(57)【要約】【課題】本発明は、眼へのイオントフォレシスによる送達に適したｓｉＲＮＡの製剤、ｓｉＲＮＡのイオントフォレシス送達のための装置、およびその使用方法を提供する。【解決手段】経強膜イオントフォレシスによって有効量のｓｉＲＮＡを対象の眼に送達する際に、ａ）装置を対象の眼球表面の中心に配置し、ｂ）イオントフォレシスを実行することにより、ｓｉＲＮＡを対象の眼に投与する。装置の適用面は装置と眼球との間に画定され、該装置は、１つ以上のｓｉＲＮＡ分子またはその製剤で構成された水溶液を含むリザーバーを備えるとともに、発電機に接続されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
経強膜イオントフォレシスによって有効量のｓｉＲＮＡを対象の眼に送達する方法であって、
ａ）装置を対象の眼球表面の中心に配置する工程であって、装置の適用面は装置と眼球との間に画定され、該装置は、１つ以上のｓｉＲＮＡ分子またはその製剤で構成された水溶液を含むリザーバーを備えるとともに、発電機に接続されている工程；および
ｂ）イオントフォレシスを実行することにより、ｓｉＲＮＡを対象の眼に投与する工程
を含み、それによりｓｉＲＮＡを眼に送達する、方法。
【請求項２】
請求項１において、装置を眼球表面へ適用する際に、前記適用面が眼球の光軸に向かって凹入する外線によって少なくとも部分的に画定されており、前記装置の外壁は、光軸に対して外側の前記外線に延在している、方法。
【請求項３】
請求項１において、前記ｓｉＲＮＡが、約１５〜約３０ヌクレオチド長である、方法。
【請求項４】
請求項１において、前記ｓｉＲＮＡが、約２１〜約２３ヌクレオチド長である、方法。
【請求項５】
請求項１において、前記リザーバーが、眼へのイオントフォレシスに適した水溶液中に、処方された少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む治療組成物を含む、方法。
【請求項６】
請求項５において、前記治療組成物が、緩衝剤、浸透圧剤、浸透増強剤、キレート剤、抗酸化剤、および抗菌性保存剤から選択される少なくとも一種の添加剤を含む、方法。
【請求項７】
請求項５において、前記治療組成物が、イオントフォレシス適用のために調整される前に凍結乾燥される、方法。
【請求項８】
請求項１において、前記リザーバーが、ナノ粒子形態のｓｉＲＮＡ製剤を含む、方法。
【請求項９】
請求項８において、前記ナノ粒子が、緩衝剤、浸透圧剤、浸透増強剤、キレート剤、抗酸化剤、および抗菌性保存剤から選択される少なくとも一種の添加剤を含む、方法。
【請求項１０】
請求項８において、前記ナノ粒子が、約２０ｎｍ〜約４００ｎｍの直径を有する、方法。
【請求項１１】
請求項８において、前記ナノ粒子が、約４０ｎｍ〜約２００ｎｍの流体力学的直径を有する、方法。
【請求項１２】
請求項８において、前記ナノ粒子が、約＋５ｍＶ〜約＋１００ｍＶのゼータ電位を有する、方法。
【請求項１３】
請求項８において、前記ナノ粒子が、約＋２０ｍＶ〜約＋８０ｍＶのゼータ電位を有する、方法。
【請求項１４】
請求項８において、前記ナノ粒子が、約−５ｍＶ〜約−１００ｍＶのゼータ電位を有する、方法。
【請求項１５】
請求項８において、前記ナノ粒子が、約−２０ｍＶ〜約−８０ｍＶのゼータ電位を有する、方法。
【請求項１６】
請求項８において、前記ナノ粒子が、約＋０．２５ｍＡ〜約＋１０ｍＡのイオントフォレシス電流により送達される、方法。
【請求項１７】
請求項８において、前記ナノ粒子が、約＋０．５ｍＡ〜約＋５ｍＡのイオントフォレシス電流により送達される、方法。
【請求項１８】
請求項１において、前記リザーバーが、約５０μＬ〜約５００μＬのｓｉＲＮＡ製剤を保持する、方法。
【請求項１９】
請求項１において、前記リザーバーが、約１５０μＬ〜約４００μＬのｓｉＲＮＡ製剤を保持する、方法。
【請求項２０】
請求項１において、投与時間が約１分間〜約２０分間である、方法。
【請求項２１】
請求項１において、投与時間が約２分間〜約１０分間である、方法。
【請求項２２】
請求項１において、投与時間が約３分間〜約５分間である、方法。
【請求項２３】
請求項１において、前記溶液形態のｓｉＲＮＡが、約−０．２５ｍＡ〜約−１０ｍＡのイオントフォレシス電流により送達される、方法。
【請求項２４】
請求項２３において、前記溶液形態のｓｉＲＮＡが、約−０．５ｍＡ〜約−５ｍＡのイオントフォレシス電流により送達される、方法。
【請求項２５】
請求項１において、前記ｓｉＲＮＡの投与が、単回投与で行われる、方法。
【請求項２６】
請求項１において、前記ｓｉＲＮＡの投与が、多回投与で行われる、方法。
【請求項２７】
請求項１において、前記オリゴヌクレオチドが、イオントフォレシスの前に注射により送達される、方法。
【請求項２８】
請求項２７において、注射方法が、眼房内注射、角膜内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、網膜下注射、硝子体内注射、および前房内注射からなる群から選択される、方法。
【請求項２９】
請求項１において、前記オリゴヌクレオチドが、イオントフォレシスの前に局所的に投与される、方法。
【請求項３０】
請求項１において、前記眼へのイオントフォレシスが、オリゴヌクレオチドを投与する工程前に、工程中に、または工程後に実施される、方法。
【請求項３１】
有効量のｓｉＲＮＡを眼へのイオントフォレシスにより投与することを含む、哺乳動物の眼の疾患を処置するための、方法。
【請求項３２】
対象の眼へのイオントフォレシス送達に適した、ｓｉＲＮＡ製剤。
【請求項３３】
請求項３２において、前記製剤が、ｓｉＲＮＡを含むナノ粒子組成物を含む、ｓｉＲＮＡ製剤。
【請求項３４】
対象の眼にｓｉＲＮＡを送達するための装置であって、
ａ）眼球の一部を覆うように意図された表面に沿って延在している、ｓｉＲＮＡ製剤を含む少なくとも１つの媒体を含むリザーバー；および
ｂ）リザーバーと接続された電極
を含み、ここで、リザーバーが眼球に接触して配置されるとき、電極が、媒体を通って眼の表面に向けられる電界を供給することができ、それによってｓｉＲＮＡを眼内に移行させて、その結果、イオントフォレシスにより眼の表面を通してｓｉＲＮＡ製剤を送達する、装置。
【請求項３５】
請求項３４において、前記リザーバーが、
ａ）ｓｉＲＮＡ製剤を含む少なくとも１つの媒体を受容するための第１容器；
ｂ）導電素子を含む導電媒体を受容するための第２容器；および
ｃ）第１容器と第２容器との間に位置する半透膜であって、該半透膜は、導電素子に対して透過性であり、活性物質に対して非透過性である半透膜；
を含む、装置。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００７年１２月５日に出願された米国仮特許出願番号61/005,635号の利益を主張するものであり、引用によりその全内容が本明細書に取り込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、治療的に有意義なオリゴヌクレオチドの短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を対象の眼に経強膜イオントフォレシスにより治療的に送達する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
