(57)【要約】  本発明は、単一分子を処理するため、特に一本鎖ＤＮＡを感知又はシークエンシングするための装置１００及び方法に関する。第１のスリット１１１を有する底部層１１０と、第２のスリット１２１を有する導電性の上部層１２０とが互いに上下に配設され、それにより、スリットによってアパーチャＡが形成される。スリット１１１、１２１は、好ましくは互いに垂直である。電気回路１４０が、上部層１２０に接続されることがあり、アパーチャＡを通過する単一分子を感知することを可能にする。
2014529082.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一分子を処理するための装置であって、
ａ）第１のスリットを有する底部層と、
ｂ）導電性の上部層とを備え、前記上部層が、前記底部層の上に配設され、第２のスリットを有し、前記第２のスリットが、前記第１のスリットの上方に配設されて、単一分子が通過することができるアパーチャを提供する
装置。
【請求項２】
導電性の上部層を備え、前記上部層が、単一分子が通過することができるアパーチャを提供し、前記上部層の表面の少なくとも一部に電気絶縁材を有する
単一分子を処理するための装置、特に請求項１に記載の装置。
【請求項３】
請求項１に記載の装置を製造するための方法であって、
ａ）底部層に第１のスリットを提供するステップと、
ｂ）前記底部層の上に導電性の上部層を堆積するステップと、
ｃ）アパーチャを形成するために、前記第１のスリットの上方で、前記上部層に第２のスリットを形成するステップと
を含む方法。
【請求項４】
単一分子を処理するための方法であって、
ａ）分子を、導電性の上部層の第２のスリット、及び隣接する底部層の第１のスリットに順次に通すステップであって、前記スリットがアパーチャを提供するステップと、
ｂ）前記分子が前記アパーチャを通過するときに、前記分子と、前記上部層及び／又は前記底部層との相互作用を実行又は感知するステップと
を含む方法。
【請求項５】
前記第１のスリットが前記第２のスリットに対して斜めであることを特徴とする
請求項１に記載の装置又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２のスリットが、前記上部層を２つの切り離された部分に分割することを特徴とする
請求項１に記載の装置又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項７】
前記上部層が、好ましくは５単層未満、最も好ましくは１単層でグラフェンを含むことを特徴とする
請求項１若しくは２に記載の装置又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項８】
追加層、特に非導電性の追加層が、前記アパーチャを除く前記上部層の上に配設されることを特徴とする
請求項１若しくは２に記載の装置又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項９】
前記上部層、及び／又は前記底部層、及び／又は前記追加層が、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの間の厚さを有することを特徴とする
請求項１若しくは２に記載の装置又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項１０】
前記底部層が、誘電体材料、特に二酸化ケイ素及び／又は窒化ケイ素を含むことを特徴とする
請求項１に記載の装置又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項１１】
前記アパーチャが、約０．１ｎｍ２〜約１０ｎｍ２の間、好ましくは約２ｎｍ２〜５ｎｍ２の間のサイズを有することを特徴とする
請求項１若しくは２に記載の装置又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のスリット及び／又は前記第２のスリットが、約０．１ｎｍ〜約１００ｎｍの間の幅を有することを特徴とする
請求項１に記載の装置又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項１３】
前記上部層が電気回路に接続され、前記電気回路によって、前記アパーチャを通過する分子との相互作用が制御され得ることを特徴とする
請求項１若しくは２に記載の装置又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【請求項１４】
