(57)【要約】  本明細書に開示されているのは、予後値の染色体領域を定義するため、染色体の既定部分におけるすべてのＳＮＰ（一塩基多型）の有意性を要約することによって、予後値の染色体領域を定義する方法である。特定の遺伝子におけるＳＮＰに基づいて、乳癌のより正確な予後診断が提供される。
2011505840.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予後値の染色体領域を定義するために染色体の既定部分におけるすべてのＳＮＰの有意性を要約するステップを含む、予後値の染色体領域を定義する方法。
【請求項２】
前記要約ステップが、前記領域における各ＳＮＰのＣｏｘ比例ハザード回帰のＰ値を決定することと、組み合わせた該Ｐ値を要約することと、によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＳＮＰのコピー数と、前記既定の染色体領域内にある遺伝子の発現レベルとを相関させるステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組み合わせたＰ値に基づく治療レジメンを開発するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ヒトからＤＮＡサンプルを採取するステップと、
少なくとも、ＳＭＣ４、ＰＤＣＤ１０、ＰＲＥＰ、ＣＢＸ３、ＮＵＰ２０５、ＴＣＥＢ１、ＴＥＲＦ１、ＴＰＤ５２、ＧＧＨ、ＴＲＡＭ１、ＺＢＴＢ１０、ＹＴＨＤＦ３、ＥＩＦ３Ｅ、ＰＯＬＲ２Ｋ、ＲＰＬ３０、ＣＣＮＥ２、ＲＡＤ５４Ｂ、ＭＴＥＲＦＤ１、ＥＮＹ２、ＤＰＹ１９Ｌ４、ＺＮＦ６２３、ＳＣＲＩＢ、ＳＬＣ３９Ａ４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＴＣＴＮ３、ＰＳＭＡ６、ＳＴＲＮ３、ＣＬＴＣ、ＴＲＩＭ３７、ＮＭＥ１、ＮＭＥ２、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＭＥＤ１３、ＳＬＣ３５Ｂ１、ＡＰＰＢＰ２、ＭＫＳ１、Ｃ１７又はｆ７１、ＨＥＡＴＲ６、ＴＭＥＭ４９、ＵＳＰ３２、ＡＮＫＲＤ４０、ＮＭＥ１−ＮＭＥ２、ＺＮＦ２６４、ＺＮＦ３０４、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＳＴＦ１、ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ、ＡＵＲＫＡ、ＲＡＥ１、ＳＴＸ１６、Ｃ２０又はｆ４３、ＲＡＢ２２Ａ、ＨＤＡＣ１、ＢＳＤＣ１、Ｃ１又はｆ９、ＣＯＸ５Ｂ、ＥＩＦ５Ｂ、ＤＤＸ１８、ＴＳＮ、ｐ２０、ＭＥＴＴＬ５、ＭＧＡＴ１、ＴＵＢＢ２Ａ、ＲＷＤＤ１、ＰＧＭ３、ＦＯＸＯ３、ＣＤＣ４０、ＲＥＶ３Ｌ、ＨＤＡＣ２、ＴＳＰＹＬ４、Ｃ６又はｆ６０、ＡＳＦ１Ａ、ＭＥＤ２３、ＴＳＰＹＬ１、ＡＣＴＲ１０、ＫＩＡＡ０２４７、ＲＡＲＡ、ＫＲＴ１０、ＲＩＯＫ３、ＩＭＰＡＣＴ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択された遺伝子において、一塩基多型について該ＤＮＡサンプルを調べるステップと、
該ＤＮＡサンプルを調べるステップの結果に基づいてヒト乳癌の予後診断を提供するステップと、を含む、ヒト乳癌の予後診断を提供するための方法。
【請求項６】
前記ヒトから乳房腫瘍サンプルを採取するステップを更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍サンプルがエストロゲン受容体陽性であるか又はエストロゲン受容体陰性であるかを判断するステップを更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍サンプルがエストロゲン受容体陽性であると判定され、前記一塩基多型がＴＣＴＮ３の減少であると判定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍サンプルがエストロゲン受容体陰性であると判定され、前記一塩基多型がＨＤＡＣ１、ＢＳＤＣ１、又はこれらの組み合わせの減少であると判定される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ヒトからＤＮＡサンプルを採取するステップと、
染色体番号１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、及びこれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１つの染色体において、一塩基多型について該ＤＮＡサンプルを調べるステップであって、該一塩基多型が表７及び８に記載されている対応する開始塩基と終了塩基との間に生じている、ステップと、
該ＤＮＡサンプルを調べるステップの結果に基づいてヒト乳癌の予後診断を提供するステップと、を含む、ヒト乳癌の予後診断を提供するための方法。
【請求項１１】
前記ヒトから乳房腫瘍サンプルを採取するステップを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍サンプルがエストロゲン受容体陽性であるか又はエストロゲン受容体陰性であるかを判断するステップを更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍サンプルが、エストロゲン受容体陽性であると判定され、前記一塩基多型が、表７に記載されている対応する開始塩基と終了塩基との間に生じている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍サンプルが、エストロゲン受容体陰性であると判定され、前記一塩基多型が、表８に記載されている対応する開始塩基と終了塩基との間に生じている、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【開示の内容】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、同時係属中の米国特許仮出願第６１／００７，６５０号（２００７年１２月１４日出願）に対して優先権及び利益を主張し、この出願は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、１つの実施形態において、特定の遺伝子中の一塩基多型（ＳＮＰ）の数を測定することによって乳癌の予後診断を提供する方法に関連する。
【０００３】
〔発明の背景〕
