(57)【要約】  式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）：（Ｉｂ）を有する新規な化合物またはそれらの薬学的に許容しうる塩、それらの製造方法、それらを含有する医薬組成物、および療法でのそれらの使用を提供する。2011524888.tif 000030
2011524888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）：
【化１】
2011524888.tif 000028
を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
【請求項２】
化合物が、式（Ｉｂ）：
【化２】
2011524888.tif 000029
を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
薬剤として用いるための、請求項２に記載の式（Ｉｂ）を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩。
【請求項４】
療法で用いるための薬剤の製造における、請求項２に記載の式（Ｉｂ）を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩の使用。
【請求項５】
黒色腫、乳頭状甲状腺腫瘍、肝内胆管癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、白血病、リンパ性悪性疾患、多発性骨髄腫、肝、腎臓、膀胱、前立腺、乳房および膵臓の癌腫および肉腫、ならびに皮膚、結腸、甲状腺、肺および卵巣の原発性および再発性の充実性腫瘍の処置に用いるための薬剤の製造における本明細書中に定義の、請求項２に記載の式（Ｉｂ）を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩の使用。
【請求項６】
ＦＧＦＲ阻害作用を生じる処置を必要としているヒトなどの温血動物にＦＧＦＲ阻害作用を生じる方法であって、該動物に、有効量の請求項２に記載の式（Ｉｂ）を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩を投与することを含む方法。
【請求項７】
抗癌作用を生じる処置を必要としているヒトなどの温血動物に抗癌作用を生じる方法であって、該動物に、有効量の請求項２に記載の式（Ｉｂ）を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩を投与することを含む方法。
【請求項８】
医薬組成物であって、本明細書中に定義の請求項２に記載の式（Ｉｂ）を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうるアジュバント、希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物。
【請求項９】
黒色腫、乳頭状甲状腺腫瘍、肝内胆管癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、白血病、リンパ性悪性疾患、多発性骨髄腫、肝、腎臓、膀胱、前立腺、乳房および膵臓の癌腫および肉腫、および皮膚、結腸、甲状腺、肺および卵巣の原発性および再発性の充実性腫瘍の処置を必要としているヒトなどの温血動物においてこれらを処置する方法であって、該動物に、本明細書中に定義の有効量の請求項２に記載の式（Ｉｂ）を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩を投与することを含む方法。
【請求項１０】
式（Ｉｂ）を有する化合物が、結晶形である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
式（Ｉｂ）を有する化合物が、Form Ａと称される結晶形である、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピラゾール化合物、それらの製造方法、それらを含有する医薬組成物、それら医薬組成物を製造する方法、および療法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼは、いろいろな細胞機能を調節するタンパク質（酵素）のクラスである。これは、タンパク質基質上の特定のアミノ酸のリン酸化によって行われて、その基質タンパク質のコンホメーション変化を引き起こす。そのコンホメーション変化は、基質の活性を、または他の結合パートナーと相互作用するその能力をモジュレーションする。プロテインキナーゼの酵素活性とは、そのキナーゼが、リン酸基を基質へ付加する速度を意味する。それは、例えば、生成物へ変換される基質の量を時間の関数として決定することによって測定することができる。基質のリン酸化は、プロテインキナーゼの活性部位で起こる。
【０００３】
チロシンキナーゼは、タンパク質基質上のチロシン残基へのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の末端ホスフェートの転移を触媒するプロテインキナーゼのサブセットである。これらキナーゼは、細胞の増殖、分化および移動をもたらす増殖因子シグナル伝達の伝播において重要な役割を果たしている。
【０００４】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、発生および血管新生の際の形態形成などの多数の生理的過程の重要なメディエーターとして認識された。現在のところ、ＦＧＦファミリーについて２５種類を超えるメンバーが知られている。線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）ファミリーは、細胞外リガンド結合ドメイン、単一膜貫通ドメインおよび細胞内細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメインを各々が含んで成る四つのメンバーから成る。ＦＧＦでの刺激時に、ＦＧＦＲは、二量体化およびトランスホスホリレーション（transphosphorylation）を行って、受容体活性化を引き起こす。受容体活性化は、細胞成長、細胞代謝および細胞生存などの多様な過程の調節に関与する特定の下流シグナリングパートナーの補充および活性化に十分である（Reviewed in Eswarakumar, V.P. et. al., Cytokine & Growth Factor Reviews 2005, 16, p139-149）。したがって、ＦＧＦおよびＦＧＦＲは、腫瘍形成を開始するおよび／または促進する可能性を有する。
【０００５】
現在、ＦＧＦシグナリングをヒト癌へ直接的に連結する顕著な証拠が存在している。いろいろなＦＧＦの高発現は、（特に）膀胱、腎細胞および前立腺などの多様な範囲の腫瘍細胞において報告された。ＦＧＦは、更に、強力な血管新生因子として記載された。内皮細胞におけるＦＧＦＲの発現も報告された。いろいろなＦＧＦＲの活性化突然変異は、（特に）膀胱癌および多発性骨髄腫に関連していたが、受容体発現も、特に、前立腺癌および膀胱癌において示された（Reviewed in Grose, R. et. al., Cytokine & Growth Factor Reviews 2005, 16, p179-186 および Kwabi-Addo, B. et. al., Endocrine-Related Cancer 2004, 11, p709-724）。これらの理由で、ＦＧＦシグナリングシステムは、魅力的な治療標的であるが、特に、ＦＧＦＲおよび／またはＦＧＦシグナリングを標的とする治療は、腫瘍細胞に直接的に、そして腫瘍血管新生にも影響することがありうるからである。
【０００６】
ＦＧＦＲおよび／またはＦＧＦＲとしてのＦＧＦシグナリングを標的とする治療に用いることができるピラゾールアミドは、２００７年１２月２０日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００４９１７号に記載されている。具体的には、記載されている特定のピラゾールアミドは、ラセミ混合物として製造された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ２００７／００４９１７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Reviewed in Eswarakumar, V.P. et. al., Cytokine & Growth Factor Reviews 2005, 16, p139-149
【非特許文献２】Reviewed in Grose, R. et. al., Cytokine & Growth Factor Reviews 2005, 16, p179-186
【非特許文献３】Kwabi-Addo, B. et. al., Endocrine-Related Cancer 2004, 11, p709-724
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ここで、特定の鏡像異性体について、好都合でありうる一つまたはそれを超える生物学的および／または生理学的性質に相違がありうるということが判明した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明により、式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）：
【００１１】
【化１】
2011524888.tif 000003
【００１２】
を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩を提供する。
本発明のもう一つの側面において、式（Ｉｂ）：
【００１３】
【化２】
2011524888.tif 000004
【００１４】
を有する化合物またはその薬学的に許容しうる塩を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Form ＡのＸＲＤ図形を、図１に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の化合物の適する薬学的に許容しうる塩は、例えば、十分に塩基性である本発明の化合物の酸付加塩、例えば、無機酸または有機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸またはマレイン酸との、例えば、酸付加塩である。更に、十分に酸性である本発明の化合物の適する薬学的に許容しうる塩は、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム塩またはマグネシウム塩；アンモニウム塩；または生理学的に許容しうる陽イオンを与える有機塩基との塩、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリンまたはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンとの塩である。
【００１７】
本発明は、ＦＧＦＲ阻害活性を有する式（Ｉａ）および式（Ｉｂ）の化合物のいずれかのおよび全ての互変異性体形に関する。例えば、式（ＩＡ）の化合物は、式（Ｉａ）の化合物の互変異性体である。
【００１８】
【化３】
2011524888.tif 000005
【００１９】
例えば、式（ＩＢ）の化合物は、式（Ｉｂ）の化合物の互変異性体である。
【００２０】
【化４】
2011524888.tif 000006
【００２１】
式（Ｉａ）および式（Ｉｂ）を有する特定の化合物が、溶媒和の形で、更には、非溶媒和の形で、例えば、水和した形などで存在しうるということも理解されるはずである。本発明が、ＦＧＦＲ阻害活性を有するこのような溶媒和の形を全て包含するということは理解されるはずである。
【００２２】
本発明の別の側面において、本発明の具体的な化合物は、実施例のいずれか一つ、またはそのいずれか一つの薬学的に許容しうる塩である。
本発明は、更に、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうるの製造方法であって、式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）
【００２３】
【化５】
2011524888.tif 000007
【００２４】
｛式中、Ｚは、脱離基［例えば、ハロゲン、例えば、塩素、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＯＨ、または−ＯＲ基、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ基、−ＯＣＲ（ＮＲａＲｂ）２基または−ＯＣ（＝ＮＲ）ＮＲａＲｂ基（式中、Ｒは、置換されていてよいアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはアルカリール（alkaryl）であり、そしてＲａ、Ｒｂは、各々独立して、水素または置換されていてよいアルキル、アリールまたはアルカリールである）］である｝
を有する化合物と、式（ＩＩＩ）
【００２５】
【化６】
2011524888.tif 000008
【００２６】
［式中、Ｑは、水素または保護基（例えば、ｔ−Ｂｕ基またはＢＯＣ基、または‘Protective Groups in Organic Synthesis’, 2nd edition, T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Wiley-Interscience (1991) に記載の通り）である］
を有する化合物とを反応させて、式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物を生じることを含み、そして場合により、次の一つまたはそれを超えること、すなわち、
・得られた化合物を、本発明の化合物へと変換すること、
・その化合物の薬学的に許容しうる塩を形成すること
を行う方法を提供する。
【００２７】
