(57)【要約】  がんを検出または診断するための、または、がん、特に肺癌、子宮頚癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍を発症する素因を決定するための、客観的な方法が本明細書において記載される。一つの態様において、診断方法は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを決定することを含む。本発明は、さらに、ＳＵＶ３９Ｈ２関連がん、例えば肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍の治療および／または予防において有用な候補物質のスクリーニング方法を提供する。本発明は、さらに、細胞増殖を阻害し、それによりＳＵＶ３９Ｈ２関連がんの症状を治療または緩和する方法を提供する。本発明はまた、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子およびそれをコードするベクター、ならびにこのような成分を含む組成物およびＳＵＶ３９Ｈ２関連がんの治療および予防に関係するその用途を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるがんを検出または診断するためまたはがんを発症する素因を決定するための方法であって、この方法は、対象由来の生物学的試料中のＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを決定する工程を含み、ここで、前記遺伝子の正常対照レベルと比較して前記レベルの増加は前記対象ががんに罹患しているまたはがんの発症リスクを有することを示し、ここで、前記発現レベルは、以下からなる群から選択される方法によって決定される、方法：
（a）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出する工程；
（b）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出する工程、および
（c）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出する工程。
【請求項２】
前記増加が、前記正常対照レベルよりも少なくとも１０％高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象由来の生物学的試料が、生検標本、唾液、痰、血液、血清、血漿、胸水または尿を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
がんを検出または診断するためまたはがんを発症する素因を決定するためのキットであって、以下からなる群より選択される試薬を含む、キット：
（a）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（b）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬、および
（c）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【請求項５】
前記試薬が、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写物に対するプローブである、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記試薬が、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体である、請求項４に記載のキット。
【請求項７】
検出されるべき生物学的活性が、細胞増殖促進活性またはメチルトランスフェラーゼ活性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法または請求項４〜６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項８】
前記がんが、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法または請求項４〜６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９】
以下の工程を含む、がんの治療および予防の一方または両方あるいはがん細胞増殖の阻害のための候補物質のスクリーニング方法：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；
（b）  前記ポリペプチドまたはその機能的等価物と前記試験物質との間の結合活性を検出する工程；および
（c）  前記ポリペプチドまたはその機能的等価物に結合する試験物質を選択する工程。
【請求項１０】
以下の工程を含む、がんの治療および予防の一方または両方あるいはがん細胞増殖の阻害のための候補物質のスクリーニング方法：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞と接触させる工程、および
（b）  前記試験物質の非存在下における発現レベルと比較してＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを低下させる試験物質を選択する工程。
【請求項１１】
以下の工程を含む、がんの治療および予防の一方または両方あるいはがん細胞増殖の阻害のための候補物質のスクリーニング方法：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；
（b）  工程（a）のポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を検出する工程；および
（c）  前記試験物質の非存在下で検出された生物学的活性と比較して前記ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を抑制する試験物質を選択する工程。
【請求項１２】
前記生物学的活性が、細胞増殖促進活性またはメチルトランスフェラーゼ活性である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程を含む、がんの治療および予防の一方または両方あるいはがん細胞増殖の阻害のための候補物質のスクリーニング方法：
a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写調節領域および前記転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入されている細胞と接触させる工程、
b）  前記レポーター遺伝子の発現または活性レベルを測定する工程、および
c）  前記試験物質の非存在下でのレベルと比較して前記レポーター遺伝子の発現または活性レベルを低下させる試験物質を選択する工程。
【請求項１４】
以下の工程を含む、がんの治療および予防の一方または両方あるいはがん細胞増殖の阻害のための候補物質のスクリーニング方法：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子、および表７および表８に示される遺伝子から選択された下流遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；
（b）  前記下流遺伝子の発現レベルを検出する工程、および
（c）  前記試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して下流遺伝子の発現レベルを変更する試験物質を選択する工程。
【請求項１５】
前記ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の下流遺伝子が、表７に示される遺伝子から選択され、かつ、工程（c）が、前記試験物質の非存在下で検出された検出された発現レベルと比較して前記下流遺伝子の発現レベルを増加させる試験物質を選択する工程である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の下流遺伝子が、表８に示される遺伝子から選択され、かつ工程（c）が、前記試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して前記下流遺伝子の発現レベルを低下する試験物質を選択する工程である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
がんが、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍からなる群から選択される、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、ここで、前記センス鎖は、配列番号１９または２０の標的配列に相当するヌクレオチド配列を含み、かつ、前記アンチセンス鎖は、この標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ、ここで、前記二本鎖分子は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞に導入された場合、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子。
【請求項１９】
二本鎖分子が、約１９〜約２５ヌクレオチド長である、請求項１８に記載の二本鎖分子。
【請求項２０】
二本鎖分子が、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一ポリヌクレオチド分子である、請求項１８に記載の二本鎖分子。
【請求項２１】
前記二本鎖分子が、一般式
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’または
５’−［Ａ’］−［Ｂ］−［Ａ］−３’
を有し、ここで、［Ａ］は、配列番号１９または２０の標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり；［Ｂ］は、約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり；および［Ａ’］は、標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖である、請求項２０に記載の二本鎖分子。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の二本鎖分子をコードするベクター。
【請求項２３】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むベクターであって、ここで、前記センス鎖核酸は、配列番号１９または２０のヌクレオチド配列を含み、および前記アンチセンス鎖核酸は、前記センス鎖に相補的なヌクレオチド配列から構成され、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の転写物は、相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、前記ベクターは、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を阻害する、ベクター。
【請求項２４】
対象におけるがんの治療および予防の一方または両方の方法であって、ここで、前記方法は、前記対象に、医薬的有効量のＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子または前記二本鎖分子をコードするベクターを投与する工程を含み、前記二本鎖分子は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞に導入された場合、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現ならびに細胞増殖を阻害する、方法。
【請求項２５】
前記二本鎖分子が、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の二本鎖分子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ベクターが、請求項２２または２３記載のベクターである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
がんの治療および予防の一方または両方のための組成物であって、前記組成物が、医薬的有効量のＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子または前記二本鎖分子をコードするベクターおよび医薬的に許容可能なキャリアを含み、ここで、前記二本鎖分子は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞に導入された場合、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現ならびに細胞増殖を阻害する、組成物。
【請求項２８】
前記二本鎖分子が、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の二本鎖分子である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ベクターが、請求項２２または２３に記載のベクターである、請求項２７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん、特に肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍を発症する素因を検出または診断する方法に関する。本発明はまた、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の過剰発現に関連したがん、例えば肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍の治療もしくは予防の一方あるいは両方のための候補物質のスクリーニング方法に関する。さらに、本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を阻害または低減する二本鎖分子およびその治療用途に関する。
【０００２】
優先権
本願は、２０１１年６月３日に出願された米国仮特許出願第６１/４９３，２３５号の恩典を主張し、その全内容は参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
ヌクレオソームは、ヒストンタンパク質コアの周りに順序正しく巻きつけられた１４７ｂｐのＤＮＡからなる、真核生物におけるＤＮＡパッケージングの基本単位であり、クロマチン構造の基礎単位である（非特許文献１）。４種すべてのコアヒストン（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ２ＡおよびＨ２Ｂ）は、構造化されていないＮ末端尾部を有し、これらのヒストンのＮ末端は、特に多様な翻訳後修飾のアレイの対象となる：アセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化およびＡＤＰリボシル化（非特許文献２）。これらのヒストン修飾は、クロマチン構造の動的変化を引き起こし、それによって転写調節、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、および選択的スプライシングに影響を及ぼす（非特許文献３、４）。ヒストンに対するこれらのエピジェネティックなマークの中で、メチル化プロセスは、転写調節に特に重要である（非特許文献５）。５個のリジン残基（Ｈ３Ｋ４、Ｈ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ２７、Ｈ３Ｋ３６およびＨ４Ｋ２０）は、Ｎ末端尾部に位置し、これらは、モノ、ジ、またはトリメチル化されることができる代表的なリジンである。Ｈ３Ｋ９、Ｈ３Ｋ２７およびＨ４Ｋ２０のメチル化が主に転写を抑制する一方、Ｈ３Ｋ４およびＨ３Ｋ３６のメチル化マークは、活性転写の誘導に関連する（非特許文献６）。たとえば、リジン９でのヒストンＨ３のメチル化（Ｈ３Ｋ９）は、最も豊富で安定なヒストン修飾の一つであり、遺伝子抑制およびヘテロクロマチン形成の両方に関与する。Ｈ３Ｋ９は、Ｈ３Ｋ９上でモノ、ジ、またはトリメチル化されることができる一方、サイレントな真性クロマチン領域は、モノおよびジメチル化されたＨ３Ｋ９について富化される（非特許文献１７）。哺乳動物においては、ヘテロクロマチン領域はＨ３Ｋ９で高度にトリメチル化されており、一方、サイレントな真性クロマチン領域は、モノおよびジメチル化されたＨ３Ｋ９について富化される（非特許文献１７）。Ｈ３Ｋ９メチル化は、新規遺伝子サイレンシングおよびＤＮＡメチル化と関連づけられ、ＤＮＡメチル化とカップリングされた方式で有糸分裂後に受け継がれる。
【０００４】
いくつかのヒストンメチルトランスフェラーゼおよびデメチラーゼは、ヒトの発がんに深くかかわっていることが、従来報告されている（非特許文献７、８、９、１０、１１）。たとえば、ＳＭＹＤ３、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ６、ＳＵＶ４２０Ｈ１およびＳＵＶ４２０Ｈ２は、その酵素活性を通じて細胞の増殖を刺激することが示されている（特許文献１、非特許文献８、９、１２、１３、１４、１８）。
【０００５】
ＳＵＶ３９Ｈ２は、ＫＭＴ１Ｂとしても知られ（非特許文献１５）、
ＳＥＴドメインを含むヒストンメチルトランスフェラーゼであり、Ｈ３Ｋ９リジン残基をメチル化することが知られている。Ｓｕｖ３９ｈ２は、ヒトＳＵＶ３９Ｈ２のマウスホモログであり、第二のマウスＳｕｖ３９ｈ遺伝子として単離されて特徴づけされ、Ｓｕｖ３９ｈ１と５９％の同一性を有することが明らかになっている（非特許文献１６）。Ｓｕｖ３９ｈ２の発現は、成体の精巣に限られており、内因性Ｓｕｖ３９ｈ２タンパク質の免疫局在性により、精子形成の初期ステージにおいて第一減数分裂前期中にヘテロクロマチンに富化された分布が明らかになる。中パキテン期の間に、Ｓｕｖ３９ｈ２は、ＸＹ体に存在するサイレンス化された性染色体のクロマチン中に特異的に蓄積する。さらに、Ｓｕｖ３９ｈ２のヒストンメチルトランスフェラーゼ活性は、雄性減数分裂の間の高位のクロマチンダイナミックスの調節において重要な役割を果たすように見える（非特許文献１６）。
しかしながら、現在まで、ヒト発がんにおけるＳＵＶ３９Ｈ２脱調節の重要性の示唆あるいは証明は存在しなかった。
引用文献リスト
特許文献
【０００６】
[特許文献１]  ＷＯ２００５／０７１１０２
非特許文献
【０００７】
[非特許文献１]
Strahl BD et al. Nature 2000； 403： 41−45
[非特許文献２]
Kouzarides T et al.Cell 2007； 128：693−705
[非特許文献３]
Huertas D et al. Epigenetics 2009； 4： 31−42
[非特許文献４]
Luco RF et al. Science 2010； 327： 996−1000
[非特許文献５]
Kouzarides T et al. Curr Opin Genet Dev 2002； 12： 198−209
[非特許文献６]
Peterson CL et al. Curr Biol 2004； 14：R546−551
[非特許文献７]
Cho HS et al. Cancer Res 2010
[非特許文献８] 
Hamamoto R et al. Nat Cell Biol 2004；6：731−40
[非特許文献９]
Hamamoto R et al. Cancer Sci 2006；97：113−8
[非特許文献１０]
Yoshimatsu M et al. Int J Cancer 2011； 128： 562−573
[非特許文献１１]
Hayami S et al. Int J Cancer 2011； 128： 574−586
[非特許文献１２] 
Kunizaki M et al. Cancer Res 2007；67：10759−65
[非特許文献１３] 
Silva FP et al. Oncogene 2008；27：2686−92
[非特許文献１４]
Tsuge M et al. Nat Genet 2005；37：1104−7
[非特許文献１５]
Allis CD et al. Cell 2007； 131： 633−636
[非特許文献１６]
O’Carroll D et al. Mol Cell Biol 2000； 20： 9423−9433
[非特許文献１７]
Martin C et al. Nat Rev Mol Cell Biol 2005；6：838−49
[非特許文献１８]
Schneider R et al. Trends Biochem Sci 2002；27：396−402.
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２およびその発がんにおける役割に関する。したがって、本発明は、がん、特に肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍の検出、診断、治療および／もしくは予防のための新規組成物および方法に関する。本発明はまた、がんの予防および治療の一方あるいは両方に有用な候補物質のスクリーニング方法に関する。
本発明の中心は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子はがん細胞において過剰発現しており、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子によるＳＵＶ３９Ｈ２のノックダウンはがん細胞の増殖の有意な抑制をもたらすという発見である。このような二本鎖分子は、センス鎖とアンチセンス鎖とから構成されることができ、ここで、センス鎖は、配列番号１９および２０からなる群から選択される標的配列に相当するヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は、そのセンス鎖に相補的な配列を含み、また、ここで、この分子のセンスおよびアンチセンス鎖は、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。
【０００９】
したがって、細胞に導入された際、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現ならびに細胞の増殖を阻害する、単離された二本鎖分子を提供することは、本発明の一つの目的であり、この分子は、センス鎖とそれに対して相補的なアンチセンス鎖とを含み、これらの鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。これらの二本鎖分子は、単離された状態で利用されてもよく、またはベクターにコードされてベクターから発現されてもよい。したがって、別の側面において、本発明は、このような二本鎖分子ならびにベクターおよびそれらを発現する宿主細胞を提供する。
【００１０】
本発明の二本鎖分子またはベクターを、それを必要とする対象に投与することによる、ＳＵＶ３９Ｈ２発現細胞の増殖の阻害方法およびがん、例えば肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍のようなＳＵＶ３９Ｈ２関連疾患の治療方法を提供することは、本発明の別の目的である。このような方法は、本発明の二本鎖分子またはベクターを1つ、あるいはそれ以上含む組成物を、対象に投与することを包含する。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、がん、例えば肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍のようなＳＵＶ３９Ｈ２関連疾患の治療もしくは予防の一方あるいは両方のための組成物を提供することであり、このような組成物は本発明の二本鎖分子またはベクターの少なくとも一つを含む。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを指標として用いることによって対象におけるがんを検出または診断する方法を提供することである。より詳細には、対象由来生物学的試料中の試験遺伝子（すなわちＳＵＶ３９Ｈ２）の発現レベルの、その試験遺伝子の正常対照レベルと比較しての増加は、対象におけるがんの存在あるいは対象ががんに罹患していることを示し、そのがんの例としては、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍が挙げられる。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、がん、例えば肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍のようなＳＵＶ３９Ｈ２関連疾患の治療および予防の一方あるいは両方に有用な候補物質をスクリーニングする方法を提供することである。有用な候補物質は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに対する結合活性、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性に対する阻害活性またＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルに対する抑制活性を指標として用いて選択することができる。本発明のスクリーニング方法として特に興味深いＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性としては、細胞増殖促進活性およびメチルトランスフェラーゼ活性（たとえば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性）が含まれる。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、ＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡ、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質またはＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬を含む、がんを検出または診断するためのキットを提供することである。一連の具体的な目的は以下に記載される。当業者には、この発明の１つあるいはそれ以上の側面はある目的には適合し得、一方、１つあるいはそれ以上の他の側面はある種の他の目的に適合し得ることは理解されるであろう。各目的は、この発明の個々の側面に、そのすべての側面において、等しく適用されなくてもよい。それ自体として、以下の目的は、この発明の任意の一つの側面に関する選択肢とみなされ得る。
【００１５】
より詳細には、本発明は、以下の〔１〕〜〔２９〕を提供する：
[１]  対象におけるがんを検出または診断するため、あるいはがんを発症する素因を決定するための方法であって、対象由来生物学的試料におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを決定する方法を含み、ここで、該遺伝子の正常対照レベルと比較した該レベルの増加が、該対象ががんに罹患しているかまたはがんを発症するリスクを有することを示し、
該発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって決定される、前記方法：
（a）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出する方法；
（b）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出する方法；および
（c）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を決定する方法；
［２］  前記増加が正常対照レベルより少なくとも１０％高い、前記［１］に記載の方法；
［３］  対象由来生物学的試料が、生検標本、唾液、痰、血液、血清、血漿、胸水または尿である、前記[1]に記載の方法；
［４］  以下からなる群より選択される試薬を含む、がんを検出あるいは診断するため、あるいはがんを発症する素因を決定するためのキット
（ａ）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出するための試薬；
（ｃ）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出するための試薬；
［５］  前記試薬が、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写物に対するプローブである、前記［４］に記載のキット；
［６］  前記試薬が、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体である、前記［４］記載のキット；
［７］  検出されるべき生物学的活性が、細胞増殖促進活性またはメチルトランスフェラーゼ活性である、前記［１］〜［３］のいずれか１項記載の方法または前記［４］〜［６］のいずれか１項記載のキット；
［８］  前記がんが、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍からなる群から選択される、前記［１］〜［３］のいずれか１項記載の方法または前記［４］〜［６］のいずれか１項に記載のキット；
［９］  以下の工程を含む、がんの治療もしくは予防の一方あるいは両方、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質のスクリーニング方法：
（ａ）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物と接触させる工程；
（ｂ）  前記ポリペプチドまたはその機能的等価物と試験物質との間の結合活性を検出する工程；および
（ｃ）  前記ポリペプチドあるいはその機能的等価物に結合する試験物質を選択する工程；
［１０］  以下の工程を含む、がんの治療もしくは予防の一方あるいは両方、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質のスクリーニング方法：
（ａ）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；および
（ｂ）  試験物質の非存在下における発現レベルと比較してＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを低減させる試験物質を選択する工程；
［１１］  以下の工程を含む、がんの治療もしくは予防の一方あるいは両方、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質のスクリーニング方法：
（ａ）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物と接触させる工程；
（ｂ）  工程（ａ）のポリペプチドあるいはその機能的等価物の生物学的活性を検出する工程；
（ｃ）  前記試験物質の非存在下で検出された生物学的活性と比較して前記ポリペプチドあるいはその機能的等価物の生物学的活性を抑制する試験物質を選択する工程；
［１２］  生物学的活性が、細胞増殖促進活性またはメチルトランスフェラーゼ活性である、前記［１１］に記載の方法；
［１３］  以下の工程を含む、がんの治療もしくは予防の一方あるいは両方、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質のスクリーニング方法：
（ａ）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写調節領域およびこの転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる工程；
（ｂ）  前記レポーター遺伝子の発現または活性レベルを測定する工程；および
（ｃ）  前記試験物質の非存在下におけるレベルと比較して前記レポーター遺伝子の発現活性またはレベルを低減させる試験物質を選択する工程；
［１４］  以下の工程を含む、がんの治療もしくは予防の一方あるいは両方、またはがん細胞増殖の阻害のための候補物質のスクリーニング方法：
（ａ）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子、および表７および表８に示す遺伝子から選択された下流遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；
（ｂ）  前記下流遺伝子の発現レベルを検出する工程；
（ｃ）  前記試験物質の非存在下において検出される発現レベルと比較して前記下流遺伝子の発現レベルを変更する試験物質を選択する工程；
［１５］  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の下流遺伝子が、表７に示される遺伝子から選択され、かつ、工程（ｃ）が、前記試験物質の非存在下において検出される発現レベルと比較して前記下流遺伝子の発現レベルを増加させる試験物質を選択する工程である、前記［１４］に記載の方法；
［１６］  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の下流遺伝子が、表８に示される遺伝子から選択され、かつ、工程（ｃ）が、前記試験物質の非存在下において検出された発現レベルと比較して前記下流遺伝子の発現レベルを低減させる試験物質を選択する工程である、前記［１４］に記載の方法；
［１７］  がんが、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍からなる群から選択される、前記［９］〜［１６］のいずれか１項に記載の方法；
［１８］  センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、このセンス鎖は、配列番号１９または２０の標的配列に相当するヌクレオチド配列を含み、かつ、このアンチセンス鎖は、前記標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、この二本鎖分子は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞に導入された場合、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を阻害する、二本鎖分子；
［１９］  二本鎖分子が、約１９〜約２５ヌクレオチド長である、前記［１８］に記載の二本鎖分子；
［２０］  前記二本鎖分子が、一本鎖ヌクレオチド配列を介して連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一ポリヌクレオチド分子である、前記［１８］に記載の二本鎖分子；
［２１］  前記二本鎖分子が、一般式：
５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’または５’−［Ａ’］−［Ｂ］−［Ａ］−３’
式中、［Ａ］は配列番号１９また２０の標的配列に相当するヌクレオチド配列を含むセンス鎖、［Ｂ］は約３〜約２３ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列、および［Ａ’］は前記標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖である、前記［２０］に記載の二本鎖分子；
［２２］  前記［１８］〜［２１］のいずれか１項記載の二本鎖分子をコードするベクター；
［２３］  センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むベクターであって、前記センス鎖核酸は、配列番号１９また２０のヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖核酸は、前記センス鎖に相補的なヌクレオチド配列から構成され、前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の転写物は、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、前記ベクターは、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を阻害する、ベクター；
［２４］  対象におけるがんの治療もしくは予防の一方あるいは両方の方法であって、この方法は、前記対象に、医薬的有効量のＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子または前記二本鎖分子をコードするベクターを投与する工程を含み、前記二本鎖分子は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞に導入された場合、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現ならびに細胞増殖を阻害する、方法；
［２５］  二本鎖分子が、前記［１８］〜［２１］のいずれか１項記載の二本鎖分子である、前記［２４］に記載の方法；
［２６］  ベクターが、前記［２２］または［２３］記載のベクターである、前記［２４］に記載の方法；
［２７］  がんの治療もしくは予防の一方あるいは両方のための組成物であって、この組成物は、医薬的有効量のＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子または前記二本鎖分子をコードするベクターおよび医薬的に許容可能なキャリアを含み、前記二本鎖分子は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞に導入された場合、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現ならびに細胞増殖を阻害する、組成物；
［２８］  二本鎖分子が、前記［１８］〜［２１］のいずれか１項記載の二本鎖分子である、前記［２７］に記載の組成物；
［２９］  ベクターが、前記［２２］または［２３］記載のベクターである、前記[２７]に記載の組成物。
【００１６】
本発明のこれらおよびその他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面および実施例と併せて読めば、より十分に明らかになるであろう。しかしながら、前述の本発明の概要および以下の詳細な説明の両方が、好ましい態様についてのものであり、本発明または本発明の他の代替的な態様を制限するものではないことは理解されるべきである。本発明の他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面および実施例と併せて読めば、より十分に明らかになるであろう。特に、本発明はここで多数の具体的な態様を参照して記載されている一方、この記載は、本発明を説明するものであって、本発明を限定するものとして構築されていないことは理解されるであろう。添付の特許請求の範囲に記載されたとおりの本発明の精神および範囲を逸脱することなしに、当業者は様々な変更および適用に思い至ることができる。同様に、本発明の他の目的、特徴、有効性および利点は、この概要および以下に記載されたある種の態様から明らかであり、当業者には容易に明らかになるであろう。このような目的、特徴、有効性および利点は、添付の実施例、データ、図面およびそれらから引き出されるすべての妥当な推測と併せて上記から、単独で、または本明細書に組み入れられる参考文献を考慮して、明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明ならびに本発明の詳細な説明および好ましい態様を考慮することで、当業者に明らかになるであろう：
【図１】図１は、臨床肺癌におけるＳＵＶ３９Ｈ２の過剰発現を示す。パートＡは、１４例の肺癌症例（ＮＳＣＬＣ：９例、ＳＣＬＣ：５例）および１６種の正常重要器官におけるＳＵＶ３９Ｈ２のｍＲＮＡレベルを示す。パートＢは、１４種の肺癌試料および１４種の正常組織を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ測定を表し、結果を、箱髭図により示す。統計的解析のため、クラスカル・ワリス（Kruskal−Wallis）検定（＊Ｐ＜０．０５）およびスチューデント（Student）のｔ−検定（＊＊Ｐ＜０．０５）を行なった。パートＣは、正常成人ヒト組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の免疫組織化学染色を表す。すべての組織試料は、BioChainから購入した。倍率：×２００。
【００１８】
【図２】図２は、肺癌組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の上昇した発現を明らかにする。ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質について標準免疫組織化学解析により染色された肺腫瘍の組織マイクロアレイ像を示す。肺癌組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質発現の免疫組織化学解析は、ＳＵＶ３９Ｈ２が核において豊富に発現されることを示す。各切片についての臨床的情報は、組織像の上に表されている。すべての組織試料は、BioChainから購入した。倍率：×２００。
【００１９】
【図３】図３は、膀胱癌試料におけるＳＵＶ３９Ｈ２の有意な上方調節を明らかにする。パートＡは、１２５種の膀胱癌組織および２８種の正常膀胱試料（イギリス人）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ測定を表し、結果を箱髭図により示す。統計的解析については、スチューデントのｔ−検定を採用した（＊Ｐ＜０．０５）。パートＢは、日本人患者における正常および腫瘍膀胱組織間のＳＵＶ３９Ｈ２発現の比較を表す。各試料についてのシグナル強度を、ｃＤＮＡマイクロアレイにより解析し、結果を箱髭図により示す（中央値（５０％）を四角で囲んでいる）。マン・ホイットニー（Mann−Whitney’s）のＵ−検定を統計的解析のために使用した。パートＣは、BioChainから購入した膀胱癌および正常膀胱組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の上方調節を示す免疫組織化学解析を表す。各切片についての臨床的情報は、組織像の上に表されている。すべての組織試料は、BioChainから購入した。倍率：×２００。
【００２０】
【図４Ａ−Ｅ】図４は、ＳＵＶ３９Ｈ２ノックダウンの増殖抑制効果を示す。パートＡは、種々の細胞株におけるＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡ発現レベルを表す。定量的リアルタイムＰＣＲは、正常細胞株（ＩＭＲ−９０、ＷＩ−３８、ＳＡＥＣおよびＣＣＤ−１８Ｃｏ）、３つの肺癌細胞株（Ａ５４９、ＲＥＲＦおよびＳＢＣ−５）および３つの膀胱癌細胞株（ＳＷ７８０、ＲＴ４およびＳＣａＢＥＲ）を用いて行なった。パートＢは、種々の細胞株におけるＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質発現レベルの検証を表す。３つの正常細胞株（ＩＭＲ−９０、ＷＩ−３８およびＳＡＥＣ）および３つの肺癌細胞株（Ａ５４９、ＲＥＲＦおよびＳＢＣ５）由来の溶解物を、抗ＳＵＶ３９Ｈ２抗体を用いて免疫ブロッティングした。ＡＣＴＢを内部コントロールとして使用した。パートＣは、Ａ５４９およびＳＷ７８０細胞における２つの独立したＳＵＶ３９Ｈ２特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＵＶ３９Ｈ２＃１、＃２）による内因性ＳＵＶ３９Ｈ２発現の抑制を示す定量的リアルタイムＰＣＲの結果を表す。ｓｉＲＮＡターゲティングＥＧＦＰ（ｓｉＥＧＦＰ）およびｓｉＮｅｇａｔｉｖｅコントロール（ｓｉＮＣ）を対照として使用した。ｍＲＮＡ発現レベルは、ＧＡＰＤＨ発現によって標準化し、値は、ｓｉＥＧＦＰ（ｓｉＥＧＦＰ＝１）に対する相対値である。結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＤである。パートＤは、がん細胞株（Ａ５４９およびＳＷ７８０）および正常細胞株（ＣＣＤ−１８Ｃｏ）の増殖に対するＳＵＶ３９Ｈ２ノックダウンの効果を表す。細胞数は、セルカウンティングキット８によって測定した。相対細胞数は、ｓｉＥＧＦＰ処理細胞（ｓｉＥＧＦＰ＝１）の数に対して標準化した：結果は、３回の独立した実験の平均±ＳＤである。Ｐ値は、スチューデントのｔ−検定を用いて算出した（＊、Ｐ＜０．０５）。パートＥおよびＦは、細胞の増殖調節に対するＳＵＶ３９Ｈ２発現の効果を確認するためのコロニー形成アッセイの結果を表す。パートＥは、ＳＵＶ３９Ｈ２  ｓｉＲＮＡを用いた機能喪失実験を表す。ギムザ染色は、ｓｉＲＮＡで処理した９日後（Ａ５４９）および３日後（ＳＷ７８０）に行なった。
【００２１】
【図４Ｆ】パートＦは、ＳＵＶ３９Ｈ２のクローン形成能（ｃｌｏｎｏｇｅｎｅｃｉｔｙ）アッセイの結果を表す。ＳＵＶ３９Ｈ２のメチル化活性は、その増殖促進効果に重要である。ＣＯＳ７細胞は、ＦＬＡＧ−Ｍｏｃｋ、−ＳＵＶ３９Ｈ２（ＷＴまたはΔ−ＳＥＴ）でトランスフェクションし、トランスフェクションの１４日後、ギムザで染色した。
【００２２】
