(57)【要約】  本発明は、以前に記載されているグアバ１３−ヒドロペルオキシドリアーゼに対して修飾された脂肪酸１３−ヒドロペルオキシドリアーゼタンパク質と、当該タンパク質をコードする核酸配列とに関する。また本発明は、当該修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼを発現する５つの手段と、有機合成の分野においてかかるリアーゼを使用する方法にも関する。
2011502469.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１による野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較すると１〜４０個のアミノ酸改変を有し、前記配列番号１による野生型タンパク質のアミノ酸配列の３、４、５、１９、２０８、３４０、３４２、３５２、３５４、３５８、３５９、３６０、３７１、３７２、３７５、３７７、３８２、３８３、３８７、３８８、３８９、３９２、３９３、３９４、３９５、３９９、および４５７位からなる群から選択された位置に少なくとも１つのアミノ酸改変を含むアミノ酸配列を含む修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼポリペプチドであって、前記配列番号１による野生型タンパク質と比較して高められた酵素活性を有する、修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項２】
Ｖ３Ｌ、Ｒ４Ｋ、Ｔ５Ｐ、Ｓ１９Ｌ、Ｎ２０８Ｈ、Ｆ３４０Ｌ、Ｙ３４２Ｆ、Ｋ３５２Ｒ、Ｋ３５２Ｓ、Ｈ３５４Ｙ、Ｆ３５８Ｙ、Ｄ３５９Ｅ、Ｖ３６０Ｉ、Ｋ３７１Ｐ、Ｖ３７２Ｌ、Ｔ３７５Ｒ、Ｐ３７７Ｓ、Ｅ３８２Ｄ、Ｐ３８３Ａ、Ｎ３８７Ｋ、Ｓ３８８Ａ、Ｄ３８９Ｅ、Ｖ３９２Ｍ、Ｑ３９３Ｇ、Ｎ３９４Ｅ、Ｄ３９９Ｓ、Ｄ３９９Ｎ、およびＮ４５７Ｋからなる群から選択された１つ以上の置換を含む、請求項１に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項３】
前記配列番号１による野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較すると、少なくとも以下の置換：Ｖ３Ｌ、Ｒ４Ｋ、Ｔ５Ｐ、およびＮ２０８Ｈを含む、請求項２に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項４】
アミノ酸置換Ｖ３６０ＩおよびＤ３９９Ｎをさらに含む、請求項３に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項５】
置換Ｋ３７１Ｐ、Ｖ３７２Ｌ、Ｔ３７５Ｒ、Ｐ３７７Ｓ、Ｅ３８２Ｄ、Ｐ３８３Ａ、Ｎ３８７Ｋ、Ｓ３８８Ａ、Ｄ３８９Ｅ、Ｖ３９２Ｍ、Ｑ３９３Ｇ、Ｎ３９４Ｅ、およびＤ３９９Ｓをさらに含む、請求項３に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項６】
前記配列番号１による野生型タンパク質のアミノ酸配列の３９４位と３９５位との間にアミノ酸ＫおよびＧの挿入をさらに含む、請求項５に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項７】
置換Ｓ１９Ｌ、Ｆ３４０Ｌ、Ｖ３６０Ｉ、およびＮ４５７Ｋをさらに含む、請求項６に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項８】
置換Ｆ３４０ＬおよびＮ４５７Ｋをさらに含む、請求項６に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項９】
置換Ｓ１９Ｌ、Ｆ３４０Ｌ、Ｙ３４２Ｆ、Ｋ３５２Ｒ、Ｆ３５８Ｙ、Ｖ３６０Ｉ、およびＮ４５７Ｋをさらに含む、請求項６に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項１０】
置換Ｆ３４０Ｌ、Ｙ３４２Ｆ、Ｆ３５８Ｙ、Ｄ３５９Ｅ、およびＶ３６０Ｉをさらに含む、請求項６に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項１１】
置換Ｓ１９Ｌ、Ｆ３５８Ｙ、Ｖ３６０Ｉ、およびＮ４５７Ｋをさらに含む、請求項６に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項１２】
アミノ酸置換Ｖ３６０Ｉをさらに含む、請求項６に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項１３】
置換Ｓ１９Ｌ、Ｆ３４０Ｌ、Ｙ３４２Ｆ、Ｋ３５２Ｓ、Ｈ３５４Ｙ、Ｆ３５８Ｙ、Ｖ３６０Ｉ、およびＮ４５７Ｋをさらに含む、請求項６に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項１４】
そのＮ末端にアミノ酸配列ＡＴＰＳＳＳＳＰＥをさらに含む、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項１５】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１６からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ。
【請求項１６】
請求項１から１５までのいずれか１項に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７からなる群から選択される、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のヌクレオチド配列を含む、組換え核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組換え核酸分子を含む、トランスジェニック細胞。
【請求項２０】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項１９に記載のトランスジェニック細胞。
【請求項２１】
請求項１から１５までのいずれか１項に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼポリペプチドを製造するための方法であって、
ａ）前記ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項１９または２０に記載のトランスジェニック細胞１つ以上を培養するステップと、場合によっては、
ｂ）前記ポリペプチドを回収するステップと、
を含む方法。
【請求項２２】
多価不飽和脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドをアルデヒドとオキソカルボン酸とに切断するための、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼの使用。
【請求項２３】
ａ）請求項１から１５までのいずれか１項に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼを提供するステップと、
ｂ）多価不飽和脂肪酸、好ましくはリノール酸またはアルファリノレン酸の１３−ヒドロペルオキシドを、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼと接触させるステップと、
ｃ）生成されたアルデヒドを回収するステップと、
を含む、アルデヒドを生成するための方法。
【請求項２４】
１３−リポキシゲナーゼの活性によって、前記１３−ヒドロペルオキシドを生成するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アルデヒドを相当するアルコールに還元するステップと、場合によっては、前記アルコールを回収するステップとをさらに含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、以前に記載されているグアバ１３−ヒドロペルオキシドリアーゼに対して修飾された脂肪酸１３−ヒドロペルオキシドリアーゼタンパク質と、当該タンパク質をコードする核酸配列とに関する。また本発明は、当該修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼを発現する手段と、有機合成の分野においてかかるリアーゼを使用する方法にも関する。
【０００２】
香料および香味料産業において有用な化合物の中で、酵素反応によって行なわれ得るヒドロペルオキシド切断を伴ういわゆる「グリーンノート」には、ｎ−ヘキサナール、ヘキサン−１−オール、２−（Ｅ）−ヘキセン−１−アール、２−（Ｅ）−ヘキセン−１−オール、３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オール（ピポールとしても知られる）、および３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アールが含まれ、これらはフレッシュグリーンの性質を与えるために香味料、特に果実香味料に広く使用されている。さらに、グリーンノートは、果実アロマには必須であり、アロマ産業において広範に使用されている。天然グリーンノートの需要は拡大し、従来の供給源、例えばハッカ（Ｍｅｎｔｈａ  ａｒｖｅｎｓｉｓ）油などからの供給を上回っている。このことは、これらの材料を得る代替的な自然手段の発見への研究努力の動機となっている。
【０００３】
グリーンノート化合物の合成は、遊離（多価不飽和）脂肪酸、例えばリノール（９−（Ｚ），１２−（Ｚ）−オクタデカジエン）酸、およびα−リノレン（９−（Ｚ），１２−（Ｚ），１５−（Ｚ）−オクタデカトリエン）酸から出発する。本来は、これらの酸は、細胞傷害後に脂肪分解酵素によって細胞膜から放出される。脂肪酸１３−ヒドロペルオキシドは、特異的１３−リポキシゲナーゼ（１３−ＬＯＸ）の作用によって形成され、続いて特異的１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ（１３−ＨＰＯＬ）によって、Ｃ6アルデヒドとＣ12ω−オキソ酸部分とに切断される。アルデヒドに、続いて、熱異性化および／またはデヒドロゲナーゼ酵素による還元を行ない、別のＣ6生成物（すなわち、グリーンノート）、アルコールなどを生成することができる（Ｈａｔａｎａｋａ  Ａ．（１９９３）  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１２０１−１２１８；Ｈａｔａｎａｋａ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ  ４４：４３１−３６１）。
【０００４】
グアバは、この合成経路に使用するための凍結安定性１３−ＨＰＯＬの優れた供給源として認識されている。グアバ１３−ＨＰＯＬは、現在、グリーンノート生産のための工業方法において使用されている（米国特許第５，４６４，７６１号）。この方法において、必要とされる１３−ヒドロペルオキシドの溶液は、新たに調製した大豆粉を１３−ＬＯＸ源として用いて、リノール酸またはリノレン酸（それぞれひまわり油および亜麻仁油から得られる）から作成する。次に、この溶液を１３−ＨＰＯＬ源としてのグアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｊａｖａ）全果実の新たに調製したピューレと混合する。次に、アルデヒド生成物を蒸留によって単離する。相当するアルコールが必要な場合、グアバピューレと混合する前に、ヒドロペルオキシド溶液に生パン酵母を加える。この酵母は、１３−ＨＰＯＬによってアルデヒドが形成される際にアルデヒドを相当するアルコールに還元する活性アルコールデヒドロゲナーゼ酵素を含有している。
【０００５】
この工業方法には、複数の不利点がある。主要な不利点は、多量の新鮮なグアバ果実が必要とされることである。これは、この方法が、新鮮なグアバ果実が安価かつ自由に入手できる国で行なわれなければならないことを意味している。たとえそのような場所が見つかったとしても、入手の可能性はこの果実の生育時期に限定される。高品質のグアバ果実は、例えば、ブラジルにおいて１年間のうち１０ヶ月間しか入手できない。
【０００６】
第２の不利点は、所望の酵素活性が、利用する供給源においてむしろ弱められることである。これは、この方法に比較的大量の大豆粉（５％）、グアバピューレ（４１％）、および酵母（２２％）を使用しなければならないことを意味する。工業生産に要求されるこれらの大量の原料は、達成できるグリーンノートの収率に物理的制約を課し、また工業方法のコストを上昇させる。
【０００７】
第３の不利点は、これが大容量のバッチ方法であり、その性質から、１３−ＨＰＯＬ酵素の触媒活性を最大限に利用せず、比較的大きな労働力を要し、大量の残留有機物質を生じることである。残留有機物質は、その後堆肥農場に輸送するか、あるいは廃棄しなければならない。
【０００８】
この工業方法の不利点のうちのいくつかを克服するために、欧州特許第１  ０８０  ２０５号は、精製組換えグアバ１３−ＨＰＯＬタンパク質、核酸、発現系、およびそれらの使用方法を開示している。しかしながら、Ｃ6−アルデヒドを生成するためのこの組換えグアバ１３−ヒドロペルオキシドリアーゼの使用時に、組換えグアバ１３−ヒドロペルオキシドリアーゼを用いて得られる生成物の収率はさらに最適化させることができることが判明した。
【０００９】
