(57)【要約】  本発明は、カフェイン及び／またはその類似体、及び／またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する脳腫瘍の予防用及び／または治療用の組成物に関するものである。本発明による脳腫瘍の治療用の組成物は脳腫瘍の浸潤、転移、及び増殖を阻害するため、脳腫瘍の予防及び／または治療に非常に効果的である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カフェイン、７−イソプロピルテオフィリン、７−（β−ヒドロキシエチル）テオフィリン、キサンチン、テオフィリン、及び１，７−ジメチル−３−イソブチルキサンチンからなる群より選択される１種以上またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、脳腫瘍の予防用または治療用の組成物。
【請求項２】
前記脳腫瘍は、神経膠腫、髄膜腫、脳下垂体腺腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、及び先天性脳腫瘍からなる群より選択される１種以上である、請求項１に記載の脳腫瘍の予防用または治療用の組成物。
【請求項３】
前記神経膠腫は、膠茅細胞腫である、請求項２に記載の脳腫瘍の予防用または治療用の組成物。
【請求項４】
病変細胞のイノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体（ＩＰ３Ｒ）のサブタイプ３（ＩＰ３Ｒ３）の作用を選択的に遮断することによって、脳腫瘍の予防活性または治療活性を有する、請求項１乃至３のうちのいずれか１つに記載の脳腫瘍の予防用または治療用の組成物。
【請求項５】
請求項１乃至３のうちのいずれか１つに記載の組成物を含む、脳腫瘍の予防用または改善用の機能性食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００８年１月３１日付けで出願された韓国特許出願第１０−２００８−００１０１５５号の優先権利益を主張し、前記韓国特許出願の明細書は、本明細書に参照として含まれる。
【０００２】
本発明は、カフェイン及び／またはその類似体、及び／またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、脳腫瘍の予防用及び／または治療用の組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
「脳腫瘍（または癌）」は、脳組織及び脳を包んでいる脳膜で発生する原発性脳癌と、頭蓋骨や身体の他の部位で発生した癌から転移した二次性脳癌とを通称するものである。このような脳癌は他の臓器で発生する癌と区分される点が多い。まず、肺、胃、乳房などに生じる癌は臓器別に一種類か二種類に限定され、その性質が同一、類似している方である。しかし、脳には非常に多様な種類の癌が発生する。例えば、多形成膠茅細胞腫、悪性神経膠腫、リンパ節腫、胚細胞腫瘍、転移性腫瘍など多様である。この中でも神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）、特に多形成膠茅細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、ＧＢＭ）は最も悪性であり攻撃的であるため予後が非常に良くなく、診断後の平均生存期間が約１年を越えない非常に致命的な疾患である。脳細胞と腫瘍細胞の間の境界が明らかでないために、ＧＢＭを外科的に完全に除去するのはほとんど不可能である。したがって、外科的治療以外の化学的治療剤の開発が至急であるのが実情であるが、まだ効果的な治療法が開発されていないため、これに関する研究および開発が要求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明は腫瘍細胞の増殖抑制だけでなく、浸潤及び転移を抑制して、脳腫瘍、特に膠茅細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）などの神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）疾患を効果的に予防及び／または治療することができる技術を提供することをその目的とする。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１ａ〜ｅは、多様なＧＰＣＲ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）及びＲＴＫ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ）アゴニストによるＣａ２＋応答を示したものであって、  図１ａは、代表的な疑似カラー蛍光強度イメージ（ｐｓｅｕｄｏ  ｃｏｌｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｉｍａｇｅｓ）（３８０ｎｍまたは３４０ｎｍ励起、５１０ｎｍ発光）（上段）、下段はＦｕｒａ−２ＡＭ（５μＭ）を添加した膠茅腫細胞でのＥＧＦ刺激前後の比率イメージ（ｒａｔｉｏ  ｉｍａｇｅｓ）を示したものであり、  図１ｂは、４個の膠茅細胞腫細胞株で行われたＣａ２＋イメージレコーディングから得られたトレースであり、  図１ｃは、Ｆｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞上での多様なアゴニストによるＦｕｒａ−２ＡＭの強度比率の変化を示し、  図１ｄは、ヒト膠茅細胞腫細胞の低倍率での写真（Ｌｏｗ  ｐｏｗｅｒ  ｖｉｅｗ）であって、左上端は２００倍率の写真であり、  図１ｅは、多様なＧＰＣＲ及びＲＴＫアゴニストが、ヒト膠茅細胞腫細胞において細胞内Ｃａ２＋増加を誘導することを示す、カルシウムイオン放出の減衰動態（ｄｅｋａｙ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示したものである。
【図２】図２ａ〜２ｆは、Ｃａ２＋シグナル伝達に関連した結果を示したものであって、  図２ａは、Ｆｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞でのカルシウムイオン放出の減衰動態であって、Ｆｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞は２ｍＭ  Ｃａ２＋  ＨＥＰＥＳバッファー、Ｃａ２＋−無添加ＨＥＰＥＳバッファー、及びＳＫＦ９６３６５の存在下でブラジキニンによって刺激されたものをそれぞれ示したものであり、  図２ｂ及び２ｃは、各サンプルの減衰動態の代表的な平均トレース及び半幅値（ｈａｌｆ  ｗｉｄｔｈ）を示したものであり、  図２ｄは、Ｕ７３３４３前処理によってレスキューされた、Ｕ７３１２２の前処理によりあらかじめ遮断された、ブラジキニンまたはＥＧＦ誘導性Ｃａ２＋放出の減衰動態の変化を示したものであり、  図２ｅは、タブシガルギンによる小胞体でのＣａ２＋枯渇後のＧＰＣＲアゴニストの適用の結果を示したものであり、  図２ｆは、リアノジン受容体拮抗剤の存在下における、ブラジキニンによるＵ１７８ＭＧ上でのＩＰ３Ｒ介在性Ｃａ２＋の放出の減衰動態を示したものである。
【図３】図３ａ〜３ｃは、カフェインの膠茅腫細胞の転移及び浸潤に対する阻害活性を示したものであって、  図３ａは、損傷部位及び創傷閉鎖（ｗｏｕｎｄ  ｃｌｏｓｕｒｅ）率を示したものであり、  図３ｂは、カフェイン濃度の変化によってマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）を通じて浸潤する細胞の代表的な写真（上段）、及び浸潤細胞の比率（下段）を示したものであり、  図３ｃは、カフェイン濃度の変化によるコロニーの代表的な写真（上段）、及びコロニー数の比率（下段）を示したものである。
【図４】図４ａ〜ｈは、カフェインのＣａ２＋放出阻害活性を示したものであって、  図４ａ及び４ｂは、各々、ＥＧＦまたはブラジキニンで刺激されたＵ１７８ＭＧでのカフェインによる細胞内Ｃａ２＋の放出の遮断を示したものであり、  図４ｃは、Ｕ１７８ＭＧにおいてカフェイン存在下での多様なアゴニストによって誘導されたＣａ２＋放出に対する％遮断を示したものであり、  図４ｄは、多様な濃度のカフェイン存在下でのＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋応答の阻害レベルを示したものであり、  図４ｅは、ＴＦＬＬＲによって誘発されるＣａ２＋放出の用量応答曲線であり、  図４ｆ及び図４ｇは、ＧＰＣＲアゴニストで刺激されたＨＥＫ２９３及びヒト膠茅細胞腫の、カフェインによる細胞内Ｃａ２＋の放出に対する遮断を各々示したものであり、  図４ｈは、各々の細胞でのカフェイン存在下でのＧＰＣＲ誘導性Ｃａ２＋放出の％遮断を示したものである。
