(57)【要約】  本発明は、融合タンパク質を哺乳動物筋肉細胞に導入するのに有効な第２の領域に作動可能に連結している、μ−ユートロフィン領域又はその抗ジストロフィン異常症断片を含む、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
融合タンパク質を哺乳動物筋肉細胞に導入するのに有効な第２の領域に作動可能に連結している、μ−ユートロフィン領域又はその抗ジストロフィン異常症断片を含み；
但し、単離されたポリペプチドが配列番号１を含まない、ポリペプチド。
【請求項２】
前記μ−ユートロフィン領域又はその抗ジストロフィン異常症断片が、未変性のユートロフィンと比較して少なくとも１つのスペクトリン様繰り返し配列の欠失を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記第２の領域が配列番号７のアミノ酸３〜１３を含む、請求項１又は請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記第２の領域が配列番号７のアミノ酸２１〜２９を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
医薬的に許容し得る担体と組合わされた、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド又はその医薬的に適切な塩を含む組成物。
【請求項６】
ポリペプチドをコードする単離された核酸発現構築物であって、前記核酸発現構築物が、以下：
μ−ユートロフィンポリペプチド又はその抗ジストロフィン異常症断片をコードする第１の核酸領域；及び
前記μ−ユートロフィンポリペプチドを哺乳動物筋肉細胞に導入するのに有効なアミノ酸配列をコードする、前記第１の核酸領域に作動可能に連結している第２の核酸領域
を含み；
但し、前記ポリペプチドが配列番号１を含まない、発現構築物。
【請求項７】
前記μ−ユートロフィンポリペプチド又はその抗ジストロフィン異常症断片が、未変性のユートロフィンと比較して少なくとも１つのスペクトリン様繰り返し配列の欠失を含む、請求項６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記第２の核酸領域が配列番号７のアミノ酸３〜１３を含むポリペプチドをコードする、請求項６又は請求項７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記第２の核酸領域が配列番号７のアミノ酸２１〜２９を含むポリペプチドをコードする、請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
対象のジストロフィン異常症の治療方法であって、以下：
このような治療の必要な対象に、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドの抗ジストロフィン異常症量を投与することを含む、方法。
【請求項１１】
前記ジストロフィン異常症がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記単離されたポリペプチドが週に少なくとも２回投与される、請求項１０又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離されたポリペプチドが少なくとも１３週間投与される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドの単離方法であって、以下の工程：
前記ポリペプチドを含む試料を受け取り；
前記試料の少なくとも一部に陽イオン交換クロマトグラフィーを行い；及び
前記ポリペプチドを少なくとも８６％の純度で回収する
ことを含む、方法。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが少なくとも９０％の収率で回収される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドの単離方法であって、以下の工程：
前記ポリペプチドを含む試料を受け取り、
前記試料の少なくとも一部に陽イオン交換クロマトグラフィーを行い；及び
前記ポリペプチドを少なくとも９０％の収率で回収する
ことを含む、方法。
【請求項１７】
正味の陰性荷電を有するポリペプチドの単離方法であって、以下の工程：
前記正味の陰性荷電を有するポリペプチドと、少なくとも１２個のアミノ酸を含む陽性荷電したタグと、を含む融合ポリペプチドを含む試料を得て
（ここで、以下：
前記陽性荷電したタグが少なくとも１つの非アルギニンアミノ酸残基を含むこと、又は
前記陽性荷電したタグが前記融合ポリペプチドのＮ末端に位置すること
の少なくとも１つが当てはまる）；及び
前記試料の少なくとも一部に陽イオン交換クロマトグラフィーを行う
ことを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照と関連出願
本出願は、２０１１年７月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／５０６，７０６号（これは参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、3500人の新生男児につき約１人が罹患する致死的X連鎖疾患である（Emery, 1991 Neuromuscul Disord 1:19-29）。ＤＭＤは、心筋細胞及び骨格筋細胞の筋線維鞘下スペースに局在化している４２７ｋＤａタンパク質であるジストロフィン（dystrophin）の欠損から生じる（Hoffman et al., 1987 Cell 51:919-28）。ジストロフィン欠損症は、筋線維鞘の透過性亢進、筋細胞の死と再生のサイクル、及び筋力低下に関連しており、これは最終的には呼吸及び／又は心不全により死を引き起こす（Emery, 2002 Lancet 359:687-95）。生化学的研究は、ジストロフィンがマルチサブユニット複合体であるジストロフィン−糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）と関連していることを明らかにしている（Ervasti, 2007 Biochim Biophys Acta 1772:108-171; Blake, 2002 Physiol Rev 82:291-329）。ジストロフィンは、膜に埋め込まジストログリカン（dystroglycan ）、サルコグリカン／サルコスパンサブ複合体（sarcoglycan/sarcospan subcomplex）、ならびに細胞質ジストロブレビン（dystrobrevin）及びシントロフィン（syntrophin）と、生化学的に安定な複合体を形成する。ジストロフィンはまた、アクチン繊維（Ervasti, 2007 Biochim Biophys Acta 1772:108-17）、中間体繊維（Bhosle et al., 2006 Biochem Biophys Res Commun 346:768-77）、及び細胞骨格の微小管（Prins et al., 2009 J Cell Biol 186:363-9）と相互作用する。ジストロフィンの構造、他の細胞成分とのその相互作用、及びジストロフィンが存在しない時に現れる病理に基づいて、ジストロフィンは、機械的活動中に筋繊維鞘を安定化させる構造タンパク質として主に機能すると考えられている（Petrof et al., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90:3710-4）。優れた治療方針を研究している多くの研究室の精力的な努力にもかかわらず、ＤＭＤの壊滅的な進行を緩和することができる効果的な治療は現在のところ存在しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
ある形態において本開示は、単離されたμ−ユートロフィン（μＵｔｒ）ポリペプチドを記載する。一般にこのポリペプチドは、μ−ユートロフィン領域、又は融合タンパク質を哺乳動物筋肉細胞に導入するのに有効な第２の領域に作動可能に連結しているその抗ジストロフィン異常症断片を含むが、ただし、単離されたポリペプチドは、公知のＦＬＡＧ親和性タグである配列番号１を含まない。
【０００４】
別の形態において本開示は、ポリペプチドをコードする単離された核酸発現構築物を記載する。一般にこの核酸発現構築物は、μ−ユートロフィンポリペプチド又はその抗ジストロフィン異常症断片をコードする第１の核酸領域と、第１の核酸領域に作動可能に連結している、μ−ユートロフィンポリペプチドを哺乳動物筋肉細胞に導入するのに有効なアミノ酸配列をコードする第２の核酸領域とを含むが、ただし、このポリペプチドは、配列番号１を含まない。
【０００５】
別の形態において本開示は、医薬的に適した担体と組合せた、単離されたμＵｔｒポリペプチド又はその医薬的に適した塩を含む組成物を記載する。
【０００６】
別の形態において本開示は、対象のジストロフィン異常症を治療する方法を記載する。一般にこの方法は、そのような治療の必要な対象に、抗ジストロフィン異常症量の単離されたμＵｔｒポリペプチドを投与する工程を含む。
【０００７】
別の形態において本開示は、上記のμＵｔｒポリペプチドを単離する方法を記載する。一般にこの方法は、μＵｔｒポリペプチドを含む試料を受け取る工程と、その試料の少なくとも一部に陽イオン交換クロマトグラフィーを行う工程と、そしてそのポリペプチドを少なくとも８６％の純度と少なくとも９０％の収率で回収する工程とを含む。
【０００８】
さらに別の形態において本開示は、正味の陰性荷電を有するポリペプチドを単離する方法を記載する。一般にこの方法は、融合ポリペプチドが正味の陰性荷電を含むポリペプチドと少なくとも１２個のアミノ酸を含む陽性荷電したタグとを含む融合ポリペプチドを含む試料を得る工程であって、この陽性荷電したタグが少なくとも１種の非アルギニンアミノ酸残基を含むこと、及び／又はこの陽性荷電タグが融合ポリペプチドのＮ末端に位置することと、の少なくとも１つが当てはまる、工程と：この試料の少なくとも一部に陽イオン交換クロマトグラフィーを行う工程とを含む。
【０００９】
上記要約は、本発明の各開示された態様又はすべての実施を記載することを意図しない。以下の記載は、例示的態様をさらに詳しく示す。本出願のいくつかの部分で、実施例のリストを通して、実施例が種々の組合せで使用できるという指針が提供される。各例において、記載のリストは代表的な群として機能するのみであり、決して包括的リストであると解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】陽イオン交換クロマトグラフィーによるＴＡＴ−μＵｔｒの精製  ＴＡＴ−μＵｔｒ（ａ）、ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒ（ｂ）、又はＦＬＡＧ−μＵｔｒ（ｃ）を発現するＳｆ９細胞からの溶解物（Ｔ）、ＳＰセファロースに通した後のボイド（Ｖ）、カラム洗浄液（Ｗ）、及び記載の［ＮａＣｌ］勾配で溶出した画分、をのせたクマシーブルー染色ゲル。（ｄ）等量の精製したＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒとＴＡＴ−μＵｔｒをのせたクマシーブルー染色ゲル、又は対応するウェスタンブロット。ウェスタンブロットは、ＦＬＡＧエピトープに対するウサギポリクローナル抗体と、ユートロフィン特異的モノクローナル抗体８Ａ４とでブロットした。分子量標準物質（ｋＤａ）はパネル（ａ）と（ｄ）の左に示される。
