(57)【要約】本発明は細菌および細菌感染の処置および防止に関する。特に本発明は、抗微生物剤による抗微生物効果および細菌死滅を増強するために抗微生物剤と組み合わせて使用される改変バクテリオファージに関する。本発明は、概して、細菌を処置するための、改変バクテリオファージと抗微生物剤とを含む方法および組成物に関し、より具体的には、少なくとも1つの抗微生物剤と組み合わされた、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子を阻害する物質を含むバクテリオファージ、および/またはSOS応答遺伝子のリプレッサーもしくは抗微生物防御遺伝子の阻害因子を含みかつ/または抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させる物質を発現させるバクテリオファージ、ならびにそれらの使用に関する。2011518543.tif 000083
2011518543.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、改変バクテリオファージ。
【請求項２】
抗生物質抵抗性遺伝子がcat、vanAもしくはmecDまたはその変種を含む群から選択される、請求項1記載のバクテリオファージ。
【請求項３】
細胞生残遺伝子がRecA、RecB、RecC、spot、RelAまたはその変種を含む群から選択される、請求項1または2のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項４】
物質がsiRNA、アンチセンス核酸、asRNA、RNAi、miRNAおよびその変種を含む群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項５】
物質がアンチセンスRNA（asRNA）である、請求項1〜4のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項６】
少なくとも2つの異なる細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも2つの物質をコードする核酸を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項７】
RecA、RecBまたはRecCの少なくとも2つを阻害する少なくとも2つの物質をコードする核酸を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項８】
プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸がSOS応答遺伝子および/または細菌防御遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、改変バクテリオファージ。
【請求項９】
SOS応答遺伝子のリプレッサーがlexAである、請求項8のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項１０】
防御遺伝子のリプレッサーがSoxRである、請求項8または9のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項１１】
リプレッサーがmarR、arcR、fur、crp、icdAまたはその変種もしくはフラグメントからなる群より選択される、請求項8〜10のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項１２】
少なくとも1つのSOS応答遺伝子の少なくとも2つの異なるリプレッサーをコードする核酸を含む、請求項8〜11のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項１３】
少なくとも1つの細菌防御遺伝子の少なくとも2つの異なるリプレッサーをコードする核酸を含む、請求項8〜12のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項１４】
プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも1つの物質をコードする、改変バクテリオファージ。
【請求項１５】
抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる物質が、抗微生物剤の抗微生物効果の効力を少なくとも10％増加させる、請求項14記載のバクテリオファージ。
【請求項１６】
抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる物質が細菌細胞に対する抗微生物剤の侵入を増加させる、請求項14または15のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項１７】
細菌細胞への抗微生物剤の侵入を増加させる物質がポリンである、請求項14〜16のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項１８】
ポリンがompFまたはその変種もしくはフラグメントである、請求項14〜17のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項１９】
抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる物質がcraAまたはその変種もしくはフラグメントである、請求項14〜15のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項２０】
抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる物質がcraAまたはその変種もしくはフラグメントである、請求項14〜15のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項２１】
抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる物質が、細菌細胞中で特異的に発現される経路を改変する、請求項14〜15のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項２２】
改変が、細菌細胞中で特異的に発現される経路の阻害または活性化である、請求項14〜15または21のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項２３】
物質が細菌細胞中の鉄-硫黄クラスターを増加させる、請求項14〜15のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項２４】
物質が、細菌細胞中の酸化ストレスを増加させるか、細菌細胞中のヒドロキシルラジカルを増加させる、請求項14〜15のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項２５】
物質が、抗微生物剤の非存在下では、細菌細胞にとって実質的に毒性でない、請求項14〜24のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項２６】
物質が化学療法剤でもタンパク質毒素でもない、請求項14〜25のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項２７】
抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも2つの異なるタンパク質をコードする核酸を含む、請求項14〜26のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項２８】
タンパク質がcsrAおよびompFまたはその変種もしくはフラグメントである、請求項14〜27のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項２９】
溶原性バクテリオファージである、請求項1〜28のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項３０】
溶原性バクテリオファージがM13バクテリオファージである、請求項1〜29のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項３１】
溶菌性バクテリオファージである、請求項1〜29のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項３２】
溶菌性バクテリオファージがT7バクテリオファージである、請求項1〜29または31のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
【請求項３３】
細菌が感染した表面に、
（a）バクテリオファージプロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、バクテリオファージと、
（b）少なくとも1つの抗微生物剤と
を投与する工程を含む、細菌感染を阻害または排除するための方法。
【請求項３４】
細菌が感染した表面に、
（a）バクテリオファージプロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸がSOS応答遺伝子または細菌防御遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、バクテリオファージと、
（b）少なくとも1つの抗微生物剤と
を投与する工程を含む、細菌感染を阻害または排除するための方法。
【請求項３５】
細菌が感染した表面に、
（a）バクテリオファージプロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも1つの物質をコードする、バクテリオファージと、
（b）少なくとも1つの抗微生物剤と
を投与する工程を含む、細菌感染を阻害または排除するための方法。
【請求項３６】
バクテリオファージが請求項1〜7または29〜32のいずれか一項記載のバクテリオファージである、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
バクテリオファージが請求項8〜13または29〜32のいずれか一項記載のバクテリオファージである、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
バクテリオファージが請求項14〜32のいずれか一項記載のバクテリオファージである、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
バクテリオファージと抗微生物剤の投与が同時に行われる、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
バクテリオファージの投与が抗微生物剤の投与に先だって行われる、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
抗微生物剤の投与がバクテリオファージの投与に先だって行われる、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
抗微生物剤がキノロン系抗微生物剤である、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
抗微生物剤がシプロフロキサシン（ciproflaxacin）、レボフロキサシン、およびオフロキサシン、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン、モキシフロキサシン、スパルフロキサシン、ゲミフロキサシン、パズフロキサシンまたはその変種もしくは類似体からなる群より選択される、請求項33〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
抗微生物剤がオフロキサシンまたはその変種もしくは類似体である、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
抗微生物剤がアミノグリコシド系抗微生物剤である、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
抗微生物剤がアミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネトロマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ネオマイシンまたはその変種もしくは類似体からなる群より選択される、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
抗微生物剤がゲンタマイシンまたはその変種もしくは類似体である、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
抗微生物剤がβ-ラクタム系抗生物質抗微生物剤である、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
抗微生物剤がペニシリン、アンピシリン、ペニシリン誘導体、セファロスポリン類、モノバクタム類、カルバペネム類、β-ラクタマーゼ阻害剤またはその変種もしくは類似体からなる群より選択される、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
抗微生物剤がアンピシリンまたはその変種もしくは類似体である、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
細菌が対象中に存在する、請求項33〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
対象が哺乳動物である、請求項33〜51のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
哺乳動物がヒトである、請求項33〜52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
細菌がバイオフィルム中に存在する、請求項33〜53のいずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、バクテリオファージと、少なくとも1つの抗微生物剤とを含む組成物。
【請求項５６】
プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸がSOS応答遺伝子または抗微生物防御遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、バクテリオファージと、少なくとも1つの抗微生物剤とを含む組成物。
【請求項５７】
プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも1つのタンパク質をコードする、バクテリオファージと、少なくとも1つの抗微生物剤とを含む組成物。
【請求項５８】
抗微生物剤がキノロン系抗微生物剤またはアミノグリコシド系抗微生物剤またはβ-ラクタム系抗微生物剤である、請求項55〜57のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５９】
バクテリオファージが請求項1〜7または29〜32のいずれかに従う、請求項55または58のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６０】
バクテリオファージが請求項8〜13または29〜32のいずれかに従う、請求項56または58記載の組成物。
【請求項６１】
バクテリオファージが請求項14〜32のいずれかに従う、請求項57または58記載の組成物。
【請求項６２】
プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、バクテリオファージを含むキット。
【請求項６３】
プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸がSOS応答または抗微生物防御遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、バクテリオファージを含むキット。
【請求項６４】
プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも1つのタンパク質をコードする、バクテリオファージと、少なくとも1つの抗微生物剤とを含むキット。
【請求項６５】
抗微生物剤を単独で使用した場合と比較して細菌の数を減少させるための、抗微生物剤と組み合わされた、請求項1〜23のいずれか一項記載のバクテリオファージの使用。
【請求項６６】
細菌がバイオフィルム中に存在する、請求項62〜65のいずれか一項記載の使用。
【請求項６７】
請求項1〜23のいずれか一項記載の少なくとも2つのバクテリオファージと少なくとも1つの抗微生物剤との組合せ。
【請求項６８】
抗微生物剤がキノロン系抗微生物剤である、請求項67記載の組合せ。
【請求項６９】
抗微生物剤がシプロフロキサシン、レボフロキサシン、およびオフロキサシン、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン、モキシフロキサシン、スパルフロキサシン、ゲミフロキサシン、パズフロキサシンまたはその変種もしくは類似体からなる群より選択される、請求項67記載の組合せ。
【請求項７０】
抗微生物剤がオフロキサシンまたはその変種もしくは類似体である、請求項67記載の組合せ。
【請求項７１】
抗微生物剤がアミノグリコシド系抗微生物剤である、請求項67記載の組合せ。
【請求項７２】
抗微生物剤がアミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネトロマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ネオマイシンまたはその変種もしくは類似体からなる群より選択される、請求項67記載の組合せ。
【請求項７３】
抗微生物剤がゲンタマイシンまたはその変種もしくは類似体である、請求項67記載の組合せ。
【請求項７４】
抗微生物剤がβ-ラクタム系抗生物質抗微生物剤である、請求項67記載の組合せ。
【請求項７５】
抗微生物剤がペニシリン、アンピシリン、ペニシリン誘導体、セファロスポリン類、モノバクタム類、カルバペネム類、β-ラクタマーゼ阻害剤またはその変種もしくは類似体からなる群より選択される、請求項67記載の組合せ。
【請求項７６】
抗微生物剤がアンピシリンまたはその変種もしくは類似体である、請求項67記載の組合せ。
【請求項７７】
請求項68〜76に記載の抗微生物剤のいずれかの組合せを含む、請求項67記載の組合せ。
【請求項７８】
請求項1〜32のいずれか一項記載のバクテリオファージと少なくとも1つの抗微生物剤との使用。
【請求項７９】
請求項1〜32記載のバクテリオファージのいずれかの少なくとも2つと少なくとも1つの抗微生物剤との組合せの使用。
【請求項８０】
細菌感染を阻害または排除するための、請求項78もしくは79記載の、または請求項1〜32のいずれか一項記載の、バクテリオファージの使用。
【請求項８１】
細菌が対象中に存在する、請求項78または79記載のバクテリオファージの使用。
【請求項８２】
対象が哺乳動物である、請求項81記載のバクテリオファージの使用。
【請求項８３】
哺乳動物がヒトである、請求項82記載のバクテリオファージの使用。
【請求項８４】
細菌がバイオフィルム中に存在する、請求項78または79記載のバクテリオファージの使用。
【請求項８５】
細菌感染を阻害または排除するための、請求項55〜57のいずれか一項記載の組成物の使用。
【請求項８６】
細菌が対象中に存在する、請求項85記載の組成物の使用。
【請求項８７】
対象が哺乳動物である、請求項86記載の組成物の使用。
【請求項８８】
哺乳動物がヒトである、請求項87記載の組成物の使用。
【請求項８９】
細菌がバイオフィルム中に存在する、請求項85記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2008年1月10日に出願された米国仮特許出願第61/020,197号の、35 U.S.C. 119（e）に基づく優先権を主張し、この仮特許出願の内容は参照によりその全てが本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、アメリカ国立科学財団（NSF）によって授与された契約番号EF-0425719および米国国立衛生研究所（NIH）によって授与された契約番号OD003644に基づく政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は細菌および細菌感染の処置および防止という分野に関する。特に本発明は、抗微生物剤の抗微生物効果および細菌死滅を増強するために抗微生物剤と組み合わせて使用される改変（engineered）バクテリオファージに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
細菌は最初の臨床使用から数年の間に抗生薬に対する抵抗性を迅速に発生させる1。抗生物質抵抗性は、遺伝子の水平伝播によって獲得されるか、ある集団中のごく一部の細胞が抗微生物薬に対して非遺伝性の耐性を示す持続生残（persistence）に起因する2。抗生物質の創薬は抗生物質抵抗性の進化にますます後れを取りつつあるので、新しい抗細菌療法が差し迫って必要とされている3。
【０００５】
細菌感染は臨床現場においてかなりの罹病および死亡の原因になっている3。抗生物質の出現は細菌性疾患がヒトの健康に及ぼす影響を減少させたが、抗生物質抵抗性の絶え間ない進化が、現在の抗生薬の有用性に対する深刻な障害となっている3-7。過去には抗生物質によって容易に治っていたであろう感染も、現在では、より多く残存することができるようになり、より重症な患者およびより長い入院期間をもたらしている5,8,9。抗生物質抵抗性感染の経済的影響は米国だけで年間50億米ドル〜240億米ドルと推定される10。抗生薬に対する抵抗性は、迅速に（多くの場合、最初の臨床使用から数年以内に）発生し、蔓延する1。しかし製薬会社の薬品パイプラインは、抗生物質抵抗性の進化と歩調を合わせてはいない1,3。
【０００６】
後天的抗生物質抵抗性は、抗細菌剤のターゲットにおける突然変異によってもたらされるか、または抗生物質を細胞外に排出しもしくは失活させる抱合タンパク質をコードする遺伝子によってもたらされる11。形質転換、接合プラスミド、または接合トランスポゾンによって起こり得る遺伝子の水平伝播は、抗生物質抵抗性遺伝子が蔓延する主要な機序である12,13。例えば黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）は、1940年代にはサルファ薬に対して、1950年代にはペニシリンに対して、そして1980年代にはメチシリンに対して、迅速に抵抗性になった12。2002年には、ブドウ球菌が、大便レンサ球菌（Enterococcus faecalis）（これ自体、1988年までに、院内でバンコマイシンに対して完全に抵抗性になったもの）と同時感染して接合することでバンコマイシン抵抗性遺伝子を受容することにより、ブドウ球菌に対して一律に有効であった唯一の抗生物質バンコマイシンに対する抵抗性を発生させた12,14。SOS応答を誘導するシプロフロキサシンなどの薬物は、遺伝要素を可動化することにより、抗生物質抵抗性遺伝子の水平転移をさらに促進することができる15,16。例えば、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）および淋菌（Neisseria gonorrhoeae）も、抗生物質に対する抵抗性を獲得している（Morens, et al., (2004) Nature 430:242-249（非特許文献１））。阻害濃度未満の濃度または不完全な処置クールは、抗生物質抵抗性を発生させる進化的圧力を生じさせることができる17。臨床現場外での抗生物質の使用、例えば農業用家畜類における抗生物質の使用は、メチシリン抵抗性ブドウ球菌などの抵抗性生物が出現する一因となっており、経済的理由および現代の農業経営実務ゆえに、このような使用が衰える可能性は低い12,18。非臨床現場で発生する抵抗性遺伝子は、次に、ヒトに感染する細菌集団に伝達されて、抗生物質抵抗性の問題を悪化させ得る12。
【０００７】
抗生物質抵抗性遺伝子を獲得することの他に、持続生残型微生物（persister）と呼ばれる細胞の小さな部分集団は、代謝的に不活発な状態に入ることにより、抗生物質処置に耐えて生き残ることができる2,19,20。持続生残型微生物細胞は、典型的には遺伝子突然変異を持たないが、抗生物質に対して表現型上、抵抗性を示す21。大腸菌（Escherichia coli）では、持続生残型微生物細胞に相当する集団の割合が、対数増殖後期および定常期では劇的に増加する。染色体がコードする毒素は、持続生残型微生物表現型の重要な一因であり得るが、確率的持続生残現象を制御する基本的機序はよくわかっていない22-25。持続生残型微生物は、抗生物質処置が終わった後に再増殖を開始することができる潜在性細胞のリザーバーを構成し、細菌バイオフィルムに観察される増加した抗生物質耐性の原因であり得る20。処置に耐えて生き残ることにより、持続生残型微生物は、突然変異の発生または抗生物質抵抗性を付与する遺伝子の獲得に、重要な役割を果たし得る。
【０００８】
抗生物質抵抗性感染を管理するためにいくつかの戦略が提案されている。新しい抗生物質クラスは、抗生物質抵抗性細菌と闘うために利用することができる薬品の蓄えを改善することになるだろうが、製薬パイプラインにはわずかしかない3,26。問題のある感染が迅速に検出され単離されるように、監視手段および封じ込め手段が政府および病院に設立されているが、これらは抵抗性の根本的進化に対する対処ではない12。抗生物質の循環使用（cycling）は、抵抗性生物を抑制する方法の一つであるが、多大な費用を要し、有効でない場合もある27,28。抗生物質の過剰処方を減らしても、抗生物質抵抗性はわずかに減少するにすぎなかった29。農場における抗生物質の使用を減らす努力もなされているが、ある程度の使用は避けられない30。バクテリオファージを使って細菌を殺すことは、20世紀初頭から、特に東欧で実施されてきた16,17。細菌を溶解して殺すようにバクテリオファージを選択するか、細胞死を引き起こす致死的遺伝子を発現させるように、バクテリオファージを改変することができる31-35。しかし、細菌宿主に対して直接致死的であるバクテリオファージは、短期間のうちにファージ抵抗性細菌を生成させる場合もある6,7,31,32,36。上述のアプローチに加えて、抗微生物薬をデザインするための新規な方法も、抗生物質時代の寿命の延長にとって、ますます重要になりつつある37。異なる抗生物質による併用療法または抗生物質とファージとの併用療法は、細菌細胞の死滅を強化し、よって抗生物質抵抗性の発生率を減少させ、持続生残型微生物を減少させ得る38-41。無改変糸状バクテリオファージは抗生物質の効力を増大させることが示されている42。システム生物学解析を使ってターゲットへの経路を同定し、次に合成生物学を使ってそれらの経路を攻撃するための方法を考案することができる38,43,44。
【０００９】
細菌バイオフィルムは、さまざまな工業現場、環境現場および臨床現場において排除することが困難な汚染源である。バイオフィルムは、さまざまな環境攻撃から細菌を保護するために細菌が分泌するポリマー構造物であり、それゆえに消毒薬および抗生物質からの細菌の保護ももたらす。バイオフィルムは、十分な湿気と栄養が存在する任意の環境表面上に見いだすことができる。細菌バイオフィルムは、数多くのヒトおよび動物の健康問題および環境問題と関連する。例えば細菌は、埋め込まれた医療器具、例えばカテーテル、心臓弁、人工関節や、および損傷した組織、例えば嚢胞性線維症患者の肺などの上にバイオフィルムを形成する。バイオフィルム中の細菌は、抗生物質および宿主の防御手段に対して著しく抵抗性であり、したがって持続的な感染源である。
【００１０】
バイオフィルムは例えば配水管などの表面も汚染し、他の工業的表面を消毒することも難しくする。例えば、カテーテル、特に中心静脈カテーテル（CVC）は、慢性病患者または重病患者の処置に最もよく使用される道具の一つであり、米国では毎年2000万人を超える入院患者に挿入されている。それらの使用は、細菌バイオフィルム感染の結果として、しばしばその機能が重度に損なわれ、それは、かなりの死亡および費用の増加と関連する。カテーテルは、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、黄色ブドウ球菌、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、大便レンサ球菌およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）などといった数多くのバイオフィルム形成生物による感染と関連し、それらはしばしば全身性血流感染をもたらす。米国では毎年、12〜25％の死亡を伴う約250,000例のCVC関連血流感染が起こり、1エピソードあたりの推定処置費用は約25,000ドルである。従来の抗微生物剤のみによるCVC関連感染の処置は、バイオフィルムがこれらの薬剤に対して極めて高い耐性を持つので、成功しないことが多い。CVCが感染状態になった場合、最も効果的な処置には、依然として、可能であればカテーテルを除去することと、抗微生物剤を使ってあらゆる周囲組織または全身感染を処置することとが含まれる。これは、多大な費用を要する危険な手法であり、カテーテルを再設置すると再感染が迅速におこり得る。
【００１１】
バクテリオファージ（単に「ファージ」と呼ばれることも多い）は、細菌内で増殖するウイルスである。この名称は「細菌を食べるもの（eaters of bacteria）」と翻訳することができ、これは、それらが増殖し、大半のバクテリオファージが次世代のバクテリオファージを放出するために細菌宿主を殺すという事実を反映している。天然のバクテリオファージは、ターゲット細菌の特定株以外には一切、感染する能力を持たず、そのことが、制御薬剤としての使用に関するそれらの潜在性を損なわせている。
【００１２】
バクテリオファージが20世紀初頭に初めて認識されて以来、バクテリオファージとそれらの治療的使用には、大きな関心が寄せられてきた。溶菌性バクテリオファージは、もっぱら細菌に感染し、複製し、細菌の代謝作用を乱し、溶菌と呼ばれるプロセスにおいてファージ子孫を放出する時に細胞を破壊するウイルスである。これらのバクテリオファージは極めて効果的な抗細菌活性を有し、理論上、抗生物質と比較していくつかの利点を持っている。最も注目すべきことに、それらは感染部位で複製するので、それらが最も必要とされる場所で大量に利用可能である。また、ファージ療法の重篤なまたは不可逆的な副作用は今だかつて記載されておらず、抵抗性細菌に対して代替ファージを選択することは、数日または数週間で行うことができる比較的迅速なプロセスである。
【００１３】
バクテリオファージは、米国特許第4,678,750号（特許文献１）に記載されているように、過去に、火傷病などの植物疾病の処置に使用されている。また、バクテリオファージは、バイオフィルムを破壊するためにも使用されている（例えば米国特許第6,699,701号（特許文献２））。また、バイオフィルム破壊酵素全般をコードする天然バクテリオファージを使用するシステムも記載されている。当技術分野では、細菌を破壊するための酵素分散系として使用された、バクテリオファージがコードする溶菌酵素の例も、いくつか得られている（米国特許第6,335,012号（特許文献３）および米国特許出願公開第2005/0004030号（特許文献４））。東欧での（特に腸管感染などのヒト疾患の処置における）研究および臨床治験は、天然ファージの使用およびそれらの併用に集中していたようである（Lorch, A. (1999)「Bacteriophages: An alternative to antibiotics?」Biotechnology and Development Monitor, No.39, p.14-17（非特許文献２））。
【００１４】
例えば非改変バクテリオファージが抗生物質（例えばクロラムフェニコール）を送達するための担体として使用されている（Yacobyら, Antimicrobial agents and chemotherapy, 2006; 50; 2087-2097（非特許文献３））。非改変バクテリオファージは、糸状非改変バクテリオファージの外側に取り付けられたクロラムフェニコールなどのアミノグリコシド系抗生物質も持っていた（Yacoby et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2007; 51; 2156-2163（非特許文献４））。また、M13非溶菌性バクテリオファージが、致死的細胞死遺伝子GefおよびChpBKを保持するように改変されている。しかし、これらのファージは使用されておらず、抗微生物剤または抗生剤と組み合わせると有用であるという示唆もなされていない（Westwater et al., 2003, Antimicrobial agents and chemotherapy, 47; 1301-1307（非特許文献５））。また、糸状Pf3もゲンタマイシンも単独では細菌感染を排除できない状況で、非改変糸状Pf3バクテリオファージが低濃度のゲンタマイシンと共に投与されている（Hagens et al., Microb. Drug resistance, 2006; 12; 164-8（非特許文献６））。非改変バクテリオファージと抗生物質エンロフロキサシンとが同時に投与されたが、この抗生物質の使用は、抗生物質とバクテリオファージの組合せよりも効果的だった（Huff et al., 2004; Poltry Sci, 83;1994-1947の表1参照（非特許文献７））。
【００１５】
絶え間ない進化的圧力は、抗生物質抵抗性細菌が数を増やし続けることを保証するだろう。過去25〜30年間に開発された新しい抗細菌剤の欠乏は、抗生物質時代の将来にとって、確かに良くない前兆である（Wise, R (2004) J Antimicrob Chemother 54: 306-310（非特許文献８））。したがって、抗生物質時代を引き延ばすために、細菌感染と闘うための新しい方法が必要とされている。例えばバクテリオファージ療法または合成抗細菌ペプチドが潜在的解決策として提案されている（Loose et al., (2006) Nature 443: 867-869（非特許文献９）;Curtin, et al., (2006) Antimicrob Agents Chemother 50: 1268-1275（非特許文献１０））。
【００１６】
細菌感染およびバイオフィルムの処置における抗生物質抵抗性は、従来の抗微生物薬による細菌およびバイオフィルムの排除または制御または阻害にとって、著しい障害になるので、ファージ療法などの新しい抗バイオフィルム戦略を探究すべきである。環境における新しいバイオフィルム分解バクテリオファージを求めてスクリーニングする努力を補完することができる酵素活性ファージのライブラリーを、バイオフィルム分解酵素を持つ天然ファージの工学的改変（engineering）によって作成することができるようにするには、新規な合成生物学的技術が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第4,678,750号
【特許文献２】米国特許第6,699,701号
【特許文献３】米国特許第6,335,012号
【特許文献４】米国特許出願公開第2005/0004030号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Morens, et al., (2004) Nature 430:242-249
【非特許文献２】Lorch, A. (1999)「Bacteriophages: An alternative to antibiotics?」Biotechnology and Development Monitor, No.39, p.14-17
【非特許文献３】Yacobyら, Antimicrobial agents and chemotherapy, 2006; 50; 2087-2097
【非特許文献４】Yacoby et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2007; 51; 2156-2163
【非特許文献５】Westwater et al., 2003, Antimicrobial agents and chemotherapy, 47; 1301-1307
【非特許文献６】Hagens et al., Microb. Drug resistance, 2006; 12; 164-8
【非特許文献７】Huff et al., 2004; Poltry Sci, 83;1994-1947
【非特許文献８】Wise, R (2004) J Antimicrob Chemother 54: 306-310
【非特許文献９】Loose et al., (2006) Nature 443: 867-869
【非特許文献１０】Curtin, et al., (2006) Antimicrob Agents Chemother 50: 1268-1275
【発明の概要】
【００１９】
本発明者らは、細菌感染を著しく低減または排除するための二面的戦略（two pronged strategy）を発見した。特に本発明者らは、抗微生物剤と組み合わせて使用されるバクテリオファージを、改変されたバクテリオファージが抗微生物剤にとって佐剤として機能するように、改変した。特に本発明者らは、抗微生物剤および/またはファージ感染に対して細菌が持つ天然の抵抗性機序が特異的に無力化（または不活化）されるように、バクテリオファージを改変した。したがって本発明の一局面は、概して、（i）少なくとも1つの細菌抵抗性遺伝子を阻害するか、または（ii）細菌中の少なくとも1つのSOS応答遺伝子もしくは細菌防御遺伝子を阻害するか、または（iii）抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させるタンパク質を発現させるように修飾または改変されている改変バクテリオファージに関する。単独でまたは任意の組合せで使用されるこれらの改変バクテリオファージはどれでも、抗微生物剤と共に使用することができる。したがって本発明者らは、抗微生物剤と一緒に（または組み合わせて）使用されるバクテリオファージを改変することで（ここで、改変されたバクテリオファージは抗微生物剤抵抗性遺伝子を阻害するか、SOS応答遺伝子または非SOS細菌防御遺伝子を阻害するか、抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させるためのタンパク質を発現させることができる）、通常は抗微生物効果を回避する局所的細菌合成機構（local bacterial synthetic machinery）を阻害することによって、抗微生物剤に対する細菌抵抗性の発生および持続生残型細菌の生成を防止するための方法を発見した。
【００２０】
したがって、本発明の一局面は、少なくとも1つの抗微生物剤と一緒に（すなわち、組み合わせて）使用するための本明細書において議論する改変バクテリオファージに関し、また、それらの改変バクテリオファージが上述の抗微生物剤にとって佐剤として役立つことに関する。本発明のもう一つの局面は、本明細書において議論する少なくとも1つの改変バクテリオファージと少なくとも1つの抗微生物剤とを含む組成物を投与することによって、環境現場、工業現場、および臨床現場において、細菌を阻害しかつ/または細菌バイオフィルムを除去するための方法に関する。
【００２１】
本発明の一局面は、抗微生物剤による細菌死滅という抗微生物効果（すなわち、細菌を排除し、またはその増殖を阻害し、または細菌を制御する効果）を増強するために、改変バクテリオファージを抗微生物剤と組み合わせて使用する方法に関する。したがって本発明は、抗生物質佐剤としての改変バクテリオファージの発見に関する。いくつかの態様において、本明細書で議論する改変バクテリオファージは、限定するわけではないがゲンタマイシンなどのアミノグリコシド系抗微生物剤用の抗生物質佐剤として機能し、限定するわけではないがアンピシリンなどのβ-ラクタム系抗生物質用の抗生物質佐剤として機能し、限定するわけではないがオフロキサシンなどのキノロン系抗微生物剤の抗生物質佐剤として機能する。
【００２２】
本発明のもう一つの局面は、抗生物質抵抗性に関与する少なくとも1つの遺伝子を阻害する物質をコードする核酸を含む改変バクテリオファージに関する。本発明のこの局面の上述の態様において、改変バクテリオファージは、抗生物質抵抗性に関与する少なくとも1つの遺伝子を阻害する少なくとも2個、3個、4個、5個またはそれ以上（例えば10個）の異なる核酸を含むことができる。代替的一態様において、改変バクテリオファージは、細胞生残修復（cell survival repair）に関与する少なくとも1つの遺伝子を阻害する物質をコードする核酸を含むことができる。もう一つの態様において、改変バクテリオファージは、細胞生残修復に関与する少なくとも1つの遺伝子を阻害する少なくとも2個、3個、4個、5個またはそれ以上（例えば10個）の異なる核酸を含むことができる。細菌の抗生物質抵抗性に関与する少なくとも1つの遺伝子および/または細胞生残遺伝子（cell survival gene）を阻害する物質をコードする核酸を含む本明細書に開示する上述の改変バクテリオファージを、本明細書では、「阻害因子-改変バクテリオファージ（inhibitor-engineered bacteriophage）」という。いくつかの態様では、物質が、限定するわけではないがcat、vanAまたはmecDなどといった抗生物質抵抗性遺伝子の遺伝子発現および/またはタンパク質機能を阻害する。いくつかの態様では、物質が、限定するわけではないがRecA、RecB、RecC、SpotまたはRelAなどといった細胞生残修復遺伝子の遺伝子発現および/またはタンパク質機能を阻害する。もう一つの態様において、阻害因子-改変バクテリオファージは、抗生物質抵抗性遺伝子または細胞生残修復遺伝子、例えば限定するわけではないが、群:cat、vanA、mecD、RecA、RecB、RecC、SpotまたはRelAおよび他の抗生物質抵抗性遺伝子または細胞生残修復遺伝子から選択される少なくとも2個、3個、4個、5個またはそれ以上、に対する阻害因子をコードする、少なくとも2個、3個、4個、5個またはそれ以上（例えば8個）の異なる核酸を含むことができる。この局面および本明細書に記載する全ての局面のいくつかの態様において、阻害因子-改変バクテリオファージの核酸によってコードされる物質は、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子を阻害するタンパク質であるか、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子の翻訳および発現を阻害するRNA阻害因子（RNAi）物質をコードする。
【００２３】
本発明のもう一つの局面は、細菌SOS応答遺伝子のリプレッサータンパク質もしくはそのフラグメントまたは非SOS経路細菌防御遺伝子を阻害する物質（タンパク質など）をコードする核酸を含む改変バクテリオファージに関し、本明細書では、これを「リプレッサー-改変バクテリオファージ」という。いくつかの態様において、SOS応答遺伝子のリプレッサーは、例えば限定するわけではないが、lexA、またはその修飾型である。いくつかの態様において、SOS応答遺伝子は、例えば限定するわけではないが、marRAB、arcABおよびlexOである。この局面および本明細書に記載する他の全ての局面のいくつかの態様において、非SOS経路細菌防御遺伝子の阻害因子はsoxR、またはその修飾型である。この局面および本明細書に記載する他の全ての局面のいくつかの態様において、非SOS経路細菌防御遺伝子の阻害因子は、marR、arc、soxR、fur、crp、icdAもしくはcraAもしくはompAまたはその修飾型の群から選択される。本発明のこの局面の別の態様において、非SOS防御遺伝子を阻害するリプレッサー改変バクテリオファージの核酸によってコードされる物質は、表2に列挙する任意の遺伝子を阻害することができる。いくつかの態様において、非SOS防御遺伝子を阻害するリプレッサー-改変バクテリオファージは、選ばれた抗微生物剤と組み合わせて使用することができる。例えば、リプレッサー-改変バクテリオファージが表2Aに列挙する遺伝子を阻害する物質をコードする場合、そのようなプレッサー-改変バクテリオファージは、シプロフロキサシン抗微生物剤またはその変種もしくは類似体と組み合わせて使用することができる。同様に、別の態様において、非SOS防御遺伝子を阻害するリプレッサー-改変バクテリオファージは、表4Bに列挙する遺伝子を阻害する物質をコードすることができ、それらは、バンコマイシン抗微生物剤またはその変種もしくは類似体と組み合わせて使用することができる。同様に、別の態様において、非SOS防御遺伝子を阻害するリプレッサー-改変バクテリオファージは表2C、2D、2E、2Fおよび2Gに列挙する遺伝子を阻害する物質をコードすることができ、それらは、それぞれリファンピシン抗微生物剤もしくはアンピシリン抗微生物剤もしくはスルフメタキサゾン（sulfmethaxazone）抗微生物剤もしくはゲンタマイシン抗微生物剤もしくはメトロニダゾール抗微生物剤、またはその変種もしくは類似体と組み合わせて使用することができる。
【００２４】
本発明のもう一つの局面は、例えば限定するわけではないが、抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させるタンパク質などといった物質をコードする核酸を含む改変バクテリオファージに関する。抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させる物質をコードする核酸を含む、そのような本明細書に記載の改変バクテリオファージを、本明細書では「感受性物質-改変バクテリオファージ」という場合があるが、これは、「リプレッサー-改変バクテリオファージ」の定義にも包含される。この局面および本明細書に記載する他の全ての局面のいくつかの態様において、抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させるそのような物質を「感受性物質」と呼び、これは、抗微生物剤に対する細菌の感受性を、抗微生物剤だけを使用した場合と比較して、少なくとも約10％または少なくとも約15％、または少なくとも約20％または少なくとも約30％または少なくとも約50％または50％以上、または10％と50％以上の間の任意の整数％、増加させる任意の物質を指す。ある態様において、感受性物質は、細菌細胞を特異的に標的とする物質である。もう一つの態様において、感受性物質は細菌細胞中で特異的に発現される経路を改変（すなわち阻害または活性化）する。ある態様において、感受性物質は、抗微生物剤の効力に対して相加効果を持つ物質である（すなわち、物質は、抗微生物剤による死滅効力または増殖の阻害に対して相加効果を持つ）。好ましい一態様において、感受性物質は、抗微生物剤の効力に対して相乗効果を持つ物質である（すなわち、物質は、抗微生物剤による死滅効力または増殖の阻害に対して相乗効果を持つ）。
