(57)【要約】  本発明は、第二のＦａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換され；二重特異性抗体がＦｃドメインを含まない、第一のＦａｂ断片及び第二のＦａｂ断片を含み、Ｔ細胞活性化抗原および腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体、その生産方法、前記抗体を含む薬学的組成物、及びその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のＦａｂ断片及び第二のＦａｂ断片を含む、Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体であって、第二のＦａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換され；二重特異性抗体がＦｃドメインを含まない、二重特異性抗体。
【請求項２】
第一の断片が腫瘍抗原に特異的な少なくとも一の抗原結合部位を含み；第二のＦａｂ断片がＴ細胞活性化抗原に特異的な少なくとも一の抗原結合部位を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
Ｔ細胞活性化抗原がＣＤ３Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）抗原である、請求項１又は２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
第二のＦａｂ断片のＮ末端が第一のＦａｂ断片のＣ末端へ連結されている、請求項１から３に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
第三のＦａｂ断片を更に含む、請求項１から４に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
第三のＦａｂ断片が腫瘍抗原に特異的な少なくとも一の抗原結合部位を含む、請求項１から５に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
第三のＦａｂ断片が第一のＦａｂ断片へ連結されている、請求項５又は６に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
第三のＦａｂ断片が第一のＦａｂ断片のＮ末端へ連結されている、請求項７に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
第三のＦａｂ断片が第二のＦａｂ断片へ連結されている、請求項５又は６に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
第三のＦａｂ断片のＮ末端が第一のＦａｂ断片のＣ末端へ連結されている、請求項９に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
Ｆａｂ断片がペプチドリンカーを介して連結されている、請求項１から１０の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
ペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）２リンカーである、請求項１１に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
腫瘍抗原は、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、及びＣＤ３３からなる群から選択され、請求項１から１２の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
腫瘍抗原がＭＣＳＰである、請求項１３に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
請求項１から１４に記載の二重特異性抗体を含む薬学的組成物。
【請求項１６】
癌の治療のための請求項１から１４に記載の二重特異性抗体。
【請求項１７】
医薬として使用のための請求項１から１４に記載の二重特異性抗体。
【請求項１８】
医薬の製造における請求項１から１４に記載の二重特異性抗体の使用。
【請求項１９】
医薬が癌の治療用である、請求項１８の使用。
【請求項２０】
請求項１から１４の何れか一項に記載の二重特異性抗体の軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子を含む原核生物又は真核生物の宿主細胞。
【請求項２１】
抗体が産生されるように請求項２０に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗体を産生する方法。
【請求項２２】
特に、前述の実施例を参照して本明細書に記載される発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、第二のＦａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換され；二重特異性抗体がＦｃドメインを含まない、第一のＦａｂ断片及び第二のＦａｂ断片を含み、Ｔ細胞活性化抗原および腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体、その生産方法、前記抗体を含む薬学的組成物、及びその使用に関する。
【０００２】
背景
個々の細胞又は特定の細胞型の選択的破壊は、様々な臨床設定において望ましい場合が多い。例えば、健常細胞及び組織を損傷を受けない状態にしつつ、腫瘍細胞を特異的に破壊することは癌治療の主要な目標である。一つのアプローチは、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のような免疫エフェクター細胞による腫瘍細胞の攻撃及びその後の破壊をトリガーする腫瘍に対する免疫応答を選択的に誘導することである。ＣＴＬは、免疫系の最も強力なエフェクター細胞を構成するが、しかしそれらは従来の治療抗体のＦｃドメインによって媒介されるエフェクター機構によって活性化することができない。この点で、一つの「腕」で標的細胞上の表面抗原に、第ニの「腕」でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性な不変成分に結合することができる二重特異性抗体は近年の関心となっている。その標的の両方に対する二重特異性抗体の同時結合は、細胞傷害性Ｔ細胞及び標的細胞のその後の溶解の活性化を引き起こす、癌細胞とＴ細胞との間の一時的な相互作用を強制する。
【０００３】
いくつかの二重特異性抗体フォーマットが開発されており、Ｔ細胞媒介性癌免疫療法のためのそれらの適合性を調べた。このうち、いわゆるＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞結合性(engager)）分子は非常によく特徴づけられ、既にクリニックでいくつかの有望な結果が示されてきた（Nagorsen and Baeuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)に総説される）。２のｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されるＢｉＴＥは、タンデムなｓｃＦｖ分子である。Ｔ細胞の係合のために評価される更なる二重特異性のフォーマットは、ダイアボディ（Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)）およびなタンデムダイアボディなどその誘導体（Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66 (1999)）が挙げられる。より最近の開発は、二重特異性抗体フォーマットに基づいているが、更なる安定化のためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴としているいわゆるＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）分子である（Moore et al., Blood 117, 4542-51 (2011)）。全体がハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であり、また現在臨床試験において評価されつつあるいわゆるｔｒｉｏｍａｂは大きなサイズのフォーマットを表している（Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)に総説される）。
【０００４】
しかし、既知のＴ細胞媒介性癌免疫療法のために開発された二重特異性抗体は、今までのところ、それらの効力、毒性及び適用に関連して大きな欠点を有する。例えば、ＢｉＴＥ分子など小さな構築物は、−効率的にエフェクターと標的細胞を架橋できる一方−連続注入によって患者に投与されるためにそれらに要求される非常に短い血清半減期を有する。一方ＩｇＧ様フォーマットは−長い半減期という大きな利点を持ちながら−ＩｇＧ分子に固有の天然エフェクター機能に関連する毒性に悩まされる。この免疫原性の可能性は、有効な治療薬開発のために、ＩｇＧ様二重特異性抗体の別の望ましくない特徴である。最後に、二重特異性抗体の一般的な開発における大きな課題は、依然として臨床的に十分な量及び純度での二重特異性抗体構築物の産生である。同時発現の際の異なる特異性の抗体の重鎖と軽鎖の誤対合は、正確に組み立てられた構築物の収率を低下させ、多くの非機能性副生成物を生じる。
【０００５】
Ｔ細胞媒介性癌免疫療法のために現在利用可能な二重特異性抗体に関連した困難や欠点を考えると、依然としてそのような分子の新規な改良されたフォーマットの必要性がある。これらの欠点は、今、本発明の新規二重特異性抗体を用いて克服された。新規二重特異性抗体は、誤対合した副生成物の量が減少するため容易に高収量で産生することができ、それは当該技術分野で知られた二重特異性抗体断片よりも少ない凝集を示している。クロスオーバーアプローチを使用して、共通の軽鎖の生成を必要とすることなく正しいＬＣ会合を強制することができる。更に、新規二重特異性抗体は、多くの従来の二重特異性抗体断片と比較して、より高い分子量を有し、従って過剰な腎臓クリアランスを防止し、インビボでの半減期の改善につながる。新規二重特異性抗体は、完全に機能性であり、対応する従来の二重特異性抗体と同等又は改善された結合及び活性を有する。
【０００６】
本発明は、良好な有効性および生成可能性を低毒性と好ましい薬物動態特性と組み合わせたＴ細胞活性化および再指向のために設計された二重特異性抗原結合分子を提供する。
【０００７】
要約
本発明は、第二のＦａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換され；二重特異性抗体がＦｃドメインを含まない、第一のＦａｂ断片及び第二のＦａｂ断片を含み、Ｔ細胞活性化抗原および腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体に関する。
【０００８】
本発明の抗体は、腫瘍細胞の表面上の腫瘍抗原に特異的に結合し、同時にＴ細胞活性化抗原に結合する。それにより二重特異性抗体は、免疫応答を、特に腫瘍の部位で、誘発することが可能であり、続いて標的細胞のアポトーシスを生じる。
【０００９】
一態様において、少なくとも２つのｆａｂ断片を含むＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）が提供され、ここで第一のＦａｂ断片は腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含み；第二のＦａｂ断片は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含み、第二のＦａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換され；二重特異性抗体は、Ｆｃドメインを欠いている。
【００１０】
特に、本発明は、Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）標的化抗原である、二重特異性抗体に関する。
【００１１】
一態様において、少なくとも２つのｆａｂ断片を含むＣＤ３Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）が提供され、ここで第一のＦａｂ断片は腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含み；第二のＦａｂ断片は、ＣＤ３Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含み、第二のＦａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換され；二重特異性抗体は、Ｆｃドメインを欠いている。一実施態様において、第一及び第二のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介して連結されている。好ましくは、前記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２リンカーである。
【００１２】
一実施態様において、前記抗体は、さらに、第三のＦａｂ断片を含む。別の実施態様において、前記第三のＦａｂ断片は腫瘍抗原に特異的な少なくとも一の抗原結合部位を含む。一実施態様において、第三のＦａｂ断片は、第一のＦａｂ断片の軽鎖又は重鎖のＮ又はＣ末端に連結されている。別の実施態様において、第三のＦａｂ断片は、第二のＦａｂ断片の軽鎖又は重鎖のＮ又はＣ末端に連結されている。一実施態様において、第三のＦａｂ断片は第一又は第二のＦａｂ断片にペプチドリンカーを介して連結されている。好ましくは、前記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２リンカーである。
【００１３】
本発明の二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、三価又は多価、例えば四価又は六価であり得る。一実施態様において、前記二重特異性抗体は、腫瘍抗原（ＴＡ）及びＴ細胞活性化抗原をそれぞれ標的とする一つの結合部位を持つ二価（１＋１）フォーマットである。別の実施態様において、前記二重特異性抗体は、各々が腫瘍抗原（ＴＡ）を標的とする二つの結合部位、及びＴ細胞活性化抗原を標的とする一つの結合部位を持つ三価（２＋１フォーマット）である。好ましい実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３である。
【００１４】
第二の目的において本発明は、本発明の二重特異性抗体を含有する薬学的組成物に関する。
【００１５】
第三の目的において本発明は、癌を治療するための本発明の二重特異性抗体に関する。別の実施態様において、医薬としての二重特異性抗体の使用が提供される。好ましくは、前記使用は、癌の治療のためである。
【００１６】
更なる目的において、本発明は、本発明の二重特異性抗体の重鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の二重特異性抗体の軽鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の核酸配列を含む発現ベクター、及び本発明のベクターを含む原核生物または真核生物宿主細胞に関する。更に、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む抗体の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の典型的な二重特異性抗体のフォーマットの模式図。ａ）Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子のＣ末端、ｂ）Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子のＮ末端、ｃ）（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子のＣ末端、ｄ）（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子のＮ末端、ｅ）Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ−Ｆａｂ分子。
【図２】ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）の産生及び精製の分析：ＳＤＳ−Ｐａｇｅ：４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ（ＮｕＰａｇｅ［インビトロジェン］；クーマシー染色）：ａ）１−Ｍａｒｋ １２（インビトロジェン），２−ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）非還元型；ｂ）１−Ｍａｒｋ １２（インビトロジェン），２−ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）還元型。
【図３】ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）の産生及び精製の分析。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラムＡ２８０（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ［ＧＥヘルスケア］；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０μｇのサンプルを注入した）。
【図４】ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）の産生及び精製の分析。ＳＤＳ−Ｐａｇｅ：４−１２％ Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ （ＮｕＰａｇｅ［インビトロジェン］；クーマシー染色）：ａ）１−Ｍａｒｋ １２（インビトロジェン），２−ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）非還元型；ｂ）１−Ｍａｒｋ １２（インビトロジェン），２−ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）還元型。
【図５】ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）の産生及び精製の分析。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラムＡ２８０（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ［ＧＥヘルスケア］；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０μｇのサンプルを注入した）。
【図６】ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）の産生及び精製の分析。ＳＤＳ−Ｐａｇｅ：４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ（ＮｕＰａｇｅ［インビトロジェン］；クーマシー染色）：ａ）１−Ｍａｒｋ １２（インビトロジェン），２−ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）非還元型；ｂ）１−Ｍａｒｋ １２（インビトロジェン），２−ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）還元型。
【図７】ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）の産生及び精製の分析。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラムＡ２８０（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ［ＧＥヘルスケア］；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０μｇのサンプルを注入した）。
【図８】マウスＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）の産生及び精製の分析。ＳＤＳ−Ｐａｇｅ：４−１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓ（ＮｕＰａｇｅ［インビトロジェン］；クーマシー染色）：ａ）１−Ｍａｒｋ １２（インビトロジェン）２−マウスＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）非還元型；ｂ）１−Ｍａｒｋ １２（インビトロジェン），２−マウスＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）還元型。
【図９】マウスＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）の産生及び精製の分析。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラムＡ２８０（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ［ＧＥヘルスケア］；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０μｇのサンプルを注入した）。
【図１０】ヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ：Ｔ比＝５：１）、及びｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）（＝「Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」），ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）（＝「Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ−Ｆａｂ」），ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）（＝「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」），並びに（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）（＝「（ｓｃＦｖ）２」）二重特異性分子の異なる濃度による２０時間の活性化に際して、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出により測定される）死滅。二価のＭＣＳＰ標的化を有する構築物は、（ｓｃＦｖ）２構築物と比較して同程度の細胞傷害活性を示すが、一方一価のＭＣＳＰ結合を有する「Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」構築物は明らかに作用が弱い。
【図１１】ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）（＝「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」）及び（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）（＝「（ｓｃＦｖ）２」）構築物の比較、ヒトパンＴ細胞との共培養（Ｅ／Ｔ比＝５：１）及び二重特異性構築物と対応するＩｇＧの異なる濃度による２１時間の活性化に際しての、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍細胞からのＬＤＨの放出が示されている。「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」は、（ｓｃＦｖ）２分子と少なくとも同程度に良好に標的細胞においてアポトーシスを誘導する。
【図１２】ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）（＝「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」）及び（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）（＝「（ｓｃＦｖ）２」構築物の比較。ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ／Ｔ比＝１０：１）、及び二重特異性構築物及び対応するＩｇＧの．異なる濃度による２６時間の活性化に際してのＭＶ−３ヒトメラノーマ腫瘍細胞からのＬＤＨ放出を示す。「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」は、（ｓｃＦｖ）２分子と少なくとも同程度に良好に標的細胞においてアポトーシスを誘導する。
【図１３】ヒトＭＣＳＰを標的化するマウスＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）構築物（＝（Ｆａｂ）２−ＣｒｏｓｓＦａｂ）、並びにマウスＣＤ３との初代マウスＴ細胞活性化により誘導されたＢ１６／Ｆ１０−ｈｕＭＣＳＰ Ｆｌｕｃ２，クローン４８からのＬＤＨ放出。標的細胞に対するエフェクター比は５：１であった。アッセイは３７℃で５％のＣＯ２での２３．５時間のインキュベーション後に分析した。構築物は、ヒトＭＣＳＰを発現する標的細胞のＴ細胞媒介性アポトーシスを濃度依存的に誘導する。
【図１４】ヒトＭＣＳＰを標的化する５０ｎＭのマウスＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）構築物（＝（Ｆａｂ）２−ＣｒｏｓｓＦａｂ）、並びにマウスＣＤ３との初代マウスＴ細胞活性化により誘導されたＢ１６／Ｆ１０−ｈｕＭＣＳＰ Ｆｌｕｃ２，クローン４８からのＬＤＨ放出。標的細胞に対するエフェクター比は５：１であった。アッセイは３７℃で５％のＣＯ２での２３．５時間のインキュベーション後に分析した。構築物は、ヒトＭＣＳＰを発現する標的細胞のＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導する。構築物のこの濃度でＴ細胞の弱い過剰活性がある。
【図１５】２４時間、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の存在下（Ａ、Ｂ）又は非存在下（Ｃ、Ｄ）で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）（＝「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」）及び（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）（＝「（ｓｃＦｖ）２」））で処置した後、全血の上清で測定した様々なサイトカインのレベル。示されるように、２８０μｌの全血を、９６ウェルプレートのウェルあたりに蒔き、３００００Ｃｏｌｏ−３８細胞を添加した。Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の存在下でＴ細胞の活性化の際に分泌された主要なサイトカインは、ＩＬ−６続いてＩＦＮガンマである。加えて、標的細胞の存在下でＴ細胞の活性化の際に、グランザイムＢのレベルは非常に増加した。一般に、（ｓｃＦｖ）２構築物は、標的細胞の存在下で（Ａ及びＢ）、他の二重特異性構築物と比較して、ＴＮＦ及びＩＦＮガンマ、並びにグランザイムＢのレベルを少し上昇させた。標的細胞の存在（または非存在）下で二重特異性構築物によるＴ細胞の活性化の際に、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−１０およびＩＬ−４）の有意な分泌はなかった。このアッセイにおいて、標的細胞の存在下で、「（Ｆａｂ）２−Ｃｒｏｓｓｆａｂ」構築物により誘導されるＩＦＮガンマの弱い分泌もあった。
【図１６】脾細胞から単離したマウスパンＴ細胞上の後期活性化マーカーＣＤ２５の表面発現レベル。マウスパンＴ細胞は、Ｂ１６／Ｆ１０−ｈｕＭＣＳＰ Ｆｌｕｃ２クローン４８腫瘍標的細胞の存在下又は非存在下で、５０ｎＭのマウスＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）構築物（＝（Ｆａｂ）２−ＣｒｏｓｓＦａｂ）二重特異性構築物（マウスＣＤ３、並びにヒトＭＣＳＰを標的とする）とともにインキュベートした（Ｅ：Ｔ比は１０：１）。７０時間後のＣＤ８＋Ｔ細胞上の後期活性化マーカーＣＤ２５の発現レベルを示す。（Ｆａｂ）２−ＣｒｏｓｓＦａｂ構築物によるＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５の上方制御は、標的細胞の存在下においてのみ起きる。同じモル濃度に調整されて使用された参照のＩｇＧはＣＤ２５を上方制御することができなかった。
【図１７】Ｆａｂ（ＣＤ３３）−ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＤ３）の産生及び精製の分析。ＳＤＳ−Ｐａｇｅ：ａ）３−８％トリス／酢酸（ＮｕＰａｇｅ［インビトロジェン］；クーマシー染色）：ａ）１−ＨｉＭａｒｋ（インビトロジェン），２−Ｆａｂ（ＣＤ３３）−ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＤ３）．非還元型；ｂ）４−１２％Ｂｉｓ／トリス（ＮｕＰａｇｅ［インビトロジェン］：１−Ｍａｒｋ １２（インビトロジェン），２−Ｆａｂ（ＣＤ３３）−ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＤ３）．還元型。
【図１８】Ｆａｂ（ＣＤ３３）−ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＤ３）の産生及び精製の分析。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラムＡ２８０（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ［ＧＥヘルスケア］；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０μｇのサンプルを注入した）。
【図１９】ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）、及び異なる濃度のＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）；「１＋１ 非Ｆｃ」と表される，及び（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）（＝「（ｓｃＦｖ）２」）参照分子）による２４時間の活性化に際しての、ＭＶ−３腫瘍細胞の（ＬＤＨ放出によって測定される）死滅。「１＋１ 非Ｆｃ」構築物は、計算されるＥＣ５０が２５．４ｐＭでＭＶ−３標的細胞でアポトーシスを誘導するが、一方「（ｓｃＦｖ）２」参照分子の計算されるＥＣ５０は５７ｐＭで、ＥＣ５０の観点から、「１＋１ 非Ｆｃ」分子の僅かに良好な有効性を示している。
【図２０】ＣＤ６９の上方制御により測定されるＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化（Ａ）、ＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（それぞれ、ｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）；「１＋１ 非Ｆｃ」と表される，及び（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）（＝「（ｓｃＦｖ）２」）参照分子）で〜２４時間処置された、ヒトＰＢＭＣとの共培養の際、ｈｕＭＣＳＰ陽性ＭＶ−３腫瘍細胞の存在下でのＣＤ６９陽性細胞の各増加（Ｂ）。一般に、ＣＤ６９の中央値は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞上でより高い。両方の構築物において、ＣＤ６９中央値並びにＣＤ６９陽性細胞の割合の両方で明らかな濃度依存的な増加がある。
【図２１】（ｓｃＦｖ）２参照分子の模式図。
【図２２】（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）の産生及び精製の分析。ＳＤＳ−Ｐａｇｅ：４−１２％Ｂｉｓ／トリス（ＮｕＰａｇｅ［インビトロジェン］；クーマシー染色）：１−Ｍａｒｋ １２（インビトロジェン），２−（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）還元型；３−（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ），非還元型。
【図２３】（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）の産生及び精製の分析。分析用サイズ排除クロマトグラフィー、クロマトグラムＡ２８０（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬ［ＧＥヘルスケア］；２ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．３，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ；５０μｇのサンプル（（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ））を注入した）。
【００１８】
本発明の実施態様の詳細な記述
Ｉ．定義