前記回路が、分子又は分子の様々な部分が前記アパーチャを通過するときに生じる導電率の変化を感知することを特徴とする
請求項１３に記載の装置又は方法。
【請求項１５】
複数のアパーチャが提供されることを特徴とする
請求項１若しくは２に記載の装置又は請求項３若しくは４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単一分子を処理するための装置及び方法に関する。さらに、本発明は、そのような装置を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国特許出願公開第２０１０／０３２７８４７Ａ１号は、グラフェン層を通って延びるアパーチャを有する固体状態分子センサを開示する。分子が前記アパーチャを通過するときに、前記層の電気的特性の変化が測定される。このセンサの１つの欠点は、グラフェン層の高い導電率であり、分子によって誘発される導電率変化は、それに比べて非常に小さい。
【０００３】
さらに、文献（H.W.Ch. Postma, “Rapid sequencing of individual DNA molecules in graphene nanogaps”, Nano Lett. 10 (2010) 420-425）に、２つのグラフェン層の間のギャップにＤＮＡ分子を通すことによってＤＮＡ分子がシークエンシングされ得ることが述べられている。しかしながら、関連の装置は、遊離したグラフェン層が使用されるので機械的にそれほど頑強ではない。さらに、前記層間の比較的長いギャップは、長い分子が多くの異なる向き及び形状でギャップを通ることを可能にし、測定結果の解釈を難しくする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、単一分子を処理するため、特にＤＮＡなど核酸をシークエンシングするための改良された手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この目的は、請求項１及び２に記載の装置並びに請求項３及び４に記載の方法によって実現される。好ましい実施形態は、独立請求項に開示されている。
【０００６】
本発明による装置は、単一分子（又は原子）、特に蛋白質又は核酸など高分子を処理するのに役立つ。この文脈で、用語「核酸」は、最も一般的に、天然由来及び／又は非天然由来のヌクレオチド又はそれらの改変体、並びにＬＮＡ（ロックド核酸（locked nucleic acids））及びＰＮＡ（ペプチド核酸（peptide nucleic acids））を含む分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含むものとする。これらの分子の「処理」は、分子の物理的及び／又は化学的な変換又は変性を含むことがある。しかしながら、多くの重要な用途において、処理は、特に、分子の異なる区間の検出を行う感知である。従って、例えば、ｓｓ−ＤＮＡをシークエンシングすることが可能であることがある。本発明の第１の態様によれば、装置は、以下の構成要素を備える。
ａ）第１の材料の第１の層。ここで、第１の層は、第１のスリットを備える。参照の便宜上、第１の層は、以下では「底部層」と呼ばれる（図面にはその通常の位置を示すが、現実にはその向きに対して制約はない）。用語「スリット」は、本出願の文脈では、一般に任意の形状の、連接された開口、ギャップ、穴、又はアパーチャを表すものであるが、しばしば、この語のより狭い意味合いで、細長い（例えば長方形の）スリットを表す。
ｂ）前述の底部層の上に配設され、第２のスリットを有する第２の層。参照の便宜上、この第２の層は、以下では「上部層」と呼ばれる。上部層の第２のスリットは、底部層の第１のスリットに少なくとも部分的に重畳するものとし、それにより、両方のスリットが合わさって、単一分子が通過することができるアパーチャを成す。さらに、上部層は、（少なくとも一部）導電性であるものとする。
【０００７】
本発明の第２の態様によれば、装置は、導電層を備え、導電層が、単一分子が通過することができるアパーチャを提供し、導電層の表面の少なくとも一部に電気絶縁材を有する。前記導電層は、以下では「上部層」と呼ばれる。なぜなら、前述の実施形態の導電性の上部層と同一視され得るからである。実際、本発明の第２の態様による装置は、第１の態様による装置であって、底部層が絶縁材を提供する装置とみなされ得る。絶縁材は、典型的には、アパーチャに、及び／又はアパーチャ内部には存在しないことが留意されるべきである。
【０００８】
本発明は、さらに、上述の種類の装置を製造するための方法であって、列挙される順序又は任意の他の適切な順序で実行され得る以下のステップを含む方法に関する。
