(57)【要約】癌等の増殖障害の処置において使用するための、次式2011521986.tif 000043[式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立にＨまたは低級アルキルであり；Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は独立に、Ｈ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであって、少なくとも１つが−Ｏ−低級アルキルであるか；または環上で互いに隣り合ったＲ4〜Ｒ8のペアの少なくとも１つが一緒になって−Ｏ−（ＣＲ14Ｒ15）n−Ｏ−を形成し、ここでｎは１または２であり、Ｒ14およびＲ15は独立にＨまたは低級アルキルであり、Ｒ4〜Ｒ8の残りの基は独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであり；およびＲ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであって、少なくとも１つが−Ｏ−低級アルキルであるか；または環上で互いに隣り合ったＲ9〜Ｒ13のペアの少なくとも１つが一緒になって−Ｏ−（ＣＲ16Ｒ17）m−Ｏ−を形成し、ここでｍは１または２であり、Ｒ16およびＲ17は独立にＨまたは低級アルキルであり、Ｒ9〜Ｒ13の残りの基は独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルである］を有する化合物。
2011521986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2011521986.tif 000030
[式中、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立にＨまたは低級アルキルであり；
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は独立に、Ｈ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであって、少なくとも１つが−Ｏ−低級アルキルであるか；または環上で互いに隣り合ったＲ4〜Ｒ8のペアの少なくとも１つが一緒になって−Ｏ−（ＣＲ14Ｒ15）n−Ｏ−を形成し、ここでｎは１または２であり、Ｒ14およびＲ15は独立にＨまたは低級アルキルであり、Ｒ4〜Ｒ8の残りの基は独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであり；および
Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであって、少なくとも１つが−Ｏ−低級アルキルであるか；または環上で互いに隣り合ったＲ9〜Ｒ13のペアの少なくとも１つが一緒になって−Ｏ−（ＣＲ16Ｒ17）m−Ｏ−を形成し、ここでｍは１または２であり、Ｒ16およびＲ17は独立にＨまたは低級アルキルであり、Ｒ9〜Ｒ13の残りの基は独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルである］
で示される化合物またはその製薬的に許容し得る塩、溶媒和物、アミド、エステル、エーテル、化学的に保護された形態またはプロドラッグ。
【請求項２】
Ｒ6およびＲ11の両方が−ＯＭｅである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ9、Ｒ12およびＲ13が独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであり、Ｒ10およびＲ11が一緒になって−Ｏ−Ｃ（Ｒ16Ｒ17）m−Ｏ−を形成し、ｍが好ましくは１である、請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ9、Ｒ12およびＲ13がＨである請求項３記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ16およびＲ17の両方がＨである請求項３または４記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ9〜Ｒ13の１つが−Ｏ−Ｒ18であり、Ｒ18は低級アルキルであり、残りの基は独立にＨ、ハロまたは低級アルキルである、請求項１記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ10〜Ｒ12の１つ、好ましくはＲ11、が−Ｏ−Ｒ18である請求項６記載の化合物。
【請求項８】
前記Ｒ9〜Ｒ13の残りの基がＨである、請求項６または７記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ18が、Ｃ1-4またはＣ1-3アルキル、好ましくはｎ−プロピルである、請求項６〜８のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8の少なくとも２つが−Ｏ−低級アルキルである請求項１〜９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ4およびＲ6またはＲ5およびＲ6が−Ｏ−Ｒ19であり、残りの基が独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであり；Ｒ19が好ましくはＣ1-4またはＣ1-3アルキル、好ましくはメチルである、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ6が−Ｏ−Ｒ19であり、Ｒ19は低級アルキルであり、残りの基は独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであり、Ｒ19は好ましくはＣ1-4またはＣ1-3アルキル、好ましくはメチルである、請求項１〜９のいずれかに記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ4〜Ｒ8の残りの基がＨである請求項１０〜１２のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
各低級アルキルがＣ1-6、好ましくはＣ1-4またはＣ1-3である請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
前記化合物が
【化２】
2011521986.tif 000031
である請求項１記載の化合物。
【請求項１６】
前記化合物が
【化３】
2011521986.tif 000032
【化４】
2011521986.tif 000033
または
【化５】
2011521986.tif 000034
である請求項１記載の化合物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかの化合物の代謝産物であって、ＣＹＰ１Ｂ１酵素の基質としての該化合物の生成物である代謝産物。
【請求項１８】
式（Ｘ）：
【化６】
2011521986.tif 000035
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は独立にＨまたは低級アルキルであり；
Ｒ4〜Ｒ13は独立にＨ、ＯＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであって、Ｒ4〜Ｒ13の少なくとも１つがＯＨである］
を有する細胞毒性化合物またはその製薬的に許容し得る塩、溶媒和物、アミド、エステル、エーテル、化学的に保護された形態またはプロドラッグ。
【請求項１９】
Ｒ6がＣｌであるとき、Ｒ12がＯＨまたはＯＭeではない、請求項１８記載の細胞毒性化合物。
【請求項２０】
Ｒ5がＯＭｅであるときＲ12がＯＨではない、請求項１８記載の細胞毒性化合物。
【請求項２１】
Ｒ6がＯＨであるときＲ11がＯＭｅではない、請求項１８記載の細胞毒性化合物。
【請求項２２】
Ｒ4〜Ｒ13の少なくとも２つがＯＨである、請求項１８記載の細胞毒性化合物。
【請求項２３】
Ｒ4、Ｒ7およびＲ8がＨであり、好ましくはＲ9、Ｒ12およびＲ13がＨである、請求項１８記載の細胞毒性化合物。
【請求項２４】
Ｒ4〜Ｒ8の少なくとも２つが−Ｏ−低級アルキルである、請求項１８記載の細胞毒性化合物。
【請求項２５】
Ｒ9〜Ｒ13の少なくとも２つがＯＨである、請求項２４記載の細胞毒性化合物。
【請求項２６】
Ｒ5がＯＨまたは−Ｏ−低級アルキルであり、Ｒ6がＯＨまたは−Ｏ−低級アルキルである、請求項１８記載の細胞毒性化合物。
【請求項２７】
Ｒ9〜Ｒ13の少なくとも２つがＯＨである、請求項２６記載の細胞毒性化合物。
【請求項２８】
Ｒ10およびＲ11がＯＨであり、残りの基がＨである、請求項２７記載の細胞毒性化合物。
【請求項２９】
Ｒ9〜Ｒ12の少なくとも１つが−Ｏ−低級アルキルである、請求項２６記載の細胞毒性化合物。
【請求項３０】
Ｒ11が−Ｏ−低級アルキルである請求項２９記載の細胞毒性化合物。
【請求項３１】
Ｒ11が−ＯＨであり、残りの基がＨである、請求項２６記載の細胞毒性化合物。
【請求項３２】
Ｒ4〜Ｒ8の少なくとも１つがＯＨであり、Ｒ9〜Ｒ13の少なくとも１つが−Ｏ−低級アルキルであり、Ｒ9〜Ｒ13の残りの基が独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルである請求項１８記載の細胞毒性化合物。
【請求項３３】
Ｒ4〜Ｒ8の２つがＯＨであり、残りの基がＨ、ハロまたは低級アルキルである請求項３２記載の細胞毒性化合物。
【請求項３４】
Ｒ9〜Ｒ13の１つが−Ｏ−Ｒ18であり、Ｒ18は低級アルキルであり、残りの基が独立にＨ、ＯＨ、ハロまたは低級アルキルであり、Ｒ10〜Ｒ12の１つが−Ｏ−Ｒ18であり、Ｒ9〜Ｒ13の残りの基がＨである、請求項３３記載の細胞毒性化合物。
【請求項３５】
Ｒ9〜Ｒ13の少なくとも１つがＯＨであり、Ｒ4〜Ｒ8の少なくとも１つが−Ｏ−低級アルキルであり、Ｒ4〜Ｒ13の残りの基が独立にＨ、ハロ、低級アルキル、−Ｏ−低級アルキルである、請求項１８に記載の細胞毒性化合物。
【請求項３６】
Ｒ9〜Ｒ13の２つがＯＨであり、残りの基がＨ、ハロまたは低級アルキルである、請求項３５記載の細胞毒性化合物。
【請求項３７】
