(57)【要約】  透明な媒体の中に分散した１つ以上の粒子といった試料の画像を作成するインラインホログラフィである。光散乱理論の結果を用いたこれらの画像の分析により、ナノメートル分解能での粒子のサイズと、１０００分の１の範囲内での粒子の屈折率と、ナノメートル分解能での粒子の３次元位置とが得られる。この手順は、試料および試料媒体の力学的特性と、光学的特性と、化学的特性とを迅速かつ直接的に特徴付ける。
2011502256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホログラフィック顕微鏡を提供するステップと、
コリメートされたレーザビームを前記ホログラフィック顕微鏡に提供するステップと、
コリメートされたレーザビームをある試料から散乱させて、散乱した部分を生成するステップと、
コリメートされたレーザビームのうちの散乱していない部分と前記散乱した部分とから干渉パターンを発生させるステップと、
後の分析のために前記干渉パターンを記録するステップと、
前記試料の空間的位置と、力学的特性と、光学的特性と、化学的特性とのうちの少なくとも一つを測定するステップと
を含む、試料を光学的に特徴付ける方法。
【請求項２】
前記試料が、粒子を含むことのできる媒体と、前記媒体内にある粒子とのうちの少なくとも一方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記干渉パターンを記録するステップが、前記試料の少なくとも一つのサイズと前記試料の複素屈折率とに関する情報を得るステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ある散乱関数を適用して、前記記録された干渉パターンを分析するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記散乱関数がローレンツ・ミー関数を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、球形試料と、均一な試料と、不均一な試料と、ミルク液滴と、コロイド粒子と、固体粒子と、エマルジョン液滴と、コア・シェル粒子と、フィルムと、ゲルとからなる群から選ばれるものである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ホログラフィック顕微鏡が焦点面を有しており、
前記測定するステップが前記焦点面に対する前記試料の軸方向変位を特定するステップを含み、
前記試料が媒体内の粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記軸方向変位を特定するステップが、少なくとも１回のキャリブレーションを必要としないか、または前記ホログラフィック顕微鏡の焦点深度の制限を受けない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記測定するステップが、１回の単一タイムスナップショットにおいて、前記試料内の粒子の位置を特定し、当該粒子の特性を特徴付けることにより、当該粒子についてのデータを生成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記測定するステップが、複数回にわたるタイムスナップショットにおいて、前記試料内の粒子の軌跡を特定し、当該軌跡に沿って特性を特徴付けることにより、当該粒子についてのデータを生成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記粒子についてのデータが、当該粒子と表面との間の相互作用と、少なくとも２つの当該粒子の相互作用と、前記試料の流体の速度場と、前記試料の媒体の粘弾性特性とのうちの少なくとも一つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記粒子についてのデータが、当該粒子と表面との間の相互作用と、少なくとも２つの前記粒子の相互作用と、前記試料の流体の速度場と、前記試料の媒体の粘弾性特性とのうちの少なくとも一つを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が粒子のコロイド懸濁液を保持する媒体を含み、
前記測定するステップが、前記媒体と前記懸濁液内の粒子の相互作用とのうちの少なくとも一方を分析するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記力学的特性を測定するステップが粒子の形状を測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記測定するステップが、
前記試料の流れている流体におけるストリームラインを測定するステップと、
凝結および凝集に対する前記試料のコロイド分散体の熱力学的安定性を評価するステップと、
前記試料のコロイド粒子間の相互作用を測定するステップと、
前記コロイド粒子と前記試料の表面との相互作用を測定するステップと、
前記試料の外部場および外力に対する粒子の反応を評価するステップと、
前記試料における前記粒子の粘性抵抗を特徴付けるステップと、
前記試料を含んだ媒体の粘弾性特性およびレオロジカル特性のプローブとして前記粒子の運動を用いるステップと
のうちの少なくとも一つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記測定するステップが、前記試料のサイズと前記試料の空間的位置とを同時に測定するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
前記測定するステップが、レオロジカル特性の多点アッセイを実行するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記測定するステップが、前記試料の特性をその場測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が複数の粒子を含み、
前記測定するステップが前記粒子の各々に対して個別に測定を実行するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記干渉パターンがビデオカメラによって全時間にわたって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記測定するステップが、プローブ粒子の特性を分析するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記プローブ粒子の特性を分析するステップが、前記試料の特性の熱駆動ゆらぎを評価することにより、前記試料を含む媒体の粘弾性特性を決定するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記測定するステップが、平均二乗ゆらぎΔｒ２（ｔ）を決定することにより、前記プローブ粒子を含んだ媒体の特徴付けを行うステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記媒体の特徴付けを行うステップが、前記媒体のレオロジカル特性を決定するステップを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記光学的特性を測定するステップが、温度と、化学的組成と、化学的濃度とのうちの少なくとも一つの関数として測定された、前記試料を含む粒子の屈折率及び半径の少なくとも一方を決定することにより、前記試料の安定性と、前記試料の化学的変化と、前記試料の選択可能な物質の族についての様々な化学状態とのうちの少なくとも一つを特徴付けるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記コリメートされたレーザビームが、前記試料に関する分光情報を得るために異なる複数の光波長を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記干渉パターンが正規化されて、正規化された干渉パターンが光散乱の特定の予測方法に選択的にフィッティングされて、それにより、前記試料の特徴に関する情報を提供する請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
空間的位置を測定するスコープが、媒体内の粒子を動的に追跡し、それにより、当該粒子の特性を特徴付けるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記粒子の特性が、流体力学的半径と、半径と、屈折率とを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
コヒーレント・レーザビームを供給するレーザビーム源と、
前記レーザビーム源から下流に配置されており、前記レーザビームを受ける試料台と、
前記試料台から下流に配置された対物レンズと、
前記対物レンズから下流に配置されており、試料データを収集するビデオ接眼レンズおよびイメージングシステムと
を備えたホログラフィック顕微鏡。
【請求項３１】
コンピュータ・ソフトウェア・モジュールに組み込まれたコンピュータソフトウェアを実行するコンピュータをさらに備えた請求項３０に記載のホログラフィック顕微鏡。
【請求項３２】
前記コンピュータソフトウェアが干渉パターンを分析する方法を実行し、それにより、試料の特徴付けを行うものである、請求項３１に記載のホログラフィック顕微鏡。
【請求項３３】
前記方法がローレンツ・ミーの利用を含む、請求項３２に記載のホログラフィック顕微鏡。
【請求項３４】
試料の品質を制御するために試料のデータに対応する制御システムをさらに備えた請求項３０に記載のホログラフィック顕微鏡。
【請求項３５】
コンピュータ・ソフトウェア・モジュールが試料の特徴を示すデータを処理する一連の命令を有するコンピュータソフトウェアを含むものであり、
前記試料の特徴を示すデータが、前記試料から散乱したレーザビームと前記レーザビームのうちの散乱していない部分との相互作用から生じる干渉パターンに関係しており、
