(57)【要約】  本発明は、第１の細胞の少なくとも１つの透過処理された核、または前記核を含む少なくとも１つの透過処理された第１の細胞と；多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の抽出物［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］と；を含む組成物の、多能性幹細胞または前記多能性幹細胞に由来する組織を得るための方法または人間のクローニングを目的としていないことを条件として、クローニングする方法を実施するための使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
・  第１の細胞の少なくとも１つの透過処理された核、または前記核を含む少なくとも１つの透過処理された第１の細胞［なお前記第１の細胞は、多細胞生物に由来する人工多能性幹細胞、すなわちｉＰＳ細胞である］と；
・  多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の単離された抽出物［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］と；
を含む組成物の、
−  多能性幹細胞または前記多能性幹細胞に由来する組織を得るための方法、または
−  前記プロセスが人間のクローニングを目的としていないことを条件とする、クローニングする方法、
を実施するための使用。
【請求項２】
前記雌生殖細胞の単離抽出物が、非ヒト雌生殖細胞の単離抽出物であるか、または前記卵子の単離抽出物が非ヒト卵子の単離抽出物である、請求項１に記載の組成物の使用。
【請求項３】
・  第１の細胞の少なくとも１つの透過処理された核、または前記核を含む少なくとも１つの透過処理された第１の細胞［なお、前記第１の細胞は多細胞生物に由来し、前記第１の細胞は人工多能性幹細胞すなわちｉＰＳ細胞であり、前記ｉＰＳは、少なくとも
−  Ｏｃｔファミリー成員タンパク質およびＳｏｘファミリー成員タンパク質、ならびに
−  Ｋｌｆファミリー成員タンパク質およびＭｙｃファミリー成員タンパク質か、
−  あるいはＮａｎｏｇ成員タンパク質およびＬＩＮ２８成員のいずれか、
をコードする遺伝子の組合せを発現する］と；
・  多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の単離抽出物［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］と；
を含む組成物。
【請求項４】
前記雌生殖細胞が、好ましくは哺乳動物、詳細にはヒト、鳥類、爬虫類および両生類の中から選択される脊椎動物の雌生殖細胞である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記雌生殖細胞の単離抽出物が非ヒト雌生殖細胞の単離抽出物であるか、または前記卵子の単離抽出物が非ヒト卵子の単離抽出物である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記雌生殖細胞がアフリカツメガエル細胞である、請求項３〜５に記載の組成物。
【請求項７】
人間をクローニングするためのプロセスでないことを条件として、第１の細胞の少なくとも１つの透過処理された核または前記核を含む少なくとも１つの透過処理された第１の細胞［なお、前記第１の細胞は多細胞生物に由来し、前記第１の細胞は、人工多能性幹細胞すなわちｉＰＳ細胞である］と、多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の単離抽出物［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］とを接触させるステップを含む、多能性幹細胞の生産方法。
【請求項８】
−・  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質の第１の組合せか、
・  あるいはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質の第２の組合せのいずれか、
を少なくともコードする遺伝子で分化した体細胞をトランスフェクトして、ｉＰＳ細胞である第１の細胞を得る第１のステップと；
−  先行するステップで得た前記第１の細胞を透過処理して、透過処理されたｉＰＳ細胞を得る第２のステップと；
−  多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の単離抽出物と前記透過処理されたｉＰＳ細胞とを接触させる第３のステップ［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断され、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］と；
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記雌生殖細胞が、好ましくは哺乳動物、詳細にはヒト、鳥類、爬虫類および両生類の中から選択される脊椎動物の雌生殖細胞であり、好ましくは前記生殖細胞がアフリカツメガエル細胞である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記雌生殖細胞の単離抽出物が非ヒト雌生殖細胞の単離抽出物であるか、または前記卵子の単離抽出物が非ヒト卵子の単離抽出物である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
・  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質の第１の組合せか、
・  あるいはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質の第２の組合せのいずれか、
を少なくともコードする遺伝子で分化した体細胞をトランスフェクトする第１のステップにおいて、第１の組合せまたは第２の組合せがそれぞれ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質あるいはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質をコードする核酸を少なくとも含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質をコードする前記少なくとも１つの核酸が、少なくとも１つのウイルスベクター、好ましくは少なくとも１つのレトロウイルスベクター、詳細には少なくとも１つの組込み型レトロウイルスベクターの中に含まれている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの組込み型レトロウイルスベクターが、前記分化体細胞のゲノム内に組込まれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記多能性幹細胞の多能性の維持を可能にする培地内で先行ステップにおいて得られた細胞を培養するステップをさらに含む、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
人間をクローニングするためのプロセスではないことを条件として、
−  請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法において定義されている多能性幹細胞の生産ステップと；
−  前記多能性幹細胞が由来する種と同じ種の動物の除核卵子内に前記多能性幹細胞の核を移植して、アロ有核卵子を得るステップと；
を含む、動物、好ましくは哺乳動物をクローニングするための方法。
【請求項１６】
所望の分化段階で、多細胞生物、詳細には脊椎動物の細胞、細胞株または組織を得るための方法において、
−  請求項７−１２のいずれか一項に記載の方法において定義されている多能性幹細胞の生産ステップと；
−  所望の分化段階で細胞、細胞株または組織を得るための適切な条件下で、多能性幹細胞を培養するステップと；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞を得るための、詳細には、分化細胞を再プログラミングするための細胞抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
核移植は、分化した組織から多能性細胞の新たな供給源を得、クローン動物を生産するために使用できる強力な方法である。分化した両生類または哺乳動物の細胞からの核を除核卵子内に移植することによって完全な動物を発生させ得る胞胚または胚盤胞の胚を得ることができ、あるいはこれを用いて広い範囲の組織および細胞型を形成することができる［Ｇｕｒｄｏｎら、（２００３）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００  Ｓｕｐｐｌ  １、１１８１９−１１８２２］。多くの疾患のための細胞に基づく療法にとってかなり有望である多能性細胞供給物を送出する潜在的能力のため、核移植は、正常な成体組織から天然の幹細胞を直接単離するという困難な実践に対する魅力的な代替案となっている［ＭｃＫａｙ，Ｒ．（２０００）、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ−−ｈｙｐｅ  ａｎｄ  ｈｏｐｅ、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６、３６１−３６４］。
【０００３】
近年、異なる再プログラミング戦略を結び合わせてそれらの効率の相乗作用が得られることが示唆されてきた［Ｇｕｒｄｏｎ  ＪおよびＭｕｒｄｏｃｈ  Ａ（２００８）、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２：１３５−１３８］。細胞抽出物を使用して体細胞を再プログラミングすることによる試みがいくつかなされてきたが、それらは、ＮＴ（核移植）によって得られる効果の範囲を再現できていない。
【０００４】
ＮＴ実験においては、再プログラミングを誘発するのは、受入卵母細胞の細胞質に対する移植された核の曝露である。卵子は分化全能性にとって不可欠な発生上のおよび後成的な因子の全てを天然に含むことから、核移植によって得られる胚幹細胞は、天然の胚幹細胞により近いものである。しかしながら、これは、哺乳動物の卵母細胞を大量に得ることが困難であることに起因して、インビトロで模倣するのがむずかしい。
【０００５】
しかしながら、その多くの利点にも関わらず、核移植は、初期発生の事象のために分化した成体の核を完全に再プログラミングすることに関与する問題点のため、非効率的である場合が多い。実際、卵子が有する成体ドナー細胞の後成的マークをリセットする能力が、核クローニングの効率にとっての決定要因であることは公知である。したがって、新たに発生を開始できる前にリセットされなければならない分化細胞核の特異的後成的特性を識別すること、そしてこのようなリセット作業をいかに効率良く達成できるかが、主要な生物学的および医学的意義のある課題となっている。
【０００６】
第１世代
核移植の効率を増強できるさまざまな方法が識別されてきた。
【０００７】
例えば両生類においては、クローニング効率は、連続核移植によって実質的に改善される。これは、分化ドナー細胞から除核卵子へと核を移植して、細胞が複数の分裂を起こすことができるようにするステップと、次に第２の核移植実験のためのドナーとして娘核を使用するステップからなる［Ｇｕｒｄｏｎ，Ｊ．Ｂ．（１９６２）、Ｊ  Ｅｍｂｒｙｏｌ  Ｅｘｐ  Ｍｏｒｐｈｏｌ  １０、６２２−６４０］。卵子に代わる成熟卵母細胞内への核の注入［ＤｉＢｅｒａｒｄｉｎｏ，Ｍ．Ａ．、およびＨｏｆｆｎｅｒ，Ｎ．Ｊ．（１９８３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１９、８６２−８６４］は、成熟卵母細胞の構成要素により、注入された核が活性化された卵子内のＤＮＡ合成誘発因子に対し応答できるようになるかもしれないという仮説を導いた［Ｌｅｏｎａｒｄら、（１９８２）、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ９２、３４３−３５５］。クローニング実験の効率の低さに寄与すると考えられる１つの要因は、分化した成体核の染色体構成のＤＮＡ複製に対する適応性が低いのかもしれないということにある。
【０００８】
動物クローニングは、動物の種の保存、クローン動物によるタンパク質、例えば治療用タンパク質の生産から、詳細には自己移植に有用である幹細胞を得るための治療用クローニングに至るまで、さまざまな分野における重要な課題である。
【０００９】
しかしながら、現在のクローニング技術の効率は、大規模利用分野を企図するために改善される必要がある。
【００１０】
先行技術の欠陥は、部分的にしか解決されていない。
【００１１】
国際公開第２００７／０３９２５８号は、細胞を再プログラミングまたはクローニングするためのプロセスを実施する目的で、染色体を再構成するための細胞抽出物の使用について開示している。この出願の目的は、本質的に、染色体を再プログラミングすることにある。したがって、この出願書は、分化細胞の完全な脱分化に関する問題を部分的にしか解決しない。
【００１２】
したがって、ＮＴ技術を改善する必要があった。
【００１３】
第２世代
より近年では、クローニング効率および分化細胞の再プログラミング方法の効率を増強するために、他のアプローチが行われてきた。
【００１４】
例えば、欧州特許出願第１９７０４４６号明細書は、４つの転写因子、すなわちＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ（ＯＫＳＭ）の異所性発現による体細胞内での多能性の誘発について開示している。この出願書は、以上の４つの因子が、胚幹（ＥＳ）細胞に極めて類似する人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を提供し得ることを立証している。
【００１５】
とりわけ、マウスのｉＰＳ細胞は、奇形腫を形成し、キメラを発生させ、生殖細胞系列に寄与するその能力が実証しているように、完全な発生能を有する。しかしながら、ｉＰＳ細胞の生産および核移植（ＮＴ）の両方の効率は、低いままであり、得られる再プログラミングされた細胞の大部分は、部分的にしか再プログラミングされないように思われる。
【００１６】
したがって、これらを改善するためにさらなる要因が必要とされるかもしれず［Ｆｅｎｇ  Ｂら（２００９）、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：３０１−３１２；Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄら（２００８）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：７９５−７９７］、過去何年にもわたりこれらの手順を最適化するために多くの努力がなされてきた。
【００１７】
最近の精査［Ｌａｉら、（２０１１）、Ｊ．Ａｓｓｉｓｔ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｇｅｎｅｔ、Ｍａｒｃｈ  ９，２０１１］では、最初の開示（欧州特許第１９７０４４６号明細書を参照のこと）以降のｉＰＳ技術の改良が要約されており、今日までのところ、特に効率に関して、多くの課題を克服する必要があるという結論が下されている。
【００１８】
したがって、当該技術分野において開示された方法の欠陥を回避するために、ｉＰＳ技術の改善を提供する必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、このような欠陥を克服することにある。
【００２０】
本発明の１つの特定の目的は、分化細胞の脱分化の効率を増大させる新しい方法を提供することにある。
【００２１】
本発明の別の目的は、前記方法を実施する組成物を提供することにある。
【００２２】
本発明の別の目的は、同様に、多細胞生物の多能性または分化全能性幹細胞を得るための方法を提供することにもある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、
・  第１の細胞の少なくとも１つの透過処理された核、または前記核を含む少なくとも１つの透過処理された第１の細胞［なお前記第１の細胞は、多細胞生物に由来する人工多能性幹細胞、すなわちｉＰＳ細胞である］と；
・  多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の単離された抽出物［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］と；
を含む組成物の、
−  多能性幹細胞または前記多能性幹細胞に由来する組織を得るための方法、または
−  詳細には前記プロセスが人間のクローニングを目的としていないことを条件とする、クローニングする方法、
を実施するための使用に関する。
【００２４】
本発明は、多細胞細胞の卵子の細胞抽出物と分化細胞の脱分化を可能にする遺伝子の組合せが相乗的に作用して細胞の再プログラミングすなわち分化細胞の細胞脱分化を著しく増強し、ひいては先行技術の技法によって得られる核移植およびクローニング、すなわちｉＰＳおよび核抽出物を増強するという発明者らがなした予想外の観察事実に基づくものである。
【００２５】
「生殖細胞」という表現は、配偶子を形成する可能性のある細胞を意味する。
【００２６】
「雌生殖細胞」という表現は、「卵子」とも呼ばれ、卵形成の任意の段階における細胞、詳細には始原生殖細胞、卵原細胞および卵母細胞に関するものである。