式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）を有する適する化合物には、カルボン酸またはカルボン酸の反応性誘導体が含まれる。カルボン酸またはカルボン酸の反応性誘導体には、酸と無機酸塩化物との反応によって形成される塩化アシルなどのハロゲン化アシル、例えば、塩化チオニル；混成無水物、例えば、酸と、クロロギ酸イソブチルなどのクロロホルメートとの反応によって形成される無水物；活性エステル、例えば、カルボン酸と、ペンタフルオロフェノールなどのフェノールとの、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニルなどのエステルとの、またはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノールまたはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどのアルコールとの反応によって形成されるエステル；アジ化アシル、例えば、酸と、アジ化ジフェニルホスホリルなどのアジ化物との反応によって形成されるアジ化物；シアン化アシル、例えば、酸と、シアン化ジエチルホスホリルなどのシアン化物との反応によって形成されるシアン化物；または酸と、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどのカルボジイミドとの、または２−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（Ｖ）などのウロニウム化合物との反応生成物が含まれる。
【００２８】
その反応は、好都合には、適する不活性溶媒または希釈剤、例えば、塩化メチレン、クロロホルムまたは四塩化炭素などのハロゲン化溶媒；メタノール、エタノール、イソプロパノールまたは酢酸エチルなどのアルコールまたはエステル；テトラヒドロフランまたは１，４−ジオキサンなどのエーテル；トルエンなどの芳香族溶媒の存在下で行ってよい。その反応は、更に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリジン−２−オンまたはジメチルスルホキシドなどの双極性非プロトン性溶媒の存在下で行うことができる。反応は、好都合には、行われている反応および脱離基Ｚの性状に依存して、例えば、−２０℃〜１００℃、好ましくは、０℃〜周囲温度の範囲内の温度で行われる。
【００２９】
その反応は、典型的に、塩基の存在下で行うことができる。適する塩基には、行われている反応および脱離基Ｚの性状に依存して、ピリジン、２，６−ルチジン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、コリジン、４−ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、モルホリン、Ｎ−メチルモルホリンまたはジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エンなどの有機アミン塩基；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の炭酸塩または水酸化物；ナトリウムヘキサメチルジシラジド（ＮａＨＭＤＳ）などのアルカリ金属アミド；または水素化ナトリウムなどのアルカリ金属水素化物が含まれる。
【００３０】
反応は、更に、行われている反応および脱離基Ｚの性状に依存して、Lewis 酸、例えば、トリメチルアルミニウムの存在下で行うことができる。
式（ＩＩａ）、式（ＩＩｂ）または式（ＩＩＩ）の化合物は、商業的に入手可能であるか、参考文献で知られているか、または既知の技法を用いて製造することができる。
【００３１】
Ｚが、ハロゲンまたは−ＯＲである式（ＩＩ）の化合物は、Ｚが−ＯＨである式（ＩＩ）の化合物から、参考文献で知られている方法によって製造することができる。例えば、カルボン酸からの酸塩化物またはエステルの製造について知られている方法を用いることができる。
【００３２】
Ｚが−ＯＲである式（ＩＩ）の化合物は、２−メチルピペラジンと４−フルオロ安息香酸エステルとの反応で４（３−メチルピペラジニル）安息香酸エステルを生じた後、Ｎ−メチル化を行うことによって製造することができる。
【００３３】
式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＶ）
【００３４】
【化７】
2011524888.tif 000009
【００３５】
を有する化合物と、式（Ｖ）
【００３６】
【化８】
2011524888.tif 000010
【００３７】
を有するヒドラジンとを反応させることによって製造することができる。
その反応は、好都合には、エタノールなどの溶媒中において６０〜８０℃の温度範囲で行ってよい。
【００３８】
式（ＩＶ）および式（Ｖ）の化合物は、商業的に入手可能な化合物であるし、またはそれらは、参考文献で知られているし、またはそれらは、当該技術分野において知られている標準法によって製造される。
【００３９】
本発明の方法において、出発試薬または中間体化合物中のヒドロキシル基またはアミノ基などの特定の官能基を、保護基で保護する必要がありうるということは、当業者に理解されるであろう。したがって、式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物の製造は、いろいろな段階において、一つまたはそれを超える保護基の付加および除去を必要とすることがありうる。
【００４０】
官能基の保護および脱保護は、‘Protective Groups in Organic Chemistry’, edited by J.W.F. McOmie, Plenum Press (1973) および‘Protective Groups in Organic Synthesis’, 2nd edition, T.W. Greene and P.G.M. Wuts, Wiley-Interscience (1991) に記載されている。
【００４１】
上の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物は、薬学的に許容しうる塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、酢酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩またはｐ-トルエンスルホン酸塩などの酸付加塩；またはナトリウム塩またはカリウム塩などのアルカリ金属塩へ変換されてよい。
【００４２】
互変異性体およびそれらの混合物の使用も、本発明の側面を形成する。
式（１ｂ）の化合物は、一つまたはそれを超える結晶形で存在してよい。本発明の具体的な側面において、式（１ｂ）の化合物は、Form Ａと称される結晶形である。
【００４３】
本発明の別の側面において、式（１ｂ）の化合物が結晶形である、本明細書中に定義の医薬組成物を提供する。
本発明のまた別の側面において、式（１ｂ）の化合物を、実質的に結晶性 Form Ａとして含む、本明細書中に定義の医薬組成物を提供する。
【００４４】
実質的に結晶性 Form Ａとしてとは、存在する Form Ａが９５％より大であるということを意味する。具体的には、９６％より大の Form Ａが存在する。具体的には、９７％より大の Form Ａが存在する。具体的には、９８％より大の Form Ａが存在する。具体的には、９９％より大の Form Ａが存在する。具体的には、９９．５％より大の Form Ａが存在する。具体的には、９９．８％より大の Form Ａが存在する。
【００４５】
一つの態様において、２−θ（λ＝１．５４１８Å）に５．２８８、１７．９３５、１８．０１１、２０．５１３および２０．７５３のピークを含むＸＲＤ図形を有する結晶形の式（１ｂ）の化合物を提供する。
【００４６】
もう一つの態様において、２−θ（λ＝１．５４１８Å）に５．２８８、１７．９３５、１８．０１１、１８．７６６、１９．６２８、１９．６６７、２０．５１３、２０．７５３および２３．８９２のピークを含むＸＲＤ図形を有する結晶形の式（１ｂ）の化合物を提供する。
【００４７】
もう一つの態様において、２−θ（λ＝１．５４１８Å）に５．２８８、１７．７６１、１７．９３５、１８．０１１、１８．７６６、１９．０９４、１９．６２８、１９．６６７、２０．５１３、２０．７５３、２２．２６４および２３．８９２のピークを含むＸＲＤ図形を有する結晶形の式（１ｂ）の化合物を提供する。
【００４８】
もう一つの態様において、２−θ（λ＝１．５４１８Å）に５．２８８、１０．４８３、１１．３８８、１１．９１２、１４．０８６、１５．６７１、１６．３２２、１７．７６１、１７．９３５、１８．０１１、１８．７６６、１９．０９４、１９．６２８、１９．６６７、２０．５１３、２０．７５３、２１．７６５、２２．２６４、２２．７６６、２２．７９３および２３．８９２のピークを含むＸＲＤ図形を有する結晶形の式（１ｂ）の化合物を提供する。
【００４９】
もう一つの態様において、２−θ（λ＝１．５４１８Å）に３．６４２、４．３５７、５．２８８、７．２２６、９．０６２、９．４８２、１０．４８３、１１．３８８、１１．８５、１１．９１２、１３．０７８、１４．０８６、１４．５５９、１５．６７１、１６．１５６、１６．１７９、１６．３２２、１７．７６１、１７．９３５、１８．０１１、１８．７６６、１９．０９４、１９．６２８、１９．６６７、２０．５１３、２０．７５３、２１．７６５、２２．２６４、２２．７６６、２２．７９３、２３．８９２、２６．２５７および３６．２６９のピークを含むＸＲＤ図形を有する結晶形の式（１ｂ）の化合物を提供する。
【００５０】
当業者は、本明細書中に示された回折図形データを絶対と解釈すべきではないということを理解するであろう（追加の情報については、Jenkins, R & Snyder, R.L. ‘Introduction to X-Ray Powder Diffractometry’ John Wiley & Sons, 1996 を参照されたい）。したがって、結晶形が、本明細書中に記載のＸ線粉末回折図形と同一のＸ線粉末回折図形を与える結晶に制限されるわけではないということは理解されるであろう。本発明は、更に、本明細書中に記載されたものと実質的に同じＸ線粉末回折図形を与えるいずれの結晶も包含する。Ｘ線粉末回折の業者は、Ｘ線粉末回折図形の実質的類似性を判断することができるし、そして相違が、いろいろな因子、例えば、測定条件（装置、試料標品または用いられる試験機など）によって生じる測定誤差；測定条件および試料標品によって生じる強度変動；結晶のサイズまたは非ユニタリアスペクト比の変動によって生じるピークの相対強度変動；および回折計中の試料が置かれている正確な高さによっておよび回折計のゼロ検定によって影響されることがありうる反射の位置、および試料の表面平坦さの結果でありうるということを理解するであろう。
【００５１】
式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物は、薬剤として、具体的には、ＦＧＦＲ活性のモジュレーターまたは阻害剤としての活性を有するので、増殖性および高増殖性疾患／状態の処置に用いることができるが、その例には、次の癌、すなわち、
（１）膀胱、脳、乳房、結腸、腎臓、肝、肺、卵巣、膵臓、前立腺、胃、子宮頸部、結腸、甲状腺および皮膚の癌腫を含めた癌腫；
（２）急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫および Burketts リンパ腫を含めた、リンパ系統の造血系腫瘍；
（３）急性および慢性の骨髄性白血病および前骨髄球性白血病を含めた、骨髄系統の造血系腫瘍；
（４）線維肉腫および横紋筋肉腫を含めた、間葉起原の腫瘍；および
（５）黒色腫、セミノーマ、テトラトカルシノーマ（tetratocarcinoma）、神経芽細胞腫およびグリオーマを含めた他の腫瘍が含まれる。
【００５２】
一つの態様において、本発明の化合物は、膀胱、乳房および前立腺の腫瘍および多発性骨髄腫の処置に有用である。
したがって、本発明は、療法で用いるための、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を提供する。
【００５３】
本発明のもう一つの側面により、療法によるヒトまたは動物体の処置方法で用いるための、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を提供する。
【００５４】
もう一つの側面において、本発明は、療法で用いるための薬剤の製造における、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩の使用を提供する。
【００５５】
本明細書の文脈中、「療法」という用語には、そうではないと特に示されない限り、「予防」も含まれる。したがって、「治療的」および「治療的に」という用語が解釈されるはずである。
【００５６】
本発明は、更に、癌を処置する方法であって、それを必要としている患者に、治療的有効量の本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を投与することを含む方法を提供する。
【００５７】
本発明者は、本発明に定義の化合物またはそれらの薬学的に許容しうる塩が、有効な抗癌剤であり、その性質は、ＦＧＦＲ活性をモジュレーションすることまたは阻害することによると考えられるということを発見した。したがって、本発明の化合物は、ＦＧＦＲによって単独でまたは一部分媒介される疾患または医学的状態の処置に有用であると期待される、すなわち、それら化合物は、このような処置を必要としている温血動物にＦＧＦＲ阻害作用を生じるのに用いることができる。
【００５８】
したがって、本発明の化合物は、ＦＧＦＲの阻害を特徴とする癌を処置する方法を提供する、すなわち、それら化合物は、ＦＧＦＲの阻害によって単独でまたは一部分媒介される抗癌作用を生じるのに用いることができる。
【００５９】
本発明のこのような化合物は、ＦＧＦＲの活性化突然変異が、乳房、膀胱、前立腺が含まれるがこれに制限されるわけではない多数のヒト癌および多発性骨髄腫において認められたように、広範囲の抗癌性を有すると期待される。したがって、本発明の化合物は、これら癌に対して抗癌活性を有するであろうと期待される。更に、本発明の化合物は、一定範囲の白血病、リンパ性悪性疾患、および肝、腎臓、膀胱、前立腺、乳房および膵臓などの組織の癌腫および肉腫などの充実性腫瘍に対して活性を有するであろうと期待される。一つの態様において、本発明の化合物は、例えば、皮膚、結腸、甲状腺、肺および卵巣の原発性および再発性の充実性腫瘍の成長を好都合に遅らせると期待される。より具体的には、本発明のこのような化合物またはそれらの薬学的に許容しうる塩は、ＦＧＦＲに関連しているそれら腫瘍、特に、それらの成長および拡散について有意にＦＧＦＲに依存しているそれら腫瘍、例えば、膀胱、前立腺、乳房の特定の腫瘍を含めた腫瘍および多発性骨髄腫の成長を阻害すると期待される。
【００６０】
したがって、本発明のこの側面により、薬剤として用いるための、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を提供する。
本発明のもう一つの側面により、ヒトなどの温血動物でのＦＧＦＲ阻害作用の生成に用いるための薬剤の製造における、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩の使用を提供する。
【００６１】
