(57)【要約】  本発明は、ポリクローナルタンパク質、例えば、ポリクローナル抗体の少なくとも2個の異なるメンバーを含む医薬を製造する方法であって、各々の異なるメンバーが別々の細胞集団で発現する方法に関する。当該方法は、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを発現する細胞集団が別々に培養される少なくとも最初の工程を含む。個々の細胞集団または個々の細胞集団を発現するタンパク質を、より後の上流地点で、または下流工程で組み合わせて、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを含む単一医薬を得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリクローナルタンパク質の少なくとも2個の異なるタンパク質メンバーを含む医薬を製造するための方法であって、下記の工程:
a) 少なくとも2種の細胞集団を提供し;
ここで、各々の集団は、ポリクローナルタンパク質の1個の異なるメンバーをコードし、培養培地および当該タンパク質を発現する細胞を含む物理的に別々の容器に包含されるものであり、当該方法は、下記の工程:
i) 1またはそれ以上のシードトレイン(train)の工程において、別々の容器で少なくとも2種の細胞集団を増殖させ; 
ii) 1またはそれ以上の接種トレインの工程において、シードトレインからの細胞を増殖させ;
iii) 製造段階において、タンパク質メンバーの発現を支持する条件下で接種トレインからの細胞を培養して、少なくとも2個の異なるタンパク質メンバーを発現させること
を含む上流の工程を含み、
ここで、少なくとも2種の細胞集団は、少なくともシードトレインの間、別々に維持され、
b) 発現したタンパク質を回収し;
c) 回収したタンパク質について少なくとも1の精製工程を行い;
d) 精製した薬剤物質を取得し; そして
e) 精製した薬剤物質をポリクローナル医薬に製剤化すること
を含む、方法。
【請求項２】
少なくとも2種の細胞集団が、少なくとも接種トレイン(接種トレインを含む)まで別々に維持される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも2種の細胞集団が、少なくとも製造段階(製造段階を含む)まで別々に維持される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも2種の細胞集団で発現する少なくとも2個の異なるタンパク質メンバーが、少なくともタンパク質の回収(タンパク質の回収を含む)まで別々に維持される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも2種の細胞集団で発現する少なくとも2個の異なるタンパク質メンバーが、少なくとも1個の精製工程(1個の精製工程を含む)まで別々に維持される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも2種の細胞集団で発現する少なくとも2個の異なるタンパク質メンバーが、少なくとも薬剤物質を得る(薬剤物質を得ることを含む)まで別々に維持される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも2種の細胞集団の同数の細胞を組み合わせる、請求項1-3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも2種の細胞集団の異なる数の細胞を組み合わせる、請求項1-3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
異なる集団に由来する細胞を組み合わせて、ほぼ等しい量のポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを発現することが可能なポリクローナル細胞集団を得る、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも2種の細胞集団に由来する細胞を所定の比率で混合する、請求項1-3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも2種の細胞集団に由来する細胞を薬剤物質または医薬における異なるタンパク質メンバーの所定の比率を提供する比率で組み合わせる、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーの細胞培養物からの同体積を組み合わせる、請求項1-6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーの等量を組み合わせる、請求項1-6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
ポリクローナルタンパク質の少なくとも2個の異なるメンバーを、薬剤物質または医薬における異なるタンパク質メンバーの所定の比率を提供する比率で組み合わせる、請求項1-6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも1個の最初の精製工程の間に、少なくとも1個の異なるタンパク質メンバーを他のメンバーとは別々に維持する、請求項1-5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
製造方法の別々の工程が、少なくとも2種の異なる細胞集団および/または少なくとも2種の細胞集団で発現する少なくとも2個の異なるタンパク質メンバーについて平行して行われる、請求項1-15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
製造方法の別々の工程が、少なくとも2種の異なる細胞集団および/または少なくとも2種の細胞集団で発現する少なくとも2個の異なるタンパク質メンバーについて連続して行われる、請求項1-15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
工程a)の培養において使用される容器が、シェーカーフラスコ、ローラーボトル、T型フラスコ、ならびに使い捨てでないおよび使い捨てバイオリアクターからなる群から選択される、請求項1-17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
製造方法の別々の工程が、異なるタンパク質メンバーの発現について同一の培地および製造パラメーターを用いて行われる、請求項1-18のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも2種の細胞集団が、異なるタンパク質メンバーをコードする発現ベクター配列における差異を除いては同一である、請求項1-19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも2種の細胞集団が、異なるタンパク質メンバーの可変領域をコードする少なくとも1個の発現ベクター配列における差異を除いては同一である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
ポリクローナルタンパク質の少なくとも1個の異なるメンバーが1個の定常領域を含み、少なくとも1個の他の異なるメンバーが異なる定常領域を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
ポリクローナルタンパク質の少なくとも1個の異なるメンバーが1個のグリコシル化パターンを含み、少なくとも1個の他の異なるメンバーが異なるグリコシル化パターンを含む、請求項1-22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
ポリクローナルタンパク質が少なくとも3個の異なるメンバーを含む、請求項1-23のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
ポリクローナルタンパク質が分泌されるものである、請求項1-24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
ポリクローナルタンパク質がポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体断片である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
ポリクローナルタンパク質が多量体タンパク質である、請求項1-26のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２８】
細胞が原核細胞である、請求項1-27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２９】
細胞が真核細胞である、請求項1-27のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３０】
真核細胞が植物、酵母、真菌、脊椎動物および無脊椎動物からなる群から選択される真核生物に由来するものである、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
真核細胞が哺乳類細胞である、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、骨髄腫細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、HeLa細胞、HEK293細胞およびPER.C6細胞のような不死化ヒト細胞からなる群から選択される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
製造および/またはそれに続く精製工程の間にポリクローナルタンパク質の各々のメンバーの存在および/または量を確認するための少なくとも1個の工程をさらに含む、請求項1-32のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリクローナルタンパク質の少なくとも2個の異なるメンバーを含む医薬を製造する方法に関する。本発明は、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを発現する細胞の少なくとも最初の別々の培養工程を含む。より後の上流地点で、または下流工程の前に、もしくはその間に、細胞株またはタンパク質調製物を組み合わせて、最終的にポリクローナルタンパク質の少なくとも2個の異なるメンバーを含む1個の医薬を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組み換えポリクローナルタンパク質の製造は、相対的に新規な技術である。多くの組み換え医薬は、望まれる産物を発現する1個のクローン細胞に由来する選択された細胞株を用いて、モノクローナル製品として製造される。本願における上流および下流の製造法は、特定のモノクローナル医薬について最適化され得る。
【０００３】
母乳(哺乳類)もしくは卵(ニワトリ)中に組み換え産物を発現するトランスジェニック動物または植物体もしくは個々の器官(塊茎、種子、葉)を介して組み換え産物を発現するトランスジェニック植物を用いて、インビボで組み換え抗体および他のタンパク質産物を製造するための費用効率が高い方法が最近開発されている。しかしながら、これらの方法は、なおポリクローナル抗体産物の製造に適合させる必要がある。
【０００４】
ポリクローナル医薬を製造するための1つの方法は、WO 2004/009618に開示されており、それは、同一の軽鎖を有する抗体を発現するモノクローナル細胞株の使用に関するものである。この文献によると、抗体の混合物は、組み換え宿主中で、共通する軽鎖をコードする核酸配列および共通の軽鎖と対を形成することができる異なる可変領域を有する少なくとも2個の異なる重鎖をコードする核酸配列を発現させることにより製造され得る。
【０００５】
WO 2004/061104は、部位特異的組み換えを用いて発現細胞のゲノムの特定の位置に組み込まれた1個の発現構築体のみを有することにより、WO 2004/009618に記載された方法に伴う重鎖および軽鎖抗体鎖のスクランブリングの問題の解決策を提供する。この解決策により、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを発現することが可能なポリクローナル産生細胞株を製造することができ、その結果、該ポリクローナルタンパク質、例えばポリクローナル抗体は、1個の細胞バンクを用いて回分培養で製造され得て、1個のバイオリアクターで増やされる。次いで、1個の下流の精製法を用いて上清を精製し、1個の医薬に製剤化された1個の医薬品を生じる。この方法を用いて製造された組み換えポリクローナル抗体は、例えば、組み換えポリクローナル抗RhesusD抗体(WO 2006/007850)および組み換えポリクローナル抗ワクシニアウイルス抗体(WO 2007/065433)を含む。
【０００６】
WO 2008/145133は、無作為組み換えの手段による組み換えポリクローナルタンパク質組成物、特に組み換えポリクローナル抗体組成物を製造する方法を開示しており、ここで、宿主細胞は、個々に、細胞のゲノム中への発現ベクターの部位特異的組み込みを避ける条件下で、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーをコードする異なる核酸の少なくとも1個のコピーを各々含む一組の発現ベクターを導入される。
【０００７】
ポリクローナルタンパク質の製造におけるこれらの前進にもかかわらず、例えばポリクローナルタンパク質の1個またはそれ以上のメンバーが発現および/または精製のための特定の条件を必要とするような場合に、または別々の上流工程が好ましい条件下において、
別の製造法を提供する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
発明の要約
最初の局面において、本発明は、ポリクローナルタンパク質の少なくとも2個の異なるタンパク質メンバーを含む医薬を製造するための方法であって、下記の工程:
a) 少なくとも2種の細胞集団を提供し;
ここで、各々の集団は、ポリクローナルタンパク質の1個の異なるメンバーをコードし、培養培地および当該タンパク質を発現する細胞を含む物理的に別々の容器に包含されるものであり、当該方法は、下記の工程:
i) 1またはそれ以上のシードトレイン(train)の工程において、別々の容器で少なくとも2種の細胞集団を増殖させ; 
ii) 1またはそれ以上の接種トレインの工程において、シードトレインからの細胞を増殖させ;
iii) 製造段階において、タンパク質メンバーの発現を支持する条件下で接種トレインからの細胞を培養して、少なくとも2個の異なるタンパク質メンバーを発現させること
を含む上流の工程を含み、
ここで、少なくとも2種の細胞集団は、少なくともシードトレインの間、別々に維持され、
b) 発現したタンパク質を回収し;
c) 回収したタンパク質について少なくとも1の精製工程を行い;
d) 精製した薬剤物質を取得し; そして
e) 精製した薬剤物質をポリクローナル医薬に製剤化すること
を含む、方法に関する。
【０００９】
当該方法の特性的特徴は、各々がポリクローナルタンパク質の1個の異なるメンバーをコードする少なくとも2種の細胞集団が、少なくとも最初の細胞増殖段階の間に物理的に別々の容器で別々に維持されることである。本明細書で記載される他の態様において、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを発現する細胞集団は、より長い工程の間に、または上流工程の全体の工程の間に別々に維持される。またさらなる態様において、発現したポリクローナルタンパク質の異なるメンバーは、精製された薬剤物質が得られると完成する下流工程の一部の間に、またはおそらくはその全体の間に別々に維持される。異なる態様の利点は、下記に詳述する。