【図２】インビボでのＴＡＴ−μＵｔｒ安定性  （ａ）単回ＩＰ注射後の時間の関数としての、蛍光標識したＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒとＴＡＴ−μＵｔｒの、全身（ＷＢ）、大腿四頭筋（Ｑ）、及び肝臓（Ｌ）中の低下の定量的比較。全身の蛍光は自己蛍光に対して標準化された。組織溶解物はＳＤＳ−ゲル上で分解され、ニトロセルロースに移された。移動後のクマシーブルー染色ゲルの濃度測定により、組織の蛍光はタンパク質添加量に対して標準化された（各時点でｎ＝２）。（ｂ）界面活性剤で可溶化した骨格筋から濃縮した大腿四頭筋中のμＵＧＣ成分であるシントロフィン（Ｓｙｎ）、α−サルコグリカン（α−ＳＧ）、及びβ−ジストログリカン（β−ＤＧ）の、ＷＧＡセファロースクロマトグラフィーによるウェスタンブロット。ジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ）が添加対照として使用された。分子量標準物質はｋＤａで示される。
【図３】ｍｄｘマウスでのＴＡＴ−μＵｔｒの長期投与後のジストロフィン結合タンパク質の筋線維鞘への回復  マウスにＰＢＳ又はＴＡＴ−μＵｔｒを、週２回１３．５週間にわたって投与した。ラミニン（Ｌａｍ）ユートロフィン（Ｕｔｒ）、α−ジストログリカン（α−ＤＧ）、α−サルコグリカン（α−ＳＧ）、ジストロブレビン（ＤＢ）、又は神経亜酸化窒素シンターゼ（ｎＮＯＳ）に対する抗体で染色した大腿四頭筋の凍結切片が示される。スケールバー＝１００μｍ。
【図４】短期及び長期ＴＡＴ−μＵｔｒ処理による生理学的改善  ｍｄｘマウスを、ＴＡＴ−μＵｔｒ又はＰＢＳを用いて短期（２．５週間）又は長期（１３．５週間）処理を行なった。ＰＢＳ（１８０５５±４３３９；ｎ＝８）又はＴＡＴ−μＵｔｒ（６１７７±１００５；ｎ＝１１；Ｐ＝０．００７）で処理したマウスで、血清を（ａ）クレアチンキナーゼ活性（Ｕ／Ｌ）について分析した。ＰＢＳ処理したマウス（２．５±０．２；ｎ＝１３）とＴＡＴ−μＵｔｒ処理したマウス（３．１±０．１；ｎ＝１４；Ｐ＝０．０３８）で、ボディマス（ｇ／ｇ）に対して標準化した（ｂ）グリップ力により、筋力を分析した。ＰＢＳ（６４±４；ｎ＝１４）群又はＴＡＴ−μＵｔｒ（３４±６；ｎ＝１４；Ｐ＜０．００１）群の伸張性収縮中に、単離したＥＤＬ筋を、（ｃ）比力（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒｃｅ）（Ｐ＝０．６６２）と（ｄ）力の喪失パーセントについて試験した。データは平均±ＳＥＭとして示される。すべてのデータは二元配置分散分析を用いて解析された。いずれの変数についても有意な交互作用は検出されず、Ｐ値は処理の主作用を示す。白丸＝ＰＢＳ；四角＝ＴＡＴ−μＵｔｒ。＊は処理の主作用を示す。**は時間の主作用を示す。
【図５】骨格筋組織構造はＴＡＴ−μＵｔｒにより改善されない  ｍｄｘマウスを、ＴＡＴ−μＵｔｒ又はＰＢＳを用いて短期間（２．５週間）又は長期間（１３．５週間）処理した。大腿四頭筋、ＥＤＬ筋、及び横隔膜筋から凍結切片を調製し、ヘマトキシリンとエオシン−フロキシンで染色して、中心核繊維（ＣＮＦ）を定量した。（ａ）には、ＰＢＳとＴＡＴ−μＵｔｒで長期処理したｍｄｘマウスからの代表的画像（２００×）が示される。スケールバー＝１００μｍ。ＣＮＦのパーセントは、（ｂ）大腿四頭筋（Ｐ＝０．１４８）又は（ｃ）ＥＤＬ筋（Ｐ＝０．６２７）で、処理により異ならなかった。データは平均±ＳＥＭとして示される。すべてのデータは二元配置分散分析を用いて解析した。いずれの変数についても有意な交互作用は検出されず、Ｐ値は処理の主作用を示す。白丸＝ＰＢＳ；四角＝ＴＡＴ−μＵｔｒ。**は時間の主作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ジストロフィンの喪失は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及びある型の拡張型心筋症を引き起こす。最近、本発明者等は、短期的概念実証試験で、ＦＬＡＧタグ付きＴＡＴ−μ−ユートロフィン融合タンパク質が、ジストロフィン欠損により引き起こされる横紋筋疾患の効果的な直接タンパク質補充療法となることを証明した。試験したタンパク質構築物は、精製を容易にするためにFLAGタグを含有したが、このタグは、臨床試験に向けてタンパク質補充を進めることについて問題を提起する。ここでは、本発明者等は、ＦＬＡＧの無いＴＡＴ−μＵｔｒ構築物の作成を報告する。本発明者等は、ＴＡＴ−結合治療薬を精製するための広く適用可能で拡張性のある方法の基礎となる、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する迅速な１工程精製法を開発した。本発明者等はまた、ＦＬＡＧの無いＴＡＴ−μ−ユートロフィンが、３週間又は３ヶ月にわたって毎週２回投与された時でも、ジストロフィン欠損ｍｄｘマウスのジストロフィン表現型を低減させるのに有効であることを証明する。本発明者等の新しい結果は、安価なクロマトグラフィー支持体を使用して拡張性のある方法で、発現し精製することができるＴＡＴ−μＵｔｒ構築物の長期有効性を確立する。
【００１２】
ある形態において本開示は、ＦＬＡＧの無いＴＡＴ−μ−ユートロフィン構築物を記載する。別の形態において本開示は、陽性荷電したタグを含む融合ポリペプチドを精製するための広く適用可能で拡張性のある方法の基礎となる陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する迅速な１工程精製法を記載する。ある具体例において、そのような方法は、例えばＴＡＴ−μ−ユートロフィンなどのＴＡＴ−融合治療薬を精製するための基礎となる。
【００１３】
本明細書において、以下の用語は記載された意味を有する。
「ＴＡＴ」は、哺乳動物細胞へのＴＡＴアミノ酸を含有するポリペプチドの導入を誘導する、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）−１の転写のトランスアクチベータータンパク質の高塩基性タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）、又はその断片をいう。
【００１４】
「μ−ユートロフィン」は、指定されたスペクトリン様繰り返し配列が欠失しているユートロフィンの末端切断型をいう。スペクトリン様繰り返し配列４〜２１が欠失しているμ−ユートロフィンの例は、配列番号９のアミノ酸１４から始まる配列番号９に記載されている。
【００１５】
「ＦＬＡＧ−タグ」は、例えば通常の組換えＤＮＡ技術を使用してタンパク質に付加することができるポリペプチドタンパク質タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号１）をいう。これは、このタグを有する組換え産生ポリペプチドの親和性クロマトグラフィー分離のために使用することができる。
【００１６】
「改善する」は、特定の状態に特徴的な症状又は臨床的兆候の程度、重症度、頻度、及び／又は確率の何らかの低減をいう。
「予防」及びその変形は、ある状態に特徴的な症状又は臨床的兆候の程度、進行、及び／又は出現を、任意の程度、制限する処置をいう。予防的処置はしばしば、ある状態に特徴的な症状又は臨床的兆候の発生の前に開始される。
【００１７】
「兆候」又は「臨床的兆候」は、患者以外の人が見いだすことができる具体的な状態に関する客観的な肉体的知見をいう。
「症状」は、疾患の又は患者の状態の主観的証拠を言う。
「治療」及びその変形は、ある状態に関連する１種以上の存在する症状又は臨床的兆候を改善する処置をいう。
「処置する」又は「処置」又はその任意の変形は、ある状態に関連する症状又は兆候を、任意の程度に、低減、改善、又は解消することをいう。
【００１８】
用語「含む」及びその変形は、これらの用語が明細書や特許請求の範囲に現れる場合、限定的意味は持たない；特に別の指定がなければ、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、及び「少なくとも１つの」は同義に使用され、１つ又はそれ以上を意味する；用語「及び／又は」は、列記された要素の１つ又はすべて、又は列記された要素の任意の２つ以上の組合せを意味する；及び、終点による数値範囲の記載は、その範囲内に包含されるすべての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２，２．７５、３、３．８０、４、５など）。
【００１９】
ユートロフィンは、ジストロフィンと高い配列類似性を有する、広く発現される常染色体遺伝子産物である（Tinsley et al., 1992 Nature 360:591-3）。ユートロフィンは、胎児及び再生筋肉において筋線維鞘全体に分布しているが、正常な成人の筋肉ではダウンレギュレートされ、筋腱間接合部及び神経筋接合部に限定されている（Blake et al., 1996 Brain Pathol 6:37-47）。ジストロフィンとユートロフィンの両方を欠損したマウスはより深刻なＤＭＤ様表現型（Deconinck et al., 1997 Cell 90:717-27; Grady et al., 1997 Cell 90:729-38）を示し、ユートロフィンの過剰発現はｍｄｘマウスにおいてジストロフィー表現型をレスキューする（Tinsley et al., 1998 Nat Med 4:1441- 4）ため、ユートロフィンはジストロフィン欠損を補償すると考えられている。すなわち、過剰発現を含む種々のアプローチが、ＤＭＤの治療候補として研究されている（Khurana and Davies, 2003 Nat Rev Drug Discov 2:379-90; Krag et al., 2004 Proc Natl Acad Sci USA 101:13856-60; Odom et al., 2008 Mol Ther 16:1539-45; Squire et al., 2002 Hum Mol Genet 11 :3333-44）。
【００２０】
ＨＦＶ−１  ＴＡＴタンパク質の高塩基性タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）は、多くの組織の細胞への種々の荷物の送達を有効に仲介するために使用されている（Schwarze et al., 1999 Science 285:1569-72; Haase et al., 2006 Faseb J20:865-73）。ＦＬＡＧ−タグ付きＴＡＴ−μ−ユートロフィン（ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒ）をコードする組換え融合タンパク質の全身性送達は、インビボで骨格筋を導入し、集合させてμ−ユートロフィン−糖タンパク質複合体（μＵＧＣ）とし、ｍｄｘマウス中のジストロフィー表現型のいくつかのパラメータを改良することができる（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）。ＤＭＤを有するヒト患者では直接のタンパク質補充が可能であるが、融合タンパク質の精製を促進するアミノ末端ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号１）は、タンパク質補充療法のためのＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒ構築物の適切性を低下させることがある。ＦＬＡＧエピトープは元々高度に免疫原性であるように設計された（Hopp et al., 1988 Bio/Technology 6:1204- 1210）。さらに、より最近のデータは、近位に係留された酸性ポリペプチド（例えばＦＬＡＧタグ）がＴＡＴ介在導入を阻害することができることを示唆する（Aguilera et al., 2009 Integr Biol (Camb) 1:371-81; Jiang et al., 2004 Proc Natl Acad Sci USA 101:17867-72; Olson et al., 2009 Integr Biol (Camb) 1 :382-93）。これらの可能性のある問題に対処するために、本発明者等は、ＦＬＡＧの無いＴＡＴ−μＵｔｒ（ＴＡＴ−μＵｔｒ）構築物を作成し、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する１工程でこれをＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒと同程度の純度まで単離できることを示す。本発明者等はまた、ｍｄｘマウスの短期及び長期試験で、ＴＡＴ−μＵｔｒの有効性を示す試験を報告する。