【図５】図５は、細胞周期分布に対するＳＵＶ３９Ｈ２発現の阻害の効果を示す。パートＡは、がん細胞における細胞周期動力学に対するＳＵＶ３９Ｈ２ノックダウンの効果を示す。Ａ５４９およびＳＷ７８０細胞は、ｓｉＲＮＡで処理し、ｓｉＲＮＡ処理の７２時間後にＦＡＣＳによって解析した。この実験の代表的なヒストグラムを示す。ＦＡＣＳ結果の数値的解析、細胞周期ステータスによる細胞の分類。３回の独立した実験の平均±ＳＤ。Ｐ値は、スチューデントのｔ−検定を用いて算出した。パートＢは、パートＡに示した各周期における細胞の割合を示すヒストグラムを表す。
【００２３】
【図６】図６は、正常細胞株（ヒト小気道上皮細胞：ＳＡＥＣ）に対する肺癌細胞におけるＳＵＶ３９Ｈ２の過剰発現を示す。ＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルは、定量的リアルタイムＰＣＲにより解析した。相対的ＳＵＶ３９Ｈ２発現は、ＳＡＥＣにおける値と比較した比率を示す。ＡＤＣ：腺癌；ＳＣＣ：扁平上皮癌；ＬＣＣ：大細胞癌；ＳＣＬＣ：小細胞肺癌。
【００２４】
【図７Ａ−Ｂ】図７は、ＳＵＶ３９Ｈ２ががん細胞増殖に重要であることを示す。パートＡは、ＳＢＣ５細胞のコロニー形成アッセイの結果を表す。ギムザ染色は、ｓｉＲＮＡ処理の１０日後に行なった。パートＢは、Ｓｕｖ３９ｈＷＴと比較したＳｕｖ３９ｈＤＮＭＥＦｓの遅延した細胞増殖を表す。１×１０５細胞のＳｕｖ３９ｈＷＴおよびＳｕｖ３９ｈＤＮ（ＳＵＶ３９Ｈ１およびＳＵＶ３９Ｈ２二重欠損（double null））ＭＥＦｓを、６ウェル組織培養プレートに播種し、上記に示した時間経過にしたがって細胞増殖アッセイを行なった。
【００２５】
【図７Ｃ】パートＣは、Ｓｕｖ３９ＷＴおよびＳｕｖ３９ＤＮマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦｓ）の細胞周期分布を表す。Ｓｕｖ３９ＷＴおよびＳｕｖ３９ＤＮ  ＭＥＦｓを、６ウェル組織培養プレートに７２時間播種し、材料および方法に記載したとおりに、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合化抗ＢｒｄＵおよび７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を用いたカップリング染色後に、細胞周期分布をフローサイトメトリーによって解析した。各細胞期のＤＮ対ＷＴ比率の代表的なヒストグラムを示す。
【００２６】
【図８Ａ】図８は、ＳＵＶ３９Ｈ２発現のノックダウン後のＳＷ７８０およびＡ５４９  ｍＲＮＡ発現プロフィールの二次元、非階層型クラスタリング解析の結果を表示する。異なって発現される遺伝子を、この解析のために選択した。上方調節される遺伝子を、表７に示す。下方調節される遺伝子を、表８に示す。
【００２７】
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａのつづきである。
【００２８】
【図９】図９は、７８種の正常組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルを示す。データは、ＢｉｏＧＰＳ（http：//biogps.gnf.org/#goto=genereport&id=79723）から得た。  シグナル強度の対照としてＧＡＰＤＨ発現を示す。ＳＵＶ３９Ｈ２に相当するバーがほとんど見えないという事実は、これらの正常組織におけるＧＡＰＤＨと比較してＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルは有意に低いことを確認する。
【００２９】
【図１０】図１０は、肺ＡＤＣ、ＳＣＣ組織および正常肺組織における陽性のＳＵＶ３９Ｈ２発現の代表的な例を明らかにする。倍率、×１００。態様の説明
【００３０】
本発明の態様の実施あるいは試験において、本明細書に記載されたものと同様または等価のあらゆる方法および材料を使用することができるが、好ましい方法、装置、および材料を以下に記載する。しかしながら、本発明の材料および方法を記載する前に、本明細書で記載される特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコール等は慣行的な実験法および最適化に従って変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。本記載において用いられる専門用語は特定の種類または態様を説明する目的のためのみのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することは意図されないことも、また理解されるべきである
本明細書において言及される各刊行物、特許あるいは特許出願の開示は、その全体が参照により具体的に組み入れられる。しかしながら、本明細書におけるいずれも、先行発明により本発明がこのような開示より先行する権利を与えられないことの認容として解釈されるべきものではない。
【００３１】
特記しない限り、ここで使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。ここに記載されたものと同様または等価の方法および材料は、本発明の実施または試験において用いることができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合には、定義も含めて本明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は、例示にすぎず、限定を意図するものではない。
【００３２】
定義：
本明細書で用いられる「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単語は、特記しない限り「少なくとも１つの」を意味する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は本明細書において互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、天然アミノ酸ポリマーに加えて、１つまたは複数のアミノ酸残基が修飾残基であるか、または非天然残基、例えば対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣体である、アミノ酸ポリマーに適用される。
【００３３】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに、天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされる天然アミノ酸および、細胞内で翻訳後修飾された天然アミノ酸（たとえば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基、およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾Ｒ基または修飾骨格を有する化合物を指す（たとえば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）。「アミノ酸模倣体」という語句は、異なる構造を有するが、一般のアミノ酸と類似した機能を有する化学物質を指す。
アミノ酸は、本明細書において、IUPAC−IUB生化学命名法委員会 （Biochemical
Nomenclature Commission）によって推奨される公知の３文字表記または１文字表記でよぶことができる。
【００３４】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、特記されない限り、互換的に用いられ、アミノ酸と同様に、一般に受け入れられている１文字コードによって呼ばれる。アミノ酸と同様に、それらは、天然核酸ポリマーおよび非天然核酸ポリマーの両方を包含する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、または核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの組み合わせから構成されていてもよい。
【００３５】
本発明の文脈において、「ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子」の語句は、ヒトＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子またはヒトＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の機能的等価物のいずれかをコードするポリヌクレオチドを包含する。本発明の文脈において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子またはその機能的等価物は、従来のクローニング方法を介して天然タンパク質として自然から、または選択されたヌクレオチド配列に基づく化学合成を通じて、得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーを用いて遺伝子をクローニングする方法およびそれらは、当技術分野において周知である。
【００３６】
物質（たとえば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、その他）に関して使用される「単離された」または「精製された」という用語は、その物質がその元の環境（たとえば、天然のものであれば自然環境）から取り出され、したがって、その天然の状態から変更されていることを示す。単離された核酸の例としては、ＤＮＡ（たとえばｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）、および他の細胞物質あるいは組み換え技術により産生された場合は培地を実質的に含まない、または化学的に合成された場合は化学前駆体あるいは他の化学物質を実質的に含まない、それらの誘導体が挙げられる。好ましい態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は、単離または精製されている。
【００３７】
「単離された」または「精製された」抗体は、細胞物質、たとえば、炭水化物、脂質またはそのタンパク質（抗体）が由来する供給源である細胞または組織からの他の混入タンパク質を実質的に含まない抗体、または化学的に合成された場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない抗体を指す。「細胞物質を実質的に含まない」という用語は、そのポリペプチドが、それが単離されたまたは組み換えにより産生された細胞の細胞成分から分離されている、ポリペプチドの調製物を含む。
【００３８】
したがって、細胞物質を実質的に含まないポリペプチドとしては、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量あたり）未満の異種タンパク質（ここで、「混入タンパク質」とも呼ばれる）を有するポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドが組み換えによって作製される場合、いくつかの態様においては、それは、培養培地も実質的に含まず、それはタンパク質調製物の容量の約２０％、１０％、または５％未満の培養培地を含む、該ポリペプチドの調製物を含む。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合、いくつかの態様においては、それは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、それはタンパク質調製物の容量の約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量）未満の、タンパク質の合成において関与した化学前駆体または他の化学物質を含む、ポリペプチドの調製物を含む。特定のタンパク質調製物が単離されたあるいは精製されたポリペプチドを含むことは、たとえば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびその後のゲルのクマシーブリリアントブルー染色等の後の単一バンドの出現によって示すことができる。
【００３９】
ここで用いられる場合、「生物学的試料」という用語は、生物全体またはその組織、細胞もしくは構成成分のサブセット（たとえば、血液、粘液、リンパ液、滑液、脳脊髄液、唾液、羊水、羊水臍帯（amniotic cord）血、尿、膣液および精液を含むが、これらに限らない体液）を指す。「生物学的試料」は、さらに、生物全体、またはその細胞、組織もしくは構成成分のサブセット、またはそれらの画分もしくは一部から調製された、ホモジネート、溶解物、抽出物、細胞培養物もしくは組織培養物を指す。最後に、「生物学的試料」は、培地、たとえば、生物を増殖させた、細胞成分（たとえばタンパク質またはポリヌクレオチド）を含む、栄養ブイヨンまたはゲルを指す。本発明の文脈において、生物学的試料は、好ましくは肺、頸部、膀胱、食道、または前立腺または骨肉腫または軟部腫瘍から抽出された、組織または細胞を含んでいてもよい。
特記しない限り、「がん」という用語は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を過剰発現しているがんを指す。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を過剰発現しているがんとしては、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍が挙げられるが、これらに限らない。
【００４０】
本発明の方法および組成物が「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」の文脈において有用である限りこれらの用語は、本明細書において互換的に用いられ、疾患による死亡率あるいは罹患率を低減する任意の活性を指す。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「一次、二次、および三次の予防レベル」で起こることができる。一次の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の発症を回避する一方、二次および三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）とともに、機能を回復し、疾患関連合併症を低減することにより、すでに確立された疾患の負のインパクトを低減することを目的とする活性を含む。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を緩和すること、たとえば腫瘍の増殖および転移を低減することを目的とする、広範囲の予防的療法を含むことができる。
【００４１】
本発明のある種の態様ががんの治療および／もしくは予防ならびに／または術後の再発の予防を含む限りにおいて、このような方法は、以下の段階のいずれかを含んでいてもよい：がん細胞の外科的切除、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退行または退縮、がんの出現の抑制および寛解の誘導、腫瘍退縮、ならびに転移の低減または阻害。がんの効果的な治療および／または予防は、死亡率を低減し、がんを有する個体の予後を改善し、血中腫瘍マーカーのレベルを低減し、がんに付随する検出可能な症状を緩和する。処置はまた、たとえばＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現の低減または対象におけるがんの大きさ、蔓延、もしくは転移能の低減のような、臨床的有効性をもたらすのであれば、「有効」であると認定することができる。治療を予防的に適用する場合、「有効」とは、がんの形成を遅延もしくは阻害されるか、またはがんの臨床症状を予防もしくは緩和することを意味する。有効性は、特定の腫瘍タイプについて公知のあらゆる診断またはは治療方法に関連して決定される。
【００４２】
遺伝子およびポリペプチド：
本発明は、少なくとも部分的には、ＳＵＶ３９Ｈ２をコードする遺伝子が非がん性組織と比較していくつかのがんにおいて過剰発現されているという発見に基づいている。ＳＵＶ３９Ｈ２（the suppressor of variegation 3-9 homolog 2）は、ＫＭＴ１Ｂ （Allis CD、et al、 Cell 2007；131： 633−636）とも呼ばれており、Ｈ３Ｋ９を選択的にメチル化するＳＥＴ−ドメイン含有メチルトランスフェラーゼである。
【００４３】
ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の例示的な核酸配列は、配列番号２１（GenBank accession No. NM_001193424.1）、２３（GenBank accession No. NM_001193425.1）、２５（GenBank accession No.NM_001193426.1）、２７（GenBank accession No. NM_001193427.1）および２９（GenBank accession No. NM_024670.3）に記載されている。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２２（GenBank accession No. NP_001180353.1）、２４（GenBank accession No. NP_001180354.1 または NP_078946.1）、２６（GenBank accession No. NP_001180355.1）、２８（GenBank accession No. NP_001180356.1）、および３０（GenBank accession No. NP_078946.1）である。しかしながら、本発明は、これらの配列に限定されない。
【００４４】
ここで、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるポリペプチドは、「ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチド」または「ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質」、あるいは単に「ＳＵＶ３９Ｈ２」と呼ばれる。本発明の文脈において、「ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子」という語句は、ヒトＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのみならず、ヒトＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の機能的等価物をコードするポリヌクレオチドも含む。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子は、従来のクローニング方法を介して天然ポリヌクレオチドとして自然界から、あるいは選択されたヌクレオチド配列に基づいて化学合成を通じて得られる。上述のように、かつ以下において詳細に論じられるように、ｃＤＮＡライブラリーを用いる遺伝子クローニング方法等は、当技術分野において周知である。上記のとおり、本発明は、タンパク質（ポリペプチド）の「機能的等価物」におよび、これらを「ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチド」のさらなる例として認識する。ここで、タンパク質（たとえば、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチド）の「機能的等価物」は、元の参照タンパク質と等価の生物学的活性を有するポリペプチドである。
したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の生物学的活性を保持するあらゆるポリペプチドは、本発明の文脈において、その機能的等価物であるものとして考えられる。たとえば、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの機能的等価物は、ネイティブなＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの細胞増殖促進活性および／あるいはメチルトランスフェラーゼ活性を保持していてもよい。本発明の文脈において、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの機能的等価物は、多形変異体、種間ホモログ、およびこれらのポリペプチドのアレルによってコードされるものを含む。
【００４５】
ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの好ましい機能的等価物は、ネイティブなＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの細胞増殖促進活性およびメチルトランスフェラーゼ活性の一方あるいは両方を保持する。ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性を保持するＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの機能的等価物は、ネイティブなＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドのＳＥＴ−ドメインを保持することが期待される。前述の配列において、ＳＥＴ−ドメインは、配列番号２２に示すアミノ酸配列のアミノ酸位置２５１〜３７２、配列番号２４に示すアミノ酸配列のアミノ酸位置１９１〜３１２、配列番号２６に示すアミノ酸配列のアミノ酸位置１００〜１９２、配列番号２８に示すアミノ酸配列のアミノ酸位置４０〜１３２、および配列番号３０に示すアミノ酸配列の１９１〜３１２に位置する。このような機能的等価物の一例は、配列番号３２のアミノ酸配列に記載されている。
【００４６】
機能的等価物の例としては、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の天然アミノ酸配列に対し、１以上、たとえば、１〜５アミノ酸あるいはもとのアミノ酸の５％までが置換、欠失、付加または挿入されているものが挙げられる。あるいは、ポリペプチドは、それぞれのタンパク質の配列に対して少なくとも約８０％相同性（配列同一性とも呼ばれる）、より好ましくは少なくとも約９０％〜９５％相同性、しばしば約９６％、９７％、９８％または９９％相同性を有するアミノ酸配列から構成されていてもよい。他の態様においては、ポリペプチドは、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の天然ヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされていることができる。
【００４７】
ここで記載されるポリペプチドは、それを生産するために用いられた細胞もしくは宿主あるいは利用された精製方法によって、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に変異があってもよい。それにもかかわらず、それは、ヒトＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質と機能的に等価である限りにおいて、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの機能的等価物の範囲内である。
【００４８】
１つ、あるいはそれ以上のアミノ酸が天然配列に対して置換、欠失、付加または挿入されている、ネイティブなＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの変異または改変形態から構成される機能的等価物に関して、タンパク質中の１つ、２つあるいはそれ以上のアミノ酸の修飾はそのタンパク質の機能に有意にインパクトや影響を与えないであろうことは一般に知られている。いくつかの場合においては、そのことは、もとのタンパク質の所望の機能を増強することさえあり得る。実際、変異または改変タンパク質、すなわち、あるアミノ酸配列の１つ、２つあるいはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および／または付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、もとの生物学的活性を保持することができる（Mark et al.、 Proc Natl Acad Sci USA 81： 5662−6 （1984）； ZollerおよびSmith、Nucleic Acids Res 10：6487−500 （1982）； Dalbadie−McFarland
et al.、 Proc Natl Acad Sci USA 79： 6409−13 （1982））。したがって、当業者は、単一のアミノ酸もしくは低割合のアミノ酸（すなわち、５％未満、より好ましくは３％未満、さらにより好ましくは１％未満）を変更する、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入および置換、あるいは「保存的改変」と考えられるようなものであって、タンパク質の変更が同様の機能を有するタンパク質をもたらすものは、本発明の文脈において許容可能であることを認識するであろう。したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの機能的等価物は、天然ヒトＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチド配列において１、２あるいはそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失および／または置換されているアミノ酸配列を有していてもよい。
【００４９】
ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の活性が維持されている限り、アミノ酸変異の部位および数は、特に限定されない。したがって、変異／改変（すなわち、アミノ酸配列に対する付加、欠失、挿入あるいは置換）は、Ｎ末端およびＣ末端、ならびに中間の部位に導入されていてもよい。しかしながら、アミノ酸配列の５％以下、より好ましくは３％未満、さらにより好ましくは１％未満が変更されることが一般に好ましい。したがって、好ましい態様においては、このような変異体において変異されるべきアミノ酸の数は、一般に、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは１０アミノ酸以下、より好ましくは６アミノ酸以下、およびさらにより好ましくは３アミノ酸以下である。
【００５０】
変異されるべきアミノ酸残基は、好ましくは、アミノ酸側鎖の特性が保存される異なるアミノ酸に変異される（保存的アミノ酸置換として知られるプロセス）。アミノ酸側鎖の特性の例としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；イオウ原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；および芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。たとえば、以下の８群はそれぞれ互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）  アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）  アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）  アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）  アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）  イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）  フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）  セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）  システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（たとえば、Creighton、Proteins 1984参照）。
【００５１】
このような保存的改変ポリペプチドは、本発明の文脈においてＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の機能的等価物に包含される。しかしながら、本発明は、これらに制限されず、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の機能的等価物は、生じる改変ペプチドがＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を保持する限りにおいて非保存的改変を含むことができる。このような改変ポリペプチドにおいて変異されるべきアミノ酸の数は、一般に、２０アミノ酸以下、好ましくは１０アミノ酸以下、６アミノ酸以下、５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下、あるいは２アミノ酸以下である。さらに、改変タンパク質は、多型変異体、種間ホモログ、およびこれらのアレルによってコードされるものを除外しない。
【００５２】
いくつかのアミノ酸残基の付加によって改変されたＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの機能的等価物の例は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドおよび他のポリペプチドまたはペプチドの融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、当業者に周知の技術によって、たとえば、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子をコードするＤＮＡを他のポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡとフレームが一致するように連結し、この融合ＤＮＡを発現ベクターに挿入しそれを宿主において発現させることによって、作製することができる。融合タンパク質の「他の」成分は、典型的には、数個〜１ダースのアミノ酸から構成される小さなエピトープである。もたらされる融合タンパク質がＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの目的の生物学的活性のいずれか１つを保持する限りにおいて、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに融合されるポリペプチドまたはペプチドに関して、制限はない。
【００５３】
本発明によって企図される例示的融合タンパク質としては、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドと、他の小さなペプチド、たとえば、ＦＬＡＧ（Hopp TP、 et al.、
Biotechnology 6： 1204−10 （1988））、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基を含有する６ｘＨｉｓ、１０ｘＨｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃ断片、ＶＳＰ−ＧＰ断片、ｐ１８ＨＩＶ断片、Ｔ７−タグ、ＨＳＶ−タグ、Ｅ−タグ、ＳＶ４０Ｔ抗原断片、ｌｃｋタグ、α−チューブリン断片、Ｂ−タグ、タンパク質Ｃ断片等との融合物が挙げられる。ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに融合することができるタンパク質の例としては、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、インフルエンザアグルチニン（ＨＡ）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、等が含まれる。
さらに、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの機能的等価物は、多型変異体、種間ホモログ、およびこれらのポリペプチドのアレルによってコードされるものを除外しない。
【００５４】
機能的等価物を単離するための当技術分野において公知の方法としては、
たとえば、ハイブリダイゼーション技術（SambrookおよびRussell、 Molecular Cloning： A Laboratory Manual、 3rd ed.、 Cold Spring Harbor Lab. Press、 2001）が知られている。当業者は、ヒトＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドをコードするヒトＳＵＶ３９Ｈ２  ＤＮＡ配列（たとえば、配列番号２１、２３、２５、２７または２９）の全体または一部と高い相同性（すなわち、配列同一性）を有するＤＮＡを容易に単離することができ、単離されたＤＮＡからヒトＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチの機能的等価物を単離することができる。
【００５５】
ヒトＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の機能的等価物をコードするＤＮＡを単離するのに好適なハイブリダイゼーション条件は、当業者が慣行的に選択することができる。ここで用いられる場合、「ストリンジェント（な）（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、核酸分子が、典型的には核酸の複雑な混合物において、その標的配列にハイブリダイズするが、他の配列に対しては検出可能にハイブリダイズしないであろう、条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況においては異なっている。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションについての広範な指針は、Tijssen、Techniques in Biochemistry and Molecular Biology− Hybridization with Nucleic Probes、「Overview of principles of Hybridization and the strategy of nucleic acid assays」（1993）に見いだされる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特異的配列の熱融解温度（thermal melting point；Ｔｍ）より約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍにおいて、５０％のプローブが平衡状態で占有される）である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加を用いて達成してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては、以下のものが挙げられる：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、あるいは、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でのインキュベーション、０．２×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳ中、５０℃で洗浄を行う。
【００５６】
本発明の文脈において、ヒトＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質と機能的に等価のポリペプチドをコードするＤＮＡを単離するための最適なハイブリダイゼーション条件は、当業者が慣行的に選択することができる。たとえば、ハイブリダイゼーションは、「Rapid−hyb 緩衝液」（Amersham LIFE SCIENCE）を用いて６８℃で３０分以上のプレハイブリダイゼーションを行ない、標識プローブを添加し、６８℃で１時間以上温めることによって行なってもよい。その後の洗浄工程は、たとえば、低ストリンジェント条件で行なうことができる。低ストリンジェント条件の例としては、４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、を挙げることができる。高ストリンジェンシー条件は、しばしば好ましく用いられる。例示的な高ストリンジェンシー条件としては、２×ＳＳＣ、０．０１％ＳＤＳ中で室温で２０分間３回洗浄し、次いで１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３７℃で２０分間３回洗浄し、かつ１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃で２０分間２回洗浄することを挙げられる。しかしながら、いくつかの因子、たとえば温度および塩濃度は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響することができ、当業者は、これらおよび他の因子を慣例的に調整し、所望のストリンジェンシーに到達することができる。
したがって、本発明において使用されるＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの機能的等価物としては、ストリンジェントな条件下でヒトＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の全体または一部とハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるポリペプチドが含まれる。これらの機能的等価物としては、ヒトＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに相当する哺乳類のホモログ（たとえば、サル、マウス、ラット、ウサギまたはウシＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるポリペプチド）が挙げられる。
【００５７】
ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて、ヒトＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチド（配列番号２２、２４、２６、２８あるいは３０）をコードするＤＮＡ（配列番号２１、２３、２５、２７あるいは２９）の配列情報に基づいて合成されたプライマーを用いてヒトＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの機能的等価物をコードするＤＮＡを単離することができる。プライマー配列の例は、実施例の半定量的ＲＴ−ＰＣＲに示されている。
【００５８】
上記のハイブリダイゼーション技術また遺伝子増幅技術を通して単離されたＤＮＡによってコードされるヒトＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの機能的等価物は、通常、ヒトＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドのアミノ酸配列に対して高い相同性（配列同一性とも呼ばれる）を有する。「高い相同性」（「高い配列同一性」とも呼ばれる）は、典型的には２つの最適に整列させた配列（ポリペプチドあるいはポリヌクレオチド配列のいずれか）間の同一性の程度を指す。典型的には、高（い）相同性または配列同一性は、４０％以上、たとえば６０％以上、たとえば８０％以上、たとえば、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、あるいはそれより高い相同性を指す。２つのポリペプチドあるいはポリヌクレオチド配列間の相同性または同一性の程度は、以下のアルゴリズムにしたがって決定することができる[Wilbur WJ & Lipman DJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1983 Feb； 80 （3）：726−30]。
【００５９】
配列同一性および配列類似性の割合は、記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムのような慣例的な技術によって容易に決定することができる[Altschul SF、 et al.、 J Mol Biol. 1990 Oct 5； 215 （3）：403−10； Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1；25（17）：3389−402]。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information （ワールドワイドウェブ上、ncbi.nlm.nih.gov/にて）を通じて公に利用可能である。このアルゴリズムは、最初に、クエリー配列中の長さＷの短い語句を同定することによりハイスコアな配列対（ＨＳＰｓ）を同定することを包含する。これは、データベース配列中の同じ長さの語句と並べた場合、何らかのポジティブ値のスコア閾値Ｔと一致あるいはそれを充足する。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al、前出）。これらの当初の近傍語句の一致は、それらを含むより長いＨＳＰｓを見つけるための検索を開始する基盤として作用する。
【００６０】
この語句の一致は、次に、累積アラインメントスコアが増加することができる限り、各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（マッチング残基対についてのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチング残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を用いて算出される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアが算出される。各方向への語句一致の延長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値からある量Ｘ分落ちた場合；累積スコアが、１つ以上のネガティブスコア残基アラインメントの蓄積のため、ゼロ以下になる場合；あるいはいずれかの配列の末端に到達した場合、に停止される。
【００６１】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、２８個の語句サイズ（Ｗ）、１０個のエクスペクテーション（Ｅ）、Ｍ＝１、Ｎ＝−２、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３個の語句サイズ（Ｗ）  、１０個のエクスペクテーション（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる[Henikoff S & Henikoff JG. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Nov 15；89（22）：10915−9]。
【００６２】
本発明はまた、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの部分的ペプチドおよびスクリーニング方法におけるそれらの用途をも含む。ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの部分的ペプチドは、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに対して特異的なアミノ酸配列を有し、好ましくは約４００アミノ酸未満、通常約２００未満およびしばしば約１００アミノ酸未満であり、かつ、少なくとも７アミノ酸、好ましくは８アミノ酸以上、９アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、１５アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、５０アミノ酸以上、または８０アミノ酸以上から構成される。
【００６３】
本発明において使用されるＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドおよびその機能的等価物は、従来の精製法を介して天然タンパク質として自然界から、または選択されたアミノ酸配列に基づいて化学的合成を通じて、得ることができる。たとえば、合成のために採用することができる従来のペプチド合成法は、以下のものを含む：
（１）  Peptide Synthesis、 Interscience、 New York、 1966；
（２）  The Proteins、 Vol. 2、 Academic Press、 New York、 1976；
（３）  ペプチド合成，丸善，１９７５；                         
（４）  ペプチド合成の基礎と実験，丸善，１９８５；
（５）  医薬品の開発（続  第１４巻）ペプチド合成，広川書店，１９９１；
（６）  ＷＯ９９／６７２８８；および
（７）  Barany G. & Merrifield R.B.、 Peptides Vol. 2、 "Solid Phase  Peptide Synthesis"、 Academic Press、 New York、 1980、 100−118.
