(57)【要約】  対象となる生体分子、例えばｍＡｂ、哺乳動物細胞培養物または細菌細胞培養物を含有する、化学的に処理された、軟凝集された供給材料を含む供給材料の、一次清澄化深層ろ過装置を使用し、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過ステップを使用しない、一次清澄化のための方法。該一次清澄化深層ろ過装置は、さまざまな細孔等級の段階的多孔質層を有する多孔質デプスフィルターを含有する。該一次清澄化深層ろ過装置は、約０．５μｍから約２００μｍの粒径分布を有する、軟凝集された細胞残屑およびコロイド状微粒子を含有する、化学的に処理された、軟凝集された供給材料を含む流体供給材料を、１０リットル／ｍ２／時から約１００リットル／ｍ２／時の流量でろ過する。キットならびにこれらの使用法および製作法もまた提供する。
2014523247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象となる標的生体分子ならびに複数の細胞残屑および／またはコロイド状微粒子を含有する供給材料の、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過ステップを使用しない、深層ろ過による清澄化のための方法であって、
ａ）多孔質デプスフィルター媒体を有する深層ろ過装置を提供するステップ、
ｂ）対象となる標的生体分子ならびに複数の細胞残屑および／またはコロイド状微粒子を含有する供給材料を提供するステップ、
ｃ）デプスフィルター媒体と供給材料とを接触させるステップ、ならびに
ｄ）対象となる標的生体分子を、供給材料中の細胞残屑およびコロイド状微粒子から、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過ステップを使用せずに分離するステップ、
を含む方法。
【請求項２】
化学的凝集剤をステップ（ｂ）の供給材料に加え、複数の軟凝集された細胞残屑およびコロイド状微粒子を含む化学的に軟凝集された供給材料を形成するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多孔質デプスフィルター媒体が異方性であり、細孔が公称細孔径等級＞約２５μｍを有し、軟凝集された供給材料が＞約３％の固形分を有し、流出濁度＜約２０ＮＴＵをもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
清澄化方法が一次清澄化方法であり、デプスフィルターが、少なくとも２つの不織繊維段階層を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
段階層が、約０．３ｃｍから約３ｃｍの合計の厚みを有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
デプスフィルターが、少なくとも３つの不織繊維段階層を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
段階層が、約０．３ｃｍから約３ｃｍの合計の厚みを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞残屑およびコロイド状微粒子が、約０．５μｍから約２００μｍの粒径分布および約１０μｍを超える平均粒径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
デプスフィルター媒体が、化学的に軟凝集された供給原料をろ過するために十分な開放公称細孔径等級を有する、不織繊維、セルロースおよび珪藻土の段階層の複合体を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
対象となる標的生体分子が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体およびバイオ治療薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
化学的凝集剤がポリマーまたは酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
化学的凝集剤がスマートポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
スマートポリマーが変性ポリアミンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
酸が酢酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
不織繊維が、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステルまたはナイロンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
デプスフィルターが、＞約１００Ｌ／Ｍ２／時の処理能力を提供し、約０．５μｍから約２００μｍの粒径分布を有する、軟凝集された細胞残屑およびコロイド状微粒子を除去する、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
供給材料が、バイオリアクター中に配置された細胞培養物であり、バイオリアクターから深層ろ過装置に、一次清澄化処理のために直接添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
清澄化された細胞培養流出物が、クロマトグラフィー処理のために、プロテインＡ結合および溶出クロマトグラフィーカラムに直接添加される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
対象となる二分子種および複数の細胞材料を含む軟凝集された供給材料の、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過ステップを使用しない、深層ろ過による一次清澄化方法であって、
ａ）多孔質デプスフィルター媒体を有する深層ろ過装置を提供するステップ、
ｂ）化学的凝集剤を提供するステップ、
ｃ）対象となる標的生体分子ならびに複数の細胞材料および／またはコロイド状微粒子を含有する供給材料を提供するステップ、
ｄ）化学的凝集剤を供給材料に加えるステップ、
ｅ）軟凝集された細胞材料および／またはコロイド状微粒子を含む、化学的に軟凝集された供給材料を形成するステップ、
ｆ）デプスフィルター媒体と、化学的に軟凝集された供給材料とを接触させるステップ、ならびに
ｇ）対象となる標的生体分子を、供給材料中の軟凝集された細胞材料および／または軟凝集されたコロイド状微粒子から、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過清澄化ステップを使用せずに分離するステップ、
を含む方法。
【請求項２０】
多孔質デプスフィルター媒体が異方性であり、細孔が公称細孔径等級＞約２５μｍを有し、軟凝集された供給材料が＞約３％の固形分を有し、流出濁度＜約２０ＮＴＵをもたらす、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
デプスフィルターが、少なくとも２つの不織繊維段階層を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
段階層が、約０．３ｃｍから約３ｃｍの合計の厚みを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
デプスフィルターが、少なくとも３つの不織繊維段階層を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
段階層が、約０．３ｃｍから約３ｃｍの合計の厚みを有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞材料およびコロイド状微粒子が、約０．５μｍから約２００μｍの粒径分布ならびに約１０μｍを超える平均粒径を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
デプスフィルター媒体が、化学的に軟凝集された供給材料をろ過するために十分な開放公称細孔径等級を有する、不織繊維、セルロースおよび珪藻土の段階層の複合体を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
対象となる標的生体分子が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体およびバイオ治療薬を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
化学的凝集剤がポリマーまたは酸である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
化学的凝集剤がスマートポリマーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
スマートポリマーが変性ポリアミンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
酸が酢酸である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
デプスフィルターが、＞約１００Ｌ／Ｍ２の処理能力を提供し、軟凝集された細胞残屑および軟凝集されたコロイド状微粒子を除去する、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
供給材料が、細胞培養物、トランスジェニック哺乳動物培養物、細菌細胞培養物、非トランスジェニック哺乳動物培養物、組織培養物、微生物発酵バッチ、植物抽出物、生物燃料、海水培養物、淡水培養物、排水培養物、下水処理水、下水未処理水、ミルク培養物、血液培養物およびこれらの組み合わせを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
不織繊維がポリプロピレンを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
供給材料が、バイオリアクター中に配置された細胞培養物であり、バイオリアクターから深層ろ過装置に、一次清澄化処理のために直接添加される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
清澄化された細胞培養流出物が、プロテインＡ結合および溶出クロマトグラフィーカラムに、クロマトグラフィー処理のために直接添加される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
対象となる標的生体分子ならびに複数の細胞残屑および／またはコロイド状微粒子を含有する供給材料の、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過ステップを使用しない、一次清澄化のための深層ろ過装置であって、約０．３ｃｍから約３ｃｍの合計の厚みを有する少なくとも２つの不織繊維段階層を有する多孔質デプスフィルター媒体を含み、ならびに細孔が公称細孔径等級＞約２５μｍを有する、装置。
【請求項３８】
媒体が異方性である、請求項３７に記載の装置。
【請求項３９】
媒体が、少なくとも３つの不織繊維段階層を含む、請求項３７に記載の装置。
【請求項４０】
媒体が、化学的に軟凝集された供給原料をろ過するために十分な開放公称細孔径等級を有する、不織繊維、セルロースおよび珪藻土の段階層の複合体を含む、請求項３７に記載装置。
【請求項４１】
不織繊維が、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエステルまたはナイロンを含む、請求項３７に記載の装置。
【請求項４２】
細胞残屑およびコロイド状微粒子が、約０．５μｍから約２００μｍの粒径分布ならびに約１０μｍを超える平均粒径を有する、請求項３７に記載の装置。
【請求項４３】
媒体が、＞約１００Ｌ／Ｍ２／時の処理能力を提供し、約０．５μｍから約２００μｍの粒径分布を有する、軟凝集された細胞残屑およびコロイド状微粒子を除去する、請求項３７に記載の装置。
【請求項４４】
化学的凝集剤を供給材料に加えた場合、軟凝集された供給材料が＞約３％の固形分を有し、流出濁度＜約２０ＮＴＵをもたらす、請求項３７に記載の装置。
【請求項４５】
対象となる標的生体分子が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ポリクローナル抗体およびバイオ治療薬を含む、請求項３７に記載の装置。
【請求項４６】
標的タンパク質を試料から精製する方法であって、
（ｉ）標的タンパク質および１種または複数種の不純物を含む試料を提供するステップ、
（ｉｉ）沈殿剤を試料に加え、１種または複数種の不純物を、勾配密度デプスフィルターを使用して除去し、これによって清澄化試料を得るステップ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の清澄化試料を、結合および溶出クロマトグラフィーステップに供し、これによって溶出液を得るステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の溶出液と、１種または複数種のウイルス不活性化剤とを、１または複数のインライン静的ミキサー、または１または複数のサージタンクを使用して接触させるステップ、
（ｖ）ウイルス不活性化ステップの流出を、活性炭、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体およびウイルスろ過膜から選択される２種以上のマトリックスの使用を含む、フロースルー精製方法に供するステップ、ならびに、
（ｖｉ）ステップ（ｖ）の流出を、所望の濃度およびバッファー条件において製剤化し、前記方法が、少なくとも２以上の方法ステップが、これらの持続期間の少なくとも一部分において同時に実施されるように連続して実施されるステップ、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
概して、本発明は、供給材料の一次清澄化に関する。ある特定の実施形態において、本発明は、供給材料、供給流、供給原料、細胞培養ブロスなどの一次清澄化の深層ろ過方法を提供し、該方法は、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過ステップを使用しない、一次清澄化深層ろ過装置を利用する。他の実施形態において、本発明は、細胞集団がより大きな凝結体に軟凝集された、化学処理された供給材料の一次清澄化深層ろ過方法を提供する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年７月８日出願の米国特許仮出願第６１／５７１，９９４号の利益を主張するものであり、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）などのタンパク質を含む医薬品グレードの生体分子の製造は、患者のための高品質製品を生産するために設計された、多層ろ過、遠心分離およびクロマトグラフィーの技術を備えた複合製造方法である。細胞培養回収物および高固形分供給原料の清澄化は、近代化生産のバッチ式バイオリアクター（≦２５，０００Ｌ）による回収物の大容量、および多くの場合クロマトグラフィー操作の前に一次および二次清澄化を必要とする高細胞密度により、骨の折れる仕事となり得る。従って、哺乳動物細胞およびｍＡｂなどの細胞培養回収物および高固形分供給原料の生産方法に関する回収および清澄化スキームは、この２０年あまりにわたって実施された大きな進化および評価の産物である。
【０００４】
哺乳動物細胞培養物およびｍＡｂの回収技術は、高収率（＞９５％）および最小の細胞破壊での操作が現在日常的に期待される。生成物分子の力価が増加する場合、細胞集団が多く、生成物の量が多くなるほど、下流の精製ステップに対する課題が生じる。細胞密度が高くなると、清澄化および除菌ろ過に困難をもたらす。生成物濃度が高くなると、一般に不純物負荷の増加およびより大きなクロマトグラフィー設備の必要をもたらす。従って、効率および処理能力の増加の形での改良が、大いに求められている。
【０００５】
治療用ｍＡｂの要求および成長の増加により、工業的治療用モノクローナル抗体の生産に関する製品の生産増加、品質、方法効率および費用対効果に対する取り組みが刺激されてきた。過去十年に、生産、上流の細胞培養生成物の力価ならびに不純物および混入物質の特徴付けの技術的発展における著しい成長が目撃されてきた。
【０００６】
ｍＡｂおよび哺乳動物細胞培養物の供給原料を含有するような高固形分供給材料を含む、供給材料、供給流、供給原料、細胞培養ブロスなどの一次清澄化により、大量のバイオマス、特に細胞全体および他のより大きな細胞残屑が除去され、次いで、より小さなコロイド状微粒子および下流のフィルターの能力を損なう他の粒子を除去する二次清澄化が続く。遠心分離は、通常ｍＡｂおよび哺乳動物細胞培養ブロスおよび供給原料の生産方法における通常の一次清澄化ステップである。
【０００７】
ｍＡｂの製造業者は、多大な時間および尽力を費やし、供給原料の生成物力価を増加させる。しかし、高力価は細胞培養物の生産性を増加する一方で、大量のバイオマスおよび細胞残屑含有量を含む供給原料もまた生産する。このような大量のバイオマスおよび細胞残屑を含有する供給材料は、遠心分離後に高濁度の遠心分離液を生産する可能性がある。高濁度の遠心分離液は、多くの場合、遠心分離の下流で使用される二次清澄化デプスフィルターおよびこの後の除菌フィルターの処理能力を低下させる。処理能力の低下は、フィルターの目詰まりおよび長い方法遅延による、方法費用の増加から方法手順の逸脱にまで及ぶ幅広い問題を引き起こす。最終的に、遠心分離を使用する一次清澄化の必要性は、バッチと治療用分子種との間の相互汚染の危険性を低下させるために試みる、大がかりな、工程間の検証された洗浄手順を要求する。
【０００８】
これは、比較的短時間に複数製品を処理することが望ましい、パイロット規模または臨床規模のバイオ治療薬の生産において特に問題がある。遠心分離洗浄手順は、異なる生体分子の生産に転換するパイロットプラントの能力を減速させ、生産工程の間の相互汚染の危険性を大いに増加させる。加えて、遠心分離は、これらの供給原料からすべての微粒子および細胞残屑を一次清澄化ステップにおいて有効に除去することができず、従って、深層ろ過を利用する二次清澄化ステップが、遠心分離ステップの後と、後続のクロマトグラフィーステップの前との間に必要である。
【０００９】
代替的には、多段階ろ過工程は、供給原料から異なるサイズの細胞および細胞残屑を除去することに有用であることが証明されているが、通常、フィルター設備が妥当なサイズを有する場合、体積的処理能力がより小さい体積（＜１０００Ｌ）への適用を限定する。ろ過の使用は、相互汚染の危険性を大きく低下させ、ろ過装置の使い捨て特性により、工程間の洗浄および洗浄バリデーションの必要を取り除く。残念ながら、処理能力が低いと多数のフィルターユニットが必要となり、各段階的ステップにおいて、フィルター装置および設備のホールドアップ体積のため供給材料溶液の一部分が喪失されるので、ろ過の収率が低下し得る。
【００１０】
清澄化性能、処理能力および下流のろ過操作をさらに強化するために、細胞培養回収物の軟凝集が使用されてきた。凝集剤は、溶液から微細粒子を凝結および凝集させ、液相からこれらの沈降をもたらし、溶液の濁度を低下させることができる、ある種の材料である。
【００１１】
軟凝集は、ポリマー処理、化学的処理（ｐＨ変化）または界面活性剤の添加を含むさまざまな方法で達成することができる。凝集剤を使用する沈殿は、溶液中のタンパク質産物を残しながら不純物を選択的に除去するために使用することができる。しかし、凝集剤は、ｍＡｂ、哺乳動物細胞および対象となる供給原料の他の二分子細胞材料の清澄化にはあまり使用されていない。
【００１２】
化学薬品による細胞培養回収物の軟凝集は、酢酸などの酸またはキトサン、多糖類、ポリアミンもしくはポリアクリルアミドなどのポリマーのいずれかの使用が必要である。軟凝集は、代替の分離技術として使用され、遠心分離の清澄化処理能力および遠心分離液の品質を強化し、これによって下流のろ過操作を改良する。一方、化学的軟凝集は、細胞残屑および細胞混入物質（宿主細胞のタンパク質およびＤＮＡ）の凝集に極めて有効であり、得られた軟凝集懸濁液は、一般に、ろ過前に遠心分離を使用しなければ、普通のろ過方法では容易に分離することができない。