【００１０】
少なくとも2種の異なる細胞集団は、少なくとも接種トレイン(接種トレインを含む)まで別々に維持され、さらなる態様において、少なくとも2種の異なる細胞集団は、少なくとも製造段階(製造段階を含む)まで別々に維持される。
【００１１】
少なくとも2種の細胞集団で発現する少なくとも2個の異なるタンパク質メンバーはさらに、少なくともタンパク質の回収(タンパク質の回収を含む)まで別々に維持され、その結果、各々の異なるメンバーは、別々に回収され得る。
【００１２】
ある態様において、少なくとも2種の細胞集団で発現する少なくとも2個の異なるタンパク質メンバーは、少なくとも1の精製工程(少なくとも1の精製工程を含む)まで別々に維持され、異なるメンバーの異なる最初の精製工程を可能にする。例えば、タンパク質メンバーは、少なくとも親和性クロマトグラフィー工程(親和性クロマトグラフィー工程を含む)まで別々に維持され得る。
【００１３】
本発明はまた、少なくとも2種の細胞集団で発現する少なくとも2個の異なるタンパク質メンバーが、少なくとも薬剤物質を得る(薬剤物質を得ることを含む)まで別々に維持される態様を含む。
【００１４】
別々の容器での単細胞生物におけるポリクローナルタンパク質の製造とは別に、製造は、各々がポリクローナルタンパク質の1個のメンバーを発現する多細胞生物の形態で、物理的に別々の単位で行われ得る。これらの多細胞生物は植物であり得て、その場合には、物理的に別々の単位は植物または植物器官である。多細胞生物はまた、トランスジェニック非ヒト動物、例えば、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを卵に発現および分泌するように遺伝学的に改変された鳥類であり得る。あるいは、トランスジェニック非ヒト動物は、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーが母乳に分泌される哺乳類であり得る。哺乳類は、例えば、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ラクダもしくはバッファローであり得る。
【００１５】
定義
哺乳類細胞、例えばCHO (チャイニーズハムスター卵巣)細胞におけるタンパク質製造は、半継続的な工程を使用し得て、それにより細胞は、さまざまな期間、「シードトレイン」で培養され、次いで、接種発酵槽に移され(「接種トレイン」)、細胞増幅工程を開始し、関心のあるタンパク質のより大規模な製造まで続く。したがって、タンパク質製造のために使用される細胞は、所定の最大細胞齢までのさまざまな期間培養される。細胞培養工程のパラメーター、例えば、シード密度、pH、DO2および温度、製造培養の持続時間、回収の操作条件などは、特定の細胞株および使用される培養培地の関数であり、過度の負担なく実験的に決定され得る。本発明の目的について「シードトレイン」段階は、細胞溶解からの工程および最初の増殖工程を含む。これらの工程は、一般に、ペトリ皿、シェーカーフラスコ、T型フラスコ、プラスチックバッグ、スピナーフラスコ、遠心管、マルチウェルプレート、ローラーボトル、または他のボトル、すなわち、サンプルをある容器から他の容器に移す管を備えていない容器で行われる。最初のバイオリアクターまたは発酵槽(スチールバイオリアクターまたは使い捨てバイオリアクター)に「シードトレイン」からの細胞が接種されるときに、「接種トレイン」は開始される。細胞が接種バイオリアクターに移されると、他のバイオリアクターへの次の移動は、一般に、細胞がある容器から他の容器に送り出されるのを可能にする閉鎖管系を介して行われる。
【００１６】
「医薬」は、錠剤、カプセル、溶液または凍結乾燥された製品のような最終剤形を意味し、それは、一般に1個またはそれ以上の他の成分と組み合わせた「薬剤物質」を含む(必ずしも含む必要はない)。「薬剤物質」は、通常大バッチで製造され、次いで、それを他の成分と組み合わせることにより「医薬」に製剤化される。本発明の文脈において、医薬は、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを含む最終ポリクローナルタンパク質混合物を含み得る。特定の製造計画に依存して、薬剤物質はまた、ポリクローナルタンパク質のすべての異なるメンバーを含むポリクローナル混合物であり得るか、またはポリクローナルタンパク質の1種または数種のみの異なるメンバーを含み得る。後者の場合において、2種またはそれ以上の物質が単一医薬に製剤化され得る。
【００１７】
「容器」または「入れ物」なる用語は、インビトロ細胞培養に適した容器または入れ物を意味する。容器は、例えば、ペトリ皿、シェーカーフラスコ、T型フラスコ、プラスチックバッグ、スピナーフラスコ、遠心管、マルチウェルプレート、ローラーボトル、スチールのバイオリアクターまたは他の使い捨てでないバイオリアクター、ならびにプラスチックもしくは他の使い捨てバイオリアクターを含む。
【００１８】
「タンパク質」または「ポリペプチド」は、長さもしくは翻訳後修飾にかかわらず、アミノ酸の任意の鎖を意味する。タンパク質は、2個もしくはそれ以上の集合したポリペプチド鎖、タンパク質の断片、ポリペプチド、オリゴペプチドまたはペプチドを含む単量体または多量体として存在し得る。
【００１９】
本明細書で使用される「ポリクローナルタンパク質」または「ポリクロナリティ(polyclonality)」なる用語は、好ましくは免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される、異なるが相同であるタンパク質分子を含むタンパク質組成物を意味する。したがって、各々のタンパク質分子は、組成物中の他の分子と相同であるが、またポリクローナルタンパク質の個々のメンバー間のアミノ酸配列中の差異により特徴づけられる1個またはそれ以上の可変ポリペプチド配列のストレッチを含む。そのようなポリクローナルタンパク質の既知の例は、抗体または免疫グロブリン分子、T細胞受容体およびB細胞受容体を含む。ポリクローナルタンパク質は、共通の特徴、例えば望まれる標的に対する共有される結合活性、例えば望まれる標的抗原に対するポリクローナル抗体の場合における特徴により規定されるタンパク質分子の一部からなり得る。
【００２０】
「組み換えポリクローナルタンパク質の異なるメンバー」なる用語は、異なるが相同であるタンパク質分子を含むタンパク質組成物の1個のタンパク質分子を示し、ここで、各々のタンパク質分子は、組成物中の他の分子と相同であるが、またポリクローナルタンパク質の個々のメンバー間のアミノ酸配列中の差異により特徴づけられる1個またはそれ以上の可変ポリペプチド配列のストレッチを含む。
【００２１】
ポリクローナルタンパク質の1個の異なるメンバーをコードする各々の「細胞集団」は、本明細書中の他の場所において記載されたとおり単一細胞に由来する、個々のモノクローナル細胞バンクまたはモノクローナル細胞培養物に由来する。
【００２２】
本明細書で使用される「回収」なる用語は、発現したタンパク質を含む上清の収集を意味するが、清澄化を含む上清から望まれるタンパク質を単離する次の工程は、一般に精製工程であると考えられる。
【００２３】
「抗体」なる用語は、血清の機能的成分を示し、しばしば、分子の集合物(抗体または免疫グロブリン)または1個の分子(抗体分子または免疫グロブリン分子)を意味する。抗体分子は、特定の抗原決定基(抗原または抗原性エピトープ)に結合するか、もしくはそれと反応することができ、次いで、免疫グロブリンエフェクター機構の誘導を生じ得る。個々の抗体分子は、通常単一特異的であると見なされ、抗体分子の組成物は、モノクローナル(すなわち、同一の抗体分子からなる)またはポリクローナル(すなわち、同一の抗原上もしくは異なる異種の抗原上の同一であるかもしくは異なるエピトープと反応する異なる抗体分子からなる)であり得る。各々の抗体分子は、当該抗体がその対応する抗原に特異的に結合するのを可能にする固有の構造を有し、すべての天然の抗体分子は、2個の同一の軽鎖および2個の同一の重鎖の同一の全体的な基本構造を有する。抗体はまた集合的に免疫グロブリンとして既知である。本明細書で使用される抗体なる用語はまた、キメラおよび単一鎖抗体、ならびに抗体の結合断片、例えば、Fab、Fv断片もしくはscFv断片、および多量体型、例えば、二量体IgA分子もしくは5価IgMを含むことを意図する。
【００２４】
「免疫グロブリン」なる用語は、通常、血液または血清中に見出される抗体混合物の集合的な表示として使用されるが、また他の起源に由来する抗体混合物を表示するためにも使用され得る。
【００２５】
「ポリクローナル抗体」なる用語は、同一の抗原上もしくは異なる抗原上のいくつかの異なる特異的抗原決定基に結合するか、もしくはそれと反応することができる異なる抗体分子の組成物を示す。通常、ポリクローナル抗体の可変性は、いわゆるポリクローナル抗体中の可変領域に位置すると考えられる。しかしながら、本発明の文脈において、ポリクロナリティはまた、いわゆる定常領域に存在する個々の抗体分子間の差異を示すものとして理解され得て、例えば、抗体の混合物の場合には、2個またはそれ以上のアイソタイプ、例えば、ヒトアイソタイプIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2、またはマウスアイソタイプIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3およびIgAを含むものとして理解され得る。本明細書で使用される「ポリクローナル抗体」なる用語はまた、2種またはそれ以上のモノクローナル抗体の混合物と考えられ得る。
【００２６】
「関心のある変異型核酸分子のライブラリー」なる用語は、集合的に「関心のある組み換えポリクローナルタンパク質」をコードする核酸分子の集合物を示すものとして使用される。導入のために使用されるとき、関心のある変異型核酸分子のライブラリーは、発現ベクターのライブラリーに含まれる。そのようなライブラリーは、一般に、少なくとも3、5、10、20、50、1000、104、105または106の異なるメンバーを有する。
【００２７】
本明細書で使用される「操作可能に結合」なる用語は、断片が他の断片と機能的な関係に置かれるように結合することを意味する。例えば、シグナル配列をコードするDNAは、それがポリペプチドの小胞体への輸送に参加するリーダーとして発現する場合に、ポリペプチドをコードするDNAに操作可能に結合する。また、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写を刺激する場合に、コード配列に操作可能に結合する。
【００２８】
「導入」なる用語は、外来DNAを細胞に導入するための広義の用語として本明細書で使用される。該用語はまた、外来DNAを細胞に導入するための他の機能的に同等な方法、例えば、形質転換、感染、形質導入、または供与細胞および受容細胞の融合を包含することを意味する。
【００２９】
「可変ポリペプチド配列」および「可変領域」なる用語は、交換して使用することができる。
【００３０】
「head-to-headプロモーター」なる用語は、近接して置かれており、その結果当該プロモーターにより誘導される2個の遺伝子断片の転写が反対の方向に生じるプロモーター対を意味する。head-to-headプロモーターはまた、2個のプロモーター間の無関係な核酸からなるスタファー(stuffer)を用いて構築され得る。そのようなスタファー断片は、容易に500ヌクレオチド以上を含み得る。head-to-headプロモーターはまた、双方向性プロモーターを呼ばれ得る。
【００３１】
「植物」なる用語は、植物界のメンバーである生物を意味する。本発明の目的とする植物は、植物の独立した成長のために必要とされる器官(例えば、根、茎、葉)を含む。植物なる用語が単離された植物細胞を包含するとき、これは、明確に述べられる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の他の製造計画の略図(個々のシード/接種トレイン)。
【図２】本発明の他の製造計画の略図(別々の製造段階)。
【図３】混合集団中での培養7日後の6種の抗ワクシニア抗体各々の相対面積(詳細については、実施例1を参照のこと)。
【図４】混合集団中での培養12日後の6種の異なる抗RSV抗体の相対量(実施例3を参照のこと)。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
発現構築体の組み換えにより作製される産生細胞において発現する組み換えポリクローナル抗体の製造は、個々の回分式の製造として行われ得る。有利には、個々の細胞株または細胞クローンは、1個の培養容器中への細胞株の混合前に類似する増殖速度について適当に選択され、1個または少数の細胞株の過剰増殖を避ける。
【００３４】
例えば特定の望まれる組み換えタンパク質/抗体の製造が細胞株の成長速度に負の方向で影響を与える場合に、望まれる方法で個々の細胞株の成長速度をそろえることが困難であるか、または不可能である状況が存在し得る。また、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーの極めて異なる比率が望ましい状況が存在し得る。そのような場合は、例えば、例えば標的に対する異なる親和性のために、組成物におけるポリクローナルタンパク質メンバーの極めて不均衡な量が望ましいような場合であり得る。例えば、例えば20:5:1:1:1:0.5の個々のメンバー間の比率で6個のタンパク質メンバーを含むポリクローナル組成物が望まれる場合に、製造工程の少なくとも1個の工程の間、異なるメンバーを別々に維持することにより、そのような組成物を制御し、取得することがより実現可能であり得る。他の例は、2個またはそれ以上の異なる親細胞株が異なる組み換え産物の導入および発現のために使用される場合であり得て、その場合には、2種もしくはそれ以上の細胞株についての細胞培養条件、例えば、細胞増殖および/またはポリクローナルタンパク質の異なるメンバーの発現のための最適な培地組成が異なり得る。
【００３５】
個々の発現細胞株の同様の増殖率の必要性を回避するのを助け得るそのような組み換えタンパク質の別の製造法は、少なくとも上流工程のシードトレイン部分の間に細胞株を別々に維持することである。次いで、より後の段階で、例えば、接種トレインの前にもしくはその間に、または製造段階の前にもしくはその間に、異なる抗体を発現する細胞株を組み合わせ得る。この方法の1つの利点は、混合した細胞培養物の集団倍化数を劇的に減少させ、その結果、たとえ個々の細胞株が異なる増殖率を示す場合であっても、最終医薬中におけるポリクローナルタンパク質の個々のメンバーの比率を制御するのがより容易になることである。別々の製造は、1個またはそれ以上の下流処理工程の間継続され得て、異なるタンパク質メンバーは、薬剤物質が必要とされる程度まで精製される時点まで別々に維持され得る。後者の場合において、その後、薬剤物質を組み合わせて、ポリクローナルタンパク質の少なくとも2個のメンバー、例えば、同一もしくは異なる抗原を標的とする2個またはそれ以上の異なる抗体を含む最終医薬を製造する。
【００３６】
本発明の1つの重要な要素は、組み合わせが細胞株の増殖の間に行われるか、またはタンパク質が細胞株から分離した時点で行われる場合に、最終産物は必ずポリクローナルタンパク質の少なくとも2個のメンバー、例えば、同一もしくは異なる抗原を標的とする2個またはそれ以上の異なる抗体を含む単一ポリクローナル医薬であることである。
