(57)【要約】  綿繊維などの成熟植物繊維から、およびテキスタイルから、ペプチド、タンパク質、および核酸をはじめとする生体高分子を単離する方法が提供される。生体高分子を使用して、植物繊維を特性解析（産生植物の原料、起源、ゲノム組成など）し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．植物繊維から、多糖類またはリグニン以外の前記植物繊維中の天然の生体高分子を単離するステップと、
ｂ．前記生体高分子のモノマー配列中にコードされる情報を特性解析するステップと
を含んでなる、成熟植物繊維または加工植物繊維を特性解析する方法。
【請求項２】
ａ．植物繊維から、多糖類またはリグニン以外の前記植物繊維中の天然の生体高分子を単離するステップと、
ｂ．前記植物繊維に対して特異的な検出アッセイを前記生体高分子に実施するステップと
を含んでなる、成熟植物繊維または加工植物繊維を同定する方法。
【請求項３】
前記植物繊維が種子繊維である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物繊維が綿繊維である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記生体高分子がポリペプチド、タンパク質、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡの群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記検出アッセイがポリメラーゼ連鎖反応に基づく検出アッセイである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出アッセイが抗体に基づく検出アッセイである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記検出アッセイが核酸ハイブリダイゼーションに基づく検出アッセイである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記検出アッセイが繊維産生植物のゲノム中に存在するキメラ遺伝子の存在または不在を検出する、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記キメラ遺伝子が、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、ＥＰＳＰＳ、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）結晶タンパク質の殺虫性部分、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）グルコヒドロラーゼ、スクロースシンターゼ、スクロースリン酸シンターゼ、グルカナーゼ、セルロースシンターゼ、キチナーゼ、エクスパンシン、カロースシンターゼ、キナーゼ、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンセターゼまたはニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼから選択される、コード領域またはその一部またはアンチセンス部分を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出アッセイが事象特異的検出アッセイである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出アッセイが繊維産生植物のゲノム中に存在する特定の対立遺伝子の存在または不在を検出する、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記繊維が、糸、布帛、薄織物または完成服飾品中に存在する、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ．植物の成熟または加工繊維から前記植物繊維中の天然の核酸を単離するステップと、
ｂ．前記核酸にゲノム分析プロトコルを実施するステップと
を含んでなる、繊維産生植物のゲノムを分析する方法。
【請求項１５】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、および二本鎖ＲＮＡの群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸にゲノム分析プロトコルを実施する前に、前記単離されたＤＮＡに全ゲノム増幅ステップを実施する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
古い成熟繊維、または古い糸、布帛または完成服飾品に適用される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ａ．収穫された成熟植物繊維から葉および茎夾雑物を除去するステップと、
ｂ．前記植物繊維を洗剤、プロテアーゼ、および塩を含有する溶解緩衝液中で長時間、好ましくは４〜１００時間にわたりインキュベートするステップと、
ｃ．前記溶解緩衝液を標準核酸単離法に従って処理して前記ＤＮＡを単離するステップと
を含んでなる、成熟植物繊維または加工植物繊維から核酸を単離する方法。
【請求項２０】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ａ．布帛の糸を解すステップと、
ｂ．前記糸を洗剤、プロテアーゼ、および塩を含有する溶解緩衝中で長時間、好ましくは４〜１００時間にわたりインキュベートするステップと、
ｃ．前記溶解緩衝液を標準核酸単離法に従って処理して前記核酸を単離するステップと
を含んでなる、織布またはメリヤスから核酸を単離する方法。
【請求項２２】
前記核酸がＤＮＡである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
取引される植物繊維のアイデンティティを証明するプロセスにおける、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項２４】
ａ．植物繊維混合物から、多糖類またはリグニン以外の前記植物繊維中の天然の生体高分子を単離するステップと、
ｂ．前記各植物繊維に対して特異的な検出アッセイを前記生体高分子に実施するステップと、
ｃ．各繊維の相対量を判定するステップと
を含んでなる、成熟または加工植物繊維混合物中の異なる植物繊維の相対量を判定する方法。
【請求項２５】
ａ．特定のゲノム組成物を含んでなり特定銘柄の綿繊維を産生する認定綿種子の登録生産者による購入を記録するステップと、
ｂ．前記登録生産者によって前記認定綿種子から生産される未加工綿繊維の梱を前記特定銘柄の綿繊維として登録するステップと、
ｃ．前記梱を前記種子購入記録との照合によって認証するステップと、
ｄ．前記登録梱を紡績工場に提供して、好ましくは主に前記銘柄の綿繊維から、特に排他的に前記銘柄の綿繊維から、糸、布帛または服飾品を製造するステップと、
ｅ．請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記銘柄の綿繊維のアイデンティティを１つ以上のステップで監査するステップと
を含んでなる、取引される綿繊維のアイデンティティを証明する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、綿繊維などの成熟植物繊維から、ペプチド、タンパク質、および核酸をはじめとする生体高分子を単離する方法に関する。植物繊維は生体高分子の単離前に糸に加工されていてもよく、それは次に布帛または完成服飾品に織られまたは編まれてもよい。単離された高分子は、それらの構成単位の配列中にコードされた情報を含有するので、目下記載される方法に従って植物繊維から単離されるこれらの高分子を好都合に使用して、植物繊維を特性解析し、または植物繊維の起源または原料を同定してもよい。得られた情報は、例えば特殊植物繊維のための同一性保持プログラムにおいて、植物繊維の起源の証明において、または植物繊維の歴史的原料を使用した繁殖純血種の再構築においてさえ使用してもよい。
【背景技術】
【０００２】
植物繊維は、紙、ロープ類（コードおよびロープ）、およびテキスタイルなどの経済的に重要な製品の原料を構成する。繊維は植物学的に、セルロースおよび通常、リグニンから大部分ができている硬質で分厚い細胞壁がある、成熟時に死んで中空となった細長い先細り細胞と定義される。軟質または靱皮繊維は、双子葉植物茎（亜麻、ジュート、麻、ラミー）の師部（内部樹皮）に見られる。硬質または葉繊維は単子葉植物葉維管束（サイザル、マニラ麻、パイナップル）に見られる。表面繊維は、種子（綿）、葉または果実（ココナツコイア）の表面に生える。
【０００３】
綿はテキスタイル産業に高品質繊維の大半を提供し、古典的方法または綿植物のゲノムの遺伝的改変のどちらかによる育種を通じて、産業の要件に適する特徴がある綿繊維を得るために多大な努力が傾けられている。
【０００４】
綿繊維は、開花時にまたはその直前に、種子毛茸として、より具体的には胚珠の外珠皮の表皮に始まる単細胞として発生する。綿繊維の形態学的発達は、文献で十分に立証されている（Ｂａｓｒａ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｋ，１９８４，Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  ８９：６５−１１３；Ｇｒａｖｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｗａｒｔ，１９８８，ｓｕｐｒａ；Ｒａｍｓｅｙ  ａｎｄ  Ｂｅｒｌｉｎ，１９７６，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ６３（６）：８６８−８７６；Ｒｕａｎ  ａｎｄ  Ｃｈｏｕｒｅｙ，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １１８：３９９−４０６；Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７：７９５−８００；Ｓｔｅｗａｒｔ，１９７５，Ａｍ．Ｊ．Ｂｏｔ．６２，７２３−７３０）。特にリクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）からの綿繊維は、繊維細胞開始、伸長、二次細胞壁生合成、および成熟の４つの重なり合う発達段階を経る。繊維細胞開始は迅速な過程である。白色産毛繊維は開花直後に発達し始めて開花後（ＤＰＡ）約３日間まで継続し、それに繊維細胞伸長が（約１０〜約１７ＤＰＡまで）続く。成長条件次第で、二次細胞壁生合成が開始して約２５〜約４０ＤＰＡまで継続し、それに成熟過程が約４５〜約６０ＤＰＡまで続く。二次細胞壁合成および成熟相は、一般に「繊維強度構築相」と見なされる。約２５〜３０％の表皮細胞のみが、商業的に重要なリント繊維に分化する（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｔｒｉｐｌｅｔｔ，２００１）．細胞の大部分は繊維に分化せず、または短繊維または産毛に発達する。繊維伸長および二次壁代謝中に繊維細胞は迅速に延長して二次壁構成要素を合成し、劇的な細胞、分子、および生理学的変化を示す。繊維伸長は、迅速な細胞成長および増殖（Ｓｅａｇｕｌｌ，１９９１．Ｉｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｈａｉｇｌｅｒ，Ｃ．Ｈ．＆  Ｗｅｉｍｅｒ，Ｐ．Ｊ．，ｅｄｓ）ｐｐ．１４３２１６３，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）と、大量の細胞代謝産物およびセルロースなどの細胞壁構成要素の絶え間ない合成を伴う。成熟綿繊維中の乾燥重量の約９５％はセルロースである（Ｐｆｌｕｇｅｒ  ａｎｄ  Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ，２００１，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：Ｒ４３６−Ｒ４３９；Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３：４７−６３）。非セルロイド構成要素もまた、繊維細胞発達にとって重要である（Ｈａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｄｅｌｍｅｒ，１９８８，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１８１：２７３−２７７；Ｈｕｗｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｐｌａｎｔａ  １４６：６３５−６４２；Ｍｅｉｎｅｒｔ  ａｎｄ  Ｄｅｌｍｅｒ，１９７７，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５９：１０８８−１０９７；Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：１４７−１５０）。その他の植物細胞と比較して、綿繊維は二次壁中にリグニンを含有しないが、恐らく迅速な細胞成長および拡大に関わる大型液胞を有する。（Ｂａｓｒａ  ａｎｄ  Ｍａｌｉｋ，１９８４，ｓｕｐｒａ；Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｔｒｉｐｌｅｔｔ，２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２７：１３６１−１３６６；Ｍａｕｎｅｙ，１９８４，ｓｕｐｒａ；Ｒｕａｎ  ａｎｄ  Ｃｈｏｕｒｅｙ，１９９８，ｓｕｐｒａ；Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，ｓｕｐｒａ；Ｖａｎ  ’ｔ  Ｈｏｆ，  １９９９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ８６：７７６−７７９）。
