(57)【要約】  本発明は、無機層状複水酸化物を有するデプスフィルター層、それを生産するための方法、後者を含む濾過装置、少なくとも１つの上記のデプスフィルター層を用いて液体メディウムにおいて少なくとも１つの標的生成物から少なくとも１つの汚染物質を除去するための方法、および汚染物質を除去するためのデプスフィルター層の使用に関するものである。デプスフィルター層は、核酸などの汚染物質を選択的に保持し、一方で、バイオテクノロジー的プロセスの標的タンパク質は濾液内に透過し得る。【選択図】図１
2011530405.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  セルロース繊維および／またはその誘導体、
−  少なくとも１つの無機層状複水酸化物、ならびに
−  少なくとも１つの有機湿潤強度増強剤
から生産されるデプスフィルター層であって、混合物の全質量に基づいて、含有量１０〜６５質量％の少なくとも１つの無機層状複水酸化物、含有量３０〜８０質量％のセルロース繊維および／またはその誘導体、ならびに含有量０．５〜１０質量％の有機湿潤強度増強剤を含む混合物から生産されるデプスフィルター層。
【請求項２】
少なくとも１つの無機層状複水酸化物が、一価のアルカリ金属イオンＭ＋および／または二価のアルカリ土類金属イオンもしくは遷移金属イオンＭ２＋、三価の主族元素イオンもしくは遷移金属イオンＭ３＋、ｎ＝１〜４のｎ価の陰イオンＡｎ−、ならびにヒドロキシドイオンＯＨ−を含有することを特徴とする、請求項１に記載のデプスフィルター層。
【請求項３】
一価のアルカリ金属イオンＭ＋が、単独または組み合わされたＬｉ＋、Ｎａ＋であり、二価のアルカリ土類金属イオンまたは遷移金属イオンＭ２＋が、Ｍｇ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、またはその組合せの群から選択され、三価の主族元素イオンまたは遷移金属イオンＭ３＋が、Ｂ３＋、Ａｌ３＋、Ｇａ３＋、Ｎｉ３＋、Ｃｏ３＋、Ｃｒ３＋、Ｆｅ３＋、Ｍｎ３＋、Ｖ３＋、Ｔｉ３＋、Ｓｃ３＋、Ｉｎ３＋、またはその組合せの群から選択され、かつ、ｎ価の陰イオンが、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−、ＣｌＯ３−、ＩＯ３−、ＣＯ３２−、ＳＯ４２−、ＰＯ４３−、ＡｓＯ４３−、Ｓ２Ｏ３２−、ＷＯ４２−、ＣｒＯ４２−、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−、［ＳｉＯ（ＯＨ）３］−、ヘテロポリ酸、有機酸、有機金属錯体、またはその組合せの群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載のデプスフィルター層。
【請求項４】
無機層状複水酸化物が結晶水を含有することを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のデプスフィルター層。
【請求項５】
無機層状複水酸化物が、式
［（Ｍ２＋）１−ｘ（Ｍ３＋）ｘ（ＯＨ）２］ｘ＋（Ａｎ−ｘ／ｎ）・ｍＨ２Ｏ
を有し、０．１≦ｘ≦０．５、１≦ｎ≦４であり、かつｍが０を含む有理数であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載のデプスフィルター層。
【請求項６】
無機層状複水酸化物が、式
［（Ｍ＋）１−ｘ（Ｍ３＋）ｘ（ＯＨ）２］（２ｘ−１）＋（Ａｎ−（２ｘ−１）／ｎ）・ｍＨ２Ｏ
を有し、０．１≦ｘ≦０．５、１≦ｎ≦４であり、かつｍが０を含む有理数であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載のデプスフィルター層。
【請求項７】
無機層状複水酸化物が、ハイドロタルサイト
Ｍｇ６Ａｌ２（ＣＯ３）（ＯＨ）１６・４Ｈ２Ｏ
であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載のデプスフィルター層。
【請求項８】
ハイドロタルサイトが焼成されていないことを特徴とする、請求項７に記載のデプスフィルター層。
【請求項９】
少なくとも１つの有機湿潤強度増強剤が、水溶性でありかつ正に荷電していることを特徴とする、請求項１から８のいずれか１項に記載のデプスフィルター層。
【請求項１０】
少なくとも１つの有機湿潤強度増強剤が、ポリアミド／ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂、ポリアミドエピクロロヒドリン樹脂、ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂、またはその混合物の群から選択されることを特徴とする、請求項９に記載のデプスフィルター層。
【請求項１１】
さらに、二酸化ケイ素および／または少なくとも１つのその誘導体を用いて生産されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか１項に記載のデプスフィルター層。
【請求項１２】
さらに、キーゼルグール(kieselguhr)またはパーライトまたはその混合物を用いて生産されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか１項に記載のデプスフィルター層。
【請求項１３】
二酸化ケイ素および／または少なくとも１つの誘導体が、０．５μｍから１００μｍの平均直径を有する粒子を含むことを特徴とする、請求項１１に記載のデプスフィルター層。
【請求項１４】
キーゼルグール、パーライト、またはその混合物が、０．５μｍから１００μｍの平均直径を有する粒子を含むことを特徴とする、請求項１２に記載のデプスフィルター層。
【請求項１５】
少なくとも１つの無機層状複水酸化物が、０．１μｍから５００μｍの平均直径を有する粒子を含むことを特徴とする、請求項１から１４のいずれか１項に記載のデプスフィルター層。
【請求項１６】
少なくとも１つの無機層状複水酸化物ならびに二酸化ケイ素および／または少なくとも１つのその誘導体の含有量が２０〜７５質量％であり、セルロース繊維および／またはその誘導体の含有量が３０〜８０質量％であり、かつ有機湿潤強度増強剤の含有量が０．５〜１０質量％であり、かつ含有量が合計１００質量％である混合物から生産されることを特徴とする、請求項１１または１３に記載のデプスフィルター層。
【請求項１７】
少なくとも１つの無機層状複水酸化物およびキーゼルグールまたはパーライトまたはその混合物の含有量が２０〜７５質量％であり、セルロース繊維および／またはその誘導体の含有量が３０〜８０質量％であり、かつ有機湿潤強度増強剤の含有量が０．５〜１０質量％であり、かつ含有量が合計１００質量％である混合物から生産されることを特徴とする、請求項１２または１４に記載のデプスフィルター層。
【請求項１８】
（１）少なくとも１つの液体メディウムにおいてセルロース繊維および／またはその誘導体を調製するステップ、
（２）少なくとも１つの無機層状複水酸化物を添加するステップ
（３）ステップ（２）において得られた混合物に少なくとも１つの有機湿潤強度増強剤を添加するステップ、
（４）ステップ（３）で得られた懸濁液を担体上にアプライするステップ、
（５）少なくとも１つの液体メディウムを除去するステップ、ならびに
（６）ステップ（５）において得られたデプスフィルター層を乾燥させるステップ
を含む、請求項１から１７のいずれか１項に記載のデプスフィルター層を生産するための方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの有機湿潤強度増強剤がステップ（２）において添加され、かつ少なくとも１つの無機層状複水酸化物がステップ（３）において添加されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
セルロース繊維および／またはその誘導体が、ステップ（１）の後、かつステップ（２）の前に粉砕されることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
デプスフィルター層がステップ（６）において１００℃から２５０℃で乾燥されることを特徴とする、請求項１８から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
二酸化ケイ素および／または少なくとも１つのその誘導体が、さらなる成分としてステップ（４）の前に添加されることを特徴とする、請求項１８から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
二酸化ケイ素および／または少なくとも１つのその誘導体が、少なくとも１つの無機層状複水酸化物と共にステップ（２）において添加されることを特徴とする、請求項１８から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
キーゼルグール、パーライト、またはその混合物が、さらなる成分としてステップ（４）の前に添加されることを特徴とする、請求項１８から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
キーゼルグール、パーライト、またはその混合物が、少なくとも１つの無機層状複水酸化物と共に、さらなる成分としてステップ（２）において添加されることを特徴とする、請求項１８から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から１７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのデプスフィルター層を含有する濾過装置。
