(57)【要約】  ＦＭＳを阻害する薬物による治療と相関するバイオマーカーを開示する。該化合物に対する応答を評価するための有用性をこのバイオマーカーが有することが示された。このバイオマーカーの血漿レベルがＦＭＳ阻害化合物による治療の際に上昇したことは、このバイオマーカーがＦＭＳ活性に関与することを示している。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＭＳ活性を阻害する薬物による治療に対する細胞応答を予測するバイオマーカー。
【請求項２】
前記バイオマーカーが、ＦＭＳ活性を阻害する薬物による治療に対する、ヒトである被験体又は他の動物の応答を予測するものである、請求項１に記載のバイオマーカー。
【請求項３】
細胞内のＦＭＳ活性を阻害する能力が薬物にあるかどうかを予測する方法であって、ａ）前記薬物の投与前に第１の細胞試料を入手し、前記薬物の投与後に第２の細胞試料を入手する工程と、ｂ）前記第１の細胞試料及び前記第２の細胞試料におけるＣＳＦ−１レベルを測定する工程と、ｃ）前記ＣＳＦ−１レベルを比較する工程と、ｄ）ＣＳＦ−１の任意の変化を、前記細胞におけるＦＭＳ活性を阻害する前記薬物の能力あるいは無能力と相関する工程と、を含む、方法。
【請求項４】
請求項３の方法が、ヒトである被験体又は他の動物におけるＦＭＳ活性を阻害する能力が薬物にあるかどうかを予測するための方法であって、ａ）前記薬物の投与前に第１の血清又は血漿の試料を入手し、前記薬物の投与後に第２の血清又は血漿の試料を入手する工程と、ｂ）前記第１の血清又は血漿の試料及び前記第２の血清又は血漿の試料におけるＣＳＦ−１レベルを測定する工程と、ｃ）前記ＣＳＦ−１レベルを比較する工程と、ｄ）ＣＳＦ−１の任意の変化を、前記ヒトである被験体又は他の動物におけるＦＭＳ活性を阻害する前記薬物の能力あるいは無能力と相関する工程と、を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＦＭＳの活性を阻害する能力のある候補薬物のスクリーニングの方法であって、ａ）試験薬物を細胞試料と接触させる工程と、ｂ）前記細胞試料におけるＣＳＦ−１レベルを増加する試験薬物を候補薬物として選択する工程と、を含む、方法。
【請求項６】
請求項５の方法が、ヒトである被験体又は他の動物におけるＦＭＳ活性を阻害する能力のある候補薬物をスクリーニングする方法であって、ａ）試験薬物をヒトである被験体又は他の動物と接触させる工程と、ｂ）前記ヒトである被験体又は他の動物におけるＣＳＦ−１の血清又は血漿レベルを増加する試験薬物を候補薬物として選択する工程と、を含む、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００７年１０月３１日に出願された出願第６０／９８４，１２２号に対する優先権を主張し、その出願の全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概して、薬力学の分野に関するものであり、より具体的には、癌患者を含む患者における薬物感度を特定するための材料、方法及び手順に関する。本発明は、分子レベルでの患者の応答に基づいて病気及び障害を治療するための助けとなる。
【背景技術】
【０００３】
ＦＭＳの活性を低減又は阻止する多くの薬物が現在開発されつつある。例えば、米国公開特許第２００６−０１４８８１２−Ａ１号及び同第２００６−０１８９６２３−Ａ１号が参照され、その出願の全文は参照により本明細書に組み込まれる。予測マーカーは、医療でそのような薬物に対する患者の応答を正確に予知するために必要である。そのようなマーカーは、一人一人の患者に合った個別の治療を容易にするであろう。
【０００４】
本発明は、ＦＭＳを低減又は阻止する薬物での治療又は療法に対する患者の感度をよりよく予測することができるバイオマーカーの同定を目的とする。このマーカーを薬物治療への患者の応答と関連づけることは、応答しない患者のための薬物開発の新しい機会をもたらすことを可能にし、また、その効能に対する確信が強まることにより、１つの薬物の適応症をその他の治療選択肢から区別することを可能にする。更に、薬物又は組み合わせ療法に良好に応答する可能性の高い患者を予め選択することで、治験に必要な患者数を減らすこと、又は、試験開発プログラムを完了するために必要な時間を短縮することが可能である（Ｍ．コケット（M. Cockett）ら、２０００年、「現代のバイオテクノロジーの見解（Current Opinion in Biotechnology）」１１：６０２〜６０９）。
【０００５】
