(57)【要約】  ポジション１０３での塩基性アミノ酸、極性アミノ酸または非極性アミノ酸、ポジション１３６でのバリンまたはイソロイシン、ポジション１８６でのチロシン、ポジション３６５でのグルタミン酸またはグルタミンおよびポジション４１０でのグルタミンから選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、ファミリー６セルラーゼバリアント酵素が提供される（前記ポジションは配列番号：１と親のファミリー６のアライメントから決定される）。ファミリー６セルラーゼバリアントをコードするＤＮＡ配列を含む遺伝的コンストラクトおよび遺伝的に修飾された微生物も提供される。本発明のファミリー６セルラーゼは、親のファミリー６セルラーゼに比べてグルコースによる阻害の減少を提示する。かかるセルラーゼは、親の酵素の活性を阻害するグルコース濃度の存在下においてセルロース活性を必要とする産業における様々な用途での使用が見出される。
2011509662.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポジション１０３での塩基性残基、非極性残基またはプロリン残基（Ｘ１０３Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｍ）；
ポジション１３６でのバリン残基またはイソロイシン残基（Ｘ１３６Ｖ、Ｉ）；
ポジション１８６でのチロシン残基またはリジン残基（Ｘ１８６Ｙ、Ｋ）；
ポジション３６５での酸性残基、グルタミン残基またはセリン残基（Ｘ３６５Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｓ）；および
ポジション４１０でのアラニン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン残基またはセリン残基（Ｘ４１０Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｓ）
からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含むファミリー６セルラーゼバリアントであって、
前記ポジションが配列番号：１において定義されるようなトリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａアミノ酸配列と親のファミリー６セルラーゼのアライメントから決定され、該ファミリー６セルラーゼバリアントが由来する親のファミリー６セルラーゼよりも少なくとも約１．４倍より少ないグルコースによる阻害を示す、前記ファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項２】
配列番号：１のアミノ酸８３〜４４７と少なくとも約４５％〜約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項３】
配列番号：１のアミノ酸８３〜４４７と少なくとも約５５％〜約１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項４】
前記ファミリー６セルラーゼバリアントのアミノ酸配列が、配列番号：１のアミノ酸８３〜４４７と少なくとも約６３％同一である、請求項３に記載のファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項５】
前記ファミリー６セルラーゼバリアントのアミノ酸配列が、配列番号：１のアミノ酸８３〜４４７と少なくとも約９５％同一である、請求項４に記載のファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項６】
ポジション１０３での前記塩基性残基が、ヒスチジン残基、アルギニン残基またはリジン残基である、請求項１に記載のファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項７】
ポジション１０３での前記非極性残基が、アラニン残基、バリン残基、メチオニン残基またはロイシン残基である、請求項１に記載のファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項８】
ポジション３６５での前記酸性残基が、アスパラギン酸またはグルタミン酸である、請求項１に記載のファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項９】
ポジション１３４でイソロイシン残基、バリン残基、スレオニン残基、チロシン残基またはグルタミン残基をさらに含む、請求項１に記載のファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項１０】
ポジション２１５でイソロイシン残基をさらに含む、請求項１に記載のファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項１１】
ポジション４１３でプロリン残基をさらに含む、請求項１に記載のファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項１２】
請求項１に記載のファミリー６セルラーゼバリアントであって、該ファミリー６セルラーゼバリアントが由来する親のファミリー６セルラーゼよりも少なくとも約１．８倍少ないグルコースによる阻害を示す、前記ファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項１３】
前記ファミリー６セルラーゼバリアントが由来する前記親のファミリー６セルラーゼが、ポジション１０３で、天然に存在する塩基性残基、非極性残基もしくはプロリン残基、ポジション１３６で、天然に存在するバリン残基もしくはイソロイシン残基、ポジション１８６で、天然に存在するチロシン残基もしくはリジン残基、ポジション３６５で、天然に存在する酸性残基、グルタミン残基もしくはセリン残基、またはポジション４１０で、天然に存在するアラニン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン残基もしくはセリン残基を有しない、請求項１に記載のファミリー６セルラーゼバリアント。
【請求項１４】
請求項１に記載のファミリー６セルラーゼバリアントをコードするＤＮＡを含む遺伝的コンストラクト。
【請求項１５】
ファミリー６セルラーゼバリアントの分泌の発現を指令する調節性ＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１４に記載の遺伝的コンストラクト。
【請求項１６】
前記調節性ＤＮＡ配列が、ファミリー６セルラーゼバリアントの産生のために使用される宿主生物と相同である、請求項１５に記載の遺伝的コンストラクト。
【請求項１７】
請求項１４に記載の遺伝的コンストラクトを含む遺伝的に修飾された微生物。
【請求項１８】
前記微生物が、酵母または糸状菌の一種である、請求項１７に記載の遺伝的に修飾された微生物。
【請求項１９】
前記微生物が、サッカロミセス属、ピキア属、トリコデルマ属、ヒポクレア属、アスペルギルス属、フザリウム属、フミコーラ属、ニューロスポラ属の一種である、請求項１８に記載の遺伝的に修飾された微生物。
【請求項２０】
前記微生物が、サッカロミセス・セレビシエまたはトリコデルマ・リーゼイである、請求項１９に記載の遺伝的に修飾された微生物。
【請求項２１】
請求項１に記載のファミリー６セルラーゼバリアントを産生するプロセスであって、ファミリー６セルラーゼバリアントの発現および分泌を誘導する条件下で請求項１７に記載の遺伝的に修飾された微生物を増殖すること、並びに培養培地からファミリー６セルラーゼバリアントを回収することを含む、前記プロセス。
【請求項２２】
セルロース基質をグルコースへ加水分解するプロセスであって、セルロースのグルコースへの転換を達成するようにセルラーゼ組成物でセルロース基質を処理することを含み、前記セルラーゼ組成物が請求項１に記載のファミリー６セルラーゼバリアントを含む、前記プロセス。
【請求項２３】
前記セルロース基質が、前処理したリグノセルロース原料である、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記前処理したリグノセルロース原料が、トウモロコシ茎葉、麦わら、大麦わら、稲わら、エンバクわら、キャノーラわら、大豆茎葉；トウモロコシ繊維、甜菜パルプ、パルプミル微粉および不良品、サトウキビバガス、硬材、軟材、おがくず、スイッチグラス、ミスカンサス、コードグラス、およびリードキャナリーグラスを含む、請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ａ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：３７）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｈ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：３８）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｋ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：３９）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｌ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４０）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｍ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４１）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｐ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４２）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｒ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４３）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｖ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４４）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｌ１３６Ｉ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４５）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｌ１３６Ｖ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４６）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ１８６Ｋ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４７）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ１８６Ｙ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４８）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ３６５Ｄ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４９）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ３６５Ｅ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５０）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ３６５Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５１）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ３６５Ｓ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５２）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ａ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５３）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｆ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５４）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｌ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５５）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５６）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｓ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５７）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｍ１３４Ｖ−Ｌ１３６Ｉ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：６２）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｌ１３６Ｉ−Ｌ２１５Ｉ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：６３）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｍ１３４Ｖ−Ｌ１３６Ｉ−Ｌ２１５Ｉ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：７１）；
ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０７Ｋ（配列番号：７８）；
ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０７Ｌ（配列番号：７９）；
ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｑ１３９Ｔ（配列番号：８０）；
ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｌ１４１Ｖ（配列番号：８１）；
ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ａ１９４Ｙ（配列番号：８２）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｙ９８Ｋ（配列番号：８３）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｙ９８Ｌ（配列番号：８４）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｌ１３１Ｉ（配列番号：８５）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｌ１３１Ｖ（配列番号：８６）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ１８２Ｋ（配列番号：８７）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ１８２Ｙ（配列番号：８８）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｇ３５９Ｑ（配列番号：８９）；および
