(57)【要約】  本発明は、潜在型増殖因子がその上に固定化されたバイオマテリアル、及び潜在型増殖因子をバイオマテリアルに固定化することを含む、前記バイオマテリアルを生産する方法に関する。前記バイオマテリアルは医療において、例えば組織再生又は修復において使用され得る。
2011521692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
潜在型増殖因子がその上に固定化されたバイオマテリアル。
【請求項２】
前記潜在型増殖因子が、潜伏関連ペプチドに結合した増殖因子を含む、請求項１に記載のバイオマテリアル。
【請求項３】
前記増殖因子が、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、ＴＧＦ−β５又はＴＧＦ−βスーパーファミリーの任意の他の成員、例えばアクチビン、インヒビン及び骨形成タンパク質、例えばＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７である、請求項１又は請求項２に記載のバイオマテリアル。
【請求項４】
その上に細胞をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のバイオマテリアル。
【請求項５】
前記潜在型増殖因子を前記バイオマテリアル上に固定化することを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のバイオマテリアルを生産する方法。
【請求項６】
前記潜在型増殖因子上の官能基に結合することができる官能基を提供するように前記バイオマテリアルを修飾する工程；及び
前記潜在型増殖因子がバイオマテリアル上の前記官能基に結合することを可能にする条件下で前記修飾したバイオマテリアルを前記潜在型増殖因子と接触させる工程
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオマテリアルを、前記潜在型増殖因子上の官能基と結合することができるアミン基及び／又はマレイミド基で修飾する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオマテリアルを前記潜在型増殖因子に特異的な抗体で修飾する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
医療における使用のための、請求項１から４のいずれか一項に記載のバイオマテリアル。
【請求項１０】
組織再生又は修復における使用のための、請求項９に記載のバイオマテリアル。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれか一項に記載の前記バイオマテリアルのインビトロでの使用。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれか一項に記載の前記バイオマテリアルを患者に移植することを含む、患者において組織損傷を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、例えば組織工学において使用することができる、バイオマテリアルの分野に関する。特に、本発明は、組織の構築又は修復、例えば骨及び軟骨組織の構築又は修復における使用のための生成物及び方法に関する。本発明は一般に、バイオマテリアルの表面への潜在型増殖因子の固定化、そのようなバイオマテリアルを製造する工程、及びそのようなバイオマテリアルを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先天異常又は疾患及び外傷によって引き起こされる軟骨変性は、組織の内在性治癒能力が限られていることを考慮すると、臨床的に極めて重大である。軟骨は無血管組織であり（血液供給を欠く）、その創傷治癒応答は、特に成人においては、破壊された関節軟骨の自己修復のための能力がほとんど又は全くないことを意味する。従って、軟骨への損傷（例えば軟骨病変）は、局所軟骨細胞による修復への不完全な試みに終わる可能性が高い。関節全置換術が比較的成功を収めているにもかかわらず、軟骨損傷の修復のための治療はしばしば満足のいかないものであり、完全な機能を回復する又は組織がその生来の正常な状態に戻ることはめったにない。軟骨組織の修復を助ける増殖因子の全身投与は、これらの分子の毒性と多面発現効果及び効果のために必要とされる非生理的な高用量の故に選択肢とはならない(Prud'homme & Piccirillo, 2000. J. Autoimmun., 14, 23-42)。関節軟骨損傷に関して、修復を助ける一部の技術は、骨膜（又は軟骨膜）移植による欠損の表面再建又は自家軟骨細胞移植と組み合わせた骨膜弁又はバイオマテリアル弁の使用を含む。どちらのアプローチも主として非常に小さな限局性病変に限られ、再生される軟骨の性質（繊維性対硝子質）は未だに不明である。自家骨軟骨移植術は、荷重がかからない表面（通常は大腿骨において）から骨軟骨柱を採取し、欠損に移植する、もう１つの一般的なアプローチであるが、この技術は罹患率に結びつき、移植された骨軟骨柱の間に繊維軟骨が形成し得る。外傷から生じる大きな軟骨欠損又は変形性関節症から生じる軟骨損傷（大きく、非限局性であり得る）の場合は、現在の治療は適切ではなく、関節全置換術又は部分置換術がしばしば実施される。
【０００３】
この１０年間、新しい組織工学の概念は、その後インビボで移植するための３次元組織構築物をインビトロで作製することによって又はインビボでの直接注射／移植によって、中でも特に軟骨(Ng et al., 2007. Ann Biomed Eng. 35, 11, 1914-23)、骨(Fedorovich et al., Tissue Eng Part A. 2008,14, 1, 127-33; Yefang et al., 2007. Int J Oral Maxillofac Surg. 36, 2, 37-45) 及び多くの他の組織、例えば皮膚(Priya et al., 2008. Tissue Eng Part B Rev., 14, 1, 105-18)、ニューロン、肝臓を含む、機能的組織代替物の生成への期待をもたらしてきた(総説については Lee et al., 2008. Tissue Eng Part B Rev., 14, 1, 61-86参照)。基本的な原理は、適切な細胞供給源と共に接種される生体適合性の構造的及び機械的に適切な足場を使用して、その足場に細胞の分化及び／又は成熟を促進する生物活性分子を担持させることである。天然及び合成のバイオマテリアル足場材料を成熟細胞、前駆細胞又は幹細胞の同種及び自家供給源と共に使用して(Kim & Recum, 2008, Tissue Eng Part B Rev., 14, 1, 133-47)、さらに、例えば骨形成及び軟骨形成を促進する特異的誘導性増殖因子（中でも特に、骨誘導性、軟骨誘導性増殖因子）及びこれらの組合せを使用して、組織を構築することへの数多くのアプローチが為されてきた。
【０００４】
３次元足場は、より高レベルの組織の構造化及びリモデリングのための構造的支持体を提供し、接種された細胞が新しい天然組織を合成する間、一時的な構造体を提供する。サイトカイン及び増殖因子は、他方で、種々の細胞型の増殖、移動、基質産生及び分化を含む細胞挙動の多くの局面の制御において決定的な役割を果たす(Polizzotti et al., 2008. Biomacromolecules. 9, 4, 1084-7; Franzesi et al., 2006. J.Am.Chem.Soc, 128, 47, 15064-5)。種々の増殖因子を含有する培地での足場中の細胞の培養は、数ある組織の中でも軟骨及び骨への細胞の分化を誘導した。しかし、これらの外因性増殖因子は、典型的には培地に直接添加され（すなわち足場から直接には供給されない）、従って、インビトロでの分化工程が必要とされるので、この系内のインビトロでの細胞の分化を直接インビボでの状況に置き換えることはできない。これを克服するため、増殖／分化過程のインサイチューでのある程度の空間的及び時間的制御を達成することを目指して、遊離形態の生物活性分子、例えば増殖因子を、インビボでのそのような物質の送達のために、足場の内部に、主として注射可能なヒドロゲル内に組み込む試みが為されてきた(Levenberg et al., 2003, PNAS, 100, 22, 12741- 12746)。遊離形態の増殖因子は半減期が短いため、短期間（ＴＧＦβ１の場合は２〜３分）後にそれらは無効になる(Coffey et al., 1987. J. Clin Inv., 80, 750-757; Wakefield et al., 1990. J Clin Inv., 86, 1976-84)。
【０００５】
