(57)【要約】【課題】血管形成関連性疾患の治療または予防のための少なくとも２つのヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーまたはヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーのフラグメントを含むタンパク質オリゴマーの提供。【解決手段】本発明は血管形成関連性疾患の治療または予防に使用する、少なくとも２つのヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーまたはヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーのフラグメントを含むタンパク質オリゴマーに関し、本発明はさらにヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーと免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質も提供する。また本発明は、ａ）エンドスタチンペプチドまたはエンドスタチン誘導ペプチドと、ｂ）フィブロネクチンのＲＧＤモチーフ及び（または）ＰＨＳＲＮモチーフを含む融合タンパク質にも関連し、本発明はさらに本発明のタンパク質オリゴマーまたは融合タンパク質を含むキットも提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーまたはヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーのフラグメントを含むことを特徴とする、血管形成関連性疾患の治療または予防に使用するタンパク質オリゴマー。
【請求項２】
ヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーが、オリゴマー化領域、ヒンジ領域及び（または）エンドスタチン領域または前記エンドスタチン領域のフラグメント、及び選択的に、前記ヒンジ領域内の組み換えプロテアーゼ切断部位を含むことを特徴とする、請求項１に記載の血管形成関連性疾患の治療または予防に使用するタンパク質オリゴマー。
【請求項３】
前記オリゴマー化領域が、ヒトコラーゲン１８の非三重螺旋三量化領域、Ｆｃ領域及び（または）人工的オリゴマー化領域を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の血管形成関連性疾患の治療または予防に使用するタンパク質オリゴマー。
【請求項４】
前記Ｆｃ領域がＩｇＧ由来であることを特徴とする、請求項３に記載の血管形成関連性疾患の治療または予防に使用するタンパク質オリゴマー。
【請求項５】
前記人工的オリゴマー化領域が、前記エンドスタチン領域のポジション７でグルタミンがシステインにより置換される単一の変異を含むことを特徴とする、請求項３に記載の血管形成関連性疾患の治療または予防に使用するタンパク質オリゴマー。
【請求項６】
前記ヒンジ領域内の組み換えプロテアーゼ切断部位が、エンテロキナーゼまたはトロンビン切断部位であることを特徴とする、請求項３に記載の血管形成関連性疾患の治療または予防に使用するタンパク質オリゴマー。
【請求項７】
前記ヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマー内の前記領域配置が、オリゴマー化領域―ヒンジ領域―エンドスタチン領域またはエンドスタチン領域―ヒンジ領域―オリゴマー化領域であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の血管形成関連性疾患の治療または予防に使用するタンパク質オリゴマー。
【請求項８】
前記血管形成関連性疾患が、固形腫瘍、メラノーマ、腫瘍転移、白血病などの血液由来の腫瘍、血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫などの良性腫瘍を含む血管新生依存型がん；関節リウマチ；乾癬；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障、後水晶体繊維増殖症、ルベオーシスなどの眼球血管新生疾患；オスラー病；心筋血管新生；プラーク血管新生（ｐｌａｑｕｅ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）；毛細血管拡張症；血友病関節症；血管線維腫；創部肉芽形成；腸管癒着症、アテローム性動脈硬化症、強皮症、肥厚性瘢痕（ケロイド）などの過剰または異常な内皮細胞の刺激の疾患；猫引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）及び潰瘍（ヘリコバクターピロリ）などの病理的結果として血管新生を有する疾患から成る群より選択されることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれかに記載の血管形成関連性疾患の治療または予防に使用するタンパク質オリゴマー。
【請求項９】
ヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーと免疫グロブリンのＦｃ領域を含むことを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１０】
前記融合タンパク質が、オリゴマー化領域、ヒンジ領域及び（または）エンドスタチン領域と、選択的に、前記ヒンジ領域内の組み換えプロテアーゼ切断部位を含むことを特徴とする、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記オリゴマー化領域が、ヒトコラーゲン１８の非三重螺旋三量化領域及び（または）人工的オリゴマー化領域を含むことを特徴とする、請求項９または１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記Ｆｃ領域がＩｇＧ由来であることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記人工的オリゴマー化領域が、前記エンドスタチン領域のポジション７でグルタミンがシステインにより置換される単一の変異を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ヒンジ領域内の組み換えプロテアーゼ切断部位が、エンテロキナーゼまたはトロンビン切断部位であることを特徴とする、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記融合タンパク質の前記領域配置が、Ｆｃ領域―オリゴマー化領域―ヒンジ領域―エンドスタチン領域またはオリゴマー化領域―ヒンジ領域―エンドスタチン領域―Ｆｃ領域またはＦｃ領域―エンドスタチン領域―ヒンジ領域―オリゴマー化領域またはエンドスタチン領域―ヒンジ領域―オリゴマー化領域―Ｆｃ領域であることを特徴とする、請求項９乃至１４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
ａ）エンドスタチンペプチドまたはエンドスタチン誘導ペプチドと、ｂ）フィブロネクチンのＲＧＤモチーフ及び（または）ＰＨＳＲＮモチーフと、を含むことを特徴とする、融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項９乃至１６のいずれかに記載の融合タンパク質の薬剤または診断用組成物としての使用。
【請求項１８】
請求項９乃至１６のいずれかに記載の融合タンパク質を含むキット。
【請求項１９】
適用されたがん治療に対するがん患者の反応を予測する方法であって、
ａ）請求項１乃至８のいずれかのＮＣ−１オリゴマー、または請求項９乃至１５のいずれかの融合タンパク質を使用して、前記患者の試料中のフィブロネクチンのレベルを測定する工程と、
ｂ）前記適用されたがん治療に対する前記がん患者の反応を予測する工程を含み、そのうち、（健康な被験者の）基準レベルと比較して低いフィブロネクチンのレベルが適用されたがん治療に対する前記患者の非反応性を示すことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血管形成関連性疾患の治療または予防に使用する、少なくとも２つのヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーまたはヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーのフラグメントを含むタンパク質オリゴマーに関する。本発明は特に、ヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーと免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質に関する。本発明はまた、ａ）エンドスタチンペプチドまたはエンドスタチン誘導ペプチドと、ｂ）フィブロネクチンのＲＧＤモチーフ及び（または）ＰＨＳＲＮモチーフを含む融合タンパク質に関する。本発明はさらに、本発明のタンパク質オリゴマーまたは融合タンパク質を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドスタチン、コラーゲン１８（または１８型コラーゲン）のＣ末端に対応する１８３アミノ酸タンパク質分解切断フラグメントはその抗腫瘍作用と、血管新生阻害がん治療としての潜在的用途のために、多くの実験室によって研究の対象となっている（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ他、１９９７、Ｃｅｌｌ  ８８、２７７；Ｆｏｌｋｍａｎ他、２００６、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１２、５９４；Ｂｅｒｇｅｒｓ他、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４、８０８）。エンドスタチンの抗腫瘍作用は確立されている。エンドスタチンの作用については数々の異なる機序が提示されているが、その機序に対する一般的な合意はまだない。
【０００３】
ヒトエンドスタチンの第Ｉ相と第ＩＩ相の臨床試験では酵母中で発現された組み換え分子が使用された。エンドスタチンのこの製剤には２つの主要な障害がある。循環系内におけるタンパク質の半減期が非常に短く、かつ元の臨床試験で使用された、注入された組み換えヒトエンドスタチンの５０％において亜鉛結合に不可欠な２つのヒスチジンを含む４つのアミノ酸がＮ末端で欠乏していたため、不活性分子であった（Ｌｅｅ他、２００８、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４、１４８７；Ｂｏｅｈｍ他、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２５２、１９０；Ｔｊｉｎ他、２００５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５、３６５６；Ｓｉｍ他、１９９９、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３、４１）。これらの欠陥を克服するために、大腸菌で発現・精製され、追加の９つのアミノ酸配列を持ち、別のｈｉｓタグ構造を形成したエンドスター（Ｅｎｄｏｓｔａｒ）と呼ばれる新しい組み換え組み換えヒトエンドスタチンが、非小細胞肺がんの治療向けに２００５年にＳＤＦＡにより承認された。エンドスターはインビトロにおけるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＥＧＦ刺激性の増殖、遊走、チューブ形成を抑制し、インビトロにおけるラット大動脈輪からの微小血管萌出を阻害した。さらに、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおける既存の血管からの血管新生形成を阻害し、腫瘍中の血管成長に影響を与えることができる。また、エンドスターの血管新生抑制作用は、ＶＥＧＦによりトリガーされるシグナリングと相関性があることが分かった（Ｌｉｎｇ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍ  ３６１、７９）。別の研究では、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に融合されたエンドスタチンが作られている（Ｌｅｅ他、２００８、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４、１４８７）。Ｆｃの存在によって半減期が１週間以上に延長され、これはｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ（アバスチン）とＶＥＧＦ  Ｔｒａｐの２つの血管新生阻害剤に類似している（Ｇｏｒｄｏｎ他、２００１、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９、８４３；Ｈｏｌａｓｈ他、２００２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９、１１３９３）。
【０００４】
エンドスタチンは多様な投与計画で非常に安全な薬剤であることが数々の臨床試験によって実証されているが、それらの結果は実質的なエンドスタチンの抗腫瘍作用を示していない。投与量とスケジュールは最適でなかった場合があり、かつ（または）後期患者の巨大病変は組み換えヒトエンドスタチンに最適な反応を示さないことがある。このため、中国の現行の臨床試験では、エンドスタチンの抗腫瘍作用を向上するために、エンドスタチンは化学療法と組み合わせて主に使用されている。例えば、ある研究では、固形腫瘍の患者４５人が参与した。２００６年から２００８年にかけて全員が静脈内注射として１日７．５ｍｇ／ｍ２の投与量で７日超にわたり化学療法と組み合わせてエンドスターの投与を受けた。この研究では治療に関連する死亡は発生しなかった。主に報告された副作用には、骨髄抑制、肝障害、食欲不振、吐き気、嘔吐、下痢、発熱、疲労が含まれる。完全寛解は観察されなかった。４２人の患者のうち２人は部分寛解し、２１人が安定した状態を維持、そして１９人に進行性疾患があった。腫瘍進行までの平均期間は３．０ヶ月であった。全体的生存期間中央値は３０．０ヶ月、１年後生存率は８１．０％であった。このデータは、固形腫瘍の治療において化学療法と組み合わせたエンドスターは中程度の有効性があり、その副作用は許容範囲であったことを示している（Ｌｉ他、２０１０、Ａｓｉａｎ  Ｐａｃ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．１１、１１１９−２３）。
【０００５】
血管新生阻害遺伝子治療が高濃度の血管新生阻害因子を継続的に提供する代替的方法として提案されている。ウイルスベクターを使用した血管新生阻害剤の遺伝子導入は、複数のマウスモデルで腫瘍の成長を阻害することができる。しかしながら、ウイルスベクターは繰り返しの注射で炎症と免疫反応を引き起こすことがあり、副作用／安全性の懸念によって近い将来におけるヒトでの使用が除外される可能性がある。さらに、遺伝子導入造血幹細胞の使用は、動物モデルでエンドスタチンの持続的生成にも関わらず効果が出ていない。加えて、遺伝子ベクターを使用した生物学的製剤の投与は、ベクター力価、導入効率、発現レベルのばらつきのため標準化が非常に困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このため、血管形成関連性疾患の治療法の改善が必要とされている。本発明に内在する技術的な問題は、前述のニーズを満たす手段及び方法の提供にあるとみなすことができる。この技術的な問題は本発明の請求項及び以下において特徴付けられる実施形態により解決されている。したがって、本発明の目的は、血管形成関連性疾患の治療または予防のための少なくとも２つのヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーまたはヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーのフラグメントを含むタンパク質オリゴマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書で使用される「コラーゲン１８」及び「１８型コラーゲン」という用語は同じ意味で使用され、同じタンパク質を指す。マウス及びヒトコラーゲン１８タンパク質のクローニングはＯｈ他（ＰＮＡＳ  １９９４、９１、４２２９；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９４、１９、４９４）により説明されている。１８型コラーゲンは、コラーゲンスーパーファミリーの固有で新しいサブクラス（「ＭＵＬＴＩＰＬＥＸＩＮファミリー」という名が提案されている）に属する。マウスコラーゲン１８のヌクレオチド及びアミノ酸の配列はアクセッション番号ＮＭ＿００１１０９９９１．１で示されており、一方対応するヒトの配列はＮＭ＿０３０５８２．３で示されている。さらに、マウスのアミノ酸配列とヒトコラーゲン１８はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ（配列番号）：１と２でそれぞれ示されている。より具体的に、コラーゲン１８はＮ末端（ＮＣ−１１領域）とＣ末端（ＮＣ−１領域）でより大きな非三重螺旋、球状構造により隣接された中央の断続性三重螺旋ドメインを含む（Ｏｈ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ａｂｅ他、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９６、５７６）。
【０００８】
コラーゲン１８のＣ末端ＮＣ−１領域（または単にＮＣ−１）は、Ｎ末端会合領域（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）（約５０のアミノ酸残基）、中央のプロテアーゼ感受性ヒンジ領域（約７０のアミノ酸残基）、Ｃ末端安定エンドスタチン領域（約１８０のアミノ酸残基）を含む（Ｓａｓａｋｉ他、１９９８、ＥＭＢＯ  Ｊ  １７、４２４９）。エンドスタチン領域は、エンドスタチンのＮ末端に位置して亜鉛への結合を媒介する亜鉛結合部位を含む（Ｄｉｎｇ他、１９９８、ＰＮＡＳ  ９５、１０４４３；米国特許公報第７５２４８１１号明細書）。興味深いことに、この亜鉛結合部位はエンドスタチンの抗腫瘍／血管新生阻害作用を担っていることが示されている（Ｂｏｅｈｍ他、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．２５２、１９０）。マウスコラーゲン１８のＮＣ−１領域のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で描写されており、一方ヒトコラーゲン１８配列のＮＣ−１領域の対応する配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示されている。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列の約１０〜約６０からのアミノ酸残基を含むヒトＮＣ−１領域の会合領域はＮＣ−１モノマーに球状の三量体を形成させる非共有結合的な三量化を担っている。タンパク質分解切断感受性ヒンジ領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４.出示されるアミノ酸配列の約６１〜約１２９からのアミノ酸残基を含む。コンパクトなエンドスタチン領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で示されるアミノ酸配列の約１３０〜約３０８からのアミノ酸残基を含む。例えば、Ｓａｓａｋｉ、ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｋｕｏ  ２００１、ＪＣＢ  １５２、１２３３；Ｔｊｉｎ他、２００５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５、３６５６を参照できる。ＮＣ−１領域の会合領域とエンドスタチン領域は、ヒンジ領域により接続されている（Ｓａｓａｋｉ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．を参照）。ヒンジ領域は、例えばＭＭＰ−３、−７、−９、−１３、−２０などのマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）によって切断されていることが分かっている（Ｈｅｌｉａｓｖａａｒａ他、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２００５、３０７、１９２）。上述のＮＣ−１の領域構造は構造データに基づいている。ＮＣ−１内の領域の位置に使用される用語「約」は、言及された領域間の正確な境界は示された位置から１、２、３またはそれ以上のアミノ酸残基分異なる場合があることを反映している。例えば、会合領域とヒンジ領域間の正確な境界は、例えば、出発点としてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の約１０〜約６０からのアミノ酸残基を含む会合領域を生成し、例えば長さ４９、４８、４７、４６、４５などのアミノ酸残基でより短いフラグメントを産生することによって判定することができる。その後、前述のより短いフラグメントのオリゴマー化特性について解析することができ、即ち、それらが完全な会合領域の場合可能であるように、まだ三量体などのオリゴマーを形成できるかを解析して判定することができる。または、エンドスタチン領域をＮＣ−１領域のオリゴマー化特性に対処する出発点とすることもできる。本明細書に別途記載されているとおり、本発明はさらに本明細書で定義されるＮＣ−１領域におけるモノマー、二量体及び（または）���量体の変移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）の正確な境界を特定する方法を提供する。しかしながら、上述の領域モデルは、会合領域をコードするエクソン３８と３９、ヒンジ領域をコードするエクソン４０、及びエンドスタチン領域をコードするさらに３つのエクソンを備え、遺伝子構造に非常によく適合する（Ｓａｓａｋｉ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。
【０００９】
