(57)【要約】  β−除去性リン保護基、特にβ−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去することを含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、好ましくはピリジンから構成されていない溶媒中のアミン溶液に接触させることを含み、前記アミンの共役酸が好ましくは１１．５より大きいｐＫａを有し、前記溶液中の前記アミンの濃度が０．５モル／リットル未満である方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−除去性リン保護基、特にβ−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去することを含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、好ましくはピリジンから構成されていない溶媒中のアミン溶液に接触させることを含み、前記アミンの共役酸が好ましくは１１．５より大きいｐＫａを有し、前記溶液中の前記アミンの濃度が０．５モル／リットル未満である方法。
【請求項２】
β−除去性リン保護基、特にβ−シアノエチル保護基を、保護ＢＮＡ−オリゴヌクレオチド、保護ＬＮＡ−オリゴヌクレオチド、保護ＥＮＡ−オリゴヌクレオチドまたは保護ＵＮＡ−オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むＢＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＵＮＡおよびそれらの誘導体から選択されたオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、好ましくはピリジンから構成されていない溶媒中のアミンに接触させることを含み、前記アミンの共役酸が１１．５より大きいｐＫａを有する方法。
【請求項３】
前記溶液中の前記アミンの濃度が０．０３〜０．２５モル／リットルである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶媒がハロゲン化化合物またはシアノアルキル化合物を含むか、またはハロゲン化化合物またはシアノアルキル化合物から本質的になる請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記溶媒がアセトニトリルを含むか、またはアセトニトリルから本質的になる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドを３〜３６０分の反応時間にわたり前記アミン溶液に接触させる請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記反応時間が３０分未満、好ましくは２０分以下である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記除去を１０℃〜６０℃の温度で実施する請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記保護オリゴヌクレオチドが固体支持体に結合されている請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
アミンが用いられ、前記アミンの共役酸が１１．５超〜１２．５のｐＫａ、好ましくは約１２のｐＫａを有する請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アミンがＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン）である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アミンが用いられ、前記アミンの共役酸が８〜１１．５のｐＫａを有する請求項１または３〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記保護オリゴヌクレオチドに接触させるアミンの全量が、前記アミンと、除去されるべき前記保護基、特にβ−シアノエチル保護基との間のモル比が１以上であるような量である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記保護オリゴヌクレオチドに接触させるアミンの全量が、前記アミンと、脱保護中に除去されるべき前記保護基、特にβ−シアノエチル保護基との間のモル比が０．０１以上および０．９以下、好ましくは約０．１であるような量である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＢＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＵＮＡおよびそれらの誘導体から選択される請求項１または３〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年４月２４日出願の米国仮特許出願第６１／０４７５２４号の利益を主張するものである。これらの明細書の全内容は参照により本明細書に援用される。
本発明はオリゴヌクレオチドの製造方法に関する。オリゴヌクレオチドおよびそれらの誘導体は、例えば、癌治療のために有用な候補薬である。
【背景技術】
【０００２】
β−シアノエチル保護基は、特にアミド亜リン酸エステル法を介したオリゴヌクレオチドの合成中にリン保護基として一般に用いられる。シアノエチル基の脱保護は、最終製品に応じるための一工程である。
