(57)【要約】  本発明は、新規ドメイン交換された、二価の二重特異的抗体類、それらの製造及び使用に関する。
2011505848.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖；及び
ｂ）第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖を含んで成り、ここで不変ドメインCL及びCH1はお互いにより置換されている、二価の二重特異的抗体。
【請求項２】
１つのH鎖のCH3ドメイン及び他のH鎖のCH3ドメインが、抗体CH3ドメイン間にオリジナル界面を含んで成る界面で個々に接触し；ここで前記界面は二価の二重特異的抗体の形成を促進するよう変更され、ここで前記変更が、
ａ）二価の二重特異的抗体内の他のH鎖のCH3ドメインのオリジナル界面と接触する、１つのH鎖のCH3ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ残基により置換され、それにより、他のH鎖のCH3ドメインの界面内の腔に位置決定できる、１つのH鎖CH3ドメインの界面内に突出物を生成するよう、１つのH鎖のCH3ドメインが変更され、そして
ｂ）二価の二重特異的抗体内の第１CH3ドメインのオリジナル界面と接触する、第２CH3ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第１CH3ドメインの界面内の突出物が位置決定できる第２CH3ドメインの界面内に腔を生成するよう、他のH鎖のCH3ドメインが変更されることにより特徴づけられる、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）から成る群から選択されることを特徴とする、請求項２記載の抗体。
【請求項４】
より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、バリン（V）から成る群から選択されることを特徴とする、請求項２又は３記載の抗体。
【請求項５】
両CH3ドメインがさらに、個々のCH3ドメインのその対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（C）の導入により変更されることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項記載の抗体。
【請求項６】
両H鎖の不変H鎖ドメインCH3の１つが不変H鎖ドメインCH1により置換され；そして他の不変H鎖ドメインCH3が不変L鎖ドメインCLにより置換されることを特徴とする、請求項１記載の抗体。
【請求項７】
請求項1記載の二価の二重特異的抗体の調製方法であって、
ａ）宿主細胞を、
−第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクター；及び
−第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクターにより形質転換し、ここで不変ドメインCL及びCH1は互いにより置換されており；
ｂ）前記宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能にする条件下で培養し；そして
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する段階を含んで成る方法。
【請求項８】
−第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクター；及び
−第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクターを含んで成り、ここで不変ドメインCL及びCH1は互いにより置換されている、宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか１項記載の二価の二重特異的抗体の組成物、好ましくは医薬又は診断組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項記載の二価の二重特異的抗体、及び少なくとも１つの医薬的に許容できる賦形剤を含んで成る医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規二価の二重特異的抗体類、それらの製造及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
構築されたタンパク質、例えば複数の抗原を結合できる二重又は多重特異的抗体は、当業界において知られている。そのような多重特異的結合タンパク質は、細胞融合、化学的接合又は組換えDNA技法を用いて、生成され得る。
【０００３】
広範囲の種類の組換え二重特異的抗体形、例えば四価の二重特異的抗体が、IgG抗体形及び単鎖ドメインの融合により、最近開発されている（例えば、Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO 2001/077342号; 及び Morrison, S.L. , Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234を参照のこと）。
【０００４】
また、抗体コアー構造（IgA, IgD, IgE, IgG 又は IgM）がもはや保持されていない、いくつかの他の新規形、例えば複数の抗原を結合できる、ニ、三又は四量体、ミニ体、いくつかの単鎖形（scFv、Bis-scFv）が開発されて来た（Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136 2005; Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J-, et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C, et al., Nature Biotech 25 (2007) 1290-1297）。
【０００５】
すべてのそのような形は、抗体コアー（IgA, IgD, IgE, IgG 又はIgM）を、さらなる結合タンパク質（例えば、scFv）に融合するために、又は例えば２種のFabフラグメント又はscFvを融合するために、リンカーを用いる（Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14）。リンカーが二重特異的抗体の構築のための利点を有することは明白であるが、それらはまた、治療設定において問題を引き起こす。実際、それらの外来性ペプチドは、リンカー自体に対して、又はタンパク質とリンカーとの間の接合に対して免疫応答を誘発する。さらに、それらのペプチドの柔軟な性質は、タンパク質分解の傾向を引き起こし、不良な抗体安定性、凝集及び高められた免疫原性を実質的に導く。さらに、天然に存在するものに対して高い程度の類似性を維持することにより、Fc受容体結合を通して介在される、エフェクター機能、例えば補体−依存性細胞毒性（CDC）又は抗体依存性細胞毒性（ADCC）を保持することが所望される。
【０００６】
従って、理想的には、ヒト配列からの最少の逸脱を伴って、天然に存在する抗体（例えば、IgA, IgD, IgE, IgG 又はIgM）に一般的に非常に類似する二重特異的抗体を開発することが所望される。
【０００７】
１つのアプローチにおいては、天然の抗体は非常に類似する二重特異的抗体が、二重特異的抗体の所望する特異性を有するネズミモノクローナル抗体を発現する２種の異なったハイブリドーマ細胞系の体細胞融合に基づいて、クアドロマ（quadroma）技法（Milstein, C, and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-40を参照のこと）を用いて生成されて来た。得られるハイブリッド−ハイブリドーマ（又はクオドロマ）内の２種の異なった抗体H及びL鎖のランダム対合のために、10種での異なった抗体種（そのうち１つのみが所望の機能的ニ重特異的抗体である）が生成される。誤って対合された副産物の存在及び有意に低められた生成収率のために、高度な精製方法が必要とされる（Morrison, S. L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234を参照のこと）。一般的に、誤って対合された副産物の同じ問題が、組換え発現技法が使用される場合、残存する。
【０００８】
“knobs-into-holes”として知られている、誤って対合された副産物の問題を回避するためのアプローチは、接触界面を変性するためにCH3ドメイン中に突然変異を導入することにより、２種の異なった抗体H鎖の対合を強制することを目的とする。１つの鎖上の大きなアミノ酸が、“ホール”を創造するために、短い側鎖を有するアミノ酸により置換された。逆に言えば、大きな側鎖を有するアミノ酸が、“ノブ”を創造するために、他のCH3ドメイン中に導入された。それらの２種のH鎖（及び両H鎖のために適切であるべきである２種の同一のL鎖）を同時発現することにより、高い収率のヘテロダイマーを形成（“ノブ−ホール”）対ホモダイマー形成（“ホール−ホール”又は“ノブ−ノブ”）が観察された（Ridgway, J. B., Presta, L.G., Carter, P. 及び WO 96/027011号）。
【０００９】
ヘテロダイマーの百分率は、ファージ表示アプローチを用いて２種のCH3ドメインの相互作用表面の改造、及びヘテロダイマーを安定化するためのジスルフィド橋の導入により、さらに高められ得た（Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998)677-681; Atwell, S., Ridgway, J.B., Wells, J.A., Carter, P., J., MoI Biol 270 (1997) 26- 35）。knobs-into-holes技法のための新しいアプローチは例えば、EP1870459A1号に記載されている。この形は非常に魅力的であるように思われるが、クリニックへの進行を記載するデータは現在入手できない。この方法の１つの重要な制限は、２種の親抗体のL鎖が誤った対合及び不活性分子の形成を妨げるために、同一であるべきである。従って、この技法は、第１及び第２抗原に対する２種の抗体から出発して、２種の抗原に対する組換え、二価の二重特異的抗体を容易に間発するためには、それらの抗体のH鎖及び/又は同一のL鎖のいずれかが最適化されるべきであるので、適切ではない。
【００１０】
Simon T. et al, EMBO Journal, 9 (1990) 1051 -1056は、単一特異的抗体のドメイン変異体に関する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、
ａ）第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖；及び
ｂ）第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖を含んで成り、ここで不変ドメインCL及びCH1はお互いにより置換されている、二価の二重特異的抗体に関する。
本発明のさらなる態様は、
ａ）宿主細胞を、
−第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクター；及び
−第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクターにより形質転換し、ここで不変ドメインCL及びCH1は互いにより置換されており；
ｂ）前記宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能にする条件下で培養し；そして
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する段階を含んで成る、本発明の二価の二重特異的抗体の調製方法に関する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、
−第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクター；及び
−第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクターを含んで成り、ここで不変ドメインCL及びCH1は互いにより置換されている、宿主細胞に関する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、本発明の抗体の組成物、好ましくは医薬又は診断組成物である。
本発明のさらなる態様は、本発明の抗体、及び少なくとも１つの医薬的に許容できる賦形剤を含んで成る医薬組成物である。
本発明のさらなる態様は、治療の必要な患者の処理方法であって、治療的有効量の本発明の抗体を、前記患者に投与することを特徴とする方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、IgG, すなわち典型的な順序で可変及び不変ドメインを含んで成る、２対のH及びL鎖を有する、１つの抗原に対して特異的な天然に依存する完全な抗体を図示する。
【図２】図２は、ａ）第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖；及び  ｂ）第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖を含んで成る、二価の二重特異的抗体を図示し、ここで不変ドメインCL及びCH1はお互いにより置換されている。
【００１５】
