(57)【要約】  本発明は、イネいもち病菌由来の新規のビリルビンオキシダーゼ、その調製方法、並びにとりわけビリルビンのアッセイ及び酵素バイオ燃料電池用途へのその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）であって、配列番号１のイネいもち病菌(Magnaporthe oryzae)由来のＢＯＤに対して少なくとも８０％の同一性パーセントを有し、ビリルビンのビリベルジンへの酸化反応を触媒し、４つの銅原子に結合することを特徴とする、精製ビリルビンオキシダーゼ。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３及び配列番号５の精製ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の精製ビリルビンオキシダーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のＢＯＤをコードすることを特徴とする核酸分子。
【請求項４】
配列番号２及び配列番号４から選択される配列である、請求項３に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターによって形質転換されることを特徴とする、請求項１に記載のＢＯＤを発現する宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載のＢＯＤを調製する方法であって、
ａ）請求項６に記載の宿主細胞を準備する工程と、
ｂ）工程ａ）で準備した前記宿主細胞を培養する工程と、
ｃ）タンパク質が分泌された又は前記宿主細胞が溶解した場合に、培養培地を回収するとともに、前記宿主細胞を取り除く工程と、
ｄ）工程ｃ）で得られた前記培地又は溶解物を疎水性相互作用クロマトグラフィによって処理する工程と、
ｅ）前記精製ＢＯＤを回収する工程と、
を含み、工程ａ）で準備した前記宿主細胞がｐＦＤ５５ベクターによって形質転換されたピキア・パストリス(Pichia pastoris)酵母株であり、前記ＢＯＤの発現がメタノールの添加によって誘導されることを特徴とする、方法。
【請求項８】
液体試料中のビリルビン濃度の測定のための請求項１又は２に記載のＢＯＤの使用。
【請求項９】
請求項１又は２に記載のＢＯＤを含むことを特徴とするビリルビンアッセイキット。
【請求項１０】
流体試料の溶液中のビリルビンを化学分析する方法であって、
ａ）酵素反応の前にλｍａｘ＝４４０ｎｍでの前記流体試料の吸光度を測定する工程と、
ｂ）請求項１又は２に記載のＢＯＤを前記流体試料に導入する工程と、
ｃ）酵素反応の後にλｍａｘ＝４４０ｎｍでの前記流体試料の吸光度を測定する工程と、
ｄ）工程ａ）で測定された吸光度と、工程ｃ）で測定された吸光度との差を算出するとともに、該差をビリルビン含有量が既知の標準溶液で測定された吸光度の差と比較する工程と、
ｅ）前記流体試料中の前記ビリルビンの濃度を決定する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１１】
試料中に存在するビリルビンの分解のための請求項１又は２に記載のＢＯＤの使用。
【請求項１２】
食品の安定性及び／又は品質の改善のための請求項１又は２に記載のＢＯＤの使用。
【請求項１３】
有機合成用の試薬としての請求項１又は２に記載のＢＯＤの使用。
【請求項１４】
廃水の脱色及び／又は無毒化のための請求項１又は２に記載のＢＯＤの使用。
【請求項１５】
紙パルプの漂白及び／又は脱リグニン化のための請求項１又は２に記載のＢＯＤの使用。
【請求項１６】
工業用溶剤に使用される染料の漂白のための請求項１又は２に記載のＢＯＤの使用。
【請求項１７】
少なくとも１つの請求項１又は２に記載のＢＯＤを含む被覆材で覆われている導電性材料を含む、ＢＯＤ電極。
【請求項１８】
請求項１７に記載の電極で構成されることを特徴とする、ビリルビンバイオセンサー。
【請求項１９】
請求項１７に記載の電極で構成されることを特徴とする、酸素センサー。
【請求項２０】
酸化反応を触媒する酵素が上に固定されているアノードと、カソードとしての請求項１７に記載の電極とを含む、酵素バイオ燃料電池。
【請求項２１】
請求項１９に記載の酸素センサーを用いて糖化ヘモグロビンを化学分析する方法であって、
ａ）標準緩衝溶液中の遊離酸素を測定する工程と、
ｂ）血液試料中の遊離酸素を測定する工程と、
ｃ）工程ａ）で行われた測定と、工程ｂ）で行われた測定とを比較するとともに、前記血液試料中のヘモグロビン含有量を推測する工程と、
ｄ）前記血液試料から前記糖化ヘモグロビンを抽出する工程と、
ｅ）工程ｄ）で得られた血液試料中の遊離酸素を測定する工程と、
ｆ）工程ｂ）で行われた測定と、工程ｃ）で行われた測定とを比較するとともに、前記血液試料中の糖化ヘモグロビン含有量を推測する工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のビリルビンオキシダーゼ、その調製方法、並びにとりわけビリルビンの決定及び燃料として酸素を使用する酵素バイオ燃料電池用途へのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビリルビンオキシダーゼすなわちＢＯＤ（Ｅ．Ｃ．  １．３．３．５）は、ビリルビンをビリベルジンへと酸化する反応：
ビリルビン＋１／２Ｏ２→ビリベルジン＋Ｈ２Ｏ
を触媒する酵素である。
【０００３】
ＢＯＤは、銅原子結合部位を４つ有する。これらの４つの銅原子は、この酵素の適切な活性のために必要である。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のＣｏｔＡタンパク質（Genzyme Diagnostics社によってＢＯＤとして販売されているビリルビンオキシダーゼ活性を有するタンパク質）における１つの銅の欠失がこの酵素の活性を低減させるのに十分であることが、実際に示されている（非特許文献１の論文の表３）。ＢＯＤに存在するように酵素の配列に４つの銅イオン結合部位が存在することでは、その酵素活性を推測することができず、実際にこのような部位を有するという共通の特徴がある様々な酵素（例えばラッカーゼ等）が存在することに留意されたい。
【０００４】
ビリルビンは、ヘモグロビンの分解によって血液中に形成される黄色の物質である。ビリルビンは、肝臓で生成される主要な色素の１つである。
【０００５】
ＢＯＤは、例えばビリルビンの決定等の様々な用途において関心が持たれており、例えば血液中の過剰のビリルビンを診断することを可能とする。ＢＯＤは、ＢＯＤがカソードの電子を捕捉して酸素を水へと還元する酵素バイオ燃料電池（図１Ａの、ＢＯＤがレドックスポリマー中でカソードに固定されている酵素バイオ燃料電池の概略図を参照されたい）を調製するのに、又は酸素バイオセンサーとして使用することもできる。
【０００６】
