(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明は、以下の工程：分析される試料を提供すること、少なくとも２０個の遺伝子座の同時ポリメラーゼ連鎖反応増幅に必要である、試薬、酵素、及びプライマーオリゴヌクレオチドを提供すること、前記遺伝子座を増幅すること、増幅産物を検出すること、を含む、ＤＮＡプロファイリングアッセイ法であって、前記増幅産物、及び増幅される前記遺伝子座が、以下の特徴によって特徴付けられる方法：増幅される各遺伝子座は、母集団に存在することが知られる少なくとも１つの欠失-挿入多型によって特徴づけられ、各遺伝子座からの２つの対立遺伝子は、その大きさにおいて２ヌクレオチド超かつ１００ヌクレオチド未満だけ異なること、少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある、少なくとも２つの増幅産物の第一のセットは、第一の標識を有すること、少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある、少なくとも２つの増幅産物の第二のセットは、第二の標識を有すること、少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある、少なくとも２つの増幅産物の第三のセットは、第三の標識を有すること、標識１、標識２、及び標識３は、例えば、ＤＮＡ配列決定装置と組合せたマルチカラー検出器によって区別され、かつ同時に検出され得る、それぞれ異なる蛍光標識であること、に関する。【選択図】図１
2011518568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（i）分析される試料を提供すること、
（ii）少なくとも２０個の遺伝子座の同時ポリメラーゼ連鎖反応増幅に必要である、試薬、酵素、及びプライマーオリゴヌクレオチドを提供すること、
（iii）前記遺伝子座を増幅すること、
（iv）増幅産物を検出すること、
を含む、ＤＮＡプロファイリングアッセイ法であって、
前記増幅産物、及び増幅される前記遺伝子座が、以下の特徴によって特徴付けられる方法：
ａ）増幅される各遺伝子座は、母集団に存在することが知られる少なくとも１つの欠失-挿入多型によって特徴づけられ、各遺伝子座からの２つの対立遺伝子は、その大きさにおいて１ヌクレオチド超かつ１００ヌクレオチド未満だけ異なること、
ｂ）少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある、少なくとも２つの増幅産物の第一のセットは、第一の標識を有すること、
ｃ）少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある、少なくとも２つの増幅産物の第二のセットは、第二の標識を有すること、
ｄ）少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある、少なくとも２つの増幅産物の第三のセットは、第三の標識を有すること、
ｅ）標識１、標識２、及び標識３は、それぞれ異なる蛍光標識であること、
ｆ）与えられる遺伝子座に関する２つの対立遺伝子の間における大きさの差異が、１ヌクレオチド超かつ１００ヌクレオチド未満であること。
【請求項２】
少なくとも２５個の遺伝子座が同時に増幅される、請求項１に記載のプロファイリングアッセイ法。
【請求項３】
少なくとも３０個の遺伝子座が同時に増幅される、請求項１に記載のプロファイリングアッセイ法。
【請求項４】
前記３つのセットｂ）からｄ）の増幅産物のそれぞれが、少なくとも１０個の増幅産物を含む、請求項３に記載のプロファイリングアッセイ法。
【請求項５】
各遺伝子座からの２つの対立遺伝子は、その大きさにおいて１ヌクレオチド超かつ４０ヌクレオチド未満だけ異なる、前記請求項のいずれか１項に記載のプロファイリングアッセイ法。
【請求項６】
少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある増幅産物の２つ以上が、第四の標識を有する、請求項１〜５のプロファイリングアッセイ法。
【請求項７】
検出工程が、キャピラリーゲル電気泳動装置を用いて実施される、請求項１〜６のプロファイリングアッセイ法。
【請求項８】
増幅される前記遺伝子座が以下の配列の群から選択され、かつプライマーペアーが異なるＤＩＰ配列に対してそれぞれ特異的である、請求項１〜７のプロファイリングアッセイ法、
DIP番号1:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２、
DIP番号2:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号255の間に存在する配列番号４、
DIP番号3:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号６、
DIP番号4:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号262の間に存在する配列番号８、
DIP番号5:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１０、
DIP番号6:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１２、
DIP番号7:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１４、
DIP番号8:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１６、
DIP番号9:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号１８、
DIP番号10:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号247の間に存在する配列番号１９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号252の間に存在する配列番号２０、
DIP番号11:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２２、
DIP番号12:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号２３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号260の間に存在する配列番号２４、
DIP番号13:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２６、
DIP番号14:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号２８、
DIP番号15:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号３０、
DIP番号16:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号３２、
DIP番号17:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号270の間に存在する配列番号３４、
DIP番号18:
-挿入-欠失多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３５、
-挿入-欠失多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号３６、
DIP番号19:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号３８、
DIP番号20:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号４０、
DIP番号21:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号４２、
DIP番号22:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号４３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号257の間に存在する配列番号４４、
DIP番号23:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号４６、
DIP番号24:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号４８、
DIP番号25:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号４９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号296の間に存在する配列番号５０、
DIP番号26:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号266の間に存在する配列番号５２、
DIP番号27:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号５３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号273の間に存在する配列番号５４、
DIP番号28:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号５６、
DIP番号29:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号267の間に存在する配列番号５８、
DIP番号30:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号270の間に存在する配列番号６０、
DIP番号31:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号271及び番号272の間に存在する配列番号６１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号271及び番号278の間に存在する配列番号６２、
DIP番号32:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号280及び番号281の間に存在する配列番号６３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号280及び番号284の間に存在する配列番号６４、
DIP番号33:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号６５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号６６、
DIP番号34:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号６７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号６８、
DIP番号35:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号６９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号255の間に存在する配列番号７０、
DIP番号36:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号258の間に存在する配列番号７２、
DIP番号37:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号７３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号７４、
DIP番号38:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号255及び番号256の間に存在する配列番号７５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号255及び番号261の間に存在する配列番号７６、
DIP番号39:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号７７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号７８、
DIP番号40:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号259の間に存在する配列番号８０、
DIP番号41:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号254の間に存在する配列番号８２、
DIP番号42:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号254の間に存在する配列番号８４、
DIP番号43:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号255の間に存在する配列番号８６、
DIP番号44:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号８７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号８８、
DIP番号45:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号８９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号９０、
DIP番号46:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号９１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号９２、
DIP番号47:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号９４、
DIP番号48:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号９６、
DIP番号49:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号247及び番号248の間に存在する配列番号９７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号247及び番号252の間に存在する配列番号９８、
DIP番号50:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号９９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１００、
DIP番号51:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号１０２、
DIP番号52:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１０３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１０４、
DIP番号53:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１０５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１０６、
DIP番号54:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号１０８、
DIP番号55:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号１１０、
DIP番号56:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号258の間に存在する配列番号１１２、
DIP番号57:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号247の間に存在する配列番号１１３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号252の間に存在する配列番号１１４、
DIP番号58:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号263の間に存在する配列番号１１６、
DIP番号59:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号266の間に存在する配列番号１１８、
DIP番号60:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１１９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号268の間に存在する配列番号１２０、
DIP番号61:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１２１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号277の間に存在する配列番号１２２、
DIP番号62:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１２３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号１２４、
DIP番号63:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号２８９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号２９０。
【請求項９】
さらに、１つ以上の縦列型反復配列（ＳＴＲ）が増幅され、及び／又は、１つ以上の変動数縦列型反復配列（ＶＮＴＲ)が増幅され、及び／又は、１つ以上の一塩基多型（ＳＮＰ)が増幅される、前記請求項のいずれか１項に記載のプロファイリングアッセイ法。
【請求項１０】
さらに、１つ以上の性特異的縦列型反復配列（ＳＴＲ）及び／又は性特異的非変異型ＤＮＡ断片が増幅され、及び／又は、１つ以上の性特異的変動数縦列型反復配列（ＶＮＴＲ)が増幅され、及び／又は、１つ以上の性特異的一塩基多型（ＳＮＰ)が増幅される、前記請求項のいずれか１項に記載のプロファイリングアッセイ法。
【請求項１１】
プライマー・オリゴヌクレオチド・ペアーが、以下の配列を有する核酸分子の群から選択される、前記請求項のいずれか１項に記載のプロファイリングアッセイ法：
a) DIP番号1:配列番号125及び配列番号126
又は配列番号267及び配列番号268
b) DIP番号2:配列番号127 及び配列番号128
c) DIP番号3:配列番号129及び配列番号130
d) DIP番号4:配列番号131及び配列番号132
e) DIP番号5:配列番号133及び配列番号134
f) DIP番号6:配列番号135及び配列番号136
g) DIP番号7:配列番号137及び配列番号138
h) DIP番号8:配列番号139及び配列番号140
又は配列番号287及び配列番号288
i) DIP番号9:配列番号141及び配列番号142
j) DIP番号10:配列番号143及び配列番号144
k) DIP番号11:配列番号145及び配列番号146
l) DIP番号12:配列番号147及び配列番号148
m) DIP番号13:配列番号149及び配列番号150
n) DIP番号14:配列番号151及び配列番号152
o) DIP番号15:配列番号153及び配列番号154
又は配列番号281及び配列番号282
p) DIP番号16:配列番号155及び配列番号156
q) DIP番号17:配列番号157及び配列番号158
又は配列番号273及び配列番号274
r) DIP番号18:配列番号159及び配列番号160
又は配列番号277及び配列番号278
s) DIP番号19:配列番号161及び配列番号162
又は配列番号279及び配列番号280
t) DIP番号20:配列番号163及び配列番号164
又は配列番号275及び配列番号276
u) DIP番号21:配列番号165及び配列番号166
v) DIP番号22:配列番号167及び配列番号168