乳癌は、幅広い種類の臨床的様相、組織学的タイプ及び成長速度を呈する不均質な疾患（heterogeneous disease）である。検出可能なリンパ節関与のない患者（低リスクと見なされる母集団）では、それら患者の２０〜３０％が、５〜１０年後の追跡調査で再発疾患を生じている。再発のリスクがあるこの群の個人を特定するのは、現在のところ、信頼性のある方法で行うことはできない。
【０００４】
欠失、挿入及び増幅などの、ＤＮＡコピー数変化（ＣＮＡ）又はコピー数多型（ＣＮＰ）は、発癌現象に寄与する主な遺伝子変化の１つであると考えられている。従来型及びアレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーションの両方によって、乳房腫瘍中で変化している染色体領域が明らかにされている。しかしながら、高スループット、高解像度プラットフォームを使用して、ＤＮＡコピー数変化と乳癌の予後との関連を調査した研究は存在しない。
【０００５】
〔発明の概要〕
本明細書に開示される方法は、患者の予後結果を予測するためにコピー数変化（ＣＮＡ）の利用を実行可能にするものである。予後診断のための遺伝子発現に基づく署名（gene expression based signatures for prognosis）と組み合わせると、コピー数署名（ＣＮＳ）はリスク分類をより正確にし、有意に不良の予後見通しと、化学療法薬剤に対して潜在的に特異な反応とを有する乳癌患者を特定することができる。
【０００６】
本明細書で検討される実施例では、乳癌ゲノム中の１００，０００超のＳＮＰ座についてのＣＮＡ分析に、高スループットかつ高解像度のオリゴヌクレオチド系一塩基多型（ＳＮＰ）アレイ技術が使用された。３１３人のＬＮＮ（リンパ節陰性）乳癌患者の大規模コホートにおいて、遠隔転移を生じる可能性が非常に高い患者のサブセットと相関関係にあるＣＮＡが同定された。ＣＮＡの予後診断能（prognostic power）は、２つの独立した患者コホートにおいて検証された。加えて、公開されている予測遺伝子署名を使用して、異なる予後を有するものとして同定された患者サブグループに対して、推定される薬剤有効性の試験が行われた。この結果、ＤＮＡコピー数分析と遺伝子発現分析とを組み合わせることにより、乳癌患者のリスク評価について、追加的かつより良い手段がもたらされることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
本発明は、下記の添付図面を参照して開示されている。
【図１】予後コピー数変化（ＣＮＡ）を有する遺伝子（ＳＮＰ）を同定するための分析ワークフロー。
【図２Ａ】予後ＣＮＡの染色体領域を図示。
【図２Ｂ】予後ＣＮＡの染色体領域を図示。
【図３】遠隔転移のない生存数をＣＮＳの関数として示している。
【図４】化学療法化合物に対する感受性。
【図５】ＥＲ陽性腫瘍及びＥＲ陰性腫瘍の分化をグラフで表わしたもの。
【図６】ＥＲ陰性腫瘍の特定のデータ。
【０００８】
本明細書に述べられている実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示すものであるが、いかなる意味でも本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【０００９】
〔詳細な説明〕
欠失及び増幅などの特定のＤＮＡコピー数変化（ＣＮＡ）は、アポトーシスの低下、抑制のない増殖、運動性及び脈管形成の増加を介して、発癌及び腫瘍の発達に寄与する主要なゲノム変化である。かなりの割合のゲノム異常は癌の生物学には無関係であり、単にランダムな中立の事象によるものであるため、究極的に悪性の形質転換及び進行に至る遺伝子発現制御をもたらす原因遺伝子ＣＮＡを同定するのは難しい。蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションと比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）の両方によって、乳房腫瘍のＣＮＡを示す染色体領域が明らかにされている。５１例の乳房腫瘍を含む最近の研究において、乳癌アンプリコン境界を精密にし、可能性のあるドライバー遺伝子のリストを絞り込むために、高解像度ＳＮＰアレイが遺伝子発現プロファイリングと共に使用された。しかしながら、予後有意性との関連でＣＮＡを調べた研究はごく限定的な数しかなく、これらの研究のサンプルサイズは確かな結論を導くには小さすぎた。加えて、十分なサンプルサイズで、ヒトゲノムの適切な適用範囲及びマッピング解像度を有するテクノロジーを用い、ＣＮＡ分析と遺伝子発現プロファイリングとを組み合わせて使用して乳癌予後を調べた研究は更に少ない。
【００１０】
本明細書は、ゲノム全体の遺伝子発現データも入手可能な３１３例のリンパ節陰性（ＬＮＮ）原発性乳房腫瘍から得たゲノムＤＮＡにおいて、ヒトゲノム全体で１００，０００を超えるＳＮＰ座のＤＮＡコピー数の分析を記述している。これら２つのデータセットを組み合わせることにより、ゲノム座の同定、及び、遠隔転移と高い相関性を有するマップされた遺伝子の同定が可能になった。同定された患者サブグループは、更に、公開されている予測診断署名に基づいて、推定される薬剤有効性の試験が行われた。
【００１１】
ＤＮＡコピー数及び遺伝子発現の組み合わせ分析が、アジュバント全身性治療を受けていない、大規模コホートの３１３人のＬＮＮ乳癌患者に対して実施された。我々の知る限り、これはａＣＧＨよりもはるかに高い解像度を有する高密度ＳＮＰアレイ技術を用いた乳癌予後診断のためにＣＮＡ分析を行う研究として最大のものである。ＣＮＡ及び一致する遺伝子発現制御を示した８１の遺伝子の署名が、２００人のＬＮＮ患者のトレーニング群から同定された。このＣＮＳは、独立した１１３人のＬＮＮ患者において検証され、また１１６人のＬＮＮ患者の外部ａＣＧＨデータセットにおいても検証された。８１遺伝子ＣＮＳによって同定された特に急速な再発を伴う非常に予後不良の群が、実際には７６遺伝子ＧＥＳのみによって予測された予後不良患者のサブセットを構成したため、予備的臨床有用性が示された。よってＧＥＳに加えてＣＮＳを適用することにより、乳癌患者の予後のリスク分類が明らかに改善される。更に、化学療法化合物に対する感受性についての既報の遺伝子署名プロファイルを使用することによって、非常に予後不良の群が、手術前Ｔ／ＦＡＣ混合化学療法、特にシクロホスファミド及びドキソルビシン化合物に対して、より強い抵抗性を有する可能性があり、一方エトポシド及びトポテカンからは効果が得られる可能性が示された。これは、このカテゴリーに属する患者を、他の患者群よりもしっかりと監視すべきこと、他の患者群とは異なる化学療法レジメンで管理すべきこと、並びに、８１のＣＮＳ遺伝子も、化学療法感受性において重要な役割を果たしていることを示唆している可能性がある。
