(57)【要約】【課題】眼疾患を治療するためのＴＧＦ−β受容体阻害剤又はアクチビン様キナーゼ（ＡＬＫ）５阻害剤、Ａ−８３−０１及びＳＢ−４３１５４２の使用方法及び創傷治療条件を提供する。【解決手段】アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤の有効量を含む、緑内障ろ過手術後に生じ得る結膜瘢痕化の防止に有用な医薬組成物。同様に開示されるものは、アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤を含む医薬組成物の一定量を適用することを含む眼科手術後に発現し得る角膜の濁り及び結膜瘢痕化の治療方法である。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼科手術及び／又は眼球外傷に伴う瘢痕組織の形成を減少する方法であって、
成長因子−βを形質転換するシグナル伝達経路を阻害するのに充分な量で、下記式
【化１】
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及び
【化２】
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及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるアクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤の有効量並びにそれらの医薬的に許容可能なビヒクルを含む組成物を、手術後の部位又は外傷後の部位に適用することを含む方法。
【請求項２】
前記アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤が、約１．０ないし約１０．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤が、下記式
【化３】
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を表し、約１．０ないし約３．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤が、下記式
【化４】
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を表し、約１．０ないし約１０．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記組成物が更に、持続放出ポリマーキャリアを含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が更に、患者の眼の手術部位への投与においてゲル形成が可能なキャリア媒体を含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
眼科手術に伴う瘢痕組織の形成を減少する方法であって、
成長因子−βを形質転換するシグナル伝達経路を阻害するのに充分な量で、下記式
【化５】
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及び
【化６】
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及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるアクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤の有効量並びにそれらの医薬的に許容可能なビヒクルを含む組成物を、手術部位に適用することを含み、前記組成物は、局所適用の形態で手術に伴う前記手術部位に適用される方法。
【請求項８】
前記アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤が、約１．０ないし約１０．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤が、下記式
【化７】
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を表し、約１．０ないし約３．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤が、
【化８】
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を表し、約１．０ないし約１０．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が更に、患者の眼の手術部位へ投与してゲル形成が可能なキャリア媒体を含む請求項７記載の方法。
【請求項１２】
医薬組成物であって、該組成物は、手術後の眼球の瘢痕化の防止に有用であり、下記式
【化９】
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及び
【化１０】
