(57)【要約】  本発明は、おそらくVN結合部位のより効果的な露出に起因してビトロネクチン(VN)結合活性の著しい増大を示す、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体(uPAR)のバリアントに関する。本発明は、uPARのVN結合部位に結合することができ、次いでuPAR機能の阻害剤として作用し、VN活性化uPAR機能の機能的アンタゴニストとして作用する、前記uPARバリアントに対して産生される抗体にも言及する。本発明において、そのような抗体は、ファージディスプレイライブラリ由来の合成抗体(scFv)のような、モノクローナル、ポリクローナル、その合成または組換え誘導体である。本発明の抗体は、競合アンタゴニストとして作用する。
2014529581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型分子に対して、VN結合活性が増大したウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体(uPAR)バリアント分子。
【請求項２】
a)野生型uPAR配列のN末端でuPAの成長因子様ドメイン(GFD)配列、および/または
b)野生型uPAR配列のC末端で抗体分子のFc領域の鎖
に連結された野生型uPARアミノ酸配列を含み、前記Fc領域の鎖が存在する場合に二量体である、請求項1に記載のuPARバリアント分子。
【請求項３】
野生型uPAR配列が、本質的に配列番号1の成熟huPARのaa.32〜92から成る配列もしくは本質的に配列番号2の成熟muPARのaa.32〜93から成る配列、またはuPARオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体を含む、請求項2に記載のuPARバリアント分子。
【請求項４】
野生型uPAR配列が、本質的に配列番号1の成熟huPARのaa.3〜271から成る配列もしくは本質的に配列番号2の成熟muPARのaa.3〜270から成る配列、またはuPARオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体を含む、請求項2に記載のuPARバリアント分子。
【請求項５】
野生型uPAR配列が、本質的に配列番号1の成熟huPARのaa.1〜277から成る配列もしくは本質的に配列番号2の成熟muPARのaa.1〜273から成る配列、またはuPARオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体を含む、請求項2に記載のuPARバリアント分子。
【請求項６】
野生型uPAR配列が、本質的に配列番号1もしくは配列番号2から成る配列、またはuPARオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体を含む、請求項2に記載のuPARバリアント分子。
【請求項７】
uPAのGFD配列が、本質的に配列番号3のヒトuPAのGFDのaa.11〜42から成る配列もしくは本質的に配列番号4のマウスuPAのGFDのaa.12〜43から成る配列、またはGDFオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のuPARバリアント分子。
【請求項８】
uPAのGFD配列が、本質的に配列番号3のヒトuPAのGFD配列からもしくは配列番号4のマウスuPAのGFD配列から、またはGFDオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体から成る、請求項1から7のいずれか一項に記載のuPARバリアント分子。
【請求項９】
Fc領域の鎖が、ヒト起源のものであり、本質的に配列番号5から成る配列を含み、またはFc領域の鎖が、マウス起源のものであり、本質的に配列番号6から成る配列、またはFc領域の鎖のオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のuPARバリアント分子。
【請求項１０】
a)uPAのGFD配列と野生型uPAR配列のN末端の間に第1のリンカー領域、および/または
b)抗体分子の前記Fc領域の鎖と前記野生型uPAR配列のC末端の間に第2のリンカー領域
をさらに含む、請求項2から9のいずれか一項に記載のuPARバリアント分子。
【請求項１１】
第1のリンカー領域が、本質的に配列番号7または配列番号8の配列から成る、請求項10に記載のuPARバリアント分子。
【請求項１２】
第2のリンカー領域が、本質的に配列番号9、配列番号10または配列番号11の配列から成る、請求項10または11に記載のuPARバリアント分子。
【請求項１３】
本質的に配列番号12、13、14、15、16または17の配列を有する配列を含む、請求項1から12のいずれか一項に記載のuPARバリアント分子。
【請求項１４】
ｕＰＡＲ機能のアンタゴニスト活性を有する特異的な抗体分子を得るためのまたは前記抗体の組換えもしくは合成抗原結合フラグメントを選択するための抗原としての、請求項1から13のいずれか一項に記載のｕＰＡＲバリアント分子の使用。
【請求項１５】
請求項1から13のいずれか一項に記載のウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体(uPAR)バリアントに結合できる抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
uPAR機能のアンタゴニスト活性を有する、請求項15に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
uPAR分子のエピトープに結合でき、前記エピトープが、R89、R91およびY92アミノ酸残基の少なくとも一つを含む、請求項15または16に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
配列番号18、19、20、21もしくは25のaa.90〜102、配列番号24のaa.90〜101および配列番号22または23からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDRH3)アミノ酸配列、
ならびに/または配列番号18、19、20、21、24もしくは25のaa.41〜57からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDRH2)アミノ酸配列、
ならびに/または配列番号18、19、20、21もしくは24のaa.22〜26および配列番号25のaa.17〜26からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDRH1)アミノ酸配列
を含む、請求項15から17のいずれか一項に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
配列番号65、66、67、68もしくは69のaa.80〜87および配列番号74もしくは85からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの軽鎖相補性決定領域(CDRL3)アミノ酸配列、
ならびに/または配列番号65、66、67、68および69のaa.41〜47からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの軽鎖相補性決定領域(CDRL2)アミノ酸配列、
ならびに/または配列番号65、66、67、68および69のaa.15〜23からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの軽鎖相補性決定領域(CDRL1)アミノ酸配列
を含む、請求項15から18のいずれか一項に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
配列番号18、19、20、21、24および25からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに/または配列番号65、66、67、68および69からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項15から19のいずれか一項に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
配列番号18、19、20、21および24からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号66、65、68、67およびは69からなる群から選択されるアミノ酸配列と、それぞれ少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項20に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
医薬として使用する、請求項15から21のいずれか一項に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
癌の治療に使用する、請求項15から21のいずれか一項に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
前立腺癌の治療に使用する、請求項15から21のいずれか一項に記載の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
請求項15から21のいずれか一項に記載の抗体、その組換えもしくは合成抗原結合フラグメントの少なくとも1つならびに適切な希釈剤および/または賦形剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体(uPAR、CD87とも呼ばれる)は、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーによって原形質膜に固定されている膜糖タンパク質である。ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子(uPA)およびその受容体(uPAR)は、生理的プロセス、例えば創傷治癒、炎症および幹細胞動員において、ならびに重篤な病態、例えばHIV-1感染、腫瘍浸潤および転移において重要な役割を果たす。ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体(uPAR)は、炎症中におよびほとんど全てのヒト癌において過剰発現している原形質膜受容体である。腫瘍細胞の接着、移動、浸潤および増殖におけるuPARの重要な役割により、この受容体は癌治療における魅力的な薬剤標的となる。腫瘍成長の抑制のためにuPA系を阻害するいくつかの治療的な戦略が開発されてきた、または現在開発されている。uPARは、細胞周囲のタンパク質分解の調節において確立された役割の他に、ビトロネクチン(VN)を含めた細胞外マトリックスに存在するタンパク質との相互作用よって細胞の接着、移動および増殖もモジュレートする。
【背景技術】
【０００２】
VNとの相互作用の重要性が、uPARのシグナル伝達活性に重要であることについてはこれまでにもたくさん書かれている(Madsen et al、2007;Smith et al、2008)が、in vivoにおけるこの相互作用の重要性は、これまで対象にされてこなかった。
【０００３】
直接的なVN相互作用は、直接的なタンパク質-タンパク質側方相互作用とは独立して、細胞の形態、移動およびシグナル伝達におけるuPAR誘導変化を開始するのに必要十分である。uPARとVNとの単独の相互作用は、uPARによって開始される、タンパク質分解に非依存的な生物学的効果の多くに関与している可能性が有る。uPAR/ビトロネクチン相互作用阻害剤の開発は別の魅力的な標的であり、天然の強力なuPAR/ビトロネクチン相互作用アンタゴニストである、ビトロネクチンのuPAR結合ソマトメジンBドメインからおそらく出発することができる。
【０００４】
WO01/17544などいくつかの国際出願は、ウロキナーゼ受容体のペプチドリガンドについて開示している。
【０００５】
W097/35969は、uPARに結合し、インテグリンおよびビトロネクチンの結合を阻害可能なペプチドについて開示している。その文書は、uPA結合については言及していない。uPAR中のペプチド結合部位は決定されておらず、文書中にペプチドの活性を遮断する機能に関するデータは全く提示されていない。
【０００６】
WO2008/073312は、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体エピトープ、およびそれに由来するモノクローナル抗体に関する。その文書は、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子受容体(uPAR)に特異的な抗体およびその抗原結合フラグメントならびに癌の治療または予防へのそれらの使用について開示している。特に、開示されている抗体は、uPAR上の特定のエピトープに特異的である。WO2008/073312に記載の抗体は、本発明に記載のエピトープと重ならないそれを認識する。
【０００７】
Rabbani SA、et al(Neoplasia (2010) 12、778〜788頁)は、前立腺癌の進行に対するモノクローナル抗uPAR抗体(ATN-658)の投与の効果をin vitroおよびin vivoで調べた。ATN-658(マウスIgG1)は、高いアフィニティー(Kd約1nM)でuPARのD2D3に結合でき、uPARに対するuPAの結合を阻害せず、uPAが結合しているときでもuPARに結合することができる。この研究において使用される抗体(ATN-658)は、WO2008/073312に記載されているものである。ATN-658抗体によって認識されるエピトープは、本発明に記載したそれと重ならない。ATN-658抗体は、uPAR中のビトロネクチン結合部位に結合しないので、uPAR/ビトロネクチン相互作用の競合アンタゴニストではない。ATN-658抗体は、別のよく特徴づけられたモノクローナル抗体R2(Sidenius et al. JBC (2002) 277 27982〜90頁)と類似のまたは同一の、uPAR中のエピトープに結合する。ATN-658は、完全なuPARおよび短縮されたD2D3受容体に同様に良く結合する。したがって、その中に記載されている抗体は、完全なuPARに優先的に結合するわけではない。
【０００８】
WO2005/116077は、二成分uPA-uPAR複合体、uPA-uPARを含む三成分複合体およびuPARとuPA以外のタンパク質(インテグリンなど)との複合体に特異的な抗体または他のリガンドを同定している。その抗体は、複合体が相互作用するさらなる分子とuPAおよびuPARとの相互作用を阻害する。そのような抗体または他のリガンドは、診断および治療方法、特に癌に対して使用される。その文書は、ビトロネクチン結合を阻害しないが、ビトロネクチン成分の組立てを阻害し;さらに、本明細書に記載したエピトープと重ならないそれを認識するリガンドについて言及している。
【０００９】
WO2006/094828は、短縮された可溶性形態のuPAR受容体(D2D3)を優先的に認識する抗体について開示している。その中に記載されている抗体は、完全なuPARに優先的に結合するわけではない。
【００１０】
CN101050237は、uPAとuPARとの相互作用を遮断できる化合物、およびその適用について開示している。その化合物は、uPAのATF、ATFフラグメント、uPARフラグメント、抗ATF抗体および抗uPAR抗体を含む。その化合物は、uPAとuPARとの相互作用を遮断することができ、アテローム性動脈硬化症を予防および治療する医薬品の調製に使用できる。
【００１１】
Tressler RJ et al.、(APMIS. 1999年 1月;107(1):168〜73頁)は、ヒトとマウスウロキナーゼ両方の成長因子ドメインに基づくウロキナーゼ受容体アンタゴニストについて開示している。そのようなアンタゴニストは、その相同な受容体に対してナノモル以下のアフィニティーを示す。ヒトIgG定常領域との融合物を調製するこれら分子のさらなる修飾は、高いアフィニティーおよび長いin vivo半減期を持つ分子をもたらした。バクテリオファージディスプレイとペプチド類似体合成との組合せにより、より小さいペプチド阻害剤が得られた。これら分子の全てが、uPA受容体に対するuPAの成長因子ドメインの結合を阻害し、ビトロネクチンに対するuPA受容体の結合を促進する。
【００１２】
Gardsvoll H, et al (J Biol Chem、2011年9月 23;286(38):33544〜56頁) は、ビトロネクチンマトリックス上における膜状仮足のuPAR依存的誘導を強化するための、uPAとビトロネクチンとの協調モデルを提唱しており;これは、uPAR機能を標的にする薬剤開発(すなわちエピトープマップしたモノクローナル抗体)に対して意味があることになる。この研究において調査した抗体のいずれも、uPA存在下でuPARへのビトロネクチン結合を遮断しない。
【００１３】
したがって、完全なuPARに優先的に結合し、uPAR機能の強力な阻害剤となる抗体が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第WO01/17544号パンフレット
【特許文献２】国際公開第WO97/35969号パンフレット
【特許文献３】国際公開第WO2008/073312号パンフレット
【特許文献４】国際公開第WO2005/116077号パンフレット
【特許文献５】国際公開第WO2006/094828号パンフレット
【特許文献６】中国第CN101050237号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Rabbani SA、et al(Neoplasia (2010) 12、778〜788頁
【非特許文献２】Sidenius et al. JBC (2002) 277 27982〜90頁
【非特許文献３】Tressler RJ et al.、(APMIS. 1999年 1月;107(1):168〜73頁
【非特許文献４】Gardsvoll H, et al (J Biol Chem、2011年9月 23;286(38):33544〜56頁
【非特許文献５】Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition、Osol, A. Ed.、1980
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、おそらくVN結合部位のより効果的な露出が原因で、ビトロネクチン(VN)結合活性の著しい増大を示す(見かけのKdが＞10,000倍増大した)、ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体(uPAR)の固有のバリアントに関係する。
【００１７】
前記uPARバリアントに対して産生されたモノクローナル抗体が、uPAR機能の強力な阻害剤であることを示した。抗体結合エピトープのマッピングは、これらの抗体がuPARのVN結合部位に結合することを示し、これらを競合アンタゴニストに分類する。上記uPARバリアントを使用して、ファージディスプレイライブラリからuPARの機能的阻害剤である合成抗体(scFv)を単離することも示した。阻害された機能は、細胞接着(図11)ならびにそれによる細胞移動および細胞増殖(細胞接着に関して下流の事象にあたる)である。これらの機能は、VN依存的である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の目的は、野生型分子に対してVN結合活性が増大したウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体(uPAR)バリアント分子である。本発明のuPARバリアント分子は、好ましくは:
a)野生型uPAR配列のN末端でuPAの成長因子様ドメイン(GFD)配列、および/または
b)野生型uPAR配列のC末端で抗体分子のFc領域の鎖
に連結された野生型uPARアミノ酸配列を含み、前記Fc領域の鎖が存在する場合に、uPARバリアント分子は二量体である。
【００１９】
「野生型uPARアミノ酸配列」とは、完全な野生型タンパク質またはVN結合活性を維持しているそのフラグメントの配列を意図している。
【００２０】
好ましい実施形態において、野生型uPAR配列は、本質的に配列番号1の成熟huPARのaa.32〜92から成る配列もしくは本質的に配列番号2の成熟muPARのaa.32〜93から成る配列、またはuPARオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体を含む。
【００２１】
より好ましくは、野生型uPAR配列は、本質的に配列番号1の成熟huPARのaa.3〜271から成る配列もしくは本質的に配列番号2の成熟muPARのaa.3〜270から成る配列、またはuPARオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体を含む。
【００２２】
さらにより好ましくは、野生型uPAR配列は、本質的に配列番号1の成熟huPARのaa.1〜277から成る配列もしくは本質的に配列番号2の成熟muPARのaa.1〜273から成る配列、またはuPARオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体を含む。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施形態において、野生型uPAR配列は、本質的に配列番号1もしくは配列番号2から成る配列、またはuPARオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体を含む。
