(57)【要約】１７位にリン酸化されたアミノ酸セリンを有している完全長の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）のバリアントまたはそのフラグメント［ｐ（１７）ＰＴＨ］に対する抗体、ならびに同抗体を生産する方法。本発明はさらに、体液中のｐ（１７）完全長ＰＴＨ（１−８４）またはフラグメントの循環血中レベルを測定するための、上記抗体を単独でまたは他の抗体と組み合わせて使用する様々なイムノアッセイ法を含んでいる。そのような抗体およびイムノアッセイは、体液中に存在するすべての生物学的に活性な形態のｈＰＴＨを検出するために、他の抗体と併用して使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１７位にリン酸化されたセリンアミノ酸を有している副甲状腺ホルモンに特異的な、ほぼ純粋な抗体または抗体フラグメント。
【請求項２】
抗体または抗体フラグメントは、アミノ酸１３−２２（配列番号２）で構成される副甲状腺ホルモンエピトープに対し特異的であることを特徴とする、請求項１に記載の抗体または抗体フラグメント。
【請求項３】
生体試料中のｐ（１７）ＰＴＨレベルの測定に役立つ抗体を生産する方法であって、
ａ）宿主動物において第１のペプチド抗原に対する抗体産生を引き起こすために、該宿主動物に前記第１のペプチド抗原を投与するステップであって、前記第１のペプチド抗原は、ＰＴＨの一部分とほぼ同様のアミノ酸配列であってＰＴＨ中の１７番目の残基に存在しかつリン酸化されているアミノ酸セリンを少なくとも含んでいるアミノ酸配列を有することを特徴とするステップと、
ｂ）宿主動物への前記第１のペプチド抗原の投与によって生じる抗体価を観察するステップと、
ｃ）前記宿主動物において産生された抗血清を抽出するステップと、
ｄ）ステップｃ）で抽出した抗血清を、生物活性形態のｐ（１７）ＰＴＨである第２のペプチド抗原を利用するアフィニティクロマトグラフィに供して、前記第２のペプチド抗原に親和性を有する抗体を前記抗血清から回収するステップと、
ｅ）ステップｄ）で回収した前記抗体を、リン酸化されていない形態の生物活性を有するＰＴＨである第３のペプチド抗原を利用するアフィニティクロマトグラフィに供して、前記第３のペプチド抗原に対する親和性を有していない少なくとも１つの抗体を回収するステップと
からなる方法。
【請求項４】
ステップａ）の前記第１のペプチド抗原はキャリアタンパク質に結合されている、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）の前記アミノ酸配列は配列番号２である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ステップｄ）の第２のペプチド抗原は、ｐ（１７）ＰＴＨ（１−３４）およびｐ（１７）ＰＴＨ（１−８４）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ステップｅ）の第３のペプチド抗原は、ＰＴＨ（１−３４）およびＰＴＨ（１−８４）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
請求項３に記載の方法によって生産される抗体。
【請求項９】
生体試料中のｐ（１７）ＰＴＨの量を計測する方法であって、
ａ）前記試料に、ｐ（１７）ＰＴＨに特異的な抗体と、生物活性を有する標識ｐ（１７）ＰＴＨとを添加するステップと、
ｂ）前記試料中のｐ（１７）ＰＴＨ、および生物活性を有する標識ｐ（１７）ＰＴＨを、前記抗体上の結合部位について競合させ、該部位に結合させるステップと、
ｃ）前記試料中のｐ（１７）ＰＴＨの量を測定するために、抗体に結合した標識ｐ（１７）ＰＴＨの量を計測するステップと
からなる方法。
【請求項１０】