【００２１】
ＦＬＡＧの無いＴＡＴ−μＵｔｒの作成は、ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒをコードするバキュロウイルス構築物を構築する必要があり、またＦＬＡＧタグ付きμＵｔｒの親和性精製のために使用したＦＬＡＧエピトープが排除されているため、別の精製法の開発が必要であった。
【００２２】
ＴＡＴ−μＵｔｒ、ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒ、又はＦＬＡＧ−μＵｔｒを含有するバキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞溶解物をＳＰ−セファロースカラムにのせ、カラムを線形ＮａＣｌ勾配で溶出させた（図１ａ〜１ｃ）。溶解物が０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有した時でも、ＴＡＴ−μＵｔｒはＳＰ−セファロース空隙から定量的に取り除かれ、ＮａＣｌ濃度０．７Ｍで高度に精製された状態で溶出された（図１ａ）。同じ条件下で、ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒはＳＰ−セファロースに結合しなかったが、昆虫細胞溶解物及び初期カラム洗浄液中のＮａＣｌ濃度を０．１Ｍに下げると、精製することができた（図１ｂ）。本発明者等はまた、０．１Ｍ  ＮａＣｌ又は０．３Ｍ  ＮａＣｌの存在下でＦＬＡＧ−μＵｔｒはＳＰ−セファロースに結合できなかったため、ＳＰ−セファロースでのＴＡＴ−μＵｔｒの高塩精製のためにはＴＡＴ配列が必要であることを確認した（図１ｃ）。クマシーブルー染色ゲルの濃度測定分析とウェスタンブロット解析により評価すると、ＳＰ−セファロース精製ＴＡＴ−μＵｔｒと抗ＦＬＡＧ  Ｍ２ーアガロース精製ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒの相対的純度は同様（９３％）であった（図１ｄ）。これらのデータは、通常のクロマトグラフィー支持体を使用して、ＦＬＡＧの無いＴＡＴ−μＵｔｒが効率的かつ経済的に精製され得ることを示す。
【００２３】
インビボでのＴＡＴ−μＵｔｒとＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒとの相対的安定性を比較するために、本発明者等は、ｍｄｘマウスに赤外線励起性蛍光色素で標識した各タンパク質の１回注射（８．５μｇ／ｇボディマス）を行なった。注射の３時間２４時間、４８時間、又は７２時間後に、マウスを屠殺し、全身の蛍光について画像化を行なった。各時点でマウスから採取した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のタンパク質レベルで画像化した（図２ａ）。ＴＡＴ−μＵｔｒとＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒは、同様の全身蛍光強度と崩壊速度を与えた。これは、大腿四頭筋中の崩壊速度を反映したが、肝臓中の両方のタンパク質の崩壊がより急速であった（図２ａ）。
【００２４】
ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒは、ユートロフィン糖タンパク質複合体（ＵＧＣ）の他のメンバーと生化学的に安定な複合体を形成することがすでに証明されているため（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）、本発明者等は、ＴＡＴ−μＵｔｒ又はＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒで処理したｍｄｘマウスからの界面活性剤で可溶化した筋抽出物について、コムギ胚芽アグルチニン（ＷＧＡ）クロマトグラフィーを行なった。ウェスタンブロット解析は、ＴＡＴ−μＵｔｒとＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒは、ＰＢＳ対照と比較すると、増加量のジストロフィン結合タンパク質で同時精製され、一方、同時精製される内因性ユートロフィンの量は変化しなかった（図２ｂ）。これらのデータは、ｍｄｘ筋肉と導入しμＵＧＣに組み込むのに、ＴＡＴ−μＵｔｒはＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒと同様に有効であることを示唆する。
【００２５】
直接タンパク質補充が臨床的に有用になるためには、短期効果と長期効果の両方を証明しなければならない。従って本発明者等は、ＴＡＴ−μＵｔｒ（８．５ｍｇ／ｋｇボディマス）をｍｄｘマウスに毎週２回２．５週間又は１３．５週間注射し、これをＰＢＳ処理したｍｄｘマウスと比較した。注射はＰ１８に開始し、マウスが５週齢又は１６週齢になるまで続けた。ジストロフィン発現が無いことは、筋肉細胞膜からの他のジストロフィン−糖タンパク質複合体メンバーの不安定化と同時喪失につながるため（Blake, 2002 Physiol Rev 82:291-329）、本発明者等はまず、ＴＡＴ−μＵｔｒの長期投与が筋線維鞘でμＵＧＣを回復させるかどうかを調べた。本発明者等は、ユートロフィンに対する１次抗体を用いて大腿四頭筋凍結切片を調べ、ＴＡＴ−μＵｔｒ処理マウスで筋肉細胞の周囲に沿って強い染色を観察し、ＰＢＳ注射試料では弱い染色を観察した（図３）。ＴＡＴ−μＵｔｒの染色パターンは、筋線維鞘下スペースに適切に標的化されており、本発明者等の以前の短期実験と位置した（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）。α−ジストログリカンとα−サルコグリカンに対する抗体を使用する免疫蛍光分析は、ＴＡＴ−μＵｔｒ処理マウスからの筋肉繊維の周囲に沿って強い染色を証明し、一方、これらのタンパク質はＰＢＳ注射マウスからの凍結切片ではほとんど観察されなかった。さらに、細胞内タンパク質ジストロブレビンとｎＮＯＳもまた、処理した筋肉の細胞周囲に局在化されており、ＴＡＴ−μＵｔｒの長期投与が筋線維鞘において安定なμＵＧＣを維持することが示唆された。
【００２６】
ｍｄｘマウスへのＴＡＴ−μＵｔｒの毎週２回の腹腔内投与は、ＰＢＳ注射同腹子と比較して、ジストロフィー表現型のいくつかのパラメータで大きな改善を与えた（図４）。筋膜安定性も顕著に改善され、ＰＢＳ注射マウスと比較してＴＡＴ−μＵｔｒ処理マウスは、処理期間の長さに無関係に、６６％低い血清クレアチンキナーゼレベルを有した（図４ａ）。本発明者等はまた、筋力のインビボ尺度（グリップ力）を用いて、ＴＡＴ−μＵｔｒ処理マウスが２１％大きい自発的前肢筋力を示すことを見いだした（図４ｂ）。電気的に誘発される最大等尺性筋力と伸張性収縮からの損傷に対する感受性を決定するために、長趾伸（ＥＤＬ）筋も試験した。具体的な力（図４ｃ）は、処理により大きく改善されなかった。しかし、ＴＡＴ−μＵｔｒ処理したマウスは、５回の伸張性収縮後に、ＰＢＳ注射マウスより４７％大きい力を発生したため、伸張性収縮誘発性の損傷から顕著に防御された（図４ｄ）。すなわち、短期及び長期試験は、ＴＡＴ−μＵｔｒが、通常は損傷を誘発する大きい力による収縮後に、膜の完全性と筋肉機能とを改善することを証明する。
【００２７】
大腿四頭筋、ＥＤＬ筋、及び横隔膜筋から凍結切片を作製し、ヘマトキシリン及びエオシン−フロキシンで染色して、筋線維の変性／再生の指標である中心核繊維の数を定量した（図５ａ）。ＰＢＳ注射ｍｄｘ対照と比較して、ＴＡＴ−μＵｔｒ処理大腿四頭筋又はＥＤＬ筋において中心核繊維の割合に改善は観察されなかった（図５ｂと図５ｃ）。横隔膜筋ストリップの定性的な検査は、ＰＢＳ処理試料とＴＡＴ−μＵｔｒ処理試料の両方で、中心核繊維、線維症、筋線維サイズのばらつき、及び炎症性細胞の存在を示した。ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒ（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）とは異なり、ＴＡＴ−μＵｔｒの短期又は長期処理により、骨格筋の組織学的改善は起きなかった。
【００２８】
本発明者等は、最近、ＦＬＡＧタグ付きＴＡＴ−μ−ユートロフィンをコードする組換え融合タンパク質の全身性投与が、ｍｄｘマウスにおいてジストロフィーのいくつかの表現型パラメータを顕著に改善することができることを証明した（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）。本発明者等のこの試験は、本発明者等の以前の知見に基づき、３つの重要な課題を取り上げている。
【００２９】
第１に、ＦＬＡＧタグは、免疫親和性クロマトグラフィーによる組換えタンパク質の精製をしばしば促進できるが、生体治療にこれを加えることは、その固有の免疫原性から問題がある（Hopp et al., 1988 Bio/Technology 6:1204-1210）。さらに、最近の研究（Aguilera et al., 2009 Integr Biol (Camb) 1 :371-81; Jiang et al., 2004 Proc Natl Acad Set USA 101:17867-72; Olson et al., 2009 Integr Biol (Camb) 1:382-93）は、共有結合した酸性ポリペプチド（例えばＦＬＡＧタグ）が、細胞へのＴＡＴ介在導入を阻害することができることを示唆する。従って、本発明者等は、ＦＬＡＧタグが欠如した構築物を作成し、多くのＴＡＴ−融合タンパク質に適用できるはずの安価な陽イオン交換クロマトグラフィープロトコールを使用して、ＴＡＴ−μＵｔｒタンパク質をうまく精製した。
【００３０】
第２に、本発明者等は、ＴＡＴ−μＵｔｒを用いるｍｄｘマウスの短期及び長期処理の両方が、筋ジストロフィーのいくつかの表現型パラメータを顕著に改善したことを示す。３〜１４週間の毎週２回のｍｄｘマウスへのＴＡＴ−μＵｔｒの投与後に、ＤＧＣ／ＵＧＣのいくつかのタンパク質（α−サルコグリカン、シントロフィン、β−サルコグリカン、α−ジストログリカン、ジストロブレビン、及びｎＮＯＳを含む）は、ＴＡＴ−μＵｔｒ処理された骨格筋でアップレギュレートされた。本発明者等は、ＰＢＳ注射した同腹子と比較して、血清クレアチンキナーゼの大幅な低下、グリップ力の改善、及び伸張性収縮誘発性の損傷に対する感受性の低下を測定した。この研究では、ＴＡＴ−μＵｔｒで処理されたｍｄｘマウスでは、血清クレアチンキナーゼと伸張力の喪失が４７％〜６６％改善された。これらの結果は、ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒを用いて、これらの同じパラメータの約５０％の改善を示す、ｍｄｘマウスの短期処理法を使用した以前の結果を拡大している（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）。本発明者等の結果のまとめに基づき、本発明者等は、ＦＬＡＧエピトープの存在が、マウスのジストロフィン異常症に関連した体力不足や膜透過性を改善するＴＡＴ−μＵｔｒの安定性、導入、又は治療効果に対して何の影響も与えないと結論する。