【００２４】
本発明において、uPAのGFD配列は、好ましくは、本質的に配列番号3のヒトuPAのGFDのaa.11〜42から成る配列もしくは本質的に配列番号4のマウスuPAのGFDのaa.12〜43から成る配列、またはGDFオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体を含む。
【００２５】
本発明のuPARバリアント分子において、uPAのGFD配列は、好ましくは、本質的に配列番号3のヒトuPAのGFD配列からもしくは配列番号4のマウスuPAのGFD配列から、またはGFDオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体から成る。
【００２６】
本発明において、Fc領域の鎖は、好ましくはヒト起源のものであり、本質的に配列番号5から成る配列を含み、またはFc領域の鎖は、好ましくはマウス起源のものであり、本質的に配列番号6から成る配列、またはFc領域鎖のオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体を含む。
【００２７】
本発明のuPARバリアント分子において、Fc領域のヒト鎖は、好ましくは、本質的に配列番号5から成り、マウスFc領域は、好ましくは、本質的に配列番号6またはヒトFc領域鎖のオーソロガス遺伝子の対応領域によってコードされるポリペプチド、またはその機能的変異体もしくは誘導体または類似体から成る。
【００２８】
好ましい実施形態において、本発明のuPARバリアント分子は、
a)uPAのGFD配列と野生型uPAR配列のN末端の間に第1のリンカー領域、および/または
b)抗体分子のFc領域の鎖と野生型uPAR配列のC末端の間に第2のリンカー領域
をさらに含む。
【００２９】
好ましくは、前記第1のリンカー領域は、本質的に配列番号7または配列番号8の配列から成る。
【００３０】
第2のリンカー領域は、好ましくは、本質的に配列番号9、配列番号10または配列番号11の配列から成る。
【００３１】
好ましい実施形態において、uPARバリアント分子は、本質的に配列番号12、13、14、15、16または17の配列を有する配列を含む。
【００３２】
本発明の別の目的は、uPAR機能のアンタゴニスト活性を有する特異的な抗体分子を得るためまたは前記抗体の組換えもしくは合成抗原結合フラグメントを選択するための抗原としての、本発明のuPARバリアント分子の使用である。
【００３３】
本発明のさらなる目的は、上述したウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子受容体(uPAR)バリアントに結合できる抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントである。前記抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、好ましくは、uPAR機能のアンタゴニスト活性を有する。
【００３４】
抗体は、ヒトにおける治療適用に有用である。通常、抗体は、患者に投与した際のその抗体に対する免疫応答の危険性を最小限に抑えるために、完全ヒトまたはキメラもしくはヒト化抗体である。本明細書に記載の通り、例えば、抗原結合抗体フラグメント、抗体誘導体、および多重特異性分子など他の抗原結合分子は、そのような抗体から設計するまたは得ることができる。
【００３５】
そのような抗体の抗体結合フラグメント、ならびに改変抗体フラグメント、抗体誘導体、二重特異性抗体および他の多重特異性分子を含めたそのような抗原結合フラグメントを含む分子も本発明の目的である。
【００３６】
好ましい実施形態において、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、uPAR分子のエピトープに結合でき、前記エピトープは、R89、R91およびY92アミノ酸残基の少なくとも一つを含む。
【００３７】
好ましくは、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号18、19、20、21もしくは25のaa.90〜102、配列番号24のaa.90〜101および配列番号22または23からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDRH3)アミノ酸配列、ならびに/または配列番号18、19、20、21、24もしくは25のaa.41〜57からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDRH2)アミノ酸配列、ならびに/または配列番号18、19、20、21もしくは24のaa.22〜26;配列番号25のaa.17〜26からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの重鎖相補性決定領域(CDRH1)アミノ酸配列を含む。
【００３８】
好ましくは、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号65、66、67、68もしくは69のaa.80〜87および配列番号74もしくは85からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの軽鎖相補性決定領域(CDRL3)アミノ酸配列、ならびに/または配列番号65、66、67、68および69のaa.41〜47からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの軽鎖相補性決定領域(CDRL2)アミノ酸配列、ならびに/または配列番号65、66、67、68および69のaa.15〜23からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有する少なくとも1つの軽鎖相補性決定領域(CDRL1)アミノ酸配列を含む。
【００３９】
好ましい実施形態において、上述した抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号18、19、20、21または24のaa.22〜26と少なくとも80%の同一性を有するCDRH1アミノ酸配列、配列番号18、19、20、21または24のaa.41〜57のそれぞれと少なくとも80%の同一性を有するCDRH2アミノ酸配列、配列番号18、19、20もしくは21のaa.90〜102、または配列番号24のaa.90〜101のそれぞれと少なくとも80%の同一性を有するCDRH3アミノ酸配列を含む。
【００４０】
別の好ましい実施形態において、上述した抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号25のaa.17〜26と少なくとも80%の同一性を有するCDRH1アミノ酸配列、配列番号25のaa.41〜57と少なくとも80%の同一性を有するCDRH2アミノ酸配列、配列番号25のaa.90〜102と少なくとも80%の同一性を有するCDRH3アミノ酸配列を含む。
【００４１】
なお好ましい実施形態において、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号65、66、67、68もしくは69のaa.15〜23と少なくとも80%の同一性を有するCDRL1アミノ酸配列、配列番号65、66、67、68もしくは69のaa.41〜47のそれぞれと、少なくとも80%の同一性を有するCDRL2アミノ酸配列、配列番号65、66、67、68もしくは69のaa.80〜87のそれぞれと、少なくとも80%の同一性を有するCDRL3アミノ酸配列をさらに含む。
【００４２】
なお好ましい実施形態において、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号18、19、20、21または24のaa.22〜26と少なくとも80%の同一性を有するCDRH1アミノ酸配列、配列番号18、19、20、21または24のaa.41〜57のそれぞれと、少なくとも80%の同一性を有するCDRH2アミノ酸配列、配列番号18、19、20もしくは21のaa.90〜102、または配列番号24のaa.90〜101のそれぞれと、少なくとも80%の同一性を有するCDRH3アミノ酸配列、配列番号66、65、68、67もしくは69のaa.15〜23のそれぞれと、少なくとも80%の同一性を有するCDRL1アミノ酸配列、配列番号66、65、68、67もしくは69のaa.41〜47のそれぞれと、少なくとも80%の同一性を有するCDRL2アミノ酸配列、配列番号66、65、68、67もしくは69のaa.80〜87のそれぞれと少なくとも80%の同一性を有するCDRL3アミノ酸配列をさらに含む。
【００４３】
別の態様において、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号18、19、20、21、24および25からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに/または配列番号65、66、67、68もしくは69からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００４４】
好ましい実施形態において、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、配列番号18、19、20、21および24からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに配列番号66、65、68、67および69からなる群から選択されるアミノ酸配列と、それぞれ少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００４５】
本発明において、「少なくとも80%の同一性」とは、同一性が、参照した配列に対して少なくとも80%または少なくとも85%もしくは90%もしくは95%もしくは100%の配列同一性になり得ることを意味する。
【００４６】
好ましくは、上述した抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体またはキメラもしくはヒト化、または脱免疫化(deimmunized)もしくは完全ヒト抗体である。
【００４７】
本発明の別の目的は、医薬として使用する、特に癌治療、好ましくは前立腺癌の治療に使用する上述した抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントである。
【００４８】
上で定義した抗体、その組換えもしくは合成抗原結合フラグメントをコードしている核酸分子または上記の核酸とハイブリダイズする、もしくはその縮重した配列から成る核酸分子が、本発明のさらなる目的である。本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントをコードしている発現ベクターが、本発明のさらなる目的である。上述した核酸を含む宿主細胞が、本発明のさらなる目的である。好ましくは、宿主細胞は、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントを産生する。
【００４９】
上述した、抗体を産生する細胞を培養し、細胞培養から抗体を回収することを含む、本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントを生産する方法が、本発明のさらなる目的である。
【００５０】
本発明において、CDR配列中の1個または複数のアミノ酸を変異させることによって、開示されているCDRの変異体を生成できる。CDR中で適切に位置している単一のアミノ酸の置換は、アフィニティーを改善するのに十分であることが公知である。研究者は、部位特異的突然変異誘発法を使用して、いくつかの免疫グロブリン産物のアフィニティーを約10倍増大させた。CDRを変異させることによって抗体のアフィニティーを増大または低下させる(すなわちモジュレートする)この方法は常識である(例えば、Paul, W. E.、1993を参照のこと)。したがって、結合アフィニティーまたは特異性を増大または低下させる(すなわちモジュレートする)ための、本発明のCDRに対するアミノ酸の置換、欠失または付加もこの発明の範囲内である。
【００５１】
便宜上、本発明の好ましい抗体を、名称10H6(配列番号19および配列番号65を含む)、8B12(配列番号18および配列番号66を含む)、13D11(配列番号21および配列番号67を含む)、19.10(配列番号20および配列番号68を含む)、AL6(配列番号24および配列番号69を含む)(図9に示す)、OMD4(配列番号25を含む)(図22に示す)で識別するものとする。本発明はそのような抗体に重点を置くが、本発明の実例として本開示を一旦得たら、他の類似の抗体、およびその抗体フラグメント、ならびにこれら類似抗体の抗体フラグメントを本発明の範囲内で生産し、使用できることを当業者なら認識できよう。そのような類似抗体は、当業者によって実験に十分な量で生産できる。
【００５２】
なお好ましくは、抗体は、scFv、Fvフラグメント、Fabフラグメント、F(ab)2フラグメント、多量抗体、ペプチドまたはエピトープ結合領域を含有するタンパク質分解フラグメントである。好ましくは、scFvフラグメントは、
a)配列番号22および/もしくは74(Table3(表3)に示すように、本明細書において名称3B6で識別される)、または
b)配列番号23および/もしくは85(Table3(表3)に示すように、本明細書において名称3C10で識別される)、
を含む。本発明の抗体を含むキットまたは他の品も、本発明の部分である。
【００５３】
本発明のさらなる目的は、上述した抗体、その組換えもしくは合成抗原結合フラグメントの少なくとも1つならびに適切な希釈剤および/または賦形剤を含む医薬組成物である。組成物は、有効量の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントを含む。医薬組成物は、この分野において従来通りであり、一般常識に基づけば当業者によって作製できる。少なくとも1つの医薬として許容できる賦形剤および/またはビヒクルが入った混合物中に、抗体ならびに/またはそのフラグメントおよび/もしくは組換え誘導体および/もしくはコンジュゲートを含む医薬組成物は、本発明の範囲に含まれる。
【００５４】
対象において癌を治療および/または予防する方法であって、治療上有効な量の上述した抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントをそれを必要とする対象に投与することを含む方法も、本発明の目的である。有効な量の上述した抗体、その組換えもしくは合成抗原結合フラグメントを投与することを含めた、uPARを低下させるおよび/または阻害する方法は、本発明の目的である。
【００５５】
本発明は、治療上有効な量の本明細書に開示した抗体、pHを約4.5〜約6.5の範囲に維持する緩衝液、および場合によっては、界面活性剤を含む処方を提供する。処方は通常、活性成分濃度約0.1mg/mL〜約100mg/mLである本明細書に開示した抗体、本発明のその組換えまたは合成抗原結合フラグメントのものである。ある特定の実施形態において、抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメント濃度は、約0.1mg/mL〜1mg/mL;好ましくは1mg/mL〜10mg/mL、好ましくは10〜100mg/mLである。本明細書の目的において、「医薬組成物」は、哺乳動物、特にヒトへの投与に適合し、適切なものである。したがって、その組成物を使用して、哺乳動物における疾患または障害を治療することができる。さらに、組成物中の抗体は、治療上の使用を妨害する可能性がある汚染物質(複数可)を分離するような、1つまたは複数の精製または単離ステップに供された。一般に、医薬組成物は、治療用タンパク質および医薬として許容できる担体または希釈剤を含む。組成物は、通常無菌であり、凍結乾燥されてもよい。医薬製剤については、以下に詳述される。所望の純度の抗体を任意選択の生理的に許容できる担体、賦形剤または安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition、Osol, A. Ed.、1980)と混合することによって、凍結乾燥処方または水溶液の形態で、抗体(単数)/抗体(複数)の治療処方を調製することができる。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、利用される用量および濃度においてレシピエントに対して無毒であり、緩衝液、酸化防止剤、防腐剤、ペプチド、タンパク質、親水性ポリマー、キレート剤(EDTAなど)、糖、塩形成対イオン(ナトリウムなど);金属複合体(例えば、Znタンパク質複合体);および/または非イオン性界面活性剤(TWEEN(登録商標)、PLURONICS(登録商標)またはポリエチレングリコール(PEG)など)を含むことができる。有効成分を、例えばコアセルベーション技術によってもしくは界面重合によって調製されるマイクロカプセル(例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル)中に、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン微小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中にまたはマクロエマルジョン中に捕捉することもできる。そのような技術については、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition、Osol, A. Ed.、1980に開示されている。in vivo投与に使用しようとする処方は、滅菌されなければならない。これは、無菌の濾過膜で濾過することによって容易に果たされる。
【００５６】
別の実施形態において、疾患の予防または治療の場合、本発明の抗体(単数)/抗体(複数)の適切な用量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度および経過、抗体が予防的または治療目的で投与されるのか、薬歴、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに主治医の裁量によって決まる。抗体は、1回または一連の治療に渡って患者に適切に投与される。例えば、1回または複数の別々の投与であろうが連続注入であろうが、疾患の種類および重症度に応じて約1μg/kg〜15mg/kgの抗体またはそのフラグメントが、患者への投与に対する初期用量候補になる。数日間またはより長期にわたる反復投与の場合、病態に応じて、病徴に所望の抑制が現れるまで治療は継続される。しかし、他の用量計画が有効な場合もある。この療法の経過は、従前通りの技術およびアッセイによって容易に観察される。抗体組成物は、優れた医療行為と合致した仕方で処方され、調薬され、投与されるべきである。本発明の抗体/誘導体は、任意の適切な経路で投与できる。これには、(それに限らないが)腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、関節内、気管内、経口、経腸、非経口、鼻腔内または経皮投与がある。この状況において考慮すべき因子には、治療される具体的な障害、治療される具体的な哺乳動物、個々の患者の病態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医療専門家に公知の他の因子がある。投与すべき抗体の「治療有効量」は、そのような考慮によって定められることになり、疾患または障害を防止、改善または、治療するのに必要な最小量である。抗体は、必ずしも必要ではないが場合によっては問題の障害を防止または治療するために現在使用されている1つまたは複数の薬剤と一緒に処方される。そのような他の薬剤の有効量は、処方中に存在する抗体の量、障害または治療の種類、および上述した他の因子によって決まる。
【００５７】
本発明において、抗体とは、
a)モノクローナル、ポリクローナルもしくはキメラ、またはヒト化、または脱免疫化、またはアフィニティー成熟抗体(affinity matured antibody)、または完全ヒト抗体もしくはscFv;
b)その組換えもしくは合成抗原結合フラグメント、ならびに改変抗体フラグメント、抗体誘導体、二重特異性抗体および他の多重特異性分子を含めたそのような抗原結合フラグメントを含む分子を指す。
【００５８】
本明細書において「抗体」という用語は、最も幅広い意味に使用され、所望の抗原結合活性を呈する限り、それだけには限らないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および抗体フラグメントを含めた様々な抗体構造を包含する。
【００５９】
「抗体フラグメント」とは、完全な抗体の一部を含み、完全な抗体が結合する抗原に結合する完全な抗体以外の分子のことを指す。抗体フラグメントの例には、それだけには限らないが、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子(例えばscFv)、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体がある。
【００６０】
