(57)【要約】本明細書において、短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質、及び短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を含む脂質粒子、ならびにその使用について報告する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号０１のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号０１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するその変異体である、融合タンパク質。
【請求項２】
請求項１記載の融合タンパク質を含む、脂質粒子。
【請求項３】
−  請求項１記載の融合タンパク質と、
−  ホスファチジルコリンと、
−  脂質と
を含む、請求項２記載の脂質粒子。
【請求項４】
−  請求項１記載の融合タンパク質と、
−  第１のホスファチジルコリンと、
−  第２のホスファチジルコリンと
を含むことを特徴とする、請求項２〜３のいずれか一項記載の脂質粒子。
【請求項５】
１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリン及び１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルコリンを含むことを特徴とする、請求項２〜４のいずれか一項記載の脂質粒子。
【請求項６】
１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリンの１，２−ジパルミトイル−ホスファジルコリンに対するモル比が、９９：１〜２５：７５であることを特徴とする、請求項５記載の脂質粒子。
【請求項７】
融合タンパク質が３個の単量体を含む多量体であることを特徴とする、請求項２〜６のいずれか一項記載の脂質粒子。
【請求項８】
キュビリン、スカベンジャー受容体クラスＢ−１型（ＳＲ−ＢＩ）、ＡＴＰ−結合カセット１（ＡＢＣＡ−１）、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、コレステリル−エステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）、又はリン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）からなる群より選択される受容体に結合することを特徴とする、請求項２〜７のいずれか一項記載の脂質粒子。
【請求項９】
脂質粒子中のアポリポプロテイン単量体１個当たりのリン脂質分子の数が、４０〜１２０であることを特徴とする、請求項２〜８のいずれか一項記載の脂質粒子。
【請求項１０】
脂質粒子中のアポリポプロテイン単量体１個当たりのリン脂質分子の数が、５０〜９０であることを特徴とする、請求項９記載の脂質粒子。
【請求項１１】
請求項１記載の融合タンパク質又は請求項２〜１０のいずれか一項記載の脂質粒子を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
医薬としての使用のための、請求項１記載の融合タンパク質又は請求項２〜１０のいずれか一項記載の脂質粒子。
【請求項１３】
−  急性冠動脈症候群を有する患者における二次予防のため、あるいは
−  アテローム性動脈硬化症の予防又は治療のため、あるいは
−  コレステロール逆転送及び／又はプラーク軽減を誘導するため、あるいは
−  対象の血管中の動脈硬化性プラークの清浄／溶解／安定化のため、又は対象の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するため、あるいは
−  対象における狭窄性弁膜症を予防する又は治療するため、あるいは
−  対象におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるため、あるいは
−  対象におけるコレステロール逆転送の開始のため、あるいは
−  内毒素の除去のため、あるいは
−  敗血症性ショックの予防のため
−  狭心症の治療のため、あるいは
−  心筋梗塞の治療のため、あるいは
−  不安定狭心症の治療のため、あるいは
−  末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄症、脳動脈狭窄症又は冠状動脈狭窄症のような動脈狭窄症の治療のため、あるいは
−  血管性認知症の治療のため、あるいは
−  一過性黒内障の治療のため
の医薬としての使用のための、請求項１記載の融合タンパク質又は請求項２〜１０のいずれか一項記載の脂質粒子。
【請求項１４】
医薬の製造のための、請求項１記載の融合タンパク質又は請求項２〜１０のいずれか一項記載の脂質粒子の使用。
【請求項１５】
−  急性冠動脈症候群を有する患者における二次予防のため、あるいは
−  アテローム性動脈硬化症の予防又は治療のため、あるいは
−  コレステロール逆転送及び／又はプラーク軽減を誘導するため、あるいは
−  対象の血管中の動脈硬化性プラークの清浄／溶解／安定化のため、又は対象の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するため、あるいは
−  対象における狭窄性弁膜症を予防する又は治療するため、あるいは
−  対象におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるため、あるいは
−  対象におけるコレステロール逆転送の開始のため、あるいは
−  内毒素の除去のため、あるいは
−  敗血症性ショックの予防のため
−  狭心症の治療のため、あるいは
−  心筋梗塞の治療のため、あるいは
−  不安定狭心症の治療のため、あるいは
−  末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄症、脳動脈狭窄症又は冠状動脈狭窄症のような動脈狭窄症の治療のため、あるいは
−  血管性認知症の治療のため、あるいは
−  一過性黒内障の治療のため
の医薬の製造のための、請求項１記載の融合タンパク質又は請求項２〜１０のいずれか一項記載の脂質粒子の使用。
【請求項１６】
−  急性冠動脈症候群を有する患者における二次予防のため、あるいは
−  請求項１記載の融合タンパク質又は請求項２〜１０のいずれか一項記載の脂質粒子が、対象においてコレステロール逆転送及び／又はプラーク軽減を誘導するのに十分な量で構成されている、アテローム性動脈硬化症の予防又は治療のため、あるいは
−  コレステロール逆転送及び／又はプラーク軽減を誘導するため、あるいは
−  対象の血管中の動脈硬化性プラークの清浄／溶解／安定化のため、又は対象の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するため、あるいは
−  対象における狭窄性弁膜症を予防する又は治療するため、あるいは
−  対象におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるため、あるいは
−  対象におけるコレステロール逆転送の開始のため、あるいは
−  内毒素の除去のため、あるいは
−  敗血症性ショックの予防のため
−  狭心症の治療のため、あるいは
−  心筋梗塞の治療のため、あるいは
−  不安定狭心症の治療のため、あるいは
−  末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄症、脳動脈狭窄症又は冠状動脈狭窄症のような動脈狭窄症の治療のため、あるいは
−  血管性認知症の治療のため、あるいは
−  一過性黒内障の治療のため
の方法。
【請求項１７】
−  急性冠動脈症候群、又は
−  アテローム性動脈硬化症、又は
−  対象の血管中の動脈硬化性プラーク、又は
−  対象における狭窄性弁膜症、又は
−  敗血症性ショック、又は
−  狭心症、又は
−  心筋梗塞、又は
−  不安定狭心症、又は
−  動脈狭窄症、又は
−  末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、又は
−  頸動脈狭窄症、又は
−  脳動脈狭窄症、又は
−  冠状動脈狭窄症、又は
−  血管性認知症、又は
−  一過性黒内障
の処置において使用するための、請求項１記載の融合タンパク質又は請求項２〜１０のいずれか一項記載の脂質粒子。
【請求項１８】
−  コレステロール逆輸送を誘導すること、あるいは
−  プラーク軽減を誘導すること、あるいは
−  動脈硬化性プラークを清浄すること、又は溶解すること、又は安定化させること、あるいは
−  動脈壁から肝臓へコレステロールを再分配すること、あるいは
−  ＨＤＬ粒子の数を増加させること、あるいは
−  内毒素の除去
において使用するための、請求項１記載の融合タンパク質又は請求項２〜１０のいずれか一項記載の脂質粒子。
【請求項１９】
個体において、コレステロール逆転送を誘導する、又はプラーク軽減を誘導する、又は動脈硬化性プラークを清浄するもしくは溶解するもしくは安定化させる、又は動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配する、又はＨＤＬ粒子の数を増加させる、又は内毒素を除去する方法であって、有効量の請求項１記載の融合タンパク質又は請求項２〜１０のいずれか一項記載の脂質粒子を個体に投与することを含む、コレステロール逆転送を誘導する、又はプラーク軽減を誘導する、又は動脈硬化性プラークを清浄するもしくは溶解するもしくは安定化させる、又は動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配する、又はＨＤＬ粒子の数を増加させる、又は内毒素を除去するための、方法。
【請求項２０】
急性冠動脈症候群の患者における二次予防のための方法であって、それを必要とする対象に、請求項１記載の融合タンパク質又は請求項２〜１０のいずれか一項記載の脂質粒子を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポプロテイン及び脂質粒子の分野にある。本明細書において、短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質、この短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質及び２つの異なるホスファチジルコリンを含む脂質粒子、ならびに当該融合タンパク質及び脂質粒子の使用が報告されている。
【０００２】
発明の背景
血漿リポプロテインは、血液中の脂質輸送及び代謝を行う可溶性タンパク質−脂質複合体である。リポプロテインのいくつかの主要なクラスが、それらの密度、サイズ、化学組成、及び機能に基づいて識別される。それらの間で、高密度リポプロテイン（ＨＤＬ）粒子（代替的に高密度脂質粒子として表示される）は、１８０kDa〜３６０kDaのそれらの平均分子量において変動するいくつかのサブクラスで構成される。それらの平均的な脂質及びタンパク質含量は、各々５０重量％である。ホスファチジルコリン（ＰＣ）は総脂質の３８％を占め、次いでコレステリルエステルならびに少量の他の極性及び非極性脂質（遊離コレステロールを含む）が続く。主なタンパク質成分はアポリポプロテインＡ−Ｉ（Ａｐｏ Ａ−Ｉ）であり、ヒトＨＤＬ中の総タンパク重量の約６０％に相当する。
【０００３】
ＨＤＬ粒子及びその主なポリペプチドであるアポリポプロテインＡ−Ｉは、コレステロール逆輸送（ＲＣＴ）に関与する。コレステロール逆輸送において、アポリポプロテインＡ−Ｉは、細胞、例えば血管壁の細胞からのコレステロールの排出、脂質の結合、及びレシチン−コレステロール−アセチル−トランスフェラーゼの活性化を増加させて、それにより肝臓による血漿の流れを介したコレステロールの排出をする。これは、細胞膜タンパク質であるＡＴＰ−結合カセット輸送体−Ａ−Ｉ（ＡＢＣＡ−Ｉ）の関与する能動輸送プロセスである。
【０００４】
アポリポプロテインＡ−Ｉ及びアポリポプロテインに基づく治療法、例えば再構成されたＨＤＬ粒子は、１９７０年代後半及び１９８０年代前半には既に同定されていた。アポリポプロテインＡ−Ｉ−Milano含有脂質粒子については、臨床的証拠（動脈硬化の患者におけるプラークの著しい減少を意味する）を示すことができた。野生型アポリポプロテインＡ−Ｉの二量体型であるアポリポプロテインＡ−Ｉ−Milanoは、アポリポプロテインＡ−Ｉ分子の天然に存在する突然変異体に従って設計された。二量体形成は、ジスルフィド結合の形成を可能にするシステインによるアミノ酸残基１７３（アルギニン）の交換により可能になる。
【０００５】
WO2009/131704では、無機物質を含むコアを含む、コレステロール及び他の分子を隔離するのに適切なナノ構造が報告されている。WO2006/125304では、冠動脈疾患を治療する又は予防するための医薬組成物が報告されている。脂質代謝及び心血管疾患に関連するアポリポプロテインをコードする組成物が、US2002/0142953に報告されている。WO2005/084642では、アポタンパク質−コキレート（cochelate）組成物が報告されている。WO2009/036460では、改変型のヒトアポリポプロテインＡ−Ｉポリペプチド及びその使用が報告されている。二量体型及び／又はオリゴマー型のヒトアポリポプロテインＡ−Ｉタンパク質変異タンパク質の植物生産が、WO2008/017906に報告されている。WO2007/137400では、弁狭窄の処置のための方法及び化合物が報告されている。WO2006/100567では、帯電したリポプロテイン複合体及びその使用が報告されている。
【０００６】
US2002/0156007では、アポリポプロテイン類似体が報告されている。テトラネクチン三量体化ポリペプチドが、US2010/0028995に報告されている。J. Cardiovascular Pharmacol. (51 (2008) 170-177)では、Graversen, J.H., et al.によって、アポリポプロテインＡ−Ｉの三量体化が、血漿クリアランスを遅らせ、そして抗アテローム動脈硬化特性を保つことが報告されている。心血管疾患の処置のための新規治療手段である高密度リポプロテイン投与は、Sirtori, C.R., et al. (Curr. Med. Chem. Immunol. Endocrine Metabol. Agents 5 (2005) 321-333）によって報告されている。
【０００７】
WO03/097696では、虚血再灌流の処置のための方法及び組成物が報告されている。ナノスケール結合型二重層、使用及び製造の方法が、WO2009/097587に報告されている。WO2007/098122では、黄斑変性症及び関連する眼病状の処置のための方法が報告されている。アポリポプロテイン類似体は、WO02/38609に報告されている。WO2005/041866では、医薬製剤が報告されている。冠不全症候群の治療及び予防のための方法及び投与計画が報告されている。脂質異常症性障害を処置するための遺伝子治療、アポリポプロテインＡ−Ｉアゴニストを供給するアプローチ、及びその使用が、WO99/16409に報告されている。WO2008/106660では、単離されたリン脂質−タンパク質粒子が報告されている。アポリポプロテイン（ＡＰＯ Ａ−Ｉ）模倣ペプチド／リン脂質複合体を使用する拡張機能障害の予防及び治療のための方法が、WO2010/083611に報告されている。WO2008/156873では、ＡＰＯ Ａ−Ｉペプチド模倣体が報告されている。封入ＨＤＬ模倣ペプチドが、WO2008/094905に報告されている。WO98/56906では、三量体化モジュールが報告されている。
【０００８】