ステップａ）で添加される抗体は、アミノ酸１３−２２（配列番号２）で構成されている副甲状腺ホルモンエピトープに特異的である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップａ）で添加される抗体は固体担体に結合されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ステップａ）で添加される抗体は液体状態である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｂ）は、ステップａ）で添加された抗体を沈澱させることをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップａ）で添加される生物活性を有する標識ｐ（１７）ＰＴＨは、酵素、蛍光性の化学薬品、放射性同位元素、化学発光性の化学薬品、または比色定量用の試薬からなる群から選択される検出可能な成分を含んでいる、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
ステップａ）で添加される生物活性を有する標識ｐ（１７）ＰＴＨは、ｐ（１７）ＰＴＨ（１−３４）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
ステップａ）で添加される生物活性を有する標識ｐ（１７）ＰＴＨは、ｐ（１７）ＰＴＨ（１−８４）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
生体試料中のｐ（１７）ＰＴＨの量を計測するための方法であって、
ａ）前記試料に、ｐ（１７）ＰＴＨに特異的な第１の抗体であって少なくともＰＴＨのリン酸化された１７番目のアミノ酸と結合する抗体を添加するステップと、
ｂ）該試料に、ＰＴＨの一部分であって前記第１の抗体が結合する部分以外の部分に特異的な第２の抗体を添加するステップであって、前記抗体のうちの一方が、検出可能な成分で標識されていることを特徴とするステップと、
ｃ）２つの抗体を試料中のｐ（１７）ＰＴＨと結合させることにより、標識複合体を形成させるステップと、
ｄ）前記試料中のｐ（１７）ＰＴＨの量を測定するために、前記標識複合体の量を計測するステップと
からなる方法。
【請求項１８】
ステップｂ）で添加される第２の抗体は固体担体に結合されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップｂ）で添加される第２の抗体は液体状態である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ステップｃ）は、ステップｃ）で形成される標識複合体を沈澱させることをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップａ）で添加される第１の抗体は、酵素、蛍光性の化学薬品、放射性同位元素、化学発光性の化学薬品、または比色定量用の試薬からなる群から選択される検出可能な成分を含んでいる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
ステップｂ）で添加される第２の抗体は、酵素、蛍光性の化学薬品、放射性同位元素、化学発光性の化学薬品、または比色定量用の試薬からなる群から選択される検出可能な成分を含んでいる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
第２の抗体は第１の抗体と同時に添加される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
第２の抗体は第１の抗体の後に順次添加される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
ステップａ）で添加される第１の抗体は、アミノ酸１３−２２（配列番号２）で構成されている副甲状腺ホルモンエピトープに特異的である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
ステップｂ）で添加される第２の抗体は、ＰＴＨ（７７−８４）に特異的である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
ステップｂ）で添加される第２の抗体は、ＰＴＨ（３９−８４）に特異的である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
ステップｂ）で添加される第２の抗体は、ＰＴＨ（４４−６８）に特異的である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
