(57)【要約】  本発明は、成長因子活性を示す成長因子−模倣ペプチド、これを含む皮膚状態改善または創傷治療用組成物及び皮膚状態改善または創傷治療方法に関する。本発明の成長因子−模倣ペプチドは、天然のヒト成長因子と同一な機能または作用をすることができ、安定性が天然成長因子と比較して非常に優れており、皮膚透過度に非常に優れている。したがって、本発明のペプチドを含む組成物は、成長因子の活性が要求される疾患または状態を治療、予防または改善するのに非常に優れた効能を発揮する。また、本発明のペプチドの優れた活性及び安定性は、医薬、医薬外品及び化粧品に非常に有利に適用できる。
2011519358.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長因子由来であって、配列番号１乃至４に記載のアミノ酸配列から構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなる成長因子活性を示すペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドのＣ−末端は、ヒドロキシ基（-OH）またはアミノ基（-NH2）に変形されたことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドのＮ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（PEG）からなる群から選択される保護基が結合されていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、皮膚状態の改善用組成物。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、創傷治療用組成物。
【請求項６】
前記皮膚状態の改善は、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、脱毛の防止または発毛の促進、皮膚保湿の改善、シミの除去、またはニキビの治療であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１乃至３のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む組成物を対象（subject）に投与する段階を含む皮膚状態の改善方法。
【請求項８】
請求項１乃至３のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む組成物を対象（subject）に投与する段階を含む創傷治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長因子活性を示す成長因子−模倣ペプチド、これを含む皮膚状態改善または創傷治療用組成物及び皮膚状態改善または創傷治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人間の脳下垂体（pituitary gland）から分泌される成長ホルモンは、細胞成長及び分化に直接的に関与すると知られており、軟骨や骨の成長及び発育促進、筋肉や肝などの臓器復元、傷の再生だけではなく、感染などの免疫機能にも影響を及ぼす。だけではなく、老化が進行されるほど成長ホルモンの生産量がだんだん減少して、６０代になると、２０代に比べて１/４水準に落ちると報告されており、足りない成長ホルモンを補充する抗老化ホルモン治療の中心として使用され始めている。
【０００３】
成長ホルモンは、細胞で成長ホルモン受容体（growth hormone receptor）に直接結合するか、インシュリン様成長因子Ｉ（IGF-I: insulin-like growth factor I）の分泌を誘発し、細胞内信号伝達物質であるヤヌスキナーゼ（JAK; Janus kinases）/転写信号伝達剤及び活性化剤（STAT; Signal Transducers and Activators of Transcription）やミトゲン−活性化された蛋白質キナーゼ（MAPK; mitogen-activated protein kinase）、ホスファチジル−３キナーゼ（PI3K; phosphatidyl-3 kinase）などを活性化させて、毛嚢細胞や皮膚内線維芽細胞の成長を促進して、ｂｃｌ−２−様（bcl-2-like）遺伝子であるｂｃｌ−ｗを通じてアポトーシス（apoptosis）を抑制すると判断されている。このような成長因子の効能は、たくさんの研究者らにより明かされて、その有用度のため、多い企業が商用化をしている。
【０００４】
線維芽細胞成長因子（FGF）は、二つの形態、即ち、酸性ＦＧＦ（aFGF）及び塩基性ＦＧＦ（bFGF）形態に存在して、これらの二つの形態は、哺乳類の脳から分離及び精製できると明かされた（Thomas and Gimenez-Gallego, TIBS 11:81-84(1986)）。
【０００５】
特に、成長因子類の中、酸性線維芽細胞成長因子（aFGF）は、１５４個のアミノ酸から構成された蛋白質であって、動物細胞、特に人間細胞の生長を調節するなど、組織回復及び傷の治癒関する生医学的研究において、主要物質の一つである。酸性線維芽細胞類似分裂物質は、トロウェル（Trowell）ら（J. Exp. Biol. 16:60-70(1939)）及びホフマン（Hoffman）（Growth 4:361-376(1940)）により最初に記述されて、次いで脳下垂体抽出物も同様に線維芽細胞類に対する強力な類似分裂物質活性を有することが明かされた（Amelin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70:2702-2706(1973)）。
【０００６】