発明の概要
本明細書では、改善された生産特性を有し、特に副生成物形成の出現がより少ない、短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質が報告される。
【０００９】
最初にコードされるアミノ酸残基として、アミノ酸残基プロリン（Ｐ）で始まる短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質の画分は、粗大腸菌（E.coli）培養上清中で９０％以上であることが見出され、その際Ｎ末端メチオニン残基が効率的に除去される。
【００１０】
本明細書において報告される一つの態様は、配列番号０１のアミノ酸配列又はその変異体（これは、少なくとも７０％の配列同一性を有する）を含む、短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質であり、Ｎ末端アミノ酸配列として、
ここで、配列番号０１は、アミノ酸配列：
【化１】
2014529602.tif 000003
を有し、
そして変異体は、Ｎ末端アミノ酸残基ＰＩＶＮを有する。
【００１１】
本明細書において報告される一つの態様は、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を含む脂質粒子である。
【００１２】
一つの実施態様において、脂質粒子は、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質と、リン脂質、リゾリン脂質、ガラクトセレブロシド、ガングリオシド、セレブロシド、グリセリド、脂肪酸、トリグリセリド、ステロイド脂質、コレステロール、コレステロールエステル、又はそれらの類似体もしくは誘導体より選択される１つ以上の脂質とを含む。
【００１３】
一つの実施態様において、脂質粒子は、
ａ）本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質と、
ｂ）ホスファチジルコリンと、
ｃ）さらなる脂質と
を含む。
【００１４】
一つの実施態様において、さらなる脂質は、第２のホスファチジルコリンである。
【００１５】
一つの実施態様において、脂質粒子は、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質、２つの異なるホスファチジルコリン、及び界面活性剤から構成されている。
【００１６】
一つの実施態様において、ホスファチジルコリン及び第２のホスファチジルコリンは、ホスファチジルコリンのホスホグリセロール骨格にエステル化される１つもしくは２つのカルボン酸部分又はカルボン酸部分誘導体において異なる。
【００１７】
一つの実施態様において、ホスファチジルコリンは、ＰＯＰＣであり、そして第２のホスファチジルコリンは、ＤＰＰＣである。
【００１８】
一つの実施態様において、脂質粒子中のＰＯＰＣのＤＰＰＣに対するモル比は、９９：１〜１：９９である。一つの実施態様において、脂質粒子中のＰＯＰＣのＤＰＰＣに対するモル比は、９９：１〜１０：９０である。一つの実施態様において、脂質粒子中のＰＯＰＣのＤＰＰＣに対するモル比は、９９：１〜２５：７５である。
【００１９】
一つの実施態様において、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質は、ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣと非共有結合的に関連する。
【００２０】
一つの実施態様において、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質は、３個の単量体を含む多量体である。
【００２１】
一つの実施態様において、脂質粒子は、０．７５重量％未満の界面活性剤を含む。一つの実施態様において、界面活性剤は、糖系界面活性剤、又はポリオキシアルキレン系界面活性剤、又は胆汁酸塩系界面活性剤、又は合成界面活性剤又はそれらの組合せである。一つの実施態様において、界面活性剤は、コール酸である。
【００２２】
一つの実施態様において、脂質粒子は、キュビリン、スカベンジャー受容体クラスＢ−１型（ＳＲ−ＢＩ）、ＡＴＰ−結合カセット１（ＡＢＣＡ−１）、レシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、コレステリル−エステル転移タンパク質（ＣＥＴＰ）、又はリン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）からなる群より選択される受容体に結合することができる。
【００２３】
一つの実施態様において、本発明による脂質粒子は、脂質粒子中のアポリポプロテイン単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、４０〜１２０であることを特徴とする。一つの実施態様において、脂質粒子中のアポリポプロテイン単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、５０〜９０である。
【００２４】
一つの実施態様において、短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質は、組換えで生成される。
【００２５】
本明細書において報告される一つの態様は、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子を含む、医薬組成物である。
【００２６】
本明細書において報告される一つの態様は、医薬としての使用のための、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子である。
【００２７】
本明細書において報告される一つの態様は、医薬の製造のための、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子の使用である。
【００２８】
本明細書において報告される一つの態様は、下記のための医薬の製造のための、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子の使用である：
−  急性冠動脈症候群を有する患者における二次予防のため、あるいは
−  アテローム性動脈硬化症の予防又は治療のためであって、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子が、対象においてコレステロール逆転送及び／又はプラーク軽減を誘導するのに十分な量で構成されている、アテローム性動脈硬化症の予防又は治療のため、あるいは
−  コレステロール逆転送及び／又はプラーク軽減を誘導するため、あるいは
−  対象の血管中の動脈硬化性プラークの清浄／溶解／安定化のため、又は対象の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するため、あるいは
−  対象における狭窄性弁膜症を予防する又は治療するため、あるいは
−  対象におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるため、あるいは
−  対象におけるコレステロール逆転送の開始のため、あるいは
−  内毒素の除去のため、あるいは
−  敗血症性ショックの予防のため
−  狭心症の治療のため、あるいは
−  心筋梗塞の治療のため、あるいは
−  不安定狭心症の治療のため、あるいは
−  末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄症、脳動脈狭窄症又は冠状動脈狭窄症のような動脈狭窄症の治療のため、あるいは
−  血管性認知症の治療のため、あるいは
−  一過性黒内障の治療のため。
【００２９】
本明細書において報告される一つの態様は、医薬の製造における、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子の使用である。
【００３０】
本明細書において報告される一つの態様は、下記のための医薬の製造のための方法である：
−  急性冠動脈症候群を有する患者における二次予防のため、あるいは
−  アテローム性動脈硬化症の予防又は治療のためであって、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子が、対象においてコレステロール逆転送及び／又はプラーク軽減を誘導するのに十分な量で構成されている、アテローム性動脈硬化症の予防又は治療のため、あるいは
−  コレステロール逆転送及び／又はプラーク軽減を誘導するため、あるいは
−  対象の血管中の動脈硬化性プラークの清浄／溶解／安定化のため、又は対象の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するため、あるいは
−  対象における狭窄性弁膜症を予防する又は治療するため、あるいは
−  対象におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるため、あるいは
−  対象におけるコレステロール逆転送の開始のため、あるいは
−  内毒素の除去のため、あるいは
−  敗血症性ショックの予防のため
−  狭心症の治療のため、あるいは
−  心筋梗塞の治療のため、あるいは
−  不安定狭心症の治療のため、あるいは
−  末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄症、脳動脈狭窄症又は冠状動脈狭窄症のような動脈狭窄症の治療のため、あるいは
−  血管性認知症の治療のため、あるいは
−  一過性黒内障の治療のため。
【００３１】
本明細書において報告される一つの態様は、下記のための方法である：
−  急性冠動脈症候群を有する患者における二次予防、あるいは
−  アテローム性動脈硬化症の予防又は治療であって、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子が、対象においてコレステロール逆転送及び／又はプラーク軽減を誘導するのに十分な量で構成されている、アテローム性動脈硬化症の予防又は治療、あるいは
−  コレステロール逆転送及び／又はプラーク軽減を誘導するため、あるいは
−  対象の血管中の動脈硬化性プラークの清浄／溶解／安定化のため、又は対象の動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配するため、あるいは
−  対象における狭窄性弁膜症を予防する又は治療するため、あるいは
−  対象におけるＨＤＬ粒子の数を増加させるため、あるいは
−  対象におけるコレステロール逆転送の開始のため、あるいは
−  内毒素の除去のため、あるいは
−  敗血症性ショックの予防のため
−  狭心症の治療のため、あるいは
−  心筋梗塞の治療のため、あるいは
−  不安定狭心症の治療のため、あるいは
−  末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、頸動脈狭窄症、脳動脈狭窄症又は冠状動脈狭窄症のような動脈狭窄症の治療のため、あるいは
−  血管性認知症の治療のため、あるいは
−  一過性黒内障の治療のため。
【００３２】
本明細書において報告される一つの態様は、下記の処置において使用するための、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン-アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子である：
−  急性冠動脈症候群、又は
−  アテローム性動脈硬化症、又は
−  対象の血管中の動脈硬化性プラーク、又は
−  対象における狭窄性弁膜症、又は
−  敗血症性ショック、又は
−  狭心症、又は
−  心筋梗塞、又は
−  不安定狭心症、又は
−  動脈狭窄症、又は
−  末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、又は
−  頸動脈狭窄症、又は
−  脳動脈狭窄症、又は
−  冠状動脈狭窄症、又は
−  血管性認知症、又は
−  一過性黒内障。
【００３３】
本明細書において報告される一つの態様は、下記において使用するための、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン-アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子である：
−  コレステロール逆輸送を誘導すること、あるいは
−  プラーク軽減を誘導すること、あるいは
−  動脈硬化性プラークを清浄すること又は溶解させること又は安定化させること、あるいは
−  動脈壁から肝臓へのコレステロールを再分配すること、あるいは
−  ＨＤＬ粒子の数を増加させること、あるいは
−  内毒素を除去すること。
【００３４】
本明細書において報告される一つの態様は、急性冠動脈症候群、又はアテローム性動脈硬化症、又は血管中の動脈硬化性プラーク、又は狭窄性弁膜症、又は敗血症性ショック、又は狭心症、又は心筋梗塞、又は不安定狭心症、又は動脈狭窄症、又は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、又は頸動脈狭窄症、又は脳動脈狭窄症、又は冠状動脈狭窄症、又は血管性認知症、又は一過性黒内障を有する個体を処置する方法であって、有効量の本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子を個体に投与することを含む、方法である。
【００３５】
本明細書において報告される一つの態様は、個体において、コレステロール逆転送を誘導する又はプラーク軽減を誘導する、又は動脈硬化性プラークを清浄するもしくは溶解するもしくは安定化させる、又は動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配する、又はＨＤＬ粒子の数を増加させる、又は内毒素を除去する方法であって、有効量の本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子を個体に投与することを含む、コレステロール逆転送を誘導する、又はプラーク軽減を誘導する、又は動脈硬化性プラークを清浄するもしくは溶解するもしくは安定化させる、又は動脈壁から肝臓にコレステロールを再分配する、又はＨＤＬ粒子の数を増加させる、又は内毒素を除去するための方法である。
【００３６】
一つの実施態様において、非正常な脂質レベルは、体液におけるレベルである。一つの実施態様において、体液は、全血又は血清である。
【００３７】
一つの実施態様において、非正常な脂質レベルは、上昇したコレステロールレベルである。
【００３８】
一つの実施態様において、脂質含有沈着物は、血管におけるプラークである。
【００３９】
一つの実施態様において、疾患は心血管疾患である。
【００４０】
本明細書において報告される一つの態様は、非正常な脂質レベル又は身体の構成要素内における脂質含有沈着物を特徴とする疾患又は病状を処置する方法であって、
ｉ）治療有効量の本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子を、処置又は人工系を必要とする対象に投与すること、及び
ii）場合により、対象の脂質レベル又は脂質含有沈着物の変化についてモニタすることを含む方法である。
【００４１】
本明細書において報告される一つの態様は、急性冠動脈症候群の患者における二次予防のための方法であって、それを必要とする対象に、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子を投与することを含む方法である。
【００４２】
