(57)【要約】  カリコシン及びその類似物質を含有するエストロゲン組成物が提供される。また、特にヒト、例えば女性のヒトにおいてエストロゲン作用を得るために前記抽出物を使用する方法が提供される。幾つかの実施形態において、前記方法は、更年期症状の治療を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、エストロゲン受容体陽性癌、例えばエストロゲン反応性乳癌の治療を含む。幾つかの実施形態において、前記方法は、骨粗鬆症の治療又は予防を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）を調節するのに十分な量の化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）：
【化１】
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の１つ又はそれ以上を含有する医薬組成物。
【請求項２】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の２つ又はそれ以上を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の３つ又はそれ以上を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれを含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
１種又はそれ以上の医薬賦形剤と、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の１つ又はそれ以上とのみからなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
（ｄ）を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
（ｄ）と、（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の１つ又はそれ以上とを含有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
医薬の製造に使用するための請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記医薬が、エストロゲン受容体βアゴニスト作用を有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記医薬が、選択的エストロゲン受容体βアゴニスト作用を有する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記医薬が、エストロゲン受容体αをアンタゴナイズするか、あるいはエストロゲン受容体αに対して測定可能な作用をほとんど又は全く有していない、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記エストロゲン作用が、少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防すること、骨粗鬆症を治療又は予防すること、子宮癌を治療又は予防すること、及び心臓血管疾患を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの作用である、請求項９、１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記エストロゲン作用が、ほてり、不眠症、膣乾燥、性欲減退、尿失禁及びうつ病を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防することを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記エストロゲン作用が、骨粗鬆症を治療又は予防することを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記エストロゲン作用が、ほてりを治療又は予防することを含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記エストロゲン作用が、子宮癌又は乳癌を治療又は予防することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記エストロゲン作用が、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを上昇させることを含まない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記エストロゲン作用が、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを低下させることを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）の１つ又はそれ以上を約１ｍｇ〜約１００ｇ含有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
医薬の製造のための請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
ヒト患者のエストロゲン受容体介在疾患を治療するための請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２２】
前記疾患に介在する前記エストロゲン受容体が、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）である、請求項２０〜２１のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２３】
患者においてエストロゲン作用を誘発させる方法であって、前記患者に、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）を調節するのに十分な量であるエストロゲン有効量の、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）：
【化２】
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の１つ又はそれ以上を含有する組成物を投与することからなる、方法。
【請求項２４】
前記組成物が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の２つ又はそれ以上を含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の又はそれ以上を含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記組成物が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれを含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記エストロゲン作用が、少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防すること、骨粗鬆症を治療又は予防すること、子宮癌を治療又は予防すること、及び心臓血管疾患を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの作用である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記エストロゲン作用が、ほてり、不眠症、膣乾燥、性欲減退、尿失禁及びうつ病を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記エストロゲン作用が、骨粗鬆症を治療又は予防することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記エストロゲン作用が、ほてりを治療又は予防することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記エストロゲン作用が、子宮癌を治療又は予防することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記エストロゲン作用が、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを上昇させることを含まない、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記エストロゲン作用が、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを低下させることを含む、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）の１つ又はそれ以上を約１ｍｇ〜約１００ｇ含有する、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
エストロゲン応答要素の制御下で遺伝子を活性化させる方法であって、前記遺伝子に作用するように連結されたエストロゲン応答要素と、エストロゲン受容体とを有する細胞に、前記遺伝子を活性化させるのに十分な量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物を投与することからなる、方法。
【請求項３６】
前記細胞が生体外に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が生体内に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞がＥＲα＋乳房組織内に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞がＥＲβ＋乳房組織内に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞がＥＲα／ＥＲβ＋乳房組織内に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記エストロゲン応答要素が形質転換細胞内で発現される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記エストロゲン応答要素と前記エストロゲン受容体の両方が、形質転換細胞内で発現される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記エストロゲン応答要素が前記細胞内で異種発現される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記エストロゲン応答要素と前記エストロゲン受容体の両方が、前記細胞内で異種発現される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が、ＥＲＥ制御遺伝子を用いて形質転換されたＵ９３７細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞及びＭＣＦ−７細胞からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞がＥＲαを発現する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞がＥＲβを発現する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＥＲＥ制御遺伝子がＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子の発現を抑制する方法であって、ＴＮＦ応答要素の制御下の遺伝子と、エストロゲン受容体とを含有する細胞に、前記ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子を抑制するのに有効な量の請求項１〜４のいずれか1項に記載の組成物を投与することからなる、方法。
【請求項５０】
前記ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子がＴＮＦ−αである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子がＴＮＦ  ＲＥ−Ｌｕｃである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞が生体外に存在する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞が生体内に存在する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞がＥＲ＋乳房組織内に存在する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞がＥＲα＋乳房組織内に存在する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞がＥＲβ＋乳房組織内に存在する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＴＮＦ応答要素が前記細胞内で内在発現される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＴＮＦ応答要素とエストロゲン受容体の両方が、前記細胞内で内在発現される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＴＮＦ応答要素が、前記細胞内で異種発現される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＴＮＦ応答要素と前記エストロゲン受容体の両方が、前記細胞内で異種発現される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が、エストロゲン受容体遺伝子を含有し、ＴＮＦ応答要素制御遺伝子を用いて形質転換され、且つＵ９３７細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞及びＭＣＦ−７細胞からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
前記エストロゲン受容体遺伝子が、ＥＲαを発現する遺伝子である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記エストロゲン受容体遺伝子が、ＥＲβを発現する遺伝子である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
カリコシンの製造方法であって、
（ａ）キバナオウギ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）の植物部分を低級アルキルエーテルの水溶液を用いて抽出し、
（ｂ）得られた抽出物を濃縮して前記低級アルキルエーテルを除去し、
（ｃ）得られた前記抽出物をヘキサン／酢酸エチルで連続的に分画し、
（ｄ）得られた酢酸画分を逆相クロマトグラフィーで分画し、
（ｅ）得られたＥＲβ活性画分をシリカゲルクロマトグラフィーで分画し、且つ
（ｆ）ＥＲβ活性画分を採取し、濃縮して精製カリコシンを産生することからなる、カリコシンの製造方法。
【請求項６５】
カリコシンの製造方法であって、
（ａ）１，３−ジヒドロキシベンゼンを４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸と反応させてデオキシベンゾインを形成し、且つ
（ｂ）デオキシベンゾインをメタノールと反応させてカリコシンを産生することからなる、カリコシンの製造方法。
【請求項６６】
前記（ａ）を、還流下、ＢＦ３の存在下で、場合によりＥｔ２Ｏの存在下で、又は両方の存在下で行う、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記（ｂ）を、（ｉ）ＢＦ３及び／又はＥｔ２Ｏ、（ｉｉ）Ｎ，Ｎ´−ジメチル（クロロメチレン）アンモニウムクロリド、及び／又は（ｉｉｉ）ＨＣｌの存在下で行う、請求項６５又は６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）介在疾患を治療する医薬を製造するためにカリコシン及びその類似物質を使用する方法に関する。本発明はまた、ＥＲβ介在疾患を治療するためのカリコシン及びその類似物質を使用する方法に関する。
（相互参照及び優先権主張）
【０００２】
本出願は、米国特許法３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で２００８年４月１４日付け出願の米国特許仮出願第６１／０４４，８８０号及び２００８年６月６日付け出願の米国特許仮出願第６１／０５９，６７５号の優先権の利益を主張する。これらの米国特許仮出願のそれぞれは、その全体を参照することにより本明細書において援用される。
【背景技術】
【０００３】
ホルモン補充療法（ＨＲＴ）は、種々様々な疾患、例えば骨粗鬆症、閉経後の女性の心臓血管疾患のリスクの上昇並びに更年期症状、例えばほてり、性欲減退及びうつ病を治療するのに首尾よく使用されている。しかし、エストラジオール（Ｅ２）を単独で用いるか又はプロゲスチンと組み合わせて用いるＨＲＴは、望ましくない効果をもたらすことがある。実際に、最近のウィメンズ・ヘルス・イニシアチブ〔Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＷＨＩ）〕試験が、予備段階の結果がＨＲＴは乳癌の３５％のリスク上昇に関連していることを示した際に、突然に中止された。
【０００４】
