(57)【要約】本明細書に開示される発明は，ＪＡＫ２遺伝子およびＪＡＫ２蛋白質における新規変異の同定に基づく。本発明は，新生物疾患，例えば，骨髄増殖性疾患を診断するのに有用な方法および組成物を提供する。本発明はまた，新生物疾患を有すると診断された個体の予後を判定するのに有用な方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生物疾患を診断する方法であって，患者のＪＡＫ２核酸における１またはそれ以上の変異の存在または非存在を測定することを含み，前記変異は，Ｇ１９２０Ａ，Ｔ１９２３Ｃ，およびＧ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記変異はＧ１９２０Ａである，請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記変異はＧ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔである，請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記変異はＴ１９２３Ｃである，請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ＪＡＫ２核酸はさらにＧ１９２０Ｔ変異を含む，請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ＪＡＫ２核酸はさらにＧ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔ変異を含む，請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記ＪＡＫ２核酸はさらにＴ１９２０Ａ変異を含む，請求項４記載の方法。
【請求項８】
前記新生物疾患は骨髄増殖性疾患である，請求項１記載の方法。
【請求項９】
骨髄増殖性疾患は，真性赤血球増加症，本態性血小板血症，突発性骨髄線維症，および未分類骨髄増殖性疾患からなる群より選択される，請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記変異はＪＡＫ２キナーゼ活性に影響を及ぼす，請求項１記載の方法。
【請求項１１】
新生物疾患と診断された個体の予後を判定する方法であって，
患者のＪＡＫ２核酸における１またはそれ以上の変異の存在または非存在を測定し，前記変異は，Ｇ１９２０Ａ，Ｔ１９２３Ｃ，およびＧ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔからなる群より選択され，そして
変異状態を用いて個体の臨床転帰を予測する，
ことを含む方法。
【請求項１２】
前記変異はＧ１９２０Ａである，請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記変異はＧ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔである，請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記変異はＴ１９２３Ｃである，請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記ＪＡＫ２核酸はさらにＧ１９２０Ｔ変異を含む，請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記ＪＡＫ２核酸はさらにＧ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔ変異を含む，請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記ＪＡＫ２核酸はさらにＴ１９２０Ａ変異を含む，請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記新生物疾患は骨髄増殖性疾患である，請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
骨髄増殖性疾患は真性赤血球増加症，本態性血小板血症，突発性骨髄線維症，および未分類骨髄増殖性疾患からなる群より選択される，請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記変異はＪＡＫ２キナーゼ活性に影響を及ぼす，請求項１１記載の方法。
【請求項２１】
変異状態を少なくとも１つの他の臨床パラメータと組み合わせて，個体の臨床転帰を判定する，請求項１１記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの他の臨床パラメータは，年齢および芽細胞数のパーセントからなる群より選択される，請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
新生物疾患を診断する方法であって，患者のＪＡＫ２蛋白質中の変異の存在または非存在を判定することを含み，前記変異はＶ６１７ＡおよびＣ６１８Ｒからなる群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項２４】
前記変異はＶ６１７Ａである，請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記変異はＣ６１８Ｒである，請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記ＪＡＫ２蛋白質はさらにＶ６１７Ｆ変異を含む，請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記新生物疾患は骨髄増殖性疾患である，請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
骨髄増殖性疾患は真性赤血球増加症，本態性血小板血症，突発性骨髄線維症，および未分類骨髄増殖性疾患からなる群より選択される，請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記変異はＪＡＫ２キナーゼ活性に影響を及ぼす，請求項２３記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１の少なくとも１４ヌクレオチドを含む単離された核酸であって，Ｇ１９２０Ａ，Ｔ１９２３Ｃ，およびＧ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔからなる群より選択される変異またはその相補体を含むことを特徴とする核酸。
【請求項３１】
前記変異はＧ１９２０Ａである，請求項３０記載の核酸。
【請求項３２】
前記変異はＧ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔである，請求項３０記載の核酸。
【請求項３３】
前記変異はＴ１９２３Ｃである，請求項３０記載の核酸。
【請求項３４】
前記核酸はさらにＧ１９２０Ｔ変異を含む，請求項３３記載の核酸。
【請求項３５】
前記核酸はさらにＧ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔ変異を含む，請求項３３記載の核酸。
【請求項３６】
前記核酸はさらにＴ１９２０Ａ変異を含む，請求項３３記載の核酸。
【請求項３７】
前記核酸は少なくとも５０ヌクレオチドを含む，請求項３０記載の核酸。
【請求項３８】
前記核酸はさらに検出可能な標識を含む，請求項３０記載の核酸。
【請求項３９】
配列番号３の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む単離されたポリペプチドであって，Ｖ６１７ＩおよびＣ６１８Ｒからなる群より選択される変異を含むことを特徴とするポリペプチド。
【請求項４０】
前記変異はＶ６１７Ｉである，請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記変異はＣ６１８Ｒである，請求項３９記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドはさらにＶ６１７Ｉ変異を含む，請求項４１記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリペプチドは少なくとも５０アミノ酸を含む，請求項３９記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，癌の診断および治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
以下の本発明の背景に関する記載は，単に読者の本発明に関する理解を促進するために提供するものであり，本発明に対する従来技術を記述または構成すると認めるものではない。
【０００３】