本明細書において報告される一つの態様は、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子を含む診断用組成物であって、サンプル又は対象内における融合タンパク質又は脂質粒子の検出を可能にするために、アポリポプロテイン又は脂質粒子が標識されている診断用組成物である。
【００４３】
本明細書において報告される一つの態様は、診断のための、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子の使用である。
【００４４】
本明細書において報告される一つの態様は、非正常な脂質レベル又は脂質含有沈着物の存在を特徴とする疾患又は病状を患う対象の予防又は治療のための、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子の使用である。
【００４５】
本明細書において報告される一つの態様は、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質をコードする核酸である。
【００４６】
本明細書において報告される一つの態様は、本明細書において報告される核酸を含む細胞である。
【００４７】
一つの実施態様において、細胞は、CSPZ-2、K12株294(ATCC 31446)、B、X 1776(ATCC 31537)、W3110(ATCC 273325)、BL21、RM_82、SCS_110、G、XL-1_F-、SE_13009、LA_5709、C 600、CSH_1、TG_1、UT400、及びUT5600のような大腸菌株より選択される。
【００４８】
本明細書において報告される一つの態様は、単量体が互いに共有結合的に結合していない、単量体である本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を３つ含む多量体である。
【００４９】
発明の詳細な記載
定義
用語「アポリポプロテイン」は、それぞれ脂質又はリポプロテインの粒子中に含まれるタンパク質を意味する。
【００５０】
用語「アポリポプロテインＡ−Ｉ」は、タンパク質−脂質及びタンパク質−タンパク質の相互作用特性を有する両親媒性螺旋状ポリペプチドを意味する。アポリポプロテインＡ−Ｉは、肝臓及び小腸によって２６７個のアミノ酸残基のプレプロ−アポリポプロテインとして合成され、これはプロ−アポリポプロテインとして分泌され、これが切断されて２４３個のアミノ酸残基を有する成熟ポリペプチドとなる。アポリポプロテインＡ−Ｉは、リンカー部分（リンカー部分は、多くの場合プロリンであり、また場合によっては７個の残基で構成される伸長からなる）によって分離されている、各２２個のアミノ酸残基からなる６〜８つの異なるアミノ酸反復からなる。例示的なヒトのアポリポプロテインＡ−Ｉのアミノ酸配列は、GenPeptデータベースエントリ NM-000039又はデータベースエントリ X00566;GenBank NP-000030.1(gi 4557321)に報告されている。ヒトのアポリポプロテインＡ−Ｉ（配列番号０２）には、天然の変異体、例えば、P27H、P27R、P28R、R34L、G50R、L84R、D113E、A-A119D、D127N、K131の欠失、K131M、W132R、E133K、R151C（アミノ酸残基１５１がArgからCysに変化している、アポリポプロテインＡ−Ｉ-Paris）、E160K、E163G、P167R、L168R、E171V、P189R、R197C（アミノ酸残基１７３がArgからCysに変化している、アポリポプロテインＡ−Ｉ−Milano）及びE222Kが存在する。また、保存的アミノ酸改変を有する変異体も含まれる。
【００５１】
一般に、用語「心血管疾患」は、動脈硬化症、冠状動脈性心疾患、脳血管疾患、大動脈腸骨動脈疾患、虚血性心疾患又は末梢血管疾患のような心臓または血管に関する疾患又は病状を意味する。かかる疾患は、心筋梗塞、脳卒中、狭心症、一過性脳虚血発作、うっ血性心不全、大動脈瘤、大部分は対象の死に至るような疾病の結果として、有害事象の前に発見されない場合がある。
【００５２】
用語「コール酸」は、３α、７α、１２α−トリヒドロキシ−５β−コラン−２４−酸又はその塩、特にナトリウム塩を意味する。
【００５３】
互換的に使用することができる、用語「臨界ミセル濃度」及びその省略形「ＣＭＣ」は、それを超えると個々の界面活性剤分子（単量体）が、自発的にミセル（ミセル、球状、棒状、ラメラ構造等）に凝集する表面活性剤又は界面活性剤の濃度を意味する。
【００５４】
用語「保存的アミノ酸改変」は、本発明に係る脂質粒子又はアポリポプロテインの特性に影響を与えたり又は変化させたりしない、アミノ酸配列の改変を意味する。改変は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ介在性突然変異誘発のような当技術分野において公知である標準的な技術により導入することができる。保存的アミノ酸改変には、あるアミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものを含む。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本明細書において「変異体」タンパク質は、最大１０まで、一つの実施態様においては、約２〜約５の付加、欠失、及び／又は置換により、「親」タンパク質のアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なる分子を指す。アミノ酸配列改変は、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327、及びQueen, C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033に記載されているような分子モデリングに基づく突然変異誘発によって実施することができる。
【００５５】
異なるアミノ酸配列の相同性及び同一性は、BLOSUM 30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BLOSUM 55、BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85又はBLOSUM 90のような周知のアルゴリズムを使用して算出することができる。一つの実施態様において、アルゴリズムは、BLOSUM30である。
【００５６】
脂質粒子の形成は、それぞれの転移温度にて、界面活性剤で可溶化した脂質と共にアポリポプロテインをインキュベートすることにより実施することができる。用語「界面活性剤」は、表面活性化学物質を意味する。「界面活性剤」は、一般に、無極性の疎水性部分と極性の親水性部分とを有する両親媒性分子である。用語「双性イオン性界面活性剤」は、全体としてゼロ電荷を有し、かつ同時に少なくとも１つの正に帯電した部分と少なくとも１つの負に帯電した部分とを含む、表面活性化学化合物を意味する。一つの実施態様において、界面活性剤は、糖系界面活性剤、ポリオキシアルキレン系界面活性剤、胆汁酸塩系界面活性剤、合成界面活性剤又はそれらの組合せから選択される。用語「糖系界面活性剤」は、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ノニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド、又は５−シクロヘキシルペンチル−β−Ｄ−マルトピラノシド、及びそれらの誘導体から選択される界面活性剤を意味する。用語「胆汁酸塩系界面活性剤」は、コール酸ナトリウム、コール酸カリウム、コール酸リチウム、３−［（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−イル−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、及びそれらの誘導体から選択される界面活性剤を意味する。用語「ポリオキシアルキレン系界面活性剤」は、Tween 20、Triton X-100、Pluronic F68、及びそれらの誘導体から選択される界面活性剤を意味する。用語「合成界面活性剤」は、Zwittergent 3-6、Zwittergent 3-8、Zwittergent 3-10、Zwittergent 3-12、及びそれらの誘導体から選択される界面活性剤を意味する。
【００５７】
剤（agent）、例えば医薬製剤の「有効量」は、ある投薬量で、かつ必要な期間、所望の治療的又は予防的結果を達成するための有効な量を指す。
【００５８】
互換的に使用することができる、用語「高密度リポプロテイン粒子」又はその省略形「ＨＤＬ粒子」は、主なタンパク質性化合物としてアポリポプロテインＡ−Ｉを含む脂質−タンパク質−複合体を意味する。
【００５９】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、そして外因性の核酸が導入されている細胞を指し、かかる細胞の後代も含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、それに由来する一次形質転換細胞及び後代を含む。後代は、核酸含有量において親細胞と完全に同一ではなくてもよく、しかし突然変異を含有していてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択したのと同じ機能又は生物活性を有する変異体後代も本明細書に含まれる。
【００６０】
用語「脂質排出の増加」及びその文法的等価物は、細胞又はプラークからの脂質排出のレベル及び／又は速度の増加、脂質排出の促進、脂質排出の強化、脂質排出の推進、脂質排出のアップレギュレート、脂質排出の改善、及び／又は脂質排出の増強を意味する。一つの実施態様において、脂質排出は、リン脂質、トリグリセリド、コレステロール、及び／又はコレステロールエステルの排出を含む。
【００６１】
「個体」又は「対象」は、哺乳類である。哺乳類は、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルのような非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むが、これらに限定されない。特定の態様では、個体又は対象は、ヒトである。
【００６２】
用語「ＤＰＰＣ」は、リン脂質１，２−ジ−パルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンを指し、また１，２−ジパルミトイル−ホスファチジルコリンとも呼ばれる。
【００６３】
用語「多量体」は、２個以上の単量体からなる複合体を意味する。多量体は、単量体間の非共有相互作用によって形成される。各単量体は、多量体化ドメインを含む。一つの実施態様において、多量体は、２個又は３個の単量体を含む。別の実施態様において、多量体化ドメインは、各単量体に含まれる個々の多量体化ドメイン間の非共有相互作用を介して相互作用する。用語「多量体化ドメイン」は、２個以上の単量体分子を共有結合又は非共有結合させることができるアミノ酸配列を意味する。多量体化ドメインは、異なるか、類似するか、又は同一のアミノ酸配列の多量体化ドメインと相互作用することができる。一つの実施態様において、多量体化ドメインは、配列番号０３のコンセンサスアミノ酸配列と少なくとも６８％同一であるアミノ酸配列を有するテトラネクチン三量体化構造エレメント又はその誘導体である。一つの実施態様において、配列番号０３の位置５０におけるシステイン残基は、異なるアミノ酸残基によって、別の実施態様においては、セリン残基又はトレオニン残基又はメチオニン残基によって置換されている。多量体化ドメインを含むポリペプチドは、同じく多量体化ドメインを含む１つ以上の他のポリペプチドと結合することができる。多量体の形成は、適切な条件下でポリペプチドを混合することにより簡便に開始させることができる。別の実施態様において、多量体化ドメインは、アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端から１〜１０残基が欠失しているか又は付加されている配列番号０３のアミノ酸配列を有する。更なる実施態様において、多量体化ドメインは、アミノ酸配列のＮ末端から６個又は９個のアミノ酸残基が欠失している配列番号０３のアミノ酸配列を有する。更に別の実施態様において、多量体化ドメインは、Ｎ末端のアミノ酸残基Ｌ又はＮ末端のアミノ酸残基Ｃ及びＬが欠失している配列番号０３のアミノ酸配列を有する。一つの実施態様において、多量体化ドメインは、テトラネクチン三量体化構造エレメントであり、そして、配列番号０３のアミノ酸配列を有する。多量体は、一つの実施態様において、ホモマーである。
【００６４】
多量体化ドメインを含む異なるアポリポプロテインを組み合わせて多量体に組み込むこともできるので、多量体は、ホモマーであっても又はヘテロマーであってもよい。一つの実施態様において、多量体は、ホモ三量体である。
【００６５】
一つの実施態様によれば、多量体化ドメインは、テトラネクチンから得られる。一つの実施態様において、多量体化ドメインは、配列番号０４のアミノ酸配列を有するテトラネクチン三量体化構造エレメントを含む。テトラネクチン三量体化構造エレメントの三量体化作用は、２つの他のテトラネクチン三量体化構造エレメントのコイルドコイル構造と相互作用して三量体を形成するコイルドコイル構造により引き起こされる。テトラネクチン三量体化構造エレメントは、ヒトのテトラネクチン、ウサギのテトラネクチン、マウスのテトラネクチン、又はサメ軟骨のＣ型レクチンから得ることができる。一つの実施態様において、テトラネクチン三量体化構造エレメントは、配列番号０３のコンセンサス配列と少なくとも６８％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８１％、又は少なくとも８７％、又は少なくとも９２％の同一性を有する配列を含む。
【００６６】
用語「非共有相互作用」は、イオン性相互作用力（例えば、塩橋）、非イオン性相互作用力（例えば、水素結合）、又は疎水性相互作用力（例えば、ファンデルワールス（van-der-Waals）力又はπスタッキング相互作用）のような非共有結合力を意味する。
【００６７】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性の割合（％）」は、配列を整列させ、そして必要に応じて、配列同一性の割合の最大化を達成するためにギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義され、任意の保存的置換は配列同一性の一部として考慮しない。アミノ酸配列同一性の割合を決定するためのアライメントは、当技術分野における技術の範囲内にある様々な方法で、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェアのような公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長に対して最大のアライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかし、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性の割合（％）の値は、配列比較コンピュータプログラム ALIGN-2を使用して求められる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech, Inc.によって開発され、そして、ソースコードは、U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559においてユーザ文書と共に保管されており、そこで米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に入手可能であるか又はソースコードからコンパイルすることもできる。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステムで使用するためにコンパイルしなければならない。配列比較パラメータは全て、ALIGN-2プログラムによって設定されており、変化しない。