「キメラ」抗体という用語は、一部の重および/または軽鎖が特定の起源もしくは種から得られ、一方で残りの重および/または軽鎖が異なる起源または種から得られる抗体のことを指す。
【００６１】
本明細書において「Fc領域」という用語は、抗体、好ましくは免疫グロブリン、より好ましくは定常領域の少なくとも一部を含有するヒトIgG重鎖の、C末端領域を定義するために好ましくは使用され、より好ましくは、ヒトIgGヒンジと定常領域(hFc)、またはマウスIgGヒンジと定常領域(mFc)を定義するために使用される。二量体またはオリゴマーを形成する他の免疫グロブリン型および/または種由来の類似配列は、本用語に含まれる。本用語は、天然のFc領域およびバリアントFc領域配列も含む。
【００６２】
「宿主細胞」、「宿主細胞系」および「宿主細胞培養」という用語は、互換的に使用され、外生の核酸が導入された細胞(その細胞の子孫を含める)のことを指す。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、継代の数に関係なく初代形質転換細胞およびそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸情報内容において親細胞と完全に一致しない場合があるが、変異を含有していてもよい。同じ機能または生物活性を有する変異体である子孫は、最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されているので、本明細書に含まれる。「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される、またはヒト抗体レパートリもしくはヒト抗体をコードしている他の配列を利用して非ヒト源から得られる抗体のアミノ酸配列に対応する配列を持つものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。
【００６３】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトHVR由来アミノ酸残基およびヒトFR由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体のことを指す。ある特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、通常は2つの可変ドメインの実質的に全てを含むことができ、この中でHVR(例えば、CDR)の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のそれに対応しており、FRの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のそれに対応している。ヒト化抗体は、場合によっては、ヒト抗体から得られる抗体定常領域の少なくとも一部を含むことができる。抗体(例えば、非ヒト抗体)の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けた抗体のことを指す。
【００６４】
「脱免疫化」抗体とは、HLA結合(T細胞刺激の根底になる要件である)の破壊によって免疫原性が低下した抗体である。
【００６５】
本明細書において「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体のことを指し、すなわち、考え得るバリアント抗体(例えば天然に存在する変異を含有するもしくはモノクローナル抗体製剤の生産中に生じる(そのようなバリアントは概して、小量存在する)を除き、その集団を含む個々の抗体は同一である、および/または同じエピトープに結合する。別々の決定基(エピトープ)に対して作られる別々の抗体を通常含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のうちの各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して作られる。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体の性質を示し、何かしら特別の方法による抗体生産を要すると解釈されるべきでない。例えば、本発明にしたがって使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれに限定されない様々な技術によって作製でき、そのような方法およびモノクローナル抗体を作製する他の典型的な方法が、本明細書に記載される。
【００６６】
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列し、最大のパーセント配列同一性を得るために必要に応じてギャップを導入した後に、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義され、配列同一性の一環としてどんな保存的置換も考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定するための整列は、当業者の範囲内にある様々な方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなど一般公開されているコンピュータソフトウェアを使用して実現できる。当業者は、比較しようとする配列の全長にわたって最大整列を実現するのに必要な、どのアルゴリズムも含めて、配列を整列するのに適切なパラメータを決定できる。
【００６７】
「医薬処方」という用語は、中に含有される有効成分の生物活性を有効にできるような形態の製剤のことを指し、それは、処方が投与される対象にとって容認できないほど毒性があるどんな追加成分も含有しない。
【００６８】
本明細書では、「治療(treatment)」(および「治療する(treat)」または「治療している(treating)」などその文法的異形)とは、治療されている個体の自然経過を変更するための臨床的介入のことを指し、予防のためまたは臨床病理の経過中のいずれかで実施できる。治療の望ましい効果には、それだけには限らないが、疾患の発生または再発を予防する、症状の軽減、任意の直接的または間接的な疾患の病理的転帰の減少、転移を予防する、疾患の進行速度を減少させる、病状の改善または緩和、および寛解または予後の改善がある。いくつかの実施形態において、本発明の抗体を使用して、疾患の発症を遅延させるまたは疾患の進行を遅くする。
【００６９】
本発明の抗体、その組換えまたは合成抗原結合フラグメントは、分子にコンジュゲートさせることができ、前記分子は、好ましくは治療剤である。
【００７０】
ここで本発明は、以下の図を参照する非限定的な実施例によって記載される:
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】3つのuPARバリアント、uPAR-hFc、uPAR-mFcおよびuPARmyc(対照)のドメイン構造をそれぞれ例示している漫画である。  （図１Ａ）uPAR-hFc(ヒト-Fcタグを持つuPARの可溶性二量体形態)の構造を例示している漫画である。uPAR-hFc(配列番号14に対応する配列1)は、ヒトuPAR(配列番号1に対応する配列4に全配列がある)の残基1〜277(配列番号1のaa.1〜277に対応する配列1A、ドメインD1、D2およびD3)、リンカー領域(配列番号9に対応する配列1B)ならびにヒンジおよびヒトIgG重鎖の定常領域(Fc)(配列番号5に対応する配列1C)から成る。hFcタグが存在することにより、2つのポリペプチドがジスルフィド結合によって連結され、ホモ二量体が形成される。  （図１Ｂ）uPAR-mFc(マウスFcタグを持つuPARの可溶性二量体形態)の構造を例示している漫画である。uPAR-mFc(配列番号15に対応する配列2)は、ヒトuPARの残基1〜277(配列番号1のaa.1〜277に対応する配列1A)、リンカー領域(配列番号10に対応する配列2A)ならびにヒンジおよびマウスIgG重鎖の定常領域(Fc)(配列番号6に対応する配列2B)から成る。uPAR-hFcと同様に、mFcタグが存在することにより、2つのポリペプチドがジスルフィド結合によって連結され、ホモ二量体が形成される。  （図１Ｃ）uPARmyc(C末端mycタグを持つuPARの可溶性単量体形態)の構造を例示している漫画である。uPARmyc(配列番号26に対応す配列3)は、ヒトuPARの残基1〜274(配列番号1のaa.1〜274に対応する配列3A)およびC末端mycタグ(配列番号27に対応する配列3B)から成る。示したとおり、成熟した野生型uPARは、D1、D2およびD3と称する3つの相同なドメインから成る。
【図２】免疫グロブリン重鎖定常領域を使用するuPARの強制的な二量体化は、VNに対する結合アフィニティーを増大させるが、uPAに対しては増加させないことを示す図である。  （図２Ａ）固定化VNに対するuPAR-hFcの結合を示す図である。過剰のプロuPA存在下(黒)または非存在下(灰色)でuPAR-hFcの濃度を増大させながら、VNでコートした96ウェルプレートを室温で2時間インキュベートした。洗浄後に、モノクローナルuPAR抗体(13F6)およびEu3+標識ヤギ抗マウス抗体と順次インキュベーションすることにより、結合している受容体を検出した。結合している物質を、時間分解蛍光強度を測定することによって検出した。同一サンプルとインキュベートした、コートしていないウェルにおいて測定した非特異的結合を減算することによって、特異的結合を算出した。示したデータは、代表的な実験の平均±SDである。Prism5.0ソフトウェアスイートを使用する非線形回帰(4パラメータ適合)によって、結合曲線、平衡解離定数(Kdをナノモル単位で)、および最大結合能力(BmaxをCPS単位で(カウント毎秒))を算出した。uPAR-hFcは、パネルBに示される単量体uPARmycよりも約10倍高いアフィニティーおよび約3倍高い結合能力を有することに留意されたい。  （図２Ｂ）固定化VNに対するuPARmycの結合を示す図である。過剰のプロuPA存在下(黒)または非存在下(灰色)でuPARmycの濃度を増大させながら、VNでコートした96ウェルプレートを室温で2時間インキュベートした。パネルAに記載の通り、uPARmycの結合を検出し、厳密に分析した。  （図２Ｃ）固定化プロuPAに対するuPAR-hFcおよびuPARmycの結合を示す図である。uPAR-hFc(円)およびuPARmyc(正方形)の濃度を増大させながら、プロuPAでコートした96ウェルプレートを室温で2時間インキュベートした。パネルAに記載の通り、uPARmycの結合を検出し、厳密に分析した。uPAR-hFcおよびuPARmycは、よく似たKdおよびBmaxで固定化プロuPAに結合することに留意されたい。
【図３】uPARのN末端結合による、uPA成長因子様ドメインとuPARとのキメラ分子によって作製されるuPARバリアントは、VN結合を増大させ、uPA結合を低下させる。  （図３Ａ）野生型ヒトuPARおよびuPARバリアントGFD-uPARキメラのドメイン構造を例示している漫画である。成熟した野生型uPAR(配列4(配列番号1))は、uPARのC末端に位置するグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)脂質アンカーによって細胞膜の外葉に連結される3つの相同なタンパク質ドメイン(D1、D2およびD3)から成る。GFDuPARキメラ(配列5(配列番号16))は、野生型uPAR(配列4(配列番号1))と同じ配列を有するが、併せてuPAの受容体結合成長因子様ドメインであるGFD(配列5A(配列番号3))を含有し、これは短いリンカー配列(配列5B(配列番号7))を使用してuPAR(配列4(配列番号1))のN末端に結合されている。  （図３Ｂ）293細胞におけるGFDuPARの発現が、ビトロネクチンに対する細胞接着を促進することを示す図である。野生型uPAR(uPAR)、VN結合欠損uPAR変異体(uPARW32AおよびuPARR91A、(Madsen et al.、2007))、GFDuPARキメラ(GFDuPAR)またはuPAR無し(模擬)のいずれかを発現している293細胞を、インテグリン結合欠損VNフラグメント(VN(1〜66)RAD、(Madsen et al.、2007))でコートしたウェルに37℃で1時間付着させた。洗浄後に、付着細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、530nmでの吸光度を測定することによって定量した。非特異的結合(コートしていないウェルにおいて測定した)を減算することによって、特異的な細胞接着を算出し、ポリ-L-リシンに対する接着の%で提示する。データは、独立した実験(n=3)の平均±SDを表す。uPARとGFDuPARの両方が、VNに対する強力な細胞接着を促進するが、W32AおよびR91A変異体受容体ならびに模擬トランスフェクト細胞は付着しなかったことに留意されたい。  （図３Ｃ）GFDuPARキメラが、固定化プロuPAに対する細胞接着の促進を欠損していることを示す図である。異なるuPARバリアントを発現している293細胞を、プロuPAでコートしたウェルに37℃で1時間結合させ、パネルBに記載の通り、細胞接着を定量した。uPAR、uPARW32AおよびuPARR91Aの発現は、プロuPAに対する安定した細胞接着を誘導するが、GFDuPARキメラはせず、したがって、このキメラはプロuPA結合欠損であることが実証されることに留意されたい。
【図４】可溶性GFDuPARが、uPA非依存的なVNへの高いアフィニティー結合、およびuPA結合の低下を示す図である。  （図４Ａ）GFDuPARmycのドメイン構成を例示している漫画である。GFDuPARmyc(配列6(配列番号28))は、C末端mycタグを含有するGFDuPARの分泌型バリアント(図3A)である。GFDuPARmycキメラ(配列6(配列番号28))の組成は、uPAの受容体結合成長因子様ドメインであるGFD(配列5A(配列番号3))、短いリンカー(配列5B(配列番号7))、uPAR残基1〜274(配列番号1のaa.1〜274に対応する配列3A)およびC末端mycタグ(配列3B(配列番号27))である。  （図４Ｂ）固定化VNに対するGFDuPARmycおよびuPARmycの結合を示す図である。GFDuPARmyc(黒い正方形)およびuPARmyc(灰色の円)の濃度を増大させながら、VNでコートした96ウェルプレートを室温で2時間インキュベートした。洗浄後に、モノクローナルuPAR抗体(13F6)およびEu3+標識ヤギ抗マウス抗体と順次インキュベーションすることにより、結合している受容体を検出した。結合している物質を、時間分解蛍光強度を測定することによって検出した。同一サンプルとインキュベートした、コートしていないウェルにおいて測定した非特異的結合を減算することによって、特異的結合を算出した。示したデータは、代表的な実験の平均±SDである。Prism5.0ソフトウェアスイートを使用する非線形回帰(4パラメータ適合)によって、結合曲線および解離定数(Kd)を算出した。uPARmycでなく、GFDuPARmycが、高いアフィニティーでVNに結合することに留意されたい。  （図４Ｃ）固定化プロuPAに対するGFDuPARmycおよびuPARmycの結合を示す図である。GFDuPARmyc(黒い正方形)およびuPARmyc(灰色の円)の濃度を増大させながら、プロuPAでコートした96ウェルプレートを室温で2時間インキュベートし、パネルBに記載の通り、結合している受容体を検出した。上述の通り非線形回帰によって、結合曲線、KdおよびBmaxを算出した。GFDuPARmycは、uPARmycと比較して、約1/30低いアフィニティーおよび約1/5少ない結合能力でuPAに結合することに留意されたい。
【図５】他のuPARバリアント:強制的な二量体化およびuPARのN末端におけるGFDドメインの付加が、相乗して受容体のVN結合活性を増大させることを示す図である。  （図５Ａ）GFDuPAR-hFcのドメイン構造を例示している漫画である。GFDuPAR-hFc(配列7(配列番号12))は、図1Aに示すようなC末端ヒトFcタグの付加による強制的な二量体化を、図3Aに示すようなN末端へのGFDドメインの追加と組み合わせる。  （図５Ｂ）GFDuPAR-mFcのドメイン構造を例示している漫画である。GFDuPAR-mFc(配列8(配列番号13))は、Fc領域がマウス免疫グロブリンに由来する点を除いてGFDuPAR-hFcと同一である(図1Bを参照のこと)。  （図５Ｃ）GFDuPAR-mFcが、極めて高いアフィニティーで固定化VNに結合することを示す図である。GFDuPAR-mFcの濃度を増大させながら、VNでコートした96ウェルプレートを室温で2時間インキュベートした。洗浄後に、マウスIgGの定常領域に特異的なビオチン化抗体およびEu3+標識ストレプトアビジンと順次インキュベーションすることにより、結合している受容体を検出した。結合している物質を、時間分解蛍光を測定することによって定量した。同じサンプルとインキュベートした、コートしていないウェルにおいて測定した非特異的結合を減算することによって、特異的結合を算出した。データは、平均±SDを表し、代表的な実験のものである。非線形回帰によって、結合曲線およびKdを算出した。
【図６】異なる形態をした可溶性uPARのVN結合活性の直接比較を示す図である。  （図６Ａ）GFDuPAR-hFcが、高いアフィニティーで固定化VNに結合することを示す図である。プロuPA非存在下でGFDuPAR-hFcの、または過剰のプロuPAの存在および非存在下でuPAR-hFcおよびuPARmycの、濃度を増大させながら、VNでコートした96ウェルプレートをインキュベートした。洗浄後に、モノクローナルuPAR抗体(13F6)およびEu3+標識ヤギ抗マウス抗体と順次インキュベーションすることにより、結合している受容体を検出した。データは、単一の実験のものであり、平均±SDとして提示する。非線形回帰によって、結合曲線およびKdを算出した。GFDuPAR-hFcは、試験したuPARの他のどの形態よりも高いアフィニティーおよび能力でVNに結合することに留意されたい。  （図６Ｂ）固定化VNへのGFDuPAR-hFcおよびGFDuPARmyc結合の比較を示す図である。プロuPA非存在下でGFDuPAR-hFcおよびGFDuPARmycの濃度を増大させながら、VNでコートした96ウェルプレートを室温で2時間インキュベートした。洗浄後に、モノクローナルuPAR抗体(13F6)およびEu3+標識ヤギ抗マウス抗体と順次インキュベーションすることにより、結合している受容体を検出した。データは、単一の実験のものであり、平均±SDとして提示される。非線形回帰によって、結合曲線およびKdを算出した。二量体GFDuPAR-hFcは、単量体GFDuPARmycよりも高いアフィニティー(約4倍)および能力(約2.5倍)でVNに結合することに留意されたい。
【図７】uPAR-hFcのGFDとuPARドメインとを接続しているリンカー領域に対する特定の要件の欠如を示す図である。  （図７Ａ）試験したリンカー領域を示す図である。GFDuPAR-hFcのGFDとuPARドメインの間の異なる長さのリンカー(図5Aを参照のこと)の起こり得る効果を比較するために、5、8、16または20残基長の示したリンカー配列を持つGFDuPAR-hFcのバリアントを作製した。リンカー8は、上の実験の全てで使用される配列5B(配列番号7)および配列9B(配列番号8)と同一である。  （図７Ｂ）固定化VNへの結合を示す図である。10nMプロuPAの存在また非存在下で、示したuPARバリアントで一過性にトランスフェクトした293細胞由来の馴化培地(10倍希釈)と一緒に、VNでコートしたウェルをインキュベートした。洗浄後に、Eu3+標識抗ヒトFc抗体とインキュベーションし、時間分解蛍光を測定することにより、結合している物質を検出した。リンカー長に関係なく、GFDuPAR-hFcバリアントの全てが、プロuPAとは無関係にVNに結合することに留意されたい。  （図７Ｃ）固定化uPAへの結合を示す図である。示したuPARバリアントで一過性にトランスフェクトした293細胞由来の馴化培地(10倍希釈)と一緒に、プロuPAでコートしたウェルをインキュベートした。洗浄後に、パネルBに記載の通り、結合している物質を検出した。リンカー長に関係なく、GFDuPAR-hFcバリアントの全てが、uPAR-hFcと比較してuPAへの結合の低下を示すことに留意されたい。
【図８】uPAR上へのGFDの追加がVN結合を増大させ、uPA結合を低下させる可能性がある、考え得る2つの機序を例示している漫画である。  （図８Ａ）分子内結合を示す図である。立体配置的に可能な場合、GFDuPARのGFDドメインは、uPARのuPA結合ポケットに結合することができ、キメラ受容体の自己飽和をもたらす。uPARの自己飽和は、受容体に立体構造変化を誘導し、VN結合部位の効果的な露出を引き起こし、uPAの結合を防止する可能性が有る。  （図８Ｂ）分子間結合を示す図である。立体的な理由によりパネルAで示す自己飽和が起こりえない場合、GFDuPARは、ヘテロ二価になり、したがって、uPAとuPAR両方の結合活性を示すことになる。この場合、GFDuPARは、uPA結合活性の低下とVN結合活性の増大を示すオリゴマーを形成する可能性がある。
【図９】8種の抗体可変領域のアミノ酸配列である。材料および方法に記載の通り、重および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、PCR増幅によって得たcDNA配列から推測された。アミノ酸配列を、Kabatシステムにしたがって番号付けする。相補性決定領域(CDR)1、2および3(左から右)に下線を引く。整列を維持するために配列に導入したギャップを、ハイフンで示す。ピリオド(配列リスト中でXaaに対応する)は、その配列が不明かまたは不確実かどちらかであることを示す。したがって、Xaaは、任意の天然に存在するアミノ酸であり得る。