【００６４】
あるいは、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドおよびその機能的等価物は、ポリペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法（たとえば、 Morrison DA.、 et al.、 J Bacteriol. 1977 Oct；132（1）：349−51； Clark−Curtiss JE & Curtiss R 3rd. Methods Enzymol. 1983；101：347−62）を採用して得ることができる。たとえば、最初に、発現可能な形態（たとえば、プロモーターを含む調節配列の下流）で目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む好適なベクターを調製して、好適な宿主細胞を形質転換し、そして次にこの宿主細胞を培養してポリペプチドを産生させる。より具体的には、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物をコードする遺伝子は、外来遺伝子を発現するためのベクター、たとえば、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ  Ｉ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳ、またはｐＣＤ８中に遺伝子を挿入することにより、宿主（たとえば、動物）細胞等において発現される。
【００６５】
目的のタンパク質に加えて、ベクターは、タンパク質発現を誘導するためのプロモーターをも含んでいてよい。通常使用される任意のプロモーターを使用することができ、たとえば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson （ed.）、Genetic engineering、 vol. 3. Academic Press、 London、 1982、 83−141）、ＥＦ−αプロモーター（Kim DW、 et al. Gene. 1990 Jul 16；91（2）：217−23）、ＣＡＧプロモーター（Niwa H、 et al.、Gene. 1991 Dec 15；108（2）：193−9）、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen BR. Methods Enzymol. 1987；152：684−704）、ＳＲ  αプロモーター（Takebe Y、et al.、 Mol Cell Biol. 1988 Jan；8（1）：466−72）、ＣＭＶ最初期プロモーター （Seed B & Aruffo A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 May；84（10）：3365−9）、ＳＶ４０後期プロモーター（Gheysen D & Fiers W. J Mol Appl Genet. 1982；1（5）：385−94）、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman RJ、 et al.、Mol Cell Biol. 1989 Mar； 9（3）：946 − 5）、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター、等が挙げられる。
【００６６】
ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物をコードする遺伝子を発現させるための宿主細胞へのベクターの導入は、任意の方法にしたがって行なうことができ、たとえば、エレクトロポレーション法（Chu G、 et al.、 Nucleic Acids Res. 1987 Feb 11；15（3）：1311−26）、リン酸カルシウム法（Chen C & Okayama H. Mol Cell Biol. 1987 Aug；7（8）：2745−52）、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Lopata MA、 et al.、 Nucleic Acids Res. 1984 Jul 25；12（14）：5707−17； Sussman DJ & Milman G. Mol Cell Biol. 1984 Aug；4（8）：1641−3）、リポフェクタミン法（Derijard B、 et al.、Cell. 1994 Mar 25；76（6）：1025−37； Lamb BT、 et al.、 Nat Genet. 1993 Sep；5（1）：22−30； Rabindran SK、 et al.、 Science. 1993 Jan 8；259（5092）：230−4）、等が挙げられる。
ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドおよびその機能的等価物は、インビトロ翻訳系を用いてインビトロで作製することもできる。
【００６７】
がんの診断または検出のための方法：
本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２はがんの診断マーカーとして役立つことができ、したがって、それに関連するがんの検出に用途が見い出されるという発見に関する。ここで明らかにされるように、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現は、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍（図１、３、６、１０および表６）において特異的かつ有意に上昇する。したがって、ここで同定されたＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子、ならびにその転写および翻訳生成物は、上記のがんのためのマーカーとして、および試料中のＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を測定することにより、診断的利用性が見いだされる。これらのがんは、対象由来試料中のＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを正常試料におけるそれと比較することにより、診断または検出することができる。具体的には、本発明は、対象由来試料におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを測定することによりがんを診断または検出する方法を提供する。本発明の方法により診断または検出されるがんの例としては、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍が挙げられる。本発明の文脈において、肺癌は、ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣを含む。さらに、ＮＳＣＬＣは、肺腺癌（ＡＤＣ）、肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）および肺大細胞癌（ＬＣＣ）を含む。
【００６８】
本発明の文脈において、「診断（する）」という用語は、検出、ならびに予測および尤度解析を含み得る。対象由来生物学的試料中のがんの指標としてＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを用いてがんを診断あるいは検出する方法であって、ＳＵＶ３９Ｈ２発現レベルが対照レベルと比較して試料中の増加、あるいは上昇していることにより試料中のがん細胞の存在または疑いを示す方法を提供することは、本発明の目的の１つである。本発明は、対象由来組織試料中のがん細胞を検出または同定する方法であって、この方法は組織試料中のＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを決定する工程を含み、ここで、正常対照レベルと比較して遺伝子発現レベルの増加は、この組織試料中のがん細胞の存在または疑いを示す。
【００６９】
本発明によれば、対象の状態を検査するための中間的な結果、すなわち、対象をモニタリングする方法が提供されてもよい。このような中間的な結果は、医師、看護師、または他の実務者を補助するための付加的な情報と組み合わせて、対象がその疾患に罹患することを診断することができる。あるいは、本発明は、対象由来組織におけるがん性細胞を検出するために用いられてもよく、その対象がその疾患に罹患することを診断するための有用な情報を医師に提供することができる。
【００７０】
診断方法は、治療的介入、病期のような診断基準、ならびにがんの疾患モニタリングおよび監視を含む、治療法に関する決定をすることにおいて臨床的に用いられてもよい。診断の正確性を改善するために、他のがん関連遺伝子の発現レベル、たとえば、がんにおいて異なって発現されることが公知の遺伝子もまた、測定することができる。さらに、複数のがん関連遺伝子の発現レベルが比較される場合、試料およびがん性である参照との間で遺伝子発現パターンが類似していることにより、その対象が肺癌に罹患しているあるいは肺癌を発症するリスクを有することを示す。
【００７１】
したがって、試験対象がその疾患を有するかどうかを決定することにおいて、医師、看護師、またまたは他の医療実務者を補助するために、ＳＵＶ３９Ｈ２発現の結果は、付加的な情報あるいは別の診断的指標と組み合わせてもよく、これらとしては、組織病理学、血液中の公知の腫瘍マーカーのレベル、および対象の臨床経過が挙げられる。たとえば、本発明によれば、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルは、組織病理学、血液中の公知の腫瘍マーカーのレベルおよび対象の臨床経過、等を含む別の診断的指標と組み合わせて使用することができる。たとえば、血液中の周知の診断用肺癌マーカーのいくつかとしては、ＣＹＦＲＡ、ＰｒｏＧＲＰ、ＮＳＣ、ＳＬＸ、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、ＴＰＡおよびＢＦＰが挙げられ、血液中の子宮頸癌マーカーとしてはＳＴＮ、ＣＡ７２−４およびＳＣＣが挙げられ、血液中の膀胱癌マーカーとしてはＮＭＰ２２、ＢＦＰ、ＴＰＡが挙げられ、血液中の食道癌マーカーとしてはＳＣＣ、ＣＥＡ、ＴＰＡ、ＢＦＰおよびＣＡ１９−９が挙げられ、血液中の前立腺癌マーカーとしてはＰＳＡ、ＰＡＰおよびＢＦＰが挙げられる。具体的には、この本発明の特定の態様においては、遺伝子発現解析の結果は、対象の疾患状態のさらなる診断のための中間的な結果として役立つ。
【００７２】
本発明の特に好ましい態様は、以下の〔１〕〜〔１１〕項に記載される：
［１]  対象におけるがんの検出あるいは診断方法であって、対象由来生物学的試料におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを決定する工程を含み、ここで、この遺伝子の正常対照レベルと比較しての、前記レベルの増加は、この対象ががんに罹患しているあるいはがんを発症するリスクを有することを示す、方法、または対象におけるがんの検出あるいは診断方法であって、以下の工程を含む方法：
（i）  対象由来生物学的試料を単離または回収する工程、
（ii）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを測定または決定するために、この対象由来生物学的試料を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドあるいはＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドと結合する抗体と接触させる工程、および
（iii）  この接触に基づいてＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを測定または決定する工程、ここで、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の正常対照レベルと比較しての前記レベルの増加は、この対象ががんに罹患しているあるいはがんを発症するリスクを有することを示す、方法；
［２］  測定された試料発現レベルが、正常対照レベルより少なくとも１０％高い前記[１]記載の方法；
［３］  発現レベルは以下から選択される方法によって検出される、前記［１］または［２］記載の方法：
（ａ）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出する方法、
（ｂ）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質を検出する方法、および
（ｃ）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によってコードされるタンパク質の生物学的活性を検出する方法；
［４］  前記生物学的活性が、細胞増殖促進活性またはメチルトランスフェラーゼ活性である、前記［３］記載の方法；
［５］  前記発現レベルが、ｍＲＮＡに対するプローブによってｍＲＮＡを検出することにより決定される、前記［３］記載の方法；
［６］  前記発現レベルが、前記タンパク質に対する抗体によってタンパク質を検出することにより決定される、前記［３］記載の方法；
［７］  がんが、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍癌からなる群から選択される、前記［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法；
［８］  対象由来の生物学的試料が、生検標本、唾液、痰、血液、血清、血漿、胸水または尿試料である、前記［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法；
［９］  対象由来の生物学的試料が、上皮細胞を含む、前記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法；
［１０］  対象由来の生物学的試料が、がん細胞を含む、前記［１］〜［９］のいずれか１項に記載の方法；および
［１１］  対象由来の生物学的試料が、がん性上皮細胞を含む、前記［１］〜［１０］のいずれか１項記載の方法。
【００７３】
がんを診断する方法は、以下においてより詳細に記載される。本発明によって診断されるべき対象は、好ましくは哺乳類である。例示的な哺乳類としては、たとえば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが挙げられるが、これらに限らない。
本発明の方法は、好ましくは、診断されるべき対象から入手あるいは回収した生物学的試料を利用する。あらゆる生物学的材料は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の目的の転写または翻訳生成物を含むことができる限りにおいて、決定のための生物学的試料として使用することができる。好適な対象由来生物学的試料の例としては、生検標本のような体組織、ならびに、血液、痰および尿のような体液が挙げられるが、これらに限らない。好ましくは、生物学的試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞あるいはがん性であることが疑われる組織由来の上皮細胞を含む、細胞集団を含有している。さらに、必要な場合には、この細胞は、得られた体組織および体液から精製され、その後、生物学的試料として使用してもよい。
【００７４】
本発明の文脈において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を過剰発現する任意のがんを、本発明の方法によって診断あるいは検出することができる。診断あるいは検出されるべき好ましいがんとしては、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍が挙げられる。このようながんを診断あるいは検出するために、対象由来生物学的試料は、好ましくは以下の器官から回収する：肺癌については肺；子宮頸癌については子宮頸管；膀胱癌については膀胱；食道癌については食道；骨肉腫については骨；前立腺癌については前立腺；および軟部腫瘍については軟部組織。
【００７５】
好ましくは、対象由来生物学的試料は、上記の器官におけるがん性であることが疑われる領域から回収される。したがって、疑わしい領域から回収された肺組織試料、子宮頸管組織試料、膀胱組織試料、食道組織、骨組織、前立腺組織、または軟部組織試料は、好ましくは、それぞれ、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌または軟部腫瘍の診断あるいは検出のための対象由来生物学的試料として使用することができる。このような組織試料は、生検あるいは外科的切除によって得ることができる。
【００７６】
本発明によれば、対象由来生物学的試料におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルは、対照試料に対する比較によって決定され、次いで特定の健康あるいは疾患状態と関係づけられる。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルは、当技術分野において公知の方法を用いて転写生成物レベルで決定することができる。たとえば、ＳＵＶ３９Ｈ２のｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション法（たとえば、ノーザンハイブリダイゼーション）によってプローブを用いて定量してもよい。検出は、チップまたはアレイ上で行なってもよい。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を含む複数の遺伝子（たとえば、種々のがん特異的遺伝子）の発現レベルを検出するためにはアレイの使用が好ましい。当業者は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子についての公知の配列情報を利用してこのようなプローブを調製することができる。たとえば、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のｃＤＮＡを、プローブとして用いてもよい。必要であれば、プローブは、色素、蛍光および放射性同位元素のような好適な標識によって標識化してもよく、遺伝子の発現レベルは、ハイブリダイズした標識の強度として検出してもよい。
【００７７】
あるいは、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写生成物は、増幅に基づく検出法（たとえば、ＲＴ−ＰＣＲ）によってプライマーを用いて定量してもよい。このようなプライマーもまた、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の利用可能な配列情報に基づいて調製することができる。たとえば、実施例において使用されたプライマー（配列番号５および６、ＳＵＶ３９Ｈ２用）は、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットによる検出のために利用してもよいが、本発明はそれらに限らない。
【００７８】
本発明の方法の文脈における使用のために好適なプローブあるいはプライマーは、ストリンジェント、中程度のストリンジェント、または低ストリンジェンシー条件下において、ＳＵＶ３９Ｈ２のｍＲＮＡとハイブリダイズするであろう。「ストリンジェントな条件」の詳細は、「遺伝子およびポリペプチド」と題した章において記載されている。あるいは、診断は、当技術分野において公知の方法を用いる、ＳＵＶ３９Ｈ２翻訳生成物（すなわち、ポリペプチドあるいはタンパク質）の検出を含んでいてもよい。たとえば、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の量は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに対する抗体を用いて決定し、疾患または正常状態と関連づけてもよい。ここにおいて、「ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに対する抗体」は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその断片に対して生成された抗体であって、かつ、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体を指す。ここにおいて、「ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに特異的に結合する」は、抗体が、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合するが、他のポリペプチドに対しては検出可能な程度に結合しないことを意味する。
【００７９】
翻訳生成物／タンパク質の量は、たとえば、そのタンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫アッセイ法を用いて、決定してもよい。本発明の方法の文脈において使用に好適な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の免疫学的断片または改変抗体（たとえば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、等）は、その断片または改変抗体がＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質に対する結合能を保持する限りにおいて、検出のために使用してもよい。タンパク質の検出のためのこれらの種の抗体を調製するための方法は、当技術分野において周知であり、あらゆる方法を、このような抗体およびその等価物を調製するために本発明において利用してもよい。
【００８０】
あるいは、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルをその翻訳生成物に基づいて決定してもよく、たとえば、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析を介して観察される染色強度の調査を通じてでもよい。より詳細には、強い染色の観察は、タンパク質の増加した存在および同時にＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の高い発現レベルを示す。
【００８１】
さらに、翻訳生成物は、その生物学的活性に基づいて決定してもよい。ここにおいて発見されたように、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質は、がん細胞の増殖に関与していることが明らかになった。したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質のがん細胞増殖促進活性は、生物学的試料中に存在するＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の指標として用いてもよい。あるいは、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質のメチルトランスフェラーゼ活性もまた、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルの決定のために用いてもよい。
さらに、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルに加えて、他のがん関連遺伝子、たとえば、がんにおいて異なって発現されることが知られている遺伝子の発現レベルもまた、診断を確認するために決定してもよい。
【００８２】
本発明の文脈において、対象におけるがん、あるいは対象由来試料中のがん細胞を検出または同定する方法は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルの決定から始まる。この発現レベルは、上記のいずれかの技術によって決定してもよい。一旦決定されると、次に、このレベルを、対照レベルと比較することができる。本発明の文脈において、遺伝子発現レベルは、対照レベルと比較して、遺伝子発現が、たとえば、１０％、２５％、または５０％、または少なくとも０．１倍、少なくとも０．２倍、少なくとも０．５倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、あるいは少なくとも１０倍以上、変化あるいは増加した場合、「変更された」または「増加した」と認定される。したがって、生物学的試料中のＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を含むがんマーカー遺伝子の発現レベルは、対応する肺癌マーカー遺伝子の対照レベルから、たとえば、１０％、２５％、または５０％だけ増加した場合、または１．１倍より上、１．５倍より上、２．０倍より上、５．０倍より上、１０．０倍より上、あるいはそれより上まで増加した場合、増加したと考えられる。
【００８３】
本発明の文脈において、「対照レベル」という語句は、対照試料において検出されたＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを指し、正常対照レベルおよびがん対照レベルの両方を含む。「正常対照レベル」という語句は、正常健常者、またはがんに罹患していないことが判明している者の集団において検出されたＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子発現のレベルを指す。健常者は、がんの臨床的症状のない者である。正常対照レベルは、非がん性組織から得られた正常細胞を用いて決定することができる。「正常対照レベル」はまた、がんに罹患していないことが判明している者、あるいは集団の正常健常組織または細胞において検出されたＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルであってもよい。一方、「がん対照レベル」または「がん性対照レベル」という語句は、がんに罹患している者あるいは集団のがん性組織または細胞において検出されたＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを指す。
【００８４】
正常対照レベルと比較した対象由来試料中に検出されたＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルの増加は、その対象（その試料の入手元である）ががんに罹患していることあるいはがんを発症するリスクを有することを示す。本発明の文脈において、対象由来試料は、試験対象、たとえば、がんを有することがわかっているまたは疑われている患者から得られた任意の組織であることができる。たとえば、組織は、上皮細胞を含んでいてもよい。より具体的には、組織は、がん性であることが疑われている上皮細胞であってもよい。試料の発現レベルおよびがん対照レベル間の類似性は、その対象（その試料の入手元である）ががんに罹患していることまたはがんを発症するリスクを有することを示す。他のがん関連遺伝子の発現レベルもまた測定および比較する場合、試料およびがん性の参照との間の遺伝子発現パターンにおける類似性は、対象ががんに罹患していることあるいはがんの発症リスクを有することを示す。
【００８５】
対照レベルは、その疾患状態（がん性または非がん性）がわかっている対象からあらかじめ集めて保存しておいた試料を用いて、試験生物学的試料と同時に決定してもよい。あるいは、対照レベルは、あらかじめ決定された、その疾患状態がわかっている対象からの試料中のＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを解析することによって得られた結果に基づいて、統計的な方法によって決定してもよい。さらに、対照レベルは、あらかじめ試験した細胞からの発現パターンのデータベースであってもよい。そのうえ、本発明のある側面によれば、生物学的試料におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルは、複数の対照レベルと比較してもよく、それらの対照レベルは、複数の参照試料から決定される。対象由来生物学的試料と同様の組織タイプ由来の参照試料から決定された対照レベルを使用することが好ましい。そのうえ、既知の疾患状態を有する集団におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は、当技術分野において公知の任意の方法によって得てもよい。たとえば、平均値±２ＳＤまたは平均値±３ＳＤの範囲を標準値として用いてもよい。
【００８６】
ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルが、正常対照レベルと比較して増加した場合、またはがん性対照レベルと同様である場合、その対象は、がんに罹患しているあるいはがんの発症リスクを有するとして診断されることができる。さらに、複数のがん関連遺伝子の発現レベルを比較する場合、試料とがん性である参照との間の遺伝子発現パターンの類似性は、その対象ががんに罹患していることあるいはがんの発症リスクを有することを示す。
【００８７】
試験生物学的試料の発現レベルおよび対照レベルの間の相違は、対照核酸、たとえば、細胞のがん性または非がん性の状態に依存して発現レベルが相違しないことがわかっているハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して、標準化することができる。例示的な対照遺伝子としては、β−アクチン、グリセルアルデヒド３ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびリボソームのタンパク質Ｐ１が挙げられるが、これらに限らない。
上述した用途を容易にするために、本発明は、がんを診断するための診断試薬を提供する。このような試薬は、以下のものから選択することができる：
（a）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（b）  ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質を検出するための試薬；および
（c）  ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【００８８】
具体的には、このような試薬は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写生成物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合する抗体である。言い換えれば、本発明はまた、がんの診断あるいは検出において使用されるためのキットであって、ここで、このキットはＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写または翻訳生成物に結合する試薬を含むキットを提供する。
【００８９】
本発明の知見は、ＳＵＶ３９Ｈ２は有用な診断マーカーであるだけでなく、がん治療のための標的でもあることを明らかにする。したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２を標的とするがん治療は、本発明によって達成され得る。本発明の文脈において、「ＳＵＶ３９Ｈ２を標的とするがん治療」という語句は、がん細胞におけるＳＵＶ３９Ｈ２活性および／または発現の抑制あるいは阻害を指す。任意の抗ＳＵＶ３９Ｈ２剤は、ＳＵＶ３９Ｈ２を標的とするがん治療のために使用することができる。本発明の文脈において、好ましい抗ＳＵＶ３９Ｈ２剤は、活性成分として以下の物質を含む：
（a）  本発明の二本鎖分子、
（b）  それをコードするＤＮＡ、または
（c）  それをコードするベクター。それらのすべては以下において詳細に論じられる。
【００９０】
したがって、好ましい態様において、本発明は、（i）  対象が治療すべきがんを有するかどうかを診断する、および／または（ii）  がん治療のための対象を選択する、方法を提供し、それらの方法は、以下の工程を含む：
（a）  治療すべきがんを有することが疑われる対象から得られたがん細胞または組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルを決定する工程；
（b）  このＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルを正常対照レベルと比較する工程；
（c）  そのＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルが正常対照レベルと比較して増加している場合、その対象が治療すべきがんを有すると診断する工程；および
（d）  工程（ｃ）において、その対象が治療すべきがんを有すると診断される場合、がん治療のためにその対象を選択する工程。
【００９１】
あるいは、このような方法は、以下の工程を含む：
（a）  治療すべきがんを有することが疑われる対象から得られたがん細胞または組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルを決定する工程；
（b）  ＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルをがん性対照レベルと比較する工程；
（c）  そのＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルががん性対照レベルと同様または等価である場合、その対象が治療すべきがんを有すると診断する工程；および
（d）  工程（ｃ）において、その対象が治療すべきがんを有すると診断される場合、がん治療のためにその対象を選択する工程。
【００９２】
例示的ながんとしては、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および／また軟部腫瘍が挙げられるが、これらに限らない。したがって、活性成分としての本発明の二本鎖分子の投与の前に、治療すべきがん細胞または組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルが同じ器官の正常細胞と比較して増強されているかどうかを確認することが好ましい。したがって、一つの態様においては、本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２を（過剰）発現するがんを治療する方法を提供し、その方法は、以下の工程を含んでいてよい：
i）  治療すべきがんを有する対象から得られたがん細胞または組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルを決定する工程；
ii）  このＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルを、正常対照と比較する工程；および
iii）  正常対照と比較してＳＵＶ３９Ｈ２を過剰発現するがんを有する対象に、
（a）  本発明の二本鎖分子、
（b）  それをコードするＤＮＡ、および
（c）  それをコードするベクター
からなる群から選択される少なくとも１つの成分を、投与する工程。あるいは、本発明はまた、
（a）  本発明の二本鎖分子、
（b）  それをコードするＤＮＡ、および
（c）  それをコードするベクター
からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む、ＳＵＶ３９Ｈ２を過剰発現するがんを有する対象に投与する用途のための医薬組成物を提供する。言い換えれば、本発明は、さらに、
（a）  本発明の二本鎖分子、
（b）  それをコードするＤＮＡ、または
（c）  それをコードするベクター
で治療すべき対象を同定する方法を提供する。
【００９３】
このような方法は、対象由来のがん細胞または組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルを決定する工程を含んでいてもよく、ここで、この遺伝子の正常対照レベルと比較してそのレベルの増加は、本発明の二本鎖分子で治療してもよいがんをその対象が有することを示す。
【００９４】
本発明のがんの治療方法は、以下においてより詳細に記載される。
本発明の方法によって治療されるべき対象は、好ましくは哺乳類である。例示的な哺乳類としては、たとえば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが挙げられるが、これらに限らない。
本発明によれば、対象から得られたがん細胞または組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルは、当技術分野において公知の方法を用いて、たとえば転写（核酸）生成物レベルで、決定される。たとえば、ハイブリダイゼーション法（たとえば、ノーザンハイブリダイゼーション）、チップまたはアレイ、プローブ、ＲＴ−ＰＣＲを用いてＳＵＶ３９Ｈ２の転写生成物レベルを決定することができる。
【００９５】
あるいは、翻訳生成物を、本発明の治療のために検出してもよい。たとえば、観察されるタンパク質（配列番号２２、２４、２６、２８、および３０）の量を決定してもよい。
翻訳生成物に基づいてＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学的解析を介して染色の強度を測定してもよい。具体的には、この測定において、強い染色は、タンパク質の存在／レベルの増加を示し、同時に、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の高い発現レベルを示す。
ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドおよび／またはそれをコードするポリヌクレオチドの検出または測定のための方法は、上記のとおりに例示されることができる。
【００９６】
がんを診断するためのキット：
本発明は、がんを診断あるいは検出するためのキットを提供する。好ましくは、がんは、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍からなる群から選択されてもよい。
本発明のキットは、対象由来生物学的試料におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出するための少なくとも一つの試薬を含み、この試薬は、以下のものからなる群から選択されてもよい：
（a）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（b）  ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質を検出するための試薬；および
（c）  ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬。
【００９７】
ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡを検出するための好適な試薬としては、ＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのような、ＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡに特異的に結合または同定する核酸が挙げられる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、ＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡに特異的であるプライマーおよびプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製されてもよい。必要であれば、ＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡを検出するための試薬は、固体基質上に固定されていてもよい。そのうえ、ＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡを検出するための２つ以上の試薬がキットに含まれていてもよい。
【００９８】
本発明のプローブあるいはプライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェント条件下で、少なくとも約２０００個、１０００個、５００個、４００個、３５０個、３００個、２５０個、２００個、１５０個、１００個、５０個、または２５個の、連続する、ＳＵＶ３９Ｈ２配列を含む核酸のセンス鎖ヌクレオチド配列、またはＳＵＶ３９Ｈ２配列を含む核酸のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列、またはこれらの配列の天然突然変異体にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。特に、たとえば、好ましい態様においては、長さ５〜５０個を有するオリゴヌクレオチドを、検出されるべき遺伝子を増幅するためのプライマーとして使用することができる。より好ましくは、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、１５〜３０ｂｐの長さを有するオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いて検出することができる。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの長さは、１５〜２５ｂｐから選択することができる。このようなオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを用いる遺伝子の検出のためのアッセイ手順、装置、または試薬は周知である（たとえばオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはＰＣＲ）。これらのアッセイにおいて、プローブまたはプライマーは、タグまたはリンカー配列をも含むことができる。さらに、プローブまたはプライマーは、検出可能な標識または捕捉すべき親和性リガンドで改変することができる。あるいは、ハイブリダイゼーションベースの検出手順において、長さ数百（たとえば、約１００〜２００個）の塩基〜数キロ（たとえば、約１０００〜２０００個）の塩基を有するポリヌクレオチドを、プローブ（たとえば、ノーザンブロッティングアッセイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ解析）のために使用することもできる。
【００９９】
一方、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質を検出するための好適な試薬としては、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質に対する抗体が挙げられる。抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよい。さらに、抗体の任意の免疫学的断片あるいは改変抗体（たとえば、キメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、等）は、その断片あるいは改変抗体がＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質に結合する能力を保持する限りにおいて、試薬として用いてもよい。タンパク質の検出のためのこの種の抗体を調製するための方法は、当技術分野において周知であり、任意の方法を、このような抗体およびその等価物を調製するために本発明において用いてもよい。
【０１００】
抗体は、直接連結または間接標識技術を介してシグナル発生分子で標識してもよい。抗体を標識するためおよびその標的に対する抗体の結合を検出するための標識および方法は、当技術分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために用いてもよい。そのうえ、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質を検出するための２以上の試薬をキットに含めてもよい。
【０１０１】
あるいは、生物学的試料におけるＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の発現は、指標としてその生物学的活性を用いて検出または測定してもよい。生物学的活性は、たとえば、生物学的試料中の発現されたＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質による細胞増殖活性を測定することによって決定することができる。たとえば、対象由来生物学的試料の細胞増殖活性は、対象由来生物学的試料の存在下で細胞を培養すること、および増殖の速度を検出すること、細胞周期を測定することもしくはコロニー形成能力を測定することによって決定することができる。ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の生物学的活性を検出するための２つ以上の試薬をキットに含めてもよい。
【０１０２】
キットは、上記の２つ以上の試薬を含んでいてもよい。さらに、キットは、ＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡに対するプローブまたはＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質に対する抗体を結合するための固体基質および試薬、細胞を培養するための培地および容器、陽性および陰性対照試薬、ならびにＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質に対する抗体を検出するための二次抗体を含んでいてもよい。たとえば、がんに罹患しているまたは罹患していない対象から得られた組織試料は、有用な対照試薬として役立つ。
【０１０３】
本発明のキットは、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよく、これらとしては、緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用説明を含む添付文書（たとえば、書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、等）が挙げられる。これらの試薬その他は、ラベルを貼った容器に包装されていてもよい。適切な容器としては、ボトル、バイアルおよび試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成されていてもよい。
【０１０４】
本発明の一態様として、試薬がＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡに対するプローブである場合、試薬は、多孔質ストリップのような固体基質上に固定化されて、少なくとも一つの検出部位を形成していてもよい。多孔質ストリップの測定または検出領域は、複数の部位を含んでいることができ、それぞれが、核酸（プローブ）を含む。試験ストリップはまた、陰性および／または陽性対照用の部位を含んでいてもよい。あるいは、対照部位は、試験ストリップから分離されたストリップ上に位置していてもよい。付加的に、異なる検出部位は、異なる量の固定化核酸、すなわち、最初の検出部位により高い量およびその後の部位に順次より低い量を含んでいてもよい。試験試料の添加の際、検出可能なシグナルを呈している部位の数は、試料中に存在するＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡの量の定量的表示を提供する。検出部位は、任意の好適な検出可能な形に設計してもよく、典型的には、試験ストリップの幅にわたる棒状または点状の形である。
【０１０５】
本発明のキットは、陽性対照試料をさらに含んでいてもよい。本発明の陽性対照試料は、ＳＵＶ３９Ｈ２陽性試料を集め、次いでこれらのＳＵＶ３９Ｈ２レベルをアッセイすることにより調製してもよい。一つの態様においては、ＳＵＶ３９Ｈ２陽性組織試料は、ＳＵＶ３９Ｈ２を発現するがん細胞から構成されていてもよい。このようながん細胞としては、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍からなる群から選択されるがんが挙げられるが、これらに限らない。陽性対照試料のＳＵＶ３９Ｈ２レベルは、たとえば、カットオフ値を上回るものであることができる。
【０１０６】
あるいは、ＳＵＶ３９Ｈ２陽性試料は、がん患者から得られた臨床がん組織であってもよい。このようながんとしては、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍が挙げられるが、これらに限らない。あるいは、陽性対照試料は、カットオフ値を決定し、このカットオフ値を上回る量のＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡまたはタンパク質を含む試料を調製することによって調製してもよい。ここにおいて、「カットオフ値」という語句は、正常範囲とがん性範囲との間を分ける値を指す。たとえば、当業者は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いてカットオフ値を決定してもよい。
【０１０７】
本発明のキットは、ＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡまたはポリペプチドのカットオフ値量を提供するＳＵＶ３９Ｈ２標準試料を、付加的にまたは代替的に含んでいてもよい。本発明のキットは、さらに、非ＳＵＶ３９Ｈ２発現細胞または組織、あるいはがんを有さない対照由来の血液試料のような陰性対照試料を含んでいてもよい。本発明の文脈において、陰性対照試料は、非がん性細胞株、または正常な肺組織、子宮頚管組織、膀胱組織、食道組織、骨組織、前立腺組織および軟部組織のような非がん性組織から調製してもよく、カットオフ値未満のＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡまたはタンパク質を含む試料を調製することによって調製してもよい。
【０１０８】
抗がん物質のスクリーニング：
ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはそれらの機能的等価物、またはその遺伝子の転写調節領域を用いて、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現またはＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を変更する物質をスクリーニングすることが可能である。このような物質は、がんのようなＳＵＶ３９Ｈ２過剰発現に関連する疾患を治療もしくは予防するための医薬の候補として用いてもよい。したがって、本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはそれらの機能的等価物、またはＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写調節領域を用いる、がんの治療もしくは予防の一方あるいは両方のための候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【０１０９】
好適な候補として本発明のスクリーニング方法によって単離および同定される物質は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現またはＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の翻訳生成物の活性を低減、抑制および／または阻害することが期待され、したがって、がん（特に、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍）の治療および予防の一方あるいは両方のための候補である。具体的には、本発明の方法を通じてスクリーニングされる物質は、臨床的有効性を有すると認定され、動物モデルまたは試験対象におけるがん細胞増殖を制限または防止するその能力についてさらに試験されることができる。
【０１１０】
本発明の文脈において、本発明のスクリーニング方法を通じて同定されるべき物質は、任意の物質またはいくつかの物質を含む組成物であってもよい。さらに、本発明のスクリーニング方法にしたがって細胞またはタンパク質に曝露される試験物質は、単一の物質であってもよく、物質の組み合わせであってもよい。物質の組み合わせがそれらの方法において使用される場合、物質は、連続的にまたは同時に接触させてもよい。
【０１１１】
任意の試験物質、たとえば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物の生成物、海洋生物由来抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド物質、合成マイクロ分子物質（アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマー、等の核酸構築物を含む）および天然物質は、本発明のスクリーニング方法において使用することができる。本発明の試験物質はまた、当技術分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法の多数のアプローチの任意のものを用いて、得ることができ、これらとしては、（１）生物学的ライブラリー、（２）空間的にアドレス可能なパラレル固相ライブラリーまたは液相ライブラリー、（３）デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、（４）「１ビーズ１物質」ライブラリー法および（５）アフィニティクロマトグラフィ選択を用いる合成ライブラリー法が挙げられる。アフィニティクロマトグラフィ選択を用いる生物学的ライブラリー法は、ペプチドライブラリーに制限されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の低分子ライブラリーに適用することができる（Lam、 Anticancer Drug Des 1997、 12： 145−67））。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、先行技術中に見つけることができる（DeWitt et al.、 Proc Natl Acad Sci USA 1993、 90： 6909−13； Erb et al.、 Proc Natl Acad Sci USA 1994、 91： 11422−6； Zuckermann et al.、 J Med Chem 37： 2678−85、 1994； Cho et al.、 Science 1993、 261： 1303−5； Carell et al.、 Angew Chem Int Ed Engl 1994、 33： 2059； Carell et al.、 Angew Chem Int Ed Engl 1994、 33： 2061； Gallop et al.、 J Med Chem 1994、 37： 1233−51）。化合物のライブラリーは、溶液中（Houghten、 Bio/Techniques 1992、 13： 412−21参照）、またはビーズ（Lam、 Nature 1991 、354： 82−4 、チップ（Fodor. Nature 1993、 364： 555−6）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号；および第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Cull et al.、 Proc Natl Acad Sci USA 1992、 89： 1865−9）もしくはファージ（ScottおよびSmith 、Science 1990 、 249： 386−90； Devlin、 Science 1990、 249： 404−6； Cwirla et al.、Proc Natl Acad Sci USA 1990、 87： 6378−82； Felici、 J Mol Biol 1991、 222： 301−10； 米国特許出願第２００２１０３３６０号）上に存在してもよい。