【０００５】
成育中の綿繊維細胞は生細胞であり、したがってペプチド、タンパク質、およびＤＮＡやＲＮＡのような核酸などの生体高分子を含有する。対照的に成熟繊維は死んだ中空細胞であり、主にセルロースから構成される。繊維細胞、特に綿繊維細胞は、抽出可能な核酸またはタンパク質をもはや含有しないものと一般的に認識されている。この不活性に基づいて、綿棒は医療物質の塗布器として、ならびに法医学検査において通常、頬の内側からＤＮＡサンプルを採取するために使用される。
【０００６】
さらに植物繊維は、産業におけるそれらの使用に先だって、特にテキスタイル産業におけるそれらの使用に先だって、徹底的な加工を受ける。綿の場合、販売するための完成服飾品分野における原料繊維からの加工は、所望の最終製品に応じて大きく異なる多数の段階を伴う。これらの加工における様々な可能な段階は、一般に機械的および化学的段階に分けられる。
【０００７】
収穫および綿繰り工程は、繊維に熱および機械的損傷を被らせることもある。綿繰り工程中、化学薬品は適用されない。綿が８％超える水分を含有する場合、綿繰り工程中に熱を用いて綿を乾燥させることが多い。熱は通常厳密に調節して、繊維の損傷を避ける。機械的損傷は、綿摘みおよび綿繰り操作中に起こり得る。この機械的損傷は、総繊維の非常に低い％に影響するはずである。
【０００８】
精紡中、加工段階は主として機械的である。精紡加工においては、短繊維（未熟および／または機械的損傷繊維）および異物が除去される。加工中の第１の化学処理は、メリヤス編み用糸が潤滑剤で処理され、製織用糸の約半分が糊付剤で処理される精紡加工の終盤に行われる。メリヤス編み用綿糸はほとんどの場合、潤滑剤としてワックスで処理され、メリヤス編み装置を通過する糸の動きが容易にされる。合成潤滑剤もまた利用できるが、ワックスが依然として最も一般的な処理と考えられる。たて糸糊付とも称される糊付は、完成布帛中の縦方向ストランド（縦糸）として使用される織り糸に塗布される。横向き（横）糸は糊付処理されない。糊付で処理される一般的な材料は、デンプンである。ポリビニルアルコールもまた糊付のために使用され、デンプンとポリビニルアルコールとの配合物が一般的である。バインダー、湿潤剤、軟化剤、湿潤剤、脱泡剤、およびその他のアジュバントなどの添加剤を糊付処理に添加しもよい。
【０００９】
メリヤス編みおよび製織は、どちらも化学薬品または熱の適用を伴わない機械的工程である。メリヤス編みおよび製織工程の終わりに、得られた布帛を最終加工に向けて準備する段階は、化学薬品そして場合によっては高温の適用を伴う。仕上げ段階の準備工程の目的は、染色、印刷またはその他の仕上げ段階を通じた加工を妨げる不純物を除去することである。主にメリヤスからワックスを除去しなくてはならず（洗織）、織物から糊付を除去しなくてはならない（糊抜）。この段階で種子殻、ペクチン、およびその他の化学薬品をはじめとするその他の不純物を除去してもよい。糊抜のために使用される化学薬品としては、デンプンを除去する酵素、そしてポリビニルアルコールを除去する炭酸ナトリウム、灰または洗剤が挙げられる。洗織は、使用されるワックスまたはその他の潤滑剤を溶解する有機溶剤を用いて行われる。洗織または糊抜後、布帛は通常、塩素または過酸化物漂白剤を使用して漂白される。漂白の目標はあらゆる残留する非繊維性材料を除去し、残留糊付け剤を加水分解、酸化、および除去して、染料吸収を改善することである。過酸化物による漂白は蒸気または沸騰温度前後での水浴を伴ってもよく、漂白剤浴は安定剤および金属イオン封鎖剤などの添加剤を含有してもよい。塩素による漂白はより低い温度（４０〜５０℃）で行われ、セルロース分解は過酸化物によるものより少ない。漂白のために塩素を使用する場合、脱塩素剤処理もまた必要である。布帛によっては制御された火炎による毛焼が実施されて、布帛表面が清潔にされてピリングが除去または低下される。白色無染色製品として販売される布帛または被服には、蛍光増白剤を添加してもよい。綿ではアニオン性有機蛍光増白剤が典型的に使用される。数種類の化合物が利用でき、漂白中に添加できるものもある。
【００１０】
シルケット加工は、染料およびその他の化学仕上処理剤の吸収または反応を改善して破壊強度を改善し、寸法安定性を改善して布帛の滑らかさと艶を改善し、未熟綿繊維をカバーするために綿糸または布帛に適用し得る工程である。それはＮａＯＨによる処理、洗浄、酸洗織、洗浄、および乾燥を伴う工程である。
【００１１】
最も一般的な仕上げ処理は染色である。これは糸、布帛または被服段階で実施し得る。綿のために使用される染料は数多く、多くの異なるタイプがある。綿のための最も一般的な染料製品はインジゴであるが、それは染色される布帛の４％のみに相当する。染色は、連続プロセスまたはバッチプロセスとして実施し得る。染色のために使用される化学薬品が数多くある一方、習慣的に伴う工程は、それに布帛、糸または被服を長時間浸してもよい染料バット内での沸騰寸前の高温の使用である。印刷は、色またはデザインをテキスタイルに加える別の主要な工程である。印刷は、布帛または被服表面に着色インクを塗布するための主に機械的工程を伴う。染色および印刷のどちらも、工程の終わりに化学固定剤の塗布を伴ってもよい。
【００１２】
特に染色後の別の一般的な仕上げ処理は、アグレッシブな洗濯である。これは完成布帛または被服から残留仕上げ材料を除去するための洗剤およびその他の洗浄剤の使用を伴う。
【００１３】
化学薬品および処理工程の多数のオプションを伴う、その他の多数の機械的および化学仕上げ段階を布帛、糸または被服に実施してもよい。軟化剤だけでも３種の異なるタイプであってもよく、各タイプはいくつかの異なる化学薬品を含んでいてもよい。
【００１４】
未加工綿繊維を最終用途テキスタイル製品に転換する上記概要は高度に一般的に述べられているが、当業者は、習慣的に関与する多数の化学および熱処理工程の後に、糸、テキスタイルまたは完成服飾品製品からペプチド、タンパク質または核酸が抽出できることを予期しないことは明らかである。
【００１５】
産業において、植物繊維、特に成熟および／または加工植物繊維の原料および／または起源を追跡できることに対する必要性がある。このような植物繊維の原料および／または起源の同定は、ＦｉｂｅｒＭａｘ（登録商標）証明プログラム（ｗｗｗ．ｃｅｒｔｉｆｉｅｄｆｉｂｅｒｍａｘ．ｃｏｍ）などの特定の生殖質から製造された規定品質の繊維の生産および加工を保証する、証明プロセスにとって重要かもしれない。成熟および／または加工繊維中の原料および／または起源を追跡する能力はまた、国際公開第２００６／１３６３５１号パンフレットに記載されるような改善された化学反応性または可染性がある繊維などの特性を有する植物繊維の同定ができるようにする。
【００１６】
既存の証明プログラムは、生産者または種子小売業者による綿などの繊維作物の特定の生殖質の種子の購入記録、および登録生産者の生産繊維の同定（綿の場合は恒久的なＵＳＤＡ梱同定番号による）に基づく。
【００１７】
植物繊維、特に成熟および／または加工繊維の原料および／または起源を追跡する能力は、繊維の原料植物に関する生物学的情報を含有する成熟および／または加工植物繊維から、ペプチド、タンパク質、核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの生体高分子を抽出することが可能であれば大幅に改善されよう。このようにして既存の証明プログラムを監査することが可能になる。さらに繊維生産者または供給者の域を越えて、例えば紡績工、織工または小売顧客レベルなどの供給連鎖の後半段階で繊維を同定することが可能になる。
【００１８】
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、ＵＳＤＡ、およびＡｐｐｌｉｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓは連携して、米国産綿およびテキスタイル構成要素を追跡するＤＮＡ埋込み技術に基づく標識付けシステムを開発した（ｈｔｐｐ：／／ｓｅｅｄｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／Ｎｅｗｓ／ｒｅｌｅａｓｅｓ／２００４／Ｆｅｂｒｕａｒｙ／７８２９．ｈｔｍ）。
【００１９】
したがって綿繊維などの植物繊維から、特に成熟および／または加工繊維、テキスタイル、糸または服飾品から天然生体高分子を抽出できれば、そしてさらにこのような植物繊維から植物原料関連情報を導き出せれば有利であろう。
【００２０】
下文において異なる実施態様、実施例、図、および特許請求の範囲に記載される方法は、綿繊維などの植物繊維から、特に成熟および／または加工繊維、テキスタイル、糸または服飾品から天然生体高分子を抽出できるようにし、さらにこのような植物繊維から植物原料関連情報を導き出せるようにすることで、前述の問題の解決法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
一実施態様では、本発明は、植物繊維から、多糖類またはリグニン以外の前記植物繊維中の天然の生体高分子を単離するステップと；前記生体高分子のモノマー配列中にコードされる情報を特性解析するステップとを含んでなる、種子繊維または綿繊維などの成熟植物繊維または加工植物繊維を特性解析する方法を提供する。
【００２２】
別の本発明の実施態様では、本発明は、植物繊維から、多糖類またはリグニン以外の前記植物繊維中の天然の生体高分子を単離するステップと；前記植物繊維に対して特異的な検出アッセイを前記生体高分子に実施するステップとを含んでなる、種子繊維または綿繊維などの成熟植物繊維または加工植物繊維を同定する方法を提供する。
【００２３】
一実施態様では生体高分子は、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡであってもよい。
【００２４】
別の実施態様では検出アッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく検出アッセイ、抗体に基づく検出アッセイ、または核酸ハイブリダイゼーションに基づく検出アッセイであってもよい。
【００２５】
さらに別の実施態様では、検出アッセイは繊維産生植物のゲノム中に存在するキメラ遺伝子の存在または不在を検出してもよい。キメラ遺伝子は、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、ＥＰＳＰＳ、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）結晶タンパク質の殺虫性部分、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）グルコヒドロラーゼ、スクロースシンターゼ、スクロースリン酸シンターゼ、グルカナーゼ、セルロースシンターゼ、キチナーゼ、エクスパンシン、カロースシンターゼ、キナーゼ、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンセターゼまたはニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼから選択されるコード領域またはその一部またはアンチセンス部分を含んでなってもよい。検出アッセイはまた、事象特異的検出アッセイであってもよい。
【００２６】
本発明のなおも別の実施態様では、検出アッセイは、繊維産生植物のゲノム中に存在する特定の対立遺伝子の存在または不在を検出してもよい。
【００２７】
さらに別の本発明の実施態様では、それから生体高分子が単離される繊維は、糸、布帛、薄織物または完成服飾品中に存在する。
【００２８】
本発明は、植物の成熟または加工繊維から前記植物繊維中の天然である核酸を単離するステップと；前記核酸にゲノム分析プロトコルを実施するステップとを含んでなる、繊維産生植物のゲノムを分析する方法をさらに提供する。方法は、古い成熟繊維、または古い糸、布帛または完成服飾品に適用してもよい。
【００２９】
さらに別の本発明の実施態様は、植物繊維を洗剤、プロテアーゼ、および塩を含有する緩衝液中で長時間、好ましくは４〜１００時間にわたりインキュベートするステップと；前記溶解緩衝液を標準核酸単離法に従って処理して前記ＤＮＡを単離するステップとを含んでなる、成熟植物繊維または加工植物繊維からＤＮＡなどの核酸を単離する方法である。
【００３０】
本発明の別の実施態様では、布帛の糸を解すステップと；前記糸を洗剤、プロテアーゼ、および塩を含有する緩衝液中で長時間、好ましくは４〜１００時間にわたりインキュベートするステップと；前記溶解緩衝液を標準核酸単離法に従って処理して前記核酸を単離するステップとを含んでなる、織布またはメリヤスからＤＮＡなどの核酸を単離する方法が提供される。
【００３１】
本発明のさらに別の実施態様では、収穫された成熟植物維繊から葉および茎夾雑物を除去するステップと；前記植物繊維を洗剤、プロテアーゼ、および塩を含有する緩衝液中で長時間、好ましくは４〜１００時間にわたりインキュベートするステップと；前記溶解緩衝液を標準核酸単離法に従って処理して前記核酸を単離するステップとを含んでなる、収穫された成熟植物繊維からＤＮＡなどの核酸を単離する方法が提供される。
【００３２】
本発明はまた、取引される植物繊維のアイデンティティを証明するプロセスにおける本発明に従った方法の使用も提供する。
【００３３】
本発明は、植物繊維混合物から、多糖類またはリグニン以外の前記植物繊維中の天然の生体高分子を単離するステップと；前記生体高分子に対して特異的な検出アッセイを前記各植物繊維に実施するステップと；各繊維の相対量を判定するステップとを含んでなる、成熟または加工植物繊維の混合物中の異なる植物繊維の相対量を判定する方法をさらに提供する。