したがって、酵素の組換え発現を可能にし、また所望の生成物の高い収率を得るために使用できる１３−ＨＰＯＬ酵素を提供することには、依然として強い関心が存在する。
【００１０】
上述の本発明の目的は、請求項１に記載の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼポリペプチドによって解決される。好適な実施形態は、従属請求項の内容によって表わされる。
【００１１】
本発明は、配列番号１による野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較すると１〜４０個のアミノ酸改変を有し、配列番号１による野生型タンパク質の３、４、５、１９、２０８、３４０、３４２、３５２、３５４、３５８、３５９、３６０、３７１、３７２、３７５、３７７、３８２、３８３、３８７、３８８、３８９、３９２、３９３、３９４、３９５、３９９、および４５７位からなる群から選択された位置に少なくとも１個のアミノ酸改変を含むアミノ酸配列を含む、修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼポリペプチドを提供する。
【００１２】
本発明は、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子と、適切な宿主細胞における修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼの発現を可能にする組換え核酸分子と、かかる組換え核酸分子を含むトランスジェニック細胞とをさらに提供する。
【００１３】
また本発明は、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で１つ以上のトランスジェニック細胞を培養することによって、また場合によってはそのポリペプチドを回収することによって、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼポリペプチドを製造するための方法も提供する。
【００１４】
本発明は、さらに、多価不飽和脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドをアルデヒドとオキソカルボン酸とに切断するための、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼの使用にも関する。
【００１５】
最後に、本発明は、本発明による修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼを提供し、多価不飽和脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドを修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼと接触させ、生成されたアルデヒドまたはアルデヒドの還元後の相当するアルコールを回収することによって、アルデヒドを生成する方法を提供する。
【００１６】
本発明は、修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼポリペプチドと、該修飾ポリペプチドをコード化する核酸分子と、それらの発現手段と、前記修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼを用いた方法とに関する。
【００１７】
発明者らは、驚くべきことに、突然変異誘発法（ＤＮＡシャフリングおよび誤りがちなＰＣＲなど）によって、欧州特許第１  ０８０  ２０５号に記載されているようなグアバ１３−ヒドロペルオキシドリアーゼのアミノ酸配列にアミノ酸改変を導入することによって、グアバ由来の非修飾組換え酵素と比較して改良された酵素活性を有する修飾酵素がもたらされることを発見した。さらに、修飾ヒドロペルオキシドリアーゼを発現する組換え宿主細胞は、優れた保存安定性を示すこと、すなわちこれらは特に冷蔵保管した場合に数ヶ月間保存できることも発見した。本発明の別の利点は、この修飾酵素が高い初期反応速度を示すことであり、これにより少量の組換えバイオマスを使用するだけで、短時間に多量の生成物の生成が可能になる。さらに、さらなる反応に修飾酵素を再利用することも可能である。最後に、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼを用いて得られる生成物の質は、生成物の形成時に異性化がほぼ発生しないため、現在例えば香料製造において使用されている既存の生成物よりも優れていることが示されている。
【００１８】
本発明の意味の範囲内で、「リアーゼ」とは、少なくとも１つのリアーゼ機能、すなわち分子の切断を触媒する能力を有するタンパク質を意味する。具体的には、「１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ」という用語は、リアーゼタンパク質が多価不飽和脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドを切断することができることを意味する。例えば、１３−ヒドロペルオキシドリアーゼは、リノール酸またはリノレン酸の脂肪酸１３−ヒドロペルオキシドをＣ6−アルデヒドとＣ12−オキソ酸部分とに切断することができる。
【００１９】
本発明に関して、「修飾された」または「変異型の」とは、配列番号１による野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較すると、修飾または変異型ポリペプチドのアミノ酸配列が改変されていることを意味する。
【００２０】
修飾１３−ＨＰＯＬ酵素は、当業者により、例えば、遺伝子合成、部位指向性突然変異誘発、部位飽和突然変異誘発、および新しいＤＮＡ配列が生じて新しい変異体（または新しい変異体のライブラリー）が作り出されるその他のあらゆる指向性進化技術（ランダム突然変異誘発、シャフリングなど）を含むＤＮＡ工学など、さまざまな手段によって得ることができる。これは、単一遺伝子から、ランダム突然変異誘発を用いて行なうことができる（国際出願第２００６／００３２９８号）。また、多様性は、例えば国際出願第００／０９６７９号に記載されているように、ファミリーシャフリング組換えステップを用いて、いくつかの親遺伝子から生じることもできる。そのあと変異体をストリンジェントな条件下で、改良された酵素活性を選択するためにスクリーニングする。これらの改良された変異体は、その後次回の進化において使用することができる。
【００２１】
修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼのアミノ酸配列は、配列番号１による野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較すると、１〜４０個のアミノ酸改変、好ましくは５〜３５個、また好ましくは４〜２５個、より好ましくは６〜２５個、さらに好ましくは１０〜３０個、最も好ましくは１７〜２５個のアミノ酸改変を有する。
【００２２】
「野生型タンパク質」という用語は、欧州特許第１  ０８０  ２０５号に開示されている修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ酵素であるが、欧州特許第１  ０８０  ２０５号に開示されている配列と比較すると、Ｎ末端の３１個のアミノ酸が欠失しているものを指す。この欠失を有する酵素は、この欠失を示さない酵素と比較したときに改良された発現を示し、より高い触媒活性をもたらす。本発明による野生型タンパク質の配列は、配列番号１に表わされる。
【００２３】
本明細書において「アミノ酸改変」という用語は、配列番号１に表わされる野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較したときに、２つのアミノ酸の間への１つ以上のアミノ酸の挿入、１つ以上のアミノ酸の欠失、または１つ以上のアミノ酸の１つ以上の異なるアミノ酸による置換を包含するものとする。アミノ酸改変は、修飾されたタンパク質のアミノ酸配列を野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較することによって、容易に識別することができる。
【００２４】
アミノ酸配列比較は、当該技術分野で公知の種々の配列比較アルゴリズムおよびプログラムのうちのいずれを用いて実施してもよい。かかるアルゴリズムおよびプログラムには、ＢＬＡＳＴＰ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２；Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２９：２９９４−３００５）、またはＢｉｏＥｄｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ．／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
「位置」という用語は、アミノ酸の特定の番号付けよって識別される、野生型タンパク質中に存在する特定のアミノ酸残基を指す。専門家には、野生型配列と比較して１つ以上のアミノ酸残基の挿入または欠失が、野生型アミノ酸配列と修飾されたアミノ酸配列との異なる番号付けをもたらすことは明らかである。例えば、野生型アミノ酸配列のアミノ酸２９９と３００との間にアミノ酸１個を挿入した場合、挿入されたものの次のアミノ酸は、修飾されたアミノ酸配列において３０１の番号付けを有することになるが、これは野生型配列においては３００の番号付けのままである。
【００２６】
本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼは、Ｖ３Ｌ、Ｒ４Ｋ、Ｔ５Ｐ、Ｓ１９Ｌ、Ｎ２０８Ｈ、Ｆ３４０Ｌ、Ｙ３４２Ｆ、Ｋ３５２Ｒ、Ｋ３５２Ｓ、Ｈ３５４Ｙ、Ｆ３５８Ｙ、Ｄ３５９Ｅ、Ｖ３６０Ｉ、Ｋ３７１Ｐ、Ｖ３７２Ｌ、Ｔ３７５Ｒ、Ｐ３７７Ｓ、Ｅ３８２Ｄ、Ｐ３８３Ａ、Ｎ３８７Ｋ、Ｓ３８８Ａ、Ｄ３８９Ｅ、Ｖ３９２Ｍ、Ｑ３９３Ｇ、Ｎ３９４Ｅ、Ｄ３９９Ｓ、Ｄ３９９Ｎ、およびＮ４５７Ｋからなる群から選択された１つ以上の置換を含んでもよい。
【００２７】
本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼは、配列番号１による野生型タンパク質のアミノ酸配列に対して、前記置換のうち少なくとも３個、好ましくは少なくとも４、５、６、７、または８個、より好ましくは少なくとも９、１０、１１、１２、１３、または１４個、さらに好ましくは少なくとも１５、１６、１７、または１８個、最も好ましくは１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の置換を含んでもよい。
【００２８】
好ましくは、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼは、野生型タンパク質と比較すると、少なくとも以下の置換：Ｖ３Ｌ、Ｒ４Ｋ、Ｔ５Ｐ、およびＮ２０８Ｈを含んでもよい。本明細書において開示されている、強化された活性を示す全ての変異体は、これらの置換を有する。例えば、本明細書に開示されている変異体Ｄ１０Ａは、野生型タンパク質と比較すると、これらの４個の置換と、さらなる置換Ｖ３６０ＩおよびＤ３９９Ｎとを含む。
【００２９】
また本発明のヒドロペルオキシドリアーゼは、野生型タンパク質のアミノ酸配列の３９４位と３９５位との間にアミノ酸ＫおよびＧの挿入を含んでもよい。この挿入は、この挿入によって修飾されたアミノ酸配列が、この挿入を含まないアミノ酸配列よりも２アミノ酸長くなるという影響を与える。さらに、挿入後のあらゆる付加突然変異は、野生型アミノ酸配列と修飾アミノ酸配列とにおいて異なる番号付けを有することになる。例えば、野生型配列のアミノ酸残基３９９は、挿入によって修飾された配列におけるアミノ酸残基４０１に相当する。
【００３０】
本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼは、以下の置換：Ｋ３７１Ｐ、Ｖ３７２Ｌ、Ｔ３７５Ｒ、Ｐ３７７Ｓ、Ｅ３８２Ｄ、Ｐ３８３Ａ、Ｎ３８７Ｋ、Ｓ３８８Ａ、Ｄ３８９Ｅ、Ｖ３９２Ｍ、Ｑ３９３Ｇ、Ｎ３９４Ｅ、Ｄ３９９Ｓをさらに含んでもよい。
【００３１】
本発明の１３−ヒドロペルオキシドリアーゼのさらなる例として、指定されているＧＣ７、Ｅ８Ｂ、Ｂ７Ａ、Ｃ２Ａ、ＡＣ５、４Ｅ１０、および９Ｄ３は、野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較すると、異なる組み合わせのアミノ酸改変を有する。配列番号１による野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較すると、変異体ＧＣ７は２１個のアミノ酸置換を有し、変異体Ｅ８Ｂは１９個のアミノ酸置換を有し、変異体ＡＣ５は２４個のアミノ酸置換を有し、変異体Ｃ２Ａは２２個のアミノ酸置換を有し、変異体Ｂ７Ａは２１個のアミノ酸置換を有し、変異体４Ｅ１０は１５個のアミノ酸置換を有し、９Ｄ３は２５個のアミノ酸置換を有する。これら７種の変異体は、配列番号１による野生型タンパク質のアミノ酸配列と比較すると、置換Ｖ３Ｌ、Ｒ４Ｋ、Ｔ５Ｐ、およびＮ２０８Ｈ、ならびに置換Ｋ３７１Ｐ、Ｖ３７２Ｌ、Ｔ３７５Ｒ、Ｐ３７７Ｓ、Ｅ３８２Ｄ、Ｐ３８３Ａ、Ｎ３８７Ｋ、Ｓ３８８Ａ、Ｄ３８９Ｅ、Ｖ３９２Ｍ、Ｑ３９３Ｇ、Ｎ３９４Ｅ、およびＤ３９９Ｓを有する。さらに、これらの変異体全ては、野生型タンパク質のアミノ酸配列の３９４位と３９５位との間にアミノ酸ＫおよびＧの挿入をさらに有する。本明細書に記載する全ての位置は、特に明記しない限り、野生型タンパク質のアミノ酸配列における位置を指す。
