(57)【要約】  本発明は、複数のアレナウイルス剤を単独でまたは同時に標的とするＤＮＡワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレナウイルスに対する防御免疫応答を、それを必要とする対象において生成することができる１つ以上の免疫原性タンパク質をコードするヌクレオチドコード配列を含むＤＮＡワクチンであって、
前記対象のためにコドン最適化された、アレナウイルスの糖タンパク質前駆体；または前記糖タンパク質前駆体に９８％相同性であるその免疫原性フラグメントをコードするコード配列を含むＤＮＡワクチン。
【請求項２】
前記コード配列が、ＬＡＳＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ）、ＬＣＭＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＬＣＭＶ−ＧＰＣ）、ＭＡＣＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＭＡＣＶ−ＧＰＣ）、ＪＵＮＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＪＵＮＶ−ＧＰＣ）、ＧＴＯＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＧＴＯＶ−ＧＰＣ）、ＷＷＡＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＷＷＡＶ−ＧＰＣ）、またはＰＩＣＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＰＩＣＶ−ＧＰＣ）から本質的になる、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項３】
前記フラグメントが、
残基４４１〜４４９を含むＬＡＳＶ−ＧＰＣのフラグメント、
残基４４７〜４５５を含むＬＭＣＶ−ＧＰＣのフラグメント、
残基４４４〜４５２を含むＭＡＣＶ−ＧＰＣのフラグメント、
残基４２９〜４３７を含むＪＵＮＶ−ＧＰＣのフラグメント、
残基４２７〜４３５を含むＧＴＯＶ−ＧＰＣのフラグメント、
残基４２８〜４３６を含むＷＷＡＶ−ＧＰＣのフラグメント、または
残基４５５〜４６３を含むＰＩＣＶ−ＧＰＣのフラグメント
を含む、請求項２に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項４】
前記ＤＮＡワクチンが、前記コード配列のうちの１つから本質的になる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項５】
前記ＤＮＡワクチンが、前記コード配列のうちの少なくとも２つから本質的になる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項６】
ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、１Ｌ−２８、またはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるアジュバントをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項７】
前記コード配列が、
配列番号１もしく２であるか、または配列番号４もしくは５をコードするヌクレオチド配列である、請求項６に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項８】
アレナウイルスに対する防御免疫応答を誘導する方法であって、
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡワクチンを、それを必要とする対象に投与し、および
前記対象に電気穿孔を行う
ことを含む方法。
【請求項９】
前記電気穿孔ステップは、
投与ステップが行われた前記対象の部位に、電気穿孔エネルギーパルスを送達することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与ステップおよび電気穿孔ステップは、いずれも、前記対象の皮内層で行われる、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年７月１１日に出願された米国特許仮出願第６１／５０６，５７９号、および２０１１年７月１２日に出願された同第６１／５０７，０６２号の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の支援による研究開発
本発明の主題の開発に関連する活動は、少なくともある程度、米国政府軍契約番号Ｗ８１ＸＷＨ−１２−０１５４による資金提供を受けており、したがって、米国は、本発明にある権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、アレナウイルスに対する防御免疫応答の誘発に効果的なＤＮＡに基づくワクチン、ならびにそれを作製および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
アレナウイルス（ＡＶ）は、齧歯類媒介性ウイルスであり、不快感、重度の浮腫、失血、および高死亡率を伴う、急性およびしばしば致死性の出血熱を引き起こす。ラッサウイルス（ＬＡＳ）は、西アフリカ地域に固有の旧世界アレナウイルスである。ラッサ熱の輸入症例は、米国、ヨーロッパ、およびカナダで報告されている。毎年、３００，０００〜５００，０００件のラッサ熱症例が発生し、入院患者の死亡率が１５％〜２０％であると推定されている。新世界アレナウイルス、フニンウイルス（ＪＵＮＶ）、マチュポウイルス（ＭＡＣＶ）、グアナリトウイルス、およびサビアウイルスは、南アメリカに固有であり、１年に何千もの重度出血熱の症例を引き起こすことが知られている。アレナウイルスは、ＣＤＣのカテゴリーＡの生物学的に脅威となる作用物質であり、これらのウイルスによる新興疾病の発生または生物テロ攻撃という不運な事件が発生した場合、一般市民が入手できるＦＤＡに認可されている暴露前または暴露後の治療薬またはワクチンは存在しない。マウスにおいて免疫応答を誘発し得るＨＬＡクラスＩ制限エピトープを特定した研究が報告されている。Ｂｏｔｔｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．９９４７−９９５６（Ｏｃｔ  ２０１０）を参照されたい。
【０００５】
その発生ならびに高い罹患率および死亡率の理由から、近年、あらゆる関心がアレナウイルスに向けられているが、利用可能な治療はほとんど存在しない。ＡＶの予防に認可されたワクチンは存在せず、ヒトＡＶ感染の治療に認可された唯一の薬物は、抗ウイルス薬リバビリンである。リバビリンは、暴露の初期に摂取した場合、ＡＶ感染に関連する罹患率および死亡率の減少を助けるが、強い毒性および副作用を被る。低費用および／または治療に有効な薬物、ならびに世界のＡＶ流行地における予防に効果的であり、かつ世界の流行地において生物テロの脅威を介して、または米国軍人の配置を介して暴露と闘うのに効果的なワクチンを開発する満たされていない明確な必要性が存在する。
【０００６】
さらに、多剤アレナウイルスワクチンの満たされていない必要性も存在する。前述のように、競合的な効果的予防法も治療法も利用可能ではない。我々が知る限り、研究新薬（ＩＮＤ）の状態での限られた使用がＦＤＡによって認可されている弱毒化生フニンウイルスワクチン（候補番号１）が、アレナウイルス感染症について試験された唯一のワクチンである。しかしながら、このワクチンも、他のアレナウイルス株に対する交差防御が不可能であることが、その後の動物研究で示されている。
【０００７】
したがって、アレナウイルスに対する有効薬または効果的なワクチンを提供するワクチン、および複数のアレナウイルス剤を単独で、または同時に標的とするワクチンの必要性が依然として存在する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１（Ａ）、１（Ｂ）、１（Ｃ）、および１（Ｄ）は、非最適化構築物（配列番号３を含む）と対比させた、最適化構築物（配列番号１を含む）でワクチン接種されたモルモットの血清ウイルス血症および罹患率スコアを示す。図１（Ｂ２）および１（Ｄ２）は、図１（Ｂ）および１（Ｄ）のデータを示すが、それぞれ、非侵襲的電気穿孔（ＮＩＶＥＰ）の血清ウイルス血症スコアおよび罹患率スコアを追加する。
【図２】図２（Ａ）および２（Ｂ）は、モルモットにおける非最適化（配列番号３を含む）およびコドン最適化（配列番号ＮＯＴを含む）ＬＡＳＶ  ＤＭＡワクチンの生存率曲線を示す。
【図３】図３（Ａ）および３（Ｂ）は、バックチャレンジ（ｂａｃｋ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）研究に採用したモルモットの体重および体温を示す。
【図４】ＬＡＳＶでの致死チャレンジに耐え抜いたＬＡＳＶ−ＧＰＣまたは疑似ワクチンが接種されたサルのＢＡＥＲＶＯＭ聴覚スクリーニングを示す。
【図５】図５（Ａ）、５（Ｂ）、および５（Ｃ）は、ＬＡＳＶ−ＧＰＣ（配列番号２を含む）または疑似（配列番号３を含む）ＤＮＡワクチンを受けたカニクイザルマカクの生存率曲線、血清ウイルス血症、および罹患率スコアを示す。
【図６Ａ】図６（Ａ）は、ＬＡＳＶ−ＧＰＣ（配列番号２を含む）または疑似（配列番号３を含む）ＤＮＡワクチンを受けたカニクイザルマカクの血液化学値を示す。
【図６Ｂ】図６（Ｂ）は、ＬＡＳＶ−ＧＰＣ（配列番号２を含む）または疑似（配列番号３を含む）ＤＮＡワクチンを受けたカニクイザルマカクの血液化学値を示す。
【図６Ｃ】図６（Ｃ）は、ＬＡＳＶ−ＧＰＣ（配列番号２を含む）または疑似（配列番号３を含む）ＤＮＡワクチンを受けたカニクイザルマカクの血液化学値を示す。
【図７】ＬＡＳＶ−ＧＰＣ（配列番号２を含む）または疑似（配列番号３を含む）ＤＮＡワクチンを受けたカニクイザルの選択的血液学値を示す。
【図８−１】モルモットのためにコドン最適化されたＬＡＳＶ−ＧＰＣ（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ  ＧＰ）、非ヒト霊長類のためにコドン最適化されたＬＡＳＶ−ＧＰＣ（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ  ＮＨＰ）、および参照ＬＡＳＶ  ＧＰＣ（対照）の間の配列アライメントを示す。
【図８−２】モルモットのためにコドン最適化されたＬＡＳＶ−ＧＰＣ（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ  ＧＰ）、非ヒト霊長類のためにコドン最適化されたＬＡＳＶ−ＧＰＣ（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ  ＮＨＰ）、および参照ＬＡＳＶ  ＧＰＣ（対照）の間の配列アライメントを示す。
【図８−３】モルモットのためにコドン最適化されたＬＡＳＶ−ＧＰＣ（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ  ＧＰ）、非ヒト霊長類のためにコドン最適化されたＬＡＳＶ−ＧＰＣ（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ  ＮＨＰ）、および参照ＬＡＳＶ  ＧＰＣ（対照）の間の配列アライメントを示す。
【図８−４】モルモットのためにコドン最適化されたＬＡＳＶ−ＧＰＣ（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ  ＧＰ）、非ヒト霊長類のためにコドン最適化されたＬＡＳＶ−ＧＰＣ（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ  ＮＨＰ）、および参照ＬＡＳＶ  ＧＰＣ（対照）の間の配列アライメントを示す。
【図８−５】モルモットのためにコドン最適化されたＬＡＳＶ−ＧＰＣ（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ  ＧＰ）、非ヒト霊長類のためにコドン最適化されたＬＡＳＶ−ＧＰＣ（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ  ＮＨＰ）、および参照ＬＡＳＶ  ＧＰＣ（対照）の間の配列アライメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の態様は、アレナウイルスに対する防御免疫応答を、それを必要とする対象において生成することができる１つ以上の免疫原性タンパク質をコードするヌクレオチドコード配列を含むＤＮＡワクチンを提供する。コード配列は、アレナウイルスの糖タンパク質前駆体をコードし、目的とされる対象のためにコドン最適化されている。さらに、このコード配列は、糖タンパク質前駆体と少なくとも９８％相同性である、その免疫原性フラグメントであってもよい。
【００１０】
いくつかの実施形態において、コード配列は、ＬＡＳＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ）、ＬＣＭＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＬＣＭＶ−ＧＰＣ）、ＭＡＣＶ（ＭＡＣＶ−ＧＰＣ）の糖タンパク質前駆体ドメイン、ＪＵＮＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＪＵＮＶ−ＧＰＣ）、ＧＴＯＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＧＴＯＶ−ＧＰＣ）、ＷＷＡＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＷＷＡＶ−ＧＰＣ）、またはＰＩＣＶの糖タンパク質前駆体ドメイン（ＰＩＣＶ−ＧＰＣ）から本質的になる。好ましくは、フラグメントは、残基４４１〜４４９を含むＬＡＳＶ−ＧＰＣのフラグメント、残基４４７〜４５５を含むＬＭＣＶ−ＧＰＣのフラグメント、残基４４４〜４５２を含むＭＡＣＶ−ＧＰＣのフラグメント、残基４２９〜４３７を含むＪＵＮＶ−ＧＰＣのフラグメント、残基４２７〜４３５を含むＧＴＯＶ−ＧＰＣのフラグメント、残基４２８〜４３６を含むＷＷＡＶ−ＧＰＣのフラグメント、または残基４５５〜４６３を含むＰＩＣＶ−ＧＰＣのフラグメントを含む。
【００１１】
１つの好ましい実施形態において、ＤＮＡワクチンは、前記コード配列のうちの１つから本質的になる、単剤または一価ワクチンである。別の好ましい実施形態において、ＤＮＡワクチンは、前記コード配列のうちの少なくとも２つから本質的になる、複合剤または多価ワクチンである。好ましくは、一価または多価ワクチンには、本開示のＬＡＳＶ−ＧＰＣが含まれ、より好ましくは、配列番号１または２、あるいは配列番号４もしくは５をコードするヌクレオチドコード配列が含まれる。