【００３４】
本発明の別の実施態様では、取引される綿繊維のアイデンティティを証明する方法が提供され、前記方法は、特定のゲノム組成物を含んでなり特定銘柄の綿繊維を産生する認定綿種子の登録生産者による購入を記録するステップと；前記登録生産者によって前記認定綿種子から生産される未加工綿繊維の梱を前記特定銘柄の綿繊維として登録するステップと；前記梱を前記種子購入記録との照合によって認証するステップと；前記登録梱を紡績工場に提供して、好ましくは主に前記銘柄の綿繊維から、特に排他的に前記銘柄の綿繊維から、糸、布帛または服飾品を製造するステップと；本明細書に記載されるプロトコルを使用して、前記銘柄の綿繊維のアイデンティティを１つ以上のステップで監査するステップとを含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】成熟綿繊維材料（リクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）ＦＭ９６６）から単離された核酸テンプレート上のＧｈＧｌｕｃ１のＰＣＲ増幅である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：精製繊維からのテンプレートＤＮＡ（１μｌ）；レーン３：葉夾雑物を含有する未精製繊維からのテンプレートＤＮＡ（１μｌ）；レーン４：葉夾雑物のみからのテンプレートＤＮＡ（１μｌ）；レーン５：精製繊維からのテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン６：葉夾雑物を含有する未精製繊維からのテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン７：葉夾雑物のみからのテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン８：テンプレートなしの対照；レーン９：陽性対照−ＦｉｂｅｒＭａｘ９６６（ＦＭ９６６）植物材料から単離されたゲノムＤＮＡ。
【図２】成熟リクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）ＦＭ９６６綿繊維材料から、および４年物のピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ  Ｐｉｍａ）Ｙ５綿繊維材料から単離された核酸テンプレート上のＧｈＧｌｕｃ１のＰＣＲ増幅である。レーン１：分子量マーカー；レーン２〜３：葉夾雑物を含有しないＦＭ９６６精製繊維からのテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン４〜５：葉夾雑物を含有するＦＭ９６６未精製繊維からのテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン６：繊維材料を含有しないＦＭ９６６葉夾雑物からのテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン７〜８：葉夾雑物を含有しないＰｉｍａ  Ｙ５精製繊維からのテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン９：テンプレートなしの対照；レーン１０：陽性対照−ＦｉｂｅｒＭａｘ９６６植物材料から単離されたゲノムＤＮＡ。
【図３】様々なプロトコルにより単離された核酸テンプレート上のＧｈＧｌｕｃ１のＰＣＲ増幅である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔにより単離されたテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン３：ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔにより単離されたテンプレートＤＮＡ（１μｌ）；レーン４：ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔにより単離されたテンプレートＤＮＡ（１μｌ）；レーン５：ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔにより単離されたテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン６：Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キットにより単離されたテンプレートＤＮＡ（１μｌ）；レーン７：Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キットにより単離されたテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン８：Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キットにより単離されたテンプレートＤＮＡ（１μｌ）；レーン９：Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キットにより単離されたテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン１０：ＣＴＡＢ処理により単離されたテンプレートＤＮＡ（１μｌ）；レーン１１：ＣＴＡＢ処理により単離されたテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン１２：テンプレートなしの対照；レーン１３：陽性対照−ＦｉｂｅｒＭａｘ９６６植物材料から単離されたゲノムＤＮＡ。
【図４】綿布から単離された核酸テンプレート上のＧｈＧｌｕｃ１のＰＣＲ増幅である。レーン１および８：分子量マーカー；レーン２：綿布からのテンプレートＤＮＡ（一晩のインキュベーション）（１μｌ）；レーン３：綿布からのテンプレートＤＮＡ（３０分間のインキュベーション）（１μｌ）；レーン４：綿布（一晩のインキュベーション）からのテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン５：綿布（３０分間のインキュベーション）からのテンプレートＤＮＡ（５μｌ）；レーン６：テンプレートなしの対照；レーン７：陽性対照−ＦｉｂｅｒＭａｘ９６６植物材料から単離されたゲノム材料。
【図５】織り方の異なる（メリヤスまたは織布）木綿シャツから単離された核酸テンプレート上のＧｈＧｌｕｃ１のＰＣＲ増幅である。レーン１：分子量マーカー；レーン２：織布木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、一晩のインキュベーション、（１μｌ）；レーン３：織布木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、一晩のインキュベーション、（５μｌ）；レーン４：織布木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、一晩のインキュベーション、（１μｌ）；レーン５：織布木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、一晩のインキュベーション、（５μｌ）；レーン６：メリヤス木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、一晩のインキュベーション、（１μｌ）；レーン７：メリヤス木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、一晩のインキュベーション、（５μｌ）；レーン８：メリヤス木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、一晩のインキュベーション、（１μｌ）；レーン９：メリヤス木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、一晩のインキュベーション、（５μｌ）；レーン１０：織布木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、６日間のインキュベーション、（１μｌ）；レーン１１：織布木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、６日間のインキュベーション、（５μｌ）；レーン１２：織布木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、６日間のインキュベーション、（１μｌ）；レーン１３：織布木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、６日間のインキュベーション、（５μｌ）；レーン１４：メリヤス木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、６日間のインキュベーション、（１μｌ）；レーン１５：メリヤス木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、６日間のインキュベーション、（５μｌ）；レーン１６：メリヤス木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、６日間のインキュベーション、（１μｌ）；レーン１７：メリヤス木綿シャツからのテンプレートＤＮＡ、６日間のインキュベーション、（５μｌ）；レーン１８：テンプレートなしの対照；レーン１９：陽性対照−ＦｉｂｅｒＭａｘ９６６植物材料から単離されたゲノムＤＮＡ。
【図６】キメラＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼコーディング遺伝子を含有する成熟遺伝子導入綿繊維材料から単離された、核酸テンプレート上のＮｏｄＣのＰＣＲ増幅である。レーン１：遺伝子導入繊維材料からのテンプレートＤＮＡ、複製１（１μｌ）；レーン２：遺伝子導入繊維材料からのテンプレートＤＮＡ、複製１（５μｌ）；レーン３：遺伝子導入繊維材料からのテンプレートＤＮＡ、複製２（１μｌ）；レーン４：遺伝子導入繊維材料からのテンプレートＤＮＡ、複製２（５μｌ）；レーン５：テンプレートなしの対照；レーン６：陽性対照−遺伝子導入綿植物材料から単離されたゲノムＤＮＡ；レーン７：分子量マーカー。
【図７】リクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）からのＧｈＧｌｕｃ１  Ａサブゲノム対立遺伝子と、ピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）からのＧｈＧｌｕｃ１  Ａサブゲノム対立遺伝子を識別する終点Ｔａｑｍａｎアッセイの図解である。純粋形態の、または様々な比率の混合物（７５／２５、５０／５０、および２５／７５）中の、Ｐｉｍａ（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）またはＦＭ９６６（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）植物（葉）材料から調製されたゲノムＤＮＡサンプルにＴａｑＭａｎ検出アッセイを実施する。Ｘ軸がＧｌｕｃ１のｈｉｒｓｕｔｕｍ対立遺伝子の存在を示唆する一方、Ｙ軸はＧｌｕｃ１のｂａｒｂａｄｅｎｓｅ対立遺伝子の存在を示唆する。Ｔａｑｍａｎ分析により、混合ＤＮＡサンプル中で様々な比率の双方の対立遺伝子の検出ができるようになる。
【図８】繊維材料上およびポロシャツテキスタイル上で、リクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）からのＧｈＧｌｕｃ１  Ａサブゲノム対立遺伝子と、ピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）からのＧｈＧｌｕｃ１  Ａサブゲノム対立遺伝子を識別する終点Ｔａｑｍａｎアッセイの図解である。ゲノムＤＮＡサンプルは、純粋形態または対照サンプルとしての５０／５０混合物のどちらかで、Ｐｉｍａ（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）またはＦＭ９６６（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）植物（葉）材料から調製される。繊維材料（ＦＭ９６６梱）からまたは織編生地（ポロ）から調製された核酸にＴａｑＭａｎ検出アッセイを実施する。Ｘ軸がＧｌｕｃ１のｈｉｒｓｕｔｕｍ対立遺伝子の存在を示唆する一方、Ｙ軸はＧｌｕｃ１のｂａｒｂａｄｅｎｓｅ対立遺伝子の存在を示唆する。分析ではｈｉｒｓｕｔｕｍ対立遺伝子のみが検出され、全ての繊維材料および全ての織編生地がｈｉｒｓｕｔｕｍタイプの繊維のみを含有することが示唆された。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
ここに記載される方法は、成熟および／または加工植物繊維から、特に綿繊維などの種子繊維からペプチド、タンパク質、核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの生体高分子（多糖類以外）を抽出することが可能であるという意外な発見に基づく。さらに単離されたＤＮＡは、例えばポリメラーゼ連鎖反応に基づく増幅などの検出アッセイを使用して繊維の特性解析ができるようにする、さらなる処理で使用できるのに十分な品質であることが判明した。
【００３７】
したがって第１の実施態様では、本発明は、植物繊維から、多糖類またはリグニン以外の前記植物繊維中の天然の生体高分子を単離するステップと；前記生体高分子のモノマー配列中にコードされる情報を特性解析するステップとを含んでなる、成熟植物繊維または加工植物繊維のための方法を提供する。
【００３８】