ステップｂ）で添加される第２の抗体は、ＰＴＨ（１−３）に特異的である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全長のヒト副甲状腺ホルモン［ｈＰＴＨ（１−８４）］（配列番号１）のバリアントまたはそのフラグメントであって１７位にリン酸化されたセリンアミノ酸を有するもの［ｐ（１７）ｈＰＴＨ］に対し、高親和性かつ特異性を有する抗体、ならびにそのような抗体を調製する方法に関する。本発明はさらに、体液中における完全長のｐ（１７）ｈＰＴＨ（１−８４）（配列番号１）またはそのフラグメントの循環血中レベルを測定するために上述の抗体を単独でまたは他の抗体と組み合わせて使用する様々なイムノアッセイ法を含んでいる。
【背景技術】
【０００２】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、および血中カルシウムイオン濃度の調節における同ホルモンの重要性は良く知られている。この点に関して述べると、ＰＴＨは副甲状腺によって作り出され、他の因子と協力して血中カルシウムイオンレベルを調節するように機能し、該レベルが細胞内および周囲の体液中で安定した濃度に維持されるようにする。本来、ＰＴＨは血清中カルシウムレベルが減少した時に貯蔵カルシウムを体内に放出するように機能する。他方、そのような分泌作用は血清中カルシウム濃度が上昇する範囲に抑制される。
【０００３】
ｈＰＴＨは、完全な生物活性形態では、８４アミノ酸で構成された固有のペプチドからなる（配列番号１）。カルシウム代謝におけるその重要性を考えれば、ＰＴＨの正確な測定は臨床上非常に重要なものであったし、今後も重要であり続ける。十分立証されているように、血清中ＰＴＨレベルは、数ある中でもとりわけ高カルシウム血症、原発性副甲状腺機能亢進症、および骨粗鬆症のような疾病の患者に関する重要なパラメータとして役立っている。同様にＰＴＨは、ＰＴＨ産生過剰により腎性骨形成異常症を発症する可能性のある慢性腎不全患者においても臨床上非常に重要となる。
【０００４】
代謝におけるその重要な役割および臨床上の重要性にもかかわらず、生物学的に活性なＰＴＨの循環血中レベルの測定に関しては大きな困難が存在してきたし、依然として存在し続けている。第一に、ＰＴＨは通常非常に低レベルで存在し、正常では５ｐｇ／ｍＬ〜４５ｐｇ／ｍＬであることが良く知られている。さらに、ＰＴＨペプチドは、生物活性をもたないアミノ末端切断型フラグメントなどの、様々な循環血中ＰＴＨフラグメントとしても存在することが良く知られている。第二世代のＰＴＨアッセイは、生物活性を有するＰＴＨと同様に生物活性をもたない上記フラグメントの多くを計測することで、生物活性を有するＰＴＨの実際の循環血中レベルよりも高いＰＴＨレベルを示す結果をもたらすことが周知であった。第三世代のアッセイは、ＰＴＨのアミノ末端に結合し、よって患者における生物活性ＰＴＨのレベルについてより正確な測定値を与えることにより、上記の欠点を克服することができた。
【０００５】
しかしながら、ダムール（Ｄ’Ａｍｏｕｒ）らは、ＨＰＬＣによってｈＰＴＨ（１−８４）から分離可能なアミノ末端型ｈＰＴＨについて述べている（非特許文献１）。この論文はさらに、このバリアントが１７位のセリン残基においてリン酸化されているｈＰＴＨかもしれないことを提唱している。この論文の重要な発見は、この新しい形態のｈＰＴＨの、完全長ｈＰＴＨ（１−８４）に対する比率（％）が、疾病の状態によって変化したということである。具体的には、この新しい形態のｈＰＴＨは疾病ではない対照群において最も低く、腎不全患者では増大し、原発性副甲状腺機能亢進症の患者で最も高かった。従って、この新しい形態のｈＰＴＨを能率的かつ費用効率高く計測することができるアッセイが当分野において必要とされている。
【０００６】
アミノ末端の最初の数アミノ酸に結合するにすぎない第三世代の生物活性ｈＰＴＨアッセイは、完全長のｈＰＴＨ（１−８４）と共にこの新しい形態のｈＰＴＨを認識する。しかしながら、完全長のｈＰＴＨ（１−８４）、およびｈＰＴＨ（７−８４）のようなアミノ末端切断型ｈＰＴＨフラグメントの両方を認識する第二世代のｈＰＴＨアッセイでは、この新しい形態のｈＰＴＨの認識が低下していた。第二世代のアッセイにおいて利用される抗体は通常ｈＰＴＨの１７位アミノ酸の領域に結合するので、上記のようなｈＰＴＨの認識低下はさらに、上記アミノ酸部位における修飾（例えばリン酸化）の可能性を示唆している。
【０００７】