前記一連の命令が、実行時に前記試料の特性を記述する収束解を与えて、それにより、前記試料の力学的特性と、光学的特性と、化学的特性とのうちの少なくとも一つの特徴付けを行う散乱関数をさらに含むものである、試料を特徴付けるために情報を処理するコンピュータ読み取り可能な媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、助成金番号ＤＭＲ−０６０６４１５として米国国立科学財団の支援を受けてなされた。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、引用することにより本明細書の一部をなす２００７年１０月３０日出願の米国特許出願第６１／００１，０２３号および２００８年６月１９日出願の米国特許出願第６１／０７３，９５９号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
本システムおよび本方法は、ホログラフィックビデオ顕微鏡によって記録されたホログラムの定量分析を用いたコロイド分散体の内部のコロイド粒子の３次元位置の測定と、各粒子の形状、サイズ、光学的特性の特徴付けとを対象とする。この分析により得られる情報は、コロイド粒子自体を特徴付けるために用いることができる。この情報は、粒子が内部に分散している媒体の特性を測定して分析（assay）するためにも利用することができる。このように、あらゆる用途において、定量的ホログラフィックビデオ顕微鏡は、これまでに研究され、実施されてきた方法および分析システムに対して相当な優位性を提供する。
【０００４】
粒子画像流速測定法（particle-image velocimetry）は、透明な媒体内に分散しているコロイド粒子の軌跡（trajectory）を測定するために広く用いられている。従来の粒子画像流速測定法の実施には、標準的な光学顕微鏡を使用して粒子の画像を生成し、次いで、コンピュータ画像分析の方法によってこれらの画像を分析することが必要である。このような測定および分析により、典型的には、顕微鏡の焦点面の中の個々の粒子の位置に関する情報が得られるものの、焦点面に対する粒子の軸方向の変位に関する情報は得られない。軸方向の追跡情報が抽出される場合には、その結果は、典型的には、面内の位置より実質的に悪い空間分解能を有している。さらに、軸方向位置の測定には、粒子毎に別々のキャリブレーション測定を必要とする。このような従来の粒子イメージング法では、一般的に、粒子のサイズ、形状、組成に関する情報がほとんど得られない。従来の粒子イメージング法が適用される軸方向変位の範囲は、焦点面から過度に遠くへ移動する粒子の画像が、分析するにはあまりにも薄暗く拡散するために、顕微鏡の焦点深度によって制限を受ける。
【０００５】
画像に基づく粒子追跡の用途としては、流れる流体の中のストリームラインの測定と、凝結（aggregation）および凝集（flocculation）に対するコロイド分散体の熱力学的安定性の評価と、コロイド粒子間の相互作用の測定と、コロイド粒子の表面との相互作用の測定と、外部場および外力に対する粒子の反応の評価と、粒子の粘性抵抗の特徴付けと、埋め込み媒体（embedding medium）の粘弾性特性およびレオロジカル特性のプローブとしての粒子の運動の利用とがある。コロイド粒子が媒体のレオロジーの顕微鏡プローブ（microscopic probe）として使用される後者の測定のクラスは、一般に粒子追跡マイクロレオロジーと呼ばれる。このようなすべての用途は、より良い空間分解能と、３次元追跡と、より広い軸方向範囲とを提供する粒子追跡の技術によるものである。たとえば、マイクロレオロジーのようなこれらの用途のうちのいくつかは、プローブ粒子（probe particle）の特徴、たとえば、プローブ粒子の半径に関する情報をさらに必要とする。典型的に、このような粒子特徴データは別の測定により得られる。
【０００６】
このような特定のマイクロレオロジーの場合には、媒体の粘弾性特性に関する等価的な情報を得るために他の方法が利用できる。例えば、拡散波分光法（diffusing wave spectroscopy）、動的光散乱法（dynamic light scattering）、干渉粒子追跡法（interferometric particle tracking）がある。このような方法は、いずれも、粒子イメージングに基づく方法より優れた帯域幅を提供する。しかし、最初の２つの方法によれば、いくつかの用途では必要な空間分解測定が得られない。干渉粒子追跡法は、優れた帯域幅および優れた追跡分解能の両方を提供する。しかし、この干渉粒子追跡法はサンプルの中の１点または２点にしか適用できないので、レオロジー特性の多点アッセイには使用できない。これらの方法は、いずれも不均一なサンプルの特性を分析するのには適していない。
【０００７】
個々のコロイド粒子は、典型的には、粒子の形状と、粒子のサイズと、粒子のバルク組成と、粒子の表面特性とによって特徴付けられる。コロイド分散体は、分散体の量の分布と、粒子の全体濃度とによって特徴付けられる。サイズおよび形状は、乾燥しているか、さもなければ調製したサンプルを電子顕微鏡で検査することによって評価できる。しかし、調製により粒子の特性が変化することがあるために、このような測定の結果は粒子の本来の特徴を正確に反映していない可能性がある。光散乱法は、一般に、コロイド粒子のサイズのその場分析（in situ analysis）のために使用される。しかし、このような測定は、分散体の中の粒子のサンプル平均見通しを提供し、一般的に、粒子のサイズ分布、形状、屈折率のための近似モデルまたは現象論的モデルを用いた入念な解釈を必要とする。一般によく利用されている市販の粒度測定（particle sizing）機器は、これらの方法を基礎とし、それらの制限を共有している。さらに、これらの方法は、粒子追跡測定で使用される特有の粒子を特徴付けるためには使用できない。コールターカウンタ（Coulter counter）のような他の粒度測定機器は、同様に粒子サイズを測定するための間接的な方法に依存しており、その場（in situ）で適用できないことがある。コロイド粒子の屈折率を測定する種々の方法がさらに知られている。従来の光散乱法は、一般に、屈折率のサンプル平均値を提供し、粒子のサイズおよび形状に関する情報を必要とする。特に効率的な方法は、流体の屈折率を粒子の屈折率に整合させ、次に、流体の屈折率を測定することを必要とする。この方法は、コロイドと互換性のある屈折率の整合した流体を必要とし、評価できる屈折率の範囲の点で非常に制限を受ける。
【発明の概要】
【０００８】
ホログラフィックビデオ顕微鏡法により得られた画像の定量的分析は、多数のコロイド粒子を同時に追跡して特徴付けるために必要な情報を提供し、各粒子に関する情報を個別に得る。この方法は、粒子を追跡するために、非常に広範囲の軸方向位置にわたって３次元のナノメートルスケール位置測定を行う。このような高分解能で広範囲の３次元追跡データは、マイクロレオロジーにおける用途にとって理想的であり、従来の粒子追跡が現在適用されているいずれの用途においても同様に有利に使用できる。ホログラフィック粒子追跡は、数ナノメートルから少なくとも数マイクロメートルまでサイズが変化する粒子に対して機能する。ホログラフィック粒子追跡は、ホログラムを得るために使用されるビデオカメラの全時間分解能を提供する。粒子を特徴付けるために、ホログラフィック分析は、ナノメートル分解能の半径と、１０００分の１程度の相対誤差の複素屈折率とを生じさせる。ホログラフィック分析は、高屈折率媒体の中の低屈折率バブルから、屈折率があまりに高く他の手段では評価できない粒子までの屈折率の全範囲に及ぶものである。これらの仕様は、粒子の特徴付けのみに特化した方法の多くの仕様を凌ぐ。高分解能粒子追跡と精密なその場粒子特徴付けとの組み合わせにより、他の手段では実行できない測定が可能となる。
【０００９】
本発明の様々な態様が本明細書に記載されており、これらの改良および他の改良を、後述する図面を含めて、より詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】ホログラフィックビデオ顕微鏡の概略図である。
【図１Ｂ】図１Ａに示した撮像面に生じた光散乱を示す図である。
【図１Ｃ】得られた測定ホログラムを示す図である。
【図１Ｄ】本発明の方法を使用して適合（fit）させたホログラムを示す図である。
【図２Ａ】特徴的な特性情報を得るために試料を分析する好ましい実施形態の概略フローチャートである。
【図２Ｂ】試料データを処理するコンピュータソフトウェアを用いて実施する方法の詳細を示す図である。
【図３】図３Ａは、ニュートン流体の中で自由に拡散するポリスチレンビーズの軌跡の３次元プロットを示す図である。図３Ｂは、時間の関数としてｘ、ｙ、ｚの座標毎の平均二乗変位を示す図である。
【図４】図４Ａは、図３Ａおよび図３Ｂのデータから抽出された粘弾性率Ｇ’（ω）およびＧ’’（ω）の測定値を示す図である。図４Ｂは、関連する動的粘度η（ω）を示す図である。図４Ｃは、プローブ粒子の軌跡の平均二乗変位を示すグラフを挿入した、水中の２５０ｋＤａ酸化ポリエチレン（「ＰＥＯ」）サンプル１７重量％に対する粘弾性率を示す図である。図４Ｄは、動的粘度を示す図である。
【図５】図５Ａは、平均二乗変位のグラフを挿入した、再構成されたＳタイプのバイオフィルム多糖体の粘弾性率Ｇ’（ω）およびＧ’’（ω）を示す図である。図５Ｂは、Ｓタイプのバイオフィルムの動的粘度を示す図である。図５Ｃは、同じ濃度のＮタイプの多糖体に対する図５Ａと同じ変数を示す図である。図５Ｄは、Ｎタイプの多糖体の同じ濃度に対する図５Ｂと同じ変数を示す図である。
【図６Ａ】各データ点が単一の脂肪液滴に対する結果（誤差バーが、適合用パラメータ（fitting parameter）の正規化された変動指数から計算される）を表現している、市販ミルクのサンプルに対する脂肪球半径と屈折率との関係を示す図である。
【図６Ｂ】個数分布と直径との関係を示す図である。
【図６Ｃ】個数分布と屈折率との関係を示す図である。
【図７Ａ】界面活性剤を含む場合と含まない場合において、水中に分散したタイプＢの液浸油に対する屈折率と液滴半径との関係を示す図である。
【図７Ｂ】個数分布と直径との関係を示す図である。
【図７Ｃ】個数分布と屈折率との関係を示す図である。
【図８Ａ（１）】ｚｐ＝２２．７μｍで水中の直径１．４３μｍのポリスチレン球から正規化されたホログラムＢ（ρ）を示す図である。
【図８Ａ（２）】式（１８）を使用した数値適合（numerical fit）を示す図である。
【図８Ａ（３）】球に対して方位角方向に平均化した半径方向プロファイルＢ（ρ）を示す図である。
【図８Ｂ（１）】ｚｐ＝７．０μｍで液浸油中に分散した（ｎｍ＝１．５１５）直径１．４５μｍのＴｉＯ２球に対するホログラムデータを示す図である。
【図８Ｂ（２）】図８Ａ（３）の方法の場合と同様に数値適合を示す図である。
【図８Ｂ（３）】対応する方位角方向に平均化した半径方向プロファイルＢ（ρ）を示す図である。