ａ）底部層に第１のスリットを提供するステップ。底部層は、例えば、まず材料の均質な層として提供されることがあり、次いで、その層に、リソグラフィなどの方法によってスリットが形成される。
ｂ）前記底部層の上に導電性の上部層を堆積するステップ。
ｃ）上部層に第２のスリットを形成するステップであって、この第２のスリットは、第１のスリットの上方に設けられ、それにより両方のスリットが合わさってアパーチャを形成する、ステップ。
【０００９】
さらに、本発明は、単一分子を処理するための方法であって、以下のステップを含む方法に関する。
ａ）分子を、導電性の上部層の第２のスリット、及び隣接する底部層の第１のスリットに順次に通すステップであって、前記スリットが一般にアパーチャを提供するステップ。分子の通過は、例えば、適切な電気力、磁気力、又は流体力学的な力によって、能動的に誘発又は支援され得る。しかしまた、分子は、単にそれらのランダム（熱）運動によって押し進められて、受動的にのみアパーチャを通って移動することも可能である。両方の通過方向、即ち、まず上部層を通り、次いで底部層を通る方向、又はその逆の方向が、このステップによって含まれることが留意されるべきである。
ｂ）前述の分子と上部層及び／又は底部層との相互作用を実行又は感知するステップであって、分子が前記アパーチャを通過するステップ。
【００１０】
上述の装置及び方法は、共通の概念、即ち、追加の構成要素（底部層及び／又は絶縁材）によって（機能的に）サポート又は補完される導電層にアパーチャを提供し、上部層及び底部層にある適切に配置されたスリットによってアパーチャが形成されることがあるという概念の異なる実現形態である。従って、これらの実現形態の１つのために提供される説明及び定義は、他の実現形態に関しても同様に有効である。
【００１１】
これらの装置及び方法は、導電層の機械的及び／又は電気的特性が、好ましくは、追加の構成要素、即ち底部層及び／又は絶縁材によって調節され得るという利点を有する。さらに、アパーチャは、単一分子が通過することができる適切な形状及び寸法を与えられる。特に、比較的コンパクトな（例えば円形又は正方形の）形状を有するアパーチャが使用される場合には、ｓｓ−ＤＮＡなどの長い分子が軸方向でのみアパーチャを通過することができ、それにより、そのような分子の処理のために良く定義された条件を提供する。同時に、アパーチャは、基本的には２つのスリットからなるので、容易に製造され得る。最後に、導電性の上部層が、（第２のスロットによって分離された）２つの別個の部分に完全に分割され得るという利点があり、それにより、第２のスリットが空であるときにはバックグラウンド電流は流れない。さらに、バックグラウンド電流は、導電性の上部層の絶縁材によって抑制され得る。
【００１２】
以下、上述の装置と方法の両方に関する本発明の様々な好ましい実施形態が説明される。
【００１３】
底部層の第１のスリットと、上部層の第２のスリットとが互いに上下に配置され、それにより、それらが一般に所望のアパーチャを形成する。一般に、（例えば、両方のスリットが、サイズ及び形状が同一であり、且つ正確に位置合わせされる場合には）一方のスリットが他方のスリットによって完全に重畳されることが可能である。このとき、得られるアパーチャは、この（小さい方の）スリットにサイズ及び形状が対応する。そのような実施形態も本発明によって含まれるものとするが、第１のスリットと第２のスリットとは完全には重畳しないことが好ましい。このとき、スリット間の重畳の領域に常に対応するアパーチャは、単独での各スリットよりも小さい。この設計は、比較的大きなアパーチャ（スリット）を用いて小さなアパーチャがより容易に形成され得るので好ましい。
【００１４】
第１及び第２のスリットは、軸方向での相対的なずれを有して同軸に向けられた細長い（例えば長方形の）形状を有することがある。従って、これらのスリットが重畳するより小さな領域のみがアパーチャを成す。しかしながら、最も好ましくは、２つのスリットは、互いに対して斜めに、特に垂直に向けられる。この場合、スリットの正確な相対位置は大きく変わり得、大きな製造公差を許容し、得られるアパーチャのサイズ及び形状に影響を及ぼさない。
【００１５】
第１及び／又は第２のスリットは、対応する層（前記層の内部開口）によって完全に取り囲まれることがあり、層の１つの縁部とつながる部分を有することがあり、又は層を２つの切り離された部分に切断することがある。切断する状況は、好ましくは、上部層と第２のスリットに関して実現されることがある。このとき、上部層の２つの部分は、電気的に切り離され、第２のスリットにわたるゼロバックグラウンド電流を生成する。最も好ましくは、これは、第１のスリットと組み合わされ、第１のスリットは、その層の内部に完全に位置し、それにより機械的に安定な一部片の底部層を提供する。
