(57)【要約】  本発明は、（ｉ）グルコース、セロビオース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースまたは他のヘミセルロース糖の少なくとも１つを生成する条件下にて、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの少なくとも１つの混合物に、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの少なくとも１つを加水分解する１つ以上のセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびラッカーゼを生成する少なくとも１つの微生物株を接種するステップと、（ｉｉ）上記少なくとも１つの微生物株の増殖を抑制するステップと、（ｉｉｉ）少なくとも１つの藻株が１つ以上の脂肪酸を生成する条件下にて、ステップ（ｉｉ）の混合物に、上記グルコース、セロビオース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースまたは他のヘミセルロース糖の少なくとも１つを代謝する上記少なくとも１つの藻株を接種するステップと、任意で、（ｉｖ）上記少なくとも１つの藻株から上記１つ以上の脂肪酸を回収するステップと、による、脂肪酸を生成する方法に関する。
2011521669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）グルコース、セロビオース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースまたは他のヘミセルロース糖の少なくとも１つを生成する条件下にて、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの少なくとも１つの混合物に、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの少なくとも１つを加水分解する１つ以上のセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびラッカーゼを生成する少なくとも１つの微生物株を接種するステップと、
（ｉｉ）前記少なくとも１つの微生物株の増殖を抑制するステップと、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの藻株が１つ以上の脂肪酸を生成する条件下にて、ステップ（ｉｉ）の混合物に、前記グルコース、セロビオース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースまたは他のヘミセルロース糖の少なくとも１つを代謝する前記少なくとも１つの藻株を接種するステップと
を含む、脂肪酸を生成する方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｉ）における混合物が、フルフラール、フェノール化合物および酢酸の少なくとも１つを更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｉ）における混合物が、バイオマスから得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマスが、植物バイオマスを含むことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオマスが、植物または動物廃棄物から得られることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記植物バイオマスが、前記ステップ（ｉ）において接種される混合物を生成するために酸加水分解および熱処理による前処理を受けることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記植物バイオマスが、１０〜３５％リグニン；１５〜３５％ヘミセルロース；および３０〜６０％セルロースを含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記植物バイオマスが、スイッチグラス、トウモロコシ茎葉および植物の混合廃棄物からなる群より選択される少なくとも１つから得られることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの微生物株が、細胞外および／または細胞内セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびラッカーゼ酵素生成微生物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞外および／または細胞内セルラーゼ生成微生物が、原核生物、細菌、古細菌および真核生物ならびに菌類からなる群より選択されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞外および／または細胞内セルラーゼ生成微生物が、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）およびスポロサイトファーガ（Ｓｐｏｒｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リグノラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｉｇｎｏｒｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ペニシリウム・ベルクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・サーモグルコシダシウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）ｓｐｐ．ならびにスポロサイトファーガ（Ｓｐｏｒｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）ｓｐｐ．からなる群より選択される菌類または細菌であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの微生物株が菌類であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの微生物株がトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ））であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの微生物株が、バイオマスの前処理によって生成される１つ以上の化合物に対して耐性を示し、前記１つ以上の化合物が、フルフラール、酢酸および他の不純物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの微生物株が、未改変野生型バージョンの微生物と比べて、より効率的に対象の前処理されたバイオマスを代謝し、かつフルフラール、フェノール化合物および酢酸に対してより耐性を示すように進化的に改変されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記進化的に改変された微生物株が、未改変野生型バージョンの微生物と比べて、リグニンを有するセルロースおよびヘミセルロースを代謝するより高い能力を有するように、前記少なくとも１つの進化的に改変された微生物株が１つ以上のセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよび／またはラッカーゼを生成することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの微生物株が、連続転移（ｓｅｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）、連続希釈、遺伝子エンジン、連続培養およびケモスタットからなる群より選択される少なくとも１つの方法によって進化的に改変されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が連続培養であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの進化的に改変された微生物株が好気性菌類であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの微生物株が、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ））であり、連続培養によって進化的に改変されたことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの微生物株が、特定のバイオマス植物用に進化的に改変されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上のセルラーゼが、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼならびにヘミセルラーゼおよび場合によりラッカーゼからなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ステップ（ｉ）においてセルラーゼおよび／またはヘミセルラーゼ活性を測定することと、酵素の活性によって、ステップ（ｉｉ）に進むこととを更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの遺伝子改変微生物の成長が、温度が４５℃に高められた際に抑制されるように、前記抑制ステップ（ｉｉ）が、ステップ（ｉ）の前に、熱ショック、ＵＶ照射、放射線照射、ガス圧入、均質化および前記少なくとも１つの微生物の遺伝子改変からなる群より選択される１つ以上の方法によって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ（ｉｉｉ）における前記少なくとも１つの藻株が、緑藻類、紅藻類、藍藻類、シアノバクテリアおよび珪藻からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップ（ｉｉｉ）における前記少なくとも１つの藻株が、モナランタス・サリナ（Ｍｏｎａｌａｎｔｈｕｓ  Ｓａｌｉｎａ）；ボトリオコッカス・ブラウニイ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  Ｂｒａｕｎｉｉ）；クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｅｃｏｉｄｅｓ）；オウチロコッカス（Ｏｕｔｉｒｏｃｏｃｃｕｓ）  ｓｐ．；セネデスムス・オブリクース（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）；ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）ｓｐ．；ドナリエラ・バルダヴィル（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｂａｒｄａｗｉｌ）（Ｄ．サリナ（Ｓａｌｉｎａ））；ナビクラ・ペリクロサ（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）；ラジオスファエラ・ネゲベンシス（Ｒａｄｉｏｓｐｈａｅｒａ  ｎｅｇｅｖｅｎｓｉｓ）；ビダルフィア・アウリタ（Ｂｉｄｄｕｌｐｈｉａ  ａｕｒｉｔａ）；クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；ニッチア・パレア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐａｌｅａ）；オクロモナス・ダンニカ（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｄａｎｎｉｃａ）；クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）；ペリディニウム・キンクトゥム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｃｉｎｃｔｕｍ）；ネオクロリス・オレオアブンダンス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅａｂｕｎｄａｎｓ）；オーキスティス・ポリモルファ（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）；クリソクロムリナ（Ｃｈｒｙｓｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ）ｓｐｐ．；セネデスムス・アクトゥス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｃｕｔｕｓ）；セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）ｓｐｐ．