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及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるアクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤の有効量を含む組成物。
【請求項１３】
前記アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤の医薬的に許容可能な塩を含む請求項１２記載の組成物。
【請求項１４】
前記アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤が、約１．０ないし約１０．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項１２記載の組成物。
【請求項１５】
前記アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤が、下記式
【化１１】
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を表し、約１．０ないし約３．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項１２記載の組成物。
【請求項１６】
前記アクチビン受容体様キナーゼ５阻害剤が、下記式
【化１２】
2011521969.tif 000016
を表し、約１．０ないし約１０．０μＭの量で前記組成物中に存在する請求項１２記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が更に、ポリマーキャリアを含む請求項１２記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が更に、患者の眼の手術部位へ投与してゲル形成が可能なキャリア媒体を含む請求項１２記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年５月３０日に出願された米国仮出願特許第６１／０５７，４６１号への優先権を請求する。
【０００２】
この発明の進展は、米国健康支援財団（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、Ｇ２００６−０１４及び米国国立眼科機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＥＹ０１７９２からの財政的支援により支持されている。政府機関は本発明に興味を持っている。
【背景技術】
【０００３】
背景
眼の線維傷害反応は、特に、緑内障のための外科的治療の結果として、視覚障害及び失明の主な原因である。緑内障は、米国における失明の主な原因であり、２０００年に２５０万人のアメリカ人及び世界中で６５００万人の人が該疾患に罹患した。緑内障は視神経頭への損傷並びに神経障害及び視力障害により特徴付けられる疾患である。緑内障の主な危険因子の一つは、房水流出路における異常の結果として生じる眼圧の上昇（ＩＯＰ）である。緑内障ろ過手術（ＧＦＳ）は通常、薬物治療がＩＯＰを的確に制御することに失敗した場合に行なわれる。
【０００４】
過度の術後瘢痕化が、しばしばＧＦＳの失敗をもたらす。結膜の抗−瘢痕化治療として、ミトマイシン−Ｃ（ＭＭＣ）及び５−フルオロウラシルのような代謝拮抗剤の使用が多くの患者に利益をもたらしているものの、これらは広範な細胞死を引き起こすことによって、その利益をもたらすのであって、低眼圧黄斑症及び感染症のような重度の及び潜在的な失明合併症を伴う。そのため、他の抗−瘢痕化のアプローチが調査されてきている。特に、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）及びその経路が、術後の抗−瘢痕化治療のための標的として浮上した。
【発明の概要】
【０００５】
図面の簡単な説明
本明細書に組み込まれ且つ本明細書の一部を構成する、添付の図面は、本発明の観点の種々の実施例態様を説明する種々の実施例系、方法等を説明する。図中で説明される成分枠（例えば、四角形、四角形の群又は他の形状）は、枠の１例を表すものと理解され得る。当業者は、１種の要素は、多重要素として設計され得るか又は多重要素は１種の要素として設計され得ると理解し得る。別の要素の内部構成材として示される要素は、外部構成材として実施され得るが、その逆も同じである。更に、要素は、縮尺通りとは限らない。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、緑内障ろ過手術の間のヒトの目の側面図である。
【図２】図２は、ウサギの培養結膜線維芽細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達レベル上のＡＬＫ−５阻害剤、Ａ−８３−０１の効果を示すグラフである。
【図３】図３は、ウサギの培養結膜線維芽細胞のＴＧＦ−βシグナル伝達レベル上のＡＬＫ−５阻害剤、ＳＢ−４３１５４２の効果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＡＬＫ−５阻害剤、Ａ−８３−０１及びＳＢ−４３１５４２で処理されたウサギの培養結膜線維芽細胞における結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）の発現を示すウエスタンブロッティング像である。