【請求項２７】
請求項１から１７のいずれか１項に記載の少なくとも１つのデプスフィルター層を用いて、液体メディウムにおいて少なくとも１つの標的生成物から少なくとも１つの汚染物質を分離するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの汚染物質および少なくとも１つの標的生成物を含有する液体メディウムと、少なくとも１つのデプスフィルター層とを接触させるステップ、
（ｂ）少なくとも１つのデプスフィルター層によって少なくとも１つの汚染物質を保持するステップ、ならびに
（ｃ）少なくとも１つの標的生成物および液体メディウムを含有する濾液を得るステップ
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
ステップ（ｃ）の後に、濾液における少なくとも１つの標的生成物の含有量を増大させるために、液体メディウムおよび／またはすすぎメディウムでデプスフィルター層を洗浄する、さらなるステップ（ｄ）が続くことを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの汚染物質が、核酸、細胞タンパク質、ウイルス、内毒素、またはその混合物の群から選択されることを特徴とする、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの標的生成物がタンパク質であることを特徴とする、請求項２７から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
タンパク質が、抗体、ホルモン、酵素、ペプチド、またはその混合物の群から選択されることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
汚染物質を除去するための、請求項１から１７のいずれか１項に記載のデプスフィルター層の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無機層状複水酸化物を有するデプスフィルター層、それを生産するための方法、これを含有する濾過装置、少なくとも１つの上流のデプスフィルター層を用いて液体メディウムにおいて少なくとも１つの標的生成物から少なくとも１つの汚染物質を分離するための方法、および汚染物質を除去するためのデプスフィルター層の使用に関するものである。これにおいて、プロセス溶液から望ましくない生物学的成分を分離するために、これらの生物学的成分および所望の標的生成物を含有する液体メディウムを本発明に従ったデプスフィルター層と接触させ、それにより、少なくとも１つの望ましくない生物学的成分がデプスフィルターに吸着により結合し、その結果、プロセス溶液から除去される。したがって、例えば治療用タンパク質などの所望の標的生成物は、デプスフィルターをスムーズにかつ活性な形態で通過し得なくてはならない。望ましくない生物学的成分には、特に生物学的汚染物質、例えば、プロセス溶液からの核酸、細胞タンパク質、ウイルス、または内毒素などが含まれる。治療用タンパク質の例は、抗体、ホルモン、酵素、またはペプチドである。
【背景技術】
【０００２】
多くの治療用組換えタンパク質は、大小の産業規模でバイオリアクターまたは発酵槽において実施される細胞培養プロセスに基づくものである。細胞培養溶液は、多くの構成ステップからなるコストのかかるプロセス（「下流プロセス」）において標的タンパク質から分離されなくてはならない無傷細胞、細胞断片、およびわずかな細胞成分などの多くの他の成分のうち、所望の標的タンパク質を含有する。デプス濾過は、細胞、細胞断片、およびコロイド成分の分離において主要な役割を有する。
【０００３】
セルロース繊維に基づいたデプスフィルターは、以下の特許においてとりわけ記載されている。ＵＳ５，２３２，５９５は、セルロース、ポリオレフィン、ガラス、またはセラミックなどの繊維材料と、キーゼルグール(kieselguhr)またはパーライト(perlite)との組合せからなるデプスフィルターを記載している。
【０００４】
ＵＳ４，６７６，９０４は、中性のおよび正に荷電したセルロース繊維とキーゼルグールまたはパーライトとの組合せからなるデプスフィルター層を記載している。
【０００５】
ＵＳ４，００７，１１４は、サイズが０．１〜０．７μｍの電気陰性粒子を分離するための、セルロース繊維およびガラス繊維と、正に荷電したメラミンホルムアルデヒド樹脂とからなる、無粒子フィルター媒質を記載している。このフィルター系へのキーゼルグールの添加は、ＵＳ４，００７，１１３およびＵＳ４，３２１，２８８において記載されている。
【０００６】
ＵＳ４，３０５，７８２は、セルロース繊維と、湿潤強度増強剤を有していないＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３複合材料とからなる、正ゼータ電位を有するフィルター系を記載している。ＵＳ４，３０５，７８２において記載されているフィルター系を用いて生物学的溶液からサブミクロン範囲のサイズの汚染物質を除去するための方法は、ＵＳ４，３６６，０６８において記載されている。
【０００７】
非粉砕セルロース繊維と粉砕セルロース繊維との組合せを、５０質量パーセントのキーゼルグール／パーライトなどの粉末および正に荷電したメラミンホルムアルデヒド樹脂と共にフィルター系内に導入することは、ＵＳ４，３０９，２４７において記載されている。
【０００８】
ＵＳ４，２８２，２６１は、セルロース繊維、キーゼルグール、およびポリアミド／ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂からなるフィルター系を用いて、不安定な飲料から懸濁物質を除去するための方法を記載している。
【０００９】
ＵＳ４，８５９，３４０は、少なくとも５０質量パーセントのキーゼルグールなどのＳｉＯ２含有粉末、セルロース繊維、および１〜３質量パーセントのポリアミド／ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂からなるデプスフィルター層を記載しており、このデプスフィルター層は、液体の電気陰性粒子汚染物質への増大した結合能力を示す。
【００１０】
セルロース繊維およびキーゼルグールを含有するデプスフィルター要素内への一次電荷キャリアおよび二次電荷キャリアの導入は、ＵＳ４，９８１，５９１において記載されている。ポリアミド／ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂は、一次電荷修飾作用物質としてデプスフィルター要素の表面上に吸着され、次に、一次アミン官能基および二次アミン基を有する脂肪族ポリアミンが、二次電荷修飾作用物質として一次電荷修飾作用物質のエポキシ基に結合する。ＵＳ４，９８１，５９１において開示されているこれらのフィルター層を用いて水性溶液から陰イオン性汚染物質を除去するためのプロセスは、ＵＳ５，０８５，７８０において記載されている。
【００１１】
最新技術に従って用いられるデプスフィルター層は、一方ではフィルターの孔サイズよりも大きい粒子を分離するために（ふるい効果）用いられ、また他方では、フィルターの孔サイズよりも小さな粒子は、吸着による相互作用によりデプスフィルターによって保持される。これまでに、セルロースベースのデプスフィルター層はとりわけ、細胞培養溶液の精製のための使用を既に見出している。ここ１０年間で、細胞培養プロセスにおける細胞密度は、およそ１０５個細胞／ｍｌから、１０７個細胞／ｍｌをはるかに上回るまでに上昇している。これに伴って細胞の生存率が顕著に低減し、このことは、包括的な細胞溶解と共に、細胞のタンパク質およびＤＮＡの濃度の非常に顕著な増大をもたらした。現代の細胞培養プロセスは、ｍｌ当たり１０７個細胞を超える細胞密度および５０質量％未満の生存率を示し、これにより、ＤＮＡ濃度は最大１０６ｐｐｍ（１ｇ／ｌ）となり得る（Ｔａｒｒａｃｈら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ、２００８年４月１日、７１〜７７頁）。これは、細胞、細胞断片、コロイド成分、細胞タンパク質、ＤＮＡなどの望ましくない成分の分離に関して特別なデプスフィルターに対する要求が増大していることの、基本的な理由である。同時に、コストの大きい治療用標的タンパク質がスムーズにかつ活性な形態でデプスフィルターを通過し得ることを確実にしなくてはならない。したがって、標的タンパク質の十分に高い透過を伴う、高い能力および／または高い汚染物質除去という観点から、改良されたデプスフィルター層が常に要求されている。
【００１２】
細胞培養ＤＮＡはヒトの病因という観点から患者に対するリスクとなるため、細胞培養ＤＮＡの枯渇は、当局により明示的に要求されている。ガイドラインは、「Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ」（ＦＤＡ  ＣＢＥＲ、１９９７年２月２８日）および「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  Ｎｏ．５０．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ」（ＷＨＯ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．８７８、１９９８）である。ガイドラインに従うと、バイオリアクター／発酵槽の下流の精製プロセスによって、このＤＮＡは検出限界を下回る含有量まで除去されなくてはならないため、プロセス技術に関して、高いＤＮＡ濃度は問題である。原則として、クロマトグラフィープロセス（フローモードの「捕捉ステップ」および陰イオン交換クロマトグラフィーにおけるタンパク質Ａ）がＤＮＡの枯渇に用いられる。しかし、１０６ｐｐｍを超える最初のＤＮＡ濃度では、これらのプロセスによる適切なＤＮＡ枯渇は、プロセス技術および経費の観点から実施不可能である（Ｋ．Ｔａｒｒａｃｈ、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｃｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」、ＷＩＢｉｏ’ｓ  ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、２００７年４月））。