【００３１】
従って、ある形態において本開示は、μＵｔｒポリペプチドを含むポリペプチドを記載する。本明細書において「ポリペプチド」は、ペプチド結合により結合されたアミノ酸のポリマーをいう。すなわち、例えば、用語ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、及び酵素は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾物、例えばグリコシル化物、アセチル化物、リン酸化物などを含む。用語ポリペプチドは、アミノ酸のポリマーの特定の長さを暗示しない。ポリペプチドは、天然の供給源から直接単離できるか、又は組換え、酵素的、又は化学的方法の助けで調製することができる。天然に存在するポリペプチドの場合、そのようなポリペプチドは典型的には単離される。「単離された」ポリペプチドは、その天然の環境から取り出されたものである。例えば、単離されたポリペプチドは、細胞質から又は細胞膜から取り出されたポリペプチドであり、その天然の環境のポリペプチド、核酸、及び他の細胞物質の多くはもう存在しない。「単離可能な」ポリペプチドは、特定の供給源から単離できるであろうポリペプチドである。「精製された」ポリペプチドは、これらが天然では結合している他の成分から、任意の指定した程度まで、遊離しているものである。通常その中に存在する生体の外で化学的又は組換え手段によって生産されたポリペプチドは、自然環境に存在することはなかったため、定義により単離され精製されたと見なされる。本明細書で使用される「ポリペプチド断片」は、ポリペプチドの一部をいう。ポリペプチド断片は、プロテアーゼによるポリペプチドの消化から生じ得るか、又は組換え、酵素的、又は化学的技術を用いて製造することができる。
【００３２】
本明細書において「μＵｔｒポリペプチド」は、未変性型のユートロフィンポリペプチドの少なくとも１つのスペクトリン様繰り返し配列が欠失しているユートロフィンポリペプチドである。μＵｔｒポリペプチドの例は、配列番号３（配列番号３のアミノ酸４１で始まる）、配列番号５（配列番号５のアミノ酸４１で始まる）、配列番号７（配列番号７のアミノ酸３３で始まる）、配列番号９（配列番号９のアミノ酸１４で始まる）、配列番号１０（配列番号１０のアミノ酸３１で始まる）、配列番号１１（配列番号１１のアミノ酸１３で始まる）に記載されている。
【００３３】
μＵｔｒポリペプチドは、特に限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ブタ、イヌなどを含む種々の種の哺乳動物から得られる。
μＵｔｒポリペプチドはまた、参照μＵｔｒポリペプチドの「生物活性のある類似体」を含んでよい。μＵｔｒポリペプチドの機能活性は、本明細書に記載の種々のアッセイや当業者に公知の他のアッセイを使用して評価することができる。機能活性の刺激又は阻害を含む機能活性の調整は、本明細書に記載の種々のアッセイや当業者に公知のアッセイを使用して確認することができる。
【００３４】
機能活性の調整は、定量的に測定し、比較対照の機能活性の割合として記載することができる。μＵｔｒポリペプチドの機能活性は、適切な対照の活性の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、又は少なくとも２５０％であるμＵｔｒ活性の調整を示してもよい。
【００３５】
例えば、μＵｔｒポリペプチドの機能活性の刺激は、定量的に測定し、比較対照の機能活性の割合として記載することができる。μＵｔｒポリペプチドの機能活性の刺激は、適切な対照の活性より、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、又は少なくとも２５０％大きい刺激を含む。
【００３６】
別の例として、μＵｔｒポリペプチドの機能活性の阻害は、定量的に測定し、比較対照の機能活性の割合として記載することができる。μＵｔｒポリペプチドの機能活性の阻害は、適切な対照の活性の５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、５５％以下、６０％以下、６５％以下、７０％以下、７５％以下、８０％以下、８５％以下、９０％以下、９５％以下、９９％以下、又は１００％以下の阻害を含む。
【００３７】
μＵｔｒポリペプチドの「生物活性のある類似体」は、機能活性を排除しない１つ以上のアミノ酸置換を有するポリペプチドを含む。μＵｔｒポリペプチドの生物活性のある類似体中のアミノ酸の置換基は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されてよい。例えば、タンパク質生化学の分野では、特定のサイズ又は特性（例えば、電荷、疎水性及び親水性）を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸は、タンパク質の活性を変化させることなく、特に生物活性に直接関係しないタンパク質の領域の、別のアミノ酸で置換することができることは、よく知られている。アミノ酸の置換基は、そのアミノ酸が属するクラスの別のメンバーから選択してもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含む。極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン及びヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。このような好ましい保存的置換の例は、正電荷を維持するためにＬｙｓをＡｒｇで及びその逆；不電荷を維持するためにＧｌｕをＡｓｐで及びその逆；遊離−ＯＨが維持されるようにＳｅｒをＴｈｒで；及び遊離ＮＨ２を維持するためにＧｉｎをＡｓｎで置換するものがある。同様に、μＵｔｒポリペプチドの生物活性のある類似体は、μＵｔｒポリペプチドの機能活性を排除しない１種以上の連続的な又は非連続的なアミノ酸の付加及び／又は欠失を含むことができる。
【００３８】
１種以上の連続的アミノ酸の付加は、μＵｔｒポリペプチドに所望の機能を提供することがある。例えば、μＵｔｒポリペプチドは、ＴＡＴ配列（例えば、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号３のアミノ酸１１〜２１、配列番号５のアミノ酸１１〜２１、配列番号７のアミノ酸３〜１３、配列番号９のアミノ酸３〜１６、配列番号１０のアミノ酸２〜１２、及び配列番号１１に示される）、又はＨＡ配列（例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号３のアミノ酸２９〜３７、配列番号５のアミノ酸２９〜３７、配列番号７のアミノ酸２１〜２９、及び配列番号１０のアミノ酸２０〜２８）を含むことができる。ＴＡＴ及び／又はＨＡの付加は、例えば、μＵｔｒポリペプチドの哺乳動物筋肉細胞への導入、及び／又はμＵｔｒポリペプチドの精製の促進などの機能を提供することができる。μＵｔｒポリペプチドの例示的態様は、ＴＡＴとＨＡ付加を含むポリペプチド（例えば配列番号１０）、ならびに例えばＴＡＴ付加を含むがＨＡ付加を含まないポリペプチド（例えば配列番号１１）を含む。
【００３９】
種々の可能なアミノ酸付加にもかかわらず、本明細書に記載のμＵｔｒポリペプチドは、明らかにＦＬＡＧタグ（配列番号１）が欠如している。
【００４０】
μＵｔｒポリペプチドの「生物活性のある類似体」は、μＵｔｒポリペプチドの「断片」及び「修飾物」を含む。本明細書において、μＵｔｒポリペプチドの「断片」は、Ｎ末端で末端切断されているか、Ｃ末端で末端切断されているか、連続的アミノ酸の１つ以上（例えば、スペクトリン様繰り返し配列のすべて又は一部）の欠失もしくはこれらの組合せを有するか、抗ジストロフィン異常症活性を有する、μＵｔｒポリペプチドを意味する。
【００４１】
μＵｔｒポリペプチドの「修飾物」は、１つ以上の構成アミノ酸で化学的又は酵素的に誘導されたμＵｔｒポリペプチド又はその断片を含み、例えば側鎖修飾物、骨格修飾物、及びＮ末端及びＣ末端修飾物（アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、及び炭水化物もしくは脂質成分、補助因子などの付加を含む）がある。修飾されたμＵｔｒポリペプチドは、非修飾ポリペプチドの生物活性を保持することができ、低下したか又は上昇した生物活性を示すことができる。
【００４２】
μＵｔｒポリペプチド又はその生物活性のある類似体は、組換え法で、化学合成で、又は酵素的に合成してもよい。
【００４３】
μＵｔｒポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１に記載されたポリペプチドのμＵｔｒ部分と「構造的類似性」を有するポリペプチド、及び／又はこれらの断片を含むことができる。本明細書において「構造的類似性」は、２つのポリペプチド間の同一性をいう。ポリペプチドについて、構造的類似性は一般に、２つのポリペプチド（例えば、候補ポリペプチドと、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１のポリペプチドのμＵｔｒ部分、又はその関連する機能性断片）の残基を整列させて、その配列の長さに沿った同一アミノ酸の数を最適化することにより決定される。同一アミノ酸の数を最適化するために整列を行うのに、いずれかの又は両方の配列のギャップは許容されるが、各配列中のアミノ酸はその本来の順序で留まらなければならない。候補ポリペプチドは、μＵｔｒポリペプチドと比較されるポリペプチドである。候補ポリペプチドは、組換え法で、化学合成で、又は酵素的に合成してもよい。
【００４４】
μＵｔｒポリペプチド配列の対応のある比較解析は、ＧＣＧパッケージ（バージョン１０．２、Madison WI）中のＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズムを使用して行うことができる。あるいは、ポリペプチドは、Tatiana et al. (1999 FEMS Microbiol Lett, 174, 247-250) に記載されているように、及びワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で入手できるＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｐプログラムを使用して比較してもよい。ＢＬＡＳＴ２検索パラメータのデフォールト値を使用してもよく、例えばマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、オープンギャップペナルティ＝１１、エクステンションギャップペナルティ＝１、ギャップｘ＿ドロップオフ＝５０、エクスペクト＝１０、ワードサイズ＝３、及びフィルターオンを含む。
【００４５】
２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は、パーセント「同一性」をいうか、又はパーセント「類似性」と呼んでもよい。「同一性」は同一のアミノ酸の存在をいい、「類似性」は同一のアミノ酸のみでなく保存的置換物の存在もいう。
【００４６】
μＵｔｒポリペプチドは、参照μＵｔｒアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列類似性を示すポリペプチドを含むことができる。
【００４７】
あるいは本明細書において、μＵｔｒポリペプチドへの言及及び／又は１つ又はそれ以上の配列番号のアミノ酸配列への言及は、参照アミノ酸配列との、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むことができる。
