(57)【要約】本発明者らは、キナゾリン類化合物がもつ大きな可能性の観点から、新規な構造的特徴を有する非常に多数の新規化学物質類の合成およびそのスクリーニングを開始した。この結果、意外にもまた予期せぬことに、４位に３−エチニルアニリノ基を有し、さらに６位および７位に特異的置換アルコキシ基をもつキナゾリン類が、他の著名なキナゾリン型薬剤と比較して、非常に強力で特異的な抗増殖特性を与えることを見出した。また、驚くべきことに、本発明の化合物類はかなり低毒性であり、この安全性の特徴は治療上極めて有益である。本発明中記載した新規化学物質は一般式（１）で表されるが、これら化学物質は過去に合成されておらず、また、治療上の利益および安全性についての研究もなされていない。なお、Ｒ１およびＲ２の構造が式（３）で表されるとき、化合物式（１）はＮＲＣ−２６９４である。【化１】2011509995.tif 000021
2011509995.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
2011509995.tif 000011
（式中、Ｒ１およびＲ２は式（２）
【化２】
2011509995.tif 000012
で表される。）
で示されるキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２が式（３）
【化３】
2011509995.tif 000013
で表されることを特徴とする請求項１に記載の式（１）のキナゾリン誘導体（すなわちＮＲＣ−２６９４）またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
前記薬学的に許容される塩が１塩酸塩（すなわちＮＲＣ−２６９４Ａ）であることを特徴とする請求項２に記載の式（１）のキナゾリン誘導体。
【請求項４】
前記薬学的に許容される塩が２塩酸塩（すなわちＮＲＣ−２６９４Ｂ）であることを特徴とする請求項２に記載の式（１）のキナゾリン誘導体。
【請求項５】
温血動物体内で、ＥＧＦタイプの受容体チロシンキナーゼ酵素類を阻害する方法であって、前記方法は、
請求項１乃至請求項４に記載される式（１）のキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩の有効量を、前記動物に投与する工程を有する。
【請求項６】
温血動物体内で、Ｅｒｂ−２、Ｅｒｂ−３およびＥｒｂ−４チロシンキナーゼ感受性癌のＥｒｂグループ受容体類を阻害する方法であって、前記方法は、
請求項１乃至請求項４に記載される式（１）のキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩の有効量を、前記動物に投与する工程を有する。
【請求項７】
温血動物体内で、ＥＧＦタイプの受容体チロシンキナーゼ酵素類を阻害する方法であって、前記方法は、
請求項２に記載される式（１）のキナゾリン誘導体ＮＲＣ−２６９４またはその薬学的に許容される塩の有効量を、前記動物に投与する工程を有する。
【請求項８】
温血動物体内で、Ｅｒｂ−２、Ｅｒｂ−３およびＥｒｂ−４チロシンキナーゼ感受性癌のＥｒｂグループ受容体類を阻害する方法であって、前記方法は、
請求項２に記載される式（１）のキナゾリン誘導体ＮＲＣ−２６９４またはその薬学的に許容される塩の有効量を、前記動物に投与する工程を有する。
【請求項９】
温血動物体内で、ＶＥＧＦタイプの受容体キナーゼ感受性癌を阻害する方法であって、前記方法は、
請求項２に記載される式（１）のキナゾリン誘導体ＮＲＣ−２６９４またはその薬学的に許容される塩の有効量を、前記動物に投与する工程を有する。
【請求項１０】
温血動物体内で、ＥＧＦタイプの受容体キナーゼ感受性癌を阻害する方法であって、前記方法は、
請求項３および請求項４に記載されるキナゾリン誘導体ＮＲＣ−２６９４ＡおよびＮＲＣ−２６９４Ｂの有効量を、前記動物に投与する工程を有する。
【請求項１１】
温血動物体内で、Ｅｒｂ−２、Ｅｒｂ−３およびＥｒｂ−４チロシンキナーゼ感受性癌のＥｒｂグループ受容体類を阻害する方法であって、前記方法は、
請求項３および請求項４に記載されるキナゾリン誘導体ＮＲＣ−２６９４ＡおよびＮＲＣ−２６９４Ｂの有効量を、前記動物に投与する工程を有する。
【請求項１２】
温血動物体内で、ＶＥＧＦタイプの受容体キナーゼ感受性癌を阻害する方法であって、前記方法は、
請求項３および請求項４に記載されるキナゾリン誘導体ＮＲＣ−２６９４ＡおよびＮＲＣ−２６９４Ｂの有効量を、前記動物に投与する工程を有する。
【請求項１３】
請求項１に記載の式（１）のキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩を合成する方法であって、前記方法は、
ａ）式（４）のキナゾリン
【化４】
2011509995.tif 000014
を塩化ホスホリルまたは塩化オキサリルと反応させて式（５）
【化５】
2011509995.tif 000015
の４−クロロキナゾリンを得る工程と、
ｂ）上記式（５）の４−クロロキナゾリンを３−エチニルアニリンと縮合反応させて、
