(57)【要約】  本発明は、ペンタミジンのプロドラッグ誘導体に関し、疾患、とくに腫瘍、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、ニューモシスティスカリニ肺炎（ＰｃＰ）およびマラリアの処置および／または予防のためのそれらの使用に関する。
2014529579.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2014529579.tif 000022
式中、
ｎは、１〜１０を表す、
で表される化合物またはその薬学的に許容し得る誘導体。
【請求項２】
ｎが２を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｎが３を表す、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物の塩、溶媒和物または塩の溶媒和物。
【請求項５】
疾患の処置および／または予防のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
任意の病因の腫瘍学的疾患および腫瘍疾患の処置および／または予防に使用するための請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
リーシュマニア症、トリパノソーマ症および／またはニューモシスティスカリニ肺炎（ＰｃＰ）の処置および／または予防に使用するための請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
マラリアの処置および／または予防に使用するための請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物を含み、適当な場合、１または２以上の不活性の、非毒性の、薬学的に適した賦形剤と組み合わせた、薬物。
【請求項１０】
１または２以上のさらなる活性剤と組み合わせた、請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物を含む薬物。
【請求項１１】
経口または非経口投与のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物を含む薬物。
【請求項１２】
腫瘍疾患の処置および／または予防のための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物を含む薬物。
【請求項１３】
薬物が腸溶性処方物であることを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の薬物。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物または請求項９〜１２のいずれか一項に記載の薬物を使用した、ヒトまたは動物における腫瘍学的疾患および腫瘍疾患の処置および／または予防のための方法。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の少なくとも１種の化合物または請求項９〜１２のいずれか一項に記載の薬物を使用した、ヒトまたは動物におけるリーシュマニア症、トリパノソーマ症および／またはニューモシスティスカリニ肺炎（ＰｃＰ）の処置および／または予防のための方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の製造方法であって、
式（Ａ）
【化２】
2014529579.tif 000023
で表されるアミドキシムを、
式（Ｂ）
【化３】
2014529579.tif 000024
式中、ｎは１〜１０を表す、で表されるジカルボン酸無水物と反応させることにより、
式（Ｃ）
【化４】
2014529579.tif 000025
で表される化合物に変換することを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
説明
本発明はペンタミジンのプロドラッグ誘導体、疾患、とくに腫瘍および癌疾患ならびにリーシュマニア症、トリパノソーマ症、ニューモシスティスカリニ肺炎（ＰｃＰ）ならびにマラリアの処置および／または予防のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペンタミジンは、トリパノソーマ症、リーシュマニア症ならびにニューモシスティスカリニ肺炎（ＰｃＰ）の処置におけるその使用が確立されている抗寄生虫性および抗菌性の活性化合物である。２種の強い塩基性アミジン官能基によって、化合物は生理的条件下で電荷を帯びて、経口適用後に器官によって吸収されないであろう。これが、該化合物を非経口で、例えば筋肉内、静脈内または吸入経路によって、投与する必要がある理由である。本文脈において、上述の病原体によって引き起こされる感染症のほとんどは医学的ケアがしばしば不十分である熱帯および亜熱帯の国で発生していることに留意しなければならない。
【０００３】
静脈内および吸入適用に代表されるような複雑な適用形態は、それゆえに、これらの国における安全な薬物療法を特に困難にしている。この理由で、治療の選択肢を決定的に改善するために、経口投与可能なペンタミジンプロドラッグの開発はかなり重要である。さらなる負の側面は、ＣＮＳへ通過するペンタミジンの能力が存在しないことであり、ペンタミジンは、病原体がＣＮＳに浸透する髄膜脳炎段階よりはむしろトリパノソーマ症（アフリカ睡眠病）の初期段階でのみ有効になる。
