(57)【要約】  本発明は、新規ラクトースホスホリラーゼ酵素及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、セルロモナス・ウーダから得られるセロビオースホスホリラーゼの変異によって作製されたラクトースホスホリラーゼ酵素に関する。この酵素に変異を導入することによって、セロビオースホスホリラーゼからラクトースホスホリラーゼへ活性を切り替えることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも０．０５ユニット／ｍｇの比活性を有するラクトースホスホリラーゼ酵素。
【請求項２】
セロビオースホスホリラーゼの突然変異誘発によって得られる、請求項１に記載のラクトースホスホリラーゼ酵素。
【請求項３】
前記変異がセルロモナス・ウーダの領域３００から７５０（配列番号１）又は相同な酵素中の等価な領域中に位置している、請求項２に記載のラクトースホスホリラーゼ酵素。
【請求項４】
前記変異が、セルロモナス・ユーダの領域３３５から３７５、３９５から４３５、４７５から５１５及び６４０から６８０（配列番号１）又は相同な酵素中の等価な領域からなる群から選択される領域中に位置している、請求項３に記載のラクトースホスホリラーゼ酵素。
【請求項５】
配列番号１（シー・ウーダ酵素）の変異Ｔ５０８及び／若しくはＮ６６７又は相同な酵素中の均等な領域を少なくとも含む、請求項４に記載のラクトースホスホリラーゼ酵素。
【請求項６】
Ｔ５０８Ａ、Ｔ５０８Ｉ、Ｎ６６７Ｔ及びＮ６６７Ａからなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項５に記載のラクトースホスホリラーゼ酵素。
【請求項７】
配列番号２を含む、請求項６に記載のラクトースホスホリラーゼ酵素。
【請求項８】
配列番号３を含む、請求項６に記載のラクトースホスホリラーゼ酵素。
【請求項９】
配列番号４を含む、請求項６に記載のラクトースホスホリラーゼ酵素。
【請求項１０】
野生型酵素と比べて増加したラクトースホスホリラーゼ活性を有する変異体セロビオースホスホリラーゼ酵素。
【請求項１１】
請求項１から９の何れかに記載のラクトースホスホリラーゼ酵素をコードする核酸配列。
【請求項１２】
ガラクトース−１−リン酸を生産するための、請求項１から９の何れかに記載のラクトースホスホリラーゼ酵素の使用。
【請求項１３】
ラクトースを生産するための、請求項１から９の何れかに記載のラクトースホスホリラーゼ酵素の使用。
【請求項１４】
ガラクトース−１−リン酸を生産するための、請求項１０に記載のセロビオースホスホリラーゼ酵素の使用。
【請求項１５】
ラクトースを生産するための、請求項１０に記載のセロビオースホスホリラーゼ酵素の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ラクトースホスホリラーゼ酵素及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、セルロモナス・ウーダ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎｓａ  ｕｄａ）から得られるセロビオースホスホリラーゼの変異によって作製されたラクトースホスホリラーゼ酵素に関する。この酵素の中に変異を導入することによって、セロビオースホスホリラーゼからラクトースホスホリラーゼへ活性を切り替えることができる。
【背景技術】
【０００２】
α結合されたホスファート基を有する単糖は、グリコシド結合を合成するためのルロア経路における中心的中間体である。実際、α結合されたホスファート基を有する単糖は、グリコシル転移酵素に対する供与体基質であるヌクレオチド糖へ転化され得る。インビボにおいて、ガラクトース−１−リン酸は、ガラクトース−１−リン酸ウリジル転移酵素（ＧＡＬＴ）によって、ＵＤＰ−ガラクトースへ転化される。この酵素の不存在は、血中へのガラクトースの有毒なレベルの蓄積をもたらす（ガラクトース血症として知られる遺伝病（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ−Ｋｅｉｌ，２００６））。次いで、ＵＤＰ−ガラクトースは、糖タンパク質及び糖脂質中の多岐にわたる重要な炭水化物エピトープの合成に関与するガラクトシル転移酵素に対する基質である（Ｖａｒｋｉ，１９９３）。
【０００３】
グリコシルリン酸は、慣用の化学的触媒を用いて伝統的に合成されてきた。１９３７年に始まり、異なる触媒及び異なるグリコシル又はホスファート供与体を使用する幾つかの操作が文献に記載されてきた（Ｃｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９３７；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９６１；Ｉｎａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２；Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。さらなる情報は、欧州特許０５５３２９７：“Ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒｉｅｓｔｅｒｓ”に見出すことができる。炭水化物の化学的リン酸化は、典型的には、複数工程の反応スキームからなり、低い総収率をもたらし、アノマー選択性の達成においてあまり成功を収めていない。その結果、酵素的リン酸化技術の開発が極めて望ましく、過程において生成される廃棄物の量を低減するというさらなる利点を有している（環境にやさしい化学）。