式（１）                
【化６】
2011509995.tif 000016
（式中、Ｒ１およびＲ２は式（２）
【化７】
2011509995.tif 000017
で表される。）
で示されるキナゾリン誘導体を得る工程を有する。
【請求項１４】
請求項２に記載の式（１）のキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩を合成する方法であって、前記方法は、
ａ）式（４ａ）のキナゾリン
【化８】
2011509995.tif 000018
を塩化ホスホリルまたは塩化オキサリルと反応させて式（５ａ）
【化９】
2011509995.tif 000019
で示される対応する４−クロロキナゾリンを得る工程と、
ｂ）上記式（５ａ）の４−クロロキナゾリンを３−エチニルアニリンと縮合反応させて、キナゾリン誘導体ＮＲＣ−２６９４
【化１０】
2011509995.tif 000020
を得る工程を有する。
【請求項１５】
上記実施例１乃至実施例３に基本的に記載した前記キナゾリン誘導体ＮＲＣ−２６９４を合成する方法。
【請求項１６】
上記実施例４に基本的に記載した１塩酸塩ＮＲＣ−２６９４Ａを合成する方法。
【請求項１７】
上記実施例５に基本的に記載した２塩酸塩ＮＲＣ−２６９４Ｂを合成する方法。
【請求項１８】
請求項１に記載した式（１）の前記キナゾリン誘導体の最大耐用量（ＭＴＤ）および急性毒性を、上記の実施例６に基本的に記載したように評価する方法。
【請求項１９】
請求項１に記載した式（１）の前記キナゾリン誘導体を、上記実施例７に基本的に記載したようにインビトロおよびインビボで評価し、および治療効果を評価する方法。
【請求項２０】
上記請求項１乃至請求項１９に記載した式（１）のキナゾリン誘導体、またはその薬学的に許容される塩からなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌作用を有し、それゆえにヒトの治療方法に有用な６，７−ジアルコキシキナゾリン誘導体またはその薬学的に許容される塩に関する。また、本発明は、前記キナゾリン誘導体の製造方法および前記キナゾリン誘導体を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬および癌などの細胞増殖疾患に関する従来の治療方法は、その大部分がＤＮＡ合成阻害化合物を利用するものである。このような化合物は細胞毒性をもつため、急速に分裂する腫瘍細胞に選択性を示す場合にのみ、薬効を得ることができる。
【０００３】
近年、ＤＮＡの一部が癌遺伝子に形質変換されることで、細胞が癌化することが発見された。この癌遺伝子は、活性化して悪性腫瘍細胞の形成を引き起こす遺伝子である（非特許文献１参照）。いくつかの癌遺伝子類はチロシンキナーゼ酵素類をコードし、ある種の増殖因子受容体類はチロシンキナーゼ酵素類である（非特許文献２参照）。
【０００４】
受容体チロシンキナーゼ類は、細胞複製を開始させる生化学的信号を発信する点で重要である。前記キナーゼ類は、上皮細胞成長因子などの増殖因子に対する細胞外結合領域や、キナーゼのように機能してタンパク質中のチロシンアミノ酸をリン酸化し、その結果、細胞増殖に影響を与える細胞内部分を有している。また、このようなキナーゼ類は、乳癌（非特許文献３参照）および、小腸癌、直腸癌および胃癌などの消化器系癌（非特許文献４参照）などの一般的なヒトの癌に、頻繁に存在することが知られている。また、正常細胞よりも悪性腫瘍細胞において、より頻繁にチロシンキナーゼ活性（ＴＫ活性）が検出されることが発見されている（非特許文献５参照）。
【０００５】
さらに最近になって、ＴＫキナーゼ活性を有する上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）が、脳、肺、扁平上皮細胞、膀胱、乳、頭および頚部、食道、甲状腺などのヒトの多数の癌において、過剰発現していることが示された（非特許文献６参照）。前記上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、Ｅｒｂ１／ＨＥＲ１、Ｅｒｂ／ＨＥＲ２、Ｅｒｂ／ＨＥＲ３、およびＥｒｂ／ＨＥＲ４の４つの受容体からなる受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの一員である。
【０００６】
ＥＧＦＲ−ＴＫ活性を阻害する重要な戦略として、小さな合成分子類が開発されてきた（非特許文献７参照）。例えば、ゲフィチニブ（イレッサＴＭ、アストラゼネカ社）、エルロチニブ（ＯＳＩ−７７４、タルセバＴＭ）、ＰＤ−１８３８０５、ＰＫＩ−１６６、ＥＫＢ−５６９、ＰＤ−１６８３９３、ＣＧＰ−５９３６２などの、ある種のキナゾリン誘導体は、いくつかの形態の癌が治療可能になるように広範囲にわたって研究されてきた（非特許文献８および非特許文献９参照）。また、欧州特許出願である特許文献１乃至特許文献５には、ＴＫ阻害特性の結果として抗癌特性を有するある種のキナゾリン誘導体が開示される。
【０００７】