【０００４】
ペンタミジンの用途のさらなる可能な分野は癌治療である。エンド−エキソヌクレアーゼに対するペンタミジンの阻害作用が長年の間徹底的に研究されてきた１、２。最初の臨床研究は、乳癌および結腸癌の治療に有望な結果を示した３。ここでも、経口投与可能なペンタミジンプロドラッグの使用が非常に重要である。
【０００５】
このような理由で、バイオアベイラビリティおよびＣＮＳ経路の両方を改善するために、多数の試験が行われている。以前の研究において、ペンタミジンは、親油性の強い増加をもたらす、塩基性の低いペンタミジンジアミドキシムにした。アミドキシムは、生理学的条件下で電荷を帯びていないため、消化管からのこれらの化合物の吸収は劇的に向上する４。アミドキシムの薬理学的に活性なアミジンへの著しい還元は、モデル化合物ベンズアミドキシムに基づいて１９８８年に初めて示すことができた５。原理は、後に、ペンタミジンに転用され、これにより、ペンタミジン−モノアミドキシムおよびペンタミジン−ジアミドキシム（３）が得られる。動物実験において、両化合物は低いバイオアベイラビリティおよび活性型ペンタミジンに活性化される良好な能力を示した６。一方、還元に関与する酵素系は、これまでに知られていない、ｍＡＲＣ（ミトコンドリアアミドキシム還元成分）と呼ばれたモリブデン含有系として特定することができた７、８。
【０００６】
バイオアベイラビリティを改善するための薬物動態プロファイルおよびＣＮＳへ通過する能力の両方を最適化するために、さらなるプロドラッグが開発されている。Ｎ，Ｎ−ビス（アセトキシ）ペンタミジンでは、他のペンタミジンプロドラッグと比較して明らかに増加した親油性を有する化合物が得られた。同様に、このプロドラッグは、ラットならびにブタについての動物実験において経口バイオアベイラビリティを発揮することができた。Ｎ，Ｎ−ビス（アセトキシ）ペンタミジンの欠点は、極めて低い水溶性であり、一方で確認されたバイオアベイラビリティは、他方では極めて低く、ＣＮＳへの通過は確認することができなかった９。
【０００７】
同様の試みが、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシ）ペンタミジンの開発につながり、これはＮ，Ｎ’−ビス（アセトキシ）ペンタミジン同様に、極めて低い水溶性である。ペンタミジンに転用される、さらなるプロドラッグ原理は、Ｎ，Ｎ’−ビス（ジヒドロキシ）ペンタミジンにヒドロキシル化することおよびＮ，Ｎ’−ビス（バロキシ）ペンタアミジンへのアミノ酸（特にバリン）とのコンジュゲーションである１０〜１２。要約すると、今日まで、最適な方法で、必要な基準（良好な経口バイオアベイラビリティ、ＣＮＳへの通過および良好な溶解度）を満たすペンタミジンプロドラッグは開発することができなかったことを述べなければならない。
【発明の概要】
【０００８】
上に照らして、本発明は、ペンタミジンの公知のプロドラッグと比較して改善された特性を示すペンタミジンプロドラッグを提供するという課題に基づいていた。
【０００９】
前記課題は式（Ｉ）
【化１】
2014529579.tif 000003
式中、ｎは１〜１０を表す、で表される化合物ならびにその薬学的に許容し得る誘導体により解決される。
【００１０】
好ましい態様において、式（Ｉ）において、ｎは２を表す。
さらなる好ましい態様において、式（Ｉ）において、ｎは３を表す。さらなる好ましい態様において、式（Ｉ）において、ｎは１、３、４、５、６、７、８、９または１０を表す。
【００１１】
特に、Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）は、明らかに、これまで記載したペンタミジンプロドラッグよりも優れている。他のペンタミジンドラッグの非常に重大なパラメータを表す溶解度の大幅な改善が示された。良好な溶解特性は薬用物質の吸収において重要なパラメータを構成するので、この改善された溶解度によって、物質の薬物動態挙動は正の影響を受ける。
【００１２】
本発明は、さらにまた、前記式（Ｉ）化合物の塩、溶媒和物および塩の溶媒和物に関する。
本発明はさらに、疾患の処置および／または予防のための前記式（Ｉ）化合物に関する。
【００１３】
好ましい態様において、本発明は、任意の病因の腫瘍学的疾患および腫瘍疾患の処置および／または予防において使用するための前記化合物に関する。
さらなる好ましい態様において、本発明は、リーシュマニア症、トリパノソーマ症および／またはニューモシスティスカリニ肺炎（ＰｃＰ）の処置および／または予防における使用のための前記化合物に関する。
さらなる好ましい態様において、本発明は、マラリアの処置および／または予防に使用するための前記化合物に関する。
【００１４】
本発明はさらに、少なくとも１種の前記式（Ｉ）化合物を含み、適当な場合、不活性の、非毒性の、薬学的に適した賦形剤の１または２以上と組み合わせた、薬物に関する。
本発明はさらにまた、少なくとも１種の前記式（Ｉ）化合物を、１または２以上のさらなる活性剤と組合せて含む薬物に関する。
本発明はさらにまた、経口または非経口適用のための薬物に関する。
