(57)【要約】  本発明は、結腸直腸疾病、例えばポリープ、前癌段階の治療及び結腸直腸癌の予防及びアジュバント治療に関し、これはイミダゾリキノリンファミリー、例えばイミキモド（１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）、レシキモド（４−アミノ−α，α−ジメチル−２−エトキシメチル−１−Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール）、ソチリモド（２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］［１，５］ナフチリジン−４−アミン）の免疫調節薬物の局所投与による。
2011509956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イミダゾリキノリン誘導体の適用による結腸直腸のポリープ／ポリポーシスの治療方法。
【請求項２】
イミダゾリキノリン誘導体の適用による、有利には粘膜中の、結腸直腸の前癌病変の治療方法。
【請求項３】
イミダゾリキノリン誘導体の適用による、有利には粘膜中の、初期の結腸直腸の癌病変の治療方法。
【請求項４】
イミダゾリキノリン誘導体の適用による大腸癌腫の予防方法。
【請求項５】
イミダゾリキノリン誘導体の適用による結腸直腸ポリープ／ポリポーシスの結腸直腸癌腫へのトランスフォーメーションの予防方法。
【請求項６】
イミダゾリキノリン誘導体の適用による結腸直腸のポリープ／ポリポーシスのアジュバント治療方法。
【請求項７】
イミダゾリキノリン誘導体の適用による結腸直腸癌腫のアジュバント治療方法。
【請求項８】
患者がＨＩＶ又は免疫無防備状態の患者である請求項１から７までのいずれか１項記載の治療方法。
【請求項９】
イミダゾリキノリン誘導体が、イミキモド、レシキモド、ソチリモドを含む群から選択される請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
イミダゾリキノリン誘導体が、溶液、クリーム又はフォームの形で局所的に投与される請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
イミダゾリキノリン誘導体が、数週間にわたり１週間に１〜７回、有利には１〜５回投与される請求項１から９までのいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結腸直腸疾病、例えばポリープ、前癌段階の治療及び結腸直腸癌の予防及びアジュバント治療に関し、これはイミダゾリキノリンファミリー、例えばイミキモド（１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）、レシキモド（４−アミノ−α，α−ジメチル−２−エトキシメチル−１−Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール）、ソチリモド（２−メチル−１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］［１，５］ナフチリジン−４−アミン）の免疫調節薬物の局所投与による。意外なことに、これら免疫調節性イミダゾキノリン誘導体は、前癌性消化管細胞の悪性結腸直腸腫瘍細胞へのトランスフォーメーションを阻害する。
【０００２】
様々なイミダゾリキノリン誘導体の使用は、上述の結腸直腸疾病のより効率的かつより安全な治療を生じてよい。
【０００３】
結腸直腸ポリープは、中年及び老年の成人において極めて一般的であり、しばしば目立つ症状を有しない。６０歳を超える人の約５０％が、大腸中にポリープを有する。これらは癌性になる可能性を有するため、深刻にとらえることが重要である。ポリープの大多数は良性（非癌性）であり、ほぼ全ての大腸癌は良性ポリープから発達する。癌腫はヒトの癌の８０％より多くを占め、皮膚、肺、大腸、胸、前立腺及び子宮が最も頻繁な部位である。
【０００４】
大腸ポリープは、大きさ、形及び数が大きく変動する。この２つの主たる種類は、増殖性及び腺腫様である。増殖性ポリープは最も一般的であり、典型的には癌性とはならない。腺腫様ポリープはより癌性となり易いようである。
【０００５】
一般的に、腫瘍発達は３つの別個の相を経る：イニシエーション、プロモーション及びプログレッションである。癌の予防アプローチは特に、癌に対する宿主防御機構の促進、化学的予防及びその他を含む。初期検出及び癌の治療における改善にもかかわらず、全体としての致死率は過去３０年間減少していない。
【０００６】
ポリープの癌性発達の危険性を低下させるためにいくつかの可能性が存在する。大腸ポリープが癌へと発達することを妨げるための１つの可能性とは、脂肪が少なく繊維が多い食餌療法にある。特定のビタミン、すなわちビタミンＣ及びＥも大腸癌に対して保護する。非ステロイド性抗炎症性薬物、例えばアスピリンは、非ステロイド性抗炎症性薬物は大腸ポリープを予防するための手段としては大腸ポリープを妨げるための手段として候補にはあがっていないものの、ポリープの形成を減少させる。
【０００７】
