(57)【要約】  ポリペプチド又はその医薬的に許容できる塩の製造方法で、Ｌ−アラニンとＬ−チロシンとＬ-グルタメートと保護基で保護されたＬ−リシンとを含む、Ｌ−リシンで保護されたポリペプチドを、水酸化テトラアルキルアンモニウム水溶液と反応させて保護基を取り除く工程を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ-グルタメート、Ｌ−リシンを含むポリペプチド又はその医薬的に許容できる塩の製造方法であって、
Ｌ−アラニンとＬ−チロシンとＬ-グルタメートと第１保護基で保護されたＬ−リシンとを含む、Ｌ−リシンで保護されたポリペプチドを、水酸化テトラアルキルアンモニウム水溶液と反応させて前記第１保護基を取り除く工程を含む、前記製造方法。
【請求項２】
前記水酸化テトラアルキルアンモニウムが水酸化テトラアルキル（C1-C8）アンモニウムである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記水酸化テトラアルキルアンモニウムが、水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウム、水酸化テトラブチルアンモニウム、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記水酸化テトラアルキルアンモニウムが水酸化テトラブチルアンモニウムである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記第１保護基が、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、アロキシカルボニル及びこれらの置換誘導体の基から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記第１保護基がトリフルオロアセチルである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記Ｌ−リシンで保護されたポリペプチドが、
ａ）Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、第２保護基で保護されたＬ-グルタメート、前記第１保護基で保護されたＬ−リシンのそれぞれのＮ−カルボキシ無水物の混合物を溶媒中で重合して保護基を有するポリペプチドを得る工程と、
ｂ）前記第２保護基を取り除き、前記Ｌ−リシンで保護されたポリペプチドを得る工程とを有する方法で調製されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記工程ａ)の保護基を有するポリペプチドを酢酸中で臭化水素酸と反応させることにより前記第２保護基を取り除く、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記保護基を有するポリペプチドと臭化水素酸との酢酸中での反応中に形成された反応混合物を、Ｃ5−Ｃ12アルカンで洗浄する工程を更に含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃ5−Ｃ12アルカンがヘプタンである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記第２保護基がベンジル及びt-ブチルからなる群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
前記第２保護基がベンジルである、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチド又はその医薬的に許容できる塩が酢酸グラチラマーである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記水酸化テトラアルキルアンモニウム塩基の量が、前記第１保護基で保護されたＬ−リシンの１０モル等量未満である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記水酸化テトラアルキルアンモニウム塩基の量が、前記第１保護基で保護されたＬ−リシンの1.5〜６モル等量である、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記水酸化テトラアルキルアンモニウム塩基の量が、前記第１保護基で保護されたＬ−リシンの約３モル等量である、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、前記ポリペプチドを精製単離するいずれの工程にも先だって、透析で前記ポリペプチドを精製単離する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
請求項１記載の方法にしたがって製造されたポリペプチド又はその医薬的に許容できる塩。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願〕