【０１１２】
本発明のスクリーニング方法によってスクリーニングされた物質の構造の一部が付加、欠失および／または置換によって変換されている化合物は、本発明のスクリーニング方法によって得られる物質に包含される。
さらに、スクリーニングされた試験物質がタンパク質である場合、そのタンパク質をコードするＤＮＡを得るために、そのタンパク質のアミノ酸配列の全体を、そのタンパク質をコードする核酸配列を推定するために決定してもよく、または得られたタンパク質の部分アミノ酸配列を、その配列に基づくプローブとしてオリゴＤＮＡを調製するために解析して、そのプローブを用いてタンパク質をコードするＤＮＡを得るためにｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてもよい。得られたＤＮＡは、がんまたはその術後再発を治療もしくはは予防するためまたはがん細胞増殖阻害のための候補である試験物質を調製することにおけるその有用性を確認される。ここで記載されるスクリーニングにおいて有用な試験物質としては、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質に特異的に結合する抗体、またはインビボにおいて元のタンパク質の生物学的活性を欠くその部分ペプチドが挙げられる。
【０１１３】
試験物質ライブラリーの構築は当技術分野において周知であるものの、ここで以下において、本発明のスクリーニング方法のためのこのような物質のライブラリー構築および試験物質の同定におけるさらなる指針を提供する。
ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の発現レベルあるいは生物学的活性のいずれかの抑制が、がん細胞の増殖の抑制をもたらすことがここで明らかにされる。したがって、ある物質がＳＵＶ３９Ｈ２の発現および／または活性を抑制する場合、このような抑制は、対象における潜在的な治療効果を示す。本発明の文脈において、潜在的な治療効果は、妥当な期待を伴う臨床的な有効性を指す。このような臨床的有効性の例としては、以下のものが挙げられるが、それらに限らない：
（a）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現の低減、
（b）  対象におけるがんの大きさ、罹患率、または転移能の低減、
（c）  がん形成の予防、または
（d）  がんの臨床的症状の予防または緩和。
【０１１４】
（i）  分子モデリング：
試験物質ライブラリーの構築は、求めている特性を有することが公知の化合物の分子構造、および／またはＳＵＶ３９Ｈ２の分子構造の知見によって容易になる。さらなる評価に好適な試験物質の予備的スクリーニングの一つのアプローチは、試験物質とその標的間の相互作用のコンピュータモデリングである。
【０１１５】
コンピュータモデリング技術は、選択された分子の三次元原子構造の可視化およびその分子と相互作用するであろう新規化合物の合理的設計を可能にする。この三次元構築物は、典型的には、選択された分子のＸ線結晶解析またはＮＭＲイメージングのデータに依存する。分子動力学は、力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムは、どのようにして新規化合物が標的分子に連結するかの予測を可能にし、完全な結合特異性への化合物および標的分子の構造の実験的操作を可能にする。一方あるいは両方に小さな変化が作られた場合に分子−化合物相互作用がどのようなものになるかの予測は、通常は、分子設計プログラムとユーザーとの間に使いやすいメニュー形式のインターフェースを備えた分子力学ソフトウェアおよび計算集約型コンピューターが必要である。
【０１１６】
上記で一般的に記載された分子モデリングシステムの例としては、ＣＨＡＲＭＭおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation、Waltham、Mass）が挙げられる。ＣＨＡＲＭＭは、エネルギー最小化および分子動力学機能を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび解析を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、分子相互の挙動の相互作用的構築、修飾、可視化、および解析を可能にする。
【０１１７】
多数の記事が、特異的タンパク質と相互作用する薬剤のコンピュータモデリングを論じており、たとえば、Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988、 97： 159−66； Ripka、 New Scientist 1988、 54−8； McKinlay & Rossmann、 Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989、 29： 111−22； Perry & Davies、 Prog Clin Biol Res 1989、 291： 189−93； Lewis & Dean、 Proc R Soc Lond 1989、 236： 125−40、 141−62；および核酸成分のためのモデルレセプターに関してAskew et al.、 J Am Chem Soc 1989、 111： 1082−90がある。
【０１１８】
化学物質をスクリーニングし図式化する他のコンピュータプログラムは、BioDesign 、Inc.、Pasadena 、Calif. 、Allelix 、Inc 、Mississauga 、Ontario 、Canada 、およびHypercube 、Inc. 、Cambridge 、Ontarioのような企業から入手可能である。たとえば、DesJarlais et al.、 J Med Chem 1988、 31： 722−9； Meng et al.、J Computer Chem 1992、 13： 505−24； Meng et al.、Proteins 1993、 17： 266−78； Shoichet et al.、 Science 1993、 259： 1445−50を参照されたい。
【０１１９】
推定阻害剤が一旦同定されると、以下に記載するように、コンビナトリアル化学技術を用いて、同定された推定阻害剤の化学構造に基づいて任意の数の変異体を構築することができる。結果として得られる推定阻害剤のライブラリー、または「試験物質」は、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍のようながんを治療もしくはは予防する試験物質を同定するために、本発明の方法を用いてスクリーニングされることができる。
【０１２０】
（ii）  コンビナトリアル化学合成：
試験物質のコンビナトリアルライブラリーは、公知の阻害剤に存在するコア構造の知識を含む、合理的薬剤設計プログラムの一部として作製してもよい。このアプローチは、ライブラリーが妥当なサイズに維持されることを可能にし、ハイスループットスクリーニングを容易にする。あるいは、簡便な、特に短いポリマー分子ライブラリーを、そのライブラリーを構成する分子ファミリーのすべての順列を単に合成することにより構築してもよい。この後者のアプローチの例は、６アミノ酸の長さのすべてのペプチドのライブラリーである。このようなペプチドライブラリーは、すべての６アミノ酸配列の順列を含むことができる。このタイプのライブラリーは、直線的コンビナトリアル化学ライブラリーと呼ばれる。
【０１２１】
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製は、当業者には周知であり、化学的合成または生物学的合成のいずれによって作製されてもよい。コンビナトリアル化学ライブラリーとしては、ペプチドライブラリー（たとえば、米国特許第５,０１０，１７５号； Furka 、Int J Pept Prot Res 1991、 37：487−93； Houghten et al.、 Nature 1991、 354：
84−6を参照） が挙げられるが、これらに限らない。化学的多様性ライブラリーを生じるための他の化学を用いることもできる。このような化学としては、以下のものが挙げられるが、これらに限らない：  ペプチド（たとえば、国際公開公報ＷＯ９１／１９７３５）、コードされるペプチド（たとえば、ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（たとえば、ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン類（たとえば、米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン類およびジペプチド類のようなダイバーソマー類（DeWitt et al.、 Proc Natl Acad Sci USA 1993、 90：6909−13）、ビニル様（vinylogous）ポリペプチド（Hagihara et al.、 J Amer Chem Soc 1992、 114： 6568）、グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmann et al.、 J Amer Chem Soc 1992、114： 9217−8）、低化合物ライブラリーの類似有機合成（Chen et al.、 J. Amer Chem Soc 1994、 116： 2661）、オリゴカルバメート（Cho et al.、 Science 1993、 261： 1303）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbell et al.、 J Org Chem 1994、 59： 658）、核酸ライブラリー （Ausubel、Current Protocols in Molecular Biology 1995 supplement； Sambrook et al.、 Molecular Cloning： A Laboratory Manual、 1989、 Cold Spring Harbor Laboratory、 New York、 USAを参照されたい）、ペプチド核酸ライブラリー（たとえば、米国特許第５，５３９，０８３号を参照されたい）、抗体ライブラリー（たとえば、 Vaughan et al.、 Nature Biotechnology 1996、 14（3）：309−14およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照されたい）、糖質ライブラリー（たとえば、Liang et al. 、 Science 1996、 274： 1520−22； 米国特許第５，５９３，８５３号を参照されたい）、および有機低分子ライブラリー（たとえば、ベンゾジアゼピン類、 Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1；6（6）：624−31.；イソプレノイド類、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノン類およびメタチアザノン類、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン類、米国特許第５，５２５，７３５号および第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン類、５，２８８，５１４、等を参照されたい）。
【０１２２】
コンビナトリアルライブラリーの調製のための材料および方法は、市販されている（たとえば、357 MPS、 390 MPS、Advanced Chem Tech、 Louisville KY、 Symphony、 Rainin、Woburn、 MA、 433A Applied Bio systems、 Foster City、 CA、 9050 Plus、 Millipore、 Bedford、 MAを参照されたい）。それに加えて、多数のコンビナトリアルライブラリーは、それ自体市販されている。（たとえば、ComGenex、 Princeton N.J.、 Tripos、 Inc.、 St. Louis、 MO、 3D Pharmaceuticals、 Exton、 PA、 Martek Biosciences、 Columbia、 MD、等を参照されたい）。
【０１２３】
（iii）
他の候補：
別のアプローチは、組み換えバクテリオファージを用いてライブラリーを作製する。「ファージ法」（Scott & Smith、 Science 1990、 249： 386−90； Cwirla et al.、 Proc Natl Acad Sci USA 1990、 87： 6378−82； Devlin et al.、 Science 1990、 249： 404−6）を用いて、非常に大きいライブラリーを構築することができる（たとえば、１０６〜１０８化学物質）。第二のアプローチは、主として化学的方法を用い、そのうち、Geysen法（Geysen et al.、 Molecular Immunology 1986、 23：709−15； Geysen et al.、 J Immunologic Method 1987、 102： 259−74）； およびFodorらの方法（Science 1991、 251：767−73）が例示的である。Furkaら（14th International Congress of Biochemistry 1988、 Volume #5、 Abstract FR：013； Furka、 Int J Peptide Protein Res 1991、 37： 487−93）、Houghten（米国特許第４，６３１，２１１号）およびRutterら（米国特許第５，０１０，１７５号）は、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験することができるペプチドの混合物を製造する方法を記載する。
【０１２４】
アプタマーは、特異的分子標的にしっかり結合する核酸から構成される巨大分子である。TuerkおよびGold （Science. 249：505−510 （1990））は、アプタマーの選択のためのＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）法を開示する。ＳＥＬＥＸ法においては、核酸分子の大きいライブラリー（たとえば、１０１５の異なる分子）をスクリーニングに使用することができる。
【０１２５】
全長のＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに加えて、ポリペプチドの断片は、使用されるその断片が天然ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保持している限り、本発明のスクリーニング方法のために使用してもよい。このような本発明によって企図される生物学的活性の例としては、ネイティブなＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの細胞増殖促進活性およびメチルトランスフェラーゼ活性が挙げられる。
ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物は、得られるポリペプチドが天然ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を保持する限り、他の物質にさらに連結されていてもよい。有用な物質としては、ペプチド類、脂質類、糖類および糖鎖、アセチル基、天然および合成ポリマー類、等が挙げられる。これらの種類の修飾は、付加的な機能を付与するためまたはポリペプチドおよび断片を安定化するために行なってもよい。
【０１２６】
（I）  一般的なスクリーニング方法：
ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写調節領域を用いて、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現またはＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を変更する物質を同定することができる。ここで明らかにされるように、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子は、がんにおいて過剰発現され、がん細胞の増殖および／または生存に関与する。したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現またはＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を変更する物質は、がんの治療剤候補になり得る。
【０１２７】
ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合するアンタゴニストは、がんの細胞増殖を媒介する生物学的活性を低減、抑制または阻害することができる。そのようにして、それらは、がんを治療するための潜在的候補である。したがって、本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合する物質を同定することにより、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現するがんの治療もしくは予防の一方あるいは両方を行なうための候補を同定する方法を提供する。
【０１２８】
いくつかの態様において、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドは、適切な支持体に固定化されていてもよい。タンパク質の結合に使用することができる支持体の例としては、たとえば、不溶性多糖類、たとえばアガロース、セルロースおよびデキストラン；および合成樹脂、たとえば、ポリアクリルアミド、ポリスチレンおよびシリコン；たとえば、上記の材料から調製された市販のビーズおよびプレート（たとえば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップ、等）を用いることができる。ビーズを用いる場合、それらはカラム中に充填することができる。あるいは、磁性ビーズの使用もまた当技術分野において公知であり、磁力を介してビーズ上に結合したタンパク質を容易に単離することを可能にする。
支持体に対するタンパク質の結合は、たとえば、化学的結合および物理的吸着のような、慣例的方法にしたがって行なうことができる。あるいは、タンパク質は、そのタンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合することができる。そのうえ、支持体に対するタンパク質の結合は、アビジンおよびビオチンを用いて行なってもよい。
【０１２９】
固定化されたポリペプチドは、合成化合物、天然物質バンク、またはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーに曝露することができ、タンパク質だけでなく、そのタンパク質に結合する化合物（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）をも単離するためのコンビナトリアルライブラリに基づいたハイスループットを用いるスクリーニング法（Wrighton et al.、 Science 273： 458−63 （1996）； Verdine、 Nature 384： 11−3 （1996））は、当業者に周知である。
【０１３０】
さらに、本発明のスクリーニング方法において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを抑制する物質は、がんの治療候補として同定することもできる。ポリペプチドあるいはその機能的等価物の発現レベルは、当技術分野において公知の任意の方法にしたがって検出することができる。たとえば、レポーターアッセイを使用することができる。好適なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野において周知である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写調節領域を用いて調製することができる。遺伝子の転写調節領域が当業者に公知の場合、レポーター構築物は、従来の配列情報を用いて調製することができる。転写調節領域が同定されていない場合、転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、その遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいてゲノムライブラリーから単離することができる。具体的には、スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写調節領域にレポーター遺伝子配列をつなげることにより調製することができる。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写調節領域は、開始コドンから、少なくとも５００ｂｐ上流、たとえば、１０００ｂｐ、たとえば、５０００または１００００ｂｐ上流の領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離することができ、あるいは、ＰＣＲによって増幅することができる。転写調節領域を同定するための方法、およびアッセイプロトコールも、周知である（SambrookおよびRussell、Molecular Cloning： A Laboratory Manual、 3rd Ed.、 Chapter 17、 2001、 Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
さらに、本発明のスクリーニング方法において、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を阻害する物質は、がんの治療剤候補としても同定することができる。
【０１３１】
種々のロースループットおよびハイスループット酵素アッセイ方式が当技術分野において公知であり、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性の検出または測定のために容易に適合させることができる。ハイスループットアッセイのためには、基質は、固体支持体上に好都合に固定化される。反応の後、ポリペプチドによって変換された基質は、上記の方法により固体支持体上で検出することができる。あるいは、接触工程は、溶液中で行なうこともでき、その後、基質を固体支持体上に固定し、ポリペプチドによって変換された基質を検出することができる。このようなアッセイを容易にするために、固体支持体をストレプトアビジンでコーティングし、基質をビオチンで標識することができ、あるいは、固体支持体を基質に対する抗体でコーティングすることができる。当業者は、スクリーニングの所望のスループット能に応じて好適なアッセイ方式を決定することができる。
【０１３２】
本発明のアッセイはまた、ハイスループットスクリーニングを容易にする自動化手順にも好適である。多数の周知のロボットシステムが溶液相化学のために開発されている。これらのシステムとしては、Takeda Chemical Industries、 Ltd. （Osaka、 Japan）によって開発された自動合成装置のような自動化ワークステーション、およびロボットアームを利用する多数のロボットシステム（Zymate II、 Zymark Corporation、 Hopkinton、 Mass.；Orca、 Hewlett Packard、 Palo Alto、 Calif.）が挙げられ、これらは化学者による手動の合成操作を模倣するものである。上記の装置の任意のものが本発明に用いるのに好適である。これらのデバイスがここで論じられたように作動できるようにする、これらに対する改変の性質および施行（もし存在する場合）は、当業者には明らかである。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーが、それ自体市販されている（たとえば、 ComGenex、 Princeton、 N.J.、 Asinex、Moscow、 Ru、 Tripos、 Inc.、 St. Louis、 MO、 ChemStar、 Ltd、Moscow、 RU、 3D Pharmaceuticals、 Exton、 PA、 Martek Biosciences、 Columbia、 MD、等を参照されたい）。
【０１３３】
本発明において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルまたはＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性の抑制は、がん細胞の増殖の抑制をもたらすことが明らかになる。したがって、ある物質がＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現またはＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの活性を抑制する場合、この抑制は、対象における潜在的な治療効果の指標である。本発明において、潜在的な治療効果は、妥当な期待を伴う臨床的有効性を指す。本発明において、このような臨床的有効性は、以下のものを包含する；
（ａ）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現の低減、
（ｂ）  対象におけるがんの大きさ、罹患率、または転移能の低減、
（ｃ）  がんの形成の予防、または
（ｄ）  がんの臨床的症状の予防あるいは緩和。
【０１３４】
（II）ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合する物質のスクリーニング：
本発明の過程において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子は、種々のがん、たとえば肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍においてで過剰発現するが、それにもかかわらず精巣を除く正常器官においてはほとんどあるいはまったく発現しないことが解明されている（図１、２、３、６、９、１０および表３、４、５、６）。したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドを用いて、
本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合する物質をスクリーニングする方法を提供する。がんにおけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現のため、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合する物質は、がん細胞の増殖を抑制し、したがってがんの治療および予防の一方あるいは両方に有用であることが期待される。したがって、本発明はまた、がん細胞の増殖を抑制する候補物質のスクリーニング方法、およびＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドを用いるがんの治療および予防の一方あるいは両方のための候補物質のスクリーニング方法を提供する。具体的には、一つの態様において、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含む：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物と接触させる工程；
（b）  このポリペプチドあるいはその機能的等価物およびこの試験物質間の結合活性を検出する工程；および
（c）  このポリペプチドあるいは機能的等価物に結合する試験物質を選択する工程。
【０１３５】
本発明によれば、がん細胞増殖の阻害ならびにＳＵＶ３９Ｈ２の過剰発現に関連するがんの治療および予防に対する試験物質の治療効果は、評価または推測することができる。したがって、本発明はまた、がん細胞増殖の阻害、またはがんの治療および予防の一方あるいは両方のための候補物質のスクリーニング方法も提供し、これは、以下の工程を含む：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；
（b）  ポリペプチド（または機能的等価物）および試験物質間の結合を検出する工程；および
（c）  （b）の結合を試験物質の潜在的治療効果と関連づける工程。
【０１３６】
本発明の文脈において、治療効果は、試験物質の結合特性と関連づけてもよい。たとえば、試験物質がポリペプチド（または機能的等価物）に結合する場合、その試験物質は、治療効果を有する候補物質として同定あるいはは選択することができる。あるいは、試験物質がポリペプチド（または機能的等価物）に結合しない場合、この試験物質は、有意な治療効果を有さない物質として同定されることができる。
【０１３７】
あるいは、本発明によれば、ＳＵＶ３９Ｈ２の過剰発現に関連するがんの治療および予防の一方あるいは両方に対する試験物質の潜在的治療効果は、以下のようにして評価または推測することができる：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；
（b）  ポリペプチドまたは機能的等価物および試験物質間の結合活性を検出する工程；および
（c）  潜在的治療効果および試験物質を関連づける工程、ここで潜在的治療効果は、物質がポリペプチドまたは機能的等価物に結合する場合に示される。
【０１３８】
本発明の方法は、以下においてより詳細に説明される。本発明のスクリーニング方法に使用されるＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドは、組み換えポリペプチドまたは天然由来のタンパク質あるいはそれらの部分ペプチドであってもよい。試験物質と接触されるべきポリペプチドは、たとえば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、担体に結合した形態または他のポリペプチドと融合された融合タンパク質であることができる。好ましい態様においては、ポリペプチドは、ＳＵＶ３９Ｈ２発現細胞から単離されるか、あるいは、インビトロで試験物質と接触されるために化学合成される。
【０１３９】
ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合するタンパク質のスクリーニング方法として、当業者に周知の多数の方法を使用することができる。このようなスクリーニングは、たとえば、免疫沈降法によって、具体的には以下のようにして行なうことができる。ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドをコードする遺伝子を、外来遺伝子用の発現ベクター、たとえばｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＡＧＧＳおよびｐＣＤ８にこの遺伝子を挿入することによって、宿主（たとえば、動物）細胞等において発現させる。
【０１４０】
発現のために用いるべきプロモーターは、通常使用され得る任意のプロモーターであってよく、たとえば、ＳＶ４０初期プロモーター（Rigby in Williamson （ed.）、Genetic Engineering、 vol. 3. Academic Press、 London、 83−141 （1982））、ＥＦ−αプロモーター（Kim et al.、Gene 91： 217−23 （1990））、ＣＡＧプロモーター（Niwa et al.、Gene 108： 193 （1991））、ＲＳＶ  ＬＴＲプロモーター（Cullen、 Methods in Enzymology 152： 684−704 （1987））、ＳＲ  αプロモーター（Takebe et al.、 Mol Cell Biol 8： 466 （1988））、ＣＭＶ最初期プロモーター（SeedおよびAruffo、 Proc Natl Acad Sci USA 84： 3365−9 （1987））、ＳＶ４０後期プロモーター（GheysenおよびFiers、 J Mol Appl Genet 1： 385−94 （1982））、アデノウイルス後期プロモーター（Kaufman et al.、 Mol Cell Biol 9： 946 （1989））、ＨＳＶ  ＴＫプロモーター等が挙げられる。
【０１４１】
外来遺伝子を発現させるための宿主細胞への遺伝子の導入は、任意の方法にしたがって実施することができ、たとえば、エレクトポレーション法（Chu et al.、 Nucleic Acids Res 15： 1311−26 （1987））、リン酸カルシウム法（ChenおよびOkayama、 Mol Cell Biol 7： 2745−52 （1987））、 ＤＥＡＥデキストラン法（Lopata et al.、 Nucleic Acids Res 12： 5707−17 （1984）； SussmanおよびMilman、 Mol Cell Biol 4： 1641−3 （1984））、リポフェクチン（the Lipofectin）法（Derijard B.、Cell 76： 1025−37 （1994）； Lamb et al.、Nature Genetics 5： 22−30 （1993）： Rabindran et al.、 Science 259： 230−4 （1993））等がある。
【０１４２】
ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端へ、その特異性が解明されているモノクローナル抗体のエピトープを導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質として発現させることができる。市販のエピトープ−抗体システムを使用することができる（Experimental Medicine 13： 85−90 （1995））。複数のクローニング部位を使用することにより、たとえば、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現することができるベクターは、市販されている。融合によってＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの特性を変えないように数個〜１ダースのアミノ酸から構成される小さなエピトープのみを導入することにより調製される融合タンパク質もまた、ここで提供される。ポリヒスチジン（His−タグ）、インフルエンザ凝集素ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水胞性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−タグ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等のようなエピトープ、およびそれらを認識するモノクローナル抗体は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合するタンパク質をスクリーニングするためのエピトープ−抗体システムとして使用することができる（Experimental Medicine 13： 85−90 （1995））。
【０１４３】
免疫沈降の文脈において、免疫複合体は、適切な界面活性剤を用いて調製された細胞溶解物にこれらの抗体を添加することにより形成される。免疫複合体は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチド、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドとの結合能を有するポリペプチド、および抗体から構成される。免疫沈降は、上記のエピトープに対する抗体を用いることに加えて、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに対する抗体を用いて行なうこともでき、それらの抗体は上記のように調製することができる。免疫複合体は、たとえば、抗体がマウスＩｇＧ抗体である場合、プロテインＡセファロースまたはプロテインＧセファロースによって沈降させることができる。もしＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドがＧＳＴのようなエピトープを有する融合タンパク質として調製されるのであれば、免疫複合体は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに対する抗体の使用の場合と同じ方式で、グルタチオン−セファロース４Ｂのようなこれらのエピトープに特異的結合する物質を用いて形成することができる。
免疫沈降は、たとえば、文献における方法（HarlowおよびLane、Antibody、 511−52、 Cold Spring Harbor Laboratory publications、 New York （1988））にしたがって、行なうことができる。
【０１４４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、免疫沈降したタンパク質の解析のために一般的に使用され、結合したタンパク質は、適切な濃度のゲルを用いてタンパク質の分子量によって解析することができる。ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合したタンパク質は、クマシー染色または銀染色のような一般的な染色法によって検出することが困難であるので、このタンパク質の検出感度は、放射性同位元素の、３５Ｓ−メチオニンもしくは３５Ｓ−システインを含有する培地中で細胞を培養し、細胞中のタンパク質を標識し、タンパク質を検出することによって改善することができる。標的タンパク質は、タンパク質の分子量が解明されている場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから直接精製し、その配列を決定することができる。
【０１４５】
あるいは、ウェスト−ウェスタンブロッティング解析（Skolnik et al.、 Cell 65： 83−90 （1991））を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合するタンパク質のスクリーニングに使用することができる。具体的には、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合するタンパク質は、ファージベクター（たとえば、ＺＡＰ）を用いて、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると期待される培養細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製し、タンパク質をＬＢアガロース上で発現させ、発現されたタンパク質をフィルター上に固定し、精製され標識されたＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドを上記のフィルターと反応させ、標識にしたがってＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合したタンパク質を発現するプラークを検出することにより得ることができる。ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドは、ビオチンおよびアビジンとの結合を利用して、あるいは、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに融合されたペプチドもしくはポリペプチド（たとえば、ＧＳＴ）を利用して、標識してもよい。放射性同位元素または蛍光等を用いる方法を使用してもよい。
【０１４６】
「標識」および「検出可能な標識」という用語は、ここでは、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学または化学手段によって検出可能な任意の組成物を指すために使用される。このような標識としては、標識されたストレプトアビジン接合による染色のためのビオチン、磁性ビーズ（たとえば、DYNABEADS（登録商標））、蛍光色素（たとえば、フルオレッセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、等）、放射性標識（たとえば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて一般に使用される他のもの）、および熱量測定（calorimetric ）標識、たとえば金コロイドまたは着色ガラスもしくはプラスチック（たとえば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等）ビーズ、が挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７５，１４９号；および第４，３６６，２４１号が挙げられる。このような標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、たとえば、放射性標識は、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、発光を検出するための光検出器を用いて検出することができる。酵素的標識は、典型的にはその酵素に基質を与えて、基質に対する酵素の作用により生成された反応生成物を検出することにより検出され、熱量測定標識は、単に着色された標識を可視化することにより検出される。
【０１４７】
あるいは、別の態様においては、本発明のスクリーニング方法は、ツーハイブリッド細胞システム（「MATCHMAKER ツーハイブリッドシステム」、「Mammalian MATCHMAKER ツーハイブリッドアッセイキット」、「MATCHMAKER ワンハイブリッドシステム」（Clontech）；「HybriZAP ツーハイブリッドベクターシステム」（Stratagene）；参考文献「DaltonおよびTreisman、 Cell 68：597−612 （1992）」、「FieldsおよびSternglanz、Trends Genet 10： 286−92 （1994）」）を使用してもよい。
【０１４８】
ツーハイブリッドシステムにおいて、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドは、 ＳＲＦ結合領域またはＧＡＬ４結合領域に融合され、酵母細胞において発現される。ｃＤＮＡライブラリーは、発現された場合、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域に融合されるように、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合するタンパク質を発現すると期待される細胞から調製される。次に、ｃＤＮＡライブラリーを、上記の酵母細胞に導入し、ライブラリー由来のｃＤＮＡを、検出された陽性クローンから単離する（本発明のポリペプチドに結合するタンパク質が酵母細胞において発現された場合、その２つの結合はレポーター遺伝子を活性化し、陽性クローンを検出可能にする）。このｃＤＮＡによってコードされるタンパク質は、上記で単離されたｃＤＮＡを大腸菌に導入し、そのタンパク質を発現させることにより調製することができる。好適なレポーター遺伝子の例としては、Ａｄｅ２遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等が挙げられるが、これらに限らず、これらは、ＨＩＳ３遺伝子に加えて使用することができる。
【０１４９】
ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合する物質は、アフィニティクロマトグラフィを用いてスクリーニングすることもできる。たとえば、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドは、アフィニティカラム上の担体に固定化してもよく、本発明のポリペプチドに結合することができるタンパク質を含む試験物質をこのカラムに用いる。ここで、試験物質は、たとえば、細胞抽出物、細胞溶解物等である。試験物質を負荷した後、カラムを洗浄し、本発明のポリペプチドに結合した物質を調製することができる。試験物質がタンパク質である場合、得られたタンパク質のアミノ酸配列を解析し、その配列に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、このオリゴＤＮＡをプローブとして使用してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そのタンパク質をコードするＤＮＡを得る。
【０１５０】
表面プラスモン共鳴現象を用いるバイオセンサーは、本発明において結合した物質を検出または定量するための手段として使用してもよい。このようなバイオセンサーを使用する場合、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドおよび試験物質間の相互作用は、わずかな量のポリペプチドのみを用い、標識することなしで、表面プラスモン共鳴シグナルとしてリアルタイムで観察することができる（たとえば、 BIAcore、 Pharmacia）。したがって、BIAcoreのようなバイオセンサーを用いて本発明のポリペプチドおよび試験物質間の結合を評価することができる。
【０１５１】
タンパク質のみでなく、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）に結合する化合物質を単離するための、固定化されたＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドが合成化合物あるいは天然物質バンクまたはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーに曝露された場合に結合する分子のスクリーニング方法、および、コンビナトリアル化学技術に基づいたハイスループットを用いるスクリーニング方法（Wrighton et al.、 Science 273： 458−64 （1996）； Verdine、 Nature 384： 11−13 （1996）； Hogan、 Nature 384：17−9 （1996））は、当業者に周知である。
【０１５２】
本発明においては、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを抑制することは細胞増殖を低減することが解明される。したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合する候補物質のスクリーニングによって、がんを治療もしくはは予防する可能性を有する候補物質を同定することができる。これらの候補物質のがんを治療もしくは予防する可能性は、がんの治療剤を同定するための第二のおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価してもよい。たとえば、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドに結合する物質ががんの活性を阻害する場合、このような物質はＳＵＶ３９Ｈ２特異的治療効果を有すると結論づけてもよい。
【０１５３】
（III）ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を抑制する物質のスクリーニング：
本発明の過程において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子は、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍を含む種々のがんにおいて高度に過剰発現されることが明らかになっている。
さらに、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の抑制は、がん細胞の増殖阻害および／または細胞死をもたらした。したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドががん細胞生存に関与し、したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を阻害する物質はがん治療のために好適な候補物質であることは明らかである。
したがって、本発明はまた、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を指標として用いるＳＵＶ３９Ｈ２関連がんの治療および予防の一方あるいは両方のための候補物質のスクリーニング方法を提供する。
例示的なＳＵＶ３９Ｈ２関連がんとしては、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍が挙げられる。
【０１５４】
具体的には、本発明は、以下の方法を提供する：
がんの治療および予防の一方あるいは両方のための候補物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリヌクレオチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；
（b）  工程（a）のＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を検出する工程；
（c）  工程（b）において検出された生物学的活性を、試験物質の非存在下で検出されたそれと比較する工程；
（d）  ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を低減または阻害する試験物質を選択する工程。
【０１５５】
本発明の文脈において、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性（たとえば、細胞増殖促進活性またはメチルトランスフェラーゼ活性）を抑制することに対する試験物質の治療効果またはがんの治療もしくは予防の一方あるいは両方のための候補物質を評価してもよい。したがって、本発明はまた、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物を用いる、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を抑制するための物質、またはＳＵＶ３９Ｈ２関連がんの治療および予防の一方あるいは両方のための候補物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物と接触させる工程；および
（b）  工程（a）のポリペプチドまたは機能的等価物の生物学的活性を検出する工程、および
（c）  （b）の生物学的活性を試験物質の治療効果と関連づける工程。
【０１５６】
本発明の文脈において、治療効果は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物の生物学的活性と関連づけてもよい。たとえば、試験物質が、試験物質の非存在下において検出されたレベルと比較して、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物の生物学的活性を抑制または阻害する場合、その試験物質は、治療効果を有する候補物質として同定または選択することができる。あるいは、試験物質が、試験物質の非存在下において検出されたレベルと比較して、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物の生物学的活性を抑制または阻害しない場合、その試験物質は、有意な治療効果を有さない物質として同定することができる。
【０１５７】
あるいは、いくつかの態様においては、本発明は、がんの治療および予防、またはＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の過剰発現に関連するがんの阻害の一方あるいは両方に対する試験物質の治療効果を評価または見積りする方法を提供し、その方法は以下の工程を含む：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物と接触させる工程；
（b）  工程（a）のポリペプチドあるいはその機能的等価物の生物学的活性を検出する工程；および
（c）  潜在的な治療効果および試験物質を関連づける工程であって、ここで、潜在的な治療効果は、物質が、試験物質の非存在下において検出された上記ポリペプチドの生物学的活性と比較して、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物の生物学的活性を抑制する場合、示される。発現、結合および生物学的活性の文脈において、「抑制（する）」という用語は、「低減（する）」および「阻害（する）」という用語と互換的に使用され、部分的から完全にわたる効果を含む。したがって、ここで定義する「生物学的活性を抑制（する）」という語句は、その物質の非存在下と比較してＳＵＶ３９Ｈ２の生物学的活性の少なくとも１０％抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％または７５％抑制、そして最も好ましくは９０％抑制を指す。上記のとおり、このようなＳＵＶ３９Ｈ２関連がんの例としては、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍が挙げられる。
【０１５８】
本発明の文脈において、治療効果は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物の生物学的活性と関連づけてもよい。たとえば、試験物質が、試験物質の非存在下において検出されたレベルと比較して、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を抑制または阻害する場合、その試験物質は、治療効果を有する候補物質して同定または選択されてもよい。あるいは、試験物質が、試験物質の非存在下において検出されたレベルと比較して、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物の生物学的活性を抑制または阻害しない場合、その試験物質は、有意な治療効果を有さない物質として同定されてもよい。
【０１５９】
本発明の方法は、以下においてさらに詳細に説明される。任意のポリペプチドは、それがＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性を有する限り、本発明のスクリーニング方法に使用することができる。このような生物学的活性の例としては、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの細胞増殖促進活性およびメチルトランスフェラーゼ活性が挙げられる。たとえば、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドを使用することができ、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドと機能的に等価なポリペプチドもまた使用することができる。このようなポリペプチドは、細胞によって内在的または外来的に発現されてもよい。ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの機能的等価物の詳細については「遺伝子およびポリペプチド」の項を参照されたい。
【０１６０】
本発明のスクリーニング方法によって単離される物質は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドのアンタゴニスト（阻害剤）候補である。「アンタゴニスト」という用語は、ポリペプチドに対する結合によりその機能を阻害する分子を指す。この用語はまた、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低減または阻害する分子をも指す。そのうえ、本発明のスクリーニング方法によって単離される物質は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドと分子（ＤＮＡおよびタンパク質を含む）とのインビボ相互作用を阻害する物質の候補である。
【０１６１】