【図３】図３は、ａ）第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖；及び  ｂ）第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖を含んで成る、二価の二重特異的抗体を図示し、ここで不変ドメインCL及びCH1はお互いにより置換され、そして両H鎖のCH3ドメインがknobs-into-holes技法により変更されている。
【図４】図４は、ａ）第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖；及び  ｂ）第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖を含んで成る、二価の二重特異的抗体を図示し、ここで不変ドメインCL及びCH1はお互いにより置換され、そして両H鎖の不変H鎖ドメインCH3の１つは不変H鎖ドメインCH1により置換され、そして他の不変H鎖ドメインCH3は不変L鎖ドメインCLにより置換されている。
【００１６】
【図５】図５は、<IGF-1R> CL-CHl交換抗体（κ不変L鎖ドメインCLを有する）のH鎖**<IGF-1R>HC**のタンパク質配列スキームを示す。
【図６】図６は、<IGF-1R> CL-CHl交換抗体のL鎖**<IGF-1R>LC**のタンパク質配列スキームを示す。
【図７】図７は、H鎖**<IGF-1R>HC**発現ベクターpUC-HC**-IGF-1Rのプラスミド地図を示す。
【図８】図８は、L鎖**<IGF-1R>LC**発現ベクターpUC-LC**-IGF-1Rのプラスミド地図を示す。
【００１７】
【図９】図９は、4700-Hyg-OriP発現ベクターのプラスミド地図を示す。
【図１０】図10は、機能的二重特異的<ANGPT2-IGF-1R> CL-CHl交換抗体の存在を検出するためのI24IGF-1R発現細胞に対する細胞性FACS IGF-1R-ANGPT2架橋アッセイのアッセイ原理を示す。
【図１１】図11は、IGF-1R ECD Biacoreのスキームを示す。
【図１２】図12は、HEK293-F細胞の一過性トランスフェクションの後、細胞培養上清液から単離されたHC**及びLC**を有する、精製された二価の単一特異的<IGF-IR>CL-CH1交換抗体（IgG1**）のSDS-PAGE及びサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【００１８】
【図１３】図13は、ELISAに基づく結合アッセイにおけるIGF-IR ECDへの単一特異的<IGF-1R>CL-CH1交換抗体及び野生型<IGF-1R>抗体の結合を示す。
【図１４】図14は、一過性にトランスフェクトされたHEK293-F細胞からの細胞培養上清液から精製された<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体混合物のSDS−PAGE及びサイズ排除クロマトグラフィーを示す。
【００１９】
【図１５】図15は、精製された抗体混合物：精製されたタンパク質における機能的二重特異的<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体を検出するためにI24 IGF-1R発現細胞に対する細胞FACS IGF-1R-ANGPT2架橋アッセイのサンプルA〜Fについての結果を示す；  サンプルA〜F：  A：I24未処理  B：I24＋2μg/mlのhANGPT2+hIgGイソタイプ  C：I24＋2μg/mlのhANGPT2＋<IGF-1R>CL-CH1交換抗体及び二重特異的<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体を含んで成る<ANGPT2>野生型抗体の同時発現からの混合物  D：存在しない  E：I24＋2μg/mlのhANGPT2+<ANGPT2>野生型抗体  F：I24＋2μg/mlのhANGPT2+<IGF-1R>野生型抗体
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の特定の記載：
本発明は、
ａ）第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖；及び
ｂ）第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖を含んで成り、ここで不変ドメインCL及びCH1はお互いにより置換されている、二価の二重特異的抗体に関する。
【００２１】
従って、前記二価の二重特異的抗体は、
ａ）第１抗原に対して特異的に結合する抗体の第1L鎖及び第1H鎖；及び
ｂ）第２抗原に対して特異的に結合する抗体の第２L鎖及び第２H鎖（ここで、前記第２L鎖及び第２H鎖の不変メインCL及びCH1はお互いによりにより置換される）を含んで成る。
【００２２】
従って、第２抗原に対して特異的に結合する前記抗体に関しては、次のことが適用できる：
L鎖内で、不変L鎖ドメインCLが前記抗体の不変H鎖ドメインCH1により置換され；そして
H鎖内で、不変H鎖ドメインCH1が前記抗体の不変L鎖ドメインCLにより置換される。
【００２３】
用語、“抗体”とは、本明細書において使用される場合、完全モノクローナル抗体を意味する。そのような完全抗体は、２対の“L鎖”（LC）及び“H鎖”（HC）（そのようなL鎖（LC）/H鎖対は、LC/HCとして本明細書において簡略される）から成る。そのような抗体のL鎖及びH鎖は、いくつかのドメインから成るポリペプチドである。完全な抗体においては、個々のH鎖は、H鎖可変領域（本明細書においては、HCVR又はVHとして簡略される）及びH鎖不変領域を含んで成る。H鎖不変領域は、H鎖不変ドメインCH1、CH2及びCH3（抗体種類IgA, IgD及びIgG）、及び任意には、H鎖不変ドメインCH4（抗体種類IgE及びIgM）を含んで成る。
【００２４】
個々のL鎖は、L鎖可変ドメインVL及びL鎖不変ドメインCLを含んで成る。１つの天然に存在する完全な抗体、すなわちIgG抗体の構造は、例えば図１に示される。可変ドメインVH及びVLはさらに、より保存される、骨格領域（FR）と称する領域により点在される、相補性決定領域（CDR）と称する超可変性の領域に細分され得る。個々のVH及びVLは、次の順序でアミノ末端側からカルボキシ末端側に配置される、３種のCDR及び４種のFRから構成される：FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4（Janeway, C.A., Jr. et al. (2001). Immunobiology., 5th ed., Garland Publishing;及びWoof, J., Burton, D., Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99）。
【００２５】
２対のH鎖及びL鎖（HC/LC）は、同じ抗原に対して特異的に結合することができる。従って、前記完全な抗体は、二価の単一特異的抗体である。そのような“抗体”は、例えばマウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト適合された抗体及び遺伝子的に構築された抗体（変異体又は変異抗体）を、それらの特徴的性質が保持される限り包含する。ヒト又はヒト適合された抗体、特に組換えヒト又はヒト適合された抗体が特に好ましい。
【００２６】
ギリシア文字により示される次の５種の哺乳類抗体H鎖が存在する：α、δ、ε、γ及びμ（Janeway, C.A., Jr., et al., (2001). Immunobiology., 5th ed., Garland Publishing）。存在するH鎖のタイプが抗体の種類を定義し；それらの鎖はそれぞれ、IgA, IgD, IgE, IgG及びIgM抗体に見出される（Rhoades, R.A., Pflanzer RG (2002). Human Physiology, 4th ed., Thomson  Learning）。異なったH鎖は、サイズ及び組成において異なり；α及びγは約450個のアミノ酸を含み、そしてμ及びεは約550個のアミノ酸を有する。
【００２７】
個々のH鎖は、２腫の領域、すなわち不変領域及び可変領域を有する。不変領域は同じイソタイプのすべての抗体で同一であるが、しかし異なったイソタイプの抗体においては異なる。H鎖γ、α及びδは、３種の不変ドメインCH1, CH2及びCH3（並んで）から構成される不変領域、及び付加される柔軟性のためのヒンジ領域を有し（Woof, J., Burton, D., Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99）；H鎖μ及びεは、４種の不変ドメインCH1, CH2, CH3及びCH4から構成される不変領域を有する（Janeway, C.A., Jr., et al., (2001). Immunobiology., 5th ed., Garland Publishing）。H鎖の可変領域は、異なったB細胞により生成される抗体において異なるが、しかし単一のB細胞又はB細胞のみにより生成されるすべての抗体に関して同じである。個々のH鎖の可変領域は、約110個の長さのアミノ酸であり、そして単一の抗体ドメインから構成される。
【００２８】
哺乳類における、λ及びκと呼ばれる、わずか２種のタイプのL鎖が存在する。L鎖は次の２種の連続したドメインを有する：１つの不変ドメインCL及び１つの可変ドメインVL。L鎖のおおよその長さは、221〜217個のアミノ酸である。好ましくは、L鎖はκL鎖であり、そして不変ドメインCL葉好ましくは、Cκである。
【００２９】
用語“モノクローナル抗体”又は“モノクローナル抗体組成物”とは、本明細書において使用される場合、単一のアミノ酸組成物の抗体分子の調製を意味する。
本発明の“抗体”は、いずれかの種類（例えば、IgA, IgD, IgE, IgG, 及び IgM, 好ましくは IgG 又はIgE）、又は亜種（例えば、IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl 及び IgA2, 好ましくはIgGl）のものであり得、それにより、本発明の二価の二重特異的抗体が由来する両抗体は、同じ亜種のFc部分（例えば、IgGl, IgG4 及び同様のもの, 好ましくはIgGl）のもの、好ましくは同じアロタイプ（例えば、白人）を有する。
【００３０】
“抗体のFc部分”とは、当業者に良く知られており、そして抗体のパパイン分解に基づいての定義される用語である。本発明の抗体は、Fc部分として、好ましくはヒト起源のFc部分、及びヒト不変領域のすべての他の部分を含む。抗体のFc部分は、補体活性化、C1q結合、C3活性化及びFc受容体結合に直接的に包含される。補体システムへの抗体の影響は一定の条件に依存するが、C1qへの結合はFc部分における定義される結合部位により引起される。
【００３１】
そのような結合部位は、当業界において知られており、そして例えば、Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., MoI. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980)338-344; Thommesen, J.E., et al., MoI. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；及びEP0307434号により記載される。そのような結合部位は、例えばL234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 及び P329（KabatのEUインデックスによる番号付け、下記参照のこと）である。亜種IgG1, IgG2及びIgG3の抗体は通常、補体活性化、C1q結合及びC3活性化を示すが、ところがIgG4は、補体システムを活性化せず、C1qを結合せず、そしてC3を活性化しない。好ましくは、Fc部分は、ヒトFc部分である。
【００３２】
用語“キメラ抗体”とは、通常組換えDNA技法により調製される、可変領域、すなわち１つの源又は種からの結合領域、及び異なった源又は種に由来する不変領域の少なくとも一部を含んで成る抗体を意味する。ネズミ可変領域及びヒト不変領域を含んで成るキメラ抗体が好ましい。本発明により包含される他の形の“キメラ抗体”は、不変領域が、特にC1q結合及び/又はFc受容体（FcR）結合に関して、本発明の性質を生成するために、修飾されているか、又は元の抗体のその領域から変更されているそれらの抗体である。
【００３３】
そのようなキメラ抗体はまた、“クラス−スイッチ抗体”としても言及される。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメント、及び免疫グロブリン不変領域をコードするDNAセグメントを含んで成る、発現された免疫グロブリン遺伝子の生成物である。キメラ抗体を生成するための方法は、当業界において現在良く知られている、従来の組換えDNA及び遺伝子トランスフェクション技法を包含する。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; アメリカ特許第5,202,238号 及びアメリカ特許第5,204,244号を参照のこと。
【００３４】
