(57)【要約】  前立腺癌を発見するためのアッセイは、１つの遺伝子、例えばＧＳＴＰ１内からの、複数のメチル化マーカーを発見するための試薬を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のメチル化部位の発見のための試薬を有する前立腺癌アッセイであって、各標的が同じ遺伝子の異なる部分を目的とする、前立腺癌アッセイ。
【請求項２】
前記遺伝子がＧＳＴＰ１である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
少なくとも１つのメチル化部位がプロモーター領域にある、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
２つ以上のメチル化部位が、プロモーション領域にある、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項５】
試薬が少なくとも３つの異なるメチル化部位を発見する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記同じ遺伝子の異なる部分を目的とする、複数のメチル化部位のみの発見のための試薬を有する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記遺伝子はＧＳＴＰ１である、請求項６に記載のアッセイ。
【請求項８】
少なくとも１つのメチル化部位が、プロモーター領域にある、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項９】
２つ以上のメチル化部位が、プロモーション領域に存在する、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項１０】
試薬が、少なくとも３つの異なるメチル化部位を発見する、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項１１】
配列番号２及び配列番号４を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を有する、前立腺癌アッセイ。
【請求項１２】
配列番号６を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を更に含む、請求項１２に記載のアッセイ。
【請求項１３】
配列番号２及び配列番号６を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を有する、前立腺癌アッセイ。
【請求項１４】
配列番号４を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を更に含む、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１５】
同じ遺伝子内からの複数のメチル化ヌクレオチド配列を発見するための試薬、及び変換試薬を含む、キット。
【請求項１６】
前記変換試薬が重亜硫酸ナトリウムを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記遺伝子がＧＳＴＰ１である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記試薬が、ＦＦＰＥ組織サンプルとの使用のために設計されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
前記サンプルが、前立腺サンプルである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記試薬が、尿サンプルとの使用のために設計されている、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、他の診察方法と連繋する、メチル化した遺伝子の調査、及びこれらの方法と共に使用するキットに関する。
【０００２】
後成的な変化（ＤＮＡヌクレオチド配列における変化を伴わない、遺伝子発現の変化）は、主にＤＮＡメチル化における修飾及びクロマチン再構築を含む。ＤＮＡメチル化における変化が、広範な腫瘍及び遺伝子において立証されてきた。Ｅｓｔｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、Ｂａｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、及びＥｓｔｅｌｌｅｒ（２００５）。特定のＣｐＧ部位におけるメチル化の程度は、患者のサンプルによって様々であり得る。Ｊｅｒｏｎｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、及びＰａｏ  ｅｔ  ａｌ（２００１）。
【０００３】
最近では多くの潜在的なメチル化マーカーが開示されている。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）は、それらを発現する遺伝子のメチル化状態が、前立腺癌のための重要な予後診断的及び診断的価値を有し得る、代表的なタンパク質である。タンパク質は細胞内の解毒反応を触媒し、解毒反応は化学的に反応性の求電子をグルタチオンに共役させることによって、求電子性発癌性物質を不活性化させることを含む（Ｐｉｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、Ｃｏｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）、及びＲｕｓｈｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３））。異なる遺伝子座でいくつかの異なる遺伝子によってコードされるヒトＧＳＴは、α、μ、π、及びβと称される４つのファミリーに分類されている。Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）。後成的な変化から生じる低減したＧＳＴＰ１発現は、多くの場合、前立腺癌及び肝臓癌に関連する。
【０００４】
計算による手法（Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００６））、及び重亜硫酸塩シークエンシング（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５））は、ＣｐＧアイランド内の多数の部位がメチル化され得ること、及びメチル化の程度がこれらの部位によって異なり得ることを示す。例えば、口腔癌においては、ｐ１６、Ｅ−カドヘリン、サイクリンＡ１、及びサイトグロビンに関して、個別のＣｐＧ部位のメチル化の程度における差異が認められる。Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）。前立腺及び膀胱腫瘍において、エンドセリン受容体Ｂは、メチル化のホットスポットを示した。（Ｐａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１））。結腸直腸癌及び胃癌では、死因となり得るプロテインキナーゼ遺伝子のＣｐＧアイランドの縁部のメチル化が、より中央の領域と比較して、実質的に全てのサンプルから検出された。Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）。乳癌では、ＲＡＳＳＦ１Ａ  ＣｐＧアイランドにおいて、異なる分布のメチル化が検出され、メチル化は、第１エクソンから、プロモーター領域へと次第に広がっていく場合がある。Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）、及びＳｔｒｕｎｎｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）。ＲＡＳＳＦ２は、ＣｐＧアイランドの５’及び３’縁部において、高頻度のメチル化を有し、転写開始部位の付近でより低い頻度のメチル化を有する。Ｅｎｄｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）。
【０００５】
子宮内膜癌においては、４つのＧＳＴＰ１の設計が１４％〜２４％の感度を示したが、サンプルの大きさが小さすぎたために、これらの差異が正しいかどうかは決定できなかった（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。２つのアッセイの設計が前立腺癌の発見の感度を増加させたが（Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３））、双方の設計が、同じリバースプライマーを共有していたために、調査された領域にかなりの重複があった。ｐ１６、Ｅ−カドヘリン、サイクリンＡ１、及びサイトグロビンに関する、異なるＣｐＧ配列において、パーセントメチル化に差異が生じる。Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）。乳癌では、ＣｐＧ部位において異なるメチル化レベルが存在している。Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）。
【０００６】
腫瘍ＭＬＨ１  ＲＮＡ発現と、ＭＬＨ１  ＤＮＡメチル化との間には、逆相関関係が存在する。Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）。肺癌細胞株においては、メチル化陽性サンプルは、より低いレベルのＤＡＰＫ遺伝子のＲＮＡ発現を呈した。Ｔｏｙｏｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）。しかしながら、これらの研究はメチル化の一部位のみを調査していたために、ＣｐＧアイランドの複数の位置でのＲＮＡ発現に関する相関関係を決定できなかった。転写開始部位を囲むコア領域は、プロモーターメチル化に関する情報価値のある代替である。Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）。