オリゴヌクレオチドは、様々な眼の疾患を処置するために使用されている。全身用製剤、局所用製剤、および注射製剤が、様々な眼の状態に対して使用される。特に、局所適用は、眼の障害に対して非侵襲的に送達されるオリゴヌクレオチドの最も広範囲な用途を占める。しかしながら、このアプローチは、生物学的利用能が低いため、有効性が限られるという問題を有する。
【０００４】
短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、様々な眼の疾患を処置するために使用されている二重鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの一種である。眼粘膜を通過するｓｉＲＮＡの拡散を可能とする眼用製剤が使用されるが、そのような局所製剤は、取り込みが遅く、不十分で、むらがあるという問題を有する。現在の眼内送達方法は、眼の被曝量が少ないので、頻繁な適用が必要とされ、コンプライアンス（医薬品の服用を規則正しく守ること）の問題が深刻である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ｓｉＲＮＡ製剤、薬物送達のためのｓｉＲＮＡ製剤の使用方法、および患者の安全を最大にするための製剤の使用方法に関する。本発明は、眼へのイオントフォレシス（oscular iontophoresis）に適したｓｉＲＮＡ製剤に関する。これらの新規製剤は、様々な眼の障害を処置するために使用することができる。該製剤は、様々なイオントフォレシス量（例えば、様々な電流レベルと適用時間）で使用することができる。このような製剤溶液は、例えば、（１）導入前後のｐＨを維持するために適切に緩衝化されてもよく、（２）貯蔵寿命（化学的安定性）を長期化するために安定化されてもよく、および／または（３）浸透圧を調節する他の賦形剤を含んでいてもよい。さらに、ｓｉＲＮＡ溶液は、競合イオンの量を低減にすることが求められる。
【０００６】
このようなユニークな投薬形態は、さまざまな治療ニーズに対処できる。眼へのイオントフォレシスは、有効量のｓｉＲＮＡを眼の組織に送達するための、新規で非侵襲的な外来患者への投与手段である。この非侵襲的な投与手段によって、眼注射で得られる程度またはそれ以上の効果をもたらすことができる。
【０００７】
眼へのイオントフォレシスによって、局所的にｓｉＲＮＡを適用することは、これまでに報告されていない。様々な治療剤を皮膚へ局所適用するための電気制御されたイオントフォレシスは、すでに商業的ベースで行なわれているが、このような既知の医薬でさえ、イオントフォレシス用にカスタマイズされた製剤を必要とする。そして、このようなカスタマイズにより、投薬の有効性を最大にし、安全性を改善し、商業的な難問に対処する。したがって、皮膚病への適用で既に明らかとなった技術的な問題が、眼内送達においても問題となる。そればかりか、眼へのイオントフォレシスは、さらなる製剤のカスタマイズを必要とする。すなわち、ｓｉＲＮＡを眼へイオントフォレシスにより送達するためには、その目的に適合した新規な製剤を開発することが必要である。非侵襲性で局所的に眼へ送達することが可能であるｓｉＲＮＡを開発することは、眼科医にとっての処置の選択肢を大幅に広げるであろう。
【０００８】
１つの実施形態は、治療的に有意義なオリゴヌクレオチドの短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を対象の眼に経強膜イオントフォレシスにより治療的に送達する方法に関し、該方法は、以下の工程：
ａ．眼へのイオントフォレシス装置を準備する工程であって、前記装置はオリゴヌクレオチドの水性組成物を含んでいる工程；
ｂ．この装置を対象の眼球表面の中心に配置する工程であって、前記装置は直流発電機に接続されており、この装置の適用面は、眼球の光軸に向かって凹状の外線によって少なくとも部分的に画定されており、前記装置の外壁は、光軸に対して外側の前記外線に延在している工程；および
ｃ．オリゴヌクレオチドを対象の眼に、イオントフォレシスを実行することにより投与する工程
を含み、それによりオリゴヌクレオチドを眼に送達する。
【０００９】
１つの実施形態は、経強膜イオントフォレシスによって有効量のｓｉＲＮＡを対象の眼に送達する方法に関し、該方法は、
ａ）装置を対象の眼球表面の中心に配置する工程であって、装置の適用面は装置と眼球との間に画定され、該装置は、１つ以上のｓｉＲＮＡ分子またはその製剤で構成された水溶液を含むリザーバーを備えるとともに、発電機に接続されている工程；および
ｂ）イオントフォレシスを実行することにより、ｓｉＲＮＡを対象の眼に投与する工程
を含み、それによりｓｉＲＮＡを眼に送達する。特定の実施形態では、装置を眼球表面へ適用する際には、適用面は、眼球の光軸に向かって凹入する外線によって少なくとも部分的に画定されており、前記装置の外壁は、光軸に対して外側の前記外線に延在している。
【００１０】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１５〜約３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約２１〜約２３ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、装置のリザーバーに治療組成物が含まれており、この治療組成物は、眼へのイオントフォレシスに適した水溶液中に、処方された少なくとも１つのオリゴヌクレオチド化合物を含む。特定の実施形態では、治療組成物は、緩衝剤、浸透圧剤、浸透増強剤、キレート剤、抗酸化剤、および抗菌性保存剤からなる群から選択される少なくとも一種の添加剤を含む。特定の実施形態では、治療組成物は、イオントフォレシス適用のために調整される前に、凍結乾燥される。
特定の実施形態では、リザーバーは、ナノ粒子形態のｓｉＲＮＡ製剤を含む。特定の実施形態では、ナノ粒子は、緩衝剤、浸透圧剤、浸透増強剤、キレート剤、抗酸化剤、および抗菌性保存剤からなる群から選択される少なくとも一種の添加剤を含む。特定の実施形態では、ナノ粒子は、約２０ｎｍ〜約４００ｎｍの直径を有する。特定の実施形態では、ナノ粒子は、約４０ｎｍ〜約２００ｎｍの流体力学的直径を有する。特定の実施形態では、ナノ粒子は、約＋５ｍＶ〜約＋１００ｍＶのゼータ電位を有する。特定の実施形態では、ナノ粒子は、約＋２０ｍＶ〜約＋８０ｍＶのゼータ電位を有する。特定の実施形態では、ナノ粒子は、約−５ｍＶ〜約−１００ｍＶのゼータ電位を有する。特定の実施形態では、ナノ粒子は、約−２０ｍＶ〜約−８０ｍＶのゼータ電位を有する。特定の実施形態では、ナノ粒子は、約＋０．２５ｍＡ〜約＋１０ｍＡのイオントフォレシス電流により送達される。特定の実施形態では、ナノ粒子は、約＋０．５ｍＡ〜約＋５ｍＡのイオントフォレシス電流により送達される。