w) DIP番号23:配列番号169及び配列番号170
x) DIP番号24:配列番号171及び配列番号172
y) DIP番号25:配列番号173及び配列番号174
z) DIP番号26:配列番号175及び配列番号176
aa) DIP番号27:配列番号177及び配列番号178
ab) DIP番号28:配列番号179及び配列番号180
ac) DIP番号29:配列番号181及び配列番号182
又は配列番号271及び配列番号272
ad) DIP番号30:配列番号183及び配列番号184
又は配列番号283及び配列番号284
ae) DIP番号31:配列番号185及び配列番号186
af) DIP番号32:配列番号187及び配列番号188
又は配列番号269及び配列番号270
ag) DIP番号33:配列番号189及び配列番号190
又は配列番号285及び配列番号286
ah) DIP番号34:配列番号191及び配列番号191
ai) DIP番号35:配列番号193及び配列番号194
aj) DIP番号36:配列番号195及び配列番号196
ak) DIP番号37:配列番号197及び配列番号198
al) DIP番号38:配列番号199及び配列番号200
am) DIP番号39:配列番号201及び配列番号202
an) DIP番号40:配列番号203及び配列番号204
ao) DIP番号41:配列番号205及び配列番号206
又は配列番号251及び配列番号252
ap) DIP番号42:配列番号207及び配列番号208
又は配列番号253及び配列番号254
aq) DIP番号43:配列番号209及び配列番号210
又は配列番号255及び配列番号256
ar) DIP番号44:配列番号211及び配列番号212
又は配列番号257及び配列番号258
as) DIP番号45:配列番号213及び配列番号214
又は配列番号259及び配列番号260
at) DIP番号46:配列番号215及び配列番号216
又は配列番号261 及び配列番号262
au) DIP番号47:配列番号217及び配列番号218
又は配列番号263及び配列番号264
av) DIP番号48:配列番号219及び配列番号220
aw) DIP番号49:配列番号221及び配列番号222
ax) DIP番号50:配列番号223及び配列番号224
ay) DIP番号51:配列番号225及び配列番号226
又は配列番号265及び配列番号266
az) DIP番号52:配列番号227及び配列番号228
ba) DIP番号53:配列番号229及び配列番号230
bb) DIP番号54:配列番号231及び配列番号232
bc) DIP番号55:配列番号233及び配列番号234
bd) DIP番号56:配列番号235及び配列番号236
be) DIP番号57:配列番号237及び配列番号238
bf) DIP番号58:配列番号239及び配列番号240
bg) DIP番号59:配列番号241及び配列番号242
bh) DIP番号60:配列番号243及び配列番号244
bi) DIP番号61:配列番号245及び配列番号246
bj) DIP番号62:配列番号247及び配列番号248
bk) DIP番号63:配列番号249及び配列番号250
【請求項１２】
ポリメラーゼ連鎖反応増幅のための少なくとも３つのプライマーペアーを含む、ＤＮＡ増幅方法に用いるためのキットであって、各１つの上流プライマー及び１つの下流プライマーからなるプライマーペアーは、以下の群から選択される配列のいずれか１つに記載の配列に結合することが可能であり、かつプライマーペアーが異なるＤＩＰ配列に対してそれぞれ特異的である、キット：
DIP番号1:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２、
DIP番号2:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号255の間に存在する配列番号４、
DIP番号3:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号６、
DIP番号4:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号262の間に存在する配列番号８、
DIP番号5:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１０、
DIP番号6:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１２、
DIP番号7:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１４、
DIP番号8:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１６、
DIP番号9:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号１８、
DIP番号10:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号247の間に存在する配列番号１９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号252の間に存在する配列番号２０、
DIP番号11:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２２、
DIP番号12:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号２３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号260の間に存在する配列番号２４、
DIP番号13:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２６、
DIP番号14:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号２８、
DIP番号15:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号３０、
DIP番号16:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号３２、
DIP番号17:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号270の間に存在する配列番号３４、
DIP番号18:
-挿入-欠失多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３５、
-挿入-欠失多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号３６、
DIP番号19:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号３８、
DIP番号20:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号４０、
DIP番号21:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号４２、
DIP番号22:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号４３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号257の間に存在する配列番号４４、
DIP番号23:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号４６、
DIP番号24:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号４８、
DIP番号25:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号４９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号296の間に存在する配列番号５０、
DIP番号26:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号266の間に存在する配列番号５２、
DIP番号27:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号５３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号273の間に存在する配列番号５４、
DIP番号28:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号５６、
DIP番号29:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号267の間に存在する配列番号５８、
DIP番号30:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号270の間に存在する配列番号６０、
DIP番号31:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号271及び番号272の間に存在する配列番号６１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号271及び番号278の間に存在する配列番号６２、
DIP番号32:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号280及び番号281の間に存在する配列番号６３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号280及び番号284の間に存在する配列番号６４、
DIP番号33:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号６５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号６６、
DIP番号34:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号６７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号６８、
DIP番号35:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号６９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号255の間に存在する配列番号７０、
DIP番号36:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号258の間に存在する配列番号７２、
DIP番号37:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号７３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号７４、
DIP番号38:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号255及び番号256の間に存在する配列番号７５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号255及び番号261の間に存在する配列番号７６、
DIP番号39:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号７７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号７８、
DIP番号40:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号259の間に存在する配列番号８０、
DIP番号41:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号254の間に存在する配列番号８２、
DIP番号42:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号254の間に存在する配列番号８４、
DIP番号43:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号255の間に存在する配列番号８６、
DIP番号44:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号８７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号８８、
DIP番号45:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号８９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号９０、
DIP番号46:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号９１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号９２、
DIP番号47:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号９４、
DIP番号48:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号９６、
DIP番号49:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号247及び番号248の間に存在する配列番号９７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号247及び番号252の間に存在する配列番号９８、
DIP番号50:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号９９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１００、
DIP番号51:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号１０２、
DIP番号52:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１０３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１０４、
DIP番号53:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１０５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１０６、
DIP番号54:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号１０８、
DIP番号55:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号１１０、
DIP番号56:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号258の間に存在する配列番号１１２、
DIP番号57:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号247の間に存在する配列番号１１３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号252の間に存在する配列番号１１４、
DIP番号58:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号263の間に存在する配列番号１１６、
DIP番号59:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号266の間に存在する配列番号１１８、
DIP番号60:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１１９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号268の間に存在する配列番号１２０、
DIP番号61:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１２１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号277の間に存在する配列番号１２２、
DIP番号62:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１２３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号６４、
DIP番号63:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号２８９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号２９０。
【請求項１３】
請求項１１に開示される群から選択される異なる配列に結合することがそれぞれ可能である、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個のプライマーペアーを含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
プロファイリングアッセイ法における、以下の群から選択される少なくとも２つのＤＩＰ配列の選択物の使用であって、プライマーが、欠失-挿入多型が増幅され得るように調整されている、使用：
DIP番号1:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２、
DIP番号2:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号255の間に存在する配列番号４、
DIP番号3:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号６、
DIP番号4:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号262の間に存在する配列番号８、
DIP番号5:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１０、
DIP番号6:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１２、
DIP番号7:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１４、
DIP番号8:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１６、
DIP番号9:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号１８、
DIP番号10:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号247の間に存在する配列番号１９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号252の間に存在する配列番号２０、
DIP番号11:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２２、
DIP番号12:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号２３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号260の間に存在する配列番号２４、
DIP番号13:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２６、
DIP番号14:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号２８、
DIP番号15:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号３０、
DIP番号16:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号３２、