【００１６】
上部層は、任意選択的に、その表面の少なくとも一部、好ましくはアパーチャ及び／又は第２のスリットを除くその全面に、電気絶縁材を提供される。電気絶縁材は、望ましくない電流、特に、第２のスリットによって分離された上部層の２つの切り離された部分の間の電流の流れを防止する（前述の実施形態を参照のこと）。従って、対象の領域を通る電流（即ち、典型的には第２のスリットにわたる電流）のみが生成され、周囲の試料媒体を通る、及び／又は装置の他の構成要素（例えば底部層）を通る電流は、妨げられるか又は少なくとも最小限に抑えられる。
【００１７】
導電性の上部層は、好ましくはグラフェンを含むことがある。グラフェンは、ナノスケール寸法でのその好ましい電気的及び機械的特性により、好ましい材料である。
【００１８】
上部層の厚さ（第２のスリットの領域内で決定される）は、好ましくは約２ｎｍ未満、最も好ましくは約１ｎｍ未満である。第２のスリット内での分子との相互作用が測定される場合、低い厚さは、より高い空間分解能をもたらすので有利である。従って、ＤＮＡ鎖の単一塩基が、例えば、それらを通るトンネル電流によって検出されることができ、前記塩基は、典型的には、互いに約０．３ｎｍの距離を有する。
【００１９】
グラフェンを含む又はグラフェンからなる上部層の場合、前記グラフェンは、５単層以下、好ましくは２単層、又はより好ましくは単一の単層で存在することがある。従って、前述の好ましい低い厚さが実現され得る。
【００２０】
本発明の別の実施形態によれば、上部層の上に追加層が配設されることがあり、前記追加層は、第２のスリットを開いたままにする。追加層は、特に非導電性でよい。追加層は、機械的安定性を高め、（非導電性である場合には）電気的絶縁を提供し、且つ分子を適切に方向付ける助けとなるので、有利であることがある。
【００２１】
上部層、及び／又は底部層、及び／又は追加層は、好ましくは、約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍの間の厚さを有することがある。この厚さは、処理されるべき典型的な細長い分子、例えばｓｓ−ＤＮＡの直径よりもかなり大きい。従って、そのような分子は、対応する層のスリットによって画定される平面内で方向付けられ、これはさらに、分子がアパーチャを通過する際の分子の一定の方向付けに寄与する。
【００２２】
一般に、上部層は、異なる材料の２つ以上の副層からなることがある（同じ材料、即ちグラフェンの複数の副層は既に上述した）。これらの副層の少なくとも１つは、上部層全体の導電性をもたらすように導電性であるべきである。異なる材料を組み合わせることによって、上部層の電気的及び機械的特性は、より良く且つ個別に調節され得る。
【００２３】
一般に、底部層の電気的特性に関して制限は加えられず、従って、底部層は、例えば導体又は半導体を含むことがある。しかしながら、最も好ましくは、底部層（又は少なくとも上部層とのその界面）は、非導電性である。底部層は、特に、誘電体材料、例えば二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）及び／又は窒化ケイ素（ＳｉＮｘ）を含むことがある。これらの材料は、その上でマイクロ電子又はマイクロ機械構造が既知の製造処置で構成され得る適切なキャリア又は基板である。底部層は、均一な層でよく、又は副層から構成されてもよい。上述のように、底部層を通る望ましくない電流の流れを防止するために、底部層（導体又は半導体である場合）と上部層との間に電気絶縁層が配設されるべきである。
【００２４】
第１のスリットと第２のスリットとによって形成されるアパーチャのサイズ及び形状は、通常は、意図される用途に応じて、特に処理される分子に応じて選択される。好ましくは、アパーチャのサイズは、約０．１ｎｍ２〜１０ｎｍ２の間、最も好ましくは約２ｎｍ２〜５ｎｍ２の間の範囲内である。アパーチャの関連の形状は、好ましくは、円形、長方形、又は正方形である。上述のサイズは、例えばｓｓ−ＤＮＡの処理に適している。
【００２５】
第１のスリット及び／又は第２のスリットの幅は、好ましくは、約０．１ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲内である。第１のスリット及び／又は第２のスリットの長さは、好ましくは、約０．１μｍ〜約１μｍの範囲内である。上述のサイズを有するスリットは、既知の処置を用いて容易に形成されることができ、スリットは、適切な（小さい）サイズのアパーチャの形成を可能にする。
