(57)【要約】  有機酸を製造するための発酵法を提供する。該方法は、ａｃｋ及びｐｔａ遺伝子の一つ又は両方を破壊された代謝工学的変異細菌を供給し、前記変異細菌を発酵性基質に暴露している間、前記変異細菌を固定化することによって、それらの酸耐性及びそれらの増殖速度が増大するように前記変異細菌を適応させ、そして前記適応変異細菌を約５０ｇ／Ｌを超える最終有機酸発酵生成物濃度を提供するのに足る時間発酵性基質にさらに暴露することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸を製造するための発酵法であって、ａｃｋ及びｐｔａ遺伝子の一つ又は両方を破壊された代謝工学的変異クロストリジウム又はプロピオン酸菌を供給し、その変異細菌を発酵性基質に暴露している間、前記変異細菌を固定化することによって、それらの酸耐性及びそれらの増殖速度が増大するように前記変異細菌を適応させ、そして前記適応変異細菌を約５０ｇ／Ｌを超える最終有機酸発酵生成物濃度を提供するのに足る時間発酵性基質にさらに暴露することを含む方法。
【請求項２】
前記変異細菌がＣ．チロブチリカムＰＡＫ−Ｅｍを含み、前記有機酸発酵生成物が酪酸及び水素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記糖が、グルコース、フルクトース、キシロース、ラクトース、マルトース、スクロース、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記変異細菌がＣ．チロブチリカムＰＰＴＡ−Ｅｍを含み、前記有機酸発酵生成物が酪酸及び水素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記糖が、グルコース、フルクトース、キシロース、ラクトース、マルトース、スクロース、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記変異細菌がＣ．チロブチリカムＨｙｄＥｍを含み、前記有機酸発酵生成物が酪酸及び水素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖が、グルコース、フルクトース、キシロース、ラクトース、マルトース、スクロース、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異細菌がＰ．アシディプロピオニシＡＣＫ−Ｔｅｔを含み、前記有機酸発酵生成物がプロピオン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵性基質が、ラクテート及びグリセロールから選ばれる炭素源を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記変異細菌がＰ．アシディプロピオニシＴＡＴ−ＡＣＫ−Ｔｅｔを含み、前記有機酸発酵生成物がプロピオン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発酵性基質が、ラクテート及びグリセロールから選ばれる炭素源を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
有機酸を製造するための発酵法であって、ａｃｋ及びｐｔａ遺伝子の一つ又は両方を破壊された、Ｃ．チロブチリカム、Ｃ．ブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキイ、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ポプレチ、及びＣ．サーモブチリカム、並びにＰ．アシディプロピオニシからなる群から選ばれる代謝工学的変異細菌を供給し、前記変異細菌を発酵性基質に暴露している間、前記変異細菌を繊維床リアクターに固定化することによって、それらの酸耐性及びそれらの増殖速度が増大するように前記変異細菌を適応させ、そして前記適応変異細菌を約５０ｇ／Ｌを超える最終有機酸発酵生成物濃度を提供するのに足る時間発酵性基質にさらに暴露することを含む方法。
【請求項１８】
前記変異細菌がＣ．チロブチリカムＰＡＫ−Ｅｍを含み、前記有機酸発酵生成物が酪酸及び水素を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記変異細菌がＣ．チロブチリカムＨｙｄＥｍを含み、前記有機酸発酵生成物が酪酸及び水素を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記変異細菌がＣ．チロブチリカムＰＰＴＡ−Ｅｍを含み、前記有機酸発酵生成物が酪酸及び水素を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変異細菌がＰ．アシディプロピオニシＡＣＫ−Ｔｅｔを含み、前記有機酸発酵生成物がプロピオン酸を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記発酵性基質がグリセロールを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記変異細菌がＰ．アシディプロピオニシＴＡＴ−ＡＣＫ−Ｔｅｔを含み、前記有機酸発酵生成物がプロピオン酸を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記発酵性基質がグリセロールを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
酪酸を製造するための発酵法であって、相同的組換えによってａｃｋ及びｐｔａ遺伝子の一つ又は両方を破壊された代謝工学的Ｃ．チロブチリカムＰＡＫ−Ｅｍ、Ｃ．チロブチリカムＨｙｄＥｍ、又はＣ．チロブチリカムＰＰＴＡ−Ｅｍ変異細菌を供給し、前記変異細菌を発酵性基質に暴露している間、前記変異細菌を繊維床リアクターに固定化することによって、それらの酸耐性及びそれらの増殖速度が増大するように前記変異細菌を適応させ、そして前記適応変異細菌を約５０ｇ／Ｌを超える最終酪酸発酵生成物濃度を提供するのに足る時間発酵性基質にさらに暴露することを含む方法。
【請求項３１】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
プロピオン酸を製造するための発酵法であって、相同的組換えによってａｃｋ及びｐｔａ遺伝子の一つ又は両方を破壊された代謝工学的Ｐ．アシディプロピオニシＡＣＫ−Ｔｅｔ又はＰ．アシディプロピオニシＴＡＴ−ＡＣＫ−Ｔｅｔ変異細菌を供給し、前記変異細菌を発酵性基質に暴露している間、前記変異細菌を繊維床リアクターに固定化することによって、それらの酸耐性及びそれらの増殖速度が増大するように前記変異細菌を適応させ、そして前記適応変異細菌を約５０ｇ／Ｌを超える最終プロピオン酸発酵生成物濃度を提供するのに足る時間発酵性基質にさらに暴露することを含む方法。
【請求項３３】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記発酵性基質がグリセロールを含む、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に有機酸の製造法に関し、特に代謝工学及びプロセス工学から誘導された嫌気性細菌の酸耐性株を用いた発酵による酪酸、プロピオン酸、及び酢酸の製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化石燃料の将来的不足、コスト、及び環境影響に対する懸念から、燃料及び化学物質の代替源として安価で再生可能なバイオマスの開発に関心が高まっている。原油価格が上昇しているので、バイオベースの化学物質及び工業製品が石油由来のそれの魅力的な代替品となっている。嫌気性微生物を使用した発酵プロセスは、バイオマス及び農業廃棄物を化学物質及び燃料に変換するための有望な道筋を提供する。汚染問題を回避するために適切な処分を必要とする低価値の農産物及び食品加工副産物／廃棄物は豊富に存在する。これらのバイオマス廃棄物は、燃料及び有機酸のような化学物質製造用の低コスト原料として使用できる。
【０００３】
再生可能資源からの酪酸及び水素の製造は、石油系原料のコストの増大、石油化学工業によって引き起こされる環境汚染への社会的関心のほか、食品、化粧品、及び医薬品中のバイオ系天然成分に対する消費者の好みのため、石油系プロセスに代わるますます魅力的な代替手段となっている。酪酸は、クロストリジウム種、例えばＣ．チロブチリカム(C. tyrobutyricum)、Ｃ．ブチリカム(C. butyricum)、Ｃ．ベイジェリンキイ(C. beijerinckii)、Ｃ．アセトブチリカム(C. acetobutyricum)、Ｃ．ポプレチ(C. populeti)、及びＣ．サーモブチリカム(C. thermobutyricum)によって糖から製造される短鎖脂肪酸である。酪酸は現在、主に石油化学的経路によって製造されているが、発酵による天然資源からの酪酸の製造に関心が高まっている。しかしながら、酪酸製造のための従来の発酵技術は、ブチレート生成菌がヘテロ発酵性で、酪酸によって強く阻害されるため、低いリアクター生産性、生成物濃度、及び収率によって制限されている。
【０００４】
同様に、従来のプロピオン酸発酵プロセスも、低い生産性、収率、及び最終生成物の濃度と純度に苦しみ、商業的に応用するには経済的でない。プロピオン酸は、セルロースプラスチック、除草剤、及び香料の製造に広く使用されている重要な化学物質である。プロピオン酸は重要なカビ抑制剤でもある。そのアンモニア、カルシウム、ナトリウム、及びカリウム塩は食品及び飼料の保存剤として広く使用されている。現在市販されている大部分のプロピオン酸は石油化学プロセスによって製造されている。しかしながら、プロピオン酸菌属による糖の発酵によるプロピオン酸の製造に関心が高まっている。様々なプロセス及び菌株の改良によって発酵生産性及び最終生成物濃度の改良にある程度の成功は見られているが、発酵プロセスにおけるプロピオン酸の収率及び純度を更に如何に改良するかは課題として残されたままである。