【図８Ｃ（１）】ｚｐ＝３８．８μｍでの水中の４．５μｍのＳｉＯ２球に対するホログラムデータを示す図である。
【図８Ｃ（２）】図８Ａ（３）の方法の場合と同様に数値適合を示す図である。
【図８Ｃ（３）】対応する方位角方向に平均化した半径方向プロファイルＢ（ρ）を示す図である。
【図９】図９Ａ（１）は、軌跡の最初においてコロイドシリカ球のデジタルホログラム画像を示す図である。図９Ａ（２）は、軌跡の最後にコロイドシリカ球を示す図である。図９Ｂ（１）は、軌跡の最初において式（１８）を使用した対応する数値適合を示す図である。図９Ｂ（２）は、軌跡の最後での対応する適合を示す図である。
【図１０】始点（円形）および終点（正方形）がラベル付けされたコロイドシリカ球の３次元軌跡を示す図である。
【図１１】熱沈降と関連した熱ゆらぎ関数ｚ（ｔ）を示す図である（挿入しているグラフは位置とは独立した屈折率の適合である）。
【図１２】アインシュタイン・スモルコフスキーのｘｙｚスケーリングを用いてτ（秒）の関数として平均二乗位置ゆらぎを示しており、軌跡を投影したｘｙ平面のグラフを挿入した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
図１Ａに概略的に示しているホログラフィック顕微鏡１０は、市販の倒立型光学顕微鏡（Zeiss Axiovert TV 100 S）に基づいている。従来の白熱照明は、真空波長λ＝６３２．８ｎｍで動作するコリメートされた１０ｍＷのＨｅＮｅレーザ２０（たとえば、Uniphase）に置き換えられている。位置ｒｐにおいて試料台またはホルダ３８に配置されている媒体３５内の個々の粒子１２または異なる相（phase）３０といった試料は、平面波照明光４０のごく一部を散乱させる。次いで、散乱光５０は、顕微鏡１０の焦点面６０へと伝搬し、焦点面において光５０はレーザビーム光４０の散乱していない部分と干渉する。結果として生じる干渉パターンは、顕微鏡の対物レンズ７０（たとえば、S Plan Apo、倍率１００、開口数（NA）１．４、油浸）によって拡大され、ビデオ接眼レンズ８０（倍率０．６３）によってＣＣＤカメラ１５（たとえば、NEC TI-324AII）に投影され、その後、デジタル・ビデオ・レコーダ１８（たとえば、Panasonic DVR-H110、図示せず）を用いて非圧縮デジタルビデオとして記録されて、蓄積されたデータが、モジュール１２０に組み込まれた様々なコンピュータソフトウェアを実行するコンピュータ１００によって処理される。本発明の好ましい形態では、モジュール１２０上のコンピュータソフトウェアは、試料の特徴を示すデータを操作する一連の命令を含んでいる。試料１２、３０の特徴を示すデータは、試料１２、３０から散乱したレーザ光５０とレーザ光４０の散乱していない部分との相互作用から生じる干渉パターンに関係している。一連の命令は、実行時に、試料１２、３０の特性を表す収束解（convergent solution）を与え、それにより、試料１２、３０の力学的特性と、光学的特性と、化学的特性とのうちの少なくとも１つの特徴付けを可能にする散乱関数をさらに含んでいる。
【００１２】
レコーダ１８によって提供されるビデオストリーム内の各ホログラフィック画像は、顕微鏡の視野の中の散乱体の３次元分布の時間分解スナップショットである。さらなる実施形態では、複数の時間スナップショットは、粒子の軌跡（trajectory）の追跡と特徴的な特性の取得とを可能にする。次に、各粒子１２または異なる相３０の特徴を計測するため、小さな粒子１２による光散乱のローレンツ・ミー（Lorenz-Mie）理論（または、ソフトウェアモジュール１２０内にプログラムとして組み込まれた他の適切な光散乱方法）の結果を用いる。図１Ａのシステムでは、レコーダ１８から出力されて、コンピュータ１００によって処理される試料データは、試料１２、３０に関する品質制御信号（quality control signal）または製造制御信号（manufacturing control signal）１００を発生する制御システム１５０へと出力することができる。
【００１３】
最も好ましい実施形態では、顕微鏡１０は、図２Ａおよび図２Ｂに示したフローチャートに従って動作する。ホログラフィック画像の取得は、試料１２、３０を照明するために使用するレーザ２０の選定から始まる。特定の用途に対して選択されるレーザ２０の特徴は、光４０の波長と、光４０の区別可能な波長の個数と、コヒーレンス長と、各波長での光４０の強度と、レーザ２０が連続型であるかパルス型であるかとを含む。レーザ２０がパルス型である場合には、パルスの形状およびタイミングは様々な用途に対して最適化することができる。これらの選定は、典型的には、目的とする用途と、顕微鏡１０の中の他のハードウェアコンポーネントおよびソフトウェアコンポーネントとを考慮して行われることになる。たとえば、パルス形式のレーザ２０が急速に移動する物体の時間分解イメージングに際して好ましい場合がある。この場合、パルスは、ビデオレコーダ１８または画像を記録するために使用される他のカメラのシャッタと同期を取ることができる。同様に、波長も試料１２、３０の光学特性をうまく利用するために選択することができる。異なる波長で記録されたホログラムの分析を通じてスペクトル分析情報を得るために、レーザ２０の複数の波長を選択することができる。異なる波長でのホログラムは、カラー情報を記録する機能をもつカメラ（たとえば、ビデオレコーダ１８）を用いて同時に記録することができる。ホログラムは、それぞれが特定の波長のために選択された複数のカメラを使って記録することができる。あるいは、ホログラムは１台以上のカメラを使って順次記録することもできる。
【００１４】
インラインホログラフィに対して、試料１２、３０は、十分な割合の照明用レーザ２０が干渉パターンを形成するように歪みなく通過するために十分に透明であることが最も好ましい。従って、試料１２、３０は、透明なタイプのサンプルホルダ３８に載せるべきであり、サンプルホルダ３８は、結果として生じる干渉パターンが顕微鏡１０で見えるように配置されたレーザビーム２０内にしっかりと搭載されるべきである。これらの条件を充足するときに、試料１２、３０によって散乱した光４０は、レーザビーム２０の散乱していない部分と干渉することになり、干渉パターンまたはホログラムを形成する光５０を提供する。顕微鏡１０の役割は、ホログラムを拡大して、拡大されたホログラムをカメラ１８に投影することである。従って、顕微鏡の対物レンズ７０および接眼レンズ８０は、選ばれた波長で光４０の収集、拡大、投影を最適化するために選択されることが好ましい。
【００１５】
場合によっては別のデジタル化システムと接続されているビデオレコーダまたはカメラ１８は、ホログラムを記録し、ホログラムをデジタル化して、デジタル化された画像を（たとえば、図１Ａにおいて２５として図示されている）デジタル画像蓄積システムへ転送する。カメラの画素数、空間分解能、フレームレートは、ホログラフィック顕微鏡法を用いて実行できる測定の空間レンジ、空間分解能、時間帯域幅を定める。その上、カメラのダイナミックレンジは、有用な画像を得るために必要なレーザ２０の強度と、各画像から得ることができる情報の量とを定める。カラー情報を記録するカメラの機能により、複数の波長によりホログラムを得る際にカメラ１８が果たし得る役割が定まる。カメラ１８によって得られた画像は、後の分析のために記録することができるか、あるいは、リアルタイム分析のために画像分析ルーチンへそのまま転送することができる。
【００１６】
画像は図２Ｂに示したやり方で分析とその後の利用のために準備することができる。カメラ１８によって得られた画像と、場合によっては、デジタル画像蓄積システム２５に記憶されたデータとは、画素のアレイで構成されており、各画素は局所強度値を数として記録されている。これらの数は、光散乱理論を用いて分析できるようにする前に、適切に正規化することが最も好ましい。正規化は、本明細書中に記載されているように、予め記録された背景画像によって画像を割る（divide）ことにより行うことができる。この正規化は、偽の干渉縞による画像内の強度の変動を取り除くという利点を持つ。代替的には、正規化は、正規化定数によって画像全体を割ること、または、背景照明パターンのための数値モデルによって画像を正規化することにより行うこともできる。
【００１７】
画像が正規化されると、その画像は、選択された適切な光散乱理論に基づく予測に適合（fit）させることにより分析することができる。光散乱理論は、ローレンツ・ミー理論と、Ｔ行列理論と、照射された物体によって散乱した電磁波を予測する他の対処法とを含むいくつかの数式を含んでいる。このような数式はいずれも正規化された画像を分析するために使用できる。試料１２、３０が球であるという特定の場合には、ローレンツ・ミー理論が特に適している。より複雑な構造体の場合には、Ｔ行列理論が好ましい。
【００１８】
散乱光場のための適切な式が選択されると、正規化された画像は、調整可能なパラメータを操作することにより理論に適合あるいはフィッティングすることができる。試料１２、３０が均一な等方性の球形の物体であるという特定の場合には、調整可能なパラメータは、球の３次元位置、球の半径、球の複素屈折率を含んでいる。より複雑な物体の場合には、付加的な適合用パラメータ（fitting parameter）が必要となることもある。一般に、必要な適合（fit）は、調整可能なパラメータの高度の非線形最適化を伴う。この方法の実施に際して、レーベンバーグ・マルカート法による非線形最小二乗最適化アルゴリズムを採用した。いくつかの用途に対しては他のアルゴリズムが好ましいことがある。適合あるいはフィッティングはコンピュータ１００のＣＰＵを使用して画素毎に行うことができる。代替的には、グラフィックス処理ユニット（ＧＰＵ）、または、別のこのような並列処理システム（図１Ａにおいて「コンピュータ１００」としても表されている）の使用によって計算を高速化することができる。
【００１９】
適合あるいはフィッティングは、記録された各ホログラフィック画像内の試料１２、３０に対して実行することができる。代替的には、さらなる検討のためにいくつかの特定の試料１２、３０を各画像内で選択することもできる。画像を分析してから、オブジェクトデータを単独で、または、他の画像のデータと併せて分析することができる。オブジェクトデータは、そのオブジェクトデータを用いるための望ましい最終的な生成物であってもよい。オブジェクトデータが望ましい最終的な生成物であると考えられるのは、試料１２、３０の３次元構造を検証する場合、または、試料１２、３０のサンプルの光学的特徴を評価する場合である。