【００１３】
凝集剤は、タンパク質の電荷とポリマー（例えばポリマー電解質）の電荷との相互作用のため、細胞、細胞残屑およびタンパク質を沈殿させ、不溶性複合体を作り出し、続いて残留電荷の相互作用によるか、または複合体の疎水性パッチを介するかのいずれかにより不溶性複合体を架橋し、より大きなクラスタを形成する。これらの大型のクラスタを除去するために、遠心分離ステップまたはタンジェンシャルフロー精密ろ過が、清澄化の一次モードであり、この後に、捕捉クロマトグラフィーステップの前の細胞培養ブロスの清澄化に広く使用される二次清澄化ステップが続く。遠心分離は無粒子遠心分離液を供給できないので、デプスフィルター（二次深層ろ過）および除菌フィルターが、さらに下流に組み込まれていることが必要である。
【００１４】
タンジェンシャルフロー精密ろ過（クロスフロー精密ろ過とも呼ばれる）は、哺乳動物細胞培養由来のｍＡｂおよび治療用生成物の回収および清澄化に関して、遠心分離と競合する。この技術の提供の１つの有利性は、追加のろ過の必要性が最小である、無粒子回収流を作り出すことである。しかし、細胞培養回収物に使用するタンジェンシャルフロー精密ろ過膜は、多くの場合、膜ファウリングの問題（即ち、膜透過流束の回復不能な低落）に悩まされ、通常、厳密な複合運転条件およびこの後の使用毎の（遠心分離の場合と同様）膜の徹底的な洗浄計画を必要とする。最適化された膜化学およびより親水性のタンジェンシャルフロー精密ろ過膜の使用により、一般に著しいファウリングの発生が幾分少なくなり、この問題に対処することになる。
【００１５】
伝統的に、軟凝集は、変形不能な固体粒子を凝集するために一般に使用される。例えば、これらの粒径の小ささのためろ過が非常に困難である、サブミクロンサイズの粘土または二酸化チタン粒子の希釈懸濁液は、化学的に軟凝集され、これらのサブミクロン粒径のサイズが、凝集されたフロックの形成により大幅に増大し、より迅速に沈降し、この結果ケーキ内の流路が大きくなるためろ過が早くなることにより、容易に分離することができる。
【００１６】
しかし、化学的軟凝集を、ｍＡｂ供給原料または他の生体分子／細胞性供給原料に適用した場合、得られた凝集体は独特であり、これらの二分子材料の生物学的特性の性質のため、土質材料および金属酸化物の変形不能な固体粒子とはかけ離れている。土質材料または金属酸化物などの大部分の固体変形不能粒子は水よりはるかに大きな密度を有する。従って、これらの小粒子がひとたび軟凝集すると、これらの粒径は大幅に増大し、得られたフロックは重力により迅速に（即ち数分で）沈降する。対照的に、細胞、ｍＡｂおよび他の生体分子種は、アミノ酸と水とで作られており、水の密度に非常に近い密度を有する。従って、軟凝集された細胞および他の生体分子は容易には沈降せず、多くの場合沈降が起こる前に数時間はかかる。
【００１７】
別の問題は、軟凝集された細胞集団の比較的小さい密度であり、これは通常供給材料体積のかなりの部分を占める綿毛状の集団を形成し、圧縮されたケーキは形成しない。さらに、粒子の生物学的起源のため、フロックは壊れやすく、圧力下で容易に破壊される傾向がある。
【００１８】
このような理由で、既存の固体−液体分離法の大部分は、固体粒子系では有用であっても、ｍＡｂ供給原料などの軟凝集された細胞集団においては有用とは言えない。
【００１９】
粒子保持は、サイズ排除および疎水性、イオン性および他の相互作用を介する吸着の両方を伴うと考えられる。ファウリングの機序は、細孔の閉塞、ケーキ形成および／または細孔の収縮を含むと思われる。デプスフィルターは混入物質の除去において非常に有効であり、使い捨てフォーマットとして供給されているので、これによって、再使用可能なハードウェア設備に関する検証および混入問題、例えば遠心分離を使用する場合に遭遇する検証および混入問題を排除するため、有利である。しかし、デプスフィルターは現在、高力価ｍＡｂの処理に特有である高固形分供給流に対処することができず、従ってデプスフィルターは遠心分離後に使用されている。非清澄化細胞培養物上清中に存在する微粒子高負荷および高濁度が、深層ろ過単独による一次清澄化に課題を与えている。
【００２０】
しかし、デプスフィルターは現在、高固形分供給流の一次清澄化に対処することができず、多くの場合、遠心分離またはタンジェンシャルフロー精密ろ過の後に使用しなければならない。非清澄化細胞培養物上清中に存在する微粒子高負荷および高濁度が、深層ろ過単独による一次清澄化に課題を与えている。現在、限定された処理能力が、一次清澄化用デプスフィルターの大型設備をもたらし、この大型設備は、上記のように、大量のホールドアップ体積およびスケールアップ問題により収率の低下をもたらす。
【００２１】
加えて、ｍＡｂ供給原料は、高いバイオマス含有量の存在のため清澄化およびろ過に難易度の高い供給流であり、遠心分離後に高濁度の遠心分離液をもたらす。大量のバイオマスの除去が必要なため、高濁度の遠心分離液が清澄化の下流のデプスフィルターの寿命を短縮する。ｍＡｂの清澄化を改良し、これによって処理能力の向上をもたらす必要性が存在する。
【００２２】
一次清澄化の遠心分離ステップまたは一次清澄化精密ろ過ステップ、この後の大粒子を除去する深層ろ過媒体に依存する二次清澄化ステップの使用に依存する上記の一次清澄化工程を考慮すると、使い捨てで、合理的信頼性があり、実施が過度に高価でない、一次清澄化の遠心分離または精密ろ過ステップおよびこの後の追加の二次清澄化ステップを使用しない、一次清澄化方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【００２３】
供給材料、供給流、供給原料、細胞培養ブロスなどの一次清澄化方法に伴う上記の必要性および問題に応えて、本発明は、一次清澄化深層ろ過装置を利用し、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過ステップを使用しない、一次清澄化深層ろ過方法を使用することによって、この課題を克服する。
【００２４】
本発明は、対象となる標的生体分子ならびに複数の細胞残屑およびコロイド状微粒子を含有する、供給材料、供給流、供給原料、細胞培養ブロスなどの、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過ステップを使用しない、深層ろ過による一次清澄化のための方法を包含し、該方法は、
ａ）多孔質デプスフィルター媒体を有する深層ろ過装置を提供するステップ、
ｂ）対象となる標的生体分子ならびに複数の細胞残屑および微粒子を含有する供給流を提供し、該細胞残屑および微粒子が約０．５μｍから約２００μｍの粒径分布を有するステップ、
ｃ）多孔質デプスフィルター媒体と供給流とを、デプスフィルター媒体が、約０．５μｍから約２００μｍの粒径分布を有する細胞残屑および微粒子を、約１０リットル／ｍ２／時から約１００リットル／ｍ２／時の流量でろ過可能なように接触させるステップ、ならびに
ｄ）対象となる標的生体分子を細胞残屑および微粒子から、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過ステップを使用せずに分離するステップ、
を含む。
【００２５】
本発明は、一次清澄化深層ろ過装置を使用し、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過ステップを使用しない、深層ろ過による、対象となる標的生体分子または対象となるバイオ治療薬および軟凝集された細胞残屑、材料およびコロイド状微粒子をこの中に含有する軟凝集された供給材料の一次清澄化方法をさらに包含し、該方法は、
ａ）多孔質デプスフィルター媒体を含有する深層ろ過装置を提供するステップ、
ｂ）化学的凝集剤を提供するステップ、
ｃ）対象となる標的生体分子ならびに複数の細胞材料、残屑およびコロイド状微粒子を含有する供給材料を提供するステップ、
ｄ）化学的凝集剤と供給材料とを組み合わせるステップ、
ｅ）供給材料において化学的に軟凝集された細胞材料、残屑およびコロイド状微粒子を形成し、場合により、対象となる標的生体分子を化学的に軟凝集させるステップ、
ｆ）多孔質デプスフィルター媒体と、化学的に軟凝集された細胞材料、残屑およびコロイド状微粒子を含有する供給材料とを接触させるステップ、ならびに
ｇ）軟凝集された対象となる二分子種および複数の軟凝集された細胞材料を、遠心分離清澄化ステップまたはタンジェンシャルフロー精密ろ過清澄化ステップを使用せずに分離するステップ、
を含む。
【００２６】
本発明は、深層ろ過装置を使用し、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過ステップを使用しない、供給材料の一次清澄化を対象とする。該深層ろ過装置は、およそ０．５μｍから２００μｍの粒径分布を有する粒子を含有する高固形供給材料を、約１０リットル／ｍ２／時から約１００リットル／ｍ２／時の流量で、ＴＭＰが２０ｐｓｉに達するまでろ過可能である。本明細書において教示する一次清澄化デプスフィルター媒体は、さまざまな細孔等級の段階的多孔質層を含む。
【００２７】
本明細書において提供する一次清澄化多孔質異方性デプスフィルター媒体の好ましい一用途は、対象となる二分子種またはバイオ治療薬および複数の軟凝集された細胞残屑および軟凝集されたコロイド状微粒子を含有する、化学的に処理された、軟凝集された高固形分供給材料の一次清澄化である。
【００２８】
ある実施形態において、本発明は、多孔質フィルター媒体を有する深層ろ過装置を、ｍＡｂ、哺乳動物細胞培養物、植物細胞培養物、細菌細胞培養物、昆虫細胞培養物ならびに他の対象となる二分子細胞材料および培養物を含有する、軟凝集された供給材料の一次清澄化に使用する方法を提供し、該装置は、軟凝集された凝結細胞集団および残屑を対象となる生体分子種から、一次清澄化遠心分離ステップまたは一次清澄化タンジェンシャルフロー精密ろ過ステップを使用せずに、非常に大きな粒子を含有する高容量の供給原料の深層ろ過を実施できる繊維系多孔質デプスフィルター媒体を使用することによって、ケーキろ過の意図的でない作用なしに有効に分離する。
【００２９】
ある実施形態において、本発明は、凝集剤を使用して軟凝集された細胞残屑および約１０ミクロン（μｍ）より大きいサイズを有するコロイド状微粒子またはより小さい粒子を含む、凝結された細胞性バイオマスの一次清澄化および除去に使用する、複数の段階層（ｇｒａｄｅｄ  ｌａｙｅｒｓ）を有する多孔質デプスフィルター媒体を含む深層ろ過装置を提供する。
【００３０】
さらに他の実施形態において、本発明は、０．５μｍから２００μｍまで変動する粒径を有する細胞残屑およびコロイド状微粒子の深層ろ過が可能な、一次清澄化深層ろ過に使用するための開放段階層（ｏｐｅｎ  ｇｒａｄｅｄ  ｌａｙｅｒｓ）を有する多孔質デプスフィルター媒体を含む深層ろ過装置を提供し、これによって、非清澄化供給流に対する処理能力を、ケーキろ過の意図しない作用がないように改良する。
【００３１】
ある実施形態において、本発明は、
ａ）ケーキろ過の意図しない作用またはフィルター細孔内のフロック架橋の形成なしに、細胞残屑の大きなフロックが侵入する、大細孔を有し、
ｂ）フロックの崩壊を引き起こし得る圧力損失の集中を回避するために、細胞集団を広げ、媒体内、媒体の外側もしくは内側の内部ケーキろ過につながる内部のフロック架橋を防止するための非常に大きな深層を有し、
ｃ）異方性デプスフィルター層を有し、即ち、供給原料中のフロックサイズの母集団に一致する細孔径の段階的縮小を有し、微細フロック、例えば、ポリマーの代わりに酸の軟凝集により生成されたフロックの相当量を含む特定の供給原料のために、デプスフィルター層は、フェルト材料、ＤＥおよび微細物除去のために必要とされる短繊維の組み合わせを有する複合媒体を含み、
ｄ）凝集剤および化学的処理された供給流に特有の１０ｕｍを超える平均粒径を有する、対象となる二分子種の一次清澄化のために、デプスフィルターが、大量の固形分を含む軟凝集された供給流をろ過可能な、開放公称細孔径等級を有する不織繊維の段階層を含み、
ｅ）大量の固形分を含む、ポリマー凝集剤により処理された供給流をろ過可能な開放公称細孔径等級を有する不織繊維およびセルロース／珪藻土の複合段階層からなり、
ｆ）高い透過性にもかかわらず、ポリマー凝集剤（例えば、スマートポリマー（ＳｍＰ）、キトサンなど）により処理された供給材料に対して優れた保持特性を有し、
ｇ）高い透過性にもかかわらず、ポリマー凝集剤（例えば、酸沈殿、カプリル酸など）により処理された供給材料に対して優れた保持特性を有し、
ｈ）不織繊維の段階層を含むデプスフィルターを使用する、細胞および細胞残屑含有培養物の一次清澄化の方法に使用され、
ならびに
ｉ）不織繊維の段階層を含むデプスフィルターを使用する、軟凝集された細胞および細胞残屑含有培養物の一次清澄化の方法に使用される、
深層ろ過媒体を提供する。
【００３２】
ある実施形態において、本発明は、公称細孔径＜約２５μｍを有する不織繊維の段階層を含む、デプスフィルター用深層ろ過媒体前置フィルターを提供する。
【００３３】
さらに他の実施形態において、本発明は、公称細孔径＜約２５μｍを有する不織繊維の少なくとも３つの段階層を含む、デプスフィルター用深層ろ過媒体前置フィルターを提供する。
【００３４】
さらに他の実施形態において、本発明は、公称細孔径等級＞約２５μｍを有する少なくとも２層の段階的不織繊維を含み、＞約３％の固形分を含む、軟凝集された供給流をろ過可能なデプスフィルターを含む、深層ろ過媒体を提供する。
【００３５】
さらに他の実施形態において、本発明は、公称細孔径等級＞約２５μｍを有する少なくとも２層の段階的不織繊維を含み、＞約３％の固形分を含む、ポリマーにより軟凝集された供給流をろ過可能なデプスフィルターを含む、深層ろ過媒体を提供する。
【００３６】
さらに他の実施形態において、本発明は、公称細孔径等級＞約２５μｍを有する少なくとも２層の段階的不織繊維を含み、＞約３％の固形分を含む、ポリマーにより軟凝集された供給流をろ過可能であり、流出濁度（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  ｏｕｔｐｕｔ）＜２０ＮＴＵをもたらすデプスフィルターを含む、深層ろ過媒体を提供する。
【００３７】
該デプスフィルターに伴う本課題を克服するために、本発明は、一次清澄化デプスフィルター媒体およびこれらの使用方法を対象とし、該一次清澄化デプスフィルター媒体は、およそ０．５ミクロンから２００ミクロンの粒径分布を有する流体流を含有する高固形分を、約１０リットル／ｍ２／時（１０ＬＭＨ）から１００リットル／ｍ２／時（１００ＬＭＨ）の流量で、ＴＭＰが２０ｐｓｉに達するまでろ過可能である。該一次清澄化デプスフィルターは、さまざまな細孔等級を有し、ポリマーおよび化学的に処理された、軟凝集された供給材料の一次清澄化に適用される段階層を含む。
【００３８】
本発明は、使い捨て一次清澄化方法のためのデプスフィルターを対象とする。深層ろ過のための開放段階層の使用は、大きな塊を含有する供給材料のろ過を可能にし、遠心分離を排除する可能性があり、約０．５ミクロンから約２００ミクロンまで変動する粒径を有する、さらに高い固形分のろ過を可能にし、これによって、これらの非清澄化供給流の処理能力を改良する。
【００３９】
本発明のさらなる特色および有利性は、後続の詳細な説明および特許請求の範囲において説明する。本発明の多くの改良および変形が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく実施可能であり、当業者には明らかであると思われる。前述の概説および後続の詳細な説明、特許請求の範囲および添付の図面は、単なる例示および説明であり、本教示のさまざまな実施形態の説明を提供する意図のものとして理解されるべきである。本明細書に記載された特定の実施形態は、単なる例の目的として提示され、限定の意味では決してない。
【００４０】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する付随の図面は、本発明の現在企図されている実施形態を例示し、説明と共に、本発明の原理を説明するために機能する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】本発明に従った一次清澄化デプスフィルターの実施例のさまざまな概略の実施形態を表す図であり、図１Ａ（８層）は、ポリマー凝集剤（スマートポリマー）により処理された供給材料に使用する一次清澄化デプスフィルターを表す。
【図１Ｂ】本発明に従った一次清澄化デプスフィルターの実施例のさまざまな概略の実施形態を表す図であり、図１Ｂは、化学的に処理（酸処理）された供給材料に使用する、少なくとも８層を有する一次清澄化デプスフィルターを表す。
【図１Ｃ】本発明に従った一次清澄化デプスフィルターの実施例のさまざまな概略の実施形態を表す図であり、図１Ｃ（７層）は、ポリマー凝集剤（スマートポリマー）により処理された供給材料に使用する一次清澄化デプスフィルターを表す。
【図１Ｄ】本発明に従った一次清澄化デプスフィルターの実施例のさまざまな概略の実施形態を表す図であり、図１Ｄは、化学的に処理（酸処理）された供給材料に使用する、少なくとも８層を有する一次清澄化デプスフィルターを表す。
【図１Ｅ】本発明に従った一次清澄化デプスフィルターの実施例のさまざまな概略の実施形態を表す図であり、図１Ｅ（８層）は、ポリマー凝集剤（スマートポリマー）により処理された供給材料に使用する一次清澄化デプスフィルターを表す。
【図１Ｆ】本発明に従った一次清澄化デプスフィルターの実施例のさまざまな概略の実施形態を表す図であり、図１Ｆは、化学的に処理（酸処理）された供給材料に使用する、少なくとも８層を有する一次清澄化デプスフィルターを表す。
【図２】本明細書に記載の例示的一次清澄化デプスフィルターの精製方法の概略図である。示した精製方法は、細胞培養物のためにバイオリアクターを使用し、続いて、一次清澄化深層ろ過ステップ、プロテインＡ結合および溶出クロマトグラフィー（捕捉）ステップ、ウイルス不活性化ステップ、フロースルー精製ステップ、および製剤化ステップ、を使用する。示したように、各方法ステップは、方法ステップの意図した結果を達成するために使用される１または複数の装置を用いる。示したように、清澄化は、本明細書に教示し、図１Ａから１Ｆに表した次段階的清澄化深層ろ過を用い、プロテインＡ結合および溶出クロマトグラフィーは連続多層カラムクロマトグラフィー（ＣＭＣ）を使用して実施され、ウイルス不活性化は、２種のインライン静的ミキサーを用い、フロースルー精製は活性炭（ＡＣ）続いて陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー、続いてインライン静的ミキサーおよびサージタンクを使用したｐＨ変化、続いてフロースルー陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーおよびウイルスろ過、ならびに製剤化は透析ろ過／濃縮タンジェンシャルフローろ過装置この後の除菌ろ過を用いる。１または複数の除菌フィルターもまた、本方法に用いられる。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本明細書に引用されたすべての公報、特許および特許出願は、上記のものも下記のものも、個々の公報、特許および特許出願が具体的および個別に参照により本発明に組み込まれることが示された場合と同じ程度で、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００４３】
本明細書および添付の特許請求の範囲の目的に関して、特に明記しない限り、原料の量、材料の百分率および割合、反応条件を表すすべての数字ならびに本明細書および特許請求の範囲に使用される他の数値は、明白に示してあろうとなかろうと、「約」という用語により、すべての事例において修飾されていると解釈すべきである。「約」という用語は、概して、列挙された値と同等（即ち、同じ機能または結果を有する）と考えられる数値範囲を指す。多くの場合、「約」という用語は、最も近い有効数字を四捨五入した数字を含んでよい。
【００４４】