特定の実施形態では、リザーバーは、約５０μＬ〜約５００μＬのｓｉＲＮＡ製剤を保持する。特定の実施形態では、リザーバーは、約１５０μＬ〜約４００μＬのｓｉＲＮＡ製剤を保持する。特定の実施形態では、投与時間は、約１分間〜約２０分間である。特定の実施形態では、投与時間は、約２分間〜約１０分間である。特定の実施形態では、投与時間は、約３分間〜約５分間である。特定の実施形態では、溶液形態のｓｉＲＮＡは、約−０．２５ｍＡ〜約−１０ｍＡのイオントフォレシス電流により送達される。特定の実施形態では、溶液形態のｓｉＲＮＡは、約−０．５ｍＡ〜約−５ｍＡのイオントフォレシス電流により送達される。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの投与は、単回投与で行われる。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡの投与は、多回投与で行われる。
特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、イオントフォレシスの前に注射により送達される。特定の実施形態では、注射方法は、眼房内注射、角膜内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、網膜下注射、硝子体内注射、および前房内注射からなる群から選択される。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、イオントフォレシスの前に局所的に投与される。特定の実施形態では、眼へのイオントフォレシスの工程は、オリゴヌクレオチドを投与する工程前に、工程中に、または工程後に実施される。
【００１１】
１つの実施形態は、哺乳動物の眼の疾患を処置する方法に関し、該方法は、有効量のｓｉＲＮＡを眼へのイオントフォレシスにより投与することを含む。
【００１２】
１つの実施形態は、対象の眼へのイオントフォレシス送達に適したｓｉＲＮＡ製剤に関し、該製剤は、ｓｉＲＮＡを含むナノ粒子組成物を含む。
【００１３】
１つの実施形態は、対象の眼にｓｉＲＮＡを送達するための装置に関し、該装置は、
ａ）眼球の一部を覆うように意図された表面に沿って延在している、ｓｉＲＮＡ製剤を含む少なくとも１つの媒体を含むリザーバー；および
ｂ）リザーバーと接続された電極
を含み、ここで、リザーバーが眼球に接触して配置されるとき、電極は、媒体を通って眼の表面に向けられる電界を供給することができ、それによってｓｉＲＮＡを眼内に移行させて、その結果、イオントフォレシスにより眼の表面を通してｓｉＲＮＡ製剤を送達する、装置に関する。特定の実施形態では、リザーバーは、
ａ）ｓｉＲＮＡ製剤を含む少なくとも１つの媒体を受容するための第１容器；
ｂ）導電素子を含む導電媒体を受容するための第２容器；および
ｃ）第１容器と第２容器との間に位置する半透膜であって、該半透膜は、導電素子に対して透過性であり、活性物質に対して非透過性である半透膜；
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡ分子を所望の眼の組織に送達するための眼用イオントフォレシスシステムの概略図である。
【図２Ａ】１ｍｇ／ｍｌの濃度で１本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓ−オリゴ）でイオントフォレシス処置されたウサギの眼の結膜および強膜の蛍光顕微鏡画像（図２Ａ）である。動物は、１５ｍＡ・分のイオントフォレシス電流（図２Ａ）で処置された。スケールバーは、２５ミクロン（μｍ）を表し、パネルＡおよびＢの両方に適用される。
【図２Ｂ】１ｍｇ／ｍｌの濃度で１本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓ−オリゴ）で受動拡散されたウサギの眼の結膜および強膜の蛍光顕微鏡画像（図２Ｂ）である。図２Ａと同じ継続時間の受動拡散の効果を示す。動物は、無電流（図２Ｂ）で処置された。スケールバーは、２５ミクロン（μｍ）を表し、パネルＡおよびＢの両方に適用される。
【図３Ａ】図２で見られる画像から生成した強度プロファイルである。図３Ａは、イオントフォレシス処置後のｓｓ−オリゴの強度プロファイルを示す。これらの画像は、より高い強度およびより広い分布の両方を示し、このことは、受動拡散と比較して、より多くのｓｓ−オリゴがイオントフォレシス処置後に組織内に浸透したことを示す。
【図３Ｂ】図２で見られる画像から生成した強度プロファイルである。図３Ｂは、５分間の受動拡散後のｓｓ−オリゴの分布を表す。これらの画像は、より高い強度およびより広い分布の両方を示し、このことは、受動拡散と比較して、より多くのｓｓ−オリゴがイオントフォレシス処置後に組織内に浸透したことを示す。
【図４Ａ】イオントフォレシス送達（図４Ａ）後のｓｓ−オリゴの分布の蛍光顕微鏡画像である。これらの画像は、受動拡散と比較して、ｓｓ−オリゴがイオントフォレシス処置後により広い面積に送達されたことを示す。
【図４Ｂ】受動拡散（図４Ｂおよび４Ｃ）後のｓｓ−オリゴの分布の蛍光顕微鏡画像である。これらの画像は、受動拡散と比較して、ｓｓ−オリゴがイオントフォレシス処置後により広い面積に送達されたことを示す。
【図４Ｃ】受動拡散（図４Ｂおよび４Ｃ）後のｓｓ−オリゴの分布の蛍光顕微鏡画像である。これらの画像は、受動拡散と比較して、ｓｓ−オリゴがイオントフォレシス処置後により広い面積に送達されたことを示す。
【図５Ａ】イオントフォレシス処置後のウサギの網膜の蛍光顕微鏡画像である。図５Ａは、網膜の全層におけるｓｓ−オリゴの分布を示す。なお、図５Ｂは、網膜のこの領域で観察された自家蛍光を示し、これより図５Ａで記録されたシグナルがｓｓ−オリゴの存在によるものであることを示す。赤＝Ｃｙ５標識ｓｓ−オリゴ、青＝核、緑＝網膜組織内で見られた自家蛍光シグナル。
【図５Ｂ】イオントフォレシス処置後のウサギの網膜の蛍光顕微鏡画像である。図５Ｂは、網膜のこの領域で観察された自家蛍光を示す。赤＝Ｃｙ５標識ｓｓ−オリゴ、青＝核、緑＝網膜組織内で見られた自家蛍光シグナル。
【図６】−４ｍＡの電流で処置された動物（レーン：５〜８）の眼房水中で検出されたｓｓ−オリゴを示すが、他方、受動的に処置されたウサギ（レーン：１〜４）の眼房水では、ｓｓ−オリゴは検出することができなかったことを示す。レーン９は、水中にスパイクされた既知量のｓｓ−オリゴが実験サンプルと同じ大きさで検出されることを示し、これはｓｓ−オリゴのイオントフォレシス送達が、分子の完全性に影響を与えないという主張を裏付ける。濃度：１ｍｇ／ｍｌ；継続時間５分間；電流は０ｍＡまたは−３．０ｍＡであった；対照レーンは１ｎｇ／ｍｌの１本鎖オリゴである。
【図７Ａ】Ｃｙ５標識２本鎖ＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）で無電流で処置されたウサギの眼の結膜（図７Ａ）の蛍光顕微鏡画像（図７Ａ）である。動物は、無電流で５分間、または２０ｍＡ・分のイオントフォレシス電流（−４ｍＡ、５分間）で処置された。スケールバーは、２５ミクロン（μｍ）を表し、図７Ａおよび７Ｂに適用される。
