(57)【要約】  本発明は、ヒト血清アルブミンと結合することが可能なアミノ酸配列；このようなアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的に成る、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は構築物；このようなアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は構築物をコードする核酸；このようなアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は構築物を含む、組成物、特に医薬組成物；及びこのようなアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は構築物の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）との、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％ではあるが、１００％ではない配列同一性（本明細書中で規定する）を有し、
ｂ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合する、
アミノ酸配列。
【請求項２】
ａ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）との、９個以下、好ましくは８個以下、特に７個以下、例えば６個、５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸差異（本明細書中で規定する）を有し、
ｂ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合する、
アミノ酸配列。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列と比較して、
配列番号１の３位のセリン残基（Ｓ）がアルギニン（Ｒ）、プロリン（Ｐ）、芳香族アミノ酸残基（Ｆ、Ｙ、Ｗ又はＨ、特にＦ、Ｙ又はＷ）又は疎水性アミノ酸残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＭ）から選択されるアミノ酸残基で置き換わっており、及び／又は
配列番号１の５位のセリン残基（Ｓ）がアルギニン（Ｒ）、プロリン（Ｐ）又は芳香族アミノ酸残基（Ｆ、Ｙ、Ｗ又はＨ、特にＦ、Ｙ又はＷ）から選択されるアミノ酸残基で置き換わっており、及び／又は
配列番号１の１５位のアスパラギン酸残基（Ｄ）がプロリン（Ｐ）又は低分子アミノ酸残基（Ａ、Ｇ、Ｓ又はＴ）から選択されるアミノ酸残基で置き換わっており、及び／又は
配列番号１の１６位のフェニルアラニン残基（Ｆ）がプロリン（Ｐ）、疎水性アミノ酸残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＭ）又は低分子アミノ酸残基（Ａ、Ｇ、Ｓ又はＴ）で置き換わっており、及び／又は
配列番号１の１８位のプロリン残基（Ｐ）が維持されているか、又は（部分的に）負に荷電したアミノ酸残基（Ｄ、Ｅ、Ｑ又はＮ）若しくは低分子アミノ酸残基（Ａ、Ｇ、Ｓ又はＴ）で置き換わっており、並びに
任意で１つ又は複数のさらなる好適なアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を含む、
請求項１又は２に記載のアミノ酸配列。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列と比較して、配列番号１の３位のセリン残基（Ｓ）がアルギニン（Ｒ）に置き換わっている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
【請求項５】
（ｉ）Ａｒｇ（Ｒ）残基、特にヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能な、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４残基及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖の酸素原子と静電相互作用を形成することが可能なＡｒｇ（Ｒ）残基、及び／又は
（ｉｉ）Ｔｒｐ（Ｗ）残基、特にヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能なＴｒｐ（Ｗ）残基、及び／又は
（ｉｉｉ）配列モチーフＧＧＧ、
並びに好ましくは（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくともいずれか２つ、より好ましくは３つ全てを含む、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
【請求項６】
（ｉ）配列モチーフＲＸＷＤ（モチーフ内、Ｘは任意のアミノ酸配列であり得るが、好ましくはＷ、Ｙ、Ｆ、Ｓ又はＤである）、及び／又は
（ｉｉ）配列モチーフＧＧＧ、好ましくは配列モチーフＦＧＧＧ、より好ましくは配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）、
並びに最も好ましくはこれらの配列モチーフ（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
【請求項７】
配列番号２〜配列番号１１５のアミノ酸配列の１つ、又は配列番号２〜配列番号１１５のアミノ酸配列の１つとの、３個以下、例えば３個、２個若しくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、また好ましくは請求項４〜６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
【請求項８】
配列番号１４若しくは配列番号１４７〜配列番号１５７のアミノ酸配列の１つ、又は配列番号１４若しくは配列番号１４７〜１５７のアミノ酸配列の１つとの、３個以下、例えば３個、２個若しくは１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、また好ましくは請求項４〜６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
【請求項９】
ａ）配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）であるか、又は
ｂ）アミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）との、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％又は少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は
ｃ）アミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）との、６個以下、好ましくは５個以下、特に４個以下、例えば３個、２個又は１個のアミノ酸差異（本明細書中で規定する）を有し、並びに好ましくは
ｄ）アミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）と同様に良好に、好ましくはアミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）より良好にヒト血清アルブミンと結合する、
アミノ酸配列。
【請求項１０】
ａ）アミノ酸配列５９Ａ５（配列番号１４７）、５９Ｃ８（配列番号１４８）、５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｂ３（配列番号１５０）、５９Ｂ２（配列番号１５１）、６０Ｅ６（配列番号１５２）、６０Ｆ１（配列番号１５３）、６０Ｇ５（配列番号１５４）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）、５９Ｃ２（配列番号１５６）若しくは５９Ｈ１０（配列番号１５７）の１つであるか、又は
ｂ）アミノ酸配列５９Ａ５（配列番号１４７）、５９Ｃ８（配列番号１４８）、５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｂ３（配列番号１５０）、５９Ｂ２（配列番号１５１）、６０Ｅ６（配列番号１５２）、６０Ｆ１（配列番号１５３）、６０Ｇ５（配列番号１５４）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）、５９Ｃ２（配列番号１５６）及び／又は５９Ｈ１０（配列番号１５７）の少なくとも１つとの、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％又は少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は
ｃ）アミノ酸配列５９Ａ５（配列番号１４７）、５９Ｃ８（配列番号１４８）、５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｂ３（配列番号１５０）、５９Ｂ２（配列番号１５１）、６０Ｅ６（配列番号１５２）、６０Ｆ１（配列番号１５３）、６０Ｇ５（配列番号１５４）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）、５９Ｃ２（配列番号１５６）及び／又は５９Ｈ１０（配列番号１５７）の少なくとも１つとの、６個以下、好ましくは５個以下、特に４個以下、例えば３個、２個又は１個のアミノ酸差異（本明細書中で規定する）を有し、並びに好ましくは
ｄ）アミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）と同様に良好に、好ましくはアミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）より良好にヒト血清アルブミンと結合する、
アミノ酸配列。
【請求項１１】
ｅ）アミノ酸配列５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）若しくは５９Ｃ２（配列番号１５６）の１つであるか、又は
ａ）アミノ酸配列５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）及び／又は５９Ｃ２（配列番号１５６）の少なくとも１つとの、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％又は少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は
ｂ）アミノ酸配列５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）及び／又は５９Ｃ２（配列番号１５６）の少なくとも１つとの、６個以下、好ましくは５個以下、特に４個以下、例えば３個、２個又は１個のアミノ酸差異（本明細書中で規定する）を有し、並びに好ましくは
ｃ）アミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）と同様に良好に、好ましくはアミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）より良好にヒト血清アルブミンと結合する、
アミノ酸配列。
【請求項１２】
ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能な、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４残基及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖の酸素原子と静電相互作用を形成することが可能なＡｒｇ（Ｒ）残基；ヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能なＴｒｐ（Ｗ）残基；並びに配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）を含む、アミノ酸配列。
【請求項１３】
ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、配列モチーフＲＸＷＤ（モチーフ内、ＸはＷ、Ｙ、Ｆ、Ｓ又はＤから選択される）及び配列モチーフＦＧＧＧ、好ましくは配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）を含む、アミノ酸配列、特に請求項１２に記載のアミノ酸配列。
【請求項１４】
前記アミノ酸配列が治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体と連結又は融合した場合、このようにして得られた該化合物が、前記治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体が配列番号１のアミノ酸配列と連結又は融合した対応する化合物又は構築物より長い半減期を有し、好ましくは前記治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体が配列番号１４のアミノ酸配列と連結又は融合した対応する化合物若しくは構築物と同じか、又は対応する化合物若しくは構築物より長い半減期を有するようなものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
【請求項１５】
カニクイザル（マカク・ファシクラリス（Macaca fascicularis））由来の血清アルブミンと交差反応性である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアミノ酸配列。
【請求項１６】
少なくとも１つの請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列と少なくとも１つの治療部とを含む化合物又は構築物。
【請求項１７】
少なくとも２つの請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列と少なくとも１つの治療部とを含む化合物又は構築物。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を少なくとも２つ含む少なくとも１つのタンデムリピートと少なくとも１つの治療部と含む化合物又は構築物。
【請求項１９】
少なくとも１つの請求項１〜１５のいずれか一項に記載のアミノ酸配列と少なくとも１つの治療部とを含む化合物又は構築物であって、前記本発明の化合物が、前記アミノ酸配列（複数可）の代わりにアミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）を含有する、対応する化合物より長い半減期（本明細書中で規定する）を有し、好ましくは前記アミノ酸配列（複数可）の代わりに配列番号１４のアミノ酸配列を含有する、対応する化合物と同程度の、又は対応する化合物より長い半減期（本明細書中で規定する）を有する、化合物又は構築物。
【請求項２０】
融合タンパク質又はポリペプチドである、請求項１１又は１２に記載の化合物又は構築物。
【請求項２１】
少なくとも１つの治療部が好ましくは、免疫グロブリン配列又はその抗原結合断片、例えば免疫グロブリン可変ドメイン又はその抗原結合断片を含むか、又はこれから本質的に成る、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の化合物又は構築物。
【請求項２２】
少なくとも１つの治療部が好ましくは、（単一）ドメイン抗体、「ｄＡｂ」又はナノボディ（登録商標）を含むか、又はこれから本質的に成る、請求項１４に記載の化合物又は構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清タンパク質と結合することが可能なアミノ酸配列；このようなアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的に成るペプチド；このようなアミノ酸配列を含む化合物及び構築物（例えば融合タンパク質及びポリペプチド）；このようなアミノ酸配列、ペプチド、融合タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸；このようなアミノ酸配列、ペプチド、構築物、化合物、融合タンパク質又はポリペプチドを含む、組成物、特に医薬組成物；並びにこのようなアミノ酸配列、ペプチド、構築物、化合物、融合タンパク質又はポリペプチドの使用に関する。
【０００２】
本発明の他の態様、実施の形態、利点及び用途が本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
【背景技術】
【０００３】
「血清タンパク質と結合することが可能なペプチド（Peptides capable of binding to serum proteins）」と題された事前発行されていない（non-prepublished）特許文献１は、血清タンパク質と結合することが可能なペプチドを生成する方法であって、該ペプチドはその半減期を増大させるために、治療部（moiety）、化合物、タンパク質又は他の治療実体（entity）と連結又は融合することができる、方法を説明している。
【０００４】
また特許文献１は、ヒト血清アルブミンと結合することが可能であり、その半減期を増大させるために治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体と連結又は融合することができる特定のアミノ酸配列を数多く説明している。これらのアミノ酸配列には、特許文献１において「１７Ｄ１２」と呼ばれ、特許文献１で配列番号３として挙げられるアミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６３３４８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）と比較して血清アルブミンとの結合が改善されたアミノ酸配列を提供することである。特に本発明の目的は、
アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと（本明細書中で規定するように）結合する、及び／又は
ヒト血清アルブミンと（本明細書中で規定するように）特異的に結合することができ、また少なくとも１つの他の種の哺乳動物由来の血清アルブミン（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、又はヒヒ若しくはアカゲザル等の霊長類種由来の血清アルブミン）とも特異的に結合することができ、特にヒト血清アルブミン及びカニクイザル由来の血清アルブミンと特異的に結合することができる、及び／又は
（ヒト）血清アルブミンと結合することができ、アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）と比較して薬学的使用に関する他の特性の改善、例えば安定性の改善、プロテアーゼ耐性の改善等を有する、及び／又は
治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体と連結又は融合した場合、（同じ治療剤（therapeutic）と連結又は融合した場合）配列番号１のアミノ酸配列より大きい血清半減期又は他の薬理学的に関連のある特性の増大を与える、
アミノ酸配列を提供することである。
【０００７】
本発明の目的は、得られた化合物又は構築物が、アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）を含有する、対応する化合物又は構築物と比較して改善した半減期を有するように、治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体と連結又は融合することができるアミノ酸配列を提供することでもある。
【０００８】
本発明の目的は、特許文献１に記載の血清タンパク質結合アミノ酸配列の代替物、特に改善された代替物である、アミノ酸配列を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
概して本発明は、本明細書中に記載のアミノ酸配列を提供することによりこの目的を達成している。これらのアミノ酸配列は、血清アルブミン（特にヒト血清アルブミン）と結合する（特に本明細書中で規定のように特異的に結合する）ことができ、かつその半減期を増大させるために、治療化合物（例えば治療タンパク質又はポリペプチド）と連結又は融合する小ペプチド又はペプチド部として使用することができる。これらのアミノ酸配列（本明細書中において「本発明のアミノ酸配列」とも称される）は本明細書中でさらに規定されるようなものである。
【００１０】
したがって第１の態様によれば、本発明は、
ａ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）との、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％ではあるが、１００％ではない配列同一性（本明細書中で規定する）を有し、
ｂ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合する、アミノ酸配列に関する。
【００１１】
本発明の別の態様は、
ａ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）との、９個以下、好ましくは８個以下、特に７個以下、例えば６個、５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸差異（本明細書中で規定する）を有し、
ｂ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合する、アミノ酸配列に関する。
【００１２】
さらに別の態様において本発明は、
ａ）ＤＹＤＶ（配列番号１１６）、ＹＤＶＦ（配列番号１１７）、ＤＶＦＧ（配列番号１１８）、ＶＦＧＧ（配列番号１１９）、ＦＧＧＧ（配列番号１２０）及び／又はＧＧＧＴ（配列番号１２１）の配列モチーフを１つ又は複数含有し、
ｂ）全長が５アミノ酸残基〜５０アミノ酸残基、好ましくは７アミノ酸残基〜４０アミノ酸残基、より好ましくは１０アミノ酸残基〜３５アミノ酸残基、例えば約１５アミノ酸残基、２０アミノ酸残基、２５アミノ酸残基又は３０アミノ酸残基であり、
ｃ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合し、
該アミノ酸配列が配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）ではない、アミノ酸配列に関する。
【００１３】
さらに別の態様において本発明は、
ａ）ＤＹＤＶＦ（配列番号１２２）、ＹＤＶＦＧ（配列番号１２３）、ＤＶＦＧＧ（配列番号１２４）、ＶＦＧＧＧ（配列番号１２５）及び／又はＦＧＧＧＴ（配列番号１２６）の配列モチーフを１つ又は複数含有し、
ｂ）全長が５アミノ酸残基〜５０アミノ酸残基、好ましくは７アミノ酸残基〜４０アミノ酸残基、より好ましくは１０アミノ酸残基〜３５アミノ酸残基、例えば約１５アミノ酸残基、２０アミノ酸残基、２５アミノ酸残基又は３０アミノ酸残基であり、
ｃ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合し、
該アミノ酸配列が配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）ではない、アミノ酸配列に関する。好ましくは、このようなアミノ酸配列は本明細書中でさらに記載されるようなものである。
【００１４】
さらに別の態様において本発明は、
ａ）ＤＹＤＶＦＧ（配列番号１２７）、ＹＤＶＦＧＧ（配列番号１２８）、ＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）及び／又はＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３０）の配列モチーフを１つ又は複数含有し、
ｂ）全長が６アミノ酸残基〜５０アミノ酸残基、好ましくは７アミノ酸残基〜４０アミノ酸残基、より好ましくは１０アミノ酸残基〜３５アミノ酸残基、例えば約１５アミノ酸残基、２０アミノ酸残基、２５アミノ酸残基又は３０アミノ酸残基であり、
ｃ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合し、
該アミノ酸配列が配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）ではない、アミノ酸配列に関する。好ましくは、このようなアミノ酸配列は本明細書中でさらに記載されるようなものである。
【００１５】
さらに別の態様において本発明は、
ａ）ＤＹＤＶＦＧＧ（配列番号１３１）、ＹＤＶＦＧＧＧ（配列番号１３２）及び／又はＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）の配列モチーフを１つ又は複数含有し、
ｂ）全長が７アミノ酸残基〜５０アミノ酸残基、好ましくは８アミノ酸残基〜４０アミノ酸残基、より好ましくは１０アミノ酸残基〜３５アミノ酸残基、例えば約１５アミノ酸残基、２０アミノ酸残基、２５アミノ酸残基又は３０アミノ酸残基であり、
ｃ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合し、
該アミノ酸配列が配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）ではない、アミノ酸配列に関する。好ましくは、このようなアミノ酸配列は本明細書中でさらに記載されるようなものである。
【００１６】
さらに別の態様において本発明は、
ａ）ＤＹＤＶＦＧＧＧ（配列番号１３４）及び／又はＹＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３５）の配列モチーフを１つ又は複数含有し、
ｂ）全長が８アミノ酸残基〜５０アミノ酸残基、好ましくは９アミノ酸残基〜４０アミノ酸残基、より好ましくは１０アミノ酸残基〜３５アミノ酸残基、例えば約１５アミノ酸残基、２０アミノ酸残基、２５アミノ酸残基又は３０アミノ酸残基であり、
ｃ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合し、
該アミノ酸配列が配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）ではない、アミノ酸配列に関する。好ましくは、このようなアミノ酸配列は本明細書中でさらに記載されるようなものである。
【００１７】
さらに別の態様において本発明は、
ａ）ＤＹＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３６）の配列モチーフを含有し、
ｂ）全長が９アミノ酸残基〜５０アミノ酸残基、好ましくは９アミノ酸残基〜４０アミノ酸残基、より好ましくは１０アミノ酸残基〜３５アミノ酸残基、例えば約１５アミノ酸残基、２０アミノ酸残基、２５アミノ酸残基又は３０アミノ酸残基であり、
ｃ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合し、
該アミノ酸配列が配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）ではない、アミノ酸配列に関する。好ましくは、このようなアミノ酸配列は本明細書中でさらに記載されるようなものである。
【００１８】
本発明のアミノ酸配列（本明細書中にさらに記載される）は好ましくは（少なくとも）、
（ｉ）Ａｒｇ（Ｒ）残基、特にヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能な、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４残基及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖の酸素原子と静電相互作用を形成することが可能なＡｒｇ（Ｒ）残基、及び／又は
（ｉｉ）Ｔｒｐ（Ｗ）残基、特にヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能なＴｒｐ（Ｗ）残基、及び／又は
（ｉｉｉ）配列モチーフＧＧＧ、
並びに好ましくは（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくともいずれか２つ、より好ましくは３つ全てを含有する。
【００１９】
本発明のアミノ酸配列（本明細書中にさらに記載される）は好ましくは（少なくとも）、
（ｉ）配列モチーフＲＸＷＤ（モチーフ内、Ｘは任意のアミノ酸配列であり得るが、好ましくはＷ、Ｙ、Ｆ、Ｓ又はＤである）、及び／又は
（ｉｉ）配列モチーフＧＧＧ、好ましくは配列モチーフＦＧＧＧ、より好ましくは配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）、
並びに最も好ましくはこれらの配列モチーフ（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含有する。
【００２０】
配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）の代わりとして、本発明の好ましいアミノ酸配列は例えば、配列モチーフＤＡＦＧＧＧ（配列番号１９２）を含有してもよい。また、配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）の代わりとして、本発明の好ましいアミノ酸配列は例えば、配列モチーフＤＶＦＧＧＧＳ（配列番号１９３）又はＤＡＦＧＧＧＴ（配列番号１９４）を含有してもよい。本発明のアミノ酸配列に存在し得る他の同様の配列モチーフが本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかである（例えば表ＩＩ及び表Ｖで言及される配列）。
【００２１】
したがって別の態様において本発明は、
ａ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）との、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％ではあるが、１００％ではない配列同一性（本明細書中で規定する）を有し、
ｂ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合し、
ｃ）Ａｒｇ（Ｒ）残基、特にヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能な、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４残基及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖の酸素原子と静電相互作用を形成することが可能なＡｒｇ（Ｒ）残基を含む、アミノ酸配列に関する。
【００２２】
このアミノ酸配列は好ましくは、（ｉ）配列モチーフＲＸＷＤ（モチーフ内、Ｘは任意のアミノ酸配列であり得るが、好ましくはＷ、Ｙ、Ｆ、Ｓ又はＤである）、及び／又は（ｉｉ）配列モチーフＧＧＧ、好ましくは配列モチーフＦＧＧＧ、より好ましくは配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）、並びに最も好ましくはこれらの配列モチーフの両方をも含む。
【００２３】
上記のアミノ酸配列は本明細書中でさらに記載されるようなものであるのも好ましい。
【００２４】
別の態様において本発明は、
ａ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）との、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％ではあるが、１００％ではない配列同一性（本明細書中で規定する）を有し、
ｂ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合し、
ｃ）Ｔｒｐ（Ｗ）残基、特にヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能なＴｒｐ（Ｗ）残基を含む、アミノ酸配列に関する。
【００２５】
このアミノ酸配列は好ましくは、（ｉ）配列モチーフＲＸＷＤ（モチーフ内、Ｘは任意のアミノ酸配列であり得るが、好ましくはＷ、Ｙ、Ｆ、Ｓ又はＤである）、及び／又は（ｉｉ）配列モチーフＧＧＧ、好ましくは配列モチーフＦＧＧＧ、より好ましくは配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）、並びに最も好ましくはこれらの配列モチーフの両方をも含む。
【００２６】
上記のアミノ酸配列は本明細書中でさらに記載されるようなものであるのも好ましい。
【００２７】
別の態様において本発明は、
ａ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）との、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％ではあるが、１００％ではない配列同一性（本明細書中で規定する）を有し、
ｂ）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合し、
ｃ）Ａｒｇ（Ｒ）残基、特にヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能な、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４残基及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖の酸素原子と静電相互作用を形成することが可能なＡｒｇ（Ｒ）残基を含み、
ｄ）Ｔｒｐ（Ｗ）残基、特にヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能なＴｒｐ（Ｗ）残基を含む、アミノ酸配列に関する。
【００２８】
このアミノ酸配列は好ましくは、（ｉ）配列モチーフＲＸＷＤ（モチーフ内、Ｘは任意のアミノ酸配列であり得るが、好ましくはＷ、Ｙ、Ｆ、Ｓ又はＤである）、及び／又は（ｉｉ）配列モチーフＧＧＧ、好ましくは配列モチーフＦＧＧＧ、より好ましくは配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）、並びに最も好ましくはこれらの配列モチーフの両方をも含む。
【００２９】
上記のアミノ酸配列は本明細書中でさらに記載されるようなものであるのも好ましい。
【００３０】
幾つかの好ましいが非限定的な本発明のアミノ酸配列に存在し得る配列モチーフは以下の通りである：
アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７１）（配列中、（Ｎ末端から見て）１番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ、Ｓ又はＤから選択され、２番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ又はＦから選択される）、
アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１７２）（配列中、（Ｎ末端から見て）１番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ、Ｓ又はＤから選択され、２番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ又はＦから選択される）、
アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１７３）（配列中、（Ｎ末端から見て）１番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ、Ｓ又はＤから選択され、２番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ又はＦから選択される）、
アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴＰＧ（配列番号１７４）（配列中、（Ｎ末端から見て）１番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ、Ｓ又はＤから選択され、２番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ又はＦから選択される）、
アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴＰＧＧ（配列番号１７５）（配列中、（Ｎ末端から見て）１番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ、Ｓ又はＤから選択され、２番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ又はＦから選択される）、
ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７６）、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７７）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７８）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７９）から選択される、特にＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７７）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７８）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７９）から選択されるアミノ酸配列、
ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８０）、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８１）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８２）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８３）から選択される、特にＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８１）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８２）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８３）から選択されるアミノ酸配列、
ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８４）、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８５）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８６）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８７）から選択される、特にＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８５）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８６）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８７）から選択されるアミノ酸配列、
ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１８８）、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１８９）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１９０）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１９１）から選択される、特にＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１８９）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１９０）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１９１）から選択されるアミノ酸配列。
【００３１】
本発明との関連では、本発明のアミノ酸配列は、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン又は別の種の哺乳動物由来の血清アルブミン、例えばカニクイザルの血清アルブミン）と、
配列番号１のアミノ酸配列より高い特異性で上記血清アルブミンと結合する場合、及び／又は
配列番号１のアミノ酸配列より高い親和性（本明細書中で規定されるようなものであり、ＫＤ、ＫＡ、ｋｏｎ又はｋｏｆｆ速度として表され、本明細書中に記載の方法の１つを使用して求められる）で、上記血清アルブミンと結合する場合、及び／又は
以下の実施例２に記載のファージ−ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、配列番号１のアミノ酸配列よりも強く上記血清アルブミンと結合する場合、及び／又は
以下の実施例３に記載の溶液結合競合（solution binding competition）ＥＬＩＳＡにおいて、配列番号１のアミノ酸配列より良好に上記血清アルブミンと結合する場合、
以下の実施例５に記載の溶液結合競合ＥＬＩＳＡにおいて、配列番号１のアミノ酸配列より良好に上記血清アルブミンと結合する場合、
配列番号１のアミノ酸配列（即ち同程度のコンカテマーの形態で使用する場合）より高い結合活性（avidity：結合力）で、上記血清アルブミンと結合する場合（即ち本発明のアミノ酸配列をコンカテマーとして使用する場合）、及び／又は
上記の本発明のアミノ酸配列を１つ又は複数含む本発明の化合物（本明細書中で規定する）が、配列番号１のアミノ酸配列を１つ又は複数含む、対応する本発明の化合物より高い特異性、親和性及び／又は結合活性で上記血清アルブミンと結合する場合（例えば実施例６で使用されるビアコア（商標）測定を使用して求められる）、
配列番号１のアミノ酸配列より「良好に結合する」と考えられる。例示的なものであり、これに限定されないが、関連のあるアミノ酸配列が（任意で好適なリンカーを介して）ナノボディ２Ｄ３（配列番号１３７）と融合した融合タンパク質が、ナノボディ２Ｄ３が（任意で同じ好適なリンカーを介して）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）と融合した対応する融合タンパク質より高い特異性、親和性及び／又は結合活性で血清アルブミンと結合する場合（例えば実施例６で使用されるビアコア測定（商標）を使用して求められる）、本発明のアミノ酸配列は血清アルブミンとより良好に結合するといえる。この比較のために、関連のあるアミノ酸配列及びアミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）は例えば（これに限定されないが）２Ｄ３のＣ末端と（任意で同じ好適なリンカーを介して）連結し得る。それらの具体的であるが非限定的な例としては、配列番号１３９で与えられる２Ｄ３−５６Ｈ５融合タンパク質に対応する融合タンパク質（ここではアミノ酸配列５６Ｈ５が関連のあるアミノ酸配列で置き換わっている）の血清アルブミンに関する特異性、親和性及び／又は結合活性を、配列番号１３８で与えられる、対応する融合タンパク質２Ｄ３−１７Ｄ１２の血清アルブミンに関する特異性、親和性及び／又は結合活性と比較し得る（例えば実施例６で使用されるビアコア（商標）測定を使用して求められる）。
【００３２】
特に、本明細書中に記載の「結合（binding）」は、実施例３若しくは実施例９に記載の溶液結合競合アッセイを使用して、又は実施例７若しくは実施例１０に記載のように、ナノボディ２Ｄ３との融合体としてアミノ酸配列が表される場合、これらの実施例に記載のビアコアアッセイで求めることができる。
【００３３】
好ましくは本発明のアミノ酸配列は、本発明のアミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）と同様に良好に、又は好ましくは本発明のアミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）より良好にヒト血清アルブミンと結合するようなものである。このため、このような本発明のアミノ酸配列は例えば、本発明のアミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）、又はアミノ酸配列５６Ｅ４と同様に良好に、若しくは好ましくはアミノ酸配列５６Ｅ４より良好にヒト血清アルブミンと結合するようなものであるアミノ酸配列５６Ｅ４の変異型、例えばアミノ酸配列５６Ｅ４の親和性成熟型であり得る。このような本発明のアミノ酸配列の好ましいが、非限定的な例の幾つかが実施例９及び表Ｖで与えられ、アミノ酸配列５９Ｅ４（配列番号１４）、５９Ａ５（配列番号１４７）、５９Ｃ８（配列番号１４８）、５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｂ３（配列番号１５０）、５９Ｂ２（配列番号１５１）、６０Ｅ６（配列番号１５２）、６０Ｆ１（配列番号１５３）、６０Ｇ５（配列番号１５４）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）、５９Ｃ２（配列番号１５６）及び５９Ｈ１０（配列番号１５７）を含み、その中でも５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｃ２（配列番号１５６）及び５９Ｈ１２（配列番号１５５）が特に好ましい。
【００３４】
このため別の態様において本発明は、
ａ）配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）であるか、又は
ｂ）アミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）との、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％又は少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は
ｃ）アミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）との、６個以下、好ましくは５個以下、特に４個以下、例えば３個、２個又は１個のアミノ酸差異（本明細書中で規定する）を有し、並びに好ましくは
ｄ）アミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）と同様に良好に、好ましくはアミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）より良好にヒト血清アルブミンと結合する、
アミノ酸配列に関する。
【００３５】
同様に、このようなアミノ酸配列はその最も広範な意味で本明細書で使用されるように、「本発明のアミノ酸配列」という用語の意味に包含され、本明細書でさらに記載されるようなものであるのが好ましい。このため例えばこのようなアミノ酸配列は好ましくは、（ｉ）Ａｒｇ（Ｒ）残基、特にヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能な、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４残基及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖の酸素原子と静電相互作用を形成することが可能なＡｒｇ（Ｒ）残基、及び／又は（ｉｉ）Ｔｒｐ（Ｗ）残基、特にヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能なＴｒｐ（Ｗ）残基、及び／又は（ｉｉｉ）配列モチーフＧＧＧ、並びに好ましくは（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくともいずれか２つ、より好ましくは３つ全てを含む。特にこのような本発明のアミノ酸配列は好ましくは（少なくとも）、（ｉ）配列モチーフＲＸＷＤ（モチーフ内、Ｘは任意のアミノ酸配列であり得るが、好ましくはＷ、Ｙ、Ｆ、Ｓ又はＤである）、及び／又は（ｉｉ）配列モチーフＧＧＧ、好ましくは配列モチーフＦＧＧＧ、より好ましくは配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）、並びに最も好ましくはこれらの配列モチーフ（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含有する。
【００３６】
別の態様において本発明は、
ａ）アミノ酸配列５９Ａ５（配列番号１４７）、５９Ｃ８（配列番号１４８）、５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｂ３（配列番号１５０）、５９Ｂ２（配列番号１５１）、６０Ｅ６（配列番号１５２）、６０Ｆ１（配列番号１５３）、６０Ｇ５（配列番号１５４）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）、５９Ｃ２（配列番号１５６）若しくは５９Ｈ１０（配列番号１５７）の１つであるか、又は
ｂ）アミノ酸配列５９Ａ５（配列番号１４７）、５９Ｃ８（配列番号１４８）、５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｂ３（配列番号１５０）、５９Ｂ２（配列番号１５１）、６０Ｅ６（配列番号１５２）、６０Ｆ１（配列番号１５３）、６０Ｇ５（配列番号１５４）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）、５９Ｃ２（配列番号１５６）及び／又は５９Ｈ１０（配列番号１５７）の少なくとも１つとの、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％又は少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は
ｃ）アミノ酸配列５９Ａ５（配列番号１４７）、５９Ｃ８（配列番号１４８）、５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｂ３（配列番号１５０）、５９Ｂ２（配列番号１５１）、６０Ｅ６（配列番号１５２）、６０Ｆ１（配列番号１５３）、６０Ｇ５（配列番号１５４）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）、５９Ｃ２（配列番号１５６）及び／又は５９Ｈ１０（配列番号１５７）の少なくとも１つとの、６個以下、好ましくは５個以下、特に４個以下、例えば３個、２個又は１個のアミノ酸差異（本明細書中で規定する）を有し、並びに好ましくは
ｄ）アミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）と同様に良好に、好ましくはアミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）より良好にヒト血清アルブミンと結合する、
アミノ酸配列に関する。
【００３７】
同様に、このようなアミノ酸配列はその最も広範な意味で本明細書で使用されるように、「本発明のアミノ酸配列」という用語の意味に包含され、本明細書でさらに記載されるようなものであるのが好ましい。
【００３８】
別の態様において本発明は、
ａ）アミノ酸配列５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）若しくは５９Ｃ２（配列番号１５６）の１つであるか、又は
ｂ）アミノ酸配列５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）及び／又は５９Ｃ２（配列番号１５６）の少なくとも１つとの、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％又は少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は
ｃ）アミノ酸配列５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）及び／又は５９Ｃ２（配列番号１５６）の少なくとも１つとの、６個以下、好ましくは５個以下、特に４個以下、例えば３個、２個又は１個のアミノ酸差異（本明細書中で規定する）を有し、並びに好ましくは
ｄ）アミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）と同様に良好に、好ましくはアミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）より良好にヒト血清アルブミンと結合する、
アミノ酸配列に関する。
【００３９】
同様に、このようなアミノ酸配列はその最も広範な意味で本明細書で使用されるように、「本発明のアミノ酸配列」という用語の意味に包含され、本明細書でさらに記載されるようなものであるのが好ましい。
【００４０】
別の態様によれば本発明は、アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）との、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％ではあるが、１００％ではない配列同一性（本明細書中で規定する）を有するアミノ酸配列であって、上記アミノ酸配列は、治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体と連結又は融合した場合、このようにして得られた本発明の化合物（本明細書中で規定する）が、上記治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体が配列番号１のアミノ酸配列と（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）連結又は融合した対応する化合物又は構築物より長い半減期（本明細書中で規定する）を有するようなものである、アミノ酸配列に関する。
【００４１】
さらに別の態様によれば本発明は、アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）との、９個以下、好ましくは８個以下、特に７個以下、例えば６個、５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸差異（本明細書中で規定する）を有するアミノ酸配列であって、ここで上記アミノ酸配列は、治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体と連結又は融合した場合、このようにして得られた本発明の化合物（本明細書中で規定する）が、上記治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体が配列番号１のアミノ酸配列と（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）連結又は融合した対応する化合物又は構築物より長い半減期（本明細書中で規定する）を有するようなものである、アミノ酸配列に関する。
【００４２】
本発明の他の態様、実施の形態、用途及び利点は本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
【００４３】
本発明のアミノ酸配列の代表的であるが、非限定的な例の幾つかが、表ＩＩにおいて配列番号２〜配列番号１１５で、及び以下の表Ｖにおいて配列番号１４７〜配列番号１５７で挙げられる（好ましい代表例の幾つかは太字体及び下線処理で印を付けている）。
【００４４】
本発明のアミノ酸配列の特に好ましい代表例の幾つかは、アミノ酸配列ＰＭＰ５６Ｇ１１（配列番号６８）、ＰＭＰ５６Ｅ４（配列番号１４）、ＰＭＰ５４Ｈ４（配列番号１０６）、ＰＭＰ５４Ｈ５（配列番号３３）、ＰＭＰ５６Ｈ１（配列番号３１）、ＰＭＰ５６Ｅ２（配列番号４７）、ＰＭＰ５６Ｇ３（配列番号３５）、ＰＭＰ５４Ｇ１（配列番号３８）、ＰＭＰ５６Ｆ１（配列番号３０）、ＰＭＰ５４Ｈ２（配列番号４０）、ＰＭＰ５６Ｈ９（配列番号１００）、ＰＭＰ５６Ｆ２（配列番号５１）、ＰＭＰ２６Ａ３（配列番号２６）及び０１Ｂ３（配列番号１１５）、特に５９Ｅ４（配列番号１４）、５９Ａ５（配列番号１４７）、５９Ｃ８（配列番号１４８）、５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｂ３（配列番号１５０）、５９Ｂ２（配列番号１５１）、６０Ｅ６（配列番号１５２）、６０Ｆ１（配列番号１５３）、６０Ｇ５（配列番号１５４）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）、５９Ｃ２（配列番号１５６）及び５９Ｈ１０（配列番号１５７）であり、その中でも５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｃ２（配列番号１５６）及び５９Ｈ１２（配列番号１５５）が特に好ましい。
【００４５】
概して本発明のアミノ酸配列は、得られる本発明のアミノ酸配列が（本明細書中で規定するように）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合するように、（本明細書中で提示の範囲（limit）全体内に）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）との１つ又は複数の「アミノ酸差異」（本明細書中で規定する）を含有する。
【００４６】
概して本明細書中で提示の範囲全体内に、このようなアミノ酸差異は、配列番号１の配列と比較して、１つ又は複数の位置で１つ又は複数のアミノ酸残基の（or）挿入、欠失又は置換を含み得る。通常、配列番号１の配列と比較して、本発明のアミノ酸配列は少なくとも１つのアミノ酸置換（本明細書中で言及されるようなもの）及び任意でまた１つ又は複数のアミノ酸挿入及び／又は１つ又は複数のアミノ酸欠失を含有する。
【００４７】
好適な置換、挿入及び／又は欠失（及びその組合せ）は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかであり、例えば配列番号２〜配列番号１１５及び配列番号１４７〜配列番号１５７の配列のアミノ酸配列に（特に配列番号２〜配列番号１１５のアミノ酸配列の１つである好ましいアミノ酸配列に、及び／又は配列番号１４７〜配列番号１５７のアミノ酸配列に）存在する１つ又は複数の置換、挿入及び／又は欠失、又はこれらの置換、挿入及び／又は欠失の任意の好適な組合せが挙げられる。この目的のために、配列番号１の配列アラインメント及び配列番号２〜配列番号１１５の配列が図１）及び表Ｖで与えられ、配列番号１４７〜配列番号１５７の配列が配列番号１４の配列と比較される。
【００４８】
本発明のアミノ酸配列に存在し得る可能性がある置換（配列番号１のアミノ酸配列と比較して）の好ましいが非限定的な例の幾つかが以下の表Ｉで挙げられる（本発明のアミノ酸配列は、本明細書中で提示の範囲内に１つ又は複数のさらなる好適なアミノ酸の置換、挿入又は欠失を含有することができることが理解される）。
【００４９】
最も好ましい本発明のアミノ酸配列では、最も好ましくは３位がＲであり、５位がＷであり（好ましくは６位のＤと組合せて）、好ましくは７位がＦであり（しかしＹ又はＷであってもよい）、１５位がＰであり、１６位がＶであることに留意されたい。
【００５０】
比較として、配列番号１の配列では、３位がＳであり、５位がＳであり、７位がＹであり、１５位がＤであり、１６位がＦである。
【００５１】
最も好ましい本発明のアミノ酸配列は配列番号１の配列と以下の残基を共有する：４位にＹ（ただし本発明の配列では、これはＦ、Ｗ、Ｓ又はＤであってもよい）、６位にＤ、８位〜１３位にＤＶＦＧＧＧモチーフ（ただし好ましい本発明の配列ではこれはＤＡＦＧＧＧであってもよい）、及び１４位にＴ、並びに１７位にＧ。
【００５２】
表Ｉ：本発明のアミノ酸配列に存在し得る可能性がある置換の例
【表１】
2011516603.tif 000002
【００５３】
任意で本明細書中の開示（例えば以下の表ＩＩ）に基づき、当業者は、限定的な試行錯誤により、例えば以下の実施例２及び／又は実施例３のアッセイを使用して、ヒト血清アルブミンとの結合に関して意図される置換、挿入及び／又は欠失を含む候補アミノ酸配列を試験することにより、他の（即ちさらなる）好適な置換、挿入及び／又は欠失（又はそれらの組合せ）を求めることもできる（それから任意で、上記候補アミノ酸配列を配列番号１のアミノ酸配列と、及び／又は配列番号２〜配列番号１１５及び／又は配列番号１４７〜配列番号１５７のアミノ酸配列の１つ又は複数と比較してもよい）。
【００５４】
同様にこのようなアミノ酸配列は本明細書中にさらに記載されるようなものであるのが好ましい。このため例えばこのようなアミノ酸配列は好ましくは、（ｉ）Ａｒｇ（Ｒ）残基、特にヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能な、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４残基及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖の酸素原子と静電相互作用を形成することが可能なＡｒｇ（Ｒ）残基、及び／又は（ｉｉ）Ｔｒｐ（Ｗ）残基、特にヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能なＴｒｐ（Ｗ）残基、及び／又は（ｉｉｉ）配列モチーフＧＧＧ、好ましくは（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の少なくともいずれか２つ、より好ましくは３つ全てを含む。特にこのような本発明のアミノ酸配列は好ましくは（少なくとも）、（ｉ）配列モチーフＲＸＷＤ（モチーフ内、Ｘは任意のアミノ酸配列であり得るが、好ましくはＷ、Ｙ、Ｆ、Ｓ又はＤである）、及び／又は（ｉｉ）配列モチーフＧＧＧ、並びに好ましくは配列モチーフＦＧＧＧ、より好ましくは配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）、並びに最も好ましくはこれらの配列モチーフ（ｉ）及び（ｉｉ）の両方を含有する。
【００５５】
概して、本発明のアミノ酸配列がアミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）と比較して１つ又は複数のアミノ酸置換を含有する場合、これらは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定する）又は非保存的アミノ酸置換であってもよい（好適な非保存的アミノ酸置換は概して、ヒト血清アルブミンとの結合を改善又はさらに改善する傾向にあることは当業者によって理解される）。
【００５６】
他の本発明のアミノ酸配列は、得られる本発明のアミノ酸配列が（本明細書中で規定するように）アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）より良好にヒト血清アルブミンと結合するように、配列番号２〜１１５及び／又は配列番号１４７〜配列番号１５７のアミノ酸配列の１つに好適なアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失（又はそれらの組合せ）を導入することにより提供され得る。同様に、これらは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定する）又は非保存的アミノ酸置換であってもよい（好適な保存的アミノ酸置換は概して、ヒト血清アルブミンとの有利な結合を確実に保持又はさらに改善させる傾向にあることは当業者によって理解される）。
【００５７】
本明細書中の開示から、本発明のアミノ酸配列は好ましくは、配列番号１の配列と比較して、４位、６位、７位、８位、９位、１０位、１２位、１３位、１４位若しくは１７位にアミノ酸の置換若しくは欠失を（好ましくは挿入も）含有しないか、又は配列番号１の配列と比較して限定数（即ち３個、２個又は好ましくは１個だけ）のアミノ酸の置換若しくは欠失しか含有しない（これらは好ましくは本明細書で規定のような保存的置換である）ことが明らかである。この理由は、実施例４に記載のアラニンスキャニング実験から、本発明の範囲からは排除されないが、アミノ酸の置換又は欠失の導入がヒト血清アルブミンとの結合を低減する危険性の増大を伴い得ることが明らかになっているためである。
【００５８】
好ましいが非限定的な別の態様において、本発明のアミノ酸配列は好ましくは少なくとも１つのプロリン残基、例えば１つ、２つ、３つ又は４つのプロリン残基を含有する。特に、本発明のアミノ酸配列は、１位、２位、３位、５位、１１位、１５位、１６位又は１８位（特に３位、５位、１５位、１６位及び／又は１８位）の１つ又は複数（例えば任意の１つ、２つ、３つ又は４つ）にプロリン残基を含有し得る。プロリン残基はこれらの位置に隣接して又はこれらの位置の近くに挿入してもよい。
【００５９】
好ましいが非限定的な一態様によれば、本発明のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、以下のアミノ酸置換の１つ又は複数（例えばいずれか２つ、いずれか３つ、いずれか４つ又は５つ全て）を含み得る：
配列番号１の３位のセリン残基（Ｓ）がアルギニン（Ｒ）、プロリン（Ｐ）、芳香族アミノ酸残基（Ｆ、Ｙ、Ｗ又はＨ、特にＦ、Ｙ又はＷ）又は疎水性アミノ酸残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＭ）から選択されるアミノ酸残基で置き換わっており、及び／又は
配列番号１の５位のセリン残基（Ｓ）がアルギニン（Ｒ）、プロリン（Ｐ）又は芳香族アミノ酸残基（Ｆ、Ｙ、Ｗ又はＨ、特にＦ、Ｙ又はＷ）から選択されるアミノ酸残基で置き換わっており、及び／又は
配列番号１の１５位のアスパラギン酸残基（Ｄ）がプロリン（Ｐ）又は低分子アミノ酸残基（Ａ、Ｇ、Ｓ又はＴ）から選択されるアミノ酸残基で置き換わっており、及び／又は
配列番号１の１６位のフェニルアラニン残基（Ｆ）がプロリン（Ｐ）、疎水性アミノ酸残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＭ）又は低分子アミノ酸残基（Ａ、Ｇ、Ｓ又はＴ）で置き換わっており、及び／又は
配列番号１の１８位のプロリン残基（Ｐ）が維持されているか、又は（部分的に）負に荷電したアミノ酸残基（Ｄ、Ｅ、Ｑ又はＮ）若しくは低分子アミノ酸残基（Ａ、Ｇ、Ｓ又はＴ）で置き換わっており、並びに
任意で１つ又は複数のさらなる好適なアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換（本明細書中でさらに記載される）。
【００６０】
本発明のアミノ酸配列の特に好ましいサブクラスにおいて、配列番号１の３位のセリン残基（Ｓ）がアルギニン（Ｒ）で置き換わっている。これらのアミノ酸配列は、本明細書中で記載のように、１つ又は複数のさらなるアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換を含み得る。
【００６１】
特に３位にＲを有する本発明のアミノ酸配列では、
配列番号１の５位のセリン残基（Ｓ）がプロリン（Ｐ）又は芳香族アミノ酸残基（Ｆ、Ｙ、Ｗ又はＨ、特にＦ、Ｙ又はＷ）から選択されるアミノ酸残基で置き換わっており、及び／又は
配列番号１の１５位のアスパラギン酸残基（Ｄ）がプロリン（Ｐ）又は低分子アミノ酸残基（Ａ、Ｇ、Ｓ又はＴ）から選択されるアミノ酸残基で置き換わっており、及び／又は
配列番号１の１６位のフェニルアラニン残基（Ｆ）がプロリン（Ｐ）、疎水性アミノ酸残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ又はＭ）又は低分子アミノ酸残基（Ａ、Ｇ、Ｓ又はＴ）で置き換わっており、及び／又は
配列番号１の１８位のプロリン残基（Ｐ）が維持されているか、又は（部分的に）負に荷電したアミノ酸残基（Ｄ、Ｅ、Ｑ又はＮ）若しくは低分子アミノ酸残基（Ａ、Ｇ、Ｓ又はＴ）で置き換わっており、並びに
任意で１つ又は複数のさらなる好適なアミノ酸の挿入、欠失及び／又は置換（本明細書中でさらに記載のように）が含まれる。
【００６２】
本発明のアミノ酸配列内の好ましいアミノ酸配列の幾つかは、配列番号２〜配列番号１１５及び／又は配列番号１４７〜配列番号１５７のアミノ酸配列、又は配列番号２〜配列番号１１５及び／又は配列番号１４７〜配列番号１５７のアミノ酸配列の１つとの、３個以下、例えば３個、２個、又は１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である（ここで上記アミノ酸差異は好ましくは本発明のアミノ酸配列に関して概して本明細書中で記載のようなものである）。
【００６３】
本発明のアミノ酸配列内のより好ましいアミノ酸配列の幾つかは、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号６６、配列番号６８、配列番号８６、配列番号９４、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０３、配列番号１０６、配列番号１１１、配列番号１１５、特に配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６及び／又は配列番号１４７のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸配列の１つとの、３個以下、例えば３個、２個、又は１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である（ここで上記アミノ酸差異は好ましくは本発明のアミノ酸配列に関して概して本明細書中で記載のようなものである）。
【００６４】
本発明のアミノ酸配列内の特に好ましいアミノ酸配列の幾つかは、アミノ酸配列ＰＭＰ５６Ｇ１１（配列番号６８）、ＰＭＰ５６Ｅ４（配列番号１４）、ＰＭＰ５４Ｈ４（配列番号１０６）、ＰＭＰ５４Ｈ５（配列番号３３）、ＰＭＰ５６Ｈ１（配列番号３１）、ＰＭＰ５６Ｅ２（配列番号４７）、ＰＭＰ５６Ｇ３（配列番号３５）、ＰＭＰ５４Ｇ１（配列番号３８）、ＰＭＰ５６Ｆ１（配列番号３０）、ＰＭＰ５４Ｈ２（配列番号４０）、ＰＭＰ５６Ｈ９（配列番号１００）、ＰＭＰ５６Ｆ２（配列番号５１）、ＰＭＰ２６Ａ３（配列番号２６）又は０１Ｂ３（配列番号１１５）、特に５９Ｅ４（配列番号１４）、５９Ａ５（配列番号１４７）、５９Ｃ８（配列番号１４８）、５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｂ３（配列番号１５０）、５９Ｂ２（配列番号１５１）、６０Ｅ６（配列番号１５２）、６０Ｆ１（配列番号１５３）、６０Ｇ５（配列番号１５４）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）、５９Ｃ２（配列番号１５６）及び５９Ｈ１０（配列番号１５７）（その中でも５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｃ２（配列番号１５６）及び５９Ｈ１２（配列番号１５５）が特に好ましい）、又はこれらのアミノ酸配列の１つとの、３個以下、例えば３個、２個、又は１個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である（ここで上記アミノ酸差異は好ましくは本発明のアミノ酸配列に関して概して本明細書中で記載のようなものである）。
【００６５】
好ましくは、本発明のアミノ酸配列は全長が９アミノ酸残基〜２７アミノ酸残基、例えば１２アミノ酸残基〜２４アミノ酸残基、例えば１５アミノ酸残基〜２１アミノ酸残基、例えば１６アミノ酸残基、１７アミノ酸残基、１８アミノ酸残基、１９アミノ酸残基又は２０アミノ酸残基）である。
【００６６】
本発明のアミノ酸配列は、アミノ酸配列がＣ末端、Ｎ末端又はその両方で（例えば１０アミノ酸残基以下、好ましくは５アミノ酸残基以下の）小隣接配列と連結するペプチドの形態で提供及び／又は使用することもできる。これらは例えば、本発明のアミノ酸配列（又は上記アミノ酸配列が存在する本発明の化合物）が対応するヌクレオチド配列の発現により得られているために存在し得る（ここで本発明のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、制限部位をコードする又はクローニング部位の一部を形成する（発現ペプチドにおいて隣接配列（複数可）の存在をもたらす）小ヌクレオチド配列が前に（即ち５’末端側に）及び／又は後に（即ち３’末端側に）ある）。このような隣接配列の例はアミノ酸配列ＧＳＡ及びＡＡＡである。
【００６７】
本明細書中に記載のアミノ酸配列は、「非拘束（non-constrained）」型（即ち、ジスルフィド架橋を全く含まない）で血清アルブミンと結合することができ、またこのような非拘束型で有利に使用することができる。しかしながら本明細書中で記載のアミノ酸配列が「拘束（constrained）」型、例えば本発明のアミノ酸配列が間にジスルフィド架橋を形成することができる２つの隣接配列と隣接するペプチドの形態で与えられる、及び／又は使用されることが本発明の範囲内に含まれる（それらのさらなる説明に関しては、特許文献１を参照する）。
【００６８】
本発明のアミノ酸配列は好ましくは、血清アルブミン分子の半減期が（有意に）低減しないように、血清アルブミン（特にヒト血清アルブミン）と結合するようなものである。
【００６９】
好ましくは、本発明のアミノ酸配列は、血清アルブミン又はその少なくとも１つの部分、断片、エピトープ若しくはドメイン；特に、ヒト血清アルブミン又はその少なくとも１つの部分、断片、エピトープ若しくはドメインと結合する。本発明のアミノ酸配列が（ヒト）血清アルブミンと結合する場合、（ヒト）血清アルブミンとＦｃＲｎとの結合に関与しない血清アルブミン上のアミノ酸残基；及び／又は（ヒト）血清アルブミンのドメインＩＩＩの部分を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基と結合可能であることが好ましい。国際公開第０６／０１２２７８７号パンフレットを参照する。
【００７０】
概して本発明のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列より良好にヒト血清アルブミンと結合するようなものである。好ましくは本発明のアミノ酸配列は、配列番号１４のアミノ酸配列と同様に良好に、又は配列番号１４のアミノ酸配列より良好にヒト血清アルブミンと結合するようなものである。言及されるように、本明細書中に記載の「結合」は、特に、実施例３若しくは実施例９に記載の溶液結合競合アッセイを使用して、又は実施例７若しくは実施例１０に記載のように、ナノボディ２Ｄ３との融合体としてアミノ酸配列が発現される場合、これらの実施例に記載のビアコアアッセイで求めることができる。
【００７１】
好ましくは本明細書中に記載の任意の本発明のアミノ酸配列の全長が５アミノ酸残基〜５０アミノ酸残基、好ましくは７アミノ酸残基〜４０アミノ酸残基、より好ましくは１０アミノ酸残基〜３５アミノ酸残基、例えば約１５アミノ酸残基、２０アミノ酸残基、２５アミノ酸残基又は３０アミノ酸残基である。
【００７２】
また好ましくは、本発明のアミノ酸配列は、治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体と連結又は融合した場合、このようにして得られた本発明の化合物（本明細書中で規定する）が、上記治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体が配列番号１のアミノ酸配列と（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）連結又は融合した対応する化合物又は構築物より長い半減期（本明細書中で規定する）を有するようなものである。特に実施例６又は実施例１０に記載の方法で本発明のアミノ酸配列をナノボディ２Ｄ３と融合させ、その後実施例７又は実施例１３に記載のように薬物動態プロファイルを求めることにより、これを求めることができる。
【００７３】
特に、好ましい一態様において、本発明のアミノ酸配列は、治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体と連結又は融合した場合、このようにして得られた本発明の化合物（本明細書中で規定する）が、上記治療部、化合物、タンパク質又は他の治療実体が配列番号１４のアミノ酸配列（５６Ｅ４）と連結又は融合した対応する化合物若しくは構築物と同程度の、又は対応する化合物若しくは構築物より長い半減期（本明細書中で規定する）を有するようなものである。
【００７４】
本発明のアミノ酸配列は、ヒト以外の哺乳動物の少なくとも１種由来の血清アルブミンと交差反応性（本明細書中で規定する）である、特にカニクイザル由来の血清アルブミンと交差反応性であるのも好ましい。
【００７５】
概して本発明のアミノ酸配列は、ヒト血清アルブミンとの結合に関して、配列番号１のペプチド及び／又は配列番号１４のペプチドと競合するようなもの、及び／又は配列番号１のペプチド及び／又は配列番号１４のペプチドとヒト血清アルブミンとの結合を（本明細書中で規定するように）交差遮断するようなものであるのも好ましい。
【００７６】
本発明のアミノ酸配列は、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基（実施例８で示されるようにナンバリングする）：Ａｓｎ（Ｎ）１３３、Ｐｒｏ（Ｐ）１３４、Ａｓｎ（Ｎ）１３５、Ｌｅｕ（Ｌ）１３６、Ｌｅｕ（Ｌ）１３９、Ａｒｇ（Ｒ）１４１、Ｔｙｒ（Ｙ）１６２、Ｇｌｕ（Ｅ）１６５、Ｉｌｅ（Ｉ）１６６、Ｈｉｓ（Ｈ）１７０、Ｐｈｅ（Ｆ）１７３、Ｐｈｅ（Ｆ）１８１、Ｇｌｙ（Ｇ）２１３、Ｌｙｓ（Ｋ）２１４、Ｓｅｒ（Ｓ）２１７、Ｇｌｎ（Ｑ）４８３及び／又はＬｙｓ（Ｋ）５４３の１つ又は複数と結合することができるようなもの、及び／又は１つ又は複数のこれらのアミノ酸残基との結合に関して、配列番号１のアミノ酸配列及び／又は配列番号１４のアミノ酸配列と競合し得るようなもの、及び／又は配列番号１のアミノ酸配列及び／又は配列番号１４のアミノ酸配列と１つ又は複数のこれらのアミノ酸残基との結合を交差遮断することができるようなものであるのが好ましい。
【００７７】
より具体的には本発明のアミノ酸配列は、（ｉ）残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３、Ｐｒｏ（Ｐ）１３４、Ａｓｎ（Ｎ）１３５、Ｌｅｕ（Ｌ）１３６、Ｌｅｕ（Ｌ）１３９及びＡｒｇ（Ｒ）１４１を含むアミノ酸残基のストレッチ及び／又は（ｉｉ）残基Ｔｙｒ（Ｙ）１６２、Ｇｌｕ（Ｅ）１６５、Ｉｌｅ（Ｉ）１６６、Ｈｉｓ（Ｈ）１７０、Ｐｈｅ（Ｆ）１７３、Ｐｈｅ（Ｆ）１８１を含むアミノ酸残基のストレッチ及び／又は（ｉｉｉ）残基Ｇｌｙ（Ｇ）２１３、Ｌｙｓ（Ｋ）２１４及びＳｅｒ（Ｓ）２１７を含むアミノ酸残基のストレッチのいずれかを含むヒト血清アルブミン上のエピトープと結合することができるようなもの、及び／又はアミノ酸残基のこれらのストレッチの１つとの結合に関して、配列番号１のアミノ酸配列及び／又は配列番号１４のアミノ酸配列と競合し得るようなもの、及び／又は配列番号１のアミノ酸配列及び／又は配列番号１４のアミノ酸配列とアミノ酸残基のこれらのストレッチの１つ又は複数との結合を交差遮断することができるようなものであるのが好ましい。