；クロレラ・ミヌティシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）；プリムネシン・パルヴム（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）；ナビクラ・ペリクロサ（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）；セネデスムス・ジモルフス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ）；スコチエラ（Ｓｃｏｔｉｅｌｌａ）ｓｐ．；クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ｓｐｐ．；ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）；およびポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ｉｉｉ）における前記少なくとも１つの藻株の増殖が、１つ以上のリグニン、フルフラール、フェノール化合物、塩類ならびにセルラーゼ酵素および／またはヘミセルラーゼおよび／またはラッカーゼの存在によって抑制されないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ステップ（ｉｉｉ）における前記少なくとも１つの藻株が、好気性、嫌気性、光栄養性および従属栄養性からなる群より選択される１つ以上の条件において増殖することができることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ｉｉｉ）における前記少なくとも１つの藻株が、連続転移、連続希釈、遺伝子エンジン、連続培養およびケモスタットからなる群より選択される少なくとも１つの方法によって進化的に改変されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が連続培養であることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの藻株が、連続培養法によって進化的に改変されたクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）であることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ステップ（ｉｉｉ）における前記少なくとも１つの藻株が、前記グルコース、セロビオース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースまたは他のヘミセルロース糖ならびに廃グリセロールの少なくとも１つを代謝することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ステップ（ｉｉｉ）における前記少なくとも１つの藻株が、炭素源として酢酸を用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ステップ（ｉｉｉ）が好気性および従属栄養性条件下である際、前記少なくとも１つの藻株が呼吸を用いることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ステップ（ｉｉｉ）において、前記藻類が発酵副産物生成体を生成する生物と同量の炭素源を用いる際、前記方法が最大で１０％二酸化炭素を生成することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ステップ（ｉｉｉ）における前記少なくとも１つの藻株が、前記藻類の増殖を抑制する抑制副産物を生成しないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの藻株から前記１つ以上の脂肪酸を回収するステップ（ｉｖ）を更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記回収ステップ（ｉｖ）が、脂肪酸を含む前記少なくとも１つの藻株の濾過−遠心分離、綿状沈殿、溶媒抽出、酸抽出、塩基抽出、均質化、超音波処理、マイクロ波、加圧、蒸留、熱蒸発、水素化分解（流動式接触分解）および乾燥からなる群より選択される少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ステップ（ｉｖ）において回収される上澄みが再利用され得ることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ステップ（ｉｉｉ）が、脂肪酸、炭化水素、蛋白質、色素、糖、例えば、多糖および単糖ならびにグリセロールから選択される少なくとも１つの化合物の細胞外および／または細胞内生成のための条件下にて、前記少なくとも１つの藻株を培養し、増殖させることを更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの化合物が、バイオ燃料、化粧品、食物、機械油、色素形成および医学用途製品のために用いられ得ることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
オクタン、ガソリン、石油（ｐｅｔｒｏｌ）、ケロシン、ディーゼルならびに溶媒、プラスチック、油、グリースおよび繊維としての他の石油製品からなる群より選択される１つ以上の化合物を生成するために、前記少なくとも１つの藻株が、石油精製所における水素化分解用の原料として用いられ得る炭化水素鎖を生成することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ステップ（ｉｖ）の後、バイオディーゼル燃料用の脂肪酸を生成するために、前記少なくとも１つの藻株の細胞の直接エステル交換を更に含むことを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記直接エステル交換が、バイオディーゼル燃料を生成するための、藻細胞の破壊、脂肪酸の放出および、メタノールもしくはエタノールを用いた塩基もしくは酸方法を通じたエステル交換を含むことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの藻株が、バイオディーゼル生成のための脂肪酸を生成するための前処理または精製なしに、エステル交換反応によって生成される廃グリセロールを炭素源として用いるように適合されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
石油は再生不能資源である。その結果として多くの人が将来的な石油埋蔵量の最終的な枯渇を懸念している。世界の石油資源は２１世紀までに底を突くと一部では予測されている（非特許文献１）。
【０００２】
これにより、エタノールのような代替の炭化水素製品、あるいは、植物由来の原料および廃棄物由来の他の微生物発酵産物の拡大が促進されている。実際、現在の研究では、米国は１年に１０億乾燥重量トンのバイオマス（バイオマス原料）材料（その半分以上は廃棄物）を容易に生成し得ることが推定されている。これは主にセルロース性バイオマスの形態である。
【０００３】
セルロースは農業努力または生育させるのに必要なコストなしに世界中の牧草地、森林および野原における、ほぼ全ての天然の、自由に生育する植物、樹木および低木に含まれている。
【０００４】
これらのセルロース材料は２０３０年に米国のエネルギー需要の３０％以上を置き換えるのに十分なエタノールを生成するために用いられ得ると推定されている。この戦略の大きな利点は、セルロースが地球上で最も豊富且つ再生可能な炭素源であり、その使用可能燃料への効率的な転換が世界のエネルギー問題を解決し得るということである。
【０００５】
セルロース系エタノールは広範に研究されている。セルロース系エタノールはコーンスターチまたは糖のような他の供給源由来のエタノールと化学的に同一であるが、セルロース材料は極めて豊富且つ多様であるという利点を有する。しかしながらセルロース系エタノールは、発酵によってエタノールを生成するために一般的に用いられる微生物が利用できる糖モノマーを作るために、より多量の処理を必要とする点で異なる。
【０００６】
セルロースは豊富な植物材料資源であるが、その強固な構造により、セルロースは処理するのに困難な出発物質となる。その結果として、引き続く加水分解ステップに利用可能とするため、セルロースをリグニンシールおよびその結晶構造から遊離させるために効果的な前処理が必要とされる。圧倒的に、大部分の前処理は物理的または化学的手段によってなされる。より高い効率を果たすため、一部の研究者は両方の作用を組み込もうとしている。
【０００７】
これまでに利用可能な前処理法には、酸加水分解、蒸気爆発、アンモニア繊維膨張、アルカリ湿式酸化およびオゾン前処理が含まれる。効果的なセルロースの遊離に加え、理想的な前処理は、引き続く加水分解および発酵プロセスに対する阻害作用があるため、分解産物の形成を最小限にする必要がある。
【０００８】
阻害物質の存在は、エタノールを生成することをより困難にする。酸加水分解による前処理は恐らく最も古く、最も研究されている前処理法であるが、リグノセルロース加水分解物に存在する、群を抜いて最も有毒な阻害物質と見なされる、フルフラールおよびヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）を含む、いくつかの強力な阻害物質を生成する。
【０００９】
セルロース分子は様々な種類の糖分子の長鎖から構成されている。加水分解プロセスにおいて、これらの鎖は分解されて糖を遊離させ、その後、アルコール生成のために発酵される。
【００１０】
セルロース加水分解プロセスには、ｉ）酸を用いた化学反応、または、ｉｉ）酵素反応の主たる２つのがある。しかしながら現行の加水分解プロセスは、高価で非効率的である。例えば酵素加水分解プロセスは、外部の供給業者から高価なセルラーゼ酵素を入手することを要する。
【００１１】
セルロース産物のエタノールへの転換における更なる問題は、利用可能な炭素−二酸化炭素の最大５０％が発酵プロセスを通じて本質的に喪失されることである。加えて、エタノールはガスおよびディーゼルより腐食性である。その結果として、エタノールは確かな流通社会基盤および特殊設計エンジンを必要とする。最後に、エタノールは化石ガスより２０〜３０％効率が低く、エタノールとしてより容易に蒸発し、製造・流通プロセス全体の間により高いパーセントが喪失される。
【００１２】
セルロースからバイオディーゼルを生成し得るプロセスは、エタノールおよび他のバイオディーゼル製造と関連する問題を軽減し得る。
【００１３】
微生物（例えば、藻類および細菌）から得られるバイオディーゼルも非毒性、生分解性で、硫黄を含まない。バイオディーゼルの燃焼から放出される二酸化炭素の大部分は、微生物（例えば、藻類および細菌）の増殖中に吸収されたものから再利用されるため、バイオディーゼルの燃焼は、過去何世紀もの間地球の内部に貯蔵されている供給源から二酸化炭素を放出する石油の燃焼より少ない二酸化炭素を放出すると考えられる。従って、バイオディーゼルの生成のために微生物を利用することは、より少ない二酸化炭素のような温室ガスをもたらし得る。
【００１４】
一部の微生物種はその高油分含有のため、バイオディーゼルの生成に理想的に適する。いくつかの微生物は、膜成分、貯蔵産物、代謝産物およびエネルギー源として、脂質および／または他の望ましい炭化水素化合物を含む。脂質、炭化水素化合物および脂肪酸が微生物に発現するパーセントは、増殖される微生物のタイプによって異なる。しかしながら、全体的質量の最大９０％が脂質、脂肪酸および他の望ましい炭化水素化合物を含むいくつかの株が見出されている（例えば、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ））。
【００１５】
クロレラ属（Ｃｈｌｏｒｅｌａ  ｓｐ．）およびドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）のような藻類は、長年認識されているバイオディーゼル用の脂肪酸源である。実際、これらの真核性微生物は、高収量の脂肪酸（乾燥重量の２０〜８０％）を生成し、太陽エネルギー源があればＣＯ２を炭素として利用することができる。
【００１６】
しかしながら光合成過程は、この過程が費用対効果の高いバイオディーゼル源になることを可能にするほど効率的ではない。代替案は、藻類の有機従属栄養性を用い、グルコースのような炭素源上に藻類を増殖させることであった。これらの条件下では、脂肪酸収量は極めて高く、脂肪酸は高品質である。残りの乾燥重量は主に蛋白質からなる。しかしながら用いられる炭素源は、商業化を達成するには希少で高価すぎる。
【００１７】