従って、長期間にわたって特定の場所での増殖因子の放出を制御し、それらの薬物動態プロフィールの低さを改善するために、１又はそれ以上の生物活性分子を担体に封入し（主としてＰＬＡとＰＧＡのコポリマーに基づく）、その後それらを足場製剤／試料に組み込む試みが為されてきた(Chen et al., 2007. J. Control Release., 12, 118, 1, 65-77)。その例は、中でも特に、例えば血管新生を促進する(Steffens et al., 2004. Tissue Eng., 10, 1502-1509)、軟骨(Park et al., 2005. Biomaterials, 26, 7095-7103)、骨(Lu et al., 2001. J Bone Joint Surg Am., 83, S82-91) のための増殖因子の一段階、二段階、さらには多段階放出を使用した文献において見出される。しかし、このアプローチは、担体分子（しばしばマイクロ粒子として製剤される）がインビボで分解するので、組み込まれた生物活性分子の時間依存的放出を達成するために困難で厄介な設計と最適化工程を必要とする。封入工程自体も、例えば有機溶媒を含む場合、増殖因子の生物活性を低下させ得る。また、多数の増殖因子の組合せ効果は常に好ましいものであるとは限らず、一部の組合せは、例えば軟骨の生成量にマイナスの影響を及ぼすことにも留意すべきである(Veilleux et al., 2005. Osteoarthritis Cartilage, 13, 278-286)。これらすべてのシグナル伝達分子のインビボでの調節作用を再現することは、これが増殖因子自体の化学的性質だけでなくその形状、投与の用量及び時期にも依存するため、困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、足場からの１又はそれ以上の増殖因子の放出が、細胞周期、増殖又は分化の必要とされる段階に従って並びに細胞型及び供給源に応じて、細胞の相互作用及び細胞特異的要求によって媒介される、より簡単でよりバイオミメティックな方法に関する。このように、細胞自体が多数の細胞挙動のために必要に応じて固定化された潜在型増殖因子を「活性化」することができ、増殖因子はその必要な活性化のときまで保護されたままである。
【０００７】
サイトカイン及び他の細胞増殖因子は、一般に細胞及び組織の増殖と機能を調節することが公知である。それらは細胞メッセンジャーであり、細胞受容体に結合することによって低濃度（ナノモルからフェムトモル）で働き、ホルモン様作用を生じさせる。これらの分子は、数ある事象の中でも特に細胞の増殖、分化及び基質産生の鍵となる調節因子である(Alsberg et al., 2006. Expert Opin Biol Ther. 6, 9, 847-66)。大部分のサイトカイン及び増殖因子は厳密な制御機構の下で発現される。それらの遺伝子発現は環境刺激、例えば感染、細胞間相互作用、細胞外マトリックス組成及び接着分子との相互作用などによって、又は他のサイトカインによる刺激を介して調節される。しかし、一部の場合には、サイトカインの活性調節は、炎症、創傷治癒及び組織修復の過程が起こるときにサイトカイン部分を放出することによって「活性化」される潜在型の分子の分泌を含む(Khalil N, 1999. Microbes and Infection, 1, 1255-1263)。多くの細胞が潜在型の増殖因子を産生し、それらを細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に貯蔵する。活性化はより後の時点で起こり、オートクリン因子としてもとの細胞に又はパラクリン因子として隣接細胞に作用し得る。これに関して、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）ファミリーは、それらが調節できる生物学的プロセスの広範囲さの故に最も注目を集めた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、潜在型増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）を使用して本発明の概念の証拠を明らかにした。この概念は、しかし、他の潜在型増殖因子、例えばＴＧＦβスーパーファミリーの成員又は潜在型融合タンパク質の形態で提供される増殖因子にも適用できる。
【０００９】
最初の態様では、本発明は、潜在型増殖因子がその上に固定化されたバイオマテリアルを提供する。バイオマテリアルは、宿主生物に移植することができるいかなる材料であってもよい。バイオマテリアルは天然に又は合成によって生産され得る。バイオマテリアル（本明細書では足場とも称する）は再生医療応用において中心的役割を果たし、いくつかの基本的必要条件が同定された（分解時間、孔径及び多孔性）。足場は様々な天然及び合成材料から製造されてきたが、２回目の外科手術を回避するために生分解性材料が望ましい。
【００１０】
潜在型増殖因子をその上に固定化することができる任意の公知のバイオマテリアルが本発明において使用できる。例えば、種々の材料が潜在型増殖因子を固定化するために使用でき、例えば、分解性又は非分解性の、合成ポリマー及びコポリマー（例えばポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレン−コ−ビニルアセテート等）、天然ポリマー（例えば多糖類、タンパク質、プロテオグリカン、すべての型のコラーゲン、ヒアルロン酸、デンプン、キトサン、キチン、デキストラン、プルラン及び当分野において公知の他の物質）又はそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、バイオマテリアルは、ポリエステル、例えばＰＬＬＡ、ＰＬＧＡ、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシルアルカノエート及び他のポリエステルを含み得る。バイオマテリアルは、ゲル、ゾル−ゲル、ヒドロゲル、膜、繊維構造体、ナノ又はマイクロファイバー、マイクロ又はナノワイヤ、多孔性スポンジ、織物又は不織メッシュの形態、他の公知の形態、又はそれらの任意の組合せであり得る。バイオマテリアルは種々の手順を用いて、例えばガス発泡／微粒子、凍結乾燥、電気紡糸、熱誘導相分離、注射可能足場などの、しかしこれらに限定されない手順を用いて製造できる。固定化は、身体への移植のために任意のタイプの他の材料、例えばセラミック材料、例えばヒドロキシアパタイト、可溶性ガラス及びセラミックフォーム、金属材料又は複合材料、並びに先に述べた可能性との組合せを含む、それらの組合せに対しても実施できる。
【００１１】
以下で提供する例では、電気紡糸ポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）繊維を、それらの生分解性及び一部の装置における臨床使用に関して米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認を得ていることから、概念の証拠を明らかにするための足場として選択した。加えて、ポリ（乳酸）に基づく足場を使用したインビボ及びインビトロ試験は、主として天然ＥＣＭとナノファイバーの形態的類似性により、軟骨細胞表現型の維持を示した(Mouw et al., 2005. Osteoarthritis Cartilage, 13, 828-836)。従って、バイオマテリアルは、好ましくは電気紡糸ポリＬ−乳酸繊維である。しかし、前述したバイオマテリアルのいずれもが本発明において使用できることに留意すべきである。
【００１２】
潜在型で提供される任意の増殖因子が本発明において使用できる。増殖因子は、細胞の増殖、移動、脱分化、再分化又は分化を刺激することができる任意の分子であり得る。例えば、増殖因子は、ＴＧＦβ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、胎盤増殖因子；分化因子；サイトカイン、例えばインターロイキン（例えば各々α又はβのいずれかの、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０又はＩＬ−２１）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＦＮ−γ誘導因子（ＩＧＩＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ケモカイン（例えばＭＩＰ（マクロファージ炎症性タンパク質）、例えばＭＩＰ１α及びＭＩＰ１β）；ＭＣＰ（単球走化性タンパク質）、例えばＭＣＰ１、２又は３；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時正常Ｔ細胞発現及び分泌調節タンパク質）及び栄養因子であり得るが、これらに限定されない。例えば、増殖因子は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、ＴＧＦ−β５又はＴＧＦ−βスーパーファミリーの任意の他の成員、例えばアクチビン、インヒビン及び骨形成タンパク質、例えばＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７の群から選択され得る。好ましくは、生物活性分子は治療される種に由来し、例えばヒトの治療のためにはヒト起源である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書では、特にＴＧＦβの使用に関して本発明を説明するが、潜在型で提供される任意の増殖因子が使用できる。多くの細胞型がＴＧＦβ因子を発現し、それに応答するので、ＥＣＭ中のＴＧＦβレベルが厳密に制御されることを確実にするための複雑な機構が存在し、それには（遺伝子転写調節に加えて）増殖因子を潜在型分子として貯蔵することが含まれる。大部分の細胞型では、ＴＧＦβは、潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）に共有結合連結された、ＴＧＦβ及びその潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）プロペプチド二量体から成る潜在型で分泌される。