米国特許第６，８５８，７１５号明細書および米国特許第７，１９９，２３６号明細書は、β−シアノエチル保護基の脱保護のための方法を記載しており、該方法では、共役酸が約８〜約１１のｐＫａを有するアミンを用いなければならない。これらの明細書の内容は参照により本明細書に援用される。
エリトジャ（Ｅｒｉｔｊａ）らは、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，Ｖｏｌ  ８３（２０００年）ｐ．１４１７〜１４２３で、アセトニトリル中の０．５Ｍ濃縮ＤＢＵ溶液によるβ−シアノエチル保護オリゴヌクレオチドの脱保護を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
核酸塩基、特にチミジンへのシアノエチル付加体の形成を実質的に回避しつつ、例えば、β−シアノエチル保護基の実質的に完全な脱保護を引き起こすために、共役酸が１１．５超、例えば、約１２のｐＫａを有する強塩基さえも特定の条件下で使用可能であることが驚くべきことに今見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
従って、本発明は、β−除去性リン保護基、特にβ−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、好ましくはピリジンから構成されていない溶媒中のアミン溶液に接触させることを含み、前記アミンの共役酸が好ましくは１１．５より大きいｐＫａを有し、前記溶液中の前記アミンの濃度が０．５モル／リットル未満である方法に関する。
本発明による方法が、リン保護オリゴヌクレオチド、特にβ−シアノエチル保護基の高い選択性および収率を伴う特に効率的な脱保護を可能にすることが驚くべきことに見出された。脱保護中の好ましくない副反応を実質的に回避することが可能である。
【０００５】
溶液中のアミンの濃度は０モル／リットルより高い。好ましくは０．０３モル/リットル以上である。溶液中のアミンの濃度は、しばしば０．４モル/リットル以下、好ましくは０．３モル／リットル以下、より好ましくは０．２５モル／リットル以下である。好ましいこうした濃度は、例えば、０．１５モル／リットル以下、または０．１モル／リットル以下であることが可能である。約０．０５モル／リットルのアミン濃度は良好な結果を与える。
保護オリゴヌクレオチドに接触させるアミンの全量は異なることが可能である。一実施形態において、この量は、アミンと、除去されるべき保護基、特にβ−シアノエチル保護基との間のモル比が１以上であるような量である。
別の実施形態において、保護オリゴヌクレオチドに接触させるアミンの全量が、アミンと、除去されるべき保護基、特にβ−シアノエチル保護基との間のモル比が０．０１以上および０．９以下、好ましくは約０．１であるような量である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】実施例１におけるHPLCデータを表す。
【図２】実施例１におけるLC/MSデータを表す。
【図３】実施例２におけるHPLCデータを表す。
【図４】実施例２におけるLC/MSデータを表す。
【図５】実施例３（比較）におけるHPLCデータを表す。
【図６】実施例３（比較）におけるLC/MSデータを表す。
【図７】実施例４におけるHPLCデータを表す。
【図８】実施例５におけるHPLCデータを表す。
【図９】実施例６（比較）におけるLC/MSデータを表す。
【図１０】実施例７におけるLC/MSデータを表す。
【図１１】実施例８（比較）におけるHPLCデータを表す。
【図１２】実施例９におけるHPLCデータを表す。
【図１３】実施例１０（比較）におけるHPLCデータを表す。
【図１４】実施例１１におけるHPLCデータを表す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の枠内の「オリゴヌクレオチド」という用語は、核酸塩基に接続された糖単位を含む、ヌクレオチド間結合によって接続されるヌクレオシドモノマー単位のオリゴマーを特に表わす。「ヌクレオチド間結合」は、自然に見られる核酸中に典型的に存在するホスホジエステル連結または合成核酸および核酸類似体中に典型的に存在する他の連結などの２個のヌクレオシド部分の間の化学連結を特に意味する。こうしたヌクレオチド間結合は、例えば、ホスホ基またはホスフィット基を含んでよく、ホスホ基またはホスフィット基の１個以上の酸素原子が置換基で修飾されているか、または別の原子、例えば、硫黄原子またはモノアルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基の窒素原子で置換されている連結を含んでよい。典型的なヌクレオチド間結合は、リン酸またはその誘導体のジエステル、例えば、ホスフェート、チオホスフェート、ジチオホスフェート、ホスホロアミデート、チオホスホロアミデートである。
【０００８】
「ヌクレオシド」という用語は、糖に接続された核酸塩基からなる化合物を特に表すと理解される。糖は、リボース、２’−デオキシリボースなどのフラノース環およびシクロヘキセニル、アンヒドロヘキシトール、モルホリノなどの非フラノース環を含むが、それらに限定されない。ヌクレオシド中に含まれる糖の以後に示された修飾、置換および位置はフラノース環に関して論じられているが、同じ修飾および位置は他の糖環の類似位置にも当てはまる。糖を追加的に修飾してよい。糖の修飾の非限定的な例として、例えば、水素；ヒドロキシ；メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシなどのアルコキシ；アジド；アミノ；アルキルアミノ；フルオロ；クロロおよびブロモを含むフラノシル糖環の例えば２’−位置または３’−位置、特に２’−位置における修飾、２’−４’−および３’−４’−連結フラノシル糖環修飾、例えば、Ｓ、ＣＨ2、ＮＲ、ＣＨＦまたはＣＦ2による環４’−Ｏのための置換を含むフラノシル糖環における修飾について特に言及することが可能である。