数多い細胞株が、精製されたａＦＧＦによる刺激に反応してＤＮＡを合成して分裂するが、その種類は、一次線維芽細胞、血管及び角膜内皮細胞、軟骨細胞、骨髄芽細胞、線筋芽細胞、平滑筋、神経膠細胞及び神経芽細胞が挙げられる（Each et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6507-6511(1985); Kuo et al., Fed. Proc. 44:695(1985); Gensburger et al., C.R. Acad. Sc. Paris 303:465-468(1986)）。また、ａＦＧＦは、培養された血管内皮細胞に対する強力な類似分裂物質として作用するだけではなく、生体内で血管生長を誘導する（Thomas. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6409-6413(1985)）。また、精製されたａＦＧＦの類似分裂物質活性は、傷の回復を促進させるに利用できる（Thomas, 米国特許第4,444,760号）。
【０００７】
一方、角質細胞成長因子（KGF）は、１６３個のアミノ酸から構成された蛋白質であって、外皮細胞の分裂を促進し、多様な傷から速い再生を可能にする。ＫＧＦは、線維芽細胞成長因子群の一員として多様な種類の細胞類型に影響を及ぼす。ＫＧＦは、細胞間の付着、細胞の分裂、そして老化を含んだ多様な原因による細胞の傷害を治癒するのに重要な役割をする。ＫＧＦは、毛髪において、毛髪成長初期段階で細胞世代間の架橋役割をするのにおいて重要な役割をする。ＫＧＦを、皮膚弾力の増加、毛髪成長の促進、傷治癒促進の他にも、多様なところに使用できる。
【０００８】
また、形質転換成長因子（TGF）は、皮膚の深いところでさらに若くて健康に維持するように、皮膚細胞の成長と分化に重要な作用をするサイトカインである。例えば、変換と回復を通じて、老いて傷付けられた細胞は、さらに健康で且つ生産的な細胞に変わるようになる。ＴＧＦは、既に傷付けられた細胞の治癒と、これによる組織における傷跡の形成を防止する。これは、ＥＧＦの受容体と結合して基底膜蛋白質の合成を増加させて、内皮細胞の成長を刺激する。ＴＧＦを使用することにより、皮膚弾力性の増加、毛髪成長の促進、傷治癒の促進、抗老化環境の組成の他に、様々な効果を得ることができる。
【０００９】
このような成長因子を大量に生産するために、たくさんの研究者らが大腸菌発現システムを利用した組換え蛋白質の生産を試みているが、この方法は、天然型の成長因子を得るために、リフォールディングという追加工程と時間が要求されて、また精製過程で大腸菌由来の汚染源を除去するための複雑な精製過程を必要とするようになる。このような問題点を解決するために、一部成長因子の一部分のみを固体相合成の方法を利用して生産し、類似機能を得ようとする試みが報告された。例えば、米国特許第５，４７３，０５４号でＪａｍｅｓｏｎらは、ＩＧＦ−１の２９−３８及び６１−７０番の断片をそれぞれＪＢ２とＪＢ１と命名して、このペプチド断片の細胞成長効果とＪＢ１の鏡像異性体 であるＪＢ３のＩＧＦ−１阻害効果を報告した。また、Ｔｅｒｕｏらは、ＷＯ  ０３/０４８１９２で、ＩＧＦ−１の３３−３７の断片とＳｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ由来テトラペプチドと傷治癒における相互補完作用に対して報告している。その他にも、Ｋｏｄａｍａらは、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３７：４８１−４８７（２００４）でＩＧＦ−１の５０−７０の断片がマウスで糖尿病治療に役に立つと報告している。
【００１０】
本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、成長因子の中、ヒト由来の角質細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子または形質転換成長因子と同一な機能を維持しながらも、天然の成長因子より活性、皮膚透過度及び安定性に優れた物質を開発するために鋭意研究した結果、天然の成長因子のアミノ酸配列に基づいて、上述の特性を示す多数の成長因子模倣（mimicking）ペプチドを合成することにより、本発明を完成した。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、成長因子活性を示すペプチドを提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、皮膚状態の改善用組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明のまた他の目的は、創傷治療用組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明のまた他の目的は、皮膚状態の改善方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のまた他の目的は、創傷治療方法を提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の一様態によると、本発明は、成長因子由来であって、配列番号１乃至４に記載のアミノ酸配列から構成された群から選択される１種のアミノ酸配列を含む成長因子活性を示すペプチドを提供する。
【００１９】
本発明者らは、成長因子の中、ヒト由来の角質細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子または形質転換成長因子と同一な機能を維持しながらも、天然の成長因子より活性、皮膚透過度及び安定性に優れた物質を開発するために鋭意研究した結果、天然の成長因子のアミノ酸配列に基づいて、上述の特性を示す多数の成長因子模倣（mimicking）ペプチドを合成した。
【００２０】
本発明のペプチドは、ヒト成長因子由来の配列番号１乃至４のアミノ酸配列から構成された群から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明におけるペプチドは、配列番号１乃至４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列で必須的に構成されている。最もこのましくは、本発明におけるペプチドは、配列番号１乃至４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列から構成されている。
