(57)【要約】  本発明は、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識するヒト化抗体を提供するものである。これら抗体のあるものは、α９インテグリンの生物学的機能を抑制し、癌、例えば、癌細胞の増殖や転移、並びに関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、自己免疫疾患などの炎症性疾患など、α９インテグリンが関与する様々な障害又は疾患に対する治療効果を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヒト抗体のＶＨ領域由来の少なくとも１つのＦＲＨ、及びヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識する非ヒト抗体のＣＤＲＨの少なくとも１つに由来する少なくとも１つのＣＤＲＨとを有するＨ鎖；
（ｉｉ）ヒト抗体のＶＬ領域由来の少なくとも１つのＦＲＬ、及びヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識する非ヒト抗体のＣＤＲＬの少なくとも１つに由来する少なくとも１つのＣＤＲＬとを有するＬ鎖；又は
（ｉｉｉ）前記（ｉ）と（ｉｉ）の両方
を有する、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記非ヒト抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１３及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３２からなる群から選択されるハイブリドーマが産生するマウスモノクローナル抗体である、請求項１に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記ヒト化抗体の少なくとも１つのＣＤＲＨが配列番号４、５及び６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、該ヒト化抗体の少なくとも１つのＣＤＲＬが配列番号１１、１２及び１３のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記ヒト抗体のＶＨ領域がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５８９１（配列番号１８）のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列由来であるアミノ酸配列を有し、かつ、前記ヒト抗体のＶＬ領域がＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７２４４１（配列番号２３）のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列由来であるアミノ酸配列を有する、請求項２又は３に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記Ｈ鎖が配列番号２９のアミノ酸配列を有し、かつ、前記Ｌ鎖が配列番号３１のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
配列番号２９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が配列番号２８のヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に有する、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記シグナルペプチドが配列番号１０のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項１０】
配列番号３１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が配列番号３０のヌクレオチド配列を有する、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１２】
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に有する、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項１３】
前記シグナルペプチドが配列番号１７のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
前記核酸分子が１つ以上の調節因子に作動可能となるように結合されている、請求項６若しくは１０又は両方に記載の核酸分子を有するベクタ。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクタを有する、単離された宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の宿主細胞をヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントが発現される条件下で培養し、発現されたヒト化抗体を回収することを含む、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントを調製する方法。
【請求項１７】
請求項１、２又は５のいずれか１項に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントと、医薬的に許容されるキャリアとを有する医薬組成物。
【請求項１８】
請求項５に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントの有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む、α９インテグリンが関与する障害又は疾患を予防又は治療する方法。
【請求項１９】
請求項１又は２に記載のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントの有効量を検査対象に投与することを含む、α９インテグリンが関与する障害又は疾患を診断する方法。
【請求項２０】
（ｉ）ヒト抗体のＶＨ領域由来の少なくとも１つのＦＲＨと、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＨとを有するＨ鎖；
（ｉｉ）ヒト抗体のＶＬ領域由来の少なくとも１つのＦＲＬと、配列番号３７、３８及び３９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＬとを有するＬ鎖；又は
（ｉｉｉ）前記（ｉ）と（ｉｉ）の両者
を有するる、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
（ｉ）ヒト抗体のＶＨ領域由来の少なくとも１つのＦＲＨと、配列番号４２、４３及び４４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＨとを有するＨ鎖；
（ｉｉ）ヒト抗体のＶＬ領域由来の少なくとも１つのＦＲＬと、配列番号４７、４８及び４９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＬとを有するＬ鎖；又は
（ｉｉｉ）前記（ｉ）と（ｉｉ）の両方
を有する、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
（ｉ）ヒト抗体のＶＨ領域由来の少なくとも１つのＦＲＨと、配列番号５２、５３及び５４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＨとを有するＨ鎖；
（ｉｉ）ヒト抗体のＶＬ領域由来の少なくとも１つのＦＲＬと、配列番号５７、５８及び５９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＬとを有するＬ鎖；又は
（ｉｉｉ）前記（ｉ）と（ｉｉ）の両方
を有する、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
（ｉ）ヒト抗体のＶＨ領域由来の少なくとも１つのＦＲＨと、配列番号６２、６３及び６４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＨとを有するＨ鎖；
（ｉｉ）ヒト抗体のＶＬ領域由来の少なくとも１つのＦＲＬと、配列番号６７、６８及び６９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＬとを有するＬ鎖；又は
（ｉｉｉ）前記（ｉ）と（ｉｉ）の両方
を有する、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識するヒト化抗体に関し、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患を含むα９インテグリンが関与し又はこれを伴う様々な疾患又は障害の治療及び診断への該抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、インテグリンと呼ばれている細胞表面受容体のグループに仲介されて、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ：以下、ＥＣＭという）に接着する。インテグリンは、α鎖とβ鎖の１：１ヘテロ二量体を形成することによってその機能を発揮する。現在までに、少なくとも、１８種のα鎖、８種のβ鎖及び２４種のαβヘテロ二量体が同定され、確認されている。各インテグリンは特定のリガンドを認識することが知られている。インテグリンは、そのリガンド特異性又は作用によりサブファミリに分類され、コラーゲン受容体、ラミニン受容体、フィブロネクチンやビトロネクチンなどに存在するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を認識するＲＧＤ受容体、及び白血球のみに存在する白血球特異的受容体に分類される（Ｈｙｎｅｓ，  Ｒ．  Ｏ．，  ２００２，  Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：  Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ，  Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ．  Ｃｅｌｌ  １１０：６７３−８７、及び宮坂昌之，  ２０００，  接着分子ハンドブック新版，  秀潤社）。α４及びα９インテグリンは、上記のいずれにも属しないサブファミリのメンバーであり、α４インテグリンサブファミリと呼ばれている（Ｅｌｉｓｅ  Ｌ．  Ｐａｌｍｅｒ，  Ｃｕｒｚｉｏ  Ｒｆｉｅｇｇ，  Ｒｏｎａｌｄ  Ｆｅｒｒａｎｄｏ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｐｙｔｅｌａ，  Ｓｈｅｐｐａｒｄ  Ｄ．，  １９９３，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  α９  Ｓｕｂｕｎｉｔ，  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｐａｒｔｎｅｒ  ｏｆ  β１  Ｔｈａｔ  Ｉｓ  Ｗｉｄｅｌｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｉｎ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｌｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １２３：１２８９−９７）。一方、ＥＣＭは、これまで単に細胞間を固定する物質として機能していると考えられていたが、最近になってインテグリンが介在するＥＣＭ細胞間相互作用が、細胞の成長、接着、移動などの制御に深く関与し、癌の進行、炎症の増悪などを含む疾患の発症と関連することが明らかになってきている。
【０００３】
例えば、ＥＣＭの１つであるオステオポンチン（ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ：以下、ＯＰＮという）は、分子量約４１ｋＤａの、リン酸化された分泌型酸性糖タンパク質であり、母乳、尿、尿細管、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージ、活性化Ｔ細胞、腫瘍細胞などに広く認められる分子である。ＯＰＮは、その分子中央に接着配列ＧＲＧＤＳ（配列番号１）を有し、ヒトＯＰＮではＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２）配列、マウスＯＰＮではＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号３）配列を有し、また、そこに近接してトロンビン切断部位を有する。ＯＰＮは、ＧＲＧＤＳ（配列番号１）配列を介してＲＧＤインテグリンに、ＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２）配列又はＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号３）配列を介してα４（α４β１）及びα９（α９β１）インテグリンと結合する。
【０００４】
国際公開ＷＯ０２／０８１５２２は、ＯＰＮノックアウトマウス又はＯＰＮに対する中和抗体を使ってＯＰＮの作用を阻害することによる、関節リウマチや肝炎に対する治療効果を開示している。更に、この公開公報には、ＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号２）配列はα９及びα４インテグリンを認識して炎症性疾患が発症するために必須であり、ＯＰＮの受容体が免疫担当細胞などで発現され、炎症性疾患に関与していることが開示されている。
【０００５】
また、α４β１はトロンビンで切断されていないＯＰＮ（非切断型ＯＰＮ）とトロンビンで切断されたＯＰＮ（切断型ＯＰＮ）のＮ末端フラグメントの両方に結合するのに対して、α９β１は切断型ＯＰＮのみに結合する点で接合特性に違いがあることが知られている（Ｙ  Ｙｏｋｏｓａｋｉら，  １９９９，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７４：３６３２８−３６３３４；  Ｐ．  Ｍ．  Ｇｒｅｅｎら，  ２００１，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ５０３：７５−７９；  Ｓ．  Ｔ．  Ｂａｒｒｙら，  ２０００，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２５８：３４２−３５１）。
【０００６】
α４及びα９インテグリンは、ＯＰＮ以外にも多数の共通リガンドを共有している。既知のリガンドとしては、フィブロネクチンのＥＤＡドメイン、プロペプチド−フォンビルブラント因子（ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ−ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ：ｐｐ−ｖＷＦ）、組織トランスグルタミナーゼ（ｔｉｓｓｕｅ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ：ｔＴＧ）、第ＸＩＩＩ血液凝固因子、血管細胞接着分子−１（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１：ＶＣＡＭ−１）などがある。更に、α４インテグリンにより特異的に認識されるリガンドとして、フィブロネクチンのＣＳ−１ドメインやＭａｄＣＡＭ−１（α４β７）などが知られており、α９インテグリンにより特異的に認識されるリガンドとして、テネイシンＣやプラスミンなどが知られている。
【０００７】
インテグリンサブユニットα９、α４及びβ１のアミノ酸配列は公知であり、例えば、ヒトα９はＮＭ＿００２２０７として、マウスα９はＮＭ＿１３３７２１として、ヒトα４はＮＭ＿０００８８５として、マウスα４はＮＭ＿０１０５７６として、ヒトβ１はＸ０７９７９として、マウスβ１はＮＭ＿０１０５７８としてＧｅｎＢａｎｋに登録されている。これらのインテグリンは、種間でアミノ酸配列の類似性が高いことも知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、癌、炎症性疾患、及び自己免疫疾患の治療薬は種々知られているが、より改善された癌、炎症性疾患、自己免疫疾患の予防薬及び／又は治療薬等を開発することが望まれている。本発明は一部には、本発明者らがα９インテグリンを特異的に阻害する抗体が癌抑制及び抗炎症効果を有することを発見したことに基づく。
【０００９】