本明細書で使用される「タンパク質」または「ポリペプチド」あるいは「ペプチド」という用語は、原則的にその他宿主細胞がないポリペプチドである、単離されたまたは原則的に精製された（ポリ）ペプチドを包含する。本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０またはそれ以上のアミノ酸残基において、そのうち一方のαカルボキシル基がもう一方のαアミノ基に結合しているものにより構成される。本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、ペプチド模倣薬を包含する。当技術分野で既知の通り、ペプチド模倣薬は、必須要素（ファーマコフォア）が立体空間で天然のペプチドまたはタンパク質を模倣し、生物学的標的と相互作用して同じ生物学的効果を生み出す能力を保持する組成物であり、例えば、Ｖａｇｎｅｒらによるレビュー（Ｖａｇｎｅｒ他、２００８、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２、２９２−２９６）を参照できる。ペプチド模倣薬は、タンパク質分解に対する安定性（作用期間）や低い生体利用効率などの天然のペプチドに関連するいくつかの問題を回避するために設計されている。受容体選択性や有効性など特定のその他性質を往々にして大幅に改善することができる。本発明によれば、タンパク質またはペプチドは一態様においてオリゴマーである。別の一態様において、タンパク質またはペプチドは以下でさらに定義されるように融合タンパク質である。本明細書で使用される「オリゴマー」とは、有限個のモノマーユニットから構成される分子を指し、対照的にポリマーは少なくとも原則的に、無限個のモノマーから構成される。好ましくは、オリゴマーはタンパク質オリゴマーであり、即ち、オリゴマーが２個、３個、４個、５個またはそれ以上のタンパク質モノマーから構成され、即ち、オリゴマーは例えば、二量体、三量体、四量体、五量体などとすることができる。二量体は定義として、２個で形成された高分子錯体であり、通常非共有結合的に結合された、タンパク質またはペプチドなどの分子である。このような錯体は、タンパク鎖の残りから独立して進化、機能、存在することができるタンパク質配列及び構造の一部であるタンパク質領域により形成することもできる。ホモ二量体は２個の同じ分子により形成され、その基礎となるプロセスはホモ二量体化と呼ばれる。ヘテロ二量体はヘテロ二量化によって形成された２個の異なる高分子から構築される。当技術分野で既知の通り、ほとんどの二量体は、ジスルフィド架橋を除き、生化学的に共有結合によって結び付けられていない。一部タンパク質は、二量化（またはオリゴマー化）領域と呼ばれる、二量化（またはオリゴマー化）を確約するための専門領域を含み、これについては以下でさらに定義すると共に、当技術分野では既知である。三量体は３個の、通常非共有結合的に結合されたタンパク質またはタンパク質領域の巨大分子錯体である。ホモ三量体は３個の同じ分子により形成され、一方へテロ三量体は３個の異なる分子により構築されている。例えば、���ラーゲン１８はホモ三量体タンパク質である。四量体は４個、五量体は５個の分子から成る、という具合である。一部のケースで、上述のように、錯体形成は往々にしてオリゴマー化領域により媒介される。例えば、二量化は本明細書で別途説明するように免疫グロブリンのＦｃ領域またはジスルフィド架橋によって媒介され、一方コラーゲン１８のＮＣ−１三量化は、ＮＣ−１領域内の会合領域（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ）を利用することができる。
【００１０】
本発明のタンパク質またはペプチドオリゴマーは、本明細書で定義されるように、コラーゲン１８の少なくとも２つのＮＣ−１モノマーから構成される。しかしながら、タンパク質オリゴマーは３、４、５、６、またはそれ以上のコラーゲン１８、好ましくはヒトコラーゲン１８の前記ＮＣ−１モノマーから構成されてもよい。いくつかの態様において、本明細書で言及されるタンパク質オリゴマーまたは融合タンパク質は１つまたはそれ以上のジスルフィド結合によりオリゴマー化できることも、本発明の範囲に含まれる。さらに、本明細書で定義されるＮＣ−１モノマーは、例えば、化学的架橋または当技術分野で既知のその他方法により、共有結合されると想定される。
【００１１】
本明細書で使用される「タンパク質」または「ペプチド」はさらに、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質及びその他タンパク質から成るタンパク質製剤も含む。さらに、この用語は一態様において、化学修飾されたタンパク質またはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質を含む。そのような修飾は人工的修飾または自然発生修飾とすることができる。
【００１２】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質は、本明細書で述べる生物学的特性を有し、好ましくは血管新生阻害活性を有する。そのような血管新生阻害活性は、例えば、体内における内皮細胞及び（または）周皮細胞の成長または遊走、チューブまたは内皮の形成、新しい毛細血管の成長の阻害、血液供給を遮断することによる良性または悪性腫瘍の成長速度低下または阻害などあらゆる生物活性を含み、作用機序に干渉する、即ち、血圧を下げる、悪性及び良性疾患における炎症反応の調節により、ＶＥＧＦ阻害剤などその他抗腫瘍または血管新生阻害剤の副作用／毒性を減少し、または治療後の治療可能時間域内におけるかん流または低酸素症など病態生理学的パラメータを改善して、その結果、追加治療（例：放射線治療、化学療法または抗アポトーシス療法）の効果を促進することができる。血管新生阻害活性は、インビトロアッセイで、または当技術分野で既知の動物モデルによりインビボで、テストすることができる（Ａｂｄｏｌｌａｈｉ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３、６３、８８９０；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ２００４、１３、６４９；ＰＮＡＳ  ２００７、１０４、１２８９０；Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔｅ  ２００５、８、５９；Ｂｅｒｇｅｒｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９、２８４、８０８；Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２、２７７、４５２１１；Ｌｅｅ他、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８）。例えば、抗血管形成活性は、例えばＶＥＧＦなどの成長因子により模擬された内皮細胞の増殖及び（または）遊走の阻害によってインビトロでテストすることができる。インビボでは、血管新生阻害活性は、例えば、ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイで分析することができ、一方抗腫瘍作用は、例えば、Ａ５４９、ＬＬＣまたはＨ４６０非小細胞性肺癌、ＨＴ２９結腸癌、ＢｘＰＣ３膵臓癌、Ｋａｒｐａｓ  ２９９リンパ腫、ＭＯＬＭ−１３  ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）、７８６−０、Ａ２０５８細胞株（メラノーマ）またはＲＥＮＣＡ腎細胞癌（ＲＣＣ）及びその他多くを含む動物腫瘍モデルでテストすることができる（Ａｂｄｏｌｌａｈｉ他、Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ.  Ｕｐｄａｔｅ  ２００５、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。
【００１３】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質は、一態様において、当業者に既知の化学合成または組み換え分子生物学的手法によって作製することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、２００１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ／Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊｏｓｅｐｈ；Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｄａｖｉｄ  Ｗ．-．３ｒｄ  ｅｄ．-Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、２００１に見ることができる。一態様において、そのような本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質の作製方法は、（ａ）本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する工程と、（ｂ）工程（ａ）の前記宿主細胞から前記タンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質を取得する工程と、及び選択的に、前記タンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質を保存する工程を含む。前記方法は無血清条件下で実施されることが好ましく、これは本発明の発明者によって、本明細書で定義される２個またはそれ以上のＮＣ−１モノマーを含むタンパク質オリゴマーは血清または血清を含む細胞培地で分解の影響を受けやすいことが発見されたためである。本方法の一態様において、前記タンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質は、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及び（または）前処理のゲル電気泳動を含むがこれらに限らない従来の精製法により、例えば宿主細胞溶解物から、取得することができる。
【００１４】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質の一実施形態において、本明細書で使用される本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質における「ＮＣ−１モノマー」、「コラーゲン１８のＮＣ−１モノマー」または「ヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマー」は、本明細書で定義されるヒトコラーゲン１８の非コラーゲン性ＮＣ−１領域の少なくとも一部分、即ち、少なくとも１つのドメイン、領域またはフラグメントを含む。好ましくは、ＮＣ−１モノマーはヒトとする。本明細書で使用されるＮＣ−１モノマーは、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質の一態様において、エンドスタチン領域の亜鉛結合部位／領域を含む、少なくとも１つのエンドスタチン誘導ペプチドまたはエンドスタチンペプチドを含む。前記ヒトエンドスタチン亜鉛結合部位は、ヒスチジン１、３、１１及びアスパラギン酸７６により形成される（Ｄｉｎｇ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。エンドスタチンの亜鉛結合はその血管新生阻害活性に不可欠であることが報告されている（Ｂｏｅｈｍ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。さらに、Ｔｊｉｎ他（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によると、エンドスタチンのＮ末端亜鉛会合領域に対応する２７アミノアミノ酸合成ペプチド（２７  ａｍｉｎｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）がその抗腫瘍活性を担うことが分かっている。本明細書で使用される「エンドスタチンペプチド」という用語は、このペプチドのアミノ酸配列をＮＣ−１のエンドスタチン領域中に見ることができることを意味する。「エンドスタチン誘導ペプチド」という用語は、そのようなペプチドがＮＣ−１のエンドスタチン領域における対応するエンドスタチンペプチドと１、２、３、４またはそれ以上のアミノ酸残基で異なり、同時にＮＣ−１のエンドスタチン領域における対応するエンドスタチンペプチドの生物活性（本明細書で別途説明するとおり）を少なくとも維持（またはさらには超越）することができるペプチドを指す。エンドスタチン領域の前記亜鉛結合部位／領域を含み、血管新生阻害及び（または）抗腫瘍活性を備えたエンドスタチンペプチドの例は、例えば、Ｔｊｉｎ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．または米国特許公報第ＵＳ７５２４８１１号明細書に記載されている。好ましくは、エンドスタチン誘導ペプチドまたはエンドスタチンペプチドは約１０〜約４０アミノ酸残基の長さであり、好ましくは２３〜３５、より好ましくは２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸残基である。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９は、ＮＣ−１エンドスタチン領域（ＥＤ）活性モチーフ（即ち、血管新生阻害及び（または）抗腫瘍活性を媒介するアミノ末端亜鉛会合領域）の２６アミノ酸残基の長さの対応するマウス配列を示し、一方ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０は２５アミノ酸残基の長さである対応するヒト配列を示している。これら配列においてヒスチジンは特に重要であり、これは本発明の発明者により以前の研究で発見されているとおり、前記ヒスチジンをアラニン残基で置換すると抗腫瘍及び血管新生阻害活性が消失するためである。実施例２．１０を参照する。前記ＮＣ−１モノマーが１つまたはそれ以上のエンドスタチン誘導ペプチドまたはエンドスタチンペプチドを含み、例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のペプチドを含むことは本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質の好ましい実施形態において、本発明のＮＣ−１モノマーは、本明細書に別途定義されるエンドスタチン領域を含む、または前記エンドスタチン領域から構成される。好ましくは、前述のエンドスタチン誘導ペプチド、エンドスタチンペプチドまたはエンドスタチン領域が、前記エンドスタチン領域の第７ポジションでグルタミンからシステインへの単一の変異を有する。そのような変異はジスルフィド架橋を形成でき、したがって、二量体を形成することができ、これは例えば、Ｋｕｏ  ２００１、ＪＣＢ  １５２、１２３３；Ｔｊｉｎ他、２００５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５、３６５６を参照できる。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態において、本発明のＮＣ−１モノマーは、エンドスタチン領域の亜鉛結合部位／領域、エンドスタチン誘導ペプチド、エンドスタチンペプチドまたはエンドスタチン領域に加え、ヒンジ領域を含む。そのような構築物は恐らくモノマーを形成し、あるいは二量体を形成する可能性がある。前記ヒンジ領域がそのような構築物の二量体会合に寄与する可能性もあるため、二量体の形成は除外することができない。随意に、そのようなＮＣ−１モノマーは、前述の領域の組成に加えて、会合領域、即ち、本明細書で言及されるヒトコラーゲン１８の非三重螺旋三量化領域、または別のオリゴマー化領域を含む。当業者には明らかであるように、会合領域の存在は三量体の形成につながる。別の一態様において、前記ＮＣ−１モノマーは上述で定義されたＮＣ−１領域のエンドスタチン領域と会合領域を含み、かつさらに別の態様において、前記ＮＣ−１領域のそれぞれ会合領域、ヒンジ領域、エンドスタチン領域を含む。後者の態様において、前記ＮＣ−１モノマーは、ヒトコラーゲン１８の完全なＮＣ−１領域を含むか、あるいは（約３８ｋＤａの）ヒトコラーゲン１８のＮＣ−１領域である、即ち、ヒトコラーゲン１８のＮＣ−１領域で構成される。ヒトコラーゲン１８のＮＣ−１領域及び前記ＮＣ−１領域の構造は、例えば、Ｓａｓａｋｉ他（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって定義されている。コラーゲン１８のＮＣ−１領域は、３１５（マウス）または３１２（ヒト）アミノ酸残基の非三重螺旋配列から構成される。上述したように、ＮＣ−１領域は上述の会合領域を介して非共有結合的に会合し、三量体を形成することが分かっている。
【００１７】
ＮＣ−１のオリゴマー化はこのタンパク質の少なくとも２つの領域によって媒介され、１つは三重螺旋構造を表すタンパク質のＮ末端で約５０のアミノ酸を含むもの、つまり、会合領域である。オリゴマー化に関与する第２の領域はエンドスタチンのＮ末端にあり、亜鉛に結合することができる。ヒトエンドスタチン亜鉛部位はヒスチジン１、３、１１とアスパラギン酸７６により形成される。前記領域は高濃度のエンドスタチンで二量体を形成することが示されている（Ｄｉｎｇ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。また、プロテアーゼ感受性のヒンジ領域が、すでに上述したように、ＮＣ−１のオリゴマー化で役割を果たすことも可能である。したがって、本発明のいくつかの態様において、ＮＣ−１モノマーはさらにＮＣ−１領域のヒンジ領域を含むことができる。
【００１８】
本発明のＮＣ−１モノマーは好ましくは、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、または３１０アミノ酸残基より長い。ＮＣ−１モノマーが会合領域、ヒンジ領域、及びエンドスタチン領域の亜鉛結合部位／領域または完全なエンドスタチン領域を含む場合、好ましくはＮＣ−１モノマーが３１２アミノ酸残基より長いことが、かつ少なくとも３１５、３２０、３３０、３４０、３５０、４００、５００またはそれ以上のアミノ酸残基を含むことがより好ましい。
【００１９】
本明細書で使用される「オリゴマー化領域」という用語は、一般に本明細書で定義される２つまたはそれ以上のＮＣ−１モノマーのサブユニットアセンブリを媒介する、タンパク質領域を指す。上述したように、オリゴマー化領域はＮＣ−１モノマーの二量化、三量化、及び（または）四量化等を媒介する。そのようなオリゴマー化は、例えば、多価と高結合強度、向上された構造安定性、異なる領域の機能組み合わせの機能的な利点につながり、向上または増加された血管新生阻害及び（または）抗腫瘍作用など、生物活性の強化をもたらす。一態様において、前記オリゴマー化領域は上述したＮＣ−１領域の会合領域、即ち、ＮＣ−１モノマーまたはコラーゲン１８螺旋の非共有結合的なオリゴマー化を担うコラーゲン１８の非三重螺旋三量化領域を含む。別の一態様において、前記オリゴマー化領域は、オリゴマー化とより長い半減期を提供する、当技術分野で既知の他の足場構築物／領域を含むことができ、これは例えば、Ａｌｉ  ａｎｄ  Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ  ２００５、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３、５０１３を参照できる。そのようなオリゴマー化領域は、上述の天然ヒトＮＣ−１領域で見られるような会合領域を構造的及び機能的に置換し、または前記会合領域に加えて使用される。本発明のタンパク質オリゴマーまたは融合タンパク質のさらなる実施形態において、前記オリゴマー化は、免疫グロブリンのＦｃ領域、即ち、本明細書で定義される、免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、または免疫グロブリンのＦｃ領域である、ＮＣ−１モノマーのオリゴマー化領域によって媒介される。当技術分野において既知であるとおり、Ｆｃ領域の、例えば、ペプチドまたはタンパク質への融合は循環系におけるより長い半減期を媒介する。Ｆｃ領域は、上述したＮＣ−１領域の会合領域に加えて、前記ＮＣ−１モノマーで使用でき（例えば、以下の例で示すように）、または会合領域を置換できることが分かっている。Ｆｃ領域は、Ｆｃそのものが二量体であるため、本明細書で定義されるＮＣ−１モノマーに二量体構造をもたらす。別の一実施形態において、前記オリゴマー化は、例えば、以下でより詳細に説明されるように、ジスルフィド結合の形成につながるＮＣ−１モノマーへの変異など、構造修飾によって媒介されてもよい。さらに本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質は、共有的に形成されてもよいと考えられる。
【００２０】
本発明はさらに本明細書で定義されるＮＣ−１領域においてモノマー、二量体及び（または）三量体の変移の正確な境界を特定する方法に関し、この方法が、ａ）ＮＣ−１領域に由来する、またはＮＣ−１領域から誘導される、エンドスタチン領域を含むペプチドで始まり、約１０〜２０アミノ酸残基ずつ大きさが増加するエンドスタチン領域を含む前記ペプチドが続く、一連の組み換えペプチドを生成する工程と、ｂ）工程ａ）の組み換えペプチドをオリゴマー化特性、即ち、前記ペプチドが二量体または三量体を形成できるか否かについてテストし、かつオリゴマーを形成できるペプチドを特定する工程と、ｃ）ＮＣ−１領域においてモノマー、二量体及び（または）三量体の変移の正確な境界を判定する工程を含む。この方法はさらに、工程ｂ）で特定された二量体または三量体を形成できる組み換えペプチドを使用して本発明のオリゴマーまたは融合タンパク質を構築する工程ｄ）を含んでもよい。ＮＣ−１領域に由来する、またはＮＣ−１領域から誘導される一連の組み換えペプチドの生成には、当技術分野で既知のペプチドまたはタンパク質合成を使用することができる。「から誘導される」（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）という用語は、本明細書で別途定義されており、かつＮＣ−１領域から誘導されるペプチドに必要な変更を加えて適用される。前記フラグメントのオリゴマー化特性の試験には、ウェスタンブロット解析、免疫沈降法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クロマトグラフ法またはその他当技術分野で既知の方法を利用することができる。上述の方法によって生成された組み換えペプチドは本発明のオリゴマーまたはＦｃ融合タンパク質などの融合タンパク質を生成するために使用でき、その後その血管新生阻害及び（または）抗腫瘍作用についてさらに試験することができる。本発明はさらに、そのような方法で特定された、本明細書に別途定義される生物活性、好ましくは血管新生阻害及び（または）抗腫瘍活性を示す、ＮＣ−１領域に由来する、またはＮＣ−１領域から誘導される組み換えペプチドに関する。そのようなペプチドを含む本発明のオリゴマーまたは融合タンパク質は、本明細書で別途説明するように、特に医薬組成物として役立つ。本発明はまた、約１０〜２０アミノ酸残基ずつエンドスタチン領域の大きさを増加することにより生成されるＮＣ−１領域に由来する、またはＮＣ−１領域から誘導される、組み換えペプチドにも関連する。これらペプチドはそれぞれが、本明細書で別途説明されるインビトロ及び（または）インビボアッセイを使用することにより、それらの血管新生阻害及び（または）抗腫瘍作用を調べる対象である。
【００２１】
