(57)【要約】  本発明は、エリスロポイエチンを産生する真核細胞が灌流リアクター中で細胞の滞留下に培養される際に、エリスロポイエチンを連続的に発酵により製造する方法に関し、この場合には、培養上澄液中でのグルコース濃度は、灌流速度により、および細胞数は、細胞滞留率により調節され、および／またはバイオリアクターからの定義された量の細胞含有培地の排出は、予め定めた範囲内に調節される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポイエチンを産生する真核細胞が灌流リアクター中で細胞の滞留下に培養される際に、エリスロポイエチンを連続的に発酵により製造する方法において、リアクター中でのグルコース濃度を培地の灌流速度により、およびリアクター中での細胞数を細胞滞留率により、予め定めた範囲内に調節することを特徴とする、エリスロポイエチンを連続的に発酵により製造する方法。
【請求項２】
ａ）培地の灌流速度をリアクター中でのグルコース濃度に依存して、予め定めた範囲内に調節し、および
ｂ）細胞滞留装置の細胞滞留率をリアクター中での細胞密度に依存して、予め定めた範囲内に調節しおよび／またはリアクター中で一定の細胞密度に調節するために時間間隔で定義された量の細胞含有培地をリアクターから排出する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
エリスロポイエチンを産生する真核細胞を使用しながらの連続的で発酵による製造の場合には、有利にアミノ酸交換体、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加物最大１０個、特に有利に最大５個を有する野生型ヒトエリスロポイエチンの変形、特に有利にアミノ酸交換体、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加物最大１個を有する変形であるエリスロポイエチンが得られる、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
培養上澄液中でのグルコース濃度を０．０５〜１．５ｇ／ｌの範囲内に調節し、細胞数を１ｍｌ当たり細胞０．５×１０7〜５．０×１０7個の範囲内に調節する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
エリスロポイエチンを産生する真核細胞は、哺乳動物細胞、有利にヒト細胞、特に有利にチャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
超音波滞留システムを使用しながら細胞を滞留させる、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
発酵溶液は、なお指数的成長段階で存在する、高められた相対的割合の細胞を有する細胞集団を含有する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
プロセスパラメーターのｐＨ値、温度、酸素分圧、攪拌速度および供給された培地の組成を、発酵の全時間に亘って一定に維持する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
産生能力は、発酵上澄液１  ｌ当たりエリスロポイエチン少なくとも１０ｍｇ、有利に少なくとも２０ｍｇ、さらに有利に少なくとも２５ｍｇ、殊に有利に少なくとも３０ｍｇである、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
細胞１個当たり毎日の平均的な特殊な産生能力は、エリスロポイエチン少なくとも０．５ｐｇ、有利に少なくとも１．０ｐｇ、特に有利に少なくとも１．２ｐｇ、殊に有利に少なくとも１．４ｐｇである、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞の平均活力は、少なくとも７０％、特に少なくとも７５％、特に有利に少なくとも８０％、さらに有利に少なくとも９０％、殊に有利に少なくとも９５％である、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
発酵中の灌流速度は、０．５〜３、有利に１〜２．５、特に有利に１．５〜２．０である、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
本方法を少なくとも１０日間、有利に少なくとも２０日間、特に有利に少なくとも３０日間、殊に有利に少なくとも４０日間の期間に亘って実施する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
培養上澄液中のグルコース濃度を０．２５〜１．２５ｇ／ｌの範囲内、有利に０．５〜１．０ｇ／ｌの範囲内に調節する、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