研究の主目標は、医療で与えられた患者の薬物応答を正確に予測するマーカーを同定することである。そのような個別の評価は、個人に合った治療を大いに促進することができる。このような性質のアプローチは、一般に使用される薬物が、多くの患者にとって効果がなく、また副作用が頻繁な、癌の治療及び療法で特に必要とされる。薬物応答は標的細胞に固有の特性及び宿主の代謝特性の両方を反映するため、患者の薬物感度を予測する能力は、特に困難である。
【０００６】
当該技術では、病気及び障害、特に癌を治療するために、分子レベルでの患者応答に基づき、患者の薬物感度を特定するための材料、方法、及び手順を必要としている。本発明は、ＦＭＳを低減又は阻止する薬物と薬物感度を相関するバイオマーカーの同定に関する。マーカーを同定する本明細書の説明は、ＦＭＳを低減又は阻止する薬物への応答を予測するためにこのマーカーが使用される臨床状況もまた広く含むことができる。
【０００７】
バルトッチ（Bartocci）ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：６１７９〜６１８３（１９８７年））は、肝臓マクロファージによってマウスの循環ＣＳＦ−１がクリアされたことを開示している。このクリアランスは、明らかに、ＣＳＦ−１受容体媒体エンドサイトーシス及び細胞内破壊による。
【０００８】
カールバーグ（Carlberg）ら（「ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ」、１０（４）：８７７〜８８３（１９９１年））は、ＣＳＦ−１の結合誘導による内在化及び受容体の劣化を開示しており、キナーゼに欠陥のある変異受容体の劣化率は低減されたが除去はされなかった。
【０００９】
シューミン（Xu-Ming）ら（「Ｂｌｏｏｄ」、９９（１）：１１１〜１２０（２００２年））は、マウスのＣＳＦ−１受容体遺伝子の不活性化が循環ＣＳＦ−１の２０倍の上昇をもたらしたことを開示している。
【００１０】
アーバイン（Irvine）ら（「ＦＡＳＥＢ  Ｊ．」、２０：１３１５〜１３２２（２００６年））は、ＣＹＣ１０２６８がＣＳＦ−１受容体の阻害物質であることを開示しており、２０分間のＣＳＦ−１の曝露の後にＣＳＦ−１誘導受容体の欠乏は阻害されなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＣＳＦ−１の血清又は血漿レベルの上昇がＦＭＳ受容体の阻害と相関していることの同定に関する。この「マーカー」は、宿主の薬物応答及び／又は薬物治療の予測において有用性を示す。
【００１２】
本発明の一観点において、ＦＭＳを調節する薬物で治療可能な病気を有する患者の治療を監視する方法を提供する。これは、ＦＭＳ活性を阻害する薬物での治療前及び治療後の患者からのＣＳＦ−１の血清又は血漿レベルを比較することにより達成される。したがって、血清又は血漿ＣＳＦ−１に観察される増加の相関に基づき、患者の応答がＦＭＳ阻害化合物による治療に対して敏感になれば、患者の治療予後は好ましいと限定でき、治療を継続できる。また、薬物による治療後に患者のＣＳＦ−１の血清又は血漿レベルが増加しなければ、それは、現行の治療を修正又は変更、あるいは中止さえすべきであるという指標として使うことができる。そのような監視プロセスは、薬物による患者の治療の成功又は失敗を示すことができ、この監視プロセスは、必要又は所望に応じて繰り返すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】化合物１（賦形剤及び丸を除く全データ）及び別の化合物（丸）の存在下及び欠如下における生体外骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）によるＣＳＦ−１のクリアランスを示す線形−線形プロット。化合物１の構造を次に示す。
【００１４】
【化１】
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【図２】線形回帰分析によるログ線形プロットであり、化合物１の存在下及び欠如下での生体外ＢＭＤＭによるＣＳＦ−１のクリアランス。
【図３】３Ａ及び３Ｂは、血漿中のＭＭＣＳＦ−１レベルに化合物２（５ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇ）及び化合物１（４０ｍｇ／ｋｇ）が与える影響。化合物２の構造を次に示す。
【００１５】
【化２】
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【００１６】
化合物２及びその使用は、米国特許出願第２００５００４９２７４Ａ１号に開示されている。
