(57)【要約】  本発明は、酵素変異体、補因子に対するそれらの応答性に関し、並びに酵素変異体の活性、及び補因子に対するそれらの応答性を試験するインビボアッセイに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
補因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）の投与により治療可能な酵素をコードする遺伝子のアレル（ａｌｌｅｌｅ）の障害をインビボでスクリーニングする方法であり：
ｉ）該酵素をコードする遺伝子の試験アレルを酵母に導入し、ここで該酵母細胞が、該酵素をコードする遺伝子に機能的に類似する第一の遺伝子に第一の突然変異を含み、そして該酵母細胞を、酵素が機能するのに必要な補因子の投与に依存させる第二の遺伝子又は遺伝子群に第二の突然変異を含み、ここで該第一の突然変異が、該第一の遺伝子の機能に関連する酵母の測定可能な特徴（ｍｅａｓｕｒａｂｌｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）を変化させ；
ｉｉ）増殖培地に補因子を添加し；そして
ｉｉｉ）野生型の酵素の存在下よりも試験アレルの存在下で該測定可能な特徴が回復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）し難いことを検出することにより、該試験アレルによる第一の遺伝子突然変異の不完全な補完を検出し、試験アレルを障害アレル（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｌｌｅｌｅ）として同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
前記試験アレルが補因子感受性であるか否かを判定するために添加した補因子の量の滴定（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ）を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵母が二倍体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記二倍体の酵母が、酵素をコードする遺伝子の試験アレルにおいてヘテロ接合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一の遺伝子がｍｅｔ１３であり、前記第二の遺伝子がｆｏｌ３であり、前記補因子が葉酸塩であり、前記測定可能な特徴が増殖であり、そして前記酵素をコードする遺伝子が、ＭＴＨＦＲ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＧＡＲＴ、ＭＴＨＦＳ及びＡＴＩＣからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第一の遺伝子がｓｙｓ３であり、前記第二の遺伝子が六重欠失（ｓｅｘｔｕｐｌｅ−ｄｅｌｅｔｅ）ｓｎｏ１Δ  ｓｎｏ２Δ  ｓｎｏ３Δ  ｓｎｚ１Δ  ｓｎｚ２Δ  ｓｎｚ３Δであり、前記酵素をコードする遺伝子がＣＴＨであり、前記補因子がビタミンＢ６であり、そして前記測定可能な特徴が増殖である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記前記第一の遺伝子がｓｙｓ４であり、前記第二の遺伝子が六重欠失（ｓｅｘｔｕｐｌｅ−ｄｅｌｅｔｅ）ｓｎｏ１Δ  ｓｎｏ２Δ  ｓｎｏ３Δ  ｓｎｚ１Δ  ｓｎｚ２Δ  ｓｎｚ３Δであり、前記酵素をコードする遺伝子がＣＢＳであり、前記補因子がビタミンＢ６であり、そして前記測定可能な特徴が増殖である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
補因子に依存する酵素機能不全の素因を検出する方法であり：
ｉ）対象から試料を取得し；
ｉｉ）１つ以上の酵素をコードする遺伝子の、補因子で治療可能な複数の障害アレルの存否を検出することを含み、
ここで１つ以上の障害アレルの存在が、該対象が補因子に依存する酵素機能不全のリスクを有することを示す、前記方法。
【請求項９】
対象における代謝経路中の酵素機能不全を同定及び／又は特徴付ける方法であり；
ｉ）該対象から試料を取得し；
ｉｉ）該経路中の１つ以上の酵素をコードする遺伝子の、複数の障害アレルの存否を検出することを含み、
該障害アレルの存在が、該対象が治療可能な酵素機能不全を有することを示す、前記方法。
【請求項１０】
前記障害アレルが低頻度アレル（ｌｏｗ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｌｌｅｌｅ）である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記障害アレルが、前記経路中の複数の酵素をコードする遺伝子に由来する、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の障害アレルが、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により同定される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１３】
対象の代謝酵素機能不全を処置する方法であり；
ｉ）該対象から試料を取得し；
ｉｉ）１つ以上の酵素をコードする遺伝子の複数の障害アレルの存否を検出し；そして
ｉｉｉ）１つ以上の障害アレルの存在に基づいて該対象に補因子補給剤（ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を投与する
ことを含む、前記方法。
【請求項１４】
前記代謝経路がホモシステインであり、前記ビタミンが葉酸塩であり、そして前記障害アレルが、ヒトＭＴＨＦＲのＭ１１０Ｉ、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、Ｄ２９１Ｎ、Ｒ５１９Ｃ、Ｒ５１９Ｌ、及びＱ６４８Ｐからなる群から選択される、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記代謝経路がホモシステインであり、前記ビタミンが葉酸塩であり、そして前記障害アレルが、ヒトＭＴＨＦＳのＲ８４Ｑ、Ｖ１１９Ｌ及びＴ２０２Ａからなる群から選択される、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記代謝経路がホモシステインであり、前記ビタミンが葉酸塩であり、そして前記障害アレルが、ヒトＭＡＴ１ＡのＩ９０Ｖ、Ｌ１７６Ｒ及びＲ３１２Ｑからなる群から選択される、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記代謝経路がホモシステインであり、前記ビタミンが葉酸塩であり、そして前記障害アレルが、ヒトＧＡＲＴのＴ１６Ｍ、Ａ１６１Ｇ、Ｌ３６３Ｉ、Ｖ３６７Ｍ、Ｒ３８５Ｋ、Ｉ３９７Ｖ、Ｖ４２１Ｉ、Ａ４４５Ｔ、Ｄ５１０Ｇ、Ｈ６０１Ｒ、Ａ６３２Ｖ、Ｐ６４１Ａ、Ｄ７５２Ｇ、Ｌ７９７Ｍ、Ｅ８０４Ａ、及びＮ８７０Ｓからなる群から選択される、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
代謝経路中の治療可能な酵素機能不全を評価するキットであり、該代謝経路中の酵素をコードする遺伝子の低頻度の治療可能な障害アレルを検出する複数の核酸プローブを含む、前記キット。
【請求項１９】
前記障害アレルが、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により同定される、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
障害アレルの突然変異又はその相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む単離された核酸であり、ここで該障害アレルの突然変異が、ＭＴＦＲ遺伝子の４０７８；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド４２３４；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド５７３３；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド５８７２；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド６６４２；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド６６５７；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド６６８１；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド６７７４；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド１０９０６；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド１１６５６；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド１１６６８；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド１１９０２；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド１２２３２；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド２６２２；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド１２７５９；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド１３０４０；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド１４５９３；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド１４６１２；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド１４７０５；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド１３１７０；ＭＴＦＲ遺伝子のヌクレオチド１１６４０１；からなる群から選択され、ここでＳＮＰの配列が表Ａにおいて提供される、前記単離された核酸。
【請求項２１】
障害アレルの突然変異又はその相補体を含む単離された核酸であり、ここで該障害アレルの突然変異が、ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１１００；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１１１４；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１１７９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１２４４；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１２７０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１２８８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１３０１；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１３８０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１３９６；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４５３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５０６；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１６８９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド７２２７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド７２３２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド７３８８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド８７５６；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド８８０８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４０９９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４１４０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４１４４；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４１８３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４２２９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４２３８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４２４５；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４２６０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４４８９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４９７０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５００３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５０４０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５０４３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５１４９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５２４０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５８４４；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１６０６３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２１３６３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２１３７２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２１４００；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２１５２１；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２１６１１；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２１８７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２２７３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２２８２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２２９１；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２３４２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２５１２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２５１９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２５３８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２５６４；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２５８９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２７３７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２４９９２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２５００９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２７７５７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２７８５５；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２７９８５；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２８０１５；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３３９０１；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３３９１９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３３９２０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３３９３３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５７２３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５７３７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５７４２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５８４０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５９１７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５９６８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５９７３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８３３８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８３４２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８４３７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８３４２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８５８２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８６２７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８６６７からなる群から選択され、ここで該ヌクレオチドの配列が表Ｂにおいて提供される、前記単離された核酸。
【請求項２２】
障害アレルの突然変異又はその相補体を含む単離された核酸であり、ここで該障害アレルの突然変異が、ＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド８８０８；ＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド８９１２；ＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド８９５７；ＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド８９９８；ＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド５２５６０；ＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド５２８７８からなる群から選択され、ここでＳＮＰの配列が表Ｃにおいて提供される、前記単離された核酸。
【請求項２３】
障害アレルの突然変異又はその相補体を含む単離された核酸であり、ここで該障害アレルの突然変異が、ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド５０４５；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド５１８１；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド５２３３；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド６７３９；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド６７９５；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド９８３３；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１０００６；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１０３１２；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１０３３９；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１０３７４；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１０４８４；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１０５５５；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１４０３８；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１４１１４；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１４１７７；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５４２４；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５５００；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５６４６；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７０６；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７１５；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７３０；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７５８；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１６１３３；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１６１７４；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７０６；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７１５；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７３０；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７５８；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１６１３３；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１６１７４；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１６２１８からなる群から選択され、ここでＳＮＰの配列が表Ｄにおいて提供される、前記単離された核酸。
【請求項２４】
