(57)【要約】  本発明は一以上のＢ細胞及び／又はＴ細胞エピトープの置換を有するアミノ酸配列を含むシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）を提供する。本発明は、関連するキメラ分子、並びに核酸の関連、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、及び薬学的組成物を更に提供する。哺乳動物において癌を治療又は予防する方法、標的細胞の増殖を阻害する方法、ＰＥを生産する方法、及びキメラ分子を生産する方法が本発明によって更に提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が、アミノ酸残基Ｒ３０２のアラニンの置換を含む場合、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、及びＬ２９９の少なくとも一つが置換されていることを条件とし、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２のうちの一以上の置換を有するアミノ酸配列を含むシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）であって、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２は配列番号１を参照することによって定義され、任意で配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープのうちに一以上のアミノ酸残基の置換を有し、及び／又は配列番号１のアミノ酸残基のＲ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６，及びＷ５５８のうちの一以上のＴ細胞エピトープのうちに一以上のアミノ酸残基の置換を有するシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）。
【請求項２】
アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９，及びＲ３０２の一以上の置換が、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２の一以上の代わりに、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンの置換である、請求項１に記載のＰＥ。
【請求項３】
ＰＥがＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号３）を含まずに、及びＸ５がアラニンである場合、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４の少なくとも一はアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンであることを条件として、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ４が、独立してロイシン、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンであり、
Ｘ３は、チロシン、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンであり、及び
Ｘ５は、アルギニン、アラニン、グリシン、セリン、グルタミンである、
Ｘ１ＶＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＡＸ５ＬＳＷ（配列番号２）を含む、請求項１又は２に記載のＰＥ。
【請求項４】
ＰＥが、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換を有する、請求項１から３の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項５】
アミノ酸残基Ｅ２８２、Ｅ２８５、Ｐ２９０、Ｒ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１、Ｑ３３２、Ｄ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｄ４６３、Ｒ４６７、Ｙ４８１、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｌ５１６、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｒ５７６、Ｋ５９０、Ｑ５９２、及びＬ５９７が配列番号１を参照することにより定義され、
ＰＥが、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換を有し、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換が、アミノ酸残基Ｅ２８２、Ｅ２８５、Ｐ２９０、Ｒ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１、Ｑ３３２、Ｄ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｄ４６３、Ｒ４６７、Ｙ４８１、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｌ５１６、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｒ５７６、Ｋ５９０、Ｑ５９２、及びＬ５９７の一以上の代わりに、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換である、請求項１から４の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項６】
配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換が、アミノ酸残基のＤ４０６、Ｒ４３２、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５１３、Ｅ５４８、Ｋ５９０、及びＱ５９２一以上の代わりにアラニン、グリシン、又はセリンの置換である、請求項５に記載のＰＥ。
【請求項７】
一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の更なる置換は、アミノ酸残基Ｒ４２７、Ｒ４５８、Ｄ４６３、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、及びＲ５３８の一以上の代わりに、独立してアラニン、グリシン、又はセリンの置換である、請求項５に記載のＰＥ。
【請求項８】
ＰＥが、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換を有し、及び配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換が、アミノ酸残基Ｒ４９０の代わりに、バリン、ロイシン、又はイソロイシンの置換であり、アミノ酸残基Ｒ４９０が、配列番号１を参照することによって定義される、請求項１から３の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項９】
ＰＥが配列番号１の一以上のＴ細胞エピトープ内に一以上のアミノ酸残基の置換を有し、配列番号１の一以上のＴ細胞エピトープ内のアミノ酸残基の置換が、アミノ酸残基Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、Ｙ４７０、Ｉ４７１、Ａ４７２、Ｐ４７５、Ａ４７６、Ｌ４７７、Ｉ４９３、Ｒ４９４、Ｎ４９５、Ｌ４９８、Ｌ４９９、Ｒ５００、Ｖ５０１、Ｙ５０２、Ｖ５０３、Ｒ５０５、Ｌ５０８、Ｐ５０９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８の一以上の置換である、請求項１から８の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項１０】
配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換が、
（ａ）アミノ酸残基Ｄ４０６のアラニンの置換；
（ｂ）アミノ酸残基Ｒ４３２のグリシンの置換；
（ｃ）アミノ酸残基Ｒ４６７のアラニンの置換；
（ｄ）アミノ酸残基Ｒ４９０のアラニンの置換；
（ｅ）アミノ酸残基Ｒ５１３のアラニンの置換；
（ｆ）アミノ酸残基Ｅ５４８のセリンの置換；
（ｇ）アミノ酸残基Ｋ５９０のセリンの置換；及び
（ｈ）アミノ酸残基Ｑ５９２のアラニンの置換である
請求項６に記載のＰＥ。
【請求項１１】
位置５１６でアミノ酸残基がアラニンと置換されるとき、アミノ酸残基Ｄ４６３及びＹ４８１の少なくとも一もまた置換されることを条件として、配列番号１を参照することによって定義されるアミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１，及びＬ５１６の一以上の置換を有するＰＥのアミノ酸配列を含み、
ＰＥが任意で、一以上のＢ細胞エピトープ内に一以上のアミノ酸残基の更なる置換、及び／又は一以上のＴ細胞エピトープ内に一以上のアミノ酸残基の更なる置換、及び／又は配列番号１により定義される残基１〜２７３及び２８５〜３９４の一以上の連続するアミノ酸残基の欠失を有する、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）。
【請求項１２】
ＰＥが、一以上のＢ細胞エピトープ内にアミノ酸残基の更なる置換を有し、及び一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の更なる置換が、配列番号１を参照することにより定義されるアミノ酸残基Ｅ２８２、Ｅ２８５、Ｐ２９０、Ｒ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１、Ｑ３３２、Ｄ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｒ５７６、Ｋ５９０、Ｑ５９２，及びＬ５９７の一以上の置換である、請求項１１に記載のＰＥ。
【請求項１３】
アミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１、及びＬ５１６の一以上の置換が、アミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１、及びＬ５１６の一以上の代わりに、独立して、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンの置換である、請求項１２に記載のＰＥ。
【請求項１４】
一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の更なる置換は，アミノ酸残基Ｒ４２７、Ｒ４５８、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、及びＲ５３８の一以上の代わりに、独立してアラニン、グリシン、又はセリンの置換である、請求項１２又は１３に記載のＰＥ。
【請求項１５】
配列番号１を参照することによって定義される場合、
アミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１、及びＬ５１６の一以上の置換が、アミノ酸残基Ｄ４６３の代わりにアラニンの置換であり、一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の更なる置換が、
（ａ）アミノ酸残基Ｒ４２７のアラニンの置換；
（ｂ）アミノ酸残基Ｒ４５８のアラニンの置換；
（ｃ）アミノ酸残基Ｒ４６７のアラニンの置換；
（ｄ）アミノ酸残基Ｒ４９０のアラニンの置換；
（ｅ）アミノ酸残基Ｒ５０５のアラニンの置換；及び
（ｆ）アミノ酸残基Ｒ５３８のアラニンの置換である、
請求項１４に記載のＰＥ。
【請求項１６】
式Ｉを含むアミノ酸配列を含むＰＥであって、
2014523237.tif 000030
ここで、
ｍ、ｎ、及びｐは独立して０又は１であり；
ＦＣＳは、配列がフューリンによって切断可能なアミノ酸残基のフューリン切断配列を含み；
Ｒ１は、配列番号１のアミノ酸残基２８５〜２９３の一以上の連続アミノ酸残基を含み；
Ｒ２は、Ｘ１ＶＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＡＸ５ＬＳＷ（配列番号２）を含み、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ４は、独立してロイシン、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンであり；Ｘ３は、チロシン、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンであり；及びＸ５は、アルギニン、アラニン、グリシン、セリン、グルタミンであり；ＰＥがＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号３）を含まずに、Ｘ５がアラニンである場合、Ｘ１Ｘ２Ｘ３及びＸ４の少なくとも一はアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンであることを条件とし；
Ｒ３は、配列番号１のアミノ酸残基３０６〜３９４の一以上の連続アミノ酸残基を含み；
ＰＥの機能ドメインＩＩＩは配列番号１の残基３９５〜６１３を含み、
任意で、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープのうち一以上のアミノ酸残基の置換、及び／又は配列番号１のアミノ酸残基Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６，及びＷ５５８のうちの一以上のＴ細胞エピトープのうち一以上のアミノ酸残基の置換を有するＰＥ。
【請求項１７】
ＦＣＳが、配列番号１の残基２７４〜２８４を含み、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の任意の置換が、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８２のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換である、請求項１６に記載のＰＥ。
【請求項１８】
ｍが１であり、Ｒ１が、配列番号１の残基２８５−２９３を含み、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の任意の置換が、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８５及び／又はＰ２９０のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換である、請求項１６又は１７に記載のＰＥ。
【請求項１９】
ｎが１であり、Ｒ３が、配列番号１の残基３０６〜３９４を含み、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の任意の置換が、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１、及びＱ３３２のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換を含む、請求項１６から１８の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項２０】
ＰＥの機能ドメインＩＩＩが配列番号１の残基３９５〜６１３を含み、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の任意の置換が、配列番号１のアミノ酸残基Ｄ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｄ４６３、Ｒ４６７、Ｙ４８１、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｌ５１６、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｒ５７６、Ｋ５９０、Ｑ５９２，及びＬ５９７の一以上のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換である、請求項１６から１９の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項２１】
ｍ、ｎ、及び／又はｐが０である、請求項１６、１７、及び２０の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項２２】
ここでアミノ酸残基Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８は配列番号１を参照することにより定義され、
位置Ｑ４８５又はＬ５１６でアミノ酸がアラニンと置換されるとき、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で少なくとも一の更なるアミノ酸残基が置換され、及び
位置Ｒ４２７、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、又はＲ５５１でアミノ酸残基がアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンと置換されるとき、又は位置Ｒ４９０でアミノ酸残基がバリン、ロイシン、又はイソロイシンと置換されるとき、位置Ｒ４２７、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、又はＲ５５１でアミノ酸残基がアラニン、グリシン、セリンとの置換、又は位置Ｒ４９０でアミノ酸残基がバリン、ロイシン又はイソロイシンとの置換を含まずに、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で少なくとも一の更なるアミノ酸残基が置換されることを条件として、
配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で一以上のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列を含むＰＥ。
【請求項２３】
配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で一以上のアミノ酸残基の置換がアミノ酸残基Ｉ４９３、Ｒ４９４、Ｎ４９５、Ｇ４９６、Ｌ４９８、Ｌ４９９、Ｒ５００、Ｖ５０１及びＹ５０２の一以上の代わりに、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換である、請求項１又は２２に記載のＰＥ。
【請求項２４】
（ｂ）請求項１から２３の何れか一項に記載のＰＥに（ａ）コンジュゲート又は融合した標的化部分を含んでなるキメラ分子。
【請求項２５】
標的化部分がモノクローナル抗体である、請求項２４に記載のキメラ分子。
【請求項２６】
モノクローナル抗体が、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７９ｂ、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体、メソテリン、カドヘリン、及びルイスＹからなる群から選択される細胞表面マーカーに特異的に結合する、請求項２５に記載のキメラ分子。
【請求項２７】
標的化部分が、Ｂ３、ＲＦＢ４、ＳＳ、ＳＳ１、ＭＮ、ＭＢ、ＨＮ１、ＨＮ２、ＨＢ２１、及びＭＯＲＡｂ−００９、及びその抗原結合部分からなる群から選択される抗体である、請求項２５に記載のキメラ分子。
【請求項２８】
標的化部分が、ＨＡ２２の抗原結合部分である、請求項２５に記載のキメラ分子。
【請求項２９】
請求項１から２２の何れか一項に記載のＰＥ又は請求項２４から２８の何れか一項に記載のキメラ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３０】
請求項２９の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項３１】
請求項３０の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３２】
請求項３１の少なくとも一の宿主細胞を含む細胞の集団。
【請求項３３】
（ａ）請求項１から２２の何れか一項に記載のＰＥ、請求項２４から２８の何れか一項に記載のキメラ分子、請求項２９に記載の核酸、請求項３０に記載の組換え発現ベクター、請求項３１に記載の宿主細胞、又は請求項３２に記載の細胞の集団、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項３４】
哺乳動物において癌を治療又は予防する方法であって、該方法が、請求項１から２３の何れか一項に記載のＰＥ、請求項２４から２８の何れか一項に記載のキメラ分子、請求項２９に記載の核酸、請求項３０に記載の組換え発現ベクター、請求項３１に記載の宿主細胞、又は請求項３２に記載の細胞の集団、又は請求項３３に記載の薬学的組成物を、哺乳動物において癌を治療又は予防するために有効な量で哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項３５】
標的細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法が、標的細胞の増殖を阻害するために有効な量の請求項１から２３の何れか一項に記載のＰＥ、請求項２４から２８の何れか一項に記載のキメラ分子、請求項２９に記載の核酸、請求項３０に記載の組換え発現ベクター、請求項３１に記載の宿主細胞、又は請求項３２に記載の細胞の集団、又は請求項３３に記載の薬学的組成物と細胞を接触させることを含む方法。
【請求項３６】
標的細胞が癌細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
標的細胞が、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７９ｂ、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体、メソテリン、カドヘリン、及びルイスＹからなる群から選択される細胞表面マーカーを発現する、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）組換え的にＰＥを発現し（ｂ）ＰＥを精製することを含む、請求項１から２３の何れか一項に記載のＰＥを生産する方法。
【請求項３９】
（ａ）組換え的にキメラ分子を発現し（ｂ）キメラ分子を精製することを含む、請求項２４から２８の何れか一項に記載のキメラ分子を生産する方法。
【請求項４０】
（ａ）請求項１から２３の何れか一項に記載のＰＥを組換え的に発現し、（ｂ）ＰＥを精製し、（ｃ）標的化分子を精製されたＰＥに共有結合で連結することを含む、請求項２４から２８の何れか一項に記載のキメラ分子を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本特許出願は、２０１１年６月９日に出願された米国仮特許出願第６１／４９５０８５号、及び２０１１年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／５３５６６８号の利益を主張し、これらの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
電子的に提出される、物質の参照による援用
参照によりその全体が本明細書に援用されるのは、本明細書と同時に提出されるコンピューター可読形式のヌクレオチド／アミノ酸配列表であり、次のように識別される：２０１２年６月２日付けの「７１０３３９_ＳＴ２５.ＴＸＴ」と命名される５３８８４バイトのアスキー（テキスト）ファイル。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）は、所望されない細胞、例えば、癌細胞の増殖を破壊又は阻害するのに有効であり得る細胞傷害活性を有する細菌毒素である。従って、ＰＥは、例えば癌などの疾患を治療又は予防するために有用であり得る。しかしながら、ＰＥは非常に免疫原性であり得る。従って、ＰＥ投与は、例えば、ＰＥの細胞傷害活性を望ましくなく中和する抗ＰＥ抗体及び／又はＴ細胞の産生を含む抗ＰＥ免疫応答を刺激することができる。そのような免疫原性は、今度は、例えば癌などの疾患を治療するためのＰＥの有効性を減少させ得る、患者に対して投与することができるＰＥの量を減らすことができる。従って、改良されたＰＥの必要性が存在する。
【０００４】
本発明の簡潔な要約
本発明の実施態様は、アミノ酸配列は、アミノ酸残基Ｒ３０２のアラニンの置換を含む場合、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、及びＬ２９９の少なくとも一つが置換されていることを条件とし、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２のうちの一以上の置換を有するアミノ酸配列を含むシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）を提供し、ここでアミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２は配列番号１を参照することによって定義され、任意で配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープのうちに一以上のアミノ酸残基の置換を有し、及び／又は配列番号１のアミノ酸残基のＲ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６，及びＷ５５８のうちの一以上のＴ細胞エピトープのうちに一以上のアミノ酸残基の置換を有する。
【０００５】
本発明の別の実施態様は、式Ｉを含むアミノ酸配列を含むＰＥを提供し、
2014523237.tif 000002
ここで、
ｍ、ｎ、及びｐは独立して０又は１であり；
ＦＣＳは、配列がフューリンによって切断可能なアミノ酸残基のフューリン切断配列を含み；
Ｒ１は、配列番号１のアミノ酸残基２８５〜２９３の一以上の連続アミノ酸残基を含み；
Ｒ２は、Ｘ１ＶＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＡＸ５ＬＳＷ（配列番号２）を含み、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ４は、独立してロイシン、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンであり；Ｘ３は、チロシン、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンであり；及びＸ５は、アルギニン、アラニン、グリシン、セリン、グルタミンであり；ＰＥがＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号３）を含まずに、Ｘ５がアラニンである場合、Ｘ１Ｘ２Ｘ３及びＸ４の少なくとも一はアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンであることを条件とし；
Ｒ３は、配列番号１のアミノ酸残基３０６〜３９４の一以上の連続アミノ酸残基を含み；及び
ＰＥの機能ドメインＩＩＩは配列番号１の残基３９５〜６１３を含み、
任意で、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープのうち一以上のアミノ酸残基の置換、及び／又は配列番号１のアミノ酸残基Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６，及びＷ５５８のうちの一以上のＴ細胞エピトープのうち一以上のアミノ酸残基の置換を有する。
【０００６】
本発明の更に別の実施態様は、
アミノ酸残基Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８は配列番号１を参照することにより定義され、