ＢＯＤの供給源が数多く存在する。この酵素は、バチルス（Bacillus）属の微生物等の微生物［ＣｏｔＡがビリルビンオキシダーゼ活性を有するバチルス・サブチリス（非特許文献２を参照されたい）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）（特許文献１）］によって、又は真菌（mycetes）、その中でもペニシリウム属（Penicillium）［ペニシリウム・ヤンシネルム（Penicillium janthinellum）（特許文献２）］、エビタケ属（Trachyderma）（特許文献３）、ミロセシウム属（Myrothecium）（非特許文献３）、若しくはスエヒロタケ属（Schizophyllum）、ヒトヨタケ属（Coprinus）、ホウロクタケ属（Trametes）、カワラタケ属（Coriolus）、スギタケ属（Pholiota）、ヒラタケ属（Pleurotus）、カイガラタケ属（Lenzites）若しくはツガサルノコシカケ属（Fomitopsis）（特許文献４）の真菌によって、産生され得る。
【０００７】
この酵素は、ウマゴヤシ属（Alfalfa）（特許文献５）、ナス科（Solanaceae）、バショウ科（Musaceae）及びユリ科（Liliaceae）（特許文献６）、又は他にはキク科（Compositae）、例えばアーティチョーク（特許文献７）等の植物から抽出することもできる。
【０００８】
これらの酵素の中でも、最も有利な酵素特性、特に活性及び安定性を示すＢＯＤが選択され上市されている。これらは、バチルス・サブチリス由来のビリルビンオキシダーゼ活性を有するＣｏｔＡ（Genzyme Diagnostics社によってＢＯＤとして販売されており、以降ＢＯＤと称する）、及びミロセシウム・ベルカリア（Myrothecium verrucaria）由来のＢＯＤ（Sigma-Aldrich社及びAmano社によって販売されている）である。
【０００９】
ここで本発明者らは、酸性ｐＨ（５未満）、とりわけ５０℃未満の温度で市販のＢＯＤよりもはるかに活性の高い、イネいもち病菌（Magnaporthe oryzae）によって産生される新規のＢＯＤを特定している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第４，７７０，９９７号
【特許文献２】欧州特許出願公開第０２９５１０１号
【特許文献３】米国特許第４，６００，６８９号
【特許文献４】米国特許第４，６７７，０６２号
【特許文献５】米国特許第５，６２４，８１１号
【特許文献６】欧州特許第０１４０００４号
【特許文献７】欧州特許第０２４７８４６号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Durao et al. in J Biol Inorg Chem. 2008 Feb; 13(2): 183-93
【非特許文献２】Sakasegawa et al. 2006 Applied and Environmental Microbiology 72, No. 1, 972-975
【非特許文献３】Tanaka et al. 1982 Agric. Biol. Chem. 46, 2499-2503
【発明の概要】
【００１２】
第１の目的によれば、本発明は配列番号１のイネいもち病菌由来のＢＯＤに関する。この酵素は、タンパク質のＮ末端に位置する２４個のアミノ酸を除き、イネいもち病菌のゲノムのシークエンシングから推測される予測タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースにおいてアクセッション番号Ａ４ＱＶ２７を有する遺伝子に基づき翻訳される。この完全な遺伝子は配列番号２の配列を有する）に相当するものである。とりわけ、本発明による精製ビリルビンオキシダーゼ（純度９５％超）は、配列番号１のイネいもち病菌由来のＢＯＤに対して少なくとも８０％の同一性パーセント、また低い方から順に少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％及び９９％の同一性を有する。本発明による精製ビリルビンオキシダーゼは、ビリルビンのビリベルジンへの酸化反応を触媒するとともに、４つの銅原子に結合する。配列番号４の核酸配列（Ｎ末端に位置する２４個のアミノ酸をコードする断片を除く配列番号２に相当する）はこの配列番号１のＢＯＤをコードするものである。
【００１３】
配列番号３のＢＯＤも本発明の目的とするものの一つである。配列番号３のＢＯＤは、Ｎ末端位置に更なるアミノ酸、セリンを含むという点で配列番号１のＢＯＤとは異なる。このＢＯＤは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）酵母においてｐＦＤ５５発現ベクターにクローニングされている配列番号４の核酸分子を発現することによって得られ、その構造はＮ末端位置に更なるセリンを有するタンパク質の発現が可能となるようなものである。
【００１４】
配列番号２によってコードされるポリペプチドに相当するものであり、Ｎ末端の２４個のアミノ酸を含む、配列番号５のＢＯＤも本発明の目的とするものの一つである。
【００１５】
概して本発明者らは、Ｎ末端に導入される配列修飾は、Ｎ末端内でのアミノ酸の付加若しくは置換、欠失、又は挿入にかかわらず、配列番号１との少なくとも８０％、好ましくは９０％の同一性を維持する限りにおいて、本発明によるＢＯＤの酵素特性に影響を与えなかったことを見出した。
【００１６】
基準配列としてのイネいもち病菌由来のＢＯＤの配列（配列番号１）に対する配列の同一性は、２つの配列の間で最大の一致が得られるように２つの配列を整列させた場合に、同一であるアミノ酸残基のパーセントによって評価される。
【００１７】
当業者は、同一性パーセントを、配列比較ソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ一式（Altschul et al., NAR, 25, 3389-3402）を使用して算出することができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、基準配列として示される配列番号２の全体からなる比較ウインドウに対して実行される。
【００１８】
基準配列と少なくともＸ％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明においては、配列が、上記基準ペプチドの機能特性（本件ではそのビリルビン酸化酵素活性）を保持しながら、基準配列のアミノ酸１００個当たり最大１００−Ｘ個の変化を含み得るペプチドと定義される。本発明における意味において、「変化」という用語は、基準配列におけるアミノ酸の連続又は分散した欠失、置換又は挿入を含む。
【００１９】
イネいもち病菌のゲノムの系統的シークエンシングから予測される配列番号５のタンパク質配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（アクセッション番号Ａ４ＱＶ２７）に記載されている。Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースで与えられている情報は、予測推定されるものであり、イネいもち病菌のタンパク質の単離及び実験的特性評価によるものではないことを強調する。その上、この予測タンパク質に関して、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースには任意の特定の酵素活性は示されていない。