また、米国特許の特許文献６乃至特許文献１１には、キナゾリン核の４位に置換アニリノ基をもち、６位および７位に様々な官能基化アルキル基をもつなどの構造的特徴を有するキナゾリン誘導体が述べられている。
【０００８】
具体的には、特許文献７および特許文献８には、Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン（ゲフィチニブ）が記載され、特許文献１０および特許文献１１には、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリンアミン（エルロチニブ）が述べられている。さらに、特許文献１２および特許文献１３には、これら２種類のよく普及している抗癌剤の合成法または結晶多形が種々述べられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許出願第０５６６２２６号明細書
【特許文献２】欧州特許出願第０６０２８５１Ａ１号明細書
【特許文献３】欧州特許出願第０６３５５０７Ａ１号明細書
【特許文献４】欧州特許出願第０６３５４９８Ａ１号明細書
【特許文献５】欧州特許出願第０５２０７２２Ａ１号明細書
【特許文献６】米国特許第５４７５００１号明細書
【特許文献７】米国特許第５４５７１０５号明細書
【特許文献８】米国特許第５６１６５８２号明細書
【特許文献９】米国特許第５７７０５９９号明細書
【特許文献１０】米国特許第５７４７４９８号明細書
【特許文献１１】米国特許第６９００２２１号明細書
【特許文献１２】国際公開第ＷＯ２００５／０７０９０９号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第ＷＯ２００７／０６０６９１Ａ２号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第ＷＯ０６／０９０４１３号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｒａｄｓｈａｓ，Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，１９８６，１：９１頁
【非特許文献２】Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８９，Ｃｈａｐｔ．１３
【非特許文献３】Ｓａｉｍｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９８８，５８：４５８頁
【非特許文献４】Ｂｏｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓ．，１９８７，１：１４９頁
【非特許文献５】Ｈｕｎｔｅｒ，Ｃｅｌｌ，１９８７，５０：８２３頁
【非特許文献６】Ｗ．Ｊ．Ｇｕｌｌｉｃｋ，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．１９９１，４７：８７頁
【非特許文献７】Ａｒｔｅａｇａ  ＣＬ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２００３，２８４：１２２−１３０頁
【非特許文献８】Ｂａｓｅｌｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ２００２，６３：６−１６頁
【非特許文献９】Ｃｏｈｅｎ  ＲＢ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ，２００３，２：２４６−２５１頁
【非特許文献１０】Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９４９，９６：９９−１１３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者らは、前記キナゾリン類化合物がもつ大きな可能性の観点から、新規な構造的特徴をもつ非常に多数の新規化学物質類の合成およびそのスクリーニングを開始した。この結果、意外にもまた予期せぬことに、４位に３−エチニルアニリノ基を有し、さらに６位および７位に特異的置換アルコキシ基をもつキナゾリン類が、他の著名なキナゾリン型薬剤と比較して、非常に強力で特異的な抗増殖特性を与えることを見出した。また、驚くべきことに、本発明の化合物類はかなり低毒性であり、この安全性特性は治療上きわめて有利である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明で述べる新規化学物質は一般式（１）で表されるが、これら化学物質は過去に合成されておらず、また、治療上の利益および安全性についての研究もなされていない。
【００１３】
【化１】
2011509995.tif 000003
（式中、Ｒ１およびＲ２は、式（２）
【化２】
2011509995.tif 000004
で表される。）          
ここで、Ｒ１およびＲ２が以下の式（３）
【化３】
2011509995.tif 000005
で表されるとき、式（１）の化合物はＮＲＣ−２６９４である。    
【００１４】