【００２５】
ある態様において、感受性物質は細菌細胞への抗微生物剤の侵入を増加させる。例えば、感受性物質は、ポリンまたはポリン様タンパク質、例えば限定するわけではないが、タンパク質OmpF、およびベータバレルポリン（Beta barrel porin）、または外膜ポリン（ourwe membrane porin:OMP）機能スーパーファミリー（これは、ワールドワイドウェブサイト:「//biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE？object＝BC-4.1.B」に開示されているものを含むが、これらに限るわけではない）の他のメンバー、または本明細書に開示する表3に列挙するOMPファミリーメンバー、またはそれらの変種もしくはフラグメントである。もう一つの態様において、感受性物質は、細菌細胞中の鉄-硫黄クラスターを増加させ、かつ/または細菌における酸化ストレスまたはヒドロキシルラジカルを増加させる物質、例えば限定するわけではないがタンパク質である。鉄-硫黄クラスターを増加させる感受性物質の例には、Kahanski et al., Cell, 2007, 130; 797-810（この文献は参照によりその全てが本明細書に組み入れられる）に開示されているように、フェントン反応によるヒドロキシルラジカルの形成を調整する（すなわち増加または減少させる）物質が含まれる。感受性-改変バクテリオファージによって発現される感受性物質の例には、例えば、表4に列挙するもの、またはそのフラグメントもしくは変種、あるいはワールドワイドウェブサイト「biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE？type＝COMPOUND＆object＝CPD-7」に記載されているものが含まれる。
【００２６】
いくつかの態様では、感受性物質が化学療法剤ではない。もう一つの態様では、感受性物質が毒素タンパク質ではなく、もう一つの態様では、感受性物質が細菌毒素タンパク質または細菌毒素分子ではない。
【００２７】
したがって本発明者らは、細菌を死滅させる能力が強化されていて、抗微生物剤またはファージ感染に対する細菌の天然の抵抗性遺伝子を無力化または不活化するように、バクテリオファージが改変される、モジュラーデザイン戦略を開発した。いくつかの態様において、バクテリオファージは、（i）少なくとも1つの細菌抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子に対する少なくとも1つの阻害因子、または（ii）細菌中の少なくとも1つのSOS応答遺伝子または細菌防御遺伝子の少なくとも1つの阻害因子（例えば限定するわけではないがリプレッサー）、または（iii）抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる感受性物質を発現させるように、改変または修飾することができる。
【００２８】
いくつかの態様において、単独でまたは任意の組合せで使用されるこれらの改変バクテリオファージはどれでも、少なくとも1つの抗微生物剤と共に使用することができる。例えば、本明細書において議論する一局面は、少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つの抗生物質遺伝子および/または細胞生残遺伝子、例えば限定するわけではないが、cat、vanA、mecD、RecA、RecB、RecC、SpotまたはRelAなどを阻害する、アンチセンス核酸阻害因子またはアンチセンスRNA（asRNA）などの核酸阻害因子を発現させる改変バクテリオファージに関する。もう一つの局面において、改変バクテリオファージは、少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つのSOS応答遺伝子のリプレッサー、例えば限定するわけではないが、lexA、marR、arc、soxR、fur、crp、icdA、craAまたはompA、またはそのフラグメントを発現させることができる。
【００２９】
本発明者らは、リプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または阻害因子-改変バクテリオファージおよび/または感受性物質-改変バクテリオファージが、集団中の抗生物質抵抗性細菌の数を減少させ、他のさまざまな殺細菌性抗生物質（例えば限定するわけではないがゲンタマイシンおよびアンピシリンなど）にとって、強力な佐剤として作用できることも実証した。
【００３０】
本発明のあらゆる局面のいくつかの態様において、本明細書に開示する任意の改変バクテリオファージ、例えば本明細書において議論するリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または阻害因子-改変バクテリオファージおよび/または感受性物質-改変バクテリオファージは、細菌バイオフィルムを効果的に分解する分解酵素の少なくとも1つ、例えばターゲットバイオフィルムに特異的な効果的EPS分解酵素、特に、PCT出願PCT/US2005/032365および米国特許出願第12/337,677号（これらは参照により本明細書に組み入れられる）で論じられているディスパーシンB（dispersin B:DspB）などを、さらに含むことができる。
【００３１】
本明細書では、本明細書に記載する改変バクテリオファージの多様なライブラリー、例えば佐剤として作用する能力または抗微生物剤を強化するように作用する能力を持つリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または阻害因子-改変バクテリオファージおよび/または感受性物質-改変バクテリオファージのライブラリーの作成についても議論する。これは、佐剤として機能するそのようなバクテリオファージを環境から単離しようと試みるよりも有利である。阻害因子改変バクテリオファージは、細菌コロニーまたはバイオフィルム内で増殖し、細菌の機構を乗っ取ることにより、少ない初期ファージ接種量でさえ、複数のバイオフィルムコンポーネントが標的となるように、酵素と溶菌性ファージの両方について高い局所濃度を達成する。
【００３２】
迅速なバクテリオファージ（本明細書では「ファージ」ともいう）の複製と、それに続く細菌溶解およびSOS遺伝子の阻害因子の発現とにより、これは、環境現場、工業現場、および臨床現場において細菌を阻害しかつ/または細菌バイオフィルムを除去するための効率のよい自己触媒的方法に抗微生物剤と組み合わせて使用するための、二面的攻撃戦略になる。
【００３３】
本明細書には、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性物質-改変バクテリオファージを少なくとも1つの抗微生物剤と併用する方法も開示する。本発明者らは、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性物質-改変バクテリオファージの併用が、細菌の死滅または排除に関して、抗微生物剤のみの使用よりも少なくとも4.5桁は効率がよく、抗微生物剤を非改変バクテリオファージのみと一緒に使用した場合（すなわち、阻害因子-改変バクテリオファージでもリプレッサー-改変バクテリオファージでも感受性物質-改変バクテリオファージでもないバクテリオファージの存在下での抗微生物剤）と比較して少なくとも2桁は効率がよいことを実証した。このように、本発明者らは、先行技術に記載されている治療法としての非改変バクテリオファージと抗微生物剤との併用に対して、有意義で驚くべき改善を実証した。本発明者らは、本明細書に開示するそのような改変バクテリオファージ、例えば阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージが、阻害濃度未満の抗微生物薬濃度の存在下で発生し得る抗生物質抵抗性細菌細胞の数を減少させるのに極めて有効であることも実証した。
【００３４】
また、非改変バクテリオファージを抗微生物剤と組み合わせて使用する方法と比較して、本発明の有意義な利点の一つは、本明細書に開示する改変バクテリオファージを抗微生物剤と共に使用することにより、持続生残型微生物細胞の集団を著しく減少させまたは排除することが可能になることである。例えば、抗微生物剤による初回処置後に、本明細書に開示する改変バクテリオファージを投与または適用すれば、持続生残型微生物細胞の集団を減少させまたは排除することができる。さらにまた、本発明者らは、本明細書に開示する改変バクテリオファージ、例えば阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージまたは感受性物質-改変バクテリオファージが、1つ以上の抗微生物剤に曝露された細菌集団において生き残る抗生物質抵抗性突然変異型細菌の数を減少させ得ること、したがって本明細書に記載する改変バクテリオファージが、阻害濃度未満の抗微生物薬濃度の存在下で発生する抗生物質抵抗性細胞の数を減少させるのに有効であることも発見した。
【００３５】
本発明のもう一つの利点は、細菌バイオフィルムを持つ表面を処理する際に、組成物の複数回適用を減少させまたは排除することが可能になることである。
【００３６】
本発明の一局面は、本明細書に開示する改変バクテリオファージを作製するための、任意のバクテリオファージ株またはバクテリオファージ種の工学的改変または修飾に関する。例えば、阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージまたは感受性物質-改変バクテリオファージは、当業者に公知の任意のバクテリオファージであることができる。例えばある態様では、バクテリオファージが、溶原性バクテリオファージ、例えば限定するわけではないが、M13バクテリオファージなどである。もう一つの態様では、バクテリオファージが、溶菌性バクテリオファージ、例えば限定するわけではないが、T7バクテリオファージなどである。もう一つの態様では、バクテリオファージが、メチシリン抵抗性黄色ブドウ球菌（S. aureus）の細菌感染に対して使用するためのファージKまたはブドウ球菌ファージKである。
【００３７】
本発明の一局面は、M13プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、改変溶原性M13バクテリオファージに関する。
【００３８】
本発明のもう一つの局面は、M13プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸が少なくとも1つのSOS応答遺伝子のリプレッサーおよび/または非SOS細菌防御遺伝子に対する阻害因子をコードする、改変溶原性M13バクテリオファージに関する。
【００３９】
本発明のもう一つの局面は、M13プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸が抗微生物遺伝子に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも1つの物質をコードする、改変溶原性M13バクテリオファージに関する。
【００４０】
本発明のもう一つの局面は、T7プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸が少なくとも1つの抗生物質抵抗性遺伝子および/または少なくとも1つの細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、改変溶菌性T7バクテリオファージに関する。
【００４１】
本発明のもう一つの局面は、T7プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸が少なくとも1つのSOS応答遺伝子のリプレッサーおよび/または非SOS細菌防御遺伝子に対する阻害因子をコードする、改変溶菌性T7バクテリオファージに関する。
【００４２】
本発明のもう一つの局面は、T7プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸が抗微生物遺伝子に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも1つの物質をコードする、改変溶菌性T7バクテリオファージに関する。
【００４３】
いくつかの態様において、抗生物質抵抗性遺伝子は、cat、vanAもしくはmecDまたはその変種を含む群から選択される。いくつかの態様において、細胞生残遺伝子は、RecA、RecB、RecC、Spot、RelAまたはその変種を含む群から選択される。
【００４４】
本明細書に記載する全ての局面のいくつかの態様において、バクテリオファージは、siRNA、アンチセンス核酸、asRNA、RNAi、miRNAおよびそれらの変種を含む群から選択される物質を含むことができる。いくつかの態様において、バクテリオファージはasRNA物質を含む。
【００４５】
いくつかの態様において、バクテリオファージは、少なくとも2つの異なる細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも2つの物質、例えば限定するわけではないが、RecA、RecBまたはRecCの少なくとも2つを阻害する少なくとも2つの物質、をコードする核酸を含む。
【００４６】
いくつかの態様において、SOS応答遺伝子のリプレッサーは、lexA、marR、arcR、soxR、fur、crp、icdA、craA、ompFまたはその変種もしくはフラグメントを含む群から選択される。いくつかの態様ではリプレッサーがLexAであり、いくつかの態様ではリプレッサーがcsrAまたはomFであり、いくつかの態様において、バクテリオファージは、LexA、csrAまたはomFの任意の組合せの混合物をコードする核酸を含むことができる。例えば、いくつかの態様において、バクテリオファージは、少なくとも1つのSOS応答遺伝子の少なくとも2つの異なるリプレッサーをコードする核酸を含むことができる。例えば限定するわけではないが、バクテリオファージは、リプレッサーcsrAおよびompFまたはその変種もしくはホモログを含むことができる。
【００４７】
本発明のもう一つの局面は、細菌に感染した表面に、（i）バクテリオファージプロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、バクテリオファージと、（ii）少なくとも1つの抗微生物剤とを投与する工程を含む、細菌感染を阻害または排除するための方法に関する。
【００４８】
本発明のもう一つの局面は、細菌が感染した表面に、（i）バクテリオファージプロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸がSOS応答遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、バクテリオファージと、（ii）少なくとも1つの抗微生物剤とを投与する工程を含む、細菌感染を阻害または排除するための方法に関する。
【００４９】
本発明のもう一つの局面は、細菌が感染した表面に、（i）バクテリオファージプロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸が抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも1つの物質をコードする、バクテリオファージと、（ii）少なくとも1つの抗微生物剤とを投与する工程を含む、細菌感染を阻害または排除するための方法に関する。
【００５０】
本明細書に記載する全ての局面のいくつかの態様において、本明細書に開示される方法に役立ち、阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージまたは感受性-改変バクテリオファージなどの改変バクテリオファージの作製に使用されるバクテリオファージは、当業者に公知の任意のバクテリオファージである。使用することができるバクテリオファージの例の限定でないリストを、本明細書の表5に開示する。ある態様において、バクテリオファージは、例えばM13溶原性バクテリオファージなどの溶原性バクテリオファージである。代替的態様において、本明細書に開示するあらゆる局面で有用なバクテリオファージは、溶菌性バクテリオファージ、例えば限定するわけではないが、T7溶菌性バクテリオファージである。ある態様において、本明細書に開示するあらゆる局面で有用なバクテリオファージは、SP6バクテリオファージもしくはファージK、またはブドウ球菌ファージKバクテリオファージである。
【００５１】
いくつかの態様では、本明細書に開示する任意の改変バクテリオファージと抗微生物剤との投与が同時に行われ、代替的態様では、改変バクテリオファージの投与が抗微生物剤の投与に先だって行われる。別の態様では、抗微生物剤の投与が、改変バクテリオファージの投与に先だって行われる。
【００５２】
いくつかの態様において、本明細書に開示する方法において有用な抗微生物剤は、キノロン系抗微生物剤、例えば限定するわけではないが、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、およびオフロキサシン、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン、モキシフロキサシン、スパルフロキサシン、ゲミフロキサシン、パズフロキサシン、またはその変種もしくは類似体を含む群から選択される抗微生物剤である。いくつかの態様において、本明細書に開示する方法において有用な抗微生物剤はオフロキサシンまたはその変種もしくは類似体である。
【００５３】
いくつかの態様では、本明細書に開示する方法において有用な抗微生物剤が、アミノグリコシド系抗微生物剤、例えば限定するわけではないが、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネトロマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ネオマイシン、またはその変種もしくは類似体からなる群より選択される抗微生物剤である。いくつかの態様では、本明細書に開示する方法において有用な抗微生物剤が、ゲンタマイシン、またはその変種もしくは類似体である。
【００５４】
いくつかの態様では、本明細書に開示する方法において有用な抗微生物剤が、β-ラクタム系抗生物質抗微生物剤、例えば限定するわけではないが、ペニシリン、アンピシリン、ペニシリン誘導体、セファロスポリン類、モノバクタム類、カルバペネム類、β-ラクタマーゼ阻害剤、またはその変種もしくは類似体からなる群より選択される抗微生物剤である。いくつかの態様では、本明細書に開示する方法において有用な抗微生物剤が、アンピシリン、またはその変種もしくは類似体である。
【００５５】
本発明のもう一つの局面は、M13プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、溶原性M13バクテリオファージと、少なくとも1つの抗微生物剤とを含む組成物に関する。本発明のもう一つの局面は、M13プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸がSOS応答遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、溶原性M13バクテリオファージと、少なくとも1つの抗微生物剤とを含む組成物に関する。
【００５６】
本発明のもう一つの局面は、T7プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、溶菌性T7バクテリオファージと、少なくとも1つの抗微生物剤とを含む組成物に関する。本発明のもう一つの局面は、T7プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸がSOS応答遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、溶菌性T7バクテリオファージと、少なくとも1つの抗微生物剤とを含む組成物に関する。
【００５７】
いくつかの態様において、本組成物は、例えば限定するわけではないが、キノロン系抗微生物剤および/またはアミノグリコシド系抗微生物剤および/またはβ-ラクタム系抗微生物剤などの抗微生物剤、例えば限定するわけではないが、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、およびオフロキサシン、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン、モキシフロキサシン、スパルフロキサシン、ゲミフロキサシン、パズフロキサシン、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネトロマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、アンピシリン、ペニシリン誘導体、セファロスポリン類、モノバクタム類、カルバペネム類、β-ラクタマーゼ阻害剤、またはその変種もしくは類似体を含む群から選択される抗微生物剤を含む。
【００５８】
いくつかの態様において、本組成物は、本明細書に開示する少なくとも1つの阻害因子-改変バクテリオファージおよび/または少なくとも1つのリプレッサー-改変バクテリオファージを含む。
【００５９】
本発明のもう一つの局面は、M13プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、溶原性M13バクテリオファージを含むキットに関する。本発明のもう一つの局面は、M13プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸がSOS応答の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、溶原性M13バクテリオファージを含むキットに関する。
【００６０】
本発明のもう一つの局面は、T7プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、溶菌性T7バクテリオファージを含むキットに関する。本発明のもう一つの局面は、T7プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸がSOS応答の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、溶菌性T7バクテリオファージを含むキットに関する。
【００６１】
いくつかの態様では、本明細書に開示する方法および組成物が、対象に投与される。いくつかの態様では、本明細書に開示する組成物を対象に投与する工程を含む、細菌が対象中に存在する、細菌感染を阻害または排除するための方法が開示される。いくつかの態様では、対象は哺乳動物、例えば限定するわけではないが、ヒトである。
【００６２】
いくつかの態様では、本明細書に開示するバクテリオファージがいずれも、少なくとも1つの抗微生物剤との組合せにおいて、抗微生物剤だけを使用する場合と比較して、細菌の数を減少させるのに役立つ。いくつかの態様では、本明細書に開示するバクテリオファージがいずれも、少なくとも1つの抗微生物剤との組合せにおいて、細菌感染を阻害または排除（例えばバイオフィルム中に存在する細菌を阻害または排除）するのに役立つ。
【００６３】
いくつかの態様において、本発明は、細菌が感染した表面に（i）バクテリオファージプロモーターに機能的に連結された核酸を含み、その核酸がSOS応答遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーを含む、バクテリオファージと、（ii）少なくとも1つの抗微生物剤とを投与する工程を含む、細菌感染を阻害または排除する方法に関する。いくつかの態様では、細菌がバイオフィルム中に存在する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ】図1A〜Eは、改変φlexA3バクテリオファージが殺細菌性抗生物質による野生型大腸菌（E. coli）EMG2細菌の死滅を強化することを表す。図1Aは、改変ファージと抗生物質とによる併用療法の概略を表す。殺細菌性抗生物質は、ヒドロキシルラジカルによるDNA損傷を誘発し、それがSOS応答の誘導につながる。SOS誘導はDNA修復を引き起こし、生残をもたらすことができる（Kohanski et al., 2007, Cell 130, 797-8108）。合成プロモーターPLtetOおよびリボソーム結合配列（Lutz et al., 1997, Nucleic Acids Res 25, 1203-121027）の制御を受けるlexA3遺伝子を持つ改変ファージ（φlexA3）は、SOS応答を抑止し、細胞死を増加させることにより、抗生物質佐剤として作用する。
【図１Ｂ】60ng/mLオフロキサシン［oflox］（実線、中実の記号）と組み合わせたファージなし（菱形）、無改変ファージφunmod（四角形）、および改変ファージφlexA3（丸）に関する死滅曲線を表す。108PFU/mLのファージを使用した。無処理の大腸菌EMG2に関する増殖曲線を比較のために示す（点線、中空の記号）。φlexA3は、4時間の処理で、オフロキサシンによる死滅を著しく強化した。
【図１Ｃ】φlexA3（丸と実線）が、ファージなし（菱形と一点鎖線）およびφunmod（四角形と破線）と比較して、低レベルの薬物でさえ、死滅を増加させることを示す、オフロキサシン用量応答である。108PFU/mLのファージを使用した。
【図１Ｄ】5μg/mLのゲンタマイシン［gent］と組み合わせたファージなし（菱形）、φunmod（四角形）、およびφlexA3（丸）に関する死滅曲線を表す。109PFU/mLのファージを使用した。φlexA3ファージは、ゲンタマイシンによる死滅を大きく増加させる。
【図１Ｅ】5μg/mLアンピシリン［amp］と組み合わせたファージなし（菱形）、φunmod（四角形）、およびφlexA3（丸）に関する死滅曲線を表す。109PFU/mLのファージを使用した。φlexA3ファージはアンピシリンによる死滅を大きく増加させる。
【図２】改変φlexAバクテリオファージがオフロキサシンによるキノロン抵抗性大腸菌RFS289細菌の死滅を強化することを表す。1μg/mLオフロキサシン［oflox］（実線、中実の記号）と組み合わせたファージなし（菱形）、無改変ファージfunmod（四角形）、および改変ファージφlexA3（丸）に関する死滅曲線。108PFU/mLのファージを使用した。φlexA3は、1時間の処理で、オフロキサシンによる死滅を著しく強化した。
【図３Ａ】図3A〜3Bは、改変φlexA3バクテリオファージが細菌に感染したマウスの生残率を増加させることを表す。図3Aは、8.8×107CFU/マウスの大腸菌EMG2細菌を腹腔内注射で接種した雌Charles River CD-1マウスの概略を表す。1時間後に、マウスに処置を施さないか、0.2mg/kgオフロキサシンと組み合わせたファージなし、無改変ファージφunmod、または改変ファージφlexA3による静脈内処置を施した。109PFU/マウスのファージを使用した。マウスを5日間観察し、それぞれの日の終わりに死亡数を記録して、生残曲線を作成した。
【図３Ｂ】ファージおよび/またはオフロキサシンで処置した感染マウスに関する生残曲線を表し、これらは、改変ファージφlexA3＋オフロキサシン（中実の丸と実線）が、無改変ファージfunmod＋オフロキサシン（中実の四角形と実線）、ファージなし＋オフロキサシン（中実の菱形と実線）、および無処置（中空の菱形と破線）と比較して、マウスの生残率を有意に増加させることを示している。
【図４】図4A〜4Bは、さまざまな条件下で増殖させた後に100ng/mLオフロキサシンに対して抵抗性であった、60の観察記録中の大腸菌EMG2細胞の総数の箱ひげ図である（バーは中央値を示し、菱形は外れ値を表す）。図4Aは、ファージなしかつオフロキサシンなしで24時間増殖させた細胞が、極めて少数の抗生物質抵抗性細胞しか含まなかったことを表す。ファージなしおよび30ng/mLオフロキサシンで24時間増殖させた細胞は、阻害濃度未満の薬物濃度（Martinezら, 2000, Antimicrob. Agents Chemother. 44, 1771-177730）における増殖ゆえに、多数の抵抗性細胞を含んでいた。ファージなしおよび30ng/mLオフロキサシンで12時間増殖させた後、109PFU/mLの無改変ファージfunmodおよび30ng/mLオフロキサシンで12時間増殖させた細胞は、あまり大きくないレベルの抗生物質抵抗性細菌を示した。ファージなしおよび30ng/mLオフロキサシンで12時間増殖させた後、109PFU/mLのφlexAおよび30ng/mLオフロキサシンで12時間増殖させた細胞は、オフロキサシンなしかつファージなしで見られた数に近い低レベルの抗生物質抵抗性細菌を示した。図4Bは、低い総抵抗性細胞数付近の解像度を上げた（a）に記載の箱ひげ図の拡大版を表し、これにより、φlexA3と30ng/mLオフロキサシンとによる処理が、オフロキサシンなしかつファージなしの場合と同様のレベルにまで、抵抗性細胞の数を減少させたことが確認される。
【図５Ａ】図5A〜5Dは、オフロキサシン処理［oflox］用佐剤としての、単一のおよび複数の遺伝子ネットワーク（SOSネットワーク以外）を標的とする改変バクテリオファージを表す。図5Aは、オフロキサシンがスーパーオキシド生成を刺激し、それが通常は、SoxRによってコーディネートされる酸化ストレス応答によって打ち消されることを表す（Kohanski et al., 2007, Cell 130, 797-8108）。SoxR（φsoxR）を産生する改変ファージは、酸化ストレス応答の調節を乱すことにより、オフロキサシンに基づく死滅を強化する。
【図５Ｂ】60ng/mLオフロキサシン（実線、中実の記号）と併用したファージなし（菱形）、無改変ファージφunmod（四角形）、および改変ファージφsoxR（下向きの三角形）に関する死滅曲線を表す。1O8PFU/mLのファージを使用した。funmodに関する死滅曲線および無処理の大腸菌EMG2に関する増殖曲線（点線、中空の記号）は、比較のために図1Bから作り直したものであり、φsoxRがオフロキサシンによる死滅を強化することを表している。
【図５Ｃ】CsrAは、細菌細胞が抗生物質に対する抵抗性を増す傾向を持つバイオフィルム状態を抑止する（Jackson et al., 2002, J. Bacteriol. 184, 290-30135）。OmpFは、キノロン類が細菌細胞に侵入するために使用するポリンである（Hirai K, et al., 1986, Antimicrob. Agents Chemother. 29, 535-53837）。CsrAとOmpFを同時に産生する改変ファージ（φcsrA-ompF）は、OmpFによる抗生物質の浸透を強化し、バイオフィルム形成および抗生物質耐性をCsrAによって抑制して、オフロキサシン用の改良された二重ターゲティング佐剤になる。
【図５Ｄ】60ng/mLオフロキサシンと併用したφcsrA（菱形）、φompF（四角形）、およびφcsrA-ompF（上向きの三角形）に関する死滅曲線を表す。108PFU/mLのファージを使用した。csrAとompFをどちらも発現させるファージ（φcsrA-ompF）は、csrAだけを発現させるファージ（φcsrA）またはompFだけを発現させるファージ（φompF）よりも良い、オフロキサシン用佐剤である。
【図６Ａ】図6A〜6Dは、オフロキサシン処理［oflox］用の佐剤としての、大腸菌中の非SOS系を標的とする改変バクテリオファージを表す。図6Aは、オフロキサシンなし（点線、中空の記号）の、または60ng/mLオフロキサシン（実線、中実の記号）と併用した、ファージなし（黒い菱形）、108PFU/mLの無改変M13mp18（すなわちφunmod）（四角形）、および108PFU/mLのM13mp18-soxR（すなわちφSoxR）（下向きの三角形）に関する死滅曲線を表す。ファージなしおよび無改変m13mp18ファージ（φunmod）に関する死滅曲線は比較のために図1Bから作り直したものであり、M13mp18-soxR（すなわちφSoxR）がオフロキサシンによる死滅を強化することを示している。108PFU/mLは約1:10のMOIに相当する。
【図６Ｂ】オフロキサシンなし（点線、中空の記号）の、または60ng/mLオフロキサシン（実線、中実の記号）と併用した、108PFU/mLのM13mp18-csrA（φcsrA）（黒い菱形）、108PFU/mLのM13mp18-ompF（φompF）（四角形）、および108PFU/mLのM13mp18-csrA-ompF（φcsrA-ompF）（上向きの三角形）に関する死滅曲線を表す。csrAとompFをどちらも発現させるファージ（M13mp18-csrA-ompF、すなわちφcsrA-ompF）は、csrAだけを発現させるファージ（M13mp18-csrA;φcsrA）またはompFだけを発現させるファージ（M13mp18-ompF;φompF）よりも、良いオフロキサシン用佐剤である。108PFU/mLは約1:10のMOIに相当する。
【図６Ｃ】ファージ用量応答を表し、これは、M13mp18-soxR（下向きの三角形と実線）とM13mp18-csrA-ompF（上向きの三角形と実線）がどちらも、広範囲にわたる初回接種量で、オフロキサシン（60ng/mL）用の佐剤として有効であることを示している。ファージなし（一点鎖線）および無改変M13mp18ファージ（四角形と破線）に関するファージ用量応答曲線は、比較のために図1cから作り直したものである。
【図６Ｄ】108PFU/mLでのオフロキサシン用量応答を表し、これは、M13mp18-soxR（下向きの三角形と実線）とM13mp18-csrA-ompF（上向きの三角形と実線）がどちらも、ある薬物濃度範囲の全域で、死滅を改善することを示している。ファージなし（菱形と一点鎖線）および無改変M13mp18ファージ（四角形と破線）に関するオフロキサシン用量応答曲線は、比較のために図1Dから作り直したものである。
【図７Ａ】図7A〜7Dは、さまざまな条件下で増殖させた後に100ng/mLオフロキサシンに対して抵抗性であった、60の観察記録中の大腸菌細胞の総数のヒストグラムを表す。図7Aは、ファージなしかつオフロキサシンなしで24時間増殖させた細胞が、極めて少数の抗生物質抵抗性細胞しか含まなかったことを表す。図8Aの差し込み図は、0〜50の総抵抗性細胞数を持つ観察記録の分布を拡大表示したものであり、多くの観察記録が抗生物質抵抗性細菌を欠いていることを示している。
【図７Ｂ】ファージなしおよび30ng/mLオフロキサシンで24時間増殖させた細胞が多数の抵抗性細胞を含んでいたことを表し、このことは、阻害濃度未満の薬物濃度における増殖に起因する抗生物質抵抗性の大きな増加を示している17。抵抗性細胞数が50未満である観察記録はなかったので、挿入図は示していない。
【図７Ｃ】ファージなしおよび30ng/mLオフロキサシンで12時間増殖させた後、109PFU/mLの無改変M13mp18ファージおよび30ng/mLオフロキサシンで12時間増殖させた細胞が、あまり大きくないレベルの抗生物質抵抗性細菌を示したことを表す。図7Cの挿入図は、0〜50の総抵抗性細胞数を持つ観察記録の分布を拡大表示したものであり、抗生物質抵抗性細菌を欠いている観察記録はなかったことを示している。
【図７Ｄ】ファージなしおよび30ng/mLオフロキサシンで12時間増殖させた後、109PFU/mLのM13mp18-lexA3および30ng/mLオフロキサシンで12時間増殖させた細胞が、図7Dのファージなしおよび30ng/mLオフロキサシンや図8Cの無改変M13mp18および30ng/mLオフロキサシンと比較して、低レベルの抗生物質抵抗性細菌を示したことを表す。図7Dの挿入図は、0〜50の総抵抗性細胞数を持つ観察記録の分布を拡大表示したものであり、M13mp18-lexA3処理が、30ng/mLオフロキサシン下での抵抗性細胞の数を、図8Aにおける0ng/mLオフロキサシンの場合と類似するレベルまで減少させたことを示している。
【図８Ａ】図8A〜8Bは、改変M13mp18-lexA3バクテリオファージが他の殺細菌性薬による死滅を強化することを表す。図8Aは、5μg/mLゲンタマイシン［gent］と併用したファージなし（菱形）、109PFU/mLの無改変M13mp18（四角形）、および109PFU/mLのM13mp18-lexA3（丸）に関する死滅曲線を表す。改変M13mp18-lexA3ファージは、ゲンタマイシンによる死滅を著しく改善した。109PFU/mLは約1:1のMOIに相当する。
【図８Ｂ】5μg/mLアンピシリン［amp］と併用したファージなし（菱形）、109PFU/mLの無改変M13mp18（四角形）、および109PFU/mLのM13mp18-lexA3（丸）に関する死滅曲線を表す。改変M13mp18-lexA3ファージは、アンピシリンによる死滅を著しく改善した。109PFU/mLは約1:1のMOIに相当する。
【図９Ａ】図9A〜9Fは、無改変M13mp18バクテリオファージと改変バクテリオファージのゲノムを表す。SacI制限部位とPvuI制限部位の間に、合成プロモーター（PLtetO）およびリボソーム結合配列（RBS）の制御を受ける遺伝子モジュールを挿入することによって、改変バクテリオファージを構築した。ターミネーター（TermT1）はそれぞれの遺伝子の転写を終わらせる。図9Aは、改変バクテリオファージの青-白スクリーニングが可能になるように、無改変M13mp18（φunmod）がlacZを含有していることを表す。
【図９Ｂ】lexA3を発現させる改変M13mp18バクテリオファージ（φlexA3）を表す。
【図９Ｃ】soxRを発現させる改変M13mp18バクテリオファージ（φsoxR）を表す。
【図９Ｄ】csrAを発現させる改変M13mp18バクテリオファージ（φcsrA）を表す。
【図９Ｅ】ompFを発現させる改変M13mp18バクテリオファージ（φompF）を表す。
【図９Ｆ】csrAおよびompFを発現させる改変M13mp18バクテリオファージ（φcsrA-ompF）を表す。
【図１０Ａ】図10A〜10Eは、さまざまな用量のオフロキサシンと共にファージなし（黒線）、無改変ファージφunmod（赤線）、または改変ファージφlexA3（青線）に6時間曝露したSOS応答性GFPプラスミドを持つ細胞のフローサイトメトリーを表す。108プラーク形成ユニット/mL（PFU/mL）のファージを適用した。ファージなしまたはφunmodに曝露された細胞が類似するSOS誘導プロファイルを示したのに対し、φlexA3に曝露された細胞は、有意に抑止されたSOS応答を示した。図10Aは、0ng/mLオフロキサシン処理を表す。
【図１０Ｂ】20ng/mLオフロキサシン処理を表す。
【図１０Ｃ】60ng/mLオフロキサシン処理を表す。
【図１０Ｄ】100ng/mLオフロキサシン処理を表す。
【図１０Ｅ】200ng/mLオフロキサシン処理を表す。
【図１１】前もって薬物処理された集団に改変バクテリオファージを適用することで、生き残っている持続生残型微生物細胞の死滅を増加させ得ることが、持続生残型微生物死滅アッセイによって実証されることを表す。200ng/mLオフロキサシン処理の3時間後に、ファージなし、109PFU/mLの対照M13mp18ファージ、または109PFU/mLの改変M13mp18-lexA3ファージを、その前もって薬物処理された培養物に加えた。さらに3時間の後、生細胞数を計数したところ、M13mp18-lexA3は、ファージなしまたは対照M13mp18ファージよりも良く、持続生残型微生物細胞を減少させ得ることが実証された。
【図１２】アンチセンスRNAがステムの最上部にある隣接制限部位間にクローニングされる、Nakashima, et al (2006) Nucleic Acids Res 34: e138による対合末端デザインを表す。Nakashima, et al (2006) Nucleic Acids Res 34: e138からリプリント。
【図１３】オフロキサシンなどの薬剤によるDNA損傷に呼応してrecAがlexAを切断した場合にlexA発現のレベルを増加させることができる、Morens, et al., (2004) Nature 430: 242-249によるlexA抑制性PLlexOを持つ、自己調節型ネガティブフィードバックモジュールを表す。
【図１４】1mM IPTGの存在下で8時間増殖させた後、5μg/mLオフロキサシンで8時間処理した野生型大腸菌EMG2細胞におけるさまざまなコンストラクトに関する持続生残アッセイを表す。二重ノックアウトにより、特にPLtetO-recB-asRNA/PLlacO-recA-asRNAおよびPLtetO-recC-asRNA/PLlacO-recB-asRNAにより、著しく改善された細胞死滅が生じた。pZE1L-lexAも、野生型大腸菌EMG2と比較して、生残細胞の数を減少させた。
【図１５】改変φlexA3バクテリオファージが殺細菌性抗生物質による野生型大腸菌EMG2細菌の死滅を強化することを表す。ファージ用量応答は、φlexA3（青い丸と実線）が、ファージなし（黒い一点鎖線）やφunmod（赤い四角形と破線）と比較して、広範囲の初期接種量にわたり、オフロキサシン（60ng/mL）にとって強力な佐剤であることを表している。細菌の出発濃度は約109CFU/mLだった（データ未掲載）。
【図１６】前もって薬物処理された集団に改変バクテリオファージを適用することで、生き残っている持続生残型微生物細胞の死滅を増加させ得ることが、持続生残型微生物死滅アッセイによって実証されることを表す。200ng/mLオフロキサシン処理の3時間後に、ファージなし（黒いバー）、109PFU/mLの無改変ファージφunmod（赤いバー）、または109PFU/mLの改変ファージφlexA3（青いバー）を、その前もって薬物処理された培養物に加えた。さらに3時間の後、生細胞数を計数したところ、φlexA3は、ファージなしまたはφunmodよりも良く、持続生残型微生物細胞を減少させ得ることが実証された。
【図１７】前もって24時間増殖させた大腸菌EMG2バイオフィルムの12時間処理後の60ng/mLオフロキサシンによる平均死滅を表す。表示に応じて、108PFU/mLのφlexA3バクテリオファージを使用した。
【図１８】前もって24時間増殖させた大腸菌EMG2バイオフィルムの12時間処理後の60ng/mLオフロキサシンによる平均死滅を表す。表示に応じて、108PFU/mLのφcsrA、φompF、またはφcsrA-ompFバクテリオファージを使用した。
【図１９】改変バクテリオファージ中の核酸を発現させるために使用することができるプロモーターの一例を表す。図19は、使用することができるPLtetO-1（配列番号:32）、PLlacO-1（配列番号:33）、PAlacO-1（配列番号:34）およびPlac/ara-1（配列番号:35）プロモーターを表す。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
詳細な説明
本明細書に開示するとおり、本発明者らは、細菌感染を著しく減少させまたは排除するための二面的戦略を発見した。特に本発明者らは、抗微生物剤と組み合わせて使用されるバクテリオファージを、改変されたバクテリオファージがその抗微生物剤に対して佐剤として機能するように改変した。したがって本発明者らは、抗微生物剤と組み合わせて使用されるバクテリオファージを、改変されたバクテリオファージが少なくとも一つの抗微生物剤に対して佐剤として機能するように改変した。特に本発明者らは、抗微生物剤および/またはファージ感染に対する細菌の天然の抵抗性機構が特異的に無力化（または不活化）されるように、バクテリオファージを改変した。したがって本発明の一局面は、概して、（i）少なくとも1つの細菌抵抗性遺伝子を阻害するか、または（ii）細菌中の少なくとも1つのSOS応答遺伝子もしくは細菌防御遺伝子を阻害するか、または（iii）抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させるタンパク質を発現させるように修飾または改変されている改変バクテリオファージに関する。単独でまたは任意の組合せで使用されるこれらの改変バクテリオファージはどれでも、抗微生物剤と共に使用することができる。したがって本発明者らは、抗微生物剤と一緒に（または組み合わせて）使用されるバクテリオファージを改変することで（ここで、改変されたバクテリオファージは抗微生物剤抵抗性遺伝子を阻害するか、SOS応答遺伝子または非SOS細菌防御遺伝子を阻害するか、抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させるためのタンパク質を発現させることができる）、通常は抗微生物効果を回避する局所的細菌合成機構を阻害することによって、抗微生物剤に対する細菌抵抗性の発生および持続生残型細菌の生成を防止するための方法を発見した。
【００６６】
したがって、本発明の一局面は、少なくとも1つの抗微生物剤と一緒に（すなわち、組み合わせて）使用するための本明細書において議論する改変バクテリオファージに関し、また、それらの改変バクテリオファージが上述の抗微生物剤にとって佐剤として役立つことに関する。
【００６７】
本発明の一局面は、抗微生物剤の細菌死滅効果を増強するための方法に関する。特に、本発明の一局面は、抗微生物剤の抗微生物効果および細菌死滅を増強するために抗微生物剤と組み合わせて使用するための改変バクテリオファージを含む方法および組成物に関する。もう一つの局面は、抗生物質佐剤としての改変バクテリオファージの使用に関する。この局面および本明細書に記載する全ての局面のいくつかの態様において、改変バクテリオファージは、限定するわけではないがゲンタマイシンなどのアミノグリコシド系抗微生物剤用の抗生物質佐剤として機能し、限定するわけではないがアンピシリンなどのβ-ラクタム系抗生物質用の抗生物質佐剤として機能し、限定するわけではないがオフロキサシンなどのキノロン系抗微生物剤の抗生物質佐剤として機能する。この局面および本明細書に記載する全ての局面の一態様において、改変バクテリオファージは、一度に、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個もしくは少なくとも10個またはそれ以上の異なる抗微生物剤のための抗微生物佐剤または抗生物質佐剤として機能することができる。いくつかの態様において、本明細書に開示する改変バクテリオファージはどれでも、少なくとも1つまたはそれ以上の抗微生物剤と組み合わせて使用することができる。例えば本明細書に開示する改変バクテリオファージは、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個もしくは10個またはそれ以上の異なる抗微生物剤と組み合わせて使用することができる。
【００６８】
