(57)【要約】  本発明は、ビタミンＤ３とともに、カルシウム、マグネシウム、亜鉛の酢酸塩を包含する成分組成物の製剤のための剤形を生成する方法を提供する。酢酸塩は、真珠、サンゴ、カキなどの天然資源から抽出されるか、あるいは、合成材料を用いて調合することができる。カルシウムとマグネシウムの投与量と比率は、インビトロおよびインビボの評価を用いて推定された。骨の健康と骨粗鬆症の緩和を促進する用量は、従来の用量の約４分の一から３分の一である。【選択図】図１
2014523921.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、および、ビタミンＤ３を含む錠剤を調製する方法であって、
前記方法は、
（ｉ）酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、および酢酸亜鉛を含む第１のカルシウム組成物を、ビタミンＤ３を含む組成物と混合する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）から得られた組成物を、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、および酢酸亜鉛を含む第２のカルシウム組成物と混合する工程と、
（ｉｉｉ）混合する工程を一巡以上行う工程であって、各工程では、以前の工程で得られた組成物が、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、および酢酸亜鉛を含むまた別のカルシウム組成物と混合され、それによって、錠剤を調製するための、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、およびビタミンＤ３を含む組成物を得る、工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１の方法によって作成された錠剤。
【請求項３】
酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、油、およびビタミンＤ３を含むソフトジェルカプセルを調製する方法であって、
前記方法は、
（ｉ）酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛を含むカルシウム組成物を、ビタミンＤ３と、オメガ３またはオメガ３−６−９の脂肪酸を含む油とを含む組成物に溶解する工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた組成物を、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、および酢酸亜鉛を含むカルシウム組成物と混合する工程であって、それによって、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、油、およびビタミンＤ３を含むソフトジェルカプセルを得る、工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
カルシウム組成物は、少なくとも１０重量パーセントの酢酸カルシウム、少なくとも５重量パーセントの酢酸マグネシウム、および、少なくとも０．２重量パーセントの酢酸亜鉛を含む、ことを特徴とする請求項１または３に記載の方法。
【請求項５】
前記油は魚油またはアマニ油である、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記油と酢酸カルシウムの混合比率は、１：１、１．５：１、および２：１からなる群から選択される、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記油と酢酸カルシウムの比率は、１：０．１４、１．５：１、および２：１からなる群から選択される、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記油とマグネシウムの比率は、１：０．０７、１．５：０．０７、および２：０．０７からなる群から選択される、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記油と亜鉛の比率は、１：０．００７、１．５：０．００７、および２：０．００７からなる群から選択される、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
請求項３の方法を用いて作られたソフトジェルカプセル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１１年７月２７日に出願された台湾特許出願第１００１２６６０１号と、２０１１年７月２８日に出願された米国仮特許出願第６１／５１２，６８５号の優先権の利益を主張する。先行する出願の全ての内容および開示情報は、参照することにより本出願に組み込まれる。
【０００２】
本出願にわたって、様々な参考文献が引用されており、本発明が関係する技術分野の状況を余すところなく記載するために、このような公開物の開示は、全体として参照することによって本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
カルシウムは骨の主要成分であり、体内のカルシウムの９９％以上が骨の中に存在する。食事によるカルシウムの適切な摂取が骨の成長と維持に必要である。骨粗鬆症は骨質量の著しい損失により引き起こされる病気であり、骨折を引き起こしやすくする原因となり、３５歳以上の女性で最も頻繁に発生するが、閉経後の女性でより頻繁に発生する。（１、２）
【０００４】
カルシウムを含む栄養補助食品が骨の健康維持において重要な因子だと過去５０年間考えられていた（３）。しかしながら、カルシウムの総摂取量を増やすことの骨の健康に対する利点は、明確には立証されておらず、その効果について文献の中に矛盾する報告がある。１９８８年から１９９３年にかけて出版されたへーネイが再調査したカルシウム補給の４３の研究において、カルシウム摂取量が制限された１９のプラシーボ対照試験のうち１６が、ミネラルが骨の減少を妨げるまたは遅らせることを示したが、１６の研究によるとカルシウムは骨の損失に対して何の影響も及ぼしていなかった。
【０００５】
エストロゲン欠乏がカルシウムの補給の効果を凌ぐ期間である閉経後５年以内の女性を除いた１２の研究において、すべての研究はカルシウムが非常に有益な影響を持つことを示していた。
【０００６】
年配の女性において、骨ミネラル密度といくつかの重要な栄養素：エネルギー、タンパク質、カルシウム、マグネシウム、亜鉛およびビタミンＣとの間に重要な関係があることが示された（１）。しかしながら、高濃度のカルシウム摂取は心疾患の高い発生率につながることがあることも分かった。
【０００７】
総カルシウム摂取量は骨の健康状態に関して決定的なものであるとは示されていないため、他の因子も、現代の食生活や栄養補助食品形態でのカルシウムとマグネシウムの比率なども考慮されてきた。現代の食生活におけるＣａ／Ｍｇの比率は、１９００年代の最初の４０年の２／１から、１９６０年代の＞３／１へ、２０００年の＞６／１へと増加した。Ｃａ／Ｍｇの２０００年の一日当たりの推奨摂取量（ＤＲＩ）は、＞３／１から＞４／１であった。この変化は、骨の健康に対してマイナスの結果と、心疾患に対するリスクの増大と相関する。
【０００８】
Ｃａ／Ｍｇの増加が、主に、マグネシウムの変化ではなくカルシウム摂取の増加に起因するものであることに注目する。２０００年代初頭、日々のカルシウム摂取量は、新たに２５００ｍｇに達した（３）。カルシウムの一日あたりの必要とされる量は最近になって再評価された（７）。カルシウムを平均して７４９ｍｇ摂取する必要があることが分かったが、これは以前に推定されていたよりも低い推定量であった。
【０００９】
他の因子のなかで、Ｃａ／Ｍｇの比率がカルシウム消費よりも骨の維持と健康には重要な因子であるという仮説を支持することが１つの臨床治験であり、閉経後間もない４３人の女性がランダムに以下を投与する１つの治療群に割り当てられた：経皮エストラジオール、経口用カルシウム（２０００ｍｇ／日）、またはプラシーボ。前腕、全身、および脊柱における骨ミネラル含有量は、エストラジオール群では変化はなかったが、カルシウム群とプラセボ群では減少がみられた。カルシウムは有意な効果をなんら示さず、カルシウムの補給は皮質骨の減少にわずかな効果を有することもあるが、海綿骨に対しては全く効果がなかった（６）。
【００１０】
１９８８年から１９９４年に行われた全国健康栄養検査（ＮＨＡＮＥＳ）において、予測モデルが確立され、人種、身体構成、アルコール摂取量、喫煙状態および栄養摂取といった項目を評価した（８）。栄養摂取による分析は、カルシウム、リン、マグネシウム、鉄、亜鉛、ナトリウムおよびカリウムといった成分の研究を含む。検査に参加した２０歳以上の７５３２人の女性のなかで、自然摂取は骨粗鬆症の予測因子ではなかった。しかしながら、平均カルシウム摂取量は６５９ｍｇであり、マグネシウムは２４１ｍｇであり、これらの値、はそれぞれ１０００ｍｇと３１０ｍｇのＲＤＡの平均摂取量よりも低いものであった。
【００１１】
身体活動は椎骨の骨ミネラル密度の増加と関連があると考えられていた（９）。活動を除けば、脊椎の骨ミネラル密度はカルシウム摂取に依存した。カルシウム摂取量が１日あたり８００から１０００ｍｇを超えると、この関係は消滅した。カルシウムの天井効果は、セロッティとビグナミニによっても観察された（１０）。彼らは、カルシウムの補給が骨の健康を維持するために重要であると報告した。しかしながら、過剰な量のカルシウムは無益な場合もあり、高カルシウム尿症および腎結石を起こす可能性がある。少量のマグネシウムの補給が提案された。
【００１２】
それ以外の研究は、消費または投与されたＣａ／Ｍｇの比率の重要性を示しているだけでなく、亜鉛の量を最適化する重要性も示している。マトルら（１１）は、マグネシウムと亜鉛の濃度が、骨粗鬆の閉経後の女性でもっとも低く、骨減少症の閉経後の女性よりも低く、通常の骨密度の閉経後の女性よりも低いことを示した。カルシウム補給は、亜鉛の吸収を減らし、マグネシウムと亜鉛の保持力を減少させることもある。結果的に、他の最適化した量のミネラルを投与しないカルシウム補給は、骨粗鬆症の重症度をさらに悪化させることもある（２、１２、１３）。カルシウムとは別に、マグネシウム、亜鉛、マンガン、および、銅の欠乏が骨粗鬆症に関連付けられている（１４）
【００１３】
アングスら（１５）は、カルシウムが閉経前と後の女性における骨ミネラル密度（ＢＭＤ）の予測因子ではないことを示した。しかしながら、マグネシウムと鉄は、骨ミネラル密度の重要な予測因子であった。しかしながら、この研究では、被験者は推奨される量よりも少ない成分を摂取していた。閉経後の女性の約２９％は一日当たり５００ｍｇ未満のカルシウムを消費しており（１６）、マグネシウムなどの他の栄養素も欠乏していた。
【００１４】
閉経後の女性に対するマグネシウムの利点を強調する研究において、Ｍｇ／Ｃａ比率が１．２／１の場合の方が０．４／１の場合よりも効果的であることが分かった（１７）。この研究では、０．４／１の群において、クエン酸カルシウムの形態で５００ｍｇのカルシウムと、酸化マグネシウムの形態で２００ｍｇのマグネシウムを用い、１．２／１の群において、酸化マグネシウムの形態で６００ｍｇのマグネシウムを用いた。この研究によると、１．２／１の食事を６から１２ヶ月間摂った女性は骨密度が平均１１％増加し、一方で、もう一方の群は０．７％という有意でない増加であった。
【００１５】
骨の健康は多様な因子に依存するが、成分の必要条件の範囲で、カルシウムは別として、マグネシウム、リン、亜鉛、銅、などの他の成分も骨の健康の維持と改善に対して重要であることを示す十分な証拠がある。さらに、生物学的利用能が異なるため、基本的な塩類は吸収性の観点からより正確に特徴付けられることと、好ましい塩類の使用を介してカルシウム製剤（ｃａｌｃｉｕｍ  ｆｏｒｍｕｌａｓ）が最適化されることが提案される。
【００１６】
カルシウム塩の溶解性が成分の生物学的利用能とは関係がないことを示すレポートがあったため、最適化された製剤に適切な塩類の選択には、妥当な関心が払われてこなかった。カルシウム塩の吸収は、それが可溶性であっても不溶性であっても、胃酸分泌には影響されない（１８）。炭酸カルシウムが胃の中で溶解性の高いカルシウム塩、すなわち、塩化カルシウムに変化し、カルシウムの吸収を増強するという仮説が検証された。その結果は炭酸カルシウムの吸収は胃酸の影響を受けないということを示した（１８）。ヒトにおいて吸収される平均量は２４％である。