また、ＮＲＣ−２６９４の１塩酸塩をＮＲＣ−２６９４Ａとし、２塩酸塩をＮＲＣ−２６９４Ｂと表す。本発明の新規化合物、特にＮＲＣ−２６９４は、予期せぬ優れた抗癌／抗増殖特性を有するとともに、以下述べるようにこのクラスの一般的薬剤と比べると治療上の利益をさらに提供するものである。
【００１５】
１）比較的低い阻害濃度
ＭＴＴ増殖測定法における本発明の化合物の阻害濃度（ＩＣ５０）は、４０−９０ｎｇ／ｍｌ（１００−２００ナノモーラー）の値を示した。一方、エルロチニブ塩酸塩は８３６ｎｇ／ｍｌ（１９４５ナノモーラー）の値を示す。同じ結果が、ウエスタンブロット分析およびマトリゲル浸潤測定によって確認された。
【００１６】
２）完全な腫瘍の退縮
Ａ５４９ヒト肺腫瘍細胞を移植したヌードマウスに、本発明の化合物を１０ｍｇ／ｋｇで経口投与することによって、完全な腫瘍の退縮が見られた。対照試験として、エルロチニブ塩酸塩を投与したが、１００ｍｇ/ｋｇにおいても完全な腫瘍の退縮を起こすことができなかった。Ａ５４９を移植したマウスの肺組織の目視検査、およびルシフェラーゼ発現試験でも、同様の観察結果を確認した。
【００１７】
３）薬剤有効性
有効投与量試験から、本発明の一般的化合物、すなわちＮＲＣ−２６９４のＥＤ５０値は６．３ｍｇ／ｋｇであった。一方、エルロチニブ塩酸塩のＥＤ５０値は２２ｍｇ／ｋｇであった。エルロチニブ塩酸塩の場合には５０−６０％の治療効果しか見られなかったのに対し、ＮＲＣ−２６９４では１００％の治療効果が見られた。
【００１８】
４）他に類を見ない追加の特性
本発明の化合物類（一般にＮＲＣ−２６９４）は、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、およびＶＥＧＦＲ受容体類の発現レベルをダウンレギュレーションするという追加特性を示した。この独特かつ非常に卓越した驚くべき結果は、全く予期せぬものであり、エルロチニブ塩酸塩には全く見られなかった。
【００１９】
５）安全性の特徴
典型的にはＮＲＣ−２６９４である本発明の化合物類の安全性の特徴は、非常に有望であるとともに予期しないほど広範囲かつ極めて有益なものである。例えば、エルロチニブ塩酸塩の最大耐用量（ＭＴＤ）が２０００ｍｇ／ｋｇであるのに対して、ＮＲＣ−２６９４は５００ｍｇ／ｋｇの最大耐用量を示した。
【００２０】
ＮＲＣ−２６９４の広い治療ウインドウは、エルロチニブ塩酸塩のＬＤ０値が５００ｍｇ／ｋｇであるのに対して、ＮＲＣ−２６９４のＬＤ０値が２０００ｍｇ／ｋｇであることによって証明された。なお、ＮＲＣ−２６９４のＬＤ５０値は正確には測定できなかったが、一方、エルロチニブ塩酸塩のＬＤ５０値は８０５ｍｇ／ｋｇと測定された。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】エルロチニブ塩酸塩およびＮＲＣ−２６９４で処理したＡ５４９細胞のウエスタンブロット分析の結果を示す。用量依存的なＥＧＦＲレベルの減少が見られた。
【図２】エルロチニブおよびＮＲＣ−２６９４で処理したＨ１２９９細胞のマトリゲル浸潤測定の結果を示す。用量依存的な浸潤の減少が見られた。
【図３】ヒト肺腫瘍細胞Ａ５４９を移植したヌードマウスに、エルロチニブ塩酸塩およびＮＲＣ−２６９４を経口およびｉｐ投与することで誘発された腫瘍サイズの縮小を示す。
【図４】経口またはｉｐ経路で種々の濃度のエルロチニブ塩酸塩およびＮＲＣ−２６９４を処置したＡ５４９ルシフェラーゼ発現細胞担持ヌードマウスから採取した肺を示す。
【図５】エルロチニブ塩酸塩およびＮＲＣ−２６９４処置後における、ヌードマウス担癌肺のＨ＆Ｅ染色切片を示す。
【図６】Ａ５４９ルシフェラーゼ発現細胞移植ヌードマウスに、種々の濃度のエルロチニブ塩酸塩を経口およびｉｐ経路で処置した結果を示す。
【図７】Ａ５４９ルシフェラーゼ発現細胞移植ヌードマウスに、種々の濃度のＮＲＣ−２６９４を経口およびｉｐ経路で処置した結果を示す。
【図８】ＨＥＲ−１，２，３，４およびＶＥＧＦＲなど他の受容体類に関してＮＲＣ化合物の効果をインビトロで試験した結果を示す。Ａ５４９細胞にＮＲＣ−２６９４を処理した後に、Ｅｒｂ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４レベルの減少が見られた。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下の実施例は、本発明の化合物類の合成方法、およびこれら化合物類の優れた生物学的有効性を示す目的で挙げたものであり、本発明の範囲または精神を限定するものではない。
【００２３】
【化４】
2011509995.tif 000006
【実施例１】
【００２４】
Ｎ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン（（１）、ＮＲＣ−２６９４）の合成
１）４−クロロ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリン（５ａ）の合成