【００７８】
さらにより具体的には、本発明のアミノ酸配列は、（数ある残基の中でも）残基Ｌｅｕ（Ｌ）１３９、Ｇｌｕ（Ｅ）１６５、Ｉｌｅ（Ｉ）１６６、Ｈｉｓ（Ｈ）１７０、Ｐｈｅ（Ｆ）１７３、Ｐｈｅ（Ｆ）１８１、Ｇｌｙ（Ｇ）２１３、Ｌｙｓ（Ｋ）２１４、Ｓｅｒ（Ｓ）２１７及びＧｌｎ（Ｑ）４８３を含むヒト血清アルブミン上で疎水性サブポケットと結合することができるようなもの、及び／又はこのサブポケットとの結合に関して、配列番号１のアミノ酸配列及び／又は配列番号１４のアミノ酸配列と競合し得るようなもの、及び／又は配列番号１のアミノ酸配列及び／又は配列番号１４のアミノ酸配列とこのサブポケットとの結合を交差遮断することができるようなものであるのが好ましい。
【００７９】
上記のペプチドは本明細書中でさらに記載されるようなものであり、例えば配列番号１のペプチドの親和性成熟変異型であり、特に配列番号１４のペプチドの親和性成熟変異型であり得る。
【００８０】
特定の一態様において、本発明は特許文献１の図４又は図８に言及されるアミノ酸配列を含まない。
【００８１】
本発明のアミノ酸配列（又は本明細書中でさらに記載のように、このようなアミノ酸配列を少なくとも１つ含む本発明の化合物）は、
１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの範囲の解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの範囲の結合定数（ＫＡ）で）、上記解離定数が、アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）がヒト血清アルブミンと結合する解離定数よりも良好である（即ち小さくなる／低くなる）ように、及び／又は
１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは１０３Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは１０４Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１（１０５Ｍ−１ｓ−１〜１０７Ｍ−１ｓ−１等）の範囲のｋｏｎ速度で、上記ｋｏｎ速度が、アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）がヒト血清アルブミンと結合するｋｏｎ速度よりも良好である（即ち高くなる）ように、及び／又は
１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）〜１０−６ｓ−１（ｔ１／２が数日である略不可逆的な複合体の場合）、好ましくは１０−２ｓ−１〜１０−６ｓ−１、より好ましくは１０−３ｓ−１〜１０−４ｓ−１（１０−４ｓ−１〜１０−６ｓ−１等）の範囲のｋｏｆｆ速度で、上記ｋｏｆｆ速度がアミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）がヒト血清アルブミンと結合するｋｏｆｆ速度よりも良好である（即ち高くなる）ように、
血清アルブミン、特にヒト血清アルブミンと結合することができるようなものであるのが好ましい。
【００８２】
好ましくは、本発明のアミノ酸配列（又は本明細書中にさらに記載のようなこのようなアミノ酸配列を１つ含む本発明の化合物）は、１０００ｎＭ未満、好ましくは５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性で、上記親和性がアミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）がヒト血清アルブミンと結合する親和性よりも良好である（即ち小さくなる／低くなる）ように、ヒト血清アルブミンと結合するようなものである。
【００８３】
本発明のアミノ酸配列（及び本明細書中に規定のように、これを含む本発明の化合物）は、アミノ酸配列（又は化合物）がヒトにおいてヒト血清アルブミンと結合する、又はそうでなくとも会合する場合、その血清半減期がヒトにおけるヒト血清アルブミンの天然半減期の少なくとも約５０％（例えば約５０％〜７０％）、好ましくは少なくとも６０％（例えば約６０％〜８０％）、又は好ましくは少なくとも７０％（例えば約７０％〜９０％）、より好ましくは少なくとも８０％（例えば約８０％〜９０％）、又は好ましくは少なくとも約９０％であるように、ヒト血清アルブミンと結合する、又はそうでなくとも会合するようなものであるのが好ましい。
【００８４】
本発明のアミノ酸配列は、（Ablynx N.V.の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０８５０号明細書に記載のように）条件付きで、即ち
ａ）解離定数（ＫＤ）が１０−５モル／Ｌ以下の第１の生物学的条件下でヒト血清アルブミン分子と結合するように、及び
ｂ）解離定数（ＫＤ）が、上記アミノ酸配列が上記第１の生物学的条件下で上記所望の分子と結合する解離定数と少なくとも１０倍異なる（特に上記アミノ酸配列が上記第１の生物学的条件下で上記所望の分子と結合する解離定数より１０倍大きい）第２の生物学的条件下でヒト血清アルブミンと結合するように、
血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン)と結合してもよく、ここで第１の生物学的条件及び第２の生物学的条件はAblynxN.V.の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０８５０号明細書に記載のようなものであり得る。特に、国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０８５０号明細書に記載のように、第１の生物学的条件及び第２の生物学的条件はｐＨに関して異なっていてもよく、上記第１の生物学的条件が７．０を超える生理学的ｐＨ、例えば７．１を超えるｐＨ又は７．２を超えるｐＨ、例えば７．２〜７．４の範囲のｐＨを含み、第２の生物学的条件が７．０未満の生理学的ｐＨ、例えば６．７未満のｐＨ又は６．５未満のｐＨ、例えば６．５〜６．０の範囲のｐＨを含み得る（又は逆もまた同様）。
【００８５】
しかしながら好ましくは、本発明のアミノ酸配列は、「本質的にｐＨに非依存的である」ように（Ablynx N.V.の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０６０８４９号明細書に記載のように、及び本明細書中でさらに規定のように）血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン）と結合し得る。
【００８６】
非限定的な一態様において、本発明のアミノ酸配列は、好ましくは少なくとも１つの他の種の哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、ラット、又は霊長類由来の血清アルブミンとの交差反応性がある（本明細書中で規定する）。特に、本発明のアミノ酸配列は、マカク属のサル（例えば、特に、カニクイザル（マカク・ファシクラリス（Macaca fascicularis））及び／又はアカゲザル（マカク・ムラタ（Macacamulatta）））及びヒヒ（パピオ・ウルジヌス（Papio ursinus））から成る群から選択される霊長類由来の血清アルブミン、好ましくは少なくともカニクイザル血清アルブミンと交差反応性があり得る。また、本発明のアミノ酸配列が、このような霊長類の種由来の血清アルブミンとの交差反応性がある場合、好ましくは、上記霊長類の血清アルブミン分子と結合又は会合した場合、その血清半減期が上記霊長類の上記血清アルブミンの天然の半減期の少なくとも約５０％（例えば、約５０％〜７０％）、好ましくは少なくとも約６０％（例えば、約６０％〜８０％）、又は好ましくは少なくとも約７０％（例えば、約７０％〜９０％）、より好ましくは少なくとも約８０％（例えば、約８０％〜９０％）、又は好ましくは少なくとも約９０％であるようなものである。
【００８７】
本発明は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列及び少なくとも１つの治療部を含む化合物又は構築物（本明細書で「本発明の化合物」とも称される）にも関する。これらの化合物又は構築物は本明細書中にさらに記載のようなものであってもよく、例えば任意で１つ又は複数の好適なリンカー又はスペーサーを介して、少なくとも１つの治療部と連結する少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的に成る、ポリペプチド又はタンパク質構築物であってもよい。このようなポリペプチド又はタンパク質構築物は例えば（これに限定されないが）、本明細書中でさらに記載のように融合タンパク質であってもよい。
【００８８】
このような本発明の化合物は、（本明細書で記載のように）任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して少なくとも１つの治療部と（任意で互いと）好適に連結して、本発明のアミノ酸配列を１つ、２つ、３つ又はそれ以上含有してもよい。また、本発明の化合物が本発明のアミノ酸配列を２つ、３つ又はそれ以上含む場合、これらは同じであっても又は異なっていてもよい。
【００８９】
特定の一態様において、このような本発明の化合物は、（本明細書で記載のように）任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して少なくとも１つの治療部と好適に連結して、本発明のアミノ酸配列を１つ含んでいてもよい。例えばこのような場合、治療部が（得られる本発明の化合物が融合タンパク質であるように）タンパク質又はポリペプチドであると、本発明のアミノ酸配列は、（同様に任意で好適なリンカーを介して）治療部のＣ末端又は治療部のＮ末端のいずれかと連結してもよい。
【００９０】
別の特定の態様において、このような本発明の化合物は、（本明細書で記載のように）任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して少なくとも１つの治療部と（任意で互いと）好適に連結して、本発明のアミノ酸配列を２つ含んでいてもよい。
【００９１】
より具体的に、このような本発明の化合物は、同様に任意で好適なリンカーを介してそれぞれ少なくとも１つの治療部と（即ち治療部の異なる結合部位で）好適に連結した本発明のアミノ酸配列を２つ含んでいてもよい。例えばこのような場合、治療部が（得られる本発明の化合物が融合タンパク質であるように）タンパク質又はポリペプチドであると、例えば本発明のアミノ酸配列の１つは、（同様に任意で好適なリンカーを介して）治療部のＣ末端と連結してもよく、本発明のアミノ酸配列の１つは、例えば（同様に任意で好適なリンカーを介して）治療部のＮ末端と連結してもよい。
【００９２】
代替的にこのような本発明の化合物は、「タンデムリピート」を形成するように、（同様に任意で好適なリンカーを介して）互いに連結する本発明のアミノ酸配列を２つ（又はそれ以上）含んでいてもよく、それからタンデムリピートは（同様に任意で好適なリンカーを介して）少なくとも１つの治療部と好適に連結し得る。例えばこのような場合、治療部が（得られる本発明の化合物が融合タンパク質であるように）タンパク質又はポリペプチドであると、２つ以上の本発明のアミノ酸配列のタンデムリピートは、（同様に任意で好適なリンカーを介して）治療部のＣ末端又は治療部のＮ末端のいずれかと連結してもよい。
【００９３】
２つ以上の本発明のアミノ酸配列と１つ又は複数の治療部との他の好適な組合せ（同様に任意で好適なリンカーを介して連結されている）は、本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかである。
【００９４】
別の態様において、本発明の化合物は、２つ以上の（例えば２つ、３つ又は４つの）治療部（同じであっても又は異なっていてもよい）、及び１つ又は複数の（例えば２つ、３つ、４つ又はそれ以上の）本発明のアミノ酸配列（同じであっても又は異なっていてもよい）を含み、２つ以上の（例えば２つ、３つ又は４つの）治療部及び／又は１つ又は複数の（例えば２つ、３つ、４つ又はそれ以上の）本発明のアミノ酸配列は、本発明の化合物を形成するように、（同様に任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して）互いに好適に連結し得る。例えばこのような本発明の化合物において、２つ以上の治療部が（同様に任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して）互いに好適に連結してもよく、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列（及び／又は本明細書中に記載のように、２つ以上の本発明のアミノ酸配列の１つ又は複数のタンデムリピート）が（同様に任意で１つ又は複数の好適なリンカーを介して）治療部のいずれか（又は全て）と連結してもよい。
【００９５】
またさらなる一態様において、２つ以上の治療部を互いに連結させるのに使用される、１つ又は複数のリンカーは本発明のアミノ酸配列を１つ又は複数含んでいてもよく、本発明のアミノ酸配列を１つ又は複数含むこのようなリンカー（任意に本発明のアミノ酸配列を互いに及び／又は１つ又は複数の治療部と連結させるために、さらなる連結アミノ酸配列を１つ又は複数含む）は本発明のさらなる一態様を形成する。
【００９６】
例えば、本発明の化合物が２つの治療部（同じであっても又は異なっていてもよい）を含む場合、上記の本発明の化合物の可能であるが非限定的な立体配置の例の幾つかは以下の通りである：
［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＡＡ］−［Ｌ］−［ＴＭ］
［ＡＡ］−［Ｌ］−［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＴＭ］
［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＡＡ］
［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＡＡ］−［Ｌ］−［ＡＡ］−［ＴＭ］
［ＡＡ］−［Ｌ］−［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＡＡ］
［ＡＡ］−［Ｌ］−［ＡＡ］−［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＴＭ］
［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＡＡ］−［ＡＡ］
［ＡＡ］−［Ｌ］−［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＡＡ］−［Ｌ］−［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＡＡ］
［ＡＡ］−［Ｌ］−［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＡＡ］−［Ｌ］−［ＡＡ］−［Ｌ］−［ＴＭ］−［Ｌ］−［ＡＡ］
ここで「［ＴＭ］」は治療部を表し、「［Ｌ］」はリンカー（それぞれの場合で任意である）を表し、「［ＡＡ］」は本発明のアミノ酸配列を表す。他の好適な立体配置は本明細書中の開示に基づき当業者にとって明らかである。同様にこれらの構築物では、２つ以上のリンカー及び／又は本発明のアミノ酸配列が存在する場合、これらは同じであっても異なっていてもよい。同様に治療部及びリンカーがタンパク質又は（ポリペプチド）である場合、上記の構築物は融合タンパク質又は融合構築物（例えば対応する核酸又はヌクレオチド配列の好適な発現により好適に得ることができる）であり得る。
【００９７】
別の態様において本発明は、本発明のアミノ酸配列を２つ以上（特に２つ又は３つ、好ましくは２つ）含むポリペプチド構築物であって、上記ポリペプチドに存在する２つ以上の本発明のアミノ酸配列は同じであっても、又は異なっていてもよく、２つ以上の本発明のアミノ酸配列は互いに直接連結していても、又は（本明細書中でさらに記載のように）好適なリンカーを介して互いに連結していてもよい、ポリペプチド構築物に関する。このような本発明の「タンデムリピート」構築物はまた、単一の本発明のアミノ酸配列と同じように１つ又は複数の治療部と連結していてもよい。幾つかの場合、タンデムリピートの使用は、（単一の本発明のアミノ酸配列の使用と比較して）ヒト血清アルブミンに対する親和性の（さらなる）改善、及び／又は（単一の本発明のアミノ酸配列を含む本発明の化合物と比較して）このようなタンデムリピートを含有する本発明の化合物に対する半減期の（さらなる）改善を提供し得る。このようなタンデムリピート、及びこのようなタンデムリピートを含む本発明の化合物の使用の非限定的な例は実施例１４で与えられる。また本明細書中で記載のように、このようなタンデムリピート構築物はリンカーとして使用してもよい。
【００９８】
このようなタンデムリピートは、好ましい本発明のアミノ酸配列、特に好ましくは全て本明細書中に記載のような（例えば）５６Ｅ４及び５９Ｈ１２、５９Ｆ２及び／又は５９Ｃ２等の５６Ｅ４の親和性成熟変異型のような本発明のアミノ酸配列を２つ以上含有するのが好ましい（同じであっても又は異なっていてもよい）。本発明は、このようなタンデムリピートを含む化合物及び構築物（同様に融合タンパク質であり得る）、このような融合タンパク質のこのようなタンデムリピートをコードするヌクレオチド配列又は核酸、並びに（例えば半減期を延長するため、及び／又はリンカーとしての）このようなタンデムリピートの使用にも関する。
【００９９】
このように別の態様において本発明は、本発明のアミノ酸配列を２つ以上（特に２つ又は３つ、好ましくは２つ）含むポリペプチド構築物であって、上記ポリペプチドに存在する２つ以上の本発明のアミノ酸配列は同じであっても、又は異なっていてもよく、２つ以上の本発明のアミノ酸配列は互いに直接連結していても、又は（本明細書中でさらに記載のように）好適なリンカーを介して互いに連結していてもよく、このポリペプチドに存在するアミノ酸配列がそれぞれ、
ａ）アミノ酸配列５９Ａ５（配列番号１４７）、５９Ｃ８（配列番号１４８）、５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｂ３（配列番号１５０）、５９Ｂ２（配列番号１５１）、６０Ｅ６（配列番号１５２）、６０Ｆ１（配列番号１５３）、６０Ｇ５（配列番号１５４）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）、５９Ｃ２（配列番号１５６）若しくは５９Ｈ１０（配列番号１５７）の１つであるか、又は
ｂ）アミノ酸配列５９Ａ５（配列番号１４７）、５９Ｃ８（配列番号１４８）、５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｂ３（配列番号１５０）、５９Ｂ２（配列番号１５１）、６０Ｅ６（配列番号１５２）、６０Ｆ１（配列番号１５３）、６０Ｇ５（配列番号１５４）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）、５９Ｃ２（配列番号１５６）及び／又は５９Ｈ１０（配列番号１５７）の少なくとも１つとの、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％又は少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は
ｃ）アミノ酸配列５９Ａ５（配列番号１４７）、５９Ｃ８（配列番号１４８）、５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｂ３（配列番号１５０）、５９Ｂ２（配列番号１５１）、６０Ｅ６（配列番号１５２）、６０Ｆ１（配列番号１５３）、６０Ｇ５（配列番号１５４）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）、５９Ｃ２（配列番号１５６）及び／又は５９Ｈ１０（配列番号１５７）の少なくとも１つとの、６個以下、好ましくは５個以下、特に４個以下、例えば３個、２個又は１個のアミノ酸差異（本明細書中で規定する）を有し、並びに好ましくは
ｄ）アミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）と同様に良好に、好ましくはアミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）より良好にヒト血清アルブミンと結合する、
ポリペプチド構築物に関する。
【０１００】
同様に、このようなタンデムリピートに存在するアミノ酸配列は本明細書にさらに記載されるようなものであってもよく、タンデムリピートは本明細書中に記載のように１つ又は複数の治療部と連結していてもよい。
【０１０１】
このため別の態様において本発明は、本発明のアミノ酸配列を２つ以上（特に２つ又は３つ、好ましくは２つ）含むポリペプチド構築物であって、上記ポリペプチドに存在する２つ以上の本発明のアミノ酸配列は同じであっても、又は異なっていてもよく、２つ以上の本発明のアミノ酸配列は互いに直接連結していても、又は（本明細書中でさらに記載のように）好適なリンカーを介して互いに連結していてもよく、このポリペプチドに存在するアミノ酸配列がそれぞれ、
ａ）アミノ酸配列５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）若しくは５９Ｃ２（配列番号１５６）の１つであるか、又は
ｂ）アミノ酸配列５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）及び／又は５９Ｃ２（配列番号１５６）の少なくとも１つとの、少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％又は少なくとも９０％の配列同一性を有し、及び／又は
ｃ）アミノ酸配列５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）及び／又は５９Ｃ２（配列番号１５６）の少なくとも１つとの、６個以下、好ましくは５個以下、特に４個以下、例えば３個、２個又は１個のアミノ酸差異（本明細書中で規定する）を有し、並びに好ましくは
ｄ）アミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）と同様に良好に、好ましくはアミノ酸配列ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ（５６Ｅ４、配列番号１４）より良好にヒト血清アルブミンと結合する、
ポリペプチド構築物に関する。
【０１０２】
同様に、このようなタンデムリピートに存在するアミノ酸配列は本明細書にさらに記載されるようなものであってもよく、タンデムリピートは本明細書中に記載のように１つ又は複数の治療部と連結していてもよい。
【０１０３】
本発明の化合物に存在する少なくとも１つの治療部は好ましくは、アミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的に成り、特に免疫グロブリン配列若しくはその抗原結合断片（例えば抗体若しくはその抗原結合断片）、例えば免疫グロブリン可変ドメイン若しくはその抗原結合断片（例えばＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＨＨドメイン若しくはその抗原結合断片）；又はこれを含むタンパク質又はポリペプチド（例えばｓｃＦｖ構築物）を含むか、又はこれから本質的に成り得る。このような構築物に関しては例えば、Holliger and Hudson, Nat Biotechnol. 2005 Sep; 23(9):1126-36による概説及びそこで言及されたさらなる従来技術を参照する。
【０１０４】
具体的ではあるが非限定的な一態様によれば、治療部は（単一）ドメイン抗体、「ｄＡｂ」又はナノボディ（登録商標）を含むか、又はこれから本質的に成る。
【０１０５】
１つ又は複数の治療部は、１つ又は複数の薬学的に関連のある標的に指向性を有する場合、それ自体が既知の任意の好適な標的に指向性を有し得る。例えば、治療部は、（単一）ドメイン抗体、「ｄＡｂ」又はナノボディ（登録商標）を含むか、又はこれから本質的に成る場合、例えばｄＡｂ又はナノボディ、ＩＧＮ−γ（例えば国際公開第０４／０４１８６３号パンフレットを参照されたい）、ＩｇＥ（例えば国際公開第０４／０４１８６７号パンフレットを参照されたい）、ＥＧＦＲ（例えば国際公開第０５／０４４８５８号パンフレット、国際公開第０７／０６６１０６号パンフレット又は国際公開第０７／０８０３９２号パンフレットを参照されたい）、ｖＷＦ（例えば国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット又は国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットを参照されたい）、ＩＧＦ−ＩＲ（例えば国際公開第０７／０４２２８９号パンフレットを参照されたい）、ＩＬ−６（例えば国際公開第０７／１１０２１９号パンフレットを参照されたい）、ＩＬ−６Ｒ（例えば国際公開第０８／０２００７９号パンフレットを参照されたい）、ＧＰＣＲ（例えば国際公開第０８／０７４８３９号パンフレットを参照されたい）、ケモカイン（例えば国際公開第０８／０７７９４５号パンフレットを参照されたい）、ＶＥＧＦ又はその受容体（例えば国際公開第０７／０８０３９２号パンフレット、国際公開第０８／１０１９８５号パンフレット、国際公開第０８／１４９１４７号パンフレット、国際公開第０８／１４９１４６号パンフレット又は国際公開第０８／１４９１５０号パンフレットを参照されたい）、ＲＡＮＫ−Ｌ（例えば国際公開第０８／１４２１６４号パンフレットを参照されたい）、ＩＬ−Ｒ１（例えば国際公開第０６／０５９１０８号パンフレット、国際公開第０７／０６３３１１号パンフレット、国際公開第０７／０６３３０８号パンフレット又は国際公開第０８／１４９１４９号パンフレットを参照されたい）、ＴＮＦ−Ｒ１（例えば国際公開第０６／０３８０２７号パンフレット、国際公開第０７／０４９０１７号パンフレット、国際公開第０８／１４９１４８号パンフレット又は国際公開第０８／１４９１４４号パンフレットを参照されたい）、ＩＬ−４又はＩＬ−１３（例えば国際公開第０７／０８５８１５号パンフレットを参照されたい）、ＣＤ４０Ｌ（例えば国際公開第０６／０３０２２０号パンフレットを参照されたい）であり得る。
【０１０６】
治療部は、既知の治療的及び／又は薬理的作用を伴う他のタンパク質又はペプチド、例示的なものであり、これに限定されないが、ＧＬＰ−１、インスリン、ＥＰＯ、ソマトロピン、インターフェロン、インターロイキン、及び癌療法に使用される（他の）サイトカイン及び／又はタンパク質薬物でもあり得る。
【０１０７】
本発明の化合物において、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列は少なくとも１つの治療部と直接連結していても、又は１つ又は複数の好適なリンカー若しくはスペーサーを介して少なくとも１つの治療部と連結していてもよい。好適なリンカーは、例えば本明細書中のさらなる開示に基づき、当業者にとって明らかである。幾つかの好ましいが非限定的なリンカーは、Ablynx N.V.の国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの１２７頁及び１２８頁で言及されるものであり、そこで言及される「ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー」を含む。
【０１０８】
１つ又は複数の治療部がアミノ酸配列である場合、リンカー又はスペーサーは好ましくは、得られる化合物又は構築物が（融合）タンパク質又は（融合）ポリペプチド（本明細書中で「本発明のポリペプチド」とも称される）から本質的に成るように、アミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的に成る。
【０１０９】
さらなる一態様において本発明は、アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）との、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、又は少なくとも９５％ではあるが、１００％ではない配列同一性（本明細書中で規定する）を有するアミノ酸配列を少なくとも１つ含む本発明の化合物（本明細書中でさらに規定する）であって、上記アミノ酸配列（複数可）の代わりにアミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）を含有する、対応する化合物より長い半減期（本明細書中で規定する）を有する、本発明の化合物に関する。好ましくは、このような化合物は、上記アミノ酸配列（複数可）の代わりにアミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）を含有する、対応する化合物と本質的に同じか、又は対応する化合物より長い半減期を有する。同様に、このような化合物に存在するアミノ酸配列（複数可）は本明細書中にさらに記載のようなものであってもよく、好ましいものとして本明細書中に記載される本発明のアミノ酸配列であるのが好ましい。
【０１１０】
さらなる一態様において本発明は、アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）との、１０個以下、好ましくは９個以下、より好ましくは８個以下、さらにより好ましくは７個以下、例えば６個、５個、４個、３個、２個又は１個のアミノ酸差異（本明細書中で規定する）を有するアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を少なくとも１つ含む本発明の化合物（本明細書中でさらに規定する）であって、上記アミノ酸配列（複数可）の代わりにアミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）を含有する、対応する化合物より長い半減期（本明細書中で規定する）を有する、本発明の化合物に関する。好ましくは、このような化合物は、上記アミノ酸配列（複数可）の代わりにアミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）を含有する、対応する化合物と本質的に同じか、又は対応する化合物より長い半減期を有する。同様に、このような化合物に存在するアミノ酸配列（複数可）は本明細書中にさらに記載のようなものであってもよく、好ましいものとして本明細書中に記載される本発明のアミノ酸配列であるのが好ましい。
【０１１１】
さらなる一態様において本発明は本発明のアミノ酸配列を少なくとも２つ含む本発明の化合物に関する。別の態様では本発明は、少なくとも２つの本発明のアミノ酸配列の少なくとも１つのタンデムリピート（本明細書中で規定する）を含む本発明の化合物に関する。好ましくは、上記本発明の化合物は、上記アミノ酸配列の代わりに同じ数のアミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）のコピーを含有する、対応する化合物より長い半減期（本明細書中で規定する）を有する。より好ましくはこのような化合物は、上記アミノ酸配列（複数可）の代わりに同じ数のアミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）のコピーを含有する、対応する化合物と本質的に同じか、又は対応する化合物より長い半減期を有する。同様に、このような化合物に存在するアミノ酸配列（複数可）は本明細書中にさらに記載のようなものであってもよく、好ましいものとして本明細書中に記載される本発明のアミノ酸配列であるのが好ましい。
【０１１２】
幾つかの本発明の他の態様は以下のペプチドに関する。同様に、このようなペプチドはその最も広範な意味で本明細書で使用されるように、「本発明のアミノ酸配列」という用語の意味に包含され、これらのペプチドは本発明のアミノ酸配列に関して本明細書中でさらに記載されるようなものであるのが好ましい。
【０１１３】
このため別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、（本明細書中で規定するように）アミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）より良好にＨＳＡと結合するペプチドに関する。
【０１１４】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、アミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）の親和性成熟変異型であるペプチドに関する。
【０１１５】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、Ａｒｇ（Ｒ）残基、及び配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）を含む、ペプチドに関する。
【０１１６】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能な、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４残基及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖の酸素原子と静電相互作用を形成することが可能なＡｒｇ（Ｒ）残基、並びに配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）を含む、ペプチドに関する。
【０１１７】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、Ｔｒｐ（Ｗ）残基、及び配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）を含む、ペプチドに関する。
【０１１８】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、ヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能なＴｒｐ（Ｗ）残基、及び配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）を含む、ペプチドに関する。
【０１１９】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、Ａｒｇ（Ｒ）残基、Ｔｒｐ（Ｗ）残基、及び配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）を含む、ペプチドに関する。
【０１２０】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、Ａｒｇ（Ｒ）残基、ヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能な芳香族アミノ酸残基、及び配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）を含む、ペプチドに関する。
【０１２１】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能な、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４残基及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖の酸素原子と静電相互作用を形成することが可能なＡｒｇ（Ｒ）残基；ヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能なＴｒｐ（Ｗ）残基；並びに配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）、特に配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）を含む、ペプチドに関する。
【０１２２】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７１）（配列中、（Ｎ末端から見て）１番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ、Ｓ又はＤから選択され、２番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ又はＦから選択される）を含む、ペプチドに関する。
【０１２３】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１７２）（配列中、（Ｎ末端から見て）１番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ、Ｓ又はＤから選択され、２番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ又はＦから選択される）を含む、ペプチドに関する。
【０１２４】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１７３）（配列中、（Ｎ末端から見て）１番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ、Ｓ又はＤから選択され、２番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ又はＦから選択される）を含む、ペプチドに関する。
【０１２５】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴＰＧ（配列番号１７４）（配列中、（Ｎ末端から見て）１番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ、Ｓ又はＤから選択され、２番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ又はＦから選択される）を含む、ペプチドに関する。
【０１２６】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、アミノ酸配列ＲＸＷＤＸＤＶＦＧＧＧＴＰＧＧ（配列番号１７５）（配列中、（Ｎ末端から見て）１番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ、Ｓ又はＤから選択され、２番目のＸで示されるアミノ酸残基はＹ又はＦから選択される）を含む、ペプチドに関する。
【０１２７】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７６）、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７７）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７８）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７９）から選択される、特にＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７７）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７８）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧ（配列番号１７９）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチドに関する。