用語“ヒト適合された抗体”とは、その骨格又は“相補性決定領域”（CDR）が、親イムノグロブリンのCDRに比較して、異なった特異性の免疫グロブリンのCDRを含んで成るよう修飾されている抗体を意味する。好ましい態様においては、ネズミCDRは、“ヒト適合された抗体”を調製するために、ヒト抗体の骨格領域中に移植される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; and Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照のこと。特に好ましいCDRは、キメラ抗体に関して上記に示される抗原を認識する配列を表すそれらに対応する。本発明により包含される他の形の“ヒト適合された抗体”とは、不変領域が、特にC1q結合及び/又はFc受容体（FcR）結合に関して、本発明の性質を生成するために、さらに修飾されているか、又は元の抗体のその領域から変更されているそれらの抗体である。
【００３５】
用語“ヒト抗体”とは、本明細書において使用される場合、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び不変領域を有する抗体を包含することを意図する。ヒト抗体は技術的に良く知られている（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374）。ヒト抗体はまた、免疫化に基づいて、内因性免疫グロブリン生成の不在下で十分なレパートリー又は選択のヒト抗体を生成できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）においても生成され得る。
【００３６】
そのような生殖系変異体マウスにおけるヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイのトランスファーは、抗原攻撃に基づくヒト抗体の生成をもたらすであろう（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40を参照のこと）。ヒト抗体はまた、ファージ表示ライブラリーにおいても生成され得る（Hoogenboom, H. R., and Winter, G., J. MoI. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. MoI. Biol. 222 (1991) 581-597）。Cole, など., 及びBoerner, など.の技法はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利用できる（Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); 及び Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991)86-95）。
【００３７】
本発明のキメラ及びヒト適合された抗体についてすでに言及されたように、用語“ヒト抗体”とは、本明細書において使用される場合、また、特にC1q結合及び/又はFcR結合に関して、例えばFc部分の“クラススイッチ”、すなわち変更又は突然変異誘発（IgG1からIgG4への及び/又はIgG1/IgG4突然変異）により、本発明の性質を生成するために不変領域において修飾されているそのような抗体も含んで成る。
【００３８】
用語“組換えヒト抗体”とは、本明細書において使用される場合、組換え手段により調製され、発現され、創造され、又は単離されるすべてのヒト抗体、例えば宿主細胞、例えばNSO又はCHO細胞から又はヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスゲニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、又は宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体を意味する。そのような組換えヒト抗体は、転位された形で、可変及び不変領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、インビボ体細胞超突然変異にゆだねられている。従って、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系VH及びVL領域に由来し、そしてその配列に関連しているが、天然においては、ヒト抗体生殖系レパートリー内にインビボで存在することができない配列である。
【００３９】
“可変ドメイン”（L鎖の可変領域（VL）、H鎖の可変領域（VH））は、本明細書において使用される場合、抗原への抗体の結合において直接関与するL鎖及びH鎖の対の個々を示す。ヒト可変L及びH鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、そして個々のドメインは４個の骨格（FR）領域を含んで成り、それらの配列は広く保存され、３個の“超可変領域”（又は相補性決定領域、CDR）により結合される。骨格領域は、β−シートコンホメーションを採用し、そしてCDRはβ−シート構造体を結合するループを形成することができる。個々の鎖におけるCDRは、骨格領域によりそれらの立体構造を保持され、そして他の鎖からのCDRと共に抗原結合部位を形成する。抗体H及びL鎖CDR3領域は、本発明の抗体の結合特異性/親和性において特に重要な役割を演じ、そして従って、本発明のさらなる目的を提供する。
【００４０】
用語“超可変領域”又は“抗体の抗原−結合部分”とは、本明細書において使用される場合、抗原結合を担当できる抗体のアミノ酸残基を言及する。超可変領域は“相補性決定領域”又は“CDR”からのアミノ酸残基を含んで成る。“骨格”又は“FR”領域は、本明細書において定義されるように超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体のL鎖及びH鎖は、N−末端からC−末端の方に、ドメインFRl、 CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4を含んで成る。個々の鎖上のCDRはそのような骨格アミノ酸により分離される。特に、H鎖のCDR3は、ほとんど抗原結合に寄与する領域である。CDR及びFR領域は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. ( 1991)の標準の定義に従って決定される。
【００４１】
H鎖及びL鎖の“不変ドメイン”は、抗原への抗体の結合には直接的に包含されないが、しかし種々のエフェクター機能を示す。それらのH鎖の不変領域のアミノ酸配列に依存して、抗体又は免疫グロブリンは再分類される。
【００４２】
用語“二価の二重特異的抗体”とは、本明細書において使用される場合、２対のH鎖及びL鎖（HC/LC）の個々が異なった抗原に対して特異的に結合し、すなわち第１H鎖及び第１L鎖（第１抗原に対する抗体に起因する）が第１抗原に対して一緒に特異的に結合し、そして第２H鎖及び第２L鎖（第２抗原に対する抗体に起因する）が第２抗原に対して一緒に特異的に結合する（図２に示されるように）、上記のような抗体を言及し；そのような二価の二重特異的抗体は、同時に２種の異なった抗原に対して特異的に結合し、そして２種以上の抗原に対して結合せず、反して、一方では、第一特異的抗体は１つの抗原にみに結合し、そして他方では、例えば四価の四重特異的抗体は同時に４種の抗原に結合できる。
【００４３】
本発明によれば、所望しない副産物に比較しての所望する二価の二重特異的抗体の比率は、単に一対のH鎖及びL鎖（HC/LC）における一定のドメインの置換により改良され得る。２つのHC/LC対の第１対は第１抗原に対して特異的に結合する抗体に起因し、そして実質的に未変化のまま存続するが、２つのHC/LC対の第２対は第２抗原に対して特異的に結合する抗体に起因し、そして次の置換により変更される：
−L鎖：第２抗原に対して特異的に結合する前記抗体の不変H鎖ドメインCH1による不変L鎖ドメインCLの置換、及び
−H鎖：第２抗原に対して特異的に結合する前記抗体の不変L鎖ドメインCLによる不変H鎖ドメインCH1の置換。
【００４４】
従って、得られる二価の特異的抗体は、
ａ）第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖；及び
ｂ）第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖を含んで成る人工抗体であり；ここで前記L鎖（第２抗原に対して特異的に結合する抗体の）は、CLの代わりに不変ドメインCH1を含み、前記H鎖（第２抗原二対して特異的に結合する抗体の）は、CH1の代わりに不変ドメインCLを含む。
【００４５】
本発明の追加の観点においては、所望しない副産物に比較しての所望する二価の二重特異的抗体のそのような改良された比率は、次の２種の変法の１つにより、さらに改良され得る：
【００４６】
A）第１の変法（図３を参照のこと）：
本発明の前記二価のニ重特異的抗体のCH3ドメインは、例えばWO96/027011号、Ridgway, J.B., et al, Protein Eng 9(1996) 617-621; 及びMerchant, A.M., et al, Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681において、いくつかの例により詳細に記載される“knob-into-holes”技法により変更され得る。この方法においては、２種のCH3ドメインの相互作用表面が、それらの２種のCH3ドメインを含む両H鎖のヘテロダイマー化を高めるために変更される。２種のCH3ドメイン（２種のH鎖の）の個々が“knob”であり、そして他が“hole”である。ジスルフィド橋の導入は、ヘテロダイマーを安定化し（Merchant, A..M., et al, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., Ridgway, J.B., Wells, J.A., Carter, P., J MoI Biol 270 (1997) 26-35）、そして収率を高める。
【００４７】
従って、好ましい態様においては、第１CH3ドメイン及び第２CH3ドメインの個々が、抗体CH3ドメイン間にオリジナル界面を含んで成る界面で接触する、二価の二重特異的抗体のCH3ドメインが、二価の二重特異的抗体の形成を促進するために、CH3ドメインにおけるジスルフィド橋の導入によるさらなる安定化（WO 96/027011号、Ridgway, J.B., et al, Protein Eng 9 (1996) 617-621; Merchant. A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; 及びAtwell, S., Ridgway, J.B., Wells, J.A.,Carter P., J MoI Biol 270 (1997) 26-35）を包含する“knob-holes”技法により変更される。
【００４８】
従って、本発明の１つの観点においては、前記二価の二重特異的抗体は、１つのH鎖のCH3ドメイン及び他のH鎖のCH3ドメインが、抗体CH3ドメイン間にオリジナル界面を含んで成る界面で個々に接触し；ここで前記界面は二価の二重特異的抗体の形成を促進するよう変更され、ここで前記変更が、
ａ）二価の二重特異的抗体内の他のH鎖のCH3ドメインのオリジナル界面と接触する、１つのH鎖のCH3ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ残基により置換され、それにより、他のH鎖のCH3ドメインの界面内の腔に位置決定できる、１つのH鎖CH3ドメインの界面内に突出物を生成するよう、１つのH鎖のCH3ドメインが変更され、そして
ｂ）二価の二重特異的抗体内の第１CH3ドメインのオリジナル界面と接触する、第２CH3ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第１CH3ドメインの界面内の突出物が位置決定できる第２CH3ドメインの界面内に腔を生成するよう、他のH鎖のCH3ドメインが変更されることにより特徴づけられる、請求項１記載の抗体により特徴づけられる。
【００４９】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）から成る群から選択される。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、バリン（V）から成る群から選択される。
【００５０】
本発明の１つの観点においては、両CH3ドメインはさらに、それらの両CH3ドメイン間にジスルフィド橋が形成され得るよう、個々のCH3ドメインのその対応する位置におけるアミノ酸としてのシステイン（C）の導入により変更される。
本発明のもう１つの好ましい態様においては、両CH3ドメインは、EP1870459A1号に記載されるように、knobs残基に関しては残基R409D；K370E（K409D）及びhole残基に関してはD399K；E357Kの使用により変更され；又は
【００５１】
B)第２の変法（図４を参照のこと）：
１つの不変H鎖ドメインCH3が不変H鎖ドメインCH1により置換され、；そして他の不変H鎖ドメインCH3が不変L鎖ドメインCLにより置換される。H鎖ドメインCH3が置換される不変H鎖ドメインCH1は、いずれかのIgクラス（例えば、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM）又はサブクラス(例えば、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl及びIgA2)のものであり得る。H鎖ドメインCH3が置換される不変L鎖ドメインCLは、λ又はκ型、好ましくはκ型のものであり得る。
【００５２】