発酵リアクター内での細胞数を発酵培地１ｍｌ当たり細胞１．０×１０7〜４．０×１０7個、有利に細胞１．５×１０7〜３．０×１０7個の範囲内に調節する、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）を連続的に発酵により製造するための方法に関する。本方法は、この方法が細胞堆積部を備えた灌流リアクター中で実施され、この場合発酵プロセスが僅かに選択された測定パラメーターおよび調整パラメーターによってのみ、ＥＰＯに関連して選択された宿主微生物の生産性ならびにＥＰＯの製品品質に好ましい影響が及ぼされるように制御されることを示す。
【０００２】
エリスロポイエチン、略してＥＰＯと呼称される、は、グリコ蛋白質であり、このグリコ蛋白質は、骨髄中の赤血球の形成を刺激する。ＥＰＯは、主に腎臓内で形成され、そこから血液循環路を経て目的地に到達する。腎臓機能不全の場合、損傷された腎臓は、殆んどＥＰＯを産生しないかまたはそもそも全くＥＰＯを産生せず、このことは、骨髄の菌種細胞から殆んど赤血球を生じない結果をまねく。このいわゆる腎臓貧血は、赤血球の形成を骨髄中で刺激する生理的量でＥＰＯを投与することによって処置される。ＥＰＯの治療効果および使用は、例えばＥｃｋａｒｄｔ  Ｋ．Ｕ．，Ｍａｃｄｏｕｇａｌｌ  Ｉ．Ｃ，Ｌａｎｃｅｔ  ２００６，３６８，９４７−９５３，Ｊｅｌｋｍａｎｎ  Ｗ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９２，７２，４４９−４８９，Ｅｓｃｈｂａｃｈ  Ｊ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９８７，３１６，７３−７８，欧州特許第０１４８６０５号明細書、欧州特許第０２０９５３９号明細書、欧州特許第０２０５５６４号明細書、Ｈｕａｎｇ  Ｓ．Ｌ．，ＰＮＡＳ  １９８４，２７０８−２７１２，Ｌａｉ，Ｐ．Ｈ．  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２６１，３１１６−３１２１、ならびにＤｉｅｔｚｆｅｌｂｉｎｇｅｒ  Ｈ．  ｅｔ．ａｌ．，Ｍａｎｕａｌ  Ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  Ｍａｓｓｎａｈｍｅｎ  ｕｎｄ  ｓｙｍｐｔｏｍｏｒｉｅｎｔｉｅｒｔｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅ，Ｔｕｍｏｒｚｅｎｔｒｕｍ  Ｍｕｅｎｃｈｅｎ，２００１，７０−７７に詳細に記載されている。
【０００３】
投与に使用されるＥＰＯは、ヒトの尿から取得されることができるか、または遺伝子工学的方法によって製造されることができる。ＥＰＯは、ヒトの体内に極く微少量で含まれているので、治療的用途のために天然の源からＥＰＯを単離することは、実際に不可能である。従って、遺伝子工学的方法は、前記物質を大量に産生する唯一の経済的方法を提供する。
【０００４】
エリスロポイエチンを遺伝子組換えにより製造することは、エリスロポイエチン遺伝子を１９８４年に同定して以来、可能である。１９９０年の初頭以来、ヒトのエリスロポイエチンを含有する種々の医薬品が開発されており、この場合このエリスロポイエチンは、遺伝子工学的過程で遺伝子工学的に組み換えられて変化された真核細胞中で産生された。遺伝子組換えヒトエリスロポイエチンの製造は、なかんずく欧州特許出願公開第０１４８６０５号明細書および欧州特許出願公開第２０５５６４号明細書中に記載されている。
【０００５】
数多くの蛋白質、例えばエリスロポイエチンまたはインターフェロンの作用については、いわゆるシアリル化度、即ち糖鎖を介して蛋白質を末端結合されたシアリン酸の含量が決定的に重要である。この場合には、一般に高いシアリル化度を有する蛋白質は、高い特異的活性を有する。このような蛋白質、例えばＥＰＯ、ｔ−ＰＡ（組織プラスミノゲン活性化因子）または活性が特にシアリル化度に依存する血液凝固因子ＶＩＩＩは、公知技術水準によれば、このように必要とされる、蛋白質の翻訳後グリコシル化またはシアリル化への状態にある哺乳動物細胞の培養で製造される。この場合、ＥＰＯの遺伝子組換え製造は、通常、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞中で行なわれる。このチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞は、早期には胎児子牛血清および多くの場合に牛インシュリンも添加された培地中で培養されたが、この培養は、今日では規則的に血清不含および蛋白質不含の培地中で行なわれている。