【００２６】
意図される単一分子の処理によっては、追加の構成要素が必要とされることもある。そのような構成要素は、特に、上部層と、アパーチャを通過する分子との相互作用を制御するように適合された電気回路によって実現されることがある。そのような回路は、好ましくは、上部層に接続される。さらに、アパーチャは、マイクロ流体回路内に埋め込まれることがあり、対象の分子、例えばＤＮＡ断片がアパーチャへ移動することを保証する。
【００２７】
好ましい実施形態では、前述の回路は、分子又は分子の様々な部分がアパーチャ（及び／又は上部層の第２のスリット）を通過するときに生じる導電率の変化を感知するように適合されることがある。従って、例えば、第２のスリットにわたる（塩基に依存するはずの／塩基に依存する）トンネル電流の発生を検出することによって、ｓｓ−ＤＮＡのシークエンシングを実現することが可能である。
【００２８】
複数の単一分子の並列処理を可能にするために、複数のアパーチャが提供されることが好ましい。好ましくは、これらのアパーチャは、共通のキャリア又は基板上に提供され、各アパーチャが、底部層にある対応する第１のスリットと、上部層にある対応する第２のスリットとの間に形成される。各アパーチャに対応する底部層と上部層は、各アパーチャ毎に異なっていても又はすべて同じであってもよい。最も好ましくは、複数の第１のスリットが共通の底部層に提供され、一方、対応する第２のスリットは個別の上部層に実現される。
【００２９】
本発明のこれら及び他の態様は、本明細書で以下に述べる実施形態から明らかであり、実施形態を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明による装置の概略上面図である。
【図２】図１のＩＩ−ＩＩ線に沿った装置を通る断面図である。
【図３】本発明による装置の製造の連続するステップを示す図である。
【図４】本発明による装置の製造の連続するステップを示す図である。
【図５】本発明による装置の製造の連続するステップを示す図である。
【図６】本発明による装置の製造の連続するステップを示す図である。
【図７】本発明による装置の製造の連続するステップを示す図である。
【図８】本発明による装置の製造の連続するステップを示す図である。
【図９】本発明による装置の製造の連続するステップを示す図である。
【図１０】本発明による装置の製造の連続するステップを示す図である。
【図１１】本発明による装置の製造の連続するステップを示す図である。
【図１２】本発明による装置の製造の連続するステップを示す図である。
【図１３】上部層の上に追加層が提供される図１及び図２の装置の修正形態を示す図である。
【図１４】導電層が絶縁材によってカプセル化される代替の装置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
図面中、１００の整数倍異なる同様の参照番号は、同一又は同様の構成要素を表す。
【００３２】
米国特許出願公開第２０１０／０３２７８４７Ａ１号は、ナノ細孔シークエンシングにおけるグラフェン層／電極の使用を述べる。この特許では、ナノ細孔がグラフェン内に埋め込まれ、ナノ細孔以外の領域を残すことが提案されている。
【００３３】
しかしながら、グラフェンが非常に高い導電率を有することが既に知られている。室温で約１０，０００ｃｍ２／Ｖｓの移動度が報告されている（K.S. Novoselov, A.K. Geim, S.V. Morozov, D. Jiang, Y. Zhang, S.V. Dubonos, I.V. Grigorieva, and A.A. Firsov, “Electric Field Effect in Atomically Thin Carbon Films”, Science, 306 (204) 666-669）。従って、米国特許出願公開第２０１０／０３２７８４７Ａ１号のデバイスにおける電流は、ほぼすべての電流がナノ細孔を通り過ぎて残りのグラフェンに入るので、変調されず又はほとんど変調されず、このデバイスは、ナノ細孔を通過する塩基を決定する有効性が低い。
【００３４】
このことに鑑みて、Postma（H.W.Ch. Postma, “Rapid sequencing of individual DNA molecules in graphene nanogaps”, Nano Lett. 10 (2010) 420-425）によって提案されているように、ナノギャップを使用することがより効果的であると考えられる。この論文に記載されているように、ナノギャップを使用することは、ナノ細孔に（ナノ）電極を位置合わせするという問題が回避されるという追加の利点を有する。