従って、本発明の１つの好ましい態様は、
ａ）第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖；及び
ｂ）第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖を含んで成り、ここで不変ドメインCL及びCH1はお互いにより置換されている、二価の二重特異的抗体であり、そしてここで任意には、
ｃ）１つのH鎖のCH3ドメイン及び他のH鎖のCH3ドメインが、抗体CH3ドメイン間にオリジナル界面を含んで成る界面で個々に接触し；ここで前記界面は二価の二重特異的抗体の形成を促進するよう変更され、ここで前記変更が、
ca）二価の二重特異的抗体内の他のH鎖のCH3ドメインのオリジナル界面と接触する、１つのH鎖のCH3ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ残基により置換され、それにより、他のH鎖のCH3ドメインの界面内の腔に位置決定できる、１つのH鎖CH3ドメインの界面内に突出物を生成するよう、１つのH鎖のCH3ドメインが変更され、そして
cb）二価の二重特異的抗体内の第１CH3ドメインのオリジナル界面と接触する、第２CH3ドメインのオリジナル界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第１CH3ドメインの界面内の突出物が位置決定できる第２CH3ドメインの界面内に腔を生成するよう、他のH鎖のCH3ドメインが変更されることにより特徴づけられる；又は
ｄ）１つの不変H鎖ドメインCH3が不変H鎖ドメインCH1により置換され；そして他の不変H鎖ドメインCH3は不変L鎖ドメインCLにより置換される。
【００５３】
用語“抗原”又は“抗原分子”とは、本明細書において使用される場合、交換可能的に使用され、そして抗体により特異的に結合され得るすべての分子を言及する。二価の二重特異的抗体は、第１抗原及び第２の異なった抗原に対して特異的に結合する。用語“抗原”とは、本明細書において使用される場合、例えばタンパク質、タンパク質上の異なったエピトープ（本発明の意味内の異なった抗原のような）、及び多糖類を包含する。これは主に、細菌、ウィルス及び他の微生物の一部（被膜、カプセル、細胞壁、鞭毛、線毛及び毒素）を包含する。脂質及び核酸は、タンパク質及び多糖類と組合される場合でのみ抗原性である。非微生物性外因性（非自己）抗原は、花粉、卵白、及び移植された組織及び器官からの輸血された血液細胞の表面上のタンパク質を包含することができる。好ましくは、抗原は、サイトカイン、細胞表面タンパク質、酵素及び受容体サイトカイン、細胞表面タンパク質、酵素及び受容体から成る群から選択される。
【００５４】
腫瘍抗原は、腫瘍細胞の表面上にMHC I又はMHC II分子により表されるそれらの抗原である。それらの抗原は時々、腫瘍細胞により表され、そして正常細胞によっては決して表されない。この場合、それらは腫瘍−特異的抗源（TSA）と呼ばれ、そして典型的には、腫瘍特異的突然変異に起因する。腫瘍細胞及び正常細胞により表される抗原がより通常であり、そしてそれらは腫瘍関連抗原（TAA）と呼ばれる。それらの抗原を認識した細胞毒性Tリンパ球は、それらが増殖するか又は転移する前、腫瘍細胞を破壊することができる。腫瘍抗原はまた、例えば突然変異誘発された受容体の形で腫瘍の表面上に存在することができ、この場合、それらはB細胞により認識されるであろう。
【００５５】
１つの好ましい態様においては、二価の二重特異的抗体が特異的に結合する、２種の異なった抗原（第１及び第２抗原）の少なくとも１つは、腫瘍抗原である。
もう１つの好ましい態様においては、二価の二重特異的抗体が特異的に結合する、２種の異なった抗原（第１及び第２抗原）の両者はまた、同じ腫瘍特異的タンパク質での２種の異なったエピトープでもあり得る。
【００５６】
もう１つの好ましい態様においては、二価の二重特異的抗体が特異的に結合する、２種の異なった抗原（第１及び第２抗原）の１つは、腫瘍抗原である、そして他は、T−細胞受容体、CD3、CD16及び同様のものようなエフェクター細胞抗原である。
もう１つの好ましい態様においては、二価の二重特異的抗体が特異的に結合する、２種の異なった抗原（第１及び第２抗原）の１つは、腫瘍抗原である、そして他は、抗-癌物質、例えば毒素又はキナーゼインヒビターである。
【００５７】
本明細書において使用される場合、“特異的に結合する”又は“〜に対して特異的に結合する”とは、抗原に特異的に結合する抗体を言及する。好ましくは、この抗原に対して特異的に結合する抗体の結合親和性は、10-9 モル/1又はそれ以下(例えば10-10 モル/1)の KD-値、好ましくは 10-10 モル/1 又はそれ以下 (e.g. 10- mol/1)のKD-値のものである。結合親和性は、標準結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴法(Biacore（商標）)により決定される。
【００５８】
用語“エピトープ”とは、抗体に対して特異的に結合できるいずれかのポリペプチド決定因子を包含する。ある態様においては、エピートープ決定因子は、分子、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリン又はスルホニルの化学的活性表面群を包含し、そしてある態様においては、特定の立体構造特性及び/又は比電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体により結合される結合される抗原の領域である。ある態様においては、抗体は、それがタンパク質及び/又は高分子の複合混合物においてその標的抗原を選択的に認識する場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
【００５９】
本発明のさらなる態様は、
ａ）宿主細胞を、
−第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクター；及び
−第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクターにより形質転換し、ここで不変ドメインCL及びCH1は互いにより置換されており；
ｂ）前記宿主細胞を、前記抗体分子の合成を可能にする条件下で培養し；そして
ｃ）前記培養物から前記抗体分子を回収する段階を含んで成る、本発明の二重特異的抗体の調製方法である。
【００６０】
一般的に、第１抗原に対して特異的に結合する前記抗体のL鎖及びH鎖をコードする２種のベクター、及びさらに、第２抗原に対して特異的に結合する前記抗体のL鎖及びH鎖をコードする２種のベクターが存在する。２種のベクターの１つは、それぞれのL鎖コードし、そして他はそれぞれのH鎖をコードする。しかしながら、本発明の二価の二重特異的抗体の調製のための他の方法においては、第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードするわずか１つの第１ベクター、及び第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードするわずか１つの第２ベークターが宿主細胞を形質転換するために使用され得る。
【００６１】
本発明は、対応する宿主の細胞を、前記抗体分子の合成を可能にする条件下で培養し、そして前記培養物から前記抗体を、例えば
−第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖をコードする第１核酸配列；
−第１抗原に対して特異的に結合する前記抗体のH鎖をコードする第２核酸配列；
−第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖をコードする第３核酸配列、ここで不変L鎖ドメインCLは不変H鎖ドメインCH1により置換される；及び
−第２抗原に対して特異的に結合する前記抗体のH鎖をコードする第４核酸配列（ここで、不変H鎖ドメインCH1が不変L鎖ドメインCLにより置換される）を発現することにより回収することを含んで成る、抗体の調製方法を包含する。
【００６２】
本発明のさらなる態様は、
−第１抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクター；及び
−第２抗原に対して特異的に結合する抗体のL鎖及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクターを含んで成り、ここで不変ドメインCL及びCH1は互いにより置換されている、宿主細胞である。
【００６３】
本発明のさらなる態様は、
ａ）第１抗原に対して特異的に結合する抗体の、L鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクター及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクター；及び
ｂ）第２抗原に対して特異的に結合する抗体の、L鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクター及びH鎖をコードする核酸分子を含んで成るベクター（ここで、不変ドメインCL及びCH1が互いにより置換されている）を含んで成る宿主細胞である。
【００６４】
本発明のさらなる態様は、本発明の二価の二重特異的抗体の組成物、好ましくは医薬又は診断組成物である。
本発明のさらなる態様は、本発明の二価の二重特異的抗体、及び少なくとも１つの医薬的に許容できる賦形剤を含んで成る医薬組成物である。
【００６５】
本発明のさらなる態様は、治療的有効量の本発明の二価の二重特異的抗体を、治療の必要な患者に投与することを特徴とする、前記患者の処理方法である。
用語“核酸又は核酸分子”とは、本明細書において使用される場合、DNA分子及びRNA分子を意図する。核酸分子は、単鎖又は二本鎖、好ましくは二本鎖DNAである。
【００６６】
本明細書において使用される場合、用語“細胞”、“細胞系”、及び“細胞培地”とは、交換可能的に使用され、そしてすべてのそのような名称は子孫も包含する。従って、用語“形質転換体”及び“形質転換された細胞”とは、トランスファーの数に関係なく、それらに由来する一次対象細胞及び培養物を包含する。すべての子孫は、故意の又は偶然な突然変異のために、DNA含有において正確には同一でないこともまた理解されている。元の形質転換された細胞についてスクリーンされる場合、同じ機能的又は生物学的活性を有する変異体子孫が包含される。異なった命名法が意図される場合、その内容から明白であろう。
【００６７】
用語“形質転換”とは、本明細書において使用される場合、宿主細胞中へのベクター/核酸のトランスファー工程を言及する。強い細胞壁バリヤーを有さない細胞が宿主細胞として使用される場合、トランスフェクションが、例えばGraham and Van der Eh, Virology 52 (1978) 546ffにより記載されるようなリン酸カルシウム沈殿方法により実施される。しかしながら、核注入又はプロトプラスト融合による細胞中へのDNAの導入のための他の方法がまた使用され得る。原核細胞、又は実質的な細胞壁構成を含む細胞が使用される場合、１つのトランスフェクション方法は、Cohen, F. N, et al, PNAS. 69 (1972) 71 lOffにより記載されるような、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法である。
【００６８】
形質転換を用いる抗体の組換え生成は、当業界において良く知られており、そしてMakrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, RJ., MoI. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., et al., Arzneimittelforschung 48 (1998) 870-880の再考文献、及びアメリカ特許第6,331,415号及び第4,816,567号に記載されている。
【００６９】
本明細書において使用される場合、“発現”とは、核酸がmRNAに転換される方法、及び/又は転写されたmRNA（また、転写体としても言及される）がペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に連続的に翻訳される方法を言及する。転写体及びコードされるポリペプチドは、集合的には、遺伝子生成物として言及される。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、真核細胞における発現は、mRNAのスプライシングを包含する。
【００７０】
“ベクター”とは、挿入される核酸分子を、宿主細胞中に及び/又は宿主細胞間にトランスファーする、核酸分子、特に自己複製する核酸分子である。この用語は、DNAの細胞中への挿入（例えば、染色体組込み）のために主に機能するベクター、DNA又はRNAの複製のために主に機能するベクターの複製、及びDNA又はRNAの転写及び/又は翻訳のために機能する発現ベクターを包含する。１つよりも多くの記載されるような機能を提供するベクターもまた包含される。
【００７１】
“発現ベクター”とは、適切な宿主細胞中に導入される場合、転写され、そしてポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチドである。“発現システム”とは、所望する発現生成物を生成するために機能することができる発現ベクターから構成される適切な宿主細胞を通常言及する。
【００７２】