【０１２８】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８０）、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８１）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８２）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８３）から選択される、特にＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８１）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８２）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１８３）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチドに関する。
【０１２９】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８４）、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８５）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８６）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８７）から選択される、特にＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８５）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８６）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰ（配列番号１８７）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチドに関する。
【０１３０】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、ＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１８８）、ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１８９）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１９０）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１９１）から選択される、特にＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１８９）、ＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１９０）又はＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶ（配列番号１９１）から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチドに関する。
【０１３１】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、配列モチーフＲＸＷＤ（モチーフ内、ＸはＷ、Ｙ、Ｆ、Ｓ又はＤから選択される）及び配列モチーフＦＧＧＧを含む、ペプチドに関する。
【０１３２】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、配列モチーフＲＸＷＤ（Ｘは好ましくはＷ、Ｙ、Ｆ、Ｓ又はＤから選択される）及び配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）又はＤＡＦＧＧＧ（配列番号１９２）を含む、ペプチドに関する。
【０１３３】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、配列モチーフＲＸＷＤ（モチーフ内、Ｘは好ましくはＷ、Ｙ、Ｆ、Ｓ又はＤから選択される）及び配列モチーフＤＶＦＧＧＧＴ（配列番号１３３）、ＤＶＦＧＧＧＳ（配列番号１９３）又はＤＡＦＧＧＧＴ（配列番号１９４）を含む、ペプチドに関する。
【０１３４】
好ましい態様において、上記のペプチドは全て、さらに配列番号１のアミノ酸配列より良好にヒト血清アルブミンと結合するようなものであるのが好ましく、（本明細書中で規定するように）アミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）と同様に良好に、より好ましくはアミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）より良好にＨＳＡと結合するようなものであるのがより好ましい。
【０１３５】
別の態様において、上記のペプチドはアミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）の親和性成熟変異型であり得る。
【０１３６】
また上記のペプチドが配列モチーフＲＸＷＤを含有しているといえる場合、（ｉ）このモチーフでＡｒｇ（Ｒ）残基は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能であり、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４残基及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖の酸素原子と静電相互作用を形成することが可能であるか、及び／又は（ｉｉ）このモチーフでＴｒｐ（Ｗ）残基は、ヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能であるかのいずれかであり、好ましくは（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が当てはまる。
【０１３７】
上述のように、これらのペプチド全てが本発明のアミノ酸配列に関して本明細書中にさらに記載されるようなものであり得る。
【０１３８】
別の態様において本発明は、（本明細書中で規定するように）ヒト血清アルブミンに特異的であると共に、配列モチーフＲＸＷＤ（モチーフ内、Ｘは任意のアミノ酸であり得るが、Ｗ、Ｙ、Ｆ、Ｓ又はＤから選択されるのが最も好ましい）を含む、ペプチドであって、（ｉ）このモチーフでＡｒｇ（Ｒ）残基は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成することが可能であり、及び／又はヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４残基及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖の酸素原子と静電相互作用を形成することが可能であるか、及び／又は（ｉｉ）このモチーフでＴｒｐ（Ｗ）残基は、ヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基と静電相互作用を形成することが可能であるかであり、好ましくは（ｉ）及び（ｉｉ）の両方が当てはまる、ペプチドに関する。このペプチドは配列モチーフＦＧＧＧ、より好ましくは配列モチーフＤＶＦＧＧＧ（配列番号１２９）及びさらにより好ましくは配列モチーフＤＶＧＧＧＧＴ（配列番号１３３）をさらに含有するのが好ましい。
【０１３９】
同様にこのようなペプチドは、さらに配列番号１のアミノ酸配列より良好にヒト血清アルブミンと結合するようなものであるのが好ましく、（本明細書中で規定するように）アミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）と同様に良好に、より好ましくはアミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）より良好にＨＳＡと結合するようなものであるのがより好ましく、及び／又はアミノ酸配列５６Ｅ４（配列番号１４）の親和性成熟変異型であってもよく、概して本明細書中でさらに記載されるようなものであってもよい。
【０１４０】
別の態様において本発明は、ヒト血清アルブミンとの結合に関して配列番号１のペプチドと競合する、及び／又は配列番号１のペプチドとヒト血清アルブミンとの結合を（本明細書中で規定するように）交差遮断する、並びに（本明細書中で規定するように）配列番号１のペプチドより良好にヒト血清アルブミンと結合する、ペプチドに関する。
【０１４１】
別の態様において本発明は、ヒト血清アルブミンとの結合に関して配列番号１のペプチドと競合する、及び／又は配列番号１のペプチドとヒト血清アルブミンとの結合を（本明細書中で規定するように）交差遮断する、並びに（本明細書中で規定するように）配列番号１４のペプチドより良好にヒト血清アルブミンと結合する、ペプチドに関する。このようなペプチドは本明細書中でさらに記載されるようなものであってもよい。
【０１４２】
別の態様において本発明は、ヒト血清アルブミンとの結合に関して配列番号１４のペプチドと競合する、及び／又は配列番号１４のペプチドとヒト血清アルブミンとの結合を（本明細書中で規定するように）交差遮断する、並びに（本明細書中で規定するように）配列番号１のペプチドより良好にヒト血清アルブミンと結合する、ペプチドに関する。このようなペプチドは本明細書中でさらに記載されるようなものであってもよい。
【０１４３】
別の態様において本発明は、ヒト血清アルブミンとの結合に関して配列番号１４のペプチドと競合する、及び／又は配列番号１４のペプチドとヒト血清アルブミンとの結合を（本明細書中で規定するように）交差遮断する、並びに（本明細書中で規定するように）配列番号１４のペプチドより良好にヒト血清アルブミンと結合する、ペプチドに関する。このようなペプチドは本明細書中でさらに記載されるようなものであってもよい。
【０１４４】
上記のペプチドは本明細書中でさらに記載されるようなものであってもよく、例えば配列番号１のペプチドの親和性成熟変異型であってもよく、特に配列番号１４のペプチドの親和性成熟変異型であってもよい。また特に、上記のペプチドは、ヒト血清アルブミンの以下のアミノ酸残基（実施例８で示されるようにナンバリングする）：Ａｓｎ（Ｎ）１３３、Ｐｒｏ（Ｐ）１３４、Ａｓｎ（Ｎ）１３５、Ｌｅｕ（Ｌ）１３６、Ｌｅｕ（Ｌ）１３９、Ａｒｇ（Ｒ）１４１、Ｔｙｒ（Ｙ）１６２、Ｇｌｕ（Ｅ）１６５、Ｉｌｅ（Ｉ）１６６、Ｈｉｓ（Ｈ）１７０、Ｐｈｅ（Ｆ）１７３、Ｐｈｅ（Ｆ）１８１、Ｇｌｙ（Ｇ）２１３、Ｌｙｓ（Ｋ）２１４、Ｓｅｒ（Ｓ）２１７、Ｇｌｎ（Ｑ）４８３及び／又はＬｙｓ（Ｋ）５４３の１つ又は複数と；より具体的には（ｉ）残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３、Ｐｒｏ（Ｐ）１３４、Ａｓｎ（Ｎ）１３５、Ｌｅｕ（Ｌ）１３６、Ｌｅｕ（Ｌ）１３９及びＡｒｇ（Ｒ）１４１を含むアミノ酸残基のストレッチ及び／又は（ｉｉ）残基Ｔｙｒ（Ｙ）１６２、Ｇｌｕ（Ｅ）１６５、Ｉｌｅ（Ｉ）１６６、Ｈｉｓ（Ｈ）１７０、Ｐｈｅ（Ｆ）１７３、Ｐｈｅ（Ｆ）１８１を含むアミノ酸残基のストレッチ及び／又は（ｉｉｉ）残基Ｇｌｙ（Ｇ）２１３、Ｌｙｓ（Ｋ）２１４及びＳｅｒ（Ｓ）２１７を含むアミノ酸残基のストレッチのいずれかを含むヒト血清アルブミン上のエピトープと；さらにより具体的には（数ある残基の中でも）残基Ｌｅｕ（Ｌ）１３９、Ｇｌｕ（Ｅ）１６５、Ｉｌｅ（Ｉ）１６６、Ｈｉｓ（Ｈ）１７０、Ｐｈｅ（Ｆ）１７３、Ｐｈｅ（Ｆ）１８１、Ｇｌｙ（Ｇ）２１３、Ｌｙｓ（Ｋ）２１４、Ｓｅｒ（Ｓ）２１７及びＧｌｎ（Ｑ）４８３を含むヒト血清アルブミン上の疎水性サブポケットとの結合に関して、それぞれ配列番号１又は配列番号１４のペプチドと競合し得る。
【０１４５】
特定の一態様において本発明は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列（本明細書中にさらに記載されるようなものであり得る）及び少なくとも１つの、ｖＷＦに対する単一ドメイン抗体（特にナノボディ）、例えば国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット又は国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットに記載の１つのナノボディ）を含む本発明の化合物に関する。
【０１４６】
特にこのような本発明の化合物は、２つの、ｖＷＦに対する単一ドメイン抗体（特に２つのナノボディ）（例えば国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット又は国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットに記載の２つのナノボディ）、及び少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列を含み得る。このような化合物は上記で例示された立体配置の１つを有し得る。例えばこのような化合物では、ｖＷＦに対する単一ドメインの２つが互いに直接連結しても、又は本発明のアミノ酸配列を少なくとも１つ、好ましくは２つ含むリンカーを介して互いに連結していてもよい。
【０１４７】
しかしながら好ましくはこのような化合物は、二価の抗ｖＷＦ構築物を形成するように好適なリンカー（本発明のアミノ酸配列を含有していない）を介して互いに連結する、ｖＷＦに対する単一ドメイン抗体（特にナノボディ）を２つ含み（これに関しては同様に国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット又は国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットを参照する）、ここで１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列（本明細書に記載のようにタンデムリピートの形態であり得る）は二価の抗ｖＷＦ構築物のＣ末端、Ｎ末端のいずれか又はＣ末端及びＮ末端の両方と（同様に任意で好適なリンカーを介して）連結する。
【０１４８】
より好ましくはこのような化合物は、二価の抗ｖＷＦ構築物を形成するように好適なリンカー（本発明のアミノ酸配列を含有していない）を介して互いに連結する、ｖＷＦに対する単一ドメイン抗体（特にナノボディ）を２つ含み（異なっていてもよいが好ましくは同じである）、該二価の抗ｖＷＦ構築物は、本明細書に記載のように（特に好適なリンカーを介して連結した、本発明のアミノ酸配列を２つ含む）本発明のアミノ酸配列のタンデムリピートと（任意で好適なリンカーを介して、Ｃ末端、Ｎ末端又はＣ末端及びＮ末端の両方で）連結する。最も好ましくは、このようなタンデムリピートは二価の抗ｖＷＦ構築物のＣ末端と連結する。
【０１４９】
これらの化合物に存在するｖＷＦに対する（好ましくは２つの）単一ドメイン抗体（特にナノボディ）はｖＷＦのＡ１ドメインの活性化立体構造に指向性を有するのが好ましい（同様に国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット、特に国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットを参照されたい）。具体的には、これらの化合物に存在するｖＷＦに対する（好ましくは２つの）単一ドメイン抗体（特にナノボディ）は国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットに記載のナノボディ、より具体的にはナノボディ１２Ａ２のヒト化型（国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットの配列番号７１）、例えば国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットに記載の１２Ａ２のヒト化型（例えば国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットの配列番号９０〜配列番号９４、１２Ａ２Ｈ１／配列番号９０のヒト化変異型が特に好ましい）の１つであり得る。
【０１５０】
このような本発明の抗ｖＷＦ化合物の好ましいが非限定的な例の幾つかが記載されており、以下の実施例１２〜実施例１５で使用されている。他の好ましい例は実施例１２に記載されているようなものであるが、（実施例１２の構築物に存在するように）１２Ａ２の代わりに１２Ａ２のヒト化変異型、特に１２Ａ２Ｈ１（国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットの配列番号９０）を含む。このような化合物の別の好ましい例は、本明細書中で記載のように、本発明のアミノ酸配列と、好ましくは本発明のアミノ酸配列のタンデムリピートとそのＮ末端（あまり好ましくない）又はそのＣ末端（好ましい）で連結した、国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットの配列番号９０の抗ｖＷＦ構築物を含む。
【０１５１】
最も好ましい例は、（本明細書中で記載のように）本発明のアミノ酸配列と、好ましくは本発明のアミノ酸配列５９Ｃ２、５９Ｆ２及び／又は５９Ｈ２のうちの２つを含むタンデムリピートとそのＮ末端（あまり好ましくない）又はそのＣ末端（好ましい）で連結した、国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットの配列番号９０の抗ｖＷＦ構築物を含む化合物である。
【０１５２】
本発明は、本発明のアミノ酸配列又は本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は核酸（本明細書中で「本発明のヌクレオチド配列」又は「本発明の核酸」とも称される）にも関する。
【０１５３】
本発明は、本発明のヌクレオチド配列又は核酸を含有する、及び／又は本発明のアミノ酸配列又は本発明のポリペプチドを発現する（又は発現することが可能である）宿主又は宿主細胞にも関する。
【０１５４】
本発明は本発明のアミノ酸配列及び化合物を調製する方法にも関し、該方法は本明細書中でさらに記載されるようなものである。
【０１５５】
本発明は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列又は本発明の化合物、及び任意で１つ又は複数のさらなる好適な成分又は構成要素を含む組成物にさらに関する。特に本発明は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列、本発明の化合物又は本発明の核酸、及び任意で少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【０１５６】
本発明は、本発明の構築物及び化合物を調製する幾つかの他の方法であって、概して任意で１つ又は複数の好適なリンカー又はスペーサーを介して、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列と少なくとも１つの治療部とを連結させる工程を含む、幾つかの他の方法も包含する。これは例えば使用するリンカー（複数可）に応じて（存在する場合）、それ自体が既知の任意の好適な方法で行ってもよく、例えば１つ又は複数の共有結合の形成による、当該技術分野でそれ自体が既知の化学結合に関する技法を含み得る。１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列及び１つ又は複数の治療部は本明細書中でさらに記載されるようなものであってもよい。同様に、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列は本明細書中で記載のようにジスルフィド架橋を含むのが好ましい。
【０１５７】
本発明は、上記の方法のいずれかにより得られる化合物又は構築物、また少なくとも１つのこのような化合物又は構築物、及び任意で少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物にも関する。
【０１５８】
本発明は本発明のアミノ酸配列の使用にも関する。概してこれらの使用は、結合単位、結合ドメイン、又は概して血清タンパク質、特に血清アルブミンと結合することができるアミノ酸配列に関してそれ自体が既知の任意の使用を含む。このような使用は当業者にとって明らかであり、治療部、治療実体又は薬物に対する半減期の増大だけでなく（又はそれに加えて）、血清アルブミンが身体、例えば炎症部位又は関節に存在する及び／又は集積する場合、身体又は組織の一部へと治療部、治療実体又は薬物を指向させることも含む。
【０１５９】
本発明は、ポリペプチド又はタンパク質構築物又は融合タンパク質の治療的使用、及びこのようなポリペプチド又はタンパク質構築物又は融合タンパク質を含む医薬組成物にさらに関する。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１−１】配列番号２〜配列番号１１５（本発明）及び１７Ｄ１２（配列番号１、参照）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１−２】配列番号２〜配列番号１１５（本発明）及び１７Ｄ１２（配列番号１、参照）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１−３】配列番号２〜配列番号１１５（本発明）及び１７Ｄ１２（配列番号１、参照）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１−４】配列番号２〜配列番号１１５（本発明）及び１７Ｄ１２（配列番号１、参照）のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
【図２】実施例２に記載のファージ−ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図３】実施例３に記載の溶液結合競合アッセイの結果を示すグラフである。
【図４】実施例３に記載のアラニンスキャニング実験の結果を示すグラフである。
【図５】実施例６に記載のナノボディ（登録商標）２Ｄ３（配列番号１３７）、２Ｄ３及び１７Ｄ１２のナノボディ（登録商標）融合タンパク質（配列番号１３８、参照）、並びに２Ｄ３及び５６Ｈ５のナノボディ（登録商標）融合タンパク質（配列番号１３９、本発明）とヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）との結合の表面プラズモン共鳴解析の結果を示すグラフである。チップ（ＣＭ５）のコーティングを活性化にＮＨＳ／ＥＤＣ及び不活性化にエタノールアミン（ビアコアアミンカップリングキット）を使用するアミンカップリングにより行った。チップを約７０００ＲＵのヒト血清アルブミン（Sigma、純度９９％）及び２４６０ＲＵの関連のないタンパク質抗原でコーディングした。続いて２Ｄ３及び２Ｄ３−１７Ｄ１２をチップ上に１μＭ及び５μＭの濃度で注入した。ＨＢＳ−ＥＰを１０μｌ／分の流速でフローバッファーとして使用した。試料２０μｌを１２０秒間注入した。２Ｄ３及び１７Ｄ１２の融合タンパク質（配列番号１３８）は図５では「２Ｄ３−５６Ｇ４」と呼ばれることに留意されたい。
【図６】試験物（test item）（ナノボディ（登録商標）構築物２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４、配列番号１４２）を投与したカニクイザル及び陰性対照（ナノボディ（登録商標）２Ｄ３、配列番号１３７）を投与したカニクイザルの薬物動態プロファイルを示す図である。
【図７−１】実施例９に記載の５６Ｅ４の親和性成熟型を用いて、これらを実施例５に記載のファージ競合アッセイで試験した際に実施例９で得られた結果を示す図である。
【図７−２】実施例９に記載の５６Ｅ４の親和性成熟型を用いて、これらを実施例５に記載のファージ競合アッセイで試験した際に実施例９で得られた結果を示す図である。
【図８】融合タンパク質化合物２Ｄ３−９ＧＳ−５６Ｅ４−ＭｙｃＨｉｓ、２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｃ２−ＭｙｃＨｉｓ、２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｆ２−ＭｙｃＨｉｓ及び２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｈ１２−ＭｙｃＨｉｓとヒト血清アルブミンとの結合に関して実施例１０で得られた結果を示す図である。
【図９】雄のカニクイザルでのそれぞれ２ｍｇ／ｋｇの２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４、２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２又は２Ｄ３の静脈内ボーラス投与後の２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４、２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２及び２Ｄ３の平均（±ＳＤ、ｎ＝３）血清濃度−時間プロファイルを示す図である。
【図１０】雄のカニクイザルでのそれぞれ２ｍｇ／ｋｇのｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５、ｖＷＦ−００５６（試験物）及びｖＷＦ０００１（対照）の静脈内注射ボーラス投与後のｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５、ｖＷＦ−００５６及びｖＷＦ０００１の平均（±ＳＤ、ｎ＝３）血漿濃度−時間プロファイルを示す図である。
【図１１】雄のカニクイザルでのそれぞれ２ｍｇ／ｋｇのｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５、ｖＷＦ−００５６（試験物）及びｖＷＦ０００１（対照）の静脈内注射ボーラス投与後のｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５、ｖＷＦ−００５６及びｖＷＦ０００１の平均（±ＳＤ、ｎ＝３）％ＲＩＣＯ−時間プロファイルを示す図である。
【図１２】本発明の抗ｖＷＦ化合物ｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６を用いて実施例１５で行ったかん流実験の結果を示す図である。
【図１３】本発明の抗ｖＷＦ化合物ｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６を用いて実施例１５で行ったｖＷＦとのリストセチン誘導性の結合に関してＥＬＩＳＡで得られた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１６１】
発明の詳細な説明
本明細書、実施例及び特許請求の範囲において：
ａ）特に本明細書で（例えば実施例８で）他に指示がなければ、本発明のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基及び位置はＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）における対応するアミノ酸残基及び位置に関して番号を付ける。
【０１６２】
ｂ）特に本明細書で（例えば実施例８で）他に指示がなければ、アミノ酸置換はアミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）における対応する位置に存在するアミノ酸残基に関して言及する。例えばＳ３Ｒは、アミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）と比較して、３位のセリン残基Ｓのアルギニン（Ｒ）への置換を表す。
【０１６３】
ｃ）特に他に指示又は規定がなければ、使用される全ての用語は、当業者にとって明らかな、当該技術分野における通常の意味を有する。例えば「ＩＬ−６媒介性シグナル伝達に関与する疾患及び障害の治療のためのＩＬ−６Ｒに指向性を有するアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド（Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptidescomprising the same for the treatment of diseases and disorders associated withIl-6 mediated signalling）」と題されたAblynx N.V.の国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの４６頁の段落ａ）で言及される標準的なハンドブックを参照する。
【０１６４】
ｄ）特に他に指示がなければ、「免疫グロブリン配列」、「配列」、「ヌクレオチド配列」及び「核酸」という用語は国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの４６頁の段落ｂ）で説明されているようなものである。
【０１６５】
ｅ）特に他に指示がなければ、具体的に詳しく説明されていない全ての方法、工程、技法及び操作を実施することができ、当業者にとって明らかなそれ自体が既知の方法で実施する。同様に例えば、標準的なハンドブック及び本明細書で言及される一般的な背景技術、並びにそこで言及されるさらなる参考文献並びに例えば以下の総説、Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 （5-6）: 640-56、Levin and Weiss, Mol. Biosyst.2006, 2（1）: 49-57、Irving et al., J.Immunol. Methods, 2001, 248（1-2）, 31-45、Schmitzet al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12、Gonzaleset al., Tumour Biol., 2005, 26（1）, 31-43（これらは、親和性成熟等のタンパク質工学技法及び免疫グロブリン等のタンパク質の特異性及び他の所望の特性を改善する他の技法を説明している）を参照する。
【０１６６】
ｆ）アミノ酸残基は、表Ａに言及されるように標準的な３文字アミノ酸コード又は１文字アミノ酸コードに従って示す。
【０１６７】
表Ａ：１文字アミノ酸コード及び３文字アミノ酸コード
【表２】
2011516603.tif 000003
【０１６８】
ｇ）２つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、国際公開第０８／０２００７９号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）の４９ページのｃ）段落に記載のように、例えば［第２のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一な第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって（ここで第１のヌクレオチド配列と比較される第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一ヌクレオチド（位置）での差異と考えられる）、又は同様に国際公開第０８／０２００７９号パンフレット（参照により本明細書中に援用される）の４９ページのｃ）段落に記載のような好適なコンピュータアルゴリズム若しくは技法を使用することによって、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」のパーセントを算出又は決定することができる。
【０１６９】
ｈ）２つ以上のアミノ酸配列を比較するために、［第２のアミノ酸配列における対応する位置のアミノ酸残基と同一な第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって（ここで第１のアミノ酸配列と比較される第２のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一アミノ酸残基（位置）での差異、即ち本明細書に規定の「アミノ酸差異」と考えられる）第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」（本明細書で「アミノ酸同一性」とも称される）のパーセントを算出することができる。
【０１７０】
代替的に、同様に標準的な設定を用いて、既知のコンピュータアルゴリズム（例えばヌクレオチド配列に関する配列同一性の程度を決定するのに上記で言及されるもの）を使用して、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を算出することができる。
【０１７１】
通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列とし、他のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列とする。
【０１７２】
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換を考慮してもよく、これは一般的に、アミノ酸残基が同様の化学構造を有する別のアミノ酸残基に置き換わり、かつポリペプチドの機能、活性又は他の生物学的特性への影響がほとんど、又は本質的に全くないアミノ酸置換と説明することができる。このような保存的なアミノ酸置換は、例えば国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット、英国特許出願公開第３３５７７６８号明細書、国際公開第９８／４９１８５号パンフレット、国際公開第００／４６３８３号パンフレット及び国際公開第０１／０９３００号パンフレットから当該技術分野において既知であり、このような置換の（好ましい）種類及び／又は組合せは、国際公開第０４／０３７９９９号パンフレット及び国際公開第９８／４９１８５号パンフレット、並びにそこで言及されるさらなる参考文献の関連の教示に基づいて選択することができる。
【０１７３】
このような保存的な置換は、好ましくは以下の（ａ）群〜（ｅ）群内の或るアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基に置換される置換である：（ａ）低分子脂肪族で非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ、（ｂ）極性で負に荷電した残基及びこの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、（ｃ）極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、（ｄ）巨大な脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ、並びに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
【０１７４】
特に好ましい保存的置換は以下のようなものである：ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに、ＡｒｇをＬｙｓに、ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに、ＡｓｐをＧｌｕに、ＣｙｓをＳｅｒに、ＧｌｎをＡｓｎに、ＧｌｕをＡｓｐに、ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに、ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎに、ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに、ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに、ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに又はＧｌｕに、ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに又はＩｌｅに、ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに又はＴｙｒに、ＳｅｒをＴｈｒに、ＴｈｒをＳｅｒに、ＴｒｐをＴｙｒに、ＴｙｒをＴｒｐに、及び／又はＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに又はＬｅｕに。
【０１７５】
本明細書に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag,1978によって開発された異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変異頻度の解析、Chou and Fasman,Biochemistry 13: 211, 1974及びAdv. Enzymol., 47: 45-149,1978によって開発された構造形成能（structure forming potentials）の解析、並びにEisenberg et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984、Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981、及びGoldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986によって開発されたタンパク質における疎水性パターンの解析に基づき得る（全て全体が参照により本明細書に援用される）。ナノボディ（登録商標）の一次構造、二次構造、及び三次構造に関する情報は、本明細書中の記載及び上記で言及された一般的な背景技術で与えられる。またこのため、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造は例えば、Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803（1996）、Spinelli et al., Natural StructuralBiology（1996）; 3, 752-757、及びDecanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361（1999）によって与えられる。従来のＶＨドメインにおいてこれらの位置でＶＨ／ＶＬ界面及び潜在的なラクダ化置換を形成する幾つかのアミノ酸残基に関するさらなる情報は、上記で言及された従来技術で見出すことができる。
【０１７６】
ｉ）アミノ酸配列及び核酸配列は、その全長にわたって（本明細書に規定のように）１００％の配列同一性を有する場合、「全く同じ」であるといえる。
【０１７７】
ｊ）２つのアミノ酸配列を比較するとき、「アミノ酸差異」という用語は、第２の配列と比較した第１の配列の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を表し、２つのアミノ酸配列は、１つ、２つ又はそれ以上のこのようなアミノ酸差異を含有し得ることが理解される。
【０１７８】
ｋ）ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列がそれぞれ、別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列「を含む」、又は別のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列「から本質的に成る」という場合、これは国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの５１頁、５２頁の段落ｉ）で与えられる意味を有する。
【０１７９】