【００３５】
しかしながら、実用のためには、Postmaの理論計算においてPostmaによって考察されているデバイスは、２つの重要な欠点を有する。即ち、
−  容易に製造され得るデバイスを作製するために、ナノギャップ又は「スリット」が、グラフェン電極全体に及ぶ有限長さを有さなければならない。これは、０．１〜１μｍ程度の寸法である。測定されるべき一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ−ＤＮＡ）は非常に柔軟であるので、これは、ＤＮＡが多くの形で、特に折り畳まれた形でナノギャップを通過できるようにする。これは、企図される一塩基分解能での測定を行うことをできないようにする。
−  グラフェン層が機械的な支持を有さず、グラフェンは強い材料であるものの、そのようにして製造されたデバイスはそれほど頑強ではない。
−  イオンで帯電された緩衝液を通る分流電流が生じ、この分流電流は、測定されるべき任意のトンネル電流よりも大きいことがある。
【００３６】
上記の問題に対処するために、本明細書では、ナノホールもナノギャップデバイスも使用せず、別のデバイス、即ち、クロススリット（グラフェン）デバイスを使用することが提案される。
【００３７】
図１及び図２は、前述の概念に従って設計された例示的な装置１００を概略的に示す。この装置１００の中心的構成要素は、２層である。即ち、
−  ｘ方向に延びる幅ｗｂの細長い長方形の第１のスリット１１１を備える「底部層」１１０。
−  前述の底部層１１０の上に配設された「上部層」１２０。前記上部層は、２つの切り離された部分１２０ａと１２０ｂからなり、部分１２０ａと１２０ｂは、ｙ方向に延びる幅ｗｔの第２のスリット１２１によって分離されている。
【００３８】
第１のスリット１１１と第２のスリット１２１は、互いに垂直に向けられ、単一分子Ｍが通過することができる（正方形の）アパーチャＡの領域で部分的に重なる。
【００３９】
図面に示すように、装置１００は、さらに、それぞれ上部層部分１２０ａ及び１２０ｂの上に配設された接点１３０ａ及び１３０ｂを備える。これらの接点を介して、上部層が回路１４０に接続される。この回路１４０は、上部層１２０と、アパーチャＡを通過する単一分子との間で生じる電気的相互作用を感知するように適合される。
【００４０】
説明されるクロスナノスリットデバイス１００は、グラフェンナノ細孔を使用して横伝導ベースのシークエンシングを行うための既知のデバイスに勝る以下の利点を有する。
−  米国特許出願公開第２０１０／０３２７８４７Ａ１号で提案されているナノホールデバイス構造とは異なり、ＤＮＡがナノ開口を通過する場合及び時にのみ（トンネル）電流が発生される。さらに、このデバイスは、ゼロバックグラウンドに対する測定を行うという重要な利点を有し、即ち、ＤＮＡがデバイスを通過してないときには、生じる信号が（非常に）限られるか、さらには信号が生じない。
−  このデバイス構造は、容易に製造されることができ、且つｓｓ−ＤＮＡのみが通過することができる単一のナノ開口を保証することができる。ナノホールが形成される必要はなく、ｎｍ幅を有する２つのスリットのみが形成されればよい。
−  ｓｓ−ＤＮＡは、折り畳まれた形ではこのデバイスを通過することができない。折り畳まれた形での通過は、単一塩基の検出を妨げることにもなる。
【００４１】
図３〜図１２は、本発明による装置の製造の連続するステップを示し、各図は、左側に側断面図を示し、右側に上面図を示す。
【００４２】
図３から始めて、シリコン（Ｓｉ）基板１０１がキャリアとして提供され、その上に、ＳｉＯ２からなる（絶縁）誘電体「底部層」１１０が堆積されている（約１００ｎｍの典型的な厚さを有する）。さらに、底部層１１０の上に、レジスト層１５１が堆積されている（約５０ｎｍの典型的な厚さを有する；レジストは、例えば、Zeon Corp.からのZEP520など、高分解能の電子ビームポジレジストでよい）。
【００４３】
図４で、電子ビームリソグラフィ（ＥＢＬ:electron beam lithography）又は極端ＵＶリソグラフィによって、レジスト層１５１にスリットＳが形成されている。
【００４４】
図５で、レジスト１５１のスリットを通した反応性イオンエッチング（ＲＩＥ:reactive ion etching）によって、底部層１１０に第２のスリット１１１が形成されている。
【００４５】