【図５】図５ａ〜５ｄは、ＩＰ３Ｒｓサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅｓ）のｍＲＮＡ発現率を示したものであって、  図５ａは、ヒト神経膠腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ１７８ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｍ０５９Ｋ）、ヒト神経芽細胞腫細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞株でのＩＰ３Ｒｓ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現を示した電気泳動の画像であり、  図５ｂは、各々の細胞でのＩＰ３Ｒサブタイプ３の発現とカフェイン遮断間の相関関係を示したものであり、  図５ｃは、正常なヒトの脳細胞とヒト膠茅細胞腫でのＩＰ３ＲサブタイプｍＲＮＡ発現を確認した電気泳動画像であり、  図５ｄは、ヒト試料中でのＩＰ３Ｒ  ｍＲＮＡの濃度測定ヒストグラム（Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ）の結果を示したものである。
【図６】図６ａ〜６ｇは、カフェインがＩＰ３Ｒ３に特異的に作用することを示したものであって、  図６ａ及び６ｂは、ＩＰ３Ｒ１（ウシ）及びＩＰ３Ｒ３（ウシ）で各々形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのカフェインによるＴＦＬＬＲ誘導Ｃａ２＋放出の遮断を各々示したものであり、  図６ｃは、ＩＰ３Ｒ１（ウシ）、ＩＰ３Ｒ３（ウシ）、及びＩＰ３Ｒ３（マウス）で各々形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔでのカフェインによる％遮断を示したものであり、  図６ｄは、Ｕ１７８ＭＧ細胞でＧＦＰだけ発現した場合と、ＩＰ３Ｒ３−ｓｈＲＮＡ＋ＧＦＰが発現した場合とのカフェイン処理後のカルシウムイメージング結果を示したものであり、  図６ｅは、対照群とｓｈＲＮＡ発現群でのカフェイン添加によるＣａ２＋応答を示したグラフであり、  ６ｆ及び６ｇは、カフェインを処理していないＵ１７８ＭＧ細胞と、カフェインを処理したＵ１７８ＭＧ細胞との細胞遊走をライブイメージングした結果を示す。
【図７】図７ａ〜７ｄは、カフェインの浸潤阻害及び生存率改善の活性を示したものであって、  図７ａは、カフェインの存在下または非存在下で、６日目（６ｄａｙ  ａｇｅｄ）の器官型海馬切片培養物（Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｌｉｃｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）上に乗せたＵ１７８ＭＧ細胞を示した写真であり、  図７ｂは、カフェインによって、腫瘍細胞ＯＨＳＣｓへの浸潤及び遊走が阻害されることを示したグラフであり、  図７ｃは、カフェイン処理による腫瘍の大きさの相対的減少を示したグラフであり、  図７ｄは、脳腫瘍動物モデルにおける、カフェイン摂取によるの生存率の増加を示したグラフである。
【図８】各細胞株での様々なカフェイン濃度に応じた細胞生存率を示したＭＴＴアッセイの結果である。
【図９】図９ａ〜９ｄは、カフェイン作用がストア感受性チャンネル（ｓｔｏｒｅ  ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）またはストア（ｓｔｏｒｅ）枯渇に依存的であることを示したものであって、  図９ａは、Ｃａ２＋無添加ＨＥＰＥＳバッファーでタブシガルギンを２分間添加した後の、カルシウムイオン濃度の変化の挙動を示し、ここで無添加群（上）、カフェイン（中央）またはＳＫＦ９６３６５（下）であり、  図９ｂ及び９ｃは、カフェイン処理なしでＦｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞（対照群）、及びカフェイン処理されたＦｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞での細胞内Ｃａ２＋濃度のシクロピアゾン酸（ｃｙｃｌｏｐｉａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）−誘導性またはタブシガルギン−誘導性増加を各々示したものであり、  ９ｄは、カフェイン存在下でシクロピアゾン酸及びタブシガルギンによる調節率（％）を示したものである。
【図１０】図１０ａ〜図１０ｃは、カフェイン類似体の脳腫瘍細胞内のカルシウムイオンの放出の阻害活性を示したものであって、  図１０ａ及び１０ｂは、ＴＦＬＬＲ誘導Ｃａ２＋放出のカフェイン（ａ）及びテオフィリン（ｂ）に対する遮断の代表的なトレースを各々示したものであり、図１０ｃは、カフェイン類似体による％遮断を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明のより完全な評価、及びこれらの多様な利点は、以下の詳細な説明により十分に理解されるだろう。
【０００７】
本発明者らは、カフェイン及びその誘導体が脳腫瘍、その中でも特に膠茅細胞腫（ＧＢＭ）を含む神経膠腫の増殖を抑制し、浸潤及び遊走を抑制して効果的に脳癌を治療するということを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の一態様は、カフェイン及び／またはその類似体、及び／またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む脳腫瘍の治療用の組成物を提供する。また、他の態様において、本発明は、カフェイン及び／またはその類似体、及び／またはこれらの薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、脳腫瘍の予防用及び／または改善用の機能性食品組成物を提供する。
【０００９】
カフェインは、高等植物で発見されるプリン塩基の一種であって、下記の化学式Ｉ（Ｃ８Ｈ１０Ｏ２Ｎ４）として表される、３個のメチル基を有するキサンチン構造である。
【化１】
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【００１０】
カフェインは、白色の軟らかい結晶性物質であり、興奮性成分としての特性を有し、そしてブラジルのコーヒー豆に１乃至５％、熱帯アフリカのコーラー果実に約３％、パラグアイのマテ茶に１乃至２％、ブラジルのガラナ種子に３乃至５％存在する。
【００１１】
カフェインは、緑茶などを熱い水に滲出させた後、タンニンなどの物質を除去して単離することができる。または、カフェインは、ジメチル尿素及びマロン酸を出発物質として化学的に合成することもできる。植物中でのカフェインは、その他のプリン塩基と同様に、グリシン、ギ酸、二酸化炭素などの物質を材料にして合成される。また、カフェイン中に存在する３個のメチル基はメチオニンに由来する。カフェインの重要性はその薬理作用にある。カフェインは主に、ＣＮＳ（中枢神経）興奮剤、呼吸興奮剤、強心剤、利尿剤としての活性を有する。少量を投与した場合、カフェインは疲労回復の効力があり、偏頭痛や心臓病軽減する。しかし、カフェインの脳腫瘍、特に神経膠腫に対する治療活性については本発明で最初に明らかにされた。
【００１２】
本発明で脳腫瘍に対する治療活性を有するカフェイン類似体としては、７−イソプロピルテオフィリン、７−（β−ヒドロキシエチル）テオフィリン、キサンチン、テオフィリン、１，７−ジメチル−３−イソブチルキサンチンなどが挙げられる。前記カフェイン誘導体の脳腫瘍治療活性は、図面（図１０参照）に示してある。
【００１３】
本発明の組成物によって治療可能な脳腫瘍は、脳組織または他の部位で発生して脳組織に転移した全ての腫瘍を含み、例えば、膠茅細胞腫、星状細胞腫などの神経膠腫、髄膜腫、脳下垂体腺腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、先天性脳腫瘍などからなる群より選択される１種以上の病気であることができ、この中でも神経膠腫、特に、膠茅細胞腫（ＧＢＭ）に対する予防、治療、改善及び／または軽減効果が非常に優れている。また、本発明の組成物の適用可能な患者は哺乳類動物、好ましくはヒトである。
【００１４】
本発明の組成物に有効成分として含まれているカフェイン、その類似体またはこれらの薬学的に許容可能な塩の量に関して、望ましい量は、０．３乃至３０ｍＭ、好ましくは０．５乃至２０ｍＭ、より好ましくは２．５乃至１２ｍＭである。有効成分の含有量を前記範囲内に設定することにより、前記組成物は高濃度による細胞毒性を引き起こすことなく、十分な薬理学的効果を発揮することができる。また、前記組成物の１日投与量は、適用しようとする病気の症状、程度、患者の状態などによって適切に調節される。１日投与量は、好ましくは１乃至５ｍｇ／ｋｇ（体重）に設定することが好ましく、前記の量を１回または数回に分量して服用することができる。
【００１５】