【０００７】
食道の扁平上皮細胞癌では、個別の遺伝子におけるメチル化の頻度は、正常から浸潤癌にかけて増加した（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。ＴＭＳ１（ｐ＝０．００２）、ＤｃＲ１（ｐ＝−０．０１）、ＤｃＲ２（ｐ＝０．０３）、及びＣＲＢＰ１（ｐ＝０．０３）のメチル化はグリーソンスコアと相関し、ＣＲＢＰ１のメチル化は、より高い段階（ｐ＝０．０００２）と相関し、Ｒｅｐｒｉｍｏ（ｐ＝０．０２）及びＴＭＳ１（ｐ＝０．００６）のメチル化はより高い（＞８ｎｇ／ｍｌ）ＰＳＡレベルと相関する。Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）。メチル化状態は、子宮内膜癌における子宮筋層への浸潤の程度と相関した。患者の、腫瘍に隣接する正常な組織におけるＡＳＣメチル化の著しく（ｐ＝０．０４）より高い頻度は、生化学的な再発と関連付けられ、侵攻性疾患との相関を示唆する。Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）。ＲＡＲｂ２、ＰＴＧＳ２、及びＥＤＮＲＢは、前立腺全摘出術を受けている患者において、予後診断的な価値を有し得る。Ｂａｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）。
【０００８】
前立腺癌においてメチル化しているものとして既知の２つの遺伝子、ＧＳＴＰ１及びＲＡＲｂ２の複数の部位で、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）アッセイが行われた。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｈａｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）、Ｊｅｒｏｎｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、及びＮａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様では、ＧＳＴＰ１配列の塩基８３４〜１３１９に及ぶＣｐＧアイランド（登録番号Ｘ０８５０８）に基づくアッセイが提示される。これらの新しい設計は、先行技術（本明細書を通じてバージョン１と称される）のものと重複しない。新しいバージョンは、本明細書を通じてバージョン２及びバージョン３と称される。これらのアッセイは、臨床的感度及び分析的感度を大幅に向上する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
前立腺癌の存在の指標となり得る、いくつかの遺伝子のプロモーター配列における高メチル化の存在を発見する分子アッセイは、既知である。１つのこのような遺伝子はＧＳＴＰ１であり、このアッセイは、例えば、本明細書においてその全体を組み込まれる米国特許公開第２００８０２５４４５５号に記載されている。このアッセイは、プロモーターのＣｐＧアイランドのシトシンのメチル化による、遺伝子の後成的サイレンシングを焦点とし、これによって遺伝子発現は、著しく下方制御されるか、又は完全に排除される。メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）アッセイは、メチル化シトシンと非メチル化シトシンとを区別することによって、メチル化配列を発見するように設計されている。ＰＣＲ反応で使用される前に、ゲノムＤＮＡは重亜硫酸修飾に供され、重亜硫酸修飾は非メチル化ＤＮＡでは全てのシトシンをウラシルに変換するが、メチル化ＤＮＡでは、グアニンに先行しないシトシンのみがウラシルに変換される。（ＣｐＧジヌクレオチドにおいて）グアニンに先行する全てのシトシンは、シトシンのままである。
【００１１】
ＧＳＴＰ１プロモーターの高メチル化、及びその前立腺癌との関連は、文献中に広範に記載されている。本発明のアッセイは、ＧＳＴＰ１のプロモーター配列におけるメチル化の発見のための、大幅に改善されたアッセイである。新しいアッセイはより感度が高く、特異的であり、その同じ遺伝子に対する２つ以上の単位複製配列の組み合わせの使用は、信頼性を向上する。本発明は、新しい設計、及びそれらの、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルでの既存の設計との比較について記載する。分子アッセイの高い感度及び高い特異性は、ＦＦＰＥ組織からの分解したＤＮＡ、尿中に流れた極僅かな前立腺細胞からのＤＮＡ、加えて前立腺癌の患者の血中の浮遊ＤＮＡで行うときに、より有益である。
【００１２】
ゲノム内のタンパク質、ペプチド、又はｍＲＮＡを発現する可能性を有する核酸配列（「遺伝子」と称される配列）の修飾が単独で示され、タンパク質、ペプチド、又はｍＲＮＡが所与の細胞内で発現するかどうかを決定する。タンパク質、ペプチド、又はｍＲＮＡを発現することのできる所与の遺伝子が発現するかどうか、及び仮に発現したとして、このような発現がどの程度生じるかは、様々な複雑な要因によって決定される。これらの要因の理解及び評価の難しさには無関係に、遺伝子発現、又は修飾パターンの分析は、腫瘍形成、転移、アポトーシス、及び他の臨床的に関連する現象などの、重要な事象の発生に関する有用な情報を提供し得る。遺伝子の活性又は不活性の程度の相対的な目安は、遺伝子発現又は修飾特性に見出すことができる。
【００１３】
サンプルは、メチル化発見のために好適なゲノムＤＮＡを含有する、任意の生体液、細胞、組織、器官、又はその部分であり得る。試験サンプルは、腫瘍性細胞、例えば、結腸、直腸、乳房、卵巣、前立腺、腎臓、肺、血液、脳、又は腫瘍性細胞を含むか、若しくは含むものと推測される他の器官若しくは組織からの細胞を含むか、又は含むものと推測され得る。この用語は、個体に存在するサンプル、加えて、個体から得られるか、又は個体に由来するサンプルを含む。例えば、サンプルは、生検によって得られる非検査物の組織学的な区分であるか、又は組織培養に配置されるか若しくはこれに適合される細胞であり得る。サンプルは更に、細胞内区画、若しくは抽出物、又は粗核酸分子若しくは実質的に純粋な核酸分子、又はタンパク質標本であり得る。基準サンプルは、基準レベルを設定するために使用され得るので、したがって試験サンプルが比較される、特定の表現型特性を有することを満たす供給源組織から得ることができる。
【００１４】
遺伝子修飾プロファイルを決定するためのサンプルは、当該技術分野において既知の任意の方法で得ることができる。サンプルは、ＤＮＡ、細胞株、生検、体液、例えば、血液、唾液、糞便、尿、脳脊髄液、精液、パラフィンに包摂される組織、例えば、目、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、又は肝臓からの組織、組織学的な対象のスライド、及びこれらの全ての可能な組み合わせが挙げられるがこれらに限定されないゲノムＤＮＡの通常の供給源である、あらゆる種類の生物学的起源から、標準的な技術に従って得ることができる。好適な生物学的サンプルは、診断目的のマーカーの処方の後に調達及び獲得することができる。サンプルは、症状を有する、又は症状の表現型を有するものと予測される細胞の集合から、又は組織から得ることができる。ゲノムＤＮＡは、サンプルは対象とする組織のみを、最小限の汚染及び最小限のＤＮＡ断片化で含むような、高品質の供給源から得ることができる。
【００１５】
サンプル調製は、患者サンプルの収集を必要とする。本発明の方法で使用される患者サンプルは、異常細胞、例えば、結腸サンプルの原発腫瘍から、又は切除縁からとられる上皮細胞を含むと推測されるものである。レーザ捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）技術は、研究する細胞を選択する１つの方法であり、細胞型の不均一性によって生じるばらつきを最小化する。その結果、正常細胞と癌細胞との間の遺伝子の発現の、中程度の、又は僅かな変化を容易に発見することができる。サンプルはまた、末梢血から抽出される、循環上皮細胞を含む場合もある。これらは、多くの方法に従って得ることができるが、最も好ましい方法は、米国特許第６１３６１８２号に記載される磁気分離技術である。一度対象とする細胞を含むサンプルが得られると、適切なポートフォリオの遺伝子に関し、ＤＮＡが抽出され、増幅され、シトシンメチル化プロファイルが得られる。
【００１６】
ＤＮＡメチル化、及びこれに関する方法は、例えば、米国特許公開番号第２００２０１９７６３９号、同第２００３００２２２１５号、同第２００３００３２０２６号、同第２００３００８２６００号、同第２００３００８７２５８号、同第２００３００９６２８９号、同第２００３０１２９６２０号、同第２００３０１４８２９０号、同第２００３０１５７５１０号、同第２００３０１７０６８４号、同第２００３０２１５８４２号、同第２００３０２２４０４０号、同第２００３０２３２３５１号、同第２００４００２３２７９号、同第２００４００３８２４５号、同第２００４００４８２７５号、同第２００４００７２１９７号、同第２００４００８６９４４号、同第２００４０１０１８４３号、同第２００４０１１５６６３号、同第２００４０１３２０４８号、同第２００４０１３７４７４号、同第２００４０１４６８６６号、同第２００４０１４６８６８号、同第２００４０１５２０８０号、同第２００４０１７１１１８号、同第２００４０２０３０４８号、同第２００４０２４１７０４号、同第２００４０２４８０９０号、同第２００４０２４８１２０号、同第２００４０２６５８１４号、同第２００５０００９０５９号、同第２００５００１９７６２号、同第２００５００２６１８３号、同第２００５００５３９３７号、同第２００５００６４４２８号、同第２００５００６９８７９号、同第２００５００７９５２７号、同第２００５００８９８７０号、同第２００５０１３０１７２号、同第２００５０１５３２９６号、同第２００５０１９６７９２号、同第２００５０２０８４９１号、同第２００５０２０８５３８号、同第２００５０２１４８１２号、同第２００５０２３３３４０号、同第２００５０２３９１０１号、同第２００５０２６０６３０号、同第２００５０２６６４５８号、同第２００５０２８７５５３、並びに米国特許番号第５７８６１４６号、同第６２１４５５６号、同第６２５１５９４号、同第６３３１３９３号、及び同第６３３５１６５号に記載される。