【００３７】
1つの態様において、個々の組み換えタンパク質を含む上清を回収するまで、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーを別々に維持する。次いで、下流の精製工程の前にこれらの産物を混合し、CMC工程を単純化し、コストを減少させる。
【００３８】
同一の方法を用いてポリクローナルタンパク質の個々のメンバーを精製できない場合において、より後の段階の下流精製工程の間に、または最終医薬を製造する前の精製の完了時点で、それらをまた混合し得る。
【００３９】
より早期の段階で混合しないか、または2種もしくはそれ以上の細胞集団の混合後に一緒に製造しない場合には、ポリクローナル医薬の形成までにポリクローナルタンパク質の個々のメンバーを共に組み合わせることは明らかである。
【００４０】
最終産物中の構成要素の各々を産生する個々の発現細胞株の製造は、優先的に使い捨てバイオリアクター、例えば、Wave Bag(それは、多くの異なるバッグサイズで、市販で利用可能である)のような低コスト装置での培養により行われるが、個々の製造ランの容積が低い場合、例えば、50 L以下、または優先的に20 Lもしくは10 L以下である場合、複数の使い捨てでないバイオリアクターを走らせることがまた可能である。個々の細胞株の各々に由来する組み換えタンパク質の培養は、優先的に平行して行われるが、また2個またはそれ以上の集団において連続して行われ得る。
【００４１】
各々の製造容器(例えば、Wave Bagもしくはバイオリアクターの他の型)についての接種材料は、各々の個々のタンパク質産生細胞株またはクローンについて、第1にMaster Cell Bank (MCB)を作製し、おそらくその後のWorking Cell Bank (WCB)の作製により得られる。別々の培養容器への接種のために、各々のWCB (または、MCB)に由来するバイアルを使用する。シードトレインは、接種バイオリアクターの接種のための十分な細胞が得られるまで、これらの細胞株の各々を増やすために設計される。
【００４２】
可能ならば、製造の別々の工程は、優先的に異なるタンパク質メンバーの発現についての条件、例えば、同一の培地成分および添加されたフィード溶液(例えば、グルコース、グルタミン、潜在的な選択剤、例えば、G418、ビタミン、ミネラル、タンパク質、加水分解異物など)、ならびに培養工程パラメーター、例えば、pH、DOT (溶存酸素テンション)、CO2圧および温度を含む条件と同条件で行われる。これは、品質管理工程を促進するために重要であり、そこでは、宿主細胞タンパク質減少、添加された選択剤の除去および添加された増力因子の除去のような要因について取り組まれる必要がある。それはまた、組み換えタンパク質の同様の翻訳後修飾、例えば、同様のグリコシル化パターンを得るために、極めて重要である。
【００４３】
同様に、精製の任意の別々の部分は、好ましくは、可能な程度まで同様のカラム、緩衝液、溶出プロファイルなどを用いて行われる。
【００４４】
円滑で、コストおよび時間効率のよい下流および分析工程を可能にするために、ポリクローナル組成物中の個々の異なるタンパク質メンバーの物理化学的特性ができるかぎり類似していることが好ましい。これは、分子の定常部分を同一に維持することにより最大限保証される。抗体の場合において、個々の組み換え抗体分子の各々を製造するために、同一の発現ベクターが優先的に使用され、これらの一次配列は、重鎖および軽鎖の各々の可変領域においてのみ選択的に異なる。最も好ましい計画において、発現構築体によりコードされる抗体分子の定常部分は、ポリクローナル抗体組成物のすべのメンバーについて正確に同一(例えば、IgG1アイソタイプ分子)である。さらに、軽鎖はまた、好ましくは同一型であり、ヒト抗体の場合にはκまたはλである。抗体分子の主要部をできるかぎり同一に保つことにより、多様性を失う危険性なしに、1個の手順を用いて高純度での組み換え抗体の精製を可能にする。それはまた、製造された医薬の特徴づけ、品質管理および販売のために必要とされる分析方法の確立を促進する。
【００４５】
タンパク質精製工程は、一般に、抗体または他のタンパク質分子の物理化学的特性に基づいて開発される複数の工程であり、各々の工程について、多様性の喪失の危険、すなわち1個またはそれ以上の個々の産物成分を失う危険性が存在する。工程は、例えば、プロテインAまたはプロテインG結合であり得る捕捉工程を含むいくつかのクロマトグラフィー工程、陰イオン交換クロマトグラフィー工程および疎水性相互作用に基づくクロマトグラフィー工程を含み得る。それはさらに、低pHでのインキュベーションおよびいくつかのろ過工程を含む。分子間のこれらの物理化学的特性のいずれかにおける差異が純粋で多様なポリクローナル抗体産物の成功した回収を妨げ得ることは、当業者に明らかである。
【００４６】
分析的品質管理法に関して、定常領域が分子間で同一もしくは類似でない場合に、組み換え抗体産物の規制認可を得るために必要なすべての特徴づけアッセイ、例えば、例えば、ペプチドマッピング、サイズ排除、SDS-PAGE、ウエスタンブロット、アミノ酸解析、ジスルフィド架橋および遊離スルフヒドリル基のマッピングならびにモノ-およびジ-オリゴサッカライド特徴づけが満足のいく程度まで行われることが困難であり得ることは当業者に明らかである。組み換えポリクローナル抗体および他のポリクローナルタンパク質の構造的特徴づけの方法、およびそのようなポリクローナルタンパク質を発現するポリクローナル細胞株の特徴づけの方法は、WO 2006/007853に開示されている。
【００４７】
異なる製造計画
培養槽における組み換え発現
培養哺乳類細胞は、それらの適当な折り畳み、集合および翻訳後修飾についての能力のために、臨床適用のための組み換えタンパク質の製造についての主要な系になっている。接着細胞の培養および懸濁培養という2つの主要な様式が哺乳類細胞における組み換えタンパク質の製造のために使用された。後者が極めて一般的である。
【００４８】
回分培養または流加培養製造工程において、極めて大きい容量までの大規模化は、より大きなリアクターで前もって温められた5-20容量の新鮮な培地へのバイオリアクターの内容物の希釈により生じ得る。保存された細胞の融解から実際の大規模製造までの工程は、3個の別々の段階 − シードトレイン、接種トレインおよび製造段階からなる。シードトレインは、通常、より小さい細胞培養容器で行われ、保存された細胞の融解後すぐに少量の数mLの培養から開始して、数Lの細胞培養物、例えば、5-100 Lの細胞培養物まで増加させ、製造について選択された期間の間に大規模化のための新鮮な細胞を提供する。シードトレインの間に製造された細胞懸濁液を接種リアクター(また、シードリアクターと呼ばれる)に移したときに接種トレインは開始され、その容量を増大させ、最終製造バイオリアクターへの接種のために十分な細胞数を製造する(Wurm, 2004, Nature Biotechnology, 22 (11):1393-1398)。
【００４９】
モノクローナル組み換えタンパク質の製造のために、一般に、拡張された数の集団倍化について、シードトレイン段階または接種リアクターにおける融解した細胞を維持することが可能である。これは、2個以上の製造バイオリアクターに同一のアンプルから融解した細胞を接種する可能性を提供し、それはまた、例えば技術的な問題のために製造が遅延する場合に、予備細胞を提供する。しかしながら、組み換えポリクローナルタンパク質を製造する場合に、世代数にわたって厳格な制限を設定し、制御を介して維持することが必要であり、一般に、延長された時間の間、ポリクローナル細胞バンクからのジードトレインを維持することはできない。これは、異なる細胞株の増殖率をできるかぎり一致させた場合においてさえ、ポリクローナル細胞組成物における個々の細胞株は、常にわずかに異なる増殖率および生産性を示し、延長された培養期間中の組成の変動を生じるという事実による。これは、モノクローナルタンパク質製造工程の場合と比較して、より多くの制約および低い柔軟性を与え、例えば遅延を生じる製造リアクターを用いた技術的な問題の場合において、より高い製造失敗の危険性を生じ得る。
【００５０】
組み換え抗体の製造のための好ましい技術である回分もしくは流加培養製造の場合において、多くの集団倍化は実際に製造リアクターへの接種前に行われる。集団倍化に関する一般的な上流工程は、下記のように考えられる: pMCBからのバイアルの拡張によりpWCBを作製するために、8-12回の集団倍化が必要とされる。シードトレイン増殖は、一般に、最終製造規模に依存して10-20の倍化を必要とするが、接種リアクターで行われる集団倍化の数は、一般に、2-5世代である。流加培養製造リアクターにおいて、細胞は、相対的に低い数の世代、例えば、5-8世代通過する。ポリクローナルマスター細胞バンクから出発して回分培養製造工程を用いると、上流工程を完成するのに全体で約25-43世代が必要とされる。これらのうち約20-37回の集団倍化は、製造容器の接種前に生じる。混合した培養期間が短い程、望まれる組成比を制御し、かつ、維持することが可能であることは明らかである。したがって、同様の増殖率を得ることが困難であるか、または極めて狭い制限の組成比を得ることが重要なポリクローナル産物について、製造工程の最初の段階の間、別々の容器に個々の細胞株を維持し、後の時点で細胞を混合することは有利であり得る。
【００５１】
組み換えタンパク質産物は、一般に、異種もしくは内因性タンパク質産物を発現する単離した細胞を用いて、タンパク質産物の発現を支持する条件下、液体もしくは半固体培地でこれらの細胞を培養することによりインビトロで発現する。これらの方法は特に、選択されたタンパク質産物がタンパク質精製の第1工程として容易に細胞から分離され得るので、当該タンパク質産物の発現のために有利である。
【００５２】
培養のために使用される容器は、例えば、シェーカーフラスコ、ローラーボトル、T型フラスコ、および使い捨てもしくは使い捨てでないバイオリアクターからなる群から選択され得る。好ましい態様において、容器は、1個またはそれ以上の使い捨て容器を含む。使い捨て容器は、10 Lから1000 Lを超える範囲にわたる異なるサイズで、多くの製造工程で利用可能なWave Bagを含み得る。適当な使い捨てバイオリアクターは、BIOSTAT(登録商標) CultiBag (Sartorius Stedim Biotech)、Cell Maker Lite2(商標) (Cellexus Biosystems)、Biowave(登録商標) (Wave Biotech AG)、Wave Biotech LLC (GE Healthcare)バッグ、Single-Use Bioreactors S.U.B. (Hyclone Thermo Fisher Scientific)およびFlexFactory(商標) (Xcellerex)を含むがこれらに限定されない。本発明は、少なくとも上流工程の部分について、平行もしくは連続した製造におけるポリクローナルタンパク質の異なるメンバーのための別々のバイオリアクターの使用を含むので、高価なスチールタンクではなく相対的に安価な使い捨てバイオリアクターを使用することが有利である。さらに、使い捨てバイオリアクターは、複数のスチールタンクを用いた場合と比較してバイオリアクターの数を増大させることが容易かつ安価であるために、本発明の方法に対して柔軟性を与える。
【００５３】
当該方法は、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーの発現について開発されたが、これらの方法は、ある場合には不十分である。例えば、ポリクローナルタンパク質が同一の下流工程手順を用いて精製できない異なるタンパク質メンバーを含む場合には、個々のバッチにおいて異なるメンバーを発現することは有利ではない。また、ある理由のために、特定の細胞型の1個の異なるメンバーおよび他の細胞型の他のメンバーを発現することが望まれる場合には、個々の回文式製造は、好ましくない。
【００５４】
最後に、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを発現する異なる細胞クローンの発現レベルおよび/または増殖率における差異が極めて大きいために、ポリクローナル細胞バンクにおいて異なるクローンを組み合わせることが不利である場合が存在し得る。
【００５５】
別々のシードトレイン
本発明の1つの態様は、別々の培養容器で融解される異なるモノクローナル細胞バンクを有することに依存し、その結果、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを発現する各々のクローンについて、最適な融解および適合条件が使用され得る。融解および適合のこれらの最初の工程の間、細胞の生存は圧力をかけられ、これらの早期工程におけるクローン間の生存のわずかな差異でさえ、最終産物におけるタンパク質メンバーの相対的な分布に劇的な影響を与え得る。
【００５６】
本発明の態様によると、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを発現する個々の産生細胞株は、融解、適合およびシードトレイン増殖の間、別々に維持される。次いで、望まれる基準にしたがい、クローンを混合し、接種トレイン、製造段階、回収および下流の処理について、1個のバッチで培養し得る。
【００５７】
別々の接種トレイン
さらなる態様において、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを発現する異なるクローンは、接種トレイン(接種トレインを含む)まで別々に維持される(図1)。この態様によると、製造段階の開始時において、各々の産生細胞株について同数の細胞を有することは可能である。上記したとおり、この態様におけるポリクローナル段階は相対的に短く、限定された数の細胞分裂を有しており、その結果、細胞クローン間の増殖率における任意の差異は、組成に関して限定的な効果を有する。このようにして、個々の異なる産生細胞株を組み合わせて、製造段階の最後にポリクローナルタンパク質の異なるメンバーの所定の分布を得ることは容易である。
【００５８】
別々のシードトレイン、および特に、別々のシードトレインおよび別々の接種トレインを用いることの重要な利点は、別々のクローンがプールされた時点から製造段階の最後までの工程の数が減少することである。結果として、異なる細胞クローンがプールされ、共培養される工程の全数が最小化される。これは、1個またはそれ以上のクローンが異なる細胞クローンの混合物において他のクローンより成長するか、もしくはより産生される可能性を有する世代がほとんど存在しないので、バッチごとの最終産物におけるより全体的な安定性および均一性を可能にし、したがって、最終結果物にわたるより大きな制御を可能にする。
【００５９】
例えばポリクローナルマスター細胞バンクの使用と比較して、当該方法の他の利点は、所望によりポリクローナル混合物を適合させることにおいて、より柔軟性を与えることである。例えば、ポリクローナルMCBにおける細胞クローンの1個が不安定であるか、または準最適であることが見出された場合には、ポリクローナルMCBの全体が再構築されなければならないであろう。対照的に、本発明は、単一の準最適クローンが除去されるか、またはより短い時間およびより少ない労力で、同じタンパク質を産生する新たなクローンにより置換されることを可能にする。それはまた、相対的に容易に、新規タンパク質を産生する新規クローンを確立されたポリクローナルタンパク質を産生する現存のクローン混合物に加えることを可能にする。さらに、この方法は、シードトレインおよび接種トレインのために、例えばWave Bagもしくは他の使い捨てバイオリアクターを用いて、最終タンパク質組成物における変化の危険性を最小限にしながら製造段階を大規模化することを容易にする。