本発明のこの側面により、ヒトなどの温血動物での抗癌作用の生成に用いるための薬剤の製造における、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩の使用を提供する。
【００６２】
本発明のもう一つの特徴により、黒色腫、乳頭状甲状腺腫瘍、肝内胆管癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、白血病、リンパ性悪性疾患、多発性骨髄腫、肝、腎臓、膀胱、前立腺、乳房および膵臓の癌腫および肉腫、および皮膚、結腸、甲状腺、肺および卵巣の原発性および再発性の充実性腫瘍の処置に用いるための薬剤の製造における、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩の使用を提供する。
【００６３】
本発明のもう一つの側面により、ヒトなどの温血動物でのＦＧＦＲ阻害作用の生成における、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩の使用を提供する。
【００６４】
本発明のこの側面により、ヒトなどの温血動物での抗癌作用の生成における、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩の使用を提供する。
【００６５】
本発明のもう一つの特徴により、黒色腫、乳頭状甲状腺腫瘍、肝内胆管癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、白血病、リンパ性悪性疾患、多発性骨髄腫、肝、腎臓、膀胱、前立腺、乳房および膵臓の癌腫および肉腫、および皮膚、結腸、甲状腺、肺および卵巣の原発性および再発性の充実性腫瘍の処置における、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩の使用を提供する。
【００６６】
本発明のこの側面のもう一つの特徴により、ＦＧＦＲ阻害作用を生じる処置を必要としているヒトなどの温血動物にＦＧＦＲ阻害作用を生じる方法であって、この動物に、有効量の本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を投与することを含む方法を提供する。
【００６７】
本発明のこの側面のもう一つの特徴により、抗癌作用を生じる処置を必要としているヒトなどの温血動物に抗癌作用を生じる方法であって、この動物に、有効量の本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を投与することを含む方法を提供する。
【００６８】
本発明のこの側面の更にもう一つの特徴により、黒色腫、乳頭状甲状腺腫瘍、肝内胆管癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、白血病、リンパ性悪性疾患、多発性骨髄腫、肝、腎臓、膀胱、前立腺、乳房および膵臓の癌腫および肉腫、および皮膚、結腸、甲状腺、肺および卵巣の原発性および再発性の充実性腫瘍の処置を必要としているヒトなどの温血動物のこれらを処置する方法であって、この動物に、有効量の本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を投与することを含む方法を提供する。
【００６９】
本発明のもう一つの側面において、ヒトなどの温血動物でのＦＧＦＲ阻害作用の生成に用いるための医薬組成物であって、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００７０】
本発明のもう一つの側面において、ヒトなどの温血動物での抗癌作用の生成に用いるための医薬組成物であって、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００７１】
本発明のもう一つの側面において、ヒトなどの温血動物の黒色腫、乳頭状甲状腺腫瘍、肝内胆管癌、結腸癌、卵巣癌、肺癌、白血病、リンパ性悪性疾患、多発性骨髄腫、肝、腎臓、膀胱、前立腺、乳房および膵臓の癌腫および肉腫、および皮膚、結腸、甲状腺、肺および卵巣の原発性および再発性の充実性腫瘍の処置に用いるための医薬組成物であって、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうる希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００７２】
式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）を有するそれら化合物およびそれらの薬学的に許容しうる塩は、それらだけで用いてよいが、概して、式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）化合物または塩（活性成分）が、薬学的に許容しうるアジュバント、希釈剤または担体と一緒にある医薬組成物の形で投与されるであろう。投与様式に依存して、その医薬組成物は、全ての重量百分率が全組成物に基づく、０．０１〜９９％ｗ（重量％）、０．０５〜８０％ｗ、０．１０〜７０％ｗの、および／または０．１０〜５０％ｗもの活性成分を含んでよい。
【００７３】
本発明は、更に、医薬組成物であって、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうるアジュバント、希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物を提供する。
【００７４】
本発明は、更に、本発明の医薬組成物の製造方法であって、本明細書中に定義の式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の化合物またはその薬学的に許容しうる塩を、薬学的に許容しうるアジュバント、希釈剤または担体と混合することを含む方法を提供する。
【００７５】
それら医薬組成物は、局所に（例えば、皮膚にまたは肺および／または気道に）、例えば、クリーム剤、液剤、懸濁剤、ヘプタフルオロアルカンエアゾル剤および乾燥粉末製剤の形で；または全身に、例えば、経口投与によって錠剤、カプセル剤、シロップ剤、散剤または顆粒剤の形で；または非経口投与によって液剤または懸濁剤の形で；または皮下投与によって；または直腸投与によって坐剤の形で；または経皮で投与することができる。
【００７６】
本発明の組成物は、当該技術分野において周知の慣用的な医薬賦形剤を用いて慣用法によって得ることができる。したがって、経口使用を予定した組成物は、例えば、一つまたはそれを超える着色剤、甘味剤、着香剤および／または保存剤を含有してよい。
【００７７】
錠剤製剤に適する薬学的に許容しうる賦形剤には、例えば、ラクトース、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムなどの不活性希釈剤；トウモロコシデンプンまたはアルゲン酸（algenic acid）などの造粒剤および崩壊剤；デンプンなどの結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクなどの滑沢剤；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピルなどの保存剤；およびアスコルビン酸などの酸化防止剤が含まれる。錠剤製剤は、未コーティングであってよいし、または胃腸管内でのそれらの崩壊および引き続きの活性成分の吸収を変更するかまたは、それらの安定性および／または外観を改善するために、どちらの場合も、当該技術分野において周知の慣用的なコーティング剤および手順を用いてコーティングされていてよい。
【００７８】
経口使用のための組成物は、活性成分が、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されているゼラチン硬カプセル剤の形であってよいし、または活性成分が、ラッカセイ油、流動パラフィンまたはオリーブ油などの油または水と混合されているゼラチン軟カプセル剤としてあってよい。
【００７９】
水性懸濁剤は、概して、微粉の形の活性成分を、一つまたはそれを超える懸濁化剤であって、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴムなどのもの；分散助剤または湿潤剤であって、レシチン；またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート（polyoxethylene stearate））；またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール；またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレアートのような、エチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物；またはエチレンオキシドと、脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレアートなどのものと一緒に含有する。それら水性懸濁剤は、更に、一つまたはそれを超える保存剤（ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはプロピルなど）、酸化防止剤（アスコルビン酸など）、着色剤、着香剤および／または甘味剤（スクロース、サッカリンまたはアスパルテームなど）を含有してよい。
【００８０】
油状懸濁剤は、活性成分を、植物油（ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油など）中にまたは鉱油（流動パラフィンなど）中に懸濁させることによって製剤化することができる。それら油状懸濁剤は、更に、蜜蝋、硬質パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含有してよい。上に挙げられたものなどの甘味剤、および着香剤は、風味のよい経口製剤を提供するために加えられてよい。これら組成物は、アスコルビン酸などの酸化防止剤の添加によって保存することができる。
【００８１】
水の添加による水性懸濁剤の製造に適する分散性散剤および顆粒剤は、概して、活性成分を、分散助剤または湿潤剤、懸濁化剤および一つまたはそれを超える保存剤と一緒に含有する。適する分散助剤または湿潤剤および懸濁化剤は、上に既述されたものによって代表される。甘味剤、着香剤および着色剤などの追加の賦形剤も、存在してよい。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、更に、水中油エマルジョンの形であってよい。油状相は、オリーブ油またはラッカセイ油などの植物油または鉱油、例えば、流動パラフィンなど、またはいずれかこれらの混合物であってよい。適する乳化剤は、例えば、アラビアゴムまたはトラガカントゴムなどの天然に存在するガム；ダイズ、レシチンなどの天然に存在するホスファチド；脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導されるエステルまたは部分エステル（例えば、ソルビタンモノオレアート）；およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートのような、この部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物であってよい。それらエマルジョンは、更に、甘味剤、着香剤および保存剤を含有してよい。
【００８３】
シロップ剤およびエリキシル剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、アスパルテームまたはスクロースなどの甘味剤と一緒に製剤化することができるし、そして更に、粘滑剤、保存剤、着香剤および／または着色剤を含有してよい。
【００８４】
それら医薬組成物は、更に、滅菌注射可能水性または油状懸濁液の形であってよく、それらは、既知の手順にしたがって、上に挙げられた一つまたはそれを超える適当な分散助剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて製剤化することができる。滅菌注射可能製剤は、更に、無毒性の非経口的に許容しうる希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液であってよい。
【００８５】
坐剤製剤は、活性成分を、常温では固体であるが、直腸温度で液体である適する無刺激性賦形剤と混合することによって製造することができるので、直腸内で融解して、薬物を放出するであろう。適する賦形剤には、例えば、カカオ脂およびポリエチレングリコールが含まれる。
【００８６】
クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤および水性または油状の液剤または懸濁剤などの局所用製剤は、概して、当該技術分野において周知の慣用法を用いて、活性成分を、慣用的な局所に許容しうるビヒクルまたは希釈剤と一緒に製剤化することによって得ることができる。
【００８７】
吹入による投与用の組成物は、例えば、３０μまたはそれよりはるかに小さい平均直径の粒子を含有する微粉の形であってよいが、その粉末自体、活性成分を単独でかまたは、ラクトースなどの一つまたはそれを超える生理学的に許容しうる担体で希釈された状態で含む。次に、その吹入用粉末を、好都合には、既知のナトリウムクロモグリケート（sodium cromoglycate）薬の吹入に用いられるようなターボ吸入器具で用いるための、例えば、１〜５０ｍｇの活性成分を含有するカプセル中で保持する。
【００８８】
吸入による投与用の組成物は、活性成分を、微粉固体を含有するエアゾルかまたは液体粒子として分配するように配置された慣用的な加圧エアゾルの形であってよい。揮発性のフッ素化炭化水素または炭化水素などの慣用的なエアゾル噴射剤を用いることができ、そしてエアゾル装置は、好都合には、一定計測量の活性成分を分配するように配置される。
【００８９】
製剤についての追加の情報について、読者は、Chapter 25.2 in Volume 5 of Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990 を参照する。
【００９０】
本発明の化合物の治療目的のサイズおよび用量は、当然ながら、周知の医学慣例にしたがって、状態の性状および重症度、動物または患者の年齢および性別、および投与経路によって変化するであろう。
【００９１】