Ｒ9、Ｒ12およびＲ13が独立に、Ｈ、ハロまたは低級アルキルであり、Ｒ10およびＲ11が両方ともＯＨであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8はの１または２つが−Ｏ−低級アルキルである、請求項３６に記載の細胞毒性化合物。
【請求項３８】
Ｒ4およびＲ6またはＲ5およびＲ6が−Ｏ−Ｒ19であり、Ｒ19は低級アルキルであり、残りの基が独立にＨ、ハロまたは低級アルキルである、請求項３７に記載の細胞毒性化合物。
【請求項３９】
Ｒ5およびＲ6が−Ｏ−Ｒ19であり、Ｒ4、Ｒ7およびＲ8が独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであり、Ｒ9、Ｒ12およびＲ13が独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであり、Ｒ10およびＲ11が両方ともＯＨである、請求項３８に記載の細胞毒性化合物。
【請求項４０】
各低級アルキルがＣ1-6、好ましくはＣ1-3である、請求項１８〜３９のいずれかに記載の細胞毒性化合物。
【請求項４１】
式
【化７】
2011521986.tif 000036
【化８】
2011521986.tif 000037
【化９】
2011521986.tif 000038
【化１０】
2011521986.tif 000039
【化１１】
2011521986.tif 000040
【化１２】
2011521986.tif 000041
または
【化１３】
2011521986.tif 000042
で示される化合物。
【請求項４２】
治療によるヒトまたは非ヒト動物の身体の処置の方法において使用するための請求項１〜４１のいずれかに記載の化合物。
【請求項４３】
増殖障害の処置において使用するための請求項１〜４１のいずれかに記載の化合物。
【請求項４４】
前記増殖障害が癌である、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４５】
前記癌が、肺、結腸、乳房、卵巣、前立腺、肝臓、膵臓、脳、膀胱、腎臓および皮膚の癌から選択される、請求項４４記載の化合物。
【請求項４６】
増殖障害の処置において使用するための医薬の製造において使用するための、請求項１〜４１のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項４７】
請求項１〜４１のいずれかに記載の化合物の治療上有効量を、必要とするヒトまたは非ヒト動物患者に投与することを含んでなる、増殖性障害の処置方法。
【請求項４８】
医薬として使用するための、請求項１〜４１のいずれかに記載の化合物。
【請求項４９】
請求項１〜１７に記載の化合物の治療上有効量を投与することを含んでなる処置方法であって、細胞毒性化合物が体内で生成する、方法。
【請求項５０】
請求項１〜４１のいずれかに記載の１以上の化合物を、１以上の製薬的に許容し得る添加剤とともに含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌およびシトクロームＰ−４５０ ＣＹＰ１Ｂ１を発現する細胞によって特徴付けられる他の増殖状態の処置または予防に使用するための新規化合物に関する。本発明はまた、そのような癌または他の増殖状態の処置または予防において使用するための、１以上のかかる化合物を含有する医薬組成物、並びにヒトまたはヒト以外の動物におけるそのような癌または他の状態の治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
シトクロームＰ−４５０ ＣＹＰ１Ｂ１は、異物代謝酵素のシトクロームＰ−４５０ファミリーのダイオキシン誘導可能な形態である。ＣＹＰ１Ｂ１は、種々の組織学的タイプのヒトの癌の広い範囲で高頻度で発現し、正常な組織では発現しない（発現しても無視できるレベルである）（例えば, McFadyen MC, Melvin WT and Murray GI, "Cytochrome P450 Enzymes: Novel Options for Cancer Therapeutics", Mol Cancer Ther., 3(3): 363-71, 2004; McFadyen MC and Murray GI, "Cytochrome P450 1B1: a Novel Anticancer Therapeutic Target", Future Oncol., 1(2): 259-63, 2005;Sissung TM, Price DK, Sparreboom A and Figg WD, "Pharmacogenetics and Regulation of Human Cytochrome P450 1B1: Implications in Hormone-Mediated Tumor Metabolism and a Novel Target for Therapeutic Intervention", Mol. Cancer Res., 4(3): 135-50, 2006参照）。より具体的には、ＣＹＰ１Ｂ１は、膀胱、脳、乳房、結腸、頭部および頸部、腎臓、肺、肝臓、卵巣、精巣および皮膚癌において発現することが示されており、対応する正常な組織では発現はみられない。
【０００３】
例えば、Barnett, et al.は、Clin. Cancer Res., 13(12): 3559-67, 2007において、ＣＹＰ１Ｂ１が膠芽腫、未分化星細胞腫、乏突起膠腫および未分化乏突起膠腫を含む神経膠腫において過剰発現したが脳組織には影響を及ぼさなかったことを報告している。
【０００４】
Carnell, et al.は、Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 58(2): 500-9, 2004において、ＣＹＰ１Ｂ１が前立腺腺癌において過剰発現したが、対応する正常な前立腺組織では過剰発現はみられなかったことを示した。
【０００５】
Carnell et al.2004 (前掲)はまた、CYP1B1が膀胱癌において発現することを示している（ｎ＝２２、１００％)。
【０００６】
Downie, et al., in Clin. Cancer Res., 11(20): 7369-75, 2005およびMcFadyen, et al., in Br. J. Cancer, 85(2): 242-6, 2001は、ＣＹＰ１Ｂ１の発現の増大が原発性および転移性の卵巣癌においてみられたが正常な組織では過剰発現はみられなかったことを報告している。
【０００７】
Gibson, et al., Mol. Cancer Ther., 2(6): 527-34, 2003およびKumarakulasingham, et al., Clin. Cancer Res., 11(10): 3758-65, 2005は、正常な組織と比較してＣＹＰ１Ｂ１が結腸腺癌で過剰発現したことを報告している。
【０００８】
いくつかの研究により、対応する正常な組織と比較して乳癌においてＣＹＰ１Ｂ１が過剰発現することが示されている(例えば、Murray GI, Taylor MC, McFadyen MC, McKay JA, Greenlee WF, Burke MD and Melvin WT, "Tumor-Specific Expression of Cytochrome P450 CYP1B1", Cancer Res., 57(14): 3026-31, 1997; Haas S, Pierl C, Harth V, Pesch B, Rabstein S, Bruning T, Ko Y, Hamann U, Justenhoven C, Brauch H and Fischer HP, "Expression of Xenobiotic and Steroid Hormone Metabolizing Enzymes in Human Breast Carcinomas". Int. J. Cancer, 119(8): 1785-91, 2006; McKay JA, Murray GI, Ah-See AK, Greenlee WF, Marcus CB, Burke MD and Melvin WT, "Differential Expression of CYP1A1 and CYP1B1 in Human Breast Cancer", Biochem. Soc. Trans., 24(2): 327S, 1996を参照)。
【０００９】
Everett, et al., J. Clin. Oncology, 25: 18S, 2007は、ＣＹＰ１Ｂ１が悪性黒色腫および播腫性疾患において過剰発現するが、正常な皮膚では過剰発現はみられないことを報告している。
【００１０】
Gibson, et al., 2003 (前掲)およびChang, et al., Toxicol. Sci., 71(1): 11-9, 2003はいずれもＣＹＰ１Ｂ１は正常な肝臓には存在しないが、ステージＩＶの肝臓への転移では過剰発現したことを報告している。
【００１１】
Greer, et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 45: 3701, 2004は、CYP1B1は、頭部および頸部の膀胱扁平上皮癌の悪性進行の間に過剰発現するが正常な上皮では過剰発現はみられなかったことを報告している。
【００１２】
McFadyen, et al., Br. J. Cancer, 91(5): 966-71, 2004は、腎臓癌においてＣＹＰ１Ｂ１を検出したが、対応する正常組織においては検出されなかった。
【００１３】
Murray, et al., 2004 (前掲)は、免疫組織化学法を用い、正常な肺組織と比較して、肺癌細胞におけるＣＹＰ１Ｂ１の過剰発現を示した。
【００１４】
上記の数多くの開示から、ＣＹＰ１Ｂ１の発現が幅広い様々な癌や他の増殖状態に特徴的であること、およびこのような様々な癌や他の状態を定義するのにＣＹＰ１Ｂ１発現を用いることができることは明かである。正常な（癌でない）細胞は有意のレベルのＣＹＰ１Ｂ１を発現しないので、ＣＹＰ１Ｂ１発現細胞では細胞毒性を示すが正常な細胞では実質的に非毒性である化合物は、ＣＹＰ１Ｂ１発現によって特徴付けられる癌における標的化された抗癌剤として有用であることが合理的に期待できる。「標的化された」は、そのような化合物を全身に投与することができ、ＣＹＰ１Ｂ１を発現する癌細胞の存在下でのみ活性化され、身体のそれ以外の部分では実質的に非毒性であることを意味する。