【００６０】
またさらなる利点は、いったん望まれるポリクローナルタンパク質の異なるメンバーが同定されると、ポリクローナルタンパク質または他の治療タンパク質の前臨床開発へ迅速に移行する可能性である。これは、いったん適当な個々のタンパク質メンバーが同定されると、ポリクローナルマスター細胞バンクおよびポリクローナルワーキング細胞バンクの安定性試験にさらなる時間を費やすことなく、個々のクローン(それは、次いで、製造目的のために直接使用され得る)の安定性について試験することのみが必要となるからである。さらに、前臨床および臨床フェーズI/II試験について、世代についての時間を費やしたり、WCBの試験を行ったりすることなく、MCBに基づく製造を行うことがまた可能であり得る。
【００６１】
別々の製造段階
またさらなる態様において、製造段階はまた、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーについて別々に行われる(図2)。これは、異なる細胞型での、および/または異なる条件下における異なるメンバーの発現を可能にし、それはまた、ポリクローナルタンパク質のすべての異なるメンバーについて、1個の同一の手順で完全な下流工程を行うことができない状況下において適用可能である。この計画はまた、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーについての発現プラットホームを選択することに関して、十分な自由度を与える。
【００６２】
したがって、例えば、あるメンバーを酵母細胞で発現させ、あるメンバーを哺乳類細胞で発現させることができる。あるいは、例えば、あるタンパク質メンバーを単離された植物細胞においてインビトロで発現させ、所望により、あるタンパク質メンバーを細菌で発現させることができる。異なる種は、発現したタンパク質の異なる翻訳後修飾を生じることが、当分野において既知である。このようにして、そのような異なる翻訳後修飾を有する産物は製造され、ある通常のまたは部分的に通常の下流の工程にかけられ得る。この製造計画はまた、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーについて、異なる培養モードの使用を可能にする。バッチ工程を用いて1個のメンバーを製造し、流加培養またはかん流工程を用いて他のメンバーを製造し得る。
【００６３】
ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーについて、別々の製造段階を有するさらなる利点は、所定の比率での下流の処理前に、異なるタンパク質メンバーを混合もしくは組み合わせることができることである。これは、潜在的な増殖率および/または発現レベルにおける差異により引き起こされ得るすべての歪んだ分布を減少させる。
【００６４】
さらなる利点は、異なるタンパク質メンバーの連続製造を行うことができることである。これは、1個または少数のバイオリアクターにおいて、多くの異なるタンパク質メンバーを有する複雑なポリクローナルタンパク質の製造を可能にする。発現した異なるタンパク質メンバーは、発現後に順次または同時に数回回収され、すべてのメンバーが発現するまで保存される。次いで、1個の下流処理工程を用いて、ポリクローナルタンパク質を精製し得る。
【００６５】
別々の回収
異なるタンパク質メンバーの別々の発現後、次の回収工程は、ポリクローナルタンパク質の1個またはそれ以上のメンバーについて別々に行われるか、または通常の手順により、2個またはそれ以上のメンバーが回収され得る。
【００６６】
発現したタンパク質産物は、異なるバイオリアクターからの上清もしくは細胞を回収することにより取得されるか、または植物もしくは動物での製造の場合には、回収された植物から、または例えばトランスジェニック動物の母乳もしくは卵からタンパク質を単離することにより取得され得る。
【００６７】
別々の第1精製工程
下流工程(DSP)の最初の段階は、一般に、細胞および細胞残屑(細胞壁、細胞膜および細胞断片)からタンパク質産物を分離する1またはそれ以上の工程を含む。これは、遠心分離およびろ過を含むがこれらに限定されない浄化手順を用いて行われ得る。異なるメンバーを別々に製造する場合に、異なるタンパク質の別々の製造および回収の場合において、別々に回収された上清はまた、一般に、別々に浄化され得るが、最初の浄化は、異なるメンバーについて別々に、または2個またはそれ以上のメンバーについて結合して行われ得る。
【００６８】
浄化後、次の工程は、親和性クロマトグラフィー工程、例えば、結合および溶出モード(捕捉モード)で行われるプロテインAもしくはプロテインG精製を含み得る。そのような精製工程は、一般に、さまざまな混入物質(宿主細胞タンパク質、DNA、ウイルス、培地成分)の除去において極めて有効である。プロテアーゼおよび他の酵素が混入物質の一部を構成し得る場合には、タンパク質産物の安定化のために、初期の段階でこれらを除去することが重要である。
【００６９】
さらに、最初の親和性クロマトグラフィー工程は、一般に、容積のかなりの減少を生じ、その結果、この精製工程後の部分的に精製されたタンパク質産物の貯蔵を容易かつ簡便にする。連続製造の場合において、タンパク質の回収後、迅速もしくは簡便に容積減少工程を行うことが有利である。また、タンパク質産物の安定化のために、タンパク質の回収後、できるだけ素早く混入物質の主要部分を除去することが有利である。次いで、ポリクローナルタンパク質の1個の異なるメンバーを各々含む凍結アリコートを融解し、混合し、さらなるDSPにかけることができる。
【００７０】
例えば、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーが同じカラムで捕捉されない異なるアイソタイプを有する抗体を含むか、または個々のメンバーの製造が時間的に別々である場合に、別々の最初のクロマトグラフィー工程はまた、少なくとも1個の異なるメンバーについて適用され得る。例えば、ポリクローナルタンパク質は、プロテインAカラムで精製され得る少なくとも1個の異なる抗体メンバーおよびプロテインGカラムで精製され得る少なくとも1個の他の異なる抗体メンバーを含むポリクローナル抗体であり得る。下流工程の残りの部分は、1の工程として行われ得る。
【００７１】
別々のさらなるクロマトグラフィー工程
他の態様において、さらなる下流工程はまた、異なるタンパク質メンバーについて別々に行われ得る。これは、特定の精製工程について極めて異なる回収率が予期され、および/またはサイズ、荷電および/または疎水性に関して異なるメンバーが極めて異なるために、ある通常の精製手順を使用できない場合に有利であり得る。異なるタンパク質メンバーについての極めて異なる混入物質の存在はまた、別々のクロマトグラフィー工程の使用を正当化し得る。
【００７２】
この態様は、異なるタンパク質メンバーの各々についての工程の最適化を可能にし、すべてのタンパク質メンバーについての高収率を維持する。これは、下流工程の間により少ない損失を生じ得る。
【００７３】
薬剤物質の別々の製造
またさらなる本発明の態様において、「薬剤物質」を得るためのすべての工程は、異なるタンパク質メンバーについて別々に行われる。この計画において、ポリクローナルタンパク質鋸となるメンバーを含む薬剤物質は、平行して、もしくは連続して製造され得る。これにより、正確な所定の比率で異なるタンパク質メンバーを組み合わせることが可能になる。これは、正確な比率がその機能のために重要である場合に有利であり得る。完全な上流および下流工程を分離させ、異なるタンパク質メンバーの各々について最適化し得る。これは、より高い発現レベルおよび回収率を生じ得る。本発明の態様を用いると、タンパク質産物の1個またはそれ以上のメンバーを誘導体化すること、例えば、毒素、ポリマー、または他の非タンパク質基を異なるタンパク質メンバーのすべてではないが、1個またはそれ以上に結合させることが可能である。そのような誘導体化は、誘導体化前に、タンパク質が精製されていることを必要とする。さらに、誘導体化は、誘導体化された産物が他の異なる非誘導体化タンパク質メンバーと共に容易に精製されないという結果を生じる。ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーの各々について、別々の特徴づけおよび/または放出(release)アッセイは、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを含む薬剤物質の各々について個々に行われ得る。1個またはそれ以上の異なるメンバーが誘導体化されるとき、この異なるメンバー単独で、特定の放出もしくは特徴づけアッセイを行い得ることが有利であり得る。
【００７４】
得られた薬剤物質は、最終的に、必要とされる医薬賦形剤、担体などと共に医薬に製剤化される。
【００７５】
特定の製造計画
下記において、本発明による抗体産物の製造のための異なる製造計画が段階的に記載される。これらは、非限定的な例を提供するものである。
【００７６】
1) 部分的に別々のシードトレインおよび製造前の混合
この計画は、下記の工程を含む(図1を参照):
プールにおける導入
選択
高産生クローンについてのスクリーニング
シード/接種トレインの特定の段階における別々の増殖
混合
ポリクローナル産物の回分培養製造。
【００７７】
当該計画は、最初に、異なるポリクローナルタンパク質メンバーの各々をコードする一組の発現ベクターを提供することを含む。発現ベクターの各々を適当な宿主細胞のゲノムに別々に導入し、その結果、1個の細胞は、ポリクローナルタンパク質の1個のメンバーのみを発現する。導入されたクローンの選択は、例えば、共発現させる優性遺伝学的マーカー、例えば、薬剤耐性マーカーを用いて行われ得る。
【００７８】
ハイスループットスクリーニングについてのプロトコールを用いて、高産生単一細胞クローンを選択することができる。さらに、適当なバイオリアクターパラメーターならびに細胞特異的生産性および最大力価について、クローンをスクリーニングする。
【００７９】
次いで、ポリクローナル製造についてのアルゴリズムにしたがい、バイオリアクターパラメーター、生産性および力価に関するデータを用いて、異なるポリクローナルタンパク質メンバーの各々をコードするクローンを集団に分類し得る。最善の製造セット(すなわち、平衡生産性および組成安定性)を選択する。あるいは、最善の共培養結果を提供するクローンの組み合わせについて試験するための実験が行われ得る。
【００８０】
異なるポリクローナルタンパク質メンバーの各々について、マスター細胞バンク(MCB)を作製する。次いで、各々のMCBを別々のシードトレインで使用する。次いで、特徴づけ工程からのデータもしくは実験結果に基づく特定の基準にしたがい、別々のシードトレインを用いてバイオリアクターに接種する。その後、1個のバイオリアクターでの回分培養製造において接種材料を使用し、回収されたポリクローナルタンパク質を単一の下流工程にかける。
【００８１】
2) 個々の産生細胞株における別々の製造、精製前の混合
この計画は、下記の工程を含む(図2を参照):
プールにおける細胞の導入
形質転換体の選択
抗産生細胞株/クローンについてのスクリーニング
別々の製造および精製前の混合。
【００８２】
当該計画は、最初に、異なるポリクローナルタンパク質メンバーの各々をコードする一組の発現ベクターを提供することを含む。発現ベクターの各々を適当な宿主細胞のゲノムに別々に導入し、その結果、1個の細胞は、ポリクローナルタンパク質の1個のメンバーのみを発現する。その後、導入されたクローンを選択するために、共発現させる優性遺伝学的マーカー、例えば、薬剤耐性マーカーについての選択を行う。
【００８３】
ハイスループットスクリーニングについてのプロトコールを用いて、高産生単一細胞クローンを選択することができる。さらに、適当なバイオリアクターパラメーターならびに細胞特異的生産性および最大力価について、クローンをスクリーニングする。
【００８４】
異なるポリクローナルタンパク質メンバーの各々をコードする最善のクローンを選択し、異なるポリクローナルタンパク質メンバーの各々について、マスター細胞バンク(MCB)を作製する。次いで、従来の上流製造において、各々のMCBを使用する。異なるポリクローナルタンパク質メンバーの各々について、すべてのバイオリアクターランからの上清を貯蔵タンク/容器に集めて、混合し、次いで、混合したポリクローナル上清を精製する。所望により、貯蔵タンクにおける回収前に、容積減少工程を行うことができる。容積減少工程は、限外ろ過または親和性クロマトグラフィー、例えば、プロテインAクロマトグラフィーを含み得る。容積減少工程は、異なるタンパク質メンバーについて、別々に行われる。
【００８５】
3) 別々の製造および精製、精製したタンパク質の混合
この計画は、下記の工程を含む:
プールにおける導入
選択
高産生クローンについてのスクリーニング
別々の製造
別々の精製
精製した抗体の混合(薬剤物質)。
【００８６】
当該計画は、上流工程の最後まで、計画2と同一である。その後、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを従来の別々の下流工程にかける。特定の基準にしたがい、異なるポリクローナルタンパク質メンバーの各々について、すべてのラン(run)から精製された薬剤物質を回収し、所望により貯蔵し、混合し、最終医薬を得る。
【００８７】
細胞およびタンパク質の混合
製造の上流処理工程の間に異なる細胞集団を混合する場合、これは、最終産物として取得されるポリクローナルタンパク質の組成に影響を与えるであろう。
【００８８】
細胞を混合する1つの方法は、少なくとも2種の細胞集団の同数の細胞を混合もしくは組み合わせることを含む。しかしながら、異なる細胞集団が異なる発現レベルまたは異なる増殖率を有する場合には、これは、最終産物において異なるタンパク質メンバーの等しい分布を生じないこともある。これを補うために、少なくとも2種の異なる細胞集団の異なる細胞数を組み合わせ得る。したがって、異なる集団からの細胞を組み合わせて、ほぼ等しい量のポリクローナルタンパク質の異なるメンバーを発現することができるポリクローナル細胞集団を得てもよい(例えば、実験的に決定され得る所定の比率でそれらを混合し得る)。
【００８９】
他の態様において、薬剤物質または医薬において異なるタンパク質メンバーの所定の比率を与える比率で、少なくとも2種の異なる細胞集団からの細胞を組み合わせる。これは、異なる細胞集団の発現レベルおよび/または増殖率についての知見、および/または少なくとも1個の精製工程における異なるメンバーの回収についての知見を用いて行われ、比率を計算し、その後、細胞が組み合わされ得る。あるいは、望まれる結果を得るのに適当な混合比率は、実験データに基づいて実験的に決定され得る。
【００９０】
上流工程の最後に、または下流工程の間に組み合わせが行われるとき、これは、単に、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーの細胞培養物からの同量を組み合わせることにより達成され得る。あるいは、そのような情報が取得されると、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーの等量を組み合わせ得る。
【００９１】
薬剤物質または医薬において異なるタンパク質メンバーの所定の比率を与える比率で、ポリクローナルタンパク質の少なくとも2個の異なるメンバーを組み合わせ得る。これは、少なくとも1個の精製工程における異なるメンバーの回収についての知見を用いて行われ、比率を計算し、その後、細胞が組み合わされ得る。
