(57)【要約】  平均分子量が異なり、かつ、レオロジー、隔離、組織足場および分解特性が異なるヒアルロン酸（ＨＡ）混合物を含む、粘膜関連障害または疾患の治療または予防に使用するためのＨＡの組成物が提供される。得られる製剤は、結膜炎、耳炎、アレルギー性鼻炎、歯肉炎、口腔潰瘍、気管支炎、胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、食道炎、胃炎、腸炎、消化性潰瘍、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、尿道炎、膀胱炎および膣炎を含む粘膜関連障害または疾患の治療および予防において、粘着性と組織足場と処置時間の間の最適なバランスを示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘膜関連障害または疾患の治療または予防に使用するための組成物であって、
低平均分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）と高平均分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷＨＡ）を含む治療上有効な量のヒアルロン酸混合物を含み、ＬＭＷＨＡの平均分子量（Ｍｗ）は５０キロＤａ〜１５０万Ｄａの間であり、かつ、ＨＭＷＨＡの平均分子量は１５０万Ｄａ〜５００万Ｄａの間であり、ＬＭＷＨＡの平均分子量はＨＭＷＨＡの平均分子量と少なくとも５０万Ｄａ異なり、ＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡの混合比は重量で２０：８０〜８０：２０の範囲であることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記ＬＭＷＨＡの平均分子量は１０万Ｄａ〜１５０万Ｄａの間であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＬＭＷＨＡの平均分子量は１０万Ｄａ〜０．５万Ｄａの間であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＨＭＷＨＡの平均分子量は１５０万Ｄａ〜３５０万Ｄａの間であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＨＭＷＨＡの平均分子量は１５０万Ｄａ〜２５０万Ｄａの間であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡの混合比は重量で１：１であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記治療上有効な量は０．０５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記治療上有効な量は０．０５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
粘膜関連障害または疾患は潰瘍形成、炎症、アレルギー反応または出血の症状を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記粘膜は眼の粘膜、耳の粘膜、鼻の粘膜、口腔の粘膜、気道の粘膜、消化管の粘膜、尿路の粘膜、または生殖管の粘膜であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記粘膜関連障害または疾患は結膜炎、耳炎、アレルギー性鼻炎、歯肉炎、口腔潰瘍、気管支炎、胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、食道炎、胃炎、腸炎、消化性潰瘍、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、尿道炎、膀胱炎または膣炎であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記腸炎は急性腸炎、慢性腸炎、感染性腸炎、虚血性腸炎、放射線腸炎、または薬剤性腸炎であることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記消化性潰瘍は胃潰瘍、十二指腸潰瘍、食道潰瘍またはメッケル憩室潰瘍であることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＩＢＤはクローン病または潰瘍性大腸炎であることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＩＢＳは小児脂肪便症、フルクトース吸収不良、軽度感染症、ジアルジア症などの寄生虫感染、機能性慢性便秘、下痢、または慢性機能性腹痛であることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
眼、耳、口、鼻、気道、消化管または局所的使用のための投与形としての組成物を調剤するためにさらに賦形剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記経口使用のための投与形は固体投与形、溶液、制御放出錠を含む錠剤、およびカプセル剤からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記消化管使用のための投与形は固体投与形、灌流、浣腸、坐剤、および懸濁液を含む溶液からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記局所使用のための投与形は灌流、浣腸、坐剤、スプレー、吸入、および点滴剤からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ヒアルロン酸組成物は固体投与形であり、前記ヒアルロン酸組成物の治療上有効な量は５０ｍｇ〜１０００ｍｇヒアルロン酸／日の間であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
アレルギー性鼻炎または気管支炎が、抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、抗うっ血薬、ステロイドまたは抗喘息薬と併用されるアジュバントとしての前記組成物により処置可能であることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２２】
腸炎が、抗生物質または抗痙攣薬と併用されるアジュバントとしての前記組成物により処置可能であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２３】
消化性潰瘍が、凝血薬、抗生物質、制酸薬、Ｈ２遮断薬、カリウム水素イオンポンプ遮断薬（ＰＰＩ）、細胞保護薬、または粘膜保護薬と併用されるアジュバントとしての前記組成物により処置可能であることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】
ＩＢＤがステロイド、免疫抑制薬、抗生物質、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）および誘導体、または抗炎症薬と併用されるアジュバントとしての前記組成物により処置可能であることを特徴とする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２５】
ＩＢＳが抗アレルギー薬、抗痙攣薬、抗下痢薬、神経破壊薬、トランキライザー、鎮痛薬、抗鬱薬、またはセロトニンアンタゴニストと併用されるアジュバントとしての前記組成物により処置可能であることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、症状に潰瘍形成、炎症、アレルギー反応、および出血が含まれる、粘膜関連障害または疾患を治療および予防するためのヒアルロン酸組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、ヒアルロナン、ヒアルロン酸塩、およびヒアルロン酸ナトリウムとしても知られ、一般にＨＡと表示され、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンとＤ−グルクロン酸が交互のβ−１，３およびβ−１，４グリコシド結合により交互に連結されたものから構成される、二糖類を含む天然のグリコサミノグリカン高分子である。天然に見られる、５０，０００ダルトン（Ｄａ）〜数１００万ダルトンの間の分子量（Ｍｗ）を有するＨＡは、通常、高い粘度を有する。