【図１０】GFDuPAR-hFcに対して産生されたモノクローナル抗体が、細胞表面uPARを認識することを示す図である。ヒトuPAR(huPAR)、マウスuPAR(muPAR)またはuPAR無し(模擬)を発現している293細胞を、GFDuPAR-hFcに対して産生されたモノクローナル抗体8B12、10H6、13D11、19.10、13F6、AL6、AL38およびBE18で染色した。結合した抗体を、フルオレセイン標識ヤギ抗マウス抗体を使用して検出し、その染色をフローサイトメトリーによって分析した。ヒストグラムは、染色強度(X軸、FL1-H)および頻度(Y軸、最も頻繁な強度の%)を示している。8つ全ての抗体が、ヒトuPARを発現している細胞を特異的に染色することに留意されたい。抗体BR4およびAK17は、以前に記載されており、マウスuPARと特異的に反応する(Tjwa et al.、2009)。
【図１１】mAb  8B12の機能的な阻害活性を示す図である。ビトロネクチン(AおよびB)またはフィブロネクチン(C)でコートした96ウェルEプレートにヒトuPARを発現している293細胞を播種し、リアルタイム細胞分析機器(RTCA、xCELLigence、SP  Roche  Corp.)に移した。電気的インピーダンス(細胞インデックス(CI)と呼ぶ)を、一定の間隔で記録した。およそ2時間後に、細胞にプロuPA(BおよびC)またはビヒクル(A)を添加し、細胞インデックス測定を続けた。さらに約1時間後に、グラフに示した最終濃度で8B12抗体の希釈曲線をウェルに添加し、細胞インデックス測定を続けた。プロuPAおよび8B12を添加した時間を、垂直の点線によってグラフ中に示す。曲線は、時間(X軸)の関数として、標準化した細胞インデックス(NCI、Y軸)を示している。全ての細胞インデックスは、抗体添加の直前に測定した細胞インデックスに対して標準化された。IC50値を決定するために(パネルD)、抗体添加の1時間後に測定したNCIを、同じ時点での未処理細胞に対するNCIの%で算出し(ΔNCI、Y軸)、抗体濃度(X軸)の関数でグラフ化した。
【図１２】フローサイトメトリーによるエピトープマッピングを示す図である(I)。ヒトuPAR(uPAR  WT)、uPAR  R83/89Aを発現している293細胞を示した通り異なる抗体で染色し、その結合をフローサイトメトリーによって分析した。プロuPAの存在および非在下の両方で、uPAR  WT細胞の染色を実行して、抗体結合に対するリガンド占有の考え得る効果を検出した。陰性対照(Neg.Ct.)として、一次抗体を受けていないuPAR  WT細胞の染色プロファイルを全てのパネルに示す。
【図１３】フローサイトメトリーによるエピトープマッピングを示す図である(II)。図12と同様だが異なるuPARバリアントを分析した。
【図１４】フローサイトメトリーによるエピトープマッピングを示す図である(III)。図12および図13と同様だが異なるuPARバリアントを分析した。
【図１５】uPARの阻害抗体に対する結合エピトープの位置を示す図である。uPARは、3つのドメイン(D1、D2およびD3)から成り、D1は短いリンカー領域によってD2に連結されている。このリンカー領域は、VNとの受容体相互作用に重要な残基(R91およびY92、下線部)を含有する(Madsen et al、2007)(Gardsvoll and Ploug、2007)。この実施例において生成された阻害抗体の結合部位は、結合に重要なホットスポットであるR89、R91およびY92と重なるエピトープ(複数可)を有する。uPARの短縮変形であるD2D3の構造が、以下に示される。このバリアントは、配列番号1のuPARの残基1〜82を欠いている。
【図１６】mAb  8B12、13F6、R3およびプロuPAによる、293/uPAR細胞へのEu3+uPA結合の阻害を示す図である。mAb  8B12は、uPARのタンパク質分解機能を妨害しない。阻害抗体8B12が、uPAR/VN相互作用に特異的な阻害剤かどうか、またはそれが受容体に対するuPA結合も妨害するかどうか調査するために、in vitro結合アッセイを実行した。mAb  8B12が全くまたはほとんど阻害活性を示さないことから、この抗体が受容体のタンパク質分解機能を妨害しないことが実証されることに留意されたい。アッセイの有効性は、R3抗体および非標識のプロuPAが、効果的な競合活性を示したという事実によって実証される。(CPS-カウント毎秒)。
【図１７】mAb  8B12が、in vivoでPC3腫瘍成長を阻害することを示す図である。オスBalb  C  nu/nuマウスに、皮下(s.c.)経路でPC3細胞(1×106個)を接種した。腹腔内経路で10.0mg/kgのmAb  8B12、mAb  13F6、非免疫性対照マウスのIgG(mIgG)またはPBSを隔週に注射することによって、動物を処理した。材料および方法に記載の通り、腫瘍を週2回測定し、腫瘍体積を決定した。PBSとmIgG処理動物の間で腫瘍成長に差異は観察されず、これらのデータをプールした後に、統計分析した。対照動物と8B12処理動物との間の有意差を、星印によって表す(NS、有意差無し、P＞0.05、*P＜.05、**P＜.01および***P＜.001)。対照と8B12処理動物との間の腫瘍体積の差異(%)が示される。
【図１８】mAb  8B12が、PC3腫瘍細胞の増殖を低下させ、in vivoでアポトーシスを促進することを示す図である。オスBalb  C  nu/nuマウスを、PC3細胞を皮下に接種し、腹腔内経路で10.0mg/kgのmAb  8B12、mAb  13F6または非免疫性対照マウスのIgGを隔週に注射することによって処理した。材料および方法の項に記載の通り、異種移植の8週間後に腫瘍を回収し、免疫組織化学によって分析した(パネルA)。Ki-67および活性型カスパーゼ3の染色を示し、核をDAPIで対比染色する。データの定量化については、パネルBに示される。対照IgGによる処理と比較したとき、阻害mAb  8B12による処理は、腫瘍細胞増殖を著しく低下させ、アポトーシスを増大させることに留意されたい。同じアイソタイプの非阻害性mAb  13F6がこの活性を示さないことから、その活性が抗増殖およびプロアポトーシス効果に関与するmAb  8B12の阻害活性であると実証される。Y軸の単位は、領域当たりの陽性細胞数である。
【図１９】mGFDmuPAR-Fcのドメイン組成およびVN結合特性を示す図である。  （図１９Ａ）mGFDmuPAR-hFcのドメイン構成を例示している漫画である。mGFDmuPAR-hFc(配列9(配列番号17))は、マウスuPAの受容体結合成長因子様ドメインであるmGFD(配列9A(配列番号4))、短いリンカー(配列9B(配列番号8))、マウスuPAR残基1〜273(配列番号2のaa.1〜273に対応する配列9C)、別の短いリンカー(配列9D(配列番号11))およびC末端ヒトFcタグ(hFc、配列1C(配列番号5))から成る。マウスFcタグのC末端も、同様に使用できる。  （図１９Ｂ）固定化VNに対するmGFDmuPAR-hFcの結合を示す図である。mGFDmuPAR-hFcの濃度を増大させながら、VNでコートした96ウェルプレートを室温で2時間インキュベートした。洗浄後に、Eu3+標識ヤギ抗ヒトFc抗体とインキュベーションすることにより、結合している受容体を検出した。結合している物質を、時間分解蛍光強度を測定することによって検出した。同一サンプルとインキュベートした、コートしていないウェルにおいて測定した非特異的結合を減算することによって、特異的結合を算出した。示したデータは、代表的な実験の平均±SDである。Prism5.0ソフトウェアスイートを使用する非線形回帰(4パラメータ適合)によって、解離定数(Kd)を算出した。
【図２０】mGFDmuPAR-hFcに対して産生された抗体が、マウスuPARによって媒介されるVNに対する細胞接着を阻害することを示す図である。mGFDmuPAR-hFcを認識する抗体を産生する骨髄腫雑種の細胞培養上清による、VNに対する293/muPAR細胞接着の阻害。VNコートしたEプレートにマウスuPARを発現している293細胞を播種し、細胞接着させ、続いてxCELLigenceプレートリーダー(Roche)を使用してインピーダンスを測定した。接着がプラトーに到達したら(垂直の点線によって示す)、mGFDmuPAR-hFcで免疫したマウスの脾細胞から得られる13種の異なる骨髄腫雑種の馴化培地をウェルに添加した(最終濃度30%v/v)。4種の雑種の馴化培地は、(標準化細胞インデックスとして測定した)細胞接着に大幅な(OMD4、NE43およびOOF12)または中程度の(NM23)減少をもたらすが、残り9種の雑種の馴化培地はほとんどまたは全く阻害活性を示さないことに留意されたい。
【図２１】阻害抗体OMD4およびNE43が、マウスuPARのVN結合部位に結合することを示す図である。生成した抗体の結合エピトープがマウスuPAR(muPAR)のVN結合部位に収まるかどうか決定するために、免疫化に使用した抗原(mGFDmuPAR-hFc)およびmuPARのVN結合部位に単一のアミノ酸置換を含有するこのキメラのバリアント(mGFDmuPAR-hFc  R92A)に対して、ならびにその抗体がヒトuPARも認識するかどうか決定するためにヒト可溶性受容体(suPAR)に対して、in vitro結合アッセイを実行した。mGFDmuPAR-hFc、mGFDmuPAR-hFc  R92Aまたはヒト可溶性uPAR(suPAR)で96ウェルELISAプレートをコートし、ブロッキングし、希釈緩衝液に1:100に希釈したハイブリドーマ上清と共にインキュベートした。洗浄後に、Eu3+標識ヤギ抗マウス抗体とインキュベーションすることにより、結合している抗体を探査し、増強時間分解蛍光強度測定(Delfia)により定量化した。コートしていないウェルに対して観察した結合を減算することによって、特異的結合を算出した。OMD4およびNE43がmGFDmuPAR-hFc  R92Aバリアントを認識しないことから、これらの抗体が、muPAR中のVN結合部位に結合することが示唆されることに留意されたい。これら抗体のうちの1つ(OMD4)は、ヒト受容体も認識する。
【図２２】mGFDmuPAR-Fc重鎖可変領域に対して産生されたmAb  OMD4のアミノ酸配列である。材料および方法(実施例2)に記載の通り、OMD4重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、PCR増幅によって得たcDNA配列から推測された。アミノ酸配列は、Kabatシステムにしたがって番号付けされる。相補性決定領域(CDR)1、2および3(左から右)に下線を引く。
【図２３】mAb  OMD4、NE43、OOF12、NM23、8B12の阻害活性の種特異性を示す図である。VNコートしたEプレートにヒトuPAR(パネルA)およびマウスuPAR(パネルB)を発現している293細胞を播種し、インピーダンス測定によって細胞接着を観察した。一旦、細胞接着がプラトーに達したら(垂直の点線)、最終濃度100nM*になるようにウェルに精製抗体を添加し、得られた細胞接着の変化を記録した。ヒトuPARを発現している細胞の接着は、mAb  8B12によって阻害され、mAb  OMD4によって部分的に阻害されるが、残りの抗体には顕著な効果が無いことに留意されたい。対照的に、マウスuPARを発現している細胞の接着は、mAb  NE43、OOF12、NM23によって阻害され、OMD4によって部分的に阻害されるが、8B12では全く阻害されない。13F6は、ヒトuPARに結合する非阻害性陰性対照抗体として使用された。  *OMD4抗体は、IgAアイソタイプであり、1:5に希釈した細胞培養上清の形態で使用された。上清中のこの抗体の濃度は、不明であり、低い可能性がある。したがって、この抗体で観察された部分的な効果は、これに起因している可能性がある。
【図２４】リガンドが占有している二量体uPARを認識するscFvを単離するためのパニング戦略を示す図である。
【図２５】単離したscFvと細胞表面uPARとの反応性を示す図である。ヒトuPARを発現している293細胞を、示したscFv(200nM)で染色した。結合した抗体をフルオレセイン標識ヤギ抗ヒトF(ab)2抗体を使用して検出し、その染色をフローサイトメトリーによって分析した。ヒストグラムは、染色強度(X軸、FL1-H)および頻度(Y軸、カウント)を示す。
【図２６】scFv  3B6の阻害活性を示す図である。図11においてmAb  8B12について記載した通り、scFv  3B6の阻害活性をアッセイした。曲線は、時間(X軸)の関数として、標準化した細胞インデックス(NCI、Y軸)を示す。全ての細胞インデックスは、抗体添加の直前に測定された細胞インデックスに対して標準化された。IC50値を決定するために(パネルD)、抗体添加の1時間後に測定したNCIを、同じ時点での未処理細胞に対するNCIの%で算出し(ΔNCI、Y軸)、抗体濃度(X軸)の関数でグラフ化した。
【図２７】scFv  3C10の阻害活性を示す図である。図26においてscFv  3B6について記載した通り、3C10の阻害活性を厳密にアッセイした。
【図２８】8B12の阻害活性とuPAR/VN相互作用またはuPAR機能を阻害することが公知の他の化合物のそれとの比較を示す図である。図11において8B12抗体について記載した通り、SMBドメイン(パネルA)、ペプチドP7(パネルB)、抗体R3およびR5(パネルC)ならびにR2抗体(パネルD)の阻害活性を測定した。IC50値を決定するために、化合物添加の1時間後に測定したNCIを、同じ時点での未処理細胞に対するNCIの%で算出し(ΔNCI、Y軸)、化合物濃度(X軸)の関数でグラフ化した。図11の8B12に対する阻害曲線を、比較のために4枚全てのパネルに含めた。試験した化合物の各々について算出したIC50および最大阻害定数は、Table2(表2)に見られる。
【実施例１】
【００７２】
材料および方法
発現ベクターの構築
ヒトIgG定常領域(hFc)でタグ付けした組換えタンパク質用の発現ベクターは、pFRT/TO-Fcプラスミド(Madsen et al.、2007)を基礎にしているが、異なるコーディング領域のシャフリングを容易にし、タンパク質収率を改善するためにいくつかの修飾が導入された。最初に、hFcコード領域の下流のベクター配列中に位置するXhoI制限部位を、オリゴdXu/dXdを使用する部位特異的突然変異誘発法によって破壊した。第2に、シグナルペプチド/Fc接合部に位置するXhoI部位に、PreScissionプロテアーゼ用の切断配列をコードしているリンカー(オリゴPreF/PreRをアニーリングすることによって作製される)を挿入した。構築物のFc領域に存在するイントロンを除去するために(これにより組換えタンパク質の収量が増大することが分かっている(未発表の結果))、ベクターをCHO細胞にトランスフェクトし、RNAを抽出し、逆転写し、オリゴhVNukpn/FcNrを用いてcDNAを増幅し、そしてKpnI/NotIでpcDNA5/FRT-TO(Invitrogen  corp.)およびpEGFP-N1(Clontech  corp.)にクローニングして、pFRT/TO-hFcおよびpN1-hFcをそれぞれ生成した。オリゴmFcU/mFcDを用いるマウスIgG1  cDNA(クローンIRAVp968B035D(imaGenes  GmbHより入手))のPCR増幅によってマウスIgG定常領域(mFc)でタグ付けした組換えタンパク質用の発現ベクターを生成し、XhoI/NotIでpFRT/TO-hFcおよびpN1-hFcにクローニングして、それぞれpFRT/TO-mFcおよびpN1-mFcを生成した。オリゴURskF/UpreR2Dを用いる全長uPAR  cDNA(Madsen et al、2007)の増幅によってヒトFc(uPAR-hFc、配列1(配列番号14))およびマウスFc(uPAR-mFc、配列2(配列番号15))でタグ付けした可溶性uPARをコードしている構築物を作製し、KpnI/XhoIでpFRT/TO-hFcおよびpFRT/TO-mFcにクローニングして、pFRT/TO-uPAR-hFcおよびpFRT/TO-uPAR-mFcをそれぞれ生成した。オリゴURskF/URMYCRを用いるuPAR  cDNAの増幅によりmycでタグ付けした可溶性uPAR(uPARmyc、配列3(配列番号26))をコードしている構築物を生成し、KpnI/NotIでpcDNA5/FRT-TOにクローニングして、pFRT/TO-uPARmycを生成した。uPAの成長因子ドメイン(GFD、配列5A(配列番号3))と全長uPAR(配列4(配列番号1))とのキメラをコードしている発現ベクター。GFDuPAR(配列5(配列番号16))を、二段階PCRオーバーラップ増幅(two-step PCR overlap amplification )手順で生成した。最初に、オリゴATFkpnF/GFD1rを用いてuPA  cDNAを、およびオリゴUL8f/FO12394を用いてuPAR  cDNAを増幅した。第2に、2つのPCR産物を混合し、オリゴATFkpnF/FO12394を使用して共増幅し、KpnI/NotIでpcDNA5/FRT-TOにクローニングして、pFRT/TO-GFDuPARを生成した。オリゴATFkpnF/URMYCRを用いてpFRT/TO-GFDuPARを増幅し、産物KpnI/NotIでpcDNA5/FRT-TOにクローニングして、pFRT/TO-GFDuPARmycを生成することによって、C末端mycタグを持つ可溶性GFDuPARをコードしている発現ベクター(GFDuPARmyc、配列6(配列番号28))を生成した。オリゴATFkpnF/UpreR2Dを用いてpFRT/TO-GFDuPARを増幅し、産物をpFRT/TO-hFcおよびpFRT/TO-mFcのKpnI/XhoIにクローニングして、pFRT/TO-GFDuPAR-hFcおよびpFRT/TO-GFDuPAR-mFcをそれぞれ生成することによって、C末端ヒトFcタグ(GFDuPAR-hFc、配列7(配列番号12))およびマウスFcタグmFc(GFDuPAR-mFc、配列8(配列番号13)をもつ可溶性二量体GFDuPARバリアントをコードしている発現ベクターを生成した。キメラのGFDとuPARドメインの間に異なる長さのリンカー領域を持つキメラをコードしている発現ベクターを、オリゴuL8fをuL5f、uL12f、uL16fまたはuL20fと置きかえて、上述した通りに作製した。GFDuPAR-hFcをコードしている領域、および異なる長さのリンカーを���つそれのバリアントを、pEGFP-N1発現ベクター(Clontech  Corp.)のKpnI/NotIに移し、一過性の発現実験に使用されるpN1-GFDuPAR-hFcを生成した。
【００７３】
組換えタンパク質の発現および精製
pFRT/TO-uPAR-hFc、pFRT/TO-GFDuPAR-hFc、pFRT/TO-uPAR-mFc、pFRT/TO-GFDuPAR-mFc、pFRT/TO-uPARmyc  pFRT/TO-GFDuPARmyc、発現ベクターを、CHO  Flp-In細胞(Invitrogen  Corp.)にトランスフェクトし、前述したように無血清条件下で組換えタンパク質を発現させた(Madsen et al.、2007)。ヒトまたはマウスFcタグでタグ付けされた組換え体を、標準的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって馴化培地から精製し、PBSに対して十分に透析した。pFRT/TO-uPARmycおよびGFDuPARmycでトランスフェクトした細胞の馴化培地を約20倍濃縮し、さらに精製すること無く結合アッセイに利用した。標準的なELISAアッセイを利用して、濃縮馴化培地中のuPARmyc濃度を決定した。pN1-GFDuPAR-hFcベクターバリアントを用いるOptiMEM無血清培地(Invitrogen  Corp.)中で培養したフェニックス細胞(Phoenix cell)の一過性のトランスフェクションによって、GFDとuPAR部分の間に異なる長さのリンカーを持つGFDuPAR-hFcバリアントを発現させ、培養6〜8日後に馴化培地を回収した。
【００７４】
結合アッセイ
黒い96ウェル免疫プレートを、コーティング緩衝液(50mM炭酸ナトリウム、pH9.6)に希釈したプロuPAまたはVN(10nM)で、4℃で、ONでコートした。プレートを洗浄緩衝液(0.1%Tween-20含有リン酸緩衝食塩水(PBS-T))で洗浄し、非特異的結合部位をブロッキング緩衝液(2%ウシ血清アルブミン含有PBS(BSA))を用いてRTで2時間超飽和させた。PBS-Tで洗浄した後に、示した通り、プロuPAの存在または非存在下で、ウェルを希釈緩衝液(1%BSA含有PBS)で希釈した指示濃度のuPAR-hFc、uPAR-mFcおよびuPARmycとインキュベートした。RTで2時間結合を起こさせ、その後、洗浄緩衝液ですすぐことによって結合していない試薬を除去した。抗uPARモノクローナル抗体(13F6、1μg/mL)およびEu3+標識ヤギ抗マウス抗体(1:5,000、Perkin  Elmer  Corp.)と順次インキュベーションすることにより、結合しているuPAR-hFcおよびuPARmycを検出した。DELFIA標識手順を利用してEnvision  Xciteプレートリーダー(Perkin  Elmer  Corp.)を使用して時間分解蛍光強度を測定することによって、Eu3+標識を検出した。特異的結合を算出するために、コートしたウェルにおいて測定した全結合から、コートしていないウェルにおいて測定した非特異的結合(同一試料とインキュベートした)を減算した。