本願は、２００８年８月７日に出願された米国仮特許出願第６１／１８８，２１６号の優先権を主張するものである。この米国仮特許出願の全内容は本願明細書に含まれる。
【０００２】
（発明の分野）
本出願は、アミノ酸ユニット、即ち、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン及びＬ−チロシンを構造体中に含むポリペプチドの合成方法に関する。酢酸グラチラマーは、Copolymer-1としても公知であるが、本発明の代表的なポリペプチドである。
【０００３】
（関連技術の説明）
酢酸グラチラマーは、多発性硬化症の治療薬として認可されているポリペプチドの混合物である。４種の天然アミノ酸であるＬ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−リシン及びＬ−チロシンが一般に平均モル比0.392-0.462、0.129-0.159、0.300-0.374及び0.086-01000でそれぞれ含まれる化学的に合成されたポリペプチドの酢酸塩混合物である。酢酸グラチラマーの平均分子量は4,700〜11,000ダルトンである。 
化学的に言うならば、酢酸グラチラマーは、Ｌ−アラニン、Ｌ−リシン及びＬ−チロシンと指定されたＬ−グルタミン酸ポリマーとのアセテート（塩）である。酢酸グラチラマーの構造式は、(Glu, Ala, Lys, Tyr)x・xCH3COOHである。CASナンバーは147245-9-2-9である。
酢酸グラチラマーをはじめとするこの種のポリペプチドの調製方法は、米国特許第3,849,550号、米国特許第5,800,808号、米国特許出願第2006/0172942号、米国特許出願第2006/0154862号、米国特許出願第2007/0141663号に記載されている。これらの特許及び特許出願の全内容は引用により本願明細書の記載に含まれるものとする。この種のポリペプチドの調製方法は、チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護基で保護されているＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物、及び、保護基で保護されているＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の共重合をもとに、保護基で保護された共重合体が形成される。保護基を有するＬ−グルタミン酸のデブロック（deblocking）は、酸分解又は水素添加により行い（第１の脱保護）、その後、塩基開裂によりＬ−リシンから保護基を取り除く（第２の脱保護）。
【０００４】
一般に、Ｌ−リシンはトリフルオロアセチル基で保護し、ピペリジンのような塩基度の弱い窒素系塩基を使ってＬ−リシンの保護基を取り除く。通常、Ｌ−リシン35モル等量を超える量に対し、窒素系塩基の濃度は１Ｍより高い濃度である。 このような調製方法は非経済的であり、かつ環境に優しいものではない。
その為、酢酸グラチラマー等のポリペプチドの製造における改良が望まれている。
【０００５】
（発明の概要）
本出願は、ポリペプチド又はその医薬的に許容できる塩の製造方法を提供する。ポリペプチドは、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−グルタメート、Ｌ−リシンを含む。この製造方法は、Ｌ−アラニンとＬ−チロシンとＬ−グルタメートと第１保護基で保護されたＬ−リシンとを含む、Ｌ−リシンで保護されたポリペプチドを、水酸化テトラアルキルアンモニウム水溶液と反応させて第１保護基を取り除く工程を有する。 
水酸化テトラアルキルアンモニウムが水酸化テトラアルキル（C1-C8）アンモニウムであることが好ましい。更には、水酸化テトラアルキルアンモニウムが水酸化テトラメチルアンモニウム、水酸化テトラエチルアンモニウム、水酸化テトラブチルアンモニウムであることがより好ましく、とりわけ水酸化テトラブチルアンモニウムが好ましい。
第１保護基としては、不要な反応からリシンを保護し、そののちに容易に取り除くことができる基であればいかなるものでもよい。例えば、カルボメート（carbomate）及び／又はアミドとして、アルコキシもしくはアロキシ（aroxy）カルボニル基及び／又はアルキルもしくはアリールカルボニル基で、より好ましくは、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、2,2,2-トリクロロエトキシカルボニル、トリクロロアセチル、ピコリニル及びこれらの組合せから選択される基でリシンを保護することができる。とりわけ、第１保護基はトリフルオロアセチルが好ましい。
【０００６】
Ｌ−リシンで保護されたポリペプチドはいずれの適当な方法によってでも調製することができる。好ましくは以下の方法で調製することができる。
ａ）Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、第２保護基で保護されたＬ−グルタメート、第１保護基で保護されたＬ−リシンのそれぞれのＮ-カルボキシ無水物の混合物を溶媒中で重合し、保護基を有するポリペプチドを得る工程と、