【００１３】
したがって、高濃度のＤＮＡおよび汚染物質から下流のプロセスをなくすために、最初の精密検査ステップにおいてさらなるステップまたは改良された技術が必要であり、それは、現時点のクロマトグラフィー法が、伝導性プロフィールが高いと失敗するためである（Ｊ．Ｎｏｌａｎ、ＥＭＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｆｏｒｕｍ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、２００７年１０月９日）。
【００１４】
このような可能性は、より大きなデプスフィルター領域またはより大きなフィルター容積の使用により原則としてもたらされ、特に多層デプスフィルターがここでは効果的であることが見出されており、それは、より大きなフィルター高さ（２つのフィルター層が重なり合っている）の使用を介して、かつそれに伴う長い滞留時間およびより大きな結合能力によって、単層デプスフィルターを用いるよりも大量のＤＮＡを枯渇させ得るためである。
【００１５】
文献から、デプスフィルターによるＤＮＡ枯渇に対するわずかな研究のみが今までのところ知られている（Ｙｉｇｚａｗら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００８、２２、２８８〜２９６頁、「Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｐｔｈ  Ｆｉｌｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」において概説されている）。これらは、ＤＮＡの結合が疎水性メカニズムおよび電荷依存性メカニズムの両方を介して起きることを示す。これにおいて、フィルターの正の表面電荷は最も重要なものであり、正に荷電したバインダーを用いて実現される。ＤＮＡの保持に対するバインダー含有量の影響はＥｓｃｈｒｉｃｈらによって研究されており、ＤＮＡの保持がバインダー含有量を介して限定的に増大され得るのみであることを示す（ＢｉｏＰｈａｒｍ、１９９７年１月、４６〜４９頁）。さらに、この方法は、デプスフィルターにおけるバインダー含有量の増大を伴う、考慮すべき不利益を有し、プロセスにおける抽出可能な成分の含有量もまた増大する。
【００１６】
したがって、抽出可能な成分を同時に増大させることなくＤＮＡの枯渇を増大させ得るデプスフィルターが所望の改良を有するものとなる。同時に、ＤＮＡの枯渇を増大させながら、例えば治療用タンパク質などの標的生成物の枯渇を増大させてはならない。この関連において、ＤＮＡ枯渇デプスフィルター層が、下流プロセスにおけるクロマトグラフィープロセスの前または後にそれらを使用することを可能にする物理化学的安定性を有しているべきであることを重視することが重要である。同時に、ＤＮＡ枯渇デプスフィルター層の結合能力は、記載される汚染物質の信頼性のある枯渇を可能にするために、細胞培養上清の伝導性プロフィールの範囲内にあるべきである。下流の、よりコストの大きい精製ステップへの負担を軽減するために、第１の精製ステップの後のプロセスの開始時点でこのようなデプスフィルター層を用いることが可能であり、必要である。
【００１７】
Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２０００、１１２、４２０７〜４２１１頁において、ＤＮＡ−ＬＤＨハイブリッドの形態の無機の非細胞傷害性ベクターとして、可溶性の層状複水酸化物（ＬＤＨ）が報告されている。ここで、負に荷電したＤＮＡ断片が、層状複水酸化物の正に荷電した水滑石様層の層間空間内に、イオン交換プロセスを介してインターカレートされる。この組み込みを介してＤＮＡの分解が妨げられ、エンドサイトーシスによる哺乳動物細胞内へのＤＮＡ−ＬＤＨハイブリッドの輸送が可能になる。細胞の細胞質において、ＤＮＡは次に、さらなるプロセスのために遊離する。
【００１８】
ＤＥ１０２  ３７  ５１７Ａ１およびＤＥ１０２  ３７  ５１８Ａ１において、焼成ハイドロタルサイトなどの粉末形態の層状複水酸化物を用いた、生体分子の富化または枯渇が記載されている。多孔質の層状複水酸化物は吸着材として機能し、この吸着材は、とりわけアルギン酸塩、キトサン、ペクチン、および炭酸カルシウムなどのバインダーと結合して粒子凝集物もしくは成形体となっているか、または炭酸カルシウムなどの担体上に堆積している。それによって、焼成ハイドロタルサイトとＤＮＡとの間、またさらに焼成ハイドロタルサイトと所望の標的タンパク質との間の高い結合能力が実現される。１μｍを超えるハイドロタルサイトの平均粒子サイズ（Ｄ５０）は、吸着材としての使用に特に有利であることが見出されている。ＤＥ１０２  ３７  ５１７Ａ１およびＤＥ１０２  ３７  ５１８Ａ１に従うと、標的タンパク質からの選択的なＤＮＡ分離はこの吸着材では実現されない。
【００１９】
ＪＰ２００６−０２６５６６Ａは、気体の吸着のため、家庭内区域における脱臭のため、食品を新鮮に保つため、および防虫剤として、有機ポリマー粒子、ハイドロタルサイト、および紙またはプラスチックフィルムに基づくフィルター材料からなるフィルム様材料を記載している。ＪＰ２００３−０４７６４７Ａは、ハイドロタルサイト、金属酸化物、アクリル酸（メタクリル酸）誘導体、およびオルガノポリシロキサンの脱臭組成物を記載している。ＷＯ２００５／０１４１６０Ａ１は、セルロース含有またはリグニン含有紙および無機層状複水酸化物に基づく多孔質材料を記載している。ＤＥ２９５２０８１７Ｕ１は、セルロース繊維から生産される紙および湿潤強度増強剤を記載している。ＤＥ１００４４２１８Ａ１は、湿潤強度処理された、親水性ポリイソシアネートで処理されたセルロース繊維を有するデプスフィルターを記載している。
【００２０】
最新技術において、ハイドロタルサイトを用いた、またはデプスフィルター層を用いた、標的タンパク質を同時に結合することのない、ＤＮＡなどの望ましくない生体分子の選択的なかつ十分に高い枯渇については、何も知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】ＵＳ５，２３２，５９５
【特許文献２】ＵＳ４，６７６，９０４
【特許文献３】ＵＳ４，００７，１１４
【特許文献４】ＵＳ４，００７，１１３
【特許文献５】ＵＳ４，３２１，２８８
【特許文献６】ＵＳ４，３０５，７８２
【特許文献７】ＵＳ４，３６６，０６８
【特許文献８】ＵＳ４，３０９，２４７
【特許文献９】ＵＳ４，２８２，２６１
【特許文献１０】ＵＳ４，８５９，３４０
【特許文献１１】ＵＳ４，９８１，５９１
【特許文献１２】ＵＳ５，０８５，７８０
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｔａｒｒａｃｈら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ、２００８年４月１日、７１〜７７頁
【非特許文献２】「Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ」（ＦＤＡ  ＣＢＥＲ、１９９７年２月２８日）
【非特許文献３】「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  Ｎｏ．５０．Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ」（ＷＨＯ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．８７８、１９９８）
【非特許文献４】Ｋ．Ｔａｒｒａｃｈ、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｃｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」、ＷＩＢｉｏ’ｓ  ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、２００７年４月）
【非特許文献５】Ｊ．Ｎｏｌａｎ、ＥＭＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｆｏｒｕｍ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、２００７年１０月９日
【非特許文献６】Ｙｉｇｚａｗら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００８、２２、２８８〜２９６頁、「Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｐｔｈ  Ｆｉｌｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」
【非特許文献７】ＢｉｏＰｈａｒｍ、１９９７年１月、４６〜４９頁