【００１７】
炭酸カルシウム、Ｄ−乳酸カルシウム、Ｌ−乳酸カルシウム、および牡蠣の殻の生物学的利用能は、塩の溶解性とは無関係であることが分かった（１９）。この研究はバランススタディの方法とは異なる方法を用いた。この研究では、実際のカルシウム吸収の代わりに下垂体の甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）などにおける変化を測定した。しかしながら、カルシウムの生物学的利用能の正確な比較はＰＴＨのような間接的方法を用いて達成することはできない。
【００１８】
Ｃａ４５をトレーサーとして用いると、低用量（カルシウム３００ｍｇ）で炭酸カルシウムとクエン酸カルシウムの吸収率の値はわずかに異なることが分かった。しかしながら、炭酸カルシウムからのカルシウムの吸収量は若干だが有意にクエン酸カルシウムよりも優れていた（２０）。ヘーネイ（２１）の報告によると、３つの市販のカルシウム製品（市販の炭酸カルシウム、カプセル剤の炭酸カルシウム、および市販のクエン酸カルシウム）の尿中排泄率が同じであった。
【００１９】
これらの観察にも関わらず、全てのカルシウム塩が同じ生物学的利用能を持つわけではないという報告がある。アスコルビン酸カルシウムの生物学的利用能は、炭酸カルシウムと塩化カルシウムのそれよりも高い（２２）。
【００２０】
酢酸カルシウムの生物学的利用能は４５Ｃａを用いて測定された（２３）。アスコルビン酸カルシウムと比べると、酢酸カルシウムの生物学的利用能は非常に低かった（２５ｍｇのカルシウム負荷で７０％対４５％）。８区画からなる動態モデルを用いて、血漿カルシウム対時間のデータを合わせた。その差は飽和可能な過程によるものであった。酢酸塩からのカルシウムがリン酸塩または塩化物を腸内で沈殿させることがあるため、酢酸カルシウムの溶解度は腸で減少する場合があると論ずることもできる。従って、酢酸カルシウムの生物学的利用能が塩化カルシウムおよびリン酸カルシウムの生物学的利用能と異ならないのは、驚くべきことではない。
【００２１】
１０種類の有機及び無機塩類からのマグネシウム吸収量がラットにおいて試験された（２４）。マグネシウムの生物学的利用能は５０％から６６％の範囲内であった。グルコン酸マグネシウムが最も高い値を示した。小腸と大腸におけるこれらの塩の溶解度と、盲腸におけるその溶解度も測定された。これらの塩の溶解度は腸の基部において極めて高く、腸管に沿ってｐＨが増えるにつれ、急速に低下した。個体間のばらつきを考えれば、これらのマグネシウム塩の吸収量の違いは重要ではないかもしれない。
【００２２】
亜鉛の吸収は小腸全体で生じ、人によって用量依存性である（２５）。亜鉛に関しては、二重の同位体法を用いて測定されたような酸化亜鉛と硫酸亜鉛の生物学的利用能には何の違いもなく、両方とも約２４％であった。鉄の生物学的利用能は１５．９％であった。しかしながら、硫酸亜鉛は鉄の生物学的利用能を１１．５％に減少させる傾向にあり、この数字は有意である。一日あたり８乃至１１ｍｇの亜鉛を摂取することが推奨されている（http://ods.od.nih.gov/factsheets/Zinc-HealthProfessional/）。推奨される亜鉛の１日あたりの許容量は６ｍｇだった（２７）。
【００２３】
以下は従来技術における特筆すべき発明と開示である。
【００２４】
１９９９年に発行された特許文献１は、カルシウム、マグネシウム、亜鉛などを含むカルシウムの栄養補助食品に関するものである（２８）。カルシウムとマグネシウムの比率は高く、使用されるマグネシウムの範囲は５０ｍｇから１５０ｍｇであった。カルシウムの塩は炭酸カルシウムである。使用されるカルシウムとマグネシウムの量と用いられる塩のタイプは本発明とは異なる。
【００２５】
２００４年にミーガンとステンジャーに与えられた特許文献２は、カルシウムとビタミンＤ混合物からなる組成物について言及している。
【００２６】
２００４年にヘンドリクスに与えられた特許文献３は、カルシウムとリンを含む栄養補助食品について記載している。ビタミンＤを含むビタミンも栄養補助食品には含まれることが可能であった。ヘンドリクスはリンの効果を強調し、随意に、ビタミンＢ１２、葉酸、および、ビタミンＢ６の効果を強調した。しかしながら、本発明はリンを含むものではない。
【００２７】
メーザーらは、グリセロリン酸カルシウム、ビタミンＤ、およびビタミンＣを含む固体の形態のカルシウム栄養補助食品に関して、１９９７年に特許文献４を付与された。これについても、本発明はこの種のカルシウム塩を含まない。
【００２８】
別の特許である１９９１年に発行された特許文献５では、ウォルスドルフらは、カルシウム塩を作るためにクエン酸と乳酸塩の化学量論的混合物を混ぜ合わせることによるクエン酸−乳酸二カルシウムの合成について記載している（２９）。
【００２９】
クラムハーとジョンソンは微結晶性のカルシウムハイドロキシアパタイト、タンパク質（大部分はコラーゲン）、リン、脂肪、および他のミネラルからなる、２００６年に発行された特許文献６で開示された、骨の健康のための栄養補助食品を設計した。これは、ビタミンＤ３、コレカルシフェロール、および、好ましい骨芽細胞刺激薬であるイプリフラボンも含む。これらの基礎材料に加え、組成物は、骨内に生じることが知られている様々な他のミネラルである、ビタミンＣやグルコサミン・サルフェイトを含み、これらはすべて健康な骨の成長と維持に対して有益な効果を持つと主張されている。
【００３０】
１９９６年に発行された特許文献７において、サルテンファスは、ビタミンＡ、βカロチン、ナイアシン、リボフラビン、パントテン酸、ピリドキシン、シアノコバラミン、ビオチン、パラアミノ安息香酸、イノシトール、コリン、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ホウ素、カルシウム、クロム、銅、ヨウ素、鉄、マグネシウム、マンガン、モリブデン、セレン、亜鉛およびバイオフラボノイドを含む、別の日常用のビタミン及びミネラル栄養補助食品について記載している。４０歳までの女性用のものは、鉄を含む。４０歳を超える女性用のものは、鉄は任意に含まれる。Ｃａ／Ｍｇ比は１０−１５/４−６である。
【００３１】
広範なリストのミネラルとビタミンからなる栄養補助食品は、特許文献８で記載された（３０）。該特許は、骨の健康に対するそれぞれの成分の貢献についての定量的な記載を明記していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３２】
【特許文献１】米国特許５，８７９，６９８号
【特許文献２】米国特許６，７１６，４５４号
【特許文献３】米国特許６，７９０，４６２号
【特許文献４】米国特許５，６９８，２２２号
【特許文献５】米国特許５，０７５，４９９号
【特許文献６】米国特許７，０２９，７０３号
【特許文献７】米国特許５，５１４，３８２号
【特許文献８】米国特許５，６５４，０１１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明は、カルシウム、マグネシウム、亜鉛の酢酸塩、およびビタミンＤ３からなる栄養補助食品の製剤について記載している。これらの調合剤は、水、胃液、および腸液において高い溶解度を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】人工胃液（ＵＳＰ）中の様々な製剤のカルシウムの平均的な（±Ｓ．Ｄ．）割合−時間のプロファイルを示す。
【図２】カルシウムが含まれない食餌を４日間に渡って与えられたラットにおいて保持された累積の正味の（±Ｓ.Ｅ.Ｍ.）カルシウムの平均量を示す。
【図３】カルシウムが含まれない食餌を４日間に渡って与えられたラットにおいて保持された累積の正味の（±Ｓ.Ｅ.Ｍ.）マグネシウムの平均量を示す。
【図４】カルシウムが含まれない食餌を４日間に渡って与えられたラットにおいて保持された累積の正味の（±Ｓ.Ｅ.Ｍ.）亜鉛の平均量を示す。
【図５】カルシウムを含まない食餌を与えられながら、治療期間の最後にラットからサンプリングした（Ａ）血漿カルシウム、（Ｂ）血漿マグネシウム、（Ｃ）血漿亜鉛のレベルを示す。
【図６】通常の食餌を４日間に渡って与えられたラットにおいて保持された累積の正味の（±Ｓ.Ｅ.Ｍ.）カルシウムの平均量を示す。
【図７】通常の食餌を４日間に渡って与えられたラットにおいて保持された累積の正味の（±Ｓ.Ｅ.Ｍ.）マグネシウムの平均量を示す。
【図８】通常の食餌を４日間に渡って与えられたラットにおいて保持された累積の正味の（±Ｓ.Ｅ.Ｍ.）亜鉛の平均量を示す。
【図９】通常の食餌を与えられながら、治療期間の最後にラットからサンプリングした（Ａ）血漿カルシウム、（Ｂ）血漿マグネシウム、（Ｃ）血漿亜鉛のレベルを示す。
【図１０】カルシウムが含まれない食餌と毎日消費される量のカルシウムを、４日間にわたって与えられたラットにおいて保持されたカルシウムの累積した正味の量（±Ｓ.Ｅ.Ｍ.）を示す。
【図１１】カルシウムが含まれない食餌と毎日消費される量のカルシウムを、４日間にわたって与えられたラットにおいて保持されたマグネシウムの累積した正味の量（±Ｓ.Ｅ.Ｍ.）を示す。
【図１２】カルシウムが含まれない食餌と毎日消費される量のカルシウムを、４日間にわたって与えられたラットにおいて保持された亜鉛の累積した正味の量（±Ｓ.Ｅ.Ｍ.）を示す。
【図１３】カルシウムが含まれない食餌と通常の一日量のカルシウムを与えられながら、治療期間の最後にラットからサンプリングした（Ａ）血漿カルシウム、（Ｂ）血漿マグネシウム、（Ｃ）血漿亜鉛のレベルを示す。
【図１４】個々の成分による処置を受けたラットの体重の記録である。
【図１５】３ｐＱＣＴスライスから平均化した大腿遠位の海綿骨の骨ミネラル密度を示す。（＊）：卵巣摘出手術の対照群とは有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
【図１６】３ｐＱＣＴスライスから平均化した脛骨近位部の海綿骨の骨ミネラル密度を示す。（＊）：卵巣摘出手術の対照群とは有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
一般に、可溶性のカルシウム塩はカルシウムの割合が低い。例えば、アスコルビン酸カルシウムにはわずか９％のカルシウムしかない。その含量は、不溶性の炭酸カルシウム（４０％のカルシウム）の含量よりも数倍低い。可溶性のカルシウムの中では、酢酸カルシウムのカルシウム含量（２５％のカルシウム）が最も多い。このおかげで、酢酸カルシウムは固体の剤形を作るのにふさわしい候補である。
【００３６】
製剤に成分とビタミンを加えることで、カルシウムの割合は低下する。これは、消費者に許容可能な大きさを有する剤形を調製するという困難な課題を伴う。
【００３７】
本発明は許容可能な大きさの剤形を調製する方法を記載している。
【００３８】
本発明は、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、およびビタミンＤ３を含む錠剤を調製する方法を提供し、該方法は、（ｉ）酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、および酢酸亜鉛を含むカルシウム組成物を、ビタミンＤ３を含む組成物と混合する工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）から得られた組成物を、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、および酢酸亜鉛を含むカルシウム組成物と混合する工程であって、それによって、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、およびビタミンＤ３を含む錠剤を得る、工程を含む。１つの実施形態では、カルシウム組成物は、少なくとも１０重量パーセントの酢酸カルシウム、少なくとも５重量パーセントの酢酸マグネシウム、および少なくとも０．２重量パーセントの酢酸亜鉛を含む。
【００３９】
本発明はさらに、上記の方法によって生成された錠剤を提供する。
【００４０】