本発明の一局面において、本明細書に開示する改変バクテリオファージは、抗生物質抵抗性の発生に関与する少なくとも1つの細菌遺伝子を阻害する物質をコードする核酸を含むことができる。この局面および本明細書に記載する全ての局面のもう一つの態様において、改変バクテリオファージは、細胞生残修復に関与する少なくとも1つの遺伝子を阻害する物質をコードする核酸を含むことができる。先に議論したように、抗生物質抵抗性に関与する少なくとも1つの細菌遺伝子および/または細胞生残に関与する少なくとも1つの細菌遺伝子を阻害する物質をコードする核酸を含むそのような改変バクテリオファージを、本明細書では、「阻害因子-改変バクテリオファージ」という。この局面および本明細書において議論する全ての局面のいくつかの態様において、抗生物質抵抗性細菌遺伝子を阻害する物質は、例えば限定するわけではないが、cat、vanAまたはmecDなどの抗生物質抵抗性遺伝子の遺伝子発現および/またはタンパク質機能を阻害することができる。この局面および本明細書において議論する全ての局面のいくつかの態様において、細菌細胞生残遺伝子を阻害する物質は、例えば限定するわけではないがRecA、RecB、RecC、SpotまたはRelAなどの細胞生残修復遺伝子の遺伝子発現および/またはタンパク質機能を阻害することができる。
【００６９】
この局面および本明細書に記載する全ての局面のいくつかの態様において、阻害因子-改変バクテリオファージは、抗生物質抵抗性および/または細胞生残修復に関与する少なくとも1つの遺伝子を阻害する物質をコードする核酸を含むことができる。この局面および本明細書に記載する全ての局面の一態様において、阻害因子-改変バクテリオファージは、抗生物質抵抗性および/または細胞生残修復に関与する少なくとも1つの遺伝子、例えば2、3、4、5または10個までの遺伝子を阻害する少なくとも2個、3個、4個、5個またはそれ以上（例えば10個）の異なる核酸を含むことができる。この局面のいくつかの態様において、阻害因子-改変バクテリオファージは、少なくとも1つの抗生物質抵抗性遺伝子または少なくとも1つの細胞生残修復遺伝子に対する阻害因子、例えば限定するわけではないが、cat、vanA、mecD、RecA、RecB、RecC、SpotまたはRelAの群、および他の抗生物質抵抗性遺伝子または細胞生残修復遺伝子から選択される、少なくとも2個、3個、4個、5個またはそれ以上に対する阻害因子をコードする、少なくとも2個、3個、4個、5個またはそれ以上（例えば8個）の異なる核酸を含むことができる。いくつかの態様では、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子の阻害因子のありとあらゆる異なる組合せが、阻害因子-改変バクテリオファージ中に存在し得る。
【００７０】
本発明のもう一つの局面において、改変バクテリオファージは、細菌SOS応答遺伝子のリプレッサータンパク質もしくはそのフラグメントをコードする少なくとも1つの核酸、または非SOS経路細菌防御遺伝子を阻害する物質（タンパク質など）をコードする少なくとも1つの核酸を含むことができ、これを本明細書では、「リプレッサー-改変バクテリオファージ」という。いくつかの態様において、SOS応答遺伝子のリプレッサーは、例えば限定するわけではないが、lexA、またはその修飾型である。いくつかの態様において、SOS応答遺伝子は、例えば限定するわけではないが、marRAB、arcABおよびlexOである。この局面および本明細書に記載する他の全ての局面のいくつかの態様において、非SOS経路細菌防御遺伝子の阻害因子は、任意の物質、例えば限定するわけではないが、タンパク質またはRNAi物質、例えば非SOS遺伝子に対するアンチセンス、例えば限定するわけではないが、soxRまたはその修飾型などであることができる。この局面および本明細書に記載する他の全ての局面のいくつかの態様において、リプレッサー、例えば非SOS経路細菌防御遺伝子を阻害する物質は、例えば、次に挙げる遺伝子の群から選択される遺伝子を阻害する:marR、arc、soxR、fur、crp、icdAもしくはcraAもしくはompAまたはその修飾型。本発明のこの局面の別の態様では、リプレッサー改変バクテリオファージの核酸が、非SOS防御遺伝子を阻害する物質である。例えば、リプレッサー物質は、表2に列挙する任意の遺伝子または表2に列挙する遺伝子の任意の組合せを阻害することができる。いくつかの態様において、非SOS防御遺伝子を阻害するリプレッサー-改変バクテリオファージは、選ばれた抗微生物剤と組み合わせて使用することができる。例えば、リプレッサー-改変バクテリオファージが表2Aに列挙する遺伝子を阻害する物質をコードする場合、そのようなリプレッサー-改変バクテリオファージは、シプロフロキサシン抗微生物剤またはその変種もしくは類似体と組み合わせて使用することができる。同様に、別の態様において、非SOS防御遺伝子を阻害するリプレッサー-改変バクテリオファージは、表4Bに列挙する遺伝子を阻害する物質をコードすることができ、それらは、バンコマイシン抗微生物剤またはその変種もしくは類似体と組み合わせて使用することができる。同様に、別の態様において、非SOS防御遺伝子を阻害するリプレッサー-改変バクテリオファージは、表2C、2D、2E、2Fおよび2Gに列挙する遺伝子を阻害する物質をコードすることができ、それらは、それぞれリファンピシン抗微生物剤もしくはアンピシリン抗微生物剤もしくはスルフメタキサゾン（sulfmethaxazone）抗微生物剤もしくはゲンタマイシン抗微生物剤もしくはメトロニダゾール抗微生物剤、またはその変種もしくは類似体と組み合わせて使用することができる。
【００７１】
この局面および本明細書において議論する他の全ての局面のいくつかの態様において、リプレッサーは、例えば限定するわけではないが、lexA、marR、arc、soxR、fur、crp、icdA、craAもしくはompAまたはその修飾型である。いくつかの態様において、SOS応答遺伝子は、例えば限定するわけではないが、marRAB、arcABおよびlexOである。
【００７２】
この局面および本明細書に記載する他の全ての局面のいくつかの態様において、リプレッサー-改変バクテリオファージは、SOS応答遺伝子の異なるリプレッサー、例えば、限定するわけではないが、lexA、marRAB、arcABおよびlexO、ならびにSOS応答遺伝子の他のリプレッサーの群から選択される少なくとも2個、3個、4個、5個またはそれ以上をコードする、少なくとも2個、3個、4個、5個またはそれ以上（例えば8個）の異なる核酸を含むか、または非SOS防御遺伝子の異なるリプレッサー（すなわち阻害因子）をコードする少なくとも2個、3個、4個、5個もしくはそれ以上（例えば8個）の異なる核酸を含むことができる。いくつかの態様において、リプレッサー改変バクテリオファージは、本明細書に記載するSOS遺伝子のリプレッサーのありとあらゆる異なる組合せを含むことができ、かつ/または表2および表2A〜2Gに列挙する非SOS防御遺伝子の阻害因子のありとあらゆる異なる組合せが、リプレッサー-改変バクテリオファージ中に存在し得る。
【００７３】
本発明のもう一つの局面において、改変バクテリオファージは、抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させる物質（限定するわけではないがタンパク質など）をコードする少なくとも1つの核酸を含むことができる。抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させる物質をコードする核酸を含む、そのような本明細書に記載の改変バクテリオファージを、本明細書では、「感受性物質-改変バクテリオファージ」という場合があるが、これは「リプレッサー-改変バクテリオファージ」の定義にも包含される。この局面および本明細書に記載する他の全ての局面のいくつかの態様において、抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させるそのような物質を「感受性物質」と呼び、これは、抗微生物剤に対する細菌の感受性を、抗微生物剤だけを使用した場合と比較して、少なくとも約10％または少なくとも約15％、または少なくとも約20％または少なくとも約30％または少なくとも約50％または50％以上、または10％と50％以上の間の任意の整数％、増加させる任意の物質を指す。ある態様において、感受性物質は、細菌細胞を特異的に標的とする物質である。もう一つの態様において、感受性物質は細菌細胞中で特異的に発現される経路を改変（すなわち阻害または活性化）する。ある態様において、感受性物質は、抗微生物剤の効力に対して相加効果を持つ物質である（すなわち、物質は、抗微生物剤による死滅効力または増殖の阻害に対して相加効果を持つ）。好ましい一態様において、感受性物質は、抗微生物剤の効力に対して相乗効果を持つ物質である（すなわち、物質は、抗微生物剤による死滅効力または増殖の阻害に対して相乗効果を持つ）。
【００７４】
したがって、本発明のもう一つの局面は、抗微生物剤の死滅効果を増強するための、別の言い方をすると、抗微生物剤の効力を強化するための、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性-改変バクテリオファージの使用に関する。本明細書に開示する改変バクテリオファージと組み合わせて使用される抗微生物剤の量を少なくとも約10％減少させても、結果に有害な影響が及ばないのであれば、例えば抗微生物活性のレベルに有害な影響が及ばないのであれば、その阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー改変バクテリオファージおよび/または感受性-改変バクテリオファージは、抗微生物剤の有効性を増強するとみなされる。もう一つの態様において、抗微生物剤の活性を増強する阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー改変バクテリオファージおよび/または感受性-改変バクテリオファージを選択するために使用される基準は、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー改変バクテリオファージおよび/または感受性-改変バクテリオファージを添加していない類似する量と比較して、抗微生物効果に有害な影響を及ぼさない、少なくとも約10％、…または少なくとも約15％、…または少なくとも約20％、…または少なくとも約25％、…または少なくとも約35％、…または少なくとも約50％、…または少なくとも約60％、…または少なくとも約90％、および10％と90％の間の任意の整数％の、抗微生物剤の量の低減である。別の言い方をすると、抗微生物剤と改変バクテリオファージの組合せが、抗微生物剤の用量（すなわち量）を減少させても、細菌感染を減少させまたは細菌を死滅させることにおいて、ほとんど同じレベル（すなわち約10％以内）の抗微生物効果をもたらすのであれば、その阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー改変バクテリオファージおよび/または感受性-改変バクテリオファージは、抗微生物剤に対する佐剤として有効である。抗微生物剤の用量のそのような低減は、例えば、同じレベルの抗微生物効力で、約10％、または約15％、…または約20％、…または約25％、…または約35％、…または約50％、…または約60％、…または60％以上の低減であることができる。
【００７５】
本発明者らは、本明細書において、改変バクテリオファージが、抗生物質によって直接的には攻撃されない遺伝子ネットワークを標的にすることができること、そしてそうすることにより、大腸菌などの細菌における抗生物質処理の効力を著しく強化したことを実証した。本発明者らは、リプレッサー-改変バクテリオファージによって細菌のSOS応答ネットワークを抑止または阻害することによって、抗生物質（例えば限定するわけではないがキノロン薬の一つオフロキサシンなどの抗微生物剤）による死滅が、対照バクテリオファージ（すなわち非改変バクテリオファージ）＋オフロキサシンと比較して2.7桁以上、オフロキサシン単独と比較して4.5桁以上、強化され得ることを、実証した。
【００７６】
また、本発明者らは、1つ以上の非SOS遺伝子ネットワークに対する少なくとも1つの阻害因子を含むリプレッサー-改変バクテリオファージも効果的な抗生物質佐剤であることを、本明細書の実施例6〜8において実証した。本発明者らは、リプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または阻害因子-改変バクテリオファージが、集団中の抗生物質抵抗性細菌の数を減少させ、他のさまざまな殺細菌性抗生物質（例えば限定するわけではないがゲンタマイシンおよびアンピシリンなど）にとって、強力な佐剤として作用できることも実証した。こうして本発明者らは、バクテリオファージを使って遺伝子ネットワークを選択的に標的とすることによって、抗生物質による死滅を強化することができることを実証し、よって極めて効果的な新しい抗微生物戦略を発見した。
【００７７】
定義
便宜上、本出願全体（明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲を含む）で使用する一定の用語を、ここにまとめておく。別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者が共通して理解している意味と同じ意味を持つ。
【００７８】
本明細書において、本明細書で使用する用語「佐剤」は、別の物質の薬学的効果を強化する物質を指す。本明細書において、本明細書に開示するバクテリオファージは、抗微生物剤を単独で使用した場合と比較して、抗微生物剤の効果を少なくとも…5％、….少なくとも10％、…少なくとも15％、…少なくとも20％、…少なくとも25％、…少なくとも35％、…少なくとも50％、…少なくとも60％、…少なくとも90％、および全ての中間量、強化することによって、抗微生物剤、例えば限定するわけではないが抗生剤などに対して、佐剤として機能する。したがって、本明細書に開示する改変バクテリオファージ、例えば阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー改変バクテリオファージは、抗微生物剤佐剤として機能する。
【００７９】
本明細書で使用する用語「阻害因子-改変バクテリオファージ」は、抗生物質抵抗性および/または細胞生残に関与する少なくとも1つの遺伝子を阻害する物質をコードする核酸を含むように遺伝子改変されているバクテリオファージを指す。本明細書に開示するそのような改変バクテリオファージは、少なくとも1つの阻害因子遺伝子、例えば限定するわけではないが抗生物質抵抗性遺伝子、例えば限定するわけではないがcat、vanAもしくはmecD、または細胞生残修復遺伝子、例えば限定するわけではないが、RecA、RecB、RecC、SpotまたはRelAなどをコードする核酸を含むので、これらは「阻害因子-改変バクテリオファージ」と名付けられる。当然ながら、本明細書に開示する方法および組成物で使用することができる同じ遺伝子または少なくとも2つの異なる遺伝子に対する1つより多い阻害因子、例えば2つ以上の阻害因子をコードする少なくとも1つの核酸を含むように、バクテリオファージを改変することができる。
【００８０】
本明細書で使用する用語「リプレッサー-改変バクテリオファージ」は、リプレッサータンパク質またはそのフラグメントをコードする少なくとも1つの核酸を含むように遺伝子改変されているバクテリオファージを指し、ここでリプレッサータンパク質は、SOS応答に関与する遺伝子の活性化を防止するように機能する。あるいは、リプレッサー-改変バクテリオファージという用語は、非SOS細菌防御を阻害する阻害因子（限定するわけではないがRNAi物質を含む）などのリプレッサータンパク質をコードする少なくとも一つの核酸を含むように遺伝子改変されているバクテリオファージを指す。本明細書に開示するそのような改変バクテリオファージは、リプレッサータンパク質をコードする核酸、例えばlexA、もしくはsoxR、またはその修飾型を含むので、これらを本明細書では「リプレッサー-改変バクテリオファージ」という。いくつかの態様では、SOS応答遺伝子が、例えば限定するわけではないが、marRAB、arcABおよびlexOである。同じSOS応答遺伝子または異なるSOS応答遺伝子に対する1つより多いリプレッサー、例えば少なくとも2つ、3つ、4つまたはそれ以上のリプレッサーをコードする少なくとも1つの核酸を任意の組合せで含むように、リプレッサー-改変バクテリオファージを改変することができ、それを、本明細書に開示する方法および組成物で使用することができる。同様に、1つより多いリプレッサー、例えば少なくとも2つ、3つ、4つまたはそれ以上のリプレッサー、例えば表2に列挙する非SOS細菌防御遺伝子のいくつかおよび任意の組合せを阻害する阻害因子などをコードする少なくとも1つの核酸を含むように、リプレッサー-改変バクテリオファージを改変することもでき、それを、本明細書に開示する方法および組成物で使用することができる。「リプレッサー-改変バクテリオファージ」という用語は、本明細書で定義する用語としての感受性-改変バクテリオファージも包含する。
【００８１】
本明細書で使用する用語「感受性-改変バクテリオファージ」は、抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも1つの物質をコードする少なくとも1つの核酸を含むように遺伝子改変されているバクテリオファージを指す。抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させる物質を、本明細書では「感受性物質」といい、これには、抗微生物剤に対する細菌の感受性を、抗微生物剤を単独で使用した場合と比較して、少なくとも約10％または少なくとも約15％、または少なくとも約20％または少なくとも約30％または少なくとも約50％または50％以上、または10％と50％以上の間の任意の整数％、増加させる、任意の物質（タンパク質またはRNAi物質など）が含まれる。ある態様において、感受性物質は、細菌細胞を特異的に標的とする物質である。もう一つの態様において、感受性物質は細菌細胞中で特異的に発現される経路を改変（すなわち阻害または活性化）する。ある態様において、感受性物質は、抗微生物剤の効力に対して相加効果を持つ物質である（すなわち、物質は、抗微生物剤による死滅効力または増殖の阻害に対して相加効果を持つ）。好ましい一態様において、感受性物質は、抗微生物剤の効力に対して相乗効果を持つ物質である（すなわち、物質は、抗微生物剤による死滅効力または増殖の阻害に対して相乗効果を持つ）。
【００８２】
本明細書で使用する用語「改変バクテリオファージ」は、本明細書において定義する表現としての阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージまたは感受性-改変バクテリオファージの任意の一つまたは組合せを指す。
【００８３】
感受性物質に関して使用する場合、または抗微生物剤の効力に対して相加効果を持つ感受性-バクテリオファージなどの改変バクテリオファージに関して使用する場合、「相加的」という用語は、抗微生物剤と本発明の感受性-改変バクテリオファージコンポーネントとの組合せによる、各コンポーネント単独の個別の効力を上回る、抗微生物効力（すなわち、死滅、または細菌集団の生存率の低減、もしくは細菌集団の増殖の阻害）の総合的増加を指す。相加効果による総合的抗微生物有効性の増加は、両コンポーネント（すなわち抗微生物剤および感受性-改変バクテリオファージ）の抗微生物効果が増加した結果であるか、あるいは、それらコンポーネントの一方だけ（すなわち抗微生物剤または感受性-改変バクテリオファージ）の活性が増加した結果であることができる。わかりやすいように、相加効果の限定でない具体例を挙げると、抗微生物剤が細菌集団を30％減少させるのに有効であり、感受性-改変バクテリオファージが細菌集団を20％減少させるのに有効であったとすると、その抗微生物剤と感受性-改変バクテリオファージの組合せの相加効果は、例えば35％になり得る。別の言い方をすると、この例では、30％より大きい（すなわち最も高い抗微生物効力（すなわちこの例では抗微生物剤が示す30％）より大きい）総合的効果はいずれも、相加効果を示すであろう。本発明のいくつかの態様では、抗微生物剤と感受性-改変バクテリオファージコンポーネントが、少なくとも多少の相加的抗病原体活性を示す。抗微生物剤と改変バクテリオファージとの組合せの相加効果は、抗微生物剤のみまたは改変バクテリオファージのみのどちらか一方によって達成される最も高い抗微生物効果と比較して、少なくとも約10％または少なくとも約20％または少なくとも約30％または少なくとも約40％または少なくとも約50％またはそれ以上の抗病原体（または抗微生物）効力の増加であることができる。
【００８４】
「相乗作用」または「相乗的」という用語は、本明細書においては可換的に使用され、感受性物質に関してまたは抗微生物剤の効力に対して相乗効果を持つ感受性-バクテリオファージなどの改変バクテリオファージに関して使用される場合は、抗微生物剤と本発明の感受性-改変バクテリオファージコンポーネントとの組合せによる、各コンポーネント単独の個別の効力および/または相加的効力を上回る、抗微生物効力（すなわち、死滅、または細菌集団の生存率の低減、もしくは細菌集団の増殖の阻害）の総合的増加を指す。相乗効果による総合的抗微生物有効性の増加は、両コンポーネント（すなわち抗微生物剤および感受性-改変バクテリオファージ）の抗微生物効果が増加した結果であるか、あるいは、それらコンポーネントの一方だけ（すなわち抗微生物剤または感受性-改変バクテリオファージ）の活性が増加した結果であることができる。わかりやすいように、相乗効果の限定でない具体例を挙げると、抗微生物剤が細菌集団を15％減少（すなわち死滅）させるのに有効であり、感受性-改変バクテリオファージが細菌集団を10％減少させるのに有効であったとすると、その抗微生物剤と感受性-改変バクテリオファージとの組合せの相乗効果は、例えば50％になり得る。別の言い方をすると、この例では、25％より大きい（すなわち抗細菌剤のみ（すなわち15％）と感受性物質のみ（すなわち10％）の和より大きい）総合的効果はいずれも、相乗効果を示すであろう。本発明のいくつかの態様では、抗微生物剤と感受性-改変バクテリオファージコンポーネントとが、少なくとも多少の相乗的抗病原体活性を示す。抗微生物剤と改変バクテリオファージとの組合せの相乗効果は、抗微生物剤のみまたは改変バクテリオファージのみを使用して達成される抗微生物効果の和と比較して、少なくとも約10％または少なくとも約20％または少なくとも約30％または少なくとも約40％または少なくとも約50％またはそれ以上の抗病原体（または抗微生物）効力の増加であることができる。
【００８５】
「二方向相乗作用（bidirectional synergy）」という用語は、互いに組み合わせて使用した場合の、単に一方の抗微生物コンポーネントの活性の増加だけではなく、各コンポーネント（すなわち抗微生物剤および改変バクテリオファージ）の活性の増加を指す。いくつかの態様において、抗微生物剤および改変バクテリオファージは、少なくとも相乗作用的抗微生物活性を示す。いくつかの態様において、抗微生物剤および改変バクテリオファージは、二方向相乗作用的抗微生物活性を示す。言い換えると、例えば二方向相乗作用とは、改変バクテリオファージが抗微生物剤の活性を強化すると共に、その逆もまた真であり、抗微生物剤を使って改変バクテリオファージの活性を強化することができることを意味する。
【００８６】
本明細書にいう「SOS応答」または「SOS応答遺伝子」との関連で使用される「SOS」という用語は、細菌がDNA損傷の突然の増加に耐えて生き残ることを可能にする誘導性DNA修復系を指す。SOS応答遺伝子は、正常増殖条件下では、さまざまな度合いに抑制される。理論に束縛されるものではないが、SOS応答は、DNA複製がDNA中の傷またはエラーをバイパスすることを可能にする複製後DNA修復系である。その一例が、SOSリプレッサーRecAタンパク質である。一本鎖DNAによって刺激されたRecAタンパク質は、LexAリプレッサーの不活化に関与し、それによって応答を誘導する。大腸菌において詳細に研究された細菌SOS応答は、細胞周期が停止しDNA修復および突然変異生成が誘発されるDNA損傷に対するグローバルな応答である。SOSは、プロトタイプ細胞周期チェックポイント制御およびDNA修復系である。SOS応答の中心部分は、LexAリプレッサーの直接的および間接的転写制御を受ける20を超える遺伝子の脱抑制である。LexAレギュロンには、組換えおよび修復遺伝子recA、recN、およびruvAB、ヌクレオチド除去修復遺伝子uvrABおよびuvrD、エラープローンDNAポリメラーゼ（pol）遺伝子dinB（pol IVをコードする）およびumuDC（pol Vをコードする）、ならびにDNAポリメラーゼII、そして、他の多数の遺伝子機能が含まれる。機能的SOS応答の非存在（すなわち本明細書に開示するリプレッサーの存在下）では、細胞はDNA損傷剤に対して感受性である。McKenzie et al., PNAS, 2000; 6646-6651;Michel, PLos Biology, 2005; 3; e255（これらは参照によりその全てが本明細書に組み入れられる）。「非SOS遺伝子」は「細菌防御遺伝子」を含み、この用語は、細菌または微生物を細胞死から、例えば抗微生物剤による死滅または増殖の抑止から、保護する役割を果たす、細菌または微生物によって発現される遺伝子を指す。典型的には、そのような非SOS防御遺伝子の阻害またはノックアウトは、抗微生物剤に対する細菌などの微生物の感受性を増加させる。「非SOS遺伝子」または「細菌防御遺伝子」は、SOS応答ネットワークの一部ではないが、それでもなお、微生物の細胞死を防止する防御機能として役割をはたす。一定の条件において、いくつかの非SOS遺伝子および/または細菌防御遺伝子は、DNA損傷時またはストレスの多い条件下で、発現（すなわちアップレギュレート）され得る。非SOS遺伝子の例は、soxRによって抑制されるsoxSであり、防御遺伝子の例は、表2に列挙する任意の遺伝子である。
【００８７】
本明細書で使用する「リプレッサー」とは、遺伝子のオペレーターに結合して、その遺伝子の転写を防止するタンパク質を指す。したがってリプレッサーは遺伝子の転写を効果的に「抑止」または阻害することができる。オペレーターに対するリプレッサーの結合アフィニティーは、リプレッサーに結合してオペレーターへのそれらの結合を減少させる他の分子、例えば誘導因子などによる影響を受け得る。一方、コリプレッサーは結合を増加させる。リプレッサータンパク質の範例は、ラクトースなどのβ-ガラクトシドを誘導因子とするlacオペロンに作用するラクトースリプレッサータンパク質であり、これは、四量体として活性な360アミノ酸のポリペプチドである。他の例には、溶菌サイクルに必要な遺伝子の転写を防止して溶原性をもたらすラムダバクテリオファージのラムダリプレッサータンパク質や、ラムダリプレッサータンパク質の転写を抑制する、同じくラムダの、croタンパク質がある。これらはどちらも、二量体として活性であり、隣接する主溝にヘリックスをはめ込んでDNAに結合すると考えられる共通の構造的特徴、ヘリックスターンヘリックスモチーフを持つ。本発明において有用なリプレッサーには、lexA、marR、arc、soxR、fur、crp、icdA、もしくはcraA、またはその修飾型が含まれるが、これらに限るわけではない。
【００８８】
本明細書で使用する用語「抗微生物剤」は、抗微生物活性、すなわち、例えばグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌などの細菌の増殖を阻害しかつ/または細菌を殺す能力を持つ、任意の実体を指す。抗微生物剤は、その抗微生物剤が存在しない場合と比較して、少なくとも約30％または少なくとも約40％、または少なくとも約50％または少なくとも約60％または少なくとも約70％または70％以上、または30％と70％以上の間の任意の整数％、細菌の増殖を阻害するか、細菌の生存率を減少させる、任意の薬剤である。別の言い方をすると、抗微生物剤は、その抗微生物剤が存在しない場合と比較して、細菌などの抗微生物細胞の集団を、少なくとも約30％または少なくとも約40％、または少なくとも約50％または少なくとも約60％または少なくとも約70％または70％以上、または30％と70％の間の任意の整数％、減少させる任意の薬剤である。ある態様において、抗微生物剤は、細菌細胞を特異的に標的とする薬剤である。もう一つの態様において、抗微生物剤は、細菌細胞中で特異的に発現される経路を改変（すなわち阻害または活性化または増加）する。いくつかの態様において、抗微生物剤には、次の薬剤は含まれない:化学療法剤、細菌または他の微生物によって発現される毒素タンパク質（すなわち細菌毒素タンパク質）など。抗微生物剤には、任意の化学物質、ペプチド（すなわち抗微生物ペプチド）、ペプチドミメティック、全体もしくは部分、またはそのハイブリッドの類似体、例えば限定するわけではないが合成および天然の非タンパク質実体などを含めることができる。いくつかの態様では、抗微生物剤が化学成分を持つ小分子である。例えば化学成分には、無置換または置換アルキル、マクロライドを含む芳香族またはヘテロシクリル成分、レプトマイシン類および関連天然物またはその類似体が含まれる。抗微生物剤は、所望の活性および/または性質を持つことが知られている任意の実体であるか、多様な化合物のライブラリーから選択することができる。
【００８９】
本明細書および本出願全体を通して使用する用語「物質」は、任意の手段、例えば有機分子または無機分子、例えば修飾核酸および無修飾核酸、例えばアンチセンス核酸、RNAi、例えばsiRNAまたはshRNA、ペプチド、ペプチドミメティック、受容体、リガンド、および抗体、アプタマー、ポリペプチド、核酸類似体、またはその変種を指すものとする。
【００９０】
本明細書で使用する用語「抗微生物ペプチド」は、抗微生物活性、すなわち、例えばグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌などの細菌の増殖を阻害しかつ/または細菌を殺す能力を持つ、任意のペプチドを指す。抗微生物ペプチドという用語は、抗微生物活性を持つ全てのペプチドを包含し、典型的には、例えば限定するわけではないが短いタンパク質、一般的には12〜50アミノ酸長であるが、それより大きいタンパク質、例えばリゾチームなども、本発明における抗微生物ペプチドとして包含される。抗微生物ペプチドという用語には、抗微生物ペプチドミメティック、およびその類似体またはフラグメントも含まれる。「抗微生物ペプチド」という用語には、あらゆる環状および非環状抗微生物ペプチド、またはその誘導体もしくは変種（互変異性体を含む）も含まれる。例えばLi et al. JACS, 2006, 128: 5776-85およびワールドワイドウェブの//aps.unmc.eduの/AP/main.phpを参照されたい（これらは参照によりその全て本明細書に組み入れられる）。いくつかの態様では、抗微生物ペプチドがリポペプチドであり、いくつかの態様では、リポペプチドが環状リポペプチドである。リポペプチドには、例えば限定するわけではないが、ポリミキシンクラスの抗微生物ペプチドが含まれる。
【００９１】
「微生物」という用語には、藻類、細菌、真菌、酵母および原虫類などのカテゴリー内の任意の顕微鏡的生物または分類学的に関係がある巨視的生物が含まれる。これには、感受性微生物および抵抗性微生物、ならびに組換え微生物が含まれる。そのような微生物がもたらす感染の例を本明細書に記載する。本発明の一局面では、微生物の増殖を防止しかつ/または阻害するために、かつ/または微生物（例えば多剤抵抗性微生物およびグラム陰性微生物）によって引き起こされる感染の処置および/または予防にそれらを使用するために、抗微生物剤とその強化因子とを使って微生物を標的にする。いくつかの態様では、グラム陰性微生物も標的になる。
【００９２】
本発明の抗病原体局面は、本明細書に定義する「微生物」の幅広いクラスを標的とする。しかし、多剤抵抗性微生物は処置することが非常に困難なことを考えると、本発明の抗病原体局面に関連して、抗微生物剤と阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージは、例えば多剤抵抗性微生物を含む全ての微生物、例えば細菌および多剤抵抗性細菌を処置するのに適している。
【００９３】
別段の明記がない限り、本明細書に関連して、「微生物」という用語の単独での使用は、「多剤抵抗性生物」に限定されず、薬物感受性微生物と薬物抵抗性微生物の両方を包含する。「多剤抵抗性微生物」という用語は、最低でも2つより多い抗微生物剤（例えば異なる抗生物質クラスの抗生物質）に対して抵抗性である生物を指す。これには、単一の抗生物質クラスに属する3つ以上の抗生物質に抵抗性であるものより多くの抵抗性を持つ微生物が含まれる。これには、より広範囲にわたる抗生物質に対して抵抗性である微生物、すなわち1つ以上の抗生物質クラスに対して抵抗性である微生物も含まれる。
【００９４】
「持続生残型細胞（persistent cell）」または「持続生残型微生物」という用語は、本明細書においては可換的に使用され、抗生物質などの抗微生物剤に対して感受性でない、微生物（典型的には細菌）の代謝的に不活発な部分集団を指す。持続生残型微生物は、抗生物質が作用する経路を非致死的にダウンレギュレートさせているので、典型的には応答性でない（すなわち抗生物質によって殺されない）。すなわち、持続生残型微生物細胞は、通常であれば抗微生物剤によって阻害または損壊される経路、例えば転写、翻訳、DNA複製および細胞壁生合成経路などをダウンレギュレートさせている。持続生残型微生物は非致死的な（または致死濃度未満の）抗微生物剤濃度で、発生することができる。
【００９５】
本明細書で使用する用語「アナログ」は、本明細書におけるポリペプチドまたは核酸と同じ構造または機能（例えば受容体への結合）を保っている組成物を指す。類似体の例には、ペプチドミメティック、ペプチド核酸、小および大有機または無機化合物、ならびに本発明におけるポリペプチドまたは核酸の誘導体および変種が含まれる。本明細書で使用する用語「アナログ」は、本明細書におけるポリペプチドまたは核酸と同じ構造または機能（例えば受容体への結合）を保っている組成物を指す。
【００９６】
「感染」または「微生物感染」という用語は、本明細書において可換的に使用され、その最も広い意味において、微生物が引き起こす任意の感染を指し、細菌感染、真菌感染、酵母感染および原虫感染を包含する。
【００９７】
「処置および/予防」という用語は、一般に、対象、組織または細胞に作用して所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを指し、本発明の方法の場合、これには微生物感染の減少もしくは排除または微生物感染の防止が含まれる。本明細書に開示する方法は、例えば個体が特定の細菌株またはそのような株の組合せによる感染または再感染に対して感受性であるような場合に、予防的に使用することができる。例えば、微生物感染、例えば細菌感染、例えばバイオフィルムは、十分な湿気と栄養が存在する任意の表面に発生し得る。そのような表面の一つは、植え込まれた医療器具、例えばカテーテル、心臓弁および人工関節などの表面である。特にカテーテルは、多くのバイオフィルム形成生物、例えば表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、大便レンサ球菌およびカンジダ・アルビカンスなどによる感染に関連し、それらはしばしば全身性血流感染をもたらす。細菌に感染したカテーテル、例えば細菌感染した中心静脈カテーテル（CVC）などを持つと同定された対象では、感染したカテーテルを除去し、細菌感染を排除するために、改変バクテリオファージと抗微生物剤とを含む本明細書に開示する方法および組成物で処置することができる。さらにまた、感染したカテーテルを除去し、新しいカテーテルで置き換えたら、その対象には、再感染または細菌感染の再発を防止するために、本明細書に開示する改変バクテリオファージと抗微生物剤とを含む組成物を、予防的に投与することもできる。あるいは、対象には、カテーテルの初回設置時に、細菌バイオフィルム感染などのあらゆる抗微生物感染を防止するために、改変バクテリオファージと抗微生物剤とを含む本明細書に開示する組成物を、予防的に投与することもできる。効果は、疾患またはその徴候もしくは症状を完全にまたは部分的に防止するという点で予防的であることができ、かつ/または疾患の部分的なまたは完全な治癒という点で治療的であることができる。
【００９８】
本明細書で使用する用語「有効量」とは、抗微生物剤単独（すなわち本明細書に開示する改変バクテリオファージなし）での活性と比較して、細菌数の所望の減少または増加を達成して、抗微生物剤の効力を増加させるのに有効な、抗微生物剤および/または阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージの量を意味する。本明細書で使用する用語「有効量」は、表示した効果、すなわち生存可能な微生物数（例えば細菌）の少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、…少なくとも35％、…少なくとも50％、…少なくとも60％、…少なくとも90％の減少、またはその間にある生存可能な微生物数の任意の減少、を達成するのに必要な組成物の量を指す。本明細書において、本明細書に開示するバクテリオファージの有効量は、抗微生物剤の効果を、抗微生物剤を単独で使用した場合と比較して、少なくとも…5％、少なくとも10％、…少なくとも15％、…少なくとも20％、…少なくとも25％、…少なくとも35％、…少なくとも50％、…少なくとも60％、…少なくとも90％、およびその間の全ての量、強化するのに十分であるような量であるか、あるいは単独で使用して同じ効力の抗微生物効果を達成する場合と比較して、少ない（すなわち、例えば約10％、または約15％、…または約20％、…または約25％、…または約35％、…または約50％、…または約60％、…または60％以上少ない）量または用量の抗微生物剤で、同じ効力の抗微生物効果をもたらすのに十分であるような量である。「有効量」または「有効用量」が、特に、処置される細菌の株、使用するバクテリオファージの株、使用するバクテリオファージの遺伝子修飾、抗微生物剤、ならびに処置されるその状態、対象の身体状態、処置される対象のタイプ、処置の継続期間、投与経路、抗微生物剤のタイプおよび/または抗微生物剤の強化因子、併用療法がある場合はその性質、ならびに使用する具体的製剤、抗微生物剤および/または強化因子抗微生物剤コンポーネントの互いに対する比、これらのコンポーネントまたはそれらの誘導体のそれぞれの構造などといった要因と共に変動することは、明らかである。抗微生物剤と本明細書に開示する改変バクテリオファージとを含む組成物の対象への投与に関連して使用する場合、「有効量」という用語は、疾患または障害（例えば細菌感染などの微生物感染の症状または障害）の少なくとも1つの症状を軽減または停止させる組成物の量を指す。例えば、本明細書に開示する方法を使用する場合、有効量は、細菌感染の疾患または障害の症状を少なくとも10％軽減するのに十分な量とみなされるだろう。本明細書にいう有効量には、疾患の症状の発生を防止するまたは遅延させるか、疾患の症状の経過を変化させる（例えば限定するわけではないが、疾患の症状の進行を遅らせる）か、疾患の症状を後退させるのに十分な量も含まれるだろう。
【００９９】
本明細書にいう「薬学的担体」とは、抗微生物剤および/または阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージの組合せを、細菌が感染した表面または対象に送達するための、薬学的に許容される溶媒、懸濁化剤またはビヒクルである。担体は液状または固形であることができ、計画された投与法を念頭において、選択される。各担体は、組成物中の他の成分と適合し、対象にとって有害でないという意味で、薬学的に「許容される」ものでなければならない。
【０１００】
RNAi分子（例えばsiRNAまたはmiRNA）の活性に関連して本明細書にいう「遺伝子サイレンシング」または「サイレンシングされた遺伝子」とは、miRNAまたはRNA干渉分子が存在しない場合に細胞中に見いだされるmRNAレベルの少なくとも約5％、約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、約100％の、ターゲット遺伝子に関する細胞中のmRNAレベルの減少を指す。ある好ましい態様では、mRNAレベルが、少なくとも約70％、約80％、約90％、約95％、約99％、約100％減少する。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「RNAi」は、任意のタイプの干渉RNAを指し、限定するわけではないが、siRNAi、shRNAi、内在性マイクロRNAおよび人工マイクロRNAを含む。例えばこれには、RNAの下流プロセシングの機序とは無関係に、siRNAであると先に同定された配列が含まれる（すなわち、siRNAは、mRNAの切断をもたらす特殊なインビボプロセシングの方法を持つと考えられるが、そのような配列は本明細書に記載する隣接配列に関連してベクター中に組み込むことができる）。
【０１０２】
本明細書にいう「siRNA」は、二本鎖RNAを形成する核酸であって、その二本鎖RNAが、そのsiRNAがターゲット遺伝子、例えばLp-PLA2と同じ細胞中に存在するか、同じ細胞中で発現される場合に、遺伝子またはターゲット遺伝子の発現を減少させまたは阻害する能力を持つものを指す。二本鎖RNAであるsiRNAは、相補的な鎖によって形成され得る。ある態様において、siRNAは、二本鎖siRNAを形成することができる核酸を指す。siRNAの配列は、完全長ターゲット遺伝子、またはその部分配列に対応することができる。典型的には、siRNAは、少なくとも約15〜50ヌクレオチド長である（例えば二本鎖siRNAの各相補的配列は約15〜50ヌクレオチド長であり、二本鎖siRNAは約15〜50塩基対長、好ましくは約19〜30塩基ヌクレオチド、好ましくは約20〜25ヌクレオチド長、例えば20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30ヌクレオチド長である）。
【０１０３】
本明細書にいう「shRNA」または「低分子ヘアピンRNA」（ステムループともいう）はsiRNAの1タイプである。ある態様では、これらのshRNAが、短い（例えば約19〜約25ヌクレオチド）のアンチセンス鎖と、それに続く約5〜約9ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖で構成される。あるいは、センス鎖がヌクレオチドループ構造の前にあって、アンチセンス鎖が後に続いてもよい。
【０１０４】
「マイクロRNA」または「miRNA」という用語は本明細書では可換的に使用され、内在性RNAであって、その一部は、タンパク質をコードする遺伝子の発現を転写後レベルで調節することが知られている。内在性マイクロRNAはゲノム中に自然に存在する小さなRNAであり、mRNAの生産的利用を調整する能力を持つ。人工マイクロRNAという用語には、mRNAの生産的利用を調整する能力を持つ、内在性マイクロRNA以外のあらゆるタイプのRNA配列が含まれる。マイクロRNA配列は、Lim, et al., Genes & Development, 17, p. 991-1008 (2003)、Lim et al., Science 299, 1540 (2003)、Lee and Ambros Science, 294, 862 (2001)、Lau et al., Science 294, 858-861 (2001), Lagos-Quintana et al., Current Biology, 12, 735-739 (2002)、Lagos Quintana et al., Science 294, 853-857 (2001)、およびLagos-Quintana et al., RNA, 9, 175-179 (2003)などの刊行物に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。複数のマイクロRNAを前駆体分子に組み入れることもできる。さらにまた、miRNA経路および/またはRNAi経路によって内在性遺伝子の発現を調整する目的で人工miRNAおよび短鎖干渉RNA（siRNA）を送達するための運搬体として、miRNA様のステム-ループを細胞内で発現させることもできる。
【０１０５】
本明細書にいう「二本鎖RNA」または「dsRNA」とは、2つの鎖を含んでなるRNA分子を指す。二本鎖分子には、二つ折りになって二本鎖構造を形成する単一のRNA分子を含んでなるものが含まれる。例えば、プレ-miRNA（Bartel et al. 2004. Cell 116:281-297）と呼ばれる、そこから一本鎖miRNAが誘導される前駆体分子のステムループ構造は、dsRNA分子を含む。
【０１０６】
「患者」「対象」および「個体」という用語は、本明細書では可換的に使用され、予防的処置を含む処置が与えられる動物、特にヒトを指す。本明細書で使用する用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を指す。用語「非ヒト動物」と「非ヒト哺乳動物」は本明細書では可換的に使用され、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物、例えば非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、齧歯類（例えばマウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシ、および非哺乳動物、例えばニワトリ、両生類、爬虫類などを包含する。ある態様では、対象がヒトである。もう一つの態様では、対象が、実験動物または疾患モデルとしての代用動物である。適切な哺乳動物には、霊長目、齧歯目、ウサギ目、クジラ目、ヒト（Homo sapiens）、食肉目、奇蹄目および偶蹄目のメンバーも含まれる。奇蹄目および偶蹄目のメンバーは、それらの類似するバイオロジーおよび経済的重要性ゆえに本発明に包含される。例えば、限定するわけではないが、経済的に重要であり商業的に重要である動物、例えばヤギ、ヒツジ、ウシおよびブタなどの多くは、極めて類似するバイオロジーを持ち、高度なゲノム相同性を共有している。
【０１０７】
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、転写および/または翻訳調節配列および/またはコード領域および/または非翻訳配列（例えばイントロン、5'および3'非翻訳配列ならびに調節配列）を含むゲノム遺伝子であることができる。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列をコードするか、機能的RNA、例えばtRNA、rRNA、触媒RNA、siRNA、miRNAおよびアンチセンスRNAをコードするヌクレオチド配列であることができる。遺伝子は、5'または3'非翻訳配列が連結されていてもよいコード領域（例えばエキソンおよびmiRNA）に対応するmRNAまたはcDNAであることもできる。遺伝子は、コード領域の全部または一部および/またはそこに連結された5'または3'非翻訳配列を含む、インビトロで生産された増幅核酸分子であることもできる。