本発明の組成物において、カフェイン、その類似体またはこれらの薬学的に許容可能な塩は組成物内に単独で、または他の薬学的に許容可能な薬剤、担体または賦形剤と共に含むことができる。組成物に含まれているカフェイン、その類似体またはこれらの薬学的に許容可能な塩の含有量の範囲は、組成物の使用目的に応じて、当業者が適切に設定することができる。本発明の組成物に使用可能である担体または賦形剤は剤形に応じて適切な物質を使用することができ、通常の希釈剤、充填剤、増量剤、湿潤剤、崩壊剤、及び／または界面活性剤を使用することができる。代表的な希釈剤または賦形剤としては、水、デキストリン、炭酸カルシウム、ラクトース、プロピレングリコール、流動パラフィン、タルク、異性化糖、メタ重亜硫酸ナトリウム、メチルパラフィン、プロピルパラベン、ステアリン酸マグネシウム、乳糖、生理食塩水、色素及び香料が挙げられる。
【００１６】
本発明の組成物は、所望の使用方法に応じた多様な剤形で、経口または非経口経路で投与される。剤形の例としては、硬膏剤、顆粒剤、ローション剤、散剤、シロップ剤、液剤、エアロゾル剤、軟膏剤、流動エキス剤、油剤、懸濁剤、沈剤、錠剤、注射剤、カプセル剤または丸剤を含むことができるが、これらに限定されない。
【００１７】
また、本発明の一態様は、カフェイン、その類似体またはこれらの薬学的に許容可能な塩を含む脳腫瘍予防及び／または改善用の機能性食品を提供する。本発明の機能性食品に含まれるカフェイン、その類似体またはこれらの薬学的に許容可能な塩の含有量は特別な制限はなく、最終製品の目的及び特性によって適切に調節可能であり、例えば、食品組成物全体に対して０．００００１乃至９９．９重量％、好ましくは０．００１乃至５０重量％の範囲で設定することができる。本発明においてこのような機能性食品は、各種食品、健康補助食品、及び食品添加剤を総称する。上記式品、健康補助食品または食品添加剤は特別な制限がない。例えば、前記食品は、特殊栄養食品（調剤乳類、嬰児、乳児食など）、食肉加工品、魚肉製品、豆腐類、カード、麺類（ラーメン類、そば類など）、パン類、機能性食品、調味食品（醤油、味噌、唐辛子みそ、混合醤など）、ソース類、クッキー類及びスナック類、乳加工品（醗酵乳、チーズなど）、その他の加工食品、キムチ、漬物食品（醤油に漬けた薄切り大根またはキュウリ）、並びに飲料（果物ジュース、野菜ジュース、豆乳類、発酵飲料類など）を含むことができ、かつこれらは通常の製造方法で製造されたものであることができる。
【００１８】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００１９】
最も悪性でかつ浸潤する脳腫瘍である多形性膠茅細胞腫（ＧＢＭ）は、診断後の平均生存期間が約１年以下であり、予後が非常に良くない。また、脳細胞と腫瘍細胞の間の境界が明らかでないため、ＧＢＭを外科的に完全除去するのはほとんど不可能である。このような困難性は、これらの細胞が脳の隣接した部位に転移及び浸潤する潜在的な傾向を有することに基本的に起因する。高度に浸潤するＧＢＭ細胞は、能動的なニューロンの死滅を通じて、正常脳に散在的に浸潤して、空間を確保する。様々なシグナル伝達分子がこれらのＧＢＭ細胞を活性化してこれらの増殖、運動性、及び浸潤性に影響を与える。これらのシグナル伝達分子には、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの多様な成長因子、並びにＡＴＰ、ブラジキニン（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）、リゾフォスファチジン酸酸（ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＬＰＡ）、スフィンゴシン１−リン酸（Ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ  １−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｓ１Ｐ）、トロンビン、及びプラスミンなどのＧ−タンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）アゴニストなどが含まれる。このようなシグナル伝達分子は、次にこれらの対応部（ｃｏｕｎｔｅｒ  ｐａｒｔ）表面の受容体を活性化する。これらの表面受容体は、ＥＧＦＲ、ＰＡＲ１、Ｂ２、Ｐ２Ｙ、ＬＰＡ受容体、Ｓ１Ｐ受容体など多様であり、これらの活性化は下流のエフェクターの活性を誘発し、より重要なことには、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）の増加を誘発する（図１参照）。
【００２０】
図１は、多様なＧ−タンパク質共役受容体（）及び受容体チロシンキナーゼ（）アゴニストによるＣａ２＋応答を示したものである。図１ａは、代表的な疑似カラー蛍光強度イメージ（３８０ｎｍまたは３４０ｎｍ励起、５１０ｎｍ発光）（上段）、及びＦｕｒａ−２ＡＭ（５μＭ）が添加された膠茅細胞腫細胞でのＥＧＦ刺激前後の比率イメージ（下段）を示したものである。右側のカラースケール（ｂａｒ）は、蛍光強度に応じた疑似カラーの程度を示したものであって、黒い色に行くほど蛍光強度が低く、黄色に行くほど蛍光強度が高い。図１ｂは、４種の膠茅細胞腫細胞株で行われたＣａ２＋イメージ記録から得られたトレースである。各々のトレースは、各々の細胞でのＦｕｒａ−２ＡＭの強度比率の変化を示したものである（各細胞株当りｎ＝３６乃至８３）。赤色線は平均応答を示したものである。灰色の棒グラフは、ＥＧＦ適用時間を示したものである。
【００２１】
図１ｃは、Ｆｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞上での多様なアゴニストによるＦｕｒａ−２ＡＭの強度比率の変化を示したものである。図１ｄは、ヒトＧＢＭ細胞の低倍率画像であり、左上端は２００倍率写真であって、細胞水準の膠細胞腫瘍は二つの地点で偽柵状配列（ｐｓｅｕｄｏｐａｌｉｓａｄｉｎｇ）壊死（矢印、Ｈ＆Ｅ、Ｘ２００）を示しており、右上段は４００倍率写真であって、頻繁に有糸分裂する細胞（矢印）を示しており（Ｈ＆Ｅ、Ｘ４００）、左下端は多核多形態性核を示しており（Ｈ＆Ｅ、Ｘ２００）、右下段は大部分の腫瘍細胞がグリア繊維性酸性タンパク質（ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に対して免疫反応性があるということを示している（Ｘ２００）（ＧＦＡＰ免疫染色）。図１ｅは、ＧＰＣＲ及びＲＴＫアゴニストが、ヒト膠茅細胞腫細胞において細胞内Ｃａ２＋増加を誘導することを示している。
【００２２】
癌細胞遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）は主にアクチン重合反応及び細胞内組織化に依存するが、前記重合反応及び細胞内組織化は多様なアクチン結合蛋白質によって影響を受ける。アクチン結合蛋白質の活性の調節はホスホイノシチド（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅｓ）及びカルシウムなどの二次情報伝達物質（ｓｅｃｏｎｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ）によって媒介される。したがって、ＧＢＭ細胞内でのＣａ２＋増加の正確なメカニズムが、前記細胞の増殖、運動性、及び浸潤性を調節するのにかなり重要な１つの要因であるといえる。しかしながら、今まで前記ＧＢＭ細胞でのＣａ２＋シグナル伝達と関連して行なわれた研究は、ごくわずかに行われているのみである。
【００２３】
Ｆｕｒａ２−ＡＭが添加された培養ＧＢＭ細胞株、及び外科的に除去された組織から急性的に分離して得られたＧＢＭ細胞に対してＣａ２＋イメージ化を行うことによって、これら細胞内での［Ｃａ２＋］ｉの増加が部分的には細胞内放出プール（ｐｏｏｌｓ）からのＣａ２＋放出によるものであり、部分的にはストア感受性チャンネル（ｓｔｏｒｅ  ｏｐｅｒａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）を通じたＣａ２＋の流入によるものであることを見出した（図２ａ、２ｂ、及び２ｃ参照）。このような細胞内ストアからのＣａ２＋の放出は、Ｇ−蛋白質結合受容体（ＧＰＣＲｓ）及び受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ、ＲＴＫｓ）の活性化に応答してホスホイノシトール−４，５−ビスホスフェート（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ−４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ＰＩＰ２）の代謝によってＩＰ３を生産する、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）に対する特異な抑制剤であるＵ７３１２２によって完璧に抑制された（図１ｃ参照）。
【００２４】