【０００９】
「核酸塩基」という用語は、特に相補的な核酸塩基または核酸塩基類似体と対になることができる特に窒素含有ヘテロ環式部分を表すと理解される。典型的な核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む天然に産出する核酸塩基ならびに５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（擬ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン、およびフッ素化塩基などの他の合成核酸塩基および天然核酸塩基を含む修飾核酸塩基である。更なる修飾核酸塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）―オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などのＧ−クランプが挙げられる。潜在的に適する他の塩基には、万能塩基、疎水性塩基、混合塩基およびサイズ拡大塩基が挙げられる。
【００１０】
本発明による方法において、溶媒は、塩化メチレンまたは１，２−ジクロロエタンなどの、１個または２個の炭素原子を含むクロロアルカンなどのハロゲン化化合物をしばしば含む。塩化メチレンはクロロ溶媒として好ましい。
シアノアルキル化合物を含む溶媒が好ましい。アセトニトリルがシアノアルキル化合物として好ましい。
前述した化合物から本質的になる溶媒が好ましい。より特に、溶媒は、好ましくはアセトニトリルからなる。
【００１１】
本発明において用いられる特定のβ−除去性リン保護基（Ｒt）によって保護されたヌクレオチド間結合は、以下の式Ｉにおいて表されうる。
【化１】
2011521901.tif 000002
式中、各ＸおよびＹは独立してＯ、ＳまたはＮＲであり、
Ｒtは、−Ｃ（Ｒ1）2−Ｃ（Ｒ1）2−ＷまたはＣ（Ｒ1）2−（ＣＨ−ＣＨ）p−Ｃ（Ｒ1）2−Ｗであり、
ここで、各Ｒ1は独立してＨまたはより低級のアルキルであり、Ｗは電子求引基であり、ｐは０〜３である。
特に好ましい実施形態において、β−除去性リン保護基（Ｒt）は、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｃ≡Ｎまたは−ＣＨ2−（ＣＨ＝ＣＨ）ｐ−ＣＨ2−Ｃ≡Ｎ（式中、ｐは１−３の整数である）であり、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｃ≡Ｎまたは−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−Ｃ≡Ｎが好ましく、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｃ≡Ｎが特に好ましい。
【００１２】
本発明による方法の特定の実施形態において、保護オリゴヌクレオチドを少なくとも２００分の反応時間にわたりアミンに接触させる。反応時間は、好ましくは２４０〜６００分、より好ましくは３００〜４００分である。約３６０分の反応時間は所定の良好な結果を有する。
【００１３】
反応時間は、典型的には、保護オリゴヌクレオチドをアミン溶液に接触させる間の時間を表すと理解される。
好ましい別の実施形態において、反応時間は、２００分未満、典型的には１００分以下、より好ましくは３０分以下である。２０分以下の反応時間が、より特に好ましく、１５分以下の反応時間が最も特に好ましい。この好ましい実施形態において、反応時間は、典型的には３分以上であり、より好ましくは６分以上である。
短い反応時間でも非常に効率的な脱保護を達成することが可能であることが驚くべきことに見出された。
【００１４】
本発明による方法の異なる実施形態において、除去は、一般に０〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃の温度で行われる。約２０〜３０℃の温度は所定の良好な結果を有する。
【００１５】
本発明による方法において、保護オリゴヌクレオチドは、例えば、保護ヌクレオチドの溶液相カップリングまたは好ましくは固相カップリングによって得ることが可能である。上述した保護オリゴヌクレオチドを提供するカップリング技術はそれ自体知られている。
【００１６】
本発明による方法の異なる実施形態において、保護オリゴヌクレオチドは、好ましくは固体支持体に結合される。「固体支持体」は、オリゴヌクレオチドの合成が上で起きるあらゆる粒子、ビードまたは表面を特に表す。本発明による方法の異なる実施形態において使用できる固体支持体は、例えば、無機支持体および有機支持体から選択される。無機支持体は、好ましくは、シリカゲルおよび制御された細孔ガラス（ＣＰＧ）から選択される。有機支持体は、好ましくは、高度架橋ポリスチレン、テンタゲル（ポリエチレングリコール（ＰＥＧまたはＰＯＥ）が上にグラフトされている低架橋ポリスチレンマトリックスからなるグラフトコポリマー）、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、ポリスチレン／ジビニルベンゼンの有孔−コポリマー、アミノポリエチレングリコールおよびセルロースから選択される。