微生物における脂質および他の望ましい炭化水素化合物の蓄積は、栄養欠乏条件下での増殖を含む、環境ストレスの期間中に生じ得る。従って、微生物の脂質および脂肪酸含量は培養条件によって異なり得る。
【００１８】
これらの微生物において自然発生する脂質および他の炭化水素化合物は、バイオディーゼルを得るために分離され、エステル交換され得る。ほとんどの場合にメタノールである、一価アルコールによる脂質のエステル交換は、バイオディーゼルの主成分であるアルキルエステルを生じさせる。
【００１９】
脂質のエステル交換反応は、用いられた当初の脂質（例えば、脂質は動物または植物源から得ることができる）と同様の脂肪酸プロファイルを有するバイオディーゼル燃料をもたらす。生じるバイオディーゼルの脂肪酸プロファイルが脂質源によって異なるため、エステル交換反応から生じるアルキルエステルのタイプも異なる。その結果として、バイオディーゼルの特性も、脂質源によって異なり得る（例えば、非特許文献２および非特許文献３を参照。各々は参照により本明細書に組み込まれる）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｋｅｒｒ  ＲＡ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８１，１１２８
【非特許文献２】Ｓｃｈｕｃｈａｒｄｔら、ＴＲＡＮＳＥＳＴＥＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＶＥＧＥＴＡＢＬＥ  ＯＩＬＳ：Ａ  ＲＥＶＩＥＷ，Ｊ．Ｂｒａｚ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．９，１，１９９−２１０，１９９８
【非特許文献３】Ｇ．Ｋｎｏｔｈｅ，ＦＵＥＬ  ＰＲＯＣＥＳＳＩＮＧ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，８６，１０５９−１０７０（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、バイオマスから脂肪酸を生成する方法、特に、バイオマスから脂肪酸を生成し、上記脂肪酸からバイオ燃料を生成する方法に関する。特に、本発明は、
（ｉ）グルコース、セロビオース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースまたは他のヘミセルロース糖の少なくとも１つを生成する条件下にて、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの少なくとも１つの混合物に、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの少なくとも１つを加水分解する１つ以上のセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびラッカーゼを生成する少なくとも１つの微生物株を接種するステップと、
（ｉｉ）上記少なくとも１つの微生物株の増殖を抑制するステップと、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの藻株が１つ以上の脂肪酸を生成する条件下にて、ステップ（ｉｉ）の混合物に、上記グルコース、セロビオース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースまたは他のヘミセルロース糖の少なくとも１つを代謝する上記少なくとも１つの藻株を接種するステップと、
任意で、（ｉｖ）上記少なくとも１つの藻株から上記１つ以上の脂肪酸を回収するステップと、による、脂肪酸を生成する方法に関する。
【００２２】
本発明のこれらおよび他の特徴は下記の図面および詳細な説明を参照により更に説明および例証される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、バイオエタノール生成のための従来のプロセスを示す流れ図である。
【図２】図２は、本発明の脂肪酸生成およびバイオ燃料生成のための全般プロセスを示す流れ図である。
【図３】図３は、本発明の脂肪酸生成およびバイオ燃料生成のための具体的なプロセスを示す流れ図である。
【図４】図４は、本発明の脂肪酸生成およびバイオ燃料生成のための具体的なプロセスの好ましい実施形態を示す流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
これより本発明の実施形態に詳細に言及する。実施形態例は添付図面に示されている。本発明はこれらの実施形態と関連して説明されるが、本発明をそのような実施形態に限定するものではないことが理解される。それとは逆に、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲内に含まれ得る代替例、改変例および等価例を含むものとする。
【００２５】
以下の説明では、本発明の完全な理解を与えるために、多くの具体的な詳細が示される。本発明はこれらの具体的な詳細の一部またはすべてを含まずに実施され得る。他の例では、本発明を不必要に曖昧にしないように、周知のプロセス操作は詳細には説明されていない。
【００２６】
本発明は、バイオマス材料から脂肪酸を生成する方法に関する。脂肪酸は、例えば、バイオ燃料生成に用いられ得る。
【００２７】
本発明の一実施形態は、（ｉ）グルコース、セロビオース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースまたは他のヘミセルロース糖の少なくとも１つを生成する条件下にて、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの少なくとも１つの混合物に、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンの少なくとも１つを加水分解する１つ以上のセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびラッカーゼを生成する少なくとも１つの微生物株を接種し、
（ｉｉ）上記少なくとも１つの微生物株の増殖を抑制し、上澄みの細胞外および／または細胞内セルラーゼ酵素を回収し（細胞内セルラーゼ酵素の回収は、超音波処理、フレンチプレス、温度、化学プロセス、酵素プロセス、ホモジナイザ、マイクロ波を含む一般的な技法を用いて細胞内酵素の放出のために細胞を粉砕／破壊することによってなされ得る）、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの藻株が１つ以上の脂肪酸を生成する条件下にて、ステップ（ｉｉ）の混合物に、上記グルコース、セロビオース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースまたは他のヘミセルロース糖の少なくとも１つを代謝する上記少なくとも１つの藻株を接種し、
任意で、（ｉｖ）上記少なくとも１つの藻株から上記１つ以上の脂肪酸を回収することによる脂肪酸を生成する方法に関する。
【００２８】
ステップ（ｉ）における混合物はバイオマスから得ることができる。バイオマスは生きている、または最近死んだ生体物質を含む、植物または動物から作製される任意の有機物であり、燃料として、または工業生産のために用いられ得る。最も一般的には、バイオマスはバイオ燃料として用いるために生育させられる植物を指すが、繊維、化学物質または熱の生産のために用いられる植物または動物も含む。バイオマスは再生可能なエネルギー源である。
【００２９】
樹木および飼料用農作物および森林、農業および都市廃棄物を含む多種多様なバイオマス源があり、これらはすべて本発明において用いられ得る。国内バイオマス資源の例には、農林廃棄物、都市固形廃棄物、産業廃棄物ならびに陸生および水性作物が含まれる。
【００３０】
世界には多くの種類の植物があり、多くの方法でエネルギー生産のために用いられ得る。一般に、２つの取り組み方があり、それはエネルギー使用専用に植物を生育させることと、他のことに用いられる植物残渣を用いることである。本発明において用いられる植物の種類は、気候、土壌、地形、個体数などによって地域で異なる。
【００３１】
エネルギー作物（「パワー作物とも称される」）は、潜在的に極めて多い量にて農場で生育させられ得る。地域原産のものを含む草木が好ましいエネルギー作物であるが、トウモロコシを含む他のより農業的に持続可能な程度の低い作物も用いられ得る。
【００３２】
樹木は本発明において加工するのに良好な再生可能なバイオマス源である。極めて速く成長することに加え、一部の樹木は地面近くで切断された後に再成長する（「刈り取り」と称される）。これにより、樹木は植え直す前に２０または３０年間、３〜８年毎に刈り取られ得る。そのような樹木（「短期輪作木質作物」とも称される）は、刈り取りの間の年月に４０フィートの高さまでも成長する。米国北部のより涼しい多湿の地域では、種々のポプラ、カエデ、ハリエンジュおよび柳が好ましい。より暖かい南東部では、アメリカスズカケノキおよびモミジバフウが好ましい。フロリダおよびカリフォルニアの最も暖かい地域では、ユーカリおよび松が良好に成長するようである。
【００３３】
草は、本発明に用いるのに良好な再生可能なバイオマス源である。細い茎の多年草は、米国全土にわたって一般的である。その例には、国の多くの地方で速やかに成長するスイッチグラス、ビッグブルーステムおよび他の自生種が含まれ、植え直す前に最大１０年間刈り取られ得る。サトウキビおよびエレファントグラスを含む細い茎の多年草は、フロリダおよびハワイのような高温湿潤な気候において生育させられ得る。トウモロコシおよびソルガムのような一年草は食物用に一般的に生育させられる別の種類の草である。
【００３４】
油脂植物も本発明に用いるのに良好なバイオマス源である。そのような植物には、例えば、油を生成する大豆およびヒマワリが含まれ、バイオ燃料を作製するために用いられ得る。ジャトロファ樹木またはトウゴマ植物のようなものは、豆粕が哺乳動物の栄養に対して有毒であるため、良好な油収量を保つ一部の他の油脂植物はエネルギー原料として不十分にしか用いられず、実際には良好なバイオマス作物である。別の異なる種類の油料作物は微細藻類である。これらの微小水生植物は、米国の砂漠南東部における湖に見出される高温の浅い塩水中で極めて速く成長する潜在力を有する。
【００３５】
この点において、通常、バイオマスは大量に植物・動物廃棄物を生成する林業、農業および製造業の廃棄物から得られる。
【００３６】
木材、パルプおよび製紙工場が工場に動力を供給するために使用するため、現在、森林廃棄物は大きな熱・電気源である。別の大きな木材廃棄物源は、通常木材収穫作業後に森林に残される木の最上部および枝である。
【００３７】
他の木材廃棄物源には、製材所由来のおがくずおよび樹皮、家具の製造時に生じる削りくずならびにパルプおよび製紙工場由来の有機性汚泥（または「リカー（ｌｉｑｕｏｒ）」）が含まれる。
【００３８】
林業では、収穫後に大量の残留物が野外に残存する。そのような廃棄物は、バイオ燃料生成のために回収され得る。動物農場は、肥料の形態で多くの「湿潤廃棄物」を生じさせる。そのような廃棄物は回収され、バイオ燃料生成のための脂肪酸を生成するために本発明によって用いられ得る。
【００３９】
人々は「都市木材廃棄物」（例えば、配送パレットおよび残った建築用木材）、ゴミの生分解性部分（紙、食物、革、庭ゴミなど）および、廃棄物が分解する際にゴミ廃棄場によって放出されるガスを含む多くの形態でバイオマス廃棄物を生成する。下水でさえもエネルギーとして用いられ得る。一部の下水処理工場は、下水によって放出されるメタンを捕捉し、熱および動力のためにこれを燃焼させ、空気汚染および地球温暖化ガスの放出を低減する。
【００４０】
一実施形態では、本発明は植物または動物から得られるバイオマスを用いる。そのようなバイオマス材料は、例えば、細断原料、植物廃棄物、動物廃棄物などを含む任意の形態でもよい。
【００４１】
通常、そのような植物バイオマスは、約１０〜３５％リグニン；約１５〜３５％ヘミセルロース；および約３０〜６０％セルロースを含む。
【００４２】
本発明において用いられ得る植物バイオマスは、スイッチグラス、ミスカンサス、麻、野菜パルプ、トウモロコシ、豆粕、トウモロコシ茎葉、サトウキビ、サトウダイコン、ソルガム、キャッサバ、ポプラ、柳、ジャガイモ廃棄物、バガス、おがくず、植物の混合廃棄物、油やし（ヤシ油）および木材工場廃棄物を含む樹木、紙、麦わら、葉、穀皮、殻、小枝、草からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。
【００４３】
本発明の一実施形態では、植物バイオマスは、スイッチグラス、トウモロコシ茎葉および植物の混合廃棄物からなる群より選択される少なくとも１つの植物から得られる。別の実施形態では、植物バイオマスは、高レベルのセルロースであるため、スイッチグラスから得られる。
【００４４】
任意のそのようなバイオマス材料が本発明の方法において用いられ得ることに留意すべきである。
【００４５】