【図４】化合物２（５ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇ）及び化合物１（４０ｍｇ／ｋｇ）が子宮のマクロファージ含有量に与える影響。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書で引用する全ての刊行物は、参照することにより組み入れられるものとする。特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１８】
定義
本明細書で使用するとき、「含む」、「含有する」、「有する」及び「包含する」は、これらのオープンで非限定的な意味で用いられる。
【００１９】
本明細書で使用するとき、「生体試料」という用語は、被験体から単離された細胞又は生体液のような、細胞又は組織物質を含有する又はそれから成る試料を指す。「被験体」は、治療、観察又は実験の対象となっている、ラット、マウス、サル、又はヒトのような哺乳類であってもよい。生体試料の例としては、例えば、痰、血液、血球（例えば、白血球）、羊水、血漿、血清、精液、唾液、骨髄、組織又は細針生検試料、尿、腹水、胸水及び細胞培養物（cell cultures）が挙げられる。生体試料はまた、組織学的目的のためにとられた凍結切片のような、組織の切片を含んでもよい。試験生体試料は、分析、モニタリング、又は観察の対象となっている生体試料である。対照生体試料は、試験生体試料に対するポジティブ又はネガティブコントロールのいずれかであってもよい。しばしば、対照生体試料は、試験生体試料のものと同種の関心組織、細胞及び／又は生体液を含有する。具体的な実施形態では、生体試料は「臨床試料」であり、これはヒト患者由来の試料である。
【００２０】
「細胞」は、検出方法の感度に対して適当な、少なくとも１つの細胞又は複数の細胞を指す。細胞は、培養された細胞培養物中に存在してもよい。細胞はまた、生体組織又は生体液のような、その天然の環境に存在してもよい。本発明に好適な細胞は細菌細胞であってもよいが、好ましくは真核細胞、最も好ましくは哺乳類細胞である。
【００２１】
「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に用いられ、アミノ酸残基がペプチド結合又は修飾ペプチド結合により結合したアミノ酸鎖を指す。アミノ酸鎖は、２アミノ酸を超える任意の長さのものであってもよい。特に指定のない限り、「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」という用語は、その種々の修飾形態をも包含する。かかる修飾形態は、自然発生的に修飾された形態であっても化学的に修飾された形態であってもよい。修飾形態の例としては、グリコシル化形態、リン酸化形態、ミリストイル化形態、パルミトイル化形態、リボシル化形態、アセチル化形態、ユビキチン化形態等が挙げられるが、これらに限定はされない。修飾としては、分子内架橋、及び、脂質、フラビン、ビオチン、ポリエチレングリコール又はその誘導体のような種々の部分への共有結合等も挙げられる。更に、修飾はまた、環化、分枝及び架橋も含む。更に、遺伝子のコドンによりコードされた従来の２０種のアミノ酸以外のアミノ酸もまた、ポリペプチドに含まれることができる。
【００２２】
「単離されたタンパク質」は、タンパク質の天然源中に存在する他のタンパク質の少なくとも１つから実質的に分離されたものであるか、又はタンパク質が化学的に合成される場合、化学的前駆体若しくは他の化学物質の少なくとも１つを実質的に含まない。タンパク質は、約３０％、２０％、１０％又は５％（乾燥重量）未満の他のタンパク質又は他の化学物質（本明細書では「夾雑タンパク質」又は「夾雑化学物質」とも呼ばれる）が存在する場合、タンパク質の調製時に他のタンパク質若しくは他の化学物質「から実質的に分離される」又は他のタンパク質若しくは他の化学物質「を実質的に含まない」。
【００２３】
単離されたタンパク質は、いくつかの異なる物理的形態を有することができる。単離されたタンパク質は、完全長の新生若しくは未加工ポリペプチドとして、又は部分的に加工されたポリペプチドとして、又は加工されたポリペプチドの組み合わせとして存在できる。完全長の新生ポリペプチドは、完全長の新生ポリペプチドの断片形成をもたらす特異的タンパク質分解的切断により翻訳後（postranslationally）に修飾されてもよい。断片又は断片の物理的結合は、完全長ポリペプチドに関連する生物活性を有することができるが、個々の断片に付随する生物活性の程度は異なり得る。
【００２４】