【００１７】
ＤＮＡ修飾キットは市販されており、これらは非メチル化シトシンを有する精製ゲノムＤＮＡを、非メチル化シトシンを有さず、追加のウラシルを有するゲノムへと変換する。この処理は、重亜硫酸塩により促進される脱アミノ反応、及び水酸化ナトリウムによって促進される脱スルホン工程からなる２工程の化学処理である。典型的には脱アミノ反応は、液体として行われ、氷上でインキュベートして、次にカラム結合緩衝液を加えることによって終了する。固相の結合及び洗浄に続きＤＮＡが溶出されて、脱スルホン反応が液体で行われる。エタノールを加えることで反応は終了し、修飾ＤＮＡが沈殿によって洗浄される。しかしながら、双方の市販のキット（Ｚｙｍｏ及びＣｈｅｍｉｃｏｎ）が脱スルホン反応を行う一方で、ＤＮＡはカラム上に結合され、カラムを洗浄することによって反応は終了する。処理されたＤＮＡはカラムから溶出されて、ＭＳＰアッセイのために準備される。
【００１８】
ＤＮＡを単離する工程は、標準的なプロトコルに従って行うことができる。ＤＮＡは、任意の好適な本体サンプル、例えば、組織（採取したてのサンプル、又は固定サンプル）、血液（血清、及び血漿を含む）、精液、尿、リンパ液、又は骨髄からの細胞から単離されてもよい。いくつかの種類の本体サンプル、特に、血液、精液、尿、及びリンパ液などの流体サンプルでは、ある細胞型（例えば、前立腺細胞）の濃度を高めるために最初にサンプルを処理にかけることが好ましい場合がある。濃度を高めるための、１つの好適なプロセスは、磁気ビーズ及び磁気細胞分離装置と組み合わされた、細胞特異的な抗体の使用により、必要とされる細胞を分離することを含む。
【００１９】
増幅工程の前に、単離されたＤＮＡは、好ましくは、非メチル化シトシンがウラシルに、又はアデニンと塩基対を形成することができる別のヌクレオチドに変換される一方で、メチル化シトシンは変化しないか、又はグアニンと塩基対を形成することのできるヌクレオチドに変換されるように、処理される。
【００２０】
好ましくは、単離されたＤＮＡの処理及び増幅に続き、非メチル化シトシンが、ウラシルに、又はアデニンと塩基対を形成することができる別のヌクレオチドに有効に変換されたこと、及びメチル化シトシンが変更されないか、又はグアニンと塩基対を形成することができる別のヌクレオチドに有効に変換されたことを実証するために試験が行われる。
【００２１】
好ましくは、単離されたＤＮＡの処理は、標準的なプロトコルに従い、単離されたＤＮＡを重亜硫酸塩と反応させることを含む。重亜硫酸塩処理では、非メチル化シトシンはウラシルに変換され、メチル化シトシンは変化しない。非メチル化シトシンがウラシルに変換され、メチル化シトシンは変化しないままであることの実証は、（ｉ）処理され増幅されたＤＮＡのアリコートを、重亜硫酸塩処理によって生成されるか、これに抵抗する制限部位を認識する、好適な制限酵素で制限する工程と、（ｉｉ）電気泳動によって制限酵素切断パターンを評価する工程とによって達成され得る。あるいは、実証は、非メチル化シトシンがウラシルに変換され、メチル化シトシンが変化しない、処理されたＤＮＡの領域を標的とする特異的オリゴヌクレオチドを使用する、ディファレンシャルハイブリダイゼーションによって達成され得る。増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、リガーゼ連鎖反応増幅などを含み得る。
【００２２】
好ましくは、増幅工程は、ＰＣＲ増幅のための標準的なプロトコルに従って行われ、この場合、反応物は、典型的には好適なプライマー、ｄＮＴＰ、及び熱安定性のＤＮＡポリメラーゼであり、条件は様々な温度及び持続時間の周期であり、交互の二本鎖の変性の変化、プライマーのアニーリング（例えば、高いストリンジェンシーの条件下で）、及び続くＤＮＡ合成をもたらす。
【００２３】
重亜硫酸塩処理されたＤＮＡでの、選択的なＰＣＲ増幅を達成するために、プライマー及び条件を使用して、異常なシトシンメチル化の部位を含む標的領域と、異常なシトシンメチル化の部位が存在しない標的領域とを区別してもよい。異常なシトシンメチル化が生じる部位がメチル化される、標的領域のみの増幅のために、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡにアニールするために使用されるプライマー（即ち、リバースプライマー）は、メチル化シトシンと塩基対を形成する部位にグアニンヌクレオチドを含み得る。このようなプライマーは、単離されたＤＮＡの標的領域が、異常なシトシンメチル化が生じる部位において非メチル化シトシンヌクレオチド（これは、重亜硫酸塩によってウラシルに変換されるはずである）を有する場合、ミスマッチを形成する。反対側の鎖にアニーリングするために使用されるプライマー（即ち、フォワードプライマー）は、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡのメチル化シトシンの部位に対応する任意の部位でシトシンヌクレオチドを含み得る。
【００２４】
増幅の工程は、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子及び／又はその調節隣接配列の内部の標的領域を増幅するために使用される。調節隣接配列は、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の隣接配列５’及び３’としてみなされることがあり、これは、単独又は別の同様の要素との組み合わせで、ＧＳＴ−Ｐｉ遺伝子の発現を調節する要素を含む。
【００２５】
異常なシトシンメチル化の部位は、選択的な増幅を含まない方法によって、疾患又は状態の診断又は予後診断の目的で検出され得る。例えば、オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーション研究での用途において（例えば、サザンブロッティング）重亜硫酸塩処理されたＤＮＡとの使用のために設計されてよく、かかるプローブは適切なストリンジェンシーの条件下で、シトシンの異常なメチル化部位を含むＤＮＡにのみ選択的にハイブリダイズする。あるいは、適切に選択された情報価値のある制限酵素が使用されて、シトシンの異常なメチル化部位を含むＤＮＡと含まないＤＮＡとを区別する、制限酵素切断パターンを生じ得る。
【００２６】
本発明の方法はまた、核酸を含有する被検査物を非メチル化シトシンを修飾する剤と接触させる工程と、ＣｐＧ特異的オリゴヌクレオチドプライマーの手段によって、被検査物中のＣｐＧ含有核酸を増幅させる工程と、メチル化核酸を発見する工程とを含み得る。好ましい修飾は、非メチル化シトシンの別のヌクレオチドへの１５の変換であり、これは非メチル化シトシンをメチル化シトシンから区別する。好ましくは、剤は非メチル化シトシンをウラシルに修飾し、これは重亜硫酸ナトリウムであるが、非メチル化シトシンを修飾するがメチル化シトシンを修飾しない他の剤もまた使用され得る。重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）修飾が最も好ましく、シトシンの５，６−二重結合と容易に反応するが、メチル化シトシンとの反応は弱い。シトシンは重亜硫酸塩イオンと反応して脱アミノ化を受けやすいスルホン化シトシン反応中間体を形成し、スルホン化ウラシルを生じる。スルホン酸基は、アルカリ性条件下で取り除くことができ、ウラシルの形成を生じる。ウラシルは、Ｔａｑポリメラーゼによってチミンとして認識され、それによってＰＣＲの際に、得られる産物は開始テンプレートの５−メチルシトシンが生じる位置のみにシトシンを含む。スコーピオンリポーター及び試薬、並びに他の発見システムが、同様に、この方法で処理された修飾された非検査物を、修飾されていない非検査物から区別する。
【００２７】
修飾（例えば、重亜硫酸塩で）の後に、被検査物中のＣｐＧ含有核酸の増幅のために本発明で使用されるプライマーは、特に、未処理ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡと、非メチル化ＤＮＡとを区別する。メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰＣＲ）では、非メチル化ＤＮＡのプライマー又はプライミング配列は、好ましくは３’ＣＧ対にＴを有し、これをメチル化ＤＮＡ内に保持されるＣから区別し、アンチセンスプライマーのために相補体が設計される。非メチル化ＤＮＡのＭＳＰプライマー又はプライミング配列は、通常、配列中に比較的少ないＣ又はＧを含むが、これは、Ｃがセンスプライマー中に不在となり、Ｇがアンチセンスプライマー中に不在となるためである（ＣはＵ（ウラシル）へと修飾され、これは、増幅産物中でＴ（チミジン）として増幅される）。
【００２８】
