(57)【要約】  本発明は、光学センサ装置の導電性材料表面において行われる表面プラズモン共鳴技術を用いる、所定の細菌宿主株に感染可能なバクテリオファージを検出および／または定量化するための方法およびシステムに関する。また、本発明は、上記方法を実施するマイクロ電子センサ装置に関し、さらに、バクテリオファージを検出および／または定量化するためのマイクロ電子センサ装置の使用に関する。
2011516073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の細菌宿主株に感染可能なバクテリオファージを検出および／または定量化するための方法であって、
ａ）表面プラズモン共鳴技術を用いたマイクロ電子光学センサ装置（１）の導電性材料表面（１ａ）に上記宿主株の少なくとも１つから得た細菌を付着させる工程と、
ｂ）バクテリオファージを含んでいる可能性のある分析材料の溶液に上記表面に付着した細菌（２）を晒す工程と、
ｃ）上記センサの導電性材料表面（１ａ）に付着した上記細菌（２）が上記バクテリオファージに感染している場合に上記細菌の溶解が行われるように、工程ｂ）の溶液を所定の条件にてインキュベートする工程と、
ｄ）細菌の溶解による共鳴角の変化を検出するために、工程ｃ）のインキュベートを実施しながら、上記センサ（１）に入射する光の共鳴角を測定する工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
検出時間とバクテリオファージ濃度とを相互に関連づける較正曲線を用いて、共鳴角の変化を検出するまでに経過した時間に基づいて上記バクテリオファージの濃度を決定する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）における上記細菌の付着は、上記細菌（２）を上記センサ（１）に固定化するための化学材料または生物材料を、導電性材料表面（１ａ）に予め吸着させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記生物材料がアビジンまたはアビジン由来のタンパク質を含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記アビジン由来のタンパク質がＣａｐｔＡｖｉｄｉｎであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記細菌がビオチニル化細菌（２）であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記バクテリオファージが、体細胞大腸菌ファージまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株に感染可能なバクテリオファージであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記バクテリオファージが、乳酸菌株に感染可能なバクテリオファージであることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記分析材料の溶液が、液体材料の試料、または可溶性材料の試料から得られることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
上記分析材料の溶液が、水試料から得られることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法に従ってバクテリオファージを検出および／または定量化するための、表面プラズモン共鳴技術を用いたマイクロ電子光学センサ装置であって、
センサ（１）の導電性材料表面（１ａ）に付着した細菌（２）を有し、
上記細菌（２）は、少なくとも１つの所定の宿主株に属し、当該宿主株に対して特異的なバクテリオファージに感染するものから選択されることを特徴とする装置。
【請求項１２】
上記導電性材料（１ａ）が金であることを特徴とする請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の装置を用いてバクテリオファージを検出および／または定量化するためのシステムであって、
−表面プラズモン共鳴技術を用いたマイクロ電子光学センサ装置（１）と、
−上記装置（１）の導電性材料表面（１ａ）に付着している宿主株の細菌（２）と、
−上記細菌が上記バクテリオファージに感染し、当該バクテリオファージによって溶解されたときの溶菌によって生じる、上記センサ（１）に入射する光の共鳴角の変化を検出するための処理および制御をおこなう手段とを有することを特徴とするシステム。