ｌ）「本質的に単離形態で」という用語は国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの５２頁及び５３頁の段落ｊ）で与えられる意味を有する。
【０１８０】
ｍ）「ドメイン」及び「結合ドメイン」という用語は国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの５３頁の段落ｋ）で与えられる意味を有する。
【０１８１】
ｎ）また本明細書中で区別なく使用することもできる「抗原決定基」及び「エピトープ」という用語は国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの５３頁の段落ｌ）で与えられる意味を有する。
【０１８２】
ｏ）国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの５３頁のｍ）段落にさらに記載のように、特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質（又はその少なくとも１つの部分、断片若しくはエピトープ）と（特異的に）結合することができる、特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する親和性を有する、及び／又は特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する特異性を有するアミノ酸配列（例えば本発明のナノボディ（登録商標）、抗体、ポリペプチド、又は概して抗原結合タンパク質若しくはポリペプチド、又はその断片）は、上記抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質「に対する」又は「に指向性を有する」（"against" or "directed against"）又は「に特異的な」と言われる。
【０１８３】
ｐ）「特異性」及び「に特異的な」という用語は国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの５３頁〜５６頁の段落ｎ）で与えられる意味を有し、そこで言及されるように、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチド）分子が結合することができる、異なる種の抗原又は抗原決定基の数を表す。抗原結合タンパク質の特異性は、国際公開第０８／０２００７９号パンフレット（参照により本明細書中で援用される）の５３頁〜５６頁で説明されているように親和性及び／又は結合活性に基づき求めることができ、この文献は抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチド）と関連抗原との間の結合を測定するのに好ましい技法も幾つか説明している。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば本発明のアミノ酸配列及び／又は化合物）は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌ以下、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で（即ち１０５Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及び好ましくは１０７Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モル以上、及びより好ましくは１０８Ｌ／モル〜１０１２Ｌ／モルの結合定数（ＫＡ）で）これらの抗原と結合する。１０−４モル／Ｌより大きい任意のＫＤ値（即ち１０４Ｍ−１（Ｌ／モル）より小さい任意のＫＡ値）は一般的に非特異的な結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明のアミノ酸配列又は化合物は、１０００ｎＭ未満、好ましくは５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満（５００ｐＭ未満等）の親和性で所望の血清タンパク質と結合する。抗原結合タンパク質と抗原又は抗原決定基との特異的な結合は、それ自体が既知の任意の好適な方法（例えばスキャッチャード解析及び／又は競合的結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ）を含む）及び当該技術分野でそれ自体が既知の様々なその変更方法、並びに本明細書で言及される他の技法で求めることができる。
【０１８４】
当業者にとって明らかなように、及び国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの５３頁〜５６頁で説明されているように、解離定数は実際の解離定数であっても又は見掛けの解離定数であってもよい。解離定数を求める方法は当業者にとって明らかであり、例えば国際公開第０８／０２００７９号パンフレットの５３頁〜５６頁で言及される技法が挙げられる。
【０１８５】
ｑ）本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの半減期は概して、例えば自然機構による配列若しくは化合物の分解及び／又は配列若しくは化合物のクリアランス（clearance）若しくは捕捉（sequestration）のために、ｉｎ  ｖｉｖｏでアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドの血清濃度が５０％低減するのにかかる時間と定義することができる。本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、それ自体が既知の任意の方法（例えば薬物動態解析）で求めることができる。好適な技法は当業者にとって明らかであり、例えば概して、好適な用量の本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドを温血動物（即ち、ヒト又は別の好適な哺乳動物、例えばマウス、ウサギ、ラット、ブタ、イヌ又は霊長類（例えばマカク属のサル（例えば特にカニクイザル（マカク・ファシクラリス）及び／又はアカゲザル（マカク・ムラット））及びヒヒ（パピオ・ウルジヌス））に好適に投与する工程と、血液試料又は他の試料を上記動物から採取する工程と、上記血液試料中の本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのレベル又は濃度を求める工程と、このようにして得られたデータ（のプロット）から本発明のアミノ酸配列、化合物又はポリペプチドのレベル又は濃度が投与時の最初のレベルに比べて５０％低減するまでの時間を算出する工程とを伴い得る。例えば、以下の実験部部分、及びDennis et al., J. Biol. Chem 277:35035-42（2002）、標準的なハンドブック（例えばKenneth, A et al:Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists及びPeters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach（1996））を参照する。"Pharmacokinetics",M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition（1982）も参照する。
【０１８６】
また当業者にとって明らかなように（例えば国際公開第０４／００３０１９号パンフレットの６頁及び７頁とそこに言及されたさらなる参考文献とを参照されたい）、半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−β及び曲線下面積（ＡＵＣ）等のパラメータを利用して表すことができる。本明細書において、「半減期の増大」は、これらのパラメータのいずれか１つ、例えばこれらのパラメータのいずれか２つ、又は本質的に３つ全てのこれらのパラメータの増大を表す。本明細書で使用される「半減期の増大」又は「増大した半減期」は特にｔ１／２−βの増大を表し、ｔ１／２−α及び／又はＡＵＣのいずれか又は両方は増大しても又は増大しなくてもよい。
【０１８７】
ｒ）本発明では、「調節（"modulating" or "to modulate"）」は一般的に、好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して測定するような標的又は抗原の活性の低減若しくは阻害のいずれか、又は代替的に活性の増大を意味する。特に「調節」は、好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞アッセイ、又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ（通常関与する標的又は抗原によって変わる）を用いて測定するような、本発明の構築物が存在しない以外は同じ条件下での同じアッセイにおける標的又は抗原の活性に比べて、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上標的又は抗原の活性を低減又は阻害すること、又は代替的に（関連又は対象の）生物学的活性を増大させることを意味し得る。
【０１８８】
当業者にとって明らかなように、「調節」は、本発明の構築物が存在しない以外は同じ条件下に比べて、そのリガンド、結合パートナー、ホモ多量体形態若しくはヘテロ多量体形態で会合するパートナー又は基質の１つ又は複数に対する標的又は抗原の親和性、結合活性、特異性及び／又は選択性を変化させること（増大又は減少のいずれであってもよい）、及び／又は標的又は抗原が存在する媒体又は環境における１つ又は複数の条件（ｐＨ、イオン強度、補因子の存在等）に対する標的又は抗原の感受性を変化させること（増大又は減少のいずれであってもよい）も伴い得る。当業者にとって明らかなように、関与する標的又は抗原に応じて、任意の好適な方法で、及び／又はそれ自体が既知の任意の好適なアッセイを用いてさらにこれを求めてもよい。
【０１８９】
「調節」は、標的又は抗原が関与する（又はその基質（複数可）、リガンド（複数可）若しくは経路（複数可）が関与する、シグナル伝達経路若しくは代謝経路及び関連の生物学的作用若しくは生理学的作用のような）１つ又は複数の生物学的な若しくは生理学的な機構、作用、反応、機能、経路又は活性に関して変化させる（即ち標的又は抗原及び所望の生物学的作用若しくは生理学的作用に応じて、それぞれ、アゴニスト、アンタゴニスト、又は逆アゴニストとしての活性に影響を与える）ことも意味し得る。同様に、当業者にとって明らかなように、関与する標的又は抗原に応じて、任意の好適な方法で、及び／又はそれ自体が既知の任意の好適な（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び通常は細胞又はアッセイ内（in assay））アッセイを使用して、アゴニスト又はアンタゴニストとしてのこのような作用を求めてもよい。特に、アゴニスト又はアンタゴニストとしての作用は、対象の生物学的活性又は生理学的活性をそれぞれ、本発明の構築物が存在しない以外は同じ条件下での同じアッセイにおける生物学的活性又は生理学的活性に比べて少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％若しくは少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は９０％以上増大又は低減させるようなものであり得る。
【０１９０】
調節は例えば、標的又は抗原のアロステリック調節、及び／又は標的又は抗原とその基質又はリガンドの１つとの結合の低減又は阻害及び／又は標的又は抗原との結合に対する基質である天然リガンドとの競合も伴い得る。調節は、標的若しくは抗原、又はこれが関与する機構若しくは経路を活性化することも伴い得る。調節は例えば標的若しくは抗原のフォールディング若しくは立体構造に関して、又は標的若しくは抗原がフォールディングする能力、（例えばリガンドの結合の際に）その立体構造を変更する能力、他の（サブ）ユニットと会合する能力、又は解離する能力に関して変化させることも伴い得る。調節は例えば、標的若しくは抗原が、他の化合物を移動させる能力、又は他の化合物（イオン等）に対するチャネルとして働く能力を変化させることも伴い得る。
【０１９１】
調節は、可逆であっても又は不可逆であってもよいが、薬学的及び薬理学的目的では通常、可逆的である。
【０１９２】
ｓ）標的又は抗原に関して、標的又は抗原上の「相互作用部位」という用語は、リガンド、受容体若しくは他の結合パートナーとの結合に関する部位、触媒部位、切断部位、アロステリック相互作用に関する部位、標的又は抗原の多量体化（ホモマー化又はヘテロ二量体化等）に関与する部位である、標的又は抗原上のアミノ酸残基の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン若しくはストレッチ；又は標的若しくは抗原の生物学的作用又は機構に関与する標的又は抗原上のアミノ酸残基の任意の他の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はストレッチを意味する。より一般的には、「相互作用部位」は、本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドが、（本明細書中に規定のように）標的又は抗原（及び／又は標的又は抗原が関与する任意の経路、相互作用、シグナル伝達、生物学的機構又は生物学的作用）を調節するように結合することができる、標的又は抗原上のアミノ酸残基の任意の部位、エピトープ、抗原決定基、部分、ドメイン又はストレッチであり得る。
【０１９３】
ｔ）アミノ酸配列又はポリペプチドは、上記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２の標的又はポリペプチドと結合する親和性よりも少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍、及び最大１００００倍以上良好な親和性（上記のように、好適にＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆ速度及び／又はＫｏｎ速度と表す）で第１の抗原と結合する場合、第２の標的又は抗原と比べて、第１の標的又は抗原「に特異的」であるといえる。例えば、第１の抗原は、上記アミノ酸配列又はポリペプチドが第２の標的又はポリペプチドと結合する場合のＫＤの少なくとも１０分の１、例えば少なくとも１００分の１、及び好ましくは少なくとも１０００分の１、例えば１００００分の１又はさらにはそれ以下のＫＤ値で標的又は抗原と結合し得る。好ましくは、アミノ酸配列又はポリペプチドが、第２の標的又は抗原に比べて第１の標的又は抗原「に特異的」である場合、そのアミノ酸配列又はポリペプチドは、（本明細書中に規定のように）上記第１の標的又は抗原に指向性を有するが、上記第２の標的又は抗原に対しては指向性を有しない。
【０１９４】
ｕ）アミノ酸配列が、（本明細書中で規定するように）２つの異なる抗原又は抗原決定基（例えば異なる２種の哺乳動物由来の血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン及びカニクイザル血清アルブミン）の両方に特異的である場合、これらの異なる抗原又は抗原決定基に対して「交差反応性」であるといえる。
【０１９５】
ｖ）「本質的にｐＨに非依存的である」結合は概して本明細書中では、（本明細書中でさらに記載されるように）動物又はヒトの身体の細胞で生じるｐＨ値（複数可）で血清タンパク質（例えば血清アルブミン）に関するアミノ酸配列の結合定数（ＫＡ）が、上記細胞の外側で生じるｐＨ値（複数可）で同じ血清タンパク質に関するアミノ酸配列の結合定数（ＫＡ）の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、例えばさらにより好ましくは少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％又は９０％以上（又はさらには１００％超、例えば１１０％超、１２０％超又はさらには１３０％以上、又はさらには１５０％超、又はさらには２００％超）であることを意味する。代替的には、「本質的にｐＨに非依存的である」結合は概して本明細書中では、動物又はヒトの身体の細胞で生じるｐＨ値（複数可）（例えば本明細書中でさらに記載されるようなものであり、例えばおよそ５．５、例えば５．３〜５．７のｐＨ）で血清タンパク質（例えば血清アルブミン）に関するアミノ酸配列のｋｏｆｆ速度（ビアコアで測定する、例えば実験２を参照されたい）が、上記細胞の外側で生じるｐＨ値（複数可）、例えばｐＨ７．２〜７．４で同じ血清タンパク質に関するアミノ酸配列のｋｏｆｆ速度の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、例えばさらにより好ましくは少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％又は９０％以上（又はさらには１００％超、例えば１１０％超、１２０％超又はさらには１３０％以上、又はさらには１５０％超、又はさらには２００％超）であることを意味する。「動物又はヒトの身体の細胞で生じるｐＨ値（複数可）」は、細胞の内側、特に血清タンパク質の再生に関与する細胞の内側で生じ得るｐＨ値（複数可）を意味する。特に、「動物又はヒトの身体の細胞で生じるｐＨ値（複数可）」は（例えばピノサイトーシス、エンドサイトーシス、トランスサイトーシス、エキソサイトーシス及びファゴサイトーシス、又は上記細胞への取り込み若しくは内在化の同様の機構の結果として）血清タンパク質の再生に関与する細胞（内）コンパートメント又は小胞、例えばエンドソーム、リソソーム又はピノソームの内側で生じ得るｐＨ値（複数可）を意味する。
【０１９６】
ｗ）「交差遮断（"cross-block", "cross-blocked" and "cross-blocking"）」という用語は、本明細書中で区別なく使用し、アミノ酸配列又は他の結合剤（本発明のナノボディ、ポリペプチド又は化合物若しくは構築物等）が、他の本発明のアミノ酸配列又は結合剤と所定の標的との結合を妨げる能力を意味する。本発明のアミノ酸配列又は他の結合剤が別のアミノ酸配列又は結合剤と関連のある標的との結合を妨げることができる範囲、ひいては本発明に従って交差遮断するということができるか否かを、競合結合アッセイを使用して求めることができる。１つの特に好ましい定量的な交差遮断アッセイは、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定することができるビアコア機器を使用する。別の好適な定量的な交差遮断アッセイは、標的とのこれらの結合に関して、アミノ酸配列又は他の結合剤間の競合を測定するＥＬＩＳＡに基づくアプローチを使用する。
【０１９７】
概して以下に、アミノ酸配列又は他の結合剤が、本発明に従って交差遮断するか、又は交差遮断することができるか否かを求めるのに適したビアコアアッセイを説明している。このアッセイは、本明細書中に記載のアミノ酸配列又は他の結合剤のいずれかと共に使用することができることが理解されよう。ビアコア機器（例えばビアコア３０００）は、製造元の推奨に沿って操作する。このように、１つの交差遮断アッセイでは、標的でコーティングされた表面を作製するのに、標準的なアミンカップリングケミストリを用いて、標的タンパク質をＣＭ５ビアコアチップと結合させる。典型的に２００個〜８００個の標的の共鳴単位をチップに結合させる（容易に測定可能なレベルの結合を与えるが、使用する試験試薬の濃度によって容易に飽和することができる量）。互いに交差遮断する能力を評価する、２つの試験アミノ酸配列（Ａ＊及びＢ＊と呼ばれる）を、好適なバッファー中で、１：１の結合部位のモル比で混合し、試験混合物を作製する。結合部位ベースの濃度を算出する場合、アミノ酸配列の分子量は、アミノ酸配列の全分子量を、このアミノ酸配列上の標的結合部位の数で除算したものであるとみなす。試験混合物中の各アミノ酸配列の濃度は、ビアコアチップ上に捕捉された標的分子上のこのアミノ酸配列に対する結合部位を容易に飽和するのに十分高いものとする。混合物中のアミノ酸配列は（結合部位ベースで）同じモル濃度であり、その濃度は典型的に（結合部位ベースで）１．００マイクロモル〜１．５マイクロモルである。Ａ＊及びＢ＊を単独で含有する分離溶液も調製する。これらの溶液中のＡ＊及びＢ＊は、試験混合物と同じバッファー中で、かつ試験混合物と同じ濃度であるとする。試験混合物を標的コーティングビアコアチップ上に通し、結合総量を記録する。それから、チップ結合標的を損なうことなく、結合したアミノ酸配列を取り除くようにチップを処理する。典型的に、チップを３０ｍＭのＨＣｌで６０秒処理することによってこれを行う。その後、Ａ＊単独の溶液を標的コーティング表面上に通し、結合量を記録する。同様に、チップを処理し、チップ結合標的を損なうことなく、結合したアミノ酸配列を全て取り除く。それから、Ｂ＊単独の溶液を標的コーティング表面上に通し、結合量を記録する。次に、Ａ＊とＢ＊との混合物の理論最大結合を算出し、これは単独で標的表面上を通した際の各アミノ酸配列の結合の合計である。実際に記録された混合物の結合がこの理論最大値より小さい場合、２つのアミノ酸配列は互いに交差遮断している。このように概して、交差遮断する本発明によるアミノ酸配列又は他の結合剤は、アッセイ中、及び本発明の第２のアミノ酸配列又は他の結合剤の存在下で、記録された結合が、組合せた２つのアミノ酸配列又は結合剤の最大理論結合（直前に規定）の８０％〜０．１％（例えば８０％〜４％）、具体的に最大理論結合の７５％〜０．１％（例えば７５％〜４％）、及びより具体的に最大理論結合の７０％〜０．１％（例えば７０％〜４％）であるように、上記のビアコア交差遮断アッセイで標的と結合するものである。上記のビアコアアッセイは、アミノ酸配列又は他の結合剤が本発明に従って互いに交差遮断するかどうかを求めるのに使用する主なアッセイである。稀に、特定のアミノ酸配列又は他の結合剤が、ＣＭ５ビアコアチップとアミンケミストリを介して結合した標的と結合しないことがある（通常、標的上の関連の結合部位がチップとの連結によって塞がれるか、又は破壊される場合にこれが起こる）。このような場合、標識型、例えばＮ末端Ｈｉｓ標識型の標的を用いて交差遮断を求めることができる。この特定のフォーマットでは、抗Ｈｉｓアミノ酸配列をビアコアチップに結合させた後、Ｈｉｓ標識した標的をチップの表面上に通し、抗Ｈｉｓアミノ酸配列で捕捉する。各チップ再生サイクル後に、抗Ｈｉｓアミノ酸配列コーティング表面上に、新たなＨｉｓ標識した標的を充填し戻すことを除いて、本質的に上記のように、交差遮断解析を行う。Ｎ末端Ｈｉｓ標識した標的を使用するとして与えられた例の他に、代替的にＣ末端Ｈｉｓ標識した標的を使用することができる。さらに、当該技術分野で既知の様々な他の標識及び標識結合タンパク質の組合せをこのような交差遮断解析に使用することができる（例えば、抗ＨＡ抗体によるＨＡ標識；抗ＦＬＡＧ抗体によるＦＬＡＧ標識；ストレプトアビジンによるビオチン標識）。
【０１９８】
概して以下に、標的に指向性を有するアミノ酸配列又は他の結合剤が、本明細書中に規定のように、交差遮断するか、又は交差遮断することができるか否か求めるＥＬＩＳＡアッセイを説明している。このアッセイは、本明細書中に記載のアミノ酸配列（又は本発明のポリペプチド等の他の結合剤）のいずれかと共に使用することができることが理解されよう。このアッセイの一般原理は、ＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングした標的に指向性を有するアミノ酸配列又は結合剤を有することである。過剰量の第２の、潜在的に交差遮断する抗標的アミノ酸配列を溶液中に添加する（即ちＥＬＩＳＡプレートと結合しない）。それから、限定量の標的をウェルに添加する。コーティングしたアミノ酸配列と溶液中のアミノ酸配列とは、限定数の標的分子の結合に対して競合する。プレートを洗浄し、コーティングしたアミノ酸配列と結合していない過剰な標的を取り除き、また第２の溶液相のアミノ酸配列及び第２の溶液相のアミノ酸配列と標的との間に形成される任意の複合体を取り除く。その後、標的を検出するのに適切な試薬を使用して、結合標的の量を測定する。コーティングしたアミノ酸配列を交差遮断することができる溶液中のアミノ酸配列によって、第２の溶液相のアミノ酸配列の非存在下でコーティングしたアミノ酸配列と結合することができる標的分子の数に比べて、コーティングしたアミノ酸配列と結合することができる標的分子の数を低減させることができる。固定化させるアミノ酸配列として第１のアミノ酸配列、例えばＡｂ−Ｘを選択する場合、第１のアミノ酸配列をＥＬＩＳＡプレートのウェル上にコーティングし、その後、プレートを好適なブロッキング溶液でブロッキングし、その後添加する試薬の非特異的な結合を最小にする。第２のアミノ酸配列、即ちＡｂ−Ｙの標的結合部位の１つのウェル当たりのモルが、ＥＬＩＳＡプレートのコーティング中に使用したＡｂ−Ｘ標的結合部位の１つのウェル当たりのモルの少なくとも１０倍になるように、過剰量のＡｂ−ＹをＥＬＩＳＡプレートに添加する。それから、添加した標的の１つのウェル当たりのモルが、各ウェルをコーティングするのに使用したＡｂ−Ｘ標的結合部位のモルの少なくとも２５分の１になるように、標的を添加する。好適なインキュベーション期間の後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、標的を検出する試薬を添加し、コーティングした抗標的アミノ酸配列（この場合、Ａｂ−Ｘ）と特異的に結合した標的の量を測定する。アッセイに関するバックグラウンドシグナルは、コーティングしたアミノ酸配列（この場合、Ａｂ−Ｘ）、第２の溶液相のアミノ酸配列（この場合、Ａｂ−Ｙ）、標的バッファーのみ（即ち標的が存在しない）及び標的検出試薬を用いてウェル中で得られたシグナルと定義する。アッセイに関する陽性対照シグナルは、コーティングしたアミノ酸配列（この場合、Ａｂ−Ｘ）、第２の溶液相のアミノ酸配列バッファーのみ（即ち第２の溶液相のアミノ酸配列が存在しない）、標的及び標的検出試薬を用いてウェル中で得られたシグナルと定義する。陽性対照シグナルがバックグラウンドシグナルの少なくとも６倍になるように、ＥＬＩＳＡアッセイを行い得る。どのアミノ酸配列をコーティングアミノ酸配列として使用し、どのアミノ酸配列を第２の（競合）アミノ酸配列として使用するかという選択に起因する任意のアーチファクト（例えば有意に異なる、標的に対するＡｂ−ＸとＡｂ−Ｙとの親和性）を避けるために、交差遮断アッセイを２つのフォーマットで行い得る：１）フォーマット１は、Ａｂ−Ｘが、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングするアミノ酸配列であり、かつＡｂ−Ｙが、溶液中にある競合アミノ酸配列である場合であり、また２）フォーマット２は、Ａｂ−Ｙが、ＥＬＩＳＡプレート上にコーティングするアミノ酸配列であり、かつＡｂ−Ｘが、溶液中にある競合アミノ酸配列である場合である。Ａｂ−Ｘ及びＡｂ−Ｙは、フォーマット１又はフォーマット２のいずれかで、溶液相の抗標的アミノ酸配列が、溶液相の抗標的アミノ酸配列の非存在下（即ち陽性対照ウェル）で得られた標的検出シグナルに比べて、標的検出シグナル（即ちコーティングしたアミノ酸配列で結合した標的の量）の６０％〜１００％、具体的に７０％〜１００％、及びより具体的に８０％〜１００％の低減を引き起こすことができる場合、交差遮断すると定義する。
【０１９９】
ｘ）任意の図面、配列表及び実験部部分／実施例は、本発明をさらに説明するためだけに与えられ、特に他にはっきりと本明細書中に指示がなければ、本発明の範囲及び／又は添付の特許請求の範囲を限定するものとしては決して解釈すべきではない。
【０２００】
重鎖抗体及びその可変ドメインの概要に関しては、特に本明細書で言及される従来技術、Reviews in Molecular Biotechnology 74（2001）, 277-302におけるMuyldermansによる総説、及び一般的な背景技術として言及される以下の特許出願：Vrije Universiteit Brusselの国際公開第９４／０４６７８号パンフレット、国際公開第９５／０４０７９号パンフレット、及び国際公開第９６／３４１０３号パンフレット；Unileverの国際公開第９４／２５５９１号パンフレット、国際公開第９９／３７６８１号パンフレット、国際公開第００／４０９６８号パンフレット、国際公開第００／４３５０７号パンフレット、国際公開第００／６５０５７号パンフレット、国際公開第０１／４０３１０号パンフレット、国際公開第０１／４４３０１号パンフレット、欧州特許第１１３４２３１号明細書及び国際公開第０２／４８１９３号パンフレット；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）の国際公開第９７／４９８０５号パンフレット、国際公開第０１／２１８１７号パンフレット、国際公開第０３／０３５６９４号パンフレット、国際公開第０３／０５４０１６号パンフレット及び国際公開第０３／０５５５２７号パンフレット；Algonomics N.V.及びAblynx N. V.の国際公開第０３／０５０５３１号パンフレット；カナダのNational Research Councilによる国際公開第０１／９０１９０号パンフレット；Institute of Antibodiesによる国際公開第０３／０２５０２０号パンフレット（＝欧州特許第１４３３７９３号明細書）；並びにAblynx N.V.による国際公開第０４／０４１８６７号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６５号パンフレット、国際公開第０４／０４１８６３号パンフレット、国際公開第０４／０６２５５１号パンフレット、国際公開第０５／０４４８５８号パンフレット、国際公開第０６／４０１５３号パンフレット、国際公開第０６／０７９３７２号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８６号パンフレット、国際公開第０６／１２２７８７号パンフレット及び国際公開第０６／１２２８２５号パンフレット、並びにAblynx N.V.によってさらに公開された特許出願を参照する。これらの出願で言及されるさらなる従来技術、特に国際公開第０６／０４０１５３号パンフレットの４１頁〜４３頁で言及される参考リストも参照する（このリスト及び参考文献は参照により本明細書に援用される）。
【０２０１】
本発明のアミノ酸配列はそれ自体が既知の方法で調製してもよい。例えば、所望のアミノ酸配列は、ペプチド合成又は上記アミノ酸配列をコードする核酸を好適に発現することにより調製してもよい。所望のヌクレオチド配列はそれ自体が既知の核酸合成技法により調製してもよい。
【０２０２】
本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドを調製する一方法は概して、
ａ）本発明のヌクレオチド配列又は核酸を発現する工程を少なくとも含み、任意で
ｂ）このように発現した本発明のアミノ酸配列又は本発明のポリペプチドをそれぞれ単離する工程をさらに含む。
【０２０３】
本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドを調製する別の方法は概して、
ａ）宿主又は宿主細胞が本発明のアミノ酸配列又はポリペプチドを生成するような条件下で本明細書に記載のように上記宿主又は宿主細胞を培養又は維持する工程を少なくとも含み、任意で
ｂ）このようにして得られた本発明のアミノ酸配列又は本発明のポリペプチドをそれぞれ単離する工程とをさらに含む。
【０２０４】
本発明のアミノ酸配列が拘束型（即ち本発明のアミノ酸配列と隣接する隣接配列の間にジスルフィド架橋を含む）で使用される場合、上記の方法は、特許文献１にさらに記載のようにこのようなジスルフィド架橋を形成するさらなる工程を含んでいてもよい。
【０２０５】
本発明は上記の方法により得られたアミノ酸配列、化合物、構築物又はポリペプチドにも関する。
【０２０６】
本明細書中で開示のアミノ酸配列は、タンパク質、化合物（小分子を含むが、これに限定されない）又は他の治療実体等の治療部の半減期を増大させるために融合パートナーとしての利点を伴って使用することができる。
【０２０７】
このため別の態様において、本発明は、その半減期を増大させるために治療化合物との連結又は融合に対して小ペプチド又はペプチド部として使用することができるアミノ酸配列、並びに本発明のアミノ酸配列、構築物又は融合タンパク質が血清タンパク質分子と結合する場合、血清タンパク質分子の半減期が（即ちアミノ酸配列、構築物又は融合タンパク質が結合しない場合の血清タンパク質分子の半減期と比較して)（有意に）低減しないように血清タンパク質と結合することができる、このようなペプチド又はペプチド部を含む構築物及び融合タンパク質を提供する。本発明のこの態様では、「有意に低減しない」とは血清タンパク質分子の半減期（それ自体が既知の好適な技法を使用して測定される）が５０％を超えて低減しない、好ましくは３０％を超えて低減しない、さらにより好ましくは１０％を超えて低減しない、例えば５％を超えて低減しない、又は本質的に全く低減しないことを意味する。
【０２０８】
好ましいが非限定的な別の態様において、本発明のアミノ酸配列は、好ましくは、アミノ酸配列が、ヒト血清アルブミンと結合するか、又はそうでなくとも会合する場合に、アミノ酸配列が示すヒトでの血清半減期が、少なくとも約９日（例えば約９日〜１４日）、好ましくは少なくとも約１０日（例えば約１０日〜１５日）又は少なくとも約１１日（例えば約１１日〜１６日）、より好ましくは少なくとも約１２日（例えば約１２日〜１８日以上）又は１４日超（例えば約１４日〜１９日）となるように、ヒト血清アルブミンと結合するか、又はそうでなくとも会合するようなものである。
【０２０９】
別の態様において本発明は、本明細書中で開示のようにアミノ酸配列を含むか、又はこれから本質的に成る、ポリペプチド又はタンパク質構築物を提供する。
【０２１０】
本発明は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列及び少なくとも１つの治療部を含む化合物又は構築物（本明細書中で「本発明の化合物」とも称される）にも関する。
【０２１１】
例示的なものであり、これに限定されないが、本発明の化合物は、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上の本発明のアミノ酸配列と連結する少なくとも１つの治療部を含み得る。例えば、治療部がタンパク質又はポリペプチドである場合、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列は、タンパク質又はポリペプチドのＣ末端と（直接又は好適なスペーサー若しくはリンカーを介して）；タンパク質又はポリペプチドのＮ末端と（これも直接又は好適なスペーサー若しくはリンカーを介して）；又はＣ末端及びＮ末端の両方と連結され得る。本発明の化合物が２つ以上の本発明のアミノ酸配列を含む場合、これらは同一であってもよく、又は異なっていてもよい。
【０２１２】
治療部はまた、互いに直接又は好適なリンカー若しくはスペーサーを介して連結し得る、少なくとも２つの（例えば、２つ、３つ又は４つの）本発明のアミノ酸配列（同一であってもよく、又は異なっていてもよい）を含む多量体又はコンカテマー（concatamer）と（そのＣ末端、そのＮ末端の一方又は両方のいずれかで、これも直接又は好適なスペーサー若しくはリンカーを介して）連結し得る。このような（二価、三価又は多価の）多量体又はコンカテマー（及びこれをコードするヌクレオチド配列、並びにこれらを含む本発明の化合物）は、本発明のさらなる態様を形成し、単量体の本発明のアミノ酸配列より高い結合活性で血清アルブミンと結合し得る。
【０２１３】
また、本発明の化合物が２つ以上の治療部を含む場合、これらの治療部のそれぞれ（又は両方）は、本明細書中でさらに記載するように、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列と連結し得る。また、２つ以上の治療部は、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列（及び任意でさらなる連結するアミノ酸配列）を含むか、又はこれから本質的に成るリンカーを介して互いに連結することができ、このようなリンカー（及びこれを含む本発明の化合物）は、本発明のさらなる態様を形成する。
【０２１４】
一態様において治療部は、所望の抗原又は標的に指向性を有し、所望の抗原と結合することが可能であり（特に所望の抗原と特異的に結合することが可能であり）、及び／又は所望の標的と相互作用することが可能である。別の実施の形態では、少なくとも１つの治療部は治療タンパク質又はポリペプチドを含むか、又はこれから本質的に成る。さらなる実施の形態では、少なくとも１つの治療部が、免疫グロブリン又は免疫グロブリン配列（免疫グロブリンの断片を含むがこれに限定されない）、例えば抗体又は抗体断片（ＳｃＦｖ断片又はＦａｂ断片を含むが、これらに限定されない）を含むか、又はこれから本質的に成る。さらに別の実施の形態では、少なくとも１つの治療部が、抗体可変ドメイン、例えば重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを含むか、又はこれから本質的に成る。
【０２１５】
好ましいが非限定的な一態様において、１つ又は複数の治療部又は治療実体は、１つ又は複数の結合単位（特許文献１に規定される）又は結合ドメイン（本明細書中で規定する）、即ち所望の標的、抗原又は抗原決定基（例えば治療上関連する標的）と結合することが可能な結合単位又はドメインであり得る。そのため、本発明の化合物は一価、二価、二重特異性、多価又は多重特異性の構築物（特許文献１に規定される）であり得る。結合単位は概して、骨格をベースとする結合単位又はドメイン、例えば免疫グロブリンをベースとする又は免疫グロブリンから誘導される（即ち本明細書中で既に記載の免疫グロブリン配列以外の）結合骨格、プロテインＡドメインから誘導されるタンパク質骨格（例えばアフィボディ（Affibodies）（商標））、テンダミスタット（tendamistat）、フィブロネクチン、リポカリン、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、設計アンキリンリピート、アビマー（avimers）及びＰＤＺドメイン（Binz et al., Nat. Biotech2005, Vol 23:1257）、並びにＤＮＡアプタマー又はＲＮＡアプタマーを含むがこれらに限定されないＤＮＡ又はＲＮＡをベースとする結合部（Ulrich et al., Comb Chem High Throughput Screen 2006 9(8):619-32）を含み得る。
【０２１６】
本発明のアミノ酸配列は、国際公開第０５／１１８６４２号パンフレット（Domantis Ltd.）又は国際公開第０６／０５９１０６号パンフレット（Domantis Ltd.）で言及された「ポリペプチド薬物」の１つ、例えば国際公開第０５／１１８６４２号パンフレットの４５頁〜５０頁で言及されたポリペプチド薬物の１つ；ＩＬ−１ｒａの機能的変異型を含むインターロイキン１受容体のアンタゴニスト（国際公開第０５／１１８６４２号パンフレットの１１頁及び１２頁を参照されたい）；サポリン（国際公開第０５／１１８６４２号パンフレットの１２頁〜１４頁を参照されたい）；国際公開第０５／１１８６４２号パンフレットの表８に挙げられた抗癌ペプチド；及びＧＬＰ−１又はＧＬＰ−１類似体等のインスリン分泌促進剤又はその類似体（国際公開第０６／０５９１０６号パンフレットを参照されたい）とも連結し得る。
【０２１７】
