(57)【要約】  本発明は、細胞中のPIK3CA mRNAを標的化して、PIK3CAの発現を低下するオリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。PIK3CA発現の低下は、ある特定の医学的障害、例えば過増殖疾患、例えば癌の治療にとって有利である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
合計10〜30ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む長さ10〜30ヌクレオチドのオリゴマーであって、該連続ヌクレオチド配列が哺乳動物のPIK3CA遺伝子またはmRNA、例えば配列番号1の逆相補体またはその天然変異体に対応する領域と少なくとも80％同一性であり、該オリゴマーが少なくとも1つのLNAユニットを含む前記オリゴマー。
【請求項２】
連続ヌクレオチド配列がi）配列番号115または配列番号7、またはii）配列番号119または配列番号11、またはiii）配列番号2〜16および／または17〜28および／または110〜124および／または125〜136および／または149〜160のいずれかから選択される配列に対応する領域と少なくとも80％同一性である、請求項１に記載のオリゴマー。
【請求項３】
連続ヌクレオチド配列が配列番号1の対応する領域の逆相補体とミスマッチがないかまたは1もしくは2以下のミスマッチを含む、請求項１または２に記載のオリゴマー。
【請求項４】
オリゴマーのヌクレオチド配列が連続ヌクレオチド配列から成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項５】
連続ヌクレオチド配列が長さ10〜18ヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項６】
連続ヌクレオチド配列がヌクレオチド類似体を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項７】
ヌクレオチド類似体が糖修飾されたヌクレオチド、例えばロックされた核酸（LNA）ユニット；2'-O-アルキル-RNAユニット、2'-OMe-RNAユニット、2'-アミノ-DNAユニット、および2'-フルオロ-DNAユニットからなる群より選択される糖修飾されたヌクレオチドである、請求項６に記載のオリゴマー。
【請求項８】
ヌクレオチド類似体がLNAである、請求項６に記載のオリゴマー。
【請求項９】
ギャップマーである、請求項６〜８のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１０】
PIK3CA遺伝子またはmRNAを発現している細胞においてPIK3CA遺伝子またはmRNAの発現を阻害する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１１】
オリゴマーが
5'-AsGsMeCscsaststscsaststscscsAsMeCsMeCC-3'（配列番号67）および
5'-TsTsAststsgstsgscsastscstsMeCsAsG-3'（配列番号77）
［式中、大文字はβ-D-オキシ-LNA モノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付き文字「s」はホスホロチオエート結合を表し、そしてMeCは5-メチルシトシン塩基を含有するβ-D-オキシ-LNA モノマーを表す］
から選択される連続ヌクレオチド配列から成るかまたは含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー、および少なくとも1つの前記オリゴマーと共有結合した非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲート。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー、または請求項１２に記載のコンジュゲート、および製薬上許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む医薬組成物。
【請求項１４】
例えば過増殖疾患、例えば癌の治療用の医薬品として使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー、または請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
例えば過増殖疾患、例えば癌の治療用の医薬品を製造するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー、または請求項１２に定義されたコンジュゲートの使用。
【請求項１６】
例えば 過増殖疾患、例えば癌を治療する方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー、または請求項１２に記載のコンジュゲート、または請求項１３に記載の医薬組成物を、例えば 過増殖疾患、例えば癌を患うか、または患うと思われる患者に投与するステップを含むものである前記方法。
【請求項１７】
PIK3CAを発現している細胞においてPIK3CAを阻害する方法であって、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴマー、または請求項１２に記載のコンジュゲートを前記細胞に投与して前記細胞中のPIK3CAを阻害するステップを含むものである前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞中のPIK3CA mRNAを標的化し、PIK3CA発現の低下に導くオリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。特に、本発明は細胞中のPIK3CAキナーゼmRNAを標的化し、PIK3CAキナーゼ発現の低下に導くオリゴマー化合物（オリゴマー）に関する。PIK3CA発現の低下はある領域の医学的障害、例えば癌などの過増殖疾患にとって有益である。
【０００２】
関係事例
本出願は米国予備特許出願第60/992,050号（2007年12月3日出願）の優先権を主張し、その開示は本明細書に参照によりその全てが組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ（PI3K）は、チロシンキナーゼ受容体による受容体シグナル伝達に関わる偏在性の脂質キナーゼである。PI3Kは、複数のサブユニットとイソ型をもつ3クラスを含む大きくかつ複雑なファミリーを含む。クラスI PI3Kは、85kDa調節サブユニット（p85）および100-kDa触媒サブユニット（p110）を含有するSrc同一性の2ドメインから構成され、D3位置のホスホイノシトール4-リン酸およびホスホイノシトール4,5-リン酸のリン酸化を触媒する。PI3K調節サブユニットはp85αおよびその末端切断スプライス変異体p50αおよびp55α、ならびにp85βおよびp55γを含み；触媒サブユニットはp110α、p110β、およびp110δを含む。ヒト触媒サブユニットp110αをコードするのはPIK3CA遺伝子であり、この遺伝子は特異的にヒト染色体3[Chr3:180.35-180.44Mbp][chr3:180、349、005-180、435、191bp]（NCBI参照配列注記）（3q26.3）に位置し、様々なヒト癌ではしばしば変異している；すなわち、PIK3CAは、32％の結腸直腸癌、27％のグリア芽細胞腫、25％の胃癌、36％の肝細胞癌、18-40％の乳癌、4-12％の卵巣癌および4％の肺癌において変異していることが示されている（Samuelsら、2006）。
【０００４】
見出された突然変異のほとんどは、E542K、E545K および H1047Rとして公知の、PIK3CAコード配列内の3つの変異ホットスポットにマッピングしている（Kang ら、2005）。色々なヒト組織において検出されたPIK3CA突然変異およびそれらの優先度の包括的なマップは、http://www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/cosmic?action=gene&ln=PIK3CA （本明細書に参照により組み入れられる）に見出すことができる。
【０００５】
PI3Kは広範囲の癌、例えば結腸直腸癌で示されており、PI3K/Aktの活性化は結腸直腸癌と関連していてかつ分化したヒト胃または結腸の癌細胞を分化が少なくかつより悪性の表現型に転換しうることが示されている（Rychahou ら、2006）。
【０００６】
P13Kの腫瘍成長および進行に与える効果はAkt、すなわち下流のPI3Kのエフェクターが介在すると考えられる。ヒトには、Akt遺伝子ファミリーの3メンバー、Akt1、Akt2およびAkt3が存在する。Aktは、結腸、膵臓、卵巣およびいくつかのステロイドホルモン非感受性乳癌を含むいくつもの癌において過剰発現される。
【０００７】
可能性のある治療薬として示唆されているP13K/Aktシグナリングに関わるタンパク質のインヒビターにはsiRNAとアンチセンスオリゴヌクレオチドの両方が含まれる（US2006030536A）、しかし、今までこの領域のほとんどの研究はsiRNAの使用に集中してきたようである。
【０００８】
WO2005/091849は、PI3Kのアンチセンスダウンレギュレーションに関わるが、非特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示している。
【０００９】
Zhangら、2004（Cancer Biology and Therapy 3:12 1283-1289,）は、標的化するp110αを標的化するsiRNAを開示し、卵巣癌の遺伝子治療における利用を指摘している。
【００１０】
Rychahouら、2006（Annals of Surgery 243833 - 844）は、p85αおよびp110αを標的化するsiRNA複合体を開示し、in vitroで結腸細胞癌の生存率を低下しかつヒト大腸癌細胞のアポトーシスを増加しかつin vivo実験において肝臓転移を低下することを見出した。
【００１１】
Mengら、2006（Cellular Signalling 18 2262-2271）は、卵巣癌細胞においてPI3K活性を阻害するp110αを標的化するsiRNAを開示している。その著者らはAKT1の阻害が細胞遊走、浸潤および増殖に十分影響を与えることを確認した。
【００１２】
Hsiehら、2004（NAR 32 893-901）は、PI3K経路内の30遺伝子を標的化する148 siRNA二重鎖の使用について報じている。
【００１３】
US 2005/0272682は、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）シグナル伝達経路を標的化するsiRNA複合体を開示している。
【００１４】
例示の態様において、本発明はPI3K経路、とりわけPIK3CA mRNAを標的化する高度に効率的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに、特にLNA化学に基づいて、および／または、特にPIK3CA mRNA上の効果的な標的部位の選択により選ばれた新しいクラスのPIK3CAアンタゴニストを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】US2006030536A
【特許文献２】WO2005/091849
【特許文献３】US 2005/0272682
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献４】Zhangら、Cancer Biology and Therapy 3:12 1283-1289 (2004)
【非特許文献４】Rychahouら、Annals of Surgery 243833-844 (2006)
【非特許文献４】Mengら、Cellular Signalling 18 2262-2271 (2006)
【非特許文献４】Hsiehら、NAR 32 893-901 (2004)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、合計10〜30ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、長さで10〜50、例えば10〜30ヌクレオチドのオリゴマーであって、前記連続ヌクレオチド配列が哺乳動物のPIK3CA遺伝子またはmRNA、例えば、配列番号1の逆相補体またはその天然の変異体に対応する領域と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、98％、または99％）同一性である前記オリゴマーを提供する。
【００１８】
本発明は、10〜50モノマー、例えば10〜30モノマーの第1の領域を含む10〜30モノマーのオリゴマーであって、第1の領域の配列が、哺乳動物のPIK3CAをコードする核酸、例えば哺乳動物のPIK3CA遺伝子、またはmRNA、例えば配列番号1に記載した配列の逆相補体またはその天然の変異体の標的領域と少なくとも80％（例えば、85％、90％、95％、98％、または99％）同一である前記オリゴマーを提供する。
【００１９】
本発明は、本発明によるオリゴマー、および前記オリゴマーと共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（「コンジュゲートした部分」）を含むコンジュゲートを提供する。
【００２０】
本発明は、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲート、および製薬上許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明は、合計10〜50核酸塩基の連続核酸塩基配列を含む、長さで10〜50核酸塩基のオリゴマーであって、前記連続核酸塩基配列が哺乳動物のPIK3CAをコードする核酸の標的領域の逆相補体と少なくとも80％同一である前記オリゴマーを提供する。
【００２２】
本発明は、例えば、過増殖疾患、例えば癌を治療する医薬品として使用するための、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートを提供する。
【００２３】
本発明は、過増殖疾患例えば癌を治療する医薬品を製造するための、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートの使用を提供する。
【００２４】
本発明は、過増殖疾患、例えば癌を治療する方法であって、本発明によるオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を、前記過増殖疾患例えば癌を患うかまたは患うと思われる患者に投与するステップを含むものである前記方法を提供する。
【００２５】
本発明は、PIK3CAとβカテニンの両方を発現している細胞においてPIK3CAとβカテニンの両方を阻害する方法であって、前記細胞においてPIK3CAとβカテニンの阻害を果たすために本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートを前記細胞に投与するステップを含むものである前記方法を提供する。好適には、細胞においてPI3CAとβカテニンの両方を阻害またはダウンレギュレーションできるオリゴマーは、両方の標的核酸の逆相補体と有意な同一性を有するかまたはハイブリダイズすることができ、例えば配列番号82の核酸塩基の配列をもつオリゴマーである。
【００２６】
本発明はさらに医薬に使用するための本発明によるオリゴマーを提供する。
【００２７】
本発明はさらに、本明細書で参照した1以上の疾患、例えば過増殖疾患からなる群より選択される疾患、例えば癌の治療に使用するための本発明によるオリゴマーを提供する。
【００２８】
さらに、細胞または組織におけるPIK3CAの発現をダウンレギュレーションする方法であって、前記細胞または組織を、in vitroまたはin vivoで、1以上の本発明のオリゴマー、コンジュゲートまたは組成物と接触させるステップを含むものである前記方法を提供する。
【００２９】
また、過増殖疾患、例えば癌、および／またはPIK3CAの発現または過剰発現に関係する疾患または症状を有するかまたは易発性（感受性）であることが疑われる動物、例えば非ヒト動物、またはヒトを治療する方法であって、前記動物またはヒトに、治療または予防上有効な量の1以上の本発明のオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物を投与することによる前記治療する方法を開示する。さらに、PIK3CAの発現を阻害するため、およびPIK3CAの活性に関連する疾患を治療するために、オリゴマーを用いる方法を提供する。
【００３０】
本発明は過増殖疾患からなる群より選択される疾患、例えば癌を治療する方法であって；本発明の1以上のオリゴマー、コンジュゲート、またはその医薬組成物（の有効量）を、それを必要とする患者に投与するステップを含むものである前記方法を提供する。
【００３１】
本発明は細胞または組織におけるPIK3CA（および任意にβカテニン）の発現を例えばダウンレギュレーションにより阻害または低減する方法であって、前記細胞または組織を本発明の1以上のオリゴマー、コンジュゲートまたはその医薬組成物を接触させ、PIK3CA（および任意にβカテニン）の発現を阻害または低減するステップを含むものである前記方法を提供する。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマーは、
5'-AsGsMeCscsaststscsaststscscsAsMeCsMeC-3'（配列番号67）；および
5'-TsTsAststsgstsgscsastscstsMeCsAsG-3'（配列番号77）
［式中、大文字はβ-D-オキシ-LNAモノマーを、そして小文字はDNAモノマーを示し、下付き添字「s」はホスホロチオエート結合を示し、MeCは5-メチルシトシン塩基を含有するβ-D-オキシ-LNAモノマーを示す］
からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】表3に提示したオリゴヌクレオチドを、PIK3CA mRNAをノックダウンするそれらの潜在能力について、0.8、4および20nMの濃度で、MCF7細胞において、トランスフェクション後24時間に、リアルタイムPCRを用いて評価した。全ての結果をGAPDHに規準化して、PIK3CA mRNAの阻害を模擬トランスフェクトした対照の％として示した。示した結果は3つの独立実験の平均である。
【図２】表3に提示したオリゴヌクレオチドを、PIK3CA mRNAをノックダウンするそれらの潜在能力について、0.8、4および20nMの濃度で、PC3細胞において、トランスフェクション後24時間に、リアルタイムPCRを用いて評価した。全ての結果をGAPDHに規準化して、PIK3CA mRNAの阻害を模擬トランスフェクトした対照の％として示した。示した結果は3つの独立実験の平均である。
【図３−１】ヒトPIK3CA mRNA配列（Genbank受託番号：NM_006218）およびマウスPIK3CA mRNA配列（Genbank受託番号：NM_008839）の配列アラインメントを示す。
【図３−２】図３−１の続き。
【図３−３】図３−２の続き。
【図３−４】図３−３の続き。
【図４−１】ヒトPIK3CA mRNA配列（Genbank受託番号：NM_006218）上の標的配列の位置を示す。灰色でマークした位置が突然変異ホットスポット1781、1790および3297である。
【図４−２】図４−１の続き。
【図５】配列番号1：Homo sapiens ホスホイノシチド-3-キナーゼ、触媒性、αポリペプチド（PIK3CA）、mRNA（Genbank受託番号：NM_006218）3724bpを示す。
【図６】配列番号105：Homo sapiens ホスホイノシチド-3-キナーゼ、触媒性、αポリペプチドタンパク質配列（PIK3CA）（Genbank受託番号：NP_006209）を示す。
【図７】配列番号106：Mus musculus ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ、触媒性、αポリペプチド（Pik3ca）、mRNA（Genbank受託番号：NM_008839）を示す。
【図８】配列番号107：Mus musculus ホスホイノシチド-3-キナーゼ、触媒性、αポリペプチドタンパク質配列（PIK3CA）受託番号NP_032865を示す。
【図９−１】配列番号108：Macaca mulatta ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ、触媒性、αポリペプチド（Pik3ca）、mRNA（Genbank受託番号：XM_001109162）を示す。
【図９−２】図９−１の続き。