乳癌は、いわゆる選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェンを使用することによって治療又は予防できる。（タモキシフェンの承認前は、閉経前の女性の乳癌治療は、多くの場合、エストロゲンの癌刺激作用を低下させるために卵巣を摘出することを含んでいた。）タモキシフェンは、閉経前の女性の乳房組織においてエストロゲンの癌誘発作用を選択的に阻害すると思われる。別のＳＥＲＭであるラロキシフェンは、エストロゲン補充の代替として骨粗鬆症の治療について承認されている。また、ラロキシフェンの長期投与は、骨組織でエストロゲン作用を選択的に誘導する他に、ラロキシフェン評価の多様効果〔Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＭＯＲＥ）〕試験において乳癌の罹患率の減少に関連することも明らかにされている。
【０００５】
ＳＥＲＭ、例えばタモキシフェン及びラロキシフェンは、乳房においてエストロゲンの癌誘発作用の選択的低下を提供するが、これらはリスクがないわけではない。例えば、タモキシフェン療法及びラロキシフェン療法の両方は、ほてりの発生率の上昇に関連しており、またタモキシフェン療法は、子宮（子宮内膜）癌のリスクを上昇させることが明らかにされている。
【０００６】
骨粗鬆症、冠動脈性心疾患及び更年期症状の治療でのエストロゲン補充療法の成功、並びに乳癌及び骨粗鬆症の治療でのタモキシフェン及びラロキシフェンのようなＳＥＲＭの成功にもかかわらず、エストロゲン特性を有する組成物の必要性が未だにある。さらに、薬剤化合物を製造するコストの上昇を考慮に入れると、おそらく天然源から得られるであろうさらなるエストロゲン組成物の必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、エストロゲン受容体に関連した１つ又はそれ以上の病状の治療に有用なエストロゲン組成物の必要性を確認した。また、本発明者は、前記組成物を投与された患者がエストロゲン受容体に関連した別の病状を患うリスク又は可能性を上昇させないエストロゲン組成物の必要性も確認している。本発明者は、同様に、１つ又はそれ以上のエストロゲン受容体介在疾患のリスクを減らし、さらに同時に別のエストロゲン受容体介在疾患を治療するエストロゲン組成物の必要性を認識している。本発明者はまた、天然源から容易に得られるエストロゲン組成物の必要性、及びこのようなエストロゲン組成物を調製する方法及び使用する方法の必要性も確認している。本明細書の開示は、このような必要性を満たし、また関連した利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、幾つかの実施形態は、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）を調節するのに十分な量の化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）：
【化１】
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の１つ又はそれ以上を含有する医薬組成物を提供する。
【０００９】
幾つかの実施形態において、前記組成物は、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の２つ又はそれ以上を含有する。幾つかの実施形態において、前記組成物は、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の３つ又はそれ以上を含有する。幾つかの実施形態において、前記組成物は、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれを含有する。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれは、高極性であり、従って水性媒体によく溶解すると考えられ、それぞれは、塩を形成するために1つ又はそれ以上のイオンと一緒に存在し得ることが理解されるべきである。本明細書において特に明記しない限りは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）に対する全ての言及は、塩の形態を包含することを意図する。本発明はまた、医薬の製造における、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）の使用を提供する。特に、医薬は、エストロゲン受容体βアゴニスト作用を有する。幾つかの実施形態において、医薬は、選択的エストロゲン受容体βアゴニスト作用を有する。具体的実施形態において、医薬は、エストロゲン受容体αをアンタゴナイズするか、あるいはエストロゲン受容体αに対して測定可能な作用をほとんど又は全く有していない。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防すること、骨粗鬆症を治療又は予防すること、子宮癌を治療又は予防すること、及び心臓血管疾患を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの作用である。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、ほてり、不眠症、膣乾燥、性欲減退、尿失禁及びうつ病を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、骨粗鬆症を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、ほてりを治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、子宮癌又は乳癌を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを上昇させることを含まない。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを低下させることを含む。幾つかの実施形態において、前記組成物は、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）の１つ又はそれ以上を約１ｍｇ〜約１００ｇ含有する。従って、本発明は、医薬を製造するための（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）の１つ又はそれ以上の使用を提供する。幾つかの実施形態において、前記医薬は、ヒト患者においてエストロゲン受容体介在疾患の治療を意図する。幾つかの具体的な実施形態において、前記疾患に介在するエストロゲン受容体は、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）である。
【００１０】
また、患者においてエストロゲン作用を誘発させる方法であって、前記患者に、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）を調節するのに十分な量であるエストロゲン有効量の、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）：
【化２】
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の１つ又はそれ以上を含有する組成物を投与することからなる、方法が提供される。
【００１１】
幾つかの実施形態において、前記組成物は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の２つ又はそれ以上を含有する。幾つかの実施形態において、前記組成物は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）の３つ又はそれ以上を含有する。幾つかの実施形態において、前記組成物は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれを含有する。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防すること、骨粗鬆症を治療又は予防すること、子宮癌を治療又は予防すること、及び心臓血管疾患を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの作用である。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、ほてり、不眠症、膣乾燥、性欲減退、尿失禁及びうつ病を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、骨粗鬆症を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、ほてりを治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、子宮癌を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを上昇させることを含まない。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを低下させることを含む。幾つかの実施形態において、前記組成物は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）の１つ又はそれ以上を約１ｍｇ〜約１００ｇ含有する。
【００１２】
本明細書に記載のように、幾つかの実施形態において、前記組成物は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の２つ又はそれ以上、３つ又はそれ以上、あるいは４つ全部を含有する。幾つかの実施形態は、医薬を製造するためのこのような組成物の使用を提供する。特に、本明細書に記載の組成物又は医薬は、エストロゲン受容体βアゴニスト作用を有する。幾つかの実施形態において、前記の組成物又は医薬は、選択的エストロゲン受容体βアゴニスト作用を有する。幾つかの実施形態において、前記の組成物又は医薬は、エストロゲン受容体αをアンタゴナイズするか、あるいはエストロゲン受容体αに対して測定可能な作用をほとんど又は全く有していない。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防すること、骨粗鬆症を治療又は予防すること、子宮癌を治療又は予防すること、及び心臓血管疾患を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの作用である。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、ほてり、不眠症、膣乾燥、性欲減退、尿失禁及びうつ病を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、骨粗鬆症を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、ほてりを治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、子宮癌又は乳癌を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを上昇させることを含まない。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを低下させることを含む。幾つかの実施形態は、医薬を製造するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
【００１３】
本明細書に記載の幾つかの実施形態は、エストロゲン応答要素の制御下で遺伝子を活性化させる方法であって、前記遺伝子に作用するように連結されたエストロゲン応答要素と、エストロゲン受容体とを有する細胞に、前記遺伝子を活性化させるのに十分な量の本明細書に記載の組成物を投与することからなる、方法を提供する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、生体外に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、生体内に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲα＋乳房組織内に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲβ＋乳房組織内に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲα／ＥＲβ＋乳房組織内に存在する。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン応答要素は、形質転換細胞内で発現される。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン応答要素と前記エストロゲン受容体は、形質転換細胞内で発現される。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン応答要素は、前記細胞内で異種発現される。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン応答要素と前記エストロゲン受容体は、前記細胞内で異種発現される。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲＥ制御遺伝子を用いて形質転換されたＵ９３７細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞及びＭＣＦ−７細胞からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲαを発現する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲβを発現する。幾つかの実施形態において、前記ＥＲＥ制御遺伝子は、ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃである。
【００１４】
本明細書に記載の幾つかの実施形態は、ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子の発現を抑制する方法であって、ＴＮＦ応答要素の制御下の遺伝子とエストロゲン受容体を含有する細胞に、前記ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子を抑制するのに有効な量の本明細書に記載の組成物を投与することからなる、方法を提供する。幾つかの実施形態において、ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子は、ＴＮＦ−αである。幾つかの実施形態において、前記ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子は、ＴＮＦ  ＲＥ−Ｌｕｃである。幾つかの実施形態において、前記細胞は、生体外に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、生体内に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲ＋乳房組織内に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲα＋乳房組織内に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲβ＋乳房組織内に存在する。幾つかの実施形態において、前記ＴＮＦ応答要素は、前記細胞内で内在発現される。幾つかの実施形態において、前記ＴＮＦ応答要素とエストロゲン受容体の両方は、前記細胞内で内在発現される。幾つかの実施形態において、前記ＴＮＦ応答要素は、前記細胞内で異種発現される。幾つかの実施形態において、前記ＴＮＦ応答要素と前記エストロゲン受容体の両方は、前記細胞内で異種発現される。幾つかの実施形態において、前記細胞は、エストロゲン受容体遺伝子を含有し、ＴＮＦ応答要素制御遺伝子を用いて形質転換され、且つＵ９３７細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞及びＭＣＦ−７細胞からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン受容体遺伝子は、ＥＲαを発現する遺伝子である。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン受容体遺伝子は、ＥＲβを発現する遺伝子である。
【００１５】
本明細書に記載の幾つかの実施形態は、カリコシンの製造方法であって、
（ａ）キバナオウギ（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）の植物部分を低級アルキルエーテルの水溶液を用いて抽出し、
（ｂ）得られた抽出物を濃縮して低級アルキルエーテルを除去し、
（ｃ）得られた抽出物をヘキサン／酢酸エチルで連続的に分画し、
（ｄ）得られた酢酸画分を逆相クロマトグラフィーで分画し、
（ｅ）得られたＥＲβ活性画分をシリカゲルクロマトグラフィーで分画し、且つ
（ｆ）ＥＲβ活性画分を採取し、濃縮して精製カリコシンを産生することからなる、製造方法を提供する。
（ｇ）本明細書に記載の幾つかの実施形態は、カリコシンの製造方法であって、
（ｈ）１，３−ジヒドロキシベンゼンを４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸と反応させてデオキシベンゾインを形成し、且つ
（ｉ）デオキシベンゾインをメタノールと反応させてカリコシンを産生することからなる、製造方法を提供する。
【００１６】
文献の援用
本明細書に述べた全ての刊行物及び特許出願は、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出願が参照することにより援用されることが具体的に及び個々に示されているかのように同じ程度に参照することより本明細書において援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の新規な特徴を、特に添付の特許請求の範囲に記載する。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的実施形態を示す以下の詳細な説明、及び以下の添付図面を参照することにより得られるであろう。