本発明の方法において検出されるべき生物学的活性が細胞増殖促進活性である場合、それは、たとえば、ＭＴＴアッセイ、コロニー形成アッセイもしくはＦＡＣＳにより、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドを発現する細胞を調製し、試験物質の存在下でこの細胞を培養し、細胞増殖の速度を決定して、細胞周期を測定することによって、細胞生存またはコロニー形成活性を測定することによって、検出することができる。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞の増殖速度を低減する物質は、がんの治療もしくは予防の一方あるいは両方のための候補物質として選択される。いくつかの態様において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞は、インビトロでＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を外因性またはは内因性で発現する単離され培養された細胞である。
【０１６２】
より具体的には、本方法は以下の工程を含む：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；
（b）  細胞増殖促進活性を測定する工程；および
（c）  試験物質の非存在下における細胞増殖促進活性と比較して、細胞増殖促進活性を低減する試験物質を選択する工程。
好ましい態様において、本発明の方法は、さらに以下の工程を含むことができる：
（d）  検出可能なＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子をほとんどあるいはまったく発現しない細胞に対して実質的に効果を有さない試験物質を選択する工程。
【０１６３】
本発明の方法において検出されるべき生物学的活性がメチルトランスフェラーゼ活性である場合、メチルトランスフェラーゼ活性は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドを基質（たとえば、ヒストンＨ３、またはリジン９を含むその断片（たとえば、配列番号３１））およびコファクター（たとえば、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）と、基質のメチル化に好適な条件下で接触させ、基質のメチル化レベルを検出することにより、決定することができる。
【０１６４】
より具体的には、本発明は、以下の方法［１］〜［７］を提供する：
［１］  以下の工程を含む、がんの治療および予防の一方または両方のための候補物質のスクリーニング方法：
（ａ）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物、基質およびコファクターと、基質のメチル化に好適な条件下で接触させる工程；
（ｂ）  基質のメチル化レベルを検出する工程；および
（ｃ）  試験物質の非存在下におけるメチル化レベルと比較して基質のメチル化レベルを低減する試験物質を選択する工程；
［２］  基質が、ヒストンまたは少なくとも１つのメチル化領域を含むその断片である、前記［１］に記載の方法；
［３］  基質が、ヒストンＨ３または少なくとも１つのメチル化領域を含むその断片である、前記［２］に記載の方法；
［４］  メチル化領域が、ヒストンＨ３のリジン９である、前記［３］に記載の方法；
［５］  コファクターが、Ｓ−アデノシルメチオニンである、前記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法；
［６］  ポリペプチドを、メチル化の増強剤の存在下で基質およびコファクターと接触させる、前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法；および
［７］  メチル化の増強剤が、Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）である、前記［６］に記載の方法。
【０１６５】
本発明の文脈において、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性は、当技術分野において公知の方法によって決定することができる（たとえば、ＷＯ０１／０９４６２０、 Hamamoto et al、 Nature 2004；6（8）：731−740、 O’carraol et al、 Mol Cell Biol 2000；20（24）：9423−9433、 Rea et al、 Nature 2000；406：593−599を参照されたい）。
たとえば、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドおよび基質は、好適なアッセイ条件下で、標識されたメチル化ドナーとインキュベートすることができる。ヒストンＨ３ペプチド（すなわち、ヒストンＨ３またはその断片）、およびＳ−アデノシル−［メチル−１４Ｃ］−Ｌ−メチオニン、またはＳ−アデノシル−［メチル−３Ｈ］−Ｌ−メチオニンを、好ましくは、それぞれ基質およびメチルドナーとして、使用することができる。ヒストンＨ３ペプチドへの放射性標識の移転は、たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動およびフルオログラフィによって検出することができる。あるいは、反応の後、ヒストンＨ３ペプチドは、ろ過によってメチルドナーから分離し、フィルター上に保持された放射性標識の量をシンチレーションカウンティングによって定量することができる。メチルドナーにつけることができる他の好適な標識は、色原性標識および蛍光標識のようなものであり、ヒストンおよびヒストンペプチドへのこれらの標識の移転の検出方法は、当技術分野において公知である。メチルトランスフェラーゼアッセイの例は、「実施例５：ＳＵＶ３９Ｈ２のメチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤のスクリーニング」に記載される。
【０１６６】
あるいは、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性は、非標識メチルドナー（たとえば、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）およびメチル化された基質（たとえば、ヒストンＨ３ペプチド）を選択的に認識する試薬を使用して決定することができる。たとえば、基質のメチル化が可能な条件下で、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチド、メチル化されるべき基質およびメチルドナーをインキュベーション後、メチル化された基質は、免疫学的方法によって検出することができる。メチル化された基質を認識する抗体を用いる任意の免疫学的技術を、検出のために使用することができる。たとえば、メチル化されたヒストンに対する抗体は、市販されている（abcam Ltd.）。メチル化されたヒストンを認識する抗体を用いるＥＬＩＳＡまたは免疫ブロッティングを、本発明のために使用することができる。
【０１６７】
本発明の文脈において、ヒストンＨ３またはその断片（たとえば、配列番号３１）は、好ましくは、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドによってメチル化されるべき基質として使用することができる。基質として使用されるべきヒストンＨ３断片は、好ましくはリジン９を保持する。このようなヒストンＨ３断片は、好ましくは少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、およびさらにより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基から構成される。このようなヒストンＨ３断片の例としては、配列番号３１のアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。あるいは、それに対してメチルトランスフェラーゼが増加したアフィニティ／活性を有するような、ヒストンＨ３またはその断片の改変ペプチドを用いてもよい。このようなペプチドは、アミノ酸を交換および／または付加および／または欠失させ、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドを用いるメチルトランスフェラーゼアッセイのための連続的な実験においてその基質を試験することにより、設計することができる。
【０１６８】
本発明の文脈において、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの任意の機能的等価物は、それがもとの（ネイティブ、野生型）ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドのメチルトランスフェラーゼ活性を保持する限り、使用することができる。そのため、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの機能的等価物は、好ましくはＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドのＳＥＴ−ドメインを保持する（「遺伝子およびポリペプチド」の項を参照されたい）。このような機能的等価物の例としては、配列番号３２のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
【０１６９】
ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物は、特異性が解明されているモノクローナル抗体のエピトープを、ポリペプチドのＮまたはＣ末端に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を含む融合タンパク質として発現させてもよい。市販のエピトープ−抗体システムを使用することができる（Experimental Medicine 13： 85−90 （1995））。複数のクローニング部位の使用により、たとえば、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等との融合タンパク質を発現することができるベクターは、市販されている。また、融合によりＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの特性を変化させないように数個〜１ダースのアミノ酸からなる小さなエピトープのみを導入することよって調製された融合タンパク質も報告されている。ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、水胞性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７−タグ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−タグ（モノクローナルファージ上のエピトープ）等のようなエピトープ。
【０１７０】
本発明は、物質のメチル化を増強する薬剤の使用を企図する。メチル化のための好ましい増強剤は、ＳＡＨＨまたはその機能的等価物である。このような薬剤は、物質のメチル化を増強し、それによって高感度でのメチルトランスフェラーゼ活性の決定を可能にする。したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２は、増強剤の存在下で基質およびコファクターと接触させてもよい。
【０１７１】
メチルトランスフェラーゼ活性は、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドを発現する細胞を調製し、試験物質の存在下でこの細胞を培養し、たとえばメチル化されたヒストンに特異的に結合する抗体を用いて、ヒストンのメチル化レベルを決定することによっても検出することができる。
【０１７２】
より具体的には、本方法は以下の工程を含む：
［１］  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；
［２］  ヒストンＨ３  リジン９（Ｈ３Ｋ９）のメチル化レベルを検出する工程；および
［３］  試験物質の非存在下におけるメチル化レベルと比較してメチル化レベルを低減する試験物質を選択する工程。
【０１７３】
上記のように、「生物学的活性を抑制（する）」という語句は、ここでは、その物質の非存在下と比較して、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドの生物学的活性の、好ましくは少なくとも１０％抑制、より好ましくは少なくとも２５％、５０％または７５％抑制、および最も好ましくは９０％抑制と定義される。したがって、試験物質は、１０％のオーダーの低減、より好ましくは少なくとも２５％、５０％または７５％低減、および最も好ましくは９０％低減を提供する場合、「メチル化レベルを低減する」として特徴づけしてもよい。
【０１７４】
好ましい態様において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現しない対照細胞が使用される。したがって、本発明はまた、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を用いる、細胞増殖を阻害するための候補物質またはＳＵＶ３９Ｈ２関連がんの治療および予防の一方または両方のための候補物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
（a）  ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を発現する細胞、およびＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を発現しない対照細胞を、試験物質の存在下で培養する工程；
（b）  ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはその機能的等価物を発現する細胞および対照細胞の生物学的活性（細胞増殖またはメチルトランスフェラーゼ活性）を検出する工程；および
（c）  対照細胞においておよび試験物質の非存在下において検出された生物学的活性（細胞増殖促進活性またはメチルトランスフェラーゼ活性）と比較して、ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドあるいはその機能的等価物を発現する細胞における生物学的活性（細胞増殖またはメチルトランスフェラーゼ活性）を阻害する試験物質を選択する工程。
【０１７５】
（IV）ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を変更する物質のスクリーニング
本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を阻害する物質のスクリーニングをも提供する。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を阻害する物質は、がん細胞（たとえば、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌または軟部腫瘍）の増殖を抑制し、したがって、がん（たとえば、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌または軟部腫瘍）の治療および予防の一方あるいは両方に有用であることが期待される。したがって、本発明はまた、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍細胞のようなＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を過剰発現するがん細胞の増殖を抑制する物質のスクリーニング方法、および肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍のようなＳＵＶ３９Ｈ２過剰発現に関連するがんの治療および予防の一方あるいは両方のための候補物質のスクリーニング方法を提供する。
【０１７６】
本発明の文脈において、このようなスクリーニング方法は、たとえば、以下の工程を含むことができる：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；
（b）  この細胞におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出する工程；および
（c）  試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを低減する試験物質を選択する工程。
【０１７７】
さらに、本発明は、がん細胞の増殖の抑制、またはがんの治療および予防の一方または両方に対する、試験物質の治療効果を評価または概算する方法を提供し、その方法は以下の工程を含む：
（a）  物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；
（b）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出する工程；および
（c）  試験物質の潜在的治療効果を、工程（b）において検出された発現レベルと関連づける工程であって、ここで、潜在的治療効果は、試験物質が、試験物質の非存在下において検出された発現レベルと比較してＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを低減する場合に示される。
【０１７８】
本発明の文脈において、治療効果は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルと関連づけることができる。たとえば、試験物質の非存在下で検出されるレベルと比較して、試験物質がＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを低減する場合、その試験物質は、治療効果を有する候補物質として同定または選択してもよい。あるいは、試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して、試験物質がＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを低減しない場合、その試験物質は、有意な治療効果を有さない物質として同定してもよい。
【０１７９】
さらに、本発明の過程において、ＳＵＶ３９Ｈ２のノックダウンによって影響されるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の下流遺伝子が同定された。表８は、ＳＵＶ３９Ｈ２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＳＷ７８０およびＡ５４９細胞において下方調節された遺伝子の一覧を示す。表７は、ＳＵＶ３９Ｈ２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＳＷ７８０およびＡ５４９細胞において上方調節された遺伝子の一覧を示す。これらの下流遺伝子の発現レベルは、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルの指標として使用することができる。
【０１８０】
したがって、本発明はまた、ＳＵＶ３９Ｈ２過剰発現と関連するがん（たとえば、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌（canter）または軟部腫瘍）の治療および予防の一方または両方のための、あるいはＳＵＶ３９Ｈ２を過剰発現するがん細胞（たとえば、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌または軟部腫瘍細胞）の増殖の防止のための、候補物質のスクリーニング方法を提供し、その方法は以下の工程を含む：
（ａ）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子、および表７および表８に示される遺伝子から選択されるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の下流遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；
（ｂ）  下流遺伝子の発現レベルを検出する工程；および
（ｃ）  試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して、下流遺伝子の発現レベルを変更する試験物質を選択する工程。
【０１８１】
より具体的には、下流遺伝子が、表８に示す遺伝子から選択される遺伝子である場合、その発現レベルを低減する試験物質が、候補物質として選択されるべきである。一方、下流遺伝子が、表７に示す遺伝子から選択される遺伝子である場合、その発現レベルを増加する試験物質が、候補物質として選択されるべきである。したがって、好ましい態様において、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含む：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子および表８に示す遺伝子から選択されるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の下流遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；
（b）  下流遺伝子の発現レベルを検出する工程；および
（c）  試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して、下流遺伝子の発現レベルを低減する試験物質を選択する工程。
【０１８２】
あるいは、いくつかの態様において、本発明はまた、ＳＵＶ３９Ｈ２過剰発現と関連するがんの治療および予防の一方あるいは両方のための、またはＳＵＶ３９Ｈ２を過剰発現するがん細胞の増殖の防止のための候補物質の治療効果を評価または推測する方法をも提供し、その方法は以下の工程を含む：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子および表８に示す遺伝子から選択されるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の下流遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；
（b）  下流遺伝子の発現レベルを検出する工程；および
（c）  潜在的な治療効果および試験物質を関連づける工程であって、ここで、潜在的な治療効果は、物質が、対照と比較して下流遺伝子の発現レベルを低減する場合に示される。
【０１８３】
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含んでいてもよい：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子および表７に示す遺伝子から選択されるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の下流遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；
（b）  下流遺伝子の発現レベルを検出する工程、および
（c）  試験物質の非存在下で検出された発現レベルと比較して、下流遺伝子の発現レベルを増加する試験物質を選択する工程。
【０１８４】
あるいは、いくつかの態様において、本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２過剰発現と関連するがんの治療および予防の一方または両方、またはＳＵＶ３９Ｈ２を過剰発現するがん細胞の増殖の防止のための候補物質の治療効果を評価または推測する方法をも提供し、その方法は以下の工程を含む：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子および表７に示す遺伝子から選択されるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の下流遺伝子を発現する細胞と接触させる工程；
（b）  下流遺伝子の発現レベルを検出する工程、および
（c）  潜在的な治療効果および試験物質を関連づける工程であって、ここで、潜在的な治療効果は、物質が、対照と比較して下流遺伝子の発現レベルを増加する場合に示される。
【０１８５】
本発明のスクリーニング方法は、以下にさらに詳細に説明される。ＳＵＶ３９Ｈ２、および表７および表８に示される下流遺伝子を発現する細胞としては、たとえば、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌または軟部腫瘍から樹立された細胞株が挙げられる。このような細胞（たとえば、ＳＷ７８０、ＲＴ４、Ａ５４９、ＬＣ３１９、ＳＢＣ５）は、本発明の上記のスクリーニング方法に使用することができる。発現レベルは、当業者に周知の方法、たとえば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットアッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫染色およびフローサイトメトリー解析によって概算することができる。上記のように、「発現レベルを低減（する）」という語句は、ここで、試験物質の非存在下における発現レベルと比較して、ＳＵＶ３９Ｈ２または下流遺伝子の発現レベルの、好ましくは少なくとも１０％の低減、より好ましくは少なくとも２５％、５０％または７５％低減したレベル、および最も好ましくは９５％低減したレベルと定義される。ここで、試験物質としては、たとえば、化学物質、二本鎖分子、等が挙げられる。化学物質の調製方法は、上記において記載されている。二本鎖分子の調製方法は、以下において記載される。本発明のスクリーニング方法において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを低減する試験物質は、ＳＵＶ３９Ｈ２過剰発現と関連するがん、たとえば肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍の治療または予防のために使用されるべき候補物質として選択されることができる。がんを治療または予防するためのこれらの候補物質の潜在能力は、がんの治療物質を同定するための第二のまたはさらなるスクリーニングの一方または両方によって評価してもよい。いくつかの態様において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞は、インビトロで外因性または内因性にＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する、単離され、培養された細胞である。
【０１８６】
あるいは、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含んでいてもよい：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写調節領域およびその転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入されている細胞と接触させる工程；
（b）  レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を検出する工程、および
（c）  試験物質の非存在下で検出された発現レベルまたは活性と比較してレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低減する試験物質を選択する工程。
【０１８７】
さらに、 本発明は、がんの治療および予防の一方または両方、あるいはがん細胞の増殖の阻害に対する、試験物質の治療効果を評価または概算する方法を提供し、その方法は、以下の工程を含む：
（a）  試験物質を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写調節領域およびその転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入されている細胞と接触させる工程；
（b）  レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を検出する工程、および
（c）  試験物質の潜在的治療効果を工程（ｂ）で検出された発現レベルまたは活性と関連づける工程であって、潜在的治療効果は、試験物質の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較して試験物質がレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低減する場合、示される。
【０１８８】
本発明の文脈において、治療効果は、レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性と関連づけてもよい。たとえば、試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較して試験物質がレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低減する場合、試験物質は、治療効果を有する候補物質として同定または選択されてもよい。あるいは、試験物質が、試験物質の非存在下で検出されたレベルと比較してそのレポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低減しない場合、試験物質は、有意な治療効果を有さない物質として同定してもよい。
【０１８９】
好適なレポーター遺伝子および宿主細胞は、当技術分野において周知である。たとえば、レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、イソギンチャクモドキ（Discosoma sp.） 赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｌａｃＺおよびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、および宿主細胞は、ＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ等である。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列をＳＵＶ３９Ｈ２の転写調節領域につなげることにより調製することができる。ここで、ＳＵＶ３９Ｈ２の転写調節領域は、開始コドンから、少なくとも５００bp上流、好ましくは１，０００bp、より好ましくは５０００または１０，０００bp上流までの領域である。転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントは、ゲノムライブラリーから単離することができ、あるいは、ＰＣＲによって増幅することができる。スクリーニングに必要とされるレポーター構築物は、レポーター遺伝子配列を、これらの任意の遺伝子の転写調節領域につなげることにより調製することができる。転写調節領域を同定する方法、およびアッセイプロトコールもまた、周知である（Molecular Cloning third edition chapter 17 、2001 、 Cold Springs Harbor Laboratory Press）。
【０１９０】
レポーター構築物を含むベクターは、宿主細胞を感染させ、レポーター遺伝子の発現または活性は、当技術分野において周知の方法により検出される（たとえば、ルミノメーター、吸光光度計、フローサイトメーター等を用いる）。いくつかの態様において、本発明の細胞は、単離され、培養された細胞であって、その細胞には、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写調節領域および転写調節領域の制御下において発現されるレポーター遺伝子から構成されるベクターがインビトロで導入されている。ここで定義される場合、「発現または活性を低減（する）」は、その物質の非存在下と比較してレポーター遺伝子の発現または活性の好ましくは少なくとも１０％低減、より好ましくは少なくとも２５％、５０％または７５％低減、および最も好ましくは９５％低減である。
【０１９１】
ここで、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を抑制（低減、阻害）することは細胞増殖を抑制（低減、阻害）することが解明される。したがって、レポーター遺伝子の発現または活性を低減する候補物質をスクリーニングすることにより、がんを治療もしくはまたは予防する潜在能力を有する候補物質を同定することができる。がんを治療または予防するこれらの候補物質の潜在能力は、がんの治療物質を同定するための第二のおよび／またはさらなるスクリーニングによって評価されてもよい。
【０１９２】
二本鎖分子：
ここで用いる場合、「単離された二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子の発現を阻害する核酸分子を指し、たとえば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；たとえば、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））および低分子干渉ＤＮＡ/ＲＮＡ（ｓｉＤ/ＲＮＡ；たとえば、ＤＮＡおよびＲＮＡの二本鎖キメラ（ｄｓＤ/Ｒ−ＮＡ）またはＤＮＡおよびＲＮＡの低分子ヘアピン型キメラ（ｓｈＤ/Ｒ−ＮＡ））が挙げられる。
ここで、「二本鎖分子」は、「二本鎖核酸」、「二本鎖核酸分子」、「二本鎖ポリヌクレオチド」、「二本鎖ポリヌクレオチド分子」、「二本鎖オリゴヌクレオチド」および「二本鎖オリゴヌクレオチド分子」とも呼ばれる。
【０１９３】
ここで用いる場合、「標的配列」という用語は、標的遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列であって、その配列をターゲッティングする二本鎖分子がその遺伝子を発現する細胞内に導入された場合、標的遺伝子の全ｍＲＮＡの翻訳の抑制をもたらすものを指す。標的遺伝子のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ配列内のヌクレオチド配列は、標的配列に相当する配列を有する二本鎖分子が、その遺伝子を発現する細胞内の遺伝子の発現を阻害する場合、標的配列であると決定することができる。標的配列がｃＤＮＡ配列によって示される場合、二本鎖ｃＤＮＡのセンス鎖配列、すなわち、ｍＲＮＡ配列がＤＮＡ配列に転換された配列は、標的配列を定義するために使用される。二本鎖分子は、標的配列に相当する配列を有するセンス鎖および標的配列に相補的な配列を有するアンチセンス鎖から構成され、そのアンチセンス鎖は、相補的配列でセンス鎖とハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。
【０１９４】
ここで、「（に）相当する」という語句は、二本鎖分子のセンス鎖を構成する核酸の種類にしたがって標的配列を変換することを意味する。たとえば、標的配列がＤＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がＲＮＡ領域を有する場合、ＲＮＡ領域内の塩基「ｔ」は、塩基「ｕ」で置き換えられる。一方、標的配列がＲＮＡ配列で示され、二本鎖分子のセンス鎖がＤＮＡ領域を有する場合、ＤＮＡ領域内の塩基「ｕ」は、「ｔ」で置き換えられる。
【０１９５】
たとえば、標的配列が配列番号１９または２０で示されるＲＮＡ配列であり、二本鎖分子のセンス鎖がＤＮＡから構成される３’側半分領域を有する場合、「標的配列に相当する配列」は、「５’−ＣＵＵＵＧＧＵＵＧＴＴＣＡＴＧＣＡＣＡ−３’」（配列番号１９について）、または「５’−ＣＵＧＧＡＡＵＣＡＧＣＴＴＡＧＴＣＡＡ−３’」（配列番号２０について）である。
【０１９６】
また、二本鎖分子のアンチセンス鎖のための標的配列に相補的な配列は、アンチセンス鎖を構成する核酸の種類にしたがって定義することができる。たとえば、標的配列が配列番号１９または２０に示されるＲＮＡ配列であり、二本鎖分子のアンチセンス鎖がＤＮＡから構成される５’側半分の領域を有する場合、「標的配列に相補的な配列」は、「３’−ＧＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＧＴＡＣＧＴＧＴ−５’」（配列番号１９について）または「３’−ＧＡＣＣＵＵＡＧＵＣＧＡＡＴＣＡＧＴＴ−５’」（配列番号２０について）である。
【０１９７】
一方、二本鎖分子がＲＮＡから構成される場合、配列番号１９または２０に示される標的配列に相当する配列は、配列番号１９または２０のＲＮＡ配列、および配列番号１９または２０に示される標的配列に相当する相補的配列は、「３’−ＧＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＧＵＡＣＧＵＧＵ−５’」（配列番号１９について）または「３’−ＧＡＣＣＵＵＡＧＵＣＧＡＡＵＣＡＧＵＵ−５’」（配列番号２０について）のＲＮＡ配列である。
【０１９８】
二本鎖分子は、長さ２〜５ヌクレオチド（たとえば、ｕｕ）を有する１または２個の３’オーバーハングまたはヘアピン構造を形成するためのセンス鎖およびアンチセンス鎖を連結するループ配列、またはその両方を、標的配列に相当する配列およびそれに相補的な配列に加えて、有していてもよい。
【０１９９】
ここで用いる場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防止する二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｓｉＲＮＡを細胞に導入する標準的技術が使用され、ＤＮＡはＲＮＡが転写される鋳型であるようなものが含まれる。あるいは、ｓｉＲＮＡは、処理すべき細胞に直接導入されてもよい。対象にｓｉＲＮＡを導入する方法は、当技術分野において周知である。たとえば、送達物質と一緒のｓｉＲＮＡの投与は、ｓｉＲＮＡの導入のために好ましい。
【０２００】
ｓｉＲＮＡとしては、ＳＵＶ３９Ｈ２センス核酸配列（「センス鎖」とも呼ばれる）、ＳＵＶ３９Ｈ２アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも呼ばれる）または両方が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、単一の転写物が、標的遺伝子のセンスおよび相補的アンチセンス核酸配列の両方を有する、たとえば、ヘアピンのように構築してもよい。ｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡまたはｓｈＲＮＡのいずれであってもよい。
【０２０１】
ここで用いる場合、「ｄｓＲＮＡ」という用語は、互いに相補的な配列から構成され、相補的配列を介してアニールして二本鎖ＲＮＡ分子を形成する、２つのＲＮＡ分子の構築物を指す。２個の鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ＲＮＡのみではなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子を含んでいてもよい。
【０２０２】
「ｓｈＲＮＡ」という用語は、ここで用いる場合、相互に相補的配列な第一および第二の領域、すなわち、センスおよびアンチセンス鎖から構成されるステムループ構造を有するｓｉＲＮＡを指す。相補性の程度および領域の配向は、それらの領域間の対形成が起こるのに十分であり、第一および第二の領域は、ループ領域によって連結され、このループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠如からもたらされる。ｓｈＲＮＡのループ領域は、センスおよびアンチセンス鎖間に介在する一本鎖領域であり、「介在性一本鎖」と呼ばれてもよい。
【０２０３】
ここで用いる場合、「ｓｉＤ/Ｒ−ＮＡ」という用語は、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方から構成される二本鎖ポリヌクレオチド分子を指し、ＲＮＡおよびＤＮＡのハイブリッドおよびキメラを含み、標的ｍＲＮＡの翻訳を妨げる。ここで、ハイブリッドは、ＤＮＡから構成されるポリヌクレオチドおよびＲＮＡから構成されるポリヌクレオチドが相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子を示す；一方、キメラは、二本鎖分子を構成する一方または両方の鎖がＲＮＡおよびＤＮＡを含んでいてもよいことを示す。ｓｉＤ／ＲＮＡを細胞に導入する標準的技術が使用される。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、ＳＵＶ３９Ｈ２センス核酸配列（「センス鎖」とも呼ばれる）、ＳＵＶ３９Ｈ２アンチセンス核酸配列（「アンチセンス鎖」とも呼ばれる）または両方を含む。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、単一の転写物が標的遺伝子からのセンスおよび相補的アンチセンス核酸配列の両方を有するように、たとえば、ヘアピンのように構築されてもよい。ｓｉＤ／Ｒ−ＮＡは、ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのいずれかであってもよい。
【０２０４】
ここで用いる場合、「ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、相互に相補的な配列から構成され、それらの相補的配列を介してアニーリングし、二本鎖ポリヌクレオチド分子を形成している、２つの分子の構築物を指す。２つの鎖のヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列のタンパク質コード配列から選択される「センス」または「アンチセンス」ポリヌクレオチド配列のみでなく、標的遺伝子の非コード領域から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡを構築する２つの分子の一方または両方は、共にＲＮＡおよびＤＮＡから構成されてもよく（キメラ分子）、あるいは、一方の分子はＲＮＡから構成され、他方はＤＮＡから構成されていてもよい（ハイブリッド二本鎖）。
【０２０５】
「ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ」という用語は、ここで用いる場合、相互に相補的な第一および第二の領域、すなわち、センスおよびアンチセンス鎖から構成される、ステムループ構造を有するｓｉＤ／Ｒ−ＮＡを指す。相補性の程度および領域の配向は、領域間の塩基対形成が起こるのに十分であり、第一および第二領域は、ループ領域によって結合されており、ループは、ループ領域内のヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）間の塩基対形成の欠如からもたらされる。ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡのループ領域は、センスおよびアンチセンス鎖間に介在する一本鎖領域であり、「介在性一本鎖」とも呼ばれてよい。
【０２０６】
ここで用いる場合、「単離された核酸」は、その元の環境（たとえば、天然のものであれば、自然環境）から取り出された核酸であり、したがって、その自然の状態から合成によって変更されている。本発明においては、単離された核酸の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその誘導体が挙げられる。
【０２０７】
本発明の文脈において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、通常は一本鎖ｍＲＮＡであるこの遺伝子の転写物と会合し、それによって翻訳に干渉し、したがって、タンパク質の発現を阻害することによって、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子によりコードされるＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の生成を低減または阻害することになる。ここで明らかにされるように、いくつかのがん細胞株におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現は、ｄｓＲＮＡによって阻害される（図４Ｃおよび４Ｄ）。したがって、本発明は、この遺伝子を発現する細胞に導入された場合、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を阻害することができる単離された二本鎖分子を提供する。二本鎖分子の標的配列は、下記で言及されるようなｓｉＲＮＡ設計アルゴリズムによって設計されてもよい。
ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のための標的配列としては、たとえば、配列番号１９または２０のヌクレオチド配列が挙げられる。
【０２０８】
本発明の文脈において特に興味深い二本鎖分子は、［１］〜［１８］に規定される：
［１］  細胞に導入された場合、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のインビボ発現および細胞増殖を阻害する単離された二本鎖分子であって、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖から構成され、相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成する分子；
［２］  二本鎖分子が、ｍＲＮＡに作用し、配列番号１９または２０の標的配列にマッチングする、前記［１］に記載の二本鎖分子；
［３］  センス鎖が、配列番号１９または２０の標的配列に相当する配列を含む、前記［１］に記載の二本鎖分子；
［４］  約１００ヌクレオチド長未満である、前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の二本鎖分子；
［５］  約７５ヌクレオチド長未満；である、前記［４］に記載の二本鎖分子
［６］  約５０ヌクレオチド長未満である、前記［５］に記載の二本鎖分子；
［７］  約２５ヌクレオチド長未満である、前記［６］に記載の二本鎖分子；
［８］  約１９〜約２５ヌクレオチド長である、前記［７］に記載の二本鎖分子；
［９］  介在性一本鎖により連結されたセンスおよびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドから構成される、前記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の二本鎖分子；
［１０］  一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’または５’−［Ａ’］−［Ｂ］−［Ａ］−３’を有し、ここで、［Ａ］は配列番号１９または２０の標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり；［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドから構成される介在性一本鎖であり、かつ［Ａ’］は標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、前記［９］に記載の二本鎖分子；
［１１］  ＲＮＡから構成される、前記［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の二本鎖分子；
［１２］  ＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成される、前記［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の二本鎖分子；
［１３］  分子が、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、前記［１２］に記載の二本鎖分子；
［１４］  センスおよびアンチセンス鎖がそれぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成されている、前記［１３］に記載の二本鎖分子；
［１５］  分子がＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、前記［１２］に記載の二本鎖分子；
［１６］  アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡである、前記［１５］に記載の二本鎖分子；
［１７］  隣接領域が９〜１３ヌクレオチドから構成される、前記［１６］に記載の二本鎖分子；および
［１８］  分子が３’オーバーハングを含む、前記［２］に記載の二本鎖分子；
本発明の二本鎖分子は、以下においてさらに詳細に説明される。
【０２０９】
細胞における標的遺伝子発現を阻害する能力を有する二本鎖分子を設計する方法は公知である。（たとえば、米国特許第６，５０６，５５９号を参照されたい、これは参照によりここにその全体が包含される）。たとえば、ｓｉＲＮＡを設計するためのコンピュータプログラムは、Ambionウェブサイト（ambion.com/techlib/misc/ｓｉＲＮＡ_finder.html）から入手可能である。
このようなコンピュータプログラムは、以下のプロトコールに基づいて二本鎖分子のための標的ヌクレオチド配列を選択する。
【０２１０】
標的部位の選択：
１．  転写物のＡＵＧ開始コドンから始まって、下流をＡＡジヌクレオチド配列についてスキャンする。各ＡＡおよびその３’隣接１９ヌクレオチドの出現を潜在的ｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。Tuschlらは、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲｓ）および開始コドンに近い領域（７５塩基以内）に対するｓｉＲＮＡを設計することを回避することを推奨しているが、これは、これらは調節タンパク質結合部位を豊富に含む可能性があり、およびＵＴＲ結合タンパク質および／または翻訳開始複合体がｓｉＲＮＡエンドヌクレアーゼ複合体の結合と干渉する可能性があるためである。
２．  潜在的標的部位を適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット、等）と比較し、他のコード配列に有意な相同性を有するあらゆる標的配列を考慮から除外する。ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/にてＮＣＢＩサーバー上に見出すことができるＢＬＡＳＴが使用される（Altschul SF et al.、 Nucleic Acids Res 1997 Sep 1、 25（17）： 3389−402）。
３．  適格な標的配列を合成のために選択する。典型的には、いくつかの標的配列を、評価すべき遺伝子の長さに沿って選択する。
【０２１１】
上記のプロトコールを用いて、本発明の単離された二本鎖分子の標的配列は、配列番号１９または２０として設計された。上記で言及した標的配列をターゲティングする二本鎖分子は、標的遺伝子を発現する細胞の増殖を抑制する能力についてそれぞれ試験された。したがって、本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のための配列番号１９または２０の配列をターゲティングする二本鎖分子を提供する。
【０２１２】
ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の上記標的配列をターゲティングする本発明の二本鎖分子の例としては、標的配列または標的配列に対して相補的な配列のいずれか、または両方に相当する核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドが挙げられる。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子をターゲティングするポリヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号１９または２０に相当する配列および／またはこれらの配列に対して相補的な配列を含むものが挙げられる。ある態様においては、二本鎖分子は２つのポリヌクレオチドから構成され、１つのポリヌクレオチドは標的配列、すなわち、センス鎖に相当する配列を有し、もう１つのポリペプチドは、標的配列に対して相補的な配列、すなわち、アンチセンス鎖を有する。センス鎖ポリヌクレオチドおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドは、相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。このような二本鎖分子の例としては、ｄｓＲＮＡおよびｄｓＤ／Ｒ−ＮＡが挙げられる。
【０２１３】
別の態様において、二本鎖分子は、標的配列、すなわち、センス鎖に相当する配列、および標的配列に相補的な配列、すなわち、アンチセンス鎖、の両方を有するポリヌクレオチドから構成される。一般に、センス鎖およびアンチセンス鎖は、介在する鎖により連結され、相互にハイブリダイズしてヘアピンループ構造を形成する。このような二本鎖分子の例としては、ｓｈＲＮＡおよびｓｈＤ／Ｒ−ＮＡが挙げられる。
【０２１４】
言い換えれば、本発明の二本鎖分子は、標的配列のヌクレオチド配列を有するセンス鎖ポリヌクレオチドおよび標的配列に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖ポリヌクレオチドから構成され、両方のポリヌクレオチドは相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。このポリヌクレオチドを含む二本鎖分子において、鎖の一方または両方のポリヌクレオチドの一部は、ＲＮＡであってもよく、標的配列がＤＮＡ配列で定義される場合、標的配列およびそれに相補的な配列内におけるヌクレオチド「ｔ」は、「ｕ」で置き換えられる。
【０２１５】
本発明の一つの態様において、本発明のこのような二本鎖分子は、センスおよびアンチセンス鎖から構成されるステムループ構造を含む。センス鎖およびアンチセンス鎖は、ループによって連結されていてもよい。したがって、本発明はまた、介在性一本鎖によって連結または隣接されるセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドから構成される二本鎖分子をも提供する。
本発明の二本鎖分子は、単一の標的ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子配列に向けられていてもよく、または複数の標的ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子配列に向けられていてもよい。
【０２１６】
ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の上記のターゲティング配列をターゲティングする本発明の二本鎖分子は、標的配列および／または標的配列に相補的な配列の核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子をターゲティングするポリヌクレオチドの例としては、配列番号１９または２０の配列、および／またはこれらのヌクレオチドに対して相補的な配列が挙げられる。しかしながら、本発明は、この例に限られず、上述の核酸配列における軽微な改変は、改変された分子がＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を抑制する能力を保持する限り、許容可能である。ここで、核酸配列に関連して用いられる「軽微な改変」という語句は、配列に対する核酸の１、２または数個の置換、欠失、付加または挿入を示す。本発明の文脈において、核酸置換、欠失、付加および／または挿入に適用される「数個」という用語は、３〜７個、好ましくは３〜５個、より好ましくは３〜４個、さらにより好ましくは３個の核酸残基を意味することができる.
