(57)【要約】  ヒポクレア  タワ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｔａｗａ）、トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）由来単離されたアルファ‐グルカナーゼを開示し、並びにそれらを含む口腔ケア組成物を開示する。口腔ケア組成物を歯垢を予防し又は低減するために用いてよい。  【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)  成熟ヒポクレア  タワ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｔａｗａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号１のアミノ酸残基３８−６３５）と少なくとも９９％の同一性、又は
ｂ）成熟トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号３のアミノ酸残基３８−６２７）と少なくとも８５％の同一性、
を有するアミノ酸配列を含む単離されたアルファ‐グルカナーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたアルファ‐グルカナーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む組み換え核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の組み換え核酸を含むベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の組み換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項６】
ａ）培養培地、及び
ｂ）請求項５に記載の細胞の集団
を含む細胞培養物。
【請求項７】
前記単離されたアルファ‐グルカナーゼの生産に適した条件下にて請求項６に記載の細胞培養物を維持すること
を含むタンパク質を生産する方法。
【請求項８】
培養培地から前記アルファ‐グルカナーゼを採取することをさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
a)  成熟ヒポクレア  タワ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｔａｗａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号１のアミノ酸残基３８−６３５）と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアルファ‐グルカナーゼ、
ｂ）成熟トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号２のアミノ酸残基３８−６２２）と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアルファ‐グルカナーゼ、又は
ｃ）成熟トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号３のアミノ酸残基３８−６２７）と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアルファ‐グルカナーゼ、
から選択される単離されたアルファ‐グルカナーゼを得ること、及び
前記単離されたアルファ‐グルカナーゼを経口的に許容な賦形剤と混合し、口腔ケア組成物を作ること
を含む方法。
【請求項１０】
前記口腔ケア組成物をパッケージングすることをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アルファ‐グルカナーゼがトリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号２のアミノ酸残基３８−６２２）と同一でないことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）経口的に許容な賦形剤、及び
ｂ）請求項１に記載の単離されたアルファ‐グルカナーゼ
を含む口腔ケア組成物。
【請求項１３】
経口的に許容な賦形剤、及び
a)  成熟ヒポクレア  タワ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｔａｗａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号１のアミノ酸残基３８−６３５）と少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアルファ‐グルカナーゼ、
ｂ）成熟トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号２のアミノ酸残基３８−６２２）と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアルファ‐グルカナーゼ、又は
ｃ）成熟トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号３のアミノ酸残基３８−６２７）と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアルファ‐グルカナーゼ、
から選択される単離されたアルファ‐グルカナーゼ
を含む口腔ケア組成物。
【請求項１４】
アルファ‐グルカナーゼがトリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号２のアミノ酸残基３８−６２２）と同一でないことを特徴とする請求項１３に記載の口腔ケア組成物。
【請求項１５】
前記アルファ‐グルカナーゼが前記組成物の重量に基づき０．０００１ｗｔ.％から５ｗｔ.％の濃度にて前記組成物に存在することを特徴とする請求項１２から１４のいずれか一つに記載の口腔ケア組成物。
【請求項１６】
第二の酵素をさらに含むことを特徴とする請求項１２から１５のいずれか一つに記載の口腔ケア組成物。
【請求項１７】
前記第二の酵素がデアミナーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、ウレアーゼ、又はセルラーゼであることを特徴とする請求項１６に記載の口腔ケア組成物。
【請求項１８】
口腔ケア組成物が練り歯磨きとして製剤化されることを特徴とする請求項１２から１７のいずれか一つに記載の口腔ケア組成物。
【請求項１９】
口腔ケア組成物が増粘剤、界面活性剤、保湿剤、及び研磨剤の少なくとも一つを含むことを特徴とする請求項１２から１８のいずれか一つに記載の口腔ケア組成物。
【請求項２０】
前記アルファ‐グルカナーゼの活性に適した条件下にて請求項１２から１９のいずれか一つに記載の口腔ケア組成物を歯と接触させること
を含む方法。
【請求項２１】
前記接触させることが歯ブラシを用いて行われることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が歯垢の予防及び／又は低減をもたらすことを特徴とする請求項２０又は２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は、参照によりその全体が組み込まれる２００８年４月１１日に出願した米国仮出願第61/044,316に基づいて優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
歯垢の形成は虫歯、歯肉炎、歯周病、及び最終的に歯を失うことをもたらす。歯垢は、細菌、上皮細胞、白血球、マクロファージ、及び他の口腔滲出液の混合物である。細菌は高度に分岐したポリサッカライドを生産し、口腔からの微生物とともに歯垢の連続的な増殖のための付着マトリックスを形成する。
【０００３】
歯垢は、蓄積され続け、石のように硬い白色又は黄色っぽい沈着物が生じる。これらの沈着物は石灰化プラーク、歯石、又はタータと呼ばれ、歯垢及び例えば、カルシウムのようなミネラルから唾液中に形成される。
【０００４】
歯垢及び関連する虫歯を予防及び／又は低減するための新しい治療が必要となる。
【発明の概要】
【０００５】
ある態様において、本発明は
a)成熟ヒポクレア  タワ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｔａｗａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号１のアミノ酸残基３８−６３５）と少なくとも９９％の同一性、又は
ｂ）成熟トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号３のアミノ酸残基３８−６２７）と少なくとも８５％の同一性
を有するアミノ酸配列を含む単離されたアルファ‐グルカナーゼを提供する。
【０００６】
別の態様においては、本発明は本発明のアルファ‐グルカナーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド、及び単離されたポリヌクレオチドを含む組み換え核酸を提供する。また、本発明は組み換え核酸を含むベクター及び宿主細胞も提供する。
【０００７】
別の態様においては、本発明は細胞培養物を提供する。いくつかの実施態様においては、細胞培養物は培養培地、及び上記に記載の宿主細胞の集団を含む。細胞培養物は単離されたアルファ‐グルカナーゼの生産に適した条件下にて細胞培養物を維持することにより本発明のアルファ‐グルカナーゼを生産するために用いられてよい。アルファ‐グルカナーゼが分泌される場合、アルファ‐グルカナーゼを培養培地から採取してよい。
【０００８】
別の態様においては、本発明は、単離されたアルファ‐グルカナーゼの生産に適した条件下にて上述の細胞培養物を維持することを含むタンパク質を生産する方法を提供する。いくつかの実施態様においては、方法は培養培地からアルファ‐グルカナーゼを採取することをさらに含む。
【０００９】
別の態様においては、本発明は
a)成熟ヒポクレア  タワ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｔａｗａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号１のアミノ酸残基３８−６３５）のアミノ酸配列に少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアルファ‐グルカナーゼ、
ｂ）成熟トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号２のアミノ酸残基３８−６２２）のアミノ酸配列に少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するアルファ‐グルカナーゼ、又は
ｃ）成熟トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号３のアミノ酸残基３８−６２７）のアミノ酸配列に少なくとも８５％同一性であるアミノ酸配列を有するアルファ‐グルカナーゼ、
から選択される単離されたアルファ‐グルカナーゼを得ること、及び
前記単離されたアルファ‐グルカナーゼを経口的に許容な賦形剤と混合し、口腔ケア組成物を作ること
を含む方法を提供する。いくつかの実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼはトリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号２のアミノ酸残基３８−６２２）に同一でない。いくつかの実施態様においては、方法は口腔ケア組成物をパッケージングすることをさらに含む。
【００１０】
別の態様において、本発明は、
ａ）経口的に許容な賦形剤、及び
ｂ）単離されたアルファ‐グルカナーゼ
を含む口腔ケア組成物を提供する。
【００１１】
関連する態様において、経口的に許容な賦形剤、及び
a)成熟ヒポクレア  タワ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｔａｗａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号１のアミノ酸残基３８−６３５）のアミノ酸配列に少なくとも９９％同一性であるアミノ酸配列を有するアルファ‐グルカナーゼ、
ｂ）成熟トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号２のアミノ酸残基３８−６２２）のアミノ酸配列に少なくとも８５％同一性であるアミノ酸配列を有するアルファ‐グルカナーゼ、又は
ｃ）成熟トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号３のアミノ酸残基３８−６２７）のアミノ酸配列に少なくとも８５％同一性であるアミノ酸配列を有するアルファ‐グルカナーゼ、
から選択される単離されたアルファ‐グルカナーゼ
を含む口腔ケア組成物を提供する。いくつかの実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼがトリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号２のアミノ酸残基３８−６２２）と同一でない。
【００１２】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼが組成物の重量に基づき０．０００１ｗｔ.％から５ｗｔ.％の濃度にて組成物に存在する。
【００１３】
いくつかの実施態様においては、口腔ケア組成物が第二の酵素をさらに含む。ある実施態様においては、前記第二の酵素がデアミナーゼ、エステラーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、ウレアーゼ、又はセルラーゼである。
【００１４】
いくつかの実施態様においては、他の口腔ケア製剤が想定されるけれども、組成物が練り歯磨きとして製剤化される。いくつかの実施態様においては、組成物が例えば、増粘剤、界面活性剤、保湿剤、及び研磨剤の少なくとも一つを含む。
【００１５】
別の態様においては、本発明は、単離されたアルファ‐グルカナーゼを得ること、及びそれから経口的に許容な賦形剤と混合し、口腔ケア組成物を作る方法を提供する。口腔ケア組成物はパッケージングされる。
【００１６】
別の態様において、本発明は、前記アルファ‐グルカナーゼの活性に適した条件下にて本発明の口腔ケア組成物を歯と接触させることを含む方法を提供する。接触させることが例えば、歯ブラシを用いて行われてよい。ある場合、方法が歯垢の予防及び／又は低減をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
図１はヒポクレア  タワ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｔａｗａ）（配列番号１）、トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号２）、トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）（配列番号３）、及びトリコデルマ  ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）（配列番号４）由来のアルファ‐グルカナーゼのアミノ酸配列アライメント及びアライメントに基づいたコンセンサス配列（配列番号５）を示す。シグナル配列、触媒ドメイン、リンカードメイン、及びグルカン結合ドメインのような、アルファ‐グルカナーゼの多様な特徴を示す。