【非特許文献８】Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２０００、１１２、４２０７〜４２１１頁
【特許文献１３】ＤＥ１０２  ３７  ５１７Ａ１
【特許文献１４】ＤＥ１０２  ３７  ５１８Ａ１
【特許文献１５】ＪＰ２００６−０２６５６６Ａ
【特許文献１６】ＪＰ２００３−０４７６４７Ａ
【特許文献１７】ＷＯ２００５／０１４１６０Ａ１
【特許文献１８】ＤＥ２９５２０８１７Ｕ１
【特許文献１９】ＤＥ１００４４２１８Ａ１
【非特許文献９】Ｆ．Ｃａｖａｎｉら、Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｄａｙ  １９９１、１１（２）、１７３〜３０１頁
【非特許文献１０】Ｋ．Ｌ．Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０（６）１９９６、９６８〜９７０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の目的は、液体メディウムからの、例えば核酸などの望ましくない生物学的汚染物質の特に高度で迅速な枯渇を可能にし、一方で同時に、例えば治療用タンパク質などの所望の標的生成物がデプスフィルターをスムーズにかつ活性な形態で通過し得る、大小の産業規模の安定で安価なデプスフィルター層を提供することである。さらに、本発明に従ったデプスフィルター層の利用、プロセス溶液から生物学的汚染物質を分離するための方法、および本発明に従ったデプスフィルター層を含有する濾過装置が提案される。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
この課題は、請求項１に記載のデプスフィルター層、請求項１８に記載のデプスフィルター層を生産するための方法の提供により、請求項３２に記載の発明に従ったデプスフィルター層の使用により、請求項２７に記載の汚染物質から標的生成物を分離するための方法の提供により、かつ請求項１に記載のデプスフィルター層を含有する請求項２６に記載の濾過装置の提供により解決される。
【００２５】
標的生成物は、上流の生産プロセスによって得られる全ての生成物を意味すると理解されるべきである。これらには、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、またはホルモンなどの生体分子が含まれる。特に、標的生成物は治療用タンパク質を意味すると理解される。
【００２６】
ここで、核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、特に、真核生物源、原核生物源、およびウイルス源に由来するゲノムＤＮＡ、またさらにエピゲノムＤＮＡ、特に１５塩基対を超える鎖長を有する核酸などの、全ての自然に生じる核酸を意味すると理解されるべきである。
【００２７】
汚染物質は、標的物質とは異なり、かつプロセス溶液内に含有される、全ての物質、特に、細胞全体、ならびに細胞凝集物、細胞断片、コロイド成分、および高分子生体分子を意味し、また、後者のケースでは特に、核酸、宿主細胞タンパク質、リポ多糖、脂質、糖質などの群から選択される生体分子を意味すると理解されるべきである。プロセス溶液という用語には、標的分子が生物学的手順（発酵アプローチ）、特に真核生物および原核生物および細胞の群からの生物学的手順により生産される溶液が含まれる。さらに、これには、発酵酒に由来する溶液、特に、遠心分離、前濾過、浸透プロセス、または化学物質の希釈もしくは導入などの分離プロセスにより生産される溶液が含まれる。
【００２８】
驚くべきことに、本発明に従うと、無機層状複水酸化物、特にハイドロタルサイトを含有するデプスフィルター層が、ＤＮＡなどの望ましくない生物学的汚染物質の特に高い枯渇が起こる一方で所望の標的タンパク質がデプスフィルターをスムーズに通過し得るという点で、生物学的成分を選択的に結合することが見出された。最新技術のデプスフィルターは、不十分な量のＤＮＡのみを枯渇させ、標的タンパク質はデプスフィルターをほぼスムーズに通過する。デプスフィルター層において加工されない、最新技術のハイドロタルサイト粉末は、望ましくＤＮＡを枯渇させ、かつまた、望ましくないことに標的タンパク質を枯渇させる。
【００２９】
本発明に従ったデプスフィルター層を用いると、デプスフィルター上への所望の標的タンパク質の結合を伴うことなく、最新技術と比較して最大１０倍高いＤＮＡ枯渇が達成される（以下の表３、「５０質量％ＤＢＴ」、例えばＤＦ４対ＤＦ７を比較されたい）。この挙動は驚くべきことであり、それは、例えば、粉末状のハイドロタルサイトは選択性を有さず、ＤＮＡなどの生物学的汚染物質および所望の標的タンパク質の両方がかなりの程度で結合し、それにより細胞培養溶液の精製のための粉末自体の使用が不可能になるためである。得られるプロセス溶液から分離される生物学的成分に関するこの高い選択性は、唯一、本発明に従った加工、例えば、セルロース繊維、場合によりキーゼルグール、および正に荷電した湿潤強度増強剤との、デプスフィルター層への、ハイドロタルサイト粉末の加工による。明らかに、この驚くべき、かつ有利な挙動は、ハイドロタルサイトと、荷電した湿潤強度増強剤の複合構造との間の相互作用に基づくものである。
【００３０】
ここで、本発明に従うと、湿潤強度増強剤は、湿潤状態のデプスフィルターの引張強度、耐折強度、破裂強度、および摩耗強度を増大させるために、デプスフィルターの生産プロセスにおいて水性懸濁液に添加される、全ての水溶性合成樹脂を意味すると理解されるべきである。ここで、ポリマー化合物または多官能性化合物が用いられるが、それが有する反応基は、乾燥条件下でセルロースおよび無機粉末のカルボキシル基および／またはＯＨ基とのみ反応し、それによりフィルター成分を互いに架橋するものである。湿潤強度増強剤の最も重要な基は、エピクロルヒドリン樹脂、メラミンホルムアルデヒド樹脂（ＭＦ）、尿素ホルムアルデヒド樹脂（ＵＦ）、グリオキサルポリアクリルアミド樹脂、またさらにイソシアネート樹脂である。正に荷電した湿潤強度増強剤には、好ましくは、ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂、ポリアミドエピクロロヒドリン樹脂、およびポリアミドポリアミンエピクロロヒドリン樹脂、例えばＫｙｍｅｎｅ（登録商標）、Ｎａｄａｖｉｎ（登録商標）、またはＰｏｌｙｃｕｐ（登録商標）が含まれ、これらにおいて、反応基としての、環が歪んだ４員環構造を有する陽イオン性アゼチジニウム基が、ホモ架橋および共架橋し得る。例えばハイドロタルサイトを含有する、本発明に従ったデプスフィルター層を用いて初めて、従来の細胞および細胞断片の分離ならびにコロイド成分の除去に加えて、さらに同時に細胞培養溶液から大量のＤＮＡも除去される、デプスフィルター層が提供され得る。したがって、例えばハイドロタルサイトを含有する、本発明に従ったデプスフィルター層は、汚染物質の濃度が低下しているという観点から質が向上した濾液を生じさせ、それにより、有利なことに、「下流プロセス」における、その後の、また時にはコストのかかる精製ステップ、すなわち、標的分子を精密検査するための下流の多段階プロセスが単純化される。本発明に従ったデプスフィルター層の物理化学的安定性は、したがって、下流プロセスにおけるクロマトグラフィーステップの前およびクロマトグラフィーステップの後の両方での細胞培養溶液を濾過するためのデプスフィルターの使用を可能にする。それにより、細胞培養上清の伝導性プロフィールにおける高いＤＮＡ結合能力が実現される。
【００３１】
上記で既に一部記載したように、本発明に従ったデプスフィルター層は、セルロース繊維および／またはその誘導体、少なくとも１つの無機層状複水酸化物、および少なくとも１つの有機湿潤強度増強剤から生産される。
【００３２】
本発明に従うと、木材（硬材もしくは軟材）または綿から本来得られるセルロース繊維および／またはその誘導体が用いられる。好ましくは、木材から得られる、特に好ましくは軟材から得られるセルロース繊維が用いられる。長さの異なる（長繊維および短繊維セルロース）セルロース繊維の混合物、および純粋な短繊維セルロースもしくは純粋な長繊維セルロースを用いることができ、ここで、繊維の長さは０．１ｍｍから７ｍｍであり、繊維の幅は５μｍから３０μｍであり、好ましくは１０μｍから３０μｍである。フィルターにおいて、セルロースは３次元のネットワークを形成し、これにより、高い機械的安定性および速い流速が確実になる。３次元ネットワークの空洞、および無機粉末には、フィルターとしても機能し、フィルター表面の平滑化にも寄与する、短繊維セルロースが存在する。好ましい実施形態において、短繊維のみのセルロースがセルロース繊維として用いられる。セルロース繊維の誘導体もまた用いることができ、水溶性カルボキシアルキルセルロースが好ましい。カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）は、水溶性カルボキシアルキルセルロースの中でも特に好ましい。本発明に従ったデプスフィルター層の生産のために用いられる混合物におけるＣＭＣの質量割合は、０．１から１０質量％であり、好ましくは０．３から２．０質量％であり、より好ましくは０．４から１．５質量％であり、最も好ましくは０．５から１．０質量％である。ＣＭＣをエピクロロヒドリン樹脂と組み合わせると、乾燥強度および湿潤強度が向上する。さらに、セルロースの誘導体として、例えば、アンモニウムイオン担持基で官能化されたセルロース、好ましくはトリメチルアンモニウムプロピルセルロールクロリドおよび２−ヒドロキシトリメチルアンモニウムプロピルセルロースクロリド、またはアミノ基、好ましくはアルキルアミンで官能化されたセルロースなどの、陽イオン修飾セルロースを用いることができる。