【００１５】
さらに、数多くのシトクロームＰ４５０酵素は、様々な抗癌剤を代謝および無毒化することが知られている。McFadyen, et al. Biochem Pharmacol. 2001, Jul 15; 62(2): 207-12は、ＣＹＰ１Ｂ１を発現しない細胞と比較して、ＣＹＰ１Ｂ１を発現する細胞において、ドセタキセルの感受性の有意の減少を示した。この知見は、細胞におけるＣＹＰ１Ｂ１の存在がいくつかの細胞毒性薬に対する感受性を減少し得るとことを示している。従って、ＣＹＰ１Ｂ１活性化プロドラッグは、その薬物耐性がＣＹＰ１Ｂ１によって媒介される癌の治療に有用であろう。
【００１６】
WO-A-03/028713は、３,４−メチレンジオキシカルコンがＣＹＰ１Ｂ１発現細胞においてそのような細胞毒性を示す増殖状態の処置に使用するための３,４−メチレンジオキシカルコンを開示している。WO-A-03/028713によれば、そのような置換されたカルコンは式（Ａ）で示される：
【化１】
2011521986.tif 000003
[式中、
ＲB2、ＲB3、ＲB4およびＲB5はそれぞれ独立に−Ｈ、−ＯＨまたは−ＯＭｅであり；
Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立に−Ｈ、置換されていてもよいＣ1-4アルキルまたは置換されていてもよいＣ5-20アリールであり；
ＲA3は−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＲE、−ＯＳ（＝Ｏ）2ＯＨまたは−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）2であり；および
ＲEは−Ｈ、置換されていてもよいＣ1-6アルキル、置換されていてもよいＣ3-20ヘテロサイクリルまたは置換されていてもよいＣ5-20アリールである］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、癌細胞において細胞毒性を示すが、正常な細胞においては示さない代替化合物を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、癌または他の増殖状態の処置または予防に適切に使用することができる代替化合物を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、その薬剤耐性がCYP1B1によって媒介される癌の処置または予防のために使用することができる化合物を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、癌または他の増殖状態を処置または予防する代替法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
従って、本発明の一態様によれば、式Ｉ：
【化２】
2011521986.tif 000004
[式中、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は独立にＨまたは低級アルキルであり；
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は独立に、Ｈ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであって、少なくとも１つが−Ｏ−低級アルキルであるか；または環上で互いに隣り合ったＲ4〜Ｒ8のペアの少なくとも１つが一緒になって−Ｏ−（ＣＲ14Ｒ15）n−Ｏ−を形成し、ここでｎは１または２であり、Ｒ14およびＲ15は独立にＨまたは低級アルキルであり、Ｒ4〜Ｒ8の残りの基は独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであり；および
Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであって、少なくとも１つが−Ｏ−低級アルキルであるか；または環上で互いに隣り合ったＲ9〜Ｒ13のペアの少なくとも１つが一緒になって−Ｏ−（ＣＲ16Ｒ17）m−Ｏ−を形成し、ここでｍは１または２であり、Ｒ16およびＲ17は独立にＨまたは低級アルキルであり、Ｒ4〜Ｒ8の残りの基は独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであり、Ｒ16およびＲ17は独立にＨまたは低級アルキルであり、Ｒ9〜Ｒ13の残りの基は独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルである］
で示される化合物およびその製薬的に許容し得る塩、溶媒和物、アミド、エステル、エーテル、化学的に保護された形態またはプロドラッグを提供する。
【００２２】
本発明の化合物は、ＣＹＰ１Ｂ１酵素を発現する細胞では細胞毒性を示すが、ＣＹＰ１Ｂ１を発現しない正常な細胞においては実質的に無毒であることが見出された。本発明の化合物はまたＣＹＰ１Ａ１酵素を発現する細胞においても細胞毒性を示し得る。ゆえに、実際のところ、本発明の化合物は、ＣＹＰ１Ｂ１により細胞毒性の薬剤に変換される非毒性のプロドラッグである。
【００２３】
好ましくは、本発明の化合物は、以下で定義されるように、１０μＭ未満、好ましくは５μＭ未満、さらに好ましくは１．０μＭまたは０．５μＭ未満のＩＣ50値を有する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物の細胞毒性は、ＣＹＰ１Ｂ１を発現するように遺伝子操作された細胞と段階希釈した化合物とをインキュベーションすることにより測定することができる。好ましくは、該細胞はChinese Hamster Ovary (CHO)細胞であり、この細胞は組換えＣＹＰ１Ｂ１およびシトクロームＰ−４５０還元酵素（ＣＰＲ）を含むことができる。ヒトＰ−４５０還元酵素と同時発現させる場合、高レベルの機能的な酵素は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子増幅を用いて達成することができる。一般的に、操作した細胞を化合物とインキュベーションし、適当な時間（例えば９６時間）後、適当なアッセイ試薬とさらにインキュベーション（例えば１．５時間）して、培地中の生細胞数を指標とする。適当なアッセイ試薬はＭＴＳ（以下参照）であり、これは細胞によって組織培地中に溶解するホルマザン産物に生物還元される。ホルマザン産物の吸光度を５１０ｎｍにて直接測定することができ、４９０ｎｍまたは５１０ｎｍでの吸光度によって測定されるホルマザン産物の量は培地中の生細胞数に直接比例する。本発明の化合物のＩＣ50値の算出方法は、以下の実施例１に記載する。
【００２５】
比較することによって、本発明の化合物のＩＣ50を、ＣＹＰ１Ｂ１を含まない細胞（例えばChinese Hamster Ovary細胞）、例えば野生型ＣＨＯ細胞、において測定することもできる。本発明の化合物は、好ましくは、少なくとも２０倍の選択性をＣＹＰ１Ｂ１発現細胞に対して有し、ここで「〜倍の選択性」とは、ある特定の化合物の非ＣＹＰ１発現細胞におけるＩＣ50値を、同一化合物のＣＹＰ１Ｂ１発現細胞におけるＩＣ50値で割った値として定義される。
【００２６】
こうして、本発明は、ヒトまたは動物の身体の処置、特に、例えば、ＣＹＰ１Ｂ１を発現する細胞によって特徴づけられる増殖状態を含む、ヒトまたは非ヒト動物における、増殖性障害または増殖性疾患等の処置または予防に使用するための、１またはそれ以上の、上記の製薬的に許容し得る塩、溶媒和物およびプロドラッグを含む本発明化合物の使用を包含する。より具体的には、本発明は、ＣＹＰ１Ｂ１発現によって特徴付けられる癌の処置のための、１またはそれ以上の本発明化合物の使用を包含する。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、本発明の少なくとも１つの化合物の治療上有効な量を、そのような処置を必要とするヒトまたは非ヒト動物の患者に投与することを含んでなる、増殖状態の処置または予防の方法を提供する。
【００２８】
本明細書において用いられる「増殖状態」なる語は、in vitroまたはin vivoで新生物のまたは肥厚増殖等、好ましくない過剰なまたは異常な細胞の望ましくないまたは制御不能な細胞増殖によって特徴付けられる疾患または障害を意味する。増殖状態の例としては、悪性新生物および腫瘍、癌、白血病、乾癬、骨疾患、繊維増殖疾患（例えば、結合組織の）およびアテローム性動脈硬化を含む、前癌状態および癌の状態の細胞増殖である。
【００２９】
この増殖状態は、ＣＹＰ１Ｂ１を発現する細胞によって特徴付けられる。
【００３０】
この増殖状態は、膀胱、脳、乳房、結腸、頭部および頸部、腎臓、肺、肝臓、卵巣、前立腺および皮膚の癌から選択される。いくつかの実施形態では、この増殖状態は、固形癌を包含し得る。
【００３１】
本明細書における「処置」なる語は、増殖状態に対するいくつかの望ましい治療効果：例えば、進行速度の減少、進行の停止、障害の改善またはその状態の治癒を含む障害の進行阻害が達成される、ヒトまたは非ヒト動物の治療による処置を意味する。予防的手段としての治療もまた含まれる。本明細書において用いられる「治療上有効な量」なる語は、合理的な利益／リスク比に見合う、治療効果をもたらすのに有効な、本発明の１またはそれ以上の化合物またはそのような１またはそれ以上の化合物を含有する医薬製剤の量を意味する。
【００３２】
従って、本発明の化合物は、抗癌剤として用いることができる。本明細書における「抗癌剤」なる語は、癌を処置する化合物（即ち、癌の処置に有用な化合物）を意味する。本発明の化合物の抗癌作用は、細胞増殖の調節、血管形成の阻害、転移の阻害、浸潤の阻害またはアポトーシスの促進を含む１またはそれ以上のメカニズムによってもたらされうる。
【００３３】