本明細書で定義されるヒトコラーゲン１８の「ＮＣ−１モノマー」は、例えば、精製及び（または）検出に使用することができる、追加のタンパク質領域またはサブユニット、例えば、上述の免疫グロブリンのＦｃ領域、またはタンパク質タグ、例えば、Ｈｉｓタグまたは類似のものなどを含んでもよい。当技術分野で既知のとおり、タンパク質タグは組み換えタンパク質に遺伝子工学的に結合したペプチド配列である。これらのタグは一態様において、化学薬品またはタンパク質分解またはインテインスプライシングなどの酵素的手段によって除去可能である。そのようなタグは本明細書で言及される前記ＮＣ−１モノマーに結合される。タンパク質にアフィニティタグが付けられ、当技術分野で既知のアフィニティ法を使用して細胞溶解物などの自然の生物源からそれらを精製することができる。これらには例えば、キチン質結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、免疫グロブリンのＦｃ領域またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が含まれる。ポリ（ヒスチジン）タグはタンパク質タグとして広く使用されており、金属マトリックス上に結合する。可溶性タグは、タンパク質における適切な折りたたみを支援し、沈殿しないようにするために、特にＥ．Ｃｏｌｉなどのシャペロン欠損株において発現される組み換えタンパク質に使用される。これらには、例えば、チオレドキシン（ＴＲＸ）及びポリ−（ＮＡＮＰ）が含まれる。一部のアフィニティタグはＭＢＰ、及びＧＳＴなどの溶解補助剤として二重の役割を有する。クロマトグラフィータグはＮＣ−１モノマーのクロマトグラフィー特性を変えるために使用され、特定の単離法にわたる異なる分解能を可能にする。往々にして、これらはＦＬＡＧタグなどのポリアニオンアミノ酸から成る。エピトープタグは、多くの異なる株において高親和性の抗体を高い信頼性で産生することができるために選択された短いペプチド配列である。これらは通常ウイルス遺伝子に由来し、これがそれらの高い免疫活性を説明している。エピトープタグは、例えば、Ｖ５タグ、ｃ−ｍｙｃタグ、ＨＡタグを含む。これらのタグは、例えば、ウェスタンブロッティング及び免疫沈降法の実験に有用であり、またタンパク質精製にも利用できる。蛍光タグはタンパク質に関する可視的な情報を提供するために用いられる。最も一般的に使用される蛍光タグはＧＦＰ及びその異形である。ＧＦＰのより高度な応用には、折りたたみレポーター（折りたたみの場合蛍光色、そうでない場合色なし）としての使用が含まれる。タンパク質タグには、特異的な酵素修飾（ビオチンリガーゼタグなど）及び化学修飾（Ｆｌａｓｈタグ）など、その他多くの利用法がある。また、さまざまなタグを組み合わせてＮＣ−１モノマーの多機能的修飾を生み出すこともできる。本明細書で定義されるヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーは、本発明のタンパク質オリゴマーまたは融合タンパク質の血管新生阻害活性の向上及び（または）検出に役立つ可能性がある、例えば、１2４Ｉ、１２5Ｉ、１３１Ｉ、Ｃｕ−６４、Ｃｕ−６７、Ｙ−８６、Ｚｒ−８９、Ｙ−９０、Ｒｅ−１８８、Ｇａ−６８などの放射性同位元素；またはＤＴＰＡなどのキレートに結合する放射���核種；ジフテリア毒素、またはアポトーシス誘導剤などの毒素；または化学薬品、例えばタキソールまたはゲムシタビンなどの化学療法も含んでもよい。他の実施形態において、本発明のタンパク質オリゴマーまたは融合タンパク質はＰＥＧ化される。ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、一般に薬物または治療用タンパク質など、他の分子にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）高分子鎖を共有結合するプロセスである。ＰＥＧ化は通常、ＰＥＧの反応性誘導体と標的高分子のインキュベーションにより達成される。ＰＥＧの薬物または治療用タンパク質に対する共有結合は、宿主の免疫系から物質（ａｇｅｎｔ）を「被覆」でき（免疫原性と抗原性を減弱化する）、物質の流体力学的サイズ（溶液中の大きさ）を増加して、腎クリアランスを減少することで体内循環時間を延長する。ＰＥＧ化は疎水性薬物及びタンパク質に水溶性を提供することもできる。化合物のＰＥＧ化は当技術分野で既知であり、例えば、Ｄａｍｏｄａｒａｎ  ａｎｄ  Ｆｅｅ  ２０１０、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  １５、１８を参照できる。
【００２２】
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」という用語は、細胞表面受容体と相互作用する抗体または免疫ブロブリンのテール領域である結晶化フラグメント領域、即ち、Ｆｃ受容体、及び補体系の一部タンパク質を指す。この特性は抗体が免疫系を活性化することを可能にする。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は抗体の２本の重鎖の第２および第３定常領域から誘導される２つの同一タンパク質フラグメントから成り、ＩｇＭ及びＩｇＥのＦｃ領域は各ポリペプチド鎖に３つの重鎖定常領域（ＣＨ領域２〜４）を含む。ＩｇＧのＦｃ領域は非常によく保存されたＮ型糖鎖付加部位を有する。Ｆｃフラグメントの糖鎖付加はＦｃ受容体媒介活性に不可欠である。この部位に付加されたＮ−グリカンは主に複合型のコアフコシル化二分岐構造である。加えて、これらＮ−グリカンの少量はバイセクティングＧｌｃＮＡｃとα−２，６結合型シアル酸残基も有する。免疫グロブリンのＦｃ領域のタンパク質への融合は哺乳類細胞における融合タンパク質の産生と分泌を強化することが分かっている（Ｌｏ他、１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１、４９５；Ｃａｐｏｎ他、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７、５２５）。さらに、血管新生阻害剤の免疫グロブリンＦｃ領域への結合は当該阻害剤の半減期を増加することが示されている（Ｃａｐｏｎ他、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７、５２５；Ｇｏｒｄｏｎ他、２００１、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９、８４３；Ｈｏｌａｓｈ他、２００２、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９、１１３９３）。しかしながら、Ｆｃ領域は精製、可溶化及び（または）検出目的に利用できるのみならず、以下の説明と続く実施例に示すように、本発明のタンパク質オリゴマーまたは融合タンパク質の生物学的特性を有利に変える。一実施形態において、１つまたはそれ以上のＦｃ領域が、希望に応じて、エンテロキナーゼまたはトロンビンなどのプロテアーゼで処理することにより切断可能である。好ましくは、本明細書で言及されるＦｃ領域はヒトＩｇＧ由来である（Ｂｅｒｇｅｒｓ  ａｎｄ  Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９；Ｌｅｅ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｅ  Ｒｅｓ  ２００８）。当業者に明らかであるように、原則的に、任意のＩｇＧアイソフォームを使用して本発明のオリゴマーまたは融合タンパク質を生成することができる。ＩｇＧのＦｃ領域のサブフラグメントまたは単鎖でさえも本発明のオリゴマーまたは融合タンパク質の半減期延長またはオリゴマー化に使用することができる。本発明のオリゴマーまたは融合タンパク質の生成に使用できるマウス及びヒトＦｃ領域のアミノ酸配列、例えば、Ｆｃ−ＮＣ−１またはＮＣ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と６にそれぞれ示されている。
【００２３】
本明細書で使用される「血管形成関連性疾患」という用語は、過剰または不充分な、異常な血管成長に関連付けられるあらゆる疾患を指す。「血管形成関連性疾患」という用語は、好ましくは、固形腫瘍、白血病などの血液由来の腫瘍、メラノーマ、腫瘍転移、血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫などの良性腫瘍を含む血管新生依存型がん；関節リウマチ；乾癬；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障、後水晶体繊維増殖症、ルベオーシスなどの眼球血管新生疾患；オスラー病；心筋血管新生；プラーク血管新生（ｐｌａｑｕｅ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）；毛細血管拡張症；血友病関節症；血管線維腫；創部肉芽形成；腸管癒着症、アテローム性動脈硬化症、強皮症、肥厚性瘢痕（ケロイド）などの過剰または異常な内皮細胞の刺激の疾患；猫引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）及び潰瘍（ヘリコバクターピロリ）などの病理的結果として血管新生を有する疾患から成る群より選択される。好ましくは、本明細書で言及される血管形成関連性疾患はメラノーマである。
【００２４】
本明細書で使用される「治療」とは、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質の投与による、本明細書で言及される血管形成関連性疾患に関連する１またはそれ以上の症状の改善またはさらには排除を意味する。改善とは、本明細書で説明する血管形成関連性疾患の進行の遅延または停止としてみなすこともできる。
【００２５】
本明細書で使用される「予防」（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）とは、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質の投与による、本明細書で指定される血管形成関連性疾患の発生または再発の回避を意味する。
【００２６】
本発明の発明者によって、ヒトコラーゲン１８から誘導される三量体ＮＣ−１（ＮＣ−１が会合領域、ヒンジ領域、エンドスタチン領域を含む）はフィブロネクチンを結合し、一方エンドスタチンモノマーはフィブロネクチンへの結合を欠いていることが予期せず発見されている。フィブロネクチンは血管形成及び抗血管形成試薬（ｒｅａｇｅｎｔ）を結合する主要な細胞外マトリックスタンパク質として認識されている。エンドスタチンは生理的条件下でモノマーである。エンドスタチンの主要な前駆体は、それぞれが約３３０のアミノ酸を有する３つの相互に連結された鎖から成る三量体分子、ＮＣ−１である。これは、エンドスタチンと比較してＮＣ−１三量体が特異的な性質を持つことを示している。さらに、二量体を形成するＦｃ−エンドスタチン、及びエンドスタチンのアミノ酸ポジション７で（グルタミンからシステインへの）単一の変異を有する人工（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ）エンドスタチン二量体はフィブロネクチンへの結合を維持し、フィブロネクチンへの結合におけるオリゴマー化の重要性が示されている。ヒト血清中のエンドスタチンサイズの分子探しの後、発明者は従来サイズの（約２０ｋＤａの）エンドスタチンを特定できなかった。ヒト血液循環中におけるエンドスタチンサイズ分子の出現はヒト血清採取後のプロテアーゼによるＮＣ−１三量体の分解に起因する可能性がある。ＮＣ−１三量体はコラーゲン１８分解の主要な生理的産物のようであり、組織と循環系に存在し、（単量体）エンドスタチンにはない特異的な生物学的特性を示す。発明者はさらにフィブロネクチンのＶＥＧＦ、ＮＣ−１三量体に対する高親和性結合を示し、末梢血血小板タンパク質溶解物からのこれら３つの相互作用パートナー候補に免疫共沈降を行った。さらに、ＮＣ−１三量体、フィブロネクチン、ＶＥＧＦ及びアルファ５ベータ１（α５β１）インテグリンの生体内共局在を示すことができ、フィブロネクチンとＶＥＧＦ、ＮＣ−１三量体、インテグリンα５β１の集合は血管新生阻害プロセス開始の前触れとなるモデルを提示した。最も重要なことに、ＮＣ−１三量体対エンドスタチンの抗腫瘍研究により、ＮＣ−１三量体がエンドスタチンよりも有力な血管新生阻害タンパク質であることが示された。上述のデータは以下の実施例でより詳細に示されている。
【００２７】
本発明のタンパク質オリゴマーの一実施形態において、ヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーは、（ｉ）オリゴマー化領域、（ｉｉ）ヒンジ領域及び（または）（ｉｉｉ）エンドスタチン領域または前記エンドスタチン領域のフラグメント、オプションとしてヒンジ領域内における組み換えプロテアーゼ切断部位を含む。好ましくは、前記エンドスタチン領域のフラグメントはエンドスタチンの亜鉛結合部位／領域を含むペプチドである。
【００２８】
本発明のタンパク質オリゴマーの別の好ましい一実施形態において、前記ヒンジ領域はオリゴマー化領域とエンドスタチン領域の間に介在される。好ましくは、前記ヒンジ領域は本明細書で言及されるＮＣ−１モノマーにおけるオリゴマー化領域とエンドスタチンまたはエンドスタチン領域の亜鉛結合部位／領域間に位置する。ヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマー内の領域配置は、好ましくは、オリゴマー化領域−ヒンジ領域−エンドスタチン領域、またはエンドスタチン領域−ヒンジ領域−オリゴマー化領域である。
【００２９】
随意に、ヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマー内のヒンジ領域は、ヒンジ領域の内因性プロテアーゼ切断部位に加え、１つまたはそれ以上の組み換えプロテアーゼ切断部位を含むことができる。そのような組み換えプロテアーゼ切断部位は、例えば、エンテロキナーゼまたはトロンビン切断とすることができる（Ｂｅｒｇｅｒｓ  ａｎｄ  Jａｖａｈｅｒｉａｎ；Ｌｅｅ他；ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。それぞれのプロテアーゼによる切断は、例えば、本発明のタンパク質オリゴマーまたは融合タンパク質のエンドスタチン領域のリリースを可能にする。
【００３０】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質の好ましい一実施形態において、オリゴマー化領域は、ヒトコラーゲン１８の非三重螺旋三量化領域（即ち、会合領域）、Ｆｃ領域及び（または）人工オリゴマー化領域を含む。前記オリゴマー化領域は一態様において、ＮＣ−１領域の３鎖の三量化を担うヒトコラーゲン１８の非三重螺旋三量化領域を含む。別の一態様においては、Ｆｃ領域を含む。前記Ｆｃ領域はそれ自体が二量体であるため、本明細書で定義されるＮＣ−１モノマーに二量体構造をもたらす。第三の態様において、２つのモノマー間のジスルフィド架橋をもたらし、上述の天然のヒトＮＣ−１において見られる会合領域を構造的且つ機能的に置換する、または前記会合領域に加えて使用される、人工オリゴマー化領域、例えば、システインを含む。また、本発明の範囲は、本発明のタンパク質オリゴマーまたは融合タンパク質のオリゴマー化領域が、ヒトコラーゲン１８の非三重螺旋三量化領域とＦｃ領域を含むことも含む。さらに、人工オリゴマー化領域とＦｃ領域を含むことができる。
【００３１】
好ましくは、前記Ｆｃ領域がＩｇＧまたはその他免疫グロブリンアイソフォーム、及び当技術分野で説明されるオリゴマー化とより長い半減期を提供するその他足場構築物に由来し、これは例えば、Ｌｏ他、Ｐｒｏｔeｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １９９８、１１、４９５を参照できる。マウスＦｃ領域は、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されている。より好ましくは、前記Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ由来であり、さらに好ましくはヒトＩｇＧ１由来である。特に好ましくは、前記ヒトＦｃ領域がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示されるアミノ酸配列を含む、または当該アミノ酸配列から構成される。
【００３２】
ＮＣ−１モノマーのオリゴマー化領域は、上述の説明のとおり、免疫グロブリンのＦｃ領域、好ましくはＩｇＧ１由来のＦｃ領域とすることができる。本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質は、２つ、３つまたはそれ以上のＦｃ領域を含んでもよい。一態様において、前記Ｆｃ領域は、必要に応じて、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質を切断してもよい。例えば、エンテロキナーゼまたはトロンビン切断部位などの人工プロテアーゼ切断部位は、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマー中のＮＣ−１モノマーとＦｃ領域間に、例えば、対応する（ポリ）ペプチドリンカーによって、介在されてもよい。それぞれのプロテアーゼによる切断で、オリゴマーはＦｃ領域からリリースされる。Ｆｃ領域は精製及び（または）検出に使用することができる。さらに、Ｆｃ領域は、循環中の半減期延長、及び生物活性の改善、好ましくは血管新生阻害活性の改善など、本発明のタンパク質オリゴマーまたは融合タンパク質の生物学的特性を変化させる。例えば、Ｆｃ−エンドスタチン融合タンパク質は二量体としてフィブロネクチンを結合することができることが分かっており、一方エンドスタチンモノマーはできない。さらに、Ｆｃ−エンドスタチンはエンドスタチンより長い半減期を示す。
【００３３】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質のさらに好ましい実施形態において、人工オリゴマー化領域はエンドスタチン領域のポジション７で単一の変異を含み、グルタミンがシステインにより置換される。好ましくは、本明細書で定義されるモノマーは一部の態様において、エンドスタチン領域のポジション７でグルタミンからシステインへの単一の変異を含む。例えば、融合タンパク質中のＦｃ領域とエンドスタチン領域間の組み換えにより導入されたエンテロキナーゼ切断部位は、エンドスタチン領域中の隣接するＣ７残基間のジスルフィド結合形成により、エンテロキナーゼ切断に際して二量体の形成につながることが分かっている。これはＫｕｏ  ２００１、ＪＣＢ  １５２、１２３３を参照できる。上述したように、ＮＣ−１三量体とエンドスタチン二量体は、エンドスタチンモノマーと比較して、特異的な特性を有する。上述のポジション７で（グルタミンからシステインへ）の変異は、エンドスタチンの抗腫瘍領域を表すことが示されている、エンドスタチンのＮ末端ペプチドに導入することもできる（Ｔｊｉｎ他、２００５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５、３６５６）。前記ペプチドのオリゴマー化は、上述した人工的二量化、または単にポジション７での変異のない、Ｆｃ部分への組み換え融合のいずれかにより達成することができる。二量化を媒介するポジション７での前記変異を含む本発明の融合タンパク質の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示されており、実施例２．１０を参照する。
【００３４】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーの別の好ましい実施形態において、前記ヒンジ領域内の組み換えプロテアーゼ切断部位はエンテロキナーゼまたはトロンビン切断部位である。タンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーとエンテロキナーゼまたはトロンビンの切断は、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーからのエンドスタチン領域リリースをもたらす。
【００３５】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーのさらに好ましい実施形態において、本明細書で定義されるＮＣ−１モノマーは、前記ヒンジ領域内で自然に発生するプロテアーゼ切断部位のみを含み、即ち、組み換えプロテアーゼ切断部位を含まない。この場合、前記ヒンジ領域は、本明細書で別途説明されるように、例えば、エンドスタチン領域をリリースするために、例えば、ＭＭＰによって切断することができる。別の一態様において、ＮＣ−１モノマーのヒンジ領域において自然に発生するこれらのプロテアーゼ切断部位は、ＮＣ−１モノマーが前記プロテアーゼにより切断されなくなるように変異させることができる。この方法で、本発明のタンパク質オリゴマーの血管新生阻害活性をやはり改善することができる。
【００３６】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーの別の一実施形態において、治療される血管形成関連性疾患は、固形腫瘍、メラノーマ、腫瘍転移、白血病などの血液由来の腫瘍、血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫などの良性腫瘍を含む血管新生依存型がん；関節リウマチ；乾癬；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障、後水晶体繊維増殖症、ルベオーシスなどの眼球血管新生疾患；オスラー病；心筋血管新生；プラーク血管新生（ｐｌａｑｕｅ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）；毛細血管拡張症；血友病関節症；血管線維腫；創部肉芽形成；腸管癒着症、アテローム性動脈硬化症、強皮症、肥厚性瘢痕（ケロイド）などの過剰または異常な内皮細胞の刺激の疾患；猫引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）及び潰瘍（ヘリコバクターピロリ）などの病理的結果として血管新生を有する疾患から成る群より選択される。好ましくは、血管形成関連性疾患は腎細胞癌、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がんまたは肺がんである。
【００３７】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質は、好ましくは標準的な投与経路で投与可能な医薬組成物として配合される。一般に、前記医薬組成物は、局所、経皮、腹腔内、頭蓋内、脳室内、脳内、膣内、子宮内、経口、直腸または非経口（例：静脈内、髄腔内、皮下または筋肉内）経路によって投与することができる。
【００３８】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質を医薬活性化合物として含む医薬組成物は、本明細書で別途明示されるように、ヒト以外または好ましくはヒトのさまざまな血管形成関連性疾患または疾病の治療に治療的に有効な量で使用することができる。一態様において、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質は液体または凍結乾燥の形態で存在することができる。一態様において、前記タンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質は、グリセロール、タンパク質安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））または非タンパク質安定化剤と共に存在することができる。
【００３９】
前記化合物（即ち、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質）は、前記医薬組成物の有効成分であり、一態様において、従来の手順に従って薬物を標準の医薬担体と組み合わせることで調製された従来の剤形で投与される。これらの手順は、成分を所望の調製に合わせて混合、造粒、圧縮、または溶解することを含むことができる。当然ながら、薬学的に許容可能な担体または希釈剤の形態及び性質は、それが組み合わされる有効成分の量、投与経路、その他既知の変数によって決まる。
【００４０】
前記担体は、製剤のその他成分と混合可能であり、かつその被提供者にとって有害でないという意味で許容可能でなければならない。使用される医薬担体は、固形、ゲル、または液体を含むことができる。固形担体の例は、ラクトース、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸及び類似物である。液体担体の例は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、シロップ、オイル、水、乳剤、多様な種類の浸潤剤及び類似物である。同様に、担体または希釈剤は、単独または蝋を含むモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなど、当技術分野で既知の時間遅延物を含むことができる。前記適した担体は、上述のもの及び当技術分野で既知のその他のものを含み、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａを参照する。