単離されたタンパク質は非自然発生的ポリペプチドであってもよい。例えば、「単離されたポリペプチド」は、「ハイブリッドポリペプチド」であってもよい。「単離されたポリペプチド」はまた、アミノ酸の追加又は欠失又は置換による自然発生的ポリペプチド由来のポリペプチドであってもよい。単離されたポリペプチドはまた、他の細胞成分、他のポリペプチド、ウイルス性物質、若しくは培地、又はポリペプチドが化学的に合成される場合、化学的前駆体若しくは化学合成に付随する副生成物を実質的に含まない、実質的に均質な製剤中の特定のポリペプチドを意味するために本明細書で使用される「精製ポリペプチド」であってもよい。「精製ポリペプチド」は、当業者に明らかになるように、標準的な精製技術又は化学合成によって、天然又は組み換え宿主細胞から得ることができる。
【００２５】
本発明は、ＣＳＦ−１の血清又は血小板レベルが、ＦＭＳの機能又は活性の直接又は間接の阻害又は拮抗作用によってＦＭＳ活性に影響する薬物応答を予測するための有用な分子ツールとして働くことの同定を説明する。
【００２６】
また、本発明は、ＦＭＳ活性と相互作用する薬物か、又はＦＭＳ活性を阻害する薬物を使う薬物治療の進捗を監視する監視アッセイを提供する。そのような生体外アッセイは、ＦＭＳ活性を阻害する薬物による治療前と治療後のＣＳＦ−１の血清又は血漿レベルを比較することによって、ＦＭＳを調節又はＦＭＳと相互作用する薬物によって治療可能な病気を有する患者の治療を監視することができる。患者から単離した細胞を検定し、好ましくはＦＭＳ阻害剤である薬物への曝露前及び曝露後のＣＳＦ−１レベルを測定し、変化の有無によって、別の薬物による治療の正当性あるいは現行治療を中止すべきかを決定する。
【００２７】
別の実施形態において、ヒトのＦＭＳバイオマーカーを用いて、多様な薬物スクリーニング技術で治療薬をスクリーニングすることができる。
【００２８】
本明細書で使用される用語「薬物」は、薬物治療として又は薬物製剤中に使用することが可能な物質を指す。本質的に、いかなる化学化合物も、本発明によるアッセイで薬物として使用できる。被験化合物は、任意の小さい化学化合物であってもよく、また、生物学的実体（例えば、アミノ酸鎖、タンパク質、糖、核酸、又は脂質）であってもよい。試験化合物は、通常、小化学分子及びペプチドである。概して、潜在的調整物質（potential modulators）として使用される化合物は、水性又は有機（例えばＤＭＳＯベース）溶液中に溶解することができる。これらのアッセイは、アッセイ工程を自動化し、任意の便利なソースから化合物を提供することによって、大きい化学ライブラリをスクリーニングするために設計される。アッセイは、通常、並列に、例えばロボットアッセイでは、マイクロタイタープレート上でマイクロタイターフォーマットにて実行される。数多くの化学化合物供給元があり、例えば、シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich）（ミズーリ州セントルイス）及び、フルカケミカ−バイオケミカアナリティカ（Fluka Chemika-Biochemica Analytika）（スイス、Buchs）が挙げられる。化合物は、また、当該技術分野で既知の方法により合成することができる。
【実施例】
【００２９】
本明細書の実施例は、本発明を実行する際の様々な観点を例示することを意図するものであって、本発明の範囲を限定する意図は一切ない。
【００３０】
（実施例１）
生体外骨髄由来マクロファージによるＣＳＦ−１のクリアランスは、化合物１によって阻害された。
【００３１】
化合物１は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１０ｍＭストックとして提供された。組み換えマウスＣＳＦ−１（４１６  ＭＬ  ０５０）及びマウスＣＳＦ−１  ＥＬＩＳＡ（ＭＮＣ００）は両方ともＲ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems Inc.）（ミネソタ州ミネアポリス）から購入した。
【００３２】
マウス骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を調製し、培養物（１０％ＦＣＳ及びグルタミンペン−ストレプ（glutamine PenStrep）含有αＭＥＭ）及びＣＳＦ−１  ２５ｎｇ／ｍｌの存在下で１２のウェルプレートに、約６０％の密集度が達成されるまで３日間置いた。次に培養物を、ＣＳＦ−１を伴わずに培地で２回洗浄し、ＣＳＦ−１の欠如下で２時間培養して、ウェルに残留している可能性のあるＣＳＦ−１をマクロファージに消費させた。次に、培養物を調製して、表１（実験設計）に示すようにＣＳＦ−１及び化合物１を含ませ、３７℃及び５％のＣＯ2で培養を続けた。いくつかのウェルは細胞を有さず、デバイスバインディング及びＣＳＦ−１の安定のための対照としての役割りを果たす。時間をおいて（０、１．１、２．３、４．９、１０．３、１９．９、２９及び４４時間）、調整培地５０μｌをそれぞれのウェルから取り除き、冷蔵保存した。最終時点で収穫した後、全ての試料をＣＳＦ−１  ＥＬＩＳＡにさらした。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