ある種の新生物疾患，例えば，真性赤血球増加症（ＰＶ），本態性血小板血症（ＥＴ），および慢性突発性骨髄線維症（ＩＭＦ）等の非ＣＭＬ骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ），および未だに分類されていない骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ−ＮＣ）は，血液細胞の異常な増加を特徴とする。例えば，Ｖａｉｎｃｈｅｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ），１９５−２００（２００５）を参照。この増加は，一般に骨髄に存在する多能性の造血幹細胞の自然突然変異により引き起こされる（上掲）。変異により，幹細胞は特定のリニアージの血液細胞を正常よりはるかに多く産生し，それによって赤血球細胞，巨核球，顆粒球，および単球などの細胞の過剰生成が起こる。ＭＰＤを有する患者に共通する症状には脾腫大，肝腫大，白血球，赤血球，および／または血小板数の増加，凝血（血栓），脱力感，目まい，および頭痛がある。ＰＶ，ＥＴ，およびＩＭＦ等の疾病は白血病の前兆であり得るが，病態変化の（例えば急性転化に至るまでの）速度は各疾患によって異なる（上掲）。
【０００４】
多くのＭＰＤに関与する特定の遺伝子およびそれに付随する突然変異（単数または複数）は不明である。しかしながら，細胞質性非レセプターチロシンキナーゼであるヤヌスキナーゼ２（ＪＡＫ２）遺伝子の変異が多くのＭＰＤで同定されている。例えばこの変異は９７％ものＰＶ患者，および，ＥＴまたはＩＭＦ患者の４０％以上で報告されている。例えば，Ｂａｘｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３６５：１０５４−１０６０（２００５）；Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：１１４４−１１４８（２００５）；Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（２４）：２２７８８−２２７９２（２００５）；Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，７：３８７−３９７（２００５）；Ｋｒａｌｏｖｉｃｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２（１７）：１７７９−１７９０（２００５）；Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０６：２１６２−２１６８（２００５）；Ｓｔｅｅｎｓｍａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０６：１２０７−２１０９（２００５）を参照。
【０００５】
ヤヌスキナーゼはサイトカイン・シグナリングに関与するチロシンキナーゼ・ファミリーである。例えばＪＡＫ２キナーゼは膜結合型サイトカインレセプター（例えばエリスロポエチンレセプター（ＥｐｏＲ））とシグナル伝達経路の下流のメンバー（例えばＳＴＡＴ５（シグナル伝達・転写活性化蛋白質５；Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５））との間の介在物質として作用する。例えば，Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｃ．Ｗ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：１１３３−１１３７（２００２）；Ｔｅｆｆｅｒｉ  ａｎｄ  Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８０：９４７−９５８（２００５）；Ｇｉｏｒｄａｎｅｔｔｏ  ａｎｄ  Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１５（９）：７２７−７３７（２００２）を参照。サイトカインレセプター／リガンド複合体が付随するＪＡＫ２キナーゼをリン酸化するとＪＡＫ２が活性化される（上掲）。次にＪＡＫ２はその基質分子，例えばＳＴＡＴ５をリン酸化および活性化し，これが核に入り，他の調節蛋白質と相互作用して転写に作用を及ぼす（上掲；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．，ａｎｄＳｔｅｅｎｓｍａ，Ｄ．Ｐ．，Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ４７：１７７−１９４（２００６））。
【０００６】
あるＪＡＫ２変異体では，６１７位のアミノ酸でバリン（コドン"ＧＴＣ"）がフェニルアラニン（コドン"ＴＴＣ"）で置換されている（"Ｖ６１７Ｆ変異体"）。Ｂａｘｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３６５：１０５４−１０６０（２００５）。６１７位のアミノ酸は第１２エクソンに位置するが，そこにはシュードキナーゼ（ＪＨ２（Ｊａｋホモロジー２ドメイン）と呼ばれる自己阻害（または負制御）ドメイン）が含まれる（上掲；Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：１１４４−１１４８（２００５））。
【０００７】
このドメインはキナーゼ活性を有さないが，キナーゼ活性を有するＪＨ１（Ｊａｋホモロジー１）ドメインと相互作用する。Ｂａｘｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ３６５：１０５４−１０６０（２００５）。野生型蛋白質では２つのドメインが適切に接触することによって適切なキナーゼ活性および調節が行われる。しかし，Ｖ６１７Ｆ変異によって２つのドメインの接触は不適切となり，その結果，変異型ＪＡＫ２蛋白質では構成的キナーゼ活性が生ずる（上掲）。
【０００８】
種々の異なるアプローチおよび多くの証拠により，ＪＡＫ２のＶ６１７Ｆ変異は，もし存在すれば，ＭＰＤの発病機序に関与することが示唆されている。例えば，Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ），５３３−７（２００５）を参照。変異は血液サンプル，骨髄，および口腔サンプルから検出されており（例えば，Ｂａｘｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３６５：１０５４−１０６０（２００５）；Ｊａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３８：１１４４−１１４８（２００５）；Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（２４）：２２７８８−２２７９２（２００５）；Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，７：３８７−３９７（２００５）；Ｋｒａｌｏｖｉｃｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２（１７）：１７７９−１７９０（２００５）を参照），ホモ接合性およびヘテロ接合性の細胞集団がＭＰＤ患者で報告されている。Ｂａｘｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ３６５：１０５４−１０６０（２００５）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明は，ＪＡＫ２遺伝子および蛋白質中の，これまでに知られていない変異の発見に基づく。詳細には，ＪＡＫ２遺伝子変異には，Ｇ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔ二重変異，Ｇ１９２０Ａ変異，およびＴ１９２３Ｃ変異が含まれ，これらはそれぞれ，ＪＡＫ２蛋白質のＪＨ２ドメインにおいて，Ｖ６１７Ｆ，Ｖ６１７Ｉ，およびＣ６１８Ｒのアミノ酸置換を生ずる。本発明はさらに，新生物疾患，例えば骨髄増殖性疾患の診断および予後予測に有用な方法および組成物を提供する。
【００１０】
したがって，１つの観点においては，本発明は，新生物疾患を診断する方法を提供する。この方法は，患者のＪＡＫ２核酸における１またはそれ以上の変異の存在または非存在を判定することを含み，前記変異は，Ｇ１９２０Ａ，Ｔ１９２３Ｃ，およびＧ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔからなる群より選択される。
【００１１】
別の観点においては，本発明は，新生物疾患と診断された個体の予後を判定する方法を提供する。この方法は，患者のＪＡＫ２核酸における１またはそれ以上の変異の存在または非存在を判定し，前記変異はＧ１９２０Ａ，Ｔ１９２３Ｃ，およびＧ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔからなる群より選択され，そして変異状態を用いて個体の臨床転帰を予測することを含む。
【００１２】
ある態様においては，ＪＡＫ２核酸は，Ｇ１９２０Ｔ変異，Ｇ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔ変異，またはＧ１９２０Ａ変異と組み合わせて，Ｔ１９２３Ｃ変異を有する。予後予測のための好ましい方法においては，ＪＡＫ２変異状態を少なくとも１つの別の臨床パラメータと組み合わせる。適当な臨床パラメータとしては，例えば，年齢および芽細胞数のパーセンテージが挙げられる。
【００１３】
別の観点においては，本発明は，新生物疾患を診断する方法を提供する。この方法は，患者のＪＡＫ２蛋白質における変異の存在または非存在を判定することを含み，前記変異はＶ６１７ＡおよびＣ６１８Ｒからなる群より選択される。
【００１４】
ある態様においては，ＪＡＫ２蛋白質は，別のＪＡＫ２変異，例えば，Ｖ６１７Ａ変異およびＶ６１７Ｆ変異に加えてＣ６１８Ｒ変異を含む。
【００１５】