ｂ）第２保護基を取り除き、Ｌ−リシンで保護されたポリペプチドを得る工程とを有する方法で調製できる。
あるいは、重合工程で使用したアミノ酸のなかの少なくとも１種を、Ｎ−カルボキシ無水物ではなくＮ−チオカルボキシ無水物にしてもよい（米国特許出願第2009/0035816号を参照のこと。この全内容は引用により本願明細書の記載に含まれるものとする）。
第２保護基としては、不要な反応からＬ−グルタメートを保護し、その後に容易に取り除くことができる基であればいかなるものでもよい。例えば、Ｌ−グルタメートは、エステルとしてアルキル基及び／又は芳香族基で保護することができ、好ましくは、シクロヘキシル、ベンジル、t-ブチル、アリルエステル、アダマンチル、9-フルオレニルメチル、及びこれらの組合せから選択される基により保護することができる。第２保護基はベンジル及びt-ブチルからなる群から選択されることが更に好ましく、とりわけベンジルが好ましい。
第２保護基の除去（即ち、脱保護）は、例えば、塩基開裂、酸分解、チオール開裂（thiolysis）、水素添加又は酵素触媒による加水分解により行うことができる。
【０００７】
本発明の態様の１つによると、脱保護工程が、保護ポリペプチドに酸を添加することを含む。酸としては、例えば、臭化水素酸、トリフルオロ酢酸又は塩酸を、酢酸、ジオキサン、酢酸エチル及びこれらの混合物から選択される溶媒で使用することができる。好適な態様では、酸は酢酸に溶解した臭化水素酸である。さらに、この方法が、脱保護工程中に形成された反応混合物をC5-C12アルカン、とりわけヘプタンで洗浄する工程を更に有していることが好ましい。
本出願の方法によって作製したポリペプチド又はその医薬的に許容できる塩としては、酢酸グラチラマーが好ましい。
水酸化テトラアルキルアンモニウム塩基の濃度は、好ましくは約0.5Mである。水酸化テトラアルキルアンモニウム塩基の量は、第１保護基で保護されているＬ−リシンのモル量に対して、10モル等量未満、好ましくは1.5〜６モル等量、更に好ましくは約３モル等量である。
第１保護基を取り除き、ポリペプチドを合成した後、好ましくは、透析によりポリペプチドを精製及び単離する工程が含まれているとよい。他のいずれの精製及び単離工程があれとしても、前記精製及び単離工程が先に行われることが更に好ましい。水で透析を１回行うことによりポリペプチドを単離精製するとよい。 
好適な態様として、本発明で使用する水酸化テトラアルキルアンモニウム塩基は、その濃度が水に対して約40％（質量％）であるとよい。第１保護基で保護されているリシンに対する水酸化テトラアルキルアンモニウムのモル量は1.5〜6がよい。第１保護基を取り除く最中に使用する水の量は、リシンで保護されているポリペプチドの量に対して約10質量部であるとよい。第１保護基の除去反応の他の条件としては、反応温度が20〜25℃、反応時間が24時間、反応圧力は標準大気圧であるとよい。
【０００８】
他の態様によると、本出願は前記方法によって製造された新規なポリペプチドを提供する。
別の方法と比較すると、本出願の方法には以下の利点がある。 
本願出願人らは、第１保護基の脱保護のために、ピペリジンのような塩基度の低い窒素系塩基よりも若干塩基度が高い酸素系塩基を見出した。第１保護基を取り除く際、本願で使用する塩基のモル量は、第１保護基で保護されたリシンに対して、他に刊行物に記載の方法において使用される窒素塩基の量よりもはるかに少なくすることができる。本願で使用の酸素系塩基の濃度も、他の方法で使用されている窒素系塩基の濃度よりもはるかに少なくすることができる。上記反応で得られたポリペプチドポリマーの濃度は、本出願人らが知っている他の方法で得られた濃度よりも高い。このため、本発明による方法は、報告されている他の方法と比べると、はるかに経済的であり、ワークアップ（分離精製のための一連の手順）がより簡単になる。更には、他の刊行物に記載されているように透析後にワークアップを行うかわりに、ワークアップ後に透析をすることができるので、本願の方法は、製品を調製するためのワークアップ時間を節約することができる。
本発明を特徴づける新規性の様々な特徴については、本願の開示に添付し、開示の一部を形成する請求の範囲に詳細に記載する。本発明、本発明の操作効果、本発明の使用により達成される具体的な目的をさらによく理解するために、本発明の好適な実施形態が説明及び記載されている説明を参照すべきものである。
【０００９】
（本発明の好適な実施形態の詳細な説明）
下記実施例は、本発明による実施形態を説明するためのものであって、限定するものではない。本発明の実施形態の１つによると、下記実施例に示されるように、共重合体の製造方法には、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、γ-ベンジルＬ−グルタメートのＮ−カルボキシ無水物、Ｎ−トリフルオロアセチルリシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物の重合により、保護共重合体を調製することが含まれる。保護基の除去は、33％HBr/HOAcの次に水酸化テトラアルキルアンモニウム水溶液で行い、グラチラマーが得られる。