固体支持体は、より好ましくは、高度架橋ポリスチレンから選択される。保護オリゴヌクレオチドは、連結によって固体支持体に結合することが可能である。連結は、共有結合、または固体支持体をヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合する原子の鎖を含む化学部分として当該技術分野において知られている。リンカーを介して前もって結合されたヌクレオシドを保有するいわゆる「標準固体支持体」は市販されている。このヌクレオシドは、剥離工程および脱保護工程後に最終オリゴヌクレオチドの３’末端残基または５’末端残基になる。本発明のこの実施形態において使用できる適するリンカーは、例えば、スクシニル、カーボネート、カルバメートである。スクシニルリンカーが最も好ましい。標準固体支持体は、３’末端ヌクレオシドまたは５’末端ヌクレオシドをまさに保有する。
【００１７】
３’末端ヌクレオシドまたは５’末端ヌクレオシドを前もって結合していない固体支持体、すなわち、「万能」固体支持体も当該技術分野において知られており、市販されている。これらの支持体は、意図された３’末端ヌクレオシドまたは５’末端ヌクレオシドを結合させていない。それどころか、対応する末端ヌクレオシドまたは残基が第１のサイクルにおいて添加され、よってこのヌクレオシドと万能支持体との間に望ましくないホスフェート連結またはチオホスフェート連結を生じさせる。このアプローチは、剥離工程および／または脱保護工程中に望ましくないホスフェート連結またはチオホスフェート連結を除去することを必要とする。「万能」固体支持体の典型的な例はスキーム１において示されている。
スキーム１
【化２】
2011521901.tif 000003
万能支持体タイプ１
【化３】
2011521901.tif 000004
万能支持体タイプ２
【００１８】
本発明による方法が、支持体からオリゴヌクレオチドを剥離しないリン保護基の選択的な脱保護を可能にすることが驚くべきことに見出された。
【００１９】
この実施形態の特定の態様において、保護オリゴヌクレオチドを含有する固体支持体は、入口開口および出口開口を有するカラムなどの装置に含まれてよい。この実施形態によると、アミン溶液をこうした装置に通すことによりアミンを保護オリゴヌクレオチドに接触させてよい。好ましくは、本方法は、シンセサイザーの吐出ラインの１つを通して溶媒中のアミンを送出するようにプログラムされた市販の自動化シンセサイザーを用いて自動化される。
少なくとも１、しばしば少なくとも２カラム体積の量、最も好ましくは少なくとも５カラム体積の量においてアミン溶液を有利にカラムに通してよい。多くとも１００カラム体積の量、好ましくは多くとも６０カラム体積の量においてアミン溶液を有利にカラムに通してよい。
【００２０】
特定の実施形態において、本発明による方法は以下の工程を含む。
（ａ）固体支持体に結合された保護オリゴヌクレオチドを固相カップリング技術によって合成する。
（ｂ）保護オリゴヌクレオチドを本明細書に記載された通りリン保護基の脱保護に供する。
（ｃ）支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを場合により処理して、そのアミン含有率を削減する。
（ｄ）オリゴヌクレオチドを支持体から剥離する。
【００２１】
工程（ｃ）は、例えば、本明細書に記載された溶媒、特にアセトニトリルによる例えば洗浄操作であることが可能である。工程（ｄ）は、プロトン性塩基溶液または求核性塩基溶液での処理から適切に選択される。適する塩基の例は、水性アンモニア、メチルアミンおよびアンモニア／メチルアミン混合物から選択される。
本発明による方法の異なる実施形態において、アミンが一般に用いられ、その共役酸は１１．５より大きい且つ１２．５以下であるｐＫａを有する。好ましくは、アミンが用いられ、その共役酸は約１２のｐＫａを有する。ｐＫａという用語は、特に２５℃で測定された水溶液中の共役酸の平衡解離定数のマイナス底１０対数として通常定義される。適するこうしたアミンの非限定的な例は、ＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン）、ＤＢＮ（１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノン−５−エン）、ＴＭＧ（テトラメチルグアニジン）、ＴＢＤ（トリアザビシクロデセン）である。適するこうしたアミンの例はＤＢＵ（ジアザビシクロウンデセン）である。ＤＢＵが最も好ましい。
【００２２】
最も好ましい実施形態において、本発明は、β−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、アセトニトリルを含む好ましくは前述した濃度のＤＢＵに接触させることを含む方法に関する。この実施形態において、反応時間は好ましくは上述した通りである。
【００２３】
本発明による方法の異なる実施形態は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＢＮＡ、ＵＮＡおよびそれらの誘導体から選択されたオリゴヌクレオチドの合成に適用することが可能である。ＬＮＡ、ＥＮＡはＢＮＡの典型的な例である。特定のオリゴヌクレオチドの例は、米国特許第６，４５６，６２８号明細書の欄２  １行目〜欄３  １５行目における式のように定義することが可能である。
ＤＮＡは、デオキシリボ核酸単位のポリマーを特に表し、ＲＮＡは、リボ核酸単位のポリマーを特に表し、ＢＮＡは、二環式核酸のポリマーを特に表し、ＬＮＡは、ロックド核酸単位のポリマーを特に表し、ＥＮＡは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン橋架け核酸のポリマーを特に表し、ＵＮＡは、非ロックド核酸のポリマーを特に表す。