障害アレルの突然変異又はその相補体を含む単離された核酸であり、ここで該障害アレルの突然変異が、ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド２８７１；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド２８７３；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド２９３９；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド３２８７；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド３３９４；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド３４６６；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド３４９８；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド３６５０；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド３７０４；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４１７４；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４４４９；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４４７６；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４６０８；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４６６０；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４６９２；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４９３１；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド５３１３；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド５４６０からなる群から選択され、ここでＳＮＰの配列が表Ｅにおいて提供される、前記単離された核酸。
【請求項２５】
障害アレルの突然変異又はその相補体を含む単離された核酸であり、ここで該障害アレルの突然変異が、ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３７８２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３８４２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド７７４５；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド７９８４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１０７７５；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１１５２１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１１５２２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１１５４１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１２３５６；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１４２００；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１４２７３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１４２８２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１４７３９；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１４７８１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８０５５；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８０６４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８１３０；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８１４２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８１９７；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８２３２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８４０１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２０８１２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２０８２５；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１６１７４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１５７０６；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２０８６２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２２４８１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２２５２１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５４２５；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５４３３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５６０１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５８６７；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５９１２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５９５１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５９５６；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２６１２７；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２６１９５；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３１６２７；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３１６４１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３１８８７；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３１９０２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３１９３３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３３１７３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３３２６４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３１９３３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３３１７３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３３２６４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３３２８６；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３６９６３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３６９６４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３７４２８；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３７４３３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３８７６２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３８９１４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３８９８９からなる群から選択され、ここでＳＮＰの配列が表Ｆにおいて提供される、前記単離された核酸。
【請求項２６】
障害アレルの突然変異又はその相補体を含む単離された核酸であり、ここで該障害アレルの突然変異が、Ｍ１１０Ｉ、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、Ｄ２９１Ｎ、Ｒ５１９Ｃ、Ｒ５１９Ｌ、及びＱ６４８Ｐからなる群から選択される、前記単離された核酸。
【請求項２７】
葉酸塩／ホモシステイン代謝の異常に関連する症状又は疾患のリスクをスクリーニングする方法であり、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の方法を使用する障害アレルの検出を含む、前記スクリーニング方法。
【請求項２８】
前記疾患又は症状が、冠動脈疾患、虚血性脳梗塞、アテローム性動脈硬化、神経管欠損、口唇口蓋裂（ｏｒｏｆａｃｉａｌ  ｃｌｅｆｔ）、子癇前症（ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ）、早産（ｐｒｅ−ｔｅｒｍ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）／低出生体重児（ｌｏｗ  ｂｉｒｔｈｗｅｉｇｈｔ）、反復早期自然流産（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｅａｒｌｙ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｂｏｒｔｉｏｎ）、血栓症、網膜動脈閉塞、ダウン症、直腸結腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、鬱、統合失調症、アルツハイマー症／認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、加齢性黄斑変性症、及び緑内障からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
化学治療に対する応答能力をスクリーニングする方法であり、ＭＴＨＦＲ及びＧＡＲＴからなる群から選択される遺伝子の障害アレルの検出を含む、前記方法。
【請求項３０】
化学治療の毒性をスクリーニングする方法であり、ＭＴＨＦＲ及びＧＡＲＴからなる群から選択される遺伝子の障害アレルの検出を含む、前記方法。
【請求項３１】
葉酸塩／ホモシステイン代謝経路の遺伝子の障害アレルを検出するためのアレイであり、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の単離された核酸を含む、前記アレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府による資金提供
本発明は、Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ  Ａｇｅｎｃｙ及びＵ．Ｓ．  Ａｒｍｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｆｆｉｃｅ  （＃Ｗ９１１ＮＦ−０６−１−０１６６）及びＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈ  （ＧＭ０７２８５９）の政府支援を利用して行われた。米国政府は、本発明の権利の一部を有する。
【０００２】
本発明は、代謝に影響する酵素変異体、補因子に対するそれらの機能的感受性、並びにそのような酵素変異体をコードする障害アレル（ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｌｌｅｌｅｓ）を検出する、及び補因子に対するそれらの感受性を判定するアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
葉酸塩／ホモシステイン代謝経路は、葉酸塩を代謝し、及び／又はホモシステインに影響する、酵素のネットワーク及び酵素経路を構成する。該経路は、メチオニンシンターゼ反応、並びに培養細胞、動物モデル系及びヒトホモシステイン再メチル化障害における限界葉酸塩欠乏を介して結び付けられている（例えば、Ｓｔｏｖｅｒ  ＰＪ．  ２００４．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｆｏｌａｔｅ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎｕｔｒ  Ｒｅｖ  ６２：Ｓ３−１２を参照されたい）。
【０００４】
葉酸塩の不足は、神経管欠損（ＮＴＤ）及び他の出生時欠損、並びに不都合な妊娠転帰（ａｄｖｅｒｓｅ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｏｕｔｃｏｍｅ）、例えば口唇口蓋裂（ｏｒｏｆａｃｉａｌ  ｃｌｅｆｔ）、子癇前症（ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ）、早産（ｐｒｅ−ｔｅｒｍ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）／低出生体重児（ｌｏｗ  ｂｉｒｔｈｗｅｉｇｈｔ）、及び反復早期自然流産（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｅａｒｌｙ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｂｏｒｔｉｏｎ）と関連付けられている（例えば、Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５．    Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ｎｅｕｒａｌ  ｔｕｂｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ．    Ｌａｎｃｅｔ  ３４５：１４９−１１５１を参照されたい）。葉酸塩不足は、心血管疾患、冠動脈疾患、虚血性脳梗塞、アテローム性動脈硬化、血栓症、網膜動脈閉塞、ダウン症、直腸結腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、鬱、統合失調症、アルツハイマー症／認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、加齢性黄斑変性症、及び緑内障とも関連付けられている。
【０００５】
葉酸塩／ホモシステイン代謝経路の全ての代謝ステップは、葉酸塩の不足及び／又はホモシステイン代謝と関連する症状及び疾患に潜在的に関与する。葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する酵素として、例えば、二機能性酵素ＡＩＣＡＲトランスフォルミラーゼかつＩＭＰシクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ）、グリシンアミドリボヌクレオチドトランスフォルミラーゼ（ＧＡＲＴ）、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼＩアルファ（ＭＡＴ１Ａ）、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼＩＩアルファ（ＭＡＴ２Ａ）、メチレンテトラヒドロフォレートリダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）、及びメテニルテトラヒドロフォレートシンセターゼ（ＭＴＨＦＳ）が挙げられる。また、葉酸塩の不足は、ＭＴＨＦＲ及びＣＢＳの両方のアロステリック阻害剤であるＳ−アデノシル−メチオニン（”ＳＡＭ”）により媒介されるメチル化を阻害する（例えば、Ｋｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９．    Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  β−ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ．    Ｈｕｍ  Ｍｕｔ  １３：３６２−３７５；  Ｄａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２．    Ｉｎ  Ｆｌａｖｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ｅｄｓ．  Ｍａｓｓｅｙ，  Ｖ．  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｃ．  Ｈ．  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ｐｐ．  １６５−１７２を参照されたい）。Ｓ−アデノシル−ホモシステイン：Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＨ／ＳＡＭ）の比率の上昇は、ＮＴＤ発生のメカニズムにおいて指摘されている。
【０００６】
５，１０−メチレンテトラヒドロフォレートリダクターゼ（ＭＴＨＦＲ）は、ホモシステインがメチオニンに転換する葉酸塩依存的多段階経路に関与する。ホモシステインの転換の低下は、高ホモシステイン血症を引き起こし得る。
【０００７】
ＭＴＨＦＲの稀な突然変異のあるものは、臨床的なＭＴＨＦＲ機能不全、常染色体劣性疾患に関連する。ＭＴＨＦＲ機能不全の臨床症状は多様で、成長の遅延、運動及び歩行の異常、発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）、並びに早期血管疾患（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）が挙げられる。
【０００８】
また、ＭＴＨＦＲの通常の多型（Ｃｏｍｍｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）も記載されており、機能的な障害アレルＡ２２２Ｖが含まれる。通常の多型と疾患との遺伝的関連性は、これまで説明されていない。これは、部分的には、疾患の潜在的リスク、及び同定されていないが、低頻度障害アレル（ｌｏｗ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ａｌｌｅｌｅ）のそのような疾患に対する関与をマスクする、葉酸塩のアベイラビリティーの補整効果（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ）によると思われる。興味深いことに、一般的な多型は、メトトレキサートや５−フルオロウラシル等の化学治療剤の効果や毒性における個人差に関与することが知られている。
【０００９】
酵母遺伝子ｍｅｔ１１の機能補償アッセイは、公知である（Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢＣ，  ２７４：３２６１３−３２６１８，  １９９９）。このアッセイにおいて、野生型ヒトＭＴＨＦＲは、サッカロマイケス・セレウィシアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｍｅｔ１１突然変異を補償することが示された。しかしながら、このアッセイは、ＭＴＨＦＲの突然変異による活性の量的変化に対しては感受性ではない。このことは、機能的な障害アレルＡ２２２Ｖが酵母の突然変異を補償する能力が、野生型酵素と比較して類似していたことからわかる。また、このアッセイは、葉酸塩のアベイラビリティーに対する感受性もない。
【００１０】
葉酸塩を利用する酵素に加えて、一部のビタミンＢ６及びＢ１２依存的酵素並びに酵素経路も、ホモシステイン代謝、ＮＴＤ及び他の出生障害、並びに不都合な妊娠結果（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ  ｏｕｔｃｏｍｅ）に関与する。例えば、Ｂ６を利用する酵素シスタチオニン−ベータ−シンターゼ（”ＣＢＳ”）の機能不全は、ホモシステインの蓄積を引き起こす（Ｋｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９．    Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  β−ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ．    Ｈｕｍ  Ｍｕｔ  １３：３６２−３７５）。同じく、Ｂ６を利用する酵素シスタチオニン−γ−リアーゼ（”ＣＴＨ”）の単一ヌクレオチド多型も、ホモシステイン血症に関与している（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４．    Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ＣＴＨ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．    Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  ６５：４８３−４８６）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、部分的には、代謝経路中の酵素をコードする遺伝子の障害アレルを同定し、補因子救済（ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）に対するそれらの感受性を判定する新規インビボアッセイの開発に由来する。機能的に類似する関心のある酵素により補完され得る第一の突然変異、及び補因子の添加に対する強力な依存性を付与する第二の突然変異（又は突然変異群）を含む、複合的な（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）酵母突然変異は、補因子の可用性（ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）に応じた酵素補完の実験を可能とする。救済可能な（ｒｅｍｅｄｉａｂｌｅ）アレルを含む補因子感受性障害アレルが同定され得て、そして、補因子可用性：酵素活性の関係は、本明細書中に開示されるアッセイを使用して解析され得る。取得される結果は、代謝酵素の機能不全及び異常な代謝に関与する症状及び疾患を予防及び治療するための、予防的及び治療的栄養補給アプローチの情報を得るのに使用され得る。
【００１２】
また、本発明は、部分的には、酵素をコードする遺伝子の低頻度障害アレルの補因子救済が驚くほどありふれたことであることを本明細書中で初めて実証したことに由来する。本明細書中で例示されているように、代謝経路中の多くの補因子感受性遺伝子のそれぞれが、その集団中で多くの低頻度突然変異を有し得る。これらの突然変異は、集団として解析した場合、単一の遺伝子の単一の低頻度障害アレルの実験から明らかにされ得るよりも、代謝経路に対して、より顕著なインパクトを有する。更に、そのような低頻度障害アレルの多くがヘテロ接合した細胞は、定量的な障害を呈するので、そのような個々では稀なアレルの頻度の蓄積は、より通常の多型がない場合であっても、通常の表現型に関与し得る。前記経路にインパクトを有するそのような低頻度障害アレルは、通常の多型において観察される表現型の変異にも関与し得る。よって、本発明は、酵素をコードするそのような低頻度障害アレルの検出及び特定、並びにそれらの有効な救済を判定することを特に目標とする、診断及び予測方法を意図する。
【００１３】
また、本発明は、特に葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の新しい低頻度障害アレルを同定及び特定するための、これらのアッセイの特定の応用にも由来する。本明細書中でＭＴＨＦＲに関して実証したように、酵素の機能不全に累積的に関与するが、補因子の添加によりその影響が解消されもする、多くの低頻度障害アレルが存在する。また、本発明は、ＭＴＨＦＲの障害アレルが、その酵素のＮ末端触媒ドメインのコーディング配列に位置する配列の変化を含むことを発見したことにも由来する。
【００１４】
故に、本発明は、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＨＦＲ、及びＭＴＨＦＳ等の葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する酵素をコードする遺伝子の、障害があるが救済可能なアレルを検出する新規インビボアッセイを提供する。従来技術において、野生型のヒトＭＴＨＦＲ活性がｍｅｔ１１の障害を救済するという補償アッセイが記載されている（Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢＣ，  ２７４：３２６１３−３２６１８，  １９９９）が、このアッセイは、高度な感受性を有さず、そして全ての機能的な障害ヒトＭＴＨＦＲアレルを検出することが出来なかった。例えば、このアッセイは、野生型ＭＴＨＦＲと機能的に障害を有する通常の多型Ａ２２２Ｖとを区別することが出来ない。更に、このアッセイは、葉酸塩レベルと酵素活性との間の関連性を何ら明らかにしない。