【００２０】
試料１２、３０の１つずつのホログラフィック画像のシーケンスは、その試料の３次元軌跡の時間分解測定を行うために組み合わせることができる。このような軌跡はそれ自体がさらなる分析のための入力として使用することもできる。たとえば、軌跡データの統計的分析は、流れる流体の中の速度場の測定を行うために使用することもできる。このような測定は、粒子画像流速測定法という名前で従来から知られている。従って、ホログラフィック粒子追跡に基づいた修正は、ホログラフィック粒子画像流速測定法と呼ぶことができる。代替的には、軌跡データは、複数の試料粒子１８が分散している媒体３５の粘弾性特性に関する情報を得るために分析することができ、ホログラフィックマイクロレオロジーと呼ばれる（ホログラフィックマイクロレオロジーは、以下のセクションＡで詳細に述べる）。
【００２１】
詳細は後述するが、試料のサイズおよび屈折率データと、個々の粒子のサイズおよび屈折率とを長時間にわたり監視することができる。これらの値は安定系においては一定に保たれるはずである。これらの値の変動は、系の内部で変化する状態に関する情報を提供する。このような情報はホログラフィックマイクロレオロジーのような用途において役立つ。代替的には、粒子１８または相３０の統計的アンサンブルのサイズおよび屈折率は、複数のホログラフィック画像から得ることができる。このようなアンサンブルは、バルク試料１２、３０の内部のサイズおよび屈折率の統計的分布を推定するために分析することができる。このような情報は、品質および稠度（consistency）に関してプロセスおよび生成物を監視するのに役立つ。試料１２、３０が非球体である場合には、さらに形状および配向のような付加的な情報を得て、統計的分析を実行することができる。
【００２２】
いくつかの場合に、試料１２、３０の化学的組成は、複数の波長で試料の屈折率を測定することにより評価することができる。被覆球体のような不均一な試料の場合には、組成分析により、試料１２、３０の表面上の被覆物の存在または組成が検出されることがある。組成分析は、たとえば、エマルジョン系または粒子系の生成物中の混和物（adulterant）を検出する手段として、プロセス制御および生成物の品質保証のために役立つ。分子スケールの被覆物の検出は、ラベルフリー分子結合アッセイに役立つ。同様に、追跡データを利用する用途を含む幾何学的データおよび組成データの他の用途も明らかである。
【００２３】
Ａ．媒体のマイクロレオロジー
様々な実施形態において、この方法を、複数の異なるタイプの粒子および相１２、３０の分析に適用する。好ましい一実施形態では、媒体の熱駆動ゆらぎ（thermally-driven fluctuation）を直接的に、あるいは、組み込まれたプローブ粒子（probe particle）への熱駆動ゆらぎの影響を通して分析することにより、媒体の粘弾性特性のホログラフィックマイクロレオロジカル分析を実行する。一実施形態では、このやり方は、プローブ粒子の平均二乗位置ゆらぎ＜Δｒ２（ｔ）＞を監視し、媒体の周波数に依存した貯蔵弾性率（frequency-dependent storage modulus）Ｇ’（ω）を抽出するために一般化されたストークス・アインシュタインの関係を使用する。これは、クラマース・クローニッヒの関係によって、マイクロメカニカルな記述を完成させる周波数に依存した損失弾性率（frequency-dependent loss modulus）Ｇ’’（ω）に関係付けられる。
【００２４】
本実施例のプローブ粒子は、ボルテックス（vortex）することによってサンプル媒体内でランダムに分散した公称半径（nominal radius）ａ＝０．７５μｍの帯電安定化ポリスチレン球（Duke Scientific, Catalog #5133A,Lot #26621）である。サンプル媒体は、カバーガラスＮｏ．１を顕微鏡スライドの面に接合することにより形成された透明容器へ封入される。シールされたサンプル媒体は、Ｔ＝２３±１℃において顕微鏡台上で熱平衡及び力学的平衡に達するまで放置する。
【００２５】
ホログラフィック画像は、デジタル・ビデオ・レコーダ（Panasonic DMR-E100H）に毎秒３０フレームで非圧縮デジタル・ビデオ・ストリームとして記録する。次に、顕微鏡の焦点面の中心に対するプローブ粒子の３次元的位置を測定するために各画像を分析する。
【００２６】
より具体的には、コリメートされたレーザを、屈折率ｎｍの媒体中の光の波数（wavenumber）をｋ＝２πｎｍ／λとして、平面波入射電界Ｅ０（ｒｐ）＝ｕ０（ｒｐ）ｅｘｐ（−ｉｋｚｐ）を用いて、位置ｒｐにあるプローブ粒子に照射する。粒子によって散乱した電界Ｅｓ（ｒ）＝ｕ０（ｒｐ）ｆｍ（ｒ−ｒｐ）はｚ＝０にある焦点面へ伝搬し、入射ビームと干渉する。散乱光の分布は、粒子の位置ｒｐと、粒子の半径ａと、粒子の屈折率ｎｐとに依存する従来のローレンツ・ミー散乱関数ｆｍ（ｒ−ｒｐ）によって記述される。
【００２７】
実際には、入射照明は位置によって変化するため、入射照明Ｉ０（ｒ）＝｜ｕ０（ｒ）｜２を測定して、測定された干渉パターンＩ（ｒ）を正規化すると、次式が得られる。
【数１】
2011502256.tif 000003
ただし、
【数２】
2011502256.tif 000004
は、Ｉ０（ｒｐ）の変分（variation）である。式（１）は、たとえば、粒子の位置、半径、
屈折率を自由なパラメータとして、図１Ｂに示した実施例のような正規化された画像にフィッティングされる。同じ機器での従来の明視野（bright field）における粒子追跡では、面内分解能１０ｎｍおよび軸方向分解能１００ｎｍが得られるが、ホログラフィック粒子追跡法は少なくとも１桁改善する。さらに、従来の粒子追跡法とは異なり、ホログラフィック追跡法は、軸方向測定毎の別個のキャリブレーションが必要ない。
【００２８】
水のようなニュートン流体の中を自由に拡散するプローブ粒子を追跡することにより、粒子位置の測定誤差を評価することができる。粒子が境界面から十分に離れているならば、３つのデカルト方向（Cartesian directions）のそれぞれにおける粒子の平均二乗変位は、ストークス・アインシュタインの関係、すなわち、
【数３】
2011502256.tif 000005
に基づいて得られる。ただし、Ｄ０＝ｋＢＴ／（６πηａ）は、絶対温度Ｔにおける粘度ηの流体中の球体に対する拡散係数である。式（２）の中の山括弧（angle bracket）は、スタート時間にわたるアンサンブル平均を表している。平均を間隔ｔによって分離されたスタート時間に限定することは、＜Δｒｊ２（ｔ）＞への寄与が統計的に独立であることを確実にする。しかし、離散的に標本化した単一の軌跡を分析するときには、この選択は、より長い遅延時間ｔにおいて不均衡に大きな統計誤差を生じる。すべてのスタート時間にわたる平均化は、＜Δｒｊ２（ｔ）＞の推定を改善し、軌跡をマルコフ過程として扱うことができるならば、正当であると判断できる。ここで考慮している熱駆動軌跡がこの場合であり、このような網羅的な標本化は、数千回のタイムステップにわたって測定された単一の軌跡から平均二乗変位を推定することを可能にする。間隔ｔにわたる相関測定の共分散は、＜Δｒｊ２（ｔ）＞の統計誤差を補正するはずである。
【００２９】
ｒｊ（ｔ）の測定量は、平均値εｊが追跡分解能を定めるランダム誤差の影響も受ける。これらの誤差は、ｔとは無関係に２εｊ２ずつ粒子の見かけの平均二乗変位を増加させる。カメラのシャッタ間隔τｓの間の動きぶれに起因する付加的な誤差は、見かけの平均二乗変位を減少させる。その結果は、両方の効果を考慮する次式、
【数４】
2011502256.tif 000006
によって与えられ、εｊを測定することを可能にする。
【００３０】
＜Δｒｊ２（ｔ）＞のフーリエ変換は、現象論的な一般化されたストークス・アインシュタインの関係、すなわち、
【数５】
2011502256.tif 000007
によって、複素周波数に依存する粘弾性率に関係付けられる。ただし、Γ（ｘ）はガンマ関数であり、
【数６】
2011502256.tif 000008
である。これにより、
【数７】
2011502256.tif 000009
を得る。
【００３１】
Ｇ’（ω）は、剪断力（shear force）に対する媒体の弾性応答（elastic response）であり、Ｇ’’（ω）は媒体の粘度である。これらは、潜在的な治療薬に対するバイオフィルムの反応の通常のプローブである。同様に、動的粘度、すなわち、
【数８】
2011502256.tif 000010
は、周囲の環境と物質をやり取りするバイオフィルムの機能についての全体的な印象を与える。
【００３２】
ホログラフィック・マイクロレオロジー・システムの精度を定めるために、最初に、ニュートン流体中に拡散するプローブ粒子の運動を分析する。図３Ａにプロットされている５分間の軌跡は、粘度が１．７ｍＰａ・ｓであると期待される水中の２５％（ｗ／ｗ）グリセロールの濃度にマッチした溶液中に懸濁した公称半径ａ＝０．７５μｍの単一のポリスチレン球に対して得られたものである。粒子は、ガラス壁への流体力学的結合を最小限に抑えるために厚さ５０μｍのサンプルの塊の中央平面に光学ピンセットを用いて位置合わせされていて、次いで解放してデータを得た。
【００３３】
ローレンツ・ミー散乱の式への画像のフィッティングにより、εｘ＝εｙ＝４ｎｍおよびεｘ＝２０ｎｍの推定された単一画像精度が得られる。各座標の平均二乗変位は、式（３）へのフィッティングとともに図３Ｂにプロットされている。３本の軌跡はすべてＤ０＝０．１６９５±０．０００１μｍ２／ｓと整合している。粒子の測定半径の軌跡平均（trajectory average）ａ＝０．７７５±０．０１４μｍと組み合わせれば、全体的な粘度η＝１．６７±０．０１ｍＰａ・ｓを意味する。シャッタ間隔ｔｓ＝１ｍｓとすると、推定されたオフセットは、εｘ＝εｙ＝８±４ｎｍおよびεｚ＝３５±８ｎｍをもたらす。これらの値は推定された単一フレーム分解能と整合し、位置測定の精度がこの推定された単一フレーム分解能の精度に匹敵することを意味する。
【００３４】
高分解能の軸方向の追跡データの利用可能性は、マイクロレオロジーのためのホログラフィック粒子追跡の主要な利点の１つである。この場合、３つのデータセットの間の整合性は、表面への流体力学的な結合との測定の独立性を確かにする。より一般的には、このような比較は、サンプルの等方性および均一性を評価するために役立つ。
【００３５】