【００４１】
希釈剤は、その組み合わせの生物活性、好ましくは、血管新生阻害活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液である。さらに、前記医薬組成物または製剤はその他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤及び類似物を含むことができる。
【００４２】
治療的に有効な量とは、医薬組成物において使用され、本明細書で言及される血管形成関連性疾患または疾病に付随する症状を予防、改善または治療する、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質の量を指す。化合物の治療的有効性及び毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（全体の５０％に治療的効果を有する用量）及びＬＤ５０（全体の５０％に致死的な用量）によって判定することができる。治療的効果と有害な効果間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率で表すことができる。
【００４３】
投薬計画は担当医師とその他臨床的因子によって決定される。医療の分野で既知であるように、任意の１人の患者に対する用量は、患者の体重、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全般的健康状態、同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。進歩は定期的な評価によって監視することができる。
【００４４】
本明細書で言及される薬剤は、本明細書で列挙される疾病または疾患を治療または改善あるいは予防するために少なくとも１回投与される。しかしながら、前記薬剤は１回以上投与してもよい。
【００４５】
特定の医薬組成物が医薬分野で既知の方法で調製され、上述で言及された少なくとも１つの活性化合物を混合剤中にまたはその他の方法で薬学的に許容可能な担体または希釈剤と共に含む。それら特定の医薬組成物を作るために、前記活性化合物は通常担体または希釈剤と混合される。得られた製剤が投与形態に適応される。検討される被提供者に応じて用量の調整を行うために、処方者または使用者向けの説明書で推奨される用量を示す必要がある。
【００４６】
医薬組成物は本発明のさらなる一態様において、本発明のタンパク質オリゴマーに加えて製剤中に薬剤に添加される薬物を含むことができる。最後に、前記医薬組成物の製剤は薬剤の品質、医薬的安全性、有効性を確約するために、ＧＭＰ標準条件または類似の条件下で行われると理解される必要がある。
【００４７】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーの別の好ましい一実施形態において、オリゴマーは二量体または三量体である。しかしながら、本発明のタンパク質オリゴマーは、四量体または五量体、あるいはより多くの本明細書で定義されるＮＣ−１モノマーを持つオリゴマーも含む。
【００４８】
本発明はまた、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質を産生する方法にも関し、前記方法が、（ａ）本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、好ましくは無血清条件下で、培養する工程と、（ｂ）工程（ａ）の宿主細胞から前記タンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質を取得する工程と、随意に、（ｃ）前記タンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質を、好ましくは無血清条件下で保存する工程を含む。以下の例に示すように、本発明の発明者によって、ＮＣ−１三量体のようなオリゴマーＮＣ−１は、血清または細胞培養培地中に長時間保持されると、４℃であっても、分解の影響を受けやすいことが分かっている。したがって、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーを無血清条件下で産生し、維持することが望ましい。
【００４９】
さらに、本発明は血管新生阻害物質の同定方法に関し、前記方法が、（ａ）本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーがフィブロネクチン及び（または）ＶＥＧＦに結合して錯体を形成できる条件下で、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーをフィブロネクチン及び（または）ＶＥＧＦと接触させる工程と、（ｂ）工程（ａ）の錯体を一連の物質と接触させる工程と、（ｃ）工程（ａ）の錯体に結合できる物質を同定して単離する工程と、（ｄ）工程（ｃ）で同定された物質の血管新生阻害活性をインビトロアッセイでテストする工程を含む。
【００５０】
本発明の方法は自動化により補助することができる。具体的に、一態様において、工程（ａ）及び（または）（ｂ）及び（または）（ｃ）は、化合物の混合と錯体形成測定用のロボット装置と自動化読み取りシステムで補助することができる。適したシステムは当技術分野で既知であり、かつ判定される応答の種類によって異なる。さらに、前記方法は、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーの生成に関する追加工程を含んでもよい。
【００５１】
本明細書で使用される「接触」という用語は、少なくとも２つの異なる化合物を物理的に近接させ、前記化合物の物理的及び（または）化学的な相互作用を可能にすることを指す。前述の方法において、本発明によるタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーはまずフィブロネクチン及び（または）ＶＥＧＦに接触されて錯体を形成する。その後、前記錯体が一連の物質、例えばタンパク質、ペプチド、生物活性ポリペプチドを含むと考えられる化学またはアプタマーライブラリと接触される。本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーは、錯体形成を可能にするに足る時間と条件下で前述の化合物と接触される必要がある。本明細書で使用される接触とは、一態様において、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーを含む宿主細胞で発生する。前記時間と条件は、タンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーの量によって異なる。宿主細胞と、タンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーの種類に基づいてどの条件を適用する必要があるかは当業者の知るところである。別の一態様において、接触は本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーを含む無細胞系で発生する。前記無細胞系は、タンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマー及び上述の化合物の錯体形成を可能にする必要がある。血管新生阻害活性をテストするためのインビトロアッセイについては、本明細書で別途説明されている。
【００５２】
さらに、本発明は本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーを含むキットに関する。
【００５３】
本明細書で使用される「キット」という用語は、本明細書で定義されるように、血管新生関連疾患の治療を実施するために個別または共通のバイアルで提供される、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーを含む手段の集合を指す。一態様において、キットは血管形成関連性疾患の治療を実施するための追加手段を含み、一態様において、さらに、特に、ＩＧＦ１Ｒ、ｃ−Ｍｅｔ、Ｐｉ３Ｋ、ＶＥＧＦＲ、Ｂｒａｆ、ＡＬＫ−ＥＭＬ４、ＰＤＧＦＲに対する抗体または低分子キナーゼ阻害剤、ＣＣＬ２、ＧＭ−ＣＳＦ／ＣＳＦ、Ｂｖ８、ＳＤＦ１などの主要なサイトカインに対して拮抗する抗体、及び放射線治療や化学療法など標準の抗がん治療など、本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーと組み合わせて使用できる血管新生阻害剤を含む。さらに、一態様において、キットは血管形成関連性疾患の治療を実施するための指示（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）を含む。これらの指示は、説明書または、実装することで血管形成関連性疾患治療の１つまたはそれ以上の手順を管理できる、データストレージ媒体上のコンピュータ実装可能なアルゴリズムとして提供することができる。前記指示は本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーの投与量、投与の時間と形態などに関する情報を含む。一態様において、キットは本明細書で上述した特定の血管形成関連性疾患、例えば血管新生関連のがんなどの治療を実施するために使用される。
【００５４】
本発明はさらに、ヒトコラーゲン１８のＮＣ−１モノマーと免疫グロブリンのＦｃ領域を含む融合タンパク質に関する。
【００５５】
本明細書において、用語「タンパク質」、「ペプチド」、（ヒトコラーゲン１８の）「ＮＣ−１モノマー」、及び（免疫グロブリンの）「ＦｃドメインまたはＦｃ領域」が定義されている。前記定義及び本明細書で説明されるＮＣ−１モノマーの実施形態が、必要な変更を加えて、本発明の融合タンパク質に適用される。
【００５６】
本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、免疫グロブリンから誘導される少なくとも１つのＦｃ領域に連結された、少なくとも１つの本明細書で定義されるＮＣ−１モノマーを含むポリペプチドを表す。好ましくは、前記融合タンパク質はヒトである。前記Ｆｃ領域はＮＣ−１モノマーのＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合され、好ましくはＮ末端に融合される。
【００５７】
本発明の融合タンパク質の好ましい一実施形態において、前記融合タンパク質は、オリゴマー化領域、ヒンジ領域及び（または）エンドスタチン領域及び、随意に、ヒンジ領域内の組み換えプロテアーゼ切断部位を含む。Ｆｃ−ＮＣ−１融合タンパク質の生成と発現を以下の例に示す。本発明の融合タンパク質が本明細書で定義される会合領域とＦｃ領域から成る場合、単一のジスルフィド架橋が欠落したＦｃ領域の使用が有益である場合がある。ジスルフィド架橋の除去は次の理由で有益であり得る。Ｆｃは二量体であり、一方ＮＣ−１は三量体であるため、二量体が三量体に付着する必要があることを意味する。したがって、Ｆｃの二量体形成を阻止して、例えば、タンパク質の貧弱な発現などを回避するために、Ｆｃに存在する単一のジスルフィドが欠落したＮＣ−ｌ−Ｆｃ融合タンパク質を構築することが役立つ可能性がある。これは、例えば、Ｆｃ領域のＮ末端（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示されるヒトＦｃ領域のシステインアミノ酸残基１１と１４）でシステインをアラニンに変異させることにより達成可能である。このアプローチは、非三重螺旋三量化領域により媒介されるＮＣ−１三量化の結果として三量体Ｆｃ−三量体ＮＣ−１構築物を提供することが見込まれる。別の態様において、融合タンパク質は、例えば、オリゴマー化領域とエンドスタチン領域を含むことができる。さらに、随意に組み換えプロテアーゼ切断部位を備えた、ヒンジ領域を含んでもよい。あるいは、ヒンジ領域とエンドスタチン領域を含むこともできる。
【００５８】
本発明の融合タンパク質の別の好ましい一実施形態において、前記オリゴマー化領域は、ヒトコラーゲン１８の非三重螺旋三量化領域及び（または）人工的オリゴマー化領域及び（または）その他モノマーのオリゴマー化に関する上述の機序を含む。
【００５９】
好ましくは、前記Ｆｃ領域（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５または６に示される）はＩｇＧに由来する。一態様において、本明細書で定義されるＮＣ−１モノマーは１つまたはそれ以上のＦｃ領域に（ポリ）ペプチドリンカーを介して融合される。例えば、ＮＣ−１モノマーはヒトＩｇＧのＦｃ部分にポリグリシン（ｐｏｌｙ  Ｇｌｙ）リンカーを介して融合されることができる。
【００６０】
本発明の融合タンパク質のさらに好ましい一実施形態において、人工的オリゴマー化領域はエンドスタチン領域のポジション７でグルタミンがシステインによって置換される単一の変異を含む。
【００６１】
一実施形態において、ヒンジ領域は本明細書で言及されるＮＣ−１モノマー中のＦｃ領域とエンドスタチン領域間に介在される。前記ヒンジ領域はエンテロキナーゼまたはトロンビン切断部位などの組み換えプロテアーゼ切断部位を含むことができる。随意に、コラーゲン１８のＮＣ−１モノマー内のヒンジ領域は、１つまたはそれ以上の組み換えプロテアーゼ切断部位を、例えばＭＭＰの場合、ヒンジ領域の、内因性プロテアーゼ切断部位に加えて、含むことができる。
【００６２】
本発明の融合タンパク質の別の好ましい一実施形態において、融合タンパク質の領域配置は、Ｆｃ領域―オリゴマー化領域―ヒンジ領域―エンドスタチン領域、またはオリゴマー化領域―ヒンジ領域―エンドスタチン領域―Ｆｃ領域、またはＦｃ領域―エンドスタチン領域―ヒンジ領域―オリゴマー化領域、またはエンドスタチン領域―ヒンジ領域―オリゴマー化領域―Ｆｃ領域である。好ましくは、融合タンパク質の領域配置が、２つのＦｃフラグメント間のジスルフィド結合上でエンドスタチンモノマーのオリゴマー化を媒介する。
【００６３】
さらに好ましい本発明の融合タンパク質の実施形態において、前記融合タンパク質はＮＣ−１領域の会合領域が欠落しており、即ち、Ｆｃ領域をオリゴマー化領域として含む。
【００６４】
本発明のタンパク質オリゴマーに加えて、ＮＣ−１モノマーと免疫ブロブリンのＦｃ領域を含むＦｃ−ＮＣ−１融合タンパク質が最近作られており、血管新生阻害活性及び（または）抗腫瘍活性とより長い半減期について試験が行われる。そのような融合タンパク質は、本発明のタンパク質オリゴマーより、さらに長い半減期及び（または）さらに改善された血管新生阻害活性を示すことが予想されている。
【００６５】
前記融合タンパク質の一実施形態において、前記融合タンパク質はタンパク質オリゴマーであり、好ましくは二量体、三量体または四量体である。「タンパク質オリゴマー」という用語は本明細書で別途定義されている。本発明のタンパク質オリゴマーの定義及び実施形態は、必要な変更を加えて、本明細書で定義される前記ＮＣ−１モノマーと免疫グロブリンのＦｃ領域を含む本発明の融合タンパク質に適用される。前記融合タンパク質が本明細書で定義される１個より多いＮＣ−１モノマー、例えば２個、３個、４個またはそれ以上のモノマーを含むことができることも本発明の範囲内に含まれる。そのような実施形態において、本発明の融合タンパク質はオリゴマーとして使用される。さらに、前記融合タンパク質は、１つより多いＦｃ領域、例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のＦｃ領域を含むことができる。
【００６６】
本発明の融合タンパク質の好ましい実施形態において、本発明の融合タンパク質中のヒンジ領域は構造的修飾を含み、例えば、前記ＭＭＰプロテアーゼにより切断が減少されたＭＭＰプロテアーゼ切断部位における１つまたはそれ以上の変異を含む。
【００６７】
本発明はまた、次を含む融合タンパク質に関する：
ａ）エンドスタチンペプチドまたはエンドスタチン誘導ペプチド；及び
ｂ）フィブロネクチンのＲＧＤモチーフ及び（または）ＰＨＳＲＮモチーフ。
【００６８】
本発明のタンパク質オリゴマーまたはペプチドオリゴマーあるいは融合タンパク質（ＮＣ−１モノマーとＦｃ領域を含む）に関する定義及び実施形態は、必要な変更を加えて、上述のａ）とｂ）で説明される特徴を含む本発明の融合タンパク質に適用される。
【００６９】
エンドスタチンのＮ末端亜鉛結合領域、またはエンドスタチンのＮ末端亜鉛結合領域に対応する合成ペプチドなどの「エンドスタチンペプチド」または「エンドスタチン誘導ペプチド」は、本明細書で別途説明され、以下の例で詳細に示されており、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９と１０のアミノ酸配列を参照する。本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９と１０のアミノ酸配列の変化形も含み、例えば、より短いＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９と１０のアミノ酸配列も使用することができる。例えば、本発明の発明者は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のポジション１から１３、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のポジション１から１２に対応するペプチドを本発明の上述の融合タンパク質においてエンドスタチンペプチドとして使用できることを発見した。さらに、そのようなペプチドは、ＮＣ−１のエンドスタチン領域中の対応するエンドスタチンペプチドの生物活性（本明細書で別途説明される）を少なくとも維持しながら（または超えて）、対応するエンドスタチンペプチドまたはエンドスタチン誘導ペプチドと１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のアミノ酸残基において異なることができる。これを踏まえて、本明細書で別途説明する理由のため、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９または１０のポジション１、３及び（または）１１に対応するヒスチジンアミノ酸残基を維持することが重要である。本発明の融合タンパク質またはオリゴマーで使用可能な血管新生阻害及び（または）抗腫瘍作用を示すエンドスタチンペプチドの例は、例えば、Ｔｊｉｎ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．または米国特許公報第ＵＳ７５２４８１１号明細書に記載されている。
【００７０】
同様に、フィブロネクチン（ＦＮ）内のＲＧＤモチーフ及び（または）ＰＨＳＲＮモチーフは本明細書で別途言及されており、さらに次の例で特徴付けられる。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１と１２はフィブロネクチンのインテグリンへの結合にとって重要なＲＧＤモチーフと周囲のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を提供する。簡単に言うと、フィブロネクチンはインテグリンα５β１及びαＶβ３によって認識される。インテグリン結合のためのフィブロネクチンの一次（ｐｒｉｍａｒｙ）配列モチーフは、力を受ける（ｆｏｒｃｅ−ｂｅａｒｉｎｇ）ＦＮ−ＩＩＩ１０のＧ鎖とＦ鎖に繋がるループ上にあるトリペプチド、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）である。フィブロネクチンのインテグリン結合に関与するのはタイプＩＩＩフィブロネクチンの第９ドメインにあるＰｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ（ＰＨＳＲＮ）モチーフである。対応するマウス及びヒトフィブロネクチン（ＦＮ）のアミノ酸配列は、例えば、アクセッション番号ＮＰ＿０３４３６３．１及びＮＰ＿９９７６４７．１にそれぞれ示されている。ヒトＦＮのドメイン構造は、例えば、Ｗｉｊｅｌａｔｈ他による２００６、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９９、８５３−８６０の刊行物から誘導することができる。好ましくは、フィブロネクチンのＲＧＤモチーフはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１１、１２または１７を含む、またはこれら配列のいずれかから構成される。
【００７１】
好ましくは、エンドスタチンペプチドまたはエンドスタチン誘導ペプチドは融合タンパク質のアミノ末端に位置し、フィブロネクチンのＲＧＤモチーフ及び（または）ＰＨＳＲＮモチーフは、本発明の融合タンパク質のカルボキシ末端に位置する。
【００７２】
好ましくは、本発明のこの融合タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７または１３に示されるアミノ酸配列を含む。
【００７３】
本発明のこの融合タンパク質の別の好ましい一実施形態において、前記融合タンパク質はさらに本明細書で定義されるようにＦｃ領域または人工的オリゴマー化領域を含む。好ましくは、人工的オリゴマー化領域を有する前記融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示されるアミノ酸配列を含む。
【００７４】
以下の実施例において示される実験データに基づき、本発明の発明者らはオリゴマーＮＣ−１がフィブロネクチン（ＦＮ）結合を介して少なくとも２つの重要な血管新生経路での干渉、即ち、ＶＥＧＦとインテグリンα５β１（ＩＴＧＡ５Ｂ１）シグナリングにより、その効果が導き出されると仮定した。さらに、長い暴露、即ち、４連続インビボ継代後、ＦＮが腫瘍で大幅に下方制御され、オリゴマーＮＣ−１（Ｆｃ−エンドスタチン）に対して耐性を示すようになることがわかった。このため、ＦＮを失うことがオリゴマーＮＣ−１に対する先天的及び後天的耐性の主要な機序を構成する可能性があると仮定した。この概念を証明するために、エンドスタチン（ＥＤ）−フィブロネクチン錯体の主要な効果を模擬して最小ペプチド配列が操作された。この目的のために、発明者らはまず、２７のアミノ酸−ＮＨ２−末端領域から成るＥＤ領域全体で最も活性のあるモチーフを選択した（Ｔｊｉｎ  Ｔｈａｍ  Ｓｊｉｎ他、２００５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５、３６５６−６３）。本発明の発明者らによる予備データは、この領域自体がＶＥＧＦに結合可能であり、このペプチド配列における２つのヒスチジン（亜鉛結合領域）がＶＥＧＦ結合に不可欠である可能性があることを示している。ヒスチジンがアラニン残基で置換された変異ペプチドはＶＥＧＦ−ＥＤ−二量体（Ｆｃ−エンドスタチン）結合と張り合うことができなかったため、これはあり得ることである。一方、フィブロネクチンは、ＩＴＧＡ５Ｂ１への結合に不可欠な２つの活性モチーフ、即ち、ＰＨＳＲＮ依存（ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）モチーフとＲＧＤ依存モチーフを含む。図１０にＥＤ領域とＦＮ内の不可欠のモチーフの図式的概観を示す。ＮＣ−１−ＥＤのインテグリンシグナリングとその他特性を媒介したオリゴマーＮＣ−１とＦＮの生理学的錯体を模擬するために、発明者らはこれら２つの不可欠のモチーフ、即ち、上述のＮＣ−１−ＥＤ領域で最も活性があるモチーフと、「ＲＧＤ」及び結合に重要な周囲のアミノ酸残基を含むフィブロネクチンのインテグリン結合モチーフを融合し、「スーパースタチン」（Ｓｕｐｅｒｓｔａｔｉｎ）と呼ばれるハイブリッドの融合タンパク質を生成した。各融合タンパク質について、以下及び実施例２．１０でより詳細に説明されるように、マウス及びヒトの相当物が設計された。マウス（Ｃ５７ＢＬ６）ＬＬＣ（ルイス肺癌）肺がんモデルを使用して、発明者らは図１１に示すように、マウススーパースタチンペプチドが腫瘍の成長を強く阻害する有効性を示すことができた。加えて、スーパースタチンは対照群と比較して大幅に長く生存した。対照的に、ＦＮモチーフ単独では腫瘍成長の予防において有意な改善は見られなかった。