本発明の二価の二重特異的抗体は好ましくは、組換え手段により生成される。そのような方法は、当業界において広く知られており、そして原核及び真核細胞におけるタンパク質発現、及び抗体ポリペプチドの続く単離及び通常、医薬的に許容できる純度への精製を包含する。タンパク質発現のためには、L鎖及びH鎖又はそのフラグメントをコードする核酸が標準方法により発現ベクター中に挿入される。発現は、適切な原核又は真核宿主細胞、例えばCHO細胞、NSO 細胞、 SP2/0 細胞、HEK293 細胞、COS 細胞、酵母又は E.コリ 細胞において実施され、そして抗体は細胞（溶解後は、上清液又は細胞）から回収される。
【００７３】
二価の二重特異的抗体は、完全な細胞に、細胞溶解物に、又は一部精製された又は実質的に純粋な形で存在することができる。精製は、他の細胞成分又は他の汚染物、例えば他の細胞核酸タンパク質を排除するために、標準の技法、例えばアルカリ/SDS処理、カラムクロマトグラフィー、及び当業界において知られている他の技法により実施される。Ausubel, F., et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照のこと。
【００７４】
NS0細胞における発現は、例えばBarnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123;及びBarnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270により記載されている。一過性発現が、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9により記載される。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 89 (1992) 4285-4289;及び Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87により記載されている。好ましい一過性発現システム（HEK293）は、Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 及びSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199により記載される。
【００７５】
原核生物のために適切である制御配列は、プロモーター、任意にはオペレーター配列及びリボソームに結合部位を包含する。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを使用することが知られている。
【００７６】
核酸は、それがもう１つの核酸配列と機能的関係に配置される場合、“操作可能的に結合される”。例えば、前配列又は分泌リーダーのためのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためのDNAに操作可能的に結合され；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に操作可能的に結合され；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するために配置される場合、コード配列に操作可能的に結合される。一般的に、“操作可能的に結合される”とは、結合されるDNA配列が連続的であり、そして分泌リーダーの場合、連続的且つ読み取り枠を整合して存在することを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続的であるべきではない。結合は、便利な制限部位での連結により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、従来の実施に従って使用される。
【００７７】
二価の二重特異的抗体は、従来の免疫グロブリン精製方法、例えばプロテインA−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーにより、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするDNA及びRNAは、従来の方法を用いて、容易に単離され、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNA及びRNAの源として作用することができる。単離されると、DNAは発現ベクター中に挿入され、次に宿主細胞、例えば免疫グロブリンタンパク質を生成しない、HEK293細胞、CHO細胞又は骨髄腫細胞中にトランスフェクトされ、宿主細胞において組換えモノクローナル抗体の合成が得られる。
【００７８】
二価の二重特異的抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド配列変化を抗体DNA中に導入することにより、又はヌクレオチド合成により調製される。しかしながら、そのような修飾は、例えば上記のように、非常に制限された範囲でのみ、実施され得、例えば、修飾は、上記抗体特性、例えばIgGイソタイプ及び抗原結合を変更しないが、しかし組換え生成の収率、タンパク質安定性を改良するか、又は精製を促進する。
次の例、配列の列挙及び図は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は付随する請求項に示されている。修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解される。
【００７９】
配列表：
配列番号１：野生型<IGF-1R>抗体H鎖のアミノ酸配列。
配列番号２：野生型<IGF-1R>抗体L鎖のアミノ酸配列。
配列番号３：<IGF-1R> CL-CHl交換抗体のH鎖** (HC**)のアミノ酸配列、ここでH鎖ドメインCH1はL鎖ドメインCLにより置換される。
配列番号４：<IGF-1R> CL-CHl交換抗体のL鎖** (LC**)のアミノ酸配列、ここでL鎖ドメインCLはH鎖ドメインCH1により置換される。
配列番号５：IGF−1R外ドメインHis−ストレプタビジン結合ペプチド−標識（IGF-1R-His-SBP ECD）のアミノ酸配列。
【００８０】
配列番号６：野生型ANGPT2<ANGPT2>抗体H鎖のアミノ酸配列。
配列番号７：野生型ANGPT2<ANGPT2>抗体L鎖のアミノ酸配列。
配列番号８：knobs-into-holes技法への使用のためのT366W交換を有するCH3ドメイン（knobs）のアミノ酸配列。
配列番号９：knobs-into-holes技法への使用のためのT366S、L368A、Y407V交換を有するCH3ドメイン（Hole）のアミノ酸配列。
配列番号10：IGF−1R外ドメインHis−ストレプタビジン結合ペプチド−標識（IGF-1R-His-SBP ECD）のアミノ酸配列。
【実施例】
【００８１】
材料及び一般方法：
ヒト免疫グロブリンL及びH鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に与えられている。抗体鎖のアミノ酸はEU番号付けに従って、番号付けされ、そして言及される（Edelman, G.M., et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)）。
【００８２】
組換えDNA技法：
標準方法が、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されるように、DNAを操作するために使用された。分子生物学的試薬が、その製造業者の指示に従って使用された。
【００８３】
遺伝子合成：
所望する遺伝子セグメントを、化学合成により製造されたオリゴヌクレオチドから調製した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を両端に有する、600-1800bpの長さ遺伝子セグメントを、PCR増幅を包含するオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結によりアセンブリーし、そして続いて、示される制限部位、例えばKpnI/SacI又はAxI/PacIを通して、pPCRScript(Stratagene)に基づくpGA4クローニングベクター中にクローン化した。サブクローン化された遺伝子フラグメントのDNA配列を、DNA配列決定により確かめた。遺伝子合成フラグメントを、Geneart (Regensburg, Germany)での得られる規格に従って意図した。
【００８４】
DNA配列決定：
DNA配列を、MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany) 又はSequiserve GmbH (Vaterstetten, Germany)で実施される二本鎖配列決定により決定した。
【００８５】
DNA及びタンパク質配列分析及び配列データ管理：
GCG's (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)ソフトウェアパッケージバージョン10.2及びInfomax's Vector NTl Advance suiteバージョン8.0を、配列創造、マッピング、分析、注釈及び例解のために使用した。
【００８６】
発現ベクター：
記載される抗体の発現のために、CMV-イントロンAプロモーターによるcDNA構成又はCMVプロモーターによるゲノム構成のいずれかに基づいての一過性発現（例えば、HEK293 EBNA 又はHEK293-Fにおける）細胞のための発現プラスミドの変異体を適用した。
抗体発現カセットの他に、ベクターは、次のものを含んだ：
−E. コリにおいてこのプラスミドの複製を可能にする複製の起点、及び
−E. コリにおいてアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子。
抗体遺伝子の転写ユニットは、次の要素から構成される：
−5’末端でのユニーク制限部位、
−ヒトサイトメガロウィルスからの即時初期エンハンサー及びプロモーター、
−cDNA構成の場合、続くイントロンA配列、
−ヒト抗体遺伝子の5’−非翻訳領域、
−免疫グロブリンH鎖シグナル配列、
−cDNAとしての又は免疫グロブリンエキソン-イントロン構成を伴ってのゲノム構成としてのヒト抗体鎖（野生型、又はドメイン交換を有する）、
−ポリアデニル化シグナル配列を有する3’未翻訳領域、及び
−3’末端でのユニーク制限部位。
【００８７】
下記のような記載される抗体鎖を含んで成る融合遺伝子を、PCR及び/又は遺伝子合成により生成し、そしてそれぞれのベクターにおけるユニーク制限部位を用いて、核酸セグメントの結合により、既知組換え方法及び技法によりアセンブリーした。サブクローン化された核酸配列を、DNA配列決定により確証した。一過性トランスフェクションのために、多量のプラスミドを、形質転換されたE. コリ培養物（Nucleobond AX, Macherey-Nagel）からのプラスミド調製物により調製した。
【００８８】
細胞培養技法：
標準の細胞培養技法を、Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Incに記載されるようにして使用した。
【００８９】
二重特異的抗体を、付着的に増殖するHEK293-EBNAにおける、又は下記のような懸濁液において増殖するHEK29-F細胞における、それぞれの発現プラスミドの一過性同時トランスフェクションにより発現した。
【００９０】
HEK293-EBNAシステムにおける一過性トランスフェクション：
二重特異的抗体を、10% Ultra Low IgG FCS (ウシ胎児血清, Gibco)、2 mM L-グルタミン (Gibco)及び 250 μg/ml Geneticin (Gibco)により補充されたDMEM（ダルベッコ変性イーグル培地, Gibco）において培養された、付着的に増殖するHEK293-EBNA細胞（エプスタイン-バールウィルス核抗原を発現するヒト胚腎臓細胞系293；ATCC寄託番号CRL-10852, ロット959218）におけるそれぞれの発現プラスミド（例えば、H鎖及び修飾されたH鎖、及びその対応するL鎖及び修飾されたL鎖をコードする）の一過性同時トランスフェクションにより発現した。トランスフェクションのために、FuGENETM 6 トランスフェクション 試薬 (Roche Molecular Biochemicals)を、４：１（３：１〜６：１の範囲）の比率のFuGENETM試薬（μl）：DNA（μg）において使用した。
【００９１】
タンパク質を、それぞれ、１：１（等モル）（１：２〜２：１の範囲）のモル比の（修飾された及び野生型）L鎖コードのプラスミド：H鎖コードのプラスミドを用いて、それぞれのプラスミドから発現した。細胞は、３日目で、Lグルタミン（4mM）、グルコース（Sigma）及びNAA（Gibco）を供給された。二重特異的抗体含有細胞培養上清液を、遠心分離により、トランスフェクションの５〜11日後、収穫し、そして-20℃で貯蔵した。例えばHEK293細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に与えられる。
【００９２】
HEK293-Fシステムにおける一過性トランスフェクション：
二重特異的抗体を、HEK293-Fシステム（Invitrogen）を用いて、その製造業者の指示に従って、それぞれのプラスミド（例えば、H鎖及び修飾されたH鎖、及びその対応するL鎖及び修飾されたL鎖をコードする）の一過性トランスフェクションにより生成した。手短に言及すると、血清を有さないFreeStyle293発現培地（Invitrogen）を含む、振盪フラスコ又は撹拌された発酵器において増殖するHEK293-F細胞（Invitrogen）を、４種の発現プラスミド及び293フェクチン又はフェクチン（Invitrogen）の混合物によりトランスフェクトした。2Lの振盪フラスコ（Corninｇ）に関しては、HEK293-F細胞を、600mlにおいて1.0×106個の細胞/mlの密度で接種し、そして120rpm, 8％CO2下でインキュベートした。