【００２４】
本発明において有用な天然に産出する核酸塩基の非限定的な他の例として、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルおよびチミンを挙げることが可能である。天然に産出せず、希に天然に産出する核酸塩基の非限定的な例として、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（擬ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、オキサ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンを挙げることが可能である。
【００２５】
適する核酸塩基保護基は、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキサセチル、アリールオキシアセチル、フタロイル、２−（４−ニトロ−フェニル）エチル、ペント−４−エノイル、ジメチルホルムアミジン（ｄｍｆ）、ジアルキルホルムアミジンおよびジアルキルアセトアミジンのように当業者に知られている。
【００２６】
適する５’−ヒドロキシル保護基には、トリチル基、好ましくはジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）またはモノメトキシトリチル基（ＭＭＴｒ）が挙げられるが、それらに限定されない。適する他の５’−保護基には、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、レブリニル、ベンゾイル、フルオレンメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、９−フェニルチオキサンテン−９−イル（Ｓ−ピキシル）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２７】
ＲＮＡ合成において用いられる適する２’−保護基には、２’−Ｏ−保護基、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、９−フェニルキサンテン−９−イル（Ｐｘ）、９−フェニルチオキサンテン−９−イル（ＳＰｘ）、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｃｔｍｐ）、１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｆｐｍｐ）、［２−（メチルチオ）フェニル］チオメチル（ＭＴＰＭ）、ビス−（アセトキシエチルオキシ）メチルエステル（ＡＣＥ）、（１−メチル−１−メトキシエチル）（ＭＭＥ）、メトキシ（エトキシメチル（ＭＥＭ）、ｐ−ニトロフェニルエチルシルホニル（ＮＰＥＳ）、ｐ−シアノフェニルエチルシルホニル（ＣＰＥＳ）、カルボメトキシエチルスルホニル（ＣＥＭＳ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）および２’シリル含有チオカ−ボネート保護基が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２８】
本発明による方法の異なる実施形態において、保護オリゴヌクレオチドは、一般に、β−シアノエチル保護ホスフェート結合および／またはβ−シアノエチル保護ホスホルチオエート結合および／またはβ−シアノエチル保護ホスホルジチオエート結合および／またはβ−シアノエチル保護ホスホルアミデート結合および／またはβ−シアノエチル保護チオホスホルアミデート結合を含有する。
本発明による方法の好ましい異なる実施形態において、保護オリゴヌクレオチドは、一般に、β−シアノエチル保護ホスフェート結合および／またはβ−シアノエチル保護ホスホルチオエート結合を含有する。
【００２９】
以下において、本発明の方法の特に好ましい特定の幾つかの実施形態が提示される。
【００３０】
本発明の特定の一実施形態は、β−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、上述した濃度のＤＢＵに接触させることを含み、前記オリゴヌクレオチドが固体支持体に結合され、前記溶媒が好ましくはアセトニトリルである方法に関する。
【００３１】
特定の別の実施形態において、本発明は、β−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、上述した濃度のアミンに接触させることを含み、前記アミンの共役酸が１１．５より大きいｐＫａを有し、前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡであるとともに固体支持体に結合されている方法に関する。アミンは好ましくはＤＢＵである。溶媒は好ましくはアセトニトリルである。
【００３２】
特定の別の実施形態において、本発明は、β−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、上述した濃度のアミンに接触させることを含み、前記アミンの共役酸が１１．５より大きいｐＫａを有し、前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡであるとともに固体支持体に結合されている方法に関する。アミンは好ましくはＤＢＵである。ＲＮＡは、好ましくは、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳまたは２’−Ｏ−アルキルＲＮＡである。溶媒は好ましくはアセトニトリルである。