【００１５】
かかる従来技術と対象的に、ここで開示するインビボアッセイは、本明細書中でＭＴＨＦＲにおいて実証するように、葉酸塩／ホモシステイン対処に関与する遺伝子の障害アレルを高度な感受性で検出しつつ、それらの葉酸塩に対する感受性を同時に判定することが出来る。同定されるアレルとして、ヘテロ接合体としての表現型を呈する、低頻度アレル、優性アレル又は相互優性アレル、例えば葉酸塩により救済可能なアレル等の葉酸感受性のアレル、及びこれらの特徴を組み合わせて有するアレルが挙げられる。重要なことに、これらの障害アレルは、様々な症状及び疾患のリスク、そして多くの化学治療剤の作用性及び毒性に関連付けられる。これらの障害アレルの機能不全は、人によっては、葉酸塩可用性の補償的効果のため、症状、疾患、又は化学治療に対する様々な応答として現れない場合がある。ＭＴＨＦＲの機能的障害アレルを検出する能力により、そのような症状及び疾患のリスク、そして化学治療の潜在的な治療効率及び毒性を、スクリーニングする方法が提供される。
【００１６】
また、本発明は、ＣＴＨ及びＣＢＳの障害アレルを検出する新規なインビボアッセイも提供する。これらの遺伝子の機能的障害遺伝子を検出する能力により、同時に、関連する疾患及び症状のリスクをスクリーニングする方法が提供される。
【００１７】
よって、一つの側面において、本発明は、代謝経路の酵素をコードする遺伝子の障害アレルを検出し、そしてそれらの補因子に対する感受性を判定するためのインビボアッセイを提供する。該アッセイは、野生型酵素をコードする遺伝子により補完され得る第一の遺伝子中の第一の突然変異、及び補因子（又はその前駆体）の添加に対する依存性を付与する第二の遺伝子中の第二の突然変異を含むことにより、第一の遺伝子の機能と関連するアッセイ可能な表現型を示す、酵母株の使用を含む。
【００１８】
前記方法は、ｉ）酵素をコードする遺伝子の試験アレルを酵母に導入し、ここで該酵母細胞が、該酵素をコードする遺伝子に機能的に類似する第一の遺伝子に第一の突然変異を含み、そして該酵母細胞を、酵素が機能するのに必要な補因子の投与に依存させる第二の遺伝子又は遺伝子群に第二の突然変異を含み、ここで該第一の突然変異が、該第一の遺伝子の機能に関連する酵母の測定可能な特徴（ｍｅａｓｕｒａｂｌｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）を変化させ；ｉｉ）増殖培地に補因子を添加し；そしてｉｉｉ）野生型の酵素の存在下よりも試験アレルの存在下で該測定可能な特徴が回復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）し難いことを検出することにより、該試験アレルによる第一の遺伝子突然変異の不完全な補完を検出し、そして試験アレルを障害アレルとして同定することを含む。添加される補因子を滴定（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ）することにより、補因子可用性における障害アレルの感受性が判定される。
【００１９】
一つの態様において、二倍体の酵母が使用される。該二倍体の酵母は、試験アレルにおいてヘテロ接合体又はホモ接合体である。二倍体の酵母は、野生型の遺伝子及び試験アレルを含み得る。二倍体の酵母は、試験アレルの組合せを含み得る。
【００２０】
好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、配列において、自然発生的なアレルと、又は個々の自然発生的なアレルの編集物（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）に対応する。好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、ヒトの酵素をコードするアレル、又は個々のヒトアレルの編集物を含む。
【００２１】
好ましい態様において、前記酵母は、サッカロマイケス・セレウィシアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００２２】
一つの態様において、第一の酵母遺伝子はｍｅｔ１３で、第二の酵母遺伝子はｆｏｌ３である。そのような酵母株は、ＭＴＨＦＲアレルの活性、及びそれらの葉酸塩のステータスに対する応答性を判定するのに使用され得る。従って、一つの態様において、本発明は、ＭＴＨＦＲアレルの活性を判定し、更に、葉酸塩のステータスに応じた活性を判定することができる、インビボアッセイを提供する。好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、自然発生的なヒトＭＴＨＦＲアレルを含む。他の好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＭＴＨＦＲアレルの編集物を含む。
【００２３】
好ましい態様において、前記アッセイ手法は、関心のあるＭＴＨＦＲアレルの活性と野生型のＭＴＨＦＲの活性とを比較することを含む。
【００２４】
好ましい態様において、前記アッセイ手法は、ＭＴＨＦＲ酵素が葉酸塩可用性に感受性であるか否かを判定するために葉酸塩の量を滴定することを含む。
【００２５】
一つの態様において、前記酵母は二倍体である。一つの態様において、前記に媒体酵母は、補完が試験されるべきＭＴＨＦＲアレルにおいてヘテロ接合体である。一つの態様において、前記に媒体酵母は、野生型ＭＴＨＦＲ及び突然変異ＭＴＨＦＲアレルを含む。
【００２６】
一つの好ましい態様において、アッセイで測定されるアウトプットは増殖である。
【００２７】
一つの態様において、前記第一の酵母遺伝子はａｄｅ１６又はａｄｅ１７で、前記第二の酵母遺伝子はｆｏｌ３である。そのような酵母株は、二機能性酵素ＡＩＣＡＲトランスフォルミラーゼかつＩＭＰシクロヒドロラーゼ（ＡＴＩＣ）アレルの活性、及び葉酸塩ステータスに対するその応答を判定するために使用され得る。従って、一つの態様において、本発明は、ＡＴＩＣアレルの活性を判定し、更に、葉酸塩のステータスに応じた活性を判定することができる、インビボアッセイを提供する。好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、自然発生的なヒトＡＴＩＣアレルを含む。他の好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＡＴＩＣアレルの編集物を含む。
【００２８】
一つの態様において、前記第一の酵母遺伝子はａｄｅ７で、前記第二の酵母遺伝子はｆｏｌ３である。そのような酵母株は、グリシンアミドリボヌクレオチドトランスフォルミラーゼ（ＧＡＲＴ）アレルの活性、及び葉酸塩ステータスに対するその応答を判定するために使用され得る。従って、一つの態様において、本発明は、ＧＡＲＴアレルの活性を判定し、更に、葉酸塩のステータスに応じた活性を判定することができる、インビボアッセイを提供する。好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、自然発生的なヒトＧＡＲＴアレルを含む。他の好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＧＡＲＴアレルの編集物を含む。
【００２９】
一つの態様において、前記第一の酵母遺伝子はｓａｍ１又はｓａｍ２で、前記第二の酵母遺伝子はｆｏｌ３である。そのような酵母株は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼＩアルファ（ＭＡＴ１Ａ）アレルの活性、及び葉酸塩ステータスに対するその応答を判定するために使用され得る。従って、一つの態様において、本発明は、ＭＡＴ１Ａアレルの活性を判定し、更に、葉酸塩のステータスに応じた活性を判定することができる、インビボアッセイを提供する。好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、自然発生的なヒトＭＡＴ１Ａアレルを含む。他の好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＭＡＴ１Ａアレルの編集物を含む。
【００３０】
一つの態様において、前記第一の酵母遺伝子はｓａｍ１又はｓａｍ２で、前記第二の酵母遺伝子はｆｏｌ３である。そのような酵母株は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼＩＩアルファ（ＭＡＴ２Ａ）アレルの活性、及び葉酸塩ステータスに対するその応答を判定するために使用され得る。従って、一つの態様において、本発明は、ＭＡＴ２Ａアレルの活性を判定し、更に、葉酸塩のステータスに応じた活性を判定することができる、インビボアッセイを提供する。好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、自然発生的なヒトＭＡＴ２Ａアレルを含む。他の好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＭＡＴ２Ａアレルの編集物を含む。
【００３１】
一つの態様において、前記第一の酵母遺伝子はｆａｕ１で、前記第二の酵母遺伝子はｆｏｌ３である。そのような酵母株は、メチレンテトラヒドロフォレートシンセターゼ（ＭＴＨＦＳ）アレルの活性、及び葉酸塩ステータスに対するその応答を判定するために使用され得る。従って、一つの態様において、本発明は、ＭＴＨＦＳアレルの活性を判定し、更に、葉酸塩のステータスに応じた活性を判定することができる、インビボアッセイを提供する。好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、自然発生的なヒトＭＴＨＦＳアレルを含む。他の好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＭＴＨＦＳアレルの編集物を含む。
【００３２】
他の態様において、前記第一の酵母遺伝子はｃｙｓ３で、前記第二の酵母遺伝子の群は、六重欠失ｓｎｏ１Δ  ｓｎｏ２Δ  ｓｎｏ３Δ  ｓｎｚ１Δ  ｓｎｚ２Δ  ｓｎｚ３Δである。そのような酵母株は、ＣＴＨアレルの活性、及びビタミンＢ６ステータスに対するその応答を判定するために使用され得る。従って、一つの態様において、本発明は、ＣＴＨアレルの活性を判定し、更に、ビタミンＢ６のステータスに応じた活性を判定することができる、インビボアッセイを提供する。好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、自然発生的なヒトＣＴＨアレルを含む。他の好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＣＴＨアレルの編集物を含む。
【００３３】
他の態様において、前記第一の酵母遺伝子はｃｙｓ４で、前記第二の酵母遺伝子の群は、六重欠失ｓｎｏ１Δ  ｓｎｏ２Δ  ｓｎｏ３Δ  ｓｎｚ１Δ  ｓｎｚ２Δ  ｓｎｚ３Δである。そのような酵母株は、ＣＢＳアレルの活性、及びビタミンＢ６ステータスに対するその応答を判定するために使用され得る。従って、一つの態様において、本発明は、ＣＢＳアレルの活性を判定し、更に、ビタミンＢ６のステータスに応じた活性を判定することができる、インビボアッセイを提供する。好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、自然発生的なヒトＣＢＳアレルを含む。他の好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子は、個々のヒトＣＢＳアレルの編集物を含む。
【００３４】
一つの側面において、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の障害アレル、及びその補因子に対する感受性を検出することができる酵母株を提供する。
【００３５】
一つの態様において、本発明は、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＨＦＲ、及びＭＴＨＦＳからなる群から選択される酵素をコードする遺伝子の障害アレルを検出し、そしてその葉酸塩に対する応答性を判定することが出来る酵母株を提供する。好ましい態様において、前記酵母は、各酵素をコードする遺伝子において上記に記載されている各突然変異及び追加物（ａｄｄｉｔｉｏｎ）を含む。
【００３６】
一つの態様において、本発明は、ＣＨＴの障害アレルを検出し、そしてそのビタミンＢ６に対する応答性を判定することが可能な酵母株を提供する。
【００３７】
一つの態様において、本発明は、ＣＢＳの障害アレルを検出し、そしてそのビタミンＢ６に対する応答性を判定することが可能な酵母株を提供する。
【００３８】
一つの側面において、本発明は、代謝経路、例えば葉酸塩／ホモシステイン代謝等の酵素をコードする遺伝子の障害アレルを検出する方法を提供する。一つの態様において、該障害アレルは、自然発生的なヒトＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＨＦＲ、及び／又はＭＴＨＦＳである。一つの態様において、該障害アレルは、ＣＢＳアレルである。一つの態様において、該障害アレルは、ＣＴＨアレルである。好ましい態様において、前記方法は、本明細書中で提供されるインビボアッセイを使用して補因子による救済が可能であることが示された代謝酵素をコードする遺伝子の障害アレルの検出を含む。
【００３９】
他の側面において、本発明は、対象における代謝経路中の酵素機能不全を同定及び／又は特徴付ける方法であり、該対象から試料を取得し、そして該試料中の複数の障害アレルの存否を検出することを含み、１つ以上の該障害アレルの存在が、該対象が酵素機能不全のリスクを有することを示す、前記方法を提供する。複数の障害アレルは、代謝経路中の同一の酵素をコードする遺伝子に由来するものでも、又は同一の経路中の複数の遺伝子に由来するものであってもよい。
【００４０】
好ましい態様において、１つ以上の障害アレルが、低頻度アレルであり、例えば一般的には、一般集団の４％未満しか発現しておらず、より一般的には、一般集団の３％未満しか発現しておらず、好ましくは２．５〜２％未満、そして最も好ましくは一般集団の１％未満しか発現していない。好ましい態様において、１つ以上の障害アレルは、補因子による救済が可能なアレルである。特に好ましい態様において、該補因子による救済が可能なアレルは、本明細書中で提供されるインビボアッセイ及び方法により同定される。
【００４１】
他の態様において、対象中の酵素の補因子依存的な機能不全の素因を検出する方法が提供され、該方法は、対象から試料を取得し、そして該試料中の複数の障害アレルの存否を検出することを含み、１つ以上の障害アレルの存在が、該対象が救済可能な酵素機能不全を有し得ることを示す。該複数の障害アレルは、前記代謝経路中の同一の酵素をコードする遺伝子に由来するものであっても、又は同一の経路中の複数の遺伝子に由来するものであってもよい。
【００４２】
好ましい態様において、１つ以上の障害アレルは、低頻度アレルであり、例えば一般的には、一般集団の４％未満しか発現しておらず、より一般的には、一般集団の３％未満しか発現しておらず、好ましくは２．５〜２％未満、そして最も好ましくは一般集団の１％未満しか発現していない。好ましい態様において、１つ以上の障害アレルは、補因子による救済が可能なアレルである。特に好ましい態様において、該補因子による救済が可能なアレルは、本明細書中で提供されるインビボアッセイ及び方法により同定される。
【００４３】
試料中の特定のアレルの検出は、当該技術分野で一般的であり、任意の確立した検出プロトコルが、有利に主題の方法に採用され得て、例えば、本明細書中に記載されるように、ハイブリダイゼーション、増幅、シークエンシング、ＲＦＬＰ解析等に基づくプロトコルが挙げられる。また、本明細書中の使用では、核酸試料中のアレルの検出に特に有用なものとして将来開発されるプロトコル及び／又は材料も意図される。
【００４４】
更なる側面において、対象中の代謝酵素機能不全を処置する方法が提供され、この方法は、本明細書中に記載されているように、そのような機能不全がある、若しくは疑われる対象から試料を取得し、該試料中の複数の補因子により救済可能な障害アレルの存否を検出し、そして該試料で検出された障害アレルの数及び種類に基づいて適切な補因子を添加することを含む。
【００４５】
一つの態様において、前記方法は、本明細書中に記載されるように、酵素活性を判定するインビボアッセイの使用を更に含む。
【００４６】
一つの態様において、前記方法は、本明細書中に記載されるように、酵素活性を判定し、及び酵素をコードする核酸中の突然変異を検出するインビボアッセイの使用を更に含む。
【００４７】
一つの態様において、前記方法は、本明細書中に記載されるように、酵素活性を判定するインビボアッセイ、及び温度上昇時の酵素安定性を判定する温度感受性アッセイの使用を更に含む。
【００４８】
一つの態様において、前記方法は、本明細書中に記載されるように、酵素活性を判定するインビボアッセイ、及び該酵素の特定の活性を判定するインビトロアッセイの使用を更に含む。
【００４９】
一つの側面において、本発明は、ホモシステイン代謝の異常に関連する症状又は疾患のリスクをスクリーニングする方法を提供する。該方法は、本明細書中に開示する、ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の障害アレルのスクリーニングを含む。好ましい態様において、該方法は、本明細書中に記載されるインビボアッセイを使用して特定した障害アレルの検出を含む。好ましい態様において、好ましい態様において、前記疾患又は症状は、冠動脈疾患、虚血性脳梗塞、アテローム性動脈硬化、神経管欠損、口唇口蓋裂（ｏｒｏｆａｃｉａｌ  ｃｌｅｆｔ）、子癇前症（ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ）、早産（ｐｒｅ−ｔｅｒｍ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）／低出生体重児（ｌｏｗ  ｂｉｒｔｈｗｅｉｇｈｔ）、反復早期自然流産（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｅａｒｌｙ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｂｏｒｔｉｏｎ）、血栓症、網膜動脈閉塞、ダウン症、直腸結腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、鬱、統合失調症、アルツハイマー症／認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、加齢性黄斑変性症、及び緑内障からなる群から選択される。
【００５０】
一つの態様において、前記方法は、本明細書中に記載される、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＨＦＲ、及び／又はＭＴＨＦＳの障害アレルのスクリーニングを含む。
【００５１】
一つの態様において、前記方法は、本明細書中に記載される、ＣＢＳの障害アレルのスクリーニングを含む。
【００５２】
一つの態様において、前記方法は、本明細書中に記載される、ＣＴＨの障害アレルのスクリーニングを含む。
【００５３】
一つの側面において、本発明は、個人の化学治療剤に対する応答能力を判定する方法を提供する。該方法は、本明細書中に記載される、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の障害アレルを検出する方法の使用を含む。好ましい態様において、前記遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴからなる群から選択される。本明細書中に記載されるインビボアッセイにより、及び／又は特定のアレルを検出する方法の利用により、個人において障害アレルが検出されることは、応答能力の低下を示唆する。
【００５４】
一つの側面において、本発明は、個人の化学治療剤の毒性を判定する方法を提供する。該方法は、本明細書中に記載される、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の障害アレルを検出する方法の使用を含む。好ましい態様において、前記遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴからなる群から選択される。本明細書中に記載されるインビボアッセイにより、及び／又は特定のアレルを検出する方法の利用により、個人において障害アレルが検出されることは、毒性作用の増大を示唆する。
【００５５】
一つの側面において、本発明は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴからなる群から選択される酵素をコードする遺伝子のアレルに対応する単離された核酸を提供する。一つの態様において、該単離された核酸は、表Ａに記載のＳＮＰ等の、ＭＴＨＦＲ遺伝子のアレルの配列を有する及び／又は含む。一つの態様において、該単離された核酸は、表Ｂに記載のＳＮＰ等の、ＡＴＩＣ遺伝子のアレルの配列を有する及び／又は含む。一つの態様において、該単離された核酸は、表Ｃに記載のＳＮＰ等の、ＭＴＨＦＳ遺伝子のアレルの配列を有する及び／又は含む。一つの態様において、該単離された核酸は、表Ｄに記載のＳＮＰ等の、ＭＡＴ１Ａ遺伝子のアレルの配列を有する及び／又は含む。
一つの態様において、該単離された核酸は、表Ｅに記載のＳＮＰ等の、ＭＡＴ２Ａ遺伝子のアレルの配列を有する及び／又は含む。
一つの態様において、該単離された核酸は、表Ｆに記載のＳＮＰ等の、ＧＡＲＴ遺伝子のアレルの配列を有する及び／又は含む。一つの態様において、該核酸は、ＭＴＨＦＲアレルの配列に対応し、そして、Ｍ１１０Ｉ、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、Ｄ２９１Ｎ、Ｒ５１９Ｃ、Ｒ５１９Ｌ、及びＱ６４８Ｐからなる群から選択されるＭＴＨＦＲタンパク質中の非同義的（ｎｏｎ−ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ）突然変異をコードする配列を含む。
【００５６】
一つの側面において、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の障害アレルを検出するアレイを提供する。
【００５７】
一つの態様において、本発明は、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＨＦＲ及びＭＴＨＦＳからなる群から選択される遺伝子の障害アレルを検出するアレイを提供する。好ましい態様において、該アレイは、該群から選択される１つの遺伝子から２つ以上の障害アレルを検出できる。好ましい態様において、該アレイは、該群から選択される複数の遺伝子から２つ以上の障害アレルを検出できる。一つの態様において、該アレイは、該群から選択される複数の遺伝子のそれぞれから２つ以上の障害アレルを検出できる。好ましい態様において、該アレイは、救済可能な障害アレルである障害アレルを検出できる。好ましい態様において、該アレイは、救済可能な障害アレルである複数の障害アレルを検出できる。好ましい態様において、１つ以上の該障害アレルは、低頻度アレルである。
【００５８】
一つの態様において、本発明は、障害ＭＴＨＦＲアレルを検出するアレイを提供する。一つの態様において、該アレイは、Ｍ１１０Ｉ、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、Ｄ２９１Ｎ、Ｒ５１９Ｃ、Ｒ５１９Ｌ、及びＱ６４８Ｐをコードするものからなる群から選択される非同義的突然変異を含むＭＴＨＦＲとハイブリダイズすることができる１つ以上の核酸を含む。
【００５９】
一つの態様において、本発明は、ＣＢＳの障害アレルを検出するアレイを提供する。該アレイは、ＣＢＳの障害アレルとハイブリダイズすることが出来る１つ以上の核酸を含む。
【００６０】
一つの態様において、本発明は、ＣＴＨの障害アレルを検出するアレイを提供する。該アレイは、ＣＴＨの障害アレルとハイブリダイズすることが出来る１つ以上の核酸を含む。
【００６１】
好ましい態様において、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する複数の遺伝子の障害アレルを検出するアレイを提供する。本発明のアレイは、当該技術分野で公知の多くのアレイ、プローブ及び読取り技術を使用したものであり得る。
【００６２】
一つの側面において、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の救済可能な障害アレルを有する個人における異常な葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する症状又は疾患を予防する方法を提供する。一つの態様において、該方法は、個人のビタミンＢ６の取り込みを増大させることを含む。好ましい態様において、該方法は、本明細書中に記載される、異常な葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する疾患又は症状のリスクをスクリーニングする方法を含む。
【００６３】
一つの側面において、本発明は、異常な葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する症状又は疾患を処置する方法を提供し、ここで、患者は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の救済可能な障害アレルを有する。一つの態様において、該方法は、個人の葉酸の取り込みを増大させることを含む。一つの態様において、該方法は、個人のビタミンＢ６の取り込みを増大させることを含む。好ましい態様において、該方法は、本明細書中に記載される、異常な葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する疾患又は症状のリスクをスクリーニングする方法を含む。
【００６４】