これらの結合特性により、ブードー（Ｂｏｕｄｏｕ）らの最近の論文に記載されている現象について説明できるのではないだろうか（非特許文献２）。一般的には、第二世代のｈＰＴＨアッセイは完全長のｈＰＴＨ（１−８４）に加えてアミノ末端切断型ｈＰＴＨフラグメントも検出するので、第二世代のアッセイは第三世代のｈＰＴＨの結果よりも患者について高い結果を生じる。ブードーらの論文は、この比率が逆転している、すなわち第三世代のアッセイが第二世代のアッセイよりも患者について高い結果を生じている、７人の患者について述べている。これは、第二世代のＰＴＨアッセイによって検出されなかったｐ（１７）ｈＰＴＨの増加分に起因する可能性がある。前記７人の患者は臨床的には重症の原発性副甲状腺機能亢進症を呈しており、著者らはさらに、この予想外のプロファイルが悪性度を予測している可能性を推測している。この研究は間接証拠のみを使用したものなので、ｐ（１７）ｈＰＴＨを直接計測することができるアッセイは、機能亢進性の副甲状腺活性の評価にとって非常に有益なものとなる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｍｉｎｏ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｆｏｒｍ  ｏｆ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ（ＰＴＨ）  ｗｉｔｈ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｔｏ  ｈＰＴＨ（１−８４）  ｉｓ  Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ４９：１２，２０３７−２０４４（２００３）
【非特許文献２】Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  Ｓｏｍｅ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｙｐｅｒｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ５２：４，７５７−７６０（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、リン酸化ＰＴＨを検出するためのアッセイを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
コンパクトディスク上の配列参照
本願は、米国特許法規則１．５２（ｅ）に従って本明細書とともに提出された、アミノ酸配列番号１−７を含んでいる２００６年９月作成の同一な二つの（２）コンパクトディスクを参照する。
【００１１】
本発明は、血清、血漿もしくは細胞培養培地のような試料流体中の特定のＰＴＨまたはＰＴＨフラグメントの量を測定するための、ある種の新規な抗体、そのような抗体の生産方法、ならびにそのような抗体の利用方法に関する。特に、そのような抗体は、ＰＴＨ分子の１７位にあるセリンアミノ酸がリン酸化されているＰＴＨまたはＰＴＨフラグメント［ｐ（１７）ＰＴＨ］に対して特異的である。
【００１２】
本発明の１つの実施形態は、１７位にリン酸化されたセリンアミノ酸を有している副甲状腺ホルモンに特異的な、ほぼ純粋な抗体または抗体フラグメントである。該抗体または抗体フラグメントは、アミノ酸１３−２２、すなわちＬｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（配列番号２）で構成される副甲状腺ホルモンエピトープに対し特異的であってよい。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、生体試料中のｐ（１７）ＰＴＨレベルの測定に役立つ抗体を生産する方法を企図している。該方法の第１ステップは、宿主動物において免疫反応を引き起こすため該宿主動物に第１のペプチド抗原を投与することである。第１のペプチド抗原は、ＰＴＨ中の１７番目の残基に存在しかつリン酸化されているアミノ酸セリンを少なくとも含んでいる、ＰＴＨの一部分とほぼ同様のアミノ酸配列を有する。次に、宿主動物への第１のペプチド抗原の投与によって生じる抗体価を観察する。適切な時に、前記宿主動物において産生された抗血清を抽出する。