こうして、ウシ蛋白質、ウシウィルス、ウシＤＮＡまたは別の望ましくない物質での汚染の危険性は、排除される。このような血清不含および蛋白質不含の培地の内容物質は、当業者に公知である。この内容物質は、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、無機酸およびホルモンの種々の濃度での混合物からなり、この濃度は、例えば欧州特許第１４８１７９１号明細書およびＷＯ  ８８／００９６７Ａ１に提示されている。この場合、培地は、宿主細胞の成長速度、細胞密度、飜訳および転写に決定的な影響を及ぼし、ひいては特に遺伝子組換えにより製造された蛋白質のグリコシル化パターンおよびシアリル化パターンにも決定的な影響を及ぼす。即ち、一般に種々の製造業者によって提供されるような血清不含の培地、例えば培地ＭＡＭ−ＰＦ２（特に、Bioconcept社, Allschwil, Schweiz在、によって販売されている）または培地ＤＭＥＭおよびＤＭＥＮＵ１２（例えば、Invitrogen/Gibco社, Eggenstein, Deutschland在、によって提供されている）が使用される。
【０００６】
原則的に、組換え蛋白質、例えばＥＰＯを産生するための宿主細胞を培養する３つの異なる処理形式は、区別することができる。
【０００７】
バッチ法の場合、培地および細胞は、培養の開始時にバイオリアクター中に導入される。培養が終結するまで、栄養物質は、供給もされないし、細胞は、発酵槽から除去もされずに、単に酸素だけが供給される。１つ以上の基質が消費されると、このプロセスは、終結され、産生物が発酵上澄液から取得される。このバッチ法の変形は、いわゆる繰り返しバッチ法であり、この場合には、発酵の終結時に培養容量の一部分が接種剤としてバイオリアクター中に放置され、このリアクターは、中性培地で充填され、発酵プロセスは、再度開始される。
【０００８】
バッチ法の１つの利点は、簡単な工業的変換可能性にある。しかし、一般に遺伝子組換え蛋白質を製造するための細胞の能力が、培地中での選択的な栄養物質の含量不足のため、ならびに細胞に対して毒性の代謝産物、例えばアンモニウムおよびラクテートの含量増加のために、完全には使用し尽くされないことは、欠点である。同様にバッチ発酵槽中で含量増加する産生物が、絶えず同様に含量増加する代謝性酵素に晒され、それによって産生物の品質および／または収量が不利に影響を及ぼされうることは、欠点である。Ｇｒａｍｅｒ  Ｍ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９５，１３．６９２−６９８の記載と同様に、これは、殊にいわゆるシアリダーゼにも当てはまり、このシアリダーゼは、既に形成されたグリコ蛋白質の末端シアリン酸を分解する能力を有し、それによって所望の高度にシアリル化されたグリコ蛋白質の収量は、低下する。更に、バッチ法の欠点は、細胞培養への制限された栄養物質供給のために時間的に制限された産生時間（典型的には５〜１０日間の範囲内）とバイオリアクターの構築、清浄化および滅菌のための時間（典型的には４日間までの範囲内）を付加的に含む全サイクル時間との不利な比にある。
【０００９】
第２の公知の培養方法は、絶えず新しい培地を供給し、および同じ程度に発酵内容物を取り出す連続的な方法である。即ち、栄養物質の不断の供給が生じ、この場合には、同時に望ましくない代謝産物、例えば成長抑制物質のアンモニウムおよびラクテートが除去されるかまたは希釈される。従って、この方法では高い細胞密度を達成することができ、比較的長い期間に亘って維持することができる。いわゆる透析リアクターは、連続的なプロセス実施の特殊な場合を表わし、この場合高分子量物質、例えば蛋白質は、発酵槽中で滞留され、一方、低分子量物質、例えば基質は、供給されうるか、または主要な廃棄産生物のアンモニウムおよびラクテートは、系から除去されうる。連続的な方法の前記利点と共に、殊に細胞滞留系の汚染物質（典型的には、メンブランフィルターの清浄化を困難にする）による汚染ならびにメンブランを完全に閉塞するまでの貫流の減少をまねきうる、プロセス経過中のフィルター表面上での細胞材料の堆積の比較的高められた危険性に関連する欠点が明らかになる。他の選択可能な方法によれば、超音波で支持された滞留系が提供され、この滞留系中で細胞は、存在する超音波によって発酵リアクターからの流出部で阻止され、メンブランフィルターは、もはや使用される必要はない。
【００１０】
種々の細胞滞留系を備えた、化合物および蛋白質を微生物学的に製造する灌流リアクターの使用は、一般に公知であり、ＥＰＯにも記載されている（BioProcess International 2004, 46, Gorenflo et al., Biotech. Bioeng. 2002, 80, 438; www.sonosep.com/biosep.htm;ＷＯ  ９５／０１２１４）。