【００３３】
本発明に従ったデプスフィルター層の無機層状複水酸化物は、好ましくは、Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｄａｙ  １９９１、１１（２）、１７３〜３０１頁においてＦ．Ｃａｖａｎｉらによって記載されているような、天然および合成のハイドロタルサイトならびにハイドロタルサイト様化合物の群から選択される。これに関連して、特に１７６から１９１頁を参照することができ、その開示の内容は、参照することにより本明細書に組み込まれる。ハイドロタルサイトは、陽イオン性の層構造を有しており、層間空間には交換可能な陰イオンを有する。本発明に従うと、前記天然および合成のハイドロタルサイトならびにハイドロタルサイト様化合物は、例えば以下の式で説明することができる。
［（Ｍ２＋）１−ｘ（Ｍ３＋）ｘ（ＯＨ）２］ｘ＋（Ａｎ−ｘ／ｎ）・ｍＨ２Ｏ
［（Ｍ＋）１−ｘ（Ｍ３＋）ｘ（ＯＨ）２］（２ｘ−１）＋（Ａｎ−（２ｘ−１）／ｎ）・ｍＨ２Ｏ
この式において、ｘは０から１、好ましくは０．１≦ｘ≦０．５、より好ましくは０．２≦ｘ≦０．３３の値を取ることができる。ｎは１から４の値を取り得、ｍは結晶水含有量に応じて変化し、０を含む有理数である。適切な化合物における結晶水の最大可能量は、上記文献の１８９および１９０頁において記載されている様々なアプローチによって決定可能である。さらに、前記天然および合成のハイドロタルサイトならびにハイドロタルサイト様化合物について、例えば、Ｍ＋およびＭ２＋の両方を含有する化合物もまた挙げることができる。これらのケースでは、上記文献を同様に参照することができる。
【００３４】
本発明に従うと、ハイドロタルサイトＭｇ６Ａｌ２（ＣＯ３）（ＯＨ）１６・４Ｈ２Ｏは、好ましくは、天然または合成の非焼成生成物として用いられる。通常、用いられる層状複水酸化物は、一価、二価、および三価の金属陽イオンＭ＋、Ｍ２＋、およびＭ３＋、ヒドロキシド陰イオンＯＨ−、ならびにさらなる一価から多価の陰イオンＡｎ−（ｎ＝１、２、３、４）、ならびに必要であれば結晶水からなる。ここで、Ｍ＋は、例えばＬｉ＋またはＮａ＋などの一価のアルカリ金属イオンであり、Ｍ２＋は、例えばＭｇ２＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣａ２＋などの二価のアルカリ土類金属イオンまたは遷移金属イオンであり、Ｍ３＋は、例えばＢ３＋、Ａｌ３＋、Ｇａ３＋、Ｎｉ３＋、Ｃｏ３＋、Ｃｒ３＋、Ｆｅ３＋、Ｍｎ３＋、Ｖ３＋、Ｔｉ３＋、Ｓｃ３＋、またはＩｎ３＋などの三価の主族元素イオンまたは遷移金属イオンであり、Ａｎ−は、例えばＦ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＯＨ−、ＮＯ３−、ＣｌＯ４−、ＣｌＯ３−、ＩＯ３−、ＣＯ３２−、ＳＯ４２−、ＰＯ４３−、ＡｓＯ４３−、Ｓ２Ｏ３２−、ＷＯ４２−、ＣｒＯ４２−、［Ｆｅ（ＣＮ）６］３−、［Ｆｅ（ＣＮ）６］４−、［ＳｉＯ（ＯＨ）３］−などの陰イオン、ヘテロポリ酸、有機酸、または有機金属錯体である。ここで、ヘテロポリ酸の例は、（ＰＭｏ１２Ｏ４０）３−および（ＰＷ１２Ｏ４０）３−であり、有機酸の例は、アジピン酸、シュウ酸、コハク酸、マロン酸、セバシン酸、１，１２−ドデカンジカルボン酸、アシルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩、ならびにクロロ桂皮酸であり、有機金属錯体の例は、［Ｒｕ（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリンジスルホネート）３］４−である。ここで、Ｍ２＋とＭ３＋とのモル比は、最大で２．５：１であり、好ましくは最大で２．３：１であり、特に好ましくは最大で２．１：１である。酸化物ＭＯとＭ２Ｏ３との質量比として計算される、Ｍ２＋とＭ３＋との質量比は、最大で２．２：１であり、好ましくは最大で２．０：１であり、特に好ましくは最大で１．８５：１である。最も好ましくは、マグネシウムおよびアルミニウムの陽イオンならびに陰イオンとしてのカルボン酸塩からなる、合成の非焼成ハイドロタルサイトが用いられる。実施例において、アルミニウムマグネシウムのヒドロキシカルボン酸塩である、Ｓｕｄｃｈｅｍｉｅ  ＡＧから入手されるＳｙｎｔａｌ（登録商標）６９６が用いられ、この塩において、酸化物ＭｇＯとＡｌ２Ｏ３との質量比は１．６２５に等しい。無機層状複水酸化物粒子の直径は、０．１μｍから５００μｍであり、好ましくは０．３から３００μｍであり、特に好ましくは０．５から１００μｍである。用いられるハイドロタルサイトは、１５ｍ２／ｇを超える、好ましくは２５ｍ２／ｇを超える、特に好ましくは３５ｍ２／ｇを超えるブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）表面積を有する。特別な実施例において、５０ｍ２／ｇまたは５４ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積を有するハイドロタルサイト粉末が用いられる。ここで、ＢＥＴ表面積は、以下で述べるようにして決定される。
【００３５】
本発明に従ったデプスフィルター層は、無機粉末として、無機層状材料のみを、またさらに、無機層状材料とＳｉＯ２に基づいた粒子および／または少なくとも１つのその誘導体との混合物を含有し得る。ＳｉＯ２に基づいた粒子として、場合によってはパーライトと組み合わされた、多孔質のキーゼルグールおよび／または合成シリカゲルが、好ましくは用いられる。特に好ましくは、場合によってはパーライトと組み合わされて、珪藻土が用いられ、最も好ましくは天然の珪藻土が用いられる。天然の珪藻土は焼成されていない。ＳｉＯ２に基づいた粒子の誘導体には、ＳｉＯ２に基づいた全ての陰イオン交換材料、例えば、第４級アンモニウムイオンを含有する有機基で官能化されたＳｉＯ２、特に好ましくは、トリメチルアンモニウムプロピルクロリドで官能化されたＳｉＯ２が含まれる。ＳｉＯ２に基づいた粒子の平均粒子サイズ直径は、０．５μｍから１００μｍであり、好ましくは２μｍから４０μｍであり、非常に好ましくは４μｍから２０μｍである。実施例において、８μｍの平均粒子サイズ直径を有するキーゼルグールが用いられる。
【００３６】
好ましくは、ハイドロタルサイトのみ、またはハイドロタルサイトとキーゼルグールとの混合物が、無機粉末として用いられる。ここで、特に好ましいものは、ハイドロタルサイトのみ、またはハイドロタルサイトの含有量がキーゼルグールの含有量よりも大きい、ハイドロタルサイトとキーゼルグールとの混合物である。本発明に従ったデプスフィルター７（ＨＴ９００）についての実施例においては、ハイドロタルサイトのみが用いられ、さらなる実施例では、ハイドロタルサイトの含有量は、キーゼルグールの含有量の、好ましくは少なくとも１．７倍高く、特に好ましくは少なくとも２倍高い。
【００３７】
用いられる他の成分に基づいた無機粉末の含有量は、１０質量％から７５質量％であり、好ましくは２０質量％から７０質量％であり、特に好ましくは３０質量％から６５質量％である。デプスフィルター層におけるハイドロタルサイトの含有量が高いほど、本発明に従ったデプスフィルターのＤＮＡ結合能力が高い。
【００３８】
湿潤強度増強剤として、本発明に従うと、エピクロロヒドリン樹脂、メラミンホルムアルデヒド樹脂、尿素ホルムアルデヒド樹脂、グリオキサルポリアクリルアミド樹脂、イソシアネート樹脂、およびその混合物からなる群から得られる水溶性樹脂が用いられる。正に荷電したエピクロロヒドリン樹脂が好ましく、ポリアミド／ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂、ポリアミンエピクロロヒドリン樹脂、およびポリアミドエピクロロヒドリン樹脂、例えば、Ｋｙｍｅｎｅ（登録商標）、Ｎａｄａｖｉｎ（登録商標）、またはＰｏｌｙｃｕｐ（登録商標）が特に好ましい。実施例において、Ｈｅｒｃｕｌｅｓから入手されるＫｙｍｅｎｅ（登録商標）が、湿潤強度増強剤として使用される。生産プロセスにおいて、樹脂を、本発明に従ったデプスフィルター層の他の成分と接触させると、湿潤強度増強剤の反応性アゼチジニウム基またはエピクロロヒドリンに基づいた他の基と、セルロース繊維および無機粉末（無機層状複水酸化物、および場合によっては天然珪藻土または合成シリカゲルなどのＳｉＯ２に基づいた粒子からなる）のカルボキシル基および／またはヒドロキシ基との間でポリマー架橋が生じ、一方、例えばエステル結合などの共有結合および非共有結合の形成を伴う化学的架橋が生じるのは、主に、フィルター生産のその後の乾燥プロセスにおいてのみである。この反応を介してのみ、デプスフィルターは、使用プロセスにおいて、正の荷電を維持しながら、その湿潤強度を保持する。添加される他のフィルター成分に基づいた湿潤強度増強剤の含有量は、０．５質量％から１０質量％であり、好ましくは１質量％から５質量％である。実施例において、２質量％の湿潤強度増強剤が使用される。
【００３９】
好ましい実施形態に従うと、本発明は、
−  セルロース繊維および／またはその誘導体、
−  少なくとも１つの無機層状複水酸化物、ならびに
−  少なくとも１つの有機湿潤強度増強剤
から生産されるデプスフィルターを提供し、このデプスフィルター層は、少なくとも１つの無機層状複水酸化物の含有量が１０〜６５質量％であり、セルロース繊維および／またはその誘導体の含有量が３０〜８０質量％であり、かつ有機湿潤強度増強剤の含有量が０．５〜１０質量％であり、かつ含有量が合計１００質量％である混合物から生産される。