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に４つのＦＲのドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。従って、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００１９】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。幾つかの実施態様において、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、Ｖはヒト免疫グロブリンのフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列に、配列が同一である。
【００２０】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的には、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからのものである。一般的には、配列のサブグループは、 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3にあるサブグループである。一実施態様において、ＶＬについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループカッパＩである。一実施態様において、ＶＨについて、サブグループは上掲のＫａｂａｔらにあるサブグループＩＩＩである。
【００２１】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変であるか、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３つの６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。典型的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。超可変領域（ＨＶＲ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）なる用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分への参照において本明細書で互換的に使用される。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) and by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)に記述されており、そこで本定義は、相互に対して比較するときにアミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。にも関わらず、抗体又はその変異体のＣＤＲを参照するために、何れかの定義の適用は、本明細書において定義され使用される用語の範囲内であることを意図されている。上記の引用文献の各々によって定義されるように、ＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基が、比較として以下の表１に記載されている。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列や大きさによって異なる。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。
2014529600.tif 000002
【００２２】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能である可変領域配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列それ自体を超えた任意の実験データに頼ることなく、任意の可変領域配列に対してこのＫａｂａｔの番号付けシステムを一義的に割り当てることができる。本明細書で用いる場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」とは、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)で明記されている番号付けシステムを指す。特記されない限り、抗体可変領域内の特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの参照は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従う。
【００２３】
ＶＨのＣＤＲ１の例外を除いて、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」をも含む。ＳＤＲは、略称（abbreviated-）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれる、ＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２で生じる。(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）。特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従い、本明細書において番号が付けられる。
【００２４】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。特に、用語「抗体」は、Ｆｃドメインは含まないが少なくとも２つのｆａｂ断片を含む本発明の二重特異性抗体を含む。
【００２５】
用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。ある実施態様において、二重特異性抗原は、２つの抗原決定基、特に２つの別個の細胞上に発現した２つの抗原決定基を同時に結合することが可能である。
【００２６】
「抗原への一価結合」なる用語は、抗体に含まれる一以下の抗原がその抗原に特異的に結合することを意味する。
【００２７】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００２８】
本明細書で使用される、用語「組換えヒト抗体」は、ＮＳ０又はＣＨＯ細胞などの宿主細胞から、又はヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物から単離された抗体、又は宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体など、組換え方法により調製され、発現され、作成され又は単離された全てのヒト抗体を含むことを意図する。このような組換えヒト抗体は再配置された形態で可変及び定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、インビボで体細胞超変異にさらされている。従って、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒトの生殖系列のＶＨ及びＶＬ配列に由来し関連しているが、インビボでヒト抗体生殖系列のレパートリーのうちに存在しない可能性がある配列である。
【００２９】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来アミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。所定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、全てまたは実質的にＦＲの全てが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げた抗体を指す。本発明により包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関する本発明の特性を生成するために、定常領域が元の抗体のそれから更に修飾または変更されているものである。
【００３０】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる起源又は種から由来し、通常組換えＤＮＡ技術により調製される抗体を指す。マウス可変領域およびヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明により包含される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関する本発明の特性を生成するために、定常領域が元の抗体のそれから修飾または変更されているものである。このようなキメラ抗体は「クラススイッチ抗体」と呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント及び免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含む、発現された免疫グロブリン遺伝子の産物である。キメラ抗体を作製する方法は、従来の組換えＤＮＡを含み、遺伝子トランスフェクション技術は、当該分野で周知である。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第５，２０２，２３８号及び第５，２０４，２４４号を参照。
【００３１】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００３２】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)に記載される。更に、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴、即ち、ＶＬドメインと一緒に機能的な抗原結合部位へアセンブルすることができる特徴、又はＶＬドメインの特徴、即ち、ＶＨドメインと一緒に機能的な抗原結合部位へアセンブルすることができる特徴を有し、それによって、完全長抗体の抗原結合性を付与する単鎖ポリペプチドを含む。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」は、軽鎖のＶＬドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片、及び重鎖のＶＨドメイン及び第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。本発明の二重特異性抗体は少なくとも２つのＦａｂ断片を含み、第二のＦａｂ断片の重鎖と軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換される。可変領域又は定常領域のどちらかの交換に起因して、前記第二のＦａｂ断片はまた「クロス−Ｆａｂ」断片、又は「ｘＦａｂ」断片又は「クロスオーバーＦａｂ」断片とも言う。クロスオーバーＦａｂ分子の２つの異なる鎖の構成が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる。一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の可変領域が交換され、即ちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖及び重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖を含む。クロスオーバーＦａｂ分子はまたＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも言う。一方では、Ｆａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されるとき、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖及び軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖を含む。クロスオーバーＦａｂ分子はまたＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも言う。
【００３４】
一実施態様において、前記Ｆａｂ断片は、ペプチドリンカーを介して連結されている。「連結された」とは、Ｆａｂ断片が、直接または一つ以上のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されていることを意味する。
【００３５】
本発明で使用される用語「ペプチドリンカー」は、好ましくは合成起源のものであるアミノ酸配列を持つペプチドを意味する。本発明に係るこれらのペプチドリンカーはＦａｂ断片の一つを他のＦａｂ断片のＣ−又はＮ−末端に連結し、本発明の多重特異性抗体を形成するために使用される。好ましくは、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸の長さ、好ましくは５から１００の長さ、より好ましくは１０から５０のアミノ酸の長さを持つアミノ酸を有するペプチドである。一実施態様において、前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここで、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３，ｎ＝３，４，５又は６，及びｍ＝０，１，２又は３）又は（ｘ＝４，ｎ＝２，３，４又は５及びｍ＝０，１，２又は３），好ましくはｘ＝４及びｎ＝２又は３，、より好ましくはｘ＝４，ｎ＝２である。さらに、リンカーは免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでもよい。一実施態様において、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２（配列番号２８）である。Ｆａｂ断片を連結するために適した他のペプチドリンカーは、例えば、（Ｇ４Ｓ）６−ＧＧ（配列番号１４７）又は（ＳＧ３）２−（ＳＥＧ３）４−（ＳＧ３）−ＳＧ（配列番号１４８），又はＥＰＫＳＣ（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１４５及び１４６）である。
【００３６】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全体に相補的であり特異的に結合する領域を含む抗原結合分子の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、エピトープと呼ばれる抗原の特定の部分にのみ結合することができる。抗原結合ドメインは、例えば、一以上の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により与えられうる。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００３７】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91頁 (2007)を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照。
【００３８】
「抗体の抗原結合部位」は、本明細書で使用されるとき、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部位は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、ここで定義する高頻度可変領域の残基以外の可変ドメイン残基である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインは、ＮからＣ末端に、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与する領域であり、抗体の特性を定める。ＣＤＲ及びＦＲは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) の標準的定義に従って決定され、及び／又は「超可変ループ」からの残基である。
【００３９】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができる任意のポリペプチド決定因子を含む。ある実施態様において、エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基を含み、そして、特定の実施態様では、特異的な三次元構造特性、およびまたは特定の電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。
【００４０】
用語「Ｆｃドメイン」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。例えば、天然抗体では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤアイソタイプの抗体の２つの重鎖の第二および第三の定常ドメインに由来する２つの同一のタンパク質断片からなり；ＩｇＭおよびＩｇＥのＦｃドメインは、各ポリペプチド鎖中に３つの重鎖の定常ドメイン（ＣＨドメイン２−４）を含む。本発明の二重特異性抗体は、Ｆｃドメインを欠いている。本明細書で使用される「Ｆｃドメインを欠く」とは、本発明の二重特異性抗体が、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメインを含まない；つまり定常重鎖は、単に１つ以上のＣＨ１ドメインからなることを意味する。
【００４１】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（ＫＤ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
【００４２】
本明細書で使用される用語「結合」又は「特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、不必要な又は非特異的相互作用と区別されうることを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗原結合部分の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で解析される）(Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000))および伝統的な結合アッセイ(Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002))のいずれかによって測定することができる。一実施態様では、無関係のタンパク質への抗体の結合の程度は、例えばＳＰＲにより測定される場合、抗原に対する抗体の結合の約１０％未満である。ある実施態様において、抗原へ結合する抗原結合部分、又はその抗原結合部分を含む抗原結合分子は、解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ，、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。
【００４３】
一実施態様において、無関係のタンパク質へのＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により測定される場合、Ｔ細胞活性化抗原又は腫瘍抗原（ＴＡ）の結合の約１０％未満である。ある実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）へ特異的に結合する二重特異性抗体は、解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。ある実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）へ特異的に結合する二重特異性抗体は、異なる種からの、Ｔ細胞活性化抗原又は腫瘍抗原（ＴＡ）の間に保存されているＴ細胞活性化抗原又は腫瘍抗原（ＴＡ）のエピトープに結合する。
【００４４】
「親和性成熟」抗体とは、その改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性に改良を生じせしめる、その一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）において一又は複数の改変を持つものである。
【００４５】
用語「Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体」は、抗体が、腫瘍抗原を発現する細胞中又は細胞近傍でＴ細胞媒介性免疫応答を媒介するのに有用であるように十分な親和性でＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合することができる二重特異性抗体を指す。特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）抗原、特にヒト又はカニクイザルのＣＤ３，最も具体的にはヒトＣＤ３である。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３のイプシロンサブユニットである。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３のアルファ又はベータサブユニットである。
【００４６】
一実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原又は腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体は、ＣＤ３のエピトープの結合についてモノクローナル抗体Ｈ２Ｃ（ＰＣＴ公報ＷＯ２００８／１１９５６７に記載）と競合可能である。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原又は腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体は、ＣＤ３のエピトープの結合についてモノクローナル抗体Ｖ９（Rodrigues et al., Int J Cancer Suppl 7, 45-50 (1992) 及び米国特許第６，０５４，２９７号に記載）と競合可能である。更に別の実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原又は腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体は、ＣＤ３のエピトープの結合についてモノクローナル抗体FN18(Nooij et al., Eur J Immunol 19, 981-984 (1986)に記載）と競合可能である。
【００４７】
本明細書で使用する「活性化Ｔ細胞抗原」は、抗原結合分子との相互作用によりＴ細胞活性化を誘導することが可能である、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面に発現する抗原決定基を意味する。具体的には、活性化Ｔ細胞抗原と抗原結合分子との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達カスケードを誘発することにより、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。特定の実施態様において、活性化Ｔ細胞はＣＤ３である。
【００４８】
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の一つ以上の細胞応答を指す。本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子は、Ｔ細胞活性化を誘導することができる。Ｔ細胞活性化を測定するための適切なアッセイは、本明細書に記載の当該技術分野で知られている。
【００４９】
用語「ＣＤ３Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）」は本明細書で使用される場合、タンパク質複合体を指し、４つの異なる鎖から成る。哺乳動物では、複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖を含む。これらの鎖はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）として知られる分子及びζ−鎖と会合し、Ｔリンパ球に活性化シグナルを生成する。特に断らない限り、用語「ＣＤ３Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型ＣＤ３を含む。その用語は、「完全長」、未処理のＣＤ３並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＣＤ３を包含する。その用語はまた、天然に存在するＣＤ３の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。好ましい実施態様において、用語「ＣＤ３Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）」は、ヒト又はカニクイザルのＣＤ３、具体的にはヒトのＣＤ３を指す。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３のイプシロンサブユニットである。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３のアルファ又はベータサブユニットである。ヒヒトＣＤ３の典型的な配列は配列番号１０３に与えられる。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「腫瘍抗原（ＴＡ）」は、腫瘍関連抗原、並びに腫瘍特異的抗原、即ち腫瘍細胞によって発現される任意の免疫原性エピトープ（例えば、タンパク質）を指す。タンパク質は、非腫瘍細胞によって発現されるが、腫瘍細胞により発現される場合にのみ免疫原性でありうる。あるいは、タンパク質は、正常細胞ではなく腫瘍細胞によって発現されてもよい。好ましくは、本発明の抗ＴＡ抗体はＴＡの細胞外ドメインに結合する。一つの好ましい実施態様において、前記腫瘍抗原はヒト腫瘍抗原である。例示的な腫瘍抗原としては、限定されないが、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ６ＵＶＫ１，ＮＣＢＩ登録ＮＰ＿００１８８８）線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ，Ｕｎｉ Ｐｒｏｔ Ｑ１２８８４，Ｑ８６Ｚ２９，Ｑ９９９９８；ＮＣＢＩ登録ＮＰ＿００４４５１）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１及びＨＥＲ１としても知られる、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ００５３３；ＮＣＢＩ登録ＮＰ＿９５８４３９、ＮＰ＿９５８４４０）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ、癌胎児性抗原関連細胞接着分子５またはＣＤ６６ｅとしても知られる、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０６７３１， ＮＣＢＩ登録ＮＰ＿００４３５４）、及びＣＤ３３（ｇｐ７６またはシアル酸結合Ｉｇ様レクチン３（Ｓｉｇｌｅｃ−３）としても知られる、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２０１３８，ＮＣＢＩ登録ＮＰ＿００１０７６０８７、ＮＰ＿００１１７１０７９）を含む。
【００５１】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的である少なくとも一の抗原結合部位を含む。
【００５２】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、ＣＤ３３に特異的である少なくとも一の抗原結合部位を含む。
【００５３】
抗体特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。天然の抗体は、例えば、単一特異性である。本発明による「二重特異性抗体」は、２つの異なる抗原結合特異性を有する抗体である。本発明の抗体は、２つの異なる抗原、即ち第一抗原としてＴ細胞活性化抗原、第二抗原として腫瘍抗原に対して特異的である。
【００５４】
本明細書で使用する用語「単一特異性」抗体は、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する一以上の結合部位を有する抗体である。
【００５５】
本明細書で使用する用語「二重特異性」抗体は、各々が同じ抗原又は異なる抗原の異なるエピトープに結合する少なくとも二つの結合部位を有する抗体である。
【００５６】
本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。本明細書で提供されるのは、腫瘍抗原（ＴＡ）およびＴ細胞活性化抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、ＴＡの２つの異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体はまたＴＡを発現する細胞に対して細胞傷害性薬物を局在化させるために用いることができる。
【００５７】
本出願の中で使用する用語「価」は、抗体分子における指定された数の結合部位の存在を示す。このように、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗体分子において、それぞれ、２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位が存在することを意味する。本発明による二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、三価又は多価（例えば四価又は六価）であり得る。
【００５８】
本発明の抗体は、２つ以上の結合部位を有し、二重特異性である。つまり、抗体は２つ以上の結合部位がある場合でさえ（すなわち、抗体が三価または多価であること）、二重特異性であってもよい。
【００５９】
参照抗体として「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体、逆に競合アッセイにおいて５０％以上、その抗体のその抗原への結合をブロックするその参照抗体を指す。典型的な競合アッセイが、本明細書において提供される。
【００６０】
「交差反応性が実質的に無い」とは、分子（例えば抗体）が、分子の実際の標的抗原とは異なる抗原（例えば、標的抗原に密接に関連した抗原）を、特にその標的抗原と比較した場合に、認識しないか又は特異的に結合しないことを意味する。例えば、抗体が実際の標的抗原とは異なる抗原に対して約１０％未満から約５％未満が結合する場合があり、又は約１０％、９％、８％７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、又は０．１％未満、好ましくは約２％、１％又は０．５％未満、最も好ましくは約０．２％又は０．１％未満の、実際の標的抗原とは異なる抗原からなる群から選択される量において、実際の標的抗原とは異なる前記抗原に結合しうる。
【００６１】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作製され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２もまた、ジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【００６２】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して所定の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一と一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用し、直前の段落で説明したように得られる。
【００６３】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上または９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００６４】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００６５】
「Ｔ細胞活性化抗原又は腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクター内にそのような核酸分子を、及び宿主細胞中の一又は複数の場所に存在するそのような核酸分子を含む。
【００６６】
用語「アミノ酸」は、本出願で使用される場合、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に生じるカルボキシα−アミノ酸の群を示す。
【００６７】
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それがリンクされている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００６８】
本明細書中で用いる「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」なる表現は相互に交換可能に用いられ、かかる標記は子孫を含む。よって、「形質転換体」や「形質転換細胞」のような用語には、初代対象細胞と何世代移行したかを問わずそれから由来した培養物とを含む。全ての子孫が、意図的な突然変異あるいは意図せざる突然変異のため、正確に同一のＤＮＡ内容であるわけではないことも理解される。最初に形質転換された細胞に対してスクリーニングされたものと同じ機能あるいは生物的活性を有する変異型子孫も含まれる。
【００６９】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本明細書において含まれる。
【００７０】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００７１】
「イムノコンジュゲート」は、一以上の異種分子にコンジュゲートした抗体であり、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。
【００７２】