【００２１】
本明細書において用語‘ペプチド’は、ペプチド結合により、アミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。
【００２２】
本発明のペプチドは、当業界に公知された化学的合成方法、特に固相合成技術（solid-phase synthesis techniques）により製造できる（Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)）。
【００２３】
本発明でペプチドのデザインは、図１に例示されている。
【００２４】
成長因子の受容体蛋白質に対する結合可能部位を予測して、この予測された部位のアミノ酸配列を最適化して、本発明のペプチドが製造される。例えば、ＫＧＦ（角質細胞成長因子）の場合、アミノ酸配列１００〜１４０、ａＦＧＦの場合、アミノ酸配列１１０〜１２５、そしてＴＧＦ−αの場合、アミノ酸配列３５〜４９を受容体結合可能部位と予測する。そして、前記受容体結合可能部位の配列を参照し、候補ペプチドを製造して、これらの候補ペプチドの中、最も活性に優れたペプチドをスクリーニングすることにより、本発明のペプチドが提供される。
【００２５】
配列番号１のペプチドは、天然ヒトＫＧＦ（角質細胞成長因子）のアミノ酸配列１２０〜１２７由来のものである。配列番号２のペプチドは、天然ヒトａＦＧＦのアミノ酸配列１１１〜１２２由来のものである。配列番号３及び４のペプチドは、それぞれ天然ヒトＴＧＦ−αのアミノ酸配列１０〜２０及び３８〜４９由来のものである。
【００２６】
本発明のペプチドは、それ自体が天然の成長因子より安定性に優れているが、アミノ酸の変形により安定性がさらに向上できる。本発明の好ましい具現例によると、ペプチドのＣ−末端は、ヒドロキシ基（−ＯＨ）またはアミノ基（−ＮＨ２）に変形されている。
【００２７】
本発明の好ましい具現例によると、前記ペプチドのＮ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（PEG）からなる群から選択される保護基が結合されている。
【００２８】
上述のアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を大きく改善する作用をする。本明細書において用語‘安定性’は、インビボ安定性だけではなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）も意味する。上述の保護基は、生体内のタンパク質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。
【００２９】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述の本発明の成長因子−模倣ペプチドを有効成分として含む、皮膚状態の改善用組成物を提供する。
【００３０】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、上述の本発明の成長因子−模倣ペプチドを有効成分として含む、創傷治療用組成物を提供する。
【００３１】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述の本発明のペプチドを有効成分として含む組成物を対象（subject）に投与する段階を含む皮膚状態の改善方法を提供する。
【００３２】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述の本発明のペプチドを有効成分として含む組成物を対象（subject）に投与する段階を含む創傷治療方法を提供する。
【００３３】
本発明の組成物は、上述の本発明の成長因子−模倣ペプチドを有効成分として含むため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるためにその記載を省く。
【００３４】
下記の実施例で立証されたように、本発明の成長因子−模倣ペプチドは、天然成長因子（KGF、aFGF及びTGF-α）と非常に優れた線維芽細胞及び角質細胞成長促進能力を有して、また、コラーゲンとフィブロネクチン生成促進を有する。したがって、本発明の組成物は、皮膚状態の改善に非常に有効である。
【００３５】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、脱毛の防止または発毛の促進、皮膚保湿の改善、シミの除去、またはニキビの治療のような皮膚状態の改善に利用される。
【００３６】
興味深いことに、本発明の成長因子−模倣ペプチドは、創傷治療に非常に卓越な効能を発揮し、これは、下記の実施例で立証されている。
【００３７】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、閉鎖創（closed wound）及び開放創（open wound）の治療に利用される。閉鎖創の例は、挫傷（contusion or Burise）を含み、開放創の例は、擦過傷（abrasion）、裂傷（laceration）、引き抜き（Avulsion）、貫通傷（penetrated wound）及び銃傷（gun shot wound）を含む。
【００３８】
本発明の組成物は、薬剤学的組成物と化粧品組成物に製造できる。
【００３９】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、（ａ）上述の本発明の成長因子−模倣ペプチドの薬剤学的有効量、及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物である。
【００４０】
本明細書において用語‘薬剤学的有効量’は、上述のペプチド−模倣ペプチドの効能または活性を達成するのに十分な量を意味する。