【００１５】
本発明はさらに、腫瘍学的疾患および腫瘍疾患の処置および/または予防のための薬物に関する。
また、本発明は、さらに腸溶性処方物である上記薬物に関する。
本発明は、さらに、少なくとも１種の前記式（Ｉ）化合物または前記薬物の１つを使用して、ヒトまたは動物における腫瘍疾患の処置および/または予防するための方法に関する。
さらに、本発明は、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、およびニューモシスティスカリニ肺炎（ＰｃＰ）の処置および／または予防のための方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、上記化合物を調製するための方法に関し、ここで、式（Ａ）
【化２】
2014529579.tif 000004
で表されるアミドキシムを、式（Ｂ）
【化３】
2014529579.tif 000005
式中、ｎは１〜１０を表す、で表されるジカルボン酸無水物と反応させることにより、
式（Ｃ）
【化４】
2014529579.tif 000006
で表される化合物へ変換される。
【００１７】
さらに開発されたプロドラッグ原理は、特許出願WO2009095499およびDE10200800738111に記載のようなジカルボン酸へのアミドキシムのカップリングである。対応するペンタミジンプロドラッグは、これらの研究に関連して開発された。得られた化合物は、詳細に特性評価され、それらのバイオアベイラビリティに関して調べられた。我々の研究は、ペンタミジンジカルボン酸誘導体が、優れた溶解性とは別にまた、経口投与後に良好な経口バイオアベイラビリティをも持つ、特に適したペンタミジンプロドラッグであることを示した。他のペンタミジンプロドラッグを用いた比較分析は、この場合において、これまでに記載したペンタミジンプロドラッグに対するＮ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の優位性を示した。
【００１８】
発明の説明
ペンタミジンの治療的使用は、不十分な経口バイオアベイラビリティのため、これまで極めて制限されている。特に組織的に弱い第三世界の国々において、経口投与可能な薬用物質の開発は、複雑で危険な静脈内適用を回避することができるため、薬物療法において大幅な進歩を構成している。また、特にトリパノソーマ、カリニ肺炎、ニューモシスティスジロベシおよびリーシュマニア感染において、今日の治療の選択肢は満足のいくものではない。この理由のため、本発明の主な焦点は、ペンタミジンの経口投与可能なプロドラッグを開発することである。
【００１９】
また、経口適用可能なペンタミジンプロドラッグは、癌治療において大幅に重要性が増し得る。ペンタミジンは、現在、様々な種類の癌（乳癌および結腸癌）に対して臨床実験で調べられている。最初の臨床実験は、既に有望な結果を示した３。ここでも、新規なペンタミジンプロドラッグは、適用法を見出すことができ、治療を改善することができ、さらには他の腫瘍学的活性剤と組み合わせてもできた。
【００２０】
新規のペンタミジンプロドラッグは、ジカルボン酸にペンタミジンジアミドキシム（３）を結合させることにより、本発明の枠組みの中で開発された。得られた化合物は、in vitro およびin vivoで包括的に特性評価し、ここでこれらは優れた溶解性ならびに良好なバイオアベイラビリティを示した。異なるペンタミジンプロドラッグを用いた比較分析はまた、これまでに記載したペンタミジンに対する、新しく開発したＮ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の優位性を示した。
【００２１】
合成
プロドラッグ（１、２）の調製は、ペンタミジンジアミドキシム（３）とそれぞれの酸無水物（それぞれ、コハク酸、グルタル酸無水物）から続いて行った。出発化合物は、コハク酸無水物を添加することにより、乾燥させたアセトン中、４時間、還流下で加熱した（図1参照）。続いてトルエン中で沸騰させ、直接ろ別することにより、物質１および２を分離し、分析的に純粋な形態で所望の化合物を調製することができた。
【００２２】
安定性
分析は、中性および弱アルカリ性のｐＨ範囲、ゆえにｐＨ７．４〜ｐＨ９．９内で安定である。ｐＨ２．０で酸性媒体中、化合物は、急速に加水分解で切断される（図２、３）。
【００２３】
分析中、水溶液中でＮ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）が、モノスクシニルペンタアミジンおよびペンタミジンジアミドキシム（３）に加水分解されたことが示された。この加水分解はｐＨ７．４およびｐＨ９．０ではわずかにしか進行しないが、ｐＨ２．０ではヒトならびにマウス血漿において、著しく進行する。ｐＨ２．０でのＮ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の急速な加水分解は（図２、３参照）、プロドラッグとしての使用に関しては問題があると分類しなければならない。Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）は、経口適用後の胃の酸性媒体中で、プロドラッグのペンタミジンジアミドキシム（３）への急速な加水分解をもたらすであろう。