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｒ４０４Ｑ（配列番号：９０）
からなる群から選択されるファミリー６セルラーゼバリアントであって、
該ファミリー６セルラーゼバリアントが由来する親のファミリー６セルラーゼよりも少なくとも１．４倍少ないグルコースによる阻害を示す、前記ファミリー６セルラーゼバリアント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年１月１８日に出願された先行予備特許出願第６１／０２２，１０１号の利益を主張する。
【０００２】
本発明はセルラーゼバリアントに関する。より具体的には、本発明は、グルコースによる阻害が減少したファミリー６セルラーゼバリアントに関する。本発明は、ファミリー６セルラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的コンストラクト、宿主株からのファミリー６セルラーゼバリアントの産生のための方法、およびセルロースの加水分解におけるファミリー６セルラーゼバリアントの使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
セルロースは、β（１→４）−グリコシド結合によって結合するグルコースの非分岐ポリマーである。セルロース鎖は水素結合によって互いと相互作用して、高い機械強度および化学的安定性の結晶性固体を形成することができる。エタノール産生において使用される発酵微生物などの生物がセルロース鎖を代謝燃料として使用することができる前に、セルロース鎖はグルコースおよび短いオリゴ糖へと単量体に分解されなくてはならない。セルラーゼ酵素は、グルコース、セロビオース、および他のセロオリゴ糖などの産物へと原料中のセルロースの加水分解（β−１，４−Ｄ−グルカン結合の加水分解）を触媒する。セルラーゼは、多数の植物および微生物によって産生することができる、エキソ活性のあるセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）およびβ−グルコシダーゼ（βＧ）を含む多酵素の混合物を示す総称である。トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）のセルラーゼ中の酵素は、ＣＢＨ１（より一般的にはＣｅｌ７Ａ）、ＣＢＨ２（Ｃｅｌ６Ａ）、ＥＧ１（Ｃｅｌ７Ｂ）、ＥＧ２（Ｃｅｌ５）、ＥＧ３（Ｃｅｌ１２）、ＥＧ４（Ｃｅｌ６１Ａ）、ＥＧ５（Ｃｅｌ４５Ａ）、ＥＧ６（Ｃｅｌ７４Ａ）、Ｃｉｐ１、Ｃｉｐ２、β−グルコシダーゼ（例えばＣｅｌ３Ａを含む）、アセチルキシランエステラーゼ、β−マンナナーゼ、およびスウォレニンを含む。
【０００４】
セルラーゼ酵素は、セルロースのグルコースへの加水分解に相乗的に作用する。ＣＢＨ１およびＣＢＨ２はセルロース鎖の反対の末端に作用するが（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）、エンドグルカナーゼはセルロース中の内部の位置に作用する。これらの酵素の一次産物はセロビオースであり、それは１つまたは複数のβ−グルコシダーゼによってグルコースにさらに加水分解される。
【０００５】
セルラーゼにより不溶性であるセルロース基質の酵素的加水分解の動態は、単純なミカエリス・メンテンの挙動に従わない（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。具体的には、加水分解反応におけるセルラーゼの投与量を増加させることは、規定の時間で産生されたグルコースの量の線形従属性増加を提供しない。セルロース加水分解が進行するにつれて、反応速度も有意に減少する（Ｔｏｌａｎ，  ２００２）。反応速度の減少について説明する複数の説明が提唱され、主要な仮説は、基質不均質性（Ｎｉｄｅｔｓｋｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｅｒ，  １９９３；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）、酵素不活性化（Ｃａｍｉｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５；  Ｃｏｎｖｅｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；  Ｇｕｓａｋｏｖ  ａｎｄ  Ｓｉｎｉｔｓｙｎ，  １９９２；  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）、および生産物阻害（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｆａｎ，  １９８３；  Ｃａｍｉｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５；  Ｈｏｌｔｚａｐｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０；  Ｇｕｓａｋｏｖ  ａｎｄ  Ｓｉｎｉｔｓｙｎ，  １９９２；  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ｇｒｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）を含む。
【０００６】
それらが触媒する反応の産物による酵素の阻害は、長年認識されてきた。この現象は、酵素学の分野におけるすべての先駆者であるＨｅｎｒｉ、ＭｉｃｈａｅｌｉｓおよびＭｅｎｔｅｎに知られていた（Ｆｒｉｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｗａｌｔｅｒ，  １９６３）。産物が基質と競合して同じ相互作用を酵素と形成するので、生産物阻害の性質は競合的でありえるが、阻害の他の形態は可能である。実際は、動態研究において、セルロースの不溶性性質および基質としてのセルロースがもたらす障害に起因して、セルラーゼシステムにおける阻害の性質に関する多くの矛盾する報告があった（Ｈｏｌｔｚａｐｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０、およびその中の参照文献）。セロビオヒドロラーゼは、それらの直接産物（セロビオース）による阻害、およびβ−グルコシダーゼによるセロビオースのさらなる加水分解によって産生されたグルコースによるより低い程度の阻害にさらされる。セロビオースはグルコースよりもセルラーゼに対してより阻害性であるので、セルラーゼ阻害を減少させることのための１つの技術は、システム中のβ−グルコシダーゼの量を増加させること（米国特許第６，０１５，７０３号）である（Ｈｏｌｔｚａｐｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０；  Ｔｅｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。阻害は、合理的デザインによって導かれるかまたはランダムに適用されるＤＮＡ変異誘発を使用して、タンパク質の一次配列を改変することによって軽減することができる。例えば、合理的デザインを使用してＣｅｌ５Ａ（エンドグルカナーゼ）中のＹ２４５残基を変異誘発のために標的化し、それはセロビオース阻害定数の増加をもたらした（米国公報第２００３／００５４５３５号）。
【０００７】
望ましい特性のために、Ｔ．リーゼイ（ヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）としても公知である）セルラーゼシステムの主要なセロビオヒドロラーゼである、Ｃｅｌ６Ａ（セロビオヒドロラーゼＩＩまたはＣＢＨ２としても公知である）を操作する比較的少数の報告がある。Ｓｔ−Ｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（米国公報第２００８／００７６１５２号）は、Ｔ．リーゼイＣｅｌ６Ａ配列のポジション２３１、３０５、４１０および４１３の同等のポジションで天然に存在するアミノ酸を、セリンもしくはスレオニン（ポジション２３１および３０５）、グルタミンもしくはアスパラギン（ポジション４１０）、またはプロリン（ポジション４１３）へ置換することは、ファミリー６セルラーゼの耐熱性、好熱性および／または好アルカリ性を増加させることを示した。Ｗｏｈｌｆａｈｒｔ  ｅｔ  ａｌ．は、残基Ｅ１０７、Ｄ１７０およびＤ３６６での変異誘発を介してアミド−カルボキシラートペアを形成することによって、タンパク質の安定性を促進した（米国公報第２００４／０１５２８７２号）。合理的デザインを関連するセロビオヒドロラーゼ（サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）からのＣｅｌ６Ｂ）に対しても適用して、セロビオースによる阻害を軽減した（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。Ｃｅｌ６Ａ配列のＷ２６９、Ｈ２６６およびＥ３９９に同等のＣｅｌ６Ｂ残基での突然変異は、セロビオース阻害を減少させるが、結晶セルロースに対する活性に対しては有意な損失があることが示された。複数の種からのＣｅｌ６Ａ配列のアライメントに由来するコンセンサス配列に基づく他のアプローチ（米国公報第２００６／０２０５０４２号）は、耐熱性の改善に関連する３８のアミノ酸を同定した（具体的には：Ｖ９４、Ｐ９８、Ｇ１１８、Ｍ１２０、Ｍ１３４、Ｔ１４２、Ｍ１４５、Ｔ１４８、Ｔ１５４、Ｌ１７９、Ｑ２０４、Ｖ２０６、Ｉ２１２、Ｌ２１５、Ｇ２３１、Ｔ２３２、Ｖ２５０、Ｑ２７６、Ｎ２８５、Ｓ２９１、Ｇ３０８、Ｔ３１２、Ｓ３１６、Ｖ３２３、Ｎ３２５、Ｉ３３３、Ｇ３３４、Ｓ３４３、Ｇ３６０、Ｓ３８０、Ａ３８１、Ｓ３９０、Ｆ４１１、Ｓ４１３、Ａ４１６、Ｑ４２６およびＡ４２９）。この著者は、これらの突然変異が産生物阻害および／または酵素処理能力にも影響しうると推測するが、請求された残基とこれらの特性の変化を関連づけるモデル化に基づいたデータまたは具体的な仮説を提示しない。コンセンサスアプローチは改善された熱力学的安定性を備えたタンパク質バリアントを生成するようにデザインされ（Ｓｔｅｉｐｅ，  ２００４）、それは他の生化学的性質の改善のための予測力を提供しない。
【０００８】
セルラーゼ組成物は以前に記述されているが、セルロースの発酵性糖への転換における使用のため、ならびにパルプおよび紙、織物ならびに飼料などのセルロース系材料加工の関連分野のための新しく改善された組成物の必要性が存続する。改善されたパフォーマンスを備えたセルラーゼは、同等の化学プロセスおよび／または物理的なプロセスと比べた場合、プロセスのコストを低下させて、典型的には、実質的な環境上の利益を提示する。例えば、セルロースからの燃料エタノールの産生は、実質的な環境上の利益および経済的な利益を達成する。燃料としてエタノールを使用することは、ガソリンと比べた場合、燃焼の間に放出された二酸化炭素を、さらなるエタノール産生のための原料として成長させた生物資源へと戻して固定することによって、正味炭素排出を有意に減少させる。原料として農業生物資源を使用することはさらに農村経済を刺激し、輸入の石油に対する依存性を減少させることができる。デンプン（トウモロコシエタノールに関しては）または糖よりもむしろ、セルロースからエタノールを産生することは、ヒトおよび動物のための食料の産生の競合を回避する追加の利益を有する。米国の農務省およびエネルギー省は、食物の収穫に影響せずにセルロース系燃料を使用することによって、アメリカ（世界における最大の石油市場）の輸送燃料使用の３０％を置き換えることができると推測する（Ｐｅｒｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。さらにセルロース系生物資源を生成するのに必要な低いエネルギー入力に起因して、セルロースエタノールの使用はガソリンと比べた場合に正味の温室効果ガス産生を８８％減少させるが、トウモロコシエタノールの使用は１８％の減少のみであることが推測された（Ｆａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。
【発明の概要】
【０００９】
本発明はファミリー６セルラーゼバリアントに関する。より具体的には、本発明は、グルコースによる阻害の減少を示すファミリー６セルラーゼバリアントに関する。本発明は、ファミリー６セルラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的コンストラクト、宿主株からのファミリー６セルラーゼバリアントの産生のための方法、およびセルロースの加水分解におけるファミリー６セルラーゼバリアントの使用にも関する。
【００１０】
本発明は、グルコースによる阻害が減少した改善されたセルラーゼを提供することを目的とする。
【００１１】
本発明は、ポジション１０３での塩基性残基、非極性残基またはプロリン残基（Ｘ１０３Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｍ）、ポジション１３６でのバリン残基またはイソロイシン残基（Ｘ１３６Ｖ、Ｉ）、ポジション１８６でのチロシン残基またはリジン残基（Ｘ１８６Ｙ、Ｋ）、ポジション３６５での酸性残基、グルタミン残基またはセリン残基（Ｘ３６５Ｄ、Ｅ、Ｑ、Ｓ）、およびポジション４１０でのアラニン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン残基またはセリン残基（Ｘ４１０Ａ、Ｆ、Ｌ、Ｑ、Ｓ）からなる群から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含むファミリー６セルラーゼバリアントに関する。
【００１２】
アミノ酸置換のポジションは、配列番号：１に定義されるようなトリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａアミノ酸配列を備えたファミリー６セルラーゼバリアントの配列アラインメントから決定される。ポジション１０３での塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン、またはポジション１０３での非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、メチオニンもしくはロイシンでありえる。本発明のファミリー６セルラーゼバリアントは、それが由来する親のファミリー６セルラーゼよりも少なくとも約１．４倍少ないグルコースによる阻害を示す。例えば、ファミリー６セルラーゼバリアントは、それが由来する親のファミリー６セルラーゼよりも、約１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．８倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５、４倍、５倍、６、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍少ないグルコースによる阻害を示すことができる。
【００１３】
本発明の１つの実施形態において、本発明のファミリー６セルラーゼバリアントは、配列番号：１のアミノ酸８３〜４４７と少なくとも約４５％〜約１００％同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、ファミリー６セルラーゼバリアントは、配列番号：１のアミノ酸８３〜４４７と少なくとも約５５％〜約１００％同一、または配列番号：１のアミノ酸８３〜４４７と少なくとも約６３％〜約１００％同一であるアミノ酸配列を有することができる。
【００１４】
なお他の実施形態において、本発明のファミリー６セルラーゼバリアントは、配列番号：１のアミノ酸８３〜４４７に少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００１５】