【００４１】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に利用されるものであって、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適合する薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)に詳細に記載されている。
【００４２】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口、好ましくは、非経口で投与でき、非経口投与の場合は、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などにより投与できる。
【００４３】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により様々である。一方、本発明の薬剤学的組成物の好ましい一日投与量は、０．００１〜１００ｍｇ/ｋｇである。
【００４４】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体及び/または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位容量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造できる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤またはゲル（例えば、ハイドロゲル）の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００４５】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の組成物は、（ａ）上述の本発明の成長因子−模倣ペプチドの化粧品学的有効量（cosmetically effective amount）、及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物である。
【００４６】
本明細書において用語‘化粧品学的有効量’は、上述の本発明の組成物の皮膚改善効能を達成するのに十分な量を意味する。
【００４７】
本発明の化粧品組成物は、当業界で通常的に製造されるいかなる剤形にも製造でき、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化することができるが、これに限定されるものではない。より詳しくは、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたはパウダーの剤形に製造することができる。
【００４８】
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合は、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、または酸化亜鉛などが利用できる。
【００４９】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合は、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、またはポリアミドパウダーが利用でき、特にスプレーの場合は、クロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体をさらに含むことができる。
【００５０】
本発明の剤形が溶液または乳濁液の場合は、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が利用されて、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、またはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【００５１】
本発明の剤形が懸濁液である場合は、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラガカントなどが利用できる。
【００５２】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合は、担体成分として、脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イソチオネート、イミダゾリウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体、またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用できる。
【００５３】
本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分としてのｂＦＧＦ変異体と担体成分の他に、化粧品組成物に通常的に利用される成分を含むが、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常的な補助剤を含むことができる。
【発明の効果】
【００５４】
本発明の特徴及び利点を要約すると、次のようである：
（ａ）本発明の成長因子−模倣ペプチドは、天然のヒト成長因子と同様な機能または作用をすることができる。
（ｂ）本発明のペプチドは、その安定性が、天然成長因子に比べ非常に優れており、また皮膚透過度が非常に高い。
（ｃ）したがって、本発明のペプチドを含む組成物は、成長因子の活性が要求される疾患または状態を治療、予防、または改善するのに非常に優れた効能を発揮する。
（ｄ）上述の本発明のペプチドの優れた活性及び安定性は、医薬、医薬外品及び化粧品に非常に有利に適用できるようにする。
【００５５】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】成長因子のアミノ酸配列及び本発明のペプチドとして選定された部位を示す。
【図２ａ】本発明の合成例により製造された配列番号１のペプチドの高性能液体クロマトグラフィー分析結果を示すグラフである。