好ましい態様において、少なくとも１つの治療部はドメイン抗体又は単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」又はナノボディ（登録商標）を少なくとも１つ含むか、又はこれから本質的に成る。このため例えば本発明の化合物では、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列は得られる本発明の化合物が一価、二価、多価、二重特異性又は多重特異性の構築物（「一価」、「二価」、「多価」、「二重特異性」及び「多重特異性」という用語は特許文献１又は上記で言及されたAblynx N.V.の特許出願で説明されるようなものである）となるように、１つ又は複数のドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」又はナノボディ（登録商標）と融合又は連結し得る。
【０２１８】
このため本発明の一実施の形態は、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列及び少なくとも１つの免疫グロブリン配列、例えばドメイン抗体、単一ドメイン抗体、「ｄＡｂ」又はナノボディ（登録商標）を含むか、又はこれから本質的に成るタンパク質又はポリペプチド構築物又は融合タンパク質に関する。
【０２１９】
概して好ましくは本発明の化合物は、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、例えば約１日、２日、１週間、２週間又は３週間、及び好ましくは２ヶ月以下の半減期を有するが、後者は必須というわけではない。
【０２２０】
好ましくは、少なくとも１つの本発明のアミノ酸配列及び少なくとも１つの治療部を含む本発明の化合物又はポリペプチドは好ましくは、治療部自体の半減期の少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍又は２０倍超の半減期を有する。例えば、本発明の化合物又はポリペプチドは治療部自体と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、又はさらに２４時間超、４８時間超又は７２時間超増大した半減期を有し得る。
【０２２１】
好ましいが非限定的な本発明の態様において、本発明のこのような化合物又はポリペプチドは、治療部自体と比較して１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、又はさらに２４時間超、４８時間超又は７２時間超増大した血清半減期を有する。
【０２２２】
本発明は、本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物をコードするヌクレオチド配列又は核酸にも関する。本発明はさらに、上記ヌクレオチド配列又は上記核酸を含む遺伝的構築物、及びそれ自体既知の遺伝的構築物の１つ又は複数の要素を含む。遺伝的構築物は、プラスミド又はベクターの形態であり得る。このような遺伝的構築物及び他の遺伝的構築物は当業者に既知である。
【０２２３】
本発明は、このようなヌクレオチド配列又は核酸を含有し、及び／又は本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物を発現する（又は発現可能である）宿主又は宿主細胞にも関する。また、このような宿主又は宿主細胞は当業者に既知である。
【０２２４】
本発明は、概して、本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物を調製する方法であって、本明細書中に記載の宿主細胞を、上記宿主細胞が本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物を生産又は発現する条件下で、培養又は維持することを含み、かつ任意でそのようにして生産されたアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物を単離することをさらに含む、方法にも関する。さらに、このような方法は、本明細書中に記載のAblynx N.V.による同時係属中の特許出願、例えば、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット又は国際公開第０６／１２２８２５号パンフレット中に概して記載されているように実施することができる。
【０２２５】
本発明は、本発明のアミノ酸配列、化合物又は多価及び多重特異性の化合物を包含する医療的使用及び治療方法であって、上記薬剤が、ヒト血清アルブミンの天然の半減期の少なくとも約５０％の間隔での投与に好適であることを特徴とする、医療的使用及び治療方法も包含する。
【０２２６】
本発明は、治療剤（即ち、治療部、化合物、タンパク質又は他の治療的実体）の血清半減期を延長又は増大させる方法にも関する。本方法は、治療剤が本発明のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質又は構築物と結合するか、又はそうでなくとも会合するように、治療剤と上記アミノ酸配列のいずれかとを接触させることを含む。幾つかの実施の形態において、治療剤は、生物学的治療剤、好ましくはペプチド又はポリペプチドであり、この場合、治療剤を接触させる工程は、ペプチド又はポリペプチドと本発明のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質又は構築物とを連結することによって融合タンパク質を調製することを含み得る。
【０２２７】
これらの方法は、治療剤を本発明のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質又は構築物と結合又は会合させた後に、被験体に治療剤を投与することをさらに含み得る。このような方法において、治療剤の血清半減期は、治療剤自体の半減期の少なくとも１．５倍であるか、又は治療剤自体の半減期と比較して、少なくとも１時間（例えば少なくとも６時間、好ましくは少なくとも１２時間、より好ましくは少なくとも１日、例えば２日を超えて、若しくはさらに５日を超えて又はそれ以上）増大する。幾つかの好ましい実施の形態において、治療剤の血清半減期は、対応する治療部自体の半減期の、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍又は２０倍超である。他の好ましい実施の形態において、治療剤の血清半減期は、対応する治療部自体の半減期と比較して、２時間超、６時間超又は１２時間超、増大する。
【０２２８】
上記の方法において、治療剤の血清半減期は、上記（即ちこのようにして得られた本発明の化合物の）血清半減期が治療剤と配列番号１のアミノ酸配列（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）とを含む対応する化合物又は構築物の血清半減期よりも長くなるように増大又は延長するのが好ましい。好ましくは、本発明の化合物の血清半減期は、治療剤と配列番号１のアミノ酸配列（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）とを含む対応する化合物又は構築物の血清半減期と比較して少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、又はさらにより好ましくは少なくとも５０％、例えば１００％超長いか又はさらにより改善する。
【０２２９】
例えばこのような方法において、本発明の化合物の血清半減期は、治療剤と配列番号１のアミノ酸配列（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）とを含む対応する化合物又は構築物の半減期の少なくとも１．１倍、例えば少なくとも１．２倍、より好ましくは少なくとも１．５倍であり、及び／又は治療剤と配列番号１のアミノ酸配列（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）とを含む対応する化合物又は構築物の半減期と比較して少なくとも１時間（例えば少なくとも６時間、好ましくは少なくとも１２時間、より好ましくは少なくとも１日、例えば２日を超えて、若しくはさらに５日を超えて又はそれ以上）増大し得る。幾つかの好ましい実施の形態では、本発明の化合物の血清半減期は、治療剤と配列番号１のアミノ酸配列（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）とを含む対応する化合物又は構築物の半減期の少なくとも２倍、少なくとも３倍又は少なくとも５倍である。
【０２３０】
別の態様において、本発明は、治療剤を修飾する方法であって、上記治療剤の好適な投与時に所望の治療レベルを達成するように、上記治療剤の所望の治療レベルを長時間維持する、方法に関する。
【０２３１】
本方法は、治療剤が、本発明のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質又は構築物と結合するか、又はそうでなくとも会合するように、治療剤と上記アミノ酸配列のいずれかとを接触させることを含む。幾つかの実施の形態において、治療剤は、生物学的治療剤、好ましくは、ペプチド又はポリペプチドであり、この場合、治療剤を接触させる工程は、ペプチド又はポリペプチドと、本発明のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質又は構築物とを連結することによって融合タンパク質を調製することを含み得る。
【０２３２】
これらの方法は、治療剤を本発明のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質又は構築物と結合させるか、又はそうでなくとも会合させた後に、被験体に治療剤を投与することであって、かかる投与時に所望の治療レベルを達成する、投与することをさらに含む。このような方法において、かかる投与時に上記治療剤の所望の治療レベルが維持される時間は、治療剤自体の半減期の少なくとも１．５倍であるか、又は治療剤自体の半減期と比較して、少なくとも１時間増大する。幾つかの好ましい実施の形態において、かかる投与時に上記治療剤の所望の治療レベルが維持される時間は、対応する治療部自体の半減期の少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍又は２０倍超である。他の好ましい実施の形態において、かかる投与時に上記治療剤の所望の治療レベルが維持される時間は、対応する治療部自体の半減期と比較して、２時間超、６時間超又は１２時間超、増大する。
【０２３３】
好ましくは、かかる投与時に上記治療剤の所望の治療レベルが維持される時間は、本発明の化合物に関して本明細書中で規定する頻度で治療剤を投与することができるように増大させる。
【０２３４】
上記の方法において、上記治療剤の所望の治療レベルが維持される時間は、上記（即ちこのようにして得られた本発明の化合物の）血清半減期が、上記治療剤の所望の治療レベルが治療剤と配列番号１のアミノ酸配列（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）とを含む対応する化合物又は構築物により維持される時間よりも長くなるように増大又は延長するのが好ましい。好ましくは、上記治療剤の所望の治療レベルが維持される時間は、上記治療剤の所望の治療レベルが治療剤と配列番号１のアミノ酸配列（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）とを含む対応する化合物又は構築物により維持される時間と比較して、少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、又はさらにより好ましくは少なくとも５０％、例えば１００％超長いか又はさらにより改善する。
【０２３５】
例えばこのような方法において、上記治療剤の所望の治療レベルが維持される時間は、上記治療剤の所望の治療レベルが治療剤と配列番号１のアミノ酸配列（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）とを含む対応する化合物又は構築物により維持される時間の少なくとも１．１倍、例えば少なくとも１．２倍、より好ましくは少なくとも１．５倍であり、及び／又は上記治療剤の所望の治療レベルが治療剤と配列番号１のアミノ酸配列（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）とを含む対応する化合物又は構築物により維持される時間と比較して少なくとも１時間（例えば少なくとも６時間、好ましくは少なくとも１２時間、より好ましくは少なくとも１日、例えば２日を超えて、若しくはさらに５日を超えて又はそれ以上）増大し得る。幾つかの好ましい実施の形態では、上記治療剤の所望の治療レベルが維持される時間は、上記治療剤の所望の治療レベルが治療剤と配列番号１のアミノ酸配列（即ち本発明のアミノ酸配列の代わりとして）とを含む対応する化合物又は構築物により維持される時間の少なくとも２倍、少なくとも３倍又は少なくとも５倍である。
【０２３６】
別の態様において、本発明は、患者の血清中の上記化合物又は上記構築物における治療薬のレベルを増大及び／又は延長させる薬剤を生産する（本明細書中で規定する）本発明の化合物の使用であって、上記化合物又は上記構築物における上記治療薬が、治療薬単独と比較してより低い用量で（即ち、本質的に同一の投与頻度で）投与可能である、使用に関する。
【０２３７】
本発明は、本明細書中に記載の少なくとも１つのアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物と、任意で少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤とを含む、医薬組成物にも関する。このような調製品、担体、賦形剤及び希釈剤は、概して、本明細書中に記載のAblynx N.V.による同時係属中の特許出願、例えば、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット又は国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットに記載されているようなものであり得る。
【０２３８】
しかしながら、本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物は半減期が増大しているため、好ましくは循環に投与される。したがって、本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物が、静脈内等の循環に入ることができる任意の好適な様式、注射若しくは点滴、又は任意の他の好適な様式（経口投与、経皮投与、鼻腔内投与、経肺投与等を含む）で投与することができる。好適な投与方法及び投与経路は、ここでもまた、例えば、国際公開第０４／０４１８６２号パンフレット又は国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットの教示からも当業者には明らかである。
【０２３９】
したがって、別の態様において、本発明は、本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物の使用によって予防又は治療することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、それらを必要とする被験体に対して、薬学的に活性のある量の本発明のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物、及び／又はこれらを含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。当業者には明らかなように、本明細書中に記載のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物を使用することによって予防又は治療することができる疾患及び障害は、概して本発明のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物中に存在する治療部を使用することによって予防又は治療することができる疾患及び障害と同一である。
【０２４０】
本発明では、「予防及び／又は治療」という用語は、疾患を予防する及び／又は治療することを含むだけでなく、概して、疾患の発症を予防すること、疾患の進行を遅延又は逆行させること、疾患に伴う１つ又は複数の症状の発症を予防又は遅延させること、疾患に伴う１つ又は複数の症状を低減及び／又は緩和すること、疾患及び／又は疾患に伴う任意の症状の重症度及び／又は継続期間を低減させること、及び／又は疾患及び／又は疾患に伴う任意の症状の重症度のさらなる増大を予防すること、疾患が引き起こす任意の生理的ダメージを予防、低減又は逆行させること、並びに概して治療すべき患者に有益な任意の薬理学的作用を含む。
【０２４１】
治療すべき被験体は、任意の温血動物であり得るが、特に哺乳動物、より詳細にはヒトである。当業者には明らかなように、治療すべき被験体は、特に、本明細書中で言及される疾患及び障害を患っているか、又はそのリスクがある人である。
【０２４２】
より具体的には、本発明は、本発明のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質又は構築物を投与する頻度が、上記哺乳動物の血清アルブミンの（即ち、人間の場合、ヒト血清アルブミンの）天然の半減期の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である、治療方法に関する。
【０２４３】
本発明の範囲内である哺乳動物への具体的な投与頻度は、上記のように、上記哺乳動物における血清アルブミンの天然の半減期の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は少なくとも１００％である。
【０２４４】
即ち、本発明の範囲内である具体的な投与頻度は、４日毎、５日毎、６日毎、７日毎、８日毎、９日毎、１０日毎、１１日毎、１２日毎、１３日毎、１４日毎、１５日毎、１６日毎、１７日毎、１８日毎又は１９日毎である。
【０２４５】
限定するものではないが、上記で言及した投与頻度は、任意で上記所望の血清レベルの達成を意図する１つ又は複数の（初回）用量を投与した後、アミノ酸配列、化合物、融合タンパク質又は構築物で処理した被験体の血清中のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質又は構築物の所望のレベルを維持するのに特に好適である。当業者には明らかなように、所望の血清レベルは、使用したアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質若しくは構築物及び／又は治療対象の疾患にとりわけ依存し得る。臨床家又は医師は、本発明のアミノ酸配列、化合物、融合タンパク質又は構築物を本明細書中の上記で言及される頻度で投与する場合、上記被験体において所望の血清レベルを達成及び／又は維持するために、所望の血清レベルを選択し、治療すべき被験体に対して投与すべき用量（複数可）及び／又は量（複数可）を選択することが可能である。
【０２４６】
別の実施の形態において、本発明は、免疫療法、特に、受動免疫療法に関する方法であって、本明細書中で言及される疾患及び障害を患っているか、そのリスクがある被験体に対して、薬学的に活性のある量の本発明の融合タンパク質若しくは構築物、及び／又はこれらを含む医薬組成物を投与することを含む、方法に関する。
【０２４７】
アミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物及び／又はこれらを含む組成物は、予防又は治療対象の疾患又は障害の予防及び／又は治療に好適な治療のレジメンに従って投与される。臨床家は、概して、予防又は治療対象の疾患又は障害、治療対象の疾患の重症度及び／又はそれらの症状の重症度、使用する本発明の特定のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物、使用する特定の投与経路及び医薬製剤又は組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態等の因子、並びに同様の臨床家に既知の因子に応じて好適な治療レジメンを決定することができる。
【０２４８】
概して、治療レジメンは、１つ又は複数の本発明のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物、又はこれらを含む１つ若しくは複数の組成物を、１つ又は複数の薬学的に有効な量又は用量で投与することを含む。投与する具体的な量（複数可）又は用量は、ここでもまた、上記で言及した因子に基づいて臨床家が決定することができる。
【０２４９】
概して、対象の疾患及び障害（即ち、治療実体自体の使用を通じて通常治療又は予防するような疾患及び障害）を予防及び／又は治療するために、治療すべき具体的な疾患又は障害、使用する具体的なアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物の効力及び／又は半減期、使用する具体的な投与経路及び具体的な医薬製剤又は組成物に応じて、本発明のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物は、概して１ｇ／ｋｇ体重／日〜０．０１μｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは０．１ｇ／ｋｇ体重／日〜０．１μｇ／ｋｇ体重／日、例えば約１μｇ／ｋｇ体重／日、１０μｇ／ｋｇ体重／日、１００μｇ／ｋｇ体重／日、１０００μｇ／ｋｇ体重／日、又は２０００μｇ／ｋｇ体重／日の量で、連続的に（例えば、点滴によって）、単回の日用量として、又は日中複数の分割用量で投与され得る。臨床家は概して、本明細書中で言及される因子に応じて好適な日用量を決定することが可能である。具体的な症例においては、臨床家が例えば、上記で引用した因子及び専門的判断に基づいてこれらの量からの逸脱を選択する可能性があることも明らかであろう。概して、投与すべき量についての何らかの指針は、本質的に同一の経路を介して投与した同一の標的に対する同程度の通常の抗体又は抗体断片に関して通常投与される量から得ることができるが、親和性／結合活性、効力、体内分布、半減期及び当業者に既知の同様の因子の差異が参酌される。
【０２５０】
通常、上記方法において、単一の本発明のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物を使用する。しかしながら、２つ以上の本発明のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物を（例えば別々の調製物として又は単一の調製物中に組合せて）併用することは、本発明の範囲内である。
【０２５１】
本発明のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物はまた、相乗効果をもたらす場合もあれば、もたらさない場合もある、１つ又は複数のさらなる薬学的に活性な化合物又は成分と組み合わせて、即ち、混合治療レジメンとして使用してもよい。ここでもまた、臨床家が、上記で引用した因子及び専門的判断に基づいて、このようなさらなる化合物又は成分、及び好適な混合治療レジメンを選択することが可能である。
【０２５２】
特に、本発明のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物は、本発明のアミノ酸配列、化合物、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質又は多価若しくは多重特異性の構築物で予防又は治療することができる疾患及び障害の予防及び／又は治療に使用されるか、又は使用することができる他の薬学的に活性な化合物又は成分と併用してもよく、また結果として、相乗効果が得られてもよく、又は得られなくてもよい。
【０２５３】
本発明により使用する治療レジメンの有効性は、臨床家には明らかなように、包含される疾患又は障害に対してそれ自体既知の任意の様式で決定及び／又はフォローされ得る。臨床家は、適宜及び／又はケースバイケースで、特定の治療レジメンを変更又は調整することにより、所望の治療効果を達成し、望まれない副作用を回避、制限又は低減し、及び／又は一方で所望の治療効果を達成することと、他方で望ましくない副作用を回避、制限又は低減することとの適切なバランスを達成することが可能である。
【０２５４】
概して、治療レジメンは、所望の治療効果が達成されるまで及び／又は所望の治療効果が維持される限り継続される。ここでもまた、これは、臨床家によって決定することができる。
【０２５５】
治療すべき被験体は、任意の温血動物であり得るが、特に哺乳動物、より具体的にはヒトである。当業者には明らかなように、治療すべき被験体は、特に、本明細書中で言及した疾患及び障害を患っているか、又はそのリスクがある人間である。
【０２５６】
本発明はこれより以下の非限定的な実験部部分及び非限定的な図面によりさらに説明される。
【実施例】
【０２５７】
実験部
実施例１：本発明のアミノ酸配列の例
本発明のアミノ酸配列の非限定的な例の幾つかは以下の表ＩＩで配列番号２〜配列番号１１５及び配列番号１４７〜配列番号１５７として与えられる。配列番号２〜配列番号１１５の配列のアラインメントは図１で与えられる。
【０２５８】
幾つかの好ましい本発明のアミノ酸配列は太字体及び下線処理で印付けている（例えば配列番号１４を参照されたい）。
【０２５９】
これらの中でも、アミノ酸配列ＰＭＰ５６Ｇ１１（配列番号６８）、ＰＭＰ５６Ｅ４（配列番号１４）、ＰＭＰ５４Ｈ４（配列番号１０６）、ＰＭＰ５４Ｈ５（配列番号３３）、ＰＭＰ５６Ｈ１（配列番号３１）、ＰＭＰ５６Ｅ２（配列番号４７）、ＰＭＰ５６Ｇ３（配列番号３５）、ＰＭＰ５４Ｇ１（配列番号３８）、ＰＭＰ５６Ｆ１（配列番号３０）、ＰＭＰ５４Ｈ２（配列番号４０）、ＰＭＰ５６Ｈ９（配列番号１００）、ＰＭＰ５６Ｆ２（配列番号５１）、ＰＭＰ２６Ａ３（配列番号２６）及び０１Ｂ３（配列番号１１５）が本発明のアミノ酸配列の特に好ましい代表例である。
【０２６０】
配列番号１４７〜配列番号１５７の配列は、上記配列の１つ（この場合、ＰＭＰ５６Ｅ４（配列番号１４））の親和性成熟変異型（以下の実施例９を参照されたい）の幾つかの好ましいが非限定的な例であり、このため幾つかは特に好ましい本発明のアミノ酸配列でもある。これらの中でも、配列５９Ｆ２（配列番号１４９）、５９Ｈ１２（配列番号１５５）及び５９Ｃ２（配列番号１５６）は特に好ましい。
【０２６１】
「１７Ｄ１２」と呼ばれるアミノ酸配列（配列番号１）は本発明のアミノ酸配列ではないが、事前発行されていない特許文献１に記載の比較用のアミノ酸配列である。
【０２６２】
以下の本発明の配列（配列番号２〜配列番号１１５及び配列番号１４７〜配列番号１５７）は全て、ヒト血清アルブミン及びカニクイザル血清アルブミンの両方と交差反応性であることが予測される。配列番号２〜配列番号６０及び配列番号１１５の配列をヒト血清アルブミンとの結合に関して試験し、配列番号６１〜配列番号１１４の配列をカニクイザル由来の血清アルブミンとの結合に関して試験した。配列番号２〜配列番号６０及び配列番号１１５の配列は全て、配列番号１の配列より良好に（実施例２及び／又は実施例３に記載のアッセイを使用して求められるように）ヒト血清アルブミンと結合する（同じことが配列番号６１〜配列番号１１４の配列でも予測される）。配列番号１４７〜配列番号１５７の配列の幾つかで得られるデータを実施例９以下に表す。
【０２６３】
表ＩＩ：本発明のアミノ酸配列の例（配列番号２〜配列番号１１５及び配列番号１４７〜配列番号１５７）
【表３】
2011516603.tif 000004
2011516603.tif 000005
2011516603.tif 000006
【０２６４】
実施例２：ファージＥＬＩＳＡ
５倍段階希釈のファージクローン（約５×１０１１個のファージから開始する）をヒト血清アルブミンでコーティングした（２μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液、４℃で一晩；プレートを室温で１時間Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  Ｔ２０（Pierce）でブロッキングした）９６ウェルのＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに添加した。マイクロタイタープレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、結合ファージを抗Ｍ１３及びヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ複合体（conjugate）（６１０−１３０−１２１、Rockland）を用いて検出した。結合したＩＲＤｙｅの量をＯｄｙｓｓｅｙ（LI-COR Biosciences）で測定した。ファージの希釈液を測定した近赤外蛍光強度に対してプロットした（図２）。クローン５６Ｅ２及びクローン５６Ｆ２はアミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）と比較してＨＳＡとのより強い結合を示す。
【０２６５】
実施例３：溶液結合競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡを選択されたファージクローンに対する相対的な結合親和性を求めるのに行った。９６ウェルのＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを４℃で２μｇ／ｍｌのＨＳＡのコーティングバッファー溶液でコーティングした。プレートを室温で１時間Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  Ｔ２０（Pierce）でブロッキングした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。
【０２６６】
１２．５倍希釈の１０１２個／ｍｌのファージストック６０μｌを様々な濃度のＨＳＡ（１．６ｎＭ〜１００００ｎＭの最終濃度）６０μｌと共に組織培養マイクロタイタープレートにおいて室温で３０分間インキュベートした。非結合ファージを、ウェル混合物１００μｌをＨＳＡでコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐプレートに移し、室温で３０分間インキュベートすることにより捕捉した。ファージが捕捉されたプレートをＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で少なくとも５回洗浄した。結合ファージを抗Ｍ１３及びヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ複合体を用いて検出した。結合したＩＲＤｙｅの量をＯｄｙｓｓｅｙ（LI-COR Biosciences）で測定した。ファージ結合％を以下の式により算出した：ファージ結合％＝競合因子のあるウェルの蛍光シグナル／競合因子のないウェルの蛍光シグナル×１００（図３）。ファージ結合を５０％阻害する溶液中のＨＳＡ濃度であるＩＣ５０は親和性を表す。
【０２６７】
このアッセイを本発明のアミノ酸配列と血清アルブミンとの結合をアミノ酸配列ＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰ（配列番号１）と血清アルブミンとの結合と比較するのに使用する場合、本発明のアミノ酸配列は関連の血清アルブミンと（例えばヒト血清アルブミン）と「より良好に」結合する。
【０２６８】
実施例４：１７Ｄ１２のアラニンスキャニング
ペプチド１７Ｄ１２（配列番号１）のアラニンスキャニングを、ＨＳＡとの結合を改善する突然変異の影響を受けやすい（amenable）ペプチド配列内のアミノ酸を同定するために行った。１７Ｄ１２ペプチドのアミノ酸残基に以下の通りに１〜１８の番号を付けた：
1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18
A  A  S  Y  S  D  Y  D  V  F   G   G   G   T   D F   G   P （配列番号１）
【０２６９】
既に元の配列においてアラニンではなかった個々のアミノ酸をアラニンへと突然変異させ、それぞれの変異型ペプチドのＨＳＡとの結合に対する影響を調べた。１６個の変異型ペプチド構築物（配列番号１の３位〜１８位がアラニンで置換された）をＭ１３バクテリオファージｇｅｎｅＩＩＩとのＮ末端融合体として生成し、ファージを産生した。ファージで発現した変異型ペプチドをＨＳＡとの結合に関して検査した。この結合をファージ上で提示された野生型ペプチドの結合と比較した。Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートを２μｇ／ｍＬのＨＳＡでコーティングし、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｔ２０を用いてブロッキングした。２倍の段階希釈の変異型ファージ又は野生型ファージのＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０＋１０％  Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  Ｔ２０（Pierce）溶液を室温で１．５時間インキュベートした。結合ファージを抗Ｍ１３抗体（２７−９４２０−０１、GE Healthcare）及びヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ７００抗体（６１０−１３０−１２１、Rockland）を使用して検出し、近赤外の蛍光強度をＯｄｙｓｓｅｙ（LI-CORBiosciences）で測定した。根拠を明確にするために、データを２つのグラフで表す（図４Ａ及び図４Ｂ）。ＨＳＡ結合の有意な低減をもたらさなかった１７Ｄ１２におけるアミノ酸置換をランダム化（randomization）のために選択した（上記の配列における下線処理）。
【０２７０】
１７Ｄ１２の親和性成熟のために、６つの残基をアラニンスキャニングデータ及び残基の官能性に基づきｎｎｋコドンを用いたランダム化のために選択した（配列における下線処理）。
【０２７１】
実施例５：クローン０１Ｇ７、０１Ｂ３及び０１Ｃ７の溶液結合競合ＥＬＩＳＡ
以下の表ＩＩＩで挙げられる３つのクローンを以下の通りに溶液結合競合ＥＬＩＳＡで試験した。
【０２７２】
競合ＥＬＩＳＡを選択されたファージクローンに対する相対的な結合親和性を求めるのに行った。９６ウェルのＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを４℃で２μｇ／ｍｌのＨＳＡのコーティングバッファー溶液でコーティングした。プレートを室温で１時間Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  Ｔ２０（Pierce）でブロッキングした。マイクロタイタープレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。
【０２７３】
ファージストック４５μｌを１．６７μＭ（最終１μＭ）のＨＳＡ溶液６５μｌ又は１６．９％  Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  Ｔ２０のＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０溶液６５μｌと共に組織培養マイクロタイタープレートにおいて室温で３０分間プレインキュベートした。非結合ファージを、ウェル混合物１００μｌをＨＳＡでコーティングしたＭａｘｉｓｏｒｐプレートに移し、室温で３０分間インキュベートすることにより捕捉した。ファージが捕捉されたプレートをＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。結合ファージを抗Ｍ１３及びヤギ抗マウスＩＲＤｙｅ複合体を用いて検出した。結合したＩＲＤｙｅの量をＯｄｙｓｓｅｙ（LI-COR Biosciences）で測定した。ファージ結合比を以下の式により算出した：競合因子のあるウェルの蛍光シグナル／競合因子のないウェルの蛍光シグナル（図ＩＩＩ）。
【０２７４】
表ＩＩＩ：溶液結合競合アッセイ
【表４】
2011516603.tif 000007
【０２７５】
実施例６：ナノボディ−Ｅｘｐｅｄｉｔｅ融合タンパク質の構築及びＨＳＡとの結合の解析
ＨＳＡと結合したペプチド１７Ｄ１２（参照）及び５６Ｈ５（配列番号３３、本発明）をそれぞれ、
以下のリンカー配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ−Ｇｌｙ３Ｓｅｒリンカー及び隣接アミノ酸配列ＧＳＡを含む）：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡ［配列番号１４０］
を介して、以下のＣ末端標識：
ＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨ［配列番号１４１］
を用いて、ナノボディ２Ｄ３：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＳＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＮＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＷＲＤＡＧＴＴＷＦＥＫＳＧＳＡＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［配列番号１３７］
のＣ末端で遺伝子的に融合させた。
【０２７６】
得られた融合タンパク質は以下の配列を有していた：
２Ｄ３−１７Ｄ１２融合タンパク質：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＳＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＮＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＷＲＤＡＧＴＴＷＦＥＫＳＧＳＡＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＡＡＳＹＳＤＹＤＶＦＧＧＧＴＤＦＧＰＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨ［配列番号１３８］
２Ｄ３−５６Ｈ５融合タンパク質：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＳＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＮＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＷＲＤＡＧＴＴＷＦＥＫＳＧＳＡＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＡＡＦＹＤＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＡＧＧＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨ［配列番号１３９］
【０２７７】
得られた２Ｄ３−１７Ｄ１２融合タンパク質及び２Ｄ３−５６Ｈ５融合タンパク質とヒト血清アルブミンとの結合を表面プラズモン共鳴解析を使用して求めた。この目的のために、融合タンパク質を大腸菌ＴＧ１細胞で発現させた。融合タンパク質をＩＭＡＣ／ＳＥＣで精製し、ＨＳＡとの結合を、約７０００ＲＵのヒト血清アルブミン（Sigma、純度９９％）及び２４６０ＲＵの関連のないタンパク質抗原（参照）でコーティングしたＣＭ５チップ上に１μＭ及び５μＭの２Ｄ３−１７Ｄ１２融合タンパク質及び２Ｄ３−５６Ｈ５融合タンパク質を注入することによりビアコア（商標）３０００において評価した。チップ（ＣＭ５）のコーティングを活性化にＮＨＳ／ＥＤＣ及び不活性化にエタノールアミン（ビアコアアミンカップリングキット）を使用するアミンカップリングにより行った。ＨＢＳ−ＥＰを１０μｌ／分の流速でフローバッファーとして使用した。試料２０μｌを１２０秒間注入した。２Ｄ３ナノボディを対照として注入した。