それぞれのウェルのＣＳＦ−１濃度（ｐｇ／ｍｌ）対時間を、線形−線形及びログ線形の形式でプロットした。消費は、最初の４．９時間にかけてログ線形であった。４．９時間にかけてのそれぞれのウェルのＣＳＦ−１消費を表す最適な線形等式を計算するためにＥｘｃｅｌを使い、相対消費率を決定するためにスロープを使った。
【００３５】
結果
細胞欠如では、組み換えマウス（murine）ＣＳＦ−１は、現在の培養条件（３７℃、５％ＣＯ2、１ｍｌ／ウェル（１２ウェルプレートのウェル））で４４時間安定であった（図１）。組み換えＣＳＦ−１欠如のＢＭＤＭの条件培地は、検出可能なＣＳＦ−１を含まなかった。１ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１をＢＭＤＭに加えた後、最初の数時間、ＣＳＦ−１は毎時約３７％の率で消費された。化合物１は、用量に依存してＣＳＦ−１の消費を阻害した。消費率は、０．００１、０．０１、０．１、及び１μＭの化合物１で、それぞれ、１６、５６、６４、及び６４％低減した。
【００３６】
考察
ここで、３つのことが発見された。第１に、ＢＭＤＭは培地からＣＳＦ−１を効果的にクリアした。１ｍｌの培地で１ｎｇのＣＳＦ−１にさらされたとき、１２ウェルプレート内の単層（〜６０％コンフルエント）のＢＭＤＭは毎時約３７％の率でＣＳＦ−１をクリアした。第２に、消費率に基づき、化合物１によってクリアランスの一部（〜６４％）を阻害することができた。ＣＳＦ−１誘導ＢＭＤＭ増殖（０．００２６μＭ）の阻害では、化合物１のＩＣ50と一致した、消費の半最大限の阻害が０．００１μＭ〜０．０１μＭの化合物１で生じた。（データ図示せず。）したがって、この部分のクリアランスは、おそらくＦＭＳキナーゼ依存型である。第３に、一部分（〜３６％）は、１μＭの化合物１でさえ阻害されなかった。この濃度はＩＣ50値の１００〜１０００倍であるので、ＦＭＳキナーゼが最大に阻害されたと仮定することができ、これは、すでに０．１μＭの化合物１で達成されたクリアランスのプラトー効果と一致する結論である。ＣＳＦ−１クリアランスの阻害されなかった部分は、ＦＭＳキナーゼ独立型であることが可能である。この研究は、ＦＭＳキナーゼ独立型を、他の可能なＦＭＳ独立型機構と区別することはしない。全体として、生体内データは、化合物１によって引き起こされる生体内のＣＳＦ−１の上昇、すなわちＦＭＳキナーゼを媒介とするＣＳＦ−１のクリアランスの直接的阻害と、組織のマクロファージの欠乏によるクリアランスの間接的阻害とのための機構的ベースを提供する。
【００３７】
これまで誰も、マクロファージによるＣＳＦ消費におけるＦＭＳキナーゼ阻害物質の役割りの調査をしていない。しかし、ＦＭＳ内在化及び劣化におけるＦＭＳキナーゼの役割りを調査した研究がいくつかある。カールバーグ（Carlberg）らは、野生型とＦＭＳＡ６１４キナーゼ死亡変異体のＣＳＦ−１の誘導内在化率を比較した。ＣＳＦ−１曝露の最初の５分間に、野生型の約８５％及びキナーゼ死亡ＦＭＳの３５％が内在化した。したがって、受容体内在化の有意な部分（〜４１％）はＦＭＳキナーゼ独立型であり、我々のＣＳＦ−１消費研究と一致している。より最近では、アーバイン（Irvine）らが、新たに記述されたＦＭＳキナーゼ阻害物質であるＣＹＣ１０２６８の、ＢＭＤＭでのＣＳＦ−１誘導ＦＭＳ内在化に与える効果を研究した。ＣＳＦ−１依存型ＦＭＳリン酸化反応を著しく阻害したＣＹＣ１０２６８の濃度では、２０分でＦＭＳ内在化を低減することができなかった。これらの研究を総合し、我々は、ＦＭＳ内在化及びＣＳＦ−１クリアランスのためのＦＭＳキナーゼ依存型経路及び独立型経路が存在すると結論付ける。
【００３８】
結論
マクロファージはＣＳＦ−１を消費する。マクロファージを媒介とする消費のほぼ３分の２は、化合物１により阻害することができ、したがって、ＦＭＳキナーゼ依存型である。これらのデータは、化合物１の用量投与後の血漿ＣＳＦ−１の上昇の機構的ベースを提供する。ＣＳＦ−１の消費の３分の１強は、化合物１により阻害されず、したがって、第２の、キナーゼ独立型の消費経路を示唆する。
【００３９】
（実施例２）
ラットにおけるＦＭＳ阻害物質（化合物２及び化合物１）の忍容性及びバイオマーカー応答の検査