図６で、レジスト１５１が除去されており、図７で、浮動するグラフェンの追加によって、約１ｎｍの厚さを有するグラフェン上部層１２０が底部層１１０の上に堆積されている。グラフェン層１２０の上に絶縁層１２２が提供される場合、この絶縁体／絶縁材は、追加される浮動するグラフェン内のパッケージの一部となり得る。
【００４６】
図８で、グラフェン上部層１２０の上にレジスト１５２が塗布されており、前記レジストは、例えば、約１００ｎｍの厚さのＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート(poly-methylmethacrylate)）の層である。さらに、このレジスト１５２は、４つの穴Ｈを提供するように電子ビームリソグラフィによって構造化されている。グラフェン層１２０の上に絶縁層１２２が提供されている場合、後続の（Ｃｒ）Ａｕ（層１３１及び１３２）とグラフェンとの電気的な接触を可能にするために、この絶縁材は、ここでスパッタエッチング、ＲＩＥ、又は湿式化学法によって除去されるべきである。例えばZEP520のＰＭＭＡ以外のレジストの使用も、特にそれらがいずれにせよリフトオフステップで除去されるときには可能である。
【００４７】
図９によれば、クロム（Ｃｒ）層１３１（厚さ約５ｎｍ）と金（Ａｕ）層１３２（厚さ約１００ｎｍ）とが、デバイスの上に堆積されている。下にある層に金が十分に結合する場合には、クロム層は省略され得る。
【００４８】
図１０で、レジスト１５２がリフトオフされており、４つの穴にのみＡｕ／Ｃｒを残し、そこでは、Ａｕ／Ｃｒがグラフェン１２０のすぐ上にある。
【００４９】
図１１で、グラフェン上部層１１０をパターン形成するために、集束イオンビーム（ＦＩＢ:Focused Ion Beam）又は高線量電子ビームリソグラフィ（又は他の細線リソグラフィ）が使用されている。底部層は、（約５ｎｍの分解能をもたらす）従来のリソグラフィによってパターン形成されることができるが、グラフェン上部層のパターン形成は、グラフェン電極間のギャップが１〜２ｎｍの範囲内になければならないので、異なる技法で行われなければならない。これは、約１００ｋｅＶの電子を使用する電子ビームリソグラフィによって行われ得る。パターン形成により、グラフェンの２つの切り離された部分１２０ａと１２０ｂが形成され、第２のスリットによって分離される。さらに、デバイスの縁部に沿って、グラフェンのフレーム１２０ｃが残される。
【００５０】
図１２は、シリコン層１０１のシリコンが裏面から除去され、それにより、底部層の第１のスリットと上部層の第２のスリットとの間に形成されるアパーチャを開く最終ステップを示す。さらに、Ａｕ／Ｃｒ接点が回路（図示せず）に接続されており、それにより、アパーチャ内の感知が実現され得る。
【００５１】
ナノスリットを有する底部層と上部層との位置合わせは比較的簡単である。なぜなら、各スリットの長さは十分に長く（０．１〜１μｍ）されてよく、それにより、重畳を実現することは、従来のリソグラフィツールでさえ簡単な作業であるからである。これは、提案される手法の中心的な態様であり、即ち、ナノホールを形成するという問題は、合わさってナノ開口を提供する２つのスリットの形成によって置き換えられる。
【００５２】
さらなる実施形態として、グラフェン上部層の上の保護層が提供され、最適な形状、例えば円錐形状を与えられることが提案される。これは、グラフェンの上の第２のスリットの高さを増加し、それにより、ｓｓ−ＤＮＡが、クロススリットデバイスのナノ開口を通過する角度を減少させる。
【００５３】
図１３は、これを、上述の装置１００の修正形態である装置１００’の（図２の断面図と同様の）断面図で示す。この装置１００’での（唯一の）新たな構成要素は、非導電性の「追加層」１６０であり、追加層１６０は、上部層１２０の上に配設され、第２のスリット１２１（のみ）を開いたままにする。従って、追加層１６０は、２つの別個の部分１６０ａと１６０ｂを備える。
【００５４】
追加層１６０は、周囲の試料媒体から導電性の上部層１２０を電気的に絶縁し、それにより、上部層に電圧が印加されるときに、分流電流の流れを防止する。さらに、追加層１６０は、第２のスリット１２１の（ｚ方向での）厚さを増加し、これは、分子ＭがアパーチャＡを通過する前に分子Ｍを適切に方向付ける助けとなる。
【００５５】
図１４は、本発明の第２の態様による装置２００を通る断面を概略斜視図で示す。前の実施形態のものと同様又は同一の構成要素は、１００だけ増加された参照符号を付されており、重ねて説明されない。装置２００は、以下の構成要素を備える。