【図２ｂ】本発明の合成例により製造された配列番号２のペプチドの高性能液体クロマトグラフィー分析結果を示すグラフである。
【図２ｃ】本発明の合成例により製造された配列番号３のペプチドの高性能液体クロマトグラフィー分析結果を示すグラフである。
【図２ｄ】本発明の合成例により製造された配列番号４のペプチドの高性能液体クロマトグラフィー分析結果を示すグラフである。
【図３ａ】本発明の合成例により製造されたペプチド１−４を処理した角質細胞の細胞成長促進効果を示したグラフである。
【図３ｂ】本発明の合成例により製造されたペプチド１−４を処理した線維芽細胞の細胞成長促進効果を示したグラフである。
【図４】本発明のペプチド１−４を処理した線維芽細胞と角質細胞の細胞成長促進効果を顕微鏡で確認した写真である。
【図５ａ】本発明のペプチド１−４が処理された角質細胞における増加されたコラーゲン生成量を示したグラフである。
【図５ｂ】本発明のペプチド１−４が処理された角質細胞における増加されたフィブロネクチン生成量を示したグラフである。
【図６】本発明のペプチド及び天然酸性繊維芽細胞成長因子（aFGF）の熱安定性を比較したグラフである。
【図７】本発明のペプチドを含有したハイドロゲルの写真である。
【図８】本発明のペプチドを含有したハイドロゲルを１０日間マウスの傷部位に処理して、傷部位組織を切開し、傷治療効果を検鏡した組織写真である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
合成例１：Ac-Tyr-Lys-Ser-Lys-Lys-Gly-Gly-Trp-Thr-His（配列番号１）の合成
クロロトリチルクロライドレジン（chloro trityl chloride resin；CTL resin, Nova Biochem Cat No. 01-64-0021）７００ｍｇを反応容器に入れて、メチレンクロライド（MC）１０ｍｌを加えて３分間攪拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（DMF）を１０ｍｌ入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れて、Fmoc-His（Trt）-OH（Bachem, スイス）200mmole及びジイソプロピルエチルアミン（DIEA）400mmoleを入れた後、攪拌してよく溶かして、１時間攪拌しながら反応させた。反応後、洗浄して、メタノールとＤＩＥＡ（2:1）をＤＣＭに溶かして１０分間反応した後、過量のＤＣＭ/ＤＭＦ（1:1）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（DMF）を１０ｍｌ入れて３分間攪拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液（20%のピペリジン/DMF）１０ｍｌを反応容器に入れて、１０分間常温で攪拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、再び１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、ＤＭＦで２回、ＭＣで１回、再びＤＭＦで３分間１回洗浄して、His-（Trt）-CTLレジンを製造した。新しい反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Fmoc-Thr（tBu）-OH（Bachem, スイス）200mmole、HoBt 200mmole及びBop  200mmoleを入れた後、攪拌してよく溶解させた。反応器に400mmoleのＤＩＥＡを分画で２回に分けて入れて、全ての固体が溶解されるまで少なくとも５分間攪拌した。溶解されたアミノ酸混合溶液を、脱保護されたレジンが入っている反応容器に入れて、１時間常温で攪拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で５分間ずつ３回攪拌して除去した。反応レジンを少量取って、カイザーテスト（Ninhydrine test）を利用して反応程度を点検した。脱保護溶液で上記と同様に２回脱保護反応し、Thr（tBu）-His（Trt）-CTL Resinを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再びカイザーテストを行った後、上記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。図１のように選定されたアミノ酸配列に基づき、Fmoc-Trp, Fmoc-Gly, Fmoc-Gly, Fmoc-Lys（Boc）, Fmoc-Lys（Boc）, Fmoc-Ser（tBu）, Fmoc-Lys（Boc）, 及びFmoc-Tyr（tBu）の順に連鎖反応を行った。Fmoc-保護基を脱保護溶液で１０分間ずつ２回反応した後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れて一時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気を徐々に流して乾燥した後、Ｐ２Ｏ５下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液[トリフルオロ化酢酸（TFA）81.5%、蒸留水5%、チオアニソール5%、フェノール5％、EDT2.5％、TIS  1%]３０ｍｌを入れて、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングでレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を利用して、全体容量が半分ぐらい残るように蒸留して、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のAc-YKSKKGGWTHペプチド１を１．１８ｇ合成した（収率72.6%）。分子量測定器を利用して測定時、分子量１２３３．８（理論値1233.4）が得られた。