一つの側面において、本発明は、異常な葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の救済可能な障害アレルを有する患者の化学治療に対する応答能力を増大させる方法を提供する。該方法は、個人の葉酸の取り込みを増大させることを含む。好ましい態様において、該方法は、本明細書中に記載される、異常な葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する疾患又は症状のリスクをスクリーニングする方法を含む。好ましい態様において、が前記遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴからなる群から選択される。
【００６５】
一つの側面において、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の救済可能な障害アレルを有する個人に対する化学治療の毒性を低下させる方法を提供する。該方法は、個人の葉酸の取り込みを増大させることを含む。好ましい態様において、該方法は、本明細書中に記載される、異常な葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する疾患又は症状のリスクをスクリーニングする方法を含む。好ましい態様において、が前記遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ細胞の増殖速度及びヒトＭＴＨＦＲの細胞内活性に対するフォリン酸添加の効果を表す。（ａ）  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓに記載のように、ｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ  ＭＥＴ１３一倍体酵母の増殖は、９６ウェルプレート中で測定された。培地に所定の濃度のフォリン酸を添加した。ＦＯＬ３と標識した曲線（ＦＯＬ３  ＭＥＴ１３）は、フォリン酸不添加培地中の増殖を表す。（ｂ）メチオニンを含まず所定の濃度のフォリン酸を添加した培地中で、ｐｈＭＴＨＦＲ  を用いて、ｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ  ｍｅｔ１３Δ：：ＫａｎＭＸ一倍体酵母を形質転換した。試験の再現性を示すため、３つの独立した形質転換体を各フォリン酸濃度について試験した。ｍｅｔ１３Δと標識した曲線は、空のベクターで形質転換し、５０μｇ／ｍｌのフォリン酸存在下で増殖させた、単離した細胞を表す。
【００６７】
【図２】非同義的ＭＴＨＦＲ集団変異の機能的影響及び葉酸塩救済可能性を表す。（ａ）６つのＭＴＨＦＲ変異体において、３種類のフォリン酸濃度でメチオニンを含まない培地中でのｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ  ｍβｔ１３Δ：：ＫａｎＭＸ細胞の救済能力を試験した。Ｍ１１０Ｉアレル並びにＭ１１０Ｉ及びＡ２２２Ｖ二重置換アレルは、フォリン酸濃度５０及び２５μｇ／ｍｌのみで試験された。Ｍａｊｏｒと標識された曲線は、集団中で最も一般的なＭＴＨＦＲアレルに相当する。各曲線は、３〜６個の独立した形質転換体のプールから取られた。（ｂ）ＭＴＨＦＲタンパク質の模式図を表す（６５６アミノ酸）。Ｎ末端触媒ドメイン及びＣ末端制御ドメインに分かれており、それらは概ね等しいサイズである（３５）。全ての非同義的変化の位置が表示されている。良性の（Ｂｅｎｉｇｎ）変化は、緑色で示す。変化の位置に付けた１〜４の番号は、葉酸塩による救済が可能なアレルを重症度の順位で示したものである。５番（Ｒ１３４Ｃ）の変化では機能が殆ど失われ、葉酸塩救済は認められない（結果を参照されたい）が、葉酸塩による多少の増強が可能である。
【００６８】
【図３】ＭＴＨＦＲ変異体の酵素活性を表す。前記ＭＴＨＦＲコンストラクトで形質転換した細胞から粗酵母抽出物を得て、そして本明細書中に記載されるように、ＭＴＨＦＲ活性を試験した。所定の時間熱処理により反応させた後、放射性標識をした基質を添加した。測定は、平均で、２つの独立した３重アッセイとして行った。エラーバーは、それらの６つのデータポイントの標準偏差である。
【００６９】
【図４】ＭＴＨＦＲのヘテロ接合変異体の酵母の表現型を表す。ＭＴＨＦＲアレルのホモ接合性又はヘテロ接合性は、本明細書中に記載のように、二倍体酵母で、Ｍａｊｏｒ、Ｒ１３４Ｃ及びＡ２２２Ｖアレルにおいて再現された。二倍体は、それぞれゲノムに組み込まれた単一のＭＴＨＦＲアレルを発現する一倍体株を交雑することにより取得した。フォリン酸添加と増殖との関係は、一倍体と全く同じようにアッセイされた。
【００７０】
【図５】酵母で発現するヒトＭＴＨＦＲ変異体のイムノブロットを表す。（ａ）本明細書中に記載のように、異なるＭＴＨＦＲアレルを保有する酵母細胞から抽出物を得て、抗ＨＡ抗体を用いて検出する。Ａ２２２Ｖ  Ｍ１１０Ｉは二重置換アレルである。Ｍａｊｏｒは集団中最も一般的なＭＴＨＦＲアレルを示す。右端の２つ並んだレーンは、メジャーアレルと非リン酸化Ｔ３４Ａアレルである（３７）。（ｂ）本研究において同定した全てのＭＴＨＦＲの変異体における、下方の非リン酸化バンドと上方のリン酸化バンドとのシグナル強度の比率を、機能的影響の重大度の増大との関数としてプロットした。ｘ軸上のアレルは、良性として分類され、又は活性に関してランク付けされた。全ての良性のアレル（Ｍａｊｏｒアレル及び全ての制御ドメインの変化を含む）がプロットされ、該２つのＭＴＨＦＲ種において前記比率がほぼ等しかったため、マークがオーバーラップした。
【００７１】
【図６】ヒトＢ６酵素：ＣＢＳ及びＣＴＨの、Ｂ６（ピリドキシン）−応答性をアッセイした。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
発明の詳細な説明
上記のように、本発明は、代謝経路内の酵素をコードする遺伝子の障害アレルを同定し、それらの補因子救済に対する感受性を判定する新規インビボアッセイを提供する。機能的に類似する関心のある酵素により補完され得る第一の突然変異、及び補因子の添加に対する依存性を付与する第二の突然変異（又は突然変異群）を含む、複合的な酵母突然変異は、補因子の可用性に応じた酵素補完の実験を可能とする。また、重要なことに、本発明は、酵素をコードする遺伝子中の低頻度障害アレルの補因子救済が、驚くほど普通のことであること、及びこれらのアレルが、前記代謝経路に顕著な影響を及ぼし得ることを実証する。よって、本発明は、酵素をコードするそのような低頻度障害アレルの検出及び特定、並びにそれらの有効な救済を判定することを特に目標とする、診断及び予測方法を意図する。
【００７３】
ＭＴＨＦＲの「Ｎ末端触媒ドメイン」は、ヒトＭＴＨＦＲの１〜３５９アミノ酸を意味する。参照日とＭＴＨＦＲ  ｍＲＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５９５７で見られる。それにコードされているアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５９５８で見られる。
【００７４】
ＭＴＨＦＲ機能不全は、野生型ＭＴＨＦＲ活性からの逸脱を意味する。酵素機能不全並びに関連する症状及び疾患として、例えば、酵素の特異的活性の変化、酵素の異所局在（ｍｉｓｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）、酵素レベルの変化、及び他の変化が挙げられる。
【００７５】
酵素活性やその補因子に対する感受性を測定するインビボアッセイについて述べる。
【００７６】
本明細書中で提供されるアッセイは、機能的に類似する酵母遺伝子中の突然変異を補完するための酵素をコードする遺伝子のアレルの能力を試験し、及びそれらの酵素の補因子に対する応答性を測定するために使用され得る。該アッセイは、アウトプット、又は酵母遺伝子の通常の機能に関連し、その機能不全により変化する表現型の測定を含む。
【００７７】
該アッセイは、機能的に類似する関心のある酵素により補完され得る第一の突然変異、及び補因子の添加に対する依存性を付与する第二の突然変異を含むことにより、第一の遺伝子の機能と関連するアッセイ可能な表現型を示す酵母株の使用を含む。
【００７８】
該方法は、ｉ）酵素をコードする遺伝子の試験アレルを酵母細胞に導入し、ここで該酵母細胞が、該酵素をコードする遺伝子に機能的に類似する第一の遺伝子に第一の突然変異を含み、そして該酵母細胞を、酵素が機能するのに必要な補因子の投与に依存させる第二の遺伝子又は遺伝子群に第二の突然変異を含み、ここで該第一の突然変異が、該第一の遺伝子の機能に関連する酵母の測定可能な特徴（ｍｅａｓｕｒａｂｌｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）を変化させ；
ｉｉ）増殖培地に補因子を添加し；そして
ｉｉｉ）野生型の酵素の存在下よりも試験アレルの存在下で該測定可能な特徴が回復（ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ）し難いことを検出することにより、該試験アレルによる第一の遺伝子突然変異の不完全な補完を検出し、そして試験アレルを障害アレルとして同定する；
ことを含む。
【００７９】
好ましい態様において、前記酵素をコードする遺伝子の試験アレルは、配列において、自然発生的なアレル、又は個々の自然発生的な多型の編集物に対応する。好ましい態様において、前記試験アレルは、ヒト遺伝子のアレル、又は複数のアレルの個々の多型の編集物に対応する。
【００８０】
好ましい態様において、前記酵母は、サッカロマイケス・セレウィシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であるが、他の酵母も使用できる。
【００８１】
一つの態様において、二倍体酵母が使用される。二倍体酵母は、試験アレルにおいてヘテロ接合体又はホモ接合体である。二倍体の酵母は、野生型の遺伝子及び試験アレルを含み得る。二倍体の酵母は、試験アレルの組合せを含み得る。
本明細書中で示すように、機能的障害アレルは、ヘテロ接合表現型を有するアレルを含み得る。一つの態様において、該ヘテロ接合酵母は、補完を試験するアレルにおいてヘテロ接合体である。一つの態様において、該二倍体酵母は、酵素をコードする遺伝子の野生型アレル及び障害アレルを含む。
【００８２】
好ましい態様において、前記アッセイで測定されるアウトプットは増殖である。
【００８３】
好ましい態様において、前記アッセイ方法は、関心のある試験アレルと野生型アレルとの活性の比較を含む。
【００８４】
一つの態様において、本発明は、酵素をコードする遺伝子のアレル等の、試験アレルの活性を判定するインビボアッセイを提供する。一つの態様において、該酵素をコードする遺伝子は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与し、又は関する。他の態様において、試験アレルは、ＭＴＨＦＲアレル、ＡＴＩＣアレル、ＧＡＲＴアレル、ＭＡＴ１Ａアレル、ＭＡＴ２Ａアレル、及びＭＴＨＦＳアレルからなる群から選択され、アッセイにより、葉酸塩ステータスに対するそれらの活性を判定できる。他の態様において、該酵素をコードするアレルは、ＣＴＨアレル及びＣＢＳアレルからなる群から選択される。
【００８５】
一つの態様において、試験アレルはＭＴＨＦＲアレルであり、Ｎ末端触媒ドメインに１つ以上の置換、そしてＣ末端制御領域に１つ以上の突然変異を含む。Ｃ末端領域の置換のみでは典型的には障害機能を有しないが、アレルが機能的に障害のあるものとなるに、それらの置換が他の置換と組み合わされ得る。
【００８６】
好ましい態様において、第一の突然変異は酵母遺伝子ｍｅｔ１３にあり、この突然変異は、野生型ヒトＭＴＨＦＲにより機能的に補完され得る。他の態様において、第一の酵母遺伝子はａｄｅ１６又はａｄｅ１７であり、これらの遺伝子は、野生型ヒトＡＴＩＣにより機能的に補完され得る。一つの態様において、第一の酵母遺伝子はｓａｍ１又はｓａｍ２であり、これらの遺伝子は、野生型ヒトＭＡＴ１又は野生型ヒトＭＡＴ２Ａにより機能的に補完され得る。一つの態様において、第一の酵母遺伝子はｆａｕ１であり、これらの遺伝子は、野生型ヒトＭＴＨＦＳにより機能的に補完され得る。
【００８７】
好ましい態様において、第二の突然変異は、酵母遺伝子ｆｏｌ３にあり、この突然変異は、酵母に、添加される培地中の葉酸塩に対する依存性を付与する。そのような酵母株は、試験アレルの活性、第一の突然変異に依存する試験アレル、及びその葉酸塩ステータスに対する応答を判定するのに使用され得る。例えば、酵母遺伝子ｍｅｔ１に第一の突然変異があり、酵母遺伝子ｆｏｌ３に第二の突然変異がある、複合的な酵母は、ＭＴＨＦＲアレルの活性、及び葉酸塩ステータスに対するその応答を判定するのに使用され得る。
【００８８】
好ましい態様において、前記アッセイ方法は、前記試験アレルにコードされる酵素が葉酸塩可用性に感受性であるか否かを判定するために、葉酸塩の量を変化させることを含む。好ましい態様において、該アッセイ方法は、５０μｇ／ｍｌ未満の葉酸塩の存在下でのアウトプットの測定を含む。好ましい態様において、該アッセイ方法は、約５０μｇ／ｍｌの葉酸塩の存在下でのアウトプットの測定を含む。好ましい態様において、該アッセイ方法は、５０μｇ／ｍｌ以上の葉酸塩の存在下でのアウトプットの測定を含む。
【００８９】
一つの態様において、前記葉酸塩は、酵素をコードする遺伝子の障害アレルが葉酸塩により救済可能であるか否かを判定するために、濃度を変化させられる。
【００９０】
他の態様において、第一の酵母遺伝子はｓｙｓ３であり、前記第二の遺伝子が六重欠失ｓｎｏ１Δ  ｓｎｏ２Δ  ｓｎｏ３Δ  ｓｎｚ１Δ  ｓｎｚ２Δ  ｓｎｚ３Δである。そのような酵母株は、ＣＴＨアレルの活性、及びビタミンＢ６ステータスに対するその遺伝子の応答を判定するのに使用され得る。よって、一つの態様において、本発明は、ＣＨＴアレルの活性を判定するインビボアッセイを提供し、該アッセイは、更に、ビタミンＢ６ステータスに対する活性の変化を判定できる。好ましい態様において、ＣＨＴアレルは、自然発生的なヒトアレルを含む。他の好ましい態様において、ＣＴＨアレルは、個々のヒトＣＴＨアレルの編集物を含む。
【００９１】
他の態様において、第一の酵母遺伝子はｓｙｓ４であり、前記第二の遺伝子が六重欠失ｓｎｏ１Δ  ｓｎｏ２Δ  ｓｎｏ３Δ  ｓｎｚ１Δ  ｓｎｚ２Δ  ｓｎｚ３Δである。そのような酵母株は、ＣＢＳアレルの活性、及びビタミンＢ６ステータスに対するその遺伝子の応答を判定するのに使用され得る。よって、一つの態様において、本発明は、ＣＢＳアレルの活性を判定するインビボアッセイを提供し、該アッセイは、更に、ビタミンＢ６ステータスに対する活性の変化を判定できる。好ましい態様において、ＣＢＳアレルは、自然発生的なヒトアレルを含む。他の好ましい態様において、ＣＢＳアレルは、個々のヒトＣＴＨアレルの編集物を含む。
【００９２】
下記表１は、酵素をコードする遺伝子を列挙し、そして該酵素をコードする遺伝子のアレルの活性を判定するのに使用され得る複合的な酵母突然変異の例を提供する。
【表１】
2011519267.tif 000002
【００９３】
酵母株は、当該技術分野で周知の方法により生産される。例えば、Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢＣ，  ２７４：３２６１３−３２６１８，  １９９９を参照されたい。
【００９４】
酵母株への核酸の導入は、当該技術分野で周知の方法を使用して行われる。例えば、Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢＣ，  ２７４：３２６１３−３２６１８，  １９９９を参照されたい。
【００９５】
酵素をコードする遺伝子の新規アレルを示す。
【００９６】
実施例の項で述べるように、例えば酵素をコードする遺伝子の障害アレルとなるような、酵素に微妙な影響をもたらす単一ヌクレオチド多型は、アレルの頻度にかかわらず、本明細書中で開示されるインビボアッセイを使用して特定され得る。例えば、本明細書中に開示される方法は、アレルが障害アレルであるか否か、もしそうなら、そのアレルが補因子により救済可能か否かを判定するのに使用された。表３及び表Ａ〜Ｆに、本明細書中に記載のアッセイにより特定された（表３）又は特定され得る（表Ａ〜Ｆ）、酵素をコードする遺伝子ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ及びＧＡＲＴの単一ヌクレオチド多型を示す。これらの表には、従来同定されていなかったこれらの遺伝子についてのＳＮＰｓをも提供する。故に、本明細書中には、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ及びＧＡＲＴからなる群から選択される酵素をコードする遺伝子の新規アレルが開示される。これらのアレルは、本明細書中に開示のアッセイを使用して特定され得て、本明細書中に開示のスクリーニング、予防及び処置の方法が有利に利用できる。当業者は、補因子による救済が可能なものとして障害アレルを特定することで、本明細書中に開示されるスクリーニング、予防及び処置の方法が導き出されることを認識及び評価する。
【００９７】
本明細書中で使用されるとき「アレル」は、ヌクレオチド配列、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）であり、ゲノム中に１つ以上の形態で存在する。「アレル」は、本明細書中で使用されるとき、ゲノム遺伝子座（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｏｃｕｓ）の自然発生的な配列に限定されない。「アレル」として、転写産物、及びそのスプライシングされた配列（ｍＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列等）も挙げられる。「アレル」は、自然発生的なアレル又は合成アレルであってもよい。これらは、Ｎ末端触媒ドメインに突然変異を有し、そしてＣ末端制御領域に突然変異を有し得る。
【００９８】
本発明において「ホモ接合」は、遺伝子又はＳＮＰの２つのコピーが、配列上互いに同一で在ることを示す。例えば、酵素をコードする遺伝子の野生型アレルにおいてホモ接合である対象は、該配列の同一のコピーを２つ以上有する。そのような対象は、代謝経路内の補因子依存性酵素機能不全の素因を有し得ない。
【００９９】
本明細書中で使用されるとき「ヘテロ接合」は、２つの異なるコピーのアレルがゲノム中に存在すること、例えば１つのコピーが野生型で、１つのコピーが障害アレルであり得る変異アレルであること等を示す。そのようなゲノムを有する対象は、ヘテロ接合であり、代謝疾患中に補因子依存的な酵素機能不全の素因を有する場合がある。また、「ヘテロ接合」は、複数のアレル中に異なる突然変異を有する対象も包含する。
【０１００】
「障害アレル」は、機能的に障害を有する代謝酵素をコードする遺伝子のアレルを意味し、機能的障害は、補因子による救済が可能であってもなくてもよい。
【０１０１】
「障害アレル突然変異」は、障害アレルの機能的障害を基礎とし、障害アレルを野生型配列から突然変異の部位において峻別する、特定の核酸突然変異を意味する。典型的には、障害アレル突然変異は、単一のコドン中の非同義的点突然変異である。
【０１０２】
「補因子により救済可能」は、補因子のレベルの変化が障害代謝酵素の機能的障害を補償することを意味する。
【０１０３】
補因子の添加には、補因子に変換され得る補因子の前駆体の添加も含む。
【０１０４】
「補因子」は、関心のある酵素の直接的な補因子（例えばＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＭＴＨＦＳにおける葉酸塩）や、関心のある酵素の間接的な補因子である因子を意味する。故に、補因子は、酵素機能に対して、直接的に又は間接的に影響を及ぼす。
【０１０５】
当業者に公知の頻度の尺度として「アレル頻度」があり、これは、特定のＳＮＰを有する集団中の遺伝子の割合（ｆｒａｃｔｉｏｎ）である。任意の遺伝子のアレル頻度は、合計すると１になるはずである。当業者に公知の他の頻度の尺度として、「ヘテロ接合頻度」があり、これは、集団中、それぞれ各親から受け継いだものである、ある遺伝子の２つのアレル、あるいは２つの形態のＳＮＰを保有する個体の割合である。あるいは、遺伝子の特定のアレルがホモ接合である個体の数は、有用な尺度となり得る。アレル頻度、ヘテロ接合頻度及びホモ接合頻度の間の関係は、ハーディ−ワインベルグ平衡により多くの遺伝子において記載されており、それによると、自由に交雑できる集団中のアレル頻度、ヘテロ接合頻度及びホモ接合頻度の間の関係は、平衡となる。殆どのヒト変異は、実質的にハーディ−ワインベルグ平衡に納まる。本明細書中で使用するとき、「低頻度アレル」は、頻度が４％未満のアレルである。
【０１０６】
本明細書中には、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する、あるいは重要な役割を果たすヒトの酵素をコードする遺伝子の新規アレルが開示されている。「葉酸塩／ホモシステイン代謝」とは、葉酸塩及び／又はホモシステイン代謝を意味する。そのような酵素をコードする遺伝子として、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、ＭＴＨＦＳが挙げられる。葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する、あるいは重要役割を果たす酵素をコードする遺伝子のＨｕｇｏ  Ｇｅｎｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  （ＨＧＮＣ）シンボル、ＧｅｎｅｌＤｓ、ＮＣＢＩヌクレオチドアクセッション番号（ＮＣ＿）、ＮＣＢＩポリペプチドアクセッション番号（ＮＢ＿）を、表２に示す。
【表２】
2011519267.tif 000003
【０１０７】
一つの側面において、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する新規ヒト酵素をコードするアレルと配列において対応する単離された核酸を提供する。例えば、本発明は、補因子により救済されるものであってもそうでなくともよい、ＭＴＨＦＲアレル、ＡＴＩＣアレル、ＧＡＲＴアレル、ＭＡＴ１Ａアレル、ＭＡＴ２Ａアレル、及びＭＴＨＦＳアレルからなる群から選択される酵素をコードするアレルと配列において対応する単離された核酸を提供する。これらの新規アレルの例として、低頻度アレルが挙げられる。これらの新規アレルとして、障害アレルが含まれる。
【０１０８】
よって、本明細書において、ＭＴＨＦＲ遺伝子のアレルと配列において対応する単離された核酸が提供され、該核酸は、ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド４０７８；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド４２３４；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド５７３３；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド５８７２；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド６６４２；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド６６５７；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド６６８１；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド６７７４；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１０９０６；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１１６５６；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１１６６８；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１１９０２；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１２２３２；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド２６２２；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１２７５９；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１３０４０；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１４５９３；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１４６１２；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１４７０５；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１３１７０；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１１６４０１；ＭＴＨＦＲ遺伝子のヌクレオチド１１６４５１からなる群から選択されるヌクレオチドにおいて見出されるＳＮＰを含む。これらの位置のＳＮＰの配列を、表Ａに示す。
【０１０９】