【図１０】配列番号109：Macaca mulatta ホスホイノシチド-3-キナーゼ、触媒性、αポリペプチドタンパク質配列（PIK3CA）（Genbank受託番号：XP_001109162）を示す。
【図１１】MCF7細胞における細胞増殖アッセイ（MTSアッセイ）を示す。4つの独立実験を実施した。各オリゴの平均活性を最もよく表す実験から得た結果を示した。
【図１２】PC3細胞における細胞増殖アッセイ（MTS）を示す。2つの独立実験を実施した。各オリゴの平均活性を最もよく表す実験から得た結果を示した。
【図１３】PC3細胞における、PIK3CAオリゴヌクレオチドによるトランスフェクション後のカスパーゼ3/7活性を示す。データは模擬と比較した倍数誘導（fold induction）として表した。
【図１４】HCT116細胞における細胞増殖アッセイ（MTS）を示す。
【図１５】HCT116細胞における、PIK3CAオリゴによるトランスフェクション後のカスパーゼ3/7活性を示す。データは模擬と比較した倍数誘導（fold induction）として表した。
【図１６】PIK3CAオリゴヌクレオチドの血漿安定性を示す。LNAオリゴヌクレオチドをマウス血漿と37℃にてインキュベートし、アリコートを0、24、48および120時間に採取した。その結果をSDS-PAGEゲルを用いてゲル電気泳動により可視化した。
【図１７】標的核酸の標的領域とハイブリダイズしたPIK3CAオリゴヌクレオチドのTm測定を示す。右の上付き添字「o」を付した太字の大文字はβ-D-オキシLNAモノマーを表す。MCは5-メチルシトシン塩基を伴うLNAモノマーを表す。下付き添字「s」はホスホロチオエート結合を表す。小文字はDNAモノマーを表す。
【図１８】A549細胞におけるPIK3CAタンパク質とpAktのダウンレギュレーションを示す。
【図１９】15PC3細胞におけるPIK3CAタンパク質とpAktのダウンレギュレーションを示す。
【図２０】肝臓におけるPIK3CA mRNAのノックダウンの分析を示す。
【図２１】マウス肝臓におけるPIK3CA mRNAのin vivoノックダウンを示す。データは生理食塩水（100％）と比較した％ダウンレギュレーション±標準偏差として表した。各グループには5動物が存在した。
【図２２】最も強力なオリゴヌクレオチドを、PIK3CA mRNAをノックダウンするそれらの潜在能力について、0.04nM、0.2nM、0.8nM、4nM、10nMおよび20nMの濃度で、PC3細胞において、トランスフェクション後24時間に、リアルタイムPCRを用いて評価した。全ての結果をGAPDHに規準化して、PIK3CA mRNAの阻害を模擬トランスフェクトした対照の％として示した。示した結果は2つの独立実験の平均である。
【図２３】最も強力なオリゴヌクレオチドを、PIK3CA mRNAをノックダウンするそれらの潜在能力について、0.04nM、0.2nM、0.8nM、4nM、10nMおよび20nMの濃度で、MCF7細胞において、トランスフェクション後24時間に、リアルタイムPCRを用いて評価した。全ての結果をGAPDHに規準化して、PIK3CA mRNAの阻害を模擬トランスフェクトした対照の％として示した。示した結果は2つの独立実験の平均である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
オリゴマー
本発明は哺乳動物のPIK3CA、例えば配列番号1に示したPIK3CA核酸をコードする核酸分子、および哺乳動物のPIK3CAをコードするかかる核酸分子の天然変異体の機能をモジュレーションするのに利用するために、オリゴマー化合物（本明細書ではオリゴマーと呼ぶ）を使用する。用語「オリゴマー」は、本発明の文脈では、2以上のヌクレオチド（すなわちオリゴヌクレオチド）の共有結合により形成された分子を意味する。本明細書において、各単一ヌクレオチド、例えば、本発明のオリゴマー中に存在するヌクレオチドはまた、「モノマー」または「ユニット」と呼ぶことができる。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、長さで10〜30ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むかまたは成る（すなわち10〜30の共有結合で結合されたモノマーを含むかまたは成る）ものであってもよい。
【００３５】
様々な実施形態において、本発明による化合物は直鎖分子であるかまたは直鎖分子として合成される。かかる実施形態において、オリゴマーは1本鎖分子であり、典型的には、同じオリゴマー内の他の領域と相補性である（例えば、少なくとも3、4または5連続ヌクレオチドの）短い領域（すなわち2本鎖）を含まない〜この点については、いくつかの実施形態において、オリゴマーは、本質的に、2本鎖でない。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、本質的に、siRNAのように2本鎖でない。様々な実施形態において、本発明のオリゴマーは完全に連続ヌクレオチド領域から構成されうる。従って、オリゴマーは実質的に自己相補性はない。siRNAは、例えば21〜23nt長さで、典型的には両末端に2ヌクレオチドの3'オーバーハングを伴う、2つの相補性の短いRNA（または等価の核酸塩基ユニット）配列から成る。in vivo取込みを促進するために、siRNAはコンジュゲートしていてもよく、例えばステロール、例えばコレステロール基とコンジュゲートしていてもよい（一般的に、一または両方の鎖の3'または5'にて）。
【００３６】
標的
好適な本発明のオリゴマーはPIK3CA遺伝子の発現をダウンレギュレーションできる。この点について、本発明のオリゴマーは典型的には哺乳動物、例えばヒトの細胞においてPIK3CAの阻害を果たすことができる。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマーは標的核酸と結合し、（例えば、オリゴマー投薬の直前の）正常な発現レベルと比較して少なくとも10％または20％の発現の阻害、より好ましくは正常な発現レベルと比較して少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％の発現の阻害を果たす。いくつかの実施形態において、かかるモジュレーションは、本発明の化合物の0.04〜25nM、例えば0.8〜20nM濃度を用いるときに見られる。同じまたは異なる実施形態において、発現の阻害は100％未満、例えば98％未満の阻害、95％未満の阻害、90％未満の阻害、80％未満の阻害、例えば70％未満の阻害である。発現レベルのモジュレーションは、例えば、SDS-PAGEと次いで標的タンパク質に対する好適な抗体を用いるウェスタンブロットの方法により、タンパク質レベルを測定することによって決定することができる。あるいは、発現レベルのモジュレーションは、例えば、ノーザンブロットまたは定量RT-PCRにより、mRNAのレベルを測定することにより決定することができる。RNAレベルを介して測定する場合、適当な用量、例えば0.04〜25nM、例えば0.8〜20nM濃度を用いるときのダウンレギュレーションのレベルは、いくつかの実施形態において、典型的には本発明の化合物の非存在のもとでの正常レベルの10〜20％のレベルになる。
【００３７】
PIK3CA遺伝子は天然の遺伝子が適当と思われ、それ故に、ヒト遺伝子については、配列番号1の配列またはその自然変異体を有しうるのであって、前記変異体は「サイレントな」（例えば、疾患またはPIK3CAキナーゼ特性の他の改変に関連しない）」または「機能的な」（例えば疾患に関連した）」変異体のどちらであってもよい。PIK3CA遺伝子からの標的配列はDNAまたはRNA、好ましくはmRNAでありうる。オリゴマーは、配列番号1の部分配列を有する1本鎖核酸分子とハイブリダイズする、例えば特異的にハイブリダイズするかまたはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【００３８】
いくつかの実施形態において、いくつかのオリゴマーはPIK3CAとβカテニンの両方を標的化できることが注目されるであろう。それ故にいくつかの実施形態において、標的はPIK3CAとβカテニンであってもよい。
【００３９】
本発明はそれ故に、いくつかの実施形態において、PIK3CAタンパク質および／またはmRNAを発現している細胞中の、PIK3CAタンパク質および／またはmRNAの発現をダウンレギュレーションまたは阻害する方法であって、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートを（好適には有効な量で）前記細胞に投与または接触させ、前記細胞中のPIK3CAタンパク質および／またはmRNAの発現をダウンレギュレーションまたは阻害するステップを含むものである前記方法を提供する。好適には、前記細胞は哺乳動物の細胞、例えばヒト細胞である。投与は、いくつかの実施形態においてはin vitroで行ってもよい。投与は、いくつかの実施形態においてはin vivoで行ってもよい。
【００４０】
本明細書で使用する用語「標的核酸」は、哺乳動物PIK3CAポリペプチド、例えばヒトPIK3CAをコードするDNAまたはRNA、例えば配列番号1を意味する。PIK3CAをコードする核酸またはその天然の変異体、およびそれから誘導されるRNA核酸、好ましくはmRNA、例えばプレmRNAであるが、好ましくは成熟mRNAを意味する。いくつかの実施形態において、例えば、研究または診断において用いる場合、「標的核酸」は、上記DNAまたはRNA核酸標的から誘導されるcDNAまたは合成オリゴヌクレオチドであってもよい。本発明によるオリゴマー化合物は、好ましくは標的核酸にハイブリダイズすることができる。配列番号1はcDNA配列であり、従って、cDNA配列でウラシルはチミジンにより置き換えられているが、成熟mRNA標的配列に対応することは理解されよう。
【００４１】
哺乳動物のPIK3CAキナーゼは好ましくはヒトまたはマウスPIK3CAキナーゼからなる群より選択される。好ましくは哺乳動物のPIK3CAキナーゼはヒトPIK3CAキナーゼ、例えば配列番号1に示した核酸がコードするPIK3CAキナーゼである。哺乳動物のPIK3CAキナーゼをコードする核酸は、好ましい実施形態において、配列番号1に示されるヒトPIK3CAキナーゼcDNA配列および／または配列番号106に示されるマウスPIK3CAキナーゼcDNA配列、またはそれらの対立遺伝子変異体、例えば、http：//www.sanger.ac.uk/perl/genetics/CGP/cosmic?action=gene&amp；ln=PIK3CA （本明細書に参照により組み入れられる）に掲げられたPIK3CA突然変異体である。
【００４２】
用語「その天然の変異体」は、定義した分類学的グループ、例えば哺乳動物、例えばマウス、サル、および好ましくはヒトに天然に存在する核酸配列のPIK3CAポリペプチドの変異体を意味する。典型的には、あるポリヌクレオチドの「天然の変異体」を意味する場合、その用語はまた、染色体3[Chr 3： 180.35 - 180.44 M bp]、具体的には[chr3：180,349,005-180,435,191 bp]（NCBI参照配列注釈）（3q26.3）に見出されるゲノムDNAをコードするPIK3CAの染色体転位または複製による任意の対立遺伝子変異体およびそれから誘導されるRNA、例えばmRNAを包含しうる。「天然の変異体」はまた、PIK3CA mRNAの選択的スプライシングから誘導される変異体も含みうる。特定のポリペプチド配列を意味する場合、例えば、その用語はまた、従って、例えば、同時または後翻訳修飾、例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、グリコシル化、などによりプロセシングされていてもよいタンパク質の天然の形も含む。変異体配列はPIK3CA中の標的配列と少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％配列同一性を有しうる。典型的には、前記変異体配列に対応する本発明のオリゴマーはなおPIK3CAをダウンレギュレーションすることができる。
【００４３】
本発明のオリゴマーが標的化しうるPIK3CAの特に関係がある変異体は、過増殖疾患、例えば癌に関係する偶発点突然変異であり、これについては、位置E542、E545またはH1047でアミノ酸置換を引き起こす点突然変異、例えば置換E542K、E545KおよびH1047Rを引き起こす点突然変異が特に関係がある。かかる偶発突然変異を含むPIK3CA mRNAを標的化するオリゴマーを設計することにより、PIK3CAの変異（突然変異）型mRNAに優先活性（ダウンレギュレーション）を有するオリゴマーを作製することができ、位置E542、E545またはH1047にアミノ酸置換を引き起こす点突然変異の場合、これは癌表現型に関係する。
【００４４】
いくつかの実施形態において、PIK3CA遺伝子またはmRNA標的は配列番号1の位置1781、1790または3297に対応する位置において単一塩基置換を含有する。かかる実施形態において、位置1781に存在するヌクレオチドはG以外のもの、例えばA、CまたはT/Uであってもよく、位置1790に存在するヌクレオチドはG以外のもの、例えば、A、CまたはT/Uであってもよく、または位置3297に存在するヌクレオチドはA以外のもの、例えば、G、CまたはT/Uであってもよい（TはDNA標的を、UはmRNA標的を意味する）。
【００４５】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーの連続ヌクレオチド配列は、配列番号1の位置1781に対応する核酸塩基を含んでもよく、ここで位置1781に対応する核酸塩基はCでなく、A、GまたはTなどから選択される。好適には、いくつかの実施形態において、かかる連続ヌクレオチド配列の残りの核酸塩基は配列番号1の対応する領域と完全に相補性でありうる。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーの連続ヌクレオチド配列は配列番号1の位置1790に対応する核酸塩基を含んでもよく、この場合、位置1790に対応する核酸塩基はCでなく、A、GまたはTなどから選択される。好適には、いくつかの実施形態において、かかる連続ヌクレオチド配列の残りの核酸塩基は配列番号1の対応する領域と完全に相補性でありうる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーの連続ヌクレオチド配列は、配列番号1の位置3297に対応する核酸塩基を含んでもよく、ここで位置3297に対応する核酸塩基はTでなく、A、GまたはCなどから選択される。好適には、いくつかの実施形態において、かかる連続ヌクレオチド配列の残りの核酸塩基は配列番号1の対応する領域と完全に相補性でありうる。
【００４８】
オリゴマー配列
オリゴマーは、配列番号1に存在するヌクレオチド配列の逆相補体に対応する連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれから成る。従って、オリゴマーは、配列番号：2〜16または17〜28または110〜124または125〜136または149〜160からなる群より選択される配列を含むかまたはそれから成り、ここで前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は任意に、前記選択される配列に対して1、2、または3つのミスマッチを有しうる。
【００４９】
オリゴマーは、哺乳動物のPIK3CAをコードする核酸（例えば、配列番号1）の等価領域と全く相補性（完全に相補性）である連続ヌクレオチド配列を含むかまたは成ってもよい。従って、オリゴマーはアンチセンスヌクレオチド配列を含むかまたは成ってもよい。
【００５０】
しかし、いくつかの実施形態において、オリゴマーは、標的配列とハイブリダイズしかつなお十分に標的と結合して所望の効果、すなわち標的をダウンレギュレーションする場合、1、2、3、または4つ（またはそれ以上）のミスマッチを黙認してもよい。ミスマッチは、例えば、オリゴマーヌクレオチド配列の長さの増加によりおよび／またはヌクレオチド配列中に存在するヌクレオチド類似体、例えばLNAの数の増加によって補償することができる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、標的配列と、例えば、哺乳動物のPIK3CAをコードする核酸の対応する領域とハイブリダイズした時、3つ以下、例えば2つ以下のミスマッチを含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、連続ヌクレオチド配列は、標的配列と、例えば、哺乳動物のPIK3CAをコードする核酸の対応する領域とハイブリダイズした時、1つ以下のミスマッチを含む。
【００５３】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列は、好ましくは配列番号：2〜16または17〜28または110〜124または125〜136または149〜160からなる群より選択される対応する配列と少なくとも80％、例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％同一性、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、例えば100％同一性（100％の場合は同一）である。
【００５４】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列またはその連続ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号1に存在する対応する配列の逆相補体と、少なくとも80％、例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％同一性、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、例えば100％同一性（100％の場合は同一）である。
【００５５】
本発明のオリゴマーのヌクレオチド配列またはその連続ヌクレオチド配列は、好ましくは、配列番号1に存在するサブ配列と、少なくとも80％、例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％相補性、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、例えば100％相補性（100％の場合は完全に相補性）である
いくつかの実施形態において、オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は配列番号：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26および28またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列からなる群より選択される配列の1つから選択されるか、またはそれを含むものであって、ここで前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は前記配列と比較すると任意に1、2、または3つのミスマッチを含んでもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態において、オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は配列番号：110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、28、129、130、131、132、133、134、135および136またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列からなる群より選択される配列の1つから選択されるか、またはそれを含むものであって、ここで前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は前記配列と比較すると任意に1、2、または3つのミスマッチを含んでもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態において、オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は配列番号：149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159および160またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列からなる群より選択される配列の1つから選択されるか、またはそれを含むものであって、ここで前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は前記配列と比較すると任意に1、2、または3つのミスマッチを含んでもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態において、サブ配列は11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、または29連続ヌクレオチド、例えば12〜22、例えば12〜18ヌクレオチドから成ってもよい。好適には、いくつかの実施形態において、サブ配列は本発明のオリゴマーの連続ヌクレオチド配列と同じ長さである。