位置Ｑ４８５でアミノ酸がアラニンと置換されるとき、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で少なくとも一の更なるアミノ酸残基が置換され、及び
位置Ｒ４２７、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、又はＲ５５１でアミノ酸残基がアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンと置換されるとき、又は位置Ｒ４９０でアミノ酸残基がバリン、ロイシン、又はイソロイシンと置換されるとき、位置Ｒ４２７、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、又はＲ５５１でアミノ酸残基がアラニン、グリシン、セリンとの置換、又は位置４９０でアミノ酸残基がバリン、ロイシン又はイソロイシンとの置換を含まずに、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で少なくとも一の更なるアミノ酸残基が置換されることを条件として、
配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で一以上のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列を含むＰＥを提供する。
【０００７】
本発明の更に別の実施態様は、位置５１６でアミノ酸残基がアラニンと置換されるとき、アミノ酸残基のＤ４６３及びＹ４１８の少なくとも一もまた置換されることを条件として、配列番号１を参照することにより定義されるアミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１、及びＬ５１６の一以上の置換を有するＰＥアミノ酸配列を含むシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）を提供し、ここでＰＥは任意で、一以上のＢ細胞エピトープ内で一以上のアミノ酸残基の更なる置換、及び／又は一以上のＴ細胞エピトープ内で一以上のアミノ酸残基の更なる置換、及び／又は配列番号１により定義される残基１〜２７３及び２８５〜３９４の一以上の連続するアミノ酸残基の欠失を有する。
【０００８】
本発明の更なる実施態様は、関連するキメラ分子、並びに核酸の関連、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、及び薬学的組成物を提供する。
【０００９】
本発明の更に別の実施態様は、本発明のＰＥ、キメラ分子、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団又は薬学的組成物を哺乳動物における癌を治療または予防するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む哺乳動物における癌を治療又は予防する方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の実施態様は、標的細胞の増殖を阻害するのに有効な量で、本発明のＰＥ、キメラ分子、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団又は薬学的組成物と細胞を接触させることを含む、標的細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【００１１】
本発明の更なる実施態様は、本発明のＰＥを生成する方法及び本発明のキメラ分子を生成する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、世界人口（影無しの棒）及びドナーコホート（影付きの棒）における、種々の主要組織適合性複合体クラスＩＩ ＤＲベータ１（ＤＲＢ１）対立遺伝子（ｘ軸）の対立遺伝子頻度（ｙ軸）を示すグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、１×１０６細胞あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数（ｙ軸）を示すグラフであり、インビトロでの増殖及び培地（Ｍ）（ペプチド無し）、ペプチドプール３、ペプチドプール１６，又はペプチドプール２２によりインキュベーション後に、インターロイキン（ＩＬ）２ＥＬＩＳｐｏｔにより測定されたナイーブドナー０３１８１０ａｐｈのＴ細胞の応答を示している。
【図２Ａ】図２Ｂは、１×１０６細胞あたりのＳＦＣの数（ｙ軸）を示すグラフであり、インビトロでの増殖を伴わずに、ペプチド無し、ペプチドプール３、ペプチドプール１６，又はペプチドプール２２によるインキュベーションに際して、ＩＬ−２ＥＬＩＳｐｏｔにより測定されたナイーブドナー０３１８１０ａｐｈのＴ細胞の応答を示している。
【図３】図３は、ドナー１〜５０の各々からのＴ細胞による、１×１０６細胞あたりのＳＦＣの総数（ｙ軸）を、インビトロでの増殖の１４日後、ペプチド無し又はペプチドプール１〜２２の各々に対して（ｘ軸）示すグラフである。点線はバックグラウンドの３倍を示している。
【図４】図４は、様々なドナーにおいて様々な強度でＴ細胞応答を刺激するペプチドプール３に由来するペプチド内の特異的ペプチド及び領域（影付き領域）を同定している。
【図５】図５は、ＣＡ４６細胞において、野生型ＨＡ２２（ＰＥ３８にコンジュゲートしたジスルフィド結合型Ｆｖ抗ＣＤ２２抗体断片）（丸）、Ｌ２９７Ａ ＨＡ２２（四角）、又はＲ３０２Ａ ＨＡ２２（菱形）の濃度（ｎｇ／ｍＬ）（ｘ軸）に対する細胞傷害活性（％対照）（ｙ軸）を示すグラフである。
【図５】図６Ａは、野生型ＨＡ２２（影付きの棒）又はＲ３０２Ａ ＨＡ２２（影無しの棒）による１４日間の培養後における、ペプチド無し、野生型ペプチド（ＷＴ１５）、又はＲ３０２Ａ（ｙ軸）による再刺激に際して、ドナー０１０７１０のＴ細胞応答を示すグラフである。
【図６】図６Ｂは、野生型ＨＡ２２（影付きの棒）又はＲ３０２Ａ ＨＡ２２（影無しの棒）による１４日間の培養後における、ペプチド無し、野生型ペプチド（ＷＴ１５）、又はＲ３０２Ａによる（ｙ軸）再刺激に際して、ドナー１１１９０９のＴ細胞応答（１×１０６細胞あたりのＳＦＣ）（ｙ軸）を示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、ＨＡ２２（ＰＥ３８を含む）（影付きの棒）、又はＬＲ ＲＩＴ（ＬＲ）（配列番号１のアミノ酸残基２７４−２８４及び３９５−６１３を含む）（影無しの棒）による刺激、及びペプチドプール１〜２２の一による（ｘ軸）再刺激に際しての、ドナー０３１５１０のＴ細胞応答（１×１０６細胞あたりのＳＦＣ）（ｙ軸）を示すグラフである。対照は、セフタジジム（ＣＥＦＴ）増殖性細胞、０日目での抗原刺激を伴わずかつ１４日目での抗原刺激を伴わない細胞（「Ｍ株」）、及び０日目でＬＭＢ９の刺激を伴い１４日目での抗原刺激を伴わない細胞（「ペプチド無し」）を含んでいた。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＨＡ２２（ＰＥ３８を含む）（影付きの棒）、又はＬＲ ＲＩＴ（ＬＲ）（配列番号１のアミノ酸残基２７４−２８４及び３９５−６１３を含む）（影無しの棒）による刺激、及びペプチド無しによるか又はペプチドプール１〜２２の各々による再刺激（ｘ軸）に際しての、ドナー０３１５１０のＴ細胞応答（１×１０６細胞あたりのＳＦＣ）（ｙ軸）を示すグラフである。対照は、セフタジジム（ＣＥＦＴ）増殖性細胞、０日目での抗原刺激を伴わずかつ１４日目での抗原刺激を伴わない細胞（「Ｍ株」）、及び０日目でＬＭＢ９の刺激を伴い１４日目での抗原刺激を伴わない細胞（「ペプチド無し」）を含んでいた。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＨＡ２２（ＰＥ３８を含む）（影付きの棒）、又はＬＲ ＲＩＴ（ＬＲ）（配列番号１のアミノ酸残基２７４−２８４及び３９５−６１３を含む）（影無しの棒）による刺激、及びペプチド無しによるか又はペプチドプール１〜２２の各々による再刺激（ｘ軸）に際しての、ドナー１０１５０９のＴ細胞応答（１×１０６細胞あたりのＳＦＣ）（ｙ軸）を示すグラフである。対照は、セフタジジム（ＣＥＦＴ）増殖性細胞、０日目での抗原刺激を伴わずかつ１４日目での抗原刺激を伴わない細胞（「Ｍ株」）、及び０日目でＬＭＢ９の刺激を伴い１４日目での抗原刺激を伴わない細胞（「ペプチド無し」）を含んでいた。
【図８】図８は、様々なドナーにおいてＩＬ−２の産生により測定されるＴ細胞応答を刺激する配列番号１０２〜１１１のペプチドのうち特異的ペプチド（影付き領域）を同定する。
【図９】図９は、配列番号３１〜１４１の各々において５０のドナーのドナー当たりの総応答の累積割合を示すグラフである。
【図１０】図１０は、点置換型ＨＡ２２に対する抗ＰＥ３８（ドメインＩＩＩ）ファージの反応性を示す図である。黒いセルは、１０％未満の反応性を示し、空のセルは１０％を越える反応性を示し、グレーのセルは試験されていないことを示す。置換は、Ｎ末端（左）からＣ末端（右）へそれらの位置に従って並べられている。
【図１１Ａ】図１１Ａ及び１１Ｂは、ＨＡ２２による臨床試験を受けている第一（図１１Ａ）の患者と第二（図１１Ｂ）の患者の血清においてＨＡ２２と反応する抗体のレベルを５０％（点線）減少させた、置換された免疫毒素ＨＡ２２（「ＨＡ」、黒丸）、ＨＡ２２−ＬＲ（「ＬＲ」、白丸）、ＨＡ２２−ＬＯ５（「ＬＯ５」、黒三角）、ＨＡ２２−ＬＯ６（「ＬＯ６」、白三角）、ＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍ（「ＬＲ８Ｍ」、黒四角）及びＨＡ２２−ＬＯ１０（「ＬＯ１０」、白四角）の各々の濃度を試験する競合実験の結果を示す線グラフである。
【図１２】図１２は、ＰＥ３８を用いて治療された患者の血清において、ＨＡ２２、ＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍ、ＨＡ２２−ＬＯ１０（ＨＡ２２−ＬＲＬＯ１０）、又はＨＡ２２−ＬＲＬＯ１０Ｒに対する抗体の結合の割合を示すグラフである。
【００１３】
本発明の詳細な説明
シュードモナス外毒素Ａ（「ＰＥ」）は、緑膿菌が分泌する細菌毒素（分子量６６ｋＤ）である。天然の、野生型ＰＥ配列（配列番号１）は米国特許第５６０２０９５号に記載されており、参照により本明細書に援用される。天然の野生型ＰＥは、細胞傷害性に寄与する３つの構造ドメインを含む。ドメインＩａ（アミノ酸１〜２５２）は、細胞の結合を媒介し、ドメインＩＩ（アミノ酸２５３〜３６４）は、サイトゾルへの移行を媒介し、及びドメインＩＩＩ（アミノ酸４００〜６１３）は伸長因子２のＡＤＰリボシル化を媒介する。ＰＥのドメインＩＩＩの構造上の境界は４００残基で始まると考えられているが、ドメインＩＩＩは、ＡＤＰ−リボシル化活性を保持するドメインＩｂのセグメントを必要とし得ることが予期される。従って、機能性ドメインＩＩＩは残基、ＰＥの３９５〜６１３として定義されている。ドメインＩｂ（アミノ酸３６５〜３９９）の機能は定義されぬままである。特定の理論又はメカニズムに縛られることなく、ＰＥの細胞傷害活性は、真核細胞におけるタンパク質合成の阻害を介して、例えば伸長因子２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化の不活性化によって起きると考えられている。
【００１４】
ＰＥの置換は、ＰＥのアミノ酸配列を参照することにより本明細書に定義される。従って、ＰＥの置換は、特定の位置にて存在するアミノ酸残基、続いてその残基が議論されている特定の置換で置換されているアミノ酸を参照することにより本明細書に記載される。この点に関して、ＰＥの特定の実施態様のアミノ酸配列の位置は、特定の実施態様のアミノ酸配列の位置として、又は配列番号１によって定義される位置として本明細書において言及される。位置が配列番号１により定義されると、ＰＥの特定の実施態様のアミノ酸配列の実際の位置が配列番号１の対応する位置に対して定義され、配列番号１の残基位置番号とは異なる残基位置番号を表す場合がある。従って、例えば、置換は、それぞれのアミノ酸配列中の実際の位置は異なる場合があるとする理解のもとで、配列番号１の６１３アミノ酸配列の指定位置に対応するＰＥの特定の実施態様のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の置換を指す。例えば、位置が配列番号１により定義される場合、用語「Ｒ４９０」は、配列番号１の位置４９０にて通常存在するアルギニンを指し、「Ｒ４９０Ａ」は配列番号１の位置４９０にて通常存在するアルギニンがアラニンにより置換されることを示し、一方「Ｋ５９０Ｑ」は配列番号１の位置５９０にて通常存在するリジンがグルタミンにより置換されていることを示す。二つ以上の位置における複数の置換の場合には、二つ以上の置換は、同一又は異なっていてもよく、即ち、置換されている二つ以上のアミノ酸残基の各アミノ酸残基は、明示的に示されない限り、同一又は異なるアミノ酸残基で置換することができる。
【００１５】
本明細書で使用される用語「シュードモナス外毒素」及び「ＰＥ」は、免疫原性を低減又は排除するために天然のタンパク質から改変されているＰＥを含む。このような修飾は、限定されないが、ドメインＩａの除去、ドメインＩｂ、ＩＩ、及びＩＩＩにおける様々なアミノ酸の欠失、単一のアミノ酸置換、ＤＥＬ及びＲＥＤＬ（配列番号７）など、カルボキシル末端に一以上の配列の付加を含むことができる。Siegall et al., J. Biol. Chem., 264: 14256-14261 (1989)を参照。そのような改変されたＰＥは、本明細書に記載の一以上のＴ細胞及び／又はＢ細胞エピトープ内の一以上のアミノ酸残基において、本発明の置換の何れかを含むように更に改変されてもよい。一実施態様において、改変されたＰＥは、天然、野生型ＰＥの細胞傷害性断片であってもよい。ＰＥの細胞傷害性断片は、標的細胞においてその後のタンパク質分解又は他のプロセシングの有無に関わらず細胞傷害性であるものを（例えば、タンパク質又はタンパク質前駆体として）含み得る。好ましい実施態様において、ＰＥの細胞傷害性断片は、天然型ＰＥの細胞傷害性の少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは約５０％、更により好ましくは７５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは９５％を保持する。特に好ましい実施態様では、細胞傷害性断片は、天然ＰＥの少なくとも細胞傷害性を有し、天然のＰＥと比較して、好ましくは細胞傷害性が増加している。
【００１６】
免疫原性を低減又は排除する改変されたＰＥは、例えば、ＰＥ４Ｅ、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ＰＥ２５、ＰＥ３８ＱＱＲ、ＰＥ３８ＫＤＥＬ、及びＰＥ３５を含む。一実施態様において、ＰＥは、ＰＥ４Ｅ、ＰＥ４０、ＰＥ３８、ＰＥ２５、ＰＥ３８ＱＱＲ（ＰＥ３８はＣ末端に付加された配列ＱＱＲを有する）、ＰＥ３８ＫＤＥＬ（ＰＥ３８はＣ末端に付加された配列ＫＤＥＬ（配列番号５）を含む）、ＰＥ−ＬＲ（リソソーム分解に対する抵抗性）、及びＰＥ３５の何れであってもよい。
【００１７】
一実施態様において、ＰＥは、米国特許第４，８９２，８２７号に記載されるようにドメインＩａを除去することにより免疫原性を低下させるするように改変されている。ＰＥはまた、ドメインＩａの特定の残基を置換することによって改変することができる。一実施態様において、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５５１２６５８号に開示されているように、ＰＥは、ドメインＩａは存在するが、位置５７、２４６、２４７、及び２４９でドメインＩａの塩基性残基が酸性残基（例えば、グルタミン酸）に置換されている置換されたＰＥであるＰＥ４Ｅであっても良い。
【００１８】
ＰＥ４０は、ＰＥの切断された誘導体である(Pai et al., Proc. Nat ‘l Acad. Sci. USA, 88: 3358-62 (1991)及びKondo et al., Biol. Chem., 263: 9470-9475 (1988))。ＰＥ３５は、アミノ酸残基の１〜２７９が削除され、その分子は位置２８０でＭｅｔで始まり、続いて天然型ＰＥのアミノ酸２８１〜３６４及び３８１〜６１３が続く、ＰＥの３５ｋＤａカルボキシル末端断片である。ＰＥ３５及びＰＥ４０は、例えば、米国特許第５６０２０９５号及び第４８９２８２７号に開示されており、これらの各々は、参照により本明細書に援用される。ＰＥ２５は、ドメインＩＩからの１１残基の断片とドメインＩＩＩの全てが含まれている。幾つかの実施態様において、ＰＥはドメインＩＩＩのみを含む。
【００１９】
好ましい実施態様において、ＰＥはＰＥ３８である。ＰＥ３８は、ＰＥの転移しているＡＤＰリボシル化ドメインを含むが、細胞結合部分は含まない(Hwang J. et al., Cell, 48: 129-136 (1987))。ＰＥ３８は、アミノ酸２５３〜３６４及び３８１〜６１３（配列番号１４４）からなる切断型ＰＥプロタンパク質であり、細胞内でプロセシングによりその細胞傷害性形態へと活性化される（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，６０８，０３９号、及びPastan et al., Biochim. Biophys. Acta, 1333: C1-C6 (1997)を参照）。  
【００２０】
別の好ましい実施態様において、ＰＥはＰＥ−ＬＲである。ＰＥ−ＬＲは、配列番号１のアミノ酸残基２７４〜２８４に対応するフューリン切断配列（ＦＣＳ）（ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ（配列番号８））を除くドメインＩＩの欠損、及びドメインＩｂのアミノ酸残基３６５〜３９４の欠損を含む。このように、ＰＥ−ＬＲは、配列番号１のアミノ酸残基２７４〜２８４及び３９５〜６１３を含む。ＰＥ−ＬＲは、国際特許出願公開ＷＯ２００９／０３２９５４に記述され、それは参照により本明細書に援用される。ＰＥ−ＬＲは、場合によっては、ＦＣＳと配列番号１のアミノ酸残基３９５〜６１３の間のＧＧＳ連結ペプチドを更に含む場合がある。
【００２１】
上述したように、代替的又は追加として、ドメインＩｂの一部又は全部は、架橋により連結され、又はペプチド結合によって直接結合された残りの部分とともに削除されてもよい。代替的又は追加として、ドメインＩＩのアミノ部分の一部を欠失されてもよい。代替的又は追加として、Ｃ末端は天然型配列の残基６０９〜６１３（ＲＥＤＬＫ）（配列番号６）を含んでも良く、又はＫＤＥＬ（配列番号５）又はＲＥＤＬ（配列番号７）及びこれらの配列の反復など、サイトゾルに移行するＰＥの能力を維持し得るバリエーションを含み得る。例えば、参照により本明細書に援用される、米国特許第５，８５４，０４４号；第５，８２１，２３８号；及び第５，６０２，０９５号、及び国際特許出願公開ＷＯ１９９９／０５１６４３を参照。免疫原性が排除又は低減されたＰＥの任意の形態は、例えば、標的細胞における移行及びＥＦ−２リボシル化による、標的細胞への細胞傷害性の能力を保ったままである限り、本明細書に記載の一以上のＴ細胞及び／又はＢ細胞エピトープ内の一以上のアミノ酸残基にたいして本発明の置換の何れかと組み合わせて使用することができる。
【００２２】
本発明の一実施態様は、アミノ酸配列がアミノ酸残基Ｒ３０２のアラニンの置換を含むとき、少なくとも一の更なるアミノ酸残基が置換されることを条件として、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２の一以上の置換を有するアミノ酸配列を含む、本明細書に記載される天然のタンパク質から改変されたＰＥを含む、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）を提供し、ここで、アミノ酸残基のＬ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２は配列番号１を参照することにより定義され、任意で配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内に一以上のアミノ酸残基の置換を含み、及び／又は配列番号１のアミノ酸残基Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８のうちの一以上のＴ細胞エピトープ内に一以上のアミノ酸残基の置換を含む。好ましくは、一以上のＴ細胞エピトープ内の一以上のアミノ酸残基の置換は、位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、Ｙ４７０、Ｉ４７１、Ａ４７２、Ｐ４７５、Ａ４７６、Ｌ４７７、Ｉ４９３、Ｒ４９４、Ｎ４９５、Ｌ４９８、Ｌ４９９、Ｒ５００、Ｖ５０１、Ｙ５０２、Ｖ５０３、Ｒ５０５、Ｌ５０８、Ｐ５０９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６，及びＷ５５８での一以上のアミノ酸残基の置換である。
【００２３】
本発明の別の実施態様は、アミノ酸配列がアミノ酸残基Ｒ３０２のアラニンの置換を含むときに、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、及びＬ２９９の少なくとも一が置換されることを条件として、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２の一以上の置換を有するアミノ酸配列を含む、本明細書に記載される天然のタンパク質から改変された任意のＰＥを含むシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）を提供し、ここで、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２は配列番号１を参照することにより定義され、任意で、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内に一以上のアミノ酸残基の置換、及び／又は配列番号１のアミノ酸残基Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８のうちの一以上のＴ細胞エピトープ内に一以上のアミノ酸残基の置換を含む。アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９及びＲ３０２はＰＥの一以上のＴ細胞エピトープ内に位置していることが発見されている。このように、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２の一以上の置換は、有利に、一以上のＴ細胞エピトープを除去し得る。従って、本発明のＰＥは、有利なことに、置換されていない（例えば、野生型）ＰＥより低免疫原性であり得る。
【００２４】
アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９，及びＲ３０２の一以上の置換とは、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２の一以上の任意のアミノ酸残基の置換であり得る。本発明の実施態様において、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９，及びＲ３０２の一以上の置換とは、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２の一以上の代わりに、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンの置換である。
【００２５】
本発明の実施態様において、ＰＥはＸ１ＶＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＡＸ５ＬＳＷ（配列番号２）を含み、ここで、ＰＥは、ＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号３）含まないこと、及びＸ５がアラニンであるとき、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４のうちの少なくとも一はアラニン、グリシン、セリン又はグルタミンであることを条件として；Ｘ１、Ｘ２、及びＸ４は独立してロイシン、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンであり；Ｘ３は、チロシン、アラニン、グリシン、セリンまたはグルタミンであり；及びＸ５は、アルギニン、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンである。
【００２６】
本発明の別の実施態様は、位置５１６でアミノ酸残基がアラニンと置換されるとき、アミノ酸残基のＤ４６３及びＹ４１８の少なくとも一が置換されることを条件として、配列番号１を参照することにより定義されるアミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１、及びＬ５１６の一以上の置換を有するＰＥアミノ酸配列を含むシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）を提供し、ここでＰＥは任意で、一以上のＢ細胞エピトープ内で一以上のアミノ酸残基の更なる置換、及び／又は一以上のＴ細胞エピトープ内で一以上のアミノ酸残基の更なる置換、及び／又は配列番号１により定義される残基１〜２７３及び２８５〜３９４の一以上の連続するアミノ酸残基の欠失を有する。好ましくは、アミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１、及びＬ５１６の一以上の置換とは、アミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１、及びＬ５１６の一以上の代わりに、独立して、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンの置換である。アミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１、及びＬ５１６はＰＥの一以上のＢ細胞エピトープ内に位置していることが発見されている。このように、アミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１、及びＬ５１６の一以上の置換は、有利に、一以上のＴ細胞及び／又はエピトープを除去し得る。従って、本発明のＰＥは、有利なことに、置換されていない（例えば、野生型）ＰＥより低免疫原性であり得る。
【００２７】
本発明の実施態様において、一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸残基の更なる置換は、配列番号１を参照することにより定義されるアミノ酸残基Ｅ２８２、Ｅ２８５、Ｐ２９０、Ｒ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１、Ｑ３３２、Ｄ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｒ５７６、Ｑ５９２、及びＬ５９７の一以上の置換である。好ましくは、一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の更なる置換は、独立して、アミノ酸残基Ｒ４２７、Ｒ４５８、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、及びＲ５３８の一以上の代わりにアラニン、グリシン、又はセリンの置換である。特に好ましい実施態様において、アミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１及びＬ５１６のうちの一以上の置換は、アミノ酸残基Ｄ４６３の代わりにアラニンの置換であり、及び一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の更なる置換は；配列番号１を参照することによって定義されるように、（ａ）アミノ酸残基Ｒ４２７のアラニンの置換；（ｂ）アミノ酸残基Ｒ４５８のアラニンの置換；（ｃ）アミノ酸残基Ｒ４６７のアラニンの置換；（ｄ）アミノ酸残基Ｒ４９０のアラニンの置換；（ｅ）アミノ酸残基Ｒ５０５のアラニンの置換；及び（ｆ）アミノ酸残基Ｒ５３８のアラニンの置換である。