【００３２】
変異体ＧＣ７は、アミノ酸置換Ｓ１９Ｌ、Ｆ３４０Ｌ、Ｖ３６０Ｉ、およびＮ４５７Ｋをさらに含む。変異体Ｅ８Ｂは、アミノ酸置換Ｆ３４０ＬおよびＮ４５７Ｋをさらに含む。変異体ＡＣ５は、アミノ酸置換Ｓ１９Ｌ、Ｆ３４０Ｌ、Ｙ３４２Ｆ、Ｋ３５２Ｒ、Ｆ３５８Ｙ、Ｖ３６０Ｉ、およびＮ４５７Ｋをさらに含む。変異体Ｃ２Ａは、アミノ酸置換Ｆ３４０Ｌ、Ｙ３４２Ｆ、Ｆ３５８Ｙ、Ｄ３５９Ｅ、およびＶ３６０Ｉをさらに含む。変異体Ｂ７Ａは、アミノ酸置換Ｓ１９Ｌ、Ｆ３５８Ｙ、Ｖ３６０Ｉ、およびＮ４５７Ｋをさらに含む。変異体４Ｅ１０は、アミノ酸置換Ｖ３６０Ｉをさらに含む。変異体９Ｄ３は、アミノ酸置換Ｓ１９Ｌ、Ｆ３４０Ｌ、Ｙ３４２Ｆ、Ｋ３５２Ｓ、Ｈ３５４Ｙ、Ｆ３５８Ｙ、Ｖ３６０Ｉ、およびＮ４５７Ｋをさらに含む。
【００３３】
例示した単離された変異体（Ｄｌ０Ａ、ＧＣ７、Ｅ８Ｂ、Ｂ７Ａ、Ｃ２Ａ、ＡＣ５、４Ｅ１０、および９Ｄ３）の全ては、Ｎ末端にアミノ酸配列ＡＴＰＳＳＳＳＰＥをさらに含み、これによりこの挿入を有さない酵素と比較すると増加した活性がもたらされる。この付加的なアミノ酸配列は、Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ（メロン）の９−ヒドロペルオキシドリアーゼに由来し（米国特許第７，０３７，６９３号）、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、および１６による配列のアミノ酸位置１〜９に位置する。専門家には、このアミノ酸配列の挿入が、野生型タンパク質と変異型タンパク質との間に異なる番号付けをもたらすことは知られている。例えば、野生型タンパク質の３位のアミノ酸は、変異体の１２位のアミノ酸に相当する。
【００３４】
最も好ましくは、本発明による修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼは、配列番号２（変異体ＧＣ７）、４（変異体Ｅ８Ｂ）、６（変異体ＡＣ５）、８（変異体Ｃ２Ａ）、１０（変異体Ｂ７Ａ）、１２（変異体Ｄｌ０Ａ）、１４（変異体４Ｅ１０）、および１６（変異体９Ｄ３）からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する。
【００３５】
本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ酵素は、配列番号１による野生型１３−ヒドロペルオキシドリアーゼと比較すると、増加した酵素活性を示す。この活性の増加は、少なくとも１０％または２０％、好ましくは３０％または４０％、また好ましくは少なくとも５０％または８０％、特に好ましくは少なくとも１００％または２００％、また特に好ましくは少なくとも５、７、または９倍の増加、とりわけ好ましくは少なくとも１０または２０倍の増加、またとりわけ好ましくは少なくとも５０または８０倍の増加、最も好ましくは少なくとも１００倍の増加である。「改良された酵素活性」という用語は、修飾された酵素が野生型酵素よりも高い収率係数をもたらす能力を指す。「収率係数」とは、本明細書において、得られる生成物の濃度と生体触媒（例えば、精製された組換え酵素、あるいは酵素を発現する宿主細胞または組換え細胞からの抽出物）の濃度の反応培地における比率であると理解される。本発明者らは、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼが、基質１３−ヒドロペルオキシ−オクタデカトリエン酸の１００％変換をもたらす一方、グアバ由来の野生型１３−ヒドロペルオキシドリアーゼは、高い細胞濃度であっても同じ基質の約３０％を変換できるにすぎないことを示した。
【００３６】
１３−ヒドロペルオキシドリアーゼ活性は、精製酵素または宿主細胞もしくは完全な宿主生物からの抽出物を多価不飽和脂肪酸、例えばリノレン酸などの１３−ヒドロペルオキシドとともに適当な条件下でインキュベートし、例えばガスクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣ分析によって反応生成物を分析することによって測定することができる。反応生成物の酵素活性検定および分析についての詳細は、下記の実施例に記載する。
【００３７】
本発明は、さらに、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子にも関する。専門家には、遺伝コードの縮重のために、特定のアミノ酸配列が異なる核酸配列によってコードできることは知られている。本発明は、本発明の１３−ヒドロペルオキシドリアーゼをコード化する全てのヌクレオチド配列を含むものとする。
【００３８】
好ましくは、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼをコード化するヌクレオチド配列は、タンパク質変異体ＧＣ７、Ｅ８Ｂ、ＡＣ５、Ｃ２Ａ、Ｂ７Ａ、Ｄｌ０Ａ、４Ｅ１０、および９Ｄ３をそれぞれコード化する、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される。
【００３９】
「単離された」核酸分子は、核酸の天然のレポジトリーに存在する他の核酸分子から分離されている。本発明の核酸分子、例えばヌクレオチド配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、または１７、あるいはそれらの一部を有する核酸分子は、標準的な分子生物学的技法および本明細書において提供される配列情報を用いて、単離または作製することができる。
【００４０】
本発明は、さらに、本発明のヌクレオチド配列を備える組換え核酸分子にも関する。
【００４１】
本発明に関して、「トランスジェニックの」または「組換えの」とは、例えば核酸配列、発現カセット（＝遺伝子構築物）、または本発明による核酸配列を含有するベクター、あるいはそれぞれの核酸配列、発現カセット、またはベクターで形質転換された生物（これらすべての構築物は遺伝子技術を用いて生成される）に関して、
ａ）本発明による核酸配列、または
ｂ）本発明による核酸配列に機能的に連結した遺伝子制御配列、例えばプロモーター、または
ｃ）ａ）およびｂ）
のいずれかが、その天然の遺伝的環境にないか、あるいは遺伝子法によって修飾されており、その修飾は、例えば、１つまたはいくつかのヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆位、または挿入であることを意味する。天然の遺伝的環境とは、親生物における天然のゲノムまたは染色体の遺伝子座、あるいはゲノムライブラリーにおける存在を意味する。
【００４２】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された生物または宿主細胞に関連する。「宿主細胞」、「トランスジェニック細胞」、および「組換え細胞」という用語は、本明細書において、交換可能に使用される。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指す。かかる子孫は、突然変異または環境の影響により後の世代で一定の修飾が生じる可能性があるため、事実上は親細胞と同一でない可能性があるが、依然として本明細書中で使用されるこの用語の範囲内に含まれる。
【００４３】
本発明の核酸、発現カセット、およびベクターを発現するための宿主細胞には、細菌、酵母、真菌、植物細胞、植物、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が含まれる。
【００４４】
当業者には、１３−ＨＰＯＬをコードし、トランスジェニック細胞の作製に使用される核酸配列は、生物特異的なコドン使用頻度に調整しなければならないかもしれないことは明らかである。コドン使用頻度は、選択した生物の別の公知の遺伝子のコンピューター解析によって決定することができる。
【００４５】
この方法に使用される核酸は、細胞への挿入後、別のプラスミド上に位置しても、あるいは有利には宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。ゲノムへの組み込みの場合、組み込みは、ランダムに行なっても、あるいは細胞１３−ＨＰＯＬ発現の調節をもたらす、天然遺伝子が挿入されたコピーに置き換えられるような組換えによって行なっても、あるいは遺伝子の発現を確実にする少なくとも１つの配列と機能転写遺伝子のポリアデニル化を確実にする少なくとも１つの配列とを含有する機能発現単位に遺伝子が機能的に連結されるように、遺伝子をトランスに用いて行なってもよい。
【００４６】
移入すべき１３−ＨＰＯＬをコード化する核酸配列に加え、１３−ＨＰＯＬの発現に使用する組換え核酸分子は、調節要素をさらに含む。これらのベクターが正確にどの調節要素を含有しなければならないかは、それぞれの場合において、これらのベクターが使用される方法による。当業者には、組換え核酸分子がどの調節要素およびその他の要素を含有しなければならないかは公知である。
【００４７】
典型的には、ベクターの一部である調節要素は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または植物細胞において、転写を可能にし、所望であれば翻訳を可能にするようなものである。選択した生物に応じて、これは例えば、遺伝子が誘導後にのみ発現および／または過剰発現される、あるいは遺伝子が即座に発現および／または過剰発現されることを意味し得る。例えば、これらの調節配列は誘導物質またはリプレッサーが結合する配列であり、それによって核酸の発現を調節する。これらの新規の調節配列に加え、あるいはこれらの配列の代わりに、実際の構造遺伝子上流の配列の天然の調節が依然として存在していてもよく、場合によっては天然の調節が無効となり、遺伝子の発現が増加するように遺伝子操作されていてもよい。しかしながら、組換え核酸分子は、より単純な形で、すなわち核酸配列上流に付加的な調節シグナルが挿入されず、その調節を伴う天然プロモーターが除去されていない形で構築されていてもよい。あるいは、天然調節配列は、調節がもはや起こらないように、および／または遺伝子発現が増加するように突然変異させてある。活性を増加させるために、これらの改変されたプロモーターを部分配列の形で、天然遺伝子上流に単独で挿入してもよい。さらに、遺伝子構築物は、有利には、プロモーターに機能的に連結され、かつ核酸配列の発現増加を可能にするいわゆるエンハンサー配列を１つ以上含有してもよい。また、付加的な有用な配列、例えば付加的な調節要素または終止因子をＤＮＡ配列の３′末端に挿入してもよい。
【００４８】
原則として、本発明による方法には、調節配列を有するいかなる天然プロモーターを使用することも可能である。しかしながら、合成プロモーターを単独であるいは付加的に使用することも可能であり、有利である。
【００４９】
本発明によるベクターは、調節要素として、例えばエンハンサー要素を付加的に含んでもよい。またこれらのベクターは、耐性遺伝子、複製シグナル、および付加的なＤＮＡ領域を含有してもよいが、これは細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）などにおけるベクターの増殖を可能にする。調節要素は、宿主細胞におけるベクターの安定化をもたらす配列も含む。かかる調節要素は、特に、宿主ゲノムへのベクターの安定的な組み込み、あるいは細胞におけるベクターの自己複製を促進する配列を備える。かかる調節要素は、当業者には公知である。
【００５０】
いわゆる終止配列は、転写または翻訳の適当な終結を確実にする配列である。移入された核酸が翻訳される場合、終止配列は、典型的には、停止コドンおよびそれぞれの調節配列であり；移入された核酸が真核生物において転写されるだけである場合、それらは一般的にポリ（Ａ）配列である。
【００５１】
本明細書において「ベクター」という用語は、組換え核酸分子であって、それが結合している別の核酸を細胞内に輸送することができる組換え核酸分子に関する。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる環状二本鎖ＤＮＡループを表わす。別のベクターの型は、ウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションさせることができる。一部のベクターは、それらが挿入された宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌性ベクター）。別のベクターは、有利には、宿主細胞に挿入されたときにその宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。また、一部のベクターは、それらが機能的に連結している遺伝子の発現を制御することができる。これらのベクターは、本明細書において「発現ベクター」とする。通常は、ＤＮＡ組換え法に適した発現ベクターは、プラスミド型のものである。本記載においては、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最もよく使用されるベクターの型であることから、交換可能に使用できる。しかしながら、本発明は、別の型の発現ベクター、例えば、類似の機能を果たすウイルスベクターなども含むものとする。さらに、「ベクター」という用語は、当業者に公知のその他のベクター、例えば、ファージ、ウイルス、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、ＴＭＶなど、トランスポゾン、ＩＳ（挿入配列）要素、ファスミド、ファージミド、コスミド、線状または環状ＤＮＡなども含むものとする。