【０１０８】
本明細書で使用する用語「遺伝子産物」は、遺伝子から転写されるRNA、または遺伝子がコードするもしくはRNAから翻訳されるポリペプチドを指す。
【０１０９】
本明細書で使用する用語「阻害する」または「減少した」または「低減する」または「減少させる」は、一般に、タンパク質（すなわち抗生物質抵抗性タンパク質）の遺伝子または生物学的機能を、阻害因子の非存在下と比較して、統計的に有意な量、阻害しまたは減少させることを意味する。本明細書に開示する抗微生物剤または組成物の活性に関して「阻害」または「阻害する」または「低減する」という用語は、細菌の増殖の防止または増殖速度の低減を指す。抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残を阻害する物質に言及する文脈において使用される場合、阻害および/または阻害するとは、不活化された時に抗微生物剤の活性を増強する遺伝子または遺伝子産物の活性の防止または低減を指す。しかし、念のために述べると、「阻害する」とは、タンパク質の生物学的機能の活性の、阻害因子の非存在下と比較して、少なくとも約10％という統計的に有意な減少、例えば阻害因子の非存在下と比較して、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％もしくはそれ以上、100％阻害まで（すなわち、阻害因子の存在下での抗生物質抵抗性遺伝子タンパク質の完全な欠如）（100％阻害を含む）の減少、または10〜100％の間のタンパク質（すなわち抗生物質抵抗性遺伝子タンパク質）の生物学的活性の任意の減少を意味する。
【０１１０】
本明細書において、タンパク質の生物学的活性に関して使用される用語「活性化する」または「増加した」または「増加させる」（すなわちSOS応答遺伝子の活性化）は、一般に、タンパク質（すなわちSOS応答タンパク質）の生物学的機能の、対照条件と比較して統計的に有意な量での増加を意味する。念のために述べると、活性の「増加」またはタンパク質の「活性化」とは、アゴニストまたは活性化因子剤の非存在下と比較して少なくとも約10％の統計的に有意な増加、例えば対照条件下と比較して、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％またはそれ以上、例えば少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍またはそれ以上の増加を意味する。
【０１１１】
本明細書において使用される用語「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、互いに共有結合された少なくとも2つのヌクレオチドを意味することができる。当業者には理解されるように、一本の鎖を描写すれば相補鎖の配列も定義される。したがって核酸は、描写された一本の鎖の相補鎖も包含する。当業者には同様に理解されるように、ある核酸の数多くの変種を、与えられた核酸と同じ目的に使用することができる。したがって核酸は実質的に同一な核酸およびその相補体も包含する。当業者には同様に理解されるように、一本の鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でターゲット配列にハイブリダイズすることができるプローブを与える。したがって核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【０１１２】
核酸は一本鎖または二本鎖であるか、二本鎖配列部分と一本鎖配列部分の両方を含有することができる。核酸は、DNA（ゲノムDNAとcDNAの両方）、RNA、またはハイブリッドであることができ、ここでは核酸が、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシンおよびイソグアニンを含む塩基の組合せを含有することができる。核酸は、化学合成法によって、または組換え法によって、得ることができる。
【０１１３】
核酸は、一般的には、リン酸ジエステル結合を含有するが、少なくとも1つの異なる結合、例えばホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、またはO-メチルホスホロアミダイト結合ならびにペプチド核酸バックボーンおよび結合などを持つことができる核酸アナログも包含され得る。他のアナログ核酸には、陽性バックボーンを持つもの、非イオン性バックボーンを持つもの、および非リボースバックボーンを持つもの、例えば参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,235,033号および同第5,034,506号に記載されているものが含まれる。1つ以上の非天然ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを含有する核酸も核酸の定義の一つに包含される。修飾ヌクレオチドアナログは、例えば核酸分子の5'端および/または3'端に位置することができる。ヌクレオチドアナログの代表的な例は、糖修飾リボヌクレオチドまたはバックボーン修飾リボヌクレオチドから選択することができる。しかし、核酸塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち天然核酸塩基の代わりに非天然核酸塩基を含有するリボヌクレオチド、例えば5位が修飾されたウリジンまたはシチジン、例えば5-（2-アミノ）プロピルウリジン、5-ブロモウリジン;8位が修飾されたアデノシン、例えば8-ブロモグアノシン;デアザヌクレオチド、例えば7デアザアデノシン;O-およびN-アルキル化ヌクレオチド、例えばN6-メチルアデノシンなども適切であることに留意すべきである。2'OH基は、H、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2またはCN（ここで、RはC-C6アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはF、Cl、BrまたはIである）から選択される基で置き換えることができる。リボース-リン酸バックボーンの修飾はさまざまな理由で、例えば、生理的環境における、またはバイオチップ上のプローブとしての、そのような分子の安定性および半減期を増加させるためなどの理由で、行うことができる。天然の核酸とアナログの混合物を作ることができる。あるいは、異なる核酸アナログの混合物、および天然の核酸とアナログの混合物を作ることができる。
【０１１４】
本明細書で使用する用語「投与する」および「導入する」は可換的に使用され、本明細書に開示するバクテリオファージおよび/または抗微生物剤を、細菌がコロニーを形成している表面上に、または対象（例えば細菌感染または他の微生物感染を持つ対象）中に、所望する部位における改変バクテリオファージおよび/または抗微生物剤の少なくとも部分的な局在化をもたらす任意の方法または経路によって配置することを指す。本明細書に開示する組成物は、細菌の効果的な死滅、排除、または細菌の増殖の管理をもたらす任意の適当な経路によって投与することができる。
【０１１５】
「ベクター」という用語は「プラスミド」と可換的に使用されて、そこに連結されたもう一つの核酸を輸送する能力を持つ核酸分子を指す。ベクターはプラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であることができる。ベクターはDNAベクターまたはRNAベクターであることができる。ベクターは、自己複製性染色体外ベクターであるか、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターであることができる。ベクターに機能的に連結された遺伝子および/または核酸配列の発現を指示する能力を持つベクターを、本明細書では「発現ベクター」という。一般に、組換えDNA技法で役に立つ発現ベクターは、多くの場合、「プラスミド」（これは、ベクターの形態では染色体に結合しない、環状二本鎖DNAループを指す）の形態をとる。本発明の異なる態様では、他の発現ベクター、例えば限定するわけではないが、プラスミド、エピソーム、バクテリオファージまたはウイルスベクターなどを使用することができ、それらのベクターは宿主のゲノム中に組み込まれ得るか、または特定細胞中で自律的に複製することができる。等価な機能を果たす当業者に公知の他の形態の発現ベクターも使用することができる。発現ベクターは、DNAをコードする安定発現または一過性発現用の発現ベクターを含む。
【０１１６】
本明細書で使用する用語「アナログ」は、本明細書に記載のポリペプチドまたは核酸と同じ構造または機能（例えば受容体への結合）を保持している組成物を指す。アナログの例には、ペプチドミメティック、ペプチド核酸、小さいおよび大きい有機または無機化合物、ならびに本明細書に記載するポリペプチドまたは核酸の誘導体および変種が含まれる。本明細書で使用する用語「アナログ」は、本明細書に記載のポリペプチドまたは核酸と同じ構造または機能（例えば受容体への結合）を保持している組成物を指す。
【０１１７】
本明細書で使用する用語「誘導体」または「変種」は、天然のポリペプチドまたは核酸と1つ以上のアミノ酸または核酸の欠失、付加、置換または側鎖修飾によって異なる、ペプチド、化学物質または核酸を指す。アミノ酸置換には、アミノ酸が異なる天然または非通常型アミノ酸残基で置き換えられる改変が含まれる。そのような置換は「保存的」と分類されるものであることができ、その場合は、ポリペプチドに含まれるアミノ酸残基が、極性、側鎖官能性またはサイズのいずれかに関して類似する特性を持つ別の天然アミノ酸で置き換えられる。
【０１１８】
本発明に包含される置換は、「非保存的」であることもでき、その場合は、ペプチド中に存在するアミノ酸残基が、異なる性質を持つアミノ酸、例えば異なるグループから選ばれたアミノ酸で置換（例えば荷電アミノ酸または疎水性アミノ酸がアラニンで置換）されるか、天然アミノ酸が非通常型アミノ酸で置換される。いくつかの態様ではアミノ酸置換が保存的である。
【０１１９】
冠詞「a」および「an」は、本明細書においては、その冠詞の1つのまたは1つより多い（すなわち少なくとも1つの）文法上の目的語を指すために使用される。例えば「要素（an element）」とは、1つの要素または1つより多い要素を意味する。したがって本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「a」「an」および「the」には、文脈上そうでないことが明白でない限り、複数の指示語が含まれる。したがって例えば「物質（an agent）」を含む薬学的組成物への言及には、2つ以上の物質への言及が含まれる。
【０１２０】
本明細書で使用する用語「を含む（comprising）」は、明示した要素が存在することに加えて、他の要素も存在できることを意味する。「を含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。用語「からなる（consisting of）」は、その態様の説明において列挙されなかった要素はいずれも除外される、本明細書に記載の組成物、方法、およびその各々のコンポーネントを指す。本明細書で使用する用語「から本質的になる(consisting essentially of)」は、所与の態様に必要な要素を指す。この用語は、本発明のその態様の基本的で新規なまたは機能的な特徴に著しい影響を及ぼさない要素の存在を許す。
【０１２１】
作用例または別段の表示がある場合を除き、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表す数字は全て、いずれの場合も、「約」という用語で修飾されていると理解すべきである。パーセンテージと共に使用される場合、「約」という用語は、±1％を意味し得る。
【０１２２】
以下に実施例を上げて本発明をさらに例示するが、それら実施例を限定とみなしてはならない。本出願の全体を通して、引用する全ての参考文献の内容ならびに図面および表は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２３】
本発明は本明細書に記載する特定の方法、プロトコールおよび試薬類などに限定されず、したがって多様であり得ると理解すべきである。本明細書において使用する専門用語は、特定の態様を説明するために過ぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定しようとするものではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【０１２４】
阻害因子-改変バクテリオファージ
本発明の一局面は、少なくとも1つの抗生物質抵抗性遺伝子または少なくとも1つの細胞生残遺伝子を阻害し、それによって、そのような遺伝子を遺伝子サイレンシングし、抗微生物剤の存在下での抗生物質抵抗性の発生および/または細菌の増加した細胞生存率を防止する物質をコードする核酸を含む、改変バクテリオファージに関する。本明細書において議論するように、抗生物質抵抗性に関与する少なくとも1つの遺伝子および/または本明細書に開示する少なくとも1つの細胞生残遺伝子を阻害する物質をコードする核酸を含むそのような改変バクテリオファージを、本明細書では、「阻害因子-改変バクテリオファージ」という。
【０１２５】
いくつかの態様において、阻害因子-改変バクテリオファージは、任意のタイプの阻害因子、例えば核酸阻害因子などをコードする核酸を含むことができる。核酸阻害因子には、例えば限定するわけではないが、アンチセンス核酸阻害因子、オリゴヌクレオシド、RNA干渉（RNAi）および対合末端型（PT）アンチセンスならびにその変種が含まれる。
【０１２６】
本発明のこの局面のいくつかの態様において、阻害因子-改変バクテリオファージは、当業者に一般に知られている任意の細菌抗生物質抵抗性遺伝子、例えば限定するわけではないが、cat（配列番号:1）、vanA（配列番号:2）またはmecD（配列番号:3）などの、遺伝子発現および/またはタンパク質機能を阻害する物質をコードすることができる。代替的態様では、物質が、当業者に一般に知られている任意の細菌細胞生残修復遺伝子、例えば限定するわけではないが、RecA、RecB、RecC、SpotまたはRelAなどの、遺伝子発現および/またはタンパク質機能を阻害することができる。
【０１２７】
参考までに、RecA（リコンビナーゼA）は、アクセッション番号P03017および遺伝子ID Seq ID GI:132224によって同定することができる。表1に、本発明の方法で阻害することができる抗生物質抵抗性遺伝子および細胞生残遺伝子の例、ならびにリプレッサー-改変バクテリオファージに使用することができるリプレッサーの例について、アクセッション番号および遺伝子ID番号を記載する。
【０１２８】
（表1）遺伝子ID番号および配列番号
2011518543.tif 000003
2011518543.tif 000004
【０１２９】
いくつかの態様では、細菌を種特異的に殺すバクテリオファージが、少なくとも1つの抗生物質遺伝子および/または細胞生残遺伝子の少なくとも1つの阻害因子を発現するように改変される、またはSOS応答遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーを発現するように改変される、モジュラーデザイン戦略を使用することができる。例えば、いくつかの態様において、バクテリオファージは、少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つの抗生物質遺伝子および/または細胞生残遺伝子、例えば限定するわけではないが、cat（配列番号:1）、vanA（配列番号:2）、mecD（配列番号:3）、RecA（配列番号:4）、RecB（配列番号:5）、RecC（配列番号:6）、Spot（配列番号:7）またはRelA（配列番号:8）などを阻害するアンチセンス核酸阻害因子またはアンチセンスRNA（asRNA）などの核酸阻害因子を発現させることができる。
【０１３０】
本発明のいくつかの局面は、抗微生物剤に対する佐剤としての阻害因子-改変バクテリオファージの使用に向けられ、ここで、阻害因子-改変バクテリオファージは、細菌中の抗微生物剤抵抗性遺伝子または抗細菌剤抵抗性遺伝子に対する、少なくとも1つの阻害因子をコードする。抗生物質抵抗性遺伝子は、抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させるために使用されている。例えば米国特許出願US2002/0076722では、抗細菌剤に対する細菌の感受性を減少させる遺伝子座を同定することによって抗細菌剤に対する細菌の感受性を改善する方法が議論されており、そのような座として、OftX、WbbL、Slt、およびWzaを同定している。しかし、本出願とは対照的に、US2002/0076722は、抗細菌剤に対する細菌の感受性を増加させるためにそれらの座を阻害するための方法は教示していない。同様に、米国特許第7,125,622号は、細菌ゲノムフラグメントのプールを解析し、（コンピュータ援用インシリコ法を使って）数多くの公知の細菌抵抗性遺伝子にハイブリダイズするまたは高いホモロジーを持つフラグメントを選択することによって、細菌の抗生物質抵抗性遺伝子を同定するための方法を議論している。この第7,125,622号特許には、本明細書において議論する阻害因子-改変バクテリオファージ中の阻害因子のターゲットとして包含される細菌抵抗性遺伝子が、katG、rpoB、rpsL、ampC、ベータ-ラクタマーゼ類、アミノグリコシドキナーゼ類、mexA、mexB、oprM、ermA、carA、ImrA、ereA、vgbA、InvA、mphA、tetA、tetB、pp-cat、vanA、vanH、vanR、vanX、vanY、vanZ、folC、folE、folP、およびfolkを含めて、いくつか開示されている。しかし、本出願とは対照的に、第7,125,622号特許は、本発明の阻害因子-改変バクテリオファージを使って細菌抵抗性遺伝子を阻害するための方法も、抗微生物剤と組み合わされたそのような阻害因子-改変バクテリオファージによるそれらの阻害も教示していない。同様に、国際出願WO2008/110840では、抗生物質に対する細菌の感受性を増加させるための6つの異なるバクテリオファージ（NCIMB番号41174〜41179）の使用が議論されている。しかし、WO2008/110840は、細菌抵抗性遺伝子を阻害するために、またはSOS遺伝子を抑制するために、そのようなバクテリオファージを遺伝子修飾することは教示していない。バクテリオファージを改変してそれらの殺細菌有効性を増加させる報告はいくつかあるが、以前の研究は、例えばアルギン酸リアーゼなどのリアーゼ酵素を導入すること（国際出願WO04/062677で議論されている）;またはバクテリオファージを改変して、そのバクテリオファージを増殖させる細胞を阻害すること、例えばバクテリオファージ中にホリン遺伝子などのKIL遺伝子を導入すること（国際出願WO02/03489およびWO04/046319で議論されている）、またはpGefもしくはChpBKおよびトキシンAなどの細菌毒素遺伝子を導入すること（米国特許第6,759,229号およびWestwater et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2003., 47:1301-1307で議論されている）など、主として細菌バイオフィルムを分解するための方法を最適化することに集中していた。しかし本発明とは異なり、WO04/062677、WO02/034892、WO04/046319、第6,759,229号およびWestwater et al.で議論されている改変バクテリオファージは、細菌抵抗性遺伝子を阻害することまたはSOS遺伝子に対するリプレッサーを発現させることによって細菌の抗微生物剤抵抗性機序を標的とし無力化するようには改変されていない。
【０１３１】
当業者に公知の任意の抗微生物剤抵抗性遺伝子に対する阻害因子は、本明細書で開示する阻害因子-改変バクテリオファージにおける使用のために包含される。本明細書において議論する抗生物質抵抗性遺伝子に加えて、使用することができる他のそのような抗生物質抵抗性遺伝子には、例えば、参照によりその全てが本明細書に組み入れられる米国特許第7,125,622号に開示されているkatG、rpoB、rpsL、ampC、ベータ-ラクタマーゼ類、アミノグリコシドキナーゼ類、mexA、mexB、oprM、ermA、carA、ImrA、ereA、vgbA、InvA、mphA、tetA、tetB、vanH、vanR、vanX、vanY、vanZ、folC、folE、folP、およびfolkが含まれる。
【０１３２】
リプレッサー-改変バクテリオファージ
本発明のもう一つの局面において、改変バクテリオファージは、SOS応答遺伝子または非SOS防御遺伝子のリプレッサーまたはそのフラグメントをコードする核酸を含むことができ、上で議論したように、本明細書では、これを「リプレッサー-改変バクテリオファージ」という。
【０１３３】
この局面および本明細書に記載する全ての局面のいくつかの態様において、リプレッサー-改変バクテリオファージは、細菌SOS応答遺伝子のリプレッサータンパク質、もしくはそのフラグメント、または非SOS経路細菌防御遺伝子を阻害する物質（タンパク質など）をコードする核酸を含むことができる。
【０１３４】
理論に束縛されることは望まないが、細菌におけるSOS応答は、細菌がDNA損傷の突然の増加に耐えて生き残ることを可能にする誘導性DNA修復系である。例えば、細菌がストレスに曝露されると、細菌は、通常は抑制状態にある遺伝子から防御タンパク質を産生して、損傷したDNAの修復とDNA合成の再活性化を可能にすることができる。SOS応答は、細菌が、ストレスの多い条件において、突然変異を助長するタンパク質、例えばPol II(PolB)、Pol IV(dinB)およびPol V(umuDおよびumuC)などを誘導することにより、自分自身のゲノムの突然変異に能動的な役割を果たすというパラダイムに基づいている。これらのタンパク質、例えばPol II、Pol IVおよびPol Vなどの阻害、またはLexA切断の阻害によるそれらの脱抑制の防止は、抗生物質抵抗性細菌の発生を防止するための一戦略である。SOS応答は、一般に、DNA損傷もしくは問題のある複製の結果として蓄積するかバクテリオファージ感染時に蓄積する一本鎖DNAによってトリガーされる。状況によっては、抗生物質がSOS応答をトリガーする。というのも、いくつかの抗生物質、例えばフルロキノロン（fluroquinolone）類およびβ-ラクタム類は、抗生物質媒介性DNA損傷を誘発するからである。SOS応答は、参照によりその全てが本明細書に組み入れられるBenedicte Michel, PLos Biology, 2005;3;1174-1176、Janion et al., Acta Biochemica Polonica, 2001;48;599-610およびSmith et al., 2007, 9;549-555、ならびにCirz et al., PLoS Biology, 2005;6;1024-1033において、議論されている。
【０１３５】
いくつかの態様では、SOS応答遺伝子のリプレッサーが、例えば限定するわけではないが、lexA（配列番号:9）、またはその修飾型である。本発明のこの局面の別の態様では、SOS応答遺伝子が、例えば限定するわけではないが、marRAB（配列番号:18）、arcAB（配列番号:19）およびlexO（配列番号:20）である。
【０１３６】
この局面および本明細書に記載する他の全ての局面のいくつかの態様では、非SOS経路細菌防御遺伝子の阻害因子がsoxR（配列番号:12）、またはその修飾型である。この局面および本明細書に記載する他の全ての局面のいくつかの態様では、非SOS経路細菌防御遺伝子の阻害因子が、marR（配列番号:10）、arc（配列番号:11）、soxR（配列番号:12）、fur（配列番号:13）、crp（配列番号:14）、icdA（配列番号:15）、craA（配列番号:16）もしくはompA（配列番号:17）またはその修飾型の群から選択される。いくつかの態様では、リプレッサー-改変バクテリオファージによって発現される非SOSリプレッサーが、soxSを抑制し、酸化ストレスから保護する、soxR（配列番号:12）である。
【０１３７】
本発明のこの局面の別の態様において、リプレッサー-改変バクテリオファージは、少なくとも1つ、少なくとも2つ、もしくは少なくとも3つまたはそれ以上のSOS応答遺伝子のリプレッサーまたはそのフラグメント、例えば限定するわけではないが、lexA、marR、arc、soxR、fur、crp、icdA、craAまたはompAを発現させることができる。当業者に公知の他のリプレッサーも、リプレッサー-改変バクテリオファージにおける使用のために包含される。いくつかの態様では、リプレッサー-改変バクテリオファージが、SOS応答をトリガーする抗微生物剤またはDNA損傷をトリガーする抗微生物剤、例えばフルロキノロン（fluroquinolone）類、シプロフロキサシンおよびβ-ラクタム類などと組み合わせて使用される。
【０１３８】
本発明のこの局面の別の態様において、非SOS防御遺伝子を阻害するリプレッサー改変バクテリオファージの核酸がコードする物質は、表2に列挙する任意の遺伝子を阻害することができる。
【０１３９】
（表2）リプレッサー-改変バクテリオファージによって発現されるリプレッサーまたは阻害因子によって阻害することができる非SOS防御遺伝子の例
2011518543.tif 000005
【０１４０】
いくつかの態様では、非SOS防御遺伝子を阻害するリプレッサー-改変バクテリオファージを、選ばれた抗微生物剤と組み合わせて使用することができる。例えば、リプレッサー-改変バクテリオファージが表2Aに列挙する遺伝子を阻害する物質をコードする場合、そのようなリプレッサー-改変バクテリオファージは、シプロフロキサシン抗微生物剤またはその変種もしくは類似体と組み合わせて使用することができる。同様に、別の態様において、非SOS防御遺伝子を阻害するリプレッサー-改変バクテリオファージは、表2Bに列挙する遺伝子を阻害する物質をコードすることができ、バンコマイシン抗微生物剤またはその変種もしくは類似体と組み合わせて使用することができる。同様に、別の態様において、非SOS防御遺伝子を阻害するリプレッサー-改変バクテリオファージは、表2C、2D、2E、2Fおよび2Gに列挙する遺伝子を阻害する物質をコードすることができ、それぞれ、リファンピシン抗微生物剤、もしくはアンピシリン抗微生物剤もしくはスルフメタキサゾン（sulfmethaxazone）抗微生物剤もしくはゲンタマイシン抗微生物剤もしくはメトロニダゾール抗微生物剤、またはその変種もしくは類似体と組み合わせて使用することができる。いくつかの態様において、リプレッサー-改変バクテリオファージにおいて阻害または抑制することができる他の非SOS応答遺伝子には、例えば限定するわけではないが、参照によりその全てが本明細書に組み入れられるDwyer et al., Mol Systems Biology, 2007;3;1-15で議論されているように、DNA損傷によって誘導される遺伝子、例えばDinD、DinF、DinG、Dinl、DinP、OraA、PolB、RecA、RecN、RuvA、RuvB、SbmC、Ssb、SulA、UmuC、UmuD、UvrA、UvrB、およびUvrDなどが含まれる。もう一つの態様において、リプレッサー-改変バクテリオファージにおいて阻害または抑制することができる他の非SOS応答遺伝子には、例えば限定するわけではないが、参照によりその全てが本明細書に組み入れられるDwyer et al., Mol Systems Biology, 2007;3;1-15で議論されているように、酸化的損傷によって誘導される遺伝子、例えばMarA、MarB、MarR、SodAおよびSoxSが含まれる。
【０１４１】
感受性物質-改変バクテリオファージ
本発明のもう一つの局面は、抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させる物質（例えば限定するわけではないがタンパク質）をコードする核酸を含む改変バクテリオファージに関する。抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させる物質をコードする核酸を含むそのような本明細書に記載の改変バクテリオファージを、本明細書では、「感受性物質-改変バクテリオファージ」または「感受性-改変バクテリオファージ」という場合があるが、これらは、「リプレッサー-改変バクテリオファージ」の定義にも包含される。この局面および本明細書に記載する他の全ての局面のいくつかの態様では、そのような抗微生物剤に対する細菌の感受性を増加させる物質を「感受性物質」といい、これは、抗微生物剤を単独で使用した場合と比較して、抗微生物剤に対する細菌の感受性を、少なくとも約10％または少なくとも約15％、または少なくとも約20％または少なくとも約30％または少なくとも約50％または50％以上、または10％と50％以上の間の任意の整数％、増加させる任意の物質を指す。ある態様では、感受性物質が、細菌細胞を特異的に標的とする物質である。もう一つの態様では、感受性物質が、細菌細胞中で特異的に発現される経路を改変（すなわち阻害または活性化）する。ある態様では、感受性物質が、抗微生物剤の効力に対して相加効果を持つ物質である（すなわち物質は抗微生物剤による死滅効力または増殖の阻害に対して相加効果を持つ）。好ましい一態様では、感受性物質が、抗微生物剤の効力に対して相乗効果を持つ物質である（すなわち物質は抗微生物剤による死滅効力または増殖の阻害に対して相乗効果を持つ）。
【０１４２】
ある態様では、感受性物質が細菌細胞への抗微生物剤の侵入を増加させ、例えば感受性物質がポリンまたはポリン様タンパク質、例えば限定するわけではないが、タンパク質OmpF、およびベータバレルポリン類、または外膜ポリン（OMP）機能スーパーファミリーの他のメンバー、例えば限定するわけではないが、ワールドワイドウェブサイト「//biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE？object＝BC-4.1.B」に開示されているもの、または本明細書に開示する表3に列挙したOMPファミリーメンバー、またはその変種もしくはフラグメントである。
【０１４３】
（表3）感受性物質改変バクテリオファージによって感受性物質として発現させ得る外膜ポリン（OMP）スーパーファミリーのメンバーの例
2011518543.tif 000006
【０１４４】
もう一つの態様では、感受性物質が、細菌細胞中の鉄-硫黄クラスターを増加させかつ/または細菌における酸化ストレスまたはヒドロキシルラジカルを増加させる物質（例えば限定するわけではないがタンパク質）である。鉄-硫黄クラスターを増加させる感受性物質の例は、参照によりその全てが本明細書に組み入れられるKahanski et al., Cell, 2007, 130; 797-810に開示されている、フェントン反応によるヒドロキシルラジカルの形成を調整する（すなわち増加または減少させる）物質である。感受性-改変バクテリオファージによって発現される感受性物質の例には、例えば表4に列挙するもの、またはそのフラグメントもしくは変種、またはワールドワイドウェブサイト「biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE？type＝COMPOUND＆object＝CPD-7」に記載されているものが含まれる。細菌細胞中の鉄-硫黄クラスターを増加させる感受性物質の例には、例えば限定するわけではないが、IscA、IscR、IscSおよびIscUが含まれる。鉄の取り込みおよび利用を増加させ、感受性物質として使用することができる感受性物質の例には、例えば限定するわけではないが、参照によりその全てが本明細書に組み入れられるDwyer et al., Mol Systems Biology, 2007;3;1-15で議論されているように、EntC、ExbB、ExbD、Fecl、FecR、FepB、FepC、Fes、FhuA、FhuB、FhuC、FhuF、NrdH、Nrdl、SodAおよびTonBが含まれる。
【０１４５】
（表4）細菌における鉄クラスター形成を増加させるために感受性-改変バクテリオファージによって感受性物質として発現され得る遺伝子の例
2011518543.tif 000007
【０１４６】
いくつかの態様では、感受性物質が、ワールドワイドウェブサイト「biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE？type＝ENZYME＆object＝CPLX0-1041に記載されているCsrAなどの物質である。
【０１４７】
いくつかの態様では、感受性物質が化学療法剤ではない。もう一つの態様では、感受性物質が毒素タンパク質ではなく、もう一つの態様では、感受性物質が細菌毒素タンパク質または細菌毒素分子ではない。
【０１４８】
阻害因子-改変バクテリオファージ、リプレッサー-改変バクテリオファージおよび感受性物質改変バクテリオファージの改変
もう一つの態様では、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性-改変バクテリオファージを、ファージ抵抗性遺伝子、例えば当業者に公知の任意のファージ抵抗性遺伝子、例えば限定するわけではないが、AbiZ（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,169,911号に開示されているもの）、sie2009、sieIL409、sieF7/2A、orf2、orf258、orf2（M）、orfD、orf304、orfB、orf142、orf203、orf3Ψ、orf2Ψgp34、gp33、gp32、gp25、glo、orf1、SieA、SieB、imm、sim、rexB（McGrath et al., Mol Microbiol, 2002, 43;509-520）をコードする核酸を含むように、さらに改変することができる。
【０１４９】
もう一つの態様では、バイオフィルムマトリックスの破壊または分解を助ける酵素をコードする核酸、例えば当業者にバイオフィルム分解酵素として公知の任意のファージ抵抗性遺伝子、例えば限定するわけではないが、ディスパーシンDアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ-ガラクトシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ-グルコシダーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼまたはリアーゼなどを含むように、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性-改変バクテリオファージを、さらに改変することができる。別の態様では、酵素が、米国特許第11/662,551号および国際特許出願WO2006/137847および仮特許出願第61/014518号（これらは特に参照によりその全てが本明細書に組み入れられる）に開示されている方法で開示されているように、セルラーゼ、例えばセルラーゼのグリコシルヒドロキシラーゼファミリー、例えばセルラーゼAとも呼ばれるグリコシルヒドロキシラーゼ5ファミリーの酵素;ポリグルコサミン（PGA）デポリメラーゼ;コラン酸（colonic acid）デポリメラーゼ、例えば1,4-L-フコシド（fucodise）ヒドロラーゼ（例えばVerhoef R. et al.「Characterization of a 1,4-beta-fucoside hydrolase degrading colanic acid」Carbohydr Res. 2005 Aug 15;340(11）:1780-8）、解重合アルギナーゼ、およびDNase I、またはその組合せからなる群より選択される。
【０１５０】
もう一つの態様では、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性-改変バクテリオファージを、種特異的な方法で、さらに改変することができる。例えば、バクテリオファージを、特異的細菌に対するその感染性に基づいて改変または選択することができる。
【０１５１】
阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージまたは感受性-改変バクテリオファージに改変または発展させるべきバクテリオファージは、当業者に公知の任意のバクテリオファージであることができる。いくつかの態様では、阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージまたは感受性-改変バクテリオファージが、表5に列挙するバクテリオファージのいずれかまたは組合せから誘導される。
【０１５２】
いくつかの態様では、改変されて本明細書に開示する改変バクテリオファージになるバクテリオファージが、溶菌性バクテリオファージまたは溶原性バクテリオファージであるか、大腸菌、緑膿菌（P. aeriginosa）、黄色ブドウ球菌（S. aureaus）、大便レンサ球菌（E. facalis）などに感染する任意のバクテリオファージである。そのようなバクテリオファージは当業者には周知であり、表5に列挙されており、限定するわけではないが、ラムダファージ、M13、T7、T3、ならびにT偶数ファージおよびT偶数様ファージ、例えばT2およびT4、ならびにRB69などが含まれる。また、Pf1、Pf4、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）ファージB40-8および大腸菌ファージMS-2などのファージも使用することができる。例えばラムダファージは、細菌の外側に取り付き、そのDNAを細菌中に注入することによって、大腸菌を攻撃する。ひとたびその新しい宿主中に注入されると、バクテリオファージは大腸菌の遺伝機構を使ってその遺伝子を転写する。公知のファージはどれでも、抗生物質抵抗性遺伝子または細胞生残遺伝子を阻害する物質を発現するように、あるいはリプレッサー-改変バクテリオファージの場合は非SOS防御遺伝子のリプレッサー物質もしくは阻害因子を発現するように、または本明細書に記載する感受性-改変バクテリオファージの場合は感受性物質を発現するように、改変することができる。
【０１５３】
いくつかの態様では、より効率のよいクローニングベクターになるように改変されたバクテリオファージ、または全ての細菌、例えば雄性および雌性細菌に感染するのに重要な遺伝子を天然に欠いているバクテリオファージを使って、本明細書に開示する改変バクテリオファージを作製することができる。通例、バクテリオファージは、全ての細菌変種および細菌種に感染するための遺伝子を欠くように改変されており、天然の細菌における複製能力が低下しているために、天然の細菌が産生するバイオフィルムの分解におけるそのようなファージの使用が制限される場合がある。
【０１５４】
例えば、ファージT7、遺伝子10のキャプシドタンパク質は、主要産物10A（36kDa）および副次的産物10B（41kDa）という、2つの形態をとる（Condron,B.G., Atkins,J.F., and Gesteland,R.F. 1991「Frameshifting in gene 10 of Bacteriophage T7」J. Bacteriol. 173:6998-7003）。キャプシドタンパク質10Bは、10Aのコード領域の末端近くで起こるフレームシフトによって産生される。NOVAGEN（登録商標）は、T7中の遺伝子10を修飾して、表面ディスプレイのためにユーザーが導入したペプチドが取り付けられている10Bだけが産生されるように、そのフレームシフトを取り除いた（米国特許第5,766,905号、1998、「Cytoplasmic bacteriophage display system」、これは参照によりその全てが本明細書に組み入れられる）。T7などのファージ中に典型的に導入される酵素は大きい（数百アミノ酸より大きい）ので、10B-酵素融合産物は大きすぎてファージキャプシド全体を構成することはできない。その結果、T7select 10-3bは、ファージの複製が可能なように十分な10Aが利用できて10B-酵素融合産物と共に散在するように、野生型1OAキャプシドタンパク質を産生する宿主細菌株中で、例えばBLT5403またはBLT5615などで、増殖させなければならない（米国特許第5,766,905号、1998、「Cytoplasmic bacteriophage display system」、これは参照によりその全てが本明細書に組み入れられる）。しかし、大半のバイオフィルム形成大腸菌は野生型10Aキャプシドタンパク質を産生しないので、これは、大きな酵素をその表面にディスプレイするT7select 10-3bの、いくつかの重要な大腸菌株内で増殖してそれらを溶菌するという能力を制限することになる。したがって、いくつかの態様において、本発明は、細胞生残遺伝子もしくは抗生物質抵抗性遺伝子に対する阻害因子を含むこと、またはリプレッサータンパク質をコードする核酸を含むことに加えて、天然の細菌株におけるウイルス複製にとって不可欠な全ての遺伝子も発現させる遺伝子改変ファージを提供する。ある態様において、本発明は、セルラーゼと10Aキャプシドタンパク質をどちらも発現させる改変T7select 10-3bファージを提供する。
【０１５５】
野生型T7が、Fプラスミドタンパク質PifAとT7遺伝子1.2または10との相互作用ゆえに、雄性（Fプラスミド含有）大腸菌に増殖性感染しないことは、公知である（Garcia,L.R., and Molineux,I.J. 1995「Incomplete entry of bacteriophage T7 DNA into F plasmid-containing Escherichia coli」J. Bacteriol. 177:4077-4083）。T7に感染したFプラスミド含有大腸菌は死ぬが、溶菌せず、大量のT7を放出することもない（Garcia,L.R., and Molineux,I.J. 1995「Incomplete entry of bacteriophage T7 DNA into F plasmid-containing Escherichia coli」J. Bacteriol. 177:4077-4083）。野生型T3は、T3の遺伝子1.2産物ゆえに、雄性細胞上で正常に増殖する（Garcia,L.R., and Molineux,I.J. 1995, 同上）。T3遺伝子1.2を野生型T7で発現させると、T7は雄性細胞に増殖性感染することができる（Garcia, L.R., and Molineux, I.J. 1995. 同上）。
【０１５６】
多くのバイオフィルム産生大腸菌はFプラスミドを含有するので（Ghigo, et al., 2001「Natural conjugative plasmids induce bacterial biofilm development」Nature. 412:442-445）、改変バクテリオファージにとって、雄性細胞にも増殖性感染できることは、必要ではないものの、重要である。したがって、バイオフィルム分解酵素をその表面にディスプレイするようにそのファージを改変することに加えて、雄性細菌に感染するのに必要な遺伝子を発現するようにファージを改変することもできる。例えば、GarciaとMolineuxが記載した改変（Garcia,L.R., and Molineux,I.J. 1995「Incomplete entry of bacteriophage T7 DNA into F plasmid-containing Escherichia coli」J. Bacteriol. 177:4077-4083）を使ってT3遺伝子1.2をT7中で発現させることができる。
【０１５７】
阻害因子-改変バクテリオファージ用の抗生物質抵抗性遺伝子および/もしくは細胞生残遺伝子の核酸阻害因子またはリプレッサー-改変バクテリオファージ中の非SOS防御遺伝子の核酸阻害因子
阻害因子-改変バクテリオファージが関わる本発明の局面のいくつかの態様では、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子を阻害する物質が核酸である。もう一つの態様では、リプレッサー-改変バクテリオファージが、非SOS防御遺伝子、例えば表2ならびに表2A〜2Fに列挙するものを阻害する核酸を含む。抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子および/または非SOS防御遺伝子は、そのような抗生物質抵抗性タンパク質および/もしくは細胞生残ポリペプチドまたは非SOS防御遺伝子の発現の阻害によって、または当業者に一般に知られている「遺伝子サイレンシング」法によって、阻害することができる。抗生物質抵抗性遺伝子および/もしくは細胞生残遺伝子または非SOS防御遺伝子の核酸阻害因子には、例えば限定するわけではないが、RNA干渉誘発（RNAi）分子、例えば限定するわけではないが、siRNA、dsRNA、stRNA、shRNA、miRNAおよびそれらの修飾型が含まれ、この場合は、RNA干渉分子が、抗生物質抵抗性遺伝子および/もしくは細胞生残遺伝子または非SOS防御遺伝子の発現を遺伝子サイレンシングする。いくつかの態様では、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子および/または非SOS防御遺伝子の核酸阻害因子の核酸阻害因子が、アンチセンスオリゴ核酸または核酸類似体、例えば限定するわけではないが、DNA、RNA、ペプチド-核酸（PNA）、シュードコンプリメンタリー（pseudo-complementary）PNA（pc-PNA）、またはロックト核酸（LNA）などである。代替的態様では、核酸が、DNAまたはRNA、および核酸類似体、例えばPNA、pcPNAおよびLNAである。核酸は一本鎖または二本鎖であることができ、関心対象のタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、PNAなどを含む群から選択することができる。そのような核酸阻害因子には、例えば限定するわけではないが、転写リプレッサーであるタンパク質、アンチセンス分子、またはリボザイム、または小さな阻害核酸配列、例えばRNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi（miRNA）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどをコードする核酸配列が含まれる。
【０１５８】