【図１】エストロゲン受容体α（ＥＲα）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）のいずれか又はその両方の存在下でのエストラジオール（Ｅ２）の濃度変化に応じた、最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターと、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする配列とに連結されたエストロゲン応答要素をコードするＤＮＡを用いて形質転換されたＵ９３７（ヒト単球）細胞でのルシフェラーゼ発現のグラフである。ＥＲβは、Ｅ２の存在下で、ＥＲＥに対してＥＲαよりもはるかに小さい刺激効果を有する。
【図２】エストロゲン受容体α（ＥＲα）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）のいずれか又はその両方の存在下でのエストラジオール（Ｅ２）の濃度の変化に応じた、最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターと、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする配列とに連結されたエストロゲン応答要素をコードするＤＮＡを用いて形質転換されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ヒト転移性乳癌）細胞でのルシフェラーゼ発現のグラフである。ＥＲβは、Ｅ２の存在下で、ＥＲＥに対してＥＲαよりもはるかに小さい刺激効果を有する。意外にも、ＥＲαとＥＲβがこの細胞株で同時発現されると、ＥＲβの発現は、Ｅ２の存在下でＥＲαのＥＲＥ刺激効果を大きく低下させる。
【図３ａ】エストロゲン受容体α（ＥＲα）又はエストロゲン受容体β（ＥＲβ）のいずれかの存在下でのカリコシン（化合物「（ｄ）」）の濃度変化に応じた、最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターと、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする配列とに連結されたエストロゲン応答要素αをコードするＤＮＡを用いて形質転換された細胞でのルシフェラーゼの発現を比較するグラフである。ＥＲαに対してＥＲβの存在下でのルシフェラーゼの高められた発現は、カリコシンが選択的エストロゲン受容体βアゴニストであることを実証している。
【図３ｂ】エストロゲン受容体α（ＥＲα）又はエストロゲン受容体β（ＥＲβ）のいずれかの存在下でのＣＲ０１−１５８−１（化合物「（ｂ）」）の濃度変化に応じた、最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターと、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする配列とに連結されたエストロゲン応答要素αをコードするＤＮＡを用いて形質転換された細胞でのルシフェラーゼの発現を比較するグラフである。ＥＲαに対してＥＲβの存在下でのルシフェラーゼの高められた発現は、カリコシンが選択的エストロゲン受容体βアゴニストであることを実証している。
【図３ｃ】エストロゲン受容体α（ＥＲα）又はエストロゲン受容体β（ＥＲβ）のいずれかの存在下でのＣＲ０２−１６７−１（化合物「（ｃ）」）の濃度変化に応じた、最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターと、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする配列とに連結されたエストロゲン応答要素αをコードするＤＮＡを用いて形質転換された細胞でのルシフェラーゼの発現を比較するグラフである。ＥＲαに対してＥＲβの存在下でのルシフェラーゼの高められた発現は、カリコシンが選択的エストロゲン受容体βアゴニストであることを実証している。
【図３ｄ】エストロゲン受容体α（ＥＲα）又はエストロゲン受容体β（ＥＲβ）のいずれかの存在下でのＣＲ０１−１１１−１（化合物「（ａ）」）の濃度変化に応じた、最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターと、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする配列とに連結されたエストロゲン応答要素αをコードするＤＮＡを用いて形質転換された細胞でのルシフェラーゼの発現を比較するグラフである。ＥＲαに対してＥＲβの存在下でのルシフェラーゼの高められた発現は、カリコシンが選択的エストロゲン受容体βアゴニストであることを実証している。
【図３ｅ】エストロゲン受容体α（ＥＲα）又はエストロゲン受容体β（ＥＲβ）のいずれかの存在下でのカリコシン（化合物「（ｄ）」）の濃度変化に応じた、最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターと、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする配列とに連結されたエストロゲン応答要素αをコードするＤＮＡを用いて形質転換された細胞でのルシフェラーゼの発現を比較するグラフである。ＥＲαに対してＥＲβの存在下でのルシフェラーゼの高められた発現は、カリコシンが選択的エストロゲン受容体βアゴニストであることを実証している。
【図４ａ】エストロゲン受容体β（ＥＲβ）の存在下でのＣＲ０１−１５８−１＋ＥｔＯＨ、ＣＲ０１−１５８−１＋ラロキシフェン、ＣＲ０１−１５８−１＋タモキシフェン、及びＣＲ０１−１５８−１＋エストラジオール（Ｅ２）に応じた、最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターと、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする配列とに連結されたエストロゲン応答要素αをコードするＤＮＡを用いて形質転換された細胞でのルシフェラーゼの発現を比較する。
【図４ｂ】エストロゲン受容体β（ＥＲβ）の存在下でのＣＲ０１−１６７−１＋ＥｔＯＨ、ＣＲ０１−１６７−１＋ラロキシフェン、ＣＲ０１−１６７−１＋タモキシフェン、及びＣＲ０１−１６７−１＋エストラジオール（Ｅ２）に応じた、最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターと、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする配列とに連結されたエストロゲン応答要素αをコードするＤＮＡを用いて形質転換された細胞でのルシフェラーゼの発現を比較する。
【図４ｃ】エストロゲン受容体β（ＥＲβ）の存在下でのＣＲ０１−１７２−１＋ＥｔＯＨ、ＣＲ０１−１７２−１＋ラロキシフェン、ＣＲ０１−１７２−１＋タモキシフェン及びＣＲ０１−１７２−１＋エストラジオール（Ｅ２）に応じた、最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターと、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする配列とに連結されたエストロゲン応答要素αをコードするＤＮＡを用いて形質転換された細胞でのルシフェラーゼの発現を比較する。（ＣＲ０１−１７２−１は、本明細書においてカリコシンともいう。）
【図４ｄ】エストロゲン受容体β（ＥＲβ）の存在下でのＣＲ０１−１１１−１＋ＥｔＯＨ、ＣＲ０１−１１１−１＋ラロキシフェン、ＣＲ０１−１１１−１＋タモキシフェン、及びＣＲ０１−１１１−１＋エストラジオール（Ｅ２）に応じた、最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターと、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする配列とに連結されたエストロゲン応答要素αをコードするＤＮＡを用いて形質転換された細胞でのルシフェラーゼの発現を比較する。（ＣＲ０１−１１１−１は、本明細書においてキセノグノシン（ｘｅｎｏｇｎｏｓｉｎ）ともいう。）
【図５】ＭＣＦ−７乳癌細胞の腎被膜異種移植片に対するエストラジオール（Ｅ２）、カリコシン及び対照（担体）の効果の比較を表す。ＭＣＦ−７異種移植片をヌードマウスの腎臓に導入した。マウスを３つの処置群に無作為に割り当てた。エストラジオール群には、生理食塩水中のＥ２を０．５ｍｇ／ｈ投与し、カリコシン群には、生理食塩水中のカリコシンを２．５ｍｇ／ｈ投与し、対照群には、生理食塩水のみを投与した。それぞれの処置群を２８日間処置し、その後にマウスを安楽死させ、前記異種移植片を含んでいる腎臓を切除し、写真に撮り、秤量した。認めることができるように、エストラジオールは、対照と比べて腫瘍異種移植片の増殖をアゴナイズし、これに対してカリコシンは、ＭＣＦ−７乳癌異種移植片の増殖を阻止する。
【図６】生体内での子宮重量に対するＥ２、カリコシン及び対照の効果の比較を表す。雌性ヌードマウスをＥ２で処置した。マウスは、３つの処置群に無作為に割り当てた。エストラジオール群には、生理食塩水中のＥ２を０．５ｍｇ／ｈ投与し、カリコシン群には、生理食塩水中のカリコシンを２．５ｍｇ／ｈ投与し、対照群には、生理食塩水のみを投与した。２８日後に、それぞれのマウスを安楽死させ、その子宮を取り出し、秤量した。認めることができるように、対照と比べて、Ｅ２は、子宮の増殖をアゴナイズし、これに対してカリコシンは、反対の効果を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本明細書に開示の実施形態は、医薬組成物であって、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）を調節するのに十分な量の、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）：
【化３】
2011516583.tif 000005
からなる群の少なくとも１つが単離され、精製された構成要素を含有する医薬組成物を提供する。
【００１９】
幾つかの実施形態において、前記組成物は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の２つ又はそれ以上、３つ又はそれ以上、あるいは４つ全部を含有する。幾つかの実施形態は、医薬を製造するためのこのような組成物の使用を提供する。特に、本明細書に記載の組成物又は医薬は、エストロゲン受容体βアゴニスト作用を有する。幾つかの実施形態において、前記の組成物又は医薬は、選択的エストロゲン受容体βアゴニスト作用を有する。幾つかの実施形態において、前記の組成物又は医薬は、エストロゲン受容体αをアンタゴナイズするか、あるいはエストロゲン受容体αに対して測定可能な作用をほとんど又は全く有していない。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防すること、骨粗鬆症を治療又は予防すること、子宮癌を治療又は予防すること、及び心臓血管疾患を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの作用である。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、ほてり、不眠症、膣乾燥、性欲減退、尿失禁及びうつ病を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、骨粗鬆症を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、ほてりを治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、子宮癌又は乳癌を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを上昇させることを含まない。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを低下させることを含む。幾つかの実施形態は、医薬を製造するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
【００２０】
本明細書に記載の幾つかの実施形態は、エストロゲン作用を誘発させる方法であって、被検体に、多細胞生物においてエストロゲン受容体β（ＥＲβ）を調節するのに十分な量であるエストロゲン有効量の、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）：
【化４】
2011516583.tif 000006
からなる群の少なくとも１つが単離され、精製された構成要素を含有する組成物を投与することからなる、方法が提供される。
【００２１】
幾つかの実施形態において、前記組成物は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の２つ又はそれ以上、３つ又はそれ以上、あるいは４つ全部を含有する。幾つかの実施形態は、医薬を製造するためのこのような組成物の使用を提供する。特に、本明細書に記載の組成物又は医薬は、エストロゲン受容体βアゴニスト作用を有する。幾つかの実施形態において、前記の組成物又は医薬は、選択的エストロゲン受容体βアゴニスト作用を有する。幾つかの実施形態において、前記の組成物又は医薬は、エストロゲン受容体αをアンタゴナイズするか、あるいはエストロゲン受容体αに対して測定可能な作用をほとんど又は全く有していない。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防すること、骨粗鬆症を治療又は予防すること、子宮癌を治療又は予防すること、及び心臓血管疾患を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの作用である。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、ほてり、不眠症、膣乾燥、性欲減退、尿失禁及びうつ病を治療又は予防することからなる群から選択される少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、骨粗鬆症を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、ほてりを治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、子宮癌又は乳癌を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを上昇させることを含まない。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン作用は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを低下させることを含む。幾つかの実施形態は、医薬を製造するための本明細書に記載の組成物の使用を提供する。
【００２２】
本明細書に記載の幾つかの実施形態は、エストロゲン応答要素の制御下で遺伝子を活性化させる方法であって、前記遺伝子に作用するように連結されたエストロゲン応答要素と、エストロゲン受容体とを有する細胞に、前記遺伝子を活性化させるのに十分な量の本明細書に記載の組成物を投与することからなる、方法を提供する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、生体外に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、生体内に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲα＋乳房組織内に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲβ＋乳房組織内に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲα／ＥＲβ＋乳房組織内に存在する。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン応答要素は、形質転換細胞内で発現される。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン応答要素と前記エストロゲン受容体は、形質転換細胞内で発現される。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン応答要素は、前記細胞内で異種発現される。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン応答要素と前記エストロゲン受容体は、前記細胞内で異種発現される。幾つかの実施形態において、細胞は、ＥＲＥ制御遺伝子を用いて形質転換されたＵ９３７細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞及びＭＣＦ−７細胞からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲαを発現する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲβを発現する。幾つかの実施形態において、前記ＥＲＥ制御遺伝子は、ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃである。
【００２３】