【００６８】
アミノ酸配列比較のためにALIGN-2を使用する場合、所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性の割合（％）（これは、あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂに対して特定のアミノ酸配列同一性の割合（％）を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと表現することもできる）は、以下のとおり算出される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
［式中、Ｘは、配列アラインメントプログラムALIGN-2による、そのプログラムのＡ及びＢのアラインメントにおいて同一であると記録されたアミノ酸残基の数であり、そして、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である］。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性の割合（％）が、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性の割合（％）とは等しくならないことが理解されるであろう。特記のない限り、本明細書において使用されるアミノ酸配列の同一性の割合（％）の値は全て、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して、直前の段落に記載のとおり得られる。
【００６９】
用語「医薬組成物」は、それに含有されている活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、かつ前記製剤が投与される対象に対して許容し得ないほど毒性である追加成分を含有しない調製物を指す。
【００７０】
「薬学的に許容し得る担体」は、対象に対して無毒である、医薬製剤における活性成分以外の成分を指す。薬学的に許容し得る担体は、緩衝液、賦形剤、安定剤又は保存剤を含むが、これらに限定されない。
【００７１】
用語「ホスファチジルコリン」は、１つのグリセロール部分、２つのカルボン酸部分、及び１つのホスホコリン部分からなる分子を意味し、該グリセロール部分は、それぞれエステル結合、すなわち、２つのカルボン酸エステル結合及び１つのリン酸エステル結合により他の部分に共有結合し、それによって該リン酸エステル結合は、該グリセロール部分の１−ヒドロキシル基又は３−ヒドロキシル基のいずれかに結合する。用語「カルボン酸部分」は、少なくとも１つのアシル基（Ｒ−Ｃ（Ｏ）Ｏ）を含む有機部分を意味する。ホスファチジルコリンは、任意の種類又は起源であってよい。一つの実施態様において、ホスファチジルコリンは、卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジラウリルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、１−オレオイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、ならびにこれらの類似体及び誘導体から選択される。
【００７２】
本明細書で使用するリン脂質は全て、任意の起源、すなわち（適切な場合には）大豆、乳、卵又はさらにはヒト以外の動物の内臓に由来してよく、それらは、天然由来であっても、又は半合成であっても、又はさらには完全に合成であってもよい。
【００７３】
用語「ＰＯＰＣ」は、リン脂質１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリンを指し、また１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルコリンとも呼ばれる。
【００７４】
本明細書で使用する「処置（treatment）」（及び「処置する（treat）」又は「処置すること（treating）」のような文法上の変形）は、処置される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、そして、予防のために又は臨床病理の間に行うことができる。処置の望ましい効果は、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の減少、転移を予防すること、疾患の進行の速度を低下させること、病態の寛解又は緩和、及び緩解又は予後の改善を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発生を遅らせるか又は疾患の進行を緩徐にするために使用される。
【００７５】
用語「変異体」は、本明細書に報告されるアポリポプロテイン又はアポリポプロテイン模倣物の変異体も含み、該変異体においては、アポリポプロテイン又はアポリポプロテイン模倣物それぞれのアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失を含む。この改変は、アポリポプロテイン受容体又はアポリポプロテイン転換酵素に対するアポリポプロテインの親和性を増加させる場合も又は減少させる場合もあり、あるいはそれぞれのアポリポプロテインに比べてアポリポプロテイン変異体の安定性を上昇させる場合もあり、あるいはそれぞれのアポリポプロテインに比べて水溶液中のアポリポプロテイン変異体の溶解度を上昇させる場合もあり、あるいはそれぞれのアポリポプロテインに比べて宿主細胞における／宿主細胞によるアポリポプロテイン変異体の組換え体生成を増加させる場合もある。
【００７６】
短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質
本明細書において、短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質が報告される。
【００７７】
短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質は、Ｎ末端で短縮されたヒトテトラネクチン三量体化構造エレメントと野性型ヒトアポリポプロテインＡ−Ｉとの融合タンパク質である。ヒトテトラネクチン部分のアミノ酸配列は、最初の９アミノ酸だけ短縮されており、したがって位置１０のイソロイシン残基から始まり、そしてＮ末端アミノ酸残基プロリンだけ拡張される。この短縮の結果として、位置４のスレオニン残基での自然発生のＯ−グリコシル化部位が欠失されている。テトラネクチン三量体化構造エレメントとヒトアポリポプロテインＡ−Ｉの間で、５アミノ酸残基「ＳＬＫＧＳ」（配列番号０５）が除去された。
【００７８】
短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質は、配列番号０１のアミノ酸配列を持つことができるか、又は少なくとも７０％配列同一性を有するその変異体である。
【００７９】
テトラネクチン三量体化構造エレメントは、個々の単量体の各々の間の非共有相互作用により構成される多量体を含む、三量体の短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質の形成を可能にするドメインを提供する。
【００８０】
一つの実施態様において、野生型ヒトアポリポプロテインＡ−Ｉは、保存的アミノ酸置換を含む変異体であることができる。
【００８１】
アポリポプロテインＡ−Ｉは、ＮＭＲ分光法を介して、又はモノクローナルもしくはポリクローナル抗アポリポプロテインＡ−Ｉ抗体の使用によって、酵素的に決定することができる。したがって、本明細書に報告される他の態様は、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質に特異的に結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体である。かかる抗体は、当業者に公知の方法によって得ることができる。また、イムノアッセイにおける使用のための、融合タンパク質、融合タンパク質を含む脂質粒子、及び融合タンパク質又は脂質粒子に結合する抗体の標識は、当業者に公知の方法を用いて実施することができる。
【００８２】
一つの実施態様において、野生型ヒトアポリポプロテインＡ−Ｉは、１〜１０の保存的アミノ酸置換を含む変異体である。
【００８３】
このように、一つの実施態様において、短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質は、
【化２】
2014529602.tif 000004
のアミノ酸配列を有する。
【００８４】
配列番号０１のアミノ酸配列を有する短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質は、例えば、１つのさらなるＮ末端アミノ酸を有する融合タンパク質として、より少ない副生成物と共に得られる。これを以下の表に示す。
【００８５】
【表１】
2014529602.tif 000005
【００８６】
短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質が大腸菌中で生成される場合、それは封入体から得られる。
【００８７】
脂質粒子
本明細書において、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を含む脂質粒子が報告される。
【００８８】
一つの実施態様において、脂質粒子は、
ａ）本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質と、
ｂ）ホスファチジルコリンと、
ｃ）さらなる脂質とを含む。
【００８９】
一つの実施態様において、脂質粒子は、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質、第１のホスファチジルコリン及び第２のホスファチジルコリンを含む。一つの実施態様において、第１のホスファチジルコリン及び第２のホスファチジルコリンは、ホスファチジルコリンのホスホグリセロール骨格にエステル化される１つもしくは２つのカルボン酸部分又はカルボン酸部分誘導体において異なる。一つの実施態様において、第１のホスファチジルコリンは、ＰＯＰＣであり、そして第２のホスファチジルコリンは、ＤＰＰＣである。
【００９０】
一つの実施態様において、脂質粒子中の短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質、ホスファチジルコリン、及びさらなる脂質は、非共有結合的に関連する。
【００９１】
脂質の組み合わせの選択は、アポリポプロテインを含む脂質粒子の効力及び肝臓の安全性を決定する。ウサギを用いた脂質粒子を含むＤＭＰＣのインビボ試験において、３０mg/kgで処理したウサギは、生存しているが重篤な副作用を示し、一方、１００mg/kgで処理したウサギは死亡したことが見出された。
【００９２】
インビトロの機能テストでは、単一のホスファチジルコリン（例えば、ＤＰＰＣ又はＰＯＰＣ）を含有する脂質粒子がＬＣＡＴを活性化することが確認された。
【００９３】
また、脂質粒子が異なるリン脂質の組み合わせを含む場合、コレステロール排出がより高いことが示された。以下の表に、インビボのウサギ試験のために調整した脂質組成において異なるリン脂質の組み合わせで得られた結果を示す。
【００９４】
【表２】
2014529602.tif 000006
【００９５】
これらの結果はまた、インビボデータにより確認され、全ての組み合わせについてのコレステロール動員を実証した。しかし、単一のホスファチジルコリンＤＰＰＣのみ、又はＤＰＰＣとスフィンゴミエリン（ＳＭ）との組み合わせを含有する脂質粒子について、肝酵素の増加を測定した（図１）。
【００９６】
技術的な観点から、純粋なＤＰＰＣを用いた脂質粒子の形成は、純粋なＰＯＰＣを用いた形成と比較して、より簡便である。沈殿物形成のリスクが、異なるリン脂質の組み合わせを使用することにより低減される。また、純粋なＤＰＰＣは相転移温度が４１℃であるので、相転移温度が４℃である純粋なＰＯＰＣと比較して、脂質粒子の調製がより容易である。また得られた生成物は、より均質である。これは、タンパク質−脂質組成の決定（タンパク質コンジュゲート分析）も可能にする分析ツールであるＳＥＣ−ＭＡＬＬＳを介した脂質粒子分析により確認することができる。図２において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＵＶ２８０検出）において分解されたサンプルのクロマトグラムを示す。サンプルの不均質性は、分離されたピーク又は半ば離れたピークが複数発生したことから見ることができる。
【００９７】
脂質粒子を生成するために純粋なＰＯＰＣが使用される場合の脂質粒子中のアポリポプロテイン単量体１個当たりのＰＯＰＣ分子の数は、一つの実施態様において４０〜８５、一つの実施態様において５０〜８０、及び一つの実施態様において５４〜７５である。
【００９８】
脂質粒子を生成するために純粋なＤＰＰＣが使用される場合の脂質粒子中のアポリポプロテイン単量体１個当たりのＤＰＰＣ分子の数は、一つの実施態様において５０〜１５０、一つの実施態様において６５〜１３５、一つの実施態様において７６〜１２３、及び一つの実施態様において８６〜１０２である。
【００９９】
脂質粒子を生成するためにモル比１：３でＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子中のアポリポプロテイン単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、一つの実施態様において約５０〜約１２０、一つの実施態様において約６５〜約１０５、及び一つの実施態様において約７２〜約９６である。
【０１００】
脂質粒子を生成するためにモル比１：１でＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子中のアポリポプロテイン単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、一つの実施態様において５０〜１２０、一つの実施態様において６０〜１００、及び一つの実施態様において７１〜９２である。
【０１０１】
脂質粒子を生成するためにモル比３：１でＰＯＰＣとＤＰＰＣとの混合物を使用する場合の脂質粒子中のアポリポプロテイン単量体１個当たりのリン脂質分子の数は、一つの実施態様において５０〜９０である。一つの実施態様において、該数は、６０〜９０である。一つの実施態様において、該数は、６０〜８８である。一つの実施態様において、該数は、６０〜８０である。
【０１０２】
アポリポプロテイン及びＰＯＰＣを含む脂質粒子の生成の場合、一つの実施態様においてアポリポプロテインのＰＯＰＣに対するモル比１：４０〜１：１００を用い、一つの実施態様においてモル比１：４０〜１：８０を用い、及び一つの実施態様においてモル比約１：６０を用いる。
【０１０３】
アポリポプロテイン及びＤＰＰＣを含む脂質粒子の生成の場合、一つの実施態様においてアポリポプロテインのＤＰＰＣに対するモル比１：７０〜１：１００を用い、一つの実施態様においてモル比１：８０〜１：９０を用い、及び一つの実施態様においてモル比約１：８０を用いる。
【０１０４】