【００５８】
合成例２：他のペプチドの合成
前記合成例１と同様な方法により合成するが、アミノ酸は、配列に符合するアミノ酸を使用して、配列番号２−４のペプチドを合成した。配列番号２（Tyr-Ile-Ser-Lys-Lys-His-Ala-Gly-Lys-Asn-Trp-Phe: YISKKHAGKNWF）は、ａＦＧＦF １１１−１２２配列、配列番号３（Asp-Ser-His-Thr-Gln- Tyr-Cys-Phe-His-Gly-Thr: DSHTQYCFHGT）は、ＴＧＦα １０−２０、配列番号４（Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys-Glu-Ala-Ala-Asp-Leu-Asp-Ala: GYVGVRCEAADLDA）は、ＴＧＦαのアミノ酸残基３８−４９に該当する。合成されたペプチドに対する分子量測定器による測定値は、表１に示した通りである：
【００５９】
【表１】
2011519358.tif 000003
【００６０】
試験例１：合成ペプチドのＨａＣａＴ角質細胞及びＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞成長促進効果の分析
合成例１及び２に記載の４種のペプチドに対する成長因子−１の類似効能を分析するために、Rizzinoらの方法（Rizzino, et al. Cancer Res., 48:4266(1988)）などを参照し、ＨａＣａＴ角質細胞株とＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を利用したＳＲＢ（Sulforhodamine B）の比色法を利用して測定した。
【００６１】
ＨａＣａＴ角質細胞株（The Korean Cell Line Bank）及びＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞（The Korean Cell Line Bank）を、それぞれ２５０ｍｌ容量の組織培養用フラスコを利用し、１００％ＦＢＳ（fetal bovine serum）の含有されたＥＭＥＭ（Eagle's minimal essential media, Gibco, U.S.A.）で培養した。培養された細胞株を、０．２５％トリプシン溶液で培養容器の底から取り外した後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。これを、ＦＢＳが含有されていないＥＭＥＭ培養液に再び懸濁した後、９６ウェル組織培養用平板に、各ウェル当たり４×１０３細胞となるように入れて、２４時間３７℃、７％ＣＯ２条件下で培養した。２４時間後、血清を完全に排除した同一な培養液で培地を入れ替えた後、標準を取るための空試料、ヒトの酸性線維芽細胞成長因子（NIBSC、UK）、合成ペプチドの４種を、水と１０％ＤＭＳＯに滅菌状態で溶解した後、１０ｎｇと１，０００ｎｇの濃度で７２時間、上記の同一条件で培養した。培養が完了した後、培養上清液を除去して、ＰＢＳで１回洗浄した。洗浄溶液を除去した後、比色ＳＲＢ溶液で処理し、ＰＢＳで十分洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察し、生存細胞の状態を観察して、紫外線５９０ｎｍで吸光度を測定し、細胞の生存状態を測定した。
【００６２】
図３ａ及び図３ｂは、それぞれ角質細胞及び線維芽細胞の成長に対する結果が示されており、図４には、細胞にペプチドを処理後、７２時間後に細胞の生存状態を顕微鏡で検鏡して、線維芽細胞及び角質細胞の成長を確認した。
【００６３】
図３ａから分かるように、本発明の４種のペプチドは、角質細胞の成長を増進させた。特に、ペプチド１、３及び４が角質細胞の成長に対して優れた促進効果を示した。また、図３ｂから分かるように、本発明の４種のペプチドは、線維芽細胞の成長を増進させた。特に、ペプチド１及び２が線維芽細胞の成長に対して優れた促進効果を示した。また、顕微鏡観察結果である図４から分かるように、本発明のペプチドは、角質細胞及び線維芽細胞の成長を大きく促進させることが分かる。
【００６４】
試験例２：合成ペプチドのコラーゲン及びフィブロネクチン生成促進効果の分析
４８時間を培養したＨａＣａＴに、合成したペプチド４種を処理して、７２時間経過後、皮膚シワ改善の標識であるプロコラーゲン及びフィブロネクチンの濃度を測定した。濃度測定は、Procollagen ELISAキット（Takara、Japan）及びFibronectinキット（CHEMICON、米国）を利用して行った。図５ａから分かるように、本発明の４種のペプチドは、角質細胞のプロコラーゲン生成を増加させた。特に、ペプチド２が最も優れたプロコラーゲン生成促進能を示した。また、図５ｂから分かるように、本発明の４種ペプチドは、角質細胞のフィブロネクチン生成を増加させた。特に、ペプチド１及び４の優れたプロコラーゲン生成促進能を示した。
【００６５】
試験例１及び２の実験結果からみると、本発明のペプチドは、非常に優れた皮膚改善効能を発揮するということが分かる。
【００６６】
試験例３：製造されたペプチドの熱安定性
合成例１及び２を通じて製造された４種のペプチドとＮＩＢＳＣ（英国）で購入した標準品成長因子（KGF, aFGF及びTGF-α）を０．１１ｍｇ/ｍｌの濃度にPhosphate緩衝液で調製した。用意された溶液を１ｍｌずつガラスバイアルに入れた後、３７℃で静置した。３７℃に静置された溶液を0, 5, 10, 20, 25, 30, 40, 60そして100日目にサンプリングして、日付別に遠心分離して変性されたペプチドや蛋白質を除去して、上澄液を取って、ＨＰＬＣを利用して定量をした（図6）。合成ペプチドの場合、天然の成長因子より残存量が高くて、これを試料として試験例１と同一な方法で細胞に処理した後、ＭＴＴ方法（Scudiero, D. A., et al. Cancer Res. 48:4827-4833(1988)）を使用して、残存している活性を測定することによりペプチドの熱安定性を分析した結果、全ての場合、成長因子類より活性度がさらに高いことが分かった。