本明細書での用法では、「成熟植物繊維」はその発育周期を完了した繊維であり、死滅細胞の残遺物であると見なされる。具体的には成熟植物繊維は、植物繊維を産生する繊維作物から収穫された後の植物繊維である。例えば綿では、成熟繊維は収穫時に摘み取られる綿ボール中に存在する繊維とみなされる。成熟植物繊維が、繊維産業によって加工される全ての植物繊維を構成することは明らかである。
【００３９】
「加工植物繊維」とは、本明細書での用法では、ワックスがけ、染色、梳綿、紡績、製織、糊付、シルケット加工などをはじめとする、追加的な機械的、加熱および／または化学処理を受ける、作物から収穫される成熟植物繊維である（背景技術セクション参照）。
【００４０】
「植物繊維」とは、本明細書での用法では植物起源の細長い狭い先細り細胞であり、成熟時に死滅して中空で、主にセルロースおよびリグニンからできている硬質の厚い細胞壁がある。
【００４１】
「種子繊維」とは、本明細書での用法では綿などの種子表面から生える繊維である。「綿」は、本明細書での用法では、インドワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ａｒｂｏｒｅｔｕｍ）、アジアワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｅｒｂａｃｅｕｍ）、およびライモンディワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｒａｉｍｏｎｄｉｉ）およびロンギカリックスワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｌｏｎｇｉｃａｌｙｘ）などの「綿祖先植物」をはじめとするリクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）またはピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）を含む。
【００４２】
「植物繊維細胞中の天然の生体高分子」とは、例えば植物繊維を標識するために、外来性ＤＮＡ分子、ペプチドまたはタンパク質などとのインキュベーションまたは分子注入を通じて、前記植物繊維に外来性に添加されたのではない生体高分子であり、それには全ての高分子、すなわち情報内容を有するポリマー性分子が含まれる。情報内容は、通常、構成単位またはモノマーの配列中にコードされる。生体高分子の例は、ポリペプチド、タンパク質、一本鎖または二本鎖を問わずＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸である。
【００４３】
「生体高分子を特性解析する」とは、本明細書での用法では生体高分子の情報内容を解読することを意味する。これは好都合には、高分子がそれから構成されるモノマーの配列を決定することをはじめとする一連の分析を生体高分子に実施することで実施し得るが、また生体高分子に１つ以上の特定の検出アッセイを実施することでも実施し得る。
【００４４】
「検出アッセイ」とは、本明細書での用法では生体高分子中のモノマーの特定の配列を見つけることを目指す方法またはプロトコルである。
これは、ポリメラーゼ連鎖反応ベースの増幅、抗体検出または核酸ハイブリダイゼーションに基づく検出アッセイを含んでもよい。
【００４５】
特定の抽出方法は抽出される生体高分子の質に影響を与える一方で、植物繊維からこのような生体高分子を抽出できる能力には重要でないことが実証されている。
【００４６】
それにもかかわらず、成熟および／または加工植物繊維から単離された生体高分子、特にその核酸画分の質および／または量をいくつかの手段によって改善し得ることが意外にも発見された。
【００４７】
例えば分析する植物繊維を洗剤と場合によりその他の構成物とを含有する溶解緩衝液中に、長時間残すことが有利かもしれない。特に成熟および／または加工植物繊維を少なくとも３０分間にわたり、より好ましくは少なくとも４時間から最高１２０時間にわたり、好ましくは室温で溶解緩衝液中においてインキュベートすることが、回収される生体高分子、特にその核酸画分の収率を改善することが分かっている。
【００４８】
また生体高分子の単離に先立って、収穫された綿繊維および／または繰綿繊維などの植物繊維から、葉残遺物、樹脂、およびその他の夾雑物をはじめとする不純物を注意深く除去することが、特に単離核酸のさらなる分析および加工性に関して単離核酸の質を大幅に改善すると断定された。本発明の方法は有利には、アメリカ合衆国においてＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（ＵＳＤＡ）のＡｎｉｍａｌ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＡＰＨＩＳ）に提出された規制除外申請の対象かもしれない、形質転換事象、または形質転換事象の組み合わせを含有する植物に由来する綿繊維を同定するのに使用し得て、このような申請が認可されているかまたは依然として審理中であるかを問わず、以下の事象が挙げられる。
【００４９】
【表１】
2011530276.tif 000002
【００５０】
この目的を達成するために、生体高分子、特にＤＮＡなどの核酸に、形質転換事象を特異的に検出するようにデザインされた検出アッセイを実施してもよい。このような検出アッセイとして、少なくとも事象ＭＯＮ１４４５、ＭＯＮ５３１、ＭＯＮ１５９８５、ＬＬＣｏｔｔｏｎ２５、３００６−２１０−２３、および２８１−２４−２３６については、ｈｔｔｐ：／／ｇｍｏ−ｃｒｌ．ｊｒｃ．ｉｔ／ｓｔａｔｕｓｏｆｄｏｓｓ．ｈｔｍで公開されるアッセイが挙げられる。これらの形質転換事象中で挿入ＤＮＡに隣接する植物のヌクレオチド配列などの追加的情報（その情報により特異的ＤＮＡ検出アッセイをデザインし得る）は、以下の特許出願にある。
【００５１】
【表２】
2011530276.tif 000003
【００５２】
本発明の方法を有利に使用して、特に有利で有用な形質を綿植物に与える遺伝物質を含有する植物に由来する、綿繊維を同定し得る。このような形質の例は、より良い植物成長；高温または低温、干ばつ、土壌中の極度な水または塩またはミネラル含量などの非生物的ストレスに対する耐性増大；開花能力増大；より容易な収穫；成熟加速；商業的価値を持つ植物部分（例えば種子）のより高い収率；収穫産物のより高い品質および／またはより高い栄養価；収穫産物のより良い貯蔵安定性および／または加工性である。このような形質のさらに別の特に強調される例は、生物的ストレスに対する抵抗性、すなわち昆虫、ダニ、植物病原性の真菌、細菌および／またはウィルスなどの有害動物および有害微生物に対する植物のより良い防御、および特定の除草活性化合物に対する植物の耐性増大である。
【００５３】
本発明の方法を有利に使用して、例えばグリホサート耐性植物、すなわち除草剤グリホサートまたはそれらの塩類に耐性にされた植物などの除草剤抵抗性を与える遺伝物質を含有する綿植物に由来する綿繊維を同定し得る。植物は異なる手段を通じて、グリホサート耐性にでき得る。例えばグリホサート耐性植物は、酵素５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子で植物を形質転換して得られる。このようなＥＰＳＰＳ遺伝子の例は、細菌ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（Ｃｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２１，３７０−３７１）のＡｒｏＡ遺伝子（突然変異体ＣＴ７）；細菌アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．７，１３９−１４５）のＣＰ４遺伝子；ペチュニアＥＰＳＰＳ（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３，４７８−４８１）、トマトＥＰＳＰＳ（Ｇａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，４２８０−４２８９）、またはエレウシネＥＰＳＰＳ（国際公開第０１／６６７０４号パンフレット）をコードする遺伝子である。それはまた、例えば欧州特許第０８３７９４４号明細書、国際公開第００／６６７４６号パンフレット、国際公開第００／６６７４７号パンフレットまたは国際公開第０２／２６９９５号パンフレットに記載されるような変異型ＥＰＳＰＳであり得る。グリホサート耐性植物はまた、米国特許第５，７７６，７６０号明細書および米国特許第５，４６３，１７５号明細書に記載されるように、グリホサートオキシド還元酵素をコードする遺伝を発現させることによっても得られる。グリホサート耐性植物はまた、例えば国際公開第０２／３６７８２号パンフレット、国際公開第０３／０９２３６０号パンフレット、国際公開第０５／０１２５１５号パンフレット、および国際公開第０７／０２４７８２号パンフレットに記載されるように、グリホサートアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現させることによっても得られる。グリホサート耐性植物はまた、例えば国際公開第０１／０２４６１５号パンフレットまたは国際公開第０３／０１３２２６号パンフレットに記載されるように、上述の遺伝子の天然突然変異を含有する植物を選択することによっても得られる。その他の除草剤抵抗性植物は、例えばビアラホス、ホスフィノトリシンまたはグルホシネートなどの除草剤に耐性にされた、酵素グルタミンシンターゼを阻害する植物である。このような植物は、除草剤を解毒する酵素、または阻害抵抗性の突然変異グルタミンシンターゼ酵素を発現させることによって得られる。このような１つの効率的な解毒酵素は、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする酵素である（ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種からのｂａｒまたはｐａｔタンパク質など）。外来性ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼを発現する植物は、例えば米国特許第５，５６１，２３６号明細書、米国特許第５，６４８，４７７号明細書、米国特許第５，６４６，０２４号明細書、米国���許第５，２７３，８９４号明細書、米国特許第５，６３７，４８９号明細書、米国特許第５，２７６，２６８号明細書、米国特許第５，７３９，０８２号明細書、米国特許第５，９０８，８１０号明細書、および米国特許第７，１１２，６６５号明細書に記載される。さらに別の除草剤耐性植物は、除草剤耐性にされた、酵素ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＰＤ）を阻害する植物である。ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼは、パラヒドロキシフェニルピルビン酸（ＨＰＰ）がホモゲンチジン酸に転換する反応を触媒する酵素である。ＨＰＰＤ阻害剤に耐性の植物は、国際公開第９６／３８５６７号パンフレット、国際公開第９９／２４５８５号パンフレット、および国際公開第９９／２４５８６号パンフレットに記載されるように、天然抵抗性ＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子で、または変異型ＨＰＰＤ酵素をコードする遺伝子で形質転換させ得る。ＨＰＰＤ阻害剤に対する耐性はまた、特定の酵素をコードする遺伝子で植物を形質転換して、ＨＰＰＤ阻害剤による天然ＨＰＰＤ酵素阻害にもかかわらずホモゲンチジン酸を形成できるようにすることによっても得られる。このような植物および遺伝子は、国際公開第９９／３４００８号パンフレットおよび国際公開第０２／３６７８７号パンフレットに記載される。ＨＰＰＤ阻害剤に対する植物の耐性はまた、国際公開第２００４／０２４９２８号パンフレットに記載されるように、ＨＰＰＤ耐性酵素をコードする遺伝子に加えて、酵素プレフェン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子で植物を形質転換させることで改善させ得る。なおもさらに別の除草剤抵抗性植物は、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）阻害剤に耐性にされた植物である。既知のＡＬＳ阻害剤としては、例えばスルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、プリイミジニオキシ（チオ）安息香酸、および／またはスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン除草剤が挙げられる。例えばＴｒａｎｅｌおよびＷｒｉｇｈｔ（２００２，Ｗｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５０：７００−７１２）、そしてまた米国特許第５，６０５，０１１号明細書、米国特許第５，３７８，８２４号明細書、米国特許第５，１４１，８７０号明細書、米国特許第および５，０１３，６５９号明細書にも記載されるように、ＡＬＳ酵素（アセトヒドロキシ酸シンターゼとしてもまた知られている、ＡＨＡＳ）中の異なる突然変異は、異なる除草剤および除草剤群に対する耐性を与えることが知られている。スルホニル尿素耐性植物およびイミダゾリノン耐性植物の作成については、米国特許第５，６０５，０１１号明細書、米国特許第５，０１３，６５９号明細書、米国特許第５，１４１，８７０号明細書、米国特許第５，７６７，３６１号明細書、米国特許第５，７３１，１８０号明細書、米国特許第５，３０４，７３２号明細書、米国特許第４，７６１，３７３号明細書、米国特許第５，３３１，１０７号明細書、米国特許第５，９２８，９３７号明細書、および米国特許第５，３７８，８２４号明細書、および国際公開第９６／３３２７０号パンフレットに記載される。その他のイミダゾリノン耐性植物は、また例えば国際公開第２００４／０４００１２号パンフレット、国際公開第２００４／１０６５２９号パンフレット、国際公開第２００５／０２０６７３号パンフレット、国際公開第２００５／０９３０９３号パンフレット、国際公開第２００６／００７３７３号パンフレット、国際公開第２００６／０１５３７６号パンフレット、国際公開第２００６／０２４３５１号パンフレット、および国際公開第２００６／０６０６３４号パンフレットに記載される。さらに別のスルホニル尿素およびイミダゾリノン耐性植物が、例えば国際公開第０７／０２４７８２号パンフレットにも記載される。