−  単一分子Ｍが通過することができるアパーチャＡを有する導電性の「上部層」２２０。この上部層は、特に、グラフェン層（単層、二層、又は多層）でよい。
−  前述の上部層２２０（アパーチャＡの内部を除いて）を覆う、「底部層」２１０と「追加層」２６０とからなる電気絶縁材。
−  アパーチャＡの両側に配設され、上部層２２０に電気的に接触する２つの電気接点２３０ａ及び２３０ｂ。これらの接点は、外部回路（図示せず）に接続されることがある。
【００５６】
用語「上部層」、「底部層」、及び「追加層」は、主に、本発明の前の実施形態との対応関係を示すように選択されていることが留意されるべきである。実際、「底部層」と「追加層」は、均質な絶縁材によって構成されることがある。
【００５７】
アパーチャＡは、底部層２１０の「第１のスリット」と上部層２２０の「第２のスリット」（さらに、追加層２６０の第３のスリット）の重畳によって形成されるものとみなされることがある。図示される例では、これらのスリットは、形状及びサイズが同一であり、アパーチャＡはほぼ円形である。しかしながら、アパーチャＡは、前の実施形態と同様の形状、特に導電層２２０を２つの切り離された部分に分割する形状を有することもできる。
【００５８】
装置２００は、接点２３０ａと２３０ｂの間に電圧が印加されるときに、アパーチャＡの内部以外で試料媒体を通って電流が流れることができないという利点を有する。これは、アパーチャＡ内での測定が意図されるときに、望ましくないバックグラウンド電流の寄与を減少させる。
【００５９】
二本鎖ＤＮＡの幅は２．３ｎｍであり、従って、ｓｓ−ＤＮＡの幅は約１．１ｎｍであり、従って、形成される２×５ｎｍ２のナノ開口は十分に小さく、１本、最大で２本のｓｓ−ＤＮＡ鎖しか通さないことが留意されるべきである。後者の場合、デバイスが（大規模に）並列様式で動作されることが予見されるので、これは容易に対処され得る。従って、望ましくないことに幾つかのデバイスが同時に複数のＤＮＡ鎖を供給される可能性は、デバイス全体のこれらのセル／画素からのデータを無視することによって対処され得る。
【００６０】
本発明によるナノ細孔アパーチャは、好ましくは、導電率を測定するように適合される。「導電率の変化の測定」とは、この測定が、ＤＣ電流−電圧測定、ＡＣ電流−電圧測定、ＤＣ電圧に（小さな）ＡＣ電圧を重ね合わせることによって実施されるＡＣ電流−電圧測定（いわゆるアドミタンス測定）、又は一般に、任意の時間依存印加電圧に応答する電流の測定であり得るものと理解される。好ましくは、ＡＣ測定は、緩衝媒体中での任意のイオンモーメントの典型的なタイプのスケールを超える測定周波数で行われ、それにより、緩衝媒体中のイオン調節によって影響を及ぼされない。
【００６１】
さらに、説明される技法は、当然、ｓｓ−ＤＮＡ以外の分子、例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ−ＤＮＡ）、一般的な核酸、又は蛋白質を処理するために使用されることもできることが留意されるべきである。ｄｓ−ＤＮＡでは、例えば、塩基対の数が（それらのシークエンシングの正確な決定と共に、又はそのような決定なしで）計数されることがある。代替形態では、ＤＮＡへの後成的変化が決定されることがある。また、本発明の手法は、微量元素、分子、又は分子断片、特に、導電（例えばグラフェン）層のスリット内のトンネル電流を誘発することができる元素、分子、又は分子断片の検出に関する「電子の鼻(electronic nose)」を設計するために使用されることもできる。この用途では、検出されるべき元素及び分子は、気体媒体又は液体媒体中にあることがある。
【００６２】
本発明は、図面及び前述の説明で詳細に例示及び説明されているが、そのような例示及び説明は、例示的なものとみなされるべきであり、限定的なものとはみなされるべきでない。本発明は、開示される実施形態に限定されない。開示される実施形態に対する他の変形形態は、図面、開示、及び添付の特許請求の範囲を検討することにより、特許請求される発明を実施する際に当業者によって理解されて実施され得る。特許請求の範囲において、用語「備える」は、他の要素又はステップを除外せず、単数での表記は、複数を除外するものではない。特定の手段が互いに異なる独立請求項に記載されていることだけでは、これらの手段の組合せが有利に使用され得ないことを示してはいない。特許請求の範囲内の任意の参照符号は、範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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