その後、抽出した抗血清をアフィニティクロマトグラフィに供する。具体的には、抗血清を、第２のペプチド抗原を有するアフィニティカラムにかけるとよい。第２のペプチド抗原は生物活性形態のｐ（１７）ＰＴＨであり、溶出の際に生物活性形態のｐ（１７）ＰＴＨに親和性を有する抗体を抗血清から回収するのを可能とする。その後、溶出相から回収した抗体を再びアフィニティクロマトグラフィに供する。今度は、抗体を、第３のペプチド抗原を含んでいるアフィニティカラムにかけるとよい。第３のペプチド抗原は、リン酸化されていない形態の生物活性ＰＴＨである。カラムのフロースルー画分から回収された抗体を単離することによって、リン酸化された形態の生物活性ＰＴＨに親和性を有するが、リン酸化されていない形態には親和性のない、少なくとも１つの抗体を回収し、この回収された抗体によってリン酸化形態のＰＴＨだけが確実に計測されるようにすることが可能である。
【００１４】
第１のペプチド抗原は、キャリアタンパク質、例えばマレイミド活性化キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）に結合されてもよい。第１のペプチド抗原は、結合を助けるためにＰＴＨ（１３−２２）（配列番号２）にシステインアミノ酸が付加されているＣｙｓ−１２  ｈＰＴＨ（１３−２２）、すなわちアミノ酸配列Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（配列番号３）であってもよい。下記に限定されるものではないが、第２のペプチド抗原はｐ（１７）ＰＴＨ（１−８４）（配列番号１）またはｐ（１７）ＰＴＨ（１−３４）（配列番号４）であってよい。下記に限定されるものではないが、第３のペプチド抗原はＰＴＨ（１−３４）（配列番号４）またはＰＴＨ（１−８４）（配列番号１）であってよい。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態は、生体試料中のｐ（１７）ＰＴＨの量を計測する方法で構成される。そのような１つの方法は、試料に、ｐ（１７）ＰＴＨに特異的な抗体と、生物活性を有する標識ｐ（１７）ＰＴＨとを添加することを含んでいる。試料中のｐ（１７）ＰＴＨ、および生物活性を有する標識ｐ（１７）ＰＴＨは、ｐ（１７）ＰＴＨ抗体上の結合部位について競合し、該部位に結合する。試料中のｐ（１７）ＰＴＨの量を測定するためには、抗体に結合した標識ｐ（１７）ＰＴＨの量を計測する。本法は競合イムノアッセイであるので、結合した標識ｐ（１７）ＰＴＨの量は試料中のｐ（１７）ＰＴＨの量に反比例する。抗体は、アミノ酸１３−２２（配列番号２）で構成されている副甲状腺ホルモンエピトープに特異的であってよい。抗体は固体担体に結合されていてもよいし、液体状態で添加されて後で沈澱させることができてもよい。生物活性を有する標識ｐ（１７）ＰＴＨは、酵素、蛍光性の化学薬品、放射性同位元素、化学発光性の化学薬品、または比色定量用の試薬で構成される検出可能な成分を含んでいてもよい。下記に限定されるものではないが、生物活性を有する標識ｐ（１７）ＰＴＨは、ｐ（１７）ＰＴＨ（１−３４）（配列番号４）またはｐ（１７）ＰＴＨ（１−８４）（配列番号１）であってよい。
【００１６】
試料中のｐ（１７）ＰＴＨの量を計測するための別の方法には、試料に、ｐ（１７）ＰＴＨに特異的な第１の抗体であって少なくともＰＴＨのリン酸化された１７番目のアミノ酸と結合する抗体を添加することが挙げられる。ＰＴＨの一部分であって前記第１の抗体が結合する部分以外の部分に特異的な第２の抗体も、試料に添加する。この２つの抗体のうちの一方を、検出可能な成分で標識する。２つの抗体を試料中のｐ（１７）ＰＴＨと結合させることにより、ｐ（１７）ＰＴＨ、第１の抗体、および第２の抗体から構成されている標識複合体が形成される。その後、標識複合体の量を計測して試料中のｐ（１７）ＰＴＨの量を測定する。第２の抗体は固体担体に結合されていてもよいし、液体状態で試料に添加されてもよい。該方法は、標識複合体を沈澱させることをさらに含んでもよい。第１または第２の抗体は、酵素、蛍光性の化学薬品、放射性同位元素、化学発光性の化学薬品、または比色定量用の試薬で構成される検出可能な成分を含んでいてもよい。第２の抗体は、第１の抗体と同時に添加されてもよいし、順次添加されてもよい。第１の抗体は、アミノ酸１３−２２（配列番号２）で構成されている副甲状腺ホルモンエピトープに特異的であってよい。下記に限定されるものではないが、第２の抗体は、アミノ酸７７−８４（配列番号５）、アミノ酸３９−８４（配列番号６）、アミノ酸４４−６８（配列番号７）、またはアミノ酸１−３（配列番号８）で構成されている副甲状腺ホルモンエピトープに特異的であってよい。