メスのスプラーグダウリーラット（ｎ＝５）の群に、５若しくは１５ｍｇ／ｋｇの化合物２、又は４０ｍｇ／ｋｇの化合物１を１日２回連続５日、経口投与し、化合物の忍容性を特性化した。賦形剤又は４０ｍｇ／ｋｇの化合物１で治療したラットの追加群は、様々なパラメータの中間的分析のために、１日目及び３日目の午前投与の１時間後に終了した。肝臓組織学評価を伴う標準剖検及び標準血液学・血清学を含む死後分析を、治療した全ての動物で実行した。予定の終了の前に、死亡又は安楽死（瀕死）した動物はなかった。いずれの治療も、体重、又は選択した器官（肝臓、胸腺、脾臓及び子宮）の器官対体重比に影響しなかった。両方の化合物で、５日目までにＣＳＦ−１の血漿濃度の上昇（４〜６倍）が見られた。どちらの化合物も、試験の最高用量で５日目に子宮内マクロファージ数が減少（化合物２では最高〜６０％）したが、このパラメータは特にばらつきがある。これらの化合物は、用量を制限する明らかな毒性を生成しなかった。
【００４０】
本研究は、２つのＦＭＳ／ＦＬＴ３チロシンキナーゼ抑制剤である化合物２及び化合物１の忍容性及び付随するバイオマーカー応答を特性付ける。
【００４１】
化合物２及び化合物１は合成した。試験品は−２０℃で乾燥保管した。ヒドロキシプロピル−ｂ−シクロデキストリン（ＣＡＳ番号１２８４４６−３５−５、シグマ）を２０％（Ｗ：Ｖ）水溶液として調製し、試験品製剤の賦形剤及び試験品の投与用賦形剤対照として使用した。
【００４２】
化合物２は、２．７８ｍｇ／ｍｌ及び８．３３ｍｇ／ｍｌの２０％ＨＰｂＣＤ透明溶液として毎日新しく調製し、１ｋｇ当たり５及び１５ｍｇを送達した。化合物１は、２１．９ｍｇ／ｍｌの２０％ＨＰｂＣＤ透明溶液として毎日新しく調製し、４０ｍｇ／ｋｇを送達した。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
０日目にラットの耳にタグ付けし、治療群にランダムに割り当て（群１及び４はｎ＝１５、群２及び３はｎ＝５）、体重測定し、賦形剤（２０％ＨＰｂＣＤ）又は試験品で表２（治療群の割り当て）のように治療（１日２回経口投与）した。
【００４５】
１日目及び３日目の午前投与の１時間後に、ＣＯ2窒息を用いて１群及び４群の５匹のラットを安楽死させ、心穿刺により放血させた。血液試料（〜５００μＬ）を別々のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ミクロテナーに移し、アドビア（Advia）１２０血液学システム（バイエルダイアグノスティクス（Bayer Diagnostics）、ニューヨーク州タリータウン）を用いて完全血球算定（ＣＢＣ）を行った。追加的な血液試料を別々のミクロテナーに（抗凝血剤あり又はなしに）移し、バイオマーカー（すなわちＭＣＳＦ−１）及び血清学（すなわちＡＳＴ／ＡＬＴ）分析のために処理した。肝臓及び胸腺は重量を測定し、廃棄した。脾臓は重量を測定し、瞬間凍結し、子宮（卵巣を伴わず）は重量を測定して１０％緩衝ホルマリンに静置した。マクロファージ特定（ＥＤ−１）抗体を用いて、子宮のマクロファージ含有量を免疫組織化学的に測定した。
【００４６】
５日目に、二酸化炭素を用いてラットを安楽死させ、心穿刺により放血させた。血液試料（〜５００μＬ）を収集し、上述のようにＣＢＣ、バイオマーカー分析、血液学分析用に処理した。肝臓、脾臓、胸腺及び子宮（卵巣を伴わず）を隔離し、重量を測定し、緩衝ホルマリンに静置した。大腿と共に右膝を隔離し、トリムし、ホルマリンに静置した。左大腿を隔離し、骨髄細胞数を測定した。肝臓の組織病理学も行った。
【００４７】
データ分析
治療群と対照群との差をダンネットの多重比較検定及びＡＮＯＶＡにより統計的に解析した（ｐ値は*：＜０．０５、**：＜０．０１）。
【００４８】
結果
１５ｍｇ／ｋｇのＦＭＳ阻害物質化合物２及び４０ｍｇ／ｋｇの化合物１で連続５日治療したラットでは、ＣＳＦ−１血漿濃度の増加が対照の４〜６倍であった（図３Ａ）より低い投与量（すなわち５ｍｇ／ｋｇ）の化合物２は、ＣＳＦ−１血漿濃度に有意に影響しなかった。研究期間中の特定の日に行った、４０ｍｇ／ｋｇの化合物１治療ラットの血漿ＣＳＦ−１濃度検査で、平均ＣＳＦ−１濃度は１日目、３日目及び５日目にそれぞれ１１２、３１４及び５２６ｐｇ／ｍｌであり、５日目に観察されたこの因子の上昇レベルが徐々に起きたことを示すものであった（対照値は〜７５ｐｇ／ｍｌ、図３Ｂ）。
【００４９】
ＦＭＳ阻害物質によるラットの治療が、膣内ＥＤ−１陽性マクロファージの数を減少することが発見された。対照の膣は高強度（顕微鏡）照野につき２００個のＥＤ−１陽性細胞を含んでおり、一方、化合物２による治療は、これらの照野当たりの細胞数の、用量に依存する減少（最高６０％）を引き起こした（図４）。化合物１での治療は、また、子宮のマクロファージ含有量も減少したが、このパラメータは特にばらつきがあり、化合物２のみが１５ｍｇ／ｋｇで有意な影響を誘導した（ｐ値＜０．０５）。
【００５０】
結論