図２はＣａ２＋シグナル伝達に関連した結果を示したものであって、図２ａは、Ｆｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞が２ｍＭ  Ｃａ２＋ＨＥＰＥＳバッファー、Ｃａ２＋−無添加ＨＥＰＥＳバッファー、及びＳＫＦ９６３６５の存在下においてブラジキニンで刺激されることを各々示したものである。図２ｂ及び２ｃは、前記各サンプルの代表的な平均動き及び半幅値（ｈａｌｆ  ｗｉｄｔｈ）の挙動（Ｄｅｃａｙ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示したものである。エラーバーはＳＥＭを示す。図２ｄは、Ｕ７３１２２の前処理によって抑制されたブラジキニンまたはＥＧＦ誘導性Ｃａ２＋の放出が、Ｕ７３３４３前処理によってレスキューされた（ｒｅｓｃｕｅｄ）ことを示したものである。図２ｅは、タブシガルギンによる小胞体でのＣａ２＋枯渇後のＧＰＣＲアゴニストの適用結果を示したものである。図２ｆは、リアノジン受容体拮抗剤の存在下での、Ｕ１７８ＭＧ上でブラジキニンによるＩＰ３Ｒ介在性Ｃａ２＋減衰動態を示したものである。
【００２５】
タブシガルギンによるストアの欠乏によって、後続のブラジキニンによる［Ｃａ２＋］ｉの増加誘導が完璧に抑制されるという事実に照らし合わせると（図２ｅ参照）、ストア感受性チャンネルを通じたＣａ２＋の流入は放出と密接に関連していると見られる。このような結果から、ＧＢＭ細胞が、細胞内ストアからのＣａ２＋放出を導く共通のホスホイノシチド経路と、それに続くストア感受性チャンネルを通じたＣａ２＋流入と共役される、様々な表面受容体を発現していると結論付けた。Ｃａ２＋放出経路にあるこれらの分子が、ＧＢＭの遊走及び浸潤を調節する潜在的分子標的として役割を果たすと仮定される。
【００２６】
細胞内貯蔵所（ｓｔｏｒｅ）からのＣａ２＋放出に関与するチャンネルとして、ＩＰ３Ｒｓ（イノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体）及びＲｙＲｓ（リアノジン受容体）の２つのチャンネルが知られている。カフェインは、特に筋肉細胞及び心筋細胞において、ＲｙＲｓの開放によって、細胞内ストアからのＣａ２＋放出を誘導することが古典的に知られている。したがって本発明者等は、ＧＢＭ運動性、浸潤及び増殖に対する多様なアッセイにおいて、Ｃａ２＋放出機構を強化または阻害する製剤と共に、カフェインをテストした。
【００２７】
しかし、本発明者等の予想と異なり、１０ｍＭカフェインが多様なＧＢＭ細胞株（Ｕ１７８ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、及びＴ９８Ｇ細胞）の運動性、浸潤性、及び増殖性を著しく抑制する反面（図３ａ、３ｂ、及び３ｃ）、細胞生存性にはほとんど影響を与えないことが明らかになった（図８参照）。このカフェインの矛盾的効果は、１μＭのタブシガルギン、１０μＭの２−ＡＰＢ、２０μＭのＣＰＡ、５０μＭのＢＡＰＴＡ−ＡＭなどのような細胞内ストアからのＣａ２＋放出を阻害することが知られている多様な製剤により模倣されるが、この濃度でのＲｙＲｓに対するアゴニストである１０μＭのリアノジンによっては、模倣されなかった（図３ａ参照）。
【００２８】
上記の事実は、カフェインの作用機序は細胞内ストアからのＣａ２＋放出の阻害に関与し、阻害作用はＲｙＲｓではなく、ＩＰ３Ｒｓを選択的に標的化していることを示唆している。本発明での実験結果、カフェインまたはその類似体は病変細胞である脳癌細胞、特に膠茅細胞腫でイノシトール−１，４，５−トリホスフェート受容体（ＩＰ３Ｒ）のサブタイプ３（ＩＰ３Ｒ３）の作用を選択的に遮断して、ＩＰ３Ｒ３媒介Ｃａ２＋の増加を抑制することにより、カルシウムイオンによってシグナル伝達される細胞増殖、移動性、及び浸潤性を抑制して優れた膠茅細胞腫の治療活性を有することが明らかになった。
【００２９】
このような結果をインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）試験でより全身的水準に適用するために、空間的微細生息環境がカフェイン効果を折衝することができるインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）動物モデル及び即席分離切片に対するカフェインの効果を試験した結果、動物モデルでもカフェイン処理によってＧＢＭ細胞の転移、浸潤及び増殖が著しく減少することが確認された（図７ｂ−ｃ参照）。
【００３０】
本発明は、最も致命的な脳癌と知られたＧＢＭの転移及び浸潤に対するカフェイン作用の詳細な分子的メカニズムを提供する。このようなカフェインの有利な効果は脳癌だけでなく、これとメカニズムが類似しているまだ治療手段のない致命的な他の病気の治療に有用に用いられることができるであろう。
【実施例１】
【００３１】
膠芽細胞腫細胞の準備
ヒトＧＢＭを除いた膠芽細胞腫細胞株は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（５０単位／ｍＬ）が補充されたダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ′ｓ）修正イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）に保持した。ヒト膠芽細胞種は２０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（５０単位／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（５０単位／ｍＬ）が補充されたＤＭＥＭに保持し、使用時まで保管した。
【実施例２】
【００３２】
カフェインのＧＢＭ細胞に対する運動性、浸潤性、及び増殖性の阻害試験
カフェインの多様なＧＢＭ細胞株に対する運動性、浸潤性、及び増殖性の阻害活性を試験した。
【００３３】
２．１．掻爬遊走試験（Ｓｃｒａｐｅ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）
まず、運動性に対する効果を試験するために、神経膠腫細胞株として、Ｕ１７８ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、ｗｔＥＧＦＲ、及びΔＥＧＲＦ細胞を使用した。前記細胞株は、各々、Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉ．（Ｕ１７８ＭＧ）、及びＡＴＣＣ（Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、及びＭ５９Ｋ）から得た。全ての細胞株を１２−ウェル培養プレート内の血清含有培地（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉ．製）で単層に増殖させた。その後、１０μＬのピペットチップで掻爬（ｓｃｒａｐｅ）を作って、１０ｍＭカフェイン、１μＭタブシガルギン、または１０μＭリアノジンを各々添加し、プレートをインキュベータに戻して培養した（各細胞株当りｎ＝３乃至４、３７℃）。増殖を防止するために、フルオロデオキシウリジン（ＦｄＵ／Ｕ；Ｓｉｇｍａ社製）を添加した。２４時間培養した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した。損傷領域内の３個の１０Ｘフィールドの再増殖広さを測定し、損傷領域の傷口縫合の平均パーセントを測定した。カフェイン処理していない細胞株を対照群として使用した。
【００３４】
得られた結果を図３ａに示した。図３ａの左側写真のボックスで表示された部分は近似的な傷部位の境界を示す。右側のグラフに示されたデータは、細胞遊走による傷口縫合（ｗｏｕｎｄ  ｃｌｏｓｕｒｅ）比率を示したものである。上記の結果から分かるように、カフェインは、細胞内のＣａ２＋濃度を減少させるタブシガルギンの処理と同様に細胞内Ｃａ２＋ストアの枯渇を誘導して、傷部位への細胞移動を非常に効果的に阻害することが明らかになった。反面、細胞内Ｃａ２＋濃度に関与する受容体のうちの１つのＲｙＲｓ（リアノジン受容体）に対するアゴニストであるリアノジンで処理した場合はこのような細胞遊走がほとんど観察されなかった。エラーバーは±ＳＥＭを示す。**ｐ＜０．０１、事後のニューマン−クールズ分散分析（ＡＮＯＶＡ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ）。
【００３５】
２．２．マトリゲル浸潤試験（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）