本発明は、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛、およびビタミンＤ３を含むソフトジェルカプセルを調製する方法も提供し、該方法は、（ｉ）魚油、アマニ油、またはオメガ３あるいはオメガ３−６−９のいずれかを包含している他の油に、ビタミンＤ３を溶解する工程、および、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた組成物を、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、および酢酸亜鉛を含むカルシウム組成物と混合する工程であって、それによって、酢酸カルシウム、酢酸マグネシウム、酢酸亜鉛を含むソフトジェルカプセルを得る、工程を含む。１つの実施形態では、カルシウム組成物は、少なくとも１０重量パーセントの酢酸カルシウム、少なくとも５重量パーセントの酢酸マグネシウム、および、少なくとも０．２重量パーセントの酢酸亜鉛を含む。
【００４１】
本発明は、以下に挙げる例を参照することでより良く理解されるだろうが、当業者は、詳細に記載された特定の実験が一例にすぎず、この後に続く請求項によって定義される本発明を、本明細書に記載されたように限定するものではないということを容易に理解するであろう。
【００４２】
本出願にわたって、様々な参考文献が引用されている。これらの参考文献または公開物の開示は、本発明が関連する技術的な現状を余すところなく記載するために、全体として参照することによって本出願に組み込まれる。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同意語である移行性の単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、包括的であるか、または、制限がなく、さらに、追加の列挙されていない成分または方法の工程を除外しない。
【００４３】
（実施例１）
（真珠抽出による製剤）
真珠抽出はＬｉとＬｉによって報告されている特許済みの方法を適応させることによって調製された。手短に言えば、真珠は８０から１２０メッシュのサイズに粉砕される。その粉末は滴定された量の酢酸と塩化ナトリウムの飽和溶液の混合溶液に浸される。数日間に渡って混合溶液に電流が印加される。水で希釈し、磁化した後、混合溶液は濾過され、沈殿させる。その沈殿物は酢酸カルシウムが豊富で、乾燥させると、栄養補助食品として摂取される準備が整う。その抽出物に存在する成分の詳細なリストは表１において提示される。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
この抽出物Ａ１がマグネシウムの酢酸塩で強化されることで、０．５／１（Ａ６）、１／１（Ａ４）、および、２／１（Ａ５）のＣａ／Ｍｇ比がもたらされる。真珠の抽出物およびその強化された混合溶液の主要な成分内容が表２に挙げられている。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
真珠に加え、本実施例において記載される方法は、サンゴ、カキ、ミネラル鉱山などの天然資源からカルシウム、マグネシウム、および、亜鉛の多数の酢酸塩を抽出するために使用することもできる。製剤Ａ１およびＡ４乃至Ａ６の組成物も、カルシウム、マグネシウム、および亜鉛を適切な量混合することによって得られる。
【００４８】
成分の溶解度についての実験データ。消化管は複雑な器官である。カルシウム、マグネシウム、および亜鉛を含む成分の溶解度を変化させ、それに伴ってその吸収率および生物学的利用能も変化させ得る多くの因子が存在する。実施例２−５は、成分の溶解度に対して有意な影響を持つとみなされてきた生理学的な要因のうちのいくつかを強調している。
【００４９】
（実施例２）
（人工の胃液や腸液におけるカルシウムの溶解度）
人工胃液（ｐＨ＝１）および腸液（ｐＨ＝７）中の４つの製剤のカルシウムの溶解度は、ＩＣＰ−ＯＥＳ（誘導結合プラズマ発光分光分析法）（パーキンエルマー  Ｏｐｔｉｍａ ４３００ＤＶ）用に開発された方法を用いて試験された。Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）および酢酸カルシウムの二つの商品サンプルも比較のため並行して試験した。結果は表３に示されている。
【００５０】
Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）と比較すると、酢酸カルシウムの溶解度は、人工胃液においてはおおよそ４５倍高く、人工腸液においては２６０００倍高い。その大部分が酢酸カルシウムからなる真珠抽出物Ａ１の溶解度は、人工の胃液および腸液（ｐ＞０．０５）中の酢酸カルシウムの溶解度とほぼ同じである。酢酸カルシウムの溶解度はｐＨに依存し、人工の胃液と比較すると人工の腸液の方でより低い。マグネシウムはカルシウムの溶解度を低くする傾向を有する。Ｃａ／Ｍｇの比率が減少すると、抽出物の溶解度は減少し、Ａ５＞Ａ４＞Ａ６となる。それにもかかわらず、もっとも溶解度が低い真珠抽出製剤であるＡ６は、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）の溶解度よりも、人工の胃液中に〜１２倍溶けやすく、人工の腸液中に８５００倍溶けやすい。したがって、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）とは違って、酢酸塩は溶液中に依然として存在するため、酢酸塩の溶解度は消化管液においては論点とするべきではない。
【００５１】
マグネシウム塩の溶解プロファイルはカルシウムの溶解プロフェイルと非常に似ている（表４）。一般的に、マグネシウムの酢酸塩は溶解度が高い。マグネシウムの酢酸塩は、人工の腸液よりも人工の胃液の方で溶解度が高い。酢酸マグネシウムとは対照的に、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）における炭酸マグネシウムの溶解度は低い。
【００５２】
亜鉛塩の溶解プロファイルも、異なるｐＨでの塩の形態と環境の条件との違いの規模がさほど大きくないということを除けば、マグネシウムとカルシウムの溶解プロファイルに類似している（表５）。
【００５３】
この一連の実験は、酢酸塩が高溶解性を有しているので、開示された製剤中の好ましい塩であるという結論を導く。
【００５４】
【表３】
2014523921.tif 000005
【００５５】
【表４】
2014523921.tif 000006
【００５６】
【表５】
2014523921.tif 000007
【００５７】
（実施例３）
（異なる製剤中のカルシウムの溶解度に対するｐＨの影響）
本実施例において、４つの真珠製剤（Ａ１、Ａ４、Ａ５、およびＡ６）、市販の製品（Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）、および合成化合物（酢酸カルシウム、Ｃａ  ＡＣＥ）の中の３つの成分の溶解度に対するｐＨの影響（１から９までの範囲に及ぶ）を調査した。溶液のｐＨは、適切な量の酢酸（ＡｃＯＨ）、硝酸（ＨＮＯ３）、または水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）を用いて調節された。飽和溶液は、最終的なｐＨ値が１から９の範囲となる溶液に各々の調合剤を溶かすことによって調製された。結果として生じる混合物を、一時間３７℃で水浴でインキュベートした。それぞれのサンプルはその後すぐに（遠心分離法を用いて、または用いずに）濾過し、濾過物を、成分分析に適した濃度まで希釈した。カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の濃度は、ＩＣＰ−ＯＥＳを用いて測定した。その結果が表６−８に示されている。一元配置分散分析を用いて統計分析を行い、Ｐ値を０．０５に設定した。
【００５８】
試験されたｐＨの範囲にわたって、Ａ１と酢酸カルシウムの両方が、他の調合剤よりも、溶液において非常に高いカルシウム含有量を示した。Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）はカルシウム含有量が最も低かった（ｐ＜０．０５）。Ａ１および酢酸カルシウムは、ｐＨ１において最も溶解度が高い（表６）。
【００５９】
マグネシウムは溶液のカルシウム含有量に対してマイナスの効果を持ち、溶解度に関する順位はＡ５＞Ａ４＞Ａ６である。Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）を除けば、ｐＨ１においてより溶解度が高い酢酸カルシウムおよびＡ１に関しては、ｐＨは溶液中のマグネシウムの溶解度に対して全く影響を及ぼさない（表７）。
【００６０】
同様に、溶液における亜鉛の量は、異なる製剤における亜鉛の含有量と十分に相関した（Ａ５＞Ａ４＞Ａ１＞Ａ６）（表８）。４つの全ての試験した酢酸製剤に対して、５よりも高いｐＨの値は、ｐＨ２および３のときの溶解度よりも高い溶解度に関連付けられた。
【００６１】
腸のｐＨ値が一般的に６よりも高いため、本発明の製剤は、そのようなｐＨ条件下でのＣａｌｔｒａｔｅ（商標）における炭酸カルシウムの溶解度と比較すると、溶解度の観点で利点をもたらす。これらの結果は、表３で報告されている溶解度と一致する。
【００６２】
【表６】
2014523921.tif 000008
【００６３】
【表７】
2014523921.tif 000009
【００６４】
【表８】
2014523921.tif 000010
【００６５】
（胃および腸の共通する陰イオンと陽イオンの存在下における溶解度についての実験データ）
消化管液に豊富に存在する陰イオンを用いる以下の分析を、４つの試験製剤（Ａ１、Ａ４、Ａ５、およびＡ６）、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）、および、酢酸カルシウムについて行い、その溶解度と、その後に吸収速度と生物学的利用能を評価した。以下は、ヒトの消化管液中の共通する陰イオンと陽イオンの標準範囲である。
【００６６】
【表９】
2014523921.tif 000011
【００６７】
（実施例４）
（試験調合剤におけるカルシウム、マグネシウムおよび亜鉛の溶解度に対する陰イオンの影響）
消化管液に豊富に存在する陰イオンを用いる以下の分析を、４つの試験製剤（Ａ１、Ａ４、Ａ５、およびＡ６）、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）、および、酢酸カルシウムについて行い、その溶解度と、その後に吸収速度と生物学的利用能を評価した。本実施例において、カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の溶解度に対する炭酸水素塩とリン酸塩（ＨＣＯ３−および ＰＯ４３−）の影響をｐＨ７で調査した。さらに、これらの３つの成分のｐＨ１およびｐＨ７における吸収性に対する塩化物の影響も調査した。実施例３に記載されたｐＨ調節と溶解度の測定のための手順を用いた。カルシウム、マグネシウム、および亜鉛を定量化するために誘導結合プラズマ発光分光分析法が用いられた。統計分析は一元配置分散分析を用いて行われ、その有意水準は、ｐ＜０．０５に設定された。
【００６８】
（Ａ．ｐＨ１における塩化物の影響）
表１０−１２は、ｐＨ１における塩化物の影響の結果である。これらの条件は、胃における酸環境の塩化物の影響を模倣する。塩化物は、ｐＨ１で、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）における、カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の溶解度に対して最も強力な影響を及ぼす。２００ｍＭのＣｌ―濃度で、カルシウムの溶解度は最も高かった。マグネシウムおよび亜鉛の溶解度の最大値には、それぞれ５０ｍＭおよび１２０ｍＭのＣｌ―濃度で達した。カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の溶解度の変動は、全ての酢酸製剤（酢酸カルシウム、Ａ１、Ａ４、Ａ５、およびＡ６）で最小であった。最も高いＣｌ−濃度で、しばしば有意な差が得られた（ｐ＜０．０５）。
【００６９】
【表１０】
2014523921.tif 000012
【００７０】
【表１１】
2014523921.tif 000013
【００７１】
【表１２】
2014523921.tif 000014
【００７２】
（Ｂ．ｐＨ７における塩化物の効果）