【００７５】
細胞株および細胞接着アッセイ  
既報の手順(Madsen et al、2007)にしたがってpFRT/TO-GFDuPARベクターでトランスフェクションすることにより、GFDuPARを発現しているHEK293  Flp-In  T-REx細胞(293)を生成した。空のベクターをトランスフェクトした293細胞ならびにuPARW32AおよびuPARR91Aを発現している細胞については、以前に記載されている(Madsen et al、2007)。
【００７６】
オリゴヌクレオチド配列
dXu: 5'-gtaaatgagcggccgcgtcgagtctagaggg-3'(配列番号29)
dXd: 5'-ccctctagactcgacgcggccgctcattta-3'(配列番号30)
PreF: 5'-tcgagctggaagttctgttccaggggccca-3'(配列番号31)
PreR: 5'-agctacccggggaccttgtcttgaaggtcg-3'(配列番号32)
hVNukpn: 5'-cggggtaccatggcacccctgaga-3'(配列番号33)
FcNr: 5'-ttgcggccgctcatttacccggagacag-3'(配列番号34)
mFcU: 5'-gcctcgaggcaggagcaggacccagggattgtggttgtaa-3'(配列番号35)
mFcD: 5'-gcgcggccgctcatttaccaggagagtg-3'(配列番号36)
URskF: 5'-gcgtcgacggtacccgccaccatgggtcacccgccgctgctg-3'(配列番号37)
UpreR2D: 5'-gcctcgaggggcccctggaacagaacttccagatccaggtctgggtggttacagccact-3'(配列番号38)
URMYCR: 5'-gcgcggccgctcacagatcctcttcagagatgagtttctgctctcctcctgggtggttacagccact-3'(配列番号39)
ATFkpnF: 5'-gcggtacccgccaccatgagagccctgctggcgcgc-3'(配列番号40)
GFDlr: 5'-tgtgaaatagataagtcaaaagggggggccggggcg-3'(配列番号41)
uL8f: 5'-gggggggccggggcggctggaggactgcggtgcatgcagtgtaag-3'(配列番号42)
FO12394: 5'-tagtttagcggccgcttaggtccagaggagagt-3'(配列番号43)
UpreR2D: 5'-gcctcgaggggcccctggaacagaacttccagatccaggtctgggtggttacagccact-3'(配列番号44)
URMYCR: 5'-gcgcggccgctcacagatcctcttcagagatgagtttctgctctcctcctgggtggttacagccact-3'(配列番号45)
uL5f: 5'-gggggggccggggcgctgcggtgcatgcagtgtaag-3'(配列番号46)
uL16f: 5'-gggggggccggggcggctggagcaggagcaggtgctggtgctggaggactgcggtgcatgcagtgtaag-3'(配列番号47)
uL20f: 5'-gggggggccggggcggctggagcaggagcaggtgctggtgctggagcaggtgctggtggtctgcggtgcatgcagtgtaag-3'(配列番号48)
【００７７】
結果
uPARの強制的な二量体化は、ビトロネクチンへの結合を強く促進する
背景および原理
いくつかの証拠から、受容体の二量体化がuPARとVNとの相互作用に重要な役割を果たすことが示唆される(Caiolfa et al.、2007;Sidenius et al.、2002)が、表面プラズモン共鳴(SPR)によって決定した固定化uPARと可溶性VNとの相互作用に対する解離定数(約1μM、(Gardsvoll and Ploug, 2007))は、固定化VNと可溶性uPARを使用した平衡結合実験から予測される高アフィニティー相互作用(Gardsvoll and Ploug、2007;Sidenius et al.、2002)を説明するには明らかに不十分である。VN結合に対するuPAR二量体化の役割を直接解決するために、ここでは、可溶性形態の組換え二量体uPARの構築、発現および精製ならびにこれらのリガンド結合特性と「従来の」可溶性単量体uPARのそれとの比較について記述する。
【００７８】
二量体uPARの構築および発現
可溶性uPARと固定化VNとの相互作用に対する受容体二量体化の重要性を直接決定するために、C末端をヒンジおよびヒトIgG1定常領域(hFc)でタグ付けした可溶性ヒトuPARを構築した。得られたuPAR-hFcキメラは、Fcタグのヒンジ領域に位置するジスルフィド結合で2つのポリペプチドが結合される共有結合ホモ二量体である(図1A)。uPAR-hFcキメラ(配列1(配列番号14))は、uPAR(残基1〜277、配列番号1のaa.1〜277に対応する配列1A)、リンカー領域(LEVLFQGPLE、配列1B(配列番号9))およびヒトFcタグ(241残基、配列1C(配列番号5))から成る。図1Bに図示した通り、マウス免疫グロブリンのFc領域を使用して類似の構築物も作製され、このキメラ、uPAR-mFc(配列2(配列番号15))の配列および予測されるドメイン構造は、僅かに異なるリンカー領域(配列2A(配列番号10))およびマウスFcタグ(配列2B(配列番号6))を除いてuPAR-hFcと同一である。単量体対照受容体として、図1Cに図示したC末端mycタグを持つ可溶性ヒトuPAR(uPARmyc、配列3(配列番号26))を構築した。このタンパク質は、uPAR(残基1〜274、配列番号1のaa.1〜274に対応する配列3A)およびC末端mycタグ(GGEQKLISEEDL、配列3B(配列番号27))から成る。組換えタンパク質をチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞に発現させ、標準的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって馴化培地から精製した(uPAR-hFcおよびuPAR-mFc)、またはELISAによる定量化後に精製せずに(uPARmyc)利用した。
【００７９】
二量体uPARの結合特性
過剰のプロuPA(uPAの触媒的に不活性な酵素原形態)の存在または非存在下で組換え受容体の濃度を増大させながら、固定化VNをインキュベートすることにより、uPAR-hFc(図2A)およびuPARmyc(図2B)のVN結合活性を測定した。洗浄後に、マウスモノクローナル抗uPAR抗体(13F6)、Eu3+標識ヤギ抗マウス抗体と順次インキュベーションすることにより、結合している受容体を明らかにし、時間分解蛍光測定によって定量化した。プロuPA非存在下でuPAR-hFcとuPARmycの両方が、VNに対して弱い結合しか示さず、その相互作用のアフィニティーは信頼性をもって推定できない。しかし、過剰なプロuPAの存在下でuPAR-hFcとuPARmycの両方が、VNに対して特異的かつ用量依存的な結合を示す。結合曲線の非線形回帰分析によって、uPAR-hFc、uPARmycと固定化VNとの相互作用の見かけの解離定数(Kd)は、それぞれ約10nMおよび約80nMになると算出された。対照的に、単量体と二量体両方の可溶性受容体が、約6nM(uPAR-hFc)および約10nM(uPARmyc)の同等の見かけのアフィニティーで、固定化uPAに結合する。
【００８０】
これらのデータは、免疫グロブリンFcタグを使用するuPARの強制的な二量体化により、VNに対する受容体の見かけのアフィニティーを、単量体受容体と比較して、約10〜100倍増大させることを実証している。uPA非存在下で、全くまたはほとんど結合が観察されないので、単量体(uPARmyc)と二量体(uPAR-hFcおよびuPAR-mFc)両方の可溶性uPARの結合は、uPAによる同時占有に左右される。uPARの強制的な二量体化が、uPA非存在下での固定化VNに対する、および固定化uPAに対する受容体の結合を増大させないという事実は、見かけのアフィニティーの増大が固有の立体構造変化を含み、それが結合活性の増大の結果とは限らないことを示唆している。
【００８１】
uPAとuPARとのキメラは、強力なVN結合およびuPA結合の低下を示す
背景および原理
文献に記載の通り、および図2に図示した通り、VNに対する可溶性uPARの結合は、uPAによる受容体の同時占有に強く左右される。この観察に対するもっともらしい説明は、uPARへのuPA結合が、受容体に立体構造変化を誘導し、占有された受容体においてVN結合エピトープの露出を引き起こすということである。構成的な(すなわちuPA非依存的な)VN結合をuPA結合欠損と併せて示すuPARバリアントを生成する目的は、適切なuPA/uPARキメラを構築することによって達成することができ、そのようなキメラ内で起こると予測される分子内結合反応はVN結合エピトープの露出を引き起こし、uPAのトランスでの結合を防止すると考えられた。
【００８２】
uPA/uPARキメラGFDuPARの構築
VN結合においては構成的に活性でありuPA結合は欠損しているuPARバリアントを生成するために、図3Aに図示した通り、ヒトuPARのN末端にuPAの成長因子様ドメイン(GFD)を結合した。得られたキメラ(GFDuPAR、配列5(配列番号16))は、完全な成熟ヒトuPAR(配列4(配列番号1))のN末端に短いリンカー(配列5B(配列番号7))によって接続されたヒトuPA(配列5A(配列番号3))の成長因子様ドメインから成る。
【００８３】
細胞表面GFDuPARの結合特性
GFDuPARキメラの結合特性を分析するために、細胞表面にGFDuPARを発現している293細胞系を生成し、それらの接着特性を野生型uPARおよびVN結合に特異的欠損を有するuPARバリアントを発現している細胞の接着特性と比較した(図3)。これらのアッセイにおいて、GFDuPARが野生型受容体のように、VNに対して安定的かつインテグリン非依存的な細胞接着を促進する(図3B)ことから、キメラが完全なVN結合活性を保持していることが確認されると判明した。加えて、GFDuPARの発現が、固定化uPAへの細胞結合を促進しなかったことから、uPA結合活性の予測された消失もこのキメラにおいて達成されたことが示唆された(図3C)。
【００８４】
可溶性GFDuPARの構築および結合特性
細胞表面発現レベルが十分に高い限り、VNに対するuPAR媒介性細胞接着は、uPA結合を必要としない(Madsen et al.、2007;Sidenius and Blasi、2000)、したがって次に、in vitro結合実験用としてGFDuPARの可溶性バリアントを生成した。この目的のために、野生型uPARの膜固定配列の代わりにC末端mycタグを持つGFDuPARの短縮された変形を構築した。図4Aに図示される構築されたキメラ(GFDuPARmyc、配列6(配列番号28))は、GFDuPARについて上述した通り同じN末端GFDドメイン(配列5A(配列番号3))およびリンカー配列(配列5B(配列番号7))を、ならびに図1CにおいてuPARmycについて記載した通りuPAR配列(配列3A(配列番号1のaa.1〜274に対応する))およびC末端mycタグ(配列3B(配列番号27))を有する。
【００８５】
GFDuPARmycキメラをCHO細胞で産生し、その結合特性を固定化VN(図4B)または固定化プロuPA(図4C)に対するin vitro結合アッセイにより分析した。提示した通り、uPA非存在下で、GFDuPARmycキメラは固定化VNに高いアフィニティー(Kd約1.3nM)で結合する。同一条件でアッセイした場合、N末端GFDドメインを欠いている、対照受容体uPARmycは、1μMまでの濃度でも固定化VNに対していかなる評価可能な結合も示さない。したがって、uPARのN末端にuPAのGFDドメインを追加することによって、VNに対する受容体の測定される結合アフィニティーが少なくとも3桁増大される。同じタンパク質(GFDuPARmycおよびuPARmyc)を固定化プロuPAへの結合活性について試験したとき(図4C)、GFDuPARmycキメラは、対照受容体(uPARmyc)と比較して、結合アフィニティー(約1/30)および能力(約1/5)の低下を示す事が判明した。
【００８６】
結論
これらのデータは、uPARのN末端にuPAのGFDドメインを追加することによって、VNに対する受容体のアフィニティーが3桁超増大されることを実証している。
【００８７】
強制的な二量体化およびuPA:uPARキメラ化が相乗してVN結合活性を増大させる
背景および原理
上で実証したように、強制的な二量体化によってまたはuPARのN末端にuPAのGFDドメインを追加することによって、VNに対するuPARの見かけのアフィニティーを強力に増大させることができる。最後に、強制的な二量体化とGFDドメインの追加との組合せが相乗して、VNに対する見かけのアフィニティーが増大することをここで実証する。
【００８８】
二量体GFDuPARの構築および発現
図3Aに図示した通り、図1A〜図１Bに示すC末端Fcタグと、uPARのN末端へのuPAのGFDドメインの結合とを併用することによって、uPARのN末端にGFDドメインを含有する二量体uPARをコードしている発現ベクターを構築した。得られたキメラタンパク質GFDuPAR-hFc(配列7(配列番号12))およびGFDuPAR-mFc(配列8(配列番号13))は、それぞれ図5Aおよび図5Bに図示され、uPAのGFDドメイン(配列5A(配列番号3))、リンカー領域(配列5B(配列番号7))、uPAR残基1〜277(配列番号1のa.a.1〜277に対応する配列1A)、別のリンカー領域(配列1B(配列番号9)または配列2A(配列番号10)、ならびにヒト(配列1C(配列番号5))またはマウス(配列2B(配列番号6))IgG由来C末端Fcタグから成る。
【００８９】
二量体GFDuPAR-hFcおよびGFDuPAR-mFcの結合特性
GFDuPAR-hFcおよびGFDuPAR-mFcキメラをCHO細胞に発現させ、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって馴化培地から精製した。組換え受容体のVN結合特性を決定するために、固定化VNに対するGFDuPAR-mFcの結合を最初に測定した(図5C)。示した通り、GFDuPAR-mFcが非常に高いアフィニティー(約20pM)で結合することから、強制的な二量体化(Fcタグを使用する)とリガンド自己飽和(GFDドメインを使用する)が相乗してuPARのVN結合活性を増大させることが示唆される。
【００９０】
可溶性uPARの異なる形態のVN結合特性をより直接的に比較するために、さらなる結合実験を実行した(図6)。uPA存在下でuPAR-hFcと比較した場合、GFDuPAR-hFcは、約3倍高いアフィニティーおよび結合能力を有する。uPA存在下での単量体可溶性uPAR(uPARmyc)と比較した場合、GFDuPAR-hFcは、約600倍高いアフィニティーおよび6倍高い結合能力を示す。uPA非存在下でuPARの単量体(uPARmyc)と二量体(uPAR-hFc)形態の両方が、VNへの結合を全くまたはほとんど示さず、したがってアフィニティーの差異の定量化は困難である。しかし、固定化uPARに対するVNの結合について既報の値(1.3μM(Gardsvoll and Ploug、2007))と比較したとき、GFDuPAR-hFcは約10,000倍高いアフィニティーを示す。GFDuPARmyc(図6B)と直接比較したとき、GFDuPAR-hFcが3倍高いアフィニティーおよび2.5倍高い結合能力を示すことから、二量体化とリガンド自己飽和の両方が、GFDuPAR-hFcおよびおそらくはGFDuPAR-mFcの優れた結合活性に寄与していることが実証される。
【００９１】
uPARにGFDを接続しているリンカー領域に対する要件
GFDuPAR-hFcキメラのuPARのN末端にGFDドメインを接続しているリンカー領域の長さおよび配列の重要性を決定するために、短いリンカー(5残基)および長いリンカー(16および20残基)をもつこのバリアントを生成し、VNおよびuPA結合活性を、この研究の別の場所で使用される「標準的な」リンカー(8残基)のそれと比較した(図7A)。バリアントは、293細胞系において一過性のトランスフェクションにより発現され、馴化培地中での結合活性を測定した(図7)。示した通り、uPARのN末端へのGFDドメインの付加は、適用されるリンカー長とは無関係にVN結合を促進し(図7B)、uPA結合を低下させる(図7C)ことから、この配列が長さに関しては非常に柔軟であることが示唆される。
【００９２】
VNに対するGFDuPARキメラの高いアフィニティーを説明するのに考え得る機序
GFDuPARの構築の背後にある概念は、uPARのN末端に結合されたGFDドメインが、図8Aに図示した通り、分子内様式でuPAR中のuPA結合穴に結合するということであった。しかし、立体的な制約により分子内結合が妨げられることはあり得る。この場合、GFDuPARの単一分子は、uPARとuPA両方の結合活性を効果的に示すことができ、図8Bに示すように自己会合し、オリゴマー形成する可能性がある。
【実施例２】
【００９３】
材料および方法
抗原製剤
実施例1に詳細に記載した通り、GFDuPAR-hFcおよびGFDuPAR-mFcを発現させ精製した。
【００９４】
マウスの免疫化
3匹の2ヶ月齢オスC57B1/6  uPAR−/−マウス(Ms#21574、Ms#1416およびMs#1417)を、PBS中の免疫原100μLとフロイント完全アジュバント(CFA)100μLとの1:1乳液200μL中のGFDuPAR-hFc  67μgを用いて腹腔内注射(i.p.)により免疫した。PBS中の免疫原100μLとフロイント不完全アジュバント(IFA)100μLとの1:1乳液200μL中のGFDuPAR-hFc  67μgのIP注射によって、免疫した動物を3週間間隔で3回追加免疫した。7週間の休止期間の後、および融合の4日前に、PBS  200μL中のGFDuPAR-hFc  200μgをi.p.で使用して、Ms#21574を融合前最終追加免疫に供した。Ms#1416およびMs#1417は、1:1  PBS/IFA乳液200μL中のGFDuPAR-hFc  34μgを用いて3週間間隔でさらに3回IP追加免疫を受けた。7週間の休止期間の後、融合の3日および4日前に、Ms#1416およびMs#1417は、PBS  200μL中のGFDuPAR-mFc  250μgをi.p.で、さらにPBS  200μL中のGFDuPAR-mFc  250μgを皮下に使用して、融合前最終追加免疫を受けた。
【００９５】
融合およびハイブリドーマ培養およびクローニング  
脾臓を摘出し、標準的な手順を使用するポリエチレングリコール法(Galfre et al.、1977)によって、脾細胞をマウスSP2/0骨髄腫細胞系と融合させた。融合の後、細胞を、非選択培地(Iscove、10%FBS、1xHFCS)中で1日間培養し、次いで1xHFCS(ハイブリドーマ融合クローニング用添加剤、Roche  Corp.)を補充した選択HAT培地(Iscove、1xHAT)が入った96ウェルプレートに播いた(35,000脾細胞/ウェル)。抗原特異的免疫グロブリンの産生について陽性のハイブリドーマをELISAによって同定し(下記参照)、12ウェルプレートに展開し、凍結した。選択したハイブリドーマを、96ウェルプレートでの限界希釈法によってサブクローニングした。1xHFCSを補充したHT培地(Iscove、1xHT)に0.4〜0.1個細胞/ウェルの範囲の密度で細胞を播いた。必要に応じて、ELISAによって全てのサブクローンが陽性と記録されるまで、サブクローニング手順を繰り返した。異なるハイブリドーマによって産生される免疫グロブリンのアイソタイプを、市販のELISAキット(Mouse  Immunoglobulin  Isotyping  ELISA  Kit、BD  Pharmingen  Corp.)を使用して決定した。
【００９６】
上清のスクリーニング
透明な96ウェルプレート(MAXI-SORP、NUNC  Corp.)を、GFDuPAR-hFc(0.1M炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.5中に1μg/mL)でコートした。PBST(0.1%Tween-20含有PBS)で洗浄した後、ウェルをPBST中の3%BSAでブロッキングし、PBSTに1:2に希釈した細胞培養上清で洗浄およびインキュベートした。結合しているマウス免疫グロブリンを、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体を使用して検出し、その後洗浄し、クエン酸緩衝液中のABTSを使用して比色検出し、415nmでプレート測定した。
【００９７】
抗体可変鎖のクローニング
本質的に前述のように増幅した重および軽鎖可変領域(Wang et al.、2000)。簡潔には、キット(RNAeasy、Qiagen)を使用して全RNAを抽出し、ランダムヘキサマーおよびオリゴ(dT)20プライマーの混合物を使用する逆転写によって第1鎖cDNAを生成した。重鎖の可変領域を、フォワードプライマーMH1およびMH2ならびにリバースプライマーIGG1の混合物を使用して増幅した。軽鎖の可変領域を、フォワードプライマーMKおよびリバースプライマーKCを使用して増幅した。PCR産物をゲル精製し、プライマーMH1およびIGG1(重鎖PCR産物)またはMKおよびKC(軽鎖PCR産物)を使用して両方向的に配列決定した。IgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)を使用して配列を組み立て、分析した。