【図７Ｂ】Ｃｙ５標識２本鎖ＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）でイオントフォレシス処置されたウサギの眼の結膜（図７Ｂ）の蛍光顕微鏡画像（７Ｂ）ある。動物は、無電流で５分間、または２０ｍＡ・分のイオントフォレシス電流（−４ｍＡ、５分間）で処置された。スケールバーは、２５ミクロン（μｍ）を表し、図７Ａおよび７Ｂに適用される。
【図７Ｃ】Ｃｙ５標識２本鎖ＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）で無電流で処置されたウサギの眼の強膜（図７Ｃ）の強度プロファイル（図７Ｃ）である。動物は、無電流で５分間、または２０ｍＡ・分のイオントフォレシス電流（−４ｍＡ、５分間）で処置された。
【図７Ｄ】Ｃｙ５標識２本鎖ＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）でイオントフォレシス処置されたウサギの眼の強膜（図７Ｄ）の強度プロファイル（図７Ｄ）である。動物は、無電流で５分間、または２０ｍＡ・分のイオントフォレシス電流（−４ｍＡ、５分間）で処置された。
【図８Ａ】受動拡散（図８Ａ）後のウサギの眼の角膜縁領域の蛍光顕微鏡画像であり、これは、イオントフォレシス処置後のｓｉＲＮＡ送達面積の増大を示している。スケールバーは、２５０ミクロン（μｍ）を表し、パネルＡおよびＢの両方に適用される。
【図８Ｂ】イオントフォレシス処置（図８Ｂ）後のウサギの眼の角膜縁領域の蛍光顕微鏡画像であり、これは、イオントフォレシス処置後のｓｉＲＮＡ送達面積の増大を示している。スケールバーは、２５０ミクロン（μｍ）を表し、パネルＡおよびＢの両方に適用される。
【図８Ｃ】図８Ｃは、受動拡散およびイオントフォレシス処置後のｓｉＲＮＡの分布における違いを比較するグラフである。
【図９Ａ】Ｃｙ５標識２本鎖ＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）でイオントフォレシス処置されたウサギの眼の結膜（図９Ａ）および固有層（図９Ａ）の蛍光顕微鏡画像である。これらの画像は、イオントフォレシス処置後の広範囲な細胞取り込みを示す。スケールバーは、１０ミクロン（μｍ）を表し、図９Ａおよび図９Ｂの両方に適用される。赤＝Ｃｙ５標識ＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ、青＝核。
【図９Ｂ】Ｃｙ５標識２本鎖ＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）でイオントフォレシス処置されたウサギの眼の固有層（図９Ｂ）の蛍光顕微鏡画像である。これらの画像は、イオントフォレシス処置後の広範囲な細胞取り込みを示す。スケールバーは、１０ミクロン（μｍ）を表し、図９Ａおよび図９Ｂの両方に適用される。赤＝Ｃｙ５標識ＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ、青＝核。
【図１０】−４ｍＡの電流で処置された動物（レーン：１〜４）の眼房水中で検出されたｓｉＲＮＡを示すが、他方、受動的に処置されたウサギ（レーン：５〜８）の眼房水中では、ｓｉＲＮＡは検出することができなかった。レーン１１は、眼房水中にスパイクされた既知量のｓｉＲＮＡが実験サンプルと同じ大きさで検出されることを示し、これはｓｉＲＮＡのイオントフォレシス送達が、分子の完全性に影響を与えないという主張を裏付ける。濃度：１ｍｇ／ｍｌ；継続時間１０分間；電流は−４．０ｍＡまたは０ｍＡのいずれかであった；対照レーン９、１０および１１は、それぞれ０．５、１および１．５ｎｇ／ｍｌで眼房水中にスパイクされたｓｉＲＮＡである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書では、ｓｉＲＮＡを対象の眼に送達するための組成物および方法が記載される。ｓｉＲＮＡの送達は、例えば、様々な疾患［例えば、緑内障、糖尿病性網膜症、増殖性硝子網膜症、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、萎縮型ＡＭＤ、滲出型ＡＭＤ、ドライアイなど］を処置するために有用である。本明細書に記載される実施形態は、有効量のｓｉＲＮＡが、眼へのイオントフォレシスによって送達され得るという予想外の発見に関する。送達は、例えば、１つ以上の特定の遺伝子の下方制御を可能とし、これにより、例えば、特定の疾患または障害の処置（または治療）を行なうことができる。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「短鎖干渉ＲＮＡ」という用語は、約１８〜２５ヌクレオチド長の２本鎖ＲＮＡ分子の一種を意味する。標準的なｓｉＲＮＡ分子の平均的な長さは、２１または２３ｎｔ（塩基）である。ｓｉＲＮＡは、生物学において色々な役割を果たす。本発明では、ｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用して、様々な眼の状態を処置するために、遺伝子の発現を特異的に低下させる。ＲＮＡｉの機序は、２本鎖ＲＮＡ分子に関わるが、本発明では、１本鎖または部分的２本鎖ＲＮＡ分子を、所望の組織へ送達することができる。そして、１本鎖または部分的２本鎖ＲＮＡ分子は、標的遺伝子の発現を下方制御する所望の２本鎖ＲＮＡ分子に変換される。なお、本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、動物、特に哺乳動物、例えば、ヒトを意味する。
【００１７】
眼へのイオントフォレシスは、眼の前方区画および後方区画の双方へ薬剤を送達することが可能であり、従来の方法についての実際的な制約を克服することができる眼科治療における技術である（Eljarrat-Binstock, E. and Domb, A., J. Control Release, 110:479-489, 2006）。イオントフォレシスは、非侵襲性の技術であり、この方法では、弱い電流が印加されることにより、イオン化薬剤または荷電した薬剤担体が体組織へ浸透する量を増強する。正に荷電した物質は、アノードにおける電荷反発によって組織に運搬され得るが、他方、負に荷電した物質は、反発によってカソードから離れる。適用の簡易さ、副作用の減少、および標的領域への薬剤送達の増強は、主に経皮分野でのイオントフォレシスの広範囲な臨床的使用をもたらした。一方、眼へのイオントフォレシスは、抗生物質（Barza, M. et al., Ophthalmology, 93:133-139, 1986; Rootman, et al., Arch. Ophthalmol., 106:262-265, 1988; Yoshizumi, M. et al., J. Ocul. Pharmacol., 7:163-167, 1991; Frucht-Pery, J. et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther., 15:251-256, 1999; Vollmer, D. et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther., 18:549-558, 2002; Eljarrat-Binstock, E. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 45:2543-2548, 2004; Frucht-Pery, J. et  al., Exp. Eye Res., 78:745-749, 2004）、抗ウイルス剤（Lam, T. et al., J. Ocul. Pharmacol, 10:571-575, 1994）、コルチコステロイド（Behar-Cohen, F. et al., Exp. Eye Res., 65:533-545, 1997; Behar-Cohen, F. et al., Exp. Eye Res., 74:51-59, 2002; Eljarrat-Binstock, E. et al., J. Control Release, 106:386-390, 2005）、化学療法剤（Kondo, M. and Araie, M., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 30:583-585, 1989; Hayden, B. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 45:3644-3649, 2004; Eljarrat-Binstock, E. et al., Curr. Eye Res., 32:639-646, 2007; Eljarrat-Binstock, E. et al., Curr. Eye Res., 33:269-275, 2008）、およびオリゴヌクレオチド（Asahara, T. et al., Jpn. J. Ophthalmol., 45:31-39, 2001; Voigt, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 295:336-341, 2002）を含むいろいろな有効成分を送達するために広範囲に研究されてきた。イオントフォレシスのプロセスは、イオン化し得る物質（例えば、薬剤または製剤）に電流を印加し、対象の表面を通過する製剤の移動度を増大させることを伴う。３つの原理的な力により、電流によって引き起こされる流動（物質の移動）が支配され、最も主要な力は電気化学的反発であり、この力によって同符号の荷電種が表面（組織）を通過して侵入する。
【００１８】
電流が、電解質や帯電物質（例えば、活性医薬成分（Active pharmaceutical ingredient：ＡＰＩ）、またはＡＰＩを含む製剤）を含む水溶液を通過するとき、以下の事象：
（１）電極によりイオンが発生する事象、
（２）新しく発生したイオンが、同符号荷電粒子（一般に、送達されている薬剤）に接近／衝突する事象、および
（３）新たに発生したイオン間の電荷反発によって、溶解／浮遊した荷電粒子（ＡＰＩ）が電極に隣接している表面（組織）へ押し込まれ、および／または該表面（組織）を通過する事象が起こる。電流を継続的に印加すると、単なる局所的な投与で達成されるよりも格段に深く、組織内へＡＰＩを侵出させることができる。イオントフォレシスの程度は、印加電流および処置時間に比例する。
【００１９】
イオントフォレシスは、水系製剤を利用してもよく、水系製剤では、電極により容易にイオンが発生し得る。イオンを生成するために、以下の２つの種類の電極：（１）不活性電極および（２）活性電極を使用することができる。それぞれの種類の電極は、電解質を含む水性媒体を必要とする。不活性電極でのイオントフォレシスは、印加電流によってもたらされ得る加水分解の程度によって支配される。電気分解反応は、水酸化物（陰極）イオンまたはヒドロニウム（陽極）イオンのいずれかを生成する。製剤は、緩衝剤を含んでいてもよく、緩衝剤は、こうしたイオンにより引き起こされるｐＨ変動を緩和することができる。ある種の緩衝剤は、同符号に帯電した複数のイオンをもたらすことができ、これらのイオンは、電気分解的に発生して医薬品の送達を減少させ得るイオンをめぐって、医薬品［すなわちイオントフォレシスされる積み荷（cargo）であって、例えば、ｓｉＲＮＡなど］と競合してもよい。薬剤送達電極の極性は、医薬品の化学的性質、特にそのｐＫａ（複数を含む）／等電点および初期投薬溶液のｐＨに依存する。このような極性は、電気分解により発生したイオンと、医薬品を組織内に侵入させる医薬品の電荷（または活性成分を含む組成物、例えば、ナノ粒子製剤の電荷）との間の電気化学的反発に主としてよるものである。従って、イオントフォレシスは、局所的な薬剤適用と比較して、薬剤送達を増大させるという重要な利点を提供する。薬剤送達速度は、当業者により決定され、印加電流を変えることにより調節できる。
【００２０】
イオントフォレシス送達に有用な装置としては、例えば、ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターおよび関連技術が挙げられる。ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターおよび技術を使用することにより、他の装置と比較した場合、薬物の使用量を減少でき、１回の処置当たりの経費を削減できる。本明細書で記載される組成物および方法では、ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターおよび関連技術の能力を利用して、治療的に有意義なオリゴヌクレオチドを無傷のままで眼の組織中へ送達することもできるし、さらに眼の組織を通過させて送達することもできる。そして、送達されたオリゴヌクレオチドが送達後に機能するのを可能にする。
【００２１】
本明細書で記載される組成物および方法では、ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターおよび技術によるイオントフォレシス処置することにより、細胞へ取り込まれるオリゴヌクレオチドの量を増強することを可能とする。オリゴヌクレオチドを眼の組織に送達するためにＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターおよび技術を使用すると、送達の局所的方法と比べて、この分子の細胞透過性を増大させる。さらに、特定の組成物（例えば、特異的に設計されたナノ粒子など）を用いることにより、より効率的に送達することが可能となる。また、例えば、所望の電荷／質量比を生み出すことによってより効果的な送達が可能となり、また、例えば、ナノ粒子の表面に取り込み因子を組み込むことによって、細胞による取り込みが可能となる。
【００２２】