【００２７】
生殖細胞抽出物は、第２減数分裂の中期段階で停止させられた卵子から作られる。
【００２８】
「雌生殖細胞または卵子の抽出物」は、Ｍｅｎｕｔら［Ｍｅｎｕｔら、（１９９９）、「Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅＭｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｏｏｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｓ」、ｅｄ  Ｒｉｃｈｔｅｒ  ＪＤ（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ｐｐ１９６−２２６、２００１］中に記載されているプロセスを実施することによって得られる細胞抽出物（ＣＳＦ抽出物と呼ばれる）である。
【００２９】
上述の抽出物は、「単離されている」、すなわち前記抽出物はインビトロで得られる。この抽出物はこうして、細胞または細胞の一部分、例えば当該技術分野において公知であるスフェロプラストまたはリポソームとは全く異なるものである。
【００３０】
抽出物は、実施例１に開示されている通りに調製される。
【００３１】
抽出物における絶対必要条件の１つは、減数分裂の中期ＩＩに抽出物を維持することを可能にするカルシウムキレート剤であるＥＧＴＡの存在である。実際、当該技術分野において、卵子は、精子と接触した後、カルシウムが細胞内に入った時点で活性化され、中期ＩＩから退出することが周知である。
【００３２】
拡大解釈すると、電気ショック、針接触または卵子の原形質膜を修飾するあらゆる動作が、卵子内にカルシウム流出を誘発し、こうして、活性化された中期ＩＩ停止卵子となった卵子、すなわち間期卵子を「ロック解除」する。
【００３３】
本発明においては、雌生殖細胞の単離抽出物または卵子の単離抽出物が、その調製およびその使用中、中期状態に保たれることが必須である。
【００３４】
雌生殖細胞の単離抽出物または卵子の単離抽出物が中期に遮断されている、ＥＧＴＡにより誘発された脆い状態を制御することが必要である。本発明においては、中期における単離抽出物の遮断は安定した状態に維持される。すなわち、多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の抽出物を得るために使用される卵子は、減数分裂の中期ＩＩにおいて安定した形で遮断される。
【００３５】
中期における単離抽出物の遮断の安定性は、異なる方法で判定される。抽出物の中期段階は、クロマチンの構造、セリン１０上のヒストンＨ３のリン酸化反応によって検査可能である。その上、抽出物の中期安定性は、中期で遮断された抽出物が、カルシウム添加により予め活性化されている場合にのみ精子クロマチンを効率良く複製できることから、ＤＮＡ合成から追跡可能である。追跡ＤＮＡ合成の試験は、当該技術分野において周知の技術、例えば［３２Ｐ］αｄＣＴＰ取込みの測定（図１２）によって達成される。
【００３６】
以上および以下では、雌生殖細胞抽出物は、脊椎動物の有糸分裂非ヒト初期胚によって置換され得る。前記脊椎動物の有糸分裂非ヒト初期胚は、Ｌｅｍａｉｔｒｅら［Ｌｅｍａｉｔｒｅら、（２００５）、Ｃｅｌｌ  １２３：１−１５］中に記載のプロセスによって得られるかもしれない。
【００３７】
「多細胞生物（ｐｌｕｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｓｍまたはｍｕｌｔｉ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｇｎｉｓ）」という表現は、複数の細胞で構成された生物を意味している。前記多細胞（ｍｕｌｔｉ  ｃｅｌｌｕｌａｒまたはｐｌｕｒｉｃｅｌｌｕｌａｒ）生物においては、類似の細胞が通常、組成内で凝集し、異なる組織の特異的配置が器官を形成する。
【００３８】
本発明において、一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣｓと省略されている「人工多能性細胞」は、特異的遺伝子の「強制的」発現を誘発することによって非多能性細胞、典型的には成体体細胞から人工的に誘導されるタイプの多能性幹細胞を意味する。
【００３９】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、一部の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存キメラ形成、および効能および分化可能性などの多くの面において、天然の多能性幹細胞、例えば胚幹（ＥＳ）細胞と類似しているが、天然多能性幹細胞に対するそれらの関与の全容は、いまだ評価の途上にある。
【００４０】
発明者らによりなされた予想外の考察の１つは、非相同抽出物がｉＰＳ誘発遺伝子と相乗作用を示して分化細胞を脱分化し得るということである。換言すると、アフリカツメガエル抽出物は、ｉＰＳ誘発遺伝子と共に、アフリカツメガエルと異なる多細胞生物に由来する分化細胞を脱分化するように作用することができる。
【００４１】
以上を準用して、マウスの卵子抽出物は、ｉＰＳ誘発遺伝子と相乗作用を示して、例えばアフリカツメガエル分化細胞を脱分化することができると考えられる。
【００４２】
全ての組合せが可能であり、当業者であれば、過度の負担なく、本発明に係る方法を実施するのに自らにとってより容易である抽出物を、容易に選択できるものと考えられる。
【００４３】
幹細胞は、分裂能力を保ち他の細胞型へと分化できる原始未分化細胞である。分化全能性幹細胞は、胚細胞型および胚体外細胞型へと分化できる。多能性幹細胞は分化全能性細胞に由来し、３つの胚葉、すなわち中胚葉、外胚葉および内胚葉の誘導体である後代を発生させることができる。
【００４４】
体細胞は、卵母細胞および精子以外の任意の細胞である。
【００４５】
「分化体細胞」は、特定の機能を専門とし、他の種類の細胞を発生させる能力またはより低い分化状態に戻る能力を維持しない体細胞である。
【００４６】
分化体細胞は、詳細には生物のあらゆる種類の組織、例えば皮膚、腸、肝臓、血液、筋肉などに由来してよい。
【００４７】
細胞内への雌生殖細胞抽出物の進入を改善するため、細胞膜は透過処理される。細胞膜の透過処理は、当該技術分野において周知の技術、例えば化学的作用物質または穏やかな洗浄剤、例えばジギトニン、Ｎｏｎｉｄｅｔ（商標）Ｐ４０（４−ノニルフェニル−ポリエチレングリコール；ＮＰ４０）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００（４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル−ポリエチレングリコール、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル）、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｎ１０１（ポリオキシエチレン分岐ノニルシクロヘキシルエーテル）、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６（ポリオキシエチレン１０オレオイルエーテル）、または細胞膜内に小孔を作ることのできる酸素、例えばリゾレシチンの使用によって、あるいは例えばピペット操作など、細胞膜を少なくとも部分的に開放できる機械的プロセスを介して、達成される。
【００４８】
好ましくは、第１の細胞の核または前記核を含む第１の細胞が、軽く透過処理される。
【００４９】
「軽い透過処理」は、例えば、低濃度の洗浄剤、例えばＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００、ＤＯＣ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｎ１０１、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６、リゾレシチン、ジギトニンを使用することによって得られる。
【００５０】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記ｉＰＳ細胞が、Ｋｌｆファミリー成員タンパク質、Ｍｙｃファミリー成員タンパク質、Ｎａｎｏｇ成員タンパク質およびＬＩＮ２８成員の中から選択された少なくとも１つの他の因子と共に、少なくともＯｃｔファミリー成員タンパク質およびＳｏｘファミリー成員タンパク質を分化体細胞内で発現させることを可能にすることによって得られる、以上で定義した使用に関する。
【００５１】
１つの有利な実施形態においては、本発明は、前記ｉＰＳ細胞が、Ｋｌｆファミリー成員タンパク質、Ｍｙｃファミリー成員タンパク質、Ｎａｎｏｇ成員タンパク質およびＬＩＮ２８成員の中から選択された少なくとも１つの他の因子と共に、少なくともＯｃｔファミリー成員タンパク質およびＳｏｘファミリー成員タンパク質をコードする遺伝子を用いて分化体細胞をトランスフェクトすることによって得られる、以上で定義した使用に関する。
【００５２】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記ｉＰＳ細胞が、
−  Ｋｌｆファミリー成員タンパク質およびＭｙｃファミリー成員タンパク質、
−  またはＮａｎｏｇ成員タンパク質およびＬＩＮ２８成員のいずれか、
と共に、少なくともＯｃｔファミリー成員タンパク質およびＳｏｘファミリー成員タンパク質を分化体細胞内で発現させることを可能にすることによって得られる、以上で定義した使用に関する。
【００５３】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記ｉＰＳ細胞が、
−  Ｋｌｆファミリー成員タンパク質およびＭｙｃファミリー成員タンパク質、
−  またはＮａｎｏｇ成員タンパク質およびＬＩＮ２８成員のいずれか、
と共に、
少なくともＯｃｔファミリー成員タンパク質およびＳｏｘファミリー成員タンパク質をコードする遺伝子を用いて分化体細胞をトランスフェクトすることによって得られる、以上で定義した使用に関する。
【００５４】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、前記Ｏｃｔファミリー成員タンパク質がＯｃｔ３かＯｃｔ４タンパク質のいずれかである、以上で定義した使用に関する。
【００５５】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、前記Ｓｏｘファミリー成員タンパク質がＳｏｘ２タンパク質である、以上で定義した使用に関する。
【００５６】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、前記ｉＰＳ細胞が、Ｋｌｆファミリー成員タンパク質、Ｍｙｃファミリー成員タンパク質、Ｎａｎｏｇ成員タンパク質およびＬＩＮ２８ファミリー成員タンパク質の中から選択された少なくとも１つの他の因子と共に、少なくともＯｃｔ４タンパク質およびＳｏｘ２タンパク質を分化体細胞内で発現させることを可能にすることによって得られる、以上で定義した使用に関する。
【００５７】
１つの有利な実施形態においては、本発明は、前記ｉＰＳ細胞が、Ｋｌｆファミリー成員タンパク質、Ｍｙｃファミリー成員タンパク質、Ｎａｎｏｇ成員タンパク質およびＬＩＮ２８ファミリー成員タンパク質の中から選択された少なくとも１つの他の因子と共に、少なくともＯｃｔ４タンパク質およびＳｏｘ２タンパク質をコードする遺伝子を用いて分化体細胞をトランスフェクトすることによって得られる、以上で定義した使用に関する。
【００５８】
発明者らは、以上で言及した抽出物と組合せた形での、
−  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＫｌｆファミリー成員タンパク質、
−  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＭｙｃファミリー成員タンパク質
−  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇ成員タンパク質、および
−  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＬＩＮ２８ファミリー成員タンパク質、
という遺伝子の最小限の組合せが、遺伝子のみあるいは抽出物のみの場合に比べて核移植およびクローニングを増強できることを実証した。
【００５９】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、前記Ｋｌｆファミリー成員タンパク質がＫｌｆ４タンパク質である、以上で定義した使用に関する。
【００６０】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、前記Ｍｙｃファミリー成員タンパク質がｃ−Ｍｙｃタンパク質である、以上で定義した使用に関する。
【００６１】
さらに別の有利な実施形態において、本発明は、前記ｉＰＳ細胞が、
−  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質の第１の組成物、
−  またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質の第２の組成物のいずれかと、
分化体細胞とを接触させることによって得られる、以上で定義した使用に関する。
【００６２】
遺伝子の上述の組合せが、好ましい組合せである。
【００６３】
本発明は、別の有利な実施形態において、前記抽出物が実質的にいかなる細胞質膜も有していない、以上で定義した使用に関する。
【００６４】
核を抽出した卵子の断片化（超音波処理、機械的断片化など）からなる他のクローニング技術とは異なり、本発明に係る抽出物にはいかなる細胞質膜も無い。ただし、抽出物は、機能性核を再構成するために使用可能な核膜前躯体（核エンベロープ膜を含む小胞）を含む場合がある。
【００６５】
さらに別の有利な実施形態においては、本発明は、前記抽出物が、０．１ｍＭ−１０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ−６ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ−４ｍＭ、詳細には１−２ｍＭの濃度でＥＧＴＡを含む、以上で定義した使用に関する。
【００６６】
１つの実施形態において、本発明は、前記雌生殖細胞の単離抽出物または卵子の単離抽出物が非ヒト細胞である以上で定義した使用に関する。
【００６７】
本発明は同様に、
・  第１の細胞の少なくとも１つの透過処理された核、または前記核を含む少なくとも１つの透過処理された第１の細胞［なお、前記第１の細胞は多細胞生物に由来し、前記第１の細胞は人工多能性幹細胞すなわちｉＰＳ細胞である］と；
・  多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の、場合によって単離された抽出物［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］と；
を含む組成物にも関する。
【００６８】
核は、低張緩衝液中でのインキュベーションによる細胞破砕、ダウンス型ホモジナイザーまたはポッター型ホモジナイザーあるいはスクロース、グリセロールまたは類似の安定化剤を含む等張緩衝液の使用および、細胞膜を開放または分断することのできるポッター型ホモジナイザーまたはダウンス型ホモジナイザーの使用など、当該技術分野において周知の技術により、細胞から抽出され得る。
【００６９】
核は、直接使用されるか、またはその無欠性を維持する特定の条件下、例えば−２０℃、−８０℃の温度下または液体窒素中など、卵母細胞または初期胚を保管するのに使用することが公知である条件下で保管される。
【００７０】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記ｉＰＳが、少なくとも、
−  Ｏｃｔファミリー、
ー成員タンパク質およびＳｏｘファミリー成員タンパク質、および
−  Ｋｌｆファミリー成員タンパク質およびＭｙｃファミリー成員タンパク質か、
−  あるいはＮａｎｏｇ成員タンパク質およびＬＩＮ２８成員のいずれか、
と分化体細胞を接触させることによって得られる、以上で定義した組成物に関する。
【００７１】
１つの有利な実施形態において、本発明は、
・  第１の細胞の少なくとも１つの透過処理された核、または前記核を含む少なくとも１つの透過処理された第１の細胞［なお、前記第１の細胞は多細胞生物に由来し、前記第１の細胞は人工多能性幹細胞すなわちｉＰＳ細胞であり、前記ｉＰＳは、少なくとも
−  Ｏｃｔファミリー成員タンパク質およびＳｏｘファミリー成員タンパク質、ならびに
−  Ｋｌｆファミリー成員タンパク質およびＭｙｃファミリー成員タンパク質か、
−  あるいはＮａｎｏｇ成員タンパク質およびＬＩＮ２８成員のいずれか、
をコードする遺伝子の組合せを発現する］と；
・  多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の単離抽出物［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］と；
を含む、以上で定義した組成物に関する。
【００７２】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、前記Ｏｃｔファミリー成員タンパク質がＯｃｔ３またはＯｃｔ４タンパク質である、以上で定義した組成物に関する。
【００７３】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、前記Ｓｏｘファミリー成員タンパク質がＳｏｘ２タンパク質である、以上で定義した組成物に関する。