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死又は破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤）、成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など、抗生物質、小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）、及び以下に開示される様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含する。
【００７３】
用語「Ｎ末端」は、Ｎ末端の最後のアミノ酸を意味し、用語「Ｃ末端」は、Ｃ末端の最後のアミノ酸を意味する。
【００７４】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００７５】
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の製剤処方中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００７６】
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する(treat)」または「治療している(treating)」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００７７】
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。所定の実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【００７８】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【００７９】
本明細書で使用する用語「癌」は、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、細気管支肺胞性細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部又は頸部の癌、皮膚又は眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆管癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、多形性膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫などの増殖性疾患を意味し、上記癌の任意の難治性バージョン、又は上記癌のうちの一又は複数の組み合わせを含む。
【００８０】
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
【００８１】
ＩＩ．組成物及び方法
一態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的な第一の抗原結合部位および腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な第二の抗原結合部位を含む二重特異性抗体に一部が基づく。本発明の抗体は、例えば、癌の治療のために、有用である。
【００８２】
Ａ．Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）と結合する例示的な二重特異性抗体。
本発明は、腫瘍抗原（ＴＡ）を標的とする第二の抗原結合部位とＴ−細胞活性化抗原結合部位とを組み合わせた二重特異性抗体に関する。本発明の抗体は、腫瘍細胞の表面上の腫瘍抗原に特異的に結合し、同時に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面上の抗原に結合する。好ましくは前記抗原はＣＤ３Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）抗原である。二重特異性抗体は、免疫応答を、特に腫瘍の部位で、誘発することが可能であり、続いて標的細胞のアポトーシスを生じる。
【００８３】
本発明に係る特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、腫瘍細胞抗原、及び活性化Ｔ細胞抗原に同時に結合することが可能である。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、腫瘍細胞抗原及び活性化Ｔ細胞抗原に同時に結合することによって、Ｔ細胞および腫瘍細胞を架橋することができる。さらにより特定の実施態様において、このような同時結合は標的細胞の溶解をもたらす。一実施態様において、このような同時結合はＴ細胞の活性化をもたらす。他の実施態様において、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、および活性化マーカーの発現の群から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答をもたらす。一実施態様において、標的細胞抗原への同時結合を伴わないＴ細胞活性化二重特異性抗体の活性化Ｔ細胞抗原への結合は、Ｔ細胞活性化をもたらさない。
【００８４】
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、標的細胞へのＴ細胞の細胞傷害活性を再指向することができる。特定の実施態様において、前記再指向は、標的細胞及び／又はＴ細胞の特異性によって媒介されるＭＨＣ−ペプチド抗原提示とは無関係である。
【００８５】
特に、本発明の実施態様の何れかに記載のＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞はＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００８６】
一実施態様において第一のＦａｂ断片及び第二のＦａｂ断片を含む、Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体が提供され、ここで第二のＦａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換され；二重特異性抗体はＦｃドメインを含まない。
【００８７】
一態様において、少なくとも２つのｆａｂ断片を含むＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）が提供され、ここで第一のＦａｂ断片は腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含み；第二のＦａｂ断片は、Ｔ細胞活性化抗原に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含み、第二のＦａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換され；二重特異性抗体は、Ｆｃドメインを欠いている。
【００８８】
特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）抗原、特にヒト又はカニクイザルのＣＤ３，最も具体的にはヒトＣＤ３である。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３のイプシロンサブユニットである。幾つかの実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原はＣＤ３のアルファ又はベータサブユニットである。
【００８９】
一態様において、少なくとも２つのｆａｂ断片を含むＣＤ３Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）が提供され、ここで第一のＦａｂ断片は腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含み；第二のＦａｂ断片は、ＣＤ３Ｔ細胞共受容体（ＣＤ３）に特異的な少なくとも１つの抗原結合部位を含み、第二のＦａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換され；二重特異性抗体は、Ｆｃドメインを欠いている。
【００９０】
一実施態様において、第一及び第二のＦａｂ断片は、ペプチドリンカーを介して連結されている。好ましくは、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５アミノ酸の長さ、好ましくは５から１００の長さ、より好ましくは１０から５０のアミノ酸の長さを持つアミノ酸を有するペプチドである。一実施態様において、前記ペプチドリンカーは（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここで、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３，ｎ＝３，４，５又は６，及びｍ＝０，１，２又は３）又は（ｘ＝４，ｎ＝２，３，４又は５及びｍ＝０，１，２又は３），好ましくはｘ＝４及びｎ＝２又は３、より好ましくはｘ＝４，ｎ＝２である。一実施態様において、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。ペプチドリンカーは、第一及び第二のＦａｂ断片を連結するために使用される。
【００９１】
一実施態様において、第一のＦａｂ断片は第二のＦａｂ断片のＣ又はＮ末端へ連結されている。
【００９２】
一実施態様において、第一のＦａｂ断片は第二のＦａｂ断片のＮ末端へ連結されている。第二のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変又は定常ドメインが交換されるかどうかに依存して、第一のＦａｂ断片が第二のＦａｂ断片のＮ末端に連結されている場合、異なる二重特異性抗体分子が可能である。
【００９３】
一実施態様において、第二のＦａｂ断片の可変ドメインが交換され（即ち、第二のＦａｂ断片がＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨＶＬ）である）、第一のＦａｂ断片の重鎖又は軽鎖のＣ末端が第二のＦａｂ断片のＶＬＣＨ１鎖のＮ末端へ連結されている。好ましくは、第一のＦａｂ断片のＣ末端重鎖は、第二のＦａｂ断片のＶＬＣＨ１鎖のＮ末端へ連結されている。このように、一実施態様において、二重特異性抗体は三つの鎖：第一のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、ペプチドリンカーを介して第二のＦａｂ断片のＶＬＣＨ１鎖に連結された第一のＦａｂ断片の重鎖（ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＬＣＨ１）  及び第二のＦａｂ断片のＶＨＣＬ鎖を含む。
【００９４】
別の実施態様において、第二のＦａｂ断片の定常ドメインが交換され（即ち、第二のＦａｂ断片がＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）である）、第一のＦａｂ断片の重鎖又は軽鎖のＣ末端が第二のＦａｂ断片のＶＨＣＬ鎖のＮ末端へ連結されている。好ましくは、第一のＦａｂ断片の重鎖のＣ末端は、第二のＦａｂ断片のＶＬＣＬ鎖のＮ末端へ連結されている。このように、一実施態様において、二重特異性抗体は三つの鎖：第一のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、ペプチドリンカーを介して第二のＦａｂ断片のＶＨＣＬ鎖に連結された第一のＦａｂ断片の重鎖（ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＬ）及び第二のＦａｂ断片のＶＨＣＨ１鎖を含む。
【００９５】
一実施態様において、第一のＦａｂ断片は第二のＦａｂ断片のＣ末端へ連結されている。第二のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変又は定常ドメインが交換されるかどうかに依存して、第一のＦａｂ断片が第二のＦａｂ断片のＣ末端に連結されている場合、異なる二重特異性抗体分子が可能である。
【００９６】
一実施態様において、第二のＦａｂ断片の可変ドメインが交換され（即ち、第二のＦａｂ断片がＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨＶＬ）である）、第二のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインが第一のＦａｂ断片の重又は軽鎖のＮ末端へ連結されている。好ましくは、第二のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインは、第一のＦａｂ断片の重鎖のＮ末端へ連結されている。このように、一実施態様において、二重特異性抗体は三つの鎖：第一のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、ペプチドリンカーを介して第一のＦａｂ断片の重鎖に連結された第二のＦａｂ断片のＶＬＣＨ１鎖（ＶＬＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１）及び第二のＦａｂ断片のＶＨＣＬ鎖を含む。
【００９７】
別の実施態様において、第二のＦａｂ断片の定常ドメインが交換され（即ち、第二のＦａｂ断片がＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）である）、第二のＦａｂ断片のＣＬドメインが第一のＦａｂ断片の重又は軽鎖のＮ末端へ連結されている。好ましくは、第二のＦａｂ断片のＣＬドメインは、第一のＦａｂ断片の重鎖のＮ末端へ連結されている。このように、一実施態様において、二重特異性抗体は三つの鎖：第一のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、ペプチドリンカーを介して第一のＦａｂ断片の重鎖に連結された第二のＦａｂ断片のＶＨＣＬ鎖（ＶＬＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１）及び第二のＦａｂ断片のＶＬＣＨ１鎖を含む。
【００９８】
本発明の二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、三価又は多価、例えば四価又は六価であり得る。一実施態様において、前記二重特異性抗体は、腫瘍抗原（ＴＡ）及びＴ細胞活性化抗原をそれぞれ標的とする一つの結合部位を持つ二価（１＋１）フォーマットである。別の実施態様において、前記二重特異性抗体は、各々が腫瘍抗原（ＴＡ）を標的とする二つの結合部位、及びＴ細胞活性化抗原を標的とする一つの結合部位を持つ三価（２＋１フォーマット）である。
【００９９】
一実施態様において、前記抗体は、さらに、第三のＦａｂ断片を含む。一実施態様において、前記第三のＦａｂ断片は腫瘍抗原に特異的な少なくとも一の抗原結合部位を含む。一実施態様において、前記第三のＦａｂ断片の抗原結合部位は、第一のＦａｂ断片の抗原結合部位と同じ腫瘍抗原に特異的である。
【０１００】
一実施態様において、第三のＦａｂ断片は第一のＦａｂ断片のＮ又はＣ末端へ連結されている。一実施態様において、第三のＦａｂ断片は第一のＦａｂ断片にペプチドリンカーを介して連結されている。好ましくは、前記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２リンカーである。
【０１０１】
一実施態様において、第三のＦａｂ断片は、第一のＦａｂ断片の軽鎖又は重鎖のＮ又はＣ末端に連結されている。（上記で詳述したように）第一のＦａｂ断片のどちらの末端が第二のＦａｂ断片へ連結しているかに依存して、第三のＦａｂ断片は、第一の断片の反対側の（遊離）末端に連結されている。
【０１０２】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、前記Ｆａｂ断片と前記リンカーがＮ末端からＣ末端の方向へ次の順序：Ｆａｂ断片３−リンカー−Ｆａｂ断片１−リンカー−Ｆａｂ断片２で連結され、第二のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている三つのＦａｂ断片を含む。この実施態様において、第三のＦａｂ断片のＣ末端は第一のＦａｂ断片のＮ末端へ連結されている。上に詳述したように、Ｆａｂ断片は、重鎖又は軽鎖を介して互いに連結することができる。一実施態様において、第三のＦａｂ断片の重鎖のＣ末端は、ペプチドリンカーを介して第一のＦａｂ断片の重鎖のＮ末端へ連結され；第一のＦａｂ断片のＣ末端は、第二のＦａｂ断片のＮ末端へ連結され、ここで、第二のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換される。第二のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変又は定常ドメインが交換されるかどうかに依存して、異なる二重特異性抗体分子が可能である。
【０１０３】
一実施態様において、第二のＦａｂ断片の可変ドメインが交換され（即ち、第二のＦａｂ断片がＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨＶＬ）である）、三つのＦａｂ断片の鎖がＮ末端からＣ末端の方向へ次の順序：ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＬＣＨ１で連結されている。一実施態様において、二重特異性抗体は四つの鎖：第三のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、第一のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、ペプチドリンカーを介して第二のＦａｂ断片のＶＬＣＨ１鎖にそれ自身が連結された第一のＦａｂ断片の重鎖へ連結された第三の断片の重鎖（ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＬＣＨ１）及び第二のＦａｂ断片のＶＨＣＬ鎖を含む。
【０１０４】
一実施態様において、第二のＦａｂ断片の定常ドメインが交換され（即ち、第二のＦａｂ断片がＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）である）、三つのＦａｂ断片の鎖がＮ末端からＣ末端の方向へ次の順序：ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＬで連結されている。一実施態様において、二重特異性抗体は四つの鎖：第三のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、第一のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、ペプチドリンカーを介して第二のＦａｂ断片のＶＨＣＬ鎖にそれ自身が連結された第一のＦａｂ断片の重鎖へ連結された第三の断片の重鎖（ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＬ）及び第二のＦａｂ断片のＶＬＣＨ１鎖を含む。
【０１０５】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、前記Ｆａｂ断片と前記リンカーがＮ末端からＣ末端の方向で次の順序：Ｆａｂ断片２−リンカー−Ｆａｂ断片１−リンカー−Ｆａｂ断片３で連結され、第二のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている三つのＦａｂ断片を含む。この実施態様において、第三のＦａｂ断片のＮ末端は第一のＦａｂ断片のＣ末端へ連結されている。上に詳述したように、Ｆａｂ断片は、重鎖又は軽鎖を介して互いに連結することができる。一実施態様において、第三のＦａｂ断片の重鎖のＮ末端は、ペプチドリンカーを介して第一のＦａｂ断片の重鎖のＣ末端へ連結され；第一のＦａｂ断片のＮ末端は、第二のＦａｂ断片のＣ末端へ連結され、ここで、第二のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換される。第二のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変又は定常ドメインが交換されるかどうかに依存して、異なる二重特異性抗体分子が可能である。
【０１０６】
一実施態様において、第二のＦａｂ断片の可変ドメインが交換され（即ち、第二のＦａｂ断片がＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨＶＬ）である）、三つのＦａｂ断片の鎖がＮ末端からＣ末端の方向へ次の順序：ＶＬＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１で連結されている。一実施態様において、二重特異性抗体は四つの鎖：第三のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、第一のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、ペプチドリンカーを介して第一のＦａｂ断片の重鎖にそれ自身が連結された第一の断片の重鎖へ連結された第二のＦａｂ断片のＶＬＣＨ１鎖（ＶＬＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１）及び第二のＦａｂ断片のＶＨＣＬ鎖を含む。
【０１０７】
一実施態様において、第二のＦａｂ断片の定常ドメインが交換され（即ち、第二のＦａｂ断片がＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）である）、三つのＦａｂ断片の鎖がＮ末端からＣ末端の方向へ次の順序：ＶＨＣＬ−リンカー−ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１で連結されている。一実施態様において、二重特異性抗体は四つの鎖：第三のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、第一のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、ペプチドリンカーを介して第一のＦａｂ断片の重鎖にそれ自身が連結された第一の断片の重鎖へ連結された第二のＦａｂ断片のＶＨＣＬ鎖（ＶＨＣＬ−リンカー−ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１）及び第二のＦａｂ断片のＶＬＣＨ１鎖を含む。
【０１０８】
別の実施態様において、第三のＦａｂ断片は、第二のＦａｂ断片の軽鎖又は重鎖のＮ又はＣ末端に連結されている。一実施態様において、第三のＦａｂ断片は第二のＦａｂ断片にペプチドリンカーを介して連結されている。好ましくは、前記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２リンカーである。上に詳述したように、Ｆａｂ断片は、重鎖又は軽鎖を介して互いに連結することができる。
【０１０９】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、前記Ｆａｂ断片と前記リンカーがＮ末端からＣ末端の方向で次の順序：Ｆａｂ断片１−リンカー−Ｆａｂ断片１２−リンカー−Ｆａｂ断片３で連結され、第二のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換されている三つのＦａｂ断片を含む。一実施態様において、第三のＦａｂ断片のＮ末端は第二のＦａｂ断片のＣ末端へ連結されている。
【０１１０】
別の実施態様において、第三のＦａｂ断片の重鎖のＣ末端は、ペプチドリンカーを介して第二のＦａｂ断片のＮ末端へ連結され；第一のＦａｂ断片のＮ末端は、第二のＦａｂ断片のＣ末端へ連結され、ここで、第二のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のどちらかが交換される。
【０１１１】
第二のＦａｂ断片の重鎖及び軽鎖の可変又は定常ドメインが交換されるかどうかに依存して、異なる二重特異性抗体分子が可能である。
【０１１２】
一実施態様において、第二のＦａｂ断片の可変ドメインが交換され（即ち、第二のＦａｂ断片がＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＨＶＬ）である）、三つのＦａｂ断片の鎖がＮ末端からＣ末端の方向へ次の順序：ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＬＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１で連結されている。一実施態様において、二重特異性抗体は四つの鎖：第三のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、第一のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、ペプチドリンカーを介して、第二のＦａｂ断片のＶＬＣＨ１鎖のＮ末端及び第一のＦａｂ断片の重鎖のＮ末端に連結された前記ＶＬＣＨ１鎖のＣ末端に連結した第三の断片の重鎖（ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＬＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＨ１）及び第二のＦａｂ断片のＶＨＣＬ鎖を含む。
【０１１３】
一実施態様において、第二のＦａｂ断片の定常ドメインが交換され（即ち、第二のＦａｂ断片がＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）である）、三つのＦａｂ断片の鎖がＮ末端からＣ末端の方向へ次の順序：ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＬ−リンカー−ＶＨＣＨ１で連結されている。一実施態様において、二重特異性抗体は四つの鎖：第三のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、第一のＦａｂ断片の軽鎖（ＶＬＣＬ）、ペプチドリンカーを介して、第二のＦａｂ断片のＶＨＣＬ鎖のＮ末端及び第一のＦａｂ断片の重鎖のＮ末端に連結された前記ＶＨＣＬ鎖のＣ末端に連結した第三の断片の重鎖（ＶＨＣＨ１−リンカー−ＶＨＣＬ−リンカー−ＶＨＣＨ１）及び第二のＦａｂ断片のＶＬＣＨ１鎖を含む。
【０１１４】
一実施態様において、前記第三のＦａｂ断片の抗原結合部位は第一のＦａｂ断片の抗原結合部位と同じ腫瘍抗原に特異的であり、本発明の二重特異性抗体は次の順序で（Ｎ末端からＣ末端の方向又はＣ末端からＮ末端の方向のどちらかで）ペプチドリンカーを介して連結された三つのＦａｂ断片を含む：Ｆａｂ（ＴＡ）−リンカー−Ｆａｂ（ＴＡ）−リンカー−ｘＦａｂ（Ｔ細胞胞活性化抗原）、ここでＦａｂ（ＴＡ）は腫瘍抗原に特異的な抗原結合部位を有するＦａｂ断片を意味し、そしてｘＦａｂ（Ｔ細胞活性化抗原）はＴ細胞活性化抗原に特異的な抗原結合部位を有するＦａｂ断片を意味し、ここで重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される。
【０１１５】
一実施態様において、前記第三のＦａｂ断片の抗原結合部位は第一のＦａｂ断片の抗原結合部位と同じ腫瘍抗原に特異的であり、本発明の二重特異性抗体は次の順序で（Ｎ末端からＣ末端の方向又はＣ末端からＮ末端の方向のどちらかで）ペプチドリンカーを介して連結された三つのＦａｂ断片を含む：Ｆａｂ（ＴＡ）−リンカー−ｘＦａｂ（Ｔ細胞活性化抗原）−リンカ−Ｆａｂ（ＴＡ）、ここでＦａｂ（ＴＡ）は腫瘍抗原に特異的な抗原結合部位を有するＦａｂ断片を意味し、そしてｘＦａｂ（Ｔ細胞活性化抗原）はＴ細胞活性化抗原に特異的な抗原結合部位を有するＦａｂ断片を意味し、ここで重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される。
【０１１６】
一実施態様において、二重特異性抗体は、ＣＤ３のエピトープへの結合について、モノクローナル抗体Ｖ９と競合し得る抗原結合部分を含む。例えば、全体が参照によって本明細書に援用される、Rodigues et al., Int J Cancer Suppl 7 (1992), 45-50 ；米国特許第６，０５４，２９７号を参照。
【０１１７】
一実施態様において、二重特異性抗体は、ＣＤ３のエピトープへの結合について、モノクローナル抗体ＦＮ１８と競合し得る抗原結合部分を含む。例えば、全体が参照によって本明細書に援用される、Nooij et al., Eur J Immunol 19 (1986), 981-984を参照。
【０１１８】
一実施態様において、二重特異性抗体は、ＣＤ３のエピトープへの結合について、モノクローナル抗体ＣＨ２５２７（配列番号１５７及び１５８）又はその親和性成熟型変異体と競合し得る抗原結合部分を含む。
【０１１９】
一実施態様において、二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片を含み、ここで重鎖可変領域は配列番号１０又は配列番号３２のＣＤＲ１、配列番号１１又は配列番号３３のＣＤＲ２、及び配列番号１２又は配列番号３４のＣＤＲ３を含み；軽鎖可変領域は配列番号７又は配列番号２９のＣＤＲ１、配列番号８又は配列番号３０のＣＤＲ２、及び配列番号９又は配列番号３１のＣＤＲ３を含む。
【０１２０】
一実施態様において、二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片を含み、ここで重鎖可変領域は配列番号１０のＣＤＲ１、配列番号１１のＣＤＲ２、及び配列番号１２のＣＤＲ３を含み；軽鎖可変領域は配列番号７のＣＤＲ１、配列番号８のＣＤＲ２、及び配列番号９のＣＤＲ３を含む。
【０１２１】
一実施態様において、二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片を含み、ここで重鎖可変領域は配列番号３２のＣＤＲ１、配列番号３３のＣＤＲ２、及び配列番号３４のＣＤＲ３を含み；軽鎖可変領域は配列番号２９のＣＤＲ１、配列番号３０のＣＤＲ２、及び配列番号３１のＣＤＲ３を含む。
【０１２２】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域配列が配列番号２０又は配列番号３６に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり；軽鎖可変領域配列が配列番号１９又は配列番号３５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域が配列番号２０のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域が配列番号１９のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１２３】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域が配列番号３６のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１２４】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域が配列番号１５８のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域が配列番号１５７のアミノ酸配列を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域配列が配列番号１５８に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり；軽鎖可変領域配列が配列番号１５７に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域配列が配列番号１５８の親和性成熟型変異体であり；軽鎖可変領域配列が配列番号１５７の親和性成熟型変異体である、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１５８及び／又は配列番号１５７の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１２５】
一実施態様において、二重特異性抗体は、前記重鎖が配列番号２２又は配列番号３８のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、又は機能性を保持するその変異体を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖が配列番号２２又は配列番号３８のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含む腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１２６】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖が配列番号２２のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖が配列番号２２のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含む腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１２７】
一実施態様において、二重特異性抗体は、軽鎖が配列番号２１又は配列番号３７のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、軽鎖が配列番号２１又は配列番号３７のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含む腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１２８】
一実施態様において、二重特異性抗体は、軽鎖が配列番号２１のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、軽鎖が配列番号２１のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含む腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１２９】