【００１２】
遺伝子増幅と乳癌予後との間の関係を調べた過去の研究では、ＥＲ陽性及びＥＲ陰性などの異なる乳癌サブタイプを単一の均質コホートと見なしていた。しかしながらこれらの腫瘍は、おびただしい量の明確かつ全体的な遺伝子発現プロファイルによって証明されるように、病理学的及び生物学的に非常に異なることが知られている。この相違は、ＤＮＡコピー数の全体的なパターンにも敷延される。よって、ＥＲ陽性及びＥＲ陰性（エストロゲン受容体陽性及び陰性）の腫瘍については、別々に分析を実施する必要がある。実際に、ＥＲ陽性腫瘍から同定された、予後染色体領域は、ＥＲ陰性腫瘍から同定されたものと共通する部分はほとんどない。例えば、染色体領域８ｑは、乳癌の予後不良に関係するＤＮＡ増幅の部位として広く知られている。この領域８ｑは実際にＥＲ陽性腫瘍の増幅のホットスポットであったが、ＥＲ陰性腫瘍の明らかな増幅領域はここに含まれていなかった。ＥＲ陰性腫瘍はＬＮＮ乳癌の少ないパーセンテージ（２５％以下）しか構成していないため、分析においてこの２つのタイプの乳癌を分けない研究では、その結論が、ＥＲ陽性腫瘍の多数派サンプルの結果に埋もれてしまっていたと推測するのが妥当である。我々の分析で観察された、この２つのタイプの腫瘍間の明らかな違いとして、もう１つは、染色体領域２０ｑ１３．２〜１３．３であった。ＥＲ陽性腫瘍におけるこの領域のコピー数の増加、しかしながらこれとは対照的に、ＥＲ陰性腫瘍におけるこの領域のコピー数の減少は、早期再発に関連していた。合わせて考えると、これらの結果は、ＥＲ陽性腫瘍とＥＲ陰性腫瘍は、癌の発生と進行に関して異なる生物学的経路をたどることを再強調している。
【００１３】
予後染色体領域の同定
各ＳＮＰの四分位数間コピー数見積りから算出された平均コピー数の中央値は２．１であり、ゲノムの大半が二倍体であると全体的に仮定した場合と首尾一貫している。３１３例の腫瘍すべてについてＰＣＡを使用した無管理分析では、染色体コピー数の変化が、ＥＲ陽性腫瘍とＥＲ陰性腫瘍との間に明白な分離の傾向を表わしたことを示している（図５）。したがって、これら２つのタイプの乳房腫瘍は、これまでの多くの研究で示唆された全体的な遺伝子発現プロファイルについて異なるだけでなく、ＤＮＡレベルで異なる染色体変化も有している。よって、ＥＲ陽性腫瘍とＥＲ陰性腫瘍について別々に実施する後続の分析が必要である。患者は無作為に、約２：１の比率で、２００人のトレーニング群（ＥＲ陽性腫瘍１３３人、ＥＲ陰性腫瘍６７人）と１１３人の試験群（ＥＲ陽性腫瘍６６人、ＥＲ陰性腫瘍４７人）とに分けた（表１及び図１）。このトレーニング群は、予後染色体領域及びマップされた遺伝子の同定と、遠隔転移を予測するためにＣＮＳの作成に使用された。この試験群は、検証目的のためにのみ、別に分類された。
【００１４】
第一に、ＣＮＡが患者のＤＭＦＳに相関している染色体領域が同定された。ＥＲ陽性腫瘍については、１７本の染色体にわたって分布する４５の染色体領域が、ＤＭＦＳに相関するＣＮＡを有するものとして同定され（図２Ａ及び表７）、ＥＲ陰性腫瘍については、１９本の染色体にわたって分布する５６の染色体領域があった（表８）。ＥＲ陽性腫瘍及びＥＲ陰性腫瘍のこれら領域サイズの合計は、それぞれ５２１Ｍｂ（表４）及び４９６Ｍｂ（表５）であった。ＥＲ陽性腫瘍から同定された、予後染色体領域は、ＥＲ陰性腫瘍から同定されたものと共通する部分がほとんどない（図２Ａ及び２Ｂ）。
【００１５】
２００人の患者のトレーニング群において、８１遺伝子予後コピー数署名（ＣＮＳ）が作成され、１１３人の患者の独立試験群（ハザード比［ＨＲ］：２．８、９５％信頼区間［ＣＩ］：１．４〜５．６、ｐ＝０．００３６）において、及び、１１６人の患者の外部データセット（ＨＲ：３．７、９５ＣＩ：１．３〜１０．６、ｐ＝０．０１０２）において、高い遠隔転移確率を有する患者サブグループを識別した。これらの高リスク患者は、我々が既に確立した７６遺伝子発現署名（ＧＥＳ）によって予測された高リスク患者のサブセットを構築する。このＣＮＳ及びＧＥＳによって同定された非常に予後不良の群は、手術前パクリタキセル及び５−ＦＵ−ドキソルビシン−シクロホスファミド（Ｔ／ＦＡＣ）の混合化学療法に対してより強い抵抗性を有すると推定され、（ｐ＝０．０００３）、特にドキソルビシン及びシクロホスファミド化合物に対して、より強い抵抗性を有すると推定され、一方エトポシド及びトポテカンからは効果が得られる可能性が示された。
【００１６】
患者サンプル
Ｅｒａｓｍｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（オランダ・ロッテルダム）の腫瘍バンクから選択した３１３人のＬＮＮ乳癌患者の凍結腫瘍試料がこの研究に使用された。これらの患者のいずれも、全身性（ネオ）アジュバント治療を受けていなかった。局所的な主要治療のガイドラインは同じであった。これら試料のうち、２７３件が、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａチップを使用した遠隔転移の予測に関する７６遺伝子署名を調べるのに使用された。残る４０人の患者は、予後生物学的経路を研究するのに使用された。この研究はＭｅｄｉｃａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｒａｓｍｕｓ  ＭＣ（オランダ・ロッテルダム）（ＭＥＣ  ０２．９５３）によって認可され、Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｄｕｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｍｗｖ．ｎｌ／）に準拠して実施され、可能な場合にはＲｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ＲＥＭＡＲＫに従った。
【００１７】