【００１１】
これに関連して、例えばＷａｎｇ  Ｍ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２００２，７７（２），１９４−２０３によって種々の系が討論され、この場合細胞は、マクロ多孔質ビーズ上に結合され、細孔によって大きな表面積を装備させることができ、このことは、高い細胞密度を生じる。栄養物質の管理は、新しい培地の連続的な供給によって行なわれ、この場合には、同時に細胞で成長されたビーズは、上向きに流入される。ビーズの代わりに、ポリエステル小板（直径約１ｃｍ）も攪拌釜に梱包することができ、新しい培地と一緒に連続的に貫流することができる（Jixian D. et. al., Chinese Journal of Biotechnology 1998. 13 (4), 247-252）。
【００１２】
勿論、そのための前提条件は、細胞が粘着して成長することである。キャリヤーを装備することは、如何なる種類および化学組成であるのかとは無関係に、内部状態がもはや正しく管理されないように細胞が緊密に成長する可能性があり、そこに装備された細胞が産生を調節するかまたは望ましくない代謝物も、この代謝物が十分には導出されず、ひいては製品品質に不利な影響を及ぼしうるように高度に放出されるという欠点を有する。
【００１３】
最後に、第３の可能な方法は、流加発酵（Fed-Batch-Fermentation）であり、この場合培養は、一部分だけが培地で充填された発酵槽中で開始され、短い成長段階後に次第に新しい培地が添加される。それによって、バッチ法よりも高い細胞密度および長いプロセス時間が可能になる。更に、この方法の利点は、細胞の代謝が栄養補給（Zufuetterung）の程度により影響を及ぼされうることであり、このこととは、廃棄物質の僅かな産生を生じうる。この場合、連続的な方法と比較して細胞の産生物は、長時間に亘って発酵槽中に蓄積され、それと共によりいっそう高い産生物濃度が達成され、それによって引続く後処理が簡易化される。勿論、これは、細胞の産生物が十分に安定しており、発酵槽中での数日間の滞留時間で酵素分解しないかまたは別の方法でも分解しないことを前提とする。更に、この方法の欠点は、バイオリアクター中での生理学的割合が濃縮された基質溶液の栄養補給によって不利に変化しうることである。
【００１４】
哺乳動物細胞の培養の際の主要な問題は、栄養物質の分解産生物が細胞生理に対して臨界的範囲を超えて含量増加することなしに、細胞に十分な栄養物質を供給することである。動物細胞の主要なエネルギー源としては、グルコースおよびグルタミンが使用され、これらの主要な分解産生物のラクテートまたはアンモニウムは、高い濃度で前記細胞の成長および代謝を妨害し、細胞の壊死をまねく（Hasseil et al., Applied Biochemistry and Biotechnology 1991, 30, 29-41）。従って、動物細胞を培養する場合には、十分な栄養物質供給の際にラクテートおよびアンモニウムの蓄積を減少させ、それによってよりいっそう高い細胞密度およびよりいっそう高い産生物収量が達成されることは、好ましい。
【００１５】
廃棄産生物の産生を減少させる１つの方法は、制御された基質添加にあり、この基質添加は、"異化作用の制御"とも呼称される。この場合には、発酵培地中に供給された、栄養物質の濃度による細胞代謝の依存性が利用される。グルタミンおよび／またはグルコースの制限された栄養補給は、ハイブリドーマ細胞の際にアンモニウムおよびラクテートの明らかに減少された産生を生じることが判明した（Ljunggren & Haggstrom, Biotechnology and Bioengineering 1994, 44, 808-818）。
【００１６】
グルコース濃度を濃縮された培地の制御された添加によって適合させる流加培養（Fed-Batch-Kulturen）において、数時間後に"代謝シフト"とも呼称される、細胞代謝の変化を観察することができた。この"代謝シフト"は、培地中でグルコース濃度およびグルタミン濃度を数日間に亘って制限することによって開始され、僅かな栄養物質が細胞によって吸収され、および代謝されることを生じる。その後、培地中でのグルコースおよびグルタミンの含量は、上昇し、一方、廃棄物質のラクテートおよびアンモニウムの産生は、減少された使用量のために明らかに減少する（Zhou et al., Biotechnology and Bioengineering 1995, 46, 579-587）。"代謝シフト"は、ハイブリドーマ細胞の場合だけに観察されるのではなく、細胞系列、例えばＳＰＯ、ＨＥＫ−２９３、ＢＨＫおよびＣＨＯの場合も観察される。
【００１７】