ｐＨ７のとき、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）におけるカルシウムの溶解度は、塩化物が存在するｐＨが１のときの溶解度よりも著しく低い（表１０と表１３における値を比べる）。塩化物濃度が増加するにつれ、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）におけるカルシウムの溶解度が増加した。ｐＨおよび塩化物の影響は酢酸製剤に対しては顕著なものではなかった。一般に、カルシウムの溶解度の最大値は、塩化物濃度が５０から１００ｍＭのときに達成される。
【００７３】
塩化物の存在下では、マグネシウムの溶解度に対するｐＨの影響は小さい（表１１と１４の値を比べる）。一般に、ｐＨ７のマグネシウムの溶解度は、全ての製剤に関してわずかに低く、塩化物の効果は顕著ではない。
【００７４】
塩化物の存在下では、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）におけるｐＨ７のときの亜鉛の溶解度は、ｐＨ１のときの溶解度の半分未満である（表１１と１４の値を比べる）。しかしながら、この相違は、酢酸製剤では顕著なものではない。亜鉛の溶解度は、塩化物濃度の増加に伴って増加する傾向がある。Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）を評価した際に、最大亜鉛溶解度は１２０ｍＭの塩化物に達する。酢酸製剤の場合、塩化物濃度が２００ｍＭに達したときに、亜鉛の溶解度が最大となった。
【００７５】
【表１３】
2014523921.tif 000015
【００７６】
【表１４】
2014523921.tif 000016
【００７７】
【表１５】
2014523921.tif 000017
【００７８】
（Ｃ．ｐＨ７における炭酸水素塩の影響）
炭酸水素塩の濃度の増加に伴ってＣａｌｔｒａｔｅ（商標）におけるカルシウムの溶解度は増加した（表１６）。しかしながら、酢酸カルシウムに関しては反対のことが言える。溶解度は少なくとも４０％減少した。全ての真珠抽出製剤における減少率は、少なく、およそ２０から２５％だった。
【００７９】
Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）におけるマグネシウムの溶解度は、炭酸水素塩濃度と共に増加した（表１７）。炭酸水素塩の影響は酢酸製剤については最小であった。
【００８０】
Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）における亜鉛の溶解度は、炭酸水素塩の存在下で増加した（表１８）。亜鉛の溶解度の最大値は７０ｍＭにおいて達成された。酢酸カルシウムについて、この傾向は、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）の亜鉛の溶解度と同様である。炭酸水素塩は真珠抽出製剤に対してほとんど影響を及ぼさない。
【００８１】
【表１６】
2014523921.tif 000018
【００８２】
【表１７】
2014523921.tif 000019
【００８３】
【表１８】
2014523921.tif 000020
【００８４】
（Ｄ．ｐＨ７におけるリン酸塩の影響）
リン酸塩は、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）におけるカルシウムの溶解度に対してさほど影響を与えない（表１９）。リン酸塩濃度が増加するにつれて、全ての酢酸製剤においてカルシウムの溶解度は減少した。より高い割合のマグネシウムを含む製剤（Ａ４、Ａ５、およびＡ６）において最大の減少（４０％まで）が観察された。試験されたリン酸塩濃度の範囲（１０、０００倍）を考慮すると、カルシウムの溶解度の変化は重要ではない。
【００８５】
リン酸塩濃度が増加するにつれ、マグネシウムの溶解度は減少した（表２０）。減少（８０％）は、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）中のマグネシウムに関して最も顕著である。他の製剤に関して、最大の減少はおよそ５０％だった。この場合も、リン酸塩の効果は、試験された濃度の範囲を考慮するとそれほど重要ではなかった。
【００８６】
３つの成分のうち、リン酸塩は亜鉛の溶解度に対して最も大きい影響を持つ（表２１）。全ての製剤は同程度影響され、最大の減少は約７０％だった。試験されたリン酸塩濃度の範囲を考慮すると、この場合もリン酸塩の影響はそれほど重要ではなかった。
【００８７】
【表１９】
2014523921.tif 000021
【００８８】
【表２０】
2014523921.tif 000022
【００８９】
【表２１】
2014523921.tif 000023
【００９０】
（実施例５）
（試験調合剤におけるカルシウム、マグネシウム、および亜鉛の溶解度に対する陽イオンの影響）
消化管液に豊富に存在する陰イオンを用いる以下の分析を、４つの試験製剤（Ａ１、Ａ４、Ａ５、およびＡ６）、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）、および、酢酸カルシウムについて行い、その溶解度と、その後に吸収速度と生物学的利用能を評価した。
【００９１】
（Ａ．ｐＨ１におけるＮａ＋の影響）
４つの製剤（Ａ１、Ａ４、Ａ５、およびＡ６）、Ｃａｌｔｒａｔｅ、およびＣａＡＣＥにおける、３つの成分の溶解度に対するＮａ＋濃度の影響が、胃のｐＨ（ｐＨ＝１）および腸のｐＨ（ｐＨ＝７）において、それぞれ調査された。表２２および２３は、ｐＨ１における試験の結果を示す。全ての製剤のカルシウムおよびマグネシウムの溶解度に対するＮａ＋濃度の有意な影響は、観察されなかった。微量の亜鉛を含むＣａｌｔｒａｔｅ（商標）および酢酸カルシウムにおける亜鉛の溶解度は、ナトリウム濃度の増加に伴って有意に増加した。しかしながら、全ての酢酸製剤に関して有意な相違は全く見られなかった（表２４）。
【００９２】
【表２２】
2014523921.tif 000024
【００９３】
【表２３】
2014523921.tif 000025
【００９４】
【表２４】
2014523921.tif 000026
【００９５】
（Ｂ．ｐＨ７におけるＮａ＋の影響）
表２５乃至２７は、ｐＨ７におけるナトリウムイオンの影響を示す。Ｎａ＋はカルシウム、マグネシウム、および亜鉛の溶解度に対して一般的に全く重要な影響を持たない。ｐＨ７におけるＮａ＋の存在下では、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）における全ての３つの成分が検出され得ないことに注目することは興味深い。
【００９６】
【表２５】
2014523921.tif 000027
【００９７】
【表２６】
2014523921.tif 000028
【００９８】
【表２７】
2014523921.tif 000029
【００９９】
（Ｃ．ｐＨ１におけるＫ＋の影響）
カルシウムの溶解度は、カリウムイオン濃度の増加に伴って増加する傾向がある（表２８）。しかし、相違の大部分は統計的に異なるものではない（ｐ＜０．０５）。Ａ５において、カルシウムの溶解度は５０％以上増加した。この違いは有意である（ｐ＜０．０５）。
【０１００】
酢酸製剤に関するマグネシウムの溶解度のプロファイルは、カルシウムの溶解プロファイルと同様の傾向を示す（表２９）。Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）におけるマグネシウムの溶解度では３倍の増加である（ｐ＜０．０５）。しかしながら、Ａ４、Ａ５、およびＡ６と比較すると、増加の大きさは取るに足らないものであった。
【０１０１】
カリウムの増加は、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）とＣａＡＣＥについての亜鉛の溶解度の増加に伴う（表３０）。カリウムは、４つの製剤における亜鉛の溶解度に対してそれほど影響しない（ｐ＞０．０５）。この場合も同様に、Ａ４、Ａ５、およびＡ６と比較すると、亜鉛の溶解度の増加の規模は取るに足らないものである。
【０１０２】
【表２８】
2014523921.tif 000030
【０１０３】
【表２９】
2014523921.tif 000031
【０１０４】
【表３０】
2014523921.tif 000032
【０１０５】
（Ｃ．ｐＨ７におけるＫ＋の影響）
カルシウムの溶解度は、カリウムイオン濃度の増加に伴って増加する傾向があるが、その相違は有意なものではない（ｐ＞０．０５）（表３１）。Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）を用いる調合剤においてカルシウムは全く検出され得なかった。
【０１０６】
酢酸塩を含む全ての製剤において、カルシウムの溶解度に対する同様の観察結果が，マグネシウムおよび亜鉛の溶解度（ｐ＞０．０５）に関しても得られた（表３２−３３）。Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）を用いた調合剤については、測定可能なマグネシウムおよび亜鉛は一切報告されなかった。
【０１０７】
【表３１】
2014523921.tif 000033
【０１０８】
【表３２】
2014523921.tif 000034
【０１０９】
【表３３】
2014523921.tif 000035
【０１１０】
（実施例６）
（カルシウム、マグネシウム、および亜鉛のバランスのインビボ評価）
バランス研究の目的は、カルシウム、マグネシウム、および亜鉛のバランスにおける食餌条件および製剤の効果を評価することである。
【０１１１】
（Ａ．食餌条件）
二つの食餌が研究に使用され、一方は標準的なカルシウムを含む食餌で、もう一方はカルシウムが含まれていなかった。食餌の栄養成分は、表３４に示されている。
【０１１２】
【表３４】
2014523921.tif 000036
【０１１３】
（Ｂ．材料および方法）
初期重量が２２０ｇから２５０ｇのオスのＳＤラット（Ｓｐｒａｎｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔｓ）（約６−７週）を無作為に異なる処理群に分けた。全てのラットを、恒温室の個々の代謝ケージに収容した。夫々のラットは、試験が開始されるまで、標準的な食餌（表３４）を自由に摂ることができた。この一連の研究には、標準的な食餌とカルシウムが含まれていない食餌の双方を用いた。脱イオン水が自由に与えられた。全てのラットの体重を処置前に測定した。
【０１１４】
（Ｃ．処置）
標準的な食餌とカルシウムが含まれていない食餌の二組の研究を行った。夫々の研究は、７つの処置群で行われた。処置群の１つには３５の動物が無作為に割り当てられ、処置群の１つには以下：Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）、酢酸カルシウム（Ｃａ ＡＣＥ）、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ４＋ビタミンＤ３、およびＡ５＋ビタミンＤ３が投与された（ｎ＝群ごとに５）。標準的な食餌に参加するラットは、初めから終りまで標準的な食餌を自由に与えられた。カルシウムが含まれていない食餌の群に参加するラットは、処置の５日前から開始して処置の間ずっと、カルシウムが含まれていない食餌を自由に与えられた。何れの試験群においても、動物は、５日間、一日に１用量与えられた。個々の製剤および夫々の食餌におけるカルシウム、マグネシウム、および亜鉛の含有量は、ＩＣＰ-ＯＥＳを使用して測定された。投与量および食餌摂取量は、成分バランスの算定のために測定された。カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の毎日の平均的な成分摂取量は、夫々一日当たり、６２５、１５５、および１０ｍｇ／ｋｇであった。毎日の成分の投与量は、人間と同じく、カルシウムが一日当たり５３．１４ｍｇ／ｋｇ、マグネシウムが一日当たり０．３８から５５ｍｇ／ｋｇ、および亜鉛が一日当たり０．０１７から２．５ｍｇ／ｋｇであった。一日当たり１．０６μｇ／ｋｇのビタミンＤ３（一日当たり４２．５１２  ＩＵ／ｋｇ；  １ＩＵ＝０．０２５μｇ）が、投与前に夫々の投与調合剤に添加された。各投与量を調製するためのビヒクルは脱イオン水であった。すべての投与量調合剤中のカルシウムの濃度は１５．９４ｍｇ／ｍＬであった。経管栄養によって１ｍＬの夫々の調合剤を投与した。体重、成分投与量、および食餌消費を毎日記録した。
【０１１５】
（Ｄ．サンプル採取、処理、および分析）