【００７４】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、前記Ｋｌｆファミリー成員タンパク質がＫｌｆ４タンパク質である、以上で定義した組成物に関する。
【００７５】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、前記Ｍｙｃファミリー成員タンパク質がｃ−Ｍｙｃタンパク質である、以上で定義した組成物に関する。
【００７６】
さらに別の有利な実施形態において、本発明は、４つのタンパク質、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質、または４つのタンパク質、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質と分化体細胞とを接触させることによって前記ｉＰＳ細胞が得られる、以上で定義した組成物に関する。
【００７７】
１つの別の有利な実施形態においては、本発明は、４つのタンパク質、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質または４つのタンパク質、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質をコードする遺伝子で分化体細胞をトランスフェクトすることによって前記ｉＰＳ細胞が得られる、以上で定義した組成物に関する。
【００７８】
前記４種のタンパク質の両方共、本発明中に定義されている抽出物と共に使用された場合のその相乗作用に関して、類似の効果を有する。
【００７９】
本発明は、別の有利な実施形態において、前記抽出物が実質的にいかなる脂質膜も有していない、以上で定義した組成物に関する。
【００８０】
さらに別の有利な実施形態において、本発明は、前記抽出物が、０．１ｍＭ−１０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ−６ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ−４ｍＭ、詳細には１−２ｍＭの濃度でＥＧＴＡを含んでいる、以上で定義した組成物に関する。
【００８１】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記雌生殖細胞が、好ましくは哺乳動物、詳細にはヒト、鳥類、爬虫類および両生類から選択される脊椎動物の雌生殖細胞である、以上で定義した組成物に関する。
【００８２】
上述の脊椎動物から卵子または雌生殖細胞を得るための技術は、当該技術分野において周知の現行の獣医学的技術である。
【００８３】
１つの別の有利な実施形態において、本発明は、前記雌生殖細胞がアフリカツメガエル細胞である、以上で定義した組成物に関する。
【００８４】
アフリカツメガエルの卵子は、Ｍｅｎｕｔら（１９９９年）で開示されている通りに得られる。
【００８５】
１つの実施形態において、本発明は、前記雌生殖細胞の単離抽出物または卵子の単離抽出物が非ヒト細胞である以上で定義した組成物に関する。
【００８６】
本発明は同様に、第１の細胞の少なくとも１つの透過処理された核または前記核を含む少なくとも１つの透過処理された第１の細胞［なお、前記第１の細胞は多細胞生物に由来し、前記第１の細胞は、人工多能性幹細胞すなわちｉＰＳ細胞である］と、多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の(単離)抽出物［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］とを接触させるステップを含む、多能性幹細胞の生産方法にも関する。
【００８７】
本発明は同様に、場合によっては人間をクローニングするためのプロセスでないことを条件として、第１の細胞の少なくとも１つの透過処理された核または前記核を含む少なくとも１つの透過処理された第１の細胞［なお、前記第１の細胞は多細胞生物に由来し、前記第１の細胞は、人工多能性幹細胞すなわちｉＰＳ細胞である］と、多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の抽出物［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］とを接触させるステップを含む、多能性幹細胞の生産方法にも関する。
【００８８】
「接触させる」という用語は、細胞、または核および雌生殖細胞が、好適な条件下で共に存在し、こうして、雌生殖細胞抽出物内に含まれた分子が前記細胞または核内へ拡散できるようにしていることを意味する。接触は、好ましくは、優先的に２０℃−２３℃の温度で、好ましくは少なくとも１０分間、より好ましくは少なくとも２０分間、より好ましくは少なくとも３０分間実施される。
【００８９】
上述の方法によると、分化細胞の透過処理された核または透過処理された分化細胞は、多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の抽出物との接触後［前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されている］、多能性幹細胞の全ての特徴を有するか、獲得するかまたは再度獲得する。
【００９０】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記ｉＰＳが、少なくとも
−  Ｏｃｔファミリー成員タンパク質およびＳｏｘファミリー成員タンパク質、および
−  Ｋｌｆファミリー成員タンパク質およびＭｙｃファミリー成員タンパク質か、
−  あるいはＮａｎｏｇファミリー成員タンパク質およびＬＩＮ２８ファミリー成員タンパク質のいずれか、
と分化体細胞を接触させることによって得られる、以上で定義した方法に関する。
【００９１】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記ｉＰＳが、少なくとも、
−  Ｏｃｔファミリー成員タンパク質およびＳｏｘファミリー成員タンパク質、および
−  Ｋｌｆファミリー成員タンパク質およびＭｙｃファミリー成員タンパク質か、
−  あるいはＮａｎｏｇファミリー成員タンパク質およびＬＩＮ２８ファミリー成員タンパク質のいずれか、
をコードする遺伝子を用いて分化体細胞をトランスフェクトすることによって得られる、以上で定義した方法に関する。
【００９２】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記Ｏｃｔファミリー成員タンパク質がＯｃｔ３またはＯｃｔ４タンパク質である、以上で定義した方法に関する。
【００９３】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記Ｓｏｘファミリー成員タンパク質がＳｏｘ２タンパク質である、以上で定義した方法に関する。
【００９４】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記Ｋｌｆファミリー成員タンパク質がＫｌｆ４タンパク質である、以上で定義した方法に関する。
【００９５】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記Ｍｙｃファミリー成員タンパク質がｃ−Ｍｙｃタンパク質である、以上で定義した方法に関する。
【００９６】
こうして、透過処理された細胞の場合、細胞が適切な培地、好ましくはＥＳ細胞の維持のために使用される培地の中で維持されるならば、前記細胞は、抽出物との接触および上述の遺伝子すなわちＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質の再発現の後、ＥＳ細胞と比べて類似の特徴を内包することになる。
【００９７】
１つの有利な実施形態において、本発明は、
・  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質の第１の組合せか、
・  あるいはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質の第２の組合せのいずれか、
を少なくともコードする遺伝子で分化した体細胞をトランスフェクトする第１のステップにおいて、第１の組合せまたは第２の組合せがそれぞれ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質をコードする核酸を少なくとも含む、以上で定義した方法に関する。
【００９８】
１つの有利な実施形態において、本発明は、
−・  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質の第１の組成物か、
・  あるいはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質の第２の組成物のいずれか、
と分化した体細胞を接触させて、ｉＰＳ細胞である第１の細胞を得るステップと；
−  先行するステップで得た前記第１の細胞を透過処理して、透過処理されたｉＰＳ細胞を得るステップと；
−  多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の(単離された)抽出物と前記透過処理されたｉＰＳとを接触させるステップ［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断され、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］と；
を含む、以上で定義した方法に関する。
【００９９】
１つの有利な実施形態において、本発明は、
−・  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質の第１の組合せか、
・  あるいはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質の第２の組合せのいずれか、
をコードする遺伝子で分化した体細胞をトランスフェクトして、ｉＰＳ細胞である第１の細胞を得るステップと；
−  先行するステップで得た前記第１の細胞を透過処理して、透過処理されたｉＰＳ細胞を得るステップと；
−  多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の単離抽出物と前記透過処理されたｉＰＳとを接触させるステップ［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断され、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］と；
を含む、以上で定義した方法に関する。
【０１００】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記雌生殖細胞が、好ましくは哺乳動物、詳細にはヒト、鳥類、爬虫類および両生類の中から選択される脊椎動物の雌生殖細胞であり、好ましくは前記生殖細胞がアフリカツメガエル細胞である、以上で定義した方法に関する。
【０１０１】
１つの実施形態において、本発明は、前記雌生殖細胞の単離抽出物または前記卵子の単離抽出物が非ヒト細胞である、以上で定義した方法に関する。
【０１０２】
本発明は同様に、先に定義した方法にしたがったプロセスにより得られる傾向にある多能性幹細胞にも関する。
【０１０３】
発明者らは、本発明に係るプロセスによって得られる細胞が、天然の幹細胞のパターンとは異なる後成的パターンを内包することを実証した。
【０１０４】
１つの有利な実施形態において、本発明は、
・  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質の第１の組成物か、
・  あるいはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質の第２の組成物のいずれか、
と分化した体細胞とを接触させるステップにおいて、第１の組成物または第２の組成物がそれぞれ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質をコードする核酸を少なくとも含む、以上で定義した方法に関する。
【０１０５】
１つの有利な実施形態において、本発明は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質をコードする前記少なくとも１つの核酸が、少なくとも１つのウイルスベクター、好ましくは少なくとも１つのレトロウイルスベクター、詳細には少なくとも１つの組込み型レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの中に含まれている、以上で定義した方法に関する。
【０１０６】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記少なくとも１つの組込み型レトロウイルスベクターが、前記分化体細胞のゲノム内に組込まれる、以上で定義した方法に関する。
【０１０７】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記多能性幹細胞の多能性の維持を可能にする培地内で先行ステップにおいて得られた細胞を培養するステップをさらに含む、以上で定義した方法に関する。
【０１０８】
「前記多能性幹細胞の多能性の維持を可能にする培地」は、未分化細胞の細胞分裂を可能にする滋養物、成長因子、ホルモンなどを含む培地である。
【０１０９】
例えば、ＥＳ細胞は、有糸分裂で不活性化された初代マウス胎児線維芽細胞のフィーダー細胞層でコーティングされた皿の中で、使用前に、
−  １５％（ｖ／ｖ）のＦＣＳ（牛の新生児由来の血清、液体、ＥＳ培地について試験済み、アリコートを−２０℃で保管）、
−  溶解状態で１０日間のみ安定な、１／１００（ｖ／ｖ）のＬ−グルタミン（２００ｍＭ：Ｇｉｂｃｏ  ２５０３０−０２４、アリコートを−２０℃で保管）、
−  １／１００（ｖ／ｖ）の可欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０３５、アリコートを冷蔵庫で保管）、
−  １／１００（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ  １５１４０−１２２、アリコートを−２０℃で保管）、
−  １／５００（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ３１３５０−０１０、最終濃度０．１ｍＭ、アリコートを冷蔵庫内で保管）、
−  １／１０，０００（ｖ／ｖ）のＬＩＦ（白血病抑制因子（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ製「ＥＳＧＲＯ」、Ｎｏ．ＥＳＧ１１０７、最終濃度１０００Ｕ／ｍｌ以下（それぞれの細胞株の特性による）、１０％（ｖ／ｖ）ほどの血清と共にＤＭＥＭ中で１／１００希釈液を作り、さらに１／１００だけ希釈して常用濃度を達成する。−２０℃で保管）、
で補足されたＤＭＥＭ（高グルコース、Ｇｉｂｃｏ  ４１９６６−０５２、冷蔵庫で保管）最少培地中において、３７℃／ＣＯ２、５０％／湿度９５％で成長させられる。
【０１１０】
当業者であれば、上述のプロトコルを容易に適応させることができる。
【０１１１】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記抽出物が実質的にいかなる原形質膜も有していない、以上で定義した方法に関する。
【０１１２】
１つの有利な実施形態において、本発明は、前記抽出物が、０．１ｍＭ−１０ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ−６ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ−４ｍＭ、詳細には１−２ｍＭの濃度でＥＧＴＡを含む、以上で定義した方法に関する。
【０１１３】
本発明は同様に、
−  先行する定義に係る方法において定義されている多能性幹細胞の生産ステップと；
−  前記多能性幹細胞が由来する種と同じ種の動物の除核卵子内に前記多能性幹細胞の核を移植して、アロ有核卵子を得るステップと；
−  前記多能性幹細胞が由来する種と同じ種の偽妊娠雌内に前記アロ有核卵子を移植するステップと；
を含む、動物、好ましくは哺乳動物をクローニングするための方法にも関する。
【０１１４】
この有利な実施形態において、本発明に係る動物のクローニング方法は、以下の通りである：
−  以上で言及した通り遺伝子を発現することにより分化細胞を脱分化する、
−  前記細胞の核を抽出し、わずかに透過処理し、多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の単離抽出物に対して曝露する［前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］、
−  次に、任意には核をＰＢＳで洗浄する、
−  核を除核卵子内に移植する。
【０１１５】
除核卵子は、当該技術分野において周知の技術により卵子の核を除核することによって得られる。こうして、本発明に係る抽出物によって処理された核は前記除核卵子内にマイクロインジェクションされる。好ましくは、本発明によって処理された核は、同じ種の除核卵子内にマイクロインジェクションされる。例えば、マウスの核は、マウスの除核卵子中に注入される。新たに得た有核卵子は、このときアロ有核卵子と呼ばれる。
【０１１６】
しかしながら、完全に異なるものではない異なる種の除核卵子の中に核をマイクロインジェクションすることができる。例えばマウスの核がラットの除核卵子に注入され、また逆の場合もある。新たに得られた有核卵子はこのとき、ヘテロ有核卵子と呼ばれる。