【００５４】
本発明の方法を有利に使用して、特定の標的昆虫による攻撃に対する抵抗性を与える遺伝物質を含有する綿植物に由来する綿繊維を同定し得る。このような植物は遺伝的形質転換によって、またはこのような昆虫抵抗性を与える突然変異を含有する植物の選択によって得られ、以下をコードするコード配列を含んでなる少なくとも１つの導入遺伝子を含有してもよい。
１）例えばＣｒｙタンパク質クラスＣｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ３Ａａ、またはＣｒｙ３Ｂｂのタンパク質、またはその殺虫性部分など、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，６２：８０７−８１３）により列挙され、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒素命名法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／Ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ_Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／）でＣｒｉｃｋｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）によって更新された殺虫性結晶タンパク質のようなバシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からの殺虫性結晶タンパク質またはその殺虫性部分；または
２）Ｃｒｙ３４およびＣｒｙ３５結晶タンパク質で構成される二元毒素（Ｍｏｅｌｌｅｎｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６６８−７２；Ｓｃｈｎｅｐｆ  ｅｔ  ａｌ．２００６，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１，１７６５−１７７４）など、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からの別の第２の結晶タンパク質またはその一部の存在下で殺虫性である、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からの結晶タンパク質、またはその一部；または
３）例えばコーン事象ＭＯＮ９８０３４によって生成されるＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質（国際公開第２００７／０２７７７７号パンフレット）など、上の１）のタンパク質のハイブリッド、または上の２）のタンパク質のハイブリッドのようなバシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からの異なる殺虫性結晶タンパク質の一部を含んでなるハイブリッド殺虫性タンパク質；または
４）コーン事象ＭＯＮ８６３またはＭＯＮ８８０１７中のＣｒｙ３Ｂｂ１タンパク質、またはコーン事象ＭＩＲ６０４中のＣｒｙ３Ａタンパク質など、標的昆虫種に対するより高い殺虫活性を得るために、および／または影響を受ける標的昆虫種の範囲を拡大するために、および／またはクローニングまたは形質転換中にコード化ＤＮＡ内に導入される変化のために、いくつかの、特に１〜１０個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている、上のＡ１）〜Ａ３）のいずれか１つのタンパク質；
５）例えばＶＩＰ３Ａａタンパク質クラスからのタンパク質など、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｉｆｅｓｃｉ．ｓｕｓｓｅｘ．ａｃ．ｕｋ／ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ_Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｖｉｐ．ｈｔｍｌに列挙される栄養生長期分泌殺虫タンパク質（ＶＩＰ）クラスのようなバシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）またはバシラス・セレアス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）からの殺虫性分泌タンパク質、またはその殺虫性部分；または
６）ＶＩＰ１ＡおよびＶＩＰ２Ａタンパク質で構成される二元毒素（国際公開第９４／２１７９５号パンフレット）など、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）またはＢ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）からの第２の分泌されたタンパク質の存在下で殺虫性である、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）またはバシラス・セレアス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）から分泌されるタンパク質；または
７）上の１）のタンパク質のハイブリッド、または上の２）のタンパク質のハイブリッドなど、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）またはバシラス・セレアス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）からの異なる分泌されたタンパク質からの部分を含んでなるハイブリッド殺虫性タンパク質；または
８）綿事象ＣＯＴ１０２中のＶＩＰ３Ａａタンパク質など、標的昆虫種に対するより高い殺虫活性を得るために、および／または影響を受ける標的昆虫種の範囲を拡大するために、および／またはクローニングまたは形質転換中にコード化ＤＮＡに導入される変化のために（依然として殺虫性タンパク質をコードしながら）、いくつかの、特に１〜１０個のアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている、上の１）〜３）のいずれか１つのタンパク質。
【００５５】
本発明の方法を有利に使用して、非生物的ストレスに対する耐性を与える遺伝物質を含有する綿植物に由来する、綿繊維を同定し得る。このような植物は遺伝的形質転換によって得られ、以下の導入遺伝子の１つ以上を含有してもよい。
ａ．国際公開第００／０４１７３号パンフレットまたはＥＰ０４０７７９８４．５またはＥＰ０６００９８３６．５に記載されるような、植物細胞または植物中のポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）遺伝子の発現および／または活性を低下できる、導入遺伝子。
ｂ．例えば国際公開第２００４／０９０１４０号パンフレットに記載されるような、植物または植物細胞のＰＡＲＧコード化遺伝子の発現および／または活性を低下できる、ストレス耐性を増強する導入遺伝子。
ｃ．例えばＥＰ０４０７７６２４．７または国際公開第２００６／１３３８２７号パンフレットまたはＰＣＴ／ＥＰ０７／００２４３３に記載されるような、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンセターゼまたはニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼをはじめとする、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再生合成経路の植物機能性酵素をコードする、ストレス耐性を増強する導入遺伝子。
【００５６】
本発明の方法を有利に使用して、国際公開第０５／０１７１５７号パンフレット（グルカナーゼサイレンシング遺伝子）、国際公開第０４／０６５５５７１号パンフレット（キチナーゼコード化遺伝子）、国際公開第０２／４５４８５号パンフレットおよび国際公開第０８／０１２０５８号パンフレット（スクロースシンターゼ遺伝子）、国際公開第０１／１７３３３号パンフレット（スクロースリン酸シンテターゼ遺伝子）、国際公開第９８／００５４９号パンフレット（セルロースシンターゼ遺伝子）、国際公開第０６／１３３８２７号パンフレット（キチンシンターゼまたはＮＯＤＣコード化遺伝子などのＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ遺伝子）に記載されるキメラ遺伝子をはじめとする、強度、長さ、マイクロネアなどの繊維の特徴を改変する遺伝物質を含有する綿植物に由来する綿繊維を同定し得る。
【００５７】
本発明の方法のさらに別の用途は、特定遺伝子の特定の対立遺伝子バリエーションを含んでなる植物からの綿繊維などの植物繊維を同定することである。このような対立遺伝子のバリエーションを同定する方法は、当該技術分野で良く知られている。特にこのような対立遺伝子バリエーションを使用して、例えばピマワタ（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）からの繊維とリクチメン（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）からの繊維を識別するなど、特定の植物種からの繊維を識別してもよい。例としてピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）からのグルカナーゼ１  Ａサブゲノム対立遺伝子と、リクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）からのグルカナーゼ１  Ａサブゲノム対立遺伝子との間の多形性を使用して（参照によって本明細書に援用する未公開欧州特許出願ＥＰ０８０７５５１４．３に記載されるようなピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）中のＧｌｕｃ１  Ａサブゲノム対立遺伝子のコード領域中の停止コドンの存在によって）、ピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）またはリクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）起源の繊維を識別してもよい。
【００５８】
本明細書に記載される方法を使用して、あらゆるゲノム特性解析プロトコルのために使用し得る、ＡＦＬＰ、ＲＥＡＤＳなどをはじめとする核酸テンプレートを単離してもよい。成熟または加工繊維から単離される核酸テンプレートは、ゲノム特性解析プロトコルの適用前に、全ゲノム増幅などの当該技術分野で知られている技術を使用して増幅してもよい。
【００５９】
本明細書に記載される方法を使用して、特に規定の特徴を有する綿繊維などの商取引される植物繊維の供給を保証する証明プログラムを助けてもよい。通常、このような証明プログラムは、特定のゲノム組成物を含んで特定銘柄の植物繊維を産生する綿種子の登録生産者による認定種子の購入記録を含む。登録生産者によって前記認定種子から生産される収穫産物繊維の梱は登録され、前記種子購入記録との照合により認証されて、好ましくは主に、特に排他的に前記銘柄の繊維から糸、布帛または服飾品を製造するために紡績工場に提供される。本明細書に記載される方法は、供給連鎖の異なる時点で鑑査を実施できるようにする。
【００６０】
本明細書に記載される方法はまた、トマト種子上の毛または小麦種子基部の剛毛などの植物種子上の毛様（毛状突起様）構造物から、生体高分子を単離するのにも応用できる。
【００６１】
本明細書に記載される方法はまた、古い繊維および古い織編生地（例えば１００年以上前の繊維およびテキスタイル）の核酸材料を特性解析するのにも応用できる。本発明を特定の機序または理論に制限することなく、生物由来物質が古い繊維中に保存されている１つの可能性は、我々が観察したように、成熟繊維が、生物由来物質を成熟繊維中に「捕捉」（したがって「保存」）するように捻られているためであると考えられる。
【００６２】
本明細書の実施例６に示すように、例えば前述の全ゲノム増幅ステップによって、犯罪現場で確認された繊維または織編生地を特性解析し得るので、本明細書に記載される方法は法医学用途にもまた応用できる。
【００６３】
本明細書での用法では「含んでなる」は、言及される既述の徴群、整数、ステップまたは構成要素の存在を特定するものと解釈されるが、１つ以上の徴群、整数、ステップまたは構成要素、またはそれらのグループの存在または添加を除外しない。したがって例えばヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含んでなる核酸またはタンパク質は、実際に言及されたものよりもさらに多くのヌクレオチドまたはアミノ酸、すなわちより大きな核酸またはタンパク質に組み込まれたものを含んでなってもよい。機能的または構造的に確定されたＤＮＡ領域を含んでなるキメラ遺伝子は、追加的なＤＮＡ領域などを含んでなってもよい。
【００６４】