この"代謝シフト"により、同時に比較可能な長いプロセス時間の場合に１ミリリットル当たり１０7個を上廻る細胞の高い細胞密度を達成することができ、それというのも、廃棄産生物のラクテートおよびアンモニウムは、細胞成長を不利に調整する濃度では蓄積しないからである。この場合、栄養補給溶液が細胞の需要に適合されていることは、重要であり、"代謝シフト"の達成が保証され、一定の栄養物質の枯渇ならびに過剰の蓄積、ひいてはモル浸透圧濃度の著しい上昇が回避される（Xie und Wang, Biotechnology and Bioengineering 1994, 43, 1175-1189およびBiotechnology and Bioengineering 1996, 51, 725-729）。それにも拘わらず、さらに、遺伝子組換え蛋白質のグリコシル化のために基質としてのグルコースを細胞に十分に供給することは、重要なことである。
【００１８】
供給された栄養物質の濃度を細胞の消費量に適合させうるために、一般には複雑な方法が使用され、細胞の目下の消費量が定められ、その後に栄養補給速度が要望通りに適合される。そのためには、なかんずく例えばフローインジェクション分析法によるグルコース濃度の測定または細胞の酸素消費量の測定が属する。
【００１９】
即ち、例えば米国特許第６１８０４０１号明細書には、流加培養が開示され、この場合グルコース濃度は、連続的に測定され、培地中で栄養補給への適合によって測定値に依存して一定の範囲内に維持される。また、米国特許第２００２／００９９１８３号明細書の教示によれば、グルコースの栄養補給速度は、グルコース濃度により測定され、それによって培地中でのグルコース濃度は、一定の範囲内に維持される。
【００２０】
培地中でのグルタミン濃度に依存する、要望通りの栄養物質供給は、供給原料−バッチ法（Fed-Batch-Verfahren）を基礎に欧州特許出願公開第１０３６１７９号明細書中に記載されている。
【００２１】
ＷＯ  ９７／３３９７３には、帯電した代謝産生物の産生を培地の導電率につき測定し、栄養補給速度を相応して適合させる培養法が開示されている。
【００２２】
米国特許第５９１２１１３号明細書には、培地中での炭素源が消費され、それによって培地中での高められたｐＨ値または高められた溶解酸素濃度が測定される場合に、常に栄養補給される、微生物のための発酵法が記載されている。
【００２３】
また、先に議論された、培地組成物の形での栄養物質供給のような工業的プロセスのパラメーターと共に、異なる成長速度、産生運動、細胞活力、グリコシル化およびシアリル化のための翻訳後プロセシングで現れうる細胞系列特異的性質は、得られたＥＰＯの産生物の品質ならびに発酵プロセスの全生産性にとって中心的な役を演じる。Ｌｌｏｙｄ  Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９９，３０，４９−５７の記載と同様に、例えば、産生する宿主細胞が存在するライフサイクルの段階に応じて、細胞代謝は、著しい差異を有し、本発明の場合には、殊にグリコシル化度およびシアリル化度に関連して異なる量および品質のＥＰＯを形成することができる。
【００２４】
ＥＰＯを真核細胞中で発酵により製造することは、記載された費用の掛かる方法、発酵上澄み中での典型的に比較的僅かな産生濃度ならびに高価な成分を有する、蛋白質不含および血清不含の培地の使用のために、極めて費用が掛かるので、効率的な産生法の開発は、著しく重要である。
【００２５】
従って、本発明の工業的課題は、公知技術水準と比較してプロセス実施の簡易化ならびに高い価値のエリスロポイエチンの収量に関連して利点を有する、エリスロポイエチンを発酵により製造する方法を開発することであった。この場合、得られるＥＰＯは、公式標準の全ての要件、殊にアイソホーム組成物およびグリコシル化パターンまたはシアリル化パターンに関連する全ての要件に対応するはずである（Ph. Eur. 04/2002:1316）。
【００２６】
この工業的課題は、エリスロポイエチンを連続的に発酵により製造する方法によって解決され、この場合ＥＰＯを産生する真核細胞は、灌流リアクター中で細胞の滞留下に培養され、この場合グルコース濃度は、リアクター中で培地の灌流速度により調節され、細胞数は、リアクター中で予め定められた範囲内での細胞滞留率により調節される。
【００２７】
好ましくは、エリスロポイエチンを連続的に発酵により製造するための本発明による方法において、
ａ）一面で、培地の灌流速度（調整パラメーターとして）は、発酵リアクター中でのグルコース濃度（測定パラメーターとして）に依存して調節され、
ｂ）他面、細胞滞留装置の細胞滞留率（調整パラメーターとして）は、発酵リアクター中での細胞密度（測定パラメーターとして）に依存して適当な方法で予め定められた範囲内で調節される。
【００２８】