【００２０】
新規の本発明によるＢＯＤは、ミロセシウム・ベルカリア又はバチルス・サブチリス由来の市販のＢＯＤに対して改善した特性を有する。
【００２１】
とりわけ、イネいもち病菌由来のＢＯＤは、バチルス・サブチリス由来のＢＯＤよりも優れた、或る特定の物質の酸化触媒の酵素特性（活性、触媒効率ｋｃａｔ及び基質の酵素に対する親和性ＫＭ）を示す（下記の実験の項を参照されたい）。
【００２２】
以下の表Ｉに、バチルス・サブチリス（B. subtilis）及びイネいもち病菌由来のＢＯＤに関する、触媒効率ｋｃａｔ、すなわち単位時間当たり酵素１分子に付き生成物へと変換される基質の分子の数、及び基質（ＡＢＴＳ）の親和性を表すミカエリス定数ＫＭを示している。
【００２３】
【表１】
2014523235.tif 000002
【００２４】
Kataoka et al. (2005, Protein Expression and Purification, 41, 77-83)によってミロセシウム・ベルカリア（M. verrucaria）由来のＢＯＤについて記載されたｐＨ６．５での酵素特性は、ｋｃａｔが１１５ｓ−１及びＫＭが２５０μＭである。さらに、イネいもち病菌由来のＢＯＤもビリルビンの酸化の良好な酵素特性を示す。
【００２５】
本発明は、本発明によるＢＯＤをコードする核酸分子にも関する。好ましくは、該核酸分子は配列番号２又は配列番号４から選択される配列の核酸分子である。好ましくは、該配列はタンパク質のＮ末端に位置する最初の２４個のアミノ酸の位置で切断された、イネいもち病菌由来のＢＯＤをコードする配列番号４である。
【００２６】
本発明によるＢＯＤをコードする核酸分子は、プラスミド等の発現ベクターへとクローニングした後、細菌、酵母、又は細胞培養物等の好適な宿主を形質転換することができる。
【００２７】
「発現ベクター」は、発現に不可欠なシグナル、特にプロモーター（構成的プロモーター又は誘導性プロモーター）、リボソーム結合部位、転写終結シグナル、及び任意で抗生物質抵抗性遺伝子等の選択マーカーの間へのコーディングヌクレオチド配列の挿入を可能にする領域を有するベクターを意味する。
【００２８】
本発明は、上記核酸分子を含む発現ベクター、及び上記発現ベクターによって形質転換され、本発明によるＢＯＤを発現する宿主細胞に更に関する。
【００２９】
発現ベクターを、当業者に既知の任意の方法、とりわけ例えばカルシウムイオンの存在下での宿主細胞の膜透過性の変更、又はエレクトロポレーションによって宿主細胞に導入することができる。
【００３０】
本発明によるＢＯＤを発現するように形質転換された宿主細胞の培養後に、該細胞を遠心分離により回収し、溶解することで、上記の本発明によるＢＯＤを含む酵素を放出させることができる。
【００３１】
本発明の好ましい変形形態によれば、本発明によるＢＯＤはピキア・パストリス酵母によって産生される。
【００３２】
ピキア・パストリス酵母の培養培地でのＢＯＤの過剰産生及び分泌を可能にするために、配列番号３の配列のＢＯＤをコードする配列番号４の核酸分子を、酵母ゲノムでの相同組換えによってＡＯＸ１遺伝子の位置に導入する。そのために、ｐＦＤ５５プラスミドを、ｐｍｅＩ酵素を用いた消化によって線形化してから、エレクトロポレーションによって酵母に導入し、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤ培地＋寒天において陽性クローンを選択する。ゼオシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した２００ｍＬのＹＰＤ培地の前培養物に、シャーレ内で単離したクローンを播種する。２２０ｒｐｍ、３０℃で一晩撹拌した後、この前培養物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを２００ｍｌの滅菌水中に取り、存在する全てのグルコースを取り除く。２回目の遠心分離の後、５Ｌ容の三角フラスコ内の１ｍＭのＣｕＳＯ４を含むＭＭＨ培地中の培養物２Ｌに、このペレットを播種する。酵母を２時間、撹拌しながら（２２０ｒｐｍ）、２５℃でインキュベートした後、０.５％メタノールを添加することで、誘導を開始する。この誘導工程を５日間繰り返すことで、最大量の酵素が得られる。
【００３３】
この方法の利用には、特質を制限することなく、下記の材料を使用することが可能である：
ピキア・パストリスでの発現ベクター（ｐＦＤ５５）：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のα因子分泌因子とともに、イネいもち病菌由来のＢＯＤをコードするＤＮＡ配列を含有するとともに、メタノール誘導性プロモーターＡＯＸ１を含有するプラスミドｐＰＩＣＺα；
プロモーターＡＯＸ１と、ペプチドシグナルα因子と、イネいもち病菌由来のＢＯＤをコードするＤＮＡ配列とを含有するｐＦＤ５５ベクター由来のカセットの組込み後の本発明によるＢＯＤの産生に使用されるピキア・パストリスＧＳ１１５酵母株；
培養培地：
富栄養培地ＹＰＤ（酵母用）：
１％酵母エキス
２％バクトペプトン
２％グルコース
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する
最少培地ＭＭＨ（酵母用）：
１．３４％酵母窒素ベース
１％カザミノ酸
０．４％ヒスチジン
４×１０−５％ビオチン
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する
富栄養培地ＬＢ（細菌用）：
トリプトン  １０ｇ／Ｌ
酵母エキス  ５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ
蒸留Ｈ２Ｏ  １Ｌまで適量
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する。
【００３４】
別の変形形態によれば、大腸菌（Escherichia coli）を宿主微生物として選択することができる。その後使用することができるプラスミドは、とりわけプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＧＳ、ｐＭＡＬ−ｃ２等である。
【００３５】
本発明によるＢＯＤの調製のこの変形形態によれば、ＢＯＤは、Ｃ末端位置で６ＨＩＳタグと融合した酵素をコードするｐＥＴ２１ａ発現ベクターによって形質転換された大腸菌（E. coli）細菌によって有利に発現される。
【００３６】
この手法は迅速かつ単純なものであり、実際には大腸菌細菌におけるイネいもち病菌由来のＢＯＤの発現の誘導には、４時間〜２４時間かかる。
【００３７】
さらに、６ＨＩＳタグによって、ニッケル樹脂でのアフィニティクロマトグラフィによりイネいもち病菌由来のＢＯＤを単一段階で精製し、純粋な酵素を得ることが可能となる。
【００３８】
この調製方法の適用に際して、当業者は使用する発現ベクターに応じて宿主細胞を選択する。
【００３９】