【００１８】
図２は多様な細胞の無い培養溶液で終夜インキュベーションして得られた不溶性グルカン加水分解物のＨＰＬＣ分析の結果をまとめた表である。
【００１９】
図３は、ｐＨ４．５及びｐＨ６．０にてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）、ヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）、及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）由来推定アルファ‐１，３‐グルカナーゼを発現するトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）の培養物からの上清の活性を示す。天然アルファ‐グルカナーゼは宿主菌株から排除されなかった。グルカン加水分解物反応をタンパク質含有量ではなく培養体積に基づいて充填した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本明細書にて特に断りがない限り、すべての技術用語及び科学用語は当分野で用いるような通常の意味を与えられるべきである。明確を期するために次の用語を以下のとおり定義する。他の定義は本明細書中他の場所で述べられることがある。
【００２１】
本明細書にて用いる、用語「アルファ‐グルカナーゼ」はポリサッカライド中１，３−アルファ‐Ｄ−グルコシド結合を加水分解する酵素をいう。本明細書に記載のアルファ‐グルカナーゼは、ＩＵＢＭＢ酵素命名法に従って、ＥＣ  ３．２.１．５９として記載される活性を有し、不溶性グルカンを加水分解する。アルファ‐グルカナーゼの系統名は１，３（１，３；１，４）−アルファ−Ｄ−グルカン  ３-グルカノヒドロラーゼである。この酵素はある刊行物中１，３−アルファ‐グルカナーゼとして称されてよい。本発明の酵素は１，３−アルファ‐Ｄ−グルコシド活性に加えて他の活性を有してよく、それは１，２−アルファ‐Ｄ−グルコシド活性を含むが、これに限定されない。
【００２２】
本明細書にて用いる、用語「口腔ケア組成物」は、成分の混合物をいい、その混合物は、通常使用過程が特定の治療剤の規則的な投与の目的のために意図的に服用するものではなく、むしろ口腔活性に有用な薬を運ぶ目的のために歯の表面及び／又は口腔組織に接触するのに十分な時間虫歯中に維持されるものである。口腔組成物は練り歯磨、歯磨き剤、歯磨き粉、歯磨きゲル、歯肉縁下ゲル、口腔リンス、義歯製品、口腔スプレー、薬用キャンディー、口腔錠剤、チューインガム等の形態中に存在してよい。また、口腔組成物は口腔表面に直接投与又は張るためのストリップ又はフィルムの上に取り込まれてよい。
【００２３】
他に特定しない限り、用語「デントリフィス（ｄｅｎｔｒｉｆｉｃｅ）」はペースト状、ゲル状、固形状、液状口腔ケア組成物製剤をいう。デントリフィスの例は、練り歯磨き、歯科用ゲル、及び歯磨き粉である。デントリフィスは単一層組成物又は２以上の分離組成物の組み合わせでもよい。デントリフィスはディープストリップ、表面ストリップ、ペーストの周りにゲルを有する多層ストリップ、又はそれらの組み合わせのような任意の所望の形態で存在してよい。二以上の分離する組成物を含むデントリフィス中の各組成物は物理的に分離した区画を有する容器及び隣り合う容器中に含まれてよい。
【００２４】
本明細書にて用いる用語「経口的に許容な担体」は口腔ケア組成物に用いるために安全的及び効果的な材料をいう。そのような材料はフッ化物イオン供給源、抗歯石剤、緩衝液、研磨用磨き材料、過酸化物供給源、アルカリ金属重炭酸塩、増粘剤、保湿剤、水、界面活性剤、二酸化チタニウム、香料系、甘味剤、キシリトール、着色剤、及びそれらの混合物を含む。
【００２５】
本明細書にて用いる用語「歯（ｔｏｏｔｈ）」又は「歯（ｔｅｅｔｈ）」は自然の歯、及びに人工の歯又は義歯をいう。
【００２６】
本明細書にて用いる用語「エナメル質」は通常目に見え、多くがヒドロキシアパタイトを含むミネラルから構成される歯の一部をいう。エナメル質はヒト及び動物の歯における自然発生的なエナメル質、及び損傷を受けた又は失った歯の一部を交換するために用いるエナメル様物質であって、そのような目的のために用いる樹脂及び陶材を含む物質を包含する。
【００２７】
本明細書にて用いる「歯石（ｔａｒｔａｒ）」及び「歯石（ｃａｌｃｕｌｕｓ）」は歯の歯垢の沈着の石化をいい、互換的に用いる。
【００２８】
本明細書にて用いる用語、「グリコカリックス」は細菌、上皮細胞、及び他の細胞により作られる細胞外ポリマー材料をいい、歯の表面上をコーティングするよう形成し、歯垢が接着するためのマトリックとして働く。
【００２９】
本明細書にて用いる用語「歯垢」は歯（又は歯（ｔｅｅｔｈ））の表面に形成するバイオフィルムをいう。バイオフィルムを形成する微生物は多くが、細菌であって、ストレプトコッカス  ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス  アナエロベス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎａｅｒｏｂｅｓ）、フソバクテリウム種（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ.）、及びアクチノバクテリア種（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．）等である。歯垢はグリコカリックス上に形成し、それによりサポートされ、その一部でよい。
【００３０】
歯垢中に存在する微生物は口腔中にすべて自然に存在し、通常無害である。しかしながら、規則的な歯磨きによる歯垢除去を怠ると、微生物は粘性の層を構築させる。歯の表面に最も近いそれらの微生物は嫌気呼吸へ転換する。この状態において微生物は酸を作り始める。
【００３１】
本明細書にて用いる用語「組み換え体」は野生型宿主細胞中に発生しない、野生型宿主細胞により分泌されない、又は野生型宿主細胞中で改変した発現パターンを有するポリヌクレオチド又はポリペプチドをいう。組み換えポリペプチド及びポリヌクレオチドは野生型配列と異なり、野生型ポリペプチド及びポリヌクレオチドと異なる時間的又は空間的発現パターンを有し、及び／又は野生型ポリペプチド及びポリヌクレオチドと異なるレベルで発現される個別の配列を有する。組み換え分子は、自然には生じない方法で一緒に結合される二以上の自然発生的配列を含んでよい。組み換え細胞は組み換えポリヌクレオチド又は組み換えポリペプチドを含んでよい。
【００３２】
本明細書にて用いる用語「異種の」は互いに通常は関連しない要素をいう。たとえば、宿主細胞が異種のタンパク質を生成する場合、そのタンパク質は通常その宿主細胞中に生産されない。同様に、異種のコード配列に作動可能に結合するプロモーターは野生型宿主細胞中通常作動可能に結合しないコード配列に作動可能に結合するプロモーターである。ポリヌクレオチド又はタンパク質に関して、用語「相同の」は宿主細胞中自然に生じるポリヌクレオチド又はタンパク質をいう。
【００３３】
本明細書にて用いる用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は互換可能に用いられ、ペプチド結合により結合するアミノ酸の鎖をいう。特段の断りがない限り、ポリペプチドは標準的にＮ末端からＣ末端の方向へ記載される。
【００３４】
本明細書にて用いる、「シグナル配列」はタンパク質のＮ末端の一部に存在するアミノ酸配列であり、細胞からタンパク質の成熟型の分泌を手助けする。多くのシグナル配列の構造が知られているが、シグナル配列の定義は機能的なものである。細胞外タンパク質の成熟型は分泌過程で切断されるシグナル配列を欠失している。
【００３５】
本明細書にて用いる「コード配列」はポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントである。
【００３６】
本明細書にて用いる用語「核酸」はＤＮＡ、ＲＮＡ、ハイブリッド、及び合成又は化学的に修飾した核酸を含み、一本鎖又は二本鎖いずれかを含む。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は互換可能に用いてよく、ホスホジエステル、スルホジエステル、又は類似の結合により結合されるヌクレオチドの鎖をいう。他に指示しない限り、それぞれ核酸は５’から３’の方向を左から右へ記載する。
【００３７】
本明細書にて用いる用語「ベクター」は核酸を１つ以上の宿主細胞に導入するために設計されるポリヌクレオチドをいう。ベクターは、異なる宿主細胞中で自動的に複製することができ、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子及びカセット等を含む。
【００３８】
本明細書にて用いる「発現ベクター」は適切な宿主細胞においてタンパク質の発現に影響を与えられる適切な制御配列に作動可能に結合されたタンパク質コード領域を含むＤＮＡ構築体をいう。そのような制御配列は転写に影響するプロモーター、ｍＲＮＡを生産するために転写を制御する任意のオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボゾーム結合部位をコードする配列、及びエンハンサーや転写及び翻訳の停止を制御する他の配列を含んでもよい。
【００３９】
本明細書にて用いる「プロモーター」は下流の核酸の転写を開始する調節配列である。
【００４０】
本明細書にて用いる用語「作動可能に結合する」は、開示された、又は自明な態様で要素を機能させる状態をいう。例えば、プロモーターが配列の転写を制御する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に結合する。
【００４１】
用語「選択的／選択可能なマーカー」は導入された核酸又はベクターを含む宿主細胞の選別を容易するように宿主中に発現可能なタンパク質をいう。例えば、選択可能なマーカーの例は抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）に耐性を与えるタンパク質及び／又は宿主細胞の栄養的利益のような代謝利益を与える遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
本明細書にて用いる用語「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」は「から得られる（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」、「得られる（ｏｂｔａｉｎｅｄ）」、又は「から得られる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ  ｆｒｏｍ）」及び「から単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」を含む。
【００４３】
本明細書にて用いる、「非病原性の」生物体はヒトに病原性（言い換えると、病気又は原因となる病気）ではない生物体である。
【００４４】
本明細書にて用いる用語「回収される」、「単離される」、及び「分離される」は、自然に結合する少なくとも一つの成分から除去されるタンパク質、細胞、核酸、又はアミノ酸をいう。
【００４５】
本明細書にて用いる用語「形質転換した（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」、「安定な形質転換（ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」及び細胞に関して用いる「トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」は細胞がその染色体へ組みこまれた又は複数の世代を通して維持されるエピソーム性プラスミドのような非天然の（例えば、異種の）核酸配列を有することを意味する。
【００４６】
本明細書にて用いる用語「発現」は遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生産されるプロセスをいう。プロセスは転写及び翻訳の両方を含む。
【００４７】
本明細書にて用いる、細胞へ核酸配列を挿入するという文脈中「導入される（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」という用語は、「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」、又は「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」を意味し、真核又は原核細胞へ核酸配列を取り込むことであって、核酸配列が細胞の遺伝子（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）へ取りこまれ、自律的複製への転換、又は一時的な発現（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）を生じることを特徴とする。
【００４８】
本明細書にて用いる用語「混合可能な」は特定の組成物がその組成物の成分の安定性及び／又は効果を実質的に低減する状態を生じるように相互作用することなく混じり合う（混合される）ことができることを意味する。
【００４９】
本明細書にて用いる用語「薬用キャンディー」は口臭予防ミントキャンディー（ｂｒｅａｔｈ  ｍｉｎｔｓ）、トローチ（ｔｒｏｃｈｅ）、トローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）、マイクロカプセル、及び凍結乾燥形態（ケーキ、ウエハース、薄い膜、錠剤）を含む速溶性の固形物を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書にて用いる用語「速溶性固体物」は、口腔内又は義歯を含む容器に固形剤を置いた後、固形剤が約60秒未満、約15秒未満、約5秒未満で溶解することを意味する。
【００５１】
数字範囲は範囲を規定する数字を含む。本明細書にて用いるすべてのパーセント及び比は特段の断りがない限り、特定の口腔組成物の重量に基づくものであり、与えられる口腔製剤全体の重量に基づくものではない。特段の断りがない限り又は文脈から明らかでない限り、単数「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数を含む。
【００５２】
見出しは、読みやすくするために記載されるものであり、発明を限定するものではない。特段の断りがない限り又は文脈から明らかでない限り、見出し項目に含まれる記載は明細書の全体に適用される。
【００５３】
他の方法及び材料が類似のまたは等しい結果をもたらすかもしれないが、ここでは一般的な材料及び方法が記載される。すべての特許及び刊行物は、そこに記載されるすべての配列を含み、すべて参照により明確に本明細書中に取り込まれる。
【００５４】
詳細な説明
本明細書にてアルファ‐グルカナーゼ活性を有するポリペプチドに関連する組成物及び方法を記載する。本発明の組成物及び方法は歯垢の形成を低減又は予防するために適しており、歯垢の形成を促進する根本的な生理学的条件を減少又は予防するために適している。
【００５５】