DIP番号17:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号270の間に存在する配列番号３４、
DIP番号18:
-挿入-欠失多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３５、
-挿入-欠失多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号３６、
DIP番号19:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号３８、
DIP番号20:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号４０、
DIP番号21:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号４２、
DIP番号22:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号４３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号257の間に存在する配列番号４４、
DIP番号23:
-  欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号４６、
DIP番号24:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号４８、
DIP番号25:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号４９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号296の間に存在する配列番号５０、
DIP番号26:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号266の間に存在する配列番号５２、
DIP番号27:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号５３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号273の間に存在する配列番号５４、
DIP番号28:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号５６、
DIP番号29:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号267の間に存在する配列番号５８、
DIP番号30:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号270の間に存在する配列番号６０、
DIP番号31:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号271及び番号272の間に存在する配列番号６１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号271及び番号278の間に存在する配列番号６２、
DIP番号32:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号280及び番号281の間に存在する配列番号６３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号280及び番号284の間に存在する配列番号６４、
DIP番号33:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号６５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号６６、
DIP番号34:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号６７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号６８、
DIP番号35:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号６９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号255の間に存在する配列番号７０、
DIP番号36:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号258の間に存在する配列番号７２、
DIP番号37:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号７３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号７４、
DIP番号38:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号255及び番号256の間に存在する配列番号７５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号255及び番号261の間に存在する配列番号７６、
DIP番号39:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号７７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号７８、
DIP番号40:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号259の間に存在する配列番号８０、
DIP番号41:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号254の間に存在する配列番号８２、
DIP番号42:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号254の間に存在する配列番号８４、
DIP番号43:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号255の間に存在する配列番号８６、
DIP番号44:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号８７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号８８、
DIP番号45:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号８９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号９０、
DIP番号46:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号９１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号９２、
DIP番号47:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号９４、
DIP番号48:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号９６、
DIP番号49:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号247及び番号248の間に存在する配列番号９７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号247及び番号252の間に存在する配列番号９８、
DIP番号50:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号９９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１００、
DIP番号51:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号１０２、
DIP番号52:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１０３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１０４、
DIP番号53:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１０５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１０６、
DIP番号54:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号１０８、
DIP番号55:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号１１０、
DIP番号56:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号258の間に存在する配列番号１１２、
DIP番号57:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号252の間に存在する配列番号１１３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号247の間に存在する配列番号１１４、
DIP番号58:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号263の間に存在する配列番号１１６、
DIP番号59:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号266の間に存在する配列番号１１８、
DIP番号60:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１１９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号268の間に存在する配列番号１２０、
DIP番号61:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１２１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号277の間に存在する配列番号１２２、
DIP番号62:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１２３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号１２４、
DIP番号63:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号２８９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号２９０。
【請求項１５】
増幅方法が、対立遺伝子特異的マルチプレックスＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応アッセイ、マルチプレックス・ライゲーション依存プローブ増幅アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、チップに基づくアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、一塩基プライマー・エクステンションアッセイ、アレイ型プライマー伸長（APEX)、アレイ型ライゲーションアッセイ、対立遺伝子特異的アレイ型ライゲーションアッセイ、及びチップ上のＰＣＲからなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、ゲノムシステムにおける遺伝子マーカーの検出を主題とする。本発明の特定の一実施態様では、マルチプレックスシステム内に含まれる各遺伝子座位の対立遺伝子を好ましくは一反応において決定するための、ポリメラーゼ連鎖反応又はその他の増幅システムを用いた複数の異なる多型遺伝子座位の同時増幅を特異的主題とする。したがって、本発明は、化学及び生物学、より詳細には分子生物学、より詳細には人類遺伝学、及びもっとも詳細には、法医学、さらには親子鑑定試験の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの子供の親子関係の特定、及び、馬、イヌ、及びその他の動物の血統、並びに農作物の系統の確認には一般にDNAタイピングが用いられる。さらに、DNAタイピングは一般に、犯罪現場、又は、ヒトの残留物の特定を要求するその他の現場において見出される、血液、唾液、精液、及びその他の組織の供給源を特定するために用いられる。さらに、DNAタイピングは、臨床的背景において、例えば、ある種の白血病の治療において、特定の癌組織の存在下における骨髄移植の成功又は失敗を決定するためにも用いられる。DNAタイピングは、一般に「マーカー」と呼ばれる、対象特徴を有するゲノムDNAの対立遺伝子の分析を含む。今日使用される多くのタイピング法は、母集団において少なくとも二つの異なる形で現れることが知られるDNAマーカーの、一つ以上の領域の長さ及び／又は配列における差異を検出及び分析するように特異的に設計される。このような長さ及び／又は配列の変動は「多型」と呼ばれる。このような変動が起こる領域、すなわち、DNAの「座位」は、「多型座位」と呼ばれる。
【０００３】
多型DNA配列について論じる場合、特に、いわゆる反復多型DNA配列と、非反復多型要素とを区別しなければならない。DNA配列の研究では、反復配列に関して二つの主要タイプ；縦列反復配列及び散在性反復配列に区別することができる。縦列反復配列はサテライトDNAを含む。サテライトDNAは、高度に反復的なDNAから成り、したがって、短いDNA配列から成る反復は、種々の頻度のヌクレオチド、アデニン、シトシン、グアニン、及びチミンを生成する傾向があり、したがって、大部分のDNAとは異なる密度を持つ傾向があり、そのため、密度勾配で分離されるゲノムDNAにおいて、第2の、すなわち「サテライト」状バンドを形成するのでそのように呼ばれる。ミニサテライトとは、10から100 bpの塩基の短いシリーズから成るDNAセクションである。これらは、ヒトゲノムにおいて1,000を超える場所に出現する。あるミニサテライトは、文字"GGGCAGGANG"（式中、Nは、いずれのヌクレオチドであってもよい）（Nは、A、C、G、Tに対するUPACコードである）の中心（又はコア）配列、又は、一般に鎖バイアスである、コア配列以上を含む。この配列それ自体は、染色体同士のDNAの交換を促進することが示されている。別モデルでは、ミニサテライトの反復コピー数変動の主要原因は、隣接する、cis-作動性、細胞分裂時2本鎖解離ホットスポットの存在とされる。
【０００４】
散在性反復DNA配列は、全ての真核生物のゲノムの中に認められる。これらの配列は、RNA介在性転位によって自身を伝搬させるので、レトロポゾンと呼ばれる。このようなレトロポゾンは、上述の反復要素よりも実質的に大きい。
【０００５】
いわゆる短鎖散在反復配列（SINE）は、さらに別クラスの反復DNA要素である。SINEの特定タイプがいわゆるALU配列である。これらは、長さが約300塩基対である。したがって、これらの要素もまた、単純で、直接的なプロファイリングアッセイにとって特に有用ではない。
【０００６】
マイクロサテライトは、長さが1から6塩基対の反復単位から成る、細胞核DNA又はオルガネラDNA中に存在する、単純反復配列（simple sequence repeat;SSR）、又は縦列型反復配列（short tandem repeat;STR）、又は多型座位である。これらは、血縁関係及び生物集団研究を含む、遺伝学の分野において広く応用される分子マーカーとして使用される。マイクロサテライトはさらに、遺伝子量の研究（ある特定の遺伝子領域の重複又は欠失を探し求める）に用いることが可能である。マイクロサテライトの、一つの一般的例は、（CA)n反復列であり、式中nは、対立遺伝子間において変動可能である。これらのマーカーは、種間及び種内多型においてしばしば高レベルに存在する。特に、10個以上の数の縦列型反復列が出現する場合はそうである。多くの場合、この反復列は、単純で、2、3、又は4ヌクレオチド（それぞれ、ジ-、トリ-、テトラヌクレオチド反復列）から成り、10から100回反復することが可能である。ヒト及び他のゲノムでは、CAヌクレオチド反復列がきわめて高頻度であり、数千塩基対毎に存在する。多くの場合、STR座位にはきわめて多数の対立遺伝子が存在するので、血統内部の遺伝子型は多くの場合十分な情報性を持ち、ある特定の対立遺伝子の先祖は、多くの場合特定することが可能である。しかしながら、遺伝子アッセイにおいてこれらのいわゆるSTRを利用することは、母集団における大きな変動のために、それによって極端に多数の対立遺伝子が見出される可能性があり、かつ、前記対立遺伝子たちは、それらを例えば電気泳動ゲル上で分析する場合、サイズが実質的に異なるという基本的な効果を有する。
【０００７】
例えば、RFLPを用いる場合、偶発的マッチの理論的危険度は、1000億（100,000,000,000）分の1である。しかしながら、実験誤差の比率は、これよりもほぼ確実に高く、多くの場合、実際の実験手技は、それに基づいて一致確率が計算される理論を反映していない。例えば、一致確率は、二つのサンプルにおけるマーカーが正確に同じ場所にバンドを持つ確率に基づいて計算してもよいが、実験室研究者は、同じ遺伝子サンプルから、アガロースゲルにおける何らかの不完全のために、近似の―しかし正確に同じではない―バンドが得られると結論する可能性がある。しかしながら、この場合、実験室研究者は、マッチを宣告する基準を拡大することによって一致危険度を増す。STRにも同じ問題がある。これは、各座位について多数の対立遺伝子が存在すること、及び、この複雑性が、不正確に割り当てられる不明瞭な増幅産物をもたらす可能性があることによる。
【０００８】
いくつかの座位を含むシステムはマルチプレックスシステムと呼ばれるが、最大11を超える別々のSTR座位を含むこのようなシステムが多数開発されており、市販されている。一般に長さが60から500塩基対（bp）の小さな産物を生産する、STR座位関連増幅プロトコールは設計可能であり、かつ、多くの場合、各座位の対立遺伝子は、100塩基対未満の範囲に納まる。STR座位使用における実質的欠点は、特定座位に関する母集団内部における高度の変動性のために、いくつかの対立遺伝子は、多数の反復列を持つ可能性があり、したがって、多量の増幅産物をもたらす可能性があることである。これらのシステムの設計は、一部は、単一ゲル又はキャピラリーにおいて複数座位を分離することの困難によって制限を受ける。これは、ゲル又はキャピラリー、すなわち、当業者によってDNA断片分離のために一般的に使用される手段における、種々のサイズの断片、特に、比較的長い断片が空間的に圧縮されることから、生じる。複数対立遺伝子短鎖縦列型反復列（STR）の分析は、法医学的遺伝学及び社会的事案に対し今でも最大の影響を及ぼしているが、システムは、特に、低品質及び低量のDNAの証拠によって制限されると言わなければならない。例えば、分解したDNAサンプルは、大型STR分析の大問題の一つを意味する。なぜなら、マルチプレックスアッセイ内におけるアンプリコンのサイズは、多くの場合200塩基対を超えるからである。分解したサンプルは増幅するのが極端に難しい。
【０００９】
同時に、これまでいわゆる一塩基多型（SNP）に注意が向けられてきた。しかしながら、これらSNPは、ある一つのシステムが一つの一塩基多型の位置を特定することができなければならないという理由で、分析が難しい。
【００１０】