【００２４】
しかしながら、消化管吸収の大部分は、小腸上部のセクションでのみ行われるため、このプロドラッグの腸溶性処方物が目的とされるべきである。この方法では、プロドラッグは、胃の中の酸性環境に損傷せずに耐えるであろうし、その後小腸で吸収され得るであろう。したがって、ｐＨ２．０での不安定性は、薬用物質としての後の使用に対しては問題ないものとして分類されるべきである。
【００２５】
溶解度
Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）は、ｐＨ範囲７．４〜９．０において極めて良好な溶解度をもつ（表１参照）。酸性媒体（ｐＨ２．０）における溶解度は、前に記載したとおり、この媒体における加水分解によって正確に特性評価することはできなかった。しかしながら、実験はここでも溶解度はｍＭ範囲であることを示した。
【００２６】
表１は、他の開発されたペンタミジンプロドラッグと比較したＮ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の溶解度を示す。ジカルボン酸誘導体（１）が最大の溶解度を有する化合物であることが、このデータから明らかになった。単独のペンタミジンモノアミドキシムもまた、中性及び弱アルカリ性ｐＨ値で、ｍＭ範囲で可溶性である。しかし、この化合物は、依然として経口バイオアベイラビリティに極めて不利な影響を有するフリーアミジン官能基を持つ。十分な溶解度が十分な経口吸収のための基本的な前提条件であるため、これらの優れた溶解特性は、薬用物質としての後の使用を推進する。また、Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の良好な溶解性は、注射または注入などの非経口適用形態を可能にする。
【００２７】
タンパク結合
タンパク結合についての分析は、９７％の血漿タンパク結合を有するこの化合物がとても顕著なタンパク結合を処理していることを示した。確認されたタンパク結合は、他のペンタミジンプロドラッグについて記載されている範囲内であり、従って他のプロドラッグ９と比較して不利な点を表していない。
【００２８】
プロドラッグ概念
本発明の化合物が基づいているプロドラッグ概念自体は、特許出願WO2009095499およびDE102008007381に記載されている。
エステラーゼおよびｍＡＲＣ酵素系を介する本発明のプロドラッグの活性化は、ゆえにシトクロムＰ４５０酵素から独立している。Ｐ４５０酵素の関与は、我々が選択した活性化機構には記載されていない相互作用の危険性を常に伴う。シトクロムＰ４５０酵素は、多くの薬用物質の代謝に関与している。この酵素系を介して代謝されるいくつかの薬用物質が摂取される場合、薬用物質の分解の遅延が、臨床的に関連する副作用を伴って続いて行われ得る。
【００２９】
In Vitro活性化
In Vitro活性化試験は、Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）活性化が有効に行われることを導いた（表２）。ブタ肝臓由来のカルボキシルエステラーゼとのインキュベーションは、Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の迅速な活性化をもたらした（図４参照）。約９０％の用いた基質は、早ければ６０分のインキュベーション時間後活性化した。この結果は、ジアミドキシムへのＮ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の活性化の第１工程が優れた速度で進行することを示している。
【００３０】
ペンタミジンへの還元は、細胞内酵素調製物とのインキュベーションで検出することができた（表２）。一般的に、ブタ起源の酵素源は、ヒトのものよりもより活性であるが、これは、酵素調製物を得るための方法で説明することができる事実である。ヒトの器官の処理は、極めて低い初期量のため、より問題であることを考慮すべきである。また、ブタの器官は、原則として、健康な動物に由来するが、一方ヒト組織試料は、ほとんどの場合において、器官の切除後の癌患者から採取され、これはヒト酵素調製物を使用する際の比較的低い変換率についての説明を構成する。
【００３１】
要約すると、Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）が適したペンタミジンのプロドラッグであると述べることができる。本研究は、概して、活性化合物へのプロドラッグの生物活性化が起こることを証明している。必要とされる酵素がより多い量で利用可能であるため、in vivo変換率は明らかにより高いことが期待される。
【００３２】
経口バイオアベイラビリティ
Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の経口バイオアベイラビリティは、実施した動物実験で実証することができた。プロドラッグを経口投与した後、ペンタミジン血漿レベルを検出することはできなかったが、これは、器官における、ペンタミジンの既知の高い蓄積傾向によって説明することができる事実である。器官試料の分析は、Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）が経口投与可能であることを示した。プロドラッグを経口投与した後、全ての調べた器官（肝臓、腎臓、肺、心臓、脳および脾臓）において適切な濃度を特定することができた。この場合において、腎臓および肝臓において、最も高い濃度が検出された（図５）。脾臓、心臓、脳および肺の中の濃度は明らかに低かった。相対的経口バイオアベイラビリティは最大９８％までに至ることを器官に応じて決定することができた（表３）。