いくつかの態様では、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子および/または非SOS防御遺伝子の核酸阻害因子が、例えば限定するわけではないが、対合末端型アンチセンスであることができる。その一例は、図8に開示され、また、参照によりその全てが本明細書に組み入れられるNakashima, et al., (2006) Nucleic Acids Res 34: e138に開示されている。
【０１５９】
この局面および本明細書に記載する全ての局面のいくつかの態様では、真核細胞に内在的に見いだされるRNAの一形態である一本鎖RNA（ssRNA）を使って、RNAi分子を形成させることができる。細胞性ssRNA分子には、メッセンジャーRNA（および前駆体プレメッセンジャーRNA）、核内低分子RNA、核小体RNA、トランスファーRNAおよびリボソームRNAが含まれる。二本鎖RNA（dsRNA）は、サイズ依存的免疫応答を誘発して、30bpより大きいdsRNAはインターフェロン応答を活性化し、それより短いdsRNAはダイサー酵素の下流にある細胞の内在性RNA干渉機構に送り込まれる。
【０１６０】
RNA干渉（RNAi）は、選ばれたターゲットポリペプチドの発現を阻害するための強力なアプローチになる。RNAiは、選択的分解のために、ターゲットポリペプチドをコードするメッセンジャーRNAを標的とする低分子干渉RNA（siRNA）二重鎖を利用する。遺伝子発現のsiRNA依存的転写後サイレンシングは、siRNAによってガイドされた部位におけるターゲットメッセンジャーRNA分子の切断を伴う。
【０１６１】
RNA干渉（RNAi）は、ターゲット遺伝子と同一または高度に類似する配列を持つRNAの発現または導入が、標的とする遺伝子から転写されたメッセンジャーRNA（mRNA）の配列特異的分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）をもたらし（Coburn,G. and Cullen,B.(2002) J. of Virology 76(18):9225参照）、その結果としてターゲット遺伝子の発現を阻害するという、進化的に保存された過程である。ある態様では、RNAは二本鎖RNA（dsRNA）である。この過程は植物、無脊椎動物、および哺乳動物細胞で記述されている。自然界においてRNAiは、siRNAと呼ばれる二本鎖フラグメントへの長いdsRNAの前進的切断を促進するdsRNA特異的エンドヌクレアーゼ、ダイサーによって開始される。siRNAは、ターゲットmRNAを認識して切断するタンパク質複合体（「RNA誘導サイレンシング複合体」または「RISC」と呼ばれる）に組み込まれる。抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子および/または非SOS防御遺伝子などのターゲット遺伝子の発現を阻害またはサイレンシングするために、合成siRNAまたはRNA干渉剤などの核酸分子を導入することによって、RNAiを開始させることもできる。本明細書にいう「ターゲット遺伝子発現の阻害」は、RNA干渉（RNAi）分子の非存在下におけるレベルと比較して、ターゲット遺伝子（すなわち抗生物質抵抗性遺伝子）またはターゲット遺伝子がコードするタンパク質（すなわち抗生物質抵抗性タンパク質）の発現またはタンパク質活性もしくはタンパク質レベルの任意の減少を包含する。発現またはタンパク質レベルの減少は、RNA干渉（RNAi）剤の標的にはなっておらず遺伝子サイレンシングされていない場合のターゲット遺伝子の発現またはターゲット遺伝子がコードするタンパク質の活性もしくはレベル（すなわち抗生物質抵抗性遺伝子または抗生物質抵抗性タンパク質の発現）と比較して、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％もしくは99％またはそれ以上の減少であることができる。
【０１６２】
本明細書で使用する「短鎖干渉RNA」（siRNA）という用語は、本明細書では「低分子干渉RNA」ともいい、例えばRNAiなどによってターゲット遺伝子の発現を阻害する機能を果たす物質と定義される。siRNAは化学合成するか、インビトロ転写によって製造するか、宿主細胞内で産生させることができる。ある態様では、siRNAは、約15〜約40ヌクレオチド長、好ましくは約15〜約28ヌクレオチド、より好ましくは約19〜約25ヌクレオチド長、さらに好ましくは約19、20、21、22、または23ヌクレオチド長の二本鎖RNA（dsRNA）分子であり、約0、1、2、3、4、または5ヌクレオチドの長さを持つ3'および/または5'オーバーハングを各鎖上に含有することができる。オーバーハングの長さは2本の鎖の間で独立している。すなわち、一方の鎖上のオーバーハングの長さは、もう一つの鎖上のオーバーハングの長さには依存しない。いくつかの態様では、siRNAが、ターゲットメッセンジャーRNA（mRNA）の分解または特異的転写後遺伝子サイレンシング（PTGS）によるRNA干渉を促進する能力を持つ。
【０１６３】
siRNAには低分子ヘアピン（ステムループともいう）RNA（shRNA）も包含される。ある態様では、これらのshRNAが、短い（例えば約19〜約25ヌクレオチドの）アンチセンス鎖と、それに続く約5〜約9ヌクレオチドのヌクレオチドループ、および類似のセンス鎖から構成される。あるいは、センス鎖がヌクレオチドループ構造の前にあり、アンチセンス鎖が後に続いていてもよい。これらのshRNAを、プラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルスに含有させ、例えばpol III U6プロモーターまたは別のプロモーターから発現させることができる（例えば、参照によりその全てが本明細書に組み入れられるStewart et al. (2003) RNA Apr;9(4）:493-501を参照されたい）。
【０１６４】
通例、RNA干渉（RNAi）剤による遺伝子サイレンシングが標的とするターゲット遺伝子またはターゲット配列は、抗生物質抵抗性タンパク質または細胞生残タンパク質をコードする細胞性遺伝子またはゲノム配列であることができる。いくつかの態様において、siRNAはターゲット遺伝子もしくはターゲットゲノム配列またはそのフラグメントに対して実質的に相同であることができる。この文脈で使用する用語「相同」は、ターゲットのRNA干渉が達成されるように、ターゲットmRNAまたはそのフラグメントに対して実質的に同一であるか、十分に相補的であるか、または類似していることと定義される。ターゲット配列の発現を阻害または干渉するのに適したRNAには、ネイティブRNA分子の他にも、RNA誘導体およびRNAアナログが含まれる。好ましくは、siRNAはそのターゲットと同一である。
【０１６５】
siRNAは好ましくは一つの配列だけを標的にする。siRNAなどのRNA干渉剤のそれぞれは、例えば発現プロファイリングなどにより、潜在的オフターゲット（off-target）効果について、スクリーニングすることができる。そのような方法は当業者には公知であり、例えばJackson et al., Nature Biotechnology 6:635-637, 2003などに記載されている。発現プロファイリングの他にも、オフターゲット効果を持ち得る潜在的配列を同定するために、配列データベース中の類似配列に関して、潜在的ターゲット配列をスクリーニングすることができる。例えば、Jackson et al.（同上）によれば、15個の連続ヌクレオチド、場合によってはわずか11個の連続ヌクレオチドの配列が一致するだけで、標的でない転写物のサイレンシングを指示するには十分である。したがって、潜在的なオフターゲットサイレンシングを回避するために、まず最初に、BLAST（NIBIから入手するかNIBIで利用することができるBasic Local Alignment Search Tool）などの任意の公知の配列比較方法による配列一致度解析を使って、siRNA候補を選別することができる。
【０１６６】
siRNA分子は、RNAだけを含有する分子に限定される必要はなく、例えば化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含し、リボース糖分子が別の糖分子または類似する機能を果たす分子に置換されている分子も含まれる。さらにまた、ヌクレオチド残基間にホスホロチオエート結合などの非天然結合を使用することもできる。例えば、RNA中に見いだされる天然のD-リボヌクレオシドの代わりにD-アラビノフラノシル構造を含有するsiRNAは、本発明のRNAi分子に使用することができる（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,177,196号）。他の例には、ヌクレオシドの糖と複素環式塩基との間にo-結合を含有するRNA分子が含まれ、これは、ヌクレアーゼ抵抗性と、2'-O-メチルリボース、アラビノース、そして特にD-アラビノース（参照によりその全てが本明細書に組み入れられる米国特許第5,177,196号）を含有するオリゴヌクレオチドに類似するオリゴヌクレオチド分子への強固な相補鎖結合とをもたらす。
【０１６７】
RNA鎖はフルオロフォアなどのレポーター基の反応性官能基で誘導体化することができる。特に有用な誘導体は、RNA鎖の一端または両端（典型的にはセンス鎖の3'末端）で修飾される。例えば3'末端の2'-ヒドロキシルは、さまざまな基で容易にかつ選択的に誘導体化することができる。
【０１６８】
他の有用なRNA誘導体には、2'-O-アルキル化残基または2'-O-メチルリボシル誘導体および2'-O-フルオロリボシル誘導体などの修飾糖質成分を持つヌクレオチドが組み入れられる。RNA塩基を修飾することもできる。ターゲット配列の発現を阻害または干渉するのに有用な任意の修飾塩基を使用することができる。例えば、5-ブロモウラシルおよび5-ヨードウラシルなどのハロゲン化塩基を組み入れることができる。塩基をアルキル化することもでき、例えば7-メチルグアノシンをグアノシン残基の代わりに組み入れることができる。阻害の成功をもたらす非天然塩基も組み入れることができる。
【０１６９】
最も好ましいsiRNA修飾には、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンまたはロックト核酸（LNA）ヌクレオチド、およびホスホジエステル結合またはさまざまな数のホスホロチオエート結合を含有するRNA二重鎖が含まれる。そのような修飾は当業者には公知であり、例えばBraasch et al., Biochemistry, 42:7967-7975, 2003に記載されている。siRNA分子に対する有用な修飾の大部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチド技術のために確立されたケミストリーを使って導入することができる。修飾に伴う2'-O-メチル修飾は最小限であることが好ましく、好ましくはそのような修飾は除外される。修飾からは、siRNAの遊離5'-ヒドロキシル基の修飾も除外されることが好ましい。
【０１７０】
さまざまな「テール」が3'端もしくは5'端またはその両方に共有結合されているsiRNA分子およびmiRNA分子も、当技術分野では公知であり、本発明の方法を使って送達されるsiRNA分子およびmiRNA分子を安定化するために使用することができる。一般に、RNA分子の3'端または5'端に取り付けられたインターカレート基、さまざまな種類のレポーター基および親油性基は、当業者には周知であり、本発明の方法で有用である。本発明で有用な修飾RNA分子の製造に応用することができる3'-コレステロールまたは3'-アクリジン修飾オリゴヌクレオチドの合成の説明は、例えば次に挙げる論文に見いだすことができる:Gamper,H.B., Reed,M.W., Cox,T., Virosco,J.S., Adams,A.D., Gall,A., Scholler,J.K., and Meyer,R.B. (1993)「Facile Preparation and Exonuclease Stability of 3'-Modified Oligodeoxynucleotides」Nucleic Acids Res. 21 145-150、およびReed,M.W., Adams,A.D., Nelson,J.S., and Meyer,R.B.,Jr. (1991)「Acridine and Cholesterol-Derivatized Solid Supports for Improved Synthesis of 3'-Modified Oligonucleotides」Bioconjugate Chem. 2 217-225 (1993）。
【０１７１】
Lp-PLA2発現を標的とするのに有用な他のsiRNAは、容易にデザインし、試験することができる。したがって、本明細書に記載する方法に役立つsiRNAには、約15〜約40ヌクレオチド長または約15〜約28ヌクレオチド長のsiRNA分子が含まれる。好ましくは、siRNA分子は約19〜約25ヌクレオチドの長さを持つ。より好ましくは、siRNA分子は約19、20、21、または22ヌクレオチドの長さを持つ。siRNA分子は3'ヒドロキシル基も含むことができる。siRNA分子は一本鎖または二本鎖であることができ、それらの分子は平滑末端であってもよいし、突出端（例えば5'、3'）を含んでもよい。特定の態様では、RNAが二本鎖であり、平滑末端であるか、突出端を含む。
【０１７２】
ある態様では、RNA分子の少なくとも一方の鎖が、長さが約0〜約6ヌクレオチド（例えばピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオチド）の3'オーバーハングを持つ。別の態様では、3'オーバーハングが約1〜約5ヌクレオチド長、約1〜約3ヌクレオチド長および約2〜約4ヌクレオチド長である。ある態様では、RNA分子が二本鎖であり、一方の鎖は3'オーバーハングを持ち、他方の鎖は平滑末端であるか、オーバーハングを持つことができる。RNA分子が二本鎖であり、両方の鎖がオーバーハングを含む態様において、オーバーハングの長さは各鎖ごとに同じであっても異なってもよい。特定の態様では、本発明のRNAが対合した約19、20、21、または22個のヌクレオチドを含み、それらのヌクレオチドがRNAの両方の3'端に約1〜約3ヌクレオチド、特に約2ヌクレオチドのオーバーハングを持つ。ある態様では、3'オーバーハングを分解に対して安定化することができる。好ましい一態様では、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含めることによってRNAが安定化される。あるいは、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば2'-デオキシチミジンによるウリジン2ヌクレオチド3'オーバーハングの置換は認容され、RNAiの効率に影響を及ぼさない。2'ヒドロキシルの非存在は、組織培養培地におけるオーバーハングのヌクレアーゼ抵抗性を有意に強化する。
【０１７３】
いくつかの態様において、当業者は、上述のRNAi物質、例えばアンチセンスRNAを使った、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子タンパク質および/または非SOS防御遺伝子の発現および/またはノックダウンを評価して、抗微生物剤の存在下で、そのようなRNAi物質を発現させる細菌の生存率を決定することができる。いくつかの態様では、市販のキットを使用することによって、細菌細胞生存率を決定することができる。他にも、当業者は、ターゲットmRNAの公知配列に基づいて、容易に製造することができる。念のために述べると、本明細書に開示する阻害因子-改変バクテリオファージ用の核酸阻害因子をデザインするために使用することができる核酸配列は、任意の抗生物質抵抗性遺伝子もしくは任意のSOS遺伝子、または本明細書に開示する表2もしくは2A〜2Fに列挙する任意の非SOS防御遺伝子に基づくことができる。
【０１７４】
siRNA配列は、RISCへのsiRNAのアンチセンス（ガイド）鎖の取り込みが最大になり、その結果として、抗生物質抵抗性遺伝子または細胞生残遺伝子mRNAが分解の標的になるようにRISCを誘導するという阻害因子の能力が最大になるように選択される。これは、アンチセンス鎖の5'-末端で最も低い結合の自由エネルギーを持つ配列をスキャンすることによって達成することができる。低い自由エネルギーは、siRNA二重鎖のアンチセンス鎖の5'端の巻き戻しの強化につながり、その結果として、アンチセンス鎖がRISCによって取り込まれ、標的とするmRNAの配列特異的切断を指示することを確実にする。
【０１７５】
本明細書に開示する方法において有用なRNA干渉分子および核酸阻害因子は、直接化学合成、組換えダイサータンパク質またはショウジョウバエ胚溶解物への曝露による、より長い二本鎖RNAのプロセシングによる方法、S2細胞由来のインビトロ系による方法、ファージRNAポリメラーゼ、RNA依存性RNAポリメラーゼ、およびDNAに基づくベクターの使用など、任意の公知の技法を使って製造することができる。細胞溶解物またはインビトロプロセシングの使用では、さらに、その後に、短い、例えば約21〜23ヌクレオチドのsiRNAを溶解物などから単離することが必要になり得る。化学合成は通常、2本の一本鎖RNA-オリゴマーを作製した後、それら2本の一本鎖オリゴマーを二本鎖RNAにアニーリングさせることによって進められる。他の例には、siRNAの化学合成および酵素的合成を教示する、参照により本明細書に組み入れられるWO99/32619およびWO01/688360に開示されている方法が含まれる。さらにまた、特異的siRNAのデザインおよび製造には、数多くの商業的サービスを利用することができる（例えばQIAGEN Inc.、カリフォルニア州バレンシアおよびAMBION Inc.、テキサス州オースチンを参照されたい）。
【０１７６】
ある態様では、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子の核酸阻害因子を、合成的に、例えば当業者に公知の任意の合成方法で核酸を化学合成することによって、得ることができる。抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子の合成された核酸阻害因子は、次に、当技術分野において公知である任意の方法によって精製することができる。核酸の合成方法には、限定するわけではないが、ホスホトリエステル、ホスフェートまたはホスホルアミダイトケミストリーと固相技法とを使ったインビトロ化学合成、またはデオキシヌクレオシドH-ホスホネート中間体によるインビトロ化学合成（Bhongleの米国特許第5,705,629号参照）が含まれる。
【０１７７】
状況によっては、例えば増加したヌクレアーゼ安定性が望ましい場合は、核酸アナログおよび/または修飾ヌクレオシド間結合を持つ核酸が好ましい場合もある。修飾ヌクレオシド間結合を含有する核酸も、当技術分野において周知の試薬および方法を使って合成することができる。例えば、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、メトキシエチルホスホルアミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン-スルフィド（-CH2-S-CH2）、ジメチレン（diinethylene）-スルホキシド（-CH2-SO-CH2）、ジメチレン-スルホン（-CH2-SO2-CH2）、2'-O-アルキル、および2'-デオキシ-2'-フルオロ'ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含有する核酸の合成方法は、当技術分野において周知である（Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90:543-584、Schneider et al., 1990, Tetrahedron Lett. 31:335、およびそこで引用されている参考文献を参照されたい）。Cookらの米国特許第5,614,617号および同第5,223,618号、Acevedoらの同第5,714,606号、Cookらの同第5,378,825号、Buhrらの同第5,672,697号および同第5,466,786号、Cookらの同第5,777,092号、De Mesmackerらの同第5,602,240号、Cookらの同第5,610,289号ならびにWangの同第5,858,988号にも、強化されたヌクレアーゼ安定性および細胞取り込みのための核酸アナログが記載されている。
【０１７８】
合成siRNA分子は、shRNA分子を含めて、当業者に公知のいくつかの技法を使って得ることができる。例えばsiRNA分子は、当技術分野において公知の方法を使って、例えば適当に保護されたリボヌクレオシドホスホルアミダイトと通常のDNA/RNA合成装置などを使って、化学合成または組換え生産することができる（例えばElbashir,S.M. et al. (2001) Nature 411:494-498、Elbashir,S.M., W.LendeckelおよびT.Tuschl (2001) Genes & Development 15:188-200、Harborth, J. et al. (2001) J. Cell Science 114:4557-4565、Masters,J.R. et al. （2001) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 98:8012-8017、およびTuschl,T. et al.ら (1999) Genes & Development 13:3191-3197を参照されたい）。あるいは、RNA合成業者も、例えば限定するわけではないが、Proligo（ドイツ・ハンブルク）、Dharmacon Research（米国コロラド州ラファイエット）、Pierce Chemical（Perbio Scienceの一部、米国イリノイ州ロックフォード）、Glen Research（米国バージニア州スターリング）、ChemGenes（米国マサチューセッツ州アシュランド）、およびCruachem（英国グラスゴー）など、いくつか利用することができる。したがって、siRNA分子の合成が過度に難しいということはなく、RNAiに適した品質で容易に提供される。また、dsRNAは、プラスミドベクター、レトロウイルスおよびレンチウイルスによってコードされたステムループ構造として発現させることができる（Paddison,PJ. et al. (2002) Genes Dev. 16:948-958、McManus,M.T. et al. (2002) RNA 8:842-850、Paul,CP. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:505-508、Miyagishi,M. et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:497-500、Sui,G. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:5515-5520、Brummelkamp,T. et al. （2002） Cancer Cell 2:243、Lee,N.S., et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:500-505、Yu,J.Y., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci, USA 99:6047-6052、Zeng,Y., et al. (2002) Mol. Cell 9:1327-1333、Rubinson,D.A., et al. (2003) Nat. Genet. 33:401-406、Stewart,S.A., et al. (2003) RNA 9:493-501）。これらのベクターは一般にdsRNAの上流にpolIIIプロモーターを持ち、センスおよびアンチセンスRNA鎖を個別に、かつ/またはヘアピン構造として、発現させることができる。細胞内では、ダイサーが低分子ヘアピンRNA（shRNA）を有効なsiRNAにプロセシングする。
【０１７９】
本発明のsiRNA分子の標的領域は、与えられたターゲット遺伝子配列から、例えば開始コドンの下流約25ヌクレオチドから始まり50ヌクレオチドまで、約50ヌクレオチドから始まり75ヌクレオチドまで、または約75ヌクレオチドから始まり100ヌクレオチドまでの、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子のコード配列から、選択することができる。ヌクレオチド配列は、5'または3'UTRおよび開始コドンに近接する領域を含有することができる。本発明のsiRNA分子をデザインする方法の一つでは、23ヌクレオチド配列モチーフAA（N19）TT（ここでNは任意のヌクレオチドであることができる）を同定し、少なくとも25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％または75％のG/C含量を持つヒットを選択する。この配列の「TT」部分は随意である。あるいは、そのような配列が見つからない場合は、モチーフNA（N21）（ここでNは任意のヌクレオチドであることができる）を使って検索を拡張することができる。その場合は、センスおよびアンチセンス3'オーバーハングの配列組成に関して対称的な二重鎖を生成させることができるように、センスsiRNAの3'端をTTに変換することができる。次に、アンチセンスsiRNA分子を、23ヌクレオチド配列モチーフのヌクレオチド位置1〜21に対する相補体として合成することができる。対称的な3'TTオーバーハングの使用は、低分子干渉リボ核タンパク質粒子（siRNP）が、センスおよびアンチセンスターゲットRNA切断siRNPの適当に等しい比率で、形成されるのを保証するために有利であり得る（Elbashir et al. (2001) 前記およびElbashir et al. 2001 前記）。一つの遺伝子だけを標的とすることが保証されるように、配列データベース、例えば限定するわけではないが、NCBI、BLAST、DerwentおよびGenSeqの解析も、OLIGOENGINE（登録商標）などの市販のオリゴ合成ソフトウェアと共に、ESTライブラリーに対してsiRNA配列を選択する目的で使用することができる。
【０１８０】
したがって、本明細書に開示する抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子の核酸阻害因子として機能するRNAi分子は、例えば限定するわけではないが、無修飾および修飾二本鎖（ds）RNA分子、短鎖一時（short-temporal）RNA（stRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、短鎖ヘアピン（short-hairpin）RNA（shRNA）、マイクロRNA（miRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）などである（例えばBaulcombe, Science 297:2002-2003, 2002を参照されたい）。dsRNA分子、例えばsiRNAは、3'オーバーハング、好ましくは3'UUまたは3'TTオーバーハングも含有することができる。ある態様において、本発明のsiRNA分子は、約30〜40塩基、約40〜50塩基、約50塩基以上より大きいssRNAを含むRNA分子を含まない。ある態様において、本発明のsiRNA分子は、その全長の約25％以上、約50％以上、約60％以上、約70％以上、約80％以上、約90％以上が二本鎖である。いくつかの態様では、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子の核酸阻害因子が、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子mRNAに結合してその発現を阻害する任意の物質であり、この場合は、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残mRNAの発現、または抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子によってコードされる核酸の転写物の産物の発現が阻害される。
【０１８１】
本発明のもう一つの態様では、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子を阻害する物質が、触媒的核酸コンストラクト、例えばRNA転写物を切断することによって野生型タンパク質の産生を防止する能力を持つリボザイムである。リボザイムは、ターゲットに相補的な配列を持つ2つの領域がリボザイム触媒部位に隣接することにより、特定の配列を標的とし、その配列とアニールする。結合後に、リボザイムはターゲットを部位特異的に切断する。本明細書に記載する遺伝子産物の配列を特異的に認識し切断するための、例えば抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子またはそのホモログもしくは変種を切断するための、リボザイムのデザインおよび試験は、当業者に周知の技法によって達成することができる（例えばLieber and Strauss, (1995) Mol Cell Biol 15:540.551、この文献の開示は参照により本明細書に組み入れられる）。
【０１８２】
改変バクテリオファージのプロモーター
本明細書に記載する全ての局面のいくつかの態様において、改変バクテリオファージは、抗生物質抵抗性遺伝子に対する阻害因子（例えば阻害因子-改変バクテリオファージの場合）またはSOS遺伝子に対するリプレッサーもしくは非SOS防御遺伝子に対するリプレッサー（または阻害因子）（リプレッサー-改変バクテリオファージの場合）または感受性物質（感受性物質改変バクテリオファージの場合）を発現させる核酸を含む。いずれの場合も、核酸からの遺伝子発現は、その核酸が機能的に連結されているプロモーターによって調節される。いくつかの態様では、プロモーターがバクテリオファージプロモーターである。当業者に公知の任意のバクテリオファージプロモーター、例えば限定するわけではないが、表6に列挙されまたはワールドワイドウェブサイト「partsregistry.org/cgi/partsdb/pgroup.cgi？pgroup＝other＿regulator＆show＝1」に開示されている任意のプロモーターを使用することができる。
【０１８３】
いくつかの態様では、物質が、抗生物質抵抗性遺伝子および/もしくは細胞生残遺伝子または非SOS防御遺伝子の発現を阻害するタンパク質またはポリペプチドまたはRNAi物質である。そのような態様では、例えば、バクテリオファージおよび/またはバクテリオファージ感染宿主細胞が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子の阻害因子剤または非SOS防御遺伝子のリプレッサーもしくは阻害因子または感受性物質を高レベルに発現するように、天然のバクテリオファージプロモーターの全部または一部を異種プロモーターの全部または一部で置き換えることなどにより、そのような物質の発現を増加させるために、バクテリオファージ細胞（bacteriophage cell）を修飾（例えば相同組換えによって修飾）することができる。いくつかの態様では、物質をコードする所望の核酸に機能的に連結されるような方法で、異種プロモーターが挿入される。例えば、参照によりその全てが本明細書に組み入れられるTranskaryotic Therapies, Inc.によるPCT国際公開番号WO94/12650、Cell Genesys, Inc.によるPCT国際公開番号WO92/20808、およびApplied Research SystemsによるPCT国際公開番号WO91/09955を参照されたい。
【０１８４】
いくつかの態様では、本明細書に開示するように、バクテリオファージを改変して、誘導性調節要素の制御下にある物質を含む、リプレッサータンパク質などの内在性遺伝子、または抗生物質抵抗性遺伝子もしくは細胞生残遺伝子の核酸阻害因子を発現させることができ、その場合は、内在性遺伝子の調節配列を相同組換えによって置き換えることができる。遺伝子活性化技法は、Chappelの米国特許第5,272,071号、Sherwinらの米国特許第5,578,461号、SeldenらによるPCT/US92/09627（WO93/09222）、およびSkoultchiらによるPCT/US90/06436（WO91/06667）に記載されており、これらはいずれも参照によりその全てが本明細書に組み入れられる。
【０１８５】
使用することができるプロモーターの他の典型例には、例えば限定するわけではないが、アンヒドロテトラサイクリン（aTc）プロモーター、PLtetO-1（Pubmedヌクレオチド番号U66309）、アラビノースプロモーター（PBAD）、IPTG誘導性プロモーターPTAC（Pubmedアクセッション番号EU546824などのベクター中）、PTrc-2、Plac（Pubmedアクセッション番号EU546816などのベクター中）、PLlacO-1、PA1lacO-1、ならびにアラビノースおよびIPTGプロモーター、例えばPlac/ara-aが含まれる。これらのプロモーターの例は、次のとおりである。
【０１８６】
アンヒドロテトラサイクリン（aTc）プロモーター、例えばPLtetO-1（Pubmedヌクレオチド番号U66309）:
2011518543.tif 000008
;
アラビノースプロモーター（PBAD）:またはワールドワイドウェブサイト:「partsregistry.org/wiki/index.php？title＝Part:BBa＿I13453」に見いだすことができる修飾型:
2011518543.tif 000009
;
IPTGプロモーター:（i）PTAC（参照により本明細書に組み入れられるPubmedアクセッション番号EU546824などのベクター中）、（ii）PTrc-2:
2011518543.tif 000010
ならびに温度感受性プロモーター、例えばPLs1con、
2011518543.tif 000011
およびその改変変種。
【０１８７】
改変バクテリオファージの改変
本明細書に記載する全ての局面のいくつかの態様では、例えば最適な酵素活性のために、または細胞溶解を遅延させるために、または複数のファージプロモーターを使って酵素産生量を増加させることができるように、または異なるタンパク質で複数のバイオフィルムEPSコンポーネントを標的にするために、改変バクテリオファージをデザインすることもできる。いくつかの態様では、異なる種特異的改変酵素活性ファージのカクテル、および当業者に周知の、抗微生物剤以外の他の薬剤との併用療法、および両タイプの処置の効力を改善するためのファージで、複数種バイオフィルムを標的にすることもできる。
【０１８８】
本明細書に記載する全ての局面のいくつかの態様では、改変バクテリオファージを、他の抗細菌剤もしくは細菌フィルム分解剤、または微生物活性に影響を及ぼすことなく緑膿菌（P. aeruginosa）バイオフィルムを即座にかつ実質的に剥離させたカルシウム特異的キレート剤であるEGTA、NaCl、CaCl2またはMgCl2、界面活性剤および尿素などの化学薬品と一緒に使用することもできる。
【０１８９】
ファージ療法またはバクテリオファージ療法は、工業現場およびバイオテクノロジー現場で受け入れられ始めている。例えばFDAは既に、リステリア菌（Listeria monocytogenes）を標的とするファージの食品添加物としての使用を承認している。ファージ療法は、東欧は60年以上にわたって治療目的に使用され、成功を収めている。西洋医学の臨床現場における、特にヒトなどの哺乳動物を処置するための、ファージ療法の開発と使用は、適正に計画された臨床治験が現在までなかったことと、（i）ファージ抵抗性の発生、（ii）人体におけるファージ免疫原性および網内系（RES）によるクリアランス、（iii）溶菌時の毒素の放出、および（iv）ファージ特異性に関する懸念から、遅れてきた。これらの懸念の多くは現在研究されており、例えば増加したインビボ効力が得られるようにRESクリアランスを回避することができる長時間循環型（long-circulating）ファージの単離および開発などといった取り組みがなされている。したがって、本明細書に記載する全ての局面において、本発明の方法は、細菌におけるファージ抵抗性の発生を防止するように改変バクテリオファージをデザインすることができるので、ヒト処置に応用可能である。当業者は治療目的などの臨床応用ならびにヒト対象で使用するための適当な臨床治験を開発し、実行することもできる。いくつかの例では、当業者は、ヒト対象における改変バクテリオファージの特異的トレランスを立証するための臨床治験を確立し、設定することができるだろう。本発明者らは、阻害因子-改変バクテリオファージおよびリプレッサー-改変バクテリオファージおよび感受性-改変バクテリオファージが、抗微生物剤の効力を増加させるのに有効であり、結腸または肺などのヒト臓器および細菌バイオフィルム感染などの細菌感染を起こしやすい対象中の他の臓器に存在するバイオフィルムを含むバイオフィルムを分散させるのに有効であることを、既に本明細書において実証している。
【０１９０】
もう一つの局面は、少なくとも1つの改変バクテリオファージと少なくとも1つの抗微生物剤とを含む薬学的組成物に関する。この局面および本明細書に記載する全ての局面のいくつかの態様では、組成物を、1つ以上の他の非抗微生物剤または治療剤と共に、補助製剤（co-formulation）として投与することができる。
【０１９１】
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明の組成物および/または薬学的製剤の投与方法を提供し、一般に当業者に公知である任意の手段を包含する。いくつかの態様では、対象が、例えば哺乳類、鳥類または植物を含む任意の生物である。いくつかの態様では、哺乳類がヒト、家畜および/または商業動物である。
【０１９２】
クリアランスという課題は慢性疾患の処置においては重大でないが、ファージクリアランスの問題は解決する必要がある重要な問題である。というのも、それにより、ファージ療法が、慢性感染よりもむしろ一過性感染の処置にとって、より有用になり得るからである。非溶菌性および非複製性ファージが、エンドトキシン放出を最小限に抑えつつ細菌を殺すように改変された。したがって、本発明は、最小限のエンドトキシン放出を伴う阻害因子-改変および/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージの改変または毒素フリーのバクテリオファージ調製物を包含する。
【０１９３】
宿主細菌に関するファージの特異性は、ファージ療法の利点でもあり欠点でもある。特異性は、ヒト細胞および無害な細菌に危害を加えずに、薬物毒性などの深刻な問題を潜在的に回避することを可能にする。抗生物質療法は、ターゲット特異性を欠くので、結腸内の微生物叢を変化させると考えられており、場合によっては、抵抗性クロストリジウム・ディフィシレ（C. difficile）が増殖し下痢や結腸炎などの疾患を引き起こすことを許す。本明細書に開示する阻害因子-改変バクテリオファージおよびリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージは、通常は抗微生物効果を回避して持続生残型細菌をもたらす局所的細菌合成機構を阻害する能力を持つ。
【０１９４】
宿主特異性（すなわち細菌特異的な阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージ）ゆえに、個々の細菌感染に対して適当な阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージ療法をデザインすることができるように、特徴の明確なファージのライブラリーを維持しなければならない。細菌感染の多様性は、一つの特定ファージではどれをとっても、広範囲にわたるバイオフィルムに対する効果的な治療策とするのは困難であるだろうことを含意する。したがってある態様において、本発明は、ある範囲のターゲット細菌をカバーするために、さまざまな異なる改変バクテリオファージの組合せ（すなわち本明細書において議論する改変バクテリオファージのカクテル）の使用を提供する。
【０１９５】
当業者は、本明細書に開示する阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージの収集物またはライブラリーを、新しい費用効果の高い大規模DNAシーケンシングおよびDNA合成技術によって作製することができる。シーケンシング技術により、長年にわたってファージタイピングおよびファージ療法に使用されてきた天然ファージの収集物を特徴づけることができる。したがって当業者は、本明細書に記載するような合成技術を使って、抗生物質抵抗性遺伝子または細胞生残遺伝子に対する異なる阻害因子を付加し、かつ/または異なるSOS応答遺伝子もしくは非SOS防御遺伝子に対する異なるリプレッサーまたは感受性物質を付加して、さまざまな新しい阻害因子-改変バクテリオファージおよびリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージを、それぞれ作り出すことができる。
【０１９６】
特定の態様では、誘導性調節要素の制御下にある物質を含む、リプレッサータンパク質などの内在性遺伝子、または抗生物質抵抗性遺伝子もしくは細胞生残遺伝子の核酸阻害因子を発現するように、本明細書に記載する改変バクテリオファージを改変することができ、その場合は、内在性遺伝子の調節配列を相同組換えによって置き換えることができる。遺伝子活性化技法は、Chappelの米国特許第5,272,071号、Sherwinらの米国特許第5,578,461号、SeldenらによるPCT/US92/09627（WO93/09222）、およびSkoultchiらによるPCT/US90/06436（WO91/06667）に記載されており、これらはいずれも参照によりその全てが本明細書に組み入れられる。
【０１９７】
さらにまた、合理的な工学的改変方法を新しい合成技術と共に利用して、改変バクテリオファージの宿主域を拡げることもできる。例えば、K1-5エンドシアリダーゼを発現するようにT7を改変することで、T7がK1多糖莢膜を産生する大腸菌において効果的に複製できるようにすることができる。いくつかの態様では、ファージT3由来の遺伝子1.2を使って、Fプラスミドを含有する大腸菌を含む宿主域に感染することができるように、本明細書に開示するバクテリオファージを拡張することができ、そうすることで、ファージの複製能力を著しく損なうことなく、ファージゲノムの多重修飾を行い得ることを実証することができる。ボルデテラ（Bordetella）バクテリオファージは逆転写酵素を介した機序を使って宿主親和性に多様性を生じるが、本発明によればこれを使って、抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残遺伝子を阻害する物質をコードし、あるいはSOS応答遺伝子のリプレッサーをコードし、かつ1つまたは複数のターゲット細菌に対して溶菌性であるファージを、作出することもできる。大腸菌K-12が成熟したバイオフィルムを産生するために要求する多くのバイオフィルム促進因子は、異なるバイオフィルム形成細菌株の間で共有されている可能性が高く、したがってそれらも、本明細書に開示する改変酵素バクテリオファージのターゲットである。
【０１９８】
抗微生物剤
本発明の一局面は、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージと少なくとも1つの抗微生物剤との組合せを使った、細菌の死滅または細菌増殖の阻害に関する。したがって本発明の一局面は、抗微生物剤の抗微生物効果および細菌死滅機能または増殖阻害機能を増強するために抗微生物剤と組み合わせて使用するための改変バクテリオファージを含む方法および組成物に関する。
【０１９９】
したがって、本発明のこの局面のいくつかの態様は、抗微生物剤の死滅効果を増強するための、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージの使用に関する。別の言い方をすると、阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージまたは感受性改変バクテリオファージは、少なくとも1つの抗微生物剤の効力を強化するために使用することができる。
【０２００】
阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージは、本明細書に開示する改変バクテリオファージと組み合わせて使用される抗微生物剤の量が、結果に有害な影響を及ぼすことなく、例えば抗微生物活性のレベルに有害な影響を及ぼすことなく、少なくとも10％は減少する場合に、抗微生物剤の有効性を増強するとみなされる。もう一つの態様において、抗微生物剤の活性を増強することができる阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージを選択するために使用される基準は、抗微生物効果に有害な影響を及ぼすことなく、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージの非存在下での類似する量と比較して、抗微生物剤の量（すなわち用量）の少なくとも約10％、…または少なくとも約15％、…または少なくとも約20％、…または少なくとも約25％、…または少なくとも約35％、…または少なくとも約50％、…または少なくとも約60％、…または少なくとも約90％、および10〜90％の間にある全ての整数％の減少を可能にする、改変バクテリオファージである。
【０２０１】
いくつかの態様では、当業者に公知の任意の抗微生物剤を、阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージと組み合わせて使用することができる。いくつかの態様では、抗微生物剤が抗生物質である。したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示する改変バクテリオファージが、アミングリコシド抗微生物剤、例えば限定するわけではないが、ゲンタマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネトロマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ネオマイシンなどのための抗生物質佐剤として機能する。いくつかの態様では、本明細書に開示する改変バクテリオファージが、β-ラクタム系抗生物質、例えば限定するわけではないが、アンピシリン、ペニシリン、ペニシリン誘導体、セファロスポリン類、モノバクタム類、カルバペネムおよびβ-ラクタマーゼ阻害剤などのための抗生物質佐剤として機能する。いくつかの態様では、本明細書に開示する改変バクテリオファージが、キノロン系抗微生物剤、例えば限定するわけではないが、オフロキサシン、シプロフロキサシン（ciproflaxacin）、レボフロキサシン、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン、モキシフロキサシン、スパルフロキサシン、ゲミフロキサシン、およびパズフロキサシンなどのための抗生物質佐剤として機能する。