好ましくは、ｐＥＴ２１ａ発現ベクターを使用する場合、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞、例えば大腸菌株ＢＬ２１  ＤＥ３、ＢＬ２１−ＳＩ、ＢＬ２１  ｐＬｙｓ、Ｎｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）又はＢＬ２１  Ｓｔａｒが選択される。
【００４０】
本発明は、本発明によるＢＯＤを調製する方法であって、
ａ）本発明によるＢＯＤを発現する宿主細胞を準備する工程と、
ｂ）工程ａ）で準備した宿主細胞を培養する工程と、
ｃ）培養培地を回収するとともに、例えば遠心分離によって宿主細胞を取り除く工程と、
ｄ）工程ｃ）で得られた培養培地を疎水性相互作用クロマトグラフィによって処理する工程と、
ｅ）上記精製ＢＯＤを回収する工程と、
含む、方法にも関する。
【００４１】
好ましい実施の形態によれば、本発明による方法は下記のようなものである：
使用するピキア・パストリス酵母株がＧＳ１１５株であり、
ピキア・パストリスでの発現ベクター（ｐＦＤ５５）が、サッカロミセス・セレビシエのα因子分泌因子とともに、イネいもち病菌由来のＢＯＤをコードするＤＮＡ配列を含有するとともに、メタノール誘導性プロモーターＡＯＸ１を含有するプラスミドｐＰＩＣＺαであり、
工程ｂ）で行われる培養が１８℃〜３７℃、好ましくは２５℃の温度で撹拌しながらの少なくとも１回の液相培養工程を含み、その間にＢＯＤの発現がメタノールの添加によって誘導され、メタノールの添加による誘導は任意に繰り返すことができる。
【００４２】
本方法をこれらの好ましい条件に従って適用する場合、３日〜７日程度の短い導入時間でＢＯＤを産生することが可能となり、ＢＯＤの精製を一段階の疎水性相互作用クロマトグラフィで行い、このようにして産生されたＢＯＤは、その活性に必要な４つの銅原子を確実に有する（実施例の第５項を参照されたい）。
【００４３】
本発明によるＢＯＤが大腸菌等の株によって産生される場合、本発明によるＢＯＤの調製方法は、
ａ）本発明によるＢＯＤを発現する宿主細胞を準備する工程と、
ｂ）工程ａ）で準備した宿主細胞を培養する工程と、
ｃ）宿主細胞を溶解する工程と、
ｄ）工程ｃ）で得られた溶解物をアフィニティクロマトグラフィによって処理する工程と、
ｅ）上記精製ＢＯＤを回収する工程と、
を含む。
【００４４】
尿素、塩化グアニジニウム、ＳＤＳ、トリトン等の変性剤の存在下においてＢＯＤを産生させることも可能であり、このようにして産生されたＢＯＤは、銅を欠いており、銅原子を添加することによって活性化することができる。
【００４５】
本発明は、溶液中のビリルビンの決定、すなわち試料、とりわけ生体試料中のビリルビン濃度の測定のための本発明によるイネいもち病菌由来のＢＯＤの使用にも関する。
【００４６】
「生体試料」は、血液、血清、リンパ液、胆汁、尿、脳脊髄液、汗等の生体液を意味する。
【００４７】
体内におけるビリルビンの存在は正常なことであり、ビリルビンはヘモグロビンの分解により生じ、健康な成人では１日当たり２００ｍｇ〜２３０ｍｇのビリルビンが形成される。良好な健康状態の個体においては、ビリルビンは肝臓によって取り込まれ、その後分解される。したがって、その濃度は或る特定の閾値を超えるべきではなく、ビリルビンの決定は、以下のような障害を検出するのに有用である：
重篤な溶血症例：先天性又は後天性の溶血性貧血、薬剤誘発性の毒性又は感染性の溶血、輸血事故等、
不十分な肝臓取込み又は抱合（conjugation）：ジルベール病、クリグラー−ナジャー病、リファンピシン（抗結核性抗生物質）の服用、
肝臓及び胆管の障害：様々な種類の肝炎（ウイルス性肝炎、毒性肝炎、薬剤誘発性肝炎）、様々な種類の肝硬変、稀な代謝異常（ローター病（Rotor disease）、デュービン−ジョンソン病）、
胆管の障害、
胆石症、
膵臓炎、
膵臓がん又は胆管がん。
【００４８】
したがって本発明は、液体試料、特に生体試料中のビリルビン濃度の測定のための本発明によるＢＯＤの使用に関する。
【００４９】
第１の変形形態によれば、ＢＯＤによるビリルビンの決定原理は、ビリルビンの分解によってもたらされる試料の色の変化の測定に基づいている。
【００５０】
ビリルビンは４４０ｎｍでの光の吸収ピーク（λｍａｘ）を有する。ビリルビンがＢＯＤによって酵素分解されると、ビリルビンが存在する試料のλｍａｘでの吸光度が低減し、これにより同じ実験条件で測定されたビリルビン含有量が既知の標準溶液の４４０ｎｍでの吸光度の低減との比較によって、試料中に最初に存在するビリルビンを定量することが可能となる。
【００５１】
本発明は、本発明によるＢＯＤを含むことを特徴とする、溶液中のビリルビンを化学分析するキットにも関する。
【００５２】
典型的には、アッセイキットは更に、ビリルビンアッセイ試験を適用するのに必要な試薬、特に：
緩衝液と、
検量線作成用のビリルビンの標準溶液と、
アッセイを実施するのに必要な使用説明書と、
を備える。
【００５３】
本発明は更に、流体試料の溶液中のビリルビンを化学分析する方法であって、
ａ）酵素反応の前にλｍａｘ＝４４０ｎｍでの上記流体試料の吸光度を測定する工程と、
ｂ）本発明によるＢＯＤを上記流体試料に導入する工程と、
ｃ）酵素反応の後にλｍａｘ＝４４０ｎｍでの上記流体試料の吸光度を測定する工程と、
ｄ）工程ａ）で測定された吸光度と、工程ｃ）で測定された吸光度との差を算出するとともに、この差をビリルビン含有量が既知の標準溶液で測定された吸光度の差と比較する工程と、
ｅ）上記流体試料中の初期のビリルビンの濃度を決定する工程と、
を含むことを特徴とする、方法に関する。
【００５４】
別の変形形態によれば、流体試料中のビリルビンの決定は、本発明によるＢＯＤを含む電極を利用する電気化学法によって行われる。
【００５５】
このため、本発明は、導電性金属、とりわけ白金、銅、銀、アルミニウム、金若しくはスチール、又は炭素、例えばガラス状炭素、炭素繊維、カーボンナノチューブの繊維若しくはダイアモンド等の導電性材料を含むＢＯＤ電極にも関する。上記導電性材料は少なくとも１つの本発明によるＢＯＤを含む被覆材で覆われており、上記被覆材は酵素と電極との間の電気伝導とシステムの安定性とを改善するレドックスポリマーを更に含むことができる。
【００５６】
レドックスポリマーは例えば、フェロセン、オスミウム及びルテニウム、並びに導電性ポリマー、例えばポリピロール及びポリアニリン系のポリマーから選択することができる。
【００５７】
上記導電性材料上にＢＯＤを固定する方法は、とりわけポリマーマトリクス中へのＢＯＤの内包、ポリマー膜表面上へのＢＯＤの吸着、共有結合による固定、電着を含む当業者に利用可能な従来法（Gao et al., Chem. Int. ED. 2002, 41, No. 5, 810-813）、又は米国特許出願第２００９／００５３５８２号に記載の技法から選択することができる。
【００５８】
１つの実施の形態によれば、ＢＯＤが固定されているＢＯＤ電極は、電極からの上記酵素の脱離を防止する膜にも覆われている。想定される用途に応じて、上記膜は、ナフィオン、セルロース、又は任意の他の生体適合性材料、すなわち生理環境と適合性の材料で構成することができる。
【００５９】