【０００４】
単糖をリン酸化する酵素は、ホスファート供与体としてＡＴＰを必要とするキナーゼのクラス（リン酸転移酵素）に属する。これらの糖キナーゼの多くは、Ｃ６位においてその基質をリン酸化し、アノマー中心においてその基質をリン酸化しない。唯一の公知の例外は、α−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸を産生するガラクトキナーゼ（ＥＣ２．７．１．６）及びβ−Ｌ−フコース−１−リン酸を産生するフコキナーゼ（ＥＣ２．７．１．５２）である。興味深いことに、基質としてＤ−タロース及びＬ−グルコースを含めるために誘導的進化を用いることによって、ガラクトキナーゼの特異性が広げられており（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、このようなガラクトキナーゼ変形物の使用を記載する特許が公開されている“Ｓｕｇａｒ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ”（ＷＯ２００５０５６７８６）。α−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸を生産するためにキナーゼを利用することはできるが、ホスファート供与体として、不安定且つ高価なＡＴＰが必要とされることは、産業的応用に関して深刻な欠点である。
【０００５】
その名前に関わらず、グリコシドホスホリラーゼは、その基質を実際にはリン酸化せず、代わりに、二糖及び多糖の加リン酸分解を触媒して、リン酸化された単糖を産生する。供与体として無機ホスファートを必要とするに過ぎず、マルトデキストリン（Ｇｒｉｅｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）又はショ糖（Ｇｏｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）からα−Ｄ−グルコース−１−リン酸を生産するために長く使用されてきたので、これらの酵素は生物触媒として極めて魅力的である。米国特許第６，７６４，８４１号“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ”に、さらなる情報を見出すことができる。残念なことに、炭水化物ホスホリラーゼの特異性は極めて限られており、１つの酵素が天然でα−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸を産生することが知られているに過ぎない（すなわち、ビフィドバクテリア中に見出されるラクト−Ｎ−ビオースホスホリラーゼ（Ｋｉｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５））。ラクト−Ｎ−ビオースＩ又はβ−Ｄ−ガラクトシル−（１，３）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンは、ヒトの乳にのみ存在するオリゴ糖の構造成分であり、大量に入手することは容易でない（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  ＆  Ｋｉｔａｏｋａ，２００７）。ＪＰ９２２４６９１は、セルビブリオ・ギルバス（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｌｖｕｓ）から得られるセロビオースホスホリラーゼの存在下で、キトビオース又はラクトースをリン酸と反応させることによる、食材として有用な糖リン酸の作製を開示している。ラクトースから出発して、α−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸が得られる。しかしながら、これは、セロビオースホスホリラーゼの副活性に過ぎず、長い反応時間（４８時間）とかなり低い収率のために、科学的には興味深いものの、この酵素は産業用途に適さない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】欧州特許第０５５３２９７号明細書
【特許文献２】国際公開第２００５／０５６７８６号
【特許文献３】米国特許第６，７６４，８４１号明細書
【特許文献４】特開平９−２２４６９１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ−Ｋｅｉｌ、２００６
【非特許文献２】Ｖａｒｋｉ、１９９３
【非特許文献３】Ｃｏｒｉ他、１９３７
【非特許文献４】ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９６１
【非特許文献５】Ｉｎａｇｅ他、１９８２
【非特許文献６】Ｓｃｈｍｉｄｔ他、１９８２
【非特許文献７】Ｓｉｍ他、１９９３
【非特許文献８】Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ他、２００３
【非特許文献９】Ｇｒｉｅｓｓｌｅｒ他、１９９６
【非特許文献１０】Ｇｏｅｄｌ他、２００７
【非特許文献１１】Ｋｉｔａｏｋａ他、２００５