【００２８】
本明細書に記載される一以上のＰＥのＴ細胞及び／又はＢ細胞エピトープ内の一以上のアミノ酸残基の置換に加えて、本発明のＰＥはまた、必要に応じて、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内の一以上のアミノ酸残基の更なる置換を含むことができる。この点において、本発明の実施態様では、ＰＥは、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内の一以上のアミノ酸の置換を有する。本発明の好ましい実施態様において、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内の一以上のアミノ酸の置換は、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内の一以上のアミノ酸のアラニン、グリシン、セリン又はグルタミンの置換を含む。一以上のＢ細胞エピトープ内の置換は、一以上のＢ細胞エピトープの除去により免疫原性を有利に更に低減し得る。置換は、任意の適切なＰＥのＢ細胞エピトープ内に位置することができる。典型的なＢ細胞エピトープは、例えば、国際特許出願公開第２００７／０１６１５０号、第２００９／０３２９５４号、及び第２０１１／０３２０２２号に開示されており、これらの各々は、参照により本明細書に援用される。好ましい実施態様において、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内の一以上のアミノ酸残基の置換は、アミノ酸残基Ｅ２８２、Ｅ２８５、Ｐ２９０、Ｒ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１、Ｑ３３２、Ｄ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｄ４６３、Ｒ４６７、Ｙ４８１、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｌ５１６、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｒ５７６、Ｋ５９０、Ｑ５９２、及びＬ５９７の一以上の代わりに、独立して、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換であり、ここでアミノ酸残基Ｅ２８２、Ｅ２８５、Ｐ２９０、Ｒ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１、Ｑ３３２、Ｄ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｄ４６３、Ｒ４６７、Ｙ４８１、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｌ５１６、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｒ５７６、Ｋ５９０、Ｑ５９２、及びＬ５９７は配列番号１を参照することにより定義される。特に好ましい実施態様において、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換は、アミノ酸残基のＤ４０６、Ｒ４３２、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５１３、Ｅ５４８、Ｋ５９０、及びＱ５９２一以上の代わりにアラニン、グリシン、又はセリンの置換である。特に好ましい実施態様では、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換は、（ａ）アミノ酸残基Ｄ４０６のアラニンの置換；（ｂ）アミノ酸残基Ｒ４３２のグリシンの置換；（ｃ）アミノ酸残基Ｒ４６７のアラニンの置換；（ｄ）アミノ酸残基Ｒ４９０のアラニンの置換；（ｅ）アミノ酸残基Ｒ５１３のアラニンの置換；（ｆ）アミノ酸残基Ｅ５４８のセリンの置換；（ｇ）アミノ酸残基Ｋ５９０のセリンの置換；及び（ｈ）アミノ酸残基Ｑ５９２のアラニンの置換である。
【００２９】
本発明の実施態様において、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で一以上のアミノ酸残基の置換を、単独で又は本明細書に記載される他の置換の何れかとの組み合わせて、有するアミノ酸配列を含む。本発明の実施態様において、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８での一以上のアミノ酸残基の置換は、位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、Ｙ４７０、Ｉ４７１、Ａ４７２、Ｐ４７５、Ａ４７６、Ｌ４７７、Ｉ４９３、Ｒ４９４、Ｎ４９５、Ｌ４９８、Ｌ４９９、Ｒ５００、Ｖ５０１、Ｙ５０２、Ｖ５０３、Ｒ５０５、Ｌ５０８、Ｐ５０９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８での一以上のアミノ酸残基の置換である。
【００３０】
配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８での一以上のアミノ酸残基の置換は、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８の一以上の何れかでのアミノ酸残基の代わりに任意のアミノ酸残基の置換であってもよい。配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８での一以上のアミノ酸残基の置換は、例えば、配列番号１の位置４２１、４２２、４２３、４２５、４２７、４２９、４３９、４４０、４４３、４４４、４４６、４４７、４５０、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５５１、５５２、５５４、５５５、５５６、及び５５８での一以上のアミノ酸残基の代わりにアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換を含み得る。好ましい実施態様において、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８での一以上のアミノ酸残基の置換は、アミノ酸残基のＲ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、Ｙ４７０、Ｉ４７１、Ａ４７２、Ｐ４７５、Ａ４７６、Ｌ４７７、Ｉ４９３、Ｒ４９４、Ｎ４９５、Ｌ４９８、Ｌ４９９、Ｒ５００、Ｖ５０１、Ｙ５０２、Ｖ５０３、Ｒ５０５、Ｌ５０８、Ｐ５０９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８の一以上の代わりにアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換である。配列番号１を参照することにより定義されるＰＥの位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８にて位置する一以上のＴ細胞エピトープ内の一以上の置換は、ＰＥの免疫原性を更に低減させ得る。一実施態様において、アミノ酸配列は位置４２７、４６７、４８５、４９０、５０５、５１３、５１６、及び５５１で一以上のアミノ酸残基の置換を有してはいない。
【００３１】
本発明の別の実施態様において、ＰＥは、位置Ｑ４８５又はＬ５１６でアミノ酸残基がアラニンで置換されるとき、少なくとも一の更なるアミノ酸残基が置換され、そして位置Ｒ４２７、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、又はＲ５５１でアミノ酸残基がアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンと置換されるとき、又は位置Ｒ４９０でアミノ酸残基がバリン、ロイシン、又はイソロイシンと置換されるとき、位置２８２、２８５、２９０、３１３、３１４、３１９、３２４、３２７、３３１、３３２、４０３、４０６、４１２、４２７、４３１、４３２、４５８、４６１、４６７、４９０、５０５、５１３、５２２、５３８、５４８、５５１、５７６、５９０、５９２、又は５９７でのアミノ酸残基のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換、又は位置４９０でのアミノ酸残基のバリン、ロイシン、又はイソロイシンの置換を含まずに、少なくとも一の更なるアミノ酸残基が置換されることを条件として、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で一以上のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列を含み、ここでアミノ酸残基２８２、２８５、２９０、３０２、３１３、３１４、３１９、３２４、３２７、３３１、３３２、４０３、４０６、４１２、４２７、４３１、４３２、４５８、４６１、４６３−５１９、５２２、５３８、５４８、５５１、５７６、５９０、５９２、及び５９７は配列番号１を参照することにより定義される。
【００３２】
本発明の更に別の実施態様において、ＰＥは、位置Ｑ４８５又はＬ５１６でアミノ酸残基がアラニンと置換されるとき、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で少なくとも一の更なるアミノ酸残基が置換され、そして位置Ｒ４２７、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、又はＲ５５１でアミノ酸残基がアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンと置換されるとき、又は位置４９０でアミノ酸残基がバリン、ロイシン、又はイソロイシンと置換されるとき、位置Ｒ４２７、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｒ５５１でアミノ酸残基のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンとの置換、又は位置Ｒ４９０でアミノ酸残基のバリン、ロイシン、又はイソロイシンとの置換を含まずに、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で少なくとも一の更なるアミノ酸残基が置換されることを条件として、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８での一以上のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列を含み、ここでアミノ酸残基のＲ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８は配列番号１を参照することにより定義される。
【００３３】
好ましくは、ＰＥは、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第２００７／０１６１５０号で開示されているように、例えば、細胞傷害性を増加させる一以上の置換を含む。この点において、本発明の実施態様では、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換を有するＰＥを提供し、及び配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換は、アミノ酸残基Ｒ４９０の代わりに、バリン、ロイシン、またはイソロイシンの置換であり、ここでアミノ酸残基Ｒ４９０は、配列番号１を参照することによって定義される。本発明の実施態様において、配列番号１を参照することにより定義される位置３１３、３２７、３３１、３３２、４３１、４３２、５０５、５１６、５３８、及び５９０での一以上のアミノ酸残基のアラニン又はグルタミンとの置換は、参照により本明細書に組み込まれる、例えば国際特許出願公開第２００７／０１６１５０号において開示されているように、細胞傷害性が増加したＰＥを提供することができる。細胞傷害性の増大及び免疫原性の低下は同時に生じることが可能であり、相互に排他的ではない。細胞傷害性を増大させかつ免疫原性を低下させる置換、例えばＲ４９０のグリシンの置換、又はより好ましくはアラニンの置換は特に望まれる。
【００３４】
本発明の一実施態様では、式Ｉを含むアミノ酸配列を含むＰＥを提供し、
2014523237.tif 000003
ここで、
ｍ、ｎ、及びｐは独立して０又は１であり；
ＦＣＳは、配列がフューリンによって切断可能なアミノ酸残基のフューリン切断配列を含み；
Ｒ１は、配列番号１のアミノ酸残基２８５〜２９３の一以上の連続アミノ酸残基を含み；
Ｒ２はＸ１ＶＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＡＸ５ＬＳＷ（配列番号２）を含み、ここで、ＰＥは、ＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号３）含まないこと、及びＸ５がアラニンであるとき、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４のうちの少なくとも一はアラニン、グリシン、セリン又はグルタミンであることを条件として；Ｘ１、Ｘ２、及びＸ４は独立にロイシン、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンであり；Ｘ３は、チロシン、アラニン、グリシン、セリンまたはグルタミンであり；及びＸ５は、アルギニン、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンであり；
Ｒ３は、配列番号１のアミノ酸残基３０６〜３９４の一以上の連続アミノ酸残基を含み；及び
ＰＥの機能ドメインＩＩＩは配列番号１の残基３９５〜６１３を含み、任意で配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内に一以上のアミノ酸残基の置換、及び／又は配列番号１のアミノ酸残基Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８内の一以上のＴ細胞エピトープ内に一以上のアミノ酸残基の置換を含む。実施態様において、配列番号１のＲ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８の一以上のアミノ酸残基の置換は、Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、Ｙ４７０、Ｉ４７１、Ａ４７２、Ｐ４７５、Ａ４７６、Ｌ４７７、Ｉ４９３、Ｒ４９４、Ｎ４９５、Ｌ４９８、Ｌ４９９、Ｒ５００、Ｖ５０１、Ｙ５０２、Ｖ５０３、Ｒ５０５、Ｌ５０８、Ｐ５０９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８の一以上のアミノ酸残基の置換である。
【００３５】
本発明の実施態様において、式Ｉのｍ、ｎ及び／又はｐは０である。本発明の実施態様において、ｍ、ｎ及びｐはそれぞれ０である場合、式ＩのＰＥは、ＦＣＳとＰＥの機能ドメインＩＩＩの間にＧＧＳ連結ペプチドを更に含んでも良い。
【００３６】
特定の理論又はメカニズムに縛られることなく、フューリン切断配列（ＦＣＳ）を含有するＰＥは標的細胞内でタンパク質分解処理を受け、それにより、毒素の細胞傷害活性を活性化すると考えられている。本発明のＰＥのＦＣＳは、アミノ酸残基の任意の適切なフューリン切断配列を含んでも良く、その配列はフューリンにより切断可能である。典型的なフューリン切断配列は、Duckert et al., Protein Engineering, Design & Selection, 17(1): 107-112 (2004)及び国際特許出願公開第２００９／０３２９５４号に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の実施態様において、ＦＣＳは配列番号１の残基２７４〜２８４（即ちＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ（配列番号８））を含み、ここで配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８２のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換である。他の適切なＦＣＳアミノ酸配列は、限定されないが、Ｒ−Ｘ１−Ｘ２−Ｒを含み、ここでＸ１は天然に生じるアミノ酸であり、Ｘ２は任意の天然に生じるアミノ酸（配列番号９）、ＲＫＫＲ（配列番号１０）、ＲＲＲＲ（配列番号１１）、ＲＫＡＲ（配列番号１２）、ＳＲＶＡＲＳ（配列番号１３）、ＴＳＳＲＫＲＲＦＷ（配列番号１４）、ＡＳＲＲＫＡＲＳＷ（配列番号１５）、ＲＲＶＫＫＲＦＷ（配列番号１６）、ＲＮＶＶＲＲＤＷ（配列番号１７）、ＴＲＡＶＲＲＲＳＷ（配列番号１８）、ＲＱＰＲ（配列番号１９）、ＲＨＲＱＰＲＧＷ（配列番号２０）、ＲＨＲＱＰＲＧＷＥ（配列番号２１）、ＨＲＱＰＲＧＷＥＱ（配列番号２２）、ＲＱＰＲＧＷＥ（配列番号２３）、ＲＨＲＳＫＲＧＷＥＱＬ（配列番号２４）、ＲＳＫＲ（配列番号２５）、ＲＨＲＳＫＲＧＷ（配列番号２６）、ＨＲＳＫＲＧＷＥ（配列番号２７）、ＲＳＫＲＧＷＥＱＬ（配列番号２８）、ＨＲＳＫＲＧＷＥＱＬ（配列番号２９）、ＲＨＲＳＫＲ（配列番号３０）の何れかであり、及びＲ−Ｘ１−Ｘ２−Ｒを含み、ここでＸ１は天然に生じるアミノ酸であり、Ｘ２はアルギニン又はリジン（配列番号４）である。
【００３７】
本発明の実施態様において、式Ｉのｍは１であり、式ＩのＲ１は、配列番号１の残基２８５〜２９３を含み、ここで配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸残基のＥ２８５及び／又はＰ２９０のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換を含む。
【００３８】
本発明の別の実施態様において、式Ｉのｎは１であり、式ＩのＲ３は、配列番号１の残基３０６〜３９４を含み、ここで配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸残基のＲ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１、及びＱ３３２のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換を含む。
【００３９】
本発明の更に別の実施態様において、ＰＥの機能ドメインＩＩＩは、配列番号１の残基３９５〜６１３を含み、ここで配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換は、配列番号１のアミノ酸残基のＤ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｄ４６３、Ｒ４６７、Ｙ４８１、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｌ５１６、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｒ５７６、Ｋ５９０、Ｑ５９２、及びＬ５９７の一以上のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換を含む。本発明の好ましい実施態様では、ＰＥの機能ドメインＩＩＩは、配列番号１４２を含む。本発明の特に好ましい実施態様では、ＰＥの機能ドメインＩＩＩは、配列番号１４３を含む。
【００４０】
本発明のＰＥは、置換されていないＰＥに対する免疫応答と比較して、本発明のＰＥに対する免疫応答が定量的又は定性的に低下した場合、本発明に従って、置換されていないＰＥよりも免疫原性が少ない可能性がある。免疫原性の定量的な減少は、免疫応答の大きさ又は程度の減少を包含する。免疫原性の大きさ又は程度は、サイトカイン（例えば抗原特異的サイトカイン）産生のレベル（サイトカインの濃度）の減少、活性化又は動員されたリンパ球（例えばリンパ球（例えば抗原特異的リンパ球）の増殖）の数の減少、及び／又は抗体（抗原特異的抗体）の産生の減少など任意の数の既知のパラメータに基づいて測定することができる。免疫原性の定性的減少は、ＰＥの細胞障害活性の減少の媒介において免疫応答の効果を弱くする免疫応答の特質における任意の変化を包含する。免疫原性を測定する方法は当技術分野で知られている。例えば、産生されたサイトカインのタイプ及びレベルを測定することで免疫原性を測定することができる。代替的又は追加として、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、及び／又はマウス免疫系がヒト免疫系で置換されているマウス）に投与された場合に、抗体（例えば、以前にＰＥに対して曝露された抗体）に対するＰＥの結合を測定すること、及び／又は抗体を誘導するＰＥの能力を測定することで、免疫原性を測定することができる。免疫原性の低いＰＥは、置換されていないＰＥを用いて得られたものと比較して、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びグランザイムＢのうち任意の一以上などのサイトカインの産生の減少によって、及び／又はＴ細胞及び／又はＰＥに特異的なマクロファージの増殖及び活性化の減少など細胞媒介性免疫応答の刺激の減少によって特徴付けることができる。代替的又は追加として、免疫原性の低いＰＥは、置換されていないＰＥを用いて得られたものと比較して、ＴＧＦ−β及び／又はＩＬ−１０の産生の減少によって特徴付けることができる。好ましい実施態様において、免疫原性の低下は、Ｔ細胞刺激の減少、Ｔ細胞増殖の減少、及びＴ細胞のＩＦＮγ及び／又はグランザイムＢ分泌の減少の何れか一以上によって特徴付けられる。代替的又は追加として、免疫原性の低いＰＥは、置換されていないＰＥを用いて得られたものと比較して、ＰＥに特異的なＢ細胞の刺激及び／又は活性化の減少によって特徴付けることができる。例えば、免疫原性の低いＰＥは、置換されていないＰＥを用いて得られたものと比較して、抗体を分泌する形質細胞及び／又は記憶細胞へのＢ細胞の分化の減少により特徴付けることができる。免疫原性の低下は、Ｂ細胞刺激の減少、Ｂ細胞増殖の減少、及び抗ＰＥ抗体分泌の減少の何れか一以上によって特徴付けられ得る。免疫原性の定性的及び定量的減少は同時に生じることが可能であり、互いに排他的ではない。
【００４１】
当業者は、本発明のＰＥは、本発明のＰＥの治療的又は予防的効力が修飾により増加されるように様々な方法で改変することができることを容易に理解するであろう。例えば、本発明のＰＥは標的化部分に対してリンカーを介して直接又は間接的にコンジュゲート又は融合することができる。これに関して、本発明の実施形態は、（ｂ）本明細書に記載する本発明のＰＥの何れかにコンジュゲート又は融合した（ａ）標的化部分を含んでなるキメラ分子を提供する。化合物、例えば本発明のＰＥを標的化部分にコンジュゲートさせることの実施は当技術分野で知られている。例えば、Wadwa et al., J. Drug Targeting, 3: 111 (1995)、及び米国特許第５，０８７，６１６号を参照。
【００４２】
用語「標的化部分」は本明細書で使用される場合、標的化部分が、表面上に受容体が発現している細胞の集団への本発明のＰＥの送達を指示するように、細胞表面マーカーを特異的に認識し結合する任意の分子又は薬剤を指す。標的化部分は、限定されないが、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、又はその断片、ペプチド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、及び任意の他の天然又は非天然のリガンドを含む。
【００４３】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、完全（「インタクト」としても知られる）抗体又は抗原認識及び結合能力を保持するその抗原結合部分を指す。抗体又はその抗原結合部分は、天然に存在する抗体又はその抗原結合部分、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどから単離され及び／又は精製された抗体又は抗原結合部分であって良い。抗体又はその抗原結合部分は、単量体又は重合形態であり得る。また、抗体又はその抗原結合部分は、細胞表面マーカーに対する親和性又は結合活性の任意のレベルを有することができる。望ましくは、抗体又はその抗原結合部分は、他のペプチド又はタンパク質との最小限の交差反応があるように、細胞表面マーカーに特異的である。
【００４４】
抗体は、モノクローナル又はポリクローナル、及び任意のアイソタイプ、例えばＩｇＭ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＧ２の、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）、ＩｇＤ、ＩｇＡ又はＩｇＥなどであって良い。抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）又は標的細胞表面マーカーに対する抗体の単鎖可変断片（Ｆｖ）は、選択抗体に移植され又は操作され、抗体に標的細胞表面マーカーに対する特異性を付与することができる。例えば、標的細胞表面マーカーに対する抗体のＣＤＲは、既知の三次元構造のヒト抗体フレームワーク中に移植することができ（例えば、国際特許出願公開第１９９８／０４５３２２号及び第１９８７／００２６７１号；米国特許第５８５９２０５号、第５５８５０８９号及び第４８１６５６７号；欧州特許出願公開第０１７３４９４号；Jones et al., Nature, 321 :522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534 (1988), Riechmann et al., Nature, 332: 323 (1988); 及びWinter & Milstein, Nature, 349: 293 (1991)を参照）、ヒトに投与した場合にほとんど或いは全く免疫原性応答を高めることができない抗体を形成する。好ましい実施態様では、標的化部分はモノクローナル抗体である。
【００４５】
抗原結合部分は、例えば、インタクトな抗体の可変領域又はＣＤＲなど少なくとも一の抗原結合部位を有する任意の部分とすることができる。抗体の抗原結合部分の例には、限定されないが、重鎖、軽鎖、重鎖又は軽鎖の可変領域又は定常領域、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、又はＦ（ａｂ）２’断片；単一ドメイン抗体（例えばWesolowski, Med Microbiol Immunol., 198(3): 157-74 (2009); Saerens et al., Curr. Opin. Pharmacol., 8(5):6 00-8 (2008); Harmsen and de Haard, Appl. Microbiol. Biotechnol., 77(1 ): 13-22 (2007)を参照)、ヘリックス安定化抗体(例えばArndt et al., J. Mol. Biol., 312: 221-228 (2001)を参照；トリアボディ、ダイアボディ（欧州特許出願公開第０４０４０９７号；国際特許出願公開第１９９３／０１１１６１号；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)を参照）；ジスルフィド安定化抗体（「ｄｓＦｖｓ」、例えば米国特許第５，７４７，６５４号及び第６，５５８，６７２号）、及びドメイン抗体（「ｄＡｂｓ」、例えばHolt et al., Trends Biotech, 21(11):484-490 (2003), Ghahroudi et al., FEBS Lett., 414:521 -526 (1997), Lauwereys et al., EMBO J 17:3512- 3520 (1998), Reiter et al., J. Mol. Biol. 290:685-698 (1999);及びDavies and Riechmann, Biotechnology, 13:475-479 (2001)を参照）を含む。