【００５２】
組換え発現ベクターにおいて、「それに作用可能に連結した」または「それに機能的に連結した」という用語は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現が可能なように調節配列に連結していること、また両配列が、その配列が有するとみなされる予測される機能を果たすように互いに連結していることを意味する。
【００５３】
「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、およびその他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。これらの調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ：  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）、またはＧｒｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｂｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌｏｒｉｄａ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ７，  ８９−１０８に記載されている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を調節する配列、および一定の条件下で一定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の直接的発現を調節する配列を含む。当業者には、発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選定や所望のタンパク質発現の程度などの要因に左右され得ることは公知である。
【００５４】
１３−ＨＰＯＬの発現に使用する組換え発現ベクターは、原核細胞および真核細胞の双方において活性を有し得る。このことは、ベクター構築の中間ステップが、簡易性を目的に微生物において実施されることが多いため有利である。これらのクローニングベクターは、それぞれの微生物に対する複製シグナルと、形質転換に成功した細菌細胞を選択するためのマーカー遺伝子とを含有する。原核生物における発現に適したベクターは、当業者には公知であり、これには例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｐＥＸＰ５−ＮＴ／ＴＯＰＯ、ｐＭＡＬシリーズ、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲシリーズ、例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、例えばｐＵＣ１８もしくはｐＵＣ１９、Ｍ１１３ｍｐシリーズ、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１、またはｐＢｄＣｌ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ストレプトミセス）のｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２、またはｐＩＪ３６１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、またはｐＢＤ２１４、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（コリネバクテリウム）のｐＳＡ７７、またはｐＡＪ６６７が含まれる。
【００５５】
別の実施形態において、発現ベクターは、酵母発現ベクターまたはバキュロウイルス発現ベクターを意味する。
【００５６】
上記に挙げたベクターは、可能な適切なベクターのわずかな概要を示すにすぎない。さらなるプラスミドは、当業者に公知であり、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｐｏｕｗｅｌｓ，  Ｐ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ−Ｏｘｆｏｒｄ，  １９８５）に記載されている。原核細胞および真核細胞に適したさらなる発現系は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌの１５および１６章に記載されている（上記参照）。
【００５７】
本方法の別の実施形態において、１３−ＨＰＯＬは、単細胞の植物細胞（藻類など）において（Ｆａｌｃｉａｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １（３）：  ２３９−２５１、およびその中で引用されている参考文献を参照）、および高等植物（例えば、作物植物などの種子植物）の植物細胞において発現させることができる。植物発現ベクターの例には、Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２０：  １１９５−１１９７；およびＢｅｖａｎ  （１９８４）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：  ８７１１−８７２１；  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｐｌａｎｔｓ：  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔｓ，  Ｂｄ．  １，  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：  Ｋｕｎｇ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｗｕ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３，  Ｓ．  １５−３８）において幅広く記載されているものが含まれる。
【００５８】
発現される遺伝子は、上記のように、時間特異的に、細胞特異的に、または組織特異的に遺伝子発現を調節する適切なプロモーターに機能的に連結されていなければならない。
【００５９】
１３−ＨＰＯＬヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入するために、有利には、これらに公知の方法で増幅およびライゲーションを行なう。好ましくは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＰｆｕ／Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ混合物のプロトコルに従って実施する。プライマーは、増幅される配列に従って選択する。有利には、プライマーは、増幅されたＤＮＡが、開始コドンから停止コドンまでの全暗号配列を含むように選択するべきである。有利には、増幅されたＤＮＡを増幅後に分析する。例えば、ゲル電気泳動分離後に、質と量について分析を行なうことができる。そのあと、増幅されたＤＮＡを標準プロトコル（例えば、Ｑｉａｇｅｎ）によって精製することができる。そのあと、一定分量の精製された増幅ＤＮＡを後のクローニングに使用できる。
【００６０】
適切なクローニングベクターは、一般的に当業者に公知である。これらには、具体的には微生物系において複製可能なベクター、すなわち特に細菌、酵母、または真菌における効率的なクローニングおよび発現を可能にする、および／または植物の安定的な形質転換を可能にするベクターが含まれる。特に言及する価値があるものは、植物のＴ−ＤＮＡ媒介形質転換に適した、種々のバイナリーおよびコインテグレートベクター系である。これらのバイナリーベクターには、ｐＢＩＢ−ＨＹＧ、ｐＰＺＰ、ｐＢｅｃｋｓ、ｐＧｒｅｅｎシリーズのベクターが含まれる。本発明によると、Ｂｉｎ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢｉｎＡＲ、ｐＧＰＴＶ、およびｐＣＡＭＢＩＡが好適である。バイナリーベクターおよびそれらの使用の概要は、Ｈｅｌｌｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：  ４４６−４５１により提供される。
【００６１】
ベクターの製造では、ベクターをまず制限エンドヌクレアーゼを用いて直鎖化してから、適切な方法で酵素的に修飾することができる。そのあとベクターを精製し、一定分量をクローニングに使用する。クローニング時に、酵素的に切断し、必要であれば、精製した増幅ＤＮＡを同様に製造されたベクター断片にリガーゼを用いて連結させる。一部の核酸構築物、またはベクター構築物、またはプラスミド構築物は、１つまたはいくつかの暗号遺伝子領域を有してもよい。好ましくは、これらの構築物中の暗号遺伝子領域は、上述のように、調節配列に機能的に連結されている。構築物は、有利には、適切な培地中で、微生物、特にＥ．ｃｏｌｉおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（アグロバクテリウム・ツメファシエンス）に培養し、選択条件下で安定的に増殖させることができる。そのあと細胞を収集し、溶解して、そこからプラスミドを抽出する。これにより、異種ＤＮＡの微生物または植物への移入が可能になる。
【００６２】
クローニングベクターの有利な使用により、本発明による核酸および核酸構築物は、生物、例えば微生物または植物などに挿入することができ、植物形質転換に使用することができる。本方法で使用する核酸、本発明による核酸および核酸構築物および／またはベクターは、広範囲の生物の遺伝子修飾に使用することができる。
【００６３】
本発明に関して、「トランスジェニック細胞」という用語は、上記のように、本方法において使用する核酸が、細胞のゲノムのそれらの天然の部位になく、そのためその核酸が、同種または異種の宿主細胞において発現し得ることを意味する。しかしながら、トランスジェニックとは、本発明による核酸は生物のゲノムのそれらの天然の部位、すなわち１３−ＨＰＯＬの部位に位置するが、その配列が天然配列と比較して変化している、および／または天然配列の調節配列が修飾されていることも意味する。好ましくは、トランスジェニックとは、ゲノムにおける非天然部位での本発明による核酸の発現（すなわち核酸が同種または好ましくは異種発現する）として理解されるべきである。
【００６４】
本発明の核酸、発現カセット、およびベクターを発現するための宿主細胞には、細菌、酵母、真菌、植物細胞、植物、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が含まれる。
【００６５】
本発明による好適な宿主生物は、細菌、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア）属のものなど、真菌、例えばＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ（モルティエラ）、Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ（ミズガビ）、またはＰｙｔｈｉｕｍ（フハイカビ）など、酵母、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロミセス）など、シアノバクテリア、繊毛虫類、藻類、または原虫、例えばＣｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ（クリプテコディニウム）などの渦鞭毛藻類である。工業的に使用されている適切な微生物には、グラム陰性細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉなど、グラム陽性細菌、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌）など、真菌、例えばＡ．ｎｉｇｅｒ（クロコウジカビ）、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（アスペルギルス・ニドランス）、Ｎ．ｃｒａｓｓａ（アカパンカビ）など、酵母、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母）、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（クルイベロミセス・ラクチス）、Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（ハンゼヌラ・ポリモルファ）、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ（ピキア・パストリス）、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（ヤロウィア・リポリティカ）など、放線菌類、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ（ストレプトミセスｓｐ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの微生物のうちのいくつかは、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（編集長：Ａ．  Ｌ．  Ｄｅｍａｉｎ，Ｊ．Ｅ．  Ｄａｖｉｅｓ；ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。