【図５】図５は、ＡＬＫ−５阻害剤、Ａ−８３−０１及びＳＢ−４３１５４２で処理されたウサギの培養結膜線維芽細胞におけるフィブロネクチン及びα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現を示すウエスタンブロッティング像である。
【図６】図６は、ＡＬＫ−５阻害剤、Ａ−８３−０１及びＳＢ−４３１５４２で処理されたウサギの培養結膜線維芽細胞におけるＣＴＧＦ、フィブロネクチン及びα−ＳＭＡの発現を示す免疫細胞蛍光発光像である。
【図７】図７は、ＡＬＫ−５阻害剤、Ａ−８３−０１及びＳＢ−４３１５４２で処理されたウサギの培養結膜線維芽細胞の線維芽細胞形態を示す位相差顕微鏡像である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
詳細な説明
ここで開示されるものは、哺乳類における緑内障ろ過手術後の眼疾患及び眼球瘢痕化の予防及び治療方法である。好ましくは、該方法は緑内障のろ過手術中又はその後のヒトの患者に対する治療に使用され得る。緑内障ろ過手術（ＧＦＳ）おいて、眼からの液体の排水を容易にするために新規な排水部位が創出されると、それにより眼における眼圧が低下する。図１に示されるように、ヒトの眼は、他の構成要素中に、結膜１２、小柱網１４、虹彩１６、角膜１８、網膜２４及び水晶体２６を含む。
【０００８】
ＧＦＳの間、眼の通常の排水部位（小柱網）１４中への排水の代わりに、房水が眼の結膜１２の下に創出された新規な“空間”中へ排水される。これを行うために、白眼の中に小さなフラップが作成される。その後、通路の開口部２０とろ過胞と呼ばれる貯水部２２の間に新規な排水路２８が創出される。房水と呼ばれる、前房及び後房中の流体は、その後、新規な排水路２８を介して胞２２中へ排水され、眼の周囲の血管中へ吸収される。胞２２及び／又は新規な排水路２８は、傷跡を残し得、そして、該房水が適度に流れ出るのを防ぐ経路を閉ざしてしまうが、胞不全と呼ばれる。
【０００９】
形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）は、創傷治癒反応の主要なメディエーターである。眼において、ＴＧＦ−βは、レーザー手術後の角膜の濁り及び緑内障ろ過手術後の結膜瘢痕化の誘発において関与してきた。加えて、ＴＧＦ−βの上方調節は、網膜剥離手術の失敗の主原因である、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）に関わっている。
【００１０】
アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）５阻害剤は、ＴＧＦ−βのシグナル伝達経路を遮断し、よって、ＧＦＳ、硝子体網膜手術、角膜外傷の治療及びＬＡＳＩＫを含む、眼科手術後の角膜の濁り及び瘢痕化を防止するために使用され得る。同様に、ＡＬＫ−５阻害剤の使用は、現行の抗−瘢痕化薬剤に付随する副作用、例えば、出血、感染、腫脹、瘢痕化、網膜剥離、眼瞼下垂、複視、視力低下又は失明でさえ減少し得る。最終的に、ＡＬＫ−５阻害剤のヒトの眼への局所適用は、緑内障と関連する眼圧を低下させ得る。
【００１１】
一つの態様において、以下に示される化合物の１種又はそれ以上のものが使用し得る。入手可能な所で、製造業者指定のものが提供されてきている。該化合物は、ミズーリ州、セントルイス、ピー．オー．ボックス１４５０８のシグマ（Ｓｉｇｍａ）社から入手可能である。
【化１】
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【００１２】
上述の組成物は、ＡＬＫ−５阻害剤及び医薬的に許容可能なその塩を含み得、それはポリマーキャリア及び投与においてゲル形成が可能なキャリアのような、眼内使用のために好適な医薬ビヒクルの種々のタイプの中に含まれることがある。ビヒクルは、好ましくは水性であり、眼組織と化学的及び物理的に相溶性となるように処方される。例えば、生体内分解性の（又は生体内崩壊性の）ゲル又はコラーゲン挿入物は、胞における阻害剤の有効濃度を保持するために使用され得る。そのようなゲル又は挿入物の使用は、手術部位で活性成分の持続放出を提供する利点を有する。
【００１３】
組成物は、ＡＬＫ−５阻害剤の有効量を含み得る。好ましくは、組成物は、ＡＬＫ−５阻害剤の約０．３ないし約１５μＭ、より好ましくは阻害剤の約３ないし約１０μＭを含み得る。１５μＭを越える量を含むその組成物もまた使用し得ることは、当業者に理解されることであろう。
【００１４】
当業者が理解するであろうように、上述の組成物は、無菌であるべきであり、敏感な眼内組織、特に、角膜／内皮細胞に対して毒性を示すあらゆる薬剤も含むべきでない。上述の組成物は、当業者に既知の技術に従って処方し得る。
【００１５】
上述の組成物は、種々の技術の手段により手術部位へ適用し得る。例えば、該組成物は、手術の間に又は手術後直ちに、好ましくは４時間以内に注射の手段により、又は手術部位上又は手術部位周囲の眼中へ挿入し得る持続放出ポリマーを用いて適用され得る。該組成物は、角膜の濁りを防止又は減少するために、ＬＡＳＩＫ後の局所処方で手術部位に適用され得る。
【実施例】