【００１２】
いくつかの実施形態において、提供されるＤＮＡワクチンは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、またはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるアジュバントをさらに含む。
【００１３】
本発明の一態様において、アレナウイルスに対する防御免疫応答を誘導する方法が提供され、本方法は、本明細書に提供されるＤＮＡワクチンを投与することと、前記対象に電気穿孔を行うこととを含む。いくつかの実施形態において、電気穿孔ステップは、投与ステップが行われた前記対象の部位に、電気穿孔エネルギーパルスを送達することを含む。好ましくは、投与ステップおよび電気穿孔ステップはいずれも、前記対象の皮内層で行われる。
【００１４】
本開示の発明は、対象において、１つ、またはいくつかの事例においては複数の、旧世界および新世界いずれの病原体も包含するアレナウイルス（ＬＡＳＶ、ＬＣＭＶ、ＭＡＣＶ、ＪＵＮＶ、ＧＴＯＶ、ＷＷＡＶ、およびＰＩＣＶ）に対する防御免疫応答を生成する、新規なＤＮＡワクチンに関する。
【００１５】
提供されるワクチンは、免疫応答の多様性および関連するが相違する複数のウイルスに対する交差防御を増加させるＡＶ  ＧＰＣドメインＤＮＡ免疫原から成る。より広範囲の病原体を標的とすることができるアレナウイルスのために遺伝子的に最適化された免疫原、具体的には、最適化されたＧＰＣドメインが、本明細書でさらに説明される。本ワクチンの一実施形態は、最適化されたＬＡＳＶコード配列であり、これは、多剤製剤を達成するために、ＬＡＳＶ、ＬＣＭＶ、ＭＡＣＶ、ＪＵＮＶ、ＧＴＯＶ、ＷＷＡＶ、およびＰＩＣＶウイルス、ならびに好ましくはＭＡＣＶおよびＪＵＮＶウイルスを標的するワクチンをさらに含み得る。
【００１６】
本ワクチンを、非常に革新的な製造プロセスおよび最適化されたワクチン製剤と組み合わせて、多剤製剤の効力を強化することができる。従来的には、ＤＮＡは、２〜４ｍｇ／ｍＬの濃度でのみ製造することが可能であった。この物理的制限が、複数の抗原を標的とするＤＮＡプラスミドを、防御有効性を達成するのに十分に高い用量レベルで組み合わせることを困難にしている。それらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２３８，５２２号および米国特許公開第２００９−０００４７１６号に記載される製造プロセス等の特許権を有する製造プロセスを利用することにより、ＤＮＡプラスミドは、純度の高い１０ｍｇ／ｍＬを超える濃度で製造することができる。この高濃度製剤は、従来のＩＤ注入等、少ない注入量（０．１ｍＬ）での効果的な送達にも有益である。
【００１７】
本ワクチンを、非常に革新的で効率的な電気穿孔（ＥＰ）に基づくＤＮＡ送達システムと組み合わせて、注入されたＤＮＡワクチンの効力を増加させることもできる。電気穿孔の深さが浅く、一過性が低い電気パラメーターを用いたＥＰ送達システムは、この新しいデバイスを、予防的用途および大規模なワクチン接種に対して大幅に耐容性の高いものにする。
【００１８】
提供される製造プロセスおよび電気穿孔送達デバイスと組み合わせたこのＤＮＡワクチンは、とりわけ、次の利点を提供し得る：
・ベクター誘導性の応答がなく、追加免疫の反復を行う、複合／組み合わせワクチン
・霊長類およびヒトにおいて、ウイルスベクターよりも効力が強い
・製造上の利点
【００１９】
モルモットおよび非ヒト霊長類チャレンジモデルにおいて、致死から１００％の防御を対象において誘発することが示されている、単剤ＬＡＳＶワクチン候補の詳細が、本明細書に提供される。ＬＡＳＶワクチン候補は、非ヒト霊長類モデルにおいて、このワクチンアプローチの臨床解釈を促進することが示された。２つの異なるチャレンジモデルに対するこのような成功は、これまでの文献において、ベクターまたは非ベクターのいずれの他のアレナウイルスワクチン候補にも達成されていない。
【００２０】
ＬＡＳＶワクチン候補は、旧世界および新世界の両方のウイルスを標的とする多剤候補ワクチンである。ＧＰＣ抗原（ウイルスの免疫原性構成要素）は、異なるアレナウイルスのサブタイプ（それぞれ、ＬＡＳＶ−ＭＡＣＶ／ＪＵＮＶ、およびＭＡＣＶ−ＪＵＮＶ）との相同性が４２〜７１％の範囲であり、異なるサブタイプ内での配列間の相違は２〜１０％であり、ＬＡＳＶ、ＭＡＣＶ、およびＪＵＮＶにわたって高度に保存されない。したがって、多剤ワクチンを開発することは、明白ではなく、複数の技術的問題を伴う。
【００２１】
本明細書に提供されるワクチン候補は、それらがそれぞれの株（例えば、ＬＡＳＶ、ＪＵＮＶ、ＭＡＣＶ）に対して個別に効果を有し、これらおよび他のアレナウイルス株に対して、集合的に交差防御性となるように、候補ＧＰＣワクチンを、標的とされるウイルスサブタイプのそれぞれのために最適化したものである。ワクチン候補は、プラスミド成分が、高濃度（１０ｍｇ／ｍＬ超）となるように製造される。ワクチン候補の成分は、ＥＰでの送達用に組み合わせることができる。ＥＰ送達は、ＥＰを用いないＤＮＡ送達と比較して、ＤＮＡトランスフェクションおよび遺伝子発現の効率を、１０００倍を上回って向上させ、免疫原性および有効性を、１０〜１００倍を上回って向上させることが示されている。多剤ＤＮＡワクチンを少量で注入するＥＰ送達により、このアプローチは、予防的ワクチン接種、および具体的には、多剤ワクチン送達に特に好適である。
【００２２】
本明細書に記載されるＤＮＡワクチンのアプローチは、ＤＮＡワクチンが、非複製型であり、ゲノム内に統合されず、ベクターとは異なり、ベクターワクチンの効力をさらに制限し得る抗ベクター血清学をもたらすことがないため、他の競合する弱毒化生／不活化ウイルスのアプローチおよび他のベクターに基づくアプローチ（Ａｄ５、ＭＶＡ、ＹＦ）よりも、明白な安全性の利点を有する。ＤＮＡワクチンは、現在、数百の異なるワクチン試験にわたり、数千人のヒト対象に送達されているが、安全性の観点から、注目すべきものはほとんどない。ＥＰ送達とともに、ＤＮＡＥＰワクチン（ＨＩＶ、ＨＰＶ、インフルエンザ、ＨＣＶ、前立腺癌、黒色腫）は、１５０以上の対象に、筋肉内または皮内のいずれかの経路を介して、３５０以上のワクチン接種が行われているが、安全性プロファイルは注目に値しない。
【００２３】
一実施形態において、ワクチン候補は、次の仕様を有し得る。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
モルモット（Ｓｔｒａｉｎ１３）およびカニクイザルマカクにおいて、チャレンジを実行する。研究の項に記載のように、これらはいずれも、アレナウイルスチャレンジの確立したモデルである。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ワクチン候補は、全２つ以上のワクチン候補（ＬＡＳＶ、ＬＣＭＶ、ＭＡＣＶ、ＪＵＮＶ、ＧＴＯＶ、ＷＷＡＶ、およびＰＩＣＶ）を含有し、これが、交差防御をもたらし得るが、一方で他の実施形態においては、２つのワクチン候補のみの組み合わせが存在し、より好ましくは、例として、１つが旧世界プラスミドであり、１つが新世界プラスミドである２つ、例えば、ＬＡＳＶとＪＵＮＶまたはＭＡＣＶのいずれかが、ＡＶの全ての複数株に対する防御をもたらす。一実施例において、ＤＮＡワクチンは、２つのＤＮＡワクチンプラスミド（ＬＡＳＶ−＋−ＪＵＮＶ／ＭＡＣＶ）を含む。別の実施例では、ＤＮＡワクチンは、ワクチン候補およびサイトカインプラスミドを含む。別の実施例においては、ＤＮＡワクチンは、ＬＡＳＶ、ＪＵＮＶ、およびＭＡＣＶを含む、３つのプラスミドワクチン候補を含む。
【００２７】
ワクチン候補が、例えば、ＩＬ−１２およびＩＬ−２８、ならびにＲＡＮＴＥＳを例とする、分子アジュバントもまた含む、いくつかの実施形態が存在する。アジュバントは、ワクチンの免疫応答の幅、それらの規模を増加させるか、または免疫表現型を改変して、改善された株交差有効性（幅）および／または低用量で１００％の有効性（効力）等の追加の利益をワクチンに与えることができる。いくつかの実施形態において、ワクチン候補は、ＬＡＳＶを標的とする単一のプラスミドである。この単一プラスミド候補は、致死チャレンジから、モルモットおよび非ヒト霊長類（「ＮＨＰ」）を防御することに高く効果的であることが示されている。
【００２８】
定義
本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみであり、制限するように意図するものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明確に示されない限り、複数形の指示対象を含む。
【００２９】
本明細書における数値範囲の記述について、それらの間に介在する各数字は、同程度の正確さで明確に企図される。例えば、６〜９の範囲については、６および９に加えて、７および８の数字が企図され、６．０〜７．０の範囲については、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０という数字が、明確に企図される。
【００３０】
アジュバント
本明細書に使用される「アジュバント」とは、本明細書に記載されるＤＮＡワクチンに添加され、ＤＮＡワクチンを構成するＤＮＡ構築物、および本明細書に後述されるコード核酸配列によってコードされる、抗原の免疫原性を強化する任意の分子を意味する。
【００３１】
コード配列
本明細書に使用される「コード配列」または「コード核酸」とは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、さらに、その核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞内での発現を指示する能力のある、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、制御エレメントに操作可能に接続される開始および終結シグナルを含み得る。
【００３２】
相補体
本明細書に使用される「相補体」または「相補的な」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間の、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対を意味し得る。
【００３３】
電気穿孔
本明細書で同義に使用される「電気穿孔」、「電気透過」、または「電気運動強化」（「ＥＰ」）とは、生体膜に微細通路（孔）を誘導する膜貫通電場パルスの使用を意味し、それらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および水等の生体分子が、細胞膜の一方の側面から反対側に通過することを可能にする。
【００３４】
フラグメント
核酸配列に関して本明細書に使用される「フラグメント」とは、アレナウイルスＧＰＣ抗原と交差反応する、哺乳動物において免疫応答を誘発する能力のあるポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部分を意味する。フラグメントは、コンセンサスアミノ酸配列およびこのような配列を含む構築物をコードする、種々のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つから選択される、ＤＮＡフラグメントであり得る。ＤＮＡフラグメントは、ＩｇＥまたはＩｇＧ配列等の免疫グロブリンリーダーのコード配列を含み得る。ＤＮＡフラグメントは、以下に記載されるタンパク質フラグメントをコードすることができる。
【００３５】
ポリペプチド配列に関する「フラグメント」とは、例えば、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）、脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、フニンウイルス（ＪＵＮＶ）、マチュポウイルス（ＭＡＣＶ）、リンパ球性グアナリトウイルス（ＧＴＯＶ）、ホワイトウォーターアロヨウイルス（Ｗｈｉｔｅ−ｗａｔｅｒ  Ａｒｒｏｙｏ  ｖｉｒｕｓ）（ＷＷＡＶ）、およびピチンデウイルス（ＰＩＣＶ）を含む、アレナウイルス抗原と交差反応する、哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドを意味する。
【００３６】
ＬＡＳＶ糖タンパク質前駆体（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ）配列は、約４９１のアミノ酸配列であり、好ましくはコドン最適化されている。ＬＡＳＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＬＡＳＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、ＧＰＣ領域の残基４４１〜４４９を含有する。いくつかの実施形態において、ＬＡＳＶ−ＧＰＣのフラグメントは、配列番号４または５の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。
【００３７】
ＬＣＭＶ糖タンパク質前駆体（ＬＣＭＶ−ＧＰＣ）配列は、約４９８のアミノ酸であり、好ましくは、コドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ ６９４８５１を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＬＣＭＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＬＣＭＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４４７〜４５５を含有する。
【００３８】
ＪＵＮＶ糖タンパク質前駆体（ＪＵＮＶ−ＧＰＣ）配列は、約４８５のアミノ酸であり、好ましくは、コドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＢＡＡ００９６４を参照されたく、これはその全体が本明細書に組み込まれる。ＪＵＮＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＪＵＮＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４２９〜４３７を含有する。
【００３９】