従って、逆のことが示されていない限り、以下の明細書および付属の特許請求の範囲において説明される数値パラメーターは、本発明により得られることが探求されている所望の特性に依存して変動し得る近似値である。最低限でも、特許請求の範囲と同等の教義の適用を限定する試みはなく、個々の数値パラメーターは、報告された有効数字の数を考慮し、普通の四捨五入技術を用いることにより、少なくとも解釈されるべきである。
【００４５】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲およびパラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例において説明された数値は、可能な限り正確に報告される。しかし、任意の数値は、これら各自の測定試験において見出される標準偏差から必然的にもたらされる、特定の誤差を本質的に含有する。さらに、本明細書に開示されるすべての範囲は、この中に包摂されるすべての部分範囲を包含すると解釈されるべきである。例えば、「１から１０」という範囲は、最小値の１および最大値の１０の間の（およびこれらを含む）任意およびすべての部分範囲、即ち、１と同等またはこれを超える最小値および１０と同等またはこれより小さい最大値を有する、任意およびすべての部分範囲、例えば５．５から１０を含む。
【００４６】
本発明をさらに詳細に説明する前に、幾つかの用語を定義する。これらの用語の使用は本発明の範囲を限定するものではなく、単に、本発明の説明を容易にするために機能するものである。
【００４７】
特に定義されない限り、本明細書において使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する分野の当業者により普通に理解されるものと同じ意味を有する。下記の用語を、本明細書に記載の本発明の目的のために定義する。
【００４８】
本明細書において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示していない限り、複数の指示対象を含む。
【００４９】
「バイオリアクター」という用語は、本明細書において使用する場合、生物学的活性環境を支持する、製造もしくは設計された任意の装置または系を指す。ある場合には、バイオリアクターは、生物またはこのような生物に由来する生物学的活性物質を伴う、細胞培養工程を実施する槽である。このような方法は、好気的または嫌気的のいずれであってもよい。一般的に使用されるバイオリアクターは、通常円筒形であり、数リットルから数立方メートルのサイズであり、多くの場合ステンレス鋼で作られている。本明細書に記載の幾つかの実施形態において、バイオリアクターは鋼鉄以外の材料で作られており、使い捨てまたは単回使用である。バイオリアクターの総体積は、個々の方法に依存して、１００ｍｌから最大１０，０００リットル以上の範囲の任意の体積であってよいことが企図される。本明細書に記載の工程および系に従った幾つかの実施形態において、バイオリアクターは、デプスフィルターなどの単位操作に連結される。本明細書に記載の幾つかの実施形態において、バイオリアクターは、細胞培養および沈殿両方のために使用され、沈殿剤は、直接バイオリアクターに加えることができ、これによって１種または複数種の不純物が沈殿される。
【００５０】
「細胞培養物」という用語は、懸濁液、ローラーボトル、フラスコなどにおいて成長した細胞、ならびに限定するものではないが、細胞、細胞残屑、細胞性混入物、コロイド粒子、生体分子、ＨＣＰ、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡ、ｍＡｂ、凝集剤を含む、懸濁液これ自体の成分を指す。撹拌発酵装置中のマイクロキャリアに結合して増殖する付着細胞を含むバイオリアクターなどの大規模な取り組みもまた、「細胞培養物」という用語に包含される。さらに、接触依存性細胞の培養だけでなく、特許請求する発明の方法の懸濁液培養技術の使用も可能である。例示的マイクロキャリアは、例えば、デキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチンおよびセルロースならびにＢｕｔｌｅｒ，Ｓｐｉｅｒ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：２８３−３０３（１９８８）に記載の他の物を含む。多孔質キャリア、例えば、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ．ＲＴＭ．またはＣｙｔｏｐｏｒｅ．ＲＴＭ．ならびにデキストラン系キャリア、例えばＤＥＡＥ−デキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ１．ＲＴＭ．）、第４級アミンコーティングデキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ２．ＲＴＭ．）またはゼラチン系キャリア、例えば、ゼラチンコーティングデキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ３．ＲＴＭ．）もまた使用可能である。タンパク質の大規模生産および小規模生産の両方に関する細胞培養手順は、本発明に包含される。限定するものではないが、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養または撹拌タンクバイオリアクター系を含む手順が、マイクロキャリアを有しても、または有さなくても使用でき、バッチ、フェドバッチまたは潅流モードで代替的に操作可能である。
【００５１】
「細胞培養培地」および「培養培地」という用語は、動物細胞、例えば哺乳動物細胞の成長に使用される栄養溶液を指す。このような栄養溶液は一般に、細胞の接着、成長および細胞環境の維持に必要なさまざまな要素を含む。例えば、典型的な栄養溶液は、基礎培地製剤、細胞タイプに依存したさまざまな栄養補助剤および時として抗生物質を含んでよい。幾つかの実施形態において、栄養溶液は、以下のカテゴリーのうちの１または複数から少なくとも１種の成分を含むことができる：１）エネルギー源、普通はグルコースなどの炭水化物の形態、２）全必須アミノ酸および普通は２０種のアミノ酸の基本セット＋システイン、３）ビタミンおよび／または低濃度で必要とされる他の有機化合物、４）遊離脂肪酸、および５）微量元素、微量元素は通常非常に低濃度、普通はマイクロモル範囲で必要とされる無機化合物または天然元素として定義される。該栄養溶液は多くの場合、以下のカテゴリーのうちのいずれかから１種または複数種を添加されてもよい：１）ホルモンおよび他の成長因子、例えば、インスリン、トランスフェリンおよび表皮成長因子、２）塩およびバッファー、例えば、カルシウム、マグネシウムおよびホスフェート、３）ヌクレオシドおよび塩基、例えば、アデノシンおよびチミジン、ヒポキサンチン、ならびに４）タンパク質および組織加水分解物。概して、任意の適切な細胞培養培地が使用可能である。培地は、血清、例えばウシ胎児血清、仔牛血清などを含んでもよい。代替的には、培地は無血清、無動物質または無タンパク質であってもよい。
【００５２】
「細胞培養添加物」という用語は、本明細書において使用する場合、細胞培養または発酵の方法を容易にする、または改良するために細胞培養方法に加えられる分子（例えば非タンパク質添加物）を指す。本発明に従った幾つかの実施形態において、本明細書に記載の刺激応答性ポリマーは、１種または複数種の細胞培養添加物と結合し、沈殿させる。例示的細胞培養添加物は、消泡剤、抗生物質、染料および栄養を含む。
【００５３】
「チャイニーズハムスター卵巣細胞タンパク質」および「ＣＨＯＰ」という用語は、本明細書において互換的に使用され、チャイニーズハムスターの卵巣（「ＣＨＯ」）細胞培養物由来の宿主細胞タンパク質（「ＨＣＰ」）の混合物を指す。ＨＣＰまたはＣＨＯＰは一般に、細胞培養培地または溶解物（例えば、対象となるタンパク質およびポリペプチド（例えば、ＣＨＯ細胞において発現された抗体またはイムノアドヘシン）を含有する、回収された細胞培養液）中の不純物として存在する。概して、対象となるタンパク質を含む混合物中に存在するＣＨＯＰの量は、対象となるタンパク質の純度の尺度を提供する。通常、タンパク質混合物中のＣＨＯＰの量は、混合物中の対象となるタンパク質の量に対して百万分率で表される。宿主細胞が別の哺乳動物細胞型、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞である場合、ＨＣＰは、宿主細胞の溶解物中に見出される、標的タンパク質以外のタンパク質を指すと理解されるべきである。
【００５４】
「混入物質」、「不純物」および「残屑」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の外来性または不都合な材料を指し、これらは、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの生物学的巨大分子、１種または複数種の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰまたはＣＨＯＰ）、エンドトキシン、ウイルス、脂質および１種または複数種の添加物を含み、対象となるタンパク質もしくはポリペプチド（例えば抗体）を含有する試料中に存在する可能性があり、該対象となるタンパク質もしくはポリペプチド（例えば抗体）は、本発明に従った刺激応答性ポリマーを使用して、１種または複数種の外来性もしくは不都合な分子から分離される。幾つかの実施形態において、本明細書に記載の刺激応答性ポリマーは、対象となるタンパク質またはポリペプチドおよび１種または複数種の不純物を含有する試料から、対象となるタンパク質またはポリペプチドと結合しこれを沈殿させる。他の実施形態において、本明細書に記載の刺激応答性ポリマーは、１種または複数種の不純物を結合し、これを沈殿させ、これによって、対象となるポリペプチドまたはタンパク質を１種または複数種の不純物から分離する。
【００５５】
「サージタンク」という用語は、本明細書において使用する場合、任意の容器または槽またはバッグを指し、これは、方法ステップの間または方法ステップ内（例えば、単一の方法が複数のステップを含む場合）で使用され、１つのステップの流出が、サージタンクを介して次のステップに流入する。従って、サージタンクは、ステップからの流出の全量を保持または収集する意図のものではないという点でプールタンクとは異なり、代わりに、１つのステップの流出から次への連続流入を可能にする。幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法または系において、２つの方法ステップの間または１つの方法ステップ内で使用されるサージタンクの体積は、方法ステップから流出する全体積の２５％以下である。別の実施形態において、サージタンクの体積は、方法ステップから流出する全体積の１０％以下である。幾つかの他の実施形態において、サージタンクの体積は、バイオリアクター中の細胞培養物の全体積の３５％未満、または３０％未満、または２５％未満、または２０％未満、または１５％未満、または１０％未満であり、これらは、標的分子が精製される出発材料を構成する。
【００５６】
「静的ミキサー」という用語は、２種の流体材料、通常液体を混合する装置を指す。該装置は一般に、円筒形（管）のハウジングに含有されたミキサー要素からなる。系全体の設計は、流体の２つの流れを静的ミキサーに送達する方法を組み込んでいる。流れはミキサーの中を移動するので、非移動要素が材料を連続してブレンドする。完全な混合は、流体特性、管の内径、ミキサー要素の数およびこれらの設計などを含む、多数の変数に依存する。
【００５７】
本明細書において使用する場合、「デプスフィルター」（例えば、勾配−密度デプスフィルター）という用語は、フィルター材料の深層の内部でろ過を達成する。このようなフィルターの一般的なクラスは、流路の複雑な蛇行迷路を形成するように結合された（または固定された）繊維のランダムなマトリックスを含むフィルターである。これらのフィルターにおける粒子の分離は、一般的に、繊維マトリックスによる取り込みまたは繊維マトリックスへの吸着からもたらされる。細胞培養ブロスおよび他の供給原料の生物学的処理に最も頻繁に使用されるデプスフィルター媒体は、セルロース繊維、ＤＥなどのろ過助剤および正に帯電した樹脂粘結剤からなる。アブソリュートフィルターとは異なり、デプスフィルター媒体は、多孔質媒体の間に粒子を保持し、細孔径より大きい粒子および小さい粒子の両方を保持することができる。粒子保持は、サイズ排除および疎水性、イオン性または他の相互作用を介した吸着の両方を伴うと考えられている。ファウリングの機序は、細孔の閉塞、ケーキ形成および／または細孔の収縮を含むと思われる。デプスフィルターは混入物質を除去し、さらに使い捨てフォーマットとして供給され、これによって、検証の問題を排除するため、有利である。
【００５８】
「アフィニティクロマトグラフィーマトリックス」という用語は、本明細書において使用する場合、アフィニティクロマトグラフィーに適切なリガンドを担持するクロマトグラフィーマトリックスを指す。通常このリガンド（例えば、プロテインＡまたはこれらの機能性の変異体もしくは断片）は、クロマトグラフィーマトリックス材料に共有結合しており、溶液はクロマトグラフィーマトリックスと接触しているので、溶液中の標的分子に到達可能である。アフィニティクロマトグラフィーマトリックスの一例は、プロテインＡマトリックスである。アフィニティクロマトグラフィーマトリックスは通常、鍵／鍵穴機構、例えば、抗原／抗体または酵素／受容体の結合に基づく高い特異性で標的分子と結合する。アフィニティマトリックスの例は、プロテインＡリガンドを担持するマトリックス、例えば、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）またはＰＲＯＳＥＰ（登録商標）−Ａである。本明細書に記載の方法および系において、アフィニティクロマトグラフィーステップは、精製方法全体において、結合および溶出のクロマトグラフィーステップとして使用することができる。
【００５９】
「イオン交換」または「イオン交換クロマトグラフィー」という用語は、本明細書において使用する場合、混合物中の対象となる溶質または分析物（例えば、精製される標的分子）が、固相イオン交換材料に（例えば共有結合により）連結された帯電化合物と相互作用し、対象となる溶質または分析物が、混合物中の溶質不純物または混入物質より多くまたは少なく、帯電化合物と非特異的に相互作用する、クロマトグラフィー方法を指す。混合物中の混入溶質は、対象となる溶質より速くもしくは遅く、イオン交換材料のカラムから溶出され、または対象となる溶質に対する樹脂に結合され、もしくは樹脂から排除される。
【００６０】
「イオン交換クロマトグラフィー」は、陽イオン交換、陰イオン交換および混合モードのイオン交換クロマトグラフィーを特に含む。例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーは、標的分子（例えば、標的タンパク質を含有するＦｃ領域）と結合し、この後（例えば陽イオン交換結合および溶出クロマトグラフィーまたは「ＣＩＥＸ」を使用して）溶出することができ、または標的分子がカラム（陽イオン交換フロースルークロマトグラフィーＦＴ−ＣＩＥＸ）を「フロースルー」しながら、不純物を優勢に結合できる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、標的分子（例えば、標的タンパク質を含有するＦｃ領域）を結合し、この後溶出することができ、または標的分子がカラムを「フロースルー」しながら、不純物を優勢に結合でき、ネガティブクロマトグラフィーとも称される。幾つかの実施形態において、および本明細書に説明した実施例に明示したように、陰イオン交換クロマトグラフィーステップは、フロースルーモードで実施する。
【００６１】
「イオン交換マトリックス」という用語は、負に帯電した（即ち、陽イオン交換媒体）または正に帯電した（即ち、陰イオン交換媒体）マトリックスを指す。電荷は、１または複数の帯電リガンドがマトリックスに、例えば共有結合により結合することによって提供され得る。代替的もしくは付加的には、電荷は、マトリックスの固有の性質（例えば、シリカの場合のように、全体が負の電荷を有する）であってもよい。
【００６２】
「陰イオン交換マトリックス」という用語は、正に帯電したマトリックス、例えば、第４級アミノ基などの１または複数の正に帯電したリガンドを有するマトリックスを指すように使用される。市販の陰イオン交換樹脂は、ＤＥＡＥセルロース、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）およびＦＡＳＴ  Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を含む。本明細書に記載の方法および系に使用可能な他の例示的材料は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ｈｉｇｈｃａｐ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＱおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＤＥＡＥ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）である。
【００６３】
「陽イオン交換マトリックス」という用語は、負に帯電し、マトリックスの固相に接触した水溶液中の陽イオンと交換するための遊離の陽イオンを有するマトリックスを指す。陽イオン交換マトリックスまたは樹脂を形成するために固相と結合した、負に帯電したリガンドは、カルボキシレートまたはスルホネートであってよい。一般に利用可能な陽イオン交換マトリックスは、カルボキシメチルセルロース、スルホプロピル（ＳＰ）固定アガロース（例えば、ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標）またはＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＨＩＧＨ  ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）およびスルホニル固定アガロース（例えば、Ｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）を含む。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＯ３、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＥ  Ｈｉｇｈｃａｐ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＳおよびＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＣＯＯ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が好ましい。
【００６４】
「不純物」または「混入物質」という用語は、本明細書において使用する場合、任意の外来性または不都合な分子を指し、これらは、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの生物学的巨大分子、１種または複数種の宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、脂質および１種または複数種の添加物を含み、標的分子を含有する試料中に存在する可能性があり、該標的分子は本発明の方法を使用して、外来性または不都合な分子の１種または複数種から分離される。さらに、このような不純物は、本発明の方法の前に起こり得るステップに使用される任意の試薬も含み得る。不純物は、本質的に可溶性であっても、または不溶性であってもよい。
【００６５】
「不溶性不純物」という用語は、本明細書において使用する場合、標的分子を含有する試料中に存在する、任意の望ましくない、または不都合な実体を指し、この場合この実態は、懸濁粒子または固形分である。例示的不溶性不純物は、細胞全体、細胞断片および細胞残屑を含む。
【００６６】