【非特許文献１２】Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ  ＆  Ｋｉｔａｏｋａ、２００７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
驚くべきことに、本発明者らは、セルロモナス・ウーダから得られるセロビオースホスホリラーゼがラクトースに対する活性も示し、α−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸を産生することを見出した。さらに驚くべきことに、非常に増大したラクトースホスホリラーゼ活性を有する変異体を得ることができた。前記変異体は、野生型セルビブリオ・ギルバスの比活性より少なくとも１０倍高い、好ましくは約５０倍高い比活性を有する。
【０００９】
本発明の第一の態様は、５０ｍＭＭＥＳ−緩衝液ｐＨ６．６中において、３７℃で、２００ｍＭラクトースに対して測定された場合に、少なくとも０．０５ユニット／ｍｇ、好ましくは少なくとも０．１ユニット／ｍｇ、より好ましくは０．２ユニット／ｍｇ、さらにより好ましくは少なくとも０．２５ユニット／ｍｇの比活性を有するラクトースホスホリラーゼ酵素である。１ユニット（Ｕ）は、これらの条件下で、１分に基質１μｍｏｌを転化する酵素の量として定義される。
【００１０】
好ましくは、前記ラクトースホスホリラーゼ酵素は、セロビオースホスホリラーゼの変異によって得られる。好ましくは、前記変異は、セルロモナス・ウーダ配列の領域３００から７５０中に、より好ましくは、領域３３５から３７５、３９５から４３５、４７５から５１５及び６４０から６８０の１つの中に又は相同な酵素の等価な領域の中に位置する。本明細書において使用される相同な酵素とは、セロビオースホスホリラーゼ活性を有し及びＢｌａｓｔ並置で測定された場合に、セルロモナス・ウーダ配列と少なくとも４０％の同一性、好ましくは５０％の同一性、より好ましくは６０％の同一性、より好ましくは７０％の同一性、さらにより好ましくは８０％の同一性、より好ましくは９０％の同一性を有する酵素である（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，１９９９）。本明細書において使用される等価な領域とは、ＢＬＡＳＴ並置により、保存された残基の塩基上に、両配列を並置することによって当該領域が同定され得ることを意味する（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，１９９９）。好ましくは、前記ラクトースホスホリラーゼは、セルロモナス・ウーダのセロビオースホスホリラーゼの変異によって得られる。より好ましくは、前記ラクトースホスホリラーゼ酵素は、配列番号１の変異Ａ３９７及び／又は変異Ｔ５０８及び／又は変異Ｎ６６７（シー・ウーダ酵素）又は相同な酵素中の等価な変異を少なくとも含み、好ましくは、前記変異は、Ａ３９７Ｒ、Ｔ５０８Ａ、Ｔ５０８Ｉ、Ｎ６６７Ｔ及びＮ６６７Ａからなる群から選択され、さらにより好ましくは、前記酵素は配列番号２（変異体配列１）、配列番号３（変異体配列２）又は配列番号４（変異体配列３）を含む。１つの好ましい実施形態において、前記酵素は配列番号２からなる。別の好ましい実施形態において、前記酵素は配列番号３からなる。さらに別の好ましい実施形態において、前記酵素は配列番号４からなる。
【００１１】
本発明の別の態様は、本発明のラクトースホスホリラーゼ酵素をコードする核酸配列である。本明細書において使用される核酸には、ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。このような核酸配列は、非限定的な例として、相同な宿主生物中で酵素を過剰生産するために、又はセルロモナス・ウーダ以外の生物中での該酵素を異種生産するために使用することができる。
【００１２】
本発明の別の態様は、野生型酵素と比べて増加したラクトースホスホリラーゼ活性を有する変異体セロビオースホスホリラーゼ酵素である。ラクトースホスホリラーゼ活性は、実施例の材料及び方法に記載されているように測定される。好ましくは、前記活性は、比活性として表される。好ましくは、ラクトースホスホリラーゼ活性は、野生型活性と比べて少なくとも３桁、より好ましくは少なくとも５桁、より好ましくは少なくとも７桁、最も好ましくは少なくとも１０桁増加する。本明細書において使用される変異体酵素とは、野生型配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換され、欠失され及び／又は挿入されている酵素である。好ましくは、前記変異はアミノ酸置換であり、さらにより好ましくは、前記変異は少なくとも２つのアミノ酸の置換であり、最も好ましくは、前記変異は少なくとも３つのアミノ酸の置換である。
【００１３】
本発明の別の態様は、ガラクトース−１−リン酸を生産するための、本発明のラクトースホスホリラーゼ酵素の使用である。本発明のさらに別の態様は、ラクトースを生産するための本発明のラクトースホスホリラーゼ酵素の使用である。
【００１４】
実施例
実施例に対する材料及び方法
細菌株、プラスミド及び増殖条件