【請求項１４】
請求項１１または１２に記載のマイクロ電子光学センサ装置の使用であって、
表面プラズモン共鳴を用いて、所定の細菌の宿主株に感染可能なバクテリオファージを検出および／または定量化するための使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、光学センサ装置の導電性材料表面において実施される表面プラズモン共鳴技術に基づいて、所定の細菌宿主株に感染可能なバクテリオファージを検出および／または定量化するための方法およびシステムに関する。
【０００２】
また、本発明は、上記方法を実施するためのマイクロ電子センサ装置、およびバクテリオファージを検出および／または定量化するためのマイクロ電子センサ装置の使用方法に関する。
【０００３】
〔背景技術〕
バクテリオファージは、細菌に感染するウイルスである。キャプシドタンパク質に包まれた核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）から形成される。これらのウイルスは、感染する細菌に対して高い特異性を有するので、特定の細菌宿主株からは特定のバクテリオファージまたはバクテリオファージ群が検出される。
【０００４】
端的に言うと、バクテリオファージのサイクルは４つの段階からなる。第一段階では、バクテリオファージによる細菌認識が行われ、新たなバクテリオファージを形成するために必要な遺伝情報を含むファージ核酸を注入する。続いて、バクテリオファージの遺伝材料がＤＮＡ形状の細菌染色体に統合される。一旦統合されると、宿主細胞の感染は、当該細胞に感染したバクテリオファージの型に応じて、２つのタイプの反応を起こす。このことから、溶原性バクテリオファージと溶菌性バクテリオファージとを区別することができる。溶原性バクテリオファージは、いつまでも宿主細胞の遺伝子に統合されているか、または様々な要因によって溶解が生じるまで宿主細胞の遺伝子に統合されている。溶菌性バクテリオファージは、培養期間後、宿主細胞の生合成機構を利用して、新たなウイルス粒子を生成するために必要な材料を複製し、宿主細胞の溶解によって外部に放出される。
【０００５】
腸内細菌のバクテリオファージを検出および／または定量化することは、水の微生物学的な制御、および糞便汚染の原因の特定のために特に重要である。上記バクテリオファージは、その挙動がウイルスの挙動と似ていることから、ウイルスの存在を示す指標微生物として提案されてきた。ウイルスを原因とする糞便汚染の指標として使用される腸内細菌のバクテリオファージには３つの群がある。体細胞大腸菌ファージ、Ｆ−特異的ＲＮＡファージ、およびバクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種に感染するファージである。
【０００６】
他の群のバクテリオファージにおいて、その検出および／または定量化が特に注目されるものは、チーズまたは他の乳酸発酵製品に使用されるタイプの乳酸菌に感染するバクテリオファージである。このバクテリオファージは、乳酸の産生に深刻な影響を及ぼし、乳酸発酵製品産業に甚大な経済損失をもたらす。
【０００７】
バクテリオファージの存在を検出する従来の方法は、バクテリオファージが宿主細菌に及ぼす影響を検出することに基づいている。従来、バクテリオファージは、二重寒天層を用いて定量化されている。１つの半流動寒天層に、特定の宿主株（定量化するバクテリオファージに応じたもの）を含ませて堆積させ、分析対象の試料が寒天層上に加えられる。宿主株の培養期間後の、感染による溶解の領域またはプラークの検出、および試料に存在するバクテリオファージまたはバクテリオファージ群による宿主細菌の溶解の検出によってバクテリオファージが定量化される。
【０００８】
寒天プレートの播種に基づく方法は、少なくとも２４時間のインキュベートを必要とすることから、極めて時間がかかるという欠点がある。
【０００９】
また、最近では、ＰＣＲ技術を使用したバクテリオファージの検出に基づくバクテリオファージの検出方法が挙げられている。しかし、この方法も時間がかかり、また極めて手間がかかるものである。
【００１０】
欧州特許ＥＰ０１４９３８３およびＥＰ０７１４４５０には、バクテリオファージを検出するための他の方法、特に乳酸菌のバクテリオファージを検出する方法が記載されている。
【００１１】