最初に、植物バイオマスは、ステップ（ｉ）において用いられる混合物を調製するために、前処理を受けることができる。炭水化物画分の単糖類への加水分解がより迅速に、且つ、より多い収量にてなされるように、前処理はバイオマスの巨視的・微視的サイズおよび構造、ならびに超顕微鏡的な化学組成および構造を変化させるのに役立つ。一般的な前処理法は、参照により本明細書に組み込まれるＮａｔｈａｎ  Ｍｏｓｉｅｒ，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｗｙｍａｎ，Ｂｒｕｃｅ  Ｄａｌｅ，Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｅｌａｎｄｅｒ，Ｙ．Ｙ．Ｌｅｅ，Ｍａｒｋ  Ｈｏｌｔｚａｐｐｌｅ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｌａｄｉｓｃｈ，「Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  ｂｉｏｍａｓｓ，」Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：９６，ｐｐ．６７３−６８６（２００５）に開示され、以下に述べられる。
【００４６】
前処理法は物理的または化学的である。一部の方法では両方の作用を組み込む（ＭｃＭｉｌｌａｎ，１９９４；Ｈｓｕ，１９９６）。バイオマスに外来化学物質は添加されないため、分類目的では、蒸気および水は前処理用の化学物質と見なされることから除外される。物理的前処理法は、粉砕（バイオマス微粒子サイズの機械的減少）、蒸気爆発および熱水分解を含む。後続の処理ステップを通じて材料の取扱いを容易にするため、乾式、湿式および振動ボールミル粉砕（Ｍｉｌｌｅｔｔら、１９７９；ＲｉｖｅｒｓおよびＥｍｅｒｔ，１９８７；ＳｉｄｉｒａｓおよびＫｏｕｋｉｏｓ，１９８９）ならびに加圧粉砕（Ｔａｓｓｉｎａｒｉら、１９８０，１９８２）を含む粉砕が必要とされることもある。酸または塩基は前処理時にヘミセルロースまたはリグニンを除去することによって加水分解を促進し、セルロースからのグルコースの回収の収量を向上させ得る。一般的に用いられる酸および塩基には、例えば、それぞれＨ２ＳＯ４およびＮａＯＨが含まれる。セルロース溶媒は別のタイプの化学添加物である。バガス、トウモロコシの茎、ヒロハノウシノケグサおよびカモガヤにおけるセルロースを溶解する溶媒は、セルロースのグルコースへの９０％の転換をもたらし（Ｌａｄｉｓｃｈら、１９７８；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８４）、バイオマス構造が加水分解前に破壊されると、酵素加水分解が大幅に向上され得ることを示した。アルカリ性Ｈ２Ｏ２、オゾン、オルガノソルブ（水性アルコール中のルイス酸、ＦｅＣｌ３、（Ａｌ）２ＳＯ４を用いる）、グリセロール、ジオキサン、フェノールまたはエチレングリコールはセルロースの構造を破壊し、加水分解を促進することが公知である溶媒に含まれる（ＷｏｏｄおよびＳａｄｄｌｅｒ，１９８８）。濃縮鉱酸（Ｈ２ＳＯ４、ＨＣｌ）、アンモニアベースの溶媒（ＮＨ３、ヒドラジン）、非プロトン性溶媒（ＤＭＳＯ）、金属錯体（酒石酸鉄ナトリウム、カドクセン（ｃａｄｏｘｅｎ）およびクオキサン（ｃｕｏｘａｎ）および湿式酸化もセルロースの結晶化度を低下させ、リグニンのセルロースとのつながりを破壊するとともにヘミセルロースを溶解する。これらの方法は効果的であるが、グルコースの価値で評価されると（約５¢／ｌｂ）、現在では実用となるには高価すぎる。以下の蒸気爆発、液体熱水（ｌｉｑｕｉｄ  ｈｏｔ  ｗａｔｅｒ）、希酸、石灰およびアンモニア前処理（ＡＦＥＸ）の前処理方法は、費用対効果の高い前処理として潜在力を有し得る。
【００４７】
バイオマスを変化させ、本発明において用いられる混合物を作製するために、任意のそのような前処理法が用いられ得ることに留意すべきである。この点において、ステップ（ｉ）における微生物は、すべての前処理法と、選択前処理法に依存する、例えば、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドなどのフェノール類、３−メトキシ−４−ヒドロキシ−安息香酸、桂皮酸、アニリン、バニリンアルコールならびに水酸化ナトリウムなどのナトリウム混和物（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｅｓ）、硝酸混和物（ｎｉｔｒａｔｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｅｓ）またはアンモニアを含み得るその関連残留化合物とに適用するように、適合され得る。
【００４８】
酸前処理は、一般的な前処理法である。酸加水分解および熱処理による酸前処理は、本発明のステップ（ｉ）において接種される混合物を生成するために用いられ得る。このステップにおいて任意好適な酸が用いられ得、ヘミセルロースを加水分解してセルロースから切り離す酸が好ましい。用いられ得る一部の一般的な酸は、塩酸、リン酸、硫酸または亜硫酸から選択される鉱酸を含む。例えば、約０．５％〜２．０％の濃度での硫酸が好ましい。好適な有機酸は、炭酸、酒石酸、クエン酸、グルクロン酸、酢酸、ギ酸または類似のモノ−もしくはポリカルボン酸でもよい。通常、酸前処理は、例えば、約７０℃〜５００℃の範囲または約１２０℃〜２００℃の範囲での混合物の加熱も含む。
【００４９】
そのような酸前処理法は、ステップ（ｉ）において用いられる混合物を生成するために用いられ得る。
【００５０】
バイオマスが植物から得られる際に、混合物がセルロース、ヘミセルロース、リグニン、フルフラール、フェノール類および酢酸の少なくとも１つを含むことに留意すべきである。
【００５１】
前処理後、ステップ（ｉ）において、混合物は細胞外セルラーゼ生成体である少なくとも１つの微生物株を接種される。この微生物は、グルコース、セロビオース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースまたは他のヘミセルロース糖の少なくとも１つを生成する条件下にて、混合物中に存在するセルロースおよびヘミセルロースの少なくとも１つを加水分解（酵素加水分解）する、１つ以上のセルラーゼを生成し得る。
【００５２】
セルラーゼとは、セルロース、ヘミセルロースおよび／またはリグニンを加水分解する一群の酵素をいう。通常、これは、セルロースのセルロース分解（ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｓｉｓ）（または加水分解）を触媒する古細菌、菌類、細菌、原生動物のような微生物（即ち、細胞外セルラーゼ生成体）によって生成される酵素のクラスと称される。しかしながら、他の種類の微生物によって生成されるセルラーゼがあることに留意すべきである。
【００５３】
本発明は、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼおよびラッカーゼからなる群より選択される１つ以上のセルラーゼを生成する任意の細胞外および／または細胞内セルラーゼ生成体を用いることができることに留意することが重要である。本発明において用いられ得るセルラーゼ生成微生物の例には、添付の表１における微生物が含まれる。
【００５４】
従って、微生物によって生成されるセルラーゼ酵素は、ステップ（ｉ）において混合物に対して酵素加水分解を行うことができる。酵素加水分解の終了時には、得られた培地はグルコース、セロビオース、酢酸、フルフラール、リグニン、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトースおよび他のヘミセルロース糖を含み得る。
【００５５】
再度、本発明は、ステップ（ｉ）における酵素加水分解に必須のセルラーゼ酵素を生成するために、細胞外および／または細胞内セルラーゼ酵素生成体である任意の微生物を用いることができる。そのようなものとして、細胞外および／または細胞内セルラーゼ酵素を生成する細菌、古細菌を含む任意の原核生物および菌類を含む真核生物が、ステップ（ｉ）において微生物として用いられ得る。
【００５６】
一実施形態では、細胞外および／または細胞内セルラーゼ生成体は、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）およびスポロサイトファーガ（Ｓｐｏｒｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）からなる群より選択される属の菌類、古細菌または細菌である。更なる実施形態によれば、細胞外および／または細胞内セルラーゼ生成体は、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リグノラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｉｇｎｏｒｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ペニシリウム・ベルクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・サーモグルコシダシウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）ｓｐｐ．およびスポロサイトファーガ（Ｓｐｏｒｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）ｓｐｐ．からなる群より選択される少なくとも微生物でもよい。
【００５７】
加えて、細胞外および／または細胞内ラッカーゼ酵素生成体である微生物も本発明において用いられ得る。従って、細胞外および／または細胞内ラッカーゼ酵素を生成する細菌、古細菌を含む任意の原核生物および菌類を含む真核生物がステップ（ｉ）において微生物として用いられ得る。一実施形態では、細胞外および／または細胞内ラッカーゼ生成体は、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）およびスポロサイトファーガ（Ｓｐｏｒｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）からなる群より選択される属の菌類、細菌または古細菌である。更なる実施形態によれば、細胞外および／または細胞内ラッカーゼ生成体は、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リグノラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｉｇｎｏｒｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、ペニシリウム・ベルクロサム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｖｅｒｒｕｃｕｌｏｓｕｍ）、ルミノコッカス・アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・サーモグルコシダシウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、サイトファーガ（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）ｓｐｐ．およびスポロサイトファーガ（Ｓｐｏｒｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）ｓｐｐ．からなる群より選択される少なくとも微生物でもよい。本発明において用いられ得るラッカーゼ生成微生物の例には、添付の表１における微生物が含まれる。
【００５８】
一実施形態では、微生物株は菌類であり、より好ましくはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のような好気性菌類である。
【００５９】
再度、ステップ（ｉ）における酵素加水分解に必須の酵素を生成するために、細胞外および／または細胞内セルラーゼ酵素生成体あるいは細胞外および／または細胞内ラッカーゼ酵素生成体である任意の微生物が、本発明において用いられ得る。その例には添付の表１および２に列挙された微生物が含まれる。
【００６０】
本発明において微生物のタイプは、用いられる植物バイオマスのタイプに特異的であるように選択かつ／あるいは進化され得る。
【００６１】
微生物株は、酸またはアルカリ前処理のようなバイオマス前処理法によって生成される１つ以上の化合物に対して耐性を示す。バイオマス前処理ステップにおいて生成されるそのような化合物には、例えば、フルフラール、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、３−メトキシ−４−ヒドロキシ−安息香酸、桂皮酸、バニリン、バニリンアルコール、酢酸、リグニンおよび他の残留塩もしくは不純物が含まれる。