試験の５日前に代謝ケージに動物を個別に収容した。食料消費を毎日調べた。尿および糞を４日間毎日集め、カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の含有量を測定した。５日目に夫々の動物の処理を行った。これらの処理は４日間、一日に一度施した。最後の処理の後、成分の血漿濃度のピークが達成される直前に、夫々の動物に麻酔をかける。へパリン化シリンジを用いて心穿刺による血液採取を行う。血液採取後すぐに、イソフルラン（ｉｓｏｆｌｏｕｒａｎｅ）の過剰投与で動物を殺処分した。夫々の血液サンプルを室温で１９００ｒｐｍで遠心分離する。血漿を採取し、分析まで−２０℃で保存する。尿を毎日測定し、脱イオン水で希釈し、フィルターで濾過し、一定分量を分析まで−２０℃で保存した。糞中排泄を毎日集めて凍結乾燥した。夫々のサンプルの重量を測り、３倍量の硝酸と１倍量の過塩素酸の混合物を用いて消化させた。乾燥した糞便１グラムごとに、１０ｍＬの酸混合物を加えた。夫々のサンプルを３日間消化させた。消化したサンプルの容量を測定し、消化物の一定量を分析まで−２０℃で保存した。血漿、糞便、および尿におけるカルシウム、マグネシウム、および亜鉛の含有量を、ＩＣＰ-ＯＥＳを用いて測定した。
【０１１６】
毎日のカルシウムバランスは、式１を使用して計算された。
【０１１７】
Ｃａバランス＝総Ｃａ摂取量（用量および食餌摂取量）−尿中に排泄されたＣａ−糞便中に排泄されたＣａ  （１）
【０１１８】
同時に、Ｃａバランスの割合が式２を用いて決定される。
【０１１９】
Ｃａバランス（％）＝Ｃａバランス／（総Ｃａ摂取量）×１００  （２）
【０１２０】
毎日の摂取量と排泄量の合計が、計算に用いられることを除いて、式（１）および式（２）を用いて、累積カルシウムバランスおよび％累積正味カルシウムバランスを計算した。マグネシウムおよび亜鉛に対するバランスもまた、式（１）および式（２）の概念を使用して算出された。累積成分バランスおよび％累積正味成分バランスは、上記のように同様な方法で計算した。
【０１２１】
一般に、尿の排出量は、糞便中排泄の５％未満である。従って、糞便中排泄は、成分バランスの量を実質的に決定する。
【０１２２】
（Ｅ．統計分析）
全ての結果を、２要因分散分析（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用して解析した。Ｐ＜０．０５は、有意に異なるものとみなされた。データは、表および図中で、平均±Ｓ．Ｄ．および平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として個別に表される。
【０１２３】
（Ｆ．結果：カルシウムを含まない食餌）
表３５は、試験中のラットの体重を示している。試験動物からの排泄物は柔らかく、この見解は成分摂取の少なさに関連づけることができる。食餌および投与からの成分が不十分であったことも、この一連の動物の体重が増加しなかったことの原因であったかもしれない。試験動物の開始体重には統計的な差（ｐ＜０．０５）がある（表３５）。さらに、処置の間には体重のわずかな減少もあるが、有意に異なる差ではない。
【０１２４】
【表３５】
2014523921.tif 000037
【０１２５】
製剤にマグネシウムおよび亜鉛を加えることで、カルシウム保持が促進される。非常に少ない量のマグネシウムおよび亜鉛を有する組成物であるＡ１は、カルシウム保持力が低く（１７％、表３６）、一方で、Ｃａ／Ｍｇの比率が２／１に増加したときに（Ａ５）、カルシウム保持が有意に高いものとなり、カルシウム保持は４９％となった（表３６）。例えば、Ａ４中に存在するように、高比率のマグネシウムは、カルシウム保持に多くの変化をもたらさない（４９％、表３６）。高いカルシウム保持をもたらすのに必要とされるマグネシウムの最少量に関して、Ｃａ／Ｍｇの比率が２／１であることが最適であると思われる。
【０１２６】
ビタミンＤ３の添加はカルシウム保持を有意に増加させる（図２および表３６）。ビタミンＤ３がＡ５に添加されるとき、カルシウム保持は６２％に増加した（表３６）。この値はＣａｌｔｒａｔｅ（商標）とＣａＡＣＥの群のそれよりも５倍以上高いものである。
【０１２７】
【表３６】
2014523921.tif 000038
【０１２８】
マグネシウムは、マグネシウムバランスを維持するために（マグネシウムの結合を防ぐために）必要であるように思われる。マグネシウムが非常に少ない製剤（Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）、ＣａＡＣＥ、およびＡ１）は、マグネシウムの正味損失の原因となった（図３および表３７）。
【０１２９】
ビタミンＤ３の添加は、マグネシウムの保持において有意な効果を何ももたらさない。ビタミンＤ３がＡ４およびＡ５に添加された後、マグネシウムの累積正味の割合は、有意には変化しなかった（図３および表３７）。
【０１３０】
【表３７】
2014523921.tif 000039
【０１３１】
亜鉛の保持は極めて変わりやすい。微量の亜鉛を含む、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）、酢酸カルシウム、およびＡ１等の製剤には特に当てはまる（表３８）。亜鉛の量が低い場合、亜鉛バランスが悪くなるという結果も示されている。
【０１３２】
例えばＡ４およびＡ５のような製剤に亜鉛を添加することは、亜鉛バランスを有意に改善するというわけではない（表３８）。製剤へのマグネシウムの添加は、亜鉛バランスを悪い状態のままにする原因となり得る（図４）。
【０１３３】
しかしながら、Ａ４およびＡ５へのビタミンＤ３の添加は、亜鉛バランスをプラスにした（図４および表３８）。亜鉛におけるビタミンＤ３の重要性は、この一連の試験において明確に実証された。
【０１３４】
図５は、個々の処置の後の血漿成分プロファイルを示している。成分処置後に観察された有意な違いはなかった。
【０１３５】
【表３８】
2014523921.tif 000040
【０１３６】
（Ｇ．結果：標準的な食餌）
標準的な食餌を与えられたラットは体重が増加した（表３９）。成分処理は、体重増加には有意な効果を及ぼさない（ｐ＞０．０５）。
【０１３７】
【表３９】
2014523921.tif 000041
【０１３８】
カルシウム保持のパターンは、カルシウムが含まれていない食餌を与えられたラットから得られたものと同じように思われ（表３６および表４０を比較）、このことは、投与されるカルシウムの量が動物の毎日の食餌摂取量のおよそ１０％（１日あたりのカルシウムの１３０から１４０ｍｇ）であったという事実にもかかわらず、カルシウムバランスは、成分の処理に依存していることを示している。この見解は、最も吸収しにくい炭酸塩形態で存在する食物カルシウムが成分の処置により強化されたことを強く示唆している。Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）を用いる処置は最小の影響を与える。Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）は、炭酸カルシウムのみを含むため、これは当然の結果である。Ａ５による処置は、最も顕著な影響を与える（図６および表４０）。
【０１３９】
【表４０】
2014523921.tif 000042
【０１４０】
試験動物によるマグネシウムの平均食餌摂取量はおよそ３５ｍｇである。全ての試験群のマグネシウムバランスは、プラスであった（図７および表４１）。この見解は、プラスのマグネシウムバランスを維持するためにマグネシウム摂取が必要であるという点で、カルシウムが含まれていない食餌を与えられた動物から得られた見解と一致している（表３７および表４１）。興味深いことに、酢酸製剤（ＣａＡＣＥ、Ａ１、Ａ４、およびＡ５対Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）に対する）で処置した動物は、一貫して高い割合のマグネシウムバランスを備えることを日々の動向が示している。
【０１４１】
【表４１】
2014523921.tif 000043
【０１４２】
亜鉛バランスの観点から成分処置の間で統計的な差は存在しなかった（図８および表４２）。成分製剤によって投与される亜鉛の量は、毎日の食餌摂取量のわずか３０％であった。大量のマグネシウムの添加は亜鉛バランスを低下させる傾向があり、これはＡ４による処置で観察される傾向であることは明らかである（図８および表４２）。この見解は、カルシウムが含まれていない食餌による試験で観察されたものと同じである（表３８）。
【０１４３】
カルシウムが含まれていない食餌試験（表３８）とは逆に、亜鉛バランスは、この試験においてプラスであった（表４２）。これはビタミンＤ３なしで達成された（図４および図８、表３８および表４２）。この明らかな不一致は、総亜鉛摂取量および／又は亜鉛が消費される速度に起因し得る。他の栄養素とともに成分の消費は、最大１２時間続く給餌期間を通じて起こった一方で、成分処置はボーラス投与で与えられた。腸壁に与えられる栄養素の濃度および比率は、ボーラス投与と食餌摂取の間に大きな相違があり得る。これらの違いが、亜鉛バランスにおける違いの主な原因となり得る。
【０１４４】
カルシウムを含まない食餌と通常の食餌からの結果は、成分の適切な毎日の摂取量が成分のバランスの鍵となることが明らかに示している。食餌にこれらの栄養素が欠けている場合、成分とビタミンＤ３の補給が必要である。
【０１４５】
図９は、個々の成分処置後の血漿中のカルシウム、マグネシウム、および亜鉛の血漿濃度を示している。成分処置後の血漿中のこれらの成分濃度には統計的な差はなかった（Ｐ＞０．０５）。
【０１４６】
【表４２】
2014523921.tif 000044
【０１４７】
（Ｈ．結果：毎日のカルシウムの消費量を含む、カルシウムが含まれていない食餌）
この試験の目的は、カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の毎日の摂取量を成分処置で置き換えた場合の成分バランスを評価することである。脱イオン水を自由に与えられた動物（ＤＩ水群）は、標準的なカルシウムの食餌が与えられた。日々のカルシウム摂取量をＡ１又はＡ５で代用する動物には、カルシウムが含まれていない食餌が与えられた。経管栄養による処置は、動物の体重に影響を与えなかったことは明らかである（表４３）。しかしながら、成分処置は、体重の有意な減少を誘発した。
【０１４８】
【表４３】
2014523921.tif 000045
【０１４９】
標準的な食餌とカルシウムが含まれていない食餌の試験から得られた結果に反して、マグネシウムは、カルシウム保持を増強することにおいてほとんど効果がなかった（図１０および表４４）。カルシウムの水溶性の形態である酢酸カルシウムの投与は、カルシウムバランスを有意に強化した（図１０および表４４）。
【０１５０】
【表４４】
2014523921.tif 000046
【０１５１】
上記のカルシウムが含まれていない食餌試験と一致して、マグネシウムは、プラスのマグネシウムバランスを維持することが要求された（図１１および表４５）。
【０１５２】
【表４５】
2014523921.tif 000047
【０１５３】
Ａ５と共に投与された大量の亜鉛にもかかわらず、亜鉛バランスは、ＤＩ水群のものよりも著しく低く、このことは、腸内の高いカルシウムとマグネシウムの濃度が、亜鉛吸収を低下させた可能性があることをさらに支持するものである（図１２および表４６）。ＤＩ水群およびＡ１群に投与された亜鉛の量は同じであった。しかしながら、Ａ５の結果と同様に、亜鉛バランスは、ＤＩ水群のそれよりも非常に低く、このことは、腸内におけるカルシウムの高濃度溶液が、亜鉛吸収を阻害し得ることを示している。
【０１５４】
この一連の結果は、成分の食餌での摂取量が、同等のボーラス投与のそれと比較して同じ効果をもたらさないことを示している。
【０１５５】
すべての試験結果を考慮すると、Ａ５が、異なる実験／食餌条件下で、もっとも一貫したカルシウムバランスをもたらす（表３６、４０、および４４の結果を比較する）。被験体が食餌による成分を欠いているとき、ビタミンＤ３の追加はＡ５のカルシウム保持を高める（表３６）。
【０１５６】
図１３は、夫々の成分処置後のカルシウム、マグネシウム、および亜鉛の血漿濃度を示している。これらのプロファイルには、統計的な差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。