ＴＧＦβは、Ｃ末端の成熟ＴＧＦβ及びそのＮ末端プロドメイン、ＬＡＰ（ＴＧＦβ潜伏関連タンパク質）を含む潜在型二量体複合体として細胞から分泌される(Roberts and Sporn, 1996. Springer-Verlag, 419-472; Roth-Eicchorn et al., 1998. Hepatology, 28 1588-1596)。この前駆体構造は、ＴＧＦβ４を除くＴＧＦβスーパーファミリーのすべての公知の成員によって共有されると思われる。プロＴＧＦβの２本のポリペプチド鎖が会合してジスルフィド結合の二量体を形成する。ＴＧＦβは、ＲＲＸＲ配列において分泌の間にフリン様エンドプロテイナーゼによってそのプロペプチドから切断される。ＬＡＰプロペプチド二量体は非共有結合相互作用によってＴＧＦβ二量体と結合したままであるが、成熟ＴＧＦβ二量体及びＬＡＰ二量体はどちらもジスルフィド結合される。ＬＡＰ及びＴＧＦβから成る潜在型ＴＧＦβ複合体は、小型潜在型ＴＧＦβ複合体（Small Latent TGF-β Complex）（ＳＬＣ）と称される。活性ＴＧＦβとそのＬＡＰプロペプチドの間の結合は可逆的であり、ＬＡＰの広範な構造変化を含む。ＬＡＰは、ＴＧＦβを保護することに加えて、他の分子、すなわち細胞膜インテグリンとの相互作用のために必要な重要残基（ＲＧＤ）を含む。大部分の細胞では、ＬＡＰは、付加的なタンパク質である、いくつかのプロテイナーゼ感受性部位を含む潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質（ＬＴＢＰ）に共有結合連結されており、ＥＣＭ構造体からの大型潜在型複合体（ＬＬＣ）を可溶化する手段を提供する。ＬＴＢＰは、複合体の分泌、ＴＧＦβの折りたたみ、ＥＣＭ（主としてエラスチンフィブリル及びフィブロネクチンに富む細胞周囲繊維）への結合のターゲティング及び局所基質タンパク質とＴＧＦβ１の相互作用の防止のために重要である。ＬＡＰは、ＴＧＦβの潜伏の役割を担い、そのために十分であるが、ＬＴＢＰはそうではない(Saharinen et al., 1999. Cytokine Growth Factor Rev. 11, 2691-2704)。
【００１４】
潜在型ＴＧＦβの活性化は、成熟ペプチドとそのシグナル伝達受容体の相互作用を可能にするために、ＬＡＰとＴＧＦβの間の非共有結合相互作用の破壊／解離を含む。いくつかの機構がＴＧＦβの放出を説明するために提案されているが(Saharinen,1999. Cytokine Growth Factor Rev, 10, 99-117)、その過程は複雑で、組織依存性であり、そのためまだ完全には明らかにされていない。すべての機構は、可溶性ＳＬＣ及び／又はＥＣＭ結合ＬＬＣ中のＬＡＰ−β１からのＴＧＦβ１の解離を含む。ＬＴＧＦβは、試験管中で酸、塩基、熱又は尿素のようなカオトロピック試薬によって一過性に活性化され得るが、インビボでは、タンパク質分解切断が、プロテアーゼ感受性ヒンジ領域でＬＴＢＰを切断し、切断された複合体を細胞表面に向ける種々のプロテアーゼ（中でも特に、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、プラスミン、トロンボスポンジン１、白血球エラスターゼ、マスト細胞キマーゼ）を含む、ＴＧＦβ活性化の最も顕著なプロセスであると思われる(Taipale et al., 1992. J Biol Chem., 267,25378-25384）。切断されたＬＬＣ及びＳＬＣは、その後、インビボでの活性化の種々の機構に供され得る：ａ)プロテアーゼによるＬＡＰの分解；ｂ）インテグリン及びトロンボスポンジンとの相互作用によるＬＡＰの立体配座変化の誘導；並びにｃ）ＬＡＰと成熟ＴＧＦβ１の間の非共有結合の破断(Annes et al., 2003. J Cell Sci. 116, 217-224)。ひとたび放出されれば、ＴＧＦβはそれらの特異的細胞表面受容体（Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型の３つの成分）に結合し、下流のエフェクター（例えばＳｍａｄタンパク質）を介してシグナル伝達を誘導することができる。
【００１５】
多くの機構が細胞を刺激して潜在型ＴＧＦβを活性化し得るので、潜在型ＴＧＦβの活性化の機構及び時期は各々の細胞及び組織型に特異的であると思われる。実際に、機能的に類似のタンパク質をコードするが、差次的に調節されるプロモーターによって制御される異なる遺伝子の存在(Roberts et al., 1991. Ciba Found. Symp., 157, 7-28)は、種々のＴＧＦβアイソフォームの組織特異的及び時空間的発現パターンを確実にし、適切な細胞及び組織挙動を生じさせる重要な機構を提供する(Piek et al., 1999. FASEB J., 13, 2105- 2124)。従って、本発明は、適切な潜在型増殖因子又は潜在型増殖因子の組合せを固定化することにより、特定組織における特定細胞型に影響を及ぼすために使用できる。
【００１６】
哺乳動物においては、多数のインビボ機能に関与するＴＧＦβの３つのアイソフォーム、すなわちＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３(Li et al., 2006. Annu Rev. Immunol., 24, 99-146) が存在する(総説についてはKatrien et al., 2005. Endocrine Reviews, 26, 6, 743-774参照)。ほとんどすべての細胞がＴＧＦβに対する受容体を有し、これらのアイソフォームの少なくとも１つを産生する。
【００１７】
ＴＧＦβ１は遍在性であり（血小板及び骨が最大量を含有する）、胚形成、血管新生、脈管形成、炎症（状況に依存して、主として抗炎症作用）、免疫調節（通常は免疫抑制剤）、創傷治癒及び生存中の組織ホメオスタシスの維持などの過程に影響を及ぼす(Gorelik & Flavell, 2002. Nat Rev Immunol. 2, 46-53; ten Dijke & Arthur, 2007. Nat. Rev Mol Cell Biol., 8, 857-869; Roberts AB, 1998. Miner Electrolyte Metab., 24, 111-119)多くの細胞プロセス（移動、増殖、分化、生存、ＥＣＭの産生）に関与する多機能増殖因子である(Moses HL, Serra R., 1996. Curr Opin Genet Dev., 6, 581-586)。骨格組織では、ＴＧＦβ１は発達と維持に主要な役割を果たし、軟骨(Mehlhom et al., 2007. Cell Prolif., 40, 6, 809-23)及び骨(Ripamonti et al., 2006. J Anat., 209, 4, 447-68) の両方の代謝に影響を及ぼす。ＴＧＦβ１は、骨吸収と骨形成の動的プロセスの間の平衡を維持する決定的に重要な役割を有する。骨形成は、骨芽細胞の走化性誘引、骨芽細胞増殖及びＥＣＭタンパク質の産生を伴う分化の早期段階の増強、ＩＩ型コラーゲン発現及び軟骨前駆細胞によるプロテオグリカン合成の刺激、並びに造血前駆細胞増殖の抑制を介して、ＴＧＦβ１によって促進される。成長板軟骨細胞はＴＧＦβ１に対して特に感受性であり、同様の条件下で骨芽細胞様細胞を調節するものよりも１０倍低いレベルに応答する(Dallas et al., 1994. J. Biol. Chem., 269, 6815-6822)。軟骨内分化の後期段階では、ＴＧＦβ１は軟骨細胞の肥大化及び基質石灰化を抑制する(Ballock et al., 1993, Dev Biol., 158, 414-429, 1993)。数ある増殖因子（ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ及びＥＧＦ）の中で、ＴＧＦβは、軟骨形成及び軟骨細胞における軟骨ＥＣＭ合成の増強の最も強力な誘導物質である(Vunjak-Novakovic et al., 2005. Orthod Craniofac Res., 8, 209-218)。以下で例示するように、潜在型ＴＧＦβ１をナノファイバー足場に固定化し、インビトロで概念の証拠を明らかにするためにヒト軟骨細胞を使用した。
【００１８】
さらに、骨及び軟骨に加えて、ＴＧＦβ１は、他の細胞型、例えば肝細胞(Chia et al., 2005. Biotechnol Bioeng., 5, 89, 5, 565-73)、血管内皮細胞(Sales et al., 2006. Circulation,114(1 Suppl):I193-9)、心繊維芽細胞(Caraci et al., 2008. Pharmacol Res., 57, 4, 274-82; Lim et al., 2007. Mol Cells, 31, 24, 3, 431-6)、ヒト視神経からの篩骨篩板細胞(Kirwan et al., 2004. J Glaucoma. 13, 4, 327-34)、網膜上皮細胞(Uchida et al., 2008. Curr Eye Res., 33, 2, 199-203)、腎メサンギウム細胞(Huang et al., 2008. Am J Physiol Renal Physiol., Mar 26 - epub)、外眼筋細胞(Anderson et al., 2008. Invest Ophthalmol Vis Sci., 49, 1, 221-9)、マウス中脳前駆細胞(Roussa et al., 2006. Stem Cells, 24, 9, 2120-9)、腸上皮細胞(Kurokowa et al., 1987. Biochem Biophys Res Commun., 142, 775-782)、気管支上皮細胞(Masui et al., 1986. PNAS, 83, 2483-42) などの調節に直接又は間接的に関与し、細胞挙動の中でも特に分化、異分化、移動、ＥＣＭ産生を制御する若しくは影響を及ぼすか、又は基質分解を回避する。従って、種々の組織へのＴＧＦβの多大で潜在的な作用に基づき、本発明は、種々の組織型におけるいくつかの疾患、例えば骨（骨形成）、軟骨（軟骨形成）、心疾患（例えばＬＴＧＦで修飾された大動脈弁）、眼科疾患（例えばＬＴＧＦで修飾されたナノファイバーシートから調製される移植可能な網膜上皮）又は腎疾患などの、しかしこれらに限定されない疾患を標的とするために使用できる。腎疾患の治療における応用に関して、潜在型ＴＧＦβ１が半月体形成性糸球体腎炎における腎炎症に対して保護すると報告されたことは注目すべきである(Huang et al., 2008. J Am. Soc.Nephrol., 19, 2, 233-42)。