アポリポプロテイン、ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣを含む脂質粒子の生成の場合、一つの実施態様においてアポリポプロテインのＰＯＰＣ及びＤＰＰＣ（ここで、ＰＯＰＣとＤＰＰＣとのモル比、１：３）に対するモル比１：６０〜１：１００を用い、一つの実施態様においてモル比１：７０〜１：９０を用い、及び一つの実施態様においてモル比約１：８０を用いる。
【０１０５】
アポリポプロテイン、ＤＰＰＣ、及びＰＯＰＣを含む脂質粒子の生成の場合、一つの実施態様においてアポリポプロテインのＰＯＰＣ及びＤＰＰＣ（ここで、ＰＯＰＣとＤＰＰＣとのモル比、１：１）に対するモル比１：６０〜１：１００を用い、一つの実施態様においてモル比１：６０〜１：８０を用い、及び一つの実施態様においてモル比約１：７０を用いる。
【０１０６】
アポリポプロテイン、ＤＰＰＣ、及びＰＯＰＣを含む脂質粒子の生成の場合、一つの実施態様においてアポリポプロテインのＰＯＰＣ及びＤＰＰＣ（ここで、ＰＯＰＣとＤＰＰＣは、３：１のモル比である）に対するモル比１：５０〜１：１００を用いる。一つの実施態様において、モル比１：５０〜１：７０を用いる。一つの実施態様において、モル比約１：６０を用いる。
【０１０７】
一つの実施態様において、脂質粒子を生成するために脂質の混合物を使用する場合、該混合物は、４℃〜４５℃、一つの実施態様において１０℃〜３８℃、及び一つの実施態様において１５℃〜３５℃の相転移温度を有する。
【０１０８】
脂質粒子は、一つの実施態様において脂質粒子１個当たり平均数１〜１０個の融合タンパク質分子、一つの実施態様において脂質粒子１個当たり平均数１〜８個の融合タンパク質分子、及び一つの実施態様において脂質粒子１個当たり平均数１〜４個の融合タンパク質分子を含む。
【０１０９】
一つの実施態様において、脂質粒子は、脂質粒子１個当たり平均数少なくとも１、又は２、又は３、又は４、又は５、又は６、又は７、又は８、又は９、又は１０個の融合タンパク質分子を含む。一つの実施態様において、平均数は、１である。
【０１１０】
一つの実施態様において、脂質粒子は、融合タンパク質に加えて１つ以上のさらなるポリペプチドを含む。
【０１１１】
非限定的に、脂質粒子は、酵素の補因子として及び／又は脂質、特にコレステロールを取り込むためのキャリアとして機能することができる。
【０１１２】
１つ以上の界面活性剤が、本明細書に報告される脂質粒子中に存在することができる。かかる界面活性剤は、任意の界面活性剤、すなわち、薬学的に許容し得る界面活性剤又は無毒な濃度の他の界面活性剤、例えば非イオン性又はイオン性界面活性剤等であることができる。非イオン性界面活性剤は、１つ以上のヒドロキシル基を含有する有機化合物のアルキレンオキシド誘導体であることができる。
【０１１３】
一つの実施態様において、非イオン性界面活性剤は、エトキシル化及び／又はプロポキシル化されたアルコール、あるいはそのエステル化合物又はその混合物から選択される。一つの実施態様において、エステルは、ソルビトールと脂肪酸とのエステル、例えば、ソルビタンモノオレエート又はソルビタンモノパルミテート、油性ショ糖エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンステロールエーテル、ポリオキシエチレン−ポリプロポキシアルキルエーテル、ブロック重合体及びセチルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油又は硬化ヒマシ油誘導体、及びポリグリセリン脂肪酸エステルから選択される。
【０１１４】
一つの実施態様において、非イオン性界面活性剤は、Pluronic（登録商標）、Poloxamer（登録商標）、Span（登録商標）、Tween（登録商標）、Polysorbate（登録商標）、Tyloxapol（登録商標）、Emulphor（登録商標）又はCremophor（登録商標）から選択される。
【０１１５】
イオン性界面活性剤は、胆管剤であることができる。一つの実施態様において、イオン性界面活性剤は、コール酸もしくはデオキシコール酸、又はこれらの塩及び誘導体から、あるいはオレイン酸、リノール酸等のような遊離脂肪酸から選択される。
【０１１６】
一つの実施態様において、イオン性界面活性剤は、Ｃ１０−Ｃ２４アルキルアミン又はアルカノールアミンのようなカチオン性脂質、及びカチオン性コレステロールエステルから選択される。
【０１１７】
一つの実施態様において、脂質粒子は、０．７５重量％未満の界面活性剤を含む。
【０１１８】
一つの実施態様において、脂質粒子は、０．３重量％未満の界面活性剤を含む。
【０１１９】
一つの実施態様において、界面活性剤は、糖系界面活性剤、ポリオキシアルキレン系界面活性剤、胆汁酸塩系界面活性剤、合成界面活性剤又はこれらの組合せから選択される。一つの実施態様において、界面活性剤はコール酸である。
【０１２０】
特性:
本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子は、非正常な脂質レベル、又は血管におけるプラークのような身体の構成要素内における脂質の沈着物を特徴とする疾患又は病状の処置及び／又は診断のために使用することができる。
【０１２１】
ＬＣＡＴによって触媒されるコレステロールのエステル化を補助する本明細書に報告される脂質粒子の能力を測定するために、エタノール性コレステロール溶液を添加することにより、コレステロールを脂質粒子に組み込むことができる。純粋なＰＯＰＣを含有する脂質粒子は、野生型アポリポプロテインＡ−Ｉ又はテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉのようなアポリポプロテイン成分とは無関係に、ＤＰＰＣを含有する複合体よりも優れたＬＣＡＴ基質である（図３）。
【０１２２】
ＰＯＰＣとＤＰＰＣとの様々な混合物を含む脂質粒子におけるコレステロールのエステル化の初期速度は、該混合物が単一の純粋なホスファチジルコリンよりも優れたＬＣＡＴ基質であることを示す。このことは、コレステロールのエステル化の初期速度から分かる（以下の表及び図４を参照されたい）。
【０１２３】
【表３】
2014529602.tif 000007
【０１２４】
ＴＨＰ−１単球性白血病細胞をホルボールミリスチン酸アセテートに曝露することにより得られ、かつ放射性標識されたコレステロールトレーサがロードされているヒトＴＨＰ１細胞のようなマクロファージを、コレステロールアクセプター試験化合物に曝露することができる。
【０１２５】
アクセプター試験化合物によって誘導される排出速度を、上清中のコレステロール放射活性の、細胞及びその上清中の放射活性の合計に対する比として算出し、そしてアクセプターを含有しない培地に曝露した細胞と比較し、そして線形近似によって分析することができる。主にＡＢＣＡ−１をアップレギュレートし、そしてＡＢＣＡ−１媒介輸送に排出を偏らせることが知られているＲＸＲ−ＬＸＲアゴニストに曝露された細胞、及び曝露されていない細胞を用いて、並行実験を実施することができる。
【０１２６】
ＲＸＲ−ＬＸＲ脂質粒子で予め処理されない細胞では、脂質付加されていないテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉにより得られる排出に比べてコレステロール排出がより増加することが分かる。一連の試験において、排出に対する脂質混合物のほんのわずかな影響を観察することができる（図５）。ＲＸＲ−ＬＸＲで予め処理された細胞では、脂質付加されていないテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉを用いて、コレステロール排出が同等に増加することが分かる。予め処理されていない細胞で観察された増加と比較して、全体的な増加はより多かった。一連の試験において、排出に対する脂質混合物のほんのわずかな影響を観察することができる（図６）。
【０１２７】
様々な脂質粒子をウサギにおいてインビボで試験した。脂質粒子を静脈注射として適用し、そして適用後９６時間にわたって連続的に血液サンプリングを実施した。肝酵素、コレステロール及びコレステロールエステルの値を測定した。血漿中濃度は、全ての試験脂質粒子について同程度（血漿中濃度の初期分布相に続いて対数線形下落を含む）であった（図７）。以下の表から分かるとおり、薬物動態パラメータは、全ての試験化合物について類似している。観察された半減期は、およそ１．５日である。
【０１２８】
【表４】
2014529602.tif 000008
【０１２９】
図８から分かるとおり、コレステロールは、血漿中に動員され、そしてエステル化される。テトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉの濃度が既に減少し始めた後でさえも、血漿コレステロールエステルレベルは上昇し続ける。血漿テトラネクチン−アポリポプロテインレベルが約０．５mg/mL（正常な野性型アポリポプロテインＡ−Ｉの約５０％）まで減少しても、依然としてコレステロールエステルレベルの増加を検出することができる。
【０１３０】
テトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉを含む脂質粒子は、図１及び９から分かるとおり、ウサギに加えてマウスでも肝酵素を誘導しない。また、静脈適用の２時間後に得られた血漿サンプルにおいて、溶血を測定することはできない（図１０）。
【０１３１】
したがって、本明細書に報告される態様は、本明細書において報告される短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又は本明細書において報告される脂質粒子を含む、医薬組成物及び診断用組成物である。
【０１３２】
本明細書において報告される脂質粒子は、以下の表に示すとおり、脂質付加されていないアポリポプロテイン及び他の脂質粒子に比べて、インビボにおける特性が改善された。
【０１３３】
【表５】
2014529602.tif 000009
【０１３４】
コレステロールが血液中に動員される効率は、アポリポプロテインをインビボで投与した後に、総コレステロール濃度とアポリポプロテイン濃度とのそれぞれの可動域を比較することにより測定することができる。定量的評価については、基準線補正された総コレステロールの濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）及びアポリポプロテインの濃度−時間曲線下面積の指数を算出した。
【０１３５】
本明細書において報告される脂質粒子、特に、配列番号０１のテトラネクチン−アポリポプロテインならびにＰＯＰＣ及びＤＰＰＣ（モル比３：１）を含む脂質粒子は、増強されたインビボでのコレステロール動員を示す。
【０１３６】
脂質粒子の形成
本明細書に報告される脂質粒子の形成については、凍結乾燥、凍結融解、界面活性剤可溶化に続いて透析、顕微溶液化、超音波処理、及び均質化のような様々な方法が公知である。
【０１３７】
例えば、リン脂質と界面活性剤との水性混合物を、精製されたアポリポプロテインと共にインキュベートすることができる。アポリポプロテインは、未変性形態で添加することができる。界面活性剤は、透析又はダイアフィルトレーションによって、後に除去される。短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を含む脂質粒子の形成は、単量体又は多量体の形態の短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を、界面活性剤可溶化脂質と共にそれぞれの転移温度においてインキュベートすることにより達成することができる。透析による界面活性剤の除去により、脂質粒子が形成される。アポリポプロテインを含有する脂質粒子の形成のための一般的な方法は、例えば、Jonas, A., Methods Enzymol. 128 (1986) 553-582又はExperimental Lung Res. 6 (1984) 255-270に記載されているようなコール酸法に基づく。透析による界面活性剤の除去により、脂質粒子が形成される。
【０１３８】
脂質粒子を形成するために考慮しなければならない要点は、ｉ）生物活性についての要件、及びii）脂質粒子の製造可能性に対する技術的要件である。アポリポプロテインを含む脂質粒子の形成については、これら要件は相反する。
【０１３９】
技術的な視点からは、炭素原子１６個以下の鎖を有するカルボン酸部分を含有する飽和リン脂質（例えば、ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＰＰＣ；ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＭＰＣ等）が選択される。これとは対照的に、生物学的データからは、炭素原子が少なくとも１６個のカルボン酸部分を含有する非飽和リン脂質（例えば、パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＰＯＰＣ；ステアロイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＳＯＰＣ）がより有効であり、そして、肝毒性を有しないと推測することができる。
【０１４０】
ホスファチジルコリンＤＰＰＣ及びＰＯＰＣ、ならびにこれらの混合物を、アポリポプロテインを含有する脂質粒子の形成のために使用することができる。これら例示的なホスファチジルコリンは、１つのカルボン酸部分が異なり、かつホスホグリセロール骨格にエステル化される１つの同一のカルボン酸部分を有する。脂質粒子の製造は、ＤＰＰＣを使用したときより容易である。対照的に、ＰＯＰＣは、特に、動員されたコレステロールをコレステロールエステルに変換するために必要なレシチンコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）酵素の活性化のための基質として、インビトロ機能アッセイにおいてより有効である。例えば、ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣのような２種のホスファチジルコリンの混合物を様々なモル比で含む脂質粒子は、ホスファチジルコリンを１種しか含まない脂質粒子に比べて、改善された特性を有することが見出されている（例えば、図４を参照されたい）。
【０１４１】
ヒトＨＤＬ（ＨＤＬ＝高密度リポプロテイン）粒子に由来する組換え型アポリポプロテイン又は脱脂型アポリポプロテインから脂質粒子を再構成する様々な方法が報告されている。例えば、リン脂質と界面活性剤との水性混合物を、精製されたアポリポプロテインと共にインキュベートする。アポリポプロテインは、未変性形態で添加される。界面活性剤は、透析又はダイアフィルトレーションによって、後に除去される。短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を含む脂質粒子の形成は、短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質又はその多量体を界面活性剤可溶化脂質と共にそれぞれの転移温度においてインキュベートすることにより達成することができる。透析により界面活性剤の除去により、脂質粒子が形成される。
【０１４２】
脂質粒子は、沈澱及び／又はクロマトグラフィー工程の組合せによって精製することができる。例えば、過剰な界面活性剤、すなわち、脂質粒子の一部ではない界面活性剤は、疎水性吸着クロマトグラフィー工程で除去することができる。脂質粒子は、界面活性剤を含まない溶液を用いて疎水性吸着材から回収することができる。
【０１４３】
本発明の理解を助けるために以下の実施例、配列表及び図面を提供し、その真の範囲を添付の特許請求の範囲に記載する。本発明の趣旨から逸脱することなく、記載されている手順を変更できることを理解されたい。
【０１４４】
配列表の説明
配列番号０１      短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパ                    ク質。