【０００５】
化学品製造のための経済的に実行可能な発酵プロセスの開発には、生産速度が高いばかりでなく高濃度の発酵生成物に耐容可能な微生物が必要となる。産業用微生物の改良法は、古典的な株改良（classical strain improvement,ＣＳＩ）のランダムアプローチから高度に合理的な代謝工学法まで多岐にわたる。ＣＳＩは堅実な方法であるが、時間及び資源集約的である。阻害性発酵生成物に対する高い耐性を有する菌株を得るには、阻害物質濃度を増大させながら培地中で継代培養することによって変異体を連続的にスクリーニング及び選別するという方法が、化学的変異原又はＵＶ照射による変異誘発と併せて通常使用される。しかしながら、従来の培養物スクリーニング法は単調で時間がかかり、徒労に終わることも多い。より最近では、阻害性生成物に対する細胞耐性を改良するために、組換えＤＮＡ技術も適用されている。これらの方法は一般的により効果的であるが、使用が複雑で、遺伝子レベルでの詳細な阻害機序の知識も必要とされる。産業発酵上関心を持たれている大部分の微生物の場合、そうした知識は入手できない。
【０００６】
代謝工学は、代謝フラックス分配の変更を通じて代謝産物の過剰生産におけるより高い効率を達成する工学的菌株(engineered strains)を設計するのに広く使用されている。これまでのほとんどの代謝工学の研究は、遺伝学及び生理学が良く研究された生物（例えば、大腸菌、酵母、及びハイブリドーマ細胞）を用いた、二次代謝産物（例えば抗生物質）、アミノ酸（例えばリジン）、及び異種タンパク質の製造に関するものである。代謝フラックス分配を化学量論的に分析すると、代謝工学、最適な培地調製と供給戦略、及びバイオプロセスの最適化への指針を与えてくれる。しかしながら、これには、発酵細胞における代謝ネットワーク及び調節ネットワークに関する深い知識が要求される。合理的な代謝工学的手法は、遺伝子クラスター内の単一遺伝子又は少数遺伝子が関与する事例では成功を収めているが、複雑な又はほとんど不明の代謝経路が関与する多くの事例では無効であった。この理由は、合理的な代謝工学的手法は、通常、一時に一つの遺伝子しか標的にしないため、経路における多数の遺伝子間の複雑な相互作用は予測できないからである。
【０００７】
プロピオン酸菌属は、グラム陽性、カタラーゼ陽性、非胞子形成性、非運動性、通性嫌気性桿菌である。プロピオン酸菌属のメンバーは、ビタミンＢ１２、テトラピロール化合物、及びプロピオン酸の製造のほか、プロバイオティクス及びチーズ産業でも広く使用されている。図１に示すように、プロピオン酸は、プロピオン酸菌属によりジカルボン酸経路から製造され、通常アセテート及び二酸化炭素の形成を伴う。理論的には、解糖がＥＭＰ（エムデン−マイヤーホフ−パルナス）経路を通じて行われる場合、１モルのグルコースは４／３モルのプロピオネートと２／３モルのアセテートしか製造しない。実際のプロピオネート収率は、顕著な細胞増殖とバイオマス形成がある場合、はるかに低くなる。１０ｇ／Ｌほどの比較的低濃度でも、プロピオネートは発酵に対する強力な阻害剤となる。典型的なバッチ式のプロピオン酸発酵は、〜２０ｇ／Ｌのプロピオン酸に到達するのに〜３日かかり、プロピオン酸の収率は通常０．４ｇ／ｇグルコース未満である。プロピオン酸発酵をその収率、最終生成物濃度及び生産速度に関して改良しようとして、新規バイオプロセス及び変異株の開発がなされたが、限定的な成功しか得られなかった。バイオベースのプロピオン酸をその石油化学由来の対応物及びその他の関連化学物質と経済的に競合できるようにするには、発酵プロセスにおける顕著な改良が必要である。
【０００８】
クロストリジウム・チロブチリカム(Clostridium tyrobutyricum)は、様々な炭水化物を酪酸及び酢酸に発酵できるグラム陽性、桿状、胞子形成性、偏性（絶対）嫌気性細菌である。歴史的に、生乳中に存在するクロストリジウム胞子（最も一般的には貯蔵牧草由来）の増殖によって引き起こされるチーズの酪酸発酵（後期ガス膨張(late blowing)）は、かなりの製品損失をもたらすことがある。他方で酪酸は化学、食品、及び製薬産業で多数の用途を有している。食品香料ではバター様の香りを増強するために純酸の形態で使用されている。この酸のエステルは、果物の香りを増すための添加剤として、及び香料製造用の芳香化合物として使用されている。
【０００９】
酪酸は、結腸内で食物繊維の細菌発酵によって発生する短鎖脂肪酸の一つで、抗がん作用があることが示されており、栄養補助食品として、又はさらには結腸直腸がんを治療するための薬剤として使用することができる。糖から酪酸が生成する発酵経路を図２に示す。酢酸と水素も発酵で生成する。いくつかの嫌気性細菌は、様々な基質から主要発酵生成物として酪酸を産生することができる。その中でもＣ．チロブチリカムは他の種に優る多くの利点を有している。例えば、単純な細胞増殖用培地及び比較的高い生成物の純度及び収率などである。
【００１０】
しかしながら、他の酸生成細菌と同様、酪酸菌もそれらの酸生成物によって強力に阻害される。結果として、従来の酪酸発酵は通常、低いリアクター生産性（＜０．５ｇ／Ｌ・ｈ）、低い生成物収率（＜０．４ｇ／ｇ）、及び低い最終生成物濃度（＜３０ｇ／Ｌ）によって制限されるため、生成物の回収が困難となり、プロセスを不経済なものにする。細胞密度、リアクター生産性及び最終酪酸濃度の増大に向けて多くの研究がなされてきたが、限定的な成功しか得られていない。それに、酪酸が唯一の発酵生成物でもない。酢酸も副産物として生成する。これは酪酸の収率を減じるだけでなく、最終生成物の回収も困難で厄介なものにする。
【００１１】
プロピオン酸及び酪酸発酵の一つの共通の問題点はアセテートの同時生成である。これは、主要発酵生成物の収率を低下させるだけでなく、生成物の精製も困難にする。グルコースからのプロピオン酸及び酪酸の収率は、基質の炭素が代謝工学によって再分配されると、大きく増大させることができる。例えば、プロピオン酸発酵経路の化学量論的分析から、ＨＭＰ（ヘキソースモノホスフェート）及び／又はＥＭＰ経路を通じて異化されるグルコースの割合は、プロピオネート生成、アセテート生成、及びアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）生成に大きな影響を及ぼすことが示され、一般的には、より多くのグルコースがＨＭＰ経路を通る方向に向けられると、より多くのプロピオネートが製造でき、アセテート生成は低減する。しかしながら、このことは、ＡＴＰ生成が少なくなるという代償をもたらす。細菌はエネルギーのことを考えて自然にはこの経路を取らないが、ピルベートからアセテートへの酸化が遮断されると、強制的にそうせざるを得なくなる。
【００１２】
プロピオネートの収率は、ＨＭＰ経路で生成したＣＯ２をホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）カルボキシラーゼを通じてジカルボン酸経路に再取込みできると、さらに増強できる。同様に、酪酸発酵におけるアセテートの生成は、酸化還元平衡及びＡＴＰ生成に重要な役割を果たしているが、炭素フラックスをブチレート生成経路の方向に向け直すことによって削減できる。従って、アセテート形成経路における遺伝子を不活化することは、これらの嫌気発酵でプロピオネート及びブチレートの収率を増強するための実行可能な方法である。
【００１３】
組込み変異誘発技術(integrational mutagenesis technique)は、Ｃ．チロブチリカム及びＰ．アシディプロピオニシ(P. acidipropionici)のアセテートキナーゼ（ａｃｋ）及びホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）遺伝子を破壊するために開発された。Ｙ．Ｚｈｕ，Ｘ．Ｌｉｕ及びＳ．Ｔ．Ｙａｎｇ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｔａ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｅｔｅｄ  Ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ｆｏｒ  Ｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（酪酸発酵のためのクロストリジウム・チロブチリカムのｐｔａ遺伝子消失変異体の構築及び特徴付け），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９０：１５４−１６６（２００５）；Ｘ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｚｈｕ及びＳ．Ｔ．Ｙａｎｇ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｋ  Ｄｅｌｅｔｅｄ  Ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（増強された酪酸及び水素生成のためのクロストリジウム・チロブチリカムのａｃｋ消失変異体の構築及び特徴付け），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２２（５）：１２６５−１２７５（２００６）；並びにＳ．Ｓｕｗａｎｎａｋｈａｍ，Ｙ．Ｈｕａｎｇ及びＳ．Ｔ．Ｙａｎｇ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｋ  Ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ（増強されたプロピオン酸発酵のためのプロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシのａｃｋノックアウト変異体の構築及び特徴付け），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（２）：３８３−３９５（２００６）参照。ａｃｋ又はｐｔａ遺伝子フラグメントと抗生物質抵抗性カセットを含有する非複製組込みプラスミド構築物が細胞に導入され、染色体上の相同領域への該プラスミドの組込みの結果としてａｃｋ又はｐｔａの不活化が起きた。