【００６２】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、進化的に改変され、用いられるバイオマスの特有なタイプのためにに特異化された少なくとも１つの微生物を用いる。進化的に改変された微生物は、より効率的に前処理された対象のバイオマスを代謝することができ（酵素加水分解）、そのような微生物は、例えば、フルフラールおよび酢酸などの残留化合物に対してより耐性を示すことができる。この点において、進化的に改変された微生物は、未改変野生型バージョンの微生物と比べてフルフラールおよび酢酸に対してより高い耐性を有することができる。
【００６３】
進化的に改変された微生物は、リグニンによって抑制される程度が低い１つ以上のセルラーゼおよび／またはラッカーゼ酵素を生成し、かつ／あるいはリグニンを代謝する向上した能力を有し得る。そのようなものとして、進化的に改変された微生物は、リグニンを代謝する酵素（例えば、ラッカーゼ）を生成する向上した能力を有し得る。従って、進化的に改変された微生物によって生成されるセルラーゼ、ヘミセルラーゼおよび／またはラッカーゼ酵素は、未改変野生型バージョンの微生物と比べて、リグニンを有するセルロースおよびヘミセルロースを代謝するより高い能力を有し得る。
【００６４】
進化的に改変された微生物の使用により、本発明は、ステップ（ｉ）の混合物／培地における現場でのセルラーゼの生成を可能にする。従って、外部の供給業者から高価なセルラーゼ酵素を購入する必要がない。これにより、バイオ燃料生成のための従来の方法と比べて、運用コストが低減する。更に、これも進化的に改変された微生物の使用により、通常ではバイオ燃料生成を阻害し得る（従来の方法のように）フルフラール、酢酸および塩類を除去するために、本発明における酸前処理された混合物を洗浄・解毒する必要がない。洗浄および解毒ステップを排除することにより、本発明は、バイオ燃料生成のための従来の方法と比べて更に運用コストを低減することができる。
【００６５】
進化的に改変された微生物は、自然選択法によって改変された微生物と定義されることが留意される。これらの技法は、例えば、連続転移、連続希釈、遺伝子エンジン、連続培養およびケモスタットを含む。１つの方法およびケモスタットデバイス（遺伝子エンジン；連続培養における希釈抵抗を回避することができる）が米国特許第６，６８６，１９４−Ｂ１号に述べられており、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
一実施形態において微生物は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願であるＰＣＴ／ＵＳ０５／０５６１６号、または、米国特許出願第１１／５０８，２８６号に開示されている連続培養法の使用によって進化的に改変される。
【００６７】
このようにして微生物を培養することにより、有益な突然変異が生じ、この特定の環境における生物の生存の機会および／または増殖率を向上させる、最新の対立遺伝子（即ち、遺伝子の変異体）を生じさせる。
【００６８】
そのようなものとして、本発明の微生物（例えば、菌類、古細菌、藻類または細菌）は、培養過程の間に獲得される突然変異によって識別され得る異なる株を構成し得、これらの突然変異は新しい細胞が祖先の遺伝子型特徴から識別されることを可能にし得る。従って、自然選択のプロセスを通じて向上した繁殖率を有する個体を分離することにより、微生物の新規株を選択することができる。
【００６９】
微生物を進化的に改変するための選択パラメータ。一例として、ステップ（ｉ）における微生物は、自然選択法を通じて進化的に改変され得、そのため、進化を通じ、選択される特定の炭素源を用いるのに適合されるように進化する。これは、特定の炭素源上で野生型より速く増殖する、最速で増殖する変異微生物の、用いられる自然選択法（例えば、連続培養）における適合を通じた同定および選択を含む。これはまた、希酸前処理を用いる際に、フルフラールおよび酢酸に対して向上した耐性を有する変異微生物を選択すること；あるいはリグニンによって抑制される程度の低い１つ以上のセルラーゼおよび／またはラッカーゼ酵素を生成し、かつ／あるいはリグニンを代謝する向上した能力を有する変異微生物を選択することを含む。これはまた、上述の必須セルロース酵素を生成する微生物の選択を伴い得る。
【００７０】
そのようなパラメータを用いることにより、本発明において微生物を進化的に改変するために、任意の自然選択法が本発明において用いられ得ることに留意すべきである。
【００７１】
従って、増殖率、生存能力およびバイオ燃料もしくは他の炭化水素製品としての有用性が向上され得るように、微生物は多くの方法で進化的に改変され得る。従って、微生物はバイオマス、および、存在するならば化学的前処理に関連する残留化学物質から構成される特定の基質上で増殖する能力を高めるように、進化的に改変され得る。この点において微生物は、特定のバイオマス植物および、最終的には関連する残留化学物質用に進化的に改変され得る。
【００７２】
微生物（例えば、菌類、藻類または細菌）は、好ましくは天然であって組換えＤＮＡ法によって改変されていない。言い換えると、所望の特徴を得るために微生物を遺伝子改変する必要はない。むしろ、所望の特徴は、上述の技法を用いて微生物を進化的に改変することによって得ることができる。それにもかかわらず、組換えＤＮＡ法によって改変された増殖率および／または生存能力を高めるために、遺伝子改変された微生物でさえも進化的に改変され得る。
【００７３】
本発明の一実施形態では、微生物は連続培養によって進化的に改変された菌類、特にトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）としても公知）である。
【００７４】
ステップ（ｉ）におけるセルラーゼ活性も、ステップ（ｉｉ）に進むことによって微生物の増殖を抑制かつ／あるいは停止する時期を判定するためにセルロース活性のレベルを評価する一般的な技法を用いて測定され得る。
【００７５】
本発明のステップ（ｉｉ）において、微生物の増殖および酵素生成は１つ以上の一般的な技法、例えば、熱ショック、ＵＶ照射、放射線照射、ガス圧入、および、上記少なくとも１つの微生物の遺伝子改変（ステップ（ｉ）の前）からなる群より選択される技法によって、上記少なくとも１つの遺伝子改変微生物の増殖が、例えば温度が４５℃に高められた際に抑制され得るように、抑制される。また、上澄みにおける細胞内セルラーゼ酵素の放出のために一般的な技法を用いて細胞は破壊され得る。
【００７６】
本発明のステップ（ｉｉｉ）は、少なくとも１つの藻株が１つ以上の脂肪酸を生成する条件下にて、ステップ（ｉｉ）の混合物に、グルコース、セロビオース、キシロースまたは他のヘミセルロース糖の少なくとも１つを代謝する上記少なくとも１つの藻株を接種することを含む。
【００７７】
好ましくは、上記少なくとも１つの藻株の増殖は、混合物に存在する１つ以上のリグニン、フルフラール、塩類およびセルラーゼ酵素の存在によって実質的に抑制されることはない。
【００７８】
藻株はまた、好気、嫌気、光栄養および従属栄養条件からなる群より選択される１つ以上の条件において増殖することができる。
【００７９】
微生物と同様に、ステップ（ｉｉｉ）における藻類は脂肪酸、バイオ燃料、バイオディーゼルおよび他の炭化水素製品の向上した供給源として機能するように進化的に改変され得る（上述の自然選択法を用いて）。この点において、藻類はバイオ燃料、バイオディーゼルまたは炭化水素ベースの製品としての用途のために培養され得る。
【００８０】
大部分の藻類は、幾分かの日光、二酸化炭素および水を必要とする。その結果として、藻類は開放された湖沼で培養されることが多い。しかしながら、藻類がそのような「開放」系で増殖されると、系は他の藻類および細菌による汚染を受けやすい。
【００８１】
一実施形態では、本発明は、閉鎖反応炉で増殖され得る従属栄養藻類を用いることができる（Ｓｔａｎｉｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｗｏｒｌｄ、第五版、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ社、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ  Ｃｌｉｆｆｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９８６、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８２】
種々の藻類種が用いられ得るが、多量の脂質、例えば、藻類の乾燥重量で約１５〜９０％、約３０〜８０％、約４０〜６０％または約２５〜６０％の脂質を天然に含む藻類が好ましい。本発明の実施前に、多量の脂質および多量のバイオ炭化水素を天然に含む藻類は、緩慢な増殖率を有することが関連付けられた。本発明によると、向上した増殖率を示す進化的に改変された藻株が生成され得る。
【００８３】
藻類を増殖させる条件を用いて藻類を改変することができる。例えば、培地における窒素供給の枯渇への反応として、藻類において脂質蓄積が生じるという顕著な証拠がある。研究では、窒素が培地から除去されたサンプルを分析し、そのような条件下で蛋白質含量は減少するが、炭水化物含量は増加し、次に、この後、藻類の脂質含量が増加することを認めた（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、ＥＦＦＥＣＴＳ  ＯＦ  ＮＩＴＲＯＧＥＮ  ＬＩＭＩＴＡＴＩＯＮ  ＯＮ  ＴＨＥ  ＧＲＯＷＴＨ  ＯＦ  ＡＬＧＡＥ  ＯＮ  ＴＨＥ  ＧＲＯＷＴＨ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＯＦ  Ａ  ＵＮＩＣＥＬＬＵＬＡＲ  ＡＬＧＡＥ  ＩＮ  ＣＯＮＴＩＮＵＯＵＳ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９６９、第１８巻、２２４５−２２５０頁、１９６９、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８４】
藻類は、例えば、連続転移、連続希釈、遺伝子エンジン、連続培養およびケモスタットを含む多くの技法によって進化的に改変され得る。藻類を改変するために、任意のこれらの技法が用いられ得る。一実施形態では、藻類は、各々が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ０５／０５６１６号または米国特許出願第１１／５０８，２８６号に開示されている連続培養によって進化的に改変され得る。
【００８５】
そのようにすることにおいて、増殖率、生存能力およびバイオ燃料もしくは他の炭化水素製品としての有用性が向上され得るように、藻類は多くの方法で進化的に改変され得る。従って藻類は、特定の基質上で増殖する能力を高めるように進化的に改変され得る。
【００８６】
藻類を進化的に改変するための選択パラメータ。一例として、ステップ（ｉｉｉ）における藻類は、連続培養のような自然選択法を通じて進化的に改変され得、そのため藻類は、進化を通じ、選択された特定の炭素源を用いるのに適合されるように進化する。これは、用いられる自然選択法における適合を通した、特定の炭素源上で野生型より速く増殖する、最速で増殖する変異藻類の同定および選択を含む。これはまた、例えば、リグニン、フルフラールおよび塩類に対して向上した耐性を有する、炭素源として酢酸を用いる藻類の選択を含む。そのようなパラメータを用いることにより、本発明において藻類を進化的に改変するために、任意の自然選択法が本発明において用いられ得ることに留意すべきである。
【００８７】
本発明において、そのような進化的に改変された藻類は、グルコース、セロビオース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースまたは他のヘミセルロース糖および／または廃グリセロールからなる群より選択される１つ以上の化合物を代謝し、上記少なくとも１つの藻株が１つ以上の脂肪酸を生成する条件にて、藻類は炭素源として酢酸を用いる。そのような進化的に改変された藻類は、好気、嫌気、光栄養および従属栄養条件からなる群より選択される１つ以上の条件において増殖することもできる。
【００８８】
一実施形態では、本発明のステップ（ｉｉｉ）が好気および従属栄養条件下で行われる際、藻類は呼吸を用いる。
【００８９】
ステップ（ｉｉｉ）において、発酵副産物生成体を生成する生物と同量の炭素源を用いる藻類は、最大で約１０％しか二酸化炭素を生成しない。この点において、二酸化炭素に転換される以上の糖が、増殖のために藻類によって用いられる。あるいは、微生物または藻類は発酵を用いないものでもよく、そのようなものとして、呼吸における副産物としてはるかに少ない二酸化炭素が生成される。
【００９０】
また、ステップ（ｉｉｉ）における少なくとも１つの藻株は、好ましくは、上記藻類の増殖抑制のための抑制副産物をほとんど、または、全く生成しない。
