した（Ｆｉｇｕｒｅ  ５４）。糖尿病誘導後の抗体の投与は、この群の体重における即時の急落を導くが、この体重は１２〜１４日目までに十分に回復された。次いで、ＳＴＺ単独群と比較して体重の全体的な増加が１８日目頃から見られた。
【０６５７】
２８日間の実験の過程にわたり、群の１日水摂取量を測定し、累積摂取量としてグラフ化した（Ｆｉｇｕｒｅ  ５５）。ＳＴＺマウスの水摂取量は、糖尿病状態のためにより高かったが、抗体処置後のＳＴＺ群は、非糖尿病コントロール群の摂取と近い水摂取傾向を経時的に示す。
【０６５８】
２８日目に、マウスを安楽死させ、血中グルコースレベルを評価した（Ｆｉｇｕｒｅ  ５６）。試験範囲外の血中グルコースレベルが得られた場合には最大レベルの検出を割り当てた（６００ｍｇ／ｄｌ）。これには、ＳＴＺ群のうちの３匹及び抗体処置群のうちの１匹が当てはまった。
【０６５９】
精巣上体脂肪、心臓、前脛骨筋（ＴＡ）及び四頭筋を分析のために取り出した。群平均組織重量を計算し、最終体重（２８日目；Ｆｉｇｕｒｅ  ５７Ｂ）及び開始時の体重（１日目；Ｆｉｇｕｒｅ  ５７Ｃ）に対して標準化してグラフ化した（Ｆｉｇｕｒｅ  ５７Ａ）。抗体処置は、四頭筋及び心臓の減少を減弱し、ＴＡ筋肉及び精巣上体脂肪の減少を部分的に減弱した。
【０６６０】
これらのデータは、抗Ｆｎ１４抗体（ＣＲＣＢＴ−０６−００２）による処置が、糖尿病誘導性の悪液質を予防又は処置し、１日水摂取量及び血中グルコースレベルの増加などの糖尿病の症状を低減することを実証している。
【０６６１】
参考文献：
Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７３，  ９２７−９４８，  １９９７
Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｌｌ  ｕｐｄａｔｅｓ  ｕｎｔｉｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ）
Ｂａｅｃｈｅｒ−Ａｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６７：１２４５−１２５３，  ２００１
Ｂｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２４２，  ３０９−３２０，  １９９４
Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９０：  ７５３８−７５４２，  １９９３
Ｂｒｏｗｎ  （ｅｄｉｔｏｒ），  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９１）
Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３９７：  ２９７−３０４，  ２００６
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ３８８：  １１２−６，  ２００９
Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９６：  ９０１−９１７，  １９８７
Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４２，  ８７７−８８３，  １９８９
Ｃｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：  ６９１−６９８，  ２００１
Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｌｌ  ｕｐｄａｔｅｓ  ｕｎｔｉｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ）
Ｄｈａｒｍａｐａｔｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ，  １３：  Ｒ５１，  ２０１１
Ｆｒａｕｅｎｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，  ２２７：  １−９，  ２０１０
Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ３，  ２３１−２３６，  １９７７
Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２５：  ２０６−２１１  １９９７
Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ８ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  １９９０
Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ  （ｅｄｉｔｏｒｓ），  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９５  ａｎｄ  １９９６）
Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （ｅｄｉｔｏｒｓ），  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  （１９８８）
Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８：  ６５０−６５６，  ２００９
Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９：４１３３−４１３７，  ２００１
Ｈｏｎｎｅｇｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐｌｕｋｔｈｕｎ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３０９：  ６５７−６７０，  ２００１
Ｉｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  ２７５：  １１７−１２０，  ２００８
Ｊｅｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：  ８９９−９０３，  １９８８
Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．，  １９８７  ａｎｄ  １９９１
Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ４９５−４９７，  １９７５
Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６，  ５１１−５１９，  １９７６
Ｋｒｕｉｆ  ａｎｄ  Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７１：  ７６３０−７６３４，  １９９６
Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｍｍｕｎｏ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６５，  １５３−１５９，  １９９９
Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，  １５７：  １０５−１３２，  １９８２
Ｍｏｔｙｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ  Ｐｒｏｃｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ，  １１：  ２９６−３１５，  ２００９
Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  ２４：  ４４３３−４４４２，  ２０１０
Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ３０１：  Ｒ７１６−Ｒ２６，  ２０１１
Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｃｈ；  ５：  ５３３−５４５，  ２０１２
Ｎａｈｓｈｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３８３：  ５２，  ６０，  ２００８
Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７０：  ３４１−３４８，  ２００３
Ｎａｔｓｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６８：  ３８６３−３８７２，  ２００８
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ４８，  ４４３−４５３，  １９７０
Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  ９：  １３３−１３９，  １９９５
Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  （１９８４）
Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｖｏｌ．１１３，  Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．２６９−３１５，  １９９４
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）
Ｓｃｏｐｅｓ  Ｉｎ：  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  １９９４
Ｓｈａｌａｂｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，  １７５：  ２１７−２２５，  １９９２
Ｔｒｅｎａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，  １１２：  １６８８−１６９６，  ２００２
Ｖｉｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．，  １３１：  ６８２−６９３，  ２００７
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３３：  １６７−１７７，  ２０００
Ｙｕｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８７：  ６１４−２２，  ２００４
Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １７９：  ７９４９−７９５８，  ２００７
Ｚｏｌａ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７
【図１】
2014529597.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2014529597.tif 000010
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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