【００１４】
その結果、ブチレート及びプロピオネートの最終濃度及び生産性は増加したが、細胞増殖速度は各変異体でそれらの野生型と比べて予想通り著しく減少した。最終生成物濃度はまだ約５０ｇ／Ｌ未満で、経済的な商業規模の回収及び精製の閾値に届かなかった。変異細菌の細胞増殖速度の減退も、従来式発酵法へのそれらの適用を制限することになろう。遺伝子のノックアウトで、各変異体のブチレート及びプロピオネートに対する細胞耐性は増大したが、アセテート生成は排除されなかった。
【００１５】
有機酸発酵における一つの主要な制限は、生成物阻害（細菌の低い酸耐性）によって引き起こされる最終生成物濃度の低さである。有毒な副産物に対する細胞耐性を如何に増強するかが多くの発酵法における主要課題であった。しかしながら、従来のプロピオン酸及び酪酸発酵に付随する低耐酸性を含むいくつかの問題は、細胞の固定化によって部分的に対処可能である。Ｙａｎｇによる米国特許第５，５６３，０６９号によれば、いくつかの有機酸発酵のための繊維床固定化細胞バイオリアクター（fibrous-bed immobilized-cell bioreactor,ＦＢＢ）が開発され、それによって生産性、収率、及び生成物濃度が改良された。
【００１６】
ＦＢＢを使用すると、従来の遊離細胞発酵法よりも２〜３倍高い最終生成物濃度が得られた。これは、ＦＢＢ中での高い細胞密度だけでなく、培養物が発酵生成物に対してより耐性があるように適応したことにもよる。繊維床バイオリアクターでの自発的適応及び変異を通じたこのプロセス工学的手法は、バイオマスから有機酸を工業生産するのに適した高い酸耐性及び発酵能力を有する変異株を得るための手段を提供する。ＦＢＢは、低増殖又は非増殖固定化細胞を用いて、プロピオネート及びブチレートを高発酵速度及び高収率で製造することも可能にする。Ｙ．Ｚｈｕ及びＳ．Ｔ．Ｙａｎｇ，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｆｉｂｒｏｕｓ−Ｂｅｄ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（代謝工学及び繊維床バイオリアクターでの適応から得られたクロストリジウム・チロブチリカムの変異体を用いた酪酸製造の増強），Ｂ．Ｃ．Ｓａｈａ（編），“Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．８６２，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （２００３），ｐｐ．５２−６６Ｙ；Ｚｈｕ，Ｚ．Ｗｕ及びＳ．Ｔ．Ｙａｎｇ，Ｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ  ｏｆ  Ｃｏｒｎ  Ｆｉｂｅｒ  ｂｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ｉｎ  ａ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｂｅｄ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（繊維床バイオリアクターでのクロストリジウム・チロブチリカムによるコーン繊維の酸加水分解物からの酪酸製造），Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：６５７−６６６（２００２）；Ｙ．Ｚｈｕ及びＳ．Ｔ．Ｙａｎｇ，Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  ａ  Ｆｉｂｒｏｕｓ−Ｂｅｄ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（繊維床バイオリアクターでの酪酸に対する増強された耐性のためのクロストリジウム・チロブチリカムの適応），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，１９：３６５−３７２（２００３）；並びにＳ．Ｓｕｗａｎｎａｋｈａｍ及びＳ．−Ｔ．Ｙａｎｇ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｆｉｂｒｏｕｓ−Ｂｅｄ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（繊維床バイオリアクターでの適応によって得られたプロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ変異体による増強されたプロピオン酸発酵），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９１：３２５−３３７．（２００５）参照。しかしながら、ここでも、最終生成物濃度はまだ約５０ｇ／Ｌ未満で、経済的な商業規模の回収及び精製の閾値に届かなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第５，５６３，０６９号
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Y. Zhu, X. Liu及びS.T. Yang, Biotechnol. Bioeng., 90:154-166 (2005)
【非特許文献２】X. Liu, Y. Zhu及びS.T. Yang, Biotechnol. Prog.,22(5):1265-1275 (2006)
【非特許文献３】S. Suwannakham, Y. Huang及びS.T. Yang, Biotechnol. Bioeng., 94(2): 383-395 (2006)
【非特許文献４】Y. Zhu及びS.T. Yang, Fermentation Biotechnology,”ACS Symposium Series No. 862, American Chemical Society (2003), pp. 52-66Y
【非特許文献５】Zhu, Z. Wu及びS.T. Yang, Process Biochemistry, 38:657-666 (2002)
【非特許文献６】Y. Zhu及びS.T. Yang, Biotechnol. Progress,19:365-372 (2003)
【非特許文献７】S. Suwannakham及びS.-T. Yang., Biotechnol. Bioeng., 91:325-337. (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
従って、有機酸の製造法、さらに詳しくは、酪酸、プロピオン酸、及び酢酸を、嫌気性細菌を用いた発酵によって、有機酸生成物の経済的な商業規模の回収及び精製を可能にする増殖速度、収率、及び生成物濃度で製造する方法を求める需要は依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の態様は、有機酸の製造法、さらに詳しくは、酪酸、プロピオン酸、及び酢酸を、嫌気性細菌を用いた発酵によって、有機酸生成物の経済的な商業規模の回収及び精製を可能にする増殖速度、収率、及び生成物濃度で製造する方法を提供することによってその需要を満足する。
【００２１】
一態様に従って、有機酸を製造するための発酵法を提供する。該方法は、ａｃｋ及びｐｔａ遺伝子の一つ又は両方を破壊された代謝工学的（に作製された）変異細菌を供給し、前記変異細菌を発酵性基質に暴露している間、前記変異細菌を固定化することによって、それらの酸耐性及びそれらの増殖速度が増大するように前記変異細菌を適応させ、そして前記適応変異細菌を約５０ｇ／Ｌを超える最終有機酸発酵生成物濃度を提供するのに足る時間発酵性基質にさらに暴露することを含む。
【００２２】
一態様において、変異細菌は、Ｃ．チロブチリカムＰＡＫ−Ｅｍを含み、有機酸発酵生成物は酪酸及び水素を含む。発酵性基質は糖又はその他の炭素基質を含む。好適な形態において、糖は、グルコース、フルクトース、キシロース、ラクトース、マルトース、スクロース、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる。炭素基質は、ラクテート及びグリセロールのような供給源から選ばれる。
【００２３】
別の態様において、変異細菌は、Ｃ．チロブチリカムＨｙｄＥｍを含み、有機酸発酵生成物は酪酸及び水素を含む。発酵性基質は糖を含む。
別の態様において、変異細菌は、Ｃ．チロブチリカムＰＰＴＡ−Ｅｍを含み、有機酸発酵生成物は酪酸及び水素を含む。発酵性基質は糖を含む。
【００２４】
さらに別の態様において、変異細菌は、Ｐ．アシディプロピオニシＡＣＫ−Ｔｅｔを含み、有機酸発酵生成物はプロピオン酸を含む。発酵性基質は糖を含む。あるいは、発酵性基質はグリセロールを含む。
【００２５】
なおさらに別の態様において、変異細菌は、Ｐ．アシディプロピオニシＴＡＴ−ＡＣＫ−Ｔｅｔを含み、有機酸発酵生成物はプロピオン酸を含む。発酵性基質は糖を含む。あるいは、発酵性基質はグリセロールを含む。