【００４６】
任意の細胞表面マーカーに結合する能力について抗体又はその抗原結合部分を試験する方法は当該分野で公知であり、任意の抗体−抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降、及び競合的阻害アッセイが挙げられる（例えばJanewayら（以下）、及び米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号を参照）。
【００４７】
抗体を作成する適切な方法は当技術分野で知られている。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えばKoehler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow and Lane (編者），Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988)、及びC.A. Janeway et al. （編者）， Immunobiology, 第５版，Garland Publishing, New York, NY (2001)記載されている。あるいは、他の方法、例えばＥＢＶ−ハイブリドーマ法(Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), 及びRoder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986))、及びバクテリオファージベクター発現系（例えばHuse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)）が当技術分野で知られている。更に、非ヒト動物において抗体を産生する方法が、例えば米国特許第５５４５８０６号、第５５６９８２５号、及び第５７１４３５２号、及び米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６ Ａ１号に記載されている。
【００４８】
ファージディスプレイは、本発明のキメラ分子で用いることができる抗体を生成するために使用することができる。この点において、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリーを、標準的な分子生物学及び組換えＤＮＡ技術を用いて生成することができる（例えば、Sambrook et al. （編者），Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第３版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)を参照）。所望の特異性を有する可変領域をコードするファージが、所望の抗原に対する特異的結合のために選択され、完全又は部分的な抗体が、選択された可変ドメインを含んで再構成される。再構成された抗体をコードする核酸配列は、ハイブリドーマ産生用に使用されるミエローマ細胞など適切な細胞株に、モノクローナル抗体の特性を有する抗体が細胞により分泌されるように導入される（例えば、Janewayら（前出）、Huseら（前出）、及び米国特許第６２６５１５０号を参照）。
【００４９】
あるいは、抗体は、特異的重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるトランスジェニックマウスにより産生することができる。このような方法は、当技術分野で公知であり、例えば米国特許第５５４５８０６号及び第５５６９８２５号、及びJanewayら（前出）に記載されている。
【００５０】
あるいは、抗体は、遺伝子操作された抗体、例えば、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。ヒト化抗体は、副作用のリ低いリスクを有利に提供し、長く循環に残ることができる。ヒト化抗体を産生するための方法は当該分野で既知であり、例えばJanewayら、前出、米国特許第５２２５５３９号、第５５８５０８９号及び第５６９３７６１号、ヨーロッパ特許第０２３９４００ Ｂ１号、及び英国特許第２１８８６３８号に詳細に記載されている。ヒト化抗体は又、米国特許第５６３９６４１号、及びPedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994)等に記載の抗体リサーフェイシング技術を用いて生成することができる。
【００５１】
標的化部分は、任意の適切な細胞表面マーカーに特異的に結合することができる。特定の標的化部分及び／又は細胞表面マーカーの選択は、標的化される特定の細胞集団に応じて選択され得る。細胞表面マーカーは、当技術分野で公知であり（例えば、Mufson et al., Front. Biosci., 11 :337-43 (2006); Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6:326-334 (2000)；及びKreitman et al., AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006)を参照）、例えば、タンパク質又は糖であって良い。本発明の実施態様において、標的化部分は細胞表面上の受容体に結合するリガンドである。典型的なリガンドは、限定されないが、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＦａｓＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−４、ＩＬ−１３）、リンホカイン、ホルモン、及び成長因子（例えば、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦａ）、神経成長因子、上皮成長因子）を含む。
【００５２】
細胞表面マーカーは、例えば、癌抗原であって良い。本明細書で使用する用語「癌抗原」は、抗原が腫瘍又は癌と関連するように、単独で又は腫瘍細胞又は癌細胞によって主に発現ないし過剰発現される任意の分子（例えば、タンパク質、ペプチド、脂質、糖など）を指す。癌抗原は、正常な非腫瘍、又は非癌細胞によって更に発現させることができる。しかしながら、このような場合において、正常な非腫瘍、又は非癌細胞による癌抗原の発現は、腫瘍又は癌細胞による発現ほど強力ではない。この点で、正常な非腫瘍、又は非癌細胞による抗原の発現と比較して、腫瘍又は癌細胞は抗原を過剰発現することができるか、又は有意に高いレベルで抗原を発現することができる。また、癌抗原は、発達又は成熟の異なる状態の細胞によって更に発現させることができる。例えば、癌抗原は、細胞が成人宿主に通常は見出されていない胚又は胎児期の細胞によって更に発現させることができる。あるいは、癌抗原は、細胞が成人宿主に通常は見出されていない幹細胞又は前駆細胞によって更に発現させることができる。
【００５３】
癌抗原は、本明細書に記載の癌及び腫瘍を含む任意の癌又は腫瘍の何れかの細胞によって発現される抗原であり得る。癌抗原は、癌抗原が、癌又は腫瘍の一種類のみに関連し又は特徴を示すように、癌又は腫瘍の一種類のみの癌抗原であってもよい。あるいは、癌抗原は、癌又は腫瘍の複数のタイプの（例えば、特徴的であり得る）癌抗原であってもよい。例えば、癌抗原は、乳癌細胞及び前立腺癌細胞の両方によって発現されてもよく、かつ正常な非腫瘍、又は非癌細胞によって全く発現されない。
【００５４】
標的化部分が特異的に結合し得る典型的な癌抗原としては、限定されないが、ムチン１（ＭＵＣ１）、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、メラノーマの優先的に発現される抗原（ＰＲＡＭＥ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭ−ＣＳＦＲ）、ＣＤ５６、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）（ｅｒｂＢ−２としても知られる）、ＣＤ５、ＣＤ７、チロシナーゼ腫瘍抗原、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）１、ＴＲＰ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ及びｐ５３を含む。好ましい実施態様において、標的化部分が特異的に結合する細胞表面マーカーは、表面抗原分類（ＣＤ）１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７９ｂ、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体、メソテリン、カドヘリン、及びルイスＹからなる群から選択される。メソテリンは、例えば、卵巣癌、中皮腫、非小細胞肺癌、肺腺癌、卵管癌、頭頸部癌、子宮頸癌、及び膵臓癌で発現される。ＣＤ２２は、例えば、ヘアリー細胞白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、及び急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）で発現している。ＣＤ２５は、ヘアリー細胞白血病及びホジキンリンパ腫を含む、例えば、白血病及びリンパ腫において発現される。ルイスＹ抗原は、例えば、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、肺癌、及び膵臓癌で発現される。ＣＤ３３は、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び骨髄増殖性疾患で発現される。
【００５５】
本発明の実施態様において、標的化部分は癌抗原に特異的に結合する抗体である。癌抗原に結合する典型的な抗体の例には、限定されないが、トランスフェリン受容体に対する抗体（例えば、ＨＢ２１及びその変異体）、ＣＤ２２に対する抗体（例えば、ＲＦＢ４及びその変異体）、ＣＤ２５に対する抗体（例えば、抗−Ｔａｃ及びその変異体）、メソテリンに対する抗体（例えば、ＳＳ１、ＭＯＲＡｂ−００９、ＳＳ、ＨＮ１、ＨＮ２、ＭＮ、ＭＢ、及びその変異体）及びルイスＹ抗原に対する抗体（例えば、Ｂ３及びその変異体）が含まれる。この点において、標的化部分は、Ｂ３、ＲＦＢ４、ＳＳ、ＳＳ１、ＭＮ、ＭＢ、ＨＮ１、ＨＮ２、ＨＢ２１、及びＭＯＲＡｂ−００９、及びその抗原結合部分からなる群から選択される抗体であってもよい。本発明のキメラ分子での使用に適した更なる典型的な標的化部分は、例えば、米国特許第５２４２８２４号（抗トランスフェリン受容体）；第５８４６５３５号（抗ＣＤ２５）；第５８８９１５７号（抗ルイスＹ）；第５９８１７２６号（抗ルイスＹ）；第５９９０２９６号（抗ルイスＹ）；第７０８１５１８号（抗メソテリン）；第７３５５０１２号（抗ＣＤ２２及び抗ＣＤ２５）；第７３６８１１０号（抗メソテリン）；第７４７０７７５号（抗ＣＤ３０）；第７５２１０５４号（抗ＣＤ２５）；及び第７５４１０３４号（抗ＣＤ２２）；米国特許出願公開第２００７／０１８９９６２号（抗ＣＤ２２）； Frankel et al., Clin. Cancer Res., 6: 326-334 (2000)、及びKreitman et al., AAPS Journal, 8(3): E532-E551 (2006)に開示されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。別の実施態様において、標的化部分は、当技術分野で公知の免疫毒素の標的化部分を含み得る。典型的な免疫毒素は、限定されないが、ＬＭＢ−２（抗−Ｔａｃ（ＩＶ）−ＰＥ３８）、ＢＬ２２及びＨＡ２２（ＲＦＢ４（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８）、ＳＳ１Ｐ（ＳＳ ｌ（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８）−ＰＥ３８）、ＨＢ２１−ＰＥ４０、及びその変異体を含む。好ましい実施態様では、標的化部分は、ＨＡ２２の抗原結合部分である。ＨＡ２２はＰＥ３８にコンジュゲートした、ジスルフィド結合型Ｆｖ抗ＣＤ２２抗体断片を含む。ＨＡ２２及び変異体は、国際特許出願公報ＷＯ２００３／０２７１３５及びＷＯ２００９／０３２９５４に開示され、それらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００５６】
本発明の一実施態様では、キメラ分子はリンカーを含む。本明細書で使用する用語「リンカー」は、標的化部分に本発明のＰＥを連結する任意の薬剤又は分子を指す。当業者は、  本発明のＰＥの機能に必要ではない本発明のＰＥ上の部位は、リンカー及び／又は標的化部分は、一度本発明のＰＥに結合されると、本発明のＰＥの機能、即ち細胞傷害活性を妨げず、標的細胞の増殖を阻害し、癌を治療または予防することを条件として、リンカー及び／又は標的化部分を結合させるための理想的な部位であることを認識している。リンカーは、標的化部分及びＰＥの両方に共有結合を形成することが可能であり得る。適切なリンカーは、当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、直鎖又は分枝鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカー、及びペプチドリンカーを含む。ＰＥ及び標的化部分がポリペプチドである場合、リンカーは、（例えば、システインへのジスルフィド結合を介して）側鎖基を介してアミノ酸に結合することができる。好ましくは、リンカーは、末端アミノ酸のアミノ基及びカルボキシル基のアルファ炭素に結合される。
【００５７】
本発明の範囲に含まれるのは、本明細書に記載する本発明のＰＥ及びキメラ分子の機能部分である。用語「機能的部分」は、ＰＥ又はキメラ分子に関連して使用される場合、本発明のＰＥ又はキメラ分子の任意の部分又は断片を指し、その部分又は断片は、部分であるＰＥ又はキメラ分子（親ＰＥ又はキメラ分子）の生物学的活性を保持する、機能部分は、例えば、親ＰＥ又はキメラ分子と類似の程度に、同程度に、又はそれ以上の程度に、特異的に標的細胞に結合して破壊するか又は増殖を阻害し、又は癌を治療し又は予防する能力を保持するＰＥ又はキメラ分子のその部分を包含する。親ＰＥ又はそのキメラ分子を参照すると、機能部分は、親ＰＥ又はキメラ分子の、例えば、約１０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約５０％以上、約６８％以上、約８０％以上、約９０％以上、又は約９５％以上を含むことができる。
【００５８】
機能部分は、その部分のアミノ末端又はカルボキシ末端、又は両方の末端に、親ＰＥ又はキメラ分子のアミノ酸配列中に見出されていない付加的アミノ酸を含むことができる。望ましくは、付加的なアミノ酸は、例えば、標的細胞に特異的に結合して破壊し又は増殖を阻害し、癌を治療又は予防するなどの能力を有する機能部分の生物学的機能を妨げない。より望ましくは、付加的なアミノ酸は、親ＰＥ又はそのキメラ分子の生物学的活性と比較して、生物学的活性を増強する。
【００５９】
本発明の範囲に含まれるのは、本明細書に記載する本発明のＰＥ及びキメラ分子の機能変異体である。用語「機能変異体」は本明細書で使用される場合、親ＰＥ又はキメラ分子に対して実質的又は有意な配列同一性又は類似性を有するＰＥ又はキメラ分子を指し、その機能変異体は、変異体であるＰＥ又はキメラ分子の生物学的活性を保持する。機能変異体は、例えば、親ＰＥ又はキメラ分子と類似の程度に、同程度に、又はそれ以上の程度に、特異的に標的細胞に結合して破壊するか又は増殖を阻害する能力を保持する本明細書に記載されるＰＥ又はキメラ分子（親ＰＥ又はキメラ分子）の変異体を包含する。親ＰＥ又はそのキメラ分子を参照すると、機能変異体は、親ＰＥ又はキメラ分子のアミノ酸配列に、例えば、約３０％以上、約５０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上同一であることができる。
【００６０】
機能変異体は、例えば、少なくとも一の保存的アミノ酸置換を有する親ＰＥ又はキメラ分子のアミノ酸配列を含むことができる。保存的アミノ酸置換は当技術分野で公知であり、特定の化学的及び／又は物理的特性を有する一のアミノ酸を、同一の化学的又は物理的性質を有する別のアミノ酸と交換されるアミノ酸置換を含む。例えば、保存的アミノ酸置換は、別の酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）に置換された酸性アミノ酸、非極性側鎖を有する別のアミノ酸（例えばＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌなど）で置換された非極性側鎖を有するアミノ酸、別の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇなど）に置換された塩基性アミノ酸、極性側鎖を有する別のアミノ酸（Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）に置換された極性側鎖を持つアミノ酸であることができる。
【００６１】
代替的又は追加として、機能変異体は、少なくとも一の非保存的アミノ酸置換を有する親ＰＥ又はキメラ分子のアミノ酸配列を含むことができる。この場合、機能変異体の生物学的活性を妨害又は阻害しない非保存的アミノ酸置換が好ましい。好ましくは、非保存的アミノ酸置換は、機能変異体の生物学的活性が、親ＰＥ又はキメラ分子と比較して増加されるように、機能変異体の生物学的活性を増強する。
【００６２】
ＰＥ又は本発明のキメラ分子は、機能変異体の他の成分、例えば他のアミノ酸が、機能変異体の生物学的活性を実質的に変化させないように、特定のアミノ酸配列又は本明細書に記載される配列から本質的になることができる。
【００６３】
本発明のＰＥ又はキメラ分子（機能部分及び機能変異体を含む）は、一以上の天然に存在するアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含むことができる。このような合成アミノ酸は、当技術分野で公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノ−システイン、トランス−３−及びトランス−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリンβ−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチル−リジン、Ｎ’、Ｎ’−ジベンジル−リジン、６−ヒドロキシリジン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、及び−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む。
【００６４】
ＰＥ又は本発明のキメラ分子（機能部分及び機能変異体を含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、ジスルフィド架橋などを介しての環化、又は酸付加塩に変換、及び／又は任意で二量化又は重合化、又はコンジュゲートすることができる。
【００６５】
本発明の一実施態様は、（ａ）組換え的にＰＥを発現し（ｂ）ＰＥを精製することを含む、本発明のＰＥを生産する方法を提供する。（機能部分及び機能変異体を含む）本発明のＰＥ及びキメラ分子は、当技術分野で知られているタンパク質及びポリペプチドを生産する方法によって得ることができる。デノボ合成ポリペプチド及びタンパク質の適切な方法は、Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, 編者 Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, 編者Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000；及び米国特許第５，４４９，７５２号などの文献に記載されているまた、本発明のＰＥ及びキメラ分子は、本明細書に記載の核酸を用いて、標準的な組換え方法を使用した組換えにより発現させることができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版，Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001；及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994を参照。
【００６６】
本方法は更に、ＰＥを精製することを含む。一旦発現されると、本発明のＰＥは、当技術分野で公知の精製技術に従って精製され得る。典型的な精製技術は、限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、又は例えば、R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982)に記載される手順が含まれる。
【００６７】
本発明の別の実施態様は、（ａ）組換え的にキメラ分子を発現し（ｂ）キメラ分子を精製することを含む、本発明のキメラ分子を生産する方法を提供する。キメラ分子は、組換え的に発現され、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるように精製され得る。本発明の実施態様において、組換え的にキメラ分子を発現させることは、標的化部分をコードするヌクレオチド配列及びＰＥをコードするヌクレオチド配列をベクターに挿入することを含む。本方法は、機能的な標的化部分の領域と機能的なＰＥの領域を含む一の連続したポリペプチドをコードするように、標的化部分をコードするヌクレオチド配列及びＰＥをコードするヌクレオチド配列をフレーム内に挿入することを含んでもよい。本発明の一実施態様では、本方法は、発現の際に、ＰＥが標的化部分のカルボキシル末端に位置するように、ＰＥをコードするヌクレオチド配列を標的化部分をコードするヌクレオチド配列に連結することを含む。代替の実施態様では、本方法は、発現の際にＰＥが標的化部分のアミノ末端に位置するように、ＰＥをコードするヌクレオチド配列を標的化部分をコードするヌクレオチド配列に連結することを含む。
【００６８】
本発明の更に別の実施態様は、（ａ）本発明のＰＥを組換え的に発現し、（ｂ）ＰＥを精製し、（ｃ）精製されたＰＥに標的化部分を連結することを含む、本発明のキメラ分子を生産する方法を提供する。本発明のＰＥは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるように組換えにより発現され得る。本方法はさらに、精製されたＰＥに標的化部分を共有結合で連結することを含む。標的化部分にＰＥを結合させる方法は、標的化部分の化学構造に応じて変わる場合がある。例えば、本方法は、様々な官能基、例えば、ＰＥ上に存在するカルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ２）、又はスルフヒドリル（−ＳＨ）基の何れか一以上を標的化部分上の適切な官能基と反応させ、それによりＰＥと標的化部分との間に共有結合を形成することを含み得る。代替的又は追加として、本方法は、追加の反応性官能基を露出若しくは結合させるために、標的化部分又はＰＥを誘導体化することを含んでもよい。誘導体化はまた、標的化部分又はＰＥに一以上のリンカーを結合させることを含んでもよい。
【００６９】
本発明の別の実施態様では、本発明のＰＥ及びキメラ分子は、非組換えの方法を用いて生産することができる。例えば、本明細書に記載される本発明のＰＥ及びキメラ分子（機能部分及び機能変異体を含む）は、Synpep (Dublin, CA)、Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD)、及びMultiple Peptide Systems (San Diego, CA)などの企業により商業的に合成することができる。この点において、本発明のＰＥ及びキメラ分子は、合成、組換え、単離、及び／又は精製することができる。
【００７０】
幾つかの状況において、キメラ分子が一以上の標的細胞に到達したときに、標的化部分からＰＥを解放することが望まれ得る。この点に関して、本発明のキメラ分子は、切断可能なリンカーを含んでもよい。リンカーは、任意の適切な手段により、例えば酵素的に切断可能であり得る。例えば、標的細胞が癌（例えば、腫瘍）細胞である場合、キメラ分子は、腫瘍部位で存在する条件下で（例えば、腫瘍関連酵素又は酸性ｐＨに曝露される場合）切断可能なリンカーを含むことができる。
【００７１】
本発明の一実施態様は、本発明のＰＥ又は本明細書に記載の本発明のキメラ分子の何れかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。用語「核酸」は本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を含み、一般に、ＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味し、それは一本鎖又は二本鎖であり得、合成することができ又は天然の供給源から得る（例えば、単離及び／又は精製）ことができ、天然の、非天然の又は改変されたヌクレオチドを含むことができ、改変されていないオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりに、自然の、非天然の、又は改変されたヌクレオチド間結合、例えばホスホロアミド酸結合又はホスホロチオエート結合などを含むことができる。一般的に、核酸は、任意の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含まないことが望ましい。しかし、幾つかの場合において、本明細書で議論するように、核酸は一以上の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含むことが適切である場合がある。
【００７２】
好ましくは、本発明の核酸は、組換え体である。本明細書で使用する場合、用語「組換え体」は、（ｉ）天然又は合成の核酸断片を結合することにより、生きている細胞の外側に構築される分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）に記載のものの複製から生じる分子を指す。本明細書の目的において、複製は、インビトロの複製又はインビボの複製であり得る。
【００７３】
核酸は、当技術分野で公知の手順を用いる化学合成及び／又は酵素的連結反応に基づいて構築することができる。例えば、Sambrookら（前出）及びAusubelら（前出）を参照。．例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、又は、分子の生物学的安定性を増加させ、又はハイブリダイゼーションの際に形成された二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された様々に修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドなど）を用いて化学的に合成することができる。核酸を生成するために使用できる修飾ヌクレオチドの例としては、限定されないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換型アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６−ジアミノプリンを含む。あるいは、本発明の一以上の核酸は、Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) 及び Synthegen (Houston, TX)などの企業から購入することができる。
【００７４】