ファミリー６セルラーゼバリアントは、ファミリー６セルラーゼバリアントのポジションに対応する置換されたポジションで１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸を含むが、他はファミリー６セルラーゼバリアントと同一である、親のファミリー６セルラーゼ、例えば、ネオカリマスチクス・パトリシアラム（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ  ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）、オルピノミセス属（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ）、またはサーモビフィダ・フスカからの生来のファミリー６セルラーゼに由来しうる。これらの置換が対応するファミリー６セルラーゼバリアント中にも存在するとすれば、親のファミリー６セルラーゼは他のポジションで１つまたは複数のアミノ酸置換を含むことができる。
【００１６】
本発明は、上で定義されるようなものであり、ポジション１３４での１つまたは複数のイソロイシン残基、バリン残基、スレオニン残基、チロシン残基またはグルタミン残基、ポジション２１５でのイソロイシン残基、およびポジション４１３でのプロリン残基をさらに含むファミリー６セルラーゼバリアントもまた含む。これらの突然変異を含むファミリー６セルラーゼバリアントは、トリコデルマ・リーゼイなどの糸状菌からでありえる。
【００１７】
本発明は、由来する親のファミリー６セルラーゼよりも少なくとも１．４倍少ないグルコースによる阻害を示すファミリー６セルラーゼバリアントであって、
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ａ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：３７）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｈ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：３８）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｋ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：３９）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｌ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４０）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｍ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４１）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｐ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４２）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｒ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４３）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｖ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４４）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｌ１３６Ｉ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４５）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｌ１３６Ｖ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４６）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ１８６Ｋ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４７）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ１８６Ｙ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４８）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ３６５Ｄ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：４９）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ３６５Ｅ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５０）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ３６５Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５１）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ３６５Ｓ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５２）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ａ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５３）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｆ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５４）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｌ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５５）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｑ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５６）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｓ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：５７）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｍ１３４Ｖ−Ｌ１３６Ｉ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：６２）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｌ１３６Ｉ−Ｌ２１５Ｉ−Ｓ４１３Ｐ（配列番号：６３）；
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｍ１３４Ｖ−Ｌ１３６Ｉ−Ｌ２１５Ｉ  −Ｓ４１３Ｐ（配列番号：７１）；
ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０７Ｋ（配列番号：７８）；
ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０７Ｌ（配列番号：７９）；
ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｑ１３９Ｔ（配列番号：８０）；
ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｌ１４１Ｖ（配列番号：８１）；
ＨｉＣｅｌ６Ａ−Ａ１９４Ｙ（配列番号：８２）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｙ９８Ｋ（配列番号：８３）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｙ９８Ｌ（配列番号：８４）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｌ１３１Ｉ（配列番号：８５）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｌ１３１Ｖ（配列番号：８６）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ１８２Ｋ（配列番号：８７）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｓ１８２Ｙ（配列番号：８８）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｇ３５９Ｑ（配列番号：８９）；
ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｒ４０４Ｑ（配列番号：９０）
からなる群から選択されるファミリー６セルラーゼバリアントにも関する。
【００１８】
さらに、本発明は、トリコデルマ・リーゼイまたはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株を含むが、これらに限定されない宿主微生物からのファミリー６セルラーゼバリアントの発現および分泌を指令するための遺伝的コンストラクトにも関する。
【００１９】
本発明は、ポジション１０３での塩基性残基、非極性残基もしくはプロリン残基、ポジション１３６でのバリン残基もしくはイソロイシン残基、ポジション１８６でのチロシン残基もしくはリジン残基、ポジション３６５での酸性残基、グルタミン残基もしくはセリン残基、またはポジション４１０でのアラニン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン残基もしくはセリン残基の１つまたは複数を有するファミリー６セルラーゼバリアントをコードするＤＮＡ配列であり、宿主微生物からのその発現および分泌を調節するＤＮＡ配列に作動可能に結合されるＤＮＡ配列を含む遺伝的コンストラクトに関する。好ましくは、ファミリー６セルラーゼバリアントの発現および分泌を調節するＤＮＡ配列は、単離されたセルラーゼの発現のために使用する宿主微生物に由来する。宿主微生物は、サッカロミセス・セレビシエなどの酵母またはトリコデルマ・リーゼイなどの糸状菌でありえる。
【００２０】
本発明は、遺伝的コンストラクトによってコードされたファミリー６セルラーゼバリアントが、ポジション１３４でのバリン残基またはスレオニン残基、ポジション２１５でのイソロイシン残基、およびポジション４１３でのプロリン残基の１つまたは複数をさらに含む、上で定義されるような遺伝的コンストラクトにも関する。好ましくは、ファミリー６セルラーゼバリアントの発現および分泌を調節するＤＮＡ配列は、トリコデルマ・リーゼイを含むが、これらに限定されない糸状菌に由来する。
【００２１】
本発明は、ファミリー６セルラーゼバリアントをコードする遺伝的コンストラクトを含み、ポジション１０３での塩基性残基、非極性残基もしくはプロリン残基、ポジション１３６でのバリン残基もしくはイソロイシン残基、ポジション１８６でのチロシン残基もしくはリジン残基、ポジション３６５での酸性残基、グルタミン残基もしくはセリン残基、またはポジション４１０でのアラニン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン残基もしくはセリン残基の１つまたは複数を含むファミリー６セルラーゼバリアントの発現および分泌が可能な遺伝的に修飾された微生物にも関する。１つの実施形態において、ファミリー６セルラーゼバリアントは、ポジション１３４でのバリン残基もしくはスレオニン残基、ポジション２１５でのイソロイシン残基、およびポジション４１３でのプロリン残基の１つまたは複数をさらに含む。好ましくは、遺伝的に修飾された微生物は酵母または糸状菌である。より好ましくは、遺伝的に修飾された微生物は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヒポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）またはニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）の一種である。
【００２２】
本発明は、ポジション１０３での塩基性残基、非極性残基もしくはプロリン残基、ポジション１３６でのバリン残基もしくはイソロイシン残基、ポジション１８６でのチロシン残基もしくはリジン残基、ポジション３６５での酸性残基、グルタミン残基もしくはセリン残基、またはポジション４１０でのアラニン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン残基もしくはセリン残基の１つまたは複数を含む、セルロース基質の加水分解ためのファミリー６セルラーゼバリアントの使用にも関する。
【００２３】
本発明は、ファミリー６セルラーゼバリアントをコードするＤＮＡ配列を含む遺伝的コンストラクトを有する酵母または真菌宿主の形質転換、ファミリー６セルラーゼバリアントを発現する組換えの酵母または真菌の株の選択、およびファミリー６セルラーゼバリアントの発現を誘導する条件下で液内発酵における選択された組換え株の培養を含む、上で定義されるようなファミリー６セルラーゼバリアントを産生するプロセスにも関する。
【００２４】
ポジション１０３での塩基性残基、非極性残基もしくはプロリン残基、ポジション１３６でのバリン残基またはイソロイシン残基、ポジション１８６でのチロシン残基もしくはリジン残基、ポジション３６５での酸性残基、グルタミン残基もしくはセリン残基、またはポジション４１０でのアラニン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン残基もしくはセリン残基の１つまたは複数を含む本発明のファミリー６セルラーゼバリアントは、それらが由来する親のファミリー６セルラーゼに比べて減少したグルコース阻害を提示する。
【００２５】
本明細書において記述されるようなファミリー６セルラーゼバリアントセルラーゼは、セルロース基質の高濃度、および通常はかかる基質から産生されたグルコースの阻害濃度の存在下において高活性を保持できる酵素を必要とする産業における様々な用途での使用が見出される。例えば、本明細書において記述されたようなファミリー６セルラーゼバリアントは、発酵性糖の産生のためのリグノセルロース原料の糖化のために使用するか、または反芻動物および非反芻動物における飼料の消化率を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】トリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａ（ＴｒＣｅｌ６Ａ；配列番号：１）のアミノ酸８３〜４４７に対する３５の真菌のファミリー６セルラーゼのアミノ酸配列アライメントを示した図である。各々のセルラーゼについてのアミノ酸ナンバリングは各々の配列の左右で示された通りである。ポジション１０３、１３４、１３６、１８６、２１５、３６５、４１０、および４１３の残基（ＴｒＣｅｌ６Ａに対して）は、矢印により示される。セルロース結合ドメインを備えたセルラーゼについては、触媒コア配列のみが提示される。ＣｆＣｅｌ６Ｂ（配列番号：２）；ＨｉＣｅｌ６Ａ（配列番号：３）；ＨｉＣｅｌ６Ｂ（配列番号：４）；ＭｔＣｅｌ６Ａ（配列番号：５）；ＮｐＣｅｌ６Ａ（配列番号：６）；ＯｐＣ２Ｃｅｌ６Ｆ（配列番号：７）；ＰｃＣｅｌ６Ａ（配列番号：８）；ＰＥ２Ｃｅｌ６Ａ（配列番号：９）；ＴｆＣｅｌ６Ａ（配列番号：１０）；ＴｆＣｅｌ６Ｂ（配列番号：１１）。