【００３３】
要約すると、データは、ペンタミジンのための本発明のプロドラッグ原理の優れた適合性を証明している。器官で検出されたペンタミジン濃度は、トリパノソーマ（ＩＣ５０：０．８〜３．２ｎＭ）、リーシュマニア（ＩＣ５０：０．８〜３．２ｎＭ）ならびにマラリア原虫（ＩＣ５０：３５〜１２９ｎＭ）による感染症の治療を可能にする範囲内にある。
【００３４】
要約
新たに開発されたプロドラッグは、ペンタミジンの経口投与可能なプロドラッグである。使用したプロドラッグ原理は、他のペンタミジンドラッグの、極めて重要なパラメータを構成する溶解性のかなりの改善をもたらす。良好な溶解特性は、薬用物質の吸収、特に消化管において重要なパラメータを表すため、この改善された溶解度は、物質の薬物動態学的挙動に正の影響を与える。
【００３５】
酸性のｐＨ範囲を除いて、化合物１は、良好な化学安定性をもつ。酸性媒体中で際立つ加水分解は、経口投与する場合、胃内で加水分解するのを回避するために、腸溶性処方物として投与されるプロドラッグの条件である。
【００３６】
in vitroでの生物活性のアッセイは、ペンタミジンへのプロドラッグの急速かつ広範な活性化を証明することができた。活性化は、シトクロムＰ４５０酵素から独立して進行し、ゆえに相互作用の危険性を伴わない。
良好な経口バイオアベイラビリティもまた最終的に実施した動物実験において、実験的に証明することができた。器官において検出されたペンタミジンの含有量はトリパノソーマ、リーシュマニアおよびマラリア原虫による感染に関して効率化を可能にする範囲にある。
【００３７】
要約すると、ペンタミジンジカルボン酸誘導体は、優れた物理化学的パラメータを処理し、良好な経口バイオアベイラビリティをもつ優れたプロドラッグである。これらの特性によって、これらは明らかに他のペンタミジンのプロドラッグよりも優れている。癌治療ならびにトリパノソーマ、リーシュマニアおよびニューモシスティスカリニ感染症の治療の両方に使用が可能である。
記載した発明は、付随する図に、さらにより詳細に具体化される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、ペンタミジンプロドラッグの合成の概略図である。
【図２】図２は、様々なｐＨでの、マウス血漿、ヒト血漿それぞれにおける、ならびにエステラーゼとのインキュベーションでの、Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の安定性を示す図である。
【図３−１】図３は、様々なｐＨでの、マウス血漿、ヒト血漿それぞれにおける、Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の安定性を示す図である。
【図３−２】図３は、様々なｐＨでの、マウス血漿、ヒト血漿それぞれにおける、Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の安定性を示す図である。
【図４】図４は、エステラーゼによるＮ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の活性化を示す図である。
【図５】図５は、ペンタミジンのｐ．ｏ．適用（５０ｍｇ／ｋｇ）後のペンタミジンおよびＮ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の含有量を示す図である。全ての試験ラットの平均値を示す。
【００３９】
材料および方法：例示態様
合成
【化５】
2014529579.tif 000007
４，４’−ペンタメチレンジオキシ−ビス−［Ｎ−（カルボキシプロピオニルオキシ）］ベンズアミジン
（Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン）（１）：
１ｇのペンタミジンジアミドキシムを２５０ｍｌのアセトンに溶解し、５４０ｍｇの無水コハク酸を添加する。バッチを還流下で４時間撹拌する。続いて、溶媒を真空下で除去し、残渣をトルエンから結晶化する。
【００４０】
収率：68％
融点：141℃
【数１】
2014529579.tif 000008
元素分析 C27H32N4O10 (分子量: 572.56): 
計算値: C 56.64, H 5.63, N 9.79
実測値: C 56.85, H 6.01, N 9.60
【００４１】
【化６】
2014529579.tif 000009
４，４’−ペンタメチレンジオキシ−ビス−［Ｎ−（カルボキシブチオニルオキシ）］ベンズアミジン
（Ｎ，Ｎ’−ビス（グルタリルオキシ）ペンタアミジン）（２）：
１ｇのペンタアミジンジアミドキシムを２５０ｍｌのアセトンに溶解し、６１６ｍｇの無水グルタル酸を添加する。バッチを還流下で４時間撹拌する。続いて、溶媒を真空下で除去し、残渣をトルエンから結晶化する。
収率：80％
融点：155℃
【数２】