これまで、本発明者らは、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識し、ハイブリドーマクローン１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６及び２８Ｓ１（それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１３及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３２）により産生されるマウスモノクローナル抗体、並びにマウスα９インテグリンを免疫特異的に認識し、ハイブリドーマクローン１８Ｒ１８Ｄ、１２Ｃ４’５８、１１Ｌ２Ｂ及び５５Ａ２Ｃ（それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１９５、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１９６、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１９７及びＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０１９８）により産生されるモノクローナル抗体を単離した。本明細書で、ハイブリドーマクローンの名称は、クローンにより作製されるモノクローナル抗体の名称として互換的に使用される。これらマウス抗ヒトα９インテグリン抗体は全てＩｇＧｌアイソタイプであった。これらモノクローナル抗体の一部は、ヒト及び／又はマウスα９インテグリンとオステオポンチンなどのα９インテグリンのリガンドとの間の結合を阻害する。よって、これら抗α９インテグリン抗体はα９インテグリンの機能を阻害し、癌、例えば、癌細胞の増殖や転移、並びに関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、自己免疫疾患などの炎症性疾患に対する治療効果を示す。
【００１０】
更に、本発明の抗α９インテグリン抗体は、被験者におけるα９インテグリンの存在及びその量を検出するインビボ診断剤として使用することができ、それによりα９インテグリンが関与する障害又は疾患を診断することができる。
【００１１】
しかし、これらのモノクローナル抗体はマウス由来であるので、免疫原性によるヒトへの悪影響の可能性があり、診断又は治療のためのヒトへ直接使用することを妨げていた。免疫原性を低下させるために、本発明者らは、由来するマウス抗α９インテグリン抗体が示す生物学的活性と同等の生物学的活性を示すヒト化抗体を調製した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本発明は、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識し、非ヒト由来部分とヒト由来部分からなる抗原結合領域を有するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。該抗体は、具体的な態様において、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６及び２８Ｓｌモノクローナル抗体などの非ヒト（ドナ）由来の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）とヒト（アクセプタ）由来のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）を有する。１つの態様において、該ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトα９インテグリンとヒトα９インテグリンのリガンドとの間の結合を阻害する。
【００１３】
具体的態様において、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ｉ）ヒトＨ鎖可変領域（Ｖ領域）由来の少なくとも１つのＨ鎖ＦＲ（ＦＲＨ）と、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識する非ヒト抗体のＨ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲＨ）の少なくとも１つに由来する少なくとも１つのＣＤＲＨを有する重鎖（Ｈ鎖）、又は（ｉｉ）少なくとも１つのヒト軽鎖（Ｌ鎖）のＶ領域由来のＬ鎖ＦＲ（ＦＲＬ）と、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識する非ヒト抗体のＬ鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）の少なくとも１つに由来する少なくとも１つのＣＤＲＬを有するＬ鎖、あるいは（ｉ）と（ｉｉ）の両方を有する。例えば、本発明のヒト化抗体の少なくとも１つのＣＤＲＨ及び／又は少なくとも１つのＣＤＲＬが由来する非ヒト抗体は、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１３及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３２からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である。
【００１４】
好ましい具体的態様において、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ｉ）ヒトＦＲＨ由来の少なくとも１つのＦＲＨと、配列番号４、５及び６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＨ、又は（ｉｉ）ヒトＦＲＬ由来の少なくとも１つのＦＲＬと、配列番号１１、１２及び１３のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＬ、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を有する。本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４、５及び６のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を有してもよい。又は、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１１、１２及び１３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する。好ましくは、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４、５、６、１１、１２及び１３のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する。他の態様においては、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５８９１（配列番号１８）によりコードされたヒトＨ鎖の可変領域に由来するＦＲＨ、又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７２４４１（配列番号２３）によりコードされたヒトκＬ鎖の可変領域由来のＦＲＬを有する。好ましくは、本発明のヒト化抗体のＦＲＨは、配列番号１９、２０、２１及び２２（Ｘ６５８９１のそれぞれＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３及びＦＲＨ４に対応する部位をコードしている）のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を有する。他の好ましい態様においては、本発明のヒト化抗体のＦＲＬは、配列番号２４、２５、２６及び２７（Ｘ７２４４１のそれぞれＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３及びＦＲＬ４に対応する部位をコードしている）のアミノ酸配列からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を有する。最も好ましくは、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を有するＨ鎖可変領域（ＶＨ領域）、又は（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を有するＬ鎖可変領域（ＶＬ領域）、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を有する。
【００１５】
他の好ましい具体的態様においては、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ｉ）ヒトＦＲＨ由来の少なくとも１つのＦＲＨと、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＨ、又は（ｉｉ）ヒトＦＲＬ由来の少なくとも１つのＦＲＬと、配列番号３７、３８及び３９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＬ、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を有する。本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３２、３３及び３４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を有してもよい。または、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３７、３８及び３９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する。好ましくは、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３２、３３、３４、３７、３８及び３９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する。
【００１６】
他の好ましい具体的態様において、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ｉ）ヒトＦＲＨ由来の少なくとも１つのＦＲＨと、配列番号４２、４３及び４４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＨ、又は（ｉｉ）ヒトＦＲＬ由来の少なくとも１つのＦＲＬと、配列番号４７、４８及び４９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＬ、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を有する。本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４２、４３及び４４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を有してもよい。又は、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４７、４８及び４９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する。好ましくは、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号４２、４３、４４、４７、４８及び４９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する。
【００１７】
他の好ましい具体的態様においては、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ｉ）ヒトＦＲＨ由来の少なくとも１つのＦＲＨと、配列番号５２、５３及び５４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＨ、又は（ｉｉ）ヒトＦＲＬ由来の少なくとも１つのＦＲＬと、配列番号５７、５８及び５９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＬ、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を有する。本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５２、５３及び５４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を有してもよい。又は、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５７、５８及び５９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する。好ましくは、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５２、５３、５４、５７、５８及び５９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する。
【００１８】
他の好ましい具体的態様においては、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、（ｉ）ヒトＦＲＨ由来の少なくとも１つのＦＲＨと、配列番号６２、６３及び６４のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＨ、又は（ｉｉ）ヒトＦＲＬ由来の少なくとも１つのＦＲＬと、配列番号６７、６８及び６９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのＣＤＲＬ、あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を有する。本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６２、６３及び６４のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を有してもよい。又は、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６７、６８及び６９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する。好ましくは、本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６２、６３、６４、６７、６８及び６９のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３を有する。
【００１９】
本発明は更に、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識する本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。具体的には、本発明は、配列番号４、５、６、３２、３３、３４、４２、４３、４４、５２、５３、５４、６２、６３及び６４からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を有するヒト化Ｈ鎖、又は配列番号１１、１２、１３、３７、３８、３９、４７、４８、４９、５７、５８、５９、６７、６８及び６９からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を有するヒト化Ｌ鎖、あるいは前記ヒト化Ｈ鎖及び前記ヒト化Ｌ鎖の両方をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。好ましくは、そのような単離された核酸分子は、ＶＨ領域をコードする配列番号２８のヌクレオチド配列、又は配列番号２９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する。他の好ましい具体的態様においては、そのような単離された核酸分子は、ＶＬ領域をコードする配列番号３０のヌクレオチド配列、又は配列番号３１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する。また他の好ましい具体的態様においては、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２８及び３０の両方のヌクレオチド配列を有する。更にまた他の好ましい具体的態様においては、本発明の単離された核酸分子は、それぞれ配列番号１０及び１７のアミノ酸配列などのドナ由来又は異種由来のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に有する。
【００２０】
本発明は更に、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識する本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントのＨ鎖又はＬ鎖あるいはその両方をコードするヌクレオチド配列を有する発現ベクタなどのベクタを提供する。そのようなベクタでは、本発明のヌクレオチド配列は、１つ以上の調節因子に操作可能に結合されていてもよい。本発明のヌクレオチド配列は、ＣＤＲが由来する非ヒトドナ抗体由来のシグナルペプチド又は異種由来のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を有してもよい。
【００２１】
更に、本発明は、本発明の核酸分子を有するベクタを含む本発明の核酸分子を有する宿主細胞を提供する。一態様においては、本発明は、本発明のヒト化Ｈ鎖をコードする第１の核酸分子と、本発明のヒト化Ｌ鎖をコードする第２の核酸分子を有し、第１及び第２の核酸分子が生物学的に機能する本発明のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントを発現するように、それぞれ調節因子に機能的に結合している、単離された宿主細胞を提供する。
【００２２】