【００１９】
ＴＧＦβアイソフォームは類似の機能を有すると考えられる。いくつかの試験は、細胞機能におけるＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３の潜在的作用を報告する。例えば、ＴＧＦβ２は、小児癌患者における化学療法の最も頻度が高く重篤な副作用の１つ（粘膜炎）を治療するために成功裏に使用され(Koning et al., 2007, Pediatr. Blood Cancer, 48, 5, 532-9)、またインプラント周囲の骨量及び骨−インプラント接触を高めるために整形外科インプラントにおいて局所適用された(Ranieri et al., 2005. Bone, 37, 1, 55-62)。ＴＧＦβ３は、ＣＮＳの炎症性脱髄疾患、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対して保護することが記述されている(Agata et al., 2003. Cytokine, 25, 2, 45-51)。３つのＴＧＦβアイソフォームすべてが多くの組織において検出されるので、本発明は、潜在型ＴＧＦβ１、潜在型ＴＧＦβ２及び潜在型ＴＧＦβ３又はそれらの任意の組合せを固定化するために使用できる。
【００２０】
加えて、潜在型ＴＧＦβ１、潜在型ＴＧＦβ２及び潜在型ＴＧＦβ３は、種々の細胞応答、例えば骨（石灰化への作用）及び軟骨並びに他の組織における３つのアイソフォームの正確な役割を再現することを達成するために、種々の比率及び組合せで固定化することができる。
【００２１】
前述したように、本発明は、他の公知又は未知の潜在型の任意の増殖因子又はサイトカインの固定化に適用することができる。ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３に加えて、ＴＧＦβスーパーファミリーに属する他のサイトカイン、例えばアクチビン及びインヒビン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えばＢＭＰ７(Gregory et al., 2005. J Biol Chem. 29, 280, 30, 27970-80)、増殖分化因子（ＧＤＦ）(Gaoxiang et al., 2005. Mol. Cel. Biol., 25, 14, 5846-5858)は、潜在型で産生される。増殖因子の潜伏性は、潜伏関連タンパク質、例えばＴＧＦβ  ＬＡＰと増殖因子の結合によって提供され得る。増殖因子は、当分野で公知の方法によって潜伏関連タンパク質と結合して提供され得る。従って本発明は、これら又はその組合せに対して適用できる。
【００２２】
従って、本発明は、有効な生物活性足場として使用される１又はそれ以上の潜在型増殖因子を提示するバイオマテリアルを製造するために使用できる。
【００２３】
本発明は、潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）及び特異的タンパク質分解切断部位（例えばＭＭＰによって切断され得る）を含む融合タンパク質と結合した組換え増殖因子として得られる他の選択的生物活性分子に関して、それらの生物活性分子に潜伏性を与えるために使用できる。従って、潜在型増殖因子は、潜伏関連ペプチドと結合した増殖因子を含み得る。
【００２４】
潜在型増殖因子は、ＴＧＦβの例において前述したように、１又はそれ以上の潜伏関連ペプチドと融合した活性型を含有し得る。あるいは、潜伏関連ペプチドは、任意の共有結合又は非共有結合相互作用によって活性型増殖因子と結合し得る。増殖因子の活性が、細胞シグナルによる活性化まで抑制されている形態で提供される任意の増殖因子が本発明において使用できる。
【００２５】
潜在型増殖因子は任意の適切な手段によってバイオマテリアルに固定化することができる。潜在型増殖因子は、例えば、共有結合連結によって又は非共有結合相互作用、例えばイオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子−双極子結合及びタウ−タウ相互作用などによって、バイオマテリアルの表面に直接固定化できる。固定化の特定手段は、使用されるバイオマテリアルの種類に依存する。
【００２６】
あるいは、潜在型増殖因子は１又はそれ以上の中間分子を介してバイオマテリアルに固定化することができる。例えば、潜在型増殖因子に特異的な抗体を本明細書で述べる固定化方法のいずれかによってバイオマテリアル表面に固定化することができ、潜在型増殖因子を抗体に結合することができる。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル又は組換えであり得る。完全抗体に加えて、潜在型増殖因子に結合することができるそのフラグメント又は誘導体も使用できる。従って、中間分子は、潜在型増殖因子に結合することができる抗体フラグメント又は合成構築物であり得る。抗体フラグメント又は合成構築物の例は、Dougall とその共同研究者によって示されている(Dougall et al., Tibtec, 12: 372-379, 1994)。抗体フラグメントは、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメントを含む。Ｆａｂフラグメントは、Roitt et al., Immunology second edition (1989), Churchill Livingstone, Londonにおいて論じられている。Ｆｖフラグメントは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子として公知の合成構築物を生成するように修飾できる。これは、分子の安定性に寄与する、Ｖｈ領域とＶｌ領域を共有結合連結するペプチドリンカーを含む。使用できる他の合成構築物は、相補性決定領域（ＣＤＲ）ペプチドを含む。これらは抗原結合決定基を含む合成ペプチドである。使用できる他の合成構築物は、非ヒト哺乳動物（例えばマウス又はラットなど）からの可変領域とヒト定常領域を含むキメラ分子を包含する。加えて、合成構築物は、抗体が、相補性決定領域以外はヒトであり、相補性決定領域は非ヒト哺乳動物に由来する、ヒト化（又は霊長類化）抗体又はその誘導体を包含する。キメラ／ヒト化抗体を作製する方法は、例えばMorrison et al., in PNAS (81: 6851-6855, 1984) 及びTakeda et al., in Nature (314: 452-454, 1985)によって論じられている。ペプチドミメティックも使用し得る。これらの分子は、通常、ＣＤＲループの構造を模倣し、抗原相互作用性側鎖を含む、立体配座的に制限された有機環である。
【００２７】
潜在型増殖因子に特異的に結合することが公知である市販の抗体又はそのフラグメントを使用し得る。あるいは、当分野で公知の方法によって潜在型増殖因子に対する抗体を産生してもよい。ペプチド／タンパク質に結合するモノクローナル及びポリクローナル抗体を作製するための技術は、現在広く開発されている(Roitt et al, Roitt's Essential Immunology, 2006)。ポリクローナル抗体は、適切な免疫複合体で免疫した後、適切な動物宿主（例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、サル、ウマ、ブタ）におけるそれらの産生を刺激することによって産生し得る。モノクローナル抗体は、適切な免疫複合体による免疫後、脾臓リンパ球を骨髄腫細胞（例えばＰ３−Ｘ６３／Ａｇ  ８．６５３）と融合し、融合した細胞を、潜在型増殖因子を認識する抗体の存在に関してさらにスクリーニングすることによって作製できる(Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256, 52-55)。選択したハイブリドーマをクローニングし、増殖させて、アフィニティークロマトグラフィーによって抗体を精製することができる(Nowinski et al., Virology 1979, 93, 111-126)。
【００２８】
１又はそれ以上の中間分子は、当分野で公知の任意の適切な手段によってバイオマテリアルに固定化し得る。
【００２９】