３つの座標による結果は一致しているため、式（４）、（６）、（８）を用いて３次元平均二乗変位＜Δｒ２（ｔ）＞＝Σｊ＝１３＜Δｒｊ２（ｔ）＞を分析して、図４Ａにプロットされている損失弾性率Ｇ’’（ω）と、図４Ｂにプロットされている動的粘度η（ω）とを得た。予想されたとおり、グリセロール水溶液は、貯蔵弾性率Ｇ’（ω）があまりに小さいために、プローブされる周波数の範囲全体を分解できないニュートン流体として働く。したがって、グリセロール水溶液の粘度η（ω）＝１．６８０±０．００１ｍＰａ・ｓは、周波数とは独立しており、バルク測定から得られた値と一致している。
【００３６】
３次元粒子追跡法の精度と、本実施例の機器の機械的安定性を定めた後、３次元粒子追跡法の効果が、標準的な非ニュートンサンプル、すなわち、高分子重量ＰＥＯ水溶液に粒子追跡マイクロレオロジーを適用することにより示されている。図４Ｃは、脱イオン水中の２００ｋＤａ  ＰＥＯの１７ｗｔ％溶液中に分散した単一球から得られたＧ’（ω）およびＧ’’（ω）を示している。ニュートン流体に関しては、整合する結果が３つのすべての座標で得られるので、組み合わせた結果を図４Ｃおよび図４Ｄに示している。
【００３７】
図４Ｃにプロットされている粘弾性率は、比較条件下での類似のサンプルの結果と定量的に一致する。損失弾性率Ｇ’’（ω）は、このサンプルがゲルではなく流体であることを特定する周波数範囲の全体にわたって貯蔵弾性率Ｇ’（ω）を上回っている。図４Ｄにプロットされている、関連する動的粘性率は周波数の増加に伴って単調減少し、これがシヤスィニング（shear-thinning）流体の痕跡である。
【００３８】
図５のデータは、バイオフィルム多糖体の比較のための結果を示している。他の方法を使用したバイオフィルムの構造の従来の研究により、系統的な物理分析による影響を受け難いと思われるサブミリメートルスケールでのある程度の不均一性が明らかになった。実際上、モデルとなったバイオフィルムの巨視的レオロジカル特性の測定は、名目上類似したサンプルの場合で、４桁以上異なる粘弾性率をもたらした。これらの差異は、負荷、歪み速度、全歪み、サンプル調製によるものとされている。
【００３９】
マイクロレオロジーは、平衡状態にある無負荷のサンプルの局所的なスケール特性をプローブすることにより、これらの懸念の多くに対処する。粒子追跡マイクロレオロジーは広範囲の産業的および生物学的に関連した材料に適用されているが、バイオフィルムへの適用は明らかに新規なものである。モデルバイオフィルムは、遊泳バクテリアが混入することなく調製できるため、この種の分析に役立つ。
【００４０】
１０％サッカロース存在下のスライドガラス上で成長した、S. mutans UA159（ATCC 700610）の５日齢バイオフィルムから抽出されたストレプトコッカス・ミュータンス多糖体サンプルを用いて例示的な研究を行った。水溶性（Ｓ）の多糖体を室温でMilliQ水を使って抽出した。次に、不溶性（Ｎ）の多糖体フラクション（polysaccharide fraction）を１Ｎ  ＮａＯＨの中で抽出した。双方の抽出物がｐＨ７．０±０．５まで中和され、少なくとも２４時間にわたって−１８℃で冷エタノール（７５％ｖ／ｖ）を用いて沈殿させた。結果として得られた多糖体サンプルは、少なくとも多分散性５０％で平均分子重量約１０ｋＤａを有し、微量の蛋白質を含有していた。沈殿後、サンプルは７５％（ｖ／ｖ）エタノールで数回洗浄され、ブロット乾燥され、２０％（ｗ／ｖ）で水（Ｓ）または１Ｎ  ＮａＯＨ（Ｎ）の中で溶解され、マイクロレオロジカル測定法で使用されるゲルを形成した。ポリスチレンプローブ粒子は、この時点で多糖体の中でランダムに分散し、シールされたサンプル室の中央平面付近の粒子を測定のために選んだ。
【００４１】
図５Ａおよび図５Ｂに示されているＳフラクション（S fraction）に対する結果は、図４Ｃおよび図４ＤのＰＥＯ溶液に対する結果と類似している。バイオフィルムの水溶性多糖体は、水よりおよそ１０倍粘性のあるシヤスィニング（shear-thinning）流体を形成する。
【００４２】
対照的に、図５Ｃに示されているデータは、Ｎタイプのフラクションが典型的な貯蔵弾性率１０Ｐａをもつ弾性ゲルを形成することを示している。この貯蔵弾性率は、他の従来技術においてＳミュータンス多糖類のバルクサンプルに関して報告された平均値より数百倍小さい。しかし、この貯蔵弾性率は、実質的な測定誤差を考慮したときに最低負荷で報告された値と整合している。低負荷での正確な測定はマイクロレオロジーの長所のうちの１つであり、そのため、図５Ｃおよび図５Ｄにおける結果の方がバイオフィルムの生体内特性を反映している可能性が高い。低負荷の場合でも、Ｎタイプのゲルは、図５Ｄの動的粘性率によって示されているように、シヤスィニング性が強い。このことは、ブラッシングによる除去を容易にするため、歯のバイオフィルムにとって望ましい性質である。
【００４３】
これらの観察は、バイオフィルムの生体内力学的特性および生物学的特性を定める際には２つのフラクションの付加的な役割を意味する。Ｎタイプの材料は、バイオフィルムのバクテリアコロニーがその生態系を内部に確立する機械的な骨格の役割を果たすためにより適しているように思われる。従って、Ｎタイプのゲルを崩壊させる能力は、治療薬のための有望な特性として考えることができる。このような薬のマイクロレオロジカルアッセイがＮタイプの抽出物に与える影響は、簡単かつ費用対効果に優れたスクリーニング技術を提供するはずである。複数のプローブ粒子を同時に追跡するホログラフィックマイクロレオロジーの能力は、さらに、個別に、そして、濃度の関数として組み合わせて、複数の治療薬をスクリーニングする機会を作り出す。
【００４４】
Ｂ．ミルク脂肪球の特徴付け
別の実施形態では、数種類の等級の均質化された低温殺菌済みの牛乳、羊乳、山羊乳を含む様々な市販されているミルク製品からミルク脂肪液滴を分析した。それぞれの場合に、サンプルは、顕微鏡スライドとガラスカバースリップとの間にシールされており、顕微鏡の台に取り付けられる前に、脱イオン水によって１０００：１に希釈した。１画素当たり１０１ｎｍというイメージングシステムのキャリブレーションされた倍率を仮定すると、典型的な６４０×４８０画素の画像Ｉ（ｒ）は、およそ１０個の分解可能な球を撮影する。
【００４５】
未処理のホログラムは、スペックルと、顕微鏡の光学系の干渉効果と、ゴミおよびその他の傷による散乱とに起因して大きな強度変動の影響を受ける。視野の中にサンプルのない状態で取得した背景ホログラムＩ０（ｒ）を使ってＩ（ｒ）を正規化することによって、これらの大きな強度変動を補正する。一部上述したように、正規化されたホログラムは、ローレンツ・ミー理論の予測
【数９】
2011502256.tif 000011
に当てはめる（フィッティングする）ことができる。ただし、ｋ＝２πｎｍ／λは複素屈折率ｎｍの媒体の中の光の波数であり、ｆｓ（ｒ−ｒｐ）は、位置ｒｐにある球体によって偏光
【数１０】
2011502256.tif 000012
の光が散乱する様子を記述するローレンツ・ミー散乱関数である。実際には、照明用ビームは完全に均一ではない。そして、位置に依存した変動といったＩ０（ｒｐ）の変動を考慮するために係数
【数１１】
2011502256.tif 000013
を使用する。散乱体が
【数１２】
2011502256.tif 000014
方向に直線的に偏光された光によって照射される均一かつ均質の誘電球であるとすると、
【数１３】
2011502256.tif 000015
となる。ただし、ｆｎ＝ｉｎ（２ｎ＋１）／［ｎ（ｎ＋１）］であり、Ｍｏｌｎ（３）（ｒ）およびＮｅｌｎ（３）（ｒ）は既知のベクトル球面調和関数、すなわち、
【数１４】
2011502256.tif 000016
である。ここで、Ｐｎ１（ｃｏｓθ）は第１種随伴ルジャンドル多項式（associated Legendre polynomial of the first kind）であり、ｊｎ（ｋｒ）はｎ次の第１種球ベッセル関数である。式（１０）における膨張係数は従来の周知の関係式、すなわち、
【数１５】
2011502256.tif 000017
と、
【数１６】
2011502256.tif 000018
とによって与えられる。ただし、ｍ＝ｎｐ／ｎｍは媒体に対する粒子の比屈折率であり、ｊｎ（ｘ）はｎ次の第１種球ベッセル関数であり、ｈｎ（１）（ｘ）はｎ次の第１種球ハンケル関数であり、プライム記号は引数に関する微分を表している。式（２）の和は、粒子のサイズに依存するある程度の項数ｎｃ＝ｋａ＋４．０５（ｋａ）１／３＋２の後に収束する。この計算中の唯一の難関は、ベッセル関数とそれらの比を正確かつ効率的に計算することである。最も好ましくは、係数ａｎおよび係数ｂｎを計算するために、正確かつ計算集約的であり、Ｌｅｎｔｚによる従来の方法である連分数アルゴリズムを使用する。その上、Wiscombeによるさらに効率的な再帰的アルゴリズムを球ベッセル関数のために使用することができる。いずれかを採用することにより、直径が１０ｎｍから１０μｍ以上にまで変動し、屈折率がｎｐ＝２．６を超える球に対して、本実施例の装置を使用して正確な結果を得ることを確実なものとする。
【００４６】
球を特徴付けるために、標準的なレーベンバーグ・マルカートの最小二乗アルゴリズムを使用して、ｒｐとｎｐとａとαとに対する式（９）から（１４）に、球の正規化されたホログラムをフィッティングする。相当数の自由パラメータがあるにもかかわらず、これらのフィッティングは急速かつロバストに収束し、典型的には、ナノメートルスケール分解能での粒子の位置およびサイズを得ることができ、粒子の屈折率を１０００分の１の範囲内で得ることができる。
【００４７】
この方法を地元のスーパーマーケットで入手した市販加工乳の５個のサンプルに適用した。これらのサンプルは、無脂肪から全乳まで変動する指定された脂肪含有量の低温殺菌済みの均質化された牛乳と、山羊乳とを含むものである。最大で１００滴までのランダムに選択された脂肪液滴を、各サンプルの脂肪液滴に対するサイズおよび屈折率の分布の推定値を得るためにサンプル毎に分析した。その結果は図６Ａから図６Ｃと表Ｉとにまとめている。
【００４８】
【表１】
2011502256.tif 000019
【００４９】
脂肪球の半径は、半径の分散の増加と同様に、脂肪含有量の増加に伴って増加する。牛乳の個々の球の平均屈折率ｎ＝１．４６４は、光散乱によって得られた単一液滴の屈折率のサンプル平均値と一致する。この平均屈折率は、バルクサンプルの全体的な屈折率に対して得られた範囲１．３４４４から１．３５２５を実質的に超えている。このような値は、室温での屈折率がｎｍ＝１．３３３である水の光学特性によって支配される。これに対し、ホログラフィック測定法は、個々の液滴の値をもたらすので、脂肪の特性について、これまでに報告されている方法のいずれよりも詳細な見通しを提供する。実際に、このホログラフィック測定法に基づいて、分離できるほど低い平均屈折率を有する山羊乳を牛乳と区別することができる。