本発明の化合物の適当な用量が患者ごとに異なることは理解される。最適な用量は、本発明の処置の何らかのリスクまたは有害な副作用と治療上の利益のレベルとのバランスを考えて決定される。選択される用量レベルは、具体的化合物の活性、投与経路、投与の時間、化合物の排出速度、治療の期間、組み合わせて用いる他の薬物、化合物または物質、年齢、性別、体重、病状、健康状態および患者の病歴を含む様々なファクターに依存する。化合物の量および投与経路は、一般的に、用量は、所望の効果を達成する作用部位での局所的な濃度を達成するものとされるが、結局のところ、医師の裁量である。
【００３４】
in vivoでの投与は、処置の期間を通じて、１回用量での投与、連続的または断続的に行うことができる。投与の最も効果的な手段および用量を決定する方法は、当業者に十分に知られており、治療に用いる製剤、治療の目的、標的細胞、および処置される対象により変更し得る。処置される標的細胞および処置される患者は。処置を行う医師により選択される用量のレベルとパターンを用いて１回または複数回の投与を行うことができる。
【００３５】
一般に、本発明の１またはそれ以上の１回用量は、約１μｇ〜約５０００μｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲である。例えば、１、５、１０、２５、５０、１００、２５０、１０００、２５００または５０００μｇ／ｋｇ／日である。化合物が塩、溶媒和物、プロドラッグ等である場合、投与量は親化合物に基づいて計算することができ、そのため使用される現実の重量は比例して増大し得る。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明の１またはそれ以上の化合物は、上記のような増殖状態の処置のための組合せ治療において、即ち他の薬剤、例えば細胞毒性薬と組み合わせて、用いることができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、上記式ＩのＲ9、Ｒ12およびＲ13は、独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであり、Ｒ10およびＲ11は一緒になって−Ｏ−Ｃ（Ｒ16Ｒ17）m−Ｏ−を形成していてもよい。ｍは好ましくは１である。好ましくは、Ｒ9、Ｒ12およびＲ13はＨであってよい。Ｒ16およびＲ17はいずれもＨであってよい。即ち、いくつかの実施形態では、本発明の化合物は式Ｉａ：
【化３】
2011521986.tif 000005
で示される。
【００３８】
あるいは、Ｒ9〜Ｒ13の１つが−Ｏ−Ｒ18であってよく、Ｒ18は低級アルキルであり、残りの基は独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであってよい。例えば、Ｒ18はＣ1-4またはＣ1-3アルキル、好ましくはｎ−プロピルであってよい。このような場合では、Ｒ10〜Ｒ12の１つ、好ましくはＲ11が−Ｏ−Ｒ18であり、該Ｒ9〜Ｒ13の残りの基がＨであってよい。従って、いくつかの実施形態では、本発明の化合物は式Ｉｂ：
【化４】
2011521986.tif 000006
で示される。
【００３９】
本明細書で用いられる「低級アルキル」なる語は、Ｃ1-6アルキル基、好ましくはＣ1-4またはＣ1-3を意味する。このような低級アルキル部分は、直鎖状でも分岐鎖でもよい。該低級アルキル基は、置換されていてもよく、または１またはそれ以上のハロ部分で置換されていてもよい。例えば、メチル基は１またはそれ以上のフルオロ基で置換されていてもよい。
【００４０】
本明細書において用いられる「ハロ」はフルオロ−、クロロ−、ブロモ−またはヨード−、好ましくはフルオロを意味する。
【００４１】
好ましくは、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8の１または２個が−Ｏ−低級アルキルであってよい。このような化合物は、ＣＹＰ１Ｂ１を発現している細胞において特に細胞毒性であることが分かっている。
【００４２】
従って、いくつかの実施形態では、Ｒ4およびＲ6またはＲ5およびＲ6は、−Ｏ−Ｒ19であってよく、Ｒ19は低級アルキルであり、残りの基は独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであってよい。
【００４３】
いくつかの好ましい実施形態では、Ｒ5およびＲ6は−Ｏ−Ｒ19であり、Ｒ4、Ｒ7およびＲ8は独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであり、Ｒ9、Ｒ12およびＲ13は独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであり、Ｒ10およびＲ11は一緒になって−Ｏ−Ｃ（Ｒ16Ｒ17）m−Ｏ−を形成していてもよく、ここでｍは好ましくは１である。従って、本発明の化合物は式Ｉ’：
【化５】
2011521986.tif 000007
で示される。
【００４４】
あるいは、Ｒ6は−Ｏ−Ｒ19であり、それ以外のＲ5、Ｒ7およびＲ8は独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであってよい。
【００４５】
好ましくは、Ｒ19はＣ1-4またはＣ1-3アルキル、好ましくはメチルであってよい。
【００４６】
さらに、Ｒ4〜Ｒ8の残りの基はＨであってよい。
【００４７】
例として、本発明の化合物は、式ＩＩ：
【化６】
2011521986.tif 000008
で示される。
【００４８】
本発明の化合物のさらなる例は、式ＩＩＩ，ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩ：
【化７】
2011521986.tif 000009
【化８】
2011521986.tif 000010
【化９】
2011521986.tif 000011
で示される。
【００４９】
上記したとおり、本発明の化合物には式Ｉの製薬的に許容し得る塩および溶媒和物が含まれる。
【００５０】
製薬的に許容し得る塩の例は、本発明の一部を構成する、Berge, et al., 1977, "Pharmaceutically Acceptable Salts," J. Pharm. Sci., Vol. 66, pp. 1-19に記載されている。
【００５１】
本明細書において一般的な意味で用いられる「溶媒和物」は、式Ｉの化合物と溶媒との複合体を意味する。溶媒が水である場合は、溶媒和物は、便宜上、水和物（例えば一水和物、二水和物、三水和物等）を指すとしてよい。
【００５２】
本発明はまた、細胞におけるＣＹＰ１Ｂ１の発現によって特徴付けられる障害または疾患、特に上記の癌を含む固形腫瘍または固形癌、などの増殖状態の処置における使用のための医薬製剤の製造における１またはそれ以上の本発明の化合物の使用を包含する。
【００５３】
したがって、本発明のさらなる態様では、１またはそれ以上の本発明の化合物を、場合により１またはそれ以上の製薬的に許容し得る添加剤とともに含んでなるこのような医薬製剤を提供する。
【００５４】
本明細書において用いられる「製薬的に許容し得る添加剤」なる語は、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題または合併症を伴わず、合理的な利益／リスク比にふさわしい、患者の組織に接触させて使用するのに適した製薬的な添加剤を意味する。
それぞれの添加剤はまた、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容し得る」ものであらなければならない。
【００５５】
好ましくは、本発明の組成物は単位投与形態として製剤化することができる。各単位投与形態は、本発明の１またはそれ以上の化合物の日用量をすべてまたは予め決められたその分割した量（例えば、日用量の半分または４分の１）を含有することができる。
【００５６】
従って、本組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、滅菌非経口溶液または懸濁剤、定量エアロゾルまたは液体スプレー、点滴剤、アンプル、自動注入装置、坐剤、クリーム剤またはジェル剤として製剤化することができる。
この組成物は、経口、腸溶、非経口、髄腔内、舌下、直腸内、または局所投与または吸入または吹送による投与用に適合させることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤またはウェハー等の経口組成物は特に好ましい。
【００５７】
錠剤等の固形の投与形態を製造するには、この１またはそれ以上の化合物を、１またはそれ以上の製薬的な添加剤、例えば慣用の錠剤添加剤（例えば、コーンスターチ、ラクトース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム等）または他の製薬的な希釈剤（例えば水）と混合し、実質的に相同（ホモローガス）なこの１またはそれ以上の化合物の混合物を含有する固体のプレフォーミュレーション組成物を形成し、この１またはそれ以上の化合物を組成物全体に分散させ、組成物を、錠剤、丸剤およびカプセル剤のような有効性の等しい単位投与形態にさらに容易に分割することができる。
【００５８】
次いで、この固形のプレフォーミュレーション組成物を、０．１〜約５００ｍｇの１またはそれ以上の化合物を含有し得る上記の単位投与形態にさらに分割することができる。
好ましい単位投与形態は、１〜５００ｍｇ、例えば、１、５、１０、２５、５０、１００、３００または５００ｍｇの化合物を含有する。
【００５９】
錠剤または丸剤を製剤化する場合は、この錠剤または丸剤をコーティングするかまたは投与形態に持続的作用の利点がもたらされるように調合することができる。例えば、この錠剤または丸剤は内部の投与形態と外部の投与形態のコンポーネントを含んでなることができ、外部のコンポーネントが内部のコンポーネントを包むエンベロープの形態である。
これら２つのコンポーネントは、胃での崩壊を防ぎ、十二指腸へと損傷なく通過するまたは放出を長引かせることができるように腸溶層で隔てられていてもよい。数多くのポリマー酸や、ポリマー酸とセラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料との混合物など、様々な材料が、このような腸溶層またはコーティングに用いられることが知られている。
【００６０】