【００４０】
本発明に従ったデプスフィルター層の生産は、好ましくは、
（１）少なくとも１つの液体メディウムにおいてセルロース繊維および／またはその誘導体を調製するステップ、
（２）少なくとも１つの無機層状複水酸化物を添加するステップ
（３）ステップ（２）において得られた混合物に少なくとも１つの有機湿潤強度増強剤を添加するステップ、
（４）ステップ（３）で得られた懸濁液を担体上にアプライするステップ、
（５）少なくとも１つの液体メディウムを除去するステップ、ならびに
（６）ステップ（５）において得られたデプスフィルター層を乾燥させるステップ
を含む方法により行われる。
【００４１】
好ましい実施形態に従うと、セルロース繊維は、水に添加され、粉砕機を用いて所望の粉末度まで粉砕される。セルロール繊維の粉砕の程度ならびに用いられる無機粉末の粒子サイズおよびフィルター内の粉末含有量により、デプスフィルターの濾過分解が主に決定される。セルロース繊維の粉砕はまた、無機層状複水酸化物を添加した後、すなわちステップ（２）の後、または湿潤強度増強剤を添加した後、すなわちステップ（３）の後にも行われ得る。
【００４２】
ここで、濾過分解は、溶液から異なるサイズの成分を分離することを意味すると理解されるべきである。デプス濾過はまた、フィルター層の孔サイズよりも小さな粒子についても行われ得る。したがって、デプスフィルターでは、濾過効果は、絶対保持率に基づいた膜のケースのように孔の直径を与えることによっては説明されない。ここでは、濾過分解の特徴付けはむしろ、所定の条件下での透水性の説明によってなされる。
【００４３】
無機粉末を添加した後、セルロース繊維および無機粉末の水性懸濁液の総固体含有量はおよそ４質量％である。湿潤強度増強剤の添加は、本発明に従うと、無機粉末を添加する前または後に行うことができる。得られる懸濁液は、例えばふるい器にアプライされ、例えば、水は表面真空の適用により除去され、好ましい実施形態に従うと、その間に、濃縮懸濁液が同時にオーバートラベルローラーにより均質化され、得られるフィルター表面は平滑化されている。湿潤デプスフィルター層は、好ましくは、ローラーを用いて所望のフィルター厚さに圧縮され、好ましくは、可変的に調節可能な温度範囲を有する乾燥炉においておよそ１００〜２５０℃で乾燥される。この間に、乾燥が、温度上昇プロフィールを伴って、または一定温度で行われ得る。好ましくは、温度プロフィールが、非常に好ましくは異なる温度範囲を有する温度プロフィールが実行される。好ましくは、本発明に従ったデプスフィルター層の厚さは１からら８ｍｍであり、特に好ましくは２から６ｍｍである。実施例において、厚さは３．０ｍｍから４．５ｍｍである。本発明に従ったデプスフィルターの濾過分解の尺度としての水流量は、１バールの差圧で１００ｍｌの蒸留水について、４７ｍｍの直径サイズを有する本発明に従ったデプスフィルターが必要とする、単位［秒］で表される時間の測定値によって得られる。水流量はまた、単位が［リットル／（ｍ２フィルター分）］の水流速として表されることも多い。およそ４ｍｍの厚さの、２０から２０００  ｌ（ｍ２分）の水流速を有する、本発明に従ったデプスフィルター層が好ましい。
【００４４】
本発明のさらに好ましい実施形態に従うと、二酸化ケイ素および／または少なくとも１つのその誘導体を、前記ステップ（４）の前にさらなる成分として添加することができる。あるいは、本発明に従うと、二酸化ケイ素および／または少なくとも１つのその誘導体を、少なくとも１つの無機層状複水酸化物と共にステップ（２）において添加することができる。
【００４５】
本発明のさらに好ましい実施形態に従うと、キーゼルグールおよび／またはパーライトが、前記ステップ（４）の前にさらなる成分として添加される。あるいは、本発明に従うと、キーゼルグールおよび／またはパーライトを、少なくとも１つの無機層状複水酸化物と共にステップ（２）において添加することができる。
【００４６】
本発明に従ったデプスフィルター層は、液体メディウムから微粒子成分、コロイド成分、および溶解成分を除去するための濾過プロセスにおいて用いられる。ここで、分離される成分は、好ましくは、望ましくない生物学的汚染物質である。特に好ましくは、分離される成分は、例えば細胞、細胞断片、コロイド成分、細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、および内毒素などの、細胞培養溶液からの汚染物質を含む。ここで、分離には、液体メディウムからの望ましくない生物学的汚染物質の少なくとも１つが含まれ、一方、液体メディウムに同様に含有される標的生成物は、デプスフィルター層をスムーズにかつ活性な形態で通過し得る。標的生成物は、上流の生産プロセスによって得られる全ての生成物を意味すると理解される。好ましくは、標的生成物は生体分子を含む。特に好ましくは、標的生成物は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、またはホルモンを意味すると理解される。特に、標的生成物は、治療用タンパク質を意味すると理解される。ここで、液体メディウムは、分離される成分とデプスフィルターとの接触を可能にする全てのメディウムを意味すると理解される。特に、ここでは、溶液、懸濁液、ディスパーション、エマルジョン、またはコロイド溶液の形態の水性または水含有メディウムがある。これにおいて、通常の実施から生じる全ての液体メディウム、例えば生物学的およびバイオテクノロジー的溶液、医学的溶液、食品、飲料、動物の餌、および産業廃棄物処理から生じる溶液、ならびに化学産業から生じる溶液などを用いることができる。好ましくは、本発明に従ったデプスフィルター層は、生物学的、バイオテクノロジー的、および薬学的産業から生じる液体メディウム、ならびに食品および飲料の産業から生じる液体メディウムを濾過するために用いられる。特に好ましくは、デプスフィルター層は、生物学的およびバイオテクノロジー的溶液を濾過するために用いられる。実施例において、デプスフィルター層は、細胞培養溶液ならびにＤＮＡ含有およびタンパク質含有生物学的溶液を濾過するために用いられる。ここで、濾過される液体メディウムから分離される成分の除去は、サイズ排除を介して、吸着メカニズムを介して、イオン交換プロセスおよび／またはインターカレーションを介して行うことができる。
【００４７】
必要であれば、プロセスに応じて、新たなデプスフィルター層が、すすぎプロセスによってそれらが用いられる前に、例えば、水または緩衝液含有溶液での事前すすぎの前に、準備されるべきである。必要であれば、濾過される液体メディウムも、例えば前濾過または遠心分離などによるプロセスに応じて、それらが用いられる前に、準備されるべきである。
【００４８】
デプスフィルター層を適切に利用するために、本発明はさらに、上記で特徴付けされたデプスフィルター層を含有する濾過装置を提供する。本発明に従った濾過装置は、好ましくは、金属製の、または特に好ましくはプラスチック製もしくは同様の材料製のフィルター収納部を包含し、これにより、安価な使い切りの濾過装置および上記で特徴付けされたデプスフィルター層の少なくとも１つが可能になる。
【００４９】
さらに、液体メディウムにおいて少なくとも１つの標的生成物から少なくとも１つの生物学的汚染物質を分離するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの汚染物質および少なくとも１つの標的生成物を含有する液体メディウムと、本発明に従った少なくとも１つのデプスフィルター層とを接触させるステップ、
（ｂ）少なくとも１つのデプスフィルター層によって少なくとも１つの汚染物質を保持するステップ、ならびに
（ｃ）少なくとも１つの標的生成物および液体メディウムを含有する濾液を得るステップ
を含む方法が提供される。
【００５０】
さらなるステップ（ｄ）として、さらなる好ましい実施形態において、濾液における少なくとも１つの標的生成物の含有量を増大させるために、デプスフィルター層の洗浄を、ステップ（ｃ）の後に、液体メディウムおよび／またはすすぎメディウムを用いて行うことができる。
【００５１】
本発明に従ったプロセスは、独立し得るか、または、さらなるその後の精製ステップを含む、より複雑なプロセスの一部であり得る。
【００５２】
最後に、本発明は、汚染物質を除去するための、上記で特徴付けされたデプスフィルター層の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】漏出曲線(breakthrough curve)を示す図である。この漏出曲線は、以下でより詳細に説明される。
【図２】漏出曲線を示す図である。この漏出曲線は、以下でより詳細に説明される。
【図３】漏出曲線を示す図である。この漏出曲線は、以下でより詳細に説明される。
【図４】漏出曲線を示す図である。この漏出曲線は、以下でより詳細に説明される。
【図５】漏出曲線を示す図である。この漏出曲線は、以下でより詳細に説明される。
【図６】漏出曲線を示す図である。この漏出曲線は、以下でより詳細に説明される。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本発明および本発明から生じるさらなる利益は、実施例において記載される実施形態に関連して、以下の記載においてより詳細に説明される。
【実施例】
【００５５】
分析方法の説明
静的なＤＮＡ結合およびタンパク質結合