更に別の具体的な実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含み、前記重鎖は配列番号２２又は配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み；前記軽鎖は配列番号２１又は配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【０１３０】
更に別の具体的な実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含み、前記重鎖は配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み；前記軽鎖は配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。
【０１３１】
更に別の具体的な実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含み、前記重鎖は配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含み；前記軽鎖は配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含み、及び腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖は本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１９の可変軽鎖、及び配列番号２０の可変重鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含んでなる、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１３３】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１９の可変軽鎖及び配列番号２０の可変重鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含む腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１３４】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号３５の可変軽鎖、及び配列番号３６の可変重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含んでなる、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１３５】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号３５の可変軽鎖及び配列番号３６の可変重鎖、及び配列番号３８のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含む腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１３６】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５７の可変軽鎖、及び配列番号１５８の可変重鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含んでなる、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１３７】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５７の可変軽鎖又はその親和性成熟型変異体、及び配列番号１５８の可変重鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含んでなる、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１５８及び／又は配列番号１５７の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１３８】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５７の可変軽鎖及び配列番号１５８の可変重鎖、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含む腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１３９】
一実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５７の可変軽鎖又はその親和性成熟型変異体及び配列番号１５８の可変重鎖又はその親和性成熟型変異体、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び配列番号２１のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含む腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１５８及び／又は配列番号１５７の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１４０】
一実施態様において、腫瘍抗原は、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、及びＣＤ３３からなる群から選択される。好ましい一実施態様では、腫瘍抗原はＭＣＳＰである。
【０１４１】
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的である少なくとも一の抗原結合部位を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、ＭＣＳＰのエピトープへの結合について、モノクローナル抗体Ｍ４−３ ＭＬ２（配列番号１６１及び１６２）又はその親和性成熟型変異体と競合し得る少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。
【０１４２】
一実施態様において、二重特異性抗体は、ＭＣＳＰに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖含み、ここで可変重鎖は配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、配列番号６のＣＤＲ３を含み；可変軽鎖は配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、及び配列番号３のＣＤＲ３を含む。
【０１４３】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域配列が配列番号１４に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり；軽鎖可変領域配列が配列番号１３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である、ＭＣＳＰに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１４４】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域配列が配列番号１６１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり；軽鎖可変領域配列が配列番号１６２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である、ＭＣＳＰに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１４５】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域配列が配列番号１６１の親和性成熟型変異体であり；軽鎖可変領域配列が配列番号１６２の親和性成熟型変異体である、ＭＣＳＰに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１６１及び／又は配列番号１６２の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１４６】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖が配列番号１６のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖が配列番号１６のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１４７】
一実施態様において、二重特異性抗体は、軽鎖が配列番号１５のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、軽鎖が配列番号１５のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する第二抗体の軽鎖及び重鎖、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１４８】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖定常領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含み；軽鎖定常領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１４９】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域が配列番号１４のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、重鎖定常領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含み；及び軽鎖定常領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１５０】
更なる実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１９の可変軽鎖、及び配列番号２０の可変重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖；及び配列番号１３の可変軽鎖、及び配列番号１４の可変重鎖を含む、ＭＣＳＰに特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１５１】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域が配列番号１６１のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域が配列番号１６２のアミノ酸配列を含み、重鎖定常領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含み；及び軽鎖定常領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１５２】
更なる実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１９の可変軽鎖、及び配列番号２０の可変重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖；及び配列番号１６１の可変軽鎖、及び配列番号１６２の可変重鎖を含む、ＭＣＳＰに特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１５３】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域が配列番号１６１のアミノ酸配列又はその親和性成熟型変異体を含み；軽鎖可変領域が配列番号１６２のアミノ酸配列又はその親和性成熟型変異体を含み、重鎖定常領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含み；及び軽鎖定常領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１６１及び／又は１６２の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１５４】
更なる実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１９の可変軽鎖、及び配列番号２０の可変重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖；及び配列番号１６１の可変軽鎖又はその親和性成熟型変異体、及び配列番号１６２の可変重鎖又はその親和性成熟型変異体を含む、ＭＣＳＰに特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１６１及び／又は配列番号１６２の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１５５】
更なる実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５８の可変軽鎖、及び配列番号１５７の可変重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖；及び配列番号１６１の可変軽鎖、及び配列番号１６２の可変重鎖を含む、ＭＣＳＰに特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１５６】
更なる実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５８の可変軽鎖又はその親和性成熟型変異体、及び配列番号１５７の可変重鎖又はその親和性成熟型変異体を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖；及び配列番号１６１の可変軽鎖又はその親和性成熟型変異体、及び配列番号１６２の可変重鎖又はその親和性成熟型変異体を含む、ＭＣＳＰに特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６１及び／又は配列番号１６２のうちの一以上の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１５７】
一実施態様において、二重特異性抗体は、可変重鎖が配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、配列番号６のＣＤＲ３を含み；可変軽鎖が配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２、及び配列番号３のＣＤＲ３を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する軽鎖及び重鎖を含む第三のＦａｂ断片を含む。
【０１５８】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域配列が配列番号１４に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり；軽鎖可変領域配列が配列番号１３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である、ＭＣＳＰに特異的に結合する軽鎖及び重鎖を含む第三のＦａｂ断片を含む。
【０１５９】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域配列が配列番号１６１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり；軽鎖可変領域配列が配列番号１６２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である、ＭＣＳＰに特異的に結合する軽鎖及び重鎖を含む第三のＦａｂ断片を含む。
【０１６０】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域配列が配列番号１６１の親和性成熟型変異体であり；軽鎖可変領域配列が配列番号１６２の親和性成熟型変異体である、ＭＣＳＰに特異的に結合する軽鎖及び重鎖を含む第三のＦａｂ断片を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１６１及び／又は配列番号１６２の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１６１】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖が配列番号１６のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する軽鎖及び重鎖を含む第三のＦａｂ断片を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖が配列番号１６のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する軽鎖及び重鎖、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＭＣＳＰに特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む、第三のＦａｂ断片を含む。
【０１６２】
一実施態様において、二重特異性抗体は、軽鎖が配列番号１５のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する軽鎖及び重鎖を含む第三のＦａｂ断片を含む。一実施態様において、二重特異性抗体は、軽鎖が配列番号１５のアミノ酸配列を含む定常領域を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する第二抗体の軽鎖及び重鎖、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、及びＭＣＳＰに特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１６３】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖定常領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含み；軽鎖定常領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する軽鎖及び重鎖を含む、第三のＦａｂ断片を含む。
【０１６４】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域が配列番号１４のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、重鎖定常領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含み；及び軽鎖定常領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する軽鎖及び重鎖を含む、第三のＦａｂ断片を含む。
【０１６５】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域が配列番号１６１のアミノ酸配列を含み；軽鎖可変領域が配列番号１６２のアミノ酸配列を含み、重鎖定常領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含み；及び軽鎖定常領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する軽鎖及び重鎖を含む、第三のＦａｂ断片を含む。
【０１６６】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域配列が配列番号１６１の親和性成熟型変異体であり、軽鎖可変領域配列が配列番号１６２の親和性成熟型変異体であり、重鎖定常領域が配列番号１６のアミノ酸配列を含み；及び軽鎖定常領域が配列番号１５のアミノ酸配列を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する軽鎖及び重鎖を含む、第三のＦａｂ断片を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１６１及び／又は１６２の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１６７】
更なる実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１９の可変軽鎖、及び配列番号２０の可変重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖；及び配列番号１３の可変軽鎖、及び配列番号１４の可変重鎖を含む、ＭＣＳＰに特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、及び配列番号１３の可変軽鎖及び配列番号１４の可変重鎖を含む、ＭＣＳＰに特異的な第三のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１６８】
更なる実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１９の可変軽鎖、及び配列番号２０の可変重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖；及び配列番号１６２の可変軽鎖、及び配列番号１６１の可変重鎖を含む、ＭＣＳＰに特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、及び配列番号１６２の可変軽鎖及び配列番号１６１の可変重鎖を含む、ＭＣＳＰに特異的な第三のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１６９】
更なる実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１９の可変軽鎖、及び配列番号２０の可変重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖；及び配列番号１６２の可変軽鎖又はその親和性成熟型変異体、及び配列番号１６１の可変重鎖又はその親和性成熟型変異体を含む、ＭＣＳＰに特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、及び配列番号１６２の可変軽鎖又はその親和性成熟型変異体及び配列番号１６１の可変重鎖又はその親和性成熟型変異体を含む、ＭＣＳＰに特異的な第三のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１６１及び／又は１６２の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１７０】
更なる実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５７の可変軽鎖、及び配列番号１５８の可変重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖；及び配列番号１６２の可変軽鎖、及び配列番号１６１の可変重鎖を含む、ＭＣＳＰに特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、及び配列番号１６２の可変軽鎖及び配列番号１６１の可変重鎖を含む、ＭＣＳＰに特異的な第三のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１７１】
更なる実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、配列番号１５７の可変軽鎖、及び配列番号１５８の可変重鎖を含む、ＣＤ３に特異的に結合する第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖；及び配列番号１６２の可変軽鎖又はその親和性成熟型変異体、及び配列番号１６１の可変重鎖又はその親和性成熟型変異体を含む、ＭＣＳＰに特異的な第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖、及び配列番号１６２の可変軽鎖又はその親和性成熟型変異体及び配列番号１６１の可変重鎖又はその親和性成熟型変異体を含む、ＭＣＳＰに特異的な第三のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１６１及び／又は１６２の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１７２】
更に別の実施態様において、前記二重特異性抗体は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号４１及び配列番号４３の群から選択される一以上のアミノ酸配列を含む。
【０１７３】
一実施態様において、前記二重特異性抗体は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７を含む。
【０１７４】
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的である少なくとも一の抗原結合部位を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、ＥＧＦＲのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体ＧＡ２０１と競合することができる、少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。例えば、参照によりその全体が援用されるＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８２５１５を参照。一実施態様において、ＥＧＦＲに特異的である抗原結合部位は、配列番号６８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号６９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号７０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号７１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、ＥＧＦＲに特異的である抗原結合部位は、配列番号７４に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号７５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１７５】
更なる実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号７４に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号７５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む、ＥＧＦＲに特異的である抗原結合部位を含む第一のＦａｂ断片、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１７６】
更なる実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号７４に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号７５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む、ＥＧＦＲに特異的である抗原結合部位を含む第一及び第三のＦａｂ断片、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１７７】
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的である少なくとも一の抗原結合部位を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、ＦＡＰのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体３Ｆ２と競合することができる、少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。例えば、参照によりその全体が援用される欧州特許出願番号ＥＰ１０１７２８４２．６を参照。一実施態様において、ＦＡＰに特異的である抗原結合部位は、配列番号７６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号７７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号７８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号７９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、ＦＡＰに特異的である抗原結合部位は、配列番号８２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号８３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１７８】
更なる実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号８２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号８３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む、ＦＡＰに特異的である抗原結合部位を含む第一のＦａｂ断片、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１７９】
更なる実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号８２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号８３に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む、ＦＡＰに特異的である抗原結合部位を含む第一及び第三のＦａｂ断片、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１８０】
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に特異的である少なくとも一の抗原結合部位を含む。別の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、ＣＥＡのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体ＣＨ１Ａ１Ａと競合することができる、少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、ＣＥＡのエピトープに対する結合をモノクローナル抗体ＣＨ１Ａ１Ａクローン９８／９９（ＣＨ１Ａ１（９８／９９））と競合することができる、少なくとも一、典型的には二以上の抗原結合部分を含む。参照によりその全体が援用されるＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０６２５２７を参照。一実施態様において、ＣＥＡに特異的である抗原結合部位は、配列番号８４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号８５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号８６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号８７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、ＣＥＡに特異的である抗原結合部位は、配列番号９０又は配列番号１５９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号９１又は配列番号１６０に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１８１】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域が配列番号１５９又はそのの親和性成熟型変異体を含み；軽鎖可変領域配列が配列番号１６０の親和性成熟型変異体を含む、ＣＥＡに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１５９及び／又は配列番号１６０の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１８２】
更なる実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号９０に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号９１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む、ＣＥＡに特異的である抗原結合部位を含む第一のＦａｂ断片、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１８３】