【０１１７】
−  新たに得た有核卵子（ヘテロまたはアロ有核卵子）はこうして、除核卵子が由来する種と同じ種の偽妊娠雌の子宮内に移植される。
【０１１８】
したがって、除核卵子がマウスから得られる場合、偽妊娠雌はマウスである。除核卵子がラットから得られる場合、偽妊娠雌はラットとなる。
【０１１９】
前記偽妊娠雌から得た後代はその後、本発明によって処理された核が提供された動物のクローンとなる。
【０１２０】
本発明は同様に、好ましくは人間をクローニングするためのプロセスではないことを条件として、
−  以上で定義した方法において定義されている多能性幹細胞の生産ステップと；
−  前記多能性幹細胞が由来する種と同じ種の動物の除核卵子内に前記多能性幹細胞の核を移植して、アロ有核卵子を得るステップと；
を含む、動物、好ましくは哺乳動物をクローニングするための方法にも関する。
【０１２１】
本発明は同様に、先に定義した方法に係るプロセスにより得られる傾向をもつ動物にも関する。
【０１２２】
本発明に関して、「クローニング」という用語は、ドナー細胞の核から動物全体あるいは前記動物の胚を得ることを意味する。
【０１２３】
ドナー細胞の核は、細胞周期のＳ期をひき起こして初期胚発生の最初の分裂を開始させるように活性化され得る。活性化は、当該技術分野において周知の技術により達成され得る。
【０１２４】
卵子抽出物は、詳細には例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中での数回の洗浄など、前記核を含む核または細胞を洗浄することによって、部分的または完全に除去され得る。
【０１２５】
核は、マイクロインジェクションなどの当該技術分野において周知の技術によって、除核卵子内に導入される。
【０１２６】
各々の除核卵子について、１つの核または１つのドナー細胞が導入される。
【０１２７】
除核卵子は優先的に核と同じ種に由来する。除核卵子は当該技術分野において周知の技術により得られる。
【０１２８】
このとき核を含む除核卵子を雌の種畜の体内に移植してその初期胚発生、胚発生および胎児発生を行なわせる。
【０１２９】
１つの生物の異なる組織に由来する細胞は、詳細には、任意の種類の組織、例えば皮膚、腸、肝臓、血液、筋肉などに由来する細胞の中から選択される。
【０１３０】
本発明は同様に、所望の分化段階で、多細胞生物、詳細には脊椎動物の細胞、細胞株または組織を得るための方法において、
−  以上で定義した方法において定義されている多能性幹細胞の生産ステップと；
−  所望の分化段階で細胞、細胞株または組織を得るための適切な条件下で、多能性幹細胞を培養するステップと；
を含む方法にも関する。
【０１３１】
結果として得られた多能性または分化全能性の幹細胞は、前記細胞を未分化状態で維持するための適切な条件下で培養され得る。
【０１３２】
当業者であれば、自らの一般的知識から、特定のタイプの細胞に向かう特異的分化を達成して好ましくはインビトロで異なる段階にある細胞または器官を得るために好ましい成長因子、ホルモン、培地および刺激などが何であるかを認識している。
【０１３３】
本発明は同様に、先に定義した方法に係るプロセスによって得られる傾向にある、所望の分化段階にある多細胞生物、詳細には脊椎動物の細胞株または組織にも関する。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１Ａ−Ｄ】Ｍ期のアフリカツメガエル卵子抽出物が、哺乳動物の繊維芽細胞からの核移植およびｉＰＳ細胞生産の効率を改善することを示す。
【図１Ａ】Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物（Ｍ期）に曝露されたＭＥＦを用いた核移植実験の概略的表示である。
【図１Ｂ】ＭＥＦ（白の四角）、Ｍ期のアフリカツメガエル卵子抽出物に曝露されたＭＥＦ（Ｍ−抽出物；黒の四角）および間期のアフリカツメガエル卵子抽出物に曝露されたＭＥＦ（Ｉ−抽出物；黒丸）の核移植の結果として得られ、２個の細胞−胚数に正規化された２個の細胞（Ａ）、４−８個の細胞（Ｂ）、桑実胚（Ｃ）および（胚盤胞）の百分率を表わすグラフである。対照として、ＥＳ細胞が表わされている（黒の菱形）。
【図１Ｃ】Ｏｃｔ４／Ｋｌｆ４／Ｓｏｘ２／ｃ−Ｍｙｃ（ＯＫＳＭ）の異所性発現とそれに続くＭ期アフリカツメガエル卵子抽出物に対する曝露［あるいはこの曝露無し（モック）］による、ＯＣＴ４−ＧＦＰ陽性ＭＥＦからのｉＰＳ細胞の生成の概略的表示である。
【図１Ｄ】透過処理されていない細胞との関係におけるＯＣＴ４−ＧＦＰ陽性コロニーの数を表わす。ｉＰＳ細胞生産の効率に対してＭ期卵子抽出物に対する曝露が及ぼす効果は、Ｍ期卵子抽出物に対する曝露（Ｍ期単独、Ａ）、ＯＫＳＭ過剰発現（ＯＫＳＭ単独、Ｂ）およびＯＫＳＭ過剰発現とそれに続く緩衝液単独に対する曝露（ＯＫＳＭ＋モック；Ｃ）またはＭ期卵子抽出物に対する曝露（ＯＫＳＭ＋Ｍ期；Ｄ）の後のＯＣＴ４−ＧＦＰ陽性コロニーの生産を、３つの完全に独立した実験内で測定することによって評価された。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）を表わす。
【図２Ａ−Ｕ】ＯＫＳＭ過剰発現とそれに続くＭ期アフリカツメガエル卵子抽出物に対する曝露によって得られるｉＰＳ細胞の多能性の特徴づけを表わす。
【図２Ａ−Ｆ】モック処理されたＭＥＦ（図２Ａおよび図２Ｄ）、ＥＳ細胞（図２Ｂおよび図２Ｅ）そしてＯＫＳＭ過剰発現およびＭ期卵子抽出物に対する曝露により誘発されたｉＰＳ細胞（Ｍ期ｉＰＳ；図２Ｃおよび図２Ｆ）内でのアルカリホスファターゼ発現を表わす。図２Ｄ−Ｆは、図２Ａ−Ｃをそれぞれより高い倍率で表わしている。
【図２Ｇ−Ｊ】ＯＣＴ４−ＧＦＰ  ＭＥＦから生成されたＭ期ｉＰＳ細胞内の形態（図２Ｇ、図２Ｉ）およびＧＦＰ発現（図２Ｈ、図２Ｊ）を表わす。図２Ｉ−Ｊ−Ｆはそれぞれ、図２Ｇ−Ｈのより高い倍率を表わす。
【図２Ｋ−Ｓ】Ｍ期ｉＰＳ細胞内の免疫蛍光により評価される多能性マーカーの発現を表わす：ＯＣＴ４のプロモータにより発現が駆動されたＧＦＰ（図２Ｌ、図２Ｏおよび２Ｒ）と共局在化させたＯＣＴ４（図２Ｋ）、Ｎａｎｏｇ（図２Ｎ）およびＳＳＥＡ１（図Ｑ）。ＤＮＡはＤＡＰＩで標識されている（図２Ｍ、図２Ｐおよび図２Ｓ）。
【図２Ｔ】ＭＥＦ（第１カラム）、ＥＳ細胞（第２カラム）および２つのＭ期ｉＰＳクローン（Ｍ／ｉＰＳ；最後の２カラム）中で定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定されたＯｃｔ４の発現を表わす。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）を表わす。Ｙ軸はＥＳ細胞との関係におけるｍＲＮＡの発現を表わす。
【図２Ｕ】ＭＥＦ（第１カラム）、ＥＳ細胞（第２カラム）および２つのＭ期ｉＰＳクローン（Ｍ／ｉＰＳ；最後の２カラム）中で定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定されたＮａｎｏｇの発現を表わす。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）を表わす。Ｙ軸は、ＥＳ細胞との関係におけるｍＲＮＡの発現を表わす。
【図３Ａ−Ｌ】Ｍ期ｉＰＳ細胞の発生能を示す。
【図３Ａ−Ｆ】胚様体（ＥＢ）の分化が、「材料と方法」の中で記載されている通り、レチノイン酸によって誘発されたことを表わしている。ＥＢ形成には、ＧＦＰ発現の損失が随伴していた。
【図３Ａ】分化する胚様体を表わす。
【図３Ｄ】図３Ａの分化する胚様体のＧＦＰ発現を表わす。
【図３Ｂ】分化した胚様体を表わす。
【図３Ｅ】図３Ｂの分化した胚様体のＧＦＰ発現を表わす。
【図３Ｃ．Ｆ】それぞれ図３Ｂおよび３Ｅのより高い倍率に対応する。
【図３Ｇ−Ｉ】Ｍ期ｉＰＳ細胞を用いて生産されたキメラマウスを表わす。２つの異なるＭ期ｉＰＳクローンは、ＣＤ１胚盤胞への注入後、生存能力のあるキメラを生産した。
【図３Ｊ】Ｆ１の仔（（Ｂ６ｘＪＦ１）遺伝子型由来のもの）の黒色を示し、生殖細胞系伝達を実証している。
【図４Ａ−Ｎ】Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物により誘発された透過処理されたＭＥＦの再プログラミングを示す。
【図４Ａ】曝露後から異なる日数（Ｄ）の経過後のモック処理されたＭＥＦ（四角）と比較したＭ期抽出物で処理されたＭＥＦ（円）の増殖速度を示す曲線を表わす。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝４）を表わす。Ｙ軸は、合計細胞数×１０５を表わす。
【図４Ｂ−Ｇ】Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物を用いたＭＥＦの処理後に形成されたコロニーの形態を表わす（位相コントラスト）。
【図４Ｂ−Ｅ】低い倍率（×３４）でのＭ期抽出物処理により誘発される異なるコロニーをそれぞれ表わす。
【図４Ｆ．４Ｇ】より高い倍率でコロニーの形態を表わす。
【図４Ｈ−Ｊ】野生型ＭＥＦのＭ期卵子抽出物に対する曝露の後のＯＣＴ４陽性コロニーの誘発を表わす（免疫蛍光分析）；スケールバー、１００μｍ。
【図４Ｊ】Ｍ期抽出物を用いたインキュベーションの後のＯＣＴ４−ＧＦＰ  ＭＥＦ内でのＧＦＰ発現の誘発を表わす。
【図４Ｈ】位相コントラストを表わす。
【図４Ｉ】ＤＮＡ標識化（ＤＡＰＩ）を表わす；スケールバー、５０μｍ。
【図４Ｋ−Ｍ】ＥＳ細胞（図４Ｋ）、ＭＥＦ（図４Ｌ）およびＭ期卵子抽出物に対する曝露の後のＭＥＦ（図４Ｍ）内のアルカリホスファターゼ活性の誘発を表わす。
【図４Ｎ】Ｍ期卵子抽出物でのインキュベーションの後の多能性マーカー（Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＲｅｘ１、それぞれ第１−第３カラム）の発現およびＺｆｐｍ２のダウンレギュレーション（分化マーカー；第４カラム）の誘発を表わす。Ｍ期抽出物およびモックで処理されたＭＥＦを用いて定量的ＲＴ  ＰＣＲを実施した。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）を表わす。
【図５Ａ−ＡＢ】Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物でインキュベートされたＭＥＦ核中のＤＮＡ複製の加速およびクロマチン構造の再構成を示す。
【図５Ａ−Ｄ】緩衝液単独（図５Ｃおよび図５Ｄ）またはＭ期卵子抽出物（図５Ａおよび図５Ｂ）を用いて４０分間インキュベートされたＭＥＦ核の形態を表わす。核は、ＤＡＰＩを用いて染色された（スケールバー＝１０μｍ）。
【図５Ｅ−Ｇ】緩衝液単独（図５Ｅ）またはＭ期卵子抽出物で４０分間（図５Ｆ）または６０分間（図５Ｇ）処理されたＭＥＦ核の形態を表わす。核（ＤＡＰＩで染色されたもの）は、異なるクロマチン凝縮度を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図５Ｈ−Ｏ】Ｍ期卵子抽出物に対するＭＥＦ核の曝露後のまたはそれの無い（モック）場合のＳｅｒ１０におけるヒストンＨ３のリン酸化反応（ホスホＨ３）およびクロマチンに結合したＨＰ１−αの喪失を表わす。ＭＥＦ核は、対応する抗体で固定され染色され、ＤＮＡはＤＡＰＩで染色された。スケールバー＝１０μｍ。
【図５Ｈ】モック処理されたＭＥＦ核のＤＮＡ標識化（ＤＡＰＩ）を表わす。
【図５Ｉ】モック処理されたＭＥＦ核の抗リン酸化ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）（ホスホＨ３）抗体での標識化を表わす。
【図５Ｊ】モック処理されたＭＥＦ核のＤＮＡ標識化（ＤＡＰＩ）を表わす。
【図５Ｋ】モック処理されたＭＥＦ核の抗ＨＰ１−α抗体での標識を表わす。
【図５Ｌ】Ｍ期抽出物で処理されたＭＥＦ核のＤＮＡ標識化（ＤＡＰＩ）を表わす。
【図５Ｍ】Ｍ期抽出物で処理されたＭＥＦ核の抗リン酸化ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）（ホスホＨ３）抗体での標識化を表わす。
【図５Ｎ】Ｍ期抽出物で処理されたＭＥＦ核のＤＮＡ標識化（ＤＡＰＩ）を表わす。
【図５Ｏ】Ｍ期抽出物で処理されたＭＥＦ核の抗ＨＰ１−α抗体での標識化を表わす。
【図５Ｐ−Ｒ】Ｍ期卵子抽出物でのインキュベーション（Ｂ）の後の、またはインキュベーション無しでの（Ａ）、ＭＥＦ核中のＳｅｒ１０（図５Ｐ、上部図版）、ＬａｍｉｎＢ１（図５Ｑ、上の図版）およびＨＰ１−α（図５Ｒ、上部図版）におけるクロマチン結合リン酸化ヒストンＨ３の発現の分析を表わす。クロマチンは、実施例２に記載の処理の後、遠心分離により収集された。試料は、対応する抗体を用いたウェスタンブロット法により分析された。ヒストンＨ３が、ローディングコントロールとしてプローブ探査された（図５Ｐ、５Ｑおよび５Ｒ、下部図版）。
【図５Ｓ−ＡＢ】Ｍ期抽出物中でのインキュベーション後（Ｂ）またはそれ無し（Ａ）のＭＥＦ核中のヒストン修飾の分析を表わす。試料は、対応する抗体を用いてウェスタンブロット法によって分析された。ローディングコントロールとして、ヒストンＨ３がプローブ探査された（図５Ｓ−ＡＢの各々の下部図版）。
【図５Ｓ】上部図版は、抗アセチルヒストンＨ３（ａｃＨ３）抗体でのブロッティングを表わす。
【図５Ｔ】上部図版は、抗アセチルリジン９ヒストンＨ３（Ｈ３Ｋ９）抗体でのブロッティングを表わす。
【図５Ｕ】上部図版は、抗アセチルリジン８ヒストンＨ４（Ｈ４Ｋ８）抗体でのブロッティングを表わす。
【図５Ｖ】上部図版は、抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ３抗体でのブロッティングを表わす。
【図５Ｗ】上部図版は、抗Ｈ３Ｋ９ｍｅ２抗体でのブロッティングを表わす。
【図５Ｘ】上部図版は、抗Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３抗体でのブロッティングを表わす。
【図５Ｙ】上部図版は、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ３抗体でのブロッティングを表わす。
【図５Ｚ】上部図版は、抗Ｈ３Ｋ４ｍｅ２抗体でのブロッティングを表わす。
【図５ＡＡ】上部図版は、抗Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３抗体でのブロッティングを表わす。
【図５ＡＢ】上部図版は、抗ヒストン変異体Ｈ３．３抗体でのブロッティングを表わす。
【図６】Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物での予備インキュベーションが、間期卵子抽出物内のＭＥＦ核のＤＮＡ複製速度を加速する。
【図６Ａ】アフリカツメガエルＭ期および／または間期卵子抽出物でのインキュベーション後のＭＥＦ核内のＤＮＡ複製を評価するのに使用される手順の概略的表示である。
【図６Ｂ】アフリカツメガエル間期卵子抽出物中の透過処理されたＭＥＦ核（円付きライン）およびアフリカツメガエル精子核（四角付きライン）のＤＮＡ複製を表わす。ＤＮＡ複製の百分率は、反応中への合計ＤＮＡ投入量に対するものである（実施例２の「材料および方法」を参照のこと）。Ｙ軸は、ＤＮＡ複製の％を表わし、Ｘ軸は分単位のインキュベーション時間を表わす。
【図６Ｃ】Ｍ期卵子抽出物中の透過処理されたＭＥＦ核の予備インキュベーション（ＣＳＦ；三角付きライン）により、該核は、間期卵子抽出物中での精子核（四角付きライン）と同程度の効率でＤＮＡを複製できるようになることを示している。対照として、間期抽出物が示されている（円付きライン）。Ｙ軸は、ＤＮＡ複製の％を表わし、Ｘ軸は分単位でのインキュベーション時間を表わす。
【図７】Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物でのインキュベーションは、ＯＫＳＭトランス遺伝子のウイルス組込みに影響を及ぼさない。  異なる細胞集団内での各トランス遺伝子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ）のウイルス組込みを、定量的ＰＣＲ増幅によって評価した。異なるＭＥＦ集団を、感染から２１日後に収穫し、そのＤＮＡを抽出した。  第１のバー（ミドルグレー）は、感染した透過処理されていない細胞（ＯＫＳＭ）に対応し；  第２のバー（ダークグレー）は、感染し、ストレプトリジン−Ｏ（ＳＬＯ）で透過処理され、モック処理された細胞（ＯＫＳＭ＋ＳＬＯ＋緩衝液）に対応する；  第３のバー（ライトグレー）は、ＳＬＯで透過処理され、Ｍ期抽出物で処理された細胞（ＯＫＳＭ＋ＳＬＯ＋Ｍ期抽出物）に対応する。  ４つの独立した実験が示され、エラーバーはｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝４）を表わす。  Ｙ軸は、Ｑ−ＰＣＲにより測定された組込まれたトランス遺伝子の相対数を表わす。
【図８】ＥＳ細胞とＭＥＦ間（左）およびＥＳとＭ−ｉＰＳ細胞間（右）の全般的遺伝子発現の比較を示すピアソンの相関係数（Ｒ２）の計算を伴う散布図である。ラインは、対合した細胞型の間の差次的に発現された遺伝子を表わす。
【図９Ａ．９Ｂ】ＭＥＦ、ＥＳ細胞およびＭ−ｉＰＳ細胞由来のＤＮＡの亜硫酸水素塩配列決定を表わす。増幅された領域は、中実の青色バーで表わされている。円の各水平列は、個別の分子のＣｐＧジヌクレオチドを表わす。中実円は、メチル化ＣｐＧｓを示し、白い円は、非メチル化ＣｐＧｓを示す。
【図９Ａ】Ｏｃｔ４のプロモータ領域の分析を表わす。
【図９Ｂ】Ｎａｎｏｇのプロモータ領域の分析を表わす。