セロビオースホスホリラーゼ遺伝子（受託番号ＡＹ３４３３２２）は、セルロモナス・ウーダＤＳＭ２０１０８からクローニングした。Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｓｏｙａ  Ｂｒｏｔｈ培地（ＴＳＢ：１７ｇ／Ｌトリプトン、３ｇ／Ｌ大豆ミールのパパイン消化物、２．５ｇ／Ｌグルコース、２．５ｇ／ＬＫ２ＨＰＯ４、５ｇ／ＬＮａＣｌ）中において、３０℃で生物を増殖させた。ＰＣＲ断片のクローニングのために、ｐＧＥＭ−Ｔプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、イー・コリＤＨ５α中に保存した。セロビオースホスホリラーゼ発現ベクターを構築するために、ｐＴｒｃ９９Ａプラスミド（４１７７塩基対、ＩＰＴＧ誘導性ｔｒｃプロモーター及びアンピシリン耐性遺伝子を含有）を使用した。変形物ライブラリーによる形質転換のために、Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ＴｅｔｒＤ（ｍｃｒＡ）１８３Ｄ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７３  ｅｎｄＡ１  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｒｅｃＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ  Ｈｔｅ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃＩｑＺＤＭ１５Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）  Ａｍｙ  Ｃａｍｒ］）を使用した。プラスミドを単離するために、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンが補充されたＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中において、３７℃で一晩、イー・コリを定型的に増殖させた。組換えセロビオースホスホリラーゼを発現させるために、０．１ｍＭの最終濃度になるように、増殖培地にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を補充した。改善された酵素変形物を発現するイー・コリ細胞を、Ｍ９塩（６ｇ／ＬＮａ２ＨＰＯ４、３ｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬＮＨ４Ｃｌ、０．５ｇ／ＬＮａＣｌ）、２０ｍｇ／Ｌプロリン、０．１ｍＭＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍＭＭｇＳＯ４、１ｍＭチアミン−ＨＣｌ、１８μＭＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、６．９μＭＺｎＣｌ２、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン、０．１ｍＭＩＰＴＧ及び１％（ｗ／ｖ）ラクトースから構成される最小ラクトース培地（ｐＨ７．４）中で選択した。
【００１５】
セロビオースホスホリラーゼ発現ベクターの構築
ＴＳＢ培地中でシー・ウーダを１６時間増殖させた後、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡキット（Ｓｉｇｍａ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。制限部位を含有するプライマーとともに、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、セロビオースホスホリラーゼ遺伝子をゲノムＤＮＡから増殖した。
【００１６】
フォワードプライマー  ５’−ＡＡＣＧＴＴＡＣＧＧＧＣＡＣＴＴＣＧＡＣＧＡＣ−３’；
リバースプライマー  ５’−ＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＧＡＧＧＧＴＣＡＣＧＴＣＧＡＣＧＣ−３’。
【００１７】
それぞれ、フォワード及びリバースプライマー中のＰｓｐ１４０６Ｉ及びＰｓｔＩ制限部位に下線が付されている。ＧＣに富むテンプレートからの増幅を改善するために、５％の最終濃度になるようにＤＭＳＯを添加した。以下のＰＣＲサイクル条件を使用した。９５℃（１０分）；９４℃（１分）、６２℃（１分）及び７２℃（３分）の３５サイクル；７２℃（７分）。完全長のセロビオースホスホリラーゼ遺伝子を含有する２４７７塩基対断片をこのようにして取得し、ｐＧＥＭ−Ｔベクター中に連結した。得られたプラスミドをｐＧＣＰと名付け、セロビオースホスホリラーゼのための発現ベクターを構築するために使用した。Ｐｓｐ１４０６Ｉ（Ｒｏｃｈｅ）制限酵素１０ユニットを用いて、ｐＧＣＰプラスミド５．３μｇを消化した後、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）の３ユニットを用いて、３５３１塩基対断片を平滑末端化した。ＰｓｔＩ制限酵素１０ユニットを用いて、得られた断片を切断し、発現ベクターとの連結のために、２４６７塩基対を使用した。ＮｏｃＩ１０ユニットを用いて、ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター３．１μｇを切断し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ３ユニットを用いて、制限断片を平滑末端化した。ＰｓｔＩを用いて、得られた断片を切断し、セロビオースホスホリラーゼ遺伝子を含有する２４６７塩基対断片との連結のために、４１３２塩基対断片を使用した。連結反応は、２４６７塩基対断片６３ｎｇ、４１３２塩基対断片４４ｎｇ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ５ユニット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）及び５％ＰＥＧ４０００からなった。２２℃で一晩温置した後、連結混合物を用いてイー・コリを形質転換し、アンピシリンが補充されたＬＢ培地上に播種した。プラスミド抽出後に得られたセロビオースホスホリラーゼ発現ベクターをｐＸＣＰと名付けた。