【００９２】
ポリクローナルタンパク質
本発明の大部分の態様において、ポリクローナルタンパク質は、当然には該タンパク質メンバーを発現する細胞と関連しておらず、発現系は組み換え的である。
【００９３】
本発明は、組み換えポリクローナルタンパク質の一貫性のある製造法を提供し、それは、好ましくは分泌され、より好ましくは免疫グロブリン様ドメインを有するタンパク質のファミリーである免疫グロブリンスーパーファミリーから選択される。免疫グロブリンスーパーファミリーの多くのメンバーは、細胞表面認識イベントに関与する。配列解析は、抗体、T細胞受容体、MHC分子、いくつかの細胞接着分子およびサイトカイン受容体が高度に相同的であることを示す。特に、可変領域を含むこのファミリーのメンバーは、本発明による組み換えポリクローナルタンパク質の製造に適している。そのようなメンバーは、抗体、膜結合タンパク質(B細胞受容体)、Fab断片、Fv断片、単一鎖Fv (scFv)断片、T細胞受容体(TcR)、可溶性TcR、TcR可変ドメイン断片、ポリペプチドリンカーにより結合したTcR可変ドメイン断片、および他の抗体もしくはTcR由来断片を含む。特に、本発明は、組み換え治療的ポリクローナル抗体または抗体断片ならびにTcRおよびTcR断片の大規模な製造および作製のために使用され得ることが意図される。好ましい態様において、ポリクローナルタンパク質は、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体断片である。
【００９４】
本発明の組み換えポリクローナルタンパク質は、異なるが相同であるタンパク質分子を含むタンパク質組成物を意味し、当該差異は、例えば自然発生的な多様性を反映する。したがって、各々のタンパク質分子は、組成物中の他の分子と相同であるが、またポリクローナルタンパク質の個々のメンバー間のアミノ酸配列における差異により特徴づけられる1個またはそれ以上の可変ポリペプチド配列のストレッチを含む。可変ポリペプチド配列を構成するアミノ酸配列中における当該差異は、わずか1個のアミノ酸である場合もあるが、通常、2個以上のアミノ酸で構成され得る。ポリクローナル抗体またはTcRの天然の可変性は、一般に、ポリペプチド鎖のいわゆる可変領域またはV領域に存在する。
【００９５】
本発明の1つの態様において、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーは、約80〜120アミノ酸長である可変領域を含む。可変領域は、超可変ドメイン、例えば相補性決定領域(CDR)を含み得る。自然発生的なTcRにおいて、各々の可変領域中に4個のCDRが存在する。自然発生的な抗体において、重鎖中に3個のCDRおよび軽鎖中に3個のCDRが存在する。
【００９６】
本発明のさらなる態様において、ポリクローナルタンパク質の個々のメンバーの可変領域は、1〜26アミノ酸長の、好ましくは4〜16アミノ酸長である少なくとも1個の超可変ドメインを含む。この超可変ドメインは、CDR3領域に対応し得る。抗体について、各々の可変領域は、好ましくは、3個の超可変ドメインを含む。これらは、CDR1、CDR2およびCDR3に対応し得る。TcRについて、各々の可変領域は、好ましくは、4個の超可変ドメインを含む。これらは、CDR1、CDR2、CDR3およびCDR4に対応し得る。超可変ドメインは、単独で、本発明の組み換えポリクローナルタンパク質の可変領域内に可変配列を構成し得る。
【００９７】
本発明の文脈において、ポリペプチド配列における可変性(ポリクロナリティ)はまた、例えば2種またはそれ以上の異なる抗体アイソタイプ、例えば、ヒトアイソタイプIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgDおよびIgE、またはマウスアイソタイプIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgMおよびIgAを含む抗体の混合物の場合に、抗体ポリペプチド鎖のいわゆる定常領域またはC領域に存在する個々の抗体分子間の差異を示すものとして理解され得る。したがって、組み換えポリクローナル抗体は、可変領域(V領域)または定常領域(C領域)またはその両方における個々の抗体間の配列差異により特徴づけられる抗体分子を含み得る。好ましくは、抗体は、同一のアイソタイプであり、この場合には、次の精製および特徴づけがかなり容易になる。また、異なるアイソタイプ、または好ましくは、異なるサブクラスの抗体と組み合わせることが考えられる。例えば、アイソタイプIgG1、IgG2およびIgG4の抗体は、そのすべてがプロテインA親和性クロマトグラフィーを用いて一緒に精製され得るので、組み合わせることができる。異なるアイソタイプまたはサブクラスの抗体の場合において、ポリクロナリティは、定常部分、可変ドメイン、またはその両方において生じ得る。好ましい態様において、ポリクローナル抗体を構成するすべての抗体は、さらなる精製を促進するために同一の定常領域を有する。より好ましくは、抗体は、重鎖の同一の定常領域を有する。軽鎖の定常領域はまた、異なる抗体について同一であり得る。したがって、1つの態様において、少なくとも2種の細胞集団は、異なるタンパク質メンバーをコードする発現ベクター配列における差異を除いては同一である。少なくとも2種の細胞集団は、例えば、異なるタンパク質メンバーの可変領域をコードする少なくとも1個の発現ベクター配列における差異を除いては同一である。
【００９８】
本発明の好ましい態様において、組み換えポリクローナルタンパク質は、組み換えポリクローナル抗体または抗体断片である。本発明の他の好ましい態様において、組み換えポリクローナルタンパク質は、組み換えポリクローナルTcRまたはTcR断片である。
【００９９】
いわゆる定常領域、特に抗体の重鎖におけるポリクロナリティは、抗体の治療適用について関心がある。さまざまな免疫グロブリンアイソタイプは、異なる生物学的機能を有するものであり(表1に要約している)、それは、免疫グロブリンの異なるアイソタイプが天然の免疫応答の異なる局面に関与し得るので(Canfield and Morrison 1991. J.Exp.Med. 173, 1483-91; Kumpel et al. 2002. Transfus.Clin.Biol. 9, 45.-53; Stirnadel et al. 2000. Epidemiol. Infect.124, 153-162)、抗体を治療のために利用するときに組み合わせることが望ましくあり得る。
【０１００】
表1: ヒト免疫グロブリンアイソタイプの生物学的機能
【表１】
2011518790.tif 000002
【０１０１】
上記したとおり、ポリクロナリティは、定常部分に存在し得て、その結果、ポリクローナルタンパク質の少なくとも1個の異なるメンバーは、1個の定常領域を含み、少なくとも1個の他の異なるメンバーは、異なる定常領域を含む。また、発現したタンパク質に関して異なるグリコシル化パターンを有することが好ましくあり得て、それは、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーについて異なる宿主細胞を使用することにより取得され得る。したがって、ポリクローナルタンパク質の少なくとも1個の異なるメンバーは、1個のグリコシル化パターンを含み、少なくとも1個の他の異なるメンバーは、異なるグリコシル化パターンを含み得る。
【０１０２】
他の態様において、ポリクロナリティは、ポリクローナルタンパク質の1個またはそれ以上の異なるメンバーの誘導体化を介して得られる。例えば、ポリクローナルタンパク質の少なくとも1個の異なるメンバーは、タンパク質の修飾のための化学的方法、例えば、毒素とのカップリングを用いて誘導体化され得て、少なくとも1個の他の異なるメンバーは、誘導体化されない。異なる型の化学的誘導体化は、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーについて使用され得る。
【０１０３】
ポリクローナルタンパク質は、少なくとも3個の異なるメンバー、例えば、少なくとも4個の異なるメンバー、例えば、少なくとも5個の異なるメンバー、例えば、少なくとも6個の異なるメンバー、例えば、少なくとも7個の異なるメンバー、例えば、少なくとも8個の異なるメンバー、例えば、少なくとも9個の異なるメンバー、例えば、少なくとも10個の異なるメンバー、例えば、少なくとも15個の異なるメンバー、例えば、少なくとも20個の異なるメンバー、例えば、少なくとも25個の異なるメンバーを含み得る。たいていの場合、ポリクローナルタンパク質における異なるメンバーの数は、50未満、例えば45未満、例えば40未満、例えば35未満、例えば30未満、例えば25未満、例えば20未満、例えば15未満、例えば10未満、例えば5未満である。
【０１０４】
上記した異なる製造計画において、別々の製造工程が異なるメンバーの各々について行われ得て、その結果、例えばすべての異なるメンバーは、個々に発現されることが理解されるべきである。しかしながら、また、1個、2個または3個の異なるメンバーのみが別々に製造され、他のメンバーは1つの回分培養で、もしくは少数の回分培養で製造されることが考えられる。
【０１０５】
宿主細胞
宿主細胞は、DNAをその染色体に組み込むことができるか、または染色体外要素、例えば、プラスミド、ミニ染色体、YAC (酵母人工染色体)、MAC (マウス人工染色体)もしくはHAC (ヒト人工染色体)を保持することが可能な任意の細胞から作製され得る。MACおよびHACは、WO 97/40183に詳述されている。
【０１０６】
宿主細胞は、原核生物または真核生物であり得て、いくつかの場合には、原核細胞が1個またはそれ以上の異なるメンバーの発現のために使用され、真核細胞が1個またはそれ以上の他の異なるメンバーの発現のために使用され得る。
【０１０７】
真核細胞は、植物、酵母、真菌、脊椎動物および無脊椎動物からなる群から選択される真核生物に由来するものであり得る。あるいは、真核細胞はまた、抗体の発現のためのハイブリドーマまたは不死化B細胞であり得る。
【０１０８】
好ましくは、哺乳類細胞、例えば、CHO細胞、COS細胞、BHK細胞、骨髄腫細胞(例えば、Sp2/0、YB2/0もしくはNS0細胞)、線維芽細胞、例えば、NIH 3T3、不死化ヒト細胞、例えば、HeLa細胞、HEK 293細胞もしくはPER.C6細胞が使用される。しかしながら、非哺乳類真核もしくは原核細胞、例えば、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、真菌、E. coliのような細菌などがまた使用され得る。好ましい態様において、宿主細胞は、CHO細胞のような哺乳類細胞である。
【０１０９】
本発明の1つの態様において、単一細胞レベルまで細胞株の限界希釈を行うことにより、出発材料として使用されるべき細胞株をサブクローン化し、次いで、関心のあるベクターのライブラリーを用いた導入前に、各々の単一細胞を新規の細胞集団まで増殖させる。そのようなサブクローン化はまた、所望により、適当な細胞株を選択する工程の後の方で行われ得る。単一細胞クローン化のための他の方法は、下記を含む: FACSクローニング(Brezinsky et al. J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155)、LEAP(商標)技術(Cyntellect, San Diego, California, USAから)およびClonePix (Genetix, UKから)。この方法において、特定の細胞集団は、ポリクローナルタンパク質の1個の異なるメンバーを発現する1個のクローン化細胞に由来する。
【０１１０】
単離された哺乳類細胞および細菌における伝統的な組み換え製造に加えて、他の製造系が使用され得る。
【０１１１】
例えば、真菌、酵母およびインタクト植物、トランスジェニック鳥類(卵から抗体を回収する)ならびにトランスジェニック哺乳類(母乳から抗体を回収する)において、組み換え的に抗体を発現させることができる。
【０１１２】
真菌において抗体を製造する方法は、当分野で既知であり、例えば、WO 2005/070962; Nyyssonen et al. 1993, Nat Biotech 11:591-5; およびWard et al. 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70:2567-76に記載されている。
【０１１３】
酵母においてモノクローナル抗体を製造する方法は、当分野で既知であり、例えば、Li et al., 2006, Nature Biotech. 24(2):219-215に記載されている。
【０１１４】
インタクト植物においてモノクローナル抗体を製造する方法は、当分野で既知であり、例えば、Bouquin et al., 2002, Transgenic Res. 11:115-22; Hood et al., 2002, Curr. Opin. Biotechnol. 13:630-5; およびStoger et al., 2004, Methods Mol. Biol. 248:301-318に記載されている。
【０１１５】
鳥類においてモノクローナル抗体を製造する方法(抗体産物は、卵中に見出される)は、当分野で既知であり、例えば、Zhu et al., 2005, Nature Biotech. 23:1159-69に記載されている。
【０１１６】
抗体はまた、トランスジェニック哺乳類において組み換え的に製造され得て、該組み換え抗体産物は母乳中に見出され得る。そのような方法は、例えば、下記の文献に記載されている: Behboodi et al., 2005, Cloning Stem Cells 7:107-18; Hodges et al., 2003, Reprod. Biol. Endocrinol. 1:81; Houdebine LM. 2002, Curr Opin. Biotechnol 13:625-9; Jang et al., 2006, Theriogenology 65:1800-12; Lai et al., 2003, Reprod. Biol. Endocrinol. 1:82; Lonberg N. 2005, Nature Biotech. 23:1117-25; Santora et al., 2006, Biomed. Chromatogr. 20:843-56; Tang et al., 2008, Transgenic Res; およびYoung et al., 1998, Res Immunol 149:609-10。
【０１１７】
組み換えのためのベクター