本発明はまた、本明細書に記載の何れかの核酸のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列、又は本明細書に記載の核酸の何れかのヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００７５】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好ましくは、高いストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする。「高いストリンジェンシーな条件」は、ヌクレオチド配列が、非特異的なハイブリダイゼーションよりも検出が強い量で、標的配列（本明細書に記載される何れかの核酸のヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高いストリンジェンシーな条件は、正確な相補的配列を持つポリヌクレオチド、又はごくわずかの散在したミスマッチを含むものを、ヌクレオチド配列にマッチしたごくわずかの小さな領域（例えば、３〜１０塩基）をたまたま有するランダム配列から区別するであろう条件を含む。相補性のこの小さな領域は、１４〜１７又はそれ以上の塩基の完全長相補体よりも容易に融解し、高いストリンジェンシーなハイブリダイゼーションはそれらを容易に識別可能にする。比較的高いストリンジェンシーな条件は、例えば、低塩条件及び／又は高温度条件、例えば０．０２〜０．１ＭのＮａＣｌ又はその等価物、約５０〜７０℃の温度により与えられる条件を包含するであろう。そのような高いストリンジェンシーな条件は、もしあれば、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖の間の小さなミスマッチを許容し、そして、本発明のＰＥ又はキメラ分子の何れかの発現を検出するのに特に適している。一般的に、条件は、ホルムアミドの増加量を添加することにより、よりストリンジェントにすることができることが理解される。
【００７６】
本発明はまた、本明細書に記載の核酸の何れかと、約７０％以上、例えば、約８０％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、又は約９９％以上同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００７７】
本発明の核酸は、組換え発現ベクターに組み込むことができる。この点において、本発明は、本発明の核酸の何れかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的のために、用語「組換え発現ベクター」は、コンストラクトが、ｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターは、細胞内で発現されたｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを有するのに十分な条件下で細胞と接触させる場合、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現を可能にする、遺伝的に改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンストラクトを意味する。本発明のベクターは、総じて天然に生じない。しかし、ベクターの部分は天然に生じ得る。本発明の組換え発現ベクターは、限定されないが、一本鎖又は二本鎖であり得、合成することができ又は天然の供給源から得る（例えば、単離及び／又は精製）ことができ、天然の、非天然の又は改変されたヌクレオチドであり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含む任意のタイプのヌクレオチドを含む。組換え発現ベクターは、天然に生じるヌクレオチド間結合、非天然に生じるヌクレオチド間結合、又は両方のタイプの結合を含むことができる。好ましくは、非天然ヌクレオチド又は改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写又は複製を妨げない。
【００７８】
本発明の組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであることができ、任意の適切な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために使用することができる。適切なベクターは、伝播及び増殖のために又は発現のため、またはその両方のために設計されたもの、例えばプラスミド及びウイルスなどを含む。ベクターは、ｐＵＣシリーズ(Fermentas Life Sciences)、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ(Stratagene, LaJolla, CA)、ｐＥＴシリーズ（Novagen, Madison, WI)、ｐＧＥＸシリーズ(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)、及びｐＥＸシリーズ(Clontech, Palo Alto, CA)からなる群から選択することができる。バクテリオファージベクター、例えばλＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ(Stratagene)、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭ１１４９もまた用いることができる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９ (Clontech)を含む。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ(Clontech)を含む。好ましくは、組換え発現ベクターは、例えば、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
【００７９】
本発明の組換え発現ベクターは、例えばSambrookら（前出）及びAusubelら（前出）に記載されるような標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。．環状又は直鎖状である発現ベクターのコンストラクトは、原核生物又は真核生物の宿主細胞において機能する複製系を含有するように調製することができる。複製系は、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどから由来し得る。
【００８０】
望ましくは、組換え発現ベクターは、ベクターが導入される宿主の種類（例えば、細菌、真菌、植物、又は動物）に特異的であり、必要に応じて、ベクターがＤＮＡまたはＲＮＡをベースとするかどうかを考慮して転写及び翻訳開始及び終止コドンなど調節配列を含む。
【００８１】
組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする一以上のマーカー遺伝子を含むことができる。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属等に対する耐性、原栄養性を提供するために栄養要求性宿主における相補性等を含む。本発明の発現ベクター用の適切なマーカー遺伝子は、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
【００８２】
組換え発現ベクターは、本発明のＰＥまたはそのキメラ分子（機能部分及び機能変異体を含む）をコードするヌクレオチド配列、ＰＥ又はキメラ分子をコードするヌクレオチド配列に相補的又はハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結された天然型又は非天然型プロモーターを含むことができる。プロモーターの選択、例えば、強い、弱い、誘導可能、組織特異的、発生特異的は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、プロモーターを有するするヌクレオチド配列を組み合わせることは、当業者の通常の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、又はマウス幹細胞ウイルスの末端反復配列に見出されるプロモーターであり得る。
【００８３】
本発明の組換え発現ベクターは、一過性発現のため、安定な発現のため、又は両方のために設計することができる。また、組換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導可能な発現のために作製することができる。
【００８４】
本発明の別の実施態様は、本明細書に記載される組換え発現ベクターの何れかを含む宿主細胞を更に提供する。本明細書に使用される場合、用語「宿主細胞」は、本発明の組換え発現ベクターを含むことができる任意の種類の細胞を指す。宿主細胞は真核細胞、例えば、植物、動物、真菌、又は藻類であることができ、又は原核細胞、例えば、細菌又は原生動物であることができる。宿主細胞は、培養細胞、接着細胞又は懸濁細胞、すなわち、懸濁液中で増殖する細胞であり得る。本発明の組換えＰＥ又はキメラ分子を生産する目的のために、宿主細胞は好ましくは原核細胞、例えば大腸菌細胞である。
【００８５】
また、本発明によって提供されるのは、本明細書に記載される少なくとも一の宿主細胞を含む細胞の集団である。細胞の集団は、少なくとも一つの他の細胞、例えば、組換え発現ベクターの何れかを含まない宿主細胞に加えて、記載された組換え発現ベクターの何れかを含む宿主細胞を含む不均一な集団であることができる。あるいは、細胞の集団は、実質的に均一な集団であることができ、ここで集団は、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主として含む（例えば本質的にからなる）。集団はまた、細胞のクローン集団であることができ、ここで、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含むように、集団の全ての細胞は組換え発現ベクターを含んでなる単一の宿主細胞のクローンである。本発明の一実施態様において、細胞の集団は、本明細書に記載される組換え発現ベクターを含む宿主細胞のクローン集団である。
【００８６】
本発明のＰＥ、キメラ分子（機能部分及び機能変異体を含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）、及び細胞の集団は単離及び／又は精製することができる。本明細書で使用される「単離された」という用語は、その天然の環境から採取されたことを意味する。本明細書で使用される「精製された」という用語は、本明細書において、純度が増加されることを意味し、ここで、「純度」は相対的な用語であり、必ずしも絶対的な純度と解釈されるべきではない。例えば、純度は、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、または約１００％であることができる。純度は、好ましくは約９０％以上（例えば、約９０％から約９５％）、より好ましくは約９８％以上（例えば、約９８％から約９９％）である。
【００８７】
本発明のＰＥ、キメラ分子（機能部分及び機能変異体を含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）、及び細胞の集団は、それら全てが一括して以下に「本発明のＰＥ物質」と称され、薬学的組成物などの組成物に処方することができる。この点において、本発明は、ＰＥ、キメラ分子（機能部分及び機能変異体を含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）、及び細胞の集団、及び薬学的に許容される担体の何れかを含む薬学的組成物を提供する。本発明のＰＥ物質の何れかを含む本発明の薬学的組成物は、一以上の本発明のＰＥ物質、例えば、ポリペプチド及び核酸、又は二以上のＰＥを含むことができる。あるいは、薬学的組成物は、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、ビンクリスチンなど、一以上の他の薬学的に活性な薬剤又は薬物と組み合わせて本発明のＰＥ物質を含むことができる。
【００８８】
好ましくは、担体は薬学的に許容される担体である。薬学的組成物に関して、担体は、従来使用されたものの何れかとすることができ、物理化学的考慮事項、例えば溶解性及び活性化合物との反応性の欠如により、及び投与経路によってのみ制限される。本明細書に記載される薬学的に許容される担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、及び希釈剤は、当業者によく知られており、一般に容易に入手可能である。薬学的に許容される担体は、活性剤に対して化学的に不活性であるもの及び使用条件下で有害な副作用又は毒性を持たないものであることが好ましい。
【００８９】
担体の選択は、本発明の特定のＰＥ物質によって、並びに本発明のＰＥ物質を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。従って、本発明の薬学的組成物の様々な好適な製剤がある。非経口（例えば、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び髄腔内）、経口、及びエアロゾル投与用の以下の製剤は、例示であり、限定するものではない。一以上の経路が、本発明のＰＥ物質を投与するために使用することができ、ある場合には、特定の経路が別の経路よりもより即効性でより効果的な応答を提供することができる。
【００９０】
局所製剤は当業者に良く知られている。このような製剤は、本発明との関連で皮膚への適用に特に適している。
【００９１】
経口投与に適した製剤は、（ａ）例えば、水、生理食塩水、又はオレンジジュースなどの希釈剤に溶解された本発明のＰＥ物質の有効量などの液体溶液；（ｂ）カプセル、小袋、錠剤、トローチ剤、及びトローチ（各々は所定量の活性成分を固体又は顆粒として含有する）；（ｃ）粉末；（ｄ）適当な液体中の懸濁剤、及び（ｅ）適切なエマルジョンを含むことができる。液体製剤は、水及びアルコール、例えば、エタノール、ベンジルアルコール、及びポリエチレンアルコールなどの希釈剤を、薬学的に許容される界面活性剤の添加を含み又は含まずに含むことができる。カプセル形態は、例えば、界面活性剤、潤滑剤、及び不活性充填剤（例えば、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム及びコーンスターチなど）を含んでなる通常の硬質又は軟質の殻のゼラチンタイプであって良い。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、グアーガム、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、及び他の薬理学的に適合性の賦形剤うち一以上を含むことができる。トローチ剤形態は、風味の中に、通常、スクロース及びアラビアゴム又はトラガカント、並びにゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアラビアゴム、乳剤、ゲルなど不活性基剤中に本発明のＰＥ物質を含む香錠の中に、更に当技術分野で知られる賦形剤を含有して本発明のＰＥ物質を含むことができる。
【００９２】
本発明のＰＥ物質は、単独で、又は他の適当な成分と組み合わせて、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤にすることができる。これらのエアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような加圧された許容される噴霧剤中に入れることができる。エアロゾル製剤はまた、ネブライザー又は噴霧器のような非加圧製剤用の医薬品として処方することができる。このようなスプレー製剤はまた、粘膜にスプレーするために使用されてもよい。
【００９３】
非経口投与に適した製剤としては、水性及び非水性、等張性の滅菌注射溶液を含み、それらは抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、及び意図されたレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質、及び懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液を含むことが可能である。本発明のＰＥ物質は、石鹸や界面活性剤など薬学的に許容される界面活性物質、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボキシメチルセルロースなどの懸濁化剤、又は乳化剤及び他の薬学的アジュバントの添加を伴い又は伴わずに、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、エタノール又はヘキサデシルアルコールなどのアルコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールなどのケタール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステル又はグリセリド、又はアセチル化脂肪酸グリセリドを含んでなる無菌の液体又は液体の混合物など、薬学的担体中の生理学的に許容される希釈液中で投与することができる。
【００９４】
非経口製剤に使用することができる油は、ワセリン、動物、植物、又は合成油が含まれる。油の具体的な例としては、ピーナッツ油、大豆油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリン、及び鉱油が含まれる。非経口製剤において使用するのに適した脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が含まれる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルが適切な脂肪酸エステルの例である。
【００９５】
非経口製剤で使用するのに適した石鹸としては、脂肪酸アルカリ金属、アンモニウム、及びトリエタノールアミン塩を含み、適切な界面活性剤は、（ａ）例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、及びアルキルピリジニウムハライドなどの陽イオン界面活性剤、（ｂ）例えば、アルキル、アリール、及びオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセリド硫酸塩、及びスルホサクシネートなどの陰イオン性界面活性剤、（ｃ）例えば、脂肪酸アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレン共重合体などの非イオン性界面活性剤、（ｄ）例えば、アルキル−β−アミノプロピオン酸及び２−アルキル−イミダゾリン第四級アンモニウム塩などの両性界面活性剤、及び（ｅ）それらの混合物が挙げられる。
【００９６】
非経口製剤は、典型的には、溶液中で本発明のＰＥ物質の約０．５重量％から約２５重量％を含有するであろう。保存剤及び緩衝液を使用することができる。注射部位の刺激作用を最小化又は除くために、このような組成物は、約１２から約１７の親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）を有する一以上の非イオン性界面活性剤を含むことができる。そのような製剤中の界面活性剤の量は、典型的には約５重量％から約１５重量％の範囲である。適切な界面活性剤には、ソルビタンオレイン酸モノエステルなどのポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、プロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される、疎水性塩基とエチレンオキシドの高分子量付加物が挙げられる。非経口製剤は、単位用量又は多用量の密封容器中、例えば、アンプル及びバイアル中に存在することができ、使用の直前に注射用に無菌の液体賦形剤、例えば水の添加のみを要するフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時注射溶液及び懸濁液は、先に記載した種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。非経口組成物用に効果的な薬学的担体の必要条件は、当業者に周知である（例えば、Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers,版，頁238-250 (1982)、及びASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel，第４版、頁622-630 (1986)を参照）。
【００９７】
上記の薬学的組成物に加えて、本発明の発明によるＰＥ物質は、シクロデキストリン包接複合体など包接複合体、又はリポソームとして処方することができることが当技術分野の当業者によって理解される。
【００９８】
本発明の目的のために、投与される本発明のＰＥ物質の量又は用量は、合理的な時間枠にわたって哺乳動物に所望の応答、例えば治療又は予防応答をもたらすのに十分であるべきである。例えば、本発明のＰＥ物質の用量は、投与の時点から約２時間以上、例えば、１２から２４時間以上の時間で、標的細胞の増殖を阻害するのに十分であるか、又は癌を治療ないし予防するのに十分であるべきである。特定の実施態様では、その時間はさらに長くなる可能性がある。用量は、特定の本発明のＰＥ物質の有効性及び哺乳動物（例えば、ヒト）の状態、並びに治療される哺乳動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
【００９９】
投与される用量を決定するための多くのアッセイは、当該分野で既知である。投与される用量は、インビトロ（例えば、細胞培養物）又はインビボ（例えば、動物試験）で決定することができる。例えば、投与される用量は、ＩＣ５０（症状の半最大抑制を達成する用量）、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）、細胞培養物及び／又は動物実験における治療指数を決定することによって決定することができる。治療指数はＥＤ５０に対するＬＤ５０の比率（すなわち、ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。
【０１００】
本発明のＰＥ物質の用量はまた、本発明の特定のＰＥ物質の投与を伴う可能性のある任意の有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定されるであろう。典型的には、主治医は、個々の患者を治療するために、年齢、体重、総体的な健康、食事、性別、投与される本発明のＰＥ物質、投与経路、及び治療される状態の重症度など種々の因子を考慮して、本発明のＰＥ物質の投与量を決定するであろう。一例として、かつ本発明を限定するものではないが、本発明のＰＥ物質の用量は、治療される被験体の約０．００１から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約０．０１から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約０．０１から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約５から約５００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０から約２５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約２５から約１５０ｍｇ／ｋｇ体重／日、又は約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日であることができる。
【０１０１】
あるいは、本発明のＰＥ物質が、それを投与される体内に放出される様式が、体内の時間及び位置に関して制御されるように、本発明のＰＥ物質はデポー形態に修正することができる（例えば、米国特許第４４５０１５０号を参照）。本発明のＰＥ物質のデポー形態は、例えば、本発明のＰＥ物質を含む移植可能な組成物、及びポリマーなど多孔性又は非多孔性物質とすることができ、ここで本発明のＰＥ物質は、非多孔性物質の材料及び／又は分解物により被包されるか又はその全体に拡散される。次いで、デポーは体内の所望の位置に移植され、本発明のＰＥ物質は所定の速度で移植片から放出される。
【０１０２】
本発明のＰＥ物質は当技術分野で公知のアッセイによって細胞傷害性についてアッセイすることができる。細胞傷害性アッセイの例には、国際特許出願公開第２０１１／０３２０２２号に記載されているように、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１を用いて細胞増殖を測定するＷＳＴアッセイを含む（試薬とキットはロシュ・アプライド・サイエンスから入手可能）。
【０１０３】
本発明の薬学的組成物、ＰＥ、キメラ分子、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、又は細胞の集団は、癌を治療又は予防する方法で使用することができることが意図される。特定の理論又はメカニズムに縛られることなく、本発明のＰＥは、真核細胞におけるタンパク質合成の阻害を介して、例えば伸長因子２（ＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化の不活性化によって、細胞の増殖を破壊又は阻害すると考えられている。特定の理論又はメカニズムに縛られることなく、本発明のキメラ分子は細胞表面マーカーを認識して特異的に結合し、それによって、細胞表面マーカーを発現しない細胞と最小限の交差反応性を有するか又は全く交差反応性を有しない細胞表面マーカーを発現する細胞の集団に対して細胞傷害性ＰＥを送達する。このように、ＰＥの細胞傷害性は、例えば、癌細胞など細胞の特定の集団を破壊又はその増殖を阻害するために標的とすることができる。この点において、本発明は、本明細書に記載されるＰＥ、キメラ分子、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団又は薬学的組成物の何れかを、哺乳動物における癌を治療または予防するのに有効な量で哺乳動物に投与することを含む哺乳動物における癌を治療又は予防する方法を提供する。
【０１０４】
「治療する」及び「予防する」なる用語、並びにそれらから生じる言葉は、本明細書で使用される場合、１００パーセント又は完全な治療ないし予防を必ずしも意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利点又は治療効果を有するものとして認識する様々な程度の治療又は予防がある。この点に関して、本発明の方法は、哺乳動物における癌の治療又は予防の任意のレベルの任意の量を提供することができる。更に、本発明の方法によって提供される治療又は予防は、例えば治療又は予防されている癌などの疾患の一以上の状態又は症状の治療又は予防を含むことができる。また、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患又は症状又はその状態の発症を遅らせることを含むことができる。
【０１０５】
宿主細胞又は細胞の集団が投与される本発明の方法の目的において、細胞は、宿主に同種または自家性である細胞であってもよい。好ましくは、細胞は、宿主に対して自家性である。
【０１０６】