特許ＥＰ０７１４４５０は、発光酵素などの酵素によって触媒される酵素反応における生物発光を用いた、溶解後における細菌の内部成分の検出に関する技術である。一方、特許ＥＰ０１４９３８３は、微生物活動を検出するための、ｐＨ指示薬を使用した成長阻害の検出に関する技術である。
【００１２】
上記特許文献に記載された方法の欠点は、活動状態のバクテリオファージを検出できないため、実用面ではあまり信頼性が高くないことにある。
【００１３】
さらに、上記方法は多数の試薬を用いる必要があることから、極めて複雑であり、コストが高い方法である。
【００１４】
〔発明の説明〕
本発明の第一の目的は、表面プラズモン共鳴技術（以下、ＳＰＲ技術と称す）を用いた光学センサ装置の使用に基づいて、バクテリオファージを検出および／または定量化するための代替的な方法およびシステムを開発することにある。
【００１５】
上記の目的に基づき、第一形態では、本発明は、所定の細菌宿主株に感染可能なバクテリオファージを検出および／または定量化するための方法であって、
ａ）表面プラズモン共鳴技術を用いたマイクロ電子光学センサ装置（１）の導電性材料表面（１ａ）に上記宿主株の少なくとも１つから得た細菌を付着させる工程と、
ｂ）バクテリオファージを含んでいる可能性のある分析材料の溶液に上記表面に付着した細菌（２）を晒す工程と、
ｃ）上記センサの導電性材料表面（１ａ）に付着した上記細菌（２）が上記バクテリオファージに感染している場合に上記細菌の溶解が行われるように、工程ｂ）の溶液を所定の条件にて培養する工程と、
ｄ）細菌の溶解による共鳴角の変化を検出するために、工程ｃ）の培養を実施しながら、上記センサ（１）に入射する光の共鳴角を測定する工程とを含むことを特徴とする方法を提供する。
【００１６】
上記と同じ目的に基づき、第二形態では、本発明は、表面プラズモン共鳴技術を用いたマイクロ電子光学センサ装置と、上記装置の導電性材料表面に接着された宿主株の細菌と、細菌がバクテリオファージに感染し、当該バクテリオファージによって溶解されたときの溶菌によって生じるバクテリオファージを検出および／または定量化するためのシステムを提供する。
【００１７】
本発明に係る第二の目的は、センサの導電性材料表面に付着した細菌を有し、上記細菌は、少なくとも１つの所定の宿主株に属し、当該宿主株に対して特異性をもつバクテリオファージに感染するものから選択されることを特徴とするマイクロ電子光学センサ装置を提供することにある。
【００１８】
最後に、本発明の第三の目的は、表面プラズモン共鳴を用いて、所定の上記細菌の宿主株に感染可能なバクテリオファージを検出および／または定量化するためのマイクロ電子光学センサ装置の使用である。
【００１９】
本発明では、マイクロ電子装置という用語は、平らなセンサ部材、好適には薄膜マイクロ電子技術によって製造されたセンサ部材を指す。
【００２０】
導電性材料という用語は、あらゆる導電性材料、好適には金属であり、なおかつドープ導電性酸化物である材料を指す。
【００２１】
同様に、表面プラズモン共鳴は、光学センサ装置の導電性材料表面の近傍に配置された溶液中で生じる屈折率の変化の検出に基づく技術を指す。
【００２２】
表面プラズモン共鳴現象は、異なる屈折率をもつ２つの媒体間に金属などの導電性材料の薄い層が挿入されており、その媒体間の界面を光線が照射する場合に生じる。全反射によって生成されるエバネセント波が、金属の振動電子、つまりプラズモンと相互作用することによって反射光の強度が低減する。この現象の共鳴角は、金属または導電性材料に隣接した溶液の屈折率の影響を受ける。入射光の波長、および金属および金属が蒸着された基板の屈折率が一定であることから、共鳴角は、金属に隣接した溶液の屈折率の変化によってのみ変化する。そのため、この現象に基づき、金属または導電性材料に隣接した溶液中で起こる高分子相互作用を、共鳴角の変化によってモニタリングすることができる。
【００２３】
現在、ＳＰＲ技術に基づく光学センサは、抗原−抗体の相互作用などの様々な生体分子の相互作用を検出するために使用されている。しかし、ファージ活動を検出するためにこれらの光学センサを使用する技術は開示されていない。
【００２４】
本発明は、ＳＰＲ技術に基づく光学センサ装置を使用した、バクテリオファージの検出方法およびシステムを提供する。
【００２５】
方法およびシステムは、極めて簡易であり、信頼性が高く、なおかつ感度が高いという利点をもつ。
【００２６】