「可溶性不純物」という用語は、本明細書において使用する場合、標的分子を含有する試料中に存在する、任意の望ましくない、または不都合な実体を指し、この場合この実態は、不溶性不純物ではない。例示的可溶性不純物は、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス、エンドトキシン、細胞培養培地成分、脂質などを含む。
【００６７】
「連続法」という用語は、本明細書において使用する場合、方法中の１つの方法ステップからの流出が、中断することなく次の方法ステップに直接流入し、２以上の方法ステップが、これらの継続期間の少なくとも一部分に関して同時に実施できるような２以上のステップ（または単位操作）を含む、標的分子の精製方法を指す。言い換えれば、本明細書に記載の連続法の場合、１つの方法ステップが、次の方法ステップが開始される前に完了している必要はなく、試料の一部分は常に方法ステップの間で移動している。「連続法」という用語はまた、方法ステップ内のステップにも適用され、この場合、複数ステップを含む方法ステップの実施中、試料は、方法ステップの実施が必要とされる複数のステップを介して連続して流入している。本明細書に記載のこのような方法ステップの一例は、フロースルー精製ステップであり、これは、連続様式（例えばフロースルー活性炭、続いてフロースルーＡＥＸ媒体、続いてフロースルーＣＥＸ媒体、続いてウイルスろ過）で実施される、複数ステップを含む。
【００６８】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載のデプスフィルターは清澄化に使用され、この後、清澄化細胞培養物は、精製方法の次のステップ、例えば結合および溶出クロマトグラフィーステップ（例えばプロテインＡアフィニティクロマトグラフィー）に、連続して流入することができる。
【００６９】
「半連続法」という用語は、本明細書において使用する場合、任意の単一方法ステップにおける流体材料の投入または流出が、不連続または断続的である、標的分子精製のための一般的連続方法を指す。例えば、本発明に従った幾つかの実施形態において、方法ステップ（例えば結合および溶出クロマトグラフィーステップ）における投入は、連続して添加されてよいが、流出は断続的に収集されてよく、精製方法の他の方法ステップは連続している。従って、幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法および系は、断続的様式で操作される少なくとも１つの単位操作を含み、一方で該方法または系の他の操作単位は連続様式で操作されてもよいという点で、本質的に「半連続」である。
【００７０】
「連結された方法」という用語は、２以上の方法ステップ（または単位操作）を含み、流体材料が、該方法の方法ステップを介して連続して流入するように、相互に直接流体連通にあり、該方法の正常な操作の間に２以上の方法ステップが同時に連絡する、標的分子の精製方法を指す。時として、該方法の少なくとも１つの方法ステップが、閉位置のバルブなどの障壁により、他の方法ステップから一時的に孤立してもよいことは理解されるべきである。個々の方法ステップのこの一時的孤立は、例えば該方法の始動もしくは停止の間または個々の単位操作の除去／取り換えの間に必要となることがある。「連結された方法」という用語は、例えば、方法ステップが、該方法ステップの意図した結果を達成するために実施すべき幾つかのステップを必要とする場合、方法ステップ内のステップにも適用される。このような一例は、本明細書に記載のフロースルー精製方法ステップであり、これは、フロースルーモードで実施される幾つかのステップ、例えば、活性炭、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびウイルスろ過を含むことができる。
【００７１】
「流体連通」という用語は、本明細書において使用する場合、方法ステップが、任意の適切な手段（例えば、連結ラインまたはサージタンク）により連結され、これによって１つの方法ステップから別の方法ステップへの流体の流入が可能になる、２つの方法ステップの間の流体材料の流入、または方法ステップ中のステップの間の流体材料の流入を指す。幾つかの実施形態において、２つの単位操作の間の連結ラインは、１または複数のバルブにより中断され、連結ラインの間の流体の流入を制御することができる。
【００７２】
「精製すること（ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ）」、「精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、「分離する（ｓｅｐａｒａｔｅ）」、「分離すること（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ）」、「分離する（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）」、「単離する（ｉｓｏｌａｔｅ）」、「単離すること（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ）」、「単離（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書において使用する場合、標的分子および１種または複数種の不純物を含む試料から標的分子の純度を増加させることを指す。通常、標的分子の純度は、少なくとも１種の不純物を試料から（完全にまたは部分的に）除去することによって増加させる。
【００７３】
「沈殿させる（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）」、「沈殿させること（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ）」または「沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書において使用する場合、望ましくない不純物の特性を、可溶性標的分子からより容易に分離可能なように改良する、清澄化に使用される方法を指す。これは通常、望ましくない不純物の大型の凝結粒子および／または不溶性複合体を形成するステップを伴う。これらの粒子は、可溶性標的分子を含有する液相から、例えばろ過または遠心分離により、より容易に分離可能な特性（例えば密度またはサイズ）を有する。幾つかの場合において、望ましくない不純物が可溶性標的分子からより容易に分離可能なように、相変化が生じる。相変化による沈殿は、ポリマーまたは小分子などの沈殿剤の添加によりもたらすことができる。特定の実施形態において、沈殿は刺激応答性ポリマーであり、スマートポリマーとも称される。本明細書に記載の幾つかの実施形態において、沈殿剤（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔまたはｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）は、凝集剤である。軟凝集は、本明細書において使用する場合、沈殿を実施する１つの方法であり、性能は通所使用する凝集剤の濃度に依存する（「用量依存性」）。通常、凝集剤は、反対に帯電した不純物と複合体を形成する、ポリ陽イオンなどのポリマー電解質である。
【００７４】
本明細書に記載の幾つかの実施形態において、清澄化は、標的分子および１種または複数種の不純物を含有する試料への沈殿剤の添加ならびにこの後の深層ろ過を用いる。刺激応答性ポリマーの場合などの幾つかの場合において、溶液条件（温度、ｐＨ、塩度など）の変化が、沈殿を開始するために使用できる。１種または複数種の不純物および沈殿剤を含有する沈殿材料を除去し、これによって、液相中の標的分子を回収し、通常液体をこの後、標的分子をさらに精製するためにさらなる方法ステップに供する。
【００７５】
沈殿は、精製される標的分子を発現する細胞培養物を含有するバイオリアクターにおいて直接実施することが可能であり、沈殿剤を直接バイオリアクターに添加する。代替的には、沈殿剤を、通常標的分子を含有する細胞培養物に、別の槽において加える。
【００７６】
沈殿材料を除去する、当業者に公知の多数の方法、例えばろ過または沈降またはこれらの任意の組み合わせが存在する。
【００７７】
「沈降させること（ｓｅｔｔｌｉｎｇ）」という用語は、本明細書において使用する場合、沈殿材料が、重力の影響下で槽の底に移動する、沈降方法を指す。沈降は、この後、液相または上清のデカントまたはろ過することができる。
【００７８】
本明細書において使用する場合、「スマートポリマー」（ＳｍＰ）（刺激応答性ポリマーまたはインテリジェントポリマーまたはＡｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｃｒｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ（ＡＭＬ）とも称される）という用語は、本明細書において使用する場合、外的刺激、例えば、ｐＨ，温度、光、イオン強度、放射線、電圧、外圧、溶媒組成または他の刺激のような環境条件における変化に対して、生物学的、化学的または物理的に応答性である、ポリマーの群を意味する。スマートポリマーは、わずかな物理的または化学的刺激に応答して特性が大きく変化し、これらの物理的または化学的特性を、これらの環境的刺激に対して、可逆的に変化させることができる（Ｒｏｙ  ａｎｄ  Ｇｕｐｔａ，２００３；Ｋｏｐｅｃｅｋ，２００７）。スマートポリマーは、多くの形態をとることができ、水溶液に溶解することができ、水−固体界面に吸着またはグラフトでき、または架橋してヒドロゲルを形成することもできる［Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（１９８７）６：２９７−３０５；Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｉｎ：Ｐａｒｋ  Ｋ，ｅｄ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：ＡＣＳ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（１９９７）４８５−９８；Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａｒｔｉｆ  Ｏｒｇａｎｓ（１９９５）１９：４５８−４６７］。通常、ポリマーの限界応答が刺激された場合、溶液中のスマートポリマーは、相分離したような濁度の突然の発生を示し、表面に吸着またはグラフトされたスマートポリマーは崩壊し、界面は親水性から疎水性に変換し、（ヒドロゲルの形態で架橋された）スマートポリマーは急な崩壊を示し、膨張溶液の大部分が放出される。スマートポリマーは、生体分子と物理的に混合または化学的にコンジュゲートされ、生物学的刺激ならびに物理的および化学的刺激に応答可能な、ポリマー−生体分子系の大型のファミリーを得ることができる。ポリマーとコンジュゲート可能な生体分子は、タンパク質およびオリゴペプチド、糖および多糖類、一本鎖および二本鎖のオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡプラスミド、単純脂質およびリン脂質ならびに広範囲の認識リガンドおよび合成薬物分子を含む。多数の構造パラメーターが、対象となるタンパク質を特異的に沈殿させるスマートポリマーの能力を制御し、スマートポリマーは、リガンドのカップリングのための反応基を含有しなければならず、不純物と強く相互作用してはならず、リガンドを標的タンパク質との相互作用に利用可能にし、密な沈殿を形成しなければならない。
【００７９】
本明細書において使用する場合、「高固形分」含有供給材料という語句は、およそ＞７％の固形分を有する供給材料を意味し、一方「低固形分」含有供給材料という語句は、およそ０．１％から７％の固形分である。
【００８０】
「刺激（ｓｔｉｍｕｌｕｓまたはｓｔｉｍｕｌｉ）」という用語は、本明細書において互換的に使用され、本発明に従った刺激応答性ポリマーによりもたらされる、環境の物理的変化または化学的変化を指すことを意味する。従って、本発明は、刺激に応答し、この刺激がポリマーの溶解度に変化をもたらす新規なポリマーを提供する。本明細書に記載の１種または複数種のポリマーが応答する刺激の例は、限定するものではないが、例えば、温度変化、伝導率の変化および／またはｐＨの変化を含む。幾つかの実施形態において、刺激は、錯化剤または錯体形成塩の試料への添加を含む。さまざまな実施形態において、刺激は、概してポリマーを試料に添加後に加えられる。しかし、刺激は、ポリマーを試料に添加する間またはこの前に加えられてもよい。
【００８１】
「ポリマー」（ｐｏｌｙｍｅｒ）という用語は、本明細書において使用する場合、２以上の単量体分子単位の共有結合により形成される分子を指す。これらの単量体単位は合成であっても、または天然であってもよい。反復単位により形成されるポリマーは、線形であっても分枝型であってもよい。ポリマーの例は、限定するものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコール、ポリスチレンおよびコポリマー（例えば、ポリスチレン−コ−ポリピリジン、ポリアクリル酸−コ−メチルメタクリレート、プルロニック、ＰＦ６８など）を含む。本発明に従った幾つかの実施形態において、ポリマーは、ポリマー電解質骨格を含む。
【００８２】
「プロテインＡ」および「Ｐｒｏｔ  Ａ」という用語は、本明細書において互換的に使用され、プロテインＡの天然供給源から回収されたプロテインＡ、合成的に（例えば、ペプチド合成または組換え技術により）生成されたプロテインＡ、およびＣＨ２／ＣＨ３領域、例えばＦｃ領域を有するタンパク質と結合する能力を保有しているこれらの変異体を包含する。プロテインＡは、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、ＧＥまたはＦｅｒｍａｔｅｃｈから市販品として購入可能である。プロテインＡは一般に、クロマトグラフィーマトリックスに固定されている。本発明に従った方法および系に使用されるプロテインＡの機能性誘導体、断片または変異体は、マウスＩｇＧ２ａまたはヒトＩｇＧ１のＦｃに対して、少なくともＫ＝１０８Ｍ、好ましくはＫ＝１０９Ｍの結合定数を特徴とすることができる。結合定数のこのような値に適合する相互作用は、本文脈において「高親和性結合」と呼ばれる。幾つかの実施形態において、プロテインＡのこのような機能性誘導体または変異体は、天然ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、ＣまたはＩｇＧ結合機能性を保有するこれらの遺伝子操作された突然変異体から選択される、野生型プロテインＡの機能性ＩｇＧ結合ドメインの少なくとも一部を含む。
【００８３】
さらに、固体支持体への一点結合が可能なように遺伝子操作されたプロテインＡの誘導体または変異体もまた、特許請求する方法においてアフィニティクロマトグラフィーステップに使用することができる。
【００８４】
一点結合とは、概して、タンパク質部分が単一の共有結合を介してプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーのクロマトグラフィー支持材料に結合することを意味する。このような一点結合は、曝露されたアミノ酸位置、即ちループ、Ｎ末端もしくはＣ末端の近くまたはタンパク質フォールドの外周の他の場所に配置された適切な反応残基の使用によってもまた生じさせることができる。適切な反応基は、例えばスルフリドリル基またはアミノ基である。
【００８５】
幾つかの実施形態において、変異体のプロテインＡ誘導体は、複数点結合を介して適切なクロマトグラフィーマトリックスに結合する。
【００８６】
「アフィニティクロマトグラフィーマトリックス」という用語は、本明細書において使用する場合、アフィニティクロマトグラフィーに適切なリガンドを担持するクロマトグラフィーマトリックスを指す。通常このリガンド（例えば、プロテインＡまたはこれらの機能性の変異体もしくは断片）は、クロマトグラフィーマトリックス材料に共有結合しており、溶液はクロマトグラフィーマトリックスと接触しているので、溶液中の標的分子に到達可能である。アフィニティクロマトグラフィーマトリックスの一例は、プロテインＡマトリックスである。アフィニティクロマトグラフィーマトリックスは通常、鍵／鍵穴機構、例えば、抗原／抗体または酵素／受容体の結合に基づく高い特異性で標的分子と結合する。アフィニティマトリックスの例は、プロテインＡリガンドを担持するマトリックス、例えば、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）またはＰＲＯＳＥＰ（登録商標）−Ａである。本明細書に記載の方法および系において、アフィニティクロマトグラフィーステップは、精製方法全体において、結合および溶出のクロマトグラフィーステップとして使用することができる。
【００８７】
「刺激応答性ポリマー」という用語は、本明細書において使用する場合、刺激の添加後に物理的および／または化学的特性に変化を示すポリマーである。通常の刺激応答は、ポリマーの溶解度の変化である。例えば、ポリマーのポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は、約３５℃未満の温度において水溶性であるが約３５℃の温度において水に不溶性になる。
【００８８】
「軟凝集」という用語は、本明細書において使用する場合、１種または複数種の、懸濁された不溶性または可溶性不純物を除去するために、凝集剤、例えば、本明細書に記載のポリマーまたは化学的処理（例えば酸処理）の溶液への添加を指す。該ポリマーは、通常の固体−液体分離法を介して溶液から除去可能な不溶性凝結体を、自発的に形成させる濃度で加えなければならない。
【００８９】
「組成物」、「溶液」または「試料」という用語は、本明細書において使用する場合、本明細書に記載の１種または複数種の刺激応答性ポリマーまたは化学的処理（例えば酸処理）を使用して精製される標的分子または所望の生成物と、１種または複数種の望ましくない実体または不純物との混合物を指す。幾つかの実施形態において、該試料は、標的分子または所望の生成物が分泌される供給原料または細胞培養培地を含む。幾つかの実施形態において、該試料は、標的分子（例えば治療用タンパク質または抗体）と、１種または複数種の不純物（例えば、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、細胞培養添加物細胞および細胞残屑）を含む。幾つかの実施形態において、該試料は、細胞培養培地に分泌される対象となる標的分を含む。
【００９０】
幾つかの実施形態において、標的分子が、本明細書に記載の１種または複数種の刺激応答性ポリマーまたは化学的処理（例えば酸処理）を使用して精製される試料は、試料と刺激応答性ポリマーとが接触する前に「部分精製」される。部分精製は、例えば、試料を、１種または複数種の精製ステップ、例えば、１種または複数種の非アフィニティクロマトグラフィーステップに供することにより達成することができる。標的分子は、１種または複数種の望ましくない実体または不純物から、１種または複数種の不純物を沈殿させるか、または標的分子を沈殿させるかのいずれかによって分離することができる。
【００９１】
「沈殿させる（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）」、「沈殿させること（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｎｇ）」または「沈殿（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書において使用する場合、（例えば、対象となる生体分子との複合体として）結合したポリマーまたは非結合のポリマーまたは他の可溶性種の、水性および／または可溶性状態から非水性および／または不溶性状態への変更を指す。
【００９２】