本発明の方法に関しては、癌は、副腎癌、肉腫（例えば、滑膜肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫子宮、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫、及び奇形腫）、リンパ腫（例えば、小リンパ球性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫）、肝細胞癌、神経膠腫、頭部癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、頚部癌（例えば、扁平上皮細胞癌）、急性リンパ球性癌、白血病（例えば、ヘアリー細胞白血病、骨髄性白血病（急性及び慢性）、リンパ性白血病（急性及び慢性）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、骨髄単球性白血病（急性及び慢性）、及びリンパ性白血病（急性及び慢性））、骨癌（骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、及び巨大細胞腫瘍）、脳腫瘍（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、多形性膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、及び網膜芽細胞腫）、卵管癌、乳癌、肛門、肛門管又は肛門直腸癌、目の癌、肝内胆管癌、関節の癌、頸部、胆嚢、又は胸膜の癌、鼻、鼻腔、又は中耳の癌、口腔癌、外陰癌（例えば、扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、及び線維肉腫）、骨髄増殖性疾患（例えば、慢性骨髄性癌）、大腸癌（例えば、結腸癌）、食道癌（例えば、扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、及びリンパ腫）、子宮頚癌（子宮頸癌及び前浸潤子宮頸部異形成）、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、下咽頭癌、喉頭癌、肝臓癌（例えば、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、及び血管腫）、肺癌（例えば、気管支原性肺癌（扁平上皮、未分化小細胞、未分化大細胞、及び腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、軟骨性過誤腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、及び肺腺癌）、悪性中皮腫、皮膚癌（例えば、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、母斑、異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、及びケロイド）、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、卵巣癌（例えば、卵巣癌（漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、類内膜癌及び明細胞腺癌）、顆粒・卵胞膜細胞腫瘍、セルトリ−ライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、膵臓癌（例えば、腺管癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、及びＶＩＰ産生腫瘍）、腹膜、大網、腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌（例えば、腺癌及び肉腫）、直腸癌、腎臓癌（例えば、腺癌、ウィルムス腫瘍（腎芽細胞腫）、及び腎細胞癌）、小腸癌（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、及び線維腫）、軟組織癌、胃癌（例えば、癌、リンパ腫、及び平滑筋肉腫）、精巣癌（例えば、セミノーマ、奇形腫、胎児性癌、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、ライディッヒ細胞腫瘍、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、及び脂肪腫）、子宮癌（例えば、子宮内膜癌）、甲状腺癌、及び尿路上皮癌（例えば、扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌、尿管癌、及び膀胱癌）の何れかを含む任意の癌であって良い。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物」は、限定されないが、マウス及びハムスターなどのネズミ目の哺乳動物、及びウサギなどのウサギ目の哺乳動物を含む任意の哺乳動物を指す。哺乳動物は、ネコ科の動物（ネコ）及びイヌ科動物（イヌ）を含むネコ目からのものであることが好ましい。哺乳動物は、ウシ亜科の動物（ウシ）及びイノシシ科の動物（ブタ）を含むウシ目からのもの、又はウマ科（ウマ）を含むウマ目のものであることがより好ましい。哺乳動物は、サル目、Ceboids、又はSimoids（サル）であるか、又は類人猿目（ヒト及び類人猿）であることが最も好ましい。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
【０１０８】
また提供されるのは、標的細胞の増殖を阻害するのに有効な量で、本明細書に記載されるＰＥ（複数）の任意のＰＥ、キメラ分子、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団、又は薬学的組成物と細胞を接触させることを含む、標的細胞の増殖を阻害する方法を提供する。標的細胞の増殖は、任意の量によって、例えば、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％もしくはそれ以上、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、または約１００％によって阻害され得る。標的細胞は、生物学的サンプル中に提供されてもよい。生物学的サンプルは、哺乳動物から、任意の適切な方法で、任意の適切な供給源から得ることができる。生物学的サンプルは、例えば、血液採取、白血球除去、及び／又は腫瘍生検又は剖検によって得ることができる。接触させる工程は、哺乳動物に対して、インビトロ又はインビボで行うことができる。好ましくは、接触はインビトロである。
【０１０９】
本発明の一実施態様では、標的細胞は癌細胞である。標的細胞は、本明細書に記載の癌の何れかの癌細胞であってもよい。本発明の一実施態様では、標的は細胞表面マーカーを発現することができる。細胞表面マーカーは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載の任意の細胞表面マーカーであり得る。細胞表面マーカーは、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７９ｂ、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体、メソテリン、カドヘリン、及びルイスＹ．からなる群から選択される。
【０１１０】
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、もちろん、その範囲を決して限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１１】
実施例１
この実施例では、世界の人口に比べて、ナイーブなドナーコホートにおけるＨＬＡクラス２の対立遺伝子の頻度を実証している。
【０１１２】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＮＩＨ血バンクから得られた６５人の健康なドナー、及びＮＣＩで免疫毒素による治療を受けている５０人の患者から単離した。ＰＢＭＣはフィコール密度遠心分離によりバフィーコートから単離した。患者及び健常ドナーのＰＢＭＣのＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩハプロタイプはＰＣＲ−ＳＳＰ／ＳＳＯに基づく組織タイピングキットを用いて同定した。次いで、ＰＢＭＣを熱不活性化ヒトＡＢ血清及び標準的な凍結培地中で凍結し、使用するまで液体窒素中に保存した。
【０１１３】
６５人の健康なドナーのコホートは、世界の人口で表現されるＨＬＡ ＤＲアロタイプの数及び頻度に関する情報を提供するために調べられた。ナイーブなドナーコホートにおいて表現されたアロタイプの解析を世界の人口と比較したところ(Middleton, D. et al., New Allele Frequency Database: www.allelefrequencies.net, Tissue Antigens, 61(5): 403-7(2003))、ナイーブなドナーコホートにおいて主要ＨＬＡクラスＩＩ ＤＲＢ１対立遺伝子の合理的な表現があることを示した。統計分析は、世界人口とドナーのコホートとの間にＲ２＝０．５２の相関を示した。図１は、世界人口におけるＨＬＡクラス２対立遺伝子の異なる型の頻度をナイーブドナーコホートと比較している。表１は、ドナー集団のＨＬＡクラスＩＩ ＤＲＢ１ハプロタイプを示す。
【０１１４】
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【０１１５】
実施例２
この実施例では、Ｔ細胞を刺激するために使用されるペプチドライブラリーの調製を示す。
【０１１６】
毒素部分の免疫原性を測定するために、１１１ペプチドのライブラリーが、ＰＥ３８の全配列にまたがって設計された。ペプチドの各々は１５アミノ酸の大きさを有しており、１１個のアミノ酸が重複したペプチド配列番号３１及び３２を除き、１２個のアミノ酸が重複していた。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定されるように、ペプチドは純度＞９５％で合成した(American Peptide Co. Inc., Sunnyvale, CA)。凍結乾燥された合成ペプチドを、１０μＭのストック溶液を作るためにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。
【０１１７】
ペプチドは、表２に示すように２２のプールにグループ分けした。表２は、エピトープマッピングに使用されるペプチドの配列、配列番号、及びプール番号を示している。
【０１１８】
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【０１１９】
実施例３
この実施例では、ナイーブドナーＴ細胞のインビトロでの増殖は、ペプチドプールに対する感度及びＴ細胞の応答レベルを改善することを実証している。
【０１２０】
治療後の患者に起こる免疫応答を模倣するために、及び短期間アッセイにおけるナイーブドナーのサンプルにおける低感度及び非応答を克服するために、１７日のインビトロ増殖工程が特定のＴ細胞集団を増やすために採用された(Oseroff et al., J. Immunol., 185(2): 943-55 (2010))。細胞は免疫毒素で刺激した後１４〜１７日間インキュベートされた。刺激のために、ヒト免疫細胞上に存在しない抗原である免疫毒素ＬＭＢ９又はＢ３（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８標的化ＬｅＹ(Brinkmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(16): 7538-42 (1993)）を使用した。１４〜１７日において、細胞が回収され、表２の２２ペプチドプールを使用してインターロイキン（ＩＬ）−２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによりアッセイした。インビトロでの増殖工程の追加は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの感度及び応答レベルを向上させた（例えば、よりスポット形成細胞（ＳＦＣ）が観察された）。インビトロでの増殖工程は、ボランティアドナーからのＣＤ４特異的応答の検出を可能にし、また、各アッセイに使用される細胞の数を減少させた。
【０１２１】
代表的なデータを図２Ａ及び２Ｂに示す。図２Ａは、ＬＭＢ９（１．６μｇ／ｍｌ）の最初の刺激と、続くインビトロでの増殖の１７日後の培地単独（ペプチドなし）（Ｍ）又はペプチドプール３、１６、又は２２による再刺激に対するナイーブドナー０３１８１０ａｐｈのＴ細胞の応答を示すＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔウェルの一覧を示す。図２Ｂは、ＬＭＢ９（１．６μｇ／ｍｌ）の最初の刺激と、続くインビトロでの増殖を伴わない培地単独（ペプチドなし）（Ｍ）又はペプチドプール３、１６、又は２２による再刺激に対するナイーブドナー０３１８１０ａｐｈのＴ細胞の応答を示すＩＬ−２のＥＬＩＳｐｏｔのウェルの一覧を示す。
【０１２２】
特定の理論又はメカニズムに束縛されることは望まないが、インビボで、完全組換え免疫毒素（ＲＩＴ）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により内在化し、処理され、培養の最初の数日間に提示されたため、このアプローチは免疫応答を模倣していたと考えられている。天然に提示されるペプチドに応答した特異的Ｔ細胞が維持され、ＩＬ−２を用いて増殖させた。それらのＴ細胞が１７日間の増殖後に認識したエピトープは、天然に処理され、天然に提示されるペプチドであった。
【０１２３】
実施例４
この例では、ＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号３）は、ほとんどのドナーについて、Ｔ細胞応答を刺激することを示している。
【０１２４】
免疫毒素による初回の刺激と１４日間の増殖後に、細胞の半分が回収され、ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔによる初回のプールの選別にさらされた。１７日目に、残りの細胞がプールの選別の反復に使用され、陽性と観察されたプールについて細密な選別が実施された。異なる応答パターンが、アッセイの１４日目に２８人のドナーについて観察された。幾人かのドナーの選別で単一のプールに対する応答が明らかになったが（例えば、ドナー１、４、７、及び８）、一方他のドナー（例えば、ドナー１５，１６及び２３）では３〜４のプールに対する応答が明らかにされた。ペプチドは重複するため、例えば連続するプールが応答を有した場合（例えば、ドナー１５及び１８のプール１５及び１６に対する応答）など、プール間に重複も存在した。閾値は８５ＳＦＣ／（１ｘ１０６）と決定された。８５ＳＦＣ／（１ｘ１０６）以下の値において、１４日目以降の応答の何れもが、１７日目で又はインビトロの増殖が反復されるときに再現可能でなかったため、この閾値が決定された。８５ＳＦＣ／（１ｘ１０６）を上回る応答は再現性があった。
【０１２５】
４人のドナー（ドナー２５〜２８）は何れのプールに対しても（決定された閾値を上回る）応答が無く、非応答性であると考えられた。完全に選別された初回の２８人のドナーのうち、２４人のドナーは、少なくとも一つのプールに対する応答を有していた。異なるドナーは異なる最大応答レベルを有していた。幾人かのドナー（例えば、ドナー２，７及び１０）は、（プール３で１１００ ＳＦＣを上回る）高い最大応答を有したが、一方他のドナー（例えば、ドナー３及び９）は同じプールに対して２５０〜３２０ＳＦＣの応答を有していた。
【０１２６】
選別されたドナーの数を５０に増やした。５０人の全ドナーの間で観察されたスポット形成細胞の数は、２２のペプチドプールの各々で集計された。その結果を表３及び図３に示す。５０人の全ドナーの分析は、（ＰＥのドメインＩＩ内の）プール３が最も大きい応答を与えたことを示している（図３；表３）。結果は、プール３は、異なるのＨＬＡを持つ多くのドナーからの応答を刺激した、免疫優性のプールであったことを示している。
【０１２７】
2014523237.tif 000007
【０１２８】
免疫優性領域を見つけるためのプール３の精密な選別は、ほとんどのドナーにおいて、ペプチド配列番号４４と４５はプール３内の応答に応答性であることを示した。図４は、ペプチド配列番号４４及び４５は、異なるＨＬＡの状態を有するにもかかわらず、ほとんどの患者でＴ細胞を刺激するための共通の領域（ＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ）（配列番号３）を含んでいたことを示している。
【０１２９】
実施例５
この実施例は、ＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号３）における置換Ｌ２９４Ａ、Ｌ２９７Ａ、Ｙ２９８Ａ、Ｌ２９９Ａ、又はＲ３０２Ａは、ＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号３）の免疫原性を減少させることを実証している。
【０１３０】
ペプチド配列番号４４及び４５（プール３内）は共通に１２アミノ酸を持つ。この共通領域であるＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号３）は、配列番号１のアミノ酸残基の位置２９４〜３０５のアミノ酸に対応し、ＭＨＣ結合部位並びにＴ細胞受容体結合部位の両方が含まれている。ＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号３）中の各アミノ酸をアラニンに置換した。９人のナイーブドナー及び２人の患者由来のサンプルは、実施例３に記述されるように、１７日間ＬＭＢ９で刺激され、ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔを用いてアッセイされた。表４は、置換されたペプチドに対する１１サンプルのスクリーニングからのデータをまとめたものである。１１サンプルのうち１０について、一の置換又はそれ以上が、野生型（ＷＴ）に対する応答の７％未満まで応答を減少させた。１人を除くすべてのドナーにおいて、置換Ｌ２９７Ａは応答を７％以下に減少させた。Ｙ２９８Ａは１１サンプルのうち９で応答を減少させ、Ｒ３０２Ａは１１サンプルのうち７で応答を減少させた。表４は、ＷＴペプチドで得られた応答の応答率を示す。
2014523237.tif 000008
【０１３１】
特定の理論又はメカニズムに束縛されることは望まないが、単一のアミノ酸の変化の後で減少する応答は、ＨＬＡ分子の溝へのペプチドの結合の妨害、又はＴ細胞受容体が変化したペプチドを認識できないことに起因し得ると考えられている。何れの場合においても、置換されたペプチドＬ２７９Ａ及びＹ２９８Ａは応答の減少を引き起こし、従って、低下した免疫原性を提供すると考えることができる。
【０１３２】
実施例６
この実施例は、置換Ｒ３０２Ａは、新しいＴ細胞エピトープを作成せず、低下したＴ細胞応答を提供することを実証している。
【０１３３】
以前に記述されたように、部位特異的変異誘発は、ＲＩＴ Ｒ３０２ ＨＡ２２及びＬ２９７Ａ ＨＡ２２を調製するために用いられた(Pastan et al., Methods Mol. Biol., 248: 503-18 (2004))。ＣＡ４６細胞に対する細胞傷害活性を、ＨＡ２２野生型のそれと比較した（図５）。図５は、置換Ｌ２９７Ａ又はＲ３０２Ａを持つＨＡ２２コンストラクトが細胞毒性であったことを示している。ＨＡ２２、Ｌ２９７Ａ ＨＡ２２、及びＲ３０２ＡであるＨＡ２２のＩＣ５０は、それぞれ１．１、１．８、及び１．８ｎｇ／ｍｌであった。
【０１３４】
ドナー０１０７１０と１１１９０９からのＰＢＭＣは、ＷＴ ＨＡ２２又はＨＡ２２−Ｒ３０２Ａの何れかと共に１４日間培養され、そしてペプチドを含まずに、野生型ペプチドのＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷＮＱＶ（配列番号４５）（ＷＴ１５）を用いて、又はＬＶＡＬＹＬＡＡＡＬＳＷＮＱＶ（配列番号１４５）（Ｒ３０２Ａ）を用いて再刺激して、Ｔ細胞応答についてアッセイした。ドナーの０１０７１０（図６Ａ）及び１１１９０９（図６Ｂ）の両方において、新たなエピトープは観察されず、置換されたペプチドに対するＴ細胞応答は減少した。
【０１３５】
実施例７
この実施例は、免疫優勢エピトープを含有するドメインＩＩの一部の欠損はＰＥ３８のペプチドに対するＴ細胞応答を減少させることを実証している。
【０１３６】
実施例４に示すように、ドメインＩＩは、免疫優性及び乱交雑エピトープ（プール３の配列番号４４及び４５に含まれる）を含有する。ＰＥ−ＬＲ（リソソーム分解に対する抵抗性）（ＬＲ又はＬＲ ＲＩＴとしても知られる）は、配列番号３７及び３８に存在するフューリン切断配列ＲＨＲＱＰＲＧＷＥＱＬ（配列番号８）を除き、ドメインＩＩの欠損を含む。このように、ＬＲ ＲＩＴは、配列番号１のアミノ酸残基２７４〜２８４及び３９５〜６１３を含む。
【０１３７】
表２の２２のペプチドプールに対してＨＡ２２（ＰＥ３８を含む）によって刺激されたドナーＴ細胞の応答は、ＰＥ−ＬＲ（完全に免疫優勢エピトープを欠いている）によって刺激されたドナーＴ細胞のそれと比較された。
【０１３８】
０日目に、３人のドナー（ドナー０３１５１０、ドナー０２１６１０、又はドナー１０１５０９）からのＴ細胞は６ウェルプレートに蒔かれ、ＨＡ２２又はＰＥ−ＬＲの何れかの１０μｇ／ｍｌで刺激した。１４日目に、細胞を回収し、ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔプレートに蒔き、表２の２２のプールのそれぞれ一つのペプチドと共に４つの複製においてインキュベートした。対照は、セフタジジム（ＣＥＦＴ）増殖性細胞、０日目での抗原刺激を伴わずかつ１４日目での抗原刺激を伴わない細胞（「Ｍ株」）、及び０日目でＬＭＢ９の刺激を伴い１４日目での抗原刺激を伴わない細胞（「ペプチド無し」）を含んでいた。  
【０１３９】
結果は図７Ａ（ドナー０３１５１０）、７Ｂ（ドナー０２１６１０）、及び７Ｃ（ドナー１０１５０９）に示されている。全３人のドナーからのＴ細胞が、ＨＡ２２（ＰＥ３８を含む）による刺激、及びプール３のペプチドによる再刺激で応答を示した。応答は、ＰＥ−ＬＲで刺激した細胞では観察されなかった。
【０１４０】
実施例８
この実施例は、ＰＥのドメインＩＩＩ内のＴ細胞エピトープの同定を実証する。
【０１４１】
実施例４に記述されるように、免疫毒素による初回の刺激と１４日間の増殖後に、２０人のドナーからＴ細胞が回収され、ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔによる初回のプールの選別にさらされた。１７日目に、残りの細胞がプールの選別の反復に使用され、ペプチド配列番号１０２〜１１１により細密な選別が実施された。その結果を図８に示す。ドナー１〜２０のそれぞれからのＴ細胞によるＩＬ−２産生を刺激したペプチドは、図８において影付けされている。
【０１４２】
実施例９
この実施例は、Ｉ４９３、Ｒ４９４、Ｎ４９５、Ｇ４９６、Ｌ４９８、Ｌ４９９、Ｒ５００、Ｖ５０１又はＹ５０２の代わりに、アラニンの置換は、ＩＬ−２産生により測定される場合、野生型（ＷＴ）ペプチドに対する応答と比較してＴ細胞応答を減少させることを実証している。
【０１４３】
野生型ペプチドＩＲＮＧＡＬＬＲＶＹＶＰＲＳＳ（配列番号１０６）における非アラニンアミノ酸の各々をアラニンに置換した。ナイーブドナーからのサンプルは、実施例３に記述されるように、１７日間ＬＭＢ９で刺激され、ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔを用いてアッセイされた。表５は、置換されたペプチドに対する６つのサンプルのスクリーニングからのデータをまとめたものである。
【０１４４】
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【０１４５】
表５に示すように、６つ全てのサンプルにおいて、一の置換又はそれ以上は、ＷＴに対する応答の１０〜３０％まで応答を減少させた。６つのサンプルのうち５つについて、一の置換又はそれ以上が、ＷＴに対する応答の１０％未満まで応答を減少させた。置換Ｉ４９３Ａ、Ｒ４９４Ａ、Ｎ４９５Ａ、Ｇ４９６Ａ、Ｌ４９８Ａ、Ｌ４９９Ａ、Ｒ５００Ａ、Ｖ５０１Ａ又はＹ５０２Ａは、ＷＴに対する応答と比較した場合、６つのサンプルのうち少なくとも３つでＴ細胞応答を７０％又はそれ以上減少させる。表５は、ＷＴペプチドで得られた応答の応答率を示す。
【０１４６】
実施例１０
この実施例は、配列番号３８、３９、４４、４５、８１、８２、８６−８８、９７、９８、１０５−１０８、及び１２３−１２５はＴ細胞エピトープを含むことを実証する。
【０１４７】
５０人のドナーの全陽性プールの精密な選別により免疫優性領域を決定した。各ドナーにおいて、ＳＦＣの数を集計し、ＳＦＣの総数のうち各ペプチドの相対的なシェアを算出し、下記の式（Ｉ）に従って正規化し、
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ここでＤは、ドナーを表し、ｘは、５０人のドナーのうちの一を表し、Ｐはペプチドを表し、ｙはペプチド配列番号３１〜１４１のうちの一を表し、そしてＳｙはペプチドｙのＳＦＣの数を表す。
【０１４８】
正規化された値は各ペプチドの免疫原性のレベルを表し、５０人のドナーについてこれらの相対値の集計を図９に示す。図９は、以下のペプチドがＴ細胞エピトープを含むことを示す：配列番号３８、３９、４４、４５、８１、８２、８６、８７、８８、９７、９８、１０５、１０６、１０７、１０８、１２３、１２４，及び１２５。
【０１４９】
ドメインＩＩＩにおける最も免疫原性なペプチドは、図９に記載されるデータに基づいて選択された。ペプチド、ペプチドに応答したドナー及び患者の数、及びペプチドに共通する配列は表６に記載される。表６の患者は、以前にＰＥ３８で処置され、そして表６に示される応答は記憶応答である。表６において、応答は、ペプチドに応答するドナー又は患者のＳＦＣの５％と定義される。
【０１５０】
2014523237.tif 000011
【０１５１】
実施例１１
この実施例は、配列番号１を参照することにより定義される、置換Ｒ４２１Ａ、Ｌ４２２Ａ、Ｌ４２３Ａ、Ａ４２５Ｇ、Ｒ４２７Ａ、Ｌ４２９Ａ、Ｙ４７０Ａ、Ｉ４７１Ａ、Ａ４７２Ｇ、Ｐ４７５Ａ、Ａ４７６Ｇ、Ｌ４７７Ａ、Ｉ４９３Ａ、Ｎ４９５Ａ、Ｒ４９４Ａ、Ｌ４９８Ａ、Ｌ４９９Ａ、Ｒ５００Ａ、Ｖ５０１Ａ、Ｙ５０２Ａ、Ｖ５０３Ａ、Ｒ５０５Ａ、Ｌ５０８Ａ，又はＰ５０９ＡはＰＥの免疫原性を低下することを実証している。
【０１５２】
配列番号１０６は配列番号１のアミノ酸残基の位置４９３〜５０７に対応し、配列番号１０７は配列番号１のアミノ酸残基の位置４９６〜５１０に対応し、配列番号９７は配列番号１のアミノ酸残基の位置４６６〜４８０に対応し、そして配列番号８１は配列番号１のアミノ酸残基の位置４１８〜４３２に対応する。配列番号１０６及び配列番号１０７の各々のアミノ酸をアラニンに置換した。ドナー及び患者からのサンプルは、実施例３に記述されるように、１７日間ＬＭＢ９で刺激され、ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔを用いてアッセイされた。表７（配列番号１０６）、表８（配列番号１０７）、表９（配列番号９７）、及び表１０（配列番号８１）は、置換されたペプチドに対するサンプルのスクリーニングからのデータ（野生型（ＷＴ）ペプチドに対する応答の％）を要約している。
【０１５３】
2014523237.tif 000012
【０１５４】
表７に示すように、置換Ｉ４９３Ａ、Ｒ４９４Ａ、Ｎ４９５Ａ、Ｌ４９８Ａ、Ｌ４９９Ａ、Ｒ５００Ａ、Ｙ５０２Ａ、Ｖ５０１Ａ、又はＹ５０２Ａは、ＷＴペプチドに対する応答と比較した場合Ｔ細胞応答を７０％以上減少させる。
【０１５５】
2014523237.tif 000013
【０１５６】
表８に示すように、置換Ｌ４９８Ａ、Ｌ４９９Ａ、Ｒ５００Ａ、Ｖ５０１Ａ、Ｙ５０２Ａ、Ｖ５０３Ａ、Ｒ５０５Ａ、Ｌ５０８Ａ、又はＰ５０９Ａは、ＷＴペプチドに対する応答と比較した場合Ｔ細胞応答を７０％以上減少させる。
【０１５７】
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【０１５８】
表９に示すように、置換Ｙ４７０Ａ、Ｉ４７１Ａ、Ａ４７２Ｇ、Ｐ４７５Ａ、Ａ４７６Ｇ、又はＬ４７７Ａは、ＷＴペプチドに対する応答と比較した場合Ｔ細胞応答を７０％以上減少させる。
【０１５９】
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【０１６０】
表１０に示すように、置換Ｒ４２１Ａ、Ｌ４２２Ａ、Ｌ４２３Ａ、Ａ４２５Ｇ、Ｒ４２７Ａ、又はＬ４２９Ａは、ＷＴペプチドに対する応答と比較した場合、Ｔ細胞応答を７０％以上減少させる。
【０１６１】
実施例１２
この実施例は、配列番号１を参照することにより定義される置換Ｙ４３９Ａ、Ｈ４４０Ａ、Ｆ４４３Ａ、Ｌ４４４Ａ、Ａ４４６Ｇ、Ａ４４７Ａ、Ｉ４５０Ａ、Ｒ５５１Ａ、Ｌ５５２Ａ、Ｔ５５４Ａ、Ｉ５５５Ａ、Ｌ５５６Ａ又はＷ５５８Ａは免疫原性を低下することを実証している。