したがって、本発明は、本発明によるＢＯＤ電極で構成されるビリルビンバイオセンサーにも関する。一般的に、バイオセンサーは、生物学的標的を認識することが可能なバイオレセプターが固定されている電極で構成される。バイオレセプター上での生物学的標的の固定化によって、膜の物理化学的変化、及び電極と連結した電気化学的変換器（電流測定的変換器、電位差測定的変換器、電気伝導度測定的変換器等）による電気的シグナルの生成がもたらされる。本発明の場合では、バイオセンサーは本発明によるＢＯＤであり、生物学的標的はビリルビンである。
【００６０】
本発明は更に、本発明によるビリルビンバイオセンサーを用いて流体試料の溶液中のビリルビンを化学分析する方法に関する。
【００６１】
ビリルビンバイオセンサーの使用の１つの変形形態によれば、このバイオセンサーが、人の皮膚の下に埋め込まれ、該人の血液中のビリルビン濃度を記録することを可能とする。
【００６２】
本発明は、本発明による電極で構成される酸素センサーにも関する。
【００６３】
本発明によるＢＯＤ電極は更に、酵素バイオ燃料電池におけるカソードとして有利に使用することができる。図１Ａに、酵素バイオ燃料電池の作動原理を概略的に示す。本発明による酵素バイオ燃料電池は、カソードとしてのＢＯＤ電極と、基質の酸化反応（「酵素Ｘ」によって触媒される）が起こるアノードとを備える装置である。例示としては、基質はグルコースとすることができ、「酵素Ｘ」はグルコースオキシダーゼとすることができる。この種のバイオ燃料電池は、医療用途で個体に埋め込む場合に、特に関心が持たれる。基質は、例えば亜硝酸塩、硝酸塩、スルフィド、尿酸塩（urates）、アスコルビン酸塩、グルタミン酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩、セルロース等から選択することもできる。汚染除去用途が想定される場合、酵素は分解対象の基質に応じて選択する。例えば、以下の酵素を使用することができ、これらの酵素が分解することができる基質の種類を丸括弧内に示す：グルコースオキシダーゼ（グルコース、又はこの酵素によって酸化される全ての糖）、乳酸オキシダーゼ（乳酸塩）、ピルビン酸オキシダーゼ（ピルビン酸塩）、アルコールオキシダーゼ（アルコール）、コレステロールオキシダーゼ（コレステロール）、グルタミン酸オキシダーゼ（グルタミン酸塩）、ピラノースオキシダーゼ（ピラノース）、コリンオキシダーゼ（コリン）、セロビオースデヒドロゲナーゼ（セロビオース）、グルコースデヒドロゲナーゼ（グルコース、又はこの酵素によって酸化される全ての糖）、ピラノースデヒドロゲナーゼ（ピラノース）、フルクトースデヒドロゲナーゼ（フルクトース）、アルデヒドオキシダーゼ（アルデヒド）、グルコノラクトンオキシダーゼ（グルコノラクトン）、アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコール）、アスコルビン酸オキシダーゼ（酸素又はアスコルビン酸塩）、又はスルフィドジオキシゲナーゼ（スルフィド）。バイオ燃料電池の電極での酸化及び同時的な還元のプロセスによって、電流が生成される。
【００６４】
図１Ｂに、グルコースを用いた酵素バイオ燃料電池をより具体的に示す。この酵素バイオ燃料電池は、酵素の固定によって修飾された２つの電極で構成されている。グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）が導電性ポリマー「Ｉ」を介してアノード（１）上に固定され、ビリルビンオキシダーゼ（ＢＯＤ）が導電性ポリマー「ＩＩ」を介してカソード（２）上に固定されている。作動中にアノードでは、電子は生理液中に存在するグルコースからＧＯｘ、次いでＧＯｘから導電性ポリマー「Ｉ」、導電性ポリマー「Ｉ」からアノードへと移動する。カソードでは、電子はカソードから導電性ポリマー「ＩＩ」、次いでＢＯＤへと、最終的にはＢＯＤから生理液中に存在する酸素へと移動する。
【００６５】
バイオ燃料電池は任意に、それぞれの酵素によって電極を修飾すること、及び可溶性の媒介因子、例えばアノードにフェロセンメタノール及びカソードにフェリシアン化カリウムを添加すること、並びに、必要に応じて、アノードとカソードとを分離する膜を付加することによって機能させることもできることに留意すべきである。
【００６６】
本発明は更に、カソードとして上記のＢＯＤ電極を用いて糖化ヘモグロビンを化学分析する方法であって、
ａ）標準緩衝溶液中の遊離酸素を測定する工程と、
ｂ）血液試料中の遊離酸素を測定する工程と、
ｃ）工程ａ）で行われた測定と、工程ｂ）で行われた測定とを比較するとともに、血液試料中のヘモグロビン含有量を推測する工程と、
ｄ）上記血液試料から糖化ヘモグロビンを抽出する工程と、
ｅ）工程ｄ）で得られた血液試料中の遊離酸素を測定する工程と、
ｆ）工程ｂ）で行われた測定と、工程ｃ）で行われた測定とを比較するとともに、上記血液試料中の糖化ヘモグロビン含有量を推測する工程と、
を含む、方法に関する。
【００６７】
代替的には、工程ｅ）の測定を、直接血液試料から抽出された糖化ヘモグロビンで行うことができる。この方法の適用の変形形態は米国特許出願第２００２／０１７９９２号に記載されている。
【００６８】
別の態様によれば、本発明は、試料、とりわけ生体試料中に存在するビリルビンの分解への本発明によるＢＯＤの使用に関する。実際、試料中におけるビリルビンの存在が、他の物質（例えば、グルコース又は血中コレステロール）の検出を、特にこれらの他の物質を比色法によって検出する場合に、歪める可能性がある。
【００６９】
概して、本発明によるＢＯＤには、脱酸素によって、とりわけ繊維産業及び製紙産業において、並びに例えば食品産業において食品、例えば飲料、又は植物油を含有する食品の安定性及び／又は品質を改善させるといった多くの産業的用途が見出されている。
【００７０】
より具体的には、ＢＯＤは、汚染除去に関連する用途に（例えば廃水の脱色及び／又は無毒化、並びに生体異物の分解に言及することができる）、有機合成試薬として、抗菌組成物の調製に、木材及び無毒化されたカートン製の物品の製造に、又は洗浄剤の製造に（Morozova et al. Biochemistry (Mosc.) 2007 Oct; 72(10):1136-50）、並びに工業用溶剤（industrial media）中で使用される染料の漂白、特に繊維製品の漂白及び紙パルプの漂白に使用することができる。
【００７１】
本発明によるＢＯＤは、フェノール酸を二量体化するのに使用することもでき（Koschorreck, K., et al. 2008. Appl Microbiol Biotechnol (2008) 79:217-224）、したがって、繊維用途及び食品用途に使用される色素及び染料の合成において関心が持たれる（R. Mustafa et al. Food Research International. Volume 38, Issues 8-9, October-November 2005, pages 995-1000）。この二量体化反応は、抗酸化剤、例えばフェルラ酸二量体の調製にも用いることができる（Garcia-Conesa MT, et al. Redox Rep. 1997 Oct-Dec; 3(5-6):319-23）。
【００７２】