あるいは、本発明の医薬組成物は、経口または注射により投与するための液体の投与形態；例えば水溶液、適当に風味を付けたシロップ、水性または油性懸濁液、または例えば、綿実油、ゴマ油、ココナッツ油またはピーナツ油などの食用油並びにエリキシルまたは同様の製薬用ビークルを用いた風味を付けたエマルジョンとして製剤化することができる。水溶性の懸濁剤のための適当な分散剤または懸濁化剤としては、合成および天然のガム類（例えば、トラガカント、アカシア、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチン）が挙げられる。
【００６１】
活性化合物および活性化合物を含有する組成物の適当な用量が患者ごとに異なることは認識される。最適な用量の決定は、一般に、本発明の処置の何らかなリスクまたは有害な副作用に対する治療上の利益のレベルとのバランスを考えて行う。選択される用量レベルは、具体的化合物の活性、投与経路、投与の時間、化合物の排出速度、治療の期間、組み合わせて用いる他の薬物、化合物または物質、年齢、性別、体重、病状、健康状態および患者の病歴を含む様々なファクターに依存する。化合物の量および投与経路は、一般的に、用量は、所望の効果を達成する作用部位での局所的な濃度を達成するものとされるが、結局のところ、医師の裁量である。
【００６２】
上記のとおり、本発明の化合物は、ＣＹＰ１Ｂ１酵素を発現しない細胞では実質的に細胞毒性を示さないことが分かっている。理論に束縛されることを意図するものではないが、本発明の化合物は、ＣＹＰ１Ｂ１を発現する細胞内でＣＹＰ１Ｂ１により、細胞毒性を有する活性な代謝物に変換される。実験データは、そのような活性な細胞毒性化合物が、ＣＹＰ１Ｂ１発現に関係なく動物細胞において一般的に細胞毒性である広範なスペクトルを有するキナーゼ阻害剤であることを示している。ＣＹＰ１Ｂ１を発現する細胞におけるＣＹＰ１Ｂ１による、本発明の化合物の非細胞毒性の前駆体から活性な細胞毒性の化合物への変換は、本発明の化合物を、ＣＹＰ１Ｂ１発現により特徴付けられる増殖状態の処置または予防のための標的化された抗癌剤としての使用に適したものにしている。
【００６３】
従って、本発明のさらに別の態様では、細胞毒性化合物が、本発明の化合物に対するＣＹＰ１Ｂ１酵素の触媒活性の産物となるような、本発明の細胞毒性化合物を提供する。ＣＹＰ１Ｂ１酵素の触媒活性が２つの異なるメカニズムが関与していると理解される：１）脱アルキル化または２）ヒドロキシル化。本発明は、本発明の化合物の脱アルキル化またはヒドロキシル化された形態の両方を包含する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明の細胞毒性化合物は、式Ｘ：
【化１０】
2011521986.tif 000012
［式中、
Ｒ1〜Ｒ3は独立にＨまたは低級アルキルであり；
Ｒ4〜Ｒ13は独立にＨ、ＯＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであって、Ｒ4〜Ｒ13の少なくとも１つがＯＨである］
で示される化合物およびその製薬的に許容し得る塩、溶媒和物、アミド、エステル、エーテル、化学的に保護された形態またはプロドラッグである。
【００６５】
好ましくは、Ｒ4〜Ｒ13の少なくとも１つがＯＨである。
【００６６】
いくつかの実施形態では、Ｒ4、Ｒ7およびＲ8はＨであり、好ましくはＲ9、Ｒ12およびＲ13はＨである。
【００６７】
さらに好ましい実施形態では、Ｒ4〜Ｒ8の少なくとも２つが−Ｏ−低級アルキル、好ましくはＲ9〜Ｒ13の少なくとも２つがＯＨである。
【００６８】
あるいは、Ｒ5はＯＨまたは−Ｏ−低級アルキルであり、Ｒ6はＯＨまたは−Ｏ−低級アルキルであり、であり、好ましくはＲ9〜Ｒ13の少なくとも２つがＯＨである。さらに、Ｒ10およびＲ11はＯＨであり、残りの基はＨであってよい。
【００６９】
さらなる実施形態では、Ｒ5がＯＨまたは−Ｏ−低級アルキルであり、Ｒ6がＯＨまたは−Ｏ−低級アルキルであるとき、Ｒ9〜Ｒ12の少なくとも１つは−Ｏ−低級アルキルであり、好ましくはＲ11は−Ｏ−低級アルキルである。
【００７０】
さらなる実施形態では、Ｒ5がＯＨまたは−Ｏ−低級アルキルであり、Ｒ6がＯＨまたは−Ｏ−低級アルキルであるとき、Ｒ11はＯＨであり、残りの基はＨである。
【００７１】
Ｒ4〜Ｒ8の少なくとも１つがＯＨであり、Ｒ9〜Ｒ13の少なくとも１つが−Ｏ−低級アルキルであり、Ｒ4〜Ｒ13の残りの基は独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであってよい。
【００７２】
いくつかの実施形態では、Ｒ4〜Ｒ8の２つがＯＨで残りの基はＨ、ハロ，または低級アルキルであってよく、好ましくはＨである。Ｒ4〜Ｒ8のうちのこの２つは環上で互いに隣り合っていてもよい。Ｒ9〜Ｒ13の１つは、−Ｏ−Ｒ18であってよく、Ｒ18はＨ、ＯＨ、上記の低級アルキルであり、残りの基は独立にＨ、ハロまたは低級アルキルである。この場合において、Ｒ10〜Ｒ12の１つ、好ましくはＲ11、は−Ｏ−Ｒ18であってよく、Ｒ9〜Ｒ13の残りの基はＨであってよい。
【００７３】
あるいは、Ｒ9〜Ｒ13の少なくとも１つがＯＨであり、Ｒ4〜Ｒ8の少なくとも１つが−Ｏ−低級アルキルであり、Ｒ4〜Ｒ13の残りの基が独立にＨ、ハロ、低級アルキルまたは−Ｏ−低級アルキルであってよい。
【００７４】
いくつかの実施形態では、Ｒ9〜Ｒ13のうち２つがＯＨであり、残りの基がＨ、ハロ，または低級アルキルであってよく、好ましくはＨである。Ｒ9〜Ｒ13のうちのこの２つは環上で互いに隣り合っていてもよい。従って、Ｒ9、Ｒ12およびＲ13は独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであってよく、Ｒ10およびＲ11はいずれもＯＨであってよい。好ましくは、Ｒ9、Ｒ12およびＲ13はＨであってよい。さらに、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8の１または２個が−Ｏ−低級アルキルであってよい。従って、いくつかの実施形態では、Ｒ4およびＲ6またはＲ5およびＲ6は−Ｏ−Ｒ19であってよく、Ｒ19は上記の低級アルキルであり、残りの基は独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであってよい。
【００７５】
いくつかの好ましい実施形態では、Ｒ5およびＲ6は−Ｏ−Ｒ19であってよく、Ｒ4、Ｒ7およびＲ8は独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであり；Ｒ9、Ｒ12およびＲ13は独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであり、Ｒ10およびＲ11はいずれもＯＨであってよい。
【００７６】
あるいは、Ｒ6は−Ｏ−Ｒ19であり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7およびＲ8の残りの基は、独立にＨ、ハロまたは低級アルキルであってよい。
【００７７】
Ｒ4〜Ｒ8の残りの基はＨであってよい。
【００７８】
例として、本発明の細胞毒性化合物は、式ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩおよびＸＩＶ：
【化１１】
2011521986.tif 000013
【化１２】
2011521986.tif 000014
【化１３】
2011521986.tif 000015
【化１４】
2011521986.tif 000016
【化１５】
2011521986.tif 000017
【化１６】
2011521986.tif 000018
【化１７】
2011521986.tif 000019
で示される。
【００７９】
本明細書に示したまたは記載した化合物のすべての互変異性体は本発明の一部であることは認識される。さらに本発明は本明細書に記載した化合物の代謝物を含む。
【００８０】
「互変異性体」は、その構造が原子の配置において明かに異なるが容易かつ迅速な平衡状態で存在する化合物を意味する。式Ｉの化合物は異なる互変異性体として表示することができることは理解される。化合物が互変異性体の形態を有する場合、すべての互変異性体の形態が本発明の範囲内にあり、化合物の命名によって如何なる互変異性体も排除されないことは理解される。
【００８１】
本発明のいくつかの化合物は、互変異性体の形態として存在し得、また本発明の範囲内に包含されることを意図する。
【００８２】
本発明の化合物、塩およびプロドラッグは、エノール型およびイミン型、およびケト型およびエナミン型を含むいくつかの互変異性体および幾何異性体およびそれらの混合物として存在し得る。このような幾何異性体はすべて本発明の範囲内に包含される。溶液中では、互変異性体は、互変異性体のセットの混合物として存在する。固体の形態では、通常一方の互変異性体に支配される。一方の互変異性体を記載してもよいが、本発明は、本化合物のすべての互変異性体を含む。
【００８３】
互変異性体は、平衡状態にある２またはそれ以上の構造異性体の１つであり、一方の異性体から他方の異性体に容易に変換される。この反応は隣接する共役二重結合の切り替えに伴って水素原子のホルマール移動をもたらす。互変異性化が可能な溶液中では、互変異性体の化学平衡が達成される。互変異性体の正確な比率は、溶媒およびｐＨ等を含む種々の因子に依存する。互変異性化により相互交換可能な互変異性体の概念は、互変異性と称される。
【００８４】
可能な互変異性の様々なタイプのうち、２つが一般に観察されている。ケト−エノール互変異性では、電子と水素のシフトが同時に起こる。環−鎖互変異性は、グルコースによって示される。糖鎖分子内のアルデヒド基（−ＣＨＯ）が同一分子内の水酸基（−ＯＨ）の１つと反応する結果、環状（環の形状）形態が生じる。
【００８５】
互変異性化は以下によって特徴付けられる：
塩基：１．脱保護；２．非局在化アニオンの形成（例えばエノラート）；３．アニオンの位置と異なる位置でのプロトン化；酸：１．プロトン化；２．非局在化カチオンの形成；３．カチオンと隣接する異なる位置での脱プロトン化。
【００８６】
一般的な互変異性体のペアは以下のとおりである：ケトン−エノール、アミド−ニトリル、ラクタム−ラクチン、ヘテロ環におけるアミド−イミド酸互変異性（例えば、核酸塩基、グアニン、チミンおよびシトシン）、アミン−エナミンおよびエナミン−エナミン。本発明の互変異性体の例は以下のとおりである：