【００３３】
特定のなお別の実施形態において、本発明は、β−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、上述した濃度のアミンに接触させることを含み、前記アミンの共役酸が１１．５より大きいｐＫａを有し、前記オリゴヌクレオチドがＬＮＡであるとともに固体支持体に結合されている方法に関する。アミンは好ましくはＤＢＵである。ＬＮＡは、好ましくは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオチドを含む。溶媒は好ましくはアセトニトリルである。
【００３４】
特定のなお別の実施形態において、本発明は、β−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、上述した濃度のアミンに接触させることを含み、前記アミンの共役酸が１１．５より大きいｐＫａを有し、前記オリゴヌクレオチドがＢＮＡであるとともに固体支持体に結合されている方法に関する。アミンは好ましくはＤＢＵである。ＢＮＡは、好ましくは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−橋架けヌクレオチドを含む。溶媒は好ましくはアセトニトリルである。
【００３５】
特定のなお別の実施形態において、本発明は、β−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、上述した濃度のアミンに接触させることを含み、前記アミンの共役酸が１１．５より大きいｐＫａを有し、前記オリゴヌクレオチドがＥＮＡであるとともに固体支持体に結合されている方法に関する。アミンは好ましくはＤＢＵである。ＥＮＡは、好ましくは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−橋架けヌクレオチドを含む。溶媒は好ましくはアセトニトリルである。
【００３６】
特定のなお別の実施形態において、本発明は、β−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、上述した濃度のアミンに接触させることを含み、前記アミンの共役酸が１１．５より大きいｐＫａを有し、前記オリゴヌクレオチドがＵＮＡであるとともに固体支持体に結合されている方法に関する。アミンは好ましくはＤＢＵである。ＵＮＡは、好ましくは、２’，３’−セコＲＮＡヌクレオチドを含む。溶媒は好ましくはアセトニトリルである。
【００３７】
本発明の特定のまだ別の実施形態は、β−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、上述した濃度のアミンに接触させることを含み、前記アミンの共役酸が１１．５より大きいｐＫａを有し、前記オリゴヌクレオチドが固体支持体に結合され、前記支持されたオリゴヌクレオチドがカラム中に存在し、塩基の溶液を前記カラムに通す方法に関する。アミンは好ましくはＤＢＵである。この実施形態において、溶媒は好ましくはアセトニトリルである。好ましくは、本方法は、カラムを通してアミン溶液を連続的に循環しつつ行われる。
【００３８】
本発明の特定の更なる実施形態は、β−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、上述した濃度のアミンに接触させることを含み、前記アミンの共役酸が１１．５より大きいｐＫａを有し、前記オリゴヌクレオチドが上述した通り固体支持体、特にポリスチレン支持体に結合されている方法に関する。好ましいアミンはＤＢＵであり、好ましい溶媒はアセトニトリルである。
【００３９】
本発明の特定の別の実施形態は、β−シアノエチル保護基を保護オリゴヌクレオチドから除去する工程を少なくとも含むオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、前記除去が、前記保護オリゴヌクレオチドを、上述した濃度のアミンに接触させることを含み、前記アミンの共役酸が１１．５より大きいｐＫａを有し、前記オリゴヌクレオチドが固体支持体に結合され、前記オリゴヌクレオチドが、β−シアノエチル保護ホスフェート、β−シアノエチル保護ホスホルチオエート、β−シアノエチル保護ホスホルジチオエート、β−シアノエチル保護ホスホルアミデート、β−シアノエチル保護チオホスホルアミデートまたはそれらの２つ以上からなる群から選択されたβ−シアノエチル保護基を含む方法に関する。アミンは好ましくはＤＢＵである。溶媒は好ましくはアセトニトリルである。
【００４０】
本発明の方法の利点は、保護基、特にβ−シアノエチル基の効率的な除去を含む。それは、支持体からのオリゴヌクレオチドの剥離を引き起こさずに固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドの処理を可能にする。
【００４１】
前述した説明および以下の実施例がアミン塩基（その共役酸が１１．５より大きいｐＫａを有する）の使用にどうしても引きつけられる一方で、保護オリゴヌクレオチドからの保護基、特にβ−シアノエチル基の除去が、有機溶媒に可溶性の前記濃度の他の有機塩基の溶液を用いることにより、そして本明細書において前述したプロセス条件に従って有利に実施できることが考えられる。こうした他の塩基の例には、例えば、アルキルアミン、特にジエチルアミン、トリエチルアミンまたはピペリジンなどの、その共役酸が８〜１１．５のｐＫａを有するアミンが挙げられる。