「対象となる生体分子」という用語は、本明細書において使用する場合、所望の標的分子、例えば、対象となる所望の生成物またはポリペプチド（例えば抗体）などであってよく、または所望の標的分子を含有する試料から除去されることが必要とされる、望ましくない実体であってもよい。このような望ましくない実体は、限定するものではないが、例えば、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質凝結体、細胞培養添加物、ウイルス、エンドトキシン、細胞全体および細胞残屑から選択される１種または複数種の不純物を含む。さらに、対象となる生体分子は、本明細書に記載の刺激応答性ポリマーまたは化学的に処理（例えば酸処理）により、結合および沈殿させることもできる。
【００９３】
「標的分子」、「標的生体分子」、「所望の標的分子」および「所望の標的生体分子」という用語は、本明細書において互換的に使用され、概して、対象となるポリペプチドまたは生成物を指し、この対象となるポリペプチドまたは生成物は、これを含有する試料中に存在し得る１種または複数種の望ましくない実体、例えば１種または複数種の不純物から精製または分離されることが望ましい。
【００９４】
「対象となるタンパク質」、「標的ポリペプチド」、「対象となるポリペプチおよび「標的タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、概して、治療用タンパク質またはポリペプチドを指し、限定するものではないが、本発明に従った刺激応答性ポリマーを使用して精製される抗体を含む。
【００９５】
本明細書において互換的に使用される場合、「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、概して、約１０を超えるアミノ酸を有するペプチドおよびタンパク質を指す。幾つかの実施形態において、本明細書に記載の刺激応答性ポリマーは、タンパク質またはポリペプチドを、これと一緒に試料中に存在する１種または複数種の望ましくない実体から分離するために使用される。幾つかの実施形態において、１種または複数種の実態は、精製されるべきタンパク質またはポリペプチドと一緒に試料中に存在し得る１種または複数種の不純物である。上述のように、幾つかの実施形態において、本明細書に記載の刺激応答性ポリマーは、刺激が試料に加えられると、対象となるタンパク質またはポリペプチドと特異的に結合する。他の実施形態において、本明細書に記載の刺激応答性ポリマーは、刺激が試料に加えられると、対象となるタンパク質またはポリペプチド以外の実態、例えば、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、細胞全体、細胞残屑および細胞培養添加物と結合し、これを沈殿させる。
【００９６】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載の刺激応答性ポリマーを使用して精製されるタンパク質またはポリペプチドは、哺乳動物タンパク質、例えば、治療用タンパク質または療法に使用されるタンパク質である。例示的タンパク質は、限定するものではないが、例えば、レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子；抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えばベータ−ラクタマーゼ；Ｄｎａｓｅ；ＩｇＥ；細胞障害性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子の受容体；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、−４、−５または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）または神経成長因子、例えばＮＧＦ−β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン；インターロイキン（Ｉｌ）、例えばＩＬ−１からＩＬ−１０；スーパオキシドジムスターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；ならびに上記のポリペプチドのいずれかの断片および／または変異体を含む。
【００９７】
さらに、幾つかの実施形態において、本発明に従ったスマートポリマーを使用して精製されるタンパク質またはポリペプチドは、抗体、これらの機能性断片または変異体である。幾つかの実施形態において、対象となるタンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ領域を含有する組換えタンパク質である。
【００９８】
「免疫グロブリン」、「Ｉｇ」または「抗体」という用語は（本明細書において互換的に使用され）、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる塩基性の４つのポリペプチド鎖を有し、前記鎖が例えば、鎖間のジスルフィド結合により安定化され、抗原と特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。「一本鎖免疫グロブリン」または「一本鎖抗体」という用語は（本明細書において互換的に使用され）、重鎖および軽鎖からなる２つのポリペプチド鎖構造を有し、前記鎖が、例えば、鎖間のペプチドリンカーにより安定化され、抗原と特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。「ドメイン」という用語は、例えば、βプリーツシートおよび／または鎖間ジスルフィド結合により安定化されたペプチドループを含む（例えば３から４のペプチドループを含む）、重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を指す。ドメインは、本明細書においてさらに「定常」または「可変」と称され、「定常」ドメインの場合さまざまなクラスメンバーのドメイン内の配列変動の相対的欠如に基づき、または「可変」ドメインの場合、さまざまなクラスメンバーのドメイン内の有意な変動に基づく。抗体またはポリペプチドの「ドメイン」は、多くの場合、抗体またはポリペプチドの「領域」と、当分野において互換的に称される。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域または「ＣＬ」ドメインと、互換的に称される。抗体重鎖の「定常」ドメインは、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域または「ＣＨ」ドメインと、互換的に称される。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域または「ＶＬ」ドメインと、互換的に称される。抗体重鎖の「可変」ドメインは、「重鎖可変領域」、「重鎖可変ドメイン」、「ＶＨ」領域または「ＶＨ」ドメインと、互換的に称される。
【００９９】
免疫グロブリンまたは抗体は、モノクローナルであっても、またはポリクローナルであってもよく、単量体型または重合型、例えば、五量体型で存在するＩｇＭ抗体および／または単量体、二量体または多量体型で存在するＩｇＡ抗体で存在してよい。免疫グロブリンまたは抗体は、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）および抗体断片を、リガンド特異的結合断片を保有しているか、またはリガンド特異的結合断片を含むように改変されている限り、さらに含み得る。「断片」という用語は、無傷または完全な抗体または抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部または部分を指す。断片は、無傷または完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理を介して得ることができる。断片は、組換え手段によっても得ることができる。組換え的に生成された場合、断片は、単独または融合タンパク質と呼ばれる大型タンパク質の一部として発現されてもよい。例示的断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖ断片を含む。例示的融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質を含む。
【０１００】
概して、免疫グロブリンまたは抗体は、対象となる「抗原」に対する。好ましくは、抗原は生物学的に重要なポリペプチドであり、疾患または障害を患う哺乳動物に対する抗体の投与は、この哺乳動物に治療的利益をもたらすことができる。しかし、非ポリペプチド抗原（例えば、腫瘍関連糖脂質抗原、米国特許第５，０９１，１７８号を参照されたい。）に対する抗体もまた企図される。抗原がポリペプチドである場合、抗原は膜貫通分子（例えば受容体）または成長因子などのリガンドであってよい。
【０１０１】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書において使用する場合、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち、少量存在し得る天然の突然変異の可能性を除いて、集団を含む個別の抗体が同一であることを指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対する。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含む、従来の（ポリクローナル）抗体調製品とは対照的に、個々のモノクローナル抗体が抗原の単一の決定基に対する。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を要求とすると解釈するべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ方法により作製することができ、または組換えＤＮＡ法により作製することができる（米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。）。「モノクローナル抗体」は、例えば、ファージ抗体ライブラリから、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載の技術を使用して単離することもできる。
【０１０２】
モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、もしくは相同であり、一方、鎖（複数可）の残りは、別の種に由来する抗体、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体ならびにこのような抗体の断片の対応する配列と同一であるか、もしくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を、これらが所望の生物学的活性を示す限り、さらに含み得る（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。
【０１０３】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書において定義した超可変領域以外の可変ドメイン残基である。
【０１０４】
非ヒト（例えばネズミ）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分に関して、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、非ヒト種、例えばマウス、ウサギまたは非ヒト霊長類由来の超可変領域残基（ドナー抗体）で置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの場合、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基で置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するために実施される。概して、ヒト化抗体は、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲ領域のすべてもしくは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である、少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むと思われる。
【０１０５】
該ヒト化抗体は場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常ヒト免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分をさらに含む。さらに詳細には、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、本発明に従った刺激応答ポリマーを使用して分離または精製される抗体は、治療用抗体である。例示的治療用抗体は、例えば、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５−４２８９；米国特許第５，７２５，８５６号）；抗ＣＤ２０抗体、例えばキメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」  米国特許第５，７３６，１３７号；抗−ＩｇＥ（Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２；ＷＯ９５／１９１８１）；抗ＣＤ１８（米国特許第５，６２２，７００号；ＷＯ９７／２６９１２）；Ｅ２５、Ｅ２６およびＥ２７を含む抗ＩｇＥ（米国特許第５，７１４，３３８号；米国特許第５，０９１，３１３号；ＷＯ９３／０４１７３；米国特許第５，７１４，３３８号）；抗Ａｐｏ−２受容体抗体（ＷＯ９８／５１７９３）；ｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、ＣＤＰ５７１およびＭＡＫ−１９５を含む抗ＴＮＦ−アルファ抗体（米国特許第５，６７２，３４７号；Ｌｏｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（４）：１６４６−１６５３；Ｄｈａｉｎａｕｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）  Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２３（９）：１４６１−１４６９）；抗組織因子（ＴＦ）（ＥＰ０４２０９３７Ｂ１）；抗ＣＤ４抗体、例えばｃＭ−７４１２抗体（Ｃｈｏｙ  ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ３９（１）：５２−５６）；抗Ｆｃ受容体抗体、例えばＦｃガンマＲｌに対するＭ２２抗体、Ｇｒａｚｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２；抗Ｇｐｌｌｂ／ｌｌｌａ抗体；抗ＲＳＶ抗体、例えばＭＥＤＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（商標））；抗ＣＭＶ抗体、例えば、ＰＲＯＴＯＶＩＲ（商標））；抗ＨＩＶ抗体、例えばＰＲＯ５４２；抗肝炎抗体、例えば高Ｈｅｐ  Ｂ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（商標））；抗ＣＡ１２５抗体ＯｖａＲｅｘ；抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２；抗アルファｖベータ３抗体ＶＩＴＡＸＩＮ（商標）；抗ヒト腎細胞癌抗体、例えばｃｈ−Ｇ２５０；ＩＮＧ−１；抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）；ならびに抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体、例えばＳｍａｒｔ  ＩＤ１０および抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）を含む。
【０１０７】
「単離すること」、「精製すること」および「分離すること」という用語は、標的分子（例えば、対象となるポリペプチドまたはタンパク質）を、標的分子および１種または複数種の不純物を含む組成物または試料から、本明細書に記載の刺激応答性ポリマーを使用して精製する関連において、本明細書において互換的に使用される。幾つかの実施形態において、試料中の標的分子の純度は、１種または複数種の不純物を、本明細書に記載の刺激応答性ポリマーを使用することによって（完全または部分的に）除去することによって増加させる。別の実施形態において、試料中の標的分子の純度は、標的分子を、試料中の１種または複数種の不純物から離れて沈殿させることによって増加させる。
【０１０８】
幾つかの実施形態において、精製方法は、１または複数の「クロマトグラフィーステップ」を追加で用いる。通常、これらのステップは、標的分子を、１または複数の所望でない実体から本発明に従った刺激応答ポリマーを使用して分離した後に、必要に応じて実施することができる。
【０１０９】
幾つかの実施形態において、対象となるポリペプチドまたはタンパク質を、本明細書に記載の刺激応答性ポリマーを使用して単離、分離または精製するための「精製ステップ」は、「均一」または「純粋な」組成物または試料をもたらす全精製方法の一部であってよく、この用語は、本明細書において、対象となるタンパク質を含む組成物中に１００ｐｐｍ未満のＨＣＰ、代替的には、９０ｐｐｍ未満、８０ｐｐｍ未満、７０ｐｐｍ未満、６０ｐｐｍ未満、５０ｐｐｍ未満、４０ｐｐｍ未満、３０ｐｐｍ未満、２０ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満、５ｐｐｍ未満または３ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む組成物または試料を指すように使用される。本明細書において使用する場合、「一次清澄化」は凝結された細胞バイオマスの除去を含み、該凝結された細胞バイオマスは、軟凝集された細胞残屑および約１０ミクロン（μｍ）より大きい径を有するコロイド状微粒子または凝集剤を使用したより小型の粒子を含む。
【０１１０】
「清澄化する」、「清澄化」、「清澄化ステップ」という用語は、概して、本明細書において使用する場合、生体分子の精製において最初に使用される１または複数のステップを指す。清澄化ステップは、一般的に、例えば、清澄化深層ろ過、沈殿、軟凝集および沈降のいずれかの単独またはさまざまな組み合わせを含む１または複数のステップを使用する、細胞および／または細胞残屑の除去を含む。幾つかの実施形態において、本発明は、さまざまな精製スキームに一般に使用される従来の清澄化ステップにわたる改良を提供する。清澄化ステップは、１種または複数種の望ましくない実体の除去を一般に伴い、通常、所望の標的分子の捕捉を伴うステップの前に実施される。清澄化の別の鍵となる態様は、精製方法において後に除菌フィルターのファウリングをもたらし得る試料中の可溶性および不溶性成分の除去であり、これによって、精製方法全体をより経済的にする。さらに、清澄化効率を強化する方法、例えば沈殿を使用することができる。不純物の沈殿は、さまざまな手段、例えば、軟凝集、ｐＨ調整（酸沈殿）、温度シフト、刺激応答性ポリマーもしくは小分子による相変化またはこれらの方法の任意の組み合わせにより実施することができる。
【０１１１】
「クロマトグラフィー」という用語は、本明細書において使用する場合、対象となる分析物（例えば標的分子）を混合物中に存在する他の分子から分離する、あらゆる種類の技術を指す。普通、対象となる分析物は、混合物の個別の分子が、移動相の影響下で静止媒体の間を移動する速さの差の結果として、または結合および溶出方法において、他の分子から分離される。
【０１１２】
「クロマトグラフィー樹脂」または「クロマトグラフィー媒体」という用語は、本明細書において互換的に使用され、対象となる分析物（例えば標的分子）を混合物中に存在する他の分子から分離する、あらゆる種類の相（例えば固相）を指す。普通、対象となる分析物は、混合物の個別の分子が、移動相の影響下で静止固相の間を移動する速さの差の結果として、または結合および溶出方法において、他の分子から分離される。クロマトグラフィー媒体のさまざまなタイプの例は、例えば、陽イオン交換樹脂、アフィニティ樹脂、陰イオン交換樹脂、陰イオン交換膜、疎水性相互作用樹脂およびイオン交換モノリスを含む。