従って、本発明は更に、ヒト化抗体が発現する条件下で本発明の宿主細胞を培養し、産生されたヒト化抗体を回収することを含む、本発明のヒト化抗体の調製方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、本発明のヒト化抗体の少なくとも１つを有する組成物を提供する。更に、本発明は、本発明のヒト化抗体の少なくとも１つ及び医薬的に許容されるキャリアを有するα９インテグリンが関与する障害又は疾患を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。前記組成物はいずれも更に、当該障害又は疾患を相加的又は相乗的に改善することができる他の活性化合物を更に有することができる。そのような活性化合物としては、これらに限定するものではないが、ヒトα４インテグリンに免疫特異的に結合可能な抗体などの抗体又はその抗原結合フラグメントの他、抗炎症化合物、化学療法剤などを挙げることができる。
【００２４】
他の態様では、本発明は、α９インテグリンが関与する又はこれを伴う障害又は疾患を予防又は治療する方法を提供する。該方法は、予防的又は治療的に有効な量の本発明のヒト化抗体の少なくとも１つを、それを必要とする被験者に投与することを含む。そのような使用では、本発明のヒト化抗体は、ヒト化抗体の生物学的効果を強化する治療的成分に結合されていてもよい。そのような治療的成分としては、例えば、抗α４抗体（例えば、二重特異性抗体を形成する）などの別の抗体、細胞増殖抑制的又は細胞破壊性である細胞毒素、放射性元素、及び／又は抗炎症薬や抗生物質などを含む別の治療薬を挙げることができる。
【００２５】
更に他の態様では、本発明は、被験者におけるα９インテグリンが関与する又はこれを伴う障害又は疾患を診断する方法を提供する。該方法は、検査する被験者に診断的に有効な量の本発明のヒト化抗体を投与することを含む。そのような診断的使用においては、本発明のヒト化抗体は、放射性元素などの検出可能なマーカーで標識されていてもよい。
【００２６】
（定義）
本明細書において、用語「抗体」は、α９インテグリンなどの、所望の抗原に免疫特異的に結合することができる抗体分子を意味し、抗体分子全体又はその抗原結合フラグメントなどのフラグメントを包含する。
【００２７】
本明細書で使用される用語「免疫特異的に認識する」とは、抗体又はその抗原結合フラグメントの標的ポリペプチド又はタンパク質、特にα９インテグリンに特異的に結合する能力を意味する。そのような抗体は、他のポリペプチド又はタンパク質に非特異的に結合しない。しかし、標的ポリペプチド又はタンパク質（例えば、ヒトα９インテグリン）に免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントは、別の抗原に交差反応してもよい。例えば、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識する本発明のヒト化抗体又は抗原結合フラグメントは、例えば、マウスα９インテグリンに交差反応してもよい。好ましくは、ヒトα９インテグリンに免疫特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントは他の抗原に交差反応しない。
【００２８】
本明細書で使用される用語「抗原結合フラグメント」は、標的ポリペプチド又はタンパク質、特にヒトα９インテグリン及び／又はマウスα９インテグリン、に免疫特異的に結合する能力を保持している抗体のフラグメントを意味し、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖｓ、標的ポリペプチド又はタンパク質に特異的に結合し軽鎖の可変領域（ＶＬ）及び／又は重鎖の可変領域（ＶＨ）又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有するフラグメントを包含する。このように、ヒト化抗体の抗原結合フラグメントは、部分的に又は完全にヒト定常領域を有しても有さなくてもよい。上述の抗体フラグメントを取得する様々な方法が、当技術分野で周知である。
【００２９】
本明細書で使用される用語「ヒト由来」又は「非ヒト由来」は、そのアミノ酸配列がヒト抗体又は非ヒト抗体の対応する部分に由来する抗体部分を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される用語「アクセプタ配列」は、通常は非ヒト抗体であるドナ抗体のＣＤＲに対するアクセプタとして働く、ヒト抗体のＶＨ又はＶＬ領域に由来するフレームワーク領域のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】マウス２４Ｉ１１ＶＨｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号７）及びその推定アミノ酸配列（配列番号８）を示す。アミノ酸残基は１文字コードで示す。シグナルペプチド配列（配列番号１０）をイタリック体で示し、成熟ＶＨのＮ末端アミノ酸残基（Ｅ）を二重下線で示す。Ｋａｂａｔらの定義（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，  １９９１，  第５版，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）に従うＣＤＲ配列を下線で示す。
【図２】マウス２４Ｉ１１ＶＬｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１４）及びその推定アミノ酸配列（配列番号１５）を示す。アミノ酸残基は１文字コードで示す。シグナルペプチド配列（配列番号１７）をイタリック体で示し、成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）を二重下線で示す。Ｋａｂａｔらの定義（１９９１）に従うＣＤＲ配列を下線で示す。
【図３】ＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線）が両端に配置された２４Ｉ１１ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７２）及びその推定アミノ酸配列（配列番号８）を示す。アミノ酸残基は１文字コードで示す。シグナルペプチド配列（配列番号１０）をイタリック体で示し、成熟ＶＨのＮ末端アミノ酸残基（Ｅ）を二重下線で示す。Ｋａｂａｔらの定義（１９９１）に従うＣＤＲ配列を下線で示す。イントロン配列をイタリック体で示す。
【図４】ＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位（下線）が両端に配置された２４Ｉ１１ＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７３）及びその推定アミノ酸配列（配列番号１５）を示す。アミノ酸残基は１文字コードで示す。シグナルペプチド配列（配列番号１７）をイタリック体で示し、成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）を二重下線で示す。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列を下線で示す。イントロン配列をイタリック体で示す。
【図５】ｐＣｈ２４Ｉｌｌ及びｐＨｕ２４Ｉｌｌ（合わせて発現ベクタ）の構造を概略的に示す。プラスミドは、上部に示すＳａｌＩ部位から時計回りに、抗体重鎖遺伝子の転写が開始できるように、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）主要前初期プロモータ及びエンハンサ（ＣＭＶプロモータ）で始まる重鎖転写ユニットを含有する。ＣＭＶプロモータの後に、ＶＨエクソン、イントロンを間に有するＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３エクソンを含むヒトγ−１重鎖定常領域を含有するゲノム配列、並びにＣＨ３に続いてｍＲＮＡ処理のためのγ−１遺伝子のポリアデニル化部位を有する。重鎖遺伝子配列の後、ＣＭＶプロモータで始まり、その後にＶＬエクソン、前にイントロン部分を有するヒトκ鎖定常領域エクソン（ＣＬ）を含有するゲノム配列、κ遺伝子のポリＡシグナルと並ぶ軽鎖転写ユニットを有する。軽鎖遺伝子の後に、ＳＶ４０初期プロモータ（ＳＶ４０プロモータ）、大腸菌キサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）及びＳＶ４０ポリアデニル化部位（ＳＶ４０ポリ（Ａ）部位）を含有する断片を有する。最後に、プラスミドは、細菌の複製オリジン（ｐＵＣ  ｏｒｉ）及びβラクタマーゼ遺伝子（βラクタマーゼ）を有するプラスミドｐＵＣ１９の一部を含有する。
【図６】２４Ｉ１１ＶＨ（配列番号９）、ヒト化２４Ｉ１１（Ｈｕ２４Ｉ１１）ＶＨ（配列番号２９）、並びにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５８９１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列由来のヒトアクセプタ配列のＦＲＨｌ（配列番号１９）、ＦＲＨ２（配列番号２０）、ＦＲＨ３（配列番号２１）及びＦＲＨ４（配列番号２２）のアミノ酸配列を並べて比較した図を示す。アミノ酸残基は１文字コードで示す。配列上の数字はＫａｂａｔら（１９９１）の定義に従う位置を示す。Ｋａｂａｔら（１９９１）により定義されるＣＤＲ配列を下線で示す。二重下線の残基はＣＤＲと接触していると予測され、これらの部位においてはヒト化型でもマウス残基を保持した。Ｘ６５８９１のＣＤＲ残基は図中省略されている。
【図７】２４Ｉ１１ＶＬ（配列番号１６）、ヒト化２４Ｉ１１（Ｈｕ２４Ｉ１１）ＶＬ（配列番号３１）並びにＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７２４４１のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列由来のヒトアクセプタ配列のＦＲＬｌ（配列番号２４）、ＦＲＬ２（配列番号２５）、ＦＲＬ３（配列番号２６）及びＦＲＬ４（配列番号２７）のアミノ酸配列を並べて比較した図を示す。アミノ酸残基は１文字コードで示す。配列上の数字はＫａｂａｔら（１９９１）の定義に従う位置を示す。Ｋａｂａｔら（１９９１）により定義されるＣＤＲ配列を下線で示す。二重下線の残基はＣＤＲと接触していると予測され、これらの部位においてはヒト化型でもマウスの残基を保持した。Ｘ７２４４１のＣＤＲ残基は図中省略されている。
【図８】Ｈｕ２４Ｉ１１ＶＨ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す。
【図９】Ｈｕ２４Ｉ１１ＶＬ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドを示す。
【図１０】ＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位が両端に配置されたＨｕ２４Ｉ１１ＶＨ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド（５’末端に５’−ＧＧＧ尾部、３’末端にＣＣＣ−３’尾部を有する配列番号７４）を示す。矢印は、各オリゴヌクレオチドの位置及び方向（５’から３’へ）を示す。シグナルペプチド（配列番号１０）及びＶＨ領域（配列番号２９）のアミノ酸残基は１文字コードで示す。
【図１１】ＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位が両端に配置されたＨｕ２４Ｉ１１ＶＬ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチド（５’末端に５’−ＧＧＧ尾部、３’末端にＣＣＣ−３’尾部を有する配列番号７５）を示す。矢印は、各オリゴヌクレオチドの位置及び方向（５’から３’へ）を示す。シグナルペプチド（配列番号１７）及びＶＬ領域（配列番号３１）のアミノ酸残基は１文字コードで示す。
【図１２】ＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線）が両端に配置されたＨｕ２４Ｉ１１ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７４）及びシグナルペプチド（配列番号１０、イタリック体で表示）及びＶＨ領域（配列番号２９）の推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸残基は１文字コードで示す。成熟ＶＨのＮ末端アミノ酸残基（Ｑ）を二重下線で示す。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列を下線で示す。イントロン配列をイタリック体で示す。
【図１３】ＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位（下線）が両端に配置されたＨｕ２４Ｉ１１ＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７５）及びシグナルペプチド（配列番号１７、イタリック体で表示）及びＶＬ領域（配列番号３１）の推定アミノ酸配列を示す。アミノ酸残基は１文字コードで示す。成熟ＶＬのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）を二重下線で示す。Ｋａｂａｔら（１９９１）の定義に従うＣＤＲ配列を下線で示す。イントロン配列をイタリック体で示す。
【図１４】ヒトα９インテグリンに対するキメラ及びヒト化２４Ｉ１１抗体の親和性の比較を示す。ＣＨＯ／α９細胞に対して１μｇ／ｍＬ及び０．５μｇ／ｍＬのキメラ及びヒト化２４Ｉ１１抗体の結合を、細胞ＥＬＩＳＡによって調べた。実験は３回測定した。ＳＥＭでの吸光度値の平均を図に示す。
【図１５】ヒトα９インテグリンに対するマウス、キメラ及びヒト化２４Ｉ１１抗体の結合をＦＡＣＳで分析した結果を示す。ＣＨＯ／ｈｕα９細胞に対する各抗体の結合を１、０．３３、０．１１、０．０３７及び０．０１２μｇ／ｍＬで試験した。図中、幾何平均チャネル蛍光（ＭＣＦ）の値（Ｙ軸）を、試験した各抗体の濃度（Ｘ軸）に対してプロットした。
【図１６】抗ヒトα９インテグリン抗体による、ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞と、ｈＯＰＮ（ＲＡＡ）Ｎ−ｈａｌｆ、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ−１又はヒトフィブロネクチンとの間の細胞接着阻害活性の結果を示す。
【図１７】抗ヒトα４インテグリン抗体存在下におけるヒトメラノーマ細胞に対する抗ヒトα９インテグリン抗体の細胞接着阻害活性の結果を示す。
【図１８】抗α４インテグリン抗体及び抗α９インテグリン抗体による肝炎に対する治療効果を示す。図中、ＮＨＧは正常ハムスター抗体を、ＮＲＧは正常ラット抗体を示す。
【図１９】抗α９インテグリン抗体がＢ１６−ＢＬ６細胞の成長を抑制したことを示す。
【図２０】ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞（図２０ａ）、ヒトα４／ＣＨＯ−Ｋ１（図２０ｂ）及びヒト好中球（図２０ｃ）に対して抗ヒトα９インテグリン抗体を使用したＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図２１】ＥＣＭとして固定化ＶＣＡＭ−１を使用した場合の、抗α９インテグリン抗体によるＢ１６−ＢＬ６細胞の細胞成長抑制を示す。
【図２２】マウス関節リウマチモデルにおける抗−α９インテグリンの治療効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（ヒトα９インテグリンに対する抗体の調製）
ヒトα９インテグリン又はそのエピトープを免疫特異的に認識する抗体は、本技術分野で公知のいかなる適切な方法によって作製してもよい。
【００３３】
本発明で抗原として使用されるα９インテグリンは、（１）α９インテグリンを発現するヒトのあらゆる細胞又は該細胞が存在するあらゆる組織由来のタンパク質、（２）α９インテグリンをコードする遺伝子ＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡを細菌、酵母、動物細胞などの細胞株などにトランスフェクトし、発現させた組換えタンパク質、又は（３）合成タンパク質であってもよい。
【００３４】
α９インテグリンは、ヒトα９インテグリン（配列番号７６、１−２９残基はシグナルペプチドである）のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。
【００３５】
本明細書で、用語「実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、自然に発生するヒトα９インテグリンと実質的に同等の生物学的特性を有する限り複数のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは１〜数個（例えば、１〜５個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は修飾されているアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドを意味し、並びに複数のアミノ酸、好ましくは１〜１０個のアミノ酸、より好ましくは１〜数個（例えば、１〜５個）のアミノ酸が自然に発生するヒトα９インテグリンのアミノ酸配列に付加されているアミノ酸配列を有する変異ポリペプチドを意味する。更に、変異ポリペプチドは、これらの複数のアミノ酸の置換、欠失、修飾及び付加の複数を有するものであってもよい。
【００３６】
本発明における抗原としてのヒトα９インテグリンは、本技術分野で周知の方法、例えば、遺伝子組み換え技術に加え、化学的合成方法、細胞培養法等、又はそれらの変法により作製することができる。
【００３７】