以後の実施例は本発明を例示するべく意図されているが、しかし本発明を限定しない。
【実施例】
【００４２】
これらの実施例において用いた略号および本明細書全体を通して用いた略号を次の通り定義する。
ＣＮＥＴ付加体は、合成されたオリゴヌクレオチドのＰ−センターから２−シアノエチル保護基の除去中に発生するアクリロニトリルとの反応から生じるＮ3−シアノエチル修飾チミジンを意味し、ＦＬ３５はＦｉｎｅｌｉｎｅ３５カラムを意味し、ＣＴは接触時間を意味し、ＣＶはカラム体積を意味する。
【００４３】
実施例１
完全に修飾された５’−ｄ（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）−３’ホスホロチオエート２４−マーの合成
上のシーケンス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の合成は、ケムジェネ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）（およびサーモフィッシャー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ））から得られたシアノエチルホスホルアミジトおよび２００μモル／グラムで装填されたジーイープライマー（ＧＥ  Ｐｒｉｍｅｒ）支持体を用いて、３ミリモルの合成規模でＦＬ３５カラムを用いるＡＫＴＡ１００シンセサイザー上で実施した。合成の終わりに、末端５’−Ｏ−保護基４，４−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）を除去した一方で、アミン洗浄の前に、オリゴヌクレオチド製品は固体支持体にまだ結合されていた。１０−６０カラム体積（ＣＶ）の脱シアノエチル用試薬を用い、アセトニトリル中のＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン）の０．０５Ｍ溶液を用いてアミン洗浄を少なくとも２００分にわたり行った。その後、脱シアノエチル化オリゴヌクレオチド製品を合成カラムから除去し、濃縮水性アンモニア（水中の約３０％溶液）により５５℃で１６〜２４時間にわたり処理し、分析用イオン交換ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳによって分析した（図１および２）。
【００４４】
実施例２、３、４および５：すべてのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート連結５’−ｄ（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である修飾２４−マーの合成
一般手順
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のホスホロチオエートの合成は、市販のホスホルアミジトおよび２０６μモル／グラムの装填量を有するＧＥ  Ｐｒｉｍｅｒ支持体を用いて、３ミリモルの合成規模でＦＬ３５カラムを用いるÅＫＴＡ１００シンセサイザー上で実施した。固体支持体上での合成の終わりに、末端５’−Ｏ−４，４−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）保護基をジクロロ酢酸による処理によってカラム上で除去した。その後、固体支持体を乾燥させ、種々のカラム体積（ＣＶ）の脱シアノエチル化試薬を用いて、種々の接触時間で種々の濃度のＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン）溶液を用いる脱シアノエチル化の研究のために１．２ｍｌ固定カラム（０．０５ミリモル規模）または６．３ｍｌ固定カラム（０．２５ミリモル規模）に部分的に再充填した。比較例において、ＤＢＵとの接触を行わなかった。データを表１においてまとめている。すべての実施例に関して、脱シアノエチル化オリゴヌクレオチド製品を濃縮水性アンモニア（水中の約３０重量％溶液）により５５℃で１６時間にわたり処理し、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳによって分析した。
【００４５】
【表１】
2011521901.tif 000005
（ａ）ＣＴ＝接触時間、（ｂ）ＣＶ＝カラム体積
【００４６】
ＨＰＬＣデータおよびＬＣ−ＭＳデータを図３および４に示している。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を２７．１７４分で溶離し、ＣＮＥＴ付加体を２８．４６４分で溶離する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は７６９８Ｄａの理論ＭＷを有し、ＣＮＥＴ付加体は７７５１Ｄａの理論ＭＷを有する。
【００４７】
実施例６および７：すべてのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート連結５’−ＣｃＡ  ｔｔＧ  Ｔｃａ  ＣａＣ  ｔＣＣ−３’（大文字ＬＮＡ、小文字ＤＮＡ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である修飾１５−マーの合成