【００９１】
本発明において用いられ得る藻類のタイプは、緑藻類、紅藻類、藍藻類、シアノバクテリアおよび珪藻からなる群より選択される１つ以上のものである。
【００９２】
本発明は、藻株が１つ以上の脂肪酸を生成する条件下にて、少なくとも１つのグルコース、セロビオース、キシロースまたは他のヘミセルロース糖を代謝する任意の藻株を用いることができることに留意すべきである。
【００９３】
例として、ステップ（ｉｉｉ）において用いられる藻類は以下の藻類の分類学的門からでもよい：
（１）緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）門（緑藻類）；
（２）藍色植物（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）門（藍藻類）；
（３）珪藻（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）門（珪藻）；
（４）黄金色植物（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｔａ）門；
（５）黄緑色植物（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｔａ）門；
（６）クリプト植物（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｔａ）門；
（７）ユーグレナ植物（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｔａ）門；
（８）オクロ植物（Ｏｃｈｒｏｐｈｙｔａ）門；
（９）ハプト植物（Ｈａｐｔｏｐｈｙｔａ）門；および
（１０）渦鞭毛植物（Ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）門。
【００９４】
より具体的には、藻類は上記門内に含まれる以下の藻類の種由来でもよい（括弧内の数字は門に対応する）。
ビダルフィア（Ｂｉｄｄｕｌｐｈｉａ）（８）；
ピングイオコッカス（Ｐｉｎｇｕｉｏｃｏｃｃｕｓ）（８）；
スケレトネマ（Ｓｋｅｌｅｔｏｎｅｍａ）（８）；
エミリアニア（Ｅｍｉｌｉａｎｉａ）（９）；
プリムネシン（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ）（９）；
クリプテコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）（１０）；
アナベノプシス・サークラリス（Ａｎａｂａｅｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｒｃｕｌａｒｉｓ）（２）；
アンキストロデスムス・ブラウニイ（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）（１）；
Ａ．ファルカタス（ｆａｌｃａｔｕｓ）（１）；
ボトリジオプシス・インターセデンス（Ｂｏｔｒｙｄｉｏｐｓｉｓ  ｉｎｔｅｒｃｅｄｅｎｓ）（５）；
ブラクテアコッカス・シナバリヌス（Ｂｒａｃｔｅａｃｏｃｃｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）（１）；
Ｂ．エガディエンシス（ｅｎｇａｄｉｅｎｓｉｓ）（１）；
Ｂ．マイナー（コダット（Ｃｈｏｄａｔ））ペトロワ（Ｐｅｔｒｏｖａ）（１）；
Ｂ．テレストリス（ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（１）；
ブラクテアコッカス（Ｂｒａｃｔｅａｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．（１）
ブラクテアコッカス（Ｂｒａｃｔｅａｃｏｃｃｕｓ）ｓｐ．（１）
ブミリレリオプシス・ブレビス（Ｂｕｍｉｌｌｅｒｉｏｐｓｉｓ  ｂｒｅｖｉｓ）（５）；
キロモナス・パラメシウム（Ｃｈｉｌｏｍｏｎａｓ  Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）（６）；
クラミドボトリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｂｏｔｒｙｓ）ｓｐ．（１）；
クラミドモナス・アグロエフォルミス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ａｇｌｏｅｆｏｒｍｉｓ）（１）；
Ｃ．ディソスモス（ｄｙｓｏｓｍｏｓ）（１）；
Ｃ．ムンダナ・モジャヴェ（ｍｕｎｄａｎａ  Ｍｏｊａｖｅ）株  ボロン（Ｂｏｒｏｎ）株（１）；
Ｃ．レインハーディ（ｒｅｉｎｈａｒｄｉ）（−）株（１）；
クロレラ・エリプソイディア（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）（１）；
Ｃ．プロトテコイデス（ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）（１）；
Ｃ．ピレノイドサ（ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）（１）；
Ｃ．ピレノイドサ（ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）ＡＴＣＣ  ７５１６（１）；
Ｃ．ピレノイドサ（ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）Ｃ−３７−２（１）；
Ｃ．ピレノイドサ・エメルソン（ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ  Ｅｍｅｒｓｏｎ）（１）；
Ｃ．ピレノイドサ（ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）７−１１−０５（１）；
Ｃ．ブルガリス（ｖｕｌｇａｒｉｓ）（１）；
Ｃ．ブルガリス（ｖｕｌｇａｒｉｓ）ＡＴＣＣ  ９７６５（１）；
Ｃ．ブルガリス・エメルソン（ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｅｍｅｒｓｏｎ）（１）；
Ｃ．ブルガリス・プラット−トレアレアセ（ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｐｒａｔｔ−Ｔｒｅａｌｅａｓｅ）（１）；
Ｃ．ブルガリス（ｖｕｌｇａｒｉｓ）ｖａｒ．ビリディス（ｖｉｒｉｄｉｓ）（１）；
クロレリジウム・テトラボトリース（Ｃｈｌｏｒｅｌｌｉｄｉｕｍ  ｔｅｔｒａｂｏｔｒｙｓ）（５）；
クロロクロステル・エンガディネンシス（Ｃｈｌｏｒｏｃｌｏｓｔｅｒ  ｅｎｇａｄｉｎｅｎｓｉｓ）（５）；
クロロコックム・マクロスチグマタム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ  ｍａｃｒｏｓｔｉｇｍａｔｕｍ）（１）；
クロロコックム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）ｓｐ．（１）；
クロログロエア・フリツキ（Ｃｈｌｏｒｏｇｌｏｅａ  ｆｒｉｔｓｃｈｉｉ）（２）；
クロロゴニウム・エロンガツム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ  ｅｌｏｎｇａｔｕｍ）（１）；
コッコミクサ・エロンガータ（Ｃｏｃｃｏｍｙｘａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）（１）；
キクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）ｓｐ．（３）；
ディクチオクロリス・フラグランス（Ｄｉｃｔｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｆｒａｇｒａｎｓ）（１）；
ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（７）；
Ｅ．グラシリス・ヴィスシャー（ｇｒａｃｉｌｉｓ  Ｖｉｓｃｈｅｒ）（７）；
Ｅ．グラシリス（ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｖａｒ．バシラリス（ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ）（７）；
Ｅ．グラシリス（ｇｒａｃｉｌｉｓ）ｖａｒ．サッカロフィラ（ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）（７）；
ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）（１）；
ナビクラ・インケルタ（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｉｎｃｅｒｔａ）Ｇｒｕｎ．（３）；
Ｎ．ペリクロサ（ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）（３）；
ネオクロリス・アルヴェオラリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ａｌｖｅｏｌａｒｉｓ）（１）；
Ｎ．アクアティカ・スター（ａｑｕａｔｉｃａ  Ｓｔａｒｒ）（１）；
Ｎ．ゲラチノーサ・ヘルンドン（ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ  Ｈｅｒｎｄｏｎ）（１）；
Ｎ．スードアルヴェオラリス・デアソン（ｐｓｅｕｄｏａｌｖｅｏｌａｒｉｓ  Ｄｅａｓｏｎ）（１）；
ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）ｓｐ．（１）；
ニッチア・アンギュラリス（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ａｎｇｕｌａｒｉｓ）  ｖａｒ．アフィニス（ａｆｆｉｎｉｓ）（３）（Ｇｒｕｎ．）ｐｅｒａｇ．；
Ｎ．クロステリウム（ｃｈｌｏｓｔｅｒｉｕｍ）（Ｅｈｒ．）（３）；
Ｎ．カーヴィリネアタ（ｃｕｒｖｉｌｉｎｅａｔａ）  Ｈｕｓｔ．（３）；
Ｎ．フィリフォルミス（ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）（３）；
Ｎ．フルストゥルム（ｆｒｕｓｔｕｌｕｍ）（Ｋｕｒｔｚ．）（３）；
Ｎ．ラエビス（ｌａｅｖｉｓ）Ｈｕｓｔ．（３）；
ノストック・ムスコラム（Ｎｏｓｔｏｃ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ）（２）；
オクロモナス・マルハメンシス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｈａｍｅｎｓｉｓ）（４）；
ペディアストルム・ボリアナム（Ｐｅｄｉａｓｔｒｕｍ  ｂｏｒｙａｎｕｍ）（１）；
Ｐ．デュープレックス（ｄｕｐｌｅｘ）（１）；
ポリトマ・オブトゥスム（Ｐｏｌｙｔｏｍａ  ｏｂｔｕｓｕｍ）（１）；
Ｐ．オケラツム（ｏｃｅｌｌａｔｕｍ）（１）；
Ｐ．ウベラ（ｕｖｅｌｌａ）（１）；
ポリトメラ・カエカ（Ｐｏｌｙｔｏｍｅｌｌａ  ｃａｅｃａ）（またはコエカ（ｃｏｅｃａ））（１）；
プロトテカ・ゾフィ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉ）（１）；
セネデスムス・アクミナツス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ）（１）；
Ｓ．アクティフォルミス（ａｃｕｔｉｆｏｒｍｉｓ）（１）；
Ｓ．コスツラタス・コード（ｃｏｓｔｕｌａｔｕｓ  Ｃｈｏｄ），ｖａｒ．クロレロイデス（ｃｈｌｏｒｅｌｌｏｉｄｅｓ）（１）；
Ｓ．ジモルフス（ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ）（１）；
Ｓ．オブリクース（ｏｂｌｉｑｕｕｓ）（１）；
Ｓ．カドリカウダ（ｑｕａｄｒｉｃａｕｄａ）（１）；
スポンギオクロリス・エクセントリカ（Ｓｐｏｎｇｉｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｅｘｃｅｎｔｒｉｃａ）（１）；
Ｓ．ラメラタ・デアソン（ｌａｍｅｌｌａｔａ  Ｄｅａｓｏｎ）（１）；
Ｓ．スポンギオサス（ｓｐｏｎｇｉｏｓｕｓ）（１）；
スポンギオクロリス（Ｓｐｏｎｇｉｏｃｈｌｏｒｉｓ）ｓｐ．（１）；
スポンジオコクム・アラバメンセ（Ｓｐｏｎｇｉｏｃｏｃｃｕｍ  ａｌａｂａｍｅｎｓｅ）（１）；
Ｓ．エクセントリカム（ｅｘｃｅｎｔｒｉｃｕｍ）（１）；
Ｓ．エクセントリカム・デアソン・エ・ボルド（ｅｘｃｅｎｔｒｉｃｕｍ  Ｄｅａｓｏｎ  ｅｔ  Ｂｏｌｄ）（１）
Ｓ．マルチヌクレアツム（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｕｍ）（１）；