別の態様においては，ＪＡＫ２核酸および／またはＪＡＫ２蛋白質のいずれかにおける１またはそれ以上の変異は，ＪＡＫ２キナーゼ活性に影響を及ぼす。好ましくは，ＪＡＫ２キナーゼ活性は低下する。より好ましくは，ＪＡＫ２キナーゼ活性は，ＪＡＫ２のＪＨ２（シュードキナーゼ）ドメインとＪＨ１ドメインとの間の相互作用が低下することにより低下する。
【００１６】
本発明の方法の主題である新生物疾患としては，骨髄増殖性疾患，例えば，真性赤血球増加症，本態性血小板血症，突発性骨髄線維症，および未分類の骨髄増殖性疾患が挙げられる。
【００１７】
別の態様においては，ＪＡＫ２蛋白質および／または核酸は，患者の生物学的サンプル（例えば体液）から得られる。別の態様においては，体液は無細胞の体液である。
【００１８】
別の観点においては，本発明は単離されたＪＡＫ２核酸を提供する。好ましいＪＡＫ２核酸は配列番号１の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含み，ここで，核酸は，Ｇ１９２０Ａ，Ｔ１９２３Ｃ，およびＧ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔからなる群より選択される変異またはその相補体を含む。好ましくは，ＪＡＫ２核酸は，Ｇ１９２０Ｔ変異，Ｇ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔ変異，またはＧ１９２０Ａ変異と組み合わせて，Ｔ１９２３Ｃ変異を含む。別の好ましい態様においては，ＪＡＫ２核酸は，少なくとも１４，１６，１８，２０，２２，２５，３０４０，５０，７５，１００，１５０，２００，２５０，５００，またはそれ以上のヌクレオチドを含む。任意に，ＪＡＫ２核酸はさらに検出可能な標識（例えば蛍光標識）を含んでいてもよい。
【００１９】
別の観点においては，本発明は，単離されたＪＡＫ２ポリペプチドを提供する。好ましいＪＡＫ２ポリペプチドは，配列番号３の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含み，ここで，ポリペプチドは，Ｖ６１７Ｉ変異および／またはＣ６１８Ｒ変異を含む。別の好ましい態様においては，ＪＡＫ２ポリペプチドは，少なくとも１２，１４，１６，１８，２０，２２，２５，３０４０，５０，７５，１００，１５０，２００，２５０，５００，またはそれ以上のアミノ酸を含む。
【００２０】
本明細書において用いる場合，"血漿"とは，血液中に含まれる無細胞液を表す。"血漿"は，当該技術分野において知られる方法（例えば，遠心分離，濾過等）により血液から全細胞物質を除去することによって得ることができる。本明細書において用いる場合，"末梢血血漿"とは，末梢血サンプルから得られる血漿を表す。
【００２１】
本明細書において用いる場合，"血清"とは，血漿または血液を凝固させ，凝固画分を除去した後に得られる血漿画分を含む。
【００２２】
"核酸"または"核酸配列"との用語は，オリゴヌクレオチド，ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド，およびそのフラグメントまたは一部を表し，これは一本鎖であっても二本鎖であってもよく，センス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく，天然または合成起源のものであってもよい。例えば，核酸はｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。核酸は（例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて）増幅された核酸であってもよい。"ＮＴｗｔ＃＃＃ＮＴｍｕｔ"との慣例表記法は，核酸の＃＃＃位において野生型ヌクレオチドＮＴｗｔが変異体ＮＴｍｕｔで置き換えられることにより生ずる変異を表すために用いられる。例えば，Ｇ１９２０Ａは，配列番号１（参照ヌクレオチド配列）のヌクレオチド位置１９２０において野生型のグアニンがアデニンに変化（変異）している変異を表す。
【００２３】
"アミノ酸配列"とは，ポリペプチドまたは蛋白質の配列を表す。"ＡＡｗｔ＃＃＃ＡＡｍｕｔ"との慣例表記法は，ポリペプチドの＃＃＃位において野生型アミノ酸ＡＡｗｔが変異体ＡＡｍｕｔで置き換えられることにより生ずる変異を表すために用いられる。例えば，Ｃ６１８Ｒは，配列番号３（参照ポリペプチド配列）のアミノ酸位置６１８において野生型のシステインがアルギニンに変化（変異）している変異を表す。
【００２４】
"野生型"との用語は，集団において最も高頻度で観察され，疾病に伴うものではない遺伝子または遺伝子産物を表す。"野生型"は，特定のヌクレオチド位置（単数または複数）における配列，または特定のコドン位置（単数または複数）における配列，または特定のアミノ酸位置（単数または複数）における配列も表す。例えば，遺伝子は，ヌクレオチド位置１８４９またはコドン６１７において"野生型"であってもよい。本明細書において用いる場合，"変異体"，"改変型"または"多型"とは，野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較して，配列および／または機能性が改変されている（すなわち特性が変化した）遺伝子または遺伝子産物を表す。"変異体"，"改変型"または"多型"はまた，特定のヌクレオチド位置（単数または複数）における配列，または特定のコドン位置（単数または複数）における配列，または特定のアミノ酸位置（単数または複数）における配列も表す。
【００２５】
"変異"とは，核酸配列中に，正常型配列または野生型配列と比較して少なくとも１つのヌクレオチドの変化を含むことを意味する。変異には置換，欠失，逆位，または挿入がある。コードされたポリペプチドに関して，変異は"サイレント"であってコードされるポリペプチド配列に変化をもたらさなくてもよく，または変異によってコードされるポリペプチド配列に変化が生じてもよい。例えば変異によって，コードされるポリペプチドに置換が起こってもよい。変異によって，コードされるポリペプチド配列にフレームシフトが起こってもよい。
【００２６】
本明細書において用いる場合，"コドン"との用語は，蛋白質合成の際にポリペプチド鎖に特定のアミノ酸の挿入または蛋白質合成を停止させるシグナルを決定する遺伝子コードを構成する，３つの隣接するヌクレオチド（ＲＮＡでもＤＮＡでもよい）の配列を表す。"コドン"との用語はまた，元のＤＮＡが転写されたメッセンジャーＲＮＡ中の３つのヌクレオチドの対応する（および相補的な）配列を表すためにも用いられる。
【００２７】
"実質的にすべて"との用語は，約６０−１００％，より好ましくは約７０−１００％、より好ましくは約８０−１００％，より好ましくは約９０−１００％，より好ましくは約９５−１００％を意味する。
【００２８】
標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチド（例えば，プローブまたはプライマー）は，好適な条件下で標的核酸に"ハイブリダイズ"する。本明細書において用いる場合，"ハイブリダイゼーション"または"ハイブリダイズする"とは，一本鎖のオリゴヌクレオチドが所定のハイブリダイゼーション条件下で塩基対形成により相補的な鎖にハイブリダイズするプロセスを表す。
【００２９】
核酸（例えばオリゴヌクレオチド）に関して"単離された"とは，それが天然に生ずるゲノムの実質的な部分から分離されている核酸を意味する。例えば，合成により製造された（例えば一連の塩基縮合により）任意の核酸は，単離されていると考えられる。同様に，組換え発現された，プライマー伸張反応（例えばＰＣＲ）により生成した，またはその他の方法によりゲノムから切り出されている核酸も単離されていると考えられる。
【００３０】
"特異的ハイブリダイゼーション"とは，核酸配列が高度の相補性を共有することを示す。許容されるアニーリング条件では，特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成され，続く洗浄段階の後にもハイブリダイズしたままである。核酸配列のアニーリングについての許容される条件は，当業者が日常的に決定することができ，例えば，約６×ＳＳＣの存在下で６５℃で生ずる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは，部分的には，洗浄工程を行う温度により表すことができる。そのような温度は，典型的には，所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱溶融点（Ｔｍ）より約５℃から２０℃低いように選択される。Ｔｍは５０％の標的配列が完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨにおける）である。Ｔｍを計算するための等式および核酸ハイブリダイゼーションの条件は当該技術分野において知られている。
【００３１】
標的核酸を特異的に増幅（すなわち，特定の標的核酸配列を増幅），または特異的に検出（すなわち，特定の標的核酸配列を検出）するためのプライマーまたはプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドは，一般に，標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。
【００３２】