適当なベクターは、適当な選択遺伝子を含む。哺乳類細胞発現における使用のための適当な選択遺伝子は、栄養的選択を可能にする遺伝子、例えば、チミジンキナーゼ遺伝子(TK)、グルタミンシンターゼ遺伝子(GS)、トリプトファンシンターゼ遺伝子(trpB)もしくはヒスチジンデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)を含むがこれらに限定されない。使用され得る選択マーカーは、薬剤耐性を与える代謝拮抗剤耐性遺伝子、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)(ヒポキサンチンおよびチミジン欠損培地、ならびにさらにメトトレキサートで選択され得る)、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(gpt)(ミコフェノール酸で選択され得る)、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo)(真核細胞においてG418で、および原核細胞においてネオマイシンまたはカナマイシンで選択され得る)、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(hyg、hph、hpt)遺伝子(ハイグロマイシンで選択され得る)、ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子(pac)(ピューロマイシンで選択され得る)、またはブラスチサイジンSデアミナーゼ遺伝子(Bsd)(ブラスチサイジンで選択され得る)、およびゼコシン(Zeocin)耐性遺伝子(Sh ble)(ゼコシンおよびブレオマイシンに対する耐性を仲介する)を含む。最後に、例えばフローサイトメトリーによる選別を可能にするタンパク質をコードする遺伝子がまた、選択マーカーとして使用され得て、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、神経成長因子受容体(NGFR)もしくは他の膜タンパク質、またはβ-ガラクトシダーゼ(LacZ)が使用され得る。
【０１１８】
好ましくは、選択可能マーカーは、宿主細胞が欠損している遺伝子産物をコードするものであり、それは、培養培地への例えば抗生物質の添加を避ける。他の好ましい態様において、選択可能マーカーを発現する細胞の増殖に有利に働く条件下で、細胞を連続的に培養する。これは、例えば抗生物質を添加することなく、培養期間にわたる選択条件の使用を可能にするので、特に、選択可能マーカーが、宿主細胞が欠損している遺伝子産物である場合に有用である。
【０１１９】
二量体または多量体タンパク質の発現の場合には、1個の発現ベクターが異なるポリクローナルタンパク質メンバーのすべてのサブユニットをコードし得る。あるいは、発現ベクターは、発現ベクターの2個またはそれ以上のサブセットを含み得て、ここで、第1のサブセットは、タンパク質の1個のサブユニットをコードする変異型核酸配列を含み、第2のサブセットは、タンパク質の他のサブユニットをコードする変異型核酸配列を含み、その結果、各々の導入は、発現ベクターの第1のサブセットからのメンバーおよび第2のサブセットについてのメンバーで行われる。抗体の場合において、発現ベクターは、2個の発現ベクターのサブセットにより構築され得て、ここで、第1のサブセットは、抗体重鎖をコードする変異型核酸配列を含み、第2のサブセットは、抗体軽鎖をコードする変異型核酸配列を含み、その結果、各々の導入は、発現ベクターの第1のサブセットからのメンバーおよび第2のサブセットについてのメンバーで行われる。
【０１２０】
選択マーカーは、別々の発現ベクターに存在し得て、その結果、選択マーカーをコードする発現ベクターおよび関心のあるタンパク質もしくは関心のあるタンパク質のサブユニットをコードする1個またはそれ以上の発現ベクターを用いた共導入が行われる。選択マーカーはまた、関心のあるタンパク質をコードする発現ベクターに存在し得る。後者の場合において、選択マーカーは、好ましくは、関心のあるタンパクもしくはそのサブユニットのうちの1個をコードする転写産物に存在する。これは、例えば、IRES構築体を用いて行われ得る。多量体タンパク質、例えば、多量体抗体の場合において、選択マーカーは、好ましくは、最も大きなサブユニット、例えば、抗体の重鎖をコードする転写産物に存在する。
【０１２１】
関心のある遺伝子の組み換えのためのベクターはさらに、関心のある組み換えポリクローナルタンパク質の1個のメンバーをコードするDNAを含み、該タンパク質の発現に向けられたそれ自身のプロモーター、例えば哺乳類細胞における発現のための哺乳類プロモーターが先行する。関心のある組み換えポリクローナルタンパク質のメンバーが2個以上のタンパク質鎖含む場合、例えば該メンバーが抗体またはT細胞受容体である場合、各々の鎖の高レベルの発現(双方向性または単一方向性)に向けられたそれら自身のプロモーターが該タンパク質の個々の鎖をコードするDNAに先行し得る。双方向性発現において、発現ベクターにおけるhead-to-headプロモーター構造が使用され得て、単一方向性発現について、2個のプロモーターまたは例えばIRES配列と組み合わせた1個のプロモーターが発現のために使用され得る。同様に、同一の転写産物によりコードされる2個の異なるサブユニットを有し、IRES配列により分断されるバイシストロニック発現ベクターが考えられ得る。
【０１２２】
適当なhead-to-headプロモーター構造は、例えば、両方向におけるAdMLPプロモーターおよびマウスメタロチオネイン1プロモーター、両方向におけるAdMLPプロモーターおよび伸長因子1プロモーター、両方向におけるCMVプロモーターおよびMPSVプロモーター、または両方向において使用されるCMVプロモーターである。
【０１２３】
抗体の場合において、細胞で発現する重鎖の量が軽鎖の量よりも少ないことが経験的に示されている。したがって、軽鎖の発現に向けられるプロモーターは、好ましくは、重鎖の発現に向けられるプロモーターと少なくとも同じくらい強力である。
【０１２４】
機能性リーダー配列をコードする核酸配列は、遺伝子産物を小胞体または細胞内の特定の場所、例えば細胞内小器官に標的化するために、発現ベクター中に包含され得る。タンパク質をコードするDNA配列の3'に強力なポリアデニル化シグナルを置くことができる。ポリアデニル化シグナルは、新生RNA転写産物の終結およびポリアデニル化を保証し、メッセージの安定性と相関する。関心のある組み換えポリクローナルタンパク質のメンバーをコードするDNAは、例えば、抗体の重鎖および軽鎖または抗体断片をコードし得て、所望により、それ自身の哺乳類プロモーターエレメントが各々の遺伝子配列に先行し、および/または2個の鎖の各々の高レベルの発現に向けられた強力なポリAシグナルが各々の遺伝子配列に続く。
【０１２５】
組み換えのための発現ベクターは、さらなる転写制御エレメント、例えば、組み換え部位における増加した発現のためのエンハンサー、抗リプレッサーまたはUCOE (ユビキタスクロマチン開裂エレメント)を有し得る。エンハンサーは、転写に関与する核タンパク質と特異的に相互作用する核酸配列である。UCOEは、クロマチンを開裂するか、またはクロマチンを開裂した状態に維持し、操作可能に結合した遺伝子の再現可能な発現を促進する(WO 00/05393 and Benton et al., Cytotechnology 38:43-46, 2002に詳述されている)。エンハンサーはさらに、例えばGirod & Mermod 2003 (“Chapter 10: Use of scaffold/matrix-attachment regions for protein production”, pp 359-379 in Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, SC Makrides (ed.), 2003, Elsevier Science BV)に記載されたマトリックス付着領域(MAR)を含む。抗リプレッサーエレメントは、STARエレメント(Kwaks et al., Nat Biotechnol. 2003 May;21(5):553-8)を含むがこれらに限定されない。上記した1個またはそれ以上の制御エレメントが宿主細胞の染色体に組み込まれたとき、それらは、異種制御エレメントと呼ばれる。
【０１２６】
発現レベルを増加する必要がある場合に、遺伝子増幅は、DHFR遺伝子もしくはグルタミンシンターゼ(GS)遺伝子、hprt (ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ)またはトリプトファンシンターゼ遺伝子についての選択を用いて行われ得る。これは、そのような選択マーカーを含むベクターの使用を必要とする。
【０１２７】
産生細胞の培養
培養工程の間、形質転換細胞を培養して、接種材料を作製および培養し(シードトレイン)、単一のバイオリアクターまたは一連のバイオリアクターで接種材料をスケールアップし(接種トレイン)、接種材料からタンパク質を製造および蓄積する(製造段階)。
【０１２８】
シードトレイン段階において、形質転換工程からの形質転換細胞を接種材料培養培地に回収して、接種材料を作製する。当分野で既知の方法により、形質転換細胞を吸収可能な起源の炭素(炭水化物、例えば、グルコースもしくはラクトース)、窒素(アミノ酸、ペプチド、タンパク質またはそれらの分解産物、例えば、ペプトン、アンモニウム塩など)、および無機塩(硫酸塩、リン酸塩および/またはナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムの炭酸塩)を含む液体培地中で培養する。接種材料培養培地は、好ましくは、慣用的な栄養培地、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM) (Sigma)、ハムF10 (Sigma)、最小必須培地(MEM) (Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)またはNCTC-135を含む。培養培地は、好ましくは、無血清培地であり、より好ましくは、動物タンパク質が存在しない培地、例えばEX-CELL(登録商標) 302 (SAFC Biosciences)であり、さらに好ましくは、無タンパク質培地、例えばEX-CELL(登録商標) 325 (SAFC Biosciences)であり、最も好ましくは、化学的に規定された培地、例えばOptiCHO(商標) (Invitrogen)、またはProCHO4(商標)もしくはPowerCHO2-CD(商標) (Lonza BioWhittaker)である。
【０１２９】
所望により、これらの培地のすべてにアミノ酸(グルタミン)、ホルモンまたは他の成長因子(インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子)、ビタミン、塩(硫酸亜鉛、塩化ナトリウム、リン酸塩)、緩衝液、ヌクレオチド、抗生物質、イオン性界面活性剤、および/またはグルコースもしくは同等なエネルギー源を補充することができる。培地はさらに、成長促進物質、例えば、鉄キレート(例えば、ホウ素キレート、Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)、および/またはマンガンである微量元素を含み得る。シードトレインの間、迅速な細胞増殖を保証するために、温度、pHなどのような培養条件がモニターされる。
【０１３０】
接種トレインの間、連続した培養工程を介して、スケールアップ培地で接種材料をスケールアップする。そのような工程は、細胞培養フラスコ、撹拌ボトル、ローラーボトル、回転バイオリアクターおよびスピナーフラスコを含む任意の適当な容器で行われ得て、その後、細胞は、閉鎖管系を介して製造リアクターに移され得る。好ましくは、接種材料は、バイオリアクターで行われる。スケールアップ培地はまた、慣用的な栄養培地を含み、炭水化物により提供されるアミノ酸(例えば、HySoy(登録商標)、Quest International, Chicago, IL)、ホルモンもしくは他の成長因子、ビタミン、塩、緩衝液、ヌクレオチド、抗生物質、イオン性界面活性剤、鉄キレート、およびグルコースもしくは同等のエネルギー源を含み得る。バイオリアクターにおける接種トレインの間、pH、酸素飽和度および接種材料の老廃物がモニターされる。
【０１３１】
製造段階の間、撹拌タンクもしくはエアリフト型バイオリアクターまたは使い捨てもしくは一回利用型バイオリアクターに細胞を移し、糖、アミノ酸、塩、微量元素および成長因子を含む複雑な成長培地で栄養を与え、それは、一貫性のある、強力で迅速な細胞成長のために、pH、浸透圧および成長培地の他の重要なパラメーターを維持するような量で組み合わされる。そのような市販で利用可能なフィード溶液の例は、Cell Boost 1-6 (Hyclone)ならびにEfficientFeed(商標) AおよびB (Invitrogen)である。あるいは、細胞の特定の製造の必要性に一致するように調整されたフィード溶液が使用され得る。浸透圧保護剤、例えばベタインもしくはプロリンの使用は、例えば、抗体産生を促進しながら、細胞を浸透圧ストレスから保護し得る。温度、溶存酸素、pH、圧力、ガス流速および撹拌速度はまた、製造段階の間に制御される。製造段階の間、細胞は、タンパク質を内部で発現するか、または周辺の培地中に分泌する。それらの構造体内にタンパク質を発現するそれらの細胞を化学的もしくは機械的に断片化して、タンパク質を回収することができる。哺乳類細胞のようなより複雑な細胞は、グリコシル化された細胞産物を製造することができ、単離のために該タンパク質を細胞培養培地中に分泌することができる。
【０１３２】
回収および精製
回収工程の間に、当分野で既知の任意の方法により、タンパク質は細胞から分離される。例えば、タンパク質が形質転換細胞により細胞内で製造されるとき、宿主細胞または溶解細胞を除去するために、遠心分離または限外ろ過が使用され得る。タンパク質が培地中に分泌されるとき、該タンパク質は、市販で利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon(登録商標)もしくはMillipore Pellicon(登録商標)限外ろ過ユニットを用いて、細胞に与えられた化合物の混合物および細胞自身の副産物から分離され得る。
【０１３３】
精製工程の間に、さまざまなクロマトグラフィー法を含む1個またはそれ以上の精製工程にタンパク質をかける。そのような精製法は、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィー、ならびにさまざまなろ過法、例えば、Pellicon(登録商標)膜を用いたタンジェンシャルフロー濾過(Millipore, Billerica, MA)、例えば潜在的なウイルス混入を減少させるためのDVSOフィルターを用いたナノフィルトレーション(Pall Corporation, East Hills, NY)、および適当なサイズのデッドエンドフィルトレーション(例えば、0.45 μmおよび0.2 μmのフィルター)、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いた分別(例えば、フェニルセファロースで)、エタノール沈殿、等電点電気泳動、逆相HPLC、シリカ上でのクロマトグラフィー、Heparin Sepharose(商標)でのクロマトグラフィー、クロマト分画、SDS-PAGE、硫安分画、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィー(例えば、捕捉試薬としてプロテインA、プロテインG、抗体、特異的基質、リガンドもしくは抗原を用いる)を含む。
【０１３４】
本発明のタンパク質をまた修飾または誘導体化し得る。そのような修飾は、例えば、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化(O結合型およびN結合型)、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ポリマー結合などを含む。これらの修飾のいくつかは、宿主細胞機構を用いてインビボで行われ得るが、他のものは、宿主からのタンパク質の単離後にインビトロ法を用いることが必要となる。
【０１３５】