【００１８】
突然変異誘発法
セロビオースホスホリラーゼ遺伝子の無作為遺伝子導入は、製造業者の指示に従い、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈＩＩＥＺＣｌｏｎｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて行った。ｐＸＣＰ発現ベクター４０ｎｇをテンプレートとして使用し、以下のＰＣＲプライマーを用いて、エラープローンＰＣＲを行った。
【００１９】
５’−ＣＧＴＴＣＧＴＣＧＧＣＧＣＧＴＡＣＡＡＣＴＣ−３’（ＣＰｍｕｔＦＩ、フォワード）
５’−ＡＣＧＡＣＧＡＧＣＣＣＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣ−３’（ＣＰｍｕｔＲＩ、リバース）。
【００２０】
ＧＣに富むテンプレートからの増幅を改善するために、ＤＭＳＯ（１％最終濃度）をＰＣＲ反応混合物に添加した。ＰＣＲサイクルの条件は、以下のとおりであった。９５０Ｃ（２分）；９５０Ｃ（４５秒）、６５０Ｃ（４５秒）及び７２０Ｃ（２分）の３５サイクル；７２０Ｃ（１０分）。１６２４塩基対のＰＣＲ断片をゲル精製し、完全プラスミドＰＣＲによって、変異された遺伝子がｐＸＣＰ発現ベクター中にクローニングされるいわゆるＥＺＣｌｏｎｅ反応のために使用した。精製されたＰＣＲ断片をメガプライマー（５００ｎｇ）として、及び野生型ｐＸＣＰベクター（５０ｎｇ）をテンプレートとして使用した。ＰＣＲサイクルの条件は、以下のとおりであった。９５０Ｃ（１分）；９５℃（５０秒）、６０℃（５０秒）及び６８℃（１４分）の３０サイクル。反応後、ＤｐｎＩ制限酵素１０ユニットを反応混合物に添加し、親テンプレートＤＮＡを完全に消化するために、３７℃で一晩温置した。イー・コリＸＬ１０−Ｇｏｌｄ中に、ＤｐｎＩ処理されたＰＣＲ混合物を形質転換し、アンピシリンを含有するＬＢ培地上に形質転換混合物を播種した。幾つかのコロニーを取り出し、突然変異誘発率を測定するために配列を決定した。
【００２１】
製造業者の指示に従い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、部位指定及び部位飽和突然変異誘発を行った。プライマーは突然変異誘発のための適切なコドン（飽和用のＮＮＳ）を含有し、ＰＣＲサイクルの条件は、以下のとおりであった。９５℃（３分）；９５℃（１分）、５５℃（１分）及び６５℃（１４分）の３０サイクル。反応後、ＤｐｎＩ制限酵素１０ユニットを反応混合物に添加し、親テンプレートＤＮＡを完全に消化するために、３７℃で一晩温置した。イー・コリＸＬ１０−Ｇｏｌｄ中に、ＰＣＲ混合物を形質転換し、アンピシリンを含有するＬＢ培地上に形質転換混合物を播種した。幾つかのコロニーを取り出し、変異されたプラスミドを同定するために配列を決定した。
【００２２】
ラクトースホスホリラーゼ酵素変形物に対する選択
イー・コリＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞中に、変異体ＤＮＡライブラリーを形質転換し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンが補充されたＬＢ培地２０ｍＬ中に形質転換混合物を接種した。増殖の６時間後、ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ最終濃度）及びラクトース（１％最終濃度）を添加し、３０℃でさらに１６時間、培養物を増殖させた。次いで、リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ，８ｇ／ＬＮａＣｌ，０．２ｇ／ＬＫＣｌ，１．４４ｇ／ＬＮａ２ＨＰＯ４，０．２５ｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４；ｐＨ７．４）を用いて、培養物を洗浄し、アンピシリン及びＩＰＴＧが補充されたラクトース最小培地５０ｍＬ中に接種した（０．２５％）。約１のＯＤ６００になるまで、３７℃で選択培養物を増殖させた後、アンピシリン及びＩＰＴＧが補充されたラクトース最小培地２０ｍＬ中に増殖された培養物を接種（２％）することによって、新鮮な選択培養を開始した。４回のこのようなサイクルの後、アンピシリンが補充されたＬＢ培地上に培養物の分取試料を播種した。幾つかのコロニーを取り出し、変異を同定するために配列を決定した。
【００２３】
ラクトースホスホリラーゼ酵素変形物に対するスクリーニング