【００９３】
この後、細胞を、A）それぞれ、H鎖又は修飾されたH鎖、及びその対応するL鎖を当モル比でコードする全プラスミドDNA（1μg/ml）600μgを含むOpti-MEM（Invitrogen）20ml、及びB)20mlのOpti-MEM及び1.2mlの293フェクチン又はフェクチン（2μl/ml）の混合物（約42ml）により、約1.5×106個の細胞/mlの細胞密度でトランスフェクトした。グルコース消費に従って、グルコース溶液を、発酵の間、添加した。分泌された抗体を含む上清液を、５〜10日後、収穫し、そして抗体を上清液から直接的に精製するか、又は上清液を凍結し、そして貯蔵した。
【００９４】
タンパク質決定：
精製された抗体及び誘導体のタンパク質濃度を、Pace, et. al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423に従ってのアミノ酸配列に基づいて計算されたモル消衰係数を用いて、280nmでの光学密度（OD）を決定することにより決定した。
【００９５】
上清液において抗体濃度決定：
細胞培養上清液における抗体及び誘導体の濃度を、プロテインAアガロースビーズ（Roche）による免疫沈澱法により推定した。60μlのプロテインAアガロースビーズを、TBS-NP40 (50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet-P40)により３度、洗浄した。続いて、１〜15mlの細胞培養上清液を、TBS-NP40において予備-平衡化されたプロテインAアガロースビーズに適用した。室温での１時間のインキュベーションの後、ビーズを、Ultrafree- MC-filter カラム (Amicon)上で、0.5mlのTBS-NP40により１度、0.5mlの２×リン酸緩衝溶液（２×PBS, Roche）により、２度、及び0.5mlの100mMのクエン酸ナトリウム（pH5.0）により、すばやく４度、洗浄した。
【００９６】
供給された抗体を、35μlのNuPAGE（商標）LDS サンプル緩衝液 (Invitrogen)の添加により溶出した。サンプルの半分を、それぞれNuPAGE（商標） サンプル還元剤と共に組合すか、又は末還元のままにし、そして70℃で10分間、加熱した。続いて、５〜30μlを、4-12% NuPAGE（商標） Bis-Tris SDS- PAGE (Invitrogen)（還元されていないSDS-PAGEのためにはMOPS緩衝液、及び還元されたSDS-PAGEのためには、NuPAGE（商標） 抗酸化ランニング緩衝液添加剤（Invitrogen）と共にMES緩衝液を用いる）に適用し、そしてクーマシーブルーにより染色した。
【００９７】
細胞培養上清液における抗体及び誘導体の濃度を、親和性HPLCクロマトグラフィーにより定量的に測定した。手短に言及すると、プロテインAに結合する抗体及び誘導体を含む細胞培養上清液を、200mMのKH2PO4、100mMのクエン酸ナトリウム（pH7.4）を含むApplied Biosystems Poros A/20カラムに適用し、そしてAgilent HPLC1100システム上で、200mMのNaCl、100mMのクエン酸（pH2.5）によりマトリックスから溶出した。溶出されたタンパク質を、UV吸光度及びピーク領域の積分により定量化した。精製された標準のIgG1抗体が、標準として作用した。
【００９８】
他方では、細胞培養上清液における抗体及び誘導体の濃度を、Sandwich-IgG-ELISAにより測定した。手短に言及すれば、StreptaWell High Bind Strepatavidin A-96 ウエルマイクロタイタープレート (Roche)を、100μl/ウェルのビオチニル化された抗−ヒトIgG捕獲分子F(ab')2<h-Fcγ> BI (Dianova)により、0.1μg/mlで室温で１時間、又は他方では、4℃で一晩、被覆し、そして続いて、200μl/ウェルのPBS、0.05％Tween（PBST, Sigma）により３度、洗浄した。
【００９９】
それぞれの抗体含有細胞培養上清液のPBS（Sigma）中、希釈溶液シリーズ100μlを、ウェル当たり添加し、そして室温でマイクロタイタープレートシェーカー上で１〜２時間インキュベートした。ウェルを、200μl/ウェルのPBSTにより３度、洗浄し、そして結合された抗体を、室温でマイクロタイタープレートシェーカー上で１〜２時間、検出抗体として、0.1μg/mlでの100μlのF(ab')2<hFcγ>POD (Dianova)により検出した。結合されなかった検出抗体を、200μl/ウェルのPBSTにより３度、洗浄し、そして結合された検出抗体を、100μlのABTS/ウェルの添加により検出した。吸光度の決定を、405nmの測定波長（492nmの参照波長）でTecan Fluor分光計上で実施した。
【０１００】
タンパク質精製：
タンパク質を、標準プロトコールに従って、濾過された細胞培養上清液から精製した。手短に言及すると、抗体を、プロテインAセファロースカラム（GE healthcare）に適用し、そしてPBSにより洗浄した。抗体の溶出を、pH2.8で達成し、続いてすぐに、サンプルを中和した。凝集されたタンパク質を、PBS又は20mMのヒスチジン、150mMのNaCl（pH6.0）中、サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200, GE Healthcare）により、モノマー抗体から分離した。モノマー抗体画分をプールし、必要なら、例えばMILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO)遠心分離濃縮機を用いて濃縮し、凍結し、そして-20℃〜-80℃で貯蔵した。サンプルの一部を、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー又は質量分光法による、続くタンパク質の分析及び分析特徴化のために供給する。
【０１０１】
SDS-PAGE：
NuPAGE（商標） Pre-Cast ゲルシステム(Invitrogen)を、その製造業者の指示に従って使用した。特に、10％又は４〜12％のNuPAGE（商標） Novex（商標） Bis- TRIS Pre-Castゲル(pH 6.4) 及びNuPAGE（商標） MES（NuPAGE（商標）抗酸化剤ランニング緩衝液添加剤により還元されたゲル）又はMOPS（還元されていないゲル）ランニング緩衝液を使用した。
【０１０２】
分析用サイズ排除クロマトグラフィー：
抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー処理を、HPLCクロマトグラフィーにより実施した。手短に言及すると、プロテインA精製された抗体を、Agilent HPLC 1100システム上、300mMのNaCl、50mMのKH2PO4/K2HPO4（pH7.5）中、Tosoh TSKgel G3000SWカラムに、又はDionex HPLC-システム上、２×PBS中、Superdex 200 カラム (GE Healthcare)に適用した。溶出されたタンパク質を、UV吸光度及びピーク領域の積分により定量化した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901が、標準として作用した。
【０１０３】
質量分光法：
クロスオーバー抗体の全体の脱グリコシル化された質量を、電子噴霧イオン化質量分析（ESI-MS）により、決定し、そして確かめた。手短に言及すると、100μgの精製された抗体を、100mMのKH2PO4/K2HPO4（pH7）中、50mUのN-Glycosidase F (PNGaseF, ProZyme)により、37℃で12〜24時間、2mg/mlまでのタンパク質濃度で脱グリコシル化し、そして続いてSephadex G25カラム(GE Healthcare)上、HPLCにより脱塩した。それぞれのH及びL鎖の質量を、脱グリコシル化及び還元の後、ESI-MSにより決定した。手短に言及すると、115μl中、50μgの抗体を、60μlの1MのTCEP及び50μlの8Mのグアニジン塩酸塩と共にインキュベートし、続いて脱塩した。還元されたH及びL鎖の合計質量及び質量を、NanoMate源を備えたQ−Star Elite MSシステム上でESI-MSにより決定した。
【０１０４】
IGF-1R ECD結合ELISA：
生成された抗体の結合性質を、IGF-1R細胞外ドメイン（ECD）によるELISAアッセイにおいて評価した。このために、天然のリーダー配列、及びN−末端His−ストレプタビジン結合ペプチド−標識（His-SBP）に融合されるα鎖（McKernなど., 1997；Wardなど., 2001によれば）のヒトIGF-IR外ドメインのLI−システインに富んでいる12個のドメインを含んで成る細胞外ドメインを、pcDNA3ベクター誘導体中にクローン化し、そしてHEK293F細胞において一過性に発現した。IGF-1R-His-SBP ECDのタンパク質配列は、配列番号10で与えられている。StreptaWell High Bind Strepatavidin A-96ウェルマイクロタイタープレート（Roche）を、可溶性IGF-1R-ECD-SBP融合タンパク質を含む細胞培養上清液100μl（ウェル当たり）により、4℃で一晩、被覆し、そして200μl/ウェルのPBS、0.05％Tween (PBST, Sigma)により３度、洗浄した。
【０１０５】
続いて、１％BSA（画分V, Roche）を含むPBS（Sigma）中、それぞれの抗体の及び対照野生型<IGF-1R>抗体としての100μl/ウェルの一連の希釈溶液をウェルに添加し、そしてマイクロタイタープレートシェーカー上で室温で１〜２時間インキュベートした。一連の希釈溶液に関しては、同じ量の精製された抗体がウェルに適用された。ウェルを200μl/ウェルのPBSTにより３度、洗浄し、そして結合された抗体を、マイクロタイターシェーカー上で室温で１〜２時間、検出抗体として100μl/ウェルの0.1μg/ml（１：8000）のF(ab')2<hFcγ>POD (Dianova)を用いて検出した。未結合の検出抗体を、200μl/ウェルのPBSTにより３度、洗浄し、そして結合された検出抗体を、ウェル当たり100μlのABTSの添加により検出した。吸光度の検出を、405nmの測定波長（対照波長492nm）でTecan Fluor分光計上で実施した。
【０１０６】
IGF-1R ECD Biacore：
生成された抗体のヒトIGF-1R ECDへの結合をまた、BIACORE TlOO測定機(GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden)を用いて、表面プラスモン共鳴法により調査した。手短に言及すれば、親和性測定のために、ヤギ−抗ヒトIgG、 JIR 109-005-098抗体を、標識されたヒトIGF-1R-ECD-Fcに対する抗体の表示のためにアミンカップリングを通してCM5チップ上に固定した。結合を、HBS緩衝液（HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20, ph 7.4)）において25℃で測定した。IGF-IR ECD (R&D Systems又は内部精製された)を、溶液中、種々の濃度で添加した。
【０１０７】
会合を、80秒〜３分のIGF-1R ECD注入により測定し；解離を、HBS緩衝液によりチップ表面を３〜10分間、洗浄することにより測定し、そしてKD値を１：１ラングミュア結合モデルを用いて評価した。低い負荷密度及び<IGF-1R>抗体の捕獲レベルのために、一価のIGF-1R ECD結合を得た。負の対照データ（例えば、緩衝液曲線）を、システムイントリンシック基線変動の補正及びノイズシグナル低減のためにサンプル曲線から減算した。Biacore T100評価ソフトウェアバージョン1.1.1を、センサーグラムの分析及び親和性データの計算のために使用した。図11は、Biacoreアッセイのスキームを示す。
【０１０８】
例１：
可変ドメインCL及びCH1がお互いにより置換されている、二価の単一特異的<IGF-1R>抗体の生成、発現、精製及び特徴化（本明細書においては、<IGF-1R>CL-CH1交換抗体として略される）：
例1A：
二価の単一特異的<IGF-1R>CL-CH1交換抗体のための発現プラスミドの製造：
この例に記載されるそれぞれのリーダー配列を含む、二価の単一特異的<IGF-1R>CL-CH1交換抗体のH鎖及びL鎖可変ドメインについての配列を、WO2005/005635号に記載されるヒト<IGF-1R>抗体H鎖（配列番号１、プラスミド4843-pUC-HC-IGF-lR）及びL鎖（配列番号２、プラスミド4842-pUC-LC-IGF-lR）から誘導し、そしてH鎖及びL鎖不変ドメインヒト抗体（C-κ及びIgG1）から誘導した。
【０１０９】
<IGF-1R>抗体リーダー配列、H鎖可変ドメイン（VH）及びヒトκ−L鎖不変ドメイン（CL）をコードする遺伝子セグメントを連結し、そしてヒトγ1−H鎖不変ドメインのFcドメイン（ヒンジ−CH2-CH3）の5’末端に融合した。CLドメインによるCH1ドメインの交換(CHl-CL交換)に起因するそれぞれの融合タンパク質をコードするDNAを、遺伝子合成により生成し、そして以下、<IGF-1R> HC** (配列番号3)と称する。