ＭＡＣＶ糖タンパク質前駆体（ＭＡＣＶ−ＧＰＣ）配列は、約４９６のアミノ酸であり、好ましくは、コドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＮ０５４２５を参照されたく、これはその全体が本明細書に組み込まれる。ＭＡＣＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＭＡＣＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４４４〜４５２を含有する。
【００４０】
ＧＴＯＶ糖タンパク質前駆体（ＧＴＯＶ−ＧＰＣ）配列は、約４９６のアミノ酸であり、好ましくはコドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＮ０５４２３を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＧＴＯＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＧＴＯＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４２７〜４３５を含有する。
【００４１】
ＷＷＡＶ糖タンパク質前駆体（ＷＷＡＶ−ＧＰＣ）配列は、約４９６のアミノ酸であり、好ましくはコドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＫ６０４９７を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＷＷＡＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＷＷＡＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４２８〜４３６を含有する。
【００４２】
ＰＩＣＶ糖タンパク質前駆体（ＰＩＣＶ−ＧＰＣ）配列は、約４９６のアミノ酸であり、好ましくはコドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＣ３２２８１を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＰＩＣＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＰＩＣＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４５５〜４６３を含有する。
【００４３】
遺伝子構築物
本明細書に使用される際、「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列には、核酸分子が投与される個体の細胞内での発現を指示することができる、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、制御エレメントに操作可能に結合される開始および終結シグナルが含まれる。本明細書に使用される「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞内に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に操作可能に結合される、必要な制御エレメントを含有する遺伝子構築物を指す。
【００４４】
相同性
複数の配列アライメントおよび系統樹の相同性を、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアを使用して生成した。
【００４５】
同一
２つの核酸またはポリペプチド配列に関連して本明細書に使用される「同一の」または「同一性」とは、その配列が、指定された領域にわたって同一である、指定された割合の残基を有することを意味する。その割合は、２つの配列を最適にアライメントし、指定の領域にわたり２つの配列を比較し、同一の残基が両方の配列に発生する位置の数を判定して、一致する位置の数を得、一致する位置の数を、指定領域内の位置の合計数で除し、その結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を得ることによって計算することができる。２つの配列が異なる長さであるか、またはアライメントが１つ以上の末端の食い違いをもたらし、指定の比較領域が、単一の配列のみを含む場合は、単一の配列の残基を、計算の分子ではなく、分母に含める。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を、同等と見なすとができる。同一性は、手作業またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０等のコンピュータ配列アルゴリズムを用いて行うことができる。
【００４６】
免疫応答
本明細書に使用される「免疫応答」とは、アレナウイルス抗原等の抗原の導入に応答した、例として哺乳動物のものである宿主の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性もしくは体液性応答の形態であってもよく、またはその両方であってもよい。
【００４７】
核酸
本明細書に使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、共有結合で一緒に結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記述も、相補鎖の配列を定義する。したがって、核酸は、記述された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多数の変化形を、所定の核酸と同一の目的で使用することができる。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列とハイブリダイズすることが可能なプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブをもまた包含する。
【００４８】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖および一本鎖の両方の配列の部分を含有してもよい。核酸は、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、インノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む、塩基の組み合わせを含有し得る。核酸は、化学合成法または組み換え法によって得られ得る。
【００４９】
操作可能に結合される
本明細書に使用される「操作可能に結合される」とは、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されるプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子内でそれが制御する遺伝子との間の距離とおおよそ同じであり得る。当該技術分野で既知のように、この距離の変更は、プロモーター機能を損失することなく調整することができる。
【００５０】
プロモーター
本明細書に使用される「プロモーター」とは、細胞内で核酸の発現をもたらすか、活性化するか、または強化することが可能な合成もしくは天然由来の分子を意味する。プロモーターは、さらに、その発現を強化し、かつ／またはその空間的発現および／もしくは一時的発現を変化させる１つ以上の特定の転写制御配列を含んでもよい。プロモーターは、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含んでもよく、これは、転写の開始部位から、数千塩基対程度の位置にあり得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは器官に関して、または発現が生じる成長段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤等の外部刺激に応答して、構造的または特異的に遺伝子の発現を制御することができる。プロモーターの代表的な例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーターＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーターもしくはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００５１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
本明細書に使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、核酸の複雑な混合物において等、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）とハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況においては、異なるであろう。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨで特定の配列の熱融解点（Ｔm）よりも約５〜１０℃低くなるように、選択することができる。Ｔmは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列とハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核濃度下で）であり得る（標的配列が、過剰に存在するため、Ｔmにおいて、プローブの５０％は、平衡状態にある）。ストリンジェントな条件は、塩の濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）等、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオンであるものであり得、温度は、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）については、少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドを上回る）については、少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミド等の不安定化剤の添加により達成することもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについては、正のシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍である。例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件には、次のものが挙げられる：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄。
【００５２】
実質的に相補性
本明細書に使用される「実質的に相補性」とは、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、６３０、７２０、８１０、９００、９９０、１０８０、１１７０、１２６０、１３５０、または１４４０以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたり、第２の配列の相補体と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるか、または２つの配列が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【００５３】
実質的に同一
本明細書に使用される「実質的に同一」とは、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、６３０、７２０、８１０、９００、９９０、１０８０、１１７０、１２６０、１３５０、または１４４０以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の領域にわたり、第２の配列の相補体と、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるか、または核酸に関して、第１の配列が、第２の配列の構成要素と実質的に相補性であることを意味する。
【００５４】
サブタイプまたは血清型
アレナウイルスに関連して本明細書において同義に使用される「サブタイプ」または「血清型」とは、アレナウイルス抗原の遺伝的変異体を意味し、その結果、１つのサブタイプ（または変異体）は、異なるサブタイプとは別の免疫系によって認識される。
【００５５】
変異体
核酸に関して本明細書に使用される「変異体」とは、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部分もしくはフラグメント、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列の相補体もしくはその一部分、（ｉｉｉ）参照ヌクレオチドもしくはその相補体と実質的に同一の核酸、または（ｉｖ）参照核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一の配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸を意味する。
【００５６】
アミノ酸配列におけるアミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持する、ペプチドまたはポリペプチドに関する「変異体」変異体は、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質も意味する。アミノ酸の保存的置換、すなわち、１つのアミノ酸を、類似の特性（親水性、荷電領域の程度および分布）を有する別のアミノ酸と置き換えることは、典型的に小規模な変更を伴うとして、当該技術分野で認識されている。これらの小規模な変更は、当該技術分野において理解されるように、アミノ酸の親水性指標を考慮することによって、ある程度特定され得る。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の親水性指標は、その疎水性および電荷の考察に基づく。類似の親水性指標のアミノ酸を置換することができ、依然としてタンパク質の機能を保持することは、当該技術分野で既知である。一態様において、±２の親水性指標を有するアミノ酸を置換する。アミノ酸の親水性を使用することで、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換が判明し得る。ペプチドとの関連においてアミノ酸の親水性を考慮することにより、そのペプチドの最大局所平均親水性を計算することが可能となり、これは、抗原性および免疫原性と十分に相関性があることが報告されている有用な尺度である。米国特許第４，５５４，１０１号、参照により本明細書に完全に組み込まれる。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、当該技術分野で理解されるように、免疫原性を例とする生物学的活性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、それぞれの±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性指標および親水性値のいずれも、そのアミノ酸の特定の側鎖に影響される。この見解と一致して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、寸法、および他の特性によって明らかとなるアミノ酸の相対的類似性、特にそれらのアミノ酸の側鎖に依存することが理解される。