本発明は、関連分析のためのDNAプロファイリング、刑事司法、親子鑑定試験、及び、他の法医学的又は医学的及び遺伝学的識別アプリケーションにおいて既存の技術に優る著明な改善を示し、識別、位置、及び処理能力の向上をもたらす。これは、特に、本発明が、異なるタイプの多型マーカーの組み合わせ、すなわち、いわゆる高頻度二対立遺伝子欠失‐挿入多型（DIP）を使用するという事実による。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、以下の工程：分析される試料を提供すること、少なくとも２０個の遺伝子座の同時ポリメラーゼ連鎖反応増幅に必要である、試薬、酵素、及びプライマーオリゴヌクレオチドを提供すること、前記遺伝子座を増幅すること、増幅産物を検出すること、を含む、ＤＮＡプロファイリングアッセイ法であって、前記増幅産物、及び増幅される前記遺伝子座が、以下の特徴によって特徴付けられる方法：増幅される各遺伝子座は、母集団に存在することが知られる少なくとも１つの欠失-挿入多型によって特徴づけられ、各遺伝子座からの２つの対立遺伝子は、その大きさにおいて１ヌクレオチド超かつ１００ヌクレオチド未満だけ異なること、少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある、少なくとも２つの増幅産物の第一のセットは、第一の標識を有すること、少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある、少なくとも２つの増幅産物の第二のセットは、第二の標識を有すること、少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある、少なくとも２つの増幅産物の第三のセットは、第三の標識を有すること、標識１、標識２、及び標識３は、ＤＮＡ配列決定装置と組合せたマルチカラー検出器によって区別され、かつ同時に検出され得る、それぞれ異なる蛍光標識であること、に関する。
【００１２】
本発明の目的は、また、特定の座位（DIP）を含む、多重増幅のために特異的な方法、キット、及びプライマーを提供することである。
【００１３】
本発明では、同一性に関する組合せ確率（combined probability of identity;CPI）は、母集団における、ある一組の座位について、同じ遺伝子型を持つ二つの個体を見出す尤度を表す（キルスト・エム、コルデイロ・シーエム、レゼンデ・ジーディー、グラッタパグリア・ディー（Kirst M, Cordeiro CM, Rezende GD, Grattapaglia D.）、グランディスユーカリ育種集団におけるフィンガープリンティング及び親子関係分析用マイクロサテライトマーカーの力（Power of microsatellite markers for fingerprinting and parentage analysis in Eucalyptus grandis breeding populations.）、J Hered. 2005 96:161-166. PMID: 15601907）。
【００１４】
本発明では、CPE/トリオ（父性排除の組み合わせ確率）は、母集団におけるある一組の座位について両親の遺伝子型が知られるとき、親性を排除する尤度を表す（ジャミエソン・エー、テイラー・エスシーエス（Jamieson A, Taylor SCS ）、(1997)、親子関係排除のための三つの確率式の比較（Comparisons of three probability formulae for parentage exclusion.） Animal Genetics, 28, 397-400）。
）。
【００１５】
本発明では、対立遺伝子ラダーは、未知のDNAサンプルを増幅するために適用された同じPCRプライマーを用いて、少なくとも一つの座位からの増幅された対立遺伝子から成る、標準的サイズマーカーである。各DIPは２つの対立遺伝子を有する。
【００１６】
本発明では、対立遺伝子は、DNAセグメントに関連する遺伝子変動、すなわち、同じ座位を占めるDNA配列の、二つ以上の別の形態のうちの一つである。
【００１７】
本発明では、DNA多型は、DNA配列において二つ以上の異なるヌクレオチド配列が同じ交配母集団の中に共存する状態である。
【００１８】
本発明では、座位又は遺伝子座位は、染色体における特異的位置である。
【００１９】
本発明では、ある座位の対立遺伝子は、相同染色体上の同一部位に位置するが、少なくとも一つのヌクレオチド位置においてそのDNA配列が異なる。
【００２０】
本発明では、座位特異的プライマーとは、対象座位又はその相補鎖の一部、少なくとも該座位の一対立遺伝子の一部と特異的にハイブリダイズするが、増幅法で使用される条件下では他のDNA配列とは効率的にハイブリダイズしないプライマーである。一般に、プライマーとは、典型的には10から40（15-35；18-30）ヌクレオチド長を持ち、相補的DNA鎖とのハイブリダイゼーション後、DNAポリメラーゼのために伸長可能な基質複合体を形成する1本鎖DNAオリゴヌクレオチドを指す。
【００２１】
本発明では、プロファイリングアッセイ法とは、ある生物種、特にヒトの個体の区別に好適な、増幅多型性DNAマーカーのパターンである。この方法はまた、「分子遺伝学的個体特定パターン」又は「遺伝子フィンガープリント」とも呼ばれる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】１性染色体及び30常染色体のDIPのマルチプレックスPCR増幅及び遺伝子型同定による、ヒトDNAプロファイリング及び性別決定。塩基対[bp]における断片サイズにおいて、色素6-FAM、VIC、NED、PET、及びLIZに対する相対的蛍光単位（RFU)を示す電気泳動図が示されている。マルチプレックスPCR及び遺伝子型同定は、男性ヒトの250pgゲノムDNAから出発し、実施例１において説明した通りに実行した。本文に説明するように、電気泳動前に、PCR後精製ステップを行った。断片サイズの計算には、内部LIZ標識サイズ標準を用いた。ピークと対立遺伝子間の割り当ては、各電気泳動図の底部にマークされている。
【図２−１】DIPマーカーコード、及び、対立遺伝子及びPCRプライマーの配列番号のまとめ。
【図２−２】DIPマーカーコード、及び、対立遺伝子及びPCRプライマーの配列番号のまとめ。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、以下の工程：分析される試料を提供すること、少なくとも２０個の遺伝子座の同時ポリメラーゼ連鎖反応増幅に必要である、試薬、酵素、及びプライマーオリゴヌクレオチドを提供すること、前記遺伝子座を増幅すること、増幅産物を検出すること、を含む、ＤＮＡプロファイリングアッセイ法であって、前記増幅産物、及び増幅される前記遺伝子座が、以下の特徴によって特徴付けられる方法：増幅される各遺伝子座は、母集団に存在することが知られる少なくとも１つの欠失-挿入多型によって特徴づけられ、各遺伝子座からの２つの対立遺伝子は、その大きさにおいて１ヌクレオチド超かつ１００ヌクレオチド未満だけ異なること、少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある、少なくとも２つの増幅産物の第一のセットは、第一の標識を有すること、少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある、少なくとも２つの増幅産物の第二のセットは、第二の標識を有すること、少なくとも２つの異なる遺伝子座から生じ、かつ大きさが約２０ヌクレオチドから約３００ヌクレオチドの範囲にある、少なくとも２つの増幅産物の第三のセットは、第三の標識を有すること、標識１、標識２、及び標識３は、ＤＮＡ配列決定装置と組合せたマルチカラー検出器によって区別され、かつ同時に検出され得る、それぞれ異なる蛍光標識であること、与えられる遺伝子座に関する２つの対立遺伝子の間における大きさの差異が、１ヌクレオチド超かつ１００ヌクレオチド未満であること、に関する。理想的には、大きさの差異は、2ヌクレオチドよりも大きく、80ヌクレオチドよりは小さく、60よりは小さく、40よりは小さく、30よりは小さく、又は20よりは小さい。3ヌクレオチドよりも大きく、かつ20よりも小さいことが好ましい。実行される実験から見て取れるように、この大きさの範囲は予想し得ない利点を持ち、大規模な多重（マルチプレックス）を可能とする。
【００２４】
本発明者らは、本アッセイ法は、分解したＤＮＡ、部分的に分解したＤＮＡ、ごく僅かな ＤＮＡ、又は、例えば、PCRの阻害因子を含むサンプルが使用される場合に、際だって優れた結果を与えることを見出した。
【００２５】
分析されるサンプルは、例えば、単離DNA、細胞、唾液、尿、又は血液などの多くの物の一つであってよい。他の組織も同様に含まれている。
【００２６】
DNAは、ヒト、ネコ、イヌ、又は他の任意の動物から得られたものであってもよい。
【００２７】
「単離」DNAとは、(1)いずれの天然配列とも同一でない配列を含むDNA、又は、(2)天然配列を有するDNA（例えば、cDNA、又はゲノムDNA）との関連で言うと、対象DNAを含む遺伝子が天然に見られる生物体のゲノムにおいて、該対象DNAを含む遺伝子に隣接する遺伝子のうちの少なくとも一つを含まないDNA、のいずれかである。したがって、本用語は、ベクター、自律的複製プラスミド又はウィルス、又は原核細胞又は真核細胞のゲノムDNA中に組み込まれる組み替えDNAを含む。本用語はさらに、cDNAなどの分離分子であって、対応ゲノムDNAがイントロンを有し、したがって異なる配列を持つ分離分子；隣接遺伝子のうちの少なくとも一つを欠如するゲノム断片；ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって生産され、隣接遺伝子の少なくとも一つを欠如する、cDNA又はゲノムDNAの断片；隣接遺伝子の少なくとも一つを欠如する制限断片；非天然タンパク質、例えば、融合タンパク質、突然変異タンパク質、又は任意のタンパク質の断片などをコードするDNA；及び、cDNA又は天然核酸の変性変異体である核酸、を含む。さらに、本用語は、ハイブリッド遺伝子、すなわち、非天然融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み替えヌクレオチド配列を含む。上記から、単離DNAは、例えば、cDNA又はゲノムDNAライブラリー、又は、例えば、制限消化反応混合物におけるゲノムDNA制限消化物、又は、電気泳動ゲルスライスの中の、数百から数百万の、他のDNA分子中に存在するDNAを意味しないことは明白であろう。
【００２８】
PCR反応は、DNA分子の変性及び合成の10〜45サイクルからなってもよい。このような方法としては、ただしこれらに限定されないが、ＰＣＲ（米国特許第4,683,195号及び米国特許第4,683,202号に記載、なおこれらを参照により本明細書に含める）、鎖置換増幅法（Strand Displacement Amplification;"SDA"）（米国特許第5,455,166号に記載、なおこれを参照により本明細書に含める）、核酸配列ベース増幅法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification ；"NASBA"、ナスバ法）（米国特許第5,409,818号に記載、なおこれを参照により本明細書に含める）を含む。例えば、増幅は、低い熱でDNA融解させて効率を上げるためヘリカーゼまで用いる場合のある、ローリングサイクル複製システム（rolling circle replication system）によって実現してもよい（ユズハコウ(Yuzhakou)ら、セル（Cell） 86:877-886(1996)及びモク(Mok)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J. Biol. Chem.） 262:16558-16565(1987)を参照、なおこれらを参照により本明細書に含める）。
【００２９】
好ましい実施態様では、熱サイクル増幅反応において変性が為される温度は、約90℃から、95℃より高温の温度、より好ましくは92-94℃である。好ましい熱サイクル増幅法は、約10から約100サイクル、より好ましくは約25から約50サイクル、及び、約90℃から、95℃よりも高温の温度、より好ましくは92-94℃のピーク温度を含むポリメラーゼ連鎖反応である。
【００３０】
好ましい実施態様では、PCR反応は、(a)標的配列の両端が十分詳細に知られており、そのため、それらにハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドプライマーが合成可能であること、及び、(b)連鎖反応を起動するために少量の標的配列の利用が可能であること、の条件下に、DNAポリメラーゼIを用いて、少なくとも一つの標的核酸配列を、実行される反応工程数に関して指数関数的量として生産するように実施される。この連鎖反応の産物は、使用する特異的プライマーの末端に一致する末端を持つ、個別の核酸2本鎖である。
【００３１】
もしそれが、所望の標的核酸配列を含まない、又は含まないと考えられるならば、精製形態ものであれ、非精製形態のものであれ、任意の核酸供給源を、開始核酸として利用することが可能である。したがって、本プロセスは、例えば、1本鎖又は2本鎖であってもよいDNAを用いてもよい。さらに、各一つの鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを用いてもよい。これらの核酸のいずれかの混合物を用いてもよいし、あるいは、同じ又は異なるプライマーによる前の増幅反応において生産された核酸を同様に利用してもよい。増幅される核酸はDNAであることが好ましい。増幅される標的核酸配列は、より大きな分子のほんの断片であってもよいし、又は、最初は個別分子として存在し、そのため、該標的分子が全体核酸を構成することも可能である。増幅される標的配列が最初に純粋形として存在することは必要ではない；それは、複雑な混合物の小さい断片であってもよく、又は、その生物が、特定生物サンプルのごく僅かな断片のみを構成する、特定の動物に由来する核酸配列の一部であってもよい。開始核酸は、同じであっても、異なっていてもよい、一つを超える所望の標的核酸配列を含んでいてもよい。したがって、本方法は、大量の、一つの核酸配列を生産するためばかりでなく、同時に、同じ又は異なる核酸分子の上に配置される複数の標的核酸配列を増幅するのにも有用である。これは特に、ヒトのDNAが、動物由来のDNAを背景にして増幅される場合及び時に当てはまる。そのようなことは、ある犯罪現場では起こる可能性がある。
【００３２】
核酸（単数又は複数）は、任意の供給源から取得してよく、プラスミド、クローンDNA、細菌、酵母、ウイルス、及び、植物又は動物などの高等生物を含む任意の供給源から得たDNAであってもよい。DNAは、種々の技術、例えば、サムブルック・ジェー、フリトッシェ・イーエフ、マニアティス・ティー、「分子クローニング  実験室マニュアル」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（1989）（Sambrook J, Fritsche EF, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）等に記載される様々な技術によって、例えば、血液又はその他の液体、又は、絨毛膜絨毛又は羊膜細胞などの組織材料から抽出されてもよい。
【００３３】
本アッセイ法は、座位特異的プライマーを利用する。プライマーは、DIPの上流及び下流に配置される。プライマーは、理想的にはほぼ等距離であり、ミスペアリングが抑えられ、かつ理想的融解温度が実現されるように設置される。好ましいプライマーは、約15〜100、より好ましくは約20〜50、もっとも好ましくは約20〜40塩基長を有する。本方法のプライマーが、DIP（欠失-挿入-多型）を含む領域を挟むことは必須である。特に、本発明者らは、20を超える座位を有する高度の多重PCR(multiplexed PCR)では、プライマーのアニーリング温度は、56〜65℃であるべきであり、より好ましくは57〜63℃、及びもっとも好ましくは59〜61℃の間であることを見出した。さらに、一つの座位特異的プライマーペアーのフォワード及びリバース・プライマーのアニーリング温度の間の差、及び、多重PCR混合物の全プライマー間のアニーリング温度の差は4℃未満でなければならない。全てのプライマーは、アッセイ特異的PCRを与えなければならなく、例えば、ヒトの法医学的又は診断学的多重応用の場合ならば、ヒト特異的でなければならない。座位特異的プライマーペアー、及び、多重反応混合物内の全てのプライマーは、PCR内又は多重PCR内において非特異的副産物を与えてはならない。さらに、PCR内又は多重PCR内においてオートダイマー又はヘテロダイマーの形成を阻止するために、多重反応混合物の全てのプライマーの間で、DNA配列の自己相補性を回避することはきわめて重要である。
【００３４】
オリゴヌクレオチドプライマーは、適切であるならばいずれの方法で調製してもよく、例えば、フォスフォトリエステル及びフォスフォジエステル法、又は、それらの自動化実施態様を用いて調製してもよい。そのような一自動化実施態様では、開始材料としてジエチルフォスフォルアミダイトが使用され、ビアウケイジ（Beaucage et al.）ら、テトラへドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）、22:1859-1862 (1981)によって記載されるようにして合成されてもよい。なお、これを参照により本明細書に含める。改良型固相支持体においてオリゴヌクレオチドを合成するための一方法が米国特許第4,458,006号に記載される。なおこれを参照により本明細書に含める。生物学的供給源（例えば、制限エンドヌクレアーゼ消化物）から単離されたプライマーを使用することも可能である。
【００３５】
標的核酸配列は、該配列を鋳型として含む核酸を用いることによって増幅される。核酸が2本鎖を含む場合、それを鋳型として使用するのに先だって、別工程として、又は、プライマー伸長産物の合成と同時に、核酸の鎖同士を分離することが必要である。この鎖分離は、適切であれば、物理的、化学的、又は酵素的手段を含む、いずれの変性法によって実現することも可能である。核酸の鎖同士を分離する一つの物理的方法は、核酸を、それが完全に（＞99%）変性されるまで加熱することを含む。典型的熱変性は、約８0℃から105℃、好ましくは約90℃から約98℃、さらに好ましくは93℃から95℃で、約1から10分の時間を含んでもよい。さらに、鎖分離は、ヘリカーゼ活性を有しDNAを変性させることが知られる、ヘリカーゼ又は酵素RecAとして知られる酵素クラスから得られる酵素によって誘発されてもよい。ヘリカーゼを用いて核酸鎖を分離するための好適な反応条件は、定量生物学に関するコールド・スプリング・ハーバー・シンポジウム（Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology）、第XLIII巻（Vol. XLIII）「DNA:複製及び組み替え」（"DNA: Replication and Recombination"） (ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８７（New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1978）)に記載され、RecAを使用するための技術は、シー・ラディング（C. Radding）、アニュアル・レビュー・オブ・ジェネティクス（Ann. Rev. Genetics）、16:405-37 (1982）において論じられている。なお、これらを参照により本明細書に含める。
【００３６】