【００５９】
しかし、いくつかの実施形態において、オリゴマーのヌクレオチド配列はさらなる5'または3'ヌクレオチド、例えば、独立して、標的配列と非相補性である1、2、3、4または5つのさらなる5'および／または3'ヌクレオチドを含んでもよいことは理解される。この点について、本発明のオリゴマーは、いくつかの実施形態において、さらなるヌクレオチドが5'およびまたは3'に隣接した連続ヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、さらなる5'または3'ヌクレオチドは天然のヌクレオチド、例えばDNAまたはRNAである。いくつかの実施形態において、さらなる5'または3'ヌクレオチドは、本明細書においてギャップマーオリゴマーの文脈で言及する領域Dを表しうる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は配列番号：111、112、114、115、116、118、119、122、131、132および136、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えばその11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドからなる群より選択される配列の1つから選択されるか、またはそれを含むものであって、ここで前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は前記選択される配列に対して任意に1、2、または3つのミスマッチを含んでもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態において、オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は配列番号：149、150、153、154、157、および158、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えばその11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドからなる群より選択される配列の1つから選択されるか、またはそれを含むものであって、ここで前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は前記選択される配列に対して任意に1、2、または3つのミスマッチを含んでもよい。
【００６２】
いくつかの実施形態において、オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は配列番号：3、4、6、7、8、10、11、14、23、24および28、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えばその11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドからなる群より選択される配列の1つから選択されるか、またはそれを含むものであって、ここで前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は前記選択される配列に対して任意に1、2、または3つのミスマッチを含んでもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態において、オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は配列番号：151、152、155、156、159および160、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えばその11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドからなる群より選択される配列の1つから選択されるか、またはそれを含むものであって、ここで前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は前記選択される配列に対して任意に1、2、または3つのミスマッチを含んでもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態において、オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は配列番号：57、60、64、67、70、74、77、82、87、90および96、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えばその11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドからなる群より選択される配列の1つから選択されるか、またはそれを含むものであって、ここで前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は前記選択される配列に対して任意に1、2、または3つのミスマッチを含んでもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態において、オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は配列番号：87、90および96、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えばその11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドからなる群より選択される配列の1つから選択されるか、またはそれを含むものであって、ここで前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は前記選択される配列に対して任意に1、2、または3つのミスマッチを含んでもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態において、オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は配列番号：99、100、101、102、103、または 104、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えばその11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドからなる群より選択される配列の1つから選択されるか、またはそれを含むものであって、ここで前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は前記選択される配列に対して任意に1、2、または3つのミスマッチを含んでもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態において、オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は配列番号：99、100または104、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えばその11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドからなる群より選択される配列の1つから選択されるか、またはそれを含むものであって、ここで前記オリゴマー（または連続ヌクレオチド部分）は前記選択される配列に対して任意に1、2、または3つのミスマッチを含んでもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号2によるヌクレオチド配列、例えば配列番号56、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号3によるヌクレオチド配列、例えば配列番号57、58または59、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号4によるヌクレオチド配列、例えば配列番号60、61および62、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００７１】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号5によるヌクレオチド配列、例えば配列番号63、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００７２】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号6によるヌクレオチド配列、例えば配列番号64、65および66、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号7によるヌクレオチド配列、例えば配列番号67、68または69、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号8によるヌクレオチド配列、例えば配列番号70、71または72、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００７５】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号9によるヌクレオチド配列、例えば配列番号73、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号10によるヌクレオチド配列、例えば配列番号74、75または76、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号11によるヌクレオチド配列、例えば配列番号77、78または79、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号12によるヌクレオチド配列、例えば配列番号80、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００７９】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号13によるヌクレオチド配列、例えば配列番号81、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号14によるヌクレオチド配列、例えば配列番号82、83、または84、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００８１】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号15によるヌクレオチド配列、例えば配列番号85、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号16によるヌクレオチド配列、例えば配列番号86、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号17によるヌクレオチド配列、例えば配列番号87、88または89、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号18によるヌクレオチド配列、例えば配列番号90、91または92、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号19によるヌクレオチド配列、例えば配列番号93、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号20によるヌクレオチド配列、例えば配列番号94、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号21によるヌクレオチド配列、例えば配列番号95、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号22によるヌクレオチド配列、例えば配列番号96、97または98、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号23によるヌクレオチド配列、例えば配列番号99、137または138、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号24によるヌクレオチド配列、例えば配列番号100、139または140、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号25によるヌクレオチド配列、例えば配列番号101、141または142、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００９２】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号26によるヌクレオチド配列、例えば配列番号102、143または144、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００９３】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号27によるヌクレオチド配列、例えば配列番号103、145または146、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号28によるヌクレオチド配列、例えば配列番号104、147または148、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００９５】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは配列番号149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159または160からなる群より選択されるヌクレオチド配列、またはその少なくとも10連続ヌクレオチドのサブ配列、例えば、その11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドから成るかまたは含むものである。
【００９６】
2011505124.tif 000002
XはCでない他の核酸塩基、例えばA、GまたはT、好ましくはTである。
【００９７】
† XはTでない核酸塩基、例えばA、GまたはC、好ましくはCである。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは、次の配列（5'〜3'）：
(G)(A)(T)TTXAG(A)(G)(A)(G)（ここで、括弧内の核酸塩基は任意であり、かつXはCでない他の核酸塩基、例えばA、GまたはT、好ましくはTであり；例えば、配列番号149〜152を参照されたい）、
(C)(T)(G)CTXAG(T)(G)(G)（ここで、括弧内の核酸塩基は任意であり、かつXはCでない他の核酸塩基、例えばA、GまたはT、好ましくはTであり；例えば、配列番号153〜156を参照されたい）、
(C)(A)(T)GAXGT(G)(C)(A)（ここで、括弧内の核酸塩基は任意であり、かつXはTでない他の核酸塩基、例えばA、GまたはC、好ましくはCであり；例えば、配列番号157〜160を参照されたい）
から選択される核酸塩基配列から成るかまたは含む。
【００９９】
上の実施形態のいくつかの実施形態において、Xは領域B（ギャップマーまたはショートマー）の核酸塩基、例えばDNAヌクレオチドである。好適には、Xは領域Bの中央核酸塩基として位置してもよく、または領域BはXに対して少なくとも1、2、3または4つの領域Bの他の核酸塩基を5'側におよび／または少なくとも1、2、3または4つの領域Bの他の核酸塩基を3'側に有してもよい。それ故に、いくつかの実施形態において、Xは領域A、Cの部分でなく、または、Dが存在する場合、いくつかの実施形態において、領域AまたはCに直接隣接する領域Bの核酸塩基でない。
【０１００】
しかし、いくつかの実施形態において、オリゴマーまたは連続核酸塩基配列は、PIK3CAキナーゼポリペプチドをコードする核酸と比較すると、1以上のミスマッチを含みうると考えられる。
【０１０１】
本発明のオリゴマーは、PIK3CAキナーゼポリペプチドをコードする核酸に存在する配列の対応する領域、例えば配列番号1またはその天然の変異体、例えば対立遺伝子変異体および偶発変異体、例えばE524K、E545KおよびH1047R突然変異体をコードする核酸、例えば配列番号1のG1781A、G1790AまたはA3297G偶発突然変異体（位置の前の残基文字はWTバージョンを意味し、後の文字は好ましい突然変異体残基を意味する）と、好ましくは、4を超える、例えば、3を超える、例えば、2を超える、例えば1を超えるミスマッチを含まない。
【０１０２】
一態様において、本発明は、癌細胞に関係する標的mRNA、例えばPIK3CA mRNA標的をダウンレギュレーションするためのオリゴマーを調製する方法であって、
a）癌に関係する標的mRNA中に存在する、前記癌細胞に存在するが非癌細胞に存在しない1点突然変異を同定するステップ、
b）癌に関係する前記標的mRNAと相補性である連続核酸塩基配列であって、前記1点突然変異を含む標的mRNAの領域に対応する前記連続核酸塩基配列から成るかまたは含むオリゴマーを調製するステップ
を含むものである前記方法を提供する。
【０１０３】
好適には、1点突然変異が前記癌と関係することが示されたもの、例えば本明細書で言及したPIK3CA点突然変異である。
【０１０４】
好適には、オリゴマーは本明細書に記載のギャップマーまたはショートマーオリゴヌクレオチドである（必ずしもPIK3CAを標的化するオリゴマーに限定されないが）。本明細書で言及したいくつかの実施形態において、1点突然変異に対応するかかるオリゴマーに存在する核酸塩基残基は領域Bに存在する。
【０１０５】
一態様においては、癌表現型に関係する点突然変異を含むmRNA標的の領域を特異的に標的化することが有利でありうる、何故なら、癌細胞の標的と比較して非癌細胞の標的に対して低い効力を有し、それにより癌細胞の有効な治療と非癌細胞に対する悪い影響の軽減との間の区別を可能にするオリゴマーを設計できるからである。
【０１０６】
本発明のオリゴマー（または連続ヌクレオチド配列）と哺乳動物のPIK3CAまたはその逆相補体、例えば本明細書に開示したものとの間の「同一性」を決定するときに、同一性の決定は、本発明の化合物の対応するヌクレオチド配列と哺乳動物のPIK3CA（または標的核酸）をコードする核酸に対応するヌクレオチド配列、またはその逆相補体との単純なアラインメントにより行なうことができ、同一性はアラインする塩基数を数え、本発明の化合物中の連続ヌクレオチドの合計数により除し、そして100を乗ずることにより決定する。かかる比較において、もしギャップが存在すれば、かかるギャップが単なるミスマッチであることの方が、本発明のヌクレオチド配列と標的核酸の間のギャップ内ヌクレオチド数が異なる領域であることより好ましい。
【０１０７】
用語「に対応する」はオリゴマーのヌクレオチド配列または連続ヌクレオチド配列（第1の配列）と、i）核酸標的、例えばPIK3CAタンパク質、例えば配列番号1をコードするmRNAの逆相補体のサブ配列、および／またはii）本明細書に提供したヌクレオチドの配列、例えば配列番号：2〜16または17〜28または110〜124または125〜136または149〜160、またはそのサブ配列からなる群から選択されるさらなる配列の等価な連続ヌクレオチド配列との間の比較を意味する。i）またはii）のさらなる配列に対応する第1の配列は、典型的には、第1の配列（例えば連続ヌクレオチド配列）の長さ全体にわたりその配列と同一であるか、または、本明細書に記載のように、いくつかの実施形態において、対応する配列と少なくとも80％同一性、例えば少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％同一性、例えば100％同一性（100％の場合は同一）である。
【０１０８】
用語「対応するヌクレオチド類似体」および「対応するヌクレオチド」は、ヌクレオチド類似体と天然のヌクレオチド中のヌクレオチドは同一であることを示すことを意図している。例えば、ヌクレオチドの2-デオキシリボースユニットがアデニンと結合しているとき、「対応するヌクレオチド類似体」はアデニンと結合したペントースユニット（2-デオキシリボースと異なる）を含有する。
【０１０９】
長さ