【０２１７】
本発明によれば、本発明の二本鎖分子は、実施例において用いられる方法を用いて発現を低減、抑制または阻害する能力について試験することができる。ここで以下の実施例において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡの種々の部分のセンス鎖またはそれに対して相補的なアンチセンス鎖から構成される二本鎖分子は、標準的な方法にしたがってがん細胞株におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子生成物の生成を低減するその能力についてインビトロで試験された。さらに、たとえば、候補分子の非存在下において培養された細胞と比較して候補二本鎖分子と接触させた細胞におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子生成物の低減は、たとえば、実施例１、「定量的ＲＴ−ＰＣＲ」の項に言及されている、ＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡ用のプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって検出することができる。インビトロ細胞ベースアッセイにおけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子生成物の生成を低減する配列は、次にその細胞増殖に対する阻害効果について試験することができる。インビトロ細胞ベース配列アッセイにおいて細胞増殖を阻害する配列は、次いで、がんを有する動物、たとえばヌードマウス移植片モデルを用いて、そのインビボ能力について試験し、ＳＵＶ３９Ｈ２生成物の低減した生成および低減したがん細胞増殖を確認することができる。
【０２１８】
単離されたポリヌクレオチドがＲＮＡまたはその誘導体である場合、塩基「ｔ」は、そのヌクレオチド配列において「ｕ」で置き換えられるべきである。ここで用いられる場合、「相補的（な）」という用語は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド単位間でのワトソン−クリックまたはHoogsteen塩基対形成を指し、「結合（する）」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の物理的または化学的相互作用を意味する。ポリヌクレオチドが改変ヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含む場合、これらのポリヌクレオチドは、同じように相互に結合し得る。一般に、相補的ポリヌクレオチド配列は、適切な条件下でハイブリダイズし、不一致をほとんどまたは全く含まない安定な二重鎖を形成する。しかしながら、本発明は、１個またはそれ以上のヌクレオチドの不一致を含む相補的配列におよぶ。さらに、本発明の単離されたポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、ハイブリダイゼーションによって二本鎖分子またはヘアピンループ構造を形成することができる。好ましい態様において、このような二重鎖は、１０個の一致につき１個を超える不一致を含まない。特に好ましい態様において、二重鎖の鎖が十分に相補的である場合、このような二重鎖は不一致を含まない。
【０２１９】
相補的またはアンチセンスポリヌクレオチドは、好ましくはＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子について長さ１，０００ヌクレオチド未満である。好ましくは、このポリヌクレオチドは、遺伝子のすべてについて長さ５００、２００、１００、７５、５０、または２５ヌクレオチド未満である。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子の形成のため、または二本鎖分子をコードする鋳型ＤＮＡの調製のために有用である。ポリヌクレオチドが、二本鎖分子の形成に用いられる場合、ポリヌクレオチドのセンス鎖は、１９ヌクレオチドより長くてもよく、好ましくは２１ヌクレオチドより長く、より好ましくは約１９〜２５ヌクレオチドの長さを有する。
【０２２０】
したがって、本発明は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、ここでセンス鎖は標的配列に相当するヌクレオチド配列を含む分子を提供する。好ましい態様において、センス鎖は、標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、長さ１９〜２５ヌクレオチド対を有する二本鎖分子を形成する。
【０２２１】
二本鎖分子は、二本鎖分子が細胞に導入された場合、ＲＩＳＣ複合体のためのｍＲＮＡ中の相同配列を同定するためのガイドとして役立つ。同定された標的ＲＮＡは、ダイサーのヌクレアーゼ活性によって切断され、分解され、それを通じて二本鎖分子がＲＮＡによってコードされるポリペプチドの生成（発現）を最終的に低減または阻害する。したがって、本発明の二本鎖分子は、ストリンジェントな条件下でＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズする一本鎖を生成する能力によって定義することができる。ここで、二本鎖分子から生成される一本鎖とハイブリダイズするｍＲＮＡの部分は、「標的配列」または「標的核酸」または「標的ヌクレオチド」と呼ばれる。本発明においては、「標的配列」のヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡのＲＮＡ配列のみでなく、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡのＤＮＡ配列をも用いて示されることができる。
【０２２２】
あるいは、本発明の二本鎖分子は、センス鎖が標的配列でアンチセンス鎖とハイブリダイズし、５００、２００、１００、７５、５０または２５ヌクレオチド対未満の長さを有する二本鎖分子を形成する、二本鎖分子であってもよい。好ましくは、二本鎖分子は、約１９〜約２５ヌクレオチド対の長さを有する。さらに、二本鎖分子のセンス鎖は、好ましくは５００、２００、１００、７５、５０、３０、２８、２７、２６、２５ヌクレオチド未満、より好ましくは、約１９〜約２５ヌクレオチドを含む。
【０２２３】
本発明の二本鎖分子は、１またはそれ以上の改変されたヌクレオチドおよび／または非ホスホジエステル結合を含んでいてもよい。二本鎖分子の安定性、利用可能性および／または細胞取り込みを増加させることができる化学修飾を導入することは、当技術分野において周知である。当業者は、本発明の分子に取り込むことができる広範な化学修飾を知っている（ＷＯ０３／０７０７４４；ＷＯ２００５／０４５０３７）。たとえば、一つの態様において、修飾は、改良された分解抵抗性または改良された取り込みを提供するために用いることができる。このような修飾の例としては、ホスホロチオエート結合、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（特に二本鎖分子のセンス鎖上）、２’−デオキシ−フルオロリボヌクレオチド、２’−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および逆方向デオキシ塩基性残基取り込み（ＵＳ２００６０１２２１３７）が挙げられるが、これらに限らない。
【０２２４】
別の態様において、修飾は、二本鎖分子のターゲティング効率を増加したり、安定性を増強したりするために用いることができる。このような修飾の例としては、二本鎖分子の２つの相補鎖間の化学架橋、二本鎖分子のひとつの鎖の３’または５’末端の化学修飾、糖修飾、核酸塩基修飾、および／または骨格修飾、２−フルオロ修飾リボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドが挙げられるが、これらに限らない（ＷＯ２００４／０２９２１２）。別の態様においては、修飾は、標的ｍＲＮＡおよび／または相補的二本鎖分子鎖中の相補的ヌクレオチドに対するアフィニティを増加または低減するために用いることができる（ＷＯ２００５／０４４９７６）。たとえば、非修飾ピリミジンヌクレオチドは、２−チオ、５−アルキニル、５−メチル、または５−プロピニルピリミジンと置換することができる。さらに、非修飾プリンは、７−デアザ、７−アルキル、または７−アルケニルプリンで置換することができる。別の態様において、二本鎖分子が３’オーバーハングを有する二本鎖分子である場合、３’末端ヌクレオチドのオーバーハンギングヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドで置き換えてもよい（Elbashir SM et al.、Genes Dev 2001 Jan 15、 15（2）： 188−200）。
【０２２５】
さらなる詳細については、たとえば、ＵＳ２００６０２３４９７０号を参照されたい。しかしながら、本発明は、これらの実施例に限定されるとして制約されるべきではない；多数の化学修飾の任意のものを、もたらされる分子が標的遺伝子の発現を阻害する能力を保持する限りにおいて、本発明の二本鎖分子について用いることができる。
【０２２６】
本発明の二本鎖分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含んでいてもよく、たとえば、ｄｓＤ／Ｒ−ＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡであることができる。たとえば、ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖のハイブリッドポリヌクレオチドまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドは、増加した安定性を示し、したがってここで企図される。ＤＮＡおよびＲＮＡの混合、すなわち、ＤＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）およびＲＮＡ鎖（ポリヌクレオチド）から構成されるハイブリッドタイプの二本鎖分子、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を一本鎖（ポリヌクレオチド）のいずれかまたは両方に含むキメラタイプの二本鎖分子等を、二本鎖分子の安定性を増強するために形成してもよい。
【０２２７】
ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖のハイブリッドは、もたらされる二本鎖分子が、遺伝子を発現する細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を阻害することができる限りにおいて、ＲＮＡアンチセンス鎖にカップリングされたＤＮＡセンス鎖、またはその逆を有していてもよい。好ましい態様において、センス鎖ポリヌクレオチドはＤＮＡであり、アンチセンス鎖ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【０２２８】
また、キメラタイプの二本鎖分子は、もたらされる二本鎖分子が、遺伝子を発現する細胞に導入された場合、標的遺伝子の発現を阻害する活性を有する限りにおいて、ＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるセンスおよびアンチセンス鎖の一方または両方を有していてもよく、またはＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるセンスおよびアンチセンス鎖のいずれか一つを有していてもよい。二本鎖分子の安定性を増強するために、この分子は、好ましくはなるべく多くのＤＮＡを含み、一方、標的遺伝子発現の阻害を誘導するために、この分子は、発現の十分な阻害を誘導する範囲内で、ＲＮＡであることが必要とされる。
【０２２９】
好ましいキメラタイプの二本鎖分子は、ＲＮＡの上流部分領域（すなわち、センスまたはアンチセンス鎖内の標的配列またはその相補的配列に隣接する領域）を含む。好ましくは、上流部分領域は、センス鎖の５’側（５’末端）およびアンチセンス鎖の３’側（３’末端）を示す。あるいは、センス鎖の５’末端および／またはアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域は、上流部分領域と呼ばれてもよい。つまり、好ましい態様においては、アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、あるいはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方は、ＲＮＡから構成される。たとえば、本発明のキメラまたはハイブリッドタイプの二本鎖分子は、以下の組み合わせを含んでいてもよい：
センス鎖：
５’−［−−−ＤＮＡ−−−］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’
：アンチセンス鎖、
センス鎖：
５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−５’
：アンチセンス鎖、および
センス鎖：
５’−（ＲＮＡ）−［ＤＮＡ］−３’
３’−（−−−ＲＮＡ−−−）−５’
：アンチセンス鎖。
【０２３０】
上流部分領域は、好ましくは二本鎖分子のセンスまたはアンチセンス鎖内の標的配列またはそれに相補的な配列の末端から数えて９〜１３ヌクレオチドから構成されるドメインである。そのうえ、このようなキメラタイプの二本鎖分子の好ましい例としては、１９〜２１ヌクレオチド長の鎖を有するものであって、ポリヌクレオチドの少なくとも上流半分領域（センス鎖について５’側領域およびアンチセンス鎖について３’側領域）がＲＮＡであり、他の半分がＤＮＡであるものが挙げられる。このようなキメラタイプの二本鎖分子において、標的遺伝子の発現を阻害する効果は、アンチセンス鎖の全体がＲＮＡである場合にはるかに高い（ＵＳ２００５０００４０６４号）。
【０２３１】
本発明の文脈において、二本鎖分子は、ヘアピン、たとえばショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）およびＤＮＡおよびＲＮＡから構成されるショートヘアピン（ｓｈＤ／Ｒ−ＮＡ）を形成してもよい。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレントにするために用いることができるタイトなヘアピンターンを作るＲＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの混合物の配列である。ｓｈＲＮＡまたはｓｈＤ／Ｒ−ＮＡは、単一鎖上にセンス標的配列およびアンチセンス標的配列を含み、ここで、これらの配列はループ配列によって分離されている。一般に、ヘアピン構造は、細胞装置によってｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡ分子に切断され、それらは、次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤ／Ｒ−ＮＡの標的配列と一致するｍＲＮＡに結合し、これを切断する。
【０２３２】
ヘアピンループ構造を形成するために、任意のヌクレオチド配列から構成されるループ配列が、センスおよびアンチセンス配列の間に位置していることができる。このようなループ配列は、センス鎖の５’または３’末端に連結されてヘアピンループ構造を形成してもよい。したがって、本発明は、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’または５’−［Ａ’］−［Ｂ］−［Ａ］−３’を有する二本鎖分子であって、ここで、［Ａ］は標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は介在性一本鎖であり、かつ［Ａ’］は［Ａ］に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、二本鎖分子をも提供する。標的配列は、たとえば、配列番号１９または２０のヌクレオチド配列から選択されてもよい。
【０２３３】
本発明は、これらの実施例に限られず、［Ａ］中の標的配列は、二本鎖分子が標的であるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を抑制する能力を保持する限りにおいて、これらの実施例から改変された配列であってもよい。領域［Ａ］は、［Ａ’］にハイブリダイズして領域［Ｂ］から構成されるループを形成する。介在性一本鎖部分［Ｂ］、すなわち、ループ配列は、好ましくは３〜２３ヌクレオチド長であることができる。ループ配列は、たとえば、Ambion ウェブサイト（ambion.com/techlib/tb/tb_506.html）に見出される配列から選択することができる。さらに、２３ヌクレオチドから構成されるループ配列はまた、活性ｓｉＲＮＡをも提供する（Jacque JM et al.、 Nature 2002 Jul 25、 418（6896）： 435−8、 Epub 2002 Jun 26）：ＣＣＣ、ＣＣＡＣＣ、またはＣＣＡＣＡＣＣ： Jacque JM et al.、 Nature 2002 Jul 25、 418（6896）： 435−8、 Epub 2002 Jun 26；ＵＵＣＧ： Lee NS et al.、 Nat Biotechnol 2002 May、 20（5）： 500−5； Fruscoloni P et al.、 Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18、 100（4）： 1639−44、 Epub 2003 Feb 10；およびＵＵＣＡＡＧＡＧＡ： Dykxhoorn DM et al.、 Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun、 4（6）： 457−67。）
【０２３４】
ヘアピンループ構造を有する本発明の好ましい二本鎖分子の例は、以下に示される。以下の構造において、ループ配列は、ＡＵＧ、ＣＣＣ、ＵＵＣＧ、ＣＣＡＣＣ、ＣＴＣＧＡＧ、ＡＡＧＣＵＵ、ＣＣＡＣＡＣＣ、およびＵＵＣＡＡＧＡＧＡから選択することができる；しかしながら、本発明は、そのことに限られない：
ＣＵＵＵＧＧＵＵＧＵＵＣＡＵＧＣＡＣＡ−［Ｂ］−ＵＧＵＧＣＡＵＧＡＡＣＡＡＣＣＡＡＡＧ（標的配列用  配列番号１９）、およびＣＵＧＧＡＡＵＣＡＧＣＵＵＡＧＵＣＡＡ−［Ｂ］−ＵＵＧＡＣＵＡＡＧＣＵＧＡＵＵＣＣＡＧ（標的配列用  配列番号２０）。
【０２３５】
さらに、いくつかのヌクレオチドを、二本鎖分子の阻害活性を増強するために３’オーバーハングとして標的配列のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端に付加することができる。３’オーバーハングを構成するヌクレオチドの好ましい例としては、「ｔ」および「ｕ」が挙げられるが、これらに限られない。付加されるべきヌクレオチドの数は、少なくとも２個、一般に２〜１０個、好ましくは２〜５個である。付加されたヌクレオチドは、二本鎖分子のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端で単一鎖を形成する。二本鎖分子が単一ポリヌクレオチドから構成されてヘアピンループ構造を形成する場合には、３’オーバーハング配列は、単一ポリヌクレオチドの３’末端に付加してもよい。
【０２３６】
二本鎖分子の調製方法は、特に限定されないが、当技術分野において公知の標準的化学方法のいずれかを用いることが好ましい。一つの化学合成法によれば、センスおよびアンチセンス一本鎖ポリヌクレオチドは、別々に合成し、次に、適切な方法を介して互いにアニーリングさせて二本鎖分子を得てもよい。一つの具体的な態様においては、合成された一本鎖ポリヌクレオチドは、好ましくは少なくとも約３：７、より好ましくは約４：６のモル比、そして最も好ましくは実質的に等モル量（すなわち、約５：５のモル比）で混合される。次に、混合物を二本鎖分子が解離する温度に加熱し、次いで徐々に冷ます。アニーリングした二本鎖ポリヌクレオチドは、当技術分野において通常用いられる公知の方法により精製することができる。精製方法の例としては、アガロースゲル電気泳動を用いる方法または残存する一本鎖ポリヌクレオチドが、たとえば適切な酵素を用いる分解により、場合によっては除去される方法が挙げられる。
【０２３７】
ＳＵＶ３９Ｈ２配列に隣接する調節配列は、それらの発現が独立に、または時間的または空間的方式で調整できるように、同一であっても異なっていてもよい。二本鎖分子は、たとえば、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６由来ＲＮＡ  ｐｏｌIII転写ユニットまたはヒトＨ１  ＲＮＡプロモーターを含むベクター中へのＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子鋳型のクローニングにより、細胞内で転写されることができる。
【０２３８】
本発明の二本鎖分子をコードするベクター：
本発明に同様に含まれるのは、ここで記載される一またはそれ以上の二本鎖分子をコードするベクター、およびこのようなベクターを含む細胞である。具体的には、本発明は、以下の［１］〜［１０］のベクターを提供する。
［１］  細胞に導入された場合、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子のインビボ発現および細胞増殖を阻害する二本鎖分子をコードし、この分子はセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖から構成され、相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、ベクター。
［２］  配列番号１９または２０の標的配列と一致する、ｍＲＮＡに作用する二本鎖分子をコードする、前記［１］に記載のベクター；
［３］  センス鎖が、配列番号１９または２０の標的配列に相当する配列を含む、前記［１］に記載のベクター；
［４］  約１００ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする、前記［３］に記載のベクター；
［５］  約７５ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする、前記［４］に記載のベクター；
［６］  約５０ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする、前記［５］に記載のベクター；
［７］  約２５ヌクレオチド長未満である二本鎖分子をコードする、前記［６］に記載のベクター；
［８］  約１９〜約２５ヌクレオチド長の二本鎖分子をコードする、前記［７］に記載のベクター；
［９］  二本鎖分子は、介在性一本鎖によって連結されたセンスおよびアンチセンス鎖の両方を有する単一ポリヌクレオチドから構成される、前記［１］〜［８］のいずれか１項に記載のベクター；
［１０］  一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’または５’−［Ａ’］−［Ｂ］−［Ａ］−３’を有する二本鎖分子をコードし、ここで、［Ａ］は配列番号１９または２０の標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドから構成される介在性一本鎖であり、かつ［Ａ’］は標的配列に対して相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、前記［９］に記載のベクター。
【０２３９】
本発明のベクターは、好ましくは発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。ここで、「発現可能な形態（で）」という語句は、ベクターが、細胞に導入された場合、その中に担持、含有またはコードされる分子を発現するであろうことを示す。好ましい態様において、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な１またはそれ以上の調節要素を含む。したがって、一つの態様において、発現ベクターは、本発明の核酸配列をコードし、その核酸配列の発現のために適合されている。このような本発明のベクターは、本発明の二本鎖分子を生成するために、またはがんを治療するための活性成分として直接に、使用してもよい。
【０２４０】
本発明のベクターは、たとえば、（ＤＮＡ分子の転写によって）両鎖の発現を可能にするような方式で調節配列がＳＵＶ３９Ｈ２配列に作動可能に連結されるように、発現ベクター中にＳＵＶ３９Ｈ２配列をクローニングすることによって生成することができる（Lee NS et al.、 Nat Biotechnol 2002 May、 20（5）： 500−5）。たとえば、ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子は、第一のプロモーター（たとえば、クローニングされたＤＮＡの３’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写され、ｍＲＮＡに対してセンス鎖であるＲＮＡ分子は、第二のプロモーター（たとえば、クローニングされたＤＮＡの５’末端に隣接するプロモーター配列）によって転写される。センスおよびアンチセンス鎖は、インビボでハイブリダイズして遺伝子のサイレンシングのための二本鎖分子構築物を生成する。あるいは、二本鎖分子のセンスおよびアンチセンス鎖をそれぞれコードする２つのベクター構築物は、それぞれセンスおよびアンチセンス鎖を発現し、二本鎖分子構築物を形成するために利用される。さらに、クローニングされた配列は、二次構造（たとえば、ヘアピン）を有する構築物をコードしてもよい；したがって、ベクターの単一の転写物は、標的遺伝子のセンスおよび相補的なアンチセンス配列の両方を含んでいてもよい。
【０２４１】
本発明は、センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含む、ポリヌクレオチドの組み合わせの各々または両方を含むベクターであって、アンチセンス鎖はそのセンス鎖に対して相補的なヌクレオチド配列を含み、このセンス鎖およびアンチセンス鎖の転写物は相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、かつ、このベクターは、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞に導入された場合、その遺伝子の発現を阻害する、ベクターを企図する。
【０２４２】
本発明のベクターは、標的細胞のゲノム中への安定な挿入を達成するように装備されていてもよい（たとえば、相同組み換えカセットベクターの記載について、Thomas KR & Capecchi MR、Cell 1987、 51： 503−12を参照されたい）。たとえば、Wolff et al.、 Science 1990、 247： 1465−8；米国特許第５，５８０，８５９号；第５，５８９，４６６号；第５，８０４，５６６号；第５，７３９，１１８号；第５，７３６，５２４号；第５，６７９，６４７号；およびＷＯ９８／０４７２０を参照されたい。ＤＮＡに基づく送達技術の例としては、「ネイキッドＤＮＡ」、促進（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性送達（たとえば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照されたい）が挙げられる。
【０２４３】
本発明のベクターとしては、たとえば、ウイルスまたは細菌性ベクターが挙げられる。発現ベクターの例としては、ワクシニアまたは鶏痘ウイルスのような弱毒化ウイルス宿主（たとえば、米国特許第４，７２２，８４８号を参照されたい）が挙げられる。このアプローチは、たとえば、二本鎖分子をコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしての、ワクシニアウイルスの使用を含む。標的遺伝子を発現している細胞への導入に際し、組み換えワクシニアウイルスはこの分子を発現し、それによって細胞の増殖を抑制する。使用可能なベクターの別の例としては、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）が挙げられる。ＢＣＧベクターは、Stover et al.、 Nature 1991、 351： 456−60に記載されている。非常に多様な他のベクターが、二本鎖分子の生成および治療的投与のために有用である；例としては、アデノおよびアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Salmonella typhi）ベクター、解毒化炭疽菌毒素ベクター、等が挙げられる。たとえば、 Shata et al.、 Mol Med Today 2000、 6： 66−71； Shedlock et al.、 J Leukoc Biol 2000、 68： 793−806；およびHipp et al.、 In Vivo 2000、 14： 571−85を参照されたい。
【０２４４】
本発明の二本鎖分子を用いるがんの治療方法：
本発明において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対するｄｓＲＮＡｓは、細胞増殖を阻害するその能力について試験された。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対するｄｓＲＮＡは、いくつかのがん細胞株における遺伝子の発現を効率的にノックダウンし、細胞増殖の抑制と同時に起こった（図４）。
【０２４５】
したがって、本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現の阻害を介してＳＵＶ３７Ｈ２遺伝子の機能不全を誘導することにより、細胞、すなわち、がん細胞の増殖を阻害する方法を提供する。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子発現は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を特異的に標的とする前述の本発明の二本鎖分子のいずれによっても阻害することができる。
【０２４６】
がん性細胞の細胞増殖を阻害する本発明の二本鎖分子およびベクターのこのような能力は、それらを、がんの治療、ならびに術後、二次的、または転移性のその再発の治療または予防の方法のために使用することができることを示す。例示的ながんとしては、たとえば、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍が挙げられるが、これらに限らない。したがって、本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子またはこの分子を発現するベクターを投与することにより、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子は正常器官において最少量検出されことから副作用なしに、がんを有する患者を治療する方法を提供する（図１）。
【０２４７】
本発明において特に興味のある対象は、以下に規定する［１］〜［３２］の方法である：
［１］  がん細胞の増殖を阻害するまたはがんを治療する方法であって、ここで、がん細胞またはがんは、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現し、この方法は、少なくとも１つのＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する単離された二本鎖分子またはこの二本鎖分子をコードするベクターを投与する工程を含み、ここで、二本鎖分子は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を過剰発現する細胞においてこの遺伝子の発現および細胞増殖を阻害し、ここで、この二本鎖分子は、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖から構成され、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、方法；
［２］  二本鎖分子が、配列番号１９または２０の標的配列に一致するｍＲＮＡに作用する、前記［１］に記載の方法；
［３］  センス鎖が、配列番号１９または２０の標的配列に相当する配列を含む、前記［１］に記載の方法；
［４］  治療されるべきがんが、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍からなる群から選択される、前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法；
［５］  二本鎖分子が、約１００ヌクレオチド長未満である、前記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法；
［６］  二本鎖分子が、約７５ヌクレオチド長未満である、前記［５］に記載の方法；
［７］  二本鎖分子が、約５０ヌクレオチド長未満である、前記［６］に記載の方法；
［８］  二本鎖分子が、約２５ヌクレオチド長未満である、前記［７］に記載の方法；
［９］  二本鎖分子が、約１９〜約２５ヌクレオチド長未満である、前記［８］に記載の方法；
［１０］  二本鎖分子が、介在性一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドから構成される、前記［１］〜［９］のいずれか１項に記載の方法；
［１１］  二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’または５’−［Ａ’］−［Ｂ］−［Ａ］−３’を有し、ここで［Ａ］は配列番号１９または２０の標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドから構成される介在性単一鎖であり、かつ、［Ａ’］は標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、前記［１０］に記載の方法；
［１２］  二本鎖分子がＲＮＡから構成される、前記［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の方法；
［１３］  二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成される、前記［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の方法；
［１４］  二本鎖分子が、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、前記［１３］に記載の方法；
［１５］  センスおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成されている、前記［１４］に記載の方法；
［１６］  二本鎖分子が、ＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、前記［１３］に記載の方法；
［１７］  アンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡから構成される、前記［１６］に記載の方法；
［１８］  隣接領域が、９〜１３ヌクレオチドから構成される、前記［１７］に記載の方法；
［１９］  二本鎖分子が３’オーバーハングを含む、前記［１］〜［１８］のいずれか１項に記載の方法；
［２０］  二本鎖分子が、トランスフェクション増強剤および医薬的に許容可能なキャリアを含む組成物中に含まれる、前記［１］〜［１９］のいずれか１項に記載の方法；
［２１］  二本鎖分子が、ベクターによってコードされる、前記［１］〜［２０］のいずれか１項に記載の方法；
［２２］  ベクターによってコードされる二本鎖分子が、配列番号１９または２０の標的配列に一致するｍＲＮＡで作用する、前記［２１］に記載の方法；
［２３］  ベクターによってコードされる二本鎖分子のセンス鎖が、配列番号１９または２０から選択される標的配列に相当する配列を含む、前記［２１］に記載の方法；
［２４］  治療されるべきがんが、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌（canter）または軟部腫瘍である、前記［２１］〜［２３］のいずれか１項に記載の方法；
［２５］  ベクターによってコードされる二本鎖分子が、約１００ヌクレオチド長未満である、前記［２１］〜［２４］のいずれか１項に記載の方法；
［２６］  ベクターによってコードされる二本鎖分子が、約７５ヌクレオチド長未満である、前記［２５］に記載の方法；
［２７］  ベクターによってコードされる二本鎖分子が、約５０ヌクレオチド長未満である、前記［２６］に記載の方法；
［２８］  ベクターによってコードされる二本鎖分子が、約２５ヌクレオチド長未満である、前記［２７］に記載の方法；
［２９］  ベクターによってコードされる二本鎖分子が、約１９〜約２５ヌクレオチド長である、前記［２８］に記載の方法；
［３０］  ベクターによってコードされる二本鎖分子が、介在性一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一ポリヌクレオチドから構成される、前記［２１］〜［２９］のいずれか１項に記載の方法；
［３１］  ベクターによってコードされる二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’または５’−［Ａ’］−［Ｂ］−［Ａ］−３’を有し、ここで、［Ａ］は配列番号１９または２０の標的配列に相当する配列を含むセンス鎖であり、［Ｂ］は３〜２３ヌクレオチドから構成される介在性一本鎖であり、かつ、［Ａ’］は標的配列に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、前記［３０］に記載の方法；および
［３２］  ベクターが、トランスフェクション増強剤および医薬的に許容可能なキャリアを含む組成物に含まれている、前記［２１］に記載の方法。
【０２４８】
本発明の治療および予防方法は、以下に詳細に記載される。ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する細胞の増殖は、細胞を、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子、この分子を発現するベクターまたはそれを含む組成物と接触させることによって阻害してもよい。細胞は、さらにトランスフェクション剤と接触させてもよい。好適なトランスフェクション剤は、当技術分野において公知である。「細胞増殖の阻害」という語句は、細胞が、その分子に曝露されていない細胞と比較して低速で増殖するまたは低減した生存力を有することを示す。細胞増殖は、当技術分野において公知の任意の数の方法によって、たとえば、コロニー形成アッセイまたはＭＴＴ細胞増殖アッセイを用いて、測定することができる。
【０２４９】
細胞が本発明の二本鎖分子の標的遺伝子を発現または過剰発現する限りにおいて、任意の種類の細胞の増殖を、本発明の方法によって抑制することができる。例示的な細胞としては、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍が挙げられる。
【０２５０】
したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２過剰発現と関連する疾患に罹患しているまたはそれを発症するリスクのある患者は、本発明の二本鎖分子、その分子を発現する少なくとも１つのベクターまたはその分子を含む組成物を投与することによって治療してもよい。たとえば、がん患者は、本発明の方法にしたがって治療してもよい。がんのタイプは、診断されるべき腫瘍の具体的なタイプにしたがって標準的な方法によって同定してもよい。より好ましくは、本発明の方法によって治療される患者は、ＲＴ−ＰＣＲまたは免疫アッセイによって患者からの生検試料におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を検出することによって選択される。好ましくは、本発明の治療の前に、対象からの生検標本は、当技術分野において公知の方法、たとえば、免疫組織化学解析またはＲＴ−ＰＣＲによってＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子過剰発現について確認される。
【０２５１】
細胞増殖を阻害するために、本発明の二本鎖分子は、この分子と相当するｍＲＮＡ転写物との結合を達成するための形態で、細胞に直接導入してもよい。あるいは、上記のとおり、二本鎖分子をコードするＤＮＡは、ベクターの手段によって細胞に導入してもよい。二本鎖分子およびベクターを細胞に導入するために、トランスフェクション増強剤、たとえばＦｕＧＥＮＥ（Roche diagnostics）、 リポフェタクミン（Lipofectamine）２０００ （Invitrogen）、 オリゴフェクタミン（Oligofectamine）（Invitrogen）、およびヌクレオフェクター（Nucleofector）（Wako pure Chemical）、を用いてもよい。
【０２５２】
上記の「定義」の章において記載したように、治療は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現の低減、または対象におけるがんの大きさ、罹患率、または転移潜在能力の低減のような臨床的有効性をもたらす場合に「有効」と認められる。処理が予防的に適用される場合、「有効」は、がんの形成を遅延または防止すること、またはがんの臨床症状を防止または緩和することを意味する。有効性は、特定の腫瘍タイプを診断または治療するための公知の任意の方法に関連して決定される。
【０２５３】
当業者は、本発明の二本鎖分子が準化学量論的量でＳＵＶ３９Ｈ２  ｍＲＮＡを分解することを理解する。いかなる理論にも拘束されることは望まないが、本発明の二本鎖分子は触媒的な方式で標的ｍＲＮＡの分解を起こすと信じられている。したがって、標準的ながん療法と比較して有意に少ない二本鎖分子が、治療効果を表すためにがんの部位または近傍に送達される必要がある。
【０２５４】
当業者は、所定の対象に投与されるべき本発明の二本鎖分子の至適な有効量を、その対象の体重、年齢、性別、疾患タイプ、症状およびその他の条件；投与経路；および、投与が局所的または全身的かどうかのような要因を考慮に入れることにより、容易に決定することができる；。一般に、本発明の二本鎖分子の有効量は、がんの部位またはその近傍で、約１ナノモル（nM）〜約１００nM、好ましくは約２nM〜約５０nM、より好ましくは約２．５nM〜約１０nMの細胞間濃度である。より少ないまたはより多い量の二本鎖分子を投与することができることが企図される。特定の状況について必要とされる正確な用量は、当業者によって慣行的に容易に決定されることができる。
【０２５５】
本発明の方法は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現する、より具体的には過剰発現するがん、たとえば、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍の、増殖または転移を阻害するために使用することができる。
特に、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の標的配列を含む二本鎖分子（すなわち、配列番号１９または２０）は、がんの治療のために特に好ましい。
【０２５６】
がんを治療するために、本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子とは異なる医薬物質との組み合わせで対象に投与することもできる。あるいは、本発明の二本鎖分子は、がんを治療するために設計された別の治療的方法との組み合わせで対象に投与することができる。たとえば、本発明の二本鎖分子は、がんの治療またはがん転移の予防のために現在用いられている治療的方法（たとえば、放射線療法、外科手術および化学治療剤（たとえばシスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、ダウノルビシンまたはタモキシフェン））を用いる治療との組み合わせで投与することができる。.