【０１５７】
【表４６】
2014523921.tif 000048
【０１５８】
（実施例７）
本試験の目的は、卵巣切除ラットモデルにおける骨量の減少率に対する、塩、ミネラル組成物、およびビタミンの影響を評価することである。
【０１５９】
生後４．５か月のメスＳＤラット１００匹を用い、香港中文大学の実験動物サービスセンターで、１２時間の明暗周期で飼育した。自由なケージの移動を認め、標準的なカルシウムペレットと水道水を利用できるようにした。カルシウムの日々の消費量はおよそ１４０ｍｇであり、バランス試験に加わった動物において記録されたものと同じであった。卵巣摘出（ＯＶＸ）、つまりメスのラットからの卵巣の除去は、シャム対照群（ｓｈａｍ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を除いて生後６か月の全てのラットで行った。
【０１６０】
ＯＶＸの３週間後、全てのラットは外科手術の外傷から回復した。ラットは、異なる処置群又は対照群に任意に分けられ、夫々の群は６匹のラットから構成された。４種類のカルシウム製剤（Ａ１、Ａ４、Ａ５およびＡ６）およびＣａｌｔｒａｔｅ（商標）を本試験で調べた。Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）は、成分処置の対照群として機能した。全ての製剤を蒸留水に溶解させた一方で、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）を蒸留水に懸濁した。溶液又は懸濁液を、経管栄養により８週間毎日ラットに与えた。全ての製剤の用量を、一日当たり５３．１４ｍｇ／ｋｇのカルシウム用量に基づいて計算した。ビタミンＤ３およびビタミンＫ２の用量は、夫々一日当たり１２．７５ＩＵ／ｋｇ（一日当たり７０ｋｇ男子に８００ＩＵに相当）、および、一日当たり１．７１μｇ／ｋｇ（一日当たり７０ｋｇ男子に１２０μｇに相当）であった。全ての処置されたラットの体重を毎日測定し、大量のデータを記録した。二つの対照群（シャム対照群および通常の対照群）におけるラットに、等量の蒸留水を同時に与えた。ビスホスフォネートの処置群に関して、アレンドロネート（１４μｇ／ｋｇ／２週間）を、ラットの背中の皮下に２週間に１回注射した。
【０１６１】
８週後に、イソフルランを用いてラットに麻酔をかけた。その後、心穿刺によって血液サンプルを採取した。その後、麻酔下で頚椎脱臼によりラットを安楽死させ、夫々のラットの右股関節、右大腿骨、および頸骨を分析のために集められた。血液サンプルを１５００ｇで１５分、遠心分離にかけ、血漿を集めた。カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の血漿濃度を、ＩＣＰ−ＯＥＳを使用して測定した。
【０１６２】
結果によると、血漿中のカルシウムレベルは、シャム対照群と統計学的に異なることはなく（Ｐ＞０．０５）、その値は全て、通常レベル（９０−１１０ｍｇ／Ｌ）以内であることが示されている。全ての血漿中のＭｇ濃度は、通常の範囲内（１８−３６ｍｇ／Ｌ）であった。通常の対照群（外科手術なし）が、Ａ４＋ビタミンＤ＋ビタミンＫの平均値よりも高い平均値であったことを除けば、血漿中のマグネシウム濃度に有意な差は認められなかった（Ｐ＞０．０５）。同様に、全てのラットにおける血漿中の亜鉛の濃度は、およそ１．２６ｍｇ／Ｌのラットの通常濃度に達した。通常対照群におけるラットの血漿中の亜鉛濃度は、シャム対照群のラット、並びに、Ａ５＋ビタミンＤおよびＡ４＋ビタミンＤ＋ビタミンＫで処置されたラットの値よりも顕著に高かった（ｐ＜０．０５）。
【０１６３】
異なる処置群での体重変化が図１４に示されている。予想通り、ＯＶＸラットにおける体重の増加は通常のラットよりも著しく大きかった（ｐ＜０．０５）。
【０１６４】
骨ミネラル密度（ＢＭＤ）における試験物質の効果が図１５および１６に示されている。Ａ１群、Ａ５＋ビタミンＤ群、ビス＋Ａ１＋ビタミンＤ群、ビス＋Ａ４＋ビタミンＤ群、ビス＋Ａ５＋ビタミンＤ群、および、ビス＋Ｃａｌｔｒａｔｅ＋ビタミンＤ群の大腿遠位の海綿骨のＢＭＤ値は、ＯＶＸ対照群の値よりも有意に高く（図１５）、これらの処置が骨量の損失率を減速させることを示している。ビタミンＫの添加には、骨量の減少率を低下させる有意な効果はなかった。Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）の値が統計学的に異なるほど十分に高かったことを除けば、頸骨近位端の海綿骨のＢＭＤの平均値についても同様の見解が得られた（ｐ＜０．０５、図１６）。この場合も、ビタミンＫは、少しも有意な貢献を示さなかった。Ａ５＋ビタミンＤを用いた処置は、大腿遠位および頸骨近位端で一貫して高いＢＭＤをもたらし、この製剤が他の成分製剤よりも優れた利点を有することを示している。ビスホスフォネートの添加は一貫して良い結果を提供しているが、Ａ５＋ビタミンＤの製剤と、例えばＡ１のような他の成分製剤とを比較した場合、その差は有意なものではなかった（図１５および図１６）。
【０１６５】
Ａ１のＢＭＤ結果は、Ａ５＋ビタミンＤの結果と同じである。Ａ１動物は、かなりの量のマグネシウムを含む標準的なカルシウム食餌を与えられていたため、当然の結果である。
【０１６６】
本試験で使用されるＯＶＸラットモデルは、夫々の処置後、最大の曲げ力と障害エネルギー（ｆａｉｌｕｒｅ  ｅｎｅｒｇｙ）の評価を可能とするものではなかった。というのは、ＯＶＸ対照群およびシャム対照群から得られる値がそれぞれわずかしか異なっていなかったからである（ｐ＞０．０５）。
【０１６７】
（実施例８）
（Ａ５によるジュースの栄養強化）
フルーツジュースはリンゴ酸、クエン酸などのような多くの酸を含んでおり、これらは、溶解度を変化させ、ゆえに製剤中の３つの重要な成分の回復を変化させ、それによってジュースの形態で投与されるとこれらの成分の吸収性を変化させることもある。
【０１６８】
この研究の目的は、濾したおよび濾していないオレンジ、ブドウ、およびニンジンのジュースと混ぜ合わせた後に、Ａ５中のカルシウム、マグネシウム、および亜鉛の回復に対する温度と保存の効果を評価することであった。
【０１６９】
２．６ｇまたは５００ｍｇの量のＡ５を正確に量り、３３０ｍｌの水、あるいは、濾したまたは濾していないブドウ、オレンジ、またはニンジンのジュースと混ぜ合わせた。試料を４℃または２１℃で調製した。成分含有量をＩＣＰ−ＯＥＳを使用して測定した。
【０１７０】
オレンジ、ブドウ、およびニンジンのジュースのなかに少量のカルシウム、マグネシウム、および亜鉛が見つかった（表４７、５０、および５３）。２．６ｇのＡ５を研究に用いると、温度とろ過は、Ａ５のカルシウム、マグネシウム、および亜鉛の回復には効果がなかった（表４８、５１および５４）。
【０１７１】
【表４７】
2014523921.tif 000049
【０１７２】
【表４８】
2014523921.tif 000050
【０１７３】
【表４９】
2014523921.tif 000051
【０１７４】
【表５０】
2014523921.tif 000052
【０１７５】
【表５１】
2014523921.tif 000053
【０１７６】
【表５２】
2014523921.tif 000054
【０１７７】
同様に、温度は蒸留水中のＡ５成分の回復には効果がない（表５２）。
【０１７８】
２．６ｇのＡ５を、３３０ｍｌの濾したまたは濾していないオレンジジュースとブドウジュースに溶かしたとき、一週間４℃で保存すると、カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の回復には変化がなかった（表４８および５１）。しかしながら、５００ｍｇのＡ５をその代わりに用いると、カルシウムとマグネシウムの回復は、濾していないオレンジジュースから有意に低下した（表４９）。濾していないオレンジジュースからのカルシウムの回復の低下は、オレンジジュース中の果肉（ｐｕｌｐ）がＡ５中のカルシウムおよびマグネシウムを結合させ得ることを示唆している。ニンジンジュースではこの問題は生じなかった（表５４）。
【０１７９】
【表５３】
2014523921.tif 000055
【０１８０】
【表５４】
2014523921.tif 000056
【０１８１】
この一連の研究は、多くのジュースや水の栄養を強化するためにＡ５を使用することができるということを示唆している。２．６ｇのＡ５は、骨粗鬆症の防止のための日々の３つの重要な成分の一日の必要量：３００ｍｇのカルシウム、１５０ｍｇのマグネシウム、および５．６ｍｇの亜鉛を提供する。５００ｍｇのＡ５は、機能性食品の形態でこれらの成分の一人分を提供するように意図されている。
【０１８２】
（実施例９）
（錠剤製剤組成物）
Ａ５中の比較的低いカルシウム含有量は、エンドユーザに許容可能な大きさの固体形態を作る際の難問をもたらした。以下の製剤が錠剤形態で作られた（表５５）。
【０１８３】
【表５５】
2014523921.tif 000057
【０１８４】
上記表の酢酸カルシウム混合物は、１４％の酢酸カルシウム、７％の酢酸マグネシウム、および０．７％の酢酸亜鉛を含む。ステアリン酸マグネシウムが潤滑剤として使用された。
【０１８５】
乾燥したビタミンＤ３  １００ＧＦＰ／ＨＰ組成物（ＢＡＳＦによって提供された分析証明書で言及された通り）は、以下のとおりである：
【０１８６】
【表５６】
2014523921.tif 000058
【０１８７】
分析値：１００，０００ＩＵビタミンＤ３／ｇ（＝２５００マイクログラムのコレカルシフェロール／ｇ）。１つの錠剤当たりのビタミンＤ３の標的重量は２．５ｍｇである。過多量として１つの錠剤当たり、３０％の余分なビタミンＤ３が加えられた。製造業者の分析値は１０００００ＩＵ／ｇ、すなわち、１００ＩＵ／ｍｇである。２．５ｍｇ（３０％の過剰を含めて３．２５ｍｇ）が使用されたので、各錠剤には〜２５０ＩＵのビタミンＤ３がある。
【０１８８】
錠剤は以下の工程によって作られた。
【０１８９】
工程１：調製された酢酸カルシウム混合物を、４０の網目スクリーンと１００／１２０の網目スクリーンを通ってふるいにかけた。４０の網目スクリーンを通り抜けて、１００／１２０の網目スクリーン上で保持された画分を、製剤に使用した。４０の網目の上にあり、１００の網目の下にある酢酸カルシウムの画分は、製剤には使用しなかった。この画分は、粒度をビタミンＤ３およびコリドン（Ｋｏｌｌｉｄｏｎ）Ｖａ６４などの他の成分と同じ大きさに保つために選ばれた。
【０１９０】
工程２：混合０１：６．５ｇの分注した乾燥ビタミンＤ３  １００ＧＦＰ／ＨＰと、６５ｇのＯＦ  Ｋｏｌｌｉｄｏｎ  ＶＡ６４を、小さなタンブラー式混合機（ｔｕｍｂｌｅ  ｂｌｅｎｄｅｒ）を用いて２５ｒｐｍの速度で５分間混合することで、混合物０１を得た。
【０１９１】
工程３：混合０２：工程１で調製した２５０ｇの分注した酢酸カルシウム混合物（混合物０１＊  ３．４９）を、工程２で調製した混合物０１と（２５−３０ｒｐｍでタンブラー式混合機を使用して）５分間混合させることで、混合物０２を得た。
【０１９２】
工程４：混合０３：工程１で調製した２５０ｇの分注した酢酸カルシウム混合物を、工程３で調製した混合物０２と（２５−３０ｒｐｍで二重円錐型混合機を用いて）５分間混合することで、混合物０３を得た。
【０１９３】
工程５：混合０４：工程１で調製した６００ｇの分注した酢酸カルシウム混合物を、工程４で調製した混合物０３と（２５−３０ｒｐｍで二重円錐型混合機を使用して）９分間混合することで、混合物０４を得た。
【０１９４】
工程６：混合０５：５．８６ｇの分注したステアリン酸マグネシウムを、工程５で調製した混合物０４と２分間混合した。
【０１９５】
工程７：上で調製した最終的な混合物を、回転式錠剤押圧機（Ｒｏｔａｒｙ  ｔａｂｌｅ  ｐｒｅｓｓ）を用いて分注し、標的錠剤の重量を５８８．７ｇとする。
【０１９６】
以下の製剤も錠剤の形態で作られた。          
【０１９７】
【表５７】
2014523921.tif 000059
【０１９８】
上記表の酢酸カルシウム混合物は、１４％の酢酸カルシウム、７％の酢酸マグネシウム、および０．７％の酢酸亜鉛を含む。ステアリン酸マグネシウムが潤滑剤として使用された。
【０１９９】
乾燥したビタミンＤ３  １００ＧＦＰ／ＨＰ組成物は（ＢＡＳＦによって提供された分析証明書で言及された通り）は、上に示された通りである。
【０２００】