潜在型増殖因子は、潜在型増殖因子が特定配向で提供されることを確実にするため、潜在型増殖因子分子（又は中間分子）上の特異的部位を介してバイオマテリアルに固定化できる。潜在型増殖因子は、特定配向でバイオマテリアル上に固定化された場合、より有効であり得る。あるいは、潜在型増殖因子は、潜在型増殖因子分子（又は中間分子）上の非特異的部位を介して（すなわちランダムに）バイオマテリアルに固定化できる。バイオマテリアルへの潜在型増殖因子のランダムな固定化を含む方法を使用すると、より多くの量の潜在型増殖因子をバイオマテリアルに固定化し得る。
【００３０】
潜在型ＴＧＦβ又は任意の他の潜在型増殖因子の固定化は、バイオマテリアル／足場上の利用可能な官能基に依存して、標準的な結合化学を使用して（又は当分野で公知の任意の他の手段によって）実施できる。例えば、バイオマテリアルは、その表面にアミン、カルボキシル、ヒドロキシル、ビニル及び他の反応性基を導入するために適切なプラズマ技術（その一例を以下の実施例でより詳細に説明する）を用いて修飾し得る。アミン基の場合は、スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）を使用して、バイオマテリアル表面上のアミン基と、及びまた潜在型増殖因子（例えばＴＧＦβ）上に存在するチオール基と共有結合を形成し得る。従って、潜在型ＴＧＦβは、潜在型ＴＧＦβ上に存在する末端チオール基を介してバイオマテリアルに固定化され得る。末端チオール基は、共有結合又は非共有結合によって直接バイオマテリアルに又はバイオマテリアルに適用された官能基に結合され得る。あるいは、末端チオール基は、中間分子を介して、共有結合又は非共有結合によって間接的にバイオマテリアルに結合され得る。
【００３１】
好ましくは、増殖因子がＴＧＦβである場合、バイオマテリアルはアミン基で修飾され、ＳＬＣ分子上の末端チオール基と特異的に反応し得るマレイミド基でさらに官能基化され得る（図７参照）。このように、ＳＬＣは、ひとたびバイオマテリアル表面に固定化されれば配向されたままであり、活性化前の通常のインビボでのＥＣＭの生理的条件下で提示される立体配座を模倣する。従って、潜在型増殖因子は、特定配向でバイオマテリアル上に固定化された場合、インビボでより有効であり得る。化学的カップリングは、例えばスルホ−ＳＭＣＣを使用することによって実施できる（以下の実施例参照）が、他の同様の試薬も使用できる（例えばスルホ−ＥＭＣＳ（［Ｎ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−［ｇ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル）、及び当分野で公知の他の試薬）。しかし、例えば、ＳＬＣ上の遊離ＳＨ基とさらに交換できる、ＮＨＳ末端及びピリジルジスルフィド末端基を含む分子（例えばスルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、スルホスクシンイミジル６−（３’−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート；スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ（４−スルホスクシンイミジル−６−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルアミド）ヘキサノエート；及び市販されている任意の他の適切なカップリング試薬）を含む、他の化学結合法も使用できる。
【００３２】
あるいは、ＳＬＣは、ＳＬＣのＮ末端に対する特異的抗体でバイオマテリアルを前官能基化することによって固定化できる。
【００３３】
さらに、ＳＬＣは、ＬＴＢＰ１、ＬＴＢＰ２又はＬＴＢＰ３又はそれらの混合物からの潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質から特異的ペプチドを使用して固定化できる。
【００３４】
あるいは、ＳＬＣは、ＳＬＣ末端のチオールだけでなくそれ以外の官能基も使用して、足場全体にわたってランダムに固定化し得る。
【００３５】
あるいは、前述したように、疎水性相互作用その他を含む足場への簡単で強力な物理的吸着も考慮される。
【００３６】
加えて、特定の潜在型増殖因子の固定化は、種々の細胞応答を促進する又は種々の細胞型の活性化／種々の細胞型による活性化を開始させる足場内の特定位置を対象とし得る。
【００３７】
あるいは、種々の潜在型又はその潜在型の種々の表面密度を含む種々の材料を、より良好な細胞応答を達成するために混合し得る。
【００３８】
従って、もう１つの態様では、本発明は、潜在型増殖因子をバイオマテリアルに固定化することを含む、本発明のバイオマテリアルを生産する方法を提供する。その方法は、
−潜在型増殖因子上の官能基に結合することができる官能基を提供するようにバイオマテリアルを修飾する工程；及び
−潜在型増殖因子がバイオマテリアル上の官能基に結合することを可能にする条件下で修飾したバイオマテリアルを潜在型増殖因子と接触させる
工程を含み得る。
【００３９】
官能基は、潜在型増殖因子と特異的結合相互作用を達成することができる任意の化合物であり得る。前記方法は、本明細書で述べる固定化技術のいずれかを含み得る。
【００４０】
潜在型増殖因子がその上に固定化されたバイオマテリアルは、その上に１又はそれ以上の細胞をさらに含み得る。細胞は、バイオマテリアル上に固定化され得るか又は接種され得る。例えば、細胞は水性懸濁液中で調製され得、その後それをバイオマテリアルに添加し得る。従って、細胞はバイオマテリアルへの強い又は弱い結合を形成することができ、バイオマテリアル上の固定位置に保持されてもよく又はバイオマテリアル表面に対して移動することができてもよい。細胞は前駆細胞であり得る。前駆細胞は、胚性幹細胞、胎児性幹細胞、臍帯若しくは胎盤幹細胞、又は成体幹細胞（例えば間葉細胞又は造血細胞など）、又は他の幹細胞であり得る。細胞は、骨髄又は脂肪組織に由来してもよく（しかしこれらに限定されない）、他の一次細胞であってもよい。例えば、細胞は軟骨細胞（例えば鼻又は関節軟骨細胞など）又はヒト骨膜由来細胞であり得る。特定の細胞はバイオマテリアルの意図される用途に依存する。細胞は、バイオマテリアルを移植することが意図される任意の動物種に由来し得る。好ましくは、細胞はヒト細胞である。
【００４１】
また、ＴＧＦβ作用の多くがその他のサイトカイン（例えばＴ細胞の分化のためにはＩＬ−２）の存在によって増強されるので、本発明は、他の固定化形態又は溶液中の遊離形態の増殖因子の同時使用と組み合わせることができる。
【００４２】
ＴＧＦβスーパーファミリーの役割を共調節する任意の他の分子、例えばホルモン類（デキサメタゾン）、ビタミン類（ビタミンＤ）及び当分野で公知の他の分子も使用できる。
【００４３】
加えて、バイオマテリアル又は足場は、例えば特異的骨誘導性、軟骨誘導性、血管新生ペプチド、しかしこれらに限定されないペプチドで修飾された材料（例えば種々の繊維）と、単一又は複数の増殖因子修飾材料との混合物を含み得る。
【００４４】
固定化潜在型増殖因子の活性化は、特異的活性化阻害剤、例えばペプチドの添加によって共調節され得る。
【００４５】
従って、本発明は、潜在型増殖因子（小型潜在型ＴＧＦβ１内に貯蔵されるＴＧＦβ１に例示される）を利用する細胞挙動に影響を及ぼし、それを指令する新しい方法を述べる。その手順は、直ちに使用できるが、まだその不活性型である生物活性分子のプールとして、バイオマテリアル（例えばナノファイバー）の表面に潜在型増殖因子を固定化／蓄積することを含む。関連ペプチド又はＬＡＰは、ＴＧＦβ１アイソフォームの成熟ペプチドに潜伏性を付与し、受容体と相互作用するエピトープを保護して、すぐ下流のシグナル伝達を妨げる。加えて、ＬＡＰは、ＴＧＦβ１を分解及び不活性化から保護する安定剤として働き、他の分子との相互作用のための重要な残基を有する。潜在型ＴＧＦβ１が足場の表面に提示される場合、細胞はそれと相互作用して、細胞の要求に応じて潜在型ＴＧＦβ１のレザバーの活性化を媒介し、局所的に活性型増殖因子を完全に又は部分的に（一定のパーセンテージは足場に残存する）放出することができる。可溶性増殖因子（ＧＦ）の生物活性は、その後、細胞内シグナル伝達カスケードを開始させる、細胞受容体相互作用のために利用可能である。本発明は、他の制御された増殖因子送達の試みに比べてインビボでの状況のより綿密な近似を提供する。骨において、細胞は大量のＳＬＣ（実際上これは骨における増殖因子の主要形態である）を効率的に分泌する(Bonewald et al., 1999. Mol. Endocrinol., 5, 741-751)。その環境における他の増殖因子の存在、細胞の分化段階及び環境それ自体が、利用可能な潜在型を活性化するか否かを決定する。このように、細胞自体が適切な時期及び濃度での増殖因子の活性化及び放出を調節し、細胞活性への増殖因子の厳密な成果を決定する。前述したように、本発明は、他の潜在型増殖因子並びに潜在型融合タンパク質を包含する。
【００４６】
さらなる態様では、本発明は、インビトロでの本発明のバイオマテリアルの使用を提供する。本発明のインビトロ法は、バイオマテリアルを患者に移植する前に初期細胞分化及び／又は増殖を進展させるために使用できる。加えて、本発明は、インビトロでの細胞培養及び分化のための（例えば骨又は軟骨の増殖及び／又は分化のための）細胞支持体としての生物活性材料を生成するために使用できる。さらに、本発明は、例えば栄養供給及び／又は機械的刺激のいずれかによって細胞構築物の増殖を高めるためにバイオリアクターシステム（例えばハイドロダイナミックバイオリアクター）と組み合わせて使用できる。
【００４７】
本発明はまた、バイオマテリアルに固定化された潜在型増殖因子（例えばＴＧＦβ）を使用して機械的シグナル伝達経路を検討するために使用できる。
【００４８】