【００２６】
代謝工学及びプロセス工学技術の組合せを使用することにより、他の方法では従来達成不能だった増殖速度、生成物収率、及び最終生成物濃度で有機酸を製造する発酵法のための酸耐性細菌株が開発された。最終生成物濃度は、プロピオン酸及び酪酸を含む有機酸生成物の経済的回収及び精製に必要とされる閾値を上回っている。好適な態様において、８０ｇ／Ｌを超える最終生成物濃度が達成され、発酵ブロスからの経済的回収及び精製を可能にした。
【００２７】
代謝工学とプロセス工学のこの組合せは細菌株の酸耐性を劇的に増大する。これは、固定化された野生型細菌株のみを用いて又は遺伝子工学のみによって達成できることではなく、技術の組合せを用いてのみ、細菌株を発酵の有機酸生成物に対して極めて耐性を持つように繊維床バイオリアクターの刺激的環境中で方法論的に誘導することが可能となる。そのような結果は、当該技術分野の従来知識に基づいては予測不能である。
【００２８】
本発明の態様に従って、細菌細胞が繊維マトリックスに固定された繊維床バイオリアクター（ＦＢＢ）は、酢酸、プロピオン酸、及び酪酸を含む有機酸の製造に使用できる。リアクターの繊維マトリックスに固定化された細胞密度が高いと、従来の遊離細胞発酵法と比べて生産性、最終生成物濃度、及び生成物収率がすべて高くなる。代謝工学的株を繊維床リアクターに固定化することは、迅速に適応して阻害性発酵生成物に対して高い耐性を有する富化培養物を提供するための環境を細胞に提供することになる。この結果、発酵ブロス中の有機酸の経済的な回収及び精製が可能となる閾値レベルを超える最終生成物濃度の増加がもたらされる。
【００２９】
好適な態様では、代謝工学を利用して細菌におけるアセテート形成経路を少なくとも部分的に破壊し、クロストリジウム・チロブチリカム及びプロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ(Propionibacterium acidipropionici)による酪酸及びプロピオン酸生成をそれぞれさらに増強させる。細菌ゲノム上のアセテートキナーゼ（ａｃｋ）及び／又はホスホトランスアシラーゼ（ｐｔａ）遺伝子を部分的に不活化（すなわち破壊）して、細菌によるアセテート生成を削減する。変異の結果、Ｃ．チロブチリカムによる酪酸生成及びＰ．アシディプロピオニシによるプロピオン酸生成の増大がそれぞれもたらされる。
【００３０】
代謝工学的細菌株のアセテート及びエネルギー生成の低減による増殖速度の低下は、繊維床リアクターに工学的細胞を固定化してそれらを適応させ、細胞増殖速度を改良及び回復させて発酵性能を改良することによって対処される。繊維床バイオリアクターでの固定化による細菌株の自発的適応と変異は、糖及びその他のバイオマスから工業規模で酪酸及びプロピオン酸を含む有機酸を製造するのに適した変異株を得るための手段を提供する。代謝工学的変異細菌株の繊維床リアクターでの逐次適応は、バイオマスから有機酸を製造するための経済的及び効率的な方法を提供する。本発明の態様のこれら及びその他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、添付図面及び添付の特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１（先行技術）は、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシによるプロピオン酸発酵のためのジカルボン酸経路を示す。
【図２】図２（先行技術）は、クロストリジウム・チロブチリカムによる酪酸発酵のための代謝経路を示す。
【図３】図３は、Ｃ．チロブチリカムの野生型、変異体ＰＡＫ−Ｅｍ、及び変異体ＰＰＴＡ−Ｅｍの細胞増殖に及ぼす酪酸の阻害作用を示す相対増殖速度（％）対ブチレート濃度のチャートである。野生型と変異体間の比較を容易にするために、ここではブチレート濃度ゼロにおけるそれらの相対比増殖速度を１００％とした。
【図４】図４は、グルコースを基質とし、３７℃及びｐＨ６．３における繊維床リアクターでのＣ．チロブチリカム変異体ＰＡＫ−Ｅｍの固定化細胞による発酵に関する濃度（ｇ／Ｌ）対時間（ｈ）のチャートである。
【図５】図５は、グルコース及びフルクトースを含有するぶどうジュースを基質とし、３７℃及びｐＨ６．０におけるＣ．チロブチリカム変異体ＰＡＫ−Ｅｍの遊離細胞による発酵に関する濃度（ｇ／Ｌ）対時間（ｈ）のチャートである。
【図６】図６は、ｐＨ６．５、３２℃で繊維床リアクターに固定化されたＰ．アシディプロピオニシＡＣＫ−Ｔｅｔ細胞によるグルコースの長期プロピオン酸発酵に関する濃度（ｇ／Ｌ）対時間（ｈ）のチャートである。
【図７】図７は、ｐＨ６．５、３２℃での遊離細胞培養における各種Ｐ．アシディプロピオニシ株に関する相対比増殖速度対プロピオン酸濃度（ｇ／Ｌ）のチャートである。
【図８】図８は、ｐＨ７．０、３２℃でＦＢＢに固定化されたＰ．アシディプロピオニシＡＣＫ−Ｔｅｔ細胞によるグリセロールの長期プロピオン酸発酵に関する濃度（ｇ／Ｌ）対発酵時間（ｈ）のチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
クロストリジウム・チロブチリカムを含む多くの酪酸菌が、ラクテート及び炭水化物基質、例えばデンプン質及びリグノセルロース材料由来のグルコース及びキシロースから主要発酵生成物としてブチレート、アセテート、Ｈ２、及びＣＯ２を製造する。酪酸製造のための発酵法を改良するために、代謝工学とプロセス工学技術の逐次組合せを適用して、高い酸耐性とグルコース及びキシロースからより多量の酪酸及び水素を製造する能力とを有する変異細菌株を開発した。
【００３３】
クロストリジウム・チロブチリカムの代謝工学
図１に示すように、Ｃ．チロブチリカム及びＣ．アセトブチリカムにおけるブチレート及びアセテート生成の代謝経路は広く研究されている。一般に、グルコースはＥＭＰ（エムデン−マイヤーホフ−パルナス）経路を介して異化され、キシロースはＨＭＰ（ヘキソースモノホスフェート）経路を介して異化されてピルベートになる。次に、ピルベートは酸化されてアセチル−ＣｏＡ及び二酸化炭素になり、同時にフェレドキシン（Ｆｄ）はＦｄＨ２に還元される。これは次いでヒドロゲナーゼによって酸化されてＦｄになり、水素を生じてＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換する。アセチル−ＣｏＡは、ホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）及びアセテートキナーゼ（ＡＫ）によって触媒されるアセテート形成ブランチと、ホスホトランスブチリラーゼ（ＰＴＢ）及びブチレートキナーゼ（ＢＫ）によって触媒されるブチレート形成ブランチを分ける節点における重要な代謝中間体である。発酵におけるアセテート生成を削減するのが望ましい。そうすれば、それに応じてブチレートの生成が増加しうる。これは細菌のアセテート形成経路における遺伝子を不活化することによって可能である。
【００３４】
ＡＫをコードするａｃｋ遺伝子及びＰＴＡをコードするｐｔａ遺伝子は両方とも、大腸菌(Escherichia coli)、メタノサルシナ・サーモフィラ(Methanosarcina thermophila)、及びＣ．アセトブチリカムを含むいくつかの微生物からクローン化され、配列決定され、特徴付けされている。Ｃ．チロブチリカムにおけるａｃｋ及びｐｔａ遺伝子の部分ＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅によって以下のようにして得た。大腸菌、Ｃ．アセトブチリカム、及び枯草菌(B. subtilis)由来のクローン化ａｃｋ及びｐｔａ遺伝子の既知配列とＣ．チロブチリカムのコドン出現頻度嗜好(codon usage preference)を基にして合成オリゴヌクレオチドをＰＣＲ用プライマーとして設計した。ａｃｋ遺伝子用のＰＣＲプライマーの配列は、５’−ＧＡＴ  ＡＣ（Ａ／Ｔ）  ＧＣ（Ａ／Ｔ）  ＴＴ（Ｃ／Ｔ）  ＣＡ（Ｃ／Ｔ）  ＣＡ（Ａ／Ｇ）  ＡＣ−３’及び５’−（Ｇ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｇ）  ＴＴ（Ｃ／Ｔ）  ＴＣ（Ａ／Ｔ）  ＣＣ（Ａ／Ｔ）  ＡＴ（Ａ／Ｔ）  ＣＣ（Ａ／Ｔ）  ＣＣ−３’であった。ｐｔａ遺伝子用のプライマーの配列は、５’−ＧＡ（Ａ／Ｇ）  （Ｃ／Ｔ）Ｔ（Ａ／Ｔ／Ｇ）  ＡＧ（Ａ／Ｇ）  ＡＡ（Ａ／Ｇ）  ＣＡ（Ｔ／Ｃ）  ＡＡ（Ａ／Ｇ）  ＧＧ（Ａ／Ｔ）  ＡＴＧ  ＡＣ−３’及び５’−（Ａ／Ｔ）ＧＣ  ＣＴＧ  （Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）Ｃ  （Ａ／Ｔ）ＧＣ（Ａ／Ｔ／Ｃ）  ＧＴ（Ａ／Ｔ）  ＡＴ（Ａ／Ｔ）  ＧＣ−３’であった。Ｃ．チロブチリカムのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、及び設計されたオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて増幅をＤＮＡエンジンで実施し、予想サイズそれぞれ５６０ｂｐ及び７３０ｂｐのａｃｋ及びｐｔａのＤＮＡフラグメントを得た。次にこれらをＴＡクローニングを用いてＰＣＲベクターｐＣＲ２．１にクローニングし、それらの同一性を確認するために配列決定した。
【００３５】