上述したように、請求項に記載の方法およびシステムは、光学センサ装置の導電性材料表面の隣に配置され、バクテリオファージを含む可能性のある溶液中において生じる屈折率の変化または共鳴角の変化を検出することに基づいている。この導電性材料表面には細菌を予め付着させている。
【００２７】
実施した実験では、光学センサへ入射する光の共鳴角の変化は、センサの導電性材料表面に付着した細菌のバクテリオファージのファージ活動に起因としていることがわかった。
【００２８】
具体的には、バクテリオファージのファージ複製は、残存する細菌タンパク質およびファージ粒子がセンサ装置の導電性材料表面へ吸着すること、および溶菌に起因して共鳴角を増大させることがわかった。ＳＰＲ技術によって得られる共鳴角の変化を読み取ることによって、分析材料の溶液中におけるバクテリオファージの検出および定量化が可能となる。
【００２９】
好適な実施形態によると、バクテリオファージ濃度は、共鳴角の変化を検出するまでに経過した時間とバクテリオファージ濃度とを相互に関連づける較正曲線を用いて、検出時間から求める。
【００３０】
本発明に係るシステムおよび方法は、活動状態のバクテリオファージを検出できることから、極めて信頼性が高いという利点をもつ。さらに、本システムおよび方法は極めて感度が高く、迅速な方法であり、２時間以内に１０２ＰＦＵ／ｍｌ（プラーク形成ユニット）の検出が可能である。本方法およびシステムは、再製造が容易であると共に、自動化が可能な方法およびシステムでもあり、試料中のバクテリオファージ濃度のリアルタイムでのモニタリングを可能にする。さらに、本方法およびシステムは、あらゆるタイプの基質（汚水、浄水場、牛乳、バイオソリッドなど）に存在するバクテリオファージの検出に使用可能である。
【００３１】
上述したように、請求項に記載のシステムおよび方法では、検出対象のバクテリオファージまたはバクテリオファージ群の宿主株をセンサ装置表面に付着させる必要がある。この細菌付着は、様々な技術を用いて行うことができる。
【００３２】
一実施形態においては、細菌を固定化するための化学材料または生物材料をセンサの導電性材料表面に前もって吸着させることによって付着を行ってもよい。
【００３３】
アビジン溶液またはアビジン由来のタンパク質を含む生物材料を用いて吸着を行うことが好ましい。この溶液は、予めビオチニル化した細菌に結合するように構成されている。アビジンとビオチンとの相互作用に基づく固定化が、他の方法よりも効果的にセンサ表面における生体分子活動を維持することがわかっている。
【００３４】
アビジン由来の上記タンパク質は、ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎであることが好ましい。
【００３５】
ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎは、ビオチニル化細菌と可逆的に相互作用することができるため、繰り返しの使用のためにセンサ表面を再生できるという利点をもつ。ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎとビオチンとの相互作用に基づく固定化が、請求項に記載の検出方法の感度を著しく向上させることもわかった。
【００３６】
他の実施形態においては、固定化すべき細菌を認識できる抗体を用いて、上記のように予め吸着させておく。
【００３７】
他の実施形態においては、特定の方法によってアビジンを固定させたセンサの導電性表面に自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）を形成することによって、接着を行う。好適には、自己組織化単分子膜の形成のために、エポキシ官能基およびアルデヒド官能基を含むチオール化合物を使用する。
【００３８】
いずれの場合でも、本発明は、有用な診断ツールとして構成された、バクテリオファージを検出するためのマイクロ電子センサ装置を提供し、この装置により、ラベル化試薬がなくてもリアルタイムで溶菌をモニタリングすることができる。
【００３９】
マイクロ電子装置は、好適にはセンサチップ、または平らな小型マイクロ電子装置であり、好適には薄膜リソグラフィー技術によって製造されたものである。チップは高感度センサであり、そのサイズが小さいので、微量の試料での測定を極めて短時間で行うことができる。
【００４０】
このマイクロ電子装置の導電性材料は、金であることが好ましい。しかし、上述したように、例えば銀などの他の金属を用いてもよい。
【００４１】