概して、本発明の化合物は、必要ならば分割用量で与えられる、例えば、１ｋｇ体重につき０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ活性成分の範囲内の１日用量が与えられるように投与されるであろう。しかしながら、その１日用量は、必然的に、処置される宿主、具体的な投与経路および処置されている疾患の重症度に依存して変化するであろう。したがって、最適投薬量は、いずれか特定の患者を処置している医療の実務者が決定してよい。概して、非経口経路を用いる場合、より少ない用量が投与されるであろう。したがって、例えば、静脈内投与には、概して、例えば、１ｋｇ体重につき０．１ｍｇ〜３０ｍｇ活性成分の範囲内の用量が用いられるであろう。同様に、吸入による投与には、概して、例えば、１ｋｇ体重につき０．１ｍｇ〜２５ｍｇ活性成分の範囲内の用量が用いられるであろう。しかしながら、経口投与が好適である。例えば、ヒトへの経口投与を予定した製剤は、概して、例えば、０．１ｍｇ〜２ｇの活性成分を含有するであろう。
【００９２】
投与経路および投薬計画についての追加の情報について、読者は、Chapter 25.3 in Volume 5 of Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990 を参照する。
【００９３】
本明細書中の前に定義の抗癌処置は、単独療法として適用されてよいし、または本発明の化合物に加えて、慣用的な外科手術または放射線療法または化学療法を伴ってよい。このような化学療法には、次のカテゴリーの一つまたはそれを超える抗腫瘍薬が含まれてよい。
【００９４】
（ｉ）医学腫瘍学で用いられるような他の抗増殖薬／抗腫瘍薬およびそれらの組合せであって、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン（oxaliplatin）、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、テモゾラミド（temozolamide）およびニトロソ尿素）；代謝拮抗薬（例えば、ジェムシタビン、および５−フルオロウラシルおよびテガフルのようなフルオロピリミジン類などの葉酸拮抗薬、ラルチトレキセド（raltitrexed）、メトトレキサート、シトシンアラビノシドおよびヒドロキシ尿素）；抗腫瘍抗生物質（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン（idarubicin）、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのようなアントラサイクリン系）；抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビン（vinorelbine）のようなビンカアルカロイド系、およびタキソールおよびタキソテレ（taxotere）のようなタキソイド類、およびポロキナーゼ（polokinase）阻害剤）；およびトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン類、アムサクリン、トポテカン（topotecan）およびカンプトテシン）などのもの；
（ii）細胞分裂抑制薬であって、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、フルヴェストラント（fulvestrant）、トレミフェン（toremifene）、ラロキシフェン（raloxifene）、ドロロキシフェン（droloxifene）およびヨードキシフェン（iodoxyfene））；抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド（bicalutamide）、フルタミド、ニルタミド（nilutamide）および酢酸シプロテロン）；ＬＨＲＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレリン（leuprorelin）およびブセレリン（buserelin））；プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）；アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール（anastrozole）、レトロゾール（letrozole）、ボラゾール（vorazole）およびエクセメスタン（exemestane）として）；およびフィナステリドなどの５＊−レダクターゼの阻害剤などのもの；
（iii）抗浸潤薬（例えば、４−（６−クロロ−２，３−メチレンジオキシアニリノ）−７−［２−（４−メチルピペラジン−１−イル）エトキシ］−５−テトラヒドロピラン−４−イルオキシキナゾリン（ＡＺＤ０５３０；国際特許出願ＷＯ０１／９４３４１号）およびＮ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−｛６−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ｝チアゾール−５−カルボキサミド（ダサチニブ（dasatinib）、ＢＭＳ−３５４８２５；J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661）のようなｃ−Ｓｒｃキナーゼファミリー阻害剤；およびマリマスタト（marimastat）のようなメタロプロテイナーゼ阻害剤、ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター受容体機能の阻害剤または Heparanase への抗体）；
（iv）増殖因子機能の阻害剤：例えば、このような阻害剤には、増殖因子抗体および増殖因子受容体抗体（例えば、抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ（trastuzumab）［HerceptinＴＭ］、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ（panitumumab）、抗ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ（cetuximab）［Erbitux，Ｃ２２５］、および Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29 に開示されたいずれかの増殖因子抗体または増殖因子受容体抗体）が含まれる；このような阻害には、更に、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、上皮増殖因子ファミリーの阻害剤（例えば、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ゲフィチニブ（gefitinib），ＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ（erlotinib），ＯＳＩ−７７４）および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）などのＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤；ラパチニブ（lapatinib）などのｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤；肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤；イマチニブ（imatinib）などの血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤；セリン／トレオニンキナーゼの阻害剤（例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤などのＲａｓ／Ｒａｆシグナリング阻害剤、例えば、ソラフェニブ（sorafenib）（ＢＡＹ４３−９００６））；ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼによる細胞シグナリングの阻害剤；肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤；ｃ−ｋｉｔ阻害剤；ａｂｌキナーゼ阻害剤；ＩＧＦ受容体（インスリン様増殖因子）キナーゼ阻害剤；オーロラキナーゼ阻害剤（例えば、ＡＺＤ１１５２、ＰＨ７３９３５８、ＶＸ−６８０、ＭＬＮ８０５４、Ｒ７６３、ＭＰ２３５、ＭＰ５２９、ＶＸ−５２８  ＡＮＤ  ＡＸ３９４５９）、およびＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害剤などのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤が含まれる；
（ｖ）抗血管新生薬であって、血管内皮増殖因子の作用を阻害するもの［例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベヴァシズマブ（bevacizumab）（AvastinＴＭ）；およびＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤であって、４−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−６−メトキシ−７−（１−メチルピペリジン−４−イルメトキシ）キナゾリン（ＺＤ６４７４；ＷＯ０１／３２６５１号中の実施例２）、４−（４−フルオロ−２−メチルインドール−５−イルオキシ）−６−メトキシ−７−（３−ピロリジン−１−イルプロポキシ）キナゾリン（ＡＺＤ２１７１；ＷＯ００／４７２１２号中の実施例２４０）、ヴァタラニブ（vatalanib）（ＰＴＫ７８７；ＷＯ９８／３５９８５号）およびＳＵ１１２４８（スニチニブ（sunitinib）；ＷＯ０１／６０８１４号）などのもの；国際特許出願ＷＯ９７／２２５９６号、ＷＯ９７／３００３５号、ＷＯ９７／３２８５６号およびＷＯ９８／１３３５４号に開示されたものなどの化合物；および他の機構によって働く化合物（例えば、リノマイド（linomide）、インテグリンａｖｂ３機能の阻害剤、およびアンギオスタチン（angiostatin）］；
（vi）血管損傷薬であって、Combretastatin Ａ４；および国際特許出願ＷＯ９９／０２１６６号、ＷＯ００／４０５２９号、ＷＯ００／４１６６９号、ＷＯ０１／９２２２４号、ＷＯ０２／０４４３４号およびＷＯ０２／０８２１３号に開示された化合物などのもの；
（vii）アンチセンス療法、例えば、ＩＳＩＳ２５０３、抗ｒａｓアンチセンスなどの、上に挙げられた標的に向けられているもの；
（viii）遺伝子治療アプローチであって、例えば、異常ｐ５３または異常ＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２などの異常遺伝子を置き換えるアプローチ；シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌ニトロレダクターゼ酵素を用いたものなどのＧＤＥＰＴ（遺伝子に支配される酵素プロドラッグ療法（gene directed enzyme pro-drug therapy））アプローチ；および多剤耐性遺伝子治療などの、化学療法または放射線療法への患者耐性を増加させるアプローチを含めたもの；および
（ix）免疫療法アプローチであって、例えば、インターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインでのトランスフェクションなどの、患者腫瘍細胞の免疫原性を増加させる ex vivo および in vivo アプローチ；Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ；サイトカインでトランスフェクションされた樹状細胞などのトランスフェクションされた免疫細胞を用いたアプローチ；サイトカインでトランスフェクションされた腫瘍細胞系を用いたアプローチ；および抗イディオタイプ抗体を用いたアプローチを含めたもの。
【実施例】
【００９５】
本発明を、ここで、次の詳しく説明する実施例に関して更に記載するが、ここにおいて、特に断らない限り、
（ｉ）温度は、摂氏度（℃）で与えられている；操作は、室温または周囲温度で、すなわち、１８〜２５℃の範囲内の温度で行った；
（ii）有機溶液は、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させた；溶媒の蒸発は、ロータリーエバポレーターを用いて、減圧下（６００〜４０００パスカル；４．５〜３０ｍｍＨｇ）において６０℃までの浴温度で行った；
（iii）クロマトグラフィーとは、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーを意味する；薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、シリカゲルプレート上で行った；
（iv）概して、反応経過は、ＴＬＣで追跡したが、反応時間は、単に例示のために与えられている；
（ｖ）最終生成物は、納得のいくプロトン核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルおよび／または質量スペクトルデータを有した；
（vi）収率は、単に例示のために与えられ、必ずしも、高度な方法開発によって得ることができるものではない；より多くの物質が必要とされた場合、製造を繰り返した；
（vii）与えられている場合のＮＭＲデータは、特に断らない限り、ＤＭＳＯ−ｄ６中において３００ＭＨｚで決定される、内部標準としてのテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に相対する百万分率（ｐｐｍ）で与えられる主要診断プロトンのδ値の形である；
（viii）化学記号は、それらの通常の意味を有する；ＳＩ単位および記号を用いている；
（ix）溶媒比は、容量：容量（ｖ／ｖ）という用語で与えられている；そして
（ｘ）質量スペクトル（ＭＳ）データは、ＬＣ／ＭＳシステムで生じさせたが、この場合、ＨＰＬＣ成分は、概して、Agilent １１００かまたは Waters Alliance ＨＴ（２７９０＆２７９５）装置を含み、Phemonenex Gemini Ｃ１８  ５μｍ、５０ｘ２ｍｍカラム（または類似のもの）上において、酸性溶離剤（例えば、５０：５０の水：アセトニトリル（ｖ／ｖ）混合物中の１％ギ酸を５％含む０〜９５％水／アセトニトリル勾配を用いる；またはアセトニトリルの代わりにメタノールを含む同等の溶媒系を用いる）かまたは塩基性溶離剤（例えば、アセトニトリル混合物中０．１％の８８０アンモニアを５％含む０〜９５％水／アセトニトリル勾配を用いる）で溶離して行った；そしてＭＳ成分は、概して、Waters ＺＱスペクトロメーターを含んだ。エレクトロスプレー（ＥＳＩ）正・負Base Peak Intensity クロマトグラムおよび２２０〜３００ｎｍのＵＶ Total Absorption Chromatogram を生じさせ、ｍ／ｚの値を与えている；概して、親質量を示すイオンのみを報告し、そして特に断らない限り、引用されている値は、正イオンモードについて（Ｍ＋Ｈ）＋および負イオンモードについて（Ｍ−Ｈ）−である；