本発明によるＢＯＤは、染色に好適な媒体中に、少なくとも１つの酸化基剤（oxidation base）、本発明によるＢＯＤ、及び任意に該ＢＯＤに対する供与体（例えばビリルビン等の基質）を含む、ケラチン繊維の酸化染色用の組成物、例えばヘアーカラーリング用組成物における試薬として使用することもできる。上記組成物中で使用することができるＢＯＤ以外の様々な成分は、国際出願に係る国際公開第９９／１５１３８号に記載されている。例えば、酸化基剤（単数又は複数）は、パラフェニレンジアミン、ダブルベース（double bases）、パラアミノフェノール、オルトアミノフェノール及び複素環式酸化基剤から選択することができる。
【００７３】
本発明によるＢＯＤは、パルプの漂白及び／又はリグニン分解（脱リグニン）に対する作用に関して紙パルプを処理するのに、及び／又はより良好な湿潤強度を有する紙を製造するのに有利に使用することができる（国際出願に係る国際公開第００／６８５００号を参照されたい）。
【００７４】
上述の規定に加えて、本発明は更に、本発明を適用する実施例に関する下記の明細書及び添付の図面から明らかとなる他の規定を含む。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１Ａ】酵素バイオ燃料電池の作動原理を示す概略図である。
【図１Ｂ】グルコース系酵素バイオ燃料電池を示す図である。
【図２】ｐＦＤ５５ベクターのプラスミド地図を示す図である。
【図３】ＡＢＴＳ濃度に応じたイネいもち病菌由来のＢＯＤの触媒活性を示す図である。
【図４】非抱合型ビリルビンの濃度に応じたイネいもち病菌由来のＢＯＤの触媒活性を示す図である。
【図５】抱合型ビリルビンの濃度に応じたイネいもち病菌由来のＢＯＤの触媒活性を示す図である。
【図６】異なる基質の酸化に対するｐＨに応じたイネいもち病菌由来のＢＯＤの相対活性を示す図である。
【図７】ＡＢＴＳの酸化に対する温度に応じたイネいもち病菌由来のＢＯＤの活性試験の結果を示す図である。
【図８】抱合型ビリルビンの酸化に対する温度に応じたイネいもち病菌由来のＢＯＤの安定性試験の結果を示す図である。
【図９】５０ｍＭのリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ７）中、３７℃でのイネいもち病菌由来のＢＯＤによるＲｅｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒの漂白パーセントを示す図である。
【図１０】ビキノリン試験による銅の測定に関する検量線を示す図である。
【実施例】
【００７６】
１．  材料
１．１  大腸菌細菌株
ＤＨ５α：ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９、（Φ８０  ｌａｃＺＤＭ１５）、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１（Hanahan, 1983）。
【００７７】
この菌株を使用して、タンパク質発現ベクターを構築する工程でプラスミドを増幅する。
【００７８】
１．２  ベクター
ｐＦＤ５５：サッカロミセス・セレビシエのα因子分泌因子とともに、イネいもち病菌由来のＢＯＤをコードする配列番号２のＤＮＡ配列を含有するとともに、メタノール誘導性プロモーターＡＯＸ１を含有するプラスミドｐＰＩＣＺα。ｐＰＩＣＺαプラスミドのプラスミド地図を図２に示す。
【００７９】
１．３  ピキア・パストリス酵母株
ＧＳ１１５：ＡＯＸ１プロモーターと、α因子分泌因子と、イネいもち病菌由来のＢＯＤをコードするＤＮＡ配列とを含有するｐＦＤ５５ベクター由来のカセットの組込み後のビリルビンオキシダーゼの産生に使用されるピキア・パストリス酵母株。
【００８０】
１．４  培養培地
富栄養培地ＹＰＤ（酵母用）：
１％酵母エキス
２％バクトペプトン
２％グルコース
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する
最少培地ＭＭＨ（酵母用）：
１．３４％酵母窒素ベース
１％カザミノ酸
０．４％ヒスチジン
４×１０−５％ビオチン
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する
富栄養培地ＬＢ（細菌用）：
トリプトン  １０ｇ／Ｌ
酵母エキス  ５ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ
蒸留Ｈ２Ｏ  １Ｌまで適量
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する
【００８１】
２．  遺伝子操作技法
２．１  スーパーコンピテント細菌の形質転換
ＤＨ５αスーパーコンピテント細菌を、Inoue et al.によって説明されたプロトコル（Inoue et al. 1990. Gene 96 :23-28）に従ってＳＥＭ法（単純かつ効率的な方法（Simple and Efficient Method））によって調製する。
【００８２】
２．２  ピキア・パストリス酵母の形質転換
ＤＮＡを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｅｐｏｒａｔｏｒ（Eppendorf、フランス）でのエレクトロポレーションによりピキア・パストリス酵母ＧＳ１１５に導入する。
【００８３】
２．３  ＤＮＡの調製
プラスミドＤＮＡ精製キット（Quiagen）を使用して、少量及び大量のＤＮＡを調製する。
【００８４】
２．４  二本鎖ＤＮＡのシークエンシング
二本鎖ＤＮＡを、従来技法に従ってMillegen社（フランス、トゥールーズ）でシークエンシングする。
【００８５】
２．５  ＢＯＤの発現ベクターの構築
タンパク質のＮ末端に位置する最初の２４個のアミノ酸の位置で切断された、イネいもち病菌のビリルビンオキシダーゼをコードする配列に相当する遺伝子（アクセッション番号Ａ４ＱＶ２７）を、Genecust Europe社（ルクセンブルグ）で合成した。制限部位ＮｈｅＩ（配列番号６：ｇｃｔａｇｃ）及びＮｏｔＩ（配列番号７：ｇｃｇｇｃｃｇｃ）をそれぞれ、配列の３’及び５’に付加し、クローニングを促した。
【００８６】
次いでｐＰＩＣＺαプラスミド及び合成した遺伝子を２つの制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで処理し、消化産物を「ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ」キットを用いてゲル上で精製した。
【００８７】
その後ＢＯＤの遺伝子を、３７℃で一晩、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼとともに同時インキュベートすることによってプラスミドにライゲーションする。
【００８８】
続いて新たに形成したプラスミド（ｐＦＤ５５）を、２５μｇ／ｍｌのゼオシンの入ったシャーレ内でＤＨ５α細菌の形質転換によって選択及び増幅させる。
【００８９】
２．６  ピキア・パストリスのゲノムへのビリルビンオキシダーゼをコードする配列の組込み