【化１８】
2011521986.tif 000020
【００８７】
さらに、中間体を含め、保護基を含む、示したまたは記載したすべての化合物は、本発明の一部であると認識される。「保護基」は、反応性を、マスク、減少または阻止する、分子内の反応性の基に結合した原子の集団を意味する。保護基が分子に結合している場合、保護基は化合物の化学的に保護された形態を形成する。保護基の例は、Green and Wuts, Protective Groups in Organic Chemistry, (Wiley, 2nded. 1991); Harrison and Harrison et al., Compendium of Synthetic Organic Methods, Vols. 1-8 (John Wiley and Sons, 1971-1996);およびKocienski, Protecting Groups, (Verlag, 3rd ed. 2003)に記載されている。
【００８８】
さらに、アミン保護基を含む、示したまたは記載したすべての化合物は、中間体を含め、本発明の一部であるとみなされる。「アミン保護基」なる語は、アミン、アミドまたは他の窒素含有部分を、特定の化学反応の条件に対して不活性な異なる基に変換する官能基を意味する。アミン保護基は好ましくは、分子の他の官能基に影響を及ぼさない条件下で良好な収率で容易且つ選択的に脱離される。アミン保護基の例としては、ホルミル、アセチル、ベンジル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−メトキシベンジル、メトキシメチル、トシル、トリフルオロアセチル、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、フルオレニル−メチルオキシカルボニル、２−トリメチルシリル−エトキシカルボニル、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）−エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、２−トリメチルシリル−エタンスルホニル（ＳＥＳ）、トリチルおよび置換されたトリチル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ニトロ−ベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）等が挙げられるがこれらに限定されない。他の適当なアミン保護基は当業者によって直接定義される。
【００８９】
一般的なヒドロキシ保護基としては、ベンジルおよびトリチルエーテル並びにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテルおよびアリルエーテル等、ヒドロキシ基がアシル化またはアルキル化されるものが挙げられる。
【００９０】
以下、本発明の実施形態を示す添付の図面を参照として単なる例示を目的として記載する。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】トランスフェクトしたＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１セルラインにおけるＣＹＰ１Ｂ１発現（FIG. 1a）、およびトランスフェクトしたＣＨＯ／ＣＹＰ１Ａ１セルラインにおけるＣＹＰ１Ａ１発現（FIG. 1b）の検出を示すウェスタンブロッティングの画像である。
【図２】本発明の化合物の活性の結果としての腫瘍の重量（ｇ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
合成１：化合物Ｖ
【化１９】
2011521986.tif 000021
ステップ１
４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（５ｇ）のＤＭＦ（５０ｍｌ）溶液に、Ｋ2ＣＯ3（７．５ｇ）、ジヨードメタン（１２．５ｇ）を加え、反応混合物を１１０℃にて２時間還流した。反応の進行をＴＬＣでモニターした。反応が完結したら、混合物を室温に冷却し、セライトベッドで濾過し、ＤＣＭで洗浄した。ろ液に水（１００ｍｌ）を加え、化合物をＤＣＭで抽出した（３ｘ２００ｍｌ）。集めた抽出液を水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗製の化合物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精製して中間体１を得た。
【００９３】
ステップ２
（２，４−ジヒドロキシフェニル）エタノン（１０ｇ）のアセトン（１００ｍｌ）中の溶液に、Ｋ2ＣＯ3（４５ｇ）、ＤＭＳＯ4（２０．７ｇ）を加え、反応混合物を６５〜７０℃で一晩攪拌した。反応の進行をＴＬＣでモニターした。反応が完結したら、混合物をセライトベッドで濾過し、アセトン（１５０ｍｌ）で洗浄した。ろ液を減圧下で濃縮し、得られた残留物を水（５０ｍｌ）にとり、化合物をＤＣＭで抽出した（２ｘ１００ｍｌ）。集めた抽出液をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、減圧下で濃縮し、粗製の抽出物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製して不安定な中間体２を得た。
【００９４】
ステップ３
２５０ｍｌ容の一口丸底フラスコに、ピペロナール（３ｇ）および３,４−ジメトキシ−アセトフェノン（３．６ｇ）を入れ、ＭｅＯＨ（４５ｍｌ）に溶解し、０〜１０℃に冷却した。５０％ＮａＯＨ溶液（２４ｍｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。固体を濾過し、水で洗浄した。固体を６０℃で１時間乾燥させて中間体３を得た。
【００９５】
ステップ４
１００ｍｌ容の一口丸底フラスコに、中間体３（２ｇ）、Ｎ−アセチルグリシンアミド（１ｇ）、Ｃｓ2ＣＯ3（２．７５ｇ）をＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶解し、１４０〜１５０℃で１時間３０分加熱し、０〜１０℃に冷却した。１０％ＨＣｌ溶液（２０ｍｌ）（ｐＨ＝１）を加え、反応混合物を４〜５時間静置した。固体を析出させ、ヘキサンで洗浄した。化合物を６０℃で５時間乾燥して純度９６％の生成物８００ｍｇ（クリームイエローの固体）を得た。
【００９６】
合成２および３：化合物ＩＩ、ＩＩＩおよびＶＩ
化合物ＩＩ、ＩＩＩおよび化合物ＶＩを、上記の化合物Ｖの合成で用いた方法と同様にして合成した。
合成４：化合物ＸＩ
【化２０】
2011521986.tif 000022
【００９７】
ステップ１
（ガードチューブを取り付けた２５０ｍｌの一口丸底フラスコを設置）
パラトルエンスルホン酸ピリジニウム（触媒量）およびＤＨＰ（９．２３ｇ）を、ジヒドロキシベンズアルデヒド（５ｇ）のＤＣＭ（５０ｍｌ）溶液に室温で加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌した。反応の進行をＴＬＣでモニターした。若干の出発物質とともに、モノ保護された化合物も得られた。ＤＣＭ層を水で洗浄（２ｘ１００ｍｌ）し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、ロータリーエバポレーターで蒸留して粗製物を得、これをカラムクロマトグラフィー（塩基性ＳｉＯ2＆５〜８％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製した。
【００９８】
ステップ２
（ガードチューブを取り付けた一口丸底フラスコを設置）
化合物４（３ｇ）のメタノール（３０ｍｌ）溶液に、水酸化バリウム（５．５２２ｇ）およびジメトキシアセトフェノン（１．７５３２ｇ）を室温で加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌した。反応の進行をＴＬＣによりモニターした。反応混合物を２ＮのＨＣｌで０℃にてクエンチした。メタノールを蒸留し、化合物を酢酸エチルにとり、水で洗浄した（３ｘ１００ｍｌ）。酢酸エチル層を分液し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。酢酸エチルをロータリーエバポレーターで蒸留し、生成物をカラムクロマトグラフィー（塩基性ＳｉＯ2＆２３％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製した。
【００９９】
ステップ３
（ガードチューブと還流冷却器を取り付けた一口丸底フラスコを設置）
化合物５（１ｇ）のＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液に、Ｎ−アセチルグリシンアミド（０．３２２２ｇ）およびＣｓ2ＣＯ3（０．９０５５ｇ）を室温にて加え、１４０℃にて７時間加熱した。反応の進行をＴＬＣでモニターした。水を反応混合物に加えた後、固体を析出させた。固体を濾過により除去し、減圧下で乾燥して明黄色の固体を形成した。
【０１００】
ステップ４
（ガードチューブを取り付けた一口丸底フラスコを設置）
酢酸エチル（過剰量）に溶解した化合物６（１．２ｇ）に、１２ＮのＨＣｌ（触媒量）を０℃にて加えた。添加が完了したら、化合物を酢酸エチルから析出させた。固体を濾過し、４０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで洗浄した後、真空下で完全に乾燥した。
【０１０１】
ＮＭＲおよび分子量データ
化合物ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩ、ＸＩおよびＩＩのＮＭＲおよび分子量データの詳細は、以下の表１のとおりである。
【表１】
2011521986.tif 000023
【０１０２】
実施例１：生物学的活性
野生型ＣＨＯ細胞およびＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１酵素を発現するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞におけるプロドラッグ細胞毒性