以下の非限定的例は、成熟植物繊維からおよび加工繊維から生体高分子を単離する方法、および植物繊維を特性解析または同定するためのそれらの使用について記載する。特に断りのない限り実施例では、全ての組み換えＤＮＡ技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＵＳＡの第１巻および２巻に記載される標準プロトコルに従って実施される。植物分子学研究のための標準材料および方法については、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ（ＵＫ）およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＵＫにより共同出版された、Ｒ．Ｄ．Ｄ．ＣｒｏｙによるＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（１９９３）に記載される。
【実施例】
【００６５】
実施例１：未加工綿繊維材料からの核酸の単離
Ａ．リクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）ＦＭ９６６繊維材料からの核酸の単離
植物材料からのゲノムＤＮＡ単離のための従来のＣＴＡＢ（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド）処理（Ｄｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｄｏｙｌｅ，１９８７，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ｂｕｌｌ．１９，１１）を使用して、ＦＭ９６６から収穫されて綿繰りされ梱包された綿繊維にＤＮＡ抽出を実施した。核酸のペレットが得られたが、この材料はＰＣＲ増幅または制限酵素消化をはじめとする、どのようなさらなる用途にも使用できなかった。
【００６６】
収穫され梱包された未加工綿繊維は、葉残遺物およびその他の夾雑物などのいくらかの不純物をなおも含有する。これらの汚染物質を手動浄化によって注意深く除去し、精製繊維画分（および夾雑物画分）を得た。ＱＩＡＧＥＮによって市販されるＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、製造業者の推奨事項（ｗｗｗ１．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ＨＢ／ＤＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＭａｘｉで入手できるＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ参照）に従って、未加工繊維材料、精製繊維材料、および夾雑物画分にＤＮＡ抽出を実施し、ＵＶ分光光度法を使用して単離された核酸の濃度を測定した（表１）。
【００６７】
【表３】
2011530276.tif 000004
【００６８】
以下のプライマーを使用した標準ＰＣＲ反応において、単離された核酸をテンプレートとして使用し、内在性綿グルカナーゼ遺伝子（ＧｈＧｌｕｃ１；ＧｈＧｌｕｃ１の異なる対立遺伝子のヌクレオチド配列については参照によって本明細書に援用するＥＰ０８０７５５１４．３を参照されたい）を検出した。
ＳＥ００２：ｇｇｃｃｇａａｇｃｃｇａｔｃｔｔａｔｃｔａｇｇ（配列番号：１）
ＳＥ００３：ｃｇｇｃａａｃａａｔｃｔｔｃｃａｔｃｔｃｃａｇ（配列番号：２）
【００６９】
１μｌおよび５μｌのテンプレート核酸の双方を使用した。ＰＣＲ増幅の結果を図１に示す。純粋な繊維（５μｌテンプレート）（レーン４）を使用して（予期されたように）６５６ｂｐの単位複製配列が明白に検出される一方で、純粋繊維および未加工繊維の双方から単離された少量（１μｌ）の核酸を使用して弱いシグナルを観察し得る。より高濃度で使用した場合、夾雑物のみから単離された核酸中にも、また未精製材料から得られた核酸中にも増幅シグナルは検出できず、汚染物質から得られた抽出物が未加工繊維から得られた核酸のさらなる処理を阻害するようであることが示唆される。
【００７０】
興味深いことにこの実験は、さらに分析し得る核酸を成熟綿繊維材料から抽出し得ることを実証する。実験はまた、未加工の収穫され綿繰りされた綿繊維から葉夾雑物およびその他の不純物を除去することにより、単離された核酸−ＤＮＡの質をさらに改善し得ることも示唆する。
【００７１】
Ｂ．ピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）Ｐｉｍａ−Ｙ５繊維材料からの核酸の単離
ピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）Ｐｉｍａ５Ｙからの４年ものの未加工綿繊維材料をリクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）ＦＭ９６６綿繊維材料と共に、１．Ａ．で上述したように処理した。得られた核酸を１．Ａ．に記載されるようにＰＣＲ反応中のテンプレートとして使用した。結果を図２に示す。
【００７２】
ピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）繊維はリクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）繊維よりも強く、異なる構造を有するが、結果は、処理可能なＤＮＡを含む核酸がこれらの繊維からもまた単離され得ることを実証する。興味深いことに、これらの繊維はまた、最適でない条件下で数年間にわたり保存されており、処理可能なＤＮＡまたはその他の核酸を古い繊維材料から入手し得ることが示唆される。
【００７３】
Ｃ．その他の綿内在性遺伝子の増幅
単離された核酸はまた、エクスパンシンコード化遺伝子からの２９９ｂｐの断片を増幅する以下のプライマーなどのその他の内在性遺伝子に対して特異的なプライマーを使用した標準ＰＣＲ反応において、テンプレートとして使用した。
Ｋｌ５１：ｇｇｇａｇｃｔｔｇｔｇｇｔｔａｔｇｇａａａｃｃ（配列番号：５）
Ｋｌ５２：ｃａｇｇｇａｃｇａｔｃｃｃａｇｃｔｃｇａｔａｔｔｃ（配列番号：６）
予期された単位複製配列はまた、その他の内在性遺伝子に対するその他のプライマーを使用しても検出できた。
【００７４】
Ｄ．その他の溶解緩衝液およびプロトコルを使用した、綿繊維材料からの核酸の単離
汚染葉夾雑物およびその他の不純物を除去して、セクション１．Ａ．に記載されるように未加工綿繊維材料を精製した。ＱＩＡＧＥＮにより商品化されているＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  ＫｉｔまたはＰＲＯＭＥＧＡ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮにより商品化されているＷｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キットのどちらか、または従来のＣＴＡＢ処理（Ｄｏｙｌｅ  ａｎｄ  Ｄｏｙｌｅ，１９８７，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ｂｕｌｌ．１９，１１）を使用して、核酸を精製繊維材料から抽出した。Ｕ．Ｖ．分光光度法を使用して、得られた核酸濃度を測定した（表２）。
【００７５】
【表４】
2011530276.tif 000005
【００７６】
以下のプライマーを使用した標準ＰＣＲ反応において、単離された核酸をテンプレートとして使用し、内在性綿グルカナーゼ遺伝子（ＧｈＧｌｕｃ１；ＧｈＧｌｕｃ１の異なる対立遺伝子のヌクレオチド配列については参照によって本明細書に援用するＥＰ０８０７５５１４．３を参照されたい）を検出した。
ＳＥ００２：ｇｇｃｃｇａａｇｃｃｇａｔｃｔｔａｔｃｔａｇｇ（配列番号：１）
ＳＥ００３：ｃｇｇｃａａｃａａｔｃｔｔｃｃａｔｃｔｃｃａｇ（配列番号：２）
【００７７】
１μｌおよび５μｌのテンプレート核酸の双方を使用した。ＰＣＲ増幅の結果を図３に示す。あらゆる方法により単離されたテンプレート核酸を使用して、予期されたＤＮＡ単位複製配列が観察されたが、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）およびＣＴＡＢ処理により単離されたより高濃度の核酸（５μｌ反応）は、ＰＣＲ反応に悪影響を及ぼすようであった。
【００７８】
より低い効率であったが、我々は、この繊維材料を水（Ｈ２Ｏ）と共に特定時間インキュベートすることで（例えば一定容積の水の存在下における浄化繊維材料の少なくとも４時間のインキュベーション）、核酸が浄化繊維材料からもまた抽出できることを観察した。
【００７９】
実施例２：テキスタイルからの核酸の単離
Ａ．綿布からの核酸の単離
成熟綿繊維からのさらに処理し得るＤＮＡなどの核酸の成功裏の単離は、紡績および製織後の繊維からの核酸、特に処理可能なＤＮＡなどの生体高分子を単離する試みを促した。この目的を達成するために、１片の綿布を解すことにより糸を単離して小さく切断し、５ｍｌの溶解緩衝液（ＤＮｅａｓｙ（登録商標）ＡＰ１緩衝液）中において６５℃で少なくとも３０分または室温で一晩インキュベートした。緩衝液を材料から搾り取って、５００μｌの溶解産物をエッペンドルフ管に移し、以下の製造業者の推奨事項に従ってさらに処理した。
●１３０μｌのＡＰ２緩衝液を添加して混合し、氷上で５分間インキュベートする
●１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する
●液相をライラックＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒミニスピンカラムに移す
●１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離する
●ペレットを乱すことなく通過画分を新しいエッペンドルフ管に移し；
●８００μｌのＡＰ３／Ｅ緩衝液を添加して混合する
●６５０μｌをＤＮｅａｓｙ（登録商標）ミニスピンカラムに移して８０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、通過画分を廃棄する
●このステップを残りのサンプルで繰り返し；収集管を廃棄して、カラムを新しい２ｍｌ収集管に入れる
●カラムを５００μｌのＡＷ緩衝液で洗浄して８０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、通過画分を廃棄する
●カラムを５００μｌのＡＷ緩衝液で洗浄して１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、通過画分を廃棄する
●エタノールのキャリー・オーバーなしでカラムを１．５ｍｌエッペンドルフに入れる
●カラムに５０μｌの水を添加して少なくとも５分間室温でインキュベートする
●８０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。ＤＮＡを４℃で保存する。
【００８０】
実施例１．Ａ．のプライマーを使用したＰＣＲ反応において、１および５μｌのサンプルをテンプレートＤＮＡとして使用した。結果を図４に示す。一晩インキュベーションした後の核酸サンプルを使用した場合、予期された６６９ｂｐの単位複製配列が検出でき、プロトコルを使用して、紡績および製織後に綿繊維から核酸を単離し得ることが示唆された。３０分間のインキュベーションと比べて、一晩インキュベーションした後の顕著により強いＰＣＲシグナルは、後者のプロトコルがより高濃度の処理可能なＤＮＡをもたらすことを示唆する。
【００８１】
Ｂ．織り方の異なるテキスタイルからの核酸の単離
核酸単離プロトコルを織り方の異なる（すなわち異なる加工を受けた）完成服飾品にもまた応用した。この目的を達成するために、綿長袖シャツ（織布）および綿ポロ（メリヤス）から小片を切断し、溶解緩衝液中でのインキュベーションを一晩実施し、または６日間のインキュベーションにまで延長したことを除いては、実施例２．Ａ．と同様に処理した。単離された核酸上で実施例２．Ａ．に記載するＰＣＲ反応を実施して、結果を５に示す。
【００８２】
双方の種類の布帛から単離された核酸サンプルを使用して、ＰＣＲ増幅後に予期された単位複製配列が検出された。ここでもまたシグナルは、溶解緩衝液中のインキュベーションが延長されたサンプルでより強かった。
【００８３】
実施例３：特殊繊維からの核酸の単離
国際公開第２００６／１３６３５１号パンフレットの実施例１に記載されるように、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼキメラ遺伝子（「ＮｏｄＣ遺伝子」）を含んでなる遺伝子導入綿植物から成熟繊維を単離して精製した。ＱＩＡＧＥＮにより商品化されているＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、製造業者の推奨事項（ｗｗｗ１．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ＨＢ／ＤＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＭａｘｉで入手できるＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ参照）に従って精製繊維抽出物から核酸を単離し、ＵＶ分光光度法を使用して単離された核酸濃度を判定した（表３）。
【００８４】
【表５】
2011530276.tif 000006
【００８５】
単離された核酸はまた、ＮｏｄＣコード化遺伝子から１２２４ｂｐの断片を増幅する以下のプライマーなどの、その他の内在性遺伝子に対して特異的なプライマーを使用した標準ＰＣＲ反応において、テンプレートとして使用した。
Ｉｄｂ０９３：ｃｇｔｔｔｔｔｃａｃｔｃａｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｃａａｇｔｇｔｃｇｔａｇａｔｇｔｇａｔｃｇｇｔｔｔｇｃｔｔｇｃｇ（配列番号：３）