【０２５７】
本発明の文脈において、二本鎖分子は、送達試薬と組み合わせたネイキッド二本鎖分子として、または二本鎖分子を発現する組み換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、対象に投与することができる。
本発明の二本鎖分子と組み合わせて投与するための好適な送達試薬としては、ミラストランジットＴＫＯ（Mirus Transit TKO）脂溶性試薬；リポフェクチン（lipofectin）；リポフェクタミン（lipofectamine）；セルフェクチン（cellfectin）；またはポリカチオン類もしくはポリカチオン類（たとえば、ポリリジン）、またはリポソームが挙げられる。好ましい送達試薬は、リポソームである。
【０２５８】
リポソームは、肺腫瘍組織、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍のような特定の組織への二本鎖分子の送達において補助することができ、二本鎖分子の血液半減期を増加することもできる。本発明における使用に好適なリポソームは、標準的なベシクル形成性脂質から形成され、それは一般に中性または負に荷電したリン脂質、およびコレステロールのようなステロールを含む。脂質の選択は、一般に、所望のリポソームサイズおよび血流中でのリポソームの半減期のような要因の考慮を指針とする。多様な方法が、リポソームの調製のために公知であり、たとえば、Szoka et al.、 Ann Rev Biophys Bioeng 1980、 9： 467；および米国特許第４，２３５，８７１号；第４，５０１，７２８号；第４，８３７，０２８号；および第５，０１９，３６９号に記載されたとおりであり、これらの開示の全体が、参照によりここに組み入れられる。
【０２５９】
好ましくは、本発明の二本鎖分子を被包するリポソームとしては、がん部位へリポソームを送達することができるリガンド分子が挙げられる。腫瘍抗原または内皮細胞表面抗原に結合するモノクローナル抗体のような、腫瘍または血管内皮細胞に蔓延するレセプターに結合するリガンドは好ましい。
【０２６０】
特に好ましくは、本発明の二本鎖分子を被包するリポソームは、たとえば、構造の表面に結合したオプソニン化阻害部分を有することによって、単核マクロファージおよび網内皮系によるクリアランスを回避するように修飾される。一つの態様において、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分およびリガンドの両方を含むことができる。
【０２６１】
本発明のリポソームの調製に使用するためのオプソニン化阻害部分は、典型的には、リポソーム膜に結合する大きい親水性ポリマーである。ここで用いる場合、オプソニン化阻害部分は、それが、たとえば、膜自体への脂溶性アンカーのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基への直接的な結合によって、化学的または物理的にその膜に付着している場合、リポソーム膜に「結合している」。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、保護表面層を形成し、これは、マクロファージ−単核球システム（「ＭＭＳ」）および網内系システム（「ＲＥＳ」）によって、リポソームの取り込みを有意に低減する；たとえば、米国特許第４，９２０，０１６号に記載されたとおりであり、この開示全体は、参照によりここに包含される。オプソニン化阻害部分によって修飾されたリポソームは、かくして非修飾リポソームよりもはるかに長く循環中にとどまる。この理由のため、このようなリポソームは、時に「ステルス」リポソームと呼ばれる。
【０２６２】
ステルスリポソームは、多孔質または「リーキー」な微小血管系によって肥育された組織に蓄積することが知られている。したがって、このような微小血管系欠損を特徴とする標的組織、たとえば、固形腫瘍は、効率的にこれらのリポソームを蓄積するであろう。Gabizon et al.、 Proc Natl Acad Sci USA 1988、 18： 6949−53を参照されたい。さらに、ＲＥＳによる低減された取り込みは、肝臓および脾臓における有意な蓄積の防止によりステルスリポソームの毒性を低下させる。したがって、オプソニン化阻害部分によって修飾された本発明リポソームは、腫瘍細胞に本発明の二本鎖分子を送達することができる。
【０２６３】
リポソームの修飾に好適なオプソニン化阻害部分は、好ましくは約５００〜約４０，０００ダルトン、およびより好ましくは約２，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を持つ水溶性ポリマーである。このようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体、たとえば、メトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、およびステアリン酸ＰＥＧまたはＰＰＧ；ポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドンのような合成ポリマー；線状、分岐状、またはデンドリマー状ポリアミドアミン；ポリアクリル酸；ポリアルコール、たとえば、カルボキシ基またはアミノ基が化学的に連結されたポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシドＧＭ．ｓｕｂ．１．のようなガングリオシドが挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、またはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはそれらの誘導体もまた好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧとポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであることができる。オプソニン化阻害ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖類、たとえば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン（mannuronic）酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン；アミノ化多糖類またはオリゴ糖類（線状または分岐状）；またはカルボキシ化多糖類またはオリゴ糖類、たとえば、結果として得られるカルボキシ基の連結部を有するカルボン酸の誘導体と反応されたものであることもできる。
【０２６４】
好ましくは、オプソニン化阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはそれらの誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、時に「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれる。
オプソニン化阻害部分は、多数の周知の技術のいずれかによってリポソーム膜に結合させることができる。たとえば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルは、ホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーに結合することができ、次に膜に結合することができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および３０：１２の比率のテトラヒドロフランおよび水のような溶剤混合物を６０℃で用いる還元的アミノ化を介して、ステアリルアミン（stearylamine）脂溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０２６５】
本発明の二本鎖分子を発現するベクターは上記で記載した。本発明の少なくとも１つの二本鎖分子を発現するこのようなベクターは、ミラストランジットＬＴ１（Mirus Transit LT1）脂溶性 試薬；リポフェクチン（lipofectin）；リポフェクタミン（lipofectamine）；セルフェクチン（cellfectin）； ポリカチオン類（たとえば、ポリリジン）またはリポソームを含む、好適な送達試薬とともにまたは直接、投与することができる。対象中のがんの領域に、本発明の二本鎖分子を発現する組み換えウイルスベクターを送達する方法は、当業者の技術の範囲内である。
【０２６６】
本発明の二本鎖分子は、二本鎖分子をがん部位に送達するために好適な任意の手段によって対象に投与することができる。たとえば、二本鎖分子は、遺伝子銃、エレクトロポレーションによって、または他の好適な非経口的または経腸的投与経路によって、投与することができる。好適な経腸的投与経路は、経口、直腸内もしくは鼻腔内送達を含む。
【０２６７】
好適な非経口投与経路としては、血管内投与（たとえば、静脈内ボーラス注入、静脈内点滴、動脈内ボーラス注入、動脈内点滴および脈管構造へのカテーテル滴下注入）；組織周囲または組織内注入（たとえば、腫瘍周囲および腫瘍内注入）；皮下点滴（浸透圧ポンプによるもののような）を含む皮下注入または沈着；がんの近傍または部位の領域への直接適用、たとえば、カテーテルまたは他の留置装置によるもの（たとえば、多孔質、非多孔質、またはゼラチン状物質を含む坐剤またはインプラント）；および吸入が挙げられる。二本鎖分子またはベクターの注入または点滴は、がんの部位またはその近傍に与えることが好ましい。
【０２６８】
本発明の二本鎖分子は、単一用量または複数用量で投与することができる。本発明の二本鎖分子の投与が点滴による場合、点滴は、単一持続性用量であることができ、または複数の点滴によって送達することもできる。組織への物質の直接の注入は、がんの部位または近傍であることが好ましい。がんの部位または近傍の組織への物質の複数の注入は、特に好ましい。
【０２６９】
当業者は、所定の対象へ本発明の二本鎖分子を投与する適切な投与計画を、容易に決定することもできる。たとえば、二本鎖分子は、１回で、たとえば、単一注入またはがんの部位もしくは近傍への堆積として、対象に投与することができる。あるいは、二本鎖分子は、約３〜約２８日間、より好ましくは約７〜約１０日間の期間、対象に毎日１回または２回投与することができる。好ましい投与計画において、二本鎖分子は、がんの部位または近傍に１日１回、７日間注入される。投与計画が複数の投与を含む場合、対象に投与される二本鎖分子の有効量は、投与計画全体にわたって投与される二本鎖分子の総量を含むことができることが理解される。
【０２７０】
本発明の文脈において、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を過剰発現するがんは、以下のものからなる群から選択される少なくとも１つの活性成分で処理されることができる：
（a）  本発明の二本鎖分子、
（b）  それをコードするＤＮＡ、および
（c）  それをコードするベクター。
治療すべきがんとしては、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍が挙げられるが、これらに限らない。
【０２７１】
したがって、活性成分としての本発明の二本鎖分子の投与前に、治療すべきがん細胞または組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルが同じ器官の正常細胞と比較して増強されているかどうかを確認することが好ましい。したがって、一つの態様において、本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を（過剰）発現するがんを治療するための方法を提供し、この方法は以下の工程を含んでいてもよい：
i）  治療すべきがんを有する対象から得られたがん細胞または組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを決定する工程；
ii）  ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを、正常対照と比較する工程；および
iii）  以下のものからなる群から選択される少なくとも１つの成分：
（a）  本発明の二本鎖分子、
（b）  前記二本鎖分子をコードするＤＮＡ、および
（c）  前記二本鎖分子をコードするベクター、
を、正常対照と比較してＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を過剰発現するがんを有する対象に投与する工程。あるいは、本発明は、以下のものからなる群から選択される少なくとも１つの成分：
（a）  本発明の二本鎖分子、
（b）  前記二本鎖分子をコードするＤＮＡ、および
（c）  前記二本鎖分子をコードするベクター、
を含む、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を過剰発現するがんを有する対象への投与に使用するための医薬組成物をも提供する。言い換えれば、本発明は、以下のもの：
（a）  本発明の二本鎖分子、
（b）  前記二本鎖分子をコードするＤＮＡ、または
（c）  前記二本鎖分子をコードするベクター、
で治療されるべき対象を同定するための方法をさらに提供し、この方法は、対象由来がん細胞または組織中のＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを決定する工程を含んでいてもよく、ここで、この遺伝子の正常対照レベルと比較したレベルの増加はこの対象が本発明の二本鎖分子で治療してもよいがんを有することを示す。
【０２７２】
本発明のがんの治療方法は、以下にさらに詳細に記載される。
本発明の方法によって治療されるべき対象は、好ましくは哺乳類である。例示的な哺乳類としては、たとえば、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシが挙げられるが、これらに限らない。
本発明によれば、対象から得られたがん細胞または組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルが決定される。この発現レベルは、当技術分野において公知の方法を用いて転写（核酸）生成物レベルで決定することができる。たとえば、ハイブリダイゼーション法（たとえば、ノーザンハイブリダイゼーション）、チップまたはアレイ、プローブ、ＲＴ−ＰＣＲは、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の転写生成物レベルを決定するために使用することができる。
【０２７３】
あるいは、翻訳生成物を、本発明の治療のために検出してもよい。
たとえば、観察されたタンパク質（配列番号２２、２４、２６、２８または３０）の量を決定してもよい。
翻訳生成物に基づいてＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現レベルを検出するための別の方法として、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質に対する抗体を用いる免疫組織化学解析を介して染色強度を測定してもよい。具体的には、この測定においては、強い染色は、タンパクの増加した存在／レベルを示し、同時に、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の高い発現レベルを示す。
ＳＵＶ３９Ｈ２ポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を検出または測定する方法は、上記のように例示することができる（がんの診断方法）。
【０２７４】
本発明の二本鎖分子を含有する組成物：
上記に加えて、本発明はまた、本発明の二本鎖分子またはこの分子をコードするベクターを含む医薬組成物をも提供する。
本発明の文脈において、「組成物」という用語は、特定の成分を特定の量で含む生成物、ならびに、特定の量の特定の成分の組み合わせから直接的または間接的にもたらされる任意の生成物を指すために使用される。このような用語は、修飾語句「医薬（の）」（「医薬組成物」におけるように）に関して用いられる場合、活性成分、およびキャリアを形成する任意の不活性成分を含有する生成物、ならびに、任意の２以上の成分の組み合わせ、複合体形成または凝集から、または１以上の成分の解離から、または１以上の成分の他のタイプの反応もしくは相互作用から、直接的または間接的にもたらされる任意の生成物、を含む生成物、を含む生成物を包含することを意図される。したがって、本発明の文脈において、「医薬組成物」という用語は、本発明の分子または化合物と医薬的もしくは生理学的に許容可能なキャリアとを混合することにより製造された、任意の生成物を指す。
【０２７５】
「医薬的に許容可能なキャリア」または「生理学的に許容可能なキャリア」という語句は、ここで用いる場合、液体または固体増量剤、希釈剤、添加剤、溶剤または被包物質を含むがこれらに限らない、医薬的または生理学的に許容可能な材料、組成物、物質または賦形剤を意味する。
【０２７６】
「活性成分」という用語は、ここでは、生物学的または生理学的に活性な、組成物中の物質を指す。特に、医薬組成物の文脈において、「活性成分」という用語は、客観的な薬学的効果を示す物質を指す。たとえば、がんの治療または予防における使用のための医薬組成物の場合には、薬剤または組成物中の活性成分は、がん細胞および／または組織に対して少なくとも１つの生物学的または生理学的作用を直接的または間接的にもたらしてもよい。好ましくは、このような作用は、がん細胞増殖の低減または阻害、がん細胞および／または組織の殺傷、等を含んでいてもよい。製剤化の前に、「活性成分」は、「バルク」、「薬物質」または「技術的生成物」として呼ばれることができる。
【０２７７】
本発明の特に興味の対象となるのは、以下の組成物［１］〜［２０］である：
［１］  がん細胞の増殖の阻害、およびがんの治療および予防の一方または両方のための組成物であって、ここで、がん細胞およびがんはＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現し、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する単離された二本鎖分子または二本鎖分子をコードするベクターを含み、ここで、この二本鎖分子は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現および細胞増殖を阻害し、ここで、この二本鎖分子は、センス鎖およびそれに対して相補的なアンチセンス鎖から構成され、相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成する、組成物；
［２］  二本鎖分子が、配列番号１９または２０の標的配列と一致するｍＲＮＡに対して作用する、前記［１］に記載の組成物；
［３］  二本鎖分子が、センス鎖が配列番号１９または２０の標的配列に相当する配列を含む、前記［１］に記載の組成物；
［４］  治療すべきがんが、肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌および軟部腫瘍から選択される、前記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の組成物；
［５］  二本鎖分子が、約１００ヌクレオチド長未満である、前記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の組成物；
［６］  二本鎖分子が、約７５ヌクレオチド長未満である、前記［５］に記載の組成物；
［７］  二本鎖分子が、約５０ヌクレオチド長未満である、前記［６］に記載の組成物；
［８］  二本鎖分子が、約２５ヌクレオチド長未満である、前記［７］に記載の組成物；
［９］  二本鎖分子が、約１９〜約２５ヌクレオチド長である、前記［８］に記載の組成物；
［１０］  二本鎖分子が、介在性一本鎖によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む単一ポリヌクレオチドから構成される、前記［１］〜［９］のいずれか１項に記載の組成物；
［１１］  二本鎖分子が、一般式５’−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ’］−３’または５’−［Ａ’］−［Ｂ］−［Ａ］−３’を有し、ここで、［Ａ］は、配列番号１９または２０の標的配列に相当する配列を含むセンス鎖配列であり、［Ｂ］は、３〜２３ヌクレオチドからなる介在性一本鎖であり、かつ［Ａ’］は、標的配列に対して相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、前記［１０］に記載の組成物；
［１２］  二本鎖分子がＲＮＡから構成される、前記［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の組成物；
［１３］  二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成される、前記［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の組成物；
［１４］  二本鎖分子が、ＤＮＡポリヌクレオチドおよびＲＮＡポリヌクレオチドのハイブリッドである、前記［１３］に記載の組成物；
［１５］  センスおよびアンチセンス鎖ポリヌクレオチドが、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡから構成される、前記［１４］に記載の組成物；
［１６］  二本鎖分子がＤＮＡおよびＲＮＡのキメラである、前記［１３］に記載の組成物；
［１７］  アンチセンス鎖の３’−末端に隣接する領域、またはセンス鎖の５’−末端に隣接する領域およびアンチセンス鎖の３’−末端に隣接する領域の両方が、ＲＮＡから構成される、前記［１４］に記載の組成物；
［１８］  隣接領域が９〜１３ヌクレオチドで構成されている、前記［１７］に記載の組成物；
［１９］  二本鎖分子が３’オーバーハングを含む、前記［１］〜［１８］のいずれか１項に記載の組成物；および
［２０］  組成物が、トランスフェクション増強剤および医薬的に許容可能なキャリアを含有する、前記［１］〜［１９］のいずれか１項に記載の組成物。
【０２７８】
本発明の組成物は、以下においてさらに詳細に記載される。本発明の二本鎖分子は、好ましくは、当技術分野において公知の技術にしたがって、対象に投与する前に製剤化される。本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌的および発熱物質無含有であることを特徴とする。
ここで用いる場合、「医薬組成物」は、ヒトおよび獣医学的用途のための製剤を包含する。
【０２７９】
本発明の文脈において、本発明の好適な医薬製剤としては、経口、直腸内、鼻腔内、局所的（頬側、舌下、および経皮を含む）、膣内または非経口（筋内、皮下および静脈内を含む）投与用、または吸入もしくはガス注入による投与用に好適な製剤が挙げられる。他の製剤としては、治療剤を放出する移植可能な装置および貼付用パッチが挙げられる。所望の場合には、上記の製剤は、活性成分の持続的放出を与えるように適合させてもよい。本発明の医薬組成物の調製方法は、当技術分野で公知の技術の範囲内であり、たとえば、「Remington’s Pharmaceutical Science、 17th ed.、 Mack Publishing Company、 Easton、 Pa. （1985）」に記載されており、この開示全体が参照によりここに包含される。
【０２８０】
本発明の医薬組成物は、生理学的に許容可能なキャリア媒体と混合された、本発明の二本鎖分子またはそれをコードするベクター（たとえば、０．１〜９０重量％）、またはこの分子の生理学的に許容可能な塩、を含有する。好ましい生理学的に許容可能なキャリア媒体は、水、緩衝化された水、正常生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０２８１】
本発明によれば、組成物は、複数の種類の二本鎖分子を含んでいてもよく、各々の分子は、ＳＵＶ３９Ｈ２の同じ標的配列に向けられていてもよく、異なる標的配列に向けられていてもよい。たとえば、組成物は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子または遺伝子生成物に向けられた二本鎖分子を含んでいてもよい。あるいは、たとえば、組成物は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の、１つ、２つまたはそれ以上の標的配列に向けられた二本鎖分子を含んでいてもよい。
【０２８２】
さらに、本発明の組成物は、１つまたは複数の二本鎖分子をコードするベクターを含んでいてもよい。たとえば、ベクターは、１つ、２つまたはいくつかの種類の本発明の二本鎖分子をコードしていてもよい。あるいは、本発明の組成物は、それぞれのベクターが異なる二本鎖分子をコードする複数の種類のベクターを含んでいてもよい。
そのうえ、本発明の二本鎖分子は、本発明の組成物においてリポソームとして含有されていてもよい。リポソームの詳細については、「二本鎖分子を用いてがんを治療する方法」の項を参照されたい。
【０２８３】
本発明の医薬組成物は従来の医薬品添加物および／または添加剤をも含むことができる。好適な医薬品添加物の例としては、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、およびｐＨ調整剤が挙げられる。好適な添加剤としては、生理学的に生体適合性の緩衝剤（たとえば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤の付加（たとえば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドのようなもの）またはカルシウムキレート複合体（たとえば、ＤＴＰＡカルシウム、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド）、または、場合によっては、カルシウムもしくはナトリウム塩の付加（たとえば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）が挙げられる。本発明の医薬組成物は、液体形態での使用のために包装されることもでき、あるいは凍結乾燥されることもできる。
固体組成物のためには、従来の無毒性固体キャリア、たとえば、医薬等級の、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム、等を用いることができる。
【０２８４】
たとえば、経口投与のための固体医薬組成物は、上記で列挙したキャリアおよび賦形剤の任意のものと、１０〜９５％、好ましくは２５〜７５％の１またはそれ以上の本発明の二本鎖分子を含むことができる。エアロゾル（吸入性）投与のための医薬組成物は、０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜１０重量％の上記のようなリポソームに被包された１つまたはそれ以上の本発明の二本鎖分子、および噴霧剤を含むことができる。キャリアもまた、所望により含有させることができ、たとえば、鼻腔内送達のためのレシチンである。
【０２８５】
上記に加えて、本発明の組成物は、本発明の二本鎖分子のインビボでの機能を阻害しない限り、他の医薬活性成分を含んでいてもよい。たとえば、この組成物は、がんの治療のために従来使用された化学治療剤を含んでいてもよい。医薬組成物は、抗微生物剤、免疫抑制剤または保存剤のような他の活性成分をも含んでいてもよい。さらに、上記で具体的に言及した成分に加えて、本発明の製剤は、問題の製剤のタイプに関して、当技術分野において慣習的な他の薬剤を含んでいてもよいことは、理解されるべきである。たとえば、経口投与のために好適なものは、香料剤を含んでいてもよい。
【０２８６】
別の態様において、本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を特徴とするがんの治療のための医薬組成物の製造における本発明の二本鎖核酸分子または二本鎖核酸分子をコードするベクターの用途をも提供する。たとえば、本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現するがんを治療するための医薬組成物の製造のための、細胞においてＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子の用途であって、この分子は、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、相互にハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成し、配列番号１９または２０の配列をターゲティングする分子、または、二本鎖核酸分子をコードするベクターの用途に関する。
本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を発現するがんの治療における使用のための、本発明の二本鎖核酸分子または二本鎖核酸分子をコードするベクターをさらに提供する。
【０２８７】
本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を特徴とするがんの治療および予防の一方または両方のための、医薬組成物の製造方法またはプロセスであって、この方法またはプロセスは、活性成分として細胞中のＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子または二本鎖核酸分子をコードするベクターと医薬的または生理学的に許容可能キャリアとを製剤化する工程を含み、この細胞は、この遺伝子を過剰発現し、この分子は、センス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、相互にハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成し、かつ、配列番号１９または２０の配列を標的とする方法、をさらに提供する。
【０２８８】
別の態様においては、本発明は、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を特徴とするがんの治療および予防の一方または両方のための医薬組成物の製造のための方法またはプロセスをも提供し、ここでこの方法またはプロセスは、活性成分を医薬的または生理学的に許容可能なキャリアと混合する工程を含み、ここでこの活性成分は、細胞中でのＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子の発現を阻害する二本鎖核酸分子または二本鎖核酸分子をコードするベクターであり、これはこの遺伝子を過剰発現し、この分子はセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、相互にハイブリダイズして二本鎖核酸分子を形成し、配列番号１９または２０の配列またはベクターを標的化する。
ここで以下において、本発明は、実施例を参照しながらより詳細に記載される。しかしながら、以下の材料、方法および実施例は、本発明の側面を説明するためだけのものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を制限することを意図していない。したがって、ここで記載されたものと同様または等価の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができる。
実施例
【０２８９】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１：  一般的な方法
組織試料およびＲＮＡ調製
膀胱組織試料およびＲＮＡ調製は、以前記載されたものである[ Wallard MJ、 et al、
Br J Cancer 2006； 94： 569−577]。簡単に述べると、膀胱腫瘍の膀胱切除術または経尿道的切除術（ＴＵＲＢＴ）を通じて、１２５の一次尿路上皮癌の外科的検体を集め、液体窒素中で急速凍結した（snap frozen）。正常な膀胱尿路上皮組織の２８検体を、悪性腫瘍の証拠のない患者における巨視的に正常な膀胱尿路上皮の領域から集めた。ビメンチンは、主として間葉系に由来する細胞において発現され、間質マーカーとして使用された。ウロプラキンは尿路上皮分化マーカーであり、上皮由来腫瘍の９０％までにおいて保存されている[Olsburgh J et al、 J Pathol 2003； 199： 41−49]。この研究のための組織の使用は、Cambridge shire Local Research Ethics Committeeにおいて承認された（Ref 03/018）。
【０２９０】
細胞培養
この研究において使用されたがん細胞株は以下のとおりであった：肺腺癌（ＡＤＣ）  ＮＣＩ−Ｈ１７８１、ＮＣＩ−Ｈ１３７３、ＬＣ３１９、Ａ５４９およびＰＣ−１４；肺扁平上皮癌（ＳＣＣ）  ＳＫ−ＭＥＳ−１、ＮＣＩ−Ｈ２１７０、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ１７０３およびＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩ；肺大細胞癌（ＬＣＣ）  ＬＸ１；小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）  ＳＢＣ−３、ＳＢＣ−５、ＤＭＳ２７３およびＤＭＳ１１４；膀胱癌  ＳＷ７８０、ＲＴ４およびＳＣａＢＥＲ。ヒト小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）、正常ヒト線維芽細胞（ＩＭＲ−９０、ＷＩ−３８およびＣＣＤ−１８Ｃｏ）は、正常対照細胞として使用された。すべての細胞株は、１０％ウシ胎児血清および１％抗生物質／抗真菌剤溶液（Sigma）を添加した適切な培地中で単層で増殖させた。すべての細胞は、５％ＣＯ２を含む（ＳＷ７８０以外のすべての細胞株）またはＣＯ２を含まない（ＳＷ７８０）湿潤空気中、３７℃で維持した。細胞は、製造者のプロトコールにしたがってＦｕＧＥＮＥ６（ROCHE、Basel、Switzerland）でトランスフェクトした。
【０２９１】
ｃＤＮＡマイクロアレイを用いるがんにおける発現プロファイリング