変異ポリペプチドを作製する方法として、例えば、合成オリゴヌクレオチド部位突然変異導入法（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法）、亜硝酸塩若しくは亜硫酸塩処理によってランダムに点突然変異を導入する点突然変異法、Ｂａｌ３１酵素若しくはその他の酵素により欠失変異体を調製することを含む方法、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスインコーポレーション法、ミスマッチプライマ法、ＤＮＡセグメント合成法などを挙げることができる。
【００３８】
本発明において抗原として使用するヒトα９インテグリンには、前記α９インテグリンの「一部」も包含される。ここで「一部」とは、ＯＰＮ、ＶＣＡＭ−１、テネイシンＣ等のα９インテグリンのリガンドと結合するために必要な領域を有する部分をいい、具体的には、完全ヒトα９インテグリン（配列番号７６の３０番目〜１０３５番目のアミノ酸残基）の１４番目〜９８０番目のアミノ酸残基を有する部分及び１１番目〜９８１番目のアミノ酸残基を有する部分である。前記α９インテグリンの「一部」は、後述する本技術分野において公知の方法若しくはその変法に従って、遺伝子組換技術又は化学的合成法により作製することもできるし、また細胞培養方法により単離したヒトα９インテグリンをタンパク分解酵素などにより適切に切断することにより作製することもできる。
【００３９】
抗原としては、α９インテグリンを細胞膜上に過剰発現する細胞自体、又はその膜画分を用いることもできる。ヒトα９インテグリンを過剰発現する細胞は、本技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術により調製することができる。
【００４０】
上述のように調製された適切な抗原を使用して、ヒトα９インテグリン又はその任意のエピトープに特異的な抗体は、本技術分野で周知の様々な方法により調製することができる。ヒトα９インテグリンに対するポリクローナル抗体は、本技術分野で周知の様々な手段により作製することができる。例えば、目的の抗原を、これらに限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどの様々な宿主動物に投与して、該抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する抗血清の生成を誘導することができる。宿主の種に応じて、免疫応答を高めるために様々なアジュバントを使用してもよい。アジュバントとしては、これらに限定するものではないが、フロイント（完全又は不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ：カルメット・ゲラン桿菌）やコリネバクテリウム・パルブムなどのヒトに対して潜在的に有用なアジュバントを挙げることができる。このようなアジュバントも本技術分野で周知である。
【００４１】
モノクローナル抗体は、本技術分野で公知の多様な技術であって、ハイブリドーマ、組換え、ファージ提示法又はこれらの組み合わせを含む方法により作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、本技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗら，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  第２版）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，  １９８１，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，  ｐｐ．  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．Ｙ）（両者の全体を参照することにより本明細書に組み入れられる）に記載されるようい教示される。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により作製された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により作製することができる真核クローン、原核クローン、ファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体をいい、その作製方法を意味するものではない。
【００４２】
ハイブリドーマ技術を使って特異抗体を作製、スクリーニングする方法は、本技術分野において常用の周知方法である。限定されない例えでは、マウスを目的の抗原又は該抗原を発現する細胞で免疫してもよい。免疫応答を検出したら、例えば、マウス血清中に抗原に特異的な抗体を検出したら、マウス脾臓を摘出し、脾細胞を単離する。該脾細胞は周知方法で適当なミエローマ細胞（例えば、Ｐ３Ｕ１、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３など）と融合させる。ハイブリドーマは、限界希釈法により選択及びクローン化する。ハイブリドーマクローンを本技術分野において公知の方法で分析し、抗原に結合できる抗体を分泌している細胞を得る。通常高濃度に抗体を含有する腹水は、陽性ハイブリドーマクローンをマウス腹腔内に接種して作成することができる。
【００４３】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは公知技術により作成してもよい。例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントの作製）やペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの作製）などの酵素を使用して、イムノグロブリン分子をタンパク質分解させることによりＦａｂやＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製してもよい。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは完全軽鎖、可変領域、ＣＨ１領域及び重鎖のヒンジ領域を有する。
【００４４】
本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、本技術分野において公知である抗体の作製方法、特に化学合成又は、好ましくは、組換え発現技術により作製することもできる。
【００４５】
抗体をコードするヌクレオチド配列は、当業者が入手できる情報から得てもよい（すなわち、ＧｅｎＢａｎｋ、文献から、又は所定のクローニング及び配列分析）。特定の抗体又はそのエピトープ結合フラグメントをコードする核酸を含有するクローンを入手できないが、抗体分子又はそのエピトープ結合フラグメントの配列が公知の場合には、当該イムノグロブリンをコードする核酸は、化学的に合成し、あるいは適切なソース（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、又は、抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞などの、抗体を発現する組織若しくは細胞から形成されたｃＤＮＡライブラリ、又は前記組織若しくは細胞から単離された核酸、好ましくは、ポリＡ＋ＲＮＡ）から該配列の５’端にハイブリダイズする合成プライマを使用してＰＣＲ増幅を行うことによって、又は、例えば、該抗体をコードするｃＤＮＡライブラリからｃＤＮＡクローンを識別する特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローニングを行うことによって入手してもよい。ＰＣＲにより増幅された核酸は、本技術分野において周知の方法により複製可能なクローニングベクタにクローン化してもよい。
【００４６】
組換え抗体の調製
抗体のヌクレオチド配列が決定されたならば、抗体のヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列を操作する本技術分野において周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位突然変異導入法、ＰＣＲなどにより操作し（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、及びＡｕｓｕｂｅｌら編，  １９９８，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ＮＹに記載の方法を参照。両者は全体を参照することにより本明細書に組み入れられる）、例えば、抗体のエピトープ結合ドメイン領域又は抗体の生物学的活性を高める若しくは下げるような抗体の部位へ置換、欠失及び／又は挿入によりアミノ酸を導入することによって、異なるアミノ酸配列を有する抗体を作製してもよい。
【００４７】
抗体の組換え発現には、該抗体をコードするヌクレオチド配列を含有する発現ベクタの構築が必要である。抗体分子又は抗体の重鎖若しくは軽鎖又はそれらの一部をコードするヌクレオチド配列が得られたならば、抗体分子を作製するためのベクタは、上述したように本技術分野において周知の技術を使用する組換えＤＮＡ法により作製してよい。当業者に周知である方法により、抗体をコードしている配列及び適切な転写及び翻訳調節シグナルを含有する発現ベクタを構築することができる。そのような方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ法、合成法及びインビボ遺伝子組み換えを挙げることができる。重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖及び軽鎖両可変領域、重鎖及び／又は軽鎖可変領域のエピトープ結合フラグメント又は抗体の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列は、発現のためのベクタにクローン化されてもよい。そのような配列は、元の抗体のシグナルペプチド又は非相同のシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドに融合させてもよい。その後、そのように調製した発現ベクタを抗体発現に好適な宿主細胞に導入する。従って、本発明は、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含有する。
【００４８】
重鎖に由来するポリペプチドをコードする第１のベクタと軽鎖に由来するポリペプチドをコードする第２のベクタの本発明の２つの発現ベクタを、宿主細胞に共に導入してもよい。この２つのベクタは、重鎖及び軽鎖ポリペプチドを等しく発現させるために同一の選択マーカーを含有してもよく、又は両プラスミドを確実に維持するために異なる選択マーカーを含有してもよい。または、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現することができる単一のベクタを使用してもよい。重鎖及び軽鎖をコードする配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを有してもよい。
【００４９】
他の実施形態では、抗体は本技術分野において公知の様々なファージ提示法により作製することができる。ファージ提示法では、機能的抗体ドメインは、当該ドメインをコードしているヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面に提示される。特定の実施形態では、このようなファージは、レパートリまたはコンビナトリアル抗体ライブラリ（例えば、ヒトまたはマウス）から発現したＦａｂやＦｖ又はジスルフィド結合安定化Ｆｖなどの抗原結合ドメインを提示するために用いることができる。目的の抗原に結合する抗原結合性ドメインを発現するファージは、例えば、標識化抗原又は固体表面若しくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原等の抗原を用いて、選択または識別することができる。これらの方法に用いるファージは、典型的には、ｆｄ及びＭ１３を含む繊維状ファージである。抗原結合性ドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え融合したタンパク質として発現される。本発明のイムノグロブリン又はそのフラグメントの作製に使用することのできるファージ提示法としては、以下の文献に開示されているものが挙げられる：Ｂｒｉｎｋｍａｎら，  １９９５，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １８２：４１−５０；Ａｍｅｓら，  １９９５，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら，  １９９４，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃら，  １９９７，  Ｇｅｎｅ，  １８７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎら，  １９９４，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ５７：１９１−２８０；国際出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；国際公開ＷＯ  ９０／０２８０９；ＷＯ  ９１／１０７３７；ＷＯ  ９２／０１０４７；ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９３／１１２３６；ＷＯ  ９５／１５９８２；ＷＯ  ９５／２０４０１、及び米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号；及び第５，９６９，１０８号。これら文献の各々は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるものとする。
【００５０】
上記参考文献に記載されているように、ファージ選択後、ヒト抗体などの抗体、又は任意の他の所望のフラグメントを作製するためにファージから抗体コード領域を単離し、例えば、以下に詳しく説明するように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌などの任意の所望の宿主に発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメントを組換えにより作製する技術を、以下の文献に開示されているような、当技術分野で公知の方法を用いて利用することができる：国際公開ＷＯ  ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘら，  １９９２，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １２（６）：８６４−８６９；及びＳａｗａｉら，  １９９５，  ＡＪＲＩ，  ３４：２６−３４；並びにＢｅｔｔｅｒら，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４０：１０４１−１０４３（これら文献の各々は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる）。一本鎖Ｆｖｓ及び抗体の作製に使用する技術の例として、米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら，  １９９１，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ２０３：４６−８８；Ｓｈｕら，  １９９３，  ＰＮＡＳ，  ９０：７９９５−７９９９；及びＳｋｅｒｒａら，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４０：１０３８−１０４０に記載のものが挙げられる。
【００５１】
本発明の抗体分子を上述のいずれかの方法により作製後、イムノグロブリン分子を精製するための本技術分野で公知の任意の方法により精製することができ、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインＡ又はプロテインＧ精製後の特異的抗原に対するアフィニティーによるもの、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解、又はタンパク質を精製する任意の他の標準的方法により実施することができる。更に、本発明の抗体又はそのフラグメントを本明細書に記載の、または本技術分野で公知の、精製を容易にする異種ポリペプチド配列に融合させてもよい。
【００５２】
ヒトにおける抗体のインビボ使用及びインビトロ検出アッセイなどの使用において、キメラ、ヒト化又はヒト抗体の使用が好ましい。キメラ抗体及びヒト化抗体については、詳しく後述する。
【００５３】
他の化合物又は異種ポリペプチドに融合又は結合した抗体は、インビボ治療又は診断用途に加え、インビトロイムノアッセイ、精製法（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）に使用できる。例えば、国際公開ＷＯ  ９３／２１２３２；欧州特許第４３９，０９５号；Ｎａｒａｍｕｒａら，  １９９４，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  ３９：９１−９９；米国特許第５，４７４，９８１号；Ｇｉｌｌｉｅｓら，  １９９２，  ＰＮＡＳ，  ８９：１４２８−１４３２；及びＦｅｌｌら，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４６：２４４６−２４５２を参照することができ、これらの文献は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。例えば、抗体は、公知方法又は市販のキットを使用して種々の手段により標識することができる（例えば、ビオチン標識、ＦＩＴＣ標識、ＡＰＣ標識）。他の例としては、インビボでの抗体の生物学的効果を高める治療成分に、抗体を結合させてもよい。そのような治療成分としては、例えば、他の抗体、細胞増殖抑制性又は細胞破壊性である細胞毒素、放射性元素、及び／又は抗炎症剤、抗生剤などの別の治療薬を挙げることができる。本発明では、ヒト化抗−ヒトα９インテグリン抗体は、抗−α４抗体などの他の抗体に結合（例えば、二重特異性抗体形成）させてもよい。他の例として、本発明のヒト化抗体は、インビボ診断で使用するために、放射性元素などの検出可能なマーカーで標識してもよい。