次に、ｐｔａ又はａｃｋノックアウト変異体を創製するための組込み変異誘発で使用するために、部分ｐｔａ又はａｃｋ遺伝子を持つ非複製プラスミドを構築した。ａｃｋ及びｐｔａの部分遺伝子をそれぞれ含有するプラスミドｐＣＲ−ＡＫ（４．５ｋｂ）及びｐＣＲ−ＰＴＡ（４．６５ｋｂ）から１．５ｋｂのＳｐｈ  Ｉフラグメントを除去し、ベクターを再連結してｐＣＲ−ＡＫ１及びｐＣＲ−ＰＴＡ１を形成させた。Ｅｍｒカセットを含有する１．６ｋｂのＨｉｎｄ  IIIフラグメントをｐＤＧ６４７から取り出した後、Ｈｉｎｄ  III消化ｐＣＲ−ＡＫ１及びｐＣＲ−ＰＴＡ１に連結した。得られたプラスミドｐＡＫ−Ｅｍ（４．６ｋｂ）及びｐＰＴＡ−Ｅｍ（４．７５ｋｂ）を遺伝子不活化のための組込みプラスミドとして使用した。
【００３６】
プラスミドＤＮＡ（ｐＡＫ−Ｅｍ又はｐＰＴＡ−Ｅｍ）をエレクトロポレーションによってＣ．チロブチリカムに導入し、非複製プラスミドをそれらの染色体に組み込んだ変異細胞を、寒天プレート上での培養により、Ｅｍを選択圧として選別した。Ｃ．チロブチリカムへの組込みプラスミドの形質転換は嫌気性チャンバー内でＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅパルサーを用いて実施した。Ｃ．チロブチリカムのコンピテント細胞（外来ＤＮＡを取り込みうる状態になった細胞）は次のようにして調製した。一晩増殖後、後期対数増殖期にある５ｍｌの培養物を用いて、４０ｍＭのＤＬ−トレオニンを供給された４０ｍｌのＣＧＭに植菌した。細胞を４時間増殖させて〜０．８ＯＤ６００に達したら収穫し、２回洗浄して氷冷エレクトロポレーション用バッファー（ＳＭＰ；２７０ｍＭのスクロース、７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１ｍＭのＭｇＣｌ２）中に懸濁させた。０．５ｍｌの細胞懸濁液を０．４ｃｍのエレクトロポレーション用キュベットに入れて氷上で５分間冷却し、１０〜１５μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＡＫ−Ｅｍ又はｐＰＴＡ−Ｅｍ）を該懸濁液に加え、よく混合した。パルスの印加後（２．５ｋＶ、６００Ω、２５μＦ）、細胞を５ｍｌのＣＧＭに移し、３７℃で３時間インキュベートした後、４０μｇ／ｍｌのＥｍを含有するＲＣＭ上に蒔いた。
【００３７】
不活化ａｃｋ及びｐｔａをそれぞれ有する二つの変異体ＰＡＫ−Ｅｍ及びＰＰＴＡ−Ｅｍを得、これらの変異が酵素活性及び発酵動態に及ぼす効果を調べた。Ｃ．チロブチリカムの野生型、ＰＡＫ−Ｅｍ及びＰＰＴＡ−Ｅｍの指数期培養物を採取し、細胞抽出物をアセテート及びブチレート生成酵素（ＡＫ、ＰＴＡ、ＢＫ、ＰＴＢ）について検定した。ＰＡＫ−Ｅｍは野生型より５４％低いＡＫ活性及び約１３０％高いＰＴＡ活性を示した。しかしながら、ブチレート生成酵素の活性はＰＡＫ−Ｅｍと野生型でほぼ同じであった。ＰＰＴＡ−Ｅｍは、野生型と比べてわずか２０〜４０％のＡＫ及びＰＴＡ活性、１３５％のＢＫ活性、及び類似のＰＴＢ活性を有していた。
【００３８】
Ｃ．チロブチリカムの野生型、ＰＡＫ−Ｅｍ及びＰＰＴＡ−Ｅｍの遊離細胞をそれぞれ用いたバッチ及び流加バッチ(fed-batch)発酵を、５Ｌの撹拌タンク発酵槽で、グルコース（３０ｇ／Ｌ）及び４０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｅｍ）を含有するクロストリジウム増殖培地中で実施し、発酵動態に及ぼすａｃｋ／ｐｔａノックアウト変異の効果を調べた。嫌気性は最初に培地に窒素を散布することによって達成した。培地ｐＨを６ＮのＨＣｌで〜６．０に調整した後、血清ボトル中に調製された〜１００ｍｌの細胞懸濁液を植菌した。実験は、３７℃、１５０ｒｐｍ、及びＮＨ４ＯＨ又はＮａＯＨのいずれかの添加によって制御されたｐＨ６．０で実施した。流加バッチモードは、発酵ブロス中の糖のレベルがゼロに近づいたら濃縮基質溶液をパルス供給することによって運転した。供給は、発酵が生成物阻害のためにブチレートを生成しなくなるまで続けた。ガス（Ｈ２及びＣＯ２）生成を自動計測するためにＭｉｃｒｏ−ｏｘｙｍａｘガス分析システムを発酵槽に接続した。発酵ブロスからのサンプルを、細胞密度は光学濃度（ＯＤ）測定によって、グルコース及び酸生成物濃度は高速液体クロマトグラフの使用によって分析した。結果を用いて比増殖速度（μ）及び生成物収率を推定し、以下の表に野生型と二つの変異体の比較を示す。
【００３９】
【表１】
2011524749.tif 000002
【００４０】
表１から分かるように、二つの変異体は野生型よりはるかに緩慢な増殖であったが、より多くの酪酸を生成し、〜４３ｇ／Ｌという高い最終濃度に達した。これは野生型の発酵で得られたものより〜５０％高かった。しかしながら、ｐｔａ又はａｃｋ遺伝子の不活化は発酵におけるアセテート生成を著しく削減したわけではなく、アセテート形成に至る他の酵素（又は経路）の存在を示唆していた。それでも、二つの変異体は、発酵生成物における増大したブチレートの対アセテート比から示されるように、アセテート生成に優るブチレート生成の高い選択性を示していた。ブチレートの対アセテート比の増加は、ａｃｋ及びｐｔａの欠失によってより多くの炭素フラックスがブチレート生成方向にシフトし、より高いブチレートの生産性及び収率につながったことを示唆していた。ａｃｋ欠失変異体ＰＡＫ−Ｅｍは、ブチレート収率を野生型の３４％から４７％に増大させた。思いがけず、ＰＡＫ−Ｅｍ変異体はグルコースから野生型より５０％多い水素（０．０２４ｇ／ｇ）も産生した。ｐｔａ欠失変異体ＰＰＴＡ−Ｅｍも、野生型より高いブチレート収率を有していたが、水素収率はわずかに低かった。
【００４１】
組込みプラスミドの使用によるａｃｋ又はｐｔａ遺伝子の不活化は、対応酵素の活性が野生型と比べて５０％以上削減されたのに、アセテート形成を排除又は著しく削減したわけではなかった。ブチレート生成酵素ＰＴＢ及びＢＫのような他の酵素が、発酵中の変異Ｃ．チロブチリカムの何らかのアセテート形成に関与した可能性はある。二つの変異体の比増殖速度は野生型と比べて約３２％低下し、アセテート生成経路を通る炭素フラックスの減少が、代謝される基質１モルあたりのＡＴＰ生成の減少により、細胞に代謝負荷をかけたことを示していた。ブチレート形成経路を通る炭素フラックスの増加が、この経路も炭素基質１モル当たり多少のＡＴＰを生成するので問題を緩和するが、障害されたアセテート経路で失われたすべてのＡＴＰを補えるわけではない。結果として、変異体は野生型よりはるかに緩慢にしか増殖しなかった。細胞増殖速度の減退は、これらの変異体を酪酸製造のための工業的発酵に適用するのを制限するであろう。
【００４２】
どちらの変異体も、野生型より〜５０％高いという高い最終ブチレート濃度によって示されているように、ブチレート阻害に対してかなり高い耐性を示した。増強されたブチレート耐性も、発酵における高いブチレート生産性に寄与した。Ｃ．チロブチリカムのＰＴＡは、ＰＴＢよりも酪酸によって強く阻害されることが分かった。ブチレート感受性ＰＴＡとアセテート形成経路を破壊したことが変異体をブチレート阻害に対して低感受性にした可能性はある。なぜならば、変異体は、生合成及び細胞膜内外の機能的ｐＨ勾配の維持に必要なＡＴＰを生成するのに主としてブチレート形成経路を使用したからである。変異体を用いた発酵における最終酪酸濃度は〜４３ｇ／Ｌに到達しうるが、生成物回収と精製のためのエネルギーコストはこの濃度レベルではまだ高いであろう。一般に、有機酸発酵法が石油化学合成法と経済的に競合するためには、少なくとも５０ｇ／Ｌ以上の生成物濃度が必要とされる。
【００４３】
繊維床バイオリアクターでの培養物の適応と発酵
細胞を実験室規模の繊維床バイオリアクター（ＦＢＢ）中で培養した。これはガラスのカラム製で、螺旋状に巻き付けた木綿のタオルを詰めたものであった。該リアクターは４８０ｍｌの作業容積を有し、５Ｌの撹拌タンク発酵槽に再循環ループを通じて接続され、良く混合された条件下でｐＨと温度を調節して運転された。嫌気性は最初に発酵槽の培地にＮ２を散布することによって維持され、その後発酵槽のヘッドスペースは全部の発酵運転中５ｐｓｉｇのＮ２下に維持された。２Ｌの培地を含有するリアクターは３７℃に維持され、１５０ｒｐｍで撹拌され、ＮＨ４ＯＨ又はＮａＯＨの添加によってｐＨ６．０に制御された。発酵を開始するために、血清ボトル中の細胞懸濁液〜１００ｍｌを発酵槽に植菌し、細胞濃度が〜４．０の光学濃度（ＯＤ）に達するまで３日間増殖させた。次に、細胞の固定化は、発酵ブロスをポンプ速度〜２５ｍｌ／分で繊維床中に循環させ、細胞を繊維マトリックス上に付着及び固定化させることによって実施した。約３６〜４８時間の連続循環後、大部分の細胞は固定化し、培地中の細胞密度に変化が確認できなくなった。次に、培地循環速度を〜１００ｍｌ／分に上げ、リアクターを反復バッチモードで運転して繊維床中の細胞密度を安定な高レベル（＞５０ｇ／Ｌ）に増大させた。培養物を高いブチレート濃度に耐性を持つように適応させるために、今度はリアクターを流加バッチ(fed-batch)モードで運転した。すなわち、発酵ブロス中の糖レベルがゼロに近づいたらいつでも濃縮基質溶液をパルス供給するというモードである。供給は、発酵が生成物阻害のためにブチレートの生成を止めるまで続けた。サンプルを、細胞、基質及び生成物濃度について分析した。流加バッチ実験の終了時、ＦＢＢ中の固定化細胞を繊維マトリックスから洗い落とすことによって採取し、４℃で貯蔵した。
【００４４】