【００６６】
さらなる適切な宿主細胞は、  Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）から得ることができる。例えばより低いプロテアーゼ活性を有する適切な発現株は、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，  Ｓ．，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  （１９９０）  １１９−１２８に記載されている。
【００６７】
最も好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を使用する。好ましいＥ．ｃｏｌｉ株は、例えば、ＭＣ１０６１、ＢＬ２１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、およびＤＨ５αである。
【００６８】
本発明によると、「トランスジェニック植物」という用語は、全体としての植物、ならびに本発明による１３−ＨＰＯＬタンパク質の発現が増加する植物の全ての部分を含む。これには、植物および植物器官の全ての部分、例えば、葉、茎、種、根、塊茎、葯、ひげ根、根毛、柄、胚、カルス、子葉、葉柄、作物材料、植物組織、生殖組織、トランスジェニック植物由来のおよび／またはトランスジェニック植物を作製するために使用できる細胞培養物が含まれる。
【００６９】
本発明による方法に使用する植物は、原則として、病原菌侵入への耐性を付けるべきいかなる植物でもよい。好ましくは、これは単子葉または双子葉の、例えば農作植物、食用植物、または飼料植物である。
【００７０】
適切な哺乳動物細胞には、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＢＨＫ細胞、およびＨｅＬａ細胞が含まれる。
【００７１】
本発明によるトランスジェニック細胞における１３−ＨＰＯＬタンパク質の特異的発現は、一般的な分子生物学的および生化学的方法を用いて、証明および追跡できる。当業者にはこれらの技法は公知であり、適切な検出方法、例えば、１３−ＨＰＯＬ特異的ＲＮＡの検出するため、または１３−ＨＰＯＬ特異的ＲＮＡの蓄積量を測定するためのノーザンブロット解析、あるいは１３−ＨＰＯＬコードするＤＮＡ配列の検出のためのサザンブロットもしくはＰＣＲ解析などを容易に選択することができる。この目的で使用するプローブもしくはプライマー配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、もしくは１７に記載される配列と同一であっても、あるいはこれらの配列とわずかな差異を示してもよい。
【００７２】
本発明において微生物を使用する場合、これらの生物は、好ましくは専門家に公知の方法で、発酵方法において標準条件下で成長させる。
【００７３】
「標準条件」という用語は、標準培地における微生物の培養を指す。温度、ｐＨ、およびインキュベーション時間は、下記のように異なり得る。
【００７４】
温度は、通常は、１５℃〜４５℃の範囲内であるべきであるが、好熱性生物の場合は１０５℃までと、範囲はさらに高くてもよい。温度は、一定に維持してもよく、あるいは実験中に変更してもよい。
【００７５】
培地のｐＨは、５〜８．５の範囲、好ましくはおよそ７．０であってよく、これは培地に緩衝液を加えることによって維持することができる。この目的で例となる緩衝液は、リン酸カリウム緩衝液である。合成緩衝液、例えばＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＥＳ、およびその他のものも、代替的に、あるいは同時に使用することができる。また、酸または塩基、例えば酢酸、硫酸、リン酸、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、またはＮＨ4ＯＨなどを成長中に添加することによって、一定の培養ｐＨを維持することも可能である。複合培地成分、例えば酵母抽出物などを使用する場合、多くの複合化合物は高い緩衝能力を有することから、付加的な緩衝液の必要性を減少させることができる。微生物の培養に発酵槽を使用する場合、ｐＨは、気体アンモニアを用いて制御することもできる。
【００７６】
インキュベーション時間は、通常は、数時間から数日までの範囲である。この時間は、ブロス中に最大量の生成物を蓄積させるように選択する。
【００７７】
開示されている成長実験は、さまざまな容器、例えば、さまざまな大きさのマイクロタイタープレート、ガラス管、ガラスフラスコ、またはガラスもしくは金属製発酵槽などの中で行なうことができる。
【００７８】
多数のクローンをスクリーニングするために、微生物は、マイクロタイタープレート、ガラス管、またはバッフルを備えるもしくはバッフルを備えない振盪フラスコ内で培養するべきである。好ましくは１００ｍｌまたは２５０ｍｌの振盪フラスコを使用し、必要な成長培地の約１０％（質量）を注ぐ。フラスコは、ロータリーシェーカー（振幅：約２５ｍｍ）上で、速度範囲約１００〜３００ｒｐｍを用いて振盪させるべきである。蒸発損失は、湿潤環境を維持することによって減少させることができる。あるいは、蒸発損失に対する数学的補正を行なうべきである。
【００７９】
遺伝子修飾されたクローンをテストする場合、修飾されていない対照クローン、または何も挿入していない基本プラスミドを含有する対照クローンもテストすべきである。
【００８０】
使用する各微生物に対する標準培養条件は、教本、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ３rd  ｅｄｉｔｉｏｎ  （２００１）などから得ることができる。
【００８１】
例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ株およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（コリネバクテリウム・グルタミクム）株は、通常は、ＭＢまたはＬＢおよびＢＨＩブロス中で成長させる（Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ，  Ｍ．  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７５：  ４０９６−４１０３，  Ｄｉｆｃｏ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。Ｅ．ｃｏｌｉ用の通常の標準最小培地は、Ｍ９および改変したＭＣＧＣである（Ｙｏｓｈｉｈａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６２：  ５９１−５０７；  Ｌｉｅｂｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３２：  ２０５−２１０）。細菌の培養に適したその他の標準培地には、ＮＺＣＹＭ、ＳＯＢ、ＴＢ、ＣＧ１２  １／２、およびＹＴが含まれる。
【００８２】
本発明の意味の範囲内で、「標準培地」とは、本発明の微生物の培養に適した全ての培地を含み、また強化培地および最小培地の双方を含むものとする。
【００８３】
「最小培地」とは、野生型細胞の成長に最小限必要なもの、すなわち無機塩、炭素源、および水のみを含有する培地である。
【００８４】
対照的に、「強化培地」とは、特定の微生物の全ての成長必要条件を満たすように設計されている。すなわち、最小培地の含有物に加え、これらは例えば成長因子を含有する。
【００８５】
抗生物質は、アンピシリンは５０マイクログラム／ミリリットル、カナマイシンは２５マイクログラム／ミリリットル、ナリジクス酸は２５マイクログラム／ミリリットルの量で標準培地に加えて、形質転換株の選択を可能にすることができる。
【００８６】
適切な培地は、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、および微量元素からなる。好適な炭素源は、糖類、例えば単糖類、二糖類、または多糖類などである。例えば、ブドウ糖、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、乳糖、麦芽糖、ショ糖、ラフィノース、デンプン、またはセルロースは、非常に良好な炭素源である。
【００８７】
複合化合物、例えばモラセスまたはその他の精糖の副生成物などによって、培地に糖を供給することもできる。また、異なる炭素源の混合物を供給することも有利となり得る。その他の可能な炭素源は、アルコールおよび有機酸、例えば、メタノール、エタノール、酢酸、または乳酸である。窒素源は、通常は、有機もしくは無機窒素化合物、またはこれらの化合物を含有する物質である。例となる窒素源には、アンモニアガス、またはアンモニア塩、例えばＮＨ4Ｃｌもしくは（ＮＨ4）2ＳＯ4、ＮＨ4ＯＨ、硝酸塩、尿素、アミノ酸、あるいは複合窒素源、例えばコーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉抽出物などが含まれる。
【００８８】
培地に含んでもよい無機塩化合物には、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅、および鉄の塩化物、リン酸塩、または硫化塩がある。キレート化化合物を培地に加えて、溶液中の金属イオンを保持することもできる。特に有用なキレート化化合物には、ジヒドロキシフェノール、例えばカテコールまたはプロトカテキュ酸など、あるいは有機酸、例えばクエン酸などが含まれる。培地は、典型的には、別の成長因子、例えばビタミン、または成長促進物質、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩、およびピリドキシンなども含有する。成長因子および塩は、複合培地成分、例えば酵母抽出物、モラセス、コーンスティープリカーなどからもたらされることが多い。培地化合物の正確な組成物は、当座の実験に強く依存し、それぞれの特定のケースについて個々に決定される。培地最適化についての情報は、教本「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ｅｄｓ．  Ｐ．Ｍ．  Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｐ．Ｆ．  Ｓｔａｎｂｕｒｙ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９７）  ｐｐ．  ５３−７３，  ＩＳＢＮ  ０  １９  ９６３５７７  ３）から入手できる。また、商業サプライヤーからの成長培地、例えばｓｔａｎｄａｒｄ  １（Ｍｅｒｃｋ社）またはＢＨＩ（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ、ＤＩＦＣＯ社）などを選択することも可能である。
【００８９】
さらに、活性組換えリアーゼの発現効率を向上させるために、ヘム前駆体のデルタアミノレブリン酸を培地に添加することも有利となり得る。
【００９０】
全ての培地成分は、熱によって（１．５バール、１２１℃で２０分間）、あるいは滅菌濾過によって滅菌するべきである。これらの成分は一緒に、あるいは必要であれば別々に滅菌することができる。
【００９１】
細菌の培養に使用する標準培地の調製は、通常は、単一アミノ酸の添加を伴わない。その代わり、標準培養条件下で使用する強化培地には、アミノ酸の混合物、例えばペプトンまたはトリプトンなどを加える。
【００９２】
本発明によるトランスジェニック細胞は、あらゆる適切な方法、例えばバッチ培養法またはフェドバッチ培養法で培養してよい。
【００９３】
本発明の意味の範囲内で、「バッチ培養」とは、培養中に培養培地を添加も抜き出しもしない培養法である。
【００９４】
本発明の意味の範囲内で、「フェドバッチ法」とは、培養中に培養培地を添加するが、培養培地を抜き出さない培養法である。
【００９５】
原核生物におけるタンパク質の発現は、融合タンパク質あるいは非融合タンパク質の発現を指示する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行なうことが最も多い。
【００９６】
融合ベクターは、挿入された核酸配列によってコードされたタンパク質に複数のアミノ酸を付加する。これらは通常は組換えタンパク質のアミノ末端に付加されるが、Ｃ末端にも付加され、あるいはタンパク質の適切な領域内に融合される。かかる融合ベクターは、典型的には、３つの目的を果たす。
１）組換えタンパク質の発現を増加させる目的
２）組換えタンパク質の溶解性を向上させる目的
３）親和性精製のためのリガンドを提供することによって、組換えタンパク質の精製を援助する目的
【００９７】
しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質切断部位を融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入して、融合タンパク質の精製後、組換えタンパク質の融合部分からの単離を可能にする。かかる酵素およびそれらの同族の認識配列には、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。