浸潤の阻害効果を試験するために、膠芽細胞腫細胞として、Ｕ１７８ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、及びＴ９８Ｇを使用した。前記細胞株は各々ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存器官）から得た。前記細胞にカフェインを各々１、２、５、及び１０ｍＭを添加した（ｎ＝４）。２４−ウェルプレートで８μｍＭ孔径（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、米国）を含むトランスウェルインサートを使用して細胞浸潤を検定した。浸潤分析に使用するために、インサートを２ｍｇ／ｍｌ基底膜マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）でコーティングした。無血清培地（ＦＢＳ、ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ社より、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）内の１Ｘ１０５細胞をインサート上端面にプレーティングし、完全培地をチャンバー下部に入れて化学誘引物質として作用するようにした。３７℃で２４時間培養した後、インサート上端面上の細胞を綿棒で拭いて除去し、メンブレンの下端面に遊走した細胞をＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）で染色して、４０倍率で、顕微鏡で無作為に撮影した。カフェイン未処理細胞（対照群）の平均数を１００％浸潤と見なした。
【００３６】
上記で得られた浸潤程度の結果を図３ｂに示す。上段の写真は、様々なカフェイン濃度におけるマトリゲルを通じて浸潤する細胞の代表的な写真を示したものであり、下段は対照群に対する浸潤細胞の比率を示したグラフである。浸潤細胞数はｘ２００倍率顕微鏡によってカウントした。分析は２回行い、５箇所の場を無作為に選択し、分析ごとにカウントした。結果から分かるように、カフェインは、２４時間の処理後に、用量依存的に（処理したカフェイン量に比例して減少が増加する）神経膠腫細胞の浸潤比率を減少させた。
【００３７】
２．３．コロニー形成についてのカフェイン阻害効果の軟寒天試験（Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ａｓｓａｙ）
カフェインの増殖能における阻害効果を試験するために、軟寒天試験を行った。１Ｘ１０４個の細胞を、６−ウェルプレート中の、０．６％ベース寒天を覆った軟寒天（０．３％、Ｄｉｆｃｏ社）に接種した。凝固した細胞層を、０．５、１、２、５、及び１０ｍＭｍｐカフェインを含有する培地で覆い、前記培地は４日ごとに交換した。コロニーが発生するように、前記細胞を３７℃で１４〜１７日間培養した。その後、コロニーを０．０５％クレシルバイオレットで染色して撮影した。対照群としてカフェインを処理していないものを使用した。各試験はｎ＝３で行った。
【００３８】
図３ｃは前記から得られた結果を示す。上段はカフェイン濃度において形成されたコロニーを示す写真であり、下段は、対照群に対するカフェイン処理群のコロニー数の比率を示したグラフである。図３で示すように、カフェインはインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で神経膠腫の接着非依存性増殖（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ）を濃度依存的に減少させた。
【実施例３】
【００３９】
カフェインのカルシウムイオン放出遮断活性試験
Ｕ１７８ＭＧ細胞に１０ｍＭカフェインで処理した。１００秒の処理後、細胞を２つの群に分けた後、ＧＰＣＲ（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）アゴニスト、すなわち１００ｎｇ／ｍｌＥＧＦまたは１０μＭブラジキニンで各々処理した。細胞内電流を測定して、ＥＧＦまたはブラジキニンで刺激されたＵ１７８ＭＧでのカフェインによる細胞内Ｃａ２＋放出の遮断を試験した。細胞内電流測定を通じたカルシウムイオン濃度の測定は「Ｃ．Ｊｕｓｔｉｎ  Ｌｅｅ、ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、Ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、２００７」（前記文献は参照として本明細書に含まれる）の記載通りに行った。カフェインを処理していない群を対照として使用した。前記で得られた結果を図４ａ（ＥＧＦ）及び４ｂ（ブラジキニン）に各々示した。前記図４ａ及び４ｂに示されているように、カフェインを処理した群では、アゴニストを処理しても、［Ｃａ２＋］ｉが大きく増加しないことが分かる。
【００４０】
Ｕ１７８ＭＧ細胞を１０ｍＭカフェインで１００秒処理後、Ｕ１７８ＭＧは多様なアゴニスト（１０μＭブラジキニン（ＢＫ）、１００ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、３０μＭ  ＴＦＬＬＲ）で刺激した。図４ｃは、Ｕ１７８ＭＧにおけるアゴニスト誘導性Ｃａ２＋放出に対するカフェインによる％遮断率を示す。エラーバーは±ＳＥＭを示す。図４ｃに示したように、カフェインは、多様なＣａ２＋放出アゴニストに対して細胞内Ｃａ２＋放出の遮断効果を示す。
【００４１】
Ｕ１７８ＭＧ細胞を０．３ｍＭ、３ｍＭ、１０ｍＭ、及び３０ｍＭカフェインで処理した。１００秒後、細胞を３０μＭ  ＴＦＬＬＲで処理した。図４ｄは、Ｕ１７８ＭＧにおけるＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出に対する遮断効果を示す。図４ｄに示したように、カフェインは、ＴＦＬＬＲによるＣａ２＋濃度の増加をカフェイン濃度依存的に阻害するということが分かる。
【００４２】
図４ｅは、カフェイン濃度に応じたＴＦＬＬＲ（３０μＭ）及びＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）によって誘発されるＣａ２＋放出の用量応答曲線を示したものである。測定されたＩＣ５０はＴＦＬＬＲに対しては２．４５ｍＭであり、ＥＧＦに対しては１．８７ｍＭであることが明らかになった。
【００４３】
図４ｆ及び４ｇは、ヒト膠茅細胞腫細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ＡＴＣＣ）及びＨＥＫ２９３細胞株（ＡＴＣＣ）の細胞内Ｃａ２＋放出の挙動を示し、細胞は１０ｍＭカフェインで処理した後、１０μＭブラジキニン（ヒト膠茅細胞腫）または３０μＭ  ＴＦＬＬＲ（ＨＥＫ２９３）で刺激した。図４ｆ及び４ｇから分かるように、両方の細胞株でカフェインによって細胞内Ｃａ２＋放出が遮断されることを示している。
【００４４】
図４ｈは、ＧＢＭ、Ｕ１７８ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ、及びＨＥＫ２９３細胞でのカフェイン（１０ｍＭ）によるＧＰＣＲ誘導性細胞内Ｃａ２＋放出の％遮断率を示したものである。細胞株は、：ソウル大学校病院神経外科（ＧＢＭ）、Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉ．（Ｕ１７８ＭＧ）、：ＡＴＣＣ（Ｔ９８Ｇ、Ｕ８７ＭＧ、及びＨＥＫ２９３）より入手した。大部分の細胞で、細胞内Ｃａ２＋放出がカフェインにより阻害されていることが見出された。エラーバーは±ＳＥＭを示す。
【実施例４】
【００４５】
ＩＰ３Ｒ亜型３（ＩＰ３Ｒ３）に対する選択的遮断の評価
４．１．ｍＲＮＡ発現の測定
ヒト神経膠腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ１７８ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｍ０５９Ｋ）、ヒト神経膠茅細胞腫細胞株（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）、及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞株での、ＩＰ３Ｒｓ及びグリセルアルデヒド‐３‐ホスファターゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡ発現を測定した。ｍＲＮＡの発現はＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）によって測定された。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と共に上記の調製サンプルから全ＲＮＡを分離し、１μｇの分離されたＲＮＡを増幅させた。各サイクルは、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で６０秒間の伸張で構成された。使用されたプライマー配列は次の通りである：
ＩＰ３Ｒ１センス：５′−ＣＴＣＴＧＡＴＣＧＴＴＴＡＣＣＴＧ−３′（配列番号１）、
ＩＴＰＲ１アンチセンス：５′−ＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＴＣＡＣＴＣＣＴＣ−３′（配列番号２）；
ＩＰ３Ｒ２センス：５′−ＡＧＡＡＧＧＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＣ−３′（配列番号３）、