所定の特異性をもつバクテリオファージの宿主株が入手可能である限り、あらゆるタイプのバクテリオファージの検出に、請求項に記載の方法およびシステムを使用することができる。バクテリオファージは、水、浄水汚泥、牛乳、またはバクテリオファージの検出が産業的な関心事である他のタイプの固体または液体材料などの様々な材料の試料に由来するものであってもよい。
【００４２】
具体的には、水から得た試料の場合、バクテリオファージの検出は、ウイルスの糞便汚染の存在を表す微生物指標として提案されることから、特に関心が高い。
【００４３】
好適な実施形態においては、本発明は、水の微生物学的な制御、および／または糞便汚染を特定するために重要なバクテリオファージの検出に関しており、とりわけ、当該バクテリオファージは、例えば体細胞大腸菌ファージ、Ｆ−特異的ＲＮＡファージ、およびバクテロイデスフラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）に感染するファージのいずれかを含む。
【００４４】
他の実施形態においては、本発明に係るバクテリオファージは、例えばラクトバシラスブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバシラスラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバシラスヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバシラスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、およびステレプトコッカスサーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの乳酸菌に感染するバクテリオファージである。
【００４５】
〔図面の簡単な説明〕
上記説明をよりよく理解するために、限定されない例として図面を添付する。汚水から得られた試料に存在する体細胞大腸菌ファージの検出および定量化のための実施形態を概略的に示す。
【００４６】
図１は、表面プラズモン共鳴技術を用いてバクテリオファージを検出するために使用されるマイクロ電子センサ装置の構造、特に光学センサチップを示す概略図である。
【００４７】
図２は、対照試料と、エッシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＡＴＣＣ  ７０００７８の細菌株に感染することができるΦＸ１７４体細胞大腸菌ファージを含む汚水の試料における共鳴角の測定を経時的に示すグラフである。
【００４８】
図３は、異なる濃度のΦＸ１７４体細胞大腸菌ファージの溶液における共鳴角の経時的な正規化測定を示すグラフである。溶菌の発生により共鳴角が増大する溶液の培養期中に測定した結果を図示している。
【００４９】
図４は、分析対象の汚水の３つの基準試料、ＧＡ２００７、ＨＭ１４０２およびＨＭ２１００の共鳴角の正規化測定を示すグラフである。溶菌の発生により共鳴角が増大する溶液の培養期中に、測定した結果を図示している。
【００５０】
〔好適な実施形態の説明〕
国際ＩＳＯ １０７０５−２基準においてＷＧ５株と称されるΦＸ１７４バクテリオファージを検出するための本発明に係る方法およびシステムの実施形態について説明する。このバクテリオファージは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ７０００７８の宿主株に感染する。
【００５１】
上記実施形態では、使用するマイクロ電子機器は、図１に示すように、光学センサチップ１であり、シリコン基板１ｂに蒸着された、金からなる５０ｎｍの層１ａを有する。
【００５２】
本発明の詳細な説明に記載したように、請求項に記載の方法およびシステムは、センサチップ１上で起こる表面プラズモン共鳴現象に基づいている。このセンサチップ１に、検出対象のバクテリオファージまたはバクテリオファージ群の所定の宿主株における細菌２を予め付着させておく。
【００５３】
上記実施形態では、アビジン−ビオチン結合を用いて細菌２をセンサチップ１の金表面１ａに付着させる。この付着を行うために、５０μｌのアビジン溶液（０．５ｍｌ／ｍｌ）を１０分間直接吸着させ、チップ１の金表面を官能基化させた。その後、チップ１の表面１ａをリン酸緩衝液によって洗浄し、標準的な処理で予めビオチニル化させた細菌２を固定化する。