５若しくは１５ｍｇ／ｋｇの化合物２又は４０ｍｇ／ｋｇの化合物１での、メスのスプラーグダウリーラットの連続５日治療（１日２回、経口）では、外観、行動、体重、又は肝臓・脾臓・胸腺を含む特定器官の器官対体重比に観察可能な影響がなかった。両方の化合物で、５日目までに対照レベルを超えるＣＳＦ−１血漿濃度の増加が見られた。どちらの化合物も、試験の最高用量で５日目に子宮内マクロファージ数が減少したが、このパラメータは非常にばらつきがある。これらの化合物は、用量を制限する明らかな毒性を生成しなかった。
【００５１】
このバイオマーカーを本発明に従って使用し、患者のＦＭＳ治療応答を評価することができる。例えば、臨床応答を予測するために、ＦＭＳの阻害若しくは阻害の欠如を特定することができる。
【００５２】
（実施例３）
効能研究に適切な用量を同定するために、ラットにおける薬力学活性を特定した。循環ＣＳＦ−１は、ＦＭＳキナーゼ活性に部分的に依存するプロセスにおいてＦＭＳによって結合及び内在化されると、正弦波形状マクロファージによってクリアされる。ＣＳＦ−１レベルは、ＦＭＳが阻害されたとき、又はＦＭＳの阻害がマクロファージの数／機能を低減したときに上昇する。子宮のマクロファージは短命で、ＦＭＳ依存型である。したがって、子宮のマクロファージ密度及び血漿ＣＳＦ−１レベルの定量化は、４日間投与後のラットにおける測定可能な薬力学終点を提供した。
【００５３】
方法：チャールズリバー（Charles River）のメスのスプラーグダウリーラット（体重１５０〜２００ｇ）に賦形剤又は１０及び４０ｍｇ／ｋｇの化合物３を４日間、１日２回経口投与した。５日目に最終投与し、２時間後にこれらのラットを犠牲にした。ラットはＣＯ2窒息により安楽死させ、心穿刺により放血させた。血液のアリコート（１０００ｍｌ）をＥＤＴＡ管に移し、血漿及び血漿化合物、並びにＣＳＦ−１バイオマーカーレベルの測定のために処理した。加えて、血液のアリコート（〜２ｍｌ）を、凝血剤を含まないミクロフュージ（microfuge）管に移し、室温で１時間培養した後、遠心分離によって血清を準備した。
【００５４】
脾臓、肝臓及び子宮（卵巣を含まず）を隔離し、重量を測定し、子宮はホルマリンに静置した。子宮の切片をＥＤ１で染色し、イメージプロプラス（Image-Pro Plus）ソフトウェアを用いて倍率２００でＥＤ−１染色エリア（任意のユニット）を測定した。
【００５５】
結果：１０及び４０ｍｇ／ｋｇ最終投与後２時間の化合物３平均血漿レベルは、それぞれ２５３７ｎｇ／ｍｌ及び５３７０ｎｇ／ｍｌであった。ＣＳＦ−１レベルは、４０ｍｇ／ｋｇの化合物３を投与したラットでは５．５倍上昇し、１０ｍｇ／ｋｇの化合物３を投与したラットでは４．５倍上昇した（表３）。子宮マクロファージは１０ｍｇ／ｋｇで５１％、４０ｍｇ／ｋｇで８１％、それぞれ消耗された。４０ｍｇ／ｋｇ投与ラットに存在するマクロファージは正常な網目状モホロジーを有さず、ＥＤ−１染色は大きい丸細胞か細胞破片と見られるもののいずれかに集中していた。ＣＳＦ−１の上昇及びマクロファージの低減に基づき、１０及び４０ｍｇ／ｋｇは堅固な薬力学活性を伴う用量であると同定された。
【００５６】
【表３】
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*値はマウスＣＳＦ−１ＥＬＩＳＡ（（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems））を用いて測定した。ラットＣＳＦ−１に対する正確なレベルの交差反応性は未知である。これらの値は、おそらく真の濃度より低い予測である。比較のために、このＥＬＩＳＡは、正常なマウス血漿で〜１０００ｐｇ／ｍｌのＣＳＦ−１を検出する。
【００５７】
化合物３の構造を次に示す。
【００５８】
【化３】
2011502266.tif 000008
【００５９】
化合物３のような化合物及びそれらの使用は、米国特許出願第２００７００６０５７７Ａ１号及び同第２００７００６０５７８Ａ１号に開示されている。
【００６０】
（実施例４）
【００６１】
【表４】
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*値はマウスＣＳＦ−１ＥＬＩＳＡ（（Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems））を用いて測定した。ラットＣＳＦ−１に対するレベルの交差反応性は未知である。これらの値は、おそらく真の濃度より低い予測である。比較のために、このＥＬＩＳＡは約１０００ｐｇ／ｍｌのＣＳＦ−１を正常なマウスの血漿中に検出する。ＡＤＭＥ０７−３３４*  ｐ＜０．０５対賦形剤。**  ｐ＜０．００５対賦形剤。
【００６２】