【００１７】
本発明の上記およびその他の特徴は、図面を参照すればより明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｈＰＴＨ（１−８４）タンパク質のアミノ酸一覧を示す図（配列番号１）である。
【図２Ａ】ｈＰＴＨ（１３−２２）ペプチドのアミノ酸一覧を示す図（配列番号２）である。
【図２Ｂ】Ｃｙｓ−１２  ｈＰＴＨ（１３−２２）ペプチドのアミノ酸一覧を示す図（配列番号３）である。
【図３】ｈＰＴＨ（１−３４）ペプチドのアミノ酸一覧を示す図（配列番号４）である。
【図４】ｈＰＴＨ（７７−８４）ペプチドのアミノ酸一覧を示す図（配列番号５）である。
【図５】ｈＰＴＨ（３９−８４）ペプチドのアミノ酸一覧を示す図（配列番号６）である。
【図６】ｈＰＴＨ（４４−６８）ペプチドのアミノ酸一覧を示す図（配列番号７）である。
【図７】ｈＰＴＨ（１−３）ペプチドのアミノ酸一覧を示す図（配列番号８）である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に述べる詳細な説明は、本発明の現時点で好ましい実施形態の説明として意図されるものであり、本発明が構築または利用されうる唯一の形態を表わすように意図されるものではない。この説明は、本発明の構築および実施のためのステップの機能および順序について示す。しかしながら、当然のことであるが異なる実施形態によって同一もしくは等価な機能および順序が遂行されてもよく、かつ該機能および順序は本発明の範囲内に包含されるように意図される。
【００２０】
ｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体の作製
ヒト副甲状腺ホルモンの１３位〜２２位のアミノ酸に、システインアミノ酸を１２位に伴って構成されている１１アミノ酸のペプチドであって、１７位のアミノ酸がリン酸化されているもの［Ｃｙｓ−１２  ｐ（１７）ｈＰＴＨ（１３−２２）］（配列番号３）を、当分野で周知の常法によって合成した。該ペプチドの具体的なアミノ酸配列はＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（配列番号３）であり、先に述べたように１７位のセリンアミノ酸がリン酸化されている。その後、ペプチドを、マレイミド活性化キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）とコンジュゲートした。このコンジュゲートしたリン酸化ペプチドを用いて、当分野で周知の常法によってヤギを免疫した。数か月後に、免疫したヤギから抗血清を採取した。ｈＰＴＨの１７位のリン酸化アミノ酸領域に特異的でない抗体の生成を最小限にするために、長いペプチドではなく１１アミノ酸のペプチドをヤギの免疫に使用した。ｐ（１７）ｈＰＴＨ（１−３４）ペプチド（配列番号４）を常法によって合成し、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＴＭ）４Ｂアフィニティカラムに共有結合させた。ｐ（１７）ｈＰＴＨ（１−３４）ペプチド（配列番号４）を使用したが、ｐ（１７）ｈＰＴＨ（１−８４）ペプチド（配列番号１）も使用可能であろうと考えられる。というのも、いずれの分子も生物学的活性を有するからである。コンフォーメーションからみて正しい構造の循環血中ｐ（１７）ｈＰＴＨと結合する抗体を選択するように、Ｃｙｓ−１２  ｐ（１７）ｈＰＴＨ（１３−２２）（配列番号３）ではなく生物学的に活性なペプチドをアフィニティカラムに連結する。
【００２１】