【００５４】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ７０００７８の細菌株をチップ１の活動面に固定化するために、ビオチニル化細菌２を３７℃のリン酸緩衝液中で１時間インキュベートする。インキュベートにより、吸着したアビジンに細菌２を結合させることができ、その結果、アビジン−ビオチン結合により、これらの細菌２をチップ１の表面１ａに付着させることができる。
【００５５】
細菌２をチップ表面１ａに付着させた後、バクテリオファージの検出を行う。これを行うために、具体的には細菌２が付着した金属表面１ａをバクテリオファージ増菌培地に晒す。この培地には、分析対象の材料の溶液試料を予め加えておく。次に、共鳴信号が検出されるまで、チップ１と接触した溶液を培養する。
【００５６】
全ての検出工程を実施した後、使用済みのチップ１をエタノール水で洗浄し、再使用できるように３０分間オゾン処理を施す。
【００５７】
上記実施形態の例では、異なる濃度のΦＸ１７４体細胞大腸菌バクテリオファージを含む、都市部由来（urban origin）の３種類の汚水試料を分析した。上記の３種類の試料を調製するために、試料ごとに、体細胞大腸菌ファージを増菌させるためにＭＳＢ培地９０μｌ中において、対応する試料１０μｌをインキュベートした。国際基準ＩＳＯ １０７０５−２の記載に従って、体細胞大腸菌ファージを増菌するために使用するＭＳＢ培地を調製した。
【００５８】
植菌の前に行う試料の処理は、１０００ｒｐｍにおける１０分間の遠心分離、および０．２２μｍの低タンパク吸着フィルタにおける濾過からなる。
【００５９】
チップ１と接触させた分析材料の溶液を３７℃の温度下でインキュベートしながら、共鳴角を測定した。したがって、細菌２がバクテリオファージに感染していた場合、溶菌によって生じた共鳴角の変化が検出される。
【００６０】
ＳＰＲ機器を用いて、この溶菌により生じる共鳴角の変化を測定する。ＳＰＲ機器は、ダイオード検波器を用いて、光学センサ１から反射された光の強さを分析する。
【００６１】
共鳴角を測定するために、共鳴現象が生じるセンサチップ１を光学系における結合プリズム３と接触するように配置し、この光学系を介して、偏光がセンサチップ１において試料が付着されていない未処理の平面（この場合はシリコン面１ｂ）に向かって集束される。偏光された入射光は、このプリズム３を介して電界に結合し、チップ１の平面１ａ上に蒸着された誘電体を介してエネルギー波を生成する（上記の実施形態では、上記誘電体は分析材料の溶液に植菌されたＭＳＢ培地であった）。導電性材料の振動電子またはプラズモンとエバネセント波との相互作用により、市販のＳＰＲ機器によって検出および分析される反射光の強度が減少する。上記減少により生じる共鳴角は、金属１ａに隣接した溶液の屈折率の影響を受けるので、共鳴角を測定することによって、上記の溶液の屈折率の変化をモニタリングすることができる。
【００６２】
本発明では、実施した実験により、分析材料の溶液に存在する体細胞大腸菌ファージのファージ複製がセンサ１の金属１ａに隣接する溶液の屈折率を改変し、結果、入射光の共鳴角の増加がもたらされることがわかった。この増加は、溶菌、ならびに、細菌タンパク質の残りおよびファージ粒子の残りの、センサ１の導電性材料表面１ａへの吸着によるものである。
【００６３】
図２は、対照試料、およびΦＸ１７４体細胞大腸菌ファージを含む分析対象の汚水試料において生じる共鳴角の測定を経時的に示したグラフである。グラフでは、チップ１の官能基化段階、細菌の固定化段階、およびバクテリオファージの検出段階での角度の測定を示しており、これらの段階において、分析材料の溶液をチップ１と接触させてインキュベートした。
【００６４】
図２からわかるように、バクテリオファージを含む試料は、２時間以下の検出時間において、共鳴角が約１５０ミリ度増加している（共鳴角の読み取り時の増加点にアスタリスクを付している）。この結果は、バクテリオファージの活動によって得られたものである。
【００６５】
センサ１を較正するために、ＩＳＯ  １０７０５−２に記載されたような従来の寒天重層分析によるバクテリオファージの検出量と、ＳＰＲ技術を用いた本発明に係る方法によるバクテリオファージの検出量とを同時に比較した。
【００６６】
このため、１０１０ＰＦＵ／ｍｌ（プラーク形成ユニット）のΦＸ１７４バクテリオファージ株を調製し、リン酸緩衝液中で１０倍ごとの希釈を行った。この希釈は、上記２つの技術によって同時に検証された。
【００６７】
図３は、上記の一連の希釈について、共鳴角の正規化測定を経時的に示したグラフである。溶液の培養段階中に測定した結果を図示している。この培養段階では、ファージ活動による共鳴角の増加が見られた。