【０００３】
天然に見られるＨＡは弾性を有する流体であり、主に細胞の保護および潤滑化、制御性Ｔ細胞の輸送のためのプラットフォームの提供、さらにコラーゲン網の安定化およびコラーゲン網の機械的損傷からの保護のために、細胞とコラーゲン繊維の間を満たし、一部の表皮組織を被覆している。また、ＨＡはその潤滑特性および高度な緩衝装置であるために腱および腱鞘内および滑膜表面上での主要な潤滑剤となり、組織の流動力学、運動、および細胞増殖に役立ち（非特許文献１参照）、一部の細胞の表面上の受容体相互作用に関与し、特にはＣＤ４４の主要な受容体である。ＣＤ４４は、活性化リンパ球のマーカーとして広く認められている（非特許文献２参照）。
【０００４】
近年、ＨＡは、主として眼、皮膚、整形外科、手術、関節炎、動脈処置、および化粧品の分野で、ナトリウム塩の形態で臨床処置に適用されている。アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン（例えば、マグネシウムイオン）、アルミニウムイオン、アンモニウムイオンを含むＨＡ、およびアンモニウムイオン置換塩の形態は、薬物吸収を助けるための担体となり得る（特許文献１参照）。ＨＡの重金属塩のうち、銀塩は抗真菌薬として用いられ、また金塩は関節リウマチの処置に用いられる（特許文献２参照）。
【０００５】
特許文献３は、膀胱炎の処置に有効な濃度でＨＡを用いるための方法および関連構造を開示しており、この場合のＨＡの平均分子量は２００，０００Ｄａより大きい。その実施形態では、ある分子量を有するＨＡの１種類だけが適用されている。例えば、平均分子量６５０ｋＤａまたは１，９００ｋＤａのＨＡが膀胱炎の処置に用いられるが、ある平均分子量の１種類のＨＡを、即効処置と持続的作用の両方を目的に使用することはできない。特許文献４は、急性捻挫および酷使による捻挫の処置のためのＨＡの使用とその反応を開示しており、この場合のＨＡの分子量はわずか９００ＫＤａ〜１２００ＫＤａの間であり、特定の平均分子量の１種類のＨＡは、速効治癒と持続的作用の両方を果たすことはできない。
【０００６】
特許文献５は、分子量が６００ＫＤａ〜１，２００ＫＤａの間のヒアルロン酸およびヒアルロン酸塩が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の処置に適用できることを開示している。しかしながら、単に１種類の平均分子量のヒアルロン酸およびヒアルロン酸塩は、患者に注射した後の治療効果において即効作用と持続性作用の両方にはわたり得ず、従って、このことは患者にとって臨床上極めて不都合である。
【０００７】
特許文献６は、０．６ＭＤａ〜３ＭＤａの分子量のＨＡを用いる、自己免疫疾患の処置のためのＨＡの使用を開示している。しかしながら、この参照特許では、ある平均分子量の１種類のＨＡのみを使用しており、即効作用と長期作用の両方が同時に見られることはなかった。
【０００８】
粘膜は、大部分は内肺葉起源の内膜であり、上皮に覆われ、吸収（消化管）ならびに分泌（消化管および気道）に含まれる。それらは、外部環境および内臓器官に曝される体腔の内面であり、鼻孔、口、唇、眼瞼、耳、生殖器領域、および肛門などのいくつかの身体領域で皮膚に隣接している。粘膜および腺から分泌された粘着性の高粘度流体は、粘液と呼ばれる。粘膜という用語は、それらが体内で見出される場所をさし、全ての粘膜が粘液を分泌するわけではない。
【０００９】
眼
結膜炎とは、結膜（眼の最外層、および眼瞼の内表面）の炎症をさす。感染またはアレルギー反応に起因することが最も多い（非特許文献３参照）。
【００１０】
耳
耳炎は、ヒトおよび他の動物両方における、耳の炎症または感染に関する一般用語である。耳炎は、外耳および外耳道に関与する外耳炎、中耳に関与する中耳炎、内耳に関与する内耳炎に細分される。
【００１１】
アレルギー性鼻炎
鼻炎は、鼻粘膜の炎症と定義され、くしゃみ、鼻詰まり、鼻のかゆみ、および鼻漏javascript:showcontent('active','references');の任意の組合せからなる複合症状を特徴とする。javascript:showcontent('active','references');眼、耳、鼻および喉が関与する場合もある。アレルギー性鼻炎は鼻炎の最も一般的な原因であり、集団のおよそ２０％が罹患している。アレルギー性鼻炎は生命を脅かす病態ではないが、合併症が起こり得ること、およびその病態が生活の質を著しく損なう場合があることから、多くの間接的経費につながる（非特許文献４参照）。特許文献７は、少なくとも１つの酸性グリコサミノグリカンを含む、鼻炎の治癒的局所処置のための医薬組成物を開示している。しかしながら、この発明はまた、局所適用に好適で粘膜の血管収縮薬作用または腫脹減退作用を有する少なくとも１つの交感神経様作用薬、またはその生理学上許容される塩もしくは誘導体も含む。従って、２種類の異なる平均分子量を有するＨＡを組み合わせることは開示も教示もされていない。
【００１２】
口
口腔粘膜は、口腔の粘膜上皮である。口腔潰瘍は、口腔内部の開いた傷口、または、まれではあるが、口唇上もしくは口周囲の粘膜もしくは上皮における裂け目である。潰瘍の種類は様々であり、物理的な擦傷、酸性の果物、感染、他の医学的状態、投薬、ならびに癌および不特定の経過を含む多数の関連原因がある。潰瘍は、ひと度生じると、炎症および／または二次感染により維持され得る。２つの一般的な種類は、アフタ性潰瘍（「口内炎」）、およびヘルペス（単純ヘルペス、口腔ヘルペス）である。口唇周囲のヘルペスは、ウイルスにより引き起こされる（非特許文献５参照)。
【００１３】
気管支炎
気管支炎は、気管から肺へ空気流を運ぶ気道である気管支の、粘膜の炎症である。気管支炎は急性および慢性の２つのカテゴリーに分類でき、病因、病理、および療法がそれぞれ異なる。急性気管支炎は、風邪またはインフルエンザなどの急性ウイルス性疾患の過程で起こることが多い。慢性気管支炎はほとんどの場合、吸入された刺激物により引き起こされる気道に対する反復性の損傷により発症する。喫煙が最も一般的な原因であり、次いで、大気汚染および刺激物への職業的曝露が続く（非特許文献６）。特許文献８は、ＣＤ４４に結合できる多糖による呼吸器系病態の治療法を開示している。しかしながら、関与し得るのはただ１種類のＨＡのみである。
【００１４】
消化管粘膜
粘膜は、消化管壁の最内層であり、内腔、すなわち管内の開放空間を取り囲んでいる。この層は、食物塊と直接接触し、消化における重要なプロセスである吸収、消化、および分泌を担う。
【００１５】
粘膜は、消化管のそれぞれの器官において高度に分化しており、胃では低いｐＨに直面し、小腸では数多くの様々な物質を吸収し、また、大腸では一定量の水を吸収する。これらの器官の様々な必要を反映して、粘膜の構造は、分泌腺の陥入（例えば胃小窩）により構成されるか、または表面積を増加させるために折りたたまれ得る。
【００１６】
消化管粘膜は、身体と、栄養素を含むだけでなく、不利になる可能性のある微生物および毒素に満ちている内腔環境との間にバリアを形成する。その課題は、有害な分子および生物体が動物体内へ移行することを厳密に排除しつつ、上皮を通じた栄養素の効果的な輸送を可能にすることである。胃粘膜および腸管粘膜のこの排他的な特性は「消化管バリア」と呼ばれる。一般に、上皮細胞の単層を破ることのできる毒素および微生物は、体循環へ障害なくアクセスできる。
【００１７】
胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）は、胃から食道へ上がってくる胃酸により引き起こされる慢性症状または粘膜損傷である。典型的な症状は、胸やけである。ＧＥＲＤは、本来ならば胃の上部を閉鎖する下部食道括約筋の異常な弛緩、胃逆流の食道からの排出障害、または裂孔ヘルニアなどを含む、胃および食道の間のバリアにおける変化により通常引き起こされる。これらの変化は、永続的または一時的（「一過性」）であり得る（非特許文献７参照）。
【００１８】
消化性潰瘍
周知のように、消化性潰瘍（ＰＵＤまたは消化性潰瘍疾患としても知られる）は、通常酸性である消化管領域の潰瘍であり（０．５ｃｍ以上の粘膜びらんと定義される）、従って、激しい疼痛を引き起こす。潰瘍のほぼ７０〜９０％は、胃の酸性環境下で生きるらせん型細菌であるヘリコバクターピロリ菌(Helicobacter pylori)と関連している。また、潰瘍は、アスピリン、プラビックス（クロピドグレル）、イブプロフェン、および他のＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬）などの薬物により引き起こされるか、または悪化する場合がある。
【００１９】
一般的な考え方とは反対に、消化性潰瘍は胃よりも十二指腸（小腸の最初の部分、胃のすぐ後）に生じることが多い。胃潰瘍の約４％は悪性腫瘍が原因であり、従って、癌を排除するためには何回か生検を行う必要がある。十二指腸潰瘍は、一般に良性である。領域または位置による消化性潰瘍の分類には、胃（胃潰瘍と呼ばれる）、十二指腸（十二指腸潰瘍と呼ばれる）、食道（食道潰瘍と呼ばれる）；メッケル憩室（メッケル憩室潰瘍と呼ばれる）が含まれる。
【００２０】
上記具体例は全て、粘膜関連障害または疾患を代表するものであるが、上述のものに限定されるものではない。開示された障害または疾患は、今までのところ様々な薬物または療法で処置できる。しかしながら、そのような処置は、大部分は極めて特殊な調製プロセスによる複雑な組成物を含む薬剤により達成されるものであり、単純かつ安全な処置によるものではない。本発明の発明者を除いては、１５０万Ｄａを区切りとする２つの異なる平均分子量を有する２種類のＨＡ（ＬＭＷＨＡおよびＨＭＷＨＡ）を組み合わせることを教示または予測した従来技術はなく、このことは、当業者が、他の任意の従来技術を組み合わせることにより混合物の有用性の概念を導くことができないことを意味している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】ベルギー特許第９０４，５４７号明細書
【特許文献２】国際公開第８７／０５５１７号
【特許文献３】米国特許第５，８８８，９８６号明細書
【特許文献４】米国特許出願第２００５／００８００３７号明細書
【特許文献５】米国特許第７，３５４，９１０号明細書
【特許文献６】欧州特許第１３６９１１９号明細書
【特許文献７】米国特許出願第２００５０１０７３３０号明細書
【特許文献８】米国特許出願第２００３０１７１３３２号明細書
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Delpech, B. et al., 1997, Hyaluronan: fundamental principles and applications in cancer. J. Intern. Med. 242, 41-48
【非特許文献２】Teder P, et al., 2002, Resolution of lung inflammation by CD44. Science, 296:155-158
【非特許文献３】Richards A, May 2010. "Conjunctivitis". Pediatr Rev 31 (5): 196-208
【非特許文献４】Bousquet J et al. Allergic rhinitis management pocket reference 2008. Allergy 2008 Aug; 63 (8):990-996
【非特許文献５】）J.M. Casiglia, et al., October 2006. "Aphthous stomatitis". Emedecine (website)
【非特許文献６】Cohen, Jonathan and William Powderly. Infectious Diseases. 2nd ed. Mosby (Elsevier), 2004. "Chapter 33: Bronchitis, Bronchiectasis, and Cystic Fibrosis"
【非特許文献７】DeVault KR, 1999. "Updated guidelines for the diagnosis and treatment of gastroesophageal reflux disease. The Practice Parameters Committee of the American College of Gastroenterology". Am J Gastroenterol 94 (6): 1434-42
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
これらの弱点の克服を目的とし、本発明は、上述の問題を軽減または予防するために、少なくとも２つのヒアルロン酸組成物を含むヒアルロン酸混合物の治療上有効な量を、それを必要とする被験体に投与することにより、粘膜関連障害を処置する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明の目的は、粘膜関連障害または疾患を処置するために、異なる平均分子量を有する少なくとも２種類のヒアルロン酸またはその薬学上許容される塩の生物活性を使用することである。低平均分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）および高平均分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷＨＡ）は、異なる粘稠度、隔離機能および分解速度を有する。平均分子量が１５０万Ｄａより小さいヒアルロン酸はＬＭＷＨＡとして分類され、平均分子量が１５０万Ｄａより大きいヒアルロン酸はＨＭＷＨＡとして分類される。従って、ＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡの混合物は所望の組成物を形成でき、この場合、ＬＭＷＨＡは炎症表面を迅速に被覆して粘膜関連障害または疾患（例えば、結膜炎、耳炎、アレルギー性鼻炎、歯肉炎、口腔潰瘍、気管支炎、胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、食道炎、胃炎、腸炎、消化性潰瘍、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、尿道炎、膀胱炎または膣炎）を治療および予防でき、ＨＭＷＨＡはより長い有効期間を達成する目的で分解を緩慢にできる。このようにして、迅速な処置と持続的放出効果が達成され得る。
【００２５】
よって、本発明は、粘膜関連障害または疾患の治療または予防において哺乳動物またはヒトに使用するための組成物であって、
低平均分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）と高平均分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷＨＡ）を含む治療上有効な量のヒアルロン酸混合物（ＨＡ混合物）を含み、ＬＭＷＨＡの平均分子量（Ｍｗ）が５０キロＤａ〜１５０万Ｄａの間であり、かつ、ＨＭＷＨＡの平均分子量が１５０万Ｄａ〜５００万Ｄａの間であり、ＬＭＷＨＡの平均分子量がＨＭＷＨＡの平均分子量と少なくとも５０万Ｄａ異なり、ＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡの混合比が重量で２０：８０〜８０：２０の範囲である、組成物を提供する。