2014529579.tif 000010
元素分析 C29H36N4O10 (分子量: 600.62): 
計算値: C 57.99, H 6.04, N 9.33
実測値: C 58.05, H 6.24, N 9.72
【００４２】
Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）およびＮ，Ｎ’−ビス（グルタリルオキシ）ペンタアミジン（２）の代替的合成
プロドラッグ（１、２）の調製は、ペンタミジンジアミドキシム（３）およびそれぞれの酸無水物（それぞれ、コハク酸、グルタル酸無水物）から続けて行った。
プロドラッグ（１）を製造するために、ペンタミジンジアミドキシム（３）をエタノールに溶解し、ジクロロメタンに溶解した１０倍過剰のコハク酸無水物を溶液に滴加した。混合物を還流下で４時間加熱し、室温まで放冷し、形成した沈殿物をろ別し、続いてジクロロメタンで数回洗浄した。化合物（１）は非常に良好な収率で、分析的に純粋に調製することができた。プロドラッグ（２）を製造するために、グルタル酸無水物を添加しながら、出発化合物を乾燥したアセトン中、還流下で４時間加熱した（図１参照）。続いてトルエン中で沸騰させ、直接ろ別することにより、物質２を分離し、分析的に純粋に製造することができた。
【００４３】
【化７】
2014529579.tif 000011
【００４４】
ペンタアミジンプロドラッグの特性評価
Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の安定性分析
安定性分析のために、０．１ｍＭ溶液の、Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液／ＤＭＳＯ（９０／１０、ｖｏｌ／ｖｏｌ）中に調製した。分析は、ｐＨ２．０、７．４および９．０の値で行った。１つの試料は１５０分間かけて１５分毎に採取し、ＨＰＬＣにより直ちに分析した。
【００４５】
さらなる分析は、ヒトおよびマウス血漿を用いて実施した。９００μｌの血漿を１００μｌの２ｍＭ  Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）溶液と混合した。これにより、Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の最終濃度は０．２ｍＭであった。試料を振とう水浴中３７℃でインキュベートし、試料を０、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５および１２０分後に採取した。この目的のために、各場合において１００μｌを抜き出し、１００μｌのアセトニトリルと混合した。試料を振とうし、５分間遠心分離し、上清をＨＰＬＣにより測定した。
【００４６】
また、ブタ肝臓由来のカルボキシルエステラーゼとのインキュベーションを実施した。この目的のために、Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）を０．１ｍＭの濃度で、５０ｍＭリン酸緩衝液中、ｐＨ７．４、３７℃で６０分間かけて１Ｕエステラーゼとインキュベートした。それぞれ１５分間隔で、試料をＨＰＬＣにより分析した。
【００４７】
安定性分析は以下のＨＰＬＣ法によって評価した：
【表１】
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【００４８】
Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の溶解性
１００μｌ中に不溶である量の化合物を５０ｍＭのリン酸緩衝液（それぞれｐＨ７．４、ｐＨ９．０）に懸濁させ、２０分間振とうした。続いて、溶解しなかった部分を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ）により除去し、試料を直ちにＨＰＬＣにより測定した。溶解性の評価は、ＤＭＳＯ中のＮ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の較正を介して続けて行った。化合物は生理的ｐＨ値７．４でよく溶解する（７．５ｍＭ）。ｐＨが増加すると溶解性はさらに改善される（表１参照）。
前述の誘導体と比較して溶解性をよりよく判定することができるように、様々な他のペンタミジンプロドラッグを比較することによって調べた。溶解性は、化合物１について記載の方法と同様にして決定した。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）のタンパク結合の決定
血漿タンパク結合は、３種の異なる濃度（１０、２０および５０μＭ）で決定した。４％アルブミン溶液はタンパク質溶液として使用した。各場合において、５０μｌの１０倍に濃縮した物質溶液を４５０μｌのタンパク質溶液にピペットで取った。インキュベーションは、３７℃で振とう水浴中、１５分にわたって続けて行った。続いて、試料を限外ろ過ユニット（ビバスピン５００、１０ｋＤａカットオフ）に移し、１０，０００ＲＰＭで１５分間遠心分離した。ろ液をＨＰＬＣにより分析した。さらに、タンパク質との混合も遠心分離もされなかったコントロールを、各濃度について行った。タンパク質を添加しなかったが、しかしながら遠心分離したさらなるコントロールは、該プロドラッグがダイアフラムによって保持されず、方法論を検証するために役立っていなかったことを示した。