【００４８】
μＵｔｒポリペプチドの機能に必須のアミノ酸は、当該分野で公知の方法、例えば部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャンニング突然変異誘発、に従って同定することができる（Cunningham and Wells, 1989 Science 244: 1081-1085; Bass et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4498-4502）。
【００４９】
上記したように、μＵｔｒポリペプチドは、付加物、例えばμＵｔｒポリペプチドに１つ以上の追加の機能を与えることができるタグ、を含むことができる。このようなタグの例は、例えばＴＡＴタンパク質導入ドメイン及び／又はＨＡタグを含む。ＴＡＴタンパク質導入ドメインの高度の塩基性は、例えば陽イオン交換カラムへのＴＡＴタンパク質導入ドメインを含むポリペプチドの結合を促進するタグとして機能することができる。すなわち、ＴＡＴタグを含む融合ポリペプチドは、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用することにより、拡張性のある１工程法で単離することができる。
【００５０】
あるいは、ＴＡＴタグ以外の付加物は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する精製の基礎となることができる。ある態様において、少なくとも１２個のアミノ酸と正味の陽性荷電を有するアミノ酸付加物もまた、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する精製の基礎となることができる。ある態様において、このような陽性荷電したタグは、少なくとも１つの非アルギニンアミノ酸残基を有することができる。別の態様において、陽性荷電したタグは、μＵｔｒポリペプチドのＮ末端に位置することができる。
【００５１】
例えばＴＡＴタグのような陽性荷電したタグが欠如したμＵｔｒポリペプチドは、陽イオン交換カラムにあまり結合しない。これに対して、例えばＴＡＴタグのような陽性荷電したタグを含むμＵｔｒポリペプチド（例えば、ＴＡＴ−μＵｔｒポリペプチドなどのタグ付きμＵｔｒ）は、陽イオン交換カラムに結合するのみでなく、高度に精製されたμＵｔｒの回収を可能にする。例えば、ＴＡＴタグ従ってＴＡＴ−μＵｔｒポリペプチドは、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の収率で、μＵｔｒポリペプチドの回収を可能にする。本明細書において、収率は、ある化合物を含む試料が１つ以上の分取法及び／又は分析法に付された後に保持される、その化合物（例えば、ＴＡＴ−μＵｔｒなどのタグ付きμＵｔｒ）の量に関連する。収率は、分取法及び／又は分析法後にうまく保持される、試料中の化合物の量のパーセントとして表される。ある態様において、μＵｔｒポリペプチドは少なくとも９０％の収率で回収することができる。
【００５２】
さらに、陽性荷電したタグ、例えばＴＡＴタグは、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の純度までのμＵｔｒポリペプチドの回収を提供することができる。本明細書において「純度」は、ある組成物の他の成分と比較して、組成物中の目的の化合物（例えば、ＴＡＴ−μＵｔｒなどのタグ付きμＵｔｒ）の相対量をいう定量可能な特性である。相対量は、分子の相対数（例えば１００部当たり）で、モル当量で、又は相対量で表してもよい。ある態様において、μＵｔｒポリペプチドは少なくとも８６％の純度まで回収することができる。他の態様において、μＵｔｒポリペプチドは少なくとも９３％の純度まで回収することができる。
【００５３】
ある態様において、陽性荷電したタグの使用は、特定の収率と特定の純度とを組合せた、目的の化合物（例えば、ＴＡＴ−μＵｔｒなどのタグ付きμＵｔｒ）の回収を可能にすることができる。特定の収率は、２段落前で記載したいずれの収率でもよく、特定の純度は、前の段落で記載したいずれの純度でもよい。すなわち、ある具体的な態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用するＴＡＴ−μＵｔｒポリペプチドの回収は、陽イオン交換クロマトグラフィーに付された試料中のＴＡＴ−μＵｔｒポリペプチドの少なくとも９０％を、少なくとも８６％の純度まで回収することができる。
【００５４】
従って、本明細書に記載のＴＡＴ−μＵｔｒポリペプチドは、複数の相補的機能を有することができる。例えば、μ−ユートロフィンは、ジストロフィン欠損を含む状態に関連して、完全長ユートロフィンの治療効果を提供することができる。さらに、μ−ユートロフィンポリペプチドは、完全長ユートロフィンタンパク質より小さいため、μ−ユートロフィンポリペプチドは、標的細胞により容易に送達することができる。さらにＴＡＴ領域などの陽性荷電したタグは、２重の機能を与えることができる。第１に、陽性荷電したタグは、哺乳動物細胞へのタグを含有するポリペプチドの導入を誘導することができる。第２に、陽性荷電したタグは、タグを含むポリペプチドが、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して経済的に単離できる手段を提供することができる。
【００５５】
μＵｔｒポリペプチドは、「担体」とともに調合して組成物にすることができる。本明細書において「担体」は、任意の溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び/又は抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。医薬活性物質のためのこのような媒体及び/又は薬剤の使用は、当該分野で公知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性成分と非相溶性である場合以外は、治療組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性成分も組成物に取り込むことができる。
【００５６】
「医薬的に許容し得る」とは、生物学的又は他の意味で好ましくないことは無い物質を意味し、すなわち、その物質は、好ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、又はこれが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく、μＵｔｒポリペプチドとともに個体に投与することができる。
【００５７】
μＵｔｒポリペプチドは、製剤化して医薬組成物にすることができる。医薬組成物は、好適な投与経路に適合した種々の形態で製剤化することができる。すなわち、組成物は、例えば、経口、非経口（例えば、皮内、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内等）、又は局所（例えば、鼻腔内、肺内、乳房内、膣内、子宮内、皮内、経皮、直腸、等）を含む公知の経路を介して投与することができる。これは、組成物が、例えば鼻粘膜又は呼吸粘膜投与（噴霧又はエアロゾルによって）などによって、粘膜表面に投与することができることが予想される。組成物はまた、徐放又は遅延放出を介して投与することができる。
【００５８】
製剤は便利には、単位投与型で提供され、薬剤学の分野で公知の方法により調製されてもよい。医薬的に許容し得る担体を用いて組成物を調製する方法は、１つ以上の付属成分を構成する担体を、μＵｔｒポリペプチドと一緒にする工程を含む。一般に製剤は、活性化合物に、液体担体、微細固形担体、又はその両方を、均一かつ密接に組合せて、次に必要であれば、生成物を所望の製剤に成形することにより調製される。
【００５９】
μＵｔｒポリペプチドは、特に限定されないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、スプレー、エアロゾル、又は任意の形態の混合物を含む任意の適切な形態で提供することができる。組成物は、任意の医薬的に許容し得る賦形剤、担体、又はビヒクルと調合して送達することができる。例えば、製剤は、例えばクリーム、軟膏、エアロゾル製剤、非エアロゾルスプレー、ゲル、ローションなどの従来の局所剤形で送達することができる。製剤はさらに、例えば補助剤、皮膚透過促進剤、着色剤、香料、香味剤、保湿剤、増粘剤等を含む１つ以上の添加剤を含んでもよい。
【００６０】
別の形態において本開示は、一般にμＵｔｒポリペプチドを投与する処置を必要とする対象への、有効量のμＵｔｒポリペプチドの投与を含む方法を記載する。
【００６１】
投与されるμＵｔｒポリペプチドの量は、特に限定されないが、投与される具体的なμＵｔｒポリペプチド、対象の体重、身体状態、及び/又は年齢、及び/又は投与経路を含む種々の要因に依存して変動し得る。すなわち、ある単位投与型に含まれるμＵｔｒポリペプチドの絶対重量は大きく変動することができ、対象の種、年齢、体重及び身体状態などの要因、ならびに投与方法に依存する。従って、一般的にすべての可能な用途のために効果的なμＵｔｒポリペプチドの量を構成する量を記載することは現実的ではない。しかし当業者は、このような因子を考慮して適量を容易に決定することができる。
【００６２】
ある態様において、本方法は、充分なμＵｔｒポリペプチドを投与して、対象に例えば約１００ｎｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇを与えることを含むことができるが、ある態様においては本方法は、この範囲外の用量のμＵｔｒポリペプチドを投与することにより行ってもよい。これらの態様のいくつかでは、本方法は、充分なμＵｔｒポリペプチドを投与して、対象に例えば約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量を、例えば約１００μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの用量を与えることを含む。ある具体的態様において、本方法は対象に約８．５ｍｇ／ｋｇを投与することを含む。
【００６３】
あるいは、用量は、治療コースの開始の直前に得られた実際の体重を使用して計算してもよい。こうして計算される用量について、体表面積（ｍ2）は、治療コースの開始前に、デュボワ法：ｍ2＝（体重ｋｇ0.425×身長ｃｍ0.725）×０．００７１８４を使用して計算される。
【００６４】
ある態様において、本方法は、充分なμＵｔｒポリペプチドを投与して、例えば約０．０１ｍｇ／ｍ2〜約１０ｍｇ／ｍ2の用量を与えることを含むことができる。
【００６５】
ある態様において、μＵｔｒポリペプチドは、例えば１週に１回から複数回投与してもよいが、ある態様では、本明細書に開示された本方法は、この範囲外の頻度でμＵｔｒポリペプチドを投与することにより行ってもよい。ある態様において、μＵｔｒポリペプチドは、月に約１回〜週に約５回投与してもよい。
【００６６】
すなわち、さらに別の形態において、本開示は、μＵｔｒポリペプチドを含む組成物を提供することを含み、ここで、組成物は、少なくとも一部はジストロフィン欠損を特徴とする状態の少なくとも１つの症状又は臨床的兆候を改善するのに有効である。そのような状態は、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー及び／又は拡張型心筋症を含むことができる。本明細書に記載のμＵｔｒポリペプチドを投与することにより改善される典型的な症状及び／又は臨床的兆候は、例えば筋線維鞘の損傷（例えば、血清クレアチンキナーゼ活性を測定することにより評価される）、骨格筋の筋力低下や疲労（例えば、6分間歩行検査、グリップ検査、又は徒手筋力検査によって測定される）、肺機能不全（例えば、最大吸気及び/又は呼気圧力、ピーク咳フロー）、及び/又は心不全症状への進行の遅れについての心臓モニタリングを含む。