本明細書に記載の幾つかの実施形態は、ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子の発現を抑制する方法であって、ＴＮＦ応答要素の制御下の遺伝子と、エストロゲン受容体とを含有する細胞に、前記ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子を抑制するのに有効な量の本明細書に記載の組成物を投与することからなる、方法を提供する。幾つかの実施形態において、ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子は、ＴＮＦ−αである。幾つかの実施形態において、前記ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子は、ＴＮＦ  ＲＥ−Ｌｕｃである。幾つかの実施形態において、前記細胞は、生体外に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、生体内に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲ＋乳房組織内に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲα＋乳房組織内に存在する。幾つかの実施形態において、前記細胞は、ＥＲβ＋乳房組織内に存在する。幾つかの実施形態において、前記ＴＮＦ応答要素は、前記細胞内で内在発現される。幾つかの実施形態において、前記ＴＮＦ応答要素とエストロゲン受容体の両方は、前記細胞内で内在発現される。幾つかの実施形態において、前記ＴＮＦ応答要素は、前記細胞内で異種発現される。幾つかの実施形態において、前記ＴＮＦ応答要素と前記エストロゲン受容体の両方は、前記細胞内で異種発現される。幾つかの実施形態において、前記細胞は、エストロゲン受容体遺伝子を含有し、ＴＮＦ応答要素制御遺伝子を用いて形質転換され、且つＵ９３７細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞及びＭＣＦ−７細胞からなる群から選択される。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン受容体遺伝子は、ＥＲαを発現する遺伝子である。幾つかの実施形態において、前記エストロゲン受容体遺伝子は、ＥＲβを発現する遺伝子である。
【００２４】
本明細書に記載の幾つかの実施形態は、カリコシンの製造方法であって、
（ａ）キバナオウギの植物部分を低級アルキルエーテルの水溶液を用いて抽出し、
（ｂ）得られた抽出物を濃縮して低級アルキルエーテルを除去し、
（ｃ）得られた抽出物をヘキサン／酢酸エチルで連続的に分画し、
（ｄ）得られた酢酸画分を逆相クロマトグラフィーで分画し、
（ｅ）得られたＥＲβ活性画分をシリカゲルクロマトグラフィーで分画し、且つ
（ｆ）ＥＲβ活性画分を採取し、濃縮して精製カリコシンを産生することからなる、製造方法を提供する。
【００２５】
本明細書に記載の幾つかの実施形態は、カリコシンの製造方法であって、
（ａ）１，３−ジヒドロキシベンゼンを４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸と反応させてデオキシベンゾインを形成し、且つ（ｂ）デオキシベンゾインをメタノールと反応させてカリコシンを産生することからなる、製造方法を提供する。
【００２６】
幾つかの実施形態において、前記（ａ）は、還流下で、ＢＦ３の存在下で、場合によりＥｔ２Ｏの存在下で、又は両方の存在下で行う。幾つかの実施形態において、前記（ｂ）は、（ｉ）ＢＦ３及び／又はＥｔ２Ｏ、（ｉｉ）Ｎ，Ｎ´−ジメチル（クロロメチレン）アンモニウムクロリド、及び／又は（ｉｉｉ）ＨＣｌの存在下で行う。
【００２７】
乳房新生物は、女性において診断される最も一般的な癌である。２０００年には、１８４，０００件の乳癌の新しい症例が診断され、４５，０００人の女性が乳癌で亡くなった。乳癌の原因はおそらくは多数の因子によると思われるが、エストロゲン類が乳癌を促進していることを示唆する切実な臨床的、疫学的及び生物学的な研究が存在する：（ａ）ホルモン補充療法（ＨＲＴ）は、５１例の研究のメタ分析により乳癌のリスクの３５％上昇に関連している、（ｂ）乳癌は、タモキシフェン又はラロキシフェン（これらは、ＥＲに結合し、乳房細胞におけるエストロゲン類の作用に拮抗する）によって予防することができる、（ｃ）乳癌を患う閉経前の女性の両側の卵巣摘出は、生存率の上昇をもたらす、（ｄ）エストロゲン類に対する曝露が多いほど（早い初潮又は遅い閉経、それぞれ相対リスク＝１．３及び１．５〜２．０である）乳癌の発症率を上昇させる、（ｅ）エストロゲン類は、ＥＲ陽性の乳癌細胞の増殖を増大させる、及び（ｆ）エストロゲン類は、増殖促進遺伝子、例えばサイクリンＤ１、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓの産生を高める。
【００２８】
乳房腫瘍の約６０〜７０％は、エストロゲン受容体を含んでいる。この数十年間、乳房腫瘍は、ＥＲの存在について分析されている。ＥＲ＋腫瘍の約７０％は、抗エストロゲン療法に反応する。この観察は、ＥＲ＋腫瘍が、ＥＲ陰性腫瘍よりもより良い予後を有するという見解をもたらしている。しかし、ＥＲβの発見は、これらの解釈を複雑にし、幾つかの重要な臨床上の問題を提起している。ＥＲαとＥＲβの役割を理解することは、最も重要である。なぜならば、腫瘍がＥＲ＋であるか否かを決定する現在の方法は、ＥＲαのみを検出する抗体を使用しているからである。従って、臨床結果に対する乳房腫瘍におけるＥＲの効果を調べる研究の大部分は、ＥＲαの状態のみを反映している。しかし、幾つかの最近の研究は、ヒト乳房腫瘍中のＥＲβ  ｍＲＮＡの存在を検出している。これらの研究の大部分は、ＥＲβに対する特異的で感受性の抗体がないことから、ＥＲβを測定するのにＲＴ−ＰＣＲに依存している。Ｄｏｔｚｌａｗらは、ＲＴ−ＰＣＲで乳房腫瘍生検内のＥＲβを最初に検出した。彼らは、乳房腫瘍の７０％がＥＲβを発現し、９０％がＥＲαを発現することを見出した。また、彼らは、数種のＥＲ陰性細胞株もまた、ＥＲβ  ｍＲＮＡを発現することも実証した。これらの発見は、ＥＲβが乳房腫瘍で高度に発現されること、及びＥＲαとＥＲβの両方が多数の腫瘍で同時に発現されることが多いことを示唆する。実際に、幾つかのＥＲ腫瘍は、ＥＲβを含んでいる。Ｄｏｔｚｌａｗらはまた、ＥＲβ  ｍＲＮＡが、ＥＲ＋／ＰＲ＋腫瘍と比べてＥＲ＋／ＰＲ−（ＰＲは、プロゲスチン受容体である）腫瘍において著しく少ないことも明らかにした。この著者らは、ＥＲ＋／ＰＲ＋腫瘍はおそらくタモキシフェンに反応すると思われることから、この観察結果は、ＥＲβの発現が予後不良に関連することを示すことを示唆した。他の研究は、ＥＲβの存在が予後不良に関連することを示唆している。Ｓｐｅｉｒｓらは、大部分の乳房腫瘍がＥＲβ  ｍＲＮＡを単独で発現するか又はＥＲα  ｍＲＮＡと一緒に発現することを見出した。ＥＲα  ｍＲＮＡとＥＲβ  ｍＲＮＡの両方を発現するこれらの腫瘍は、陽性リンパ節に関連し、より高いグレードの腫瘍として特徴付けられる傾向にあった。また、高められたＥＲβの発現は、化学発癌物質で処理されたＭＣＦ−１０Ｆ細胞で生じ、ＥＲβの発現が乳癌の開始と進行に寄与するであろうということを示唆している。最近、Ｊｅｎｓｅｎらは、免疫組織化学（ＩＨＣ）により２９種の浸潤性乳房腫瘍でＥＲβの発現を分析した。彼らは、ＥＲβの発現が細胞増殖の特異的マーカーであるＫｉ６７及びサイクリンＡの上昇に関連していることを見出した。さらに、これらの増殖マーカーの最も高い発現は、ＥＲα＋／ＥＲβ＋腫瘍に存在した。ＥＲα−／ＥＲβ＋の症例の数は極めて少なかった（ｎ＝７）が、この著者らは、ＥＲβが乳房腫瘍における細胞増殖に介在することを示唆した。Ｓｐｅｉｒｓらはまた、ＥＲβ  ｍＲＮＡが、タモキシフェン感受性腫瘍に比べてタモキシフェン耐性腫瘍において著しく高められることを報告した。
【００２９】
それに比べて、他の研究は、ＥＲβの存在が良好な予後を与えることを示している。Ｉｗａｏらは、乳房腫瘍が前浸潤腫瘍から浸潤腫瘍に進行するにつれて、ＥＲα  ｍＲＮＡがアップレギュートされ、ＥＲβ  ｍＲＮＡがダウンレギュレートされることを実証した。Ｊａｒｖｉｎｅｎらは、凍結腫瘍切片のＩＨＣを使用して、ＥＲβの発現が陰性腋窩リンパ節状態、低グレード及び低Ｓ期分画に関連していることを見出した。Ｏｍｏｔｏらによる研究もまた、ＥＲβ陽性腫瘍は、無病生存率がＥＲβを含有する腫瘍でより高かったことから、ＥＲβ陰性腫瘍よりも良い予後と相関することを見出した。ＥＲβ発現はまた、プロゲステロン受容体の存在及び高分化型乳房腫瘍と強い関連性を示した。また、ＥＲβの量は正常な乳房組織で最も高いこと及びＥＲβの量は腫瘍が前癌病変から癌病変に進行するのにつれて減少することが報告されている。これらの研究は、ＥＲβが腫瘍抑制因子として機能し得ること及びＥＲβの量の低下（ｌｏｓｓ）が乳癌発症を促進することを示している。Ｍａｎｎらによる研究において、１０％を超える癌細胞でのＥＲβの発現は、タモキシフェンを用いて治療された女性のよりよい生存率に関連していることが明らかにされた。これらの研究結果を総合すると、ＥＲβの存在は好ましい予後を与えることを示している。ＲＴ−ＰＣＲとＩＨＣのデータの一致は、ＥＲβのアデノウィルス介在発現が、ＥＲ陰性細胞株  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の増殖のリガンド非依存阻害をもたらすことを明らかにした報告である。
【００３０】
これらの結果は、乳癌の病因及び予後におけるＥＲβの役割が明らかでないことを示す。幾つかの理由により、これらの研究の中での明らかな矛盾を説明し得る。第一は、ＥＲβ  ｍＲＮＡとＥＲβタンパク質との間に弱い相関関係が存在し得ることである。この考えは、リガンド結合アッセイによって検出できるＥＲを有していない幾つかのＥＲ陰性細胞株でのＥＲβ  ｍＲＮＡの存在と一致している。第二は、ＩＨＣ研究は、特異性及び感受性について十分に特徴付けられていない種々の市販のＥＲβ抗体を用いたことである。第三は、結論の大部分は、数例の乳癌症例に基づいていることである。明らかに、より多くの研究が、乳癌におけるＥＲαとＥＲβの役割を明らかにするために必要とされる。
【００３１】
乳癌の補助療法及び予防的化学療法としてのＳＥＲＭの役割：エストロゲン類は乳癌細胞の増殖を促進することから、数種の治療アプローチが、この乳房腫瘍に対するエストロゲン類の作用を阻止するために実施されている。卵巣切除、抗エストロゲン類、性腺刺激ホルモン放出ホルモン類似体又はアロマターゼ阻害剤を含むこれらの方法は、エストロゲン類の産生を低下させるか又はエストロゲン類の作用を阻止することによって機能する。これらの方法の全てが、ＥＲαとＥＲβの両方の作用を非選択的に阻止する。乳房腫瘍を予防及び治療するために臨床使用される最も一般的なアプローチは、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）であるタモキシフェン及びラロキシフェンである。
【００３２】
タモキシフェンは、乳房などの幾つかの組織で拮抗作用を示すので、プロトタイプＳＥＲＭである非ステロイド性トリフェニルエチレン誘導体であるが、子宮内膜や骨などの他の組織では作動薬作用を有する。タモキシフェンは、エストロゲン受容体陽性乳癌を有する女性において乳房腫瘍の再発を減少させる補助療法としてその臨床有効性について鋭意研究されている。５年間のタモキシフェン治療は、再発のリスクを４２％低下させ、乳癌による死亡率を２２％低下させ、二次対側原発性乳房腫瘍を減少させる。ほぼ２／３のＥＲ陽性乳房腫瘍がタモキシフェンに反応し、これに対してＥＲ陰性腫瘍を有する女性が補助タモキシフェンによる恩恵を受けることを示す証拠はほんのわずかである。ごく最近、米国乳癌予防試験（ＢＣＰＴ）は、タモキシフェンが乳癌について高いリスクにあると考えられる女性において原発性浸潤乳癌のリスクを４９％低下させることを実証した。これらの研究は、タモキシフェンが乳癌の履歴をもつ女性において第一の有効な補助療法であり、乳癌の発症について高リスクである女性のための有効な化学予防薬であることを実証している。
【００３３】
ラロキシフェンは、近年骨粗鬆症の予防及び治療について最近承認されているベンゾチオフェン類のＳＥＲＭのメンバーである。ラロキシフェンは、乳癌を患う女性用の補助療法としての有効性についてはまだ評価されていない。しかし、ラロキシフェンの多様効果〔Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＭＯＲＥ）〕試験は、乳癌の予防に対するラロキシフェンの効果を評価した。ＭＯＲＥ試験は、骨粗鬆症を患う７７０５人の閉経後の女性の３年間の無作為プラセボ対照試験であった。ＭＯＲＥ試験では、４０ヶ月間の中央値追跡期間の後に、プラセボを投与された２５７６人の女性の中に２７例の乳癌が見出されたのに対して、ラロキシフェン治療群の５１２９人の女性の中に１３例の乳癌が見出された（ＲＲ＝０．２４）。タモキシフェンと同様、ラロキシフェンは、エストロゲン受容体陽性腫瘍の発生率の減少において有効であるが、エストロゲン受容体陰性腫瘍の発生率の減少においては有効ではない。乳癌の促進におけるエストロゲン類の役割についてさらなる証拠は、ラロキシフェンは検出可能な量の血清エストラジオールを有する閉経後の女性の乳癌を予防するだけであることを示した最近の研究によってもたらされた。
【００３４】
エストロゲン受容体の構造：ＳＥＲＭがＥＲ陽性腫瘍に作用するだけであるという事実は、その保護作用を乳房に対して発揮するためには、ＳＥＲＭがエストロゲン受容体と相互作用することが必要であることを示している。２つの公知のエストロゲン受容体、ＥＲα及びＥＲβが存在し、これらはステロイド核内受容体スーパーファミリーに属する。ＥＲαは、１９８６年に最初にクローン化され、驚くべきことに約１０年後に第二のＥＲが発見され、ＥＲβと命名された。ＥＲαは、５９５個のアミノ酸を含有し、これに対してＥＲβは、５３０個のアミノ酸を含有する。これら両方の受容体は、３つの異なるドメインからなるモジュールタンパク質である。アミノ末端ドメイン（Ａ／Ｂドメイン）は、最も小さい保存領域であり、ＥＲαとＥＲβの間で１５％の相同性を示すのみである。このドメインは、エストラジオール不存在下で遺伝子の転写活性をもたらすことができる活性化機能（ＡＦ−１）をもつ。ＥＲの中央領域は、標的遺伝子のプロモーター内に配置された３個のヌクレオチドで隔てられた逆転パリンドローム反復配列に結合する２つのジンクフィンガーモチーフを含有する。ＥＲαとＥＲβのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）は、実質的に同一であり、９５％の相同性を示す。カルボキシ末端ドメインは、幾つかの必須機能を遂行するリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含む。前記ＬＢＤはまた、エストロゲン化合物が結合する大きな疎水性ポケットを形成する領域と、ＥＲ二量化に関与する複数の領域とを含む。ＬＢＤはまた、同時制御タンパク質と相互作用する第二の活性化機能（ＡＦ−２）を含む。ＡＦ−２は、エストロゲン活性化と、遺伝子転写の抑制との両方に必要とされる。ＥＲαのＬＢＤと、ＥＲβのＬＢＤとは、約５５％の相同性しかない。ＥＲαのＬＢＤと、ＥＲβのＬＢＤとのアミノ酸組成の顕著な相違は、転写の役割を有するＥＲを作り出すために進化しているのかもしれない。これは、ＥＲαとＥＲβが異なる遺伝子の活性を調節すること及び異なる生理作用を生じることを可能にするであろう。この概念は、ＥＲα及びＥＲβノックアウトマウスの研究によって裏付けられる。例えば、ＥＲαノックアウトマウスは未発達な乳房及び子宮発達を有し、これに対してＥＲβノックアウトマウスは、正常な乳腺及び子宮を発達させる。これらの観察は、ＥＲαのみがこれらの組織の発達に必要であることを実証している。また、本発明者は、ＥＲαは活性化遺伝子においてＥＲβよりも有効であり、これに対してＥＲβは抑制遺伝子転写においてＥＲαよりも有効であることを見出した。
【００３５】
エストロゲン類の作用のメカニズム：エストロゲン類は、遺伝子転写を活性化するか又は抑制することができる。遺伝子転写の活性化には、２つの特徴付けられた経路、すなわち古典的なＥＲＥ（エストロゲン応答要素）経路とＡＰ−１経路がある。エストロゲン類が遺伝子の転写を調節するために必要な少なくとも３つの必須要素：ＥＲ類（ＥＲα及び／又はＥＲβ）、標的遺伝子のプロモーター要素、及び同時調節タンパク質がある。ＥＲに対するエストラジオールの結合は、立体構造の変化を招き、これが転写経路を開始する幾つかの重要な段階を結果としてもたらす。最初に、Ｅ２とＥＲとの相互作用が、シャペロンタンパク質の解離を招き、これが、ＥＲの二量化表面とＤＮＡ結合ドメインとを露出させる。シャペロンタンパク質の喪失は、ＥＲが二量化し、標的遺伝子のプロモーター領域のＥＲＥに結合することを可能にする。
【００３６】
次に、Ｅ２の結合は、ＥＲのＡＦ−２機能を構築する表面を作成するためにＥＲのＬＢＤのヘリックス１２を移動させる。ＡＦ−２は、ＥＲのヘリックス３、ヘリックス５及びヘリックス１２からなる保存された疎水性ポケットからなり、これらは一緒になってコアクチベータータンパク質（コアクチベーター）、例えばステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲＣ−１）又はグルココルチコイド受容体相互作用タンパク質１（ＧＲＩＰ  １）のｐ１６０ファミリーのための結合表面を形成する。コアクチベーター（「コレギュレーター」としても知られている）は、ＬＸＸＬＬからなる数個の反復アミノ酸モチーフ〔これは、複数のＡＦ−２ヘリックスによって囲まれた疎水性の割れ目（ｃｌｅｆｔ）に突き出る〕を含む。このコアクチベーターは、ヒストンアセチラーゼ活性を有する。遺伝子の活性化は、ＤＮＡに結合されたヒストンタンパク質のアセチル化を生じるＥＲＥ上でＥＲとコアクチベータータンパク質が複合体を形成した後に生じると考えられる。ヒストンのアセチル化は、ＥＲ／コレギュレーター複合体が、遺伝子転写を開始するために標的遺伝子のＴＡＴＡボックス領域で組み立てられる基本的な転写タンパク質とＥＲＥとの間で架橋を形成できるように、クロマチン構造を変化させる。
【００３７】