遺伝子操作されたＣＨＯ細胞を用いて、ＣＹＰ１発現が関与する選択的な細胞死滅を示す。以下に記載する実験では、化合物を、ＣＹＰ１Ａ１（ＣＨＯ／ＣＹＰ１Ａ１）またはＣＹＰ１Ｂ１（ＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１）酵素のいずれか一方を発現するように遺伝子操作した野生型ＣＨＯ細胞に暴露した。
【０１０３】
ＣＨＯ細胞：Chinese Hamster Ovary （ＣＨＯ）ＤＵＫＸＢ１１細胞を、１０％ＦＣＳ、各１単位／ｍｌのヒポキサンチンおよびチミジンおよびペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したα−ＭＥＭ中にて、文献記載の方法に従って標準的な細胞培養条件下で培養した（Ding S, et al., Arch. Biochem. Biophys., 348: 403-410, 1997）。細胞は３７℃にて、５％ＣＯ2の湿潤雰囲気下で培養した。
【０１０４】
ＣＨＯ／ＣＹＰ１Ａ１およびＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１細胞：Ｐ４５０レダクターゼを同時発現する組換えＣＹＰ１Ａ１および組換えＣＹＰ１Ｂ１を含むＣＨＯ細胞、即ち、それぞれ（ＣＨＯ／ＣＹＰ１Ａ１）および（ＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１）、を０．４ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８二硫酸塩および０．３μＭメトトレキセートを添加したＣＨＯ細胞用の標準的な培地(Sigma/Aldrich Co., Gillingham, Dorset, UK) を用いて文献（前掲）に記載方法にしたがって培養した。細胞は３７℃にて、５％ＣＯ2の湿潤雰囲気下で培養した。
【０１０５】
組換えＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１発現
ヒトｃＤＮＡＣＹＰ１Ａ１またはｃＤＮＡ  ＣＹＰ１Ｂ１のいずれか一方のＣＨＯ細胞におけるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子増幅を用い、ヒトＰ４５０レダクターゼと同時発現したときに高レベルの機能的酵素が達成されるようにした（前掲参照；Ding S, et al., Biochem J., 356(Pt 2): 613-9, 2001)。改変ＣＹＰ１Ａ１またはＣＹＰ１Ｂ１ｃＤＮＡを消化し、ほ乳類発現ベクターｐＤＨＦＲにライゲーションし、それぞれプラスミドｐＤＨＦＲ／１Ａ１およびｐＤＨＦＲ／１Ｂ１を作製した（前掲参照）。細胞培養およびＣＨＯＤＵＫＸＢ１１へのＤＮＡトランスフェクションを文献の記載に従って行い、トランスフェクションした細胞をヌクレオシド欠損培地での生育によってＤＨＦＲ＋表現型について選択した（前掲参照）。ＤＨＦＲ＋クローンをプールし、トランスフェクトしたＣＹＰ１Ａ１またはＣＹＰ１Ｂ１ｃＤＮＡの増幅のため、ＭＴＸの漸増濃度（０．０２〜０．１μＭ）で培養した。０．１ｍＭのＭＴＸ選択で生存した細胞クローンを単離した後、さらに０．３μＭのＭＴＸにて選択した。得られたセルラインを免疫ブロッティングによりＣＹＰ１Ａ１またはＣＹＰ１Ｂ１発現について解析した。各酵素を高レベルで発現するセルラインを、文献（前掲）に記載の方法にしたがい、全長ヒトシトクロームＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ｃＤＮＡを含むプラスミドｐｃＤＮＡ／ＨＲで安定にトランスフェクトし、Ｇ４１８（０．８ｍｇ／ｍｌ）およびＭＴＸ（０．３μＭ）にて選択した。耐性クローンを単離した後、Ｇ４１８の濃度を０．４ｍｇ／ｍｌに減少させ、セルラインの均質性をクローニングの反復により確認した。ｃＤＮＡＣＹＰ１Ａ１を有するプラスミド、次いでＣＰＲｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯセルラインをＣＨＯ／ＣＹＰ１Ａ１と称し、ｃＤＮＡＣＹＰ１Ｂ１を有するプラスミド、次いでＣＰＲｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＨＯセルラインをＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１と称した。
【０１０６】
ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１の免疫化学的検出
細胞を回収し、文献に記載の標準的な方法を用いて音波処理により溶解した(Ding S, et al., 1997）。タンパク質（一般には５０μｇのリゼート）をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースメンブレンにトランスファーし、標準的な方法を用いてプローブした(Paine MJ, et al., Arch. Biochem. Biophys., 328: 380-388, 1996)。細胞における酵素発現の免疫化学的検出のため、ヒトＣＹＰ１Ａ１＋レダクターゼＳｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）,ヒトＣＹＰ１Ａ２＋レダクターゼＳｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）およびＣＹＰ１Ｂ１＋レダクターゼＳｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（商標）(BD Biosciences, Oxford, UK)をポジティブコントロールとして用いた(一般に０．０３〜０．３pmole)。ＷＢ−１Ｂ１一次抗体（希釈率１：１５００, BD Biosciences, Oxford, UK)およびＣＹＰ１Ａ１と交差反応する抗ＣＹＰ１Ａ２抗体（希釈率１：２０００, Cancer Research Technology, London, UK)を用いて、ＣＹＰ１Ｂ１およびＣＹＰ１Ａ１発現をそれぞれ検出した。二次抗体は、ヤギ抗ウサギＩｇＧを希釈率１：５００で使用した。Enhanced Chemiluminescence (ECL) ウェスタンブロッティング検出キット(GE Healthcare Life Sciences, Amersham, Buckinghamshire, UK)を用いて免疫ブロットを行った。
【０１０７】
細胞におけるＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１発現のウェスタンブロッティングによるキャラクタリゼーション
図１ａは、ＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１セルラインからのリゼートにおけるＣＹＰ１Ｂ１タンパク質発現の検出を示す典型的なウェスタンブロットであり、非トランスフェクトＣＨＯＤＵＫＸＢ１１セルラインまたはＣＨＯ／ＣＹＰ１Ａ１セルラインのいずれにおいても検出されなかった。バンドは、５６ｋＤａの分子量に対応し、ヒトＣＹＰ１Ｂ１  Ｓｕｐｅｒｓｏｍａｌ（商標）酵素のバンドと一致した。
図１ｂは、ＣＨＯ／ＣＹＰ１Ａ１セルラインからのリゼートにおけるＣＹＰ１Ａ１タンパク質発現の検出を示す典型的なウェスタンブロットであり、非トランスフェクトＣＨＯＤＵＫＸＢ１１セルラインまたはＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１セルラインのいずれにおいても検出されなかった。バンドは、６０ｋＤａの分子量に対応し、抗CYP1A2抗体の交差反応性によって検出されたヒトＣＹＰ１Ａ１  Ｓｕｐｅｒｓｏｍａｌ（商標）酵素のバンドと一致した。
【０１０８】
機能的ＣＹＰ１活性
ＥＲＯＤアッセイは、機能的ＣＹＰ１活性を確認するために広く用いられている（Chang TKおよびWaxman DJ, "Enzymatic Analysis of cDNA-Expressed Human CYP1A1, CYP1A2, and CYP1B1 with 7-Ethoxyresorufin as Substrate", Methods Mol. Biol., 320: 85-90, 2006, the contents of which are incorporated herein by reference)。このアッセイは、５８０ｎｍでの蛍光を継続的にモニターし、７−エトキシレゾルフィンの、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２，およびＣＹＰＢ１によるＯ−脱アルキル化で生じた酵素産物レゾルフィンを測定するというものである。ＥＲＯＤアッセイおよび選択的および非選択的ＣＹＰ１阻害剤を用い、上記のＣＨＯセルラインが予想されるＣＹＰ１酵素を機能的な形態で発現していることを確認した。
【０１０９】
阻害剤の非存在下では、ＣＨＯ／ＣＹＰ１Ａ１およびＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１（野生型ＣＨＯ細胞ではなく）は７−エトキシレゾルフィンをレゾルフィンに変換し、それによってこれら細胞にける機能的ＣＹＰ１発現が確認された（以下、表２参照）。
【０１１０】
予測したとおり、広範なスペクトルを有するＣＹＰ１阻害剤α−ナフトフラボンの添加は、両方のＣＹＰ１を発現する細胞において活性を消失させた（表２）。選択的阻害剤、テトラメトキシスチルベンは、ＣＹＰ１Ａ１と比較してＣＹＰ１Ｂ１に対して３０倍選択的である（Chun YJ, Kim S, Kim D, Lee SK and Guengerich FP, "A New SelectiveおよびPotent Inhibitor of Human Cytochrome P450 1B1 and its Application to Antimutagenesis", Cancer Res 61(22): 8164-70, 2001）。テトラメトキシスチルベンは、両方のＣＹＰ１を発現するセルラインにおいて高濃度で活性を消失させ、（ＣＹＰ１Ａ１発現細胞と比較して）ＣＹＰ１Ｂ１発現細胞において低濃度で優先的に活性を減少させた（表２）。