オリゴマーは長さで10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30連続ヌクレオチドの合計の連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれから成る。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは長さで10〜22、例えば12〜18、例えば13〜17または12〜16、例えば13、14、15、16連続ヌクレオチドの合計の連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれから成る。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは長さで10、11、12、13、または14連続ヌクレオチドの合計の連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれから成る。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは22以下のヌクレオチド、例えば20以下のヌクレオチド、例えば18以下のヌクレオチド、例えば15、16または17ヌクレオチドから成る。いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマーは20未満のヌクレオチドを含む。
【０１１３】
ヌクレオチド類似体
本明細書で使用する用語「ヌクレオチド」は、糖部分、塩基部分を含むグリコシドおよび共有結合したリン酸基を意味し、天然のヌクレオチド、例えばDNAまたはRNA、好ましくはDNAと本明細書で「ヌクレオチド類似体」とも呼ぶ改変された糖および／または塩基部分を含む非天然ヌクレオチドの両方を包含する。
【０１１４】
非天然のヌクレオチドには、改変された糖部分を有するヌクレオチド、例えば二環式ヌクレオチドまたは2'-改変されたヌクレオチド、例えば2'-置換されたヌクレオチドが含まれる。
【０１１５】
「ヌクレオチド類似体」は、糖および／または塩基部分における改変による、自然のヌクレオチド、例えばDNAまたはRNAヌクレオチドの変異体である。類似体は原則として、オリゴヌクレオチドの文脈で単に「サイレント」または自然のヌクレオチドと「等価」でありうる、すなわちオリゴマーは標的遺伝子発現を阻害する働きをする上での機能的効果を有しなくてもよい。かかる「等価」の類似体はそれでも、もし、例えば、それらが製造するのにより容易もしくは安価であるか、または貯蔵もしくは製造条件に対してより安定であるか、またはタグもしくは標識を表すのであれば有用でありうる。好ましくは、しかし、類似体は、オリゴマーが発現を阻害する働きをする上で；例えば標的との結合アフィニティの増加を生じること、および／または細胞内ヌクレアーゼに対する耐性の増加および／または細胞中への輸送の容易さの増加により、機能的効果を有しうる。ヌクレオシド類似体の具体例は、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 および Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、およびスキーム1に記載されている。
【化１】
2011505124.tif 000003
【０１１６】
オリゴマーは従って、天然ヌクレオチド、好ましくは2'-デオキシヌクレオチド（本明細書では一般に「DNA」と呼ぶ）、しかしまた可能なのはリボヌクレオチド（本明細書では一般に「RNA」と呼ぶ）、またはかかる天然のヌクレオチドと1以上の非天然のヌクレオチド、すなわちヌクレオチド類似体の組合わせの配列を含むかまたは成ってもよい。かかるヌクレオチド類似体は好適には、標的配列に対するオリゴマーのアフィニティを増強することができる。
【０１１７】
好適なかつ好ましいヌクレオチド類似体の例は、PCT/DK2006/000512により提供されるかまたは参照されている。
【０１１８】
オリゴマーにアフィニティを増強するヌクレオチド類似体、例えばLNAまたは2'-置換された糖を組み込むことにより、特異的に結合するオリゴマーのサイズを減じることができ、かつまたその上限を非特異的または異常な結合が起こる前のオリゴマーのサイズに減じることができる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは少なくとも2つのヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマー3〜8ヌクレオチド類似体、例えば6または7ヌクレオチド類似体を含む。さらに最も好ましい実施形態において、少なくとも1つの前記ヌクレオチド類似体はロックされた核酸（LNA）；例えばヌクレオチド類似体の少なくとも3または少なくとも4、または少なくとも5、または少なくとも6、または少なくとも7、または8つはLNAである。いくつかの実施形態においては、全てのヌクレオチド類似体がLNAであってもよい。
【０１２０】
ヌクレオチドだけから成る好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列と呼ぶ場合、その配列により定義される本発明のオリゴマーは、前記配列に存在する1以上のヌクレオチドの代わりに、オリゴマー／標的2本鎖の2本鎖安定性／Tmを上昇させる対応するヌクレオチド類似体（すなわちアフィニティ増強ヌクレオチド類似体）、例えばLNAユニットまたは他のヌクレオチド類似体を含みうることは理解されるであろう。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、オリゴマーのヌクレオチド配列と標的配列との間のいずれかのミスマッチは好ましくはアフィニティを増強するヌクレオチド類似体の外側の領域で見出され、例えば本明細書で称する領域B、および／または本明細書で称する領域Dおよび／または非改変の部位、例えばオリゴヌクレオチド中のDNAヌクレオチドおよび／または連続ヌクレオチド配列の5'または3'の領域において見出される。
【０１２２】
かかるヌクレオチドの改変の例には、2'-置換基を与えるかまたは架橋した（ロックされた核酸）構造を生じる糖部分の改変が含まれ、これは結合アフィニティを増強しかつまたヌクレアーゼ耐性の増加を与えうる。
【０１２３】
好ましいヌクレオチド類似体はLNA、例えばオキシ-LNA（例えばβ-D-オキシ-LNA、およびα-L-オキシ-LNA）、および／またはアミノ-LNA（例えばβ-D-アミノ-LNAおよびα-L-アミノ-LNA）および／またはチオ-LNA（例えばβ-D-チオ-LNAおよびα-L-チオ-LNA）および／またはENA（例えばβ-D-ENAおよびα-L-ENA）である。最も好ましいのはβ-D-オキシ-LNAである。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマー（例えば、本明細書に記載の領域AおよびCにおける）内に存在するヌクレオチド類似体は、独立して、例えば：2'-O-アルキル-RNAユニット、2'-アミノ-DNAユニット、2'-フルオロ-DNAユニット、LNAユニット、アラビノ核酸（ANA）ユニット、2'-フルオロ-ANAユニット、HNAユニット、INA（挿入核酸〜本明細書に参照により組み入れられるChristensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30： 4918-4925）ユニットおよび2'MOEユニットから選択される。いくつかの実施形態においては、ヌクレオチド類似体の上記タイプの1つだけが本発明のオリゴマー、またはその連続ヌクレオチド配列中に存在する。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド類似体は2'-O-メトキシエチル-RNA（2'MOE）、2'-フルオロ-DNAモノマーまたはLNAヌクレオチド類似体であり、このようなものとして、本発明のオリゴヌクレオチドはこれらの3つの型の類似体から独立して選択されるヌクレオチド類似体を含んでもよく、または3つの型から選択されるただ1つの型の類似体を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド類似体の少なくとも1つは2'-MOE-RNA、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10個の2'-MOE-RNAヌクレオチドユニットである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド類似体の少なくとも1つは2'-フルオロDNA、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10個の2'-フルオロ-DNAヌクレオチドユニットである。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、本発明によるオリゴマーは少なくとも1つのロックされた核酸（LNA）ユニット、例えば1、2、3、4、5、6、7、または8つのLNAユニット、例えば3〜7または4〜8つのLNAユニット、または3、4、5、6または7つのLNAユニットを含む。いくつかの実施形態において、全ての類似体はLNAである。いくつかの実施形態において、オリゴマーはβ-D-オキシ-LNAと、1以上の次のLNAユニット：β-Dまたはα-L立体配置のいずれかまたはそれらの組合わせのチオ-LNA、アミノ-LNA、オキシ-LNA、および／またはENAの両方を含んでもよい。いくつかの実施形態において、全てのLNAシトシンユニットは5'メチル-シトシンである。本発明のいくつかの実施形態において、オリゴマーはLNAとDNAユニットの両方を含んでもよい。好ましくはLNAとDNAユニットの組合わせた合計は10〜25、好ましくは10〜20、さらにより好ましくは12〜16である。本発明のいくつかの実施形態において、オリゴマーのヌクレオチド配列、例えば連続ヌクレオチド配列は少なくとも1つのLNAから成り、残りのヌクレオチドユニットはDNAユニットである。いくつかの実施形態において、オリゴマーは、任意に改変されたヌクレオチド間の結合、例えばホスホロチオエートをもつLNAヌクレオチド類似体および天然のヌクレオチド（例えばRNAまたはDNA、最も好ましくはDNAヌクレオチド）だけを含む。
【０１２７】
用語「核酸塩基」は、ヌクレオチドの塩基部分を意味し、天然ならびに非天然の変異体を包含する。従って、「核酸塩基」は公知のプリンおよびピリミジンヘテロ環だけでなく、ヘテロ環式類似体およびその互変異性体も含む。
【０１２８】
核酸塩基の例は、限定されるものでないが、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、5-メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、オリゴマー中に存在する少なくとも1つの核酸塩基は5-メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンからなる群より選択される改変された核酸塩基である。
【０１３０】
LNA
用語「LNA」は「ロックされた核酸」として知られる二環式ヌクレオチド類似体を意味する。これはLNAモノマーを意味しうるし、または「LNAオリゴヌクレオチド」の文脈で使用するときは、1以上の、かかる二環式ヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１３１】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物に使用するLNAは、好ましくは一般式I：
【化２】
2011505124.tif 000004
【０１３２】
［式中、Xは-O-、-S-、-N（RN*）-、-C（R6R6*）-から選択され；
Bは水素、任意に置換されたC1-4-アルコキシ、任意に置換されたC1-4-アルキル、任意に置換されたC1-4-アシルオキシ、核酸塩基、DNAインターカレーター、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され；
Pは次のモノマー、または5'-末端基とのヌクレオチド間結合のラジカル位置を記し、かかるヌクレオチド間結合または5'-末端基は任意に置換基R5または等しく適用しうる置換基R5*を含み；
P*は先行するモノマーとのヌクレオチド間結合、または3'-末端基を示し；
R4*とR2*は一緒に-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zから選択される1〜4つの基／原子から成る二価の基（biradical）を示し、
ここで、Zは-O-、-S-、および-N(Ra)-から選択され、RaとRbはそれぞれ独立して水素、任意に置換されたC1-12-アルキル、任意に置換されたC2-12-アルケニル、任意に置換されたC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは任意に置換されていてもよく、そしてここで、2つの双子の置換基RaとRbは一緒に任意に置換されたメチレン(=CH2)を示してもよく、そして存在する置換基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6およびR6*のそれぞれは独立して水素、任意に置換されたC1-12-アルキル、任意に置換されたC2-12-アルケニル、任意に置換されたC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは任意に置換されていてもよく、ここで2つの双子の置換基は一緒にオキソ、チオキソ、イミノ、または任意に置換されたメチレンを示してもよく、または一緒に、-O-、-S-、および-（NRN）-から選択される1以上のヘテロ原子／基により任意に中断および／または終結された1〜5個の炭素原子アルキレン鎖から成るスピロの2つの基を形成してもよく、ここで、RNは水素およびC1-4-アルキルから選択され、そしてここで、2つの隣接した（非双子）置換基は二重結合となるさらなる結合を示し；そしてRN*は、存在しかつ2つの基に関わらない場合、水素およびC1-4-アルキルから選択される］の構造ならびにその塩基塩および酸付加塩を有する。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、R5*はH、-CH3、-CH2-CH3,-CH2-O-CH3、および-CH=CH2から選択される。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、R4*とR2*は一緒に、-C(RaRb)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、-C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-N(Rc)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-、-C(RaRb)-N(Rc)-O-、および-C(RaRb)-S-、-C(RaRb)-C(RcRd)-S-から選択される2つの基を示し、ここでRa、Rb、Rc、Rd、Re、およびRfはそれぞれ独立して、水素、任意に置換されたC1-12-アルキル、任意に置換されたC2-12-アルケニル、任意に置換されたC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学活性基、熱化学活性基、キレート基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここで、アリールとヘテロアリールは任意に置換されていてもよく、そしてここで2つの双子の置換基RaとRbは一緒に任意に置換メチレン（=CH2）を示してもよい。
【０１３５】
さらなる実施形態において、R4*とR2*は一緒に、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-N(CH3)-、-CH2-CH2-O-、-CH2-CH(CH3)-、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH(CH3)-、-CH=CH-CH2-、-CH2-O-CH2-O-、-CH2-NH-O-、-CH2-N(CH3)-O-、-CH2-O-CH2-、-CH(CH3)-O-、-CH(CH2-O-CH3)-O-から選択される二価の基（biradical）を示す。
【０１３６】
全てのキラル中心に対して、不斉基はRまたはS配向のいずれかで見出すことができる。
【０１３７】
好ましくは、本発明のオリゴマーで使用するLNAは、式：
【化３】
2011505124.tif 000005
【０１３８】
［式中、Yは-O-、-O-CH2-,-S-、-NH-、またはN(RH)であり；ZおよびZ*は独立してヌクレオチド間結合、末端基または保護基の中から選択され；
Bは自然または非自然のヌクレオチド塩基部分を構成し、そしてRHは水素 および C1-4-アルキルから選択される］
のいずれかで表される少なくとも1つのLNAユニットを含む。
【０１３９】
具体的に好ましいLNAユニットをスキーム2：
【化４】
2011505124.tif 000006
【０１４０】
に示す。
【０１４１】
用語「チオ-LNA」は、上記一般式中のYがSまたは-CH2-S-から選択される、ロックされたヌクレオチドを含む。チオ-LNAはβ-Dおよびα-L-立体配置の両方でありうる。
【０１４２】
用語「アミノ-LNA」は、上記一般式中のYが-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-、および-CH2-N(R)-から選択され、ここでRは水素およびC1-4-アルキルから選択されるロックされたヌクレオチドを含む。アミノ-LNAはβ-Dおよびα-L-立体配置の両方でありうる。
【０１４３】
用語「オキシ-LNA」は、上記一般式中のYが-O-または-CH2-O-を表す、ロックされたヌクレオチドを含む。オキシ-LNAβ-Dおよびα-L-立体配置の両方でありうる。
【０１４４】
用語「ENA」は、上記一般式中のYが-CH2-O-（ここでCH2-O-の酸素原子は塩基Bに対して2'-位置に結合している）であるロックされたヌクレオチドを含む。
【０１４５】
好ましい実施形態において、LNAはβ-D-オキシ-LNA、α-L-オキシ-LNA、β-D-アミノ-LNAおよびβ-D-チオ-LNA、特にβ-D-オキシ-LNAから選択される。
【０１４６】
RNAse動員
オリゴマー化合物は標的mRNAの非RNAse介在性分解、例えば、翻訳の立体障害、または他の方法を介して機能しうると理解されている、しかし、本発明の好ましいオリゴマーはエンドリボヌクレアーゼ（RNAse）、例えばRNAse Hを動員することができる。
【０１４７】
オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列は少なくとも6、例えば少なくとも7連続ヌクレオチドユニット、例えば少なくとも8または少なくとも9連続ヌクレオチドユニット（残基）の領域を含み、例えば7、8、9、10、11、12、13、14、15または16連続ヌクレオチドを含み、相補標的RNAと2本鎖を形成するとRNAseを動員できることが好ましい。RNAseを動員できる連続配列は、本明細書に記載のギャップマーの文脈で参照される領域Bでありうる。いくつかの実施形態において、RNAseを動員できる連続配列、例えば領域Bのサイズはさらに高く、例えば10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20ヌクレオチドユニットでありうる。
【０１４８】
EP 1 222 309はRNAse H活性を決定するin vitroの方法を提供しており、これを用いてRNAse Hを動員する能力を決定することができる。あるオリゴマーは、もし相補RNA標的と共に提供されると、RNAse Hを動員できると思われ、その動員は、EP1222309の実施例91〜95に提供された手法を用い、pmol/l/minで測定して、2'置換が無く、オリゴヌクレオチド中の全ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基をもつ等価DNAだけのオリゴヌクレオチドの少なくとも1％、例えば少なくとも5％、例えば少なくとも10％または20％未満の初期速度を有する。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、あるオリゴマーは、もし相補RNA標的、およびRNAse Hと共に提供されると、本質的にRNAse Hを動員することができないと思われ、RNAse H初期速度は、EP1222309の実施例91〜95に提供された手法を用いて、pmol/l/minで測定して、2'置換が無く、オリゴヌクレオチド中の全ヌクレオチド間にホスホロチオエート結合基をもつ等価DNAだけのオリゴヌクレオチドを用いて決定した初期速度の1％未満、例えば5％未満、例えば10％未満または20％未満である。
【０１５０】