ＥＲＥ経路に対するＳＥＲＭの効果：エストロゲン類と異なり、ＳＥＲＭは、ＥＲＥ経路を活性化しない。その代わりに、ＳＥＲＭは、ＥＲＥ経路に対するエストロゲン類の作用を競合的に阻止する。エストロゲンのように、ＳＥＲＭは、ＥＲα及びＥＲβと高い親和性で結合し、シャペロンタンパク質の解離、ＥＲの二量化及びＥＲＥに対するＥＲの結合を生じる。従って、ＳＥＲＭの拮抗作用は、プロモーター領域に対するＥＲの結合よりも遠位の段階で生じる。ＳＥＲＭの拮抗作用の分子メカニズムは、ＥＲα及びＥＲβのＬＢＤの結晶化によって明らかにされている。Ｅ２、タモキシフェン及びラロキシフェンが同じ結合ポケットに結合することは、ＥＲのＬＢＤの構造から明らかである。しかし、タモキシフェンとラロキシフェンは、Ｅ２にはない嵩高な側鎖を含んでいる。ＥＲのＸ線構造は、ＳＥＲＭの嵩高な側鎖がＬＢＤの移動を阻止し、機能的ＡＦ−２表面の形成を防ぐことを明らかにしている。意外なことに、ＳＥＲＭがＥＲαと結合すると、ヘリックス１２の配列（ＬＸＸＭＬ）（これは、ＬＸＸＬＬモチーフに類似する）は、コアクチベーター認識部位を塞ぐためにＡＦ−２表面の疎水性の割れ目と相互作用する。従って、エストロゲンと異なり、ＳＥＲＭは、機能的なＡＦ−２表面を作らない。これが、コアクチベーターの結合を防ぐ。コアクチベータータンパク質はＳＥＲＭの存在下でＡＦ−２表面と結合しないので、活性化経路が不意に中断される。コアクチベーターを補充する代わりに、ＳＥＲＭと配位結合したＥＲは、コリプレッサー、例えばＮ−ＣｏＲを補充する。
【００３８】
これらの研究は、ＳＥＲＭの拮抗特性が少なくとも３つの因子によることを実証した。第一に、ＳＥＲＭは、エストロゲンと同じ結合ポケットに結合し、ＥＲに対するエストロゲンの結合を競合的に阻止する。第二に、ＳＥＲＭは、ＥＲがＥＲＥ経路の転写活性化に必要なコアクチベータータンパク質と相互作用するのを防ぐ。第三に、ＳＥＲＭは、遺伝子の転写活性化を妨げるコリプレッサーを補充する。ＳＥＲＭのこれらの作用は、ラロキシフェン及びタモキシフェンが乳癌の発症を阻止するために乳房細胞中で拮抗薬としてどのように作用するのかをおそらく最もよく説明している。
【００３９】
ＳＥＲＭはまた、ＡＰ−１要素を有する遺伝子の活性化においてＥ２よりも有効である。実際に、Ｅ２は、ＡＰ−１要素のＳＥＲＭ介在活性化の拮抗薬である。ＳＥＲＭが、組織、例えば骨や子宮内膜においてＡＰ−１経路を活性化することによって作動薬作用を示すと仮定される。興味深いことに、ＳＥＲＭは、ＥＲβの存在下でＡＰ−１経路の活性化においてより強力であり、このことはＳＥＲＭがＥＲβに富む組織でより効果的にＡＰ−１経路の引き金になることを示す。エストロゲン介在による乳癌発症におけるＡＰ−１経路の役割は明らかではない。なぜならば、エストロゲンは、ＳＥＲＭと比べてＡＰ−１経路の活性化においてかなり弱いからである。しかし、ＡＰ−１経路は、乳房腫瘍におけるタモキシフェン耐性に関与しているかもしれないことが提案されている。
【００４０】
本発明の態様に従って、ＥＲβがＥＲＥ−ｔｋＬｕｃの活性化においてＥＲαよりも弱いこと、ＥＲβがＴＮＦ−ＲＥ−ｔｋＬｕｃの抑制においてＥＲαよりも効果があること、及びＥＲβがＥＲＥ−ｔｋＬｕｃのＥＲα介在転写活性化を阻止することを実証する研究を行った。詳細な実験は、以下の実施例の欄で論じる。
【００４１】
エストロゲン受容体β調節組成物の製造
マメ科の種キバナオウギＡｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ  Ｆｉｓｃｈ．Ｂｇｅ．Ｖａｒ．ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ  Ｂｇｅ．はまた、ヤギの角（ｇｏａｔｓ’ｈｏｒｎ）、ヤギのトゲ（ｇｏａｔｓ’ｔｈｏｒｎ）、テンナンショウ（ｇｒｅｅｎ  ｄｒａｇｏｎ）、ガム・ドラゴン（ｇｕｍ  ｄｒａｇｏｎ）、トラガカントゴム（ｇｕｍ  ｔｒａｇａｃａｎｔｈａｅ）、トラガカントグミ（ｇｕｍｍｉ  ｔｒａｇａｃａｎｔｈａｅ）、オウギ（Ｈｕａｎｇ  Ｑｉ）、ロコ草（ｌｏｃｏｗｅｅｄ）、キバナオウギ（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｍｉｌｋ  ｖｅｔｃｈ）、モンゴリアン・ミルク（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎ  ｍｉｌｋ）、モンゴリアン・ミルク・ベッチ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎ  ｍｉｌｋ  ｖｅｔｃｈ）、シリアン・トラガカント（Ｓｙｒｉａｎ  ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）、イエロー・ベッチ（ｙｅｌｌｏｗ  ｖｅｔｃｈ）とも種々に呼ばれる。マメ科の種キバナオウギＡｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ  Ｆｉｓｃｈ．Ｂｇｅ．Ｖａｒ．ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｓ  Ｂｇｅ．は、草質多年生草本である。キバナオウギは、一般に、４０〜８０ｃｍの高さまで成長する。キバナオウギは、１２〜１８対の小葉からなる葉を有する有毛茎を有する。ある植物は、２０対もの小葉対を有し得る。この植物は、小さな黄色の花を有する。種々の品種が入手でき、一般に商業的供給源、例えば園芸店から入手し得る。
【００４２】
化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の製造は、全合成によって又はキバナオウギから抽出することによって行い得る。カリコシンの全合成は、以下のスキーム１に示すように行うことができる。
【化５】
2011516583.tif 000007
【００４３】
従って、化合物１（１，３−ジヒドロキシベンゼン）を、化合物２〔２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）エタン酸〕と反応させて、中間体３〔１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）エタン酸〕を製造し、次いでこれをスキーム１によってメタノールと反応させてカリコシン〔３−（４−メトキシ−３−ヒドロキシフェニル）−７−ヒドロキシクマリン〕を形成する。
【００４４】
ＣＲ０１−１５８−１、ＣＲ０１−１６１−１及びＣＲ０１−１１１−１の合成は、化合物１を適切な二置換ベンゼンと反応させて適切な中間体を製造し、次いでこれをスキーム１によって閉環反応に供して最終生成物を形成する。
【００４５】
化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）はまた、キバナオウギから単離してもよい。抽出物は、キバナオウギからの植物部分を、抽出媒体、例えば水及び／又はエタノールを含有する抽出媒体と、ＥＲβ選択活性物を抽出媒体に抽出するのに十分な時間、混合することによって調製する。次いで、抽出媒体を前記植物部分から分離し、さらに有効成分を植物物質から取り出すためにさらに処理する。一般的に、抽出物は、１つ又はそれ以上のクロマトグラフィー工程、例えばＨＰＬＣ及び／又はシリカゲルクロマトグラフィーに供して活性画分を単離する。具体的な実施形態を、以下の実験のセクションに記載する。
【００４６】
幾つかの実施形態において、抽出媒体は、適当な液状溶媒、例えば酢酸エチル、水又はエタノールである。抽出媒体は、ある場合には酢酸エチル、水、エタノール又は別の比較的極性の液状溶媒である。ある場合には、抽出媒体は、希釈又は濃縮される。抽出媒体は、完全に濃縮されていてもよく、それによって抽出物は残留物（残留抽出物）の形態をとる。従って、抽出物は、場合により溶媒に溶解されていてもよい少なくとも１種又はそれ以上の植物由来の化合物（植物化学物質）を含有する。幾つかの実施形態において、分配又は精製は、クロマトグラフィーを含め種々の分離法を使用して行ってもよい。幾つかの実施形態において、抽出物は、抽出物中の活性薬剤をさらに濃縮するために、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー又は排除クロマトグラフィーによって得られる精製又は分配抽出物である。幾つかの実施形態において、精製又は分配抽出物は、液体クロマトグラフィー、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の１つ又はそれ以上の工程によって得られる。幾つかの実施形態において、高速液体クロマトグラフィーは、分取規模の高速液体クロマトグラフィーである。幾つかの実施形態において、ＨＰＬＣは、逆相クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーである。その他の分離の手段、例えば分液ロートあるいはその他の二相又は多相分離メカニズムでの分離を、抽出物を精製又は分配するのに使用してもよい。幾つかの実施形態において、精製又は分配抽出物は、１種又はそれ以上の追加の活性又は不活性成分、例えば溶媒、希釈剤などと組み合わせてもよい。幾つかの実施形態において、適当な溶媒は、酢酸エチル、アセトニトリル、ヘキサン類、（Ｃ１−Ｃ４）アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ｉ−プロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブタノール、ｓ−ブタノール、ｉ−ブタノールなど）、クロロホルム、アセトン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、石油エーテル、並びにその他の溶媒、例えば製薬学的に許容し得る溶媒及びヒトに使用するのに安全であると一般的にみなされている（ＧＲＡＳ）溶媒を包含し得る。
【００４７】
このセクションに記載の抽出物のＥＲβアゴニスト画分を分画し、単離すると、以下のＥＲβ選択的アゴニストの単離をもたらす。
【化６】
2011516583.tif 000008
【００４８】
医薬組成物
本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載の１つ又はそれ以上の化合物：
【化７】
2011516583.tif 000009
を含有する。
【００４９】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する医薬組成物は、前記のようにして溶液の形態又は乾燥形態で調製し得る。溶液の形態において、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する医薬組成物は、フレーバーティー（ｔｅａ）又はノンフレーバーティーの形態で投与し得る。幾つかの実施形態において、幾つかの香味剤、例えば甘味剤が、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する医薬組成物の苦味を中和するために望ましいものであり得る。溶液もまた、ティー又はエリキシルの形態で調製することができる。また、香味剤、例えば甘味剤が望ましいものであり得る。風味のマスキングを、医薬組成物の患者許容性を向上させるために用いてもよい。
【００５０】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する医薬組成物は、経口利用できる形態として、例えばカプセル、錠剤、カプレットなどとして製剤し得る。カプセルは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する適量の医薬組成物を、１つ又はそれ以上のゼラチンカプセルシェルに測り取り、カプセルを組み立てることによって調製し得る。錠剤及びカプレットは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する医薬組成物を、１種又はそれ以上の結合剤及び場合によっては１種又はそれ以上の崩壊剤と組み合わせることによって調製し得る。錠剤、カプレット、カプセルなどは、胃の不調を防止するために、例えば腸溶性コティングで被覆されていてもよい。
【００５１】
化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する医薬組成物は、１種又はそれ以上のゲル化剤と組み合わせ、ゲルカプセルに挿入してもよい。また、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する医薬組成物は、ゲル化剤と、場合により食用ゲルとして経口投与するための１種又はそれ以上の香味料と組み合わせてもよい。あるいはノンフレーバー変種（ｖａｒｉａｎｔ）を、直腸坐薬ゲル又はゲルカプセルとして投与してもよい。
【００５２】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物の単位用量は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を１ｍｇ〜約１００ｇ含有し得る。幾つかの実施形態において、前記単位用量は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ（１ｇ）、約１ｍｇ〜約１００００ｍｇ（１０ｇ）又は約１ｍｇ〜約１００ｇ含有するであろう。幾つかの実施形態において、前記単位用量は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約１ｍｇ〜約１００００ｍｇ、又は約１０ｍｇ〜約１００ｇ含有する。幾つかの実施形態において、前記単位用量は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上又はこれらの均等物を約１００ｍｇ〜約１００ｇ、約１００ｍｇ〜約１０ｇ、約１００ｍｇ〜約５０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２５００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約１５００ｍｇ、約１００〜約１０００ｍｇ、約１００〜約８００ｍｇを含有する。幾つかの実施形態において、前記組成物は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）又はこれらの均等物を全体量で約０．００１ｍｇ〜約１００ｇを含有する。化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれは、遊離の塩基よりも大きい分子量を有する塩の形態で存在し得る。従って、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の製薬学的に許容し得る塩の形態の当量（equivalent amount）は、遊離塩基の列挙した量に相当する前記化合物の遊離塩基の質量（ｍａｓｓ）を含有する塩の形態の質量である。非限定的な例として、塩の形態の化合物が遊離塩基の分子量の１１０％である分子量を有すると仮定すると、遊離塩基１０ｇに相当する塩の形態の化合物の量は、１１ｇであり、遊離塩基１００ｇに相当する塩の形態の化合物の量は、１１０ｇである。当業者には、どのようにして前記化合物及びそのそれぞれの塩の分子量を算出するかは分かるであろうし、従って以下に提供する例示的な例を使用して当量を算出することができるであろう。
【００５３】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する医薬組成物は、エストロゲン応答要素（ＥＲＥ）の制御下で遺伝子のＥＲβ選択的活性化を提供する。従って、幾つかの細胞において、ＥＲＥとＥＲＥＲβを含有する細胞を、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物と接触させると、ＥＲＥの制御下で遺伝子の刺激を生じる。生体外細胞系において、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物によるＥＲＥ介在活性化は、ＥＲＥに作用するように連結されている遺伝子の発現をもたらす。特定の実施形態において、ＥＲと、最小チミジンキナーゼプロモーター及びルシフェラーゼ遺伝子に連結されたＥＲＥとのエストロゲン相互作用は、高められたルシフェラーゼ発現を生じる。従って、本発明の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物は、レポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼに作用するように連結されたＥＲＥ含有プロモーターを有するＥＲα＋細胞株、ＥＲβ＋細胞株及び／又はＥＲα＋／ＥＲβ＋細胞株を特定するのに使用し得る。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物はまた、ＥＲ＋細胞株においてエストロゲン作用を有する化合物を特定するためのアッセイ試薬、例えば標準としても使用し得る。
【００５４】
一つのこのようなアッセイ方法において、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物は、最初に、公知の活性又は濃度で調製される。
【００５５】
一般的に、ＥＲ＋細胞は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物と接触させて、エストロゲン活性に関するシグナルが記録される。特に、ＥＲ＋細胞は、ＥＲＥの制御下のレポーター遺伝子を有する。このＥＲ＋細胞は、本発明の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物と接触させて、加えられた（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物の量に比例してレポーターシグナルを生じさせる。この工程は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物の同一濃度で、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物の異なる濃度で又はその両方で、多数の試料を用いて実施し得る。例として、９個の試料を試験し得る：最初の３個は、最初の濃度で、次の３個は最初の濃度よりも半対数（ｌｏｇ）大きい濃度で、次の３個は最初の濃度よりも完全対数大きい濃度で試験し得る。次いで、レポーターシグナルが、観察され、記録され、得られるデーターポイント（レポーターシグナル強度に対する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物濃度）を、慣用の曲線適合法（例えば、最小二乗法）で標準曲線に適合させる。