無機粉末の静的な結合能力を決定するために、蒸留水中の定義された粉末懸濁液を、５０ｍｇ無機粉末／ｍｌ蒸留水の含有量で調製する。懸濁液を、１０ｍｌのプラスチック製遠心分離管内の１ｍｌのアリコートに分ける。アリコートには、さらに３．５ｍｌの蒸留水および０．５ｍｌの１０倍濃縮ＰＢＳ緩衝液（水中で、２．４ｇのＫＨ２ＰＯ４／ｌ、１４．４ｇのＮａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ／ｌ、８０ｇのＮａＣｌ／ｌ、２ｇのＫＣｌ／ｌ）を添加し、それを、混合し、平衡のために振とうしながら１０分間にわたりインキュベートする。上清を遠心分離の後に除去する。平衡粉末を、２．５ｍｌのＤＮＡ試験溶液またはタンパク質試験溶液と共に、振とうしながら３時間にわたり室温でインキュベートする。試験溶液として、１倍濃縮ＰＢＳ緩衝液内に溶解された１ｍｇ／ｍｌの濃度のサケ精子ＤＮＡ（Ｎａ塩、サイズ分布５００〜１０００塩基対、製品番号５４６５３、Ｂｉｏｍｏｌ）またはポリクローナルヒトＩｇＧ混合物（Ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ（登録商標）／Ｂａｙｅｒ  Ｖｉｔａｌ、Ｄ−Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ）を用いる。次に、遠心分離の後、上清のＤＮＡまたはタンパクの濃度を、標準系列に基づいて測光により決定する。
【００５６】
無機粉末およびデプスフィルター材料のＢＥＴの決定
ブルナウアー・エメット・テラー（ＢＥＴ）法による材料の吸着表面の決定は、Ｇｅｍｉｎｉ  ＢＥＴ系（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｅｔｉｃｓ）を用いて行う。調製のために、ガラス製試料管のおよそ２５％を試料で満たし、乾燥のために１２０℃で真空下において２時間にわたり加熱する。得られた乾燥試料の質量は、空の試料管との質量差に基づいて決定する。ＢＥＴ表面積の測定のために、試料管を、提供された土台内のＧｅｍｉｎｉ  ＢＥＴ系内に固定する。測定は、液体窒素で冷却しながら、空の参照管と比較して行う。測定および評価は、２００ｍｍＨｇ／分の排出速度で１１個の測定点を記録することによって、および窒素についての以下の物理的特性の仮定を用いて、装置のソフトウェアを開始することにより行う。
密度：０．００１５４６８、非理想係数：０．００００６２、分子断面積：０．１６２ｍｍ２
【００５７】
動的なＤＮＡ結合およびタンパク質結合
デプスフィルター層への動的な結合能力の決定は、４７ｍｍの直径および１３．２ｃｍ２の有効フィルター領域を有する円形のプレスディスクを用いて、４．３ｍｌ／分の流速の一定流量下で、フローモードで行う。プレスディスクは、ステンスレス鋼製の濾過収納部（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）内に置き、２００ｍｌの逆浸透（ＲＯ）水で、次に６０ｍｌの１倍濃縮ＰＢＳ緩衝液で、事前すすぎを行い、次にＤＮＡまたはタンパク質試験溶液で完全にすすぐ。試験溶液として、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を有するサケ精子ＤＮＡ（Ｎａ塩、サイズ分布５００〜１０００塩基対、製品番号５４６５３、Ｂｉｏｍｏｌ）、または１倍濃縮ＰＢＳ緩衝液内に溶解された、１ｍｇ／ｍｌの濃度を有するポリクローナルヒトＩｇＧ混合物（Ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ（登録商標）／Ｂａｙｅｒ  Ｖｉｔａｌ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ）を用いる。さらに、試験溶液として、ＤＮＡとＩｇＧとの混合物を用いる。これに、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度を有するサケ精子ＤＮＡ（Ｎａ塩、サイズ分布５００〜１０００塩基対、製品番号５４６５３、Ｂｉｏｍｏｌ）、および、同時に、１倍濃縮ＰＢＳ緩衝液内に溶解された、１ｍｇ／ｍｌの濃度を有するポリクローナルヒトＩｇＧ混合物（Ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ（登録商標）／Ｂａｙｅｒ  Ｖｉｔａｌ、Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ）を添加する。濾液の吸光値を、オンラインの光度計によってそれぞれ２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで記録し、その記録から、標準系列を用いて濃度を決定する。ＤＮＡとポリクローナルヒトＩｇＧ混合物との混合物では、ＤＮＡ濃度は式Ａ×［２６０ｎｍでの吸光］−Ｂ×［２８０ｎｍでの吸光］を用いて計算し、ＩｇＧ濃度は式Ｃ×［２８０ｎｍでの吸光］−Ｄ×［２６０ｎｍでの吸光］を用いて計算する。係数Ａ〜Ｄは、Ｋ．Ｌ．Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０（６）１９９６、９６８〜９７０頁において記載されているように、ＤＮＡおよびポリクローナルヒトＩｇＧ混合物の吸光係数から装置特異的定数として計算される。漏出曲線の評価は、５０質量％動的漏出（ＤＢＴ）と濾過の全過程にわたる累積透過の累積結合との決定によって行われる。５０質量％ＤＢＴは、用いられるＤＮＡ濃度またはＩｇＧ濃度に基づいた、濾液流における５０質量％濃度レベルの実現を意味すると理解される。
【００５８】
水流量
水流量を測定するために、直径が４７ｍｍの円形のデプスフィルタープレスディスクを、最大容積が２００ｍｌのフィルターホルダー（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ  ＳＭ  １６２４９）内に置き、１バールの差圧で１００ｍｌの水で事前すすぎをする。次に、１バールの差圧での１００ｍｌの水について、［秒］で表される流れ時間を、ストップウォッチを用いて決定する。水流速を、水流速［ｌ／ｍ２分］＝０．１［ｌ］／（１２．５７×１０−４［ｍ２］×時間［分］）という式を用いて、有効フィルター領域が１２．５７ｃｍ２であるという仮定で計算する。
【００５９】
質量の決定、厚さの測定、および密度の決定
デプスフィルター層の質量、厚さ、および密度の決定は、１７．３５ｃｍ２のフィルター領域に対応する４７ｍｍの直径を有する円形のプレスディスクを用いて行われる。
【００６０】
質量は、試験材料モニターバランス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＬＰ  ３２００  Ｄ）を用いて１ｍｇの精度で決定する。
【００６１】
デプスフィルター試料の平均厚さの決定は、Ｈａｈｎ＆Ｋｏｌｂ（０．０１ｍｍの精度）から入手される厚さ測定装置を用いて行われる。厚さは、４個の端点で、およびプレスディスクの中央において測定する。平均厚さは、５個の測定点の平均として計算される。
【００６２】
密度は、
密度［ｇ／ｃｍ３］＝質量［ｇ］／（１７．３５ｃｍ２×厚さ［ｃｍ］）
という式に従って、厚さおよび質量について決定された値から計算される。
【００６３】
（Ａ）用いられるデプスフィルター
デプスフィルター１：Ｃ８ＨＰ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）
デプスフィルター２：Ｓ５Ｐ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）
デプスフィルター３：４０ＤＥ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）
デプスフィルター４：７５ＤＥ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）
デプスフィルター５：（Ｂ）のように、本発明に従ったＨＴ５００
デプスフィルター６：（Ｂ）のように、本発明に従ったＨＴ７５０
デプスフィルター７：（Ｂ）のように、本発明に従ったＨＴ９００
デプスフィルター８：（Ｂ）のように、本発明に従ったＨＴ５００Ｇ
（Ｂ）本発明に従ったデプスフィルターの組成
デプスフィルター５（ＨＴ５００）：
３７．５質量パーセントのセルロース繊維（Ｗｅｙｅｒｈａｅｕｓｅｒ  Ｔｙｅｅ）、０．５質量パーセントのカルボキシメチルセルロース、３８質量パーセントのハイドロタルサイトＳｙｎｔａｌ（登録商標）６９６（０．８μｍ〜２５μｍ）、２２質量パーセントのキーゼルグールＳＡ３、２質量パーセントのＫｙｍｅｎｅ（登録商標）。
【００６４】
デプスフィルター６（ＨＴ７５０）：
３２．５質量パーセントのセルロース繊維（Ｗｅｙｅｒｈａｅｕｓｅｒ  Ｔｙｅｅ）、０．５質量パーセントのカルボキシメチルセルロース、４５質量パーセントのハイドロタルサイトＳｙｎｔａｌ（登録商標）６９６（０．８μｍ〜２５μｍ）、２０質量パーセントのキーゼルグールＳＡ３、２質量パーセントのＫｙｍｅｎｅ（登録商標）。
【００６５】
デプスフィルター７（ＨＴ９００）：
３４．５質量パーセントのセルロース繊維（Ｗｅｙｅｒｈａｅｕｓｅｒ  Ｔｙｅｅ）、０．５質量パーセントのカルボキシメチルセルロース、６３質量パーセントのハイドロタルサイトＳｙｎｔａｌ（登録商標）６９６（０．８μｍ〜２５μｍ）、２質量パーセントのＫｙｍｅｎｅ（登録商標）。
デプスフィルター８（ＨＴ５００Ｇ）：
２７．５質量パーセントのセルロース繊維（Ｗｅｙｅｒｈａｅｕｓｅｒ  Ｔｙｅｅ）、０．５質量パーセントのカルボキシメチルセルロース、５５質量パーセントのハイドロタルサイトＳｙｎｔａｌ（登録商標）６９６（１μｍ〜２７８μｍ）、１５質量パーセントのキーゼルグールＳＡ３、２質量パーセントのＫｙｍｅｎｅ（登録商標）。
【００６６】