【００６７】
別の形態において本開示は、例えば動物で抗体の産生を誘導するか又は組換え技術により、抗体を製造する方法を記載する。製造される抗体は、少なくとも１つのμＵｔｒポリペプチド又はその断片に特異的に結合する抗体を含む。すなわち、関連する形態で、本開示は、μＵｔｒポリペプチド又はその断片に特異的に結合する抗体と、そのような抗体を含む組成物とを記載する。
【００６８】
本方法は、μＵｔｒポリペプチドに特異的に結合する抗体組成物を製造するために使用することができる。本明細書において、μＵｔｒポリペプチドに「特異的に結合」することができる抗体は、μＵｔｒポリペプチドのエピトープと相互作用するか、又は構造的に関連するエピトープと相互作用するか、及び／又はμＵｔｒポリペプチドに対する任意の程度の示差的非一般的（すなわち、非特異的）親和性を有する抗体である。ある態様において、抗体組成物は、μＵｔｒポリペプチドに対して作成されたポリクローナル抗体を含むことができる。他の態様において、抗体組成物は、μＵｔｒポリペプチドに対して作成された１つ以上のモノクローナル抗体を含むことができる。さらに別の態様において、抗体組成物の抗体は、組換え法又は合成法により合成してもよい。ある態様において、本方法は、μＵｔｒポリペプチドに特異的に結合するが、完全長ユートロフィンには特異的に結合しない抗体の産生を引き起こし得る。
【００６９】
別の形態において、本開示は、μＵｔｒポリヌクレオチド、すなわちμＵｔｒポリペプチドの少なくとも一部をコードする単離されたポリヌクレオチドを記載する。μＵｔｒポリヌクレオチドの例は、例えば配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１のμＵｔｒアミノ酸配列を含むアミノ酸をコードする単離されたポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチド配列の相補体を含む。μＵｔｒポリヌクレオチドの他の例は、例えば配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、又は配列番号１１のμＵｔｒアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに、標準的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド。又はそのようなポリヌクレオチドの相補体を含む。μＵｔｒポリヌクレオチドはまた、参照μＵｔｒポリヌクレオチドと、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００７０】
本明細書において「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列間の同一性をいう。配列同一性は一般に、２つのポリヌクレオチドの残基を整列させて、その配列の長さに沿った同一ヌクレオチドの数を最適化することにより決定される。共有されるヌクレオチドの数を最適化するために整列を行うのに、いずれかの又は両方の配列のギャップは許容されるが、各配列中のヌクレオチドはその本来の順序で留まらなければならない。候補配列は、既知の配列と比較される配列である。例えば、２つのポリヌクレオチド配列は、Tatiana et al., 1999 FEMS Microbiol Lett, 174, 247-250 に記載され、ワールドワイドウェブncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で入手できるＢＬＡＳＴ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｎプログラムを使用して比較してもよい。ＢＬＡＳＴ２検索パラメータのデフォールト値、例えばマッチに対する獲点＝１、ミスマッチのペナルティ＝−２、オープンギャップペナルティ＝５、エクステンションギャップペナルティ＝２、ギャップｘ＿ドロップオフ＝５０、エクスペクト＝１０、ワードサイズ＝３、及びフィルターオン、を使用してもよい。
【００７１】
別の形態において、本開示はポリヌクレオチド断片を記載する。ポリヌクレオチド断片は、本明細書に記載の単離されたμＵｔｒポリヌクレオチドの一部である。このような部分は、数百ヌクレオチドの長さ、例えば約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、又は約１０００ヌクレオチドの長さでもよい。
【００７２】
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、「担体」とともに調合して組成物にすることができる。本明細書において「担体」は、任意の溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び/又は抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等を含む。医薬活性物質のためのこのような媒体及び/又は薬剤の使用は、当該分野で公知である。任意の従来の媒体又は薬剤が活性成分と非相溶性である場合以外は、治療組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性成分も組成物に取り込むことができる。
【００７３】
「医薬的に許容し得る」とは、生物学的又は他の意味で好ましくないことは無い物質を意味し、すなわち、その物質は、好ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、又はこれが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく、μＵｔｒポリヌクレオチドとともに個体に投与することができる。
【００７４】
μＵｔｒポリペプチドが、医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物に製剤化される態様において、ポリヌクレオチドは、治療的ポリヌクレオチドを送達するための当業者に公知の方法により、製剤化され投与され得る。
【００７５】
本開示はさらに、目的のポリペプチドを効率的に精製するための一般的方法を記載する。一般に本方法は、陽性荷電したタグと目的のポリペプチドの機能性部分を含む第２の領域とを含む融合ポリペプチドを構築することを含む。この融合ポリペプチドは適切な宿主基材から発現し、宿主生物により発現されたポリペプチドを採取するのに適したルーチン法を使用して融合ポリペプチドを採取し、採取された融合タンパク質を含む試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに付すことができる。
【００７６】
陽性荷電したタグは、少なくとも１２個のアミノ酸と正味の陽性荷電とを有するアミノ酸付加物でもよい。ある態様において、このような陽性荷電したタグは、少なくとも１つの非アルギニンアミノ酸残基を有することができる。別の態様において、陽性荷電したタグは、μＵｔｒポリペプチドのＮ末端に位置することができる。上記したように、陽性荷電したタグの例は、ＴＡＴ配列（例えば、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号３のアミノ酸１１〜２１、配列番号５のアミノ酸１１〜２１、配列番号７のアミノ酸３〜１３、配列番号９のアミノ酸３〜１６、配列番号１０のアミノ酸２〜１２、及び配列番号１１に示される）、又はＨＡ配列（例えば、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、配列番号３のアミノ酸２９〜３７、配列番号５のアミノ酸２９〜３７、配列番号７のアミノ酸２１〜２９、及び配列番号１０のアミノ酸２０〜２８）を含むことができる。
【００７７】
ＴＡＴ−μＵｔｒポリペプチドについて上記したように、陽性荷電したタグ（例えばＴＡＴ配列）は、本来は陽イオン交換カラムに結合しないであろうポリペプチドをカラムに結合するようにさせ、こうしてタグ含有融合ポリペプチドの拡張性のある低コストの精製を可能にする。例えば、ＴＡＴタンパク質導入ドメインの高い塩基性はまた、ＴＡＴタンパク質導入ドメインを含有するポリペプチドの陽イオン交換カラムへの結合を促進することができるタグとして機能することもできる。すなわち、例えばＴＡＴタグを含む融合ポリペプチドは、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して拡張性のある１工程法で単離することができる。さらに、ＴＡＴ含有ポリペプチドに生物膜を通過させることにより促進される用途に、精製されたＴＡＴ含有ポリペプチドが所望の時、ＴＡＴ領域は、細胞導入活性を提供することができる。
【００７８】
前記説明において、明瞭さのために具体的な態様が独立して記載される。具体的な態様の特徴が別の態様の特徴と適合性が無いことを特に明記しない場合は、いくつかの態様は、１つ以上の態様と本明細書に記載の適合性のある特徴との組合せを含むことができる。
【００７９】
別々の工程を含む本明細書に開示された任意の方法について、これらの工程は任意の可能な順序で行われてよい。２つ以上の工程の任意の組合せを、適宜同時に行ってもよい。
【００８０】
本発明は、以下の例により例示される。具体的な例、物質、量、及び操作法は、本明細書に記載の本発明の範囲と精神に従って広く解釈すべきであることを理解されたい。
【実施例】
【００８１】
実施例１：ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒ構築物とＦＬＡＧの無いＴＡＴ−μＵｔｒ構築物
ヒトＴＡＴ−μ−ユートロフィンバキュロウイルス構築物の作成
TRIzol（登録商標）試薬（Invitrogen; Carlsbad, CA）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞から総ＲＮＡを単離した。プライマーを使用して、総ＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲ（Superscript（登録商標）One-Step RT-PCR kit with Platinum（登録商標）Taq, Invitrogen; Carlsbad, CA）を行ない、ヒトユートロフィン転写体のスペクトリン様繰り返し配列３とヒンジ１を介して開始メチオニンを増幅した。重複プライマーを用いて、ＰＣＲを使用して生じた２１００ｂｐの生成物に、コザックコンセンサス、ＴＡＴ、及びＨＡをコードする配列を加えた。ヒトユートロフィンのスペクトリン様繰り返し配列２２からＣ末端終止コドンまでを、ヒトユートロフィンｃＤＮＡ含有プラスミド（Dr. Kay Daviesから供与された）からＰＣＲ増幅した。組換えＰＣＲ法を使用して、ＴＡＴ−Ｎ末端からヒンジ１までのＰＣＲ断片を、スペクトリン繰り返し配列２２から終止コドンまでの断片に結合させた。生じた４７００ｂｐのＴＡＴ−μ−ユートロフィンＰＣＲ産物を、pCR（登録商標）-Bluntベクター（Invitrogen; Carlsbad, CA）にクローン化し、ＳｐｅＩとＸｈｏＩで消化し、pFastBac（登録商標）1ベクター（Invitrogen; Carlsbad, CA）にサブクローン化した。配列の確認により、３つの変異が明らかになり、次にこれらを、部位特異的突然変異誘発により修正した。ＴＡＴ−ＨＡ−Ｎ末端からヒンジ１までのＰＣＲ断片をpCR（登録商標）-Bluntベクターにクローン化し、ＳｐｅＩとＢｐIIで消化し、修正したＴＡＴ−μ−ユートロフィンpFastBac（登録商標）1ベクターにサブクローン化して、ＴＡＴ−ＨＡ−μ−ユートロフィンpFastBac（登録商標）1プラスミドを作成した。両方のヒトμ−ユートロフィン構築物の広範な配列確認後、DH10Bac（登録商標）細胞（Invitrogen; Carlsbad, CA）をＴＡＴ−μ−ユートロフィンpFastBac（登録商標）1プラスミド又はＴＡＴ−ＨＡ−μ−ユートロフィンpFastBac（登録商標）1プラスミドで形質転換して、組換えバクミドを作成した。Ｓｆ９昆虫細胞をバクミドでトランスフェクトして、ヒトＴＡＴ−μ−ユートロフィン又はヒトＴＡＴ−ＨＡ−μ−ユートロフィンの以後の発現のための組換えバキュロウイルスを作成した。すべてのＰＣＲ反応は、PfuUltra（登録商標）又はPfuUltra（登録商標）II Fusion HS high fidelityＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene; Cedar Creek, TX）を使用して行なった。