本発明のプライマーは、多型遺伝子座の多量の核酸に基づいて、特異的な重合開始を提供するために、十分な長さ及び適切な配列のオリゴヌクレオチドである。適切なプローブ又はレポーターに曝露されたとき、増幅された配列は、メチル化状態、ひいては診断情報を明らかにする。好ましいプライマーは、最も好ましくは、プライマー伸長産物の合成を開始することができる、８個以上のデオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドであり、これは、多型遺伝子座鎖に対して実質的に相補的である。合成を行うことができる環境条件としては、ヌクレオシド三リン酸、及び重合のための試薬、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの存在、並びに好適な温度及びｐＨが挙げられる。プライマー又はプライミング配列のプライミング区分は、好ましくは、増幅の最大限の効率性のために好ましくは１本鎖であるが、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、その鎖を単離するように最初に処理される。プライマーは、重合のための誘発剤の存在下において、伸長産物の合成を準備するために十分に長くなくてはならない。プライマーの正確な長さは、温度、バッファ、カチオン、及びヌクレオチド組成物などの要因によって異なる。オリゴヌクレオチドプライマーは、最も好ましくは約１２〜２０のヌクレオチドを含むが、これらは、好ましくは周知の設計ガイドライン又は規則に従って、より多い、又はより少ないヌクレオチドを含んでもよい。プライマーは、増幅されるゲノム遺伝子座の各鎖に対して実質的に相補的である様に設計され、上記のように適切なＧ又はＣヌクレオチドを含む。これは、重合のための試薬が作用することを可能にする条件下において、プライマーが、これらの各鎖とハイブリダイズするために十分に相補的でなくてはならないことを意味する。換言すれば、プライマーは、ゲノム遺伝子座をハイブリダイズし、その増幅を可能にするために、５’及び３’隣接配列と十分な相補性を有するべきである。プライマーは、増幅プロセスにおいて利用される。即ち、反応（好ましくは、酵素連鎖反応）は、含まれる反応工程の数に対して、より多くの標的遺伝子座を生成する。最も好ましい実施形態では、反応は、指数関数的に大きな量の標的遺伝子座を生成する。これらのような反応としては、ＰＣＲ反応が挙げられる。典型的には一方のプライマーは、遺伝子座の負（−）の鎖と相補的であり、他方は、正（＋）の鎖と相補的である。変性した核酸にプライマーをアニーリングし、続いて、酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）、及びヌクレオチドの大きな断片で伸長することにより、新たに合成された、標的遺伝子座配列を含む正鎖及び負鎖が生じる。連鎖反応の産物は、別個の核酸二重鎖であり、末端は利用される特異的プライマーの端部と対応する。
【００２９】
プライマーは、自動化された方法を含む、従来のホスホトリエステル法、及びホスホジエステル法などの、任意の好適な方法を使用して調製され得る。１つのこのような自動化された実施形態では、ジエチルホスホラミダイトが、出発物質として使用され、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）によって記載されるように合成され得る。修飾された固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、米国特許第４４５８０６６号に記載されている。
【００３０】
精製された、又は未精製の、尿又は尿道洗浄からとられる任意の核酸被検査物が、開始核酸として使用され得るが、ただしこれは、標的遺伝子座（例えば、ＣｐＧ）を含む特異的核酸配列を含むか、又は含むことが予測される。したがって、プロセスは、例えば、ＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを利用してもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡは、１本鎖又は二本鎖であってよい。ＲＮＡがテンプレートとして使用される場合、テンプレートをＤＮＡに逆転写するために最適な酵素及び／又は条件が利用される。加えて、各１本の鎖を含む、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが利用されてもよい。核酸の混合物が利用されてもよく、又は同じ若しくは異なるプライマーを使用する、本明細書における先の増幅反応で生成される核酸が同様に利用されてもよい。増幅される特異的核酸配列、即ち標的遺伝子座は、より大きな分子の一部であってもよく、又は特定の配列が全体の核酸を構成するように、別個の分子として最初に存在してもよい。
【００３１】
抽出されたサンプルが不純である場合、これは、サンプルの細胞、流体、組織、又は動物細胞膜を開き、核酸の鎖を曝露及び／又は分離するために有効な量の試薬で、増幅の前に処理されてもよい。鎖を曝露、及び分離するための、この溶解及び核酸変性工程は、はるかに多くの増幅が容易に生じることを可能にする。
【００３２】
サンプルの標的核酸配列が二本鎖を含む場合、核酸の鎖を、これがテンプレートとして使用される前に分離することが必要である。鎖の分離は、分離工程として、又はプライマー伸長産物の合成と同時的に生じ得る。この鎖の分離は、物理的、化学的、又は酵素による手段を含む、様々な好適な変性条件を使用して達成され得る。核酸の鎖を分離するための１つの物理的方法は、核酸をこれが変性するまで加熱することを含む。典型的な熱変性は、約８０〜１０５℃の範囲の温度、最大１０分間を含み得る。鎖の分離はまた、ヘリカーゼとして既知の酵素の種類からの酵素によって、又はヘリカーゼ活性を有しｒｉｂｏＡＴＰの存在下においてＤＮＡを変性させるものとして既知の酵素ＲｅｃＡによって、誘発され得る。ヘリカーゼを使用する、核酸の鎖の分離のために好適な反応条件は、Ｋｕｈｎ  Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ（１９７８）により記載されている。ＲｅｃＡを使用するための技術は、Ｃ．Ｒａｄｄｉｎｇ（１９８２）に確認することができる。これらの技術の微調整もまた、現在では周知である。
【００３３】
核酸の相補的な鎖が分離される場合、核酸がもともと二本鎖であったか、又は１本鎖であったかにかかわらず、分離された鎖は、更なる核酸鎖の合成のためにテンプレートとして使用できる状態である。この合成は、プライマーのテンプレートへのハイブリダイゼーションを生じさせる条件下で行われる。一般に、合成は、緩衝水溶液中で、好ましくはｐＨ７〜９、最も好ましくは約８で生じる。モル過剰（ゲノム核酸では、通常約１０８：１（プライマー：テンプレート））の２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、好ましくは、分離されたテンプレート鎖を含むバッファに加えられる。本発明のプロセスが診察用途に使用される場合、相補的な鎖の量は既知でないことがあり、そのため、相補的な鎖の量に関連するプライマーの量は、常に確実に決定することはできない。しかしながら、実際問題として、加えられるプライマーの量は一般的に、増幅される配列が複雑な長鎖の核酸の鎖の混合物中に含まれる場合には、相補的な鎖（テンプレート）の量に対しモル過剰となる。大きなモル過剰は、プロセスの効率性を改善するために好ましい。
【００３４】
デオキシリボヌクレオシド三リン酸ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰが、プライマーとは別々に、又は一緒に、十分な量で合成混合物に加えられ、得られた溶液は約９０〜１００℃で最大１０分間、好ましくは１〜４分間加熱された。この加熱時間の後、溶液を室温まで冷却させる（これは、プライマーハイブリダイゼーションのために好ましい）。冷却した混合物に、プライマー伸長反応を生じるために適切な剤（「重合剤」）を加え、当該技術分野において既知の条件下で反応を生じさせる。重合剤はまた、他の試薬と（これが熱安定性であれば）共に加えられてもよい。この合成（又は増幅）反応は、室温から、最高で重合剤が機能しなくなる温度までで生じ得る。重合剤は、プライマー伸長産物の合成を達成するように機能する任意の化合物又は系、好ましくは酵素であり得る。この目的のための好適な酵素は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ変異体、逆転写酵素、及び熱安定性酵素（例えば、変性を生じるために十分に高い温度に供した後に、プライマー伸長を生じる酵素）を含む他の酵素が挙げられる。好ましい剤は、Ｔａｑポリメラーゼである。好適な酵素は、各遺伝子座の核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長産物を形成するように、好適な方法でヌクレオチドの化合を促進する。一般的に合成は、各プライマーの３’末端で開始し、テンプレート鎖に沿って５’方向で、合成が終了するまで進み、異なる長さの分子を生成する。しかしながら、上記の同じプロセスを使用して、５’末端で合成を開始し、他方に進む重合剤も存在し得る。
【００３５】
最も好ましくは、増幅方法はＰＣＲによる。別の手段によって、本発明のプライマーを使用してＰＣＲによって増幅されるメチル化及び非メチル化遺伝子座が、同様に増幅されるならば、かかる別の増幅方法も利用され得る。このような１つの最も好ましい実施形態では、アッセイはネステッドＰＣＲとして実行され得る。ネステッドＰＣＲ法では、２つ以上の段階を有するポリメラーゼ連鎖反応が行われる。第１段階のポリメラーゼ連鎖反応では、５’及び３’の位置の、特定の第１標的ヌクレオチド配列に隣接する上流及び下流プライマーから構成される、一対の外側オリゴヌクレオチドプライマーがそれぞれ使用されて、この第１配列を増幅する。続く段階では、やはり上流及び下流プライマーからなる、内部の、又はネステッドオリゴヌクレオチドプライマーの第２のセットが使用されて、第１標的ヌクレオチド配列内に含まれるより小さな第２標的ヌクレオチド配列を増幅する。