【０１１３】
「捕捉ステップ」という用語は、本明細書において使用する場合、標的分子を刺激応答性ポリマーまたはクロマトグラフィー樹脂に結合するために使用される方法を一般に指し、標的分子と、ポリマーまたは樹脂との沈殿を含有する固相をもたらす。通常、標的分子は、この後溶出ステップを使用して回収され、溶出ステップは、標的分子を固相から取り外し、これによって、１種または複数種の不純物から標的分子の分離をもたらす。さまざまな実施形態において、捕捉ステップは、樹脂、膜もしくはモノリスなどのクロマトグラフィー媒体、または刺激応答性ポリマー、ポリマー電解質もしくは標的分子と結合するポリマーなどのポリマーを使用して実施することができる。
【０１１４】
「塩」という用語は、本明細書において使用する場合、酸および塩基の相互作用により形成される化合物を指す。本明細書に記載の方法に用いられるさまざまなバッファーに使用することができるさまざまな塩は、限定するものではないが、アセテート（例えばナトリウムアセテート）、シトレート（例えば、ナトリウムシトレート）、クロライド（例えば、ナトリウムクロライド）、サルフェート（例えばナトリウムサルフェート）またはカリウム塩を含む。
【０１１５】
「溶媒」という用語は、本明細書において使用する場合、１種または複数種の他の物質を溶解または分散して、溶液を提供できる液体物質を一般に指す。溶媒は、水性溶媒および／または有機溶媒を含み、有用な有機溶媒は、非極性溶媒、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ヘキシレングリコール、プロピレングリコールおよび２，２−チオジグリコールを含む。
【０１１６】
本明細書において互換的に使用される「百万分率」または「ｐｐｍ」という用語は、本明細書に記載の刺激応答性ポリマーを使用して精製された所望の標的分子（例えば標的タンパク質または抗体）の純度の尺度を指す。従って、この尺度は、精製方法後に存在する標的分子の量を計測するため、または所望でない実体を計測するためのどちらにも使用することができる。幾つかの実施形態において、単位「ｐｐｍ」は、溶液中の不純物、例えばＨＣＰまたはＣＨＯＰナノグラム／ミリリットル／対象となるタンパク質ミリグラム／ミリリットルの量（即ち、ＣＨＯＰ  ｐｐｍ＝（ＣＨＯＰ  ｎｇ／ｍｌ）／（対象となるタンパク質ｍｇ／ｍｌ）を指すように、本明細書において使用される。タンパク質が（例えば凍結乾燥により）乾燥している場合、ｐｐｍは、（ＣＨＯＰのｎｇ）／（対象となるタンパク質のｍｇ））を指す。
【０１１７】
ポリペプチドの「ｐＩ」または「等電点」という用語は、本明細書において互換的に使用され、ポリペプチドの正電荷がこの負電荷と釣合うｐＨを指す。ｐＩは、ポリペプチドの結合炭水化物のアミノ酸残基またはシアル酸残基の実効電荷から計算することができ、または等電点分画法により決定することができる。
【０１１８】
「結合および溶出モード」および「結合および溶出方法」という用語は、本明細書において使用する場合、試料中に含有される少なくとも１種の標的分子（例えば、Ｆｃ領域含有タンパク質）が適切な樹脂または媒体（例えばアフィニティクロマトグラフィー媒体または陽イオン交換クロマトグラフィー媒体）と結合し、この後溶出される、分離技術を指す。
【０１１９】
本明細書において互換的に使用される「フロースルー方法」、「フロースルーモード」および「フロースルー操作」という用語は、生物医薬調製品に含有される少なくとも１種の標的分子（例えば、Ｆｃ領域含有タンパク質または抗体）が１種または複数種の不純物と一緒に、材料の中に流入し、通常は、１種または複数種の不純物が結合し、標的分子が通常は結合しない（即ちフロースルー）ことが意図される分離技術を指す。
【０１２０】
本明細書において互換的に使用される「方法ステップ」または「単位操作」という用語は、精製方法において特定の結果を得るための、１または複数の方法または装置の使用を指す。本明細書に記載の方法および系に用いることができる方法ステップまたは単位操作の例は、限定するものではないが、清澄化、結合および溶出クロマトグラフィー、ウイルス不活性化、フロースルー精製および製剤化を含む。個々の方法ステップまたは単位操作は、この方法ステップまたは単位操作の意図される結果を達成するための１以上のステップまたは方法または装置を用いることができると理解するべきである。例えば、幾つかの実施形態において、本明細書に記載の清澄化ステップおよび／またはフロースルー精製ステップは、この方法ステップまたは単位操作を達成するための１以上のステップまたは方法または装置を用いることができる。幾つかの実施形態において、方法ステップまたは単位操作を実施するために使用される１以上の装置は、単回使用装置であり、方法中の任意の他の装置を置き換えるかまたは方法工程を停止することなく、除去および／または置き換えることができる。
【０１２１】
本明細書において使用する場合、「細孔径」および「公称細孔径」という用語は、微粒子の大多数を、細孔径等級の６０から９８％で保有する細孔径を指す。
【０１２２】
本明細書において使用する場合、「処理能力」という用語は、フィルターを通してろ過される体積を意味する。
【０１２３】
本明細書において使用する場合、「系」という用語は、全精製方法の物理的形態を一般に指し、本明細書に記載の２以上の方法ステップまたは単位操作を含む。幾つかの実施形態において、該系は、無菌環境に封入されている。
【０１２４】
本発明において、開放段階層の使用は、より大型粒子の侵入を可能にし、表面に収集されるのではなく、フィルターの深層内に捕捉される（実施例２Ａおよび２Ｂを参照されたい。）。
【０１２５】
この有利性は、より高い処理能力および大型固形分（０．５ミクロンから約２００ミクロン）の保持と同時に、ケーキ形成の問題の排除である。一次清澄化フィルターにおける開放細孔の使用は、これらのデプスフィルターに固形分の保持による圧力の線形増加を提供し、圧力の著しい増加が無く、従って高い処理能力をもたらす。層の最適化（細孔径および厚み）と組み合わせたフィルターの構造寸法は、大量の固形分を保有することができる並外れたろ過特性をもたらす。
【０１２６】
本発明において、開放段階層の使用は、供給流中のより大きな軟凝集された粒子をフィルターの深層に侵入可能にし、表面に収集するのではなく、フィルターの細孔内に捕捉する（実施例９（ＡからＥ）および１１（ＡからＪ）を参照されたい。）。本明細書において提供する一次清澄化デプスフィルターは、「開放」最上層が、軟凝集された粒子を捕捉するためにデプスフィルターの前置フィルターゾーンを構成し、一方底層は、より小型の残存する凝結された軟凝集粒子を捕捉する研磨ゾーンを構成するように配置される。このタイプの配置を有する一次清澄化デプスフィルターの１つの有利性は、より高い処理能力およびより大型の軟凝集された固形分の保持であり、同時に、ケーキ形成の問題の排除でもある。本明細書において教示する一次清澄化フィルターにおけるこのような開放細孔の使用は、固形分の保持による圧力の線形増加を提供し、圧力の著しい増加が無く、従って、より高い、より望ましい処理能力をもたらす。
【０１２７】
本発明に従った一次清澄化デプスフィルターの例を、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、１Ｄ、１Ｅおよび１Ｆに示す。
【０１２８】
図１Ｃは、少なくとも７層を有する一次清澄化デプスフィルターを表し、これは、細胞培養供給材料がポリマー凝集剤（例えば、スマートポリマーまたは伝統的な凝集剤）を用いて処理された場合に使用される。
【０１２９】
図１Ａおよび１Ｅは、少なくとも８層を有する一次清澄化デプスフィルターを表し、これらはそれぞれ、細胞培養供給材料がポリマー凝集剤（例えば、スマートポリマーまたは伝統的な凝集剤）を用いて処理された場合に使用される。
【０１３０】
図１Ｂ、１Ｄおよび１Ｆは、少なくとも８層を有する一次清澄化デプスフィルターを表し、これらはそれぞれ、細胞培養供給材料が化学的処理（例えば酸処理）された場合に使用される。
【０１３１】
図１Ａに表した一次清澄化デプスフィルターは、細胞培養供給材料がポリマー凝集剤（例えばスマートポリマー）により処理された場合に使用され、公称細孔径が約１００ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンの２つの（上）層を有し、公称細孔径が約５０ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンのさらに２つの層を有し、公称細孔径が約２５ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンの２つのさらなる層を有し、この後に、約０．３５ｃｍの厚みの材料、例えばセルロース（ＣＥ２５）の単層および例えば、約０．３５ｃｍの厚みの材料、例えば珪藻土（ＤＥ４０）の単層を有する一次清澄化デプスフィルターを示す。
【０１３２】
図１Ｂに表した一次清澄化デプスフィルターは、細胞培養供給材料が化学的処理（例えば酸処理）された場合に使用され、公称細孔径が約２５ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンの２つの（上）層を有し、公称細孔径が約１０ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンのさらに２つの層を有し、公称細孔径が約５ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンの２つのさらなる層を有し、この後に、約０．３５ｃｍの厚みの材料、例えばセルロース（ＣＥ２５）などの単層を有し、この後に約０．３５ｃｍの厚みの材料、例えば珪藻土（ＤＥ４０）などの別の単層を有する、一次清澄化デプスフィルターを示す。セルロースまたは珪藻土の層のいずれが最下（底）層として選択されてもよい。
【０１３３】
図１Ｃに表した一次清澄化デプスフィルターは、細胞培養供給材料がポリマー凝集剤（例えばスマートポリマー）により処理された場合に使用され、公称細孔径が約１００ミクロンで、不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンを含む２つの（上）層を有し、公称細孔径が約１００ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンのさらに２つの層を有し、公称細孔径が約１００ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンを含む、２つのさらなる層を有し、この後に約８ミクロンの厚みの不織布、例えば約０．２ｃｍの厚みのポリプロピレンの単層（底層）を有する、一次清澄化デプスフィルターを示す。
【０１３４】
図１Ｄに表した一次清澄化デプスフィルターは、細胞培養供給材料が化学的処理（例えば酸処理）された場合に使用され、公称細孔径が約５０ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンを含む２つの（上）層を有し、公称細孔径が約２５ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンの２つのさらなる層を有し、公称細孔径が約１０ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンのさらに２つの層を有し、この後に、約０．３５ｃｍの厚みの材料、例えばセルロース（ＣＥ２５）などの単層を有し、この後に約０．３５ｃｍの厚みの材料、例えば珪藻土（ＤＥ４０）などの別の単層を有する、一次清澄化デプスフィルターを示す。セルロースまたは珪藻土の層のいずれが最下（底）層として選択されてもよい。
【０１３５】
図１Ｅに表した一次清澄化デプスフィルターは、細胞培養供給材料がポリマー凝集剤（例えばスマートポリマー）により処理された場合に使用され、一次清澄化デプスフィルター公称細孔径が約１００ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンを含む２つの（上）層を有し、公称細孔径が約５０ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンのさらに２つの層を有し、公称細孔径が約２５ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンを含む２つのさらなる層を有し、この後に、約０．３５ｃｍの厚みの材料、例えばセルロース（ＣＥ２５）などの単層を有し、この後に約０．３５ｃｍの厚みの材料、例えば珪藻土（ＤＥ４０）などの別の単層を有する、一次清澄化デプスフィルターを示す。
【０１３６】
図１Ｆに表した一次清澄化デプスフィルターは、細胞培養供給材料が化学的処理（例えば酸処理）された場合に使用され、公称細孔径が約３５ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンを含む２つの（上）層を有し、公称細孔径が約１５ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンのさらに２つの層を有し、公称細孔径が約１０ミクロンの不織布、例えば０．４ｃｍの厚みのポリプロピレンを含む２つのさらなる層を有し、この後に、約０．３５ｃｍの厚みの材料、例えばセルロース（ＣＥ２５）などの単層を有し、この後に約０．３５ｃｍの厚みの材料、例えば珪藻土（ＤＥ４０）などの別の単層を有する、一次清澄化デプスフィルターを示す。セルロースまたは珪藻土の層のいずれが最下（底）層として選択されてもよい。
【０１３７】
一次清澄化デプスフィルターの細孔径および／または層の厚みの最適化と組み合わせた、本明細書において提供する一次清澄化デプスフィルターの構造寸法は、大量の固形分を保有する、非常に有利なろ過特性をもたらす。このようなデプスフィルターは、さまざまな機序の組み合わせを介して媒体の深層を通るろ過を達成し、供給材料のカラム体積（Ｖｆ）対媒体のカラム体積（Ｖｍ）が、さまざまなフィルターの有効性を示す。
【０１３８】
加えて、さまざまな供給材料は、異なる量の固形分を有し、非常に変動しやすい性能のデプスフィルターをもたらし、従って、（Ｖｆ）対（Ｖｍ）値は、フィルターの実際の「効率」のより優れた評価をもたらす。
【０１３９】
別の重要なパラメーターＫは、フィルター効率を表すと同時に、供給原料の固形分を正規化するために使用される。パラメーターＫは、異なる固形分を含む供給材料のろ過を、有効に比較することができる。
【０１４０】
パラメーターＫは、方程式１に示すように、実際は３つの測定可能なパラメーター、体積処理能力（ＴＰ）、収集効率（η）および固形分の初期濃度（Ｃｉ）の関数である。
【０１４１】
Ｋ＝［ＴＰ］×［η］×［Ｃｉ］×１００
【０１４２】
（１）
【０１４３】
方程式２に示すように、体積処理能力（ＴＰ）は、ろ過された供給材料体積（Ｖｆ）を媒体体積（Ｖｍ）で割ることにより得られ、収集効率（η）は、捕捉された固形分の体積（Ｖｓｃ）を供給材料中の固形分体積（Ｖｓ）で割ることによって得られ、固形分の初期濃度（Ｃｉ）は、供給材料中の固形分体積（Ｖｓ）をろ過された供給材料の体積（Ｖｆ）で割ることによって得られる。
【０１４４】
【数１】
2014523247.tif 000003
【０１４５】
（２）
【０１４６】
下記の実施例は、特定の供給原料に使用した場合、粒子デプスフィルターの効率の決定および比較における方程式（１）および（２）およびパラメーターＫの有用性を明示するものである。
【０１４７】
下記の実施例は、当業者に、本発明の組成物の作製方法および本発明の方法の実践方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように提供するものであり、本発明者が自身の発明であるとみなす範囲を限定する意図のものではない。使用した数字（例えば、量、温度など）に関する正確さを確実にする努力はなされているが、いくらかの実験誤差および偏差は考慮するべきである。特に明示しない限り、温度は摂氏温度であり、化学反応は、大気圧または膜間圧において実施し、示したように「周囲温度」という用語はおよそ２５℃を指し、「周囲圧力」は大気圧を指す。
【０１４８】
［比較実施例］
沈降は、沈降時間の長さ（時）のため多くの場合失敗する。大量の未固結細胞フロック集団が配置されることにより、ｍＡｂの有効分画が細胞集団中に捕捉されるので、ｍＡｂの低収率が引き起こされる。（実施例５を参照されたい。）
ケーキろ過は、細胞集団が圧力下で破壊されるので失敗する。言い換えれば、細胞残屑がストレス下でポリマーから分裂し、高濁度としてろ液に流入する（実施例６を参照されたい。）。
【０１４９】
深層ろ過は、フロック、特にポリマー系由来のフロックが非常に大型で、ほぼ１００ミクロン程度であるため失敗する。深層ろ過に必要な媒体への侵入に代わって、大型のフロックがデプスフィルター媒体の表面最上部に間もなく積み重なり、デプスフィルター媒体を非効率的なケーキフィルターに陥らせる。（実施例７を参照されたい。）
動的ろ過、例えばタンジェンシャルろ過または振動フィルター媒体が試みられたが、ケーキ形成を低減するために必要なせん断応力が、フロックを個別の粒子に再度崩してしまい、凝集の利益を無効にするのであまり成功してこなかった。（実施例８を参照されたい。）
本発明を、下記の実施例によりさらに明らかにするが、これらは本発明の例示意図するものである。
【実施例】
【０１５０】
［実施例１］
非清澄化、非発現細胞培養液（ＣＣＦ）の調製
代表的実験において、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）発現細胞系由来の細胞を、１０Ｌのバイオリアクター（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）において１０×１０６細胞／ｍＬの密度まで増殖させ、８０％生存において回収した。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）力価が０．８ｇ／Ｌであることを決定した。宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルが２００，０００ｎｇ／ｍＬであることを、ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ，＃３Ｇ  ＥＬＩＳＡ）を使用して見出した。非清澄化細胞培養物のｐＨは、ｐＨ６．９であった。
【０１５１】
［実施例２］
多価イオン刺激応答性ポリマーの調製
１０ｇのポリアリルアミン（ＰＡＡ）（Ｎｉｔｔｏｂｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ  １５０ｋＤ；４０％ｗｔ／ｗｔ）を１００ｍＬの丸底フラスコに入れ、２５ｍＬのＨ２Ｏ中３．３４ｇの水酸化ナトリウム（１．２Ｅｑ．／単量体）の溶液を、室温において、撹拌しながら少量ずつ加える。ベンジルクロライド（２．３０ｇ、２．０９ｍＬ）をこの後加え、数分間、室温において撹拌し、この後６０℃に一晩、１７時間加熱した。この後、反応物を室温に冷却し、溶媒を除去し、ポリマーの沈殿を得る。沈殿したポリマーを水で洗浄し、１ＭのＡｃＯＨ水溶液（４０ｍｌ）中で完全な可溶化に達するまで撹拌する。該溶液をこの後、Ｈ２Ｏで、最終体積４００ｍｌ（１％ポリマー溶液）に希釈し、リン酸二水素カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）（３．４８ｇ）を撹拌しながら加え、ｐＨをＨ６．８に調整し、変性されたポリマーを沈殿させる。ポリマーをフリットガラスの漏斗を通してろ過により収集し、最終的に真空オーブンにおいて一晩、５０℃から６０℃で脱水させる。この後、該ポリマーを１Ｍの酢酸に再溶解し、１０％ｗｔのポリマー濃縮溶液を生成した。
【０１５２】
［実施例３］
ＣＨＯ−Ｓ供給材料のスマートポリマー（ＳｍＰ）処理
細胞培養物をＳｍＰで軟凝集させるために、実施例１による細胞培養ブロスの５００ｍｌの試料を、１０００ｍｌの媒体のボトルに加えた。撹拌しながら、実施例２によるポリマー濃縮液の試料を、所望のポリマー添加量（ｗｔ％）、通常０．２％で加えた。該溶液を１５分間混合した。
【０１５３】
［実施例４］
ＣＨＯ−Ｓ供給材料の酸処理