Ｉｄｂ１２６：ｇｇｃｇｃｇｃｃｔｔａｇｇａａｃｔｃｔｃｇｃｇｔｇａｔａｇｃｃａｃ（配列番号：４）
【００８６】
１μｌおよび５μｌのテンプレート核酸の双方を使用した。ＰＣＲ増幅の結果を図６に示す。導入遺伝子存在の徴候である予期されるＤＮＡ単位複製配列が、各サンプルで観察できた。
【００８７】
実施例４：異なる繊維タイプ間の自動化および識別
参照によって本明細書に援用する未公開欧州特許出願ＥＰ０８０７５５１４．３に記載されるように、ピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）からのグルカナーゼ１  Ａサブゲノム対立遺伝子は、Ｇｌｕｃ１  Ａサブゲノム対立遺伝子のコード領域中に停止コドンが存在することより、リクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）からのグルカナーゼ１サブゲノム対立遺伝子とは異なる。この多形性を使用して、ピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）Ｇｌｕｃ１対立遺伝子を有する植物からの綿繊維と、リクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）Ｇｌｕｃ１対立遺伝子を有する植物からの綿繊維とを識別できる。この目的を達成するためにＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイがデザインされ、多形性を保有するＤＮＡ断片を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーは次のとおりであった。
順方向プライマー：ＧＣＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＧＡＴＡＴＡＡＣＡＴＣＧＡ（配列番号：７）
逆方向プライマー：ＧＧＣＡＴＡＧＧＣＡＡＡＡＴＡＡＧＧＧＴＡＣＡＣＡ（配列番号：８）
【００８８】
多形性は、多形性を検出する以下の蛍光標識プライマーの分解をモニタリングすることで検出された。
ＶＩＣ−ＡＡＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡＣＣＡＧ（ｈｉｒｓｕｔｕｍ対立遺伝子）（配列番号：９）
ＦＡＭ−ＡＴＣＣＴＧＴＣＡＡＡＣＣＡＧ（ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ対立遺伝子）（配列番号：１０）
【００８９】
これらのプライマーをｑＰＣＲセットアップで使用してサイクル数を６０まで増大させ、蛍光を終点においてのみ判定した。核酸テンプレートとしては、ピマワタ（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）繊維（ＰＩＭＡ）またはリクチメン（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）繊維（ＦＭ９６６）のどちらかから単離されたＤＮＡ混合物を以下の比率で使用した。１００％ＰＩＭＡ、７５％ＰＩＭＡ／２５％ＦＭ９６６、５０％ＰＩＭＡ／５０％ＦＭ９６６、２５％ＰＩＭＡ／７５％ＦＭ９６６、１００％ＦＭ９６６。結果を図７に概略的に示す。
【００９０】
Ｘ軸はＧｌｕｃ１のリクチメン（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）対立遺伝子の存在を示す一方、Ｙ軸はＧｌｕｃ１のピマワタ（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）対立遺伝子の存在を示す。ＰＩＭＡ繊維から単離されたＤＮＡでは、Ｇｌｕｃ１ピマワタ（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）の対立遺伝子のみが検出された。ＰＩＭＡ繊維から単離されたＤＮＡでは、Ｇｌｕｃ１のリクチメン（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）対立遺伝子のみが検出された。Ｔａｑｍａｎ分析は、混合ＤＮＡサンプル中において様々な比率の双方の対立遺伝子を検出できるようにする。
【００９１】
さらなるステップでは同じＲＴ−ＰＣＲタイプの分析を使用して、ＦＭ９６６梱からの、綿テキスタイルおよび繊維材料からの核酸サンプルを分析した。結果を図８に示すＦＭ９６６梱から抽出された核酸、およびポロシャツからから抽出された核酸では、Ｇｌｕｃ１のリクチメン（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）対立遺伝子のみが検出され、使用された綿材料が排他的にリクチメン（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）タイプ材料起源であることが示唆された。
【００９２】
アッセイにはさらなる最適化が必要かもしれないが、このような最適化は明らかに当業者の技術範囲内である。
【００９３】
実施例５：綿繊維から単離された色素体ゲノムの特性解析
成熟綿繊維からゲノムＤＮＡを単離して特性解析し得るという意外な発見のために、我々はこれらの繊維から抽出されたＤＮＡプール中の色素体ＤＮＡを同定する可能性を調査した。
【００９４】
白色色素体は発達中の綿繊維中に存在することが示されているが（Ｒｙｓｅｒ  Ｕ．（１９８５）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３９，ｐｐ．２３６−２５６）、それらが成熟綿繊維中に存在することは予期されない。白色体は、同一ゲノムを有することで葉緑体と類似している（それらは同一前駆細胞型から分化している）が、白色体はデンプン含量の高蓄積によって特殊化している。
【００９５】
Ｃｒｏｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ８９（４）：７０７−７２５は、色素体ゲノムの４つの遺伝子（ｒｐｌ１６、ｍａｔＫ、ｔｒｎＴ−ｔｒｎＬ、およびｎｄｈＦ）を増幅するプライマーの組み合わせを公開した。第１のステップでは、綿葉から単離されたＤＮＡ上で我々のＰＣＲ分析を実施することにより、我々はこれらの４つの遺伝子を増幅するための公開されたプライマーの組み合わせを最適化した。次のステップでは、遺伝子毎に最適化されたプライマーの組み合わせを綿ミニ梱（認定ＦｉｂｅｒＭａｘ綿）から得られた繊維ＤＮＡサンプルの増幅のために使用した。我々は意外にも、この繊維ＤＮＡサンプルからの４つのＰＣＲ断片の増幅を示した。ＴＯＰＯ−ｂｌｕｎｔベクター中のサブクローニングと、それに続くこれらの断片の配列分析からは、これらの４つの断片が色素体ゲノム起源であることが確認された。配列決定からはｒｐｌ１６、ｍａｔＫ、およびｔｒｎＴ−ｔｒｎＬでユニークな共通配列がもたらされ、ｎｄｈＦではいくつかの共通配列が得られた。
【００９６】
リクチメン（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）およびピマワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）の完全な葉緑体配列は、ＥＭＢＬデータベースで入手できるので（登録ＤＱ３４５９５９はｃｏｋｅｒ  ３１０ＦＲ（リクチメン（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ））の葉緑体ＤＮＡ配列であり、登録ＡＰ００９１２３はピマワタ（Ｇ．ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）の葉緑体ＤＮＡの配列である）、得られた配列と公開配列とを配列比較することができた。得られた配列は、公開されたリクチメン（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）の配列と（縮重プライマー部位以外は）１００％同一であることが分かった。これにより綿梱中の繊維がリクチメン（Ｇ．ｈｉｒｓｕｔｕｍ）に由来することが確認された。これらの特定の色素体配列の成功裏の分子特性解析は、今や繊維ＤＮＡを遺伝子型同定する新しい機会を提供する。またより古い繊維サンプルを色素体配列についてプローブし得て、進化および育種中のそれらの関係を解釈し得る。
【００９７】
ＰＣＲ条件：
２μｌテンプレート
１．５μｌ順方向プライマー（１０μＭ）
１．５μｌ逆方向プライマー（１０μＭ）
２１μｌ  ＭＱ
１μｌ  ｄＮＴＰ
１０μｌ  １０×ＨＦ緩衝液
０．５μｌ  Ｐｈｕｓｉｏｎ
１２．５μｌ  ＭＱ
ＰＣＲプログラム
３０ｓ＠９８℃
１０ｓ＠９８℃
３０ｓ＠６０℃
６０ｓ＠７２℃
３５  ｃｙｃｌｉ
１０ｍｉｎ＠７２℃
Ｈｏｌｄ＠４℃
【００９８】
プライマーの組み合わせ：
ｒｐｌ１６
Ｆ７１：ｇｃｔａｔｇｃｔｔａｇｔｇｔｇｔｇａｃｔｃｇｔｔ（配列番号１１）
Ｒ１５１６：ｃｃｃｔｔｃａｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｔｇｔｔｇ（配列番号１２）
ｍａｔＫ
ｍａｔＫＦ３：ｃｔａａｔｇｇａｔｃａａｃａｇａａｗｃｇｔｔｔｇ（配列番号１３）
ｔｒｎＫＲ：ａａｃｔａｇｔｃｇｇａｔｇｇａｇｔａｇ（配列番号１４）
ｔｒｎＴ−ｔｒｎＬ
ｔｒｎＬ２：ａａｔａｔｔａｃｔｇａｃｔｃｃｍｔｔｔｔｋａｔｔｔｔｃｋａｇ（配列番号１５）
ｔｒｎＢ：ｔｃｔａｃｃｇａｔｔｔｃｇｃｃａｔａｔｃ（配列番号１６）
ｎｄｈＦ
５’Ｆｎｅｗ：ｇａａｔａｔｇｃａｔｇｇａｔｃａｔａｃｃ（配列番号１７）
１３１８Ｒ：ｃｇａａａｃａｔａｔａａａａｔｇｃｒｇｔｔａａｔｃｃ（配列番号１８）
【００９９】
実施例６：綿繊維から単離された核酸ゲノムの特性解析
上の実施例は、成熟綿繊維およびその下流製品からＤＮＡを単離して特性解析し得ることを説得力をもって示した。次のステップでは、我々は単離された繊維ＤＮＡが綿ゲノム全体に真に相当するのか、またはそれが綿ゲノムの小部分のみに相当するのかどうかを検討した。部分的ゲノム同等物は信頼できない不完全なアッセイ結果を生じさせるので、それは形質または遺伝子型試験において有用でない。第１のチャレンジは、アッセイ試験のための出発原料としての綿繊維から得られるＤＮＡの限定的量を克服することであった。この制限を克服するために、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）法を選択した。遺伝子型決定および形質試験のため綿などの倍数体ゲノムを増幅するのに、ＷＧＡはこれまで使用されていなかった。ＤＮＡ増幅ステップは出発繊維ＤＮＡ材料の量を増強するのに重要であるが、Ｇｉａｒｄｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ａｐｒ  １４，１０：１５９によって報告されるように、時にＷＧＡステップに特有のゲノムバイアスを導入しないことが肝要である。我々は単離された繊維ＤＮＡに対するＷＧＡステップの信頼性に、機能性Ｔａｑｍａｎアッセイで対処した。そこでは実質的に同一のＴａｑｍａｎアッセイ中で、ＷＧＡ増幅繊維ＤＮＡの質を同じ市販の綿繊維原料のＷＧＡ増幅子葉ＤＮＡと比較した。
【０１００】
およそ５００グラムのＦＭ９０６３Ｂ２Ｆ繊維（３つの茶色の小袋内の各５００グラムのサンプル；サンプルの多様性のために３つの複製を梱番号７２１１３４３５０１３８、７２１１３４３５０１５４、７２１１３４３５０１５６の異なる梱から採取した）はＣｒｏｐＭａｒｋ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｆａｒｍからのＫ．Ｍｅｒｒｉｔｔによって提供された。繊維は、ＦｉｂｅｒＭａｘ証明プログラムに収載された２００８〜９年の綿シーズンに栽培された綿からのものであった。
【０１０１】
我々は、繊維中の汚染物質が、下流試験のための繊維ＤＮＡの使用に対して顕著な影響を及ぼし得ると判断したので、我々は繊維を手動で浄化した。これは少量の繊維（例えば１．５グラム）を引き伸ばし、残骸が肉眼で見えなくなるまでピンセットでほとんどの残骸を除去することで実施される。  ＤＮＡ抽出はＱｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて以下のステップで実施した。
●１グラムの浄化（葉夾雑物なし）成熟綿繊維を取って、それを５０ｍｌのファルコン管に入れる。繊維を清潔なはさみで数回切断する。
●５ｍｌのＡＰ１溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎカタログ１０１４６３０）、および１００μｌのＲＮａｓｅＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を添加する。乳棒を使用してサンプルと緩衝液の間の接触を均質化する。
●１５ｍｌの管を使用して６５℃で２０分間インキュベートし、インキュベーション中に材料を２〜３回混合する。
●１５ｍｌの管を使用して材料を絞り、５００μｌの溶解産物を２ｍｌエッペンドルフ管に移す。３つのアリコートを取って複製として使用する。
●１３０μｌのＡＰ２緩衝液を添加して混合し、各アリコートを氷上で５分間インキュベートする。
●１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
●液相をライラックＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒミニスピンカラムに移す。
●１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。
●ペレットを乱すことなく通過画分を新しいエッペンドルフ管に移す。
●８００μｌのＡＰ３／Ｅ緩衝液を添加して混合する。
●６５０μｌをＤＮｅａｓｙミニスピンカラムに移して８０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、通過画分を廃棄する。