【０２０２】
代替的態様において、抗微生物剤は、例えば限定するわけではないが、微生物の増殖を阻害しかつ/または微生物を殺す、小分子、ペプチド、ペプチドミメティック、化学薬品、化合物および任意の実体であることができる。いくつかの態様において、抗微生物剤には、以下の物質を含めることができる（ただしこれらに限定するわけではない）:本明細書において同定する遺伝子産物およびまだ同定されていないものの核酸および/またはタンパク質を不活化するように機能する、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）、中和抗体、抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、ペプチド、タンパク質、ペプチドミメティック、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ホルモン、小分子、核酸、核酸類似体、糖質またはその変種。核酸には、例えば限定するわけではないが、DNA、RNA、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）、シュードコンプリメンタリーPNA（pcPNA）、ロックト核酸（LNA）、RNAi、マイクロRNAi、siRNA、shRNAなどが含まれる。抗微生物剤阻害因子は、化学薬品、小分子、化学的実体、核酸配列、核酸類似体またはタンパク質もしくはポリペプチドまたはその類似体もしくはフラグメントの群から選択することができる。
【０２０３】
いくつかの態様では、抗微生物剤が抗微生物ペプチド、例えば限定するわけではないが、メフロキン、ベンツリシジンA、アンチマイシン、ミキソチアゾール、スチグマテリン、ジウロン、ヨードアセトアミド、亜テルル酸カリウム水和物、aDL-ビニルグリシン、N-エチルマレイミド、L-アリルグリシン（allyglycine）、ジアリールキノリン（diaryquinoline）、ベタインアルデヒドクロライド、アシビシン（acivcin）、プシコフラニン（psicofuraine）、ブチオニンスルホキシミン、ジアミノピメリン酸、4-ホスホ-D-エリトロンヒドロキサム酸、モテクサフィンガドリニウムおよび/またはキシシトリン（xycitrin）またはその修飾型もしくは類似体である。
【０２０４】
いくつかの態様では、本明細書に記載する阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージとの組合せで役立つ抗微生物剤に、例えば限定するわけではないが、アミノグリコシド、カルバペネム類、セファロスポリン類、セフェム類、糖タンパク質フルロキノロン（fluroquinolone）類/キノロン類、オキサゾリジノン類、ペニシリン類、ストレプトグラミン類、スルホンアミド類および/またはテトラサイクリン類が含まれる。
【０２０５】
アミノグリコシドは、グラム陰性菌に対して有効であることが見いだされた一群の抗生物質である。アミノグリコシドは、合併した尿路感染、敗血症、腹膜炎および他の重症腹腔内感染、重症骨盤炎症性疾患、心内膜炎、マイコバクテリウム感染、新生児敗血症、ならびにさまざまな眼感染を処置するために使用される。これらは、グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の両方を処置するために、ペニシリン類およびセファロスポリン類と組み合わせて使用されることも多い。アミノグリコシドの例には、アミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネトロマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、およびネオマイシンが含まれる。
【０２０６】
カルバペネム類は、グラム陽性、グラム陰性、および嫌気性微生物と闘うために使用される広域抗生物質の1種類である。カルバペネム類は静脈内投与に利用することができ、経口薬では十分に対処できない重症感染に、そのような形で使用される。例えばカルバペネム類は、重症単一または混合細菌感染、例えば下気道感染、尿路感染、腹腔内感染、婦人科および出産後感染、敗血症、骨および関節感染、皮膚および皮膚構造感染、ならびに髄膜炎などを処置するために使用されることが多い。カルバペネム類の例には、イミペネム/シラスタチンナトリウム、メロペネム、エルタペネム、およびパニペネム/ビタミプロンが含まれる。
【０２０７】
セファロスポリン類およびセフェム類は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、およびスピロヘータ感染を処置するために使用される広域抗生物質である。セフェム類は次世代セファロスポリン類とみなされており、新しい薬物の方がグラム陰性菌には強く、古い薬物の方がグラム陽性菌にはよい。セファロスポリン類およびセフェム類は一般にペニシリンアレルギーのために代用され、一般的な尿路感染および上気道炎（例えば咽頭炎（pharyugitis）および扁桃腺炎）を処置するために使用することができる。
【０２０８】
セファロスポリン類およびセフェム類は、中耳炎、いくつかの皮膚感染、気管支炎、下気道感染（肺炎）、および骨感染（一部のメンバー）を処置するためにも使用され、外科的予防にとって好ましい抗生物質である。セファロスポリン類の例には、セフィキシム、セフポドキシム、セフチブテン、セフジニル、セファクロル、セフプロジル、ロラカルベフ、セファドロキシル、セファレキシン、およびセフラジン（cephradineze）が含まれる。セフェム類の例には、セフェピム、セフピロム、セファタキシジム（cefataxidime）五水和物、セフタジジム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフォタキシム、セフテラム、セフォチアム、セフロキシム、セファマンドール、セフロキシムアキセチル、セフォテタン、セファゾリンナトリウム、セファゾリン、セファレキシンが含まれる。
【０２０９】
フルオロキノロン類/キノロン類は、グラム陰性菌感染を処置するために使用される抗生物質であるが、いくつかの新しい薬剤はグラム陽性細菌および嫌気性菌に対する活性を持つ。フルオロキノロン類/キノロン類は、尿路感染、性行為感染症（例えば淋疾、クラミジア尿道炎/子宮頸炎、骨盤炎症性疾患）、グラム陰性菌胃腸感染、軟組織感染、眼感染（pphthalmic infection）、皮膚感染、副鼻腔炎、および気道感染（例えば気管支炎、肺炎、および結核）などの状態を処置するために使用されることが多い。フルオロキノロン類/キノロン類は、多剤抵抗性結核、発熱した好中球減少がん患者、および潜在的に炭疽などの状態を処置するために、他の抗生物質と組み合わせて使用される。フルオロキノロン類/キノロン類の例には、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、およびオフロキサシン、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン、モキシフロキサシン、スパルフロキサシン、ゲミフロキサシン、およびパズフロキサシンが含まれる。
【０２１０】
糖ペプチドおよびストレプトグラミン類は、メチシリン抵抗性黄色ブドウ球菌（MRSA）などの、他の抗生物質に対して抵抗性である細菌を処置するために使用される抗生物質を表す。これらは、ペニシリンに対するアレルギーを持つ患者にも使用される。糖ペプチドの例には、バンコマイシン、テイコプラニン、およびダプトマイシンが含まれる。
【０２１１】
β-ラクタム系抗生物質は、ペニシリン誘導体、セファロスポリン類、モノバクタム類、カルバペネム類およびβ-ラクタマーゼ阻害剤、基本的には、β-ラクタム核をその分子構造中に含有する任意の抗生物質または薬剤または抗微生物剤を含む、幅広い抗生物質のクラスである。理論に拘泥するわけではないが、β-ラクタム系抗生物質は殺細菌性であり、細菌細胞壁のペプチドグリカン層の合成を阻害することによって作用する。ペプチドグリカン層は、特にグラム陽性生物における細胞壁構造の完全性にとって重要である。ペプチドグリカンの合成における最終ペプチド転移段階は、ペニシリン結合タンパク質（PBP）として知られるトランスペプチダーゼによって促進される。β-ラクタム系抗生物質は、新生ペプチドグリカン層の前駆体NAM/NAG-ペプチドサブユニット上の末端アミノ酸残基であるD-アラニルD-アラニンの類似体である。β-ラクタム系抗生物質とD-アラニル-D-アラニンの間の構造類似性が、ペニシリン結合タンパク質（PBP）の活性部位へのそれらの結合を容易にする。この分子のβ-ラクタム核は、PBP活性部位のSer403残基に不可逆的に結合（Ser403残基を不可逆的にアシル化）する。PBPのこの不可逆的阻害が、新生ペプチドグリカン層の最終的架橋（ペプチド転移）を妨げ、細胞壁合成を混乱させる。通常の状況下では、ペプチドグリカン前駆体が細菌細胞壁の再編成をシグナルし、その結果として、自己溶菌的細胞壁加水分解の活性化をトリガーする。β-ラクタム類による架橋の阻害は、ペプチドグリカン前駆体の構築を引き起こし、それが、新しいペプチドグリカンの産生を伴わない自己溶菌性ヒドロラーゼによる既存のペプチドグリカンの消化をトリガーする。これが、結果として、β-ラクタム系抗生物質の殺細菌作用をさらに強化する。
【０２１２】
カルバペネム類は、グラム陽性、グラム陰性、および/または嫌気性菌を処置するために使用される。
【０２１３】
オキサゾリジノン類は、一般に、グラム陽性菌感染を処置するために投与される。オキサゾリジノン類は、一般に、抵抗性を発生させた細菌に、他の抗生物質クラスの代替物として使用される。オキサゾリジノン類の例にはリネゾリドが含まれる。
【０２１４】
ペニシリン類は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、およびスピロヘータ感染を処置するために使用される広域抗生物質である。ペニシリン類でよく処置される状態には、肺炎球菌性髄膜炎および髄膜炎菌性髄膜炎、皮膚感染、耳感染、呼吸器感染、尿路感染、急性副鼻腔炎、肺炎、およびライム病が含まれる。ペニシリン類の例には、ペニシリン、アモキシシリン、アモキシシリン-クラブラン酸、アンピシリン、チカルシン、ピペラシン-タゾバクタム、カルベニシリン、ピペラシン、メズロシリン（mezocillin）、ベンザチンペニシリンG、ペニシリンVカリウム、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、およびジクロキサシリンが含まれる。
【０２１５】
ストレプトグラミン類は、既存の抗生物質の有効性を低下させた細菌抵抗性に応えて開発された抗生物質である。ストレプトグラミン類は極めて小さな薬物クラスであり、現在は非常に高価である。ストレプトグラミン類の例には、キヌプリスチン/ダルホプリスチン（dafopristin）およびプリスチナマイシンが含まれる。
【０２１６】
スルホンアミド類は、それらに対する細菌抵抗性の増加により、使用量が減少してしまった広域抗生物質である。スルホンアミド類は、一般に、リウマチ熱や尿路感染の再発性発作を処置するため、咽喉および胸部の感染、旅行者下痢症、百日咳、髄膜炎菌性疾患、性行為感染症、トキソプラズマ症、ならびに鼻炎を防止するために使用される。スルホンアミド類の例には、コトリモキサゾール、スルファメトキサゾール・トリメトプリム、スルファジアジン、スルファドキシン、およびトリメトプリムが含まれる。
【０２１７】
テトラサイクリン類は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、および/またはスピロヘータ感染を処置するために使用されることが多い広域抗生物質である。テトラサイクリン類は、慢性気管支炎および腹膜炎、尿路感染、くる病、クラミジア感染、淋疾、ライム病、および歯周病などの混合感染を処置するために使用されることが多い。テトラサイクリン類は、梅毒処置におけるペニシリンの代替療法であり、ざ瘡および炭疽を処置するためにも使用される。テトラサイクリン類の例には、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、およびドキシサイクリンが含まれる。
【０２１８】
本発明による、本明細書に開示する改変バクテリオファージとの組合せで有用であると、本明細書において考えられる他の抗微生物剤および抗生物質（その一部は上記のリストと重複している場合もある）には、次に挙げるものが含まれるが、これらに限るわけではない:アブリファム（abrifam）;アクロフロキサシン（acrofloxacin）;アプテシン、アモキシシリン＋クラブラン酸（clavulonic acid）;アパルシリン;アプラマイシン;アストロマイシン;アルベカシン;アスポキシシリン;アジドジリン（azidozillin）;アズロシリン;アズトレオナム;バシトラシン;ベンザチンペニシリン;ベンジルペニシリン;クラリスロマイシン、カルベンシリン（carbencillin）;セファクロル;セファドロキシル;セファレキシン;セファマンドール;セファパリン（cefaparin）;セファトリジン;セファゾリン;セフブペラゾン;セフカペン;セフジニル;セフジトレン;セフェピム;セフェタメト;セフィキシム;セフメタゾール;セフミノクス;セフォペラゾン;セフォラニド;セフォタキシム;セフォテタン;セフォチアム;セフォキシチン;セフピミゾール;セフピラミド;セフポドキシム;セフプロジル;セフラジン;セフロキサジン;セフスロジン;セフタジジム;セフトリアキソン;セフロキシム;セファレキシン;クロラムフェニコール;クロルテトラサイクリン;シクラシリン;シノキサシン;クレミゾールペニシリン;クレオシン、クレオシン-T、クロキサシリン;コリファム（corifam）;ダプトマイシン;ダプトマイシン;デメクロサイクリン;デスキノロン（desquinolone）;ジベカシン;ジクロキサシリン;ジリスロマイシン;ドキシサイクリン;エノキサシン;エピシリン;エタンブトール;ゲミフロキサシン;フェナンピシン（fenampicin）;フィナミシナ（finamicina）;フレロキサシン;フロモキセフ;フルクロキサシリン;フルメキン;フルリスロマイシン;ホスホマイシン;ホスミドマイシン;フシジン酸;ガチフロキサシン;ゲミフロキサシン;イセパミシン;イソニアジド;ジョサマイシン;カナマイシン;カスガマイシン;キタサマイシン;カルリファム（kalrifam）、ラタモキセフ;レボフロキサシン、レボフロキサシン;リンコマイシン;リネゾリド;ロメフロキサシン;ロラカルバフ（loracarbaf）;リメサイクリン;メシリナム;メタサイクリン;メチシリン;メトロニダゾール;メズロシリン;ミデカマイシン;ミノサイクリン;ミオカマイシン;モキシフロキサシン;ナフシリン;ナフシリン;ナリジクス酸;ネオマイシン;ネチルマイシン;ノルフロキサシン;ノボビオシン;オフラキサシン（oflaxacin）;オレアンドマイシン;オキサシリン;オキソリン酸;オキシテトラサイクリン;パロマイシン;パズフロキサシン;ペフロキサシン;ペニシリンg;ペニシリンv;フェネチシリン;フェノキシメチルペニシリン;ピペミド酸;ピペラシン・タゾバクタム合剤;ピロミド酸;プロカインペニシリン;プロピシリン;ピリメタミン;リファジン;リファブチン;リファミド;リファンピン;リファペンテン（rifapentene）;リフォマイシン（rifomycin）;リマクタン、ロファクト（rofact）;ロキタマイシン（rokitamycin）;ロリテトラサイクリン;ロキシスロマイシン;ルフロキサシン;シタフロキサシン;スパルフロキサシン;スペクチノマイシン;スピラマイシン;スルファジアジン;スルファドキシン;スルファメトキサゾール;シソマイシン;ストレプトマイシン;スルファメトキサゾール;スルフイソオキサゾール;キノプリ��タン（quinupristan）-ダルフォプリスタン（dalfopristan）;テイコプラニン;テモシリン;ガチフロキサシン;テトラサイクリン;テトロキソプリム;テリスロマイシン;チアンフェニコール;チカルシン;チゲサイクリン;トブラマイシン;トスフロキサシン;トリメトプリム;トリメトレキセート;トロバフロキサシン;バンコマイシン;ベルダマイシン（verdamicin）;アジスロマイシン;およびリネゾリド。
【０２１９】
改変バクテリオファージの用途
したがって、本発明者らは、阻害因子-改変バクテリオファージ（これは抗生物質抵抗性遺伝子または細胞生残遺伝子に対する阻害因子を発現させる）と組み合わせて、および/またはリプレッサー-改変バクテリオファージ（これは、SOS応答遺伝子に対する少なくとも1つのリプレッサー、または非SOS防御遺伝子に対する少なくとも1つの阻害因子もしくはリプレッサーを発現させる）と組み合わせて、および/または感受性改変バクテリオファージと組み合わせて使用した場合に、抗微生物剤は、抗微生物のみを使用するか、または非改変バクテリオファージと組み合わせて使用される抗微生物剤を使用した場合よりも、細菌感染または細菌バイオフィルムなどの細菌を死滅させるのに有効であることを実証した。本発明者らは、広範囲にわたる細菌および細菌バイオフィルムを標的とするために、改変バクテリオファージを、さまざまな異なる抗微生物剤と一緒に働くように適合させ得ること、ならびに他のバイオフィルム分解酵素を発現させるように修飾できることも発見した。いくつかの態様では、抗微生物剤を、本明細書に開示する少なくとも1つの改変バクテリオファージと組み合わせて、また任意で、阻害因子-改変バクテリオファージでもリプレッサー-改変バクテリオファージでも感受性改変バクテリオファージでもないが、治療遺伝子または毒素遺伝子またはバイオフィルム分解遺伝子を発現させるように改変されたバクテリオファージである追加のバクテリオファージと組み合わせて、使用する。そのようなバクテリオファージは当技術分野において周知であり、本明細書に開示する方法および組成物で使用するために包含される。
【０２２０】
細菌感染
本発明の一局面は、細菌などの微生物の増殖を阻害しかつ/または細菌などの微生物を殺す（もしくは細胞生存率を低下させる）ために、抗微生物剤と組み合わされた阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージを含む方法および組成物の使用に関する。この局面および本明細書に記載する全ての局面のいくつかの態様では、微生物が細菌である。いくつかの態様では、細菌がグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌である。いくつかの態様では、細菌が多剤抵抗性細菌である。さらなる態様では、細菌がポリミキシン抵抗性細菌である。いくつかの態様では、細菌が持続生残型細菌である。グラム陰性細菌の例は、例えば限定するわけではないが、緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ（A. bumannii）、サルモネラ属（Salmonella spp）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumonia）、赤痢菌属（Shigella spp.）および/またはステノトロホナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）である。ある態様では、本発明のファージを使って標的とされる細菌に、大腸菌、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）、ペスト菌（Yersina pestis）およびシュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）が含まれる。
【０２２１】
いくつかの態様では、本明細書に開示する方法および組成物を、細菌、例えば次に挙げるような細菌を殺すために、またはそのような細菌の生存率を低下させるために、使用することができる:セレウス菌（Bacillus cereus）、炭疽菌（Bacillus anbhracis）、セレウス菌、炭疽菌、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficle）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、ジフテリア菌（Corynebacteria diptheriae）、エンテロコッカス属（Enterococcus）（ストレプトコッカス（Streptococcus）D）、リステリア菌（Lieteria rnonocytogenes）、肺炎球菌感染（肺炎レンサ球菌）、ブドウ球菌感染およびレンサ球菌感染;グラム陰性細菌、例えばバクテロイデス属（Bacteroides）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ブルセラ属（Brucella）、カンピロバクター感染、腸管出血性大腸菌（EHEC/大腸菌O157:17）、腸管組織侵入性大腸菌（EIEC）、毒素原性大腸菌（ETEC）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、レジオネラ属（Legionella spp.）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、淋菌（Neisseria gonnorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、プロテウス属（Proteus spp.）、緑膿菌、サルモネラ属、赤痢菌属、コレラ菌（Vibrio cholera）およびエルシニア属（Yersinia）;抗酸菌、例えば結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium avium-intracellulars）、ヨーネ菌（Myobacterium johnei）、ライ菌（Mycobacterium leprae）、非定型細菌、クラミジア属（Chlamydia）、マイコプラズマ属（Myoplasma）、リケッチア属（Rickettsia）、スピロヘータ、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、回帰熱ボレリア（Borrelia recurrentis）、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorfii）および黄疸出血病レプトスピラ（Leptospira icterohemorrhagiae）、放線菌属（Actinomyces）、ノカルジア属（Nocardia）、緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ（A. bumannii）、サルモネラ属、肺炎桿菌（Klebsiella pneumonia）、赤痢菌属および/またはステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）ならびに他の雑多な細菌。
【０２２２】
細菌感染には、次に挙げるものが含まれるが、これらに限るわけではない:セレウス菌、炭疽菌（Bacillus anbhracis）、セレウス菌、炭疽菌、ボツリヌス菌、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficle）、破傷風菌、ウェルシュ菌、ジフテリア菌（Corynebacteria diptheriae）、エンテロコッカス属（ストレプトコッカスD）、リステリア菌（Lieteria monocytogenes）、肺炎球菌感染（肺炎レンサ球菌）、ブドウ球菌感染およびレンサ球菌感染/グラム陰性細菌、例えばバクテロイデス属、百日咳菌、ブルセラ属、カンピロバクター感染、腸管出血性大腸菌（EHEC/大腸菌O157:17）、腸管組織侵入性大腸菌（EIEC）、毒素原性大腸菌（ETEC）、インフルエンザ菌、ヘリコバクター・ピロリ、肺炎桿菌、レジオネラ属、モラクセラ・カタラーリス、淋菌（Neisseria gonnorrhoeae）、髄膜炎菌、プロテウス属、緑膿菌、サルモネラ属、赤痢菌属、コレラ菌（Vibrio cholera）およびエルシニア属;抗酸菌、例えば結核菌、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ（Mycobacterium avium-intracellulars）、ヨーネ菌（Myobacterium johnei）、ライ菌、非定型細菌、クラミジア属、マイコプラズマ属（Myoplasma）、リケッチア属、スピロヘータ、梅毒トレポネーマ、回帰熱ボレリア、ライム病ボレリア（Borrelia burgdorfii）および黄疸出血病レプトスピラ、ならびに他の雑多な細菌、例えば放線菌属およびノカルジア属が引き起こす感染。
【０２２３】
いくつかの態様では、微生物感染が、グラム陰性細菌、例えば緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ（A. bumannii）、サルモネラ属、肺炎桿菌（Klebsiella pneumonia）、赤痢菌属および/またはステノトロホモナス・マルトフィリアによって引き起こされる。微生物感染の例には、細菌性創傷感染、粘膜感染、腸感染、敗血症状態、肺炎、トラコーマ、オルニトーシス（onithosis）、トリコモナス症およびサルモネラ症、特に獣医学的診療におけるものが含まれる。
【０２２４】
緑膿菌が引き起こす感染の例には次に挙げるものが含まれる:A）院内感染;1.嚢胞性線維症患者および人工呼吸器装着患者における気道感染;2.菌血症および敗血症;3.創傷感染、特に熱傷患者におけるもの;4.尿路感染;5.侵襲的器具での術後感染;5.汚染された薬物溶液の静脈内投与による心内膜炎;7.後天性免疫不全症候群を持つ患者、がん化学療法、ステロイド療法を受けている患者、血液学的悪性疾患を持つ患者、臓器移植を受けた患者、腎代償療法を受けている患者、および重度の好中球減少を伴う他の状況における感染、B）市中感染;1.市中感染性気道感染;2.髄膜炎;3.汚染された水が引き起こす毛包炎および外耳道の感染;4.高齢者および糖尿病患者における悪性外耳炎;5.小児における踵骨の骨髄炎;汚染されたコンタクトレンズに一般に関連する眼感染;6.手が頻繁に水にさらされる人々における爪感染などの皮膚感染;7.消化管感染;8.筋骨格（muscoskeletal）系感染が含まれる。
【０２２５】
アシネトバクター・バウマンニ（A. baumannii）が引き起こす感染の例には、次に挙げるものが含まれる:A）院内感染、1.菌血症および敗血症、2.人工呼吸器装着患者における気道感染;3.侵襲的器具での術後感染;4.創傷感染、特に熱傷患者におけるもの;5.後天性免疫不全症候群を持つ患者、がん化学療法、ステロイド療法を受けている患者、血液学的悪性疾患を持つ患者、臓器移植を受けた患者、腎代償療法を受けている患者、および重度の好中球減少を伴う他の状況における感染、6.尿路感染;7.汚染された薬物溶液の静脈内投与による心内膜炎;8.蜂窩織炎、B）市中感染;a.市中感染性肺感染;2.髄膜炎;汚染されたコンタクトレンズに一般に関連する角膜炎（Cheratitis）;4.交戦地帯市中感染、C）非定型感染:1.慢性胃炎。
【０２２６】
ステノトロホナス・マルトフィリアが引き起こす感染の例には、菌血症、肺炎、髄膜炎、創傷感染および尿路感染が含まれる。汚染された消毒薬溶液、呼吸器具、モニタリング装置および製氷機により、いくらかの院内集団発生が起こる。感染は通常、宿主防御機構が損なわれた衰弱患者で起こる。
【０２２７】
肺炎桿菌が引き起こす感染の例には、市中感染性原発性大葉性肺炎、特に肺機能が損なわれている人々およびアルコール依存症患者におけるものが含まれる。これは、創傷感染、軟組織感染および尿路感染も引き起こした。
【０２２８】
サルモネラ属が引き起こす感染の例は、汚染された食品を摂食することによって獲得される。感染には、腸熱、腸炎および菌血症が含まれる。
【０２２９】
赤痢菌属が引き起こす感染の例には、胃腸炎（赤痢）が含まれる。
【０２３０】
阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージと少なくとも1つの抗微生物剤とを含む本明細書に開示する方法および組成物は、材料の殺菌処理または消毒、例えば表面消毒が要求される分野など、さまざまな分野でも使用することができる。
【０２３１】
阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージと少なくとも1つの抗微生物剤とを含む本明細書に開示する方法および組成物は、細胞、細胞群、または多細胞生物に感染する微生物を処置するために使用することができる。
【０２３２】
ある態様では、抗微生物剤と本明細書に記載する改変バクテリオファージとを使って、微生物の増殖および/または成長速度を低下させることができる。いくつかの態様では、微生物がグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌の一方または両方であり、そのような細菌が球菌（球状）であるか、桿菌であるか、ビブリオ（コンマ形）であるか、らせん状であるかを問わない。
【０２３３】
球菌のうち、ミクロコッカス属とスタフィロコッカス属は一般に皮膚と関連し、ストレプトコッカス属は一般に歯のエナメル質と関連して、齲蝕の一因になる。桿菌ファミリーのうち、バチルス（Bacillus）属の細菌は発生のさまざまな段階で写真に見られる内生胞子を産生し、セレウス菌（B. cereus）は、比較的軽症な食中毒（特に再加熱された揚げ物によるもの）を引き起こす。ビブリオ属のうち、コレラ菌（V. cholerae）は最も一般的な細菌であり、腸での細菌成長によって産生される毒素に起因する重症下痢疾患であるコレラを引き起こす。らせん状細菌のうち、ロドスピリラム属（rhodospirillum）および梅毒トレポネーマは、感染を引き起こす一般的な種である（梅毒トレポネーマは梅毒を引き起こす）。らせん状細菌は典型的には弱嫌気性（shallow anaerobic）条件で成長し、日光からエネルギーを得るために光合成する。
【０２３４】
さらにまた、本発明は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、もしくは混合細菌叢細菌または他の微生物のいずれかの増殖速度を低下させ、かつ/またはそれらを殺すために使用することができる、抗微生物剤と本明細書に開示する改変バクテリオファージとの使用、またはそれらを含む方法に関する。ある態様では、組成物は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、もしくは混合細菌叢細菌または他の微生物のいずれかの増殖速度を低下させ、かつ/またはそれらを殺す目的で使用するために、本質的に少なくとも1つの抗微生物剤と、少なくとも1つの改変バクテリオファージ、例えば本明細書に開示する阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージまたは感受性改変バクテリオファージとからなる。もう一つの態様では、組成物が、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、もしくは混合細菌叢細菌または他の微生物のいずれかの増殖速度を低下させ、かつ/またはそれらを殺す目的で使用するために、少なくとも1つの抗微生物剤と、少なくとも1つの改変バクテリオファージ、例えば本明細書に開示する阻害因子-改変バクテリオファージまたはリプレッサー-改変バクテリオファージまたは感受性改変バクテリオファージとを含有する。
【０２３５】
そのような細菌は、例えば限定するわけではないが、表7に列挙されるものである。細菌のさらなる例は、例えば限定するわけではないが、次に挙げるものである:炭疽菌（Baciccis Antracis）;大便レンサ球菌;ジフテリア菌;大腸菌;ストレプトコッカス・セリカラー（Streptococcus coelicolor）;化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）;ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Streptobacillus''oniliformis）;ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）;肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneurmoniae）;チフス菌（Salmonella typhi）;パラチフス菌（Salmonella paratyphi）;パラチフスB菌（Salmonella schottmulleri）;パラチフスC菌（Salmonella hirshieldii）;表皮ブドウ球菌;黄色ブドウ球菌;肺炎桿菌（Klebsiella pzeumoniae）;レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）;ヘリコバクター・ピロリ;肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumonia）;結核菌;ライ菌;腸炎エルシニア（Yersinia enterocolitica）;ペスト菌;コレラ菌（Vibrio cholerae）;腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）;発疹チフスリケッチア（Rickettsia prowozekii）;リケッチア・リケッチイ（Rickettsia rickettsii）;痘瘡リケッチア（Rickettsia akari）;クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）;破傷風菌;ウェルシュ菌;ノーヴィ菌（Clostridianz novyii）;クロストリジウム・セプティカム（Clostridianz septicum）;ボツリヌス菌;レジオネラ・ニューモフィラ;インフルエンザ菌（Hemophilus influenzue）;パラインフルエンザ菌（Hemophilus parainfluenzue）;ヘモフィルス・エジプチウス（Hemophilus aegyptus）;オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）;トラコーマクラミジア（Chlamydia trachonZatis）;百日咳菌（Bordetella pertcsis）;赤痢菌属;カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）;プロテウス属;シトロバクター属（Citrobacter spp.）;エンテロバクター属（Enterobacter spp.）;緑膿菌;プロピオン酸菌属（Propionibacterium spp.）;炭疽菌;シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）;鼠咬症スピリルム（Spirrilum minus）;髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）;リステリア菌;淋菌（Neisseria gonorrheae）;梅毒トレポネーマ;野兎病菌（Francisella tularensis）;ブルセラ属;回帰熱ボレリア;ボレリア・ハームシイ（Borrelia hermsii）;ボレリア・ツリカテ（Borrelia turicatue）;ライム病ボレリア;マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）;スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）;メチシリン抵抗性黄色ブドウ球菌（Methicillin-resistant Staphyloccus aureus）;バンコマイシン抵抗性腸球菌;および多剤抵抗性細菌（例えば2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上の異なる薬物に対して抵抗性である細菌）。
【０２３６】
（表7）細菌の例
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【０２３７】
いくつかの態様では、既に薬剤抵抗性である細菌株、例えばメチシリン抵抗性黄色ブドウ球菌（MRSA）もしくはバンコマイシン抵抗性腸球菌（VRE）またはその変種株を処置するために、抗微生物剤と本明細書に記載する改変バクテリオファージとを使用することができる。
【０２３８】
いくつかの態様において、本発明では、一定の薬物に対する抵抗性を維持しているグラム陽性細菌と闘うために、抗微生物剤および本明細書に記載する改変バクテリオファージを、他の抗微生物剤および/または抗生物質とあらゆる組合せで使用すること、およびその使用方法も考えられる。
【０２３９】
いくつかの態様では、感染、例えば細菌感染および他の状態、例えば尿路感染、耳感染、副鼻腔感染、皮膚の細菌感染、肺の細菌感染、性行為感染症、結核、肺炎、ライム病、およびレジオネラ病などを処置するために、抗微生物剤と本明細書に開示する改変バクテリオファージとを使用することができる。したがって、微生物感染に起因する上記の状態および他の状態、例えば細菌感染またはバイオフィルムはいずれも、本発明の組成物によって防止または処置することができる。
【０２４０】
バイオフィルム
本発明のもう一つの局面は、細菌バイオフィルム、例えば医療現場、または工業現場、またはバイオテクノロジー現場における細菌バイオフィルムを排除しまたは減少させるために、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージを任意の抗微生物剤と組み合わせて使用することに関する。
【０２４１】
例えば、緑膿菌を含むいくつかの細菌は、バイオフィルムと呼ばれる緻密に編成された多細胞構造物を、インビボで能動的に形成する。バイオフィルムの産生は、嚢胞性線維症およびびまん性汎細気管支炎を持つ患者におけるシュードモナス肺感染ならびに他の多くの疾患に見られるような、感染過程の持続にとって重要である。バイオフィルムは宿主免疫細胞による食作用に対して典型的には抵抗性であり、バイオフィルム構造物中の細菌の死滅に関して、抗生物質の有効性は10分の1〜1000分の1に低下し得る。バイオフィルムの産生と編成は、クオラムセンシング系によって支配される。緑膿菌などの細菌におけるクオラムセンシング系を混乱させることは、それがバイオフィルム形成を混乱させ、アルギナート産生も阻害するので、重要な抗病原活性である。
【０２４２】
改変バクテリオファージを含む組成物を投与する対象の選択
いくつかの態様では、本明細書に記載する方法を適用できる対象、または少なくとも1つの抗微生物剤と阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージとを含む組成物の投与を適用できる対象が、所望する処置レジメンに基づいて選択される。例えば対象は、その対象が細菌感染を持ち、その細菌がバイオフィルムを形成する場合、または対象が抗微生物剤による先行する治療または投与に対して非応答性であった場合に、処置のために選択される。
【０２４３】
したがって、いくつかの態様では、抗微生物剤の効果を増強するために、少なくとも1つの抗微生物剤と少なくとも1つの阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージとの組合せが、対象に投与される。
【０２４４】
いくつかの態様では、少なくとも1つの抗微生物剤、例えば少なくとも2個、3個、または4個、または10個もの異なる抗微生物剤と、本明細書に開示する少なくとも1つの改変バクテリオファージ、例えば少なくとも2個、3個、または4個、または10個もの異なる、本明細書に開示する改変バクテリオファージとを含む組成物を、対象に投与することができる。いくつかの態様において、組成物は、抗微生物剤と少なくとも1つの、もしくは多種多様な、リプレッサー-改変バクテリオファージとを、少なくとも1つの、もしくは多種多様な、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/または少なくとも1つの、または種々の、感受性改変バクテリオファージと共に含むことができる。代替的態様において、組成物は、少なくとも2個、または少なくとも3個、4個、5個または10個もの異なる阻害因子-改変バクテリオファージを含むことができ、それらの阻害因子-改変バクテリオファージのそれぞれは、異なる抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子に対する少なくとも1つの阻害因子をコードする核酸を含む。代替的態様において、組成物は、少なくとも2個、または少なくとも3個、4個、5個または10個もの異なるリプレッサー-改変バクテリオファージを含むことができ、それらのリプレッサー-改変バクテリオファージのそれぞれは、異なるSOS応答遺伝子に対する少なくとも1つのリプレッサーおよび/または非SOS防御遺伝子に対する少なくとも1つのリプレッサーもしくは阻害因子をコードする核酸を含む。本発明の組成物および方法では、抗微生物剤の任意の組合せおよび混合物ならびに阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージの混合物が有用である。
【０２４５】
いくつかの態様では、抗微生物剤が、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージの投与と同時に、またはその前もしくは後に、対象に投与される。いくつかの態様では、抗微生物剤を、活性の特異的徐放が起こるように製剤化することができ、例えば抗微生物剤は徐放性カプセル剤中に存在する。そのような態様において、徐放用に製剤された抗微生物剤は、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージの投与と同時に、並行して、またはその投与後に、対象に投与することができる。時間依存的に放出させるための抗微生物剤の製剤方法は、本明細書では、「薬学的製剤および組成物」と見出しを付けた項において「持続放出性薬学的組成物」として開示する。したがって、そのような態様では、徐放性抗微生物剤を、抗微生物剤が活性になるまでの時間とは無関係に、改変バクテリオファージの投与と同時に（すなわち並行して）、または改変バクテリオファージの投与前もしくは投与後に、対象に投与することができる。いくつかの態様では、改変バクテリオファージの投与に先だって抗微生物剤を投与することができ、抗微生物剤が徐放性カプセルザイから放出される時点が改変バクテリオファージを投与する時点と一致する。
【０２４６】
いくつかの態様において、抗微生物剤はプロドラッグであることができ、この場合、それは第2の薬剤によって活性化される。したがって、そのような態様では、抗微生物プロドラッグ薬剤を、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージの投与と同時に、並行して、またはその前もしくは後に、対象に投与することができ、プロドラッグをその活性型へと活性化する薬剤の投与は、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージの投与と同時に、並行して、またはその前もしくは後に、行うことができる。
【０２４７】
いくつかの態様では、本明細書に開示する組成物を投与するための対象が、抗微生物剤の特異的処置レジメンを必要する対象を同定することによって選択され、その対象に、抗微生物剤が、本明細書に開示する阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージの投与と並行して、またはその前もしくは後に投与される。
【０２４８】
典型例として嚢胞性線維症を持つ対象の場合を挙げると、対象には、慢性気管支内感染、例えば緑膿菌（pseudomonas aeruginosis）またはステノトロホモナス・マルトフィリア（stentrophomonas maltophilia）が引き起こすものなどを回避するために、抗微生物剤を投与することができるだろう。使用することができるそのような抗微生物剤の一つはコリスチンであるが、対象におけるそのような気管支内感染を効率よく防止するのに必要な用量で必要な継続期間にわたってコリスチンを投与することは、毒性が高く、場合によっては致死的である。したがっていくつかの態様では、処置レジメンのために選択されたそのような対象に、抗微生物剤と阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージとを含む、本明細書に開示する組成物が投与されるだろう。こうして、そのような態様では、抗微生物剤を、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージと組み合わせて使用する場合には、そのような抗微生物剤を単独で使用する場合と比較して、低い用量で使用することができる。したがって、本発明の一局面は、抗微生物剤の用量を低減または減少させると同時に、そのような抗微生物剤の効力を維持することで、より高い用量に関連する毒性副作用を低減するための方法に関する。
【０２４９】
薬学的製剤および組成物
本明細書に開示する阻害因子-改変バクテリオファージおよびリプレッサー-改変バクテリオファージは、1つ以上の薬学的に許容される抗微生物剤と組み合わせて製剤化することができる。いくつかの態様では、特定の阻害因子-改変バクテリオファージおよびリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージと組み合わせるために、異なる抗微生物剤の組合せを適合させることができ、ここで、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージは、罹病および死亡の一因となる、異なる（または同じ）微生物または細菌を標的とするようにデザインされる。本明細書に開示する阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージと抗微生物剤とを含む薬学的に許容される組成物は、動物、例えばヒトへの、体内投与に適している。
【０２５０】
いくつかの態様では、本明細書に開示する阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージを、工業的滅菌、滅菌用化学薬品、例えば洗剤、消毒薬、およびアンモニウム系化学薬品（例えば4級アンモニウム化合物、例えば活性成分として10.5％のN-アルキルジメチル-ベンジルアンモニウムHClと5.5％のグルタルアルデヒドとを含有するQUATAL（Ecochimie Ltee、カナダ国ケベック州））などに使用することができ、抗微生物剤の処置または投与と並行して、またはその前もしくは後に使用することができる。そのような滅菌化学薬品は、当技術分野では、工業的作業面を滅菌するために（例えば食品加工または病院環境において）、典型的に使用され、動物への投与には適さない。