【００２６】
本発明のその他の目的、利点および新規な特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面と共に理解すれば、より明らかとなる。
【００２７】
本発明のシナリオは、ヒアルロニダーゼ（ＨＡａｓｅ）によるヒアルロン酸（ＨＡ）の分解に端を発する。直鎖ＨＡ（ＬＭＷＨＡ）または球状ＨＡ（ＨＭＷＨＡ）は分解されて小断片となり、球状ＨＡは直鎖状ＨＡを補って、作用時間を延長するように治療効果に寄与できる。以下に要約されるように、ＨＡａｓｅ活性が炎症マーカーとして使用され得ることは周知である。よって、長期作用を伴う治療効果を推進するために、低平均分子量と高平均分子量（Ｍｗ）のＨＡの組合せが利用される。従って、より短いＨＡが減少しても持続的に供給を受けることができるので、創傷治癒、または保護された組織を損傷から隔離するためのソフトなバリアの提供が継続される。以下、このシナリオを詳細に説明する。
【００２８】
粘膜関連障害または疾患を治療および予防するために使用される、本発明による組成物は、低平均分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）と高平均分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷＨＡ）を含むＨＡ混合物の治療上有効な量を含む。低平均分子量ＨＡは、その繰り返される二糖単位に基づいて直鎖構造を形成している（図１）が、高平均分子量ＨＡでは、ヒアルロン酸とアミンの反応により、直鎖ヒアルロン酸高分子のカルボン酸基がジ／トリ／ポリアミンと反応してアミド結合を形成し、分子間または分子内架橋を形成すると考えられている。この反応のために、初めのコイル状のヒアルロン酸構造は、全体が球状のナノ粒子に変わる（米国特許第７，８７９，８１８号）。分子量が変化すれば、レオロジー、粘着性、組織足場の機能、および溶液中での分解が異なり、このために、ヒアルロン酸混合物は、粘膜関連障害または疾患を治療および予防するととともに適切かつ持続的な治療効果を達成するために、薬物作用と分解速度のバランスを取ることができる。
【００２９】
Tranchepain F et al.は、ＨＡはそのモル質量によって異なる生物学的機能を有することを開示している。物理化学的には、ウシ精巣のＨＡａｓｅにより触媒される天然のＨＡ加水分解の研究から、速度論的パラメーターはＨＡ鎖の長さに依存することが示唆されている。ＨＡａｓｅにより触媒されるＨＡ加水分解は、モル質量の異なるＨＡ断片を得るための新しい手順で使用された(Tranchepain F et al., A complete set of hyaluronan fragments obtained from hydrolysis catalyzed by hyaluronidase: Application to studies of hyaluronan mass distribution by simple HPLC devices. Anal Biochem. 2006 Jan 15; 348(2): 232-42)。同様に、同研究グループは、ＨＡは、その鎖長に強く依存する様々な生物学的機能を有することも開示している。ＨＡａｓｅにより触媒されるＨＡ加水分解は、ＨＡ長鎖と短鎖の間のバランスの制御に関与していると考えられている。短鎖ＨＡ鎖は短すぎて安定な複合体を形成できないと思われ、長鎖ＨＡもまた、おそらく立体障害のために、複合体形成においては困難に直面する。
【００３０】
いくつかの報告書では、ＨＡａｓｅは炎症に関与すると記載されている。滑液（ＳＦ）ＨＡａｓｅ活性は、滑膜炎症のマーカーとして使用され得る(Nagaya H et al., Examination of synovial fluid and serum HAase activity as a joint marker in rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Ann Rheum Dis., 1999, 58(3): 186-8)。ＨＡは、歯周靭帯（ＰＤＬ）の細胞外マトリックスの主要な成分であり、構造的および機能的完全性に寄与している。ＨＡは、咀嚼時のＰＤＬの緩衝作用に寄与し、それらはまた、炎症および創傷治癒においても重要である。この研究は、ＰＤＬ線維芽細胞がＨＡａｓｅを発現し、生理学的条件および炎症条件下での細胞外ＨＡ代謝に不可欠なＨＡａｓｅ活性を生じることを示唆している(Ohno S et al., Expression and activity of hyaluronidase in human periodontal ligament fibroblasts. J Periodontol., 2002, , 73(11): 1331-7)。ＨＡａｓｅにより触媒される短いＨＡ断片は炎症プロセスおよび血管新生に関与するが、天然のＨＡは関与しない(Tranchepain F et al.,前掲)。
【００３１】
本発明によれば、平均分子量が１５０万Ｄａよりも小さいＨＡはＬＭＷＨＡとして分類され、好ましい平均分子量範囲は５０キロＤａ〜１５０万Ｄａの間であり、より好ましい平均分子量範囲は１０万〜１５０万Ｄａの間であり、最も好ましい平均分子量範囲は１０万〜５０万Ｄａの間である。平均分子量が１５０万Ｄａより大きいＨＡはＨＭＷＨＡとして分類され、好ましい平均分子量範囲は１５０万〜５００万Ｄａの間であり、最も好ましい平均分子量範囲は１５０万〜２５０万Ｄａの間である。ＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡの混合物を含有する組成物がそれを必要とする被験体に投与される場合、ＬＭＷＨＡは粘膜関連障害または疾患を治療および予防するために迅速に炎症部分を被覆し、その一方でＨＭＷＨＡはＬＭＷＨＡの治療効果を延長する。従って、処置は迅速に行われ、放出効果が持続する。ＨＡの一般的な化学構造は、図１のように表すことができる。
【００３２】
ＨＡの種類は、分子量として示されるだけでなく、固有粘度（η）としても示され、この固有粘度はＭａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋ−Ｓａｋｕｒａｄａ（ＭＨＳ）の式：
【００３３】
【数１】
2014523435.tif 000002
【００３４】
を介して、ポリマーの分子量と直接関連している。ヒアルロン酸に関しては、Ｋは０．０００５７であり、指数αは以下の条件下で０．７５である：リン酸バッファー中０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、２０℃(“Standard Guide for Characterization and Testing of Hyaluronan as Starting Materials Intended for Use in Biomedical and Tissue Engineered Medical Product Applications”, ASTM Designation: F 2347-03)。
【００３５】
本発明は、ＨＡａｓｅ（図２）または人工胃液（図３）の作用下であっても、高平均分子量ＨＡは低平均分子量ＨＡを補い得ることを示す結果を提供する。この結果は、ＨＡａｓｅが存在する状況でまたは消化管環境で、ＨＡが補充されて長期効果を維持し得ることを示す。ＨＡａｓｅ下では、３種類全てのＨＡの分解が増すにつれ、保持時間が明らかに長くなった（図２）。酸性環境下では、３種類全てのＨＡの分解が増すにつれ、保持時間は徐々に長くなった（図３）。模擬生理学的状況を用いて実験パラメーターを推進したが、真の生理学的環境はもっと複雑であり、やや異なる結果をもたらす可能性がある。しかしながら、高平均分子量ＨＡが低平均分子量ＨＡを補い得るというその本来の分子特性のために、ＨＡ分解の傾向は変化しないであろう。
【００３６】