他の実施形態においては、あるオリゴマーは、もし、相補RNA標的、およびRNAse Hと共に提供されると、本質的にRNAse Hを動員できると思われ、RNAse H初期速度は、pmol/l/minで測定して、EP1222309の実施例91〜95に提供された手法を用いて、2'置換なしの、オリゴヌクレオチド中の全ヌクレオチドの間のホスホロチオエート結合基を伴う等価DNAだけのオリゴヌクレオチドを用いて決定した初期速度の少なくとも20％、例えば少なくとも40％、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも80％である。
【０１５１】
典型的には、相補標的RNAと2本鎖を形成するとRNAseを動員できる連続ヌクレオチドユニットを形成するオリゴマーの領域は、RNA標的とDNA/RNA様2本鎖を形成するヌクレオチドユニットから成り、DNAユニットとα-L立体配置であるLNAユニット（特に好ましくはα-L-オキシLNA）の両方を含む。
【０１５２】
本発明のオリゴマーは、ヌクレオチドとヌクレオチド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含むものであってもよく、ギャップマー（gapmer）、ヘッドマー（headmer）またはミクスマー（mixmer）の形であってもよい。
【０１５３】
ヘッドマーは、5'末端の非RNAse動員性ヌクレオチド類似体の連続鎖と次いで3'末端へ向かってRNAseにより認識および切断可能なDNAまたは改変ヌクレオチドユニットの連続鎖（例えば少なくとも7つのかかるヌクレオチド）により定義され、そしてテイルマー（tailmer）は5'末端でRNAseにより認識および切断可能なDNAまたは改変されたヌクレオチドの連続鎖（例えば少なくとも7つのかかるヌクレオチド）と次いで3'末端へ向かっての非RNAse動員性ヌクレオチド類似体の連続鎖により定義される。ミクスマーと呼ばれる本発明による他のキメラは、RNAseにより認識および切断可能なDNAまたは改変ヌクレオチドと非RNAse動員性ヌクレオチド類似体の交互の組成物から成る。いくつかのヌクレオチド類似体がRNAse H結合および切断に介在することも可能である。α-L-LNAはRNAse活性をある程度動員するので、ギャップマー構築のためのDNAまたはRNAse Hにより認識および切断可能な改変ヌクレオチドに必要とされるギャップが小さくなり、ミクスマー構築により高い柔軟性を導入することができる。
【０１５４】
ギャップマー設計
好ましくは、本発明のオリゴマーはギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、RNAse、例えばRNAse Hを動員できるヌクレオチドの連続鎖、例えば、本明細書において領域Bと呼ばれる少なくとも6または7つのDNAヌクレオチドの領域を含むオリゴマーであり、ここで、領域Bは、アフィニティを増強するヌクレオチド類似体、例えば、RNAseを動員できるヌクレオチドの連続鎖に対して5'および3'の1〜6つのヌクレオチド類似体と5'および3'の両方で隣接する（これらの領域はそれぞれ領域AおよびCと呼ばれる）。
【０１５５】
好ましくは、ギャップマーは式（5'から3'へ）A-B-C、または任意にA-B-C-DまたはD-A-B-Cの(ポリ)ヌクレオチド配列を含み、ここで、領域A（5'領域）は少なくとも1つのヌクレオチド類似体、例えば少なくとも1つのLNAユニット、例えば1〜6つのヌクレオチド類似体、例えばLNAユニットから成るかまたは含み；そして領域BはRNAseを動員できる少なくとも5つの連続ヌクレオチド（相補RNA分子例えばmRNA標的と2本鎖で形成される場合）、例えばDNAヌクレオチドから成るかまたは含み；そして領域C（3'領域）は少なくとも1つのヌクレオチド類似体、例えば少なくとも1つのLNAユニット、例えば1〜6つのヌクレオチド類似体、例えばLNAユニットから成るかまたは含み；そして領域Dは、存在する場合、1、2または3つのヌクレオチドユニット、例えばDNAヌクレオチドから成るかまたは含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、領域Aは1、2、3、4、5または6ヌクレオチド類似体、例えばLNAユニット、例えば2〜5つのヌクレオチド類似体、例えば2〜5つのLNAユニット、例えば3または4つのヌクレオチド類似体、例えば3または4つのLNAユニットから成り；および／または領域Cは1、2、3、4、5または6ヌクレオチド類似体、例えばLNAユニット、例えば2〜5つのヌクレオチド類似体、例えば2〜5つのLNAユニット、例えば3または4つのヌクレオチド類似体、例えば3または4つのLNAユニットから成る。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、Bは、RNAseを動員できる5、6、7、8、9、10、11または12連続ヌクレオチド、またはRNAseを動員できる6〜10、または7〜9、例えば8つの連続ヌクレオチドから成るかまたは含む。いくつかの実施形態において、領域Bは少なくとも1つのDNAヌクレオチドユニット、例えば1〜12 DNAユニット、好ましくは4〜12 DNAユニット、より好ましくは6〜10 DNAユニット、例えば7〜10 DNAユニット、最も好ましくは8、9または10 DNAユニットから成るかまたは含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、領域Aは3または4 ヌクレオチド類似体、例えばLNAから成り、領域Bは7、8、9または10 DNAユニットから成り、そして領域Cは3または4 ヌクレオチド類似体、例えばLNAから成る。かかる設計は、（A-B-C）3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3を含み、かつさらに1または2 ヌクレオチドユニット、例えばDNAユニットを有しうる領域Dを含んでもよい。
【０１５９】
さらなるギャップマー設計はWO2004/046160に開示されており、これは本明細書に参照により組み入れられる。
【０１６０】
本明細書に参照により組み入れられる米国予備特許出願第60/977409号は「ショートマー」ギャップマーオリゴマーに言及しており、これは、いくつかの実施形態において本発明によるギャップマーオリゴマーでありうる。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、オリゴマーは合計10、11、12、13または14ヌクレオチドユニットの連続ヌクレオチド配列からなり、ここで連続ヌクレオチド配列は式（5'-3'）A-B-C、または任意にA-B-C-DまたはD-A-B-Cにより表され、ここで：Aは1、2または3ヌクレオチド類似体、例えばLNAユニットからなり；Bは相補的RNA分子（例えば、mRNA標的）と二本鎖を形成するとRNAse Hを動員できる7、8または9ヌクレオチドユニットからなり；そしてCは1、2または3ヌクレオチド類似体ユニット、例えばLNAユニットからなる。Dは、存在する場合、単一DNAユニットからなる。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、Aは1 LNAユニットからなる。いくつかの実施形態において、Aは2 LNAユニットからなる。いくつかの実施形態において、Aは3 LNAユニットからなる。いくつかの実施形態において、Cは1 LNAユニットからなる。いくつかの実施形態において、Cは2 LNAユニットからなる。いくつかの実施形態において、Cは3 LNAユニットからなる。いくつかの実施形態において、Bは7 ヌクレオチドユニットからなる。いくつかの実施形態において、Bは8 ヌクレオチドユニットからなる。いくつかの実施形態において、Bは9 ヌクレオチドユニットからなる。いくつかの実施形態において、Bは1〜9 DNAユニット、例えば、2、3、4、5、6、7または8 DNAユニットからなる。いくつかの実施形態において、BはDNAユニットからなる。いくつかの実施形態において、Bはα-L立体配置である少なくとも1つのLNAユニット、例えば、α-L-立体配置の2、3、4、5、6、7、8または9 LNAユニットから成る。いくつかの実施形態において、Bは少なくとも1つのα-L-オキシLNAユニットから成り、またはここで全てのα-L-立体配置のLNAユニットはα-L-オキシLNAユニットである。いくつかの実施形態において、A-B-C中に存在するヌクレオチド数は、（ヌクレオチド類似体ユニット-領域B-ヌクレオチド類似体ユニット）：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4、または；1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4、または；1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、A-B-C中のヌクレオチド数は2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4、および 4-7-3からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、AとCの両方はそれぞれ2LNAユニットから成り、そしてBは8または9ヌクレオチドユニット、好ましくはDNAユニットから成る。
【０１６３】
ヌクレオチド間結合
用語「結合基」または「ヌクレオチド間結合」は、2つのヌクレオチド、2つのヌクレオチド類似体、および１つのヌクレオチドと１つのヌクレオチド類似体などを共有結合により一緒に結合できる基を意味することを意図している。具体的なかつ好ましい例にはリン酸基およびホスホロチオエート基が含まれる。
【０１６４】
本発明のオリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドは結合基を介して一緒に結合されている。各ヌクレオチドが結合基を介して3'隣接ヌクレオチドと結合されているのが好適である。
【０１６５】
好適なヌクレオチド間結合には、PCT/DK2006/000512に記載のもの、例えばPCT/DK2006/000512の34頁の第一段落に記載のヌクレオチド間結合が含まれる（本明細書に参照により組み入れられる）。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、その正常なホスホジエステルから、ヌクレアーゼ攻撃にもっと耐性のあるもの、例えばホスホロチオエートまたはボラノホスフェートへ改変することが好ましく、この2つはRNAse Hにより切断可能であって、標的遺伝子の発現を低下するアンチセンス阻害の経路も可能にする。
【０１６７】
本明細書に提供される好適な硫黄（S）を含有するヌクレオチド間結合も好ましいであろう。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合もまた、特にギャップマーのギャップ領域（B）において好ましい。ホスホロチオエート結合はまた、隣接する領域（AおよびC、ならびにAまたはCのDとの結合、ならびに適宜、領域D内）に用いることができる。
【０１６８】
しかし、特に、例えばヌクレオチド類似体の使用により領域AおよびC内のヌクレオチド間結合がエンドヌクレアーゼ分解から保護される場合、例えば、領域AおよびCがLNA核酸塩基を含む場合、領域A、BおよびCは、ホスホロチオエート結合以外のヌクレオチド間結合、例えばホスホジエステルを含んでもよい。
【０１６９】
オリゴマーのヌクレオチド間結合は、標的化RNAのRNAse H切断を可能にするために、ホスホジエステル、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートであってもよい。ホスホロチオエートは、ヌクレアーゼ耐性の改善とその他の理由、例えば製造が容易であるので好ましい。
【０１７０】
本発明のオリゴマーの一態様においては、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体をホスホロチオエート基を用いてお互いに結合する。
【０１７１】
ホスホジエステル結合、例えば、1または2つの結合の、そうでなければホスホロチオエートオリゴマー中への、特にヌクレオチド類似体ユニットの間またはそれに隣接して（典型的には領域AおよびまたはCにおいて）の封入は、オリゴマーのバイオアベイラビリティおよび／または生体分布を改変できることは理解されている（本明細書に参照により組み入れられるWO2008/053314を参照）
いくつかの実施形態、例えば上記実施形態において、好適なかつ具体的に示してない、全ての残りの結合基はホスホジエステルまたはホスホロチオエートのいずれか、またはそれらの混合物である。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、全てのヌクレオチド間結合基はホスホロチオエートである。
【０１７３】
具体的なギャップマーオリゴヌクレオチド配列、例えば、本明細書に提供されているものに言及すると、様々な実施形態において、結合がホスホロチオエート結合である場合、ヌクレオチド類似体、例えばLNAユニット間の結合に、代わりの結合、例えば、本明細書に開示したものを用いることができ、例えば、リン酸（ホスホジエステル）結合を用いることができることは理解されるであろう。同様に、具体的なギャップマーオリゴヌクレオチド配列、例えば、本明細書に提供されたものに言及すると、C残基が5'メチル改変シトシンとして注釈付きである場合、様々な実施形態において、オリゴマー中に存在する1以上のCは、いくつかの実施形態において、未改変のC残基であってもよい。
【０１７４】
オリゴマー化合物
本発明のオリゴマーは、例えば、29〜55または56〜148からなる群より選択することができる。特に好ましい化合物には、必ずしも限定されるものでないが、配列番号67および77が含まれる。
【０１７５】
コンジュゲート
本文脈において、用語「コンジュゲート」は、本明細書に記載のオリゴマーの、１以上の非ヌクレオチド／または非ポリヌクレオチド部分との共有結合（コンジュゲーション）によって形成される異種分子を示すことを意図する。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例には、高分子物質、例えばタンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはそれらの組み合わせが含まれる。典型的には、タンパク質が標的タンパク質の抗体であってもよい。典型的なポリマーはポリエチレングリコールであってもよい。
【０１７６】
それ故に、様々な実施形態において、本発明のオリゴマーは、典型的にはヌクレオチドの連続配列から成るポリヌクレオチド領域とさらなる非ヌクレオチド領域の両方を含みうる。連続ヌクレオチド配列から成る本発明のオリゴマーに言及する場合、その化合物は非ヌクレオチド成分、例えばコンジュゲート成分を含みうる。
【０１７７】
いくつかの本発明の実施形態において、例えば、オリゴマーの細胞取込みを増加させるために、オリゴマー（化合物）をリガンドまたはコンジュゲートと結合する。いくつかの実施形態において、コンジュゲートはステロール、例えばコレステロールである。
【０１７８】
本発明のオリゴマーはまた、活性のある薬物、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ薬、抗糖尿病薬、抗細菌薬または抗生物質とコンジュゲートしてもよい。
【０１７９】
本発明の様々な実施形態において、オリゴマー化合物を、オリゴマー化合物の細胞取込みを増加するために、例えば、リガンド／コンジュゲートと結合する。本明細書に参照により組み入れられるWO2007/031091は、好適なリガンドおよびコンジュゲートを提供する。
【０１８０】
本発明はまた、本明細書に記載した本発明による化合物、および前記化合物と共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド 部分を含むコンジュゲートを提供する。それ故に、本発明の化合物が本明細書に開示した具体的な核酸またはヌクレオチド配列から成る様々な実施形態において、その化合物はまた、前記化合物と共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（例えば1以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含まない）を含んでもよい。
【０１８１】
（コンジュゲート部分との）コンジュゲーションは本発明のオリゴマーの活性、細胞分布または細胞取込みを促進することができる。かかる部分には、限定されるものでないが、抗体、ポリペプチド、脂質部分、例えばコレステロール部分、胆汁酸、チオエーテル、例えばヘキシル-s-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム 1,2-ジ-o-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-h-ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれる。
【０１８２】
本発明のオリゴマーはまた、活性薬、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ薬、抗糖尿病薬、抗細菌薬または抗生物質とコンジュゲートしてもよい。
【０１８３】
ある特定の実施形態において、コンジュゲートされた部分はステロール、例えばコレステロールである。
【０１８４】
様々な実施形態において、コンジュゲートされた部分は、正電荷ポリマー、例えば、長さで1〜50、例えば2〜20、例えば3〜10アミノ酸残基の、例えば正電荷ペプチド、および／またはポリアルキレンオキシド、例えばポリエチレングリコール（PEG）またはポリプロピレングリコール（本明細書に参照により組み入れられるWO 2008/034123を参照）を含むかまたは成る。好適には、正電荷ポリマー、例えばポリアルキレンオキシドを本発明のオリゴマーとリンカー、例えば、WO 2008/034123に記載の放出可能なリンカーを介して結合してもよい。例として挙げれば、次のコンジュゲート部分：
【化５】
2011505124.tif 000007
【０１８５】
を本発明のコンジュゲートに用いることができる。
【０１８６】
活性化オリゴマー
本明細書で使用する用語「活性化オリゴマー」は少なくとも1つの官能基部分と共有結合で結合された（すなわち、官能化された）本発明のオリゴマーを意味し、前記官能基部分はオリゴマーの1以上のコンジュゲートされる部分、すなわち、それ自体は本明細書に記載のコンジュゲートを形成する核酸またはモノマーでない部分との結合を可能にして本明細書に記載のコンジュゲートを形成する。典型的には、官能基部分は、例えば、3'-ヒドロキシル基またはアデニン塩基の環外NH2基、好ましくは親水性であるスペーサーおよびコンジュゲートされた部分と結合できる末端基（例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基）を介してオリゴマーと共有結合できる化学基を含みうる。いくつかの実施形態において、この末端基は保護されてない、例えば、NH2基である。他の実施形態において、末端基は、例えば、任意の好適な保護基、例えば、“Protective Groups in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition （John Wiley & Sons、1999）に記載のものにより、保護されている。好適なヒドロキシル保護基の例には、エステル、例えば酢酸エステル、アラルキル基、例えばベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチル、およびテトラヒドロピラニルが含まれる。好適なアミノ保護基には、ベンジル、α-メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、およびアシル基、例えばトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルが含まれる。いくつかの実施形態において、官能基部分は自己切断性である。他の実施形態において、官能基部分は生物分解性である。例えば、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる米国特許第7,087,229号を参照されたい。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴマーは、コンジュゲートされる部分がオリゴマーの5'末端と共有結合できるようにするため、5'末端が官能化されている。他の実施形態においては、本発明のオリゴマーを3'末端で官能化してもよい。さらに他の実施形態においては、本発明のオリゴマーを骨格沿いにまたはヘテロ環塩基部分上で官能化することができる。なお他の実施形態においては、本発明のオリゴマーを独立して5'末端、3'末端、骨格および塩基から選択される1以上の位置で官能化することができる。
【０１８８】