【００５４】
（キメラ及びヒト化抗体）
キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒトイムノグロブリン由来の定常領域を有する抗体など、抗体の異なる部位が異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体の作製方法は本技術分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：１２０２；Ｏｉら，  １９８６，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  ４：２１４；  Ｇｉｌｌｉｅｓら，  １９８９，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号及び第４，８１６，３９７号で参照された。これらの文献は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【００５５】
ヒト化抗体は、目的の抗原に結合し、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）とヒトイムノグロブリン分子由来の１つ以上のフレームワーク領域とを含有する可変領域とを有する分子である。非ヒト抗体をヒト化する代表的な方法は、以下のような多数の文献に開示されている；Ｑｕｅｅｎら，１９８９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３；米国特許第５，５８５，０８９号及び第５，６９３，７６２号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２：３２３；及びＴｓｕｒｕｓｈｉｔａら，  ２００５，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６９−８３（これら文献は全て、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａらの文献（前記２００５、以下「Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａという」）は、Ｑｕｅｅｎら（前記１９８９）により開発された抗体−ヒト化方法に基づいて、マウスモノクローナル抗体のヒト化の実践的かつ指示的手順を提供している。Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａに開示されている一般的な手順を以下に簡単にまとめる。
【００５６】
（ヒト化抗体を調製するための一般的な手順）
（マウスＶ遺伝子のクローニング及びシークエンシング）
目的マウスモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ領域をコードするｃＤＮＡは種々の方法によりクローニングすることができる。例えば、ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  カリフォルニア州）又はＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  カリフォルニア州）を使用する５’ＲＡＣＥ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ：ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）法が通常使用されている。５’ＲＡＣＥのための遺伝子特異的プライマは、目的モノクローナル抗体のＨ鎖及びＬ鎖のアイソタイプに基づいて、Ｈ鎖及びＬ鎖のそれぞれの可変領域の直後の下流に結合できるように調製することができる。５’ＲＡＣＥをγ１、γ２ａ、γ２ｂ又はγ３などのマウスの各サブタイプに特異的であるように設計してもよい。あるいは、全てのサブタイプに共通のプライマを、サブタイプに共通し又は相同性の高い領域に基づいて設計してもよい。Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａでは、以下の５’ＲＡＣＥプライマを例示している。
（ｉ）５’−ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧ−（配列番号１２９）（マウスγｌ、γ２ａ、γ２ｂ及びγ３Ｈ鎖のクローニング用）
（ｉｉ）５’−ＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣ−（配列番号１３０）（マウスκ軽鎖のクローニング用）。
【００５７】
ＰＣＲにより増幅したＶ遺伝子フラグメントは、例えば、ＺｅｒｏＢｌｕｎｔＴＯＰＯＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、プラスミドベクタに直接クローン化でき、そのＤＮＡ配列を決めることができる。得られた配列は、例えば、それがコードするアミノ酸配列を、モデル２４１タンパク質シーケンサ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ，  カリフォルニア州）を使用したＮ末端アミノ酸シークエンシングにより決定された目的モノクローナル抗体のアミノ酸配列と比較することによって確認する。典型的には、クローン化されたＤＮＡ配列の信憑性を確認するには、例えば、エドマン分解による目的抗体のＮ末端の少なくとも１５〜２０個のアミノ酸残基の決定で十分である。Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａは、マウスのＮ末端アミノ酸として最も一般的である２つアミノ酸の内の１つであるグルタミンがＮ末端アミノ酸である場合、ピログルタミンに転換され、Ｎ末端でのシークエンスを妨害する可能性について警告している。その場合には、配列を得るためにＮ末端のブロックを解除する必要がある。
【００５８】
（Ｖ領域の三次元モデリング）
ＶＨ及びＶＬ領域の配列に基づいて、ＣＤＲの立体配座構造を保持する上で重要となる可能性のある、目的抗体のフレームワーク残基を、例えば、Ｒ．  Ｌｅｖｙら，  １９８９，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：７１６８−７１７５又はＢ．  Ｚｉｌｂｅｒら，  １９９０，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：１００３２−１００４１に記載されている方法に特定する。典型的には、ＶＨ及びＶＬ領域のそれぞれを、β鎖とイムノグロブリンスーパーファミリのドメイン構造を有するループ様構造である、１４の構造的に意味のあるセグメントに分割する。目的抗体から得られた各セグメントのアミノ酸配列を、ＰＤＢデータベース（Ｈ．Ｍ．  Ｂｅｒｍａｎら，  ２０００，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：２３５−３４２参照）で公知構造の抗体の対応セグメントと並べて比較する。複数の配列を並べて比較することにより、目的セグメントのそれぞれに最も相同性の高い対応セグメントを選択し、Ｖ領域の三次元モデルを構築する。構造を最適化するために、モデルの共役勾配エネルギ最小化を複数回行う（例えば、Ｐｒｅｓｓら，  １９９０，  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｒｅｃｉｐｅｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅに記載されているＥＮＣＡＤ；Ｗｅｉｎｅｒら，  １９８１，  Ｊ．  Ｃｏｍｐ．  Ｃｈｅｍ．  ２：２８７−３０３に記載されているＡＭＢＥＲ；ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ又はＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＵＫによって運営されているＢＭＭウェブサイトより入手可能な３Ｄ−ＪＩＧ−ＳＡＷ；又はＳｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  Ｇｅｎｅｖａによって運営されているＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバーにおいて入手可能なＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬを使用する）。
【００５９】
（ヒトフレームワークの選択）
Ｖ領域の構造のモデリングと並行して、マウスＶＨ及びＶＬ領域のｃＤＮＡクローニングから推定されたアミノ酸配列のそれぞれを、例えば、Ｋａｂａｔデータベース（Ｊｏｈｎｓｏｎら，  ２０００，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：２１４−２１８参照）、ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースのヒトＶ領域配列と比較する。配列全体として、マウス配列と少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％の相同性を有するヒトフレームワーク領域は、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｇｕｓｆｉｅｌｄ，  １９９７，  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ｏｎ  Ｓｔｒｉｎｇｓ，  Ｔｒｅｅｓ，  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）又はＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎら，  １９９０，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８）などを使用して検索することができる。これらのヒト配列は、ｃＤＮＡに基づきタンパク質に由来する配列に基づいていてもよいが、大抵の場合、ｃＤＮＡに基づくタンパク質由来の配列における体細胞超変異に関連する免疫原性の可能性を排除するために生殖細胞系列を使用することが好ましい。あるいは、Ｑｕｅｅｎら（前記１９８９）に記載されているように、共通フレームワーク配列を使用して、ｃＤＮＡに基づくタンパク質由来の配列から得られるフレームワークにおける超変異残基を同定し、除去することもできる。生殖細胞系列ＶＨセグメントをアクセプタフレームワークとして使用する場合、第１４染色体上のＶＨセグメントのみが機能性ＶＨ領域を産生するため、第１５及び１６染色体ではなく、第１４染色体上にコードされているＶＨセグメントを使用する必要がある。
【００６０】
（ヒト化Ｖ領域の設計）
Ｑｕｅｅｎら（前記１９８９）に従えば、ＣＤＲの約４〜６Å以内のフレームワークアミノ酸は正しいＣＤＲ構造を支える主要なフレームワーク残基である可能性が考えられるため、これらのアミノ酸を同定する必要がある。該同定は、原子座標からの原子間距離を計算する、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＮＳＦ）が支援する分子可視化無料ソフトウェブサイトにおいて利用可能なＲＡＳＭＯＬなどのコンピュータプログラムを使用して、又はコンピュータモデルを手動で調べることにより行うことができる。主要フレームワーク位置のアミノ酸がマウスドナ配列とヒトアクセプタ配列で異なる場合、通常、マウスドナの残基でヒト残基を置換する。しかし、そのような残基がＣＤＲ構造を支持する上で貢献度が低い場合には、対応するヒト配列を使用するのが一般的である。また、選択したヒトアクセプタが、Ｖ領域配列の約１０−２０％未満で起こる「異常」アミノ酸を含有する場合には、それらは親和性成熟中の体細胞超変異の結果であることがあり、ヒトの免疫原性の可能性を回避するためにそれらをドナ残基で置換する必要がある。
【００６１】
更に、ヒト化Ｖ領域を設計するためには、潜在的なＮ結合型糖鎖合成シグナルの残基などの他の因子を注意深く考慮する必要がある（詳細についてはＴｓｕｒｕｓｈｉｔａ参照）。
【００６２】
ヒト化抗体は、治療的使用のために要求される又は削除されるべきエフェクタ機能に応じて、ヒトκ若しくはλ軽鎖由来のヒト定常領域若しくはその一部、及び／又はヒト抗体のγｌ、γ２、γ３、γ４、μ、αｌ、α２、δ又はε重鎖、あるいはそれらの変異体を含有してもよい。例えば、抗体のＦｃ受容体への結合を低下させ、及び／又は補体への結合力を低下させるように、変異を有する定常領域のＦｃ部分を本発明のキメラ又はヒト化抗体の可変領域に融合させてもよい（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら，  英国特許第２，２０９，７５７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，  国際公開ＷＯ  ８９／０７１４２；Ｍｏｒｇａｎら，国際公開ＷＯ  ９４／２９３５１参照）。そのような抗体分子の操作は、上述の組換えＤＮＡ技術により行うことができる。
【００６３】
好ましくは、得られたキメラ又はヒト化抗体は、非ヒトドナ抗体と同じ特異性及び非ヒトドナ抗体の親和性と同様又は少なくとも１／３、少なくとも１／２又は少なくとも２／３の親和性を有する。他の態様においては、得られたキメラ又はヒト化抗体の親和定数は、少なくとも約１×１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１×１０８Ｍ−１、最も好ましくは少なくとも約１×１０９Ｍ−１である。
【００６４】
上述の一般的な手順に加え、ＣＤＲ移植（欧州特許ＥＰ  ２３９，４００；国際公開ＷＯ  ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号及び第５，５８５，０８９号）、ベニアリング又は表面再構成（欧州特許ＥＰ  ５９２，１０６；及びＥＰ  ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，  １９９１，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら，  １９９４，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ７（６）：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａら，  １９９４，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１：９６９−９７３）、及び鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）など、本技術分野において公知の様々な方法により、抗体をヒト化することができる。これらの文献の全ては、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【００６５】
（医薬としてのヒト化抗体の調製のためのその他の検討）
医薬としてヒト化抗体を提供するためには、その効率的かつ安定な製造システムを用意する必要がある。例えば、Ｈ及びＬ鎖配列を挿入してヒト化抗体用の適切な発現ベクタを調製し、発現ベクタでトランスフェクトされた高生産性細胞株を、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）の安定及び半永久的な細胞源であるマスターセルバンク（ＭＣＢ）の種細胞として取得できる。ヒト化抗体は、ＷＣＢからの機能する細胞を培養し、培養液を回収することによって調製することができる。
【００６６】
適切な調節遺伝子を有する様々な発現ベクタを、前記のような産生細胞株の調製に使用することができる。宿主細胞としては、哺乳類のタンパク質を発現させるために通常使用される細胞をヒト化抗体の発現に使用することができる。そのような宿主細胞としては、これらに制限されないが、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ：ＣＨＯ）細胞、ＳＰ２／０−Ａｇｌ４．１９細胞、ＮＳＯ細胞等を挙げることができる。ヒト化抗体の生産性は、発現ベクタと宿主細胞の最適な組み合わせを選択することによって最大化することができる。また、培養溶媒の組成は、好適な溶媒を選択するために、種々の無血清培養培地及び添加剤を試して、宿主細胞によるヒト化抗体の発現が最適になるようにする。
【００６７】
効率及び最終収量に基づいて、宿主細胞により産生されたヒト化抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの本技術分野で周知の方法により培養上清から精製できる。
【００６８】
（医薬組成物及び治療的使用）