また、本明細書において、ＡＴＩＣ遺伝子のアレルと配列において対応する単離された核酸が提供され、該核酸は、ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１１００；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１１１４；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１１７９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１２４４；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１２７０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１２８８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１３０１；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１３８０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１３９６；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４５３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５０６；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１６８９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド７２２７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド７２３２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド７３８８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド８７５６；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド８８０８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４０９９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４１４０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４１４４；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４１８３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４２２９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４２３８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４２４５；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４２６０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４４８９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１４９７０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５００３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５０４０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５０４３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５１４９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５２４０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１５８４４；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド１６０６３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２１３６３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２１３７２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２１４００；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２１５２１；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２１６１１；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２１８７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２２７３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２２８２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２２９１；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２３４２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２５１２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２５１９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２５３８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２５６４；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２５８９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２２７３７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２４９９２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２５００９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２７７５７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２７８５５；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２７９８５；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド２８０１５；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３３９０１；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３３９１９；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３３９２０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３３９３３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５７２３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５７３７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５７４２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５８４０；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５９１７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５９６８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３５９７３；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８３３８；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８３４２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８４３７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８３４２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８５８２；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８６２７；ＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８６６７；及びＡＴＩＣ遺伝子のヌクレオチド３８７２５からなる群から選択されるヌクレオチドにおいて見出されるＳＮＰを含む。これらの位置におけるＳＮＰの配列を、表Ｂに示す。
【０１１０】
また、本明細書において、ＭＴＨＦＳ遺伝子のアレルと配列において対応する単離された核酸が提供され、該核酸は、ＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド８８０８；ＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド８９１２；ＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド８９５７；ＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド８９９８；ＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド５２５６０；ＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド５２８７８；及びＭＴＨＦＳ遺伝子のヌクレオチド５２９０２からなる群から選択されるヌクレオチドにおいて見出されるＳＮＰを含む。これらの位置におけるＳＮＰの配列を、表Ｃに示す。
【０１１１】
また、本明細書において、ＭＡＴ１Ａ遺伝子のアレルと配列において対応する単離された核酸が提供され、該核酸は、ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド５０４５；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド５１８１；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド５２３３；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド６７３９；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド６７９５；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド９８３３；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１０００６；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１０３１２；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１０３３９；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１０３７４；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１０４８４；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１０５５５；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１４０３８；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１４１１４；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１４１７７；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５４２４；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５５００；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５６４６；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７０６；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７１５；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７３０；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７５８；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１６１３３；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１６１７４；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７０６；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７１５；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７３０；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１５７５８；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１６１３３；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１６１７４；ＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１６２１８；及びＭＡＴ１Ａ遺伝子のヌクレオチド１６９７１からなる群から選択されるヌクレオチドにおいて見出されるＳＮＰを含む。これらの位置におけるＳＮＰの配列を、表Ｄに示す。
【０１１２】
また、本明細書において、ＭＡＴ２Ａ遺伝子のアレルと配列において対応する単離された核酸が提供され、該核酸は、ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド２８７１；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド２８７３；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド２９３９；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド３２８７；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド３３９４；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド３４６６；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド３４９８；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド３６５０；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド３７０４；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４１７４；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４４４９；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４４７６；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４６０８；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４６６０；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４６９２；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド４９３１；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド５３１３；ＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド５４６０；及びＭＡＴ２Ａ遺伝子のヌクレオチド５４８０からなる群から選択されるヌクレオチドにおいて見出されるＳＮＰを含む。これらの位置におけるＳＮＰの配列を、表Ｅに示す。
【０１１３】
また、本明細書において、ＧＡＲＴ遺伝子のアレルと配列において対応する単離された核酸が提供され、該核酸は、ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３７８２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３８４２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド７７４５；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド７９８４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１０７７５；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１１５２１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１１５２２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１１５４１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１２３５６；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１４２００；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１４２７３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１４２８２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１４７３９；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１４７８１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８０５５；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８０６４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８１３０；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８１４２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８１９７；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８２３２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１８４０１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２０８１２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２０８２５；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１６１７４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド１５７０６；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２０８６２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２２４８１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２２５２１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５４２５；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５４３３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５６０１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５８６７；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５９１２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５９５１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２５９５６；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２６１２７；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド２６１９５；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３１６２７；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３１６４１；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３１８８７；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３１９０２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３１９３３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３３１７３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３３２６４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３１９３３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３３１７３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３３２６４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３３２８６；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３６９６３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３６９６４；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３７４２８；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３７４３３；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３８７６２；ＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３８９１４；及びＧＡＲＴ遺伝子のヌクレオチド３８９８９からなる群から選択されるヌクレオチドにおいて見出されるＳＮＰを含む。これらの位置におけるＳＮＰの配列を、表Ｆに示す。
【０１１４】
一つの態様において、本発明は、Ｍ１１０Ｉ、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、Ｄ２９１Ｎ、Ｒ５１９Ｃ、Ｒ５１９Ｌ、及びＱ６４８Ｐからなる群から選択されるＭＴＨＦＲタンパク質中の非同義的突然変異をコードする配列を含むヒトＭＴＨＦＲアレルと配列において対応する単離された核酸を提供する。一つの態様において、本発明は、Ｍ１１０Ｉ、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、Ｄ２９１Ｎ、Ｒ５１９Ｃ、Ｒ５１９Ｌ、及びＱ６４８Ｐからなる群から選択されるＭＴＨＦＲタンパク質中の非同義的突然変異をコードする配列を含む２つ以上のヒトＭＴＨＦＲアレルと配列において対応する核酸を提供する。
【０１１５】
本明細書中で使用されるとき、「単離された」という用語は、他の核酸、タンパク質、脂質、糖類、又はたの通常関連する物質を実質的に含まないポリヌクレオチドを包含する。本発明におけるポリヌクレオチド配列として、ＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列が挙げられる。
【０１１６】