いくつかの実施形態においては、本発明の活性化オリゴマーを、合成中に官能基部分と共有結合した1以上のモノマーを組み込むことにより合成する。他の実施形態においては、本発明の活性化オリゴマーを、官能化されてないモノマーを用いて合成し、そしてオリゴマーを合成の完了時に官能化する。いくつかの実施形態においては、オリゴマーを、アミノアルキルリンカーを含有する回転障害エステルを用いて官能化し、ここでアルキル部分は式(CH2)w、（式中、wは1〜10の整数、好ましくはほぼ6である）であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖または分枝鎖であってもよく、そして官能基はオリゴマーとエステル基（-O-C(O)-(CH2)wNH）を介して結合している。
【０１８９】
他の実施形態においては、オリゴマーを、(CH2)w-スルフヒドリル（SH）リンカーを含有する回転障害エステルを用いて官能化し、ここでwは1〜10の整数、好ましくはほぼ6であり、アルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖または分枝鎖であってもよく、そして官能基はオリゴマーとエステル基（-O-C(O)-(CH2)wSH）を介して結合している。
【０１９０】
いくつかの実施形態においては、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドを、ポリマー部分、例えばポリエチレングリコールまたはペプチドと（ジスルフィド結合の形成を介して）コンジュゲートする。
【０１９１】
本明細書に記載の回転障害エステルを含有する活性化オリゴマーは、任意の当技術分野で公知の方法により、特に、本明細書に参照によりその全てが組み入れられるPCT公報WO 2008/034122およびその実施例に開示された方法により合成することができる。
【０１９２】
さらに他の実施形態において、本発明のオリゴマーは、実質的に米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に記載の官能化試薬（すなわち、1つの末端にホスホロアミダイトを有し、親水性スペーサー鎖を介して、保護または非保護スルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を含む反対側の末端と結合した実質的に直鎖の試薬）を用いて、スルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基をオリゴマー中に導入することにより官能化される。かかる試薬は主にオリゴマーのヒドロキシル基と反応する。いくつかの実施形態において、かかる活性化オリゴマーはオリゴマーの5'-ヒドロキシル基と結合した官能化試薬を有する。他の実施形態において、活性化オリゴマーは3'-ヒドロキシル基と結合した官能化試薬を有する。さらに他の実施形態において、本発明の活性化オリゴマーは、オリゴマーの骨格上のヒドロキシル基と結合した官能化試薬を有する。なお、さらなる実施形態においては、本発明のオリゴマーは、本明細書に参照によりその全てが組み入れられる米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に記載の1以上の官能化試薬によって官能化される。かかる官能化試薬を合成しかつそれらをモノマーまたはオリゴマー中に組み込む方法は、米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に開示されている。
【０１９３】
いくつかの実施形態においては、固相に結合されたオリゴマーの5'末端をジエニルホスホロアミダイト誘導体によって官能化し、次いで脱保護したオリゴマーを、Diels-Alder環付加反応を介して、例えばアミノ酸またはペプチドとコンジュゲートする。
【０１９４】
様々な実施形態においては、2'-糖修飾体、例えば2'-カルバマート置換された糖または2'-(O-ペンチル-N-フタルイミド)-デオキシリボース糖を含有するモノマーのオリゴマー中への組込みは、コンジュゲート部分のオリゴマーの糖類との共有結合を容易にする。他の実施形態においては、1以上のモノマーの2'-位置にアミノを含有するリンカーをもつオリゴマーを、例えば、5'-ジメトキシトリチル-2'-O-（e-フタルイミジルアミノペンチル）-2'-デオキシアデノシン-3'-N,N-ジイソプロピル-シアノエトキシ ホスホロアミダイトなどの試薬を用いて調製する。例えば、Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171を参照されたい。
【０１９５】
なお、さらなる実施形態において、本発明のオリゴマーは、N6プリンアミノ基、グアニンの環外N2、またはシトシンのN4または5位置を含む核酸塩基のアミン含有官能基部分を有してもよい。様々な実施形態において、かかる官能化は、オリゴマー合成で既に官能化された市販試薬を用いることにより達成することができる。
【０１９６】
いくつかの官能基部分は市販されていて、例えば、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性結合部分はPierce Co. （Rockford, Ill.）から市販されている。他の市販の結合基は5'-アミノ-改変因子C6および3'-アミノ-改変因子試薬であって、両方ともGlen Research Corporation （Sterling, Va.）から市販されている。5'-アミノ-改変因子C6はまた、ABI（Applied Biosystems Inc., Foster City, Calif.）からAminolink-2として、また3'-アミノ-改変因子はまた、Clontech Laboratories Inc.（Palo Alto, Calif.）から市販されている。
【０１９７】
組成物
本発明のオリゴマーは医薬品製剤および組成物に用いることができる。好適には、かかる組成物は製薬上許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。PCT/DK2006/000512は好適なかつ好ましい製薬上許容される希釈剤、担体およびアジュバントを提供しており、本明細書に参照により組み入れられる。好適な用量、製剤、投与経路、組成物、投与剤形、他の治療薬との組合わせ、プロドラッグ製剤もPCT/DK2006/000512に提供されていて、本明細書に参照により組み入れられる。
【０１９８】
応用
本発明のオリゴマーは、例えば診断、治療および予防用の研究試薬として利用することができる。
【０１９９】
研究において、かかるオリゴマーを用いて、細胞および実験動物においてPIK3CAタンパク質の合成を特異的に阻害し（典型的にはmRNAを変質または阻害し、それによりタンパク質形成を阻止することにより）、それにより標的の機能的分析または治療介入の標的としての有用性の査定を促進することができる。
【０２００】
診断において、オリゴマーを用いて、細胞および組織におけるPIK3CA発現を、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーションまたは類似の技法により、検出および定量することができる。
【０２０１】
治療薬については、PIK3CAキナーゼの発現をモジュレーションすることにより治療できる疾患または障害を有すると疑われる動物またはヒトを、本発明によるアンチセンス化合物を投与することにより治療する。かかる障害には、過増殖性障害、例えば癌が含まれる。さらに、PIK3CAキナーゼの発現に関係する疾患または症状を有するかまたは傾向があると疑われる哺乳動物を治療する、例えばヒトを、1以上の本発明のオリゴマーまたは組成物の治療上または予防上有効な量を投与することにより治療する方法が提供される。
【０２０２】
当技術分野の指導的科学者は、PIK3CAによる医薬品介入が、例えば本明細書に言及している癌に対する治療選択肢をもたらしうることを示唆している。
【０２０３】
本発明はまた、本明細書に記載したオリゴマー、組成物またはコンジュゲートの医薬品としての使用にも関する。
【０２０４】
本発明によるオリゴマーおよび他の組成物は、PIK3CAの変異バージョンの過剰発現または発現に関係する症状の治療に用いることができる。
【０２０５】
本発明はさらに、本明細書で言及した疾患、障害または症状を治療するための医薬品の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
【０２０６】
一般的に言えば、いくつかの態様において、本発明はPIK3CAの異常なレベルに関係する症状を患うかまたは感受性のある哺乳動物を治療する方法であって、その哺乳動物に、1以上のLNAユニットを含むPIK3CAを標的化するオリゴマーの治療上有効な量を投与するステップを含むものである前記方法に関する。本発明の方法は、好ましくは、PIK3CAの異常なレベルが引き起こす疾患に対する治療または予防のために使われる。代わって言えば、いくつかの実施形態において、本発明はさらにPIK3CAの異常なレベルを治療する方法であって、本発明のオリゴマー、または本発明のコンジュゲートまたは本発明の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含むものである前記方法に関する。
【０２０７】
本発明によるオリゴマーおよび他の組成物は、PIK3CAまたはPIK3CAの変異バージョンの過剰発現または発現に関係する症状を治療するために用いることができる。
【０２０８】
本明細書で言及する疾患または障害は、いくつかの実施形態において、PIK3CA遺伝子の突然変異またはそのタンパク質産物がPIK3CAに関係するかまたは相互作用する遺伝子の突然変異に関係がありうる。それ故に、いくつかの実施形態において、標的mRNAはPIK3CA配列の突然変異型である。
【０２０９】
本発明によるオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物は典型的には有効な量だけ投与される。
【０２１０】
本発明の興味深い態様は、本明細書にて言及した疾患、障害または症状を治療する医薬品を調製するための、本明細書に定義したオリゴマー（化合物）または本明細書に定義したコンジュゲートの使用に関する。
【０２１１】
本発明はさらに、PIK3CAの異常なレベルまたはPIK3CAの突然変異体（例えば対立遺伝子変異体、例えば本明細書で言及した疾患の1つに関係するもの）の発現を治療する医薬品を製造するための、本明細書に定義した化合物、組成物、またはコンジュゲートの使用に関する。
【０２１２】
さらに、本発明は、例えば本明細書で言及した疾患または症状を患う被験者を治療する方法に関する。
【０２１３】
治療を必要とする患者は、前記疾患または障害を患うかまたは恐らく患っている患者（被験者）である。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、本明細書で使用する用語「治療」は、現存する疾患（例えば、本明細書で言及した疾患または障害）の治療、または疾患の防止（すなわち予防）の両方を意味する。それ故に、本明細書で言及する治療はいくつかの実施形態においては予防であってもよいと理解されうる。
【０２１５】
本発明によるオリゴマー、コンジュゲートまたは医薬組成物は典型的には有効な量だけ投与される。
【０２１６】
本発明はまた、本明細書で言及した障害の治療用の医薬品を製造するための記載した本発明の化合物またはコンジュゲートの使用、または本明細書で言及した障害を治療する方法を提供する。
【０２１７】
本発明はまた、本明細書で言及した障害を治療する方法であって、本発明による化合物および／または本発明によるコンジュゲート、および／または本発明による医薬組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む前記方法を提供する。本発明による医薬組成物は、PIK3CAキナーゼの異常なレベルに関係する症状、例えば過増殖疾患および癌を治療するために用いることができる。本発明はまた、癌を治療する方法であって、本明細書に記載した本発明による化合物および／または本発明によるコンジュゲート、および／または本発明による医薬組成物をそれを必要とする患者に投与するステップを含む前記方法を提供する。本発明はまた、癌の治療用の医薬品を製造するための、または癌を治療する方法のための本発明に記載した本発明の化合物またはコンジュゲートの使用を提供する。
【０２１８】
好適な用量、製剤、投与経路、組成物、投与剤形、他の治療薬との組合わせ、プロドラッグ製剤はPCT/DK2006/000512（本明細書に参照により組み入れられる）にも提供されているが、癌の治療にだけ特異的に応用可能であるPCT/DK2006/000512の態様は本発明の治療／医薬組成物および方法に適当でないことは理解すべきである。
【０２１９】
本発明はまた、本明細書に記載した化合物もしくはコンジュゲートまたはコンジュゲートおよび製薬上許容される希釈剤、担体またはアジュバントを含む医薬組成物を提供する。PCT/DK2006/000512（本明細書に参照により組み入れられる）は、好適なおよび好ましい製薬上許容される希釈剤、担体およびアジュバントを提供する。
【０２２０】
いくつかの実施形態において、本明細書で使用する用語「治療」は現存する疾患（例えば本明細書で言及した癌）の治療、または疾患の防止（すなわち予防）の両方を意味する。それ故に、本明細書で言及した治療はいくつかの実施形態において、予防であってもよい。
【０２２１】
本発明はさらに、本明細書に開示したいずれかのおよび全ての症状を治療するための医薬品の製造における本発明の化合物の使用を提供する。
【０２２２】
一般に言えば、いくつかの態様において、本発明は、PIK3CAキナーゼの異常な、典型的には高い、レベルに関係する症状を患うかまたは感受性のある哺乳動物を治療する方法であって、その哺乳動物に、1以上のLNAユニットを含むPIK3CAを標的化するオリゴマーの治療上有効な量を投与するステップを含むものである前記方法に関する。
【０２２３】
本発明の興味深い態様は、本明細書に定義したオリゴマー（化合物）または本明細書に定義したコンジュゲートの、上記による症状を治療するための医薬品の調製のための使用に関する。
【０２２４】
本発明の方法は、いくつかの実施形態において、PIK3CAキナーゼの異常なレベルにより引き起こされる疾患に対する治療または予防のために使うことができる。
【０２２５】
さらに、本明細書に記載した本発明は、疾患を予防または治療する方法であって、かかる療法を必要とするヒトに対するPIK3CAキナーゼをモジュレーションするオリゴマーの治療上有効な量の投与を含むものである前記方法を包含する。本発明はさらに、PIK3CAキナーゼをモジュレーションするオリゴヌクレオチド化合物の投与の短期使用を包含する。
【０２２６】
代わりに言えば、本発明は、いくつかの実施形態においてさらに、PIK3CAキナーゼの異常なレベルを治療する方法であって、それを必要とする患者に、本発明のオリゴマー、または本発明のコンジュゲートまたは本発明の医薬組成物を投与するステップ、およびさらに、さらなる化学治療薬の投与を含むものである前記方法に関する。前記さらなる投与は、例えば、さらなる化学治療薬が本発明の化合物とコンジュゲートしているか、医薬組成物中に存在するか、または別の製剤で投与することであってもよい。
【０２２７】
本発明はまた、いくつかの態様において、医薬品として使用するための本明細書に定義したオリゴマー、組成物またはコンジュゲートに関する。
【０２２８】
本発明はさらに、本明細書に定義した化合物、組成物またはコンジュゲートの使用であって、PIK3CAキナーゼの異常なレベルまたはPIK3CAの突然変異体型（例えば対立遺伝子変異体、例えば本明細書で言及した疾患の1つと関係するもの）発現の治療用の医薬品を製造するための前記使用に関する。
【０２２９】
さらに、本発明は、過増殖疾患および癌、例えば本明細書に言及したものから選択される疾患または症状を患う被験者を治療する方法に関する。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、本発明は、PIK3CAとβカテニンの両方を発現している細胞においてPIK3CAとβカテニンの両方を阻害する方法であって、本発明によるオリゴマー、またはコンジュゲートを前記細胞に投与して前記細胞におけるPIK3CAおよびβカテニンの阻害を果たすステップを含むものである前記方法を提供する。好適には、細胞においてPI3CAとβカテニンの両方を阻害またはダウンレギュレーションできるオリゴマーは、両方の標的核酸の逆相補体と有意な同一性を有するかまたはハイブリダイズでき、例えば、配列番号82の核酸塩基配列をもつオリゴマーである。
【０２３１】
医療上の適応症
過増殖疾患は、体内の無制御かつ有害な細胞の増殖、例えば癌、例えば本明細書で言及したものにより特徴付けられる障害を意味する。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、前記癌はi)固体腫瘍および／または癌、および／またはii)肉腫、および／またはiii)グリオーマの形態である。
【０２３３】
本明細書で言及した前記癌は、悪性黒色腫、基底細胞癌、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、腎細胞癌、膀胱癌、再発性表面膀胱癌、胃癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、頚部癌、頚部の異形成、喉頭乳頭腫症、結腸癌、結腸直腸癌および癌様体腫瘍からなる群より選択することができる。より好ましくは、前記癌は悪性黒色腫、非小細胞性肺癌、乳癌、結腸癌および腎細胞癌からなる群より選択される。好ましくは、前記癌は悪性黒色腫であり、好ましくは表面伝播性黒色腫、結節状黒色腫、悪性黒子黒色腫、先端黒色腫、メラニン欠乏黒色腫および線維形成性黒色腫からなる群より選択される。
【０２３４】
本明細書で言及する前記肉腫は、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、悪性の線維性組織球腫、線維肉腫およびカポジ肉腫からなる群より選択することができる。
【０２３５】
いくつかの実施形態において、癌は、固体腫瘍、例えばグリア芽細胞腫、悪性黒色腫、髄芽腫、肝細胞癌、頭部および頚部扁平上皮細胞癌、胃、卵巣、頚部および結腸直腸の癌、乳、肺および結腸の癌、大B細胞リンパ腫、未分化の星細胞腫、未分化の欠突起細胞腫、前立腺癌、子宮内膜癌、膵臓癌、腸癌、白血病、食道癌、および甲状腺癌、またはいくつかの実施形態において、肝臓または腎臓の癌からなる群より選択される。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、本明細書で言及する癌は、結腸直腸、グリア芽細胞腫、胃、肝細胞、乳房、卵巣および肺の癌からなる群より選択される。
【０２３７】
一態様において、本明細書で言及する癌は、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病（例えば、急性白血病、例えば急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、慢性骨髄球性白血病、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫）、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆道癌、絨毛癌、頚部癌、精巣癌、肺癌、膀胱癌、黒色腫、頭部および頚部癌、脳癌、未知の原発性部位の癌、新生物、末梢神経系の癌、中枢神経系の癌、腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜種、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、延髄癌、気管支原性癌、精上皮腫、胚性癌、ウイルムス腫瘍、小細胞肺癌、上皮癌、グリオーマ、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、欠突起細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）、重鎖疾患、転移、および無制御または異常な細胞成長により特徴付けられる任意の疾患または障害からなる群より選択することができる。
【０２３８】
いくつかの実施形態において、本明細書で言及する癌はホジキンリンパ腫、白血病、例えば急性リンパ性白血病、結腸癌、直腸癌、脳癌、神経芽細胞腫、肺癌、膵臓癌、黒色腫、急性筋原性白血病、肝臓癌、甲状腺癌、腎臓癌、尿路癌および膀胱癌からなる群より選択される。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、本明細書で言及する癌は、ホジキンリンパ腫、白血病例えば急性リンパ性白血病、結腸癌、脳癌、神経芽細胞腫からなる群より選択される。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、本明細書で言及する癌は肺、乳房、結腸、前立腺、膵臓、肺、肝臓、甲状腺、腎臓、脳、精巣、胃、腸、腸、脊髄、洞、膀胱、尿路または卵巣の癌疾患からなる群より選択される。
【０２４１】
いくつかの実施形態においては、例えば脳癌を治療するためにホスホロチオエート結合を本発明による化合物に使用しないことが好ましい。