【００５０】
興味深いことに、この関係はミルクが古くなるにつれて変化する。表Ｉは、山羊乳液滴の平均屈折率が１ヶ月の間に増加し、１．４５まで上昇することを示している。この結果は、ホログラフィック特徴付けがミルクのタイプを区別する以外にも役立ち、サンプルの（化学変化に関連する）日齢を評価するためにも使用できることを実証している。
【００５１】
粒子解像（particle-resolved）データを利用することにより、脂肪球のサイズと脂肪球の推定屈折率の分散との間の興味深い相関関係がさらに明らかになる。大きな粒子の見かけの屈折率は、測定手法の分解能の範囲内で互いに整合している。小さな液滴は、実質的により広い範囲の屈折率を示している。
【００５２】
これは、図７Ａから図７Ｃに示しているデータからわかるように、測定技術の本質的な制限ではない。円形のデータ点は、激しい剪断（shearing）によって水中に球形の液滴として分散したＣａｒｇｉｌｌｅ  タイプＢの顕微鏡液浸油の液滴について得られた結果である。この液浸油は、温度２５±Ｃで赤色光に対し公称バルク屈折率１．５１５を有する。この値は、本実施例において考慮した液滴半径の範囲全体、すなわち、０．２５μｍから２．５μｍにわたって得られた単一液滴結果と整合している。液滴間の変動は、式（９）による照明の強度の変動の不完全な補正に原因があると見られる。
【００５３】
ミルク脂肪液滴に対する結果をより連想させる結果は、油液滴が界面活性剤を用いて安定化したときに得られた。図７Ａにおける正方形の点は、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ９、すなわち、バルク屈折率が１．４９１である非イオン系界面活性剤が０．１％（ｖ／ｖ）添加されたタイプＢの油に対して得られた結果である。この界面活性剤の添加は大きな粒子に対する単一液滴屈折率を減少させる。この界面活性剤の添加は同時に小さな粒子について測定した屈折率の範囲を拡大させる。
【００５４】
この観察により、ホログラフィック粒子特徴付けが表面特性、特に、界面活性剤による表面被覆に敏感であるという結論が導かれた。この結論は、ミルク液滴の場合には、ホログラフィック顕微鏡法がミルク脂肪球膜（ＭＦＧＭ）に敏感であることを意味する。この感度は注目に値するものである。なぜならば、ＭＦＧＭは、１０〜２０ｎｍという僅かな厚さが光の波長より極めて小さく、液滴体積の非常に僅かな割合しか構成しないからである。
【００５５】
小さな液滴に対して得られた結果の変動性は、式１０から式１４の導出の基礎をなす仮定の崩壊を反映する可能性が高い。このローレンツ・ミー散乱理論の形は、急峻な界面をもつ均一な等方性球体に対して適している。被覆された球のホログラムを解釈するためにこの結果を使用することにより、必然的に、抽出されたパラメータの中に矛盾を生じさせることがある。この影響は、表面積対体積比がより大きい、小さな球に対してより顕著なはずである。コア・シェル構造を考慮した、より複雑な形の散乱関数を適用することにより、相当の付加的な計算の複雑化という負担と引き替えにこの変動性は低下するはずである。
【００５６】
小さなミルク脂肪液滴は、大きな液滴より系統的に大きな屈折率をさらに示している。これは、ＭＦＧＭおよび中性脂肪コアの脂肪酸組成のサイズの依存した変動を反映している可能性がある。したがって、ホログラフィック特徴付けの最も簡単な実施でさえ、ミルク脂肪液滴組成を評価するために役立つ。
【００５７】
複数の波長で同時に個々の液滴のホログラフィック特徴付けを実行することにより、さらに多くの情報を得ることができる。結果として得られる分光情報は、個々の球の組成をさらに定量化するために役立つ。しかし、最も簡単な形式でも、ホログラフィック顕微鏡法による脂肪球の特徴付けは、別の方法では実施できないミルク脂肪組成の粒子単位の分析を行う。この脂肪球の特徴付けは、専用の機器を殆ど必要としないため、プロセス制御および品質保証の用途に対して容易に適応させることができる。
【００５８】
ホログラフィック特徴付けのミルクへの適用は、ホログラフィック分析に基づいてミルクサンプルのタイプ（牛、山羊など）と品質（無脂肪、全乳、新鮮、古いなど）の両方を判定できることを実証している。この観察は、乳業におけるホログラフィック特徴付けの品質保証およびプロセス制御への適用を示唆している。より一般的には、本明細書中の開示内容に基づいて、塗料、他の食品、化粧品といった他のエマルジョン系システムのためにホログラフィック特徴付けをより広範囲にわたって使用することができる。
【００５９】
ホログラフィック特徴付けは、エマルジョン液滴のバルク特性と共に表面特性にも敏感であることに留意されたい。表面の特徴付けは、表面被覆物の有無の特定と、表面被覆の測定と、表面被覆物の性質の特徴付けとを含む。より複雑な形の理論へのフィッティングにより、表面被覆物の厚さおよび組成に関する定量情報を得ることができる。この定量情報はミルク特徴付けのため有用であり、粒子の表面が粒子のバルクと異なることがある（上述した）他の状況にも役立つはずである。
【００６０】
Ｃ．コロイド粒子の特徴付け
さらに別の実施形態では、水中に分散したポリスチレン硫酸塩球を分析して、特徴付けを行った。上述したように、デジタル化されたホログラムは、粒子の３次元位置ｒｐと、粒子の半径ａと、粒子の屈折率ｎｐとをもたらす。入射場、すなわち、
【数１７】
2011502256.tif 000020
が、
【数１８】
2011502256.tif 000021
方向に均一に偏光しているものとし、
【数１９】
2011502256.tif 000022
方向に伝搬する平面波として扱うことのできる粒子のサイズにわたって十分に緩やかに変化するものとする。すると、粒子の平面ｚ＝ｚｐ上の位置ρ＝（ｘ，ｙ）における粒子の振幅ｕ０（ρ）は、焦点面ｚ＝０における粒子の振幅と同じである。波は、波数ｋ＝２πｎｍ／λで、
【数２０】
2011502256.tif 000023
方向に伝搬する。ただし、λは真空中の光の波長であり、ｎｍは媒体の屈折率である。２５℃の純水に対して、λ＝０．６３２μｍ、ｎｍ＝１，３３２６である。
【００６１】
ｒｐにある粒子は、入射場の一部を、非常に構造化された出射波、すなわち、
【数２１】
2011502256.tif 000024
へと散乱させる。ただし、α＝１は照明の変動を表しており、ｆｓ（ｒ）は、ａと、ｎｐと、ｎｍと、λとに依存するローレンツ・ミー散乱関数である。散乱場は、干渉パターン、すなわち、
【数２２】
2011502256.tif 000025
が｜ｕ０（ρ）｜２の長い波長の変動によって支配される焦点面において十分に広い領域を殆どカバーする。結果として生じる歪みが特徴付けられるが、Ｉ（ρ）の先の分析では補正されていない。幸運にも、｜ｕ０（ρ）｜２は、空の視野（empty field）の中で測定可能である。そして、インラインホログラムは、平面ｚ＝０上で歪みのない画像、すなわち、
【数２３】
2011502256.tif 000026
を得るために正規化することができる。コリメートされた入射ビームの位相が視野にわたって緩やかに変化すると仮定するならば、正規化された画像は、
【数２４】
2011502256.tif 000027
を用いて、平面ｚ＝０の中で計算されたＭｉｅ散乱パターンｆｓ（ｒ）に関係付けられる。
【００６２】
式（１８）は、粒子の３次元位置と、粒子の半径と、粒子の屈折率とを自由パラメータとして扱うことにより、測定されたホログラムにフィッティングすることができる。これまでの研究では、これらの量のうちのいくつかについて、正規化されていないホログラムを現象論的モデルまたはＭｉｅの散乱理論にフィッティングしているが、決して５個全部ではない。調整可能なパラメータの誤差は強く相関しているため、これらのパラメータのすべてを同時に最適化することに失敗すると、不正確な結果をもたらす。その代わりに、完全なローレンツ・ミー理論へのフィッティングは、より高い精度でより多くの情報を提供する。
【００６３】
デジタル化されて、正規化されたホログラフィック画像への数値のフィッティングを、単一画素誤差を推定するためにカメラが測定した信号対雑音比を使用して、レーベンバーグ・マルカートの非線形最小二乗最小化アルゴリズムを使って実行した。ここで報告するフィッティングのすべてに対するχ２偏差（χ２deviates）はオーダー１であるため、適合用（フィッティング）パラメータで計算された不確実性は適合用（フィッティング）パラメータの精度を正確に反映している。
【００６４】
レーザの波長および媒体の屈折率は共に既知であるため、唯一の機器キャリブレーションは全体の倍率である。これは、特に、徹底的（in depth）に粒子を追跡するために、粒子のタイプ毎に独立したキャリブレーションを必要とする他の３次元粒子追跡技術とは対照的である。
【００６５】
図８Ａ（１）の画像（ならびに図８Ａ（２）および図８Ａ（３）の付随するデータ）は、焦点面より上方のｚｐ＝２２．７μｍの高さで水中に分散したポリスチレン硫酸塩球に対して正規化されたホログラムＢ（ρ）を示している。この球は、公称直径２ａ＝１．４８±０．０３μｍをもつ市販サンプル（Bangs Labs, Lot PS04N/6064）から得られたものである。カメラの電子シャッタは、ブラウン運動に起因したぶれを最小限に抑えるために露光時間０．２５ｍｓｅｃに設定した。未加工の８ビットデジタル化画像を正規化した後には、各画素は、おおよそ上位５ビットの情報を有している。Ｂ（ρ）への数値のフィッティングにより、干渉縞の位置だけでなく、干渉縞の大きさも忠実に再現できる。当てはめ（フィッティング）の質は方位角の平均から判断することができる。実線の曲線はＢ（ρ）の中心周りの角度平均であり、破線の曲線は平均の標準偏差を表しており、離散点は当てはめ（フィッティング）により得られた。
【００６６】
半径ａ＝０．７３±０．０１μｍに対する当てはめ（フィッティング）値（図８Ａ（２）を参照）は、Beckman Z2 Coulter Counterを使って得られた下限０．６９±０．０７μｍと、遠心分離による分析によって得られた上限０．７６±０．０８μｍとを反映した、サンプルの指定された範囲内に入る。提示された粒子サイズと測定された粒子サイズとの一致は、本測定法の正確さが本測定法の精度に匹敵することを意味する。その場合、精度および正確さは共にＩ（ρ）の分析によって以前に得られた結果を上回る。屈折率ｎｐ＝１．５５±０．０３に対する軌跡平均値も、バルク分散（bulk dispersion）に基づく光散乱測定量から推論されたポリスチレンコロイドの特性と整合している。