【００３６】
上流及び下流内部プライマーは、それぞれ、５’及び３’位置で第２標的ヌクレオチド配列と隣接する。隣接するプライマーは、ＰＣＲプロセス中に増幅される、二本鎖標的ヌクレオチド配列の、３’末端位置の区分に対して相補的である。第１段階ポリメラーゼ連鎖反応における増幅の標的である遺伝子の区域内の第１ヌクレオチド配列は、５’上流位置の上流プライマー、及び３’下流位置の下流プライマーと隣接する。第１標的ヌクレオチド配列、及びしたがって第１段階ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物は、外側プライマー対の、それぞれ、上流プライマー及び下流プライマーの、５’上流ハイブリダイゼーション位置と３’下流ハイブリダイゼーション位置との間の塩基対距離によって決定される、予想される塩基対長さを有する。
【００３７】
第１段階ポリメラーゼ連鎖反応の末端では、得られる混合物のアリコートが、第２段階のポリメラーゼ連鎖反応に繰り越される。これは、好ましくは、Ｃｅｐｈｅｉｄからの「ＳＭＡＲＴ  ＣＡＰ」装置などの、封止、又は密閉された容器の中で自動的に行われる。この第２段階の反応で、第１段階の反応の産物は、特異的な内部、又はネスト化プライマーと組み合わされる。これらの内部プライマーは、第１の標的ヌクレオチド配列内のヌクレオチド配列から得られ、第１標的ヌクレオチド配列内に含まれる第２のより小さな標的ヌクレオチド配列と隣接する。この混合物は、最初の変性、アニーリング、及び伸長工程に供され、続いて、上記のように熱循環させて、第２標的ヌクレオチド配列の反復的な変性、アニーリング、及び伸長又は複製を可能にする。第２標的ヌクレオチド配列は、５’上流位置の上流プライマー、及び３’下流位置の下流プライマーと隣接する。第２標的ヌクレオチド配列、及びしたがって第２段階ＰＣＲの増幅産物はまた、予測される塩基対長さを有し、これは、それぞれ、内部プライマー対の上流プライマー及び下流プライマーの、５’上流ハイブリダイゼーション位置と、３’下流ハイブリダイゼーション位置との間の塩基対間隔によって決定される。
【００３８】
増幅産物は、好ましくは、米国特許第４６８３１９号に記載されるように、産物に特異的なプローブ又はレポーターで、メチル化又は非メチル化したものとして特定される。プローブ及びレポーターの分野における、ポリヌクレオチドを発見するための進歩は当業者には周知である。
【００３９】
任意により、核酸のメチル化パターンは、制限酵素消化、及びサザンブロット分析などの他の技術によって確認され得る。５’ＣｐＧメチル化を発見するために使用され得るメチル化感度制限エンドヌクレアーゼの例としては、ＳｍａＩ、ＳａｃＩＩ、ＥａｇＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＢｓｔＵＩ、及びＢｓｓＨＩＩが挙げられる。
【００４０】
本発明の別の態様では、メチル化率が使用される。これは、達成されるマーカーの増幅したメチル化種の量と、増幅した基準マーカー、又は増幅した非メチル化マーカー区域の量との比率を決定することによって行われ得る。これは、定量的リアルタイムＰＣＲを使用して最も良好に行われる。設定された、又は既定のカットオフ値又は閾値を超える比率は、高メチル化し、癌（ＧＳＴＰ１の場合の前立腺癌）などの増殖性の疾患を有することの指標であるものとみなされる。既知の方法によってカットオフ値が設定され、この様な方法が少なくとも２組のサンプルに使用される（既知の異常な状態のものと、既知の正常な状態のもの）。本発明の基準マーカーはまた、内部標準として使用され得る。基準マーカーは、好ましくは、サンプルの細胞内で構造的に発現される細胞、例えば、βアクチンである。
【００４１】
設定された、又は既定の値（カットオフ値又は閾値）はまた、比率が使用されない本発明による方法においても設定及び使用される。この場合、カットオフ値は、一定の基準値、例えば、正常なサンプル、又は癌が臨床的に重要でない（臨床的に意義のある状態で進行しない、又は侵攻性でないことが既知である）サンプルにおけるメチル化の量又は程度、に対するメチル化の量又は程度に関連して決定される。これらのカットオフ値は、メチル化率に基づく方法におけるこれらの使用の場合と同じように、既知の方法に従って決定される。
【００４２】
マーカーと関連する遺伝子の、低水準の転写は、多くの場合、ポリヌクレオチド配列及び／又は発現制御配列（例えば、プロモーター配列）の特定の要素の高メチル化の結果であるため、これらの配列にマッチするよう調製されたプライマーが調製された。したがって、本発明は、特定の領域、好ましくはマーカーの発現制御、又はプロモーター領域内のメチル化を発見することによって、細胞増殖性疾患を発見又は診断する方法を提供する。これらの領域のメチル化を発見するために有用なプローブは、このような診断方法又は予後診断方法において有用である。
【００４３】
本発明のキットは、様々な構成要素を備えるように構成され得るが、ただし、これらは全て、少なくとも１つのプライマー、又はプローブ、又は検出分子（例えば、スコーピオンレポーター）を含む。一実施形態では、キットは、高メチル化マーカー区分を増幅及び発見する試薬を含む。任意により、キットは、サンプルから核酸を抽出するための、サンプル調製試薬及び／又は物品（例えば、チューブ）を含む。
【００４４】
好ましいキットでは、対応するＰＣＲプライマーセットなどの１−チューブＭＳＰに必要な試薬、Ｔａｑポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び加水分解プローブ又は分子指標などの好適な検出試薬、が含まれる。任意による好ましいキットでは、検出試薬は、スコーピオンレポーター又は試薬である。二本鎖ＤＮＡに特化した単一ダイプライマー又は蛍光染料、例えば、エチジウムブロマイドもまた使用され得る。プライマーは好ましくは、高い濃度を生じる量である。キット内の追加的な材料としては、好適な反応チューブ又はバイアル瓶、バリア組成物、典型的にはワックスビーズ（任意によりマグネシウムを含む）、必要なバッファ及びｄＮＴＰなどの試薬、対照核酸及び／又は任意の追加的なバッファ、化合物、補助因子、イオン構成成分、タンパク質及び酵素、ポリマー、ＭＳＰ反応で使用され得る同様のものが挙げられる。任意により、キットは、核酸抽出試薬及び材料を含む。
【００４５】
バイオマーカーは、指示されるマーカー核酸／タンパク質の任意のしるしである。核酸は、非制限的に、核、ミトコンドリア（ホモプラスミー、ヘテロプラスミー）、ウイルス、バクテリア、真菌、マイコプラズマなどを含むいずれかの既知のものであり得る。しるしは、直接又は間接的であり、生理的パラメーターを付与された遺伝子の過剰発現又は不足発現を、内部対照群、プラシーボ、正常な組織、又は別の癌との比較において測定することができる。バイオマーカーとしては、非制限的に、核酸及びタンパク質（双方とも、過剰及び不足発現、並びに直接及び間接的）が挙げられる。バイオマーカーとしての核酸の使用としては、非制限的に、ＤＮＡ増幅、欠失、挿入、複製、ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ，Ｂｒｏｏｋｅｓ（１９９９））、直接的に又はゲノム複製の際のいずれかにおけるコピー数多型（ＣＮＰ）、マイクロサテライトＤＮＡ、後成的変化、例えば、ＤＮＡ低メチル化又は高メチル化、並びにＦＩＳＨの測定を含む、当該技術分野において既知の任意の方法が挙げられる。バイオマーカーとしてのタンパク質の使用としては、非制限的に、量、活性、修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化反応、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化など）、又は免疫組織化学（ＩＨＣ）、及び代謝回転の測定を含む、当該技術分野において既知の任意の方法が挙げられる。他のバイオマーカーとしては、画像化、分子プロファイリング、細胞計数、及びアポトーシスマーカーが挙げられる。
【００４６】
マーカー遺伝子は、配列番号によって指定される配列に対応する（遺伝子がこの配列を含む場合）。遺伝子区分又は断片は、これが、基準配列、又はその相補体の一部を、これが遺伝子の配列であるものとして見分けるために、十分に含む場合、このような遺伝子の配列に対応する。遺伝子発現産物は、そのＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡがこのような配列（例えば、プローブ）を有する組成物にハイブリダイズする場合には、このような配列に対応し、ペプチド又はタンパク質の場合には、これは、かかるｍＲＮＡによってコードされる。遺伝子発現産物の区分又は断片は、これが基準遺伝子発現産物、又はその相補体の一部を、これが遺伝子又は遺伝子発現産物の配列であるものとして見分けるために十分に含む場合、このような遺伝子又は遺伝子発現産物の配列に対応する。
【００４７】
本明細書において記載され、請求される、発明の方法、組成物、物品、及びキットは、１つ以上のマーカー遺伝子を含む。「マーカー」、又は「マーカー遺伝子」は、本明細書を通じて、その過剰発現又は不足発現が、指標又は組織型と関連するいずれかの遺伝子と対応する、遺伝子及び遺伝子発現産物を指すものとして使用される。
【００４８】