本発明による組成物の他の好ましい実施形態には、限定されるものではないが、塩形態のＨＡの重量で１：１（ｗ／ｗ）のＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡの混合物が含まれ、また、ＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡの比のより好ましい実施形態としては、臨床目的によって重量で２０：８０〜８０：２０の間に調整できる。ＬＭＷＨＡのＨＭＷＨＡに対する比がより大きいＨＡ混合物は、処置の迅速化により有用であり得るが、これに対して、ＨＭＷＨＡのＬＭＷＨＡに対する比がより大きければ、分解時間が長くなって全体の治療効果を延長できる。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「粘膜」は、限定されるものではないが、眼の粘膜、耳の粘膜、鼻の粘膜、口腔の粘膜、気道の粘膜、消化管の粘膜、尿路の粘膜、および生殖管の粘膜を含み、一方、本発明の粘膜関連障害または疾患は、潰瘍形成、炎症、アレルギー反応または出血の症状を含む。粘膜関連障害または疾患の好ましい実施形態には、限定されるものではないが、結膜炎、耳炎、アレルギー性鼻炎、歯肉炎、口腔潰瘍、気管支炎、胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、食道炎、胃炎、腸炎、消化性潰瘍、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、尿道炎、膀胱炎および膣炎が含まれる。腸炎のより好ましい実施形態には、限定されるものではないが、急性腸炎、慢性腸炎、感染性腸炎、虚血性腸炎、放射線腸炎、および薬剤性腸炎が含まれる。消化性潰瘍のより好ましい実施形態には、限定されるものではないが、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、食道潰瘍およびメッケル憩室潰瘍が含まれる。ＩＢＤのより好ましい実施形態には、限定されるものではないが、クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる。ＩＢＳのより好ましい実施形態には、限定されるものではないが、小児脂肪便症、フルクトース吸収不良、軽度感染症、ジアルジア症などの寄生虫感染、機能性慢性便秘および慢性機能性腹痛が含まれる。
【００３８】
本発明の結果は、同じ平均分子量のＨＡが、正常結腸組織よりも損傷結腸組織において明らかに多く吸収されたことを示している（Ｐ＜０．０１、図４）。損傷結腸組織において吸収された３種類の平均分子量のＨＡ間の違いを比較すると、損傷結腸組織による３５０ＫＤａのＨＡの吸収の蛍光指数が、他の２つの平均分子量（２０００ｋＤａおよび１０００ｋＤａ）のＨＡよりも明らかに高かった。さらに、同等の正常結腸組織または損傷結腸組織による１ＭＤａのＨＡの吸収の蛍光指数は、２０００ｋＤａのＨＡよりも高かった。この結果は、即時の創傷治癒と組織のさらなる損傷からの保護を提供する低分子量ＨＡの、迅速な拡散と被覆効果を説明する。上述のデータを組み合わせれば、本発明は、粘膜関連障害または疾患の迅速かつ持続的な治療または予防の方法を提供する。
【００３９】
本発明による組成物の他の好ましい実施形態には、さらに、眼、耳、口、鼻、気道、消化管または局所使用のための投与形を調剤するための賦形剤が含まれる。経口使用のための投与形のより好ましい実施形態は、固体投与形、限定されるものではないが懸濁液を含む溶液、限定されるものではないが制御放出錠を含む錠剤、および限定されるものではないが腸溶コーティングカプセルを含むカプセル剤からなる群から選択される。固体投与形の最も好ましい実施形態は、５０ｍｇ〜１０００ｍｇ／日の間の用量で経口投与される。消化管使用のための投与形のより好ましい実施形態は、固体投与形、灌流、浣腸、坐剤、および限定されるものではないが懸濁液を含む溶液からなる群から選択される。局所使用のための投与形のより好ましい実施形態は、灌流、浣腸、坐剤、スプレー、吸入、および点滴剤からなる群から選択される。
【００４０】
アレルギー性鼻炎または気管支炎を処置する好ましい実施形態は、アジュバントとしての本発明の組成物を抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、抗うっ血薬、ステロイドまたは抗喘息薬とともに、それを必要とする被験体に併用投与することにより実施できる。腸炎を処置する好ましい実施形態は、アジュバントとしての本発明の混合物を抗生物質または抗痙攣薬とともに、それを必要とする被験体に併用投与することにより実施できる。消化性潰瘍を処置する好ましい実施形態は、アジュバントとしての本発明の混合物を凝血薬、抗生物質、制酸薬、Ｈ２遮断薬、カリウム水素イオンポンプ遮断薬（ＰＰＩ）、細胞保護薬、または粘膜保護薬とともに、それを必要とする被験体に併用投与することにより実施できる。ＩＢＤを処置する好ましい実施形態は、アジュバントとしての本発明の混合物をステロイド、免疫抑制薬、抗生物質、５−ＡＳＡ（５−アミノサリチル酸）および誘導体、または抗炎症薬とともに、それを必要とする被験体に併用投与することにより実施できる。
【００４１】
本発明は、平均体重の変化により示される、種々の重量混合比のＨＡで処置されるＩＢＤを提示する。図５Ａおよび５Ｂにおいて、Ａ群は重量混合比８：２のＨＭＷＨＡとＬＭＷＨＡの混合物を表し、Ｂ群は重量混合比１：１のＨＭＷＨＡとＬＭＷＨＡの混合物を表す。Ｃ群はＨＡをＰＢＳバッファーで置き換えた対照群を表す。統計学的有意差は５日目と６日目に示されただけであるが、図の重要な点は、１日目から１４日目までの各群の傾向にある。日数の経過とともに、その傾向は、Ａ群およびＢ群の両群が、ＩＢＤにも属す大腸炎に対して軽減効果を持っていたことを示している。対照（Ｃ群）とＨＡ（Ａ群およびＢ群）との間の平均体重の変化において、試験１４日目に至るまでの全試験期間にわたって、大腸炎の治療効果により、ＨＡ投与群の平均体重は対照群よりも高く維持された（図５Ａ）。興味深いことに、この傾向はまた、Ｂ群の方がＡ群よりも一般に良好な治療効果を有することを示し、これは、ＬＭＷＨＡの割合が高いほど、より効果的な治療効果を有することを意味する。このことは、効果の延長を目的としてＬＭＷＨＡを補充するためにＨＭＷＨＡを使用するという本発明の技術的特徴の裏付けとなり得る。
【００４２】
本発明は、アレルギー症状を示す簡単な指標として鼻をこする動作を利用し、また、鼻をこする回数の減少を改善の結果とした。結果は、２８日目（Ｄ２８）において、対照群（ＰＢＳのみ投与）とＨＡ群との間に有意差を示し、このことはアレルギー症状が上手く誘発されたことを意味している（図６）。３０日目（Ｄ３０）の結果は統計学的有意差を示さなかったが、対照群とＨＡ群の間でアレルギー症状はなお明らかに減少していた。従って、本発明によるＨＡ混合物の投与の結果により、アレルギー症状軽減の傾向が確かに証明された（図６）。
【００４３】
様々な試験において結果はやや異なる可能性があるが、本発明を概観すればこの傾向は、本発明による組成物がアレルギー症状を含む粘膜関連疾患または障害を改善する能力を有することであると推論され得る。結果を適切に示すために、本発明は試験時間の短いいくつかの関連試験で証明されるが、哺乳動物における本発明の対象の実際の適用においては、これらの試験よりもより長い期間となろう。従って、本発明の理論および結果に基づけば、本発明のＨＭＷＨＡは、体内でのＬＭＷＨＡの即時治療効果の長期にわたる補助および／または補充を裏付けるに十分であるはずである。
【００４４】
ＩＢＳを処置する好ましい実施形態は、アジュバントとしての本発明の混合物を、抗アレルギー薬、抗痙攣薬、抗下痢薬、神経破壊薬、トランキライザー、麻薬性鎮痛薬、抗鬱薬、またはセロトニンアンタゴニストとともに、それを必要とする被験体に併用投与することにより実施できる。
【００４５】