本明細書中に示される核酸は、本明細書中に開示される検出方法におけるプローブ（例えばアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ）又はプライマーとして有用である。この目的のための適切なプローブ又はプライマーの設計には、多くの要素を考慮する必要がある。例えば、長さが１０、１５又は１８〜２０又は約３０ヌクレオチドのフラグメントが、特に有用である。４０、５０、８０、９０、１００ヌクレオチド、あるいは完全長等のより長いヌクレオチドも、特定の態様においては好ましい場合がある。約１８〜２０ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレオチドが、当業者間において、アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブとして有用な程度に特異的なハイブリダイゼーションをするのに十分なものと認められている。更に、想定される実施に応じて、実施者は、標的配列に対する様々なプローブの選択性の程度を達成するために、様々なハイブリダイゼーションの条件を採用しようとする。高度な選択性を要する実施において、実施者は、典型的には、ハイブリッドを形成するのに相対的にストリンジェントな条件を採用しようとする。例えば、相対的に塩濃度を下げ、及び／又は高温の条件で、例えば約５０℃〜約７０℃で、０．０２Ｍ〜０．１５ＭのＮａＣｌ等の条件が採用され得る。そのような選択的条件は、プローブと鋳型又は標的ポリヌクレオチドフラグメントとの間のミスマッチがあったとしても、殆ど許容しない。
【０１１７】
また、本発明に係る核酸を含むベクターも提供される。これらのベクターの例として、適切なホスト細胞中で本発明に係る核酸を発現する発現ベクターが挙げられる。
【０１１８】
更に、本発明に係る核酸を含むホスト細胞が提供される。また、本発明のベクターを含むホスト細胞も提供される。また、本発明は、本発明に係る核酸にコードされる酵素を生産する方法を提供し、この方法は、本発明のホスト細胞の培養を含む。
【０１１９】
また、本発明の核酸にコードされる単離された酵素も提供される。
【０１２０】
障害アレルの検出を示す。
【０１２１】
本明細書中に開示する方法（例えば、代謝経路に関与する遺伝子の障害アレルに関連する症状又は疾患を、スクリーニング、予防、及び／若しくは処置する方法）は、一般的に、障害アレルを生じ得る、代謝経路中の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子中の複数の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）；好ましくは試験遺伝子中の複数の既知のＳＮＰの存否を検出することを必要とする。アレル及び／又は所定の配列のＳＮＰは、アレル特異的なハイブリダイゼーション、正常のアレルと障害アレルとを区別できる配列依存性に基づく技術（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ−ｂａｓｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により検出され得る。アレル特異的アッセイは、ハイブリダイゼーションが、マッチする配列（例えば、正常：正常又は障害：障害）の間で行われる場合と、ミスマッチするヌクレオチド配列（例えば、正常：障害）の間で行われる場合とで、効率に差があることに依存する。
【０１２２】
個体中の１つ以上の単一ヌクレオチド多型の存在を検出するために、様々な方法を利用できる。この分野の進歩により、正確な、簡便な、そして廉価な大規模ＳＮＰジェノタイピングが可能となった。最近では、例えば、ダイナミックアレル特異的ハイブリダイゼーション（ｄｙｎａｍｉｃ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  ＤＡＳＨ）、マイクロプレートアレイ対角線ゲル電気泳動（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ａｒｒａｙ  ｄｉａｇｏｎａｌ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：  ＭＡＤＧＥ）、パイロシークエンシング、オリゴヌクレオチド特異的ライゲーション、Ｔａｑｍａｎシステムや、様々なＤＮＡ「チップ」技術、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰチップ等の、幾つかの新しい技術が発表されている。これらの方法は、典型的にはＰＣＲによる、試験遺伝子の増幅を必要とし得る。侵襲的開裂（ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ）による小シグナル分子の生産、それに続くマススペクトロメトリー又は不動化パドロックプローブ（ｐａｄｌｏｃｋ  ｐｒｏｂｅ）及びローリングサークル増幅に基づく、他の新たに開発された方法は、最終的には、ＰＣＲの必要を無くする。特定の単一ヌクレオチド多型を検出する当該技術分野で公知の幾つかの方法の概略を以下に記載している。本発明の方法は、全ての利用可能な方法を含むものと理解される。
【０１２３】
単一ヌクレオチド多型の解析を促進するために、幾つかの方法が開発されている。一つの態様において、単一塩基多型は、Ｍｕｎｄｙ，  Ｃ．  Ｒ．  （米国特許第４，６５６，１２７号）等に記載の特製のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドを使用して検出され得る。この方法によれば、アレルの３’に隣接したアレル配列に相補的なプライマーを、特定の動物又はヒトから得られた標的分子とハイブリダイズさせることができる。この標的分子上のアレルが、存在している特定のエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含むならば、その誘導体はハイブリダイズしたプライマーの末端に取り込まれるであろう。このような取り込みはプライマーをエキソヌクレアーゼに対し耐性とし、それによりその検出を可能とする。試料のエキソヌクレアーゼ耐性誘導体の実体は既知であることから、プライマーがエキソヌクレアーゼに耐性となったという発見は、標的分子のアレルに存在するヌクレオチドが、反応に使用したヌクレオチド誘導体のアレルと相補的であることを示す。この方法は、大量の外来配列データの決定を要しないという利点を持っている。
【０１２４】
本発明の他の態様において、アレルのヌクレオチドの同一性を判定するのに、溶液に基づく方法を用いる。Ｃｏｈｅｎ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．（フランス国特許２６５０８４０；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）。米国特許第４６５６１２７号のＭｕｎｄｙの方法のように、アレルの３’に隣接するアレル配列に相補的なプライマーを使用する。この方法は、標識ジデオキシヌクレオチド誘導体を用いてその部位のヌクレオチドの同一性を判定するものであるが、この誘導体は、もし該アレルのヌクレオチドに相補的であるならば、プライマーの末端に取り込まれるであろう。
【０１２５】
Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ分析又はＧＢＡ（商標）としても知られる別の方法が、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．（ＰＣＴ出願第９２／１５７１２号）により記載されている。Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．の方法は、標識したターミネーター及びアレルの３’配列に相補的なプライマーの混合物を使用する。よって、取り込まれるこの標識化ターミネーターは、試験遺伝子のアレル中に存在するヌクレオチドに相補的であって、かつこれにより決定される。Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（フランス国特許２６５０８４０；ＰＣＴ出願第ＷＯ９１／０２０８７号）の方法とは対照的に、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．の方法は、プライマー又は標的分子を固相に固定化する、不均質相アッセイ（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ  ａｓｓａｙ）であることが好ましい。
【０１２６】
近年、ＤＮＡ中のアレルをアッセイするための幾つかのプライマーにより誘導するヌクレオチド取り込み法が記載された（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．  １７：７７７９−７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８：６８４−６９２（１９９０），  Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）  ８８：１１４３−１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．  １：１５９−１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＧＡＴＡ  ９：１０７−１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０８：１７１−１７５（１９９３））。これらの方法は全て、アレルの塩基を識別するのに標識化デオキシヌクレオチドの取り込みに頼っている点で、ＧＢＡ（商標）とは相違している。このような形式では、シグナルは、取り込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドのランに存在する多型は、そのランの長さに比例するシグナルを生ずる（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．  ５２：４６−５９（１９９３））。
【０１２７】
上記の診断方法に使用する核酸試料を取得するために、任意の細胞種又は組織を利用できる。好ましい態様において、ＤＮＡ試料は、既知の技術（静脈穿刺等）により取得した血液又は唾液等の体液から取得される。あるいは、核酸試験は乾燥試料（例えば毛髪又は皮膚）について実施できる。ＲＮＡ又はタンパク質を使用する場合、使用される細胞又は組織は、酵素をコードする遺伝子を発現していなければならない。
【０１２８】
診断方法はまた、核酸の精製が必要とならないよう、生検又は切除から得られる患者組織の（固定化及び／又は凍結した）組織切片について、ｉｎ  ｓｉｔｕで直接実施される場合もある。核酸試薬をこのようなｉｎ  ｓｉｔｕ法のためにプローブ及び／又はプライマーとして使用できる（例えば、Ｎｕｏｖｏ，Ｇ．Ｊ．，  １９９２，  ＰＣＲ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹを参照されたい）。
【０１２９】
主として１個の核酸配列の検出に焦点を絞った方法に加えて、次の検出スキームでもプロフィールを評価することができる。例えばディファレンシャルディスプレイ法、ノーザン分析及び／又はＲＴ−ＰＣＲを利用することにより、フィンガープリントプロフィールを作製できる。
【０１３０】
好ましい検出方法は、酵素をコードする遺伝子の１つ以上のアレルの領域をオーバーラップするプローブを用いる、アレル特異的ハイブリダイゼーションである。
【０１３１】
アレル特異的ハイブリダイゼーションを用いた障害アレルの検出を示す。
【０１３２】
当該技術分野で周知の様々な方法が、アレル特異的ハイブリダイゼーションによる障害アレルの検出に使用され得る。好ましくは、試験アレルは、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）でプローブされ；そして各ＡＳＯは、既知のアレルの配列を含む。ＡＳＯの解析は、アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブが標的ポリヌクレオチドフラグメントとハイブリダイズする能力を試験することによる、標的ポリヌクレオチドフラグメント中の特定の配列置換を検出する。好ましくは、アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブは、障害アレルの配列（又はその相補配列）を含む。標的ポリヌクレオチドフラグメント中の障害アレルの存在は、野生型のアレルの配列を含むオリゴヌクレオチドプローブが標的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしない条件下での、アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリヌクレオチドフラグメントとの間のハイブリダイゼーションにより示される。障害アレルの配列を有するアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブと標的ポリヌクレオチドフラグメントとの間のハイブリダイゼーションの欠如は、標的フラグメント中に障害アレルが存在しないことを示す。
【０１３３】
一つの態様において、試験遺伝子は、標準的なドットブロット形式においてプローブされ得る。ＡＳＯに対応する配列を含む試験遺伝子内の各領域は、固相表面上に個別にアプライ（例えば膜上に個別のドットとして）される。各領域は、例えば、当該技術分野で周知の方法を使用して、個別のＰＣＲ増幅産物等として生産され得る（例えばＭｕｌｌｉｓ，  Ｋ．  Ｂ．，  １９８７，  米国特許第４，６８３，２０２号の実施態様を参照されたい）。
【０１３４】
ＡＳＯ解析を実行するためのドットブロット形式の変法として使用され得る膜ベース形式には、限定されないが、リバースドットブロット（多重増幅アッセイ）、及び多重アレル特異的診断アッセイ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｓｓａｙ：ＭＡＳＤＡ）がある。
【０１３５】
リバースドットブロット形式において、例えば既知の配列を有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドプローブは、固相表面上に不動化され、続いて標識された試験ポリヌクレオチドフラグメントを含む試料とハイブリダイズされる。斯かる場合、標識試験ポリヌクレオチドフラグメントを含む試料を調製するために、増幅に先立ち、プライマーが標識されるか、又はＮＴＰが標識される場合もある。あるいは、試験ポリヌクレオチドフラグメントは、単離及び／又は合成後に標識される場合もある。多重形式において、個々の試料は、標的配列が１つではなく、試験遺伝子中の複数の標的配列を含む。例えば、それぞれが１つ以上のＡＳＯ標的配列を含む複数のＰＣＲ産物が同一の試料ドット中にアプライされる。複数のＰＣＲ産物は、Ｃａｓｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第５，５８２，９８９号等の方法を使用して、単一の増幅反応で同時に生産され得る。従って、対応する配列が試料ドット中に現れる各ＡＳＯにより、同一のブロットがプローブされ得る。
【０１３６】
ＭＡＳＤＡ形式は、各ブロットをプローブするために、複数のＡＳＯを使用する（複数の標的配列を有するドットを含む）ことにより、多重形式の複雑さのレベルを拡張する。この方法は、Ａ．  Ｐ．  Ｓｈｕｂｅｒの米国特許第５，５８９，３３０号及びＭｉｃｈａｌｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ５９（４）：  Ａ２７２，  ｐｏｓｔｅｒ  １５７３  （Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９６）に記載されており、それぞれ全体を参照することにより本明細書中に援用する。第一に、複数のＡＳＯプローブと不動化試料との間のハイブリダイゼーションを検出する。この方法は、所定のドット中の複数の標的配列における突然変異の発生が、任意の陽性ハイブリダイゼーションシグナルが、対応する障害アレルとハイブリダイズするプローブ混合物中の単一のＡＳＯに基づくというのに十分に稀であるという前提による。それから、ハイブリダイズするＡＳＯは、それをハイブリダイゼーション部分から単離して、そのヌクレオチド配列を決定することにより同定される。
【０１３７】
ドットブロット、リバースドットブロット、多重、及びＭＡＳＤＡ形式において使用され得る適切な材料は当該技術分野で周知であり、限定されないが、ナイロン及びニトロセルロース膜等が挙げられる。
【０１３８】
標的配列をＰＣＲ増幅により生産するとき、出発材料は染色体ＤＮＡであり、その場合、ＤＮＡは直接増幅される。あるいは、出発材料はｍＲＮＡであり得て、その場合、ｍＲＮＡは最初にｃＤＮＡに逆転写され、それから周知のＲＴ−ＰＣＲにより増幅される（例えばＧｅＩｆ  ａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，５６１，０５８号を参照されたい）。
【０１３９】
上記方法は、限定された数の配列の変異（障害アレル等）の穏当なスクリーニングに適している。しかし、迅速な分子診断、良好なコストの大規模スクリーニングの要望を受け、ＡＳＯの基礎概念を統合しつつ、突然変異検出の許容量及び試料数を大幅に改良した技術が開発された。上記の方法に対するそれらの変法として、限定されないが、大規模チップアレイ配列ベース技術（ｌａｒｇｅ  ｓｃａｌｅ  ｃｈｉｐ  ａｒｒａｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−  ｂａｓｅｄ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）が挙げられる。大規模アレイを使用することにより、多くの配列変異を迅速に解析できる。チップアレイの応用と開発の違いについてのレビューは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １２：  １１０−１１５  （Ｍａｒｃｈ  １９９６）及び  Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  １  ：１８３−２００  （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １９９６）にカバーされている。チップアレイの製造には、幾つかのアプローチが存在する。限定されないが：不動化オリゴヌクレオチドを付着させる固相担体、及びプローブに対する標的ポリヌクレオチドの配列ベース技術における、変異や変化を同定するための標識技術に違いがある。
【０１４０】
「ＤＮＡチップ」の大規模解析の好ましい方法は、Ｈａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １４：４４１−４４７  （１９９６）に詳述されており、その全てが本明細書中に参照により援用される。Ｈａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．が述べているように、９６，０００種類以上のオリゴヌクレオチドの高密度アレイでは、長さ２０ベースの各ヌクレオチドが、光誘導化学合成を用いて、単一のガラス又はシリコンチップ上に不動化される。アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブの数及びデザイン次第で、潜在的には、配列中のあらゆる塩基の変化を確認できる。故に、チップに利用されるアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブは、例えば集団中でまだ知られていないＳＮＰ等の配列の変異を含む場合があり、あるいはＳＮＰは集団中で既知のＳＮＰに限定される場合もある。
【０１４１】
チップ上の特定のオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーションの前に、当業者に周知の方法により、試験試料が単離、増幅及び標識（蛍光マーカー等により）される。試験ポリヌクレオチド試料は、それから、不動化されたアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチドフラグメントの不動化アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブに対する配列ベース技術の強さが定量され、そして参照配列と比較される。得られた遺伝子情報を、分子診断に使用できる。通常、限定されないが、分子診断における「ＤＮＡチップ」の用途は、既知のＳＮＰのスクリーニングである。しかし、それでは、この分野で既知の突然変異の解析のみにこの技術を限定してしまうことになる。本発明は、従来可能であったよりも遥かに多くの突然変異についてのアレル特異的ハイブリダイゼーション解析を可能とする。故に、大規模ＡＳＯ解析の効率及び包括性は拡張されつつ、面倒な終末間（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ）配列解析の必要性を低下させ、既知の突然変異のみならず、包括的に、許容される原理により予想される起こり得るすべての突然変異に対応し、そしてこれらの面倒な試験に関連するコスト及び時間が減少する。
【０１４２】
従って、一つの側面において、本発明は、酵素をコードする遺伝子又は酵素をコードする核酸の障害アレルを検出する方法を提供する。例えば、本明細書中で、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＣＢＳ、ＣＴＨ、ＧＡＲＴ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＭＴＨＦＳのアレルを検出する方法が提供される。
【０１４３】
一つの態様において、酵素をコードする核酸中のＳＮＰの検出は、核酸のシークエンシングを含む。一つの態様において、酵素をコードする核酸の突然変異の検出は、ＰＣＲを含む。一つの態様において、酵素をコードする核酸の突然変異の検出は、ＲＦＬＰ解析を含む。一つの態様において、酵素をコードする核酸の突然変異の検出は、核酸ハイブリダイゼーションを含む。ハイブリダイゼーションによる突然変異ＳＮＰの検出は、例えば、ＳＮＰを含む酵素をコードする核酸又はその断片とストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸を含む核酸アレイを使用する等して行われ得る。
【０１４４】
一つの態様において、前記方法は、本明細書中に記載される、酵素をコードする対立遺伝子の活性を判定するインビボアッセイの使用を含む。
【０１４５】
また、酵素をコードする遺伝子の障害アレルを検出及び特定するために、複数の方法が組み合わせて使用される場合もある。一つの態様において、該複数の方法は、本明細書中に記載される、酵素をコードする遺伝子の活性を判定するための、及び酵素をコードする核酸中のＳＮＰを検出するためのインビボアッセイを含む。
【０１４６】
一つの態様において、前記複数の方法は、本明細書中に記載される、酵素活性を判定するためのインビボアッセイ、及び温度上昇に対する酵素の安定性を判定する温度感受性アッセイの使用を含む。
【０１４７】
一つの態様において、前記複数の方法は、本明細書中に記載される、酵素活性を判定するためのインビボアッセイ、及び酵素の特異的活性を判定するためのインビトロアッセイの使用を含む。
【０１４８】
好ましい態様において、ＭＴＨＦＲの障害アレルは、Ｍ１１０Ｉ、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、Ｄ２９１Ｎ、Ｒ５１９Ｃ、Ｒ５１９Ｌ、及びＱ６４８Ｐからなる群から選択されるＭＴＨＦＲタンパク質中の突然変異をコードする非同義的置換を含む。特に好ましい態様において、障害アレルは、Ｍ１１０Ｉ、Ｈ２１３Ｒ、Ｄ２２３Ｎ、及びＤ２９１Ｎからなる群から選択されるＭＴＨＦＲタンパク質中の突然変異をコードする非同義的置換を含む。
【０１４９】
酵母株について以下に説明する。
【０１５０】
一つの側面において、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する酵素の障害アレルを検出できる酵母株を提供する。そのような酵母株は、本明細書中に記載の方法において有用である。該酵母株は、
関心のある機能的に類似の酵素により補完され得る第一の突然変異、及び補因子の添加に対する依存性を付与する第二の突然変異（又は突然変異群）を含むことにより、第一の遺伝子の機能と関連するアッセイ可能な表現型を示す。
【０１５１】
一つの態様において、本発明は、ＣＨＴの障害アレルを検出し、そしてビタミンＢ６に対する応答性を判定できる酵母株を提供する。好ましい態様において、該酵母株は、ｃｙｓ３に突然変異を有し、その突然変異が六重欠失ｓｎｏ１Δ  ｓｎｏ２Δ  ｓｎｏ３Δ  ｓｎｚ１Δ  ｓｎｚ２Δ  ｓｎｚ３Δである。
【０１５２】
一つの態様において、本発明は、ＣＢＳの障害アレルを検出し、そしてビタミンＢ６に対する応答性を判定できる酵母株を提供する。好ましい態様において、該酵母株は、ｃｙｓ４に突然変異を有し、その突然変異が六重欠失ｓｎｏ１Δ  ｓｎｏ２Δ  ｓｎｏ３Δ  ｓｎｚ１Δ  ｓｎｚ２Δ  ｓｎｚ３Δである。
【０１５３】
一つの態様において、本発明は、ＭＴＨＦＲの障害アレルを検出し、そして葉酸塩に対する応答性を判定できる酵母株を提供する。好ましい態様において、該酵母株は、ｍｅｔ１３及びｆｏｌ３に突然変異を有する。
【０１５４】
以下に、疾患リスクのスクリーニングについて述べる。
【０１５５】
一つの態様において、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する症状又は疾患のリスクをスクリーニングする方法を提供する。該方法は、本明細書中に記載される葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の障害アレルのスクリーニングを含む。
【０１５６】