●残りのサンプルにこのステップを繰り返す。収集管を廃棄して、カラムを新しい２ｍｌ収集管に入れる。
●カラムを５００μｌのＡＷ緩衝液で洗浄して８０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、通過画分を廃棄する。
●カラムを５００μｌのＡＷ緩衝液で洗浄して１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、通過画分および収集管を廃棄する。
●エタノールのキャリーオーバーなしに、カラムを１．５ｍｌエッペンドルフ管に入れる。
●５０μｌのＭＱ水をカラムに添加して室温で少なくとも５分間インキュベートする。
●８０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。ＤＮＡを４℃で（短期）または−２０℃で（長期）保管する。
【０１０２】
ＦＭ９０６３  Ｂ２Ｆの子葉ＤＮＡ抽出は次のように実施した。ＦＭ９０６３  Ｂ２Ｆの５０個の種子を２８℃の発芽試験器内で発芽紙と水を用いて発芽させた。子葉を採取してケイ素を用いて乾燥させた。子葉ＤＮＡを抽出した。抽出した子葉ＤＮＡを合わせて５本の１．５ｍｌ管に入れた。
【０１０３】
ＳｉｇｍａのＧｅｎｏｍｅＰｌｅｘ（登録商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＷＧＡ）Ｋｉｔ  （ＷＧＡ２）を用いて、以下のステップで全ゲノム増幅を実施した。
●１μｌの１０×断片化緩衝液をＰＣＲ管内の１０μｌの抽出ＤＮＡに添加する。
●９５℃で２分間、そして氷上での冷却の温度サイクルでインキュベートする。
●２μｌの１×ライブラリー調製緩衝液を添加する。
●１μｌのライブラリー安定化溶液を添加して混合する。
●９５℃で２分間、そして氷上での冷却の温度サイクルでインキュベートする。
●１μｌのライブラリー調製酵素を添加して混合する。
●プログラムＷＧＡ１を使用して、サーマルサイクラー内でインキュベートする。
１６℃で２０分間
２４℃で２０分間
３７℃で２０分間
７５℃で５分間
恒久的に４℃
●以下のマスターミックスを添加する。
７．５μｌの１０×増幅マスターミックス
４７．５μｌのヌクレアーゼを含まない水
５μｌのＷＧＡポリメラーゼ
●プログラムＷＧＡ２を使用して、サーマルサイクラー内でインキュベートする。
９５℃で３分間
１４回のサイクル：９４℃で１５秒間
６５℃で５分間
恒久的に４℃
●５μｌを１％アガロースゲル上にのせてＷＧＡ  ＤＮＡの質をチェックする。１００ｂｐと１０００ｂｐとの間にスメアが存在すべきである。
【０１０４】
ＷＧＡ反応（繊維および子葉）は、全て成功したことが立証された。
【０１０５】
任意にＦＭ９０６３  Ｂ２Ｆの子葉および繊維のＷＧＡ増幅ＤＮＡを以下の様式でさらに精製した。５個のサンプルからのＷＧＡ  ＤＮＡを合わせて２ｍｌの管（約２４０μｌのＤＮＡ）に入れ、２４μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２を添加して混合し、８００μｌの１００％氷冷エタノールを添加して完全に混合し、−２０℃で一晩置いて、−２０℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を注意深く除去して、ＤＮＡペレットを８００μｌの７０％氷冷エタノールで洗浄し、−２０℃、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を注意深く除去して、管を６５℃の恒温器に１５分間入れて乾燥させ、ＤＮＡを６５μｌの１×ＴＥ緩衝液に再懸濁する。
【０１０６】
増幅されたＤＮＡサンプル上で、２つの異なるＴａｑｍａｎアッセイを実施した。１つのＴａｑｍａｎアッセイは、４０個の異なるＳＮＰを同定することを目的とし、別のＴａｑｍａｎアッセイは、ＢｏｌｌｇａｒｄＩＩ（Ｍｏｎ５３１）、Ｂｏｌｌｇａｒｄ（ＭＯＮ１５９８５）、およびＦｌｅｘ（ＭＯＮ８８９１３）の３つの異なる形質を同定することを目的としている。これらの各Ｔａｑｍａｎアッセイは、１）ＦＭ９０６３  Ｂ２Ｆ繊維から抽出されたＷＧＡ増幅ＤＮＡ、２）子葉ＦＭ９０６３  Ｂ２Ｆから抽出されたＷＧＡ増幅ＤＮＡ、３）ＦＭ９０６３  Ｂ２Ｆ繊維の精製ＷＧＡ増幅ＤＮＡ、および４）ＦＭ９０６３  Ｂ２Ｆ子葉の精製ＷＧＡ増幅ＤＮＡの４つの異なるＤＮＡサンプル上で実施した。綿Ａサブゲノム（Ａｔ）は綿Ｄサブゲノム（Ｄｔ）よりも物理的サイズが５０％大きいことが知られているので、２３個のＳＮＰをＡゲノムから選択し、１７個をＤゲノムから選択した。
【０１０７】
４０個のＳＮＰは全て、Ｔａｑｍａｎアッセイにおいて精製ＦＭ９０６３  Ｂ２Ｆ  ＷＧＡ増幅繊維ＤＮＡ中で成功裏に検出できることが観察された。さらに同じ４０個のＳＮＰの検出に関して、精製ＦＭ９０６３  Ｂ２Ｆ子葉ＷＧＡ  ＤＮＡを用いて、および原料（すなわち未精製）ＦＭ９０６３  Ｂ２Ｆ子葉ＤＮＡを用いて、同一結果が得られた。Ｂｏｌｌｇａｒｄ  ＩＩ（Ｍｏｎ５３１）、Ｂｏｌｌｇａｒｄ（ＭＯＮ１５９８５）、およびＦｌｅｘ（ＭＯＮ８８９１３）を検出するためのＴａｑｍａｎアッセイもまた、繊維および子葉のＷＧＡ増幅ＤＮＡサンプルの間で同一結果を与えることが判明した。Ｍｏｎ５３１はＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５３，６２２２−６２２９に従ってアッセイした。Ｍｏｎ１５９８５およびＭｏｎ８８９１３は、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５５，３３５１−３３５７に従ってアッセイした。
【０１０８】
したがってＷＧＡ増幅綿繊維ＤＮＡはＷＧＡ増幅葉ＤＮＡ上で実施されるＴａｑｍａｎアッセイと同じ結果を提供したので、成功裏の分子マーカー判定のための信頼できる原料としてそれを使用し得る。これに加えてＷＧＡ増幅綿繊維ＤＮＡは、ＷＧＡ増幅葉ＤＮＡ上で実施されるＴａｑｍａｎアッセイと同じ結果を提供したので、成功裏の形質判定のための信頼できる原料としてそれを使用し得る。特定の綿変種の特性解析および同定のためには、通常、より多数のＳＮＰ（約３００個）を使用すべきであるが、本例は、ＷＧＡ増幅綿繊維ＤＮＡを使用することで、このアプローチが実行可能であることを示す。
【０１０９】
実施例７：綿繊維材料から単離されたその他の生体高分子
単離のための異なるプロトコルを使用した抽出物のＵＶ分光光度法は、これらの抽出物が純粋にＤＮＡから構成されず、その他の生体高分子を含有してもよいことを示唆する。Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析を使用して、低濃度のタンパク質（約１０ｎｇ／μｌ）を発見した。これに加えて繊維抽出物は、マイクロＲＮＡと同定されたＲＮＡｓｅ  Ｉに抵抗性の様々な濃度の小型ＲＮＡを含有した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成23年2月9日(2011.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．植物繊維から、多糖類またはリグニン以外の前記植物繊維中の天然の生体高分子を単離するステップと、
ｂ．前記生体高分子のモノマー配列中にコードされる情報を特性解析するステップと
を含んでなる、成熟植物繊維または加工植物繊維を特性解析する方法。
【請求項２】
ａ．植物繊維から、多糖類またはリグニン以外の前記植物繊維中の天然の生体高分子を単離するステップと、
ｂ．前記植物繊維に対して特異的な検出アッセイを前記生体高分子に実施するステップと
を含んでなる、成熟植物繊維または加工植物繊維を同定する方法。
【請求項３】
前記植物繊維が種子繊維である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物繊維が綿繊維である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記生体高分子がポリペプチド、タンパク質、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡの群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記検出アッセイが、
ａ．ポリメラーゼ連鎖反応に基づく検出アッセイ
ｂ．抗体に基づく検出アッセイ、または
ｃ．核酸ハイブリダイゼーションに基づく検出アッセイ
である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出アッセイが、
ａ．繊維産生植物のゲノム中に存在するキメラ遺伝子の存在または不在、または
ｂ．繊維産生植物のゲノム中に存在する特定の対立遺伝子の存在または不在
を検出する、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記キメラ遺伝子が、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、ＥＰＳＰＳ、ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ、バシラス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）結晶タンパク質の殺虫性部分、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ、ポリ（ＡＤＰ−リボース）グルコヒドロラーゼ、スクロースシンターゼ、スクロースリン酸シンターゼ、グルカナーゼ、セルロースシンターゼ、キチナーゼ、エクスパンシン、カロースシンターゼ、キナーゼ、ニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンセターゼまたはニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼから選択される、コード領域またはその一部またはアンチセンス部分を含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検出アッセイが事象特異的検出アッセイである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記繊維が、糸、布帛、薄織物または完成服飾品中に存在する、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ａ．植物の成熟または加工繊維から前記植物繊維中の天然の核酸を単離するステップと、
ｂ．前記核酸にゲノム分析プロトコルを実施するステップと
を含んでなる、繊維産生植物のゲノムを分析する方法。
【請求項１２】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、および二本鎖ＲＮＡの群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸にゲノム分析プロトコルを実施する前に、前記単離されたＤＮＡに全ゲノム増幅ステップを実施する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
古い成熟繊維、または古い糸、布帛または完成服飾品に適用される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ａ．収穫された成熟植物繊維から葉および茎夾雑物を除去するステップと、
ｂ．前記植物繊維を洗剤、プロテアーゼ、および塩を含有する溶解緩衝液中で長時間、好ましくは４〜１００時間にわたりインキュベートするステップと、
ｃ．前記溶解緩衝液を標準核酸単離法に従って処理して前記ＤＮＡを単離するステップと
を含んでなる、成熟植物繊維または加工植物繊維から核酸を単離する方法。
【請求項１６】
ａ．布帛の糸を解すステップと、
ｂ．前記糸を洗剤、プロテアーゼ、および塩を含有する溶解緩衝中で長時間、好ましくは４〜１００時間にわたりインキュベートするステップと、
ｃ．前記溶解緩衝液を標準核酸単離法に従って処理して前記核酸を単離するステップと
を含んでなる、織布またはメリヤスから核酸を単離する方法。
【請求項１７】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
取引される植物繊維のアイデンティティを証明するプロセスにおける、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１９】
ａ．植物繊維混合物から、多糖類またはリグニン以外の前記植物繊維中の天然の生体高分子を単離するステップと、
ｂ．前記各植物繊維に対して特異的な検出アッセイを前記生体高分子に実施するステップと、
ｃ．各繊維の相対量を判定するステップと
を含んでなる、成熟または加工植物繊維混合物中の異なる植物繊維の相対量を判定する方法。
【請求項２０】
ａ．特定のゲノム組成物を含んでなり特定銘柄の綿繊維を産生する認定綿種子の登録生産者による購入を記録するステップと、
ｂ．前記登録生産者によって前記認定綿種子から生産される未加工綿繊維の梱を前記特定銘柄の綿繊維として登録するステップと、
ｃ．前記梱を前記種子購入記録との照合によって認証するステップと、
ｄ．前記登録梱を紡績工場に提供して、好ましくは主に前記銘柄の綿繊維から、特に排他的に前記銘柄の綿繊維から、糸、布帛または服飾品を製造するステップと、
ｅ．請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法を使用して、前記銘柄の綿繊維のアイデンティティを１つ以上のステップで監査するステップと
を含んでなる、取引される綿繊維のアイデンティティを証明する方法。
【国際調査報告】
2011530276.tif 000015
2011530276.tif 000016