【００６８】
図３からわかるように、図示した較正曲線の勾配は、より高いバクテリオファージ濃度をもつ溶液ほど顕著であり、濃度が高いほど共鳴角の変化の検出時間が短かった。
【００６９】
実施した実験では、方法の検出制限が１０２ＰＦＵ／ｍｌ（プラーク形成ユニット）であり、全ての場合において、一度に生じる共鳴角の増加が２時間以内に生じることが実証された。
【００７０】
図４には、分析対象である汚水の３種類の基準試料ＧＡ２００７、ＨＭ１４０２およびＨＭ２１００の共鳴角の正規化測定を示している。溶液のインキュベート段階中に測定した結果を図示している。このインキュベート段階では、溶菌の発生による共鳴角が増大する。
【００７１】
図４からわかるように、正規化曲線の勾配が基準試料ＧＡ２００７よりも大きい。このことから、本試料におけるバクテリオファージ濃度が他の試料よりも高く、共鳴角の変化がより短時間で検出されることがわかる。
【００７２】
図４の各試料におけるバクテリオファージ濃度の算出は、対応する較正曲線を用いて、共鳴角の変化を検出するのに経過した時間に基づいて決定される。この較正曲線は、バクテリオファージ濃度と、変化の検出時間との相関関係を示す。
【００７３】
本発明は、極めて感度が高く、信頼性が高いバクテリオファージを検出するためのシステムおよび方法を提供する。これは、驚くことに、ＳＰＲ法によって得られた結果が、従来の寒天重層法によって得られた結果と高い相関関係を示したためである。
【００７４】
上記の実施形態では、予めビオチニル化された細菌２を結合させたアナビジンの溶液の吸着によってチップ１の表面に細菌２を付着させた。しかし、本発明の説明に記載したように、細菌２をセンサチップ１の導電性表面１ａに固定化する他のあらゆる同等の方法を用いて細菌を付着させることができる。
【００７５】
例えば、ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ溶液の吸着によってビオチニル化細菌を固定化することにより、バクテリオファージ検出工程の感度が著しく向上することがわかった。特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細菌株に感染可能な体細胞大腸菌ファージの検出において感度が８％向上した。
【００７６】
ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎを用いた固定化にはさらなる利点があり、細菌のビオチンとともに形成された錯体の分離を可能にする。これによって、センサの検出表面の再生を可能にする。その結果、特に、請求項に記載の装置および検出工程のオンライン実施を産業レベルで行うことができるという利点が生まれる。
【００７７】
さらに、以上で説明した実施形態は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに感染する体細胞大腸菌バクテリオファージの検出に関するものである。しかし、上述したように、本発明は、バクテリオファージに感染し易い細菌宿主株が入手可能である限り、あらゆるタイプのバクテリオファージの検出および／または定量化に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、表面プラズモン共鳴技術を用いてバクテリオファージを検出するために使用されるマイクロ電子センサ装置の構造、特に光学センサチップを示す概略図である。
【図２】図２は、対照試料と、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ７０００７８の細菌株に感染することができるΦＸ１７４体細胞大腸菌ファージを含む汚水の試料における共鳴角の測定を経時的に示すグラフである。
【図３】図３は、異なる濃度のΦＸ１７４体細胞大腸菌ファージの溶液における共鳴角の経時的な正規化測定を示すグラフである。溶菌の発生により共鳴角が増大する溶液の培養期中に測定した結果を図示している。
【図４】図４は、分析対象の汚水の３つの基準試料、ＧＡ２００７、ＨＭ１４０２およびＨＭ２１００の共鳴角の正規化測定を示すグラフである。溶菌の発生により共鳴角が増大する溶液の培養期中に、測定した結果を図示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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