Ａ．ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び宿主細胞
本発明の組成物及び方法のある態様は、単離されたアルファ‐グルカナーゼに関連する。いくつかの実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼは、成熟ヒポクレア  タワ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｔａｗａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号１のアミノ酸残基３８−６３５）のアミノ酸配列に少なくとも９８％の同一性（例えば、少なくとも９９％又は９９．５％の同一性）であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼは成熟ヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号１のアミノ酸残基３８−６３５）のアミノ酸配列を含む。
【００５６】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼは成熟トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号３のアミノ酸３８−６２７）のアミノ酸配列に少なくとも８５％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼは成熟トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼは成熟トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号２のアミノ酸３８−６２２）のアミノ酸配列に少なくとも８５％の同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性）であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼは成熟トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号２のアミノ酸３８−６２２）のアミノ酸配列に対して同一でないアミノ酸配列を含む。
【００５８】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼは野生型アルファ‐グルカナーゼに類似するが、同一ではない。例えば、いくつかの実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼは成熟ヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）アルファ‐グルカナーゼ（配列番号１のアミノ酸残基３８−６３５）に少なくとも９８％の同一性であるが、成熟ヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）アルファ‐グルカナーゼに同一でないアミノ酸配列を有する。同様に、ある実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼは成熟トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）アルファ‐グルカナーゼ（それぞれ、配列番号２のアミノ酸３８−６２２又は配列番号３のアミノ酸３８−６２７）に少なくとも８５％の同一性であるが、それらと同一でないアミノ酸配列を有してよい。
【００５９】
５０以上の異なるアルファ‐グルカナーゼのアミノ酸配列は知られており、NCBIのGenbankデータベースに保管されており、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）(登録番号:  XP_001390909.1;  GID:  145236523),  ペニシリウム  パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）  (登録番号:  AAF27912.1;  GID:  6752866),  エメリセラ  ニドゥラン（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）  (登録番号:  CAC48025.1;  GID:  15072711)及びクリプロコッカス  ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）(登録番号:  AAW47079.1;  GID:  57230770)由来のものを含む。本出願の最も早い出願日におけるこれらのGenbank登録は参照によりその全体を本明細書に取り込まれ、その核酸とタンパク質及びそれらの配列の注釈も含まれる。アルファ‐グルカナーゼに保存されたドメインを記載する項目はNCBIの保存されたドメインのデータベース（Conserved  Domain  Database）(Marchler-Bauer他、CDD:  a  conserved  domain  database  for  interactive  domain  family  analysis.  (2007)  Nucleic  Acids  Res.  35:D237-40)  においてpfam03659として登録されている。分裂酵母（Ｓ．  ｐｏｍｂｅ）由来のアルファ‐グルカナーゼの配列及びアルファ‐グルカナーゼの構造の検討はFuglsang他、((2000)  J.  Biol.  Chem.  275:2009-18)に記載される。
【００６０】
どのアミノ酸を置換してアルファ‐グルカナーゼ活性を維持するヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）、トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）の野生型アルファ‐グルカナーゼの活性型変異体を作成するかの指標は、例えば、それらのアルファ‐グルカナーゼタンパク質のアミノ酸配列を整列させ、それらのタンパク質での一致する位置であって、しかし、それらのタンパク質間で異なるアミノ酸を同定し、ひとつのタンパク質から他のタンパク質へそれらのアミノ酸を移転することにより、得られた。一般的な配列アライメントを図１及びFuglsang  他（上記を参照願いたい）に示す。
【００６１】
変異体ポリペプチドは、ポリペプチドについて他の有益な生化学的特性を与えながら、一般的な電荷、疎水性／親水性及び／又は置換されているアミノ酸の立体的かさ高さを保存する保存アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を含んでよい。保存置換の例は次のグループの間のものを含んでよいが、これらに限定されない。それは、Ｇｌｙ／Ａｌａ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｓｅｒ／Ｃｙｓ／Ｔｈｒ、及びＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｙｒである。これら及び他の保存置換を下記表に示す。
【表１】
2011516083.tif 000002
【００６２】
あるいは、アミノ酸置換は保存的ではなく、一般的な荷電、疎水性／親水性及び／又は置換されるアミノ酸の立体的かさ高さを変化させる。
【００６３】
アルファ‐グルカナーゼ活性を評価する試験は多くの刊行物に記載され、次のFuglsang他(上記を参照願いたい)、Inoue  他((1988)  Carbohydr.  Res.  182:277-86)、Ait-Lahsen他((2001)  Appl.  Environ.  Microbiol.  67:5833-9)、及びSumitomo他、((2007)  Biochim.  Biophys.  Acta.  1770:716-24)を含む。
【００６４】
また、本発明は本明細書に記載のアルファ‐グルカナーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド及びその単離されたポリヌクレオチドを含む組み換え核酸を提供する。遺伝子コードが知られているならば、そのようなポリヌクレオチドはアミノ酸配列に基づき容易に設計できる。ある実施態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、野生型ヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）アルファ‐グルカナーゼ遺伝子又はコード配列の核酸配列（例えば、それぞれ、配列番号２９及び３０）、野生型トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）アルファ‐グルカナーゼ遺伝子又はコード配列の核酸配列（例えば、それぞれ、配列番号３１及び３２）、又は野生型トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）アルファ‐グルカナーゼ遺伝子又はコード配列の核酸配列（例えば、それぞれ、配列番号３３及び３４）に少なくとも７０％の同一性（例えば、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性）であるヌクレオチド配列、又はストリンジェント条件下にてそれらの核酸配列にハイブリダイズしうるヌクレオチド配列を有する。ある実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼのコード配列は、用いる宿主細胞中でアルファ‐グルカナーゼの発現のために最適化されるコドンである。トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）及び多様な他の酵母と細菌宿主細胞を含む多くの宿主細胞における各コドンの使用頻度を記載するコドン使用頻度表は、この分野で知られ（Nakamura他(2000) Nucl. Acids Res. 28:292を参照願いたい）又は容易に導き出せるので、そのような核酸は、アルファ‐グルカナーゼのアミノ酸配列を発現させるよう容易に設計できる。
【００６５】
また、本発明は、組み換え核酸を含む発現ベクター及び宿主細胞を提供する。ある実施態様においては、宿主細胞は細菌（例えば、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）又はストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ.）宿主細胞）又は糸状菌宿主細胞であり、ある場合において、非病原性、言い換えるとヒトに非病原性であってよい。ある実施態様においては、宿主細胞はＧＲＡＳ状態、言い換えると、ＦＤＡによる食品安全認定（Generally  Recognized  as  Safe）を有するタンパク質の生産に用いた経歴を有する菌株である糸状菌細胞でよい。
【００６６】
ある実施態様においては、本発明に用いる菌細胞は次の種の細胞でよい。
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えば、トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（以前はトリコデルマ  ロンギプラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）及びまた、現在ヒポクレア  ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）として知られる）、トリコデルマ  ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ  コニンギー（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）及びトリコデルマ  ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ））、
ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、
フミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐｐ.）（例えば、フミコーラ  インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）及びフミコーラ  グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ））、
クリソスポリウム種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐｐ.）（例えば、クリソスポリウム  ルクノウエンス（Ｃ.  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、
グリオクラジウム種（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐｐ.）、
アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）（例えば、アスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス  ニドゥラン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス  カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉ）、アスペルギルス  アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス  ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス  ソジャエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、及びアスペルギルス  アワモリ（Ａ．  ａｗａｍｏｒｉ））、
フザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ.）、
ニューロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ.）、
ヒポクレア種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｐｐ.）、又は
エメリセラ種（また、Innis  他  (1985)  Science  228:21-26を参照願いたい)等。
いくつかの実施態様においては、本発明に用いる菌細胞はアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の菌株でよく、ATCC  22342、ATCC  44733、ATCC  14331及びそれら由来の菌株を含む。いくつかの実施態様においては、宿主細胞は天然の遺伝子が欠失又は不活化されているものでよい。例えば、セルラーゼ遺伝子に対応する遺伝子又はプロテアーゼ遺伝子に対応する遺伝子が、欠失又は不活化されてよい。
【００６７】
上述の核酸は宿主細胞の核ゲノム中に存在してよく、又は例えば、一過性発現ベクター、シャトルベクター、人工染色体等のような、宿主細胞中で複製するプラスミド中に存在してよい。