【図２】組換えサッカロミセス・セレビシエからの親のＴｒＣｅｌ６ＡおよびバリアントＴｒＣｅｌ６Ａセルラーゼの発現および分泌を指令するプラスミドベクターＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−ａss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐを図示した図である。
【図３】組換えサッカロミセス・セレビシエからの生来のおよびバリアントのＨｉＣｅｌ６ＡまたはＰｃＣｅｌ６Ａの発現および分泌を指令するプラスミドベクターＹｅｐ３５２／９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−６Ｈ−Ｈｉ（Ｐｃ）Ｃｅｌ６Ａを図示した図である。
【図４】Ｃｅｌ７ＡおよびＣｅｌ６Ａを不含有のセルラーゼにより処理されたシグマセル（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ）５０に対するＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐの活性を実証するデータを図示した図である。セロビオヒドロラーゼ不含有セルラーゼをデータ収集の開始に追加し、見かけ上の吸光度に対する認識可能な効果はない。データ収集の開始の５分後に、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐを追加し、見かけ上の吸光度は減少し始める。Ｃｅｌ６Ａの活性は、吸光度の減少の直線状部分の勾配に比例する。グルコースの非存在下および使用されるグルコースの最高濃度（５０ｇ／Ｌ）の存在下における活性が示される。データは、５つの重複測定の平均を表わし、エラーバーは１つの標準偏差を表わす。
【図５】ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐの相対的な活性に対するグルコース濃度の増加効果を示した図である。
【図６】ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｙ１０３Ｋ−Ｓ４１３Ｐの相対的な活性に対するグルコース濃度の増加の効果を示した図である。
【図７】ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｍ１３４Ｔ−Ｓ４１３Ｐの相対的な活性に対するグルコース濃度の増加の効果を示した図である。
【図８】ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｌ１３６Ｉ−Ｓ４１３Ｐの相対的な活性に対するグルコース濃度の増加の効果を示した図である。
【図９】ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ１８６Ｙ  Ｓ４１３Ｐの相対的な活性に対するグルコース濃度の増加の効果を示した図である。
【図１０】ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｇ３６５Ｑ−Ｓ４１３Ｐの相対的な活性に対するグルコース濃度の増加の効果を示した図である。
【図１１】ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｒ４１０Ｆ−Ｓ４１３Ｐの相対的な活性に対するグルコース濃度の増加の効果を示した図である。
【図１２】ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｍ１３４Ｖ−Ｌ１３６Ｉ−Ｓ４１３Ｐの相対的な活性に対するグルコース濃度の増加の効果を示した図である。
【図１３】ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｌ１３６Ｉ−Ｌ２１５Ｉ−Ｓ４１３Ｐの相対的な活性に対するグルコース濃度の増加の効果を示した図である。
【図１４】ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｍ１３４Ｖ−Ｌ１３６Ｉ−Ｌ２１５Ｉ−Ｓ４１３Ｐの相対的な活性に対するグルコース濃度の増加の効果を示した図である。
【図１５】１０ｇ／Ｌグルコースの存在下におけるＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰおよびＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｌ２１５Ｉ−Ｓ４１３Ｐの活性を示した図である。
【図１６】実施例８（ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ）および実施例１３（ＨｉＣｅｌ６Ａバリアント、パネルＡ）及びＰｃＣｅｌ６Ａバリアント（パネルＢ）に記述されているように精製した、親のファミリー６セルラーゼおよびファミリー６セルラーゼバリアントのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した図である。精製したファミリー６セルラーゼを、クマシーブルー染色によって可視化した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明はファミリー６セルラーゼバリアントに関する。より具体的には、本発明は、それが由来する親のファミリー６セルラーゼに比べてグルコースによる阻害が減少したファミリー６セルラーゼバリアントに関する。本発明は、ファミリー６セルラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝的コンストラクト、宿主株からのファミリー６セルラーゼバリアントの産生のための方法、およびセルロースの加水分解におけるファミリー６セルラーゼバリアントの使用にも関する。
【００２８】
以下の説明は、本発明を実行に移すために必要な特色の組み合わせのほんの一例として、およびこれらに限定されない好ましい実施形態である。
【００２９】
定義
ファミリー６セルラーゼバリアント
ファミリー６（以前はファミリーＢ）セルラーゼ酵素は、アノマー炭素の立体配置の反転によりセルロース中のβ−１，４グルコシド結合を加水分解する一群の酵素である（Ｃｌａｅｙｓｓｅｎｓ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，  Ｂ．  １９９２）。これまでに同定された大部分のファミリー６セルラーゼは中温性である。しかしながら、このファミリーは、サーモビフィダ・フスカからの耐熱性セルラーゼ（図１のＴｆＣｅｌ６ＡおよびＴｆＣｅｌ６Ｂ）およびフミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）からの好アルカリ性セルラーゼ（図１のＨｉＣｅｌ６ＡおよびＨｉＣｅｌ６Ｂ）もまた含む。
【００３０】
図１および表１は、ファミリー６の大部分のセルラーゼの中には高度に保存性がある一次アミノ酸配列があることを示す。現在のところ公知である３５のファミリー６セルラーゼのアミノ酸配列にわたる複数のアライメントは、真菌起原の大部分の天然に存在するファミリー６セルラーゼが、ＴｒＣｅｌ６Ａのアミノ酸８３〜４４７に対して約４７％〜約１００％のアミノ酸配列同一性があることを示す（図１および表１）。細菌起源のファミリー６セルラーゼは、ＴｒＣｅｌ６Ａに対してずっと低い程度のアミノ酸配列同一性を示す。
【００３１】
触媒残基として働くことができる２つのアスパラギン酸（Ｄ）残基を含む他のファミリー６セルラーゼに共通のアミノ酸を含むならば、セルラーゼはファミリー６セルラーゼとして分類される。これらのアスパラギン酸残基はポジション１７５および２２１で見出される（図１を参照；ＴｒＣｅｌ６Ａナンバリングに基づく）。「ＴｒＣｅｌ６Ａナンバリング」によって、アミノ酸のポジションに対応するナンバリングがＴｒＣｅｌ６Ａのアミノ酸配列に基づくことが意味される（表１；図１；配列番号：１）。図１によって明らかであるように、ファミリー６セルラーゼはかなりの程度の配列相同性を示す。したがって、アミノ酸をアライメントさせてセルラーゼ酵素間の配列相同性を最適化することによって、およびナンバリングの基準としてＴｒＣｅｌ６Ａのアミノ酸ナンバリングを使用することによって、他のセルラーゼ酵素内のアミノ酸のポジションはＴｒＣｅｌ６Ａと比較して決定することができる。アミノ酸配列をアライメントさせる方法は当業者に周知で利用可能であり、それらは２つの配列のアライメントに有用なＢＬＡＳＴ（基本的局所アライメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）、ＵＲＬ：ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを参照）、および２つまたはそれ以上の配列のアライメントのためのＣＬＵＳＴＡＬＷ（ＵＲＬ：ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照）を含む。
【００３２】
全体的な三次元構造の保存性は、ファミリー６セルラーゼの一次アミノ酸配列のアライメントへのさらなるガイダンスを提供する。ファミリー６触媒ドメインのトポロジーは、５つのα−ヘリックスによって連結されている７つの平行なβ−ストランドを含む、中央のβ−バレルを備えたα／β−バレルのバリアントである。ファミリー６セロビオヒドロラーゼとエンド−β−１，４−グルカナーゼとの間の１つの重要な差は、活性部位の各々の側に存在するＮ末端ループおよびＣ末端ループの長さであり、それはらセルロースに対する機能的挙動に関与する。セロビオヒドロラーゼにおいて、大規模なＣ末端ループは、活性部位を囲むＮ末端ループと共にトンネルを形成する。これは、Ｎ末端ループおよびＣ末端ループが活性部位中に単一のセルロース鎖を維持し、基質の前進的な分解を促進して、結晶セルロースの末端を攻撃するというセロビオヒドロラーゼのユニークな特性を付与する。エンド−β−１，４−グルカナーゼにおいて、Ｃ末端ループの長さは減少し、Ｎ末端ループは活性部位から離れて、同様により短くなり、その結果加水分解のためにセルロースの内部のβ−１，４グリコシド結合へ接近することを可能にするより開いた活性部位をもたらす。セルロースに対するファミリー６酵素の機能的挙動におけるこれらのループの役割は、エンド−β−１，４−グルカナーゼの特性を模倣するためにセルロモナス・フィミ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ  ｆｉｍｉ）のセロビオヒドロラーゼＣｅｌ６ＢのＣ末端ループの１５アミノ酸を欠失させることによって確認された（Ｍｅｉｎｋｅ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９５．）。変異により、カルボキシメチルセルロースなどの可溶性セルロースに対する酵素のエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を促進され、不溶性セルロースに対するそのセロビオヒドロラーゼ活性が改変された。
【００３３】
本発明の目的のために、「ファミリー６セルラーゼ」は、反転機構を使用して多糖を加水分解することができる酵素として定義され、５つのα−ヘリックスによって連結される７つの平行なβ−ストランドを含む中央のβ−バレルを備えたα／β−バレル構造のＴｒＣｅｌ６Ａのファミリー６触媒ドメインを表わす、配列番号：１のアミノ酸８３〜４４７に約４７％〜約１００％同一であるアミノ酸配列を有することによって特徴づけられる。例えば、ファミリー６セルラーゼは、配列番号：１のアミノ酸８３〜４４７に約４７％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一であるアミノ酸配列を有することができる。当業者は、１つまたは複数アミノ酸の追加、欠失または置換によって与えられたファミリー６セルラーゼのアミノ酸配列が修飾されてもなおファミリー６セルラーゼと判断できることを認識する。アミノ酸配列の改変のための技術は、部位特異的変異誘発、カセット式変異誘発、ランダム変異誘発、合成オリゴヌクレオチド構築、クローニングおよび当業者に公知であるような他の遺伝子工学手法を含むが、これらに限定されない。（Ｅｉｊｓｉｎｋ  ＶＧ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００５．、参照することにより本明細書に組み入れられる）。本明細書において略述されるような一般的アプローチおよび方法論に従って修飾することができるファミリー６セルラーゼの非限定例は、表１中に提供される。
【００３４】
表１：ファミリー６セルラーゼ
【表１】
2011509662.tif 000003
2011509662.tif 000004
2011509662.tif 000005
【００３５】
「ファミリー６セルラーゼバリアント」または「修飾されたファミリー６セルラーゼ」によって、ポジション１０３での塩基性残基、非極性残基もしくはプロリン残基によるアミノ酸置換；ポジション１３６でのバリン残基もしくはイソロイシン残基によるアミノ酸置換；ポジション１８６でのチロシン残基もしくはリジン残基により置換されたアミノ酸；ポジション３６５での酸性残基、グルタミン残基もしくはセリン残基によるアミノ酸置換；またはポジション４１０でのアラニン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン残基もしくはセリン残基によるアミノ酸置換の１つまたは複数のアミノ酸置換を含み；前記ポジションが配列番号：１において定義されるようなトリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａアミノ酸配列と前記単離されたセルラーゼの配列アラインメントから決定される、ファミリー６セルラーゼが意味される。ファミリー６セルラーゼバリアントがいずれかのファミリー６セルラーゼに由来し得ることが理解されるだろう。例えば、ファミリー６セルラーゼバリアントは、野生型セルラーゼ、または他のアミノ酸置換を既に含むセルラーゼに由来することができる。本発明の１つの実施形態において、ファミリー６セルラーゼバリアントは、ファミリー６セルラーゼバリアントが由来する対応する親のファミリー６セルラーゼよりもグルコースによる阻害の減少を示す。
【００３６】
「野生型」または「生来の」ファミリー６セルラーゼによって、何ら置換、欠失、追加または修飾の導入のない、かかるファミリー６セルラーゼを天然に産生する生物のゲノムによってコードされるようなアミノ酸配列を有するファミリー６セルラーゼが意味される。例えば、野生型ＴｒＣｅｌ６Ａ、野生型ＨｉＣｅｌ６Ａおよび野生型ＰｃＣｅｌ６Ａによって、何らアミノ酸置換のない配列番号：１、配列番号：２３および配列番号：３０のセルラーゼがそれぞれ意味される。
【００３７】
「親のファミリー６セルラーゼ」によって、少なくとも１．４倍少ないグルコースによる阻害を示し、ファミリー６セルラーゼバリアントのアミノ酸に対応する変異ポジションで１つ以上の天然に存在するアミノ酸（複数可）を含むが、他のアミノ酸はファミリー６セルラーゼバリアントと同一であるファミリー６セルラーゼが意味される。親のファミリー６セルラーゼは、ポジション１０３で天然に存在するアミノ酸が塩基性残基、非極性残基もしくはプロリン残基である、ポジション１３６で天然に存在するアミノ酸はバリン残基もしくはイソロイシン残基である、ポジション１８６で天然に存在するアミノ酸はチロシン残基もしくはリジン残基である、ポジション３６５で天然に存在するアミノ酸は酸性残基、グルタミン残基もしくはセリン残基である、および／またはポジション４１０で天然に存在するアミノ酸は、アラニン残基、フェニルアラニン残基、ロイシン残基、グルタミン残基もしくはセリン残基であるセルラーゼを含まない。この定義は、遺伝子工学または他の技術によって導入された他のポジションでの１つまたは複数の追加のアミノ酸置換が対応するファミリー６セルラーゼバリアント中にも存在するならば、これらの置換を含む親のファミリー６セルラーゼを包含する。例えば、親のセルラーゼは、増加した耐熱性を付与するポジション４１３（ＴｒＣｅｌ６Ａナンバリング）でのプロリンへのアミノ酸の変異を含むことができる。ファミリー６セルラーゼバリアントの非限定例は表２中に見出すことができる。
【００３８】
表２：ファミリー６セルラーゼバリアント
【表２】
2011509662.tif 000006