その後、調製済みアフィニティカラムに抗血清を通過させ、続いて非結合タンパク質をカラムから洗い流し、結合した抗体をカラムから溶出させ、該抗体をすべて当分野で周知の常法を使用して有効化した。リン酸化されていないｈＰＴＨ（１−３４）ペプチド（配列番号４）を、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂに共有結合させることにより、第二のアフィニティカラム一式を調製した。この場合もｈＰＴＨ（１−３４）ペプチド（配列番号４）を使用したが、ｈＰＴＨ（１−８４）ペプチド（配列番号１）も使用可能であろうと考えられる。というのも、いずれもｈＰＴＨの生物学的に活性な形態であるからである。その後、ｐ（１７）ｈＰＴＨカラムの溶出ステップから回収した抗体をｈＰＴＨ（１−３４）カラムに通過させて、リン酸化されていない形態のｈＰＴＨを認識して結合するｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体の部分を除去する。最終的な抗体調製物の特異性がｈＰＴＨのリン酸化型だけに対するのを確実にするために、このステップは不可欠である。上記ステップの結果、精製されたｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体が得られる。
【００２２】
ｐ（１７）ｈＰＴＨ（１−８４）およびｐ（１７）ｈＰＴＨフラグメントの循環血中レベルを検出および定量するためのイムノアッセイ法
１．競合阻害アッセイ
一定限度量のｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体を、検出可能な成分で標識されたｐ（１７）ｈＰＴＨ（１−３４）ペプチド（配列番号４）またはｐ（１７）ｈＰＴＨ（１−８４）ペプチド（配列番号１）と、ｐ（１７）ｈＰＴＨに関して試験すべき試料とともに混合する。上記の標識ｐ（１７）ｈＰＴＨおよび試料中の非標識ｐ（１７）ｈＰＴＨは、抗体上の一定限度数の結合部位について競合する。インキュベーション期間を経た後、標識および非標識両方の結合していないｐ（１７）ｈＰＴＨを反応混合物から除去し、抗体に結合している標識ｐ（１７）ｈＰＴＨの量を計測する。計測される標識ｐ（１７）ｈＰＴＨの量は、試料中のｐ（１７）ｈＰＴＨの濃度に反比例する。試料中に存在するｐ（１７）ｈＰＴＨの量を定量するために、同時に標準物についても実施する。
【００２３】
ｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体は、アッセイに先立って固相に固定化されてもよいし、液体として用いられてインキュベーション後に固定化もしくは沈澱されてもよい。このアッセイは、完全長ｐ（１７）ｈＰＴＨ（１−８４）（配列番号１）および１７位にリン酸化セリンを含んでいるすべてのｈＰＴＨフラグメントを検出する。
【００２４】
２．二部位式「サンドイッチ」免疫測定アッセイ
このアッセイではｈＰＴＨに対する２つの異なる抗体が採用され、該抗体のうち一方はｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体であり、他方はｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体が対象とする部分とは相違しているｈＰＴＨ分子の部分を対象とする。該抗体のうち一方を検出可能な成分で標識することも考えられる。他方の抗体を、アッセイに先立って固相に固定化すること、あるいはその抗体に特異的な固相と反応させることによりアッセイ後に固定化することも考えられる。
【００２５】
この二部位式「サンドイッチ」免疫測定アッセイは、既知量のｐ（１７）ｈＰＴＨを含有している標準物を、２つの抗体と順次または同時に反応させた後でインキュベートすることにより実施する。所望の試料についても、２つの抗体と混合してインキュベートする。２つの抗体は標準物または試料の中に存在するｐ（１７）ｈＰＴＨに結合し、標識された抗体−ｐ（１７）ｈＰＴＨ複合体を形成する。その後、最終的に固相に結合した標識複合体から、非標識抗体が洗い流される。その後、この結合しているサンドイッチ複合体を計測して試料中に存在するｐ（１７）ｈＰＴＨのレベルを測定する。上述の競合アッセイとは異なり、この場合、計測結果は試料中に存在するｐ（１７）ｈＰＴＨの濃度に正比例する。
【００２６】