【００５６】
候補組成物のエストロゲン作用を評価するために、候補化合物を、レポーター遺伝子を有するＥ＋細胞とＥＲＥの制御下で接触させる。レポーター遺伝子シグナルが観察され、候補化合物の相対エストロゲン作用を定量するために標準曲線と比較される。
【００５７】
前記の方法で使用されるＥＲ＋細胞株は、自然にＥＲを発現する細胞株、例えばヒト由来のＥＲ＋乳房細胞癌細胞株であってもよい。幾つかの実施形態において、ＥＲ＋組織は、不死化ヒト細胞株、例えば不死化骨髄又は乳房細胞株である。典型的な細胞株としては、ヒト単球、骨芽細胞株、悪性乳癌株及び不死化上皮性乳房細胞株が挙げられる。挙げ得る具体的な細胞株としては、Ｕ９３７細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞及びＭＣＦ−７細胞株が挙げられる。また、他のＥＲ＋細胞株、例えば不死化細胞株を使用してもよい。あるいは、ＥＲ＋細胞株は、ＥＲ発現ベクターを用いて形質転換されているＥＲを自然に発現しない細胞株、例えば細菌細胞株であってもよい。
【００５８】
ＥＲ＋細胞株は、レポーター遺伝子を制御するＥＲＥを含有するプロモーターを有するベクターを用いて形質転換される。例えば、前記ベクターは、ＥＲＥ、最小チミジンキナーゼプロモーター（ｔｋ）及びルシフェラーゼ遺伝子（Ｌｕｃ）を含有するウイルスベクターであってもよい。典型的なＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｋ構造体は、配列番号１に示され、配列番号１においてＥＲＥは、ヌクレオチド１−で表され、ｔｋはヌクレオチドｎｎ−で表され、Ｌｕｋはヌクレオチドｍｍ−で表される。前記構造体は、標的細胞に公知の方法で移入され、ＥＲ−ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｋ系の発現が、例えば既知量のＥ２の存在下で推定されるＥＲ＋細胞について前記のアッセイを行うことによって確認される。ＥＲ＋細胞の首尾よい形質転換を検証する他の方法としては、公知のＥＲ抗体を用いた免疫染色法が挙げられる。
【００５９】
ＥＲＥ含有プロモーターは、ＥＲＥ配列とプロモーター配列とを含有するＤＮＡである。プロモーター配列は、当該技術で認識されているプロモーター配列、例えば最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーター配列（配列番号１、ヌクレオチドｎｎ−参照）である。他のＥＲＥ含有プロモーターは、可能であり、本発明の範囲内にある。ＥＲＥ及びプロモーター配列は、一緒にレポーター遺伝子の発現を制御するために機能する。本明細書に記載のように、エストロゲン組成物（例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含む組成物）は、ＥＲに結合し、ＥＲ二量体を生じ、ＡＦ−２表面を形成する。次いで、ＥＲ二量体は、ＥＲＥに結合し、プロモーターの制御下で遺伝子を活性化させる。幾つかの実施形態において、ＥＲＥは、前記プロモーターの（５´側）のすぐ上流にあり、該プロモーターにＥＲＥが直接に連結される。例として、ＥＲＥ−ｔｋプロモーター構造体を、配列番号１、ヌクレオチド１−ｎｎ−ｌに示す。
【００６０】
レポーター遺伝子は、発現した場合に検出できるシグナルを生じる遺伝子である。ルシフェラーゼ遺伝子は、タンパク質ルシフェラーゼを生じるので適当なレポーター遺伝子であり、単一の試薬ルシフェリンの存在下で検出できる光シグナルを生じる。特に、ルシフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡは、発現されて６２ｋＤａの酵素タンパク質ルシフェラーゼを産生する。ルシフェラーゼ酵素は、Ｍｇ２＋と酸素の存在下でルシフェリンとＡＴＰの反応を触媒してオキシルシフェリン、ＡＭＰ、ピロリン酸（ＰＰｉ）及び放射光を形成する。放射光は、黄緑色（５６０ｎｍ）であり、標準光度計を使用して容易に検出し得る。ＡＴＰ、Ｏ２及びＭｇ２＋は、すでに細胞中に存在するので、このレポーター遺伝子は、検出可能なシグナルを生じるために試薬ルシフェリンの添加を必要とするだけであり、本発明のアッセイで使用するのに特によく適している。当該技術で利用できると述べ得る他のレポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（ＣＡＴ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）及びβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が挙げられる。
【００６１】
本発明の幾つかのアッセイ方法において、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する標準組成物を、１種又はそれ以上のエストロゲン化合物、ＳＥＲＭなどと比較することによってさらに特定することが有用である。このようなアッセイ方法は、本質的に前記のようにして行われ、前記方法の適切な部分において（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物のための標準エストロゲン化合物及び／ＳＥＲＭの適切な代用となる。
【００６２】
本発明の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物はまた、ＴＮＦ  ＲＥ介在経路によって遺伝子の発現を抑制する。幾つかの場合には、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物は、特にＴＮＦ  ＲＥの制御下のレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、Ｌｕｃ）を有する細胞において、遺伝子の発現を生体外で抑制する。幾つかの場合には、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物は、ＴＮＦ−α（これは、主として単球及びマクロファージによって産生されるサイトカインである）の発現を抑制する。このサイトカインは、種々の組織の滑膜細胞及びマクロファージに見出され、関節リウマチ（ＲＡ）に大きく関与している。ＴＮＦ−αはまた、他の炎症性疾患においても発現され、また細菌由来のエンドトキシンに対する反応としても発現される。ＴＮＦ  ＲＥリプレッサー経路によるＴＮＦ発現のリプレッサーとして、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物は、ＴＮＦの上昇濃度に関連した炎症性障害の治療において重要である。
【００６３】
本発明の幾つかの実施形態において、ＥＲα及びＥＲβの一方又はその両方並びにレポーター遺伝子をＴＮＦ  ＲＥの制御下で発現する細胞株が調製される。ＴＮＦ  ＲＥは、一般にレポーター遺伝子の（５´側）の上流にあり、シグナル検出は本明細書に既に記載したように行われる。ＴＮＦ  ＲＥの制御下にレポーター遺伝子（この場合はルシフェラーゼ遺伝子）を有するＤＮＡの配列を、配列番号２に示す。ヌクレオチド１は、ＴＮＦ  ＲＥに相当し、これに対してヌクレオチドｎｎは、ルシフェラーゼ遺伝子に相当する。
【００６４】
前記細胞ＴＮＦ  ＲＥを含有する細胞系は、さらに、ＥＲ遺伝子−すなわち、ＥＲα、ＥＲβ又はその両方のコピーを１つ又はそれ以上を含有する。前記の方法で使用されるＥＲ＋細胞株は、自然にＥＲを発現する細胞株、例えばヒト由来ＥＲ＋乳癌細胞株であってもよい。幾つかの実施形態において、ＥＲ＋組織は、不死化ヒト細胞株、例えば不死化骨髄細胞株又は乳房細胞株である。典型的な細胞株としては、ヒト単球、骨芽細胞株、悪性乳癌細胞株、不死化上皮性乳房細胞株が挙げられる。挙げ得る具体的な細胞株としては、Ｕ９３７細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞及びＭＣＦ−７細胞株が挙げられる。また、不死化細胞株を含め他のＥＲ＋細胞株を使用してもよい。あるいは、ＥＲ＋細胞株は、ＥＲを自然に発現しない細胞株、例えばＥＲ発現ベクターを用いて形質転換されている細菌細胞株であってもよい。
【００６５】
所定量のルシフェリンの存在下で及びエストロゲン化合物、例えばＥ２の不存在下で又は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物の不存在下で、前記細胞系は、「対照強度」又は「基準強度」と呼ばれる強度で黄色光（５６０ｎｍ）を発する。５６０ｎｍでの発光は、光学密度単位（Ｏ．Ｄ．５６０ｎｍ）で都合よく定量される。エストロゲン化合物、例えばＥ２を添加するか又は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物の１つを添加すると、５６０ｎｍでの発光の強度は、対照に比べて弱められる。意外にも、ＳＥＲＭ、例えばタモキシフェン又はラロキシフェンの存在下では、ルシフェラーゼの発現が上昇し、５６０ｎｍでの発光の強度も高められる。従って、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物は、遺伝子発現のエストロゲンＴＮＦ  ＲＥによって制御される抑制を誘導することができる。
【００６６】
ＴＮＦ  ＲＥ含有細胞系は、本発明のアッセイ方法で使用できる。本発明のアッセイ方法において、ルシフェラーゼ活性の低下（すなわち、５６０ｎｍ光の放出の低下）は、エストロゲン活性の上昇と相関し、これに対してルシフェラーゼ活性の活性化（すなわち、５６０ｎｍでの発光の増加）は、抗エストロゲン活性と相関する。標準曲線は、本明細書に記載のようにして既知量の本発明の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含む組成物を使用して調製し得る。このような標準曲線は、さらに、他の公知のエストロゲン又は抗エストロゲン標準、例えばＥ２又は他の公知のエストロゲン化合物、及び／又は抗エストロゲンＳＥＲＭ、例えばタモキシフェン又はラロキシフェンを使用することによって増強し得る。
【００６７】
次いで、形質転換Ｅ＋細胞株由来の細胞は、候補化合物に曝露され、ルシフェラーゼシグナルが観察され、このシグナルが本明細書に記載のように予め調製された標準曲線と比較される。対照（基準）と比較してルシフェラーゼ活性の上昇を生じる化合物は、抗エストロゲンＳＥＲＭと特定され、これに対して対照に対してルシフェラーゼ活性の低下を生じる化合物は、エストロゲン性として分類される。次いで、エストロゲン作用又は抗エストロゲン作用は、ルシフェラーゼ発現の減少又は増加の程度を、本発明の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含む組成物によって引き起こされる減少、場合によってはＥ２、タモキシフェン及び／又はラロキシフェンによって引き起こされるそれぞれのシグナルの減少又は増加と比較することによって定量することができる。
【００６８】
本発明の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する医薬組成物はまた、Ｅ２−ＥＲとＥＲＥとの相互作用をアンタゴナイズする。特に、キバナオウギの抽出物は、ＥＲα及びＥＲβと直接的に相互作用することによってＥ２によるＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃの活性化をアンタゴナイズすることが明らかにされている。ＥＲＥ制御遺伝子のＥ２−ＥＲ活性のアンタゴニストとして、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物は、作用においてタモキシフェンと類似しており、乳癌及び子宮癌に対して予防活性、緩和活性及び／又は抗増殖活性を有すると考えられる。
【００６９】
本明細書に開示される実施形態は、本発明の組成物を使用して生体内エストロゲン方法を提供する。一般に、生体内方法は、被検体においてエストロゲン作用をもたらすのに十分な量の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含む組成物を被検体に投与することからなる。生体内方法は、エストロゲンＥＲＥ制御遺伝子活性化、ＴＮＦ  ＲＥ制御遺伝子抑制（例えば、ＴＮＦ−α抑制）又はその両方を生じるであろう。従って、生体内方法は、生体内で種々の陽性表現型効果を生じるであろう。
【００７０】
被検体は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ又はヒツジであってもよく、一般的には雌である。被験体はまた、ヒト、特にヒトの女性であってもよい。幾つかの実施形態において、被検体は、閉経後又は卵巣全摘出後の女性であり、エストロゲン療法を必要としている。このような場合、被検体は、ほてり、不眠症、膣乾燥、性欲減退、尿失禁及びうつ病などの更年期症状に苦しんでいるかもしれない。他のこのような場合には、被検体は、骨粗鬆症にかかりやすいか又は骨粗鬆症を患っている場合がある。適当な生体内方法としては、エストロゲン補充療法に反応する医学的適応症の治療及び／又は予防が挙げられる。
【００７１】
本発明の組成物の投与は、１つ又はそれ以上の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含む組成物が標的組織にその経路によって利用できる限りは、一般的に使用されている投与経路によるものであろう。挙げ得る幾つかの投与経路としては、経口、経鼻、口腔、直腸、膣及び／又は局所（経皮）が挙げられる。あるいは、投与は、同所、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内又は静脈内注射であってもよい。このような組成物は、通常は上記に記載された製薬学に許容し得る組成物として投与される。
【００７２】
疾患、障害、症候群、状態又は症状の治療（及びその文法的変化  −  例えば、治療する、治療するために、治療しつつある、治療されたなど）は、臨床医がこのような治療を受ける被検体を確認し、この被検体に本発明の組成物を投与するという段階を含む。従って、治療は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含むエストロゲン組成物を被検体に投与することによって回復され、軽減され、改善され、除去され、治癒される可能性がある疾患、症候群、状態又は症状の診断を含む。治療はまた、疾患、障害、症候群、状態又は症状の同時回復、軽減、改善、除去又は治癒も含む。幾つかの実施形態において、治療とは、疾患、障害、症候群、状態又は症状の発症の防止又は遅延（すなわち、予防）、疾患、障害、症候群、状態又は症状の進行の防止又は遅延、及び／又は疾患、障害、症候群、状態又は症状の重症度の軽減を意味する。特に、新生物増殖の場合には、治療は、新生物増殖の軽減、及び逆転、停止又は遅延を含む。これに関して、治療はまた、寛解、例えば完全寛解及び部分寛解も含む。更年期症状の場合には、治療は、種々の症状の予防及び軽減を含む。
【００７３】
疾患、障害、症候群、状態又は症状の予防（及びその文法的変化）は、疾患、障害、症候群、状態又は症状を発症するリスクがある被検者を確認し、その被検体に前記の疾患、障害、症候群、状態又は症状の発症を未然に防ぐ又は遅らせる可能性のある十分な量の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含む組成物を投与することを含む。ある場合には、予防は、臨床医が、要求にかなう水準の医療を施し、ホルモン補充療法の必要があると考える閉経後の女性を確認し、その女性に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含む医薬組成物を投与し、それによって１つ又はそれ以上の更年期症状を阻止するか又は遅らせることを含む。幾つかの実施形態において、骨粗鬆症の予防は、予防は、臨床医が、要求にかなう水準の医療を施し、骨粗鬆症を発症するリスクがあると考える閉経後の女性を確認し、その女性に（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含む医薬組成物を投与し、それによって骨量減少の開始を阻止するか又は遅らせることを含む。
【００７４】
軽減は、疾患、障害、症候群、状態又は症状の重症度、発生の回数及び／又は頻度の減少を含む。更年期症状の軽減には、ほてり、不眠症、失禁、うつ病などの頻度及び／又は重症度を減少させることを含む。
【００７５】
骨粗鬆症の治療は、ヒト、例えば骨量減少のリスクがある閉経後の女性を確認し、その女性に本発明の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含む医薬組成物を投与し、それによって骨量減少を、重症度において軽減するか、開始時を遅らせるか又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、骨粗鬆症の治療はまた、骨量増加を含むこともできる。
【００７６】
本明細書に開示されるさらなる実施形態は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含む医薬組成物を調製する方法を提供する。本発明は、具体的には、本発明の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含む医薬組成物を調製する方法を提供する。この方法は、キバナオウギ種の植物由来の植物物質のある量を得、場合によりこの植物物質を粉砕し、前記植物物質を抽出媒体と接触させ、前記植物物質を抽出媒体から分離することを含む。