腫瘍発達のこの３相のうちプロモーション相は、活動的に増殖する、多細胞性の前悪性病巣を形成することとなる突然変異した細胞の拡大からなる。発癌のプロモーション相は、癌予防のための最良のターゲットを提供してよい。癌予防の新規かつ特殊な形態は、いわゆる化学的予防である。化学的予防は、定義によれば、発癌のプログレッションを、減速、逆転又は阻害するための剤の使用であり、これにより侵襲性の又は臨床的に重大な疾病の発達の危険性を低下させる。
【０００８】
腫瘍が確立すると、幾つかの種類の標準的な治療が使用できる。これは、外科手術、化学療法、放射線療法及び生物学的療法を含む。生物学的療法は、癌と闘うために患者の免疫系を使用する治療である。身体固有の物質又は薬物を使用して、癌に対する身体の天然防御を高めるか又は回復させる。この種の癌治療は、バイオセラピー又は免疫療法とも呼ばれる。
【０００９】
イミダゾリキノリン類：イミキモドは、抗ウィルス性及び抗腫瘍性の作用を両方示す、イミダゾリキノリンファミリーにおける免疫調節性化合物である（Diebold SSet al. Innate antiviral responses by means of toll-like receptor (TLR)-7-mediated recognition of single-stranded RNA. Science 204;303: 1529-1531 ; Bametson RSet al . Imiquimod induced regression of clinically diagnosed superficial basal cell carcinoma is associated with early infiltration by CD4 T cells and dendritic cells Clin. Exp. Dermatol 2004;29: 639-643）。イミキモドは、主としてＴＬＲ−７を介してその作用を発揮することが示された（Hemmi H et al. Small anti-viral compounds activate immune cells via the TLR 7 MyD88-dependent signaling pathway. Nat. Immunol 2002; 3:196-200）。イミキモドは、光線性角化症（ＡＫ）の、浸潤性皮膚癌、通常は扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）へのプログレッションを有効に阻害する。イミキモドは、いかなる直接的な抗腫瘍活性をも発揮しない（Schoen M et al. Tumor-selective induction of apoptosis and the small-molecule immune response modifier imiquimod. J Natl. Cancer lnst.2003, 95:1138-49）が、種々の皮膚腫瘍及び他の起源のものに対して良好な効能を示している。マウスでは、イミキモドを用いた経口治療は、ＭＣ−２６大腸癌腫の発達を著しく阻害した。イミキモドの抗腫瘍作用は、マウスのインターフェロン（ＩＦＮ）−αに対する抗血清により著しく抑止され、このことはこの抗腫瘍作用がＩＦＮ誘導によりかなりの程度媒介されたことを示唆する（Sidky YA et al. Inhibition of murine tumor growth by an interferon-inducing imidazoquinolinamine. Cancer Res 1992;52:3528-33）。
【００１０】
癌細胞に対するイミキモド及び関連する化合物の正確な作用機序は、複雑であり、未知である。
【００１１】
イミキモドが様々な悪性皮膚細胞のアポトーシスを促進できるとの証拠が存在する（Inglefield JR, et al. Apoptotic responses in squamous carcinoma and epithelial cells to small-molecule toll-like receptor agonists evaluated with automated cytometry. J Biomol Screen 2006; 11 :575-85）。
【００１２】
免疫療法：細胞媒介した免疫応答は、結腸直腸癌において腫瘍−宿主相互作用の本質的な観点である。前癌性（腺腫様）大腸ポリープの悪性結腸直腸癌へのプログレッションは、活性化したＴリンパ球の活性を伴う複雑な経路に依存する。免疫応答は、細胞毒性Ｔリンパ球ＣＤ８＋細胞又はＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞のいずれかがヒトの癌細胞からの抗原を認識する場合に開始される。この細胞媒介した応答は、Ｔ細胞増殖、細胞−細胞付着、アポトーシスに重大な作用を発揮する様々なサイトカインの作用及び宿主免疫により大概開始し、かつ制御される。大腸癌への免疫応答の存在は、ヒト及び移植可能なマウス癌モデル中で動物における免疫学的治療の研究により支持されている。ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、大腸アデノーマに対する応答において細胞毒性及びアポトーシス性の作用を促進することが示唆されている。さらに、成長因子、サイトカイン及び免疫抑制因子は、前悪性結腸直腸組織の成長及び生存に決定的な役割を果たして良い。