ｂ）に対して他の選択可能な方法またはｂ）と組み合わせた他の選択可能な方法によれば、時間間隔においても要望通りに定義された量の細胞含有培地をバイオリアクターから排出することができ、こうして一定の細胞密度をこのリアクター中で達成することができる。
【００２９】
残りの該当するプロセスパラメーター、例えばｐＨ値、温度、酸素分圧、攪拌速度ならびに供給された培地の組成は、発酵の全時間に亘って特に一定に維持される。
【００３０】
記載された方法は、新たにエリスロポイエチンの産生収量ならびに産生品質を高めるための種々の手段を組み合わせている：
（１）灌流により、絶えず細胞毒性の代謝産生物が排出され、ならびに新しい栄養物質が供給され、したがってバイオリアクター中で極めて高い細胞密度が達成され、細胞は、極めて長時間に亘って産生する。
（２）灌流プロセスの場合に典型的に極めて高い消費量の高価な培地を減少させ、経済的に改善された産生プロセスを可能にするために、さらに、灌流速度は、培養上澄液中でのグルコース含量が実際に一面で効率的な細胞成長に必要な下限を下廻らないが、しかし、他面、細胞代謝で"代謝シフト"が生じ、毒性の代謝産物のラクテートおよびアンモニウムがなお減少された範囲でのみ産生され、それによって灌流の際になお微少量の新しい培地だけが排出されなければならないような形式に制限されているように選択される。
（３）その上、調整可能な細胞滞留システムの細胞滞留率を適当に調節すること、または定義された量の細胞含有培地を繰り返し排出することにより、発酵溶液中で、なお成長プラトーが達成されずに、なお指数的成長段階が存在し、特に公式標準に相当する高い価値のＥＰＯを産生する能力を有する、高められた相対的割合の細胞での細胞集結を生じることができる。
【００３１】
記載された手段、適当な細胞滞留率の調節または同時に適当な灌流速度を調節する際に定義された量の細胞含有培地の規則的な排出は、相乗作用を有し、したがって連続的な方法に対して極めて簡単で工業的に容易に実施可能なプロセスで極めて高い収量で極めて長い時間に亘って意外なことにエリスロポイエチンを取得することができ、この場合このエリスロポイエチンは、極めて高い含量で、薬局方の要件を、殊にグリコシル化度およびシアリル化度ならびにアイソホーム分布に関連して考慮に入れたＥＰＯを有する。
【００３２】
本発明によれば、グルコース濃度および細胞数の測定または監視は、連続的に行なうことができるか、または一定の時点で行なうことができる。特に、グルコース濃度および細胞数は、連続的に調節される。グルコース濃度は、灌流速度により、即ちグルコースを含有する新しい培地がグルコース濃度に依存して発酵リアクター中に添加されることにより調節される。
【００３３】
請求項１に記載された好ましい方法において、培養上澄液中のグルコース濃度は、０．０５〜１．５ｇ／ｌの範囲内で調節され、細胞数は、１ｍｌ当たり細胞０．５×１０7〜５．０×１０7個の範囲内で調節される。
【００３４】
更に、エリスロポイエチンを産生する真核細胞が哺乳動物細胞、有利にヒト細胞、特に有利にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であることは、好ましい。
【００３５】
更に、１つの好ましい方法において、細胞は、特に段階なしに調整可能である超音波細胞滞留システムを使用しながら滞留される。
【００３６】
更に、プロセスパラメーターのｐＨ値、温度、酸素分圧、攪拌速度および培地組成が発酵の全時間に亘って技術的に必然的なずれの範囲内で一定に維持されることは、好ましい。
【００３７】
本発明による方法の特に好ましい実施態様において、産生能力は、発酵上澄液１  ｌ当たりエリスロポイエチン少なくとも１０ｍｇ、特に少なくとも２０ｍｇ、さらに有利に少なくとも２５ｍｇ、殊に有利に少なくとも３０ｍｇである。特に、平均的な産生能力は、発酵上澄液１  ｌ当たりエリスロポイエチン少なくとも１０ｍｇ、特に少なくとも１５ｍｇである。
【００３８】
更に、細胞１個当たり毎日の平均的な特殊な産生能力は、エリスロポイエチン少なくとも０．５ｐｇ、さらに有利に少なくとも１．０ｐｇ、特に有利に少なくとも１．２ｐｇ、殊に有利に少なくとも１．４ｐｇである。
【００３９】
本発明による方法を使用する場合、細胞の平均活力は、少なくとも７０％、特に７５％、特に有利に少なくとも８０％、さらに有利に少なくとも９０％、殊に有利に少なくとも９５％である。
【００４０】
本発明による方法は、特に０．５〜３、有利に１〜２．５、特に有利に１．５〜２．０の発酵中の灌流速度で実施される。
【００４１】
好ましくは、本発明による方法は、少なくとも１０日間、特に少なくとも２０日間、特に有利に３０日間、殊に有利に少なくとも４０日間の期間に亘って実施される。
【００４２】
更に、本方法の実施態様において、培養上澄液中のグルコース濃度は、有利に０．２５〜１．２５ｇ／ｌ、特に有利に０．５〜１．０ｇ／ｌの範囲内で調節される。