一つの態様において、本発明は、酵素機能不全に関与する疾患又は症状のリスクをスクリーニングする方法を提供し、ここで該酵素は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴからなる群から選択される。好ましい態様において、該疾患又は症状は、心血管疾患、冠動脈疾患、虚血性脳梗塞、アテローム性動脈硬化、神経管欠損、口唇口蓋裂（ｏｒｏｆａｃｉａｌ  ｃｌｅｆｔ）、子癇前症（ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ）、早産（ｐｒｅ−ｔｅｒｍ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）／低出生体重児（ｌｏｗ  ｂｉｒｔｈｗｅｉｇｈｔ）、反復早期自然流産（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｅａｒｌｙ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｂｏｒｔｉｏｎ）、血栓症、網膜動脈閉塞、ダウン症、直腸結腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、鬱、統合失調症、アルツハイマー症／認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、加齢性黄斑変性症、及び緑内障からなる群から選択される。前記方法は、本明細書に記載される、ＭＴＨＦＲの障害アレル、ＡＴＩＣの障害アレル、ＣＢＳの障害アレル、ＣＴＨの障害アレル、ＧＡＲＴの障害アレル、ＭＡＴ１Ａの障害アレル、ＭＡＴ２Ａの障害アレル及びＭＴＨＦＳの障害アレルからなる群から選択される障害アレルを検出する方法の使用を含む。
【０１５７】
一つの態様において、本発明は、ＣＢＳ機能不全に関与する疾患又は症状のリスクをスクリーニングする方法を提供する。好ましい態様において、該疾患又は症状は、心血管疾患、冠動脈疾患、虚血性脳梗塞、アテローム性動脈硬化、神経管欠損、口唇口蓋裂、子癇前症、早産／低出生体重児、反復早期自然流産、血栓症、網膜動脈閉塞、ダウン症、直腸結腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、鬱、統合失調症、アルツハイマー症／認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、加齢性黄斑変性症、及び緑内障からなる群から選択される。前記方法は、本明細書に記載される、ＣＢＳの障害アレルを検出する方法の使用を含む。
【０１５８】
一つの態様において、本発明は、ＣＴＨ機能不全に関与する疾患又は症状のリスクをスクリーニングする方法を提供する。好ましい態様において、該疾患又は症状は、心血管疾患、冠動脈疾患、虚血性脳梗塞、アテローム性動脈硬化、神経管欠損、口唇口蓋裂、子癇前症、早産／低出生体重児、反復早期自然流産、血栓症、網膜動脈閉塞、ダウン症、直腸結腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、鬱、統合失調症、アルツハイマー症／認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、加齢性黄斑変性症、及び緑内障からなる群から選択される。前記方法は、本明細書に記載される、ＣＴＨの障害アレルを検出する方法の使用を含む。
【０１５９】
以下に、化学治療応答能力のスクリーニングについて述べる。
【０１６０】
一つの態様において、本発明は、個人の化学治療に対する応答能力を判定する方法を提供する。該方法は、本明細書に記載される、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の障害アレルを検出する方法の使用を含む。好ましい態様において、該遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴからなる群から選択される。個人に障害対立遺伝子が検出されることは、応答能力の低下を示す。
【０１６１】
好ましい態様において、化学治療剤は、メトトレキサート又は５−フルオロウラシルである。
【０１６２】
以下に、化学治療の毒性のスクリーニングについて述べる。
【０１６３】
一つの側面において、本発明は、個人の化学治療の毒性を判定する方法を提供する。該方法は、本明細書に記載される、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の障害アレルを検出する方法の使用を含む。好ましい態様において、該遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴからなる群から選択される。個人に障害対立遺伝子が検出されることは、毒性ポテンシャルの増大を示す。
【０１６４】
好ましい態様において、化学治療剤は、メトトレキサート又は５−フルオロウラシルである。
【０１６５】
以下に、予防及び処置について述べる。
【０１６６】
一つの側面において、本発明は、代謝酵素機能不全に関連する症状又は疾患を防止する方法を提供する。該方法は、上記アッセイ及び方法から取得される情報（障害アレルが補因子感受性を有するという）に基づいて個人の補因子の取り込みを増大させることを含む。好ましい態様において、該方法は、本明細書中に記載の、補因子による救済が可能な代謝遺伝子の障害アレルの検出を含む。
【０１６７】
一つの態様において、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝の異常に関連する症状又は疾患を防止する方法を提供する。該方法は、個人の葉酸塩及び／又はビタミンＢ６の取り込みを増大させることを含む。好ましい態様において、該方法は、本明細書中に記載の、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関連する遺伝子の障害アレルの検出を含む。
【０１６８】
一つの態様において、本発明は、補因子による救済が可能な酵素をコードする遺伝子の障害アレルを有する個人の酵素機能不全に関連する症状又は疾患を防止する方法を提供し、該酵素をコードする遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴからなる群から選択される。該方法は、個人の葉酸塩の取り込みを増大させる。
【０１６９】
一つの態様において、本発明は、障害ＣＢＳアレルを有する個人のＣＢＳ機能不全に関連する症状又は疾患を防止する方法を提供する。該方法は、個人のビタミンＢ６の取り込みを増大させる。
【０１７０】
一つの態様において、本発明は、障害ＣＴＨアレルを有する個人のＣＴＨ機能不全に関連する症状又は疾患を防止する方法を提供する。該方法は、個人のビタミンＢ６の取り込みを増大させる。
【０１７１】
一つの態様において、本発明は、葉酸塩／ホモシステイン代謝の異常に関連する症状又は疾患を処置する方法を提供する。該方法は、個人の葉酸塩及び／又はビタミンＢ６の取り込みを増大させることを含む。好ましい態様において、該方法は、本明細書中に記載の、葉酸塩／ホモシステイン代謝に関与する遺伝子の障害アレルの検出を含む。
【０１７２】
一つの態様において、本発明は、補因子による救済が可能な酵素をコードする遺伝子の障害アレルを有する個人の酵素機能不全に関連する症状又は疾患を処置する方法を提供し、該酵素をコードする遺伝子は、ＭＴＨＦＲ、ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴからなる群から選択される。該方法は、個人の葉酸塩の取り込みを増大させる。
【０１７３】
一つの態様において、本発明は、障害ＣＢＳアレルを有する個人のＣＢＳ機能不全に関連する症状又は疾患を処置する方法を提供する。該方法は、個人のビタミンＢ６の取り込みを増大させる。
【０１７４】
一つの態様において、本発明は、障害ＣＴＨアレルを有する個人のＣＴＨ機能不全に関連する症状又は疾患を処置する方法を提供する。該方法は、個人のビタミンＢ６の取り込みを増大させる。
【実施例】
【０１７５】
実施例１：葉酸による救済が可能なＭＴＨＦＲ酵素変異のヒトにおける有病率
低頻度変異の発生率及び影響を判定し、及びビタミン救済の現象を調査するために、葉酸による救済が可能なＭＴＨＦＲ酵素の大集団における有病率を求めた。５００人余りの集団から１４個の異なる非同義的置換が同定され、それらの５つが酵素機能に障害を有していた。全ての有害なアレルは少なくともある程度葉酸塩応答性であったが、５つの突然変異タンパク質中４つが、細胞内葉酸塩レベルを増大させることにより、完全に通常のレベルまで回復させられた。
【０１７６】
実施例１．１：方法
【０１７７】
ＤＮＡ試料集団
ＤＮＡ試料は、Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  （Ｃａｍｄｅｎ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  ＵＳＡ）から提供された。
【０１７８】
ＭＴＨＦＲエキソンのシークエンシング
上記試料中の１１個のＭＴＨＦＲをコードするエキソンを、Ｖａｒｉａｎｔ  ＳｅｑＲ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｌｉｎｅ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）から購入したプライマーのペアを使用して、添付のプロトコルに従い、ＰＣＲシークエンシングによりシークエンシングした。これらのエキソン領域は、ＮＣＢＩ  ＭＴＨＦＲ参照配列ｍＲＮＡ（ＮＭ＿００５９５７）に対応しており、６５６アミノ酸のタンパク質（ＮＰ＿００５９５８）に対応していた。シークエンシングアンプリコン及びプローブの情報は、下記のアンプリコンにおいて、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｑｏｖ／ｑｅｎｏｍｅ／ｐｒｏｂｅで入手可能である。
【０１７９】
Ｅｘｏｎ  １  （ＲＳＡ００００４５６８４）；  Ｅｘｏｎ  ２  （ＲＳＡ００００４５６８０）；  Ｅｘｏｎ  ３  （ＲＳＡ０００５７７２４９）；  Ｅｘｏｎ  ４  （ＲＳＡ００００４５６７８）；  Ｅｘｏｎ  ５  （ＲＳＡ００００４５６７６）；  Ｅｘｏｎ  ６  （ＲＳＡ００１３０８７９５）；  Ｅｘｏｎ  ７  （ＲＳＡ００１２５３１９３）；  Ｅｘｏｎ  ８  （ＲＳＡ００００４５６６９）；  Ｅｘｏｎ  ９  （ＲＳＡ０００５８０７６７）；  Ｅｘｏｎ  １０  （ＲＳＡ  ０００５８０７６６）；  Ｅｘｏｎ  １１  （ＲＳＡ０００５８０７６５，  ＲＳＡ００００２７２４０）。コーディング領域に及ぶエキソン１１の部分のみシークエンシングされた。ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇに高い信頼性を保証するために、分析には高水準の読取りのみが使用された（標的エキソンに及ぶ領域は平均ＱＶスコア＞４０；全てのエキソンは二重鎖読取りでカバーされた）。これらのフィルタリング基準に基づき、各エキソンにおいて成功率（ｓｕｃｃｅｓｓ  ｒａｔｅ）は８９．９％〜９５％であった（表１）。全ての配列情報は、ＳｅｑＳｃａｐｅソフトウェア一式（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）．３を使用して解析した。品質管理の手段として、ｂａｓｅ  ｃａｌｌのサブセットをＴａｑＭａｎ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によるアレル区別アッセイで直接評価し、下記の公表されている遺伝子型データとの比較を行った。
【０１８０】
プラスミド
誘導性酵母ＧＡＬ１プロモーターのコントロール下にある５’末端ＨＡ（ヘマグルチニンＡ）エピトープタグ付加ＭＴＨＦＲオープンリーディングフレーム（参照タンパク質配列ＮＰ＿００５９４８）及びＵＲＡ３選択マーカーを保有するプラスミドｐｈＭＴＨＦＲは、Ｗａｒｒｅｎ  Ｋｒｕｇｅｒ  （Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  ｓｕｐｒａ）から頂戴したものである。このプラスミドを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｋｉｔ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた部位指向的突然変異形成による全てのＭＴＨＦＲ変異を再構築するバックボーンとした。ガラクトース誘導性ＭＴＨＦＲ変異体を含む組み込みプラスミドをＰＣＲクローニングにより創作した。該フラグメントは、ＵＲＡ３、ｐｈＭＴＨＦＲベースプラスミド由来のＧＡＬ１プロモーター及びＭＴＨＦＲコーディング領域をｐＨＯ−ポリ−ＨＯ（Ｖｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２９：ｅ５９）内に含み、該プラスミドは、このカセットのＨＯ遺伝子座へのターゲット組み込み（ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を可能とする。
【０１８１】
株
全ての一倍体酵母株は、Ｓ２８８ｃがバックグラウンドのＭＡＴａ  ｈｉｓ３  Ｉｅｕ２  ｕｒａ３  Ｉｙｓ２とした（Ｂｒａｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｙｅｓｔ  １４：１１５−３２）。ＭＡＴａ／ＭＡＴα二倍体株は、同系ＭＡＴａ及びＭＡＴα株を交雑することにより創作した。Ｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ及びｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ  ｍｅｔ１３Δ：：ＫａｎＭＸ株は、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｇｅｎｅ−  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来の株を用いる標準的な交雑／胞子形成技術により取得した。二倍体（ＭＴＨＦＲ変異体においてホモ接合又はヘテロ接合）は、それぞれ組み込まれたバージョンのＧＡＬ１：ＭＴＨＦＲ変異カセットを含むｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ  ｍｅｔ１３Δ：：ＫａｎＭＸ一倍体を交雑することにより創作された。
【０１８２】
増殖条件
葉酸塩を含まない合成増殖培地として、最少培地（Ｓｈｅｒｍａｎ，  ２００２，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．，  ｅｄｓ．  Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ｐｐ．３−４１）にＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ  （Ｑｂｉｏｇｅｎｅ）、及び葉酸塩を除く全てのビタミンを加えたものを使用した。全てのｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ細胞に５０μｇ／ｍｌフォリン酸（Ｓｉｇｍａ）を加えた。動的増殖測定のため、ｆｏｌ３Δ：：ＫａｎＭＸ  ｍｅｔ１３Δ：：ＫａｎＭＸ細胞をＧＡＬ１プロモーター駆動性ＭＴＨＦＲ変異体で形質転換し、そしてフォリン酸（５０μｇ／ｍｌ）及びメチオニン（２０μｇ／ｍｌ）を添加した合成ガラクトース培地（２％ガラクトース、０．１％グルコース）中で対数増殖期に至るまで増殖した。細胞を３回洗浄し、そして様々な量の葉酸塩を含むがメチオニンを含まない新鮮なガラクトース培地を含む９６ウェルプレートに分注した。ウェルあたりの体積は２００μｌで、ＯＤ５９５＝０．０１の細胞密度で開始した。３０℃で振盪無しで、Ｔｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓプレートリーダー中で６０時間以上、吸光度を１５〜３０分置きに測定した。図１ａにおいて使用されたＭＥＴ１３細胞は、全ての増殖がメチオニン非存在下で行われた点を除き、上記と同じ方法で行った。
【０１８３】
ＭＴＨＦＲ酵素活性アッセイ
生理的条件下でＭＴＨＦＲにより触媒される反応の反対の反応を測定するアッセイは、既知のアッセイ（Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  ｓｕｐｒａ）において、酵母抽出物を、リシスバッファー（１００ｍＭスクロース、５０ｍＭ  ＫＨＰＯ４（ｐＨ６．３、プロテアーゼ阻害剤カクテル）３５０μｌ中の４０  ＯＤ５９５細胞（上記フォリン酸及びメチオニンを加えたｆｏｌ３  ｍｅｔ１３細胞）相当のビーズリシスにより作製する点改変して行った。抽出物を短い遠心分離で清澄し、そして１０〜２００μｇの抽出物を使用して、活性の線形範囲（ｌｉｎｅａｒ  ｒａｎｇｅ）を決定した。放射性標識（５−［１４Ｃ］ＭｅＴＨＦ）は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓのものを用いた。加熱処理において、５−［１４Ｃ］ＭｅＴＨＦを入れていない反応混合物を一定時間５５℃まで加熱して、そこで５−［１４Ｃ］ＭｅＴＨＦを添加し、反応を進めた。
【０１８４】
ＭＴＨＦＲイムノブロット解析
１０  ＯＤ５９５細胞（上記フォリン酸及びメチオニンを加えたｆｏｌ３Δｍｅｔ１３Δ細胞）相当を、２００μｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で１５分間抽出した。５０μｌのＳＤＳサンプルバッファー（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ６．８、０．４％  ＳＤＳ）を上澄に加え、それをボイルし、清澄し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＨＡタグを付したＭＴＨＦＲ変異体をＬＩ−ＣＯＲ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｅｒで検出した。マウスモノクローナル抗ＨＡ抗体はＳｉｇｍａ製を用いた。ローディングコントロールの酵母３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｐｇｋｉｐ）は、Ｊｅｒｅｍｙ  Ｔｈｏｒｎｅｒ  （Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，  ＣＡ）から頂戴したマウス抗体で検出された。
【０１８５】
実施例１．２：結果
【０１８６】
ヒトにおけるＭＴＨＦＲ変異
様々な民族の５６４人について、ヒトＭＴＨＦＲのコーディング領域の全体を、１１個のエキソンそれぞれにおけるコーディング部分を増幅することによりシークエンシングした。コーディング領域の長さ、調査された対立遺伝子の数及び全ての非同義的置換は、表３に列挙されている。いずれもコーディングＤＮＡは２，８１，１０６ｂｐにのぼり、サンプリングされた全てのエキソンについて１，０００を超えるアレルまで解析した。これらのデータから１４の非同義的変化が見出され、それらの１１個が１％未満のマイナーアレル頻度（ＭＡＦ）を示し、７つのアレルは１回しか見られなかった。幾つかの低頻度アレルは、過去に見られたものであった（表３）。低頻度非同義的置換の数は、ランダム集団の細部まで採取した他の研究（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １６：２６５−７７；  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，  ２００４，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １４：１８２１−３１；  Ｇｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２７：４３５−３８）と十分に一致した。更に、よく研究された一般的な置換は、予想された世界の集団頻度を示した（Ａ２２２Ｖ−２９．３％、Ｅ４２９Ａ−２３．６％、Ｒ５９４Ｑ−４．４％）。
【０１８７】
ｂａｓｅ−ｃａｌｌｉｎｇの正確性における品質管理チェックとして、独立してＰＣＲ増幅を行い、データの一致が１００％であった１００サンプルにおいて、ＴａｑＭａｎアレル識別アッセイにより、８つの変異体（シングルトン（ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ）を４つ含む）を再解析した。更に、Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｅｈｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｖｑｅｎｏｍ／）及びＰｅｒｌｅｇｅｎ  （Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）のいずれもこの研究において一部が重複していたＣｏｒｉｅｌｌの試料を使用しており（ｄｂＳＮＰ  ｂｕｉｌｄ  １２７）、それらの集団ジェノタイピングデータは、８１７の遺伝子型コール（ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｃａｌｌ）中８１４において（９９．６％）一致していた。３つの不一致の遺伝子座の２つにおいて、発明者らの配列データは明確であり、正しいと思われた。
【０１８８】
４８０人から完全なコーディング領域の配列が取得された。１８人（４％）が低頻度非同義的変異のキャリアであった。意義深いことに、個人の多様性の大部分は、低頻度の変化を起こした３つの一般的な多型（Ａ２２２Ｖ、Ｅ４２９Ａ及びＲ５９４Ｑ）の組み合わせによりもたらされる。殆どの場合データからハプロタイプを類推することが出来なかったこの群中に、２８の異なる非同義的遺伝子型が観察された。
【０１８９】
インビボでのＭＴＨＦＲ−葉酸塩の相互作用
遺伝的変異の臨床的意義は機能的結果を手掛かりとしているため、全ての非同義的変化は、それらのＭＴＨＦＲ機能に対する影響について、そして重要なことに障害アレルが葉酸塩応答性を呈するか否かについて試験された。葉酸塩要求性（ｆｏｌ３）がｍｅｔ１３株に導入され、増殖培地中のフォリン酸濃度を変化させることにより、細胞内の葉酸塩濃度を滴定した。酵母中でフォリン酸（５−フォルミル−テトラヒドロフォレート）はメテニル−テトラヒドロフォレートに代謝され、これが、他の葉酸塩補酵素に転換され得る（Ｃｈｅｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５：１４０５６−６３）。このようにして、ヒトＭＴＨＦＲ機能性（メチオニン非存在下での増殖）は、次第に限定的になる葉酸塩ステータスとの関数として測定された。
【０１９０】
これらの条件下で、フォリン酸を５０μｇ／ｍｌ以上添加しても、顕著な増殖に対する利益は生じなかった（図１ａ）。しかしながら、５０μｇ／ｍｌ以下の濃度では、増殖は、培地中の利用可能なフォリン酸濃度と明確に相関していた。故に、細胞内の葉酸塩レベルは、この範囲に用量を限定した。ＦＯＬ３細胞の増殖と比較すると、フォリン酸の添加は、内在性の葉酸塩の生合成の欠損を完全に補償しなかった。しかし、このギャップは、おそらく、増殖速度ではなく細胞が静止期に入る密度を反映するものであり、これは、フォリン酸の取り込みの制限、又は唯一の葉酸塩資源としてのフォリン酸の利用の制限を反映している。
【０１９１】
ヒトＭＴＨＦＲがｆｏｌ３  ｍｅｔ１３細胞を補完する能力は、培地中へのフォリン酸の補給に応じて発揮された（図１ｂ）。葉酸塩の補給に関しては、ＧＡＬ１プロモーターからのヒトＭＴＨＦＲの発言は、Ｍｅｔ１３ｐの欠損を完全には補償しなかった（図１ｂと図１ａの等量の葉酸塩を添加したｆｏｌ３  ＭＥＴ１３細胞とを比較されたい）。故に、葉酸塩濃度が５０μｇ／ｍｌ以下である場合、葉酸塩及びＭＴＨＦＲの両方が増殖の律速要因となり、ＭＴＨＦＲ活性の微妙な変化が、増殖のリードアウトに反映され得る。葉酸塩を５０μｇ／ｍｌ以上添加しても、内在性酵母ＭＴＨＦＲ（ＭＥＴ１３；図１ａ）又はメジャーなヒトアレル（図１ｂ）のいずれかを発現する細胞の増殖において顕著な利益をもたらさないが、ＭＴＨＦＲの障害アレルにおいては有利である（下記参照）。
【０１９２】
ＭＴＨＦＲ変異の機能的影響
一定範囲の葉酸塩濃度において５つの非同義的アレルを試験して、観察される機能的影響の範囲を表現した（図２ａ）。Ａ２２２Ｖ変異体の機能は、１００μｇ／ｍｌのフォリン酸でほぼ完全に回復したが、添加レベルを４分の１にする（２５μｇ／ｍｌ）と、活性は顕著に低下した（メジャーアレルとの比較）。故に、これらの条件下で、既知のＡ２２２Ｖ欠損の葉酸救済は再現された。これらの条件下での酵母内の減少した葉酸塩の正確な細胞内濃度は分からなかった。しかし、Ａ２２２Ｖアレルの挙動は、酵母及びヒト細胞中の葉酸塩濃度を効果的にキャリブレートした。Ａ２２２Ｖの酵素活性は、一般的なアレルの本来の活性の約５０％で（Ｍａｒｔｉｎ，  ２００６，  Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １６：２６５−７７；  Ｒｏｚｅｎ，  １９９７，  Ｔｈｒｏｍｂ．  Ｈａｅｍｏｓｔ．  ７８：５２３−  ２６）、葉酸塩濃度５０μｇ／ｍｌでは、増殖率は５０％低下した。更に、フォリン酸を５０μｇ／ｍｌ加えて増殖させた細胞を用いた無細胞アッセイにおけるＡ２２２Ｖ酵素活性も、５０％の低下が観察された（図３）。故に、酵母のＡ２２２Ｖの挙動は、ヒト細胞における挙動を再現していた。
【０１９３】
４つの低頻度アレルを、同様に試験した（図２ａ）。いずれの葉酸塩濃度においても増殖に影響を受けなかったＲ５１９Ｃは、良性と思われる。Ｒ１３４Ｃは全ての葉酸塩濃度で重度に阻害されていたが、若干葉酸応答性であった。Ｄ２２３Ｎ及びＭ１１０Ｉアレルは、フォリン酸濃度が５０μｇ／ｍｌ以上のとき増殖がメジャーアレルと類似するが、フォリン酸濃度が５０μｇ／ｍｌ以下のときはメジャーアレルを下回る点で、Ａ２２２Ｖと同様の葉酸による救済が可能な活性を示している（阻害の程度は軽いが）。
【０１９４】