【０１６２】
１８量体ペプチド（ＧＰＥＥＥＧＧＲＬＥＴＩＬＧＷＰＬＡ）（配列番号１９８）は配列番号１２３及び１２４の両方からのアミノ酸残基を含むように合成された。１８量体ペプチド（ＦＶＧＹＨＧＴＦＬＥＡＡＱＳＩＶＦＧ）（配列番号１９９）は配列番号８７及び８８の両方からのアミノ酸残基を含むように合成された。配列番号１９８は配列番号１のアミノ酸残基の位置５４４〜５６１に対応し、配列番号１９９は配列番号１のアミノ酸残基の位置４３６〜４５３に対応する。配列番号１９８及び１９９の各々のアミノ酸をアラニンに置換した。ドナー及び患者からのサンプルは、実施例３に記述されるように、１７日間ＬＭＢ９で刺激され、ＩＬ−２ ＥＬＩＳｐｏｔを用いてアッセイされた。表１１（配列番号１９８）、及び表１２（配列番号１９９）は、置換されたペプチドに対するサンプルのスクリーニングからのデータ（野生型（ＷＴ）ペプチドに対する応答の％）を要約している。
【０１６３】
2014523237.tif 000016
【０１６４】
表１１に示すように、置換Ｒ５５１Ａ、Ｌ５５２Ａ、Ｔ５５４Ａ、Ｉ５５５Ａ、Ｌ５５６Ａ及びＷ５５８Ａは、ＷＴペプチドに対する応答と比較した場合、Ｔ細胞応答を７０％以上減少させる。
【０１６５】
2014523237.tif 000017
【０１６６】
表１２に示すように、置換Ｙ４３９Ａ、Ｈ４４０Ａ、Ｆ４４３Ａ、Ｌ４４４Ａ、Ａ４４６Ｇ、Ａ４４７Ａ、又はＩ４５０Ａは、ＷＴペプチドに対する応答と比較した場合、Ｔ細胞応答を７０％以上減少させる。
【０１６７】
実施例１３
この実施例は、ＰＥ内のＴ細胞エピトープの同定を実証する。
【０１６８】
実施例４〜１２で得られた結果に基づいて、表１３に記載のアミノ酸配列は、ＰＥのＴ細胞エピトープとして同定された。
【０１６９】
2014523237.tif 000018
【０１７０】
実施例１４〜１６
以下の材料及び方法を実施例１４〜１６において使用した。
【０１７１】
患者の全血液サンプルの採取、保存、及びＲＮＡの単離：血液サンプルは、組換え免疫毒素（ＲＩＴ）（複数）で処置した６人の患者から得た。２．５ｍｌの血液サンプルを陽イオン界面活性剤及び添加剤塩を含むＰＡＸＧＥＮＥチューブ(PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, Switzerland)に回収し、穏やかに４〜６回チューブを反転させて完全に混合し、１０時間室温でインキュベートした後、−８０℃で保存した。患者の全血液サンプルからの細胞内ＲＮＡを、製造業者の説明書に従ってＰＡＸＧＥＮＥ血液ＲＮＡキット（PreAnalytiX)を用いて精製し、−８０℃で保存した。
【０１７２】
重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡ合成、ｓｃＦｖ遺伝子のＰＣＲ増幅及び構築：制限酵素部位又はベクターリンカーを、幾つかのプライマーに連結した（表１５）。重鎖レパートリー及び軽鎖レパートリーは別々に調製され、リンカーで連結され、ＳｃＦｖの構造を与えた。重鎖レパートリーは成熟Ｂリンパ球を有するＩｇＧから調製した。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、ＩｇＧ定常領域プライマー：ＨｕＩｇＧ１−４ＣＨ１ＦＯＲ（表１５）と第一鎖ｃＤＮＡ合成キット(GE Healthcare, NJ)を用いて行った。軽鎖レパートリーをκ定常領域プライマー：ＨｕＧκＦＯＲ（表１５）を用いてＶκ遺伝子から調製した。４０ｐｍｏｌのプライマーを、ｃＤＮＡ合成のために１５μｌの反応混合物に加えた。
【０１７３】
ＶＨ及びＶκ遺伝子は第一鎖ｃＤＮＡ合成の生産を使用して３段階工程によって別々に増幅した。ＩｇＧの定常領域プライマー：ＨｕＩｇＧ１−４ＣＨ１ＦＯＲ及び家族に基づく適切なヒトＶＨバックプライマー（表１５）の等モル混合物を、患者の全血液サンプルからの細胞内ＲＮＡにおけるＶＨ遺伝子を網羅するために第一段階のＰＣＲで使用した。κ定常領域プライマー：ＨｕＧκＦＯＲ及び家族に基づく適切なヒトＶＨバックプライマー（表１５）をＶκ遺伝子のために使用した。第一段階のＰＣＲは、高い忠実度のポリメラーゼであるＰＨＵＳＩＯＮ (New England Biolabs, Ipswich, MA) を用いて、製造業者の推奨に従って１０ｐｍｏｌの各プライマーを含む５０μｌの反応混合物の最終体積中で行った。
【０１７４】
高い忠実度のポリメラーゼであるＰＲＩＭＥＳＴＡＲ（タカラ、京都、日本）は、第二段階のＰＣＲである、オーバーラップエクステンションによるスプライシング（ＳＯＥ）ＰＣＲのために、最終段階は製造業者の推奨に従って、１０ｐｍｏｌの各プライマーを含む挿入調製物のために用いられた。ＮｃｏＩ部位（下線）を含む
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の配列は、ヒトＶＨバックｎｃｏプライマー用にヒトＶＨバックプライマーへ連結された（表１５）。ｐＣＡＮＴＡＢベクターを、ファージライブラリーの構築のために使用した。ｐＣＡＮＴＡＢリンカーを含む５’−ＡＣＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＣＣ−３’（配列番号１８６）の配列は、ヒトＪＨフォワードリンカープライマー用にヒトＪＨフォワードリンカープライマーへ連結された。ヒトＶＨバックｎｃｏプライマー及びヒトＪＨフォワードリンカープライマーは、ＶＨ遺伝子の後ろにＮｃｏＩ部位を、及びＶＨ遺伝子の前方にｐＣＡＮＴＡＢリンカーを付加するために第二ＰＣＲで使用された。
【０１７５】
Ｖκ遺伝子を増幅する第二段階で、ｐＣＡＮＴＡＢリンカーを含む５’−ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧＴ ＧＧＴ ＧＧＣ ＧＧＡ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＧＧＡ ＡＧＣ−３’（配列番号１８７）の配列は、ヒトＶκバックリンカープライマー用にヒトＶκバックリンカープライマーへ連結された。ＮｏｔＩ部位（二重下線）を含む
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の配列は、ヒトＪκフォワァードＮｏｔプライマー用にヒトＪκフォワァードＮｏｔプライマーへ連結された。ヒトＶκバックプライマー及びヒトＪκフォワァードプライマーは、Ｖκ遺伝子の前方にＮｏｔ Ｉ部位を、後方にｐＣＡＮＴＡＢリンカーを付加するために第二ＰＣＲで使用された。
【０１７６】
ＶＨ及びＶκ遺伝子は、（ａ）ＶＨ遺伝子についてヒトＶＨバックＮｃｏプライマー及びＲ’リンカー（表１５）のｐＣＡＮＴＡＢリンカープライマーのプライマー対、及び（ｂ）Ｖκ遺伝子についてヒトＪκフォワードｎｏｔプライマー及びＦ’リンカー（表１５）のｐＣＡＮＴＡＢリンカープライマーのプライマー対を用いて別々に第三段階で調製された。
【０１７７】
第三段階で使用したＲ’のリンカーとＦ’リンカーのプライマーは、相補的なプライマーであった。ＶＨ及びＶκ遺伝子はＳＯＥ−ＰＣＲを用いてＳｃＦｖの構造を提供するために組み合わされた。最後に、ｓｃＦｖライブラリー断片は、挿入調製物のためにＶＨＩｇＧＦＯＲ及びＶＬＲＥＶのプライマー（表１５）を用いて増幅された。
【０１７８】
ファージライブラリーの構築：増幅されたＳｃＦｖ断片をＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅにサブクローン化し、Ｔ４リガーゼを用いてｓｃＦｖライブラリーを構築した。ライゲーション溶液をＱＩＡＱＵＩＣＫスピンカラム（Qiagen, Valencia, CA)を用いた抽出により精製し、水に再懸濁した。得られた濃度は約５０ｎｇ／ｍｌであった。４μｌのサンプルは、ジーンパルサー及びパルスコントローラユニット(Bio-Rad Laboratories)を用いて５０μｌのＴＧ１エレクトロコンピテント細胞(Lucigen, WI)に電気穿孔され、大型ライブラリに対しては６回繰り返された。細胞を、約２５０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１時間、６ｍｌのＳＯＣ (Invitrogen, Carlsbad, CA)中でインキュベートした。２０μｌのサンプルを収集し、希釈し、ＴＹＥアンピシリンプレート上に蒔き、ライブラリーサイズを算出した。２００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び４％グルコースを含む６ｍＬの量の２ＹＴ培地を添加し、更に１時間インキュベートした。培地は１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％グルコースを含む２ＹＴ培地を含み最大２００ｍｌ作製された。細胞は、ＯＤ６００＝０．４まで増殖させ、３０分放置した後、３０分間２５０ｒｐｍで振とうしながら、１０１１ｐｆｕのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ(New England Biolaboratories)に感染させた。細胞はＧＳＡローターで５０００ｒｐｍで５分間で収集され、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１００ミリリットルの量の２ＹＴ培地中において３０℃で一晩２５０ｒｐｍで振とうしながら、再懸濁された。
【０１７９】
ファージをＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ポリエチレングリコール６０００、２．５ＭのＮａＣｌ）の１／５容量を用いて上清から沈殿させ、２ＹＴ培地で再懸濁した。ファージライブラリーの力価は、１０μｌのファージの段階希釈を作成して、１００μｇ／ｍｌのＡｍｐ及び１％グルコースを補充したＬＢ寒天培地上に蒔かれたＯＤ６００＝０．４のＴＧ１細胞を９０μｌ添加することにより決定した。コロニーの数を一晩増殖後に測定し、力価を算出した。
【０１８０】
ファージライブラリのパンニング：ＬＭＢ−９（Ｂ３（ｄｓＦｖ）ＰＥ３８、ＬｅｗｉｓＹ抗原に特異的）をファージライブラリのパニングのための抗原として使用した。ＬＭＢ９は、ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ビオチン(Thermo Scientific, Rockford, IL)を用いて５０：１のモル比でビオチン化し、製造者の指示に従ってビオチン定量キット(Thermo Scientific, Rockford, IL) を用いて各ＬＭＢ９−ビオチン上のビオチン基の数を決定した。３５０ｍｌのファージ及びストレプトアビジン修飾型磁性ビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＭＹＯＮＥストレプトアビジンＴ１、直径１μｍ、ビオチン化Ｉｇの結合能４０−５０μｇｍｇ−１、疎水性、トシル活性化ビーズ(Invitrogen)）は３％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン−２０）で予めブロックした。ファージはビーズによる選択解除に適用された。
【０１８１】
磁気ラックは液相からビーズを分離するために使用され、ビーズをチューブの側面に沿って固定化させた。ブロッキング緩衝液を除去し、ビーズをファージ溶液に再懸濁し、３０分間、ローター上で室温でインキュベートした。ファージ溶液を更なる選択解除のために予めブロックしたビーズを含む別のチューブに移した。選択解除は、１ｍｇのビーズで２回、２ｍｇのビーズで１回繰り返した。ファージは予めブロックされたチューブに移され、ビオチン化ＬＭＢ９−ビオチン抗原を添加し、ＬＭＢ９−ビオチンによりファージ−抗原−ビオチン複合体を第一ラウンドで１０μｇ及び続くラウンドで５μｇの量で形成することができるようにした。反応溶液を室温で２時間ローター上でインキュベートし、ロータ上で更なる４５分間のインキュベーションのために２ｍｇのビーズを含むチューブへ移した。上清を除去し、ビーズはＰＢＳＴを用いて１２回洗浄した。ファージは、冷却した０．１ＭのＨＣｌを１μｌの量での添加によってビーズから遊離させ、そのｐＨを２００μｌのトリス塩酸溶液（ｐＨ８．０）で中和した。これがパンニングの出力であり、更なるパニングラウンドのためにレスキューされ力価が算出された。０．６μｌの量の出力ファージは、レスキューのために５ｍｌのＴＧ１（ＯＤ６００＝０．４）を感染させることに用いられた。
【０１８２】
ファージＥＬＩＳＡ及びファージクローンの配列決定：３回又は４回ラウンドのパニング及びファージレスキューの後、パニングの最終ラウンドからの１９８の単一クローンを、更なる分析のために選択した。シグナルクローンは１５０μｌの２ＹＴ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、２％グルコース）を含む丸底９６ウェルプレートへ３７℃で４時間かけて２５０ｒｐｍで振とうしながら移され、３０分放置した後、５０μｌの２ＹＴ培地（１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、２％グルコース）中の１０８ｐｆｕのＭ１３Ｋ０７ヘルプファージを２５０ｒｐｍで振とうしながらウェルに添加した。細胞を９６ウェルプレートの挿入物とともに１０分間２７００ｒｐｍで収集し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０μ／ｍｌのカナマイシンを含む２００μｌの量の２ＹＴ培地中に３０℃で一晩２５０ｒｐｍで振とうしながら再懸濁させた。ペレットを１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、２％グルコース、及び３０％グリセロールを含む１００μｌの２ＹＴ培地に再懸濁し、ストック用に−８０℃で保存した。ファージを１０分間、２７００ｒｐｍでファージＥＬＩＳＡ用に上清から沈殿させた。９６ウェル平底ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート(Nunc USA, Rochester, NY)を４℃で一晩かけてＬＭＢ９（ＰＢＳ中に５μｇ／ｍｌ）でコーティングした。プレートを洗浄し、２％脱脂乳(cell signaling)でブロックした。ファージ（５０μｌ）及び２％ミルク（５０μｌ）を含む上清を添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ結合型抗Ｍ１３（１：１０００、GGE Healthcare, Waukesha, WI）を室温で１時間加えた。プレートを、リン酸緩衝生理食塩水及びＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質(Thermo Scientific, Rockford, IL)を１５分間添加した。結果は４５０ｎｍで分光光度計で読み取り、正と負のクローンを決定した。陽性クローンをストックプレートの適切なウエルから小規模のファージの単離のためにピックアップし、その配列決定は、ＢＩＧＤＹＥターミネーターｖ１．１サイクル配列決定キットを用いて行った(Applied Biosystems, Foster City, CA)。同じ配列を有するクローンを除いて、得られる配列をＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔ(www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)により整列させた。
【０１８３】
競合ＩＣＣ−ＥＬＩＳＡ：ファージ−抗体を２０ｍｌ規模の培養により上記の方法で作製した。ファージ抗体の希釈はＥＬＩＳＡで測定した。２％脱脂乳中に１μｇ／ｍｌのＳＳ１Ｐ抗体の５０μｌ／ウェルを、ＰＢＳ中４μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／ウェルの量のｒＦｃメソテリンで４℃で一晩コーティングしたＥＬＩＳＡプレートに添加した。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、様々な希釈によるファージ−抗体が添加され、ＨＲＰ結合型抗Ｍ１３及びＴＭＢ基質を用いて検出した。ファージ抗体の希釈は、希釈曲線によって測定され、望まれるＡ４５０を約１．０に設定した。競合ＩＣＣ−ＥＬＩＳＡアッセイが、患者の血清、Ｆｖを持たないＰＥ３８、又はＰＥ３８におけるシグナル変異を用いて、ＰＥ３８抗原のファージ−抗体結合エピトープを決定するために行われた。ファージ抗体を４℃で一晩単一変異体の連続希釈液と混合し、ＳＳ１Ｐ-ｒＦＣメソテリン結合ＥＬＩＳＡプレートに添加した。ＳＳ１Ｐに対するファージ抗体の結合についての単一変異体の競合は、ＨＲＰ結合型抗Ｍ１３を用いてファージ抗体の残りの結合を測定することにより決定した。競合効果は、ＰＥ３８が置換を欠いているＨＡ２２−ＬＲへの結合に対して正規化された。
【０１８４】
血清の抗原性：ヒト血清中の抗体に対するＨＡ２２又は置換されたＨＡ２２の結合を置換アッセイにおいて分析した。ヒト血清は、プロトコル１０Ｃ００６６のもとで得られた。メソテリン−ｒＦＣをＥＬＩＳＡプレート（５０μｌのＰＢＳ中に１００ｎｇ／ウェル）に加え、４℃で一晩培養した。洗浄後、抗メソテリン／ＳＳ１Ｐ（５０μｌのブロッキングバッファー中に１００ｎｇ／ウェル）を、結合していないヒト抗ＰＥ３８抗体を捕捉するために１時間加えた。別々のチューブにおいて、血清（９７−３０６５８倍希釈まで）を２μｇ／ｍｌのＨＡ２２又は置換されたＨＡ２２と混合し、４℃で一晩培養した。プレートを洗浄した後、免疫毒素−抗体混合物の５０μｌを各ウェルに移した。ＨＡ２２又は置換されたＨＡ２２と結合していないヒト抗体は、ＳＳ１Ｐによって捕捉され、ＨＲＰ−結合型ウサギ抗ヒトＩｇＧのＦｃ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)、続いてＴＭＢ基質キット(Thermo Scientific Inc., Waltham, MA)により検出された。結合曲線は、４つのパラメトリックロジスティック曲線モデルを用いてＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ４．０ (Molecular Devices）によりフィットさせた。ＩＣ５０値は、ＳＳ１Ｐとの抗体の反応性の５０％を阻害するＲＩＴの濃度を示している。
【０１８５】
統計：マン・ホイットニーノンパラメトリック法を用い；ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。
【０１８６】
実施例１４
この実施例では、ＰＥ３８に特異的なヒトＳｃＦｖの特定の単離及び配列決定を示している。
【０１８７】
血液サンプルは、ＰＥ３８を含む異なる組換え免疫毒素（ＲＩＴ）で処置した６人の患者から得た（表１４）。ＲＮＡは、ＰＡＸＧＥＮＥ血液ＲＮＡキット(PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, Switzerland)を使用して血液サンプルから単離した。第一鎖ｃＤＮＡを適切な定常領域プライマーを用いてＲＮＡから合成した（表１５）。ＶＨ及びＶκｃＤＮＡについて正しいサイズの単一バンドは、鋳型として第一鎖ｃＤＮＡを用いて得られた。ＶＨ及びＶＬ断片は三段階で独立してに増幅された。制限酵素部位及びリンカーを断片に加えた。１００ｎｇのＶＨ及びＶＬ断片を、ｓｃＦｖ形成のためにオーバーラッピングエクステンションポリメラーゼ連鎖反応（ＳＯＥ−ＰＣＲ）によりスプライシングで組み合わされた。ｓｃＦｖ断片をＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、同じ酵素で消化されたｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅにサブクローン化し、ｓｃＦｖライブラリーを構築した。
【０１８８】
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【０１８９】
ビオチン化免疫毒素ＬＭＢ−９（Ｂ３−Ｆｖ−ＰＥ３８）をＰＥ３８に結合しているＦｖを発現するファージを選択するための抗原として用いた。各ＬＭＢ−９分子は、６つのビオチンを含んでいた。６つのヒト抗体ライブラリーを７．３ｘ１０７−１．２７ｘ１０８ＶＨ−ＶＬ ｓｃＦｖクローンを含んでいる大腸菌(E. coli.)ＴＧＩへの電気穿孔によって得た（表１５）。ファージライブラリーは、ヘルパーファージ（表１５）との重複感染によってレスキューされ、３５０ｍｌの各ライブラリーはファージの表面に提示された約７×１０１２のｓｃＦｖ断片を得た。
【０１９０】
７１０のＦｖを含むファージクローンが得られ、配列決定された。配列決定は、同一の軽鎖配列を有していた２つのクローンを除き、１０３のユニークなヒト重鎖及びヒトκ軽鎖配列が存在することを明らかにした。Ｆｖが抗免疫抗体を作製するＢ細胞に由来していることを示すために、競合試験が実施され、免疫抗血清はＬＭＢ−９のＰＥ３８部分へのファージの結合をブロックし、クローンのどれもが免疫毒素のＦｖ部分に結合しないことを示した。次に結合の強さをＩＣＣ−ＥＬＩＳＡを用いて測定した。４７クローンが弱い結合を有しており、更には研究されなかった。他の５６クローンは、ＰＥ３８におけるヒト特異的エピトープを決定するために使用された。
【０１９１】
実施例１５
この実施例では、ヒトＢ細胞エピトープの場所を示す。
【０１９２】
ＬＭＢ−９は、ＰＥのドメインＩＩ及びＩＩＩの両方を含む。ドメインＩＩＩにのみ結合するファージを同定するために、ドメインＩＩＩのみを有しドメインＩＩを欠いているＨＡ２２−ＬＲへの各クローンの結合が測定された。５６ファージクローンのうち１５は、ＨＡ２２−ＬＲに結合することができず、これらの１５のファージクローンによって認識されるエピトープはドメインＩＩに位置していたことを示している。残りの４１個のファージクローンは、ドメインＩＩＩ内のＢ細胞エピトープを構成する残基は、タンパク質のドメインＩＩＩの表面上の個々のアミノ酸が大きな嵩高いアミノ酸からアラニン又はグリシンへと変えられた置換タンパク質へのそれらの結合を測定することによって同定するために使用された。これらの置換は、抗体認識及び結合に関与している大きな嵩高い側鎖を除いた。データを図１０に示し、ここで弱い結合（＜１０％）を有するクローンは、黒いセルで示され、通常の反応性を持つ置換タンパク質は空白のセルで示される。結果は、単一置換は多くのクローンの結合を減少させたことを示しており、従って、それらは同じエピトープ群にあることを示している。
【０１９３】
置換されると様々なエピトープに対して＞９０％ファージ結合を減少させた残基の位置を表１６に示す。各ヒト（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５及びＨ６）及びマウス（２ｃ、４ａ、４ｂ、５、６ａ、６ｂ，及び７）のエピトープと関連するアミノ酸を表１６に示す。ヒトのエピトープＨ１はＤ４０３、Ｒ４２７、及びＥ４３１を含んでいた。Ｒ４２７とＥ４３１は、マウスエピトープ４ａに属しており、これらの残基は、マウス及びヒト抗体の結合の両方に関与していた。ヒトのエピトープＨ２は、マウスのエピトープ２ｃに属している残基Ｒ４６７及びＤ４６３、及びマウスエピトープ６ａに属しているＥ５４８を含んでいた。Ｙ４８１、Ｌ５１６、Ｅ５２２、及びＲ５５１は、ヒト特異的なエピトープであった。ヒトＨ３エピトープは、マウスエピトープ４ｂに属すＲ４５８のみを含んでいた。ヒトのエピトープＨ４はＲ４３２及びＲ５０５を含んでいた。Ｒ４３２は、マウスエピトープ４ａに属しており、Ｒ５０５はヒト特異的な残基であった。ヒトエピトープＨ５は、マウスエピトープ５に属すＲ４９０及びＲ５７６から構成されていた。ヒトのエピトープＨ６はＲ５３８を含んでいた。Ｒ５３８は、マウスエピトープ２ｃに属している。Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ５１３、Ｌ５９７、Ｑ５９２、及びＫ５９０は、マウス特異的エピトープであり、ヒトエピトープの結合には関与していない。
【０１９４】
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【０１９５】
エピトープＨ１と反応するファージクローンは、残基Ｄ４０３、Ｒ４２７、及びＥ４３１での置換により影響を受けた。これらの残基の何れかのアラニンによる置換はエピトープを認識する多くのファージの結合に多大に影響を与えた。エピトープを構成する置換について予想されるように、これらの残基は、ドメインＩＩＩ上で空間的に隣接していた。エピトープＨ２は複雑であった。エピトープＨ２と反応するファージは、８つの残基で置換によって影響を受けた。アラニンでＲ４６７を置換すると、エピトープＨ２を定める８つファージのうちの６つの結合を破壊した。残基Ｄ４６３を置換すると、４つのファージの結合を妨げ、Ｙ４８１を置換すると、３つのファージの結合を妨げ、Ｒ５５１を置換すると、２つのファージの結合を妨げ、そして残基Ｄ４６１、Ｌ５１６、Ｅ５２２、又はＥ５４８を置換すると、１つのファージの結合を妨げた。構造的には、これらの残基は制限された領域に存在し、クラスタを構成していた。エピトープＨ３はＲ４５８に結合する２つのファージによって認識された。エピトープＨ４は１１のファージにより認識され、結合はＲ５０５Ａ置換によって破壊された。Ｒ５０５に近接したＲ４３２での置換は、１１ファージのうち１の結合に影響を与えた。エピトープＨ５は４つのファージにより認識された。４つ全てに対する結合は、Ｒ４９０での置換により影響を受け、Ｒ５７６での置換は４つのファージのうち３つの結合に影響を及ぼした。これらの残基は、それらが配列中で８６個のアミノ酸だけ分離されているにもかかわらずドメインＩＩＩ上で空間的に隣接していた。Ｒ５３８での置換は、２つのファージの１の結合を排除した。要約すると、非常に露出された表面残基のアラニンによる置換は、ドメインＩＩＩに結合するファージに結合する残基を同定し、エピトープは、ドメインＩＩＩの表面上の異なる部位に位置していることを示している。
【０１９６】
実施例１６
この実施例は、ヒトの低抗原性組換え免疫毒素（ＲＩＴ）の産生を示している。
【０１９７】
ヒトの抗血清に対する結合に関与している個々の残基の同定は、ヒト抗血清との反応性を断ち切るが、なお細胞傷害活性を保持し、かつ有用であるのに十分な量で生成することができる、置換を伴った免疫毒素を設計し構築するために用いられた。ほとんどの場合、小さな側鎖は抗体との反応は弱く、通常、タンパク質のフォールディングに影響を与えないため、残基はアラニンで置換された。セリンはまた、特に疎水性表面を実質的に避けるために使用した。
【０１９８】
エピトープマッピング研究における情報に基づいて、ＨＡ２２−ＬＲのドメインＩＩＩに対するヒトＦｖの結合を破壊する異なるアミノ酸から選択される置換を組み合わせた。その置換を下の表１７に示す。ＬＲ０５は、ＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍに存在する全ての置換及び４つの新しい置換を有しており、ＬＲ０６は、ＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍからのわずか２つの置換及び４つの新しい置換を有しており、そしてＬＯ１０はＬＲ０６様であったが、更なる４６３Ａ置換を有していた（表１７）。
【０１９９】
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【０２００】
置換タンパク質を発現させ、精製した。ＳＤＳゲル分析は、置換されたタンパク質は９５％以上均質であることを示した。精製されたタンパク質は、その後、幾つかのＣＤ２２陽性細胞株で細胞傷害活性について、及びＰＥ３８を含む免疫毒素に対する中和抗体を作成した患者の血清中に存在する抗体に結合するそれらの能力の観点における抗原性について分析された。幾つかの異なる免疫毒素（ＬＭＢ−９、ＳＳ１Ｐ及びＨＡ２２）を受けていた患者から２５の血清を分析した。
【０２０１】