更なる実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号１５９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号１６０に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む、ＣＥＡに特異的である抗原結合部位を含む第一のＦａｂ断片、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１８４】
一実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域が配列番号１５９の親和性成熟型変異体を含み；及び軽鎖可変領域が配列番号１６０の親和性成熟型変異体を含むＣＥＡに特異的に結合する第一のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖；及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１５９及び／又は配列番号１６０の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１８５】
更なる実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号９０又は配列番号１５９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号９１又は配列番号１６０に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む、ＣＥＡに特異的である抗原結合部位を含む第一及び第三のＦａｂ断片、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１５９及び／又は配列番号１６０の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１８６】
更なる実施態様において、二重特異性抗体は、重鎖可変領域が配列番号１５９の親和性成熟型変異体を含み；軽鎖可変領域配列が配列番号１６０の親和性成熟型変異体を含む、ＣＥＡに特異的である抗原結合部位を含む第一及び第三のＦａｂ断片を含む。この実施態様における親和性成熟型変異体は、配列番号１５９及び／又は配列番号１６０の１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸が独立に交換されていることを意味する。
【０１８７】
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、ＣＤ３３に特異的である少なくとも一の抗原結合部位を含む。一実施態様において、ＣＤ３３に特異的である抗原結合部位は、配列番号９２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号９３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号９４の重鎖ＣＤＲ３、配列番号９５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号９６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号９７の軽鎖ＣＤＲ３を含む。更なる実施態様において、ＣＤ３３に特異的である抗原結合部位は、配列番号９８に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号９９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む。
【０１８８】
更なる実施態様において、二重特異性抗体は、配列番号９８に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である重鎖可変領域配列、及び配列番号９９に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するその変異体を含む、ＣＤ３３に特異的である抗原結合部位を含む第一のＦａｂ断片、及び本明細書に記述される実施態様の何れかに定義される一又は複数のアミノ酸配列を含むＣＤ３に特異的な第二のＦａｂ断片の軽鎖及び重鎖を含む。
【０１８９】
特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、配列番号１０１又は配列番号１０２の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１９０】
一実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、配列番号１５１、配列番号１５２及び配列番号１５３の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１９１】
更に別の実施態様において、前記二重特異性抗体は、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１５１、配列番号１５２及び配列番号１５３の群から選択される一以上のアミノ酸配列を含む。
【０１９２】
本発明の一実施態様において、二重特異性抗体は下記に詳述されるようにヒト化抗体である。
【０１９３】
本発明の別の実施態様において、二重特異性抗体は下記に詳述されるようにヒト抗体である。
【０１９４】
第二の目的において本発明は、本発明の二重特異性抗体を含有する薬学的組成物に関する。
【０１９５】
第三の目的において本発明は、癌を治療するための本発明の二重特異性抗体に関する。別の実施態様において、医薬としての二重特異性抗体の使用が提供される。好ましくは、前記使用は、癌の治療のためである。
【０１９６】
更なる目的において、本発明は、本発明の二重特異性抗体の重鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の二重特異性抗体の軽鎖をコードする配列を含む核酸配列、本発明の核酸配列を含む発現ベクター、及び本発明のベクターを含む原核生物または真核生物宿主細胞に関する。更に、抗体が産生されるように宿主細胞を培養することを含む抗体の製造方法が提供される。
【０１９７】
特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、配列番号４４，配列番号４５，配列番号４６，配列番号４７，配列番号４８，配列番号４９，配列番号５０，配列番号５１，配列番号５２，配列番号５３，配列番号５４，配列番号５５，配列番号５６，配列番号５７，配列番号５８，配列番号５９，配列番号６０，配列番号６１，配列番号６２，配列番号６３，配列番号６４，配列番号６５，配列番号６６、及び配列番号６７の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１９８】
特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、配列番号１０７，配列番号１０８，配列番号１０９，配列番号１１０，配列番号１１１、及び配列番号１１２の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【０１９９】
特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、配列番号１１３，配列番号１１４，配列番号１１５，配列番号１１６，配列番号１１７，  配列番号１１８，配列番号１１９，及び配列番号１２０の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【０２００】
特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、配列番号１２１，配列番号１２２，配列番号１２３，配列番号１２４，配列番号１２５，配列番号１２６，配列番号１２７，及び配列番号１２８の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【０２０１】
特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、配列番号１２９，配列番号１３０，配列番号１３１，配列番号１３２，配列番号１３３，配列番号１３４，配列番号１３５，及び配列番号１３６の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【０２０２】
特定の実施態様において、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、配列番号１０５，配列番号１０６，配列番号１３７，配列番号１３８，配列番号１３９，配列番号１４０，配列番号１４１，配列番号１４２，配列番号１４３，配列番号１４４，配列番号１５４，配列番号１５５及び配列番号１５６の群から選択される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列を含む。
【０２０３】
更なる態様にて、以下のセクション１−５で説明されるように、上記実施態様のいずれかに記載の二重特異性抗体は、単独または組み合わせで、任意の特徴を組み込むことができる。
【０２０４】
１．抗体親和性
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗体の親和性は、実施例に記載の方法に従って、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥヘルスケア）のような標準的な器具類を使用して決定することができ、そしてそのような受容体又は標的タンパク質は、組換え発現によって得ることができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対するＴ細胞活性化二重特異性抗体の結合を、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価することができる。
【０２０５】
所定の実施態様において、本明細書において与えられる二重特異性抗体は、解離定数（ＫＤ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。
【０２０６】
一実施態様に従って、〜１０反応単位（ＲＵ）の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いる表面プラズモン共鳴アッセイを使用してＫＤを測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５, BIAcore Inc．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の反応単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋａ又はｋｏｎ）と解離速度（ｋｄｆ又はｋｏｆｆ）を算出した。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯＴＭ分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光放出強度（励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ）の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【０２０７】
２．キメラ及びヒト化抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される二重特異性抗体は、キメラ抗体である。所定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))に記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又はサル等の非ヒト霊長類由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０２０８】
所定の実施態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性と親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が、非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、一以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部をも含む。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体の幾つかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換されている。
【０２０９】
ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、 Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)；米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、及び第７，０８７，４０９号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）； Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （「リサーフェシング」を記述）； Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)（ＦＲのシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。
【０２１０】
ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「ベストフィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域（例えば、Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)）；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；及びPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）；及びＦＲライブラリスクリーニング由来のフレームワーク領域（例えば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及び Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）を含む。
【０２１１】
３．ヒト抗体
ある実施態様において、本明細書で提供される二重特異性抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。
【０２１２】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、又は染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。このようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)を参照。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載している、米国特許第６，０７５，１８１号及び６，１５０，５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ−Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７，０４１，８７０号及び、ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術を記載している米国特許出願公開第２００７／００６１９００号）を参照。このような動物で生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、更に改変される可能性がある。
【０２１３】
ヒト抗体は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ細胞株が記載されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)を参照）。ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体はまた、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)に記載されている。更なる方法は、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載している）及びNi, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) （ヒト−ヒトハイブリドーマを記載している）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 及びVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載される。
【０２１４】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによって生成され得る。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【０２１５】
４．ライブラリー由来の抗体
本発明の二重特異性抗体は、所望の活性または活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、様々な方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。そのような方法は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)に総説され、更に、例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 及びLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)に記載されている。
【０２１６】
所定のファージディスプレイ法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別にクローニングされ、ファージライブラリーにランダムに再結合され、その後、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された起源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代わりに、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)に記載されるように、ナイーブなレパートリーが、任意の免疫感作無しで、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対して、抗体の単一起源を提供するために、（例えば、ヒトから）クローン化することができる。最後に、ナイーブなライブラリはまた、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)に記載されるように、非常に可変なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再構成を達成するために、幹細胞由来の未転位Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することにより合成することができる。ヒト抗体ファージライブラリーを記述する特許公報は、例えば、米国特許第５７５０３７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、第２００５／０１１９４５５号、第２００５／０２６６０００号、第２００７／０１１７１２６号、第２００７／０１６０５９８号、第２００７／０２３７７６４号、第２００７／０２９２９３６号及び第２００９／０００２３６０号を含む。
【０２１７】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体の断片とみなされる。
【０２１８】
５．抗体変異体
ある実施態様において、本明細書で提供される二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、二重特異性抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体は、二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、またはペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
【０２１９】
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
ある実施態様において、一つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、ＨＶＲとＦＲを含む。保存的置換は、表１の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表１の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少についてスクリーニングされる。
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アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ．
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０２２０】
置換された変異体の一つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体など）の一以上の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的には、更なる研究のために選択され得られた変異体は、親抗体と比較して、特定の生物学的特性の改変（例えば、改善）（例えば、親和性の増加、免疫原性を減少）を有し、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。典型的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成され得る。簡潔に言えば、一つ以上のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。
【０２２１】
変更（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような変更は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えばChowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えばHoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば、変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチドを標的とした突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子中に導入される。次いで、二次ライブラリーが作成される。次いで、ライブラリーは、所望の親和性を持つ抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するするもう一つの方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発、またはモデリングを用いて、特異的に同定され得る。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３がしばしば標的にされる。
【０２２２】
所定の実施態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限りにおいて、一以上のＨＶＲ内で生じる可能性がある。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的改変（例えば本明細書で与えられる保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」又はＳＤＲの外側であってもよい。上記に与えられた変異体ＶＨ又はＶＬ配列の所定の実施態様において、各ＨＶＲは不変であるか、又はわずか１個、２個または３個のアミノ酸置換が含まれているかの何れかである。
【０２２３】
突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により説明されるように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、標的残基の残基またはグループ（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを判断するために、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）に置換される。更なる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入され得る。代わりに、又は更に、抗原抗体複合体の結晶構造が、抗体と抗原との接触点を同定する。そのような接触残基及び隣接残基が、置換の候補として標的とされるか又は排除され得る。変異体はそれらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０２２４】
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素に対する抗体のＮ末端またはＣ末端への融合（例えばＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドへの融合を含む。
【０２２５】
ｂ）システイン操作抗体変異体
ある実施態様において、二重特異性抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作二重特異性抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、二重特異性抗体のアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲーを作成するために、例えば薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。所定の実施態様において、以下の残基のいずれかまたは複数がシステインに置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）及び重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成され得る。
【０２２６】
ｃ）抗体誘導体
ある実施態様において、本明細書で提供される二重特異性抗体は、当技術分野で知られ、容易に入手される追加の非タンパク質部分を含むように更に改変することができる。二重特異性抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体の何れか）及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物を包含する。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドはその水中での安定性に起因して製造における利点を有し得る。ポリマーは何れかの分子量のものであってよく、そして分枝鎖又は未分枝鎖であってよい。抗体に結合するポリマーの数は変動してよく、そして、一以上の重合体が結合する場合は、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／又は種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が限定された条件下で治療に使用されるのか等を含む考慮に基づいて決定することができる。
【０２２７】
別の実施態様において、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る二重特異性抗体と非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一実施態様において、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである(Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)。放射線は、任意の波長であって良いが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０２２８】
Ｂ．組換え方法及び組成物
本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗体は、例えば、固相ペプチド合成（例えばメリフィールド固相合成）又は組換え産生によって得ることができる。組換え生産のために、例えば上述したように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体（断片）をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明の一以上のポリヌクレオチドを含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの組換え／遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部でもよく、核酸断片でありうる。発現ベクターは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体（断片）をコードするポリヌクレオチド（すなわちコーディング領域）がプロモーター及び／又は他の転写又は翻訳コントロール要素と作動可能に結合してクローン化される発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合には、コード領域の一部と考えられ得が、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’および３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。二以上のコード領域が、単一ポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗体（断片）、又は変異体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種性コーディング領域をコードしうる。異種性コーディング領域は、限定するものではないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、例えばポリペプチドなど遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下に遺伝子産物の発現を配置するように、一以上の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコーディング領域及びそれに結合するプロモーターのような）二つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の��伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および二つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合にポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合される。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと結合することができる。好適なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連動した即初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及び（例えばラウス肉腫ウイルスなど）レトロウイルスを含む。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギ−αグロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を調節することができる他の配列に由来するものを含む。更なる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター、誘導性テトラサイクリン）が含まれる。同様に、種々な翻訳制御エレメントが、当業者によく知られている。これらには、限定するものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、またはＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）を含む。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端逆位配列（ＩＴＲ）など染色体組み込み要素など他の特徴を含んでいてもよい。
【０２２９】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コーディング領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合させることができる。例えば、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗原結合分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置されうる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは一旦粗面小胞体を横切って成長するタンパク質鎖の排出が開始すると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、一般に、ポリペプチドの分泌型または「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。ある実施態様において、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【０２３０】