【００７５】
マウス（ｍ）スーパースタチンの対応するアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７で示されており、一方ヒト（ｈ）スーパースタチンの対応するアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３で示されている。スーパースタチンはほぼモノマーである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３のポジション７でグルタミンのシステインにより置換することによって、二量化が可能なヒトスーパースタチンアミノ酸配列の変異型を示す。本発明のこの融合タンパク質は抗腫瘍活性に対する二量化の影響を分析することを可能にする。ＦＮのＲＧＤモチーフの代わりにＰＨＳＲＮを含む構築物、及びジスルフィド結合またはＦｃ領域を介したスーパースタチンの二量化を促進する構築物が別途現在調製されているか、またはすでにインビボ評価中である。ヒトスーパースタチンペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）は錯化剤１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡとも呼ばれる）に共役され、ペプチドに、例えば、非侵襲性イメージング（ＰＥＴ、ポジトロン断層法）用のガリウム（68Ｇａ）など放射性核種と、共役する能力を提供する。発明者らは現在、ＤＯＴＡ共役がヒトスーパースタチンペプチドの有効性に影響するか否かをインビボでのＢｘＰＣ３ヒト膵臓がんモデルでチェックしている。この実験によってスーパースタチン−ＤＯＴＡ構築物の活性が確認された場合、診断薬としてのスーパースタチン−ＤＯＴＡの可能性を評価するインビボＰＥＴイメージングが想定され、これについては実施例２．１０を参照する。
【００７６】
したがって、本発明はさらに、ａ）エンドスタチンペプチドまたはエンドスタチン誘導ペプチドと、ｂ）フィブロネクチンのＲＧＤモチーフ及び（または）ＰＨＳＲＮモチーフを含む、診断用組成物として使用する融合タンパク質に関する。好ましくは、ヒトスーパースタチンペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）が錯化剤１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡとも呼ばれる）に共役される。
【００７７】
本発明のこの融合タンパク質の別の好ましい一実施形態において、前記融合タンパク質はエンドスタチンに結合するフィブロネクチンの領域を同定及び（または）特徴付けるために使用することができる。そのような方法は当技術分野で既知であり、例えば、ＢｉａＣｏｒｅを参照する。
【００７８】
本発明の融合タンパク質のさらなる実施形態は以下の実施例より導くことができる。
【００７９】
本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００８０】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を指す。この用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びそれら分子種のすべての自然発生または人工的に修飾された誘導体を含む。前記ポリヌクレオチドは一態様において線状または環状分子である。さらに、本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列に加え、本発明のポリヌクレオチドは、５’−または３’−ＵＴＲ配列など適切な転写（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）及び（または）翻訳に必要な追加の配列を含んでもよい。本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列は技術者によりさらなる手間なく本発明の融合タンパク質向けに構想されたアミノ酸配列から誘導することができる。遺伝子コードの縮重を考慮し、本発明のポリヌクレオチド中の融合タンパク質をコードする核酸配列では最適化されたコドンを使用してもよい。それにより、例えば、本発明の宿主細胞で、最適な発現を達成することができる。
【００８１】
本発明は、本発明の融合タンパク質のそのような特異的アミノ酸配列またはそれらをコードする核酸配列の変異型も、これらの変異型配列が本発明の融合タンパク質の形成を可能とする限りにおいて、含むと理解される。前記変異型は、好ましくは本明細書に定義される血管新生阻害活性を有する。一態様において、本明細書で使用される配列の変異型は、前に説明された特異的アミノ酸配列または特異的核酸配列と、１つまたはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換、添加及び（または）除去によって異なる。別の一態様において、前記変異型の配列は、本発明の融合タンパク質の特異的配列と、その特異的配列の全長にわたり、または少なくとも半分の長さにわたり、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％、同一である。本明細書で使用される「同一」という用語は、配列間の同一のアミノ酸の数を判定することにより特徴付けられる配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を指し、そのうち、配列は最高の順序一致が得られるように配列される。公開されている技法または、例えば、ＢＬＡＳＴＰまたはＦＡＳＴＡなどコンピュータプログラムで体系化された方法を使用して算出することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  １９９０、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５、４０３）。同一性のパーセント値は、一態様において、アミノ酸配列全体またはクエリー配列の少なくとも５０％の長さの配列にわたって算出される。さまざまなアルゴリズムに基づいた一連のプログラムが異なる配列を比較するために当業者に利用可能となっている。この文脈では、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−ＷｕｎｓｃｈまたはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムで特に信頼性の高い結果を得ることができる。配列アラインメントを実施するために、ＰｉｌｅＵｐプログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ  １９８９、ＣＡＢＩＯＳ  ５、１５１）またはＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  １９９１、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ  ５３７１１）の一部である、Ｇａｐ及びＢｅｓｔＦｉｔプログラム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  １９７０、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８；４４３；Ｓｍｉｔｈ  １９８１、Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ  ２、４８２）を使用することができる。上に挙げられたパーセント（％）単位での配列同一性の値は、本発明の別の一態様において、ＧＡＰプログラムを配列領域全体にわたり、ギャップ加重：５０、長さ加重：３、平均一致：１０．０００及び平均不一致：０．０００の設定で使用して決定され、これが、別途特定されない限り、配列アラインメントのための標準設定として常に用いられる。
【００８２】
本発明はさらに本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。好ましくは、前記ベクターが発現ベクターである。
【００８３】
「ベクター」という用語は、好ましくはファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクター、及び細菌または酵母人工染色体などの人工染色体を含む。さらに、この用語は、ゲノムＤＮＡへの標的構築物の無作為または部位指向的組込みを可能にする標的構築物（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）にも関する。そのような標的構築物は、一態様において、以下で詳細に説明する相同組換えまたは異種組換えに充分な長さのＤＮＡを含む。本発明のポリヌクレオチドを包含するベクターは、一態様において、宿主中での増殖及び（または）選択のための選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ）をさらに含む。前記ベクターは、当技術分野で既知の多様な技法によって宿主細胞中に組込むことができる。例えば、プラスミドベクターは、リン酸カルシウムまたは塩化ルビジウム沈殿物などの沈殿物内、または荷電脂質との錯体内、あるいはフラーレンなど炭素ベースのクラスター内に導入できる。または、プラスミドベクターは熱ショック法やエレクトロポレーション法により導入することができる。ベクターがウイルスである場合、宿主細胞への適用の前に、好適なパッケージング細胞株を用いて、インビトロでパッケージングすることができる。レトロウイルスベクターは、複製能力を有するか、または複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般的には相補的宿主細胞中でのみ起こる。
【００８４】
さらに、本発明の一態様において、ポリヌクレオチドは発現制御配列に機能し得る形で連結され、前記ベクターで原核または真核宿主細胞あるいはその単離された画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）における発現を可能にする。したがって、一態様において、前記ベクターは発現ベクターである。ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへのポリヌクレオチドの転写を含む。宿主細胞における発現を確約する調節因子は当技術分野で既知である。一態様において、それらは転写の開始を確約する調節配列及び（または）転写の終了及び転写の安定化を確約するポリＡシグナルを含む。別の調節因子としては転写及び翻訳エンハンサーを含むことがある。原核宿主細胞中での発現を可能にする考えられる調節因子は、例えば、大腸菌におけるｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞中での発現を可能にする調節因子の例は、酵母におけるＡＯＸ１もしくはＧＡＬ１プロモーターまたは哺乳動物及び他の動物細胞におけるＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサーもしくはグロビンイントロンである。さらに、誘導可能な発現制御配列を、本発明により包含される発現ベクター中で用いることができる。そのような誘導性ベクターは、ｔｅｔまたはｌａｃオペレーター配列あるいは熱ショックまたは他の環境因子により誘導可能な配列を含んでもよい。好適な発現制御配列は、当技術分野で既知である。転写の開始を担う因子の他に、そのような調節因子はまた、前記ポリヌクレオチドの川下に、ＳＶ４０−ポリＡ部位またはｔｋ−ポリＡ部位などの転写終了シグナルを含んでもよい。この文脈において、好適な発現ベクターは当技術分野で既知であり、例えばＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などである。好ましくは、前記ベクターは発現ベクターであり、かつ遺伝子導入または標的化ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、もしくはウシパピローマウイルスなどのウイルスに由来する発現ベクターは、標的化された細胞集団中への本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの送達に用いることができる。当業者には既知の方法を用いて、組換えウイルスベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（２００１）Ｎ．Ｙ．及びＡｕｓｕｂｅｌ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載の技術を参照できる。
【００８５】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞に関する。
【００８６】
本明細書で使用される「宿主細胞」とは、原核宿主細胞と真核宿主細胞を含む。一態様において、前記宿主細胞は細菌細胞である。一態様において、前記細菌性宿主細胞は大腸菌宿主細胞である。そのような細菌性宿主細胞は、例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの複製に使用することができる。
【００８７】
真核宿主細胞は、一態様において、本発明の融合タンパク質と、ポリヌクレオチドまたはベクターのいずれかを含む細胞であり、そのうち、前記ポリヌクレオチドまたはベクターは、前記融合タンパク質を生成するために宿主細胞で発現される。前記ポリヌクレオチドは一過性または安定に宿主細胞に導入されることができる。一態様において、真核宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを安定に発現する真核宿主細胞株の細胞とすることができる。別の一態様において、前記宿主細胞は本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで一過的にトランスフェクションされ、本発明のポリヌクレオチドを発現する、真核宿主細胞である、別の一態様において、前記細胞は本発明の融合タンパク質を産生するために遺伝子操作された細胞である。そのような細胞がどのように分子生物学的方法によって遺伝子操作されるかについては、当業者に既知である。
【００８８】
本発明はさらに本発明の融合タンパク質を産生する方法に関し、前記方法が、
ａ）本発明の融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を、好ましくは無血清条件下で、培養する工程と、
ｂ）工程ａ）の宿主細胞から本発明の融合タンパク質を取得する工程と、
を含む。
【００８９】
本発明はさらに、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、融合タンパク質を含む、薬剤、好ましくは医薬組成物に関する。
【００９０】
本明細書で使用される「薬剤」（ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ）という用語は、一態様において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または融合タンパク質を医薬活性化合物として含む医薬組成物を指し、そのうち、前記医薬組成物は本明細書で別途明示されるように、ヒト以外または好ましくはヒトのさまざまな血管形成関連性疾患または疾病の治療に治療的に有効な量で使用することができる。可能な投与経路は本明細書で別途説明されている。一態様において、本発明の融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または融合タンパク質は、液体または凍結乾燥の形態で存在することができる。一態様において、前記化合物は、グリセロール、タンパク質安定化剤（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））または非タンパク質安定化剤と共に存在することができる。別の一態様において、前記化合物はペグ化されてもよい。
【００９１】
前記化合物（即ち、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または融合タンパク質）は、前記組成物の有効成分であり、一態様において、従来の手順に従って薬物を標準の医薬担体と組み合わせることで調製された従来の剤形で投与される。これらの手順は、成分を所望の調製に合わせて混合、造粒、圧縮、または溶解することを含むことができる。当然ながら、薬学的に許容可能な担体または希釈剤の形態及び性質は、それが組み合わされる有効成分の量、投与経路、その他既知の変数によって決まる。
【００９２】
前記担体は、製剤のその他成分と混合可能であり、かつその被提供者にとって有害でないという意味で許容可能でなければならない。使用される医薬担体は、固形、ゲル、または液体を含むことができる。固形担体の例は、ラクトース、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸及び類似物である。液体担体の例は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、シロップ、オイル、水、乳剤、多様な種類の浸潤剤及び類似物である。同様に、担体または希釈剤は、単独または蝋を含むモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなど、当技術分野で既知の時間遅延物を含むことができる。前記適した担体は、上述のもの及び当技術分野で既知のその他のものを含み、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａを参照する。
【００９３】
希釈剤は、その組み合わせの生物活性、好ましくは、血管新生阻害活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液である。さらに、前記医薬組成物または製剤はその他の担体、アジュバント、または非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤及び類似物を含むことができる。
【００９４】
治療的に有効な量とは、本発明の薬剤において使用され、本明細書で言及される血管形成関連性疾患または疾病に付随する症状を予防、改善または治療する、化合物の量を指す。化合物の治療的有効性及び毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（全体の５０％に治療的効果を有する用量）及びＬＤ５０（全体の５０％に致死的な用量）によって判定することができる。治療的効果と有害な効果間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率で表すことができる。
【００９５】
投薬計画は担当医師とその他臨床的因子によって決定される。医療の分野で既知であるように、任意の１人の患者に対する用量は、患者の体重、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全般的健康状態、同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依存する。進歩は定期的な評価によって監視することができる。
【００９６】
本明細書で言及される薬剤は、本明細書で列挙される疾病または疾患を治療または改善あるいは予防するために少なくとも１回投与される。しかしながら、前記薬剤は１回以上投与してもよい。
【００９７】
特定の薬剤が医薬分野で既知の方法で調製され、上述で言及された少なくとも１つの活性化合物を混合剤中に、またはその他の方法で薬学的に許容可能な担体または希釈剤と共に含む。それら特定の医薬組成物を作るために、前記活性化合物は通常担体または希釈剤と混合される。得られた製剤が投与形態に適応される。検討される被提供者に応じて用量の調整を行うために、処方者または使用者向けの説明書で推奨される用量を示す必要がある。
【００９８】
本発明に基づいた薬剤はさらなる一態様において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または融合タンパク質に加えて製剤中に薬剤に添加される薬物を含むことができる。最後に、薬剤の製剤は薬剤の品質、医薬的安全性、有効性を確約するために、ＧＭＰ標準条件または類似の条件下で行われると理解される必要がある。
【００９９】
本発明の融合タンパク質のさらに好適な実施形態において、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または融合タンパク質を含む薬剤または医薬組成物は、固形腫瘍、メラノーマ、腫瘍転移、白血病などの血液由来の腫瘍、血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、化膿性肉芽腫などの良性腫瘍を含む血管新生依存型がん；関節リウマチ；乾癬；糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障、後水晶体繊維増殖症、ルベオーシスなどの眼球血管新生疾患；オスラー病；心筋血管新生；プラーク血管新生（ｐｌａｑｕｅ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）；毛細血管拡張症；血友病関節症；血管線維腫；創部肉芽形成；腸管癒着症、アテローム性動脈硬化症、強皮症、肥厚性瘢痕（ケロイド）などの過剰または異常な内皮細胞の刺激の疾患；猫引っかき病（Ｒｏｃｈｅｌｅ  ｍｉｎａｌｉａ  ｑｕｉｎｔｏｓａ）及び潰瘍（ヘリコバクターピロリ）などの病理的結果として血管新生を有する疾患から成る群より選択される血管形成関連性疾患の治療または予防用である。
【０１００】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または融合タンパク質を含む診断用組成物に関する。
【０１０１】
本発明はさらに、インビトロまたはインビボでの試料中の血管新生阻害活性判定のための本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または融合タンパク質を含む使用に関する。
【０１０２】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または融合タンパク質を含むキット及び血管新生関連疾患の治療に関する指示書に関する。
【０１０３】
本明細書で使用される「キット」という用語は、本発明の融合タンパク質、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ベクター及び（または）宿主細胞を含み、個別または共通のバイアルで、血管形成関連性疾患の治療実施にすぐに使用できる方法で提供される手段の集合を指す。一態様において、キットは血管新生関連疾患の治療を実施するための追加の手段を含み、一態様において、さらに本明細書で言及される、本発明のタンパク質オリゴマーまたは融合タンパク質と組み合わせて使用できる血管新生阻害剤を含む。さらに、一態様において、キットは血管形成関連性疾患の治療実施に関する指示を含む。これらの指示は、説明書または、実装することで血管形成関連性疾患治療の１つまたはそれ以上の手順を管理できる、データストレージ媒体上のコンピュータ実装可能なアルゴリズムとして提供することができる。前記指示は本発明の融合タンパク質の投与量、投与の時間と形態などに関する情報を含む。一態様において、キットは本明細書で上述した特定の血管形成関連性疾患の治療を実施するために使用される。