スティココッカス・バシラリス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ）（１）；
Ｓ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（１）；
トリポスリックス・テヌイス（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ  ｔｅｎｕｉｓ）（２）；
トリボネマ・エクアーレ（Ｔｒｉｂｏｎｅｍａ  ａｅｑｕａｌｅ）（５）；および
Ｔ．マイナス（ｍｉｎｕｓ）（５）
【００９５】
一実施形態では、藻類は、緑藻植物（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）（クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）およびプロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ））、プラシノ藻綱（ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ））、バシラーリオフィタ（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｔａ）（ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）およびニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ））、オクロ植物門（Ｏｃｈｒｏｐｈｙｔａ）（オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ））、渦鞭毛植物（Ｄｉｎｏｐｈｙｔａ）（ギロディニウム（Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｍ））、およびユーグレノゾア（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ）（ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ））由来でもよい。より好ましくは、藻類は、モナランサス・サリナ（Ｍｏｎａｌａｎｔｈｕｓ  Ｓａｌｉｎａ）；ボトリオコッカス・ブラウニイ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）；クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）；アウチロコッカス（Ｏｕｔｉｒｏｃｏｃｃｕｓ）  ｓｐ．；セネデスムス・オブリクース（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）；ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）ｓｐ．；ドナリエラ・バルダヴィル（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｂａｒｄａｗｉｌ）（Ｄ．サリナ（Ｓａｌｉｎａ））；ナビクラ・ペリクロサ（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）；ラジオスファエラ・ネゲベンシス（Ｒａｄｉｏｓｐｈａｅｒａ  ｎｅｇｅｖｅｎｓｉｓ）；ビダルフィア・アウリタ（Ｂｉｄｄｕｌｐｈｉａ  ａｕｒｉｔａ）；クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；ニッチア・パレア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ  ｐａｌｅａ）；オクロモナス・ダンニカ（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｄａｎｎｉｃａ）；クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）；ペリディニウム・キンクトゥム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｃｉｎｃｔｕｍ）；ネオクロリス・オレオアブンダンス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｏｌｅａｂｕｎｄａｎｓ）；オーキスティス・ポリモルファ（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）；クリソクロムリナ（Ｃｈｒｙｓｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ）ｓｐｐ．；セネデスムス・アクトゥス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ａｃｕｔｕｓ）；セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）ｓｐｐ．；クロレラ・ミヌティシマ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）；プリムネシン・パルヴム（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）；ナビクラ・ペリクロサ（Ｎａｖｉｃｕｌａ  ｐｅｌｌｉｃｕｌｏｓａ）；セネデスムス・ジモルフス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ）；スコチエラ（Ｓｃｏｔｉｅｌｌａ）ｓｐ．；クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ｓｐｐ．；ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）；およびポルフィリジウム・クルエンツム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ  ｃｒｕｅｎｔｕｍ）からなる群より選択される藻類である。
【００９６】
別の実施形態では、藻株はクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）であり、上述の技法および手順を用いて連続培養によって進化的に改変されている。
【００９７】
シアノバクテリアも本発明に用いられ得る。シアノバクテリアは、「藍藻類」と称されることが多い原核生物（単細胞生物）である。大部分の藻類は真核生物であるが、シアノバクテリアは最も一般的な例外である。シアノバクテリアは概して単細胞であるが、コロニーおよび糸状形態で見出され得、その一部は様々な役割に分化する。クレームされている発明の目的では、シアノバクテリアは藻類と見なされる。
【００９８】
クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）およびドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  Ｓａｌｉｎａ）は、バイオディーゼルの生成のために進化的に改変され、培養され、収穫されている種である。
【００９９】
バイオディーゼルを生成することを目的に、異なるタイプの藻類を増殖させ、その後藻類を収穫することに関する以下の文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
−Ｘｕら、ＨＩＧＨ  ＱＵＡＬＩＴＹ  ＢＩＯＤＥＳＥＬ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＦＲＯＭ  Ａ  ＭＩＣＲＯＡＬＧＡ  ＣＨＬＯＲＥＬＬＡ  ＰＲＯＴＨＥＣＯＩＤＥＳ  ＢＹ  ＨＥＴＥＲＯＴＲＯＰＨＩＣ  ＧＲＯＷＴＨ  ＩＮ  ＦＥＲＭＥＮＴＥＲＳ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１２６巻、４９９−５０７，２００６
−Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｅｒｉｃｈ，ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＣＯＮＴＲＩＢＵＴＩＯＮＳ  ＴＯ  ＴＨＥ  ＴＡＸＯＮＯＭＹ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＧＥＮＵＳ  ＰＲＯＴＯＴＨＥＣＡ，ＩＩＩ．ＵＴＩＬＩＺＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＡＲＢＯＮ  ＡＮＤ  ＮＩＴＲＯＧＥＮ  ＣＯＭＰＯＵＮＤＳ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、第１３２巻、１０３−１０６，１９８２
−Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｄ，１９８７，ＯＶＥＲＶＩＥＷ  ＯＦ  ＴＨＥ  ＤＯＥ／ＳＥＲＩ  ＡＱＵＡＴＩＣ  ＳＰＥＣＩＥＳ  ＰＲＯＧＲＡＭ  ＦＹ  １９８６  ＳＯＬＡＲ  ＥＮＥＲＧＹ  ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
−Ｐｒａｔｔら、ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＮＤ  ＬＩＰＩＤ  ＢＹ  ＣＨＬＯＲＥＬＬＡ  ＶＵＬＧＡＲＩＳ  ＡＮＤ  ＣＨＬＯＲＥＬＬＡ  ＰＹＲＥＮＯＩＤＯＳＡ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第５２巻、第１０号、９７９−９８４、２００６および
−Ｓｏｒｏｋｉｎ，ＭＡＸＩＭＵＭ  ＧＲＯＷＴＨ  ＲＡＴＥＳ  ＯＦ  ＣＨＬＯＲＥＬＬＡ  ＩＮ  ＳＴＥＡＤＹ−ＳＴＡＴＥ  ＡＮＤ  ＩＮ  ＳＹＮＣＨＲＯＮＩＺＥＤ  ＣＵＬＴＵＲＥＳ，Ｐｒｏｃ．Ｎ．Ａ．Ｓ、第４５巻、１７４０−１７４３，１９５９
−Ｊ．Ｅ．ＺａｊｉｃおよびＹ．Ｓ．Ｃｈｉｕ，ＨＥＴＥＲＯＴＲＯＰＨＩＣ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＬＧＡＥ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ、ロンドン
【０１００】
本発明の方法を用いることにより、ステップ（ｉｉｉ）における少なくとも１つの藻株との混合物の接種は、上記少なくとも１つの藻株が脂肪酸を含む１つまたは化合物を生成する条件下にて、藻類がグルコース、セロビオース、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、アラビノースまたは他のヘミセルロース糖の少なくとも１つを代謝する結果となる。特に、ステップ（ｉｉｉ）における本発明は、１つ以上の化合物、例えば、脂肪酸、炭化水素、蛋白質、色素、糖、例えば、多糖および単糖ならびにグリセロールの細胞外および／または細胞内生成のために進化的に改変された藻類を培養し、増殖させることを含む。
【０１０１】
藻類において結果として生じる脂肪酸、炭化水素、蛋白質、色素、糖、例えば、多糖および単糖ならびにグリセロールは、バイオ燃料、化粧品、食物、機械油、色素形成および医学的用途製品のために用いられ得る。
【０１０２】
ステップ（ｉｖ）において、脂肪酸、炭化水素、蛋白質、色素、糖、例えば、多糖および単糖ならびにグリセロールは、藻類から回収され得る。回収ステップは、化合物を含む画分を得るために培養液中の藻類の分画を含む従来の技法の１つ以上、ならびに、脂肪酸を含む上記少なくとも１つの藻株の濾過−遠心分離、綿状沈殿、溶媒抽出、酸・塩基抽出、超音波処理、マイクロ波、加圧、蒸留、熱蒸発、均質化、水素化分解（流動式接触分解）および乾燥を含む他の技法によってなされ得る。
【０１０３】
一実施形態では、ステップ（ｉｖ）において回収される、結果として生じる上澄みは、再利用され得る。
【０１０４】
更に、回収された脂肪酸は、場合により分離・化学処理され（例えば、エステル交換により）、これにより、エンジン燃料に組み込まれ得るバイオ燃料（バイオディーゼル）に作製され得る。
【０１０５】
この点において、本発明の藻株は、石油精製所における水素化分解用の原料として用いられ得る炭化水素鎖を生成し、オクタン、ガソリン、石油（ｐｅｔｒｏｌ）、ケロシン、ディーゼルならびに溶媒、プラスチック、油、グリースおよび繊維としての他の石油製品からなる群から選択される１つ以上の化合物を生成する。
【０１０６】
直接エステル交換は、バイオディーゼル燃料用の脂肪酸を生成するために、藻株の細胞に対して行われ得る。直接エステル交換の方法は周知であり、バイオディーゼル燃料を生成するための藻細胞の破壊、脂肪酸の放出および、メタノールもしくはエタノールを用いた塩基もしくは酸方法を通じたエステル交換を含む。
【０１０７】