遺伝子発現の標的化阻害のための２本鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）を使用する方法は、当業者に既知である。当業者であれば、下方制御されるべき内因性遺伝子（例えば、異常に発現されて疾患の状態を引き起こす遺伝子）に対して相同なｓｉＲＮＡ分子を設計することは理解できるであろう。配列は、既知の塩基対規則に従って選択される。本明細書で記載される方法および組成物は、ｓｉＲＮＡ分子を特定の眼の組織（複数を含む）に送達するために有用である。なぜなら、このような送達および取り込みは、本発明の方法または装置などを利用しなければ有効でないことが証明されているからである。従来行なわれていたｓｉＲＮＡ分子の送達および取り込みに関する方法とは異なり、本発明では、特定の組織への送達および取り込みされた後のｓｉＲＮＡ分子の有効性は損なわれない。本明細書に記載される方法は、特定の所望の組織へのｓｉＲＮＡ分子の送達および取り込みを増強させる。そして、特定の分子のｓｉＲＮＡ機能によって、所望の遺伝子産物の下方制御が可能となり、それにより遺伝子産物に関連した疾患を効果的に処置することができる。ここで、特定ｓｉＲＮＡの有効量とは、特定の遺伝子の臨床的に有意義な下方制御を生じるのに十分な量であり、当業者によって決定される。本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望の効果（例えば、希望の効果が得られる程度の特定の遺伝子標的の下方制御）を達成するのに必要なｓｉＲＮＡの用量を意味する。「有効量」という用語は、また、眼疾患に関連した１つ以上の徴候または臨床的事象の緩和または減少を指す量を意味する。
【００２３】
本明細書で記載される組成物および方法に関し、ｓｉＲＮＡは、約１５〜約３０ヌクレオチド長、例えば、約２２〜約２３ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡ分子は、完全に２本鎖であってもよいし、部分的に２本鎖であってもよいし、または１本鎖であってもよい。したがって、当業者は、２本鎖ＲＮＡ分子として出発する分子を生成することもできるし、あるいは所望の組織または細胞への取り込み後にインビボで２本鎖ＲＮＡ分子に変換される分子を生成することもできる。本明細書に記載される方法は、ＲＮＡまたはＲＮＡを一般に含む製剤の物理的特性（例えば、電荷／質量比）に依拠するので、前記方法および組成物は、少なくとも送達および取り込みに関して、配列には非依存的であることを当業者は理解できるだろう（Brand, R. et al., J. Pharm. Sci. 49-52, 1998）。
【００２４】
所望の眼の組織への送達および取り込みの後で、ｓｉＲＮＡ分子は、所望の標的遺伝子の内因性遺伝子発現を効果的に下方制御する。標的遺伝子の特定の例としては、例えば、βアドレナリン受容体１および／または２；炭酸脱水酵素ＩＩ；コクリン；骨形態形成タンパク質受容体１／２；グレムリン；アンジオテンシン変換酵素；１型アンジオテンシンＩＩ受容体（ＡＴ１）；アンジオテンシノーゲン（ＡＮＧ）；レニン；捕体Ｄ；捕体Ｃ３；捕体Ｃ５；捕体Ｃ５ａ；捕体Ｃ５ｂ；捕体因子Ｈ；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦ受容体（１、２または両方）；インテグリンαＶβ３；ＰＤＧＦ受容体β；プロテインキナーゼＣ；ｃ−ＪＵＮ転写因子；ＩＬ−１α；ＩＬ−１β；ＴＮＦα；ＭＭＰ；ＩＣＡＭ−１；インスリン様成長因子−１；インスリン様成長因子−１受容体；成長ホルモン受容体ＧＨｒ；インテグリンαＶβ５；ＴＮＦα；ＩＣＡＭ−１；ＭＭＰ−１０；ＭＭＰ−２；ＭＭＰ−９などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明で用いられるｓｉＲＮＡは、ナノ粒子の形態でカプセル化できる。ある実施形態では、ＡＰＩがナノ粒子中にカプセル化される場合、ナノ粒子の特徴に依存して、特定の均一な電荷／質量比を達成することができる。ＡＰＩをナノ粒子中にカプセル化すると、例えば、ＡＰＩの増大した滞留時間、特定細胞への取り込みの増加、所望の組織または細胞内でのＡＰＩの特定標的に対する分子標的化、ＡＰＩの増大した安定性、および特定ナノ粒子に関連した他の有利な特質が達成される。
【００２６】
ｓｉＲＮＡ製剤または組成物は、例えば、溶液中[例えば、製剤の完全性（integrity）を保存するのに有用な溶液中、および／または適切なイオントフォレシス緩衝剤として有用な溶液中]に含まれてもよい。このような溶液は、眼の組織ヘのオリゴヌクレオチドをイオントフォレシスを利用して送達するために最適化されてもよい。この場合、例えば、ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターおよび関連技術を利用して、イオントフォレシスによる送達する前およびイオントフォレシス中でのオリゴヌクレオチドの安定性を確保しながら、このような溶液はイオントフォレシスを利用して眼の組織ヘオリゴヌクレオチドを送達する。前記製剤および／または溶液は、これらが適用される眼の組織との適合性を有するように設計することもできる。
【００２７】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド負荷ナノ粒子を送達するためにＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターおよび関連技術を使用する場合、溶液が一定の緩衝作用を達成できるようにアプリケーターを改変したり、および／またはイオントフォレシス処置を完了するのに必要な溶液の容積を低減することによって、アプリケーターおよび関連技術の機能をさらに増強することができる。上記した２つは、アプリケーターに緩衝系を添加することにより達成される。アプリケーターで緩衝系を使用すると、イオントフォレシス処置の間、患者の安全性を保証し、オリゴヌクレオチドの完全性を維持する。
【００２８】
また、膜型緩衝系（membrane-shaped buffering system）をＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターへ組み込むと、薬剤含有溶液のためのリザーバーとして有用なフォーム保持体（または発泡体）の容積を減少させることができる。フォーム保持体は、６ｍｍ（長さ）×１４ｍｍ（内径）×１７ｍｍ（外径）の概略寸法を有する中空円筒の形状で、急激に膨潤する親水性のポリウレタン系フォームマトリックスから作られている。膜型緩衝系の利用により、フォーム保持体を含浸するのに必要な溶液（薬物を含む）の全体の容積を減少させることができる。例えば、３ｍｍの厚さのハイドロゲル／膜緩衝系を組み込むと、標準ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターで必要とされる量と比較して、薬剤含有溶液を全体的に５０％減少させることができる。例えば、１ｍｍ毎にフォーム保持体をアプリケーターから除くと、リザーバーを満たすのに必要な薬剤含有溶液が約１６％減少する。このように、薬剤含有溶液の量は、個々の処置計画に必要な特定の量を満たすように適合させることができる。