酸を添加してｐＨを低下させることにより、細胞培養物を軟凝集させるために、実施例１による細胞培養ブロスの５００ｍｌの試料を、１０００ｍｌの媒体ボトルに加えた。撹拌しながら、濃縮酢酸を、所望のｐＨに達するまで滴下した。標的ｐＨは、特に明記しない限りｐＨ４．８から５．０であった。該溶液を１５分間混合した。
【０１５４】
［実施例５］
スマートポリマー（ＳｍＰ）処理ＣＨＯ−Ｓ供給材料の沈降研究
沈降実験を異なる沈降時間で実施し、密度差を使用するＳｍＰ処理供給材料の固体液体分離の有効性を決定した。５００ｍｌの細胞培養ブロスを、実施例３に従って調製した。
【０１５５】
ＳｍＰ処理供給材料を、約０．５から６時間沈降させ、試料上清を取り、濁度および固形分体積を測定した。濁度はＨＡＣＨ  Ｍｏｄｅｌ  ＃２１００Ｐ濁度計（ｔｕｒｂｉｄｉｔｉｍｅｔｅｒ）を使用して測定した。表１は、０．５から６時間の間で変動する時間に関する、ＳｍＰ処理ＣＨＯ−Ｓ供給材料の沈降研究を示す。
【０１５６】
平衡濁度が＜約２０ＮＴＵに達するまでの、ＳｍＰ処理ＣＨＯ−Ｓ供給材料の沈降時間は＞約１８０分であり、平衡濁度が＜約２０ＮＴＵに達するまでの、ＳｍＰ処理ＣＨＯ−ＤＨ４４供給材料の沈降時間は約１２０分であったことが観察された。
【０１５７】
最も少量のポリマー添加量（０．０５％）を使用した場合、不完全な軟凝集により、ＳｍＰ処理ＣＨＯ−Ｓ供給材料に関しては、１２時間の沈降時間の後でさえ、濁度の増加（＞約３５０ＮＴＵ）につながった。加えて、３時間の沈降時間では、ＳｍＰ処理ＣＨＯ−Ｓ供給材料は大量の未固結細胞集団（約３０％から４０％）を有し、ＳｍＰ処理ＣＨＯ−ＤＨ４４供給材料は２０％を有し、相当量のｍＡｂが未固結集団に捕捉されるので、このことから、明らかに低いｍＡｂ収率（約６０％から８０％）がもたらされると思われる。
【０１５８】
【表１】
2014523247.tif 000004
【０１５９】
［実施例６］
スマートポリマー（ＳｍＰ）処理されたＤＧ４４およびＣＨＯ−Ｓ供給材料に関するケーキろ過
珪藻土（Ｄｉａｍａｔｏｃｅｏｕｓ  ｅａｒｔｈ）（ＤＥ）媒体を使用して、ケーキろ過の有効性を決定した。第１に、ＤＥを、Ｂｕｃｈｎｅｒ漏斗中に少なくとも約４ｃｍの深さに詰め、この後本発明者らは、実施例３によるＳｍＰ処理供給材料を、吸引を用いて通過させた。珪藻土媒体を通るろ過の間、ＣＨＯ−Ｓ細胞は、２０μｍの篩上にフィルターケーキのフィルムを形成した。フィルターケーキがろ液の流出を妨げ、処理能力＜約１０Ｌ／ｍ２をもたらしたことが観察された。加えて、ストレス下でポリマーから分裂した細胞集団が、高濁度のろ液（約２００ＮＴＵから３００ＮＴＵ）をもたらし、これが、二次ろ過操作に有意な影響を与え得ることが観察された。
【０１６０】
［実施例７］
市販の一次清澄化フィルター（Ｄ０ＨＣおよびＦ０ＨＣ）を使用した、スマートポリマー（ＳｍＰ）処理ＣＨＯ−Ｓ供給材料の深層ろ過
実施例３によるスマートポリマー（ＳｍＰ）処理ＣＨＯ−Ｓ供給材料および実施例４による酸処理供給材料を用いてろ過実験を実施し、市販のＭｉｌｌｉＳｔａｋ（登録商標）Ｄ０ＨＣデプスフィルターの処理能力を決定した。Ｄ０ＨＣフィルターを、ユーザー取扱い説明書に従って、水で洗い流した。供給材料をデプスフィルターに、ぜん動ポンプを流量約１００Ｌ／ｍ２／時で使用して、添加した。しかし、デプスフィルターは、高固形分供給流を処理できなかった。凝結細胞がより大型であり、深層ろ過に必要な媒体への侵入に代わって、大型の微粒子がデプスフィルター媒体の表面最上部に蓄積され、デプスフィルター媒体を非効率的なケーキフィルターに陥らせるので、深層ろ過は最初に失敗したと考えられる。Ｄ０ＨＣは、ＳｍＰ処理供給材料に対して約２０Ｌ／ｍ２の処理能力を有し、Ｆ０ＨＣは、酸処理供給材料に対して約５Ｌ／ｍ２の処理能力を有した。より大型のフロック粒子によるフィルターケーキ形成は、フィルターの気密度に大いに起因するものであり、これがフィルターの処理能力を有意に低下させた。
【０１６１】
［実施例８］
スマートポリマー（ＳｍＰ）処理供給材料の動的ろ過
タンジェンシャルフローＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３（０．１１ｍ２）ろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）を使用した動的ろ過実験を実施し、ＳｍＰ処理供給材料の固体液体分離の有効性を決定した。該ろ過装置は、ポリビニルジフロライド（ＰＶＤＦ）膜で構成された精密ろ過膜（０．４５μｍ）を含有した。ＳｍＰ処理細胞培養回収物を、５０Ｌ／ｍ２／時で、ＴＭＰが１５ｐｓｉになるまで添加した。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３装置の瞬間的な目詰まりが観察され、処理能力＜５Ｌ／ｍ２をもたらした。急速な目詰まりならびに系および装置のホールドアップ体積により、材料の喪失が起こったため、観察された収率は非常に低かった。
【０１６２】
［実施例９Ａ］
凝結された大型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター。
【０１６３】
深層ろ過装置１０を、すべての層の合計の厚みが１．６ｃｍである、７層の不織繊維（ポリプロピレン）を使用して組み立てた。該層は、最も大きい開放公称細孔径２００Ｍｍ（２層）、この後に公称５０μｍ（２層）、公称４０μｍ（２層）から単層の公称８μｍの層へと続く深層ろ過装置に配列されている（図１を参照されたい。）。
【０１６４】
７層の（ニードルフェルト）不織繊維（Ｒｏｓｅｄａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）の個々の特性を表３に示す（２層×２００μｍ、２層×５０μｍ、２層×４０μｍおよび１層×８μｍ）。積層の組立て後、ポリプロピレンのホースバーブのエンドキャップを天地に取り付け、組立て部品全体を、単一の、一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に、オーバーモールドした。該深層ろ過装置を透水性に関して試験し、０．４５Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１６５】
【表２】
2014523247.tif 000005
【０１６６】
［実施例９Ｂ］
凝結された大型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター
実施例９Ｂの段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、１．６ｃｍの深層を有し、約０．５μｍから約２００μｍの範囲の粒子を含む、酸により軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルターは、７層の、Ｒｏｓｅｄａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ製不織繊維（２層×２００μｍ、２層×１００μｍ、２層×５０μｍおよび１層の８μｍ）からなる。積層の組立て後、ポリプロピレンのホースバーブのエンドキャップを天地に取り付け、組立て部品全体を、単一の、一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に、オーバーモールドした。該装置を透水性に関して試験し、０．５５Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１６７】
［実施例９Ｃ］
凝結された大型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター
実施例９Ｃの段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、１．６ｃｍの深層を有し、約０．５μｍから約２００μｍの範囲の粒子を含む、酸により軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルターは、７層の、Ｒｏｓｅｄａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ製不織繊維（３層×２００μｍ、３層×１００μｍ、および１層の８μｍ）からなる。本明細書において提供される段階的デプスフィルターは、２３ｃｍ２の一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に組み立てられ、透水性に関して試験し、０．５５Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１６８】
［実施例９Ｄ］
凝結された大型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター
実施例９Ｄの段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、１．６ｃｍの深層を有し、約０．５μｍから約１００μｍの範囲の粒子を含む、酸により軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルターは、７層の、Ｒｏｓｅｄａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ製不織繊維（２層×１００μｍ、２層×５０μｍ、２層×４０μｍおよび１層の８μｍ）からなる。積層の組立て後、ポリプロピレンのホースバーブのエンドキャップを天地に取り付け、組立て部品全体を、単一の、一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に、オーバーモールドした。該装置を透水性に関して試験し、０．５Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１６９】
［実施例９Ｅ］
凝結された大型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター
実施例９Ｅの段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、１．６ｃｍの深層を有し、約０．５μｍから約２００μｍの範囲の粒子を含む、ポリマーにより軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルターは、７層の、Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ製不織繊維（２層×ＵｎｉＰｒｏ（登録商標）７６０ＰＰ、２層×１００μｍ、２層×５０μｍおよび１層×ＵｎｉＰｒｏ（登録商標）５３０ＭＭ）からなる。該段階的デプスフィルター供給材料は、７層の、Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ製不織繊維（２層×ＵｎｉＰｒｏ（登録商標）７６０ＰＰ、２層×１００μｍ、２層×５０μｍおよび１層×ＵｎｉＰｒｏ（登録商標）５３０ＭＭ）からなる。本明細書において提供される段階的デプスフィルターは、２３ｃｍ２の一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に組み立てられ、透水性に関して試験し、０．６５Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１７０】
［実施例１０］
凝結された大型生体分子微粒子の除去用デプスフィルターのろ過性能
実施例９Ａから９Ｅのフィルター装置を、ろ過性能に関して下記の方法を使用して試験した。該デプスフィルターをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で洗い流した後、各フィルターを越えるＴＭＰを圧力トランスデューサ―によりモニターしながら、未処理およびＳｍＰ処理の非清澄化供給材料を流した。非清澄化細胞培養回収物を、０．２ｗｔ％のスマートポリマー（ＳｍＰ）添加量（ｗｔ％）で処理し、１５分間撹拌した。該デプスフィルターをまず、≧約５０ＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で、フィルター面積１平方メートル当たり６００Ｌ／ｍ２／時で洗い流しフィルター媒体を湿らせ、抽出可能物を流し出した。未処理およびＳｍＰ処理の非清澄化回収物を、１００Ｌ／ｍ２／時で、どのフィルターを越えるＴＭＰも２０ｐｓｉｇに達するまで添加した。
【０１７１】
表４は、２種のＭｉｌｌｉｓｔａｋ（登録商標）フィルター（Ｘ０ＨＣおよびＤ０ＨＣ）と、一次清澄化デプスフィルターとのフィルター処理能力を、実施例３に記載の供給材料（０．２％（ｗ／ｖ）スマートポリマー（ＳｍＰ）処理供給材料）のろ過に関して比較している。Ｘ０ＨＣおよびＤ０ＨＣは、１０Ｌ／ｍ２および４４Ｌ／ｍ２の処理能力を示し、一方、一次清澄化デプスフィルターの処理能力は３２５Ｌ／ｍ２であった。すべての事例のろ液濁度は、表４に示すように＜約５ＮＴＵであった。ろ液のカラム体積対媒体のカラム体積に関して、Ｘ０ＨＣおよびＤ０ＨＣは、１．５Ｖｆ／Ｖｍおよび６Ｖｆ／Ｖｍの処理能力を示し、一方、一次清澄化デプスフィルターの処理能力は１６．５ＣＶｆ／ＣＶｍであった。実施例９Ａは最もよく機能し、体積処理能力が１６．５Ｖｆ／Ｖｍ（３２５Ｌ／ｍ２）およびＫ効率が８４％であった。この比較から、本特許請求の範囲に記載の層で構成された実施例９Ａのフィルターが、非清澄化細胞回収物の清澄化において大量の固形分を除去可能であることが明白である。
【０１７２】
【表３】
2014523247.tif 000006
【０１７３】
本発明は、線形差圧成長に関して有意な有利性を有する。Ｘ０ＨＣおよびＤ０ＨＣの場合、流体圧力は、開始時において小さく一定であるが、突然指数関数的に増加し、この結果この限界に達する。観察された圧力応答と調和する１つの考えられる説明は、フィルター表面におけるケーキ層の急速な形成である。一次清澄化デプスフィルターの場合、圧力は線形に近い形で増加し、圧力の有意な突然の増加は無い。この結果は、微粒子がフィルターの深層中に捕捉され、ケーキ形成を回避したことと一致する。フィルターの体積処理能力の大きな増加もまた観察され、これもまた、市販のＸ０ＨＣおよびＤ０ＨＣフィルターにおいて観察されたケーキろ過ではなく深層ろ過に一致する。
【０１７４】
表５は、実施例９Ｂから９Ｅに記載の一次清澄化デプスフィルターのフィルター処理能力を、供給材料のカラム体積対媒体のカラム体積に関して比較している。
【０１７５】
実施例９Ｂに記載の段階的デプスフィルターは、体積処理能力３２Ｖｆ／Ｖｍ（６４０Ｌ／ｍ２）およびＫ効率９０％を、ＳｍＰ処理ＣＨＯ−ＤＧ４４供給材料に関して示し、体積処理能力２２Ｖｆ／Ｖｍ（４３０Ｌ／ｍ２）およびＫ効率９０％を、ＳｍＰ処理ＣＨＯ−Ｓ供給材料に関して示した。
【０１７６】
別の実施例９Ｃにおいて、段階的デプスフィルターは、体積処理能力３３Ｖｆ／Ｖｍ（６６０Ｌ／ｍ２）およびＫｍａｎ効率９４％を、ＳｍＰ処理ＣＨＯ−ＤＧ４４供給材料に関して示し、体積処理能力２２Ｖｆ／Ｖｍ（４３５Ｌ／ｍ２）およびＫ効率９０％をＳｍＰ処理ＣＨＯ−Ｓ供給材料に関して示した。
【０１７７】
実施例９Ｄに記載の段階的デプスフィルターは、体積処理能力２９Ｖｆ／Ｖｍ（５８０Ｌ／ｍ２）およびＫ効率８１％をＳｍＰ処理ＣＨＯ−ＤＧ４４供給材料に関して示し、体積処理能力２０Ｖｆ／Ｖｍ（３９０Ｌ／ｍ２）およびＫ効率８１％をＳｍＰ処理ＣＨＯ−Ｓ供給材料に関して示した。
【０１７８】
さらに別の実施例９Ｅにおいて、本特許請求の範囲に記載の段階的デプスフィルターは、体積処理能力３３Ｖｆ／Ｖｍ（６５０Ｌ／ｍ２）およびＫ効率９２％をＳｍＰ処理ＣＨＯ−Ｓ供給材料に関して示した。
【０１７９】
この比較から、本特許請求の範囲に記載の層で構成された実施例９Ａから９Ｅのフィルターが、非清澄化細胞回収物の清澄化において大量の固形分を除去可能であることが明白である。
【０１８０】
【表４】
2014523247.tif 000007
【０１８１】
［実施例１１Ａ］
凝結された小型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター
化学的に処理された供給材料（例えば酸処理）は、平均粒径を＜約５μｍから、＞約２０μｍに増大する能力を有する。加えて、酸処理された供給材料は、広範囲の粒径分布を示す。この広範囲の粒子を分離する必要性に応えて、開放段階的不織布層および緊密層（ｔｉｇｈｔｅｒ）（ＣＥおよびＤＥ）の組み合わせは有効な深層ろ過を提供する。深層ろ過装置は、すべての層の合計の厚みが２．０ｃｍである、８層の不織繊維（ポリプロピレン）を使用して組み立てた。これらの層は、図１のろ過装置５０中に配列され、開放公称細孔径２００μｍ（２層）、この後に公称５０μｍ（２層）、公称４０μｍ（２層）、この後にセルロース（ＣＥ２５）の層および珪藻土（ＤＥ４０）の層を続けて有する。６層の（ニードルパンチ）不織繊維（Ｒｏｓｅｄａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｌ）の個々の特性を表３に示す（２層×２００μｍ、２層×５０μｍ、２層×４０μｍ）。積層の組立て後、ポリプロピレンのホースバーブのエンドキャップを天地に取り付け、組立て部品全体を、単一の、一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に、オーバーモールドした。該装置を透水性に関して試験し、０．４０Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１８２】
［実施例１１Ｂ］
凝結された小型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター
実施例１１Ｂの段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、２ｃｍの深層を有し、約０．５μｍから約１００μｍの範囲の粒子を含む、酸により軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルターは、６層の、Ｒｏｓｅｄａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ製不織繊維（２層×３０μｍ、２層×２５μｍ、２層×２０μｍ）、この後のセルロース（ＣＥ２５）の層および珪藻土（ＤＥ４０）の層からなる。積層の組立て後、ポリプロピレンのホースバーブのエンドキャップを天地に取り付け、組立て部品全体を、単一の、一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に、オーバーモールドした。該装置を透水性に関して試験し、０．１５Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１８３】
［実施例１１Ｃ］
凝結された小型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター
実施例１１Ｂの段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、２ｃｍの深層を有し、約０．５μｍから約１００μｍの範囲の粒子を含む、酸により軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルター供給材料は、６層の、Ｒｏｓｅｄａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ製不織繊維（２層×２５μｍ、２層×２０μｍ、２層×１０μｍ）、この後のセルロース（ＣＥ２５）の層および珪藻土（ＤＥ４０）の層を含む。積層の組立て後、ポリプロピレンのホースバーブのエンドキャップを天地に取り付け、組立て部品全体を、単一の、一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に、オーバーモールドした。該装置を透水性に関して試験し、０．１５Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１８４】
［実施例１１Ｄ］
凝結された小型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター
実施例１１Ｄの段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、１．６ｃｍの深層を有し、約０．５μｍから約１００μｍの範囲の粒子を含む、酸により軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルター供給材料は、４層の、Ｒｏｓｅｄａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ製不織繊維（２×２０μｍ、２×１０μｍ）およびセルロース（ＣＥ２５）／珪藻土（ＤＥ６０）を含む。積層の組立て後、ポリプロピレンのホースバーブのエンドキャップを天地に取り付け、組立て部品全体を、単一の、一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に、オーバーモールドした。該装置を透水性に関して試験し、０．３Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１８５】
［実施例１１Ｅ］
凝結された小型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター
実施例１１Ｅの段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、２ｃｍの深層を有し、約０．５μｍから約１００μｍの範囲の粒子を含む、酸により軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルターは、６層の、Ｒｏｓｅｄａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ製不織繊維（２層×２５μｍ、２層×２０μｍ、２層×１０μｍ）、この後のセルロース（ＣＥ２５）の層および珪藻土（ＤＥ４０）の層からなる。積層の組立て後、ポリプロピレンのホースバーブのエンドキャップを天地に取り付け、組立て部品全体を、単一の、一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に、オーバーモールドした。該装置を透水性に関して試験し、０．２Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１８６】
［実施例１１Ｆ］
凝結された小型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター
実施例１１Ｆの段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、１．６ｃｍの深層を有し、約０．５μｍから約１００μｍの範囲の粒子を含む、酸により軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルターは、４層の、Ｒｏｓｅｄａｌｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ製不織繊維（２層×２０μｍ、２層×１０μｍ）、この後のセルロース（ＣＥ２５）の層および珪藻土（ＤＥ４０）の層からなる。積層の組立て後、ポリプロピレンのホースバーブのエンドキャップを天地に取り付け、組立て部品全体を、単一の、一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に、オーバーモールドした。該装置を透水性に関して試験し、０．３Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１８７】
［実施例１１Ｇ］
凝結された小型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター
実施例１１Ｇの段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、１．６ｃｍの深層を有し、約０．５μｍから約１００μｍの範囲の粒子を含む、酸により軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルターは、６層の、Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ製不織繊維（２層×５０μｍ、２層×２５μｍ、２層×１０μｍ）、この後のセルロース（ＣＥ２５）の層および珪藻土（ＤＥ４０）の層からなる。積層の組立て後、ポリプロピレンのホースバーブのエンドキャップを天地に取り付け、組立て部品全体を、単一の、一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に、オーバーモールドした。該装置を透水性に関して試験し、０．３５Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１８８】
［実施例１１Ｈ］
凝結された小型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター
実施例１１Ｈの段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、２ｃｍの深層を有し、約０．５μｍから約１００μｍの範囲の粒子を含む、酸により軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルターは、６層の、Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ製不織繊維（２層×２５μｍ、２層×１０μｍ、２層×５μｍ）、この後のセルロース（ＣＥ２５）の層および珪藻土（ＤＥ４０）の層からなる。積層の組立て後、ポリプロピレンのホースバーブのエンドキャップを天地に取り付け、組立て部品全体を、単一の、一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に、オーバーモールドした。該装置を透水性に関して試験し、０．４Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１８９】
［実施例１１Ｉ］
凝結された小型生体分子微粒子の除去用デプスフィルター  実施例１１Ｉの段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、２ｃｍの深層を有し、約０．５μｍから約１００μｍの範囲の粒子を含む、酸により軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルターは、６層の、Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ製不織繊維（２層×１０μｍ、２層×５μｍ、２層×１μｍ）、この後のセルロース（ＣＥ２５）の層および珪藻土（ＤＥ４０）の層からなる。積層の組立て後、ポリプロピレンのホースバーブのエンドキャップを天地に取り付け、組立て部品全体を、単一の、一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に、オーバーモールドした。該装置を透水性に関して試験し、０．４Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。
【０１９０】
［実施例１２］
凝結された小型生体分子微粒子の除去用デプスフィルターのろ過性能
実施例１１Ａから１１Ｉのフィルター装置を、ろ過性能に関して下記の方法を使用して試験した。非清澄化細胞培養回収物を１Ｍの氷酢酸で処理し、ｐＨを４．８に調整し、３０分間撹拌した。デプスフィルターをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で洗い流した後、各フィルターを越えるＴＭＰを圧力トランスデューサ―によりモニターしながら、未処理および酸処理の非清澄化供給材料を流した。該デプスフィルターを、まず≧約５０ＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水で、フィルター面積１平方メートル当たり６００Ｌ／ｍ２／時で洗い流してフィルター媒体を湿らせ、抽出可能物を流し出した。未処理および酸処理の非清澄化回収物を、１００Ｌ／ｍ２／時で、どのフィルターを越えるＴＭＰも２０ｐｓｉｇに達するまで添加した。
【０１９１】
表６は、２種のＭｉｌｌｉｓｔａｋ（登録商標）フィルター（Ｘ０ＨＣおよびＤ０ＨＣ）のフィルター処理能力を、酸処理供給材料用一次清澄化デプスフィルターと比較している。Ｘ０ＨＣおよびＤ０ＨＣは、５Ｌ／ｍ２および２０Ｌ／ｍ２の処理能力を示し、一方、一次清澄化デプスフィルターの処理能力は２１０Ｌ／ｍ２であった。
【０１９２】
【表５】
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【０１９３】
表２は、２種のＭｉｌｌｉｓｔａｋ（登録商標）フィルター（Ｘ０ＨＣおよびＤ０ＨＣ）と、酸沈殿一次清澄化デプスフィルターとのフィルター処理能力を、酸処理供給材料に関して、ろ液のカラム体積対媒体のカラム体積で比較している。Ｘ０ＨＣおよびＤ０ＨＣは、１．５Ｖｆ／Ｖｍ（Ｋ＝６）および４Ｖｆ／Ｖｍ（Ｋ＝１６）の処理能力を示し、一方、一次清澄化デプスフィルターの処理能力は９Ｖｆ／ＣＶｍ（Ｋ＝３６）であった。この比較から、本特許請求の範囲に記載の層で構成された実施例９Ａのフィルターが、非清澄化細胞回収物の清澄化において大量の固形分を除去可能であることが明白である。
【０１９４】
【表６】
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【０１９５】
表７は、実施例１１Ｂ−１１Ｉに記載の一次清澄化デプスフィルターのフィルター処理能力を、供給材料のカラム体積対媒体のカラム面積に関して比較している。この比較から、実施例１１Ａ−１１Ｉにおいて、本明細書において提供された層で構成されたフィルターが、非清澄化細胞回収物の清澄化において大量の固形分を除去可能であることが明白である。
【０１９６】
【表７】
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【０１９７】
［実施例１３］
０．１μｍから２００μｍの範囲の、凝結された小型コロイド状微粒子の除去用デプスフィルター
実施例１３の段階的デプスフィルターは、段階的不織繊維からなり、２ｃｍの深層を有し、約０．１μｍから約２００μｍの範囲の粒子を含む、酸により軟凝集された供給流をろ過可能である。該段階的デプスフィルターは、６層の、Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ製不織繊維（２層×２５μｍ、２層×１０μｍ、２層×５μｍ）、この後の市販のセルロース（ＣＥ２５）／珪藻土（ＤＥ４０）およびＩＭ７５からなる。本明細書において提供する段階的デプスフィルターは、２３ｃｍ２の一体型Ｍｉｎｉ  Ｃａｐろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ  ＵＳＡから入手可能）に組み立てられ、透水性に関して試験し、０．２５Ｌ／分の値を４ｐｓｉにおいて得た。次に、酸沈殿された非清澄回収物を、１００Ｌ／ｍ２／時で、どのフィルターを越えるＴＭＰも２０ｐｓｉｇに達するまで添加した。ろ過性能を、６層の、Ｍｉｄｗｅｓｔ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，Ｏｈｉｏ製不織繊維（２層×２５μｍ、２層×１０μｍ、２層×５μｍ）、この後のセルロース（ＣＥ２５）の層および珪藻土（ＤＥ４０）の層からなる、対照の段階的フィルターに対して比較した。本実施例に記載のフィルターは、処理能力１１Ｖｆ／Ｖｍ（Ｋ＝６６）を示し、一方、対照の段階的デプスフィルターは１２Ｖｆ／ＣＶｍ（Ｋ＝７２）であった。しかし、本実施例に記載の段階的デプスフィルターは、対照の段階的フィルターの４ＮＴＵと比較して１ＮＴＵの濁度を示した。この比較から、本明細書において提供する層で構成された実施例１３のフィルターが、清澄化において、細胞および細胞残屑に加えて小型コロイド状微粒子を除去可能であることが明白であり、このことは、本方法において二次清澄化フィルターの除去につながる可能性があると思われる。
【０１９８】
顧客にとっての別の主な利益は、高固形分供給原料の清澄化を経済的に改良したことである。先に述べたように、多くの高固形分供給原料に対する清澄化方法の適用において、遠心分離および／またはタンジェンシャルフロー精密ろ過が、一次清澄化ステップとして、通常デプスフィルターを含む二次清澄化の上流として使用されている。デプスフィルターを一次清澄化方法に、本明細書に記載の手段で組み込むことにより、遠心分離ステップおよび／またはタンジェンシャルフロー精密ろ過ステップの先行（上流の清澄化ステップ）および後続（下流の清澄化ステップ）の使用が排除される。さらに、遠心分離（複数可）および／またはタンジェンシャルフロー精密ろ過膜の洗浄、検査および置き換えに費やされる見込みの時間が少なく抑えられる。
【０１９９】
［実施例１４］
標的分子の精製用清澄化深層ろ過装置および系
図５は、標的分子の精製用の系に組み込まれた、例示的清澄化深層ろ過装置の精製方法の概略図であり、連続または半連続様式で標的分子を生成する方法を実施するために、該系は、相互に流体連通で連結された２以上の単位操作を含む。個々の単位操作は、この単位操作の意図する目的を達成するために、１または複数の装置を用いることができる。従って、幾つかの実施形態において、本明細書に記載の系は、精製方法が、連続または半連続様式で動作可能なように連結された、幾つかの装置を含む。
【０２００】
理論に縛られることを望むものではないが、系は、精製方法全体を無菌様式で実施されるように、密閉された無菌環境に封入可能なことが企図される。
【０２０１】
さまざまな実施形態において、このような系の最初の装置は、出発材料、例えば精製されるタンパク質を発現する培養細胞を含有するバイオリアクターである。該バイオリアクターは、バッチもしくはフェドバッチのバイオリアクターのような任意のタイプのバイオリアクターまたは連続かん流発酵バイオリアクターのような連続バイオリアクターであってよい。該バイオリアクターは、任意の適切な材料で作製されていてよく、任意のサイズであってよい。通常材料はステンレス鋼またはプラスチックである。特定の実施形態において、バイオリアクターは使い捨てバイオリアクター、例えば、単回使用のために設計された、柔軟性の折り畳み式バッグである。
【０２０２】
清澄化は、バイオリアクターにおいて直接実施されてもよく、代替的には、バイオリアクターは単に細胞を培養するために使用され、清澄化は異なる槽において実施されてもよい。さらに別の実施形態において、細胞培養物は、１種または複数種の不純物を除去するために、本明細書に教示の清澄化深層ろ過装置の中に単純に流入する。従って、幾つかの実施形態において、該バイオリアクターは、深層ろ過を実施する装置と流体連通している。
【０２０３】
本明細書に教示の清澄化深層ろ過装置は、結合および溶出クロマトグラフィー（例えば、連続マルチカラムクロマトグラフィー装置）を使用して捕捉を実施する装置と、流体連通している。幾つかの実施形態において、結合および溶出クロマトグラフィーのための装置は、フロースルー精製を実施するための単位操作と流体連通で連結され、この操作は１以上の装置／ステップを含むことができる。幾つかの実施形態において、インラインの静的ミキサーまたはサージタンクは、結合および溶出クロマトグラフィーのための装置と、フロースルー精製に使用される最初の装置との間に含まれる。
【０２０４】
幾つかの実施形態において、フロースルー精製方法は、１以上の装置、例えば、活性炭装置、続いてＡＥＸクロマトグラフィー装置、続いてｐＨ変化のためのインライン静的ミキサーおよび／またはサージタンク、続いてＣＥＸクロマトグラフィー装置、続いてウイルスろ過装置を含む。該装置は、一般に、任意の適切なフォーマット、例えばカラムまたはカートリッジ内であってよい。
【０２０５】
系の最終単位操作は、製剤化を達成するための１または複数の装置を含むことができ、これは透析ろ過／濃縮および除菌ろ過を含む。
【０２０６】
通常、各装置は、少なくとも１つの入り口および少なくとも１つの出口を含み、これによって、１つの装置からの出口が、系の連続した装置の入り口と流体連通可能にする。
【０２０７】
今日工業において使用される大部分の方法および系において、精製方法に使用される個々の装置は、「スキッド」とも称される方法設備の単位を用い、これは、必要なポンプ、バルブ、センサーおよび装置のホルダーを通常含む。通常、少なくとも１つのスキッドは、各装置と関連している。本明細書に記載の実施形態の幾つかにおいて、精製方法を通して使用されるスキッドの数は減少する。例えば、幾つかの実施形態において、フロースルー精製方法全体の実施に使用されるスキッドは、わずか１つであり、このスキッドは、複数の装置、例えば、活性炭装置、陰イオン交換クロマトグラフィー装置、陽イオン交換クロマトグラフィー装置およびウイルスろ過装置を、溶液条件の変化に必要な任意の設備と一緒に含むことができる。従って、幾つかの実施形態において、１つのスキッドが、フロースルー精製方法の前述のステップすべてに使用できる。
【０２０８】
幾つかの実施形態において、流体が、中断されることなくすべての装置に直接流入するという点で、さまざまな装置の間の流体連通は連続している。他の実施形態において、１または複数のバルブ、センサー、検出器、サージタンクおよび溶液のｐＨ変化のための任意のインラインの設備が、さまざまな装置の間に含まれてよく、これによって、必要に応じて、例えば、特定の単位操作を置き換え／または除去するために、系の中の流体の流れが一時的に中断される。
【０２０９】
幾つかの実施形態において、１または複数のサージタンクがさまざまな装置の間に含まれる。幾つかの実施形態において、多くて３、多くて２つのサージタンクが系全体に存在する。
【０２１０】
幾つかの実施形態において、系は、系内の１または複数の方法パラメーター、例えば、温度、圧力、ｐＨ、伝導率、溶存酸素（ＤＯ）、溶存二酸化炭素（ＤＣＯ２）、混合率、流量、製品パラメーターを制御および／またはモニターするために、１または複数のセンサーおよび／またはプローブをさらに含む。
【０２１１】
幾つかの実施形態において、方法制御は、系の無菌状態に支障をきたすことのない方法で達成することができる。
【０２１２】
幾つかの実施形態において、センサーおよび／またはプローブはセンサーエレクトロニクスモジュールと連結可能であり、この出力を、端子盤および／またはリレーボックスに送ることができる。感知操作の結果を、コンピュータにより実行されるコントロールシステム（例えばコンピュータ）に、さまざまなパラメーター（例えば、温度および重量／体積測定値、純度）の計算および制御ならびにディスプレイおよびユーザーインターフェイスのために、入力することができる。このようなコントロールシステムはまた、電子的、機械的および／または空気圧的システムの組み合わせを含み、方法パラメーターを制御することができる。該コントロールシステムは、他の機能を実行してもよく、本発明は、任意の特定の機能または機能のセットを有することに限定されないことを理解すべきである。
【０２１３】
上に説明した開示は、独立した有用性を有する、複数の異なる発明を包含できる。個々のこれらの発明はこの好ましい形態（複数可）で開示されているが、本明細書に開示および例示のこれらの特定の実施形態は、多数の変形が可能なので、限定的な意味で解釈されるべきではない。本発明の主題は、本明細書に開示のさまざまな要素、特色、機能および／または特性の、すべての新規および自明でない組み合わせおよび部分的組み合わせを含む。下記の特許請求の範囲は、新規および自明でないとみなされる特定の組み合わせおよび部分的組み合わせを個別に指摘している。特色、機能、要素および／または特性の他の組み合わせおよび部分的組み合わせで具体化された発明は、本出願または関連出願からの優先権を請求する出願において特許請求され得る。このような特許請求の範囲もまた、異なる発明を対象としていても、または同じ発明を対象としていても、元々の特許請求の範囲より広い、より狭い、等しいかまたは異なっていても、本明細書において教示される発明の主題内に含まれるとみなされる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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