本発明の方法の更なる利点は、藻株がバイオディーゼル生成のための脂肪酸を生成するための前処理または精製なしに、エステル交換反応によって生成される廃グリセロールを炭素源として用いるように適合され得ることである。
【０１０８】
粗製グリセロールは、グリセロール、ならびに、例えば、脂肪酸成分、油性成分、酸成分、アルカリ成分、セッケン成分、アルコール成分（例えば、メタノールまたはエタノール）、溶媒（Ｎ−ヘキサン）塩および／またはジオールなどの不純物を含む、エステル交換反応の副産物である。粗製グリセロール中に存在する不純物の数およびタイプにより、微生物は粗製グリセロール自体の上での増殖をほとんど、または、全く示さない。しかしながら、微生物（例えば、藻類または細菌）は粗製グリセロールを主たる炭素源として用いるように進化的に改変され得る。
【０１０９】
特定のタイプの微生物が粗製グリセロールの存在下にて増殖することができるか否かを判定するための最初の試験は、精製グリセロール試験である。精製グリセロール試験は、精製グリセロールを含む培地での微生物の培養を含む。精製グリセロール試験において用いられる培地は、グルコースのような他の炭素源を有する場合もあれば、有さない場合もある。しかしながら精製グリセロール試験における培地は、微生物が微生物の最小代謝能を示すことが判定できるように、十分な量のグリセロールを含まなければならない。好ましくは、培地は１０ｍｌ〜５０ｍｌ／ｌの精製グリセロール、０．１ｍｌ〜１００ｍｌ／ｌの精製グリセロールおよび２ｍｌ〜１５ｍｌ／ｌの精製グリセロールを含む。
【０１１０】
精製グリセロール試験で陽性結果（即ち、微生物が培地で増殖する）が得られる場合、微生物は粗製グリセロールを含む培地で増殖するように、進化的に改変され得る。好ましくは、培地は、例えば、炭素源として１０〜１００％粗製グリセロール、炭素源として２０〜９０％粗製グリセロール、炭素源として３０〜７５％粗製グリセロール、炭素源として４０〜７５％粗製グリセロール、または、炭素源として５０．０１〜５５％粗製グリセロールを含む。実際、一部の微生物株は、１００％粗製グリセロールを含む培地で増殖するように進化的に改変されている。
【０１１１】
本発明に従って得られる、細胞外および／または細胞内セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびラッカーゼを生成する進化的に改変された微生物は、前処理されたバイオマス混合物において特定の炭素源を用いて、本発明において実施するように進化的に改変されていない同じ種の微生物よりも少なくとも５％、好ましくは１０％、１５％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、２５％〜１００％、２５％〜１００％、５０％〜１５０％、２５〜２００％、２００％超、３００％超または４００％超大きい、最大増殖率を有し得る。
【０１１２】
本発明に従って得られる進化的に改変された藻類は、前処理されたバイオマス混合物において、ステップ（ｉ）由来の放出多糖および単糖を炭素源として用いて、本発明において実施するように進化的に改変されていない同じ種の藻類よりも少なくとも５％、好ましくは１０％、１５％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、２５％〜１００％、２５％〜１００％、５０％〜１５０％、２５〜２００％、２００％超、３００％超または４００％超大きい、最大増殖率を有し得る。
【０１１３】
バイオディーゼル生成の副産物から増殖される微生物の最も重要な商業用途は、微生物自体をバイオ燃料、バイオディーゼル、「バイオ」炭化水素製品、再生炭化水素製品および脂肪酸ベースの製品のような製品に用いることが想定されるが、本発明はこの実施形態に限定されない。例えば、微生物が藻類である場合、藻類はバイオ燃料生成の副産物から増殖され、食物、医薬および栄養補助食品として用途のために収穫され得る。
【０１１４】
本発明から得られるバイオ燃料は、直接、または、一部の製品に対する石油の代替として用いられ得る。
【０１１５】
別の実施形態では、本発明のバイオ燃料（例えば、バイオディーゼル）は、自動車用ガソリンおよび蒸留燃料油成分などの燃料；完成非燃料製品、例えば、溶媒および潤滑油；ならびに石油化学工業用原料、例えば、ナフサおよび種々の精油所ガスを得るため、他の石油製品との混合または石油代替物として用いられ得る。
【０１１６】
例えば、上述のバイオ燃料は、溶媒；塗料；ラッカー；および印刷用インク；潤滑油；自動車エンジンおよび他の機械用のグリース；あめ細工、包装、ろう燭、マッチおよび光沢剤において用いられるろう；ワセリン；アスファルト；石油コークス；ならびに、主に化学製品、合成ゴムおよび種々のプラスチック製造用の石油に由来する化学原料として用いられる石油原料を生成するため、直接、または、他の石油ベースの化合物と混合されて用いられ得る。
【０１１７】
好ましい実施形態では、本発明によって生成されるバイオディーゼルは、ディーゼルエンジンにおいて用いられ得、または、結果として生じる石油代替物が、総組成物の重量で約５〜９５％、１５〜８５％、２０〜８０％、２５〜７５％、３５〜５０％、５０〜７５％および７５〜９５％の量になり得るような割合にて、石油ベースの蒸留燃料油成分と混合され得る。上記成分は、任意の適した方法によって混合され得る。
【０１１８】
圧縮点火内燃機関に燃料を供給するプロセスは、圧縮点火内燃機関のシリンダに空気を引き入れることと；シリンダ内のピストンの圧縮行程によって空気を圧縮することと；圧縮行程の終了の若干前に、圧縮空気にバイオディーゼルを含む燃料を注入することと；圧縮点火内燃機関の作動中のシリンダ内の圧縮の熱によって燃料に点火することとを含む。
【０１１９】
別の実施形態においてバイオディーゼルは、潤滑油として、または圧縮点火内燃機関に燃料を供給するプロセスにおいて用いられ得る。
【０１２０】
また、バイオ燃料は、例えばパラフィン（例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタンおよびヘキサン）、芳香族化合物（例えば、ベンゼンおよびナフタレン）、シクロアルカン（例えば、シクロヘキサンおよびメチルシクロペンタン）、アルケン（例えば、エチレン、ブテンおよびイソブテン）、アルキン（例えば、アセチレンおよびブタジエン）などの、石油に見出される他の炭化水素を得るために更に処理され得る。
【０１２１】
結果として生じる炭化水素は、その後、今度は例えば、溶媒；塗料；ラッカー；および印刷用インク；潤滑油；自動車エンジンおよび他の機械用のグリース；あめ細工、包装、ろう燭、マッチおよび光沢剤において用いられるろう；ワセリン；アスファルト；石油コークス；ならびに、主に化学製品、合成ゴムおよび種々のプラスチック製造用の石油に由来する化学原料として用いられる石油原料などの、石油ベースの製品において用いられ得る。
【０１２２】
以下の実施例は、本発明の実施形態を示す。特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更および改変がなされ得ることは明らかであろう。
【実施例】
【０１２３】
本発明の方法の１つの例示的な実施形態は、図４における図表に見出され得、以下に記載される。
【０１２４】
この実施例では、細断したスイッチグラスの植物バイオマス材料を、酸加水分解（０．５％〜２．０％硫酸）および熱処理（１２０℃〜２００℃）による前処理に付した。
【０１２５】
この前処理法は、上述のステップ（ｉ）で用いるための混合物を生成した。この混合物はセルロース、ヘミセルロース、リグニン、フルフラールおよび酢酸を含んでいた。
【０１２６】
ステップ（ｉ）において、（現場での酵素生成）上記混合物に、以下の条件下にて、以下の特性を有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の進化的に改変された微生物株を接種した。
・改変トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）株を、前処理されたスイッチグラスをより効率的に代謝し、フルフラールおよび酢酸へより耐性を示すように進化させた（ＥＶＧ２２０３０と指定）。
・上記株は、スイッチグラスに特異的な外部セルラーゼ酵素を生成する。
・トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＥＶＧ２２０３０の接種および増殖を、好気環境で行った。
・結晶セルロースのグルコース、セロビオースへの加水分解。
・前処理を通じて十分に処理されなかったヘミセルロース糖の加水分解。
【０１２７】
増殖および酵素生成段階の後、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＥＶＧ２２０３０の増殖を、５０℃での熱ショックによって停止した（ステップ（ｉｉ））。
【０１２８】
ステップ（ｉｉｉ）において、ステップ（ｉｉ）の混合物に、以下の条件下にて、以下の特性を有するクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）の進化的に改変された藻株を接種した。
・クロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）を、前処理されたスイッチグラスから（ＥＶＧ２２０３０酵素によって）放出された炭素源を用いるように、従属栄養環境にて進化させ、ＥＶＧ１５０１８と指定した。
・従属栄養環境におけるクロレラ・プロトテコイデス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｒｏｔｏｔｈｅｃｏｉｄｅｓ）ＥＶＧ１５０１８の接種および増殖。
・ＥＶＧ１５０１８は、グルコース、セロビオース、キシロース、および、他のヘミセルロース糖、廃グリセロールを代謝し、炭素源として酢酸を用いる。
・リグニン、フルフラールおよび塩類の存在は、増殖を阻害しない。
・ＥＶＧ１５０１８は、４０％以上の脂肪酸を生成する（細胞の乾燥重量）。
・その後藻類を条件下にて増殖させ、脂肪酸を生成した。
【０１２９】
次に、濾過および細胞乾燥によって、藻細胞および脂肪酸を回収した。
【０１３０】
次に、乾燥細胞に対して直接エステル交換を行い（メタノールまたはエタノールを用いた塩基または酸方法を通じた、超音波処理）、バイオディーゼル燃料を生成した。廃グリセロールも回収し、再利用した。その結果生じるバイオディーゼル燃料は、車、トラック、発電機、ボート等のための任意のディーゼルエンジンにおいて直接用いられ得る。
【０１３１】
本発明は、その実施形態に関連して詳細に説明および指摘されたが、本発明の精神から逸脱することなく、種々の変更、改変、代替および省略がなされ得ることが、当業者には理解されるであろう。従って、本発明は以下の特許請求の範囲内の等価物を包含するものとする。
【０１３２】
【表１】
2011521669.tif 000003
【０１３３】
【表２】
2011521669.tif 000004
【０１３４】
【表３】
2011521669.tif 000005
【０１３５】
【表４】
2011521669.tif 000006
【０１３６】
【表５】
2011521669.tif 000007
【０１３７】
【表６】
2011521669.tif 000008
【０１３８】
【表７】
2011521669.tif 000009
【０１３９】
【表８】
2011521669.tif 000010
【０１４０】
【表９】
2011521669.tif 000011
【０１４１】
【表１０】
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【０１４２】
【表１１】
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【０１４３】
【表１２】
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【０１４４】
【表１３】
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【０１４５】
【表１４】
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【０１４６】
【表１５】
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【０１４７】
【表１６】
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【０１４８】
【表１７】
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【０１４９】
【表１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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