【００１３】
イミキモドは、光線性角化症（ＡＫ）及びまた同様に前癌性相の治療において有効であることが実証された。イミキモドは、ＡＫ病巣を有効になくし、ＳＣＣ及び他の悪性皮膚腫瘍へのプロモーションを妨げる。
【００１４】
イミダゾリキノリンの他の細胞種類、特に消化管上皮細胞への局所適用は新規アプローチである。意外なことに、イミキモド、レシキモド及びソチリモドといった免疫調節薬物は、表皮細胞（例えば、ケラチノサイト）だけでなく消化管上皮細胞のアポトーシスも阻害し、このことはこの免疫調節薬物が、大腸ポリープの癌性発達を阻害できることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、Ｃａｃｏ−２細胞中のｐ５３の発現に対するイミキモドの用量依存作用を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより評価した図を示す。
【００１６】
実験部分
アポトーシス性変化に対するイミキモドの影響を、大腸上皮細胞を使用することにより調査した。Ｃａｃｏ−２細胞株は、腸管上皮細胞バリヤーを通過する候補薬物化合物の吸収率を予測するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて広く使用されている。したがって、この細胞株は、ｐ５３発現に対するイミキモドの作用を調査するために使用された。ｐ５３は、細胞周期を制御し、このようにして腫瘍サプッレサーとして機能する転写因子である。この腫瘍サプッレサー遺伝子は、良性の過剰増殖から悪性疾病へのプログレッションの複数段階において極めて重要な要素である。
【００１７】
このｐ５３腫瘍サプッレサーは、損傷を受けた異常な細胞の成長及び生存を妨げるために本質的であるように見える。このｐ５３タンパク質は、この破損が約５０〜５５パーセントのヒトの癌に関連する遺伝子によりコードされている腫瘍サプッレサーである。ｐ５３タンパク質は、細胞周期においてチェックポイントとして作用し、プログラム化細胞死を妨げるか又は開始させる。いいかえると、ｐ５３は備え付けられた腫瘍サプッレサーである。このｐ５３分子はいくつかの方式で不活化されることができる：ｉ）特定のファミリーにおいてｐ５３突然変異は遺伝する；ｉｉ）ＤＮＡ腫瘍ウィルス、例えばヒトのアデノウィルス及びパピローマウィルスは、結合してｐ５３タンパク質機能を不活化させ、細胞を改変し、腫瘍成長を開始させる。様々な組織においてｐ５３発現における相違点がある。同様に、ｐ５３遺伝子制御はヒトのモノサイト及びリンパ球において相違する。したがって、皮膚における変化は他の組織において観察される変化とは異なる。
【００１８】
方法
イミキモドをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解した。ストック濃度は１０ｍｇ／ｍｌであった。このストックから段階的に希釈を調整した。全ての化合物のために使用した終濃度は０．１μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌの範囲であった。ＤＭＳＯの終濃度は０．１％であった。
【００１９】
結腸直腸アデノカルシノーマ細胞株Ｃａｃｏ−２をＡＴＣＣ［American Type Culture Collection］、Wesel, Germanyから獲得した。この細胞を２４ウェルプレート（BD Bioscience, Heidelberg, Germany）中に播種した。細胞を、１０％の熱不活化したウシ胎児血清及び１０％の非必須アミノ酸で補ったＤＭＥＭ中で、５％のＣＯ2を含む給湿した雰囲気中で３７℃で培養した。コンフルエントになると、細胞を洗浄し、血清不含のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に１０6細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞（１×１０6細胞／ｍｌ）を様々な濃度の試験物質でインキュベーションした。
【００２０】
ＲＮＡを、RNeasy, Qiagen（Hilden, Germany）を使用して凍結したライセートから調整した。One-tube Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction（RT-PCR）をQIAGEN（Hilden, Germany）からのQuantitect Probe RT-PCR Kitを使用して実施した。ｐ５３の発現をABI Prism 7900でのSYBR Green assayを使用したリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりβ−アクチンに関して決定した。アッセイをQIAGEN, Hilden, Germany（p53:QT00060235）から購入した。ｍＲＮＡの量をΔΔＣT法により計算した。そのつどのＲＴ−ＰＣＲのために閾値サイクル（ＣＴ）を決定し、これは蛍光が、サイクル３〜１０についての平均ベースライン発光の標準偏差を１０回超えるサイクルとして定義した。