ＩＰ３Ｒ２アンチセンス：５′−ＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＣＡＣＴＴＧＡＣＴ−３′（配列番号４）；
ＩＰ３Ｒ３センス：５′−ＣＴＧＴＴＣＡＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧ−３′（配列番号５）、
ＩＰ３Ｒ３アンチセンス：５′−ＣＡＴＣＡＡＣＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＧ−３′（配列番号６）；
ＧＡＰＤＨセンス：５′−ＡＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＣＴ−３′（配列番号７）、
ＧＡＰＤＨアンチセンス：５′−ＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＣＧＴＴＧ−３′（配列番号８）。
【００４６】
図５ａは、上記で得られたＰＣＲ産物を電気泳動して得られたｍＲＮＡ発現の結果である。３種の亜型のＩＰ３Ｒの発現率は、それぞれの細胞株で相異していた。
【００４７】
図５ｂは、各々の細胞でのＩＰ３Ｒ３の発現度と、カフェインによるＣａ２＋遮断の相関関係を示したものである。Ｃａ２＋レベルは、前記実施例２及び３の記載に従って測定した。前記図５ｂに示したように、ＩＰ３Ｒ３の発現レベルとＣａ２＋遮断との間に、統計的に有意な相関関係が見出された。これは、カフェインの阻害活性が、ＩＰ３Ｒ３と関連することを示唆する。
【００４８】
図５ｃは、正常ヒトの脳細胞（ｎ＝８、ソウル大学校病院神経外科）とヒト神経膠茅腫細胞（ｎ＝１０）との間の、ＩＰ３ＲサブタイプのｍＲＮＡ発現を電気泳動上での比較を示す。図５ｄは、上記のヒトサンプルにおける、ＩＰ３ＲサブタイプｍＲＮＡ発現の濃度測定ヒストグラムを示したものである。図５ｃ及び５ｄで確認できるように、ＩＰ３Ｒの他の亜類型と比較してＩＰ３Ｒ３が膠茅細胞腫細胞で著しく多く発現することが明らかになった。
【００４９】
４．２．ＩＰ３Ｒ３に特異的なカフェインの活性試験
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＩＰ３Ｒ１（ウシ）及びＩＰ３Ｒ３（ウシ）に各々形質転換した（ＧＦＰとＩＰ３Ｒ遺伝子を同時に形質転換させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣから入手し、かつＧＦＰが入った細胞だけをＣａ２＋イメージングし、Ｃａ２＋イメージングは、形質転換させてから２日後に行った。）。細胞はその後１０ｍＭカフェインで処理した。カフェイン処理した細胞に対して、ＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出（３０μＭ  ＴＦＬＬＲで処理）に対する遮断度を評価した。結果を各々図６ａ及び６ｂに示した。図６ａにおいて、ＩＰ３Ｒ１が発現する場合はＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出に対するカフェインによる遮断は現れなかったが、図６ｂに示されているように、ＩＰ３Ｒ３を発現する場合には、ＴＦＬＬＲ誘導Ｃａ２＋放出に対するカフェインによる遮断が観測された。
【００５０】
また、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＩＰ３Ｒ１（ウシ）、ＩＰ３Ｒ３（ウシ）、及びＩＰ３Ｒ３（マウス）に各々形質転換した（ＧＦＰとＩＰ３Ｒ遺伝子を同時に形質転換させさせたＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣから入手し、かつＧＦＰが入った細胞だけをＣａ２＋イメージングし、Ｃａ２＋イメージングは、形質転換させてから２日後に実験を行った。）。細胞はその後１０ｍＭカフェインで処理した。カフェイン処理した細胞に対して、ＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出（３０μＭ  ＴＦＬＬＲで処理）に対する遮断度を評価した。結果を図６ｃに示す。図６ｃに示したように、ウシ由来だけでなくマウス由来の遺伝子の場合にも、ＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出に対するカフェインによる遮断がＩＰ３Ｒ３に対して特異的であった。エラーバーは±ＳＥＭを示す。
【００５１】
また、図６ｄ及び６ｅは、ＩＰ３Ｒ３に対するＧＦＰを付けたｓｈＲＮＡを、電気穿孔を通じて形質させたＵ１７８ＭＧ細胞のＣａ２＋イメージングの結果である。ｓｈＲＮＡが発現している細胞ではＣａ２＋放出が殆どない反面、ＧＦＰを形質転換させた細胞では正常なＣａ２＋放出が観測された。これは、カフェイン添加が有意にカルシウム放出を遮断することを示す。この実験から、ＩＰ３Ｒ３が神経膠腫細胞でのＣａ２＋放出に非常に重要な役割を果たすことと、カフェインがＩＰ３Ｒ３に特異的なＣａ２＋放出の阻害活性を示すことが証明される。
【００５２】
また、図６ｆおよび図６ｇは、カフェイン処理していないＵ１７８ＭＧ細胞と、カフェイン処理したＵ１７８ＭＧ細胞との細胞遊走をライブイメージングした結果を示し、９時間の間、１０分間隔で顕微鏡観察（２００倍率）して得られた細胞遊走経路を赤線で表示した。図６ｆおよび図６ｇで明らかなように、カフェインで処理した場合、Ｕ１７８ＭＧ細胞の動きが顕著に鈍化することが分かる。
【実施例５】
【００５３】
カフェインによる腫瘍増殖の阻害
海馬の器官型切片培養（Ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｌｉｃｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＯＨＳＣｓ）において、カフェインがＵ１７８ＭＧ神経膠腫細胞の浸潤を減少させるかどうかについて試験した。前記ＯＨＳＣｓは「Ｓｉｍｏｎｉ  ＡＤ  ａｎｄ  ＹｕＬＭ，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｓｌｉｃｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ：ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（３）：１４３９〜４５」の記載に従って調製した。器官型神経膠腫浸潤を若干変更した（Ｅｙｕｐｏｇｌｕ  ＩＹ、Ｈａｈｎｅｎ  Ｅ、Ｂｕｓｌｅｉ  Ｒ、Ｓｉｅｂｚｅｈｎｒｕｂｌ  ＦＡ、Ｓａｖａｓｋａｎ  ＮＥ、Ｌｕｄｅｒｓ  Ｍ、Ｔｒａｎｋｌｅ  Ｃ、Ｗｉｃｋ  Ｗ、Ｗｅｌｌｅｒ  Ｍ、Ｆａｈｌｂｕｓｃｈ  Ｒ、Ｂｌｕｍｃｋｅ  Ｉ．Ｓｕｂｅｒｏｙｌａｎｉｌｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ（ＳＡＨＡ）ｈａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉ−ｇｌｉｏｍａ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．２００５  Ｍａｙ；９３（４）：９９２〜９）。簡略に説明すれば、０、１、２、５、および１０ｍＭのカフェインの存在下で、ＤｉＩ株化（ＤｉＩ−ｓｔｒａｉｎｅｄ）Ｕ１７８ＭＧ細胞（５０００細胞／２０ｎｌ）を６日目の海馬器官型切片上に乗せた。１時間および１２０時間経過後、前記神経膠腫細胞の挙動を、倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ）を使用して観察した。得られた結果を図７ａに示す。図７ａは、６日目の切片表面に乗せたＵ１７８ＭＧ細胞を示す写真で、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ７  ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して１時間後のイメージ（緑色）と１２０時間後のイメージ（赤色）を重ねておいた併合イメージである。スケールバー：５００μｍ。
【００５４】
また、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＮＩＨ、ＭＤ）を用いて、ＤｉＩ株化細胞の浸潤領域を計算した。
【００５５】
浸潤領域（％）＝（１２０時間後のＤｉＩ株化細胞領域／１時間後のＤｉＩ株化細胞領域）×１００。
【００５６】
このように得られた浸潤領域の計算結果を図７ｂに示した。データは平均±ＳＥＭとして表示している（***ｐ＜０．００１  対照に対するＳｔｕｄｅｎｔｓ  ｔ−検定；による；＋＋＋ｐ＜０．００１  未処理に対するＳｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ−検定による）。図７ｂで示されているように、カフェイン処理していない場合よりは、カフェイン処理した場合に浸潤領域が減少し、カフェイン処理濃度に比例して浸潤領域が減少することが見出された。
【００５７】