表１９のデータは、３つ全ての新しい免疫毒素は、ＣＤ２２陽性リンパ腫株において約１ｎｇ／ｍｌでＩＣ５０を示し活性であるが、ＨＡ２２−ＬＲよりも活性が低いことを示している。最も活性なのはＨＡ２２−ＬＯ１０であり、それはＤａｕｄｉ細胞においてＨＡ２２−ＬＲの６０％の活性、Ｒａｊｉ細胞において２７％の活性、ＣＡ４６細胞において２９％の活性であった。これらの新しい免疫毒素は、ＣＤ２２に特異的であり、ＣＤ２２を発現しないＡ４３１細胞において活性を持たなかった（表１９）。
【０２０２】
2014523237.tif 000028
【０２０３】
抗原性は、既存の抗体に対する免疫原の結合として定義される。置換されたＨＡ２２−ＬＯのヒト血清による抗原性を評価するために、ＨＡ２２と反応する抗体のレベルを５０％減少させる置換された免疫毒素の各濃度を測定する競合実験を行った。２人の患者血清を用いた典型的な競合の結果を図１１Ａと図１１Ｂに示す。図１１Ａは、ＰＥ３８に対する結合が５０％阻害されたＨＡ２２、ＨＡ２２−ＬＲ、ＨＡ２２−ＬＯ５、ＨＡ２２−ＬＯ６、ＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍ，及びＨＡ２２−ＬＯ１０の濃度（ＩＣ５０）は、それぞれ８４．８、３８．１、４５８０、１４４０、３６１０、＞３９６０００ｎＭであったことを示している。ＨＡ２２のＨＡ２２−ＬＲ、ＨＡ２２−ＬＯ５、ＨＡ２２−ＬＯ６、ＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍ、及びＨＡ２２−ＬＯ１０に対する結合（ＩＣ５０）の比は、それぞれ２２３、１．８５、５．８９、２．３５，及び＜０．０２１４％であった。図１１Ｂは、ＰＥ３８に対する結合が５０％阻害されたＨＡ２２、ＨＡ２２−ＬＲ、ＨＡ２２−ＬＯ５、ＨＡ２２−ＬＯ６、ＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍ，及びＨＡ２２−ＬＯ１０の濃度（ＩＣ５０）は、それぞれ５０．９、６７７００、＞３９６０００、＞３９６０００、＞３９６０００、＞３９６０００ｎＭであったことを示している。ＨＡ２２のＨＡ２２−ＬＲ、ＨＡ２２−ＬＯ５、ＨＡ２２−ＬＯ６、ＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍ、及びＨＡ２２−ＬＯ１０に対する結合（ＩＣ５０）の比は、０．７５２、＜０．０１２９、＜０．０１２９、＜０．０１２９、及び＜０．０１２９％であった。
【０２０４】
免疫毒素のＳＳ１Ｐ、ＨＡ２２、及びＬＭＢ９を含むＰＥ３８により１０年以上治療を受けた３２人の患者からの総血清を分析した。置換された免疫毒素を用いた結合率を表２０に示す。ヒト血清によるＨＡ２２−ＬＲ−ＬＯ１０の抗原性は、ＨＡ２２、ＨＡ２２−ＬＲ、及びＨＡ２２−ＬＲ８Ｍと比べて実質的に減少することが見いだされた。図１２は、ＰＥ３８を用いて治療された患者の血清において、ＨＡ２２、ＨＡ２２−ＬＲ−８Ｍ、ＨＡ２２−ＬＲＬＯ１０，又はＨＡ２２−ＬＲ−ＬＯ１０Ｒに対する抗体の結合の割合を示すグラフである。ＨＡ２２−ＬＲ−ＬＯ１０Ｒは、ＨＡ２２−ＬＲ−ＬＯ１０ＲがＨＡ２２−ＬＯ１０に存在しているＲ４５８Ａ置換を欠いている点を除いてＨＡ２２−ＬＯ１０に似ている（表１７及び１８）。図１２は、３２人の患者のうち２３人が、１００倍以上（１００〜１００００倍）減少した結合（抗原性）を実証したことを示している。３２人の患者のうち４人においてのみ抗原性の低下を検出することができなかった。
【０２０５】
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【０２０６】
刊行物、特許出願、及び特許を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、各参考文献が、参照により援用されることを個別かつ具体的に示されているかのように、及びその全体が本明細書に記載されるかのように、本明細書に参考として同程度に援用される。
【０２０７】
用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示対象の使用は、本発明を説明することに関連して（特に以下の特許請求の範囲との関連において）、本明細書に示されない限り又は文脈により明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方に及ぶものと解釈されるべきである。用語「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含む(containing)」は、特に断りのない限り制限の無い用語（即ち、「含むが、これらに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において他に示されていなければ、その範囲内の各々別個の値に対して個々に言及することの略記方法として役立つことが単に意図され、各々別個の値は、それが本明細書に個々に記載されているかのように本明細書に含まれるものである。本明細書で記載される方法の全ては、本明細書において他に示されていなければ、又は、文脈によって明確に否定されなければ、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書で提供される任意の、及び全ての実施例、又は例示的言葉（例えば、「等の」）の使用は、本発明をより明らかにすることが単に意図され、他に特許請求されていなければ、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書の如何なる言葉も、本発明の実施に必須なものとして特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【０２０８】
本発明を実施するための本発明者らが知っている最良の形態を含む、本発明の好適な実施態様を本明細書で記載する。前述の説明を読めば、それらの好適な実施態様のバリエーションが当業者に明白となるであろう。本発明者らは、当業者が適宜このようなバリエーションを用いることを予測し、本発明者らは、本発明が、本明細書に具体的に記載されたものとは異なるやり方で実施されることを意図する。そのため、本発明は、適用法によって容認されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載の主題の全ての改変及び均等物を含むものである。更に、本明細書で違うように記載されていないか、または文脈によって違うように明瞭に否定されていなければ、その全ての可能なバリエーション中の上記要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月10日(2014.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列が、アミノ酸残基Ｒ３０２のアラニンの置換を含む場合、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、及びＬ２９９の少なくとも一つが置換されていることを条件とし、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２のうちの一以上の置換を有するアミノ酸配列を含むシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）であって、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２は配列番号１を参照することによって定義され、任意で配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープのうちに一以上のアミノ酸残基の置換を有し、及び／又は配列番号１のアミノ酸残基のＲ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６，及びＷ５５８のうちの一以上のＴ細胞エピトープのうちに一以上のアミノ酸残基の置換を有するシュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）。
【請求項２】
アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９，及びＲ３０２の一以上の置換が、アミノ酸残基Ｌ２９４、Ｌ２９７、Ｙ２９８、Ｌ２９９、及びＲ３０２の一以上の代わりに、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンの置換である、請求項１に記載のＰＥ。
【請求項３】
ＰＥがＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号３）を含まずに、及びＸ５がアラニンである場合、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４の少なくとも一はアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンであることを条件として、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ４が、独立してロイシン、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンであり、
Ｘ３は、チロシン、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンであり、及び
Ｘ５は、アルギニン、アラニン、グリシン、セリン、グルタミンである、
Ｘ１ＶＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＡＸ５ＬＳＷ（配列番号２）を含む、請求項１又は２に記載のＰＥ。
【請求項４】
ＰＥが、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換を有する、請求項１から３の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項５】
アミノ酸残基Ｅ２８２、Ｅ２８５、Ｐ２９０、Ｒ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１、Ｑ３３２、Ｄ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｄ４６３、Ｒ４６７、Ｙ４８１、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｌ５１６、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｒ５７６、Ｋ５９０、Ｑ５９２、及びＬ５９７が配列番号１を参照することにより定義され、
ＰＥが、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換を有し、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換が、アミノ酸残基Ｅ２８２、Ｅ２８５、Ｐ２９０、Ｒ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１、Ｑ３３２、Ｄ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｄ４６３、Ｒ４６７、Ｙ４８１、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｌ５１６、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｒ５７６、Ｋ５９０、Ｑ５９２、及びＬ５９７の一以上の代わりに、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換である、請求項１から４の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項６】
配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換が、アミノ酸残基のＤ４０６、Ｒ４３２、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５１３、Ｅ５４８、Ｋ５９０、及びＱ５９２一以上の代わりにアラニン、グリシン、又はセリンの置換である、請求項５に記載のＰＥ。
【請求項７】
一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の更なる置換は、アミノ酸残基Ｒ４２７、Ｒ４５８、Ｄ４６３、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、及びＲ５３８の一以上の代わりに、独立してアラニン、グリシン、又はセリンの置換である、請求項５に記載のＰＥ。
【請求項８】
ＰＥが、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換を有し、及び配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換が、アミノ酸残基Ｒ４９０の代わりに、バリン、ロイシン、又はイソロイシンの置換であり、アミノ酸残基Ｒ４９０が、配列番号１を参照することによって定義される、請求項１から３の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項９】
ＰＥが配列番号１の一以上のＴ細胞エピトープ内に一以上のアミノ酸残基の置換を有し、配列番号１の一以上のＴ細胞エピトープ内のアミノ酸残基の置換が、アミノ酸残基Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、Ｙ４７０、Ｉ４７１、Ａ４７２、Ｐ４７５、Ａ４７６、Ｌ４７７、Ｉ４９３、Ｒ４９４、Ｎ４９５、Ｌ４９８、Ｌ４９９、Ｒ５００、Ｖ５０１、Ｙ５０２、Ｖ５０３、Ｒ５０５、Ｌ５０８、Ｐ５０９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８の一以上の置換である、請求項１から８の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項１０】
配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の置換が、
（ａ）アミノ酸残基Ｄ４０６のアラニンの置換；
（ｂ）アミノ酸残基Ｒ４３２のグリシンの置換；
（ｃ）アミノ酸残基Ｒ４６７のアラニンの置換；
（ｄ）アミノ酸残基Ｒ４９０のアラニンの置換；
（ｅ）アミノ酸残基Ｒ５１３のアラニンの置換；
（ｆ）アミノ酸残基Ｅ５４８のセリンの置換；
（ｇ）アミノ酸残基Ｋ５９０のセリンの置換；及び
（ｈ）アミノ酸残基Ｑ５９２のアラニンの置換である
請求項６に記載のＰＥ。
【請求項１１】
位置５１６でアミノ酸残基がアラニンと置換されるとき、アミノ酸残基Ｄ４６３及びＹ４８１の少なくとも一もまた置換されることを条件として、配列番号１を参照することによって定義されるアミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１，及びＬ５１６の一以上の置換を有するＰＥのアミノ酸配列を含み、
ＰＥが任意で、一以上のＢ細胞エピトープ内に一以上のアミノ酸残基の更なる置換、及び／又は一以上のＴ細胞エピトープ内に一以上のアミノ酸残基の更なる置換、及び／又は配列番号１により定義される残基１〜２７３及び２８５〜３９４の一以上の連続するアミノ酸残基の欠失を有する、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）。
【請求項１２】
ＰＥが、一以上のＢ細胞エピトープ内にアミノ酸残基の更なる置換を有し、及び一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の更なる置換が、配列番号１を参照することにより定義されるアミノ酸残基Ｅ２８２、Ｅ２８５、Ｐ２９０、Ｒ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１、Ｑ３３２、Ｄ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｒ５７６、Ｋ５９０、Ｑ５９２，及びＬ５９７の一以上の置換である、請求項１１に記載のＰＥ。
【請求項１３】
アミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１、及びＬ５１６の一以上の置換が、アミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１、及びＬ５１６の一以上の代わりに、独立して、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンの置換である、請求項１２に記載のＰＥ。
【請求項１４】
一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の更なる置換は，アミノ酸残基Ｒ４２７、Ｒ４５８、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、及びＲ５３８の一以上の代わりに、独立してアラニン、グリシン、又はセリンの置換である、請求項１２又は１３に記載のＰＥ。
【請求項１５】
配列番号１を参照することによって定義される場合、
アミノ酸残基Ｄ４６３、Ｙ４８１、及びＬ５１６の一以上の置換が、アミノ酸残基Ｄ４６３の代わりにアラニンの置換であり、一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の更なる置換が、
（ａ）アミノ酸残基Ｒ４２７のアラニンの置換；
（ｂ）アミノ酸残基Ｒ４５８のアラニンの置換；
（ｃ）アミノ酸残基Ｒ４６７のアラニンの置換；
（ｄ）アミノ酸残基Ｒ４９０のアラニンの置換；
（ｅ）アミノ酸残基Ｒ５０５のアラニンの置換；及び
（ｆ）アミノ酸残基Ｒ５３８アラニンの置換である、
請求項１４に記載のＰＥ。
【請求項１６】
式Ｉを含むアミノ酸配列を含むＰＥであって、
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ここで、
ｍ、ｎ、及びｐは独立して０又は１であり；
ＦＣＳは、配列がフューリンによって切断可能なアミノ酸残基のフューリン切断配列を含み；
Ｒ１は、配列番号１のアミノ酸残基２８５〜２９３の一以上の連続アミノ酸残基を含み；
Ｒ２は、Ｘ１ＶＡＸ２Ｘ３Ｘ４ＡＡＸ５ＬＳＷ（配列番号２）を含み、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ４は、独立してロイシン、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンであり；Ｘ３は、チロシン、アラニン、グリシン、セリン又はグルタミンであり；及びＸ５は、アルギニン、アラニン、グリシン、セリン、グルタミンであり；ＰＥがＬＶＡＬＹＬＡＡＲＬＳＷ（配列番号３）を含まずに、Ｘ５がアラニンである場合、Ｘ１Ｘ２Ｘ３及びＸ４の少なくとも一はアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンであることを条件とし；
Ｒ３は、配列番号１のアミノ酸残基３０６〜３９４の一以上の連続アミノ酸残基を含み；
ＰＥの機能ドメインＩＩＩは配列番号１の残基３９５〜６１３を含み、
任意で、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープのうち一以上のアミノ酸残基の置換、及び／又は配列番号１のアミノ酸残基Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６，及びＷ５５８のうちの一以上のＴ細胞エピトープのうち一以上のアミノ酸残基の置換を有するＰＥ。
【請求項１７】
ＦＣＳが、配列番号１の残基２７４〜２８４を含み、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の任意の置換が、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８２のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換である、請求項１６に記載のＰＥ。
【請求項１８】
ｍが１であり、Ｒ１が、配列番号１の残基２８５−２９３を含み、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の任意の置換が、配列番号１のアミノ酸残基Ｅ２８５及び／又はＰ２９０のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換である、請求項１６又は１７に記載のＰＥ。
【請求項１９】
ｎが１であり、Ｒ３が、配列番号１の残基３０６〜３９４を含み、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の任意の置換が、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３１３、Ｎ３１４、Ｐ３１９、Ｄ３２４、Ｅ３２７、Ｅ３３１、及びＱ３３２のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換を含む、請求項１６から１８の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項２０】
ＰＥの機能ドメインＩＩＩが配列番号１の残基３９５〜６１３を含み、配列番号１の一以上のＢ細胞エピトープ内のアミノ酸の任意の置換が、配列番号１のアミノ酸残基Ｄ４０３、Ｄ４０６、Ｒ４１２、Ｒ４２７、Ｅ４３１、Ｒ４３２、Ｒ４５８、Ｄ４６１、Ｄ４６３、Ｒ４６７、Ｙ４８１、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、Ｌ５１６、Ｅ５２２、Ｒ５３８、Ｅ５４８、Ｒ５５１、Ｒ５７６、Ｋ５９０、Ｑ５９２，及びＬ５９７の一以上のアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換である、請求項１６から１９の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項２１】
ｍ、ｎ、及び／又はｐが０である、請求項１６、１７、及び２０の何れか一項に記載のＰＥ。
【請求項２２】
ここでアミノ酸残基Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８は配列番号１を参照することにより定義され、
位置Ｑ４８５又はＬ５１６でアミノ酸がアラニンと置換されるとき、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で少なくとも一の更なるアミノ酸残基が置換され、及び
位置Ｒ４２７、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、又はＲ５５１でアミノ酸残基がアラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンと置換されるとき、又は位置Ｒ４９０でアミノ酸残基がバリン、ロイシン、又はイソロイシンと置換されるとき、位置Ｒ４２７、Ｒ４６７、Ｒ４９０、Ｒ５０５、Ｒ５１３、又はＲ５５１でアミノ酸残基がアラニン、グリシン、セリンとの置換、又は位置Ｒ４９０でアミノ酸残基がバリン、ロイシン又はイソロイシンとの置換を含まずに、配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で少なくとも一の更なるアミノ酸残基が置換されることを条件として、
配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で一以上のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列を含むＰＥ。
【請求項２３】
配列番号１の位置Ｒ４２１、Ｌ４２２、Ｌ４２３、Ａ４２５、Ｒ４２７、Ｌ４２９、Ｙ４３９、Ｈ４４０、Ｆ４４３、Ｌ４４４、Ａ４４６、Ａ４４７、Ｉ４５０、４６３−５１９、Ｒ５５１、Ｌ５５２、Ｔ５５４、Ｉ５５５、Ｌ５５６、及びＷ５５８で一以上のアミノ酸残基の置換がアミノ酸残基Ｉ４９３、Ｒ４９４、Ｎ４９５、Ｇ４９６、Ｌ４９８、Ｌ４９９、Ｒ５００、Ｖ５０１及びＹ５０２の一以上の代わりに、アラニン、グリシン、セリン、又はグルタミンの置換である、請求項１又は２２に記載のＰＥ。
【請求項２４】
（ｂ）請求項１から２３の何れか一項に記載のＰＥに（ａ）コンジュゲート又は融合した標的化部分を含んでなるキメラ分子。
【請求項２５】
標的化部分がモノクローナル抗体である、請求項２４に記載のキメラ分子。
【請求項２６】
モノクローナル抗体が、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７９ｂ、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体、メソテリン、カドヘリン、及びルイスＹからなる群から選択される細胞表面マーカーに特異的に結合する、請求項２５に記載のキメラ分子。
【請求項２７】
標的化部分が、Ｂ３、ＲＦＢ４、ＳＳ、ＳＳ１、ＭＮ、ＭＢ、ＨＮ１、ＨＮ２、ＨＢ２１、及びＭＯＲＡｂ−００９、及びその抗原結合部分からなる群から選択される抗体である、請求項２５に記載のキメラ分子。
【請求項２８】
標的化部分が、ＨＡ２２の抗原結合部分である、請求項２５に記載のキメラ分子。
【請求項２９】
請求項１から２２の何れか一項に記載のＰＥ又は請求項２４から２８の何れか一項に記載のキメラ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３０】
請求項２９の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項３１】
請求項３０の組換え発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３２】
請求項３１の少なくとも一の宿主細胞を含む細胞の集団。
【請求項３３】
（ａ）請求項１から２２の何れか一項に記載のＰＥ、請求項２４から２８の何れか一項に記載のキメラ分子、請求項２９に記載の核酸、請求項３０に記載の組換え発現ベクター、請求項３１に記載の宿主細胞、又は請求項３２に記載の細胞の集団、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項３４】
癌を治療又は予防するために、請求項１から２３の何れか一項に記載のＰＥ、請求項２４から２８の何れか一項に記載のキメラ分子、請求項２９に記載の核酸、請求項３０に記載の組換え発現ベクター、請求項３１に記載の宿主細胞、又は請求項３２に記載の細胞の集団、又は請求項３３に記載の薬学的組成物を含むＰＥ。
【請求項３５】
標的細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法が、標的細胞の増殖を阻害するために有効な量の請求項１から２３の何れか一項に記載のＰＥ、請求項２４から２８の何れか一項に記載のキメラ分子、請求項２９に記載の核酸、請求項３０に記載の組換え発現ベクター、請求項３１に記載の宿主細胞、又は請求項３２に記載の細胞の集団、又は請求項３３に記載の薬学的組成物と細胞を接触させることを含む方法。
【請求項３６】
標的細胞が癌細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
標的細胞が、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７９ｂ、トランスフェリン受容体、ＥＧＦ受容体、メソテリン、カドヘリン、及びルイスＹからなる群から選択される細胞表面マーカーを発現する、請求項３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）組換え的にＰＥを発現し（ｂ）ＰＥを精製することを含む、請求項１から２３の何れか一項に記載のＰＥを生産する方法。
【請求項３９】
（ａ）組換え的にキメラ分子を発現し（ｂ）キメラ分子を精製することを含む、請求項２４から２８の何れか一項に記載のキメラ分子を生産する方法。
【請求項４０】
（ａ）請求項１から２３の何れか一項に記載のＰＥを組換え的に発現し、（ｂ）ＰＥを精製し、（ｃ）標的化分子を精製されたＰＥに共有結合で連結することを含む、請求項２４から２８の何れか一項に記載のキメラ分子を生産する方法。
【国際調査報告】
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