前述のＥＲ（及びＰｇＲ）カットオフを使用して、１９９の腫瘍のサンプリングがＥＲ陽性、１１４がＥＲ陰性として分類された。手術時の患者の年齢中央値（乳房温存手術：患者２３０人、非定型的根治的乳房切除術：患者８３人）は５４歳であった（範囲２６〜８３歳）。生存患者（ｎ＝２２０）の追跡検査時期中央値は９９ヶ月であった（範囲２０〜１６９ヶ月）。合計１１４人の患者（３６％）に遠隔転移が発生し、ＤＭＦＳの分析においては失敗として数えられた。死亡した９３人の患者のうち、７人は疾患の形跡がなく、ＤＭＦＳ分析において最後の追跡検査で検閲された。８６人は、先の再発の後に死亡した。患者の臨床病理学的特徴は表１に記載されている。臨床データ及びＳＮＰデータを含むデータセットは、アクセッション番号１００９９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ、ユーザー名：ｊｙｕ８、パスワード：ｊａｃｋｘｙｕ）でＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓデータベースに提出された。
【００１８】
独立した検証として、本研究において使用された１１６人のＬＮＮ患者の外部アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）データセットは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ８７５７からダウンロードされた。このデータセットに関連する臨床データ（表１）は、Ｄｒ．Ｔｅｓｃｈｅｎｄｏｒｆｆ（英国・ケンブリッジ大学）の好意により提供された。
【００１９】
ＤＮＡ分離、ハイブリダイゼーション及びＤＮＡコピー数分析
ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、オランダ・ヴェンロー）を用いて、メーカー提供のプロトコルに従い、５〜１０片の３０μｍ腫瘍クライオスタット切片（１０〜２５ｍｇ）から分離された。各患者サンプルのゲノムＤＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋアレイセット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンタクララ）を用いて、標準プロトコルに従い、対立形質化された。簡単に言えば、ゲノムＤＮＡ  ２５０ｎｇをＨｉｎｄ  ＩＩＩ又はＸｂａＩで消化し、次に凝集性の４つの塩基対（ｂｐ）のオーバーハングを認識するアダプターにライゲーションした。アダプター配列を認識するジェネリックプライマーを使用して、ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、マサチューセッツ州ウォータータウン）を用い、２５０〜２０００ｂｐサイズの範囲のフラグメントを優先的に増幅するよう最適化したＰＣＲ条件で、このアダプターライゲーションしたＤＮＡフラグメントを増幅した。Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ９６  ＵＦ  ＰＣＲ精製システムで精製した後、ＰＣＲ生成物の合計４０μｇをフラグメント化し、約２．９μｇを４％ＴＢＥアガロースゲル上で可視化し、ＤＮＡフラグメントの平均サイズが１８０ｂｐ未満になるようにした。フラグメント化したＤＮＡを次にビオチンで標識し、ハイブリダイゼーションオーブン中４８０℃で１７時間、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋアレイセットにハイブリダイズした。このアレイを洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎを用いて染色し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  Ｇ７及びＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｏｐｅｒａｔｉｎｇソフトウェア（ＧＣＯＳ）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）でスキャンした。ＧＴＹＰＥ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ソフトウェアを使用して、アレイ上の各プローブセットについてＳＮＰコールを生成した。ＳＮＰコールは、研究全体にわたってプローブセットの９６．６％について決定され、標準偏差は２．６％であった。次にＣＣＮＴ  ３．０ソフトウェアを使用して、各プローブセットのコピー数を表わす値を生成した。これは、各チップのハイブリダイズされた強度を、さまざまな人種にわたる健常者１００人について強度測定したメーカー提供の参照用セットと比較することによって行われた。コピー数測定は、ウィンドウサイズ０．５ＭｂでＣＣＮＴのゲノム平滑化機能を使用して平滑化した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋアレイセットには１１５，３５３のプローブセットが含まれ、これらについて正確なマッピング位置が定義された。プローブセット間の間隔の長さ中央値は８．６ｋｂであり、間隔の７５％が２８ｋｂ未満であり、９５％が９４．５ｋｂ未満であった。
【００２０】
予後コピー数変化を伴う染色体領域の同定
ＣＮＡが遠隔転移に関係している、染色体領域及びマッピング済み候補遺伝子の同定を行うため、我々の以前の研究で生成されたＲＮＡ遺伝子発現と、本研究で利用可能となった患者の同じコホートのＤＮＡコピー数の両方についてのゲノムデータを活用することによって、統合分析手法が設計された（図１）。我々の方法は、Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．が取った、ゲノムワイドのＤＮＡコピー数と遺伝子発現データとを交差させることにより発現署名の遺伝子レギュレーターを同定するための、マイクロアレイ署名のステップワイズ連鎖分析（ＳＬＡＭＳ）として記述されているアプローチの原理に、非常に類似している。ＥＲ陽性患者及びＥＲ陰性患者は別個に分析され、ランダムに約２：１の比率で分けて、ただしＴステージ、グレード、閉経状況及び再発などの臨床的及び病理学的パラメータのバランスを取り、トレーニング群患者２００人及び試験群患者１１３人とした（図１）。このトレーニング群は、予後染色体領域及びマップされた遺伝子の同定と、遠隔転移を予測するためにＣＮＳの作成に使用された。この試験群は、検証目的のためにのみ、別に分類された。
【００２１】