【００４３】
バイオリアクター中の細胞数は、有利に発酵培地１ｍｌ当たり細胞１．０×１０7〜４．０×１０7個、特に有利に細胞１．５×１０7〜３．０×１０7個の範囲内に調節される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、本発明による方法で得られる、グルコース濃度または培養上澄液中でのＥＰＯ産生能力（ＥＰＯ  μｇ／ｍｌ）の時間的経過を示す線図である。
【図２】図２は、培養上澄液中での生体細胞数（ｖｉｔ．ＺＺ）およびＥＰＯ産生能力の時間的経過ならびに本発明方法による灌流の時間的経過を示す線図である。
【図３】図３は、培養上澄液中の細胞の全体数に対する生体細胞の百分率での割合の時間的経過および本発明方法による百分率での細胞滞留率の時間的経過を示す線図である。
【図４】図４は、本発明方法により得られる、培養上澄液中でのラクテート濃度またはグルタメート濃度の時間的経過を示す線図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な記載（最適な実施態様）
本発明は、エリスロポイエチンを連続的に発酵により製造する方法に関し、この場合ＥＰＯを産生する真核細胞は、灌流リアクター中で細胞の滞留下に培養され、この場合グルコース濃度は、培養上澄液中で培地の灌流速度により調節され、細胞数は、細胞滞留装置の細胞滞留率および／または規則的な排出により定義された量の細胞含有培地により予め定められた範囲内で調節される。
【００４６】
本発明によれば、段階なしに調節可能な超音波細胞滞留システムを備えた灌流リアクター中で、特にＣＨＯ細胞を用いてエリスロポイエチンを連続的に発酵により製造する方法で
ａ）一面で、培地の灌流速度（調整パラメーターとして）は、発酵リアクター中でのグルコース濃度（測定パラメーターとして）に依存して調節され、
ｂ）他面、細胞滞留装置の細胞滞留率（調整パラメーターとして）は、発酵リアクター中での細胞密度（測定パラメーターとして）に依存して適当な方法で互いに予め定められた範囲内で調節されることにより、
発酵溶液中で、なお成長プラトーが達成されずに、なお指数的成長段階が存在する、高められた相対的割合の細胞での細胞集結が得られる。このような細胞は、特に公式標準に相当する高い価値のＥＰＯを産生する能力を有する。
【００４７】
適当な灌流速度に同時に調節する際に適当な細胞滞留率に調節する２つの手段は、相乗作用を有し、したがって連続的な方法に対して意外にも簡単で工業的に容易に実施可能なプロセスで発酵上澄液１  ｌ当たり３０ｍｇまでの意外にも高い収量でＥＰＯを取得することができ、この場合このＥＰＯは、極めて高い含量で、薬局方の要件を、殊にグリコシル化度およびシアリル化度ならびにアイソホーム分布に関連して考慮に入れたＥＰＯを有する。
【００４８】
本発明によるＣＨＯ細胞系列に対して、灌流速度を調節することによって、０．０５〜１．５ｇ／ｌ、有利に０．２５〜１．２５ｇ／ｌ、特に有利に０．５〜１．０ｇ／ｌの培養上澄液中でのグルコース含量は、有利であることが証明された。灌流速度は、グルコース含量の測定に相応してリアクター中で調整される。これとの組合せにより、リアクター中での細胞密度は、超音波細胞滞留を相応して調節すること、または定義された量の細胞含有媒体を規則的に排出することにより、１ｍｌ当たり細胞０．５×１０7〜５．０×１０7個の範囲内で維持される。更に、１ｍｌ当たり細胞１．０×１０7〜４．０×１０7個の細胞密度、特に有利に１ｍｌ当たり細胞１．５×１０7〜３．０×１０7個の細胞密度は、好ましい。前記のパラメーター調節の制御は、リアクター中での細胞密度測定によって実現される。
【００４９】
本発明によれば、別の全ての当該プロセスパラメーター、例えばｐＨ値、温度、酸素分圧、攪拌速度および培地組成は、発酵の全時間に亘って特に一定に維持される。
【００５０】
培養は、特に血清不含および蛋白質不含の培地中で行なわれる。このような血清不含および蛋白質不含の培地の内容物質は、当業者に公知である。この内容物質は、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン、無機酸およびホルモンの種々の濃度での混合物からなり、この濃度は、例えば欧州特許第１４８１７９１号明細書およびＷＯ  ８８／００９６７Ａ１に提示されている。この場合、培地は、宿主細胞の成長速度、細胞密度、飜訳および転写に決定的な影響を及ぼし、ひいては特に遺伝子組換えにより製造された蛋白質のグリコシル化パターンおよびシアリル化パターンにも決定的な影響を及ぼす。本発明には、種々の製造業者によって提供されるような血清不含の培地、例えば培地ＭＡＭ−ＰＦ２（特に、Bioconcept社, Allschwil, Schweiz在、によって販売されている）、培地ＤＭＥＭおよびＤＭＥＮＵ１２（例えば、Invitrogen/Gibco社, Eggenstein, Deutschland在、によって提供されている）または培地ＨｙＱＰＦ  ＣＨＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｏｙ（特に、Ｈｙｃｌｏｎｅ／Ｐｅｒｂｉｏ，Ｂｏｎｎ，Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ在、によって提供されている）が使用された。