配列番号０２      ヒトアポリポプロテインＡ−Ｉ。
配列番号０３      ヒトテトラネクチン三量体形成ドメイン。
配列番号０４      短縮されたヒトテトラネクチン三量体形成ドメイン．
配列番号０５      切断されたペプチド。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】脂質組成の異なる５つの脂質粒子を用いて実施したウサギのインビボ研究の結果。上：調製したバッチの全てについて、コレステロール動員、ひいては有効性を示すことができた。下：単一のリン脂質としてＤＰＰＣの使用により作製された脂質粒子について、肝酵素の増加が認められた。
【図２】本発明によるＰＯＰＣ及びアポリポプロテイン（モル比、１：２０〜１：１６０）の脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析。
【図３】ＬＣＡＴ活性に対するＤＰＰＣ及びＰＯＰＣの影響。
【図４】ＰＯＰＣ及び／又はＤＰＰＣを含有する脂質粒子におけるコレステロールのエステル化の初速度。
【図５】ＲＸＲ−ＬＸＲアゴニストで刺激していない細胞における、ＴＨＰ−１に由来する泡沫細胞へのコレステロール排出。
【図６】ＲＸＲ−ＬＸＲアゴニストを使用してＡＢＣＡ−Ｉ経路を活性化した後の、ＴＨＰ−１に由来する泡沫細胞へのコレステロール排出。
【図７】様々なアポリポプロテイン組成物の時間依存性血漿中濃度。
【図８】血漿における、コレステロール動員及びエステル化の時間及び濃度経過。
【図９】１００mg/kgの単回静脈内注射（i.v.）後の、マウスにおける本発明によるアポリポプロテインを含む様々な組成物による肝酵素放出の比較。
【図１０】インビボにおけるウサギの研究 − 血漿における自発的溶血。
【図１１】モル比１：２０〜１：１６０で得られたＰＯＰＣ及びテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉの脂質粒子のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析。
【図１２ａ】ＤＭＰＣ（１：１００）（ジミリストイルホスファチジルコリン）で脂質付加されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ（ａ）及びＰＢＳ中で脂質付加されなかったテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ（ｂ）を用いて実施した、ウサギのインビボにおける研究の結果。
【図１２ｂ】ＤＭＰＣ（１：１００）（ジミリストイルホスファチジルコリン）で脂質付加されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ（ａ）及びＰＢＳ中で脂質付加されなかったテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ（ｂ）を用いて実施した、ウサギのインビボにおける研究の結果。
【図１３Ａ】５℃及び４０℃で保存した、野生型のアポリポプロテインＡ−Ｉ（Ａ）及び本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ（Ｂ）を含有する脂質粒子のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１３Ｂ】５℃及び４０℃で保存した、野生型のアポリポプロテインＡ−Ｉ（Ａ）及び本明細書に報告されるテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ（Ｂ）を含有する脂質粒子のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【０１４６】
材料及び方法
サイズ排除ＨＰＬＣ：
クロマトグラフィーは、ASI-100 ＨＰＬＣシステム（Dionex, Idstein, Germany）においてTosoh Haas TSK 3000 SWXLカラムを用いて実施した。溶出ピークは、ＵＶダイオードアレイ検出器（Dionex）によって２８０nmでモニタした。濃縮サンプルを１mg/mLになるように溶解させた後、安定したベースラインに達するまで、カラムを緩衝液（２００mMのリン酸二水素カリウム及び２５０mMの塩化カリウムからなる、ｐＨ７．０）で洗浄した。分析は、均一濃度条件下において０．５mL／分の流速を使用して３０分かけて室温で実施した。クロマトグラムは、Chromeleon（Dionex, Idstein, Germany）を用いて手動で積分した。凝集率（％）は、高分子量形態の曲線下面積（ＡＵＣ）を単量体ピークのＡＵＣと比較することにより求めた。
【０１４７】
動的光散乱（ＤＬＳ）：
ＤＬＳは、典型的にはサブミクロンサイズ範囲で粒径を測定するための非侵襲性技術である。本発明では、温度制御された石英キュベット（２５℃）を備えるZetasizer Nano S装置（Malvern Instruments, Worcestershire, UK）を使用して、１nm〜６μmの粒径範囲をモニタした。後方散乱レーザー光線の強度は、１７３°の角度で検出した。強度は、粒子拡散速度に依存する割合で変動し、該粒子拡散速度は、粒径によって管理される。したがって、粒径データは、散乱光強度における変動の分析から作成される（Dahneke, B.E. (ed.), Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc. (1983); Pecora, R., Dynamic Light Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press (1985)）。強度による粒度分布は、DTSソフトウェア（Malvern）の複数ナローモードを使用して算出した。実験は、未希釈のサンプルを用いて行った。
【０１４８】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ：
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳは、以下の３つの検出器システムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーの組合せである：ｉ）ＵＶ検出、ii）屈折率検出、及びiii）光散乱検出。サイズによる分離については、GE Healthcare製のSuperose 6カラム10/300 GLカラムを使用する。方法は、０．４mL／分の流速を適用し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて均一濃度で実行する。３つの検出器システムは、直列に接続する。完全な脂質粒子（タンパク質−脂質粒子）のシグナルは、屈折率検出器によってモニタされ、一方、２８０nmで測定されるＵＶ吸光度は、タンパク質部分によって誘導されるシグナルを測定する。脂質画分の比率は、完全なシグナルからタンパク質のＵＶシグナルを単に減じることによって得られる。光散乱の適用により、それぞれの種の分子量の検出、ひいては脂質粒子を完全かつ詳細に説明することが可能になる。
【０１４９】
界面活性剤の測定：
残留界面活性剤の測定は、蒸発光散乱検出器に連結された逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＥＬＳＤ）によって実施した。カラムとして、Phenomenex（Aschaffenburg, Germany）製のLuna C18 ４．６×１５０mm、５μm、１００Åを使用した。１０kDaの膜による遠心分離を行った後、９０μLのフロースルーをＨＰＬＣ分離に使用した。溶出は、０．１％（v/v）のトリフルオロ酢酸を含有する７４％（v/v）のメタノール溶液を用いて、均一濃度条件下で実施した。カラムの温度は、３０℃に設定した。検出は、３０℃の噴霧化温度、８０℃の蒸発温度、及び１．０Ｌ／分のガス流を適用して、蒸発光散乱検出器によって実施した。残留界面活性剤の定量は、０．２２μg〜７．５μgコール酸の範囲のコール酸の場合、検量線の確立によって実施した。
【０１５０】
タンパク質の定量：
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて算出されたモル吸光係数を使用して、２８０nmにおける光学密度（ＯＤ）を測定することにより決定した。
【０１５１】
組換えＤＮＡ技術：
Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring   Harbor, New York(1989)に記載のとおり、標準分析法を用いてＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の指示書に従って使用した。
【０１５２】
実施例１
大腸菌の発現プラスミドの作製及び説明
短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を、組換え手段によって調製した。発現した融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端方向において配列番号０１のアミノ酸配列を有する。
【０１５３】
コード化融合遺伝子は、適切な核酸セグメントの接続によって、公知の組換え方法及び技術により構築される。化学合成によって作製した核酸配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認される。配列番号０１の融合タンパク質の生成のための発現プラスミドは、以下のように調製することができる：
【０１５４】
プラスミド１（1-pBRori-URA3-LACI-SAC）は、大腸菌におけるコア−ストレプトアビジンの発現のための発現プラスミドである。プラスミド１は、プラスミド２（2-pBRori-URA3-LACI-T-反復；EP-B 1 422 237に報告されている）に由来する3142bp長のEcoRI/CelIIベクター断片と、コア−ストレプトアビジンをコードする435bp長のEcoRI/CelII断片とをライゲーションさせることにより作製した。
【０１５５】
コア−ストレプトアビジン大腸菌発現プラスミドは、以下のエレメントを含む：
−  大腸菌における複製用のベクターpBR322由来の複製開始点（Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90による2517〜3160 bp位置に対応する）、
−  大腸菌のpyrF突然変異株（ウラシル栄養要求性）の補完によりプラスミド選択を可能にする、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（Rose, M. et al. Gene 29 (1984) 113-124）をコードする出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のURA3遺伝子、
−  以下を含むコア−ストレプトアビジン発現カセット
−  Stueber, D., et al.（上記を参照されたい）による合成リボソーム結合部位を含むＴ５ハイブリッドプロモーター（Bujard, H., et al. Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433及びStueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモータ）、
−  コア−ストレプトアビジン遺伝子、
−  ２つのバクテリオファージに由来する転写ターミネーター：λ−T0ターミネーター（Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414）及びfd−ターミネーター（Beck E. and Zink, B. Gene 1-3 (1981) 35-58）、
−  大腸菌に由来するlacI抑制因子遺伝子（Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769）。
【０１５６】
短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質の発現のための最終的な発現プラスミドは、単一の隣接するEcoRI及びCelII制限エンドヌクレアーゼ切断部位を用いてプラスミド１からコア−ストレプトアビジン構造遺伝子を切り取り、そしてEcoRII/CelII制限部位に隣接している融合遺伝子をコードする核酸を、3142 bp長のEcoRI/CelII-1プラズミド断片に挿入することにより、調製することができる。
【０１５７】
実施例２
テトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉの発現
本明細書において報告される融合タンパク質の発現のために、大腸菌の栄養要求性（PyrF）の補完により抗生物質を用いずにプラスミド選択を可能にする大腸菌ホスト／ベクター系を使用した（EP 0 972 838及びUS 6,291,245）。
【０１５８】
大腸菌のK12株CSPZ-2（leuB、proC、trpE、th-1、ΔpyrF）を、発現プラスミドのエレクトロポレーション（電気穿孔）によって、形質転換した。形質転換された大腸菌細胞を、まず、寒天平板上で３７℃にて増殖させた。
【０１５９】
予備発酵のために、約１ｇ／ＬのＬ−ロイシン、約１ｇ／ＬのＬ−プロリン、及び約１mg／ＬのチアミンＨＣｌを補充したSambrook, et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)）によるＭ９培地を使用した。
【０１６０】
予備発酵のために、整流装置を備えた１０００mL容量のエルレンマイヤーフラスコ中のＭ９培地３００mLに、初代種子バンクアンプルのうちの２mlを接種した。１〜３の光学密度（５７８nm）が得られるまで、培養を３７℃で１３時間回転振盪機において実施した。
【０１６１】
発酵のために、Riesenberg, et al.（Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 17-27）によるバッチ培地を使用した：２７．６ｇ／Ｌのグルコース＊Ｈ２Ｏ、１３．３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、４．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１．７ｇ／Ｌのクエン酸塩、１．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、６０mg／Ｌのクエン酸鉄（III）、２．５mg／ＬのＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、１５mg／ＬのＭｎＣｌ２＊４Ｈ２Ｏ、１．５mg／ＬのＣｕＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、３mg／ＬのＨ３ＢＯ３、２．５mg／ＬのＮａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ、８mg／ＬのＺｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２＊２Ｈ２Ｏ、８．４mg／ＬのTitriplex III、１．３mL／ＬのSynperonic １０％消泡剤。該バッチ培地に、５．４mg／Ｌのチアミン−ＨＣｌ、ならびにそれぞれ１．２ｇ／ＬのＬ−ロイシン及びＬ−プロリンを補充した。フィード１溶液は、１９．７ｇ／ＬのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏが補充された７００ｇ／Ｌのグルコースを含有していた。ｐＨ調節用のアルカリ溶液は、それぞれ５０ｇ／ＬのＬ−ロイシン及び５０ｇ／ＬのＬ−プロリンが補充された１２．５％（w/v）のＮＨ３水溶液であった。構成成分は全て、脱イオン水に溶解させた。