もう１つの態様では、本発明は、医療における本発明のバイオマテリアルの使用を提供する。例えば、本発明は、組織再生又は修復における本発明のバイオマテリアルの使用を提供する。例えば、潜在型のＴＧＦβがその上に固定化されたバイオマテリアルは、骨及び／又は軟骨の修復又は再生において使用できる。
【００４９】
もう１つの態様では、本発明は、本発明のバイオマテリアルを患者に移植することを含む、患者において組織損傷を治療する方法を提供する。
【００５０】
本発明のバイオマテリアルは、動物、例えば哺乳動物、好ましくはヒトの治療において使用できる。本発明のバイオマテリアルを使用して治療できる他の動物は、家畜、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、モルモット等及び家畜、例えばヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ等を含む。
【００５１】
本発明のバイオマテリアルは、疾患又は傷害によって損傷された組織を修復する（すなわち再生及び増殖を誘導する）ために使用できる。
【００５２】
増殖因子がＴＧＦβである場合、本発明のバイオマテリアルは、いくつかの組織型におけるいくつかの疾患、例えば骨（骨形成）、軟骨（軟骨形成）、心疾患（例えばＬＴＧＦで修飾された大動脈弁）、眼科疾患（例えばＬＴＧＦで修飾されたナノファイバーシートから調製される移植可能な網膜上皮）又は腎疾患などの、しかしこれらに限定されない疾患の治療において使用できる。
【００５３】
免疫系からの細胞（例えばマクロファージ）は、生物活性ＴＧＦβをその潜在型から解き放つことができるので、本発明は、状況に応じて、というのは、ＴＧＦβは一部の自己免疫疾患では過少産生され得るが、特に肺繊維症、クローン病のような多くの病的状態において過剰産生されるため、ある種の特定条件下で強力な抗炎症作用を及ぼすために使用できる。
【００５４】
もう１つの重要な応用領域は創傷の治癒修復においてであり、というのは、ＴＧＦβは他の増殖因子と協力してこの過程を刺激するからである(Hyytiainen et al., 2004, Crit Rev Clin Lab. Sci., 4, 233-264)。従って、ＴＧＦβ１が虚血障害から心筋細胞を保護し得るという最近の証拠も存在するので、本発明は、虚血障害後の心臓リモデリングにおいて有用である(Bujak & Frangogiannis, 2007. Cardiovasc. Res., 74, 184-195)。
【００５５】
本発明の各々の態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えてその他の態様の各々にも該当する。本明細書で言及する先行技術文献は、法律が許す限りの最大範囲で本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
本発明の特定実施形態を、付属の図面を参照してここで論じる：
【図１】電気紡糸によって生産されたＰＬＬＡ繊維の形態を示す代表的ＳＥＭ写真。
【図２Ａ】種々の露光量（Ｗ）と露光時間（分）を使用した、未処理及びアンモニアプラズマで処理したＰＬＬＡ繊維のＸ線光電子スペクトル
【図２Ｂ】足場の表面のＮ  １ｓの原子パーセントの算定量
【図２Ｃ】足場の表面のＮＨ２基の算定量（ｎｍｏｌ／ｍｇ  ＰＬＬＡ）
【図３】未処理ＰＬＬＡ及びプラズマ処理したＰＬＬＡのＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光法。
【図４】生／死アッセイに基づくヒト関節軟骨細胞の細胞生存率。ｐＬＴＧＦ＝プラズマ処理したＰＬＬＡ（ｐｔＰＬＬＡ）にランダムに結合されたＬＴＧＦ；ｓＬＴＧＦ＝スルホ−ＳＭＣＣで修飾されたｐｔＰＬＬＡに配向固定化されたＬＴＧＦ。
【図５】ＭＴＳアッセイを使用した足場上のヒト関節軟骨細胞の細胞生存率／増殖の評価。結果は、２つの実験からの三重の培養の平均±ＳＤを示す。ｐＬＴＧＦ＝プラズマ処理したＰＬＬＡ（ｐｔＰＬＬＡ）にランダムに結合されたＬＴＧＦ；ｓＬＴＧＦ＝スルホ−ＳＭＣＣで修飾されたｐｔＰＬＬＡに配向固定化されたＬＴＧＦ。
【図６】７日間培養した後の、スルホ−ＳＭＣＣ及びＬＴＧＦ（ｓＬＴＧＦ）で修飾されたプラズマ処理ＰＬＬＡ上のヒト関節軟骨細胞のＳＥＭ写真。
【図７】潜在型増殖因子が共有結合連結された修飾ＰＬＬＡ繊維の生産のための可能な方法を示す。ＰＬＬＡ電気紡糸繊維をＮＨ３プラズマ処理に供し、ヘテロ二官能性スルホ−ＳＭＣＣを使用してさらに官能基化した。潜在型増殖因子複合体を、そのチオール基を介してさらに共有結合固定化した。
【図８】様々な種類の足場で１４日間培養した一次ヒト鼻軟骨細胞のｍＲＮＡ発現プロフィールを示すリアルタイムＲＴ−ＰＣＲデータ。選択した軟骨形成（Ｓｏｘ９）及び脱分化（Ｃｏｌ１Ａ１）マーカーの発現レベルを１８Ｓハウスキーピング遺伝子及び０日目の発現レベルに対して基準化した。反復した実験（ｎ＝３）の平均変化±標準偏差を示す。ＴＧＦ群のＣｏｌ１Ａ１及びｐＬＴＧＦ群のＳｏｘ９は、それぞれの遺伝子の群の残りと比較して有意に高かった（＊ｐ＜０．０５）。（Ｖｉｒｇｉｎ＝未処理電気紡糸足場；Ｐｌａｓｍａ＝プラズマ処理した電気紡糸足場；ＴＧＦ＝７日間まで１０ｎｇ／ｍＬの活性ヒト組換えＴＧＦβ１を培地に添加したプラズマ処理電気紡糸足場；ｐＬＴＧＦ＝プラズマ処理したＰＬＬＡ（ｐｔＰＬＬＡ）にランダムに結合されたＬＴＧＦ；ｓＬＴＧＦ＝スルホ−ＳＭＣＣで修飾されたｐｔＰＬＬＡに配向固定化されたＬＴＧＦ）
【図９】ＴＧＦβ１ナノグラム当たりのヒト鼻軟骨形成分化の誘導における効果。それぞれの群の相対的遺伝子発現の結果を、実験の経過中に存在した又は添加したＴＧＦβ１の量で除した。平均及び標準偏差を示す。
【実施例】
【００５７】
組換え潜在型ＴＧＦβ１によるポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）繊維の調製及び修飾並びに接種したヒト軟骨細胞活性の評価。
【００５８】
実験材料及び方法
ＰＬＬＡ繊維を、自社製電気紡糸システムを使用して〜４ｍｍ厚さの１０×１５ｃｍシートとして調製した（図１）。不織足場を、適用電圧１０ｋＶ及び送達速度１ｍＬ／分でジクロロメタン／ジメチルホルムアミド（７０：３０、ｗ：ｗ）中の３重量％ＰＬＬＡ（分子量〜３００ＫＤａ、Ｐｕｒａｃ）から紡糸した。回転アルミニウムマンドレル上で繊維を収集した。
【００５９】
プラズマ処理
容易に修飾される反応性官能基がＰＬＬＡの骨格に存在しないので、一般的な化学的方法によって表面を修飾することは困難である。プラズマ技術の利用は、ＰＬＬＡを含む材料の表面に所望化学基を導入するために広く使用されてきた(Flavia & D'Agostino, Surf Coat Technol., 98, 1102-06, 1998)。従って、ＰＬＬＡ電気紡糸繊維上にアミン官能基を導入するため、ＰＬＬＡの試料を従来のＮＨ３プラズマ処理を用いて修飾した(Yang et al., J Biom. Mater Res., 67A, 1139-47, 2003)。試料は、あらかじめ１×１ｃｍ四方に切断し、滅菌ガラスペトリ皿に均一に分配した。試料をＵＶで３０分間滅菌し、さらにエタノールに１時間浸漬した。ひとたび乾燥すれば、試料をプラズマチャンバーに入れ、〜１０Ｐａまで減圧した後、ＮＨ３ガスを満たした。チャンバーの圧が安定化した後、１３．５６ＭＨｚの無線周波数であらかじめ定められた時間（２．５分、５分及び１０分間；試料の各々の側でこの半分の時間）電力を制御することによってグロー放電プラズマを生成した。プラズマ処理した試料をさらに１０分間アンモニアガスにさらに暴露した後、試料を取り出した（Yang et al., 2002. Biomaterials, 2607-2614に従って)。プラズマ処理した試料を直ちに滅菌ペトリ皿内に納め、さらなる修飾のために細胞培養キャビネットに置いた。
【００６０】
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）分析
細胞の結合と形態を観測するためにＳＥＭ分析を使用した。種々の時点で細胞を含む足場をカコジル酸緩衝液、ｐＨ７．４中２．５％グルタルアルデヒドで４℃にて２時間固定し、一連の漸増濃度のエタノールを介して脱水して、最後に１００％ヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）に液浸することによって乾燥した。乾燥後、試料をアルミニウムスタブに取り付け、クロムでスパッタ被覆して、５ＫＶの加速電圧を使用して走査型電子顕微鏡（ＦＥＧＳＥＭ，Ｌｅｏ  １５２５）で観察した。
【００６１】
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）及びニンヒドリンアッセイを使用した表面化学分析
ＮＨ３プラズマ処理による表面修飾の成功を分析するため、減圧下に（＜３×１０−９トール）１０ｍＡ放出及び１０ＫＶ陽極電位（１００Ｗ）で操作した、Ｋｒａｔｏｓ−Ａｘｉｓ  ＵＬＴＲＡ  ＤＬＤ  ＸＰＳ装置でのＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）によって修飾の前後に試料を分析した。ピーク面積から原子パーセント（％）値を決定するためにＫｒａｔｏｓ感度因子を用いたＣＡＳＡＸＰＳソフトウエアを使用してデータを解析した。適切な対照を使用して化学結合状態を分析するために高分解能スペクトルＣ１ｓをデコンボリューションし、曲線適合させた。
【００６２】