【００１６】
阻害剤及びＴＧＦ−β２を用いるインビトロの細胞調製
試料の線維芽細胞は、ニュージーランド白ウサギの眼から得られた。該線維芽細胞は、対象者の眼から単離された結膜組織に由来するものであった。細胞の３ないし５代継代は、イーグル最小必須培地、１０％ウシ胎児血清、５％子牛血清、必須アミノ酸及び非必須アミノ酸及び抗生物質から構成される媒体３ｍＬを用いて２５ｃｍ2フラスコ中で保持された。該細胞が集まった時に、トリプシン処理され及び継代された。
【００１７】
６−ウェルプレート中の線維芽細胞培養物は、種々の濃度、０．０３、０．１、０．０３、１．０、３．０及び１０．０μＭで、ＡＬＫ−５阻害剤を含む媒体２ｍＬと一緒に１時間前処理され、更に、ＴＧＦ−β２（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮ）２ｎｇ／ｍＬで７２時間まで処理された。表１に示されるように、試料１−７は、ＡＬＫ−５阻害剤Ａ−８３−０１を用いて及び試料８−１４は、ＡＬＫ−５阻害剤ＳＢ４３１５４２を用いて調製された。
【００１８】
試料１５及び１６は、対照として調製された。試料１５は、ＡＬＫ−５阻害剤又はＴＧＦ−β２で処理されなかった。試料１６は、ＴＧＦ−β２  ２ｎｇ／ｍＬで処理されたが、ＡＬＫ−５阻害剤で処理されなかった。試料は、以下の表１に示されるように調製された。
【表１】
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【００１９】
ＣＴＧＦのウエスタンブロッティング
阻害剤及び／又はＴＧＦ−β２を用いた処理の後、種々の試料からの細胞は採取され、定量的な評価を提供するためにウエスタンブロッティングが行われた。結膜線維芽細胞はトリトン溶解緩衝液中で溶解された。溶解物中の総タンパク質は、ブラッドフォードタンパク質分析を用いて定量された。タンパク質の等量（２０μｇ／レーン）が１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルに溶解された。タンパク質はその後、ニトロセルロース膜へ転写された。
【００２０】
１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、該膜は、ポリクローナルヤギ抗−ＣＴＧＦ（１：２００、サンタクルーズ  バイオテクノロジー、サンタクルーズ、ＣＡ、）でプローブされ、そして、ＨＲＰ標識−ロバ抗−ヤギＩｇＧ（１：１，０００；ジャクソン  イムノリサーチ、ウエストグローブ、ＰＡ）が続いた。ＴＧＦ−βシグナルは、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）（ロックフォールド、ＩＬ）製のスーパーシグナル（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ）を使用する高感度化学発光（ＥＣＬ）により検出された。濃度測定はその後、バンドの強度を測定することにより達成された。
【００２１】
濃度測定は、低下したＣＴＧＦタンパク質のバンドの強度、即ち、１μＭを超える濃度で試料は、３７−３８及び４２−４４ｋＤａを示し、ＡＬＫ−５阻害剤で処理された試料における減少したタンパク質レベルを示す。膜はまた、内部標準として、ハウスキーピング遺伝子、グリセロアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼのためにもプローブされた。図２−３で示されるように、最大阻害の半分の濃度（ＩＣ５０）が、ＴＧＦ−β２機能の阻害における各阻害剤の効果を評価するために計算された。阻害剤の濃度が増加するに従って、阻害されるＴＧＦ−β２のパーセンテージもまた増加した。該成長因子の阻害のパーセンテージが、投与された各阻害剤の特定の濃度に依存することに留意すべきである。一般的に、該成長因子は、阻害剤の少なくとも１μＭでの細胞への適用により、ある程度
阻害された。シグナル経路の阻害を提供するのに３μＭ程度が必要な場合があった。阻害剤無しに調製された対照試料は、ＴＧＦ−βシグナル経路の阻害機能を示さなかった。図２−３中、グラフの“−１”境界線は、試料１５が試験された場合に見られる、ＡＬＫ−５阻害剤及びＴＧＦ−β無しのＴＧＦ−β下流タンパク質の発現パーセンテージを表し、“０”境界線は、各ＡＬＫ−５阻害剤は添加されないが、ＴＧＦ−β溶液は添加されて試験される、試料１６からの試験データを表す。
【００２２】
阻害剤の低濃度を用いて調製された試料の中には、実際に、シグナル経路の活性において増加を示したものもあったが、阻害剤を用いる効果的な治療は、使用した特定の阻害剤及び手術部位へ適用した阻害剤の濃度に依存するであろうとの結論を導く。更に、長時間に亘り、手術部位において、阻害剤の一定濃度を維持するのが望ましい。従って、局所ゲル、ポリマーインプラント等を伴うような、組成物の持続放出を提供する方法を伴って阻害剤を適用することが望ましくあり得る。
【００２３】
α−ＳＭＡ及びフィブロネクチンのためのウエスタンブロッティング