【図１０】ＥＢ分化の時点での多能性マーカーＯｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ４のダウンレギュレーションおよび分化マーカーＳｏｘ１、Ｓｏｘ７、Ｓｏｘ１７およびＢｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｂｒａｃｈ）のアップレギュレーションを表わす。分析は、ＥＳ細胞、ＥＳ由来の胚様体（ＥＢＥＳ）、Ｍ−ｉＰＳおよびＭ−ｉＰＳ由来の胚様体（ＥＢＭ−ｉＰＳ）の定量的ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって実施され、Ａｃｔｉｎ、ＨＰＲＴおよびＧＡＰＤＨの平均発現に対し正規化された。ヒストグラムは、対応する胚様体と多能性細胞（ＥＳ、青色バーまたはＭ−ｉＰＳ細胞、赤色バー）およびそれらのとの間の比を表わす。エラーバーはｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）を表わす。Ｙ軸は、ハウスキーピング遺伝子との関係におけるｍＲＮＡの折畳み誘発を表わす。
【図１１Ａ−Ｃ】：Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物でのインキュベーションは、ＭＥＦ核のＤＮＡを脱メチルしない。  モック処理されＭ期処理されたＭＥＦ核およびＥＳ細胞中で、亜硫酸水素塩配列決定を実施した。増幅された領域は、中実青色バーで表わされている。円の各水平列は、個別の分子のＣｐＧジヌクレオチドを表わす。中実円は、メチル化ＣｐＧｓを示し、白い円は、非メチル化ＣｐＧｓを示す。親の対立遺伝子起源（Ｍ：母親；Ｐ：父親）は、Ｃ５７ＢＬ／６ＪとＪＦ１のバックグラウンドの間のＤＮＡ多型を使用することにより、ＭＥＦおよびｉＰＳ細胞中で決定された。青色三角形は、多型に起因して不在である個別のＣｐＧｓを示す。
【図１１Ａ】Ｏｃｔ４のプロモータ領域の分析を表わす。
【図１１Ｂ】Ｎａｎｏｇのプロモータ領域の分析を表わす。
【図１１Ｃ】刷り込みされたＳｎｒｐｎ遺伝子のプロモータ／刷り込み制御領域の分析を表わす。
【図１２】中期における雌生殖細胞の単離抽出物の遮断の安定性。  Ｙ軸は、ＤＮＡ合成の％を表わし、Ｘ軸は、分単位のインキュベーション時間を表わす。  Ｃａ２＋を伴って（菱形）またはＣａ２＋を伴わずに（四角）ＤＮＡを合成するためにＭ期で遮断された単離抽出物の能力は、［３２Ｐ］αｄＣＴＰの取込みによって測定される。抽出物が中期で遮断される場合、それはＣａ２＋無しではＤＮＡを合成しないが、Ｃａ２＋の存在下でＤＮＡを合成する。
【実施例】
【０１３５】
実施例１：抽出物の調製
間期抽出物について使用した手順と類似の手順を通して、有糸分裂抽出物を調製する。ただし、卵子は活性化されてはならず、溶液中に存在するかまたは細胞内貯蔵から放出される微量のカルシウムをキレートするため、ＥＧＴＡを緩衝液に添加しなければならない。
【０１３６】
１．遠心分離機を１℃に設定する。チューブ、アダプターおよびシリンジを全て４℃まで冷却してから、抽出物の調製を開始する。
２．ガラス製ビーカーに卵子を移し、ＨＳＢ（ＨＳＢ−ＣＳＦ：１５ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．６；１１０ｍＭのＮａＣｌ；２ｍＭのＫＣｌ；１ｍＭのＭｇＳＯ４；０．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；２ｍＭのＮａＨＣＯ３＋２ｍＭのＥＧＴＡ）を用いて洗い流す。同じカエルに由来する卵子をプールすることが有利である。
３．精製水を添加し、外部ゼリー層を室温で５分間膨潤させる。
４．ＨＳＢ−ＣＳＦ０．３Ｘ、システイン２％、ｐＨ７．９を添加し（溶液は、調製後６時間以内に使用しなければならない）、間隔をおいて穏やかに旋回させることにより、ゼリー層を除去する。これには５−１０分かかり、卵子がわずかに変形した状態で密に詰められた時点で、ゼリー層の完全な除去が得られる。ゼリー層を完全に除去することが重要である。この段階で、成功は、調製の迅速性およびステップ１０の後の低温条件が厳守されているか否かにかかっている。
５．直後に、卵子１ｍｌあたり１００−２００ｍｌのＨＳＢ−ＣＳＦを用いて少なくとも５回洗い流す。この時点で、２０％超の卵子内で壊死が見られた場合、それ以上作業は続行しない。５０ｍｌ入りのガラス製ビーカーに移す。
６．顕微鏡での観察のため、大きいガラス製ペトリ皿に卵子を移す。卵子は自発的活性化の兆候を全く示してはならない。
７．低温のウルトラクリアチューブに移す。１０μｇ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤および１００μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含む低温のＸＢ−ＣＳＦ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．７；１００ｍＭのＫＣｌ；１ｍＭのＭｇＣｌ２；５％のスクロース；１ｍＭのＤＴＴ；５ｍＭのＥＧＴＡ）で洗い流す。３ｍｌの卵子に対して１ｍｌを使用する。
８．５−１０分間氷の中にチューブを放置して、卵子を冷やす。
１３．Ｓｏｒｖａｌｌスウィンギングローターまたはその等価物の中で、１５０ｇ、１℃で４５秒間遠心分離することにより、余剰の緩衝液を除去し、卵を詰める。
１４．１０分間１℃で、１７，０００ｇ（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＨＢ４スウィンギングローター、１０Ｋ）で、急速に余剰の緩衝液を除去し、遠心分離する。遠心分離は卵子を圧壊し、こうして可溶性内容物は排除される。
１５．可溶性抽出物の量に応じて、１−５ｍｌ入りシリンジに挿入された２０ゲージの針でチューブの側面に穴を開けることにより抽出物を抜き取る。黒色顔料層のすぐ上に針を挿入し、黄色の脂質最上層を避けながら、細胞質層を収集する。低温のウルトラクリアチューブに移す。１０μｇ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤、１０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ、１／２０体積のＥｎｅｒｇｙ  Ｍｉｘ  ２０Ｘ（Ｅｎｅｒｇｙ  Ｍｉｘ−ＣＳＦ  ２０Ｘ：２００μｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼ；２００ｍＭのクレアチンリン酸；２０ｍＭのＡＴＰ；２０ｍＭのＭｇＣｌ２；＋２ｍＭのＥＧＴＭ）、および５％のグリセロールを添加する。穏やかに混合する。
１６．同じ条件で再度遠心分離する。
１７．低温チューブ内に上清を収集する。必要な場合には２００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを添加して、タンパク質合成を防止する。液体窒素中で先に凍結させた１００または２００μｌのアリコート中で−８０℃で保管する。低速抽出物中のタンパク質濃度は、５０ｍｇ／ｍｌ前後であり、主としてリボソーム中のＲＮＡ濃度は５−１０ｍｇ／ｍｌである。アリコートは、一度しか使用してはならず、解凍後に再凍結させてはならない。
【０１３７】
実施例２：有糸分裂卵子抽出物および転写因子に対する組合せ型曝露による多能性細胞の相乗的誘発
序
まずはカエルそして次に哺乳動物の卵子における核移植（ＮＴ）実験は、体細胞を多能性に再プログラミングできることを実証した（１−４）。より最近では、４つの転写因子Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃ（ＯＫＳＭ）の異所性発現による体細胞内での多能性の誘発を用いて、胚幹（ＥＳ）細胞に極めて類似した人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞が生産された。とりわけ、マウスのｉＰＳ細胞は、奇形腫を形成してキメラを発生させ生殖細胞系列に寄与するそれらの能力により実証される通り、完全な発生能を有する。しかしながら、ｉＰＳ細胞生産およびＮＴの両方の効率はなお低いままであり、得られる再プログラミング済み細胞は、部分的にしか再プログラミングされていないように思われる。細胞の後成的記憶は、１つの重要な障壁であり、分化細胞を効率良く再プログラミングするためには、これを克服しなければならない（５）。したがって、再プログラミング効率を改善するために、追加の要因が必要とされる場合があり（６、７）、過去数年にわたりこれらの手順を最適化するために多くの努力がされてきた。異なる再プログラミング戦略を結びつけてそれらの効率を相乗的に作用させることができる、ということが示唆されてきた（８）。細胞抽出物を用いて体細胞を再プログラミングすることによって、いくつかの試みがなされてきたが、これらの試みはＮＴにより得られる効果範囲を再現することができなかった。
【０１３８】
ＮＴ実験においては、再プログラミングは、受入れる卵母細胞の細胞質に対する移植された核の曝露によって誘発される。しかしながらＮＴ再プログラミングは、大量の哺乳動物卵母細胞を入手するのが困難であるために、インビトロで研究することがむずかしいように思われる。大量に入手可能であるアフリカツメガエル卵子は、逆方向に透過処理された哺乳動物細胞（９）の核ラミナを再構成でき、アフリカツメガエル卵子抽出物は、成体マウス核がアフリカツメガエル卵母細胞内に注入された場合に観察されるもの（１１）と同様の形で、すでにＯｃｔ４を発現している細胞内でのＯｃｔ４発現をアップレギュレーションすること（１０）ができる。より最近では、アフリカツメガエル赤血球核の複製起点および染色体組織を、アフリカツメガエル卵子からの中期停止抽出物（Ｍ期抽出物）によって再構成できることが報告された（１２）。発明者らはさらに、アフリカツメガエル卵子抽出物を用いたマウス胎児繊維芽細胞（ＭＥＦ）の予備インキュベーションが、ＮＴおよびｉＰＳ生産の効率を増大できるか否かを調査した。発明者らは、間期ではなくＭ期のアフリカツメガエル卵子抽出物が、ＮＴ効率を増大させ、ＭＥＦを幹細胞プログラムに関与させたことを示している。これらは同様に、ＭＥＦクロマチン構造および複製特性の包括的な変更を誘発した。詳細には、Ｍ期抽出物は、クロマチン活性化におけるそれらの役割とは独立して、ＭＥＦ核内のいくつかの後成的マークのレベルをリセットする。その上、間期抽出物ではなくＭ期抽出物は、透過処理されたＭＥＦを部分的に再プログラミングして、コロニーを形成し、これらが多能性マーカーを発現した。最終的に、ＯＳＫＭの局所性発現によるｉＰＳ細胞の誘発は、ＭＥＦをＭ期アフリカツメガエル卵子抽出物中でインキュベートした場合に４５倍増大した。結果として得られたｉＰＳ細胞は、キメラを生産し生殖細胞系列をコロニー化するそれらの能力によって示される通り、完全に再プログラミングされていた。
【０１３９】
結果
Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物を用いた前処理は、哺乳動物における核移植およびｉＰＳ細胞生産の両方の効率を改善する。
発明者らは、最初に、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物がＭＥＦの極めて効率の悪いＮＴを改善できるか否かを問いかけた（１３）。Ｇ１期にある透過処理されたＭＥＦ核を、Ｍ期（図１Ａ）または間期のアフリカツメガエル卵子抽出物あるいは緩衝液単独を用いて予備インキュベートし、ＮＴ後の胚盤胞段階へのそれらの進行を比較した。Ｇ１ＭＥＦ核のＮＴは、１１％の胚盤胞を導き（図１Ｂおよび表１）、これは、以前にＮＴのための最良のドナー核として記載された中期ＥＳ核のＮＴ後に得られたもの（５５％）（１４）よりも著しく低い値であった。Ｍ期卵子抽出物内でのＭＥＦ核の条件づけは、胚盤胞形成速度を、中期ＥＳ核で得られたもの（４５％）に匹敵するレベルまで著しく上昇させた（図１Ｂおよび表１）。これらのデータは、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物がＮＴによる体細胞の再プログラミングを効率良く改善することを示している。逆に言うと、間期卵子抽出物での予備インキュベーションは、ＮＴ効率を改善せずむしろわずかに減少させており（３％）、このことは、再プログラミングする抽出物の有糸分裂状態の重要性を指摘するものである。有糸分裂ＭＥＦおよびＧ１  ＥＳ核は両方共、中期遮断された卵母細胞内でのＮＴにとって比較的低効率のドナーであったことから（表１に要約）、発明者の結果は、Ｍ期アフリカツメガエル抽出物での処理が、有糸分裂状態および多能性状態の両方に向けてＭＥＦ核を再構成できることも示唆している。
【０１４０】
発明者らは次に、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物での処理が、ｉＰＳ細胞の生産効率をも同様に改善できるか否かをチェックした。低効率ではあるものの、マウスおよびヒトの細胞内におけるＯＳＫＭ転写因子のウイルス媒介型発現によるｉＰＳ細胞の生成は、多能性状態への体細胞の再プログラミングにおける突破口であった（１５−１９）。したがって、発明者らは、図１Ｃに示された実験的戦略を用いてＭ期アフリカツメガエル卵子抽出物（Ｍ−ｉＰＳ細胞）でのインキュベーションとＯＳＫＭ過剰発現とを組合わせた。ＯＣＴ４−ＧＦＰ  ＭＥＦを、４つの転写因子をコードするレトロウイルスに感染させ、透過処理し、Ｍ期抽出物でインキュベーションし、その後ＥＳ培地内でゼラチンコーティングされたプレート上に再封した。発明者らは、定量的ＰＣＲにより、Ｍ期抽出物処理がＯＫＳＭトランス遺伝子のウイルス組込みに影響を及ぼさないことをチェックした（図７）。内因性ＯＣＴ４の再発現が再プログラミングのストリンジェントリポータであることが報告されている（２）ことから、感染から７日後に、発明者らは、完全な再プログラミング事象に関連づけされるＯＣＴ４−ＧＦＰ陽性コロニーの割合を決定した。ＧＦＰ陽性コロニーの数は、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）での処理を伴うかまたは伴わずに、ＯＳＫＭのみを過剰発現した細胞の場合に比べて、Ｍ期卵子抽出物に曝露されたＯＳＫＭ人工細胞（Ｍ−ｉＰＳ細胞）において４５倍多いものであった（図１Ｄ）。したがって、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物内の哺乳動物体細胞の短時間インキュベーションが、完全に再プログラミングされたｉＰＳ細胞の収率を大幅に増大させた。
【０１４１】
【表１】
2014523744.tif 000002
表１は、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物に曝露され除核マウス卵母細胞内に注入されたＭＥＦ核を用いて得た胚のインビトロ発生を表わす。
モック緩衝液、間期またはＭ期のアフリカツメガエル卵子抽出物中で予備インキュベートされたＭＥＦ核およびＥＳ核の核移植後に得られた２−細胞胚との関係における胚の百分率。有糸分裂およびＧ１  ＥＳ核を、先に記載の通り（３３）に単離し注入し、有糸分裂ＭＥＦをＬｉら（１３）中に記載の通りに単離し注入した。
＊は、ｓｖ１２９／ｓｖ細胞株を意味し；＊＊は、１２９／Ｓｖｐａｓ細胞株を意味する。
【０１４２】
Ｍ−ｉＰＳ細胞の特徴づけ
Ｍ−ｉＰＳ細胞は、ＥＳ株の形態および多能性マーカーアルカリホスファターゼ、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＳＳＥＡ１の均一な発現を提示した（図２Ａ−Ｓ）。その上、異なる多能性マーカーの発現レベルは、定量的ＰＣＲにより測定され、ＥＳ細胞内のものに類似していた（図２Ｔ−Ｕ）。Ｍ−ｉＰＳ細胞、ＭＥＦおよびＥＳ細胞の転写学的プロファイルが分析され（図７）、ＤＮＡマイクロアレイ解析の散布図が、Ｍ−ｉＰＳ細胞とＥＳ細胞の間の類似性を確認した（Ｒ２＝０．９１７５）。効率の良い再プログラミングは、Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇなどの多能性の重要な調節因子のプロモータ上でのＤＮＡの低メチル化に密接に結びつけられている［Ｍａｈｅｒａｌｉ  Ｎら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２００７  Ｊｕｎ  ７；ｌ（ｌ）：５５−７０］。Ｍ−ｉＰＳ細胞とＥＳ細胞のＤＮＡメチル化プロファイルは類似しており（図８Ａ−Ｂ）、これはＭ期アフリカツメガエル卵子抽出物とＯＫＳＭ発現を組合せることにより得られる再プログラミング効率を裏付けている。
【０１４３】
発明者らは、次に、Ｍ−ｉＰＳクローンの分化能を調査した。分化が誘発された時点で、全ての被験Ｍ−ｉＰＳクローンは、胚様体を形成し（図３Ａ−Ｆ）、幹細胞マーカーＯｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＫｌｆ４がダウンレギュレートされ（図１０）、一方３つの胚葉内の分化のマーカーは、ＥＳ細胞（図１０）および（２０−２３）から得られた胚様体中で観察されたものに匹敵するレベルでアップレギュレートされた。
【０１４４】
最終的に、Ｍ−ｉＰＳクローンの完全な再プログラミングは、ＣＤ１胚盤胞内への注入後に成体キメラを生産する２つの異なるクローン（雄と雌の１つずつ）の能力により、インビボで実証された（図３Ｇ−Ｉおよび表２）。さらに、これらのキメラをＣＤ１アルビノ動物と交配させた後の（Ｂ６×ＪＦ１の遺伝的背景に起因した）Ｆ１黒色子孫の産生により示される通り、生殖細胞系列伝達も成功していた（図３Ｊ）。
【０１４５】
発明者らは、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物がｉＰＳ細胞生産効率に対し強いプラスの効果を有すると結論づけている。重要なことに、２つの戦略が組合わされた場合の再プログラミング効率（ＧＦＰ陽性コロニーの数、図１Ｄを参照）は、それらの効率をそれぞれ単に加算した場合よりもはるかに大きいことから、この作用は付加的ではなく相乗的である。