イー・コリＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞中に、変異体ＤＮＡライブラリーを形質転換し、アンピシリンを含有するＬＢ培地上に形質転換混合物を播種した。自動化されたコロニー採取装置（ＱＰｉｘ２，Ｇｅｎｅｔｉｘ）を用いて、コロニーを採取し、アンピシリンが補充されたＬＢ培地１７５μＬ／ウェルを含有する９６ウェル平底マイクロタイタープレート中に接種した。３７℃及び２５０ｒｐｍで１６時間、マイクロタイタープレートを温置した。次いで、アンピシリン及び０．１ｍＭＩＰＴＧが補充されたＬＢ培地１７５μＬ／ウェルを含有する新しいマイクロタイタープレート中に増殖された微少培養物を接種することによって、組換え酵素発現を誘導した。３７℃及び２５０ｒｐｍで１６時間温置した後、２５００ｒｐｍで１０分間、マイクロタイタープレートを遠心し、−２０℃で沈降物を凍結した。５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、４ｍＭＭｇＣｌ２、５０ｍＭＮａＣｌ及び１ｍｇ／ｍＬリゾチームから構成される溶解緩衝液１００μＬを用いて、沈降物を溶解した。液体操作ロボット（Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ２００，Ｔｅｃａｎ）上で、３７℃で３０分間、溶解を実施した。溶解後、プレートを３５００ｒｐｍで１０分間遠心し、酵素スクリーニングのために、上清（未精製細胞抽出物）を使用した。未精製細胞抽出物３０μＬを基質溶液１７０μＬ（５０ｍＭＭｅｓ緩衝液ｐＨ６．６中の２００ｍＭラクトース及び３０ｍＭＫＨ２ＰＯ４）と混合することによって、マイクロタイタープレート中において、３７℃で酵素反応を実施した。１時間の温置後、グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼアッセイ（Ｔｒｉｎｄｅｒ，１９６９）を用いて放出されたグルコースの量を測定するために、試料５０μＬを取り出した。
【００２４】
酵素の性質決定
野生型酵素又は改善された変形物を完全に性質決定するために、対応する発現ベクターを用いてイー・コリＸＬ１０−Ｇｏｌｄを形質転換し、得られた形質転換体を取り出し、アンピシリンが補充されたＬＢ培地中において、３７℃で増殖させた。培養物の６００ｎｍでの光学密度が０．６に達した時点で、０．１ｍＭの最終濃度になるようにＩＰＴＧを添加することによって、組換え酵素の発現を誘導した。誘導の６時間後、１５０００ｇで１０分間、培養物を遠心し、沈降物を−２０℃で凍結した。ＥａｓｙＬｙｓｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて、未精製細胞抽出物を調製した。これらの細胞抽出物は、直接又は精製された形態でアッセイにおいて使用されるホスホリラーゼ酵素を含有する。
【００２５】
精製は、ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅの装置を用いて、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５中で行われ、陰イオン交換（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ，１００から５００ｍＭＮａＣｌ）、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、３００ｍＭＮａＣｌ）及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｏｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、１０ｍＭＮａＣｌ及び２．５％硫酸アンモニウム）の組み合わせからなった。
【００２６】
酵素反応は、５０ｍＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．６中に、３０ｍＭＫＨ２ＰＯ４及び３０ｍＭセロビオース又は２００ｍＭラクトースを用いて、３７℃で行った。一定の間隔で、５分間煮沸することによって試料を不活化し、グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼアッセイ（Ｔｒｉｎｄｅｒ，１９６９）を介して、放出されたグルコースを測定した。酵素活性の１ユニット（Ｕ）は、これらの条件下で、１分間に、基質１μｍｏｌを転換する酵素の量として定義された。
【００２７】
ｈｉｓタグ付加された酵素のクローニング及び精製
精製を簡略化するために、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅＸＬ部位指定突然変異誘発キットとともにＰＣＲ（プライマー配列５’−ｃａｇｇａａａｃａｇａｃｃａｔｇｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔｃｇｔｔａｃｇｇｇｃａｃｔｔｃｇ−３’を使用）を用いて、第一と第二のコドン間に、Ｈｉｓ６−タグをｐＸＣＰ−ベクター中に挿入した。慣用のクローニング操作によって、変形物酵素をこのベクター中にクローニングした。製造業者の指示に従って、Ｂｉｏ−Ｎｏｂｉｌｅ  Ｏｙ  （Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）のＩＭＡＣＱｕｉｃｋＰｉｃｋキットを用いて酵素を精製した。
【実施例１】
【００２８】
野生型セロビオースホスホリラーゼの発現及び性質決定