【０１６２】
発酵は、１０ＬのBiostat C DCU3発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）において実施した。予備発酵からの３００mLの接種材料を添加した６．４Ｌの無菌発酵バッチ培地から出発して、バッチ発酵は、３７℃、ｐＨ６．９±０．２、５００mbar、及び通気速度１０Ｌ／分で実施した。最初に添加したグルコースが枯渇した後、温度を２８℃に変化させ、そして発酵は流加（fed-batch）モードに入った。ここでは、一定に増加する撹拌機速度（１０時間以内は５５０rpm〜１０００rpm、１６時間以内は１０００rpm〜１４００rpm）及び通気速度（１０時間では１０Ｌ／分〜１６Ｌ／分、５時間では１６Ｌ／分〜２０Ｌ／分）と組み合わせてフィード１を添加することにより、溶存酸素の相対値（ｐＯ２）を５０％で維持した（DO-stat、例えば、Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. Biotechnol. 2 (1987) 79-85を参照されたい）。およそ８時間培養した後にｐＨが調節下限（６．７０）に達したとき、アルカリ溶液の添加の結果、更なるアミノ酸の供給を得た。組換え型治療用タンパク質の発現を、光学密度７０で１mMのＩＰＴＧの添加によって誘導した。
【０１６３】
発酵の最後に、細胞質かつ可溶性の発現したテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉを、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体に導入するが、これは、収集前に、発酵槽中の全培養培地を５０℃に１又は２時間加熱する加熱工程を用いて行う（例えば、EP-B 1 486 571を参照されたい）。その後、発酵槽の内容物を流水式の遠心分離機（１３，０００rpm、１３Ｌ／時間）で遠心分離し、そして更に処理するまで、収集したバイオマスを−２０℃で保存した。合成した短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質は、不溶性タンパク質凝集体、いわゆる封入体（ＩＢ）の形態で、不溶性細胞残屑画分においてのみ見出された。
【０１６４】
一方はタンパク質発現の誘導前、そして他方はタンパク質発現の誘導後の所定の時点において発酵槽から取り出したサンプルを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析する。全てのサンプルから、同量の細胞（ＯＤTarget＝５）を、５mLのＰＢＳ緩衝液に再懸濁させ、そして氷上で超音波処理を介して破壊した。次いで、各１００μLの懸濁液を遠心分離し（１５，０００rpm、５分間）、そして各上清を回収し、別々のバイアルに移す。これは、可溶性の発現した標的タンパク質と不溶性の発現した標的タンパク質とを識別するためである。各上清（＝可溶性）画分３００μL、及び各ペレット（＝不溶性）画分４００μLに、ＳＤＳサンプル緩衝液（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）を添加する。サンプルを振盪下で９５℃にて１５分間加熱して、サンプル中のタンパク質を全て可溶化しかつ還元する。室温に冷ました後、各サンプル５μLを４〜２０％のTGX Criterion Stain Freeポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）に移す。更に、５μLの分子量標準（Precision Plus Protein Standard, Bio-Rad）及び公知の生成物タンパク質濃度（０．１μg/μL）を有する３つの量（０．３μL、０．６μL及び０．９μL）の定量化標準をゲル上に配置する。
【０１６５】
電気泳動を２００Ｖで６０分間行い、その後、ゲルをGelDOC EZ Imager（Bio-Rad）に移し、そしてＵＶ放射を用いて５分間処理した。ゲル画像を、Image Lab解析ソフトウェア（Bio-Rad）を使用して分析した。３つの標準を用いて、線形回帰曲線を係数＞０．９９を用いて算出し、そこからオリジナルサンプル中の標的タンパク質の濃度を算出した。
【０１６６】
実施例３
短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質の調製
封入体の調製を、収集した細菌細胞を、Tris緩衝液（０．１M、１mMのＭｇＳＯ４を補充、ｐＨ７．０）に再懸濁させることによって実施する。デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）を添加した後、９００barの圧力でホモジナイズすることによって細胞を破壊する。１．５M ＮａＣｌ及び６０mMのＥＤＴＡを含む緩衝液を、ホモジナイズされた細胞懸濁液に添加する。２５％（w/v）のＨＣｌを用いてｐＨ値を５．０に調整した後、更なる遠心分離工程の後に最終的な封入体スラリーが得られる。スラリーは、更に処理するまで、使い捨て滅菌プラスチック袋中で−２０℃にて保存することができる。
【０１６７】
封入体スラリー（約１５kg）を、アルカリ性カリウム塩酸塩溶液で可溶化し、そして深層濾過により清澄化する。あるいは、封入体スラリーをグアニジン塩酸塩溶液（１５０Ｌ、６．７M ）で可溶化した。
【０１６８】
実施例４
短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質のリフォールディング及び脂質付加
ａ）  一般コール酸法
純粋な結晶質のＰＯＰＣ又はＤＰＰＣ（Lipoid, Switzerland）を、コール酸（リン脂質：コール酸のモル比１：１．３５）を含有する水性緩衝液（脂質付加緩衝液）に溶解する。混合物を窒素雰囲気下でインキュベートし、透明な溶液が得られるまで、室温（ＰＯＰＣ）又は５５℃（ＤＰＰＣ）で光から保護する。透明な脂質−コール酸溶液を４℃に冷却するか（ＰＯＰＣ）、又は４１℃で保存する（ＤＰＰＣ）。短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を、規定のアポリポプロテイン：リン脂質比で４℃（ＰＯＰＣ）又は４１℃（ＤＰＰＣ）にて添加する。脂質粒子の形成のために、反応混合物を窒素雰囲気下で４℃（ＰＯＰＣ）又は４１℃（ＤＰＰＣ）にて一晩インキュベートし、そして光から保護する。最後に、コール酸を、脂質付加緩衝液に対する大規模な透析（４℃／４１℃）により除去する。最後に、サンプルを遠心分離して、沈殿した物質を除去する。
【０１６９】
ＰＯＰＣ又はＤＰＰＣを含有するコール酸可溶化脂質溶液を、上記のとおり調製することができる。脂質混合物は、望ましい比率で脂質溶液を混合し、次いでそれぞれのＴｍ（Ｔｍ＝相転移温度）で保存することにより調製する。短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質の脂質粒子形成は、選択された脂質混合物のそれぞれのＴｍ以外、純粋な脂質溶液について記載したとおり実施する。
【０１７０】
以下の脂質付加緩衝液について試験した：
１．  ２５０mMの塩酸アルギニン、７．５％のスクロースを補充した５０mMのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５
２．  ２５０mMの塩酸アルギニン、７．５％のスクロース、１０mMのメチオニンを補充した５０mMのリン酸水素二カリウム緩衝液、ｐＨ７．５
３．  １４０mMのＮａＣｌ、１０mMのメチオニンを補充した、２５０mMのトリス−ヒドロキシルアミノメタン（ＴＲＩＳ）、ｐＨ７．５
４．  ２５０mMの塩酸アルギニン、７％のトレハロース、１０mMのメチオニンを補充した５０mMのリン酸水素二カリウム緩衝液、ｐＨ７．５。
【０１７１】
短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質サンプルから形成された脂質粒子の均質性を、分析ＳＥＣによって評価することができる。全体として、脂質付加緩衝液の選択は、リン脂質の選択と比べてわずかな効果しか有しない。ＤＰＰＣ−脂質粒子は、１つの主ピークとして溶出するが、一方、ＰＯＰＣ−脂質粒子は、２つのピークパターンを示す。脂質粒子形成は、脂質付加緩衝液に関係なく実現可能であることが示された。試験した様々な緩衝液の中でも、最も適切な脂質付加緩衝液は、２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのメチオニン、ｐＨ７．５であると同定された。
【０１７２】
脂質付加混合物は、規定の量の融合タンパク質を含有しており、そしてそれぞれのリン脂質、例えばＰＯＰＣの量は、それに応じて算出される。脂質のモル量の計算は全て、短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質単量体に基づく。
【０１７３】
ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析を用いて、脂質粒子の均質性及びそのアポリポプロテイン−リン脂質組成に関するより詳細な情報を得ることができる（タンパク質−コンジュゲート分析）。図１１は、ＳＥＣで分割されたサンプルの典型的なクロマトグラム（ＵＶ２８０検出）を示す。ここで、１：１６０サンプルは、３つの分離ピークに分割される。１：８０サンプルは、ダブルピークとして示されるとおり、異なるサイズの少なくとも２つの種を含有すると思われた。サンプル１：２０から得たピークは、最も均質な生成物を示す。
【０１７４】
タンパク質コンジュゲート分析により、ＳＥＣカラムから溶出した各脂質粒子について、タンパク質の総分子量（ＭＷタンパク質）及び脂質成分の総分子量（ＭＷ脂質）の計算を可能にした。短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質単量体（３２．７kDa）及びＰＯＰＣ（７６０Da）の分子量に基づいて、脂質粒子の組成を算出することができた（ｎ タンパク質及びｎ ＰＯＰＣ）。全てのモル比において脂質粒子主ピークでみられるアポリポプロテイン構成要素の分子量は、およそ１００kDaであり、これは、脂質粒子１個当たり短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質三量体に相当する。比率ｎ（ＰＯＰＣ）／ｎ（タンパク質単量体）から、脂質粒子中の短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質単量体１個当たりのＰＯＰＣ分子の数を得る。短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質単量体１個当たりのＰＯＰＣ分子の数は、変動する。タンパク質（％）の値は、脂質付加の程度のパラメータである。脂質粒子中のタンパク質の割合が低ければ低いほど、脂質付加の程度が高い。
【０１７５】
ｂ）  ＰＯＰＣ及びＤＰＰＣ及びコール酸ナトリウムを用いるリフォールディング及び脂質粒子形成のための迅速希釈法
短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を大腸菌で発現させ、そして実施例１〜３に従って精製する。精製後、２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、６．７Mのグアニジン塩酸塩を含有する溶液（ｐＨ７．４）に対するダイアフィルトレーションによって緩衝液を交換する。タンパク質濃度を約３０mg/mLに調整した。
【０１７６】
２つの別個の脂質原液を調製する。溶液Ａは、１００mol／ＬのＰＯＰＣを、２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、１３５mMのコール酸ナトリウムを含有する緩衝液（ｐＨ７．４）に室温で溶解することにより調製する。溶液Ｂは、１００mol／ＬのＤＰＰＣを、２５０mMのTris−ＨＣｌ、１３５mMのコール酸ナトリウム、ｐＨ７．４に４１℃で溶解することにより調製する。脂質原液ＡとＢとを３：１の比で混合して、そして室温で２時間インキュベートする。脂質原液混合物３８４mLを、２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、ｐＨ７．４の６，３６５mLに希釈することにより、リフォールディング緩衝液を調製する。この緩衝液を室温で更に２４時間撹拌する。
【０１７７】
リフォールディング及び脂質粒子形成を、短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質７５０mL（２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、６．７Mのグアニジン塩酸塩の溶液（ｐＨ７．４）を含む）を、リフォールディング緩衝液に添加することにより、開始させる。これにより、グアニジン塩酸塩は１：１０に希釈される。常に撹拌しながら、溶液を室温で少なくとも１２時間インキュベートする。界面活性剤の除去を、ダイアフィルトレーションによって実施する。
【０１７８】
ｃ）  変性又は未変性タンパク質から出発する脂質粒子形成
項目ａ）に報告した方法（第１の方法）は、脂質粒子形成のために未変性アポリポプロテインを必要とするが、一方、項目ｂ）に報告する方法（第２の方法）は、脂質粒子形成のために完全に変性されたアポリポプロテインで出発する。
【０１７９】
例示的な第１の方法では、６．７Mのグアニジン塩酸塩、５０mMのTris、１０mMのメチオニン、ｐＨ８．０中の変性され短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を、２５０mMのTris、１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのメチオニンからなる緩衝液（ｐＨ７．５、タンパク濃度３．４６mg/mL）に対して大規模に透析する。次いで、ＰＯＰＣとコール酸との混合物を添加して、溶液中の最終濃度をＰＯＰＣ６mM及びコール酸８mMにしたとする。これは、短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質単量体１分子当たりＰＯＰＣ６０分子の比率に相当する（６０：１）。次いで、界面活性剤をダイアフィルトレーションによって除去する。形成されたタンパク−脂質複合体の分析をＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより行う。この方法を使用すると、不均一な生成物が形成される。
【０１８０】
例示的な第２の方法では、６．７Mのグアニジン塩酸塩、５０mMのトリス、１０mMのメチオニン、ｐＨ８．０中の変性され短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を、脂質付加緩衝液で１：１０（v/v）に直接希釈して、タンパク質濃度２．５mg/mLを得る。脂質付加緩衝液は、６mMのコール酸及び４．５mMのＰＯＰＣからなっており、これは、脂質のタンパク質に対する比６０：１に相当する。この方法を使用すると、均一な生成物が形成される。
【０１８１】
ｄ）  ２５％ＤＰＰＣ／７５％ＰＯＰＣ
脂質粒子形成を、この実施例の項目ａ）において報告したとおり、以下のパラメータを用いて実施した：
タンパク質：          短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タ                        ンパク質