ＦＬＡＧの無いＴＡＴ−ＨＡ−μＵｔｒポリペプチドを、配列番号１０に記載する。ＦＬＡＧの無いＴＡＴ−μＵｔｒポリペプチドを、配列番号１１に記載する。
【００８２】
ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μユートロフィンの作成
ＦＬＡＧタグ付きＴＡＴ−μ−ユートロフィンは、既に記載されているように作成した（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）。
【００８３】
ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒ及びＦＬＡＧ−μＵｔｒの精製
ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒ及びＦＬＡＧ−μＵｔｒは、既に記載されているように抗ＦＬＡＧ  Ｍ２親和性クロマトグラフィーにより精製した（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）。ＴＡＴ−μＵｔｒの精製のために、凍結された感染Ｓｆ９細胞ペレットを、液体窒素で冷却した乳鉢と乳房を用いて粉砕し、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中１％トリトンＸ−１００、０．３Ｍ  ＮａＣｌとプロテアーゼインヒビターのカクテルとで４℃で１時間可溶化した（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）。１４，０００×ｇで１０分間遠心分離後に得られた可溶性の上清を、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中０．３Ｍ  ＮａＣｌであらかじめ平衡化させた２０ｍｌのＳｐセファロース（Sigma-Aldrich; St. Louis, MO）にのせた。カラムをＰＢＳ（ｐＨ７．５）中０．４Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、結合したタンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．５）中０．７Ｍ  ＮａＣｌで溶出させた。ＴＡＴ−μＵｔｒを含む画分をプールし、２×１００容量のＰＢＳ（ｐＨ７．５）で、４℃で透析した。精製されたタンパク質を、０．２２μｍフィルター中を通過させて滅菌し、ｍｄｘマウスの腹腔内に１．５〜３．０ｍｇ／ｍｌで注射した。
【００８４】
実施例２：タンパク質標識と赤外線イメージング
ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒとＦＬＡＧ−μＵｔｒの蛍光標識を、既に記載されているように行なった（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）。精製されたＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒ又はＴＡＴ−μＵｔｒをＰＢＳで１．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、IRDye 800CW - High MW Protein Labeling Kit (LI-COR Biosciences; Lincoln, NE) を用いて製造業者の説明書に従って標識した。標識されたタンパク質を、注射前に０．２２μｍのシリンジフィルターで滅菌した。
【００８５】
Ｃ５７Ｂ１／１０ＳｃＳｎ−Ｄｍｄmdx／Ｊ(The Jackson Laboratory; Bar Harbor, ME) マウス（１時点当たりｎ＝２）に、ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒ又はＴＡＴ−μＵｔｒを単回注射した。注射の３、２４、４８、及び７２時間後に、マウスを安楽死させ、Pearl（登録商標）Imager (LI-COR Biosciences; Lincoln, NE) を使用して、８００ｎｍ（標識タンパク質）と７００ｎｍ（バックグランド）チャネルの両方を使用して、全身の蛍光についてスキャンした。大腿四頭筋と肝臓組織も液体窒素で凍結し、後に組織蛍光について分析した。ＳＤＳ抽出物の分析のために、凍結組織を粉砕し、既に記載されているようにタンパク質を抽出した（Mendell et al., 2010 N Engl J Med 363:1429-37）。溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズで分離し、ニトロセルロースに移し、膜をOdyssey（登録商標）Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences; Lincoln, NE) を使用してスキャンした。移した後のクマシーブルー染色ゲルの濃度測定により、溶解物の蛍光をタンパク質負荷量に対して標準化した。
【００８６】
実施例３：ＴＡＴ−μＵｔｒによるｍｄｘマウスの処理
すべての試験について、タンパク質（１．５〜３．０ｍｇ／ｍｌ）は、８．５μｇ／ｇボディマスの用量で腹腔内注射により投与し、対照には等量の無菌ＰＢＳを投与した。ＴＡＴ−μＵｔｒの短期有効性を既に記載されているように評価した（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）。マウスに、ＰＢＳ（ｎ＝５）又はＴＡＴ−μＵｔｒ（ｎ＝７）を、１８日齢から開始して３週間、毎週２回注射した。同腹子を平行して処理し、性が偏らないようにした。
【００８７】
ＴＡＴ−μＵｔｒの長期有効性を、短期試験と同じ分析法で評価した。マウスには１８日齢から開始して１３．５週間、ＰＢＳ（ｎ＝８）又はＴＡＴ−μＵｔｒ（ｎ＝７）を毎週２回注射した。ミネソタ大学の施設内動物管理使用委員会が設定した基準に従って、動物を収容し処理した。
【００８８】
グリップ力
各試験の最後にすべてのマウスで、前肢グリップ力をグリップ力計（Columbus Instruments; Columbus, OH）を使用して試験した。各マウスの尾をつかみ、力変換器に接続した三角形のバーに向かって下ろした。前足によるしっかりしたグリップを確立した後、マウスの尾を地面に平行な方向に、バーを離すまで引っ張った。各マウスを５回連続して引っ張った。５回の引っ張り力を各マウスについて平均して、ボディマスに対して標準化した。
【００８９】
タンパク質抽出物
ＷＧＡ親和性クロマトグラフィー（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）を使用して膜糖タンパク質を濃縮した試料について、粉砕した筋肉を５％ジギトニン可溶化緩衝液中で１：１０（ｗ：ｖ）で、４℃で１時間可溶化した。可溶化物を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次に上清を平衡化したＷＧＡビーズ（１ｍｌの上清当たり５０μｌのビーズ、Vector Labs; Burlingame, CA）にのせ、４℃で一晩回転混合させた。次にビーズをペレットにして、１０％ジギトニン洗浄緩衝液で３回洗浄後、０．３Ｍ  ＮＡＧ溶出緩衝液でタンパク質を溶出させた。
【００９０】
電気泳動／ウェスタンブロッティング
通常の３〜１２％勾配ゲルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより筋線維鞘タンパク質を検出した。すべてのウェスタンブロッティングは、既に記載されているように（Mendell et al., 2010 N Engl J Med 363:1429-37）、以下の１次抗体を使用して行なった：抗ユートロフィンｍＡｂ  ８Ａ４（1:50; Santa Cruz Biotechnology（登録商標）, Inc.; Santa Cruz, CA）、抗ＦＬＡＧ  ｐＡｂ（１：１０００；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、抗シントロフィンｍＡｂ１３５１（１：１０００，Abcam（登録商標）, Cambridge, MA）、抗α−サルコグリカンｍＡｂ  ＮＣＬ−ａ−Ｓａｒｃ（１：５０；Novocastra Reagents（Leica Microsystems Inc.の１部門); Buffalo Grove, IL）、抗β−ジストログリカンｍＡｂ  ＮＣＬ-ｂ−ＤＧ（１：５０； Novocastra Reagents（Leica Microsystems Inc.の１部門); Buffalo Grove, IL）、及び抗ジヒドロピリジン受容体ｍＡｂ  IIＣ１２Ｄ４（１：５００，Developmental Studies Hybridoma Bank; Iowa City, IA）。２次抗体を希釈（１：５０００）し、ODYSSEY Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences; Lincoln, NE) を用いて、７００及び８００ｎｍチャネルを使用して検出した。
【００９１】
組織及び形態計測分析
個々の筋肉をばらばらにし、ＯＣＴ（TissueTek（登録商標）（Sakuraの１部門）; Torrance, CA）でコーティングし、液体窒素で冷却したイソペンタンで急速凍結した。１０μｍ厚の凍結切片をLeica CM3050で切断し、ヘマトキシリンとエオシン−フロキシンで染色した。Zeiss Axiovert 25顕微鏡で画像を採取し、ImagePro Plusでセクション全体のモンタージュに編集し、形態計測分析のためにScion Imageにエクスポートした。中心核繊維のパーセントを、各マウスの１つの筋肉から、分析のためにスコア化したすべての繊維を用いて、決定した。
【００９２】
免疫蛍光
１０μｍ厚の凍結切片を記載されているように１次抗体で染色した（Wehling et al., 2001 J Cell Biol 155:123-31）。DeltaVision personalDV解析顕微鏡システムで４０×油浸対物レンズを使用して、多くの画像を得た。画像の山を解析し、及び映像は、図の作成のためにTIFファイルとしてCorelDraw X4中にインポートされた。使用された１次モノクローナル抗体は、上記ウェスタンブロッティングについて記載したものと同一であり、抗ラミニンｍＡｂ  ４Ｈ８−２（Sigma-Aldrich; St. Lours, MO）、抗ジストロブレビン（Novocastra Reagents（Leica Microsystems Inc.の１部門）；Buffalo Grove, IL）、及び抗ｎＮＯＳ  ｐＡｂ  Ｚ−ＲＮＮ３（Invitrogen; Carlsbad, CA）を添加した。