我々の分析の第一ステップは、遠隔転移に関係するコピー数変化のある染色体領域を同定することであった。簡単に言えば、トレーニング群においては、各個人のＳＮＰのコピー数とＤＭＦＳの時間との間の関係における統計的有意性を評価するため、一変量Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析が使用された。次に、予後染色体領域を定義するため、染色体を、平均２５０ＳＮＰを含む５Ｍｂのスライディングウィンドウを用いて１Ｍｂ刻みでスキャンし、ウィンドウ内の全ＳＮＰのＣｏｘ回帰ｐ値をコンパイルし、順列で入れ替えたデータセットに比較して全体としての全ＳＮＰの平滑化したｐ値を決定した。簡単に言えば、ｎ個のＳＮＰを含むサイズ５Ｍｂの所与のウィンドウについて、βｉはＣｏｘ回帰係数を表わし、Ｐｉはｉ番目のＳＮＰについてのＣｏｘ回帰からのＰ値を表わす。このウィンドウの対数スコアＳは、次の式のように、このウィンドウ内の全ＳＮＰの統計的有意性を全体として要約することによって定義された：
【数１】
2011505840.tif 000003
【００２２】
指示変数Ｉｉは、Ｃｏｘ回帰係数βｉの符号によって示される、正の相関のコピー数変化と、負の相関のコピー数変化とを表わし、これらを区別するために使用された。正の係数は、疾患が再発した患者が疾患のない患者よりも高いコピー数を有していたことを表わし、負の係数は、その逆を示唆する。対数スコアから平滑化したｐ値を計算するため、順列を用いて、対数スコアのヌル分布を誘導した。患者ＩＤに関する臨床的情報をシャッフルすることにより、４００の順列が実施された。平滑化したｐ値から、平滑化したｐ値がすべて０．０５未満である染色体領域として、予後染色体領域が定義された。
【００２３】
ＣＮＳの構成体と予測モデル
予後染色体領域が同定されたら、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）Ｈｕｍａｎ  Ｍａｒｃｈ  ２００６（ｈｇ１８）アセンブリを用いて、この十分に定義された遺伝子を、これらの領域内でＥｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ  ＩＤと共にマッピングした。次に、２つのフィルタリングステップを使用して、ＣＮＳを構築する予後値を有する信頼性がより大きい遺伝子を選択した。まず、少なくとも１つの対応するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３ＡプローブセットＩＤを有する遺伝子を、フィルターした。遺伝子発現データの中から、統計的に有意なＣｏｘ回帰ｐ値（ｐ＜０．０５）を有するこれらの遺伝子だけが続行された。次に、遺伝子発現レベルとコピー数との間の相関関係は、０．５よりも大きくなければならない。遺伝子が複数のＳＮＰを内部に含む場合は、最良のＣｏｘ回帰ｐ値を伴うＳＮＰが選択された。ＳＮＰが含まれていない場合は、最も近いＳＮＰが選択された。Ｕ１３３Ａプローブセットについては、最良のＣｏｘ  ｐ値を有するものが使用された。
【００２４】
遠隔転移を予測するため、ＣＮＳの遺伝子を用いてモデルを構築するために、遺伝子のコピー数見積り数が、増幅、変化なし、又は欠失といった別個の値に変換された。この変換を行うために、代表的なＳＮＰコピー数データの混合正規分布モデリングを実施し、モデル化された分布の主ピークを二倍体コピー数の見積りとして使用することによって、各遺伝子の二倍体コピー数を予測した。次に増幅について、固有のデータ変動による低い偽陽性率を確実にするため、二倍体コピー数見積りより上の１．５ユニットとして定義されたのに対し、欠失は、その変化の性質と、コピー数の喪失に関するコピー数データの狭い分布とにより、二倍体コピー数見積りより下の０．５ユニットとして定義された。コピー数データが変換された後、次の単純かつ直感的なアルゴリズムを使用して、予測モデルを構築した。このアルゴリズムは、ある患者が、少なくともｎ個の遺伝子が変化したコピー数を有している場合に、再発患者として分類し、そうでない場合は非再発患者として分類した。ＣＮＳにおいてｎが１〜全遺伝子の範囲について、ログランク検定の有意なｐ値によって測定することでトレーニング群において署名のパフォーマンスを調べ、ｎが増加したときに陽性が非常に小さな数になる状況を避けるため陽性（予測された再発患者）の割合の下限を設定することによって、可能なすべてのシナリオが調べられ、ｎの値が決定された。
【００２５】
ＣＮＳの検証
ＣＮＳのパフォーマンスは、上述と同じアルゴリズムを使って、残る検査患者のコピー数データセットと、外部ａＣＧＨデータセットの両方において評価された。外部データセットについては、全く異なるａＣＧＨ技術から誘導され、そのデータフォーマットはｌｏｇ２比であったため、ＳＮＰアレイ技術として生成された陽性に匹敵するパーセンテージを確保するため、増幅のカットオフは０．４５に設定され、一方欠失のカットオフは−０．３５に設定された。ＣＮＳの構成体では、ＣＮＳの遺伝子の対応するサブセットを使用して、ＥＲ陽性腫瘍とＥＲ陰性腫瘍について別々に検証が行われた。ただし、最終的に示されたパフォーマンスは、試験群において、ＥＲ陽性患者とＥＲ陰性患者の両方を合わせたパフォーマンスを表わしていた。
【００２６】
化学療法に対する推定反応
化学療法化合物に対する試験群患者の推定反応を検査するため、公開されている２つの研究における遺伝子発現署名が使用された。元の遺伝子発現データセットと、３０遺伝子の手術前のパクリタキセル、フルオロウラシル、ドキソルビシン及びシクロホスファミド（Ｔ／ＦＡＣ）の反応署名に関する対角線形判別分析（ＤＬＤＡ）の予測アルゴリズムのためのＲ関数が、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｍｄａｎｄｅｒｓｏｎ．ｏｒｇ／ｐｕｂｄａｔａ．ｈｔｍｌからダウンロードされた。このモデルは、与えられたＲ関数を使用して元のデータセットから調整を行い、次に我々の遺伝子発現データセットにおいて試験を行った。個々の化学療法薬剤に対する感受性を予測する７つの遺伝子発現署名それぞれについて、二値プロビット回帰モデルのベイズフィッティングを使用した、各化合物に対する感受性の予測確率が、Ａｎｉｌ  Ｐｏｔｔｉ及びＪｏｓｅｐｈ  Ｎｅｖｉｎｓ両博士の助力により計算された（詳細はＰｏｔｔｉ  Ａ，Ｄｒｅｓｓｍａｎ  ＨＫ，Ｂｉｌｄ  Ａ，Ｒｉｅｄｅｌ  ＲＦ，Ｃｈａｎ  Ｇ，Ｓａｙｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｇｕｉｄｅ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００６  Ｎｏｖ；１２（１１）：１２９４〜３００を参照）。
【００２７】