結果：１０、２０及び５０ｍｐｋの最終投与後２時間の化合物４の平均血漿レベルは、それぞれ１４１４ｎｇ／ｍｌ、２６３６ｎｇ／ｍｌ及び６６１２ｎｇ／ｍｌであった。ＣＳＦ−１レベルは、１０、２０及び５０ｍｐｋを投与したラットでそれぞれ２８、７９及び３６３％有意に上昇した（表４）。子宮マクロファージは、１０、２０、及び５０ｍｐｋの化合物４でそれぞれ２７％、２８％及び４４％消耗された。これらの結果に基づき、１０ｍｇ／ｋｇは、これらの終点に対する活性のしきいレベルを伴う用量として同定された。
【００６３】
化合物４の構造を次に示す。
【００６４】
【化４】
2011502266.tif 000010
【００６５】
化合物４及びその使用は、２００７年１０月１７日付けで出願された米国特許出願第６０／９８０，２６３号に開示されている。
【００６６】
（実施例５）
健康なオス被験体において化合物１の単一漸増経口用量の安全性及び忍容性を評価した。血液試料を、１日目に、投与前及び投与後２、４、８、１２、２４及び４８時間に収集し、バイオマーカーで評価した。バイオマーカーの分析は、表５に示すように化合物１の少なくとも１回用量を受けた全被験体に対して行った。
【００６７】
【表５】
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【００６８】
４ｍｌの静脈血試料を１日目の投与前６０分以内及び投与後２、４、８、１２、２４及び４８時間、並びに３ｍｌを１日目の投与前及び投与後２及び８時間に収集し、化合物１が血漿ＣＳＦ−１に与える影響を評価した。
【００６９】
血漿ＣＳＦ−１レベルは、Ｒ＆Ｄシステムズ（R&D Systems）のヒトＣＳＦ−１ＥＬＩＳＡを用いて測定した。試料をアッセイ用に１：５に希釈した。標準のアッセイ３１〜２０００ｐｇ／ｍｌである。測定可能な最大血漿濃度は〜１００００ｐｇ／ｍｌである。現在の測定された最大濃度は〜４０００ｐｇ／ｍｌである。結果を下表に示す。
【００７０】
【表６】
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【００７１】
【表７】
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【００７２】
【表８】
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【００７３】
【表９】
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【００７４】
前述の明細書は、例示を目的として提供される実施例と共に、本発明の原理を教示するが、本発明の実践は、以下の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内に含まれる全ての通常の変形、改作及び／又は修正を包含することが理解されるであろう。
【００７５】
参照
１．バルトッチ（Bartocci）Ａ、マストロヤンニ（Mastrogiannis）ＤＳ、ミグリオラティ（Migliorat）Ｇ、ストッカート（Stockert）ＲＪ、ウォルコフ（Wolkoff）ＷＷ、スタンリー（Stanley）ＥＲ。マクロファージは、循環における独自の成長因子の濃度を特定的に調節する。（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９８７年、８４：６１７９−８３）。
２．カールバーグ（Carlberg）Ｋ、タプリー（Tapley）Ｐ、ヘイステッド（Haystead）Ｃ、ローシュナイダー（Rohrschneider）Ｌ。リガンドのキナーゼ活性の役割り及びキナーゼインサート部位はＣＦＭＳタンパク質の内在化及び劣化を誘導した。ＥＭＢＯ  Ｊ．１０（４）（１９９１年）８７７−８３。
３．アーバイン（Irvine）ＫＭ、バーンズ（Burns）ＣＪ、ウィルクス（Wilks）ＡＦ、スー（Su）Ｓ、ヒューム（Hume）ＤＡ、スイート（Sweet）ＭＪ。ＣＳＦ−１受容体キナーゼ阻害物質は、エフェクター機能を標的とし、マウス（murine）マクロファージ母集団からの炎症性サイトカインの生成を阻害する。ＦＡＳＥＢ  Ｊ  （２００６年）２０：１９２１−３。
４．ダイ（Dai）ＸＭ、ライアン（Ryan）ＧＲ、ヘーペル（Hapel）ＡＪ、ドミニゲス（Dominguez）ＭＧ、ラッセル（Russell）ＲＧ、カップ（Kapp）Ｓ、シルベスター（Sylvestre）Ｖ、スタンリー（Stanley）ＥＲ。マウスコロニー刺激因子１受容体遺伝子標的化断裂は、大理石骨病、単核食細胞欠乏症、原始前駆細胞頻度の増加、及び生殖機能欠陥をもたらす。Ｂｌｏｏｄ．９９（２００２年）１１１−２０。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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