本発明は、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識する、上述のヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物を提供する。有効成分として本発明のヒト化抗体を含有する医薬組成物は、α９インテグリンに関連する障害又は疾患、例えば、これに限定されないが、癌、例えば、癌細胞の成長又は転移、及び関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽種、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及びクローン病）、自己免疫疾患などの炎症性疾患を予防及び／又は治療するための薬剤として使用することができる。
【００６９】
本発明のヒト化抗体を含有する医薬組成物は、臓器移植後の慢性拒絶反応の治療や全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、ブドウ膜炎、ベーチェット病、多発性筋炎、糸球体増殖性腎炎、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患の治療にも使用することができる。
【００７０】
上記の障害又は疾患の予防又は治療のための本発明のヒト化抗体を含有する予防薬及び／又は治療薬は、毒性が低く、好適な溶媒中に混合して得られた液剤として直接又は適当な剤形の医薬組成物として、ヒトに経口又は非経口投与することができる。
【００７１】
上述の投与に使用される医薬組成物は、前記抗体又はその塩及び医薬的に許容される担体、希釈剤又は添加剤を含有する。そのような組成物は、経口又は非経口投与に適した剤形として提供される。
【００７２】
用量は、投与される対象の年齢や体重、対象疾患、状態、投与経路などによって異なる。例えば、大人の関節リウマチ患者の予防及び／又は治療に本抗体を使用する場合、本発明の抗体を、通常、一回につき約０．０１ｍｇ〜２０ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは約０．１ｍｇ〜５ｍｇ／体重１ｋｇを１日に１〜５回程度、好ましくは１〜３回程度静脈注射することが望ましい。他の非経口投与及び／又は経口投与では、上記用量に対応する量の抗体を投与することができる。状態が特に重症な場合には、用量を状態に応じて増加してもよい。
【００７３】
様々な投与システム、例えば、リポゾームカプセル剤、微粒子、マイクロカプセル、変異ウィルスを発現する組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシスなどが知られており、本発明の医薬組成物の投与に使用することができる（例えば、Ｗｕ及びＷｕ，  １９８７，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２：４４２９−４４３２参照）。投与の方法としては、これに限定されないが、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び／又は経口経路を挙げることができる。化合物は、例えば、注入又はボーラス注入、上皮又は皮膚粘膜を介する吸収（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）などの任意の利用しやすい経路で投与してよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与してよい。投与は、全身性でも局所的でもよい。また、例えば、エアロゾル化剤を含む剤形で、吸入器や噴霧器を使用して、経肺投与を採用することもできる。
【００７４】
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物を治療が必要な患部に局所的に投与することが望ましいことがあり、例えば、これに限定するものではないが、手術中の局所注入、例えば、手術後の創傷被覆材との併用等の局所適用、注射、カテーテル、坐薬、鼻腔用スプレー、あるいは例えば、シアラスト膜（ｓｉａｌａｓｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）などの膜又は線維を含む多孔質、無孔質又はゲル状の物質の移植により投与することができる。一実施形態において、感染組織の部位（又は元の部位）に直接注入することにより投与することもできる。
【００７５】
他の実施形態では、医薬組成物を小胞、特にリポソーム（Ｌａｎｇｅｒ，  １９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔら，  １９８９，  ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｌｏｐｅｚ  Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ  （編），  Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ３５３−３６５；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，  同書，  ｐｐ．３１７−３２７、及び同書全体を参照）の状態で投与することができる。
【００７６】
他の実施形態では、医薬組成物を放出制御システムにより投与することができる。一実施形態では、ポンプを使用してもよい（前記Ｌａｎｇｅｒ；Ｓｅｆｔｏｎ，  １９８７，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０１；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，１９８０，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７；及びＳａｕｄｅｋら，  １９８９，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２１：５７４参照）。他の実施形態では、ポリマー物質を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ  （編），  １９７４，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，  Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ  （編），１９８４，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，  １９８３，  Ｊ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｓｃｉ．  Ｒｅｖ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２３：６１；及びＬｅｖｙら，  １９８５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら，  １９８９，  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら，  １９８９，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  ７１：１０５参照）。更に他の実施形態では、放出制御システムを組成物の標的の付近に置くことができ、これにより全身性の用量の何分の１かの量のみを投与してもよい（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，  ，１９８４，  前記Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  ｖｏｌ．  ２，  ｐｐ．  １１５−１３８参照）。また、別の放出制御システムがＬａｎｇｅｒの総説（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：  １５２７−１５３３）に記載されている。
【００７７】
経口投与用の組成物としては、例えば、固体又は液体の剤形、特に錠剤（糖衣錠及びフィルムコート錠を含む）、丸剤、顆粒剤、粉剤、カプセル剤（ソフトカプセルを含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤を挙げることができる。そのような組成物は、公知の方法により製造され、製剤の分野で通常使用されている賦形剤、希釈剤、添加剤を含有する。錠剤の賦形剤又は添加剤としては、乳糖、澱粉、ショ糖、ステアリン酸マグネシウムなどを挙げることができる。
【００７８】
注射剤としては、静脈内、皮下、皮内及び筋内注射並びに点滴用の剤形を挙げることができる。これらの注射剤は、公知方法により製造することができる。注射剤は、例えば、上述の抗体又はその塩を、注入剤に通常使用されている蒸留水性溶媒又は油性溶媒に溶解、懸濁又は乳化させて調製することができる。注射剤用の水性溶媒としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の添加剤を含有する等張溶液を挙げることができ、それらは、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物））などの適当な可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。油性溶媒としては、例えば、ゴマ油、ダイズ油などを使用でき、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用してもよい。そのように調製された注射剤は、好ましくは適切なアンプルに充填される。直腸投与に使用される坐薬は、前記抗体又はその塩を坐薬用の通常使用される基剤と混合して調製することができる。
【００７９】
望ましくは、上述の経口又は非経口で使用される医薬組成物は、有効成分の投与量を調製するのに適した単位用量の剤形に調製される。そのような単位用量の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注入剤（アンプル剤）、坐剤を挙げることができる。含有される前記抗体の量は、通常、単位用量の剤形あたり約５ｍｇ〜５００ｍｇであり、特に注射剤では約５ｍｇ〜１００ｍｇ、他の剤形では１０ｍｇ〜２５０ｍｇであることが好ましい。
【００８０】
上記組成物のそれぞれは、上述の抗体と何ら有害な相互作用を引き起こさない限り、他の活性組成物を更に含有してもよい。
【００８１】
本発明はまた、細胞及び／又は組織再構成の阻害剤及び／又は促進剤に関し、そのような阻害剤及び／又は促進剤は、有効成分としてα９インテグリン結合機能性分子（例えば、ＯＰＮ、ＶＣＡＭ−１、テネイシンＣ、フィブロネクチン、ｐｐ−ｖＷＦ、ｔＴＧなど）を有する。また、本発明は、細胞及び／又は組織再構成を阻害及び／又は促進する方法に関し、そのような方法は、α９インテグリン結合機能性分子にα９インテグリン発現細胞及び／又は組織（例えば、腫瘍細胞、好中球、平滑筋など）を接触させることを含む。そのような治療薬における有効成分の用量、投与方法、医薬組成物などは、本発明のヒト化抗体を含有する医薬に関する前記説明を参照することにより適切に決めることができる。
【００８２】
上述のように、本発明は更に、α９インテグリンが関与している又はα９インテグリンを伴う障害又は疾患を予防又は治療する方法を提供する。本方法は、本発明の少なくとも１つのヒト化抗体の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む。
【００８３】
（診断的使用）
本発明のヒト化抗体を含有する医薬組成物は、癌、例えば、癌細胞の増殖や転移、及び関節リウマチ、骨関節炎、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽種などの炎症性疾患の診断薬、あるいは臓器移植後の慢性拒絶反応、又は全身性自己免疫疾患、エリテマトーデス、ブドウ膜炎、ベーチェット病、多発性筋炎、糸球体増殖性腎炎、サルコイドーシスなどの自己免疫疾患などの診断薬として使用することができる。本発明のヒト化抗体は、α９インテグリンを特異的に認識することができるため、試験体液中のα９インテグリンの定量、特にサンドイッチイムノアッセイ、競合アッセイ、イムノメトリ、ネフロメトリなどの定量法、免疫染色などに使用することができる。これらの免疫学的方法を本発明のアッセイ方法に適用する際に、特別な条件、手段などの説明は必要なく、通常の条件及び手段に本技術分野で普通の技術的検討を加えて、アッセイ系を構築すればよい。これらの一般的な技術的手段の詳細については、総論や教科書などを参照できる。
【００８４】
上述のように、α９インテグリンは、本発明の抗体を使用することによって高感度で定量することができる。本発明のヒト化抗体は、インビボでα９インテグリンを定量する方法へ応用して、α９インテグリンが関与する様々な疾患を診断する機会に特に有用である。例えば、α９インテグリンの発現レベルの上昇又は低下の検出により、被験者が癌や炎症性疾患などのα９インテグリンが関与する疾患を現在患っている可能性が高いこと、又は将来これらの疾患を患う可能性が高いことを診断することができる。従って、本発明はまた、α９インテグリンが関与又はα９インテグリンを伴う障害又は疾患の診断方法であって、本発明の少なくとも１つのヒト化抗体の有効量を、それを必要とする被験者に投与することを含む方法を提供する。そのようなインビボ診断に必要な投与量は、治療での使用量より少なくてよく、通常の手段に従って当業者が決定することができる。
【００８５】
本発明のヒト化抗体は、体液や組織などの試験液に存在するα９インテグリンを特異的に検出するために使用することもできる。ヒト化抗体はまた、α９インテグリンの精製用抗体カラムの調製、精製における各フラクションに含有されるα９インテグリンの検出、又は試験される細胞におけるα９インテグリンの挙動の分析に使用することができる。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例では、ヒト及び／又はマウスα９インテグリンを免疫特異的に認識するモノクローナル抗体の調製、該モノクローナル抗体の可変領域のシークエンシング、該抗体のエピトープマッピング、該抗体の他の特徴付け、該抗体のキメラ化及びヒト化、並びに得られたキメラ及びヒト化抗体の特徴付けについて説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものでない。
【００８７】
１．ヒトα９インテグリンに対するマウス抗体の調製
ヒトα９インテグリンに対するマウスモノクローナル抗体をサブトラクティブ免疫化法（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｃ．  Ｖ．ら，  １９９２，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：８４２−８４７）に従って調製した。簡単には、Ｂａｌｂ／ｃマウス３匹に、マウス１匹当たり４×１０６個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を腹腔内注射した。２日後、４ｍｇ／マウスのシクロホスファミドを該マウスの腹腔内に投与した。シクロホスファミド注射の２週間後に、マウス１匹当たり２×１０６個のヒトα９インテグリンを発現しているＣＨＯ−Ｋ１細胞（ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞）を該マウスの腹腔内に注射し、２週間後に更にマウス１匹当たり３×１０６個の同細胞を腹腔内に注射した。ハイブリドーマを本技術分野で周知の方法により調製した（例えば、Ｈａｒｌｏｗら，  １９８８，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  第２版；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，  １９８１，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−ＣｅＩｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，  ｐｐ．５６３−６８１，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎ．  Ｙ参照）。ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞とは免疫特異的に反応するが、ヒトα４インテグリンを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞とは反応しないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを樹立し、ヒトα９インテグリンを免疫特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する５つのハイブリドーマクローン（すなわち、１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６及び２８Ｓｌ）を単離した。
【００８８】
２．抗ヒトα９インテグリンモノクローナル抗体のエピトープ分析
ヒトα９インテグリンのＮ残基及びその後３残基毎に後ろにずれる位置から始まる１２残基のポリペプチド（すなわち、アミノ酸残基１〜１２、４〜１５、７〜１８など）を調製し、５ｎｍｏｌ／スポットとなるようにＣ６スペーサー及び２βＡｌａ残基を介してセルロース膜に結合させた。この膜をブロッキング緩衝液（ミルク／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）でブロックし、過酸化酵素で標識した各抗ヒトα９インテグリンモノクローナル抗体（すなわち、それぞれ１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、及び２５Ｂ６）１．０μｇ／ｍＬを含有する溶液１０ｍＬと３時間、室温で反応させた。Ｔ−ＴＢＳで洗浄後、上記膜を増強化学発光（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：ＥＣＬ）検出試薬と１分間、室温で反応させた。酵素反応の結果として放出された発光を測定し、抗体のエピトープを発光強度に基づいて決定した。対照例として、市販のヒトα９インテグリンに対するモノクローナル抗体であるＹ９Ａ２（Ｗａｎｇら，  １９９６，  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５，  ６６４−６７２参照）を使用した。