共重合体を透析により精製した後、酢酸で処理して酢酸塩を形成させることにより酢酸グラチラマーが得られる。実施形態の１つとして、酢酸グラチラマーの製造方法には、４種のＮ−カルボキシ無水物の重合と、２回の精製工程と、１回の酢酸塩形成工程とが含まれてもよい。
【００１０】
実施例１
保護基を有する共重合体の調製
Ｌ−アラニン（4.0g、34.78mmol）のＮ−カルボキシ無水物と、γ-ベンジルＬ−グルタメート（3.0g、11.39mmol）のＮ−カルボキシ無水物と、Ｎ−トリフルオロアセチルリシン（7.47g、mol）のＮ−カルボキシ無水物と、Ｌ−チロシン（1.6g、7.73mmol）のＮ−カルボキシ無水物とを、マグネチックスターラーの付いた一口フラスコに導入した。この混合物に無水ジオキサン（289mL）を加えて溶解した。蒸留して得たジエチルアミン（60μL）を添加した。得られた混合物を室温で24時間機械的に撹拌した。混合物にアセトン（116mL）を加え、溶液をアセトン（173mL）と水（578mL）との混合物にゆっくり注ぎ入れた。懸濁液を撹拌して濾過した。固形物を真空下、45℃以下（NMT45℃）で乾燥し、12.02gの保護基を有する共重合体を得た（収率：94.7％）。
【００１１】
実施例２
ポリ[L-Ala, 5-ベンジル-L-Glu, N6-TFA-L-Lys, L-Tyr] からベンジル保護基を取り除くことによる、ポリ[L-Ala, L-Glu, N6-TFA-L-Lys, L-Tyr]の形成
実施例１記載のごとく合成した12.02gの保護基を有する共重合体を、72mLの33％HBr/HOAcに懸濁させた。この混合物を室温で17時間撹拌したところ、透明な溶液になった。混合物を抽出し、n-ヘプタン（190mL）で洗浄した。混合物の下層を、水（240mL）とn-ヘプタン（120mL）との混合物に移した。析出物を濾別し、乾燥してトリフルオロアセチル-グラチラマーを白色固体で得た。
【００１２】
実施例３
ポリ[L-Ala, L-Glu, N6-TFA-L-Lys, L-Tyr] からトリフルオロアセチル保護基を取り除くことによる、ポリ[L-Ala, L-Glu, L-Lys, L-Tyr]の形成
実施例２記載のごとく合成した9.5gのトリフルオロアセチル-グラチラマーを、室温で、水（120.2mL）と40％水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液（52.2mL、3eq）とに24時間反応させた。この混合物を酢酸（20mL）でｐＨ３〜４に調整し、酢酸グラチラマー溶液を得た。３キロダルトンの膜を使って限外濾過を行い、低分子量の不純物を除去した。水による限外濾過を連続的に２サイクル行った後、得られた溶液を濃縮して凍結乾燥させ、酢酸グラチラマーを純粋な白色固体として得た（4.7g、収率60％）。
【００１３】
実施例４
ポリ[L-Ala, L-Glu, N6-TFA-L-Lys, L-Tyr]からトリフルオロアセチル保護基を取り除くことによる、ポリ[L-Ala, L-Glu, L-Lys, L-Tyr]の形成
実施例２記載のごとく合成した0.12gのトリフルオロアセチル-グラチラマーを、室温で、水（1.2mL）と25％水酸化テトラメチルアンモニウム水溶液（0.32mL、3eq）とに24時間反応させた。この混合物を酢酸（0.2mL）でｐＨ３〜４に調整し、酢酸グラチラマー溶液を得た。３キロダルトンの膜を使って限外濾過を行い、低分子量の不純物を除去した。水による限外濾過を連続的に２サイクル行った後、得られた溶液を濃縮して凍結乾燥させ、酢酸グラチラマーを純粋な白色固体として得た（39mg、収率42％）。
【００１４】
実施例５
ポリ[L-Ala, L-Glu, N6-TFA-L-Lys, L-Tyr] からトリフルオロアセチル保護基を取り除くことによる、ポリ [L-Ala, L-Glu, L-Lys, L-Tyr]の形成
実施例２記載のごとく合成した0.20gのトリフルオロアセチル-グラチラマーを、室温で、水（2.0mL）と20％水酸化テトラエチルアンモニウム水溶液（1.02mL、3eq）とに24時間反応させた。この混合物を酢酸（0.5mL）でｐＨ３〜４に調整し、酢酸グラチラマー溶液を得た。３キロダルトンの膜を使って限外濾過を行い、低分子量の不純物を除去した。水による限外濾過を連続的に２サイクル行った後、得られた溶液を濃縮して凍結乾燥させ、酢酸グラチラマーを純粋な白色固体として得た（76.7mg、収率49％）。
本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、これら実施形態は単に例として提示するものである。これらの実施形態は、添付の特許請求の範囲に規定の保護範囲内において様々な変更が可能である。
【国際調査報告】
2011530523.tif 000002