【００７７】
キバナオウギの抽出物は、エストロゲン活性を有し、これら抽出物が、被検体、特に閉経期前後の女性及び閉経後の女性においてエストロゲン作用をもたらすことができることを特徴とすることを意味する。幾つかの実施形態において、エストロゲン作用とは、少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防すること、骨粗鬆症を治療又は予防すること、子宮癌を治療又は予防すること、及び心臓血管疾患治療又は予防すること、からなる群から選択される少なくとも１つの作用を意味する。幾つかの実施形態において、エストロゲン作用は、ほてり、不眠症、膣乾燥、性欲減退、尿失禁、頭痛及びうつ病からなる群から選択される少なくとも１つの更年期症状を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、エストロゲン作用は、骨粗鬆症を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、エストロゲン作用は、ほてりを治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、エストロゲン作用は、子宮癌又は乳癌を治療又は予防することを含む。幾つかの実施形態において、エストロゲン作用は、過形成又は癌のリスクを上昇させることを含まない。幾つかの実施形態において、エストロゲン作用は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを上昇させることを含まない。幾つかの実施形態において、エストロゲン作用は、過形成又は癌のリスクを軽減することを含む。幾つかの実施形態において、エストロゲン作用は、乳腺過形成、乳腺腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮腫瘍、子宮頸管過形成、子宮頸管腫瘍、卵巣過形成、卵巣腫瘍、卵管過形成、卵管腫瘍のリスクを軽減することを含む。
【００７８】
幾つかの実施形態において、植物種は、キバナオウギ種であり、キバナオウギ種の種々の栽培品種である。
【００７９】
植物物質とは、キバナオウギ種由来の少なくとも１つの植物の任意の１つ又は複数の部分を意味する。植物物質とは、植物全体、あるいは該植物の任意の１つ又は複数の部分、例えば根、樹皮、木質、葉、花（又は花、例えば萼片、花弁、雄ずい、雌ずいなど）、果実、種子及び／又は前記のいずれかの部分又は混合物を包含する。植物物質は、切断直後物、乾燥物（凍結乾燥物を含む）、凍結物などであってもよい。植物物質は、その全体であってもよいし又はより小さい部分に分けられていてもよい。例えば、葉は、細断、寸断又は粉砕されていてもよく、根は、細断又は粉砕されていてもよく、果実は、細断されていてもよいし、薄切りされていてもよいし又は混合されてもよく、種子は、細断又は粉砕されていてもよく、茎は、寸断、細断又は粉砕されていてもよい。本発明の具体的な実施形態においては、使用される植物部分は、キバナオウギ種の葉である。
【００８０】
本発明の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する医薬組成物は、キバナオウギの少なくとも１つの抽出物を含有する。「抽出物」とは、植物部分を、抽出溶媒と、植物由来の１種又はそれ以上の化合物に適した条件下で接触させて植物物質から抽出溶媒に分配する際に得られる溶液、濃縮液又は残留物である。前記溶液は、次いで、場合により濃縮されて濃縮物又は残留物を形成する。
【００８１】
本発明に適した抽出媒体としては、水及びエチルアルコールが挙げられる。具体的には、水が抽出溶媒である場合には、精製水が適している。精製水としては、蒸留水、脱イオン水、注射用水、限外濾過水、及び精製された他の形態の水が挙げられる。本発明の幾つかの実施形態において用いられるエチルアルコールは、穀粒エタノール、特に未変性エタノール（例えば、場合により若干の水、例えば最大約１０％までの水を含有していてもよい純穀粒エタノール）である。幾つかの実施形態において、抽出溶媒は、水、エタノール又はこれらの混合物である。濃縮物又は残留物は、抽出液を濃縮する（例えば、蒸発させるか又は凍結乾燥する）ことによって調製してもよい。最初の抽出溶媒、濃縮物又は残留物の形態にかかわらず、これらの調製物のそれぞれは、本発明の目的の「抽出物」とみなされる。
【００８２】
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１つ又はそれ以上を含む組成物の製造方法は、場合により、植物物質を、その表面積と容積との比を増大させ且つ抽出プロセスの効率を同時に高めるために最初に粉砕することからなる。植物物質を粉砕する方法は、粉砕、細断、混合、寸断、微粉砕、磨砕などを含む。
【００８３】
次いで、抽出媒体（溶媒）は、植物物質と、１種又はそれ以上の植物化学物質、特にエストロゲン植物化学物質に適した条件下で接触させ、植物物質から抽出溶媒に分配させる。このような条件としては、幾つかの場合には、室温を超える温度までの抽出媒体の加熱、撹拌、接触時間などが挙げられる。典型的な抽出温度は、約５０℃から抽出溶媒の沸点までである。水が抽出溶媒である場合は、抽出温度は、一般的に室温から約１００℃までであり、約５０℃から約８０℃までの温度が特に適しており、約７５℃の温度が特に適している。抽出溶媒としてエタノールの場合には、抽出温度は、一般的に室温から約７８．５℃までであり、約５０℃から約７８℃までの温度が特に適しており、約７５℃の温度が特に適している。当業者には、一方の抽出効率と、他方の植物化学物質の安定性との間で適切な均衡が設けられるべきであることが認識されるであろう。
【００８４】
抽出媒体と植物物質が組み合わされると、これらは、場合により、植物物質から抽出媒体へのエストロゲン化合物の効率的な交換を確実にするために撹拌され、植物物質から抽出媒体への有用な量の植物化学物質を抽出するのに十分な時間を接触させておく。このような時間（例えば、約５分〜約１０時間、さらに詳しくは約１０分〜約５時間、特に約３０分〜約２時間）が経過した後に、植物化学物質を含有する抽出媒体は、植物物質から分離される。このような分離は、当該技術で認識されている方法で、例えば濾過、デカントなどによって達成される。
【００８５】
本発明の組成物としては、本発明の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物、あるいは本発明の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物が挙げられる。このような実施形態において、本発明の組成物は、場合により１種又はそれ以上の追加成分を含有していてもよい。このような追加成分は、不活性であってもよいし又は活性であってもよい。不活性成分としては、溶媒、賦形剤又は他の担体が挙げられる。活性成分としては、活性医薬成分（ＡＰＩ）、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物と組み合わせて相乗活性を示す活性医薬成分が挙げられる。
【実施例】
【００８６】
本発明は、以下の例示的及び非限定的な実施例を参照してさらに十分に理解し得る。
【実施例１】
【００８７】
実施例１：キバナオウギからカリコシンの誘導された単離 
乾燥し、微粉砕したキバナオウギを、８：２のメタノール：水で抽出した（容量：重量で１０：１、１〜１８時間、２回反復した）。得られたメタノール抽出物を一緒にし、真空中で濃縮してメタノールを除去し、次いでヘキサンと酢酸エチルで連続的に分配した（容量：容量で１：１、１回反復した）。ＥＲβ−ルシフェラーゼアッセイにより、酢酸エチル画分に活性が示され、これをさらにＣ１８固相抽出カートリッジ（５ｇ）上で分画した。前記Ｃ１８カラムを、メタノールが０％から１００％まで２５％ずつの１０ｍＭ酢酸アンモニウム：メタノールの濃度勾配を用いて溶出した。アッセイ結果により２５％メタノール画分にＥＲβアゴニスト活性が確認され、この画分をシリカカラムクロマトグラフィー用にロータリーエバポレーションにより濃縮した。得られた活性画分を、シリカゲル（２００〜４００メッシュ、６０Ａ）を充填したオープンガラスカラムを用いてクロマトグラフィー分離し、酢酸エチル中３０％のヘキサンで溶出した。最後に、シリカカラムから得られた活性画分を、ロータリーエバポレーションにより濃縮し、酢酸エチル：メタノール：ＴＦＡ（１０：１：０．１）で展開したシリカゲルＴＬＣ（２０×２０ｃｍ、５００μｍ）で精製した。得られた化合物を、ＬＣ／ＭＳ分析及びＮＭＲ分析（別表１参照）による構造解析のためにＴＬＣプレート（Ｒｆ＝０．５８）から回収した。
【００８８】
ＬＣ／ＭＳ分析により、カリコシンの計算分子量と一致した２８４ダルトンの分子量が得られた。プロトンＮＭＲスペクトル及び炭素ＮＭＲスペクトルは、ジヒドロキシ、メトキシイソフラボンと一致したが、Ｂ環上のメトキシ基及び水酸基の位置を明確に決定できなかった。結局、構造は、カリコシンの合成後に決定できるだけであった（以下の実施例２参照）。
【００８９】
乾燥粉末キバナオウギを、８：２のメタノール：水で２回抽出した（容量：薬草は５：１；４時間混合）。濾過後に、濾液をロータリーエバポレーションにより濃縮してメタノールを除去し、残った水性抽出物を、酢酸エチルを用いて分配した（等容量、１回反復）。プールした酢酸エチル相を、濃縮し、シリカゲル充填オープンフリットガラスカラムに充填した。このシリカカラムを、１００％ヘキサンで開始するヘキサン：酢酸エチルの濃度勾配を用いて溶出した。カリコシンは、典型的には、約３０〜４０％酢酸エチルで溶出する。カリコシンを含有する画分を、一緒にし、濃縮し、ＨＰＬＣ分析のためにメタノールに溶解した。
【００９０】
カリコシンの分取ＨＰＬＣ精製は、逆相Ｃ８カラム（７μｍ、１９×１５０ｍｍ）を使用して、１７ｍＬ／分の流量で、２２０ｎｍ及び２５４ｎｍで監視しながら達成された。初期条件は、水中５％のアセトニトリルで１分間保持、次いで５〜２０％アセトニトリルの直線勾配で１分間、２０〜４０％アセトニトリルで２０分間、及び４０〜９５％アセトニトリルで４分間であった。前記カラムを９５％アセトニトリルで３分間保持し、その後に初期条件に戻した。カリコシンは、約１６分の保持時間で溶出し、連続注入物から手動で採取した。プールした採取物を、ロータリーエバポレーションにより濃縮乾固し、次いでＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、及びプロトンＮＭＲで分析して構造を確認し、純度を決定した（別表ＩＩ参照）。純度が十分でない（＞９５％）場合には、ゲル透過クロマトグラフィーを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０媒体を有するオープンカラムを用いてメタノールで溶出して行った。
【実施例２】
【００９１】
実施例２：レゾルシノールからのカリコシンの全合成
ＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（１８．０ｍＬ）に溶解したレゾルシノール（１）（２．６７ｇ、２４．２ミリモル）と３−メトキシ−４−ヒドロキシフェニル酢酸（２）３．１ｇ（１７．０ミリモル）との混合物を、窒素ガス雰囲気下で、９０℃で９０分間還流した。反応が完結した（ＴＬＣで調べられる）後に、反応混合物を室温まで冷却し、次いで酢酸エチルと水で抽出した。一緒にした有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥し、次いで濃縮し、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してデオキシベンゾイン３を褐色固体２．８７ｇ（６０％）として得た。
【化８】
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【００９２】
デオキシベンゾイン（３）（１．０ｇ、３．６ミリモル）を、Ｎ２雰囲気下で４．０ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解し、０℃に冷却し、その後に２．０ｍＬのＢＦ３・Ｅｔ２Ｏを加え、次いで７５０．０ｍｇのＮ，Ｎ´−ジメチル（クロロメチレン）アンモニウムクロリドを加えた。反応混合物を室温まで温め、２時間攪拌した。次いで、得られた橙黄色粘稠溶液を水性ＮａＯＡｃ（１０％、２００ｍＬ）に注ぎ、生成物を、酢酸エチルを用いて分配した。得られた橙色相を、生理食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。粗生成物を真空乾燥して、橙黄色固体を得、これをメタノール（２０．０ｍＬ）に溶解し、その後にＨＣｌ（３．０ｍＬ）を加え、１時間還流した。溶媒を、ロータリーエバポレーターを使用して除去し、粗生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーでシリカゲルを用いて酢酸エチル−ヘキサン（４：６）を使用することにより精製して、カリコシンを白色固体７３０ｍｇ（７２％）として得た。
【００９３】
カリコシンをキバナオウギから単離し、その構造を文献データと実験データとを比較することによって解明した。比較したデータは、ＭＳ ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−＝２８３、図４、及び１Ｈ及び１３ＣＮＭＲデータを含んでいた。また、カリコシンを、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、Ｈ２ＢＣ、１Ｄ及び２Ｄ ＴＯＳＣＹ、ＮＯＳＥＹ、並びにＨＭＢＣによる２Ｄ  ＮＭＲ分析に供した。得られたＮＭＲデータを表１に示す。ＭＳ、１Ｄ及び２Ｄ  ＮＭＲ分析を使用すると、ＳＢ０７−４８−Ｘ２がカリコシンであることが証明された。
【００９４】
一般的実験手順：  ＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ社製ＤＲＸ−５００ＭＨｚ分光計、又はＢｒｕｋｅｒ社製ＡＶ−５００ＭＨｚ分光計を使用してＴＨＦ−ｄ８中で記録した。２５４ｎｍでの２４８７二重波長検出器を備え、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｃ１８カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を使用するＷａｔｅｒｓ社（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）製７１７分離装置を、分析ＨＰＬＣに使用した。分子量を、Ａｇｉｌｅｎｔエレクトロスプレー１１００シリーズＬＣ−ＭＳ装置を使用してネガティブモードで調べた。
【表１】
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【実施例３】
【００９５】
実施例３：ＥＲβは、ＥＲＥ−ｔｋＬｕｃの活性化においてＥＲαよりも弱い：
転写活性化に対するＥ２の効果を、ルシフェラーゼレポーターｃＤＮＡに連結された最小チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターの上流に標準的ＥＲＥを含有するプラスミドとＥＲα又はＥＲβの発現ベクターとを移入することによって調べた。Ｅ２は、ヒト単球Ｕ９３７細胞において、ＥＲβに比べてＥＲαの存在下では１０倍大きいＥＲＥの活性化を生じたが、ＥＣ５０値は同様であった。図１参照。
【実施例４】
【００９６】
実施例４：ＥＲβは、ＴＮＦ−ＲＥ−ｔｋＬｕｃの抑制においてＥＲαよりも有効である：
次いで、ＥＲα及びＥＲβ介在転写抑制に対するＥ２の効果を、腫瘍壊死因子応答要素（ＴＮＦ−ＲＥ）として知られているＴＮＦ−αプロモーターの−１２５から−８２の領域を使用して比較した。ＴＮＦ−αは、前記ｔｋプロモーター（ＴＮＦ−ＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ）の上流のＴＮＦ−ＲＥ（−１２５〜−８２）の３個のコピーの５〜１０倍の活性化を生じた。Ｅ２は、ＥＲα及びＥＲβの存在下で、ＴＮＦ−ＲＥ−ｔｋＬｕｃのＴＮＦ−α活性化を６０〜８０％抑制した。しかし、ＥＲβは、抑制においてＥＲαよりも約２０倍有効であった（それぞれ、ＥＲαについては２４１ｐＭのＩＣ５０、これに対してＥＲβについては１５ｐＭのＩＣ５０）。未変性−１０４４〜＋９３のＴＮＦ−αプロモーターの抑制において、ＥＲβはＥＲαよりも有効であることも見出された。従って、ＥＲαは、転写活性化においてＥＲβよりもはるかに有効であり、これに対してＥＲβは、転写抑制においてＥＲαよりも有効である。Ｅ２と対照的に、抗エストロゲン剤であるタモキシフェン、ラロキシフェン及びＩＣＩ  １８２７８０は、ＴＮＦ−ＲＥ−ｔｋＬｕｃの２倍活性化を生じた。また、これらの抗エストロゲン剤は、Ｅ２によって誘発された抑制を消滅させた。
【実施例５】
【００９７】
実施例５：ＥＲβは、ＥＲＥ−ｔｋＬｕｃのＥＲα介在転写活性化を阻害する：
驚くべきことに、ＥＲα又はＥＲβが、Ｕ９３７細胞において同時発現された場合には、ＥＲαによる活性化は著しく阻害された。図１参照。これらのデータは、ＥＲβがＥＲＥ−ｔｋＬｕｃのＥＲα活性化に対して抑制効果を発揮することを示す。同様の結果が、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５で観察された。図２参照。他の研究者らは、異なる細胞型においてＥＲαのトランス活性化に対するＥＲβの同様の抑制効果を見出している。これらの研究は、ＥＲＥ−ｔｋＬｕｃに対するＥＲα及びＥＲβの異なる活性化並びにＥＲα介在転写に対するＥＲβの抑制効果が、細胞型特異的でないこと及びＥＲの固有特性によることを示す。ＥＲβによるＥＲαの抑制は、ＥＲα／ＥＲβヘテロ二量体の形成を必要とする。その理由は、二量化を防ぐＥＲβのヘリックス１１の変異がその抑制活性を阻害するからである（データは示されない）。
【実施例６】
【００９８】
実施例６：化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、ＥＲβを介してエストロゲン応答要素を活性化する