2011509662.tif 000007
【００３９】
グルコース阻害の減少
セルラーゼのグルコース阻害は、阻害定数ＫG（セルラーゼの活性を５０％減少させるグルコースの濃度として定義される）の決定によって測定される。ＫGの値は、産生物阻害の性質（すなわち競合型、非競合型または混合型）に依存的ではない。グルコースによってあまり阻害されないセルラーゼは、ＫGについてより高い値を有するだろう（すなわち、酵素活性を５０％減少させるためにグルコースのより高い濃度を必要とする）。
【００４０】
本発明の目的のために、ファミリー６セルラーゼバリアントが、親のファミリー６セルラーゼよりも少なくとも１．４倍、または少なくとも約１．８倍高いＫGを有するならば、対応する親のファミリー６セルラーゼに関して減少したグルコース阻害を示す。ＫGは、単離された親のファミリー６セルラーゼの活性を５０％減少させ、実施例９において詳述された分析によって決定されるグルコースの濃度である。
【００４１】
ファミリー６セルラーゼバリアントは、対応する親のファミリー６セルラーゼよりも約１．４倍高いまたは約１．８倍高いＫGを有することができる。例えば、ファミリー６セルラーゼバリアントは、対応する親のファミリー６セルラーゼよりも少なくとも約１．４、１．５、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、８．０、１０．０、１２．０、１５．０または２０．０倍高いＫGを有することができる。
【００４２】
グルコースによって減少した阻害を示すファミリー６セルラーゼバリアントの例は、表２中に示される。
【００４３】
ファミリー６セルラーゼバリアントをコードする遺伝学的コンストラクト
本発明は、宿主微生物からのファミリー６セルラーゼバリアントの発現および分泌を指令する調節性ＤＮＡ配列に作動可能に結合されたファミリー６セルラーゼバリアントをコードするＤＮＡ配列を含む遺伝的コンストラクトにも関する。「調節性ＤＮＡ配列」によって、プロモーターおよび分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列が意味される。調節性ＤＮＡ配列は、真菌の宿主中で好ましくは機能的である。調節性ＤＮＡ配列は、工業用発酵条件下において、宿主微生物中で高度に発現されかつ分泌される遺伝子に由来し得る。好ましい実施形態において、調節配列は、いずれか１つまたは複数のトリコデルマ・リーゼイのセルラーゼ遺伝子またはヘミセルラーゼ遺伝子に由来する。
【００４４】
遺伝的コンストラクトは、当業者に一般に公知であるように、コンストラクトにより形質転換された遺伝的に修飾された微生物の単離を可能にする選択可能なマーカー遺伝子をさらに含むことができる。選択可能なマーカー遺伝子は、抗生物質に対する耐性または特異的な栄養素を欠く培地上で増殖する能力を、これらなしにはこれらの条件下で増殖することができない宿主生物に対して付与することができる。本発明は選択可能なマーカー遺伝子の選択によって限定されておらず、当業者は適切な遺伝子を容易に決定することができる。好ましい実施形態において、選択可能なマーカー遺伝子は、ハイグロマイシン、フレオマイシン、カナマイシン、またはジェネティシン、もしくはＧ４１８に対する耐性を付与するか、ｔｒｐ、ａｒｇ、ｌｅｕ、ｐｙｒ４、ｐｙｒ、ｕｒａ３、ｕｒａ５、ｈｉｓ、もしくはａｄｅ遺伝子のうちの１つの宿主微生物の欠損を補完するか、または唯一の窒素源としてのアセトアミド上で増殖する能力を付与する。
【００４５】
遺伝的コンストラクトは、他のＤＮＡ配列、例えば、転写ターミネーター、ペプチドタグをコードするＤＮＡ、様々なＤＮＡ配列をともに結合する合成配列、複製起原、および同種のものをさらに含むことができる。本発明の実施は、いずれか１つまたは複数のこれらの他のＤＮＡ配列の存在によって限定されない。
【００４６】
ファミリー６セルラーゼバリアントを産生する遺伝的に修飾された微生物
ファミリー６セルラーゼバリアントは、ファミリー６セルラーゼバリアントをコードする遺伝的コンストラクトによる宿主微生物の形質転換によって産生された遺伝的に修飾された微生物から発現および分泌することができる。宿主微生物は、サッカロミセス属、ピキア属、ハンゼヌラ属、トリコデルマ属、ヒポクレア属、アスペルギルス属、フザリウム属、フミコーラ属、またはニューロスポラ属の一種を含むが、これらに限定されない酵母または糸状菌でありえる。例えば、宿主微生物は、サッカロミセス・セレビシエまたはトリコデルマ・リーゼイの工業用株でありえる。典型的には、宿主微生物は、ファミリー６セルラーゼをコードする遺伝子を含んでいないもの、またはいずれかのまたはすべてのファミリー６セルラーゼをコードする遺伝子（複数可）が欠失されたものである。
【００４７】
遺伝的コンストラクトは、ＣａＣｌ2、エレクトロポレーション、微粒子銃砲撃、プロトプラストのＰＥＧ仲介性融合による細胞の処理を含むが、これらに限定されない微生物形質転換の当業者に公知のいずれかの数の方法によって宿主微生物へと導入することができる（例えば、Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ  ２００５／０９３０７２、参照することにより本明細書に組み入れられる）。ファミリー６セルラーゼバリアントを発現する組換え真菌株の選択後に、選択された組換え株は、ファミリー６セルラーゼバリアントの発現を誘導する条件下の液内発酵において培養することができる。
【００４８】
セルロース基質の加水分解におけるファミリー６セルラーゼバリアントの使用
本発明のファミリー６セルラーゼバリアントは、セルロースの酵素的加水分解のために使用される。本発明のファミリー６セルラーゼバリアントは、阻害的レベルのグルコースが存在または蓄積する条件下で、セルロース含有基質の加水分解のために特に有用である。例えば、本発明のファミリー６セルラーゼバリアントは、セルロースの初期開始濃度が約２０ｇ／Ｌであり約５０％のセルロースがグルコースに変換されるプロセス、またはセルロースの初期開始濃度が約２００ｇ／Ｌまでであり約５％のセルロースがグルコースに変換されるプロセスで有用かもしれない。例えば、初期セルロース濃度は２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０または２００ｇ／Ｌであり、約５０％、３３％、２５％、２０％、１７％、１２％、１０％、８％、７％または５％のセルロースはそれぞれグルコースに変換される。かかるプロセス中で親のＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐを使用する事例において、したがって、グルコースの濃度は酵素のＫGに類似し、その活性を約５０％減少させるだろう（表５、図５）。
【００４９】
例えば、本発明のファミリー６セルラーゼバリアントは、「前処理したリグノセルロース原料」中に存在するセルロースの酵素的加水分解のために使用することができる。前処理したリグノセルロース原料は、前処理の前に、少なくとも２０％のセルロース（乾燥重量）および少なくとも１０％のリグニン（乾燥重量）を含んでおり、セルロース分解性酵素の作用に対して、より接近可能なおよび／またはより感受性のある繊維を作製するために物理的および／または化学的なプロセスにさらされた植物起原の材料である。前処理後に、リグノセルロース原料は、約２０％以上のセルロース、および約１０％以上のリグニンを含みうる。１つの実施形態において、前処理したリグノセルロース原料は、約２０％以上のセルロース、および約１２％以上のリグニンを含んでいる。前処理プロセスの非限定例は、硫酸もしくは亜硫酸、もしくは他の酸；アンモニア、石灰、水酸化アンモニウム、もしくは他の塩基；エタノール、ブタノール、もしくは他の有機溶媒；または加圧水によるリグノセルロース原料の化学処理を含む（米国特許第４，４６１，６４８号、第５，９１６，７８０号、第６，０９０，５９５号、第６，０４３，３９２号、第４，６００，５９０号、Ｗｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）およびＯｈｇｒｅｎ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）を参照）。
【００５０】
本発明において使用し得るリグノセルロース原料は、トウモロコシ茎葉、麦わら、大麦わら、稲わら、エンバクわら、キャノーラわら、および大豆茎葉などの農業用残渣；トウモロコシ繊維、甜菜パルプ、パルプミル微粉および不良品（ｒｅｊｅｃｔ）、またはサトウキビバガスなどの繊維加工残渣；アスペン材、他の硬材、軟材およびおがくずなどの林業残渣；またはスイッチグラス、ミスカンサス(ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ)、コードグラス、およびリードキャナリーグラス（ｒｅｅｄ  ｃａｎａｒｙ  ｇｒａｓｓ）などの草を含むが、これらに限定されない。リグノセルロース原料は、製粉、粉砕、撹拌、破砕、圧縮／膨張、または他のタイプの機械的作用を含むが、これらに限定されない方法によるサイズの減少を最初に行なうことができる。機械的作用によるサイズ減少は、例えば、ハンマーミルであるがこれに限定されない、目的に適合したいずれかの型の装置によって実行することができる。
【００５１】
用語「酵素的加水分解」によって、本発明のファミリー６セルラーゼバリアントを含む酵素を含むセルラーゼ酵素または混合物がセルロースに作用して、そのすべてまたは一部分を可溶性糖質に変換するプロセスが意味される。用語「セルラーゼ混合物」によって、セルロースを分解し、かつ１つまたは複数の「エンドグルカナーゼ」（セルロース鎖内のβ−１，４グリコシド結合を加水分解する酵素）、「セロビオヒドロラーゼ」または「エキソグルカナーゼ」（セルロース鎖の還元末端または非還元末端のいずれかからセロビオースを連続して切断する酵素）、および１つまたは複数の「β−グルコシダーゼ」（セロビオースをグルコースへ加水分解する酵素）を含む酵素の混合物が意味される。セルラーゼ混合物は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼおよびβ−グルコシダーゼに加えて他の酵素またはタンパク質を含むことができる。
【００５２】
酵素的加水分解プロセスは、好ましくは約８０％〜約１００％、またはその間のいずれかの範囲のセルロースを可溶性糖質へ変換する。例えば、酵素的加水分解プロセスは、約９０％〜約１００％、またはその間のいずれかの範囲のセルロースを可溶性糖質へ変換する。好ましい実施形態において、酵素的加水分解プロセスは、約９８％〜約１００％、またはその間のいずれかの範囲のセルロースを可溶性糖質へ変換する。
【００５３】
好ましくは、一次セルラーゼは１つまたは複数の液内培養発酵において産生され、発酵の終了時に細胞から分離される。細胞は、濾過、遠心分離、または当業者が精通している他のプロセスによってセルラーゼから分離することができる。次に、細胞不含有セルラーゼ含有画分は、使用の前に、濃縮（例えば、限外濾過によって）、保存、および／または安定化することができる。あるいは、一次セルラーゼは細胞から分離されないが、細胞と共に酵素的加水分解に追加される。
【００５４】
ファミリー６セルラーゼのグルコース阻害の低下
ファミリー６セルラーゼバリアントのグルコース阻害定数は、様々な濃度のグルコースで基質の存在下において酵素をインキュベーションすることによって決定された。セルラーゼの活性は、基質としての不溶性の酸膨潤されたセルロースによる濁度分析によって決定された。「濁度分析」によって、粒子により散乱されず、したがって懸濁を通して直接透過される入射光の割合が測定される、液体中の微粒子の懸濁の光学的密度の分析が意味される。「比濁分析」は、典型的には入射光から９０度の観察角度からの粒子によって散乱される光の割合を測定する関連技術である。
【００５５】
ポジション１０３、１３６、１８６、３６５および４１０でのアミノ酸置換の、ポジション４１３でのプロリンによるセリンの置換を備えたＴｒＣｅｌ６Ａの耐糖能に対する効果は、互いと組み合わせて、またはポジション１３４および２１５での追加のアミノ酸置換と共に、親のファミリー６セルラーゼのＴｒＣｅｌ６ＡＳ４１３Ｐ、ＨｉＣｅｌ６ＡおよびＰｃＣｅｌ６Ａのバリアントの比較研究によって決定された。
【００５６】
ファミリー６セルラーゼバリアントについてのＫGの絶対値および親のファミリー６セルラーゼに対するグルコース阻害の相対的な減少は、以下の表３中に示される。
【００５７】
表３：ファミリー６セルラーゼバリアントのグルコース阻害の減少
【表３】
2011509662.tif 000008
2011509662.tif 000009
【００５８】
「相対的ＫG」によって、ファミリー６セルラーゼバリアントが由来する親のファミリー６セルラーゼの絶対的ＫGに対するファミリー６セルラーゼバリアントの絶対的ＫGの比率が意味される。それゆえ、ファミリー６セルラーゼバリアントは、それが由来する親のファミリー６セルラーゼよりも「〜倍」少ないグルコースによる阻害を示すといわれる。例えば、表３中に示されるように、Ｐ．クリソスポリウムのファミリー６セルラーゼのＹ９８Ｋバリアントは、３．２２の相対的ＫGを示し、したがって、Ｙ９８Ｋバリアントが由来する親の野生型Ｐ．クリソスポリウムファミリー６セルラーゼよりもグルコースによる阻害は３．２２倍少ない。
【実施例】
【００５９】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例が説明の目的のみのためであり、いかなる方式によっても本発明の範囲を限定するために使用すべきでないことが理解されるべきである。
【００６０】
実施例１は、以下の実施例において使用される株およびベクターについて記述する。実施例２〜５は、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ遺伝子のクローニングおよび酵母における形質転換、Ｃｅｌ６ＡのエラープローンＰＣＲおよび部位飽和突然変異誘発のライブラリーの作製、ならびにコンビナトリアル変異体の生成について記述する。実施例６および７は、ミクロ培養からのＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐバリアントの発現、およびグルコースによる阻害が減少したファミリー６セルラーゼバリアントを同定するハイスループットスクリーニングについて記述する。実施例８および９は、グルコースによる阻害が減少した単離された親のファミリー６セルラーゼの発現および特性評価について記述する。実施例１０〜１４は、ＰｃＣｅｌ６ＡＨｉｓ６およびＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｈｉｓ６ならびにそれらのバリアントの構築、発現、精製および特性評価について記述する。実施例１５は、ＴｒＣｅｌ６Ａバリアントの濃度の測定のための免疫分析について記述する。
【００６１】
実施例１：株およびベクター
サッカロミセス・セレビシエ株ＹＤＲ４８３Ｗ  ＢＹ４７４２［１４３１７］（ＭＡＴα  ｈｉｓ３Δ１  ｌｅｕ２Δ０  ｌｙｓ２Δ０  ｕｒａ３Δ０  Δｋｒｅ２）は、ＡＴＣＣ（＃４０１４３１７）から得た。フミコーラ・インソレンスおよびファネロカエテ・クリソスポリウムの株は、ＡＴＣＣ（登録商標）（それぞれ、＃２２０８２（商標）および＃２０１５４２（商標））から得た。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α（Ｆ-Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒk-，  ｍk+）  ｐｈｏＡ  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅｌＡ１  λ-）は、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社から得た。ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ベクターは国立衛生研究所から得た。ＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０Ｓ４１３Ｐベクターは、米国特許出願第６０／８４１，５０７号中に記述される。ＹＥｐＦＬＡＧ−１ベクターは、アミノ末端酵母ＦＬＡＧ発現キット（Ａｍｉｎｏ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｙｅａｓｔ  ＦＬＡＧ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ）の一部としてシグマ（Ｓｉｇｍａ）社から得た。ｐジェムＴイージーベクター（ｐＧＥＭ  Ｔ−ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ）はプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社から得た。