メカニカル撹拌機、還流冷却器、側管付き滴下ロート、およびソケット式温度計を取り付けた、洗浄し乾燥させた５リットルの４頚丸底フラスコに、クロロホルム（３０００ｍｌ）、ジメチルホルムアミド（３０ｍｌ）を入れ、続いて、７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）−３，４−ジヒドロ−キナゾリン−４−オン（４ａ）（１５０ｇ）を入れた。この化合物（４ａ）は、特許文献１２に記載された実施例１の合成法に従って得た。次に、塩化オキサリル（１２０ｇ）をゆっくりと加え、反応混合物を還流温度まで加熱し、還流温度で約５時間維持した。ＨＰＬＣ試験によって反応の完結を観察した。次に、溶媒のクロロホルムおよび過剰の塩化オキサリルを、減圧下蒸留して除いた。反応混合物を約４０℃に冷却し、クロロホルム（３００ｍｌ）を加え、再び減圧下で溶媒を蒸留して除いた。次に、反応混合物を室温にまで冷却し、アセトニトリル（３０００ｍｌ）を加えた後１０−１５分間撹拌し、次の工程に進むために窒素雰囲気下に保存した。
【００２５】
２）Ｎ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン（（１）、ＮＲＣ−２６９４）の合成
アセトニトリル中、上記工程１）で得られた塩化化合物を入れた、メカニカル撹拌機、還流冷却器、およびソケット式温度計を取り付けた５リットルの４頚丸底フラスコに、３−エチニルアニリン（６９ｇ）を約１０−１５分かけて徐々に加えた。反応混合物を還流温度まで加熱し、還流温度で約４時間維持した。ＨＰＬＣ試験によって反応の完結を観察した。続いて、反応混合物を２５−３５℃に冷却してろ過した。得られた固まりをアセトニトリル（５００ｍｌ）で洗浄後、この固まりを乾燥した。
【００２６】
上記乾燥した粗生成物を、別の５リットルの丸底フラスコに入れ、水（２５００ｍｌ）を加えた後に、６０−６５℃に徐々に昇温し、希釈水酸化ナトリウム溶液を用いて反応混合物のｐＨを１０−１２に調整した。分離した固形生成物をろ過し、水で洗浄し、７０−７５℃で乾燥して、１７３．０ｇのＮ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミンを、やや黄色がかった白色固体として得た。
【００２７】
３）Ｎ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン合成物のトルエンによる再結晶  
メカニカル撹拌機、還流冷却器、およびソケット式温度計を取り付けた、５リットルの４頚丸底フラスコに、トルエン（３７５０ｍｌ）を入れ、続いて、上記実施例１で記載した工程で得た、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン（５０ｇ）を入れた。反応混合物を９０−９５℃に加熱して固体を完全に溶かし、次に、活性炭処理を行ってろ過した。得られたろ液を２５−３５℃に冷却し、約１時間保持した後、ろ過した。得られた物質を乾燥して、４０．１５ｇのＮ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミンを白色の結晶固体として得た。
融点：  １８５−１８７℃
純度：  ９９．７２％（ＨＰＬＣ）
ＩＲ（ＫＢｒ）（ｃｍ−１）：  ３２８０．９、２９５４．６、２８１０．３、１６２０．１、１６０４．２、１５７２．１、１５２７．７、１５０５．２、１４８４、１４３０．５、１３８８．２、１２４７．５、１２１１．２、１１４０．３、１１１０．４、１０１０．３、９５３．４、８５９．６、７８４．２ｃｍ−１
１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ６）：  ９．５７（ｓ、１Ｈ）、８．４８（ｓ、１Ｈ）、７．９９（ｓ、１Ｈ）、７．８６−７．９７（ｄ、２Ｈ）、７．３４−７．４４（ｔ、１Ｈ）、７．１８−７．２１（ｓ、２Ｈ）、４．１５−４．２１（ｔ、４Ｈ）、３．９２（ｓ、３Ｈ）、３．５−３．６（ｔ、４Ｈ）、２．４−２．５２（ｍ、５Ｈ）、１．９５−２．０１（ｍ，２Ｈ）．
質量分析：  ４１９．４（Ｍ＋１）
【実施例２】
【００２８】
Ｎ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミンのアセトニトリルによる再結晶  
メカニカル撹拌機、還流冷却器、およびソケット式温度計を取り付けた２リットルの３頚丸底フラスコにアセトニトリル（１０００ｍｌ）を入れ、続いて、上記実施例１で記載した工程で得た、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン（２５ｇ）を入れた。反応混合物を６５−７０℃に徐々に加熱して固体を完全に溶かし、次に、活性炭処理を行ってろ過した。得られたろ液を別の丸底フラスコに移し、１０−１５℃に徐々に冷却し、同温にて３０分間保持した。得られた物質をろ過し、冷アセトニトリルで洗浄後に乾燥した。２０．５０ｇのＮ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミンを白色の結晶固体として得た。
融点：  １８６−１８７℃
純度：  ９９．６８％（ＨＰＬＣ）
【実施例３】
【００２９】