【００９８】
阻害活性の定量化
VN(5μg/mL)またはFN(10μg/mL)で96ウェルEプレートを4℃で、終夜コートした。プレートをPBSで洗浄し、無血清培地(DMEM、0.1%ウシ血清アルブミン、25mM  Hepes  pH7.0)0.1mLを添加し、リアルタイム細胞分析機器(xCELLigence  SP、Roche  Corp.)に移した。バックグラウンドインピーダンス(細胞インデックス、CI)を測定し、プレートを機器から取り出し、その培地を無血清培地100μLに懸濁した15x103個の293/uPAR細胞と置きかえた。プレートを機器に戻し、細胞インデックスを3分毎に記録した。1.5〜2時間のインキュベーション後に、プレートを機器から取り出し、ウェルに200nMプロuPAまたはビヒクル対照10μLを添加し、プレートを機器に戻した。測定のさらに1〜1.5時間後に、プレートを再び取り出し、希釈して指示した最終濃度にした抗体(20μL)をウェルに添加した。プレートを機器に戻し、3分毎に2時間、次いで15分毎に18時間、測定を実行した。
【００９９】
細胞系およびフローサイトメトリー(FACS)
指示した受容体または空のベクター(模擬)でトランスフェクトした293Flp-In  T-REx細胞(Invitrogen  Corp.)を回収し、モノクローナル抗体(10μg/mL)およびフルオレセイン標識二次抗体と順次染色した。フローサイトメトリー(FACSCalibur、BD  Corp.)によって蛍光を記録し、FlowJoソフトウェアパッケージを使用してデータを分析した。
【０１００】
オリゴヌクレオチド配列
IGG1 5'-GGAAGATCTATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3'(配列番号49)
MH1 5'-CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC-3'(相当するものは5'-CTTCCGGAATTC(G/C)A(A/G)GT(A/T/G/C)(A/C)AGCTG(G/C)AG(G/C)AGTC-3')(配列番号50)
MH2 5'-CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG-3'(相当するものは5'-CTTCCGGAATTC(G/C)A(A/G)GT(A/T/G/C)(A/C)AGCTG(G/C)AG(G/C)AGTC(A/T)GG-3')(配列番号51)
KC 5'-GGTGCATGCGGATACAGTTGGTGCAGCATC-3'(配列番号52)
MK 5'-GGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA-3'(相当するものは5'-GGGAGCTCGA(C/T)ATTGTG(A/C)T(G/C)AC(A/C)CA(A/G)(A/T)CT(A/C)CA-3')(配列番号53)。
【０１０１】
本明細書において命名法IUPAC命名法が、重複したヌクレオチド位置に対して使用される(http://www.bioinformatics.org/sms/iupac.htmlを参照のこと)
【０１０２】
細胞結合
293/uPAR細胞を、FNコートした96ウェルプレートに播種し、2時間付着させた。次いで、細胞を、濃度を増大させて試験しようとする阻害剤の存在/非存在下で一定濃度のEu3+標識プロuPA(4nM、Eu3+uPA)とインキュベートした(示した通り)。4℃で2時間結合を起こさせ、その後細胞を洗浄して結合していない試薬を除去した。Delfia増強試薬(enhancement solution)を使用してEu3+標識を可溶化し、EnVisionプレートリーダー(PerkinElmer)を使用して時間分解蛍光強度測定によって定量化した。細胞を入れていないがその他は同一に処理したウェルにおいて観察した結合を減算することによって、特異的結合を算出した。
【０１０３】
異種移植片実験
6週齢のオスBalb  C  nu/nuマウスを、Charles  Riverから入手した。接種の前に、血清含有培地中で成長しているPC3細胞を、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、トリプシン処理によって回収し、1200rpm、7分間でペレット化した。細胞(1.0×106個)を、20%マトリゲルを含むPBS  200μLに再懸濁した。アベルチンの腹腔内(i.p.)注射によって動物を麻酔し、麻酔したマウスの右側腹部に26ゲージ針を使用して皮下(s.c.)に1.0×106個の細胞を接種した。異種移植の5日後に、動物を、2つの対照群(動物を、i.p.で、ビヒクル(n=5、PBS)、または非免疫性マウスのIgG1(n=5、10mg/kg)で週2回処理した)、および2つの実験群(動物をmAb  8B12(n=5、10mg/kg)またはmAb  13F6(n=5、10mg/kg)のいずれかで処理した)にランダム化した。動物を、腫瘍発生および成長について週2回、7週間観察した。腫瘍体積を、次式にしたがって決定した:腫瘍体積=短径2×長径/2。触診可能な腫瘍を発症しなかった1匹のマウス(IgG対照群の1匹)を、データ分析から除外した。PBSでおよびIgG1で処理した動物の間で腫瘍成長に有意な差異はなかった(データ不掲載)、そして実験群8B12(n=5)および13F6(n=5)との比較のために、これらマウスのデータをプールした(n=9)。結果は平均±SEとして分析され、実験データの比較を、(対応無し、両側、等分散)t検定によって分析した。
【０１０４】
免疫組織化学的分析
免疫組織化学的な分析用として、原発腫瘍を切除し、4%パラホルムアルデヒド(ホルマリン)に固定し、最適切断温度(OCT)樹脂(Killik、BIO-OPTICA)に包埋した。組織塊を8μmに切断し、免疫染色用の正電荷を持つガラススライド上にマウントした。Ki-67染色のために、切片をアセトンと4℃で1分間インキュベートした。スライドをPBSで洗浄し、続いてプレインキュベーション緩衝液(6%BSAおよび10%FBS含有PBS)中で、RTで1時間ブロッキングした。スライドをKi-67抗体(1:500希釈)と共に4℃で終夜インキュベートし、続いてPBSで洗浄した。検出用として抗ウサギCy3(1:200)およびDAPI(1:2500)を使用した。スライドをVectamount(Vectamount)  AQにマウントした。アポトーシス細胞を検出するために、切片を80%エタノールと室温で1分間インキュベートした。スライドをPBSで洗浄し、続いてプレインキュベーション緩衝液中で、RTで1時間ブロッキングした。一次抗体(切断したカスパーゼ3、1:200)インキュベーションを、4℃で終夜行い、続いてPBSで洗浄した。Ki-67染色スライドについて検出を行った。細胞増殖およびアポトーシスを定量化するために、動物当たり合計24枚の切片を、それぞれ10×倍で分析した。データは、領域当たりの陽性細胞の平均数として示される。
【０１０５】
結果
背景および原理
実施例1に記載の通り、uPA/uPARキメラGFDuPAR-hFc、GFDuPAR-mFcおよびGFDuPARmycは、「従来の」可溶性uPARの形態と比較して、VNに対する結合アフィニティーの劇的な増大(＞10,000倍)を示す。この結合の増大は、これらキメラにおけるVN結合部位のより効果的な露出に起因するらしい。効果的に露出したVN結合部位の存在により、これらのキメラ受容体をuPAR中のVN結合部位に結合する分子の生成および/または単離に利用することができ、これらが競合拮抗的活性を有することが示唆される。事実、この実施例において、GFDuPAR-hFcに対して産生されるモノクローナル抗体は、uPAR中のVN結合部位に頻繁に結合し、多くの場合、uPAR機能の強力な阻害剤であることを示している。
【０１０６】
免疫化
GFDuPAR-hFcに対するモノクローナル抗体を生成するために、3匹のC57B16  uPAR-/-動物を、確立された手順にしたがって組換えGFDuPAR-hFcで免疫した(材料および方法を参照のこと)。最初に全てのマウスをGFDuPAR-hFcで免疫し、同じ抗原で3回、接種後追加免疫した。7週間の休止期間後に、1匹の動物(Ms#21574)は、GFDuPAR-hFcで前融合追加免疫を受け、4日後に脾臓を摘出し、標準的な手順を使用するポリエチレングリコール法(Galfre et al.、1977)によって、脾細胞をマウスSP2/0骨髄腫細胞系と融合させた。残り2匹のマウス(Ms#1416およびMs#1417)を、減量したGFDuPAR-hFcで別に3回追加免疫し、7週間の休止期間後にGFDuPAR-mFcで前融合追加免疫を行い、脾細胞を単離し、上述の通りマウスSP2/0骨髄腫と融合した。得られる抗体のアフィニティーを上げるために、レベルを減じた抗原でさらに追加免疫を行った。最初の融合後に同定された陽性雑種の約半分がhFcを認識することが判明したので(データ不掲載)、GFDuPAR-mFcで最後の追加免疫を行って、GFDuPAR-hFcのhFc部分と反応する抗体の数を減少させた。
【０１０７】
陽性雑種の同定、サブクローニングおよびアイソタイピング
3つの異なる融合体から、増殖し、GFDuPAR-hFcと反応するがhFcへの結合は陰性である免疫グロブリンの、持続的な産生を示す合計17種の雑種(Ms#21574、Ms#1416およびMs#1417からそれぞれ12種、3種および2種)を得た。得られた雑種のうち、8種(Ms#21574、Ms#1416およびMs#1417からそれぞれ5種、2種および1種)を限界希釈法によってサブクローニングして、クローン性を確実にした。免疫グロブリンを標準的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって馴化培地から精製し、市販のキットを使用してアイソタイプを決定した。マウスID、クローンおよびサブクローン番号ならびに免疫グロブリンアイソタイプを、Table1(表1)に示す。可変領域の配列を決定するために、増殖しているハイブリドーマ培養物からRNAを抽出し、逆転写し、増幅させ、配列決定した。図9に、Kabatシステムにしたがって番号付けした重および軽鎖可変領域の推測されるアミノ酸配列を、相補性決定領域(CDR)に下線を引いて示す。
【０１０８】
細胞表面uPARと抗体の反応性
抗体の主要な使用法は、細胞表面uPARに結合する阻害試薬としてなので、最初に、空のベクターでトランスフェクトしたまたはヒトuPAR(huPAR)もしくはマウスuPAR(muPAR)を発現している293細胞に対するフローサイトメトリーにより、抗体の特異性について試験した。図10に示すように、8個全てのモノクローナル抗体(mAb)(ヒストグラムの1列目および2列目)が、ヒトuPARを発現している細胞に特異的かつ効果的に結合する。1つの抗体(19.10)を例外として、全ての抗体が、マウスuPARを発現している細胞を効果的に標識することができないので、ヒトuPARに対してはっきりとした種選択性を示す。唯一の例外(19.10)は、マウスuPARと部分的な反応性を示す。マウスuPAR(BR4およびAK17(Tjwa et al.、2009))に特異的な2つのmAbを対照として分析に含めた。
【０１０９】
阻害活性
生細胞でのuPARシグナル伝達阻害における異なる抗体の活性を評価するために、リアルタイム細胞分析装置(RTCA、xCELLigence  SP、Roche  Corp.)を使用するインピーダンス測定によって細胞接着を定量化した(図11)。これらの実験において、uPARを発現している293細胞(293/uPAR)は、VNに対して強力なuPA依存的細胞接着を示すので(Madsen et al.、2007)、これを利用した。293/uPAR細胞を、VNまたはフィブロネクチン(FN)コートしたウェルに播種する場合、細胞は培養基に付着して広がり、結果として時間依存的に細胞インデックスが増大する。細胞接着のおよそ1.5〜2時間後に、細胞を、ビヒクル対照(図11A)またはプロuPA(図11B)のいずれかで処理した。プロuPA添加後に観察される細胞インデックスの激しい増大によってここで実証された通り(図11パネルAおよびパネルBの黒い曲線を比較し、プロuPA添加による細胞インデックスの急激な増大に注目のこと)、プロuPAによる処理は、uPARをリガンドで飽和させ、VNへのuPAR依存的細胞接着を促進する(Madsen et al.、2007)。プロuPAによる処理は、インテグリンによって媒介されるFNに対する細胞接着(Madsen et al.、2007)をモジュレートせず、プロuPAでの処理は、一貫してFNコートしたウェルにおける細胞インデックスを顕著に促進しない(図11C)。プロuPA(またはビヒクル)処理のおよそ1時間後に、希釈した量の抗体を添加し、細胞インデックスの変化を経時的に記録した。ビヒクル処理細胞と比較した、抗体添加1時間後に観察される細胞インデックスの減少として阻害活性を定量化し、図11Dに図示した通り非線形回帰によってIC50値を算出した。図11に示されるデータは、1種の抗体(8B12)の分析について示しており、全ての抗体について得たデータの要約は、Table2(表2)に見ることができる。この実施例において特徴付けられた8種の抗体のうち6種(8B12、10H6、13D11、19.10、AL38およびBE18)が、低ナノモル範囲のIC50値でVNへの基礎的なuPAR媒介性細胞接着を阻害すると判明した。プロuPA存在下で、6種の抗体のうちの4種(8B12、10H6、1
3D11、19.10)はおおよそ変わらない阻害活性を保持したが、2種(AL38およびBE18)は、この条件下で非阻害性であることが判明した。公知の阻害抗体(R3およびR5)は、この条件下で不活性であることが判明したので(下記参照)、これらの条件下でVNに対するuPAR媒介性細胞接着を阻害する能力は、8B12、10H6、13D11および19.10に独自の特徴である。それら抗体は、FNに対する細胞接着をモジュレートしなかった(図11のパネルCおよびパネルDならびにデータ不掲載)ので、その阻害活性は、VNへの細胞接着に高い特異性がある。
【０１１０】
8B12の阻害活性とuPAR/VN相互作用および/またはuPAR機能の他の公知の阻害剤との比較分析
uPARの非タンパク質分解活性の様々な阻害剤について記載されている。これらは、uPAR  VN相互作用の天然の競合アンタゴニストであるVNのuPAR結合N末端ドメイン(ソマトメジンBドメイン、SMB)(Deng et al.、1996)、ファージディスプレイによって単離され、uPARへのVN結合を妨害することが示されている合成ペプチド(P7)(WO97/35969)、uPAR/VN相互作用およびuPAR機能を妨害することが公知の記載されている2個の従来型の抗体(R3およびR5)(Sidenius and Blasi、2000)、ならびに前立腺癌モデルにおける腫瘍体積および骨格の損傷を縮小し(Rabbani et al.、2010)、肝臓中の結腸直腸癌細胞増殖モデルにおける小さな体積のすでに罹患した疾患を縮小し(Van Buren et al.、2009)卵巣癌の転移を減少させること(Kenny et al.、2010)が示されたATN-658抗体(WO2008/073312;WO2005/116077)を含む。uPAR中の最小のATN-658結合エピトープ(268KSGCNHPDLD277、配列番号1のaa.268〜277に対応する、WO2008/073312の配列番号16)の位置は、uPARのC末端近傍であり、この発明に記載の阻害抗体に結合されるエピトープ(R89、R91およびY92)とは別である。ATN-658の代用物として、ATN-658と全く同じエピトープ(268KSGCNHPDLD277配列中の残基D275(配列番号1のaa.275に対応する)は、R2がuPARに結合するのに重要である(Gardsvoll et al、2007))でuPARに結合する記載されているR2抗体を使用した。
【０１１１】
上述の化合物の機能阻害活性を比較するために、この発明に記載の抗体の阻害活性を決定するために適用したのと同じアッセイでこれらを分析した(図11を参照のこと)。これらの分析結果を、図28にグラフで、Table2(表2)に数値で提示する。
【０１１２】
プロuPA非存在下で定量化したIC50値に関しては、8B12抗体は、R3およびR5抗体より4〜7倍強力であり、R2抗体より34倍強力であり、SMBドメインより260倍強力であり、P7ペプチドより2000倍超強力である。これらの化合物の全て(SMBドメインを除く)で達成された最大阻害が、8B12で達成されたそれより劣ることから、ここで使用したIC50に基づく純粋な比較が、8B12の阻害活性を実際には過小評価していると示唆されることに留意されたい。
【０１１３】
プロuPA存在下で定量化した場合、SMBドメインおよびR2抗体だけが、著しく阻害性である(>20%)ことが判明した。IC50値に関しては、8B12は、R2より25倍強力であり、SMBドメインより330倍強力であることが判明した。プロuPA非存在下で測定したP7ペプチドの活性が極めて低かったので、この化合物をプロuPA存在下で試験しなかった。8B12とR2の間のIC50における25倍の差異に加えて、後者が約1/4倍低い最大阻害も示すことから、プロuPA存在下でも8B12の阻害活性を過小評価していると示唆されることに留意されたい。R2およびATN-658はuPAR中の同じエピトープに結合するので、8B12の活性は、in vivoでの有効性を確認したこの抗体より同様に優れていると思われる。
【０１１４】
uPAR中の結合エピトープのマッピング
抗体の阻害活性の分子基盤を決定するために、次に、uPAR中の結合エピトープをマッピングすることを目指した。細胞培養におけるuPARの完全な機能的アラニンスキャン(個々の残基のアラニンによる系統的な置換)については以前に記述した(Madsen et al.、2007)。255個の異なるuPAR変異体を発現している細胞の界面活性剤溶解物が利用可能であり、したがって、ELISAアッセイを実行して、異なる抗体との反応性の低下を示すuPAR変異体を同定した。いくつかの理由により、このスクリーニングデータの質は、異なるuPARアラニン置換変異体との異なるモノクロ−ナル抗体の反応性を明解に決定するには不十分であった。しかし、2個以上の阻害抗体が、R91近傍領域にアラニン置換を有するuPAR変異体との反応性の低下を示すように見えた(データ不掲載)。この発見をより厳密な様式で調査するために、この領域内で選択したuPARアラニン置換変異体を発現している293細胞でフローサイトメトリー分析(FACS)を実行した(図12、図13および図14)。最初に異なる抗体と、野生型uPARおよびR83とR89の2個をアラニン置換した変異体との反応性を比較した(図12)。示した通り、8個の抗体のうち5個(8B12、10H6、13D11、19.10およびAL6)が、R83/89A変異体との反応性の大きな低下を示したことから、これらの抗体に対する結合エピトープがR83および/またはR89を含むことが示唆される。残り3個の抗体(13F6、AL38およびBE18)が、野生型と変異体受容体を同様に良く染色したので、染色強度の減少の理由は、この受容体変異体の発現レベルがより低いことの結果ではない。同じ実験において、抗体認識における受容体のプロuPA占有の効果についても検討した。ほとんどの抗体の結合(全ての阻害抗体を含めて)が、uPAの存在によって特に影響されなかったことから、プロuPAおよびこれら抗体に対する結合部位が重なっていないことが実証された。対照的に、抗体AL38およびBE18は、プロuPA存在下で反応性の大きな低下を示したことから、これらの抗体がuPAR中のuPA結合部位と重なっているエピトープを認識することが示唆された。R83/89A受容体の認識の減少が、R83Aおよび/またはR89A変異によるものかどうか決定するために、次に、R83AおよびR89Aの別々の置換、ならびにuPARのこの領域中にあり、uPARへのVN結合に重要であることが公知である別のアルギニン残基のアラニン置換(R91A)を持つuPAR変異体を発現している細胞を分析した(Gardsvoll and Ploug、2007;Madsen et al、2007)(図13)。見て分かる通り、この実験結果は、R83でなく、R91およびR89が、阻害抗体8B12、10H6、19.10および13D11に対するならびに非阻害性抗体AL6に対する認識エピトープ部位であることを明示している。uPARに対するこれら抗体の結合は、R91A変異によって実質的に無効にされ、R89A変異によって大きく弱められ、R83A置換による影響を受けない。R83A、R89AおよびR91A変異体受容体を発現している細胞が、残りの抗体(13F6、AL38およびBE18)によって同様に良く染色されたことから、これらの抗体によって認識されるエピトープがこの領域の外にあり、変異体受容体が同様に良く発現していることが実証された。uPARのこの領域の分析を完了するために、別の組のuPAR変異体(S88A、S90AおよびY92A)および遠くの変異(P218A)ならびに残基1〜83(ドメインD1)(配列番号1のaa.1〜83に対応する)を欠失した(すなわち残基84〜283(ドメインD2およびD3)が保持されている)uPARの欠失変異体を分析した(図14)。データから分かる通り、この分析の結果は、上述のR91およびR89に加えて、Y92もuPARへの阻害抗体の結合に重要であることを実証している。全ての抗体が、D1を欠いたuPARの短縮された変形(D2D3、図15を参照のこと)を全長受容体ほど良く認識しないことから、この受容体は、細胞表面でより低レベルで発現されていることが示唆される。1個の抗体(13F6)は、D2D3受容体を他の抗体より良く認識するが、残りの抗体はD2D3を完全な受容体ほど良くは認識しない。