分析値：１００，０００ＩＵビタミンＤ３／ｇ（＝２５００マイクログラムのコレカルシフェロール／ｇ）。１つの錠剤当たりのビタミンＤ３の標的重量は５ｍｇである。分解による損失を補うために、１つの錠剤当たり３０％の余分なビタミンＤ３が加えられた。製造業者の分析値は、１０００００ＩＵ／ｇ、すなわち、１００ＩＵ／ｍｇである。５ｍｇ（３０％の過剰分を含めて６．５ｍｇ）が使用されたので、各錠剤には〜５００ＩＵのビタミンＤ３がある。
【０２０１】
錠剤は以下の工程によって作られた。
【０２０２】
工程１：調製された酢酸カルシウム混合物を、４０の網目スクリーンと１００／１２０の網目スクリーンを通ってふるいにかけた。４０の網目スクリーンを通り抜けて、１００／１２０の網目スクリーン上で保持された画分を、製剤に使用した。４０の網目の上にあり、１００の網目の下にある酢酸カルシウムの画分は、製剤には使用しなかった。この画分は、粒度をビタミンＤ３およびＫｏｌｌｉｄｏｎ  Ｖａ６４などの他の成分と同じ大きさに保つために選ばれた。
【０２０３】
工程２：混合０１：１３ｇの分注した乾燥ビタミンＤ３  １００ＧＦＰ／ＨＰと、１３０ｇのＯＦ  Ｋｏｌｌｉｄｏｎ  ＶＡ  ６４を、小さなタンブラー式混合機を用いて２５ｒｐｍの速度で５分間混合することで、混合物０１を得た。
【０２０４】
工程３：混合０２：工程１で調製した５００ｇの分注した酢酸カルシウム混合物（混合物０１  ＊  ３．４９）を、工程２で調製した混合物０１と（２５−３０ｒｐｍで二重円錐型混合機を用いて）５分間混合することで、混合物０２を得た。
【０２０５】
工程４：混合０３：工程１で調製した５００ｇの分注した酢酸カルシウム混合物を、工程３で調製した混合物０２と（２５−３０ｒｐｍで二重円錐型混合機を用いて）５分間混合することで、混合物０３を得た。
【０２０６】
工程５：混合０４：工程１で調製した１２００ｇの分注した酢酸カルシウム混合物を、工程４で調製した混合物０３と（２５−３０ｒｐｍで二重円錐型混合機を用いて）９分間混合することで、混合物０４を得た。
【０２０７】
工程６：混合０５：１１．７２ｇの分注したステアリン酸マグネシウムを、工程５で調製した混合物０４と２分間混合した。
【０２０８】
工程７：上で調製した最終的な混合物を、回転式錠剤押圧機を用いて分注し、標的の錠剤重量は１．１７ｇとする。
【０２０９】
これら２つの製剤の大きさが、試験集団にとって許容可能なものであることが分かった。
【０２１０】
（実施例１０）
（魚油からなるジェルカプセル製剤）
酢酸カルシウム混合物用のジェルカプセル製剤は、エンドユーザによる受け入れ、ビタミンＤ３の溶解度の増加、および、骨ミネラル密度に対する効能の増加を強化するために作られた。
【０２１１】
ビタミンＤ３は脂溶性ビタミンである。ビタミンＤ３は脂肪親和性の強い物質を用いて溶かすことができる。
【０２１２】
オメガ３−６−９脂肪酸を含む魚油は、骨の健康に対して有意な効果を有することが知られている（３２）。この油には、実施例９に述べられているように、ビタミンＤ３を溶解させて、酢酸カルシウム混合物の顆粒プロセスを除去するという利点もある。
【０２１３】
魚油は粉末から空気を取り除くことによって酢酸カルシウム混合物の充填密度を増加させる能力を有することが分かっている。
【０２１４】
油と酢酸カルシウムの混合比率の例は、限定されないが、１：１、１．５：１、および２：１を含んでいる。
【０２１５】
油とカルシウムの比率の例は、限定されないが、１：０．１４、１．５：１、および２：１を含んでいる。
【０２１６】
油とマグネシウムの比率の例は、限定されないが、１：０．０７、１．５：０．０７、および２：０．０７を含んでいる。
【０２１７】
油と亜鉛の比率の例は、限定されないが、１：０．００７、１．５：０．００７、および２：０．００７を含んでいる。
【０２１８】
ビタミンＤ３の投与量は３０乃至３００ＩＵまで及ぶ。
【０２１９】
ソフトジェルカプセルは、従来の方法を用いて製造することができる（３３）。
【０２２０】
１日当たり２〜４つのカプセルになる投与量の、この混合物から作られたジェルカプセルが許容可能となる。ジェルカプセルの大きさは、実施例９に記載の大きさと同等かそれよりも小さい。
【０２２１】
（実施例１１）
（成分製剤の最適化）
この実施例の目的は、骨の健康を支援するために、カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の酢酸塩とビタミンＤ３の最適な混合を提供する成分製剤を設計することである。
【０２２２】
カルシウムの生物学的利用能はカルシウム塩の溶解度とは無関係であると一般には信じられている（Ｈｅａｎｅｙ、１９９９）。低濃度のマグネシウムと亜鉛は骨粗鬆症に関連付けられている（Ｍｕｔｌｕら、（１１））。ビタミンＤ３はカルシウム吸収を増強し（Ｃｈｒｉｓｔａｋｏｓ  ｅｔ．ａｌ．，２０１１）、したがって、理想的な成分製剤の重要な要素である。
【０２２３】
本発明で示された結果は、カルシウムの生物学的利用能が胃腸液中のカルシウム塩の溶解度に依存することを明白に示している。カルシウム対マグネシウムの最適比率は、カルシウム吸収を増強するために必要とされる。ビタミンＤ３は、カルシウム吸収を増加させ、亜鉛の除去を防ぐのに貢献する。
【０２２４】
カルシウム、マグネシウム、亜鉛、およびビタミンＤ３を含む製剤は機能しないこともある。というのも、成分の形態とビタミンＤ３の量は、吸収可能な画分の観点で必ずしも正しい比率では処方されないからである。カルシウム、マグネシウム、亜鉛、およびビタミンＤ３の混合物が臨床効果に欠けていることが、その良い例である（Ｂｒａａｍ  ｅｔ．ａｌ．，２００３）。カルシウム吸収と、カルシウム補給による骨ミネラル密度についての曖昧な臨床治験の結果に関する文献の混乱が、カルシウム混合物の最適な製剤を設計する当業者に難題を与えてきた。
【０２２５】
ビタミンＤ３を適切に加えた、カルシウム、マグネシウム、および亜鉛の酢酸塩を用いて、最適なカルシウム栄養補助食品が設計される。カルシウム対マグネシウムの比率は、一般に２：１であり、マグネシウム対亜鉛の比率は１０：１であり、ビタミンＤ３の一日投与量は５００乃至１０００ＩＵまでに及ぶ。
【０２２６】
本発明に記載のカルシウムの生物学的利用能は、Ｃａｌｔｒａｔｅ（商標）のそれよりも約２〜３倍高い。カルシウムの投与量はＣａｌｔｒａｔｅ（商標）の投与量の半分から３分の一にしなければならない。
【０２２７】
すべての供給源からのカルシウムの推奨される摂取量は１０００ｍｇである。栄養源からのカルシウムの平均摂取量は４００ｍｇである。６００ｍｇのカルシウムが栄養補助食品として与えられるように推奨されており、通常、このことは、カルシウムの供給源が炭酸カルシウムであることを示唆している。本発明からのカルシウムの推奨される投与量は２００〜３００ｍｇである。これは１００〜１５０ｍｇのマグネシウムと、５〜７．５ｍｇの亜鉛を提供する。食餌での摂取に加えて、マグネシウムと亜鉛の補給は、成分の適切な一日の所要量も提供する。
【０２２８】
（参考文献）
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４．  Ｈｅａｎｅｙ  ＲＰ  （１９９３）  Ｔｈｉｎｋｉｎｇ  ｓｔｒａｉｇｈｔ  ａｂｏｕｔ  ｃａｌｃｉｕｍ．  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３２８（７）：５０３−５０５．
５．  Ｈｅａｎｅｙ  ＲＰ  （１９９３）  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．  Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３：２８７−３１６．
６．  Ｒｉｉｓ  Ｂ，  Ｔｈｏｍｓｅｎ  Ｋ，  ＆  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  Ｃ  （１９８７）  Ｄｏｅｓ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ？  Ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ．  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３１６（４）：１７３−１７７．
７．  Ｈｕｎｔ  ＣＤ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＬＫ  （２００７）  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ：  ｎｅｗ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｎ  ａｎｄ  ｗｏｍｅｎ  ｂｙ  ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｂａｌａｎｃｅ  ｄａｔａ  ｆｒｏｍ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ８６（４）：１０５４−１０６３．
８．  Ｂａｓｓ  Ｍ，  Ｆｏｒｄ  ＭＡ，  Ｂｒｏｗｎ  Ｂ，  Ｍａｕｒｏｍｏｕｓｔａｋｏｓ  Ａ，  ＆  Ｋｅａｔｈｌｅｙ  ＲＳ  （２００６）  Ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｍｏｒａｌ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｗｏｍｅｎ．  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ９９（２）：１１５−１２２．
９．  Ｋａｎｄｅｒｓ  Ｂ，  Ｄｅｍｐｓｔｅｒ  ＤＷ，  ＆  Ｌｉｎｄｓａｙ  Ｒ  （１９８８）  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｓｓ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｗｏｍｅｎ．  Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ３（２）：１４５−１４９．
１０．  Ｃｅｌｏｔｔｉ  Ｆ  ＆  Ｂｉｇｎａｍｉｎｉ  Ａ  （１９９９）  Ｄｉｅｔａｒｙ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ｍｉｎｅｒａｌ／ｖｉｔａｍｉｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ：  ａ  ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉａｌ  ｐｒｏｂｌｅｍ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７（１）：１−１４．
１１．  Ｍｕｔｌｕ  Ｍ，  Ａｒｇｕｎ  Ｍ，  Ｋｉｌｉｃ  Ｅ，  Ｓａｒａｙｍｅｎ  Ｒ，  ＆  Ｙａｚａｒ  Ｓ  （２００７）  Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ，  ｚｉｎｃ  ａｎｄ  ｃｏｐｐｅｒ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｔｉｃ，  ｏｓｔｅｏｐｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｐｏｓｔ−ｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３５（５）：６９２−６９５．
１２．  Ａｂｒａｍｓ  ＳＡ  ＆  Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ＳＡ  （２００３）  Ｃａｌｃｉｕｍ，  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ，  ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｆｏｏｄｓ．      Ｊ  Ｎｕｔｒ  １３３（９）：２９９４Ｓ−２９９９Ｓ．