【０１１０】
<IGF-1R>抗体リーダー配列、L鎖可変ドメイン（VL）及びヒトγ1−H鎖不変ドメイン（CH1）をコードする遺伝子セグメントを、独立した鎖として連結した。CH1ドメインによるCLドメインの交換(CL-CHl交換)に起因するそれぞれの融合タンパク質をコードするDNAを、遺伝子合成により生成し、そして以下、<IGF-1R> LC** (配列番号4)と称する。
図５及び６は、修飾された<IGF-1R>HC**H鎖及び修飾された<IGF-1R>LC**L鎖のタンパク質配列の図示である。
【０１１１】
次に、それぞれの発現ベクターが簡単に記載されている：
ベクターPUC-HC**IGF-1R：
ベクターPUC-HC**-IGF-1Rは、例えばHEK293（EBNA）細胞におけるCL-CH1交換<IGF-1R>H鎖HC**（cDNA構成発現カセット；CMV-イントロンAを含む）の一過性発現のための、またはCHO細胞における安定発現のための発現プラスミドである。
【０１１２】
<IGF-1R>HC**発現カセットの他に、このベクターは、次のものを含む：
−E. コリにおけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製の起点、及び
−E. コリにおける耐アンピシリン性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。
<IGF-1R>HC**遺伝子の転写単位は、次の要素から構成される：
−5’末端でのAscI制限部位、
−ヒトサイトメガロウィルスからの即時初期エンハンサー及びプロモーター、
−続くイントロンA配列、
−ヒト抗体遺伝子の5’−末翻訳領域、
−免疫グロブリンL鎖シグナル配列、
−ヒトH鎖可変ドメイン（VH）、及びヒトγ1−H鎖不変ドメイン（Hinge-CH2-CH3）のFcドメインの5’−末端に融合されるヒトκ−L鎖不変ドメイン（Cl）の融合体をコードするヒト<IGF-1R>成熟HC**鎖、
−ポリアデニル化シグナル配列を有する3’末翻訳領域、及び
−3’末端での制限部位SgrAI。
【０１１３】
H鎖**CL-CH1交換<IGF-1R>HC**発現ベクターpUC-HC**-IGF-1Rのプラスミド地図が図７に示される。<IGF-1R>HC**のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）が、配列番号３で与えられる。
【０１１４】
ベクターpUC-LC**-IGF-1R：
ベクターPUC- LC**-IGF-1Rは、例えばHEK293（EBNA）細胞におけるCL-CH1交換<IGF-1R>L鎖LC**（cDNA構成発現カセット；CMV-イントロンAを含む）の一過性発現のための、またはCHO細胞における安定発現のための発現プラスミドである。
【０１１５】
<IGF-1R>LC**発現カセットの他に、このベクターは、次のものを含む：
−E. コリにおけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製の起点、及び
−E. コリにおける耐アンピシリン性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子。
<IGF-1R>LC**遺伝子の転写単位は、次の要素から構成される：
−5’末端でのSse8387I制限部位、
−ヒトサイトメガロウィルスからの即時初期エンハンサー及びプロモーター、
−続くイントロンA配列、
−ヒト抗体遺伝子の5’−末翻訳領域、
−免疫グロブリンH鎖シグナル配列、
−ヒトL鎖可変ドメイン（VL）、及びヒトγ1−H鎖不変ドメイン（CH1）の融合体をコードするヒト<IGF-1R>抗体成熟LC**鎖、
−ポリアデニル化シグナル配列を有する3’末翻訳領域、及び
−3’末端での制限部位SalI and FseI。
【０１１６】
L鎖**CL-CH1交換<IGF-1R>LC**発現ベクターpUC-LC**-IGF-1Rのプラスミド地図が図８に示される。<IGF-1R>LC**のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）が、配列番号４で与えられる。
【０１１７】
プラスミドpUC-HC**-IGF-1R及びpUC-LC**-IGF-1Rは、例えばHEK293、HEK293EBNA又はCHO細胞中への一過性又は安定性同時トランスフェクションのために使用され得る（２−ベクターシステム）。比較理由のために、野生型<IGF-1R>抗体は、この例に記載されるプラスミドに類似するプラスミド4842-pUC-LC-IGF-lR (配列番号 2) 及び 4843-pUC- HC-IGF-IR (配列番号1)から一時的に発現された。
【０１１８】
HEK293EBNA細胞における高発現レベルの一過性発現を達成するために、<IGF-1R>HC**発現カセットがAscI、SgrAI部位を通してサブクローン化され、そして<IGF-1R>LC**発現カセットがSse8387I及びFseI部位を通して、下記のものを含む4700 pUC-Hyg_OriP発現ベクター中にサブクローン化され得る：
−OriP要素、及び
−選択マーカーとしての耐ヒグロマイシン性遺伝子。
【０１１９】
H及びL鎖転写単位は、同時トランスフェクションのために２種の独立した4700-pUC-Hyg-OriPベクター（２−ベクターシステム）中にサブクローン化され得るか、又は得られるベクターによる続く一時的又は安定したトランスフェクションのために１つの通常の4700-PUC-Hyg-OriPベクター（１−ベクターシステム）中にクローン化され得る。図９は、基本ベクター4700-pUC-OriPのプラスミド地図を示す。
【０１２０】
例１B：
二価の単一特異的<IGF-1R>CL-CH1交換抗体発現プラスミドの製造：
野生型<IGF-1R>抗体の交換されたFab配列を含んで成る<IGF-1R>融合遺伝子（HC**及びLC**融合遺伝子）を、相応の核酸セグメントの連結による既知組換え方法及び技法によりアセンブリーした。
【０１２１】
IGF-1R HC**及びLC**をコードする核酸配列を、それぞれ、Geneart（Regensburg, Germany）で、化学合成により合成し、そしてpPCRScript (Stratagene)に基づくpGA4クローニングベクター中にクローン化した。IGF-1R HC**をコードする発現カセットを、それぞれ、PvuII及びBamBI制限部位を通して、それぞれのE. コリプラスミドに連結し、最終ベクターpUC-HC**-IGF-1Rをもたらし；それぞれのIGF-1R LC**をコードする発現カセットを、PvuII及びSalI制限部位を通して、それぞれのE.コリプラスミド中に連結し、最終ベクターpUC-LC**-IGF-1Rをもたらした。サブクローン化された核酸配列を、DNA配列決定により確かめた。一過性及び安定性トランスフェクションのために、多量のプラスミドを、形質転換されたE. コリ培養物（Nucleobond AX, Macherey-Nagel）からのプラスミド調製により調製した。
【０１２２】
例1C：
二価の単一特異的<IGF-1R>CL-CH1交換抗体の一過性発現、精製及び質量分光法による同一性の確認：
組換え<IGF-1R>CL-CH1交換抗体を、上記のようにして、HEK293-F懸濁細胞におけるプラスミドpUC-HC**-IGF-lR 及び pUC-LC**-IGF-lRの一過性同時トランスフェクションにより発現した。
【０１２３】
発現され、そして分泌された二価の単一特異的<IGF-1R>CL-CH1交換抗体を、上記のようにして、プロテインA親和性クロマトグラフィーにより、濾過された細胞培養上清液から精製した。手短に言及すると、一過性トランスフェクションからの<IGF-1R>CL-CH1交換抗体含有細胞培養上清液を、遠心分離及び濾過により浄化し、そしてPBS緩衝液（10 mM のNa2HPO4, 1 mMの KH2PO4, 137 mMの NaCl 及び 2.7 mMの KCl, pH 7.4）により平衡化されたProtein A HiTrap MabSelect Xtra カラム(GE Healthcare)に適用した。末結合のタンパク質をPBS平衡化緩衝液、続いて0.1Mのクエン酸ナトリウム緩衝液（pH5.5）により洗浄し、そしてPBSにより洗浄した。抗体の溶出を、100mMのクエン酸ナトリウム（pH2.8）により達成し、続いてすぐに、2mlの画分当たり300μlの2Mのトリス（pH9.0）によりサンプルを中和した。
【０１２４】
凝集されたタンパク質を、HiLoad 26/60 Superdex 200 prep グレードカラム (GE Healthcare)上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、20mMのヒスチジン、150mMのNaCl（pH6.0）中、モノマー抗体から分離し、そして続いてモノマー抗体画分を、MILLIPORE Amicon Ultra-15遠心分離機を用いて濃縮した。<IGF-1R>CL-CH1交換抗体を凍結し、そして-20℃または-80℃で貯蔵した。<IGF-1R>CL-CH1交換抗体の統合性を、還元剤の存在及び不在下でのSDS-PAGEにより、及び続くクーマシーブリリアントブルーによる染色により分析した。<IGF-1R>CL-CH1交換抗体のモノマー状態を、分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより確かめた（図12）。特徴づけられたサンプルを、続くタンパク質分析及び機能的特徴化のために提供した。ESI質量分光法は、完全に脱グリコシル化された<IGF-1R>CL-CH1交換抗体の理論的分子質量を確かめた。
【０１２５】
例1D：
IGF-1R ECD結合ELISAにおける及びBiacoreによる二価の単一特異的<IGF-1R>CL-CH1交換抗体のIGF-1R結合性質の分析：
二価の単一特異的<IGF-1R>CL-CH1交換抗体の結合性質を、上記のようにして、IGF-1R細胞外ドメイン（ECD）によるELISAアッセイで評価した。このためには、天然のリーダー配列、及びN−末端His−ストレプタビジン結合ペプチド−標識（His-SBP）に融合されるα鎖（McKern et al., 1997; Ward et al., 2001）のヒトIGF-IR外ドメインのLI−システインに富む12のドメインを含んで成るIGF-1Rの細胞外ドメイン（残基１〜462）を、pcDNA3ベクター誘導体中にクローン化し、そしてHEK293F細胞において一時的に発現した。IGF-1R-His-SBP ECDのタンパク質配列を与える（上記参照のこと）。得られる滴定曲線は、<IGF-1R>CL-CH1交換抗体が機能的であることを示し、そして前記方法の誤差内で野生型<IGF-1R>抗体に匹敵できる結合特徴及び運動学を示し、そして従って十分に機能的であることが明らかになった（図13）。
【０１２６】
それらの発現は、3.7pMのKD値を有する、二価の単一特異的<IGF-1R>CL-CH1交換抗体が、3.2nMのKD値を有するオリジナル野生型<IGF-1R>抗体に匹敵できるIGF-1R ECDについての親和性及び結合運動学を有することを示した、それぞれの精製された抗体によるBiacoreデータにより確証された。
【０１２７】
例1G：
IGF-1R過剰発現性I24細胞によるFACSによる二価の単一特異的<IGF-1R>CL-CH1交換抗体のIGF-1R結合性質の分析：
I24細胞（組換えヒトIGF-1Rを発現するNIH3T3細胞、Roche）の表面上で過剰発現されるIGF-1Rに対する<IGF-1R>CL-CH1交換抗体の結合活性を確かめるために、FACSにより研究する。手短に言及すると、FACS管当たり５×105個のI24 細胞を、精製された<IGF-1R> CL-CHl交換抗体の希釈溶液及び対照としての野生型<IGF-1R>抗体と共にインキュベートし、そして氷上で１時間インキュベートした。末結合の抗体を、4mlの氷冷却されたPBS（Gibco）＋２％FCS (Gibco)により洗浄する。
【０１２８】
続いて、細胞を遠心分離し（400gで５分間）、そして結合された抗体を、光から保護された氷上のF(ab')2 <hFcγ>PE 接合体 (Dianova)により１時間、検出する。末結合の検出抗体を、4mlの氷冷却されたPBS＋２％FCSにより洗浄する。続いて、細胞を遠心分離し（400gで５分）、300〜500μlのPBSに再懸濁し、そして結合された検出抗体をFACSCalibur又はFACS Canto BD上で定量化する（FL2チャンネル、獲得当たり10,000個の細胞）。実験の間、それぞれのイソタイプ対照が、いずれかの非特異的結合現象を排除するために包含される。I24の細胞上のIGF-1Rに対する<IGF-1R>CL-CH1交換抗体及び野生型<IGF-1R>対照抗体の結合は、平均蛍光強度の比較できる濃度依存性シフトをもたらす。
【０１２９】
例２：
二価の単一特異的<ANGPT2>野生型抗体の説明：
例2A：
二価の単一特異的<ANGPT2>野生型抗体のための発現プラスミドの製造：
この例に記載されるそれぞれのリーダー配列を含む二価の単一特異的ANGPT2<ANGPT2>野生型抗体のH鎖及びL鎖可変ドメインについての配列を、WO2006/045049号に記載されるヒト<ANGPT2>抗体H鎖（配列番号６）及びL鎖（配列番号７）から誘導し、そしてH鎖及びL鎖不変ドメインをヒト抗体（C−κ及びIgG1）から誘導する。
【０１３０】