遺伝子発現プロファイルを決定するための好ましい方法としては、タンパク質又はペプチドをコードすることができる遺伝子によって生成されるＲＮＡの量を決定することが挙げられる。これは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、競合ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、示差表示ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、及び他の関係する試験によって達成することができる。個別のＰＣＲ反応を使用するこれらの技術を実行することが可能であるが、ｍＲＮＡから生成される相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又は相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を増幅し、マイクロアレイによってこれを分析することが最善である。多くの異なるアレイ配列、及びこれらの生成のための方法が、当業者には既知であり、例えば、米国特許第５４４５９３４号、同第５５３２１２８号、同第５５５６７５２号、同第５２４２９７４号、同第５３８４２６１号、同第５４０５７８３号、同第５４１２０８７号、同第５４２４１８６号、同第５４２９８０７号、同第５４３６３２７号、同第５４７２６７２号、同第５５２７６８１号、同第５５２９７５６号、同第５５４５５３１号、同第５５５４５０１号、同第５５６１０７１号、同第５５７１６３９号、同第５５９３８３９号、同第５５９９６９５号、同第５６２４７１１号、同第５６５８７３４号、及び同第５７００６３７号に記載されている。
【００４９】
マイクロアレイ技術は、数千の遺伝子の定常状態のｍＲＮＡレベルを同時に測定することを可能にし、それによって、制御されない細胞増殖の開始、停止、又は調節などの効果を同定するための強力なツールを提示する。２つのマイクロアレイ技術は現在幅広く使用されている。１つは、ｃＤＮＡアレイであり、２つ目はオリゴヌクレオチドアレイである。これらのチップの構成には違いが存在するものの、実質的に全ての下流データ分析及び出力は同じである。これらの分析の結果は典型的には、マイクロアレイの既知の位置で核酸配列にハイブリダイズするサンプルからのｃＤＮＡ配列を発見するために使用される、標識されたプローブから受信されるシグナルの強度の測定値である。典型的には、シグナルの強度は、サンプル細胞において発現するｃＤＮＡ、ひいてはｍＲＮＡの量に比例する。多くのこのような技術が利用可能であり有用である。遺伝子の発現を決定するための好ましい方法は、米国特許第６２７１００２号、同第６２１８１２２号、同第６２１８１１４号、及び同第６００４７５５号に見出すことができる。
【００５０】
発現レベルの分析は、このようなシグナル強度を比較することによって行われる。試験サンプルの遺伝子の発現強度と対照サンプルのそれとの比率マトリックスを生成することによって最良に行われる。例えば、異常組織からの遺伝子発現強度が、同型の良性又は正常な組織から生成される発現強度と比較され得る。これらの発現強度の比率は、試験サンプルと対称サンプルとの間の遺伝子発現における倍数変化を示す。
【００５１】
選別は、起源部の腫瘍発生源部位に関連する要因の間の、各遺伝子の異なる発現の有意性の証拠に関する順位付けされたリストを生成する統計的試験に基づき得る。このような試験の例としては、ＡＮＯＶＡ及びＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓが挙げられる。順位付けは、カットオフ値までの、このような重さの合計を、ある種類が別のものよりも優位であることを肯定する証拠として解釈するように設計されたモデルにおける重み付けとして使用され得る。本文献において記載される先の証拠もまた、重み付けを調整するために使用され得る。
【００５２】
好ましい実施形態は、安定的な対照セットを特定し、すべてのサンプルにわたって、このセットをゼロ変動に合わせることによって、各測定値を正規化する。対照セットは、アッセイにおける系統的誤差により影響を受けても、このエラーとは無関係に変化しないことが既知である、いずれかの単一の内在性転写物、又は内在性転写物のセットとして定義される。全てのマーカーは、対照セットのいずれかの記述的統計値、例えば、平均値若しくは中央値、又は直接的な測定値のための、ゼロ変動を生成する、サンプル固有の係数によって調整される。あるいは、系統的誤差のみに関する対照の変動の前提が、正確でないとしても、生じる分類誤差は、正規化が行われた際により小さく、対照セットは依然として前述のように使用され得る。非内在性スパイクコントロールもまた有用であり得るが、好ましくない。
【００５３】
遺伝子発現プロファイルは、様々な方法で表され得る。最も一般的には、未調整の蛍光強度、又は比率マトリックスをグラフィカルデンドログラム（dendogram）に配列させ、列が試験サンプルを示し、行が遺伝子を示す。同様の発現プロファイルを有する遺伝子が、互いに近位にあるように配列される。各遺伝子の発現比率が色で可視化される。例えば、１未満の比率（下方制御）はスペクトルの青色部分として顕れ、一方で１を超える比率（上方制御）はスペクトルの赤色部分として顕れる。「Ｇｅｎｅｓｐｒｉｎｇ」（Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）並びに「Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」及び「Ｉｎｆｅｒ」（Ｐａｒｔｅｋ，Ｉｎｃ．）を含む、市販のコンピューターソフトウェアプログラムが、このようなデータを表示するために利用可能である。
【００５４】
遺伝子発現を決定するタンパク質濃度の測定の場合には、当該技術分野において既知の方法が、これが十分な特異性及び感度を生じる限りにおいて好適である。例えば、タンパク質濃度は、タンパク質に特異的な抗体又は抗体断片と結合し、抗体と結合されたタンパク質の量を測定することによって測定され得る。抗体は、発見を促進するための、放射性試薬、蛍光性試薬、又は他の発見可能な試薬によって指標され得る。発見の方法としては、非制限的に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び免疫ブロット技術が挙げられる。
【００５５】
本発明の方法で使用された調節された遺伝子が、実施例で記載される。異なる方法で発現した遺伝子が、特定の起源の癌の患者内で、異なる起源からの癌の患者に対して、上方制御又は下方制御された。上方制御、及び下方制御は、一定の基準に対する遺伝子の発現の程度において、発見可能な差異（これを測定するために使用されるシステムのノイズの寄与以外）が見出されることを意味する、相対的な用語である。この場合、基準は、アルゴリズムに基づいて決定される。異常細胞中の対象とする遺伝子は次に、同じ測定方法を使用して、基準濃度に対して上方制御又は下方制御される。この関連において、疾患を有する、とは制御されない細胞の増殖を生じ、身体機能の適切な性能を中断若しくは阻害するか、又は阻害する可能性を有する身体の状態変化を指す。ある人の遺伝子型又は表現型のある態様が、疾患の存在と合致する場合、その人は疾患を有するものとして診断される。しかしながら、診断又は予後診断を行う行為は、疾患／状態の問題の決定、例えば、再発の可能性、治療の種類、及び治療の監視などの決定を含み得る。治療監視では、経時的な遺伝子の発現を比較して、遺伝子発現プロファイルが、正常な組織とより一致するパターンに変化したか、又は変化しつつあるかを決定することによって所与の治療経過の効果に関連して、臨床的判断が行われる。
【００５６】
遺伝子が分類され、その結果その分類の中の一連の遺伝子に関して得られる情報が、臨床的に関連する判断、例えば、診断、予後診断、又は治療選択などを行うための確固とした基盤を提供し得る。これらの一連の遺伝子は、本発明のポートフォリオを作製する。ほとんどの診療マーカーがそうであるように、多くの場合、正しい医療判断を行うために十分な、最小限の数のマーカーを使用することが、好ましい。これは、更なる分析を待つことによる治療の遅延、加えて、時間及び資源の非生産的な使用を防ぐ。
【００５７】
遺伝子発現ポートフォリオの設定の一方法は、資源ポートフォリオの設定において広範に使用される、平均分散アルゴリズムなどの、最適化アルゴリズムの使用による。この方法は、米国特許第２００３０１９４７３４号において詳細に記載される。本質的に、この方法は、それを使用するために受信されるリターン（例えば、生成されるシグナル）を最適化する一方で、リターンのばらつきを最小化する、一連の入力の設定を必要とする（財政適用における株式、本明細書における強度により測定される発現）。このような作業を行うための、多くの市販のソフトウェアプログラムが入手可能である。「Ｗａｇｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ」と称される「Ｗａｇｎｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｍｅａｎ−Ｖａｒｉａｎｃｅ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」が、本明細書を通じて好ましい。このソフトウェアは、効果的境界及び最適なポートフォリオを決定するために、「Ｗａｇｎｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｍｅａｎ−Ｖａｒｉａｎｃｅ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ」からの機能を使用し、そしてＭａｒｋｏｗｉｔｚセンスにおける最適ポートフォリオが好ましい。Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  （１９５２）。このタイプのソフトウェアの使用は、ソフトウェアがその意図された財政分析目的のために使用される場合、株式リターンの方法で入力として処理され、リスク測定値が使用されるように、マイクロアレイデータが変換され得ることを必要とする。
【００５８】