【００９８】
典型的な融合発現ベクターには、ｐＱＥ（Ｑｉａｇｅｎ社）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｂ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｋ．  Ｓ．  （１９８８）  Ｇｅｎｅ  ６７：  ３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州ビバリー）、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が含まれ、これらはそれぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはタンパク質Ａを組換えタンパク質に融合する。
【００９９】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍベクターの例は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ２００５  Ｅｇｇｅｌｉｎｇ，  Ｌ．  Ｂｏｔｔ，  Ｍ．，  ｅｄｓ．，  ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ  ＵＳＡに示されている。
【０１００】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｇｅｎｅ  ６９：  ３０１−３１５）、ｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳｌ、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂｌ、ｅｇｔｌｌ、ｐＢｄＣｌ、およびｐＥＴ  ｌｌｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  （１９９０）  ６０−８９；  Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９８５）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＩＳＢＮ  ０  ４４４  ９０４０１８）がある。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主のＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ  ｌｌｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現したウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎｌ）に媒介されたＴ７  ｇｎｌＯ−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）によって、ｌａｃＵＶ  ５プロモーターの転写制御下、Ｔ７  ｇｎｌ遺伝子を含む常在Ｘプロファージから供給される。その他の種類の細菌の形質転換には、適当なベクターを選択することができる。例えば、プラスミドｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２、およびｐＩＪ３６１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの形質転換に有用であることが知られており、一方プラスミドpＵＢ１１０、ｐＣ１９４、またはｐＢＤ２１４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種の形質転換に適している。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍへの遺伝情報の移入に使用されるいくつかのプラスミドには、ｐＨＭ１５１９、ｐＢＬｌ、ｐＳＡ７７、またはｐＡＪ６６７（Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９８５）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＩＢＳＮ  ０  ４４４  ９０４０１８）が含まれる。
【０１０１】
別の実施形態では、タンパク質発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃｌ（Ｂａｌｄａｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｅｍｂｏ  Ｊ．  ６：  ２２９−２３４）、２ｉ、ｐＡＧ−１、Ｙｅｐ６、Ｙｅｐｌ３、ｐＥＭＢＬＹｅ２３、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ  （１９８２）  Ｃｅｌｌ  ３０：  ９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｇｅｎｅ  ５４：  １１３−１２３）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国カリフォルニア州、サンディエゴ）がある。その他の真菌、例えば糸状菌などにおける使用に適当なベクターおよびベクターを構築するための方法には、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ，  Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｊ．  ＆  Ｐｕｎｔ，  Ｐ．Ｊ．（１９９１）：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｇｉ，  Ｊ．Ｆ．  Ｐｅｂｅｒｄｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  ｐ．  １−２８，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、およびＰｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （１９８５）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（ＩＳＢＮ  ０  ４４４  ９０４０１８）において詳述されているものが含まれる。
【０１０２】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション法によって原核細胞に導入することができる。本明細書において「形質転換」および「トランスフェクション」、「接合」および「形質導入」という用語は、外来核酸（例えば、直鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、直鎖化したベクター、またはベクターを有さない遺伝子構築物のみ）またはベクターの形態の核酸（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミド、ファージミド、トランスポゾン、またはその他のＤＮＡを宿主細胞に導入するための当分野で認められているさまざまな技法を指すものであり、これにはリン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、天然受容能、化学薬品媒介による移入、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクトに適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ２００３）、およびその他の実験室マニュアルに記載されている。
【０１０３】
これらの組み込み体を同定および選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質への耐性）をコードする遺伝子が、一般的に、目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好適な選択可能なマーカーには、薬物への耐性を付与するもの、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン（およびその他のペニシリン類）、セファロスポリン類、フルオロキノン類、ナラジキシン酸、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、およびメトトレキサートなどが含まれるが、これらに限定されない。その他の選択可能なマーカーには、宿主もしくは出発株において相当遺伝子の突然変異体を相補することができる野生型遺伝子が含まれる。例えば、上記のような本発明のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ出発もしくは宿主株のゲノムから、最小培地で成長させるための必須遺伝子、例えばｓｅｒＡなどを突然変異させるかあるいは削除してセリン栄養要求株を作り出す。次に、ｓｅｒＡ遺伝子の野生型またはその他の機能的コピーを含有するベクターを用いて、形質転換体または組み込み体を選択する。選択可能なマーカーをコードする核酸は、上述の修飾された核酸配列をコードするものと同じベクター上で宿主細胞に導入してもよく、あるいは別のベクター上で導入してもよい。導入された核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０１０４】
複製起点を持たないプラスミドと２つの異なるマーカー遺伝子とを使用する場合、ゲノムに挿入されたインサートの一部を有するマーカーを含まない菌株を作製することもできる。これは、相同組換えを連続して２回行なうことによって達成される（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７１  （１２）：  ８５８７−８５９６も参照）。
【０１０５】
別の実施形態において、導入された遺伝子の調節された発現を可能にする選択系を含有する組換え微生物を作製することができる。例えば、上述の核酸配列のうちの１つをベクター上に含ませてラクトースオペロンの制御下におくことにより、ＩＰＴＧの存在下でのみ遺伝子の発現が可能になる。かかる調節系は、当該技術分野において周知である。
【０１０６】
植物宿主細胞にＤＮＡを挿入するためには複数の公知の技法が利用可能であり、当業者は、それぞれのケースにおいて最も適切な方法を見つけることに何の困難もないであろう。これらの技法は、形質転換物質としてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（アグロバクテリウム・リゾゲネス）を用いた、Ｔ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、単離ＤＮＡのプロトプラストへの直接遺伝子移入、ＤＮＡのエレクトロポレーション、微粒子銃法を用いたＤＮＡの挿入、およびその他の可能な技法を含む。このようにして、安定形質転換体および一過性形質転換体の双方を生じ得る。
【０１０７】
もちろん、本発明による核酸分子を含有する植物細胞は、細胞培養物（プロトプラスト、カルス、懸濁液培養物などを含む）の形態でさらに培養してもよい。
【０１０８】
トランスジェニック生物または細胞、例えば、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物、または植物細胞など、および真菌、または藻類を使用するほかに、本発明の１３−ＨＰＯＬ酵素は、適切な発現ベクターを用いて、無細胞系において発現させることもできる。細胞を用いない発現は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで大量に活性組換えタンパク質を産生する転写と翻訳の共役反応であり、市販品を入手することもできる。
【０１０９】
本発明は、さらに、ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、本発明による１つ以上のトランスジェニック細胞を培養することによって、および場合によってはそのポリペプチドを回収することによって、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼポリペプチドを製造する方法に関する。
【０１１０】
「細胞の培養」という用語は、細胞の増殖およびポリペプチドの発現を可能にする条件下で細胞を成長させることを意味する。これらの条件には、上記に述べたように、細胞の代謝に必要な成分を含有する培地、温度、ｐＨ、およびインキュベーション時間が含まれる。
【０１１１】
ポリペプチドは、当該技術分野で公知のあらゆる精製方法、例えば、ゲル濾過またはクロマトグラフ法によって回収することができる。好ましくは、タンパク質は、親和性精製のためのリガンド、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、またはタンパク質Ａなどを提供する複数のアミノ酸と一緒に、融合タンパク質として発現される。上記に述べたように、これらのリガンドは、精製後に、融合タンパク質をプロテアーゼで処理することによって除去することができる。
【０１１２】