二部位式の免疫測定アッセイを利用する多くの手法が可能である。使用する抗体の組み合わせは、限定するものではないが：ｈＰＴＨ（７７−８４）（配列番号５）に特異的な抗体とｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体との組み合わせ、ｈＰＴＨ（３９−８４）（配列番号６）に特異的な抗体とｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体との組み合わせ、ｈＰＴＨ（４４−６８）（配列番号７）に特異的な抗体とｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体との組み合わせ、あるいはｈＰＴＨ（１−３）（配列番号８）に特異的な抗体とｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体との組み合わせであってよい。先の手法はいずれも、ｐ（１７）ｈＰＴＨ（１−８４）（配列番号１）とともに、１７位にリン酸化セリンを含んでいる種々の異なるｈＰＴＨフラグメントを計測することになる。最後の手法は、ｐ（１７）ｈＰＴＨの生物学的に活性な全ての形態、すなわちｈＰＴＨ受容体に結合し該受容体を活性化する全ての形態のｈＰＴＨを計測することになろう。
【００２７】
抗ｈＰＴＨ（７７−８４）抗体および抗ｈＰＴＨ（３９−８４）抗体を利用するイムノアッセイ法であって、ｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体がペルオキシダーゼで標識され、他方の抗体がビオチン化されるアッセイ法が作り出された。これらのＥＬＩＳＡアッセイは、ストレプトアビジンでコーティングを施したマイクロタイタープレート中で実施され、かつ標準物としてｐ（１７）ｈＰＴＨ（１−８４）（配列番号１）を利用するものであった。５０μＬの各標準物と５０μＬの組み合わせ抗体とを、マイクロタイタープレートのウェルに添加した。次いで、プレートを水平式回旋装置上で３時間インキュベートし、その後洗浄した。１００μＬのＴＭＢを添加し、水平式回旋装置上でさらに３０分間インキュベートして、ペルオキシダーゼと反応させて適切に発色させた。５０μＬのＨＣｌを添加することにより反応を停止させた。その後、プレートを分光光度計にて４５０ｎｍで読み出した。いずれのＥＬＩＳＡアッセイも１〜４ｐｇ／ｍＬの下限値を感知した。
【００２８】
上記の説明は例として示したものであり、限定ではない。上記開示を前提として、当業者であれば本明細書に開示された発明の範囲内および思想内で変形形態を考案することができると考えられよう。例えば、例証実験はヒトＰＴＨを対象としたが、セリンアミノ酸はすべての哺乳類動物種において１７位に保存されており、そのようなものとして、所望の生物種の異なるＰＴＨ配列に相当するように免疫化ペプチドを修正することにより、本発明の方法を使用して他の哺乳類動物種のためのｐ（１７）ＰＴＨ抗体および他の哺乳類動物種のｐ（１７）ＰＴＨに特異的なイムノアッセイを作製することができると考えられよう。ｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体のさらなる使用は、１７位にセリンを含むｈＰＴＨ分子のエピトープに対する抗体を少なくとも１つ使用するｈＰＴＨ計測用アッセイに、ｐ（１７）ｈＰＴＨ抗体を採り入れることであろう。このことにより、該アッセイはリン酸化型および非リン酸化型のｈＰＴＨ分子もしくはフラグメントをいずれも検出することが可能となり、また現在の第二世代のｈＰＴＨアッセイにおいて見られる誤差は排除されるであろう。さらに、生物学的に活性な形態のすべてのｈＰＴＨを検出するように設計されるイムノアッセイは、ｈＰＴＨ（１−３）（配列番号８）に対する抗体に加えて、アミノ酸配列１３−２２（配列番号２）を含んでいるリン酸化および非リン酸化ｈＰＴＨをいずれも検出する抗体の組み合わせを採り入れる必要があろう。というのも、受容体との結合だけでなく活性化も確実にするためには両方のｈＰＴＨセグメントが必要であり、かつｈＰＴＨおよびｐ（１７）ｈＰＴＨはいずれも生物学的活性を有することが示されているからである。さらに、本明細書に開示された実施形態の様々な特徴は、単独で、または互いに様々に組み合わせて使用することが可能であり、本明細書中で説明された特定の組み合わせに限定されるようには意図されない。したがって、特許請求の範囲は例証した実施形態によって限定されるものではない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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