後の精製を容易にし又はＴ細胞活性化二重特異性抗体の標識化における補助のために使用されうる短タンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡは、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体（断片）をコードするポリヌクレオチドの中又は末端に含まれうる。
【０２３１】
更なる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞が提供される。更なる実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれ関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独または組み合わせて組み込むことができる。一つのそのような実施態様において、宿主細胞は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗体（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされる）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗体又はその断片を生成するよう操作できる何れかの種類の細胞システムを指す。Ｔ細胞活性化二重特異性抗体の複製及び発現の補助に好適な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入され得、大量のベクター含有細胞が、臨床利用のための十分な量のＴ細胞活性化二重特異性抗体を得るため大規模発酵槽での播種により増殖されうる。好適な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要ない場合には、ポリペプチドは細菌で産生することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)，及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株(Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞(Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）��イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、また、トランスジェニック生物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【０２３２】
これらのシステムにおいて外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のどちらかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された産物が重鎖及び軽鎖の両方を有している抗体であるように、抗体鎖の他方を発現するように操作されうる。
【０２３３】
一実施態様において、本発明によるＴ細胞活性化二重特異性抗体を産生する方法が提供され、該方法は、本明細書に与えられるように、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体の発現に適した条件下で、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）からＴ細胞活性化二重特異性抗体を回収することを含む。
【０２３４】
Ｔ細胞活性化二重特異性抗体の構成要素は一般にお互いに融合される。Ｔ細胞活性化二重特異性抗体は、その成分が、お互いに直接的に又はリンカー配列を介して互いに間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成および長さは、当該技術分野において周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験され得る。Ｔ細胞活性化二重特異性抗体の別々の構成要素間のリンカー配列の例は、本明細書に与えられる配列中に見いだされる。さらなる配列はまた、所望であれば、融合体の個々の成分を分離するための切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を組み込むことが含まれていてもよい。
【０２３５】
ある実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体の一又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基に結合できる抗体可変領域を少なくとも含む。可変領域が、天然に又は非天然に生じる抗体及びその断片の一部を形成し、及びそれに由来しうる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は当分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照）。非天然に生じる抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に生産されるか（例えば米国特許第４，１８６，５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含んでなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５，９６９，１０８号を参照）によって得られうる。
【０２３６】
何れかの動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域が、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗体で用いることができる。本発明において有用な非限定的抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗体がヒトでの使用を意図する場合、抗体の定常領域はヒトに由来するキメラ形態の抗体が使用され得る。ヒト化又は完全ヒト形態の抗体がまた、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，５６５，３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、限定されなが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体の機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴うか又は伴わない、ヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植する、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみを移植ヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植する、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様部分(section)で「覆い隠す」。ヒト化抗体およびそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 米国特許第５，５，８２１，３３７号，第７，５２７，７９１号，第６，９８２，３２１号、及び第７，０８７，４０９号； Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングを記述）; Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)（「リサーフェシング」を記述）; Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （「ＦＲシャッフリング」を記述）；及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)（ＦＲシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述）に記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、それに由来することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つ又はインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによって生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001);及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991))。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。
【０２３７】
ある実施態様では、本発明の二重特異性抗体は、例えば米国特許出願公開番号２００４／０１３２０６６（この全内容を出典明記によってここに援用する）に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に結合する本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗体の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅＴ１００システムで解析される）(Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329(2000))および伝統的な結合アッセイ(Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229(2002))のいずれかによって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体と競合する抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン又は可変ドメイン、例えばＣＤ３への結合についてＶ９抗体と競合する抗体を同定するために使用されうる。ある実施態様では、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ（例えば線状又はコンホメーションエピトープ）に結合する抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。典型的な競合アッセイにおいて、固定化抗原（例えばＣＤ３）は、抗原（例えばＶ９抗体）に結合する第一の標識された抗体、及び抗原へ結合について第一の抗体と競合するその能力について試験されている第二の未標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。もし、固定化抗原に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、抗原への結合において、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。
【０２３８】
本明細書で記載のように調製されるＴ細胞活性化二重特異性抗体は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性等の要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、Ｔ細胞活性化二重特異性抗体が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明のＴ細胞活性化二重特異性抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、実施例に本質的に記載されるようにＴ細胞活性化二重特異性抗体を単離するために使用されうる。Ｔ細胞活性化二重特異性抗体の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む様々なよく知られた分析方法の何れかによって決定されうる。
【０２３９】
Ｃ．アッセイ
本明細書で提供される二重特異性抗体は、同定され、当技術分野で公知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされ、または特徴づけることができる。
【０２４０】
１．結合アッセイとその他のアッセイ
一態様において、本発明の二重特異性抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
【０２４１】
別の態様において、競合アッセイは、腫瘍抗原（ＴＡ）又はＴ細胞活性化抗原のそれぞれに対する結合について、特異的抗ＴＡ抗体又はＴ細胞活性化抗原に特異的な抗体と競合する抗体を同定するために使用され得る。ある実施態様において、このような競合する抗体は、特異的抗ＴＡ抗体又はＴ細胞活性化抗原に特異的な抗体により結合される同一のエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。
【０２４２】
２．活性のアッセイ
一態様では、アッセイは、Ｔ細胞活性化抗原及び生物学的活性を有するその腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体を同定するために提供される。生物学的活性は、例えば、標的細胞の溶解又はアポトーシスの誘導を含み得る。インビボ及び／又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
【０２４３】
所定の実施態様において、本発明の二重特異性抗体は、そのような生物学的活性について試験される。細胞溶解（例えばＬＤＨ放出の測定による）又はアポトーシス（例えば、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して）を検出するためのアッセイは、当該分野で周知である。
【０２４４】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位元素など、１つ以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書中のＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
一実施態様において、イムノコンジュゲートは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、そこでは抗体は、限定されないが、メイタンシノイド（米国特許第５２０８０２０号、第５４１６０６４号及び欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１を参照）；モノメチルアウリスタチン薬物部分ＤＥ及びＤＦ（ＭＭＡＥ及びＭＭＡＦ）（米国特許第５６３５４８３号及び５７８０５８８号及び７４９８２９８号を参照）などのアウリスタチン；ドラスタチン、カリケアマイシン又はその誘導体（米国特許第５７１２３７４号、５７１４５８６号、５７３９１１６号、５７６７２８５号、５７７０７０１号、５７７０７１０号、５７７３００１号、及び５８７７２９６号を参照；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；及びLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998))；ダウノマイシン又はドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002);及び米国特許第６，６３０，５７９号を参照）；メトトレキサート、ビンデシン、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、及びオルタタキセルなどのタキサン、トリコテセン、及びＣＣ１０６５を含む一つ以上の薬物とコンジュゲートしている。
【０２４５】
その他の実施態様において、二重特異性抗体は、酵素的に活性な毒素又はその断片にコンジュゲートした、本明細書に記載の抗体を含み、限定されないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。
【０２４６】
その他の実施態様では、二重特異性抗体は、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートした本明細書に記載されるような抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの生産のために入手可能である。例としては、Ａｔ２１１，Ｉ１３１，Ｉ１２５，Ｙ９０，Ｒｅ１８６，Ｒｅ１８８，Ｓｍ１５３，Ｂｉ２１２，Ｐ３２，Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体を含む。検出のために放射性コンジュゲートを使用するとき、それはシンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像化（磁気共鳴画像化ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えば再び、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含んでよい。
【０２４７】
抗体と細胞傷害性薬物の二重特異性抗体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの２官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルズベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えばビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネート）及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）など、を使って作成され得る。Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)に記載されるように、例えば、リシンイムノトキシンを調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体へのコンジュゲーションのためのキレート剤の例である国際公開第９４／１１０２６号を参照。リンカーは、細胞中に細胞毒性薬物の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光解離性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。
【０２４８】
本明細書において、イムノコンジュゲート又はＡＤＣは、限定されないが、市販の（例えばPierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aからの）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ−ＥＭＣＳ、スルホ−ＧＭＢＳ、スルホ−ＫＭＵＳ、スルホ−ＭＢＳ、スルホ−ＳＩＡＢ、スルホ−ＳＭＰＢ、及びスルホ−ＳＭＰＢ、ＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むクロスリンカー試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に意図する。
【０２４９】
Ｅ．診断及び検出のための方法および組成物
特定の実施態様において、本明細書に提供されるＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体の何れかは、生物学的サンプル中のＴ細胞活性化抗原及び／又は腫瘍抗原（ＴＡ）の存在を検出するために有用である。本明細書で使用する「検出」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。所定の実施態様において、生物学的サンプルは細胞又は組織を含む。
【０２５０】
一実施態様において、診断又は検出の方法における使用のためのＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。更なる態様において、生物学的サンプル中のＴ細胞活性化抗原３及び／又は腫瘍抗原（ＴＡ）の存在を検出する方法が提供される。ある実施態様において、本方法は、Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）へ結合する二重特異性抗体のＴ細胞活性化抗原及び／又は腫瘍抗原（ＴＡ）への結合を許容する条件下で、本明細書に記載されるようにＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体と生物学的サンプルを接触させること、及び複合体がＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体とＴ細胞活性化抗原及び／又は腫瘍抗原（ＴＡ）との間に形成されているか否かを検出するを含む。そのような方法は、インビトロ又はインビボでの方法であり得る。一実施態様では、例えば腫瘍抗原（ＴＡ）が患者の選択のためのバイオマーカーである場合に、Ｔ細胞活性化抗原および腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体による治療に適した被験体を選択するために、Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体が使用される。
【０２５１】
本発明の抗体を用いて診断され得る典型的な障害は癌を含む。
【０２５２】
ある実施態様において、Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）と結合する標識された二重特異性抗体が提供される。標識は、限定されるものではないが、（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）直接検出される標識又は部分、並びに、例えば、酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される酵素又はリガンドのような部分が含まれる。典型的な標識は、限定されないが、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシェフェリン、２，３−ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼと共役したもの、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどが含まれる。
【０２５３】
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載のＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその二重特異性抗体と任意の薬学的に許容される担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980))とを、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Baxter International, Inc.）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つまたは複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
【０２５４】
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２５５】
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
【０２５６】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート(methylmethacylate)）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系で（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンで調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
【０２５７】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形をしている。
【０２５８】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
【０２５９】
Ｇ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供されるＴ細胞活性化抗原および腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体のいずれかは、治療方法に使用することができる。
【０２６０】
一態様において、医薬として使用のためのＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。更なる態様において、癌の治療に使用のためのＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体が提供される。ある実施態様において、診断又は検出の方法における使用のためのＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に特異的に結合する二重特異性抗体が提供される。ある実施態様において、本発明は、Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体の有効量を個体に投与することを含む、癌を有する個体を治療する方法において使用するためのＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体を提供する。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、好ましくはヒトである。
【０２６１】
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造または調製における、Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体の使用を提供する。一実施態様において、本医薬は癌の治療のためのものである。更なる実施態様において、本医薬は、癌を有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、癌を治療する方法で使用するためのものである。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも１つの追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０２６２】
更なる態様にて、本発明は、癌を治療する方法を提供する。一実施態様において、本方法は、Ｔ細胞活性化抗原および腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体の有効量を、癌を有する個体に投与することを含む。一つのそのような実施態様において、この方法は、後述するように、少なくとも１つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
【０２６３】
更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供されるＴ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体の何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書に提供されるＴ細胞活性化抗原および腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する任意の二重特異性抗体、及び薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書に提供されるＴ細胞活性化抗原および腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する任意の二重特異性抗体、及び下記に記載されるような少なくとも一の更なる治療剤を含む。
【０２６４】
本発明の二重特異性抗体は、治療において、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の二重特異性抗体が少なくとも１つのさらなる治療剤と同時投与することができる。
【０２６５】
上記のこうした併用療法は、併用投与（２つ以上の治療剤が、同一または別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の抗体の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明の二重特異性抗体はまた放射線治療と併用して用いることができる。
【０２６６】
本発明の二重特異性抗体（及び任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、および鼻腔内、及び局所治療が所望される場合病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内または皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時間点にわたる、単一または複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考えられている。
【０２６７】
本発明の二重特異性抗体は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。二重特異性抗体は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は製剤中に存在する抗体の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【０２６８】
疾患の予防又は治療のためには、本発明の二重特異性抗体の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、二重特異性抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び二重特異性抗体に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。抗体は、患者に対して、単回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、二重特異性抗体約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される二重特異性抗体の用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば二重特異性抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与され得る。しかしながら、他の投与量レジメンも有益であり得る。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０２６９】
上記の製剤または治療方法のいずれかが、Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体の代わりか又はその抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
【０２７０】
Ｈ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベルまたは容器上にある又は容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の二重特異性抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明の二重特異性抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器と（ｂ）更なる細胞障害剤又は別の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物をさらに含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的およびユーザーの立場から望まれる他の物質のさらに含んでもよい。
【０２７１】
上記の製造品の何れかが、Ｔ細胞活性化抗原及び腫瘍抗原（ＴＡ）に結合する二重特異性抗体の代わりか又はその抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含みうることが理解される。
【実施例】
【０２７２】
ＩＩＩ．実施例
以下は本発明の方法および組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０２７３】
前述の発明は、理解を明確にする目的のために例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。すべての特許および本明細書に引用される科学文献の開示は、参照によりその全体が援用される。
【０２７４】
実施例１：Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＤ３）の調製