流加バッチ発酵は、細菌培養物をより高いブチレート濃度に適応させ、発酵で製造できる最大酪酸濃度を評価するために実施された。この研究にはＣ．チロブチリカム  ＡＴＣＣ２５７５５（野生型）を使用した。遊離細胞を用いた対照実験も比較目的のために実施した。表２に、遊離細胞及び固定化細胞によるｐＨ６．０でのグルコース及びキシロースからの酪酸生成の発酵動態をそれぞれ比較した。遊離細胞発酵と比べて、ＦＢＢ中での固定化細胞発酵は、速いというだけでなく、より多くのブチレートをかなり高い最終濃度で生成した。遊離細胞発酵で生成した最高酪酸濃度はわずか〜１９ｇ／Ｌであったが、固定化細胞発酵では酪酸は〜４０ｇ／Ｌの濃度に達した。固定化細胞発酵でのグルコース及びキシロースからのブチレート収率も、遊離細胞発酵のものよりはるかに高かった。しかしながら、固定化細胞発酵ではより多くのアセテートも生成した。酢酸と酪酸の同時生成は、発酵ブロスからの酪酸の分離及び精製を複雑にしうる。そこで、ＦＢＢでの固定化細胞発酵におけるアセテート生成を削減するのが望ましい。アセテート生成の削減は、下流における加工を容易にできるだけでなく、ブチレート生成及び糖からの収率も増大できる。
【００４５】
【表２】
2011524749.tif 000003
【００４６】
酪酸は細胞増殖を阻害することが知られている。ＦＢＢ由来の適応培養物の比増殖速度は、元の培養物と比べてはるかに高く、ブチレート濃度上昇に対する感受性が低く、ブチレートに対する高い耐性を示した。適応細胞は、ブチレート濃度がゼロから３０ｇ／Ｌに上昇しても５０％を超える増殖能力を保持していたが、元の培養物はブチレート濃度が２０ｇ／Ｌを超えると増殖能力を失った。細胞増殖に及ぼすブチレートの影響は、以下の非競合的生成物阻害モデルによって説明できる。
【００４７】
【数１】
2011524749.tif 000004
【００４８】
式中、μは比増殖速度（ｈ−１）、μｍａｘは最大増殖速度、Ｋｐは阻害速度定数（ｇ／Ｌ）、Ｐは生成物（酪酸）濃度（ｇ／Ｌ）である。速度定数μｍａｘ及びＫｐは、１／μ対Ｐの線形プロットから決定できる。元の培養物と比べて、適応培養物は、高いμｍａｘを有していただけでなく（０．２９８ｈ−１対０．１２７ｈ−１）、かなり高いＫｐ値も有していた（５３．８９ｇ／Ｌ対１．８７ｇ／Ｌ）。Ｋｐの２９倍の増加は、ＦＢＢ由来の適応培養物がブチレート阻害に対して元の野生型ほど感受性がないことを示している。ＦＢＢで適応された培養物の生成物阻害に対する増殖耐性の増大は、アセテートを生成するＣ．フォルミコアセチカム(C. formicoaceticum)及びプロピオン酸を生成するＰ．アシディプロピオニシなどの異なる微生物を用いた他の研究でも観察された。
【００４９】
ＦＢＢ由来の適応培養物は、バイオリアクターへの播種に使用された元の培養物とは生理学的に異なる。繊維床バイオリアクター（ＦＢＢ）に固定化することにより、グルコース及びキシロースから高濃度のブチレートを製造できるＣ．チロブチリカムの酸耐性株の適応と選別の成功が短期間で達成された。この変異体は高いブチレート濃度（＞３０ｇ／Ｌ）下で良く増殖し、バイオリアクターへの播種に使用された野生型株と比べて良好な発酵能力を有していた。細胞増殖、酸形成酵素、及びＡＴＰアーゼ活性に及ぼすブチレート阻害の動態分析から、ＦＢＢ由来の適応細胞は元の野生型とは生理学的に異なっていることが分かった。野生型と比べて、適応培養物の最大比増殖速度は２．３倍増大し、ブチレート阻害に対するその増殖耐性は２９倍増大した（Ｋｐ値に基づく）。ブチレート形成経路における主要酵素であるホスホトランスブチリラーゼ（ＰＴＢ）及びブチレートキナーゼ（ＢＫ）も変異体では活性が高く、１７５％高いＰＴＢ活性及び１４６％高いＢＫ活性であった。また、変異体のＡＴＰアーゼは、阻害速度定数の４倍の増加によって示されるように、酪酸による阻害に対して低感受性であり、酵素阻害剤Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣＤ）に対して高抵抗性であった。ブチレート阻害に対するＡＴＰアーゼの感受性の低さは、ブチレート阻害に対する増殖耐性の増大に寄与していると思われる。このことは、膜のリン脂質中の飽和脂肪酸のパーセンテージの高さにも起因しているのであろう（変異体７４％対野生型６９％）。この研究から、ＦＢＢでの細胞固定化は、阻害性発酵生成物に対する高い耐性を有する変異体のプロセス内適応及び選別のための効果的な手段を提供したことが示された。
【００５０】
しかしながら、Ｃ．チロブチリカム野生型を用いたＦＢＢ発酵で生成した最終酪酸濃度は、発酵で製造される有機酸の経済的回収及び精製に通常必要とされる閾値レベルの５０ｇ／Ｌにまだ満たなかった。そこで、次の実験シリーズは、５０ｇ／Ｌより高い濃度と高い生成物収率及び生産性で経済的にブチレートを製造するのに使用できる極めて酸耐性の変異体の開発に的を絞った。
【００５１】
繊維床バイオリアクターに固定されたＰＰＴＡ−Ｅｍ及びＰＡＫ−Ｅｍ変異体を用いて酪酸発酵を実施した。表３及び４から分かるように、グルコース及びキシロースからの酪酸生成は、遊離細胞発酵よりも著しく改良され、これらの流加バッチ発酵における最終酪酸濃度は〜５０ｇ／Ｌに達し、ブチレート収率も〜０．４５ｇ／ｇに増大した。改良された発酵性能は、最終ブチレート濃度〜４０ｇ／Ｌ及びブチレート収率〜０．４２ｇ／ｇ（表２参照）をもたらした野生型のＦＢＢ発酵で得られたものより良好であった。ＰＰＴＡ−Ｅｍの固定化細胞の比較的低い比増殖速度は、ＦＢＢ環境における高い細胞密度による増殖阻害に起因している可能性がある。
【００５２】
【表３】
2011524749.tif 000005
【００５３】
【表４】
2011524749.tif 000006
【００５４】
ａｃｋ欠失Ｃ．チロブチリカム変異体ＰＡＫ−Ｅｍを用いたすべての発酵で、酪酸生成の増加に加えてより多くの水素生成も観察された。ＰＡＫ−Ｅｍは、野生型及びＰＰＴＡ−Ｅｍを用いたものと比べてかなり高い水素生成を示した。この変異体がなぜ有益なバイオ燃料である水素も多く製造できるのかは不明である。ＰＡＫ−Ｅｍを用いた発酵によって様々な糖源から酪酸と水素の両方を製造する可能性を様々なｐＨ値でさらに評価し、結果を表５にまとめた。
【００５５】
予想通り、グルコースからの酪酸生成はｐＨによって顕著な影響を受けた。酪酸生成はｐＨ６．０で５０．１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０で６１．５ｇ／Ｌ、そしてｐＨ５．０ではわずかに１４．８ｇ／Ｌであった。ｐＨ５．０における低い酪酸生成は、低いｐＨ値でのより強い酪酸阻害によるものであった。ｐＨ６．０よりｐＨ７．０のほうが酪酸濃度が高いことも、高いｐＨではより多くの酪酸が解離形で存在し、細胞増殖に対してあまり阻害的でないので、想定の範囲内である。驚くべきことに、８０．２ｇ／Ｌという非常に高い酪酸濃度が発酵ｐＨを６．０から６．３にわずかに増加させると達成された（図４参照）。通常、そのように小さいｐＨ差でこのように大きい改良が得られるとは誰も想像しないであろう。しかしながら、ｐＨ及び高いブチレート濃度は生成物収率には著しい影響は及ぼさず、試験したすべてのｐＨ値で、酪酸の場合、約０．４４±０．０２ｇ／ｇ、酢酸の場合、約０．０７±０．０１ｇ／ｇであった。水素生成はｐＨの増加に伴ってわずかに増加しているようで、水素収率は、ｐＨ５．０の０．０２２ｇ／ｇ〜ｐＨ７．０の０．０２７ｇ／ｇの範囲であった。高いｐＨ値で観察された低いＣＯ２生成は、高いｐＨ値を有する培地ではＣＯ２の溶解度が高くなることによるものである。
【００５６】
【表５】
2011524749.tif 000007
【００５７】
しかしながら、基質としてキシロースを用いたＦＢＢ発酵では、ｐＨは様々な代謝産物の生成に顕著な影響を及ぼさない。ｐＨ５．０では、ＰＡＫ−Ｅｍ変異体は酪酸しか生成しないが、野生型は多量のアセテート（０．４３ｇ／ｇキシロース）及びラクテート（０．６１ｇ／ｇキシロース）及び少量のブチレート（０．０５ｇ／ｇキシロース）を生成した。この結果から、ＰＡＫ−Ｅｍは５．０という低いｐＨ値でも良好なブチレート生成菌と言えるが、野生型は、低いｐＨによってブチレート生成から離れる劇的な代謝経路シフトが起こるようなので、そうとは言えないだろう。
【００５８】
【表６】
2011524749.tif 000008
【００５９】
先に述べたように、ａｃｋ又はｐｔａ遺伝子をノックアウトした変異の一つの弊害は、アセテート形成経路の障害によって引き起こされる基質１モルあたりのＡＴＰ生成の減少による細胞増殖速度の顕著な減退である。しかしながら、ＰＡＫ−ＥｍをＦＢＢで長期間培養後、ＦＢＢから単離された一つの適応変異体（ＨｙｄＥｍ）は、野生型に匹敵する比増殖速度を示したが、依然として野生型及びその親株ＰＡＫ−Ｅｍよりもはるかに多くのブチレート及び水素を生成できる（表７参照）。このＨｙｄＥｍ変異体を得るための手順は次の通りである。ＦＢＢ中のＰＡＫ−Ｅｍ細胞を、６回の流加バッチ発酵による適応後に採取した。適応細胞を繊維マトリックスから高圧下で洗い落とした後、寒天プレート上で培養し、高い増殖速度を有するコロニーを単離した。一つの適応変異体ＨｙｄＥｍを選別し、グルコースを基質としたｐＨ６．０及び３７℃での遊離細胞発酵で特徴付けした。表７から分かるように、この変異体の比増殖速度（０．２１ｈ−１）は親株のＰＡＫ−Ｅｍ（０．１４ｈ−１）よりはるかに速く、野生型のと類似していた。ＨｙｄＥｍの遊離細胞発酵における細胞密度（ＯＤ６００＝１１．５）は、ＰＡＫ−Ｅｍ（ＯＤ６００＝４．４）及び野生型（ＯＤ６００＝７．１）よりはるかに高かった。ＨｙｄＥｍのバイオマス収率（０．１４ｇ／ｇ）も、野生型（０．１０ｇ／ｇ）及びＰＡＫ−Ｅｍ（０．０６４ｇ／ｇ）より高かった。その上、この変異体による水素生成も著しく改良され、かなり高い水素収率（０．０４ｇ／ｇ対０．２４ｇ／ｇ）及び高いＨ２／ＣＯ２比（２．６９対１．４４）を有していた。この結果は現在の知識からは予測不能で、増大した水素生成と細胞増殖を一緒にできることを示唆している。
【００６０】
【表７】
2011524749.tif 000009
【００６１】