統計分析
主成分分析（ＰＣＡ）を使用した非監視分析（Unsupervised analysis）が、腫瘍の潜在的サブクラスを調べるため、すべてのＳＮＰのコピー数データセットについて実施された。カプラン−マイヤー生存プロット及びログランク検定を使用して、予測される高リスク群及び低リスク群のＤＭＦＳにおける相違が評価された。ＨＲ及びその９５％ＣＩを計算するため、Ｃｏｘ比例ハザード回帰が実施された。グレードに関するデータ欠落のため、多変量Ｃｏｘ回帰分析は、一般配置モデル下のマルコフ連鎖モンテカルロ法（Ｓｃｈａｆｅｒ  ＪＬ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｄａｔａ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ／ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；１９９７）を使用した多重代入法によって行われた。予後群の中で治療に対する特異な反応の有意性を評価するため、Ｔ検定が実施された。すべての統計分析は、Ｒバージョン２．６．２を使用して実施された。
【００２８】
ＣＮＳ構築のための予後候補遺伝子の探求
遺伝子発現プロファイルとコピー数変化との間に一貫した変化パターンを有する遺伝子をスクリーニングするため、同じ腫瘍に関する我々の以前の研究からの遺伝子発現プロファイリングデータが使用された（Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｋｌｉｊｎ  ＪＧ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ  ＡＭ，Ｌｏｏｋ  ＭＰ，Ｙａｎｇ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈ−ｎｏｄｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ．２００５  Ｆｅｂ  １９；３６５（９４６０）：６７１〜９  ａｎｄ  Ｙｕ  ＪＸ，Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ  ＡＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｍａｒｔｅｎｓ  ＪＷ，Ｓｍｉｄ  Ｍ，Ｋｌｉｊｎ  ＪＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｄｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ．２００７  Ｓｅｐ  ２５；７（１）：１８２）。コピー数の変化は、ある表現型効果をもたせるために遺伝子発現レベルにおいて対応する変化に反映されていなければならない、ということが、妥当であると見なされた。これらの予後領域において、ＥＲ陽性腫瘍については合計２，８３３の遺伝子（表４）、ＥＲ陰性腫瘍については合計３，６５６の遺伝子（表５）がマッピングされた。ＥＲ陽性腫瘍については、遺伝子発現データとコピー数データの両方において、１２２の遺伝子が有意なＣｏｘ回帰ｐ＜０．０５を有し、ＤＮＡコピー数と遺伝子発現における変化について同じ方向性を示した。ＥＲ陰性腫瘍については、両方のデータセットにおいて７８の遺伝子が有意なｐ値を有し、同じ変化の方向性を示した（表６）。これらのうち、ＥＲ陽性腫瘍については５３（４３％）の遺伝子、ＥＲ陰性腫瘍については２８（３６％）の遺伝子がそれぞれ、０．５を超える遺伝子発現とコピー数の間の相関係数を有していた。よって合計８１の予後候補遺伝子が同定され、これらが予後ＣＮＳとして使用された（表２並びに表６Ａ及び６Ｂ）。
【００２９】
ＣＮＳの検証
検証はＥＲ陽性腫瘍及びＥＲ陰性腫瘍において、ＣＮＳからそれぞれ５３及び２８の遺伝子を使用した試験群について、別個に行われた。最終的に示されたパフォーマンスは、この２つのサブグループを合わせた結果を表わしていた。１１３の独立した患者の試験群において、８１遺伝子ＣＮＳによって階層分けされた２つの患者群のカプラン−マイヤー分析により、ハザード比（ＨＲ）２．８（ｐ＝０．００３６）で、遠隔転移の時間に統計的有意差が示された（図３、Ａ）。この２つの群の５年後遠隔転移の見積り率は、それぞれ２７％［９５％信頼区間（ＣＩ）、１７％〜３５％］及び６７％（９５％ＣＩ、３２％〜８４％）であった。我々が以前同定した７６遺伝子ＧＥＳと共に使用した場合（Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｋｌｉｊｎ  ＪＧ，Ｚｈａｎｇ  Ｙ，Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ  ＡＭ，Ｌｏｏｋ  ＭＰ，Ｙａｎｇ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈ−ｎｏｄｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ．２００５  Ｆｅｂ  １９；３６５（９４６０）：６７１〜９）、８１遺伝子ＣＮＳによって定義される、より悪い予後の結果を有する患者群は、見積もられる５年後遠隔転移は同じ６７％のままであった。７６遺伝子ＧＥＳは、より良い予後を有する他の患者群を更に、５年後の再発率見積りがそれぞれ１１％及び３７％の、予後良好群と予後不良群とに階層分けした（図３、Ｂ）。この結果、ＧＥＳ良好／ＣＮＳ良好、ＧＥＳ不良／ＣＮＳ良好、ＧＥＳ不良／ＣＮＳ不良の群それぞれについて、良好、不良、及び非常に不良の群として定義される３つの予後群がもたらされた。従来の臨床及び病理学的因子と合わせた、両方の署名の多変量Ｃｏｘ回帰分析により、この２つの署名の組み合わせは、非常に不良対良好の予後群を比較したＨＲが８．８６、不良対良好の予後群を比較した場合が３．５９であり、ＤＭＦＳに関する唯一の有意な（尤度比検定ｐ＝０．０００３）予後因子であることが示された（表３）。
【００３０】