重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列は、各レシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとともに、フレーム内でサブクローニングされた。抗体の発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、ＣＤＳの３’末端の合成ポリＡシグナル配列を運ぶ。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【０２７５】
その分子は、リン酸カルシウムトランスフェクションを使用して、哺乳動物抗体の発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトすることによって産生させる。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞は、リン酸カルシウム法によりトランスフェクトされる。あるいは、懸濁液中で増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞は、ポリエチレンイミンで形質移入される。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクターＣＨ１−ＶＨ−ＣＫ−ＶＨ」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖ＣＨ１−ＶＬ」）でトランスフェクトされる。
【０２７６】
リン酸カルシウムを用いたトランスフェクションのため、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを補填したＤＭＥＭ培養培地を使用してＴフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが５０から８０％の間で集密になったときにトランスフェクトされる。Ｔ１５０フラスコのトランスフェクションでは、ＦＣＳ（最終１０％ｖ／ｖで）を補填した２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に形質移入の２４時間前に１５００万細胞を播種し、細胞を５％ＣＯ２大気のインキュベーター中に３７℃で一晩置く。トランスフェクトされる各Ｔ１５０フラスコに対して、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液を、対応する比率で分配された９４μｇの全プラスミドベクターＤＮＡ、４６９μｌの最終容量までの水及び４６９μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液を混合することによって調製した。この溶液に、９３８μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を加え、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を、２％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを補填した１０ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ１５に加える。ついで、更なる１３ｍｌのトランスフェクション培地を加える。細胞を約１７から２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ついで培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換する。条件培養培地を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によって形質移入から７日後に収集し、溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４℃に維持する。
【０２７７】
ポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションのため、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、無血清ＣＤ ＣＨＯ培地中で懸濁液中で培養する。５００ｍｌの振とうフラスコ中での生産のため、４億のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に播種する。トランスフェクションのため、細胞を、２１０Ｘｇで５分間遠心分離し、上清を２０ｍｌの予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地で置換する。発現ベクターを２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で最終的に２００μｇのＤＮＡの量まで混合する。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、続いて室温で１０分間インキュベートする。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌのフラスコに移し、振とうし、５％ＣＯ２大気を含むインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション後、１６０ミリリットルのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のフィード１（ロンザ社）を添加する。７日間の培養後、上清を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によって精製のために収集し、溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４℃に維持する。
【０２７８】
分泌タンパク質は、プロテインＡ及びプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程によって細胞培養上清から精製する。アフィニティークロマトグラフィー用に、各カラムが３０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化されたハイトラッププロテインＧ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍｌ、ＧＥヘルスケア）に結合されたハイトラッププロテインＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍｌ、ＧＥヘルスケア）へ上清をロードする。非結合タンパク質を、６カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で両方のカラムを洗浄することによって除去する。その後、少なくとも８カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨが７．５を使用してＨｉＴｒａｐプロテインＧ ＨＰカラムのみを洗浄するために、更なる洗浄工程が必要である。標的タンパク質は７カラム容積の８．８ｍＭのギ酸、ｐＨ３．０による段階的勾配を用いてＨｉＴｒａｐプロテインＧ ＨＰカラムから溶出される。タンパク質溶液を、０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８を１／１０加えて中和した。標的タンパク質を、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．７の１００ｍＭグリシン溶液で平衡化したハイロードスーパーデックス２００カラム（ＧＥヘルスケア）へロードする前に濃縮し、濾過する。
【０２７９】
精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定する。抗体の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びクマシー（インビトロジェンからのＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭＳａｆｅＳｔａｉｎ）による染色により分析される。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（インビトロジェン，ＵＳＡ）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した（４−１２％のトリス−酢酸ゲル又は４−１２％のＢｉｓ−トリス）。抗体サンプルの凝集体含有量を、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．３の２５℃におけるランニング緩衝液（ｗ／ｖ）、スーパーデックス２００１０／３００ＧＬ分析用サイズ排除カラム（ＧＥヘルスケア、スウェーデン）を使用して分析する。
【０２８０】
典型的なＦａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子（３つの鎖：ＶＨＣＨ１（ＭＣＳＰ）−ＶＬＣＨ１（ＣＤ３Ｖ９）＝配列番号２５，ＶＬＣＬ（ＭＣＳＰ）＝配列番号１７及びＶＨＣＬ（ＣＤ３Ｖ９）＝配列番号２３からなり；配向は図１ａに示される））の産生と精製の解析を図２及び３に示す。この分子は、Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）又はｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）と称される。
【０２８１】
実施例２：Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＤ３）の調製、及びＦａｂ（ＭＣＳＰ）−ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）
重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列は、各レシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとともに、フレーム内でサブクローニングされた。抗体の発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、ＣＤＳの３’末端の合成ポリＡシグナル配列を運ぶ。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【０２８２】
その分子は、リン酸カルシウムトランスフェクションを使用して、哺乳動物抗体の発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトすることによって産生させる。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞は、リン酸カルシウム法によりトランスフェクトされる。あるいは、懸濁液中で増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞は、ポリエチレンイミンで形質移入される。細胞は、対応する発現ベクターを１：２：１の比（「ベクターＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＫ−ＶＨ」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖ＣＨ１−ＶＬ」）でトランスフェクトされる。
【０２８３】
リン酸カルシウムを用いたトランスフェクションのため、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを補填したＤＭＥＭ培養培地を使用してＴフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが５０から８０％の間で集密になったときにトランスフェクトされる。Ｔ１５０フラスコのトランスフェクションでは、ＦＣＳ（最終１０％ｖ／ｖで）を補填した２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に形質移入の２４時間前に１５００万細胞を播種し、細胞を５％ＣＯ２大気のインキュベーター中に３７℃で一晩置く。トランスフェクトされる各Ｔ１５０フラスコに対して、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液を、対応する比率で分配された９４μｇの全プラスミドベクターＤＮＡ、４６９μｌの最終容量までの水及び４６９μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液を混合することによって調製した。この溶液に、９３８μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を加え、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を、２％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを補填した１０ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ１５に加える。ついで、更なる１３ｍｌのトランスフェクション培地を加える。細胞を約１７から２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ついで培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換する。条件培養培地を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によって形質移入から７日後に収集し、溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４℃に維持する。ポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションのため、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、無血清ＣＤ ＣＨＯ培地中で懸濁液中で培養する。５００ｍｌの振とうフラスコ中での生産のため、４億のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に播種する。トランスフェクションのため、細胞を、２１０Ｘｇで５分間遠心分離し、上清を２０ｍｌの予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地で置換する。発現ベクターを２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で最終的に２００μｇのＤＮＡの量まで混合する。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、続いて室温で１０分間インキュベートする。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌのフラスコに移し、振とうし、５％ＣＯ２大気を含むインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション後、１６０ミリリットルのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のフィード１（ロンザ社）を添加する。７日間の培養後、上清を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によって精製のために収集し、溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４℃に維持する。
【０２８４】
分泌タンパク質は、プロテインＡ及びプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程によって細胞培養上清から精製する。
【０２８５】
アフィニティークロマトグラフィー用に、各カラムが３０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化されたハイトラッププロテインＧ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍｌ、ＧＥヘルスケア）に結合されたハイトラッププロテインＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍｌ、ＧＥヘルスケア）へ上清をロードする。非結合タンパク質を、６カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で両方のカラムを洗浄することによって除去する。その後、少なくとも８カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨが７．５を使用してＨｉＴｒａｐプロテインＧ ＨＰカラムのみを洗浄するために、更なる洗浄工程が必要である。標的タンパク質は７カラム容積の８．８ｍＭのギ酸、ｐＨ３．０による段階的勾配を用いてＨｉＴｒａｐプロテインＧ ＨＰカラムから溶出される。タンパク質溶液を、０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８を１／１０加えて中和した。標的タンパク質を、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．７の１００ｍＭグリシン溶液で平衡化したハイロードスーパーデックス２００カラム（ＧＥヘルスケア）へロードする前に濃縮し、濾過する。
【０２８６】
精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定する。抗体の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びクマシー（インビトロジェンからのＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭＳａｆｅＳｔａｉｎ）による染色により分析される。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（インビトロジェン，ＵＳＡ）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した（４−１２％のトリス−酢酸ゲル又は４−１２％のＢｉｓ−トリス）。抗体サンプルの凝集体含有量を、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．３の２５℃におけるランニング緩衝液（ｗ／ｖ）、スーパーデックス２００１０／３００ＧＬ分析用サイズ排除カラム（ＧＥヘルスケア、スウェーデン）を使用して分析し、従来技術の抗体断片（ｓｃＦｖ）２と比較する（結果は下の表を参照）。
2014529600.tif 000004
典型的なＦａｂ−Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子（４つの鎖：ＶＨＣＨ１（ＭＣＳＰ）−ＶＨＣＨ１（ＭＣＳＰ）−ＶＬＣＨ１（ＣＤ３Ｖ９）＝配列番号２６，２つのＶＬＣＬ（ＭＣＳＰ）鎖＝配列番号１７及び一のＶＨＣＬ（ＣＤ３Ｖ９）鎖＝配列番号２３からなり；配向は図１ｃに示される））の産生と精製の解析を図４及び５に示す。この分子は、Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）又はｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）と更に称される。
【０２８７】
典型的なＦａｂ−Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子（４つの鎖：ＶＨＣＨ１（ＭＣＳＰ）−ＶＬＣＨ１（ＣＤ３Ｖ９）−ＶＨＣＨ１（ＭＣＳＰ）＝配列番号２７，２つのＶＬＣＬ（ＭＣＳＰ）鎖＝配列番号１７及び一のＶＨＣＬ（ＣＤ３Ｖ９）鎖＝配列番号２３からなり；配向は図１ｅに示される））の産生と精製の解析を図６及び７に示す。この分子は、Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）又はｈｕ Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）と更に称される。
【０２８８】
典型的なＣｒｏｓｓｆａｂ−Ｆａｂ−Ｆａｂ分子（４つの鎖：ＶＬＣＨ１（ＣＤ３２Ｃ１１）−ＶＨＣＨ１（ＭＣＳＰ）−ＶＨＣＨ１（ＭＣＳＰ）＝配列番号４２，２つのＶＬＣＬ（ＭＣＳＰ）鎖＝配列番号１７及び一のＶＨＣＬ（ＣＤ３２Ｃ１１）鎖＝配列番号４３；配向は図１ｄに示される））の産生と精製の解析を図８及び９に示す。この分子はマウスＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）と更に称される。
【０２８９】
実施例３：Ｆａｂ（ＣＤ３３）−ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＤ３）の調製
重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列は、各レシピエント哺乳動物発現ベクターに予め挿入された定常重鎖又は定常軽鎖の何れかとともに、フレーム内でサブクローニングされた。抗体の発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、ＣＤＳの３’末端の合成ポリＡシグナル配列を運ぶ。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【０２９０】
その分子は、リン酸カルシウムトランスフェクションを使用して、哺乳動物抗体の発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトすることによって産生させる。指数関数的に増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞は、リン酸カルシウム法によりトランスフェクトされる。あるいは、懸濁液中で増殖しているＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞は、ポリエチレンイミンで形質移入される。細胞は、対応する発現ベクターを１：１：１の比（「ベクターＣＨ１−ＶＨ−ＣＫ−ＶＨ」：「ベクター軽鎖」：「ベクター軽鎖ＣＨ１−ＶＬ」）でトランスフェクトされる。
【０２９１】
リン酸カルシウムを用いたトランスフェクションのため、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを補填したＤＭＥＭ培養培地を使用してＴフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが５０から８０％の間で集密になったときにトランスフェクトされる。Ｔ１５０フラスコのトランスフェクションでは、ＦＣＳ（最終１０％ｖ／ｖで）を補填した２５ｍｌのＤＭＥＭ培養培地に形質移入の２４時間前に１５００万細胞を播種し、細胞を５％ＣＯ２大気のインキュベーター中に３７℃で一晩置く。トランスフェクトされる各Ｔ１５０フラスコに対して、ＤＮＡ、ＣａＣｌ２及び水の溶液を、対応する比率で分配された９４μｇの全プラスミドベクターＤＮＡ、４６９μｌの最終容量までの水及び４６９μｌの１ＭのＣａＣｌ２溶液を混合することによって調製した。この溶液に、９３８μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液（ｐＨ７．０５）を加え、直ぐに１０秒間混合し、室温で２０秒間静置した。懸濁液を、２％（ｖ／ｖ）のＦＣＳを補填した１０ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、既存の培地の代わりにＴ１５に加える。ついで、更なる１３ｍｌのトランスフェクション培地を加える。細胞を約１７から２０時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、ついで培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳに置換する。条件培養培地を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によって形質移入から７日後に収集し、溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４℃に維持する。
【０２９２】
ポリエチレンイミンを用いたトランスフェクションのため、ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、無血清ＣＤ ＣＨＯ培地中で懸濁液中で培養する。５００ｍｌの振とうフラスコ中での生産のため、４億のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に播種する。トランスフェクションのため、細胞を、２１０Ｘｇで５分間遠心分離し、上清を２０ｍｌの予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地で置換する。発現ベクターを２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で最終的に２００μｇのＤＮＡの量まで混合する。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、続いて室温で１０分間インキュベートする。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌのフラスコに移し、振とうし、５％ＣＯ２大気を含むインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション後、１６０ミリリットルのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のフィード１（ロンザ社）を添加する。７日間の培養後、上清を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によって精製のために収集し、溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４°Ｃに維持する。
【０２９３】
分泌タンパク質は、プロテインＡ及びプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程によって細胞培養上清から精製する。
【０２９４】
アフィニティークロマトグラフィー用に、各カラムが３０ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化されたハイトラッププロテインＧ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍｌ、ＧＥヘルスケア）に結合されたハイトラッププロテインＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍｌ、ＧＥヘルスケア）へ上清をロードする。非結合タンパク質を、６カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で両方のカラムを洗浄することによって除去する。その後、少なくとも８カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨが７．５を使用してＨｉＴｒａｐプロテインＧ ＨＰカラムのみを洗浄するために、更なる洗浄工程が必要である。標的タンパク質は７カラム容積の８．８ｍＭのギ酸、ｐＨ３．０による段階的勾配を用いてＨｉＴｒａｐプロテインＧ ＨＰカラムから溶出される。タンパク質溶液を、０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ８を１／１０加えて中和した。標的タンパク質を、２５ｍＭリン酸カリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．７の１００ｍＭグリシン溶液で平衡化したハイロードスーパーデックス２００カラム（ＧＥヘルスケア）へロードする前に濃縮し、濾過する。
【０２９５】
精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定する。抗体の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びクマシー（インビトロジェンからのＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ）による染色により分析される。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（インビトロジェン，ＵＳＡ）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した（４−１２％のトリス−酢酸ゲル又は４−１２％のＢｉｓ−トリス）。抗体サンプルの凝集体含有量を、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．３の２５℃におけるランニング緩衝液（ｗ／ｖ）、スーパーデックス２００１０／３００ＧＬ分析用サイズ排除カラム（ＧＥヘルスケア、スウェーデン）を使用して分析する。
【０２９６】
典型的なＦａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子（３つの鎖：ＶＨＣＨ１（ＣＤ３３）−ＶＬＣＨ１（ＣＤ３Ｖ９）＝配列番号１０２，ＶＬＣＬ（ＣＤ３３）＝配列番号１００及びＶＨＣＬ（ＣＤ３Ｖ９）＝配列番号２３又は配列番号１０１からなり；配向は図１ａに示される））の産生と精製の解析を図１７及び３に示す。この分子は、Ｆａｂ（ＣＤ３３）−ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＤ３）又はｈｕ Ｆａｂ（ＣＤ３３）−ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＤ３）と称される。
【０２９７】
実施例４：参照分子（ｓｃＦｖ）２の調製
クローニング及び生産
重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列は、各レシピエント哺乳動物発現ベクターの中へフレーム内でサブクローニングされた。抗体の発現はＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、ＣＤＳの３’末端の合成ポリＡシグナル配列を運ぶ。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【０２９８】
その分子は、ポリエチルアミンを使用して、哺乳動物抗体の発現ベクターをＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトすることによって産生させる。ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、無血清ＣＤ ＣＨＯ培地中で懸濁液中で培養する。５００ｍｌの振とうフラスコ中での生産のため、４億のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に播種する。トランスフェクションのため、細胞を、２１０Ｘｇで５分間遠心分離し、上清を２０ｍｌの予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地で置換する。発現ベクターを２０ｍｌのＣＤ ＣＨＯ培地中で最終的に２００μｇのＤＮＡの量まで混合する。５４０μｌのＰＥＩ溶液を加えた後、混合物を１５秒間ボルテックスし、続いて室温で１０分間インキュベートする。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌのフラスコに移し、振とうし、５％ＣＯ２大気を含むインキュベーター中、３７℃で３時間インキュベートする。インキュベーション後、１６０ミリリットルのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養する。トランスフェクションの１日後、１ｍＭのバルプロ酸及び７％のフィード１（ロンザ社）を添加する。７日間の培養後、上清を２１０×ｇでの１５分の遠心分離によって精製のために収集し、溶液を滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの最終濃度のアジ化ナトリウムを加え、４°Ｃに維持する。
【０２９９】
（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３）の精製
分泌タンパク質は、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いたアフィニティークロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー工程によって細胞培養上清から精製する。
【０３００】
最初の精製工程の前に、上清由来の妨害成分を、５．０００ＭＷＣＯ膜(Sartocon Slice Cassette, Hydrosart; Sartorius)を装備したタンジェンシャルフロー濾過システムＳａｒｃｏｊｅｔ(Sartorius)を用いてダイアフィルトレーションにより除去する。上清を２１０ｍｌに濃縮し、続いて２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５の１ｌで希釈する。タンパク質溶液を２１０ｍｌまで再び濃縮する。この工程を、完全なバッファー交換を確保するために二回繰り返す。
【０３０１】
アフィニティークロマトグラフィー用に、ダイアフィルトレーションプロセスの残余物を、２５ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭイミダゾール、ｐＨ６．５で平衡化したＮｉＮＴＡスーパーフローカートリッジ（ＣＶ＝５ｍＬ、キアゲン）にロードする。非結合タンパク質は、少なくとも２カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１５Ｍのイミダゾール、ｐＨ６．５で洗浄し、続いて３カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、６２．５ｍＭのイミダゾール、ｐＨ６．５を用いた洗浄工程により除去する。標的タンパク質を、２カラム体積の２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、１２５ｍＭのイミダゾール、ｐＨ６．５で溶出する。続いてカラムを、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ６．５で洗浄する。