【０１４６】
【表２】
2014523744.tif 000003
表２は、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物に曝露されたＭＥＦから誘導されたｉＰＳ細胞（Ｍ期ｉＰＳ細胞）の発生能を表わす。
ＣＤ１胚盤胞内へのＭ期ｉＰＳ細胞の２つの異なるクローン（雄と雌１つずつ）の注入および生殖細胞系列をコロニー化するそれらの能力の分析の後に得られたキメラの百分率。
【０１４７】
アフリカツメガエルＭ期卵子抽出物は、哺乳動物の繊維芽細胞を再プログラミングする。
Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物の相乗効果を特徴づけするために、発明者らは最初に、この処理単独で、ＭＥＦの限定された増殖能を修飾できるか否かを問いかけた（２４）。Ｍ期卵子抽出物での処理は、少なくとも２回の細胞周期中、ＭＥＦの増殖速度を強く増大させ（図４Ａ）、少数のコロニーの形成を誘発し、これらは成長停止前の数日にわたり拡張した（図４Ｂ−Ｇ）。これらのコロニーは、Ｍ−ｉＰＳ細胞誘発の時点ほど多くなく、モック処理されたＭＥＦ中で見られることは全くなかった。
【０１４８】
成長刺激には同様に、多能性細胞マーカーの発現も随伴しており、これはモック処理された細胞においては決して観察されなかった。実際、アルカリホスファターゼ発現（部分的再プログラミングのマーカー）は、Ｍ期処理（図４Ｋ−Ｍ）の時点で誘発され、よりストリンジェントな多能性マーカーであるＯＣＴ４の内因性発現（２）が、免疫蛍光ならびにＯｃｔ４プロモータにより駆動されるＧＦＰ発現により、コロニー内で検出された（図４Ｈ−Ｊ）。興味深いことに、それ以上進行してコロニーを形成しなかったものを含めたＭ期抽出物で処理された細胞の比較的高い割合の中で、アルカリホスファターゼが発現された（図４Ｋ−Ｍ）。ＯＣＴ４またはアルカリホスファターゼあるいは両方を発現したクローンの複数の独立した実験における存在は、Ｍ期卵子抽出物が、異なる再プログラミングレベルで異種細胞集団の発生に有利に作用すること示唆している。このことは、ＯＳＫＭ過剰発現を使用することによりｉＰＳ細胞の生産中に観察される不均質性と合致しており、それは確率過程の結果である可能性が高い（２５）。これらの結果は、Ｍ期抽出物が単独で、細胞周期特性を変更することができかつ、ＭＥＦの部分的かつ過渡的な再プログラミングを誘発できることを示している。
【０１４９】
多能性マーカーは多くの場合、コロニー形成前に検出されていることから、Ｍ期卵子抽出物での処理から７日後に、選択されていない全細胞集団内での定量的ＲＴ  ＰＣＲにより、多能性マーカーＯｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＲｅｘ１の発現が確認された（図４Ｅ）。Ｑ−ＰＣＲ分析に使用されるプライマーは、マウスの転写物に特異的であり、これらは、Ｍ期アフリカツメガエル抽出物からＲＮＡを増幅できず、このことは、内因性マウス遺伝子の発現誘発を裏付けていた。さらに、ＭＥＦ中で発現されたもののＥＳ細胞中では発現されていない転写因子であるＺｆｐｍ２（１８）は、Ｍ期卵子抽出物に対する曝露の後、ダウンレギュレートされた（図４Ｎ）。
【０１５０】
全体として、発明者らのデータは、ＭＥＦ内で通常発現される遺伝子のダウンレギュレーションおよび多能性遺伝子のアップレギュレーションおよび急速ではあるが過渡的な増殖誘発によって示される通り、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物単独で、ＭＥＦを部分的に再プログラミングするのに充分であることを示唆している。これらの効果のいずれも、間期アフリカツメガエル卵子抽出物を使用した場合には観察されておらず、これは、（２６）中に記載のアフリカツメガエル卵子抽出物を用いた細胞の再プログラミングの失敗についての先の報告と合致していた。
【０１５１】
Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物を用いた処理は、有糸分裂特性を誘発し、包括的な後成的サインを修飾する。
間期アフリカツメガエル卵子抽出物ではなくＭ期アフリカツメガエル卵子抽出物のみが、逆方向に透過処理されたＭＥＦならびにＮＴ効率に対して再プログラミング効果を有していたという観察事実は、ドナー抽出物の有糸分裂段階が極めて重要であることを表わしている。したがって、発明者らは、Ｇ１期におけるＭＥＦのＭ期卵子抽出物に対する曝露が、再プログラミングされた核内で有糸分裂マーカーを誘発できるか否かを調査した。実際、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物に対する曝露は、ＭＥＦ核を有糸分裂様の段階へと駆動し、それには、クロマチン構造の修飾（図５Ａ−Ｄ）とそれに続く包括的縮合（縮合されたクロマチン繊維の形成により示される）（図５Ｅ−Ｇ）が随伴していた。Ｍ期卵子抽出物に曝露されたＭＥＦ核は、同様に、全て有糸分裂期への進入の顕著な特徴である、Ｓｅｒ１０上でのヒストンＨ３のリン酸化反応、および核構造に関与する１つの因子である核エンベロープ構成成分ラミンＢ１の解離（２７、２８）（図５Ｈ−Ｏおよび５Ｒ）をも示した。
【０１５２】
Ｍ期卵子抽出物に対する曝露は、同様に、ＨＰ１発現と共にＤＡＰＩ染色により視覚化されるヘテロクロマチン構造の喪失により明らかにされる通り、クロマチン高次構造組織を消去するようにも思われた（図５Ａ−Ｒ）。したがって発明者らは、さらに、Ｍ期卵子抽出物がＭＥＦ核の包括的後成的サインを修飾したか否かを調査した。ドナー核のヒストンがＮＴ中に脱アセチル化されることが示されたため、発明者らは最初に、ヒストンアセチル化レベルを決定した（２９、３０）。ウェスタンブロット分析は、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物でのＭＥＦ核のインキュベーションが、リジン８においてＨ３（詳細にはＨ３Ｋ９）およびＨ４のアセチル化レベルを削減させることを示した（図５Ｓ−ＡＢ）。
【０１５３】
ヒストン低メチル化が哺乳動物体細胞の後成的可塑性と相関されたことから、発明者らは、次に、アフリカツメガエル卵子抽出物が同様にヒストンメチル化プロファイルも修飾するか否かを問いかけた（３１）。Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物を用いたＭＥＦ核の短時間インキュベーションは、ウェスタンブロット法によって示される通り、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２−ｍｅ３、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３およびＨ３Ｋ４ｍｅ２−ｍｅ３のレベルを包括的に削減した（図５Ｓ−ＡＢ）。逆に、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３のレベルは、Ｍ期抽出物でのインキュベーションの時点で変化せず、このことは、このマークがより安定していることを示唆していた。Ｈ３Ｋ９における包括的脱メチル化は、Ｈ３Ｋ９トリメチル化の維持がＮＴ中における発生上の失敗と関連づけされたことから、Ｍ期卵子抽出物を用いたインキュベーション後のＮＴ効率の改善に寄与するかもしれない。要するに、これらの結果は、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物でのインキュベーションが、全てでなくともいくつかの後成的マークをリセットすることによって、哺乳動物体細胞核の後成的サインを広く修飾することを示している。
【０１５４】
その上、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物でのインキュベーションは同様に、近年ＮＴによる再プログラミング中の細胞同一性記憶に関係があるとされてきたヒストン変異体Ｈ３．３の包括的レベルの削減をも誘発した（３３）（図５Ｓ−ＡＢ）。
【０１５５】
最終的に、発明者らは、細胞記憶の別の重要なマーカーであるＤＮＡメチル化プロファイルを分析した。亜硫酸水素塩配列決定が実施され、これにより、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物中で４０分間インキュベートを行っても、多能性遺伝子Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇのＤＮＡメチル化状態が修飾されないことが示された（図１１Ａ−Ｃ）。
【０１５６】
要約すると、アフリカツメガエルＭ期抽出物は、ＭＥＦ核を有糸分裂状態に駆動すると同様に、そのクロマチン構造も再構成する。これらの結果は、ＮＴおよびｉＰＳ細胞生産に対するＭ期アフリカツメガエル抽出物を用いた処理の強い相乗効果を説明することができると考えられる。
【０１５７】
ＭＥＦ核は、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物中で予備インキュベートされた場合に、胚複製プログラムに適応される。
発明者らは、先に、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物が、分化アフリカツメガエル細胞由来の核の複製プログラムをリセットし、ＤＮＡ複製の体細胞プロファイルから胚プロファイルへの遷移を可能にすることができることを示した（１２）。したがって、発明者らは、ＭＥＦ核が同様の形で再プログラミングされ得るか否かを問いかけた。この目的で、Ｇ１中で合成されたＭＥＦからの核が、間期アフリカツメガエル卵子抽出物でインキュベートされるか、または、間期卵子抽出物内への移植の前にまずＭ期卵子抽出物に曝露され、次にそれらのＤＮＡ複製能力が評価された（図６Ａ）。間期卵子抽出物のみに曝露された核は、ＤＮＡを全く（または非常にわずかしか）複製しなかった（図６Ｂ）。逆に、Ｍ期卵子抽出物内でのＭＥＦ核の予備インキュベーションが、間質抽出物にさらに移植された時点でのアフリカツメガエル精子核のものとほぼ類似の動態でＤＮＡ複製を誘発した（図６Ｃ）。発明者らは、アフリカツメガエル卵子抽出物内での有糸分裂を経験したマウス体細胞核が部分的に再プログラミングされ、アフリカツメガエル初期胚の特徴である加速されたＤＮＡ複製速度を獲得すると結論づけている。
【０１５８】
論述
アフリカツメガエル卵子抽出物によるマウス胚繊維芽細胞の再プログラミング
本明細書中に記載の実験は、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物を用いた哺乳動物体細胞核または細胞の短時間インキュベーションが、ＮＴおよびｉＰＳ細胞生産の両方の効率を改善することを示している。このことは、ＮＴおよびｉＰＳ細胞による再プログラミングの効率を限定する共通の障壁の存在、および、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物中での予備インキュベーションがこれらの障壁の除去を補助するかもしれないことを示唆している。その上、ここで提示されている結果は、異なる戦略を組合せることで哺乳動物体細胞核の再プログラミングを改善できることも強調している。ＮＴもヘテロカリオンも、技術的制限条件のため、ｉＰＳ細胞と組合せて使用することができない。しかしながら、アフリカツメガエル卵子抽出物は、大量に入手でき、ｉＰＳ細胞の収率を増大させるために使用可能である。
【０１５９】
発明者らは、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物が、多能性ＥＳ細胞で観察されるレベルまでＭＥＦ核を用いてＮＴの効率を改善するのに充分であることを示している。その上、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物の中でインキュベートされた逆方向に透過処理されたＭＥＦは、細胞増殖の誘発、コロニーの形成、多能性の最もストリンジェントなマーカーの１つであるＯＣＴ４の発現を含めたＥＳ細胞マーカーの発現など、多能性細胞の複数の特徴を獲得する。この再プログラミング活性は安定しておらず、コロニーは、２〜３の急速な細胞周期の後に成長を止める。しかしながら、この部分的再プログラミング活性は、ＯＫＳＭのウイルス形質導入による完全に再プログラミングされたｉＰＳ細胞の生産を４５倍増大させるのに充分である。効率良く透過処理されたＭＥＦの割合は、発明者らの管理下では３０％を超えないことから、この相乗効果は恐らく、過小評価されている。結果として得られるＭ−ｉＰＳクローンは、得られたクローンがキメラを効率良く生産でき生殖細胞系列をコロニー化できることから、充分に再プログラミングされているように思われる。この相乗効果は、アフリカツメガエル卵子抽出物内でのインキュベーションが、哺乳動物体細胞のゲノム特徴の修飾を誘発し、こうしてＮＴまたはＯＫＳＭ発現による再プログラミングのためにより広い作用ウィンドウを開くことができるということを示唆している。
【０１６０】
分化核を再条件づけするための有糸分裂／減数分裂条件に対する曝露の重要性
発明者らの実験は、アフリカツメガエル卵子抽出物の有糸分裂状態が極めて重要であることを示している。アフリカツメガエル間期卵子抽出物は、透過処理されたＭＥＦ中の再プログラミングを誘発することも、ＮＴ効率を改善することもなかった。逆に、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物は、Ｓｅｒ１０上のヒストンＨ３のリン酸化反応および核構造の再構成により明らかにされる通り、Ｇ１  ＭＥＦ核内の包括的な有糸分裂サインを誘発した。有糸分裂におけるクロマチンのこの包括的再組織化は、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物の再プログラミング活性にとって決定的に重大な意味をもつ可能性がある。有糸分裂を通しての遷移は、有糸分裂において一時的に停止された接合子が間期接合子よりもはるかに効率良く核再プログラミングを支援する、マウスの体内で実施されたＮＴ実験において、極めて重要であることが、つねに発見されてきた（３５）。要するに、これらの結果は、効率の良い再プログラミングには、初期胚多能性状況のみならず、有糸分裂を通した遷移も必要となることを示している。
【０１６１】
有糸分裂卵子抽出物中でのドナー体細胞核のインキュベーションは、ドナー核の細胞周期の再同期化を助けて、それらに初期発生状況との相容性を与えることができると考えられる。発明者らは、ＭＥＦ核が、アフリカツメガエル体細胞核と同様に、ただし精子核とは異なる形で、間期アフリカツメガエル卵子抽出物中でそれらのゲノムを複製するためにコンピーテントでないことを示している。有糸分裂再プログラミング期の要件が、ＮＴ実験において半分割胚からの核が正常な胞胚由来の核よりもはるかに良く発生する理由を説明してくれるかもしれない（３６）。実際、このような核は、第１の分割中に分裂できなかった胚に由来しており、このことはそれらがＳ期に入る前に有糸分裂段階を通過しているはずであることを暗に意味する。マウスにおいては、核が予め活性化された卵母細胞内に移植される場合に、不充分な発生が起こり、一方、活性化が核移植から１−３時間後に起きる場合に最良の発生速度が観察される（３７）。発明者らの観察事実は、間期アフリカツメガエル卵子抽出物ではなく、有糸分裂アフリカツメガエル卵子抽出物が分化細胞を再プログラミングできることを示すことによって、これらのデータに対する説明を提供する。
【０１６２】
Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物は、哺乳動物体細胞ゲノムの包括的組織化を再構成する。
細胞周期の同期化効果に加えて、有糸分裂胚状況における核の条件づけは、遺伝子発現の再プログラミングを容易にするかもしれない。有糸分裂中、大部分の既存の転写および複製因子は、クロマチンから消去される（３８）。例えば、３つのポリメラーゼ全てが転写のために必要とする転写機構の主要構成要素であるＴＢＰならびにＴＦＩＩＢは、核小体の消滅と共に、卵子抽出物中でインキュベートされた体細胞核のクロマチンから除去される（３９）。発明者らの実験は、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物が、Ｇ１  ＭＥＦ核内で包括的有糸分裂サインを効率良く誘発することを示しており、これはＨＰ１の喪失、Ｓｅｒ１０上でのヒストンＨ３のリン酸化反応および核構造の再構成により明らかにされている。興味深いことに、転写抑制に関連づけされるマーク（Ｈ３Ｋ９ｍｅ２、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３）および活性クロマチンに関連づけされるマーク（アセチルＨ４Ｋ８、アセチルＨ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２）が両方共、Ｍ期抽出物を用いてインキュベートされたＭＥＦ核のクロマチンの中で削減されている。この事象は、ＥＳ細胞の非定型二価後成的サインの流れをくむものであり（４０）、体細胞核の記憶をリセットすることにより再プログラミングを促進できると考えられる。ヒストン脱メチル化も同様に、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物の作用の興味深い特徴であると思われる。ただし、後成的マークの削減は完全ではなく、Ｍ期抽出物でのインキュベーションの後に一部の確定した核構造が残る可能性があることを示唆している。
【０１６３】