【００５７】
ベクター
本明細書に使用される「ベクター」とは、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであってもよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。
【００５８】
ワクチンの賦形剤および他の成分
ワクチンは、トランスフェクション促進剤、薬学的に許容される賦形剤、アジュバント等、他の成分をさらに含んでもよい。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤等の機能性分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であってもよく、これには、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレン等の小胞体、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルス性タンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、あるいは他の既知のトランスフェクション促進剤が含まれる。
【００５９】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含み、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質であってもよい。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタメートであってもよい。ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で、ワクチン中に存在し得る。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレン等の小胞体を含み得、ヒアルロン酸も、遺伝子構築物との併用で投与することができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡプラスミドワクチンはまた、脂質、ＤＮＡリポソーム混合物（例えば、ＷＯ９３２４６４０号を参照されたい）として、レシチンリポソームもしくは当該技術分野で既知の他のリポソームを含む、リポソーム等のトランスフェクション促進剤、カルシウムイオン、ウイルス性タンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、あるいは他の既知のトランスフェクション促進剤を含み得る。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含む、ポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍＬ未満、２ｍｇ／ｍＬ未満、１ｍｇ／ｍＬ未満、０．７５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．５００ｍｇ／ｍＬ未満、０．２５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．１００ｍｇ／ｍＬ未満、０．０５０ｍｇ／ｍＬ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍＬ未満である。
【００６０】
薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントであり得る。アジュバントは、別のプラスミドに発現されるか、またはワクチンにおいて上述のプラスミドと組み合わせたタンパク質として送達される他の遺伝子であってもよい。アジュバントは、シグナル配列が欠失したＩＬ−１５を含み、任意でＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含む、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ΤΝＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６からなる群から選択することができる。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００６１】
有用なアジュバントであり得る他の遺伝子には、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能性フラグメントが挙げられる。ワクチンは、１９９４年４月１日に出願され、参照により完全に組み込まれる米国特許出願第０２１，５７９号に記載のような、遺伝子ワクチン促進剤をさらに含んでもよい。
【００６２】
ワクチンは、使用される投与形態に応じて製剤化することができる。注入可能なワクチンの薬学的組成物は、滅菌、発熱物質不含、かつ微粒子不含であり得る。等張製剤または溶液を使用してもよい。等張性添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれ得る。ワクチンは、血管収縮剤を含んでもよい。等張溶液には、リン酸緩衝食塩水が含まれ得る。
ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンを含む安定剤をさらに含んでもよい。安定剤は、ＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオンを含み、製剤が長期間にわたって室温または周囲温度で安定的であることを可能にし得る。
【００６３】
ワクチン接種の方法
対象をワクチン接種する方法が本明細書に提供される。本方法は、ワクチンを送達する機構として、電気穿孔を使用する。電気穿孔は、最小限に侵襲的なデバイスを介して行うことができる。
【００６４】
コドン最適化されたＡＶ  ＧＰＣ抗原
ＬＡＳＶ糖タンパク質前駆体（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ）配列は、約４９１のアミノ酸配列であり、好ましくはコドン最適化されている。ＬＡＳＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＬＡＳＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、ＧＰＣ領域の残基４４１〜４４９を含有する。いくつかの実施形態において、ＬＡＳＶ−ＧＰＣのフラグメントは、配列番号４または５の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。
【００６５】
ＬＣＭＶ糖タンパク質前駆体（ＬＣＭＶ−ＧＰＣ）配列は、約４９８のアミノ酸であり、好ましくは、コドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ ６９４８５１を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＬＣＭＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＬＣＭＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４４７〜４５５を含有する。
【００６６】
ＪＵＮＶ糖タンパク質前駆体（ＪＵＮＶ−ＧＰＣ）配列は、約４８５のアミノ酸であり、好ましくは、コドン最適化され、ＮＣＢＩ受託番号ＢＡＡ００９６４を参照されたく、これはその全体が本明細書に組み込まれる。ＪＵＮＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＪＵＮＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４２９〜４３７を含有する。
【００６７】
ＭＡＣＶ糖タンパク質前駆体（ＭＡＣＶ−ＧＰＣ）配列は、約４９６のアミノ酸であり、好ましくは、コドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＮ０５４２５を参照されたく、これはその全体が本明細書に組み込まれる。ＭＡＣＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＭＡＣＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４４４〜４５２を含有する。
【００６８】
ＧＴＯＶ糖タンパク質前駆体（ＧＴＯＶ−ＧＰＣ）配列は、約４９６のアミノ酸であり、好ましくはコドン最適化され、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＮ０５４２３を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＧＴＯＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＧＴＯＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４２７〜４３５を含有する。
【００６９】
ＷＷＡＶ糖タンパク質前駆体（ＷＷＡＶ−ＧＰＣ）配列は、約４９６のアミノ酸であり、好ましくはコドン最適化され、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＫ６０４９７を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＷＷＡＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＷＷＡＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４２８〜４３６を含有する。
【００７０】
ＰＩＣＶ糖タンパク質前駆体（ＰＩＣＶ−ＧＰＣ）配列は、約４９６のアミノ酸であり、好ましくはコドン最適化され、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＣ３２２８１を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＰＩＣＶ−ＧＰＣのフラグメントは、ＰＩＣＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４５５〜４６３を含有する。
【００７１】
ヌクレオチド配列−コード配列ならびに構築物およびプラスミド
ＬＡＳＶ糖タンパク質前駆体（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ）ヌクレオチドコード配列は、約１４７６ヌクレオチドであり、好ましくは、コドン最適化されている。ＬＡＳＶ−ＧＰＣの免疫原性フラグメントのコード配列は、ＬＡＳＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、ＧＰＣ領域の残基４４１〜４４９を含有する。いくつかの実施形態において、ＬＡＳＶ−ＧＰＣのコード配列は、配列番号１および２である。いくつかの実施形態において、ＬＡＳＶ−ＧＰＣのフラグメントのコード配列は、配列番号４または５の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。いくつかの実施形態において、ＬＡＳＶ−ＧＰＣのフラグメントのコード配列は、配列番号１または２の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。
【００７２】
ＬＣＭＶ糖タンパク質前駆体（ＬＣＭＶ−ＧＰＣ）ヌクレオチドコード配列は、約１４９４ヌクレオチドであり、好ましくは、コドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ ６９４８５１を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＬＣＭＶ−ＧＰＣの免疫原性フラグメントのコード配列は、ＬＣＭＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは残基４４７〜４５５を含有する。
【００７３】
ＪＵＮＶ糖タンパク質前駆体（ＪＵＮＶ−ＧＰＣ）ヌクレオチドコード配列は、約１４５５ヌクレオチドであり、好ましくは、コドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＢＡＡ００９６４を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＪＵＮＶ−ＧＰＣの免疫原性フラグメントのコード配列は、ＪＵＮＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは残基４２９〜４３７を含有する。
【００７４】
ＭＡＣＶ糖タンパク質前駆体（ＭＡＣＶ−ＧＰＣ）ヌクレオチドコード配列は、約１４８８ヌクレオチドであり、好ましくは、コドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＮ０５４２５を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＭＡＣＶ−ＧＰＣの免疫原性フラグメントのコード配列は、ＭＡＣＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、残基４４４〜４５２を含有する。
【００７５】