Ｎ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミンの酢酸エチルによる再結晶  
メカニカル撹拌機、還流冷却器、およびソケット式温度計を取り付けた３リットルの３頚丸底フラスコに酢酸エチル（２０００ｍｌ）を入れ、続いて、上記実施例１で記載した工程で得た、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン（２５ｇ）を入れた。反応混合物を６５−７０℃に徐々に加熱して固体を完全に溶かし、次に、活性炭処理を行ってろ過した。得られたろ液を別の丸底フラスコに移し、１０−１５℃に徐々に冷却し、同温にて３０分間保持した。得られた結晶物質をろ過し、冷酢酸エチルで洗浄後に乾燥した。２０．９５ｇのＮ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミンを白色の結晶固体として得た。
融点：  １８５−１８７℃
純度：  ９９．７％（ＨＰＬＣ）
【実施例４】
【００３０】
Ｎ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン  １塩酸塩  の合成（ＮＲＣ−２６９４Ａ）  
メカニカル撹拌機、還流冷却器、およびソケット式温度計などを取り付けた５００ｍｌの３頚丸底フラスコにイソプロピルアルコール（２５０ｍｌ）を入れ、続いて、上記実施例１の工程で得た、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン（５ｇ）を入れた。反応混合物の温度を６５−７０℃に上げて固体を完全に溶かし、次に、活性炭処理を行ってろ過した。得られたろ液を、約５５−６０℃に冷却し、イソプロピルアルコールに溶かした塩化水素ガス１モル当量を加えた。１塩酸塩が溶液から分離した。反応混合物を還流温度にて約２時間保持し、続いて、室温に冷却後、ろ過および乾燥した。５．１ｇのＮ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン  １塩酸塩を白色の結晶物質として得た。
純度：  ９９．８％（ＨＰＬＣ）
ＨＣｌ含量（化学分析）：  ８．１９％（理論値：８．０１％）
ＩＲ（ＫＢｒ）（ｃｍ−１）：  ３４０７、３３０５、３２５９．５、２９３４、２６１９、１６２５．９、１５９３．８、１５７９．９、１５３０．８、１５１２、１４７６．９、１３９２．２、１３５６．８、１２８２．１、１２４２．１、１２０７．９、１１４１．３、１１００．８、１０７６．１、１０４２．１、１０２６．５、１０１１．５、９５７．７、９４１．５、９２２．１、８５７．３、８５２、８３８．１、７９６、７８２．４
【実施例５】
【００３１】
Ｎ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン  ２塩酸塩  の合成（ＮＲＣ−２６９４Ｂ）  
メカニカル撹拌機、還流冷却器、およびソケット式温度計を取り付けた５００ｍｌの３頚丸底フラスコにイソプロピルアルコール（２５０ｍｌ）を入れ、続いて、上記実施例１の工程で得た、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン（５ｇ）を入れた。反応混合物の温度を６５−７０℃に上げて全ての固体を溶かし、次に、活性炭処理を行ってろ過した。得られたろ液を約５５−６０℃に冷却し、イソプロピルアルコールに溶かした塩化水素ガス２モル当量を加えた。２塩酸塩が溶液から分離した。反応混合物を還流温度にて約２時間保持し、続いて、室温に冷却後、ろ過および乾燥した。５．５ｇのＮ−（３−エチニルフェニル）−７−メトキシ−６−[３−（４−モルホリニル）プロポキシ]−４−キナゾリンアミン  ２塩酸塩を白色の結晶物質として得た。
純度：  ９９．７８％（ＨＰＬＣ）
ＨＣｌ含量（化学分析）：  １４．９％（理論値：１４．８３％）
ＩＲ（ＫＢｒ）（ｃｍ−１）：  ３４０６．８、３１９４．１、２９４２．７、２６８１．９、２６２３．６、１６３３．７、１５６６．２、１５２８．６、１５１２．５、１４３８．６、１３５９．６、１２８２．３、１２１８．３、１１５７．１、１１３２．７、１１０５．９、１０７５．６、１００１．９、９４２．１、８７５．３、８１６．２、７８７．２
【実施例６】
【００３２】
最大耐用量（ＭＴＤ）および急性毒性評価（表１および表２）
雌雄のスイスアルビノ系マウス（体重２０−２５ｇ）で、ＭＴＤ初期例示試験を行った。
本試験は、ＯＥＣＤガイドライン規則４２０に従って行ない、概日周期を避けて午前９時から午後５時の間に実施した。エルロチニブおよびＮＲＣ−２６９４化合物を２％アラビアゴムに懸濁し、５、５０、３００および２０００ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与（ｐｏ）した。なお、中間投与量は死亡率に応じて投与した。薬剤投与後６時間まで、１時間ごとに総体的行動変化について動物を観察した。さらに、死亡した場合には、薬剤投与後７２時間まで死亡率について動物観察を行った。生存動物は全て、化合物の消化管からの吸収を明らかにするために解剖した。
【００３３】