【０２４２】
PIK3CAキナーゼの異常なレベルに関係しうる、そしてそれ故に、本発明による組成物、コンジュゲートおよび化合物を用いて治療することができるさらなる症状には、過増殖疾患、例えば癌、特に固体腫瘍、例えばグリア芽細胞腫、悪性黒色腫、髄芽腫、肝細胞癌、頭部および頚部扁平上皮細胞癌、胃、卵巣、頚部および結腸直腸の癌ならびに乳房、肺および結腸の癌からなる群より選択される障害が含まれる。
【０２４３】
一態様において、本明細書で言及する癌は、固体腫瘍、例えばグリア芽細胞腫、悪性黒色腫、髄芽腫、肝細胞癌、頭部および頚部扁平上皮細胞癌、胃、卵巣、頚部および結腸直腸の癌、乳房、肺および結腸の癌、大B-細胞リンパ腫、未分化星細胞腫、未分化欠突起細胞腫、前立腺癌、子宮内膜癌、膵臓癌、腸癌、白血病、食道癌、および甲状腺癌からなる群より選択することができる。
【０２４４】
一態様において、本明細書で言及する癌は腎臓または肝臓癌であってもよい。
【０２４５】
実施形態
本発明の次の実施形態は本明細書に記載した他の実施形態と組み合わせて用いることができる。
【０２４６】
1.  合計10〜50核酸塩基の連続核酸塩基配列を含む、長さで10〜50核酸塩基のオリゴマーであって、前記連続核酸塩基配列が哺乳動物のPIK3CAキナーゼをコードする核酸の対応する領域と少なくとも80％同一性である前記オリゴマー。
【０２４７】
2.  少なくとも1つのLNAユニットを含む、実施形態1によるオリゴマー。
【０２４８】
3.  連続核酸塩基配列が哺乳動物のPIK3CAキナーゼをコードする核酸の対応する領域に対して3以下、例えば2以下のミスマッチを含む、実施形態1または2によるオリゴマー。
【０２４９】
4.  前記連続核酸塩基配列が哺乳動物のPIK3CAキナーゼをコードする核酸の対応する領域に対して単一ミスマッチを含み、任意に、その単一ミスマッチが癌表現型と関係する単一ヌクレオチド点突然変異に対応する、実施形態3によるオリゴマー。
【０２５０】
5.  前記連続核酸塩基配列が哺乳動物のPIK3CAキナーゼをコードする核酸の対応する領域に対してミスマッチを含まない（すなわち相補性である）、実施形態1または2によるオリゴマー。
【０２５１】
6.  オリゴマーの核酸塩基配列が連続核酸塩基配列から成る、実施形態1〜5のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２５２】
7.  哺乳動物のPIK3CAキナーゼをコードする核酸がヒトPIK3CAキナーゼヌクレオチド配列、例えば配列番号1、またはその変異体、例えば1781、1790および3297から選択される1つの位置で1点突然変異を含む配列番号1である、実施形態1〜6のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２５３】
8.  連続核酸塩基配列がヒトPIK3CAキナーゼ核酸配列と非ヒト哺乳動物のPIK3CAキナーゼ核酸配列、例えばマウスPIK3CAキナーゼ核酸配列の両方の対応する領域に対して相補性である、実施形態1〜7のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２５４】
9.  連続核酸塩基配列が、相補性PIK3CAキナーゼ標的RNAと2本鎖を形成するとRNAse Hを動員できる、少なくとも7つの核酸塩基残基の連続サブ配列を含む、実施形態1〜8のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２５５】
10.  連続核酸塩基配列が、相補性PIK3CAキナーゼ標的RNAと2本鎖を形成するとRNAse Hを動員できる、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10の核酸塩基残基の連続サブ配列を含む、実施形態9によるオリゴマー。
【０２５６】
11.  連続核酸塩基配列が、相補性PIK3CAキナーゼ標的RNAと2本鎖を形成するとRNAse Hを動員できる、長さで少なくとも9または少なくとも10、例えば長さで少なくとも12核酸塩基または少なくとも14核酸塩基、例えば14、15または16核酸塩基残基である、実施形態9または10のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２５７】
12.  前記オリゴマーが1以上の非核酸塩基化合物とコンジュゲートしている、実施形態1〜11のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２５８】
13.  前記オリゴマーが10〜22核酸塩基の長さを有する、実施形態1〜12のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２５９】
14.  前記オリゴマーが12〜18核酸塩基の長さを有する、実施形態1〜13のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２６０】
15.  前記オリゴマーが14、15または16核酸塩基の長さを有する、実施形態1〜14のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２６１】
16.  前記連続核酸塩基配列が配列番号110〜124、または149〜160からなる群より選択される核酸配列中に存在する連続ヌクレオチド配列に対応する、実施形態1〜15のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２６２】
17.  オリゴマーまたは連続核酸塩基配列が配列番号2〜16からなる群より選択されるヌクレオチド配列中に存在する対応する核酸塩基配列を含むか、またはから選択される、実施形態1〜16のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２６３】
18.  前記連続核酸塩基配列が少なくとも1つのアフィニティ増強ヌクレオチド類似体を含む、実施形態1〜17のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２６４】
19.  前記連続核酸塩基配列が合計で2、3、4、5、6、7、8、9または10のアフィニティ増強ヌクレオチド類似体、例えば5〜8つのアフィニティ増強ヌクレオチド類似体を含む、実施形態18によるオリゴマー。
【０２６５】
20.  少なくとも1つのアフィニティ増強ヌクレオチド類似体を含み、残りの核酸塩基がDNAヌクレオチドおよびRNAヌクレオチド、好ましくはDNAヌクレオチドからなる群より選択される実施形態1〜19のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２６６】
21.  オリゴマーが、式（5'から3'方向に）A-B-C、および任意に式A-B-C-D
［式中、
Aは少なくとも1つのヌクレオチド類似体、例えば1、2、3、4、5または6ヌクレオチド類似体、好ましくは2〜5ヌクレオチド類似体、好ましくは2、3または4ヌクレオチド類似体、最も好ましくは2、3または4連続ヌクレオチド類似体から成るかまたは含むものであり、および； 
Bは、（相補RNA分子、例えばPIK3CAK mRNA標的と2本鎖を形成すると）RNAse Hを動員できる少なくとも5連続核酸塩基、例えばDNA核酸塩基、RNAse Hを動員できる例えば5、6、7、8、9、10、11または12連続核酸塩基、またはRNAse Hを動員できる6〜10、または7〜9、例えば8連続核酸塩基から成るかまたは含むものであり、および；
Cは少なくとも1つのヌクレオチド類似体、例えば1、2、3、4、5または6ヌクレオチド類似体、好ましくは2〜5ヌクレオチド類似体、例えば2、3または4ヌクレオチド類似体、最も好ましくは2、3または4連続ヌクレオチド類似体から成るかまたは含むものであり、および；
Dは、存在する場合、1以上のDNAヌクレオチド、例えば1〜3または1〜2のDNAヌクレオチドから成るかまたは含む、好ましくは、から成るものである］
の核酸塩基の配列を含む、実施形態1〜20のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２６７】
22.  領域Aが2、3または4連続ヌクレオチド類似体から成るかまたは含む、実施形態21によるオリゴマー。
【０２６８】
23.  領域Bが、相補RNA、例えばPIK3CAK mRNA標的と2本鎖を形成するとRNAse Hを動員できる7、8、9または10連続DNAヌクレオチドまたは等価の核酸塩基から成るかまたは含む、実施形態21〜22のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２６９】
24.  領域Cが2、3または4連続ヌクレオチド類似体から成るかまたは含む、実施形態21〜24のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２７０】
25.  領域Dは、存在する場合、1または2つのDNAヌクレオチドから成る、実施形態21〜24のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２７１】
26.  Aは3連続ヌクレオチド類似体から成るかまたは含み；
Bは相補RNA分子、例えばPIK3CAK mRNA標的と2本鎖を形成するとRNAse Hを動員できる7、8、9または10連続DNAヌクレオチドまたは等価の核酸塩基から成るかまたは含み；
Cは3連続ヌクレオチド類似体から成るかまたは含み；
Dは1または2つのDNAヌクレオチドから成るかまたは含む、
実施形態21〜25のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２７２】
27.  連続核酸塩基配列は10、11、12、13または14核酸塩基から成り；
Aは1、2または3連続ヌクレオチド類似体から成り；
Bは相補RNA分子、例えばPIK3CAK mRNA標的と2本鎖を形成するとRNAse Hを動員できる7、8、または9連続DNAヌクレオチドまたは等価の核酸塩基から成り；
Cは1、2または3連続ヌクレオチド類似体から成り；
Dは、存在する場合、1つのDNAヌクレオチドから成る、実施形態26によるオリゴマー。
【０２７３】
28.  Bが少なくとも1つのα-L立体配置であるLNA核酸塩基、例えばα-L-オキシLNAを含む、実施形態21〜27のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２７４】
29.  ヌクレオチド類似体が独立してまたは集合してロックされた核酸（LNA）ユニット；2'-O-アルキル-RNAユニット、2'-OMe-RNAユニット、2'-アミノ-DNAユニット、2'-フルオロ-DNAユニット、PNAユニット、HNAユニット、およびINAユニットからなる群より選択される、実施形態1〜28のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２７５】
30.  全てのヌクレオチド類似体がLNAユニットである、実施形態29によるオリゴマー。
【０２７６】
31.  1、2、3、4、5、6、7、8、9または10のLNAユニット、例えば2〜8ヌクレオチドLNAユニットを含む、実施形態1〜30のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２７７】
32.  LNAが独立してβ-Dおよびα-L立体配置のいずれか、またはそれらの組合わせのオキシ-LNA、チオ-LNA、およびアミノ-LNAから選択される、実施形態29〜31のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２７８】
33.  LNAが全てβ-D-オキシ-LNAである、実施形態32によるオリゴマー。
【０２７９】
34.  領域AおよびCのヌクレオチド類似体がβ-D-オキシ-LNAである、実施形態21〜33のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２８０】
35.  オリゴマー中に存在する少なくとも1つの核酸塩基が、5-メチルシトシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンからなる群より選択される改変された核酸塩基である、実施形態1〜34のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２８１】
36.  前記オリゴマーが対応する少なくとも50℃のTmをもつ哺乳動物のPIK3CAキナーゼmRNAとハイブリダイズする、実施形態1〜35のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２８２】
37.  前記オリゴマーが対応する80℃以下のTmをもつ哺乳動物のPIK3CAキナーゼmRNAとハイブリダイズする、実施形態1〜36のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２８３】
38.  ヌクレオシド間結合がホスホジエステル、ホスホロチオエートおよびボラノホスフェートからなる群より独立して選択される、実施形態1〜37のいずれか1つによるオリゴマー。
【０２８４】
39.  オリゴマーが少なくとも1つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、実施形態38によるオリゴマー。
【０２８５】
40.  DNAまたはRNAユニットと隣接したおよび／またはそれらの間、または領域B内のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である、実施形態39によるオリゴマー。
【０２８６】
41.  連続ヌクレオチド類似体の少なくとも1つの対の間の結合がホスホジエステル結合である、実施形態39または40によるオリゴマー。
【０２８７】
42.  連続ヌクレオチド類似体の間の全ての結合がホスホジエステル結合である、実施形態39または40によるオリゴマー。
【０２８８】
43.  全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、実施形態38によるオリゴマー。
【０２８９】
44.  実施形態1〜43のいずれか1つによるオリゴマーおよび前記化合物と共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含むコンジュゲート。
【０２９０】
45.  実施形態1〜43のいずれかに定義されたオリゴマーまたは実施形態44に定義されたコンジュゲート、および製薬上許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む医薬組成物。
【０２９１】
46.  オリゴマーがプロドラッグとして構成された、実施形態45による医薬組成物。
【０２９２】
47.  過増殖疾患、例えば癌からなる群より選択される疾患または障害の治療用医薬品を製造するための、実施形態1〜43のいずれか1つに定義されたオリゴマー、または実施形態44に定義されたコンジュゲートの使用。
【０２９３】
48.  過増殖疾患、例えば癌を治療する方法であって、実施形態1〜43のいずれか1つに定義されたオリゴマー、または実施形態44に定義されたコンジュゲート、または実施形態45〜46のいずれか1つに定義された医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含むものである前記方法。
【０２９４】
49.  細胞または組織におけるPIK3CAキナーゼの発現を低減または阻害する方法であって、前記細胞または組織を、実施形態1〜43のいずれか1つに定義された化合物、または実施形態44に定義されたコンジュゲート、または実施形態45〜46のいずれか1つに定義された医薬組成物に接触させ、PIK3CAキナーゼの発現を低減または阻害するステップを含むものである前記方法。
【実施例】
【０２９５】
実施例１  モノマー合成
LNAモノマー構築ブロックと誘導体を次の公開された手順とそれに引用された参考文献に従って調製した。WO07/031081と引用文献を参照されたい。
【０２９６】
実施例２  オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドをWO07/031081に記載の方法に従って合成した。表1は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の例を示す。表2および3は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）の例を示す。
【０２９７】
実施例３  オリゴヌクレオチドの設計
本発明によって、ヒトPIK3CA mRNA（ホスホイノシチド-3-キナーゼ、触媒性、αポリペプチド）（GenBank受託番号NM_006218、配列番号1）の異なる領域を標的化する一連の異なるオリゴヌクレオチドを設計した。
【０２９８】
表1  本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
配列番号2〜16はヒト野生型PIK3CA mRNAを標的化するように設計したオリゴ配列である。
【表１】
2011505124.tif 000008
【０２９９】
2011505124.tif 000009
【０３００】
表2  本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
配列番号17〜22はヒトPIK3CAmRNAの3ホットスポット突然変異（E542K、E545KおよびH1047R）を標的化するように設計したオリゴ配列であり、配列番号23〜28はそれらの対応する野生型オリゴである。各オリゴのホットスポット突然変異の場所は灰色で強調して示した。配列番号17、18、125、および126は、E542K突然変異に関する。配列番号19、20、127および128（SPC4168および4169）はE545K突然変異に関し、そして配列番号21、22、129および130（SPC4170および4171）はH1047R突然変異に関する。
【表２】
2011505124.tif 000010
【０３０１】
表3  本発明のオリゴヌクレオチド設計
配列番号29〜55において、大文字はヌクレオチド類似体ユニット、例えばLNAを示し、そして下付き文字「s」はホスホロチオエート結合を表す。小文字はヌクレオチドユニットを表す。「s」の不在（もし存在しなければ）は、ホスホジエステル結合を示す。
【表３】
2011505124.tif 000011
【０３０２】
実施例４  In vitroモデル：細胞培養
アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸発現に与える効果は様々な細胞型で試験できるが、標的核酸が測定可能レベルで存在することを条件とする。標的は、前記標的をコードする核酸の内因的にまたは一過性もしくは安定なトランスフェクションによって発現することができる。標的核酸の発現レベルは、日常的方法で、例えば、ノーザンブロット分析、リアルタイムPCR、RNAse保護アッセイを用いて定量することができる。以下の細胞型を説明目的のために提供するが、選んだ細胞型で標的が発現されることを条件として、他の細胞型を日常的方法で用いることができる。
【０３０３】
細胞を下記の適当な培地中で培養し、37℃で95-98％湿度および5％CO2に維持した。細胞を日常的方法で毎週2〜3回継代した。
【０３０４】
MCF7：ヒト乳房腺癌細胞株MCF7を、イーグルMEM（Sigma）＋10％ウシ胎児血清（FBS）＋2mMグルタマックスI＋ゲンタマイシン（25μg/ml）＋1 x 非必須アミノ酸中で培養した。
【０３０５】
PC3：ヒト前立腺腺癌細胞株PC3を、DMEM（Sigma）＋10％ウシ胎児血清（FBS）＋2mMグルタマックスI＋ゲンタマイシン（25μg/ml）中で培養した。
【０３０６】
実施例５  In vitroモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理
実施例4に掲げた細胞株を、オリゴヌクレオチドにより、カチオン性リポソーム製剤LipofectAMINE 2000（Gibco）をトランスフェクションビヒクルとして用いて処理した。細胞を6-ウエル細胞培養プレート（NUNC）にまいて、80〜90％コンフルエント時に処理した。用いたオリゴ濃度は0.8nM〜20nM最終濃度であった。オリゴ-脂質複合体の製剤化は、本質的に製造業者が記載したように、無血清のOptiMEM（Gibco）および2.5μg/mL（PC3）または5μg/mL（MCF7）LipofectAMINE2000の最終脂質濃度を用いて行った。細胞を37℃にて4時間インキュベートし、処理はオリゴ含有培地を除去することにより停止した。細胞を洗浄し、血清含有培地を加えた。オリゴマー処理の後、細胞を20時間回復させ、その後、収穫してRNA分析を行った。
【０３０７】
実施例６  In vitroモデル：RNAの抽出とcDNA合成