ＧＴＯＶ糖タンパク質前駆体（ＧＴＯＶ−ＧＰＣ）ヌクレオチドコード配列は、約１４８８ヌクレオチドであり、好ましくは、コドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＮ０５４２３を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＧＴＯＶ−ＧＰＣの免疫原性フラグメントのコード配列は、ＧＴＯＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含有し得、好ましくは、フラグメントは、残基４２７〜４３５を含有する。
【００７６】
ＷＷＡＶ糖タンパク質前駆体（ＷＷＡＶ−ＧＰＣ）ヌクレオチドコード配列は、約１４８８ヌクレオチドであり、好ましくは、コドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＫ６０４９７を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＷＷＡＶ−ＧＰＣの免疫原性フラグメントのコード配列は、ＷＷＡＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４２８〜４３６を含有する。
【００７７】
ＰＩＣＶ糖タンパク質前駆体（ＰＩＣＶ−ＧＰＣ）ヌクレオチドコード配列は、約１４８８ヌクレオチドであり、好ましくはコドン最適化されており、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＣ３２２８１を参照されたく、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。ＰＩＣＶ−ＧＰＣの免疫原性フラグメントのコード配列は、ＰＩＣＶ−ＧＰＣの少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含み得、好ましくは、フラグメントは、残基４５５〜４６３を含有する。
【００７８】
本明細書に開示されるＡＶ  ＧＰＣ抗原（その免疫原性フラグメントを含む）をコードする核酸を含み得る、遺伝子構築物が本明細書に提供される。遺伝子構築物は、機能性の染色体外分子として、細胞内に存在し得る。遺伝子構築物は、セントロメア、テロマー、またはプラスミドもしくはコスミドを含む、線形ミニ染色体であり得る。
【００７９】
遺伝子構築物はまた、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス、および組み換えワクチンを含む、組み換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子構築物は、細胞内に生存する弱毒化された生存する微生物または組み換え微生物ベクター中の遺伝子材料の一部であってもよい。
【００８０】
遺伝子構築物は、核酸のコード配列の遺伝子発現のための制御エレメントを含み得る。制御エレメントは、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、停止コドン、またはポリアデニル化シグナルであり得る。
【００８１】
核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子構築物を構成することができる。ベクターは、哺乳動物において免疫応答を誘発するのに効果的な量で、抗原を哺乳動物の細胞中で発現する能力を有し得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであってもよい。ベクターは、細胞に、抗原をコードする核酸をトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞は、抗原の発現が生じる条件下で培養および維持される。
【００８２】
コード配列は、発現の安定性および高いレベルのために最適化することができる。いくつかの事例において、コドンは、分子内結合によって形成されるもの等、ＲＮＡの二次構造の形成を低減させるように、選択される。
【００８３】
ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含み得、さらに、抗原コード配列の上流にあり得る開始コドン、および抗原コード配列の下流にあり得る停止コドンを含み得る。開始および終止コドンは、抗原コード配列のフレーム内にあり得る。ベクターはまた、抗原コード配列に操作可能に接続されるプロモーターを含み得る。抗原コード配列に操作可能に接続されるプロモーターは、シミアンウイルス（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター等のヒト免疫不全ウイルス（ＨＴＶ）プロモーター、Ｍｏｌｏｎｅｙウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター等のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはヒトメタロチオネイン等、ヒト遺伝子由来のプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然または合成の筋肉または皮膚特異的プロモーター等、組織特異的プロモーターであってもよい。このようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第ＵＳ２００４０１７５７２７号に記載され、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００８４】
ベクターはまた、ポリアデニル化シグナルを含み得、これは、ＡＶ  ＧＰＣタンパク質コード配列の下流にあり得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ−グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）由来のポリアデニル化シグナルであり得る。
【００８５】
ベクターはまた、ＡＶ  ＧＰＣタンパク質コード配列の上流にエンハンサーを含んでもよい。エンハンサーは、ＤＮＡ発現に必要であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶもしくはＥＢＶ等のウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能の強化は、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、およびＷＯ９４／０１６７３７号に記載され、それぞれの内容は、参照により完全に組み込まれる。
【００８６】
ベクターはまた、ベクターを染色体外に維持し、細胞内でベクターの複数のコピーを生成するために、哺乳動物の複製起点を含み得る。ベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのｐＷＲＧ７０７７（Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（下記）を参照されたい）、ｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であってもよく、これらは、エプスタインバーウイルスの複製起点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み得、これは、統合することなく高度なコピーのエピソーム複製を生成することができる。ベクターは、ｐＶＡＸ１または本明細書に記載される変異体プラスミド等の変更を有するｐＶａｘ１変異体であり得る。変異体ｐＶａｘ１プラスミドは、骨格ベクタープラスミドｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）の２９９８塩基対変異体である。ＣＭＶプロモーターは、塩基１３７〜７２４に位置する。Ｔ７プロモーター／プライミング部位は、塩基６６４〜６８３にある。多重クローニング部位は、塩基６９６〜８１１にある。ウシＧＨポリアデニル化シグナルは、塩基８２９〜１０５３にある。カナマイシン耐性遺伝子は、塩基１２２６〜２０２０にある。ｐＵＣ起点は、塩基２３２０〜２９９３にある。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＶＡＸ１の配列に基づいて、次の突然変異体が、本明細書に記載されるプラスミド１〜６の骨格として使用されたｐＶＡＸ１の配列に見いだされた。
Ｃ＞Ｇ  ２４１  ＣＭＶプロモーター中
Ｃ＞Ｔ  １９４２  骨格、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐｏｌｙＡ）の下流
Ａ＞−  ２８７６  骨格、カナマイシン遺伝子の下流
Ｃ＞Ｔ  ３２７７  ｐＵＣ複製起点（Ｏｒｉ）中、高コピー数の突然変異（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９８５を参照されたい）
Ｇ＞Ｃ  ３７５３  ｐＵＣ  Ｏｒｉの最末端、ＲＮＡＳｅＨ部位の上流
塩基対２、３、および４が、骨格、ＣＭＶプロモーターの上流において、ＡＣＴからＣＴＧに変更されている。
【００８７】
ベクターの骨格は、ｐＡＶ０２４２であり得る。ベクターは、複製能欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターであり得る。
【００８８】
ベクターはまた、ベクターが投与される哺乳動物またはヒトの細胞において、遺伝子の発現に適切であり得る制御配列を含んでもよい。ＡＶ  ＧＰＣコード配列は、宿主細胞におけるコード配列のより効率的な転写を可能にすることができるコドンを含み得る。
【００８９】
ベクターは、エシェリキア・コリ（大腸菌）におけるタンパク質の生成に使用可能なｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。ベクターはまた、酵母のサッカロミセス・セレビシエ株におけるタンパク質生成に使用可能なｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよい。ベクターはまた、昆虫細胞におけるタンパク質生成に使用可能なＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよい。ベクターはまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞におけるタンパク質生成に使用可能なｐｃＤＮＡ１またはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよい。ベクターは、参照により完全に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）を含む、日常的な技術および容易に入手可能な開始物質によってタンパク質を生成するための発現ベクターまたは系であってもよい。
【００９０】
薬学的組成物
本明細書においてＤＮＡワクチンとも表記される、本発明による薬学的組成物が本明細書に提供され、これは、約１ナノグラム〜約１０ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、１）少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ナノグラム、または少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、もしくは１０００マイクログラム、または少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、もしくは１０ｍｇ以上から、２）最大で１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、もしくは１００ナノグラム以下、または最大で１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、もしくは１０００マイクログラム以下、または最大で１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、もしくは１０ｍｇ以下までを含む。いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約５ナノグラム〜約１０ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約２５ナノグラム〜約５ｍｇのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約５０ナノグラム〜約１ｍｇのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約１０〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約１５〜約１５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約２０〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約２５〜約７５マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約３０〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約３５〜約４０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約１０マイクログラム〜約１００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約２０マイクログラム〜約８０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約２５マイクログラム〜約６０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約３０マイクログラム〜約５０マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、本薬学的組成物は、約３５マイクログラム〜約４５マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、本薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態において、本薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態において、本薬学的組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態において、本薬学的組成物は、約１００〜約２００マイクログラムのＤＮＡを含有する。