【００５１】
本発明により製造されたＥＰＯは、真核細胞中で製造された、有利に遺伝子組換えヒトエリスロポイエチンである。好ましくは、例えば一般に欧州特許出願公開第２０５５６４号明細書および欧州特許出願公開第１４８２０６０５号明細書の記載と同様に、遺伝子組換えＥＰＯは、哺乳動物細胞中、特に有利にヒト細胞中、殊に有利にＣＨＯ細胞中で製造される。
【００５２】
エリスロポイエチン（ＥＰＯ）は、本発明の範囲内で、エリスロポイエチン形成を骨髄中で刺激し、欧州薬局方（Ph. Eur. 04/2002:1316）に記載されたアッセイにより明らかにエリスロポイエチンとして同定することができる状態にある全ての蛋白質である（赤血球増加症または正赤血球症（normocythaemic）のマウスの活性の測定）。ＥＰＯは、野生型ヒトエリスロポイエチン、または１つ以上のアミノ酸交換体、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加物を有する前記野生型ヒトエリスロポイエチンの変形であることができる。
【００５３】
ＥＰＯの変形が問題である場合には、この変形がアミノ酸交換体、アミノ酸欠失またはアミノ酸付加物による野生型ヒトエリスロポイエチンのアミノ酸位置  単に１〜２０、有利に単に１〜１５、特に有利に単に１〜１０、殊に有利に単に１〜５で区別されることは、好ましい。
【実施例】
【００５４】
例
１ｍｌ当たり細胞０．４４×１０6個を有するＣＨＯ細胞培養溶液を、１０  ｌの容積で、Ｂｉｏｓｅｐ  ５０（Applikon社）を装備した、１０  ｌの灌流リアクター（Applikon社）中で接種し、培養パラメーターの維持下に３日間保持した。第４日目に、０．２５倍の灌流で開始した。灌流速度を連続的にそれぞれ０．２５回の工程で最大２．５倍になるまで上昇させ、次にそれぞれ測定されたグルコース濃度に相応してグルコース濃度の目的範囲（０．５〜１．２ｇ／ｌ）内に調節した。細胞数に対する目的範囲を、超音波装置へ細胞滞留率を適合させること、および相応する量の細胞含有培地を排出させることによって調節した。更に、発酵条件は、次の通りであった：
接種：１ｍｌ当たり細胞０．４４×１０6個
基礎培地：ＨｙＣｌｏｎｅ／Ｐｅｒｂｉｏ社のＨｙＱＰＦ  ＣＨＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｏｙ
反応容積：１０  ｌ
ｐＨ値：７．２
温度：３７℃
酸素分圧：３５％
攪拌速度：２００ｒｐｍ
細胞の滞留：Ｂｉｏｓｅｐ  ５０
発酵時間：４７時間。
【００５５】
使用される基礎培地を蛋白質加水分解物（Becton Dickinson社のYeastolate、Kerry Bio Science社のHyPEP SR3）および痕跡要素（Lonza社のCHO 4A TE Sock）で含量増加した。
【００５６】
発酵を分析パラメーターのＥＰＯ含量、グルコース含量、グルタミン含量、生体細胞の含量（絶対および相対）、細胞滞留率および灌流率に関連して記録した。このデータは、図１〜４に図示されている。
【００５７】
発酵の進行中に粗製ＥＰＯ１２ｇの全体量と一緒に７７６  ；を取得した。産生能力は、１ｍｌ当たり細胞１．６×１０7個の平均細胞数の際に平均で１５μｇ／ｍｌであり、最大細胞数は、３０μｇ／ｍｌを超える最大産生能力の際に１ｍｌ当たり細胞２．６×１０7個であった。細胞１個当たりの毎日の特殊な産生能力は、１．４ｐｇであり、平均灌流速度は、１．９であった。細胞活力は、７６〜９８％であった。Ｂｉｏｓｅｐシステムを用いての平均細胞滞留率は、８５％であった（７〜９７％）。
【００５８】
生じた取得物を細胞不含になるまで濾過し、３〜４回のクロマトグラフィー工程からなる、当業者に公知の後処理および精製に掛けた。
【００５９】
結果として、本発明による方法を用いて意外にも高い収量でエリスロポイエチンを取得することができ、この場合このエリスロポイエチンは、極めて高い含量で、薬局方の要件を、殊にグリコシル化度およびシアリル化度ならびにアイソホーム分布に関連して考慮に入れたＥＰＯを有することが判明した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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