発明者らの結果は、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物を用いた予備インキュベーションがＮＴ中に発生する再プログラミング事象を反復できることを示している。実際、これらの結果は、非活性化中期ＩＩ哺乳動物卵母細胞内に注入された哺乳動物の体細胞核の再プログラミング中の記述されてきた包括的後成的修飾を説明している（２９、３０、４１）。したがって、アフリカツメガエル卵子抽出物は、ＮＴ中に発生する分子事象を生化学的に研究するための強力な手段を提供することができると考えられる。
【０１６４】
有糸分裂におけるクロマチンの包括的再組織化は、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物による再プログラミング活性にとって極めて重要である可能性が高い。これらの抽出物は、少数の遺伝子の局所性発現を通した再プログラミングとは異なり、有糸分裂ならびに多能性に関与する全ての遺伝的および後成的因子を提供するという利点を有する。両方法の組合せは、強い相乗効果を導き、再プログラミング回路の進化的保存を実証する。
【０１６５】
材料と方法
細胞および培地
ＭＥＦは、１３．５Ｅ野生型マウス胚またはＯＣＴ４−ＧＦＰトランスジェニック対立遺伝子に対して半接合であるＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＪＦ１胚から誘導された。ＭＥＦ単離の前に、生殖腺、内蔵器官および頭を除去した。その後、１０％のＥＳ試験済みウシ胎仔血清（ｃａｔ  Ｎ°Ｓ１８１０、Ｂｉｏｗｅｓｔ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）で補足した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＭＥＦを拡張させた。ＭＥＦは、５代継代まで使用した。ＯＣＴ４−ＧＦＰマウスは、当初Ｐｒ．Ｓｃｈｏｌｅｒによって創出され、Ｐｒ．Ｓｕｒａｎｉ（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ／Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓａｒｃｈ  ＵＫ  Ｇｕｒｄｏｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）からこれを入手した。ＥＳ細胞株ＣＧＲ８は、Ｄｒ  Ｃ．Ｃｒｏｚｅｔ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｄｅ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  Ｈｕｍａｉｎｅ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ）から入手した。ＥＳ細胞を、フィーダー無しで０．１％のゼラチン上で成長させた。これらをＥＳ培地［すなわち１０００Ｕ／ｍｌのＬＩＦ（ＥＳ−ＧＲＯ）の存在下で１０％のウシ胎仔血清、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１％の可決アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭのＬ−グルタミンが補足されたＧＭＥＭ］中５％のＣＯ２内で３７℃で培養した。
【０１６６】
アフリカツメガエル卵子抽出物の調製および複製反応
Ｌｅｍａｉｔｒｅら、（１２）、Ｍｅｎｕｔら、（４３）およびｗｗｗ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｅｑｕｉｐ／ｍｅｃｈａｌｉ／で入手可能な詳細なプロトコル中に記載の通りに、アフリカツメガエル有糸分裂および間期卵子抽出物ならびに膜除去された精子核を調製し、使用した。アフリカツメガエル赤血球核について記載された手順（１２）にしたがって、初期継代（最高Ｐ５）の集密的ＭＥＦからＭＥＦ核を調製した。簡単に言うと、ＭＥＦをトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄した。低張緩衝液（１０ｍＭのＫＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５；２ｍＭのＫＣｌ；１ｍＭのＤＴＴ；２ｍＭのＭｇＣｌ２；１ｍＭのＰＭＳＦ；プロテアーゼ阻害剤）の中で１時間、ＭＥＦをインキュベートした。その後、膨潤した細胞を２０−３０ストロークで均質化し、その後、氷上で０．２％のトリトンＸ−１００を含む低張緩衝液中で３分間インキュベートした。等張緩衝液（１０ｍＭのＫＨＥＰＥＳ、２５ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、７５ｍＭのスクロースおよびプロテアーゼ阻害剤）中で２回、核を洗浄した。最後に、０．７Ｍのスクロースクッションを通して核を遠心分離し、２０％のスクロースで補足した等張緩衝液中に再懸濁させた。精子核およびＭＥＦ核（それぞれ１μｌあたり１０００個および５００個の核）をＳ期またはＭ期（ＣＳＦ）抽出物中でインキュベートした。先に記載の通りに（４３）、アフリカツメガエル間期卵子抽出物中での［３２Ｐ］αｄＣＴＰ取込みにより、ＤＮＡ合成を測定した。Ｍ期抽出物から間期抽出物への核移植を、先に記載の通り（１２）に実施した。
【０１６７】
ストレプトリジンＯ透過処理とＭ期抽出物処理
主としてＴａｒａｇｅｒら、（４４）により記載された通りに、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）を用いてＭＥＦを透過処理した。簡単に言うと、ＭＥＦをトリプシン処理し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、その後、２５０ｎｇ／μｌのＳＬＯ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０１４９）と共に１０００細胞／μｌでＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まない低温ハンクス液（ＨＢＳＳ）中に再懸濁させた。細胞を５０分間穏やかに撹拌しながら３７℃でインキュベートし、その後、氷冷のＨＢＳＳで２回洗浄した。透過処理された細胞をＭ期アフリカツメガエル卵子抽出物または緩衝液（抽出物１μｌあたり細胞１０００個）中で４０分間インキュベートし、ＨＢＳＳ中で２回洗浄し、２ｍＭのＣａＣｌ２で補足された完全ＥＳ培地中でゼラチン上で２時間再封し、その後完全ＥＳ培地中で培養した。
【０１６８】
Ｍ期−抽出物で処理されたｉＰＳ細胞の生産
メーカーの推奨事項にしたがって、リポフェクタミン２０００トランスフェクション剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−ＭｙｃをコードするｐＭＸｓレトロウイルスベクター中の構成体（Ａｄｄｇｅｎｅより入手）をＰｌａｔｉｎｕｍ  ＨＥＫ細胞中にトランスフェクトした。７５０μｌのＯＰＴＩＭＥＭに対して３０μｌのリポフェクタミン２０００を添加し、７５０μｌのＯＰＴＩＭＥＭ中に希釈され５分間インキュベートされた１２μｇのＤＮＡと混合した。２０℃で２０分間インキュベートした後、ＤＮＡ／リポフェクタミン２０００の混合物を滴下によりＰｌａｔｉｎｕｍＨＥＫ細胞に添加した。トランスフェクションから４８時間後に、上清を収集し、０．４５μｍのＭｉｌｌｅｘ  ＨＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターを通して濾過し、１２μｇ／ｍｌのポリブレンで補足した。ＯＣＴ４−ＧＦＰ  ＭＥＦを、５６ｃｍ２のペトリ皿内で０．１％のゼラチン上に８・１０５細胞の密度で播種し、上清を含む４つのウイルスを等量でプールし、ＭＥＦに添加した。１８時間後に、上清を除去し、細胞を完全ＥＳ培地中で培養した。５−６時間後に、細胞を上述の通り、トリプシン処理しＳＬＯで透過処理し、その後、モック緩衝液（ＨＢＳＳ）またはアフリカツメガエルＭ期卵子抽出物のいずれかの中で４０分間インキュベーションした。処理後、細胞を２回洗浄し、２ｍＭのＣａＣｌ２で補足したＥＳ培地を用いてゼラチン被覆した皿の中に平板固定（５６ｃｍ２あたり８・１０５個の細胞）した。２時間後、培地を除去し、ＯＣＴ４−ＧＦＰ陽性コロニーが出現するまで、完全ＥＳ培地で置換した。Ｍ期抽出物で処理したＯＣＴ４−ＧＦＰ陽性コロニーを機械的に単離し、個別の細胞を解離させ、分析のためフィーダー上に平板固定し、この分析をフィーダー上での少なくとも１５継代の後に実施した。
【０１６９】
核移植
核移植実験を主としてＺｈｏｕら（４５）に記載の通りに実施した。簡単に言うと、集密的な（Ｂ６×１２９）ＭＥＦ由来の透過処理されたＭＥＦ核を、上述の通りに新たに調製し、除核された間期ＩＩマウス卵母細胞中に直接注入するか、またはＭ期または間期アフリカツメガエル卵子抽出物中で４０分間予備インキュベートした。注入前に、予備インキュベートした核をＭ１６培地中で２回洗浄して、アフリカツメガエル卵子抽出物を除去した。注入前に、位相差顕微鏡を用いて核を目視することによって、処理効率とクロマチン無欠性を評価した。Ｚｈｏｕら（４５）に記載の通りに、（Ｂ６×１２９）中期ＥＳ細胞を単離した。
【０１７０】
ＥＳ細胞またはＭ期抽出物で処理したｉＰＳ細胞の分化
ＥＳ細胞またはＭ期抽出物で処理したｉＰＳ細胞を、０．０５％のトリプシン／ＥＤＴＡを伴う単一細胞懸濁液中に解離させ、標準的ＥＳ培地（ＬＩＦ無し）を伴う非粘着性細菌ペトリ皿内に低密度で平板固定した。２日後に、培地を、０．５μＭのレチノイン酸で補足したＥＳ培地で置換して、胚様体の分化を誘発した。
【０１７１】
再プログラミング効率
感染から７日後に、Ｍ期抽出物処理後の再プログラミング効率を分析した。異なる処理により誘発されたＯＣＴ４−ＧＦＰ陽性コロニーの数を蛍光顕微鏡下で計数し、同じ感染実験由来の透過処理されていないＯＫＳＭ感染済みＭＥＦから得たコロニー数と比較した。Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製のアルカリホスファターゼ検出キットを用いて、メーカーの手順にしたがってアルカリホスファターゼ染色を行なった。免疫蛍光については、培養中の細胞をＰＢＳ中で一回洗浄し、次に室温（ＲＴ）で１５分間３％のパラホルムアルデヒド中で固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／０．２％のトリトンＸ−１００を用いて５分間透過処理した。その後、細胞を、２％のＢＳＡを伴うＰＢＳ中で１０分間３回洗浄し、抗−ＯＣＴ−３／−４（Ｃ−１０）（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ、ｓｃ−５２７９）、抗−ＮＡＮＯＧ（Ａｂｃａｍ、ａｂ２１６０３）または抗−ＳＳＥＡ１（クローン１６ＭＣ４８０）（Ａｂｃａｍ、ａｂ１６２８５）抗体を用いて１時間、次にＰＢＳ中での３回の洗浄後二次抗体を用いて１時間インキュベートした。ＤＡＰＩを用いてＤＮＡを染色した。先に記載の通り（４３）、ＸＢ緩衝液（ＸＢ：プロテアーゼ阻害剤で補足された１００ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫＯＨ−ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．７］、５０ｍＭのスクロース）中で、１０倍希釈した後、１００ｇでの遠心分離によりカバースリップ上に処理済み核をスピンさせることによって、Ｍ期抽出物またはモック処理されたＭＥＦ核の免疫蛍光分析を実施した。
【０１７２】
定量的逆転酵素（ＲＴ）−ＰＣＲ解析
転写解析のために、ＲＮＡｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いて全細胞集団から全ＲＮＡを単離し、大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＲＴを実施した。Ｒｏｃｈｅ製のＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒキットを用いて、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ４８０器具上で定量的ＰＣＲを実施した。定量化データを、ΔΔＣｔ方法を用いて各プライマセットについて得た増幅曲線の対数線形位相内で内因性Ｈｐｒｔ１／Ｇａｐｄｈおよびβ−Ａｃｔｉｎ遺伝子の平均発現に正規化した。全ての試料は、２−３回の生物学的反復で調製された。
【０１７３】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマー：
Ｏｃｔ４
順方向：ｔｔｃｔｇｇｃｇｃｃｇｇｔｔａｃａｇａａｃｃａｔａｃｔｃｇａ（配列番号：１）
逆方向：ｇａｇｇａａｇｃｃｇａｃａａｃａａｔｇａｇａａｃｃｔｔｃａｇ（配列番号：２）
Ｒｅｘｌ
順方向：ｃａｇｃｔｃｃｔｇｃａｃａｃａｇａａｇａ（配列番号：３）
逆方向：ａｃｔｇａｔｃｃｇｃａａａｃａｃｃｔｇ（配列番号：４）
Ｎａｎｏｇ
順方向：ｔｔｃｔｔｇｃｔｔａｃａａｇｇｇｔｃｔｇｃ（配列番号：５）
逆方向：ａｇａｇｇａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇａ（配列番号：６）
Ｚｆｐｍ２
順方向：ｇｃｇａａｇａｃｇｔｇｇａｇｔｔｃｔｔｔ（配列番号：７）
逆方向：ｇｇｃｔｇｔｃｃｃｃａｔｃｔｇａｔｔｃ（配列番号：８）
β−Ａｃｔｉｎ
順方向：ｇｃｃｇｇｃｔｔａｃａｃｔｇｃｇｃｔｔｃｔｔ（配列番号：９）
逆方向：ｔｔｃｔｇｇｃｃｃａｔｇｃｃｃａｃｃａｔ（配列番号：１０）
Ｇａｐｄｈ
順方向：ｔｇｇｃａａａｇｔｇｇａｇａｔｔｇｔｔｇｃ（配列番号：１１）
逆方向：ａａｇａｔｇｇｔｇａｔｇｇｇｃｔｔｃｃｃｇ（配列番号：１２）
Ｈｐｒｔｌ
順方向：ｔｃｃｔｃｃｔｃａｇａｃｃｇｃｔｔｔ（配列番号：１３）
逆方向：ｃｃｔｇｇｔｔｃａｔｃｇｃｔａａｔｃ（配列番号：１４）
Ｓｏｘｌ
順方向：ｇｔｇａｃａｔｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃ（配列番号：１５）
逆方向：ｇａｇｇｃｃａｇｔｃｔｇｇｔｇｔｃａｇ（配列番号：１６）
Ｓｏｘ１７
順方向：ｃｔｔｔａｔｇｇｔｇｔｇｇｇｃｃａａａｇ（配列番号：１７）
逆方向：ｇｇｔｃａａｃｇｃｃｔｔｃｃａａｇａｃｔ（配列番号：１８）
Ｓｏｘ７
順方向：ｇｃｇｇａｇｃｔｃａｇｃａａｇａｔｇ（配列番号：１９）
逆方向：ｇｇｇｔｃｔｃｔｔｃｔｇｇｇａｃａｇｔｇ（配列番号：２０）
Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ
順方向：ｃａｇｃｃｃａｃｃｔａｃｔｇｇｃｔｃｔａ（配列番号：２１）
逆方向：ｇａｇｃｃｔｇｇｇｇｔｇａｔｇｇｔａ（配列番号：２２）
Ｋｌｆ４
順方向：ｇａｇｔｔｃｃｔｃａｃｇｃｃａａｃｇ（配列番号：２３）
逆方向：ｃｇｇｇａａｇｇｇａｇａａｇａｃａｃｔ（配列番号：２４）
【０１７４】
ＤＮＡマイクロアレイ解析
Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎマウス発現１３５Ｋアレイ上でＥＳ細胞、ＭＥＦおよびＭ−ｉＰＳ細胞由来の全２本鎖ｃＤＮＡをハイブリット形成し、無料試用のＡｒｒａｙｓｔａｒソフトウェアで結果を解析した。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ中に実装されるＲＭＡアルゴリズムで正規化を計算した（４６）。実験はトリプリケートで行われた。
【０１７５】
対合した細胞型間の差次的発現についての遺伝子毎の試験を、調整ｔ−統計量を用いて実施した（４７）。偽発見率（ＦＤＲ）を制御するため、ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇの手順を用いてｐ値を調整した（４８）。対合細胞型間の差次発現された遺伝子を、１％未満の調整済みｐ値を用いて同定した。
【０１７６】
亜硫酸水素塩配列決定
モック処理およびＭ期処理されたＭＥＦ核、Ｍ−ｉＰＳ細胞およびＣＧＲ８  ＥＳ細胞のＤＮＡ抽出および亜硫酸水素塩配列決定を、先に記載の通り（４９）に実施した。ＤＮＡ抽出前に、Ｆａｃｓａｒｉａ血球計算器を用いてＧＦＰ陽性Ｍ−ｉＰＳ細胞を選別して、フィーダー細胞による汚染を回避した。Ｃ５７ＢＬ／６ＪとＪＦ１バックグラウンド間のＤＮＡ多型を用いて、ＭＥＦとＭ−ｉＰＳ細胞中の対立遺伝子識別を行なった。
【０１７７】
プライマー： 
Ｂｉｓ−Ｏｃｔ４
順方向：ＴＴＡＧＡＧＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＧＴＡＡＧＧＡＴ（配列番号：２５）
逆方向：ＣＣＡＡＴＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡＡＣＣＴＴＡＡＣＣＴＣＴＡＡ（配列番号：２６）
（これらのプライマーはＯｃｔ−４内性コピーのみを増幅する）
Ｂｉｓ−Ｎａｎｏｇ
順方向：ＴＡＡＡＴＴＧＧＧＴＡＴＧＧＴＧＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＴＴＧＧ（配列番号：２７）
逆方向：ＴＡＡＡＡＡＡＣＡＴＣＣＴＣＴＡＡＴＣＴＡＡＡＡＡＣＡＴＣＣ（配列番号：２８）
Ｂｉｓ−Ｓｎｒｐｎ
順方向：ＡＴＴＧＧＴＧＡＧＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡ（配列番号：２９）
逆方向：ＡＣＡＡＡＡＣＴＣＣＴＡＣＡＴＣＣＴＡＡＡＡ（配列番号：３０）
【０１７８】
キメラの生成
（Ｂ６−ＪＦ１）Ｍ−ｉＰＳ細胞をＣＤ１胚盤胞内に注入することによってキメラを生産し、これをその後、偽妊娠のＣＤ１雌の体内に移植した。Ｍ期抽出物で処理したｉＰＳクローンを核型分析により雌雄鑑別した。
【０１７９】