【００２９】
ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターおよび技術は、治療的に有意義なオリゴヌクレオチドのナノ粒子製剤を眼の組織中に、および眼の組織を通過させて送達するために使用することができる。次いで、このナノ粒子は、オリゴヌクレオチドを完全な状態で送達するために、それらの積み荷（例えば、活性成分、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド）を時間制御および／または速度制御された様式で放出することができ、それにより、それらが細胞に取り込まれその後に機能することを可能とする。オリゴヌクレオチドの大きさ、ヌクレオチドの組成、および／またはオリゴヌクレオチドに対する改変に関わらず、ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターおよび技術は、オリゴヌクレオチドの完全性には影響を与えない。
【００３０】
ｓｉＲＮＡ分子をイオントフォレシスによって所望の眼の組織に送達するために、予め製造されたオリゴヌクレオチド負荷ナノ粒子を使用することができる。眼の薬剤送達について、以下のナノ粒子についての考察が利用できる（Zimmer, A. and Kreuter. J., Adv. Drug Delivery Reviews, 16: 61-73, 1995; Amrite and Kompella, Nanoparticles for Ocular Drug Delivery, In: Nanoparticle Technology for Drug Delivery, Vol. 159, Gupta and Kompella (eds.), 2006; Kothuri et al., Microparticles and Nanoparticles in Ocular Drug Delivery, In: Ophthalmic Drug Delivery Systems, Vol. 130, Ashim K. Mitra (eds.), 2nd edition, 2008）。
【００３１】
眼への送達のためのナノ粒子を製造する際に使用される材料としては、例えば、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（ヘキシルシアノアクリレート）、ポリ（ヘキサデシルシアノアクリレート）、またはアルキルシアノアクリレートとエチレングリコールとのコポリマーなどのポリアルキルシアノアクリレート類；ポリ（ＤＬ−ラクチド）、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（ε−カプロラクトン）、およびポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−ε−カプロラクトン）からなる群；またはＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＬ  １００、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＳ  １００、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｅ  １００、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ  １００、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ  １００−５５、およびＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ  １００などのＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ポリマーからなる群が挙げられるが、特に限定されるものではない。ナノ粒子は、また、例えば、ポリビニルアセテートフタレート、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネートからも製造することができる。さらに、材料としては、例えば、天然の多糖類（例えば、キトサン、アルギン酸塩、またはその組み合わせなど）；アルギン酸塩とポリ（ｌ−リジン）との複合体；ペグ化キトサン；アルブミンなどの天然タンパク質；リポソームなどの脂質およびリン脂質；またはシリコンなども挙げられ得る。他の材料としては、例えば、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、ポリ（ｌ−リジン）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンイミン、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）が挙げられる。
【実施例】
【００３２】
（実施例１）
図１は、眼へのイオントフォレシス装置ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターの縦断面図を示す。この装置は、オリゴヌクレオチド水溶液で含浸したフォーム保持体、および緩衝組成物を含むハイドロゲルマトリックス膜からなる。図面中の装置要素の形状、大きさ、および相対的な位置は、必ずしも正確ではないか、または一定の縮尺率で描かれていない。描かれている要素の特定の形状は、特定の要素の実際の形状に関していかなる情報をも伝えることを意図するものではなく、図面での理解を容易にするためにだけ選択されたものである。医薬製剤のリザーバーは、（ｉ）１つ以上の治療用オリゴヌクレオチド化合物、場合により、緩衝組成物、および場合により、眼内送達について医薬的に許容される不活性成分を含む液状製剤で浸透されたフォーム支持体；および、場合により、（ｉｉ）緩衝組成物を含むハイドロゲル膜を備える。少なくとも１つの治療化合物がその溶液に溶解している。緩衝組成物は、（ｉ）カチオンおよび／またはアニオン交換樹脂を含む複数のイオン交換樹脂粒子；（ｉｉ）カチオン性またはアニオン性粒子を含む複数のポリマー粒子；（ｉｉｉ）カチオン性またはアニオン性ポリマー；（ｉｖ）生物学的緩衝剤；または（ｖ）無機緩衝剤である。粒子は、規則的形状（例えば、円形、球形、立方体、円筒形、繊維状、および針状）または不規則形状を有することができる。アプリケーター（１０）は、以下の主な要素：
１１．装置のための固定支持体となり、医薬製剤をリザーバーに移す手段となる近位部；
１２．電流発生器と電極との間に接続ポイントを提供するソース接続ピン；
１３．電流を製剤リザーバーに転送する電極；
１４．送達すべき医薬製剤を含むリザーバー；
１５．眼と接触する軟質プラスチック製の遠位部；および
１６．フォーム保持体を含浸可能な溶液に溶解した治療用オリゴヌクレオチド化合物
を備える。
【００３３】