試料の分析により、９７．１±１．２％の化合物１のタンパク結合が確認された。
【００５１】
Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の生物活性の分析
様々な細胞内酵素系を使用したプロドラッグ活性化の確認
プロドラッグの活性化は、細胞内酵素調製物を用いてin vitroで決定した。ヒトおよびブタの肝臓および腎臓組織の９０００ｘｇの上清、ミクロソームならびにミトコンドリアを、酵素調製物として使用した。インキュベーションバッチは、５００ｍＭプロドラッグ、１ｍＭＮＡＤＨ、１Ｕエステラーゼおよび１５０μｌの１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．３中に溶解された０．３ｍｇの酵素調製物から構成された。インキュベーションは、３７℃で振とう水浴中で２０分にわたって行った。インキュベーションは、１５０μｌのアセトニトリルを添加することにより停止させた。続いて、試料を１０分間振とうし、沈殿したタンパク質を１５分間、１０，０００ＲＰＭで遠心分離することによって除去した。上清をＨＰＬＣにより測定した。確認された変換率を表２に示す。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
また、ブタ肝臓由来の１Ｕカルボキシルエステラーゼを用いてインキュベーションを行った。この目的のために、化合物を２５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中、５００μＭの濃度で、１Ｕエステラーゼと６０分にわたってインキュベートした。インキュベーションは２５０μＬのアセトニトリルを加えることにより停止させた。ブタ肝臓由来のカルボキシルエステラーゼを用いたインキュベーションはＮ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の急速な活性化をもたらした（図４を参照）。用いた基質の約９０％が６０分のインキュベーション時間後に既に活性化されていた。この結果は、ジアミドキシムへのＮ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）の活性化の第１工程が高スピードで進行することを示している。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
経口バイオアベイラビリティ（動物実験）
ペンタミジンは、１０ｍｇ／ｋｇの濃度で１０匹のラットに静脈内投与した。Ｎ，Ｎ’−ビス（スクシニルオキシ）ペンタアミジン（１）は、アラビアゴム（１０％ｍ／Ｖ）との懸濁液として、経管栄養あたり５０ｍｇ／ｋｇの濃度で１０匹のラットそれぞれに投与した。胃の酸性環境におけるスクシニルエステルの早期の切断を防止するために、懸濁液の調製に際し、１００ｍＭのｐＨ９．０のリン酸カリウム緩衝液を用いた。さらに、３匹のラットに、活性型自体の経口バイオアベイラビリティを決定するために、経管栄養あたり５０ｍｇ／ｋｇの用量でペンタミジンを与えた。
【００５６】
静脈内投与後、血漿試料を、５、１０、４０、７５、１５０および３００分後に、経口投与後それぞれ２０、４０、６０、９０、１２０、２４０および３６０分後に採取した。この目的のために、３００μｌの全血を、インスリン注射器を用いて抜き取り、ＥＤＴＡコーティングされたＣＢ３００  ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅｓ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ）に移した。各採血後、試料を０．９％生理食塩水１００μｌで、ヘパリン溶液（２５０Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）で、６０分間隔でそれぞれ洗浄した。血液試料を短時間振とうし、遠心分離まで氷上に置いた（４℃；１４，０００ＲＰＭ；１０分間）。試料は−８０℃で更に保存した。
屠殺は薬物投与６時間後、ギロチン断頭によって続けて行った。続いて器官を除去した。全ての器官を洗浄し、ドライアイス中で冷却された２−メチルブタン中に凍結させた。肝臓、腎臓、肺、脾臓、心臓および脳を取り出した。
【００５７】
試料調製
１．血漿試料：
血漿試料を室温で解凍した。各場合において６５μｌのアセトニトリルを調製し、血漿試料の６５μｌをピペットにより添加した。続いて、試料を４５分間振とうした。試料を、１５分間１０，０００ＲＰＭで遠心分離し、上清をＨＰＬＣバイアルに移した。各場合において、３５μｌをＨＰＣＬ決定のために使用した。
ペンタミジンの回収のための較正および分析は、定量的に血漿試料を評価するために、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液においておよびマウス血漿においてそれぞれ行った。
【００５８】
２．器官試料