ＰＡＫ−Ｅｍにおけるａｃｋ遺伝子の破壊は、ＰＡＴ−ＡＫ経路を通る炭素フラックスを減少させたため、細胞は、失われたエネルギー生成のいくらかを取り戻し、酸化還元電位のバランスを取るために、やむなく水素生成を増大させた。従って、ａｃｋ欠失変異体は、良好な増殖速度を維持するためにより多くの水素を産生しなければならないのであろう。このことは、ＦＢＢ適応変異体ＨｙｄＥｍから観察された高い増殖速度及び水素生成を良く裏付けていた。このＨｙｄＥｍ変異体は、その比較的速い増殖速度及び高い生成物収率及び酸耐性のために、バイオマスからブチレート及び水素を製造する最大の可能性を有している。明らかに、代謝工学的に作製され環境適応されたＣ．チロブチリカム変異株を使用する発酵は、野生型及び単に遺伝子工学又は環境適応だけからこの二つの適切な逐次組合せをせずに誘導された変異株に優る利点を有しているであろう。これらの実験は、明らかに、標的遺伝子の合理的な代謝工学は多少の好結果をもたらしうるが、発酵に関与する不明かつ複雑な経路のために、予期せぬ結果をもたらすことも多いことを示している。
【００６２】
要約すると、アセテートキナーゼ及びホスホトランスアセチラーゼをそれぞれコードするａｃｋ及びｐｔａ遺伝子を不活化したクロストリジウム・チロブチリカム変異体ＰＡＫ−Ｅｍ及びＰＰＴＡ−Ｅｍを組込み変異誘発から得、ＦＢＢ発酵に使用して、グルコース及びキシロースを含む糖から高濃度及び高収率の酪酸及び水素を製造することができる。ＰＡＫ−Ｅｍ変異体は、水素生成の多い良好な変異体で、この株の適応変異体（ＨｙｄＥｍ）は遊離細胞発酵条件下で良好な増殖速度を示した。ＰＡＫ−Ｅｍを用いたｐＨ６．３でのＦＢＢ発酵は、酪酸発酵でこれまでに報告された最高の酪酸濃度を達成した。以前のベストの結果は、スクロースから６２．８ｇ／Ｌ、キシロースから５７．９ｇ／Ｌ、及びグルコースから５０．１ｇ／Ｌであった。発酵から得られる高い酪酸濃度は、通常総生産コストの５０％超を占める生成物の回収及び精製コストを著しく削減することになるだろう。
【００６３】
前述のすべての発酵実験は基質として純粋なグルコース又はキシロースのいずれかを使用したが、食品加工廃棄物及びリグノセルロース系加水分解物中に存在する糖も、開示された発酵法を用いることによって酪酸及び水素に容易に変換できる。例えば、ワイン製造からの廃棄ぶどうジュース中に存在する糖（グルコース及びフルクトース）が発酵基質として使用でき、これらの糖からｐＨ６．０及び３７℃での遊離細胞発酵で、〜４０ｇ／Ｌの酪酸が高い酪酸収率（０．４２ｇ／ｇ）及び水素収率（〜０．０２４ｇ／ｇ）で製造された（図５参照）。
【００６４】
プロピオン酸発酵
プロピオン酸発酵は、５Ｌの発酵槽に再循環ループを通じて接続された繊維床バイオリアクター（ＦＢＢ）中に固定化された細胞を用い、ｐＨと温度制御された良く混合された条件下で運転することによって実施した。ＦＢＢは、ガラスカラムのバイオリアクター内に螺旋状に巻き付けた木綿のタオルを詰めることによって構築され、〜６９０ｍＬの作業容積を有していた。〜１００ｍＬの細胞懸濁液（ＯＤ６００〜２．０）を発酵槽に植菌後、細胞を３〜４日間増殖させて〜３．５の光学濃度（ＯＤ６００）に到達させた。次に発酵ブロスを流速〜３０ｍＬ／分でＦＢＢ中に循環させ、細胞を繊維マトリックスに付着及び固定化させた。このプロセスをほとんどの細胞がＦＢＢ中に固定化されるまで６０〜７２時間続けた。次に、培地循環速度を〜８０ｍＬ／分に上げ、発酵を反復バッチモードで運転して繊維床における高い細胞密度を得た。次に、濃縮グルコース溶液のパルス添加を伴う流加バッチ発酵を実施して発酵動態を研究し、到達可能な最大プロピオン酸濃度を評価した。流加バッチ終了時、ＦＢＢ中の適応細胞（変異体）を繊維マトリックスから、該マトリックスを無菌蒸留水中でをかき回すことによって取り出した。
【００６５】
遊離細胞懸濁培養の場合と、繊維床バイオリアクター（ＦＢＢ）中に固定された場合のＰ．アシディプロピオニシＡＴＣＣ４８７５によるグルコースの流加バッチ発酵について調べた。後者の方がはるかに高いプロピオン酸濃度を生成し（〜７２ｇ／Ｌ対〜５２ｇ／Ｌ）、ＦＢＢ中で適応された細胞による増強されたプロピオン酸阻害耐性を示した。遊離細胞発酵と比べて、ＦＢＢ培養物はグルコースから２０％〜５９％多くのプロピオネート（０．４０〜０．６５ｇ／ｇ対０．４１ｇ／ｇ）、１７％少ないアセテート（０．１０ｇ／ｇ対０．１２ｇ／ｇ）、及び５０％少ないスクシネート（０．０９ｇ／ｇ対０．１８ｇ／ｇ）を産生した。ＦＢＢにおける高いプロピオネート生成は、ピルベートからプロピオン酸生成をもたらす二つの重要酵素、オキサロアセテートトランスカルボキシラーゼ及びプロピオニルＣｏＡ：スクシニルＣｏＡトランスフェラーゼの変異によるものであった。両方とも野生型より変異体で高い比活性及び低いプロピオン酸阻害感受性を示していた。これに対し、ＰＥＰを直接オキサロアセテートに変換し、グルコースからスクシネートの生成をもたらすＰＥＰカルボキシラーゼの活性は、一般的に変異体の方が野生型より低かった。しかしながら、アセテート形成経路におけるホスホトランスアセチラーゼ及びアセテートキナーゼに関しては、変異体と野生型の間に顕著な差はなかった。さらに、変異体はその形態に顕著な変化があった。長さが３倍増加し、直径が〜２４％減少した変異体細胞は〜１０％高い比表面積を有していた。このことは、基質及び代謝産物の細胞膜を横断する輸送において変異体をより効率的にしたはずである。変異体に見られるわずかに低い膜結合ＡＴＰアーゼ活性も、変異体が、プロピオン酸に良く耐えることを可能にするより効率的なプロトンポンプを有しているであろうことを示していた。さらに、変異体は、多くの長鎖飽和脂肪酸（Ｃ１７：０）と少ない不飽和脂肪酸（Ｃ１８：１）を有しており、このどちらも膜の流動性を低減しうるので、これもプロピオネート耐性の増大に寄与しているのであろう。このように、Ｐ．アシディプロピオニシによるグルコースからの増強されたプロピオン酸生成は、リアクター内に維持された高い生存細胞密度と、ＦＢＢ中での細胞固定化による適応の結果の好ましい変異とによるものであった。
【００６６】
プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシは、グルコースからプロピオン酸を、副産物として酢酸、コハク酸、及びＣＯ２と共に産生する。プロピオン酸発酵におけるアセテート形成低減法として、アセテートキナーゼ（ＡＫ）をコードするａｃｋ遺伝子の、遺伝子破壊及び組込み変異誘発による不活化を使用した。Ｐ．アシディプロピオニシの〜７５０ｂｐの部分ａｃｋ遺伝子を、縮重プライマー(degenerate primer)を用いたＰＣＲベースの方法を用いてクローン化し、配列決定した。推定アミノ酸配列は、枯草菌(Bacillus subtilis)由来のＡＫのアミノ酸配列と８８％の相同性及び７６％の同一性を有していた。その部分ａｃｋ遺伝子を用いて、挿入テトラサイクリン耐性カセットを有する線状ＤＮＡフラグメント、及びテトラサイクリン耐性遺伝子カセットを含有する非複製組込みプラスミドを次のように構築した。
【００６７】
破壊ａｃｋ遺伝子を有する線状ＤＮＡフラグメントは、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔｒ）カセットを、Ｐ．アシディプロピオニシから得た部分ａｃｋ配列の中間に挿入することによって構築した。７５０ｂｐのａｃｋフラグメントをまずｐＮｏＴＡ／Ｔ７（クローニングベクター、２．７ｋｂ）にクローン化し、ｐＡＣＫ（３．５ｋｂ）を得た。次に、ＴｅｔｒカセットをＸｍａIII部位に挿入した。この付着末端は、ＴｅｔｒカセットをｐＢＥＳＴ３０９から切り離すのに使用された部位ＮｏｔＩのそれと相補的であった。ｐＡＣＫ−Ｔｅｔ（５．４ｋｂ）は、Ｔｅｔｒカセットと、部分ａｃｋフラグメントを含有するＸｍａIII切断ｐＡＣＫプラスミドとを連結することによって得た。Ｔｅｔｒカセットの挿入で、４００ｂｐ及び３５０ｂｐのａｃｋフラグメントが挿入カセットの各端に配置されることになった。一般的に使用されている制限酵素は、無傷のＡＣＫ−Ｔｅｔ配列をｐＡＣＫ−Ｔｅｔから切り離すのに使用できなかった。ｐＡＣＫ−Ｔｅｔは、無傷ＡＣＫ−Ｔｅｔ配列末端に位置する二つのＥｃｏＲＩ部位と、無傷配列の内部に位置する一つのＥｃｏＲＩ部位を有していた。そこで、ＥｃｏＲＩによる部分消化を実施して、内部のＥｃｏＲＩ部位をノックオフし（これは内部制限部位から数個のＤＮＡ塩基対を除去することによって実施した）、そしてＤＮＡフラグメントを再連結した。この改変は、Ｔｅｔｒカセットの末端に近い位置で行われたが、遺伝子機能に何ら悪影響は及ぼさなかった。次に、得られたプラスミドｐＬＡＴ４−ｄＥ１３（５．４ｋｂ）をＥｃｏＲＩで消化し、〜２．７ｋｂのサイズを有する線状ＡＣＫ−Ｔｅｔ  ＤＮＡフラグメントを切り離した。次に、線状ＡＣＫ−Ｔｅｔを使用してＰ．アシディプロピオニシを形質転換し、複交配変異体を得た。
【００６８】
部分ａｃｋ遺伝子とＴｅｔｒカセットを含有する非複製組込みプラスミドｐＴＡＴの構築は次のようにして行った。〜５００ｂｐ（塩基２５７から塩基７４９まで）の部分ａｃｋ遺伝子を、７５０ｂｐのａｃｋフラグメントのＢａｍＨＩ消化によって得た。該フラグメントは、塩基２５７の位置に一つのＢａｍＨＩ制限部位及び７５０ｂｐフラグメントの末端付近に別の部位を有していた。ｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結するためのＡ’−オーバーハングを有する平滑末端を創製するために、５００ｂｐの部分ａｃｋフラグメントの両端をまずＫｌｅｎｏｗによりｄＮＴＰｓで埋めて平滑末端を創製し、次いでシュリンプアルカリホスファターゼ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）によって脱リン酸化して５’末端のホスフェート基を除去し、最後にＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってｄＡＴＰを付加して二つの平滑末端にＡ’−オーバーハングを創製した。次に、改変された部分ａｃｋフラグメントをｐＣＲ（登録商標）２．１−ＴＯＰＯ（３．９ｋｂ）にクローン化し、ｐＴＯＰＯＡＣＫ１（４．４ｋｂ）を得た。ＸｂａＩ及びＡｐａＩによる消化によってｐＤＧ１５１５から得られた２．１ｋｂのＴｅｔｒカセットをＸｂａＩ−ＡｐａＩ−消化ｐＴＯＰＯＡＣＫ１に連結した。次に、得られた組込みプラスミドｐＴＡＴ（６．５ｋｂ）を用いてＰ．アシディプロピオニシを形質転換した。