次に、低解像度ａＣＧＨ技術（Ｃｈｉｎ  ＳＦ，Ｔｅｓｃｈｅｎｄｏｒｆｆ  ＡＥ，Ｍａｒｉｏｎｉ  ＪＣ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｂａｒｂｏｓａ−Ｍｏｒａｉｓ  ＮＬ，Ｔｈｏｒｎｅ  ＮＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｒｒａｙ−ＣＧＨ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｕｂｔｙｐｅ  ｏｆ  ＥＲ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００７  Ｏｃｔ９；８（１０）：Ｒ２１５）から誘導された１１６人のＬＮＮ患者（ＥＲ陽性腫瘍７９人、ＥＲ陰性腫瘍３７人）の完全に独立した外部データセットにおいて、ＣＮＳが試験された。８１遺伝子ＣＮＳはこの患者コホートを２つの予後群に有意に階層分けし（図３、Ｃ）、ＨＲは３．７（ｐ＝０．０１０２）で、年齢、腫瘍サイズ、グレード、ＥＲ状態を含む多変量Ｃｏｘ回帰分析において依然として唯一の有意な予後決定因子であった（ｐ＝０．０１５）。予後不良群について５年後の遠隔転移率が、我々独自のデータセットのそれに比べて低率（１９％）であるのは、このコホートにおいて腫瘍サイズが比較的小さいこと（７８％が２ｃｍ未満）、及び３分の１を超える患者がアジュバントホルモン療法及び／又は化学療法を受けていたことによるものである可能性が高い（表１）。
【００３１】
化学療法に対する反応
次に、ＧＥＳ及びＣＮＳ予後検定によって決定された３つの予後群について、２つの研究（Ｐｏｔｔｉ  Ａ，Ｄｒｅｓｓｍａｎ  ＨＫ，Ｂｉｌｄ  Ａ，Ｒｉｅｄｅｌ  ＲＦ，Ｃｈａｎ  Ｇ，Ｓａｙｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｇｕｉｄｅ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００６  Ｎｏｖ；１２（１１）：１２９４〜３００及びＨｅｓｓ  ＫＲ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｋ，Ｓｙｍｍａｎｓ  ＷＦ，Ｖａｌｅｒｏ  Ｖ，Ｉｂｒａｈｉｍ  Ｎ，Ｍｅｊｉａ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００６  Ｓｅｐ  １０；２４（２６）：４２３６〜４４）（及びこの追跡検証研究も利用可能である：Ｂｏｎｎｅｆｏｉ  Ｈ，Ｐｏｔｔｉ  Ａ，Ｄｅｌｏｒｅｎｚｉ  Ｍ，Ｍａｕｒｉａｃ  Ｌ，Ｃａｍｐｏｎｅ  Ｍ，Ｔｕｂｉａｎａ−Ｈｕｌｉｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ａ  ｓｕｂｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＯＲＴＣ  １０９９４／ＢＩＧ  ００−０１  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．２００７  Ｄｅｃ；８（１２）：１０７１〜８及びＰｅｉｎｔｉｎｇｅｒ  Ｆ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｋ，Ｍａｚｏｕｎｉ  Ｃ，Ｋｕｅｒｅｒ  ＨＭ，Ｈａｔｚｉｓ  Ｃ，Ｌｉｎ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｉｒｔｙ−ｇｅｎｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃ  ｔｅｓｔ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｕｒｄｅｎ  ａｆｔｅｒ  ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｊｕｌ  １５；１３（１４）：４０７８〜８２）から誘導された、適切に検証された遺伝子署名を使用して、化学療法反応プロファイルを調べた。第一に、手術前Ｔ／ＦＡＣ化学療法に対する病理学的完全奏効（ｐＣＲ）を予測した、既に公開されている３０遺伝子署名を使用することにより（Ｈｅｓｓ  ＫＲ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｋ，Ｓｙｍｍａｎｓ  ＷＦ，Ｖａｌｅｒｏ  Ｖ，Ｉｂｒａｈｉｍ  Ｎ，Ｍｅｊｉａ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｐｒｅｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ，ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００６  Ｓｅｐ  １０；２４（２６）：４２３６〜４４）、異なる予後サブグループの各患者は、ｐＣＲを有する者と、残留疾患を依然として有する者の、２つの反応群のいずれかが割り当てられた。非常に予後不良の群にお���ては、１５人の患者のうちわずか２人だけ（１３％）がｐＣＲを有するものとして予測され、一方、予後不良の群及び予後良好の群においてはそれぞれ、６０人の患者中３４人（５７％）、３８人の患者中１４人（３７％）が、ｐＣＲを有するものとして予測された。非常に予後不良の群についての化学療法反応スコアは、予後不良群にくらべて有意に低く（ｐ＝０．０００３）、もしこれらの患者が手術前Ｔ／ＦＡＣ化学療法を受けた場合には、手術前Ｔ／ＦＡＣ化学療法に対してより強い抵抗性を有するであろうことが示された（図４、Ａ）。第二に、細胞株で確立された発現署名を用いて（Ｐｏｔｔｉ  Ａ，Ｄｒｅｓｓｍａｎ  ＨＫ，Ｂｉｌｄ  Ａ，Ｒｉｅｄｅｌ  ＲＦ，Ｃｈａｎ  Ｇ，Ｓａｙｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｇｕｉｄｅ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００６  Ｎｏｖ；１２（１１）：１２９４〜３００）、７つの異なる化学療法化合物に対し、３つの予後群について反応プロファイルが決定された。各化合物について、化合物に対する感受性の予測確率が、二値プロビット回帰モデルのベイズフィッティングを用いて計算された。予後不良群と比較して、非常に予後不良の群の患者は、ドキソルビシン（図４、Ｄ）及びシクロホスファミド（図４、Ｅ）に対する抵抗性がより大きいことが観察され、これは、３０遺伝子署名によるＴ／ＦＡＣに対する反応の予測と一貫している（図４、Ａ）。一方、非常に予後不良の群は、エトポシド（図４、Ｇ）及びトポテカン（図４、Ｈ）に対して感受性がより大きかった。ゆえに、予後診断及び治療予測のために遺伝子発現に基づく署名と組み合わせると、ＳＮＰアレイによって測定されたＣＮＡは、リスク分類を改善し、有意に不良の予後見通しと、化学療法薬剤に対して潜在的に特異な反応とを有する乳癌患者を特定することができる。