ＪＡＫ２核酸配列について，"変異"とは，参照配列であるＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００４９７２と比較して少なくとも１つの核酸の変化を含むＪＡＫ２核酸配列を意味する。便宜のために，ＪＡＫ２のｃＤＮＡ配列を図１（配列番号１）に示し，シュードキナーゼドメインのｃＤＮＡ配列を図２（配列番号２）に示す。変異には，置換，欠失または挿入が含まれる。ＪＡＫ２核酸における変異により，コードされるポリペプチド配列が変化してもよく，または変異はコードされるポリペプチド配列に関してサイレントであってもよい。ポリペプチド配列の変化をもたらすＪＡＫ２変異の例としては，限定されないが，Ｖ６１７Ｆが挙げられる。アミノ酸配列の変化は，配列番号３（図３）を参照アミノ酸配列として比較することにより判定することができる。
【００３３】
核酸において"１またはそれ以上の変異の存在または非存在を判定する"ことは，核酸を検出することも含む。例えば，ＪＡＫ２の変異の存在または非存在の判定においては，ＪＡＫ２核酸の検出も行われる。１またはそれ以上の変異の存在または非存在を判定する方法は，当該技術分野において知られる種々の方法を含み，例えば，ＪＡＫ２ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写，ＪＡＫ２核酸の増幅，プローブまたはプライマーのＪＡＫ２核酸へのハイブリダイズ，およびＪＡＫ２核酸の配列決定の１またはそれ以上が挙げられる。
【００３４】
"オリゴヌクレオチド"との用語は，主として所定の間隔で配列された同一のモノマー単位から構成される骨格上に塩基の配列を有する分子であると理解される。塩基は，オリゴヌクレオチドの塩基と相補的な塩基の配列を有する核酸と結合することができるように，骨格上に配置される。最も一般的なオリゴヌクレオチドは，糖リン酸単位の骨格を有する。２’位にヒドロキシル基を有しないオリゴデオキシリボヌクレオチドと，この位置にヒドロキシル基を有するオリゴリボヌクレオチドは区別される。また，オリゴヌクレオチドには，ヒドロキシル基の水素が有機基，例えばアリル基で置き換えられている誘導体も含まれる。本発明の方法においてプライマーまたはプローブとして機能するオリゴヌクレオチドは，一般に少なくとも約１０−１５ヌクレオチドの長さであり，より好ましくは少なくとも約１５−２５ヌクレオチドの長さであるが，より短いまたは長いオリゴヌクレオチドも本発明の方法において用いることができる。正確なサイズは多くの因子によって異なり，これらはオリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途によって異なる。オリゴヌクレオチドは，任意の方法により，例えば，化学合成，ＤＮＡ複製，逆転写，ＰＣＲ，またはこれらの組み合わせにより生成することができる。オリゴヌクレオチドは修飾してもよい。例えば，オリゴヌクレオチドは，検出可能なシグナルを生成する物質（例えば蛍光団）で標識してもよい。
【００３５】
"プライマー"とは，プライマー伸張（例えばＰＣＲ等の適用にともなうプライマー伸張）が開始される条件に置かれたときに合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを表す。オリゴヌクレオチド"プライマー"は，精製した制限酵素消化物におけるように天然に存在するものであってもよく，合成してもよい。
【００３６】
"プローブ"とは，ハイブリダイゼーションにより標的核酸と相互作用するオリゴヌクレオチドを表す。プローブは，標的核酸配列に完全に相補的であってもよく，部分的に相補的であってもよい。相補性のレベルは，一般にはプローブの機能に基づく多くの因子によって異なる。プローブ（単数または複数）を用いて，例えば，標的の配列特性を利用して，核酸配列における変異の存在または非存在を検出することができる。プローブは標識されていてもよく，標識されていなくてもよく，または当該技術分野においてよく知られる多くの方法のいずれかにより修飾されていてもよい。プローブは標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。
【００３７】
"標的核酸"とは，プローブオリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーオリゴヌクレオチドと少なくとも部分的な相補性を有する配列を含む核酸分子を表す。プローブは，標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。
【００３８】
本明細書において用いる場合，ＪＡＫ２に関して"活性化ドメイン"との用語は，一般に，細胞活性化に関与するドメインを表す。活性化ドメインの例は，キナーゼまたはシュードキナーゼドメインである。
【００３９】
本明細書において用いる場合，"シュードキナーゼドメイン"との用語は，機能的キナーゼと相同性を示すが触媒活性を有しない，ポリペプチドの一部またはポリペプチドの一部をコードする核酸を表す。シュードキナーゼドメインは"キナーゼ様ドメイン"とも称される。シュードキナーゼドメインの例は，ＪＡＫ２シュードキナーゼドメインであり，これはＪＨ２ドメインとも称され，配列番号２（図２）に示される。
【００４０】
"キナーゼドメイン"との用語は，ポリペプチドのキナーゼ活性（例えばチロシンキナーゼ活性）に必要な，ポリペプチドの一部またはポリペプチドの一部をコードする核酸を表す。
【００４１】
本発明のある方法においては，変異は"ＪＡＫ２キナーゼ活性に影響を及ぼす"ものであってもよい。影響されるＪＡＫ２キナーゼ活性としては，キナーゼ活性が上昇する，低下する，構成的になる，完全に停止する，またはより多くの，より少ない，または異なる標的に影響を与えることが含まれる。キナーゼ活性に影響を及ぼす変異は，キナーゼドメインに存在していてもよく，またはキナーゼドメインと関連するドメイン，例えばＪＡＫ２シュードキナーゼドメインに存在していてもよい。
【００４２】
本明細書において用いる場合，"診断する"または"診断"または"診断すること"との用語は，疾病，症候群または状態を鑑別または識別すること，または特定の疾病，症候群または状態を有する個人を鑑別または識別することを表す。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１はＪＡＫ２の核酸配列である。
【図２】図２はＪＡＫ２シュードキナーゼドメイン領域の核酸配列である。
【図３】図３はＪＡＫ２のアミノ酸配列である。
【図４】図４はＪＡＫ２シュードキナーゼドメイン領域のアミノ酸配列である。
【図５】図５は一連の電気泳動像の出力である。図５Ａは，アミノ酸６１７をコードするコドンがＧＴＣ（バリン）である野生型ＪＡＫ２遺伝子からの電気泳動像の出力を示す。図５Ｂは，配列番号１の１９２０位に対応するヌクレオチド位置においてヘテロ接合性を示す個体の血液細胞サンプルからのＪＡＫ２遺伝子の電気泳動像の出力である。ドットはチアミンにともなうピークを示す。図５Ｃは，図５Ｂで用いたものと同じ個体からの血漿サンプルの電気泳動像の出力であり，この個体が１９２０位のチアミン点突然変異についてホモ接合性または半接合性であることを示す。
【図６】図６は，一連の電気泳動像の出力である。図６Ａは，野生型ＪＡＫ２遺伝子からの電気泳動像である。図６Ｂは，コドン６１７における二重点突然変異（灰色矢印）およびコドン６１８における単一の点突然変異（黒矢印）を有する個体からの電気泳動像である。変異したコドン６１７および６１８はそれぞれＴＴＴおよびＣＧＴである。図６Ｃは，変異体の電気泳動像である。それぞれの場合において，ヌクレオチドの番号付けはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００４９７２を参照している。参考までに，２３４３位は配列番号１の１９２０位に対応する。
【図７】図７は，一連の電気泳動像の出力である。図７Ａは，配列番号１の１９２０位に対応するヌクレオチド位置においてＧ＞Ａ点突然変異を有する個体からの電気泳動像である。図７Ｂは，配列番号１の１９２０位に対応するヌクレオチド位置においてＧ＞Ｔ点突然変異を有する個体からの電気泳動像である。図７Ｃは，野生型ＪＡＫ２遺伝子の電気泳動像である。それぞれの場合において，ヌクレオチドの番号付けはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ００４９７２を参照している。参考までに，２３４３位は配列番号１の１９２０位に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
発明の詳細な説明
本発明は，骨髄増殖性疾患と関連づけられているＪＡＫ２遺伝子および蛋白質において，これまでに知られていない変異を発見したことに基づく。より詳細には，ＪＡＫ２遺伝子変異は，Ｇ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔ二重変異，Ｇ１９２０Ａ変異，およびＴ１９２３Ｃ変異を含み，これらはそれぞれ，ＪＡＫ２蛋白質におけるＶ６１７Ｆ，Ｖ６１７Ｉ，およびＣ６１８Ｒのアミノ酸置換をもたらす。
【００４５】
生物学的サンプルの収集および調製