【００９３】
ＥＤＬ収縮性
ＥＤＬ筋肉の収縮性を既に記載されているように測定した（Sonnemann et al., 2009 PLoS Med 6:e1000083）。簡単に説明すると、マウスをペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇボディマス）で麻酔した。ＥＤＬ筋肉をばらばらにし、２重モード筋肉レバー装置（300B-LR; Aurora Scientific Inc.; Aurora, ON, Canada）に、２５℃に維持され９５％Ｏ2を潅流したクレブス−リンゲル重炭酸緩衝液を満たした０．３８ml浴アセンブリーに、取り付けた。最大等尺性強縮力（Ｐ0）は、筋肉を１８０Ｈｚと１５０Ｖで４００ミリ秒間（SIU5D刺激隔離ユニットを介するGrass S48刺激器；Grass Telefactor; Warwick, RI）測定することにより決定した。特定力は、筋肉の断面積に対してＰ０を標準化することによって計算した：筋肉重量は、筋密度（１．０６グラム／ｍｌ）と繊維長との積で割った。伸張性損傷プロトコールは、５回の伸張性収縮からなり、受動的にＬ０から０．９５Ｌ0まで３秒かけて短縮し、強直剤で２００ミリ秒刺激すると、筋肉が１．０５Ｌ0から０．５Ｌ0／ｓまで延長し、次に受動的にＬ0に戻った。各伸張性収縮を、３分間の休止により分離した。収縮性と損傷プロトコールを、左右両方の脚からＥＤＬ筋に行い、それらを各マウスについて単一のデータ点として一緒に平均化した。実験者（ＫＡＢ）は、各ｍｄｘマウスの処理について知らされていなかった。
【００９４】
血清クレアチンキナーゼ分析
麻酔したマウスで後眼窩採血を行った（Wehling et al., 2001 J Cell Biol 155:123-31）。データはU / mLで採取した。
【００９５】
統計解析
データは平均±ＳＥＭとして報告される。短期処理は、スチューデントのｔ検定を用いて、ＴＡＴ−μＵｔｒとＰＢＳとで処理したマウスを比較して分析した。長期試験には、スチューデントのｔ検定は、ＦＬＡＧ−ＴＡＴ−μＵｔｒとＴＡＴ−μＵｔｒ群との間で行い、すべての試験した変数について有意差は存在しなかった（Ｐ≧０．１３０）。これらの群をプールし、ＰＢＳ処理したマウスに対して比較した。有意水準はＰ＜０．０５と設定した。
【００９６】
態様
態様１：
融合タンパク質を哺乳動物筋肉細胞に導入するのに有効な第２の領域に作動可能に連結している、μ−ユートロフィン領域又はその抗ジストロフィン異常症断片を含み、
但し、配列番号１を含まない、単離されたポリペプチド。
【００９７】
態様２：
μ−ユートロフィン領域又はその抗ジストロフィン異常症断片が、未変性のユートロフィンと比較して少なくとも１つのスペクトリン様繰り返し配列の欠失を含む、態様１に記載の単離されたポリペプチド。
【００９８】
態様３：
第２の領域が配列番号７のアミノ酸３〜１３を含む、態様１又は態様２に記載の単離されたポリペプチド。
【００９９】
態様４：
第２の領域が配列番号７のアミノ酸２１〜２９を含む、態様１〜３のいずれか１つに記載の単離されたポリペプチド。
【０１００】
態様５：
医薬的に許容し得る担体と組合わされた、態様１〜４のいずれか１つに記載の単離されたポリペプチド又はその医薬的に適切な塩を含む組成物。
【０１０１】
態様６：
ポリペプチドをコードする単離された核酸発現構築物であって、この核酸発現構築物が、
μ−ユートロフィンポリペプチド又はその抗ジストロフィン異常症断片をコードする第１の核酸領域と、
μ−ユートロフィンポリペプチドを哺乳動物筋肉細胞に導入するのに有効なアミノ酸配列をコードする、第１の核酸領域に作動可能に連結している第２の核酸領域と、を含み、
但し、このポリペプチドは配列番号１を含まない、発現構築物。
【０１０２】
態様７：
μ−ユートロフィンポリペプチド又はその抗ジストロフィン異常症断片が、未変性のユートロフィンと比較して少なくとも１つのスペクトリン様繰り返し配列の欠失を含む、態様６に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１０３】
態様８：
第２の核酸領域が配列番号７のアミノ酸３〜１３を含むポリペプチドをコードする、態様６又は態様７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１０４】
態様９：
第２の核酸領域が配列番号７のアミノ酸２１〜２９を含むポリペプチドをコードする、態様６〜８のいずれか１つに記載の単離されたポリヌクレオチド。
【０１０５】
態様１０：
対象のジストロフィン異常症を治療する方法であって、
このような治療の必要な対象に、態様１〜４のいずれか１つに記載の単離されたポリペプチドの抗ジストロフィン異常症量を投与することを含む、方法。
【０１０６】
態様１１：
ジストロフィン異常症がデュシェンヌ型筋ジストロフィーを含む、態様１０に記載の方法。
【０１０７】
態様１２：
単離されたポリペプチドが週に少なくとも２回投与される、態様１０又は態様１１に記載の方法。
【０１０８】
態様１３：
単離されたポリペプチドが少なくとも１３週間投与される、態様１０〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０１０９】
態様１４：
態様１〜４のいずれか１つに記載のポリペプチドを単離する方法であって、
ポリペプチドを含む試料を受け取る工程と、
その試料の少なくとも一部に陽イオン交換クロマトグラフィーを行う工程と、そして
そのポリペプチドを少なくとも８６％の純度で回収する工程と、を含む方法。
【０１１０】
態様１５：
ポリペプチドが少なくとも９０％の収率で回収される、態様１４に記載の方法。
【０１１１】
態様１６：
態様１〜４のいずれか１つに記載のポリペプチドを単離する方法であって、
ポリペプチドを含む試料を受け取る工程と、
その試料の少なくとも一部に陽イオン交換クロマトグラフィーを行う工程と、そして
そのポリペプチドを少なくとも９０％の収率で回収する工程と、を含む方法。
【０１１２】
態様１７
正味の陰性荷電を有するポリペプチドを単離する方法であって、
正味の陰性荷電を有するポリペプチドと、少なくとも１２個のアミノ酸を含む陽性荷電したタグと、を含む融合ポリペプチドを含む試料を得る工程であって、
ここで、陽性荷電したタグが少なくとも１種の非アルギニンアミノ酸残基を含むこと、又は
陽性荷電したタグが融合ポリペプチドのＮ末端に位置すること、の少なくとも１つが当てはまる、工程と、
この試料の少なくとも一部に陽イオン交換クロマトグラフィーを行う工程とを含む、方法。
【０１１３】
本明細書に引用された全ての特許、特許出願、刊行物、及び電子的に入手可能な材料（例えばGenBank及びRefSeqのヌクレオチド配列の提出物、例えば、SwissProt、PIR、PRF、PDBのアミノ酸配列提出物、及び完全な開示、及びGenBank及びRefSeqの注釈付きのコード領域内からの翻訳物）は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願の開示と参照により本明細書に組み込まれた文書の開示との間に何らかの不一致が存在する場合は、本出願の開示が適用されるものとする。前記の詳細な説明及び実施例は理解を明確にするためにのみ与えられている。そこからは決して不必要な限定を理解すべきではない。本発明は、図示及び記載した厳密な詳細に限定されず、当業者に明らかな変更態様は、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれるであろう。
【０１１４】
特に明記しない場合は、本明細書及び特許請求の範囲で使用される、成分、分子量等の量を表す全ての数字は、全ての場合に用語「約」によって修飾されると理解すべきである。従って、特に明記しない場合は、本明細書及び特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、かつ特許請求の範囲の均等の原則を制限する試みとしてではなく、各数値パラメータは少なくとも、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め法を適用することによって解釈されるべきである。
【０１１５】
本発明の広い範囲を記載する数値範囲及びパラメータは近似値であるにもかかわらず、具体例に記載の数値は可能な限り正確に報告されている。しかし全ての数値は、必然的にそれぞれの試験測定に見られる標準偏差から生じる範囲を含む。
全ての見出しは読者の便宜のためであり、そのように特定されない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用すべきではない。
【０１１６】
【化１】
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【０１１７】
【化２】
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【０１１８】
【化３】
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【０１１９】
【化４】
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【０１２０】
【化５】
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【０１２１】
【化６】
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【０１２２】
【化７】
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【０１２３】
【化８】
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【０１２４】
【化９】
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【０１２５】
【化１０】
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【０１２６】
【化１１】
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【０１２７】
【化１２】
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【０１２８】
【化１３】
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【０１２９】
【化１４】
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【０１３０】
【化１５】
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【０１３１】
【化１６】
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【０１３２】
【化１７】
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【０１３３】
【化１８】
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【０１３４】
【化１９】
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【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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