【００９１】
本発明による薬学的組成物は、使用される投与の形態に応じて製剤化される。薬学的組成物が注入可能な薬学的組成物である場合、それらは、滅菌、発熱物質不含、かつ微粒子不含である。好ましくは、等張製剤を使用する。一般的に、等張性のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。いくつかの場合において、リン酸緩衝食塩水等の等張溶液が好ましい。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤を、製剤に添加する。
【００９２】
好ましくは、本薬学的組成物は、ワクチンであり、より好ましくは、ＤＮＡワクチンである。
【００９３】
１つ以上のＡＶに対する防御免疫応答を哺乳動物において生成することができるワクチンが本明細書に提供される。ワクチンは、本明細書に記載される遺伝子構築物を含み得る。
【００９４】
科学的理論に制限されるものではないが、ワクチンを使用して、１つ以上の種類のＡＶに対して、広範に免疫応答（体液性、細胞性、またはその両方）を誘発することができる。
【００９５】
ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および同第５，６７６，５９４号に記載され、これらは、参照により完全に本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンは、それが染色体内に統合することを阻害する、要素または試薬をさらに含んでもよい。ワクチンは、ＡＶ  ＧＰＣタンパク質のＲＮＡであってもよい。ＲＮＡワクチンは、細胞に導入することができる。
【００９６】
ワクチンは、本明細書に記載される抗原の遺伝子構築物を含む、組み換えワクチンであってもよい。ワクチンはまた、１つ以上のタンパク質サブユニットの形態で、１つ以上のＡＶ  ＧＰＣコアタンパク質、１つ以上のＡＶ  ＧＰＣタンパク質を含む１つ以上の不活ウイルス粒子、または１つ以上のＡＶ  ＧＰＣを含む１つ以上の弱毒化ウイルス粒子を含み得る。弱毒化ワクチンは、弱毒化生ワクチン、不活ワクチン、および１つ以上のＡＶ  ＰＣＧタンパク質をコードする外来遺伝子を送達するために組み換えベクターを使用するワクチン、ならびにサブユニットおよび糖タンパク質ワクチンであり得る。外来抗原を送達するために組み換えベクターを使用する弱毒化生ワクチン、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチンは、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５．５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号、および同第６，５８９，５２９号に記載され、これらは、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
ワクチンは、全世界の複数の特定の地域に由来する、複数のＡＶを対象とするベクターおよび／またはタンパク質を含み得る。提供されるワクチンを使用して、治療的および予防的免疫応答を含む、免疫応答を誘導することができる。ＡＶ  ＧＰＣタンパク質、およびさらには複数のＡＶウイルスにわたっても広範に対象とする、抗体および／またはキラーＴ細胞を、生成することができる。このような抗体および細胞を、単離することができる。
【００９８】
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤等の機能性分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であってもよく、これには、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレン等の小胞体、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルス性タンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、あるいは他の既知のトランスフェクション促進剤が挙げられる。
【００９９】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含む、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタメートであり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタメートは、６ｍｇ／ｍＬ未満の濃度でワクチン中に存在する。トランスフェクション促進剤はまた、界面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレン等の小胞体を含み得、ヒアルロン酸もまた、遺伝子構築物との併用で投与することができる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡベクターワクチンにはまた、脂質、レシチンリポソームもしくは当該技術分野で既知の他のリポソームを含む、ＤＮＡリポソーム混合物（例えばＷＯ９３２４６４０号を参照されたい）としてのリポソーム、カルシウムイオン、ウイルス性タンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、あるいは他の既知のトランスフェクション促進剤が挙げられる。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタメート（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、または脂質である。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍＬ未満、２ｍｇ／ｍＬ未満、１ｍｇ／ｍＬ未満、０．７５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．５００ｍｇ／ｍＬ未満、０．２５０ｍｇ／ｍＬ未満、０．１００ｍｇ／ｍＬ未満、０．０５０ｍｇ／ｍＬ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍＬ未満である。
【０１００】
アジュバント
薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントであり得る。アジュバントは、別のプラスミドに発現されるか、またはワクチンにおいて上述のプラスミドと組み合わせたタンパク質として送達される、他の遺伝子であってもよい。アジュバントは、シグナル配列が欠失したＩＬ−１５を含み、任意でＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含む、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ΤΝＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６からなる群から選択することができる。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ΤΝＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはこれらの組み合わせであり得る。好ましくは、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ１５、ＩＬ、２８、およびＲＡＮＴＥＳである。
【０１０１】
有用なアジュバントであり得る他の遺伝子には、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能性フラグメントが挙げられる。
【０１０２】
送達方法
エピトープを含み、それらをＡＶウイルス感染に対する免疫応答を誘導することができる特に効果的な免疫原にする、ＡＶ  ＧＰＣタンパク質の遺伝子構築物およびタンパク質を提供するための薬学的組成物、好ましくはワクチンを提供するための方法を提供する。治療的および／または予防的免疫応答を誘導する、ワクチンを送達する方法またはワクチン接種の方法を提供することができる。ワクチン接種プロセスにより、複数のＡＶウイルスに対する免疫応答を、哺乳動物において生成することができる。ワクチンを個体に送達して、哺乳動物の免疫系の活性を調節し、免疫応答を強化することができる。ワクチンの送達は、細胞内に発現され、細胞表面に送達されると、免疫系によって認識されて、細胞性、体液性、または細胞性かつ体液性の応答を誘導する、核酸分子として、ＡＶ  ＧＰＣ抗原をトランスフェクションすることであり得る。ワクチン送達を用いて、本明細書に記載されるワクチンを哺乳動物に投与することによって、複数のＡＶウイルスに対する免疫応答を、哺乳動物において誘導または誘発することができる。哺乳動物へワクチンが送達され、哺乳動物の細胞内にベクターが送達されると、トランスフェクトされた細胞が、ＡＶ  ＧＰＣタンパク質を発現および分泌することになる。これらの分泌されたタンパク質、または合成抗原は、免疫系によって異物として認識されることになり、それによって、免疫応答を開始することになり、これには、この抗原に対して作製される抗体およびこの抗原に特異的なＴ細胞応答が含まれ得る。いくつかの実施例において、本明細書に記載のワクチンをワクチン接種された哺乳動物は、準備刺激された免疫系を有することになり、ＡＶウイルス株でチャレンジされると、準備刺激された免疫系は、体液性、細胞性、またはその両方を通じてかに関係なく、それ以降のＡＶウイルスの急速な排除を可能にするであろう。ワクチンを個体に送達して、個体の免疫系の活性を調節し、それによって、免疫応答を強化することができる。
【０１０３】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンの形態で送達することができ、ＤＮＡワクチンの送達方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載され、これらはいずれも参照により完全に組み込まれる。
【０１０４】
ワクチンを哺乳動物に投与して、免疫応答を哺乳動物において誘発することができる。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、またはニワトリであり得、好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、またはニワトリであり得る。
【０１０５】
投与経路
ワクチンは、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入経由、口腔投与経由、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせを含む、異なる経路で投与することができる。獣医学的用途については、本組成物を、通常の獣医学診療にしたがって、好適に許容される剤形として、投与することができる。獣医師であれば、特定の動物に対して最も適切な投与の投薬レジメンおよび経路を用意に判定することができる。ワクチンは、従来型のシリンジ、無針注入デバイス、「微粒子遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｇｏｎｅ  ｇｕｎ）」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波等の他の物理的方法によって、投与することができる。
【０１０６】
ワクチンのベクターは、インビボ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルス、および組み換えワクチン等の組み換えベクターありおよびなしでのＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも称される）を含む、複数の周知の技術によって、哺乳動物に送達することができる。ＡＶ  ＧＰＣ抗原は、ＤＮＡ注入を介して、インビボ電気穿孔を伴って、送達されてもよい。
【０１０７】
電気穿孔
ワクチンのプラスミドの電気穿孔を介したワクチンの投与は、細胞膜に可逆孔の形成をもたらすのに効果的なエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することが可能な電気穿孔デバイスを使用して、達成することができ、好ましくは、エネルギーパルスは、使用者によって入力された事前設定電流に類似の一定電流である。電気穿孔デバイスは、電気穿孔部品と、電極アセンブリまたはハンドルアセンブリと、を備え得る。電気穿孔構成要素は、制御器、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形記録装置、入力要素、状態報告要素、通信ポート、メモリー構成要素、電源、および電源スイッチを含む、電気穿孔デバイスの種々の要素のうちの１つ以上を含み、それを組み込むことができる。電気穿孔を、インビボ電気穿孔デバイス、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎ電気穿孔器（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用して達成し、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを促進することができる。本発明のＤＮＡワクチンの送達を促進することができる電気穿孔デバイスおよび電気穿孔法には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらによって出願された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載のものが含まれ、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンの送達を促進するために使用可能な他の電気穿孔デバイスおよび電気穿孔法には、２００７年１０月１７日に出願され、米国特許法の下に、２００６年１０月１７日に出願された米国仮出願第６０／８５２，１４９号、および２００７年１０月１０日に出願された同第６０／９７８，９８２号の利益を主張する、同時継続中および共有される米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されるものが挙げられ、これらの全ては、それらの全体が本明細書に組み込まれる。Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのモジュール電極システムおよびそれの使用について記載している。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下注入針、プログラム可能な一定電極パルス制御器から複数の針電極に導電性接続を提供する電気コネクタ、および電源を備え得る。操作者は、支持構造体に載置された複数の針電極を把持し、それらを体内または植物内の選択された組織へしっかりと挿入することができる。生体分子を、次いで、皮下注入針を介して選択組織内に送達する。プログラム可能な一定電流制御器が作動し、一定電流電気パルスを複数の針電極に印加する。印加された一定電流電気パルスは、複数の電極間において生体分子の細胞内への導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全文は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０８】