本発明の方法および組成物を用いて，個体から取得した生物学的サンプルを用いて，ＪＡＫ２遺伝子および／またはＪＡＫ２蛋白質中の変異を検出することができる。核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は，当該技術分野においてよく知られる任意の方法にしたがってサンプルから単離することができる。必要な場合には，サンプルは遠心分離等により収集または濃縮することができる。サンプルの細胞は，酵素，熱，界面活性剤，超音波またはこれらの組み合わせによる処理により，溶解することができる。溶解処理は，ポリメラーゼ連鎖反応を用いて検出するのに十分な量の、個体の細胞に由来するＤＮＡを得るために行う。あるいは，ＪＡＫ２遺伝子中の変異は，米国特許出願１１／４０８，２４１（本明細書に参照として組み込まれる）に記載されている方法にしたがって，無細胞体液を用いて検出することができる。
【００４６】
ＤＮＡまたはＲＮＡの単離にはＤＮＡ抽出の種々の方法が適している。好適な方法としては，フェノール・クロロホルム抽出が挙げられる。Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅ１６．５４（１９８９）を参照。多くの市販のキット，例えば，限定されないが，ＱＩＡａｍｐ（商標）ミニブラッドキット，Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｇｅｎｆｉｎｄ（商標），Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ（登録商標），Ｒｏｃｈｅ  ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ（登録商標），またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌｓ（登録商標）を用いるフェノール：クロロホルム抽出，およびＮｕｃｌｉＳｅｎｓ抽出キット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ，Ｍａｒｃｙｌ’Ｅｔｏｉｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて適当なＤＮＡおよびＲＮＡを得ることができる。別の方法においては，ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  ｍＲＮＡ  ＨＳキットおよびＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ装置（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて患者血液／骨髄サンプルからｍＲＮＡを抽出することができる。
【００４７】
核酸の抽出および増幅
組織，細胞，血漿，または血清から抽出した核酸を，当該技術分野でよく知られる核酸増幅手法を用いて増幅することができる。これらの増幅方法の多くは，単にオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを特定の標的配列と特異的に相互作用またはハイブリダイズするよう設計することにより，変異の存在を検出するためにも用いることができる。限定されないが，これらの手法の例として，ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ），リバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ），ネステッドＰＣＲ，リガーゼ連鎖反応（例えば，Ａｂｒａｖａｙａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３：６７５−６８２，（１９９５）を参照），分枝ＤＮＡシグナル増幅（Ｕｒｄｅａ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  ７（ｓｕｐｐ  ｌ２）：Ｓ１１−Ｓ１４，（１９９３）），増幅可能ＲＮＡレポーター，Ｑ−ベータ複製，転写増幅，ブーメランＤＮＡ増幅，鎖置換活性化，サイクリングプローブ法，等温核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：２７３−２８６，（１９９１）を参照），インベーダー技術，または他の配列複製アッセイまたはシグナル増幅アッセイが挙げられる。
【００４８】
ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写
いくつかの方法は，ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写を用いる。認識されるように，逆転写および増幅の方法は，既に報告または推奨されている方法により行うことができ，そのような参考文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。種々の逆転写酵素を用いることができ，例えば，限定されないが，ＭＭＬＶ  ＲＴ，ＭＭＬＶ  ＲＴのＲＮａｓｅＨ変異体，例えばＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．），ＡＭＶ  ＲＴ，およびＴｈｅｒｍｕｓ  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の熱安定性逆転写酵素が挙げられる。例えば，血漿または血清から抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに変換するために用いることができる唯一の方法ではないが１つの方法は，Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ，Ａ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．４：Ｓ８３−Ｓ９１，（１９９４）に記載されるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．；カタログ番号１８０８９−０１１）を適用したプロトコルであり，これを以下のように改変する。
【００４９】
１３μｌのＤＥＰＣ処理水と混合した，血漿または血清から抽出した１−５マイクログラムのＲＮＡを清浄なマイクロ遠心チューブに入れる。次に１マイクロリットルのオリゴ（ｄＴ）（０．５ｍｇ／ｍｌ）またはランダムヘキサマー溶液（５０ｎｇ／μｌ）を加え，穏やかに混合する。次に混合物を７０℃で１０分間加熱した後，氷上で１分間インキュベーションする。次に，これを軽く遠心し，２μｌの１０×合成バッファー（２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４，５００ｍＭ  ＫＣｌ，２５ｍＭ塩化マグネシウム，１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ），１μｌの各１０ｍＭのｄＮＴＰミックス，２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ，１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（２００Ｕ／μｌ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）を加える。穏やかに混合した後，軽く遠心して反応液を集め，室温で１０分間インキュベーションする。チューブを４２℃の水浴またはヒートブロックに移し，５０分間インキュベーションする。次に，チューブを７０℃で１５分間インキュベーションすることにより反応を停止し，氷上に置く。軽く遠心して反応液を集め，１μｌのＲＮａｓｅＨ（２ユニット）を加え，３７℃で２０分間インキュベーションした後，核酸増幅を行う。
【００５０】
核酸増幅
ｃＤＮＡ混合物に以下を加える：８μｌの１０×合成バッファー（２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．４，５００ｍＭ  ＫＣｌ，２５ｍＭ塩化マグネシウム，１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ），６８μｌの滅菌二度蒸留水，１μｌの増幅プライマー１（１０μＭ），１μｌの増幅プライマー２（１０μＭ），１μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（２−５Ｕ／μｌ）。穏やかに混合し，反応混合物にミネラルオイルを重層する。混合物を９４℃で５分間加熱して，残余のＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドを変性させる。次に，自動化熱サイクラーで次のようにＰＣＲ増幅を行う：９４℃で１分間，５５℃で３０−９０秒間，および７２℃で２分間を１５−５０サイクル。サイクルのパラメータおよびマグネシウムの濃度は増幅すべき特定の配列によって様々であろうが，最適化の手順および方法も当該技術分野においてよく知られている。
【００５１】
また，プライマーは，適当な制限部位を含んでいてもよく，増幅産物を制限酵素消化して，変異型と野生型配列とをさらに区別することができる。
【００５２】
代替法
用いることができる核酸増幅の別の方法としては，ＲＴ−ＰＣＲの変法，例えば，定量的ＲＴ−ＰＣＲ（例えば，Ｗａｎｇ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：９７１７−９７２１，（１９８９），またはＫａｒｅｔ，Ｆ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２  ２０：３８４−３９０，（１９９４）により記載される方法を適用）が挙げられる。
【００５３】