【００６９】
これらのＤＮＡ構築物をエレクトロポレーションによってＰ．アシディプロピオニシに導入後、二つの変異体ＡＣＫ−Ｔｅｔ及びＴＡＴ−ＡＣＫ−Ｔｅｔを得た。サザンハイブリダイゼーションによって、変異体ＡＣＫ−Ｔｅｔ中のａｃｋ遺伝子は挿入されたテトラサイクリン耐性遺伝子によって破壊されていることが確認された。野生型と比べて、ＡＫの活性は、ＡＣＫ−Ｔｅｔ及びＴＡＴ−ＡＣＫ−Ｔｅｔ変異体でそれぞれ２６％及び４３％低下していた。これらの変異体の比増殖速度は、おそらくはアセテート及びＡＰ生成の削減のために、〜２５％減って０．１０ｈ−１になっていた（野生型０．１３ｈ−１）。両変異体ともグルコースから〜１４％少ないアセテートしか産生しなかった。ａｃｋの破壊だけではアセテート生成は完全に排除されなかったが、プロピオネートの収率は〜１３％増加した。
【００７０】
代謝経路に対して実施した遺伝子操作は、Ｐ．アシディプロピオニシにおけるプロピオン酸及び酢酸生成に影響を及ぼした。非工学的株と比べて、アセテート形成経路に関連するａｃｋ遺伝子を部分的に不活化された変異体（ＡＣＫ−Ｔｅｔ及びＴＡＴ−ＡＣＫ−Ｔｅｔ）は、バッチ発酵では増殖が遅かったが、糖からより多くのプロピオン酸と少ない酢酸を産生した。そこで、さらに高い最終プロピオン酸濃度及び極めてプロピオン酸耐性の変異株を得るために、ＡＣＫ−Ｔｅｔ変異体をＦＢＢ系に適応させようとする試みを行った。図６に示されているように、バイオリアクター内のプロピオネート濃度を徐々に増加させながら６ヶ月間の連続発酵の後、発酵ブロス中の最終プロピオン酸濃度は１０４ｇ／Ｌに達した。これは、ＦＢＢにおいて野生型株で以前に達成された最高濃度（〜７２ｇ／Ｌ）より４３％高かった。この発酵でのかなり高いプロピオン酸生成は、ＦＢＢで適応された変異株によるプロピオン酸耐性の増大の結果であった。耐性は１０倍以上増大した（図７及び表８参照）。
【００７１】
図７に、様々な初期プロピオン酸濃度（０〜２０ｇ／Ｌ）における野生型、ＦＢＢ適応野生型、ＡＣＫ−Ｔｅｔ、及びＦＢＢ適応ＡＣＫ−Ｔｅｔの比増殖速度を比較した。この図から分かるように、比増殖速度は、プロピオン酸の存在下、それが２０ｇ／Ｌに増大するにつれて急速に低下した。細胞に対するプロピオン酸の強力な阻害の結果である。しかしながら、適応ＡＣＫ−Ｔｅｔはプロピオン酸阻害に対してはるかに低感受性であった。２０ｇ／Ｌのプロピオン酸で、適応ＡＣＫ−Ｔｅｔは、０ｇ／Ｌのプロピオン酸時の比増殖速度の約７５％を保持していた。これに対し、野生型は同一条件下でその増殖速度の８０％以上を失った。非適応ＡＣＫ−Ｔｅｔ及びＦＢＢ適応野生型株は両方とも、非適応野生型よりプロピオン酸に対する良好な耐性を有していた。しかしながら、その改良は、適応ＡＣＫ−Ｔｅｔ株で達成されたものほど顕著ではなかった。
【００７２】
【表８】
2011524749.tif 000010
【００７３】
野生型及びＡＣＫ−Ｔｅｔと比べて、適応ＡＣＫ−Ｔｅｔ株のみがわずかに高いμｍａｘを有していた（０．２５対０．２２ｈ−１）。しかしながら、阻害速度定数Ｋｐは、この適応変異体の場合、その親株と比べて１２倍以上高かった（５９．５対４．９ｇ／Ｌ）。明らかに、ＦＢＢ中で適応されたＡＣＫ−Ｔｅｔは、プロピオン酸に対してかなり高い耐性を獲得していた。ＡＣＫ−Ｔｅｔは野生型よりわずかに高いＫｐ値しか持たないが（４．９対３．８ｇ／Ｌ）、適応ＡＣＫ−Ｔｅｔは、適応野生型よりはるかに高いＫｐ値を有している（５９．５対８．９ｇ／Ｌ）。Ｐ．アシディプロピオニシの染色体からのａｃｋ遺伝子のノックアウトは、アセテート生成に影響を及ぼし、プロピオン酸に対する感受性を減退させただけでなく、これまで見たことのない極めて高いプロピオン酸耐性を獲得するための良好な適応性も変異体に付与した。この発見は全く想定外のことである。ＦＢＢから単離された適応変異細胞には著明な変化が見られた。ＦＢＢ適応ＡＣＫ−Ｔｅｔ変異体のタンパク質発現レベル、Ｈ＋−ＡＴＰアーゼ活性及び形態は、すべて親のＡＣＫ−Ｔｅｔ株のそれとは著しく異なるものであった。適応変異体は、細くて長い桿形状を獲得し、細胞膜内外のｐＨ又はＨ＋勾配の維持に重要な役割を演じるＨ＋−ＡＴＰアーゼの高い発現レベルを有していた。
【００７４】
要約すると、繊維床バイオリアクターに固定化されたＡＣＫ−Ｔｅｔ変異体を用いたプロピオン酸発酵は、〜０．５６ｇ／ｇグルコースという最大の理論的プロピオン酸収率をもたらし、これまでに達成された中で最も高い〜１０４ｇ／Ｌというプロピオン酸濃度に達した。ＦＢＢで適応後のＡＣＫ−Ｔｅｔ変異体は、糖（グルコース、フルクトース、キシロース、ラクトース、マルトース、及びスクロースなど）及びその他の炭素源（ラクテート及びグリセロールなど）からのプロピオン酸の工業生産に特に適している。図８に示されているように、代謝工学的Ｐ．アシディプロピオニシ（ＡＣＫ−Ｔｅｔ）による繊維床バイオリアクターでのプロピオン酸生成にグリセロールを炭素源として用いると、０．７１ｇ／ｇグリセロールという高いプロピオン酸収率が得られた。これはグルコースからの収率よりはるかに高い。さらに、グリセロール発酵における酢酸の生成はわずかに０．０３ｇ／ｇグリセロールで、グルコースからのものよりはるかに少ない（０．１ｇ／ｇグルコース）。従って、グリセロール発酵からプロピオン酸対酢酸比が２０（これに対し、グルコース発酵では〜５）という高純度のプロピオン酸を製造できる。グリセロール発酵から得られた最高プロピオン酸濃度は〜１０６ｇ／Ｌ、又は文献でグリセロールを基質としてこれまで報告された最大濃度（〜４２ｇ／Ｌ）の２．５倍であった。
【図１】
2011524749.tif 000011
【図２】
2011524749.tif 000012
【図３】
2011524749.tif 000013
【図４】
2011524749.tif 000014
【図５】
2011524749.tif 000015
【図６】
2011524749.tif 000016
【図７】
2011524749.tif 000017
【図８】
2011524749.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成23年2月23日(2011.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機酸を製造するための発酵法であって、ａｃｋ及びｐｔａ遺伝子の一つ又は両方を破壊された代謝工学的変異クロストリジウム又はプロピオン酸菌を供給し、その変異細菌を発酵性基質に暴露している間、前記変異細菌を固定化することによって、それらの酸耐性及びそれらの増殖速度が増大するように前記変異細菌を適応させて適応変異細菌を製造し、そして前記適応変異細菌を約５０ｇ／Ｌを超える最終有機酸発酵生成物濃度を提供するのに足る時間発酵性基質にさらに暴露することを含む方法。
【請求項２】
前記変異細菌が、Ｃ．チロブチリカム、Ｃ．ブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキイ、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ポプレチ、及びＣ．サーモブチリカム、並びにＰ．アシディプロピオニシからなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異細菌が繊維床リアクターに固定化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記変異細菌がＣ．チロブチリカムＰＡＫ−Ｅｍを含み、前記有機酸発酵生成物が酪酸及び水素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記変異細菌がＣ．チロブチリカムＰＰＴＡ−Ｅｍを含み、前記有機酸発酵生成物が酪酸及び水素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記変異細菌がＣ．チロブチリカムＨｙｄＥｍを含み、前記有機酸発酵生成物が酪酸及び水素を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記変異細菌がＰ．アシディプロピオニシＡＣＫ−Ｔｅｔを含み、前記有機酸発酵生成物がプロピオン酸を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記変異細菌がＰ．アシディプロピオニシＴＡＴ−ＡＣＫ−Ｔｅｔを含み、前記有機酸発酵生成物がプロピオン酸を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記発酵性基質が糖を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記糖が、グルコース、フルクトース、キシロース、ラクトース、マルトース、スクロース、及びそれらの混合物からなる群から選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記発酵性基質が、ラクテート及びグリセロールから選ばれる炭素源を含む、請求項７又は８に記載の方法。
【国際調査報告】
2011524749.tif 000019