また、エルロチニブおよびＮＲＣ−２６９４の急性毒性試験を、雌雄のマウスで行った。５００、７５０、１０００および２０００ｍｇ／ｋｇの投与量で、各群を５匹として経口投与した。全ての動物について、薬剤投与後１４日間死亡率を観察した。生存動物は全て、化合物の消化管からの吸収を明らかにするために解剖した。
また、ＬＤ５０は、ＬｉｔｃｈｆｉｅｌｄおよびＷｉｌｃｏｘｏｎ（非特許文献１０参照）の方法を用いて測定した。
表１および表２に毒性試験の結果を示す。エルロチニブ塩酸塩の最大耐用量（ＭＴＤ）は５００ｍｇ／ｋｇ（ｐｏ）であったが、一方、ＮＲＣ−２６９４のＭＴＤは２０００ｍｇ／ｋｇ（ｐｏ）であった。同様にして、エルロチニブ塩酸塩のＬＤ０は５００ｍｇ／ｋｇ（ｐｏ）であり、ＮＲＣ−２６９４のＬＤ０は２０００ｍｇ／ｋｇ（ｐｏ）であった。従って、エルロチニブ塩酸塩をしのぐ、ＮＲＣ−２６９４の予期せぬ驚くべき低毒性と安全性の特徴が確かめられた。
【００３４】
表１．エルロチニブ塩酸塩とＮＲＣ−２６９４との比較（ＭＴＤ）  
（マウスによる初期例示試験）
【表１】
2011509995.tif 000007
【００３５】
表２．マウス急性毒性試験（単一用量７日間観察）
【表２】
2011509995.tif 000008
＊ＬＤ０：７日間経過後にも死亡は観察されなかった。
【実施例７】
【００３６】
インビトロおよびインビボにおける評価試験と治療効果の評価
試料：エルロチニブを対照薬として使用した。本発明の新規化合物の生物学的活性を、エルロチニブをポジティブコントロールとして比較して試験した。
【００３７】
１）ＭＴＴ増殖測定
ＭＴＴ[３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム  ブロミド]測定は、生存細胞由来のミトコンドリアの脱水素酵素能に基づく測定であり、１９８３年にＭｏｓｍａｎｎによって最初に報告された。この測定では、脱水素酵素が淡黄色のＭＴＴのテトラゾリウム環を開裂させ、細胞膜透過性が非常に低い深青色のホルマザン結晶を生成する能力を有するので、この結果、健全な細胞内にホルマザン結晶が蓄積する。界面活性剤を添加して細胞を可溶化すると、このホルマザン結晶は遊離して可溶化する。生存細胞の数は、生じたホルマザン生成物の濃度に直接比例するので、簡単な比色試験を用いて定量できる。このＭＴＴ増殖測定は、０−１０００ｎｇ／ｍｌ濃度のエルロチニブおよび試験化合物を用いて、Ａ５４９細胞およびＨ１２９９細胞で実施した。また、プロトコールはＡＴＣＣに基づき、製造者説明書（カタログ番号：３０−１０１０Ｋ）に従った。
【００３８】
ＭＴＴ増殖測定より、本発明の化合物の阻害濃度（ＩＣ５０）は、４０−９０ｎｇ／ｍｌ（１００−２００ナノモーラー）の範囲にあることが確かめられた。一方、ポジティブコントロールとして用いた「エルロチニブ塩酸塩」のＩＣ５０値は、せいぜい８３６ｎｇ／ｍｌ（１９４５ナノモーラー）である。従って、本発明の新規化合物は、エルロチニブ塩酸塩より少なくとも１０倍強いことが示された。
【００３９】
２）ウエスタンブロット分析：（図１） 
ＭＴＴ増殖測定から決定した最善の薬剤濃度を用いて、好適な培地で約７２時間、１×１０６個のＨ１２９９細胞またはＡ５４９細胞を処理した。その後、細胞可溶化物を抽出し、減圧条件下１０％ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで分画した。このゲルを処理ナイロン膜（Ｂｉｏｒａｄ）上でウエスタンブロットし、ＥＧＦＲ、Ｐ１３Ｋ、およびＡＫＴについて免疫探査した。
【００４０】
この結果、ＥＧＦＲ発現の明確な変化が投与量依存的に観察された。ＮＣＲ−２６９４は、８０ｎｇ／ｍｌ（１９０ナノモーラー）濃度において、８００ｎｇ／ｍｌ（１８６０ナノモーラー）濃度のエルロチニブ塩酸塩と同等のＥＧＦＲ発現の阻害を起こした。従って、ＮＣＲ−２６９４は、エルロチニブ塩酸塩に比べて１０倍の薬効をもつことが明らかである。
【００４１】
３）マトリゲル浸潤測定：（図２） 
種々の濃度のＮＲＣ化合物（ＭＴＴ測定で決めた）存在下、Ｈ１２９９細胞およびＡ５４９細胞のインビトロ浸潤能を、ボイデンチャンバー測定の変法を用いて評価した。これらの化合物で細胞を４８時間処理した。１×１０６個の細胞を、０．２％ＢＳＡを添加した無血清培地６００μｌ中に懸濁し、マトリゲル（０．７ｍｇ／ｍｌ）でコーティングしたトランスウェルチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、カタログ番号０７−２００−１５８、ピッツバーグ、ペンシルバニア州、米国）の上部区画に配置した。前記チャンバーの下部区画には、血清培地２００μｌを満たして前記細胞を２４時間遊走させた。培養後、細胞を固定化し、Ｈｅｍａ−３を用いて染色し、先に述べたように（Ｍｏｈａｎａｎ等、１９９３年）定量した。浸潤パーセントとして遊走細胞を定量した。化合物ＮＲＣ−２６９４は、投与量依存的に明白な浸潤減少を示した。
【００４２】
４）ヌードマウスにおける皮下肺腫瘍のインビボ評価：（図３）