【０２５１】
本発明のもう一つの局面は、阻害因子-改変バクテリオファージおよび/またはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージと抗微生物剤と薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物に関する。本発明の改変バクテリオファージにとって適切な担体およびそれらの製剤は、Osloら編「Remington's Pharmaceutical Sciences」（第16版、1980、Mack Publishing Co.）に記載されている。典型的には、製剤を等張性にするために、製剤には適当な量の薬学的に許容される塩を使用する。担体の例には、緩衝液、例えば食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液が含まれる。溶液のpHは好ましくは約5〜約8、より好ましくは約7.4〜約7.8である。さらなる担体には、持続放出調製物、例えば造形品（例えばリポソーム、フィルムまたは微粒子）の形態をとる固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれる。例えば投与経路および投与される改変バクテリオファージの濃度などに依存して、一定の担体が、より好ましい場合があることは、当業者には明白だろう。
【０２５２】
ヒトへの投与は、根底にある状態によって決まる手段を使って、達成することができる。例えば改変バクテリオファージが個体の肺内に送達されるべき場合は、吸入器を使用することができる。組成物が腸または結腸のどこか一部に送達されるべき場合は、コート錠、坐剤、または経口投与される液剤、錠剤、カプレットなどを使用することができる。当業者は、当技術分野における一般的な知識または技能に照らして、本発明のファージを投与する適当な方法を決定することができるだろう。
【０２５３】
本明細書に開示する化合物は、医薬品として使用するか、本明細書に開示する有用性の1つ以上を持つ薬学的組成物を製剤するために使用することができる。それらは、培養細胞にインビトロ投与するか、体内の細胞にインビボ投与するか、または対象の体外にあって、後に、同じ対象または別の対象の身体に戻すことができる細胞に、エクスビボ投与することができる。そのような細胞はバラバラであるか、組織移植術における固形組織として与えられる。
【０２５４】
少なくとも1つの抗微生物剤と本明細書に開示する少なくとも1つの改変バクテリオファージ（すなわち阻害因子改変バクテリオファージおよび/もしくはリプレッサー-改変バクテリオファージおよび/または感受性改変バクテリオファージ）とを含む組成物は、医薬品または他の薬学的組成物を製造するために使用することができる。少なくとも1つの抗微生物剤と改変バクテリオファージとの組合せを含む、本明細書に開示する組成物の使用は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。本組成物は、当技術分野において公知の、その組成物を対象に送達するのに役立つ他のコンポーネントまたは薬剤を、さらに含むことができる。本明細書に開示する薬剤へのそのような担体および他のコンポーネントの添加は、十分に、当技術分野の技術水準内である。
【０２５５】
いくつかの態様では、組成物が、細菌に感染する物体を滅菌するための組成物、例えば病院装置、工業装置、医療器具および食品を滅菌するための組成物である。もう一つの態様では、組成物が、対象（例えばヒトまたは動物対象）における細菌感染を処置するのに有用な薬学的組成物である。
【０２５６】
いくつかの態様では、本明細書に開示する薬学的組成物を、血液脳関門の通過または内皮との直接接触に適合させた製剤として投与することができる。いくつかの態様では、薬学的組成物を、全身送達に適合させた製剤として投与することができる。いくつかの態様では、組成物を、特定臓器（例えば限定するわけではないが肝臓、骨髄）への送達、または全身送達に適合させた製剤として投与することができる。
【０２５７】
あるいは、薬学的組成物を、エクスビボで、細胞の培養培地に添加することもできる。そのような組成物は、抗微生物剤および改変バクテリオファージの他にも、投与を容易にしかつ/または取り込みを強化することが知られている薬学的に許容される担体および他の成分または薬剤（例えば食塩水、ジメチルスルホキシド、脂質、ポリマー、アフィニティーに基づく細胞特異的ターゲティング系）を含有することができる。いくつかの態様では、薬学的組成物をゲル、スポンジ、または他の透過性マトリックス（例えばペレットまたは円盤の形状をしたもの）に組み入れて、持続的局所放出のために内皮の近傍に置くことができる。組成物は、単回投与で投与するか、異なる時点で投与される複数回投与で投与することができる。
【０２５８】
薬学的組成物は、任意の公知の経路で対象に投与することができる。例えば、組成物は、粘膜経路、肺経路、局所外用経路、または他の限局的経路もしくは全身（例えば経腸および非経口）経路で投与することができる。本明細書で使用する「非経口投与」および「非経口投与される」という表現は、経腸投与および局所外用投与以外の、通常は注射による投与様式を意味し、これには、非限定的に、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、室内、嚢内、眼窩内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内注射、注入および他の注射または注入技法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本明細書で使用する「全身投与」「全身投与される」「末梢投与」および「末梢投与される」という表現は、動物の系内に進入し、したがって代謝作用および他の類似する過程に供されるような、本明細書に開示する薬剤の投与、例えば皮下投与を意味する。
【０２５９】
「薬学的に許容される」という表現は、本明細書においては、堅実な医学的判断（sound medical judgement）の範囲内で、合理的なベネフィット/リスク比に見合うように、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わない、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適した、化合物、材料、組成物および/または剤形を指すために使用される。
【０２６０】
本明細書において使用される「薬学的に許容される担体」という表現は、本薬剤をある臓器または身体の一部分から他の臓器または身体の一部分へと運搬または輸送するのに関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば液状または固形の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料を意味する。各担体は製剤の他の成分と適合するという意味で「許容される」べきであり、例えば担体は薬剤が処置に及ぼす影響を減少させない。言い換えると、担体は薬学的に不活性である。
【０２６１】
投薬の量および時機、製剤および投与経路の適切な選択は、細菌感染または微生物による感染を持つ対象において有利な応答を達成することを目標にして行うことができ、例えば有利な応答は、微生物または細菌の死滅もしくは排除、または対象もしくはそのリスクがある対象における細菌感染の管理もしくは増殖の阻害（すなわち効力）、および対象に対する過度の毒性または他の危害を回避すること（すなわち安全性）である。したがって「有効」とは、所望の効果または有利な応答を達成するための条件の定型的操作を伴うそのような選択を指す。
【０２６２】
薬学的組成物のボーラスは短期間で対象に投与することができ、例えば1日1回は好都合な投薬スケジュールである。あるいは、1日に例えば2〜12回投与する目的で、有効1日量を複数の用量に分割することもできる。対象において、特に細菌感染または微生物による感染の領域内またはその領域付近において、組成物の一過性または持続的濃度が達成されて、所望の治療応答または保護がもたらされるように、薬学的組成物中の活性成分の投薬量レベルも変化させることができる。所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで投与を開始し、所望の効果が達成されるまで、投薬量を徐々に増加させることも、当技術分野の技量の範囲内である。
【０２６３】
対象に投与されるべき薬学的組成物の量は、当業者に公知の因子、例えばその抗微生物剤の生物活性および生物学的利用率（例えば改変バクテリオファージの体内での半減期、安定性、および代謝）;抗微生物剤の化学的性質（例えば分子量、疎水性、および溶解度）;投与経路および投与スケジュールなどに依存する。任意の特定対象について達成されるべき、抗微生物剤と本明細書に開示する改変バクテリオファージとを含む組成物の具体的用量レベルが、年齢、性別、健康、病歴、体重、1つ以上の他の薬物との組合せ、および疾患の重症度、対象が感染している細菌株または微生物、例えば多剤抵抗性細菌株による感染などを含むさまざまな因子に依存し得ることも、理解されるだろう。
【０２６４】
細菌感染または細菌定着の処置に関して「処置」という用語は、とりわけ、疾患の発生を防止すること、または疾患の経過を変化させる（例えば限定するわけではないが、疾患の進行を遅らせる）こと、または疾患の症状を逆転させること、または対象における1つ以上の症状および/または1つ以上の生化学的マーカーを減少させること、1つ以上の症状が悪化または進行するのを防止すること、回復を促進しまたは予後を改善すること、および/または疾患を持たない対象における疾患を防止することまたは既存の疾患の進行を遅くするか減少させることを包含する。
【０２６５】
いくつかの態様において、処置の効力は、罹病率または死亡率の改善（例えば選ばれた集団に関する生残曲線の延長）として測定することができる。予防的方法（例えば再発の防止または再発の発生率の低減）も処置とみなされる。
【０２６６】
生細菌数および/または活性を低下させることを目標とする、投薬量、製剤、投薬体積、レジメン、および結果を解析するための方法は、さまざまであり得る。したがって最小および最大有効投薬量は、投与方法に依存して変動する。細菌感染または微生物による感染に関連する臨床変化の抑止は、特定の投薬量範囲内で起こり得るが、それは、その投薬量を投与される生物、投与経路、抗微生物剤が本明細書に開示する改変バクテリオファージと一緒に投与されるかどうか、またいくつかの態様では、他の共刺激分子、および特定のレジメン投与に依存して変動する。例えば、一般的に、経鼻投与に要求される投薬量は、経口投与、経腸投与、直腸投与または経膣投与よりも少ない。
【０２６７】
本発明で使用するための経口または経腸製剤については、通常の手順に従い、当技術分野において周知の固形担体を使って、錠剤を製剤することができる。本発明の方法で使用するための経口製剤に使用されるカプセルは、薬学的に許容される任意の材料、例えばゼラチンまたはセルロース誘導体から製造することができる。例えば米国特許第4,704,295号「Enteric Film-Coating Compositions」1987年11月3日発行;米国特許第4,556,552号「Enteric Film-Coating Compositions」1985年12月3日発行;米国特許第4,309,404号「Sustained Release Pharmaceutical Compositions」1982年1月5日発行;および米国特許第4,309,406号「Sustained Release Pharmaceutical Compositions」1982年1月5日発行（これらは参照によりその全てが本明細書に組み入れられる）に記載されているものなど、経口投与される剤形のための持続放出性経口送達システムおよび/または腸溶コーティングも考えられる。
【０２６８】
固形担体の例には、デンプン、砂糖、ベントナイト、シリカ、および他の一般に使用される担体が含まれる。さらに、本発明の製剤に使用することができる担体および希釈剤の限定でない例には、食塩水、シロップ、デキストロース、および水が含まれる。
【０２６９】
本発明の実施では、別段の表示がない限り、当技術分野の技能の範囲内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えDNA、タンパク質化学、および免疫学の通常の技法を使用するであろう。そのような技法は文献に記載されている。例えば、以下の文献を参照されたい。
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【０２７０】
本発明のいくつかの態様は、以下の番号付き項目のいずれかに定義され得る。
1.プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、改変バクテリオファージ。
2.抗生物質抵抗性遺伝子がcat、vanAもしくはmecDまたはその変種を含む群から選択される、項目1のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
3.細胞生残遺伝子がRecA、RecB、RecC、spot、RelAまたはその変種を含む群から選択される、項目1または2のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
4.物質がsiRNA、アンチセンス核酸、asRNA、RNAi、miRNAおよびその変種を含む群から選択される、項目1〜3のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
5.物質がアンチセンスRNA（asRNA）である、項目1〜4のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
6.少なくとも2つの異なる細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも2つの物質をコードする核酸を含む、項目1〜5のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
7.RecA、RecBまたはRecCの少なくとも2つを阻害する少なくとも2つの物質をコードする核酸を含む、項目1〜6のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
8.プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸がSOS応答遺伝子および/または細菌防御遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、改変バクテリオファージ。
9.SOS応答遺伝子のリプレッサーがlexAである、項目8のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
10.防御遺伝子のリプレッサーがSoxRである、項目8または9のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
11.リプレッサーがmarR、arcR、fur、crp、icdAまたはその変種もしくはフラグメントからなる群より選択される、項目8〜10のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
12.少なくとも1つのSOS応答遺伝子の少なくとも2つの異なるリプレッサーをコードする核酸を含む、項目8〜11のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
13.少なくとも1つの細菌防御遺伝子の少なくとも2つの異なるリプレッサーをコードする核酸を含む、項目8〜12のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
14.プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも1つの物質をコードする、改変バクテリオファージ。
15.抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる物質が抗微生物剤の抗微生物効果の効力を少なくとも10％増加させる、項目14記載のバクテリオファージ。
16.抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる物質が細菌細胞に対する抗微生物剤の侵入を増加させる、項目14または15のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
17.細菌細胞への抗微生物剤の侵入を増加させる物質がポリンである、項目14〜16のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
18.ポリンがompFまたはその変種もしくはフラグメントである、項目14〜17のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
19.抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる物質がcraAまたはその変種もしくはフラグメントである、項目14〜15のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
20.抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる物質がcraAまたはその変種もしくはフラグメントである、項目14〜15のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
21.抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる物質が細菌細胞中で特異的に発現される経路を改変する、項目14〜15のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
22.改変が細菌細胞中で特異的に発現される経路の阻害または活性化である、項目14〜15または21のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
23.物質が細菌細胞中の鉄-硫黄クラスターを増加させる、項目14〜15のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
24.物質が、細菌細胞中の酸化ストレスを増加させるか、細菌細胞中のヒドロキシル（hydrozyl）ラジカルを増加させる、項目14〜15のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
25.物質が、抗微生物剤の非存在下では、細菌細胞にとって実質的に毒性でない、項目14〜24のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
26.物質が化学療法剤でもタンパク質毒素でもない、項目14〜25のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
27.抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも2つの異なるタンパク質をコードする核酸を含む、項目14〜26のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
28.タンパク質がcsrAおよびompFまたはその変種もしくはフラグメントである、項目14〜27のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
29.溶原性バクテリオファージである、項目1〜28のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
30.溶原性バクテリオファージがM13バクテリオファージである、項目1〜29のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
31.溶菌性バクテリオファージである、項目1〜29のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
32.溶菌性バクテリオファージがT7バクテリオファージである、項目1〜29または31のいずれか一項記載のバクテリオファージ。
33.細菌が感染した表面に、（a）バクテリオファージプロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、バクテリオファージと、（b）少なくとも1つの抗微生物剤とを投与する工程を含む、細菌感染を阻害または排除するための方法。
34.細菌が感染した表面に、（a）バクテリオファージプロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸がSOS応答遺伝子または細菌防御遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、バクテリオファージと、（b）少なくとも1つの抗微生物剤とを投与する工程を含む、細菌感染を阻害または排除するための方法。
35.細菌が感染した表面に、（a）バクテリオファージプロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも1つの物質をコードする、バクテリオファージと、（b）少なくとも1つの抗微生物剤とを投与する工程を含む、細菌感染を阻害または排除するための方法。
36.バクテリオファージが項目1〜7または29〜32のいずれか一項記載のバクテリオファージである、項目33記載の方法。
37.バクテリオファージが項目8〜13または29〜32のいずれか一項記載のバクテリオファージである、項目34記載の方法。
38.バクテリオファージが項目14〜32のいずれか一項記載のバクテリオファージである、項目35記載の方法。
39.バクテリオファージと抗微生物剤の投与が同時に行われる、項目33〜38のいずれか一項記載の方法。
40.バクテリオファージの投与が抗微生物剤の投与に先だって行われる、項目33〜38のいずれか一項記載の方法。
41.抗微生物剤の投与がバクテリオファージの投与に先だって行われる、項目33〜38のいずれか一項記載の方法。
42.抗微生物剤がキノロン系抗微生物剤である、項目33〜38のいずれか一項記載の方法。
43.抗微生物剤がシプロフロキサシン、レボフロキサシン、およびオフロキサシン、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン、モキシフロキサシン、スパルフロキサシン、ゲミフロキサシン、パズフロキサシンまたはその変種もしくは類似体からなる群より選択される、項目33〜42記載の方法。
44.抗微生物剤がオフロキサシンまたはその変種もしくは類似体である、項目33〜38のいずれか一項記載の方法。
45.抗微生物剤がアミノグリコシド系抗微生物剤である、項目33〜38のいずれか一項記載の方法。
46.抗微生物剤がアミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネトロマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ネオマイシンまたはその変種もしくは類似体からなる群より選択される、項目45記載の方法。
47.抗微生物剤がゲンタマイシンまたはその変種もしくは類似体である、項目33〜38のいずれか一項記載の方法。
48.抗微生物剤がβ-ラクタム系抗生物質抗微生物剤である、項目33〜38のいずれか一項記載の方法。
49.抗微生物剤がペニシリン、アンピシリン、ペニシリン誘導体、セファロスポリン類、モノバクタム類、カルバペネム類、β-ラクタマーゼ阻害剤またはその変種もしくは類似体からなる群より選択される、項目33〜38のいずれか一項記載の方法。
50.抗微生物剤がアンピシリンまたはその変種もしくは類似体である、項目33〜38のいずれか一項記載の方法。
51.細菌が対象中に存在する、項目33〜38のいずれか一項記載の方法。
52.対象が哺乳動物である、項目33〜51のいずれか一項記載の方法。
53.哺乳動物がヒトである、項目33〜52のいずれか一項記載の方法。
54.細菌がバイオフィルム中に存在する、項目33〜53のいずれか一項記載の方法。
55.プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、バクテリオファージと、少なくとも1つの抗微生物剤とを含む組成物。
56.プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸がSOS応答遺伝子または抗微生物防御遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、バクテリオファージと、少なくとも1つの抗微生物剤とを含む組成物。
57.プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも1つのタンパク質をコードする、バクテリオファージと、少なくとも1つの抗微生物剤とを含む組成物。
58.抗微生物剤がキノロン系抗微生物剤またはアミノグリコシド系抗微生物剤またはβ-ラクタム系抗微生物剤である、項目55〜57のいずれか一項記載の組成物。
59.バクテリオファージが項目1〜7または29〜32のいずれかに従う、項目55または58のいずれか一項記載の組成物。
60.バクテリオファージが項目8〜13または29〜32のいずれかに従う、項目56または58記載の組成物。
61.バクテリオファージが項目14〜32のいずれかに従う、項目57または58記載の組成物。
62.プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗生物質抵抗性遺伝子および/または細胞生残修復遺伝子を阻害する少なくとも1つの物質をコードする、バクテリオファージを含むキット。
63.プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸がSOS応答または抗微生物防御遺伝子の少なくとも1つのリプレッサーをコードする、バクテリオファージを含むキット。
64.プロモーターに機能的に連結された核酸を含み、該核酸が抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させる少なくとも1つのタンパク質をコードする、バクテリオファージと、少なくとも1つの抗微生物剤とを含むキット。
65.抗微生物剤を単独で使用した場合と比較して細菌の数を減少させるための、抗微生物剤と組み合わされた、項目1〜23のいずれか一項記載のバクテリオファージの使用。
66.細菌がバイオフィルム中に存在する、項目62〜65のいずれか一項記載の使用。
67.項目1〜23のいずれか一項記載の少なくとも2つのバクテリオファージと少なくとも1つの抗微生物剤との組合せ。
68.抗微生物剤がキノロン系抗微生物剤である、項目67記載の組合せ。
69.抗微生物剤がシプロフロキサシン、レボフロキサシン、およびオフロキサシン、ガチフロキサシン、ノルフロキサシン、ロメフロキサシン、トロバフロキサシン、モキシフロキサシン、スパルフロキサシン、ゲミフロキサシン、パズフロキサシンまたはその変種もしくは類似体からなる群より選択される、項目67記載の組合せ。
70.抗微生物剤がオフロキサシンまたはその変種もしくは類似体である、項目67記載の組合せ。
71.抗微生物剤がアミノグリコシド系抗微生物剤である、項目67記載の組合せ。
72.抗微生物剤がアミカシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネトロマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ネオマイシンまたはその変種もしくは類似体からなる群より選択される、項目67記載の組合せ。
73.抗微生物剤がゲンタマイシンまたはその変種もしくは類似体である、項目67記載の組合せ。
74.抗微生物剤がβ-ラクタム系抗生物質抗微生物剤である、項目67記載の組合せ。
75.抗微生物剤がペニシリン、アンピシリン、ペニシリン誘導体、セファロスポリン類、モノバクタム類、カルバペネム類、β-ラクタマーゼ阻害剤またはその変種もしくは類似体からなる群より選択される、項目67記載の組合せ。
76.抗微生物剤がアンピシリンまたはその変種もしくは類似体である、項目67記載の組合せ。
77.項目68〜76に記載の抗微生物剤のいずれかの組合せを含む、項目67記載の組合せ。
78.請求項1〜32のいずれか一項記載のバクテリオファージと少なくとも1つの抗微生物剤との使用。
79.請求項1〜32記載のバクテリオファージのいずれかの少なくとも2つと少なくとも1つの抗微生物剤との組合せの使用。
80.細菌感染を阻害または排除するための、請求項78もしくは79記載の、または請求項1〜32のいずれか一項記載の、バクテリオファージの使用。
81.細菌が対象中に存在する、請求項78または79記載のバクテリオファージの使用。
82.対象が哺乳動物である、請求項81記載のバクテリオファージの使用。
83.哺乳動物がヒトである、請求項82記載のバクテリオファージの使用。
84.細菌がバイオフィルム中に存在する、請求項78または79記載のバクテリオファージの使用。
85.細菌感染を阻害または排除するための、請求項55〜57のいずれか一項記載の組成物の使用。
86.細菌が対象中に存在する、請求項85記載の組成物の使用。
87.対象が哺乳動物である、請求項86記載の組成物の使用。
88.哺乳動物がヒトである、請求項87記載の組成物の使用。
89.細菌がバイオフィルム中に存在する、請求項85記載の組成物の使用。
【０２７１】
以下の実施例は、本発明を例証するために記載するものであり、本発明の限定であるとみなしてはならない。
【実施例】
【０２７２】
実施例
本明細書に提示された実施例は、阻害剤操作されたバクテリオファージ、リプレッサー操作されたバクテリオファージ、または感受性剤操作されたバクテリオファージ、および抗微生物剤を含む方法および組成物に関する。本願の全体にわたって、様々な刊行物が参照される。刊行物およびそれら刊行物内に引用された参照の全ての開示が、本発明が関する技術の状態をより完全に記載するため、参照により完全に本願に組み入れられる。以下の実施例は、本発明の特許請求の範囲の範囲を限定するためのものではなく、ある種の態様を例示するためのものである。当業者に想到されるであろう例示された方法の任意の変動が、本発明の範囲内にあるものとする。
【０２７３】
方法
細菌株、バクテリオファージ、および化学物質。O抗原を欠く大腸菌(E.coli)K-12 EMG2細胞は、Yale Coli Genetic Stock Center(CGSC#4401)から入手された。キノロン耐性にするgyrA111変異を含有している大腸菌RFS289細胞は、Yale Coli Genetic Stock Center(CGSC#5742)から入手された。M13mp18バクテリオファージは、New England Biolabs,Inc.(Ipswich,MA)から購入された。ファージをクローニングし、増幅し、ファージを播種するために使用された大腸菌XL-10細胞は、Stratagene(La Jolla, CA)から入手された。
【０２７４】
T4 DNAリガーゼおよび全ての制限酵素は、New England Biolabs,Inc.(Ipswich,MA)から購入された。PCR反応物は、INVITROGEN(Carlsbad, CA)のPCR SUPERMIX HIGH FIDELITYまたはNew England Biolabs, Inc.(Ipswich, MA)のPHUSION HIGH FIDELITYを使用して実施された。PCR反応物および制限消化物の精製は、QIAQUICK GEL ExtractionキットまたはPCR Purificationキット(QIAGEN, Valencia, CA)により実施された。プラスミドDNAはQIAPREP SPIN Miniprepキット(QIAGEN, Valencia, CA)を使用して単離された。全てのその他の化学物質および材料は、Fisher Scientific, Inc.(Hampton, NH)から購入された。
【０２７５】
遺伝子ネットワークを標的とするためのM13mp18バクテリオファージの操作。操作されたファージを構築するため、まず、lexA3遺伝子、soxR遺伝子、csrA遺伝子、およびompF遺伝子を、pZE11GベクターのPLtetOプロモーターの制御下に置いた50、51。プライマー
2011518543.tif 000014
および
2011518543.tif 000015
を用いたPCRを使用して、lexA3を、pZE11GのKpnI部位とHindIII部位の間にクローニングして、pZE11-lexA3を形成した。soxRは内部KpnI部位を有するため、本発明者らは、
2011518543.tif 000016
および
2011518543.tif 000017
、続いて、
2011518543.tif 000018
および
2011518543.tif 000019
を使用する逐次PCRによって合成RBSを構築した。得られたEcoRI-RBS-soxR-HindIII DNAを、pZE11Gから切り出されたXhoI-PLtetO-EcoRI断片にライゲートさせ、DNA断片全体をpZE11GのXhoIとHindIIIの間にライゲートさせ、pZE11-soxRを形成した50。pZE11-csrAを形成するためのpZE11GのKpnIとHindIIIの間へのクローニングのためのcsrAのためのプライマーは、
2011518543.tif 000020
および
2011518543.tif 000021
であり；pZE11-ompFを形成するためのompFのためのプライマーは、
2011518543.tif 000022
および
2011518543.tif 000023
であった。PLtetOの制御下でcsrAおよびompFを同時に発現させるため、本発明者らは、
2011518543.tif 000024
および
2011518543.tif 000025
を使用して、pZE11-ompFからRBS-ompF DNAをPCR増幅し、その産物をpZE11-csrAのHindIIIとBamHIの間にクローニングして、pZE11-csrA-ompFを形成した。得られたプラスミドを、大腸菌XL-10細胞に形質転換した。
【０２７６】
rrnBオペロンのターミネーターT1が後ろにあり、終止コドンが前にある全てのPLtetO遺伝子構築物を、プライマー
2011518543.tif 000026
および
2011518543.tif 000027
を用いて、それぞれのpZE11プラスミドからPCR増幅し、M13mp18のSacI部位およびPvuI部位へクローニングした(図5)48、50、51。得られたファージゲノムをXL-10細胞へ形質転換し、3mLトップアガー、1mM IPTG、および40μLの20mg/mL X-galにおいて一晩培養XL-10細胞200μLと混合し、プラーク形成および青白スクリーニングのため、LB寒天＋クロラムフェニコール(30μg/mL)プレート上に注入した。37℃で一晩プレートをインキュベートした後、白色プラークを剥離し、一晩培養XL-10細胞の1:10希釈物に投入し、5時間増殖させた。複製型(RF)M13mp18 DNAを、細菌培養物のDNAミニプレップによって収集した。M13mp18への全ての挿入を、RF DNAのPCRおよび制限消化物によって確証した。16,100×gで5分間、感染培養物を遠心分離し、上清を収集することにより、感染性バクテリオファージ溶液を入手した後、Nalgene#190-2520 0.2μmフィルター(Nalge Nunc International, Rochester, NY)で濾過した。
【０２７７】
プラーク形成単位の決定。プラーク形成単位を入手するため、本発明者らは、1×PBSで実施されたバクテリオファージの段階希釈物を、3mLトップアガー、1mM IPTG、および40μLの20mg/mL X-galにおいて一晩培養XL-10細胞200μLへ添加し、混合物をLB寒天＋クロラムフェニコール(30μg/mL)プレート上へ注入した。37℃で一晩インキュベートした後、プラークを計数した。
【０２７８】
コロニー形成単位の決定。CFUカウントを入手するため、妥当な培養物150μLを収集し、1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、再収集し、150μLの1×PBSに再懸濁させた。段階希釈を1×PBSで実施し、LB寒天プレート上にサンプリングした。LB寒天プレートを37℃で一晩インキュベートした後、計数した。
【０２７９】
SOS誘導のフローサイトメーターアッセイ。M13mp18-lexA3(φlexA)によるSOS応答の抑制をモニタリングするため(図10)、本発明者らは、EMG2細胞におけるgfp発現を駆動するSOS応答プロモーターを含有しているプラスミド(PLlexO-gfp)を使用した43。一晩培養細胞の1:500希釈物を37℃、300rpmで2時間15分増殖させた後(モデルG25インキュベーターシェーカー、New Brunswick Scientific)、本発明者らは、オフロキサシンおよびバクテリオファージを適用し、37℃、300rpmで6時間、処理した。次いで、低い流速で、488nmアルゴンレーザーおよび515〜545nm発光フィルター(FL1)を備えたBecton Dickinson(Franklin Lakes, NJ)FACS caliberフローサイトメーターを使用して、GFP蛍光に関して細胞を分析した。以下の光電子増倍管チューブ(PMT)設定を分析のために使用した：E00(FSC)、275(SSC)、および700(FL1)。Becton Dickinson CALIBRITE Beadsを機器較正のために使用した。各試料に関して200,000個の細胞を収集し、MATLAB(Mathworks, Natick, MA)により加工した。
【０２８０】
オフロキサシン死滅アッセイ。操作されたファージ(図1B、図3A、および図3D)の補助効果を決定するため、本発明者らは、一晩培養EMG2細胞の1:500希釈物を37℃、300rpmで3時間30分、対数期後期にまで増殖させ、初期CFUを決定した。次いで、本発明者らは、単独で、または108PFU/mLバクテリオファージ(未改変のφunmod、または操作されたφLexA、φSoxR、φcsr、φompF、もしくはφCsr-ompFファージ)と組み合わせて、60ng/mLオフロキサシンを添加し、37℃、300rpmで処理した。示された時点で、本発明者らは、上記のようにCFUを決定した。異なる実験からのデータを比較するため、処理後の平均log10(CFU/mL)から平均初期log10(CFU/mL)を差し引くことにより、平均死滅(Δlog10(CFU/mL))を決定した。抗生物質耐性菌に対する操作されたφlexA3ファージのオフロキサシン増強効果を決定するため、このプロトコルを大腸菌RFS289で繰り返した(図2)。さらに、オフロキサシンなしのEMG2培養物、φunmodファージを含むオフロキサシンなしのEMG2培養物、および操作されたφlexA3ファージを含むオフロキサシンなしのEMG2培養物に関して、生細胞数を入手した。
【０２８１】
用量応答アッセイ。60ng/mLオフロキサシンを変動する濃度のファージと共に添加した以外は、オフロキサシン死滅アッセイと同一のプロトコルを使用して、初期ファージ接種用量応答実験(図1cおよび図15)を取り扱った。培養物を6時間処理した後、生細胞数を入手した。108PFU/mLファージを変動する濃度のオフロキサシンと共に添加し、6時間の処理の後に生細胞数を入手した以外は、オフロキサシン死滅アッセイと同一のプロトコルを使用して、オフロキサシン用量応答実験(図1C)も入手した。
【０２８２】
残留細胞死滅アッセイ 。本発明者らは、操作されたファージが、バクテリオファージなしの初期薬物処理後に生存していた集団の中の残留細胞の死滅を補助し得るか否かを決定するため、残留細胞死滅アッセイを実施した(図11および16)。本発明者らは、まず、一晩培養EMG2の1:500希釈物を37℃、300rpmで3時間30分増殖させた後、200ng/mLオフロキサシンにより3時間処理して、生存細菌の集団を作出した。次いで、本発明者らは、ファージなし、109PFU/mLの対照φunmod、または109PFU/mLの操作されたφLexA3ファージを添加した。3時間の付加的な処理の後、本発明者らは試料を収集し、上記のように生細胞数に関してアッセイした。
【０２８３】
バイオフィルム死滅アッセイ。以前に報告されたプロトコル(Lu and Collins, 2007)に従って、大腸菌EMG2細胞を使用して、バイオフィルムを増殖させた。簡単に説明すると、プラスチックペグを含有しているリッド(MBEC Physiology and Genetics Assay, Edmonton, CA)を、150μL LBで1:200希釈された一晩培養細胞を含有している96穴プレートに投入した。次いで、蒸発を最小限に抑えるため、プレートをビニール袋に挿入し、Minitronシェーカー(Infors HT, Bottmingen, Switzerland)に挿入した。35℃、150rpmで24時間増殖させた後、リッドを、108PFU/mLのバクテリオファージを含むかまたは含まない200μL LBを含む新たな96穴プレートに移した。35℃、150rpmで12時間処理した後、リッドを除去し、200μLの1×PBSで3回洗浄し、150μL 1×PBSを含むNunc#262162マイクロタイタープレートに挿入し、Ultrasonic 5510音波水浴(Branson, Danbury, CT)で、40kHzで30分間、超音波処理した。得られた150μL 1×PBSを使用して、LBプレートで段階希釈を実施し、生細胞数を決定した。12時間の処理の後の平均log10(CFU/mL)から24時間の増殖の後の平均log10(CFU/mL)を差し引くことにより、平均死滅(Δlog10(CFU/mL))を計算した(図17および図18)。
【０２８４】
抗生物質耐性アッセイ。抗生物質耐性変異体の発達に対する阻害濃度未満の濃度のオフロキサシンの効果を分析するため、本発明者らは、オフロキサシンを含有していないLB培地(図4)または30ng/mLオフロキサシンを含有しているLB培地(図7)で、一晩培養EMG2の1:108希釈物を増殖させた。37℃、300rpmで12時間増殖させた後、本発明者らは、オフロキサシンなしで増殖した細胞を、96穴プレートフォーマット(Costar 3370; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)で、60個のウェルに、オフロキサシンなしの100uLアリコートに分割した。本発明者らは、30ng/mLオフロキサシンで増殖した細胞も、96穴プレートフォーマットで、ファージなしおよび30ng/mLオフロキサシン(図7B)、φunmodファージおよび30ng/mLオフロキサシン(図7C)、ならびにφlexA3および30ng/mLオフロキサシン(図7D)を含む60個のウェルに、100uLアリコートに分割した。本発明者らは、蒸発を最小限に抑えるためビニール袋を用いて、37℃、300rpmに96穴プレートを置いた。12時間の処理の後、本発明者らは、オフロキサシンに対する耐性を発達させた変異体を選択するため、LB寒天＋100ng/mLオフロキサシン上に各ウェルからの培養物を播種した。結果を比較するため、本発明者らは、各ウェルに見出された耐性菌の数のヒストグラムを図4および8にプロットした。
【０２８５】
ゲンタマイシンおよびアンピシリンによる死滅アッセイ。ゲンタマイシンおよびアンピシリンのための、操作されたバクテリオファージの抗生物質増強効果または補助効果を決定するため、本発明者らは、109PFU/mL初期ファージ接種を使用したことを除き、オフロキサシン死滅アッセイと同一のプロトコルを使用した。5μg/mLゲンタマイシンおよび5μg/mLアンピシリンを、図1D、1E、8A、および8Bにおいて使用した。
【０２８６】
統計分析。全てのCFUデータを、分析前にlog10変換した。特記しない限り、全ての実験で全てのデータポイントに関して、n=3試料を収集した。図中のエラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【０２８７】
実施例1
本発明者らは、抗生物質との組み合わせ治療において細菌の死滅を強化するため、遺伝子ネットワークを標的とするよう合成バクテリオファージを操作した。本発明者らは、抗生物質耐性のための付加的な進化圧がかかることを回避するため、抗生物質によって直接攻撃されない大腸菌の遺伝子ネットワークを特異的に標的とした。代わりに、本発明者らは、抗生物質によって引き起こされる細胞傷害の修復を担うタンパク質、調節ネットワークを制御するタンパク質、または抗生物質に対する感受性をモジュレートするタンパク質を選んだ。タンパク質活性を破壊することにより作用する従来の抗生物質とは異なり、本発明者らは、リプレッサーのような標的遺伝子を過剰発現し、効果的な抗生物質補助剤として作用するよう、操作されたファージを設計した。
【０２８８】
殺菌性抗生物質は、DNA、タンパク質、および脂質の傷害をもたらし、最終的には細胞死をもたらす、ヒドロキシルラジカル形成を引き起こす44。DNA傷害は、DNA修復をもたらすSOS応答を誘導する(Miller et al.,(2004)Science 305, 1629-1631; Lewin et al.,(1989)J. Med.Microbiol. 29, 139-144.)(図1A)。recAをノックアウトし、SOS応答を不能にすることにより、殺菌性抗生物質による細菌の死滅を増強し得ることが示されている(Kohanski et al.,(2007)Cell 130)。本発明において、本発明者らは、別のアプローチを使用し、SOS応答のリプレッサーlexA3を過剰発現するようM13mp18ファージを操作した(Little et al.,(1979)Proc Natl Acad Sci U S A 76, 6147-51)。SOS系を抑制するためのlexAの過剰発現は、抗生物質耐性の発生を阻害することが証明されている(Cirz et al.,(2005)in PLoS Biol, p. e17624)。M13ファージの改変バージョン、M13mp18は、非溶菌性の糸状ファージであり、ゲノムへのDNA挿入に適しているため、本発明者らは、それを基質として使用した(図S1)(Yanisch-Perron et al.,(1985)Gene 33, 103-119)。
【０２８９】