（xi）分取ＨＰＬＣは、Ｃ１８逆相シリカ、例えば、Waters‘Xterra’分取逆相カラム（５ミクロンシリカ、１９ｍｍ直径、１００ｍｍ長さ）上において、溶離剤として漸減極性混合物、例えば、水（１％酢酸または１％水性水酸化アンモニウム（ｄ＝０．８８）含有）およびアセトニトリルの漸減極性混合物を用いて行った；
（xii）次の略語：
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン；
ＤＭＦ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；
ＥｔＯＡｃ  酢酸エチル；
ＤＣＭ  ジクロロメタン；および
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＤＩＰＥＡ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（Ｎ−エチル−Ｎ−プロパン−２−イルプロパン−２−アミンとしても知られる）
ＰＢＳ  リン酸緩衝化生理食塩水
ＨＥＰＥＳ  Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］
ＤＴＴ  ジチオトレイトール
ＡＴＰ  アデノシン三リン酸
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
ＤＭＥＭ  ダルベッコ改変イーグル培地
ＭＯＰＳ  ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
を用いた；
（xiii）化合物は、商標命名ソフトウェア：Openeye Lexichem バージョン１．４を用い、ＩＵＰＡＣ命名条約を用いて命名している；
（xiv）特に断らない限り、出発物質は商業的に入手可能である。
【００９６】
実施例１（ａ）  （Ｓ）−Ｎ−（３−（３，５−ジメトキシフェネチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンズアミドの製造
【００９７】
【化９】
2011524888.tif 000011
【００９８】
トリメチルアルミニウム（トルエン中２Ｍ，１．９３ｍｌ，３．８７ｍｍｏｌ）を、トルエン（１０ｍｌ）中の３−（３，５−ジメトキシフェネチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（３８２ｍｇ，１．５５ｍｍｏｌ）および（Ｓ）−メチル４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート（３８４ｍｇ，１．５５ｍｍｏｌ）の懸濁液に２５℃で滴加した。得られた溶液を、６０℃で１８時間撹拌した。反応混合物を、メタノール（５０ｍｌ）中に注ぎ、２Ｍ塩酸で酸性にした。その粗生成物を、イオン交換クロマトグラフィーにより、ＳＣＸカラムを用いて精製した。所望の生成物を、７Ｍメタノール性アンモニアを用いてカラムから溶離し、蒸発乾固させて、不純な生成物を与えた。その粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（Waters XTerra Ｃ１８カラム、５μシリカ、３０ｍｍ直径、１００ｍｍ長さ）により、１％水性アンモニアおよびアセトニトリルの漸減極性混合物を溶離剤として用いて精製した。所望の化合物を含有する画分を、蒸発乾固させて、（Ｓ）−Ｎ−（３−（３，５−ジメトキシフェネチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド（３８７ｍｇ，５４％）を白色固体として生じた。
【００９９】
1H NMR (399.9 MHz, DMSO-d6) δ 1.07 (3H, d), 2.09 - 2.14 (1H, m), 2.18 - 2.25 (1H, m), 2.22 (3H, s), 2.44 - 2.53 (1H, m), 2.77 - 2.87 (2H, m), 2.88 (4H, s), 3.65 - 3.75 (2H, m), 3.73 (6H, s), 6.34 (1H, t), 6.43 (2H, d), 6.46 (1H, s), 6.96 (2H, d), 7.91 (2H, d), 10.31 (1H, s), 12.09 (1H, s)。
【０１００】
ＭＳ：ｍ／ｚ４６４（ＭＨ＋）。
（Ｓ）−メチル４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート
【０１０１】
【化１０】
2011524888.tif 000012
【０１０２】
ナトリウムトリアセトキシボロハイドライド（２．２５ｇ，１０．６ｍｍｏｌ）を、メタノール（２１ｍｌ）中の（Ｓ）−メチル４−（３−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート（０．９９ｇ，４．２４ｍｍｏｌ）、ホルムアルデヒド（６．３２ｍｌの３７％水溶液，８４．９ｍｍｏｌ）および酢酸（０．４９ｍｌ，８．４９ｍｍｏｌ）に２５℃で加えた。得られた溶液を、窒素下において周囲温度で１８時間撹拌した。反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で塩基性にし、減圧下で濃縮した。残留物を、ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）で希釈し、そして逐次的に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２００ｍｌ）で洗浄した。その水性層を、ＥｔＯＡｃ（２ｘ７５ｍｌ）で更に抽出し、合わせた有機層を、水（２００ｍｌ）および飽和ブライン（２００ｍｌ）で洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗生成物を与えた。その粗生成物を、フラッシュシリカクロマトグラフィーにより、ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン（０：１００〜１００：０へ極性が増加する）で溶離して精製した。純粋な画分を蒸発乾固させて、（Ｓ）−メチル４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート（０．５３８ｇ，５１％）を白色固体として生じた。
【０１０３】
1H NMR (399.9 MHz, CDCl3) δ 1.14 - 1.15 (3H, m), 2.18 - 2.26 (1H, m), 2.34 (3H, s), 2.35 - 2.41 (1H, m), 2.61 - 2.67 (1H, m), 2.87 - 2.91 (1H, m), 2.99 - 3.06 (1H, m), 3.58 - 3.62 (1H, m), 3.66 - 3.70 (1H, m), 3.86 (3H, s), 6.84 - 6.87 (2H, m), 7.89 - 7.93 (2H, m)。
【０１０４】
ＭＳ：ｍ／ｚ２４９（ＭＨ＋）。
（Ｓ）−メチル４−（３−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート
【０１０５】
【化１１】
2011524888.tif 000013
【０１０６】
４−フルオロ安息香酸メチル（１．００ｍｌ，７．７３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＡ（３１ｍｌ）中の（Ｓ）−（＋）−２−メチルピペラジン（１．５５ｇ，１５．５ｍｍｏｌ）に２５℃で加えた。得られた溶液を、窒素下において１２０℃で３日間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で希釈し、そして逐次的に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２００ｍｌ）で洗浄した。水性層を、ＥｔＯＡｃ（２ｘ１００ｍｌ）で更に抽出し、合わせた有機層を、水（２００ｍｌ）および飽和ブライン（２００ｍｌ）で洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、所望の（Ｓ）−メチル４−（３−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート（０．９９５ｇ，５５％）を褐色油状物として生じ、それを、放置して結晶化させた。これを、更に精製することなく直接的に用いた。
【０１０７】
1H NMR (399.9 MHz, CDCl3) δ 1.14 - 1.15 (3H, d), 2.44 - 2.50 (1H, m), 2.80 - 2.86 (1H, m), 2.91 - 3.03 (2H, m), 3.10 - 3.15 (1H, m), 3.67 - 3.70 (2H, m), 3.86 (3H, s), 6.85 - 6.87 (2H, m), 7.89 - 7.93 (2H, m)，ＮＨは認められない。
【０１０８】
ＭＳ：ｍ／ｚ２３５（ＭＨ＋）。
出発物質として用いられた３−（３，５−ジメトキシフェネチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン
【０１０９】
【化１２】
2011524888.tif 000014
【０１１０】
を、次のように製造した。
アセトニトリル（２．２９ｍｌ，４３．６１ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）を、無水トルエン（７０ｍｌ）中の水素化ナトリウム（鉱油中１．７５ｇ分散，４３．６１ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）のスラリーに加え、その混合物を室温で３０分間撹拌した。トルエン（６０ｍｌ）中の３−（３，５−ジメトキシフェニル）プロパン酸エチル（８．６６ｇ，３６．３４ｍｍｏｌ，１ｅｑ）を加え、その反応を１８時間還流させた。冷却後、反応混合物を水で急冷し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残留物を、２Ｍ  ＨＣｌ（５０ｍｌ）中に溶解させた。その酸性溶液を、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を一緒にし、そして水、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。濾過後、溶媒を減圧下で蒸発させて、粗生成物を黄色油状物として生じた。その油状物を、シリカカラムクロマトグラフィーにより（ＤＣＭで溶離して）精製し、所望の画分を一緒にし、蒸発させて、クリーム色固体（３．７６ｇ，４４％収率）を生じた。
【０１１１】
エタノール（５５ｍｌ）中のそのクリーム色固体（３．７２ｇ，１５．９６ｍｍｏｌ，１ｅｑ）に、ヒドラジン水和物（８５２μｌ，１７．５６ｍｍｏｌ，１．１ｅｑ）を加えた。その反応を、２４時間還流させた後、冷却させた。減圧下で蒸発後、残留物を、ＤＣＭ中に抽出させた。有機層を、水、ブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて、３−（３，５−ジメトキシフェネチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミンを淡黄色固体（３．７６ｇ．２工程で４２％）として与えた。
【０１１２】
1H NMR (300.132 MHz, DMSO) δ 2.64 - 2.82 (4H, m), 3.71 (6H, s), 4.07 - 4.72 (2H, m), 5.20 (1H, s), 6.31 (1H, t), 6.38 (2H, d)。
ＭＳ：ｍ／ｚ２４８（ＭＨ＋）
実施例１（ｂ）（ｉ）  （Ｒ）−Ｎ−（３−（３，５−ジメトキシフェネチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンズアミドの製造
【０１１３】
【化１３】
2011524888.tif 000015
【０１１４】
トリメチルアルミニウム（トルエン中２Ｍ，２．４４ｍｌ，４．８８ｍｍｏｌ）を、トルエン（１０ｍｌ）中の３−（３，５−ジメトキシフェネチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−アミン（４８３ｍｇ，１．９５ｍｍｏｌ）および（Ｒ）−メチル４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート（４８５ｍｇ，１．９５ｍｍｏｌ）の懸濁液に２５℃で滴加した。得られた溶液を、６０℃で１８時間撹拌した。反応混合物を、メタノール（５０ｍｌ）中に注ぎ、２Ｍ塩酸で酸性にした。その粗生成物を、イオン交換クロマトグラフィーにより、ＳＣＸカラムを用いて精製した。所望の生成物を、７Ｍメタノール性アンモニアを用いてカラムから溶離し、蒸発乾固させて、不純な生成物を与えた。その粗生成物を、分取ＨＰＬＣ（Waters XTerra Ｃ１８カラム、５μシリカ、３０ｍｍ直径、１００ｍｍ長さ）により、１％水性アンモニアおよびアセトニトリルの漸減極性混合物を溶離剤として用いて精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発乾固させて、（Ｒ）−Ｎ−（３−（３，５−ジメトキシフェネチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンズアミド（５６１ｍｇ，６２％）を白色固体として生じた。
【０１１５】
1H NMR (399.9 MHz, DMSO-d6) δ 1.07 (3H, d), 2.09 - 2.14 (1H, m), 2.18 - 2.25 (1H, m), 2.22 (3H, s), 2.44 - 2.53 (1H, m), 2.77 - 2.87 (2H, m), 2.88 (4H, s), 3.65 - 3.75 (2H, m), 3.73 (6H, s), 6.34 (1H, t), 6.43 (2H, d), 6.46 (1H, s), 6.96 (2H, d), 7.91 (2H, d), 10.31 (1H, s), 12.09 (1H, s)。
【０１１６】
ＭＳ：ｍ／ｚ４６４（ＭＨ＋）。
（Ｒ）−メチル４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート
【０１１７】
【化１４】
2011524888.tif 000016
【０１１８】