【００６８】
ある実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼを菌類宿主細胞中でアルファ‐グルカナーゼに作動可能に結合するシグナル配列を含む融合タンパク質を発現することにより生産してよい。そのような実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼを培養培地に分泌してよく、そこからアルファ‐グルカナーゼを採取できる。融合タンパク質のシグナル配列は宿主細胞からタンパク質分泌を機能させる任意のシグナル配列でよい。用いるシグナル配列は宿主細胞に内因性又は非内因性でよく、ある実施態様においては、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）又はアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から多く分泌されことが知られているタンパク質のシグナル配列でよい。そのようなシグナル配列はセロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩＩＩ、アルファ‐アミラーゼ、アスパラチルプロテアーゼ、グルコアミラーゼ、マンナナーゼ、グリコシダーゼ及びオオムギエンドペプチダーゼＢ（例えば、Saarelainen  (1997)  Appl.  Environ.  Microbiol.  63:4938-40を参照願いたい。）を含むが、これらに限定されない。ある実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼをそれ自身の（つまり、内因性）シグナル配列を用いて分泌してよい。
【００６９】
その結果、いくつかの実施態様においては、宿主細胞へ核酸を導入することによりアルファ‐グルカナーゼを生産し、ここで、核酸は、アルファ‐グルカナーゼをコードする部分に作動可能に結合するシグナル配列をコードする部分を含み、核酸の翻訳は宿主細胞からアルファ‐グルカナーゼ部分の分泌用のＮ末端シグナル配列を有するアルファ‐グルカナーゼ部分を含む融合タンパク質を生産することを特徴とする。
【００７０】
ある実施態様においては、融合タンパク質はシグナル配列に加えて、宿主細胞に内因性であり、宿主細胞により多く分泌されるタンパク質の一部であるキャリアタンパク質をさらに含んでよい。有用なキャリアタンパク質はトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）マンナナーゼＩ（Man5A又はMANI）、トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ（Cel6A又はCBHII)  (例えば、Paloheimo他(2003)  Appl.  Environ.  Microbiol.  69:7073-82を参照願いたい）、又はトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ（ＣＨＢＩ）のものを含む。ある実施態様においては、キャリアタンパク質はＣＢＨ1のコア領域及びＣＢＨ1リンカー領域の一部を含む欠失トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ１タンパク質である。従って、アミノ末端からカルボキシ末端まで、作動可能に結合するシグナル配列、キャリアタンパク質及び本発明のアルファ‐グルカナーゼを含む融合タンパク質をコードする核酸を用いる。
【００７１】
コード配列に加えて、核酸は宿主細胞中アルファ‐グルカナーゼの発現のために必要な他の要素をさらに含んでよい。例えば、核酸はコード配列の転写用プロモーター、及び転写ターミネーターを含んでよい。トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）中に用いてよい一般的なプロモーターは、トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）cbh1、cbh2、egl1、egl2、eg5、xln1及びxln2プロモーター、又はそれらのハイブリッド又はそれらの欠失バージョンを含む。例えば、プロモーターはトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）cbh1プロモーターである。適切なターミネーターはトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）cbh1、cbh2、egl1、egl2、eg5、xln1及びxln2ターミネーター及び例えば、アスペルギルス  ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、又はアスペルギルス  アワモリ（Ａ．  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ遺伝子(Nunberg他(1984)  Mol  Cell  Biol.  4:2306-15);  Boel他(1984)  EMBO  J.  3:1097-102及びBoel他(1984)  EMBO  J.  3:1581-85)、アスペルギルス  ニドゥラン（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸合成遺伝子、アスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、又はアスペルギルス  ニドゥラン（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ（Punt他(1987)  Gene  56:117-24）由来ターミネーターを含む多くの他のものを含む。プロモーター及び／又はターミネーターはトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）の宿主細胞に天然に存在するか又は非内因性のものでよい。
【００７２】
また、本発明は宿主細胞の培養物（つまり、宿主細胞の集団及び培養培地を含む組成物）を提供する。培養物の培養培地は上述のアルファ‐グルカナーゼを含んでよい。ある実施態様においては、細胞培養は培養培地及び上述の細胞の集団を含んでよい。細胞培養物を単離されたアルファ‐グルカナーゼの生産に適した条件下にて細胞培養物を維持することにより、本発明のアルファ‐グルカナーゼを生産するために用いてよい。アルファ‐グルカナーゼを分泌する場合、アルファ‐グルカナーゼを培養培地から採取してよい。
【００７３】
分泌されるタンパク質を生産するように遺伝子工学的に作られた細胞での方法を含む糸状菌中タンパク質を発現する方法は、米国特許第6,022,725と6,268,328、及び公開さらた米国特許出願第20060041113、20060040353、20060040353、20050208623に記載されるものを含み、これらは、参照により本明細書に取り込まれる。さらに、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）菌株の形質転換のための一般的な方法はCao他(2000)  Protein  Sci.  9:991-1001及びYelton他(1984)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  81:1470-74に記載され、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株の形質転換のための一般的方法は、Nevalainen他(1992)  “The  Molecular  Biology  of  Trichoderma  and  its  Application  to  the  Expression  of  Both  Homologous  and  Heterologous  Genes”  in  Molecular  Industrial  Mycology,  Eds.  Leong  and  Berka,  Marcel  Dekker  Inc.,  NY,  pp  129-48に記載される。
【００７４】
アルファ‐グルカナーゼが培養培地に分泌される場合、アルファ‐グルカナーゼは任意の従来の方法、例えば、沈殿、遠心、アフィニティー、ろ過、又は任意の当分野で知られる方法により回収されてよい。例えば、
アフィニティークロマトグラフィー(Tilbeurgh他(1984)  FEBS  Lett.  16:215)、
高分解能を有する材料を用いるイオン交換（Medve他(1998)  J.  Chromatography  A.  808153）を含むイオン交換クロマトグラフィー法(Goyal他  (1991)  Biores.  Technol.  36:37;  Fliess他  (1983)  Eur.  J.  Appl.  Microbiol.  Biotechnol.  17:314;  Bhikhabhai他(1984)  J.  Appl.  Biochem.  6:336;及びEllouz他(1987)  Chromatography  396:307)、
疎水性相互作用クロマトグラフィー（Tomaz  and  Queiroz  (1999)  J.  Chromatography  A.  865:123）、
２相分配（Brumbauer他  (1999)  Bioseparation  7:287）、
エタノール沈殿、
逆相ＨＰＬＣ、
シリカ又はＤＥＡＥのようなカチオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィー、
クロマトフォーカシング、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、
硫酸アンモニウム沈殿、又は
例えば、Sephadex  G-75を用いるゲルろ過
を用いてよい。ある実施態様においては、アルファ‐グルカナーゼを培養培地の他の成分から精製せずに用いてよい。これらの実施態様においては、培養培地を単に濃縮し、例えば、それから培養培地の成分からさらなるタンパク質の精製をせずにあるいは任意のさらなる修飾をせずに用いてよい。
【００７５】
Ｂ．口腔ケア組成物
本発明の組成物及び方法の態様は口腔ケア組成物に関連する。口腔ケア組成物は一以上の本明細書に記載のアルファ‐グルカナーゼ及び経口的に許容な担体を含む。一以上のアルファ‐グルカナーゼのそれぞれは0.0001ｗｔ．％から5ｗｔ．％(例えば、0.0001ｗｔ．％から0.0005ｗｔ．％、0.0005ｗｔ．％から0.001ｗｔ．％、0.001ｗｔ．％から0.005ｗｔ．％、0.005ｗｔ．％から0.01ｗｔ．％、0.01ｗｔ．％から0.05ｗｔ．％、0.05ｗｔ．％から0.1ｗｔ．％、0.1ｗｔ．％から0.5ｗｔ．％、0.5ｗｔ．％から1ｗｔ．％、又は1ｗｔ．％から5ｗｔ．％)の範囲の濃度にて組成物に存在してよいが、この範囲から出る濃度も用い得る。口腔ケア組成物は経口的に許容な賦形剤とアルファ‐グルカナーゼを混合することを含む方法により作ってよい。ある場合、この方法は口腔ケア組成物をパッケージングすることをさらに含んでよい。
【００７６】
口腔ケア組成物は、例えば、歯磨き剤、練り歯磨、歯磨き粉、局所経口用ゲル、口腔リンス、義歯製品、口腔スプレー、薬用キャンディー、口腔錠剤、又は、チューインガム等の形態中に存在してよい。また、口腔組成物は口腔表面に直接投与又は張るためのストリップ又はフィルム、フロス、又はテープの上に取り込まれてよい。
【００７７】
経口的に許容な担体は局所的な経口投与に適している混合可能な固形状又は液状賦形剤又は封入物質の一以上を含んでよい。適切な担体又は賦形剤は、以後詳しく記載するように、歯磨き剤（非研磨ゲル及び歯肉縁下塗布用ゲルを含む）、口腔リンス、口腔スプレー、チューイングガム、及び薬用キャンディー（口臭予防ミントキャンディー（breath mints）を含む）の通常及び従来の成分を含む。液状形態での本発明の口腔ケア組成物は、例えば、約５．０から約８．０のような約４．０から約１０．０の範囲のｐＨを任意に有してよい。
【００７８】
いくつかの実施態様においては、担体は、どの方法で組成物が口腔内へ導入されるべきかに基づいて選択される。例えば、練り歯磨き（歯のゲル等を含む）を用いる場合、「練り歯磨き担体」を例えば、米国特許第3,988,433中ベネディクト（Benedict）に記載のように選択してよい（例えば、研磨材料、界面活性剤、ビルダー、保湿剤、香味剤及び甘味剤を含む）。口腔リンスを用いる場合、「口腔リンス担体」を米国特許第3,988,433中ベネディクト（Benedict）に記載のように選択してよい（例えば、水、香味剤及び甘味剤を含む）。口腔スプレーを用いる場合、「口腔スプレー担体」を選択してよく、又は薬用キャンディーを用いる場合は「薬用キャンディー担体」を選択してよい（例えば、キャンディーベース）。チューインガムを用いる場合、「チューイングガム担体」を選択してよい（例えば、ガム基礎剤、香味剤及び甘味剤を含む）。小袋（ｓａｃｈｅｔ）を用いる場合，「小袋（ｓａｃｈｅｔ）用担体」を選択してよい（例えば、小袋（ｓａｃｈｅｔ）用の袋、香味剤及び甘味剤を含む）。歯肉縁下用ゲルを用いる場合（歯周ポケットへ又は歯周ポケットの周りに活性物の輸送のために）、「歯肉縁下用ゲル担体」を選択してよい。本発明の組成物の調製に適した他の有用な担体は当分野に周知である。それらの選択は、味、価格、貯蔵安定性、糖又は塩が入っていない組成物に対する必要性などのような二次的考察による。
【００７９】
いくつかの実施態様においては、組成物は、例えば、歯肉縁下用ゲルのような非研磨ゲルの形態でよく、水溶性又は非水溶性の形態で良い。一般的に水溶性ゲルは、増粘剤（約０．１％から約２０％）、保湿剤（約１０％から約５５％）、香味剤（約０．０４％から約２％）、甘味剤（約０．１％から約３％）、着色剤（約０．０１％から約０．５％）、及び適量の水を含む。ある場合、虫歯予防剤（フッ化物イオンとして約０．０５％から約０．３％）、及び抗歯石剤（約０．１％から約１３％）を含んでよい。
【００８０】
他の実施態様においては、組成物は、練り歯磨き、歯科用ゲル、又は歯磨き粉のような歯磨き剤の形態でもよい。そのような練り歯磨き及び歯科用ゲルの成分は歯科用研磨剤（約５％から約５０％）、界面活性剤（約０．５％から約１０％）、増粘剤（約０．１％から約５％）、保湿剤（約１０％から約５５％）、香味剤（約０．０４％から約２％）、甘味剤（約０．１％から約３％）、着色剤（約０．０１％から約０．５％）、及び水（約２％から約４５％）の１以上を含んでよい。このような練り歯磨き又は歯科用ゲルはまた、虫歯予防剤（フッ化物イオンとして約０．０５％から約０．３％）、及び抗歯石剤（約０．１％から約１３％）の１以上を含んでもよい。歯磨き粉は、実質的に全ての非液体の成分を含有する。
【００８１】
歯磨き剤組成物の一例は米国特許第6,238,648に記載され、次の製剤（ｗ／ｗ）有する。
グリシン                                14.0  
ポリエチレングリコール  300             4.5  
シリカ                                  21.5  
ピロリン酸４ナトリウム                  4.5  
水                                      23.5
キサンタンガム                          0.3  