【表１】
2011505840.tif 000004
【００３２】
グレードは、地元の病理学者によって評価されたもので、腫瘍が採取された当時の医療状況を反映している。ＥＲ陽性及びＰｇＲ陽性：＞１０ｆｍｏｌ／ｍｇタンパク質、又は＞１０％陽性腫瘍細胞。ＮＡ＝該当なし。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
2011505840.tif 000008
【表６−１】
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【表６−２】
2011505840.tif 000010
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
2011505840.tif 000013
上の５３の遺伝子はＥＲ陽性腫瘍から、下の２８の遺伝子はＥＲ陰性腫瘍から。
【表８】
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【表９−１】
2011505840.tif 000015
【表９−２】
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【００３３】
〔実施の態様〕
（１）  予後値の染色体領域を定義するために染色体の既定部分におけるすべてのＳＮＰの有意性を要約するステップを含む、予後値の染色体領域を定義する方法。
（２）  前記要約ステップが、前記領域における各ＳＮＰのＣｏｘ比例ハザード回帰のＰ値を決定することと、組み合わせた該Ｐ値を要約することと、によって行われる、実施態様１に記載の方法。
（３）  前記ＳＮＰのコピー数と、前記既定の染色体領域内にある遺伝子の発現レベルとを相関させるステップを更に含む、実施態様１に記載の方法。
（４）  前記組み合わせたＰ値に基づく治療レジメンを開発するステップを更に含む、実施態様１に記載の方法。
（５）  ヒトからＤＮＡサンプルを採取するステップと、
少なくとも、ＳＭＣ４、ＰＤＣＤ１０、ＰＲＥＰ、ＣＢＸ３、ＮＵＰ２０５、ＴＣＥＢ１、ＴＥＲＦ１、ＴＰＤ５２、ＧＧＨ、ＴＲＡＭ１、ＺＢＴＢ１０、ＹＴＨＤＦ３、ＥＩＦ３Ｅ、ＰＯＬＲ２Ｋ、ＲＰＬ３０、ＣＣＮＥ２、ＲＡＤ５４Ｂ、ＭＴＥＲＦＤ１、ＥＮＹ２、ＤＰＹ１９Ｌ４、ＺＮＦ６２３、ＳＣＲＩＢ、ＳＬＣ３９Ａ４、ＡＴＰ６Ｖ１Ｇ１、ＴＣＴＮ３、ＰＳＭＡ６、ＳＴＲＮ３、ＣＬＴＣ、ＴＲＩＭ３７、ＮＭＥ１、ＮＭＥ２、ＲＰＳ６ＫＢ１、ＰＰＭ１Ｄ、ＭＥＤ１３、ＳＬＣ３５Ｂ１、ＡＰＰＢＰ２、ＭＫＳ１、Ｃ１７又はｆ７１、ＨＥＡＴＲ６、ＴＭＥＭ４９、ＵＳＰ３２、ＡＮＫＲＤ４０、ＮＭＥ１−ＮＭＥ２、ＺＮＦ２６４、ＺＮＦ３０４、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＳＴＦ１、ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ、ＡＵＲＫＡ、ＲＡＥ１、ＳＴＸ１６、Ｃ２０又はｆ４３、ＲＡＢ２２Ａ、ＨＤＡＣ１、ＢＳＤＣ１、Ｃ１又はｆ９、ＣＯＸ５Ｂ、ＥＩＦ５Ｂ、ＤＤＸ１８、ＴＳＮ、ｐ２０、ＭＥＴＴＬ５、ＭＧＡＴ１、ＴＵＢＢ２Ａ、ＲＷＤＤ１、ＰＧＭ３、ＦＯＸＯ３、ＣＤＣ４０、ＲＥＶ３Ｌ、ＨＤＡＣ２、ＴＳＰＹＬ４、Ｃ６又はｆ６０、ＡＳＦ１Ａ、ＭＥＤ２３、ＴＳＰＹＬ１、ＡＣＴＲ１０、ＫＩＡＡ０２４７、ＲＡＲＡ、ＫＲＴ１０、ＲＩＯＫ３、ＩＭＰＡＣＴ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択された遺伝子において、一塩基多型について該ＤＮＡサンプルを調べるステップと、
該ＤＮＡサンプルを調べるステップの結果に基づいてヒト乳癌の予後診断を提供するステップと、を含む、ヒト乳癌の予後診断を提供するための方法。
（６）  前記ヒトから乳房腫瘍サンプルを採取するステップを更に含む、実施態様５に記載の方法。
（７）  前記腫瘍サンプルがエストロゲン受容体陽性であるか又はエストロゲン受容体陰性であるかを判断するステップを更に含む、実施態様６に記載の方法。
（８）  前記腫瘍サンプルがエストロゲン受容体陽性であると判定され、前記一塩基多型がＴＣＴＮ３の減少であると判定される、実施態様７に記載の方法。
（９）  前記腫瘍サンプルがエストロゲン受容体陰性であると判定され、前記一塩基多型がＨＤＡＣ１、ＢＳＤＣ１、又はこれらの組み合わせの減少であると判定される、実施態様７に記載の方法。
（１０）  ヒトからＤＮＡサンプルを採取するステップと、
染色体番号１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、及びこれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１つの染色体において、一塩基多型について該ＤＮＡサンプルを調べるステップであって、該一塩基多型が表７及び８に記載されている対応する開始塩基と終了塩基との間に生じている、ステップと、
該ＤＮＡサンプルを調べるステップの結果に基づいてヒト乳癌の予後診断を提供するステップと、を含む、ヒト乳癌の予後診断を提供するための方法。
【００３４】
（１１）  前記ヒトから乳房腫瘍サンプルを採取するステップを更に含む、実施態様１０に記載の方法。
（１２）  前記腫瘍サンプルがエストロゲン受容体陽性であるか又はエストロゲン受容体陰性であるかを判断するステップを更に含む、実施態様１１に記載の方法。
（１３）  前記腫瘍サンプルが、エストロゲン受容体陽性であると判定され、前記一塩基多型が、表７に記載されている対応する開始塩基と終了塩基との間に生じている、実施態様１２に記載の方法。
（１４）  前記腫瘍サンプルが、エストロゲン受容体陰性であると判定され、前記一塩基多型が、表８に記載されている対応する開始塩基と終了塩基との間に生じている、実施態様１２に記載の方法。
【図１】
2011505840.tif 000017
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2011505840.tif 000023
【国際調査報告】
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2011505840.tif 000025
2011505840.tif 000026
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