ナトリウムトリアセトキシボロハイドライド（１．６２ｇ，７．６３ｍｍｏｌ）を、メタノール（１５ｍｌ）中の（Ｒ）−メチル４−（３−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート（０．７１５ｇ，３．０５ｍｍｏｌ）、ホルムアルデヒド（４．５４ｍｌの３７％水溶液，６１ｍｍｏｌ）および酢酸（０．３５ｍｌ，６．１０ｍｍｏｌ）に２５℃で加えた。得られた溶液を、窒素下において周囲温度で１８時間撹拌した。反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で塩基性にし、減圧下で濃縮した。反応混合物を、ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）で希釈し、そして逐次的に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２００ｍｌ）で洗浄した。水性層を、ＥｔＯＡｃ（２ｘ７５ｍｌ）で更に抽出し、合わせた有機層を、水（２００ｍｌ）および飽和ブライン（２００ｍｌ）で洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗生成物を与えた。その粗生成物を、フラッシュシリカクロマトグラフィーにより、ＥｔＯＡｃ／イソヘキサン（３０：７０〜１００：０へ極性が増加する）で溶離して精製した。純粋な画分を蒸発乾固させて、（Ｒ）−メチル４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート（０．６００ｇ，７９％）をクリーム色固体として生じた。
【０１１９】
1H NMR (399.9 MHz, CDCl3) δ 1.14 - 1.15 (3H, d), 2.19 - 2.24 (1H, m), 2.34 (3H, s), 2.35 - 2.41 (1H, m), 2.61 - 2.67 (1H, m), 2.87 - 2.91 (1H, m), 2.99 - 3.06 (1H, m), 3.58 - 3.62 (1H, m), 3.66 - 3.71 (1H, m), 3.86 (3H, s), 6.84 - 6.87 (2H, m), 7.89 - 7.93 (2H, m)。
【０１２０】
ＭＳ：ｍ／ｚ２４９（ＭＨ＋）。
（Ｒ）−メチル４−（３−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート
【０１２１】
【化１５】
2011524888.tif 000017
【０１２２】
４−フルオロ安息香酸メチル（０．６２ｍｌ，４．７９ｍｍｏｌ）を、ＤＭＡ（１９ｍｌ）中の（Ｒ）−（−）−２−メチルピペラジン（０．９６ｇ，９．５８ｍｍｏｌ）に２５℃で加えた。得られた溶液を、窒素下において１２０℃で５０時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で希釈し、そして逐次的に、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２００ｍｌ）で洗浄した。水性層を、ＥｔＯＡｃ（２ｘ１００ｍｌ）で更に抽出し、合わせた有機層を、水（２００ｍｌ）および飽和ブライン（２００ｍｌ）で洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、（Ｒ）−メチル４−（３−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート（０．７２１ｇ，６４％）を褐色固体として生じた。これを、更に精製することなく直接的に用いた。
【０１２３】
1H NMR (399.9 MHz, CDCl3) δ 1.14 - 1.16 (3H, m), 2.45 - 2.51 (1H, m), 2.80 - 2.87 (1H, m), 2.93 - 3.04 (2H, m), 3.11 - 3.15 (1H, m), 3.66 - 3.71 (2H, m), 3.86 (3H, s), 6.84 - 6.88 (2H, m), 7.89 - 7.93 (2H, m)，ＮＨは認められない。
【０１２４】
ＭＳ：ｍ／ｚ２３５（ＭＨ＋）。
実施例１（ｂ）（ii）  （Ｒ）−Ｎ−（３−（３，５−ジメトキシフェネチル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）−４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンズアミドの別の製造
【０１２５】
【化１６】
2011524888.tif 000018
【０１２６】
２−メチルテトラヒドロフラン（３５００ｍｌ）中の５−（３，５−ジメトキシフェネチル）−１Ｈ−ピラゾール−３−アミン（１５９ｇ，０．６４３ｍｏｌ，１ｅｑ）および（Ｒ）−メチル４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート（１９１ｇ，０．７７２ｍｏｌ，１．２ｅｑ）の溶液を、Dean-Stark 装置を用いて加熱して還流させた。約３００ｍｌの溶媒を除去し、その溶液を７０℃に冷却させた。トルエン中のカリウム tert−ペントキシドの溶液（２５％，１．７Ｍ，９０８ｍｌ，１．５４４ｍｏｌ，２．４ｅｑ）を、３０分間にわたって加えた。得られた懸濁液を加熱して還流させ、そして全部で１．５Ｌの溶媒を、Dean-Stark 条件下で７５分間にわたって除去した。その懸濁液を４０℃に冷却させたが、ＬＣは、完全な変換を示した。
【０１２７】
水（２０ｍｌ）および２Ｍ塩酸（３８０ｍｌ，０．７６ｍｏｌ）を注意深く加えた（４０℃〜５０℃の発熱）。暗色溶液が形成され、これを、酢酸イソプロピル（１５００ｍｌ）で希釈した。水性層を分離し、そして有機層を、水（５００ｍｌ）およびブライン（５００ｍｌ）で洗浄した。有機層を、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空中において４５℃で蒸発させて暗色ガムを残した。酢酸イソプロピル（９６０ｍｌ）を加え、その混合物を、５５℃で６０分間回転させた。ガムは、徐々に溶解し、そして白色固体が沈殿した。そのスラリーを、０℃に冷却し、１２０分間撹拌した。生成物を濾過によって集め、冷酢酸イソプロピル（２ｘ４００ｍｌ）で洗浄し、５０℃で１２０分間乾燥させた。生成物を白色固体（２３１ｇ，７８％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）は、実施例１（ｂ）（ｉ）によるデータと一致した。
【０１２８】
ＬＣ：９９．５％純度。
（Ｒ）−メチル４−（３，４−ジメチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート
（Ｒ）−メチル４−（３−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート（２１８ｇ，０．９３ｍｏｌ，１ｅｑ）を、メタノール（２２００ｍｌ，１０ｖｏｌｓ）および酢酸（１１１．７ｇ，１．８６ｍｏｌ，２ｅｑ）中に溶解させた。３７％ホルムアルデヒド水溶液（８８０ｍｌ，１１．７４ｍｏｌ，１２．６ｅｑ）を加え、固体を沈殿させた。その混合物を撹拌し、同時に、ナトリウムトリアセトキシボロハイドライド（４９３ｇ，２．３３ｍｏｌ，２．５ｅｑ）を１時間にわたって少量ずつ加えた。温度は３０℃未満に保持した。得られた溶液を、窒素下で一晩撹拌した。
【０１２９】
メタノールを、真空中において４５℃で除去し、そして残留物を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（５０００ｍｌ）中に注意深く注いだ。その混合物を、窒素流下で１５分間撹拌し、固体を沈殿させた。生成物を、酢酸イソプロピル（２０００ｍｌおよび１５００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（１０００ｍｌ）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。酢酸イソプロピル溶液を、真空中で濃縮し、そして低容量で生成物が結晶化し始めた。その生成物を、濾過によって集め、第二収量を得た（１９６ｇ，８５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）は、実施例１（ｂ）（ｉ）によるデータと一致した。
【０１３０】
ＬＣ：９９．５％純度。
（Ｒ）−メチル４−（３−メチルピペラジン−１−イル）ベンゾエート
ＤＭＳＯ（１２００ｍｌ，６ｖｏｌｓ）中の（Ｒ）−２−メチルピペラジン（２０３ｇ，２．０３ｍｏｌ，１．５９ｅｑ）の懸濁液を、３７℃で撹拌した。炭酸カリウム（３８３ｇ，２．７７ｍｏｌ，２．１６ｅｑ）を加え、懸濁液を撹拌し、同時に、ＤＭＳＯ（２００ｍｌ，１ｖｏｌ）中の４−フルオロ安息香酸メチル（１９８ｇ，１．２８ｍｏｌ，１ｅｑ）の溶液を２０分間にわたって加えた。反応混合物を、９５℃で２４時間撹拌した。ＩＰＣは、１％未満のメチル−４−フルオロベンゾエートが残留することを示した。
【０１３１】
その反応混合物を、４０℃に冷却し、酢酸エチル（１６００ｍｌ）で希釈し、水（５０００ｍｌ）中に徐々に注いだ。その混合物を５分間撹拌し、層を分離させた。水性層を、酢酸エチル（１６００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機層を、水（１２００ｍｌ）およびブライン（１２００ｍｌ）で洗浄した。溶媒を真空中で除去して、２３３ｇ（７８％）の白色固体を与えた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）は、実施例１（ｂ）（ｉ）によるデータと一致した。
【０１３２】
ＬＣ：９８．４％純度。
ＸＲＤ−Form Ａ
粉末Ｘ線回折図形は、Bruker Ｄ４  Ｘ線回折計を用いて記録した（Ｘ線の波長１．５４１８Å  Ｃｕ源、４０ｋＶ電圧、４０ｍＡフィラメント発光）。試料は、０．００５７０°ステップおよび０．０３秒／ステップ時計数を用いて２〜４０°２θを走査した。
【０１３３】
ピークを、次で認めた。
【０１３４】
【表１】
2011524888.tif 000019
【０１３５】
【表２】
2011524888.tif 000020
【０１３６】
酵素検定
ＦＧＦＲ１キナーゼ検定−Caliper Echo Dosing
ＦＧＦＲ１活性の阻害を決定するために、キナーゼ検定を、Caliper 技術を用いて行った。
【０１３７】
キナーゼ活性検定は、Greiner ３８４ウェル低容量プレート中において、１２ｕｌ／ウェルの全反応容量で行った。各々の反応ウェル中のＦＧＦＲ１活性キナーゼの最終濃度は、７．２ｎＭであった。各々の検定の基質は、蛍光標識を含む慣例ペプチドであった（１３アミノ酸長さ、最初のＫ上にフルオレセン（fluorescene）標識を含むＫＫＳＲＧＤＹＭＴＭＱＩＧ）。
【０１３８】
化合物は、Labcyte Echo ５５０音響的液滴突出装置（acoustic droplet ejection unit）を用いて、直接的に検定プレート中に分配した。各々のウェルに、１２０ｎｌの化合物含有ＤＭＳＯを入れて、検定中の化合物の最終濃度が、停止溶液の添加前に３０ｕＭ〜３０ｐＭであるようにした。化合物に加えて、各々のプレートは、最大および最小の対照ウェルを有し、最大ウェルには、１２０ｎｌのＤＭＳＯを入れ、そして最小ウェルには、１２０ｎｌの１０ｍＭスタウロスポリン（ＬＣ Laboratories，ＭＡ０１８０１，ＵＳＡ Catalogue No. Ｓ−９３００）を入れた。酵素（７．２ｎＭ［最終］で）および基質（３．６ｕＭ［最終］で）を、それら化合物プレートに別々に加えて、反応緩衝液［５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（Sigma，Catalogue No. Ｍ１２５４）−ｐＨ６．５、０．００４％ Triton（Sigma，Catalogue No. Ｘ−１００）、２．４ｍＭ  ＤＴＴ、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０８ｕＭ  ＡＴＰを含む］中において、１％の反応配合物中の最終ＤＭＳＯ濃度を生じた。
【０１３９】
検定プレートを、室温で１．５時間インキュベート後、緩衝液［１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ｐＨ７．５、０．０３３％ Brij−３５（Sigma Catalogue No. Ｂ４１８４）、０．２２％ Caliper Coating Reagent ＃３（Caliper Life Sciences Catalogue No. ７６００５０）、８８ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％ＤＭＳＯを含む］の添加で反応を止めた。次に、停止した検定プレートを、Caliper LabChip（登録商標）ＬＣ３０００（ミクロフルディクス（microfludics）を用いて、蛍光標識されたペプチドと、このペプチドのリン酸化形であるＦＧＦＲ１キナーゼとの間の移動度変位を測定する）を用いて読み取った。
【０１４０】
検定において、化合物を、一定範囲の濃度で調べた。各々の濃度の平均データ値を、未処理対照ウェルおよび１００％阻害対照ウェルと一緒に用いて、濃度に対する阻害のプロットを得た。このデータから、所定の濃度でのＩＣ５０値または阻害百分率値を決定することができる。本明細書中に表されている１ｕＭでの阻害百分率は、実験的に得られた曲線適合に基づく理論値である。適合した曲線プロットから、１ｕＭの濃度での化合物の作用を、阻害百分率として計算した。ＩＣ５０は、この検定の場合にＦＧＦＲ１キナーゼ活性を５０％阻害する化合物の濃度である。この値は、標準曲線適合ソフトウェアパッケージ OriginＴＭを用いて計算する。化合物を二回以上調べた場合、そのＩＣ５０値は、幾何平均としてよい。
【０１４１】
実施例１ａ−０．０００７４μＭのＩＣ５０
実施例１ｂ−０．００１１μＭ、０．０００６４μＭ、０．０００７６μＭのＩＣ５０。
【０１４２】
ＦＧＦＲ４キナーゼ検定−Caliper
ＦＧＦＲ４活性の阻害を決定するために、キナーゼ検定を、Caliper 技術を用いて行った。ＦＧＦＲ４酵素を用いた（８μＭ，Cat. No. ＰＲ４３８０Ｂ，Invitrogen）。キナーゼ活性検定は、Greiner ３８４ウェル低容量プレート中において、１２μＬ／ウェルの全反応容量で行った。各々の反応ウェル中のＦＧＦＲ４活性キナーゼの最終濃度は、２５ｎＭであった。各々の検定の基質は、蛍光標識を含む慣例ペプチド（１３アミノ酸長さ、５ＦＡＭ−ＥＥＰＬＹＷＳＦＰＡＫＫＫ−ＣＯＮＨ２）であり、その配列は、ＦＧＦＲ４キナーゼに特異的であった。
【０１４３】