アンモニアプラズマで表面修飾したＰＬＬＡ足場上のアミン基の量を定量的に検出するため、ニンヒドリンアッセイを使用した。アッセイは先に記述されているように実施した(Zhu et al., 2002, Biomacromolecules, 11, 3, 1312-1319; Zhu et al., 2004, Tissue Eng., 1, 10, 53-61)。
【００６３】
ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分析
未処理及びＮＨ３プラズマ処理したＰＬＬＡのＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ２０００ＦＴＩＲを用いて６５０〜４０００ｃｍ−１の領域内で、４ｃｍ−１の分解能及び試料当たり１６回のスキャンによって得た。
【００６４】
組換え潜在型ＴＧＦβ１の固定化
ＰＬＬＡ足場へのＬＴＧＦβ１の固体化の概略図を図７に示す。ＬＡＰのＮ末端上のその２個の遊離チオールを介したＳＬＣの配向共有結合固定化のために、プラズマ処理したＰＬＬＡ繊維上のアミン基をスルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）で修飾した。このヘテロ二官能性架橋剤は水溶性であり、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳエステル）及びスルフヒドリル反応性マレイミド基を含有する。ＮＨＳエステルは、ｐＨ７でＰＬＬＡ繊維上の第一級アミンと反応して安定なアミド結合を形成し、一方マレイミド基は、ｐＨ６．５〜７．５でＳＬＣの遊離スルフヒドリル基と反応して安定なチオエーテル結合を形成する。スルホ−ＳＭＣＣ及びＳＭＣＣのマレイミド基は、スペーサーアーム内のシクロヘキサン架橋によりｐＨ７．５まで著しく安定である。親水性スルホニル部分を含むため、スルホ−ＳＭＣＣは水溶性であり、従ってＰＬＬＡの繊維構造を乱し得る有機溶媒の使用を回避する。アンモニアプラズマ処理したばかりのＰＬＬＡ試料を滅菌ＰＢＳ中に３０分間浸漬し、その後ＰＢＳ中３ｍｇ／ｍｌのスルホ−ＳＭＣＣ新鮮調製溶液に浸漬して、無菌細胞培養安全キャビネット内で撹拌下に（軌道振とう器）２時間反応させた。上清を廃棄し、足場を滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。官能基化した足場を、次に、滅菌ＰＢＳ中の組換え潜在型ＴＧＦβ１の溶液（０．７５μｇ／ｍＬ）（新鮮調製）に２時間浸漬した。上清を除去し、足場を滅菌ＰＢＳで３回洗浄して、細胞接種のために個別に細胞培養プレートに入れた。ＰＬＬＡへの組換え潜在型ＴＧＦβ１のランダムな固定化のために、新鮮調製したＮＨ３プラズマ処理ＰＬＬＡ試料を直ちにＰＢＳ中０．７５μｇ／ｍＬ ＳＬＣ（新鮮調製）中に２時間浸漬した。上清を除去し、足場を滅菌ＰＢＳで３回洗浄して、細胞接種のために個別に細胞培養プレートに入れた。
【００６５】
免疫測定法を使用した足場上の潜在型ＴＧＦβ１の定量
固定化ＬＴＧＦβ１の測定を、先に記述されている修正手順を用いて実施した(Pedrozo et al., 1998, J Cell Physiol., 177, 343-354)。修飾した足場と適切な対照を、最初にＤＭＥＭ中０．３Ｕ／ｍＬのプラスミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）で３７℃にて３時間消化し、足場からＬＴＧＦβ１を放出させた。アプロチニン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）を５μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加して反応を停止させた。上清を収集し、室温で１０分間、上清１００μＬごとに１Ｍ ＨＣｌ ２０μＬで上清を酸性化することにより、免疫反応性ＴＧＦβ１をＬＴＧＦβ１複合体から遊離させた。酸性化した上清を１．２Ｎ ＮａＯＨ／０．５Ｍ ＨＥＰＥＳでｐＨ〜７．３に中和し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＴＧＦβ１  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）を製造者のプロトコールに従って使用して、直ちにＴＧＦβ１の定量のために使用した。
【００６６】
細胞培養及び接種
この実施例では、４５歳の健常患者（全面的な倫理的同意を得た）からのヒト鼻中隔軟骨より単離した軟骨細胞及びＬｏｎｚａ（Ｌｏｎｚａ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）より入手した成人ヒト関節軟骨細胞を使用した。細胞を、組織培養プラスチック（ＴＣＰ）フラスコにおいて軟骨細胞増殖基本培地（ｂＣＧＭ）中で培養増殖させ、前記基本培地は、先の報告に従って１０％（ｖ：ｖ） ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸−２−リン酸塩を添加したフェノールレッド不含ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ４１９６６）であった。すべての細胞培養物を９５％空気及び５％ＣＯ２のインキュベータ中で３７℃に維持した。培養物に、３日ごとに３７℃で新鮮培地を補充した。
【００６７】
足場接種のために、培養細胞をトリプシン処理し、採集して、計数し、少量のｂＣＧＭに再懸濁した後、あらかじめＤＭＥＭ中で３７℃にて３０分間馴化させた足場に均一に滴下接種した。構築物を細胞インキュベータにおいて３７℃で４時間インキュベートし、細胞を足場内に拡散させて、足場に結合させた後、新鮮無血清培地を添加した（以下参照）。足場を９０００細胞／ｃｍ２で１．５×１．５ｃｍ２の足場に接種した。遺伝子発現試験に関しては、試料を３．５×１０４細胞／ｃｍ２で４×４ｃｍ２の足場に接種した。５×１０５細胞を含むペレットを瞬間凍結し、遺伝子発現分析のために０日目標本として使用した。
【００６８】
細胞培養した軟骨細胞への足場固定化ＬＴＧＦβ１の作用を評価するため、実験全体を通して無血清で化学的組成の明らかな分化培地を使用した。無血清培地は、ＩＴＳ＋プレミックス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（６．２５μｇ／ｍｌインスリン、６．２５μｇ／ｍｌトランスフェリン、６．２５μｇ／ｍｌセレン、１．２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、５．３３μｇ／ｍｌリノール酸；Ｓｉｇｍａ）及び１００ｎＭデキサメタゾンを添加した、ＦＢＳを含まないｂＣＧＭからなるものであった(Li et al., 2005. Biomaterials, 26, 599-609)。培地を３日ごとに交換した。
【００６９】
細胞生存率
足場中で培養した軟骨細胞の生存率を生／死アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）によって検査した。簡単に述べると、軟骨細胞を接種した足場をＰＢＳで洗浄し、遮光して、ＰＢＳ中の２μＭカルセインＡＭ（生細胞を染色する）及び４μＭ ＥｔｈＤ−１（死細胞を染色する）中、室温で３０〜４５分間インキュベートした。次に、各々の試料をＰＢＳで洗浄した後、デジタルカメラと画像解析のための適切なソフトウエアを備えた倒立型蛍光顕微鏡を用いて評価した。細胞分布を評価するため、種々の領域において及び両面で画像を撮影した。生細胞（緑色）及び死細胞（赤色）の数を計数し、細胞生存率を総細胞数（緑色＋赤色）当たりの生細胞（緑色）の数として表した。
【００７０】
細胞増殖
足場上の細胞増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者の使用説明に従って使用して細胞代謝活性を測定することによって評価した。簡単に述べると、細胞を接種した足場を新しいウエルプレートに移し、滅菌ＰＢＳで静かに洗浄した。次に試料をフェノール不含培地４００μＬプラスＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６試薬８０μＬと共にインキュベートし、加湿した５％ＣＯ２環境において３７℃で４時間反応させた。マイクロプレートリーダー（Ａｎｔｈｏｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて４９０ｎｍで上清の光学密度を測定した。同じ条件下にて細胞不在で培養した試料をブランクとして使用した。結果は、各々三重に実施した２つの個別実験の平均値を示す。
【００７１】
リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＬＴ緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ，ＵＫ）１ｍＬ中のβ−メルカプトエタノール１０μＬを添加することによって軟骨細胞から全ＲＮＡを抽出した。製造者のプロトコールに従って、ＲＮｅａｓｙミニキットを使用して全ＲＮＡを単離し、ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼ１で処理して（どちらもＱＩＡＧＥＮ）、ＮＤ−１０００  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）、ＵＳＡ）を用いて定量した。全ＲＮＡ  １μｇをｃＤＮＡに逆転写し、Ｔａｑｍａｎ（商標）ユニバーサルマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）１０μＬ、０．１％（ｖ／ｖ）ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｃｎ  Ｌｔｄ，ＵＫ）７μＬ、抽出したｃＤＮＡ  ２μＬ及びＴａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）１μＬを含むマスターミックスを各々の反応のために調製した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙキットを使用して、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌ１Ａ１−Ｉ、ＮＭ＿００００８８）、Ｓｏｘ９（ＮＭ＿０００３４６）及びＩＩ型コラーゲン（ＮＭ＿００１８４４．４）を含む軟骨関連遺伝子を増幅した。各々の試料を重複する3つの系で分析した。ＰＣＲ反応を５０℃、２分間及び９５℃、１０分間の工程によって開始させ、遺伝子発現の相対的定量を検出するのに使用したＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）のために熱サイクリング条件を最適化した。これに続いて、ＰＣＲ増幅を、Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）において９５℃、１５秒間及び６０℃、１分間で４０サイクル実施した。標的シグナルをサイクル数に対してプロットし、閾値レベルを０．０５に設定した。すべてのデータの比較は、試料の反応がこの増幅期と交差する切片で実施した。比較ＣＴ法(Wang et al., 2006, J.Assoc.Lab.Aut., 11, 314-318)を用いて本発明者らの結果を関連付けた。０日目の細胞に対する遺伝子発現の倍数変化を平均±標準偏差変化として提示した。各標的遺伝子についての相対的発現レベルをハウスキーピング遺伝子１８Ｓ（Ｘ０３２０５）についてのＣｔ値によって基準化した。
【００７２】
統計解析
ＳＰＳＳ  １２．０ソフトウエアパッケージ（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）を用いて結果の平均及び標準偏差を計算した。様々な足場間の統計的有意性を決定するために２つの独立した試料についてマン−ホイットニーＵ検定を実施した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【００７３】
結果及び考察
図１は本発明で使用した典型的な繊維足場を示す。電気紡糸繊維は、軟骨細胞外マトリックスからのナノサイズ規模の繊維に類似する。繊維の直径分布は極めて限られており、試料の画像当たり４０繊維の測定（重複する3つの系で）から計算した場合の繊維の平均直径は２４２ｎｍである。
【００７４】
種々のＮＨ３ガス暴露時間でのプラズマ処理ＰＬＬＡ電気紡糸試料の表面原子組成（炭素、酸素、窒素）を図２Ａに示す。スペクトルは、Ｃ  １ｓ（２８５ｅＶ）、Ｏ  １ｓ（５３２ｅＶ）及びＮ  １ｓ（４００ｅＶ）に対応する３つの主要シグナルを示す。種々の試料のＸＰＳスペクトルの相対面積から計算した補正化学組成は、表面上の窒素種の量が、１００Ｗの電力供給及び１０分間の暴露に相当する５．２原子％まで増加することを示す（図２Ｂ）。３９９．７ｅＶのピークは−Ｎ−Ｈ−に割り当てられた(Yang et al., 2002. Biomaterials, 2607-2614)。加えて、アミン基の存在を評価するために未処理ＰＬＬＡ及びＮＨ３プラズマ処理ＰＬＬＡをＡＴＲ−ＦＩＴＲによって分析した（図３）。両方の試料において１７５４ｃｍ−１（ｖＣ＝Ｏ）、１４５０ｃｍ−１（δａｓＣ−Ｈ）及び１０８５ｃｍ−１（ｖｓＣ−Ｏ−Ｃ）の典型的なＰＬＬＡピークの存在が、他の著者の所見(Paragkumar et al., 2006. Appl. Surf. Sci., 253, 2758- 2764; Kister et al., 1999. Polymer, 39, 2, 267-273)と一致して認められた。プラズマ処理ＰＬＬＡのスペクトルはまた、３４００〜３２００ｃｍ−１領域に微弱で幅広のバンド及び１６５０〜１５５０ｃｍ−１領域に弱いショルダーを示し、これらはＮ−Ｈ伸縮振動及びＮ−Ｈ変角振動の存在を指示する。ニンヒドリンアッセイを用いた化学的定量は、アンモニアプラズマ処理ＰＬＬＡ表面上の第一級アミン基の密度は暴露時間が長いほど及び電力が高いほど上昇することを示した（図２Ｃ）。表面修飾足場上のアミン基の密度を標準曲線から推定し、最高密度は１００Ｗで１０分間のプラズマ処理に対応した（６６．４２ｎｍｏｌ／ｍｇＰＬＬＡ）。
【００７５】
ＸＰＳ分析によって示されたプラズマ処理ＰＬＬＡの表面上の窒素種の存在は、ＡＴＲ−ＦＴＩＲ及びニンヒドリンからの結果と合わせて、プラズマ処理ＰＬＬＡの表面へのアミン基の組込みを明らかにした。これらのアミン基はその後の結合工程のために利用可能であった。
【００７６】
ＴＧＦβ１免疫測定法の結果は、ＬＴＧＦβ１複合体が、ランダムアプローチ又は配向アプローチのいずれかを用いて、量は異なるが、電気紡糸足場表面に成功裏に固定化されたことを示した。平均で１９５．４±３４ｐｇ／ｃｍ２のＴＧＦβ１がｐｔ−ＬＴＧＦ足場から活性化され、１４．１±１．７ｐｇ／ｃｍ２がｓＬＴＧＦ群から回収された。残りの群ではＴＧＦβ１は検出されなかった。
【００７７】
図４は、細胞接種した足場の１、７及び１４日間の培養後の生／死アッセイからの結果を示す。足場上の細胞の良好な保持は臨床応用／移植のために決定的な重要な問題である。１４日後、プラズマ処理ＰＬＬＡ（ｐｔＰＬＬＡ）上のヒト関節軟骨細胞の細胞生存率は１００％から約６５％に低下するが、組換えＬＴＧＦで修飾した足場では細胞生存率は９０％以上に維持された。
【００７８】
代謝活性の検出に基づき、種々の修飾足場での細胞増殖を比較するためにＭＴＳアッセイを使用した。図５は、接種した足場の１、７及び１４日間の培養後のＭＴＳ増殖アッセイからの結果を示す。代謝活性は、プラズマ処理ｐｔＰＬＬＡ（ｐ＜０．０１２）上よりも、ｐＬＴＧＦ（プラズマ処理ＰＬＬＡにランダムに結合されたＬＴＧＦ）及びｓＬＴＧＦ（スルホ−ＳＭＣＣで修飾されたｐｔＰＬＬＡに配向固定化されたＬＴＧＦ）足場上で培養した細胞に関して有意に高かった（ｐ＜０．０１）。さらに、７日目及び１４日目に、スルホ−ＳＭＣＣを使用して配向固定化されたＬＴＧＦを有する足場で培養した細胞と比較して、ランダムに固定化されたＬＴＧＦを有する足場で培養した細胞との間には統計的な有意差（ｐ＜０．０１５）があった。
【００７９】
図６は、ｓＬＴＧＦ修飾したＰＬＬＡ繊維と相互作用する関節軟骨細胞のＳＥＭ画像を示す。細胞が足場に結合し、広がっていることが認められる。
【００８０】
様々な種類の足場で培養した鼻軟骨細胞についての軟骨特異的マーカー及び脱分化マーカーのｍＲＮＡ発現を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した（図８）。軟骨代替物の生成に関する既存の問題は、軟骨形成表現型の維持である。軟骨細胞は速やかに脱分化し、繊維芽細胞マーカー（例えばＣｏｌ１Ａなど）を発現するが、一方軟骨特異的遺伝子、例えばＳｏｘ９の発現を喪失する。本明細書で示す結果は、潜在型ＴＧＦβ１官能基化足場（ｐＬＴＧＦ）が０日目と比較してＳｏｘ９発現を約１０倍に有意に上方調節したことを明らかにし、分化軟骨細胞表現型の維持を示した。バイオマテリアル上の潜在型ＴＧＦβのランダム配向は、明らかに、接種して新たに増殖させた細胞に対するＴＧＦのバイオアベイラビリティーを低下させなかった。この発現レベルはまた、この実験における他のすべての足場群よりも有意に高かった。軟骨細胞についての脱分化マーカーであるＣｏｌ１Ａ１は、他の足場群と比較してＴＧＦ群において有意に高かった。
【００８１】
本発明者らはまた、各々の群における増殖因子ナノグラム当たりの分化の誘導におけるＴＧＦβ１の効果を、遺伝子発現データを培地に添加したＴＧＦβ１（ＴＧＦ群）又は官能基化足場上に存在するＴＧＦβ１（ｐＬＴＧＦ及びｓＬＴＧＦ群）の量で除することによって検討した（図９）。ＴＧＦβ１ナノグラム当たりの有効性を考慮した場合、ｓＬＴＧＦ群は軟骨細胞分化を誘導するうえでより有効であった。従って、本発明のバイオマテリアルの有効性は、より多くの潜在型ＴＧＦβを固定化するように、特定配向された潜在型ＴＧＦβをバイオマテリアル上に固定化する方法を最適化することによってさらに改善できる。そのような最適化は、例えば、潜在型ＴＧＦβ複合体をバイオマテリアルに結合するより長い中間分子の使用、ＳＬＣ分子のチオール特異的修飾及び足場に結合する前の精製、並びに当分野で公知の他の方法を含み得る。より多くの特定配向された固定化潜在型ＴＧＦβを有するバイオマテリアルは、軟骨細胞へのより大きく持続的なレベルの細胞の分化を生じさせる。
【００８２】
合わせて考慮すると、本発明者らの所見は、ＬＴＧＦ修飾した繊維が、関節及び鼻軟骨から単離された接種ヒト軟骨細胞のインビトロでの細胞挙動に影響を及ぼすことを明らかにする。結果は、固定化されたＬＴＧＦが細胞培養培地中での１４日間の後にその生物活性を保持する証拠を提供する。これらの結果は、潜在型ＴＧＦβ１を細胞に提示するこの新しい方法が、軟骨再生において及びＴＧＦβ１が重要な役割を果たす骨及び他の多くの組織においても（前記参照）インビトロ及びインビボで有益な応用を有することを示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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