カルボキシメチルセルロース              0.5  
フッ化ナトリウム                        0.2  
香料                                    1.0  
ラウリル硫酸ナトリウム  (27.9%溶液)     4.5  
サッカリンナトリウム                    0.4  
二酸化チタニウム                        0.4  
重炭酸ナトリウム                        0.9  
炭酸ナトリウム無水物                    1.4  
ポロキサマー407                         1.8  
キシリトール                            10.0  
プロピレングリコール                    10.6  
全量                                    100.00
【００８２】
歯磨き剤組成物の別の例は、米国特許第5,578,295に記載され、次の製剤を含む（ｗ／ｗ）。
トリクロサン２リン酸塩                  1
ソルビトール                            33  
サッカリン                              0.46  
シリカ                                  22  
NaF                                     0.243  
グリセリン                              9  
NaOH  (50%)                             0.2  
カルボポール（Carbopol）                0.2  
ケルトロール（Keltrol）                 0.6  
TiO.sub.2                               0.5  
アルキル硫酸ナトリウム(28%溶液)         4  
PEG                                     6  
3  FD&C  Blue  #1  (1%溶液)             0.05  
香料                                    1.1  
水                                      適量
【００８３】
いくつかの実施態様においては、組成物は、口腔スプレーを含む口腔洗浄剤である。そのような口腔洗浄剤及び口腔スプレーの成分は一般的に水（約４５％から約９５％）、エタノール（約０％から約２５％）、保湿剤（約０％から約５０％）、界面活性剤（約０．０１％から約７％）、香味剤（約０．０４％から約２％）、甘味剤（約０．１％から約３％）、及び着色剤（約０．００１％から約０．５％）の１以上を含む。このような口腔洗浄剤又は口腔スプレーはまた、虫歯予防剤（フッ化物イオンとして約０．０５％から約０．３％）、及び抗歯石剤（約０．１％から約３％）の１以上を含んでもよい。
【００８４】
ある実施態様においては、組成物は洗浄液を含む歯科用溶液でよい。一般的にそのような歯科用溶液の組成物は水（約９０％から約９９％）、防腐剤（約０．０１％から約０．５％）、増粘剤（約０％から約５％）、香味剤（約０．０４％から約２％）、甘味剤（約０．１％から約３％）、及び界面活性剤（約０％から約５％）の１以上を含む。
【００８５】
チューインガム組成物は一般的にガム基礎剤（約５０％から約９９％）、香味剤（約０．４％から約２％）、及び、甘味剤（約０．０１％から約２０％）の１以上を含む。
【００８６】
薬用キャンディーは香味基礎剤中に治療剤を含む円盤形固形物を含んでよい。基礎剤は硬い糖キャンディー、グリセリンゼラチン、又はそれを形成するのに十分な粘液を有する砂糖の組み合わせでよい。これらの薬剤の形態は一般的に周知である。
【００８７】
別の実施態様においては、本発明は、本明細書に記載の組成物を浸透させた歯科用器具を提供する。歯科用器具は口腔内で歯及び他の組織に接触するための器具を含んでよく、その器具をポリエチレンイミン又はソルビトールを有するオキシダーゼを含む組成物に浸透させてよい。歯科用器具はデンタルフロス又はテープ、チップ、ストリップ、フィルム、つまようじ、及びポリマー繊維を含む浸透される繊維の形態中に存在してよい。
【００８８】
経口的に許容できる担体中存在してよい一般的な物質を下記に示す。
【００８９】
研磨剤
歯科用研磨剤は、多くの異なる物質を含む。選択される物質は、本発明の組成物内で混合可能であり、象牙質を過度に削らないものでよい。有用な研磨剤は、例えば、ゲル及び沈殿物を含むシリカ、不溶性ポリメタリン酸ナトリウム、水和アルミナ、炭酸カルシウム、オルトリン酸二カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ポリメタリン酸カルシウム、及び尿素とホルムアルデヒドとの粒子状縮合生成物のような樹脂性研磨剤物質が挙げられる。
【００９０】
組成物に用いられるある型は、粒子状熱硬化性重合樹脂である。有用な樹脂は、例えば、メラミン、フェノール成分、尿素、メラミン−尿素、メラミン−ホルムアルデヒド、尿素−ホルムアルデヒド、メラミン‐尿素‐ホルムアルデヒド、架橋されたエポキシド、及び架橋されたポリエステルを含む。
【００９１】
様々なタイプのシリカ歯科用研磨剤は、歯のエナメル質又は象牙質を過度に削らない、優れた歯の清浄及び研磨性能という効果があるため、選択されてよい。他の研磨剤と同様に、シリカ研磨物質は、約０．１ミクロンから約３０ミクロン、又は約１ミクロンから約１５ミクロンの間の範囲の平均粒子サイズを有してよい。研磨剤は、沈殿シリカ、又はシリカキセロゲルなどのシリカゲルでよい。
【００９２】
また、研磨剤の混合物も用いてよい。歯磨き剤組成物中の研磨剤の合計量は、約６ｗｔ．％から約７０ｗｔ．％の範囲でよい。練り歯磨きは、組成物の重量に基づき、約１０ｗｔ．％から約５０ｗｔ．％の研磨剤を含有してよい。溶液、口腔スプレー、口腔洗浄、及び非研磨剤ゲル組成物は、研磨剤を全く含有しない。
【００９３】
界面活性剤
また本発明の組成物は、例えば、サルコシネート界面活性剤、イセチオネート界面活性剤又はタウレート界面活性剤のような界面活性剤を含んでもよい。ある場合、これらの界面活性剤のアルカリ金属又は硫酸塩を含んでよい。ある場合、組成物は次のナトリウム及びカリウム塩を含んでよい。それは、ラウロイルサルコシン酸塩、ミリストイルサルコシン酸塩、パルミトイルサルコシン酸塩、ステアロイルサルコシン酸塩、及びオレオイルサルコシン酸塩である。他の適切な溶解可能な界面活性剤をこれらの界面活性剤の代わりに又はこれらと組み合わせて用いてよい。
【００９４】
有用な陰イオン性界面活性剤は、アルキルラジカルに１０個から１８個の炭素原子を有するアルキルサルフェートの水溶性塩、及び１０個〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸のスルホン酸モノグリセリドの水溶性塩を含む。ラウリル硫酸ナトリウム及びココナッツモノグリセリドスルホン酸ナトリウムは、このタイプの陰イオン性界面活性剤の例である。また、アニオン性界面活性剤の混合物も使用してよい。
【００９５】
適切な陽イオン界面活性剤は、約８〜約１８の炭素原子を含む一つのアルキル長鎖を有する脂肪族第四級アンモニウム誘導体を含み、例えばラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルピリジニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド、ジ−イソブチルフェノキシエチル−ジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ココナッツアルキルトリメチルアンモニウムニトライト、セチルピリジニウムフルオライドなどである。ある場合、界面活性剤は洗剤特性を有する第四級アンモニウムフルオライドでよい。いくつかの陽イオン界面活性剤は、組成物中殺菌剤としても作用できる。
【００９６】
適切な非イオン性界面活性剤は、アルキレンオキシド基類（本質的に親水性）と、本質的に脂肪族またはアルキル芳香族とすることができる有機疎水性化合物との縮合によって生成される化合物を含む。例としては、プルロニック（Pluronicｓ）、アルキルフェノール類のポリエチレンオキシド縮合物、プロピレンオキシドおよびエチレンジアミンの反応生成物とエチレンオキシドとの縮合物から得られる生成物、脂肪族アルコールのエチレンオキシド縮合物、長鎖第三級アミンオキシド類、長鎖第三級ホスフィンオキシド類、長鎖ジアルキルスルホキシド類、およびこれらの物質の混合物を含む。
【００９７】
適切な両性合成界面活性剤は、脂肪族の４級アンモニウム、ホスホニウム、及びスルホニウム化合物であって、その脂肪族基は直鎖状または分岐鎖状でよく、脂肪族置換基の１つが約８〜約１８個の炭素原子を含有し、かつ１つが陰イオン水溶性基、例えばカルボキシ、スルホネート、スルフェート、ホスフェート、ホスホネートを含有する。
【００９８】
好適なベタイン界面活性剤は、デシルベタイン又は２−（Ｎ−デシル‐Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ）アセテート、ココベタイン又は２−（Ｎ−ココ‐Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ）アセテート、ミリスチルベタイン、パルミチルベタイン、ラウリルベタイン、セチルベタイン、ステアリルベタイン等を含む。アミドベタインの例としては、ココアミドエチルベタイン、ココアミドプロピルベタイン、ラウラミドプロピルベタイン等があげられる。ある実施態様においては、組成物中のベタインはココアミドプロピルベタイン又はラウラミドプロピルベタインである。
【００９９】
界面活性剤は組成物の総量の約０．１ｗｔ．％から約２．５ｗｔ．％、約０．３ｗｔ．％から約２．５ｗｔ．％、又は約０．５ｗｔ．％から約２．０ｗｔ．％の範囲での濃度にて存在してよい。
【０１００】
抗歯垢剤
また、組成物は、例えば、ポリアクリレート又はマレイン酸又はその無水物のコポリマー、及びメチルビニルエーテル並びにポリアミノプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳ）、クエン酸亜鉛２水和物、ポリペプチド（ポリアスパラギン酸及びポリグルタミン酸のような）、及びそれらの混合物のような合成陰イオンポリマーのような抗歯垢剤を含んでよい。
【０１０１】
キレート剤
組成物はキレート剤を含んでよい。キレート剤は酒石酸及びその薬学的に許容される塩、クエン酸及びアルカリ金属クエン酸塩及びそれらの混合物を含む。キレート剤は細菌の細胞壁に見られるカルシウム複合体でもよい。キレート剤はバイオマスを無傷に保つのに役立つカルシウム架橋からカルシウムを除去することにより歯垢を崩壊してもよい。歯の脱塩をもたらすかもしれないキレート剤は使用すべきでない。
【０１０２】
いくつかの実施態様においては、アルカリ金属クエン酸塩（例えば、クエン酸ナトリウム及びクエン酸カリウム）は組成物中に存在してよい。ある場合、キレート剤はクエン酸／アルカリ金属クエン酸塩の組み合わせを含む。他の場合、酒石酸のアルカリ金属塩を用いてよい。他のものは酒石酸２ナトリウム、酒石酸２カリウム、酒石酸ナトリウムカリウム、酒石酸水素ナトリウム、酒石酸水素カリウムを含む。酒石酸塩キレート剤を単独で又は他の任意のキレート剤との組み合わせで用いてよい。ある実施態様においては、これらのキレート剤は低減される歯垢形成を有する改善された洗浄を提供するために約１０１から１０５のカルシウム結合定数を有する。
【０１０３】
キレート剤の別のグループは陰イオンポリカルボキシレートポリマーである。そのような物質は当分野に周知であり、それらの遊離酸、部分的に又は完全に中性水溶性アルカリ金属（例えば、カリウム、及び好ましくはナトリウム）又はアンモニウム塩の形態で使用される。ある場合、組成物は、１：４から４：１の比であるマレイン酸無水物又はマレイン酸と平均分子量（ＡＭＷ）約３０，０００から約１，０００，０００を有するメチルビニルエーテル（メトキシエチレン）のような重合性エチレン性不飽和コモノマーのコポリマーを含む。
【０１０４】
他の有効なポリカルボキシレートポリマーはエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−ビニル‐２−ピロリドン、又はエチレンを伴うマレイン酸無水物の１：１のコポリマー、及びメチル若しくはヒドロキシエチルメタクリレート、メチル若しくはエチルアクリレート、イソブチルビニルエーテル又はＮ−ビニル‐２−ピロリドンを伴うアクリル酸の１：１のコポリマーのようなものを含んでよい。
【０１０５】
さらなる有効なポリカルボキシレートポリマーは、スチレン、イソブチレン又はエチルビニルエーテル、ポリアクリル酸、ポリイタコン酸、ポリマレイン酸、及び１０００のＡＭＷを有するスルホアクリルオリゴマーを有するマレイン酸無水物のコポリマーを含んでよい。
【０１０６】
キレート剤の量は約０．１％から約２．５％、約０．５％から約２．５％、約１．０％から約２．５％でよい。
【０１０７】
フッ化物供給源
ある実施態様においては、水溶性フッ化物化合物は、２５℃にて組成物中に約０．００２５ｗｔ．％から約５．０ｗｔ．％、又は約０．００５ｗｔ．％から約２．０ｗｔ．％のフッ化物イオン濃度与えるのに十分な量にて口腔ケア組成物中に存在してよい。多様なフッ化物イオンを与える物質は本発明の組成物における溶解性フッ化物の供給源として用いてよい。代表的なフッ化物イオン供給源はフッ化スズ、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、モノフルオロホスフェートナトリウム等を含んでよい。ある場合、本発明の組成物はフッ化スズ及びフッ化ナトリウム、及びそれらの混合物を含む。
【０１０８】
歯を白くする活性及び歯の色を変える物質
また、歯の白色剤及び／又は歯の色を変える物質も口腔ケア組成物中に存在してよい。これらの物質は歯の色を変えるのに有効である。これらの物質は歯の表面に塗布した場合、光の吸収及び反射に関して表面を変える粒子を含んでよい。そのような粒子を含むフィルムが歯の表面上に塗布される場合、そのような粒子は明らかな利益を提供する。
【０１０９】
粒子は化粧分野で通常用いる顔料及び着色料を含む。しかし、本発明の組成物に用いる顔料及び／又は着色料に限定されない。顔料及び着色料は無機の白い顔料、無機の着色顔料、真珠箔（ｐｅａｒｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、充填用の粉等を含む。具体的な例はタルク、雲母、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、シリカ、二酸化チタニウム、酸化亜鉛、べんがら、褐色酸化鉄、黄色酸化鉄、黒色酸化鉄、フェロシアン化鉄アンモニウム（ferric  ammonium  ferrocyanide）、マンガンバイオレット、ウルトラマリン、ナイロンパウダー、ポリエチレンパウダー、メタクリレートパウダー、ポリスチレンパウダー、シルクパウダー、結晶性セルロース、デンプン、チタン酸マイカ、酸化鉄チタン酸マイカ（iron  oxide  titanated  mica）、ビスマスオキシクロライド（bismuth  oxychloride）、及びそれらの混合物からなる群から選択されてよい。ある実施態様においては、二酸化チタニウム、ビスマスオキシクロライド、酸化亜鉛、又はそれらの混合物を用いてよい。