また、カフェインによる腫瘍増殖抑制効果を確認するため、異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルを用いた試験を行い、Ｕ７８ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ）を皮膚に注入して腫瘍の進行を検討した。５週齢の無胸腺マウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ）をＣｅｎｔｒａｌ  Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｃ．（日本）から得た。異種移植腫瘍増殖アッセイのために、Ｕ８７ＭＧ細胞（３×１０６  細胞／１５０μｌ  ＰＢＳ）をマウスの左側横腹に皮下注入し（ｎ＝５乃至１０マウス／グループ）、実験は３回行った。注入後７日目に、カフェイン（Ｓｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を飲用水に１ｍｇ／ｍｌの濃度で与えた。対照群には蒸溜水を与えた。腫瘍の大きさは一週間に２回ずつ４週間測定し、腫瘍体積は次の式で計算した：
体積＝（長さ×幅２）／２
【００５８】
カフェインの効果は、移植された腫瘍細胞の増殖遅延によって測定した。
【００５９】
図７ａに示すように、カフェイン処理した場合、カフェイン処理していない対照群と比較して、顕著に腫瘍体積の増加が阻害された。図７ｂは、カフェイン処理し始めた日を０日とし、この時の腫瘍体積を１００％として腫瘍の大きさの成長を％値で示す。
【００６０】
試験管内試験の結果をより全身的水準で適用するために、局所的な微小環境がカフェインの効果を損なうことができる急性切片及び生体内動物モデルに対するカフェインの効果を試験した。マウスの脳の急性切片に対して１μｌ  ＤｉＩが添加されたＵ１７８ＭＧ細胞（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉ．）を線条体部位に乗せた後、これらの細胞の隣接部位に対する放射状進行を試験した。図７ｃで示されるように、１０ｍＭカフェインで処理された脳切片において、ＤｉＩが添加されたＵ１７８ＭＧ細胞は、１０ｍＭ  ７−エチルテオフィリン及びカフェインなし（０ｍＭ）で処理した対照群切片と比較して、顕著に低い浸潤を示したことが見出された。
【００６１】
生存率に対するカフェインの効果を試験するために、ヒトＵ８７ＭＧが移植された箇所において同所移植モデルを構築した。同所移植モデルを調製するため、最初にカフェイン溶液（０．１％  ｗｔ／ｖｏｌ）で１週間前処理した。その後、Ｕ８７ＭＧ細胞（２×１０５  細胞／５μｌ  ＰＢＳ）をブレグマ（ｂｒｅｇｍａ）の側面２ｍｍ、前方０．５ｍｍおよび脳実質（ｉｎｔｒａｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ）の３．５ｍｍの座標で、左側前頭葉に頭蓋内注入して移植した。Ｕ８７ＭＧ細胞をヌードマウス（５週齢、Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ）の脳に注入したＧＢＭ動物モデルにおいて、１ｍｇ／ｍｌカフェイン含有飲用水を通じてカフェインを摂取したモデル群とカフェインを摂取していないモデル群での生存率を測定した。結果を図７ｄに示す。生存率は図７ｄのグラフに示すように、腫瘍細胞注入日（０日）からマウスが死ぬまでの時間である。対照群（ＣＴＬ）は、カフェイン処理していない群である。図７ｄで示すように、カフェインを摂取したマウスは、カフェインを摂取していない対照マウスと比較して、生存率が顕著に増加した。これはマウスモデルにおけるカフェイン処理は、ＧＢＭ細胞の浸潤および増殖を顕著に減少させることを示す。
【実施例６】
【００６２】
細胞毒性試験
各細胞株（Ｕ１７８ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、およびＴ９８ＭＧ）でのカフェイン濃度に依存する細胞生存率を、比色ＭＴＴ還元アッセイ（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ＭＴＴ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）によって評価した。カフェイン処理前に、細胞を９６−ウェルプレートで増殖させた。処理２４時間後、ＭＴＴ溶液（２．５ｍｇ／ｍｌ）１０μｌをそれぞれのウェルに入れ、細胞を３７℃で４時間培養した。細胞をＤＭＳＯで可溶化させ、５７０ｎｍにおいて分光光度的に定量化した。データは、対照値に対する生存率で表示した。
【００６３】
得られた結果を図８に示した。図８のデータは対照群（カフェイン処理なし）に対する生存率で表示した。図８から分かるように、Ｔ９８ＭＧ細胞株における１０ｍＭカフェイン処理では生存率が減少することが見出され、他の細胞株では生存率が高かった（７０％以上）。これはカフェインが比較的高濃度でも低い細胞毒性レベルを示すことを示唆する。
【実施例７】
【００６４】
カフェイン作用とＣａ２＋濃度との関係
カフェイン作用はストア感受性チャンネルまたはストア枯渇に依存的であることを示すために、Ｃａ２＋添加およびＣａ２＋無添加浴槽（ｂａｔｈ）でのカフェイン作用を試験した。
【００６５】
まず、Ｃａ２＋無添加ＨＥＰＥＳバッファーで１μＭタプシガルギンを２分間適用した。小胞体でのＣａ２＋枯渇後、追加溶液を２ｍＭ  Ｃａ２＋  ＨＥＰＥＳバッファーに交換した。前記カルシウムイオン含有追加溶液に交換する１００秒前に、１０ｍＭカフェインまたは２０μＭ  ＳＫＦ９６３６５を適用した（Ｕ１７８ＭＧ細胞株、Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉ．）。得られたカルシウムイオン濃度変化を図９ａに示した。上段は無添加群、中段はカフェイン添加群、下段はＳＫＦ９６３６５添加群である。
【００６６】
図９ｂおよび図９ｃは、カフェイン未処理のＦｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞（対照群）および１０ｍＭカフェイン処理のＦｕｒａ−２が添加されたＵ１７８ＭＧ細胞での、シクロピアゾン酸（Ｃｙｃｌｏｐｉａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、２０μＭ）誘導性またはタプシガルギン（１μＭ）誘導性の［Ｃａ２＋］ｉ増加を示す。図９ｄは、１０ｍＭカフェイン存在下でのシクロピアゾン酸（２０μＭ）およびタプシガルギン（１μＭ）による％対照を示す。エラーバーは、平均±ＳＥＭである。
【００６７】
図９ａ乃至図９ｄは、カフェインによるＣａ２＋遮断が、ＩＰ３Ｒを通じたＣａ２＋放出の遮断によって起こることを示す。つまり、カフェインによるＣａ２＋遮断は、Ｃａ２＋枯渇または、ＴＲＰＣ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ）を通じたカルシウム流入の遮断によらない。むしろ、Ｃａ２＋遮断はＩＰ３Ｒを遮断することによって起こる。
【００６８】
［実施例７］
カフェイン誘導体の作用試験
カフェインのみならず、カフェイン類似体もカフェインと同等程度の活性、つまり、脳腫瘍細胞でのＣａ２＋放出に対する阻害、およびＣａ２＋シグナル伝達による細胞増殖、移動および浸潤阻害活性を有するかどうかを確認するために、いくつかのカフェイン類似体のＣａ２＋放出に対する阻害活性を測定した。
【００６９】
まず、Ｕ１７８ＭＧ細胞（Ｅｍｏｒｙ  Ｕｎｉ．）を１０ｍＭカフェインまたは１０ｍＭ  ７−エチルテオフィリンでそれぞれ処理した後、３０μＭ  ＴＦＬＬＲで処理した。細胞内Ｃａ２＋放出の挙動動態を測定して、図１０ａ（カフェイン）および図１０ｂ（７−エチルテオフィリン）にそれぞれ示した。図１０ａおよび図１０ｂで示すように、カフェイン処理によりＴＦＬＬＲ誘導性Ｃａ２＋放出が阻害されるが、その類似体である７−エチルテオフィリン処理によっては、このような阻害が見出されなかった。したがって、すべてのカフェイン類似体がカフェインと類似するＣａ２＋遮断効果を示すのではないことが見出された。
【００７０】
カフェイン類似体中の有意な遮断効果を有する物質を探索するために、カフェインおよび１０種類の代表的なカフェイン類似体について、Ｃａ２＋放出（％遮断）に対する遮断効果を測定した。結果を図１０ｃに示す。エラーバーはＳＥＭを示す。図１０ｃから観測されるように、カフェイン以外の物質にも、ある程度のＣａ２＋放出に対する遮断効果が見出された。このような物質には、７−イソプロピルテオフィリン、７−（β−ヒドロキシエチル）テオフィリン、キサンチン、テオフィリン、および１，７−ジメチル−３−イソブチルキサンチンが含まれる。これらの物質の中でも、７−（β−ヒドロキシエチル）テオフィリン、キサンチン、テオフィリン、および１，７−ジメチル−３−イソブチルキサンチンは、２０％以上の優れた阻害効果を示し、特に１，７−ジメチル−３−イソブチルキサンチンは、５０％以上の非常に優れた阻害効果を示した。
【実施例８】