ＭＴＨＦＲ酵素は、Ｎ末端触媒ドメイン及びＣ末端制御ドメインを有し、アロステリック阻害剤のＳ−アデノシルメチオニンと結合する（ＡｄｏＭｅｔ；  Ｓｕｍｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６１：７６９７−７７００）。触媒ドメインにある６つのアレル（Ｍ１１０Ｉ、Ｒ１３４Ｃ、Ｈ２１３Ｒ、Ａ２２２Ｖ、Ｄ２２３Ｎ及びＤ２９１Ｎ）の内、良性なのはＨ２１３Ｒのみであった（図２ｂ）。Ｍ１１０Ｉ、Ａ２２２Ｖ、Ｄ２２３Ｎ及びＤ２９１Ｎは、これらの酵素変異体が、葉酸塩添加量が多い（フォリン酸５０−２００μｇ／ｍｌ）ときはメジャーアレルと類似した挙動をとり、更に葉酸塩の添加量が限定されたときは顕著に弱体化した点で、葉酸により救済可能な挙動を示した。Ｒ１３４Ｃ変異体は、葉酸塩添加量のレベルにかかわらず、メジャーアレルの増殖速度に達することはなく、ゆえに、これは、応答性であるが救済可能ではないアレルとして分類された。制御ドメイン中の置換（Ｇ４２２Ｒ乃至Ｔ６５３Ｍ）はいずれも、メジャーアレルと同様の挙動をとった（図２ｂ）。
【０１９５】
複数のアミノ酸置換の間の協調的な相互作用
変異の分布は、２つあるいはそれ以上の置換を含む複合的なアレルの存在を示唆する。故に、幾つかの複合的なアレル（個人試料に発生したものに基づく）を創作し、複数のアレルの組合せが協調的又は抑制的効果を有するか否かを試験した。一般的な変異とＡ２２２Ｖとの組み合わせ（Ａ２２２Ｖ  Ｅ４２９Ａ及びＡ２２２Ｖ  Ｒ５９４Ｑ）において、マイナーアレルのホモ接合が、それらのアレルの１つ以上において観察され、故に、そのような突然変異が存在するのは当然である。しかし、該低頻度の変異において、Ａ２２２Ｖ変異と新規変異のいずれも、常にヘテロ接合である。ハプロタイプは知られていないので、これらの個人は、２つの単一置換アレル又は複合的なアレルのいずれかを保持し得る。故に、全てのあり得る二重置換アレルが創作され、そしてその機能をテストした（Ｍ１１０ｌ  Ａ２２２Ｖ等、図２ａ）。試験された２つの葉酸塩濃度において、Ｍ１１０ｌ  Ａ２２２Ｖ変異は、個別のアレルの合計よりも活性が低く、これは、複合的なアレルにおける協調的な機能不全が生じたことを意味する。フォリン酸濃度が５０μｇ／ｍｌのとき、Ｍ１１０Ｉ変異は、メジャーアレルと殆ど区別できないが、この変異は、Ａ２２２Ｖ機能不全を顕著に促進した。試した全ての組み合わせにおいて、単独でも機能に影響をもたらすアレル（Ｍ１１０Ｉ及びＤ２９１Ｎ）はＡ２２２Ｖと組み合わされたときに協調的であったが、良性の変化は、Ａ２２２Ｖの機能不全を促進しなかった。
【０１９６】
生化学アッセイによるインビボでの機能の再現
前記増殖アッセイの信頼性を評価するため、無細胞ＭＴＨＦＲ酵素アッセイを、粗酵母ライゼート中の全ての変異体において実行した（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓを参照されたい）。特定の活性の測定に加え、様々な処理時間で５５℃で加熱処理することにより、変異体の熱不安定性（酵素安定性の尺度）を試験した。内因性の活性と増殖率との間には、良好な関連性があった（図３：メジャーＭＴＨＦＲアレル、Ａ２２２Ｖ、Ｒ１３４Ｃの非加熱試料の活性を図２の増殖曲線と比較されたい）。既に報告されているように（２０、２５、３４）、Ａ２２２Ｖ変異の酵素活性は、メジャーアレルの酵素活性の約５０％を示した。増殖アッセイにおける場合と同様に、Ｒ５１９Ｃ変異は、メジャーアレルと類似の活性を呈し、それは、一般的なＥ４２９Ａ変異等の全ての制御ドメインにおける変化を象徴するものであった（データ無し）。Ｅ４２９Ａが酵素機能に影響を与えるという報告（２７）があったが、発明者らのデータは、この変化が良性であるという他の報告（１０，２０，２５）を支持する。
【０１９７】
Ａ２２２Ｖ突然変異酵素は、メジャー型よりも不安定で、熱不安定性が高く（Ｇｕｅｎｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ６：３５９−６５；  Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ９８：１４８５３−５８）、そしてこの変異の葉酸塩救済は、該タンパク質の安定性を向上させることにより達成されていると考えられる。ここで使用される条件（５５℃２０分）の下で、Ａ２２２Ｖは殆ど活性を失うが、メジャーアレルは元の活性の３０％を維持し、これは過去の研究（２０）を支持する。新しいＤ２２３Ｎアレルも、葉酸塩による救済を示す熱不安定性の増大を呈したが、酵素の機能不全はそれほど著しくはなかった。
【０１９８】
ヘテロ接合の表現型
低頻度アレルは通常はヘテロ接合として生じるので、その重要性が見過ごされる傾向がある。ＭＴＨＦＲアレルのヘテロ接合性の機能的重要性をより良く理解するために、それぞれ統合発現カセットから発現する同一のアレル（ホモ接合）又はヘテロ接合を構成する異なるアレルのいずれかを有する一倍体の株を交雑して、２つのヒトＭＴＨＦＲコピーを有する二倍体酵母を創作した（方法参照）。上記のように、これらの株において、葉酸塩添加に対する増殖の変化を試験した（図４）。このアッセイにおいて、ヘテロ接合は、葉酸塩を制限した条件の下では増殖の表現型が増悪し、これは、機能が低下したアレルが野生型と相互優性（ｃｏｄｏｍｉｎａｎｔ）であることを示す。
【０１９９】
前記増殖アッセイで測定した細胞内のＭＴＨＦＲ活性は、アレルの相加的効果を反映しているように見えた。更に、ヘミ接合（１つに統合した発現アレルを有する二倍体；データ無し）を用いた追加的な実験において、ヘテロ接合中のメジャーアレルとマイナーアレルとの間でのヘテロダイマーの形成が、突然変異アレルを殆ど又は全くレスキューしないことを示した。例えば、二倍体ＭＴＨＦＲメジャーアレル／ヌル細胞（ヘミ接合）は、全ての条件において、メジャーアレル／Ｒ１３４Ｃヘテロ接合と同様の挙動を示し、低葉酸塩培地（Ａ２２２Ｖが不活性化される条件）においては、メジャーアレル／Ａ２２２Ｖヘテロ接合と同様の挙動を示した。故に、ヘテロ接合細胞の有害なアレルの表現型への関与は容易に観察され、ヒトゲノム中のヘテロ接合性に起因するより広範な表現型の結果（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ）が生じる可能性がある。
【０２００】
酵母中の変異ＭＴＨＦＲのリン酸化修飾
ＭＴＨＦＲ変異タンパク質の量は、Ｎ末端に付したヘマグルチニンＡ（ＨＡ）エピトープタグに対する抗体を使用するイムノブロッティングにより判定された。全ての試料において、タンパク質は約７２ｋＤ及び７８ｋＤの二重のバンドとして検出された。このバターンは、昆虫細胞で発現させたヒトＭＴＨＦＲにおいて観察されたものと酷似していた（３７）。上の方のバンドは、Ｎ末端付近で多重にリン酸化されたＭＴＨＦＲを表す。昆虫細胞中でのＭＴＨＦＲのリン酸化は、３４の位置にあるスレオニンに依存しており、このスレオニンをアラニンに置き換える（Ｔ３４Ａ）と、リン酸化が起らなくなる（３７）。この変異は、サッカロマイケス・セレウィシアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中のヒトＭＴＨＦＲにも同じ効果を生じ、これは、昆虫細胞と同様に、上の方のバンドはリン酸化ＭＴＨＦＲであることを示唆する（図５ａ）。
【０２０１】
ＭＴＨＦＲのリン酸化は、負の制御に関与することが主張されている（３７）。この仮説を支持するものとして、ここで観察されたリン酸化パターンは、細胞内のＭＴＨＦＲ活性と直接対応していたという事実が挙げられる。特に、非リン酸化：リン酸化形態の量の比率は、活性の低下に応じて増大していた（図５ｂ）。興味深いことに、全ての変異体の合計量（リン酸化形態＋非リン酸化形態）は、顕著な違いは無いように見えた。有害な置換が内因性の酵素安定性に影響するとしたら、他の要素がタンパク質レベルの規定に関与していない限り、このような結果にはならないはずである。
【０２０２】
【０２０３】
全ての機能的障害アレルは、葉酸塩及びＦＡＤの結合部位を含む、ＭＴＨＦＲのＮ末端側にある触媒部分（３６）に集中していた。一方、ＭＴＨＦＲのＣ末端制御ドメイン中に同定された８つの非同義的置換は、いずれも、補完アッセイ及び無細胞酵素アッセイの両方において良性であった。更に、制御ドメインの置換及びＡ２２２Ｖの複合的なアレルには、協調作用は認められなかった（図２）。Ｅ４２９Ａにおいて報告されたように（１０、２０、３５）、これらの変化が中性（ｎｅｕｔｒａｌ）であったか、又はアッセイがこれらの変化による機能不全を検出できなかったことが考えられる。しかし、この知見は、深刻な臨床的表現型を生じるＭＴＨＦＲの突然変異の殆どが触媒ドメインにあったという観察（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｄ．ｃｆ．ａｃ．ｕｋ／ａｃ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）と一致していた。制御ドメインは、触媒ドメインの安定性において一定の役割を果たすという説がある（２０）。そうであるのなら、この役割はアミノ酸の置換にある程度耐性であり得て、また、サッカロマイケス・セレウィシアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＮ末端ドメインとアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＣ末端ドメインとを融合させたキメラＮＴＨＦＲ（酵母タンパク質の制御ドメインに約５０個の非同義的置換が入ったものに相当する）が全く酵素活性を損なわない（３８）理屈も説明できる。Ｃ末端ドメインの一般的なＲ５９４Ｑ変異が、ＣＯＳ−１細胞で発現されたときに、酵素活性に影響を及ぼすという、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌの報告（２５）は、注目すべきである。この変化は良性のように見えるが、それは酵母で発現した酵素の細胞ベース及び無細胞アッセイにおいてのことである。この矛盾の理由は明らかでないが、これらの著者らがイムノブロット解析において一つの種のＭＴＨＦＲ（リン酸化ステータス不明）しか観察していないので、ホストの発現システムを反映したものであると考えられる。
【０２０４】
ヘテロ接合の表現型
機能的障害ＭＴＨＦＲアレルにおいてヘテロ接合である二倍体酵母の挙動から、ヘテロ接合の表現型は、特に葉酸塩を制限した条件下で明確に観察できることが示された（図４）。集団中で殆どの遺伝的変異がヘテロ接合として生じ、そして低頻度アレルが優勢にヘテロ接合として生じるため、ヘテロ接合の表現型の出現は顕著であった。この結果は、リンパ球抽出物中の細胞ＭＴＨＦＲ活性がジェノタイプと直接対応しており：Ａ２２２Ｖがヘテロ接合の個体（Ａ／Ｖ）の酵素活性は、メジャーアレル（Ａ／Ａ）ホモ接合の活性の約６５％で、Ａ２２２Ｖホモ接合（Ｖ／Ｖ）ではＡ／Ａホモ接合活性の３０％しか保たれなかった（７）。血清トリグリセリドレベルに関与するアディポカインＡＮＧＰＴＬ４の全範囲のアレルを試験した最近の研究において、非同義的Ｅ４０Ｋアレルにおけるヘテロ接合は、血漿トリグリセリドレベルの低下と有意に関連した（１８）。故に、ヘテロ接合が表現型として検出可能なケースは、低頻度変異の寄与の重要性を増大する。なぜなら、ホモ接合よりもキャリアの数が遥かに多くなり得るからである。ヘテロ接合の表現型が、ＭＴＨＦＲ活性が細胞増殖の律速要因となる条件下で観察されたことに留意されたい。酵素的ステップがヒトの特定の経路において律速要因となるか否かは、遺伝的及び環境的要素に依存する。
【０２０５】
突然変異及びＭＴＨＦＲリン酸化及び量
触媒ドメイン中の非同義的変化の葉酸救済は、タンパク質の安定化により（Ａ２２２Ｖ；９，１０）、又は補因子のＫｍ等の、分子機能の他の面を克服することにより（２，５）生じる。少なくとも１つの有害アレルＤ２２３Ｎは、Ａ２２２Ｖと同様の熱不安定性の増大を示し（図３）、これは安定性の低下を支持する。ＭＴＨＦＲの葉酸塩による救済が可能なアレルは、葉酸塩により不安定な形態が安定化されるものであるとする説は、（２５）で示唆されているように、ＭＴＨＦＲタンパク質のレベルは、変異体の内因性の活性に比例することを示唆する。しかし、発明者らの観察によると、リン酸化ステータスは酵素活性と相関する（図５）が、全体量（リン酸化形態＋非リン酸化形態）はそれほど変化しているように見えなかった（２倍以内）。恐らく、Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌはリン酸化が内因性の活性に阻害的に作用することを報告している（３７）ので、リン酸化ＭＴＨＦＲが酵素の活性形態である可能性は低い。これと一致して、増殖アッセイ及び酵素アッセイの両方におけるリン酸化阻害Ｔ３４Ａ変異体の挙動は、メジャーアレルのものと同様であった（データ無し）。更に、葉酸塩のレベルが低い場合ＭＴＨＦＲの安定性が低下する（存在量の測定による）が、この効果は、機能障害を有する変異体においては促進しない。これらの結果は、有害な変化がタンパク質不安定化を招くという予想と食い違うので、未知の競合的制御応答の存在が推測される。このように、変異体により活性は全く異なり得る（図２）が、合計のタンパク量は異ならない場合がある。発明者らが得た結果は、リン酸化によるフィードバック制御（３７）に一致するが、ターンオーバーにおけるリン酸化の役割は知られていない。このように、Ｔ３４Ａの変化の効果を他の障害アレルと組み合わせて決定することは、興味深い者となり得る。
【０２０６】
葉酸塩／ホモシステイン代謝経路
【０２０７】
図６は、神経管欠損（ＮＴＤ）、並びに葉酸塩の添加が予防となり、及び血漿中のホモシステインレベルがリスクの増大に関与する他の不都合な妊娠転帰のエチオロジーに関連する、代謝経路のステップを示している。この図は、Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  （ＫＥＧＧ）参照経路データベース（ｗｗｗ  ｇｅｎｏｍｅ−ｊｐ／ｋｅｇｇ）を改変したものであり、葉酸及びホモシステイン代謝のステップを描画する。該経路は、メチオニンシンターゼ反応を介して関連しており、そして細胞培養、動物モデルシステム中の僅かな葉酸塩の欠乏、及びヒト障害ホモシステイン再メチル化と関連している（例えばＳｔｏｖｅｒ  ＰＪ  ２００４  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｆｏｌａｔｅ  ａｎｄ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ１２  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  Ｎｕｔｒ  Ｒｅｖ  ６２：Ｓ３−１２を参照されたい）。ホモシステインは、ＮＴＤの危険因子と目されている（例えばＭｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ  ，  １９９５  Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｉｅｓ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｂｙ  ｎｅｕｒａｌ  ｔｕｂｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｌａｎｃｅｔ  ３４５  １４９−１１５１を参照されたい）。葉酸塩の欠乏も、Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＭ、例えばＳｔｏｖｅｒ，  ｓｕｐｒａ）により誘導されるメチル化を阻害し、これはＭＴＨＦＲ及びＣＢＳの両方のアロステリック阻害剤である（例えばＫｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ  ，  １９９９  Ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ−β−ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｏｍｏｃｙｓｔｉｎｕｒｉａ  Ｈｕｍ  Ｍｕｔ  １３３６２−３７５，  Ｄａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ，  １９８２  Ｉｎ  Ｆｌａｖｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ｅｄｓ  Ｍａｓｓｅｙ，  Ｖ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｃ  Ｈ  （Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），  ｐｐ  １６５−１７２を参照されたい）。更に、Ｓ−アデノシル−ホモシステイン対Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＳＡＨ／ＳＡＭ）の比率の増大は、ＮＴＤ発生のメカニズムにおいて提案されている（例えばＳｔｏｖｅｒ，  ｓｕｐｒａ，  Ｓｃｏｔｔ，  ２００１  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｆｏｌａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｔｕｂｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｂｉｂｌ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔａ  ５５  １９２−１９５．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１．  Ｆｏｌａｔｅ，  Ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｕｂｅ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  Ｅｘｐｔｌ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  ２２６  ２４３−２７０．  １，５，６）を参照されたい）。
【０２０８】
ホモシステイン代謝に関与する葉酸を利用しない酵素
【０２０９】
システイン−β−シンターゼ（ＣＢＳ）の機能不全はホモシステインレベルの亢進を引き起こし、シスタチオニン−β−リアーゼ（ＣＴＨ）のＳＮＰは、同様にホモシステインの増大に関与する（例えばＫｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ  ，  ｓｕｐｒａ，  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４  Ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ＣＴＨ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  ６５：４８３−４８６を参照されたい）。ＣＢＳ及びＣＴＨは、いずれも葉酸塩を利用しない酵素であるが、補因子ビタミンＢ６に依存しており、障害アレルは、葉酸塩／ホモシステインの欠乏のリスクを有する。ＣＢＳ及びＣＴＨの障害アレルは、Ｂ６治療の標的であり、これは、本明細書に記載した、ＭＴＨＦＲ障害アレルに対する葉酸塩治療に類似する。ＣＢＳ及びＣＴＨの機能及びビタミン応答性は、酵母補完アッセイにおいて再現されている（図６）。
【０２１０】
サッカロマイケス・セレウィシアエ（Ｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において再現される、ＣＢＳ突然変異酵素のビタミンＢ６救済
【０２１１】
ＣＴＨ及びＣＢＳのビタミンＢ６（ピリドキシン）濃度に対する変化をアッセイするために、酵母株を加工した（図６）。サッカロマイケス・セレウィシアエ（Ｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＣＴＨ及びＣＢＳのオルソログは、それぞれｃｙｓ３及びｃｙｓ４であり、それらの機能不全は、システイン要求性を引き起こす。酵母株のバックグラウンドが、ｃｙｓ３又はｃｙｓ４の機能不全以外に、ピリドキシン生合成を欠損しているもの（六重欠失ｓｎｏ１Δ  ｓｎｏ２Δ  ｓｎｏ３Δ  ｓｎｚ１Δ  ｓｎｚ２Δ  ｓｎｚ３Δ，  Ｓｔｏｌｚ  ｅｔ  ａｌ  ，  ２００３  Ｔｐｎ１ｐ，  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ６  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８  １８９９０−１８９９６）であることを除き、本明細書中に記載したＭＴＨＦＲにおける試験と同様の方法で、ピリドキシン濃度に対して酵素を試験した。
【０２１２】
図６は、固形培地上での定量的酵母増殖アッセイを示し、これは、いずれの酵素の機能不全も、ピリドキシン添加に応じてレスキューされること、及びＣＢＳの２つのホモシスチン尿性アレル（Ｉ２７８Ｔ  Ｒ２６６Ｋ）のビタミン応答性がこの補完アッセイで再現されることを示す。これらのアレルは、野生型酵素よりもビタミンＢ６レベルの制限に感受性となり、そして、感受性の強さに応じて強く増殖機能不全を示した。ヒトＣＢＳによるｃｙｓ４突然変異のシステイン要求性のレスキューは、既に実証されている（Ｋｒｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５．  Ａ  ｙｅａｓｔ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ−β−ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅ  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ４  １１５５−１１６１；  Ｋｒｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４  Ａ  ｙｅａｓｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｂｅｔａ−  ｓｙｎｔｈａｓｅ；  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｓ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９１：６６１４−６６１８）。
【０２１３】
実施例２：追加のＭＴＨＦＲ変異体サンプルの同定
神経管欠損に罹患した２５０人の新生児それぞれ、又は神経管欠損に罹患していない２５０人の新生児それぞれの乾燥血液スポット（Ｇｕｔｈｒｉｅ  Ｃａｒｄ）から、集団ゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲノムＤＮＡサンプル中のＭＴＨＦＲエキソンを、実施例１に記載したようにシークエンシングした。酵素の構造に影響が出ている突然変異を、コンセンサスヒトゲノム配列（ＮＭ＿００５９５７）に対するミスマッチとして、配列データから同定した。全ての置換を、以下の表Ａに列記する。
【０２１４】
【表３】
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【０２１５】
実施例１に記載される機能的影響を観察するために、一定範囲の葉酸濃度における斯かるＭＴＨＦＲ変異の機能的な影響を、本明細書中に記載のインビボ酵母アッセイを使用して検査した。
【０２１６】
実施例３：ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ及びＧＡＲＴ変異体の同定
【０２１７】
ＤＮＡサンプルの集団
神経管欠損に罹患した２５０人の新生児それぞれ、又は神経管欠損に罹患していない２５０人の新生児それぞれの乾燥血液スポット（Ｇｕｔｈｒｉｅ  Ｃａｒｄ）から、集団ゲノムＤＮＡを単離した。葉酸塩／ホモシステイン代謝経路の１８個の候補遺伝子中の合計２３４個のエキソンをシークエンシングした。酵素の構造に影響が出ているシークエンシング及びアンプリコンの突然変異を、表２に列記したＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴのコンセンサスヒトゲノム配列に対するミスマッチとして、配列データから同定した。ＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴの全ての置換を、以下の表Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦにそれぞれ列記する。
【０２１８】
【表４】
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【０２１９】
【表５】
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【０２２０】
【表６】
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【０２２１】
【表７】
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【０２２２】
【表８】
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【０２２３】
【表９】
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【０２２４】
【表１０】
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【０２２５】
【表１１】
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【０２２６】
実施例１に記載される機能的影響を観察するために、一定範囲の葉酸濃度における斯かるＡＴＩＣ、ＭＴＨＦＳ、ＭＡＴ１Ａ、ＭＡＴ２Ａ、及びＧＡＲＴ変異の機能的影響を、上記で開示したインビボ酵母アッセイを使用して、及び表１に記載の適切な酵母株バックグラウンドを使用して検査した。
【０２２７】
全ての引用文献は、引用されることによりそれらの全てが本明細書中に明示的に援用される。
【０２２８】
【表１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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