用いることのできる核酸増幅または変異検出の別の方法は，リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）である。これはＷｉｅｄｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌ．３：５５１−５６４，（１９９４）に記載されている。リガーゼ連鎖反応においては，血漿または血清から抽出したＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する。ＬＣＲは単一塩基変異を検出する手法である。プライマーを２つのフラグメントとして合成し，２つのプライマーフラグメントの境界位置に変異を有する可能性のあるテンプレートとアニーリングさせる。２つのフラグメントがテンプレート配列と完全にマッチすれば，リガーゼはこれらをライゲーションさせる。プライマーがライゲーションされた場合にのみ，続くＰＣＲ反応により増幅が生ずる。制限部位を利用して変異型配列と野生型配列とを区別することもできる。
【００５４】
増幅または変異検出の別の方法は，アレル特異的ＰＣＲ（ＡＳＰＣＲ）である。ＡＳＰＣＲはテンプレートとプライマーの３’末端塩基との間のマッチまたはミスマッチを利用するものであり，当該技術分野においてよく知られている。例えば，米国特許５，６３９，６１１を参照。
【００５５】
用いることができる増幅または変異検出の別の代替方法は分枝鎖ＤＮＡシグナル増幅であり，例えば，Ｕｒｄｅａ，Ｍ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ、ＡＩＤＳ  ７（ｓｕｐｐ  ｌ２）：Ｓ１１−Ｓ１４，（１９９３）に記載の方法を，下記のように改変して適用することができる。血漿または血清からＲＮＡを抽出し，マイクロウエルに直接加える。次に，目的とする腫瘍関連または腫瘍付随ＲＮＡまたはｃＤＮＡに特異的な標的プローブを用い，血漿または血清標本中の腫瘍関連ＲＮＡの量に比例した化学発光の発光量を用いて，Ｕｒｄｅａ，ｅｔ  ａｌ（上掲）に記載されるようにして，腫瘍関連または腫瘍付随ＲＮＡを検出する方法を実施する。この方法の詳細は，Ｕｒｄｅａ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２４：１９７−２００，（１９９１）（この文献の全体は参照により本明細書に組み込まれる）にさらに記載されている。
【００５６】
用いることができる増幅または変異検出の別の方法は、等温核酸配列塩基増幅（ＮＡＳＢＡ）であり，例えば，Ｋｉｅｖｉｔｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：２７３−２８６，（１９９１））またはＶａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５２：１２１−１３２，（１９９５））に記載される方法を適用することができる。
【００５７】
用いることができる核酸の定性的または定量的増幅の別の方法としては，限定されないが，Ｑベータ複製，他の自己持続配列複製アッセイ，転写系増幅アッセイ，および増幅可能ＲＮＡレポーター，ブーメランＤＮＡ増幅，鎖置換活性化，およびサイクリングプローブ技術が挙げられる。
【００５８】
変異検出の別の方法は核酸配列決定である。配列決定は，当該技術分野において知られる多くの方法，キットまたはシステムのいずれかを用いて行うことができる。１つの例は，色素ターミネーター化学およびＡＢＩ配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いるものである。配列決定はまた，単一ヌクレオチドプライマー伸張（"ＳＮａｐＳｈｏｔ"配列決定法）またはアレルまたは変異特異的ＰＣＲ等の単一塩基決定法を含んでいてもよい。
【００５９】
ＪＡＫ２核酸変異の検出の例示的方法
核酸（例えば全核酸）は，任意の適当な方法を用いて患者の生物学的サンプルから抽出することができる。次に，全核酸調製物またはＲＮＡ調製物のいずれかを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行って，患者ＲＮＡの一部を特異的に増幅する。１工程ＲＴ−ＰＣＲ系の例は，Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。ＲＴ−ＰＣＲ反応用の他の方法およびシステムは当該技術分野においてよく知られており，市販されている。プライマー対は，目的とする領域，例えば，配列番号１のヌクレオチド１９２０−１９２３を包含するよう設計して，ＰＣＲ産物を得る。例として，限定されないが，ＪＡＫ２用のプライマー対は，５’−ＧＡＣＴＡＣＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＴＧＡＡＡ−３’（配列番号５），および５’−ＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＡ−３’（配列番号６）であることができる。得られるＲＴ−ＰＣＲ産物は２７３ヌクレオチドの長さである。次に，ＲＴ−ＰＣＲ産物をゲル精製等により精製し，得られた精製した産物を配列決定する。核酸配列決定法は当該技術分野において知られており，配列決定法の例としては，ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢＩｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）が挙げられる。次に，ＪＡＫ２核酸中の１またはそれ以上の変異の存在または非存在について，配列決定データを分析することができる。また，配列決定データを分析して，サンプル中に存在する野生型体変異型核酸の比率を決定することができる。
【００６０】
変異型ＪＡＫ２蛋白質の検出
変異したＪＡＫ２蛋白質の検出は，例えば，抗体，アプタマー，リガンド／基質，他の蛋白質または蛋白質フラグメント，または他の蛋白質結合試薬を用いて行うことができる。好ましくは，蛋白質検出試薬は，本発明の変異したＪＡＫ２蛋白質に対して特異的であり，したがって，変異した蛋白質と野生型蛋白質または他の変種との間を区別することができる。これは，一般に，例えば，変異型と野生型蛋白質との間で相違する蛋白質の領域に結合する検出試薬を選択または設計することにより行うことができる。
【００６１】
変異したＪＡＫ２蛋白質を検出するための１つの好ましい試薬は，変異の蛋白質に選択的に結合しうる抗体である。野生型と変異型ＪＡＫ２蛋白質とを区別しうる抗体は，当該技術分野において知られる任意の適当な方法により作成することができる。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく，一本鎖であっても二本鎖であってもよく，キメラ抗体またはヒト化抗体であってもよく，または抗原結合フラグメントに対応することが当該技術分野において知られている部分を含むイムノグロブリン分子の一部であってもよい。
【００６２】
ポリクローナル抗体を製造する方法は当該技術分野においてよく知られている。典型的には，抗体は，変位したＪＡＫ２蛋白質を白色ニュージーランドラビットに投与（例えば皮下注射により）することにより作成する。ＪＡＫ２抗原は，典型的には複数の部位に注射し，注射を複数回繰り返して（例えば，およそ２週間に１回）免疫応答を誘導する。望ましくは，ラビットに同時にアジュバントを投与して，抗ＪＡＫ２免疫を増強する。次に，例えば同じＪＡＫ２抗原を用いて抗体を捕捉するアフィニティークロマトグラフィーを用いて，血清サンプルからポリクローナル抗体を精製する。
【００６３】
また，変異したＪＡＫ２蛋白質を検出するためのインビトロ方法としては，例えば，酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ），ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ），ウエスタンブロット，免疫沈殿，免疫蛍光，および蛋白質アレイ／チップ（例えば，抗体またはアプタマーのアレイ）が挙げられる。イムノアッセイおよび関連する蛋白質検出方法のさらなる情報については，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，およびＨａｇｅ，"Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ"，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９  Ｊｕｎ．１５；７１（１２）：２９４Ｒ−３０４Ｒを参照。アミノ酸変異型を検出する別の分析法としては，限定されないが，電気泳動移動度の変化（例えば２次元電気泳動），トリプシンによるペプチド消化の変化，細胞系または無細胞系アッセイにおけるＪＡＫ２キナーゼ活性の変化，リガンドまたは抗体の結合パターンの変化，等電点の変化および直接アミノ酸配列決定が挙げられる。
【００６４】
診断ツール
本発明のＪＡＫ２核酸としては，例えば，配列番号１のＪＡＫ２ヌクレオチド配列の一部と実質的に同一であり，さらに以下の変異：Ｇ１９２０Ａ，Ｇ１９２０Ｔ，Ｇ１９２０Ｔ／Ｃ０９２２Ｔ，およびＴ１９２３Ｃの１またはそれ以上を含む核酸またはその相補体が挙げられる。これらの核酸は，個体が骨髄増殖性疾患を有しているか（または発症しやすいか）を診断するためのツールとして使用することができる。あるいは，ＪＡＫ２変異状態は，単独でまたは他の臨床パラメータと組み合わせて用いて，骨髄増殖性疾患を有すると診断された患者の予後を判定するために用いることができる。好ましい態様においては，ＪＡＫ２核酸は，少なくとも１０，１２，１４，１６，１８，２０，２５，３０，４０，５０，７５，１００，またはそれ以上のヌクレオチドを有する。