脂質付加緩衝液：      ２５０mMのTris−ＨＣｌ、１４０mMのＮａＣｌ、１０mMのメチ                        オニン、ｐＨ７．５
脂質付加：            １８℃で
透析：                室温で
試験したモル比：      １：６０
【０１８２】
脂質粒子形成は、簡単であった。以下の表中、ＳＥＣ結果のまとめを示す（割合は、ＡＵＣの積分によって算出した）。
【０１８３】
【表６】
2014529602.tif 000010
【０１８４】
短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質の脂質粒子の形成のために、２５％ＤＰＰＣと７５％ＰＯＰＣとの脂質混合物を使用して、均質な生成物を、モル比１：６０（タンパク質：リン脂質）で得た。以下の表中、２５％ＤＰＰＣ／７５％ＰＯＰＣ、及び短縮されたテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質（タンパク質のリン脂質に対するモル比１：６０）の脂質粒子のタンパク質コンジュゲート分析のまとめを示す。
【０１８５】
【表７】
2014529602.tif 000011
【０１８６】
実施例５
アポリポプロテインの応用
ａ）  ＬＣＡＴ活性に対するＤＰＰＣ及びＰＯＰＣの影響
パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）のいずれかと、組換え野性型アポリポプロテインＡ−Ｉ又はテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉのいずれかとを含む脂質粒子を、ＬＣＡＴによるコレステロールのエステル化を支持する能力について試験することができた。
【０１８７】
トリチウム標識したコレステロール（４％；モルベースでホスファチジルコリン含量に対して）を、エタノール性コレステロール溶液を添加することによって、脂質粒子に組み込む。ＬＣＡＴによって触媒されるコレステロールのエステル化を支持する、結果として生じるタンパク質−脂質複合体の能力を、１２５μL（１０mMのTris、１５０mMのＮａＣｌ、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＮａＮ３；ｐＨ７．４；２mg/mLのＨｕＦＡＦアルブミン；４mMのβメルカプトエタノール）中の０．２μg/mLの組換え型ＬＣＡＴ酵素（ROAR biochemical）の存在下で、３７℃で１時間試験する。クロロホルム：メタノール（２：１）の添加によって反応を停止させ、脂質を抽出する。エステル化の「割合」は、ＴＬＣ及びシンチレーション計数により、コレステロール−コレステリルエステル分離後に算出する。形成されたエステル中にトレーサの２０％未満しか組み込まれていなかったとき、反応速度が実験条件下で一定であるとみなすことができる。例示的データは、XLfitソフトウェア（IDBS）を使用して、Michaelis Mentenの等式に当て嵌める。配列番号０１のアミノ酸配列及びさらなるＮ末端アラニンアミノ酸残基を有するテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を用いて得られた結果の視覚化のために、図３を参照されたい。
【０１８８】
ｂ）  ＬＣＡＴ活性に対するＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ混合物の影響
組換え型野性型アポリポプロテインＡ−Ｉと３Ｈコレステロール、ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ混合物及びコール酸とをモル比１：４：８０：１１３で混合することにより、界面活性剤としてコール酸を使用して、脂質粒子を調製する。ＤＰＰＣ／ＰＯＰＣ混合物は、１００％ＰＯＰＣ；７５％ＰＯＰＣ；５０％ＰＯＰＣ；２５％ＰＯＰＣのいずれかを含有していた。
【０１８９】
透析によりコール酸を除去した後、ＬＣＡＴによって触媒されるコレステロールのエステル化を支持する、結果として生じるタンパク−脂質複合体の能力について試験する。３Ｈコレステロール（４％；モルベースでホスファチジルコリン含量に対して）を、エタノール性コレステロール溶液を添加することによって、脂質粒子に組み込む。ＬＣＡＴによって触媒されるコレステロールのエステル化を支持する、結果として生じるタンパク−脂質複合体の能力を、１２５μL（１０mMのTris、１５０mMのＮａＣｌ、１mMのＥＤＴＡ、１mMのＮａＮ３；ｐＨ７．４；２mg/mLのＨｕＦＡＦアルブミン；４mMのβメルカプトエタノール）中の０．２μg/mLの組換え型ＬＣＡＴ酵素（ROAR biochemical）の存在下で、３７℃で１時間試験する。クロロホルム：メタノール（２：１）の添加によって反応を停止させ、脂質を抽出する。エステル化の「割合」は、ＴＬＣ及びシンチレーション計数により、コレステロール−コレステリルエステル分離後に算出する。エステルにトレーサの２０％未満しか組み込まれていなかったとき、反応速度が実験条件下で一定であるとみなすことができる。例示的データは、XLfitソフトウェア（IDBS）を使用して、Michaelis Mentenの等式に当て嵌め、そして配列番号０１のアミノ酸配列及びさらなるＮ末端アラニンアミノ酸残基を有するテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質について図４に示す。
【０１９０】
ｃ）  ＴＨＰ−１に由来する泡沫細胞へのコレステロール排出
ヒトＴＨＰ−１細胞のようなマクロファージを、ホルボールミリステートアセテートにＴＨＰ−１単球性白血病細胞を曝露することにより得ることができる。次いで、３Ｈコレステロールトレーサを含有するアセチル化ＬＤＬの存在下で、細胞に更なる培養物を添加する。その後、これらモデル泡沫細胞をコレステロールアクセプター試験化合物に４時間〜８時間曝露する（以下を参照されたい）。
【０１９１】
細胞培養上清を採取し、そして細胞を５％のＮＰ４０に溶解させる。排出分率は、細胞と上清とにおける放射活性の合計に対する上清におけるコレステロール放射活性の比率として算出する。アクセプターを含有していない媒体に曝露された細胞からの排出を減じ、そして、線形適合によって排出速度を算出する。排出速度は、参照として細胞から１０μg/mLの野性型アポリポプロテインＡ−Ｉへの排出を使用して標準化した（相対的な排出速度）。２つの別個の実験において得られた相対的な排出速度を、コレステロールアクセプター濃度の関数としてプロットし、そしてデータをMichaelis Mentenの等式に当て嵌めることができる。
【０１９２】
ＡＢＣＡ−１輸送体をアップレギュレートし、そしてコレステロール輸送をＡＢＣＡ−１媒介排出に偏らせることが知られているＲＸＲ−ＬＸＲアゴニストに曝露された細胞を使用して、並行実験を実施することができる。
【０１９３】
脂質混合物の影響は、配列番号０１のアミノ酸配列及びさらなるＮ末端アラニンアミノ酸残基を有するテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を用いる一連の試験において僅かしか観察されなかった（図５に示した例示的データ）。
【０１９４】
ｄ）  インビボ研究
配列番号０１のアミノ酸配列及びさらなるＮ末端アラニンアミノ酸残基を有するテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を含む、５つの脂質粒子変異体について試験する：
ｉ）ＰＯＰＣのみ
ii）ＤＰＰＣのみ
iii）ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ  ３：１
iv）ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ  １：１
ｖ）ＤＰＰＣ：ＳＭ  ９：１。
【０１９５】
ウサギに、８０mg/kgで０．５時間かけて静脈内注射を行い（ｎ＝ウサギ３匹／試験化合物）、次いで注射後９６時間連続して血液をサンプリングする。
【０１９６】
ＥＬＩＳＡ用いるアポリポプロテインレベルの分析：
−  薬物レベル
−  肝酵素、コレステロール、コレステロールエステルの血漿値に対するデータ。
【０１９７】
血漿濃度は、試験した組成物全てについて非常に類似しており、それほど顕著ではない初期「分布」相に続いて、濃度の対数線形下降を示す（図７）。以下の表は、配列番号０１のアミノ酸配列及びさらなるＮ末端アラニンアミノ酸残基を有するテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質の薬物動態学的データを示す。
【０１９８】
【表８】
2014529602.tif 000012
【０１９９】
測定した薬物動態学的（ＰＫ）パラメータは、試験した化合物全てについて類似している。また、個体間差は低いことが見出された。測定された半減期は約１．５日であり、すなわち、野生型のアポリポプロテインＡ−Ｉに比べて増大している。分布容積は、血漿容積（ウサギでは約４０mL/kg）に類似している。
【０２００】
ｆ）  コレステロール動員
血漿中においてコレステロールは動員され、そしてエステル化される。テトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉが既に減少し始めた後でさえも、血漿コレステロールエステルレベルは上昇し続ける。血漿テトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉレベルが約０．５mg/mL（正常な野性型アポリポプロテインＡ−Ｉの約５０％）まで減少しても、コレステロールエステルレベルの増加を、配列番号０１のアミノ酸配列及びさらなるＮ末端アラニンアミノ酸残基を有するテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質について依然として検出することができる（図８）。
【０２０１】
ｇ）  肝酵素放出
ＰＯＰＣを含有する、配列番号０１のアミノ酸配列及びさらなるＮ末端アラニンアミノ酸残基を有するテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を含む脂質粒子は、肝酵素の放出を誘導しない（図１を参照のこと）。ウサギと同様に、ＰＯＰＣ又はＰＯＰＣ／ＤＰＰＣ混合物を含有するテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉの単回i.v.（静脈内注射）は、マウスにおいて安全である。１：３のモル比でＤＰＰＣ：ＰＯＰＣを含有するアポリポプロテイン組成物は、ＰＯＰＣ単独と同等である（図９）。
【０２０２】
５つの調製物のいずれにおいても、注射の２時間後まで著しい溶血は観察されない。テトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉをi.v.適用した２時間後に得られた血漿サンプルにおいて、溶血は測光法で赤色として測定される。全血（０．４４％のTriton X-100−最終濃度によって作製した）の１００％溶血を、キャリブレーションに使用する（図１０）。
【０２０３】
ｈ）ヒト臍帯静脈内皮細胞に対するテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉの抗炎症作用
５〜１０継代培養したＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を、それぞれのテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質（配列番号０１のアミノ酸配列及びさらなるＮ末端アラニンアミノ酸残基を有するテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質）調製物中で１６時間インキュベートし、そしてＴＮＦαで最後の４時間刺激する。ＶＣＡＭ１表面発現は、ＦＡＣＳによって特異的抗体で検出される。
【０２０４】
実施例６
脂質粒子の安定性
Ｎ末端ヒスチジンタグ及びＩｇＡプロテアーゼ切断部位を含有する野生型のアポリポプロテインＡ−Ｉを大腸菌において発現させ、そして、上記の実施例において報告したとおりカラムクロマトグラフィーによって精製することができる。ヒスチジンタグは、ＩｇＡプロテアーゼ切断によって除去し、その結果、配列番号０２のアミノ酸配列及びさらなるＮ末端アラニンアミノ酸残基を有するテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を得る。タンパク質のLipoid S100大豆リン脂質混合物に対する比１：１５０を使用して、脂質粒子（ＨＤＬ粒子）を構築する。粒子は、５mMのリン酸ナトリウム及び１％のスクロースを含有する緩衝液（ｐＨ値７．３）中で保存する。ＳＥ−ＨＰＬＣにより、１０日間の脂質付加及びインキュベートの後、インキュベート時に３つの別個のピークが明らかになった。４０℃でインキュベートした後、保持時間１０．８分において主なピークを検出することができ（総タンパク量の４７％）、これは、５℃で保存したサンプルでは存在しない。前記１０．８分のピークは、タンパク質の不安定化により可溶性の高分子量アセンブリが形成されたことを示す。
【０２０５】
ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣ混合物（ＰＯＰＣ：ＤＰＰＣの比、３：１）から出発して得られた配列番号０１のアミノ酸配列及びさらなるＮ末端アラニン残基を有するテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ融合タンパク質を含有するＨＤＬ粒子も、５℃及び４０℃でインキュベートする。高温におけるインキュベートでは、わずかな程度のプレピーク形成が導かれるが、１０．８分での高分子量アセンブリには有意なシフトはみられない（１１分で＜２％の増加）。これは、野生型のアポリポプロテインＡ−Ｉを含有する粒子に比べて、当然、ＨＤＬ粒子の安定性が改善されたことを示す。
【０２０６】
実施例７
コレステロール動員
コレステロールが血液へ動員される効率は、アポリポプロテインをインビボで投与した後に、総コレステロール濃度とアポリポプロテイン濃度とのそれぞれの可動域を比較することにより測定することができる。定量的評価については、基準線補正された総コレステロールの濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）及びアポリポプロテインの濃度−時間曲線下面積の指数を算出した。
【０２０７】
この実験では、以下の物質を分析した：
−  大腸菌において発現させ、そして上記の実施例において報告したとおりカラムクロマトグラフィーによって精製した、Ｎ末端ヒスチジンタグ及びＩｇＡプロテアーゼ切断部位を含有する野生型のアポリポプロテインＡ−Ｉ； ヒスチジンタグは、ＩｇＡプロテアーゼ切断によって除去した；タンパク質のLipoid S100大豆リン脂質混合物に対する比１：１５０を使用して、脂質粒子（ＨＤＬ粒子）を構築した、
−  アポリポプロテインＡ−Ｉ Milano変異体； タンパク質のＰＯＰＣに対する比１：４０を使用して、脂質粒子（ＨＤＬ粒子）を構築した、
−  配列番号０２のテトラネクチン−アポリポプロテインＡ−Ｉ； タンパク質のＰＯＰＣ及びＤＰＰＣ（ＰＯＰＣとＤＰＰＣ、比３：１）に対する比１：６０を使用して、脂質粒子（ＨＤＬ粒子）を構築した。
【０２０８】
３つのＨＤＬ粒子をラットに適用した。それぞれのＡＵＣ比率について得られた値を、下記の表に示す。
【０２０９】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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