ヌードマウスの右後肢側面に２×１０６個のＡ５４９細胞を移植した。一定の腫瘍（＞２ｍｍ）を観察中、ポジティブコントロールとして用いたエルロチニブ塩酸塩を加えた試験化合物類を、経口または腹腔内投与で与えた。また、エルロチニブ塩酸塩１００ｍｇ／ｋｇを、ベースライン投与量とした。
【００４３】
腫瘍サイズを測定した結果、１０ｍｇ／ｋｇ投与量でのＮＲＣ−２６９４処理マウスにおいて、腫瘍が完全に退縮したことが観測された。しかし、エルロチニブ塩酸塩を同様に処理したコントロール群では、１００ｍｇ／ｋｇ投与量レベルにおいてもなお腫瘍が存在した。以上より、本発明の化合物（ＮＲＣ−２６９４）の薬効が１０倍優れていることが確かめられた。
【００４４】
５）薬剤処理後にヌードマウスから採取した肺組織の評価：（図４）  
Ａ５４９ルシフェラーゼ発現細胞を移植し、経口／腹腔内経路によって種々の濃度のエルロニチブ塩酸塩およびＮＲＣ−２６９４で処置したヌードマウスから採取した肺を、残存腫瘍について試験した。
【００４５】
ＮＲＣ−２６９４処理群では腫瘍が完全に退縮したことが観測されたが、一方で、エルロチニブ塩酸塩処理群では腫瘍がなお存在した。このことから、本発明の化合物が、予期せぬ、驚くほど優れた薬効をもつことが確かめられた。
【００４６】
６）肺組織中の腫瘍の可視化評価：（図５）
Ａ５４９細胞を肺内注入してヌードマウスに移植した。このマウスを、エルロチニブ塩酸塩およびＮＲＣ−２６９４により、投与量２．５および２０ｍｇ/ｋｇで経口／腹腔内径路を用いて処置した。毎日薬剤を処置して３０日後に、マウスを殺処分して肺を採取した。肺組織を１０％緩衝ホルムアルデヒドで固定化し、パラフィンに埋め込んで切片化した。定められたプロトコールに従って切片をＨ＆Ｅ染色し、固形腫瘍またはびまん性腫瘍を可視化した。
【００４７】
全投与量においてＮＲＣ−２６９４処理群はエルロチニブ塩酸塩処理群よりも良好な結果を示したことから、ＮＲＣ−２６９４の優れた薬効が確かめられた。
【００４８】
７）Ａ５４９ルシフェラーゼ発現細胞を移植したヌードマウス：（図６および図７）
Ａ５４９ルシフェラーゼ発現細胞を移植した、経口および腹腔内経路で種々の濃度のエルロニチブ塩酸塩およびＮＲＣ−２６９４と処置したヌードマウスの腫瘍を観察した。図６および図７に画像による観察結果を示す。ＮＲＣ−２６９４処理群はエルロチニブ塩酸塩処理群よりも良好な結果を示すことが観察された。ＮＲＣ−２６９４を４２日間処理した後では、腫瘍が認められなかった。一方、エルロチニブ塩酸塩を処理した群では、経口でも腹腔内経路でも腫瘍がなお残存した。
【００４９】
８）ヌードマウスのインビボ試験から得られた治療効果
この試験で用いた動物数と治癒した動物数との比で治療効果を表し、表３にまとめた。
【００５０】
表３．肺癌に対するＮＲＣ−２６９４およびエルロチニブ塩酸塩の治療効果
【表３】
2011509995.tif 000009
【００５１】
表３に示すように、ＮＲＣ−２６９４の場合は治癒率が１００％に近い値を示したのに対して、エルロチニブ塩酸塩を用いた試験群の場合は、治癒率は４０−６０％であることが分かる。
【００５２】
９）ＥＤ５０の評価
肺の断片および腫瘍の退縮試験に基づいてＥＤ５０値を評価した。経口でのＮＲＣ２６９４のＥＤ５０値は６．３ｍｇ／ｋｇと求められたが、エルロチニブ塩酸塩で得られたＥＤ５０値は２２ｍｇ／ｋｇであった。この結果から、本発明の化合物の優れた薬効が確かめられた。
【００５３】
１０）ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４およびＶＥＧＦＲなど他の受容体類を用いたインビトロ試験：（図８）
ＥＧＦＲファミリー（Ｅｒｂ／ＨＥＲ）の他の様々な受容体類に対するＮＲＣ２６９４の効果を調べるために、エルロチニブ塩酸塩と１対１で評価しながら、ヒト肺癌細胞Ａ５４９を種々の濃度のＮＲＣ２６９４を用いて処理した。Ｅｒｂ−１、Ｅｒｂ−２、Ｅｒｂ−３、Ｅｒｂ−４およびＶＥＧＦＲのレベルを、ウエスタンブロット分析により測定した。
【００５４】
この結果、ＮＲＣ２６９４は、Ｅｒｂ  Ｂ２、Ｅｒｂ  Ｂ３、Ｅｒｂ  Ｂ４、およびＶＥＧＦＲのレベルを減少させることが観察された。これに対して、エルロチニブ塩酸塩ではこうした減少は観察されなかった。上記受容体類の発現レベルの阻害がさらに観察されたことは、本発明の主要化合物であるＮＲＣ２６９４が有する、予期せぬ、驚くべき特性を明確に示すものである。
【００５５】
１１）結論
このように、本発明の化合物が有する、予期せぬ、驚くべきかつ優れた抗腫瘍特性と、治療上のさらなる可能性が、エルロチニブ塩酸塩との対比実験において確かめられた。
【実施例８】
【００５６】
以下に、ヒトに予防用に使用する治療のための、ＮＲＣ２６９４で示される化合物およびその薬学的に許容される塩を含有する、代表的な薬学的剤形を示す。
【００５７】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2011509995.tif 000029
【国際調査報告】
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