【表２】
2011521986.tif 000024
【０１１１】
これら結果は、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１発現レベルが予測どおりであることの独自の裏付けを与えるものである。
【０１１２】
ＣＨＯ、ＣＨＯ／ＣＹＰ１Ａ１およびＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１セルラインにおける細胞毒性ＩＣ50値の測定
必要な培地１００μＬ中のＣＨＯ、ＣＨＯ／ＣＹＰ１Ａ１またはＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１の単一な細胞懸濁液を９６ウェルプレートに、１５００細胞／ウェルで播種し、３７℃のインキュベーターに２４時間置いた。次いで、ＤＭＳＯ中の試験化合物のストック溶液を加えて１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１、０．００３、０．００１、０μＭの濃度範囲にした。ＤＭＳＯの最終濃度０．２％では、種々のＣＨＯセルラインの増殖特性に影響はなかった。細胞を試験化合物と９６時間インキュベーションした後、すべての培地を吸引し、新鮮な培地１００μＬと交換して蒸発による培地の損失を補った。細胞を２０μＬのＭＴＳアッセイ試薬と１時間３０分間インキュベーションし、プレートリーダーを用いてウェルごとの５１０ｎｍでの吸光度を測定した。各試験化合物の濃度について、以下を含む一連のコントロール：（ａ）細胞＋培地、（ｂ）細胞＋ＤＭＳＯ  ０．２％を含有する培地、（ｃ）培地のみ、および（ｄ）ＤＭＳＯ  ０．２％および０〜１００μＭの濃度範囲の試験化合物を含む培地、に対して平均吸光度および標準偏差を計算した。細胞毒性のIC50値を計算した。試験化合物に対する細胞増殖率（ここで、細胞増殖率１００％は、非処理のコントロール細胞に対応する）のプロットから計算した。
【０１１３】
本明細書において、細胞毒性のIC50 値は５０％の細胞を死滅させる化合物の濃度として定義し、選択性の倍数は、非CYP1発現細胞におけるIC50を、CYP1A1またはCYP1B1発現細胞におけるIC50で割ることによって計算する。
【０１１４】
Promega（商標）CellTiter 96（商標）水性非放射性細胞増殖（ＭＴＳ）アッセイ
ＭＴＳアッセイは、増殖している生細胞の数の測定、細胞毒性または化学的感受性試験に関するホモジーニアスな、比色分析法である（Cali JJ, et al., "Luminescence-Based MethodsおよびProbes for Measuring Cytochrome P450 Activity", pp. 1-29. Promega Corporation, United States, 2004）。このアッセイは、テトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩；ＭＴＳ］および電子カップリング試薬（フェナジンメトスルフェート）ＰＭＳの溶液から構成される。ＭＴＳは細胞によって、組織培地に溶解するホルマザン産物に生体内還元される。９６ウェルアッセイプレートから５１０ｎｍにてホルマザン産物の吸光度を直接測定することができる。４９０または５１０ｎｍでの吸光度によって測定されるホルマザンの量は、培地中の生細胞数に直接比例する。
【０１１５】
以下のTable 3に示す本発明の化合物は、野生型ＣＨＯ細胞に対する毒性は示されず（あるいは無視できる程度）、（ＣＹＰ１発現の非存在下で）化合物が非毒性または実質的に非毒性のプロドラッグであることが確認された。プロドラッグの活性化のメカニズムは、２種類のＣＹＰ１発現セルライン：ＣＨＯ／ＣＹＰ１Ａ１およびＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１に対するそれらの活性から推測される。例えば、化合物Ｖ、化合物ＶＩおよび化合物ＩＩは、野生型およびＣＹＰ１Ａ１発現ＣＨＯ細胞の両方に対して非毒性であるが、８０ｎＭ（化合物Ｖ）〜５００ｎＭ（化合物ＶＩ）のＩＣ50値でＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１細胞の増殖を強力に阻害する。従って、化合物ＩＩ、ＶおよびＶＩはＣＹＰ１Ｂ１活性化プロドラッグである。重要なことに、これらＣＹＰ１Ｂ１選択的プロドラッグは、非ＣＹＰ１Ｂ１発現細胞よりもＣＹＰ１Ｂ１発現細胞に対して２００〜１２５０倍毒性が強い（Table 3）。化合物ＩＩＩはＣＨＯ／ＣＹＰ１Ａ１およびＣＨＯ／ＣＹＰ１Ｂ１細胞に対して活性であり、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ１Ｂ１酵素のいずれによっても活性化されることを示している（Table 2）。
【表３】
2011521986.tif 000025
【０１１６】
実施例２：代謝産物活性
上記化合物の作用機序を調べるために、化合物Ｖおよびその推定代謝産物化合物ＸＩをCerep DiversitySExpressキナーゼスクリーン (Thierry Jolas, Study No. 13991, In vitro Pharmacology: Diversity ExpresSKinase Profile)にて試験した。
【０１１７】
キナーゼスクリーニング
Cerep Laboratories (Celle l’Evescault, France) によってキナーゼスクリーニングを行った。化合物は、単一の濃度(10 μM）で２回スクリーニングした。以下のTable 4に示す結果は、化合物XIおよび化合物Vの存在下で得られる対照の比活性の阻害の百分率として示す：
{100−[(測定された比活性/対照の比活性)×100]}
ＡＴＰ濃度は、個々のキナーゼについてのＡＴＰ  Ｋｍ値に対応する(Cerep, private communication)。各実験では、アッセイの信頼性を評価するために、参照化合物を化合物ＸＩおよび化合物Ｖと並行して試験した。参照化合物についてのＩＣ50値は、過去の平均の許容限度内（±０．５ｌｏｇ単位）であった。
【０１１８】
親化合物（化合物Ｖ）および代謝産物（化合物ＸＩ）は両方とも１０μＭで試験した。結果は、化合物ＸＩ（化合物Ｖではなく）が、癌形成において重要な役割を司ることが知られているさまざまなキナーゼを阻害することを示している（以下のTable 4参照）。
【表４】
2011521986.tif 000026
【０１１９】
実施例３：シトクロームＰ４５０代謝
上記のとおり、本発明の化合物の特徴は、正常な組織では発現せず、さまざまな組織学的タイプのヒトの癌に高い頻度で発現するＣＹＰ１Ｂ１によるそれら化合物の代謝にある。正常な組織に存在するシトクロームＰ４５０酵素の基質ではないことを示すために、化合物ＶおよびＩＩを、Cerep (Mao Boryeu, Study No. 13652, ADME-Tox CYP Phenotyping, which is incorporated herein by reference)におけるＣＹＰ表現型検査で分析した。化合物ＶおよびＩＩを６種類のＣＹＰｓに暴露した（以下のTable 5参照）。結果は、どの化合物も主な異物代謝ＣＹＰ酵素のいずれによっても有意に代謝されないことを示している。
【表５】
2011521986.tif 000027
【０１２０】
方法：シトクロームＰ４５０代謝
Cerep Laboratories (Redmond, WA, USA)によりＣＹＰ代謝試験を行った。化合物を、ＣＹＰ酵素、ＮＡＤＰ（１．３ｍＭ）、Ｄ−グルコース−６−リン酸（３．３ｍＭ）およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの存在下、１μＭにて２回スクリーングした。０および６０分間インキュベーションした後、親化合物のレベルを、標準的なＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いて測定した。結果は６０分後に残存する親化合物の百分率で示す。
【０１２１】
実施例４： in vivo での生物学的活性
in vivoでの候補薬物の効果を実証するため、異種移植試験を行った。この試験では、ＵＴＳＣＣ−１４異種移植腫瘍において、化合物ＩＩの有効性を３種類の用量レベルでビークル対照と比較した。
【０１２２】
４０匹の雌性nu/nuマウス（７〜９週齢、体重２０〜２５グラム）に２ｅ６  ＵＴＳＣＣ−１４細胞を皮下移植し、１０日後、約１００〜１５０ｍｍ−３の腫瘍量を有するマウスを、無作為に９匹ずつ４の群に分けた（Table 1）。すべての群に、２９日間毎日腹腔内投与した。４０日目に腫瘍を摘出し、重量を計った。
【０１２３】
実験に用いたＵＴＳＣＣ−１４細胞は、トゥルク大学のReidar Grenman教授の研究室（頭部および頸部外科部門、トゥルク大学、トゥルク、フィンランド）から入手たものであり、雄性の頭部および頸部癌患者の舌由来のグレードＩＩの原発性腫瘍から採取されたものである。
【表６】
2011521986.tif 000028
【０１２４】
実験スケジュールをTable 7に示す。
【表７】
2011521986.tif 000029
【０１２５】
５０％ＤＭＳＯ／水のストック溶液を作製するために、化合物ＩＩを１００％セルカルチャーグレードのＤＭＳＯ中に４０ｍｇ／ｍｌで溶解／懸濁したのち、投与の直前にｄｄＨ2Ｏで希釈した。このストック溶液を用いて、５０％ＤＭＳＯ／水で希釈して必要な濃度にすることによりすべての用量を調製した。
【０１２６】
図２は、試験の４０日目に切除した腫瘍重量をグラム数で示したものである。このグラフは、試験の終了時での腫瘍湿潤重量の用量依存的減少を示している。これらの結果は、癌患者から直接採取した細胞を用いたin vivoモデルでの活性を示している。この試験は、化合物ＩＩ（および本明細書に記載した関連化合物）が、新しい癌治療の開発において有用であることの裏付けを与えるものである。
【図１】
2011521986.tif 000044
【図２】
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【国際調査報告】
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