ピキア・パストリス酵母の培養培地中の酵素を過剰産生及び分泌させるために、対応する遺伝子を相同組換えによってＡＯＸ１遺伝子の位置に導入する。このために、ｐＦＤ５５プラスミドを、酵素ｐｍｅＩを用いた消化によって線形化してから、エレクトロポレーションによって酵母に導入し、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤ培地＋寒天において陽性クローンを選択する。
【００９０】
３．  イネいもち病菌由来のＢＯＤの産生、精製及び特性評価
３．１  ＢＯＤの産生
酵素ＢＯＤをメタノール誘導によってピキア・パストリス酵母から産生させる。このために、ｐＦＤ５５プラスミドに含有されたカセットを組み込んだ後、ゼオシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した２００ｍＬのＹＰＤ培地の前培養物にＧＳ１１５株を播種する。２２０ｒｐｍ、３０℃で一晩撹拌した後、この前培養物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを２００ｍｌの滅菌水中に取り、存在する全てのグルコースを取り除く。２回目の遠心分離の後、５Ｌ容の三角フラスコ内の１ｍＭのＣｕＳＯ４を含むＭＭＨ培地中の培養物２Ｌに、このペレットを播種する。酵母を２時間、撹拌しながら（２２０ｒｐｍ）、２５℃でインキュベートした後、０.５％メタノールを添加することで、誘導を開始する。この誘導工程を５日間繰り返すことで、最大量の酵素が得られる。分泌タンパク質を回収するために、２Ｌの培養物を遠心分離し、対象の酵素を含む上清を、カットオフ値が１０ｋＤａのＹＭ１０膜を備える振盪セルにおいて濃縮することで、４ｍｌ〜５ｍｌの最終容量を達成する。
【００９１】
３．２  疎水性相互作用クロマトグラフィによるＢＯＤの精製
濃縮してから、１.７Ｍの硫酸アンモニウムを４ｍｌ〜５ｍｌの培養上清に添加した後、０.２２μｍフィルターで濾過し、システムＡＫＴＡ精製装置（GE Healthcare（商標））に接続し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、１.７Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４（ｐＨ６）中に平衡化した疎水性相互作用カラム、６０ｍｌ  ＰｈｅｎｙｌＨＰ（GE Healthcare（商標））に注入する。溶出を０％から１００％の勾配の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）を用いて２．５ｍＬ／分の流速で行う。ＢＯＤタンパク質を含む画分をＡＢＴＳ活性試験（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）によって同定し、合わせて、濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ１０膜での遠心分離によって５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）中で保管した。この段階で、ＢＯＤタンパク質は純粋であり、−２０℃で可溶性形態で保管することができる。
【００９２】
他の市販のＢＯＤと比較して、このタンパク質を使用する際の精製プロトコルにはかなりの利点があることが強調される。実際、純粋な酵素を得るには、他の既知のビリルビンオキシダーゼに用いられるクロマトグラフィ（サイズ排除クロマトグラフィ、アニオン交換クロマトグラフィ又はカチオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ等）の連続段階ではなく、単一の精製工程が必要となる。
【００９３】
３．３  酵素の特性評価
３．３．１  濃度の測定
溶液中の酵素の濃度をブラッドフォード技法（Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72 : p. 248-54）に従ってＢＳＡ範囲から算出する。
【００９４】
３．３．２  酵素試験
酵素試験を３ｍＬの容量の３７℃の０．１Ｍのクエン酸／リン酸緩衝液中でVarianの分光光度計を用いて行い、時間に応じた所与の波長での異なる基質の酸化をモニタリングする。酵素の比活性を１分当たりタンパク質１ｍｇに付き酸化される基質（μｍｏｌ単位）で表す。この研究で使用される基質は、ＡＢＴＳ（ε４２０ｎｍ＝３６ｍＭ−１ｃｍ−１）、非抱合型ビリルビン（ε４５０ｎｍ＝３２ｍＭ−１ｃｍ−１）及び抱合型ビリルビン（ε４４０ｎｍ＝２５ｍＭ−１ｃｍ−１）である。
【００９５】
３．４  イネいもち病菌由来のＢＯＤの酵素特性の研究
３．４．１  定常状態での速度定数（ｋｃａｔ）及びミカエリス定数（ＫＭ）の決定
３．４．１．１  ＡＢＴＳ
実験を３７℃の０.１Ｍのクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ４）中でVarianの分光光度計で行う。ＡＢＴＳ濃度はアッセイにおいて０ｍＭ〜４ｍＭの中で変える。アッセイを酵素の添加により開始する。試験点を、以下の方程式：ｋｓｓ＝ｋｃａｔ×［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］）に従ってＳｉｇｍａ−ｐｌｏｔ  ６．０ソフトウェアを用いてミカエリス−メンテンモデルによる非線形回帰によって分析する。
【００９６】
結果：
ｋｃａｔ＝６６４ｓ−１及びＫｍ＝４２８μＭ
ＡＢＴＳ濃度に応じたイネいもち病菌由来のＢＯＤの触媒活性を図３に示す。
【００９７】
比較用のピキア・パストリスで産生されたミロテシウム・ベルカリア（Myrothecium verrucaria）由来のＢＯＤは、ｐＨ６.５のＡＢＴＳで、３４０μＭのＫｍに対して１６４ｓ−１のｋｃａｔを示す（Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72 : p. 248-54）。
【００９８】
３．４．１．２  非抱合型ビリルビン
実験を、３７℃の５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）中でVarianの分光光度計で行う。ビリルビンの濃度はアッセイにおいて０μＭ〜１００μＭの中で変える。酵素の添加により開始されるアッセイは、比色分析による変動から４５０ｎｍでの非抱合型ビリルビンの酸化をモニタリングすることからなる（ε４５０ｎｍ＝３２ｍＭ−１ｃｍ−１）。図４に示されるように、この基質の酸化はミカエリス−メンテンプロセスに従うものではなく、そのため通例のように定数を決定することが不可能である。
【００９９】
３２Ｕ／ｍｇという算出値の比活性の最大値だけを得ることができる。
【０１００】
比較用のミロテシウム・ベルカリア真菌及びバチルス・サブチリス細菌由来のＢＯＤは、同じ基質に対してそれぞれ２４Ｕ／ｍｇ及び２８Ｕ／ｍｇという最大の比活性を示す（Kataoka, K., et al., High-level expression of Myrothecium verrucaria bilirubin oxidase in Pichia pastoris, and its facile purification and characterization. Protein Expr Purif, 2005. 41(1): p. 77-83、及び非特許文献２）。