【０１１０】
顔料は乳白剤又は着色剤として用いてよい。これらの顔料は処理される粒子として、又は加工されていない顔料自身として用いてよい。典型的な顔料のレベルは消費者により望まれる特定の効果のために選択されてよい。例えば、特に、黒く又は汚れた歯のためにその歯の色を薄くするために十分な量の顔料を使用してよい。一方、個々の歯又は歯の上の斑点が他の歯の色より薄い場合、歯を黒くするための顔料が有効である。顔料及び着色剤のレベルを組成物の約０．０５％から約２０％、約０．１０％から約１５％、約０．２５％から約１０％の範囲で用いてよい。
【０１１１】
増粘剤
ある実施態様においては、練り歯磨き又はゲルのような、いくつかの増粘物質は組成物の粘度、使用時の活性放出特性、貯蔵安定性、組成物の安定性等を与える。増粘剤は、カルボキシビニルポリマー類、カラゲナン、ヒドロキシエチルセルロース、ラポナイト（laponite）、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムやカルボキシメチルヒドロキシエチルセルロースナトリウムなどのセルロースエーテル類の水溶性塩を含む。インドゴム、キサンタンゴム、アラビアゴム、トラガカントゴムなどの天然ゴムも使用することができる。さらに感触を改善するために、コロイド状ケイ酸マグネシウムアルミニウムまたは微粒子シリカを、増粘剤の一部として使用することができる。
【０１１２】
増粘剤またはゲル化剤は、ペンタエリスリトールのアルキルエーテル又はスクロースのアルキルエーテルで架橋されたアクリル酸のホモポリマーまたはカルボマー類あるいはそれらの混合物の分類を含んでよい。
【０１１３】
ラクチドおよびグリコリドのモノマーのコポリマーである、分子量が約１，０００〜約１２０，０００（数平均）の範囲のコポリマーは、「歯肉縁下ゲル」のような本発明に用いる組成物中に用いてよい。
【０１１４】
増粘剤を練り歯磨きまたはゲル組成物の総重量で約０．１ｗｔ．％〜約１５ｗｔ．％、約２ｗｔ．％〜約１０ｗｔ．％、約４ｗｔ．％〜約８ｗｔ．％の量で用いてよい。より高濃度をチューインガム、薬用キャンディー（口臭予防用ミントを含む）、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、非研磨性ゲル、および歯肉縁下ゲルに用いてよい。
【０１１５】
保湿剤
ある実施態様においては、本発明の組成物の局所用口腔キャリアは保湿剤を含んでよい。保湿剤は、口に対する潤い感を組成物に与えるために、また特定の保湿剤については本発明の組成物に望ましい甘い香りを付与するために、練り歯磨き組成物が空気にさらされて硬化しないようにする働きをしてよい。純粋な保湿基材における保湿剤は、本明細書に記載の組成物の重量で約０ｗｔ．％〜約７０ｗｔ．％、約５ｗｔ．％〜約２５ｗｔ．％を含んでよい。本発明の組成物に用いてよい適切な保湿剤としては、グリセリン、ソルビトール、キシリトール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどの食用多価アルコール類を含む。ある場合、保湿剤はソルビトール及び／又はグリセリンである。
【０１１６】
香味剤および甘味剤
また、香味剤も本組成物に加えてよい。適切な香味剤は、ウインターグリーン油、ペパーミント油、スペアミント油、クローブの芽油、メンソール、アネトール、メチルサリチル酸、オイカリプトール、カッシア、１−メンチルアセテート、セージ、オイゲノール、パセリ油、オキサノン（ｏｘａｎｏｎｅ）、α−イリソン、マジョラム、レモン、オレンジ、プロペニルグアエトール（ｐｒｏｐｅｎｙｌ  ｇｕａｅｔｈｏｌ）、シナモン、バニリン、チモール、リナロール、ＣＧＡとして知られるシンナムアルデヒドグリセロールアセタール、およびそれらの混合物を含む。香味剤は、組成物の重量で約０．００１ｗｔ．％〜約５ｗｔ．％のレベルにて組成物中に用いてよい。
【０１１７】
適切な甘味剤は、スクロース、グルコース、サッカリン、デキストロース、果糖、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、フルクトース、マルト−ス、キシリトール、サッカリン塩、タウマチン、アスパルテーム、Ｄ−トリプトファン、ジヒドロカルコン、アセスルファム、シクラメート塩、シクラメートナトリウム又はサッカリンナトリウム、及びこれらの混合物を含む。組成物はこれらの甘味剤の約０．１ｗｔ．％〜約１０ｗｔ．％、又は組成物の重量に基づき約０．１ｗｔ．％〜約１ｗｔ．％を含有してよい。
【０１１８】
香味剤及び甘味剤に加えて、冷却剤、唾液分泌剤、加温剤、局所麻酔剤を本発明の組成物中任意の成分として用いてよい。これらの剤は組成物の重量で約０．００１ｗｔ．％から約１０ｗｔ．％、又は約０．１ｗｔ．％から約１ｗｔ．％のレベルにて組成物中に存在してよい。
【０１１９】
冷却剤は、幅広い種類の物質のいずれかでよい。このような物質には、カルボキシアミド類、メンソール、ケタール類、ジオール類、およびそれらの混合物が含まれる。冷却剤の例は、Ｎ−エチル−ｐ−メンタン−３−カルボキシアミド、Ｎ，２，３−トリメチル−２−イソプロピルブタンアミド、およびそれらの混合物などのパラメンタンカルボキシアミド剤である。その他の冷却剤は、メンソール、３−１−メントキシプロパン−１，２−ジオール、メントングルセロールアセタール、及びメチルラクテートからなる群から選択されてよい。用語、メンソールおよびメンチルは、これらの化合物の右旋性異性体および左旋性異性体、ならびにそれらのラセミ混合物を含む。
【０１２０】
加温剤はカプサイシン及びベンジルニコチネートのようなニコチネートエステルを含む。局所麻酔剤はベゾカイン、リドカイン、丁子油、及びエタノールを含んでよい。
【０１２１】
アルカリ金属重炭酸塩
また、組成物は、アルカリ金属重炭酸塩を含んでよい。アルカリ金属炭酸塩は水溶性であり、安定化しない限り、水溶液系で二酸化炭素を放出する。重曹としても知られる重炭酸ナトリウムは、アルカリ金属重炭酸塩として存在してよい。ある実施態様においては、組成物は、約０．５％〜約３０％、約０．５％〜約１５％、約０．５％〜約５％のアルカリ金属重炭酸塩を含む。
【０１２２】
その他の担体
口腔組成物の調製に用いる水は、イオン含量が低く有機不純物がなくてよく、水溶性組成物の重量で約５ｗｔ．％から約７０ｗｔ．％、約２０ｗｔ．％から約５０ｗｔ．％で存在してよい。これらの水の量には、添加される遊離水に加えて他の剤及び担体と共に導入される水が含まれる。
【０１２３】
ポロキサマーを組成物中に用いてよい。ポロキサマーは非イオン界面活性剤として分類される。乳化剤、バインダー、又は安定剤として機能でき、又は関連機能を行うことができる。ポリキサマーは１，０００から１５，０００を超えるまでの範囲の分子量を有する第一級水酸基で終わる二官能基を有するブロックポリマーを含む。
【０１２４】
組成物中に用いてよい他の乳化剤は乳化剤ポリマーを含む。主に高分子のポリアクリル酸ポリマーを乳化剤として用いてよい。
【０１２５】
二酸化チタニウムもまた組成物に加えてよい。二酸化チタニウムは組成物に混濁性を増加しうる白い粉である。二酸化チタニウムを組成物の重量に基づき約０．２５ｗｔ．％から約５ｗｔ．％を含んでよい。
【０１２６】
好ましくは、組成物のｐＨを一以上の緩衝剤の使用により調整してよい。緩衝剤は約ｐＨ４．０から約ｐＨ１０．０の範囲で組成物のｐＨを調整するために用いられる物質である。緩衝剤はリン酸１ナトリウム、リン酸３ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、酸性ピロリン酸ナトリウム、クエン酸、及びクエン酸ナトリウムを含む。緩衝剤を本発明の組成物の重量で約０．５ｗｔ．％から約１０ｗｔ．％のレベルにて投与してよい。ある実施態様においては、歯磨き剤組成物のｐＨは３：１の歯磨き剤の水溶性スラリー、（例えば水３に対して歯磨剤１）から測定してよい。
【０１２７】
本発明の組成物に用いてよい他の物質はＣ１２からＣ２０アルキルジメチコンコポリオール類のようなアルキル及びアルコキシジメチコンコポリオール類並びにそれらの混合物から選択されるジメチコンコポリオール類を含む。ある場合、組成物はセチルジメチコンコポリオールを含む。ジメチコンコポリオールは約０．０１ｗｔ．％から約２５ｗｔ．％、約０．１ｗｔ．％から約５ｗｔ．％又は約０．５ｗｔ．％から約１．５ｗｔ．％のレベルで存在してよい。ジメチコンコポリオール類を歯に良い感触与えるために添加してよい。
【０１２８】
他の活性化剤
また、本発明の口腔ケア組成物は抗菌剤のような他の活性化剤も含んでよい。そのような抗菌剤は、ハロゲン化ジフェニルエーテル、フェノールおよびその同族体を含むフェノール化合物、モノとポリ−アルキルおよび芳香族ハロフェノール、レゾルシノールおよびその誘導体、ビスフェノール化合物およびハロゲン化サリチルアニリド、安息香酸エステル、ハロゲン化カルバニリドなどの、水不溶性で非陽イオン性抗菌剤を含む。水溶性抗菌剤は、特に四級アンモニウム塩、およびビス−ビクアニド塩を含む。追加の水溶性抗菌剤はトリクロサン一リン酸である。四級アンモニウム剤は、四級窒素にて一以上の置換基が炭素原子約８〜約２０個又は約１０〜約１８個の炭素鎖長（通常はアルキル基）であり、残りの置換基（通常アルキル基またはベンジル基）が炭素原子約１〜約７個など、炭素原子数が少なく、メチル基またはエチル基であるものが含まれる。臭化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化テトラデシルピリジニウム、臭化ドミフェン、塩化Ｎ−テトラデシル−４−エチルピリジニウム、臭化ドデシルジメチル（２−フェノキシエチル）アンモニウム、塩化ベンジルジメチルステアリルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム、四級化５−アミノ−１，３−ビス（２−エチル−ヘキシル）−５−メチルヘキサヒドロピリミジン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、および塩化メチルベンゼトニウムは、典型的な四級アンモニウム抗菌剤の例である。他の化合物はビス［４−（Ｒ−アミノ）−１−ピリジニウム］アルカンである。銅ビスグリシネート、銅グリシネート、クエン酸亜鉛、乳酸亜鉛などの他の抗菌剤も含めることができる。
【０１２９】
アルファ‐グルカナーゼに加えて、本発明の口腔ケア組成物は炭水化物加水分解活性、抗菌剤活性、歯を白くする活性を有する一以上の他の酵素も含んでよい。そのような酵素はデアミナーゼ、エステラーゼ、グルコシダーゼ、グルカンヒドロラーゼ、デキストリナーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、及びウレアーゼを含むが、これらに限定されない。
【０１３０】
Ｃ．使用方法
本発明の組成物及び方法の別の態様は、歯の表面をアルファ‐グルカナーゼを含む組成物に接触させ虫歯を低減若しくは予防し、又は虫歯の根本となる原因の予防する方法である。
【０１３１】
いくつかの実施態様においては、方法は歯の表面をアルファ‐グルカナーゼを含む組成物と接触させ、歯の表面に存在するグリコカリックスを加水分解することに関係する。この実施態様に従って、アルファ‐グルカナーゼの１，３−α‐Ｄ‐グルコシダーゼ活性、及び／又はアルファ‐グルカナーゼの他の活性はポリサッカライド類、グルカン類、マンナン類、及び／又は歯垢細菌により作られる接着分子を加水分解し、それにより、歯の表面への歯垢の接着する能力を減少し、歯垢形成を低減し、又は歯垢の存在レベルを低減する。そのようなポリサッカライド類、グルカン類、マンナン類、及び／又は接着分子は、従来グリコカリックスとして呼ばれていたもの中に存在できる。
【０１３２】
いくつかの実施態様においては、方法は歯の表面をアルファ‐グルカナーゼを含む組成物と接触させ、ポリサッカライド類、グルカン類、マンナン類、及び／又は口腔中の細菌により作られる接着分子を崩壊し、それによりフィルム形成又は細菌接着を低減し、及び／又は細菌性酸及び歯の表面に傷をつける他の物質の蓄積を予防することに関する。
【０１３３】
方法は歯の表面を上述のような製剤化できる一以上のアルファ‐グルカナーゼと接触することを含んでよい。方法は歯の表面を同じ製剤又は異なる製剤中に存在してよい追加的な酵素と接触することを含んでよい。いくつかの実施態様においては、酵素は、デアミナーゼ、エステラーゼ、グルコシダーゼ、グルカンヒドロラーゼ、デキストリナーゼ、アミラーゼ、トランスグルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、及びウレアーゼである。また、追加的酵素は追加的アルファ‐グルカナーゼでもよい。
【０１３４】
歯及び他のパーソナルケア組成物並びにそれらの作用機序はLad.  R.  (ed.)  “Biotechnology  in  Personal  Care”,  Cosmetic  Science  and  Technology  Series,  Vol.29,  Taylor  and  Francis  Group,  New  York,  NY,  USA,  2006に記載される。この引例は最先端の技術を示し、本明細書に取り込まれる。
【０１３５】
口腔ケアへの利用に加えて、本発明の組成物及び方法を多くの他の状況におけるバイオフィルムの予防及び除去に適用できる。例えば、冷却水装置、飲料水装置、食品生産及び食品を取り扱う装置、医療用インプラント、製紙及び織物製造及び加工、油精製及び採掘装置、船やボートの構造物、化学工場、水泳用プール、水槽、及び池等においてである。そのような場合、アルファ‐グルカナーゼをバイオフィルム中に存在するポリサッカライド成分を崩壊するために用いることができ、それにより、表面への微生物の吸着及び／又は接着を低減できる。そのようなポリサッカライド類の崩壊は脱水ももたらし、表面上の微生物の成長及び増殖に適した微小環境の形成を低減又は予防する。
【０１３６】
本発明の組成物及び方法の他の態様及び実施態様は明細書の記載を考慮して当業者に明らかであろう。
【実施例】
【０１３７】
次の実施例は本発明の組成物及び方法並びに有益性を説明するために提供され、特許請求の範囲を限定するように理解すべきでない。
【０１３８】
実施例１．候補菌類アルファ‐１，３‐グルカナーゼ（ＥＣ  ３．２.１．５９）の同定