合成は、適切ならば、いずれの方法を用いて実施してもよい。一般に、合成は、バッファー水溶液において生じる。ある好ましい実施態様では、バッファーのpHは、約7.5〜9.2である（室温で調整）。好ましくは、モル過剰の二つのオリゴヌクレオチドプライマー（クローン化核酸に関しては、通常約1000:1のプライマー：鋳型、ゲノム核酸に関しては、通常、約106：1のプライマー：鋳型）が、分離された鋳型鎖を含むバッファーに加えられる。しかしながら、何かの応用のために本発明のプロセスが使用される場合、相補鎖の量が未知である場合もあり、したがって、相補鎖の量に対するプライマーの相対量がはっきりと決定できないことが理解される。しかしながら、実際には、増幅される配列が、複雑な長い鎖の核酸鎖の混合物の中に含まれる場合、添加されるプライマーの量は、通常、相補鎖（鋳型）の量よりもモル過剰にあるだろう。プロセスの効率を高めるため大モル過剰が好ましい。PCRのための好ましい反応条件は下記の通り：20mM トリス／塩酸（Tris/HCl）バッファー（pH8.8、室温で調整）、200μM(40〜500μM) dNTP、1〜10(1〜4)mM MgCl2、50mM KCl、各オリゴヌクレオチドプライマー0.05〜2μM、0.05〜0.5%（容量／容量；vol/vol）ツイーン２０（Tween 20）、及び、1〜2.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ。ある実施態様（法医学的汚染（forensic stains）、単一細胞、又は低コピー数（LCN）DNAの分析）では、非特異的増幅を避けるため、いわゆる「ホット・スタート技術（"hot start technology"）（米国特許第05587287号；米国特許第05677152号；米国特許第06214557号；米国特許第06183967号）によるTaq ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。さらに、5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠如する、遺伝子操作されたTaq ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、欧州特許第0553264号、欧州特許第1507002号、欧州特許第0395736号、欧州特許第0983364号）は、ある種の応用では有利である。洗浄剤ツイーン２０（Tween 20）は、ノニデットＰ−４０（Nonidet P-40）[0.05〜0.5%（容量／容量）]、又はトリトンＸ−１００（Triton X-100）[0.05〜0.5%（容量／容量）]で置換してもよく、又は、これらの洗浄剤の混合物（例えば、ツイーン20をノニデットP-40と一緒に）が適用される。一価の陽イオンK+は、NH4+（1〜20mMの最終濃度）で置換してもよく、あるいは、二つの陽イオンの混合物が使用される。時には、塩化物以外の陰イオン、例えば、硫酸塩又は酢酸塩が好ましい。当業者には、DNAポリメラーゼの安定剤及び／又はPCR強化剤などのさらなる別の添加剤が知られる。これらの物質の例としては、ベタイン（0.1〜2.0M）、トレハロース(0.02〜2.0M)、ソルビトール（0.02〜2.0M）、ジメチルスルホキシド（最大5%容量／容量）、又は、テトラメチルアンモニウムクロリド（最大5%容量／容量）がある。さらに、時には、不純なDNAサンプル標本に由来するPCR阻害物質の作用を中和するために、200〜2000mg/mLのウシ血清アルブミン（BSA)又はゼラチンが適用される。
【００３７】
さらに、ヌクレオシド三リン酸、好ましくは、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、及び／又はdUTPが、十分な量として合成混合物に加えられる。ヌクレオチドの好ましいモル濃度は、40〜500μM、特に100〜250μMである。このようなdNTP濃度は、本発明の方法に馴染むが、500μMよりも高い濃度もある実施態様では有利となる場合がある。
【００３８】
本発明によるポリメラーゼは、サーマス（Thermus）、アクイフェックス（Aquifex）、サーモトーガ（Thermotoga）、サーモクリディス（Thermocridis）、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）、サーモシンケコッカス（Thermosynchecoccus）及びサーモアナエロバクター（Thermoanaerobacter）の属から成る群から選択されることが好ましい。
【００３９】
本発明によるポリメラーゼは、アクイフェックス・アエオリカス（Aquifex aeolicus）、アクイフェックス・ピオジェネス（Aquifex pyogenes）、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）、サーモトーガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）、サーマス・パシフィカス（Thermus pacificus）、及びサーモトーガ・マリティマ（Thermotoga maritima）の生物から成る群から選択されることが好ましい。
【００４０】
DNAポリメラーゼＩは、原核生物におけるDNA複製の過程を仲介する酵素である。Pol Iは、ポリメラーゼ活性を有する最初に発見された酵素であり、もっともよくその特徴が解明された酵素である。これは、必要なポリメラーゼ活性を有することが発見された最初の酵素ではあるが、細菌のDNA複製に与る主要酵素ではない。これは、1956年にアーサー・コルンバーグ（Arthur Kornberg）によって発見された、最初に知られるポリメラーゼであり、原核生物に広く分布するものであるが、先ず、大腸菌（E. coli）においてその特徴が明らかにされた。これは、多くの場合単純にPol Iと呼ばれる。大腸菌及び他の多くの細菌において、Pol Iをコードする遺伝子はpol-Aとして知られる。本発明では、酵素は、pol-A型ポリメラーゼであることが好ましい。
【００４１】
ポリメラーゼは、Taq DNAポリメラーゼであることがもっとも好ましい。
【００４２】
一実施態様では、PCR反応の際、ウラシル残基が組み込まれる。ウラシルDNAグリコシラーゼ（ウラシル-N-グリコシラーゼ）は、大腸菌（エシェリシア・コライ；Escherichia coli）ung遺伝子の産物であり、大腸菌（E. coli）においてクローン化され、配列決定され、発現されてた。ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG)は、は、DNAの糖-ホスホジエステル・バックボーンを破壊することなく、DNA（1本鎖及び2本鎖）からこれらのウラシル残基を除去し、それが、ハイブリダイゼーション標的として、又は、DNAポリメラーゼの鋳型として使用されるのを阻止する。それによって生じる脱塩基部位は、高温における加水分解切断に対し感受性を有する。したがって、ウラシル塩基の除去は、通常、DNAの断片化を伴う。当業者であれば、汚染を避けるためにウラシルDNAグリコシラーゼをどのように使用したらよいかを知っている。同様に、酵素及びウラシルヌクレオチドの両方を本発明のキットに含めてもよい。
【００４３】
好ましい実施態様では、少なくとも25個の座位が同時に増幅される。
【００４４】
別の実施態様では、本発明のDIP座位（本明細書に開示される配列番号）は、対立遺伝子特異的マルチプレックスPCR（米国特許第5,595,890号；ニュートン・シーアール（Newton CR）、グラハム・エー（Graham A）、ヘプチンストール・エルイー（Heptinstall LE）、ポウェル・エスジェー（Powell SJ）、サマーズ・シー（Summers C）、カルシェッカー・エヌ（Kalsheker N）、スミス・ジェーシー（Smith JC）、マークハム・エーエフ（Markham AF）、DNAにおける任意の点突然変異の分析。増幅不能突然変異システム（Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS).）、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res） 17: 2503 - 2516, 1989）を用いて増幅し、遺伝子型を決定することが可能である。この場合、各座位について、三つのプライマー、即ち、一つは座位特異的、二つは対立遺伝子特異的プライマーが使用される。対立遺伝子特異的プライマーの3'末端は、対立遺伝子特異的伸長産物がDNAポリメラーゼによって合成されるような様式でDIP配列の中に配置される。したがって、ヘテロ接合DNAの場合、一のPCRにおいて、座位特異的プライマーによって二つの異なるアンプリコンが生成される。その二つの対立遺伝子特異的アンプリコンが、そのサイズによって電気泳動によって区別可能であるならば、一つの標識プライマー（座位特異的）を用いることができる。そうでない場合は、対立遺伝子特異的プライマーの一方を、人工テイリング配列(artificial tailing sequence)（ヌクレオチド又は移動度調節因子を用いた5'テイリング）によって5'末端において伸長させることが可能であるし、又は、二つの対立遺伝子特異的プライマーを、その5’末端において二つの異なるフルオロフォアによって標識する。
【００４５】
特に好ましい実施形態では、少なくとも30座位が同時に増幅される。
【００４６】
さらに好ましい実施形態では、少なくとも40座位が同時に増幅される。
【００４７】
さらに好ましい実施形態では、少なくとも50座位が同時に増幅される。
【００４８】
本発明によるプロファイリングアッセイ法の特に好ましい実施形態では、3組の増幅産物は、少なくとも六つの増幅産物を含む。最初、本発明者らは、30個の増幅産物によって反応を実施することが可能であることを証明した。その際、PCRプライマーの標識として少なくとも三つの色を用いた。本発明者らは、同時に高い組合せ特定確率（combined probability of identity;CPI)を可能としながら、複数装置における検出を可能とする、その理想的分布を特定した。
【００４９】
本発明者らは、これによってさらに、配列決定装置にしばしば存在する、第4の色を、コントロール及び／又は種々のタイプのラダー用としてさらに使用することが可能となることを見出した。
【００５０】
したがって、少なくとも3組の増幅産物が少なくとも10個の増幅産物を含む場合があると言う、驚くべき事実は、最初に、高いスコアの組合せ特定確率（combined probability of identity;CPI)を可能とするのに十分に高い数のDIPの使用を可能とし、同時に、さらなるコントロールレーン／色素／標識の使用も可能とする。これは、STRの使用を不要とする。
【００５１】
本発明者らは、ドイツ人集団から得たサンプルを用いて本システムを試験した。このシステムは、2.1 x 10-13の組合せ特定確率（combined probability of identity;CPI)を有する。これは、8個のSTRを利用するAmpFISTR Minifilierキット（CPIが8.21 x 10-11)よりも優れる値である。
【００５２】
さらに、本発明者らは、本発明による30個のDIPは、0.9979205のCPE/Trio（父子関係排除の組合せ確率）を有することを示すことができる。
【００５３】
したがって、本発明によるプロファイリングアッセイ法の一実施形態では、3組のa)からc)の増幅産物は、少なくとも10個の増幅産物を含み、これらは、2.1 x 10-13又はそれよりも良い組合せ特定確率(CPI)、及び／又は、0.9979205又はそれよりも良いCPE/Trio（父子関係排除の組合せ確率）を示す。
【００５４】
各座位からの二つの対立遺伝子は、その大きさにおいて1ヌクレオチド超かつ40ヌクレオチド未満だけ異なることが好ましい。
【００５５】
少なくとも二つの異なる遺伝子座位から生じ、かつ大きさが約20ヌクレオチドから約300ヌクレオチドの範囲にある、二つ以上の増幅産物が、第四の標識を有することが好ましい。当然のことながら、別の実施態様では、5、6、7、又はそれ以上の標識を使用してもよい。DNAのヌクレオチド含量に基づき、産物の検出に使用される多くのDNA配列決定装置は4個の標識を検出することが可能であるから、4つの標識が好ましい。
【００５６】
標識は好ましくは蛍光色素である。そのような色素は、下記の群：フルオレセインイソチオシアネート（FITC)、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM)、キサンテン、ローダミン、6-カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオロセイン（HEX)、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトジフルオレセイン（JOE)、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA)、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX)、5-カルボキシローダミン-6G（R6G5)、2'-クロロ-7'フェニル-1,4-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(VIC)、2'-クロロ-5'-フルオロ-7',8'-ベンゾ-1,4-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(NED)又はPET（独占販売品、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスター市（Foster City）、カリフォルニア州、米国）、6-カルボキシローダミン-6G（RG6)、ローダミン110；クマリン、テキサスレッド、Cy3、Cy5、Cy7、及びボディピー（BODIPY）色素、から選ばれてもよい。
【００５７】
好ましい組み合わせは、PCRオリゴヌクレオチドを標識するために3色を用いる場合、6-FAM（青）、VIC（緑）、NED（黄）、長さの内部標準のためにROX（赤）である。さらに必要に応じて、LIZ（オレンジ）標識の長さの内部標準と組み合わせて、PCRプライマーの標識として、6-FAM（青）、VIC（緑）、NED（黄）、及びPET（赤）が使用される。表１は、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）（フォスター市（Foster City）、米国）の自動配列決定装置と組合せたマルチプレックスPCRに使用される、さらなる好ましい色素標識の組合せを掲げる。ここで言っておかなければならないのは、他のマルチカラー自動配列決定装置、例えば、CEQTM8000遺伝子分析装置シリーズ(ベックマン・コールター(Beckmann Coulter)、フュラートン(Fullerton)、カリフォルニア州、米国), MEGABaceTM遺伝子型決定システムシリーズ(ジーイー・ヘルスケア（GE Healthcare）、バッキンガムシャー(Buckinghamshire)、英国)、又はLI-CORE4300DNA分析システム(ライ・コア・バイオサイエンス・ユーケー（LI-CORE Biosciences UK）、ケンブリッジ（Cambridge）、英国)も存在しており、あるいは、他の光学システムを有し、したがって他の蛍光色素及び色素の組合せを要求する自動化システムが発生する可能性があることである。したがって、他のフルオロフォアの組合せを利用し、他の自動配列決定装置に特化した本発明の実施形態はいつでも可能である。
【００５８】
米国特許第6,734,296号、米国特許第5,624,800号、及びWO 2006071568（これらを参照により本明細書に含める）は、後続の、キャピラリーゲル電気泳動による、続く遺伝子型決定のために、多重化の度合いを増大させるための、いわゆる移動度調整因子の使用を開示する。移動度調整因子は、DNA増幅産物、プライマー伸長産物、又はオリゴリガーゼ産物の電気泳動の移動度を減少させる、プライマーの5'末端の共有的非ヌクレオチド型修飾として定義される。この技術によって、同数のヌクレオチドを有する、複数の増幅産物由来のＤＮＡ断片の分離が可能とされる。好ましい実施形態では、異なる数（n = 1, 2, 3, ...)のヘキサエチレングリコール成分が、標準ホスホルアミダイト化学によって、オリゴヌクレオチドの5'末端と、多重プライマーのサブセットの蛍光標識との間において合成される（グロスマン・ピーディー(Grossman PD)、ブロック・ダブリュ(Bloch W)、ブリンソン・イー(Brinson E)、チャング・シーシー(Chang CC)、エゲルディング・エフエー(Eggerding FA)、ファング・エス(Fung S)、イオバニシ、ディーエム、（Iovannisci, DM）、ウー・エス(Woo S)、ウィン-ディーン・イーエス（Winn-Deen ES）、核酸配列の高密度マルチプレックス検出：オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ及び配列コード分離（High-density multiplex detection of nucleic acid sequences: oligonucleotide ligation assay and sequence-coded separation、ヌクレイック・アシッド・リサーチ(Nucleic Acids Res) 22: 4527-34, 1994）。
【００５９】
【表１】
2011518568.tif 000003
【００６０】
一実施形態では、検出工程は、キャピラリーゲル電気泳動装置を用いて実施される。さらに、検出工程は、ゲルに基づく装置において実施してもよい。
【００６１】
個々の遺伝子座位にに対する対立遺伝子ラダーの構築後、これらを混合し、増幅サンプルのロードと同時に、ゲル電気泳動にロードしてよい。各対立遺伝子ラダーは、対応する遺伝子座位に由来するサンプルにおける対立遺伝子と一緒に移動する。本発明の多重反応産物は、内部レーン標準、すなわち、ポリアクリルアミドゲルの同じレーン又は同じキャピラリーの中を移動するように構成された、特殊化したタイプのサイズマーカーを用いて評価することが可能である。この内部レーン標準は、既知の長さの一連の断片からなることが好ましい。内部レーン標準は、より好ましくは増幅反応における他の色素と区別することが可能な蛍光色素で標識される。
【００６２】
本発明はさらに、対立遺伝子ラダーの作製のための、本明細書において開示されるDIPの使用に関する。
【００６３】
内部レーン標準の構築後、この標準はさらに、増幅サンプル又は対立遺伝子ラダーと混合され、ゲル電気泳動の異なるレーン、又はキャピラリー電気泳動の異なるキャピラリーにおける移動の比較のために、電気泳動にロードさせることができる。内部レーン標準の移動における変動は、分離媒体の性能における変動を示す。この差の定量、及び対立遺伝子ラダーとの相関は、未知サンプルにおける対立遺伝子の大きさの決定において補正を可能とする。
【００６４】
さらなる実施形態では、さらに、一つ以上の短い縦列型反復配列（STR)が増幅されるか、及び／又は、一つ以上の変動数縦列型反復配列（VNTR)が増幅されるか、及び／又は、一つ以上の一塩基多型（SNP)が増幅される。したがって、これらの実施形態によれば、DIPは、他の多型配列と混合されてもよい。STR配列が好ましい。
【００６５】
多くの場合、個体の性別を決定可能であることが重要である。したがって、任意の先行請求項のプロファイリングアッセイ法の一実施形態では、さらに、一つ以上の非組み換え不変のＸ及び／又はＹ染色体DNA配列、性特異的短鎖縦列型反復配列（STR）、及び／又は、一つ以上の性特異的変動数縦列型反復配列（VNTR）が増幅され、及び／又は、一つ以上の性特異的一塩基多型（SNP）が増幅される。好ましい遺伝子座位は、二つのパラログコピーAmelX及びAmelYが存在する、アメロゲニン遺伝子座位であり、これは、ヒトの性染色体の非組み換え領域内に位置する（アカネ・エー(Akane A.)、X-Yアメロゲニン遺伝子のPCR分析による性別決定（Sex determination by PCR analysis of the X-Y amelogenin gene.）、 メソッド・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods Mol Biol)、第98巻(Vol 98)、第245〜249頁、1998）。アメロゲニン遺伝子のイントロン1の部分は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介して、未知のヒト起源由来のサンプルの性別決定に使用することができるＤＩＰをコードする。例えば、DNA配列番号61及び配列番号62は、６bpのDIP(-/AAAGTG)をコードする、それぞれ、AmelX及びAmelY配列である。プライマー配列番号185及び配列番号186を用いることによって、X染色体の113bp断片、及び、Y染色体の119bp断片を増幅し、電気泳動によって分離することが可能である。同様に、DNA配列番号63及び配列番号64は、３bpのDIP(-/GAT)をコードする、それぞれ、AmelX及びAmelY配列である。プライマー配列番号187及び配列番号188を用いることによって、X染色体の83bp断片、及び、Y染色体の86bp断片を増幅し、電気泳動によって分離することが可能である。
【００６６】
本発明の方法のためのプライマーペアーは、いくつかの基準を満たさなければならない。それらは、所望の場所に特異的にハイブリダイズしなければならない。本反応にとって誤ったアニーリングはきわめて不都合である。50〜68℃のTaは好ましく、56〜65℃又は57〜63℃のTaはより好ましく、59〜61℃のTaはもっとも好ましい。20〜60%GCのGC含量が好ましい。18〜30bpの長さが好ましい。マルチプレックスPCRにおける、プライマーの最大自己相同性、及び全プライマー間の最大相補性は、3〜7bpであることが好ましい。さらに、高度に多重化されたPCRのための適切なプライマーの選択は、非特異的副産物を回避するために、常に実験上の最適化を必要とする。
【００６７】
本発明によるプロファイリングアッセイ法のきわめて好ましい実施態様では、プライマー・オリゴヌクレオチドペアーは、以下の配列を有する核酸分子の群から選ばれる。