【００６７】
光学トラップ中のコロイド粒子の動力学を分析することにより、単一粒子の屈折率を測定する際に同等の精度が達成できた。しかし、
【数２５】
2011502256.tif 000028
より大きな比屈折率をもつ粒子を捕捉することが難しいため、この方法は比較的小さな屈折率をもつ粒子のみに適用できる。対照的に、ホログラフィック特徴付けは、広範囲にわたる時系列ではなく、単一のホログラフィックスナップショットのみを必要とし、光学トラッピングを必要としないため、トラップの別個のキャリブレーションを必要とすることがなく、より広範囲の粒子サイズおよび屈折率にわたって効果的である。
【００６８】
図８Ｂ（１）から図８Ｂ（３）における付加的なデータは、焦点面の上方ｚｐ＝７μｍにおいて直径１．４５μｍのＴｉＯ２球に対して得られたものである。このサンプルはチタンテトラエトキシドから合成され、その密度を高めるため熱処理されている。このような高屈折率の粒子による強い前方散乱は、媒体がカバースリップと屈折率に関して整合しない限り、イメージングアーティファクトが生じる。液浸油（ｎｍ＝１．５１５）の中で粒子を分散させるとこれらのアーティファクトは除去できるが、使用されたレンズに球面収差を取り込み、信頼性の高い結果を得るためにこの球面収差を補正しなければならない。フィッティングした直径１．４５±０．０３ｎｍおよび屈折率２．０１±０．０５は、電子顕微鏡法およびバルク光散乱法によってそれぞれ得られた結果と整合する。他の単一粒子特徴付け方法はこのような高屈折率の場合には機能しないため、この結果は注目に値する。
【００６９】
図８Ｃ（１）から図８Ｃ（３）におけるデータは、焦点面の上方ｚｐ＝３８．８μｍにおいて水中に分散した公称５μｍシリカ球（Bangs Labs, Lot SS05N/4364）に対する結果を示している。フィッティングした屈折率ｎｐ＝１．４３４±０．００１は、多孔質シリカに対して適切であり、直径ａ＝４．１５±０．０１μｍは、Beckman Z2 Coulter Counterを用いてこのサンプルに対して得られた値４．８２±０．５９μｍと一致する。直径が１００ｎｍ程度の小さなコロイド球および１０μｍ程度の大きまコロイド球へのホログラフィック特徴付けの適用に成功した。モデルベースの分析方法とは異なり、正確なローレンツ・ミー散乱理論へのフィッティングは、ｆｓ（ｒ）を計算する際に数値安定性を保つことに注意すれば、はるかに広い範囲の粒子サイズに対してロバスト性があり、信頼性がある。
【００７０】
同じフィッティングにより、面内精度１ｎｍと光学軸に沿った１０ｎｍの精度とにより粒子位置を判定する。同等のナノメートルスケールの追跡解決法が従来の照明を使って得られるが、粒子毎に詳細なキャリブレーションを必要とする。ホログラフィックイメージング法の別の利点は、従来の顕微鏡法と比べて焦点深度が非常に深いことである。従来の照明を使用した有用な焦点深度±３μｍとは対照的に、本実施例のシステムは、１００μｍを超える範囲にわたって有用なデータを提供する。
【００７１】
ホログラフィックビデオ顕微鏡法は、図９Ａ（１）から図９Ｂ（２）におけるデータが水中に分散したコロイドシリカ球（Bangs Labs, Lot SS04N/5252）に対して実証しているように、３次元粒子追跡法に役立つ。この粒子は光学ピンセットを使って焦点面より上方３０μｍに持ち上げられ、次に、解放され、堆積するまで放置した。図９Ａ（１）および図９Ｂ（１）の画像は、粒子の軌跡の始まり付近の粒子および軌跡の終わり付近の粒子を示している。式（１８）へのフィッティングは、図９Ａ（２）および図９Ｂ（２）に示している。
【００７２】
粒子の下降中の１５秒の間に１／３０秒間隔で測定した粒子の軌跡を、図１０に示している。軌跡の垂直位置ｚ（ｔ）を示した図１１は、均一な沈殿速度ｖ＝１．０２１±０．００５μｍ／ｓの周りの変動を示している。これは、ρｐ＝ρｍ＋９ｎｖ／（２ａ２ｇ）によって粒子の密度の推定値を与える。ただし、ρｍ＝０．９９７ｇ／ｃｍ３は水の密度であり、η＝０．０１０５ＰはＴ＝２１℃での水の粘度であり、ｇ＝９．８ｍ／ｓ２は重力加速度である。粒子の半径に対するフィッティング値は、ａ＝０．７２９±０．０１２μｍにおいて粒子が静置されるときに一定に保たれる。この値は、Beckman Z2 Coulter Counterを使って測定した製造業者の指定半径０．７６±０．０４μｍと整合する。したがって、サンプルに関する製造業者の定格より数パーセント小さなρｐ＝１．９２±０．０２ｇ／ｃｍ３が得られる。しかし、屈折率ｎｐ＝１．４３０±０．００７のフィッティング値は、同様に、定格値より１．５％低く、粒子が実際には仕様より密度が小さいことを意味する。
【００７３】
粒子の位置の成分の平均二乗変位、すなわち、
【数２６】
2011502256.tif 000029
は、付加的な整合性チェックを与える。図１２におけるデータが示しているように、軌跡の個々の直交座標成分のゆらぎ（fluctuation）は互いに一致しており、３つすべてがアインシュタイン・スモルコフスキーの線形スケーリングΔｒｊ２（ｒ）＝２Ｄτを表している。ただし、拡散係数Ｄ＝０．３３±０．０３μｍ２／ｓである。これは、予想されたストークス・アインシュタインの値Ｄ０＝ｋＢＴ／（６πηａ）＝０．３０±０．０３μｍ２／ｓと整合している。ただし、ｋＢはボルツマン定数である。Δｒｊ２（ｔ）への直線フィッティングから得られたオフセットも、軌跡全体を通じて面内位置に関して１ｎｍ程度の精度で整合しており、軸方向位置に関して１０ｎｍ程度の精度で整合している。粒子特性の光学的特徴付けは、このように粒子について測定された動力学と整合している。
【００７４】
ビデオホログラフィック顕微鏡法によって可能となったプローブ粒子の３次元の軌跡の精密な測定は、当然ながら、粒子イメージングマイクロレオロジーにおける用途に役立つ。特に、この技術をバイオフィルムに適用することは、治療薬の候補または改善薬の候補の高スループット組み合わせスクリーニングの見込みを示している。治療薬または改善薬の生物学的影響または生化学的影響を評価するというよりはむしろ、ホログラフィック顕微鏡法は、バイオフィルムの物理的特性へのこれらの治療薬または改善薬の影響の直接的な洞察を提供する。歯のバイオフィルムの場合、モデル多糖体ゲルの利用可能性は、治療薬の標準的なアッセイの開発を著しく単純化する。マイクロレオロジカル測定法はマイクロメートルスケールのサンプルしか必要としないため、各アッセイが僅かに数分のホログラフィック記録しか必要としない独立したアッセイの非常に大型のアレイが、センチメートルスケールのシステムにおいて可能となるはずである。
【００７５】
上述の技術は、屈折率が大きな虚数成分をもつ粒子および媒体に容易に拡張できる。コア・シェル粒子、円筒状ナノワイヤのようなより複雑な形状をもつ粒子への拡張も同様に実現できる。
【００７６】
インラインホログラフィック顕微鏡による単一のスナップショットが、ナノメートルスケールの分解能でコロイド球の位置およびサイズを測定し、典型的には１パーセントを上回る精度でコロイド球の屈折率を測定するために使用できることを実証した。
【００７７】
したがって、このような画像のビデオストリームは、柔らかい物体および生物学的システムのための強力な６次元顕微鏡法を構成する。ホログラフィック粒子追跡は、３次元マイクロレオロジーと、コロイド相互作用の測定と、生物物理学のためのフォースプローブとに対して理想的である。上述の方法は、高度な並列測定のために、視野の中の多数の粒子を同時に追跡することに適用できる。リアルタイム単一粒子特徴付け、および、大きな粒子アンサンブルの追跡は、光装置のホログラフィックアセンブリのような用途においてとても有益である。上述の方法は、生物学的細胞およびコロイド状ヘテロ構造体といったより高度に構造化されたサンプルに適用すると、血球分析法またはコンビナトリアル合成法のための基礎として使用できる。
【００７８】
そのうえ、多重波長ホログラフィック特徴付けの概念は、屈折率の波長依存性のような分光情報を得るために適用できる。分光情報は、ミルク中の栄養素濃度を定量化するため、そして、関連したシステムにとって役立つ。分光情報は、純粋生成物から混合物を区別する際に役立つ。多重波長特徴付けは、キャリブレーション不要の測定法の機会をさらに提供する。これは、測定された粒子のサイズがレーザ波長と無関係であるはずであるという考え方である。サンプルを照明するために使用したレーザの波長が既知である場合には、全体的な長さスケールキャリブレーションは、粒子の見かけの半径がすべての波長で同じであるはずであるという条件から得られる。
【００７９】
好ましい実施形態が図示され説明されているが、変更および変形が、本発明のより広い態様において本発明から逸脱することなく当業者によって実施形態の中で行われ得ることが理解されるべきである。本発明の様々な特徴は特許請求の範囲に記載されている。
【図１Ａ】
2011502256.tif 000030
【図１Ｂ−１Ｄ】
2011502256.tif 000031
【図２Ａ】
2011502256.tif 000032
【図２Ｂ】
2011502256.tif 000033
【図３Ａ】
2011502256.tif 000034
【図３Ｂ】
2011502256.tif 000035
【図４Ａ】
2011502256.tif 000036
【図４Ｂ】
2011502256.tif 000037
【図４Ｃ】
2011502256.tif 000038
【図４Ｄ】
2011502256.tif 000039
【図５Ａ】
2011502256.tif 000040
【図５Ｂ】
2011502256.tif 000041
【図５Ｃ】
2011502256.tif 000042
【図５Ｄ】
2011502256.tif 000043
【図６Ａ】
2011502256.tif 000044
【図６Ｂ．６Ｃ】
2011502256.tif 000045
【図７Ａ】
2011502256.tif 000046
【図７Ｂ．７Ｃ】
2011502256.tif 000047
【図８Ａ（１）】
2011502256.tif 000048
【図８Ａ（２）】
2011502256.tif 000049
【図８Ａ（３）】