化合物を、５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ中で連続希釈後、検定プレートに加えた。酵素（２５ｎＭ（最終）で）および基質（１．５μＭ（最終）で）を、それら化合物プレートに別々に加えて、反応緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ｐＨ７．５、０．００４％ Triton、１ｍＭ  ＤＴＴ（最終）、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２（最終）、３０μＭ  ＡＴＰ（最終）を含む）中において、０．８％の反応配合物中の最終ＤＭＳＯ濃度を生じた。
【０１４４】
検定プレートを、室温で２時間インキュベート後、緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ｐＨ７．５、０．０３３％ Brij−３５、０．２２％ Caliper Coating Reagent ＃３、４０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％ＤＭＳＯを含む）の添加で反応を止めた。次に、停止した検定プレートを、Caliper LabChipＴＭＬＣ３０００（ミクロフルディクスを用いて、蛍光標識されたペプチドと、このペプチドのリン酸化形であるＦＧＦＲ４キナーゼとの間の移動度変位を測定する）を用いて読み取った。
【０１４５】
検定において、化合物を、一定範囲の濃度で調べた。各々の濃度の平均データ値を、未処理対照ウェルおよび１００％阻害対照ウェルと一緒に用いて、濃度に対する阻害のプロットを得た。このデータから、所定の濃度でのＩＣ５０値または阻害百分率値を決定することができる。
【０１４６】
実施例１ｂ−０．０２２μＭ、０．０１６μＭ、０．０１６μＭのＩＣ５０。
細胞検定
細胞ＦＧＦＲ１（ＥＣＨＯ）−ＥＣＨＯ技術（リン特異的一次抗体および蛍光二次抗体を用いて測定）の使用による一過的発現されたＦＧＦＲ１  IIIｃリン酸化の細胞による阻害。
【０１４７】
この検定は、ArrayScan 技術を用いて検出される固定した細胞の抗体染色によって、一過的発現されたＦＧＦＲ１リン酸化の阻害剤を検出するように設計する。
Ｃｏｓ−１細胞を、常套的に、３％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％Ｌ−グルタミン（Gibco ＢＲＬ，２５０３０）を加えたＤＭＥＭ（Gibco ＢＲＬ，４１９６６）中で継代して、８０％の密集とした。検定を行うために、Ｃｏｓ−１細胞を、細胞トランスフェクションのために９０〜９５％密集で収集した。各々の９６ウェルプレートについて、２４μｌの Lipofectamine ２０００を、８０９ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭに加え、室温で５分間インキュベートした。各々の９６ウェルプレートについて、２０ｕｇの３’ＦＬＡＧ標識ＦＧＦＲ１／ｐｃＤＮＡ３．１（インハウスクローン１５（In-house clone15），ＭＳＤ４７９３）を、ＯｐｔｉＭＥＭで希釈して、８３３μｌの全容量とした。等容量のＤＮＡおよび Lipofectamine ２０００を一緒にし（ＤＮＡ：脂質＝１：１．２比）、室温で２０分間インキュベートした。
【０１４８】
収集されたＣｏｓ−１細胞を、コールターカウンターを用いて計数し、そして１％ＦＣＳ／ＤＭＥＭで更に希釈して２．５ｘ１０５個細胞／ｍｌとした。９６ウェル各々に、８．３３ｍｌの細胞を必要とした。複合したトランスフェクション溶液を、その細胞溶液に加え、それら細胞を、９６ウェルプレート（Costar，３９０４）中の、１％ウシ胎仔血清、１％Ｌ−グルタミンを加えたＤＭＥＭ中に、２．５ｘ１０５個細胞／ウェルで播種し、そして給湿インキュベーター中において３７℃（＋５％ＣＯ２）で一晩（２４時間）インキュベートした。
【０１４９】
翌日、乾燥重量試料からの化合物を、１００％ＤＭＳＯ中に溶解させて、１０ｍＭ濃度を生じた。４０μｌの化合物を、３８４ Labcyte プレート（Labcyte Catalogue No. Ｐ−０５５２５）の四半分面各々のウェル中に分配した（正対照（１００％ＤＭＳＯ）、負対照（１０μＭ）および基準化合物（２５０ｎＭ）を含めて）。次に、その３８４ Labcyte プレートを、Hydra に移して、四半分の残りのウェル中にそれら化合物を１：１００に希釈した。７０μｌの培地を、Quadra を用いて検定プレートから吸引した後、そのプレートを、ＥＣＨＯ５５０上に移した。３８４ Labcyte 化合物プレートも、ＥＣＨＯ５５０上に移した。ＥＣＨＯ５５０上の検定プレートへの化合物移動は、（１）１０μＭ、（２）３μＭ、（３）１μＭ、（４）０．３μＭ、（５）０．１μＭ、（６）０．０１の濃度範囲においてであった。
【０１５０】
それらプレートを軽くたたいて、化合物を細胞培地と混合し、そして３７℃において５％ＣＯ２で１時間インキュベートさせた。
培地を、真空吸引を用いてウェルから除去した；細胞を、５０μｌの１００％メタノールを各々のウェルに加えることによって固定し、そして室温で２０分間インキュベートした。次に、固定液を除去し、それらウェルを、２００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ／Ａ）で１回洗浄後、５０ｕｌ／ウェルの０．１％トリトン／ＰＢＳ／Ａを室温で２０分間加えることによってそれら細胞を透過性にした。次に、透過性化溶液を除去し、それら細胞を、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ／Ａでもう１回洗浄後、４０μｌの１／１０００一次抗体溶液（Cell Signalling Technologies ＃ＣＳ３４７６；１０％ＦＣＳ＋０．１％ Tween２０を含むＰＢＳ／Ａ中で希釈されたマウス抗ホスホＦＧＦＲ１）を各々のウェルに加えた。室温で１時間インキュベーション後、その抗体溶液を除去し、それらウェルを、２００ｕｌ／ウェルのＰＢＳ／Ａで１回洗浄した。次に、４０μｌの１／５００二次抗体（Ａ１１００５；ヤギ抗マウス５９４）溶液および１／１００００Hoechst（１０％ＦＣＳ＋０．１％ Tween ２０を含むＰＢＳ／Ａ中で一緒に希釈される）を加え、そのプレートを、暗所において室温で１時間インキュベートした。最後に、それらプレートを、２００μｌ／ウェルのＰＢＳ／Ａで１回洗浄して、最終洗液をウェル中に残した後、プレートを密封した。それらプレートを、Arrayscan（Cellomics）で読み取った。プレート内の未投与（最大）ウェルおよび基準化合物（最小）ウェルから得られた Channel ２（５９４ｎｍ）値を用いて、０％および１００％化合物阻害の境界を設定した。化合物データを、これら値に対して規格化して、リン酸化ＦＧＦＲ１の５０％阻害を生じる試験化合物の希釈範囲を決定した。
【０１５１】
実施例１ｂ−ＩＣ５０＜０．０１μＭ、０．００１１μＭ、０．００２２μＭ、０．００４８μＭ。
細胞ＦＧＦＲ２（ＥＣＨＯ）検定
ＥＣＨＯ技術（リン特異的一次抗体および蛍光二次抗体を用いて測定）の使用による構成性発現されたＦＧＦＲ２リン酸化の細胞による阻害。
【０１５２】
この検定は、ArrayScan 技術を用いて検出される固定した細胞の抗体染色によって、構成性発現されたＦＧＦＲ２リン酸化の阻害剤を検出するのに用いることができる。ＳＵＭ５２−ＰＥ細胞を、常套的に、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％Ｌ−グルタミン（Gibco ＢＲＬ，２５０３０）を加えたＲＰＭＩ１６４０（Gibco ＢＲＬ，３１８７０）中で継代して、７０％の密集とした。収集されたＳＵＭ５２−ＰＥ細胞を、コールターカウンターを用いて計数し、そして１％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ１６４０で更に希釈して１．５ｘ１０５個細胞／ｍＬとした。各々の９６ウェルプレートに、１０ｍＬの細胞を必要とした。１００μＬの細胞懸濁液を、９６ウェルプレート（Costar，３９０４）の各々のウェルに加え、給湿インキュベーター中において３７℃（＋５％ＣＯ２）で一晩（２４時間）インキュベートした。翌日、乾燥重量試料からの化合物を、１００％ＤＭＳＯ中に溶解させて、１００μＭ濃度を生じた。４０μＬの化合物溶液を、３８４ Labcyte プレート（Labcyte Catalogue No. Ｐ−０５５２５）の四半分面各々のウェル中に分配した（正対照（１００％ＤＭＳＯ）、負対照（１０μＭ）および基準化合物（２５０ｎＭ）、すなわち、商業的に入手可能なＦＧＦＲ阻害剤ＰＤ１７３０７４である１−tert−ブチル−３−［２−｛［３−（ジエチルアミノ）プロピル］アミノ｝−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］尿素を含めて）。次に、その３８４ Labcyte プレートを、Hydra に移して、四半分の残りのウェル中にそれら化合物を１：１００に希釈した。７０μＬの培地を、Quadra を用いて検定プレートから吸引した後、そのプレートを、ＥＣＨＯ５５０上に移した。３８４ Labcyte 化合物プレートも、ＥＣＨＯ５５０上に移した。ＥＣＨＯ５５０上の検定プレートへの化合物移動は、（１）１００ｎＭ、（２）３３．３ｎＭ、（３）１１．１ｎＭ、（４）３．７０ｎＭ、（５）１．２３ｎＭ、（６）０．４１ｎＭの濃度範囲においてであった。それらプレートを軽くたたいて、化合物を細胞培地と混合し、そして３７℃において５％ＣＯ２で１時間インキュベートさせた。培地を、真空吸引を用いてウェルから除去した；細胞を、５０μＬの１００％メタノールを各々のウェルに加えることによって固定し、そして室温で２０分間インキュベートした。次に、固定液を除去し、それらウェルを、２００μＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ／Ａ）で１回洗浄後、５０μＬ／ウェルの０．１％トリトン／ＰＢＳ／Ａを室温で２０分間加えることによってそれら細胞を透過性にした。次に、透過性化溶液を除去し、それら細胞を、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ａでもう１回洗浄後、４０μＬの１／１０００一次抗体溶液（Cell Signalling Technologies ＃ＣＳ３４７６；１０％ＦＣＳ＋０．１％ Tween２０を含むＰＢＳ／Ａ中で希釈されたマウス抗ホスホＦＧＦＲ）を各々のウェルに加えた。室温で１時間インキュベーション後、その抗体溶液を除去し、それらウェルを、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ａで１回洗浄した。次に、４０μＬの１／５００二次抗体（Ａ１１００５；ヤギ抗マウス５９４）溶液および１／１００００ Hoechst（１０％ＦＣＳ＋０．１％ Tween ２０を含むＰＢＳ／Ａ中で一緒に希釈される）を加え、そのプレートを、暗所において室温で１時間インキュベートした。最後に、それらプレートを、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ａで１回洗浄して、最終洗液をウェル中に残した後、プレートを密封した。それらプレートを、Arrayscan（Cellomics）で読み取った。プレート内の未投与（最大）ウェルおよび基準化合物（最小）ウェルから得られた Channel ２（５９４ｎｍ）値を用いて、０％および１００％化合物阻害の境界を設定した。
【０１５３】
細胞ＦＧＦＲ３（ＥＣＨＯ）検定
ＥＣＨＯ技術（リン特異的一次抗体および蛍光二次抗体を用いて測定）の使用による一過的発現されたＦＧＦＲ３  IIIｃリン酸化の細胞による阻害。
【０１５４】
この検定は、ArrayScan 技術を用いて検出される固定した細胞の抗体染色によって、一過的発現されたＦＧＦＲ３リン酸化の阻害剤を検出するのに用いることができる。Ｃｏｓ−１細胞を、常套的に、３％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％Ｌ−グルタミン（Gibco ＢＲＬ，２５０３０）を加えたＤＭＥＭ（Gibco ＢＲＬ，４１９６６）中で継代して、８０％の密集とした。検定を行うために、Ｃｏｓ−１細胞を、細胞トランスフェクションのために９０〜９５％密集で収集した。各々の９６ウェルプレートについて、２４μＬの Lipofectamine ２０００を、８０９μＬのＯｐｔｉＭＥＭに加え、室温で５分間インキュベートした。各々の９６ウェルプレートについて、２０μｇの３’ＦＬＡＧ標識ＦＧＦＲ３／ｐｃＤＮＡ３．２完全長さＦＧＦＲ３を、ＯｐｔｉＭＥＭで希釈して、８３３μＬの全容量とした。等容量のＤＮＡおよび Lipofectamine ２０００を一緒にし（ＤＮＡ：脂質＝１：１．２比）、室温で２０分間インキュベートした。収集されたＣｏｓ−１細胞を、コールターカウンターを用いて計数し、そして１％ＦＣＳ／ＤＭＥＭで更に希釈して２．５ｘ１０５個細胞／ｍＬとした。９６ウェル各々に、８．３３ｍＬの細胞を必要とした。複合したトランスフェクション溶液を、その細胞溶液に加え、それら細胞を、９６ウェルプレート（Costar，３９０４）中の、１％ウシ胎仔血清、１％Ｌ−グルタミンを加えたＤＭＥＭ中に、２．１ｘ１０４個細胞／ウェルで播種し、そして給湿インキュベーター中において３７℃（＋５％ＣＯ２）で一晩（２４時間）インキュベートした。翌日、乾燥重量試料からの化合物を、１００％ＤＭＳＯ中に溶解させて、１０ｍＭ濃度を生じた。４０μＬの化合物溶液を、３８４ Labcyte プレート（Labcyte Catalogue No. Ｐ−０５５２５）の四半分面各々のウェル中に分配した（正対照（１００％ＤＭＳＯ）、負対照（１０μＭ）および基準化合物（２５０ｎＭ）、すなわち、商業的に入手可能なＦＧＦＲ阻害剤ＰＤ１７３０７４である１−tert−ブチル−３−［２−｛［３−（ジエチルアミノ）プロピル］アミノ｝−６−（３，５−ジメトキシフェニル）−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］尿素を含めて）。次に、その３８４ Labcyte プレートを、Hydra に移して、四半分の残りのウェル中にそれら化合物を１：１００に希釈した。７０μＬの培地を、Quadra を用いて検定プレートから吸引した後、そのプレートを、ＥＣＨＯ５５０上に移した。３８４ Labcyte 化合物プレートも、ＥＣＨＯ５５０上に移した。ＥＣＨＯ５５０上の検定プレートへの化合物移動は、（１）１０μＭ、（２）３μＭ、（３）１μＭ、（４）０．３μＭ、（５）０．１μＭおよび（６）０．０１μＭの濃度範囲においてであった。それらプレートを軽くたたいて、化合物を細胞培地と混合し、そして３７℃において５％ＣＯ２で１時間インキュベートさせた。
【０１５５】