【００６８】
a) DIP番号1:配列番号125及び配列番号126
又は配列番号267及び配列番号268
b) DIP番号2:配列番号127 及び配列番号128
c) DIP番号3:配列番号129及び配列番号130
d) DIP番号4:配列番号131及び配列番号132
e) DIP番号5:配列番号133及び配列番号134
f) DIP番号6:配列番号135及び配列番号136
g) DIP番号7:配列番号137及び配列番号138
h) DIP番号8:配列番号139及び配列番号140
又は配列番号287及び配列番号288
i) DIP番号9:配列番号141及び配列番号142
j) DIP番号10:配列番号143及び配列番号144
k) DIP番号11:配列番号145及び配列番号146
l) DIP番号12:配列番号147及び配列番号148
m) DIP番号13:配列番号149及び配列番号150
n) DIP番号14:配列番号151及び配列番号152
o) DIP番号15:配列番号153及び配列番号154
又は配列番号281及び配列番号282
p) DIP番号16:配列番号155及び配列番号156
q) DIP番号17:配列番号157及び配列番号158
又は配列番号273及び配列番号274
r) DIP番号18:配列番号159及び配列番号160
又は配列番号277及び配列番号278
s) DIP番号19:配列番号161及び配列番号162
又は配列番号279及び配列番号280
t) DIP番号20:配列番号163及び配列番号164
又は配列番号275及び配列番号276
u) DIP番号21:配列番号165及び配列番号166
v) DIP番号22:配列番号167及び配列番号168
w) DIP番号23:配列番号169及び配列番号170
x) DIP番号24:配列番号171及び配列番号172
y) DIP番号25:配列番号173及び配列番号174
z) DIP番号26:配列番号175及び配列番号176
aa) DIP番号27:配列番号177及び配列番号178
ab) DIP番号28:配列番号179及び配列番号180
ac) DIP番号29:配列番号181及び配列番号182
又は配列番号271及び配列番号272
ad) DIP番号30:配列番号183及び配列番号184
又は配列番号283及び配列番号284
ae) DIP番号31:配列番号185及び配列番号186
af) DIP番号32:配列番号187及び配列番号188
又は配列番号269及び配列番号270
ag) DIP番号33:配列番号189及び配列番号190
又は配列番号285及び配列番号286
ah) DIP番号34:配列番号191及び配列番号191
ai) DIP番号35:配列番号193及び配列番号194
aj) DIP番号36:配列番号195及び配列番号196
ak) DIP番号37:配列番号197及び配列番号198
al) DIP番号38:配列番号199及び配列番号200
am) DIP番号39:配列番号201及び配列番号202
an) DIP番号40:配列番号203及び配列番号204
ao) DIP番号41:配列番号205及び配列番号206
又は配列番号251及び配列番号252
ap) DIP番号42:配列番号207及び配列番号208
又は配列番号253及び配列番号254
aq) DIP番号43:配列番号209及び配列番号210
又は配列番号255及び配列番号256
ar) DIP番号44:配列番号211及び配列番号212
又は配列番号257及び配列番号258
as) DIP番号45:配列番号213及び配列番号214
又は配列番号259及び配列番号260
at) DIP番号46:配列番号215及び配列番号216
又は配列番号261 及び配列番号262
au) DIP番号47:配列番号217及び配列番号218
又は配列番号263及び配列番号264
av) DIP番号48:配列番号219及び配列番号220
aw) DIP番号49:配列番号221及び配列番号222
ax) DIP番号50:配列番号223及び配列番号224
ay) DIP番号51:配列番号225及び配列番号226
又は配列番号265及び配列番号266
az) DIP番号52:配列番号227及び配列番号228
ba) DIP番号53:配列番号229及び配列番号230
bb) DIP番号54:配列番号231及び配列番号232
bc) DIP番号55:配列番号233及び配列番号234
bd) DIP番号56:配列番号235及び配列番号236
be) DIP番号57:配列番号237及び配列番号238
bf) DIP番号58:配列番号239及び配列番号240
bg) DIP番号59:配列番号241及び配列番号242
bh) DIP番号60:配列番号243及び配列番号244
bi) DIP番号61:配列番号245及び配列番号246
bj) DIP番号62:配列番号247及び配列番号248
bk) DIP番号63:配列番号249及び配列番号250
【００６９】
少なくとも、4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27、又は、30よりも多いペアーが選ばれることが好ましい。
【００７０】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応増幅のための少なくとも3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27，28，29，30，又は、30よりも多いプライマーペアーを含む、DNAプロファイリング法に用いるためのキットであって、各１つの上流プライマー及び１つの下流プライマーからなるプライマーペアーは、以下の群から選択される配列のいずれか１つに記載の特異的DIP配列に対して結合することが可能であり、かつプライマーペアーが異なるＤＩＰ配列に対してそれぞれ特異的である、キットに関する。
【００７１】
DIP番号1:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２、
DIP番号2:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号255の間に存在する配列番号４、
DIP番号3:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号６、
DIP番号4:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号262の間に存在する配列番号８、
DIP番号5:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１０、
DIP番号6:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１２、
DIP番号7:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１４、
DIP番号8:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１６、
DIP番号9:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号１８、
DIP番号10:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号247の間に存在する配列番号１９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号252の間に存在する配列番号２０、
DIP番号11:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２２、
DIP番号12:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号２３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号260の間に存在する配列番号２４、
DIP番号13:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２６、
DIP番号14:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号２８、
DIP番号15:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号３０、
DIP番号16:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号３２、
DIP番号17:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号270の間に存在する配列番号３４、
DIP番号18:
-挿入-欠失多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３５、
-挿入-欠失多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号３６、
DIP番号19:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号３８、
DIP番号20:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号４０、
DIP番号21:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号４２、
DIP番号22:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号４３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号257の間に存在する配列番号４４、
DIP番号23:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号４６、
DIP番号24:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号４８、
DIP番号25:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号４９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号296の間に存在する配列番号５０、
DIP番号26:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号266の間に存在する配列番号５２、
DIP番号27:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号５３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号273の間に存在する配列番号５４、
DIP番号28:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号５６、
DIP番号29:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号267の間に存在する配列番号５８、
DIP番号30:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号270の間に存在する配列番号６０、
DIP番号31:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号271及び番号272の間に存在する配列番号６１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号271及び番号278の間に存在する配列番号６２、
DIP番号32:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号280及び番号281の間に存在する配列番号６３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号280及び番号284の間に存在する配列番号６４、
DIP番号33:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号６５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号６６、
DIP番号34:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号６７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号６８、
DIP番号35:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号６９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号255の間に存在する配列番号７０、
DIP番号36:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号258の間に存在する配列番号７２、
DIP番号37:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号７３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号７４、
DIP番号38:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号255及び番号256の間に存在する配列番号７５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号255及び番号261の間に存在する配列番号７６、
DIP番号39:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号７７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号７８、
DIP番号40:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号259の間に存在する配列番号８０、
DIP番号41:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号254の間に存在する配列番号８２、
DIP番号42:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号254の間に存在する配列番号８４、
DIP番号43:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号255の間に存在する配列番号８６、
DIP番号44:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号８７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号８８、
DIP番号45:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号８９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号９０、
DIP番号46:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号９１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号９２、
DIP番号47:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号９４、
DIP番号48:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号９６、
DIP番号49:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号247及び番号248の間に存在する配列番号９７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号247及び番号252の間に存在する配列番号９８、
DIP番号50:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号９９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１００、
DIP番号51:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号１０２、
DIP番号52:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１０３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１０４、
DIP番号53:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１０５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１０６、
DIP番号54:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号１０８、
DIP番号55:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号１１０、
DIP番号56:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号258の間に存在する配列番号１１２、
DIP番号57:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号247の間に存在する配列番号１１３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号252の間に存在する配列番号１１４、
DIP番号58:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号263の間に存在する配列番号１１６、
DIP番号59:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号266の間に存在する配列番号１１８、
DIP番号60:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１１９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号268の間に存在する配列番号１２０、
DIP番号61:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１２１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号277の間に存在する配列番号１２２、
DIP番号62:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１２３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号１２４、
DIP番号63:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号２８９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号２９０。
【００７２】
キットは、少なくとも、4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27、又は、30よりも多いプライマーペアーを含むことが好ましい。
【００７３】
キットは、少なくとも、20、30、又は40個のDIPのためのプライマーを含むことが好ましく、そのキットは、DIP番号31（配列番号61及び62）、及びDIP番号32（配列番号63及び64）のためのプライマーを含むことが好ましい。これら二つのDIPは、それぞれ、Y染色体及びX染色体上のDIPである。
【００７４】
キットは、上記に開示される群から選択される異なる配列にそれぞれ結合することが可能である、6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27、28, 29, 又は30個のプライマーペアーを含むことが好ましい。
【００７５】
プライマーペアが、下記のプライマーペアーの群から選択される、キットが好ましい。
【００７６】