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のホスホロチオエートの合成は、Åｋｔａ１００シンセサイザー上で３．６ミリモル規模でＦＬ３５カラムを用い、そしてジーイープライマー（ＧＥ  Ｐｒｉｍｅｒ）支持体および市販のホスホルアミジトモノマーを用いて実施した。合成の終わりに、末端５’−Ｏ−４，４−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）保護基を除去した一方で、オリゴヌクレオチド製品はまだ固体支持体に結合されていた。その後、固体支持体を乾燥させ、種々のカラム体積（ＣＶ）の脱シアノエチル化試薬を用いて、種々の接触時間で種々の濃度のＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン）溶液を用いる脱シアノエチル化の研究のために１．２ｍｌ固定カラム（０．０５ミリモル規模）または６．３ｍｌ固定カラム（０．２５ミリモル規模）に部分的に再充填した。比較例において、ＤＢＵとの接触を行わなかった。データを表２においてまとめている。すべての実施例に関して、脱シアノエチル化オリゴヌクレオチド製品を濃縮水性アンモニア（水中の約３０％溶液）により５５℃で１６時間にわたり処理し、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳによって分析した。ＬＣ／ＭＳデータを図９に示している。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＣＮＥＴ付加体を同時に溶離する。両方の化合物の同定および定量化をＬＣ／ＭＳによって行った。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２は４９６７Ｄａの理論ＭＷを有する。ＣＮＥＴ付加体は５０２０Ｄａの理論ＭＷを有する。
【００４８】
脱シアノエチル化処理を１ミリモル規模にも広げ、好ましい結果であった（データを示していない）。
【００４９】
【表２】
2011521901.tif 000006
（ａ）ＣＴ＝接触時間、（ｂ）ＣＶ＝カラム体積、（ｃ）ピークの全表面の％
【００５０】
実施例８、９、１０および１１：すべてのヌクレオチド間結合がホスホロチオエート連結５’−ｄ（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ）−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）である修飾２４マーの合成
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のホスホロチオエートの合成は、６．３ｍＬ固定カラムおよびÅｋｔａ１００シンセサイザーならびにそれぞれ０．２１５ミリモルおよび０．１５６ミリモルの規模の市販のホスホルアミジトモノマーを用いて２つの異なる万能支持体（万能支持体タイプ１および２（スキーム１））上で実施した。万能支持体の使用は、３’末端での第１のヌクレオシドの導入のために追加のカップリングを必要とする。合成の終わりに、末端５’−Ｏ−４，４−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）保護基を除去した一方で、オリゴヌクレオチド製品はまだ固体支持体に結合されていた。支持体を真空下で乾燥させ、種々のカラム体積（ＣＶ）の脱シアノエチル化試薬を用いて、種々の接触時間で種々の濃度のＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン）溶液を用いる脱シアノエチル化の研究のために１．２ｍＬ固定カラム（それぞれ０．０４３ミリモルおよび０．０２５ミリモルの規模）に支持体の一部を再充填した。比較例において、ＤＢＵとの接触を行わなかった。データを表３においてまとめている。すべての実施例に関して、支持体の製造業者によって提案された条件に従い脱シアノエチル化オリゴヌクレオチド製品を濃縮水性アンモニア（水中の約３０％溶液）により処理し、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。
【００５１】
【表３】
2011521901.tif 000007
（ａ）ＣＴ＝接触時間、（ｂ）ＣＶ＝カラム体積
【００５２】
図１１において示した通りＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を２６．３８８分で溶離し、ＣＮＥＴ付加体を２７．６６１分で溶離する。
【００５３】
実施例は、本発明による方法が、塩基の非常に低い濃度でさえもリン保護基の効率的で選択的な脱保護を可能にすることを示している。特に、望ましくないＣＥＮＴ付加体の生成を実質的に回避することが可能である。
【図１】
2011521901.tif 000008
【図２】
2011521901.tif 000009
【図３】
2011521901.tif 000010
【図４】
2011521901.tif 000011
【図５】
2011521901.tif 000012
【図６】
2011521901.tif 000013
【図７】
2011521901.tif 000014
【図８】
2011521901.tif 000015
【図９】
2011521901.tif 000016
【図１０】
2011521901.tif 000017
【図１１】
2011521901.tif 000018
【図１２】
2011521901.tif 000019
【図１３】
2011521901.tif 000020
【図１４】
2011521901.tif 000021
【配列表】
2011521901000001.app
【国際調査報告】
2011521901.tif 000022
2011521901.tif 000023
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