【００７１】
Ｃａ２＋シグナル経路に対する遺伝子のマイクロアレイ解析
本実施例で使用されたマイクロアレイ解析は次のような方法で行った。
【００７２】
８．１：全ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡは、１０個の正常ヒト脳組織および２７個の神経膠腫から、使用説明書に従ってＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、英国）を用いて単離し、その後ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で精製した。
【００７３】
８．２．ＲＮＡ量、完全性（Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）および純度の評価
ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌａｗａｒｅ、米国）を用いて、ＯＤ２６０／２８０を測定し、全ＲＮＡ量および純度を測定した。Ａ２６０／２８０比率が＞１．８であるものを、マイクロアレイ実験に使用可能なものと見なした。ＲＮＡの長さ分布および完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏ  ｃｈｉｐ  ａｓｓａｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いる蛍光検出（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００）によるキャピラリー電気泳動で、２８Ｓおよび１８Ｓ  ｒＲＮＡバンドの存在に対して評価した。理論上、２８Ｓバンドの強度は、１８Ｓバンドの強度の２倍にならなければならない。
【００７４】
８．３．マイクロアレイプラットフォーム
遺伝子発現解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  １Ａ（Ｖ２）ｏｌｉｇｏ  ｍｉｃｒｏａｒｒｙ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）を用いて行った。マイクロアレイは各プローブ当り４個の複製配列（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）がアレイを横切って分布するように、つまり、４×２０Ｋ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘスライドフォーマットで設計した。４個の複製配列は、対照スポット（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｐｏｔ）を含む、それぞれ２０，０００個以上の６０塩基長のヒト遺伝子及び転写配列を含む。
【００７５】
８．４．ＲＮＡ標識およびハイブリダイゼーション
オリゴマイクロアレイ解析に使用するための蛍光ラベル化ｃＤＮＡは、アミノアルキル−ＵＴＰ存在下でＡｍｉｎｏ  ａｌｌｙｌ  ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐＴＭ  ａＲＮＡ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ｔｅｘａｓ）を使用して全ＲＮＡを増幅させた後、Ｃｙ３またはＣｙ５染料（１色使用の場合はＣｙ３染料）（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ社、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を結合させて調製した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ６０ｍｅｒオリゴマイクロアレイプロセシングプロトコルを使用して、回転ハイブリダイゼーション化オーブンで、６５℃で１７時間ハイブリダイゼーションを行った。プロトコルに従ってスライドを洗浄した後、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ  アレイスキャナ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）でスキャンした。
【００７６】
８．４．マイクロアレイデータ解析
スキャンされたイメージは、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて解析して、遺伝子発現比率を得た。変換されたデータはＬＯＷＥＳＳ回帰式［Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００７  Ｆｅｂ；６４（４）：４５８〜７８］を用いて正常化し、その後ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  ７．３ソフトウェアプログラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．米国）を用いて解析した。１色デフォルト正常化（チップあたり：平均または百分位数に正常化させる；遺伝子当たり：平均に正常化させる）と共に、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸは先ずそれぞれの実測強度値をチップの平均値で割った。その後、各値を、サンプルにわたる各遺伝子の平均値でさらに割って、最終正常化値を得た。
【００７７】
カルシウムイオンのシグナル経路に対する遺伝子のマイクロアレイ解析結果を、次の表１に示した。
【表１】
2011510975.tif 000004
【００７８】
表１は、カフェインの標的として見出された、Ｃａ２＋に関与するシグナル伝達系に関連した遺伝子の発現程度（数字で表される）を反映する数値を示したものである。ＩＴＰＲ３、ＴＲＰＣ６、ＥＧＦＲ、Ｆ２Ｒ、ＰＬＣＥ１などの遺伝子発現レベルが、顕著に増加していることが観測された。
【図１ａ】
2011510975.tif 000005
【図１ｂ】
2011510975.tif 000006
【図１ｃ】
2011510975.tif 000007
【図１ｄ】
2011510975.tif 000008
【図１ｅ】
2011510975.tif 000009
【図２ａ】
2011510975.tif 000010
【図２ｂ】
2011510975.tif 000011
【図２ｃ】
2011510975.tif 000012
【図２ｄ】
2011510975.tif 000013
【図２ｅ】
2011510975.tif 000014
【図２ｆ】
2011510975.tif 000015
【図３ａ】
2011510975.tif 000016
【図３ｂ】
2011510975.tif 000017
【図３ｃ】
2011510975.tif 000018
【図４ａ】
2011510975.tif 000019
【図４ｂ】
2011510975.tif 000020
【図４ｃ】
2011510975.tif 000021
【図４ｄ】
2011510975.tif 000022
【図４ｅ】
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【図４ｆ】
2011510975.tif 000024
【図４ｇ】
2011510975.tif 000025
【図４ｈ】
2011510975.tif 000026
【図５ａ】
2011510975.tif 000027
【図５ｂ】
2011510975.tif 000028
【図５ｃ】
2011510975.tif 000029
【図５ｄ】
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【図６ａ】
2011510975.tif 000031
【図６ｂ】
2011510975.tif 000032
【図６ｃ】
2011510975.tif 000033
【図６ｄ】
2011510975.tif 000034
【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図６ｇ】
2011510975.tif 000037
【図７ａ】
2011510975.tif 000038
【図７ｂ】
2011510975.tif 000039
【図７ｃ】
2011510975.tif 000040
【図７ｄ】
2011510975.tif 000041
【図８】
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【図９ａ】
2011510975.tif 000043
【図９ｂ】
2011510975.tif 000044
【図９ｃ】
2011510975.tif 000045
【図９ｄ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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