経口製剤の好ましい実施形態（例えば、腸溶コーティング錠）では、腸溶コーティングは、胃におけるより強い溶解および消化耐性を与え、小腸および結腸に到達後は、腸溶コーティングが溶解し、本明細書のＨＡ混合物が放出され、炎症領域の治癒を促進するため、また、緩慢な分解速度により治療効果を延長するために、炎症結腸（上行結腸または横行結腸の領域）で保護膜を形成する。
【００４６】
座剤製剤の好ましい実施形態では、本明細書のＨＡ混合物を含有する座剤を肛門に挿入してよく、混合物は直腸内で溶解し、結腸の他の領域（例えば、下行領域）に拡散し、炎症領域の治癒を促進するため、また、持続的放出効果をもたらすために、炎症結腸で保護膜を形成する。
【００４７】
灌流製剤の好ましい実施形態では（例えば、浣腸）、本明細書のＨＡ混合物は主要有効成分であり、賦形剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液または懸濁液製剤））と混合され、そのまま使用されるか、またはソフトチューブの中に入れられ、結腸内に上記ＨＡ混合物が注入される。ＨＡ混合物は結腸に挿入され、結腸の他の領域（例えば、下行領域）に拡散し、炎症領域の治癒を促進するため、また、持続的放出効果を達成するために、炎症結腸で保護膜を形成する。
【００４８】
本明細書で使用された混合物により処置される被験体の、より好ましい実施形態は、哺乳動物である。被験体の最も好ましい実施形態は、ヒトである。
【００４９】
上述の説明によれば、創傷または炎症表面を迅速に被覆し、処置期間を短縮し、かつ、被覆期間を延長する目的で分解を緩慢にするために、分子量の異なるヒアルロン酸の、少なくとも２種類の薬学上許容される塩が混合される。このようにして、より迅速な処置および持続的放出効果が達成される。本発明は、上述の障害または疾患を処置するための、より容易で安全な方法、また、関連する患者により良い選択肢を提供することにより、こうした患者を補助する低コストの方法を提供する。
【００５０】
本発明を特定の最良の様式に関して説明してきたが、上記説明に照らして当業者には多くの変更、改変、および変形が明らかであると理解されるべきである。よって、本発明は、含められた特許請求の範囲の趣旨および範囲に入る、このような変更、改変、および変形を全て包含することを意図する。本明細書で示された、または添付の図面に示された全ての事項は、例示的かつ非限定的なものであると解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、ヒアルロン酸の一般化学構造を示す。
【図２】図２は、ＧＰＣダイアグラムによるＨＡの保持時間を示し、Ｙ軸はＧＰＣにおける保持時間、Ｘ軸はＨＡａｓｅを含有する溶液中でのＨＡの分解時間を示す。
【図３】図３は、ＧＰＣダイアグラムによるＨＡの保持時間を示し、Ｙ軸はＧＰＣにおける保持時間、Ｘ軸は人工胃液中でのＨＡの分解時間を示す。
【図４】図４は、正常結腸組織および損傷結腸組織におけるＨＡの親和性を蛍光指数により示す。
【図５Ａ】図５Ａは、試験１日目から９日目のラットの平均体重により示される大腸炎の治療に対する、２つのカテゴリーのＨＡの効果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、試験１日目から１４日目のラットの平均体重により示される大腸炎の治療に対する、２つのカテゴリーのＨＡの効果を示す。
【図６】図６は、ラットにおいてオボアルブミン（１０μｇ／１０μｌ／鼻孔）により誘発された鼻をこする動作に対するＨＡサンプルの効果を示し、２８日目（Ｄ２８）においてＨＡ群と対照群との間に有意差が見られた（*ｐ＜０．０５）ことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
実施例１：１Ｕ／ｍｌのＨＡａｓｅ中でＨＡの分解
手順：
１．  ０．２５ｇの高分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末（ＨＨＡ；分子量：２ＭＤａ；Ｆｒｅｄａ）、および０．２５ｇの低分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末（ＬＨＡ；分子量：０．３５ＭＤａ；Ｆｒｅｄａ）をそれぞれ、５０ｍｌのＰＢＳバッファー（リン酸緩衝生理食塩水）に加え、０．５％溶液を作製した後、粉末が完全に溶解するまで６時間撹拌した。
【００５３】
２．  ０．０５ｇのＬＨＡ粉末および０．２ｇのＨＨＡ粉末（比率２：８；中間分子量ヒアルロン酸ナトリウム粉末、ＭＨＡ）を、５０ｍｌのＰＢＳバッファーに加えた後、粉末が完全に溶解するまで６時間撹拌した。
【００５４】
３．  ＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）システムの移動相溶液を以下のように調製した：（１）３５．４９ｇのＮａ2ＨＰＯ4粉末を４５０ｍｌの脱イオン蒸留水（ｄｄ水）に加え、室温にて３０分間撹拌して０．５ＭのＮａ2ＨＰＯ4溶液とし；（２）１８ｇのＮａＨ2ＰＯ4粉末を２５０ｍｌのｄｄ水に加え、室温にて３０分間撹拌して０．５ＭのＮａＨ2ＰＯ4溶液とした。
【００５５】
４．  ４℃にて、ＨＡａｓｅ粉末をＰＢＳバッファーに溶解させることにより１Ｕ／ｍｌのＨＡａｓｅを調製した。
【００５６】
５．  ２ｍｌのＨＡサンプル、１ｍｌの１０Ｕ／ｍｌ  ＨＡａｓｅ、および７ｍｌのＰＢＳバッファーを、１５ｍｌのガラス管内でボルテックスにより３分間混合した。
【００５７】
６．  上記ガラス管を水浴中、５０ｒｐｍで振盪した。１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０分後に１ｍｌの溶液を採取した後、各時点において１ｍｌのＨＡａｓｅを加えた。全ての１ｍｌ溶液を、０．４５μｍフィルターで濾過した。２０μｌの溶液をＧＰＣシステムに注入した後、ダイアグラムを記録した。
【００５８】
７．  ＧＰＣシステムの条件は次の通りとした。（１）カラム：２ｘＧＭＰＷｘｌ（ＴＳＫ−ｇｅｌ）；（２）移動相流速：１ｍｌ／分；（３）温度：３０℃。
【００５９】
８．  表中の値は全て、ｎ回の観測の平均値として表した。組織学的指数は、スチューデントのｔ検定により分析した。
【００６０】
結果：
図２は、ＧＰＣダイアグラムによるＨＡの保持時間を示す。Ｙ軸は、ＧＰＣにおける保持時間を示し、Ｘ軸は、ＨＡａｓｅを含有する溶液中でのＨＡの分解時間を示す。水平の点線は、上から下へ、それぞれ２ＭＤａ、１ＭＤａ、３５０ＫＤａおよび１７ＫＤａのＨＡの保持時間を表す。保持時間は明らかに長くなり、その後、３種類全てのＨＡの分解が増加した。１５分の分解の後に、ＨＨＡおよびＭＨＡの平均分子量は約１ＭＤａに分解された。３７分の分解の後には、ＨＨＡおよびＭＨＡの平均分子量は約３５０ＫＤａに分解された。９０分の分解の後には、ＨＨＡ、ＭＨＡおよびＬＨＡの平均分子量は、平均分子量の間に明らかな差は存在しないところまで分解され、それらは全て１７ＫＤａよりも大きかった。
【００６１】
実施例２：０．１ＮのＨＣｌ中でのＨＡの分解
手順：
１．  ＬＨＡ、ＭＨＡおよびＨＨＡは実施例１と同様に調製した。
【００６２】
２．  ＧＰＣシステムの移動相溶液は、実施例１と同様に調製した。
【００６３】
３．  人工胃液（０．１Ｎ  ＨＣｌ）は、５．７２ｍｌの１７．５Ｎ  ＨＣｌと９０ｍｌのｄｄ水を混合し、１０分間撹拌することにより調製し、保存溶液とした。
【００６４】
４．  ２ｍｌのＨＨＡ、ＭＨＡおよびＬＨＡを、それぞれ１５ｍｌのガラス管内で、８ｍｌの人工胃液とともに、ボルテックスにより３分間撹拌することにより混合した。
【００６５】
５．  上記ガラス管を３７℃の水浴中、５０ｒｐｍで振盪した。６、１２、２４、４８時間後に１ｍｌの溶液を採取した後、各時点において１ｍｌの人工胃液を加えた。全ての１ｍｌ溶液を、０．４５μｍのフィルターで濾過した。２０μｌの溶液をＧＰＣシステムに注入した後、ダイアグラムを記録した。
【００６６】
６．  表中の値は全て、ｎ回の観測の平均値として表した。組織学的指数は、スチューデントのｔ検定により分析した。
【００６７】
結果：