本発明のタンパク質を薬学的に許容される担体と混合するか、または担体により希釈するか、および/または担体内に封入する(例えば、カプセル、小袋、紙もしくは他の容器の形態であり得る)ことができることが理解される。担体が希釈剤として使用されるとき、それは、有効成分のためのビヒクル、賦形剤または培地として機能する固体、半固体もしくは液体材料であり得る。適当な薬学的に許容される担体は、例えば、1個またはそれ以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせを含む。薬学的に許容される担体はさらに、少量の補助物質、例えば、湿潤もしくは乳化剤、保存剤または緩衝液を含み、それは、タンパク質の貯蔵期間または有効性を促進する。当分野で既知のとおり、組成物は、即時の、持続した、または遅延した有効成分の放出を提供するために製剤化され得る。
【０１３６】
本発明のタンパク質は、さまざまな形態であり得る。これらは、例えば、固体、半固体および液体用量型を含み、例えば、錠剤、糖衣錠、粉末、液体溶液、分散もしくは懸濁、リポソーム、坐剤、注射用および不溶解性溶液を含む。したがって、組成物は、例えば活性化合物の10%重量までを含む、錠剤、トローチ剤、小袋、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、エアロゾル(固体として、または液体媒体で)または軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、坐剤、注射用液、懸濁液、滅菌封入粉末および局所パッチの形態であり得る。好ましい型は、意図される投与形態および治療適用に依存する。注射または点滴による非経口投与について、一般的な製剤は、おそらく凍結乾燥製品に基づく溶液または懸濁液の形態であり得る。
【０１３７】
精製後、一般に、ポリクローナル抗体中のすべての異なるメンバーの存在および/または量または相対的な分布が、例えばイオン交換クロマトグラフィーによるか、または質量分析に基づく方法、例えばWO 2006/007853に記載されたマーカーペプチド法を用いて評価される。ポリクローナル抗体組成物の特徴づけのための方法は、WO 2006/007853に詳述されている。ポリクローナルタンパク質の各々のメンバーの存在および/または量の決定はまた、所望により上流もしくは下流の製造工程の間に他のタンパク質で実施され得る。したがって、1つの態様において、本発明の方法は、製造および/または下記の精製工程の間に、ポリクローナルタンパク質の各々のメンバーの存在および/または量を確認するための少なくとも1個の工程を含む。
【０１３８】
ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーのさらに好ましい特徴は、タンパク質均一性であり、その結果、該タンパク質は容易に精製され得る。1個の明確なピークを有するイオン交換クロマトグラフィープロファイルは、特徴づけの容易さのために好ましい。これを、ポリクローナルタンパク質の異なるメンバーならびに最終医薬および薬剤組成物に適用する。それはまた、イオン交換クロマトグラフィーまたは他のタンパク質特徴づけ法を用いて区別され得る異なるメンバーを組み合わせるときに好ましく、その結果、すべての異なるメンバーを含む該組成物を1回のランで特徴づけることができる。したがって、異なるタンパク質メンバーは、好ましくは、精製後の特徴づけ工程において異なるタンパク質メンバーの同定を可能にするように選択される。
【０１３９】
最終医薬製品は、投与のために製剤化されたポリクローナルタンパク質(すなわち、おそらく、例えば投与前の滅菌水で再構築するのに適当な凍結乾燥形態で)、適当な包装、ならびに処方情報および製造承認についての参照を含むパッケージ挿入物を含む。
【０１４０】
個々の生物における関心のあるタンパク質の発現
この計画を用いることにより、インタクト生物中でのインビボ発現に依存する低コスト上流工程法を使用する利点は、ポリクローナルタンパク質産物の製造に適用可能であることである。植物および動物におけるタンパク質産物の組み換え発現は、今のところ初期段階にある。1個の生物中でポリクローナルタンパク質産物の異なるメンバーを発現させる方法は、いくつかの遺伝子が細胞中に互いに独立して挿入される必要があり、次いで、当該細胞がインタクト生物に分裂および分化する必要があるので、困難であることが理解され得る。したがって、1個の生物中でポリクローナルタンパク質の1個の異なるメンバーのみを発現させることが有利であり得る。
【０１４１】
動物について、幹細胞または卵細胞に異種発現構築体を挿入し、次いで、コードされた産物を発現させ、母乳(哺乳類の場合)または卵(鳥類の場合)中に分泌することを保証する方法が開発されている。本発明の方法を動物にまで拡張することができ、その結果、1個の動物がポリクローナルタンパク質の1個のメンバーを発現し、その後、タンパク質産物を含む母乳または卵を組み合わせて、単一の下流工程手順にかけ得る。あるいは、1個またはそれ以上の下流処理工程は、1個またはそれ以上の異なるタンパク質メンバーについて別々に行われ得る。ポリクローナルタンパク質のすべてのメンバーを発現させるために、動物の同一種が通常使用され得て、その結果、下流の処理および次の特徴づけを容易にし得る。
【０１４２】
植物について、同様に、異種タンパク質を発現させるための方法が開発されている。いくつかの方法は、植物の特定の器官、例えば、ジャガイモ塊茎、葉、種子または花における産物の発現に依存する。そのような器官特異的発現は、特に植物の繊維が豊富な部分を避け得る場合に、下流の処理を容易にし得る。そのような方法を用いて、増殖植物について低コスト法を用いることにより、組み換えタンパク質産物を高収量で発現させることができる。したがって、単一植物は、ポリクローナルタンパク質の1個のメンバーを発現させることができ、異なるメンバーは、下流処理の前に、その間に、またはその後に組み合わせ得る。ポリクローナルタンパク質のすべてのメンバーを発現させるために、植物の同一種および品種が通常使用され得る。
【０１４３】
本発明により製造された組成物の治療的使用
本発明により製造された医薬組成物は、哺乳類における疾患の処置、改善または予防のために使用され得る。本発明の医薬組成物で処置され得る疾患は、癌、感染症、炎症性疾患、アレルギー、喘息および他の呼吸器疾患、自己免疫性疾患、心血管疾患、中枢神経系の疾患、代謝および内分泌疾患、ならびに移植拒絶反応を含む。
【０１４４】
さらに、本発明により製造されるポリクローナル抗体は、診断目的のために、例えば、キットで、および環境的使用のためのキットで、例えば、混入物質の検出のために使用され得る。
【実施例】
【０１４５】
実施例
実施例1: シェーカーフラスコでの別々の細胞増殖、混合した製造
概略
異なる抗体を産生する6個の異なる細胞集団を計測し、等しい細胞比率(1:1:1:1:1:1)で混合して、それをバイオリアクターへの接種のために使用した。7日間細胞を培養し、その後、イオン交換クロマトグラフィー(IEX)を用いて6個の抗体の各々の量を定量化した。実験を2回繰り返し、得られたポリクローナル組成物のバッチごとの再現性を調べた。
【０１４６】
材料および方法
細胞株
使用される親の産生細胞株は、Lawrence Chasin, Columbia Universityから得られたDHFR欠損CHO細胞株の誘導体であるDG44である。DG44細胞にpcDNA3.1+ ベクター(Invitrogen)中のアデノウイルス5型E1AについてのcDNAを導入した。500 μg/mlの濃度のGeneticin (Invitrogen)で形質転換体を選択した。選択後、限界希釈により細胞を単一細胞にクローン化した。抗体プラスミドを用いた一過的導入による抗体発現について、クローンを試験した。単一クローンは、非導入DG44細胞株と比較して、3個の因子により改良された一過的アッセイにおける発現レベルを示した。安定的導入で行われた場合と比較すると、選択されたプールは、野生型DG44細胞株と比較して、4-5倍増加した発現レベルを示した。このクローン(ECHOと呼ばれる)を2回サブクローン化し、抗体発現に関して安定的であるように見えた。
【０１４７】
抗体発現プラスミド
使用するIgG1抗体発現プラスミドを構築し、それは、両者間にスペーサーエレメントを有する2個の同一のhead-to-headヒトCMVプロモーターを用いて、重鎖(VH + γ1定常領域)および軽鎖(κ 02-286)についてのコード領域を発現した。重鎖コード配列の下流に位置する内部リボソーム侵入部位(IRES)により駆動されるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼcDNA (DHFR)カセットを用いて、形質転換体の選択を行った。異なるワクシニアウイルス表面タンパク質を標的とする6個の異なる抗体を選択した。表2は、抗体およびそれらを発現するECHOクローンを示す。
【０１４８】
表2. 抗体およびECHOクローン
【表２】
2011518790.tif 000003
【０１４９】
ECHO細胞の導入
10% ウシ胎児血清(FCS) (Invitrogen)を含むMEMα培地(ヌクレオシドを含む) (Invitrogen)中、0.3 x 106 細胞/フラスコの濃度でT80フラスコにECHO細胞を接種した。接種の1時間以内に、Fugene(登録商標)6 (Roche)で細胞に導入した:
10 μlのFugene(登録商標)6を490 μlのダルベッコ改変イーグル培地と混合し、室温で5分間インキュベートした
5 μgの発現プラスミドを加えて、混合物を室温でさらに15分間インキュベートした
混合物を細胞培養フラスコに加えた。
【０１５０】
翌日、導入試薬を含む培地を吸引し、各々のフラスコを10% 透析FCS (Invitrogen)を含む5 mlのMEMα培地(ヌクレオシドを含まない) (MEMα-)で1回洗浄し、2 nMの濃度のメトトレキサートと共に10 mlの同じ培地を加えた。週に2回、培地を交換した。15日後に細胞をトリプシン処理し、すべての細胞を新しいフラスコに移した。
【０１５１】
単一細胞クローンの製造のために、プール中の細胞を表面結合抗体について染色し、FACS-Aria (Becton-Dickinson)を用いてFACS単一細胞選別を行った。約1週間後、単一クローンの存在について、顕微鏡でウェルを調べた。約2週間後、IgG ELISAで、およびELISA値に基づいて、およびウェルの視覚的検査で、単一希釈での単一クローンを含むウェルからの上清を各々アッセイし、無血清懸濁培養への適合のために、各々の抗体を提示する24個のクローンを選択した。
【０１５２】
無血清懸濁培養への適合
細胞をトリプシン処理し、計測した。5.0 x 106細胞を遠心分離し、10 ml ProCHO4(商標)無血清培地(Lonza) + 4 mM L-グルタミン(Invitrogen) + 1/100 MEM NEAA (Invitrogen)に再懸濁した。細胞を50 ml 細胞培養管(TRP, Switzerland)に移し、37℃でシェーカー上でインキュベートした。週に2回、細胞密度を計測し、各回に、培養物を0.5 x 106細胞/ml (最初の2週間のために)または0.3 x 106細胞/ml (残り期間のために)まで希釈した。4-5週間後、多くのクローンの倍化時間は30時間に迫り、その時間点で、クローンは無血清培地に適合したと考えられた。適合期間の最後に、ELISAにより細胞をアッセイし、凍結し、発現実験のために使用した。
【０１５３】
融解および増殖
37℃まで熱したProCHO4(商標)培地に6個の異なる細胞株の各々を融解した。800 rpm (160 G)で4分間、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、12 ml ProCHO4(商標)培地に37℃で細胞沈殿物を再懸濁した。次いで、T75フラスコに細胞懸濁液を移し、37℃、5% CO2でインキュベーターに入れた。2日後、シェーカーでのProCHO4(商標)培地中、5.0 x 105 細胞/mlまたは50 ml バイアル/バイオリアクターに細胞を調整した。細胞増殖の間、週に2もしくは3回、0.5 x 106 細胞/mlに細胞濃度を調整した。増殖の1週間後、6個の細胞株の各々を、500 mlシェーカーでの60-80 ml培地中、0.5 x 106 細胞/mlに設定した。
【０１５４】
培養
シェーカーに接種するとき、6個の細胞株を混合し、接種材料を2個の250 mlシェーカーに分割した。要約すると、混合前に各々の細胞株からのサンプルを3回計測し、平均生存細胞数を使用した。15.0 x 106細胞に相当する各々のクローンの量を取り出し、6個の量を完全に混合し、新規細胞数を作成した。この細胞数に基づいて、0.5 x 106/mlの(混合した)細胞濃度を含む2個の250 mlシェーカーを設定した。各々のシェーカーについて計算した量を50 ml 試験管に移し、800 rpm (160 G)で4分間、遠心分離した。上清を捨て、細胞を50 ml ProCHO4(商標)培地に再懸濁し、250 ml シェーカーに移した。次いで、100 rpm、2.6 cmの振幅での振とうテーブル上で、37℃、5% CO2でのインキュベーターにシェーカーを入れた。
【０１５５】
別々の日に2回の実験を行い; 1日目は、番号1Aおよび1Bで行い、2日目は、番号2Aおよび2Bで行った。7日間培養し、その後、IEXプロファイリングのために上清を保存した。
【０１５６】
IgG組成物の解析
5-10 mlの0.22 μmろ過培地上清を1 ml MabSelect SuRe(商標)カラム(GE Healthcare)に載せた。製造者の指示にしたがい、10 ml PBS pH 7.4でカラムを洗浄し、0.1 M グリシン pH 2.7で溶出した。40 mM NaCl、50 mM Na-Acetate pH 5.0に対して、プールしたタンパク質材料を2回透析し、280 nmでの吸光度を測定することにより全IgG濃度を決定した。
【０１５７】
60 μgのIgG混合物をPolyLCから弱陽イオン交換カラムPolyCat A (100x4, 6 mm, 3 μm, 1500 Å)に載せた。1 ml/分の流速で72分間、Na-Acetate pH 5.0緩衝液中、150 mMから500 mMのNaClの勾配に適用することにより、タンパク質を溶出した。溶出物の215 nmでの吸光度をモニターし、シグナルを統合することにより、個々のIgGの相対量を決定した。異なるサンプルを比較するために、全抗体量を100%に設定し、6個の抗体の各々の比率を計算した。
【０１５８】
結果
7日後に、混合した集団を含むシェーカーフラスコからの上清を回収し、IEXプロファイルを解析した。各々の抗体の相対面積を表3および図3で提供する。
【０１５９】
表3. 混合した集団における培養7日後の各々の抗体の相対面積
【表３】
2011518790.tif 000004
【０１６０】
表は下記のことを示す:
同時に混合された2個の異なるシェーカーフラスコ間の6個の抗体の各々の量における変動は、極めて小さい。おそらく、当該方法の標準偏差限界の範囲内である。
異なる日において混合された細胞はまた、極めて小さい変動を有し、これは、等しい細胞比率で6種の異なる細胞集団を混合し、それらを共培養して、培養後に6個の抗体の各々の同じ相対量を生じることが可能であることを示す。
【０１６１】
実施例2: 流加培養バイオリアクターでの別々の上流培養、精製前の混合
概略
13-14日間、バイオリアクターで、5個の異なるIgG抗体を発現する5個の異なるECHO細胞株を個々に培養した。培養後、抗体含有フラクションを精製の間に混合し(2:1:1:1:1)、バルク薬剤物質(BDS)中に抗体の組成物を得た。
【０１６２】