図３ａ〜３ｅは、化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）を介してＥＲＥ−ｔｋＬｕｃとＥＲβとを用いて形質転換された細胞においてＥＲＥを選択的に活性化することを実証する。
【化９】
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【００９９】
図４ａ〜４ｄは、ＥＲβを同時発現するＥＲＥ−ｔｋＬｕｃ形質転換細胞におけるルシフェラーゼの発現に対する化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の効果を表す。それぞれの場合の対照は、ＥｔＯＨであった。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれは、同時発現されたＥＲβを介してＥＲＥを活性化し、それによってルシフェラーゼを発現する。公知のＥＲβアンタゴニストであるラロキシフェン及びタモキシフェンの添加は、この活性化を抑制し、これに対してエストラジオールの添加は、ＥＲＥの活性化とルシフェラーゼの発現をもたらした。
【実施例７】
【０１００】
実施例７：ＭＣＦ−７腎被膜異種移植片
図５は、ＭＣＦ−７乳癌細胞の腎被膜異種移植片に対するエストラジオール（Ｅ２）、カリコシン及び対照（担体）の効果の比較を表す。ＭＣＦ−７異種移植片をヌードマウスの腎臓に導入した。マウスを、３つの処置群に無作為に割り当てた。エストラジオール群には、生理食塩水中のＥ２を０．５ｍｇ／ｈ投与し、カリコシン群には、生理食塩水中のカリコシンを２．５ｍｇ／ｈ投与し、対照群には、生理食塩水のみを投与した。それぞれの処置群を２８日間処置し、その後にマウスを安楽死させ、前記異種移植片を含んでいる腎臓を切除し、写真に撮り、秤量した。認めることができるように、エストラジオールは、対照と比べて腫瘍異種移植片の増殖をアゴナイズし、これに対してカリコシンは、ＭＣＦ−７乳癌異種移植片の増殖を阻止する。
【実施例８】
【０１０１】
実施例８：ヌードマウスにおける子宮の増殖に対するカリコシンの効果 
図６は、生体内での子宮重量に対するＥ２、カリコシン及び対照の効果の比較を表す。雌性ヌードマウスを、Ｅ２で処置した。マウスを、３つの処置群に無作為に割り当てた。エストラジオール群には、生理食塩水中のＥ２を０．５ｍｇ／ｈ投与し、カリコシン群には、生理食塩水中のカリコシンを２．５ｍｇ／ｈ投与し、対照群には、生理食塩水のみを投与した。２８日後に、それぞれのマウスを安楽死させ、その子宮を取り出し、秤量した。認めることができるように、Ｅ２は、子宮の増殖をアゴナイズし、これに対してカリコシンは、対照と比べて反対の効果を有する。
【実施例９】
【０１０２】
実施例９：非盲検用量漸増投与試験
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の１つ又はそれ以上を含有する組成物の安全性及び最大耐量（ＭＴＤ）を評価するために、非盲検用量漸増試験を行う。治験薬は、次の組成物：組成物Ｉ：単独有効成分として（ａ）；組成物ＩＩ：単独有効成分として（ｂ）；組成物ＩＩＩ：単独有効成分として（ｃ）；組成物ＩＶＶ：単独有効成分として（ｄ）；組成物Ｖ：（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が１：１：１：１の混合物、のうちの１つを含有する。
【０１０３】
治験薬は、適当な大きさのゼラチンカプセルに、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶを１ｍｇ（１週目）、１０ｍｇ（２週目）、１００ｍｇ（３週目）又は１０００ｍｇ（４週目）含有する。前記用量は、必要に応じて２個又はそれ以上のゼラチンカプセルに分割してもよい。１８歳〜６０歳の標準的な健常ボランティアに、１週目については治験薬を１日当たり１ｍｇ投与し、２週目については治験薬を１日当たり１０ｍｇ投与し、３週目については治験薬を１日当たり１００ｍｇ投与し、４週目については治験薬を１日当たり１０００ｍｇ投与する。被検体は、何らかの有害事象の出現について監視される。いかなる時にも、被検体が現行の用量に耐えられないように見える場合には、担当医療スタッフがこのような不耐性に注目するであろう。最大耐量は、被検体のそれぞれが前記用量に耐える最大用量とみなされるか、又は被検体が不耐容を経験しない場合には、１日当たり治験薬１０００ｍｇとみなされる。
【実施例１０】
【０１０４】
実施例１０：二重盲検有効性試験
エストロゲン性疾患の治療のための治験薬の有効性を実証するために、以下の二重盲検試験を行う。
【０１０５】
目的：ほてり（ｈｏｔ  ｆｌｕｓｈｅｓ）（ｈｏｔ  ｆｌａｓｈｅｓとしても知られている）の治療のためにＥＲβ選択性中国薬草抽出物（治験薬）の最適用量及び安全性並びに有効性を調べること
【０１０６】
方法：１日当たり少なくとも７回又は１週当たり５０回の中等度〜重度のほてりを報告する４０〜６０歳の概して健康な閉経後の女性１００〜３００人の多施設無作為盲検第ＩＩ相プラセボ対照試験。女性を、１２週間の治験薬１日当たり５ｇ（ＳＧ５）又は１０ｇ（ＳＧ１０）あるいは同一プラセボ（ＰＧ）に無作為に割り当てる。ほてりの頻度及び重症度を、日誌（ｄａｉｌｙ  ｄｉａｒｙ）に記録する。
【０１０７】
結果：参加者は、平均年齢及び人種によって特徴付けられる。治験薬とプラセボの両方の投与を受ける参加者はまた、１２週間の処置後のほてり頻度の％減少率（±Ｓ．Ｄ．及びｐ値）によって特徴付けられる。子宮内膜の厚みは、各参加者及び各群（全体、ＰＧ、ＳＧ５、ＳＧ１０）について評価される。有害事象もまた、各参加者及び各群（全体、ＰＧ、ＳＧ５、ＳＧ１０）について評価される。
【０１０８】
結論：評価は、健常な閉経後の女性のほてりの頻度及び重症度の低減並びに用量漸減効果に基づく。
【０１０９】
方法
設計及び設定：これは、治験薬が安全であり且つほてりの頻度及び重症度の低減に有効であるか否かを調べるために設計された多施設無作為盲検プラセボ対照試験である。この試験は、独立した第三者機関（コーディネーティング・センター（Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ））によって調整され、参加者は多数の臨床現場で採用される。
【０１１０】
参加者：有資格参加者は、１日当たり少なくとも７回又は１週当たり５０回の中等度〜重度のほてりを報告した４０〜６０歳の概して健康な閉経後の女性である。除外される女性：乳癌、子宮癌又は卵巣癌、黒色腫、静脈血栓塞栓症、心臓血管疾患、又は重度の食物及び薬物アレルギーの履歴を有する女性。また、活動性の肝疾患又は胆嚢疾患、異常子宮出血、妊娠又は授乳を報告する女性、及び癌を疑わせる異常な乳房Ｘ線撮影像、乳房検査、スミア診又は骨盤検査を有する女性も除外される。経膣超音波試験で測定される５ｍｍを超える厚みの子宮内膜を有する女性及びほてりに影響及ぼすことが知られているか又は疑われる薬剤（エストロゲン類、タモキシフェン、ラロキシフェン、プロゲスチン、選択性セロトニン再取り込み阻害剤又はガバペンチン）を使用している女性も除外される。
【０１１１】
スクリーニングにおいて、プラセボの投薬並びにほてり、出血及び服薬アドヒアレンスを記録するための日誌が、１週導入期間に提供される。日誌を正確に記入し終え、少なくとも８０％のプラセボ投薬を受け、身体検査、放射線検査及び臨床検査のスクリーニング後に依然として資格がある参加者が、無作為化される。
【０１１２】
薬物安全性は、データ安全性監視委員会（Ｄａｔａ  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｉｔｅｒｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ）によって評価される。
【０１１３】
データ収集：データは、調整センター（Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ）によって収集され、処理され、解析される。
【０１１４】
無作為化：無作為化は、最終月経期後経過時間（≦２４ヶ月と＞２４ヶ月）及び臨床現場によって階層化される。層内において、治療は、１：１：１の比率において３〜６の無作為置換ブロック法で無作為に割り当てられる。調整センターの調査薬剤師は、Ｂｉｏｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．社（エメリービル、カリフォルニア州）から治験薬を受け入れ、調整センターの統計学者によって作成された治療識別番号をラベルに適用し、治験薬を各臨床現場に発送する。治験薬は、無作為化スキームに従って連続的に有資格参加者に割り振られる。
【０１１５】
治験投薬及び盲検：治験薬を濾過し、本明細書に記載のようにして薬草の抽出物を乾燥した。米国食品医薬品局によって承認されたカルメル（Ｃａｒｍｅｌ）着色剤及び食品色素を、乾燥粉末に加えて均一な色を得、薬草の風味を覆い隠すために香味剤及び甘味剤を加える。同様の着色剤及び風味賦形剤を不活性固形希釈剤に加えて、活性薬剤と同じ外観、風味及び粒度を有するプラセボ粉末を得る。
【０１１６】
参加者は、粉末として包装されているプラセボか又は治験薬の前記２つの用量のうちの一つを受け取り、その小さな包みの内容物を少なくとも３オンスの非柑橘系液体に溶解し、得られる飲物を１日に２回飲むように指示される。全ての調査員、試験スタッフ、検査技師及び参加者は、治験投薬状況が分からなくされる（ｂｌｉｎｄｅｄ）。
【０１１７】
測定：基準時すなわち治療開始前に、参加者は、個体群統計、健康診断、履歴、投薬、生活の質、更年期症状、不眠症（不眠重症度指標）及び性機能〔女性性機能指標（Ｆｅｍａｌｅ  Ｓｅｘｕａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）〕に関するアンケートの記入を完成する。全ての参加者は、身体検査、例えば血圧及び心拍数、乳房及び骨盤検査を受け、また子宮摘出を受けていない女性は、子宮内膜二重壁厚を測定する経膣超音波を受ける。安全性を評価するために、各患者について血清血液学検査、クレアチン及び尿窒素検査、肝機能検査、並びに尿検査が行われる。全ての基準測定は、１２週の治療後に又は最終試験診療時に反復される。
【０１１８】
ほてりの頻度及び重症度は、前の試験で広く使用された日誌を手本にして作られた日誌に記録される。７日目の日誌は、無作為化の前及び治験投薬の４週及び１２週の間に記入される。それぞれのほてりについて、重症度は、１（軽度）、２（中等度）又は３（重度）と評価される。ほてりスコアは、それぞれのほてりの重症度評点を合計し、ほてりの数で除算することによって算出される。
【０１１９】
さらに、治験投薬の際に、参加者に２週目及び８週目に接触し（電話で又は病院で）、アドヒアレンス及び有害事象を監視するために４週目に来診させた。投薬の小さい包みは、アドヒアレンスを評価するために個数が数えられ、有害事象が記録される。
【０１２０】
治験投薬中断後４週目に、各参加者に有害事象に関する情報を確認するために電話で接触する。自己報告された有害事象を、医薬品規制用語集Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ（ＭｅｄＤＲＡ）の体系を使用して分類する。
【０１２１】
参加者が膣内点状出血又は出血を報告する場合、あるいは経膣超音波検査によって測定される最終子宮内膜壁厚が５ｍｍを超えるか又は基準から２ｍｍ以上増大している場合には、診断子宮内膜生検が試験中に行われる。２人の盲検病理学者が、生検試料を、もしあるならば独立して評価する。この病理学者が組織学に関して同意しない場合には、別の第三の盲検病理学者がスライドを検査し、最終診断する。
【０１２２】
統計分析：参加者１８０人の試料を評価して、基準時から１２週までのほてりの頻度の％変化において２０％ポイントの群間差を検出する８０％能力（ｐｏｗｅｒ）を得る。
【０１２３】
全ての分析は、無作為化割付に従って、アドヒアレンスに関係なく及び欠損値に帰するか又は欠損値を繰り越すことなく処理する目的によるものである。多数の試験について調整は行われない。参加者の基準特性値は、直線回帰又はロジスティック回帰あるいは臨床施設及び閉経後経過年数について調整する比例オッズモデルを使用して比較される。
【０１２４】
一次分析は、治験薬群（ＳＧ５及びＳＧ１０）のそれぞれとプラセボ（ＰＧ）との間のほてりの頻度及びほてりスコアの基準から４週及び１２週までの変化を比較する。得られた結果は右に裾を引いていたので、時間（４週及び１２週  対  基準）、治療、及び時間と治療との相互作用、並びに臨床施設及び閉経後経過年数に関する項（ｔｅｒｍｓ）を用いた反復測定ｌｏｇ−ｌｉｎｋ  Ｐｏｉｓｓｏｎ一般化線形モデルが使用される。二次結果（生活の質、性機能及び不眠症スコア）の一次分析は、同様の方法を使用する。
【０１２５】
二次分析において、ＡＮＣＯＶＡを使用し、治療群とプラセボ群の間のほてりの回数の順位（ｒａｎｋ）変換％変化を比較するために現場及び閉経後経過時間を調整する。臨床現場及び閉経後経過年数について調整されたロジスティック回帰モデルを使用して、基準から１２週までの５０％以上のほてりの頻度の減少を有する各処置群の割合を比較する。
【０１２６】
治療群のいずれかの２％以上で生じる有害事象の頻度を、処置群同士の間で、適切な場合にはカイ二乗法及び厳密法を使用して比較し、臨床現場及び閉経後経過年数によって階層化される。
【０１２７】
予め特定された予備分析において、年齢（４５〜５０歳、５０〜５５歳、５５〜６０歳）、民族性（白人、その他）、閉経後経過年数（２年未満、２年又はそれ以上）、両側の卵巣摘出（有り、無し）、エストロゲン使用の履歴（有り、無し）、喫煙（現行、以前に有り又は全く無い）、現行アルコール使用（有り、無し）、体重指数（三分位数）、基本血清エストラジオール濃度（５ｐｇ／ｍｌ以下、５ｐｇ／ｍｌ以上）、及びほてりの基準頻度（三分位数）を含むサブグループの治療効果（１２週でのほてりの％変化）の差を調べるのに相互作用項が使用される。
【０１２８】
結果
結果は、無作為化される有資格女性の人数、各群（ＰＧ、ＳＧ５、ＳＧ１０）の女性の人数、試験全体を終えている参加者及び各群及び階層の参加者の人数、参加者全体の人数及び割り当てられた投薬全部を服用する各群の人数、白人及び非白人参加者全体の人数及び各群の人数、ほてりの基準中央値及び平均１日当たり頻度（±Ｓ．Ｄ．、ｐ）、中央値及び平均１日当たりほてりスコア（±Ｓ．Ｄ．、ｐ）、ほてり頻度の中央値及び平均変化（±Ｓ．Ｄ．、ｐ）並びに各評価間隔での中央値及び平均ほてりスコア（±Ｓ．Ｄ．、ｐ）を含む。
【０１２９】
また、プラセボと比較して生活の質、睡眠の質及び性機能の測定に対する治験薬による治療の効果も評価される。
【０１３０】
基準時及び試験の終了時の経膣超音波検査を受ける参加者の人数も記録される。試験の終了時に子宮内膜超音波検査を受ける参加者の人数も記録される。基準時及び１２週時の平均子宮内膜厚み（＋Ｓ．Ｄ．）が測定される。必要と思われる場合には、子宮内膜の生検も行われる。膣内出血又は点状出血を報告する参加者の人数も記録される。また、子宮内膜の生検は、承諾としてこれらの参加者の多くが同意する場合である。前記生検は、子宮内膜の過形成及び癌の形跡について評価される。
【０１３１】
試験中の何らかの重大な有害事象もまた、記録される。
【０１３２】
考察
治験薬による治療は、中等度〜重度の症状を有する健常な閉経後の女性のほてりの頻度及び重症度を低下させると考えられる。この試験の結果は、治験薬を、同じ用量又はそれよりも多い用量の治験薬を試験し得るさらなる臨床試験に進めるために使用し得る。
【０１３３】
また、治験薬が選択性ＥＲα作動薬であるので、エストロゲン補充療法に付随する有害事象、例えば子宮内膜増殖症及び癌は、治験薬について観察されるべきでないと考えられる。
【０１３４】
エストラジオールは閉経期のほてりの有効な治療法であるが、現在承認されている選択性エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）タモキシフェン及びラロキシフェンは、閉経期のほてりの発生を高める。エストラジオールもＳＥＲＭもエストロゲン受容体サブタイプ選択性ではないので、ＥＲα又はＥＲβのどちらのエストロゲン受容体がこれらの作用に介在するかは明らかではない。ヒト乳癌細胞におけるエストロゲンによるＥＲαの活性化は、増殖及び腫瘍形成を招き、これに対してＥＲβの活性化は、増殖阻止をもたらし且つ腫瘍を形成しないことが明らかにされている。この試験は、ほてりが治験薬によって軽減される得る事を実証するデータを得るために設計される。この試験は、さらに、治験薬に付随し得る有害事象に関する予備データを得るためにさらに設計される
【０１３５】
結論：
治験薬による治療は、健常な閉経後の女性においてほてりの頻度及び重症度を減少させると予想される。また高投与量の治験薬は、低投与量よりも有効であると予想される。この試験は、さらに、ＥＲβ経路がほてりの治療において役割を果たし得るというさらなる確認を提供すると予想される。
【０１３６】
本発明をある一定の実施形態及び実施例に関して例証したが、当業者にはその他の実施形態が本発明の範囲内において構想されることが認識されるであろう。
【０１３７】
本発明の好ましい実施形態を本明細書で示し、説明したが、このような実施形態が単なる例として提供されることは、当業者には明らかであろう。当業者は、本発明から逸脱することなく、多数の改変、変化及び置換を思い付くであろう。本発明の実施において本明細書に記載される本発明の実施形態の種々の代替を使用し得ることが、理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すること及びそれによってこれらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにこれらの均等物が保護されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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