【０１０４】
本発明はさらに、血管新生阻害物質（ａｇｅｎｔ）の（インビボの）同定方法に関し、前記方法が、ａ）本発明のオリゴマーまたは融合タンパク質がフィブロネクチン及び（または）ＶＥＧＦに結合して錯体を形成できる条件下で、本発明のオリゴマーまたは融合タンパク質をフィブロネクチン及び（または）ＶＥＧＦと接触させる工程と、ｂ）工程（ａ）の錯体を一連の物質と接触させる工程と、ｃ）工程ａ）の錯体に結合できる物質を同定して単離する工程と、ｄ）工程（ｃ）で同定された物質の血管新生阻害活性をインビトロアッセイでテストする工程を含む。
【０１０５】
工程ｂ）で使用される一連の物質は、例えば、タンパク質または抗体のライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、小有機化合物（ｓｍａｌｌ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）または類似物とすることができる。この方法はさらに、本発明のオリゴマーまたは融合タンパク質への結合を担うフィブロネクチンの領域を同定する工程（ｅ）を含むことができる。この情報は血管新生阻害及び（または）抗腫瘍治療の分子設計に使用することができる。
【０１０６】
本発明のタンパク質オリゴマーを使用した方法の定義及び実施形態が必要な変更を加えて適用される。
【０１０７】
本発明はまた、本発明の変異型ＮＣ−１−ＦｃまたはＦｃ−ＮＣ−１融合タンパク質を産生する方法にも関し、前記方法が、ａ）グルタミンをシステインで置換することによりＮＣ−１−ＦｃまたはＦｃ−ＮＣ−１融合タンパク質中のエンドスタチン領域のアミノ酸ポジション７で単一の変異を導入する工程と、ｂ）工程ａ）の変異型ＮＣ−１−ＦｃまたはＦｃ−ＮＣ−１融合タンパク質を単離する工程を含む。前記変異は本明細書で別途説明されている。
【０１０８】
最後に、以前の報告とは対照的に、発明者らはＦｃ−エンドスタチン耐性の腫瘍をマウスで産生することができた。Ｆｃ−エンドスタチンはオリゴマーを形成し、したがって、本明細書で説明されるオリゴマーＮＣ−１の効果を再現し、例えば、フィブロネクチンに結合するが、一方でエンドスタチンモノマーは結合しない。これら腫瘍は、最大４代継代でマウス肺がん（ＬＬＣ）とヒト膵臓腺がん（ＢｘＰＣ３）において連続移植（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）と腫瘍の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）により産生された。ゲノム規模での発現プロファイリングによって、フィブロネクチンの下方制御がＦｃ−エンドスタチン治療に対する腫瘍の耐性形成の重要な機序であることが明らかになった。これは発明者らにより観察されたオリゴマーＦｃ−エンドスタチンとオリゴマーＮＣ−１のフィブロネクチンへの選択的結合に沿っている。
【０１０９】
したがって、本発明は適用されるがん治療に対するがん患者の反応の予測方法に関し、前記方法が、ａ）本発明のＮＣ−１オリゴマーまたは融合タンパク質を使用して患者の試料中のフィブロネクチンレベルを測定する工程と、ｂ）前記患者の前記がん治療に対する反応を予測する工程を含み、そのうち、（健康な被験者の）基準レベルと比較して低いフィブロネクチンのレベルが適用されたがん治療への患者の非反応性を示す。
【０１１０】
さらに、本発明は、本発明のオリゴマーＮＣ−１または融合タンパク質での治療に対する腫瘍の反応を予測するための、本発明のＮＣ−１オリゴマーまたは融合タンパク質を含むキットを包含する。上述したように、本発明の前記化合物は、がん患者の試料におけるフィブロネクチンまたはそのフラグメントのレベルを検出するために使用することができる。
【０１１１】
発明者らは、本発明のＮＣ−１オリゴマーまたは融合タンパク質を使用することによるフィブロネクチンレベルの解析が、がん治療の反応性予測に利用できることを予期せず発見した。本発明のＮＣ−１オリゴマーまたは融合タンパク質フィブロネクチンへの結合能力は、例えば、がん患者の試料におけるフィブロネクチンレベルの判定に利用することができる。本発明のＮＣ−１オリゴマーまたは融合タンパク質により検出された低レベルのフィブロネクチンは、予後の悪さを示し、したがって、がん患者中の治療に対する反応者（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）と非反応者（ｎｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）の特定における分子治療予測因子として使用することができる。より具体的に、本発明のＮＣ−１オリゴマーまたはＦｃ融合タンパク質による治療、化学療法または抗体療法などを含み、またこれらに限らない、抗腫瘍治療を受けているがん患者の腫瘍、腫瘍環境、血清、血漿または尿中における低フィブロネクチン濃度は、適用された治療に対する患者の低いまたは非反応性の兆候である。
【０１１２】
興味深いことに、発明者らは腫瘍をＦｃ−エンドスタチン治療耐性にする数々の補償経路が活性化されることを特定した。特に、以下の実施例で示すように、ＩＧＦ１Ｒ阻害剤での連続治療は有望であり、ＣＣＬ２は別の有望な候補ターゲットである。Ｆｃ−エンドスタチンは本発明のＮＣ−１オリゴマーまたは融合タンパク質の効果を再現するため、この発見は前記ＮＣ−１オリゴマーまたは融合タンパク質による治療に耐性を持つ患者にも関連する。本発明のオリゴマーＮＣ−１または融合タンパク質に対する後天的な薬剤耐性を回避するために、抗ＩＧＦ１Ｒ、抗ＣＣＬ２または抗ＰＩ３Ｋ標的化剤での同時または連続治療を用いることができる。この目的のため、当技術分野で説明されている抗体またはＰＩ３Ｋ阻害剤など、前述の標的の阻害剤を適用することができる。
【０１１３】
上述を踏まえ、本発明はさらに、オリゴマーＮＣ−１に対する後天的な薬剤耐性を回避するための、抗体を含むがこれに限らない、抗ＩＧＦ１Ｒ及び（または）抗ＣＣＬ２標的化剤での同時または連続治療にも関連する。
【０１１４】
本明細書で参照されるすべての文献はその開示内容全体及び明細書で特に言及される開示内容に関して参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
以下の図面及び実施例において、「ｈＮＣ−１」という用語はヒトＮＣ−１領域を指し、「ｍＮＣ−１」という用語はマウスＮＣ−１領域を指す。ＮＣ−１領域はコラーゲン１８の自然発生の三量化ＮＣ−１であり、別途記載がない限り、会合領域、ヒンジ領域、エンドスタチン領域（亜鉛結合部位を含む）を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１（Ａ）】ヒト血小板の免疫沈降法。直前に採取した血漿１５ｍｌからの血小板が、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、ｐＨ７．５とプロテアーゼ阻害剤のカクテル（合計用量３ｍｌとされた）を用いて溶解された。この溶解物が遠心分離され、濾過された。タンパク質Ｆｃ、Ｆｃ−ＶＥＧＦ、Ｆｃ−エンドスタチン（各１０μｇ）が溶解物１ｍｌに個別に添加された。タンパク質Ａが用いられた。インキュベーションは１８時間、４℃で行われた。３回洗浄後、溶出された試料がＰＡＧＥに適用され、クマシー染色で染色された。対照レーンは溶解物のない試料を参照する。対象タンパク質がゲルからスライスされ、質量分析に送られた。
【図１（Ｂ）】Ｅｌｉｓａ。タンパク質のコーティングが１０μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳで行われた。フィブロネクチンが同一濃度でリガンドとして用いられた。バッファーはすべて２％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有した。
【図１（Ｃ）】エンドスタチンモノマー、二量体、ＮＣ−１三量体のフィブロネクチンへの結合に関する平衡定数のＢｉａｃｏｒｅ測定。フィブロネクチン試料が１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含み、０．７８ｎＭ〜１００ｎＭ範囲で段階希釈により０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％界面活性剤に調製され、対照及び誘導体化表面上に流速６０μｌ／分で３分間注がれた。分離相が５分間観察された。ゼロ濃度ブランクバッファサイクルが陰性対照資料として含まれた。各相互作用分析サイクルの後１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．５の１分注射を使用してセンサー表面が再生された。センサー表面ＣＭ４への非特異的結合効果は観察されなかった。算出されたｋａ、ｋｄ、ＫＤを示す。異なる曲線はフィブロネクチンの異なる濃度に対応する。
【図２】エンドスタチン結合活性と血管内でのフィブロネクチンとの共局在。免疫組織化学を使用して治療後のＡＳＰＣ−１異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）マウスにおけるＦｃ−エンドスタチンの分布が検証された。（Ａ）腫瘍、心臓、腎臓において、外因性エンドスタチンがＡｌｅｘａ４８８標識抗体（緑）によって検出され、血管マーカー、ＣＤ３１が使用され、Ａｌｅｘａ５９４標識抗体（赤）により検出された。（Ｂ）α−ＳＭＡ、周皮細胞マーカー（赤）が使用され、エンドスタチンの腫瘍血管への結合が確認された。（Ｃ）外因性エンドスタチン（緑）の分布は腫瘍中でフィブロネクチン（赤）と類似している。ヒトＦｃ（ｈＦｃ）対照は結合を示さない。（Ｄ）内因性コラーゲン１８（緑）とフィブロネクチン（赤）が未治療の動物腫瘍でエンドスタチンとフィブロネクチンに対するポリクローナル抗体によって検出された。（Ｅ）Ｆｃ−エンドスタチンとインテグリンα５β１の染色。（Ｆ）ｖＷとインテグリンα５β１の染色。（Ｇ）Ｅｌ４．５マウス脳胚部分を使用して、フィブロネクチン、ＶＥＧＦ、Ｆｃ−エンドスタチンの分布が検証された（Ｂａｒ、１００μｍ）。
【図３（Ａ）】Ｆｃ−エンドスタチンとコラーゲンｈＮＣ−１の内皮細胞への結合。ＨＵＶＥＣがＦｃ−エンドスタチンとインキュベーションされ、Ａｌｅｘａ４８８  ＩｇＧまたはヒトＮＣ−１（ｈＮＣ−１）三量体で検出され、抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体で検出された。フィブロネクチン染色は赤で示されている（Ｂａｒ、２０μｍ）。
【図３（Ｂ）】ｈＮＣ−１が内皮細胞遊走を阻害。ＨＵＶＥＣがトランスウェルプレートの２４ウェルインサートにデュプリケーションでプレートされた。下方のチャンバに１００ｎｇ／ｍｌのｒｈｅｓｕｓ  ＶＥＧＦ（ｒｈＶＥＧＦ）と異なる濃度のｈＮＣ−１を含む無血清培地が充填された。３７℃で１６時間インキュベーション後、細胞が固定、染色された。内皮細胞はｈＮＣ−１の１００および２００ｎｇ／ｍｌ処理下で遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が減少する（ａ）。内皮細胞遊走阻害におけるｈＮＣ−１の効果はＵ字形の曲線を示す（ｂ）。エンドスタチンモノマー、二量体及びＮＣ−１が比較に使用された（ｃ）。
【図４】ヒト血清と血小板の免疫沈降法とそれに続くウェスタン分析。（Ａ）Ｍ１とＭ２はそれぞれ組み換えエンドスタチン（１８７アミノ酸）とＮＣ−１を指す。１）免疫前とヒト血清。２）エンドスタチン抗体とヒト血清。（Ｂ）ＭはｈＮＣ１とエンドスタチンマーカーを含む。レーン１と２は（Ａ）と同じである。レーン３（免疫前血清）と４（抗エンドスタチン抗体）は（Ａ）に示されていない個体の血清に対応する。（Ｃ）（Ａ）で用いられたものと異なるＰＲＰ試料から取得されたヒト血清のアフィニティ精製、続いて免疫沈降（ＩＰ）ステップなしでウェスタン分析が行われた。（Ｄ）ヒト血小板の免疫沈降法。ｈＮＣ−１とエンドスタチンマーカーがレーンＭである。１）免疫前血清と血小板溶解物。２）抗エンドスタチン抗体と血小板溶解物。ＩＰはタンパク質Ａが存在する中で実施された。試料にＰＡＧＥと転写を行った後、メンブレンが抗エンドスタチンモノクローナル抗体ＰＤＭで処理された。
【図５】ヒトメラノーマがん細胞（Ａ２０５８）の担癌マウスのｈＮＣ−１での治療。各群４〜６匹の担癌ヌードマウスが皮下で（ｓ．ｃ．）ｈＮＣ−１（１日１回、１００μｇ／マウス）、医療グレードのエンドスタチン（１日１回、１００及び５００μｇ／マウス）またはＰＢＳで治療された。治療は壊死の発生前に停止された。注射部位は腫瘍から離れた場所とした。腫瘍の大きさと治療／対照（Ｔ／Ｃ）の比率が示されている。ｈＮＣ−１治療群は実験の終わりに腫瘍成長が６７％阻害されており、一方エンドスタチン治療群は４８％の阻害のみに留まった。
【図６】フィブロネクチン、インテグリンα５β１、ＶＥＧＦ−Ａ、ｈＮＣ−１間の相互作用の図式モデル。
【図７】還元条件及び非還元条件下の２９３腎臓細胞のトランスフェクションで使用されたプラスミドの量に応じたマウスＦｃ−ＮＣ−１融合タンパク質のＳＤＳゲル。還元条件下で、産物はＦｃとＮＣ−１を含む単鎖である。非還元条件下で、Ｆｃはジスルフィド結合されているため産物は二量体である。ゲル中央の単一のバンドは分子量２０Ｋｄのエンドスタチンマーカーによるものである。
【図８】マウスＦｃ−アンギオスタチンとＦｃ−エンドスタチンへの延長された暴露後のインビボでの耐性ルイス肺がん腫瘍の産生。ＮＣ−１エンドスタチン領域の二量化がＩｇＧ−Ｆｃを使用して達成された。腫瘍成長の初期の強い阻害の後（ｐ１）、腫瘍が＞１０００〜１５００ｍｍ３の大きさに達したら腫瘍を新しい動物に再移植することで、腫瘍はＦｃ−エンドスタチン血管新生阻害治療に（最長４連続継代、ｐ１〜４）長い時間暴露された。耐性腫瘍細胞集団を増やすために、血管新生阻害治療への長時間の連続暴露を達成するべく連続インビボ継代が行われた。Ｐ４腫瘍（下方パネル）は、オリゴマーＮＣ−１フラグメント（Ｆｃ−エンドスタチン）への継続的暴露にもかかわらず、未治療の対照ｐ４腫瘍よりも速い速度で成長した。これらのデータは腫瘍がオリゴマーＮＣ−１フラグメントに対して後天的な薬物耐性を形成することを明確に示している。
【図９】オリゴマーＮＣ−１フラグメント（ｍＦｃ−エンドスタチン）耐性ルイス肺癌（ＬＬＣ）腫瘍のゲノム規模での発現プロファイリング。発現プロファイリングでフィブロネクチン（ＦＮ１）がマウス（ｍ）Ｆｃ−エンドスタチン（ＦｃＥｎｄｏ）耐性腫瘍で著しく下方制御されることが明らかにされた（温度分布図、緑色のボックス）。候補遺伝子の制御はｑ−ＲＴ−ＰＣＲによって確認され、ｐ４対照腫瘍に対する発現倍率（Ｆｏｌｄ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｒａｔｉｏ）が示されている（図）。この発見は、オリゴマーＮＣ−１フラグメントの血管新生阻害効果がＦＮ１への結合によって発揮されることを示す発明者のデータを支持している。したがって、腫瘍におけるＦＮ１の下方制御がそれらをオリゴマーＮＣ−１耐性に変える。さらに、発明者らはＩＧＦ１Ｒ及びＣＣＬ２など複数の主要経路がＦｃ−エンドスタチン耐性腫瘍で上方制御されることを特定した（赤色ボックス）。このため、主要な結合パートナーの下方制御と代替的血管新生経路の補償上方制御によって、腫瘍がオリゴマーＮＣ−１フラグメントでの治療を逃れることができる協調的機序が構成されている。したがって、ＦＮ１レベル及びＩＧＦ１Ｒ／ＣＣＬ２制御は、オリゴマーＮＣ−１フラグメントを含むがん治療に対する腫瘍の反応を予測するために利用可能である可能性がある。
【図１０】エンドスタチン（ＥＤ）領域とフィブロネクチン（ＦＮ）内の重要モチーフの図式的概観である。ＦＮ内のインテグリン結合領域は、２つのモチーフ、ＲＧＤ及びＰＨＳＲＮモチーフから成る。ＮＣ１−ＥＤと類似して、ＨｅｐＩＩなどのヘパリン結合部位がＶＥＧＦなど他のヘパリン結合因子への結合を媒介するために利用可能である。ＮＣ１−ＥＤのアミノ末端亜鉛結合モチーフは、一度アラニン（Ａ）で変異され、その活性を無効にする２つの重要なヒスチジン（Ｈ）を含む。Ｔｊｉｎ  Ｔｈａｍ  Ｓｊｉｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５、６５、３６５６−６３及びＷｉｊｅｌａｔｈ他、２００６、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９９、８５３−８６０より採用された。
【図１１】スーパースタチンが腫瘍の成長を強く阻害する。野生型ＬＬＣ腫瘍（１０．０００細胞）がＣ５７Ｂ１６マウスで皮下に移植された。腫瘍は「ＬＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫ」配列のみを含むリファレンスＦＮ様ペプチド（「ＦＮモチーフ」）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）でまたはマウススーパースタチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）で擬似治療（ｓｈａｍ  ｔｒｅａｔｅｄ）され（ＰＢＳ、対照）、１００μｌのＰＢＳ中ペプチド５０μｇの用量で１２時間ごとに皮下注射された（各群ｎ：５）。治療は腫瘍移植の４日後に開始され（「予防試験」）、２４日間継続された。注目すべきは、治療期間中スーパースタチン群では単一の腫瘍のみ成長したことである。スーパースタチン治療の中止後に２つの追加腫瘍が出現し、この治療によって治療が困難なこれらの腫瘍が制御されることが示されている。腫瘍の大きさが１０００ｍｍ２に達したものはカプラン・マイヤー分析で死亡イベントとしてみなされた。スーパースタチンは対照と比較して生存率を有意に延長した（ｐ＜０．０３、ログランク検定による）。対照的に、ＦＮモチーフ単独（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）は腫瘍成長の予防に有意な改善を示さなかった。
【図１２】ＥＤ二量体（Ｆｃ−エンドスタチン）に示されるように、フィブロネクチン（ＦＮ）のノックダウンで腫瘍がオリゴマーＮＣ１基質に耐性を示すようになった。対照的に、スーパースタチンペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）はＣ５７Ｂ１６マウスにおける皮下のＦＮ／ＬＬＣ腫瘍成長で著しい腫瘍成長阻害を示す。
【図１３】ＩＧＦ１Ｒ阻害剤での連続治療はマウスＦｃ−エンドスタチン（ｍｕＦｃＥｎｄｏ）耐性ＬＬＣ腫瘍の治療に有効である。前に生成された第４世代のＦｃ−エンドスタチン耐性ＬＬＣ細胞（Ｅｎｄｏ  Ｐ４、以下の実施例で説明する）がＣ５７Ｂ１６マウスの皮下に注射された。第５世代で、腫瘍はエンドスタチン選択圧が維持された場合模擬治療された腫瘍（対照）と比較してより速く成長した。ＩＧＦ１Ｒシグナリングの連続阻害（２０ｍｇ／ｋｇシクロリグナンピクロポドフィリン、ＰＰＰ、ＩＰ注射）は腫瘍成長を阻害した。しかし、同時投与はｍＦｃ−Ｅｎｄｏ選択圧により誘発される増殖キネティクスの強化を一部解消した。
【図１４】第５世代（Ｐ５）Ｆｃ−エンドスタチン−（Ｅｎｄｏ）耐性ＬＬＣ腫瘍細胞におけるタンパク質の発現差異（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）。ウェスタンブロットによるタンパク質の分析でさらに、マウスＦｃ−エンドスタチン（Ｅｎｄｏ）での治療に応じた第５世代ＬＬＣ腫瘍において、ＩＧＦ１Ｒ発現強化とリン酸化反応（ｐ-ＩＧＦ1Ｒ）、フィブロネクチンの下方制御及びＣＣＬ２の上方制御が確認された。ＩＧＦ１Ｒ阻害剤での連続治療はこの表現型を部分的に解消した。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
本発明について以下実施例を挙げて説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するとみなされない。
【実施例１】
【０１１８】
材料及び方法
【０１１９】
１．１  細胞株及び細胞培養。ヒト腫瘍細胞株Ａ２０５８（メラノーマ）とヒト膵臓がん細胞株ＡＳＰＣ−１がＬ−グルタミン含有ＤＭＥＭで培養され、１０％のＦＣＳと抗生物質が添加された。ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ、スイス）がＥＢＭ内皮細胞増殖培地とＥＧＭ  Ｂｕｌｌｅｔキット（Ｌｏｎｚａ、スイス）内で抗生物質とともに維持された。
【０１２０】
１．２  発現と精製。ヒトＦｃ−エンドスタチン（ｈＦｃ−エンドスタチン）、人工的エンドスタチン二量体、ＮＣ−１の構築、発現、精製は以前に説明されている（Ｂｅｒｇｅｒｓ他、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４、８０８；Ｌｏ他、１９９８、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１、４９５；Ｋｕｏ他、２００１、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５２、１２３３；Ｗｅｎ他、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９、１２３３）。組み換え構築物はエンドスタチンのＮ末端でＦｃ領域を配置することにより調製された。これら構築物の安定した細胞株がＮＳ／０マウス骨髄腫細胞で産生された。タンパク質が発現され、培地に分泌された。タンパク質Ａが組み換えタンパク質の精製に使用された（少なくとも９０％の純度）。１０〜１８リットル容量の発酵槽を使用して約５０ｍｇ／リットルのＦｃ−エンドスタチンが取得された。ヒトコラーゲン１８ＮＣ−１の調製は以前に説明されている（Ｗｅｎ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。タンパク質が発現され、培地に分泌されて、Ｎｉ−アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で精製された。
【０１２１】
１．３  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合アッセイ。この分析は２つの結合パートナー間の平衡定数を測定する独自の方法を提供する。錯体形成（ｋａ）と解離（ｋｄ）の割合を記録し、続いてこれら２つのパラメータの値を決定するソフトウェアを使用することで、相互作用のキネティクスを評価することができる。平衡定数（ＫＤ）はｋｄ／ｋａの比率を計算することにより取得される。ヒトＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）、エンドスタチン、エンドスタチン二量体とヒトＮＣ−１（ｈＮＣ−１）が１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中で５０μｇ／ｍｌに希釈され、シリーズＳセンサーチップＣＭ４に標準のＮ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＥＤＣ/ＮＨＳ）アミンカップリング手順によって固定化された。対照表面は同様にタンパク質誘導体化なしで調製され、化合物結合実験用のリファレンス表面として使用された。
【０１２２】
表面プラズモン共鳴を用い、分子の相互作用を検出・監視するＢｉａｃｏｒｅTM  Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン、ウプサラ）装置を使用して、結合の測定が行われた。
【０１２３】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアｖ  １．１．１を使用してデータ分析が実施された。データはリファレンス表面のデータとブランクバッファー試料データの差し引き、一般に「ダブルリファレンス」と呼ばれる手順によって準備され、１：１ラングミュア結合モデルに適合された。