クロマチン画分の精製および分析
透過処理されたＭＥＦ核をＭ期アフリカツメガエル卵子抽出物中で４０分間インキュベートし、５体積のＸＢ緩衝液中で希釈し、０．７Ｍのスクロースクッションを通して５００ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化した。核ペレットを０．２％のトリトンＸ−１００を用いてＸＢ中に再懸濁し、氷上で５分間インキュベートした。５０００ｇで５分間の遠心分離によりクロマチンペレットを回収し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で調整し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。以下の抗体を用いてウェスタンブロット分析を実施した：抗−ｓｅｒ１０リン酸化ヒストンＨ３（Ｏｚｙｍｅ、９７０１Ｓ）、抗−ヒストンＨ３（Ａｂｃａｍ、ａｂｌ７９１）、抗−ＨＰ１α（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３５８４または２６１６）、抗−ヒストン変異体Ｈ３．３（Ａｂｃａｍ、ａｂ６２６４２）、抗−Ｌａｍｉｎ  Ｂ１（Ａｂｃａｍ、ａｂ１６０４８）、抗−Ｈ３Ｋ４ｍｅ２（Ａｂｃａｍ、Ａｂ７７６６）、抗−Ｈ３Ｋ４ｍｅ３（Ａｂｃａｍ、Ａｂ１０１２）、抗−Ｈ３Ｋ９ｍｅ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０７−４４１）、抗−Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（Ｕｐｓｔａｔｅ）、抗−Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３（Ａｂｃａｍ、ａｂ９０５３）、抗−Ｈ４Ｋ８アセチル  （Ａｂｃａｍ、ａｂｌ７６０）、抗−Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０７−４４９）、抗−Ｈ３Ｋ９アセチル（Ａｂｃａｍ、ａｂ４４４１）および抗−アセチルＨ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ０６−５９９）。
【０１８０】
ウイルス組込み
全ての細胞集団（非感染ＭＥＦ、感染ＭＥＦおよび感染され、透過処理され、Ｍ期アフリカツメガエル卵子抽出物または緩衝液でインキュベートされたＭＥＦ）を、感染から２１日後に収穫し、ＤＮＥａｓｙキットを用いメーカーの手順にしたがって、全ＤＮＡを抽出した。その後、上述の通りに定量的ＰＣＲを実施した。定量化データは、２つのゲノム領域の平均に対して、かつ感染されていないＭＥＦのＤＮＡとの関係において正規化された。
【０１８１】
プライマー： 
ＤＮＡ  Ｏｃｔ４
順方向：ａａｇｔｔｇｇｃｇｔｇｇａｇａｃｔｔｔｇ（配列番号：３１）
逆方向：ｔｃｔｇａｇｔｔｇｃｔｔｔｃｃａｃｔｃｇ（配列番号：３２）
ＤＮＡ  Ｋｌｆ４
順方向：ｇｃｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃｃｇａｇａａｔｃ（配列番号：３３）
逆方向：ａｔｇｔｃｃｇｃｃａｇｇｔｔｇａａｇ（配列番号：３４）
ＤＮＡ  Ｓｏｘ２
順方向：ｔｃａａｇａｇｇｃｃｃａｔｇａａｃｇ（配列番号：３５）
逆方向：ｔｔｇｃｔｇａｔｃｔｃｃｇａｇｔｔｇｔｇ（配列番号：３６）
ＤＮＡ  ｃＭｙｃ
順方向：ｇｃｔｇｇａｇａｔｇａｔｇａｃｃｇａｇｔ（配列番号：３７）
逆方向：ａｔｃｇｃａｇａｔｇａａｇｃｔｃｔｇｇｔ（配列番号：３８）
ＤＮＡ  ゲノム１
順方向：ｇｔｃａｃｃｇｔｔｔｇｔｇｃｃｇａａ（配列番号：３９）
逆方向：ａｇｃｔｇａａａｔｇａｇａｃｃｇａｔｔａｔｇｇ（配列番号：４０）
ＤＮＡ  ゲノム２
順方向：ｇａｇｔｃａａａｇａｇｔｇｇｔｇａａｇｇａｇｔｔａｇｔ（配列番号：４１）
逆方向：ａｇｃｔｇａｃｇｇｇｃｃｔｔｃｔａａｇｔｃ（配列番号：４２）
【０１８２】
実施例２の参照文献
2014523744.tif 000004
2014523744.tif 000005
2014523744.tif 000006
2014523744.tif 000007
【図１Ｂ】
2014523744.tif 000008
【図１Ｄ】
2014523744.tif 000009
【図２Ａ】
2014523744.tif 000010
【図２Ｂ】
2014523744.tif 000011
【図２Ｃ】
2014523744.tif 000012
【図２Ｄ】
2014523744.tif 000013
【図２Ｅ】
2014523744.tif 000014
【図２Ｆ】
2014523744.tif 000015
【図２Ｇ】
2014523744.tif 000016
【図２Ｈ】
2014523744.tif 000017
【図２Ｉ】
2014523744.tif 000018
【図２Ｊ】
2014523744.tif 000019
【図２Ｋ】
2014523744.tif 000020
【図２Ｌ】
2014523744.tif 000021
【図２Ｍ】
2014523744.tif 000022
【図２Ｎ】
2014523744.tif 000023
【図２Ｏ】
2014523744.tif 000024
【図２Ｐ】
2014523744.tif 000025
【図２Ｑ】
2014523744.tif 000026
【図２Ｒ】
2014523744.tif 000027
【図２Ｓ】
2014523744.tif 000028
【図２Ｔ】
2014523744.tif 000029
【図２Ｕ】
2014523744.tif 000030
【図３Ａ】
2014523744.tif 000031
【図３Ｂ】
2014523744.tif 000032
【図３Ｃ】
2014523744.tif 000033
【図３Ｄ】
2014523744.tif 000034
【図３Ｅ】
2014523744.tif 000035
【図３Ｆ】
2014523744.tif 000036
【図３Ｇ】
2014523744.tif 000037
【図３Ｈ】
2014523744.tif 000038
【図３Ｉ】
2014523744.tif 000039
【図３Ｊ】
2014523744.tif 000040
【図４Ａ】
2014523744.tif 000041
【図４Ｂ】
2014523744.tif 000042
【図４Ｃ】
2014523744.tif 000043
【図４Ｄ】
2014523744.tif 000044
【図４Ｅ】
2014523744.tif 000045
【図４Ｆ】
2014523744.tif 000046
【図４Ｇ】
2014523744.tif 000047
【図４Ｈ】
2014523744.tif 000048
【図４Ｉ】
2014523744.tif 000049
【図４Ｊ】
2014523744.tif 000050
【図４Ｋ】
2014523744.tif 000051
【図４Ｌ】
2014523744.tif 000052
【図４Ｍ】
2014523744.tif 000053
【図４Ｎ】
2014523744.tif 000054
【図５Ａ−５Ｄ】
2014523744.tif 000055
【図５Ｅ】
2014523744.tif 000056
【図５Ｆ】
2014523744.tif 000057
【図５Ｇ】
2014523744.tif 000058
【図５Ｈ】
2014523744.tif 000059
【図５Ｉ】
2014523744.tif 000060
【図５Ｊ】
2014523744.tif 000061
【図５Ｋ】
2014523744.tif 000062
【図５Ｌ】
2014523744.tif 000063
【図５Ｍ】
2014523744.tif 000064
【図５Ｎ】
2014523744.tif 000065
【図５Ｏ】
2014523744.tif 000066
【図５Ｐ】
2014523744.tif 000067
【図５Ｑ】
2014523744.tif 000068
【図５Ｒ】
2014523744.tif 000069
【図５Ｓ】
2014523744.tif 000070
【図５Ｔ】
2014523744.tif 000071
【図５Ｕ】
2014523744.tif 000072
【図５Ｖ】
2014523744.tif 000073
【図５Ｗ】
2014523744.tif 000074
【図５Ｘ】
2014523744.tif 000075
【図５Ｙ】
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【図５Ｚ】
2014523744.tif 000077
【図５ＡＡ】
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【図５ＡＢ】
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【図６Ｂ】
2014523744.tif 000080
【図６Ｃ】
2014523744.tif 000081
【図７】
2014523744.tif 000082
【図９Ａ】
2014523744.tif 000083
【図９Ｂ】
2014523744.tif 000084
【図１２】
2014523744.tif 000085
【図１Ａ】
2014523744.tif 000086
【図１Ｃ】
2014523744.tif 000087
【図６Ａ】
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【図８】
2014523744.tif 000089
【図１０】
2014523744.tif 000090
【図１１Ａ】
2014523744.tif 000091
【図１１Ｂ】
2014523744.tif 000092
【図１１Ｃ】
2014523744.tif 000093
【配列表】
2014523744000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年5月27日(2014.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
・  第１の細胞の少なくとも１つの透過処理された核、または前記核を含む少なくとも１つの透過処理された第１の細胞［なお前記第１の細胞は、多細胞生物に由来する人工多能性幹細胞、すなわちｉＰＳ細胞である］と；
・  多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の単離された抽出物［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］と；
を含む組成物の、
−  多能性幹細胞または前記多能性幹細胞に由来する組織を得るための方法、または
−  前記プロセスが人間のクローニングを目的としていないことを条件とする、クローニングする方法、
を実施するための使用であって、
場合によっては、前記雌生殖細胞の単離抽出物が、非ヒト雌生殖細胞の単離抽出物であるか、または前記卵子の単離抽出物が非ヒト卵子の単離抽出物であり得る、前記組成物の使用。
【請求項２】
・  第１の細胞の少なくとも１つの透過処理された核、または前記核を含む少なくとも１つの透過処理された第１の細胞［なお、前記第１の細胞は多細胞生物に由来し、前記第１の細胞は人工多能性幹細胞すなわちｉＰＳ細胞であり、前記ｉＰＳは、少なくとも
−  Ｏｃｔファミリー成員タンパク質およびＳｏｘファミリー成員タンパク質、ならびに
−  Ｋｌｆファミリー成員タンパク質およびＭｙｃファミリー成員タンパク質か、
−  あるいはＮａｎｏｇ成員タンパク質およびＬＩＮ２８成員のいずれか、
をコードする遺伝子の組合せを発現する］と；
・  多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の単離抽出物［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］と；
を含む組成物。
【請求項３】
前記雌生殖細胞が、好ましくは哺乳動物、詳細にはヒト、鳥類、爬虫類および両生類の中から選択される脊椎動物の雌生殖細胞であって、場合によっては、前記雌生殖細胞の単離抽出物が非ヒト雌生殖細胞の単離抽出物であるか、または前記卵子の単離抽出物が非ヒト卵子の単離抽出物であり得る、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記雌生殖細胞がアフリカツメガエル細胞である、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
人間をクローニングするためのプロセスでないことを条件として、第１の細胞の少なくとも１つの透過処理された核または前記核を含む少なくとも１つの透過処理された第１の細胞［なお、前記第１の細胞は多細胞生物に由来し、前記第１の細胞は、人工多能性幹細胞すなわちｉＰＳ細胞である］と、多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の（単離）抽出物［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断されており、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］とを接触させるステップを含む、多能性幹細胞の生産方法。
【請求項６】
−・  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質の第１の組成物か、
・  あるいはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質の第２の組成物のいずれか、
と分化した体細胞とを接触させるステップにより、ｉＰＳ細胞である第１の細胞を得るステップと；
−  先行するステップで得た前記第１の細胞を透過処理して、透過処理されたｉＰＳ細胞を得るステップと；
−  多細胞生物の雌生殖細胞または卵子の（単離）抽出物と前記透過処理されたｉＰＳ細胞とを接触させるステップ［なお前記卵子は減数分裂の中期ＩＩにおいて遮断され、前記抽出物はＥＧＴＡを含む］と；
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記雌生殖細胞が、好ましくは哺乳動物、詳細にはヒト、鳥類、爬虫類および両生類の中から選択される脊椎動物の雌生殖細胞であり、有利には、前記雌生殖細胞の単離抽出物が非ヒト雌生殖細胞の単離抽出物であるか、または前記卵子の単離抽出物が非ヒト卵子の単離抽出物であり、好ましくは前記生殖細胞がアフリカツメガエル細胞である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
・  Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質の第１の組成物か、
・  あるいはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質の第２の組成物のいずれか、
と分化した体細胞とを接触させるステップにおいて、第１の組成物または第２の組成物がそれぞれ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質あるいはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質をコードする核酸を少なくとも含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃタンパク質またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬＩＮ２８タンパク質をコードする前記少なくとも１つの核酸が、少なくとも１つのウイルスベクター、好ましくは少なくとも１つのレトロウイルスベクター、詳細には少なくとも１つの組込み型レトロウイルスベクターの中に含まれている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの組込み型レトロウイルスベクターが、前記分化体細胞のゲノム内に組込まれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記多能性幹細胞の多能性の維持を可能にする培地内で先行ステップにおいて得られた細胞を培養するステップをさらに含む、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
人間をクローニングするためのプロセスではないことを条件として、
−  請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法において定義されている多能性幹細胞の生産ステップと；
−  前記多能性幹細胞が由来する種と同じ種の動物の除核卵子内に前記多能性幹細胞の核を移植して、アロ有核卵子を得るステップと；
を含む、動物、好ましくは哺乳動物をクローニングするための方法。
【請求項１３】
所望の分化段階で、多細胞生物、詳細には脊椎動物の細胞、細胞株または組織を得るための方法において、
−  請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法において定義されている多能性幹細胞の生産ステップと；
−  所望の分化段階で細胞、細胞株または組織を得るための適切な条件下で、多能性幹細胞を培養するステップと；
を含む方法。
【国際調査報告】
2014523744.tif 000094
2014523744.tif 000095
2014523744.tif 000096
2014523744.tif 000097
2014523744.tif 000098