ヒポクレア  タワ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｔａｗａ）、トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）、及びトリコデルマ  ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）を含むいくつかの候補菌類を１５％マルトースを含む規定の培地中の培養で増殖した（２８℃、７日、１５０ｒｐｍの撹拌）。グルカン（及びデキストラン）加水分解活性スクリーニングのために上清を滅菌ろ過、遠心、及び脱塩により採取した。脱塩培養上清（体積で５％）を１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．３（又は１００ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．５）中０．２％の洗浄した不溶性グルカンに加えた。反応混合物を３７から４０℃にて終夜インキュベートした。その混合物を不溶性グルカンの溶解を視覚的に確認し、可溶性加水分解物に関して上清をＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析において、反応上清を１０ｍＭＮａＯＨへ１０倍希釈して、そらから１０μｌを電気化学的検出器を備えたAgilent  1100  HPLCへ注入した。モノサッカライド及びジサッカライドをＰＡ１陰イオン交換カラムにてＮａＯＨ／酢酸ナトリウムグラジエントで溶出した。未知混合物の成分をすでに実施した標準に基づいて同定した。トリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）、及びヒポクレア  タワ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｔａｗａ）由来の上清はグルカンのとてもよい可溶化をもたらした（例えば、図２を参照願いたい）。ヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）、トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）のα‐１，３‐グルカナーゼをクローニングで選別し、発現し、特徴づけた。推定上のトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）α‐１，３‐グルカナーゼ配列を相同性によりゲノム配列（ＪＧＩ）中同定した。
【０１３９】
実施例２．ゲノムＤＮＡの単離
トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）、ヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）の菌類の培養物を安全キャビネット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｈｏｏｄ）の中で３０ｍＬの滅菌ＹＥＧブロスを３つの２５０ｍＬのバッフル三角振盪フラスコへ添加することにより調製した。滅菌プラスチック製ループを用いてそれぞれ別々の培養プレートから１ｘ１インチの大きさの正方形を切り取り、適切な培養フラスコへ移した。播種されたフラスコをそれから２８℃の振盪インキュベーターへ置いて、終夜培養した。
【０１４０】
トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）、ヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）の培養物を振盪インキュベーターから外し、各フラスコの内容物を別々の滅菌５０ｍＬザルスタット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）試験管へ注いだ。そのザルスタット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）試験管を卓上遠心機に置き、１０分間４，５００ｒｐｍで回転させ、菌の菌糸を沈殿させた。上清を破棄し、各菌糸サンプルの多めの白金耳量を溶解性マトリックス（ＦａｓｔＤＮＡ）を含む別々の試験管へ移した。藻類、菌類、及び酵母に関する取り扱い手順に従って、ゲノムＤＮＡをＦａｓｔＤＮＡを用いて採取した菌糸から抽出した。均質化の時間（Mini  BeadBeater-8）は２５秒であった。抽出したゲノムＤＮＡの量と質をゲル電気泳動により検出した。
【０１４１】
実施例３．ＰＣＲによりアルファ‐グルカナーゼポリペプチドを獲得
Ａ．トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）
推定α‐１，３グルカナーゼ遺伝子を相同性によりトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）ゲノム（ＪＧＩ）において同定した。トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）に関するＰＣＲプライマーを推定相同体ＤＮＡ配列に基づいて設計した。縮重ＰＣＲプライマーを推定トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）タンパク質配列及び他の公開されたα‐１，３グルカナーゼタンパク質配列に基づいてトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）又はヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）について設計した。
【０１４２】
トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）の具体的なＰＣＲプライマーを下記に示す。
SK592:  5'-CACCATGTTTGGTCTTGTCCGC  (配列番号:  6)
SK593:  5'-TCAGCAGTACTGGCATGCTG  (配列番号:  7)
【０１４３】
トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）菌株ＲＬ−Ｐ３７から抽出したゲノムＤＮＡ由来推定α‐１，３グルカナーゼを増幅するために用いたＰＣＲ条件を下記に示す。
１．９４℃、２分間
２．９４℃、３０秒間
３．５６℃、３０秒間
４．７２℃、３分間
５．ステップ２へ戻り２４サイクル
６．４℃を持続
反応サンプルは２μＬのＲＬ−Ｐ３７ゲノムＤＮＡ、１０μＬの１０Ｘ緩衝液、２μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰs，１μＬの２０μＭプライマーＳＫ５９２及びＳＫ５９３、１μＬのＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ及び８３μＬの蒸留水を含んだ。
【０１４４】
Ｂ．トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）及びヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）
初期のＰＣＲ反応はいくつかの相同性配列のタンパク質アライメントから設計された縮重プライマーを用いた。５´及び３´末端の近くをアニーリングするように設計した縮重プライマーのプライマリーセットを最初のＰＣＲ反応中に用いて、α‐１，３グルカナーゼの配列と類似の配列を増幅した。
最初のクローニングのための縮重プライマー
ヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）
MA1F:  GTNTTYTGYCAYTTYATGAT  (配列番号:  8)
MA2F:  GTNTTYTGYCAYTTYATGATHGGNAT  (配列番号:  9)
MA4F:  GAYTAYGAYGAYGAYATGCARCG  (配列番号:  10) 
MA5F:  GTRCAYTTRCAIGGICCIGGIGGRCARTANCC  (配列番号:  11)
MA6R:  YTCICCIGGNAGNGGRCANCCRTT  (配列番号:  12)
MA7R:  RCARTAYTGRCAIGCYGTYGGYGGRCARTA  (配列番号:  13)
【０１４５】
それからこれらのＰＣＲ反応の産物をＰＣＲフラグメントの産物内に接着するように設計されたプライマーを用いてネストＰＣＲ中に用いた。
最初のクローニングのための具体的なプライマー
トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）
TP1S:  CCCCCTGGCCAAGTATGTGT  (配列番号:  14)
TP2A:  GTACGCAAAGTTGAGCTGCT  (配列番号:  15)
TP3S:  AGCACATCGCTGATGGATAT  (配列番号:  16)
TP3A:  AAGTATACGTTGCTTCCGGC  (配列番号:  17)
TP4S:  CTGACGATCGGACTRCACGT  (配列番号:  18)
TP4A:  GGTTGTCGACGTAGAGCTGT  (配列番号:  19)
ヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）
HP2A:  ACGATCGGCAGAGTCATAGG  (配列番号:  20)
HP3S:  ATCGGATTGCATGTCACGAC  (配列番号:  21)
HP3A:  TACATCCAGACCGTCACCAG  (配列番号:  22)
HP4S:  ACGTTTGCTCTTGCGGTATC  (配列番号:  23)
HP4A:  TCATTATCCCAGGCCTAAAA  (配列番号:  24)
【０１４６】
ＰＣＲ産物のゲル電気泳動を予想されるサイズのフラグメントが増幅されたか否か測定するために用いた。予想されるサイズの単一なネストＰＣＲ産物をＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。さらに、予想されるサイズの産物を複数の産物バンドを含むアガロースゲルから切り出し及び抽出し、ＱＩＡクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。
【０１４７】
実施例４．形質転換／単離スクリーニング／プラスミド抽出
ＰＣＲ産物を取扱説明書に従ってInvitrogen  Zero  Blunt（商標）TOPO（商標）PCR  クローニングキットを用いてクローニングベクターへ挿入した。それから、製造元の推奨に従って、ベクターをワン（商標）  ショット  トップ  １０  ケミカリーコンピテント大腸菌細胞（One  Shot  Top10chemically  competent  E.  coli  cells）(Invitrogen)に形質転換し、５０ｐｐｍのカナマイシン含有ＬＢプレート上に拡げた。これらのプレートを終夜３７℃のインキュベーターでインキュベートした。
【０１４８】
ベクター及びＤＮＡ挿入を含む形質転換体を選別するために、コロニーを生のプラスミド抽出物のためのプレートから選別した。５０μＬのＤＮＡ抽出溶液（100  mM  NaCl、10  mM  EDTA、2  mM  Tris  pH  7）をきれいな１．５ｍＬエッペンドルフチューブに加えた。安全キャビネット（biological  hood）の中で、それぞれＴＯＰＯ（商標）形質転換クローンの７から１０個のコロニーを数え、取り出し、抽出溶液に再けん濁した。ドラフト（chemical  hood）内で、５０μＬのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを各サンプルに加え、しっかりボルテックスした。チューブを５分間最高の速さで微量遠心して、２０μＬの上澄み層を除き、きれいなＰＣＲチューブへ移した。それから１μＬのＲＮａｓｅ２ｍｇ／ｍＬを加え、サンプルを混合し、３７℃にて３０分間インキュベートした。それから全サンプル体積をゲル上で電気泳動し、空ベクターとのサイズの違いに基づいてＴＯＰＯ（商標）ベクター中挿入の存在を測定した。いったん形質転換体コロニーを同定したら、それらのコロニーをプレートからこすり取って、５ｍＬのＬＢ／カナマイシン培地（０．０００１％）を含む別々の１５ｍＬ試験管に稙菌した。培養を３７℃の振盪インキュベーターにおいて、終夜行った。
【０１４９】
サンプルをインキュベーターから外し、Ｓｏｒｖａｌ遠心機を用いて６分間６，０００ｒｐｍにて遠心した。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  キット  (Qiagen)及び手順を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、それから、プラスミドＤＮＡを消化し、挿入の存在を確認した。用いた制限酵素は挿入配列中及びその周りに存在する部位によって決まった。ゲル電気泳動を用いてフラクメントのサイズを測定した。適切なＤＮＡサンプルをシークエンシングのために提出した（Sequetech,  Mountain  View,  CA)。
【０１５０】
実施例５．３´及び５´末端のクローニング
すべてのＤＮＡフラグメントを配列決定した。配列をAlign  X及びContigExpress（商標）(Vector  NTI（商標）suite,  Invitrogen)を用いて整列し並びにヌクレオチド及びアミノ酸同一性を決定するために比較した。具体的なプライマーを設計し、既知の配列から外部に拡げることによりヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）からそれぞれ不完全フラグメントの３´及び５´の一部を増幅した。前回のプライマーセットの増幅産物内のそれぞれネスト化された少なくとも３つの具体的なプライマーを各鋳型として設計した。５´及び３´配列の増幅をLA  PCRインビトロクローニングキット(タカラバイオ社)とネスト化プライマーセットを用いて実施した。
【０１５１】
新しいゲノムＤＮＡをこの増幅のために調製した。トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）及びヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）の培養物を２５０ｍＬのバッフル三角フラスコ中適切な胞子形成真菌プレート培養の１平方インチ部分を用いて３０ｍＬのＹＥＧブロスに植菌することにより調製した。フラスコを２８℃振盪インキュベーターで終夜インキュベートした。培養物を１０分間４５００ｒｐｍにて５０ｍＬザルスタット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）試験管中遠心分離することにより採取した。上清を破棄し、菌糸を−８０℃の冷凍庫で終夜貯蔵した。冷凍菌糸をそれから数個のドライアイスとともにコーヒー用グラインダーへ移した。グラインダーを全体混合物が均一な粉状になるまで動かした。それから、粉を空気乾燥して１０ｍＬのEasy-DNA（商標）キット溶液A  (Invitrogen)を含む滅菌５０ｍＬザルスタット（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）試験管へ移し、取扱手順に従った。抽出物から集められたゲノムＤＮＡの濃度をNanoDropスペクトロフォトメーターを用いて測定した。
【０１５２】
LA  PCRインビトロクローニングキットカセットを既知のＤＮＡ配列内の特定の制限酵素認識部位が存在しないことに基づいて選択し及び取扱手順に従った。第一ＰＣＲの実施のために、１μＬのライゲーションＤＮＡサンプルを３３．５μＬの滅菌蒸留水に希釈した。異なるプライマーをサンプル及び所望の末端フラグメントに従って用いた。５´末端のためにＨＰ４Ａ及び  ＴＰ３Ａプライマーをヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）にそれぞれ用い、一方３´末端のためにＨＰ４Ｓ及びＴＰ３Ｓプライマーをヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）に用いた。ＰＣＲ混合物を３４．５μＬの希釈ライゲーションＤＮＡ溶液、５μＬの１０ＸＬＡ緩衝液ＩＩ（Ｍｇ２＋）、８μＬのｄＮＴＰｓ混合物、１μＬのカセットプライマーＩ、１μＬの具体的プライマーＩ（サンプル及び末端フラグメントに依存）、及び０．５μＬのタカラＬＡＴａｑを加えることにより調製した。それからＰＣＲ試験管を下記に記載する手順で行うサーモサイクラーに置いた。