【００６２】
実施例２：ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１の中へのＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ遺伝子のクローニングおよび酵母への形質転換
ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩの制限酵素を使用するクローニングを促進するために、ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ベクターのポジション１９３６でのユニークなＮｈｅＩ部位をＤＮＡポリメラーゼＩ大断片（クレノウ断片）を使用してブラントにし、ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩを生成した。ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ遺伝子は、プライマー５’ＮｈｅＣｅｌ６Ａおよび３’ＢｇｌＫｐｎＣｅｌ６Ａを使用して、ＹＥｐＦＬＡＧΔＫｐｎ１０Ｓ４１３Ｐベクター（米国特許出願第６０／８４１，５０７号）からのＰＣＲによって増幅された。並列して、酵母α−因子リーダー配列は、プライマー（５’ＢｇｌＡｌｐｈａＳＳおよび３’ＮｈｅＡｌｐｈａＳＳ）を使用してＹＥｐＦＬＡＧ−１ベクター（シグマ社）からのＰＣＲによって増幅して、アンプリコンの５’末端でのＢｇｌＩＩおよび３’末端でのＮｈｅＩのための制限部位を導入した。
【００６３】
酵母α−因子リーダー配列はＢｇｌＩＩ／ＮｈｅＩ消化によって単離され、３ピースライゲーションは、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ遺伝子（ＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩ消化によって単離された）およびＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩベクター（ＢｇｌＩＩ消化によって単離された）により実行された。結果として生じるベクターＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ（図２）は、Ｇｉｅｔｚ，  Ｒ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，  Ｒ．  Ａ．  （２００２）によって記述された手順を使用して、酵母株ＢＹ４７４２中に形質転換した。プライマー配列を以下にリストする。
５’ＢｇｌＡｌｐｈａＳＳ：５’ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＡＧＡ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＡＴＴ（配列番号：９１）
３’ＮｈｅＡｌｐｈａＳＳ：５’ＴＧＡ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＴＡＣ（配列番号：９２）
５’ＮｈｅＣｅｌ６Ａ：５’ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＧＴＣ  ＴＧＧ  ＧＧＣ（配列番号：９３）
３’ＢｇｌＫｐｎＣｅｌ６Ａ：５’ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＣＡＧ  ＧＡＡ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＧＴＴ（配列番号：９４）
【００６４】
実施例３：エラープローンＰＣＲのライブラリーの作製
ランダム変異誘発ライブラリーは、２つの方法（ミュータザイム（Ｍｕｔａｚｙｍｅ）（登録商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ法、およびＭｎ2+／バイアスデオキシリボヌクレオチド３リン酸混合法）を使用して生成された。ミュータザイム（登録商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ法のために、一連の４つの独立したＰＣＲを、１０、２０、３０および４０ｎｇのＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐベクター、ならびにプライマーＹａｌｐｈａＮ２１および３’ＰＧＫ−ｔｅｒｍと共にミュータザイム（登録商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して実行した。増幅は２５サイクルで行った。４つのＰＣＲ産物をプールし、１０ｎｇ／μＬに希釈した。第２のＰＣＲ変異誘発工程は、ミュータザイム（登録商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼと共に３０ｎｇのプールしたＰＣＲ産物を使用し、同じプライマーを使用して、３０増幅サイクルで実行した。ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰベクターをＮｈｅＩおよびＫｐｎＩにより消化し、空ベクター断片を単離した。この直線状断片および最終的なアンプリコンを同時に形質転換し、生体内組換えによって酵母株ＢＹ４７４２へとクローニングした（Ｂｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【００６５】
Ｍｎ2+／バイアスをかけたデオキシリボヌクレオチド３リン酸混合法のために、ＰＣＲは、プライマーのＹａｌｐｈａＮ２１および３’ＰＧＫ−ｔｅｒｍとＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（シグマ社）と共に、２５ｎｇのＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐベクター、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＣＴＰ、２４０μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰおよび６４０μＭ  Ｍｎ2+を使用して、３０増幅サイクルで実行した。最終的なアンプリコンは、上述されるようなＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐベクターへとクローン化した。
ＹａｌｐｈａＮ２１：５’ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＡＡＣ  ＧＧＧ  ＴＴＡ  ＴＴＧ（配列番号：９５）
３’ＰＧＫ−ｔｅｒｍ：５’ＧＣＡ  ＡＣＡ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＣＣ（配列番号：９６）
【００６６】
実施例４：部位飽和変異誘発ライブラリーの作製
グルコースに対する耐性をさらに改善するアミノ酸を見出すために、ハイスループットスクリーニング（実施例７）の間に同定されたＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐにおける７つのアミノ酸ポジション（Ｍ１３４、Ｌ１３６、Ｌ２１５、Ｙ１０３、Ｓ１８６、Ｇ３６５、およびＲ４１０）が、部位飽和突然変異誘発について選択された。部位飽和変異誘発は、ＮＮＳプライマー（以下にリストした）、鋳型としてＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐベクター、およびプラチナ（Ｐｌａｔｉｎｕｍ）（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティー（Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）（インビトロゲン社）を使用して、メガプライマーＰＣＲ（２工程のＰＣＲ反応）によって実行した。第１の工程ＰＣＲを、ＮＮＳプライマーおよび相補的な外部プライマー（ＹａｌｐｈａＮ２１または３’ＰＧＫ−ｔｅｒｍ）を使用して行なった。精製アンプリコンは、第２の工程ＰＣＲのためのメガプライマーとして供給され、他の相補的な外部プライマーを使用して完全な変異遺伝子を増幅した。次に、この最終的なアンプリコンを、実施例３中に記述されているようなＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐベクターへとクローニングした。
３’Ｍ１３４Ｘ：５’ＧＡＧ  ＴＡＴ  ＣＴＡ  ＧＣＣ  ＡＳＮ  ＮＡＡ  ＡＡＧ  ＡＧＧ  ＧＡＡ  Ｃ（配列番号：９７）
３’Ｌ１３６Ｘ：５’ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＡＡＧ  ＡＧＴ  ＡＴＣ  ＳＮＮ  ＣＣＡ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＡＧ（配列番号：９８）
３’Ｌ２１５Ｘ：５’ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＴＡＡ  ＣＣＡ  ＧＳＮ  ＮＧＧ  ＴＣＣ  ＧＧＡ  ＴＡＴ  Ｃ（配列番号：９９）
３’Ｙ１０３Ｘ：５’ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＣＧＴ  ＡＳＮ  ＮＴＧ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＣＣＣ  （配列番号：１００）
３’Ｓ１８６Ｘ：５’ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＣＧＧ  ＣＡＡ  ＴＳＮ  ＮＧＴ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＴＣ（配列番号：１０１）
５’Ｇ３６５Ｘ：５’ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＮＮＳ  ＧＡＣ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＡＡＴ  Ｇ（配列番号：１０２）
５’Ｒ４１０Ｘ：５’ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＮＮＳ  ＴＴＴ  ＧＡＣ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＧＣ  （配列番号：１０３）
【００６７】
実施例５：コンビナトリアル変異体の作製。
グルコースに対する耐性について実施例７において同定されたＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ陽性バリアントに基づいて、１セットの３つの複数変異体および１つの単一変異体を、親ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ上にデザインした（Ｍ１３４Ｖ−Ｌ１３６Ｉ、Ｌ１３６Ｉ−Ｌ２１５Ｉ、Ｍ１３４Ｖ−Ｌ１３６Ｉ−Ｌ２１５Ｉ、およびＭ１３４Ｖ）。Ｍ１３４Ｖ−Ｌ１３６Ｉ変異体については、ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰベクターはメガプライマーＰＣＲの２工程の反応のための鋳型として供給され、変異誘発プライマー５’Ｍ１３４Ｖ−Ｌ１３６Ｉ、外部プライマー３’ＰＧＫ−ｔｅｒｍ、およびプラチナ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティー（インビトロゲン社）を使用した。精製アンプリコンは第２の工程ＰＣＲのためのメガプライマーとして供給され、ＹａｌｐｈａＮ２１外部プライマーを使用して完全な変異遺伝子を増幅する。ＸｈｏＩおよびＮｒｕＩにより消化したこの最終的なアンプリコンおよび精製ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐベクターを同時に形質転換し、生体内組換えによって酵母株ＢＹ４７４２へとクローニングした。Ｌ１３６Ｉ−Ｌ２１５Ｉ変異体については、ＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＶ精製断片、ならびにＸｈｏＩおよびＮｒｕＩにより消化した精製ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ−Ｌ２１５Ｉベクター（実施例７において単離された）を同時に形質転換し、生体内組換えによって酵母株ＢＹ４７４２へとクローニングした。Ｍ１３４Ｖ−Ｌ１３６Ｉ−Ｌ２１５Ｉ変異体については、上述された精製メガプライマー、ならびにＸｈｏＩおよびＮｒｕＩにより消化した精製ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ−Ｌ２１５Ｉベクター（実施例７において単離された）を同時に形質転換し、生体内組換えによって酵母株ＢＹ４７４２へとクローニングした。最後にＭ１３４Ｖ変異体については、ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰベクターはメガプライマーＰＣＲの２工程の反応のための鋳型として供給され、変異誘発プライマー５’Ｍ１３４Ｖ、外部プライマー３’ＰＧＫ−ｔｅｒｍ、およびプラチナ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼハイフィデリティー（インビトロゲン社）を使用した。精製アンプリコンは第２の工程ＰＣＲのためのメガプライマーとして供給され、ＹａｌｐｈａＮ２１外部プライマーを使用して完全な変異遺伝子を増幅した。この最終的なアンプリコン、ならびにＸｈｏＩおよびＮｒｕＩにより消化した精製ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１ΔＮｈｅＩ−αss−ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐベクターを同時に形質転換し、生体内組換えによって酵母株ＢＹ４７４２へとクローニングした。
５’Ｍ１３４Ｖ−Ｌ１３６Ｉ：５’ＧＴＴ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＡＴＡ  ＧＡＴ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＧＡＣ（配列番号：１０４）
５’Ｍ１３４Ｖ：５’ＧＴＴ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＡＣＴ（配列番号：１０５）
【００６８】
実施例６：マイクロプレート培養からのＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐおよびそのバリアントの発現および単離
この実施例は、ハイスループットスクリーニング分析（実施例７）で使用されるサッカロミセス・セレビシエからのＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐバリアントの選択および発現について記述する。
【００６９】