ポートフォリオの選択のプロセスはまた、ヒューリスティックルールの用途を含み得る。好ましくはこのようなルールは、生態、及び臨床結果を生成するために使用される技術の理解に基づいて生成される。より好ましくは、これらは、最適化方法からの出力に適用される。例えば、ポートフォリオ選択の平均分散方法は、癌患者において異なる様式で発現された多くの遺伝子の、マイクロアレイデータに適用され得る。方法からの出力は、末梢血、加えて異常組織中において発現されたいくつかの遺伝子を含み得る遺伝子の最適化されたセットである。試験方法で使用されるサンプルが末梢血から得られ、癌の事例において異なる様式で発現された一定の遺伝子がまた、末梢血中で異なる様式で発現され得る場合、ポートフォリオが、末梢血中で異なる様式で発現されたものを除く、効果的境界から選択される、ヒューリスティックルールが適用され得る。当然、例えば、データ予備選択の間にルールを適用することにより、効果的な境界の形成の前にルールを適用することができる。
【００５９】
必ずしも問題となっているバイオロジーと関係しない、他のヒューリスティックルールを適用することができる。例えば、記載されたポートフォリオの比率のみが特定の遺伝子又は遺伝子群によって表され得るようなルールを適用することができる。Ｗａｇｎｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅなどの市販のソフトウェアは、このような種類のヒューリスティックを容易に適合させる。これは、正確性及び精密性以外の要因（例えば、予測されるライセンス料）が、１つ以上の遺伝子を含めることの望ましさに影響する場合に有用であり得る。
【００６０】
本発明の遺伝子発現プロファイルはまた、癌診断、予後診断、又は治療監視において有用な、他の非遺伝子診断方法と共に使用することができる。例えば、一定の状況では、上記の遺伝子発現の診断能力と、従来的なマーカー、例えば、血清タンパク質マーカー（ｅ．ｇ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ２７．２９（“ＣＡ  ２７．２９”））からのデータを組み合わせることが有益である。ＣＡ  ２７．２９などの検体を含む、様々なマーカーが存在する。１つのこのような方法では、治療される患者から定期的に血液がとられ、上記の血清マーカーの１つについて酵素イムノアッセイに供される。マーカーの濃度が、腫瘍の再発、又は治療の失敗を示唆する場合、遺伝子発現分析を受けるサンプル源がとられる。疑わしい腫瘤が存在する場合、細針吸引（ＦＮＡ）がとられ、腫瘤からとられる細胞の遺伝子発現プロファイルが、上記のように分析される。あるいは、組織サンプルが、腫瘍がその前に取り除かれた組織に隣接する領域からとられ得る。この手法は、他の試験手順が曖昧な結果を生じる場合に特に有用であり得る。
【００６１】
核酸とタンパク質を分離する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ワールドワイドウェブ上のＡｍｂｉｏｎウェブサイト、及び米国特許第２００７００５４２８７号に見出されるＲＮＡの説明を参照されたい。
【００６２】
ＤＮＡ分析は、非制限的に、メチル化、脱メチル化、核型、倍数性（異数性、多倍数性）、遺伝子完全性（ゲル又は分光測光法により評価される）、転座、突然変異、遺伝子融合、活性化、非活性化、１塩基多型（ＳＮＰ）、コピー数、又は遺伝子構造を発見するための全体的な遺伝子増幅を含む、当該技術分野において既知のいずれかのものであり得る。ＲＮＡ分析としては、非制限的に、ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ、ｍｉＲＮＡ、又は転写後修飾を含む、当該技術分野において既知のいずれかが挙げられる。タンパク質分析としては、非制限的に、抗体発見、転写後修飾、代謝回転を含む、当該技術分野において既知のいずれかが挙げられる。タンパク質は、細胞表面マーカー、好ましくは、上皮型、内皮型、ウイルス型、又は細胞型であり得る。バイオマーカーは、ウイルス／細菌感染、損傷、又は抗原発現に関連し得る。
【００６３】
本発明に従って作製されたキットは、遺伝子発現プロファイルを決定するための、形式を合わせたアッセイを含む。これらは、アッセイを行うために必要な材料、例えば、試薬を、並びにバイオマーカーを分析するための命令及び媒体の全て、又はいくつかを含み得る。
【００６４】
本発明の物品としては、治療、診断、予後診断、及び他の方法で疾患を評価するために有用な遺伝子発現プロファイルの表示を含む。これらの特性表示は、コンピューター読み取り可能な媒体（磁気、光学など）などの機械によって自動的に読み取ることができる媒体に変換される。物品はまた、このような媒体における、遺伝子発現プロファイルを評価するための命令も含み得る。例えば、物品は、上記の遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現特性を比較するためのコンピューター命令を有するＣＤ−ＲＯＭを含んでもよい。物品はまた、その中にデジタル処理で記録される遺伝子発現プロファイルを有してもよく、それによってこれらは、患者サンプルからの遺伝子発現データと比較され得る。あるいは、特性は、異なる表現形式で記録されてもよい。図形的な記録が１つのそのような形式である。クラスタ化アルゴリズム、例えば、上記のＰａｒｔｅｋ社からの「ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ」「ＩＮＦＥＲ」ソフトウェアに組み込まれるものは、このようなデータの可視化を最も良好に補助することができる。
【００６５】
本発明による製品の異なる種類の物品は、遺伝子発現特性を表すために使用される媒体又は形式を合わせたアッセイである。これらは、例えば、マイクロアレイを含む場合があり、この中で配列相補体、又はプローブがマトリックスに取り付けられ、これに、対象とする遺伝子の指標となる配列が結合し、それらの存在の読み取り可能な行列式を生成する。あるいは、本発明による物品は、ハイブリダイゼーション、増幅、及び癌を発見するための対象とする遺伝子の発現レベルの指標となるシグナル生成を行うための試薬キットにされ得る。
【００６６】
本出願のＧＳＴＰ１アッセイは、試験されるサンプルにおいて、大幅に改善されたアッセイ性能を示した。同じ遺伝子（ＧＳＴＰ１）の、２つ以上の設計の組み合わせが、非常に高い特異性を有する、臨床的感度の改善を示した。同じ遺伝子における２つのアッセイの組み合わせは、非常に高い特異性と共に、所与の多重構造（multiplex）において標的となるより少ない遺伝子でより良好な臨床的感度を達成するために、より複雑でない解決法を提供する。ＧＳＴＰ１のための複数アッセイ設計でのより良好なアッセイ性能は、かかる多重構造から他のマーカー遺伝子を除去する能力を提供し、これはより高い特異性へと繋がる。より高い特異性での、改善された臨床的感度は、より良好な負及び正の測定値を生成する。
【００６７】
以下の実施例は、本発明を説明するためのものであって発明を限定するためのものではない。
【実施例】
【００６８】
（実施例１）
２つの新しい設計（バージョン２及びバージョン３）が、既存の設計（バージョン１）と、ＦＦＰＥ組織サンプル中で比較される。これら全ての設計が、以下の表１に示される。
【表１】
2011509688.tif 000002
【００６９】
ＡＰＣ及びＡｃｔｉｎを有する三重アッセイのＦａｍでのバージョン１の設計、及びＦａｍチャネルの単一構造（singlex）の各新しいＧＳＴＰ１設計（バージョン２及びバージョン３）の実験が、Ｃｅｐｈｅｉｄ  ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）システムで行われた。前立腺全摘出術による３３の腺癌、及び２０の陰性の生検（negative biopsies）が試験された。ＴＰ６−２５抗体に共役したＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが、ホットスタートメカニズムで使用された。このサンプルのセットから得られるデータは、２つのより新しいアッセイ設計が、元来のバージョン１の設計と比較して改善された感度を有することを示す。データは、以下、表２に、要約されて示される。
【表２】
2011509688.tif 000003
【００７０】
アッセイの更なる最適化は、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ酵素への変更が、アッセイのＧＳＴＰ１の臨床的感度を改善したことを示した。全ての反応は、進行する全ての実験に関し、これらの最適化された条件を使用して誘起された。これらの反応条件は以下に示される。
【表３】
2011509688.tif 000004
【表４】
2011509688.tif 000005
【表５】
2011509688.tif 000006
【表６】
2011509688.tif 000007
【表７】
2011509688.tif 000008
【００７１】
臨床サンプルが、前立腺全摘出術による６７の腺癌、前立腺全摘出術からの３６の正常組織、及び２４の陰性前立腺生検からの重亜硫酸修飾されたＤＮＡに関して、Ｃｅｐｈｅｉｄプラットフォームに基づいて、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑで実行された。２つのアッセイがこれらのサンプルで実行され、１つ目のアッセイはバージョン２  ＧＳＴＰ１（Ｆａｍ）、バージョン３  ＧＳＴＰ１（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、及びＡｃｔｉｎ（Ｑ６７０）の多重構造を有し、２つ目は、バージョン１  ＧＳＴＰ１（Ｆａｍ）、ＡＰＣ（Ｑ５７０）、及びＡｃｔｉｎ（Ｑ６７０）の組み合わせを有する多重アッセイである。得られたデータは表３に要約される。
【表８】
2011509688.tif 000009
【００７２】