【０１１５】
8B12抗体は、VN依存的なuPARの機能の特異的な阻害剤であり、uPA結合に依存的な受容体のタンパク質分解機能を妨害しない。
VNへのuPAR依存的細胞接着の阻害における8B12活性が、uPA存在下でも完全であることから(図11を参照のこと)、この抗体が、VN依存的uPAR機能の特異的な阻害剤であることが示唆される。これは、uPAR中のVN結合部位の中心(R91)にあり(図13、図14および図15を参照のこと)、uPA結合には関与しないこの抗体の結合エピトープと合致している。8B12が、uPARへのuPA結合、したがって、受容体のタンパク質分解機能を妨害するかどうか実験的に決定するために、uPARを発現している293細胞(293/uPAR)を、試験しようとする化合物の濃度を増大させながら、固定濃度のユウロピウム標識プロuPA(Eu3+uPA)とインキュベートする結合アッセイを実行した。図16に示すように、このアッセイにおいて、対照抗体R3および非標識プロuPA(自己競合)は、293/uPAR細胞へのEu3+uPAの結合を効果的に阻害したが、抗体8B12および13F6は全くまたは最小の競合活性しか示さない。
【０１１６】
これらのデータは、8B12が、uPARへのuPA結合を妨害しないことを実証しており、したがって、この抗体が、VN依存的uPAR機能の選択的阻害剤であることを実証している。これは、8B12およびここに記載の他の阻害抗体(10H6、13D11および19.10)を固有にする。R3および類似の抗体は、uPARへのuPAとVN両方の結合を妨害する(図16および図28を参照のこと)。
【０１１７】
8B12抗体は、前立腺癌(PC3)の異種移植片モデルにおいて腫瘍成長を低下させる
mAb  8B12の潜在的抗腫瘍活性をin vivoで決定するために、前立腺癌異種移植片モデルを使用して研究を実行した。このモデルにおいて、1,000,000個のPC3細胞を、皮下経路によってオスBalb  C  nu/nuマウスの右側腹部に接種した。異種移植された動物を、腹腔内注射によってmAb  8B12、非阻害性mAb  13F6、対照マウスのIgGまたはPBS(ビヒクル)により隔週で処理し、腫瘍の体積を較正により観察した。図17に示すように、mAb  8B12で処理した動物は、対照動物と比較して、腫瘍体積の著しい減少を示した。処理した動物は、腫瘍体積において30〜40%の減少を示した。この減少は阻害性抗uPAR抗体ATN-658を使用する他の処理によって観察された減少と同程度である(Rabbani SA、et al.、Neoplasia 2010)。非阻害性抗体13F6に対しては、類似の阻害が観察されなかったことから、8B12の阻害活性の背後にある機序はVN結合の阻害であり、uPAR発現細胞の標的化だけではないことが実証される。
【０１１８】
異種移植されたPC3腫瘍において、8B12抗体による処理は、細胞増殖を低下させ、アポトーシスを増大させる
8B12で処理した動物におけるPC3腫瘍成長の低下についての生物学的根拠を調査するために、異種移植8週間後に動物から採取した腫瘍切片の免疫組織化学分析を実行した(図18)。腫瘍細胞増殖を評価するために、増殖している細胞抗原Ki-67を染色し、アポトーシスを評価するために、活性型(切断された)カスパーゼ3を染色した。図18Aに図示し、図18Bにおいて定量化した通り、8B12で処理したマウスから採取した腫瘍が、切断されたカスパーゼ3の反応性から明らかなように、アポトーシスを受けている細胞数の強力な増大、およびKi-67陽性によって特徴付けられるように、増殖細胞数の顕著な減少を示すことから、mAb  8B12がアポトーシスを促進し、細胞増殖を低下させることによって腫瘍成長を抑制することが示唆される。非阻害性mAb  13F6抗体による処理が、細胞増殖およびアポトーシスにいかなる有意な変化も引き起こさなかったことは、8B12の生物活性に関与するuPAR発現細胞の単なる標的化ではなく、むしろuPAR/VN相互作用に対する阻害作用が必要であることを支持している。
【０１１９】
結論
この実施例において、GFDuPAR-hFcに対して産生される抗体は、しばしばuPARの機能的な阻害剤であることを示した。本明細書において同定されたより強力な阻害抗体(8B12、10H6、19.10および13D11)は全て同じ領域でuPARに結合し、その重要な残基はR91、R89およびY92である(図15)。抗体の結合部位が、受容体中の、既報の物理的(Huai et al.、2008)および機能的(Madsen et al.、2007)VN結合部位と部分的に一致することから、これら抗体の機能的阻害活性が、uPAR/VN相互作用の競合的拮抗作用に媒介されることが実証される。これらのデータは、GFDuPAR-hFcにおいてuPAR中のVN結合部位が露出しており、この領域がマウスにおいて抗原性であることをさらに実証している。8B12は、VN依存的なuPAR機能の選択的阻害剤であることを示した。さらに、8B12は、腫瘍細胞増殖を低下させ、アポトーシスを増大させることによって腫瘍成長を阻害する。
【実施例３】
【０１２０】
材料および方法
mGFDmuPAR-Fcのクローニング
オリゴmuPAkf/mGFDrを用いるマウスuPA  cDNAの、およびオリゴmuL8f/MUPPFCRを用いるマウスuPAR  cDNAの増幅によって、mGFDmuPAR-Fcをコードしている発現ベクターを生成した。2つのPCR産物を混合し、オリゴmuPAkf/MUPPFCRを用いて共増幅し、KpnI/XhoIでベクターpFRT/TO-Fcにクローニングした。このベクター(mGFDmuPAR-Fc、配列9(配列番号17))にコードされるタンパク質は、増殖因子ドメイン(GFD、配列9A(配列番号4))を含めたマウスuPAの49個のN末端残基、短いリンカー(アミノ酸GGAGAAGG、配列9B(配列番号8))、マウスuPARの残基1〜273(配列番号2のaa.1〜273に対応する配列9C)、第2の短いリンカー(アミノ酸VELEVLFQGPIE、配列9D(配列番号11))およびヒトFcタグ(配列1C(配列番号5))、から成る。
【０１２１】
オリゴヌクレオチド配列
muPAkf: 5'-GGGGTACCATGAAAGTCTGGCTGGCGAG-3'(配列番号54)
mGFDr: 5'-CGCCCCGGCCCCTCCTTTTGATGCATCTATCTCACA-3'(配列番号55)
muL8f: 5'-GGAGGGGCCGGGGCGGCTGGAGGACTGCAGTGCATGCAGTGTGAG-3'(配列番号56)
MUPPFCR: 5'-AGCGGCTGTAACAGCCCCGTCGACCG-3'(配列番号57)
【０１２２】
抗体の生成
ヒトGFDuPAR-hFcバリアントについて記載した通り、mGFDmuPAR-Fcに対するモノクローナル抗体をuPAR-/-マウスにおいて産生した(実施例2、材料および方法の項を参照のこと)。
【０１２３】
細胞結合アッセイ
0.1%BSAおよび25mM  Hepes  pH7.0(結合緩衝液)を含有するDMEMに懸濁したヒトuPARを発現している293細胞(293/uPAR)30×103個を、フィブロネクチン(PBSに10μg/mL)コートした黒色の96ウェルELISAプレート(NUNC)のウェルに播種し、37℃で2〜4時間付着させた。穏やかに洗浄した後、細胞を、試験しようとする競合物質の存在または非存在下で固定濃度(4nM)のユウロピウム標識プロuPA(Eu3+uPA)とインキュベートした。4℃で1時間結合を起こさせ、冷結合緩衝液を使用して繰り返し洗浄することにより、結合していない試薬を穏やかに除去した。 増強試薬(Perkin  Elmer)0.1mLを添加することにより細胞を溶解し、EnVisionプレートリーダー(Perkin  Elmer)を使用する時間分解蛍光強度測定(Delfia、Perkin  Elmer)によりEu3+標識を定量化した。細胞を入れていないがその他は同じ方法で処理したウェルにおいて測定した結合を減算することによって、特異的結合を算出した。
【０１２４】
結果
背景および原理
上述の阻害抗体のいずれも、マウスuPARに結合せず(図10を参照のこと)、したがってヒト癌のげっ歯動物異種移植片モデルにおける宿主のuPAR発現細胞に対していかなる効果も無さそうである。腫瘍成長の低下におけるmAb  8B12の有効性は、したがって、抗体が、異種移植されたヒト癌細胞に直接作用している可能性があることを示している。しかし、宿主細胞に起こり得る正または負の効果を検討することはできないので、これら抗体の種特異性が信頼性の高い前臨床試験を妨げている。この制限を回避するために、類似の阻害活性を持つが、マウスuPARでも有効な抗体を生成しようと試みた。
【０１２５】
構成的に活性なVN結合を示すマウスuPAR(mGFDmuPAR-hFc)の構築および産生
この目的のために、本質的にはGFDuPAR-hFcについて記載した通りに構成的に活性なマウスuPAR(mGFDmuPAR-hFc、図19A)を構築したが、GFDおよびuPARをコードしているマウス由来配列を使用して組み立てた。予測された通り、得られたキメラが固定化VNに高いアフィニティー(Kd=0.82nM、図19B)で結合することから、この戦略には汎用性が有り、異なる種起源のGFDドメインおよびuPARにも適用可能なことが実証される。
【０１２６】
mGFDmuPAR-hFcに対して産生される抗体は、VNに対するマウスuPAR媒介性細胞接着の強力な阻害剤である
mGFDmuPAR-hFcに対するモノクローナル抗体を生成するために、ヒトGFDuPAR-hFcについて上述した通り、5匹のC57B16  uPAR-/-動物を組換えmGFDmuPAR-hFcで免疫した。最良の応答をした2匹の動物の脾臓を摘出し、標準的な手順を使用するポリエチレングリコール法によって、脾細胞をマウスSP2/0骨髄腫細胞系と融合させた。
【０１２７】
2つの融合体から、増殖し、mGFDmuPAR-hFcと反応するがFcタグへの結合は陰性である免疫グロブリンの持続性的な産生を示す合計13種の雑種を得た(データ不掲載)。阻害抗体を産生しているそれらの雑種を同定するために、マウスuPARを発現している293細胞を使用するVNに対する細胞接着アッセイで馴化培地を試験した(図20)。このアッセイにおいて、4種の異なる雑種(OOF12、NM23、NE43およびOMD4)の上清は、明白な阻害活性を示した。
【０１２８】
構成的に活性なヒトuPAR(GFDuPAR-hFc)に対して産生される阻害抗体は、機能的に重要なArg91(R91)を含むVN結合部位と同じヒトuPAR中のエピトープを認識することが判明した。同じ優れた特異性が、構成的に活性なマウスuPAR(mGFDmuPAR-hFc)に対して産生される阻害抗体についても観察されるかどうか決定するために、ハイブリドーマ上清中の抗体と固定化mGFDmuPAR-FcおよびArg92(R92)(ヒトuPARにおけるArg91、R91に対応する)をアラニン残基で置換したこの受容体の単一点変異体(mGFDmuPAR-FcR92A)との反応性を試験した。2種のハイブリドーマ(OMD4およびNE43)の上清は、置換されていないmGFDmuPAR-Fcに対して明らかな選択的結合を示した(図21)。これらの2種の雑種の上清も、阻害性であることが判明したので、産生された抗体が、muPAR中のVN結合部位に結合することによるVN/muPAR相互作用の競合的阻害剤であることが示唆される。他の2種の阻害雑種(OOF12およびNM23)が、置換されたおよび置換されていないmGFDmuPAR-Fcを同様に良く認識したことから、それらの阻害活性が異なるエピトープへの結合に媒介されることが示唆される。このアッセイにおいて、生成された抗体がヒトuPARと交差反応するどうか決定するために、ヒト可溶性uPAR(suPAR)との反応性も試験した。1つの抗体(OMD4)は、ヒトuPARと反応性を示すことが判明した。
【０１２９】
阻害活性を示している4種の雑種を選択してさらに分析し、限界希釈法によってサブクローニングして、クローン性を確実にした。免疫グロブリンを標準的なプロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって馴化培地から精製し、実施例2に記載の通り、アイソタイプを決定した。マウスID、クローンおよびサブクローン番号ならびに免疫グロブリンアイソタイプを、Table4(表4)に示す。可変領域の配列を決定するために、増殖しているハイブリドーマ培養物からRNAを抽出し、逆転写し、増幅させ、配列決定した。図22に、Kabatシステムにしたがって番号付けした重鎖可変領域の推測されるアミノ酸配列を、相補性決定領域(CDR)に下線を引いて示す。
【０１３０】
最後に、生成した抗体の種特異性を試験し、GFDuPAR-hFcに対して産生されたmAb  8B12および13F6のそれと比較した(図23)。その阻害活性(図20)、R92に対する結合エピトープ依存性(図21)、およびヒトuPARとの反応性(図21)で一致するので、抗体OMD4は、ヒトおよびマウス両方のuPARによって媒介される細胞接着を阻害することが判明した。生成された他の全ての抗体は種特異的な阻害を示し、NM23、OOF12およびNE43はマウスuPARの選択性が高い阻害剤であることが判明した。13F6抗体は、ヒトuPARと反応性がある陰性対照として含まれた。
【０１３１】
結論
構成的に活性なマウスuPARバリアントを容易に生成することができ、これらを使用して、高頻度(13個中4個)で阻害抗体を生成することでき;これら抗体の阻害活性が、VN結合部位への抗体の直接結合にしばしば媒介される(4個のうちの2個)ことを示した。
【０１３２】
そのうえ、構成的に活性なマウスuPARを抗原として使用することにより、マウス受容体と特異的に反応する阻害抗体(OOF12、NM23およびNE43)およびマウスとヒト両方の受容体と反応する抗体(OMD4)の生成が可能になる。
【０１３３】
後者の抗体は、マウスモデルにおいて、将来的な前臨床試験を大きく促進することになる。
【実施例４】
【０１３４】
材料および方法
抗原製剤
uPAR-hFcの発現および精製については、実施例1に記載されている。VN(1〜66)-Fcについては、以前に記載されている(Madsen et al.)。プロuPAは、Jack  Henkin、Abbot研究所から寄贈された。
【０１３５】
パニング手順
各パニングの周回に対して、3つのNUNC免疫チューブ(A、BおよびC)を準備し、後述の通りインキュベートした。全てのインキュベーションは合計体積4mLで実行し、コーティングは50mM炭酸緩衝液pH9.6中で行った。最初に、チューブを、抗ヒトFc抗体(チューブA:150μg/mLおよびチューブC:15μg/mL)、またはプロuPA(チューブB:150μg/mL)で終夜コートした。チューブを、PBSで3回洗浄し、2%ミルク含有PBS(2%MPBS)で2時間ブロッキングし、VN(1〜66)-Fc(チューブA:150μg/mL)、ならびにチューブCをuPAR/Fc(15μg/mL)とプロuPA(15μg/mL)との混合物とインキュベートした。チューブをPBSで洗浄して結合していない試薬を除去し、使用するまで2%MPBS中に保管した。第1のパニングステップ(負の選択)において、4%MPBSに希釈した1013t.u.(滴定単位)のファージライブラリをチューブAに添加し、RTで2時間(繰り返し反転させながら30分間、続いて立位で1.5時間)インキュベートした。第2の(負の)選択ステップにおいて、チューブAの上清をチューブBに移し、上述の通りインキュベートした。第3の(正の選択)パニングステップのために、チューブBの上清をチューブCに移し、上述の通りインキュベートした。インキュベーションの最後に、上清を捨て、チューブを0.1%Tween-20含有PBSで10回、PBSで10回洗浄して、弱く結合しているファージを除去した。結合しているファージを、100mMトリエチルアミン1mLを使用して、繰り返し反転させながらRTで5分間溶離させた。ファージ溶離液を、1M  トリスHCl、pH7.4  0.5mLで中和し、これを使用して増殖しているTG1培養物(OD=0.4)10mLを感染させた。感染したTG1細胞を、大きな選択プレート上に広げ、30℃で終夜増殖させ、スクレイピングにより回収した。VCS  M13(Stratagene  Corp.)ヘルパーファージ感染によって、ファージを液体培養で増幅させた。ファージを、培養上清から回収し、PEG沈殿によって濃縮した。負の選択ステップ(すなわち抗ヒトFc抗体、VN(1〜66)FcおよびプロuPA)において使用されるベイトタンパク質の濃度が全て15μg/m
Lであることを唯一の例外として、2周回目および3周回目のパニングを1周回目のように実行した。
【０１３６】
結果
背景および原理
実施例1、2および3において、高いVN結合活性を示すuPARの改変形態を、uPAR機能の強力な阻害剤である天然の抗体の生成に適用できることを示した。実施例2および3において生成された抗体はマウスであり、したがってヒトにおいて免疫原性である可能性が有り、おそらく臨床使用は限定される。完全ヒト抗体を生成するためにいくつかの方法が開発されてきた。ここで、ファージディスプレイを利用して、uPARと特異的に相互作用し、その機能を阻害するヒト一本鎖可変フラグメント(scFv)抗体を単離する。uPAR-hFcとプロuPAとの複合体が高いVN結合活性を示すので(図2Aを参照のこと)、図24に漫画で図示した通り、この複合体に結合しているファージの単離は、uPAR中のVN結合部位に結合しているファージを濃縮することになると結論した。
【０１３７】
ファージディスプレイscFvライブラリ
ここで適用した合成ヒト抗体のファージディスプレイライブラリ(ETH-2-Gold)については、以前に記載されており(Silacci et al.、2005)、30億個の固有配列の複雑さを有する。ライブラリは、Philogen(http://www.philogen.com/)から入手可能であり、より複雑性が高い最新のライブラリも現在入手可能である。ファージライブラリは、インターネット上でURL  http://www.pharma.ethz.ch/institute_groups/biomacromolecules/protocols/ethで、入手可能な詳細な手順に緊密にしたがって取り扱い、スクリーニングした。
【０１３８】
選択手順
リガンドが占有している二量体uPARに結合しているscFv抗体を単離するために、負および正の選択の反復周回に基づくパニング戦略を利用して、プロuPAに占有されているuPAR-hFcに結合しているファージを濃縮し、正の濃縮ステップの非uPAR成分に結合しているファージを取り除いた。パニング手順を、図24に図示する。第1の負の選択ステップにおいて、ヒトFc(hFc)に結合しているファージ、捕捉に使用されるヤギ抗ヒトFc抗体(抗hFc)およびプロuPAは、固定化hFc、抗hFcおよびプロuPAへの懸濁したファージの吸着によって除去される。吸着していないファージを第2の正の選択ステップに移し、固定化抗hFc抗体に結合しているuPAR-hFcとプロuPAとの複合体を使用してファージを捕捉した。
【０１３９】
陽性クローンの同定
2周回および3周回の選択ならびに96ウェルプレート中で増殖している液体培養へのIPTG添加によって誘導される小規模のscFv産生の後に、合計564個のクローンを採集した。正および負のパニングステップにおいて使用したタンパク質およびタンパク質複合体に対するscFv結合活性の存在について、細菌上清をELISAによってアッセイした。分析した上清のうち、59%(n=335)は、正のベイトに対する結合について陽性(バックグラウンドより3倍大きいELISAシグナル)を記録した。これらのうち、わずか12%(n=41)が、負のベイトとも陽性を記録した。これらのデータは、正の選択に使用するタンパク質複合体の望ましくない成分と反応するファージを除去する際に、負の選択手順が有効であることを実証している。
【０１４０】
陽性クローンの配列分析
正のベイトと反応するクローンだけからプラスミドDNAを単離し、配列決定に供した。これらのうち、225個のクローンが、重および軽鎖相補性決定3領域(HC-CDR3およびLC-CDR3)の高品質な配列情報をもたらし、分析をこれらに限定した。単一配列が全クローンの約90%(n=200)を占める合計13個の固有配列が見つかった。確かな配列相同性の手作業による検査から、類似の結合特異性を有するとみなされる6つの異なるクラス(A〜F)に、13個の固有配列を分類できることが示唆される(Table3(表3))。13個の各固有配列のうち代表的なクローンを1つ選択し、標準手順にしたがってscFvを発現させ、精製した。
【０１４１】
プロuPA:uPAR-hFc複合体を使用して単離されるscFvは細胞表面uPARに結合し、その結合はプロuPAによってモジュレートされる。