【０２７８】
図５は、２Ｄ３−１７Ｄ１２融合タンパク質（図５では２Ｄ３−５６Ｇ４と呼ばれている）と比較した２Ｄ３−５６Ｈ５融合タンパク質とＨＳＡとの結合の改善を示しており、予測通り２Ｄ３は同一の試験濃度では結合しない。ＨＳＡに対する２Ｄ３−５６Ｈ５融合タンパク質の算出した親和性は約１．２μＭである（ｋａ（１／Ｍｓ）＝７．５７×１０３及びｋｄ（１／ｓ）＝９．３×１０−３）。対照として、５μＭの融合タンパク質２Ｄ３−５６Ｈ５を高密度の関連のないタンパク質（２４００ＲＵ）でコーティングしたＣＭ５チップ上に注入したが、特異的な結合は検出されなかった。
【０２７９】
実施例７：雄のカニクイザルにおける薬物動態プロファイル
ナノボディ構築物をＧｌｙ４Ｓｅｒ−Ｇｌｙ３Ｓｅｒ（「９ＧＳ」）リンカー配列を介してペプチド５６Ｅ４（配列番号１４、本明細書中でＰＭＰ５６Ｅ４とも称される）及びナノボディ２Ｄ３（配列番号１３７）の融合体として調製した。
【０２８０】
使用するナノボディ構築物（２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４と称される）の配列は以下の通りであった：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＳＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＮＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＷＲＤＡＧＴＴＷＦＥＫＳＧＳＡＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ［配列番号１４２］。
【０２８１】
陰性対照として、（５６Ｅ４ペプチドを用いずに）ナノボディ２Ｄ３を使用した。
【０２８２】
この２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４ナノボディ構築物（以下、「構築物」又は「試験物」）の薬物動態プロファイルをおよそ３歳齢〜４歳齢の雄のカニクイザルにおいて解析し、２Ｄ３対照（以下「対照」又は「陰性対照」）と比較した。構築物及び対照をそれぞれ３匹のサルに注入した。構築物及び対照は両方とも静注により２ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。血液試料を投与前、投与の５分後、２０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後及び１６時間後、並びに静注開始後の試験２日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１２日目、１５日目、１８日目、２１日目、２４日目、２７日目、３０日目、３３日目、３６日目、３９日目、４２日目、４５日目、４８日目、５１日目、５４日目及び５７日目に採取した。１回のサンプリング当たり１匹の動物につき少なくとも０．２５ｍＬの血清を得るために、十分な容量の全血を各サンプリング時につき採取し、血清を３７℃で１時間のインキュベーション後に単離した。血清試料を−８０℃で保存した。
【０２８３】
血清試料を、以下のＥＬＩＳＡアッセイを使用して構築物及び対照それぞれの血清レベルに関して試験した。
【０２８４】
９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Nunc, Wiesbaden, Germany）を、陰性対照では３μｇ／ｍＬ、及び試験物では４．５μｇ／ｍＬの組換えヒトＥｒｂＢ２／Ｆｃキメラ、ＣＦ（R&D Systems, Minneapolis）のＰＢＳ溶液を用いて３７℃で１時間コーティングした。ウェルを吸引し、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）Ｔ２０  ＰＢＳ（Pierce, Rockford, IL）を用いて室温（ＲＴ）で３０分間ブロッキングした。このブロッキング工程の後、ウェルをＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。
【０２８５】
標準（standards）、ＱＣ試料及び試験試料の希釈液に対して調製をコーティングしていない（ポリプロピレン）プレートで行った。
【０２８６】
検量線及びＱＣ試料：要求される濃度の溶液をＰＢＳ  ０．１％カゼイン中で調製し、１００％サル血清に加えた。標準及びＱＣ試料を調製するために、１０倍希釈の純粋なサル血清希釈液をＰＢＳ−０．１％カゼイン中で作製した。
【０２８７】
試験試料：試験試料の希釈倍率を推測すると、１０倍〜５００倍と様々であった。試料を第１の工程でＰＢＳ  ０．１％カゼインで１０倍に希釈し、必要に応じて、１０％サル血清を含有するＰＢＳ  ０．１％カゼインでさらに希釈を行った。これらの試料希釈液を２つのウェルにおいて１０％サル血清を有するＰＢＳ  ０．１％カゼインでさらに５倍段階希釈した。
【０２８８】
標準、ＱＣ試料及び５倍希釈の試験試料をコーティングプレート上に移し、室温で１時間インキュベートした。その後プレートを洗浄し、プロテインＡに対して精製し、Ｈｅｒ２／Ｆｃを枯渇させたウサギポリクローナル抗ＶＨＨ  Ｋ１を１μｇ／ｍＬでＰＢＳ  ０．１％カゼイン中に添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、２０００倍希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（Dakocytomation, Denmark）のＰＢＳ  ０．１％カゼイン溶液をプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。この酵素は基質ｓＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、SDTの試薬、Brussels, Belgium）と共に化学反応を触媒し、比色変化をもたらす。ＨＣｌ（１Ｎ）を使用して１５分後にこの反応を停止させた後、色の強度を、４５０ｎｍの光の波長を使用して反応生成物の光学密度を求める分光光度計により測定した。
【０２８９】
血清試料における構築物及び対照の濃度をそれぞれ、構築物及び対照の検量線に関して求めた。濃度決定を勾配変化のあるＳ字形の用量応答曲線を使用して行った。血清試料を全て最低でも二連で試験した。平均値を報告した。それぞれの試料に対して、異なる結果間の標準偏差及び正確性を算出した。
【０２９０】
ＰＫプロファイルを図６に表す。
【０２９１】
ナノボディ（登録商標）の算出した最終的な半減期を表ＩＶで要約する。
【０２９２】
表ＩＶ．２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４又は陰性対照（２Ｄ３）の投与後にカニクイザルで得られた最終的な半減期（時間で表す）
【表５】
2011516603.tif 000008
【０２９３】
本実施例７に記載の実験で得られるデータは実施例１３及び図９でも言及されている。
【０２９４】
実施例８：ヒト血清アルブミンを有するＥＸＰ５６Ｅ４に基づくペプチドの結晶構造及びこのペプチドとヒト血清アルブミンとの相互作用のコンピュータでのモデリング
本発明のペプチドとヒト血清アルブミンとの結合相互作用及びエピトープを求めるために、以下のペプチド（ＡＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧＡＡＡ、配列番号１４３）及びヒト血清アルブミンの共結晶の結晶構造を求め、また配列番号１４３のペプチドとヒト血清アルブミンとの間の相互作用をコンピュータでモデリングした。配列番号１４３のペプチドはＥＸＰ５６Ｅ４の配列（配列番号１４）を基としており、ＥＸＰ５６Ｅ４の配列と比較して、さらにＮ末端にアラニン残基及びＣ末端に３つのアラニン残基を含有している。
【０２９５】
配列番号１のアミノ酸配列と比較して、配列番号１４３のアミノ酸配列はＮ末端に１つのさらなるアラニン残基を含有していることに留意されたい。このため、本実施例８で使用される番号では、２位は配列番号１の配列の１位に対応し（表ＩＩも参照されたい）、３位は配列番号１の配列の２位に対応するようなものである。
【０２９６】
結晶構造を以下のように求めた：精製タンパク質を、およそ１２００個の異なる条件の標準スクリーニング及び文献のデータを使用して同定した結晶化条件の両方を用いる結晶化試験に使用した。最初に得られた条件を標準的な戦略、結晶化に強く影響する系統的に変化するパラメータ、例えば温度、タンパク質濃度、減少率等を使用して最適化した。またこれらの条件を、系統的に変化するｐＨ又は沈殿剤濃度により改良した。結晶を共結晶化法により得た。
【０２９７】
結晶を急速冷凍し、１００Ｋの温度で測定した。Ｘ線回折データを低温条件を用いてＳＷＩＳＳ  ＬＩＧＨＴ  ＳＯＵＲＣＥ（SLS,Villigen, Switzerland）で回収した。データはＸＤＳ及びＸＳＣＡＬＥプログラムを使用して処理した。構造を決定及び解析するのに必要となる位相情報を分子置換により得た。続いて、モデル構築及び改良（refinement）をソフトウェアパッケージＣＣＰ４及びＣＯＯＴを用いて行った。ペプチドの数値化をＣＨＥＭＳＫＥＴＣＨプログラムを用いて行った。
【０２９８】
相互作用のモデリングを、Momany et al.（Momany et al. J. Phys. Chem.1975, 79, 2361-2381）に記載のパラメータに基づく力場により、ＩＣＭ−Ｐｒｏ（Molsoft）及びＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（Accelrys）を使用して行った。
【０２９９】
ヒト血清アルブミンに関しては、本実施例８及び本明細書中のさらなる開示のために、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ９８７９７下で与えられる配列を参照する（Minghetti et al., J. Biol. Chem. 261 (15), 6747-6757 (1986)、配列番号１４４）：
【表６】
2011516603.tif 000009
【０３００】
このため、本明細書中でヒト血清アルブミンの特定のアミノ酸残基を参照する場合、このアミノ酸残基の番号は上記の配列に従う。しかしながら、上記の配列が以下のシグナル配列（ｍｋｗｖｔｆｉｓｌｌｆｌｆｓｓａｙｓｒｇｖｆｒｒ、配列番号１４５）を含有することに留意されたい。成熟ヒト血清アルブミンの配列（このシグナル配列を有しない）が以下及び配列番号１４６で与えられる。このポリペプチドは、配列番号１４３のペプチドとの共結晶の結晶構造を決定するのにも使用した：
【表７】
2011516603.tif 000010
【０３０１】
［Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ００８４４及び欧州特許第０３６１９９１号明細書が配列番号１４４の配列と比較してＡＡＡ９８７９７の配列より１つ少ないアミノ酸残基を含有している、ヒト血清アルブミンに関する代替的な合成アミノ酸配列を与えていることにも留意されたい。特にＣＡＡ００８４４の配列では、配列番号１４４のアミノ酸配列と比較して４６３位及び４６４位のアミノ酸残基ＫＨが４６３位で単一アミノ酸残基Ｎに置き換わっている。本明細書で、ヒト血清アルブミンのアミノ酸配列及びそこに存在するアミノ酸残基を参照する場合、配列番号１４４で与えられる配列及び数字を参照する］。
【０３０２】
結晶構造及びモデリングデータから、配列番号１４３のペプチドとヒト血清アルブミンとの結合相互作用に関して以下の観察結果が述べられている。これらの観察結果は例示としてのみ与えられ、本発明を本発明のアミノ酸配列がヒト血清アルブミンにどこで（即ちどのエピトープと）どのように（即ちどのアミノ酸残基を介して）結合するかについての特定の（又は完璧な）説明若しくは仮説に限定しないことに留意されたい。しかしながら、以下に記載の結合相互作用及びエピトープ（複数可）は、本発明のアミノ酸配列がヒト血清アルブミンと結合し得る（好ましい）一方法を構成していると推測される。
【０３０３】
配列番号１４３のペプチドはヒト血清アルブミンのドメインＩの深いサブポケットで結合し、ヒト血清アルブミンドメインＩＩＩ由来の残基との相互作用も幾らか有する。
【０３０４】
特に配列番号１４３のペプチドは、特に以下のアミノ酸残基の１つ又は複数との相互作用を介してヒト血清アルブミンと結合し得る：Ａｓｎ（Ｎ）１３３、Ｐｒｏ（Ｐ）１３４、Ａｓｎ（Ｎ）１３５、Ｌｅｕ（Ｌ）１３６、Ｌｅｕ（Ｌ）１３９、Ａｒｇ（Ｒ）１４１、Ｔｙｒ（Ｙ）１６２、Ｇｌｕ（Ｅ）１６５、Ｉｌｅ（Ｉ）１６６、Ｈｉｓ（Ｈ）１７０、Ｐｈｅ（Ｆ）１７３、Ｐｈｅ（Ｆ）１８１、Ｇｌｙ（Ｇ）２１３、Ｌｙｓ（Ｋ）２１４、Ｓｅｒ（Ｓ）２１７、Ｇｌｎ（Ｑ）４８３、及び／又はＬｙｓ（Ｋ）５４３。これらのアミノ酸残基は上記配列において大文字で示されている。
【０３０５】
ヒト血清アルブミンの一次配列に関して、特に重要な相互作用は、配列番号１４３のペプチドと、残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３、Ｐｒｏ（Ｐ）１３４、Ａｓｎ（Ｎ）１３５、Ｌｅｕ（Ｌ）１３６、Ｌｅｕ（Ｌ）１３９及びＡｒｇ（Ｒ）１４１を含むアミノ酸残基のストレッチとの；残基Ｔｙｒ（Ｙ）１６２、Ｇｌｕ（Ｅ）１６５、Ｉｌｅ（Ｉ）１６６、Ｈｉｓ（Ｈ）１７０、Ｐｈｅ（Ｆ）１７３、Ｐｈｅ（Ｆ）１８１を含むアミノ酸残基のストレッチとの；及び／又は残基Ｇｌｙ（Ｇ）２１３、Ｌｙｓ（Ｋ）２１４及びＳｅｒ（Ｓ）２１７を含むアミノ酸残基のストレッチとの相互作用であると考えられる。
【０３０６】
ヒト血清アルブミンの三次構造（Ｘ線及びモデリングデータから推測される）に関して、特に重要な相互作用は、配列番号１４３のペプチドと、ヒト血清アルブミンにおける（数ある残基の中でも）残基Ｌｅｕ（Ｌ）１３９、Ｇｌｕ（Ｅ）１６５、Ｉｌｅ（Ｉ）１６６、Ｈｉｓ（Ｈ）１７０、Ｐｈｅ（Ｆ）１７３、Ｐｈｅ（Ｆ）１８１、Ｇｌｙ（Ｇ）２１３、Ｌｙｓ（Ｋ）２１４、Ｓｅｒ（Ｓ）２１７及びＧｌｎ（Ｑ）４８３より形成されるどちらかといえば疎水性であるサブポケットとの相互作用であると考えられる。
【０３０７】
配列番号１４３のペプチドにおける３つのＮ末端アラニン残基（Ａｌａ−１〜Ａｌａ−３）はＸ線構造では見ることができない。コンピュータでのモデリングの結果により、これらのアラニン残基がヒト血清アルブミンに接し得ることが示唆されている。
【０３０８】
配列番号１４３のペプチドにおける４位のＡｒｇ（Ｒ）残基は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）１３３及びＡｓｎ（Ｎ）１３５と水素結合を形成する可能性があり、またヒト血清アルブミンのＰｒｏ（Ｐ）１３４及びＬｅｕ（Ｌ）１３６残基の主鎖の酸素原子との静電相互作用を形成し得る。また配列番号１４３のペプチドにおける４位のＡｒｇ（Ｒ）残基は、配列番号１４３のペプチドの７位のＡｓｐ（Ｄ）残基との内部水素結合を形成し得る。結晶構造及びモデリングデータにより、この残基が配列番号１４３のペプチドとヒト血清アルブミンとの間の相互作用に重要な残基である可能性があることが示唆される。
【０３０９】
配列番号１４３のペプチドの５位のＴｙｒ（Ｙ）残基は、その主鎖を介してヒト血清アルブミンのＬｙｓ（Ｋ）５４３残基と水素結合を形成する可能性がある。結晶構造及びモデリングデータにより、配列番号１４３のペプチドにおける５位のＴｙｒ（Ｙ）残基はＨＳＡのサブポケットに位置し、配列番号１４３のペプチドの６位のＴｒｐ（Ｗ）残基によって安定化する可能性があることがさらに示唆されている。結晶構造及びモデリングデータにより、この残基が配列番号１４３のペプチドとヒト血清アルブミンとの間の相互作用に重要な残基である可能性があること、及びこの位置のＴｙｒ残基の芳香族性は厳密にこの位置である必要はないが（データは他の疎水性残基がこの位置に存在し得ることを示唆している）、配列番号１４３のペプチドの６位のＴｒｐ残基による安定化に寄与し得ることも示唆されている。
【０３１０】
配列番号１４３のペプチドにおける６位のＴｒｐ（Ｗ）残基は、ヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８とＬｙｓ（Ｋ）５４３残基との間にうまく位置していると考えられ、ヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１３８残基との強い静電相互作用を形成する可能性がある。またＴｒｐ（Ｗ）残基の芳香族性はこれらの相互作用に、及び配列番号１４３のペプチドにおける５位のＴｙｒ（Ｙ）残基との安定化に重要であり得ると考えられる。結晶構造及びモデリングデータにより、この残基が配列番号１４３のペプチドとヒト血清アルブミンとの間の相互作用に重要な残基である可能性があることが示唆されている。カニクイザル、マウス及びラットの血清アルブミンにおいて、１３８位のアミノ酸残基はＡｒｇ（Ｒ）ではなくＰｒｏ（Ｐ）であり、このことがヒト血清アルブミンと比較して、カニクイザル、マウス及び／又はラットの血清アルブミンに対する本発明のアミノ酸配列の結合親和性の低減をもたらし得ることにも留意されたい。
【０３１１】
配列番号１４３のペプチドにおける７位のＡｓｐ（Ｄ）残基は、配列番号１４３のペプチドにおける４位のＡｒｇ（Ｒ）残基との内部水素結合を形成する可能性があり、そのためペプチドの局所立体構造に重要であり得る。結晶構造及びモデリングデータにより、この残基がヒト血清アルブミンのＨｉｓ（Ｈ）１７０残基と、即ちその主鎖の酸素原子（データからは、Ａｓｐ−７の側鎖はヒト血清アルブミンとの有意な相互作用を有しているとは考えられない）を介して水素結合を形成する可能性があり得ることも示唆されている。
【０３１２】
配列番号１４３のペプチドにおける８位のＴｙｒ（Ｙ）残基は、ヒト血清アルブミンのＨｉｓ（Ｈ）１７０、Ｌｙｓ（Ｋ）２１４、Ｓｅｒ（Ｓ）２１７及びＧｌｎ（Ｑ）４８３残基により形成される疎水性のサブポケットで結合すると考えられ、またヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のＨｉｓ（Ｈ）１７０残基との芳香族相互作用、及び／又は配列番号１４３のペプチドの１１位のＰｈｅ（Ｆ）残基との内部芳香族相互作用を有し得る。結晶構造及びモデリングデータにより、この残基が、配列番号１４３のペプチドとヒト血清アルブミンとの間の相互作用に重要な残基である可能性があるが、上述の疎水性のサブポケットとの形状の相補性がさらに改善する可能性があるので、８位で別の疎水性残基に置き換わる可能性もあり得ることが示唆されている。
【０３１３】
配列番号１４３のペプチドにおける９位のＡｓｐ（Ｄ）残基は、ヒト血清アルブミンのＬｙｓ（Ｋ）５４３残基との静電相互作用を受けると考えられ、また一部が溶媒に曝露されていると考えられる。結晶構造及びモデリングデータにより、このような置換がヒト血清アルブミンにおいてカルボン酸基をＬｙｓ（Ｋ）５４３に近づけ、そのためこれらの静電相互作用をさらに改善することができるので、この残基は同じ位置でＧｌｕ（Ｅ）残基に置き換わる可能性があることがさらに示唆されている。
【０３１４】
配列番号１４３のペプチドにおける１０位のＶａｌ（Ｖ）残基は、ヒト血清アルブミンのＬｅｕ（Ｌ）１３９、Ｇｌｕ（Ｅ）１６５、Ｉｌｅ（Ｉ）１６６及びＨｉｓ（Ｈ）１７０残基により形成される疎水性のサブポケットで結合すると考えられる。結晶構造及びモデリングデータにより、ヒト血清アルブミンとの重要な疎水性相互作用及び良好な形状の相補性から、この残基が配列番号１４３のペプチドとヒト血清アルブミンとの間の相互作用に重要な残基であることが示唆されている。
【０３１５】
配列番号１４３のペプチドにおける１１位のＰｈｅ（Ｆ）残基は、ヒト血清アルブミンのＩｌｅ（Ｉ）１６６、Ｈｉｓ（Ｈ）１７０、Ｐｈｅ（Ｆ）１７３、Ｐｈｅ（Ｆ）１８１及びＧｌｙ（Ｇ）２１３残基により形成されるヒト血清アルブミンの深い疎水性のサブポケットで結合すると考えられる。また、配列番号１４３のペプチドにおける１１位のＰｈｅ（Ｆ）残基の主鎖の酸素原子は、ヒト血清アルブミンにおいてＴｙｒ（Ｙ）１６２残基との水素結合を形成する可能性があると考えられる。結晶構造及びモデリングデータにより、この残基が配列番号１４３のペプチドとヒト血清アルブミンとの間の相互作用に重要な残基である可能性があることが示唆されている。
【０３１６】
配列番号１４３のペプチドの１２位〜１４位の３つのグリシン残基は、ヒト血清アルブミンのドメインＩに深く結合し、回転して（make a turn）任意でヒト血清アルブミンの表面と好適に適合すると考えられる。結晶構造及びモデリングデータにより、この残基が配列番号１４３のペプチドとヒト血清アルブミンとの間の相互作用に重要である可能性があることが示唆されている。
【０３１７】
配列番号１４３のペプチドの１５位のＴｈｒ（Ｔ）残基は、Ｌｅｕ（Ｌ）１３９及びＡｒｇ（Ｒ）１４１残基との主鎖の水素結合を２つ形成すると考えられる。さらに、配列番号１４３のペプチドの１５位のＴｈｒ（Ｔ）残基は、配列番号１４３のペプチドの７位のＡｓｐ（Ｄ）残基との内部水素結合を形成すると考えられ、また配列番号１４３のペプチドの９位のＡｓｐ（Ｄ）残基との安定化に寄与する内部水素結合を形成する可能性がある。
【０３１８】
配列番号１４３のペプチドの１６位のＰｒｏ（Ｐ）残基は、配列番号１４３のペプチドの１５位のＴｈｒ（Ｔ）残基により形成される２つの水素結合の位置決め（及び／又は２つの水素結合に最適な立体構造の拘束）における機能を有し得る。
【０３１９】
Ｘ線構造から、Ｘ線構造では見られない配列番号１４３のペプチドのＣ末端部分に関する観察を行うことはできない。モデリングにより、Ｃ末端ストレッチは、（おそらく他のＣ末端残基と比較してヒト血清アルブミンと最も近いＣ末端由来の残基である１６位のＶａｌ（Ｖ）残基を除いて）ＨＳＡと相互作用しないことが示唆されている。モデリングデータにより、１６位のＶａｌ残基が、ヒト血清アルブミンのＡｒｇ（Ｒ）１１４残基と相互作用することができる可能性があるより大きい（ｄ−）残基（例えば特に、Ｇｌｕ残基）により置き換わっている可能性が示唆されており、またこのようにして配列番号１４３のペプチドの６位（ＨＳＡ）のＴｒｐ（Ｗ）残基のさらなる安定化にも間接的に寄与すると考えられる。
【０３２０】
同様に、上述のＸ線及びモデリングデータ、並びにこのデータに基づき述べられる観察結果は非限定的であり、例示としてのみ与えられるが、上記で言及されるものに対応する位置で同じ又は同程度のアミノ酸配列を有する他のアミノ酸配列が、配列番号１４３のペプチドに関して上記の相互作用と本質的に同じ及び／又は本質的に同様のヒト血清アルブミンとの相互作用を受けること、及びヒト血清アルブミンの一次配列におけるアミノ酸残基の上述のストレッチ、及び／又は上記のヒト血清アルブミン上の結合ポケットが、本発明のアミノ酸配列とヒト血清アルブミンとの結合に重要なエピトープを１つ又は複数形成することが推測される。
【０３２１】
実施例９：本発明のアミノ酸配列の親和性成熟
本実施例では、５６Ｅ４（ＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ、配列番号１４）を親和性成熟に関する開始点として選択した。８つの残基（太字／下線処理）を５６Ｅ４に関するコーディング配列を使用して簡素な（parsimonious）突然変異誘発を介したランダム化のために選択したが、塩基の７０：１０：１０：１０混合物（元の塩基７０％及び他の３塩基１０％）を用いて合成し、それにより各ランダム化位置で５０％頻度の野生型のアミノ酸を得た。
【０３２２】
ランダム化ペプチドは、ｐＵＣ１９由来ファージミドベクターを使用してｇｅｎｅＩＩＩタンパク質とのＮ末端融合体としてＭ１３バクテリオファージの表面で発現した。溶液中選択を、１μＭ〜１ｎＭの範囲の濃度のビオチン化ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ：Ａ５７６３、Sigma）を使用して４回行った。ブロッキング剤としてのオボアルブミン又はカゼインの存在下で２時間インキュベートした後、ビオチン化ＨＳＡと結合したファージをニュートラアビジン上で捕捉し、洗浄の後、結合ファージを１００ｍＭのトリエチルアミンで溶出し、１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）で中和した。
【０３２３】
３回及び４回の選択のそれぞれの後、モノクローナルファージを、実施例２に記載のようにＨＳＡ上での結合に関してスクリーニングした。ＨＳＡと結合するクローン（図７Ａ〜図７Ｃ及び表Ｖ）を、実施例５に記載のようにファージ競合ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。ファージの結合比を以下の式により算出した：２μＭの競合因子を有するウェルの蛍光シグナル／競合因子を有しないウェルの蛍光シグナル（表ＶＩ）。
【０３２４】
表Ｖ：ＨＳＡと結合する５６Ｅ４（最上部に示される）の親和性成熟から得られるクローンのアラインメント
【表８】
2011516603.tif 000011
【０３２５】
表ＶＩ：５６Ｅ４、５９Ｃ２、５９Ｆ２及び５９Ｈ１２に関する溶液結合競合アッセイ
【表９】
2011516603.tif 000012
【０３２６】
実施例１０：ナノボディ−Ｅｘｐｅｄｉｔｅ融合タンパク質の構築及びＨＳＡとの結合解析
ＨＳＡ結合ペプチド５６Ｅ４（参照）、５９Ｃ２、５９Ｆ２はそれぞれ、配列番号１４０のリンカー配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ−Ｇｌｙ３Ｓｅｒリンカーと隣接アミノ酸配列ＧＳＡとを含む）及び配列番号１４１のＣ末端標識を使用して、ナノボディ２Ｄ３（配列番号１３７）のＣ末端で遺伝子的に融合した。得られた融合タンパク質（これに関する配列は以下に与えられる）は大腸菌ＴＧ１細胞で発現させ、標準的なベクター、条件及び技法を使用してＩＭＡＣ／ＳＥＣにより精製した。
【０３２７】
２Ｄ３−９ＧＳ−５６Ｅ４−ＭｙｃＨｉｓ：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＳＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＮＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＷＲＤＡＧＴＴＷＦＥＫＳＧＳＡＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＡＡＲＹＷＤＹＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨ［配列番号１５８］
【０３２８】
２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｆ２−ＭｙｃＨｉｓ：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＳＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＮＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＷＲＤＡＧＴＴＷＦＥＫＳＧＳＡＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＡＡＲＹＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨ［配列番号１５９］
【０３２９】
２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｃ２−ＭｙｃＨｉｓ：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＳＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＮＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＷＲＤＡＧＴＴＷＦＥＫＳＧＳＡＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＡＡＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨ［配列番号１６０］
【０３３０】
２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｈ１２−ＭｙｃＨｉｓ：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＳＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＮＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＷＲＤＡＧＴＴＷＦＥＫＳＧＳＡＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＡＡＡＲＳＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡＨＨＨＨＨＨ［配列番号１６１］
【０３３１】
得られた２Ｄ３−９ＧＳ−５６Ｅ４−ＭｙｃＨｉｓ、２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｃ２−ＭｙｃＨｉｓ、２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｆ２−ＭｙｃＨｉｓ及び２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｈ１２−ＭｙｃＨｉｓ融合タンパク質とヒト及びカニクイザルの血清アルブミン（それぞれＨＳＡ及びＣＳＡ）との結合を、表面プラズモン共鳴解析を使用して求めた。この目的のために、ＨＳＡ及びＣＳＡとの結合を、約３０００ＲＵのＨＳＡ又はＣＳＡでコーティングしたＣＭ５チップ上に２μＭ〜２００ｎＭの範囲の濃度系列の融合タンパク質を注入することによりビアコア（商標）３０００で評価した。チップ（ＣＭ５）のコーティングを活性化にＮＨＳ／ＥＤＣ及び不活性化にエタノールアミン（ビアコアアミンカップリングキット）を使用するアミンカップリングにより行った。ＨＢＳ−ＥＰを４５μｌ／分の流速でフローバッファーとして使用した。試料９０μｌを１２０秒間注入した。
【０３３２】
図８Ａ及び図８Ｂは、２Ｄ３−９ＧＳ−５６Ｅ４−ＭｙｃＨｉｓと比較した、２Ｄ３ー９ＧＳ−５９Ｃ２−ＭｙｃＨｉｓ、２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｆ２−ＭｙｃＨｉｓ及び２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｈ１２−ＭｙｃＨｉｓ融合タンパク質とＨＳＡ及びＣＳＡとの結合の改善を示す。算出した親和性を表ＶＩＩに示す。
【０３３３】
表ＶＩＩ：ＭｙｃＨｉｓ標識２Ｄ３−Ｅｘｐｅｄｉｔｅ融合体に関する動態値
【表１０】
2011516603.tif 000013
【０３３４】
実施例１１：ＰＫ試験のための抗ＨＥＲ２ナノボディ−Ｅｘｐｅｄｉｔｅ融合タンパク質の構築
２つのＮ末端アラニン残基を有しないＨＳＡ結合ペプチド５９Ｃ２（ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ、配列番号１６２）を、抗ＨＥＲ２ナノボディ２Ｄ３（配列番号１３７）のＣ末端でＧｌｙ４Ｓｅｒ−Ｇｌｙ３Ｓｅｒ（９ＧＳ）リンカー配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ、配列番号１６３）と遺伝子的に融合させた。融合タンパク質を発現させ、実施例１２に記載のものと本質的に同じように生成した。
【０３３５】
得られた融合タンパク質は以下の配列を有していた：
２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｃ２：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＳＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＡＭＳＷＶＲＱＶＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＮＷＳＧＴＨＴＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＮＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＮＷＲＤＡＧＴＴＷＦＥＫＳＧＳＡＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ［配列番号１６４］
【０３３６】
２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｃ２とヒト、カニクイザル及びヒヒの血清アルブミンとの結合を、表面プラズモン共鳴解析を使用して求め、本質的に実施例７に記載のように、２Ｄ３−９ＧＳ−５６Ｅ４（配列番号１４２）の結合と比較した。この結合を、約３０００ＲＵのＨＳＡ又はＣＳＡでコーティングしたＣＭ５チップ上に２μＭ〜２００ｎＭの範囲の濃度系列の融合タンパク質を注入することによりビアコア（商標）３０００で求めた。チップ（ＣＭ５）のコーティングを活性化にＮＨＳ／ＥＤＣ及び不活性化にエタノールアミン（ビアコアアミンカップリングキット）を使用するアミンカップリングにより行った。ＨＢＳ−ＥＰを４５μｌ／分の流速でフローバッファーとして使用した。試料９０μｌを１２０秒間注入した。算出した親和性を表ＶＩＩＩに示す。
【０３３７】
表ＶＩＩＩ：２Ｄ３−９ＧＳ−５６Ｅ４及び２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｃ２に関する動態値
【表１１】
2011516603.tif 000014
【０３３８】
実施例１２：ＰＫ／ＰＤ試験のための抗ｖＷＦナノボディ−Ｅｘｐｅｄｉｔｅ融合タンパク質の構築
ＨＳＡ結合ペプチド５９Ｃ２（２つのＮ末端アラニン残基を有しない、配列番号１６２）は、単量体として、又は２つのペプチド間にＧｌｙ４Ｓｅｒ−Ｇｌｙ３Ｓｅｒ（９ＧＳ）リンカー配列を有する二量体（ＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ、配列番号１６５）として、二価の抗ｖＷＦナノボディ１２Ａ２＿ｓｖ１−ＡＡＡ−１２Ａ２＿ｓｖ１（ｖＷＦ−００１）：
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＹＮＰＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＲＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲＡＥＱＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＹＮＰＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＲＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲＡＥＱＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［配列番号１６６］
と、Ｃ末端で、又は２つのＶＨＨ構成要素間にＧｌｙ４Ｓｅｒ−Ｇｌｙ３Ｓｅｒ（９ＧＳ）リンカーを介して遺伝子的に融合した。
【０３３９】
生成のために、構築物を発現するｐＡＸ１０２プラスミドを含有する大腸菌株ＴＧ１を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン（Ｋａｎ）及び２％グルコースを添加したＴＢ  ２００ｍＬで接種し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩インキュベートした。各構築物で、ＴＢＫａｎ（５０ｍｇ／Ｌ）＋２％グルコースの入った１×１０Ｌ容のバイオリアクタを５０倍希釈の得られた一晩前培養物で接種し、以下のバッチ段階中に３７℃でさらに成長させ、バイオマスを得た。３時間後、培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、ＯＤ６００が１０を超えるまで誘導段階中に３０℃でさらに３時間成長させた。培養物を遠心分離により回収し（Sigma製の８Ｋ１０ローター、７０００ｒｐｍ、２０分、４℃）、その後透明になった（clarified）発酵ブロスを４℃で保存し、細胞ペレットを−２０℃で保存した。
【０３４０】
精製のために、ペリプラズム抽出物を、ペレットを１Ｌ〜１．５Ｌのペリプラズムバッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０））中に再懸濁し、２００ｒｐｍで振盪プラットフォーム上で４℃で４０分間インキュベートすることにより調製した。懸濁液を７０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、細胞残屑をペリプラズム抽出物から取り除いた後、０．４５μｍのフィルターを使用して濾過工程を行った。融合タンパク質を全て、ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（Poros）を使用して親和性クロマトグラフィにより捕捉した後、ｖＷＦ−ＥＸＰ分子ではＣＥＸ［Ｐｏｒｏｓ  ５０ＨＳ（Poros）；平衡バッファー：ＰＢＳ、溶出バッファー：ＰＢＳ／１ＭのＮａＣｌ、その後Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｓ上のｖＷＦ００５６に対する結合及び溶出；平衡バッファー：２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、７５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ＝８．０）及び溶出バッファー：２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、１７５ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ＝８．０）］又は２Ｄ３−ＥＸＰ５９Ｃ２ではＡＥＸ［Ｐｏｒｏｓ  ５０ＨＱ（Poros）；平衡バッファー：２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６６）、溶出バッファー：２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．７９）−５００ｍＭのＮａＣｌ］のいずれかによって中間精製工程を行った。最終的に、全ての試料をＬＰＳ除去のためにＯＧＰで処理した後、Ｄ−ＰＢＳ中でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ｐｇ（GE Healthcare）を使用して最終サイズ排除クロマトグラフィ工程を行った。ＯＤ２８０ｎｍを測定し、様々な融合体に対する濃度を算出した。滅菌濾過の後、試料を−２０℃で保存した。ＬＣ／ＭＳ解析は、実測（experimentallyobserved）質量はそれぞれ、各構築物の理論的な期待質量と一致していることを示していた。
【０３４１】
得られる融合タンパク質は以下の配列を有していた：
１２Ａ２＿ｓｖ１−９ＧＳ−５９Ｃ２−９ＧＳ−１２Ａ２＿ｓｖ１（ｖＷＦ−００５３）：
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＹＮＰＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＲＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲＡＥＱＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＹＮＰＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＲＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲＡＥＱＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［配列番号１６７］