Ｓｍｉｔｈらによって出願された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、体内または植物内の選択された組織の細胞内への生体分子の導入を効果的に促進するために使用可能な電気穿孔デバイスについて記載している。この電気穿孔デバイスは、その操作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される、動電デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を含む。ＥＫＤデバイスは、ユーザ制御およびパルスパラメーターの入力に基づいて、アレイの電極間に、一連のプログラム可能な一定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存および取得を可能にする。電気穿孔デバイスはまた、一連の針電極、注入針用の中央注入チャネル、および取り外し可能なガイドディスクを有する、交換可能な電極ディスクを備える。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全文は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０９】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイおよび方法は、筋肉等の組織だけでなく、他の組織または器官への深く浸透するように適合させることができる。電極アレイの構造のため、注入針（選択した生体分子を送達するための）はまた、標的期間に完全に挿入され、注入は、電極によって事前に線引きされた領域において、標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に記載される電極は、好ましくは、長さ２０ｍｍで２１ゲージである。
【０１１０】
さらに、電気穿孔デバイスおよびその使用を組み込むいくつかの実施形態に企図される、次の特許に記載されるものである電気穿孔デバイスが存在する：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された同第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日に発行された同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号。さらに、あらゆる種類のデバイスを使用してＤＮＡの送達を考察する、２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号に提供される主題を取り扱う特許、およびＤＮＡの注入方法に注目した、２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号が、本明細書に企図される。上述の特許は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【０１１１】
ワクチンを調製する方法
本明細書に記載のＤＮＡワクチンを含むＤＮＡプラスミドを調製するための方法が本明細書に提供される。哺乳動物の発現プラスミドへの最終サブクローニング後、ＤＮＡプラスミドは、当該技術分野で既知の方法を使用して、細胞培養物を大規模な発酵タンクに植え付けるために使用することができる。
【０１１２】
本発明のＥＰデバイスとともに使用するためのＤＮＡプラスミドは、既知のデバイスおよび技術との組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは、それらは、２００７年５月２３日に出願された米国公開出願第２００９０００４７１６号に記載される最適化されたプラスミド製造技術を使用して、製造される。いくつかの実施形態において、これらの研究で使用されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化することができる。製造技術はまた、米国特許出願第６０／９３９７９２号に加えて、認可された特許である２００７年７月３日に発行された米国特許第７，２３８，５２２号に記載のものを含む、当業者に一般的に既知の種々のデバイスまたは手順を含むか、またはそれらを組み込む。上で参照された出願および特許である米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１１３】
本発明を、以下の実施例でさらに説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を含むが、例示目的のみで提供されることを理解されたい。上述の説明およびこれらの実施例から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その精神および範囲を逸脱しない範囲で、種々の用途および状況に適合するように、本発明に種々の変更および修正を行うことができる。したがって、本明細書に示され、説明されるものに加えて、本発明の種々の修正は、前述の説明から当業者には明らかであろう。
【０１１４】
動物研究−モルモット。Ｓｔｒａｉｎ１３モルモット（Ｃａｖｉａ  ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）を、６匹ずつの４群（予備研究）、または各々８匹もしくは５匹ずつの７群（後続研究）に分割した。動物を麻酔し、次いで、１２μｇ（遺伝子銃もしくはＧＧ）または１００μｇ（筋肉内電気穿孔デバイス（ＩＭ  ＥＰ）、最小限に侵襲的な皮内デバイス（ＭＩＤ）、もしくは非侵襲的デバイス（ＮＩＮＶ）を介して）のＤＮＡの本物のワクチン接種（ＬＡＳＶ−ＧＰＣ、配列番号１（最適化）もしくは配列番号３（非最適化））、または疑似ワクチン接種（空プラスミド）を、３週間間隔で施した。最終ワクチン接種の４週間後に、ウイルス感染を、バイオセーフティーレベル（ＢＳＬ）４の条件下で行った。各動物に、１０００ｐｆｕのＬＡＳＶの単回皮下投与を施した。動物を、疾患の進行について毎日観察した。血液試料を、感染の７日前、または０、７、１４、２１、および２９もしくは３２日後に採取した。動物は、瀕死の時点で安楽死させた。血清試料を、ウイルス血症および血液化学値について分析した。各動物の解剖を行い、組織を、ＬＡＳＶに特異的な病理組織学的および免疫組織学的分析について、分析した。
【０１１５】
動物研究−非ヒト霊長類。カニクイザルマカク（カニクイザル）を、４匹ずつ２つの群に分割した。動物を麻酔し、次いで、１ｍｇのＤＮＡ（配列番号）の本物または疑似ワクチン接種を３週間間隔で施した。最終ワクチン接種の４週間後に、ウイルス感染を、ＢＳＬ４の条件下で行った。各動物に、１０００ｐｆｕのＬＡＳＶの単回筋肉内投与を施した。動物を、疾患の進行について毎日観察した。血液試料を、感染の０、３、６、１０、１４、２１、２８、および４５日後に採取した。動物は、瀕死の時点で安楽死させた。血清試料を、ＣＢＣ、血液化学、および血清ウイルス血症について分析した。
【０１１６】
ウイルス血症の分析。６ウェルの細胞培養プレートに播種したベロ細胞を、血清の１０倍連続希釈物で１時間、３７℃、５％ＣＯ２で穏やかに回転させながら吸収させ、次いで、１０％ウシ胎児血清を有するＥＢＭＥ中０．８％アガロースを、各ウェルに適用した。細胞を、次いで、３７℃、５％ＣＯ２において、４日間インキュベートし、続いて、ニュートラルレッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で染色した。プラークを計数し、記録した。
【０１１７】
血液化学的分析。霊長類の血清試料を、ＧＬＵ、ＣＲＥ、ＵＡ、ＣＡ、ＡＬＢ、ＴＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、（ＡＬＰ）、ＴＢＩＬ、ＧＧＴ、およびＡＭＹについて、ＡｂａｘｉｓのＰｉｃｃｏｌｏ血液化学分析器）で一般化学１３パネルのローターを介して分析した。モルモット試料を、ＡｂａｘｉｓのＶｅｔＳｃａｎ血液化学分析器を介して、総合代謝パネルにおいて上述のものについて分析した。
【０１１８】
全血球算定。霊長類研究については、おおよそ２５ｕｌ量の全ＥＤＴＡ血を、Ｈｅｍａｖｅｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｄｒｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分析した。
【０１１９】
組織の病理学的分析。組織を、パラフィンに埋め込み、断片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学を、ＬＡＳＶに特異的なモノクローナル抗体および市販のキット（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用して行った。組織に脱パラフィン処理を行い、ブロッキングし、次いで、一次抗体および二次抗体とともにインキュベートし、続いて、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１２０】
組織の病理学的分析。組織を、パラフィンに埋め込み、断片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学を、ＬＡＳＶに特異的なモノクローナル抗体および市販のキット（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用して行った。組織に脱パラフィン処理を行い、ブロッキングし、次いで、一次抗体および二次抗体とともにインキュベートし、続いて、ヘマトキシリンで対比染色した。
【０１２１】
ＬＡＳＶ  ＤＮＡの生成
ＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンを、前述のように（Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．７１，９５６３−９５６９（１９９７））、ＬＡＳＶ（Ｊｏｓｉａｈ株）の糖タンパク質前駆体（ＧＰＣ）遺伝子をコードするｃＤＮＡをプラスミドベクターｐＷＲＧ７０７７にクローニングすることによって生成した。ＬＡＳＶ−ＧＰＣ遺伝子を、ＮｏｔＩ／ＢｇＩＩＩ制限部位にクローニングした。発現は、ＣＭＶプロモーターの制御下で行われた。
【０１２２】
ワクチンの防御有効性を、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）およびヒトに観察されたものに類似の出血性疾患を発症するモルモットへの筋肉内（ＩＭ）ＥＰ送達、およびモルモットでのチャレンジによって、試験した。モルモット（１群あたり６匹）に、３〜５週間間隔で、５０μｇのＤＮＡワクチン（配列番号３を含む）を筋肉内（ＩＭ）ＥＰによって、または約５μｇを遺伝子銃（ＧＧ）によって、受容させた。ワクチン接種の約４週間後、モルモットに、標準的な致死チャレンジ用量である１０００プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＬＡＳＶの腹腔内（ＩＰ）投与によるチャレンジを行った。対照モルモットの全てがＬＡＳＶ感染により死亡したが、ワクチン接種した動物の８３％が生存し、死亡した１匹の動物は、死亡するまでの時間の遅延を示した。ＬＡＳＶに対する中和抗体が、チャレンジ後、ワクチン接種したものにおいて検出されたが、対照モルモットには検出されず、初回刺激応答が、ＤＮＡワクチンによって誘発されたことを示す（データは示されない）。
【０１２３】
このモルモット研究は、ＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンによるＩＭ  ＥＰが、防御免疫性を誘発することができたことを示したとはいえ、チャレンジを行った動物は、発熱し、軽度臨床的な疾患の兆候を示し（図１Ａ、１Ｃ）、したがって、ワクチン構築および皮内送達の方法のさらなる改善を模索した。この目標に向かって、ＬＡＳＶ  ＧＰＣ  ＤＮＡワクチンを、哺乳動物コドンの利用可能性を最大化し、発現を妨げることが示されたウイルス要素を除去するように、最適化した。この最適化されたワクチン（配列番号１を含む）を、修正されたパラメーターを用いて筋肉内電気穿孔デバイス（ＩＭ  ＥＰ）、最小限に侵襲的な皮内デバイス（ＭＩＤ）、または非侵襲的デバイス（ＮＩＮＶ）を使用して、３〜４週間間隔で３回５０μｇのＤＮＡをワクチン接種させたＳｔｒａｉｎ１３モルモット（１群あたり８匹）において試験した。電極間隔を有する（ＭＩＤ）は、形状が三角形であり、１つの側面に３ｍｍ離れた電極、他の２つの側面に５ｍｍ離れた電極を有する。ＮＩＮＶは、皮膚を貫通する（または、代替的には、角質層内まで皮膚に入る）ことなく皮膚表面と接触する、４×４パターンの電極アレイを有する。
【０１２４】
チャレンジ後、空プラスミドをワクチン接種した全てのモルモット、またはワクチンを受容しなかったものは、発熱し、疾病の兆候を見せ、体重が減少し、チャレンジの１５〜１８日後に感染により死亡した（図１）。対照的に、ＥＰ方法のいずれかによって、コドン最適化したＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンでワクチン接種した全てのモルモットは、チャレンジを生存した。非最適化ＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンでワクチン接種したモルモットが疾病の兆候を示した予備研究とは異なり、この研究では、ＭＩＤおよびＩＭ  ＥＰの両方の群におけるモルモットは、疾患の兆候を全く示さず、無熱状態に留まり、一定の体重を維持した。しかしながら、ＩＭ  ＥＰによってＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンを受容したいくつかのモルモットにおいて、微熱およびわずかなウイルス血症を含む軽度の疾患の兆候が観察され、皮膚電気穿孔が、この研究ではより有効であったことを示唆する。