１３．  Ｌｏｗｅ  ＮＭ，  Ｌｏｗｅ  ＮＭ，  Ｆｒａｓｅｒ  ＷＤ，  ＆  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＭＪ  （２００２）  Ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｃｏｐｐｅｒ  ａｎｄ  ｚｉｎｃ  ｆｏｒ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ？      Ｔｈｅ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ６１（２）：１８１−１８５．
１４．  Ｓａｌｔｍａｎ  ＰＤ  ＆  Ｓｔｒａｕｓｅ  ＬＧ  （１９９３）  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｃｅ  ｍｉｎｅｒａｌｓ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ．      Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １２（４）：３８４−３８９．
１５．  Ａｎｇｕｓ  ＲＭ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＰＮ，  Ｐｏｃｏｃｋ  ＮＡ，  ＆  Ｅｉｓｍａｎ  ＪＡ  （１９８８）  Ｄｉｅｔａｒｙ  ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ．      Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｍｉｎｅｒａｌ  ４（３）：２６５−２７７．
１６．  Ａｎｇｕｓ  ＲＭ，  Ｐｏｃｏｃｋ  ＮＡ，  ＆  Ｅｉｓｍａｎ  ＪＡ  （１９８８）  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔａｋｅ  ｏｆ  ｐｒｅ−  ａｎｄ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｃａｌｃｉｕｍ．      Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ４２（７）：６１７−６２５．
１７．  Ａｂｒａｈａｍ  ＧＥ  ＆  Ｇｒｅｗａｌ  Ｈ  （１９９０）  Ａ  ｔｏｔａｌ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｅｍｐｈａｓｉｚｉｎｇ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｉｎｓｔｅａｄ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｆ  ｃａｌｃａｎｅｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｉｎ  ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  ｗｏｍｅｎ  ｏｎ  ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．      Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３５（５）：５０３−５０７．
１８．  Ｂｏ−Ｌｉｎｎ  ＧＷ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ａｎ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｃａｌｃｉｕｍ．      Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ７３（３）：６４０−６４７．
１９．  Ｔｓｕｇａｗａ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ，  ＤＬ−ｃａｌｃｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ，  Ｌ−ｃａｌｃｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｅ  ａｎｄ  ｐｏｗｄｅｒｅｄ  ｏｙｓｔｅｒ  ｓｈｅｌｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｏｒ  −ｒｅｐｌｅｔｅ  ｒａｔｓ．      Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＆  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １８（５）：６７７−６８２．
２０．  Ｈｅａｎｅｙ  ＲＰ，  Ｄｏｗｅｌｌ  ＭＳ，  ＆  Ｂａｒｇｅｒ−Ｌｕｘ  ＭＪ  （１９９９）  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｓ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ａｎｄ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｓａｌｔｓ，  ｗｉｔｈ  ｓｏｍｅ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ  Ｉｎｔ  ９（１）：１９−２３．
２１．  Ｈｅａｎｅｙ  ＲＰ，  Ｄｏｗｅｌｌ  ＭＳ，  Ｂｉｅｒｍａｎ  Ｊ，  Ｈａｌｅ  ＣＡ，  ＆  Ｂｅｎｄｉｃｈ  Ａ  （２００１）  Ａｂｓｏｒｂａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｓｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ２０（３）：２３９−２４６．
２２．  Ｔｓｕｇａｗａ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｆｒｏｍ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ｉｎ  ｒａｔｓ．      Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １７（１）：３０−３６．
２３．  Ｃａｉ  Ｊ，  Ｚｈａｎｇ  Ｑ，  Ｗａｓｔｎｅｙ  ＭＥ，  ＆  Ｗｅａｖｅｒ  ＣＭ  （２００４）  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｓｃｏｒｂａｔｅ  ａｎｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  （Ｍａｙｗｏｏｄ，  Ｎ．Ｊ  ２２９（１）：４０−４５．
２４．  Ｃｏｕｄｒａｙ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｔｅｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｇ  ｓａｌｔｓ  ｉｎ  Ｍｇ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｒａｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｍａｇｎｅｓ  Ｒｅｓ  １８（４）：２１５−２２３．
２５．  Ｌｅｅ  ＨＨ，  Ｐｒａｓａｄ  ＡＳ，  Ｂｒｅｗｅｒ  ＧＪ，  ＆  Ｏｗｙａｎｇ  Ｃ  （１９８９）  Ｚｉｎｃ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．    Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２５６（１  Ｐｔ  １）：Ｇ８７−９１．
２６．  Ａｂｒａｍｓ  ＳＡ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＩＪ，  ＆  Ｈｅｒｍａｎ  Ｓ  （２００２）  Ｕｓｉｎｇ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｓｏｔｏｐｅｓ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｔｈｅ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍｉｎｅｒａｌｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄ  ｆｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．      Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ２３（３  Ｓｕｐｐｌ）：１５８−１６５．
２７．  Ｓｍｉｔｈ  ＪＣ，  Ｊｒ．，  Ｍｏｒｒｉｓ  ＥＲ，  ＆  Ｅｌｌｉｓ  Ｒ  （１９８３）  Ｚｉｎｃ：  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ，  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｄｉｅｔａｒｙ  ａｌｌｏｗａｎｃｅｓ．      Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ  １２９：１４７−１６９．
２８．  Ｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ  Ｌ  ＆  Ｂｕｏｎｏ  ＬＣ  （１９９９）  Ｏｆｆｉｃｅ  ＵＳＰａＴ．
２９．  Ｗａｌｓｄｏｒｆ  ＮＢ，  Ａｌｅｘａｎｄｒｉｄｅｓ  Ｇ，  ＆  Ｐａｋ  ＣＹＣ  （１９９１）  Ｏｆｆｉｃｅ  ＵＳＰａＴ．
３０．  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＳＤ  ＆  Ｂｌｕｍｂｅｒｇ  ＪＢ  （１９９７）  Ｏｆｆｉｃｅ  ＵＳＰａＴ．
３１．  Ｌｉ  Ｊ  ＆  Ｌｉ  Ｘ  （１９９５）  Ｐ．Ｒ．Ｃ．  ＳＩＰＯｏＴ．
３２．  Ｗｅｉｓｓ  ＬＡ，  Ｂａｒｒｅｔｔ−Ｃｏｎｎｏｒ  Ｅ，  ＆  ｖｏｎ  Ｍｕｈｌｅｎ  Ｄ  （２００５）  Ｒａｔｉｏ  ｏｆ  ｎ−６  ｔｏ  ｎ−３  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎ  ｏｌｄｅｒ  ａｄｕｌｔｓ：  ｔｈｅ  Ｒａｎｃｈｏ  Ｂｅｒｎａｒｄｏ  Ｓｔｕｄｙ．      Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ８１（４）：９３４−９３８．
３３．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＪＴ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９７５）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ）  １５ｔｈ  Ｅｄ．
【図１】
2014523921.tif 000060
【図２】
2014523921.tif 000061
【図３】
2014523921.tif 000062
【図４】
2014523921.tif 000063
【図５】
2014523921.tif 000064
【図６】
2014523921.tif 000065
【図７】
2014523921.tif 000066
【図８】
2014523921.tif 000067
【図９】
2014523921.tif 000068
【図１０】
2014523921.tif 000069
【図１１】
2014523921.tif 000070
【図１２】
2014523921.tif 000071
【図１３】
2014523921.tif 000072
【図１４】
2014523921.tif 000073
【図１５】
2014523921.tif 000074
【図１６】
2014523921.tif 000075
【国際調査報告】
2014523921.tif 000076
2014523921.tif 000077
2014523921.tif 000078