図３は、ＧＰＣダイアグラムにおけるＨＡの保持時間を示す。Ｙ軸は、ＧＰＣにおける保持時間を示し、Ｘ軸は、人工胃液中でのＨＡの分解時間を表す。水平の点線は、上から下へ、それぞれ２ＭＤａ、１ＭＤａ、３５０ＫＤａおよび１７ＫＤａのＨＡの保持時間を表す。保持時間はゆっくりと長くなり、その後、３種類全てのＨＡの分解が増加した。７時間の分解の後に、ＨＨＡおよびＭＨＡの平均分子量は約１ＭＤａに分解された。３１時間の分解の後に、ＭＨＡの平均分子量は約３５０ＫＤａに分解された。３５時間の分解の後には、ＨＨＡの平均分子量は約３５０ＫＤａに分解された。上述のデータは全て、ＨＡは人工胃液中でゆっくりと分解されるのに対し、ＨＨＡおよびＭＨＡの平均分子量は６時間の分解の後に１ＭＤａよりも大きく、また、ＨＨＡおよびＭＨＡの平均分子量は２４時間の分解の後に３５０ＫＤａよりも大きかったことを示している。
【００６８】
実施例３：結腸組織におけるＨＡの粘着性（ＩＶＩＳ遺伝子イメージシステム−ビジョン３）
手順：
１．  ＬＨＡおよびＨＨＡは、実施例１と同様に調製した。ＭＨＡ（ＭＨＡ；分子量：１ＭＤａ；Ｆｒｅｄａ）を、５０ｍｌのＰＢＳバッファーに加えた後、粉末が完全に溶解するまで６時間撹拌し、以下のステップで使用できる状態にした。
【００６９】
２．  蛍光ＨＡ（ＨＡ−ｆ）を以下のように調製した。（１）０．３９ｇのＭＥＳ遊離酸（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１００ｍｌのｄｄ水に溶解させた。（２）溶液Ａ：６５ｍｇのフルオレセインアミン粉末（異性体Ｉ、Ｆｌｕｋａ）を、９ｍｌの９５％エタノール溶液に溶解させた後、遮光条件下で１０分間撹拌した。（３）溶液Ｂ：３５９ｍｇのＥＤＣ粉末（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ−エチルカルボジイミド塩酸塩、Ｓｉｇｍａ）を、９ｍｌのＭＥＳバッファーに溶解させた後、１０分間撹拌した。（４）溶液Ｃ：２１６ｍｇのＮＨＳ粉末（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓｉｇｍａ）を９ｍｌのＭＥＳバッファーに溶解させた後、１０分間撹拌した。（５）３ｍｌの溶液Ａを、５０ｍｌの０．５％ＨＡ溶液中にゆっくりと滴下した後、遮光条件下で１０分間撹拌した。（６）３ｍｌの溶液Ｂと５ｍｌの溶液Ｃを、ステップ（５）の溶液中に別々に滴下した後、遮光条件下で１０分間撹拌した。（７）０．０２ＭのＭＥＳバッファーを、容量が１００ｍｌになるまでステップ（６）の溶液中にゆっくりと加えた後、遮光条件下、室温で２４時間撹拌した。（８）反応後の生成物を、５Ｌのｄｄ水を透析溶液として、透析チューブ（ＭＷ：１２０００〜１４０００）中に注いだ後、透析溶液の蛍光がなくなるまで１２時間ごとに透析溶液を交換しながら、遮光条件下、４℃で５日間撹拌した。（９）透析後の液体を５０ｃ．ｃ．のプラスチック製遠心管に分注した後、−２０℃の冷蔵庫で一晩保存し、その後、遮光条件下、凍結乾燥装置にて乾燥させた。（１０）乾燥したＨＡ−ｆ粉末を、−２０℃の冷蔵庫で保存した。（１１）５０ｍｇのＨＡ−ｆ粉末を、１０ｍｌのＰＢＳバッファーにゆっくりと加えた後、粉末が完全に溶解するまで６時間撹拌した。
【００７０】
３．  ７〜８週齢のＳＤ−ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット）の結腸組織を外科用メスで切断した後、ＰＢＳバッファーで洗浄し、その後、３〜４ｃｍの長さに切断して、最終的にＰＢＳバッファーに浸漬した。
【００７１】
４．  損傷結腸組織は、歯ブラシで長手方向に２０回擦ることにより調製した後、ＰＢＳバッファーに浸漬した。
【００７２】
５．  正常結腸組織および損傷結腸組織を１２ウェルプレートに入れた後、１ｍｌの０．５％ＨＡ−ｆ溶液を各ウェルに加え、室温で２時間振盪した。２時間後に、チップを用いて余剰のＨＡ−ｆ溶液を吸い取った後、ＰＢＳバッファーに１０分間浸漬し、その後、ＰＢＳバッファーを除去することを３回繰り返した。
【００７３】
６．  洗浄した結腸組織を、内面組織を上に向けて１２ウェルプレートに入れた後、ＩＶＩＳのドックに配置した（in vivo画像システム、ＸＥＮＯＧＥＮ）。デフォルトパラメーターをＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）に設定し、励起４６５ｎｍ、発光５００ｎｍとし、次に、画像をソフトウエアにより取り込んだ。
【００７４】
７．  表中の値は全て、ｎ回の観測の平均値として表されている。組織学的指数は、スチューデントのｔ検定により分析した。
【００７５】
結果：蛍光指数を定量し、図４のように配置した。正常結腸組織の蛍光指数を１と定義した。他の結腸組織の試験は、定義された値により較正した。結果は、同じ平均分子量のＨＡは、正常結腸組織よりも、損傷結腸組織において明らかに多く吸収されたことを示した（Ｐ＜０．０１）。損傷結腸組織において吸収された３つの異なる平均分子量のＨＡの間の差を比較すると、損傷結腸組織による３５０ＫＤａのＨＡの吸収の蛍光指数は、他の２つの平均分子量（２ＭＤａおよび１ＭＤａ）のＨＡよりも明らかに高かった。さらに、同等の正常結腸組織または損傷結腸組織による１ＭＤａのＨＡの吸収の蛍光指数は、２ＭＤａのＨＡよりも高かった。
【００７６】
実施例４：大腸炎を対象とするＨＡを投与する場合または投与しない場合のラットの体重変化
手順：
１．  試験意図：重量比が異なる２種類のＨＡを混合することによる大腸炎の治療または予防の効果を評価する目的で、ＳＰＦグレードのＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットにおいて、ＴＮＢＳを用いて大腸炎を誘発すること。
【００７７】
２．  試験目的：ＩＢＤ９８は、ＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡを含み、ＨＭＷＨＡは２００万Ｄａであり、ＬＭＷＨＡは３５０キロＤａであり、重量比８：２および１：１で混合され、それぞれＡ群およびＢ群に分類され、ＰＢＳ溶液に溶解させて０．１２５％（ｗ／ｖ）の濃度とした。
【００７８】
３．  方法：（１）試験対象：８週齢のラットを選択し、３群に分けた：Ａ群は混合比８：２、Ｂ群は混合比１：１とし、Ｃ群は、ＨＡの代わりにＰＢＳで処置した。（２）動物試験：処置群の全ラットを２日間絶食させ；試験１日目に、直腸を介して１ｍｌのＴＮＢＳ（５０ｍｇ／ｍＬ）を投与するためにラットを麻酔し；試験４日目から１４日目まで、Ａ群およびＢ群において直腸を介して１ｍｌの２種類のＩＢＤ９８を投与し；試験９日目に、Ａ群およびＢ群の半数のラットの体重変化を観察した。また、残りの半数のラットの体重変化は１４日目に観察した。対照群の全ラットを２日間絶食させ；試験１日目に、直腸を介して１ｍｌのＴＮＢＳ（５０ｍｇ／ｍＬ）を投与するためにラットを麻酔し；試験４日目から１４日目まで、直腸を介して１ｍｌのＰＢＳを投与し；試験９日目に、Ｃ群の半数のラットの体重変化を観察した。また、残りの半数のラットの体重変化は１４日目に観察した。
【００７９】
結果：
１．  炎症指標：本発明では、大腸炎（ＩＢＤ）の改善を見るための指標として平均体重の変化を用いた。体重変化は処置結果を確認するために都合のよい直接的な指標である。
２．  Ａ群およびＢ群の示した傾向は両方とも、１日目から１４日目でＩＢＤとしても表される大腸炎の軽減効果を示した（図５Ａおよび５Ｂ）。対照とＨＡ群の平均体重の変化において、大腸炎の治療効果は、試験１４日目までの全実験期間にわたって、ＨＡ投与群の平均体重を対照群の平均体重よりも高く維持させた（図５Ｂ）。
【００８０】
実施例５：アレルギー性疾患に対するＨＡの効果
手順：
１．試験意図：ＳＰＦグレードのＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットにおいてアレルギー性疾患、ここでは鼻炎、を誘発すること。
【００８１】