１．９４℃１０分間
２．９４℃３０秒間
３．５５℃３０秒間
４．７２℃４分間、ステップ２へ戻り、３０回、４℃を維持
【０１５３】
第二ＰＣＲ反応を１μＬの第一ＰＣＲ反応物を取り、１／１０，０００の希釈ファクターになるよう滅菌蒸留水でサンプルを希釈することにより調製した。第一増幅領域内でネスト化したプライマーの第二セットを第一ＰＣＲ反応で単離したフラグメントを増幅するために用いた。プライマーＨＰ３Ａ及びＴＰ４Ａをヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）の５´末端へ向かってそれぞれ増幅するために用い、一方プライマーＨＰ３Ｓ及びＴＰ４Ｓを３´末端に向かって増幅するために用いた。希釈ＤＮＡを３３．５μＬの滅菌蒸留水、５μＬの１０ＸＬＡ緩衝液ＩＩ（Ｍｇ２＋）、８μＬのｄＮＴＰｓ混合物、１μＬのカセットプライマー２、１μＬの具体的プライマー２（サンプル及び末端フラグメントに依存）、及び０．５μＬのタカラＬＡＴａｑを含むＰＣＲ反応物へ添加し、十分混合し、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲの手順は、初期の９４℃１０分間をせずに、第一反応と同様であった。反応が完了した後、サンプルをゲル電気泳動にかけ、単離されたフラグメントのサイズ及び数を確認した。もし単一バンドが存在した場合、サンプルを精製し、シークエンシングのために送付した。もしフラグメントが単離されない場合は、ネスト化ＰＣＲ反応用の前の手順を用いて第３のＰＣＲ反応を実施した。ゲル電気泳動により増幅フラグメント処理した後、最も明るいバンドを切り取り、精製し、及びシーケンシングのために送付した。
【０１５４】
実施例６．配列アライメントの分析
Align  X及びContigExpressを含むVector  NTI  suiteを用いて配列を獲得しかつ分析した。それぞれの末端フラグメント配列をすでに得られたヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）のフラグメントに並べて、全体の遺伝子配列を得た。トリコデルマ  ハージアヌム（Ｔ．  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）及びトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）配列を用いたヌクレオチドアライメントはヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）及びトリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）両者における本発明の遺伝子の転写開始及び終始点を明らかとした。全体の遺伝子配列を同定した後、具体的なプライマーを設計し、ゲノムＤＮＡから全体遺伝子を増幅した。GATEWAY（商標）クローニング(Invitrogen)のために、プライマーを翻訳開始点の前にＣＡＣＣヌクレオチド配列を加える点を除き、上述のように設計した。
最終クローニング用プライマー
トリコデルマ  コニラングブラ（Ｔ．  ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ）
T1FS:  caccatgctaggcattctccg  (配列番号:  25)
T1FA:  tcagcagtattggcatgccg  (配列番号:  26)
ヒポクレア  タワ（Ｈ．  ｔａｗａ）
H1FS:  CACCATGTTGGGCGTTTTTCG  (配列番号:  27)
H1FA:  CTAGCAGTATTGRCATGCCG  (配列番号:  28)
【０１５５】
ＰＣＲの手順は、アニーリング温度を55℃に変えた点を除いてすでに述べたように行った。ゲル電気泳動を通して単一なバンドを確認し、及び単離した後、増幅されたフラグメントを上述のように精製し、及び取扱説明書に従って、pENTR/D  TOPO（商標）(Invitrogen)形質転換に用いた。それからケミカリーコンピテント大腸菌（Chemically  competent  E.coli）をすでに述べたように形質転換し、５０ｐｐｍのカナマイシン含有ＬＢプレートへ移した。37℃終夜インキュベーション後、プラスミド及び挿入物を含む形質転換体をすでに述べたように未精製のＤＮＡ抽出物から選別し、プラスミドのサイズを分析した。選別された形質転換体をプレートからこすり取り、５ｍＬのＬＢ／カナマイシン培地（０．０００１％）を含む新しい１５ｍＬ試験管に植菌した。培養を３７℃の振盪インキュベーターに置いて、終夜行った。細胞を遠心分離により採取し、プラスミドＤＮＡをすでに述べたように抽出した。プラスミドＤＮＡを消化し、挿入配列の存在を確認した後、シークエンシングのために提出した。ＬＲクロナーゼ反応(Gatewayクローニング、Invitrogen）を取扱説明書に従って用い、直接的に挿入物をpENTR／Ｄベクターから目的ベクターへ移した。選別のためにアスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）アセタミダーゼを有するＣＢＨ１プロモーター及びターミネーターの制御下にて、トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）において、目的ベクターは本発明の遺伝子の発現のために設計される。
【０１５６】
実施例７．バイオリスティック形質転換
トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）胞子のけん濁液をアセトアミダーゼ形質転換プレートの中心から６ｃｍ径上に拡げた（１５０μＬの５ｘ１０７−５ｘ１０８胞子／ｍＬけん濁液）。それからプレートを安全キャビネット（biological  hood）内で空気乾燥した。ストッピングスクリーン（stopping  screen）(BioRad  165-2336)及びマクロキャリアホルダー（macrocarrier  holder）(BioRad  1652322)を７０％エタノールに浸し、空気乾燥した。ドライライト（DriRite）乾燥剤を小さなペトリ皿（６ｃｍ  Pyrex）に置き、ワットマン（Whatman）濾紙に銃の照準をあてた。マクロキャリア（BioRad  165-2335）を含むマクロキャリアホルダーを濾紙の上に水平に置き、ペトリ皿のふたを交換した。
【０１５７】
タングステン粒子けん濁液を６０ｍｇタングステンＭ−１０粒子（マイクロキャリア、０．７ミクロン、BioRad番号１６５２２６６）をエッペンドルフチューブに加えることにより調製した。１ｍＬエタノール（１００％）を添加した。タングステンをエタノール溶液中ボルテックスし、１５分間浸らせた。エッペンドルフチューブを最大のスピードで手短に遠心し、タングステンを沈殿した。エタノールをデカンテーションし、滅菌蒸留水で3回洗浄した。洗浄水を３回注いだ後、タングステンを１ｍＬの滅菌５０％グリセロールに再けん濁した。
【０１５８】
形質転換反応を２５μＬけん濁タングステンを各形質転換用１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに添加することにより調製した。続けて、２μＬのＤＮＡ、ｐＴｒeｘ３ｇ発現ベクター、２５μＬの２．５Ｍ  ＣａＣｌ２、１０μＬの０．１Ｍ  スペルミジンの順番で加えた。反応物を５から１０分間連続的にボルテックスし、タングステンをけん濁するよう維持した。エッペンドルフチューブを手短に遠心し、デカンテーションした。タングステン沈殿物を２００μＬの７０％エタノールで洗浄し、沈殿物を手短に遠心し、注いだ。タングステン沈殿物を２００μＬの１００％エタノールで洗浄し、沈殿物を手短に遠心し、注いだ。タングステン沈殿物を２４μＬの１００％エタノール中に再けん濁した。エッペンドルフチューブを超音波水浴中１５秒置き、８μＬのアリコートを乾燥したマクロキャリアの中央に移した。マクロキャリアを乾燥したペトリ皿の上に乾燥するように放置した。
【０１５９】
ヘリウムタンクを１５００ｐｓｉになるよう開けた。１１００ｐｓｉラプチャーディスク（rupture  disc）(BioRad  165-2329)をモデルPDS-1000/Heバイオリスティックパーティクルデリバリーシステム（Biolistic  Particle  Delivery  System）(BioRad)に用いた。タングステン溶液を乾燥した場合、ストップスクリーン及びマクロキャリアホルダーをPDS-1000へ挿入した。標的トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）胞子を含むアセタミダーゼプレートをストッピングスクリーンの下６ｃｍにおいた。２９インチＨｇの真空度で薬室を吸引し、維持した。Ｈｅバイオリスティックパーティクルデリバリーシステムを作動した。薬室を通風しアセタミダーゼプレートを除き、コロニーが現われるまで（５日間）２８℃でインキュベートした。
改良amdSバイオリスティックアガー(MABA) １リットル当たり
パートI、５００ｍｌの蒸留水中調製
1000x  塩                                          1  ml
ノーブル寒天                                       20  g
pH  6.0、オートクレーブ
パートII、５００ｍｌの蒸留水中調製
アセタミド                                         0.6  g
CsCl                                               1.68  g
グルコース                                         20  g
KH2PO4                                             15  g
MgSO4  ・7H2O                                      0.6  g
CaCl2  ・2H2O                                      0.6  g
pH  4.5,  0.2マイクロフィルター滅菌、温めるために50°Cのオーブンに放置、寒天を添加、混合、プレートに注ぐ。室温保存。
1000x  塩 １リットル当たり
FeSO4  ・7H2O                             5  g
MnSO4  ・H2O                              1.6  g
ZnSO4  ・7H2O                             1.4  g
CoCl2  ・6H2O                             1  g
蒸留水で１Ｌにする。
0.2マイクロフィルター滅菌
【０１６０】
実施例８．トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）形質転換体によるα‐１，３−グルカナーゼの発現
１ｃｍ２寒天プラグをプロフロ（Proflo）種培地を接種するために用いた。培養物を２８℃、２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。二日目、１０％培養物を無菌的に調製培地に移した。培養物を２８℃、２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。三日目、培養物を遠心分離により採取した。上清を滅菌ろ過し（０．２μｍＰＥＳ）、４℃にて保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によりそれぞれアルファ‐グルカナーゼ遺伝子を発現するクローンを同定した。
【０１６１】
実施例９．不溶性グルカン基質の調製
ＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）ブロスを含む４つの滅菌フラスコをＢＨＩプレートからストレプトコッカス  ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）(ATCC  27607)で接種した。培養物を３７℃にて２４時間静置でインキュベートした後、目に見える程度に濁った。上清（ストレプトコッカス  ソブリナス（Ｓ．  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）グルコシルトランスフェラーゼを含む）を遠心分離（１５分、１０，０００ｒｐｍ）により採取した。上清を集めて滅菌ろ過（０．２２μｍ）し、任意の残存する細胞を除去した。滅菌的に、スクロースを最終濃度が５％になるように添加した。これは、グルカンポリマーを生成するためにグルコシルトランスフェラーゼを誘発する。培養上清プラススクロースに蓋をして、混合し、２４から２８時間（静置）３７℃インキュベーターにて保存した。ふわふわした沈殿を形成し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分間）により採取した。上清をデカンテーションし、ｄＩ水で３回洗浄し、沈殿を最後に風袋の重さを測ったエッペンドルフチューブにいれた。グルカンをスピードバック（SpeedVac）で乾燥し、乾燥後、そのエッペンドルフチューブの重さを測定した。
【０１６２】
実施例１０．クローン化アルファーグルカナーゼの活性を測定するためのＰＡＨＢＡＨ低減糖アッセイ
形質転換トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）培養上清、緩衝液及び不溶性グルカンを下記に示した量において丸底９６穴プレートへ添加した。二つのタイプの緩衝液（ｐＨ４．５及びｐＨ６．０）を活性レベルを比較するために用いた。サンプルを添加した後、９６穴プレートに蓋をし、３７℃の振盪インキュベーターに終夜置いた。
グルカン加水分解混合物:
50μL培養上清
50μLの28mg/mLグルカン溶液
5μLの1Mクエン酸緩衝液(pH  4.5  又は  6.0)
105μL
ＰＡＨＢＡＨ溶液:
0.5gの酒石酸カリウムナトリウム
0.15gのp-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（hydroxybenzoic  acid  hydrazide）  (ＰＡＨＢＡＨ)
10mLの2%  NaOH
【０１６３】
インキュベーションの後、１５０μＬの新しく作られたＰＡＨＢＡＨ（ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（ｐ−hydroxybenzoic  acid  hydrazide））試薬を２０μＬの各加水分解混合物とともに０．２ｍＬのＰＣＲチューブに移した。これらのチューブをそれから軽く混ぜ、サーモサイクラーへ置き、これらのチューブを３０分間９９℃に温めた。ＰＣＲチューブを除き、１５０μＬの各サンプルを新しい９６穴プレートへ移した。各サンプルの吸光度を４１０ｎｍにて測定した。このアッセイの結果を図３に示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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