【０１２５】
図２は、ＩＭまたはＭＩＤ皮膚ＥＰデバイスを使用して、コドン最適化されたＬＡＳＶ  ＤＮＡまたは空プラスミド対照をワクチン接種したモルモット（１群あたり８匹）の生存率曲線を示す。モルモットに、最終ワクチン接種の４週間後に１０００ｐｆｕのＬＡＳＶでチャレンジを行った。
【０１２６】
ワクチンおよび送達方法の有効性および耐久性を確認するために、ＭＩＤ  ＥＰでワクチン接種したモルモットのサブセットを、バックチャレンジ実験に選択した。これらのモルモットを、１２０日間ＢＳＬ−４封じ込め（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）状態に保持し、次いで、同一の体重の４匹のナイーブモルモットとともに、１０００ｐｆｕのＬＡＳＶでチャレンジを行った。モルモットを、ウイルス感染後３０日間毎日観察し、体重、体温、および疾患の進行について監視した。ワクチン接種した動物は、研究中に発病せず、再感染を生存した（図３）。
【０１２７】
図３は、ＭＩＤ  ＥＰでワクチン接種したモルモットのサブセットのバックチャレンジの結果を示し、図３Ａは、群における体重の変化を示し、図３Ｂは、群の平均体温の変化を示す。
【０１２８】
ＮＨＰにおいてＭＩＤ  ＥＰによって送達されたコドン最適化されたＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチン（配列番号２を含む）を、さらに評価した。ＮＨＰモデルは、これらの動物に観察された疾患が、ヒト疾患を最も厳密に模倣するため、ワクチン有効性の評価の最も有益なモデルである。
【０１２９】
４匹のＮＨＰ群に、ＭＩＤ  ＥＰデバイスを使用して、３週間間隔で３回、１ｍｇのＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチン（配列番号２を含む）または１ｍｇの空ベクタープラスミドをワクチン接種し、最終ワクチン接種の４週間後に、１０００ｐｆｕのＬＡＳＶのＩＭ注入によってチャレンジを行った。ＮＨＰから収集した血液試料を、ＣＢＣおよび血液化学について監視し、動物を、疾患の進行について１日２回観察した。４匹の対照ＮＨＰのうちの２匹が、出血ウインドウ（感染後１３日目〜１７日目）中に死亡した。他の２匹の対照ＮＨＰは、研究の最終日（チャレンジ４５日後）に生成されたそれらの聴力図をＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチン接種したＮＨＰのものと比較して示されるように、運動失調および難聴を含む神経学的症状を発症した（図４）。難聴（片側または両側のいずれか）は、ＬＡＳＶ感染の十分に認識された結果であり、ＬＡＳＶ患者のおおよそ３０％に発生するが、知る限りでは、これは、ＮＨＰにおけるこの疾患の結果の証拠となる初の文書であり、疾患マーカーとして機能し得る。
【０１３０】
図４に示されるように、ＮＨＰ番号２およびＮＨＰ番号７の聴力図は、それぞれ、空プラスミドまたはＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンでワクチン接種が行われたものである。０デシベルの刺激では、いずれのサルからの聴力図も、応答を示さない。ＮＨＰ番号２の左耳および右耳の聴力図は、７５デシベルで応答を示さず、聴力応答パターンを示すＮＨＰ番号７の聴力図とは対照的である。
【０１３１】
対照ＮＨＰのうちの２匹が感染を生存したとはいえ、それらは、研究の間（感染後４５日）、瀕死状態のままであった。対照的に、ＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチン接種した４匹のＮＨＰは、研究の間、健康であり、発熱がなく、正常なＣＢＣおよび血液化学を維持した（図５）。
【０１３２】
図５は、ＭＩＤ  ＥＰによってＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンまたは空プラスミドでワクチン接種し、ＬＡＳＶでチャレンジしたＮＨＰの生存率、ウイルス血症、および罹患率スコアを示す。図５Ａは、ＬＡＳＶ  ＤＮＡをワクチン接種した全てのＮＨＰは、ＬＡＳＶチャレンジを生存したが、空プラスミドでワクチン接種した４匹の対照ＮＨＰのうちの２匹は、感染により死亡したことを示す。図５Ｂは、空プラスミドでワクチン接種した４匹全てのＮＨＰが発熱したが、２匹の生存したＮＨＰは、チャレンジ２８日後までにウイルスを排除することができたことを示す。ＬＡＳＶ  ＤＮＡでワクチン接種したＮＨＰは、全ての時点において、無熱であった。Ｃ．罹患率スコアは、研究中にＮＨＰが病気になった程度の尺度である。対照動物は、死亡する前、瀕死状態になった。死亡しなかった２匹のＮＨＰは、研究終了時まで慢性的に疾病状態のままであり、チャレンジ前の状態に戻ることはなかった。ＬＡＳＶ  ＤＮＡでワクチン接種したＮＨＰは、疾病状態になることはなかった。
【０１３３】
図６は、ＬＡＳＶ−ＧＰＣ（配列番号２を含む）または疑似ＤＮＡワクチンを受容したカニクイザルに対する、選択された血液化学値を示す。
【０１３４】
図７は、いずれもＬＡＳＶ−ＧＰＣ（配列番号２を含む）および疑似ＤＮＡワクチンでワクチン接種したワクチン接種カニクイザル（ＮＨＰ）のＣＢＣおよび血液化学を示す。提示される結果は、ＮＨＰにおいて正常なＣＢＣおよび血液化学を示す。
【０１３５】
実験および方法
ＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンの用量範囲研究を実行する（１〜８か月）：
Ｓｔｒａｉｎ１３モルモットにおいて、３つの用量のＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンを評価する。先行研究において、ＭＩＤ  ＥＰによって３週間間隔で与えられた５０μｇのＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンの３回のワクチン接種により、Ｓｔｒａｉｎ１３モルモットに、完全な防御免疫性を提供した。ＭＩＤ  ＥＰによって与えられた５０μｇ、５μｇ、および１μｇの用量の短期レジメン（３週間おきに２回のワクチン接種を与えた）におけるワクチンの防御有効性（表１）を比較する。
【０１３６】
【表２】
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【０１３７】
ＪＵＮＶおよびＭＡＣＶのＤＮＡワクチンの交差防御の判定、ならびに多剤ワクチン製剤による干渉の測定
多剤ワクチンのプラットフォームとしてのＤＮＡワクチンの皮膚電気穿孔システムの総合的な適合性を試験する。コドン最適化したＪＵＮＶおよびＭＡＣＶに対するＤＮＡワクチン（約９６％のアミノ酸相同性を共有する）を生成し、交差チャレンジ研究（表２）を実行する。ＪＵＮＶおよびＭＡＣＶワクチンが交差防御性であることを判定する際、旧世界および新世界の両方のアレナウイルスからの防御を目的とする未来研究は、２つのワクチンのうちの１つのみをＬＡＳＶワクチンと組み合わせて使用することができる。この研究のモルモットの群に、候補ＤＮＡワクチンの３つ全てをワクチン接種し、ＬＡＳＶでチャレンジを行う。
【０１３８】
【表３】
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【０１３９】
ＮＨＰチャレンジモデルにおける免疫相関性、用量減少、およびサイトカインアジュバントの測定
研究を行って、ＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチン（配列番号２を含む）をＥＰによりワクチン接種した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のサイトカインアジュバントありまたはなしでの免疫応答を測定する（以下の表３の一覧を参照されたい）。ワクチン接種後、ＮＨＰに、ＲＳＬ−４封じ込め実験室において、チャレンジを行う。
【０１４０】
ＩＬ−２８およびＩＬ−１２の２つのサイトカインＤＮＡプラスミドを、ＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンと組み合わせて試験する。
【０１４１】
３週間間隔で１ｍｇのＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチン（配列番号２を含む）を３回ワクチン接種したＮＨＰは、以前の研究において、ＬＡＳＶでのチャレンジからの防御を示したことが示された。１ｍｇ用量のワクチンを４週間間隔で３回与えたものと同用量を８週間間隔で２回与えたものとを比較する研究を行う。さらに、強度が半分のワクチン用量（０．５ｍｇ）を、単独でか、またはＩＬ−１２もしくはＩＬ−２８サイトカインの遺伝子を発現するプラスミドと組み合わせて投与したものを比較する。これらのサイトカインは、ワクチンを補助することを意図し、改善された細胞媒介性免疫応答を提供する。
【０１４２】
ＬＡＳＶワクチンおよびサイトカインアジュバントによって誘導された細胞性免疫表現型を、次の分析によって評価する：抗原特異性ＩＦＮｇ  ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色（多官能性Ｔ細胞プロファイルのアッセイを含む）、ＣＦＳＥ希釈を介した増殖、ならびにＨｅｒｓｐｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０ａ、Ｈｅｒｓｐｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０ｂ、Ｍｏｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０ｂ、およびＭｉｇｕｅｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００８に記載されるＴｂｅｔ、パーフォリン、グランザイムＢ、およびＣＤ１０７ａの発現を含む、細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞のマーカーに対する染色。これらの免疫測定法の組み合わせにより、ＣＴＬ（細胞毒性リンパ球）の表現型および活性を特に重視した、ＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の具体的な調査が可能となり、これは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のこの機能が、ウイルス感染した細胞の排除と直接的な相関にあり、免疫系がウイルス感染を制御および排除する主要機構を構築するためである。ＩＬ−１２およびＩＬ−２８を採用した以前の研究は、これらのアジュバントのいずれも、パーフォリン放出、グランザイムＢ負荷および放出、ならびにＣＤ１０７ａの発現に著しい増加を示しているワクチン特異性ＣＴＬの誘導を促進することができることを示唆した。この研究は、アジュバントに加えてＨＩＶ抗原を使用して、ＮＨＰモデルにおいて実行し、これらの増加した応答は、ＰＢＭＣ、ならびに腸間膜リンパ節から採取したＴ細胞の両方に見られ、これらのアジュバントが、末梢血、ならびに二次リンパ器官に影響を及ぼすことを示唆した。さらに、ＩＬ−１２およびＩＬ−２８のいずれも、最終免疫付与の３か月後に行った分析が、増大した抗原特異性免疫応答の継続した存在を示したため、長期的にＣＴＬ表現型および機能に影響を及ぼすことが可能であった。
【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
ＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンの効力アッセイの開発
ＩＮＤの申請を可能にするためには、強固かつ信頼性の高い効力アッセイが必要である。定量的フローサイトメトリーアッセイの効力アッセイを、ＡＶワクチン、例えばＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンに使用する。類似のアッセイが、既に開発されており、ハンタウイルス感染によってもたらされる腎症候群を伴う出血熱のＤＮＡワクチンの第１相臨床試験の裏付けとして（Ｂａｄｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスのＤＮＡワクチンのＩＮＤ申請を支持して、ＵＳＡＭＲＩＩＤにおいて３年間を上回って使用されている。一般的に、この方法は、細胞に試験ＤＮＡをトランスフェクトすること、および測定された抗原発現を、既知の量の参照物質ＤＮＡからの発現により生成されたものと比較することを伴う。
【０１４５】
このアッセイは、高速（１日未満）で再現性が高く、既に医薬品安全性試験実施基準（ＧＬＰ）のガイドライン下で実行するために適合されている。結果として、規定文書および手順は、既に定着している。これは、ＬＡＳＶ  ＤＮＡワクチンの効力を測定するためのアッセイの適合を、大いに促進するはずである。このアッセイ単独でもＤＮＡワクチンの効力および安定性の測定には十分であるが、ＬＡＳＶ感染に対する防御免疫性の相関性がほとんどないため、１年目の各安定性時点でモルモットの少数群にもワクチン接種し、遺伝子発現を抗原性と相関する情報を提供する。
【０１４６】
モルモットチャレンジモデルは、ＡＶワクチンの有効性を評価するＡＶの一般的に認められたモデルである。動物に、ＭＩＤデバイスを使用して、５０ｕｇのＧＰＣ  ＤＮＡ  ＬＡＳＶワクチンを、３〜４週間間隔で３回ワクチン接種した。最終ワクチン接種の３週間後、動物に、１０００ｐｆｕのＬＡＳＶのｉ．ｍ．注入によってチャレンジを行った。図２に示されるように、ワクチン接種した９０％を上回る動物は、チャレンジを生存し、対照（疑似ワクチン接種した）動物の１００％が、チャレンジ後１５日目までに死亡した。図５は、ＮＨＰ研究からのチャレンジのデータを示す。４匹ずつのＮＨＰ群に、１ｍｇのＧＰＣ  ＤＮＡ  ＬＡＳＶワクチンまたは１ｍｇの空ベクターを、４週間間隔で３回ワクチン接種し、最終ワクチン接種の４週間後に、１０００ｐｆｕのＬＡＳＶのｉ．ｍ．注入によりチャレンジを行った。４匹中４匹のワクチン接種したＮＨＰが生存し、ウイルス血症の兆候を全く示さなかったが、４匹中４匹の対照動物はウイルス血症を発症し、４匹中２匹は、チャレンジにより死亡した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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