【０１２４】
１．４  動物と腫瘍モデル。すべての動物手順はボストン小児病院の指針に従って実施された。手順は動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。８週齢のオス（２４〜２７ｇ）ヌード／ヌードマウス（マサチューセッツ総合病院、マサチューセッツ州ボストン）が使用された。マウスは順化され、バリアケア施設内で５匹のグループでケージに入れられ、動物食と水が自由に与えられた。動物はＣＯ２吸入により安楽死された。ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８が動物研究に使用された。ＰＢＳ０．１ｍｌ中の２ｘ１０６腫瘍細胞懸濁液がマウス背部の正中線近くに皮下（ｓ．ｃ．）注射された。マウスは計量され、腫瘍は週２回デジタル測径器で２直径が監視された。腫瘍の体積はａ２×ｂ×０．５２（そのうちａは最短の直径、ｂは最長の直径を表す）を使用して決定された。腫瘍は最大１００ｍｍ３まで成長が許可され、マウスは無作為化された。治療はボーラス皮下注射によって行われた。実験の完了後、腫瘍と臓器が切除され、かつ４％パラホルムアルデヒド中で、または急速凍結のいずれかで固定された。各群４〜６匹のマウスが治療された。
【０１２５】
１．５  免疫細胞化学。ＨＵＶＥＣがプレートされ、カバーガラス上で成長された。細胞が１０μｇ／ｍｌのｈＦｃ−エンドスタチン、ｈＦｃ、ｈＮＣ−１または対照ＩｇＧで、１２０分間３７℃でインキュベーションされた後固定された。ガラスはブロッキングバッファー（２％ＢＳＡ  ＰＢＳ）中で３０分間インキュベーションされた。ｈＦｃ−エンドスタチン群またはｈＦｃ群について、スライドはＡｌｅｘａ  ４８８抗ヒトＩｇＧでイメージング用にインキュベーションされた。ｈＮＣ−１群またはＩｇＧ群について、スライドはマウス抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体でインキュベーション後、Ａｌｅｘａ  ４８８抗マウスＩｇＧによりプローブされた。抗フィブロネクチン抗体（Ｒ＆Ｄ）がすべてのスライドで二次染色に使用され、Ａｌｅｘａ  ５９４抗ヤギＩｇＧによりプローブされ、共焦点顕微法によりイメージングされた。ＤＡＰ１核カウンター染色は青色で示されている。
【０１２６】
１．６  免疫組織化学。腫瘍セクションが冷たいＰＢＳで洗浄され、染色前に４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定された。ヒトＦｃ−エンドスタチンがＡｌｅｘａ  ４８８抗ヒトＩｇＧで検出された。コラーゲン１８（Ｒ＆Ｄ）、フィブロネクチン（Ｒ＆Ｄ）、インテグリンα５（Ｒ＆Ｄ）ＣＤ３１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンホセ）に対する抗体及びフォンヴィレブランド因子（Ｄａｋｏ、カリフォルニア州カーピンテリア）、α−ＳＭＡ（Ｄａｋｏ、カリフォルニア州カーピンテリア）が染色に使用された。一次抗体がＡｌｅｘａ  ４８８また５９４標識二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）により検出された。セクションが共焦点顕微法（モデルＤＭ  ＩＲＥ２；ライカ）によりイメージングされた。
【０１２７】
１．７  内皮細胞遊走アッセイ。ＨＵＶＥＣが無血清ＥＢＭ培地により２回洗浄され、培地０．６ｍｌ中５×１０４細胞／ウェルで再懸濁され、２４ウェルのインサート（Ｃｏｒｉｎｇ、８μｍ、ポアサイズ）にデュプリケーションでプレートされた。下方のチャンバに１００ｎｇ／ｍｌのｒｈｅｓｕｓ（ｒｈ）ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ）を含む０．６ｍｌの無血清ＥＢＭ培地が充填された。３７℃で１６時間インキュベーション後、細胞がメタノールで固定され、エオジンとヘマトキシリンで染色された。トランスウェルメンブレン上側の細胞がコットンスワブで除去された。メンブレン下側に遊走する細胞がカウントされた。
【０１２８】
１．８  細胞表面上に結合したヒトＦｃ−エンドスタチン（ｈＦｃＥＳ）のフローサイトメトリー分析。すべての操作が４℃で行われた。ＨＵＶＥＣがトリプシン処理され、ＰＢＳ（２％ＢＳＡ）で３０分間再懸濁された後、１及び１０μｇ／ｍｌのｈＦｃＥＳまたはｈＦｃで１時間インキュベーションされた。細胞が遠心分離され、冷たいＰＢＳで洗浄された後、ＦＩＴＣ標識二次抗体（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）でヒトＦｃフラグメントに対してインキュベーションされ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターにより分析された。
【０１２９】
１．９  統計法。データは平均±ＳＤで表される。統計的有意性はＳｔｕｄｅｎｔ  ｔテストを使用して評価された。
【実施例２】
【０１３０】
結果
【０１３１】
２．１  二量化エンドスタチンとＮＣ−１がフィブロネクチンに結合する。血小板におけるエンドスタチンの存在を示す報告のために、血小板溶解物でエンドスタチンに結合するタンパク質の同定が進められている（Ｉｔａｌｉａｎｏ他、２００８、Ｂｌｏｏｄ  １１１、１２２７）。Ｆｃ−エンドスタチンの利点の１つは、免疫沈降法（ＩＰ）に錯体を形成するために追加の抗体を導入することなくこの構築物を使用できることである。３つのタンパク質構築物ヒトＦｃ（対照）、二量化ヒト（ｈ）Ｆｃ−エンドスタチン、ｈＦｃ−ＶＥＧＦが用いられた。データを図１（Ａ）に示す。上述の３つの試薬についてのＩＰ結果を比較すると、クマシー染色ポリアクリルアミドゲルのレーン間の主な違いは２００ｋＤａ付近であった。この領域の質量分析はエンドスタチンとＶＥＧＦ両方についてタンパク質に結合する候補としてのフィブロネクチンの同定につながった。エンドスタチンとＶＥＧＦのフィブロネクチンへの結合を確認するために、Ｅｌｉｓａが行われた（図１Ｂ）。エンドスタチン二量体、ＮＣ−１、ＶＥＧＦ、インテグリンα５β１（フィブロネクチンの天然受容体）がフィブロネクチンに結合し、一方エンドスタチンモノマーはしなかった。人工的エンドスタチン二量体が組み換えＦｃ−エンドスタチンでエンドスタチンのアミノ酸ポジション７に単一の変異（グルタミンをシステインに変える）を導入することで生成された。エンテロキナーゼによるこの変異型タンパク質の分解を受けて、ジスルフィド結合により結合されたエンドスタチン二量体が産生される（Ｋｕｏ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。
【０１３２】
上述のタンパク質の平衡結合定数を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅシステムが用いられた。エンドスタチン二量体、ＮＣ−１及びＶＥＧＦについて高い親和定数が取得された（図１Ｃ）。エンドスタチンモノマーとフィブロネクチン間に結合は検出されなかった。このデータを裏付けるように、ＶＥＧＦのフィブロネクチンへの結合がこれまでに他のグループより報告されている（Ｗｉｊｅｌａｔｈ他、２００６、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９９、８５３）。Ｆｃ−エンドスタチンはＦｃ二量体のＣ末端で２つのエンドスタチン分子に二量体構造を課す。Ｆｃ−エンドスタチンのフィブロネクチンへの結合定数はエンドスタチン二量体に類似している（データは示されていない）。
【０１３３】
２．２  免疫組織化学の研究は、二量化エンドスタチンがフィブロネクチンを介して内皮細胞を標的とすることを示している。免疫蛍光（ＩＦ）分析を使用してＡＳＰＣ−１異種移植動物モデルでｈＦｃ−エンドスタチンの全身分布（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）が検証された。外因性オリゴマー化エンドスタチンの分布が、図２Ａに示すように、Ｆｃへの抗体を使用して検出された。イメージング結果によると、注射されたオリゴマー化エンドスタチンは腫瘍だけでなく心臓と腎臓の内皮細胞でも見付かることが示された。ＣＤ３１（内皮細胞）染色に加え、周皮細胞マーカー、α−ＳＭＡを使用して、エンドスタチンと血管の相互作用が確認された（図２Ｂ）。エンドスタチンのフィブロネクチンへの結合を調べるため、ｈＦｃ−エンドスタチンで治療された異種移植モデルの腫瘍部分が作製された。外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）二量化ｈＦｃ−エンドスタチン（ｈＦｃＥＳ）は、内因性フィブロネクチンとの共局在を示す（図２Ｃ）。内因性コラーゲン１８と内因性フィブロネクチンの共局在も検出されている（図２Ｄ）。インテグリンα５β１はフィブロネクチンの受容体である（Ｈｙｎｅｓ  １９９２、Ｃｅｌｌ  ６９、１１）。イメージングデータによると、ｈＦｃＥＳはインテグリンα５β１とも共局在した（図２Ｅ）。最後に、ＶＷＦ、インテグリンα５β１の腫瘍部分での共局在を検出した（図２Ｆ）。これらのデータは二量化ｈＦｃＥＳ、フィブロネクチン、インテグリンα５β１と血管の近接を示している。さらに、体外Ｅ１４．５マウス脳胚部分（ｂｒａｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｅｃｔｉｏｎ）を使用してこの現象が確認された。フィブロネクチン、ＶＥＧＦ、ｈＦｃＥＳはマウス胚脳で類似した結合パターンを示し（図２Ｇ）、ＶＥＧＦはこのアセンブリの構成要素であることが確認された。
【０１３４】
２．３  オリゴマー化ｈＦｃ−エンドスタチンとｈＮＣ−１のＨＵＶＥＣへの結合。免疫蛍光法を用いて内皮細胞表面のオリゴマー化エンドスタチンとＮＣ−１の結合が検出された。Ｆｃ−エンドスタチンとＮＣ−１は、細胞が２４時間のみ培養されたときのＨＵＶＥＣへの結合が少なかった（データ未表示）。インキュベーション時間を７２時間に延長すると結合が大幅に増加し、これはフィブロネクチン上方制御の結果である可能性がある（図３Ａ上方パネル）。これらのデータはフィブロネクチンが二量化エンドスタチンの内皮細胞への結合の橋渡し役としての重要な役割を担っていることを示唆している。３Ｄイメージはエンドスタチンとフィブロネクチンの内皮細胞上の分布を示した。
【０１３５】
２．４  ｈＮＣ−１が内皮細胞の遊走を阻害する。内皮細胞遊走は新血管形成と腫瘍血管新生において重要な工程である。ｈＮＣ−１の内皮細胞遊走に対する影響を評価するため、ｒｈＶＥＧＦを使用してトランスウェルアッセイでＨＵＶＥＣの遊走が誘引された。細胞の遊走が監視され、量化された。メンブレンを遊走する細胞が青紫染色で染色され（図３Ｂ（ａ））、カウントされた。ｈＮＣ−１はＶＥＧＦにより誘引された内皮細胞遊走を濃度に応じて阻害し、投与効果はＵ字形の曲線を示した（図３Ｂ（ｂ））（Ｌｅｅ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。ＮＣ−１は検査された異なるエンドスタチン分子の中で最も強力な抗遊走物質（ａｎｔｉ−ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）であった（図３Ｂ（ｃ））。
【０１３６】
２．５  ヒト血液循環中のエンドスタチン不在。エンドスタチンは最初にマウス腫瘍細胞株（ＥＯＭＡ）の馴化培地から単離された。タンパク質の精製は複数の工程が含まれた。Ｎ末端配列の同定ではＮ末端配列「ＨＴＨ」で開始するエンドスタチン分子という結果が示された。組み換えマウスとヒトエンドスタチンのいずれもこのＮ末端配列を基盤として構築されていた（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ他、１９９７、Ｃｅｌｌ  ８８、２７７）。
【０１３７】
複数の個体の血清中のエンドスタチンの大きさが調査されている。この目的のために、ＰＲＰ（多血小板血漿）半リットル袋が１〜４人から４日前に採取された。血小板を除去するための低ＲＰＭ遠心分離後、高ＲＰＭを適用して血清が取得された。この血清がタンパク質Ａに通され、ＩｇＧが除去された。その後エンドスタチンポリクローナル抗体によって免疫沈降され、続いてウェスタン分析が行われた。エンドスタチンに向けられたモノクローナル抗体がメンブレンの処理に使用された（図４）。タンパク質マーカーはＮＣ−１とエンドスタチンである。同定されたタンパク質のサイズは２つのマーカーの間であり、複数のタンパク質バンドが存在する（図４Ａ）。異なる個体からの血清に同一の手順が適用された（図４Ｂ）。これらのデータを確認するため、タンパク質Ａ工程の後に行われたより早期のＰＲＰ試料（前述のＰＲＰ袋とは異なる）のアフィニティ精製は同様の大きさの分子を生み出した（図４Ｃ）。最後に、同一のポリクローナル抗体による血小板の免疫沈降法は、同定されたタンパク質がエンドスタチンより大きい分子サイズであることを示した（図４Ｄ）。
【０１３８】
これらの結果から、発明者らはエンドスタチンでのより早期のデータを再分析することにした（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。最も早期にエンドスタチン単離に用いられた馴化培地は、最終の精製工程に先立ち、継続的に長期間（少なくとも１ヶ月）４℃に保たれていた。倍地中に存在するウシ胎仔血清はＮＣ−１の分解を引き起こす可能性がある。この仮説は昨年、発明者の研究室の別のグループにより、同一のマウス腫瘍細胞株を用いて確認されている（Ｗｅｎ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。タンパク質単離時間の短縮と精製の単一工程の採用の際、主要なタンパク質はｍＮＣ−１とエンドスタチンであることが分かった（Ｗｅｎ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。そのため、早期に観察されたエンドスタチンサイズのタンパク質がＨＰＬＣ精製の後の産物のみであったことは、ＮＣ−１が４℃での長いインキュベーション後にエンドスタチンサイズの分子に分解されたという発明者の仮説を強く支持している。この仮説に対する追加の証拠が別の一群の研究者らによって公開されたデータから示されている（Ｓａｓａｋｉ他、１９９８、ＥＭＢＯ  Ｊ  １７、４２４９）。
【０１３９】
ほぼ確実に、最初に報告されたエンドスタチンは実験室で発生した分解の結果であった。ＮＣ−１はエンドスタチンの前駆体である。ヒト血清に関する発明者らのデータは採取と精製の数日後に行われた実験に基づいており、発明者らはＮＣ−１のより小さいフラグメントへの分解を回避できなかった。発明者らはこれらのデータから、マウスＥＯＭＡと対照的に、１８７アミノ酸エンドスタチンはヒト血清と血小板に存在しないと結論付けている。ＮＣ−１のエンドスタチン分解産物より大きいものの一部は、ヒト血液循環中に存在する可能性があるものの候補である二量体に対応する、またはＮＣ−１の採取後分解の結果である可能性がある。したがって、現在のデータはＮ−１がヒト血液循環中の最も生理学的に適切な分子であることを強く示唆している。
【０１４０】
２．６  ｈＮＣ−１がインビボで腫瘍成長を抑制する。ＮＣ−１とエンドスタチンの抗腫瘍活性を比較するため、ヒトメラノーマ細胞株Ａ２０５８を有するヌードマウスが用いられた。データを図５に示す。タンパク質の濃度が５倍異なる２つの用量（低用量と高用量）の医療グレードエンドスタチンが使用された。対応する低用量のＮＣ−１は、高用量のエンドスタチンに類似した抗腫瘍作用を示した。この結果はエンドスタチンと比較してＮＣ−１による抗腫瘍効果のほうが優れていることを示す。注射されたＮＣ−１が血液循環に入った際に分解される可能性を排除することはできない。
【０１４１】
２．７  ｍＦｃ−ＮＣ−１融合タンパク質の生成と発現。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示されるマウスコラーゲン１８のＮＣ−１領域の非三重螺旋三量化領域（会合領域）、ヒンジ領域、（亜鉛結合部位を包含する）エンドスタチン領域を含むマウスＦｃ−ＮＣ−１融合構築物が生成され、２９３の腎臓細胞で発現された。この構築物において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるＦｃ領域は前記融合タンパク質のＮ末端に位置し、マウスＮＣ−１領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示される）はＣ末端に位置する。さらに、融合構築物の切断を可能にするために、エンテロキナーゼ切断部位を持つリンカーがＦｃとＮＣ−１の間に介在された。当業者には明らかであるように、患者に投与するための対応する治療産物にはそのような切断部位はない。図７に還元条件及び非還元条件下の２９３腎臓細胞のトランスフェクションで使用されたプラスミドの量に応じた前記マウスＦｃ−ＮＣ−１融合構築物のＳＤＳゲルの写真を示す。還元条件下で、前記産物はＦｃとＮＣ−１から成る単鎖である。非還元条件下で、前記産物はＦｃがジスルフィド結合されるため二量体である。二量化Ｆｃは共有結合によってＮＣ−１の２鎖のみに対応することができる。したがって、非共有結合的に結合された（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ＮＣ−１の第３鎖がＳＤＳの存在において解離され（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ）、かつ、そのため、試料とゲル自体をローディングしていると推察される。ゲルの中央にある１つのバンドは分子量２０Ｋｄを有するエンドスタチンマーカーによるものである。その後、前記構築物はこのタンパク質の抗腫瘍作用とより長い半減期について検査される。
【０１４２】
２．８  内因性血管新生阻害剤に対する後天的薬物耐性：エンドスタチン。マウスルイス肺癌（ＬLＣ）腫瘍がＣ５７／Ｂ１６マウスに皮下移植された。腫瘍は表示された用量で、マウスオリゴマーＮＣ１フラグメント、ｍＦｃ−エンドスタチンで治療された。ＬＬＣ腫瘍はそれらが治療を逃れて約１０００〜２０００ｍｍ３のサイズに達すると腫瘍の連続移植（最大４継代、ｐ４まで）によりｍＦｃ−エンドスタチンに長い時間インビボで暴露された。対照の腫瘍もｍＦｃ−エンドスタチン治療無しで新しいマウスに連続移植された。腫瘍の体積は測径器測定で測定された（図８）。４継代後、ｍＦｃ−エンドスタチン耐性腫瘍と対照腫瘍の両方が切除され、トータルＲＮＡが単離されて、ＱＣ後ゲノム規模マイクロアレイで転写分析のためハイブリダイゼーションされた。ＳＵＭＯソフトウェアパッケージを使用してマイクロアレイデータが解析された。マイクロアレイ解析によって同定された候補遺伝子の発現を確認するために、Ｔａｑｍａｎ法を使用して定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲが行われた。
【０１４３】
その結果、このデータによると、以前の報告とは対照的に、発明者らは本明細書の他所に記載されたＮＣ−１の効果に似たｍＦｃ−エンドスタチンへの耐性を持つ腫瘍を生成することができたことが示された。これらの腫瘍はマウス肺がん（ＬＬＣ）とヒト膵臓腺がん（ＢｘＰＣ３）の最長４継代での腫瘍の連続移植と治療によって生成された。ゲノム規模での発現プロファイリングによって、フィブロネクチンの下方制御がｍＦｃ−エンドスタチン治療に対して腫瘍を耐性に変えることが明らかになった（図９）。これは発明者らにより観察されたオリゴマーｍＦｃ−エンドスタチンとオリゴマーＮＣ−１のフィブロネクチンへの選択的結合に沿っている。したがって、フィブロネクチンレベルの解析は、がん治療の反応性に対する予後マーカーとして利用することができる。さらに、発明者らは腫瘍をＦｃ−エンドスタチン治療耐性にする数々の補償経路が活性化されることを特定した。特に、初歩的な動物データによると、ＩＧＦ１Ｒ阻害剤での連続治療は有望であり、ＣＣＬ２は別の有望な候補ターゲットである。
【０１４４】
２．９  抗腫瘍作用を備えた新しいハイブリッドペプチド「スーパースタチン」。前の実施例において、発明者らはヒト血液循環中のコラーゲン１８の生理的基質がコラーゲン１８の非コラーゲン性ＮＣ−１領域由来のエンドスタチン領域（ＥＤ）のオリゴマーを含むと仮説を立て、証拠を提示した。さらに、エンドスタチンのヒト免疫グロブリンＦｃ−領域への融合（Ｆｃ−エンドスタチン）に基づいて構築された合成ＥＤ−二量体はフィブロネクチン（ＦＮ）に結合し、一方モノマーは結合しないことを確認した。ＦＮのＶＥＧＦへの高親和性結合がさらに確認された。これらを踏まえて、発明者らは、オリゴマーＮＣ−１の効果が少なくとも２つの極めて重要な血管新生経路、即ち、ＶＥＧＦとインテグリンα５β１（ＩＴＧＡ５Ｂ１）シグナリングとの干渉によるＦＮ結合を介して引き出されると提案した。さらに、ＦＮは長時間の暴露後、即ち、４連続インビボ継代後、オリゴマーＮＣ−１（Ｆｃ−エンドスタチン）耐性となった腫瘍において大幅に下方制御されることを発見した。したがって、ＦＮを失うことがオリゴマーＮＣ−１基質への先天的及び後天的耐性の重要な機序を構成する可能性があると仮定した。発明者らはこの概念の究極の証拠を提供するために２つの戦略に従った。
【０１４５】
第１のアプローチはＥＤ−ＦＮ錯体の主要な効果を模擬した最小のペプチド配列を操作することであった。この目標に向けて、発明者らは、本発明の発明者の一人であるＪａｖａｈｅｒｉａｎ博士により元々同定された２７アミノ酸−ＮＨ２−末端領域で構成される全ＥＤ領域中で最も活性のあるモチーフを選択した（Ｔｊｉｎ  Ｔｈａｍ  Ｓｊｉｎ他、２００５、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ.  ６５、３６５６−６３）。本発明の発明者らによる予備データは、この領域自体がＶＥＧＦに結合可能であり、このペプチド配列における２つのヒスチジン（亜鉛結合領域）がＶＥＧＦ結合に不可欠である可能性があることを示している。ヒスチジンがアラニン残基で置換された変異ペプチドはＶＥＧＦ−ＥＤ−二量体（Ｆｃ−エンドスタチン）結合と張り合うことができなかったため、これはあり得ることである。一方、フィブロネクチンは、ＩＴＧＡ５Ｂ１への結合に不可欠な２つの活性モチーフ、即ち、ＰＨＳＲＮ依存（ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）モチーフとＲＧＤ依存モチーフを含む。図１０にＥＤ領域とＦＮ内の不可欠のモチーフの図式的概観を示す。
【０１４６】
ＮＣ−１−ＥＤのインテグリンシグナリングとその他特性を媒介したオリゴマーＮＣ−１とＦＮの生理学的錯体を模擬するために、発明者らはこれら２つの不可欠のモチーフ、即ち、上述のＮＣ−１−ＥＤ領域で最も活性があるモチーフと、「ＲＧＤ」及び結合に重要な周囲のアミノ酸残基を含むフィブロネクチンのインテグリン結合モチーフを融合し、「スーパースタチン」（Ｓｕｐｅｒｓｔａｔｉｎ）と呼ばれるハイブリッドのペプチドを生成した。各ペプチド配列について、実施例２．１０でより詳細に説明されるように、ヒト及びマウスの相当物が設計された。
【０１４７】
以下では、同系のマウス肺がんモデル（ＬＬＣ）におけるデータがマウススーパースタチン配列を使用して示されている。
HTHQDFQPVLHLVLYAVTGRGDSPASSK （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
ＮＣ１−ＥＤモチーフ−ＦＮ−モチーフハイブリッド
【０１４８】
効果がＦＮ−モチーフ自体によって媒介されていないということを証明するため、ＮＣ１−ＥＤ様モチーフがない、即ち、ＦＮ−モチーフだけで構成されるリファレンスペプチドが用いられた：
LYAVTGRGDSPASSK （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）.