SOS応答を抑制するため、本発明者らは、lexA3遺伝子を、合成リボソーム結合配列(RBS)が後続する合成PLtetOプロモーターの制御下に置き(Kohanski et al.,(2007)Cell 130, 797-810; Little et al.,(1979)Proc Natl Acad Sci U S A 76, 6147-51; Walker GC(1984)Microbiol. Rev. 48, 60-93; Lutz et al.,(1997)Nucleic Acids Res 25, 1203-1210.)；本発明者らは、このファージを「φlexA3」と命名し(図1Aおよび図S1B)、未改変のM13mp18ファージをφunmodと命名した。TetRリプレッサーの存在下で誘導可能なプロモーターであるPLtetOは、TetRを欠くEMG2細胞において構成的にオン状態である。PLtetOは本明細書に記載されたような概念実証実験において便宜のために使用され、現実の情況においては、必ずしも選択のプロモーターではないであろう。従って、当業者は、PLtetOプロモーターを、異なる選択の誘導可能プロモーターまたは構成的活性型プロモーターまたは組織特異的プロモーターに容易に置換することができる。本発明者らは、gfp発現を駆動するSOS応答性プロモーターを有するプラスミドを保持している大腸菌K-12 EMG2細胞において、GFP蛍光をモニタリングすることにより、オフロキサシン処理によって誘導されるSOS応答をφlexA3が抑制することを確認した(図S2)(Kohanski et al.,(2007)Cell 130, 797-810)。
【０２９０】
φlexA3の抗生物質増強効果を試験するため、本発明者らは、ファージおよび／またはオフロキサシンによる処理による大腸菌EMG2細菌の死滅に関して時間経過を入手した。本発明者らは、ファージなし、または108プラーク形成単位/mL(PFU/mL)のファージ、およびオフロキサシンなし、または60ng/mLオフロキサシンによる処理の間、コロニー形成単位(CFU)を計数することにより生細胞数を計算した(図1B)。オフロキサシンにのみ曝された細菌は、6時間の処理の後、約1.7 log10(CFU/mL)低下し、このことは、薬物によって死滅しない残留細胞の存在を反映していた(図1B)。6時間までに、φlexA3は、未改変ファージφunmodと比較して2.7桁、オフロキサシンの殺菌効果を改善し(およそ99.8％の付加的な死滅)、ファージなしと比較して4.5桁以上、改善した(およそ99.998％の付加的な死滅)(図1B)。未改変ファージはオフロキサシンの殺菌効果を増強し、このことは、未改変の糸状ファージが、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)に対する抗生物質の効力を強化するという以前の観察と一致している(Hagens et al.,(2006)Microb Drug Resist 12, 164-168)。他の研究者らは、M13に感染した大腸菌が、酸ストレスのような条件に対する宿主ストレス応答の障害を示すことに注目した(Karlsson et al.,(2005)Can J Microbiol 51, 29-35)。理論によって拘束されることは望まないが、未改変の糸状ファージが抗生物質の効力を強化し得る機序は、十分には特徴決定されていないが、膜の破壊またはストレス応答の障害を含むかもしれない。ファージおよび抗生物質による組み合わせ処理により、12時間まで、有意な細菌の再増殖は明らかでなかった(図1B)(Hagens et al.,(2003)Lett. Appl. Microbiol. 37, 318-23; Hagens et al.,(2004)Antimicrob. Agents Chemother. 48, 3817-22; Summers WC(2001)Annu. Rev. Microbiol. 55, 437-451)。本発明者らは、φunmodおよびφlexA3の両方が、処理の間、有意に複製することを確認した(示されないデータ)。
【０２９１】
実施例2
φlexA3が異なる情況において抗生物質補助剤として作用し得るか否かを試験するため、本発明者らは、変動する初期ファージ接種用量(図15)および変動する用量のオフロキサシン(図1C)を用いて、それぞれ、6時間の処理の後に、細菌の死滅に関してアッセイした。φlexA3は、1:1000〜1:1という広範囲の感染多重度(MOI)でオフロキサシンの殺菌活性を増強した(図15)。低いMOIでオフロキサシンによる死滅を増加させるφlexA3の能力は、M13ファージによる迅速な複製および感染を反映している。30ng/mL以上のオフロキサシン濃度で、φlexA3は、ファージなしまたは未改変ファージφunmodと比較して、はるかに大きな死滅をもたらした(図1C)。従って、本発明者らは、φlexA3が、最小阻害濃度(60ng/mL、示されないデータ)より低い用量および高い用量で、オフロキサシンのための強力な補助剤であることを証明した。
【０２９２】
本発明者らは、次に、操作されたファージが、キノロン系以外のクラスの抗生物質による死滅を増加させ得るか否かを決定した。本発明者らは、アミノグリコシド系であるゲンタマイシンおよびβ-ラクタム系抗生物質であるアンピシリンに関して、φlexA3の抗生物質増強効果を試験した。本明細書に証明されるように、φlexA3は、ゲンタマイシンの殺菌作用を、φunmodおよびファージなしと比較して、それぞれ、2.5桁以上および3桁以上、増加させた(図1D)。φlexA3は、アンピシリンの殺菌効果も、φunmodおよびファージなしと比較して、それぞれ、2桁以上および5.5桁以上、改善した(図1E)。ゲンタマイシンおよびアンピシリンの両方に関して、φlexA3の強力な抗生物質増強効果は、処理の1時間後に認識可能であった(図1Dおよび1E)。これらの結果は、ΔrecA変異体が、キノロン系、アミノグリコシド系、およびβ-ラクタム系に対する増加した感受性を示すという以前の観察と一致しており(Kohanski et al.,(2007)Cell 130, 797-810)、φlexA3のような操作されたファージが、3つの主要なクラスの殺菌薬のため一般的な補助剤として作用し得ることを証明している。本発明者らは、操作されたファージφlexA3が、抗生物質に既に曝された集団の中の残留細胞の数を低下させることができ、さらに、バイオフィルム中に生存している細菌に対する抗生物質の効力も増強することができることも見出した。例えば、以前にオフロキサシンによってのみ処理された集団に添加されたφlexA3は、φunmodおよびファージなしと比較して、それぞれ、およそ1桁および1.5桁、初期処理後に生存していた細菌の死滅を増加させた(図16)。さらに、φlexA3およびオフロキサシンの同時適用は、φunmod＋オフロキサシンおよびファージなし＋オフロキサシンと比較して、それぞれ、約1.5桁および約2桁、バイオフィルム細胞の死滅を改善した(図17)。
【０２９３】
以前の実験は、全て、バクテリオファージおよび薬物の同時適用を含んでいたため、本発明者らは、薬物によって以前に処理された集団への、操作されたφlexA3の後の添加も、死滅を増強するか否かを試験した。まず、生存細胞の集団を作成するため、対数期後期の細胞をオフロキサシンによる3時間の処理に曝した後、ファージなし、109PFU/mLのφunmod、または109PFU/mLの操作されたφlexA3ファージのいずれかに曝した。3時間の付加的な処理の後、φlexA3は、φunmodと比較して0.94 log10(CFU/mL)、ファージと比較して1.3 log10(CFU/mL)以上、死滅を増加させた(図11)。これらの結果は、操作されたφlexA3バクテリオファージが、初期抗生物質処理の後に生存していた細菌の死滅を増加させ、所定の集団における残留細胞の数を低下させることを示す。
【０２９４】
実施例3
抗生物質耐性菌の死滅の増強。本発明者らは、増加した効力での野生型細菌の死滅に加え、操作されたファージが、既に抗生物質耐性を獲得した細菌の死滅を増強することができることも証明する。本発明者らは、キノロン系抗生物質に対して耐性にする変異(gyrA111)を保持している大腸菌RFS289に対してオフロキサシンと共にφlexA3を適用した(Dwyer et al.,(2007)Mol Syst Biol 3,917; Schleif R(1972)Proc Natl Acad Sci U S A 69, 3479-84)。φlexA3は、φunmodおよびファージなしと比較して、それぞれ、2桁超および3.5桁超、オフロキサシンの殺菌作用を増加させた(図2)。これらの結果は、φlexA3のような抗生物質増強ファージが、抗生物質耐性菌に対抗するために使用され得、従って、無効になった抗生物質を再び臨床的に使用できるようにする可能性を有することを証明している。
【０２９５】
実施例4
細菌感染マウスの生存の増加。抗生物質増強ファージの臨床的妥当性をインビボで決定するため、本発明者らは、細菌感染マウスの死亡を防止するため、操作されたファージφlexA3をオフロキサシンと共に適用した。異なる静脈内処理を与える1時間前に、マウスに大腸菌EMG2を腹腔内注射した(図3A)。オフロキサシンと共にφlexA3を受容したマウスの80パーセントが生存したが、それに対し、φunmod＋オフロキサシンまたはオフロキサシン単独を受容したマウスに関しては、それぞれ、50％および20％であった(図3B)。本発明者らは、操作されたファージφlexA3が、オフロキサシンと共に、重度の細菌感染を有するマウスの死亡をインビボで防止することを証明し、従って、抗生物質増強ファージのインビボの効力が、感染マウスを死亡から救済するために効果的であることを証明し、本発明の様々な態様の臨床的使用のための実現可能性を証明した。
【０２９６】
実施例5
抗生物質耐性の発達の低下。阻害濃度未満の濃度の抗生物質への曝露は、低レベルの抗生物質耐性を付与する初期の変異をもたらし、最終的には、高レベルの耐性を与えるさらなる変異をもたらすことがある(Martinez et al.,(2000)Antimicrob. Agents Chemother. 44, 1771-77)。本発明者らは、操作されたファージが、抗生物質補助剤として、抗微生物薬に曝された細菌集団に起因する抗生物質耐性変異体の数を低下させ得るか否かを査定した。これを試験するため、本発明者らは、オフロキサシンを含まない培地で24時間、30ng/mLオフロキサシンを含む培地で24時間、30ng/mLオフロキサシンを含む培地で12時間、大腸菌EMG2を増殖させた後、φunmod＋オフロキサシンにより12時間、または30ng/mLオフロキサシンにより12時間、処理し、続いてφlexA3+オフロキサシンにより12時間、処理した(図4)。次いで、本発明者らは、各増殖条件下での60の試料の各々に関して、100ng/mLオフロキサシンに対して耐性の変異体の数を計数した。オフロキサシンの非存在下での増殖は、耐性細胞をほとんど与えなかった(中央値=1)(図4)。しかしながら、阻害レベル未満のレベルのオフロキサシンによる増殖は、多数の抗生物質耐性菌を生じた(中央値=1592)(図4)。未改変ファージφunmodによる処理は、耐性細胞の数を減少させた(中央値=43.5);しかしながら、全ての試料が、>1の耐性CFUを含有しており、試料の過半数が、>20の耐性CFUを有していた(図4)。対照的に、φlexA3処理は、抗生物質耐性細胞のレベルを劇的に抑制し(中央値=2.5)、試料の大多数が、耐性CFUを全く有しないか、または<20の耐性CFUを有していた(図4)。
【０２９７】
実施例6
その他の遺伝子ネットワークをフレキシブルに標的とすること。本発明者らは、次に、効果的な抗生物質補助剤を作製するため、多くの異なる遺伝子ネットワークを標的とするため、ファージプラットフォームが使用され得ることを証明した。これを示すため、本発明者らは、非SOS遺伝子ネットワークを調節するタンパク質(例えば、SoxRおよびCsrA)、または抗生物質に対する感受性をモジュレートするタンパク質(例えば、OmpF)を発現するようファージを操作した(図5および図9F)(Lutz et al.,(1997)Nucleic Acids Res 25, 1203-10)。例えば、soxR-soxSレギュロンは、過酸化物に対する調和的な細胞応答を制御する(Hidalgo et al.,(1997)Cell 88, 121-129)。SoxRは、SoxS産生を刺激するために、酸化されなければならない[2Fe-2S]クラスタを含有しており、次いで、SoxSが、酸化ストレスに応答する下流遺伝子の転写を制御する(Hidalgo et al.,(1997)Cell 88, 121-129)。キノロン系は、過酸化物に基づく酸化攻撃を生じるため(Dwyer et al.,(2007)Mol Syst Biol 3, 91; Kohanski et al.,(2007)Cell 130, 797-810)、本発明者らは、この応答に影響を与え、オフロキサシンの殺菌活性を改善するため、野生型SoxRを過剰発現するようファージを操作した(φsoxR)(図5A)。図5Bに示されるように、φsoxRは、未改変ファージφunmodおよびファージなしと比較して、オフロキサシンによる死滅を増強した(図5B)。本発明者らは、SoxRの過剰発現が、殺菌性抗生物質に対する感受性を増加させるために不安定化され得る付加的な鉄-硫黄クラスタを提供し得ることを発見した(Dwyer et al.,(2007)Mol Syst Biol 3, 91; Kohanski et al.,(2007)Cell 130, 797-810)。又は、SoxRは、通常、酸化ストレスによって変化しない比較的レベルにインビボで維持されるため(Hidalgo et al.,(1998)EMBO J 17, 2629-2636)、大量のSoxRの過剰発現は、細胞内の鉄を滴定するかもしくは酸化種を酸化することにより、またはsoxSプロモーターへの結合を酸化型SoxRと競合することにより、酸化ストレスに応答して起こるシグナル伝達に干渉するのかもしれない(Hidalgo et al.,(1998)EMBO J 17, 2629-36; Zheng M et al.,(1999)J. Bacteriol 181, 4639-4643; Gaudu et al.,(1996)Proc Natl Acad Sci U S A 93, 10094-98)。
【０２９８】
CsrAは、グリコーゲンの合成および異化、糖新生、ならびに解糖の包括的な調節剤であり、バイオフィルム形成を抑制することが示されている(Jackson DW et al.,(2002)J. Bacteriol. 184, 290-301)。バイオフィルム形成は抗生物質耐性に関連しているため、本発明者らは、csrA発現ファージ(φcsrA)が抗生物質処理に対する感受性を増加させるか否かを査定した(Stewart et al.,(2001)Lancet 358, 135-138)。さらに、OmpFは、細菌に侵入するためにキノロン系によって使用されるポリンであるため(Hirai et al.,(1986)Antimicrob.Agents Chemother. 29, 535-538)、本発明者らは、ompF発現ファージ(φompF)がオフロキサシンによる死滅を増加させるか否かも査定した(図5C)。6時間後、φcsrAおよびφompFの両方が、φunmodおよびファージなしと比較して、それぞれ、およそ1桁および3桁、オフロキサシンの殺菌効果を増加させた(図5D)。
【０２９９】
実施例7
システムバイオロジー分析は、しばしば、伝統的な薬物化合物によっては容易に解決されない複数の抗菌標的の同定をもたらす。対照的に、操作されたファージは、複数の標的を単一の抗生物質補助剤へ組み入れるのに適している。この能力を証明するため、本発明者らは、csrAにより制御される遺伝子ネットワークを標的とし、かつ薬物浸透を増加させるため、csrAおよびompFを同時に発現するM13mp18ファージ(φcsrA-ompF)を設計した(図5C)。φcsrA中のcsrAの直下流にRBSおよびompFを置くことにより、多重標的ファージを構築した(図9F)(Lutz et al.,(1997)Nucleic Acids Res 25, 1203-1210)。本発明者らは、φcsrA-ompFが、プランクトン状況(図5D)およびバイオフィルム状況(図18)において、その単一標的類縁体φcsrAおよびφompFと比較して、オフロキサシンの殺菌効果を増強するためにより効果的であることを証明した。総合すると、これらの結果は、抗微生物剤に対する細菌細胞の感受性を増加させるネットワークのような非SOS遺伝子ネットワークを標的とし、かつ／または複数の因子を過剰発現するようファージを操作することによって、効果的な抗生物質補助剤が作製され得ることを証明している。
【０３００】
実施例8
その他の標的が、バクテリオファージおよび抗生物質による組み合わせ治療の効力を増強することが見出され得ることを示すため、本発明者らは、soxR、fur、crp、marR、icdA、csrA、およびompFのような、抗生物質に対する感受性をモジュレートし得るか、または調節ネットワークを制御し得るタンパク質を発現するM13mp18バクテリオファージをスクリーニングした。本発明者らは、オフロキサシンによる6時間の処理の後に生細胞数を入手することにより、これを行った。soxR、csrA、またはompFを発現するファージは、オフロキサシンによる死滅を最も大きく改善した(図1参照)。φLexA3と同様に、これらのファージは、PLtetOおよび合成RBSの制御下で、それぞれのタンパク質を発現した(図9C、9D、および9E)50。SoxRは過酸化物ストレスに対する細胞応答を調節し、キノロン系は過酸化物に基づく酸化攻撃を刺激するため、本発明者らは、SoxRの過剰産生が、この応答に影響を与え、オフロキサシンの殺菌活性を改善するかもしれないと推測した43、52。図6Aに示されるように、soxR発現M13mp18(φsoxR)は、6時間の処理の後、ファージなしと比較して約3.8 log10(CFU/mL)、未改変φunmodと比較して約1.9 log10(CFU/mL)、オフロキサシンによる死滅を増強した。
【０３０１】
CsrAは、グリコーゲンの合成および異化、糖新生、解糖、ならびにバイオフィルム形成の包括的な調節剤である53。バイオフィルム形成は抗生物質耐性に関連しているため、本発明者らは、csrAの過剰発現が、抗生物質処理に対する感受性を増加させるか否かを査定した54〜56。OmpFは細菌に侵入するためにキノロン系によって使用されるポリンであり、従って、本発明者らは、OmpFの過剰産生が、オフロキサシンによる死滅を増加するであろうと決定した57。本発明者らは、csrA発現M13mp18(φcsrA)およびompF発現M13mp18(φompF)の両方が、6時間の処理の後、ファージなしと比較して約2.7 log10(CFU/mL)、未改変φunmodと比較して0.8 log10(CFU/mL)、オフロキサシンの殺菌効果を増加させることを発見した(図6B)。
【０３０２】
csrAまたはompFを単独で有する操作されたファージの抗生物質補助剤としての有効性を増強するため、本発明者らは、csrAおよびompFを同時に発現するM13mp18ファージ(φcsrA-ompF)を設計した(図9F)。csrAの直下流にRBSおよびompFを保持するようφcsrAを改変することにより、組み合わせファージを構築した50。φcsrA-ompFは、6時間の処理の後、φcsrAおよびφompFと比較して、0.7log10(CFU/mL)超、オフロキサシンによる死滅を改善した(図6B)。二重標的φcsrA-ompFファージは、様々な初期ファージ接種および60ng/mLオフロキサシン(図6C)、様々な濃度のオフロキサシンおよび108PFU/mLファージ(図6D)で、φSoxRと同等の性能であった。両方のファージが、ファージなしまたはφunmodより、オフロキサシンによる死滅を増加させるために効果的であった。これらの結果は、他の非SOS遺伝子ネットワークを標的とし、かつ複数の因子、即ち、複数のリプレッサーを過剰発現させることによって、抗生物質のための良好な補助剤である操作されたバクテリオファージがもたらされ得ることを証明している。
【０３０３】
阻害濃度未満の濃度の抗生物質への曝露は、低レベルの抗生物質耐性を付与する初期の変異をもたらし、最終的には、高レベルの抗生物質耐性を与えるさらなる変異をもたらすことがある17。オフロキサシンの殺菌効果を増強することによって、操作されたバクテリオファージは、抗微生物薬に曝された細菌集団において生存する抗生物質耐性変異体の数を低下させることができる。この効果を証明するため、本発明者らは、抗生物質耐性変異体を作製するため、オフロキサシンを含まない培地(図7A)または30ng/mLオフロキサシンを含む培地(図7B、図7C、および図7D)において12時間、大腸菌を増殖させた。次いで、本発明者らは、オフロキサシンなしで増殖した細胞を、オフロキサシンを含まない60個の個々のウェルへ分割した(図7A)。本発明者らは、30ng/mLオフロキサシンで増殖した細胞も、以下の処理の各々のため、60個の個々のウェルへ分割した：ファージなしおよび30ng/mLオフロキサシン(図7B)、109PFU/mLのφunmodおよび30ng/mLオフロキサシン(図7C)、ならびに109PFU/mLのφlexA3および30ng/mLオフロキサシン(図7D)。12時間の付加的な増殖の後、本発明者らは、100ng/mLオフロキサシンを含有しているLB寒天上に細胞を播種し、増殖した細胞の数を計数することにより、抗生物質耐性変異体の数を決定した。図7Aは、オフロキサシンの非存在下での増殖が、耐性細胞をほとんど与えなかったを示す。しかしながら、阻害レベル未満のレベルのオフロキサシンの存在下での増殖は、極めて多数の抗生物質耐性菌をもたらした(図7B)。φunmodによる処理は耐性細胞の数を低下させたが、試験された60個の個々のウェルの全てが、少なくとも1の耐性CFUを含有し、ウェルの過半数が、20以上の耐性CFUを有していた(図7C)。ファージなしまたは未改変φunmodによる処理とは対照的に、φlexA3処理は、耐性細胞のレベルを劇的に抑制し、ウェルの大多数が、観察可能な耐性CFUを有していないか、または20未満のCFUを有していた(図3d)。これらの結果は、操作されたφlexA3が、阻害濃度未満の薬物濃度の存在下で発達し得る抗生物質耐性細胞の数を低下させるために有効であることを証明している。
【０３０４】
実施例9
本発明者らは、操作されたファージが、キノロン系以外の異なるクラスの抗生物質に適用され得るか否かも決定することにした。φlexA3がオフロキサシンのための最も効果的な補助剤であったため、本発明者らは、アミノグリコシド系であるゲンタマイシンおよびβ-ラクタム系抗生物質であるアンピシリンのための、その補助効果を試験した。5μg/mLゲンタマイシンに関して、φunmodは、ファージなしと比較して、オフロキサシンによる細菌細胞の死滅を増強するためにわずかに効果的であった(図8A)。φlexA3は、6時間の処理の後、φunmodと比較して2.5 log10(CFU/mL)超、ファージなしと比較して3 log10(CFU/mL)超、ゲンタマイシンの殺菌作用を増加させた(図8A)。5μg/mLアンピシリンに関して、単独の対照φunmodは、ファージなしと比較して3桁超、オフロキサシンによる死滅を増加させた(図4b)。φlexA3は、未改変φunmodと比較して2.2 log10(CFU/mL)超、ファージなしと比較して5.5 log10(CFU/mL)超、アンピシリンの殺菌効果を改善した(図8B)。ゲンタマイシンおよびアンピシリンの両方に関して、φlexA3の強力な補助効果が、処理の1時間後に認識可能であった(図8Aおよび図8B)。これらの結果は、ΔrecA変異体が、キノロン系、アミノグリコシド系、およびβ-ラクタム系の薬物に対する増加した感受性を示すという以前の観察と一致している44。従って、φlexA3のような操作されたバクテリオファージは、3つの主要なクラスの殺菌薬のための一般的な補助剤として作用することができる。
【０３０５】
ファージを使用して、本発明者らは、既存の抗微生物薬による死滅を強化するため、遺伝子ネットワークを標的とすることが、抗生物質の有用性を増強するための高度に効果的な戦略であることを証明した。ファージの宿主特異性は、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)異常増殖のような広域性抗生物質に関連した副作用を回避するが、ある範囲の感染をカバーするため、ファージのライブラリーが維持されることを必要とする58、59。
【０３０６】
いくつかの態様において、異なる細菌種におけるSOS応答を抑制するため、例えば、lexA3のような(これに限定はされない)他の遺伝子を過剰発現するよう、既存のファージのライブラリーを改変してもよい60、61。
【０３０７】
実施例10
抗生物質耐性菌を攻撃する直接の方法は、抗生物質耐性を付与するか、または細胞修復およびSOS応答を促進する遺伝子をノックダウンするため、asRNAを発現させることである。従って、本発明者らは、cat遺伝子およびその他の抗生物質耐性遺伝子(vanA、mecA、およびその他のような、抗生物質を不活化する遺伝子、または抗生物質を汲み出す遺伝子、または残留性もしくはその他の抗生物質耐性表現型を付与する遺伝子回路)、ならびにrecA、recB、recC、spoT、relA、および細胞の修復または生存のために必要なその他の遺伝子に対するアンチセンスRNA(asRNA)を発現させた。これらのベクターは、抗生物質を不活化するかまたは汲み出す遺伝子、および抗生物質によって引き起こされる傷害からの細胞修復のために必要な遺伝子を標的とするため、抗生物質に対して細胞を感作するはずである(Dwyer et al.,(2007)Mol Syst Biol 3: 91)。SOS応答の阻害も、抗生物質耐性遺伝子の蔓延を低下させ得る(Beaber, et al.,(2004)Nature 427: 72-74; Ubeda, et al.,(2005)Mol Microbiol 56: 836-844)。
【０３０８】
現在実験されている設計は、図12に示されるものに類似しているRNAを作製するNakashima et al.,(2006)Nucleic Acids Res 34: e138に記載された対末端(paired-termini)(PT7)設計を拡張する。PT7構築物は、より大きなアンチセンス効果を可能にする、より長い半減期を有するアンチセンスRNAをインビボで産生する(Nakashima et al.,(2006)Nucleic Acids Res 34: e138)。PT系を使用して、本発明者らは、cat、recA、recB、およびrecCを標的とするアンチセンスRNAを構築した(Nakashima et al.,(2006)Nucleic Acids Res 34: e138)。これらのasRNA構築物は、pZE21s1-catへcatの代わりにクローニングすることにより、aTcによって誘導可能な制御の下に置かれている(Lutz et al.,(1997)Nucleic Acids Res 25: 1203-1210)。本発明者らは、同一プラスミド上で一つのasRNA構築物をPLtetOの制御下に置き、他方をPLlacOの制御下に置くことにより、recA、recB、およびrecCに対するasRNAの全ての対の組み合わせも作出した(Lutz et al.,(1997)Nucleic Acids Res 25: 1203-1210)。
【０３０９】
その後、全ての記載されたプラスミドを、野生型大腸菌EMG2細胞へ導入し、抗生物質処理による生存に関してアッセイした。全ての細胞および適当な対照を、(適切な誘導剤を含む)LB培地において37℃で8時間増殖させ、5μg/mLのオフロキサシンのような抗生物質によりチャレンジした。細胞数を、抗生物質への8時間の曝露の後に播種し、残留性レベルを査定するために計数した。特異的な抗生物質(例えば、cat発現プラスミドの存在下でのクロラムフェニコール)に対する耐性に関しても、細胞をアッセイする。
【０３１０】
本発明者らは、catを標的とするasRNAを構築し、ColE1型プラスミドにおいてasRNAを発現させた。本発明者らは、cat-asRNAベクターにより、標的細菌のクロラムフェニコールMICが効果的に低下するか否かを査定した。本発明者らは、recA-asRNA、recB-asRNA、recC-asRNA、ならびに全ての対のrecA、recB、およびrecCの組み合わせを含むベクターを構築し、8時間の増殖、それに続く8時間の処理により、オフロキサシン(5μg/mL)による残留性レベルに関してアッセイした。最も強力な表現型を示したベクターは、PLtetO-recB-asRNA/PLlacO-recA-asRNAプラスミドおよびPLtetO-recC-asRNA/PLlacO-recB-asRNAプラスミド(図14)であった。これらの構築物は、野生型大腸菌EMG2と比較して、それぞれ、1.87および2.37 log10(CFU/mL)少ない残留細胞を示した。
【０３１１】
実施例11
本発明者らは、抗生物質を抗生物質増強ファージとカップリングする組み合わせ治療が、効果的な抗微生物戦略となる可能性を有することを本明細書において証明した。さらに、本発明者らは、抗生物質増強ファージが、細菌感染マウスを救済するためにインビボで効果的であり、従って、細菌感染の哺乳動物モデルにおいても、ヒトの処置(治療的処置および予防的処置の両方)においても、インビボで使用するための臨床的妥当性を有することを証明した。従って、本発明者らは、インビトロおよびインビボで効果的な抗生物質補助剤として作用し、抗微生物標的同定のための方法においても、治療的な使用および実行のためにも使用され得るよう操作されるようファージ(即ち、バクテリオファージ)を改変する方法を証明した。本発明者らは、非必須遺伝子ネットワークを標的とすることによって、他の抗微生物戦略を補足するための操作されたバクテリオファージの多様なセットが開発され得ることも証明した。
【０３１２】
臨床的実務におけるファージの使用は、ファージの免疫原性、効力、標的細菌同定およびファージ選択、宿主特異性、ならびに毒素放出のような多数の問題のために広くは受け入れられていないが(Merril et al.,(2003)Nat. Rev. Drug Discov. 2, 489-497; Hagens et al.,(2003)Lett. Appl. Microbiol 37, 318-323; Hagens et al.,(2004)Antimicrob. Agents Chemother. 48, 3817-3822; Boratynski et al., ,(2004)Cell. Mol. Biol. Lett. 9, 253-259; Merril et al.,(1996)Proc Natl Acad Sci U S A 93, 3188-3192)、本発明者らは、処置後に患者体内に溶原性粒子を残すリスクを低下させる一つの方式を示しており、本発明者らによって操作された補助ファージは、以前に記載されたようにして、非複製性となるようさらに改変されてもよい(Hagens et al.,(2004)Antimicrob 11)。本発明者らは、概念実証抗生物質補助剤としてのプロトタイプファージとして、抗生物質増強ファージを証明した。本発明者らは、いくつかの態様において、抗生物質増強ファージの組み合わせまたはファージカクテルが、非Fプラスミド含有細菌を処理する効果的な効力および／または能力のため、インビボおよびインビトロの使用のためにも、臨床的状況においても、使用され得ることを示す。特に、いくつかの態様において、異なる複数の細菌受容体を標的とするファージカクテルが使用されてもよく、これは、複数の異なる手段および経路を通して細菌に侵入することによるファージ耐性の発達を低下させるという利益を有し得る。従って、もう一つの態様において、ファージカクテルは、細菌の死滅を増強するためにも、ファージおよび抗生物質の両方に対する耐性を低下させるためにも、一つまたは複数の異なる抗生物質と共に使用され得る。
【０３１３】
本発明者らは、効果的な抗生物質補助剤の開発のためのファージプラットフォームとしての、操作された抗生物質増強ファージの使用を証明し、合成生物学が重要な現実の生物医学的問題にいかにして適用され得るかの実例である。合成生物学は、新規の挙動を作出するために、生物の合理的なモジュール操作に焦点が置かれている。その領域は、興味深い特徴を有する合成遺伝子回路および系の多くの報告を作製した(Andrianantoandro et al.,(2006)Mol Syst Biol, 2, 2006.0028; Hasty et al.,(2002)in Nature, pp. 224- 230; McDaniel et al.,(2005)in Curr. Opin. Biotechnol., pp. 476--483.; Chan et al.,(2005)in Mol Syst Biol, p. 2005.0018)。より最近、合成生物学者は、重要な産業的および医学的な課題を解決し始めた(Lu et al.,(2007)Proc Natl Acad Sci U S A 104, 11197-216; Anderson et al.,(2006)J. Mol. Biol. 355, 619-627; Loose et al.,(2006)Nature 443, 867-869; Ro et al,(2006)Nature 440, 940-943)。
【０３１４】
いくつかの態様において、本発明は、異なる細菌種におけるSOS応答のような遺伝子ネットワークおよび経路を標的とするために改変された天然ファージのライブラリーの作製および使用も包含する(Hickman-Brenner et al.,(1991)J. Clin. Microbiol.29, 2817-2823)。当業者は、標的とされた細菌種に感染する能力を有する天然ファージの単離および遺伝学的改変のような、当技術分野におけるルーチンの方法を使用することにより、そのようなライブラリーを作成し使用することができる。現在のDNA配列決定および合成の技術によれば、異なる遺伝子ネットワークを標的とする複数の構築物を保持している操作されたバクテリオファージゲノム全体を合成することができる(Baker et al,(2006)Sci. Am. 294, 44-51)。従って、当業者は、そのような技術を使用して、広範囲の細菌感染に対する異なる抗生物質薬と共に適用され得る抗生物質増強ファージを作製するため、ファージライブラリーの大規模改変を実施することができる。臨床的に妥当な細菌株に対する抗生物質増強ファージとして効果的である操作されたファージをライブラリーから同定するため、当業者によりルーチンの試験によって実施され得る、操作されたファージのライブラリーにより臨床的細菌株を標的とすることは、現実の感染に対する処置の開発における重要な有用性を有する。
【０３１５】
いくつかの態様において、本明細書に記載されるような操作されたファージは、細菌バイオフィルムおよびその他の除去が困難な細菌が存在する、産業的状況、農業的状況、および食品加工状況においても使用され得る(Lu et al.,(2007)Proc Natl Acad Sci U S A 104, 11197-216)。従って、本明細書に記載されるようないくつかの態様は、本明細書に記載されるような操作されたファージを、非医学的状況における抗生物質補助剤として適用することを包含する。これは、経済的に有利であり、市中獲得抗生物質耐性を低下させ、処置としてかつ／または臨床的使用において使用する前に、特定の操作されたファージの効力を試験するためにも有用である(Morens et al.,(2004)Nature 430, 242-24949)。
【０３１６】
抗生物質耐性に対抗するためのもう一つの戦略は、耐性遺伝子または細胞修復経路を調節する、細菌に固有の多数の自己調節リプレッサーを利用することである(Okusu, el al.,(1996)J Bacteriol 178: 306-308)。例えば、lexAは、DNA傷害に応答してrecAによって切断されるまで、SOS応答を抑制する(Dwyer et al.,(2007)Mol Syst Biol 3: 91)。さらに、marRはmarRABオペロンを抑制し、acrRはacrABオペロンを抑制し；両オペロンは、ある範囲の抗生物質に対する耐性を付与する(Okusu, el al.,(1996)J Bacteriol 178: 306-308)。SOS応答または抗生物質耐性を与えるオペロンの抑制を増加させるため、本発明者らは、原因リプレッサーを過剰発現させることを提唱する。しかしながら、単純な過剰発現は、細胞に高い代謝コストをかけ、導入された構築物の拒絶をもたらすかもしれない。従って、単純な過剰発現の代わりに、本発明者らは、lexAおよびその他のリプレッサーを含む自己調節ネガティブフィードバックモジュールを作出し、これらの構築物により細胞が抗生物質処理に対して感作されるか否かを決定した(図13)。この戦略の正味の効果は、リプレッサーのレベルの攪乱が、より迅速に回復され、望ましくは生存経路の活性化の成功が防止されるよう、固有の自己調節ネガティブフィードバックループのループゲインを増加させることであるべきである。
【０３１７】
本発明者らは、pZE1L-lexAプラスミドを作製し、8時間の増殖、それに続く8時間の処理により、オフロキサシン(5μg/mL)による残留性レベルに関して査定した。本発明者らは、(Dwyer et al.,(2007)Mol Syst Biol 3: 91)に記載されたPLlexOプロモーターを利用することにより、pZE1L-lexAプラスミドを構築した。pZE1L-lexA構築物を含有している細胞は、野生型大腸菌EMG2と比較して、約1.44 log10(CFU/mL)少ない残留細胞を生じた(図10)。本発明者らは、非切断可能lexAバリアントを使用することによっても、pZE1L-lexAの設計に変化を加えた。
【０３１８】
本発明者らは、T7のような溶菌性ファージまたはM13のような溶原性ファージにおいて、合成生物学を使用して、ベクター構築物を、感染の間に発現されるよう、ファージゲノム内の最適の領域へ単純に挿入することによる、操作されたファージの構築を証明した(Lu et al.,(2007)Proc Natl Acad Sci U S A 104: 11197-11202)。M13は、大腸菌に感染する一本鎖環状DNAゲノムを有する糸状雄特異的ファージである。感染の間、ゲノムは、溶原性状態に安定的に維持され得る二本鎖複製型(RF)を採っている。続いて、M13は複製し、他の細胞に感染することができる成熟ファージ粒子を周辺の環境へ分泌する。M13は、ペプチドディスプレイおよびDNA配列決定のため一般的に使用されているファージであり、遺伝子操作のために改変されている。いくつかの態様において、M13およびその他の溶原性ファージは、内毒素のような毒性生成物の放出をもたらすか、または強力な進化圧のためにファージ耐性菌の発達をもたらすかもしれない大量の溶菌なしに、導入された構築物の細菌集団全体への伝播を可能にするため、asRNAまたはその他の遺伝子モジュールのための担体として使用され得る。構築物は、細胞の大部分に到達し、所望の効果を有し、次いで、その後、抗生物質治療によって死滅することができる必要があるため、溶原性ファージを本発明者らは使用した。例えば、既に改変されたM13mp18バクテリオファージにおいて、強力な細菌種特異的プロモーターまたはファージ特異的プロモーターの制御下で、lacZ遺伝子の代わりに遺伝子構築物をクローニングすることができる。
【０３１９】
本明細書において、本発明者らは、異なる因子を個々にまたは組み合わせて標的とする効果的なバクテリオファージ補助剤の構築が、モジュール様式で達成され得ることを証明した。DNA配列決定および合成の技術のコストは低下し続けているため、ファージライブラリーの大規模改変は実行可能になるはずである62〜64。現在の技術により、遺伝子ネットワークを標的とする複数の構築物を保持している操作されたM13mp18ゲノム全体は、10,000ドル未満で合成され得、この価格は将来的に確実に減少する65。さらに、操作されたバクテリオファージにおいて使用される新しい標的をより迅速に同定するため、システムバイオロジー技術が利用され得る43、44。アンチセンスRNAも、細菌の死滅を増強するためにバクテリオファージによって送達され得る。有害なバイオフィルムの除去を増加させるため、本明細書に記載されたもののような操作されたファージのカクテルが、バイオフィルム分散バクテリオファージおよび抗生物質と組み合わせられてもよい38。
【０３２０】
FDAが食品におけるリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)に対するバクテリオファージの使用を最近承認したため、本明細書に開示されたような操作されたファージは、細菌バイオフィルムおよびその他の除去が困難な細菌が存在する、医学的状況、産業的状況、農業的状況、および食品加工状況のために容易に採用され得る可能性が高い38、69。非医学的状況での細菌の死滅の強化は、市中獲得抗生物質耐性の低下に加えて、経済的な利点を有するはずである12。
【０３２１】
従来の薬物は、典型的には、タンパク質機能を低下させることにより、治療効果を達成する。対照的に、本明細書に記載されるようなバクテリオファージおよび選択的な遺伝子を標的とするアプローチは、lexA3、soxR、およびcsrAのような遺伝子ネットワークに影響を与えるタンパク質、またはompFのような抗生物質感受性をモジュレートするために単独で作用するタンパク質を過剰発現させることにより、抗生物質による死滅を強化する。操作されたM13mp18-lexA3バクテリオファージによりSOS応答を低下させることによって、本発明者らは、オフロキサシンの殺菌効果を、4.5桁超、強化し、残留細胞の数を低下させた(図1b)。本発明者らは、死滅を増強するため、soxR、csrA、およびompFのようなその他の因子が、個々にまたは組み合わせて、過剰発現のための標的とされ得ることも証明した(図6)。本発明者らは、オフロキサシンと組み合わせられた操作されたM13mp18-lexA3バクテリオファージの使用によって、抗生物質耐性を獲得する変異体の数が有意に減少することを証明した(図7)。さらに、本発明者らは、本発明者らの操作されたバクテリオファージが、アミノグリコシド系およびβ-ラクタム系のようなその他の薬物のための抗生物質補助剤として使用され得ることを確認した(図8)。抗生物質および操作されたファージによる組み合わせ治療は、ファージ耐性の認識可能な発達をもたらさなかった。本発明者らは、第一の抗生物質標的でない細菌の遺伝子ネットワークを標的とすることにより、抗微生物薬による死滅が実質的に改善されることを証明した。システムバイオロジーおよび合成生物学の進歩によって、細菌感染に対抗するための新たな組み合わせ治療として、操作されたバクテリオファージを抗生物質と共に実際に適用することが可能になるはずである。
【０３２２】
（表2A）：リプレッサー操作されたバクテリオファージによって阻害され得る遺伝子の例。いくつかの態様において、以下の非SOS防御遺伝子のうちの一つまたは複数を阻害するそのようなリプレッサー操作されたバクテリオファージは、シプロフロキサシン抗微生物剤との組み合わせにおいて有用である。記号：a  アクセッション番号(www「ecocyc.org」より)、b  カテゴリは以下の通りである：1 - DNAの複製、組換え、および修復、1A - カテゴリ1に間接的に影響を与える機能、2 - 輸送、流出、細胞壁および細胞膜の合成、2A - 2に関連したシャペロンおよび機能、3 - タンパク質合成、4 - 中心代謝反応、5 - 調節、6 - プロファージによってコードされた遺伝子；細胞接着、または7 - 割り当てられていない遺伝子。c  BW25113(10)を出発株として使用したKEIOコレクション(3)からの遺伝子ノックアウト。
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【０３２３】
（表2B）：リプレッサー操作されたバクテリオファージによって阻害され得る遺伝子の例。いくつかの態様において、以下の非SOS防御遺伝子のうちの一つまたは複数を阻害するそのようなリプレッサー操作されたバクテリオファージは、バンコマイシン抗微生物剤またはそのアナログもしくはバリアントとの組み合わせにおいて有用である。
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【０３２４】
（表2C）：リプレッサー操作されたバクテリオファージによって阻害され得る遺伝子の例。いくつかの態様において、以下の非SOS防御遺伝子のうちの一つまたは複数を阻害するそのようなリプレッサー操作されたバクテリオファージは、リファンピシン抗微生物剤またはそのアナログもしくはバリアントとの組み合わせにおいて有用である。
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【０３２５】
表2D：リプレッサー操作されたバクテリオファージによって阻害され得る遺伝子の例。いくつかの態様において、以下の非SOS防御遺伝子のうちの一つまたは複数を阻害するそのようなリプレッサー操作されたバクテリオファージは、アンピシリン抗微生物剤またはそのアナログもしくはバリアントとの組み合わせにおいて有用である。
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【０３２６】
（表2E）：リプレッサー操作されたバクテリオファージによって阻害され得る遺伝子の例。いくつかの態様において、以下の非SOS防御遺伝子のうちの一つまたは複数を阻害するそのようなリプレッサー操作されたバクテリオファージは、スルファメタキサゾン(Sulfamethaxazone)抗微生物剤またはそのアナログもしくはバリアントとの組み合わせにおいて有用である。
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【０３２７】
（表2F）：リプレッサー操作されたバクテリオファージによって阻害され得る遺伝子の例。いくつかの態様において、以下の非SOS防御遺伝子のうちの一つまたは複数を阻害するそのようなリプレッサー操作されたバクテリオファージは、ゲンタマイシン抗微生物剤またはそのアナログもしくはバリアントとの組み合わせにおいて有用である。
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【０３２８】
（表5）：本明細書に開示されたような阻害剤操作されたバクテリオファージ、またはリプレッサー操作されたバクテリオファージ、または感受性操作されたバクテリオファージとなるよう操作され得るバクテリオファージの例
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【０３２９】
（表6）：操作されたバクテリオファージにおいて核酸に機能的に連結され得るプロモーターの例
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【０３３０】
参照
本明細書および本願全体に引用された参照は、参照により完全に本明細書に組み入れられる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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