【０３４２】
１２Ａ２＿ｓｖ１−９ＧＳ−５９Ｃ２−９ＧＳ−５９Ｃ２−９ＧＳ−１２Ａ２＿ｓｖ１（ｖＷＦ−００５４）：
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＹＮＰＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＲＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲＡＥＱＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＹＮＰＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＲＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲＡＥＱＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［配列番号１６８］
【０３４３】
１２Ａ２＿ｓｖ１−ＡＡＡ−１２Ａ２＿ｓｖ１−９ＧＳ−５９Ｃ２（ｖＷＦ−００５５）：
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＹＮＰＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＲＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲＡＥＱＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＹＮＰＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＲＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲＡＥＱＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ［配列番号１６９］
【０３４４】
１２Ａ２＿ｓｖ１−ＡＡＡ−１２Ａ２＿ｓｖ１−９ＧＳ−５９Ｃ２−９ＧＳ−５９Ｃ２（ｖＷＦ−００５６）：
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＹＮＰＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＲＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲＡＥＱＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＡＡＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＹＮＰＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡＩＳＲＴＧＧＳＴＹＹＰＥＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＲＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＡＧＶＲＡＥＱＧＲＶＲＴＬＰＳＥＹＴＦＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧＧＧＧＧＳＧＧＧＳＲＤＷＤＦＤＶＦＧＧＧＴＰＶＧＧ［配列番号１７０］
【０３４５】
実施例１３：雄のカニクイザルにおける薬物動態プロファイル：一価のナノボディ
試験したナノボディ構築物はペプチド５９Ｃ２（配列番号１５６）とナノボディ２Ｄ３（配列番号１３７）との融合体であった。この構築物（２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｃ２）の配列は実施例１１及び配列番号１６４で与えられる。
【０３４６】
本実施例１３及びそれに対応する図９において、実施例７で得られるものとは別の本発明の構築物（２Ｄ３−９ＧＳ−５６Ｅ４、配列番号１４２）に関するデータも提示している。
【０３４７】
陰性対照として、ナノボディ２Ｄ３を使用した。
【０３４８】
血液サンプリング及びプロセシングのために、構築物（２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４及び２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２）、及び陰性対照２Ｄ３の薬物動態プロファイルをおよそ３歳齢〜４歳齢の雄のカニクイザルで求め、対照（２Ｄ３）のものと比較した。構築物及び対照を静脈内ボーラス注射により２ｍｇ／ｋｇの用量で３匹のサルに投与した。２Ｄ３及び２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４に関する血液試料を、投与前、投与の５分後、２０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後及び１６時間後（試験１日目）、並びに試験２日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１２日目、１５日目、１８日目、２１日目、２４日目、２７日目、３０日目、３３日目、３６日目、３９日目、４２日目、４５日目、４８日目、５１日目、５４日目及び５７日目に採取した。その一方で、２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｃ２に関する血液試料は最大試験３３日目までしか採取しなかった。１回のサンプリング当たり１匹の動物につき少なくとも０．２５ｍＬの血清を得るために、十分な容量の全血を各サンプリング時につき採取し、血清を３７℃で１時間のインキュベーション後に単離した。解析するまで血清試料を−８０℃で保存した。
【０３４９】
サル血清における構築物及び対照物の生物分析測定のために、血清試料を、以下のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、それぞれ構築物及び対照の血清レベルに関して試験した。９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Nunc, Wiesbaden, Germany）を、３７℃で１時間、陰性対照では３μｇ／ｍＬで及び試験物では４．５μｇ／ｍＬで組換えヒトＥｒｂＢ２／Ｆｃキメラ、ＣＦ（R&D Systems, Minneapolis）のＰＢＳ溶液でコーティングした。ウェルを吸引し、室温（ＲＴ）で３０分間ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）Ｔ２０  ＰＢＳ（Pierce, Rockford, IL）でブロッキングした。このブロッキング工程の後、ウェルをＰＢＳ−０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。標準、ＱＣ試料、及び試験試料の希釈液に対して、調製をコーティングしていない（ポリプロピレン）プレートで行った。
【０３５０】
検量線及びＱＣ試料を以下の通りに得た：要求される濃度の溶液をＰＢＳ  ０．１％カゼイン中で調製し、１００％サル血清に加えた。標準及びＱＣ試料を調製するために、１０倍希釈の純粋なサル血清希釈液をＰＢＳ−０．１％カゼイン中で作製した。
【０３５１】
試験試料の希釈倍率を推測すると、１０倍〜５００倍と様々であった。試料を第１の工程でＰＢＳ  ０．１％カゼインで１０倍に希釈し、必要に応じて、１０％サル血清を含有するＰＢＳ  ０．１％カゼインでさらに希釈を行った。これらの試料希釈液を２つのウェルにおいて１０％サル血清を有するＰＢＳ  ０．１％カゼインでさらに５倍段階希釈した。
【０３５２】
標準、ＱＣ試料及び５倍希釈の試験試料をコーティングプレート上に移し、室温で１時間インキュベートした。その後プレートを洗浄し、プロテインＡに対して精製し、Ｈｅｒ２／Ｆｃを枯渇させたウサギポリクローナル抗ＶＨＨ  Ｋ１を１μｇ／ｍＬでＰＢＳ  ０．１％カゼイン中に添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、２０００倍希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（Dakocytomation, Denmark）のＰＢＳ  ０．１％カゼイン溶液をプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。この酵素は基質ｓＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、SDTの試薬、Brussels, Belgium）との化学反応を触媒し、比色変化をもたらす。ＨＣｌ（１Ｎ）を使用して１５分後にこの反応を停止させた後、色の強度を、４５０ｎｍの光の波長を使用して反応生成物の光学密度を求める分光光度計により測定した。
【０３５３】
血清試料における構築物及び対照の濃度をそれぞれ、構築物及び対照の検量線に関して求めた。濃度決定を勾配変化のあるＳ字形の用量応答曲線を使用して行った。血清試料を全て最低でも二連で試験した。平均値を報告した。それぞれの試料に対して、種々の結果間の標準偏差及び正確性を算出した。
【０３５４】
薬物動態データの解析のために、記述統計量（平均及びＳＤ）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７を使用して１つの用量群当たり及び１つのサンプリング時点当たりで算出した。３つ全ての値がＢＱＬであった場合に、ＢＱＬを報告した。３つの値の内、１つ又は２つがＢＱＬであった場合、ＢＱＬ値を０に設定し、平均を算出した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏ  ５．１（Pharsight Corporation, USA; 2006）を使用して、個々の血清濃度−時間プロファイルを非コンパートメント解析（ＮＣＡ）（モデル２０１、静脈内ボーラス注射）にかけた。線形上昇／対数減少論（lin up/log down rule）を用いて曲線下面積（ＡＵＣ）を評価した。ＬＬＯＱを超える２つの値の間に含まれていた場合０に設定したことを除き、ＬＬＯＱ値を欠測（missing）として扱った。時点０の濃度（Ｃ０）を、２つの第１のデータ点に基づき逆算（back-calculation）により評価した。最終的な排出半減期（ｔ１／２）を、最終段階の対数−線形部の非ゼロ濃度−時間データの対数−線形回帰を用いて機械的に算出した（ベスト−フィット）。３点の最小値をλｚの決定に関して考慮した。
【０３５５】
以下の主となる薬物動態パラメータを評価した：時点０での血清濃度（Ｃ０）、無限大に外挿された血清濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ）、総身体クリアランス（ＣＬ）、定常状態の分布容積（Ｖｄｓｓ）、及び最終的な半減期（ｔ１／２）。
【０３５６】
結果（本実施例１３に記載の構築物２Ｄ３−９ＧＳ−５９Ｃ２、及び実施例７に記載の構築物２Ｄ３−９ＧＳ−５６Ｅ４の両方に関する）を図９に示す。この図９では、雄のカニクイザルにおいて２ｍｇ／ｋｇの２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４、２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２（試験物）及び２Ｄ３（対照物）をそれぞれ静脈内ボーラス投与した後の２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４、２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２及び２Ｄ３の平均血清濃度時間プロファイルを示している。
【０３５７】
表ＩＸでは、雄のカニクイザルにおける２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４、２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２及び２Ｄ３の主となる薬物動態パラメータが挙げられる。
【０３５８】
表ＩＸ．雄のカニクイザルにおける２ｍｇ／ｋｇの２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４、２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２又は２Ｄ３それぞれの静脈内ボーラス投与後の２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４、２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２（試験物）及び２Ｄ３（対照物）の主となる薬物動態パラメータ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）
【表１２】
2011516603.tif 000015
【０３５９】
２ｍｇ／ｋｇの静脈内投与後、Ｃ０値は３つ全ての化合物で同程度であった。しかしながら、２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４及び２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２の投与後の曝露及びそれに対応する総身体クリアランス（ＣＬ）はそれぞれ、対照物２Ｄ３の投与後よりも実質的に減少していた（平均すると、それぞれ２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４に関しては２３分の１、及び２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２に関しては７７分の１）。
【０３６０】
定常状態の分布容積（Ｖｄｓｓ）の評価値は、２Ｄ３と比べて２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４及び２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２の投与後に低くなった：２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４及び２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２の平均Ｖｄｓｓ値は、２Ｄ３と比べてそれぞれ２．３分の１及び２．６分の１であった。
【０３６１】
最終的な半減期（ｔ１／２）は、主に顕著に低減したＣＬの結果として、２Ｄ３での約２．０時間から２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５６Ｅ４では約８．５時間と４．２倍に、また２Ｄ３−９ＧＳ−ＥＸＰ５９Ｃ２では約２１時間と１０倍に増大した。
【０３６２】
実施例１４：雄のカニクイザルにおける薬物動態プロファイル：二価のナノボディ構築物
試験した二価のナノボディ構築物は、実施例１２に記載の構築物ｖＷＦ００５３(配列番号１６７）、ｖＷＦ００５５（配列番号１６９）及びｖＷＦ−００５６（配列番号１７０）であった。これらの内、ｖＷＦ−００５６（配列番号１７０）はリンカーを介して連結した２つの本発明のアミノ酸配列（配列番号１６５を参照されたい）を含むＣ末端標識を有する。本発明のアミノ酸配列を全く有しない対応する二価のナノボディ（ｖＷＦ−００１、配列番号１６６）を参照として使用した。
【０３６３】
構築物の薬物動態プロファイルをおよそ３歳齢〜４歳齢の雄のカニクイザルで解析し、参照（配列番号１６６）のものと比較した。構築物及び対照をそれぞれ静脈内ボーラス注射により２ｍｇ／ｋｇの用量で３匹のサルに投与した。血液試料を、投与前、投与の５分後、２０分後、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後（試験１日目）、並びに試験２日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１２日目、１５日目、１８日目、２１日目、２４日目、２７日目、３０日目、３３日目に採取した。１回のサンプリング当たり１匹の動物につき少なくとも１ｍＬの血清を得るために、十分な容量の全血を各サンプリング時につき採取した。血漿を室温（ＲＴ）で３０分間、２２００ｇの全血遠心分離後に回収した。解析するまで血漿試料を−８０℃で保存した。
【０３６４】
サル血漿における構築物及び対照物の生物分析測定のために、血漿試料を、ＥＬＩＳＡベースのＰＫアッセイを使用して、構築物及び対照のレベルに関して試験した。ＥＬＩＳＡアッセイにおける対照及び構築物の検出はこれらのナノボディとｖＷＦとの結合に基づいており、アッセイの構成は全ｖＷＦ結合ナノボディを検出するようなものである。
【０３６５】
参照（配列番号１６６）及び配列番号１６７の構築物に関して、９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Nunc, Wiesbaden, Germany）を、４℃で一晩、３μｇ／ｍｌのニュートラアビジン（Pierce）の１０：１０バッファー溶液でコーティングした。ウェルを吸引し、室温で１時間ＰＢＳ／１％カゼインでブロッキングした。このブロッキング工程の後、ウェルをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。構築物に対するビオチン化した二価のナノボディをニュートラアビジンでコーティングしたプレート上にＰＢＳ／０．１％カゼイン溶液中２μｇ／ｍｌで添加し、室温で１時間インキュベートした。この捕捉ツールのインキュベーション工程の後、ウェルをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。
【０３６６】
スタンダート、ＱＣ試料、及び試験試料の希釈液の調製をコーティングしていない（ポリプロピレン）プレートで行った。検量線及びＱＣ試料に関しては、要求される濃度の溶液をＰＢＳ／０．１％カゼイン中で調製し、１００％サル血漿に加えた。標準及びＱＣ試料を調製するために、１００倍希釈の純粋なサル血漿希釈液を２．５％プール（pooled）ヒト血漿を添加したＩｇＭ還元剤（Immunochemistry Technologies, Bloomington, USA）（試料希釈剤と称される）中で作製した。試験試料に関しては、試験試料の希釈倍率を推測すると、配列番号１６６試験の参照では１００倍〜９０００倍、及び配列番号１６７の構築物では１００倍〜１２０００倍の範囲であった。第１の工程で試料を試料希釈剤で１００倍に希釈し、必要に応じて、１％カニクイザル血漿を添加した試料希釈剤でさらなる希釈を行った。
【０３６７】
標準、ＱＣ試料、及び試験試料の希釈液をコーティングプレート上に移し、室温で１時間インキュベートした。その後プレートを洗浄した後、精製ｖＷＦ（ZLB Behring）により複合体形成工程を行った。ＰＢＳ／０．１％カゼインで、配列番号１６６の参照のアッセイでは２．５μｇ／ｍｌに、及び配列番号１６７の構築物のアッセイでは３μｇ／ｍｌに希釈したｖＷＦを室温で３０分間プレート上でインキュベートした。プレートを洗浄し、捕捉ツールと結合したナノボディ／ｖＷＦ複合体をＰＢＳ／０．１％カゼインで２０００倍希釈すると共に室温で３０分間インキュベートしたウサギ抗ヒトｖＷＦ抗体（Dako, Denmark）で検出した。洗浄後、１５０００倍希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（Dako, Denmark）のＰＢＳ／０．１％カゼイン溶液をプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。抗体と連結した酵素は、基質ｓＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、SDTの試薬、Brussels, Belgium）との化学反応を触媒し、比色変化をもたらす。ＨＣｌ（１Ｎ）を使用して１０分後にこの反応を停止させた後、色の強度を４５０ｎｍで分光光度計を使用して測定した。
【０３６８】
血漿試料における配列番号１６６の参照、又は配列番号１６７の構築物の濃度をそれぞれ、検量線（それぞれ配列番号１６６の参照又は配列番号１６７の構築物を使用して作成した）の４パラメータロジスティック適合（4-parameter logistic fit）のパラメータに基づき求めた。試験試料を全て２回の独立操作（runs）で試験し、報告値は２回の解析バッチの平均であった。
【０３６９】
配列番号１６９及び配列番号１７０の構築物に関しては、９６ウェルのマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Nunc, Wiesbaden, Germany）を４℃で一晩、６μｇ／ｍＬの構築物に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＰＢＳ溶液でコーティングした。ウェルを吸引し、室温で１時間ＰＢＳ／１％カゼインでブロッキングした。このブロッキング工程の後、ウェルをＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。標準、ＱＣ試料、及び試験試料の希釈液に対して調製をコーティングしていない（ポリプロピレン）プレートで行った。
【０３７０】
検量線及びＱＣ試料に関しては、要求される濃度の溶液をＰＢＳ０．１％／カゼイン中で調製し、１００％サル血漿に加えた。標準及びＱＣ試料を調製するために、１００倍希釈の純粋なサル血漿希釈液を２．５％プールヒト血漿を添加したＩｇＭ還元剤（ImmunochemistryTechnologies, Bloomington, USA）（試料希釈剤と称される）中で作製した。
【０３７１】
試験試料に関しては、試験試料の希釈倍率を推測すると、１００倍〜１４０００倍の範囲であった。第１の工程で試料を試料希釈剤で１００倍に希釈し、必要に応じて、１％カニクイザル血漿を添加した試料希釈剤でさらなる希釈を行った。
【０３７２】
標準、ＱＣ試料、及び試験試料の希釈液をコーティングプレート上に移し、室温で１時間インキュベートした。その後プレートを洗浄した後、精製ｖＷＦ（ZLB Behring）により複合体形成工程を行った。ＰＢＳ／０．１％カゼインで３μｇ／ｍｌに希釈したｖＷＦを室温で３０分間プレート上でインキュベートした。プレートを洗浄し、捕捉ツールと結合したナノボディ／ｖＷＦ複合体をＰＢＳ／０．１％カゼインで２０００倍希釈すると共に室温で３０分間インキュベートしたウサギ抗ヒトｖＷＦ抗体（Dako, Denmark）で検出した。洗浄後、１５０００倍希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（Dako, Denmark）のＰＢＳ／０．１％カゼイン溶液をプレートに添加し、室温で３０分間インキュベートした。抗体と連結した酵素は、ＴＭＢ（ｗｅａｋｅｎｅｒ、SDTの試薬）で２倍希釈した基質ｓＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、SDTの試薬、Brussels, Belgium）との化学反応を触媒し、比色変化をもたらす。ＨＣｌ（１Ｎ）を使用して２０分後にこの反応を停止させた後、色の強度を、４５０ｎｍで反応生成物の光学密度を求める分光光度計を使用して測定した。
【０３７３】
血漿試料における配列番号１６９及び配列番号１７０の構築物のそれぞれの濃度を、検量線（関連のある構築物を使用して作成した）の４パラメータロジスティック適合のパラメータに基づき求めた。試験試料を全て２回の独立操作で試験した。報告値は２回の操作の平均である。
【０３７４】
薬物動態データの解析のために、記述統計量（平均及びＳＤ）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７を使用して１つの用量群当たり及び１つのサンプリング時点当たりで算出した。３つ全ての値がＢＱＬであった場合に、ＢＱＬを報告した。３つの値の内、１つ又は２つがＢＱＬであった場合、ＢＱＬ値を０に設定し、平均を算出した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏ  ５．１（Pharsight Corporation, USA; 2006）を使用して、個々の血清濃度−時間プロファイルを非コンパートメント解析（ＮＣＡ）（モデル２０１、静脈内ボーラス注射）にかけた。線形上昇／対数減少論を用いて曲線下面積（ＡＵＣ）を評価した。ＬＬＯＱを超える２つの値の間に含まれていた場合０に設定したことを除き、ＬＬＯＱ値を欠測として扱った。時点０の濃度（Ｃ０）を、２つの第１のデータ点に基づき逆算により評価した。最終的な排出半減期（ｔ１／２）を、最終段階の対数−線形部の非ゼロ濃度−時間データの対数−線形回帰を用いて機械的に算出した（ベスト−フィット）。３点の最小値をλｚの決定に関して考慮した。
【０３７５】
以下の主となる薬物動態パラメータを評価した：時点０での血漿濃度（Ｃ０）、無限大に外挿された血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ）、総身体クリアランス（ＣＬ）、定常状態の分布容積（Ｖｄｓｓ）、及び主要（dominant）半減期（ｔ１／２、主要）、並びに最終的な半減期（ｔ１／２）。
【０３７６】
図１０では、雄のカニクイザルにおいて２ｍｇ／ｋｇのｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６（試験物）、並びにｖＷＦ−０００１（対照物）をそれぞれ静脈内ボーラス投与した後の配列番号１６７（ｖＷＦ−００５３）、配列番号１６９（ｖＷＦ−００５５）、配列番号１７０（ｖＷＦ−００５６）の構築物及び参照（ｖＷＦ０００１）の平均血漿濃度時間プロファイルを表している。
【０３７７】
静脈内注射後、対照物であるｖＷＦ−０００１の血漿レベルが約４５ｕｇ／ｍｌ〜およそ２ｕｇ／ｍｌの投与後、最初の２時間の間に急速に下がった。この初期下落は腎臓による結合していないｖＷＦ−０００１の急速除去の結果であると考えられる。投与後２時間を超えると、血漿レベルの緩徐な減少が観察され、このことはおそらく肝臓によるｖＷＦ０００１−ｖＷＦ複合体のより緩徐な除去により説明される。
【０３７８】
様々な構築物の一時的な血漿濃度プロファイルにおいて、血漿レベルのこのような急速な初期減少が明らかであった。このことは、構築物とサルアルブミンとの結合に関連していると考えられ、腎臓による急速クリアランスを防止する。
【０３７９】
表Ｘでは、雄のカニクイザルにおける様々な構築物及び対照ｖＷＦ０００１の主となる薬物動態パラメータが挙げられる。
【０３８０】
表Ｘ．雄のカニクイザルにおける２ｍｇ／ｋｇのｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６（試験物）、又はｖＷＦ０００１（対照物）それぞれの静脈内ボーラス投与後のｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６、並びにｖＷＦ０００１の主となる薬物動態パラメータ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）
【表１３】
2011516603.tif 000016
【０３８１】
対照と比べて、算出した構築物の総身体クリアランス（ＣＬ）は実質的に低かった。ｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６の平均ＣＬは、対照と比較してそれぞれ、２２分の１、２６分の１及び６７分の１に減少した。
【０３８２】
Ｖｄｓｓに対する効果は、あまり顕著ではなかった：ｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６のＶｄｓｓ値は、ｖＷＦ０００１のものと比べて平均して１２分の１、１１分の１及び１９分の１であった。
【０３８３】
ｖＷＦ０００１と比べて、主要半減期（ｔ１／２主要）は、ｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６それぞれで７０倍、８５倍、１５８倍顕著に増大した。構築物−ｖＷＦの除去を反映すると考えられる最終的な半減期（ｔ１／２最終）は、本質的に同じなままであった（表１を参照されたい）。
【０３８４】
ｖＷＦ００５５の化学的安定性を評価するために、ナノボディ（登録商標）ｖＷＦ００５５を３７℃で保存した。１週間、２週間及び４週間後、試料を採取し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Zorbax製の３００ＳＢ−Ｃ３、４．６×１５０ｍｍ（５μｍ）、トリフルオロ酢酸／アセトニトリル）により化学修飾又はタンパク質分解修飾に関して解析した。これらの解析は、Ｄ−ＰＢＳにおける３７℃での４週間のインキュベーション後、化学修飾もタンパク質分解も起こらなかったことを示していた（データ図示せず）。
【０３８５】
実施例１５：薬力学プロファイル及び活性アッセイ
実施例１４で使用された構築物に関して、化合物投与の際の薬力学的特徴をリストセチン補因子活性アッセイ（Biopool）により測定した。リストセチン補因子活性アッセイはｖＷＦに関する機能的なアッセイであり、ｖＷＦがモジュレータとしてリストセチンを使用して血小板受容体糖タンパク質Ｉｂと相互作用する能力を測定する。
【０３８６】
薬力学データ解析のために、記述統計量（平均及びＳＤ）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７を使用して１つの用量群当たり及び１つのサンプリング時点当たりで算出した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏ  ５．１（Pharsight Corporation, USA; 2006）を使用して、応答−時間データの非コンパートメント解析により、時間経過全体での応答パラメータ及び関連の統計を算出した。非コンパーメント解析は薬力学データに関するモデル（モデル２２０）に基づいていた。閾値は、ｖＷＦ−０００１化合物に対する広範な過去の（historical）ＰＫ／ＰＤデータに基づき２０％に設定した。前臨床試験は、この薬力学マーカーの完全な阻害が十分な抗血栓作用と相関関係にあることを示している。以下の主となる薬力学パラメータを求めた：閾値を下回る時間（Ｔを下回る時間）、閾値を下回る面積（Ｔを下回るＡＵＣ）、初めに％ＲＩＣＯが閾値を下回る時間（Ｔｏｎｓｅｔ）、並びに初めに％ＲＩＣＯが閾値を超えて戻る時間（Ｔｏｆｆｓｅｔ）。
【０３８７】
図１１では、雄のカニクイザルにおいて２ｍｇ／ｋｇのｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６（試験物）、並びにｖＷＦ−０００１（対照物）をそれぞれ静脈内ボーラス投与した後の％ＲＩＣＯ測定値の一時的な時間プロファイルを示している。
【０３８８】
表ＸＩでは、２ｍｇ／ｋｇでの単一静脈内投与後の雄のカニクイザルにおける様々な構築物及び対照ｖＷＦ−０００１の主となる薬物動態パラメータを表している。
【０３８９】
表ＸＩ．雄のカニクイザルにおける２ｍｇ／ｋｇのｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６（試験物）、又はｖＷＦ０００１（対照物）それぞれの静脈内ボーラス投与後のｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６、並びにｖＷＦ０００１の主となる薬物動態パラメータ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）
【表１４】
2011516603.tif 000017
【０３９０】
静脈内注射後、作用の急速であり、かつ同程度の開始が、対照物（ｖＷＦ０００１）及び様々な構築物（ｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６）の両方の静脈内適用後に観察された（％ＲＩＣＯ測定値により評価される）。Ｔｏｎｓｅｔ値をおよそ５分で推測した。対照と比較すると、Ｔｏｆｆｓｅｔ及びしたがって閾値を下回る時間（Ｔを下回る時間）、及びまた閾値下ＡＵＣ（Ｔを下回るＡＵＣ）は構築物の静脈内投与後に顕著に増大した。
【０３９１】
ｖＷＦ０００１の静脈内ボーラス投与後の閾値を下回る時間は平均して１．２１時間であり、各構築物（ｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６）の適用後に３３倍、１０５倍及び１６７倍増大した。
【０３９２】
静脈内ボーラス投与後の閾値下ＡＵＣの平均は、ｖＷＦ０００１投与後で６．６０％ＲＩＣＯ×時間であり、その値はｖＷＦ−００５３、ｖＷＦ−００５５及びｖＷＦ−００５６の投与後、それぞれ５７倍、１１８倍及び２５９倍増大した。
【０３９３】
構築物の活性をかん流実験（例えば国際公開第０４／０６２５５１号パンフレットの実施例１６又は国際公開第０６／１２２８２５号パンフレットの実施例４を参照されたい）及びｖＷＦと血小板とのリストセチン誘導性結合の阻害を測定する標準的な阻害ＥＬＩＳＡで決定／確認した。
【０３９４】
スリット高が０．１ｍｍ及びスリット幅が２ｍｍの改良型小かん流チャンバを使用して、非パルスフロー条件下で単通（single-pass）かん流チャンバでかん流実験を行った。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバースリップ（Nunc, Rochester, NY）を０．５ｍｇ／ｍＬのＨｏｒｍコラーゲンＩＩＩ型（Nycomed）で一晩コーティングし、その後１％ヒト血清アルブミンを含有するＨｅｐｅｓバッファーでブロッキングした。ヒトクエン酸血を試験化合物を添加して又は添加せず、３７℃で５分間プレインキュベーションした後、注入／排出ポンプ（ポンプ２２、モデル２４００−００４、Harvard Apparatus, Holliston, MA）を使用して１６００／ｓの壁せん断速度で５分間、チャンバでかん流させた。かん流を行った後、カバースリップをＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４））で洗い流し、血小板を５％グルタルアルデヒドで固定して、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ及びＧｉｅｍｓａで染色した。カバースリップの血小板沈降を、光学顕微鏡（Olympus製のＡｎａｌｙｓｉｓ  Ｆｉｖｅデジタル画像化ソリューション解析ソフトウェアを使用したＢＸ６１顕微鏡）を使用してランダムに選択した１０個の画像の血小板表面被覆率として評価した。
【０３９５】
これらの結果を図１２に示し、ｖＷＦ００５５、ｖＷＦ００５６及びそれらの半減期が延長していない同等物は、用量依存的にかつ完全に動脈せん断速度で線維状コラーゲンとの血小板接着を阻害することを明らかにする。有効濃度はｖＷＦ０００１と比較してｖＷＦ００５５とｖＷＦ００５６とでは同程度であった。
【０３９６】
ｖＷＦと血小板とのリストセチン誘導性結合の阻害を求めるために、マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Nunc）を４℃で一晩、０．１ｍｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リシン（Sigma, StLouis, MO）のＰＢＳ溶液でコーティングした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）による３回の洗浄の後、ウェルを室温（ＲＴ）で１時間、ＰＢＳ中で２倍希釈したホルマリン固定ヒト血小板（Dade Behring, Newark, DE）と共に、又はブランクとしてＰＢＳと共にインキュベートした。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、室温で２時間４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma）を含有するＰＢＳでブロッキングした。希釈系列の化合物をヒト血漿中で調製し、１．５ｍｇ／ｍＬのリストセチン（abp, NJ, USA）と共に室温で３０分間プレインキュベートし、その後混合物をコーティングウェルに移した。３７℃で１．５時間のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳで６回洗浄し、残りの結合ｖＷＦを室温で１時間、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Dako, Glostrup, Denmark）で標識した２０００倍希釈の抗ｖＷＦポリクローナル抗体を用いて検出した。ｅｓＴＭＢ（SDTの試薬、Germany）を用いて可視化画像を取得し、発色反応を１Ｍの塩酸を用いて停止させ、その後吸光を４５０ｎｍで求めた。データの解析のために、吸光値を各ブランクの吸光度を使用して補正した。
【０３９７】
結果を図１３に示し、全ての化合物が用量依存的にかつ完全にｖＷＦと血小板表面とのリストセチン誘導性結合を阻害することを明らかにする。半減期が延長していない親化合物と比較して同様の効力がｅｘｐｅｄｉｔｅ構築物で観察された。２つのｖＷＦ結合ドメインを有する化合物の効力は、ｖＷＦ結合ドメインの１つが関連のないナノボディ（登録商標）と交換されたｍｏｃｋ変異型の効力と比較してずっと高かった。このことにより、二価の化合物と多価のｖＷＦとの強い（avid）結合が示唆され、このため２つのｖＷＦ結合単位の官能性が確認される。
【０３９８】
実施例１６：ｖＷＦ００５５とＨＳＡ及びｃｙｎｏＳＡとの結合のｐＨ依存性を求めるためのビアコア解析
ＨＳＡ及びｃｙｎｏＳＡ上でのｖＷＦ００５５のｐＨ依存性の結合を、３つの異なるｐＨで親和性を評価することによりビアコア３０００機器を使用する表面プラズモン共鳴で調べた。要約すると、ＨＳＡ及びｃｙｎｏＳＡをそれぞれ１８００ＲＵ及び１９００ＲＵの密度で別々のＣＭ５センサーチップにアミンカップリングした。濃度が２５ｎＭ〜１μＭのｖＷＦ００５５の範囲の希釈試料を３つのバッファーで調製した。使用する３つのバッファーは、５０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．００５％界面活性剤Ｐを含有しており、ｐＨ５、ｐＨ７又はｐＨ８のいずれかに調整した。試料を４５μＬ／分の流速で注入し、結合及び解離を１２０秒間及び３００秒間モニタリングした。その後、結合曲線によりＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを用いて、ＫＤ、結合速度定数及び解離速度定数を算出した。最も高い親和性はＨＳＡ及びｃｙｎｏＳＡの両方でｐＨ７で観察された。ｐＨ５でのｖＷＦ００５５の親和性は約１０分の１に低減していた。
【０３９９】
用いられている用語及び表現は、限定するものではなく説明の用語として使用され、このような用語及び表現の使用においては、図示及び説明される特徴又はその一部のいずれの同等物を排除するようには意図されず、様々な変更が本発明の範囲内で可能であることが認められる。
【０４００】
本明細書中で開示される参考文献は全て、特に上記で言及される教示に関して参照により援用される。
【図１−１】
2011516603.tif 000018
【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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