【００６５】
別の好ましい態様においては，ＪＡＫ２核酸はさらに検出可能な標識を含み，患者サンプルにおいて変異したＪＡＫ２核酸を検出するためのプローブ（"ＪＡＫ２プローブ"）として用いられる。ＪＡＫ２プローブは当該技術分野において知られる方法により検出可能なように標識することができる。有用な標識としては，例えば，蛍光色素（例えば，Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），ＦＩＴＣ，ローダミン，ランタニド蛍光体，テキサスレッド，ＦＡＭ，ＪＯＥ，Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（登録商標），Ｑｕａｓａｒ  ６７０（登録商標）），放射性同位体（例えば，32Ｐ，35Ｓ，3Ｈ，14Ｃ，125Ｉ，131Ｉ），高電子密度試薬（例えば金），酵素（例えば，西洋ワサビペルオキシダーゼ，ベータ−ガラクトシダーゼ，ルシフェラーゼ，アルカリホスファターゼ），比色標識（例えば金コロイド），磁気標識（例えば，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）），ビオチン，ジゴキシゲニン，またはそれに対する抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよび蛋白質が挙げられる。他の標識としては，それぞれ対応するレセプターまたはオリゴヌクレオチド相補体と複合体を形成しうるリガンドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。標識は，検出すべき核酸中に直接取り込ませてもよく，または検出すべき核酸にハイブリダイズまたは結合するプローブ（例えばオリゴヌクレオチド）または抗体に結合させてもよい。
【００６６】
別の好ましい態様においては，ＪＡＫ２プローブはＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ，分子ビーコン，およびスコーピオン（例えばＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プローブ）である。これらのタイプのプローブは，蛍光消光の原理に基づいており，ドナー蛍光団および消光成分を含む。本明細書において用いる場合，"蛍光団"との用語は，特定の波長（励起周波数）の光を吸収し，続いてより長い波長（放出周波数）の光を放出する分子を表す。本明細書において用いる場合，"ドナー蛍光団"との用語は，消光剤成分と近接している場合に，放出エネルギーを消光剤に供与ないし移動させる蛍光団を意味する。消光剤成分にエネルギーを供与した結果，ドナー蛍光団それ自体は，近接して配置された消光剤成分が存在しない場合よりも少ない特定の放出周波数の光を放出する。
【００６７】
本明細書において用いる場合，"消光剤成分"との用語は，ドナー蛍光団の近傍に位置して，ドナーにより生成された放出エネルギーを取り込み，エネルギーを熱またはドナーの放出波長より長い波長の光として消散させる分子を意味する。後者の場合，消光剤はアクセプター蛍光団であると考えられる。消光成分は，近接（すなわち衝突）消光により，またはフォスターないし蛍光共鳴エネルギー移動（"ＦＲＥＴ"）により作用する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブにおいては一般にＦＲＥＴによる消光が用いられ，分子ビーコンおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）タイプのプローブにおいては近接消光が用いられる。適当な消光剤は，特定の蛍光団の蛍光スペクトルに基づいて選択される。有用な消光剤としては，例えば，Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ（商標）消光剤のＢＨＱ−１，ＢＨＱ−２，およびＢＨＱ−３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．），およびＡＴＴＯシリーズの消光剤（ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ，ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ，およびＡＴＴＯ  ６１２Ｑ；Ａｔｔｏ−ＴｅｃＧｍｂＨ）が挙げられる。
【００６８】
スコーピオンプライマーを用いると，配列特異的プライミングおよびＰＣＲ産物の検出を単一の分子を用いて行うことができる。スコーピオンプライマーは，ハイブリダイズしていない状態ではステム・ループ構造を保持している。蛍光団は，５’末端に結合しており，３’末端に結合している成分により消光されているが，好適な態様ではこの配置は逆でもよい。ステムの３’部分はまた，プライマーの伸張産物に相補的な配列を含む。この配列は，特異的プライマーの５’末端に増幅可能でないモノマーを介して連結されている。プライマー成分の伸張後，特異的プローブ配列は伸張されたアンプリコン中のその相補体に結合することができ，このためヘアピンループが開く。このことにより蛍光の消光が妨害され，シグナルが観察される。特異的標的は，リバースプライマーおよびスコーピオンプライマーのプライマー部分により増幅され，伸張産物が生ずる。スコーピオンプライマーのプローブ要素（例えばＪＡＫ２プローブ）が伸張産物に結合することにより，蛍光団が消光剤から離れ，蛍光シグナルが生成する。
【００６９】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｈｅｉｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ６：９８６−９９４，１９９６）は，Ｔａｑポリメラーゼの蛍光発生性５’エキソヌクレアーゼ活性を使用して，ｃＤＮＡサンプル中の標的配列の量を測定する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは，５’塩基またはその近くにドナー蛍光団を含み，典型的には３’塩基またはその近くに消光成分を含むオリゴヌクレオチドである。消光剤成分は，ＴＡＭＲＡ等の色素であってもよく，例えば４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）等の非蛍光分子であってもよい。Ｔｙａｇｉ，ｅｔ  ａｌ．，１６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４９−５３（１９９８）を参照。照射されると，励起された蛍光ドナーは，蛍光を発生するのではなく，ＦＲＥＴによりエネルギーを近傍の消光成分に移動させる。すなわち，ドナーと消光剤とが近接することにより，ドナー蛍光の放出が妨害されるが，プローブは無傷のままである。
【００７０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは，ＰＣＲ産物の内部領域にアニーリングするよう設計される。ポリメラーゼ（例えばリバーストランスクリプターゼ）がＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが結合したテンプレートを複製すると，その５’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが切断される。このことにより，消光剤（ＦＲＥＴなし）の活性が消失し，ドナー蛍光団は蛍光を放出し始め，これは各サイクルでプローブの切断速度と比例して増加する。ＰＣＲ産物の蓄積は，レポーター色素の増加をモニターすることにより検出する（プライマーは標識されていないことに注意）。消光剤がアクセプター蛍光団である場合には，ＰＣＲ産物の蓄積は，アクセプター蛍光団の蛍光の減少をモニターすることにより検出することができる。
【００７１】
ＪＡＫ２変異を検出するためのキット
本発明はまた，ＪＡＫ２変異を検出するためのキットを提供する。キットは，配列番号１のヌクレオチド１９２０−１９２３を包含する標的ＪＡＫ２核酸配列を増幅することができるプライマー対，および標的中でＪＡＫ２変異を検出する手段を少なくとも含む。好ましくは，キットのプライマー対を用いる増幅により，少なくとも２０，４０，６０，８０，１００，１２５，１５０，２００，３００，５００，またはそれ以上のヌクレオチドを有する反応生成物が得られる。適当なプライマー対としては，例えば，配列番号５および６の配列を有するプライマーが挙げられる。反応生成物においてＪＡＫ２変異を検出するための適当な手段としては，検出可能なように標識されたＪＡＫ２プローブ，例えば本明細書に記載されるものを使用することができる。
【００７２】
診断および予後予測
ＪＡＫ２変異，例えば，Ｖ６１７Ｆ，Ｖ６１７ＩおよびＣ６１８Ｒの単独変異，互いの組み合わせ，または他のＪＡＫ２変異との組み合わせの存在は，疾病の指標となりうる。さらに，これらの変異の接合状態により，疾病の進行およびある患者集団についての患者寿命を予測することができる。患者サンプルにおける変異型対野生型核酸の比率は，疾病の進行および治療効力などの事実をモニターするために用いることができる。