同じ組のデータを分析し、多数のＧＳＴＰ１設計がより良好な臨床感度に寄与するかどうかを決定した際、より良好なアッセイ性能が実際に観測され、データは表４に要約されている。
【表９】
2011509688.tif 000010
【００７３】
２つの新しいＧＳＴＰ１設計をより良好に比較し、２つの新しいＧＳＴＰ１設計が使用された際にＡＰＣが多重構造に価値を付加するかどうかを決定するために、ＧＳＴＰ１バージョン２（ＦＡＭ）、ＧＳＴＰ１バージョン３（Ｃｙ３）、ＡＰＣ、及びＡｃｔｉｎを含む多重構造により、同じサンプルで実験が行われた。前立腺全摘出術により得られた合計３８の腺癌、及び３６の正常サンプルが試験された。データは表５に要約される。
【表１０】
2011509688.tif 000011
【００７４】
上記のデータは、２つのＧＳＴＰ１設計の互いの相補性能を実証する。２つのＧＳＴＰ１設計の組み合わせは、２つの遺伝子の組み合わせ、例えば、ＧＳＴＰ１及びＡＰＣの組み合わせを有することに非常に近い性能を示した。これは、新規の適用法であり、２つ以上のアッセイが高い特異性で同じ遺伝子を標的とすることができ、改善された臨床感度を生じる。これは、高い特異性における高い感度を達成するために、異なる相補的なマーカーが必要とされない適用法へと繋がる。ＧＳＴＰ１高メチル化は、前立腺組織の癌に対して非常に高い特異性を有するものとして知られるが、ＡＰＣはより低い特異性に繋がり得る。ＧＳＴＰ１及びハウスキーピング遺伝子を備えるアッセイは、最初に陰性であり、後に陽性となる生検において、例えば、ＧＳＴＰ１とＡＰＣとの組み合わせよりも高い特異性で、匹敵する臨床感度を提供する傾向がある。陰性の生検（negative biopsies）がこのアッセイで試験された場合、高い特異性は非常に重要となる。
【００７５】
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【００７６】
〔実施の態様〕
（１）  複数のメチル化部位の発見のための試薬を有する前立腺癌アッセイであって、各標的が同じ遺伝子の異なる部分を目的とする、前立腺癌アッセイ。
（２）  前記遺伝子がＧＳＴＰ１である、実施態様１に記載のアッセイ。
（３）  少なくとも１つのメチル化部位がプロモーター領域にある、実施態様２に記載のアッセイ。
（４）  ２つ以上のメチル化部位が、プロモーション領域にある、実施態様２に記載のアッセイ。
（５）  試薬が少なくとも３つの異なるメチル化部位を発見する、実施態様１に記載のアッセイ。
（６）  前記同じ遺伝子の異なる部分を目的とする、複数のメチル化部位のみの発見のための試薬を有する、実施態様１に記載のアッセイ。
（７）  前記遺伝子はＧＳＴＰ１である、実施態様６に記載のアッセイ。
（８）  少なくとも１つのメチル化部位が、プロモーター領域にある、実施態様７に記載のアッセイ。
（９）  ２つ以上のメチル化部位が、プロモーション領域に存在する、実施態様７に記載のアッセイ。
（１０）  試薬が、少なくとも３つの異なるメチル化部位を発見する、実施態様７に記載のアッセイ。
【００７７】
（１１）  配列番号２及び配列番号４を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を有する、前立腺癌アッセイ。
（１２）  配列番号６を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を更に含む、実施態様１２に記載のアッセイ。
（１３）  配列番号２及び配列番号６を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を有する、前立腺癌アッセイ。
（１４）  配列番号４を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を更に含む、実施態様１３に記載のアッセイ。
（１５）  同じ遺伝子内からの複数のメチル化ヌクレオチド配列を発見するための試薬、及び変換試薬を含む、キット。
（１６）  前記変換試薬が重亜硫酸ナトリウムを含む、実施態様１５に記載のキット。
（１７）  前記遺伝子がＧＳＴＰ１である、実施態様１６に記載のキット。
（１８）  前記試薬が、ＦＦＰＥ組織サンプルとの使用のために設計されている、実施態様１６に記載のキット。
（１９）  前記サンプルが、前立腺サンプルである、実施態様１８に記載のキット。
（２０）  前記試薬が、尿サンプルとの使用のために設計されている、実施態様１６に記載のキット。
【配列表】
2011509688000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年11月22日(2010.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のメチル化部位の発見のための試薬を有する前立腺癌アッセイであって、各標的が同じ遺伝子の異なる部分を目的とする、前立腺癌アッセイ。
【請求項２】
前記遺伝子がＧＳＴＰ１である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
少なくとも１つのメチル化部位がプロモーター領域にある、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
２つ以上のメチル化部位が、プロモーション領域にある、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項５】
試薬が少なくとも３つの異なるメチル化部位を発見する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記同じ遺伝子の異なる部分を目的とする、複数のメチル化部位のみの発見のための試薬を有する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記遺伝子はＧＳＴＰ１である、請求項６に記載のアッセイ。
【請求項８】
少なくとも１つのメチル化部位が、プロモーター領域にある、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項９】
２つ以上のメチル化部位が、プロモーション領域に存在する、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項１０】
試薬が、少なくとも３つの異なるメチル化部位を発見する、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項１１】
配列番号２及び配列番号４を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を有する、前立腺癌アッセイ。
【請求項１２】
配列番号６を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を更に含む、請求項１１に記載のアッセイ。
【請求項１３】
配列番号２及び配列番号６を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を有する、前立腺癌アッセイ。
【請求項１４】
配列番号４を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を更に含む、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１５】
同じ遺伝子内からの複数のメチル化ヌクレオチド配列を発見するための試薬、及び変換試薬を含む、キット。
【請求項１６】
前記変換試薬が重亜硫酸ナトリウムを含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記遺伝子がＧＳＴＰ１である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記試薬が、ＦＦＰＥ組織サンプルとの使用のために設計されている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
前記サンプルが、前立腺サンプルである、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記試薬が、尿サンプルとの使用のために設計されている、請求項１６に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
（１１）  配列番号２及び配列番号４を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を有する、前立腺癌アッセイ。
（１２）  配列番号６を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を更に含む、実施態様１１に記載のアッセイ。
（１３）  配列番号２及び配列番号６を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を有する、前立腺癌アッセイ。
（１４）  配列番号４を含む、複数のメチル化部位の発見のための試薬を更に含む、実施態様１３に記載のアッセイ。
（１５）  同じ遺伝子内からの複数のメチル化ヌクレオチド配列を発見するための試薬、及び変換試薬を含む、キット。
（１６）  前記変換試薬が重亜硫酸ナトリウムを含む、実施態様１５に記載のキット。
（１７）  前記遺伝子がＧＳＴＰ１である、実施態様１６に記載のキット。
（１８）  前記試薬が、ＦＦＰＥ組織サンプルとの使用のために設計されている、実施態様１６に記載のキット。
（１９）  前記サンプルが、前立腺サンプルである、実施態様１８に記載のキット。
（２０）  前記試薬が、尿サンプルとの使用のために設計されている、実施態様１６に記載のキット。
【国際調査報告】
2011509688.tif 000012
2011509688.tif 000013