ゲノム全体にわたるｃＤＮＡマイクロアレイは、the National Center for Biotechnology Information （ＮＣＢＩ）のUniGeneデータベースから選択された３６，８６４個のｃＤＮＡを用いて確立された。このマイクロアレイシステムは、基本的に以前記載されたとおりに構築された[Kitahara O et al、 Cancer Res 2001； 61： 3544−3549]。簡単に述べると、ｃＤＮＡsを、鋳型として種々のヒト器官から単離されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲによって増幅した；アンプリコンの長さは２００〜１１００ｂｐの範囲であり、反復配列またはポリ（Ａ）配列を含まなかった。多くのタイプの腫瘍および相当する非腫瘍組織は、以前記載されたとおりに８マイクロメーター切片に調製された[Kitahara O et al、 Cancer Res 2001； 61： 3544−3549]。総数３０，０００〜４０，０００の個のがんまたは非がん性細胞は、製造者のプロトコールにしたがってＥＺカット（the EZ cut）システム（SL MicroTest GmbH、 Germany）を用いて選択的に回収された。総ＲＮＡの抽出、Ｔ７−ベース増幅、およびプローブの標識は、以前記載されたとおりに実施した[Kitahara O et al、 Cancer Res 2001； 61： 3544−3549]。各がん性および非がん性組織由来の２回増幅ＲＮＡ（ａＲＮＡ）の２．５マイクログラムの定量の測定（A measure）を、次にそれぞれＣｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰを用いて標識した。
【０２９２】
定量的リアルタイムＰＣＲ
以前記載されたように、１２５個の膀胱癌および２８個の正常膀胱組織は、Cambridge Addenbrooke’s Hospitalにおいて調製された。定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応のため、ＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）、ＳＤＨ（ハウスキーピング遺伝子）およびＳＵＶ３９Ｈ２のすべてのための特異的プライマーを設計した（表１のプライマー配列）[ Yoshimatsu M et al、 Int J Cancer 2011； 128： 562−573]。ＰＣＲ反応は、製造者のプロトコールにしたがってライトサイクラー（the LightCycler）（登録商標）４８０システム（Roche Applied Science、 Mannheim、 Germany）を用いて実施した。ＵＮＧを含まない５０％サイバーグリーン（SYBR GREEN）ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Applied Biosystem、Warrington、UK）、各５０ nMのフォワードおよびリバースプライマー、および２マイクロリットルの逆転写されたｃＤＮＡを適用した。増幅条件は、９５℃で５分、次にそれぞれ９５℃で１０秒、５５℃で１分および７２℃で１０秒からなるサイクル４５回であった。次いで、反応物を、９５℃で１５秒、６５℃で１分加熱して融解曲線を作製し、５０℃で１０秒冷却した。標的遺伝子増幅のための反応条件は、上記のとおりであり、５ngの逆転写されたＲＮＡの等価物を各反応に使用した。ｍＲＮＡレベルはＧＡＰＤＨおよびＳＤＨ発現に対して標準化された。
【０２９３】
【表１】
2014523736.tif 000002
【０２９４】
免疫組織化学
免疫組織化学解析は、以前記載されたとおりにシグマジェノシス（SIGMA GENOSYS）によって製造された特異的ポリクローナルウサギＳＵＶ３９Ｈ２抗体を使用して実施した[Takawa M、 et al. Cancer Sci 2011；102：1298−305、 Toyokawa G、 et al. Neoplasia 2011；13：887−98、 Toyokawa G、 et al. Mol Cancer 2011；10：65]。すべての組織試料について、エンビジョンプラス（EnVision+）キット／西洋ワサビペルオキシダーゼ（Dako、 Glostrup、Denmark）を適用した。簡単に述べると、パラフィン包埋された腫瘍検体のスライドを、抗原回収溶液中、高圧下（１２５℃、３０秒）、高ｐＨ９で処理し（S2367、 Dako Cytomation、 Carpinteria、 CA、USA）、ペルオキシダーゼブロッキング試薬で処理し、次いでタンパク質ブロッキング試薬で処理した（K130、 X0909、 Dako Cytomation）。組織切片は、ウサギ抗ＳＵＶ３９Ｈ２ポリクローナル抗体とともに、続いてＨＲＰ標識二次抗体（Dako Cytomation）とともにインキュベートした。抗原は、基質色素原を用いて可視化した（Dako liquid DAB chromogen； Dako Cytomation）。最後に、組織検体を、細胞質から核を識別するためにメイヤーの（Mayer’s）ヘマトキシリン（Muto pure chemicals Ltd、 Tokyo、Japan、 Hematoxylin QS、 Vector Laboratories）で２０秒染色した。各腫瘍組織コア内の染色強度はほとんど均一であったため、ＳＵＶ３９Ｈ２染色の強度は、以下の判断基準にしたがって半定量的に評価された：陰性（腫瘍細胞において認識可能な染色なし）および陽性（腫瘍細胞の核の３０％超において認識可能な褐色の染色）。
【０２９５】
免疫細胞化学
ＨｅＬａ細胞は、ｐＣＡＧＧＳ−ｎ３ＦＣ−ＳＵＶ３９Ｈ２を用いてトランスフェクトした（３ｘＦＬＡＧ−ＳＵＶ３９Ｈ２）。トランスフェクションの４８時間後、培養細胞を０．１Mリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中４％パラホルムアルデヒドによって室温で３０分固定し、ＰＢＳ中０．５％トリトン（Triton）Ｘ−１００（Sigma）を用いて透過処理した。固定された細胞は、ＰＢＳ中５％ＢＳＡを用いて１時間ブロッキングし、モノクローナルマウスＦＬＡＧ抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。次に、これらを、アレキサフルオール（Alexa Fluor）５９４接合化二次抗体（Molecular Probes）およびアレキサフルオール（Alexa Fluor）４８８ ファロイジン（Phalloidin） （Molecular Probes）とともにインキュベートした。核を、４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。染色された細胞を、ライカ（Leica）共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【０２９６】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖は、ヒトＳＵＶ３９Ｈ２転写物をターゲティングするためにSIGMA Genosysから購入した。ｓｉＥＧＦＰ、 ｓｉＦＦＬｕｃ およびｓｉＮｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｓｉＮＣ）（これは３つの異なるオリゴヌクレオチド二重鎖の混合物である）を、対照ｓｉＲＮＡとして使用した。これらのｓｉＲＮＡ配列を、表２に記載する。ｓｉＲＮＡ二重鎖（１００nM 最終濃度）は、リポフェクタミン（Lipofectamine）２０００（Invitrogen）を用いて７２時間、肺および膀胱癌細胞株中にトランスフェクトされ、細胞生存率は、以前記載されたとおりにセルカウンティングキット−８（Cell Counting Kit-8）（Dojindo、 Kumamoto、 Japan）およびコロニー形成アッセイを用いて試験した[Sato N et al、 Cancer Res 2010； 70： 5326−5336]。
【０２９７】
【表２】
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【０２９８】
フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳ）
ＳＷ７８０およびＡ５４９細胞を、ｓｉＳＵＶ３９Ｈ２（ｓｉＳＵＶ３９Ｈ２＃１およびｓｉＳＵＶ３９Ｈ２＃２）または対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＮＣ）で処理し、ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７２時間培養した。１×１０５細胞の定量をトリプシン処理によって回収し、製造者の指示書にしたがってヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した（Cayman Chemical、 Ann Arbor、 MI）。細胞は、「MultiCycle for Windows」ソフトウェア（BECKMAN COULTER）を備えたＦＡＣＳｃａｎ（BECKMAN COULTER、 Brea、 CA）によって詳細な細胞周期ステータスについて解析した。細胞周期のＧ０／Ｇ１、ＳおよびＧ２／Ｍ期にある細胞の割合は、少なくとも２０，０００個のゲートされていない細胞から決定した。
【０２９９】
共役された細胞周期および細胞増殖アッセイ
５’−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）フローキット（BD Pharmingen、San Diego、CA）を用いて、細胞周期動態を決定し、増殖している細胞のＤＮＡ中へのＢｒｄＵの取り込みを測定した。アッセイは、製造者のプロトコールにしたがって実施した。簡単に述べると、ＭＥＦｓ（１ウェル当たり１×１０５）を６ウェル組織培養プレートに７２時間播種し、続いて1０マイクロモルのＢｒｄＵを添加し、インキュベーションをさらに３０分継続した。浮遊および付着細胞の両方を、１処理点当たり３個組のウェルからプールし、パラホルムアルデヒドおよび界面活性剤サポニンを含有する溶液中で固定し、３７℃で１時間、ＤＮＡｓｅとともにインキュベートした（３０マイクログラム／試料）。ＦＩＴＣ標識抗ＢｒｄＵ抗体（１：５０希釈、洗浄緩衝液中；BD Pharmingen、San Diego、CA）を添加し、室温で２０分、インキュベーションを継続した。細胞を、洗浄緩衝液で洗浄し、総ＤＮＡを７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ；２０マイクロリットル／試料）で染色し、続いてＦＡＣＳｃａｎ（BECKMAN COULTER）を用いてフローサイトメトリー解析を行い、総ＤＮＡ含量（７−ＡＡＤ）を、ＣＸＰ解析ソフトウェアVer. 2.2 （BECKMAN COULTER）で決定した。
【０３００】
下流遺伝子の解明のためのマイクロアレイハイブリダイゼーションおよび統計的解析
下流遺伝子を同定するためのマイクロアレイ解析および遺伝子オントロジー経路解析は、以前記載されたとおりに実施した[Yoshimatsu M et al、 Int J Cancer 2011； 128： 562−573]。精製された総ＲＮＡを、製造者の指示書にしたがって、標識し、アフィメトリックス（Affymetrix）「Gene Chip U133 Plus 2.0」オリゴヌクレオチドアレイ上でハイブリダイズさせた（Affymetrix、Santa Clara、CA）。プローブシグナル強度は、（RおよびBioconductorを用いて）ＲＮＡおよび分位によって標準化した。経路解析は、超幾何分布検定を用いて実施し、これはランダムにサンプリングされた別の遺伝子リストと比較した上方／下方調節される遺伝子セットおよび各Ｇ０カテゴリー間のオーバーラップの確率を計算する。同定された上方／下方調節される遺伝子に対する試験は、遺伝子オントロジーデータベースによって定義された「生物学的プロセス」（８５７カテゴリー）の各カテゴリーにおいてそれらが有意に富化されているかどうかを試験するために適用された（ＦＤＲ＜＝０．０５）。
【０３０１】
実施例２：臨床肺および膀胱癌組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の異常発現
臨床試料におけるＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルを解析するために、１６の正常および１４の肺癌組織（９症例のＮＳＣＬＣおよび５症例のＳＣＬＣ）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲを実施し、正常組織に対して肺癌組織においてＳＵＶ３９Ｈ２が有意に上方調節されることを見出した（図１Ａおよび１Ｂ）。正常組織のうちで、精巣のみが、肺癌組織のレベルに匹敵する高いＳＵＶ３９Ｈ２発現レベルを示した。免疫組織化学解析は、ＳＵＶ３９Ｈ２のタンパク質発現レベルを評価するために行なわれ、精巣を除き、いくつかの正常組織において有意な染色が観察されなかった（図１Ｃ）。続く組織マイクロアレイ解析により、ＳＵＶ３９Ｈ２は６４の肺癌症例のうち３４例において陽性に染色され（５３．１％；図２および表３）、正常生体器官においては有意な染色が観察されなかったこと（図２Ｃ）が示された。これらの結果は、ＳＵＶ３９Ｈ２は肺癌組織において高頻度で過剰発現され、一方、生体器官を含む正常組織におけるその発現は極めて低いように見えることを暗示する。ＳＵＶ３９Ｈ２発現と臨床的結果との関連を解析するために、本発明者らは、３２８のアーカイブのＮＳＣＬＣ症例を含むアレイ上で腫瘍組織マイクロアレイを実施した（図１０）。ＳＵＶ３９Ｈ２は、２１７症例において陽性に染色され（６６．１６％）、１１１症例において陰性であった（３３．８４％）。一方、ＳＵＶ３９Ｈ２陽性と患者の特徴との間には有意な統計学的有意性は観察されなかった（表１１）。
【０３０２】
【表３】
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【０３０３】
【表１１】
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【０３０４】
次に、ＳＵＶ３９Ｈ２発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって臨床膀胱組織において解析し（イギリス人）、非腫瘍膀胱組織と比較してがん組織においてＳＵＶ３９Ｈ２の有意な上昇を見出した（Ｐ＜０．０５、マン−ホイットニー（Mann−Whitney）のＵ 検定；図３Ａ）。腫瘍グレード、転移ステータス、性別、再発ステータスおよび喫煙歴にしたがった腫瘍の下位分類によって、有意な差異は同定されなかった（表４）。日本人の膀胱臨床例のｃＤＮＡ発現解析によってもまた、ＳＵＶ３９Ｈ２過剰発現が同定された（図３Ｂ）。次いで、膀胱組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質発現レベルを、免疫組織化学によって試験し、がん組織の核における強いＳＵＶ３９Ｈ２染色が観察されたが、非腫瘍組織においては有意な染色が観察されなかった（図３Ｃ）。組織マイクロアレイ解析により、ＳＵＶ３９Ｈ２の過剰発現が２９の膀胱癌症例のうち１６例において観察されたことが示された（５５．２％；表５）。さらに、多数の臨床試料を用いたマイクロアレイ発現解析により、ＳＵＶ３９Ｈ２発現が肺および膀胱癌に加えて種々のタイプのがんにおいて有意に上方調節されることが示された（表６）。このデータは、ＳＵＶ３９Ｈ２の上昇した発現がヒト発がんにおいて高頻度で観察されることを示唆する。
【０３０５】
【表４】
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【０３０６】
【表５】
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【０３０７】
【表６】
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【０３０８】
実施例３：ＳＵＶ３９Ｈ２はがん細胞増殖にとって重要である
がん細胞増殖におけるＳＵＶ３９Ｈ２の役割を調べた。ｑＲＴ−ＰＣＲを、ＲＮＡレベルで種々の細胞株におけるＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルを測定するために実施し、非がん性細胞と比較して肺および膀胱癌細胞において上昇したＳＵＶ３９Ｈ２発現が確認された（図４Ａおよび図６）。がん細胞におけるＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の過剰発現は、ウェスタンブロッティングによって確認された（図４Ｂ）。がん細胞の増殖に対するＳＵＶ３９Ｈ２ノックダウンの影響を試験するために、ＳＵＶ３９Ｈ２を標的とする２種の独立のｓｉＲＮＡを調製し、それらの各々をがん細胞にトランスフェクトした。次いで、本発明者は、対照ｓｉＲＮＡと比較してＳＵＶ３９Ｈ２  ｓｉＲＮＡ処理後のＳＵＶ３９Ｈ２発現の有意な抑制を確認した（ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＮＣ；図４Ｃ）。これらのｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたがん細胞について行なった細胞増殖アッセイにより、肺癌細胞株Ａ５４９および膀胱癌細胞株ＳＷ７８０における有意な増殖抑制が解明された（図４Ｄ）。これらのｓｉＲＮＡは、検出不能なレベルのＳＵＶ３９Ｈ２を発現する（図４Ａ）正常細胞株ＣＣＤ−１８Ｃｏ細胞にトランスフェクトされた場合、これらは、増殖に対して全く影響しなかった（図４Ｄ）。これは、これらの特異的ｓｉＲＮＡでの処理によるがん細胞増殖の抑制が、正常細胞によって使用されるメカニズムを備えず、したがって、がん細胞に特異的な増殖メカニズムに直接作用することを暗示する。ＳＵＶ３９Ｈ２を標的とするｓｉＲＮＡによるがん細胞の増殖抑制は、コロニー形成アッセイによって確認された（図４Ｅおよび図７Ａ）。ＳＵＶ３９Ｈ２が発がん活性を有するかどうかを試験するために、本発明者は、クローン形成能アッセイを実施した。野生型ＳＵＶ３９Ｈ２（ＳＵＶ３９Ｈ２  Ｗｔ）ベクターおよび酵素不活化（ｄｅａｄ）ＳＵＶ３９Ｈ２（ＳＵＶ３９Ｈ２  ｄｅｌｔａ−ＳＥＴ）ベクターを、対照としてのモックベクターとともにＣＯＳ−７細胞中にトランスフェクトした。クローン形成能アッセイは、各培養について実施した（図４Ｆ）。野生型ＳＵＶ３９Ｈ２ベクターでトランスフェクトされた細胞は、酵素不活化ＳＵＶ３９Ｈ２ベクターまたはモック対照ベクターでトランスフェクトされた細胞よりも多くのコロニーを形成し、したがって、細胞において発がんを促進するのはＳＵＶ３９Ｈ２のメチル化活性である。ＳＵＶ３９Ｈ２は、がんの進行の初期に過剰発現されるので、ＳＵＶ３９Ｈ２は、ヒト発がんにおける重大な役割を果たす可能性がある。ｓｉＲＮＡによって誘導される増殖抑制のメカニズムをさらに評価するために、ＦＡＣＳ解析を実施して、がん細胞の詳細な細胞周期ステータスを調べた。Ｇ１期のがん細胞の比率は、対照ｓｉＲＮＡで処理された細胞と比較してｓｉＳＵＶ３９Ｈ２で処理された細胞において有意に高かった一方、Ｓ期の細胞の比率は顕著に低減した（図５）。これらのデータは、ＳＵＶ３９Ｈ２ががん細胞の増殖調節、特にＧ１／Ｓ移行において重大な役割を果たすことを示す。
【０３０９】
実施例４：  マイクロアレイ発現解析によるＳＵＶ３９Ｈ２の下流遺伝子の同定
ＳＵＶ３９Ｈ２がヒト発がんにどのようにして寄与し得るかを同定するために、本発明者は、ＳＵＶ３９Ｈ２と関連する経路および下流遺伝子を探索した。ＳＷ７８０およびＡ５４９細胞におけるＳＵＶ３９Ｈ２  ｓｉＲＮＡ処理の２４時間後、マイクロアレイハイブリダイゼーション解析を、以前記載されたとおりに実施した[Yoshimatsu M、et al、
Int J Cancer 2011； 128： 562−573]。発現プロファイルは、アフィメトリックスの「HG−U133 Plus 2.0」アレイによって解析し、対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＦＦＬｕｃ）で処理された細胞からのプロファイルと比較した。データは、ＳＵＶ３９Ｈ２のノックダウン後に１４６遺伝子が下方調節され、一方、６４遺伝子が上方調節されることを示した：これらの２１０遺伝子は、ＳＵＶ３９Ｈ２阻害によって調節される下流遺伝子であると考えられた（図８、表７および表８）。遺伝子オントロジーデータベースによる下流候補のシグナル経路解析により、ＳＵＶ３９Ｈ２が、細胞周期調節およびクロマチン修飾のための経路を調節することが示唆された（表９）。重要なことに、質量分析解析により、細胞周期調節およびクロマチン機能に関与するタンパク質が、ＳＵＶ３９Ｈ２の相互作用パートナーとして同定された（表１０）。したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２の脱調節は、部分的にはヒストンおよびクロマチン機能の調節を通じて、ヒト発がんに寄与する可能性が高い。
【０３１０】
【表７】
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【０３１１】
【表８】
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【０３１２】
【表９】
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【０３１３】
【表１０】
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【０３１４】
実施例５：ＳＵＶ３９Ｈ２のメチルトランスフェラーゼ活性の阻害剤のスクリーニング
ＧＳＴ融合ＳＵＶ３９Ｈ２（配列番号３３；ＧＳＴ：アミノ酸位置１〜９８、ＳＵＶ３９Ｈ２断片：アミノ酸位置９９〜４１０）は、０．３５mMビオチン化ヒストンＨ３ペプチド（配列番号３１）、０．１mM  Ｓ−アデノシル−Ｌ−［メチル−３Ｈ］メチオニンおよび試験物質とともに、メチルトランスフェラーゼ緩衝液（２０mM  トリス塩酸塩、５０mM  ＮａＣｌ、１０mM  ＭｇＣｌ２、０．０３％  Ｔｗｅｅｎ−８０および１０mM  ＤＴＴ）中で、室温で１時間、２０マイクロリットルの容量でインキュベートした。室温で１時間インキュベーション後、６０マイクログラムのストレプトアビジン被覆ＰＶＴビーズを含有する２０マイクロリットルのシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）ビーズ緩衝液を添加することにより反応を停止させ、次いでビーズから発光された光をシンチレーションカウンターを使用して測定した。
【０３１５】
上述のアッセイによる多数の化学合成化合物の評価の結果として、ＳＵＶ３９Ｈ２のメチルトランスフェラーゼ活性を阻害するいくつかの化合物が同定された。
【０３１６】
考察
ＤＮＡメチル化、共有結合的ヒストン修飾、ヌクレオソームポジショニングおよびｍｉＲＮＡを含むエピジェネティックな修飾は、正常な哺乳動物発生および遺伝子発現の調節において重要な役割を果たす[Sharma S et al、 Carcinogenesis 2010； 31： 27−36]。正常な生理学的機能におけるエピジェネティックスの意義に加え、その脱調節は、がん[Sharma S et al、 Carcinogenesis 2010； 31： 27−36]、循環器系疾患[Turunen MP et al、 Biochim Biophys Acta 2009； 1790： 886−891]、代謝系疾患[Symonds ME et al. Nat Rev Endocrinol 2009；5：604−610]、および自己免疫性疾患[Javierre  BM et al. Genome Res 2010；20：170−179]のような種々のタイプの疾患に深く関与する。エピジェネティックな変更の中で、異常ヒストン修飾は、がんの発生および進行に関与する[Chi P et al. Nat Rev Cancer 2010；10：457−469、 Portela A et al. Nat Biotechnol  2010；28：1057−1068]。アセチル化／脱アセチル化動態のヒト発がんとの関連は、ヒストン修飾の中で最も広く研究されてきたが[Cortez CC et al、Mutat Res 2008；647：44−51]、増加する大量の証拠は、ヒストンメチルトランスフェラーゼが発がんにも重要であることを示す[Schneider R et al. Trends Biochem Sci 2002；27：396−402]。
【０３１７】
Ｄｏｔ１／ＤＯＴ１Ｌを例外として、すべての同定されたヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（ＨＫＭＴs）は、ＳＥＴ[Su（var）3−9、 Enhancer−of−zeste、 Trithorax]ドメイン[Jenuwein T et al. Cell Mol Life Sci 1998；54： 80−93]と名付けられた保存されたメチルトランスフェラーゼドメインを担持する。ＨＫＭＴｓの中で、Ｓｕ（ｖａｒ）遺伝子は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）および分裂酵母（Shizosaccharomyces  pombe）におけるセントロメアの位置効果に対する遺伝的スクリーニングによって当初同定され[Reuter Get al. Bioessays 1992；14：605−612、 Allshire RC et al. Genes Dev 1995；9：218−233]、特徴付けされたファミリーメンバーは、クロマチンを修飾することができる酵素を実際に表す[Wallrath LL Curr Opin Genet Dev 1998；8：147−153]。その後、ヒトＳＵＶ３９Ｈ２のマウスホモログであるＳｕｖ３９ｈ２が単離され、Ｈ３Ｋ９を標的としヘテロクロマチン形成に貢献する第二のメチルトランスフェラーゼとして特徴付けされた[O’Carroll D et al. Mol Cell Biol.2000；20：9423−9433]。重要なことに、その後の研究により、Ｓｕｖ３９枯渇マウスが損なわれた生存率、染色体不安定性および精子形成不全を表現型として示すことが示唆された[Peters AH et al. Cell 2001；107： 323−337]。
【０３１８】
さらに、別の研究により、Ｓｕｖ３９発現の阻害が、テロメアでのＨ３Ｋ９の低減したジおよびトリメチル化、付随して生じるより多くのＨ３Ｋ９のモノメチル化および低減したクロモボックスタンパク質結合をもたらすことが示された[Garcia−Cao M、et al. Nat Genet 2004； 36： 94−99]。これらのデータは、多様な哺乳類の生物学的機能に対するＳｕｖ３９ｈ２によるエピジェネティックな調節を暗示するが、ヒト発がんにおけるその役割は解明されるべきものとして残る。
【０３１９】
ここで明らかにされたように、本発明者は、多数の臨床組織のマイクロアレイベースの発現プロファイルとともにｑＰＣＲによって、正常組織と比較して、肺および膀胱癌組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の有意な上方調節を見出した；ＳＵＶ３９Ｈ２は、種々のタイプのがんにおいて異常に過剰発現される。続いて、ＳＵＶ３９Ｈ２は、がん細胞の増殖調節において重要な役割をすることが解明され、ＳＵＶ３９Ｈ２発現の阻害が肺および膀胱癌細胞株の増殖抑制をもたらし、細胞数がＳ期で減少し、Ｇ１期で増加することが確認された（図４および５）。ＳＵＶ３９Ｈ２  ｓｉＲＮＡで処理された細胞の経路解析は、ＳＵＶ３９Ｈ２がクロマチン修飾を含む複数の生物学的経路を調節する可能性があることを示した。この結果は、ＳＵＶ３９Ｈ２がヒストン修飾およびクロマチン動態と関連する多数のタンパク質の発現を調節し、かつ実際にそれらと直接相互作用するという、本発明者の知見と一致する（表６）。
【０３２０】
細胞増殖およびＧ１からＳへの進行におけるＳＵＶ３９Ｈ２の重要性は、Ｓｕｖ３９ｈＤＮ（ＳＵＶ３９Ｈ１／ＳＵＶ３９Ｈ２  ダブルヌル）マウス胚線維芽細胞においても確認された（ＭＥＦｓ、図７Ｂおよび７Ｃ）。ここでもまた、マイクロアレイおよび遺伝子オントロジー解析によって、ＳＵＶ３９Ｈ２が、細胞周期を含む複数の生物学的プロセスと関連し得ることが示された（データは示していない）。最近、ＬＳＤ１はＭＹＰＴ１を脱メチル化でき、このプロセスはヒト発がんにおいて関与し得ることが報告された[Cho HS、et al. Cancer Res. 2010]。本発明者の研究に加え、一連の報告が、多様な非ヒストンタンパク質がメチル化／脱メチル化サイクルの対象となることおよびこのプロセスが転写活性、タンパク質レベルでの安定性、および相互作用パートナーへの結合アフィニティのようなプロセスに影響することを示してきた[Huang J、et al. Nature 2006； 444： 629−632、 Huang J et al. Nature 2007； 449： 105−108、 Esteve PO et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2009； 106： 5076−5081、 Guo Z et al. Nat Chem Biol 2010； 6： 766−773]。ＳＵＶ３９Ｈ２が多数の非ヒストンタンパク質と相互作用する可能性があることを前提とし（表１０）、ＳＵＶ３９Ｈ２の新規な基質を同定するためにさらなる研究がされるべきである。
【０３２１】
これらの発現解析により、種々のタイプのがん組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルが、正常組織と比較して有意に上昇すること（図１、２および３）およびｓｉＳＵＶ３９Ｈ２ががん細胞増殖の有意な抑制をもたらすことが示された（図４Ｃ〜４Ｅ）。種々のタイプの正常組織におけるＳＵＶ３９Ｈ２の発現レベルは有意に低い（図１Ｃおよび図９：ＢｉｏＧＰＳからのデータ）ので、この遺伝子は、がん療法のための理想的な標的であると思われる。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴｓ）およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣｓ）を標的とする阻害剤が血液学的悪性腫瘍について承認されているという事実は、がん療法のためのエピジェネティック機構を標的とする特異的阻害剤の開発に対し、ますます多くの注目を引きつける[Cortez CC et al. Mutat Res 2008； 647： 44−51、 Ma WW et al.CA Cancer J Clin 2009； 59：111−137]。重要なことに、ヒトＨ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼの構造解析が実施され、Ｈ３Ｋ９メチルトランスフェラーゼの選択的阻害剤の開発の指針となる重要な洞察が提供された[Wu H、et al. PLoS One 2010； 5： e8570]。これらの知見を考慮に入れて、がん療法のためのＳＵＶ３９Ｈ２の阻害剤を開発することは実現可能であると思われる。メチルトランスフェラーゼを標的とする阻害剤の開発は、最近始まったばかりであるので[Copeland RA et al. Nat Rev Drug Discov 2009； 8： 724−732]、この酵素の機能に対するさらなる検証は、近い将来において、このアプローチの有用性を確実にする可能性がある。
産業上の利用可能性
【０３２２】
ここで記載されたがんの遺伝子発現解析は、レーザーキャプチャーダイセクション（laser−capture dissection）およびゲノム全体にわたるｃＤＮＡマイクロアレイの組み合せを用いており、がん予防および療法のための標的として特異的遺伝子を同定した。異なって発現するこの遺伝子、すなわちＳＵＶ３９Ｈ２の発現に基づいて、本発明は、がんの同定および検出のための新規な分子診断マーカーを提供する。したがって、本発明はまた、ＳＵＶ３９Ｈ２を用いる新規な診断戦略をも提供する。
【０３２３】
さらに、ここで記載されたように、ＳＵＶ３９Ｈ２は、がん細胞の生存に関与する。したがって、本発明はまた、がんの治療および予防のための新規な分子標的をも提供する。それらは、副作用のない、新規な治療薬および予防剤の開発に有用であることができる。
本発明者は、細胞増殖が、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子を特異的標的とする二本鎖分子によって抑制されることを示した。したがって、ＳＵＶ３９Ｈ２遺伝子に対する二本鎖分子は抗がん医薬品の開発に有用である。
【０３２４】
そのうえ、ＳＵＶ３９Ｈ２タンパク質の発現をブロックしまたはその活性を阻害する物質は、抗がん剤、特に肺癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道癌、骨肉腫、前立腺癌または軟部腫瘍の治療のための抗がん剤としての治療的有用性を見出されることができる。
ここで記載された方法は、がんの予防、診断および治療のための付加的な分子標的の同定のためにも有用である。ここで提供されたデータは、がんの包括的な理解を増し、新規な診断戦略の開発を容易にし、かつ、治療薬および予防剤のための分子標的の同定のための手がかりを提供する。このような情報は、腫瘍形成のより深い理解に寄与し、がんの診断、治療、および最終的には予防のための新規な戦略を開発するための指標を提供する。
【０３２５】
本発明は、その具体的な態様を参照して詳細に記載されているが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の変更および改変を行うことができることは、当業者には、明らかであろう。ここで言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み入れられる。矛盾のある場合には、本明細書（定義を含む）が優先するであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、説明のためだけのものであり、制限を意図するものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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