【０１４９】
ＦＮのＲＧＤモチーフの代わりにＰＨＳＲＮを含む構築物、及びジスルフィド結合またはＦｃ領域を介したスーパースタチンの二量化を促進する構築物が別途現在調製されているか、またはすでにインビボ評価中である。実施例２．１０を参照する。
【０１５０】
ＬＬＣマウス（Ｃ５７ＢＬ６）肺がんモデルを使用して、発明者らはマウススーパースタチンペプチドの腫瘍成長を顕著に阻害する効果を示すことができた。
【０１５１】
図１１に示すように、野生型ＬＬＣ腫瘍（１０．０００細胞）がＣ５７Ｂ１６マウスで皮下に移植された。腫瘍は「ＬＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳＳＫ」配列のみを含むリファレンスＦＮ様ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；ＦＮモチーフ）でまたはマウススーパースタチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）で擬似治療（ｓｈａｍ  ｔｒｅａｔｅｄ）され（ＰＢＳ）、１００μｌのＰＢＳ中ペプチド５０μｇの用量で１２時間ごとに皮下注射された（各群ｎ：５）。治療は腫瘍移植の４日後に開始され（「予防試験」）、２４日間継続された。注目すべきは、治療期間中スーパースタチン群では単一の腫瘍のみ成長したことである。スーパースタチン治療の中止後に２つの追加腫瘍が出現し、この治療によって治療が困難なこれらの腫瘍が制御されることが示されている。腫瘍の大きさが１０００ｍｍ２に達したものはカプラン・マイヤー分析で死亡イベントとしてみなされた。スーパースタチンは対照と比較して生存率を有意に延長した（ｐ＜０．０３、ログランク検定による）。対照的に、ＦＮモチーフ単独（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）は腫瘍成長の予防に有意な改善を示さなかった。
【０１５２】
スーパースタチンペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の有効性が確認されると、発明者らは、オリゴマーＮＣ−１がその血管新生阻害及び抗腫瘍効果を作用させるためにはＦＮシグナリングが不可欠であるという提案された概念を検証するために、第二の戦略に移った。マウスフィブロネクチンに対してレンチウイルスｓｈＲＮＡ構築物を使用し、ＦＮをＬＬＣで下方制御して以前に生成されたｐ４  Ｆｃ−エンドスタチン耐性腫瘍の天然の表現型を模擬した。ＬＬＣ  ＦＮ−／−腫瘍細胞（１００．０００）がＣ５７Ｂ１６マウスに移植され、二量化マウスＦｃ−エンドスタチン対スーパースタチンでの治療が移植４日後に開始された。ＦＮのノックダウンでＬＬＣ腫瘍がオリゴマーＮＣ-１（Ｆｃ−エンドスタチン）に耐性を示すようになった。さらに、自然淘汰されるｐ４耐性ＬＬＣ腫瘍細胞に関して元々報告されていたデータに類似して、ＬＬＣ  ＦＮ−／−腫瘍は対照と比較して成長がより速い傾向を示した。対照的に、図１２に示すように、ＥＤモチーフとＦＮモチーフの両方を包含するスーパースタチンペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）は対照またはＦｃ−エンドスタチン治療腫瘍と比較して大幅に腫瘍の成長を阻害した（ｐ＜０．０１）。これらのデータは、スーパースタチンの活性が腫瘍におけるＦＮの可用性に依存しておらず、したがって腫瘍をオリゴマーＮＣ−１耐性に変える耐性機序を回避していることを示している。
【０１５３】
実施例における発見に基づき、発明者らは特定された腫瘍化促進及び血管新生促進経路の補償上方制御が腫瘍のＥＤ誘導物質またはオリゴマーＮＣ−１に対する後天的耐性を回避するための有望な標的を構成する可能性を提案した。２つの特定の経路、即ち、ＩＧＦ１ＲシグナリングとＣＣＬ２の阻害は、すでに高度な臨床試験段階に入った薬物が利用可能であるため、最も有望であると提案された。ここで、発明者らはＩＧＦ１Ｒ阻害剤の同時ではなく連続投与がマウスＦｃ−エンドスタチン（ＮＣ−１−ＥＤ−二量体）に耐性のある腫瘍の成長を妨げたことを示した。図１３を参照する。
【０１５４】
ウェスタンブロットによるタンパク質の分析でさらに、マウスＦｃ−エンドスタチン（Ｅｎｄｏ）での治療に応じた第５世代ＬＬＣ腫瘍において、ＩＧＦ１Ｒ発現強化とリン酸化反応、フィブロネクチンの下方制御及びＣＣＬ２の上方制御が確認された。図１４を参照する。ＩＧＦ１Ｒ阻害剤での連続治療はこの表現型を部分的に解消した。
【０１５５】
実施例２．１０：デザインしたペプチド。
本発明の発明者らによる前のデータは、ＮＣ−１−ＥＤの活性モチーフがタンパク質のＮ末端に存在し、２５アミノ酸ペプチドによって模倣することができることを示している。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９は、対応するマウス配列を示し、一方ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０は対応するヒト配列を示す。さらに、ＥＤの亜鉛結合配位がこのペプチド中の３つのヒスチジンによって媒介されるという事実を踏まえ、発明者ら先に、アラニンによるヒスチジンの置換が、ペプチドを腫瘍成長、血管新生、血管透過の阻害において不活性としたことを示している（Ｔｊｉｎ  Ｔｈａｍ  Ｓｊｉｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ.  ２００５、６５、３６５６−６３）。
【０１５６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１（マウス）とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（ヒト）は、「ＲＧＤ」モチーフの配列とフィブロネクチンの周囲のアミノ酸の配列がインテグリンα５β１への結合に重要であることを示している。加えて、フィブロネクチンのインテグリン結合領域中の「ＰＨＳＲＮ」モチーフがフィブロネクチンのＩＴＧＡ５Ｂ１（インテグリンα５β１）への結合に不可欠であることが明らかになっている。
【０１５７】
オリゴマー化エンドスタチン（ＮＣ−１）がフィブロネクチンを結合するという発明者らによる予備データに基づき、発明者らは前述のエンドスタチンＮ末端ペプチドのモチーフをフィブロネクチンの領域を含むＲＧＤと組み合わせる一連のペプチドを生成した。
【０１５８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７は対応するマウススーパースタチン配列を示し、一方ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３は対応するヒトスーパースタチン配列、即ち、本発明のハイブリッドペプチド配列を示す。
【０１５９】
ハイブリッドペプチドの抗腫瘍特性に関して、エンドスタチンの亜鉛結合領域の重要性を調べるため、発明者らはポジション１と３の重要なヒスチジンをアラニンで置換する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）ことによりヒトスーパースタチン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を修飾した。
【０１６０】
ハイブリッドペプチドの二量化特性の抗腫瘍活性に対する関連性を検査するために、発明者らは先に報告されたエンドスタチン二量化法（Ｋｕｏ他、２００１、ＪＣＢ  １５２、１２３３−４６）を用いた。ヒトスーパースタチン配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）においてポジション７でグルタミンをシステインにより置換することで、ハイブリッドペプチドは二量体を形成するはずであり、担癌マウスで活性を検査できる（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）。
【０１６１】
フィブロネクチンのインテグリンへのＲＧＤ結合に対する対照として、ヒトスーパースタチン配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）中の「ＲＧＤ」が新しいハイブリッドペプチド中で「ＲＡＤ」に変えられ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、野生型ペプチドと比較してその抗腫瘍活性が評価された。
【０１６２】
示されたものはこれら修飾ペプチドのヒト版（「ｈ」で表される）である。マウス版は類似の配列であり（「ｍ」で表される）、本明細書で提供された配列情報に基づいて誘導することができる。
【０１６３】
抗腫瘍研究での評価のために、フィブロネクチンのインテグリン結合領域の２５アミノ酸を含むより大きな対照ペプチドが別途現在デザインされている（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）。
【０１６４】
最後に、ヒトスーパースタチンペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）は錯化剤１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡとも呼ばれる）に共役され、ペプチドに、例えば、非侵襲性イメージング（ＰＥＴ、ポジトロン断層法）用のガリウム（68Ｇａ）など放射性核種と、共役する能力を提供する。発明者らは現在、ＤＯＴＡ共役がヒトスーパースタチンペプチドの有効性に影響するか否かをインビボでのＢｘＰＣ３ヒト膵臓がんモデルでチェックしている。この実験によってスーパースタチン−ＤＯＴＡ構築物の活性が確認された場合、診断薬としてのスーパースタチン−ＤＯＴＡの可能性を評価するインビボＰＥＴイメージングが想定される。
【０１６５】
上記ペプチドの対応する配列を表１に示す。
【０１６６】
【表１】
2014529605.tif 000002
【０１６７】
３．討論
これらの実施例で、発明者らは文献で報告されているエンドスタチンの分子サイズがマウス細胞培養培地またはヒト血清採取後のプロテアーゼ分解の産物である可能性が高いことの強力な証拠を提示した。Ｓａｓａｋｉ及び協力者ら（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって提示された証拠はこの仮説を支持している。彼らによる２つの精製工程後のヒト血清の分析では、分子の大きさにおいて複数のエンドスタチン様分子が示された。報告された全３つの分子はＮ末端で追加のアミノ酸を有し、Ｎ末端で報告されたヒスチジンで開始し、エンドスタチン分子の不在を示唆した。より高い分子量バンドのアミノ酸配列分析は報告されなかった。さらに、著者らによるマウスの異なる臓器におけるコラーゲン１８の分布の調査は、異なる組織抽出物中にエンドスタチンサイズ分子が不在であることを示した（Ｓａｓａｋｉ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。最も顕著な同定されたタンパク質はＮＣ−１に相当した。
【０１６８】
発明者らは、フィブロネクチンをエンドスタチンモノマーではなく、オリゴマー化エンドスタチン（Ｆｃ−エンドスタチン及び人工エンドスタチン二量体）の結合タンパク質として同定した。ＮＣ−１とエンドスタチン二量体は先に複数のＥＣＭタンパク質を結合することが示されており、これはエンドスタチンモノマーにはない特性である（Ｓａｓａｋｉ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．；Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ他、２００２、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７、４５２１１）。しかしながら、フィブロネクチンには特異的な性質があり、それがフィブロネクチンＥＣＭタンパク質中で独特のものにしている。血管新生抑制ペプチドは血漿フィブロネクチンを使用して血管新生血管系に誘導される（Ｙｉ他、２００３、ＰＮＡＳ−１００、１１４３５）。フィブロネクチンは、タンパク質が複数のインテグリンに結合することを可能にするアミノ酸配列ＲＧＤを含む。インテグリンα５β１は細胞表面上でフィブロネクチンを結合する受容体である。このインテグリンは血管新生の重要な媒介物である（Ｈｙｎｅｓ、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。
【０１６９】
２つのインテグリンαvβ3とα５β１へのエンドスタチンの結合は２００１年に初めて報告された（Ｒｅｈｎ他、２００１、ＰＮＡＳ  ９８、１０２４）。そのような結合は、フィブロネクチンとこれらインテグリンの相互作用を阻害すると推定された。後に、別の研究者の一群は、エンドスタチンがα５β１のみに結合することを示すデータを提示した（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ他、２００２、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２、５５８０）。エンドスタチンは配列ＲＧＤが欠落している。したがって、そのような結合はエンドスタチン上の他のアミノ酸によって媒介されるはずである。本発明の発明者らはＥｌｉｓａ、免疫沈降法、細胞接着アッセイでエンドスタチンのα５β１への直接結合を示そうとしたが、成功しなかった。
【０１７０】
発明者らのデータは、オリゴマー化エンドスタチンとＮＣ−１の重要性を示唆した（Ｌｅｅ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。ＮＣ−１三量体前駆体で始まり、ＮＣ−１は分解の結果として大きさが小さくなった後、二量体に転換された。最後に、さらなる大きさの減少でエンドスタチンモノマーが形成される。発明者らのデータは、ｈＮＣ−１と恐らくエンドスタチンより大きい分子の二量体が血液循環中に存在するという仮説を支持している。エンドスタチン大モノマーの血液循環中における存在は疑問の余地がある。先にエンドスタチンによる血管新生プロセスの生理学的終了はよく調整されている（ｗｅｌｌ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ）ことが示されている（Ａｂｄｏｌｌａｈｉ他、２００４、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  １３、６４９）。
【０１７１】
本明細書に示されたデータを取り入れるために、発明者らはフィブロネクチンがテンプレートとして作用するモデルを提案する（図６）。ＶＥＧＦとＮＣ−１の両方がフィブロネクチンを結合する。ＶＥＧＦとＮＣ−１の存在がインテグリンα５β１との相互作用を介して生物活性を調節する。血管新生促進タンパク質（ＶＥＧＦ）と血管新生阻害タンパク質（ＮＣ−１）の相互作用が細胞表面での血管新生調節に不可欠である可能性がある。
【０１７２】
発明者のＦｃ−エンドスタチン（二量体）の利用は、普通のエンドスタチン（モノマー）よりずっと優れていることが明確に示されている（Ｌｅｅ他、ｌｏｃ．ｃｉｔ．）。同じ腫瘍縮小を達成するために必要なＦｃ−エンドスタチンの容量は、エンドスタチン単独と比較して（５０〜１００倍）ずっと少ない。過去に、発明者らはこの違いをあらゆるＦｃ共役分子に関連付けられるより長い半減期に起因すると考えてきた。発明者らの現在のデータは、Ｆｃ−エンドスタチン中のエンドスタチンの二量化状態もよりよい有効性の発揮に貢献している可能性を示唆している。一方、マウスへのＮＣ−１の注射後、迅速に分解される可能性があり、これがエンドスタチンと比較して、その抗腫瘍効果に大幅な増加が見られないことを説明している可能性がある。その場合、免疫グロブリンのＦｃ領域にリンクされたＮＣ−１の融合構築物が、異なる種類のエンドスタチン間の抗がん治療の改善型試薬となる可能性がある。この種の実験が現在進行中であり、実施例２．７を参照する。
【０１７３】
総合して、これらのデータはＦＮがコラーゲン１８フラグメントの血管新生阻害と抗腫瘍作用に不可欠であることを示唆している。スーパースタチン、不可欠なＦＮモチーフとＥＤモチーフを含むハイブリッドペプチドは、腫瘍成長を顕著に阻害・予防し、フィブロネクチンの腫瘍特異的下方制御によって付与された耐性表現型を逆転させることができた。または、併用療法の合理的なデザインと、Ｆｃ−エンドスタチン耐性腫瘍における補償経路を標的とすることを狙う革新的なスケジューリングスキームの開発は、先天的または後天的腫瘍耐性を回避または逆転させる有望な戦略を提示できる可能性がある。
【符号の説明】
【０１７４】
なし
【図１Ａ】
2014529605.tif 000003
【図１Ｂ】
2014529605.tif 000004
【図１Ｃ】
2014529605.tif 000005
【図２Ａ】
2014529605.tif 000006
【図２Ｂ】
2014529605.tif 000007
【図２Ｃ】
2014529605.tif 000008
【図２Ｄ】
2014529605.tif 000009
【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ（ａ）】
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【図３Ｂ（ｂ）】
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【図３Ｂ（ｃ）】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８．１】
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【図８．２】
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【図８．３】
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【図８．４】
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【図９．１】
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【図９．２】
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【図９．３】
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【図９．４】
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【図９．５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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