サッカロミセス・セレビシエ形質転換体（実施例２〜５からの）を、合成完全培地（ＳＣ：２％寒天ｗ／ｖ、０．１７％酵母窒素ベースｗ／ｖ、０．０７８％−Ｕｒａドロップアウトサプリメントｗ／ｖ、２％グルコースｗ／ｖ、２％カザミノ酸ｗ／ｖ、０．５％硫酸アンモニウムｗ／ｖ、ｐＨ  ５．５）および０．１２％アゾ−大麦−β−グルカン（メガザイム（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）社）を含むプレート上で３０℃で４日間増殖した。
【００７０】
４５℃での一晩のインキュベーション後に目視可能な透明なハローを示すコロニーを、９６ウェルマイクロプレート中の１５０μＬの合成完全培地（ＳＣ：０．１７％酵母窒素ベースｗ／ｖ、０．０７８％−Ｕｒａドロップアウトサプリメントｗ／ｖ、２％グルコースｗ／ｖ、２％カザミノ酸ｗ／ｖ、０．５％硫酸アンモニウムｗ／ｖ、ｐＨ  ５．５）の爪楊枝接種によって、液体培地の前培養のために選択した。前培養を、３０℃および３００ｒｐｍで一晩（１６〜１８時間）静止相まで増殖した。発現培養の接種については、２５μＬの前培養を使用して１つのガラスビーズを含むディープウェルマイクロプレート中に１ｍＬのＳＣ培地を接種した。発現培養は湿度管理しながら３０℃および２５０ｒｐｍで３日間増殖させた。プレートを５分間３０００ｒｐｍで遠心分離して細胞をペレットにし、スクリーニング分析（実施例７）のために上清を吸引した。残りの前培養に、１５％の最終的な濃度までグリセロールを追加することによってストックを調製し、−８０℃で保存した。
【００７１】
実施例７：グルコースに対する耐性を備えたファミリー６セルラーゼバリアントについてのトリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａ遺伝子ライブラリーのスクリーニング
この実施例は、グルコースによる阻害が減少したトリコデルマ・リーゼイＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐバリアントのスクリーニングについて、サッカロミセス・セレビシエへとクローニングされた親のＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐと比較して記述する。
【００７２】
実施例６中に記述されているような酵母ミクロ培養からのＴｒＣｅｌ６−Ｓ４１３Ｐバリアントは、９６ウェルマイクロプレート形式を使用して、０．２５ｍＬのクエン酸塩で緩衝した（ｐＨ５）セルロース加水分解の分析において検査された。各々のバリアントからの上清のアリコートを３０ｇ／Ｌグルコースを含む第１のウェルおよびグルコースが存在しない第２のウェルに追加し、濃度０．０６７％ｗ／ｖのセルロースと共に５０℃で１９時間インキュベートした。酵母上清に、トリコデルマ・リーゼイのＣｅｌ７ＢおよびＣｅｌ５Ａ（４０ｍｇタンパク質／ｇセルロース）、および１２５ＩＵ／ｇセルロースの黒色コウジ菌β−グルコシダーゼを補充した。比較のために使用した６つの親のＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ対照が、各々の９６のウェルマイクロプレート中に含まれた。セルラーゼ活性は濁度測定によって測定した。±グルコース活性比は、グルコースの非存在下におけるセルラーゼ活性でグルコースの存在下におけるセルラーゼ活性を割ることによって、すべてのＴｒＣｅｌ６Ａバリアントおよび親のＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐについて計算された。各々のＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐバリアントについての±グルコース活性比は、特定のマイクロプレートに対する６つの親のＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ対照の平均と比較され、陽性のものはｔ−検定を使用して９５％信頼度で選択された。すべての陽性バリアントをミクロ培養において再び産生し、再スクリーニングして偽陽性の数を減少させた。表４は、ＥＰ−ＰＣＲライブラリー（実施例３）および７つのＳＳＭライブラリー（実施例４）について得られたスクリーニング結果を要約する。
【００７３】
表４：Ｅｐ−ＰＣＲおよびＳＳＭライブラリーのスクリーニング結果
【表４】
2011509662.tif 000010
【００７４】
実施例８：大量培養からのＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐおよびそのバリアントの発現および濃縮
２つの体積５００ｍＬの滅菌したＳＣ＊−Ｕｒａ培地（０．７７ｇ／Ｌ−Ｕｒａドロップアウトサプリメント、１．７ｇ／Ｌ酵母窒素ベース、５ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｇ／Ｌカザミノ酸、２０ｇ／Ｌグルコース）に、寒天プレートから新たに採集した細胞から増殖させた形質転換サッカロミセス・セレビシエの１０ｍＬの一晩の培養を接種した。次に培養は２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で９６時間インキュベートした。
【００７５】
インキュベーション後に、５００ｍＬ酵母培養の各ペアをプールし、９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿（酵母細胞を含む）は廃棄した。上清ｐＨを５．０に調節し、次に１時間４℃まで冷却した。冷却に続いて、６２５ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4を追加して、酵母上清を９３％飽和にした。持続的に撹拌しながら４℃で１６時間にわたり沈降を生じさせた。翌日、沈殿を９０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を廃棄した。
【００７６】
沈殿をピペッティングにより全体積１０ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ７．０）中に再懸濁した。一旦沈殿を再懸濁したならば、３０分間の緩やかな反転により溶液を混合した。次に溶液を３分間３０００ｒｐｍで遠心分離していずれかの不溶性物質をペレットにした。沈殿を破壊しないように上清をピペットにより注意深く除去し、保存した。この上清中のＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐの濃度は、実施例１５中に記述されているような精製ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐの標準曲線と共にＴｒＣｅｌ６Ａ特異的抗体を使用して、ＥＬＩＳＡによって決定された。サンプルの純度は、図１６中にＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐについて示されるもののようなＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって実証された。
【００７７】
実施例９：ファミリー６セルラーゼバリアントの酵素的特性評価
酸膨潤セルロース（ＡＳＣ）は、当業者に公知のシグマセル５０を使用する手順から産生された。ＡＳＣを１．８ｇセルロース／Ｌの最終的な濃度に１５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ５．０）中でスラリー化し、持続的な撹拌をしながら５分間真空下で脱気した。
【００７８】
ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐの活性は、セルラーゼの追加後に６００ｎｍで水またはグルコース溶液のいずれかによって０．６ｇセルロース／Ｌに希釈されて、スラリーの吸光度の減少としてモニタリングされた。サンプルは５０℃で維持し、データ収集の間に持続的に撹拌した。ツインビーム吸光度装置を使用して、各サンプルについて酵素のない対照スラリーの吸光度をリアルタイムで引いた。データ収集の開始後に、Ｃｅｌ７ＡおよびＣｅｌ６Ａを欠くトリコデルマ属セルラーゼを、５０ｍｇ／ｇセルロースで、すべてのキュベットに追加した。セロビオヒドロラーゼの非存在下において、基質粒子のサイズの有意な変化はなく、したがって散乱体が近似的に一定のサイズであるために見かけ上の吸光度の差はない。この間に、セロビオヒドロラーゼ不含有酵素混合物は、セロビオヒドロラーゼによる酵素作用の部位である新しい鎖末端を生成する。データ収集の開始５分後に、親のファミリー６セルラーゼまたはファミリー６セルラーゼバリアントを全用量で５０ｍｇ／ｇまで追加する。親のファミリー６セルラーゼまたはファミリー６セルラーゼバリアントのようなセロビオヒドロラーゼは、加水分解によって基質粒子のサイズの減少をもたらし、吸光度減少の初期勾配は活性の測定値として記録された。活性トレースの直線状部分のみが使用され、親のファミリー６セルラーゼまたはファミリー６セルラーゼバリアントのようなセロビオヒドロラーゼのみが基質の見かけ上の吸光度を減少させることができるので、分析はＣｅｌ６Ａ単独の活性について特異的であり、非セロビオヒドロラーゼ酵素のいずれかの可能な阻害によって影響を受けない。さらに、ファミリー６セルラーゼバリアントに対して親のファミリー６セルラーゼのグルコースによる阻害の低下を比較する場合、これらの酵素のいずれかの影響は同一であるだろう。ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐによる典型的な実験の間に回収されたデータは、図４中に図示される。
【００７９】
活性データは、グルコースの非存在下、ならびに１０、２０、３０、４０および５０ｇ／Ｌグルコースの存在下において回収された。５つの重複したデータセットをこれらの各々の条件について回収した。データは吸光度勾配ｖｓグルコース濃度としてプロットし、マイクロソフトエクセル中のソルバー機能を使用して単純な直線状阻害のモデルに適応させる。ＫGの最適値および９５％信頼区間は標準の統計的手法を使用して計算された。グルコースの非存在下において測定された勾配の平均値は、比活性の測定値として採用された。タイプ２の両側検定のｔ検定を使用して、検査された各ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３ＰバリアントのＫGおよび比活性を親の酵素のパラメータ値に対して比較した。
【００８０】
下記の表５および図５〜１５中の結果によって示されるように、ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐバリアントはすべて、親のＴｒＣｅｌ６Ａよりもグルコース阻害の少なくとも１．８倍〜６．７３倍の減少を示す。
【００８１】
表５：ＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐに由来するファミリー６セルラーゼバリアントについてのグルコース阻害定数
【表５】
2011509662.tif 000011
【００８２】
実施例１０：ＨｉＣｅｌ６ＡおよびＰｃＣｅｌ６Ａの生成、ならびにＹｅｐ３５２／ＰＧＫ９１−１−αss−６Ｈｉｓベクターへのそれらのクローニング
ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１−αss−６Ｈｉｓベクターの構築
ＳｐｅＩ、ＮｈｅＩ、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含むＤＮＡアダプターを、プライマーＡＴ０４４およびＡＴ０４５をともにアニールすることによって調製した。アダプターは、ＳｐｅＩ部位の下流のおよびＮｈｅＩ部位の上流に６つのヒスチジン残基をコードする配列を含む。アダプターをｐｇｋ１プロモーター、α接合因子分泌シグナル、およびｐｇｋ１ターミネーター配列を含む、ＹＥｐベースのプラスミド（ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１αss）の中に挿入して、プラスミドＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１／αss６ＨＮＫＥを作製する。具体的には、リンカーは、ＮｈｅＩ／ＥｃｏＲＩ断片として、α接合因子分泌シグナルの下流およびｐｇｋ１ターミネーターの上流に位置するＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩの部位の中に挿入した。プライマー配列を以下に示す。
ＡＴ０４４：５’  ＣＴＡ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  Ｇ
（配列番号：１０６）
ＡＴ０４５：５’  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  Ａ
（配列番号：１０７）
【００８３】
ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１−αss−６Ｈ−ＨｉＣｅｌ６Ａの生成
凍結乾燥したＨ．インソレンスを３００μＬの滅菌Ｈ2Ｏ中に再懸濁し、５０μＬをエマーソンＹＰＳＳのｐＨ７の寒天プレート（０．４％酵母抽出物、０．１％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０５％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１．５％グルコース、１．５％寒天）上に広げた。真菌は４５℃で６日間インキュベートし、次に胞子をノボ（Ｎｏｖｏ）培地（ＢａｒｂｅｓｇａａｒｄによるＵＳＰ第４，４３５，３０７号の通り）中に接種した：１００ｍＬの増殖相用培地（２．４％ＣＳＬ、２．４％グルコース、０．５％大豆油、ｐＨ５．５に調節した０．５％ＣａＣＯ3）中で３７℃で４８時間インキュベーションし、次に６ｍＬの前培養を１００ｍＬの生産相用培地（０．２５％ＮＨ4ＮＯ3、０．５６％ＫＨ2ＳＯ4、０．４４％Ｋ2ＨＰＯ4、０．０７５％  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２％シグマセル、ｐＨ７に調節した０．２５％ＣａＣＯ3）へと移し、培養をバイオマス採取の前に最大４日間インキュベートした。次に、５０ｍｇのバイオマスを使用して、製造業者手順に従ってアブソルートリーＲＮＡ（Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ  ＲＮＡ）（登録商標）ミニプレップキット（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社）により全ＲＮＡを単離した。製造業者手順に従ってスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）（商標）ＩＩ逆転写酵素（インビトロゲン社）を使用して、全ｃＤＮＡを全ＲＮＡから生成した。ＨｉＣｅｌ６Ａをコードする遺伝子を以下のプライマーを使用してｃＤＮＡから増幅した。
５’ＨｉＣｅｌ６Ａ−ｃＤＮＡ  ５’ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＧＣ（配列番号：１０８）
３’ＨｉＣｅｌ６Ａ−ｃＤＮＡ  ５’ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＴＴＧ  ＧＣＡ  ＴＴＡ  ＣＧＡ  ＡＧ（配列番号：１０９）
【００８４】
ＰＣＲアンプリコンは、製造業者の推奨に従ってＴＡクローニングによってｐジェム（登録商標）−Ｔイージー（Ｔ  Ｅａｓｙ）ベクターの中へクローン化した。プラスミドｐＧＥＭ−ＨｉＣｅｌ６ＡをＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩにより消化してＨｉＣｅｌ６Ａ遺伝子を遊離した。この断片を精製し、ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１／αss６ＨＮＫＥのＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩの部位の中へライゲーションしてＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１／αss６Ｈ−ＨｉＣｅｌ６Ａを得た。
【００８５】
ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１−αss−６Ｈ−ＰｃＣｅｌ６Ａの生成
凍結乾燥したＰ．クリソスポリウムを３００μＬの滅菌Ｈ2Ｏ中に再懸濁し５０μＬをＰＤＡプレート上に広げた。プレートは４日間２４℃でインキュベートした。Ｐ．クリソスポリウムの胞子はＰＤＡプレートの上のセロハン円の上に接種し、バイオマスは２４℃で４〜６日後に採取した。次に５０ｍｇのバイオマスを使用して、製造業者手順に従ってアブソルートリーＲＮＡ（登録商標）ミニプレップキット（ストラタジーン社）により全ＲＮＡを単離した。製造業者手順に従ってスーパースクリプト（商標）ＩＩ逆転写酵素（インビトロゲン社）を使用して、全ｃＤＮＡを全ＲＮＡから生成した。ＰｃＣｅｌ６Ａをコードする遺伝子を以下のプライマーを使用してｃＤＮＡから増幅した（それはＮ末端にＮｈｅＩ部位およびＣ末端にＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩの部位を導入した）。
５’ＰｃＣｅｌ６Ａ−ｃＤＮＡ  ５’ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＣＧＧ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＧＡＣ  ＡＧＴ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＧＣ
（配列番号：１１０）
３’ＰｃＣｅｌ６Ａ−ｃＤＮＡ  ５’ＣＴＡ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＧＴＡ  ＣＣＣ  ＴＡＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＧ  ＴＴＧ  ＧＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＡＣ
（配列番号：１１１）
【００８６】
ＰＣＲアンプリコンは、製造業者の推奨に従ってＴＡクローニングによってｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔイージーベクターの中へクローン化した。プラスミドｐＧＥＭ−ＰｃＣｅｌ６ＡをＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩにより消化してＰｃＣｅｌ６Ａ遺伝子を遊離した。この断片を精製し、ＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１／αss６ＨＮＫＥのＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩの部位の中へライゲーションしてＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１／αss６Ｈ−ＰｃＣｅｌ６Ａを得た。
【００８７】
実施例１１：ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｈｉｓ６およびＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｈｉｓ６ならびにそれらのバリアントを備えたベクターの変異誘発
ＨｉＣｅｌ６ＡおよびＰｃＣｅｌ６Ａのバリアントは、メガプライマー合成と後続するＰＣＲ仲介性オーバーラップ伸長を含む２工程ＰＣＲ方法を使用して構築した（Ｖａｌｌｅｊｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。すべてのＰＣＲ反応はハイフィデリティーｉプルーフ（ｉＰｒｏｏｆ）Ｔａｑポリメラーゼ（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）社）を使用して実行した。プラスミドＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１−αss−６Ｈ−ＨｉＣｅｌ６ＡおよびＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１−αss−６Ｈ−ＰｃＣｅｌ６Ａが、フミコーラ・インソレンスおよびファネロカエテ・クリソスポリウムの両方についての鋳型としてそれぞれ供給された。変異誘発部位の（およびそれを含む）上流のメガプライマーは、与えられたグルコース耐性バリアントに特異的な内部のリバースプライマー（すなわちＨｉＣｅｌ６Ａ  Ｙ１０７ＬについてはＤＫ０２２；表６を参照）と組み合わせて外部プライマーＹαＮ２１を使用して増幅された。同様に、変異誘発部位の（およびそれを含む）下流のメガプライマーは、特定のグルコース耐性バリアントにユニークな内部フォワードプライマー（すなわちＨｉＣｅｌ６Ａ  Ｙ１０７ＬについてはＤＫ０２１；表６を参照）と共に外部プライマーＰＧＫｔｅｒｍを使用して増幅された。内部プライマーは、Ｃｅｌ６Ａホモログの中へ所望されるグルコース耐性変異を導入するようにデザインされた。メガプライマーは、ウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）（登録商標）ＳＶゲルおよびＰＣＲクリーンアップシステム（Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ社）を使用して精製された。
【００８８】
表６：Ｈ．インソレンスおよびＰ．クリソスポリウムのＣｅｌ６Ａホモログ内へのグルコース耐性変異の導入のために使用したプライマーのリスト。相同のＴ．リーゼイ配列中に見出される残基ともとの残基が異なる場合は、アミノ酸をイタリック体にしてある。プライマー配列に関して、下線を引いたヌクレオチドは所望されるアミノ酸置換をもたらす。外部プラスミドプライマーが含まれる。
【表６】
2011509662.tif 000012
2011509662.tif 000013
2011509662.tif 000014
【００８９】
ＰＣＲの第２ラウンドの間に、所望されるコンストラクトの両方のメガプライマーをアニールさせ１０サイクルで伸長させて、最終的な鋳型を生成した。次に、外部プライマーのＹαＮ２１およびＰＧＫｔｅｒｍを別の２５サイクルのために追加して最終的な産物を増幅し、続いてウィザード（登録商標）ＳＶゲルおよびＰＣＲクリーンアップシステムを使用して精製した。精製したＰＣＲ産物および直線化したベクターＹＥｐ３５２／ＰＧＫ９１−１αss−６ＨＮＫＥ（ＮｈｅＩ＋ＫｐｎＩにより消化した）の両方は、Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ  （２００２）によって記述された手順を使用して、ＢＹ４７４２酵母株内で生体内組換えによって、形質転換およびクローニングした。各々のコンストラクトについては、ベクターを、Ｈｏｆｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｓｔｏｎ（Ｈｏｆｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｎｓｔｏｎ，  １９８７を修飾した方法を使用して形質転換した酵母から単離し、大腸菌ＤＨ５αの化学的にコンピテントな細胞中に形質転換した。プラスミドは、ウィザード（登録商標）プラスＳＶミニプレップＤＮＡ精製システム（Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ社）を使用して大腸菌細胞から単離した。すべてのバリアントのクローン化された領域の全体性をＤＮＡ配列分析によって確認した。
【００９０】
実施例１２：大量培養からのＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｈｉｓ６およびＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｈｉｓ６ならびにそれらのバリアントの発現および濃縮
２つの体積５００ｍＬの滅菌したＳＣ＊−Ｕｒａ培地（０．７７ｇ／Ｌ−Ｕｒａドロップアウトサプリメント、１．７ｇ／Ｌ酵母窒素ベース、５ｇ／Ｌ（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｇ／Ｌカザミノ酸、２０ｇ／Ｌグルコース）に、寒天プレートから新たに採集した細胞から増殖させた形質転換サッカロミセス・セレビシエの１０ｍＬの一晩の培養を接種した。次に培養は２００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で９６時間インキュベートした。
【００９１】
インキュベーション後に、５００ｍＬ酵母培養の各ペアをプールし、９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿（酵母細胞を含む）を廃棄した。上清ｐＨを５．０に調節し、次に１時間４℃まで冷却した。ＢＳＡ（０．１ｇ）を追加してＣｅｌ６Ａの共沈殿を支援した。冷却に続いて、５５９ｇの（ＮＨ4）2ＳＯ4を追加して、酵母上清を８５％飽和にした。持続的に撹拌しながら４℃で１６時間にわたり沈降を生じさせた。  翌日、沈殿を９０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を廃棄した。持続的に撹拌しながら４℃で１６時間にわたり沈降を生じさせた。翌日、沈殿は９０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を廃棄した。
【００９２】
沈殿をピペッティングにより全体積５０ｍＬの結合緩衝液（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、３０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４））中に再懸濁した。一旦沈殿が再懸濁されたならば、４℃で３０分間の緩やかな反転により溶液を混合した。次に、実施例１３中に記述されているような精製の前に、溶液をガラス繊維濾紙により濾過して不溶性物質を除去した。
【００９３】
実施例１３：ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｈｉｓ６およびＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｈｉｓ６ならびにそれらのバリアントの精製
活性分析（実施例１４）については、Ｈｉｓ−タグを付加した親のフミコーラ属Ｃｅｌ６Ａおよびファネロカエテ属Ｃｅｌ６Ａセルラーゼならびにそれぞれのバリアントを、固定化した金属親和性クロマトグラフィーを使用して、培養上清から精製した。Ｈｉｓ−トラップカラム上にタンパク質をロードする前に、Ｎｉ2+樹脂を結合緩衝液（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、３０ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４））により平衡化した。培養上清を結合緩衝液と同じ塩濃度およびｐＨに調節し、０．５〜１．０  ｍＬ／分の流速で１ｍＬのＨｉｓ−トラップカラム（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））に適用した。次にＯＤ２８０ｎｍが安定したベースラインに達するまで、カラムを同じ結合緩衝液により洗浄した。結合されたＨｉｓ−タグ付加Ｃｅｌ６Ａを、溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ７．４））によりカラムから溶出した。
【００９４】
溶出緩衝液を緩衝液交換によって精製さタンパク質から除去し、５ｍＬの溶出した画分を１５ｍＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に追加し、セントリコンプラス−２０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−２０）（ポリエーテルスルフォン膜、公称５ｋＤａの分子量カットオフ）上にロードした。カラムは、１０分間１６００×ｇでまたはカラム中の残りの体積２．５ｍＬがなるまで遠心分離した。この時点で、１７．５ｍＬの５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ  ５．０）をカラムにさらに追加し、遠心分離を繰り返した。１〜２  ｍＬのみがカラム中に残るまで、最後の遠心分離を同じ様式で行なった。この最終的な上清のタンパク質濃度は、既知のタンパク質濃度のトリコデルマ・リーゼイセルラーゼを使用してバイオラッド社のタンパク質分析を使用して決定した。親およびバリアントのＰｃＣｅｌ６ＡおよびＨｉＣｅｌ６Ａの純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認した（図１６）。
【００９５】
実施例１４：ＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｈｉｓ６およびＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｈｉｓ６ならびにそれらのバリアントの酵素的特性評価
上記の実施例１３中に記述されているような酵母培養濾過液から精製された親のＰｃＣｅｌ６Ａ−Ｈｉｓ６セルラーゼおよびＨｉＣｅｌ６Ａ−Ｈｉｓ６セルラーゼならびにそれから由来するバリアントを使用して、実施例９中に記述されているように活性分析を実行した。下記の表７中に結果によって示されるように、ＨｉＣｅｌ６ＡおよびＰｃＣｅｌ６Ａのバリアントはすべて、対応する親のファミリー６セルラーゼの対照よりも少なくとも１．４３倍〜３．２２倍少ないグルコースによる阻害を示す。
【００９６】
表７：親のＰｃＣｅｌ６ＡセルラーゼおよびＨｉＣｅｌ６Ａセルラーゼ、ならびにＰｃＣｅｌ６ＡおよびＨｉＣｅｌ６Ａに由来するファミリー６セルラーゼバリアントについてのグルコース阻害定数。
【表７】
2011509662.tif 000015
【００９７】
実施例１５：ＥＬＩＳＡによるＴｒＣｅｌ６Ａ−Ｓ４１３Ｐ濃度の決定。
上清および精製スタンダードをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）中に希釈し、マイクロタイタープレート（コースター（Ｃｏｓｔａｒ）社ＥＩＡ＃９０１８）中で４℃で一晩インキュベートした。一晩のインキュベーションに後続して、これらのプレートを０．１％ツイーン−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ／ツイーン）により洗浄し、次に室温で１時間１％ウシ血清アルブミン含有ＰＢＳ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中でインキュベートした。ブロッキングしたマイクロタイターウェルをＰＢＳ／ツイーンにより洗浄した。ＴｒＣｅｌ６Ａに特異的なウサギポリクローナル抗血清をＰＢＳ／ＢＳＡ中で希釈し、マイクロタイタープレートに追加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ中で１／２０００に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼにカップリングしたヤギ抗ウサギ抗体（シグマ社＃Ａ６１５４）により室温で１時間インキュベートした。洗浄後に、１００μＬのテトラメチルベンジジン（シグマ社＃８６６５）をウェルに追加し、室温で３０分間インキュベートした。３６０ｎｍでの吸光度を各ウェルにおいて測定し、ＴｒＣｅｌ６Ａ標準曲線を使用してタンパク質濃度に変換した。
ＰＢＳは以下のものを含む。
構成要素          ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ          ８０
ＫＣｌ            ２
Ｎａ2ＨＰＯ4      １４．４
ＫＨ2ＰＯ4        ２．４
【００９８】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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