2011502256.tif 000050
【図８Ｂ（１）】
2011502256.tif 000051
【図８Ｂ（２）】
2011502256.tif 000052
【図８Ｂ（３）】
2011502256.tif 000053
【図８Ｃ（１）】
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【図８Ｃ（２）】
2011502256.tif 000055
【図８Ｃ（３）】
2011502256.tif 000056
【図９Ａ（１）】
2011502256.tif 000057
【図９Ａ（２）】
2011502256.tif 000058
【図９Ｂ（１）】
2011502256.tif 000059
【図９Ｂ（２）】
2011502256.tif 000060
【図１０】
2011502256.tif 000061
【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年6月29日(2010.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホログラフィック顕微鏡を提供するステップと、
コリメートされたレーザビームを前記ホログラフィック顕微鏡に提供するステップと、
コリメートされたレーザビームをある試料から散乱させて、散乱した部分を生成するステップと、
コリメートされたレーザビームのうちの散乱していない部分と前記散乱した部分とから干渉パターンを発生させるステップと、
後の分析のために前記干渉パターンを記録するステップと、
前記試料の空間的位置と、力学的特性と、光学的特性と、化学的特性とのうちの少なくとも一つを測定するステップと
を含む、試料を光学的に特徴付ける方法。
【請求項２】
前記干渉パターンを記録するステップが、前記試料の少なくとも一つのサイズと前記試料の複素屈折率とに関する情報を得るステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ある散乱関数を適用して、前記記録された干渉パターンを分析するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記散乱関数がローレンツ・ミー関数を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ホログラフィック顕微鏡が焦点面を有しており、
前記測定するステップが前記焦点面に対する前記試料の軸方向変位を特定するステップを含み、
前記試料が媒体内の粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記軸方向変位を特定するステップが、少なくとも１回のキャリブレーションを必要としないか、または前記ホログラフィック顕微鏡の焦点深度の制限を受けない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記測定するステップが、１回の単一タイムスナップショットにおいて、前記試料内の粒子の位置を特定し、当該粒子の特性を特徴付けることにより、当該粒子についてのデータを生成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記測定するステップが、複数回にわたるタイムスナップショットにおいて、前記試料内の粒子の軌跡を特定し、当該軌跡に沿って特性を特徴付けることにより、当該粒子についてのデータを生成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記粒子と表面との間の相互作用と、少なくとも２つの前記粒子の相互作用と、前記試料の流体の速度場と、前記試料の媒体の粘弾性特性とのうちの少なくとも一つを分析するステップをさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記粒子についてのデータが、当該粒子と表面との間の相互作用と、少なくとも２つの当該粒子の相互作用と、前記試料の流体の速度場と、前記試料の媒体の粘弾性特性とのうちの少なくとも一つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が粒子のコロイド懸濁液を保持する媒体を含み、
前記測定するステップが、前記媒体と前記懸濁液内の粒子の相互作用とのうちの少なくとも一方を分析するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記力学的特性を測定するステップが粒子の形状を測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定するステップが、
前記試料の流れている流体におけるストリームラインを測定するステップと、
凝結および凝集に対する前記試料のコロイド分散体の熱力学的安定性を評価するステップと、
前記試料のコロイド粒子間の相互作用を測定するステップと、
前記コロイド粒子と前記試料の表面との相互作用を測定するステップと、
前記試料の外部場および外力に対する粒子の反応を評価するステップと、
前記試料における前記粒子の粘性抵抗を特徴付けるステップと、
前記試料を含んだ媒体の粘弾性特性およびレオロジカル特性のプローブとして前記粒子の運動を用いるステップと
のうちの少なくとも一つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記測定するステップが、前記試料のサイズと前記試料の空間的位置とを同時に測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記測定するステップが、レオロジカル特性の多点アッセイを実行するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記測定するステップが、前記試料の特性をその場測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が複数の粒子を含み、
前記測定するステップが前記粒子の各々に対して個別に測定を実行するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記干渉パターンがビデオカメラによって全時間にわたって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記測定するステップが、プローブ粒子の特性を分析するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記測定するステップが、プローブ粒子の特性を分析して、前記試料の特性の熱駆動ゆらぎを評価することにより、前記試料を含む媒体の粘弾性特性を決定するステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記測定するステップが、平均二乗ゆらぎΔｒ２（ｔ）を決定することにより、前記プローブ粒子を含んだ媒体の特徴付けを行うステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記媒体の特徴付けを行うステップが、前記媒体のレオロジカル特性を決定するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記光学的特性を測定するステップが、温度と、化学的組成と、化学的濃度とのうちの少なくとも一つの関数として測定された、前記試料を含む粒子の屈折率及び半径の少なくとも一方を決定することにより、前記試料の安定性と、前記試料の化学的変化と、前記試料の選択可能な物質の族についての様々な化学状態とのうちの少なくとも一つを特徴付けるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記コリメートされたレーザビームが、前記試料に関する分光情報を得るために異なる複数の光波長を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記干渉パターンが正規化されて、正規化された干渉パターンが光散乱の特定の予測方法に選択的にフィッティングされて、それにより、前記試料の特徴に関する情報を提供する請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
空間的位置を測定するスコープが、媒体内の粒子を動的に追跡し、それにより、当該粒子の特性を特徴付けるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記特性を決定するステップが、前記粒子の流体力学的半径と、半径と、屈折率とを分析するステップを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
コヒーレント・レーザビームを供給するレーザビーム源と、
前記レーザビーム源から下流に配置されており、前記レーザビームを受ける試料台と、
前記試料台から下流に配置された対物レンズと、
前記対物レンズから下流に配置されており、試料データを収集するビデオ接眼レンズおよびイメージングシステムと
を備えたホログラフィック顕微鏡。
【請求項２９】
コンピュータ・ソフトウェア・モジュールに組み込まれたコンピュータソフトウェアを実行するコンピュータをさらに備えた請求項２８に記載のホログラフィック顕微鏡。
【請求項３０】
前記コンピュータソフトウェアが干渉パターンを分析する方法を実行し、それにより、試料の特徴付けを行うものである、請求項２９に記載のホログラフィック顕微鏡。
【請求項３１】
前記方法がローレンツ・ミーの利用を含む、請求項３０に記載のホログラフィック顕微鏡。
【請求項３２】
試料の品質を制御するために試料のデータに対応する制御システムをさらに備えた請求項２８に記載のホログラフィック顕微鏡。
【請求項３３】
コンピュータ・ソフトウェア・モジュールが試料の特徴を示すデータを処理する一連の命令を有するコンピュータソフトウェアを含むものであり、
前記試料の特徴を示すデータが、前記試料から散乱したレーザビームと前記レーザビームのうちの散乱していない部分との相互作用から生じる干渉パターンに関係しており、
前記一連の命令が、実行時に前記試料の特性を記述する収束解を与えて、それにより、前記試料の力学的特性と、光学的特性と、化学的特性とのうちの少なくとも一つの特徴付けを行う散乱関数をさらに含むものである、試料を特徴付けるために情報を処理するコンピュータ読み取り可能な媒体。
【国際調査報告】
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