scFvの特異性を決定するために、ヒトuPARを発現している293細胞のFACS分析を実行し、図25にヒストグラムデータを示し、Table3(表3)に要約した。4個のクローン(1G5、3D9、2H10および3C10)は強い陽性染色を示し、2個のクローン(1C1および3B6)は中程度の染色を示し、2個のクローン(2G5および1C5)は弱い染色しか示さなかった。残りの7個のクローンは、陰性であり(データ不掲載)、さらに分析しなかった。scFv結合エピトープの露出が、リガンド占有によってモジュレートされるかどうかを決定するために、プロuPAの存在または非存在下で染色を実行した。プロuPAの存在により、1個のクローン(3B6)において染色強度が増大し、3個のクローン(1C1、3C10および2G5)において低下した。
【０１４２】
プロuPA:uPAR-hFc複合体を使用して単離されるscFvは、uPAR機能を阻害する
初期試験は、3個のscFv(1C1、3B6および3C10)が、VNへのuPAR媒介性293細胞接着を阻害することを示した(データ不掲載)が、scFv  1C1の発現および精製が困難なので、3B6(配列が1C1と極めて類似している)および3C10だけをより詳細に分析した。阻害活性を定量化するために、実施例2のモノクローナル抗体について記載した通り、厳密にリアルタイム細胞アッセイを実行した。図26Aに示すように、3B6は、用量依存的様式でVNへのuPAR媒介性細胞接着を阻害する。プロuPA存在下でも(図26B)、scFv  3B6は細胞接着を低下させたが、その効率は低下した。3B6は、FNへの細胞接着に影響を及ぼさなかったことから、その特異性が実証された(図26C)。用量応答曲線(図26D)の非線形回帰分析によって、IC50濃度を算出し、プロuPAの非存在および存在下で、それぞれ561nMおよび2220nMであった。同様に、scFv  3C10は、プロuPA非存在下で、用量依存的様式でuPAR媒介性細胞接着を阻害した(図27A)。しかしこのscFvは、プロuPA存在下でアッセイした場合、顕著な活性が無かった(図27B)。再び、それはFNへの接着に効果が無かったので、阻害活性はVNへのuPAR媒介性細胞接着に特異的であった(図27C)。用量応答曲線(図27D)の非線形回帰分析法から、プロuPA非存在下でのIC50濃度を算出し、108nMであった。
表
【０１４３】
【表１】
2014529581.tif 000003
【０１４４】
この実施例に記載のモノクローナル抗体のマウスID、クローン番号、サブクローン番号およびアイソタイプを示す表である。
【０１４５】
【表２】
2014529581.tif 000004
【０１４６】
異なるモノクローナル抗体の阻害活性についての要約。「非阻害性」とは、最高の試験抗体濃度(300nM)で20%未満の阻害が観察されたことを示す。IC50値(すなわち、最大半量の阻害を達成するのに必要とされる濃度)およびそれに付随する95%の信頼区間(括弧内に示した)は、図11の抗体8B12について示した通りに決定した。測定の単位は、ナノモル(nM)である。値は、プロuPAで前処理した細胞(プロuPA前処理)およびビヒクル前処理した細胞(ビヒクル前処理)について示される。
【０１４７】
【表３】
2014529581.tif 000005
【０１４８】
(Silacci et al.、2005)にしたがって番号付けされた、単離されたscFvの重(VH)および軽(VL)鎖相補性決定領域3(CDR3)の配列を示す表である。ダッシュの間の配列は、ファージライブラリにおいて超変異した領域である。分析した255個のクローンの中に合計13個の固有配列が見つかった。各固有の配列について、この配列を有するクローンの数を、生化学的特性評価に使用した代表的なクローン名と一緒に(#検出)に示す。固有配列を、配列間の相同性に基づいてクラス(A〜F)に分類した。プロuPA非存在下(FACS(-))および存在下(FACS(+))での細胞表面uPARとの反応性(図25を参照のこと)が、無し(-)、低い(+)、中程度(++)および高い(+++)反応性を表す任意の単位で提示される。各クラス内の保存残基に、下線を引く。
【０１４９】
【表４】
2014529581.tif 000006
【０１５０】
抗mGFDmuPAR-Fcモノクローナル抗体のマウスID、クローン番号、サブクローン番号およびアイソタイプを示す表である。
【０１５１】
配列
野生型ヒトuPAR
MGHPPLLPLLLLLHTCVPASWGLRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDVQYRSGAAPQPGPAHLSLTITLLMTARLWGGTLLWT(配列番号58)
【０１５２】
シグナルペプチド(Met-22〜Gly-1)(斜体)、Gly283に付着される糖脂質膜アンカーを付加する合成の間に除去されるC末端ペプチド(Ala284〜Thr313)(斜体および下線)、および成熟タンパク質(Leu1〜Gly283)(太字)を含む野生型ヒトuPARのアミノ酸配列。
【０１５３】
本明細書に記載の抗体の生成に必要と期待される、配列番号1のaa.32〜92に対応しているヒトuPARの最小の必須領域(Trp32〜Tyr92)を太字と下線で示す。
【０１５４】
野生型マウスuPAR
MGLPRRLLLLLLLATTCVPASQGLQCMQCESNQSCLVEECALGQDLCRTTVLREWQDDRELEVVTRGCAHSEKTNRTMSYRMGSMIISLTETVCATNLCNRPRPGARGRAFPQGRYLECASCTSLDQSCERGREQSLQCRYPTEHCIEVVTLQSTERSLKDQDYTRGCGSLPGCPGTAGFHSNQTFHFLKCCNYTHCNGGPVLDLQSFPPNGFQCYSCEGNNTLGCSSEEASLINCRGPMNQCLVATGLDVLGNRSYTVRGCATASWCQGSHVADSFPTHLNVSVSCCHGSGCNSPTGGAPRPGPAQLSLIASLLLTLGLWGVLLWT(配列番号96)
【０１５５】
シグナルペプチド(Met-23〜Gly-1)(斜体)、Gly275に付着される糖脂質膜アンカーを付加する合成の間に除去されるC末端ペプチド(Gly276〜Thr304)(斜体および下線)、および成熟タンパク質(Leu1〜Gly275)(太字)を含む野生型マウスuPARのアミノ酸配列。
【０１５６】
本明細書に記載の抗体の生成に必要と期待される、配列番号2のaa.32〜93に対応しているマウスuPARの最小の必須領域(Trp32〜Tyr93)を太字と下線で示す。
【０１５７】
野生型成熟マウスuPAR
LQCMQCESNQSCLVEECALGQDLCRTTVLREWQDDRELEVVTRGCAHSEKTNRTMSYRMGSMIISLTETVCATNLCNRPRPGARGRAFPQGRYLECASCTSLDQSCERGREQSLQCRYPTEHCIEVVTLQSTERSLKDQDYTRGCGSLPGCPGTAGFHSNQTFHFLKCCNYTHCNGGPVLDLQSFPPNGFQCYSCEGNNTLGCSSEEASLINCRGPMNQCLVATGLDVLGNRSYTVRGCATASWCQGSHVADSFPTHLNVSVSCCHGSGCNSPTG(配列番号2)
【０１５８】
配列1:uPAR-hFc
LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDLEVLFQGPLELEVLFQGPIEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号14)
【０１５９】
uPAR残基(配列番号1のaa.1〜277に対応する配列1A)を標準文字で、リンカー領域(配列1B(配列番号9))を下線で、およびC末端ヒトFcタグ(配列1C(配列番号5))を斜体で示す。
【０１６０】
配列1A:配列番号1のaa.1〜277に対応するuPAR残基1〜277
LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLD
【０１６１】
期待される最小の機能配列(残基3〜271)に下線を引く。
【０１６２】
配列1B:リンカー
配列:LEVLFQGPLELEVLFQGPIE(配列番号9)
【０１６３】
このリンカーの長さまたは配列に対して予測される特定の要件はない。おそらく、それは完全に除外できる。
【０１６４】
配列1C:ヒトIgGヒンジおよび定常領域(hFc)
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号5)
【０１６５】
他の免疫グロブリン型および/または種由来の類似の配列は、二量体またはオリゴマーを形成する限り、同様に良く機能する可能性がある。
【０１６６】
配列2:uPAR-mFc
LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDLEVLFQGPLEAGAGPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(配列番号15)
【０１６７】
uPAR-mFcの成熟配列は、ヒトuPAR残基1〜277(配列番号1のaa.1〜277に対応する配列1A)(標準文字)、LEVLFQGPLEAGAGリンカー(下線)(配列2A(配列番号10))ならびにマウスIgG1のヒンジおよび定常領域(配列2B(配列番号6))(斜体)から成る。
【０１６８】
配列2A:リンカー
LEVLFQGPLEAGAG(配列番号10)
【０１６９】
このリンカーの長さまたは配列に対して予測される特定の要件はない。おそらく、それは完全に除外できる。
【０１７０】
配列2B:マウスIgGヒンジおよび定常領域(mFc)。
PRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(配列番号6)
【０１７１】
マウス免疫グロブリン重鎖の残基216〜441から成るマウスIgGヒンジおよび定常領域(mFc)タグの配列((Adetugbo、1978)にしたがって番号付けした)。他の免疫グロブリン型および/または種由来の類似の配列は、二量体またはオリゴマーを形成する限り、同様に良く機能する可能性がある。
【０１７２】
配列3:uPARmyc
LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPGGEQKLISEEDL(配列番号26)
【０１７３】
可溶性ヒトuPARのポリペプチド配列(残基1〜274、配列番号1のaa.1〜274に対応する配列3A)を標準文字で、C末端mycタグ(GGEQKLISEEDL、配列番号27に対応する配列3B)を斜体で示す。
【０１７４】
配列3A:配列番号1のaa.1〜274に対応するuPAR残基1〜274
LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHP
【０１７５】
期待される最小の機能配列(残基3〜271(配列番号1のaa.3〜271))に、下線を引く。
【０１７６】
配列3B:mycタグ
GGEQKLISEEDL(配列番号27)
このC末端タグの唯一の目的は、免疫学的検出および/または精製用としてである。配列は、機能的に影響無く取り除くことができる。
【０１７７】
配列4:野生型成熟ヒトuPAR
LRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHE PKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDVQYRSG-(GPI-アンカー)(配列番号1)
【０１７８】
成熟ヒトuPAR(残基1〜283)は、C末端残基(Gly283)に付着している糖脂質アンカーによって細胞膜に連結される。
【０１７９】
配列5:GFDuPAR
SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKGGAGAAGGLRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDVQYRSG-(GPI-アンカー)(配列番号16)
【０１８０】
GFDuPARのポリペプチド配列を、ヒトuPAのGFDドメイン(残基1〜48、配列5A(配列番号3))(太字)、8残基GGAGAAGGリンカー(配列5B(配列番号7))(下線)、および成熟ヒトuPAR(残基1〜283、配列4(配列番号1))(標準文字)で示す。成熟GFDuPARポリペプチドは、uPARのC末端残基(Gly283)に付着しているGPIアンカーによって細胞膜に係留される。
【０１８１】
配列5A:ヒトuPA(残基1〜48)の増殖因子様ドメイン(GFD)
SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSK(配列番号3)
【０１８２】
予測される最少配列に下線を引く。
【０１８３】
配列5B:リンカー配列
GGAGAAGG(配列番号7)
キメラのuPARドメインへのGFDドメインの結合がシスで起こるかおよび/またはトランスで起こるか決まり得るので、このリンカーの長さおよび配列は、GFDuPARの生化学的特性に影響を及ぼす可能性がある(図8を参照のこと)。実験的に、リンカー5、8、16および20残基長は全て良く機能する(図7を参照のこと)ことから、このリンカーの長さおよびアミノ酸組成が非常に柔軟であることが示唆される。
【０１８４】
配列6:GFDuPARmyc
SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKGGAGAAGGLRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPGGEQKLISEEDL(配列番号28)
【０１８５】
GFDuPARmycのポリペプチド配列を、ヒトuPAのGFDドメイン(残基1〜48、配列5A(配列番号3))(太字)、8残基GGAGAAGGリンカー(配列5B(配列番号7))(下線)、ヒトuPAR残基1〜274(配列番号1のaa.1〜274に対応する配列3A)(標準文字)およびC末端mycタグ(配列3B(配列番号27))(斜体)で示す。
【０１８６】
配列7:GFDuPAR-hFc
SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSK
GGAGAAGGLRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDLEVLFQGPLELEVLFQGPIEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(配列番号12)
【０１８７】
GFDuPAR-hFcポリペプチドは、GFDドメイン(配列5A(配列番号3))(太字)、リンカー(配列5B(配列番号7))(下線)、uPAR残基1〜277(配列番号1のaa.1〜277に対応する配列1A))(標準文字)、リンカー(配列1B(配列番号9))(下線付き斜体)およびヒトFcタグ(配列1C(配列番号5))(斜体)から成る。
【０１８８】
配列8:GFDuPAR-mFc
SNELHQVPSNCDCLNGGTCVSNKYFSNIHWCNCPKKFGGQHCEIDKSKGGAGAAGGLRCMQCKTNGDCRVEECALGQDLCRTTIVRLWEEGEELELVEKSCTHSEKTNRTLSYRTGLKITSLTEVVCGLDLCNQGNSGRAVTYSRSRYLECISCGSSDMSCERGRHQSLQCRSPEEQCLDVVTHWIQEGEEGRPKDDRHLRGCGYLPGCPGSNGFHNNDTFHFLKCCNTTKCNEGPILELENLPQNGRQCYSCKGNSTHGCSSEETFLIDCRGPMNQCLVATGTHEPKNQSYMVRGCATASMCQHAHLGDAFSMNHIDVSCCTKSGCNHPDLDLEVLFQGPLEAGAGPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(配列番号13)
【０１８９】
GFDuPAR-mFcポリペプチドは、GFDドメイン(配列5A(配列番号3))(太字)、リンカー(配列5B(配列番号7))(下線)、uPAR残基1〜277(配列番号1のaa.1〜277に対応する配列1A))(標準文字)、リンカー(配列2A(配列番号10))(下線付き斜体)およびマウスFcタグ(配列2B(配列番号6))(斜体)から成る。
【０１９０】
配列9:mGFDmuPAR-Fc
GSVLGAPDESNCGCQNGGVCVSYKYFSRIRRCSCPRKFQGEHCEIDASKGGAGAAGGLQCMQCESNQSCLVEECALGQDLCRTTVLREWQDDRELEVVTRGCAHSEKTNRTMSYRMGSMIISLTETVCATNLCNRPRPGARGRAFPQGRYLECASCTSLDQSCERGREQSLQCRYPTEHCIEVVTLQSTERSLKDEDYTRGCGSLPGCPGTAGFHSNQTFHFLKCCNYTHCNGGPVLDLQSFPPNGFQCYSCEGNNTLGCSSEEASLINCRGPMNQCLVATGLDVLGNRSYTVRGCATASWCQGSHVADSFPTHLNVSVSCCHGSGCNSPVELEVLFQGPIEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号17)
【０１９１】
mGFDmuPAR-Fcポリペプチドは、マウスGFDドメイン(配列9A(配列番号4))(太字)、リンカー(配列9B(配列番号8))(下線)、マウスuPAR残基1〜273(配列番号2のaa.1〜273に対応する配列9C)(標準文字)、リンカー(配列9D(配列番号11))(下線付き斜体)およびヒトFcタグ(配列1C(配列番号5))(斜体)から成る。
【０１９２】
配列9A:マウスuPAの増殖因子様ドメイン(GFD)(残基1〜49)
GSVLGAPDESNCGCQNGGVCVSYKYFSRIRRCSCPRKFQGEHCEIDASK(配列番号4)
【０１９３】
予測される最小配列(残基12〜43)に下線を引く。
【０１９４】
配列9B:リンカー配列
GGAGAAGG(配列番号8)
このリンカーの長さおよび配列は、mGFDmuPAR-Fcの生化学的特性に影響を及ぼす可能性がある。実験的に、リンカー5、8、16および20残基長は、ヒトバリアントにおいて全て良く機能する(図7を参照のこと)ことから、実際には、このリンカーの長さおよびアミノ酸組成が非常に柔軟であることが示唆される。
【０１９５】
配列9C:配列番号2のaa.1〜273に対応するマウスuPAR残基1〜273
LQCMQCESNQSCLVEECALGQDLCRTTVLREWQDDRELEVVTRGCAHSEKTNRTMSYRMGSMIISLTETVCATNLCNRPRPGARGRAFPQGRYLECASCTSLDQSCERGREQSLQCRYPTEHCIEVVTLQSTERSLKDEDYTRGCGSLPGCPGTAGFHSNQTFHFLKCCNYTHCNGGPVLDLQSFPPNGFQCYSCEGNNTLGCSSEEASLINCRGPMNQCLVATGLDVLGNRSYTVRGCATASWCQGSHVADSFPTHLNVSVSCCHGSGCNSP
【０１９６】
期待される最小の機能配列(残基3〜270)に下線を引く。
【０１９７】
配列9D:リンカー
VELEVLFQGPIE(配列番号11)
この配列の長さまたはアミノ酸組成に対して予測される特定の要件はない。
【０１９８】
参考文献
【表５】
2014529581.tif 000007
【表６】
2014529581.tif 000008
【図６Ａ】
2014529581.tif 000009
【図６Ｂ】
2014529581.tif 000010
【図９】
2014529581.tif 000011
【図１０】
2014529581.tif 000012
【図１２】
2014529581.tif 000013
【図１３】
2014529581.tif 000014
【図１４】
2014529581.tif 000015
【図１８Ａ】
2014529581.tif 000016
【図１８Ｂ】
2014529581.tif 000017
【図２１】
2014529581.tif 000018
【図２２】
2014529581.tif 000019
【図２５】
2014529581.tif 000020
【図２８Ａ】
2014529581.tif 000021
【図２８Ｂ】
2014529581.tif 000022
【図２８Ｃ】
2014529581.tif 000023
【図２８Ｄ】
2014529581.tif 000024
【図１】
2014529581.tif 000025
【図２】
2014529581.tif 000026
【図３】
2014529581.tif 000027
【図４】
2014529581.tif 000028
【図５】
2014529581.tif 000029
【図７】
2014529581.tif 000030
【図８】
2014529581.tif 000031
【図１１】
2014529581.tif 000032
【図１５】
2014529581.tif 000033
【図１６】
2014529581.tif 000034
【図１７】
2014529581.tif 000035
【図１９】
2014529581.tif 000036
【図２０】
2014529581.tif 000037
【図２３】
2014529581.tif 000038
【図２４】
2014529581.tif 000039
【図２６】
2014529581.tif 000040
【図２７】
2014529581.tif 000041
【配列表】
2014529581000001.app
【国際調査報告】
2014529581.tif 000042
2014529581.tif 000043
2014529581.tif 000044
2014529581.tif 000045