a) DIP番号1:配列番号125及び配列番号126
又は配列番号267及び配列番号268
b) DIP番号2:配列番号127 及び配列番号128
c) DIP番号3:配列番号129及び配列番号130
d) DIP番号4:配列番号131及び配列番号132
e) DIP番号5:配列番号133及び配列番号134
f) DIP番号6:配列番号135及び配列番号136
g) DIP番号7:配列番号137及び配列番号138
h) DIP番号8:配列番号139及び配列番号140
又は配列番号287及び配列番号288
i) DIP番号9:配列番号141及び配列番号142
j) DIP番号10:配列番号143及び配列番号144
k) DIP番号11:配列番号145及び配列番号146
l) DIP番号12:配列番号147及び配列番号148
m) DIP番号13:配列番号149及び配列番号150
n) DIP番号14:配列番号151及び配列番号152
o) DIP番号15:配列番号153及び配列番号154
又は配列番号281及び配列番号282
p) DIP番号16:配列番号155及び配列番号156
q) DIP番号17:配列番号157及び配列番号158
又は配列番号273及び配列番号274
r) DIP番号18:配列番号159及び配列番号160
又は配列番号277及び配列番号278
s) DIP番号19:配列番号161及び配列番号162
又は配列番号279及び配列番号280
t) DIP番号20:配列番号163及び配列番号164
又は配列番号275及び配列番号276
u) DIP番号21:配列番号165及び配列番号166
v) DIP番号22:配列番号167及び配列番号168
w) DIP番号23:配列番号169及び配列番号170
x) DIP番号24:配列番号171及び配列番号172
y) DIP番号25:配列番号173及び配列番号174
z) DIP番号26:配列番号175及び配列番号176
aa) DIP番号27:配列番号177及び配列番号178
ab) DIP番号28:配列番号179及び配列番号180
ac) DIP番号29:配列番号181及び配列番号182
又は配列番号271及び配列番号272
ad) DIP番号30:配列番号183及び配列番号184
又は配列番号283及び配列番号284
ae) DIP番号31:配列番号185及び配列番号186
af) DIP番号32:配列番号187及び配列番号188
又は配列番号269及び配列番号270
ag) DIP番号33:配列番号189及び配列番号190
又は配列番号285及び配列番号286
ah) DIP番号34:配列番号191及び配列番号191
ai) DIP番号35:配列番号193及び配列番号194
aj) DIP番号36:配列番号195及び配列番号196
ak) DIP番号37:配列番号197及び配列番号198
al) DIP番号38:配列番号199及び配列番号200
am) DIP番号39:配列番号201及び配列番号202
an) DIP番号40:配列番号203及び配列番号204
ao) DIP番号41:配列番号205及び配列番号206
又は配列番号251及び配列番号252
ap) DIP番号42:配列番号207及び配列番号208
又は配列番号253及び配列番号254
aq) DIP番号43:配列番号209及び配列番号210
又は配列番号255及び配列番号256
ar) DIP番号44:配列番号211及び配列番号212
又は配列番号257及び配列番号258
as) DIP番号45:配列番号213及び配列番号214
又は配列番号259及び配列番号260
at) DIP番号46:配列番号215及び配列番号216
又は配列番号261 及び配列番号262
au) DIP番号47:配列番号217及び配列番号218
又は配列番号263及び配列番号264
av) DIP番号48:配列番号219及び配列番号220
aw) DIP番号49:配列番号221及び配列番号222
ax) DIP番号50:配列番号223及び配列番号224
ay) DIP番号51:配列番号225及び配列番号226
又は配列番号265及び配列番号266
az) DIP番号52:配列番号227及び配列番号228
ba) DIP番号53:配列番号229及び配列番号230
bb) DIP番号54:配列番号231及び配列番号232
bc) DIP番号55:配列番号233及び配列番号234
bd) DIP番号56:配列番号235及び配列番号236
be) DIP番号57:配列番号237及び配列番号238
bf) DIP番号58:配列番号239及び配列番号240
bg) DIP番号59:配列番号241及び配列番号242
bh) DIP番号60:配列番号243及び配列番号244
bi) DIP番号61:配列番号245及び配列番号246
bj) DIP番号62:配列番号247及び配列番号248
bk) DIP番号63:配列番号249及び配列番号250
【００７７】
本発明の一実施態様では、本発明は、以下の群から選択される、少なくとも2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27、28, 29, 30、又は30個よりも多い配列の選択物の使用に関する。
【００７８】
DIP番号1:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２、
DIP番号2:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号255の間に存在する配列番号４、
DIP番号3:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号６、
DIP番号4:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号262の間に存在する配列番号８、
DIP番号5:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１０、
DIP番号6:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１２、
DIP番号7:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１４、
DIP番号8:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号１６、
DIP番号9:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号１８、
DIP番号10:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号247の間に存在する配列番号１９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号252の間に存在する配列番号２０、
DIP番号11:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２２、
DIP番号12:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号２３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号260の間に存在する配列番号２４、
DIP番号13:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号２６、
DIP番号14:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号２８、
DIP番号15:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号２９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号３０、
DIP番号16:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号３２、
DIP番号17:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号270の間に存在する配列番号３４、
DIP番号18:
-挿入-欠失多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３５、
-挿入-欠失多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号３６、
DIP番号19:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号３８、
DIP番号20:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号３９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号４０、
DIP番号21:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号４２、
DIP番号22:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号４３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号257の間に存在する配列番号４４、
DIP番号23:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号４６、
DIP番号24:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号４７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号263の間に存在する配列番号４８、
DIP番号25:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号４９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号296の間に存在する配列番号５０、
DIP番号26:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号266の間に存在する配列番号５２、
DIP番号27:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号５３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号273の間に存在する配列番号５４、
DIP番号28:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号５６、
DIP番号29:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号267の間に存在する配列番号５８、
DIP番号30:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号５９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号270の間に存在する配列番号６０、
DIP番号31:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号271及び番号272の間に存在する配列番号６１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号271及び番号278の間に存在する配列番号６２、
DIP番号32:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号280及び番号281の間に存在する配列番号６３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号280及び番号284の間に存在する配列番号６４、
DIP番号33:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号６５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号６６、
DIP番号34:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号６７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号６８、
DIP番号35:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号６９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号255の間に存在する配列番号７０、
DIP番号36:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号258の間に存在する配列番号７２、
DIP番号37:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号７３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号７４、
DIP番号38:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号255及び番号256の間に存在する配列番号７５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号255及び番号261の間に存在する配列番号７６、
DIP番号39:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号７７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号７８、
DIP番号40:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号７９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号259の間に存在する配列番号８０、
DIP番号41:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号254の間に存在する配列番号８２、
DIP番号42:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号254の間に存在する配列番号８４、
DIP番号43:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号８５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号255の間に存在する配列番号８６、
DIP番号44:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号８７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号８８、
DIP番号45:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号８９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号９０、
DIP番号46:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号９１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号254の間に存在する配列番号９２、
DIP番号47:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号９４、
DIP番号48:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号９５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号256の間に存在する配列番号９６、
DIP番号49:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号247及び番号248の間に存在する配列番号９７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号247及び番号252の間に存在する配列番号９８、
DIP番号50:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号９９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１００、
DIP番号51:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号257の間に存在する配列番号１０２、
DIP番号52:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１０３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１０４、
DIP番号53:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１０５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号１０６、
DIP番号54:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号１０８、
DIP番号55:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１０９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号258の間に存在する配列番号１１０、
DIP番号56:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号258の間に存在する配列番号１１２、
DIP番号57:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号247の間に存在する配列番号１１３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号246及び番号252の間に存在する配列番号１１４、
DIP番号58:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１５、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号263の間に存在する配列番号１１６、
DIP番号59:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１１７、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号266の間に存在する配列番号１１８、
DIP番号60:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１１９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号268の間に存在する配列番号１２０、
DIP番号61:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号１２１、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号277の間に存在する配列番号１２２、
DIP番号62:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号252の間に存在する配列番号１２３、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号251及び番号260の間に存在する配列番号１２４、
DIP番号63:
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号251の間に存在する配列番号２８９、
- 欠失-挿入多型がヌクレオチド番号250及び番号256の間に存在する配列番号２９０。
【００７９】