材料及び方法の部に記載されているように、セルロモノナス・ウーダから得られるセロビオースホスホリラーゼ遺伝子をｐＴｒｃ９９Ａ発現プラスミド中に連結することによって、セロビオースホスホリラーゼ発現ベクター（ｐＸＣＰ）を首尾よく構築した。イー・コリＸＬ１０−Ｇｏｌｄの形質転換及び誘導後、細胞溶解及び遠心によって、未精製細胞抽出物を調製した。それぞれ、３０ｍＭセロビオース及び２００ｍＭラクトースに対して（ｐＨ６．６及び３７℃）、細胞抽出物１ｍＬ当り約５Ｕ及び０．０２Ｕの活性が得られた。
【００２９】
クロマトグラフィー技術の組み合わせによって、塩基泳動的均一状態になるまで野生型酵素を精製した。第一の工程は、５００ｍＭの塩濃度で酵素が溶出される陰イオン交換クロマトグラフィーであった。その後のゲルろ過によって、ほぼ完全に純粋な酵素試料が得られた。最終工程として、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用したが、前記酵素はカラムに結合せず、２．５％硫酸アンモニウムによって溶出された。それぞれ、３０ｍＭセロビオース及び２００ｍＭラクトースに対して（ｐＨ６．６及び３７℃）、１２．６６Ｕ／ｍｇおよび０．０４０６Ｕ／ｍｇの比活性が得られた。
【実施例２】
【００３０】
無作為突然変異誘発によるラクトースホスホリラーゼの開発
エラープローンＰＣＲを介したセロビオースホスホリラーゼの無作為突然変異誘発のためのテンプレートとして、ｐＸＣＰプラスミドを使用した。相同なセルビブリオ・ギルバスのセロビオースホスホリラーゼ（Ｈｉｄａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；ＰＤＢ  ２ＣＱＴ）から得られた構造的情報を用いて、本発明者らは、無作為突然変異誘発をＴ２１６とＶ７５７の間の残基に限定した。これによって、１６２４塩基対のＤＮＡ断片が増幅され、このＤＮＡ断片をｐＸＣＰ発現プラスミド中にクローニングした。ライブラリーの変異頻度を測定するためにアンピシリンを含有するＬＢ培地上に播種されたイー・コリＸＬ１０−Ｇｏｌｄを形質転換するために、作製されたＤＮＡライブラリーを使用した。６．５ＤＮＡ変異／１０００塩基対の平均変異頻度が得られた。
【００３１】
改善されたラクトースホスホリラーゼ活性を有する酵素変形物を発見するために、インビボ選択系を開発した。イー・コリＸＬ１０−Ｇｏｌｄはβ−ガラクトシダーゼを発現しないので、活性を有するラクトースホスホリラーゼによって形質転換された細胞のみが、唯一の炭素源としてラクトースを有する最小培地中で増殖することができるはずである。さらに、最高のラクトースホスホリラーゼ活性を発現する細胞が最も早く増殖するので、ライブラリー中に存在する最高の酵素は濃縮培養を用いて選択することができることを意味する。本発明者らは、ラクトース最小培地中での増殖の４サイクルを行い、ＬＢ培地上に培養の分取試料を播種した。３つのコロニーを取り出し、プラスミド抽出のために増殖させた。プラスミドの配列決定によって、プラスミドが全て同じ変異を含有することが明らかとなり、１つの変形物が選択培養中に実際に濃縮されたことを意味し、この変形物をＬＰ１と称した。９つのＤＮＡ変異を同定し、これらは６つのアミノ酸置換をもたらす（表１）。
【００３２】
【表１】
2011505862.tif 000002
【００３３】
酵素の作製及び抽出後、ＬＰ１変形物に対して、ラクトースホスホリラーゼ活性の５倍の増加を検出することができたが、セロビオースホスホリラーゼ活性は野生型酵素と比べて４倍減少していた（表２）。本発明者らは、ＬＰ１変形物中の各アミノ酸置換を野生型アミノ酸へ復帰させることによって、ＬＰ１変形物中の各アミノ酸置換の重要性を調べた。これらの実験によって、Ｔ５０８Ａ及びＮ６６７Ｔのみがラクトースに対する向上した活性に寄与することが明らかとなった。興味深いことに、他の変異のうちの２つ、すなわち、Ａ３９７Ｖ及びＧ６８１Ｓは、ラクトースホスホリラーゼ活性に対して負の効果を有することが明らかとなった。これらの結果に基づき、本発明者らは、二重変異体Ｔ５０８Ａ／Ｎ６６７Ｔ（ＬＰ２と称され、親ＬＰ１変形物の約２倍を超えるラクトースホスホリラーゼ活性を有する。）を構築した。結果は、表２ａにまとめられている。
【００３４】
【表２】
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遺伝子の開始コドンの前にＨｉｓ６タグを挿入し、製造業者の指示に従って、Ｂｉｏ−ＮｏｂｉｌｅＯｙ（Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）のＩＭＡＣＱｕｉｃｋＰｉｃｋキットを用いて酵素を精製した。２００ｍＭラクトースに対して、３０ｍＭＫＨ２ＰＯ４−５０ｍＭＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．６中、３７℃で、純粋なｈｉｓタグ付加酵素の比活性を測定した。ＬＰ２二重変異体の比活性は、精製されたシー・ウーダ野生型酵素の０．０３３ユニット／ｍｇと比べて、０．１７１ユニット／ｍｇであった（表２ｂ）。比較として、セロビオースに対する活性が与えられている。
【００３５】
２つの変異体位置を何れかの他のアミノ酸へ無作為に変異し、得られた組み合わせを活性に関してスクリーニングした。１つの変形物Ｔ５０８Ｉ／Ｎ６６７Ａ（ＬＰ３と表記される。）は、未精製抽出物（表２ａ）及び精製酵素（表２Ｂ）の何れに対して測定した場合にも、ＬＰ２変形物より約５０％高い活性を示した。
【実施例３】
【００３６】
セルビブリオ・ギルバスの活性との変異体セロモナス・ウーダ酵素の活性の比較