【０３０２】
標的タンパク質を、２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのアルギニン、ｐＨ６．７で平衡化したハイロードスーパーデックス７５カラム（ＧＥヘルスケア）へロードする前に濃縮する。
【０３０３】
最初の精製工程の後の収率、凝集体含有量、及び最終的な単量体の含有量を上記の表に示す。最初の精製工程後の凝集体含有量の比較では、（ｓｃＦｖ）２とは対照的に、Ｆａｂ−Ｃｒｏｓｓｆａｂコンストラクトの優れた安定性を示している。
【０３０４】
（ｓｃＦｖ）２の特性評価
精製されたタンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定する。抗体の純度及び分子量は、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びクマシー（インビトロジェンからのＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭＳａｆｅＳｔａｉｎ）による染色により分析される。ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲルシステム（インビトロジェン，ＵＳＡ）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した（４−１２％のトリス−酢酸ゲル又は４−１２％のＢｉｓ−トリス）。抗体サンプルの凝集体含有量を、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＮａＮ３、ｐＨ７．３の２５℃におけるランニング緩衝液（ｗ／ｖ）、スーパーデックス７５ １０／３００ＧＬ分析用サイズ排除カラム（ＧＥヘルスケア、スウェーデン）を使用して分析する。
【０３０５】
（ｓｃＦｖ）２分子の模式図を図２１に示す。
【０３０６】
典型的な（ｓｃＦｖ）２分子（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３；２つの単鎖Ｆｖｓ：ＶＬ−ＶＨ（ＭＣＳＰ）及びＶＨ−ＶＬ（ＣＤ３Ｖ９）＝配列番号１４９からなる）の産生及び精製の分析を図２２と２３に示す。この分子は、（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）と更に呼ばれる。
【０３０７】
実施例５：ＰＢＭＣからの初代ヒトパンＴ細胞の単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、地方血液銀行から、または健康なヒトのドナーからの新鮮な血液から得られた濃縮されたリンパ球調製物（バフィーコート）からヒストパック密度遠心分離によって調製した。
【０３０８】
ＰＢＭＣからのＴ細胞濃縮は、製造業者の指示に従って、パンＴ細胞単離キットＩＩ（Miltenyi Biotec #130-091-156)を用いて行った。簡潔には、細胞ペレットを１０Ｍｉｏ細胞あたり４０μｌの冷緩衝液で希釈し（０．５％ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ−滅菌濾過）、４℃で１０分間１０Ｍｉｏ細胞あたり１０μｌのビオチン抗体カクテルでインキュベートした。
【０３０９】
１０Ｍｉｏ細胞あたり２０μｌの抗ビオチン磁性ビーズ及び３０μｌの冷緩衝液を添加し、その混合物を４℃でさらに１５分間インキュベートした。
【０３１０】
細胞を標識化体積の１０−２０倍を添加し、続いて３００ｇで１０分間の遠心分離工程によって洗浄した。最大１００のＭｉｏ細胞が５００μｌの緩衝液中に再懸濁された。
【０３１１】
非標識ヒトパンＴ細胞の磁気分離は、製造業者の指示に従ってＬＳカラム(Miltenyi Biotec #130-042-401)を用いて行った。得られたＴ細胞集団は自動的に計数され（ＶｉＣｅｌｌ）、アッセイ開始まで（２４時間より長くはない）、インキュベーター中で３７℃で５％ＣＯ２でＡＩＭ−Ｖ培地中に保存された。
【０３１２】
実施例６：脾細胞からのマウスパンＴ細胞の単離
脾臓を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離し、ＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）を含むＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｃチューブ(Miltenyi Biotech#130-093-237)に移し、そして製造業者の指示に従ってＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ解離剤を用いて解離し単細胞懸濁液を得た。
【０３１３】
細胞懸濁液は、解離していない残った組織粒子を除くために、プリセパレーションフィルターに通した。４℃で４分間、４００×ｇで遠心分離した後、赤血球を溶解するためにＡＣＫ溶解緩衝液を添加した（室温で５分間のインキュベーション）。残りの細胞は、ＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、計数し、マウスパンＴ細胞の単離のために使用した。陰性（磁気）選択を、製造業者の指示に従って、パンＴ細胞単離キット(Miltenyi Biotec #130-090-861)を用いて行った。得られたＴ細胞集団は自動的に計数し（ＶｉＣｅｌｌ）、更なるアッセイのために直ちに使用した。
【０３１４】
実施例７：Ｔ細胞上のＣＤ３及び腫瘍細胞上のＭＣＳＰを標的とした架橋された二重特異性構築物によって媒介される再指向されたＴ細胞の細胞傷害性（ＬＤＨ放出アッセイ）
ヒト又はマウスＴ細胞上及びヒト腫瘍細胞上のＣＤ３を標的とする二重特異性コンストラクトが、標的細胞のＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの可能性に関してＬＤＨ放出アッセイによって分析される。
【０３１５】
簡潔には、標的細胞（ヒトＣｏｌｏ−３８、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ヒトメラノーマＭＶ−３又はマウスＢ１６／Ｆ１０−ｈｕＭＣＳＰ Ｆｌｕｃ ２クローン４８細胞は、全てヒトＭＣＳＰを発現する）細胞解離バッファーで（ＭＣＳＰはトリプシン感受性である）又はトリプシンで（前日に蒔かれる）回収し、洗浄し、適切な細胞培養培地中で再懸濁した（別の図の詳細な説明を参照）。ウェル当たり２００００−３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに蒔き、各抗体希釈は指示されたように（三通り）添加された。エフェクター細胞は、最終的なＥ：Ｔ比が５：１（ヒトパンＴ細胞）、１０：１（ヒトＰＢＭＣ）を得るために添加された。
【０３１６】
更に、１−１０μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（シグマ＃Ｌ８９０２）、インゲンマメから分離されるイソレクチンの混合物を、ヒト又はカニクイザルのＴ細胞活性化を誘導するために増殖刺激として使用した。マウスのＴ細胞では、「ＣｏｎＡによるラットＴ細胞刺激(rat T-Stim with ConA)」（ＢＤ＃３５４１１５）の５％溶液を、Ｔ細胞活性化の陽性対照として使用した。
【０３１７】
正規化のために、標的細胞（＝１００％）の最大溶解を、１％トリトンＸ−１００の最終濃度による標的細胞のインキュベーションによって達成する。最小限の溶解（＝０％）は、任意の構築物又は抗体を含まずにエフェクター細胞とともに同時インキュベートした標的細胞を指す。
【０３１８】
３７℃、５％ＣＯ２で少なくとも１８時間の一晩のインキュベーションの後、製造業者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定する。
【０３１９】
Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）及びＦａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）二重特異性構築物によるＬＤＨ放出アッセイ
精製されたＦａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３），Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）及び（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）参照分子は、細胞上のそれぞれの抗原への両方の標的化部分の結合を介した構築物の架橋の際の腫瘍標的細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの潜在能力について分析された。簡潔には、ｈｕＭＣＳＰを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト黒色腫標的細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン＃１２０５５−０９１）中に再懸濁する。ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈は指示された濃度で添加された。全ての構築物とそれに対応する対照のＩｇＧを、同じモル濃度に調整した。
【０３２０】
ヒトパンＴエフェクター細胞は、最終Ｅ：Ｔ比が５：１となるように添加された。ヒトパンＴ細胞の活性化の陽性対照として、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（シグマ＃Ｌ８９０２）を用いた。正規化のために、標的細胞（＝１００％）の最大溶解を、１％トリトンＸ−１００の最終濃度で標的細胞のインキュベーションによって決定した。最小限の溶解（＝０％）は、任意の構築物又は抗体を含まずにエフェクター細胞とともに同時インキュベートした標的細胞を指す。
【０３２１】
３７℃、５％ＣＯ２で２０時間の一晩のインキュベーションの後、製造業者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。
【０３２２】
図１０に示すように、二価のＭＣＳＰ標的化を有する構築物は、（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）構築物と比較して同程度の細胞傷害活性を示すが、一方一価のＭＣＳＰ結合を有するＦａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）構築物は明らかに作用が弱い。
【０３２３】
Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）二重特異性構築物によるＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒトメラノーマ標的細胞のＬＤＨ放出アッセイ
精製されたＦａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）及び（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）参照分子は、細胞上のそれぞれの抗原への両方の標的化部分の結合を介した構築物の架橋の際の腫瘍標的細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの潜在能力について分析された。
【０３２４】
簡潔には、ｈｕＭＣＳＰを発現するＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト黒色腫標的細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、ＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン＃１２０５５−０９１）中に再懸濁する。ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈は指示された濃度で添加された。全ての構築物とそれに対応する対照のＩｇＧを、同じモル濃度に調整した。
【０３２５】
ヒトパンＴエフェクター細胞は、最終Ｅ：Ｔ比が５：１となるように添加された。ヒトパンＴ細胞の活性化の陽性対照として、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（シグマ＃Ｌ８９０２）を用いた。正規化のために、標的細胞（＝１００％）の最大溶解を、１％トリトンＸ−１００の最終濃度で標的細胞のインキュベーションによって決定した。最小限の溶解（＝０％）は、任意の構築物又は抗体を含まずにエフェクター細胞とともに同時インキュベートした標的細胞を指す。
【０３２６】
３７℃、５％ＣＯ２で２１時間の一晩のインキュベーションの後、製造業者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。
【０３２７】
図１１に示すように、Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）は、（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）分子と少なくとも同程度に良好に標的細胞においてアポトーシスを誘導する。
【０３２８】
Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）二重特異性構築物によるＭＶ−３ヒトメラノーマ標的細胞のＬＤＨ放出アッセイ
精製されたＦａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）及び（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）分子は、細胞上のそれぞれの抗原への両方の標的化部分の結合を介した構築物の架橋の際の腫瘍標的細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの潜在能力について分析された。
【０３２９】
簡潔には、ｈｕＭＣＳＰを発現するＭＶ−３ヒトメラノーマ標的細胞を、ＬＤＨ放出アッセイを開始する前日にトリプシンで回収する。細胞は、適切な細胞培養培地中で洗浄し、再懸濁した。ウェル当たり３００００細胞を丸底９６ウェルプレートに蒔いた。翌日、上清を廃棄し、１００μｌ／ウェルのＡＩＭ−Ｖ培地（インビトロジェン＃１２０５５から０９１）並びにそれぞれの抗体希釈を示された濃度で添加した。全ての構築物とそれに対応する対照のＩｇＧを、同じモル濃度に調整した。
【０３３０】
ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞が最終Ｅ：Ｔ比１０：１を得るために添加された。ヒトパンＴ細胞の活性化の陽性対照として、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ−Ｍ（シグマ＃Ｌ８９０２）を用いた。正規化のために、標的細胞（＝１００％）の最大溶解を、１％トリトンＸ−１００の最終濃度で標的細胞のインキュベーションによって決定した。最小限の溶解（＝０％）は、任意の構築物又は抗体を含まずにエフェクター細胞とともに同時インキュベートした標的細胞を指す。
【０３３１】
３７℃、５％ＣＯ２で２６時間の一晩のインキュベーションの後、製造業者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。
【０３３２】
図１２に示すように、Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）は、（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）分子と少なくとも同程度に良好に標的細胞においてアポトーシスを誘導する。
【０３３３】
Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）二重特異性構築物によるＭＶ−３ヒトメラノーマ標的細胞のＬＤＨ放出アッセイ
上記に概説したようにＬＤＨ放出アッセイを行った。図１９は、Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ （ＣＤ３）、各（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）参照分子で〜２４時間処置された、ヒトＰＢＭＣとの共培養（Ｅ：Ｔ比＝１０：１）に際して、ｈｕＭＣＳＰ陽性ＭＶ−３腫瘍細胞の死滅を示す。
【０３３４】
マウスＣｒｏｓｓｆａｂ （ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）二重特異性構築物によるＬＤＨ放出アッセイ
マウスＣＤ３並びにヒトＭＣＳＰを標的とする精製されたＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）は、細胞上のそれぞれの抗原への両方の標的化部分の結合を介した構築物の架橋の際の腫瘍標的細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの潜在能力について分析された。
【０３３５】
簡潔には、ｈｕＭＣＳＰを発現するＢ１６／Ｆ１０−ｈｕＭＣＳＰ Ｆｌｕｃ２クローン４８腫瘍細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、１ＸＮＥＡＡ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０μｍの２−ｂ−ＭＥ及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で洗浄し再懸濁する。
【０３３６】
ウェル当たり２００００細胞を丸底９６ウェルプレートに蒔き、各抗体希釈は指示された濃度で添加された。二重特異性構築物と異なるＩｇＧ対照物を同じモル濃度に調整した。マウスＴ細胞の活性化のための追加の対照として、「ＣｏｎＡによるＴ細胞刺激（T Cell Stim with ConA)」（ＢＤ ＃３５４１１５）が使用され、アッセイ培地で１：１６０希釈した。
【０３３７】
脾細胞（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）から単離したマウスパンＴエフェクター細胞が、最終Ｅ：Ｔ比１０：１を得るために添加された。正規化のために、標的細胞（＝１００％）の最大溶解を、１％トリトンＸ−１００の最終濃度で標的細胞のインキュベーションによって決定した。最小限の溶解（＝０％）は、任意の構築物又は抗体を含まずにエフェクター細胞とともに同時インキュベートした標的細胞を指す。
【０３３８】
３７℃、５％ＣＯ２で７０時間のインキュベーションの後、製造業者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。
【０３３９】
図１３に示すように、二重特異性構築物は、「ＣｏｎＡによるＴ細胞刺激(T Cell Stim with ConA)」による陽性対照と同程度に標的細胞からの濃度依存性ＬＤＨ放出を誘導する。  
【０３４０】
マウスＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）二重特異性構築物によるＬＤＨ放出アッセイ
マウスＣＤ３並びにヒトＭＣＳＰを標的とする精製されたＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）は、細胞上のそれぞれの抗原への両方の標的化部分の結合を介した構築物の架橋の際の腫瘍標的細胞におけるＴ細胞媒介性アポトーシスを誘導するそれらの潜在能力について分析された。
【０３４１】
簡潔には、ｈｕＭＣＳＰを発現するＢ１６／Ｆ１０−ｈｕＭＣＳＰ Ｆｌｕｃ２クローン４８腫瘍細胞を、細胞解離緩衝液で回収し、洗浄し、１ＸＮＥＡＡ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０μＭの２−ｂ−ＭＥ及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で洗浄し再懸濁する。
【０３４２】
ウェル当たり２００００細胞を丸底９６ウェルプレートに播種し、各抗体希釈は最終濃度５０ｎＭを得るように添加された。二重特異性構築物と異なるＩｇＧ対照物を同じモル濃度に調整した。
【０３４３】
脾細胞（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）から単離したマウスパンＴエフェクター細胞が、最終Ｅ：Ｔ比１０：１を得るために添加された。標的細胞の非存在下でマウスＴ細胞の過剰活性のレベルを評価するために、５０ｎＭの二重特異性構築物及びＴ細胞を有する対照のウェルはそれに従って蒔かれた。
【０３４４】
正規化のために、標的細胞（＝１００％）の最大溶解を、１％トリトンＸ−１００の最終濃度で標的細胞のインキュベーションによって決定した。最小限の溶解（＝０％）は、任意の構築物又は抗体を含まずにエフェクター細胞とともに同時インキュベートした標的細胞を指す。
【０３４５】
３７℃、５％ＣＯ２で７０時間のインキュベーションの後、製造業者の指示に従ってＬＤＨ検出キット（ロシュ・アプライド・サイエンス、＃１１６４４７９３００１）により、アポトーシス／壊死性標的細胞の上清へのＬＤＨ放出を測定した。
【０３４６】
図１４に示すように、二重特異性構築物は、標的細胞からＬＤＨの強い放出を誘導する。標的細胞の非存在下では、標的細胞と共培養した未処置のマウスのＴ細胞と比較して、（Ｔ細胞の過剰活性化を反映して）ＬＤＨの僅かな増加のみがある。対照のＩｇＧの何れも、標的細胞のＬＤＨ放出を誘導しなかった。
【０３４７】
実施例８：サイトカイン放出アッセイ（ＣＢＡ分析）
標的細胞の存在下又は非存在下で、ＣＤ３二重特異性構築物によるＴ細胞活性化の際の異なるサイトカインのデノボ分泌を評価するために、ヒトＰＢＭＣを、バフィーコートから単離し、ウェル当たり０．３Ｍｉｏ細胞を丸底９６ウェルプレートに蒔いた。あるいは、健康なドナーからの２８０μｌの全血を、深型ウェルの９６ウェルプレートのウェルあたりに蒔いた。
【０３４８】
腫瘍標的細胞（例えばＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物ではＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞）が最終Ｅ／Ｔ比１０：１を得るために添加された。二重特異性構築物および対照物を示されるように添加した。３７℃で５％ＣＯ２で２４時間までインキュベートした後、アッセイプレートを３５０Ｘｇで５分間遠心分離し、その後の分析のために上清を新しい深型ウェルの９６ウェルプレートに移した。
【０３４９】
ＣＢＡ分析は、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩについての製造業者の指示に従って、以下のＣＢＡフレックスセット（Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ）：ヒトグランザイムＢ（ＢＤ＃５６０３０４）、ヒトＩＦＮ−γフレックスセット（ＢＤ＃５５８２６９）、ヒトＴＮＦフレックスセット（ＢＤ＃５５８２７３）、ヒトＩＬ−１０フレックスセット（ＢＤ＃５５８２７４）、ヒトＩＬ−６フレックスセット（ＢＤ＃５５８２７６）、ヒトＩＬ−４フレックスセット（ＢＤ＃５５８２７２）の組み合わせを用いて実施した。
【０３５０】
ＭＣＳＰ−ＣＤ３二重特異性構築物によるサイトカイン放出アッセイ
次の精製された二重特異性構築物が、腫瘍標的細胞の存在下（Ａ、Ｂ）対非存在下（Ｃ、Ｄ）でのサイトカインのＴ細胞媒介デノボ分泌を誘導するそれらの能力について分析された：「Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）及び（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）参照分子。
【０３５１】
簡潔には、健康なドナーからの２８０μｌの全血を、深型ウェルの９６ウェルプレートのウェルあたりに播いた。ヒトのＭＣＳＰを表現する３００００のＣｏｌｏ−３８腫瘍標的細胞、並びに様々な二重特異性構築物及びＩｇＧ対照を１ｎＭの最終濃度で添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートし、次いで、３５０Ｘｇで５分間遠心分離した。その後の分析のために上清を新しい深型ウェルの９６ウェルプレートに移した。
【０３５２】
ＣＢＡ分析は、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩについての製造業者の指示に従って、以下のＣＢＡフレックスセット（Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ）：ヒトグランザイムＢ（ＢＤ＃５６０３０４）、ヒトＩＦＮ−γフレックスセット（ＢＤ＃５５８２６９）、ヒトＴＮＦフレックスセット（ＢＤ＃５５８２７３）、ヒトＩＬ−１０フレックスセット（ＢＤ＃５５８２７４）、ヒトＩＬ−６フレックスセット（ＢＤ＃５５８２７６）、ヒトＩＬ−４フレックスセット（ＢＤ＃５５８２７２）の組み合わせを用いて実施した。
【０３５３】
図１５は、２４時間、Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の存在下（Ａ、Ｂ）又は非存在下（Ｃ、Ｄ）で、１ｎＭの異なるＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）及び（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ））で処置した後、全血の上清で測定した様々なサイトカインのレベルを示している。示されるように、２８０μｌの全血を、９６ウェルプレートのウェルあたりに蒔き、３００００Ｃｏｌｏ−３８細胞を添加した。
【０３５４】
Ｃｏｌｏ−３８腫瘍細胞の存在下でＴ細胞の活性化の際に分泌された主要なサイトカインは、ＩＬ−６続いてＩＦＮガンマである。加えて、標的細胞の存在下でＴ細胞の活性化の際に、グランザイムＢのレベルは非常に増加した。一般に、（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）構築物は、標的細胞の存在下で（Ａ及びＢ）、他の二重特異性構築物と比較して、ＴＮＦ及びＩＦＮガンマ、並びにグランザイムＢのレベルを少し上昇させた。
【０３５５】
標的細胞の存在（または非存在）下で二重特異性構築物によるＴ細胞の活性化の際に、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−１０およびＩＬ−４）の有意な分泌はなかった。
【０３５６】
このアッセイにおいて、標的細胞の存在下で、Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）構築物により誘導されるＩＦＮガンマの弱い分泌もあった。
【０３５７】
ＭＣＳＰマウスＣＤ３二重特異性構築物によるサイトカイン放出アッセイ
マウスＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）として精製されたｈｕＭＣＳＰ−ｍｕＣＤ３標的二重特異性分子分子は、ヒトＭＣＳＰ発現腫瘍細胞の存在下で、ＣＤ８＋Ｔ細胞上の後期活性化マーカーＣＤ２５を上方制御するその潜在能力についてフローサイトメトリーによって試験した。
【０３５８】
簡潔には、Ｂ１６／Ｆ１０−ｈｕＭＣＳＰ Ｆｌｕｃ２クローン４８腫瘍細胞を細胞解離緩衝液で回収し、計数し、そして生存率についてチェックした。細胞はＲＰＭＩ１６４０培地（１×ＮＥＡＡ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０μｍの２−β−ＭＥ、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含む）中でｍｌあたり０．３×１０６（生存可能）細胞へと調整され、ウェル当たりこの細胞懸濁液の１００μｌを、（示されるように）丸底９６ウェルプレートにピペットで入れた。（希釈した）二重特異性構築物の５０μｌを細胞を含むウェルに加え、最終濃度５０ｎＭを得た。ヒトマウスＴエフェクター細胞を脾細胞から単離し（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）、ＡＩＭ−Ｖ培地中でｍｌあたり３×１０６（生存可能）細胞へと調整した。この細胞懸濁液５０μｌをアッセイプレート（上記参照）の各ウェルに添加し、最終Ｅ：Ｔ比：１０：１を得た。二重特異性構築物がｈｕＭＣＳＰを発現する標的細胞の存在下でのみＴ細胞を活性化できるかどうかを分析するために、ウェルには、それぞれの二重特異性分子の５０ｎＭ、並びに標的細胞は無いがＴエフェクターが含まれているウェルが含まれた。
【０３５９】
３７℃、５％ＣＯ２で７０時間インキュベートした後、細胞を遠心分離し（５分間、３５０×ｇ）、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳを１５０μＬ／ウェルで２回洗浄した。
【０３６０】
ＣＤ８ａ（ラットＩｇＧ２ａ；クローン５３−６．７；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ＃１００７１２）及びＣＤ２５（ラットＩｇＧ２ｂ；クローン５３−６．７；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ＃１００７１２）の表面染色を供給者の提案に従って行った。細胞を、１００μｌ／ウェルの固定緩衝液（ＢＤ＃５５４６５５）を用いて２回洗浄し、０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳを１５０μｌ／ウェルで、４℃で１５分間固定した。
【０３６１】
遠心分離後、サンプルは０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳの２００μｌ／ウェルに再懸濁し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ装置（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いて分析した。
【０３６２】
図１６は、マウスＣｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）構築物は、標的細胞の存在下でのみＣＤ２５の上方制御を誘導することを示している。
【０３６３】
実施例９：二重特異性構築物の係合時の初代ヒトＴ細胞上の表面活性化マーカーの発現
腫瘍標的細胞の存在下で排他的にＣＤ３二重特異性構築物の結合時のＴ細胞の特異的活性化をチェックするため、初代ヒトＰＢＭＣ（上述のように単離される）を、腫瘍抗原陽性標的細胞の存在下又非存在下で少なくとも２４時間、二重特異性構築物の指定濃度でインキュベートした。
【０３６４】
簡潔には、０．３百万の初代ヒトＰＢＭＣをｈｕＭＣＳＰ陽性標的細胞（ＭＶ−３腫瘍細胞）または培地を含む、平底９６ウェルプレートのウェルごとに蒔いた。標的細胞に対する最終的なエフェクター比（Ｅ：Ｔ）は１０：１であった。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２で指示されたインキュベーション時間、ＣＤ３−ＭＣＳＰ二重特異性構築物（Ｆａｂ（ＭＣＳＰ）−Ｃｒｏｓｓｆａｂ（ＣＤ３）；「１＋１ 非Ｆｃ」と表される、及び（ｓｃＦｖ）２（抗ＭＣＳＰ／抗ｈｕＣＤ３ｅ）参照分子（「（ｓｃＦｖ）２」と表される）の指示された濃度でインキュベートした。エフェクター細胞は、ＣＤ８、および初期活性化マーカーＣＤ６９又は後期活性化マーカーＣＤ２５について染色し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩにより分析した。
【０３６５】
図２０は、この実験の結果を示す。
【０３６６】
本発明の現在の好ましい実施態様を示し、説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、別の方法で様々に具体化され、以下の特許請求の範囲内で実施され得ることが明確に理解されるべきである。
【０３６７】
配列
本発明の現在の好ましい実施態様を示し、説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、別の方法で様々に具体化され、以下の特許請求の範囲内で実施され得ることが明確に理解されるべきである。説明文：ＧＡ２０１＝ＥＧＦＲバインダー、３Ｆ２＝ＦＡＰバインダー、ＣＨ１Ａ１Ａ＝ＣＥＡバインダー。
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本発明の現在の好ましい実施態様を示し、説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、別の方法で様々に具体化され、以下の特許請求の範囲内で実施され得ることが明確に理解されるべきである。
【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２３】
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【図１ａ−ｃ】
2014529600.tif 000043
【図１ｄ−ｅ】
2014529600.tif 000044
【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
2014529600.tif 000051
【図１５ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
2014529600000001.app
【国際調査報告】
2014529600.tif 000059
2014529600.tif 000060
2014529600.tif 000061
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