器官を室温で解凍し、秤量した。それぞれの器官に応じて、異なる量の組織を調製した。肝臓試料の場合には約１０００ｍｇ；他の全ての器官の場合には約５００ｍｇを使用した。器官はポッター(potter)によって細かくした。この目的のために、秤量した各組織は、５分間、１ｍｌの再蒸留水(Aqua bidest)で細かくした。ポッター容器は、続いて、各場合において、１ｍｌの再蒸留水ですすいだ。試料を、反応容器に移し、同量のアセトニトリルを、タンパク質を沈殿させるために添加した。試料を４５分間振とうし、続いて１５分間１２，０００ＲＰＭで遠心分離した。上清をガラス瓶に移し、圧縮空気下で濃縮した。残渣を５００μｌのアセトニトリルで洗浄し、再度遠心分離し、上清を残りの試料に添加した。残渣は廃棄した。圧縮空気下で濃縮した後、試料を一晩凍結乾燥した。
【００５９】
試料の可溶化は、４００μｌのメタノール／再蒸留水（５０／５０）の混合物で続けて行った。試料を、室温で、１．５時間振とうし、続いて、残渣は、遠心分離（１５，０００ＲＰＭ、１５分間）により除去した。ペンタミジンの濃度をＨＰＬＣによって上清から決定した。
【００６０】
動物実験の結果 
静脈内投与後の血漿試料の分析は、３００分の間にわたって、検出可能な血漿レベルをもたらした。プロドラッグの経口投与後、ペンタミジンの血漿中濃度は検出できなかった。これはペンタミジン誘導体について知られている現象であり、これらは極めて顕著な程度まで組織に蓄積する傾向があるためである。ゆえに、血漿中濃度全域でのバイオアベイラビリティの直接的な計算を行うことはできなかった。したがって、調べた器官におけるペンタミジン濃度は、相対的なバイオアベイラビリティを決定するために使用した。
【００６１】
器官試料およびバイオアベイラビリティの評価：
処理された試料の分析は、全ての調べた器官において、肝臓と腎臓において最も高濃度で、検出可能な含有量のペンタミジンをもたらした。肺、脾臓、心臓中の濃度は明らかに低い。ペンタミジンの最低濃度は脳で検出された。結果を図５にまとめる。
【００６２】
化合物の経口バイオアベイラビリティは、一般的に、化合物の経口および静脈内投与後の血漿中濃度を介して決定される。しかしながら、ペンタミジンの高タンパク結合およびその組織に蓄積するという顕著な傾向によって、ペンタミジンプロドラッグの経口投与後に血漿中濃度を決定することはできなかった。したがって、調べた器官（肝臓、腎臓、肺、脾臓、心臓、脳）における血漿中濃度よりも、検出された含有量を、相対的バイオアベイラビリティを計算するために使用する。ペンタミジンプロドラッグの相対的なバイオアベイラビリティは、活性型の静脈内適用後およびプロドラッグの経口適用後の比較によって計算することができた。異なる投与量は計算において考慮した。相対的バイオアベイラビリティを表３に示す。９８％の最も高いバイオアベイラビリティは、肝臓で特定された。他の組織におけるバイオアベイラビリティは明らかに減少している。肝臓における高いバイオアベイラビリティは、プロドラッグの生物活性化によって説明し得る。同じことが、肝臓で重点的に行われ、これはこの器官での比較的高い濃度を説明する。脳内の濃度は非常に低く、これはプロラッグが極めて低い程度しか血液脳関門を通過しないことの指標である。
【００６３】
【表５】
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【００６４】
ＨＰＬＣ分析
以下のＨＰＬＣ分析は、ペンタミジンの静脈内適用後の臓器および血漿試料を分析するために使用した：
【表６】
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【００６５】
以下のＨＰＬＣ分析は、ペンタミジンプロドラッグの経口適用後の器官および血漿試料を分析するために使用した。
【表７】
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【００６６】
保存安定性：
試料は規定した期間にわたって、室温および７０℃で保存し、プロドラッグ（１）の保存安定性を分析するために調べた。保存期間は、室温試料について６ヶ月、７０℃試料について７日間であった。プロドラッグ（１）の含有量は、ＨＰＬＣによって決定した。この目的のために、試料を、等量のメタノールおよびリン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）の混合物中に溶解し、直ちに測定した。ＨＰＬＣ法は、「プロドラッグの特性評価」に記載した方法に相当する。
プロドラッグ（１）は、室温および７０℃の両方で、調べた期間内において、非常に高い安定性を表すことを示すことができた（表３、４および図６、７参照）。プロドラッグ（１）とは別に、スクシニルオキシペンタアミジンおよびペンタミジンジアミドキシム（３）が見られた。
【００６７】
【表８】
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【００６８】
【表９】
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【００６９】
表４および５に表された保存安定性の結果を図６および７にグラフ形式で示す。
【００７０】
参考文献リスト：
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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