【００６７】
実施例１：ナノ化ペプチドの製造
前記合成例から得られたペプチド４種を、５０ｍｇをそれぞれ正確に秤量した後、蒸留水５００ｍｌで十分に攪拌して溶解した。配合体溶液を、レシチン５ｇ、オレイン酸ナトリウム（sodium oleate）０．３ｍｌ、エタノール５０ｍｌ及び少量のオイルと共に混合した後、総量が１Ｌとなるように蒸留水で調節した後、マイクロ流動化装置（microfluidizer）を利用して高圧で乳化し、大きさ１００ｎｍ程度のナノソームを製造した。製造されたナノソームは、最終濃度が約５０ｐｐｍで、単独あるいは複合的に化粧品製造用に使用された。
【００６８】
剤形例１：柔軟化粧水
前記実施例１で製造された４種のペプチドナノソームの中、少なくとも一種類のナノソームを含み、下記組成からなる柔軟化粧水を、一般的な化粧水製造方法により製造した。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
剤形例２：栄養クリーム
前記実施例１で製造された４種のペプチドナノソームの中、少なくとも一種類のナノソームを含み、下記組成からなる栄養クリームを、一般的な栄養クリームの製造方法により製造した。
【００７１】
【表３】
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【００７２】
剤形例３：栄養化粧水
前記実施例１で製造された４種のペプチドナノソームの中、少なくとも一種類のナノソームを含み、下記組成からなる栄養化粧水を、一般的な化粧水の製造方法により製造した。
【００７３】
【表４】
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【００７４】
剤形例４：エッセンス
前記実施例１で製造された４種のペプチドナノソームの中、少なくとも一種類のナノソームを含み、下記組成からなるエッセンスを、一般的なエッセンスの製造方法により製造した。
【００７５】
【表５】
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【００７６】
剤形例５：傷治療用ハイドロゲル
前記実施例１で製造された４種のペプチドナノソームを同時に含み、下記組成からなるハイドロゲルパッチを製造した（図７）。ドクターブレードとローラーで加工した後、焼成し、１×１ｃｍ２のハイドロゲル薄片を作って、実験に使用した。その薄片を図７に記載した。
【００７７】
【表６】
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【００７８】
試験例４：製造されたペプチドナノソームの動物モデルにおける傷治癒効果
Ｂａｌｂ/Ｃマウスの背中部位の毛を除毛した後、手術用使い捨てナイフで約３ｍｍ〜５ｍｍになるように傷を付けた。一日が経った後、製造された複合ペプチドハイドロゲルパッチと陽性対照群としてのａＦＧＦをそれぞれの傷部位に塗布した。三日後、同量のペプチドを含むハイドロゲルパッチとａＦＧＦを前の傷部位に再び付着した。７日後に傷治癒効果を肉眼で識別して確認し、その結果を図８に示した。図８から分かるように、何の処理もしなかった傷部位（陰性対照群）に比べて、複合ペプチド処理をした傷部位では傷治癒効果が肉眼で確認されて、特にペプチド接合体処理をした傷部位は、経過時間が長いほど、ａＦＧＦ処理をした傷部位よりも著しく治療効果が高いことが肉眼で識別が可能であった。これは、本発明のペプチドが、天然の成長因子より体外でさらに安定して、長期間にかけて傷部位に作用をしたから出た結果と判断される。さらに、本発明のペプチドを含有した化粧品及びハイドロゲルの場合、成長因子の活性を維持しながら、増加された成体内半減期による皮膚改善効果及び創傷などの治療効果が明白であると判断される。
【００７９】
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１】
2011519358.tif 000009
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
2011519358.tif 000019
【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年12月8日(2010.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長因子由来であって、配列番号１乃至４に記載のアミノ酸配列から構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなる成長因子活性を示すペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドのＣ−末端は、ヒドロキシ基(-OH)またはアミノ基(-NH2)に変形されたことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドのＮ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール(PEG)からなる群から選択される保護基が結合されていることを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、皮膚状態の改善用組成物。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれかに記載のペプチドを有効成分として含む、創傷治療用組成物。
【請求項６】
前記皮膚状態の改善は、シワの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、脱毛の防止または発毛の促進、皮膚保湿の改善、シミの除去、またはニキビの治療であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【国際調査報告】
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