（Ｃ）ハイドロタルサイト粉末Ｓｙｎｔａｌ（登録商標）６９６の特徴付け
静的系におけるサケ精子ＤＮＡ：（Ｎａ塩、サイズ分布５００〜１０００塩基対、製品番号５４６５３、Ｂｉｏｍｏｌ）の結合およびポリクローナルヒトＩｇＧ混合物（Ｃｙｔｏｇｌｏｂｉｎ（登録商標）／Ｂａｙｅｒ  Ｖｉｔａｌ、Ｄ−Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ）の結合を測定した。正確な手順は上記の「分析方法」の節において記載した。
【００６７】
【表１】
2011530405.tif 000003
【００６８】
キーゼルグールはＤＮＡをほとんど結合しない。ハイドロタルサイトは高いＤＮＡ結合を示す。不都合なことに、両方の粉末は、大量の標的タンパク質ＩｇＧを結合する。
【００６９】
（Ｄ）デプスフィルターの特徴付け
デプスフィルターの水流量、厚さ、質量、密度、およびＢＥＴ表面積の決定を、上記の「分析方法」の節において記載したようにして行う。
【００７０】
【表２】
2011530405.tif 000004
【００７１】
動的系におけるＤＮＡ結合
動的系におけるＤＮＡ結合の決定を、上記の「分析方法」の節において記載したようにして行う。
【００７２】
【表３】
2011530405.tif 000005
【００７３】
動的系におけるポリクローナルヒトＩｇＧ混合物の透過
動的系におけるＩｇＧ結合の決定を、上記の「分析方法」の節において記載した通りに行う。
【００７４】
【表４】
2011530405.tif 000006
【００７５】
デプスフィルターの比較的な特徴付けのために、これらを同様の水流時間で群に分けることが必要である。以下に、１０秒未満の水流時間を有するデプスフィルターを粗大デプスフィルターとして群分けし、５０秒を超える水流時間を有するデプスフィルターを狭小デプスフィルターとして群分けする。ここで、水流時間は、４７ｍｍの直径を有するデプスフィルターおよび１バールの差圧での１００ｍｌの蒸留水に基づくものである。
【００７６】
図１は、サケ精子ＤＮＡをロードした、本発明に従った粗大(coarse)デプスフィルターＤＦ８についての、ならびに最新技術で知られている粗大デプスフィルターＤＦ１およびＤＦ３についての漏出曲線を示す。全ての３つのデプスフィルターは同様の水流時間を有し、デプスフィルターＤＦ２、ＤＦ４、およびＤＦ５からＤＦ７よりも粗大である。
【００７７】
図２は、サケ精子ＤＮＡをロードした、最新技術で知られている狭小デプスフィルターＤＦ２およびＤＦ４についての、ならびに本発明に従った狭小デプスフィルターＤＦ５、ＤＦ６、およびＤＦ７についての漏出曲線を示す。全ての５つのデプスフィルターは同様の水流時間を有し、デプスフィルターＤＦ１、ＤＦ３、およびＤＦ８よりも狭小である。
【００７８】
図３は、ポリクローナルヒト免疫グロブリン混合物（ＩｇＧ混合物）をロードした、最新技術で知られている粗大デプスフィルターＤＦ１およびＤＦ３についての、ならびに本発明に従った粗大デプスフィルターＤＦ８についての漏出曲線を示す。
【００７９】
図４は、ポリクローナルヒト免疫グロブリン混合物をロードした、最新技術で知られている狭小デプスフィルターＤＦ２およびＤＦ４についての、ならびに本発明に従った狭小デプスフィルターＤＦ５、ＤＦ６、およびＤＦ７についての漏出曲線を示す。
【００８０】
図５は、サケ精子ＤＮＡとポリクローナルヒト免疫グロブリンとの混合物をロードした、本発明に従った粗大デプスフィルターＤＦ８についての、ならびに最新技術で知られている粗大デプスフィルターＤＦ１およびＤＦ３についての漏出曲線を示す。
【００８１】
図６は、サケ精子ＤＮＡとポリクローナルヒト免疫グロブリンとの混合物をロードした、本発明に従った狭小デプスフィルターＤＦ５、ＤＦ６、およびＤＦ７についての、ならびに最新技術で知られている狭小デプスフィルターＤＦ２およびＤＦ４についての漏出曲線を示す。
【００８２】
本発明に従ったデプスフィルター層を用いると、最新技術と比較して最大１０倍高い、溶液からのＤＮＡの枯渇が得られ得る（表３、「５０質量％ＤＢＴ」、例えばＤＦ４対ＤＦ７）。図１および２は、本発明に従ったデプスフィルター層を用いると、狭小の実施形態および粗大の実施形態の両方で、濾液へのＤＮＡの漏出は、最新技術のデプスフィルター層を用いるよりも顕著に遅くにようやく起こり、すなわち、デプスフィルター層へのＤＮＡ含有溶液のロードが増大して初めて起こる。一方では、この利益は、表３の実施例における遅延したＤＮＡ漏出において見られ（表における「５０質量％ＤＢＴ」を比較されたい）、他方では、ＤＮＡ結合能力の増大がまた、本発明に従ったデプスフィルターでのＤＮＡ漏出曲線が最新技術のデプスフィルターと比較して平らな形状となっていることにおいて見られる。後者の特性は、本発明に従ったデプスフィルターがまた、より長い曝露時間でそれらのＤＮＡ枯渇能力に関するそれらの利益を保持するという効果を有する（表３におけるＤＮＡ結合についての値を参照されたい）。
【００８３】
さらに、所望の標的タンパク質、すなわちポリクローナルヒトＩｇＧ混合物は、本発明に従ったデプスフィルター層に、最新技術ほど強力には結合しない（図３および４）。したがって、粗大および狭小の実施形態における本発明に従ったデプスフィルターは、最新技術に従ったデプスフィルターと比較して、ＩｇＧ混合物の動的漏出および漏出曲線の全体的な形状に関して有利な特性を有する。
【００８４】
本発明に従ったデプスフィルター層のこれらの有利な特性はまた、上記の「分析方法」の節において記載されたような、リン酸緩衝食塩水における標的タンパク質および汚染物質を含有する混合物の濾過において見られる。図５および６は、標的タンパク質（ポリクローナルヒトＩｇＧ混合物）および汚染物質（サケ精子ＤＮＡ）からなる２つの成分の混合物の漏出挙動を示す。最新技術に従ったデプスフィルターの全ての４つの例では、ＤＮＡの漏出は、ＩｇＧ画分の漏出よりも早く起こる。したがって、最新技術のデプスフィルターでは、標的タンパク質からの汚染物質の選択的な分離は不可能である。他方で、本発明に従ったデプスフィルターは、対照的な漏出挙動を示す。最新技術に従ったデプスフィルターと同一の実験条件で、標的タンパク質の漏出は、汚染ＤＮＡの漏出のかなり前に生じる。したがって、生成物の透過が等しく良好なまま、濾液におけるＤＮＡを顕著に低減させることは、本発明に従ったデプスフィルターによってのみ可能になる（１０倍、表３の「５０質量％ＤＢＴ」）。図５は、粗大デプスフィルター層についての漏出挙動を示し、図６は狭小デプスフィルター層についての漏出挙動を示す。本発明に従ったデプスフィルター層の前述の利益は、両方の比較について明らかに認めることができる。本発明に従ったデプスフィルターによる汚染ＤＮＡの有利な分離は、したがって、これらのフィルターの開放性の広範な変形にわたり保持される。したがって、本発明に従ったデプスフィルターを、濾過されるメディウムの粒子分布に適合させ、かつ同時に本発明に従った汚染物質の選択的な分離を保持することが可能である。
【００８５】
したがって、例えばハイドロタルサイトを含有する、本発明に従ったデプスフィルター層を用いて初めて、従来の細胞および細胞断片の分離ならびにコロイド成分の除去に加えて、さらに同時に細胞培養溶液から大量のＤＮＡを除去し、一方で標的生成物はデプスフィルターをスムーズにかつ活性な形態で通過し得る、選択的なデプスフィルター層が提供され得る。したがって、例えばハイドロタルサイトを含有する、本発明に従ったデプスフィルター層は、汚染分物質の濃度が低減しているという観点から質が向上した濾液を生じさせ、それにより、有利なことに、「下流プロセス」における、その後の、また時にはコストのかかる精製ステップが単純化される。それにより、「下流」プロセスの最終部分におけるコストの大きいステップは、顕著に小さな規模で行うことができ、それにより、プロセスのコストという観点からのコストの低減がもたらされるが、また、標的タンパク質の生産損失が低くなることによるコストの低減ももたらされる。同時に、新規なデプスフィルター層の物理化学的安定性によってもまた、「下流」の細胞培養溶液の加工におけるクロマトグラフィーステップの前および後の使用が可能になり、それは、細胞培養上清の伝導性プロフィールにおける高いＤＮＡ結合能力が得られるためである。本発明に従ったデプスフィルター層は、「下流」プロセスにおける関連するプロセスウィンドウにおけるｐＨ、温度、圧力、および流量などの関連パラメータに関して十分に高い安定性を示す。本発明に従ったデプスフィルター層は、非常に単純に使い捨て生成物に加工され得、前記生成物は、バイオテクノロジー的、医学的、および薬学的生産プロセスにおいて、二次汚染を避けて最も優れた安全可能性で使用可能である。
【００８６】
無機層状複水酸化物粉末は、非常に効果的に、本発明に従ったデプスフィルター層内に組み込むことができ、適切に適合した粒子サイズ分布で、異なる開放性のまたは様々な水流速を有するデプスフィルター層もまた生産可能である。これにより、濾過される特定のプロセス溶液の要求プロフィールに対応する、デプスフィルター層のさらに柔軟な使用が可能になる。
【図１】
2011530405.tif 000007
【図２】
2011530405.tif 000008
【図３】
2011530405.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
2011530405.tif 000013
2011530405.tif 000014
2011530405.tif 000015
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