【００８９】
下記表１にエピトープマッピングの結果を示す。この結果から本発明者らにより単離されたモノクローナル抗体がＹ９Ａ２とは異なるエピトープを有していることが示された。
【００９０】
【表１】
2011509650.tif 000002
【００９１】
３．抗ヒトα９インテグリン抗体のＣＤＲ分析
モノクローナル抗体（すなわち、１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６及び２８Ｓｌ）のＣＤＲのアミノ酸配列を、それぞれのハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡの逆転写により決定し、ｃＤＮＡを調製した。これらのｃＤＮＡを鋳型として、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域を、ＳｃＦｖクローニングプライマ（軽鎖ミックス及び重鎖ミックス：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，  イリノイ州）を使用してＰＣＲにより伸長、増幅した。ＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩＴＯＰＯベクタにクローニングし、シークエンシングしてアミノ酸配列を決定した。この工程を各抗体について３回繰り返した。結果を表２に示す。
【００９２】
【表２】
2011509650.tif 000003
【００９３】
４．細胞接着抑制作用
（１）細胞接着にはα９インテグリンのそのリガンド、すなわち、ＯＰＮ、フィブロネクチン、テネイシンＣ、ＶＣＡＭ−１などの種々のＥＣＭ、への結合が関与していることが知られており、よって単離した抗ヒトα９インテグリン抗体の細胞接着抑制作用を試験した。
【００９４】
簡単には、ＧＲＤ配列がＲＡＡ配列で置換されたＯＰＮのＮ末端部位からトロンビン切断部位までを大腸菌宿主細胞から単離し、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）部位をプレシジョンプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，  イリノイ州）で切断して、ｈＯＰＮ（ＲＡＡ）Ｎ−ｈａｌｆをＧＳＴ融合タンパク質として調製した。ＶＣＡＭ−１はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，  ミネソタ州）から購入した。テネイシンＣ及びヒトフィブロネクチンは、それぞれＡＥＩＤＧＩＥＬ（配列番号９２）を含有するポリペプチド（テネイシンＣのα９インテグリン結合領域）及びＣＰＥＤＧＩＨＥＬＦＰ（配列番号：９３）を含有するポリペプチド（ヒトフィブロネクチンのα９インテグリン結合領域）を合成し、それらをウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ）に結合して調製した。ヒトα９インテグリンとしては、ヒトα９インテグリンを多く発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１）を使用した。
【００９５】
５０μＬのテネイシンＣ、フィブロネクチン、ＶＣＡＭ−１又はｈＯＰＮ（ＲＡＡ）Ｎ‐ｈａｌｆを１．２５〜５．０μｇ／ｍＬとなるように９６ウェルプレートの各ウェルに加え、３７℃で１時間静置してプレートをコートした。プレートをブロッキング溶液（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）でブロッキングし、ＰＢＳで１回洗浄した後、ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞（１．０×１０５個／ｍＬ）と単離モノクローナル抗体（１０ｇ／ｍＬ）との混合物の０．２５％ＢＳＡ最小必須培地（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉａ：ＭＥＭ）を２００μＬ／ウェルでプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２で１時間静置した。接着しなかった細胞をＰＢＳで洗い流し、接着した細胞を０．５％クリスタルバイオレット（和光、大阪、日本）／２０％メタノールで固定、染色した。染色された細胞を室温に３０分間放置した後、２０％酢酸溶液を添加し、溶解した。５９０ｎｍの波長でＯＤを測定し、接着活性を定量した。
【００９６】
図１６に示すように、テネイシンＣが関与する細胞接着は、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６及び２８Ｓｌにより抑制されたが、１Ｋ１１では抑制されなかった。フィブロネクチンが関与する細胞接着は、２１Ｃ５、２５Ｂ６及び２８Ｓｌにより抑制され、２４Ｉ１１による抑制の程度は低く、１Ｋ１１では抑制されなかった。ＶＩＣＡＭ−１が関与する細胞接着は、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６及び２８Ｓｌにより抑制されたが、１Ｋ１１では抑制されなかった。同様に、ｈＯＰＮ（ＲＡＡ）Ｎ−ｈａｌｆが関与する細胞接着は、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６及び２８Ｓｌにより抑制されたが、１Ｋ１１では抑制されなかった。
【００９７】
（２）α４インテグリン及びα９インテグリンは多くの共通ＥＣＭリガンドを有するので、抗α４インテグリン抗体及び抗α９インテグリン抗体の両者が存在すれば、細胞接着抑制活性が高められると期待される。そこで、両方の抗体を組み合わせた場合の転移癌に対する抑制作用を、α９インテグリンだけでなくα４インテグリンも発現するヒトメラノーマ細胞（Ｇ３６１）とＥＣＭとしてのＶＣＡＭ−１（１．２５μｇ／ｍＬ）との間の細胞接着に基づいて、インビトロで試験した。抗ヒトα４インテグリン抗体としては、ラットモノクローナル抗体Ｐ１Ｈ４（Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＭＡＢ１６９８３Ｚ，  Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，  カリフォルニア州）を使用した。
【００９８】
図１７に示すように、ＶＣＡＭ−１が関与する接着は、抗ヒトα９インテグリン抗体単独ではいずれも抑制されなかったが、抗ヒトα４インテグリン抗体を共存させることによって、陽性コントロール（Ｙ９Ａ２）、２１Ｃ５及び２４Ｉ１１により抑制された。α９インテグリン分子を多く発現する細胞は、通常、α４インテグリン分子も発現するので、この結果は、抗ヒトα９インテグリン抗体と抗ヒトα４インテグリン抗体の両方を使用することによって細胞接着を効果的に抑制することができ、それによりこれらのインテグリン分子が関与する転移癌などの様々な障害及び疾患の抑制を強化することができることを示している。
【００９９】
５．ＦＡＣＳ分析における抗ヒトα９インテグリン抗体の使用
抗ヒトα９インテグリン抗体がＦＡＣＳに使用できるかどうかを、ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞及びα９インテグリンを内因的に発現するヒト好中球を使用して試験した。ヒト好中球では、ＦＡＣＳ分析は、細胞数１．０×１０５で行い、抗体は氷上で反応させた。Ｆｃ受容体との非特異的反応を５０％ヤギ血清でブロックした。ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体を二次抗体として使用した。その結果、全ての抗ヒトα９インテグリン抗体が、ヒトα９／ＣＨＯ−Ｋ１及びヒト好中球上のα９インテグリンを検出でき、全ての抗体がヒトα４／ＣＨＯ−Ｋ１細胞と反応しなかった（図２０ａ、２０ｂ、２０ｃ参照）。これらの結果は、全ての抗ヒトα９インテグリン抗体が、ＦＡＣＳを使用して細胞上に発現されたヒトα９インテグリンタンパク質を検出できることを示している。
【０１００】
６．抗α９インテグリン抗体の治療的効果
抗α９インテグリン抗体の治療的効果を、マウスを用いて調べた。
【０１０１】
抗マウスα９インテグリンモノクローナル抗体（１１Ｌ２Ｂ、１２Ｃ４’５８、１８Ｒ１８Ｄ及び５５Ａ２Ｃ）を、マウスα９インテグリンを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（マウスα９／ＣＨＯ−Ｋ１細胞）でハムスターを免疫し、マウスα９／ＮＩＨ３Ｔ３細胞と反応するが、マウスα４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞には反応しないモノクローナル抗体を選択した以外は、上記マウス抗ヒトα９インテグリン抗体について記載された方法（上記、１．参照）と実質的に同じ方法により調製した。
【０１０２】
６．１．肝炎に対する治療的効果
国際公開ＷＯ  ０２／０８１５２２は、肝炎がＯＰＮ機能の抑制によって治療できることを開示している。従って、抗α９インテグリン抗体の治療的効果を、ハムスター抗マウスα９インテグリン抗体１１Ｌ２Ｂ及びラット抗マウスα４インテグリン抗体Ｒ１−２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、マウス肝炎モデルで検討した。２００μｇのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）（Ｖｅｃｔｏｒ）の静脈内注射の１２時間後にマウスの血中ＡＳＴ及びＡＬＴ値を、ＧＰＴ／ＡＬＴ−ＰＩＩＩ及びＧＯＴ／ＡＳＴ−ＰＩＩＩ（富士フィルム）を使用して測定した。ＣｏｎＡ注射の３時間前に、２００μｇの抗体を投与した。図１８に示すように、ＡＳＴ及びＡＬＴ値は、抗α９インテグリン抗体により低下することが確認され、治療効果が認められた。更に、この治療効果は抗α４インテグリン抗体との併用により高められた。この結果は、肝炎は、抗α９インテグリン抗体により治療できることを明らかにした。
【０１０３】
６．２．マウス癌細胞株の成長に対する抗α９インテグリン抗体の効果
マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６−ＢＬ６は、α９インテグリンを多く発現する。従って、樹立した抗マウスα９インテグリン抗体の癌細胞に対する細胞成長抑制活性を調査した。
【０１０４】
１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ中で５×１０４個／ｍＬとなるように調製したＢ１６−ＢＬ６細胞を、細胞培養用の９６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上に用意した。１０μｇ／ｍＬの抗マウスα９インテグリン抗体と抗マウスα４インテグリン抗体を添加した後、１００μＬの細胞抗体懸濁液を各ウェルに添加した。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間静置し、セルカウンティングキット８（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ  ８：同仁化学研究所）を各１０μＬ添加し、更に３７℃、５％ＣＯ２で１時間静置した。吸光度（ＯＤ４５０）を測定し、細胞数を定量的に分析した。図１９に示すように、１２Ｃ４’５８は抑制活性が最も高く、Ｂ１６−ＢＬ６細胞の成長を約３５％阻害した。５５Ａ２Ｃ及びＲ１−２のどちらも成長を約２０％阻害することができた。
【０１０５】
次いで、インビボ状態に近い状態での細胞成長に対する抑制効果を分析するために、ＶＣＡＭ−１を固相に固定化して同様にアッセイした。ＶＣＡＭ−１はα９インテグリンに対するリガンドであり、組換え可溶型ＶＣＡＭ−１タンパク質、ｒｈＶＣＡＭ−１−Ｆｃキメラ（Ｒｏｃｈｅ）を使用した。１０μｇ／ｍＬで固相に固定化されたｒｈＶＣＡＭ−１−Ｆｃキメラを使用し、０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで非特異的反応をブロックした。キメラは、抗体の単独使用では１０μｇ／ｍＬの濃度で、併用使用ではそれぞれ５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。その後、図１９と同じ手順を行った。その結果、１２Ｃ４’５８とα４抑制性抗体クローンＲ１−２とを同時に投与した場合には、図２１に示したように、細胞成長抑制効果は約２０％まで著しい増加を示したが、１２Ｃ４’５８の単独投与及びＲ１−２の単独使用では、抑制効果は全く認められず又はわずかに認められただけであった。
【０１０６】
６．３．マウス関節リウマチモデルにおける抗α９インテグリンの治療効果
７週齢メスマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）（各群３匹）に、４００μｇ／マウスのハムスター抗マウスα９インテグリン抗体（５５Ａ２Ｃ）又は正常ハムスターＩｇＧ（ＮＨＧ）を腹腔内注射した。２４時間後、２ｍｇ／マウスのＩＩ型コラーゲン特異性モノクローナル抗体の関節炎誘起カクテル（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．）を静脈内注射した。７２時間後、４００μｇ／マウスの５５Ａ２Ｃ又はＮＨＧを５０μｇ／マウスのＬＰＳとともに腹腔内注射した。マウスをＬＰＳの投与３日前からＬＰＳの投与後６日まで観察し、関節炎の程度をＷｏｏｄら（１９６９，  Ｉｎｔ．  Ａｒｃｈ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３５：４５６）の方法に従って得点化した。結果を図２２に示す。コントロールＮＨＧを注射されたマウスは得点が高く、関節リウマチを発症したが、抗マウスα９インテグリン抗体を注射したマウスでは、関節リウマチの発症は完全に阻止された。従って、抗α９インテグリン抗体は関節リウマチに対する予防及び治療効果を有することが示された。
【０１０７】
７．非ヒト抗体のヒト化
７．１．マウス２４Ｉ１１Ｖ遺伝子のクローニングとシークエンシング
マウス２４Ｉ１１ハイブリドーマ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ＨｙＣｌｏｎｅ，  Ｌｏｇａｎ，  ユタ州）を含有するＴＩＬ培地Ｉ（免疫生物研究所、群馬、日本）中で、７．５％ＣＯ２インキュベーターを用いて、３７℃で培養した。ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  カリフォルニア州）を添付プロトコールに従って使用して、約３×１０６個のハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添付プロトコールに従って使用して、オリゴｄＴ−プライムドｃＤＮＡを合成した。２４Ｉ１１重鎖及び軽鎖の可変領域ｃＤＮＡを、マウスγ−１及びκ鎖定常領域にそれぞれアニールするプライマと、ＧｅｎｅＲａｃｅｒキットに添付されているＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’プライマ（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−）（配列番号９４）とを使用して、ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  マサチューセッツ州）によるポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）により増幅した。重鎖可変領域（ＶＨ）のＰＣＲ増幅には、配列５’−ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧ−（配列番号９５）を有するプライマを使用し、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＰＣＲ増幅には、配列５’−ＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣ−（配列番号９６）を有するプライマを使用した。増幅されたＶＨ及びＶＬｃＤＮＡは、配列決定のためにｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクタ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローンした。可変領域のＤＮＡシークエンシングはＴｏｃｏｒｅ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  カリフォルニア州）で行った。数個の重鎖及び軽鎖クローンの配列を決定したところ、典型的なマウス重鎖及び軽鎖可変領域に相同である、特有な配列が同定された。２４Ｉ１１のＶＨ及びＶＬのコンセンサスｃＤＮＡ配列とその推定アミノ酸配列を、それぞれ図１及び２に示す。
【０１０８】
７．２キメラ２４Ｉ１１ＩｇＧ１／κ抗体の構築