β−アクチンを、ｍＲＮＡレベルを標準化するためのハウスキーピング遺伝子として使用した：Ｃt（パラメーター）−Ｃt（β−アクチン）＝ΔＣt.（パラメーター）。この値を、未処理の刺激細胞のｍＲＮＡレベルを示すビヒクルコントロールに対して設定した。ΔＣt（パラメーター刺激済み）−ΔＣt（パラメータービヒクル）＝ΔΔＣt（パラメーター）。次いで化合物Ｘのための相対的ｍＲＮＡレベルを、約１００％のＰＣＲ反応の効率を有するコントロール実験の結果に基づいて２−ΔΔＣｔ*１００％として計算した（PE Applied Biosystems User Bulletin #2; ABI PRISM 7700 Sequence Detection System, 1997による）。
【００２１】
統計学的分析をGraphPad Prism Version 5及びone-way ANOVA試験を用いて実施し、この後にDunnett's post-hoc分析をした。
【００２２】
Ｃａｃｏ−２細胞中のｐ５３の発現に対するイミキモドの用量依存作用を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより評価した（図１）。
【００２３】
１００μＭまでの濃度のイミキモドは、ｐ５３ｍＲＮＡ発現を用量依存的に増加させる。１０及び１００μＭのイミキモド濃度ではｐ５３ｍＲＮＡレベルにおける増加は統計学上の有意性に達した。
【００２４】
ｐ１６INK4aに比較して、ｐ５３はイミキモドにより一様に影響されない。光線性角化症を有する患者では、ｐ５３遺伝子発現における相違はイミキモド療法下では見出されなかった。
【００２５】
したがって、イミダゾリキノリン誘導体、例えばイミキモドが消化管路の細胞中で腫瘍サプッレサーｐ５３の発現を増加させることができることが期待されることができ、このことは、前癌性／癌性状態の治療におけるこれらの有益な作用を示唆する。
【００２６】
これら知見は、イミキモドが消化管路細胞中の腫瘍サプッレサー遺伝子の発現レベルに対して有利な影響を有することを示唆する。このイミキモドの作用は、ことによると、結腸直腸ポリポーシス／大腸ポリープの治療、結腸直腸癌腫の予防及び慣用の療法、例えば外科手術と一緒での結腸直腸癌のアジュバント治療のために重要である。
【００２７】
実施例
本発明により考慮される療法は、イミキモド又は他のイミダゾリキノリン誘導体、例えばレシキモド、ソチリモドを、癌性トランスフォーメーションの可能性を減少する、この疾病のプログレッションを減速させる目的で、存在する病理学的状態、大腸ポリープ／ポリポーシスを治療するために投与することを含む。
【００２８】
これら化合物は、溶液、クリーム、浣腸剤、又はフォームの形で局所的に投与されてよい（直腸に又は組織に直接的に、外科手術の間に）。この化合物は、予防的に又は症状の発症が生じた後に又は慣用の療法、例えば外科手術に対してアジュバントとして又は大腸鏡検査の間の結腸直腸ポリープ除去のアジュバントとして使用されてよい。
【００２９】
活性薬物を含有する調製物は、数週間にわたり１週間あたり１〜７回、有利には１〜５回適用されるべきである。
【００３０】
この好ましい用量は、１６週間にわたり１週間あたり３回、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より有利には１０〜１００ｍｇのイミキモドである。
【００３１】
イミキモドの全量は、少なくとも０．１質量パーセントであり、９質量パーセントを超えないことができる。特定の実施態様においては、イミキモドの全量は、この組成物の全質量に対して少なくとも０．５質量パーセントであり、９質量％を超えないことができる（他に記載がなければ、本願に記載の全てのパーセンテージはこの組成物の全質量に対する質量／質量である）が、いくつかの実施態様においてはこの組成物はこの範囲の外側のイミキモドの量を含有してよい。例えば、この組成物はイミキモドを０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％又は９％の濃度で含有してよい。
【００３２】
ソチリモド又はレシキモドの全量は、少なくとも０．００１質量パーセントであり、９質量パーセントを超えないことができる。特定の実施態様においては、ソチリモド又はレシキモドの全量は、この組成物の全質量に対して少なくとも０．１質量パーセントであり、９質量％を超えないことができ、有利には少なくとも０．５質量％であり、９質量％を超えないことができる（他に記載がなければ、本願に記載の全てのパーセンテージはこの組成物の全質量に対する質量／質量である）が、いくつかの実施態様においてはこの組成物はこの範囲の外側のソチリモド又はレシキモドの量を含有してよい。例えば、この組成物はソチリモド又はレシキモドを０．００１％、０．０１％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％又は９％の濃度で含有してよい。
【図１】
2011509956.tif 000003
【国際調査報告】
2011509956.tif 000004
2011509956.tif 000005