本発明は、さらに、多価不飽和脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドをアルデヒドとオキソカルボン酸とに切断するための、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼの使用にも関する。
【０１１３】
「多価不飽和脂肪酸」という用語は、少なくとも２つの二重結合を有する脂肪酸を指す。「脂肪酸ヒドロペルオキシド」は、不飽和脂肪酸の酸化によって形成される。具体的には、１３−ヒドロペルオキシドは、不飽和脂肪酸の１３番目の炭素原子における酸化によって形成される。本発明の方法において、１８個の炭素原子を有するリノール酸またはリノレン酸を多価不飽和脂肪酸として用いる場合、本発明の１３−ヒドロペルオキシドリアーゼの作用は、Ｃ6−アルデヒドおよびＣ12−オキソカルボン酸の生成をもたらす。例えば、ｎ−ヘキサナールは、リノール酸の１３−ヒドロペルオキシドから生成され、３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アールは、アルファリノレン酸の１３−ヒドロペルオキシドから生成される。
【０１１４】
より具体的には、本発明の１３−ヒドロペルオキシドリアーゼによって、亜麻仁油加水分解物の１３−ヒドロペルオキシド（リノール酸の１３−ヒドロペルオキシドとリノレン酸の１３−ヒドロペルオキシドとの混合物）を切断することで得られる反応生成物は、ｎ−ヘキサナール、３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アール、および２−（Ｅ）−ヘキセン−１−アールの混合物である。
【０１１５】
そのあと、生成されたＣ6−アルデヒドを香味および／または芳香原料として使用することも、あるいはさらに反応させて、相当するアルコールなどのその他の生成物を得ることもできる。得られた所望の生成物は、蒸気蒸留および／または不活性有機溶媒を用いた抽出によって反応媒体から分離することができる。
【０１１６】
したがって、本発明は、
ａ）多価不飽和脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドを本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼと接触させるステップと、
ｂ）生成したアルデヒドを回収するステップと、
を含む、アルデヒドを生成する方法に関する。
【０１１７】
好ましくは、前記方法は、ステップａ）の前に、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼを提供するステップをさらに含む。
【０１１８】
好ましくは、本発明は、
ａ）亜麻仁油加水分解物の１３−ヒドロペルオキシドを本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼと接触させるステップと、
ｂ）ステップａ）で生成したヘキサナール、３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アール、および２−（Ｅ）−ヘキセン−１−アールの混合物を回収するステップと、
を含む、ｎ−ヘキサナール、３−（Ｚ）−ヘキセン−１−アール、および２−（Ｅ）−ヘキセン−１−アールの混合物を生成する方法に関する。
【０１１９】
より好ましくは、前記方法は、ステップａ）の前に、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼを提供するステップをさらに含む。
【０１２０】
本発明の１３−ヒドロペルオキシドリアーゼは、さまざまな方法で提供することができる。
【０１２１】
まず１番目に、組換え微生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）を、例えば、超音波処理、浸透圧ショック、凍結融解サイクル、または細胞溶解キットの使用（例えば、Ｓｉｇｍａ社のＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標））によって溶解することができ、そのあと、得られた溶解物を脂肪酸ヒドロペルオキシドの溶液に直接加えて、アルデヒドとオキソカルボン酸とを形成することができる。
【０１２２】
２番目に、ヒドロペルオキシドをトランスジェニック細胞またはトランスジェニック生物、例えば微生物細胞、植物、植物細胞培養物、真菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞、およびシアノバクテリアなどにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで作製することができる。
【０１２３】
３番目に、トランスジェニック生物から１３−ＨＰＯＬを精製することができる。好ましくは、親和性タグ、例えばセルロース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、またはＨｉｓ−ｔａｇなどをコード化するヌクレオチド配列を含有するベクター中に、１３−ＨＰＯＬをコード化するヌクレオチド配列をクローニングする。ＤＮＡの転写および翻訳後、融合タンパク質が形成されるが、これはそのあと親和性クロマトグラフィーを用いて容易に精製することができる。融合タンパク質の生成および精製に有用なベクターおよび方法は、当業者に周知である。精製後、親和性タグは、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘなどのプロテアーゼの作用によって除去することができる。しかしながら、かかる親和性タグは、タンパク質の折り畳み／溶解性などの改善から、組換え融合タンパク質の活性を増加させる。また、これらおよびその他のタグは、融合タンパク質をアミロース、セルロースなどの安価な支持体上に固定化できるようにするが、これは組換え酵素の安定化および再利用のために反応器内で使用することができる。
【０１２４】
「接触させる」という用語は、酵素１３−ヒドロペルオキシドリアーゼと、その基質である多価不飽和脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドとを適切な反応条件下で合わせて、反応を可能にすることを意味する。専門家には、反応を生じるためにどの反応条件を選択しなければならないかは知られている。さらに、かかる反応条件の例は、下記の実施例に示す。
【０１２５】
生成したアルデヒドは、専門家に公知のあらゆる方法によって、例えば蒸気蒸留および／または不活性有機溶媒を用いた抽出によって回収することができる。次に、ガスクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣを用いて、反応生成物を分析することができる。
【０１２６】
１３−ヒドロペルオキシドリアーゼの基質、すなわち多価不飽和脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドは、１３−リポキシゲナーゼの活性によって生成することができる。オキシゲナーゼは、少なくとも１つの１−（Ｚ），４−（Ｚ）−ペンタジエン系を含有する多価不飽和脂肪酸、例えばリノール酸、リノレン酸、およびアラキドン酸などの部位特異的および立体特異的二原子酸素添加を触媒する。１３−リポキシゲナーゼは、脂肪酸内のＣ13位置に対する特異性を有する。すなわち１３−リポキシゲナーゼは、好ましくは脂肪酸の炭化水素骨格の１３番目の炭素原子に酸素を添加して、脂肪酸の１３−ヒドロペルオキシドをもたらす。
【０１２７】
１３−リポキシゲナーゼは、最も安価な１３−リポキシゲナーゼ源であるホモジナイズした大豆の形態で提供することができる（例えば、米国特許第５，４６４，７６１号；米国特許第６，７８０，６２１号を参照）。１３−リポキシゲナーゼを提供するその他方法は、組換え発現である。Ｃ13特異性を有する原核生物のリポキシゲナーゼのアミノ酸およびヌクレオチド配列は、欧州特許第０６１２３７１０．３号、およびＬａｎｇ  ａｎｄ  Ｆｅｕｓｓｎｅｒ  （２００７）  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６８（８）：  １１２０−１１２７、ならびにＫｏｅｄｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃｕｒｒ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５４（４）：  ３１５−３１９に開示されている。組換え１３−リポキシゲナーゼは、１３−ヒドロペルオキシドリアーゼと同じ細胞中で生成しても、あるいは別の細胞中で生成してもよい。同じ細胞中で生成する場合、相当するアルデヒドは、後者が形成された直後にヒドロペルオキシドから生成することができる。１３−リポキシゲナーゼは、１３−ヒドロペルオキシドリアーゼについて上記のように、細胞溶解物、細胞懸濁液、または精製タンパク質の形態で使用することができる。
【０１２８】
本発明の方法で生成したアルデヒドは、さまざまな手段、例えば反応溶液に生パン酵母を加えることによって、それらの相当するアルコールに還元してもよい。この酵母は、アルデヒドを還元する活性アルコールデヒドロゲナーゼ酵素を含有している。あるいは、単離したアルコールデヒドロゲナーゼまたは化学薬品、例えばＫＢＨ4またはＮａＢＨ4などを使用して、アルデヒドを相当するアルコールに還元してもよい。
【０１２９】
本発明の変異型１３−ヒドロペルオキシドリアーゼの単離、およびそれらの特徴付けは、下記の実施例に記載する。以下の実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。本特許出願において引用する全ての参考文献、特許出願、特許、および公開特許出願の内容は、参考として本明細書で援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１は、配列番号１による野生型アミノ酸配列とともに、ＧＣ７、Ｅ８Ｂ、Ｂ７Ａ、Ｃ２Ａ、ＡＣ５、Ｄｌ０Ａ、４Ｅ１０、および９Ｄ３に指定されるさまざまな修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２】図２は、それぞれ変異型または野生型１３−ヒドロペルオキシドリアーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉクローンのさまざまな細胞密度での１３−ＨＰＯＴの消費を示す。
【０１３１】
実施例
実施例１
野生型グアバ１３−ヒドロペルオキシドリアーゼの分子進化
配列番号１によるグアバ１３−ヒドロペルオキシドリアーゼをコード化するＤＮＡと、付加的なＣ．ｍｅｌｏ由来の９−ヒドロペルオキシドリアーゼをコード化するＤＮＡ配列、ならびにＣ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ（冬虫夏草）およびＮ．ａｔｔｅｎｕａｔａ（野生タバコ）由来の１３−ヒドロペルオキシドリアーゼをコード化するＤＮＡ配列との突然変異誘発およびシャフリングを数回行なうことにより、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼを得た。突然変異誘発ステップは、ＤΝＡに国際出願第２００６／００３２９８号に記載されているＥｖｏＳｉｇｈｔ（商標）法を用いて実施した。ＤΝＡシャフリングステップは、ＤΝＡに国際出願第００／０９６７９号に記載されているＬ−Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ（商標）法を用いて実施した。配列番号１によるグアバ１３−ヒドロペルオキシドリアーゼをコード化するＤＮＡを断片化し、Ｃ．ｍｅｌｏ、Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ、およびＮ．ａｔｔｅｎｕａｔａ由来の９もしくは１３−ヒドロペルオキシドリアーゼをコード化する断片化した付加ＤＮＡと混合し、変性／支持体上へのハイブリダイゼーション／ライゲーションの反復ステップによって再構成した。２３４ｎｍにおける基質消費をモニターすることにより、分子進化の各回における変異タンパク質のハイスループットスクリーニングを行なった。同定された改良変異体を基質および生成物のクロマトグラフ分析によって検証した。
【０１３２】
実施例２
適当な発現ベクター中への修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼのクローニング
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、および１７にそれぞれ示されている、修飾１３−ヒドロペルオキシリアーゼＧＣ７、Ｅ８Ｂ、ＡＣ５、Ｃ２Ａ、Ｂ７Ａ、Ｄ１０Ａ、Ｅ８Ｂ、および９Ｄ３をコード化するヌクレオチド配列を、ＥｃｏＲＩ部位を含有する５’リンカーとＢａｍＨｌ部位を含有する３’リンカーを用いて、ベクターｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）中にクローニングした。得られたさまざまなプラスミドの一覧を第１表に示す。
【０１３３】
第１表：組換えプラスミドの例
【表１】
2011502469.tif 000003
【０１３４】
実施例３
「野生型」酵素と比較した修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼによる脂肪酸ヒドロペルオキシド切断
実験１