これらの配列は一部だけ使用してもよい。使用は、その使用がDIPを包含するものである限り、配列の90%であってもよいし、80%、70%、60%、50%、40%、30%、又は20%であってもよい。このことは、100ヌクレオチドを持つ配列が本明細書に開示され、DIPが、該配列の5'末端から30ヌクレオチド離れて配置されている場合、50%の使用とは、例えば、5'末端から始めて最初の50ヌクレオチドを増幅することを意味し、さらに当然ながら、それがDIPを包含する限り、任意の50ヌクレオチドの増幅を意味する。DIP番号31及び32はアメロゲニンDIPである。これらは、選択されるそれらDIPの一部であることが好ましい。
【００８０】
一実施態様では、キットはさらに、「リアルタイムPCR」応用（アプリケーション）を実施するために必要とされる成分を含んでもよい。「リアルタイムPCR」という用語は、蛍光信号の検出及び定量に基づくシステムを意味する。この信号は、反応におけるPCR産物の量に直接比例して増加する。各サイクルにおいて蛍光放射量を記録することによって、PCR産物量における最初の著明な増加が標的鋳型の初期量と相関する、指数増殖期の間、PCR反応をモニター（監視）することが可能である。核酸標的の開始コピー数が高ければ高いほど、蛍光における顕著な増加がより早く観察される。3-15サイクルの間に測定される、基礎値を上回る蛍光における顕著な増加は、蓄積されたPCR産物の検出を示す。成分としては、ただしこれらに限定されないが、介在染料、蛍光標識プライマー及びプローブ、並びにそれらの誘導体がある。
【００８１】
本発明のキットは、情報パンフレットを含んでもよい。
【００８２】
本発明のプロファイリングアッセイ法による使用は、リガーゼ連鎖反応アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、チップに基づくアッセイ（chip based assay）であるなら、それは好ましい。ハイブリダイゼーションアッセイ、チップに基づくミニ配列決定反応(chip-based mini-sequencing reaction)又は一塩基伸長(sinble based extension)とも呼ばれる、アレイ型プライマー伸長（arrayed primer extension;APEX)、アレイ型ライゲーションアッセイ、対立遺伝子特異的アレイ型ライゲーションアッセイも好ましい。ポリメラーゼ連鎖反応アッセイはもっとも好ましい。
【００８３】
高度のマルチプレックス能力を持つ、その他の遺伝子型決定技術としては、アドレス指定配列(addressing sequence)を有するキャピラリー電気泳動及びビーズに基づく技術(bead-based technologies)と組み合わせた、チップに基づく技術による一塩基プライマー伸長（SnaPShot)、又はOLAに基づく（SNPlex）技術がある。これら、及び後述の方法は、本明細書に開示されるプローブと共に使用してもよく、本発明の範囲に入る。
【００８４】
多重DNA混合物において二対立遺伝子多型の遺伝子型決定を可能とする、さらなる検出技術が知られている。レビューについては、シバネン（Syvaenen）（2001）（シバネン・エーシー（Syvaenen AC）、2001. 遺伝子変動にアクセスする：一塩基多型の遺伝子型決定（Accessing genetic variation: Genotyping single nucleotide polymorphisms）. ネイチャー・レビュー・ジェネティクス２（Nature Reviews Genetics 2）: 930-941）、及びクオック（Kwock） (2003) (クオック・ピーワイ（Kwock PY）、2003. 一塩基多型。方法及びプロトコール（Single Nucleotide Polymorphisms. Methods and Protocols）. ヒュマナ・プレス（Humana Press）、トトワ（Totowa）、ニュージャージー（New Jersey）、米国（USA）)を参照。本発明の方法にとって特に価値があるのは、１つの反応において複数のDIPの同時遺伝子型決定を可能にする技術である。キャピラリー電気泳動と組み合わせた、マルチカラーDNA配列決定自動装置を用いる二つの市販システムとして、スナップ・ショット・マルチプレックス・システム（SnaPshot(R) Multiplex System）、及び、エスエヌプレックス・ジェノタイピング・システム（SNPlexTM Genotyping System）(いずれも、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスター市（Foster City）、カリフォルニア州、米国、から販売)がある。最初のものはプライマー伸長に基づく方法であり、メーカーによれば、10よりも多い二対立遺伝子多型の検出を可能とする。二番目のものは、マルチプレックス対立遺伝子特異的オリゴライゲーションアッセイ（OLA)(multiplex allele-specific oligo ligation assay)をPCRと組み合わせ、最大48個の二対立遺伝子多型の同時遺伝子型決定を可能とする。もう一つの、電気泳動に基づくマルチプレックス遺伝子型決定法は、マルチプレックスライゲーション依存プローブ増幅(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)(MLPA；ショウテン・ジェーピー（Schouten JP）、マクエルガン・シージェー（McElgunn CJ）、ワイジャー・アール（Waaijer R）、ズイネンバーグ・ディー（Zwijnenburg D）、ディエプベンズ・エフ（Diepvens F）、パルズ・ジー（Pals G）(2002). マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅による40核酸配列の相対的定量（Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification）、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Res） 30: e57）として記載されている。さらに、DNAチップに基づく技術(DNA-chip based technology)は、本発明のプロセスにとって特に有用である。欧州特許第820,524号及び米国特許第5,679,524号（これらを参照により本明細書に含める）は、チップに基づく対立遺伝子特異的ハイブダイゼーションアッセイ(chip based allele specific hybridizations assays)、アレイ型プライマー伸長（arrayed primer extension;APEX、チップに基づくミニ配列決定反応(chip-based mini-sequencing reaction)、又はチップ上での一塩基プライマー伸長(single base primer extension on a chip)とも呼ばれる）、アレイ型ライゲーション反応（arrayed ligation reaction）及び対立遺伝子特異的アレイ型ライゲーションアッセイ(allele specific arrayed ligation assay)を開示する。欧州特許第799,897号（これを参照により本明細書に含める）は、汎用タグアレイの使用を教示し、欧州特許第1,186,669 897（これを参照により本明細書に含める）は、対立遺伝子特異的ネステッド・オン・チップ(NOC(R))-ポリメラーゼ連鎖反応（allele specific nested on chip (NOCTM)-PCR）を取り扱う。最後に、米国特許第6,287,778 897（これを参照により本明細書に含める）は、ビーズと組み合わせた汎用タグ配列を記載する。
【００８５】
本発明のキットは、特に法医学的応用のためのDNAプロファイリングのために使用してもよい。
【００８６】
本キットはさらに、対立遺伝子ラダーを含んでもよい。
【実施例】
【００８７】
実施例１：１性染色体及び３０常染色体DIPの、マルチプレックスPCR増幅及び遺伝子型決定による、ヒトDNAプロファイリング及び性別決定
基本プロトコル及びDNA調製
使用した全ての試薬及び他の消耗品は、PCR品質であり、特に、DNA、DNA-及びRNA-依存性ヌクレアーゼを含まなかった。基本的分子遺伝学的実験は、サムブルック（Sambrook）ら(1989)（サムブルック・ジェー（Sambrook J）、フリッチェ・イーエフ（Fritsche EF）、マニアティス・ティー（Maniatis T）、モレキュラー・クローニング。ラボラトリー・マニュアル（Molecular cloning. A laboratory manual）、第二版（2nd edition）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）(1989)）にしたがって行った。ヒトの試験標本は、全血又は痰であり、後者は、滅菌頬部綿棒(ナーブ・プラス・ジーエムビーエイチ（Nerbe Plus GmbH）、ワイセン／ルへ（Winsen/Luhe）、ドイツ）をメーカーの指示にしたがって用いて採取した。DNAは、ヌクレオスピン・スピン・ティシュー・キット（NucleoSpin(R) Tissue kit）(マチェレイ・アンド・ナゲル(Macherey & Nagel)、ドゥエレン（Dueren）、ドイツ）をメーカーの指示にしたがって用いて抽出した。DNAの定量は、260 nmにおけるヌクレオチド塩基の吸収を記録するUV VIS分光光度計測（サムブルック(Sambrook)ら、1989）によって、あるいは、クオンティファイラー・ヒトDNA定量キット（QuantifylerTM human DNA quantification kit）（アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)、フォスター市（Foster City）、カリフォルニア州、米国）による定量リアルタイムPCR（qPCR)、及び、ABIプリズム7000 SDSリアルタイム・サーモサイクラー(ABI Prism 7000 SDS real time thermocycler)(アプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)、フォスター市（Foster City）、カリフォルニア州、米国）によって行った。
【００８８】
遺伝子マーカーの選択及びPCRプライマーの設計
Ｘ及びＹ染色体の非組み換え領域内に位置する、ヒトのアメロゲニン遺伝子の、二つのパラログコピーを区別する、3 bp DIP（配列番号61及び62）、及び、6 bp DIP（配列番号63及び64）を性別決定のために選択した。配列番号63/64によって定義されるDIP座位はさらに、本実施例のマルチプレックスPCRにおいて用いた。合計61箇所の、常染色体DIP座位を下記の基準にしたがって用いた：ヒトゲノム内の、定義され、かつマップされる単一コピー標的配列、DIP２〜30bpのヌクレオチド長、異なる染色体における配置、又は、PCRマルチプレックスのために少なくとも10,000,000 bpの、マーカー間の物理的距離、マイナー対立遺伝子の対立遺伝子頻度0.3〜0.5、及び、少なくとも一つの集団調査において報告される少なくとも40%のヘテロ接合性、である。これらの座位の内、表２に示される３０個のＤＩＰが、本実施例のマルチプレックスPCRに使用された。PCRプライマーの設計を実行した。プライマーの特異性は、ソフトウェア・ブラストエヌ（Blastn）(基本的局所的アライメント探索ツール・ヌクレオチド（Basic Local Alignment Search Tool nucleotides）；アルチャル・エス・エフ（Altschul SF）、ギッシュ・ダブリュ（Gish W）、ミラー・ダブリュ（Miller W）、マイアーズ・イーダブリュ（Myers EW）、リプマン・ディージェー（Lipman DJ）、基本的局所的アライメント探索ツール（Basic local alignment search tool）、ジャーナル・オブモレキュラー・バイオロジー（J Mol Biol）、第２１５巻(Vol 215),第403〜410頁、1990）を用いヒトゲノムに対してチェックした。多重化に対するプライマーペアーの適合性は、ソフトウェア・オートディマー（Autodimer）（バロン・ピーエム（Vallone PM）、バトラー・ジェーエム（Butler JM）、オートディマー（AutoDimer）: プライマー-ダイマー及びヘアピン構造のためのスクリーニングツール（a screening tool for primer-dimer and hairpin structures）、バイオテクニックス（Biotechniques）、第37巻(Vol 37)、第226〜231頁、2004）によって調節した。オリゴヌクレオチドを多重化するために、キャピラリー電気泳動において最適の信号分離を保証するために、プライマーペアーを、そのアンプリコンサイズ及び蛍光色素標識にしたがって、さらに注意深く選択した。オリゴヌクレオチドプライマーは、委託実験室（ユーロジェンテック・エスエー（Eurogentec SA）、セライング(Seraing)、ベルギー；又はアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスター市（Foster City）、カリフォルニア州、米国）において標準的フォスフォルアミダイト化学によって合成した。各プライマーペアーの一つのプライマーは、標準化学を用い、その5'末端において、蛍光色素、6-カルボキシフルオレセイン（6-FAM)、2'-クロロ−７’フェニル-1,4-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（VIC)、2'-クロロ-5'-フルオロ-7',8'-ベンゾ-1,4-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（NED)、又は、PET（独占販売品、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスター市（Foster City）、カリフォルニア州、米国）によって共有的に標識した。プライマーは全て、委託実験室において、標準プロトコールにしたがって、イオンペアー逆相高速液体クロマトグラフィーによって精製し、TEバッファー(10 mM Tris/HCl pH8.0、室温で調整、1 mM EDTA)に、100μモルとなるように溶解し、暗黒中4℃で保存した。
【００８９】
先ず、感度及び特異性に関するプライマーの適格性は、種々の濃度のヒト（0.03〜5.0ng)及び非ヒト（最大20ng）DNAを用い、200nMの最終濃度においてモノプレックスPCR（次の項目参照)によって試験した。さらに、アニーリングステップのための温度勾配（55〜65℃）を適用した。マルチプレックスPCRの設定のためにこれらの実験を繰り返し、手作業によるプライマー再設計の外、プライマー濃度の最適化を多数回繰り返した。マルチプレックスPCRにおける最終のプライマー及びその濃度を表2に示す。
【００９０】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)
酵素反応は、合計容量25μLにおいて、50mM Tris/HCl（pH8.8、室温で調整）、20mM NH4SO4、0.2mM dNTP（dATP, dCTP, dGTP, dTTPの等モル混合液）、1.5mM MgCl2、1.5ユニットのジャンプスタート・タックＤＮＡポリメラーゼ（JumpStartTM Taq DNAポリメラーゼ）（シグマ・アルドリッチ・ケミエ・ジーエムビーエイチ(Sigma Aldrich Chemie GmbH)、タウフキルチェン(Taufkirchen)、ドイツ）、200μg/mLウシ血清アルブミン（ロッシュ・ダイアグノスティックス・ジーエムビーエイチ（Roche Diagnostics GmbH）、マンヘイム（Mannheim）、ドイツ）、0.01%ツイーン２０(Tween 20)、及び0.1〜1.0 ngのヒトゲノムDNAを含むものであった。使用したプライマーペアー及びPCRにおけるそれらの最終濃度を表2に示し、それらのヌクレオチド配列は、配列プロトコル（配列番号125〜184及び187〜188）に示す。ABI 9600（アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスター市（Foster City）、カリフォルニア州、米国）サーモサイクラーを用いた。サイクリング条件は、240秒95℃における最初の熱活性化、それに続く、94℃における30秒の変性、60℃における120秒のプライマーアニーリング、及び72℃における75秒のプライマー伸長の30サイクルからなるものであった。全ての温度変化について傾斜速度は1℃／秒に設定した。その後、Taq DNAポリメラーゼの内在的末端トランスフェラーゼ活性によって、3'末端における1ヌクレオチド（好ましくはA)の鋳型非依存性添加が最大となるよう、68℃、3600秒の最終伸長ステップを実行した。
【００９１】
【表２】
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【００９２】
キャピラリー電気泳動及び遺伝子型決定
1μLのPCRアリコートを採取し、12μLのHiDiTM ホルムアミド(アプライド・バイオシステムズ；Applied Biosystems)、及び0.5μLの内部長さ標準(internal length standard)SST550-O (バイオタイプ・エージー；Biotype AG)--これは、蛍光色素LIZ（独占販売品、アプライド・バイオシステムズ；Applied Biosystems）によって標識された一組のDNA断片を含む--と混ぜ合わせた。それとは別に、PCRは、ミニエリュートＰＣＲ精製キット（MiniElute(R) PCR purification kit）(キアゲン・ジーエムビーエイチ(Qiagen GmbH)、ヒルデン（Hilden）、ドイツ）によって精製し、25μLのTEバッファーで溶出し、次いで、1μLの溶出液を、HiDiTM フォルムアミド及びSST550-Oと混合した。サンプルは、95℃3分で変性し、10℃に急冷し、電気泳動前に室温で保存した。キャピラリー電気泳動によってPCR断片を分離するために、ABIプリズム3130遺伝子分析器(ABI Prism 3130 Genetic Analyzer)(アプライド・バイオシステムズ；Applied Biosystems)を用いた。サンプルは電気運動的（15,000V, 10s)に注入した。電気泳動実施条件は下記の通り：POP-4［4%ポリ-(N,N-ジメチルアクリルアミド）、8M尿素、5% 2-ピロリドン、100mM （ヒドロキシメチル)-メチル-3-アミノプロパン-スルフォン酸（TAPS)／NaOH pH8.0、室温で調整、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）］で充填された、4本のキャピラリー(50μm内径、35cm長）を含むキャピラリーアレイ、60℃、及び15,000Vで25分。5色の6-FAM、VIC、NED、PET、及びLIZの同時検出のためにフィルターセットG5を適用した。遺伝子座位の断片長及び遺伝子型は、内部長標準及びソフトウェア・ジェンマッパー(Genmapper(R))(アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）、フォスター市（Foster City）、カリフォルニア州、米国)を用いて計算した。
【００９３】
図1は、ヒト男性の250 pgのゲノムDNAを用いて開始した遺伝子型決定実験の電気泳動グラムを示す。このDNAの遺伝子型は、下記のように短縮形、括弧の中に対立遺伝子式を含む座位リストとして表すことが可能である：D1 (+/+), D2 (+/+), D3 (-/-), D4 (-/+), D5 (-/-), D6 (+/+), D7 (-/-), D8 (-/+), D9 (-/+), D10 (-/+), D11 (-/+), D12 (-/+), D13 (-/+), D14 (+/+), D15 (-/+), D16 (-/+), D17 (-/-), D18 (-/-), D19 (-/+), D20 (-/+), D21 (-/-), D22 (-/+), D23 (-/+), D24 (-/+), D25 (-/+), D26 (-/+), D27 (-/+), D28 (-/-), D29 (-/+), D30 (-/+), D32 (-/+ or X/Y)
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【国際調査報告】
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