各阻害剤での処理後の、フィブロネクチン及びα−ＳＭＡタンパク質発現を試験するために、試料１−１６において調製されたように、ウサギ結膜線維芽細胞が４８ないし７２時間培養された。図５で示されるように、Ａ−８３−０１及びＳＢ−４３１５４２はＴＧＦ−Ｂ２により誘発されるタンパク質発現を効果的に阻害した。Ａ−８３−０１及びＳＢ−４３１５４２で処理された試料における、両タンパク質のバンド強度は、阻害剤で処理されなかった試料のバンドに比べて、減少された。タンパク質レベルの減少は、阻害剤の濃度を高くするほど顕著になる。ブロットはまた、均等なタンパク質負荷を制御するためのβ−アクチンのためにもプローブされる。
【００２４】
表１中で説明されるように、Ａ−８３−０１及びＳＢ−４３１６４２で処理された線維芽細胞におけるα−ＳＭＡ及びフィブロネクチンの発現は、阻害剤がＴＧＦ−β２シグナル経路を遮断する範囲を決定するために測定された。細胞溶解物中のタンパク質（２０μｇ／レーン）は、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル上で溶解された。タンパク質はニトロセルロースに転写された。１％ウシ血清アルブミンでブロッキングした後、該膜は、モノクローナルマウス抗−α−ＳＭＡ（１：９，０００）でプローブされ、続いて、ＨＲＰ標識−ヤギ抗−マウスＩｇＧ（１：１５０，０００；ジャクソン）でプローブされるか又は、モノクローナルマウス抗−フィブロネクチン（１：１，０００）でプローブされ、続いて、ＨＲＰ標識−ヤギ抗−マウスＩｇＧ（１：１０，０００）でプローブされた。シグナルは、高感度化学発光により検出された。
【００２５】
免疫細胞蛍光発光顕微鏡画像化技術
別の実施例において、結膜線維芽細胞は８−ウェルチャンバースライド上で培養された。該試料は試料５−６及び１３−１６として調製され、７２時間培養された。阻害剤処理の後、線維芽細胞培養物は各々、４％パラホルムアルデヒドを用いて又はアレクサフロウ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）のための氷冷法若しくはＦＩＴＣ染色を用いて固定された。透過化の後、細胞培養物は、ポリクローナルヤギ抗−ＣＴＧＦ（１：５０、サンタクルーズ）で培養され、続いて、アレクサフロウ  ロバ抗−ヤギＩｇＧ（１０μｇ／ｍＬ、インビトロジェン）、モノクローナルマウス抗−フィブロネクチン（１０μｇ／ｍＬ、インビトロジェン）又はモノクローナルマウス抗−α−ＳＭＡ（１：４００、シグマ）で培養され、続いてＦＩＴＣヤギ抗−マウスＩｇＧ（１：１００、ジャクソン  イムノリサーチ）で培養された。細胞培養物は、ＤＡＰＩを伴う水性マウント媒体を用いてマウントされ、蛍光顕微鏡検査法により観察された。
【００２６】
図６に示されるように、ＣＴＧＦ、フィブロネクチン及びα−ＳＭＡは、ＦＩＴＣ又はアレクサフロウ標識（緑）で視覚化された。核種はＤＡＰＩ（青）で染色された。ＣＴＧ
Ｆ、α−ＳＭＡ及びフィブロネクチンのための染色における劇的な増加が、ＴＧＦ−β２培養後に観察された。ＴＧＦ−β２−誘導タンパク質の染色強度は、細胞がＡ−８３−０１又はＳＢ４３１５４２阻害剤と同時に処理された場合、大きく低下した。何れの阻害剤のバー５０μＭで処理された試料においても、明白な細胞死は観察されなかった。
【００２７】
線維芽細胞形態
別の実施例において、ウサギ線維芽細胞は、２ｎｇ／ｍＬに代えて、５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β２を試料に添加した以外は、試料６、１４、１５及び１６と同様にして調製された。該細胞培養物の形態は、図７において示されるように、位相差顕微鏡法により視覚化された。ＴＧＦ−β２で処理された細胞において、筋線維芽細胞様の外観が観察された。該ＴＧＦ−β２誘導形態学的変化は、Ａ−８３−０１又はＳＢ４３１５４２の添加により回避されるように思われた。阻害剤で処理された試料に、明白な細胞死は観察されなかった。
【００２８】
ＡＬＫ阻害剤、Ａ−８３−０１及びＳＢ−４３１５４２は、ウサギの培養結膜線維芽細胞における創傷治癒に関連するＴＧＦ−β２活性を効果的に遮断する。何れの阻害剤で調製された細胞培養物においても、明確な細胞毒性は観察されなかった。よって、これらの阻害剤は、特に、緑内障ろ過手術のための、眼球抗−瘢痕化剤として使用し得る。
【００２９】
実施例の方法及び組成物は、記載された実施例により説明され、また、該実施例はかなり詳細に述べられているが、それは、該添付の請求項の範囲を制限したり、多少なりとも、そのような詳細まで限定したりするという出願人の意図ではない。もちろん、ここに記載される、システム、方法、デバイス等を記載するという目的で、成分又は方法論の考えられる組み合わせ全てを記載することは可能でない。更なる利点及び改良は、当業者にとって容易であると考えられる。従って、本発明は、提示及び記載された、特定の細目、代表的な装置及び説明に役立つ実施例に限定されない。よって、この出願は、添付の請求項の範囲に含まれる変更、改良、変化を包含することを目的とする。更に、前述の説明は本発明の範囲を限定することを意味しない。むしろ、本発明の範囲は、添付された請求項及びそれらの等価物により決定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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