全RNA単離と第1鎖合成：全RNAを、上記のようにトランスフェクトした細胞からQiagen RNeasyキット（Qiagenカタログ番号74104）を用いて製造業者取扱説明書に従い抽出した。第1鎖合成を、Ambionから入手した逆転写酵素試薬を用いて製造業者取扱説明書に従い実施した。
【０３０８】
各サンプルについて0.5μg全RNAを、RNAseを含まないH2Oで（10.8μl）に調節し、2μlランダムデカマー（50μM）および4μl dNTPmix（2.5mMの各dNTP）と混合し、70℃へ3分間加熱し、その後、サンプルを氷上で急冷した。サンプルを氷上で冷却した後、2μlの10xバッファーRT、1μlのMMLV逆転写酵素（100U/μl）および0.25μlのRNAseインヒビター（10U/μl）を各サンプルに加え、その後、42℃にて60分間のインキュベーション、95℃にて10分間の酵素の熱不活性化、次いでそのサンプルを4℃へ冷却した。
【０３０９】
実施例７  In vitroモデル：リアルタイムPCRによるPIK3CA発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
PIK3CA発現のアンチセンスモジュレーションは当技術分野で公知の様々な方法でアッセイすることができる。例えば、PIK3CA mRNAレベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ結合反応（PCR）、またはリアルタイムPCRにより定量化することができる。リアルタイム定量PCRが現在では好ましい。RNA分析は全細胞RNAまたはmRNAについて実施することができる。
【０３１０】
RNA単離とRNA分析の方法、例えばノーザンブロット分析は、当技術分野で日常的に行われており、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sonsに教示されている。
【０３１１】
リアルタイム定量PCRは、Applied Biosystemから入手しうる市販のマルチカラーリアルタイムPCR検出システムを用いて好都合に実施することができる。
【０３１２】
PIK3CA mRNAレベルのリアルタイム定量PCR分析：ヒトPIK3CA mRNAのサンプル含量を、ヒトPIK3CA ABI Prism Pre-Developed TaqManアッセイ試薬（Applied Biosystems cat. no. Hs00180679_m1を使用し、製造業者取扱説明書に従って定量した。
【０３１３】
グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）mRNA量を内因対照として用いて、サンプル調製の分散を規準化した。
【０３１４】
ヒトGAPDH mRNAのサンプル含量を、ヒトGAPDH ABI Prism Pre-Developed TaqManアッセイ試薬（Applied Biosystems cat. no. 4310884E）を用いて製造業者取扱説明書に従い定量した。
【０３１５】
リアルタイム定量PCRは当技術分野で周知の技法であり、例えば、Heid et al. Real time quantitative PCR, Genome Research (1996), 6： 986-994に教示されている。
【０３１６】
リアルタイムPCR：  実施例5に記載したように実施した第1鎖合成から得たcDNAを2〜20倍希釈し、Taqman 7500 FASTまたは7900 FAST（Applied Biosystems）を用いてリアルタイム定量PCRにより分析した。プライマーとプローブを2 x Taqman Fast Universal PCRマスターミックス（2x）（Applied Biosystems Cat.# 4364103）と混合し、4μl cDNAを加えて最終体積10μlにした。各サンプルを二重に分析した。目的のRNAを発現する細胞株から精製した材料で調製しておいたcDNAの2倍希釈物をアッセイして、アッセイ用の標準曲線を作製した。無菌H2Oを、無テンプレート対照のcDNAの代わりに用いた。PCRプログラム：95℃で30秒、次いで、95℃、3秒、60℃、20〜30秒の40サイクル。標的mRNA配列の相対量を、計算閾値サイクルから、the Applied Biosystems Fast System SDS Software Version 1.3.1.21.またはSDS Software Version 2.3を用いて決定した。
【０３１７】
実施例８  In vitro 分析：ヒトPIK3CA mRNA発現の、オリゴヌクレオチド化合物によるアンチセンス阻害
表3に提示したオリゴヌクレオチドを、ヒトPIK3CA mRNAをノックダウンする能力について、PC3細胞およびMCF7細胞において0.8、4および20nMの濃度で評価した（図1および2を参照）。最も活性のある配列番号57、60、64、67、77および82を有するオリゴヌクレオチドをさらに、ヒトPIK3CAのノックダウンについて、濃度0.04、0.2、0.8、4、10および20nMにて、PC3およびMCF7細胞中で評価した（図22および23を参照）。
【０３１８】
表4：ヒトPIK3CA mRNA発現の、オリゴヌクレオチドによるアンチセンス阻害
表4のデータは、20Mにて、模擬トランスフェクトした細胞と比較した％ダウンレギュレーションとして示されている。小文字はDNAユニットを表し、太い大文字はβ-D-オキシ-LNAユニットを表す。全てのLNA Cは5'メチル Cである。下付き文字「s」はホスホロチオエート結合を表す。
【表４】
2011505124.tif 000012
【０３１９】
2011505124.tif 000013
【０３２０】
2011505124.tif 000014
【０３２１】
表4に示したように、配列番号：57、60、64、67、70、74、77、82、87、90および96のオリゴヌクレオチドは、これらの実験でPC3およびMCF7細胞において20nMでPIK3CA mRNA発現の約90％以上の阻害を示し、従って、好ましいものである。
【０３２２】
また、説明したアンチセンスオリゴ配列に基づいて、例えば、色々な長さ（より短いまたはより長い）および／または核酸塩基含量（例えば、類似体ユニットのタイプおよび／または比率）を有しかつPIK3CA発現もよく阻害するオリゴヌクレオチドも好ましい。
【０３２３】
実施例９  In vitro分析：細胞増殖（MTSアッセイ）に与えるヒトPIK3CAmRNAのアンチセンス阻害の効果
MCF7乳癌、PC3前立腺癌およびHCT116大腸癌細胞を、カチオン性リポソーム製剤LipofectAMINE 2000 （Invitrogen）をトランスフェクションビヒクルとして用いてオリゴヌクレオチドにより処理した。細胞を6-ウエル細胞培養プレート（NUNC）にまき、翌日、2.5x105細胞／ウエル（MCF7およびHCT116）または2.4x105細胞／ウエル（PC3）の密度でトランスフェクションを行った。細胞を75〜90％コンフルエントの時に、異なる濃度のオリゴを用いて処理した。オリゴ-脂質複合体の製剤化は、無血清のOptiMEM（Invitrogen）および2.5μg/ml（PC3）、5μg/ml（MCF7）または10μg/ml（HCT116）LipofectAMINE2000の最終脂質濃度を用いて行った。細胞を37℃にて4時間インキュベートし、トランスフェクションはオリゴ含有培地を除去することにより停止した。4時間処理の後、培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、次いで透明な96ウエルプレート（Scientific Orange no. 1472030100）に入れた100μl培地に5000細胞／ウエルの密度でまいた。示した時間に10μlテトラゾリウム化合物［3-(4,5-ジメチル-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、分子内塩；MTS］および電子カップリング試薬（フェナジンエトサルフェート；PES）を加えることにより、生存細胞を測定した（CellTiter96（登録商標） Aqeous One Solution Cell Proferation アッセイ、Promega）。生存細胞は490nmにてPowerwave（Biotek Instruments）で測定した。490nmのOD値を時間（h）に対してプロットした（図11、12および14を参照）。図11に示したように、配列番号：57、60、64、67、77および82のオリゴヌクレオチドは、乳癌細胞株MCF7の増殖を阻害する一方、どのオリゴヌクレオチドもPC3細胞の増殖に顕著な効果を与えなかった（図12）。HCT116細胞において、配列番号57、60、67、77および82をもつオリゴヌクレオチドは増殖を阻害した。PIK3CA遺伝子において細胞株MCF7はE545Kホットスポット突然変異を有しかつHCT116はH1047Rホットスポット突然変異を有する、そしてこの事が遺伝子中に報じたホットスポット突然変異を有しないPC3細胞株よりPIK3CAシグナル伝達に一層依存性にしている。ホットスポット突然変異は活性化する突然変異である。
【０３２４】
実施例１０  In vitro分析：ヒト癌細胞株中のPIK3CAのアンチセンス阻害後のカスパーゼ-3/7誘導に与える効果
PC3前立腺癌およびHCT116大腸癌細胞をオリゴヌクレオチドにより、トランスフェクションビヒクルとしてカチオン性リポソーム製剤LipofectAMINE 2000 （Invitrogen）を用いて処理した。細胞を6-ウエル細胞培養プレート（NUNC）にまき、翌日、2.5x105細胞／ウエル（MCF7およびHCT116）または2.4x105細胞／ウエル（PC3）の密度でトランスフェクションを行った。細胞を75〜90％コンフルエントの時に、異なる濃度のオリゴを用いて処理した。オリゴ-脂質複合体の製剤化は、無血清のOptiMEM（Invitrogen）および2.5μg/ml（PC3）、5μg/ml（MCF7）または10μg/ml（HCT116）LipofectAMINE2000の最終脂質濃度を用いて行った。細胞を37℃にて4時間インキュベートし、トランスフェクションはオリゴ含有培地を除去することにより停止した。
【０３２５】
4時間処理の後、培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、次いで白色の96ウエルプレート（Nunc）に入れた100μl培地に5000細胞／ウエルの密度でまいた。示した時間に100μlカスパーゼ-Glo3/7アッセイ（promega）を加えることにより、カスパーゼ3/7活性を照度計を用いて測定した。4つの異なる時点24h、32h、48hおよび72hに、カスパーゼ3/7活性を測定した（図13および図15を参照）。配列番号57、67、77および82は、H1047Rホットスポット突然変異を有するHCT116細胞においてカスパーゼ3/7活性の用量依存性誘導を示す（図15）一方、これらのオリゴヌクレオチドはPC3細胞においてカスパーゼ3/7誘導に効果を与えなかった。
【０３２６】
実施例１１  In vitro分析：マウス血漿中のPIK3CAオリゴヌクレオチドの生体安定性
マウス血漿（リチウムヘパリン血漿、BomTac:NMRIマウスから、14-09-05採集、Taconic Europe）を解凍し、45μl血漿／チューブでチューブ中にアリコートした。次いで、5μlオリゴ（200μM）を45μl血漿に加えて最終濃度20μmにした。十分に混合した後、サンプルを37℃にて0〜120時間インキュベートした。異なる時点（0時間、24時間、48時間および120時間）にサンプルを採取し、サンプルを液体窒素にスナップ冷凍することにより反応をクエンチした。分析については、サンプルにローディングバッファーを加え、変性条件下でPAGE-配列決定ゲル上の電気泳動により分析した。PIK3CAオリゴヌクレオチドは120時間までの高い血漿安定性を示し、その結果を図16に示した。
【０３２７】
実施例１２  In vitro分析：相補RNAに対するPIK3CAオリゴヌクレオチドのTm測定
LNAオリゴ／RNA2本鎖の融点を、対応するソフトウエアでUV分光計システム（Perkin Elmer、Fremont、USA）を用いて測定した。LNAオリゴとその相補RNAを最終濃度1.5μMでTmバッファー（200nM NaCl、0.2nM EDTA、20mM NaP、pH7.0）に加えた。2本鎖形成は、サンプルを95℃に3分間加熱することにより調製し、次いで室温で30分間冷却した。
【０３２８】
融点（Tm）値をλ 25 UV/VIS分光計（Perkin Elmer）で測定し、データを採取し、TempLabソフトウエア（Perkin Elmer）を用いて分析した。計器は、オリゴ2本鎖サンプルを20から95℃に加熱し、その後、サンプルを25℃に冷却するようプログラムした。このプロセスの間、260nmの吸収を記録した。融解曲線を用いてTm値を計算した。
【０３２９】
配列番号57、60、64、67、77および82に対するTm値を図17に示す。
【０３３０】
実施例１３  In vitro分析：15PC3細胞におけるPIK3CAおよびpAktのダウンレギュレーション
15PC3細胞を、24および48時間、30nMのLNAでトランスフェクトするかまたはLY294200（小分子PI3Kインヒビター）で処理した。WB：48時間、15μgタンパク質/レーン、8％ゲル。15PC3細胞のPIK3CA LNAによるトランスフェクションの後、PIK3CAレベルの有意な低下が観察された（図19）。pAktレベルは、トランスフェクション後24時間に、ELISAにより定量して80％まで低下した（図19）。
【０３３１】
配列番号82の配列を有するオリゴマーによるトランスフェクションは、他の試験したLNAと比較して下流シグナルに与える効果が小さかった。
【０３３２】
実施例１４  In vivo分析：PIK3CAオリゴヌクレオチドのi.v.投与後のマウス肝臓中のマウスPIK3CAのダウンレギュレーション
雌NMRIマウスに、配列番号57、60、67、77および82の配列を有するオリゴヌクレオチドのi.v.注入を3連続日に25mg/kgの用量で投与した。動物を最後の用量の投与後24時間に犠牲にした。肝臓はその後、RNA安定化溶液中で使用まで貯蔵した。全RNAを肝組織から抽出し、PIK3CA mRNAレベルをqPCRにより分析した。データを、生理食塩水で処理した対照動物におけるPIK3CA発現と比較した。図21に示すように、研究した全オリゴヌクレオチドはPIK3CA mRNAの強力なダウンレギュレーションを示した。
【０３３３】
第2のスクリーニングに用いた全てのPIK3CAオリゴマーは、PC3およびMCF7細胞においてPIK3CAの強力なダウンレギュレーションを示し、IC50値は1nM未満であった。配列番号82はまた、MCF7およびPC3細胞の両方において対照の標的βカテニン遺伝子のダウンレギュレーションも示した（配列番号82は、βカテニンの最良アライン標的領域の逆相補体と比較すると2ミスマッチを有する）。
【０３３４】
実施例１５  In vivo 分析：マウスにおける肺癌腫瘍サイズに与えるオリゴマーの効果
6〜7週齢雄無胸腺nu/nuマウス（Harlan Sprague Dawley）（平均体重27.3±2.4g）を研究に用いた。5x106細胞のCalu-6（肺癌細胞株）をPBS（Gibco#14190）中に懸濁して各マウスに皮下注射した。平均腫瘍サイズが150mm3に達したとき、200μlのオリゴマーを静脈内に注射した。オリゴマーを3日毎に合計5投与を行った。対照ビヒクルをオリゴマーと同じ投薬レジメンで投与した。各マウスに対する腫瘍体積は、カリパーで2つの寸法を測定し、式：腫瘍体積=(長さx巾2)/2）を用いて計算した。図20は、本発明のオリゴによる肝臓中のPIK3CA発現のダウンレギュレーションを示す。
【０３３５】
3mg/kg用量におけるin vivo実験での良い動物生存率を用いると、配列番号60、67、77および82のオリゴマーが良い毒性プロファイルを有することが判った。配列番号60、67および77は10mg/kgで良い毒性プロファイルを示した。
【０３３６】
表６
2011505124.tif 000015
【０３３７】
実施例１６  オリゴマーとポリエチレングリコールのコンジュゲートの調製
配列番号60または配列番号87に示した配列を有するオリゴマーを、日常的なホスホロアミダイト化学を用いて、アミノアルキル基、例えば、Fmocなどのブロック基でブロックしたヘキサン-1-アミンをオリゴマーの5'リン酸基に結合することにより、5'末端で官能化し、得られる化合物を酸化し、それらを脱保護し、そしてそれらを精製して、それぞれ、式（IA）および（IB）：
【化６】
2011505124.tif 000016
【０３３８】
［式中、太字の大文字はヌクレオチド類似体モノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付き文字「s」はホスホロチオエート結合を表し、MeCは5-メチルシトシンを表す］
で表される官能化オリゴマーを得た。
【０３３９】
例えば、式（II）：
【化７】
2011505124.tif 000017
【０３４０】
［式中、PEG部分は12,000の平均分子量を有する］に示した活性化PEG、と式（IA）および（IB）の化合物のそれぞれのPBSバッファー中の溶液を、別の容器に入れて室温にて12時間攪拌した。反応溶液を3回、塩化メチレンにより抽出し、組合わせた有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして溶媒を減圧下で蒸発させた。得られる残留物を2回蒸留した水に溶解しアニオン交換カラムに供給した。未反応PEGリンカーを水で溶出し、生成物をNH4HCO3溶液で溶出した。純粋な生成物を含有する画分をプールし、凍結乾燥して、それぞれ式(IIIA)および(IIIB)：
【化８】
2011505124.tif 000018
【０３４１】
［式中、配列番号：60および87のオリゴマーのそれぞれは放出可能なリンカーを介して12,000の平均分子量を有するPEGポリマーと結合している］
で表されるコンジュゲート配列番号：60および87を得た。
【０３４２】
配列番号：67、77および82に示した配列を有するオリゴマーで、上記プロセスを用いて作ることができるPEGポリマーコンジュゲートの化学構造を、それぞれ式(IVA)、(IVB)および(IVC)：
【化９】
2011505124.tif 000019
【０３４３】
［式中、太字の大文字はβ-D-オキシ-LNAモノマーを表し、小文字はDNAモノマーを表し、下付き文字「s」はホスホロチオエート結合を表し、MeCは5-メチルシトシンを表す］に示す。
【０３４４】
このプロセスにおいて、式(IVA)、(IVB)および(IVC)に示すコンジュゲートをそれぞれ作るために用いることができる活性化オリゴマーは、式(VA)、(VB)および(VC)：
【化１０】
2011505124.tif 000020
【０３４５】
に示される化学構造を有する。
【図１】
2011505124.tif 000021
【図２】
2011505124.tif 000022
【図３−１】
2011505124.tif 000023
【図３−２】
2011505124.tif 000024
【図３−３】
2011505124.tif 000025
【図３−４】
2011505124.tif 000026
【図４−１】
2011505124.tif 000027
【図４−２】
2011505124.tif 000028
【図５】
2011505124.tif 000029
【図６】
2011505124.tif 000030
【図７】
2011505124.tif 000031
【図８】
2011505124.tif 000032
【図９−１】
2011505124.tif 000033
【図９−２】
2011505124.tif 000034
【図１０】
2011505124.tif 000035
【図１１】
2011505124.tif 000036
【図１２】
2011505124.tif 000037
【図１３】
2011505124.tif 000038
【図１４】
2011505124.tif 000039
【図１５】
2011505124.tif 000040
【図１６】
2011505124.tif 000041
【図１７】
2011505124.tif 000042
【図１８】
2011505124.tif 000043
【図１９】
2011505124.tif 000044
【図２０】
2011505124.tif 000045
【図２１】
2011505124.tif 000046
【図２２】
2011505124.tif 000047
【図２３】
2011505124.tif 000048
【配列表】
2011505124000001.app
【国際調査報告】
2011505124.tif 000049
2011505124.tif 000050
2011505124.tif 000051
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