第１表のプラスミドｐＢ７＃Ａ、ｐＡＣ＃５、ｐＣ２＃Ａ、ｐＥ８＃Ｂ、ｐＧＣ＃７、ｐ４Ｅ＃１０、ｐ９Ｄ＃３、ｐＤ１０＃Ａ、およびｐＷＴで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１細胞を振盪フラスコ培養物として、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地２５ｍｌ中、１８０ｒｐｍ、２０℃で３０時間誘導を行なわずに培養した。培養物を遠心分離し、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中にペレットを再懸濁させて、全ての形質転換細胞について光学密度をＯＤ600＝１０に調整したが、ただしプラスミドｐＤ１０＃Ａで形質転換したものだけは、光学密度をＯＤ600＝２５に調整した。１３−ＨＰＯＬ酵素変異体の触媒活性を以下のように測定した。脂肪酸源としての亜麻仁油加水分解物と１３−リポキシゲナーゼ源としての粉砕大豆を用いてあらかじめ生成しておいた脂肪酸ヒドロペルオキシド（基質１３−ＨＰＯＴ約７５％を含む）８４．３ｇ  ｋｇ-1を含有する溶液９００μｌに、細胞懸濁液（それぞれＯＤ600＝１０、ＯＤ600＝２５）１００μｌ（１０％ｖ／ｖ）を添加した。還元剤としてのウマ肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ２０ｍｇおよびＮＡＤＨ３３０ｍｇを攪拌下で添加した。反応を室温で２分間実施した。反応混合物１００μｌの一定分量を水９００μｌで希釈し、１容量の酢酸エチルで抽出し、３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールの存在をガスクロマトグラフィーにより検定した。脂肪酸ヒドロペルオキシドの消費は、ＨＰＬＣで追跡した。モル収率は、反応時に得られた３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールの量と、反応中に存在する１３−ＨＰＯＴの量から理論上得ることができる３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールの量との比率として表わす。
【０１３５】
本実験の結果は第２表に記載するが、これは組換え野生型酵素（ｐＷＴ）と比較して修飾されたリアーゼの改良された酵素活性を示している。
【０１３６】
第２表：修飾ヒドロペルオキシドリアーゼの活性
ウマ肝臓由来の可溶性アルコールデヒドロゲナーゼおよびＮＡＤＨを還元剤として使用した。
【０１３７】
【表２】
2011502469.tif 000004
*分析誤差許容範囲内
【０１３８】
実験２
第１表のプラスミドｐＢ７＃Ａ、ｐＡＣ＃５、ｐＣ２＃Ａ、ｐＥ８＃Ｂ、ｐＧＣ＃７、ｐ４Ｅ＃１０、ｐＤ１０＃Ａ、ｐ９Ｄ３およびｐＷＴを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１細胞を振盪フラスコ培養物として、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地２５ｍｌ中、１８０ｒｐｍ、２０℃で３０時間誘導を行なわずに培養した。培養物を遠心分離し、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中にペレットを再懸濁させた。光学密度をＯＤ600＝１０に調整したプラスミドｐＤ１０＃Ａで形質転換したものを除き、全ての形質転換細胞について光学密度をＯＤ600＝２０に調整した。触媒活性を以下のように測定した。脂肪酸源としての亜麻仁油加水分解物と１３−リポキシゲナーゼ源としての粉砕大豆を用いてあらかじめ生成しておいた脂肪酸ヒドロペルオキシド（基質１３−ＨＰＯＴ約７５％を含む）８４．３ｇ  ｋｇ-1を含有する溶液９００μｌに、細胞懸濁液（それぞれＯＤ600＝２０、ＯＤ600＝１０）１００μｌ（１０％ｖ／ｖ）を添加した。反応を室温で５分間実施した。反応物１００μｌの一定分量を２〜３ｍｇの還元剤ＮａＢＨ4を含有する水９００μｌで希釈し、１０分間攪拌した。還元された反応混合物を１容量の酢酸エチルで抽出し、３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールの存在をガスクロマトグラフィーにより検定した。脂肪酸ヒドロペルオキシドの消費は、ＨＰＬＣで追跡した。モル収率は、反応時に得られた３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールの量と、反応中に存在する１３−ＨＰＯＴの量から理論上得ることができる３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールの量との比率として表わす。
【０１３９】
本実験の結果は第３表に記載するが、これは組換え野生型酵素（ｐＷＴ）と比較して修飾されたリアーゼの改良された酵素活性を示している。
【０１４０】
第３表：修飾ヒドロペルオキシドリアーゼの活性
ＮａＢＨ4を還元剤として使用した。
【０１４１】
【表３】
2011502469.tif 000005
*データなし
【０１４２】
実験３
第１表のプラスミドｐＢ７＃Ａ、ｐＡＣ＃５、ｐＣ２＃Ａ、ｐＥ８＃Ｂ、ｐＧＣ＃７、ｐＤ１０＃Ａ、およびｐＷＴで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１細胞を振盪フラスコ培養物として、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地１００ｍｌ中、１８０ｒｐｍ、２０℃で３０時間誘導を行なわずに培養した。培養物を遠心分離し、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中にペレットを再懸濁させ、光学密度をＯＤ600＝１０に調整した。触媒活性を以下のように測定した。乾燥パン酵母５００ｍｇを１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）８００μｌに添加し、３０秒間攪拌した。脂肪酸源としての亜麻仁油加水分解物と１３−リポキシゲナーゼ源としての粉砕大豆を用いてあらかじめ生成しておいた脂肪酸ヒドロペルオキシド（基質１３−ＨＰＯＴ約７５％を含む）８３ｇ  ｋｇ-1を含有する溶液３．７ｍｌを添加した。次に、目的のプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉの組換え細胞（ＯＤ600＝１０）５００μｌ（１０％ｖ／ｖ）を攪拌下で迅速に添加した。反応を室温で１時間維持した。反応物１００μｌの一定分量を水９００μｌで希釈し、酢酸エチル１ｍｌで抽出し、３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールの存在をガスクロマトグラフィーにより検定した。
【０１４３】
本実験の結果は第４表に記載するが、これは組換え野生型酵素（ｐＷＴ）と比較して、本発明の修飾リアーゼの改良された酵素活性を示している。
【０１４４】
第４表：修飾ヒドロペルオキシドリアーゼの活性
パン酵母が還元剤の機能を果たした。
【０１４５】
【表４】
2011502469.tif 000006
【０１４６】
実験４
第１表のプラスミドｐＧＣ＃７、ｐ９Ｄ＃３、ｐＤ１０＃Ａ、およびｐＷＴを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１細胞を振盪フラスコ培養物として、アンピシリン１００ｐｐｍを含むＬＢ培地２５ｍｌ中、１８０ｒｐｍ、２０℃で３０時間誘導を行なわずに培養した。培養物を遠心分離し、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中にペレットを再懸濁させた。ＯＤ600＝２０〜ＯＤ600＝２５０の範囲のさまざまな光学密度を有する細胞懸濁液を調製した。触媒活性を以下のように測定した。脂肪酸源としての亜麻仁油加水分解物と１３−リポキシゲナーゼ源としての粉砕大豆を用いてあらかじめ生成しておいた脂肪酸ヒドロペルオキシド８４．３ｇ  ｋｇ-1を含有する溶液９００μｌに、細胞懸濁液（ＯＤ600＝２０〜ＯＤ600＝２５０）１００μｌ（１０％ｖ／ｖ）を加えた。反応を室温で５分間実施した。反応物１０μｌの一定分量をエタノール９９０μｌ中に希釈し、１３ＨＰＯＴの消費をＨＰＬＣ分析により検定した。本実験の結果は図２に示す。本実験は、本発明の修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼは、基質１３−ヒドロペルオキシ−オクタデカトリエン酸の１００％変換をもたらし、一方グアバ由来の野生型１３−ヒドロペルオキシドリアーゼは、ＯＤ600＝２５であっても、１３−ヒドロペルオキシ−オクタデカトリエン酸の約３０％しか変換しないことを確認した。
【０１４７】
実施例４
修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼＧＣ＃７の性能
実験１
実験室規模の攪拌反応器で、細胞Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１：ｐＧＣ＃７をアンピシリン１００ｐｐｍを含有するＬＢ培地２リットル中、２０℃で３０時間成長させた。培養物を空気により１ｖｖｍで通気した。遠心分離により細胞を収集し、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中に再懸濁させて、光学密度ＯＤ600＝６８とした。脂肪酸源としての亜麻仁油加水分解物と１３−リポキシゲナーゼ源としての粉砕大豆を用いて、脂肪酸ヒドロペルオキシドを生成した。１７２ｍｌの組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞ＭＣ１０６１：ｐＧＣ＃７（ＯＤ600＝６８）をＨＰＯＴ／Ｄ８７ｇ  ｋｇ-1を含有する脂肪酸ヒドロペルオキシド溶液１５４４ｇに、攪拌下、室温で添加した。反応は、還元剤ＮａＢＨ4を３６％含有する水溶液５０ｍｌを添加して５分後に停止した。続いて、減圧下での蒸留によって３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールを単離して、３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オール８．７グラムを得た。
【０１４８】
実験２
アンピシリン１００ｐｐｍを含有する無機塩培地を用いて、細胞Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１：ｐＧＣ＃７を３０℃で成長させた。ｐＨをｐＨ７に維持し、培養物を空気により１ｖｖｍで通気した。ＯＤ600＝４で０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより、遺伝子発現を誘導した。２４時間後、光学密度ＯＤ600＝９を達成した。遠心分離により細胞を収集し、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）中に再懸濁させて、光学密度ＯＤ600＝１０とした。脂肪酸源としての亜麻仁油加水分解物と１３−リポキシゲナーゼ源としての粉砕大豆を用いてあらかじめ生成しておいた脂肪酸ヒドロペルオキシド８３ｇ  ｋｇ-1を含有する溶液９００μｌに、この細胞懸濁液１００μｌ（１０％ｖ／ｖ）を添加した。反応を室温で５分間実施した。反応混合物１００μｌの一定分量を２〜３ｍｇの還元剤ＮａＢＨ4を含有する水９００μｌで希釈した。還元された反応混合物を１容量の酢酸エチルで抽出し、揮発性Ｃ6アルコールをガスクロマトグラフィーにより検定した。上記の反応において、組換えＭＣ１０６１：ｐＧＣ７によって、濃度９．５ｇ  ｌ-1の３−（Ｚ）−ヘキセン−１−オールが生成されたと推定される。
【０１４９】
図面の簡単な説明
図１  配列番号１による野生型アミノ酸配列とともに、ＧＣ７、Ｅ８Ｂ、Ｂ７Ａ、Ｃ２Ａ、ＡＣ５、Ｄｌ０Ａ、４Ｅ１０、および９Ｄ３に指定されるさまざまな修飾１３−ヒドロペルオキシドリアーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アミノ酸の挿入および置換は、太字で示している。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、および１６に示される変異体ＧＣ７、Ｅ８Ｂ、Ｂ７Ａ、Ｃ２Ａ、ＡＣ５、Ｄｌ０Ａ、４Ｅ１０、および９Ｄ３の最初の９個のアミノ酸は、配列番号１ではなく９−ヒドロペルオキシドリアーゼに由来するため、アラインメントには示さない。
【０１５０】
図２  それぞれ変異型または野生型１３−ヒドロペルオキシドリアーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉクローンのさまざまな細胞密度での１３−ＨＰＯＴの消費を示す図である。ｐＧＣ＃７は丸、ｐ９Ｄ＃３は三角、ｐＤ１０＃Ａは四角、ｐＷＴは菱形で示す。
【図１−１】
2011502469.tif 000007
【図１−２】
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【図２】
2011502469.tif 000009
【配列表】
2011502469000001.app
【国際調査報告】
2011502469.tif 000010
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