野生型<ANGPT2>抗体を、前記例１Aに記載されるベクターに類似するプラスミドSB04-pUC-HC- ANGPT2 (配列番号6)及びSB06-pUC-LC-ANGPT2 (配列番号7)中にクローン化した。
比較理由及び同時発現実験（例３を参照のこと）のために、野生型<ANGPT2>抗体を、プラスミドSB04- pUC-HC-ANGPT2 及び SB06-pUC-LC-ANGPT2から一時的に（同時）発現した。
【０１３１】
例2B：
二価の単一特異的<ANGPT2>野生型抗体発現プラスミドの製造：
<ANGPT2>HC 及び LCをコードする核酸配列を、それぞれ、Geneart（Regensburg, Germany）で、化学合成により合成し、そして続いてpPCRScript (Stratagene)に基づくpGA4クローニングベクター中にクローン化した。<ANGPT2> HCをコードする発現カセットを、それぞれのE. コリプラスミドにクローン化し、最終ベクターSB04-pUC-HC-ANGPT2をもたらし；それぞれの<ANGPT2> LCをコードする発現カセットを、それぞれのE.コリプラスミド中にクローン化し、最終ベクターSB06-pUC-LC-ANGPT2をもたらした。サブクローン化された核酸配列を、DNA配列決定により確かめた。一過性及び安定性トランスフェクションのために、多量のプラスミドを、形質転換されたE. コリ培養物（Nucleobond AX, Macherey-Nagel）からのプラスミド調製により調製した。
【０１３２】
例３：
IGF-1Rに対して特異的に結合するH鎖及びL鎖において、不変ドメインCL及びCH1がお互いにより置換されている、二価の二重特異的<ANGPT2-IGF-1R>抗体（本明細書においては、<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体と称する）の発現：
例3A：
二重特異的<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体を生成するためにHEK293EBNA細胞における<IGF-1R>CL-CH1交換抗体及び<ANGPT2>野生型抗体の一過性同時発現及び精製：
一方では、<IGF-1R>CL-CH1交換抗体Fabを通して、及び他方では<ANGPT2>野生型Fab領域を通してIGF-1Rを認識する機能的二重特異的抗体を生成するために、<IGF-1R>CL-CH1交換抗体（例1A）をコードする２種の発現プラスミドを、<ANGPT2>野生型抗体（例2A）をコードする２種の発現プラスミドと共に同時発現した。
【０１３３】
野生型H鎖HC及びCL-CH1交換H鎖HC**の統計学的会合を仮定すれば、これは二価の二重特異的<IGF-1R-ANGPT2>CL-CH1交換抗体の生成をもたらす。両抗体が同等に十分に発現される仮定下で、及び副生成物を考慮しない場合、これは１：２：１の比の３種の主要生成物A）<IGF-1R>CL-CH1交換抗体、B）二重特異的<IGF-1R-ANGPT2>CL-CH1交換抗体、及びC)<ANGPT2>野生型抗体をもたらすはずである。いくつかの副生成物が発現され得る。しかしながら、CL-CH1ドメインのみの交換のために、副生成物の頻度は、完全なFabクロスオーバーに比較して低められるべきである。<ANGPT2>野生型抗体が<IGF-1R>野生型及び<IGF-1R>CL-CH1交換抗体よりも高い発現の一過性発現収率を示すので、<ANGPT2>野生型抗体プラスミド及び<IGF-1R>CL-CH1交換抗体プラスミドの比率は、<ANGPT2>野生型抗体の発現のためにシフトされたことを注目すること。
【０１３４】
主要生成物A）<IGF-1R>CL-CH1交換抗体、B）二重特異的<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体、及びC)<ANGPT2>野生型抗体の混合物を生成するために、４種のプラスミドpUC-HC**-IGF-lR 及びpUC- LC**-IGF-1R 及び プラスミドSB04-pUC-HC-ANGPT2 及び SB06-pUC-LC-ANGPT2を、上記のようにして懸濁HEK293-F細胞において一時的に同時トランスフェクトした。収穫された上清液は、主要生成物A）<IGF-1R>CL-CH1交換抗体、B）二重特異的<ANGPT2-IGF-1R->CL-CH1交換抗体、及びC)<ANGPT2>野生型抗体の混合物を含み、そして“二重特異的CL-CH1交換混合物”と命名する。二重特異的CL-CH1交換混合物含有細胞培養上清液を、遠心分離により収穫し、そして続いて、上記のようにして精製した（図14を参照のこと）。
【０１３５】
抗体混合物の統合性を、記載されるように、還元剤の存在及び不在下でSDS−PAGEにより及びクーマシーブリリアントブルーによる続く染色により分析した。SDS−PAGEは、予測されるように、調製物に２種の異なったH及びL鎖が存在したことを示した（還元されたゲル）。抗体混合物のモノマー状態を、分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより確かめ、そして精製された抗体種がモノマー状態で存在することを示した。特徴づけられたサンプルを、続くタンパク質分析及び機能的特徴化のために提供した。
【０１３６】
例3B：
I24 IGF-1R発現細胞に対する細胞FACS架橋アッセイにおける機能的二重特異的<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体の検出：
例3Aに記載される一過性同時発現からの主要生成物A）<IGF-1R>CL-CH1交換抗体、B）二重特異的<ANGPT2-IGF-1R->CL-CH1交換抗体、及びC)<ANGPT2>野生型抗体の精製された二重特異的CL-CH1交換混合物における機能的二重特異的<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体の存在を確かめるために、I24細胞（組換えヒトIGF-1Rを発現するNIH3T3細胞、Roche）に対する細胞性FACS IGF-1R-ANGPT２架橋アッセイを実施した。このアッセイ原理は図10に示される。精製された抗体混合物に存在する二重特異的<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体は、I24細胞におけるIGF-1R及びANGPT2に同時に結合することができ；そして従って、２種の相互Fab領域を有するその２種の標的抗原を架橋するであろう。
【０１３７】
手短には、FACS管当たり５×105個のI24細胞を、精製された全抗体混合物と共にインキュベートし、そして氷上で１時間インキュベートした（滴定160μg/mlの混合物）。それぞれの精製された抗体野生型<IGF-1R>及び<ANGPT2>を、対照としてI24細胞に適用した。未結合の抗体を、4mlの氷冷却されたPBS（Gibco）＋2%FCS(Gibco)により洗浄し、細胞を遠心分離し（400gで５分）、そして結合された二重特異的抗体を、氷上で１時間、2μg/mlのヒトANGPT2（R&D Systems）50μlにより検出した。
【０１３８】
続いて、未結合のANGPT2を4mlの氷冷却されたPBS（Gibco）＋２％FCS（Gibco）により１又は２度、洗浄し、細胞を遠心分離し（400gで５分）、そして結合されたANGPT2を、氷上で45分間、5μg/mlの<ANGPT2>mIgG1-Biotin抗体（BAM0981, R&D Systems）50μlにより検出し；他方では、細胞を5μg/mlのmIgG1-Biotin-イソタイプ対照（R&D Systems）50μlと共にインキュベートした。未結合の検出抗体を、4mlの氷冷却されたPBS（Gibco）＋2％FCS（Gibco）により洗浄し、細胞を遠心分離し（400gで５分間）、そして結合された検出抗体を、光から保護された氷上で45分間、50μlの１：400のストレプタビジン：PE接合体（Invitrogen/Zymed）により検出した。
【０１３９】
未結合のストレプタビジン−PE接合体を、4mlの氷冷却されたPBS＋2％FCSにより洗浄した。続いて、細胞を遠心分離し（400gで５分間）、300〜500μlのPBSに再懸濁し、そして結合されたストレプタビジン−PE接合体をFACSCalibur BD（FL2チャンネル、獲得当たり10,000個の細胞）上で定量化した。実験の間、それぞれのイソタイプ対照が、いずれかの非特異的結合現象を排除するために包含された。さらに、精製された二価の単一特異的IgG1抗体<IGF-1R>及び<ANGPT2>が対照として包含された。
【０１４０】
図15における結果は、野生型抗体（<ANGPT2>野生型抗体）と共にクロスオーバー抗体（<IGF-1R>CL-CH1交換抗体）の同時発現からの精製された抗体クロスオーバー混合物（<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体）とのインキュベーションが、I24細胞におけるIGF-1R及びANGPT2に同時結合できる機能的二重特異的<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体の存在を示す蛍光の有意なシストをもたらし；そして従って２種の相反するFab領域を有するその２種の標的抗原を架橋することを示す。これとは対照的に、それぞれの<IGF-1R>及び<Ang-2>対照抗体は、FACS架橋アッセイにおける蛍光のシフトをもたらさなかった。
【０１４１】
それらを一緒に考慮すると、データは、それぞれの野生型及びクロスオーバープラスミドの同時発現により、機能的な二重特異的抗体が生成され得ることを示す。正しい二重特異的抗体の収率は、例えばknobs-into-holes技法及びジスルフィド安定化を用いて、野生型及び修飾されたクロスオーバーH鎖の正しいヘテロダイマー化を強制することにより高められ得る（例４を参照のこと）。
【０１４２】
例４：
修飾されたCH3ドメインを有する二価の二重特異的<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体の発現（knobs-into-holes）：
二重特異的<ANGPT2-IGF-1R>Cl-CH1交換抗体の収率をさらに改良するために、knobs-into-holes技法を、<IGF-1R>CL-CH1交換及び野生型<ANGPT2>抗体の同時発現に適用し、均質で且つ機能的な二重特異的抗体調製物を得た。このためには、<IGF-1R>CL-CH1交換抗体のH鎖*HC*におけるCH3ドメインを、T366W交換を有する配列番号８のCH3ドメイン（Knobs）により置換し、そして野生型<ANGPT2>抗体のH鎖におけるCH3ドメインをT366S、L368A、Y407V交換を有する配列番号９のCH3ドメイン（Hole）により置換し、又は逆もまた同様である。さらに、ジスルフィドが、安定性及び収率を高めるために包含され、そしてイオン架橋を形成し、そしてヘテロダイマー化の収率を高める追加の残基を包含され得る（EP1870459A1号）。
【０１４３】
修飾されたCH3ドメイン（knobs-into-holes）を有するその得られる二価の二重特異的<ANGPT2-IGF-1R>CL-CH1交換抗体の一過性同時発現及び精製を、例３に記載のようにして実施する。
【０１４４】
ヘテロダイマー化の最適化は、例えば異なったknobs-in-holes技法、例えばCH3ドメイン中への追加のジスルフィド架橋の導入、例えば“knobs鎖”中へのY349Cの導入及び“hole鎖”中へのD356Cの導入を用いることにより、そして/又はknobs残基のために残基R409D；K370E(K409D), 及びhole残基のためにD399K；E357Kを用いることにより達成され得る（EP1870459A1号）。
【０１４５】
例４に類似して、ANGPT2及びもう１つの標的抗原に対して向けられた（上記ANGPT2H鎖及びL鎖、及び前記他の標的物に対して向けられた抗体のCH1-CL交換H及びL鎖**HC**及びLC**を用いて、それにより両H鎖は“knobs-in-holes”により修飾される）、又はIGF-1R及びもう１つの標的物に対して向けられた（前記他の標的物に対して向けられた抗体のH鎖及びL鎖、及び上記IGF-1R CH1-CH1-CL交換H及びL鎖**HC**LC**を用いて、それにより両H鎖は“knobs-in-hole”により修飾される）、修飾されたCH3ドメイン（knobs-in-holes）を有する追加の二価の二重特異的CH1-CL交換抗体が調製され得る。
【図１】
2011505848.tif 000003
【図２】
2011505848.tif 000004
【図３】
2011505848.tif 000005
【図４】
2011505848.tif 000006
【図５】
2011505848.tif 000007
【図６】
2011505848.tif 000008
【図７】
2011505848.tif 000009
【図８】
2011505848.tif 000010
【図９】
2011505848.tif 000011
【図１０】
2011505848.tif 000012
【図１１】
2011505848.tif 000013
【図１２】
2011505848.tif 000014
【図１３】
2011505848.tif 000015
【図１４】
2011505848.tif 000016
【図１５】
2011505848.tif 000017
【配列表】
2011505848000001.app
【国際調査報告】
2011505848.tif 000018
2011505848.tif 000019
2011505848.tif 000020
2011505848.tif 000021