２４Ｉ１１ＶＨｃＤＮＡを鋳型とし、５’−ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＴＣ−（配列番号９７）（下線はＳｐｅＩ部位）を５’プライマとして、５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＴＣＴＴＡＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＡＧＧＴＴＣＣ−（配列番号９８）（下線はＨｉｎｄＩＩＩ部位）をプライマ（図３）として使用して、ＰＣＲを行い、２４Ｉ１１ＶＨをコードする遺伝子を、スプライスドナシグナル及び適当なフランキング制限酵素部位を有するエクソンとして作製した。同様に、２４Ｉ１１ＶＬｃＤＮＡを鋳型とし、５’−ＧＧＧＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＣＣＡＣＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧ−（配列番号９９）（下線はＮｈｅＩ部位）を５’プライマとして、５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＡＣＴＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣＣＣＣ−（配列番号：１００）（下線はＥｃｏＲＩ部位）をプライマ（図４）として使用して、ＰＣＲを行い、２４Ｉ１１ＶＬをコードする遺伝子を、スプライスドナシグナル及び適当なフランキング制限酵素部位を有するエクソンとして作製した。２４Ｉ１１ＶＨ及びＶＬエクソンのスプライスドナシグナルは、それぞれマウス生殖細胞系列ＪＨ４及びＪκ２配列由来のものを用いた。ＰＣＲ増幅フラグメントは、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  カリフォルニア州）を用いてゲル精製し、ＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＶＨ用）又はＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ（ＶＬ用）で消化し、ヒトγ１及びκ定常領域を含む哺乳類発現ベクタにクローン化してキメラ２４Ｉ１１ＩｇＧ１／κ抗体を作製した。得られた発現ベクタｐＣｈ２４Ｉ１１の構造を模式的に図５に示す。
【０１０９】
７．３．ヒト化２４Ｉ１１Ｖ遺伝子の作製
２４Ｉ１１可変領域のヒト化は、Ｑｕｅｅｎら（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：  １００２９−１００３３，  １９８９）に概説されているように行った。まず、２４Ｉ１１可変領域の分子モデルを、コンピュータプログラムを用いて構築した。次いで、ヒト可変領域配列のホモロジ検索に基づいて、２４Ｉ１１ＶＨに高ホモロジ（ＦＲＨで７２．４％（６３／８７）のアミノ酸相同性）を有する、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５８９１のヌクレオチド配列によりコードされるヒトアミノ酸配列を、ヒト化２４Ｉ１１ＶＨのフレームワークを提供するアクセプタとして選択した。同様に、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７２４４１（ＦＲＬで７７．５％（６２／８０）のアミノ酸相同性）のヌクレオチド配列によりコードされるヒトアミノ酸配列を、２４Ｉ１１ＶＬのヒト化用のアクセプタとして選択した。
【０１１０】
相補性決定領域（ＣＤＲ）との重要な接触がコンピュータモデルにより示唆されたフレームワーク位置については、ヒトフレームワークアミノ酸を２４Ｉ１１可変領域のアミノ酸に置換した。この置換を、２７、２８、２９、３０、４８、６６、６７及び７１番目の位置（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる：Ｋａｂａｔら，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，  第５版，  ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ９１−３２４２，  Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  １９９１）について行い、ヒト化２４Ｉ１１（Ｈｕ２４Ｉ１１）ＶＨ（図６）を作製した。軽鎖については、７０及び７１残基について置換を行い、ヒト化２４Ｉ１１（Ｈｕ２４Ｉ１１）ＶＬ（図７）を作製した。２４Ｉ１１、設計されたＨｕ２４Ｉ１１及びヒトアクセプタのＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を並べて比較した図をそれぞれ図６及び図７に示す。
【０１１１】
Ｈｕ２４Ｉ１１ＶＨ及びＶＬのそれぞれをコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライスドナシグナル及び後の哺乳類発現ベクタへのクローニングのための適当な制限酵素部位を有するエクソンとして設計した。Ｈｕ２４Ｉ１１ＶＨ及びＶＬエクソンのスプライスドナシグナルは、それぞれヒト生殖細胞系列ＪＨ４及びＪκ１配列由来のものを用いた。Ｈｕ２４Ｉ１１ＶＨ及びＶＬエクソンのシグナルペプチド配列は、それぞれ対応するマウス２４Ｉ１１ＶＨ及びＶＬ配列由来のものを用いた。Ｈｅら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０：１０２９−１０３５，  １９９８）に概説されているように、ＴｈｅｒｍａｌＡｃｅＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、いくつかの重複合成オリゴヌクレオチドプライマの伸長及びＰＣＲ増幅により、Ｈｕ２４Ｉ１１ＶＨ及びＶＬ遺伝子を構築した。Ｈｕ２４Ｉ１１ＶＨ及びＶＬ遺伝子の構築に使用したオリゴヌクレオチドをそれぞれ図８及び９に示す。Ｈｕ２４Ｉ１１ＶＨ及びＶＬ遺伝子におけるオリゴヌクレオチドの位置をそれぞれ図１０及び１１に示す。ＰＣＲ増幅されたフラグメントは、配列決定のために、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクタにクローン化した。ＳｐｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＶＨ用）又はＮｈｅＩ及びＥｃｏＲＩ（ＶＬ用）で消化した後、Ｈｕ２４Ｉ１１ＶＨ及びＶＬ遺伝子を哺乳類発現ベクタの対応する部位にサブクローンしてヒトＩｇＧ１／κ型を作製した。得られた発現ベクタｐＨｕ２４Ｉ１１の構造を概略的に図５に示す。得られたＨｕ２４Ｉ１１ＶＨ及びＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列をそれぞれ図１２及び１３に示す。
【０１１２】
７．４．キメラ及びヒト化２４Ｉ１１ＩｇＧ１／κの一過性発現
Ｄｕｒｏｃｈｅｒら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０：ｅ９，  ２００２）に従って、それぞれｐＣｈ２４Ｉ１１及びｐＨｕ２４Ｉ１１プラスミドＤＮＡを、ポリエチレンイミンを使用してＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、キメラ及びヒト化２４Ｉ１１ＩｇＧ１／κ抗体を、一過性に発現させた。一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中、３７℃で７．５％ＣＯ２インキュベーター内に４日間保持した。培養上清中のＣｈ２４Ｉ１１及びＨｕ２４Ｉ１１ＩｇＧ１／κ抗体のそれぞれの発現量を、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。ＥＬＩＳＡプレートに、ＰＢＳで２０００倍希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ鎖特異的ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ，  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，  アラバマ州）を１００μｇ／ウェルで添加して４℃、一晩コートし、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、３００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（２％スキムミルク及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で１時間、室温でブロックした。洗浄緩衝液で洗浄後、ＥＬＩＳＡ緩衝液（１％スキムミルク及び０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で適切に希釈した検体を、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに添加した。標準として、ヒトミエローマ血清（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）から精製したヒトＩｇＧ１／κ抗体を使用した。ＥＬＩＳＡプレートを室温で２時間静置し、洗浄緩衝液で洗浄した後、２０００倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトκ鎖ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を１００μＬ／ウェルを使用して結合した抗体を検出した。室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で洗浄した後、１００μＬ／ウェルのＡＢＴＳ基質（ｂｉｏＷＯＲＬＤ，  Ｄｕｂｌｉｎ，  オハイオ州）を添加して発色させた。１００μＬ／ウェルの２％シュウ酸を添加して発色を停止させ、４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１３】
７．５．ヒト化２４Ｉ１１の特徴付け
キメラ及びヒト化２４Ｉ１１抗体のヒトα９インテグリンへの結合を細胞ＥＬＩＳＡにより調べた。組換えヒトα９インテグリンをその表面に発現するＣＨＯ−Ｋ１安定形質転換体（ＣＨＯ／ｈｕα９：Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅから入手）を２×１０５個／ウェルで、５０μＬの１０％ＦＢＳ含有Ｆ１２／ＤＭＥＭ（ＨｙＣｌｏｎｅ）を有する９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに播種し、３７℃、７．５％ＣＯ２インキュベーター内で一晩培養した。ヒトα９インテグリンへの結合を調べるために、５０μＬのキメラ２４Ｉ１１、ヒト化２４Ｉ１１又は無関係なＩｇＧ１／κミエローマ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を有する１０％ＦＢＳ含有Ｆ１２／ＤＭＥＭを各ウェルに添加した。４℃で１時間静置した後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１００μＬの１０００倍希釈ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を各ウェルに添加した。４℃で１時間静置した後、細胞を氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、発色させるために、１００μＬのＡＢＴＳ基質を添加した。１００μＬの２％シュウ酸を添加して発色を停止させ、４０５ｎｍで吸光度を測定した。ヒトα９インテグリンへのキメラ２４Ｉ１１抗体の結合は、０．５及び１μｇ／ｍＬの両方で、ヒト化２４Ｉ１１抗体の結合とほとんど同程度である結果を得た（図１４）。
【０１１４】
マウス、キメラ及びヒト化２４Ｉ１１モノクローナル抗体が結合する抗原をＣＨＯ／ｈｕα９細胞を使用したＦＡＣＳ結合アッセイにより調べた。精製マウス２４Ｉ１１モノクローナル抗体はＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。各試験について約８×１０５個のＣＨＯ／ｈｕα９細胞（各試験）をＦＡＣＳ結合緩衝液（０．５％ＢＳＡ及び０．０５％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）で洗浄し、種々の量の試験抗体を含有するＦＡＣＳ結合緩衝液２００μＬに懸濁した。３０分間氷冷後、細胞をＦＡＣＳ結合緩衝液で２回洗浄した。マウス２４Ｉ１１で染色した細胞を、ＦＡＣＳ結合緩衝液で希釈した２００倍希釈ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）２００μＬに懸濁した。キメラ又はヒト化２４Ｉ１１で染色した細胞をＨＡＣＳ結合緩衝液で希釈した２００倍希釈ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）２００μＬに懸濁した。３０分間氷冷後、細胞をＦＡＣＳ結合緩衝液で洗浄し、２００μＬのＦＡＣＳ結合緩衝液に懸濁し、ＦＡＣＳＣａｎフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ニュージャージー州）を使用して分析した。この分析において、キメラ及びヒト化２４Ｉ１１抗体のＣＨＯ／ｈｕα９細胞への結合は非常に類似していた（図１５）。
【０１１５】
一過性に発現された抗体を使用した細胞ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ実験の結果は、マウス２４Ｉ１１抗体のヒト化が成功したことを示している。
【０１１６】
その他の本願に記載されたマウス抗ヒトα９抗体（すなわち、１Ｋ１１、２１Ｃ５、２５Ｂ６及び２８Ｓｌ）のヒト化についても、上記と同じ手順で行うことができる。これらのマウスモノクローナル抗体のそれぞれのＶＨ及びＶＬ領域のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を以下に要約する。
【０１１７】
【表３】
2011509650.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明のヒト化モノクローナル抗体は、α９インテグリンの機能を阻害し、癌、例えば、癌細胞の増殖や転移、並びに、関節リウマチ、変形性関節症、肝炎、気管支喘息、線維症、糖尿病、癌転移、動脈硬化、多発性硬化症、肉芽腫、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、及び自己免疫疾患などの炎症性疾患に対する治療効果を示す。本発明の抗α９インテグリン抗体及び抗α４インテグリン抗体の両方を有含する医薬組成物は、癌及び炎症性疾患に対する更に優れた治療効果を示す。
【受託番号】
【０１１９】
マウス抗ヒトα９インテグリンモノクローナル抗体を産生する、本明細書において１Ｋ１１、２１Ｃ５、２４Ｉ１１、２５Ｂ６及び２８Ｓ１として示したハイブリドーマは、微生物の寄託に関するブタペスト条約に基づいて日本国３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番１号ＡＩＳＴつくば中央第６所在の、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、２００６年２月１５日付けで、それぞれ受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１１、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５１３及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８３２として寄託されている。これらは全て、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２０】
本明細書中で参照された配列を以下に要約する。
2011509650.tif 000005
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【図１】
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【図２】
2011509650.tif 000019
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2011509650.tif 000023
【図７】
2011509650.tif 000024
【図８】
2011509650.tif 000025
【図９】
2011509650.tif 000026
【図１０】
2011509650.tif 000027
【図１１】
2011509650.tif 000028
【図１２】
2011509650.tif 000029
【図１３】
2011509650.tif 000030
【図１４】
2011509650.tif 000031
【図１５】
2011509650.tif 000032
【図１６】
2011509650.tif 000033
【図１７】
2011509650.tif 000034
【図１８】
2011509650.tif 000035
【図１９】
2011509650.tif 000036
【図２０ａ】
2011509650.tif 000037
【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
2011509650.tif 000039
【図２１】
2011509650.tif 000040
【図２２】
2011509650.tif 000041
【配列表】
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【国際調査報告】
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