【００７３】
接合状態およびサンプル中の野生型対変異型核酸の比率は，当該技術分野において知られる配列特異的，定量的検出法等の方法を用いて決定することができる。他の方法は，標準的な配列決定電気泳動像，例えばＡＢＩ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）を用いて作成されたものから，配列決定ピークの曲線下の面積を測定することを含む。例えば，電気泳動像の特定のヌクレオチドを示す位置に１つのピーク，例えば"Ｇ"のみが存在すれば，これはサンプル中の核酸がその位置に１つのヌクレオチド"Ｇ"のみを含むことを示す。この場合，このサンプルは１つのアレルのみが検出されるためホモ接合性であると分類される。電気泳動像の同じ位置に２つのピーク，例えば"Ｇ"のピークと"Ｔ"のピークが存在することは，サンプルが２つの核酸種，すなわち，問題とするヌクレオチド位置に"Ｇ"を有する種と，問題とするヌクレオチド位置に"Ｔ"を有する種を含むことを示す。この場合，このサンプルは２以上のアレルが検出されるためヘテロ接合性であると分類される。
【００７４】
２つのピークのサイズを決定し（例えば，それぞれの曲線の下の面積を測定することにより），２つの異なる核酸種の比率を計算することができる。野生型体変異型の核酸の比率を用いて，疾病の進行をモニターし，治療を決定し，または診断を行うことができる。例えば，本発明により同定される変異の１またはそれ以上を有する癌性細胞の数は，骨髄増殖性疾患の経過の間に変化するであろう。疾病の初期にベースラインの比率を定め，後に変異型核酸の野生型核酸に対する高い比率が測定されれば，これは疾病が悪化しているか，または治療が有効ではなく，患者において変異を有する細胞の数が増加していることを示すであろう。野生型対野生型核酸の比率が低ければ，これは治療が奏功しているか，または疾病が進行しておらず，患者において変異を有する細胞の数が減少していることを示すであろう。
【実施例】
【００７５】
実施例１：ＪＡＫ２変異の検出
ＭＰＤ状態が不明の６３４名の個体の全血サンプルを，配列番号３のアミノ酸６１７をコードするコドンの周辺領域におけるＪＡＫ２変異について調べた。また，ＭＰＤが確認された患者からの１３０の血漿サンプルも調べた。
【００７６】
ＮｕｃｌｉＳｅｎｓｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｉｎｃ．，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を用いて、製造元により推奨されるようにして，混合物から総ＲＮＡを抽出した。ＰＣＲプライマー対は，ＪＡＫ２遺伝子のアミノ酸６７１をコードする領域の全体を増幅するよう設計した。ＰＣＲおよび配列決定に用いたプライマー配列は以下のとおりである：ＪＡＫ２−Ｆ（５’−ＧＡＣＴＡＣＧＧＴＣＡＡＣＴＧＣＡＴＧＡＡＡ？３’）配列番号５（配列番号１のヌクレオチド１７７６−１７９７に対応），およびＪＡＫ２−Ｒ（５’−ＣＣＡＴＧＣＣＡＡＣＴＧＴＴＴＡＧＣＡＡ−３’）配列番号６（配列番号１のヌクレオチド２０２９−２０４８に対応）。１工程ＲＴ−ＰＣＲは，２５μｌの反応容量中で，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲシステムをＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）とともに用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲにおいて用いた濃度は次のとおりである：１Ｘ反応バッファー，各４００ｎＭのフォワードおよびリバースＪＡＫ２プライマー，１ユニットのＳｕｐｅｒｓ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩおよび５μＬのＲＮＡテンプレート。熱サイクル条件は次のとおりである：逆転写５５℃，３０分間，次に９４℃で２分間，および９４℃で１５秒間，６０℃で３０秒間，６８℃で１分間を４０サイクル，６８℃で７分間の最終工程。
【００７７】
増幅産物はＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｐｌａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて濾過精製し，次に，ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＫｉｔおよびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用い，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００４９７２のＪＡＫ２配列を参照として用いて，順方向および逆方向の両方で配列決定した。
【００７８】
最も普通に検出されたものは，Ｇ１９２０Ｔ変異から生ずるＪＡＫ２蛋白質のＶ６１７Ｆアミノ酸置換である。図５は，細胞に基づく，および血漿に基づくＪＡＫ２変異分析からの代表的な電気泳動像の出力を示す。図５Ａは，正常な（野生型）個体からの出力を示す。図５Ｂおよび５Ｃは，Ｇ１９２０Ｔ変異を有する個体の血液細胞および血漿サンプルからの出力を示す。図５Ｂは，この個体がＧ１９２０Ｔ変異についてヘテロ接合性であることを示す。ドットはチアミン塩基にともなうピークを示す。しかし，図５Ｃは，同じ個体から得た血漿サンプルであり，この個体が変異についてホモ接合性または半接合性であることを示す。血液細胞サンプルからの誤った結果は，おそらくは，高レベルの正常血液細胞が白血病細胞の核酸を希釈／夾雑した結果であろう。したがって，血漿は，腫瘍特異的核酸が豊富であり，ＭＰＤを検出するためのより信頼性のあるアッセイ基質を提供する。
【００７９】
２つの新規なＪＡＫ２点突然変異が１名の患者から発見された。図６に示されるように，この患者はＶ６１７Ｆアミノ酸置換をもたらす変異型の核酸変異と，Ｃ６１８Ｒアミノ酸置換をもたらす第２の核酸変異との両方を有していた。図６Ａは，正常な（野生型）ＪＡＫ２を有する患者からの電気泳動像の出力を示す。図６Ｂは，アミノ酸６１７をコードするコドンにおける二重点突然変異を示す。特に，野生型ＧＴＣコドン（バリン）は，Ｇ１９２０Ｔ／Ｃ１９２２Ｔの二重点突然変異（灰色矢印）を含み，その結果ＴＴＴコドン（アルギニン）となっている。また，この個体は，ＴＧＴ（システイン）からＣＧＴ（アルギニン）へのコドン変化をもたらすＴ１９２３Ｃ点突然変異（黒矢印）を有することが発見された。
【００８０】
異なる患者において別の新規ＪＡＫ２点突然変異が発見された。図７に示されるように，この患者はＪＡＫ２蛋白質のＶ６１７Ｉアミノ酸置換を生ずるＧ１９２０Ａ点突然変異を有していた。
【００８１】
特に明記しないかぎり，本明細書で用いられるすべての技術および科学用語は，本発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味をもつ。
【００８２】
本明細書に例示的に記載される本発明は，本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（単数または複数），制限（単数または複数）を適宜除いて実施することができる。したがって，例えば"・・・を含む"，"・・・を含有する"，"・・・が含まれる"等の用語は広範に，制限なしに理解すべきである。さらに，本明細書で用いられる用語および表現は，記述のための用語として使用するものであって制限を与えるものではなく，それらの用語および表現の使用に際しては，表示および記述する特徴の同等物またはその一部のいずれをも除外する意図はなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内で種々の改変が可能であることが認識される。
【００８３】
すなわち，好ましい態様および選択可能な特徴によって本発明を具体的に開示してきたが，当業者は，本明細書に開示する本発明の改変，改善，および変更をなすことができ，それらの改変，改善，および変更は本発明の範囲内に含まれるとみなされる。本明細書に記載される物質，方法，および実施例は好ましい態様の代表的なものであり，例証であって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００８４】
本発明について広範かつ一般的に記載した。包括的な開示に含まれる，より狭義の種および亜群もそれぞれ本発明の一部を為す。属（genus）から任意の対象を除去する条件付きまたは消極的制限を有する本発明の一般的な記述は，その除外された要素が具体的に本明細書に記載されているか否かに拘わらず，これに含まれる。
【００８５】
さらに，本発明の特徴または観点がマーカッシュ群で記載されている場合，当業者に認識されるように，本発明はマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群に関しても記載されている。
【００８６】
本明細書に記載する全ての文献，特許出願，特許，および参照は，そのそれぞれが個々に参照により組み込まれたのと同程度に，その全体が参照により明確に本明細書に組み込まれる。不一致が生じる場合，定義を含む本明細書が優先する。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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