【０１０１】
３．４．１．３  抱合型ビリルビン
実験を、３７℃の５０ｍＭのクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ３．６）中でVarianの分光光度計で行う。ビリルビンの濃度はアッセイにおいて０μＭ〜１００μＭの中で変える。酵素の添加により開始されるアッセイは、比色分析による変動に基づき４４０ｎｍでの抱合型ビリルビンの酸化をモニタリングすることからなる（ε４４０ｎｍ＝２５ｍＭ−１ｃｍ−１）。試験点を、以下の方程式：ｋｓｓ＝ｋｃａｔ×［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］）に従ってＳｉｇｍａ−ｐｌｏｔ  ６．０ソフトウェアを用いてミカエリス−メンテンモデルによる非線形回帰によって分析する。
【０１０２】
このためこの酵素は抱合型ビリルビンに関して以下の速度定数を有する：ｋｃａｔ＝２８ｓ−１及びＫＭ＝１８．５μＭ。
【０１０３】
抱合型ビリルビンの濃度に応じたイネいもち病菌由来のＢＯＤの触媒活性を図５に示す。
【０１０４】
３．４．２  ｐＨに応じた酵素活性の研究
３．４．２．１  ＡＢＴＳ
ｐＨに応じた反応速度定数の変動を、基質として１ｍＭのＡＢＴＳを用いて０.１Ｍのクエン酸／リン酸緩衝液中で３〜７のｐＨ範囲にわたって調べる。実験を、Varianの分光光度計で３７℃で行う。活性を４２０ｎｍで測定された比色分析による変動をもたらすＡＢＴＳの酸化によりモニタリングする。アッセイを酵素の添加により開始する。
【０１０５】
３．４．２．２  非抱合型ビリルビン
ｐＨに応じた反応速度定数の変動を、基質として３０μＭの非抱合型ビリルビンを用いて０．２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液中で７〜８.５のｐＨ範囲にわたって調べる。実験を、Varianの分光光度計を用いて３７℃で行う。活性を４５０ｎｍで測定された比色分析による変動をもたらすビリルビンの酸化によりモニタリングする（ε４５０ｎｍ＝３２ｍＭ−１ｃｍ−１）。アッセイを酵素の添加により開始する。
【０１０６】
３．４．２．３  接合型ビリルビン
ｐＨに応じた反応速度定数の変動を、基質として２５μＭの抱合型ビリルビンを用いて０．１Ｍのクエン酸／リン酸緩衝液中で３〜７のｐＨ範囲にわたって調べる。実験を、Varianの分光光度計を用いて３７℃で行う。活性を４４０ｎｍで測定された比色分析による変動をもたらすビリルビンの酸化によりモニタリングする（ε４５０ｎｍ＝２５ｍＭ−１ｃｍ−１）。アッセイを酵素の添加により開始する。
【０１０７】
異なる基質の酸化に対するｐＨに応じたイネいもち病菌由来のＢＯＤの相対活性を図６にグラフの形で示す。
【０１０８】
３．４．３  温度に応じた酵素活性の研究
温度に応じた反応速度定数の変動を、０．５ｍＭのＡＢＴＳの存在下での０.１Ｍのクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ４）中で調べる。温度は１５℃〜８０℃の中で変える。活性をVarianの温度制御型分光光度計ＣＡＲＹ  ＵＶ  Ｂｉｏｍｅｌｔでモニタリングする。アッセイを酵素の添加により開始する。
【０１０９】
温度に応じたイネいもち病菌由来のＢＯＤによるＡＢＴＳの酸化の結果を図７のグラフに相対活性として示す。
【０１１０】
３．４．４  温度に応じた酵素の安定性
酵素を５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）の入った６０℃及び３７℃の乾燥浴内で０.１５ｍｇ／ｍｌの濃度でプレインキュベートした。一定間隔で、５μＬの試料を回収し、これらの温度でインキュベートした酵素の残存活性を、５０μＭの抱合型ビリルビンの存在下において３７℃の０.１Ｍのクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ３．８）中、４４０ｎｍでVarianの分光光度計を用いて決定する。
【０１１１】
温度に応じたイネいもち病菌由来のＢＯＤによる抱合型ビリルビンの酸化の結果を図８のグラフに相対活性として示す。
【０１１２】
３，４，５  Ｒｅｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒの漂白活性
イネいもち病菌由来のＢＯＤによるＲｅｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ（ＲＢＢＲ）の漂白の有効性を、１０μＭのＡＢＴＳの存在下又は非存在下において５０ｍＭのリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ７）中で測定した。８０ｍｇ／ＬのＲＢＢＲの溶液をＡＢＴＳの存在下又は非存在下で３７℃でプレインキュベートし、１０μｇ／ｍｌの濃度の酵素をＴ０で添加する。５９２ｎｍ（ＲＢＢＲの吸収ピーク）での吸光度を一定間隔で測定し、酵素の漂白活性をモニタリングする。
【０１１３】
僅か２０分後には、９４％超のＲＢＢＲが３７℃の１０μＭのＡＢＴＳの存在下で漂白される。この結果から、例えば繊維産業に使用される染料を漂白するというこの酵素の優れた潜在性が明らかに実証される。
【０１１４】
図９に、３７℃の５０ｍＭのリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ７）中でのイネいもち病菌由来のＢＯＤによるＲｅｍａｚｏｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒの漂白パーセントを示す。
【０１１５】
３．５  ピキア・パストリスで産生されるイネいもち病菌のＢＯＤに対する４つの銅の決定
４つの銅の存在を銅のモル濃度を測定するのに標準的な範囲を用いたビキノリンアッセイにより決定する（表１）（Felsenfeld, G., The determination of cuprous ion in copper proteins. Arch Biochem Biophys, 1960. 87 : p. 247-5）。
【０１１６】
【表２】
2014523235.tif 000003
【０１１７】
５４６ｎｍでの比色アッセイに基づく各測定を２連で行う。図１０に、ビキノリンアッセイによる銅の測定の検量線を示す。この技法によって、１.５μＭのＢＯＤのタンパク質試料に対する６.１μＭの銅の存在、すなわち４．０６の比率が実証可能となり、酵素と結び付く４つの銅イオンの存在が良好に確認される。
【図１Ａ】
2014523235.tif 000004
【図１Ｂ】
2014523235.tif 000005
【図２】
2014523235.tif 000006
【図３】
2014523235.tif 000007
【図４】
2014523235.tif 000008
【図５】
2014523235.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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