培地を、真空吸引を用いてウェルから除去した；細胞を、５０μＬの１００％メタノールを各々のウェルに加えることによって固定し、そして室温で２０分間インキュベートした。次に、固定液を除去し、それらウェルを、２００μＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ／Ａ）で１回洗浄後、５０μＬ／ウェルの０．１％トリトン／ＰＢＳ／Ａを室温で２０分間加えることによってそれら細胞を透過性にした。次に、透過性化溶液を除去し、それら細胞を、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ａでもう１回洗浄後、４０μＬの１／１０００一次抗体溶液（Cell Signalling Technologies ＃ＣＳ３４７６；１０％ＦＣＳ＋０．１％ Tween２０を含むＰＢＳ／Ａ中で希釈されたマウス抗ホスホＦＧＦＲ１）を各々のウェルに加えた。室温で１時間インキュベーション後、その抗体溶液を除去し、それらウェルを、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ａで１回洗浄した。次に、４０μＬの１／５００二次抗体（Ａ１１００５；ヤギ抗マウス５９４）溶液および１／１００００ Hoechst（１０％ＦＣＳ＋０．１％ Tween ２０を含むＰＢＳ／Ａ中で一緒に希釈される）を加え、そのプレートを、暗所において室温で１時間インキュベートした。最後に、それらプレートを、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ａで１回洗浄して、最終洗液をウェル中に残した後、プレートを密封した。それらプレートを、Arrayscan（Cellomics）で読み取った。プレート内の未投与（最大）ウェルおよび基準化合物（最小）ウェルから得られた Channel ２（５９４ｎｍ）値を用いて、０％および１００％化合物阻害の境界を設定した。化合物データを、これら値に対して規格化して、リン酸化ＦＧＦＲ３の５０％阻害を生じる試験化合物の希釈範囲を決定した。
【０１５６】
細胞ＦＧＦＲ４（ＥＣＨＯ）検定
ＥＣＨＯ技術（リン特異的一次抗体および蛍光二次抗体を用いて測定）の使用による一過的発現されたＦＧＦＲ４リン酸化の細胞による阻害。
【０１５７】
この検定は、ArrayScan 技術を用いて検出される固定した細胞の抗体染色によって、一過的発現されたＦＧＦＲ４リン酸化の阻害剤を検出するように設計する。Ｃｏｓ−１細胞を、常套的に、３％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％Ｌ−グルタミン（Gibco ＢＲＬ，２５０３０）を加えたＤＭＥＭ（Gibco ＢＲＬ，４１９６６）中で継代して、８０％の密集とした。検定を行うために、Ｃｏｓ−１細胞を、細胞トランスフェクションのために９０〜９５％密集で収集した。各々の９６ウェルプレートについて、２４μＬの Lipofectamine ２０００を、８０９μＬのＯｐｔｉＭＥＭに加え、室温で５分間インキュベートした。各々の９６ウェルプレートについて、２０μｇの３’ＦＬＡＧ標識ＦＧＦＲ４／ｐｃＤＮＡ３．１（ＭＳＤ６２７３）を、ＯｐｔｉＭＥＭで希釈して、８３３μＬの全容量とした。等容量のＤＮＡおよび Lipofectamine ２０００を一緒にし（ＤＮＡ：脂質＝１：１．２比）、室温で２０分間インキュベートした。
【０１５８】
収集されたＣｏｓ−１細胞を、コールターカウンターを用いて計数し、そして１％ＦＣＳ／ＤＭＥＭで更に希釈して１．２ｘ１０５個細胞／ｍＬとした。９６ウェル各々に、８．３３ｍＬの細胞を必要とした。複合したトランスフェクション溶液を、その細胞溶液に加え、それら細胞を、９６ウェルプレート（Biocoat ＃６６４０）中の、１％ウシ胎仔血清、１％Ｌ−グルタミンを加えたＤＭＥＭ中に、１．０ｘ１０４個細胞／ウェルで播種し、そして給湿インキュベーター中において３７℃（＋５％ＣＯ２）で一晩（２４時間）インキュベートした。
【０１５９】
翌日、乾燥重量試料からの化合物を、１００％ＤＭＳＯ中に溶解させて、１０ｍＭ濃度を生じた。４０μＬの化合物溶液を、３８４ Labcyte プレート（Labcyte Catalogue No. Ｐ−０５５２５）の四半分面各々のウェル中に分配した（正対照（１００％ＤＭＳＯ）、負対照（１０μＭ）および基準化合物（２５０ｎＭ）を含めて）。次に、その３８４ Labcyte プレートを、Hydra に移して、四半分の残りのウェル中にそれら化合物を１：１００に希釈した。７０μＬの培地を、Quadra を用いて検定プレートから吸引した後、そのプレートを、ＥＣＨＯ５５０上に移した。３８４ Labcyte 化合物プレートも、ＥＣＨＯ５５０上に移した。ＥＣＨＯ５５０上の検定プレートへの化合物移動は、（１）１０μＭ、（２）３μＭ、（３）１μＭ、（４）０．５μＭ、（５）０．１μＭ、（６）０．０３μＭ、（７）０．０１μＭ、（８）０．００１μＭの濃度範囲においてであった。
【０１６０】
それらプレートを軽くたたいて、化合物を細胞培地と混合し、そして３７℃において５％ＣＯ２で１時間インキュベートさせた。
培地を、真空吸引を用いてウェルから除去した；細胞を、５０μＬの１００％メタノールを各々のウェルに加えることによって固定し、そして室温で２０分間インキュベートした。次に、固定液を除去し、それらウェルを、２００μＬのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ／Ａ）で１回洗浄後、５０μＬ／ウェルの０．１％トリトン／ＰＢＳ／Ａを室温で２０分間加えることによってそれら細胞を透過性にした。次に、透過性化溶液を除去し、それら細胞を、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ａで４回洗浄後、４０μＬの１／１０００一次抗体溶液（Cell Signalling Technologies ＃ＣＳ３４７６；１０％ＦＣＳ＋０．１％ Tween２０を含むＰＢＳ／Ａ中で希釈されたマウス抗ホスホＦＧＦＲ１）を各々のウェルに加えた。室温で１時間インキュベーション後、その抗体溶液を除去し、それらウェルを、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ａで４回洗浄した。次に、４０μＬの１／５００二次抗体（Ａ１１００５；ヤギ抗マウス５９４）溶液および１／１００００ Hoechst（１０％ＦＣＳ＋０．１％ Tween ２０を含むＰＢＳ／Ａ中で一緒に希釈される）を加え、そのプレートを、暗所において室温で１時間インキュベートした。最後に、それらプレートを、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ａで４回洗浄後、２００μＬ／ウェルのＰＢＳ／Ａを加えた後、プレートを密封した。それらプレートを、Arrayscan（Cellomics）で読み取った。プレート内の未投与（最大）ウェルおよび基準化合物（最小）ウェルから得られた Channel ２（５９４ｎｍ）値を用いて、０％および１００％化合物阻害の境界を設定した。化合物データを、これら値に対して規格化して、リン酸化ＦＧＦＲ４の５０％阻害を生じる試験化合物の希釈範囲を決定した。
【０１６１】
実施例１ｂ−０．０２９μＭ、０．０３３μＭ、０．０４５μＭ、０．０２８μＭのＩＣ５０。
シトクロムＰ４５０阻害検定
５種類のヒトシトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）イソ型（１Ａ２、２Ｃ９、２Ｃ１９、３Ａ４および２Ｄ６）に対する試験化合物の阻害可能性（ＩＣ５０）を、Crespi（Crespi and Stresser, J Pharmacol Toxicol Methods 2000, 44: 325-331）による修飾された自動化蛍光終点 in vitro 検定を用いて評価した。各々のヒトＣＹＰイソ型を発現する酵母（Yeast）細胞系から調製されたミクロソーム細胞下画分を、この検定において酵素源として用いた。５種類の主要ヒトＣＹＰの活性は、ＮＡＤＰＨの存在下における多数のクマリン基質の蛍光代謝産物へのバイオトランスフォーメーションから決定した。これらＣＹＰの阻害は、形成された蛍光代謝産物の量の減少を引き起こした。いろいろな濃度の試験化合物の存在下において認められる蛍光と、その不存在下で認められるものとの比較は、ＩＣ５０値を計算することを可能にした。最初の実験は、検定の速度パラメーターを最適にするように行ったが、これらは表１に挙げた。各々のＣＹＰ原液は、そのそれぞれの基質と一緒に、リン酸緩衝液ｐＨ７．４中で調製し（表１を参照されたい）、そして１７８μｌを、黒色中実平底３００μｌの９６ウェル微量滴定プレート（Corning Costar）のウェルに加えた。試験化合物を、ＤＭＳＯ／アセトニトリル中で連続希釈し、そして反応に加えて（２μｌ）、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭおよび１０μＭの最終濃度を生じた。３７℃で５分間プレインキュベート後、ＮＡＤＰＨ（２０μｌ、表１に示された濃度）の添加で、反応を開始した。各々のインキュベーション中の最終溶媒含量は、＜＝２％であった（試験化合物から１％および基質から最大１％）。適当な溶媒対照および基質ブランクを、各々の実験に含めて、対照活性を評価し且つ試験化合物によるいずれかの固有蛍光を確認した。更に、ＣＹＰ各々の既知の阻害剤を、正対照として含めた（阻害剤濃度および期待されるＩＣ５０範囲について、表３を参照されたい）。それら反応を、規定の時点で（表１を参照されたい）、１００μｌの溶媒（８０：２０ｖ／ｖのアセトニトリル：０．５Ｍ Tris 緩衝液）で急冷することによって止めた。それらプレートを、蛍光計（Spectrafluor Plus）において、適当な励起および発光波長（表２に挙げられる）で読み取り、そして対照について補正された活性パーセントを、試験化合物濃度に対してプロットした。次に、ＣＹＰ各々のＩＣ５０（代謝活性の５０％阻害を引き起こすのに必要な試験化合物の濃度）を、これらプロットの勾配から決定した。
【０１６２】
【表３】
2011524888.tif 000021
【０１６３】
【表４】
2011524888.tif 000022
【０１６４】
【表５】
2011524888.tif 000023
【０１６５】
結果
【０１６６】
【表６】
2011524888.tif 000024
【０１６７】
結論：本発明の鏡像異性体化合物は、十分なＦＧＦＲ阻害を示すが、それらのシトクロムＰ４５０阻害にも相違を示す。シトクロムＰ４５０の低い阻害は、潜在的な薬物：薬物相互作用を改善するのに望ましい。
【０１６８】
物理的性質試験および方法
タンパク質結合
タンパク質結合は、平衡透析によって決定する。２０μＭ濃度の化合物を、１０％血漿に対して３７℃の温度で１８時間透析する。得られた試料を、質量スペクトルピーク識別とカップリングした包括的ＨＰＬＣ−ＵＶ方法を用いて分析する。報告されるＫ１値は、初期見掛け会合定数［タンパク質・リガンド］／（［タンパク質］［リガンド］）であり、濃度は全て、モル／リットルで測定されている（J. Med. Chem.,  2006,  49(23),  6672-6682）。
【０１６９】
タンパク質結合は、高処理量スクリーンにおいて、液体クロマトグラフィーおよび質量分析と組み合わされた平衡透析によって測定することができる（Wan, H. and Rehngren, M., J. Chromatogr. A 2006, 1102, 125-134）。
【０１７０】
実施例１ａ：０．９１％フリー（ラット）
実施例１ｂ：０．６２％フリー（ラット）
実施例１ａ：３．７２％フリー（ヒト）
実施例１ｂ：２．７９％フリー（ヒト）
結論：タンパク質結合の減少は、より多くのフリーな薬物（未結合の）が存在するということを示している。これは、標的部位で作用するのに利用可能な薬物がより多く存在しうるので好都合でありうる。
【０１７１】
クリアランス：
０．９２７ｍｇ／ｋｇ（２ｕｍｏｌ／ｋｇ）のラット用量について、試験化合物を、２０％ＤＭＡ：８０％セーレンセン（sorensens）緩衝液ｐＨ５中において１ｕｍｏｌ／ｍｌで製剤化した。各々の製剤を、食物を自由に利用した４匹の雄ラット（２５０〜３００ｇ）に投与した（２ｍＬ／ｋｇ）。血液試料は、２匹のラットから投与後５分および２０分、および１時間および４時間に、そして他の２匹のラットから１０分および４０分、および２時間および６時間に尾静脈より採取した。終端試料は、最初の組のラットから１２時間に、そして次の組から２４時間に採取した。それら血液試料を、水で１：１に希釈後、分析した。
【０１７２】
０．９２７ｍｇ／ｋｇ（２ｕｍｏｌ／ｋｇ）のイヌ用量について、それら化合物を、１０％ＤＭＳＯ：９０％セーレンセン（sorensens）緩衝液ｐＨ５中のヒドロキシルプロピル−β−シクロデキストリン（２５％ｗ／ｖ）中において２ｕｍｏｌ／ｍｌで製剤化した。各々の製剤を、一晩絶食した雄および雌イヌ（８〜１５ｋｇ）に投与した（１ｍＬ／ｋｇ）。血液試料は、投与後５分、１０分、２０分および４０分、および１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間および２４時間に頸静脈より採取した。それら血液試料を、水で１：１に希釈後、分析した。
【０１７３】
濃度範囲（０．００１ｕｍｏｌ／Ｌ〜１０ｕｍｏｌ／Ｌ）にわたる一連の１０の検量標準を、ブランクマトリックス（１：１の血液：水）を加えることによって調製した。それら試料および標準を、固相抽出プレートを用いて抽出し、窒素下で送風後、メタノール：水（２０：８０）中で再構成した。それら試料を、ＬＣ−ＭＳＭＳを用いて分析し、そして得られた結果を用いて、各々の化合物についての０時〜無限大の曲線下面積［ＡＵＣ０〜ｉｎｆ（ｕｇ．時／ｍｌ）］、クリアランス［Ｃｌ（ｍｌ／分／ｋｇ）］および定常状態容量分布［Ｖｓｓ（Ｌ／ｋｇ）］を決定した。
【０１７４】
雄ラットのデータ
【０１７５】
【表７】
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【０１７６】
雄イヌのデータ
【０１７７】
【表８】
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【０１７８】
雌イヌのデータ
【０１７９】
【表９】
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【０１８０】
結論：クリアランスの減少は、その薬物がより長く保持されるということを示している。これは、より少ない薬物用量による効力に必要な薬物暴露レベルを達成し且つ維持することが可能でありうるので好都合でありうる。
【図１】
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【国際調査報告】
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