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）によって、シー・ギルバスから得られるセロビオースホスホリラーゼをコードする遺伝子（配列番号５）を合成した。クローニング、発現、突然変異誘発、抽出及び酵素活性の測定は、セルロモナス・ウーダから得られる酵素に関して記載されているとおりに行った。結果が、表３にまとめられている。
【００３７】
【表３】
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セルビブリオ・ギルバス酵素のＴ５０８及びＮ６６７位（それぞれ、セルロモナス・ウーダ中のＴ５０８位、Ｎ６６７位と等価）における変異の効果を評価するために、セルロモナス・ウーダに対して記載されているのと同様の方法で、位のＴをＩによって置換し、６６７位のＮをＡによって置換した。セルロモナス・ウーダにおいて発見されたのと同様に、これらの位置への変異の導入は活性を増加させたが、両変異及び二重変異に対して得られた活性は、セルロモナス・ウーダに対して得られた活性より、なお著しく低かった。
【実施例４】
【００３８】
ラクトースホスホリラーゼ活性の最適化
セルロモナス・ウーダから得られる野生型セロビオースホスホリラーゼは、（セルビブリオ・ギルバスに対して測定された活性よりずっと高いが）ｐＨ６．６及び３７℃で、２００ｍＭラクトースに対して殆ど活性を示さない。変異Ｎ６６７Ｔ及びＴ５０８Ａを導入することによって、ラクトースホスホリラーゼ活性は既に１０倍増加しているが、さらなる酵素改変操作はα−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸の産生の効率をさらに向上させる。
【００３９】
材料及び方法に記載されているように、無作為突然変異誘発及び部位飽和突然変異誘発の両方によって、変形物酵素のライブラリーを作製する。無作為突然変異誘発に対して、ｅｐＰＣＲに続く、ラクトース最小培地中での選択を使用する。部位飽和突然変異誘発に対して、活性部位残基を標的とし、高情報量スクリーニングによって効果を評価する。増加したラクトースホスホリラーゼ活性を有する変形物を配列決定し、部位指定突然変異誘発を用いて、全ての同定された変異の各効果を測定する。誘導的進化の新たなラウンドのための出発点として使用される１つの酵素中に、有益な変異をプールする。
【実施例５】
【００４０】
産生過程における改善された酵素変形物の適用
誘導的進化の各サイクルの終了時における最高の酵素変形物をより大規模に作製し、より完全に性質決定する。５０ｍＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．６中、３７℃での、２００ｍＭラクトース及び３０ｍＭホスファートに対するその比活性を測定する。さらに、その速度論的パラメータ及びα−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸産生の最大効率のための最適な基質濃度を測定する。セルビブリオ・ギルバスから得られるセロビオースホスホリラーゼはラクトースに対して若干活性を有することが報告されているので、改善された酵素変形物を用いて比較分析を行う。これらの実験において、日本国特許９２２４６９１に記載されている試験条件（Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ緩衝液ｐＨ７中の１０ｍＭラクトース及び１０ｍＭホスファートを酵素の２Ｕ／ｍＬと混合）を使用する。３７℃での反応の４８時間後、セルビブリオ・ギルバスの酵素によって、１．５ｍＭα−ガラクトース−１−リン酸が産生された。
【００４１】
二糖の加リン酸分解は可逆的反応であるので、ラクトースホスホリラーゼは、α−ガラクトース−１−リン酸及びグルコースからのラクトースの酵素的合成のためにも有用である。このようなラクトースは、動物源に由来せず、従って、ＢＳＥを持っていないことが保証されるので、医薬製剤の製造に関して極めて興味深い。本発明者らの改善された変形物の合成能力は、酵素を基質と混合し、５分間煮沸することにより一定の間隔で試料を不活化させ、ＨＰＬＣを用いてラクトース濃度を測定することによって検査される。５０ｍＭＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．６中、３７℃での、２００ｍＭα−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸及び３０ｍＭグルコースに対する比活性並びに速度論的パラメータ及びラクトース産生の最大効率のための最適な基質濃度を測定する。
【実施例６】
【００４２】
残基３９７はＬＰ１−変形物のラクトースホスホリラーゼ活性に明確に影響を与えるので（但し、変異Ａ３９７Ｖの場合には負の影響）、本発明者らは、ＬＰ３変形物中のこの位置を飽和することに決めた。１つのマイクロタイタープレート（９６コロニー）をスクリーニングした後、本発明者らは、ラクトースに対して増加した活性を有する変形物を実際に同定することができた。この酵素は変異Ａ３９７Ｒを含有し、ＬＰ−３変形物に対する未精製細胞抽出物ｍｇ当り０．１６１±０．００６Ｕ／ｍｇと比べて、０．１７７±０．００７Ｕ／ｍｇ未精製細胞抽出物の比活性を有する。
【００４３】
【表４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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