（実施例２  抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡのインビボでの送達）
体重約３ｋｇの雌性ニュージーランドホワイトウサギを、輸送のストレスから回復させ、施設の環境条件に順応させるために、処置前に少なくとも３日間飼育する。処置の少なくとも２４時間前に、両方の耳の後ろの毛を脱毛クリームを用いて除去する。動物たちに対して、処置の２０分前にケタミン（３５ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により麻酔をかける。動物に麻酔をかけた後、戻り電極を両耳の裸の皮膚（１つの耳当たり１片）に配置し、発電機に接続する。２７ゲージ針を有する１ｍＬの注射器を用いて、約０．２５ｍＬ〜約０．５０ｍＬのｓｉＲＮＡ含有液を、必要なだけ複数セットのＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーター中のフォーム保持体に加える。フォーム部（気泡部）が完全に水和したことを確かめるために、各アプリケーターを、目視で調べる。気泡または未水和部分があれば、機械的に取り除く。次いで、ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩアプリケーターを発電機に接続し、局所麻酔薬を１滴投与した右眼の上に配置する。適切な処置を施し、装置を眼から取り除く。次に、動物の向きを変え、このプロセスを左眼についても繰り返す。残りのウサギは、新しいアプリケーターを用いて同様の様式で、ｓｉＲＮＡのイオントフォレシス量の投与をそれぞれ受ける。
【００３４】
ウサギに対しては、右眼から始めてそれぞれの眼に４ｍＡの電流処置を１０分間（４０ｍＡ・分の総イオントフォレシス量）行なうことができる。各動物に対する左眼の処置が終了した直後に、１ｍＬの血液を採取し、スピンダウンして血漿サンプルを回収する。血液サンプルを採取後、動物を麻酔する。動物はすべて、辺縁耳静脈に４ｍＬの過剰用量のユサゾール（Ｅｕｔｈａｓｏｌ）を静脈内に注射して安楽死させる。死亡は心拍が無いことと無呼吸により確認される。死亡が確認されると、各眼からの眼房水を０．３３ｍＬのインスリン注射器で採取し、ＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅを含まないチューブに入れ、分析するまで−８０℃で保存する。次いで、眼を摘出してそれぞれの構成成分に解剖して、各組織型を、ＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅを含まない別々のチューブに入れて、定量および完全性の測定のための質量分析による分析まで、−８０℃で保存する。
【００３５】
（実施例３  ７．５ｋＤａの１本鎖オリゴヌクレオチドの経強膜送達）
１本鎖ＲＮＡ分子のイオントフォレシス移動度を、インビボで眼の組織において調べた。
【００３６】
ニュージランドホワイトウサギ（約３ｋｇ）は、ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩ装置を３ｍＡの電流で５分間（１５ｍＡ・分の総イオントフォレシス量）用いて、１ｍｇ／ｍＬ濃度で１本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの単回投与を受けた。
【００３７】
ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩ装置を用いてウサギの眼へ１本鎖オリゴヌクレオチドをイオントフォレシスで送達した場合、受動拡散と比較して、眼の組織に移送されたオリゴヌクレオチドの量は増加した（図２、３および５）。イオントフォレシス処置は、また、受動拡散と比較して、オリゴヌクレオチドが送達される面積を増大させた（図４）。また、オリゴヌクレオチドの完全性は、イオントフォレシス処置した後であっても、影響を受けず保たれていた（図６）。
【００３８】
（実施例４  １５ｋＤａの２本鎖ｓｉＲＮＡの経強膜送達）
加齢黄斑変性の処置に有効な１５ｋＤａの２本鎖血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ｓｉＲＮＡ分子を試験した。抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ分子（蛍光顕微鏡による検出のためにＣｙ５で標識）を、ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩ装置を用いるイオントフォレシスによりニュージランドウサギの眼に送達した（図７〜１０）。１本鎖オリゴヌクレオチドで見られたように、ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩ装置を用いてイオントフォレシスを行うと、受動拡散と比較して、眼のいろいろな組織に送達されるオリゴヌクレオチドの量を増加させ（図７）、同様にｓｉＲＮＡが送達される総面積を増大させた（図８）。また、ＥｙｅＧａｔｅ（登録商標）ＩＩ装置を用いたイオントフォレシス処置では、受動拡散と比較して、観測された抗ＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡの細胞取り込み量を増加させた（図９）。また、さらに、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの完全性は、イオントフォレシス処置後、変化しなかった（図１０）。
【００３９】
さらなる疾患および遺伝子標的を、表１に要約し、列挙する。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
【表２】
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【００４２】
【表３】
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【００４３】
【表４】
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【００４４】
【表５】
2011505917.tif 000006
【００４５】
（均等物）
本発明の特定の実施形態に関して本発明を説明したが、さらなる変更も可能であることが理解される。さらにまた、本出願は、本発明が関連する分野における既知または慣習的な実施の範囲に含まれるような、および添付の請求の範囲に包含されるような本発明の開示からの逸脱を含めて、本発明のいかなる変更、使用または改変をも包含することを意図するものである。上記で引用された全ての参考文献は、引用することによりその全体が本明細書に取り込まれる。
【図１】
2011505917.tif 000007
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2011505917.tif 000029
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