5個の抗体のみを発現したことを除いては、発現プラスミド、細胞などは、実施例1に記載されたとおりであった(表4を参照のこと)。
【０１６３】
表4. 抗体およびECHOクローン
【表４】
2011518790.tif 000005
【０１６４】
融解および増殖
37℃まで熱したProCHO4(商標)培地に5個の異なる細胞株の各々を融解した。800 rpm (160 G)で4分間、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、12 ml ProCHO4(商標)培地に37℃で細胞沈殿物を再懸濁した。次いで、T75フラスコに細胞懸濁液を移し、37℃、5% CO2でインキュベーターに入れた。2日後、シェーカーでのProCHO4(商標)培地中、5.0 x 105 細胞/mlまたは50 ml 試験管「バイオリアクター」に細胞を調整した。細胞増殖の間、週に2もしくは3回、0.5 x 106 細胞/mlに細胞濃度を調整した。増殖の1週間後、5個の細胞株の各々を無血清製造培地EX-CELL(登録商標)302 (SAFC) + 4 mM L-グルタミンに移した。500 mlシェーカーでの60-80 ml培地中、0.5 x 106 細胞/mlに細胞株を設定し、バイオリアクターへの接種まで2週間培養した。
【０１６５】
精製の間の培養および混合
pH、溶存酸素、温度、供給プロファイルおよびガス混合の自動制御を備える500 ml 可動範囲バイオリアクター(DASGIP AG)で、培養を行った。EX-CELL(登録商標) 302 + 4 mM L-グルタミン中、5.0 x 105/ml 生存細胞を6個のバイオリアクターの各々に接種した。バイオリアクターランの間、細胞に濃縮フィード溶液、グルタミンおよびグルコースを補充したEX-CELL(登録商標)302培地を500 mlの最終量で毎日与えた。13-14日後に培養物を回収し、清澄化工程(1942 Gで15分間の遠心分離)後、0.22 μm GP Express Plus Membrane Filter (Millipore)を介して、6個の上清の各々をろ過滅菌した。
【０１６６】
ろ過した上清の各々の同量を混合し、抗体の組成物を得た。抗体組成物をプロテインA捕捉で精製し、イオン交換クロマトグラフィー(IEX)で解析した。
【０１６７】
イオン交換クロマトグラフィーによるIgG組成物の解析
5-10 mlの0.22 μm ろ過抗体組成物を1 ml MabSelect SuRe(商標)カラム(GE Healthcare)に載せて、親和性精製を行った。製造者の指示にしたがい、10 ml PBS pH 7.4でカラムを洗浄し、0.1 M グリシン pH 2.7で溶出した。Aekta Express系(GE Healthcare)で精製を行った。40 mM NaCl、50 mM Na-Acetate pH 5.0に対して、プールしたタンパク質材料を2回透析し、280 nmでの吸光度を測定することにより全IgG濃度を決定した。
【０１６８】
80 μgのIgG混合物をPolyLCから弱陽イオン交換カラム(PolyCat A, 100x4, 6 mm, 3 μm, 1500 Å)に載せた。1 ml/分の流速で72分間、Na-Acetate pH 5.0緩衝液中、150 mMから500 mMのNaClの勾配に適用することにより、タンパク質を溶出した。溶出物の215 nmでの吸光度をモニターし、シグナルを積分することにより、個々のIgGの相対量を決定した。全抗体量を100%に設定し、5個の抗体の各々の比率を計算した。
【０１６９】
HPLCによるIgG組成物の解析
RX Daytonaアナライザー(Randox)および免疫比濁法を用いて、製造者の指示にしたがい、バイオリアクターからの上清サンプル中のIgG量を解析した。
【０１７０】
結果
6個の有効体積(working volume)500 mlのバイオリアクターで培養を行った。6個のバイオリアクターの各々を5.0 x 105/ml 生存細胞で接種し、培養の13-14後に回収した。バイオリアクター培養条件、回収時における抗体濃度および混合物における体積率を表5に示す。回収時における抗体濃度は、クローンの異なる特性のために異なっている。同じクローンを用いた2個の培養物(CHM020-3およびCHM020-4)は、極めて類似した回収時における抗体濃度を含んでおり、プロセスの確実性(process robustness)を示す。
【０１７１】
表5. 培養設定、回収時における抗体量および混合工程における体積率
【表５】
2011518790.tif 000006
【０１７２】
浄化および滅菌ろ過後に、6個すべての培養物の同量を混合することにより、抗体を混合した。次いで、親和性クロマトグラフィーにより抗体組成物をさらに精製し、陽イオン交換クロマトグラフィー(CIEX)を用いて解析した。CIEXクロマトグラフィーにより概算されたとおり、5個の抗体の各々の相対量を表6に示す。
【０１７３】
表6. CIEXにより定量化された混合後の各々の抗体の相対量
【表６】
2011518790.tif 000007
【０１７４】
表は下記のことを示す:
いくつかの抗体をポリクローナル抗体組成物に混合し、記載された手順を用いて精製することができる。
各々の抗体を含有するフラクションの量を調整することにより、この手順を用いて製造されたポリクローナルタンパク質を所定の組成物に調整することができる。
【０１７５】
実施例3: 別々のシードトレイン、その後のバイオリアクターにおける1回バッチの流加培養製造
概略
異なる抗体を産生する6種の異なる細胞集団を計測し、等しい細胞比率(1:1:1:1:1:1)で混合して、それをバイオリアクターへの接種のために使用した。12日間細胞を培養し、その後、イオン交換クロマトグラフィー(IEX)を用いてバイオリアクター中の6個の抗体の各々の量を定量化した。実験を8回繰り返し、混合した細胞培養物間の変動を調べた。
【０１７６】
材料および方法
細胞株
実施例1に記載されたECHO細胞株を使用した。
【０１７７】
抗体発現プラスミド
使用するIgG1抗体発現プラスミドを構築し、それは、両者間にスペーサーエレメントを有する2個の同一のhead-to-headヒトCMVプロモーターを用いて、重鎖(VH + γ1定常領域)および軽鎖についてのコード領域を発現した。重鎖コード配列の下流に位置する内部リボソーム侵入部位(IRES)により駆動されるマウスジヒドロ葉酸レダクターゼcDNA (DHFR)カセットを用いて、形質転換体の選択を行った。実験のために、呼吸器合胞体(RS)ウイルス抗原FおよびGを標的とする6個の異なる抗体(番号810、816、824、853、856および894)を選択した。
【０１７８】
ECHO細胞の導入
導入法は、実施例1に記載された導入法に基づき行う。
【０１７９】
無血清懸濁培養への適合
細胞をトリプシン処理し、計測した。5.0 x 106細胞を遠心分離し、10 ml ProCHO4(商標)無血清培地(Lonza) + 4 mM L-グルタミン(Invitrogen) + 1/100 MEM NEAA (Invitrogen)に再懸濁した。細胞を50 ml 細胞培養管(TRP, Switzerland)に移し、37℃でシェーカー上でインキュベートした。週に2回、細胞密度を計測し、各回に、培養物を0.5 x 106細胞/ml (最初の2週間のために)または0.3 x 106細胞/ml (残り期間のために)まで希釈した。4-5週間後、多くのクローンの倍化時間は30時間に迫り、その時間点で、クローンは無血清培地に適合したと考えられた。次いで、細胞をPowerCHO2(商標)無血清培地(Lonza) + 4 mM L-グルタミン(Invitrogen) + 1/100 MEM NEAA (Invitrogen)に移した。2-3週間後、倍化時間は35時間未満であり、その時間点で細胞は適合したと考えられ、その後、ELISAによりそれらを抗体産生についてアッセイし、凍結し、発現実験のために使用した。
【０１８０】
融解および増殖
37℃まで熱したPowerCHO2 (商標)培地に6個の異なる細胞株の各々を融解した。800 rpm (160 G)で4分間、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去し、12 ml PowerCHO2 (商標)培地に37℃で細胞沈殿物を再懸濁した。次いで、T75フラスコに細胞懸濁液を移し、37℃、5% CO2でインキュベーターに入れた。2日後、シェーカーでのPowerCHO2 (商標)培地中、5.0 x 105 細胞/mlまたは50 ml 細胞培養管に培養物を調整した。細胞増殖の間、週に2もしくは3回、0.5 x 106 細胞/mlに細胞濃度を調整した。増殖の31日後、6個のクローンの各々を2個の異なるシェーカーフラスコ(シリーズAおよびB)に設定し、500 mlシェーカーでの60-80 ml培地中、0.5 x 106 細胞/mlを含む全12個のシェーカーフラスコを得た。
【０１８１】
培養
個々の抗体産生細胞株のシードトレイン増殖の全35日後、4個のバイオリアクターの各々に6個のクローンの混合物を接種した。この実験を2回繰り返して行い、下記の全8個のバイオリアクターを提供した。要約すると、混合前に各々のクローンを3回計測し、平均生存細胞数を使用した。25.0 x 106細胞に相当する各々のクローンの量を取り出し、「6個のクローン混合物」を完全に混合し、新規細胞数を作成した。この細胞数に基づいて、PowerCHO2(商標)培地 + 20% (w/w)のフィード培地を加えることにより、0.3 x 106/mlの(混合した)細胞濃度を含む500 mlバイオリアクターをセットアップした。IEXプロファイル解析のために、「6個のクローン混合物」の残りをサンプル化した。次いで、30%、pH 7.0 ± 0.1、80 rpmでの制御されたDOで、バイオリアクターをインキュベートした。IEXプロファイリングのために、4日、8日および12日後にサンプルを取り出した。
【０１８２】
8個のバイオリアクター
工程のロバスト性およびバッチごとの一貫性を調べるために、12個のシェーカーフラスコからのクローンを使用し、下記のとおり8個のバイオリアクターに接種した:
【０１８３】
バイオリアクター1について、シェーカーフラスコシードトレインシリーズAの6個のクローンの各々から細胞を取り出した。
【０１８４】
バイオリアクター2について、バイオリアクター1と同様の方法で、シェーカーフラスコシードトレインシリーズAから細胞を独立して取り出した。
【０１８５】
バイオリアクター3について、シェーカーフラスコシードトレインシリーズBの6個のクローンの各々から細胞を取り出した。
【０１８６】
バイオリアクター4について、バイオリアクター1と同様の方法で、シェーカーフラスコシードトレインシリーズBから細胞を独立して取り出した。
【０１８７】
バイオリアクター5〜8について、バイオリアクター1〜4について記載されたのと同様の方法で、細胞を独立して取り出した。バイオリアクター1〜4の2日後に、バイオリアクター5〜8に接種した。
【０１８８】
抗体精製およびIgG組成物中のCIEX解析
5-10 mlの0.22 μm ろ過培地上清を1 ml MabSelect SuRe(商標)カラム(GE Healthcare)に載せた。製造者の指示にしたがい、10 ml PBS pH 7.4でカラムを洗浄し、0.1 M グリシン pH 2.7で溶出した。40 mM NaCl、50 mM Na-Acetate pH 5.0に対して、プールしたタンパク質材料を2回透析し、280 nmでの吸光度を測定することにより全IgG濃度を決定した。
【０１８９】
60 μgのIgG混合物をPolyLCから弱陽イオン交換カラムPolyCat A (100x4, 6 mm, 3 μm, 1500 Å)に載せた。1 ml/分の流速で72分間、Na-Acetate pH 5.0緩衝液中、150 mMから500 mMのNaClの勾配に適用することにより、タンパク質を溶出した。溶出物の215 nmでの吸光度をモニターし、シグナルを統合することにより、個々のIgGの相対量を決定した。異なるサンプルを比較するために、全抗体量を100%に設定し、6個の抗体の各々の比率を計算した。
【０１９０】
結果
12日後に、混合した集団を含む8個のバイオリアクターからの上清を回収し、ろ過およびプロテインA捕捉精製後にIEXプロファイルを解析した。各々の抗体の相対面積を表7および図4で提供する。
【０１９１】
表7. 混合物集団における培養12日後の各々の抗体の相対面積
【表７】
2011518790.tif 000008
【０１９２】
表7は、異なる日に、混合した培養物が異なるシェーカーフラスコからのクローンで接種され、細胞が互いに独立して取り出されるという事実にも関わらず、混合した培養物中に産生される6個の抗体の各々の量の変動が極めて小さい(おそらく、当該方法の検出限界範囲内で)ことを示す。
【０１９３】
図4のIEXクロマトグラムは、培養の12日後における各々の抗体の相対量を示す。バイオリアクターの設定における入念な変動に関わらず、8個のバイオリアクターにおける6個の抗体の各々についての生じた分布は、極めて類似しており、これは、当該工程が確実であり、極めて再現性が良いことを示す。この例はさらに、いかなる技術的な問題を生じることなく、8個の別々の培養を行うことができることを証明し、それは、当該工程がポリクローナル抗体もしくは他のポリクローナルタンパク質の大規模製造のために適当であることを示す。
【０１９４】
実施例4: 動物における別々の製造、DSP前の混合
IgG重鎖および軽鎖を最適な動物に依存する適当な発現ベクターにクローン化し、当該ベクターにおいて2個の遺伝子の発現は、遺伝子発現を乳腺に標的化するβカゼインプロモーターの制御下にあり、選択可能マーカー遺伝子を用いる。適当な供与細胞株(例えば、胎児線維芽細胞)に発現構築体を導入する(例えば、LipofectAMINE(商標)または同様のものを用いて)。適当な培地での次の培養により、選択マーカー耐性細胞を選択する。両トランスジーンの存在を検出するために、個々の細胞株をPCRおよびサザンブロッティングによりアッセイする。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)による候補細胞株のさらなる特徴づけは、単一染色体上における重鎖および軽鎖の共局在を確認し得る。除核卵母細胞(細胞質体)への電気融合を用いた体細胞核移植(SCNT)において、正確に導入された細胞株を使用する。次いで、SCNT胚盤胞を受容動物由来の黄体を有する子宮に移す。受容動物を群れに戻し、妊娠決定のための次の評価を待つ。皮膚生検のPCR解析により、IgG HおよびL遺伝子について子孫を解析する。
【０１９５】
陽性クローン化子孫をホルモン授乳にかけ、乳を搾り、IgG発現についてアッセイするためのサンプルを集める。製造群についての創始動物として、満足のいくIgGレベルを母乳中に含むクローン化動物を使用する。この方法を用いて、各々の抗体についての集団を作製する。この群集団からの母乳を、ELISA (または同様の方法)によりIgGレベルについて解析し、貯蔵タンク中に約4℃で貯蔵する。精製前の母乳の混合は、IgGレベルに基づいて行われるか、または母乳バッチは、別々に精製され得る。
【０１９６】
インタクト植物での製造に同様の方法を適用することができる。
【図１】
2011518790.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2011518790.tif 000014
2011518790.tif 000015
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