２．試験目的：ＩＢＤ９８は、ＬＭＷＨＡおよびＨＭＷＨＡを含み、ＨＭＷＨＡの平均分子量は２００万Ｄａであり、ＬＭＷＨＡの平均分子量は３５０キロＤａであり、重量比１：１で混合され、ＰＢＳ溶液に溶解して０．１２５％（ｗ／ｖ）濃度のＨＡ溶液とした。
【００８２】
３．方法：（１）試験対象：８週齢の９匹のラットを選択し、無作為に２群に分け、対照群（ＰＢＳ）は４匹のラット、試験群（ＨＡ）は５匹のラットとした。（２）動物試験：試験１日目から７日目の間、毎日、ラットに、オボアルブミン（１ｍｇ）およびミョウバン（１０ｍｇ）を含有する生理食塩水を腹腔内注射（ＩＰ）し；試験８日目から１３日目までは観察のみ行い；試験１４日目から２７日目までは、マイクロピペットを用いて生理食塩水溶液中オボアルブミン（１０μｇ／１０μｌ／鼻孔）を両側の鼻腔に滴下した。抗原投与後の鼻腔症状に対するＨＡの効果を、ラットを用いて一般的な感作後２８日目（Ｄ２８）および３０日目（Ｄ３０）に評価した。オボアルブミン注入１時間前に、ラットにＨＡ溶液またはＰＢＳを滴下した（２５μＬ／鼻孔）。生理食塩水中オボアルブミン（１０μｇ／１０μＬ／鼻孔）を両側の鼻腔へ注入した後、ラットを観察ケージに入れ（１匹／ケージ）、鼻をこする動作を３０分間数えた。鼻をこする頻度は、３０分あたりの鼻をこする回数として計算した。
【００８３】
結果：
１．アレルギー改善指標：本発明では、鼻をこする頻度をアレルギー改善の指標として使用した。
２．抗原により誘発される鼻の症状に対するＨＡサンプルの効果を図６に示した。オボアルブミンにより誘発された鼻をこする動作の頻度の平均は、２８日目（Ｄ２８）で５６．２５±１６．１回／３０分、および３０日目（Ｄ３０）で７０．０±４１．３回／３０分であった。対照群と比較して、鼻をこする回数はＨＡ溶液により２８日目に有意に減少し、３０日目には明らかに減少した。
【図１】
2014523435.tif 000003
【図５Ｂ】
2014523435.tif 000004
【図６】
2014523435.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2014523435.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成25年4月12日(2013.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘膜関連障害または疾患の治療または予防に使用するための組成物であって、  低平均分子量ヒアルロン酸（ＬＭＷＨＡ）と高平均分子量ヒアルロン酸（ＨＭＷＨＡ）を含む治療上有効な量のヒアルロン酸混合物を含み、ＬＭＷＨＡの平均分子量（Ｍｗ）は５０キロＤａ〜１５０万Ｄａの間であり、かつ、ＨＭＷＨＡの平均分子量は１５０万Ｄａ〜５００万Ｄａの間であり、ＬＭＷＨＡおよびＨＭＷＨＡの平均分子量の両方から１５０万Ｄａは除外されており、ＬＭＷＨＡの平均分子量はＨＭＷＨＡの平均分子量と少なくとも５０万Ｄａ異なり、ＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡの混合比は重量で２０：８０〜８０：２０の範囲であり、粘膜は眼の粘膜、耳の粘膜、鼻の粘膜、口腔の粘膜、気道の粘膜、消化管の粘膜、尿路の粘膜、または生殖管の粘膜であることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記ＬＭＷＨＡの平均分子量は１０万Ｄａ〜１５０万Ｄａの間であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＬＭＷＨＡの平均分子量は１０万Ｄａ〜０．５万Ｄａの間であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＨＭＷＨＡの平均分子量は１５０万Ｄａ〜３５０万Ｄａの間であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＨＭＷＨＡの平均分子量は１５０万Ｄａ〜２５０万Ｄａの間であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＬＭＷＨＡとＨＭＷＨＡの混合比は重量で１：１であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記治療上有効な量は０．０５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記治療上有効な量は０．０５ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの範囲であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
粘膜関連障害または疾患は潰瘍形成、炎症、アレルギー反応または出血の症状を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記粘膜関連障害または疾患は結膜炎、耳炎、アレルギー性鼻炎、歯肉炎、口腔潰瘍、気管支炎、胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、食道炎、胃炎、腸炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、尿道炎、膀胱炎または膣炎であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記腸炎は急性腸炎、慢性腸炎、感染性腸炎、虚血性腸炎、放射線腸炎、または薬剤性腸炎であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＩＢＳは小児脂肪便症、フルクトース吸収不良、軽度感染症、ジアルジア症などの寄生虫感染、機能性慢性便秘、下痢、または慢性機能性腹痛であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
眼、耳、口、鼻、気道、消化管または局所的使用のための投与形としての組成物を調剤するためにさらに賦形剤を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記経口使用のための投与形は固体投与形、溶液、制御放出錠を含む錠剤、およびカプセル剤からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記消化管使用のための投与形は固体投与形、灌流、浣腸、坐剤、および懸濁液を含む溶液からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記局所使用のための投与形は灌流、浣腸、坐剤、スプレー、吸入、および点滴剤からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ヒアルロン酸組成物は固体投与形であり、前記ヒアルロン酸組成物の治療上有効な量は５０ｍｇ〜１０００ｍｇヒアルロン酸／日の間であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
アレルギー性鼻炎または気管支炎が、抗ヒスタミン薬、抗アレルギー薬、抗うっ血薬、ステロイドまたは抗喘息薬と併用されるアジュバントとしての前記組成物により処置可能であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
腸炎が、抗生物質または抗痙攣薬と併用されるアジュバントとしての前記組成物により処置可能であることを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
ＩＢＳが抗アレルギー薬、抗痙攣薬、抗下痢薬、神経破壊薬、トランキライザー、鎮痛薬、抗鬱薬、またはセロトニンアンタゴニストと併用されるアジュバントとしての前記組成物により処置可能であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【国際調査報告】
2014523435.tif 000010
2014523435.tif 000011